(57)【要約】  本発明は、古典的な株開発の間に生じうる又は特異的な遺伝子操作を通しては生化学物質の生産のために独創的に構築された微生物株の代謝的進化の間に生じうるゲノム重複を同定及び追跡する方法、適切な選択マーカーを使用して望ましいゲノム重複のコピー数を安定化させる方法、及び安定化されたコピー数の機能性DNA配列を有する天然には存在しない微生物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
安定化されたコピー数の機能性DNA配列を有する天然には存在しない微生物であって、n個のコピーの機能性DNA配列、及び前記n個のコピーの機能性DNA配列の、少なくとも1つの隣接するペアの間に少なくとも1つの選択マーカーを含み、前記天然には存在しない微生物が祖先微生物の子孫であり、前記祖先微生物がn-1個未満のコピーの前記機能性DNA配列を含み、nが少なくとも2である、微生物。
【請求項２】
前記微生物が、細菌、酵母、糸状菌、又は古細菌である、請求項1に記載の天然には存在しない微生物。
【請求項３】
前記微生物が、エシェリキア属菌、クレブシエラ属菌、サッカロマイセス属菌、ペニシリウム属菌、バチルス属菌、イッサチェンキア属菌、ピキア属菌、カンジダ属菌、コリネバクテリウム属菌、ストレプトマイセス属菌、アクチノマイセス属菌、クロストリジウム属菌、アスペルギルス属菌、トリコデルマ属菌、リゾープス属菌、ムコール属菌、ラクトバチルス属菌、ザイゴサッカロマイセス属菌、及びクルイベロマイセス属菌からなる群から選択される、請求項1に記載の天然には存在しない微生物。
【請求項４】
前記微生物が、大腸菌又はクルイベロマイセス・マルキシアヌスである、請求項1に記載の天然には存在しない微生物。
【請求項５】
前記機能性DNA配列が、B重複、PDR12遺伝子、又はPDR12遺伝子のホモログにおいて重複された配列である、請求項4に記載の天然には存在しない微生物。
【請求項６】
前記選択マーカーが、トリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子、又はショ糖を代謝するためのカセットである、請求項1に記載の天然には存在しない微生物。
【請求項７】
前記微生物が、類似の培養条件下で、前記祖先微生物によって生じた所望の発酵生成物の力価より少なくとも10パーセント大きい前記所望の発酵生成物の力価を生じる、請求項1に記載の天然には存在しない微生物。
【請求項８】
安定化されたコピー数の機能性DNA配列を有する天然には存在しない微生物を創出する方法であって、
(a) n個のコピーの機能性DNA配列を含む天然には存在しない微生物を用意する工程であって、前記天然には存在しない微生物が祖先微生物の子孫であり、前記祖先微生物がn-1個未満のコピーの前記機能性DNA配列を含み、nが少なくとも2である、工程、及び
(b)前記機能性DNA配列のコピー数を安定化させるために、少なくとも1つの選択マーカーを、前記天然には存在しない微生物に、前記n個のコピーの前記機能性DNA配列の、少なくとも1つの隣接するペアの間において挿入する工程
を含む方法。
【請求項９】
前記微生物が、細菌、酵母、糸状菌、又は古細菌である、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
前記微生物が、エシェリキア属菌、クレブシエラ属菌、サッカロマイセス属菌、ペニシリウム属菌、バチルス属菌、イッサチェンキア属菌、ピキア属菌、カンジダ属菌、コリネバクテリウム属菌、ストレプトマイセス属菌、アクチノマイセス属菌、クロストリジウム属菌、アスペルギルス属菌、トリコデルマ属菌、リゾープス属菌、ムコール属菌、ラクトバチルス属菌、ザイゴサッカロマイセス属菌、及びクルイベロマイセス属菌からなる群から選択される、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
前記微生物が、大腸菌又はクルイベロマイセス・マルキシアヌスである、請求項8に記載の方法。
【請求項１２】
前記機能性DNA配列が、B重複、PDR12遺伝子、又はPDR12遺伝子のホモログにおいて重複された配列である、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
祖先微生物の機能性DNA配列の重複から得られた少なくとも1つの改善された発酵パラメーターを有する子孫微生物を同定する方法であって、
(a)少なくとも1つの子孫微生物を生成する第1の設定の発酵条件下で、前記祖先微生物を成長させる工程、
(b)第2の設定の発酵条件下で、前記少なくとも1つの子孫微生物を成長させる工程、
(c)少なくとも1つの、前記祖先微生物と比較して改善された発酵パラメーターを有する、少なくとも1つの子孫微生物を同定する工程、
(d)少なくとも1つの改善された発酵パラメーターを有する前記少なくとも1つの子孫微生物のDNA配列、及び前記祖先微生物のDNA配列を決定する工程、並びに
(e)前記子孫微生物における前記機能性DNA配列の重複を同定するために、少なくとも1つの改善された発酵パラメーターを有する前記少なくとも1つの子孫微生物の前記DNA配列を、前記祖先微生物のDNA配列と比較する工程
を含む方法。
【請求項１４】
前記第1の設定の発酵条件が嫌気的又は微好気的成長であり、前記第2の設定の発酵条件が好気的成長である、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
前記第1の設定の発酵条件が好気的成長であり、前記第2の設定の発酵条件が嫌気的又は微好気的成長である、請求項13に記載の方法。
【請求項１６】
前記祖先微生物が細菌、酵母、糸状菌、又は古細菌である、請求項13に記載の方法。
【請求項１７】
前記祖先微生物が、エシェリキア属菌、クレブシエラ属菌、サッカロマイセス属菌、ペニシリウム属菌、バチルス属菌、イッサチェンキア属菌、ピキア属菌、カンジダ属菌、コリネバクテリウム属菌、ストレプトマイセス属菌、アクチノマイセス属菌、クロストリジウム属菌、アスペルギルス属菌、トリコデルマ属菌、リゾープス属菌、ムコール属菌、ラクトバチルス属菌、ザイゴサッカロマイセス属菌、及びクルイベロマイセス属菌からなる群から選択される、請求項13に記載の方法。
【請求項１８】
前記微生物が、大腸菌又はクルイベロマイセス・マルキシアヌスである、請求項13に記載の方法。
【請求項１９】
前記機能性DNA配列が、B重複、PDR12遺伝子、又はPDR12遺伝子のホモログにおいて重複された配列である、請求項13に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2017年6月30日出願の米国仮特許出願第62/527,442号、及び2017年11月10日出願の米国仮特許出願第62/584,270号の優先権を主張するものである。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
該当なし。
【０００３】
共同研究契約
該当なし。
【０００４】
配列表に関する言及
本出願と関連する配列表は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含有するテキストファイルは、USPTO電子ファイリングシステム(EFS-Web)を通して電子的に提出した。
【０００５】
本発明は、微生物の発酵によって化学物質を生産する分野に関する。より詳細には、本発明は、所望の化学物質(「発酵生成物」とも称される)の力価を高めることによって、発酵によって化学物質を生産する方法の経済性を改善することに関する。更により詳細には、力価は、所望の化学物質の力価を高める染色体DNA配列重複を創出し、見出し、遺伝学的に安定化させることによって、高められうる。有益な重複は、同定されてしまえば、他の有益な遺伝形質と組み合わされうる。
【背景技術】
【０００６】
真正細菌、酵母、糸状菌、及び古細菌等の微生物は、遺伝子操作され得、有用な化学物質、例えば、有機酸、アルコール、ポリマー、アミノ酸、アミン、カロチノイド、脂肪酸、エステル、及びタンパク質を産生するように進化させることができる。多くの場合、この生産生物は、細胞が成長できる唯一の方法が摂取炭素源を所望の化学物質へ代謝することとなるように、所望の化学物質の生産を成長に結びつけるような遺伝子操作及び/又は古典的遺伝学によって構築されうる(例えば、Jantama等、2008年a;Jantama等、2008年b; (Zhu、Tan等、2014年);米国特許第8,691,539号;米国特許第8,871,489号;国際公開特許出願WO2011063055A2を参照されたい)。このような株を構築した後、下記のように説明した「代謝的進化」として知られるプロセスに供することができる。代謝的進化の方法のために、株は、適切な条件下で生育され、例えばコハク酸の生産を含む上記の例の場合、何世代もの間、pH制御された微好気性条件下、少量の接種から(例えば、約0.01〜0.5の低いOD600で開始)、実質的な成長(例えば、約1〜30のOD600まで)が起こるのに十分な時間、最少グルコース培地中で成長させ、次いで、この培養物を、再度、約0.01〜0.5の低いOD600で新鮮培地に接種し、次いで、培養物中でより速く成長する株が進化するまで全プロセスを何回も繰り返すことによって成長させる。上記の例における再接種の各工程は、「継代」とも称される。各継代における発酵は、回分発酵でも流加発酵でもよい。
【０００７】
新鮮培地への継代の繰り返しに代わる手段として、代謝的進化は、連続培養(「ケモスタット」、「オーキソスタット」、又は「pHスタット」としても既知である)において達成されうる。連続培養では、新鮮培地は、十分な混合が行われる発酵槽中に制御されたポンプ又はサイフォンによって送り込まれ、発酵ブロスは、培養液の作業量が一定に保たれるように同様の速度で除去され、細胞増殖の速度は、流入する新鮮培地による希釈の速度との関係を保つことができる。ケモスタットでは、供給速度は、特定の細胞密度を維持するように調整される。オーキソスタットでは、供給速度は、栄養素又は生成物の一定濃度を維持することを目的に、前記栄養素又は生成物の濃度を測定することによって決定される。pHスタットでは、供給速度は、特定の所望のpHを維持するように調整される。進化によって成長の速度は上がるため、供給の速度を上げることで、より速く成長するバリアントを連続的に選択できる。
【０００８】
どちらのタイプの代謝的進化(すなわち、継代又は連続培養)の間でも、個々の細胞において自然突然変異が生じる。偶然に自然突然変異が成長上の利点を付与すれば、次いで、変異体細胞の子孫は、(成長上の利点の重要性に応じて)徐々に又は急速に、他の細胞より増殖し、個体集団を乗っ取ることとなる。代謝的進化プロセスの間の任意の時点で、個々の細胞は、2%寒天を加えた等価の培地を含有するペトリ皿上にストリークすることによって液体培養物から分離され得、個々のコロニーが採取され、出発株及び中間分離株と比較して試験されうる。
【０００９】
代謝的進化のための好ましい出発株は、関連の遺伝子を完全に欠失させることによって望まれない競合経路が排除されているため、どの望まれない経路も復帰変異又は抑制によって再現する可能性が非常に低い株である。任意の所与の工程において、突然変異の頻度を高めるために、培養物は、変異原、例えば、ニトロソグアニジン(NTG)、メタンスルホン酸エチル(EMS)、過酸化水素、又は紫外線に曝露されてもよい。
【００１０】
代謝的進化によって経済的に魅力的な株が得られた後、そのゲノムは、当技術分野で公知の方法のいずれか、例えば、ショットガンクローニング及びシーケンシング、Illuminaプラットフォーム、並びにPacBioプラットフォームによって配列決定されうる。次いで、代謝的進化の間に生じたあらゆる突然変異が同定されうるように、得られたDNA配列は、開始株又は祖先株のDNA配列と比較されうる。任意選択で、各突然変異は、生成物形成において観察された改善にどの突然変異が貢献しているのかを調べるために、野生型対立遺伝子を進化した株へ再び取り込むことによって、又はゲノム配列由来の個々の突然変異若しくはそれらの組合せを天然株又は野生株へ導入する「リバースエンジニアリング」によって、単独で又は組み合わせて検討されうる。
【００１１】
上記のプロセスは、コハク酸、エタノール、及びD-乳酸、並びにその他の生成物を産生するように操作された大腸菌(Escherichia coli)株に対して実施されてきた(例えば、国際公開特許出願WO2011063055A2)。生のゲノム配列データを処理し、この生データを完全なゲノム配列へまとめるように設計された様々なソフトウエアパッケージ、例えば、Lasergene Genomic Suiteによって、典型的には、参照(親)株と比較して進化した株で見つかった突然変異の一覧表を作成する。しかしながら、このようなコンピューターで作成した一覧表は、特に繰り返されるDNA配列について、正確に解釈するには不完全であり、又は難解である可能性がある。例えば、大腸菌株は、典型的には、様々な挿入(IS)エレメントの複数のコピーを含有する。例えば、Genbank受託番号NC_010468の大腸菌Crooks(ATCC 8739)は、IS4のコピーを多く含有する。IS4は約1400塩基対であり、Illuminaプラットフォームの配列リード長は約50〜250塩基にすぎず、ペアエンドリードは、典型的には約500塩基対長の断片からであるため、IS4コピーの中央からの配列リードは、周囲のDNAとオーバーラップしないこととなるため、シーケンシングソフトウエアでは、IS4の様々なバリアントを正確に配置することは不可能である。更に、本明細書において開示されたタイプの重複のような、多くの遺伝子を含有する大きな重複の中央にある分岐した対立遺伝子は、PacBioプラットフォームを用いてより長いリードが可能であるとしても、扱いは容易ではなかろう。
【００１２】
1つ又は複数の遺伝子の重複が、株開発の間に生じることはよく知られている(Elliott、Cuff等、2013年)。例えば、(遺伝子操作及び代謝的進化と対照的な)突然変異誘発及びスクリーニングによって大規模に行われたペニシリン産生株の開発において、ペニシリン生合成の遺伝子クラスターが、自発的に5つ又は6つの縦列コピーにまで増幅されていたことが示された(Fierro、Barredo等、1995年)。バチルス・スブチリス(Bacillus subtilis)における遺伝子カセットの意図的増幅は、限定された耐性を提供する抗生物質耐性遺伝子、例えばテトラサイクリン耐性遺伝子を含有するカセットを入れ、次いで、濃度を高めた抗生物質で株を成長させることによって、得られた形質転換体をより高い耐性に進化させる、周知の方法である(欧州特許第1214420号)。次いで、得られた株は、縦列重複に約2〜7コピーのカセットを有することを確認される。しかしながら、このような縦列重複は、株を抗生物質の非存在下で成長させると、相同組換えによって1つのコピーまで急落する可能性がある。他方、高濃度の抗生物質の存在下での生育は、非現実的であり、望ましくない。
【００１３】
同様の方法が、大腸菌において、組み込まれたカセットのコピー数を増幅させるために使用された(Tyo、Ajikumar等、2009年)。しかしながら、またしても、増幅を達成するために抗生物質耐性遺伝子が使用され、増幅されたコピー数を維持するためにrecA遺伝子が欠失された。recA細胞の集団が高いパーセントの死細胞を含むことはよく知られており、よって、この解決策は理想的ではない。遺伝子コピー数の増幅は、動物細胞においても達成されているが、特異的な選択圧を除去すると、コピー数は不安定であった(Tyo、Ajikumar等、2009年)。
【００１４】
縦列整列での遺伝子カセットの増幅は、サッカロマイセス属(Saccharomyces)の酵母においても既知でもある(米国特許第7,527,927号(Lopes、de Wijs等、1996年))。増幅される予定のカセットは、反復リボソームDNA遺伝子に相同の配列、及び抗生物質G418耐性遺伝子等の選択マーカー(米国特許第7,52,927号)、又はdLEU2遺伝子等の栄養要求性補完マーカー(Lopes、de Wijs等、1996年)を含有しうる。しかしながら、この場合もまた、強力な選択がなければ、増幅されたコピー数は不安定であり、消失する(Lopes、de Wijs等、1996年)。
【００１５】
上記に示したペニシリンの例では、増幅されたコピー数を安定化させ、維持する選択マーカーはなかった。増幅されたカセットの安定性は論じられていなかったが、理論上、コピー数は、相同組換えによって容易に失われうる。増幅されたコピー数を維持する唯一の手段は、本来の生産性の維持について、保存株を慎重にキュレーションすること、及び頻繁に試験することであると考えられる。他の例において、コピー数が増幅される予定のカセットは最初から選択マーカーを含有するが、マーカーは、増幅されたコピー数を維持するために、高濃度の若しくは高価な抗生物質又は合成培地のいずれかである特別な条件を必要とする。したがって、発明者らに既知の従来技術のすべての場合において、望ましい培養条件、すなわち、安価で実用的で、所望の生成物の生産に十分に好適である培養条件下で、重複DNA配列のコピー数を安定化する方法はない。容易に使用できる、重複DNA配列に付随する選択マーカーがない場合、意図的選択圧を用いるにせよしないにせよ、自発的に生じた重複DNA配列を安定化する既知の方法は、やはりない。したがって、化学物質がコハク酸等の物品であれ特定のタンパク質等のより有価な化学物質であれ、化学物質の経済的に魅力的な商業生産のために、操作された微生物において、有用なコピー数の縦列重複DNA配列を安定化させ、維持する方法の必要性が依然としてある。本発明は、このような方法及び前記方法から得られる株を提供する。
【００１６】
別の驚くべき発見は、微生物株は、大規模な代謝的進化及びゲノムシーケンシングの後でさえ、慣例の取り扱い及び保管の間に更に進化しうることである。このような更なる進化は、代謝的進化の間に使用される発酵条件とは異なる発酵条件下で株を培養することから得られうる。
【００１７】
原油の需要の高まりは、現行の燃料及び石油由来化学物質に取って代わる再生可能な資源由来の代替燃料及び化学物質を生成するための全世界的な研究をもたらしてきた。2004年には、US Department of Energyが、有望なバイオマス由来化学物質の上位12種のリストを作成した。これらの化学物質のうちの1つは、コハク酸である。
【００１８】
コハク酸は、1,4-ブタンジオール(BDO)、テトラヒドロフラン(THF)、ガンマ-ブチロラクチン(GBL)及びN-メチルピロリドンを含む、産業において公知の幅広い種類の目標化合物に化学的に変換されうる。コハク酸はまた、動物飼料、可塑剤、融合助剤、凝固剤、繊維、プラスチック、及びPBS(プリブチレンサクシネート)等のポリマーを含む、多数の大量の市販製品の製造において有用である。PBSは、石油由来であり生物分解性ではない現行のポリマーに取って代わることができる生物分解性ポリマーである。
【００１９】
1,4-ブタン二酸としても既知であるコハク酸(C4H6O4)は、コハク酸アニオンの形態を容易にとり、生体において複数の役割を有するジカルボン酸である。スクシネートは、すべての好気性生物で共有されるエネルギー生産回路であるトリカルボン酸(TCA)回路における中間体であり、多くの細菌によって産生される発酵生成物のうちの1つである。スクシネートは、全般的化学量論: 7C6H12O6 + 6CO2 > 12C4H6O4 + 6H2Oで表される一連の酵素触媒反応によって、出発物質としての六炭糖、グルコース(C6H12O6)から産生される。嫌気性条件下で、還元的経路と酸化的経路とを酸化還元の平衡を保つよう組み合わせて作用させた場合、この反応の理論的な最大収量は、グルコース1モル当たりコハク酸1.71モルであり、又はグルコース1グラム当たりコハク酸1.12グラムである。
【００２０】
多数の炭素源を使用するコハク酸の商業規模の発酵生産のために、微生物による生体触媒が開発されてきた。大腸菌株KJ122は、様々な代謝経路の作用に関与する多数の遺伝子に突然変異を導入し(ΔldhA、ΔadhE、ΔackA、ΔfocA-pflB、ΔmgsA、ΔpoxB、ΔtdcDE、ΔcitF、ΔaspC、ΔsfcA)、遺伝子操作された株を、遺伝子操作の様々な段階の間に代謝的進化のプロセスに供することによって、大腸菌Crooks株から得られた((Jantama、Haupt等、2008年);(Jantama、Zhang等、2008年);Zhu等、2014年;及び米国特許第8,691,539号)。
【００２１】
ここ数年の間に、大腸菌KJ122は、グルコース以外の多数の炭素源を利用するように更に改良されてきた。KJ122をセルロースの加水分解から誘導されたC5糖及びC6糖の存在下で代謝的進化させて、コハク酸生産においてC5糖及びC6糖いずれも利用できる株を開発した(米国特許第8,871,489号)。KJ122はまた、コハク酸の生産のための炭素源としてショ糖(WO2012/082720)又はグリセロール(WO2011373671)を利用できる株を生成するために、遺伝子操作に供されてきた。KJ122細菌株においてコハク酸生産を高める方法として、糖取り込みの効率を向上させる研究も行われてきた(WO2015/013334)。
【００２２】
全ゲノムシーケンシングが、代謝的進化のプロセスの間にKJ122株において生じた様々な突然変異の同定で用いられてきた。逆遺伝学的解析に続いて、コハク酸生産における、全ゲノムシーケンシングによって同定されたこれらの突然変異の有意性を確定した。7L発酵槽の中で、多くのKJ122保存株が異なる性能を示し、これらのKJ122保存株間の性能の差は、(どの保存株が参照保存株として使用されるかに応じて)スクシネート力価で30%の減少又は50%の増加と大きいものであったことが予想外に発見されている。KJ122のこれらの様々な保存株の全ゲノムシーケンシングの後、DNAStar社(Madison、WI、米国)からのLasergene Genomic Suiteソフトウエアパッケージを使用してこれらのKJ122保存株のゲノム配列の比較分析を行って、幾つかのKJ122保存株において或るゲノム領域における多くの機能性DNA配列重複を同定し、これらのゲノム重複の少なくとも1つがコハク酸生産の力価の上昇と関連していることを明らかにした。しかしながら、望ましいゲノム重複は不安定であり、よって、有用な重複を安定化する方法が必要である。本発明は、生産株において所望のゲノム重複を安定化させるための方法を提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２３】
【特許文献１】米国特許第8,691,539号
【特許文献２】米国特許第8,871,489号
【特許文献３】国際公開特許出願WO2011063055A2
【特許文献４】欧州特許第1214420号
【特許文献５】米国特許第7,527,927号
【特許文献６】WO2012/082720
【特許文献７】WO2011/373671
【特許文献８】WO2015/013334
【特許文献９】特許出願WO2014/043591
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
前述の理由から、(1)所望の生成物の生産を増強する大きな遺伝子重複を創出し、(2)生産株における大きな遺伝子重複を同定し、(3)大きな遺伝子重複の正確な構造を決定し、(4)コピー数に関して有益な大きな遺伝子重複を安定化させる、という当技術分野におけるアンメット・ニーズが依然としてある。
【００２５】
本明細書において、当技術分野における既存の問題及び制限を克服する方法及び微生物株を開示する。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
本発明は、古典的な株開発の間に生じうる又は特異的な遺伝子操作によって生化学物質の生産のために独創的に構築された微生物株の代謝的進化の間に生じうるゲノム重複を同定及び追跡する方法、適切な選択マーカーを使用して望ましいゲノム重複のコピー数を安定化させる方法、並びに安定化されたコピー数の機能性DNA配列を有する天然には存在しない微生物に関する。
【００２７】
一実施形態において、本発明は、企図的な遺伝子操作によって生化学物質の生産のために独創的に操作された微生物株の代謝的進化の間に生じる機能性DNA配列重複を同定するための全ゲノムDNAシーケンシングを含む方法を提供する。この実施形態の一態様において、本発明は、コハク酸生産大腸菌株KJ122の幾つかの分離株及び誘導株を含む比較ゲノム解析、及び高い力価のコハク酸生産と関連した、本明細書において「B重複」と表されるゲノムの大きな多重遺伝子部分を含む機能性DNA配列の縦列重複の同定を含む。この実施形態の別の態様において、本発明は、B重複を用いたKJ122株における更なる遺伝子改変の導入における課題を特定し、解決した。
【００２８】
別の実施形態において、本発明は、代謝的進化のプロセスの間に生じた望ましいゲノム重複を安定化する方法を提供する。この実施形態の一態様において、本発明は、重複遺伝子の隣接する2つのコピーの間に選択マーカーを挿入することによる、代謝的進化の間に生じた望ましいゲノム重複を安定化する方法を提供する。この目的に好適な選択マーカーのセットには、抗生物質耐性遺伝子、ハウスキーピング機能に関与する1つ又は複数のタンパク質をコードする遺伝子、必須遺伝子、条件的必須遺伝子、栄養要求性補完遺伝子、及び成長のための唯一の炭素源としてショ糖を資化する能力等の選択表現型を有するタンパク質をコードする任意の外来遺伝子が含まれるが、それだけに限定されない。
【００２９】
更に別の実施形態において、本発明は、望ましい生化学物質の発酵生産のために、B重複を有する遺伝子操作された株を構築し、安定化する方法を提供する。この実施形態の一態様において、本発明は、コハク酸生産の高力価を有し、更に副産物としての酢酸のレベルも低減する微生物株の構築を説明する。
【００３０】
特に明記しない限り、本明細書で使用される用語はすべて、本発明が関係する分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本発明を実行するための好適な方法及び材料の実施例を下記に説明するが、当業者は、開示された実施例に基づき、本明細書に記載の方法及び材料と類似の又は等価の方法及び材料が本発明の実施又は試験において使用されうることを理解されよう。本明細書において言及されたすべての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、全体が参照により組み込まれる。矛盾がある場合、命名法及び定義を含め、本明細書が優先することとなる。本明細書に含まれる材料、方法、例、及び図面は、例示的であるにすぎず、限定することを意図するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】リード頻度の急激な倍増によってB重複を示す、Illumina社(San Diego、California、米国)プラットフォームゲノムシーケンシング及びDNAStar社(Madison、Wisconsin、米国)からのLaserGene Genomic Suiteシーケンシングソフトウエアからの、ゲノム塩基対位置に対するリード頻度(カバレッジのシークエンス深度)をプロットしたグラフである。
【図２】3工程でのKJ122におけるB重複の形成についての、理論的に仮定される機序を図示する略図である。
【図３】B重複の存在を判定する識別PCRを図示する略図である。
【図４】選択マーカーを用いてB重複を安定化する機序を図示する略図である。
【図５】glf、glk、及びB重複を含む細菌株の構築を図示する略図である。
【図６】rrsG::cscBAK及び安定化されたB重複を含む細菌株の構築を図示する略図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
命名法
本発明の理解を容易にするために、命名法の説明を下記に示す。
【００３３】
命名法に関しては、細菌遺伝子又はコード領域は、一般的にイタリック体の小文字で命名され、例えば、大腸菌由来の「tpiA」又は単に「tpi」は、トリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子のための名前であり、一方、遺伝子によってコードされた酵素又はタンパク質は、同じ文字を用いて命名されうるが、最初の文字は大文字で、イタリック体は用いず、例えば「TpiA」又は「Tpi」である。酵母遺伝子又はコード領域は、一般的にイタリック体の大文字で命名され、例えば「PDC1」は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ酵素をコードしており、一方、遺伝子によってコードされた酵素又はタンパク質は、同じ文字を用いて命名されうるが、最初の文字は大文字で、イタリック体は用いず、例えば「Pdc1」又は「Pdc1p」であり、後者は、酵素又はタンパク質を示すのに酵母において用いられる慣例の一例である。「p」は、指定された遺伝子によってコードされたタンパク質の略称である。酵素又はタンパク質はまた、より記述的な名前で呼ばれ得、例えば、トリオースリン酸イソメラーゼ又はピルビン酸デカルボキシラーゼは、上記の2例をそれぞれ指す。特定の触媒活性を有する酵素の1つの例をコードする遺伝子又はコード領域は、歴史的に異なる起源、機能的に冗長な遺伝子、別々に制御された遺伝子であるため、又は異なる種由来の遺伝子であるため、幾つかの異なる名前をもちうる。例えば、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、GPD1、GDP2、又はDAR1、並びにその他の名前が命名されうる。
【００３４】
定義
本発明の理解を容易にするために、幾つかの用語は下記に定義し、その他の用語は本明細書の他の箇所で明らかにする。
【００３５】
「微生物」とは、細菌、酵母、糸状菌、又は古細菌の任意の細胞又は株を意味する。微生物は、任意の1つ又は複数の周知の方法を用いることによって、例えば、突然変異誘発、交配、品種改良、遺伝子操作、進化、選択、及びスクリーニングによって、意図的に遺伝学的に改変されても、遺伝学的に自然に変化させてもよい。このような方法において、本明細書において「祖先微生物」又は「祖先株」と称される出発株を、遺伝学的に改変して、1つ又は複数の遺伝学的変化を獲得した後、前記祖先株からの1回又は複数回の細胞分裂によって増殖させうる新規の株を創出する。祖先株と遺伝学的に異なるが、遺伝学的改変及びその後の細胞分裂によって前記祖先株から派生した。該株は、本明細書において「子孫微生物」又は「子孫株」と称される。子孫微生物は、その祖先株に対して1つ又は複数の遺伝学的変化を有しうることができる。子孫微生物は、その祖先微生物からの任意の有限回数の発生(細胞分裂)の結果として得られうる。子孫微生物の1つのタイプは、祖先微生物におけるDNA配列の意図的な付加、除去、又は改変によって創出された微生物を意味する、「派生体微生物」である。子孫微生物は、DNAシーケンシングによって又は改善された発酵パラメーター等のその他の測定可能な表現型によって、その関連祖先微生物と区別されうる。
【００３６】
「カセット」、「発現カセット」、又は「遺伝子カセット」とは、宿主生物に取り込まれた場合、1つ又は複数の所望のタンパク質、酵素、若しくは代謝産物の生産を生じさせる又は増加させることができる、或いは排除する又は減じることができるデオキシリボ核酸(DNA)配列を意味する。タンパク質又は酵素を産生するためのカセットは、典型的には、少なくとも1つのプロモーター、少なくとも1つのタンパク質コード配列、及び任意選択で、少なくとも1つのターミネーター配列を含む。発現される予定の遺伝子が異種又は外来であれば、プロモーター又はターミネーターが由来する天然の遺伝子との二重の組換えを防止するために、プロモーター及びターミネーターは、一般的には、2つの異なる遺伝子又は異種遺伝子に由来する。カセットは、任意選択で、且つ好ましくは、祖先(又は「宿主」若しくは「親」)生物のDNA配列と相同な片方又は両方の末端に、1つ又は2つの隣接配列を含有してもよく、この結果、該カセットが宿主生物の染色体又はプラスミドのいずれかのゲノムとの相同組換えを起こすことができ、隣接配列と相同な部位に前記染色体又はプラスミドへのカセットが組み込まれる。カセットの片方の末端にのみ隣接相同を含有する場合、次いで、環状型のカセットが、前記隣接配列において1回の組換えによって組み込まれうる。カセットの両方の末端が隣接相同を含有する場合、次いで、線状又は環状型で提供されたカセットが取り囲む隣接部との二重組換えによって組み込まれ得、又は環状型は1回の乗換え事象によって全体として組み込まれる。カセットは、遺伝子操作によって構築されてもよく、例えば、コード配列は非天然のプロモーターから発現され、又は該カセットは天然にいて付随するプロモーターを用いることができる。カセットは、プラスミド中に組み込まれ、環状であってもよく、又はカセットは、制限酵素切断、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、プライマー伸長PCRによって、又はインビボ若しくはインビトロ相同組換えによって創出された線状DNAであってもよい。カセットは、選択マーカーを含むように設計されてもよい。カセットは、例えば、ライゲーション、NEBuilderキット(New England BioLabs社、Ipswitch、Massachusetts、米国)を使用した「ギブソン法」、及びインビボア
センブリーによる制限酵素で生成させた断片の連結等の、当技術分野で公知の方法を用いる1つ又は複数の工程において構築されてもよい。
【００３７】
「選択マーカー」とは、親又は祖先微生物株において機能的に存在しない任意の遺伝子、カセット、又はDNA配列の他の形態を意味するが、前記祖先微生物株へ取り込まれることが可能であり、前記祖先微生物株に取り込まれた後、機能して、1つのタイプの子孫株を生成することができ、少なくとも1つの生育条件の設定下で前記子孫株の成長のために必要とされるものである。したがって、選択マーカーは、単独で又は1つ若しくは複数の他の有用なDNA配列と共にカセットに含まれる場合、それまで前記選択マーカーを含有しなかった株への形質転換、形質導入、トランスフェクション、品種改良、又は交配後、追加的に付加されたDNA配列を伴う又は伴わない前記選択マーカーの取り込み成功について選択又はスクリーニングするために使用されうる。場合によって、選択マーカーは、株において変異(好ましくは株から欠失)させてもよく、その場合、次いで、未変異型が、得られた変異又は欠失株において選択マーカーとして使用されうる。ほどんどの場合、選択マーカーを有さない祖先株は、特定の設定条件下(例えば、富化培地、栄養補充培地、又は抗生物質を欠く培地)で成長することができるが、選択マーカーが親株に取り込まれた後は、後代又は子孫株は、親株が成長することができない設定条件下(例えば、最少培地、栄養を欠く培地、又は抗生物質含有培地)で成長することができる。有用な選択マーカー遺伝子には、機能性抗生物質耐性遺伝子又はカセット、ショ糖若しくはキシロース等の特定の炭素源での生育を付与する遺伝子又はカセット、及びある生育条件下では欠失されてもよい生合成経路遺伝子(例えば、大腸菌におけるtpiA、これは最少グルコース培地又は最少ショ糖培地中で必須であるが、ルリア培地等の富化培地中では必須ではない)が含まれるが、これらだけに限定されない。選択マーカーとして使用される予定の生合成経路遺伝子(例えば、pyrF又はURA3)については、親株は、当然、対応する遺伝子における変異、好ましくは、ヌル変異(効率的に機能を消失させる変異)を含有しなければならない。抗生物質耐性遺伝子については、該耐性遺伝子は、一般的に、選択を可能にするために宿主株において十分に機能するプロモーターを必要とする。発現されることが望ましい選択マーカーは、宿主株にカセットの形態で取り込まれうるのではあるが、DNA配列、例えば開始コドンから停止コドンまでのコード配列が、プロモーター又はターミネーターなしで、入ってくるコード配列が宿主株生来のものである遺伝子のコード配列を正確に又は概ね置換するように宿主染色体又はプラスミドに組み込まれてもよく、その結果、組込み後、入ってくるコード領域は、残存する、入ってくるコード配列によって置換された宿主のコード配列に付随していたプロモーターから発現される。
【００３８】
「形質転換体」とは、それまで所望のDNA配列を含有していなかった宿主又は親若しくは祖先株への、線状又は環状及び自己複製又は非自己複製の前記DNA配列の取り込みの結果として生じる細胞又は株を意味する。「形質転換」とは、形質転換体を得るためのあらゆる方法を意味する。
【００３９】
「力価」とは、発酵ブロス中の化合物の濃度を意味し、一般的に、1リットル当たりのグラム数(g/l)として又は体積当たりのパーセント質量(%w/v)として表される。力価は、定量分析クロマトグラフィー、例えば、高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)又はガスクロマトグラフィー(GC)等の任意の好適な解析方法によって、外標準及び任意選択で内標準を使用して作成した検量線を用いて決定される。
【００４０】
「異種の」とは、生物中で本来又は天然ではみられない遺伝子又はタンパク質を意味するが、形質転換、交配、トランスフェクション、又は形質導入等による遺伝子操作によって生物中へ導入されうるものである。異種遺伝子とは、染色体中へ組み込まれ(すなわち、挿入され又は取り込まれ)ても、プラスミド上に含有されてもよい。「外来の」とは、親又は宿主株の活性と比較して活性を増加させる、低減する、又は排除する目的で、形質転換、交配、形質導入、又は突然変異誘発等による遺伝子操作によって、生物中に導入された若しくは生物中で改変された遺伝子又はタンパク質を意味する。外来遺伝子又はタンパク質は、異種であってもよく、又は宿主生物生来のものであるが、1つ又は複数の方法、例えば、染色体又はプラスミドにおける変異、欠失、プロモーターの変更、ターミネーターの変更、重複、又は1つ若しくは複数の更なるコピーの挿入によって、改変されている遺伝子若しくはタンパク質であってもよい。したがって、例えば、DNA配列の第2のコピーが天然の部位と異なる染色体中のある部位に挿入されれば、この第2のコピーは外来であることになる。
【００４１】
「プラスミド」とは、染色体より実質的に小さく、微生物の染色体から分離され、染色体から別々に複製する、環状又は線状DNA分子を意味する。プラスミドは、細胞当たり約1個のコピーで又は細胞当たり複数のコピーで存在してもよい。微生物の細胞内でのプラスミドの維持には、通常は、例えば抗生物質耐性遺伝子、又は染色体の栄養要求性の補完を用いる、プラスミドの存在を選択する培地での生育が必要とされる。ただし、一部のプラスミド、例えば多くのサッカロマイセス属の株における2μm環状プラスミドは、安定的維持に対する選択圧を必要としない。
【００４２】
「染色体」又は「染色体DNA」とは、プラスミドより実質的に大きく、通常は、維持のために任意の抗生物質又は栄養選択を必要としない、線状又は環状DNA分子を意味する。本発明において、酵母人工染色体(YAC)が、異種及び/又は外来遺伝子を取り込むためのベクターとして使用されうるが、通常、維持のための選択圧が必要になる。
【００４３】
「過剰発現」とは、親又は宿主微生物において、遺伝子又はコード領域によってコードされた酵素又はタンパク質を、同じ又は類似の生育条件下で、親又は宿主微生物の野生型においてみられたレベルより高いレベルで産生させることを意味する。これは、例えば、次の方法のうちの1つ又は複数、すなわち、より強力なプロモーターを取り込むこと、より強力なリボソーム結合部位を取り込むこと、ターミネーター若しくはより強力なターミネーターを取り込むこと、コード領域の1つ又は複数の部位におけるコドンの選択を改善すること、mRNA安定性を改善すること、又は染色体に複数のコピーを導入すること若しくは多コピープラスミド上にカセットを置くことのいずれかによって遺伝子のコピー数を増加させることによって、達成されうる。過剰発現された遺伝子から産生される酵素又はタンパク質は、「過剰生産された」と言われる。過剰発現されている遺伝子又は過剰生産されているタンパク質は、宿主微生物生来のものであってもよく、又は異なる生物から宿主微生物中へ遺伝子操作法よって移植されたものであってもよく、その場合は、酵素又はタンパク質、及び該酵素又はタンパク質をコードする遺伝子又はコード領域は、「外来の」又は「異種の」と呼ばれる。これらは操作されていない宿主生物には存在しないため、外来又は異種遺伝子及びタンパク質は、定義上、過剰発現され、過剰生産される。
【００４４】
「ホモログ」とは、Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)配列比較用コンピュータープログラム(Altschul、Gish等、1990年、Altschul、Madden等、1997年)、並びに欠失及び挿入を考慮することによって決定された場合に、第2のDNA配列と比較して少なくとも50%配列同一性を有する第1の遺伝子又はDNA配列、又は前記第1のDNA配列が第1のタンパク質配列へ翻訳され、前記第1のタンパク質配列が、前記第2のDNA配列を翻訳することによって得られる第2のタンパク質配列と比較して少なくとも25%アミノ酸配列相同性を有する前記第1の遺伝子又はDNA配列を意味する。第1のDNA又はタンパク質配列が、第2のDNA又はタンパク質配列のホモログであることが明らかにされた場合、次いで、この2つの配列は、「ホモログ」又は「相同」であると言われる。カセットが、特定の部位でゲノムへ組み込まれることが意図される場合、隣接相同DNA配列が、標的にされているDNA配列に対して100%同一性又はほぼ100%同一性を有することが好ましい。
【００４５】
「アナログ」とは、別の遺伝子、DNA配列、又はタンパク質の生物学的機能と類似の生物学的機能を果たすが、BLAST配列比較用コンピュータープログラム(Altschul等、1990年;Altschul、1997年)、並びに欠失及び挿入を考慮することによって決定された場合に、(タンパク質配列、又は遺伝子配列から得られるタンパク質配列を比較した場合)前記別の遺伝子、DNA配列、又はタンパク質と25%未満の配列同一性がある、遺伝子、DNA配列、又はタンパク質を意味する。サッカロマイセス・セレビシエGpd1タンパク質のアナログの一例は、S.セレビシエGut2タンパク質であると考えられる。それは、どちらのタンパク質も同じ反応を触媒作用する酵素であるが、この2つの酵素又はそれらの各遺伝子の間に有意な配列相同性がないからである。当業者であれば、特定の生物学的機能を有する多くの酵素及びタンパク質(すぐ上の例では、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ)は、ホモログ又はアナログとして、且つ酵素又はタンパク質のこのようなファミリーのメンバーは構造に若干又は実質的に違いがあるものの同じ機能を共有するため、多様な生物において見出されうることを理解するであろう。同じファミリーの様々なメンバーは、ほとんどの場合、遺伝子操作の現行方法を使用して、同じ生物学的機能を果たすために使用されうる。したがって、例えば、トリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子は、多様な生物のいずれかから得られうる。
【００４６】
「変異」とは、天然の又は親若しくは祖先DNA配列からの任意の変更、例えば、逆位、重複、1つ又は複数の塩基対の挿入、1つ又は複数の塩基対の欠失、未成熟終止コドンを創出する塩基変更をもたらす点変異、又は当該位置においてコードされるアミノ酸を変更するミスセンス変異を意味する。変異とは、前記DNA配列によってコードされた予想アミノ酸配列の変更をもたらさない、DNA配列の1つ又は複数の塩基対の変更でさえ意味しうる。「ヌル変異」とは、遺伝子の機能を事実上排除する変異を意味する。あるコード領域の完全な欠失はヌル変異であることになるが、1つの塩基変更もまた、ヌル変異をもたらしうる。「変異体」、「変異体株」、「変異株」、又は「変異された」株とは、天然の、野生型、親又は祖先株と比較して1つ又は複数の変異を含む株を意味する。
【００４７】
「〜の機能を排除する又は低減させる変異」とは、mRNAレベル、タンパク質濃度、代謝産物生産、又は株の特異的酵素活性等の、遺伝子、タンパク質、又は酵素の任意の測定可能なパラメーター又は結果が測定され、類似の条件下で成長させた未変異の親株のそれらと比較された場合、前記測定可能なパラメーター又は結果を低減させるあらゆる変異を意味する。このような変異は、好ましくは欠失変異であるが、機能の所望の排除又は低減を成し遂げるあらゆるタイプの変異であってもよい。
【００４８】
「強力な構成的プロモーター」とは、RNAポリメラーゼによって転写されるDNA配列又は遺伝子の(慣習的な5'から3'への方向で示された場合、遺伝子の5'側に対して)典型的には上流に位置するDNA配列、及び前記DNA配列又は遺伝子を、RNAポリメラーゼによる転写により任意の適切な検定手法によって直接的又は間接的に容易に検出されるレベルで発現させるDNA配列を意味する。適切な検定手法の例としては、定量的逆転写酵素+PCR、コードされた酵素の酵素検定、クマシーブルー染色したタンパク質ゲル、又は、前記転写、及び転写のレベル、代謝産物、若しくはインデューサー化学物質を特に調節するタンパク質の有無にかかわらず起こるこのような測定可能な転写の結果として間接的に産生される代謝産物の測定可能な生産が挙げられる。公知の方法を使用することによって、強力な構成的プロモーターを、使用して、天然のプロモーター(そうでない場合、自然界ではDNA配列又は遺伝子から上流に存在しているプロモーターである)を置換することができ、その結果、プラスミド又は染色体のいずれかに配置され得、且つ天然のプロモーターより高いレベルの所望のDNA配列又は遺伝子の発現のレベルを提供する発現カセットが得られる。強力な構成的プロモーターは種又は属特異的でありうるが、酵母由来の強力な構成的プロモーターは、遠縁の酵母において十分に機能しうることが多い。例えば、アシュビア・ゴシッピィ(Ashbya gossypii)由来のTEF1(翻訳伸長因子1)プロモーターは、サッカロマイセス・セレビシエを含む多くの他の酵母の属において十分に機能する。
【００４９】
「微好気性」又は「微好気性発酵条件」とは、発酵タンクへの意図的給気が、1分当たりの液体ブロスの体積当たりの空気の体積(vvm)が0.1未満であることを意味する。「嫌気性」又は「嫌気性発酵条件」とは、発酵タンクへ意図的に給気されないことを意味する。「好気性」又は「好気性発酵条件」とは、1分当たりの液体ブロス体積当たり0.1体積(vvm)以上の空気が、発酵タンクへ意図的に供給されることを意味する。古典的に、「発酵」とは、微生物の嫌気性又は微好気性培養を指した。しかしながら、本明細書では簡単にするために、「発酵」又は「発酵条件」という用語は、液体培地中又は固体培地上、例えば寒天ペトリ皿上での生育を含む、嫌気性、微好気性、又は好気性を含む、微生物のあらゆるタイプの生育又は培養を意味する。「発酵槽」とは、発酵が実施される又は実施されうる任意の容器を意味する。通気条件が厳密に制御されない振盪フラスコ培養(フラスコ振盪培養としても既知である)では、発酵条件は、嫌気性、微好気性、又は好気性であり得、条件は培養の過程の間に変化しうる。例えば、低レベル(例えば、0.5以下の開始OD600)の接種、及び激しい振盪(例えば、200rpm以上)、並びに緩く取り付けたキャップ又は多孔性キャップによる振盪フラスコ培養の開始時は、発酵条件は好気性である可能性が高い。しかしながら、培養物がより高い密度(例えば、10以上のOD600)で成長するに従って、微生物による酸素の消費は、酸素がフラスコに入る速度に対して大きくなり得、その結果、嫌気性又は微好気性条件となる。振盪フラスコにおける発酵条件は、エアトラップ(例えば、二酸化炭素の離脱を可能にするバブラー)又は空気を通さないキャップ若しくは栓を使用することによって、嫌気性又は微好気性にさせうる。ストリンジェントな条件を用いない限り(例えば、窒素、二酸化炭素、又はアルゴンによるガス処理)、厳密な嫌気性条件は達成されない可能性があり、したがって、嫌気性発酵条件と微好気性発酵条件との間には連続体があることを理解されたい。したがって、嫌気性及び微好気性という用語は、本明細書において、一般的にまとめて使用される。
【００５０】
「重複」とは、関連祖先微生物において一倍体ゲノム当たりn-1個のコピーで存在するのに次いで、子孫微生物においては一倍体ゲノム当たりn個のコピーで存在する、機能性DNA配列を意味する。ここで、nは、2以上の整数である。「重複」という用語は、前記機能性DNAのn個以上のコピーすべてを指す。「重複DNA」、「重複されたDNA」、又は「重複DNA配列」とは、前記機能性DNAの任意の或る単一コピーを意味する。重複においては、重複DNAコピーの末端は、多様なコピーの間では異なっている可能性がある。したがって、本明細書において開示したB重複の例の場合、機能性DNA配列の或るコピーは、menCコード配列の中央にIS4挿入エレメントを有する末端をもつ一方、第2のコピーはmenC遺伝子の無傷のコピーを有する末端をもつ。重複DNAの2つ以上のコピーは、それらの配列において軽微な差異を含有しうる。2つ以上のコピーが相互に隣接する又は相互にほぼ隣接する重複は、「縦列重複」と称される。はっきりさせるために、「重複」及び「重複DNA」という用語は、細胞分裂又は細胞出芽までの正常な前駆体として、微生物のゲノムの複製の間に正常に創出される前記機能性DNAの枠外のコピーは指さない。
【００５１】
「類似の培養条件」又は「類似の発酵条件」とは、2つの異なる微生物の性能を比較するために設計された条件を意味し、そこでは、実験者によって、2つの培養のすべての条件ができるだけ同一であるように設定し、制御することが計られている。2つの個々の微生物培養における条件を実質的に完全に同一にすることはできないことは公知であるため、「類似の」という用語が本明細書において使用される。
【００５２】
「発酵パラメーター」とは、発酵又は培養の幾つかの測定可能な態様のうちの1つ、例えば、完了までの時間、温度、pH、グラム/リットル(g/l)での生成物の力価、グラム生成物/グラム投与栄養素における収量、又は特異的生産性(1時間当たりの、グラム生成物/グラム細胞質量)を意味する。発酵パラメーターは、祖先及び子孫の両微生物とも類似の培養条件下で培養される場合、子孫微生物について1つ又は複数の発酵パラメーターが経済的により好都合であれば、関連した祖先微生物と比較して、子孫微生物について「改善された」と言われる。改善された発酵パラメーターの例としては、力価、収量、若しくは特異的生産性の増加、又は完了までの時間の短縮がある。
【００５３】
「合成培地」、「最少培地」、又は「無機培地」とは、窒素、硫黄、マグネシウム、リン(並びに場合によってカルシウム及び塩化物)等の必要な元素を提供する無機塩(例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、リン酸塩、硫酸塩、及び塩化物)等の精製された又は部分的に精製された化学物質、ビタミン(微生物の成長に必要である又は微生物の成長を刺激する場合)、糖、グリセロール、エタノール、メタン等の1つ又は複数の精製された炭素源、微生物の成長に必要な又は微生物の成長を刺激するものとして、微量金属(鉄、マンガン、銅、亜鉛、モリブデン、ニッケル、ホウ素、及びコバルト等)、及び任意選択で、ベタインとしても既知であるグリシンベタイン等の浸透圧保護剤から構成される、任意の生育培地を意味する。任意選択の浸透圧保護剤及びビタミンを除いて、このような培地は、発酵している微生物の成長に必須でないいかなる栄養素又は複数の栄養素のいかなる混合物の有意量も含有しない。微生物が栄養要求株、例えば、アミノ酸又はヌクレオチド栄養要求株であれば、次いで、前記栄養要求株の成長を支持しうる最少培地は必然的に必要な栄養素を含有することとなるが、最少培地用には、付加される栄養素は、実質的に純粋な形態のものとなる。最少培地は、酵母エキス、ペプトン、タンパク質加水分解物、糖蜜、ブロス、植物抽出物、動物抽出物、微生物抽出物、乳清、及びキクイモ粉等の富栄養混合物又は複合栄養混合物のいかなる有意量も含有しない。単純な蒸留による所望の化学物質の精製が経済的に魅力的な選択肢ではない、発酵による汎用化学品の生産のためには、富化培地より最少培地が好ましい。
【００５４】
「発酵生産培地」とは、微生物が所望の生成物(例えばコハク酸)を産生するように生育されるプロセスにおいて、最後のタンク、槽、又は発酵槽で、1つ又は複数のタンク、槽、又は発酵槽を含む一続きで使用される培地を意味する。大規模な精製が必要な又は望まれる、発酵によるコハク酸等の汎用化学品の生産のためには、最少培地である発酵生産培地が、富化培地より好ましい。なぜならば、最少培地の方が安価であることが多く、発酵終了時の発酵ブロスに含有される、所望の化学物質から分けて精製される必要がある望まない混入化学物質の濃度が通常は低いからである。一般的には、このような発酵において富栄養素の濃度を最少化することが好ましくはあるが、場合によって、プロセス全体のためには、発酵生産培地とは異なる培地中で接種培養物を生育させること、例えば、1つ又は複数の富成分を含有する培地中で生育させた接種培養物を、比較的少量の体積(一般的に発酵生産培地体積の10%以下)で生育させることが好都合である。接種培養物が生産培養物に対して少量であるならば、接種培養物の富成分は、これらが所望の生成物の精製を実質的に妨害しない程度まで、発酵生産培地中で希釈されうる。発酵生産培地は、炭素源を含有しなければならず、これは、典型的には、糖、グリセロール、脂肪、脂肪酸、二酸化炭素、メタン、アルコール、又は有機酸である。一部の地域、例えば米国中西部では、D-グルコース(デキストロース)が比較的安価であり、したがって炭素源として有用である。酵母による乳酸生産に関する従来技術の公開物のほとんどでは、炭素源としてデキストロースが使用されている。ただし、一部の地域、例えばブラジル及び東南アジアのかなりの地域では、ショ糖がデキストロースより安価であり、よって、これらの地域では、ショ糖が好ましい炭素源である。
【００５５】
「不等乗換え」とは、DNA配列が重複となる、又は重複DNA配列が重複でなくなる機序を意味する。相互に近接する重複DNA配列の2つのコピーがある場合、不等乗換えは一般的にDNA複製の間に起こる(Reams及びRoth、2015年)。
【００５６】
「機能性DNA配列」は、生物のゲノムに存在する場合、単独で又は別のDNA配列に連続して結合して、測定可能な表現型又は結果を生成する、あらゆるDNA配列である。機能性DNA配列の一例としては、株KJ122-RYにおいては1つのコピーで存在し、株KJ122-F475においては2つのコピーで存在する(B重複に存在する)111個の遺伝子を含む、株KJ122-RYの染色体の区分がある(Table 1(表1)及びTable 2(表2)を参照されたい)。測定可能な表現型又は結果は、第2のコピーが存在する場合、発酵の典型的な比較例において、コハク酸力価が約57g/Lから約89g/Lへと高まっていることである。機能性DNA配列の別の例は、ペニシリン生産株において増幅されるペニシリン生合成遺伝子クラスターである(Fierro、Barredo等、1995年)。この場合、表現型又は結果は、ペニシリン生産の増加である。
【００５７】
発明の説明
一実施形態において、本発明は、第1の設定条件下で、例えば嫌気性又は微好気性条件下で、株を代謝的に進化させる工程、次いで、第2の設定条件下で、例えば好気的に、得られた進化した株を成長させる工程、更に進化させるために、所望の発酵生成物の生産が改善された株について、第2の条件から分離された株をスクリーニングする工程を含む、所望の発酵生成物の力価を高める方法を提供する。
【００５８】
別の実施形態において、本発明は、所望の発酵生成物の生産の改善をもたらすゲノム重複を同定し、追跡する方法を提供する。
【００５９】
別の実施形態において、本発明は、有益なゲノム重複を安定化する方法を提供する。
【００６０】
別の実施形態において、本発明は、安定化したコピー数の機能性DNA配列を有する天然には存在しない微生物を提供する。
【００６１】
続いて、2段階プロセスを、生物学的発酵による有益生化学物質の生産のための微生物株の生成において行ってもよい。第1の工程において、合理的に設計された遺伝子改変が微生物の細胞へ導入される。第2の工程において、遺伝子改変された微生物の細胞は、代謝的進化に供して、望ましい表現型を有する微生物の触媒を得る。例えば、コハク酸を生産するための細菌株を開発する場合、幾つかの遺伝子改変を導入して、微生物の細胞内での炭素の経路をコハク酸生産へと誘導する。企図的な遺伝子改変は、微生物の細胞における代謝経路の知識に基づいて設計する。所望の遺伝子改変は、段階的に行われる。遺伝子改変の各段階の合間、及び当該遺伝子改変すべての終了時に、微生物株は、微生物の細胞集団に所望の表現型、すなわち、成長、力価、及び所望の生化学物質の生産の速度の上昇を獲得するために代謝的進化をさせる。言い換えると、成長が特定の化学物質の生産に結びついている場合、より速い成長(代謝的進化)を選択することが、化学物質のより速い生産をもたらす。
【００６２】
代謝的進化のプロセスは、望ましい表現型に好都合である特定の変異、すなわち、所望の生成物のためにより好都合な生産パラメーターをもたらすことが期待される。したがって、代謝的進化の終了時には、微生物株は、或る特定の遺伝子改変を獲得していることとなる。従来技術の例では、これらの遺伝子改変は、ゲノムの重要部分の単純なヌクレオチド変化、挿入、及び欠失を含むことが示されている。ゲノムシーケンシングの費用の劇的な低下によって、代謝的に進化した株の全ゲノムを配列決定して、初めに導入された特定の変異が依然として保持されていることを確認すること、及び代謝的進化のプロセスの間に獲得された変異を同定することが可能となった。
【００６３】
一旦、代謝的進化の間に微生物株において生じた変異が同定されてしまえば、同定された変異の機能的有意性を逆遺伝学分析によって確認することが可能である。逆遺伝学分析は、変異が単一の遺伝子中にある場合、実施は容易である。
【００６４】
変異が、第2の設定条件下で、代謝的進化の間又はその後の培養中に生じた大規模なゲノム重複である場合、逆遺伝学分析は難しく、又は不可能である。しかしながら、ごく近縁の微生物株間でのゲノム及び表現型の比較分析によって、この大規模なゲノム重複が望ましい表現型と密接に関連することが明らかであるならば、この遺伝子重複を、該株のその後の培養及びラージスケールの使用の間に消失することから守ることが望ましくなる。DNA重複を安定して維持するための方法を確立することにおける最初の工程は、重複の正確な構造及び重複をもたらした機序を理解することである。一旦、発明者らが、該大規模なゲノム重複及び得られた構造をもたらした、構造及び分子機序を理解しさえすれば、株を更に遺伝子操作して、重複を安定的に維持することが可能になる。安定化が達成されたことを容易に実証するために、微生物株における遺伝子重複の有無を検出する識別方法の基礎を成すポリメラーゼ連鎖反応(PCR)開発することもまた、有用であった。
【００６５】
他に印となるものがない遺伝子重複(簡便又は実用的な選択マーカーを欠失する重複)を安定して維持する1つの新規の方法は、選択マーカー(少なくとも1つの培養条件下に対して選択されうる、遺伝子、遺伝子の群、又はオペロン等のDNA配列)を、重複配列内の遺伝子のどの発現も妨害することなく、重複DNA配列の隣接したペアの間に挿入することである。ゲノム重複の領域に容易に導入されうる選択マーカーの1つのタイプは、抗生物質耐性遺伝子又は抗生物質耐性マーカーとしても既知である、抗生物質耐性をコードする遺伝子である。幾つかの容易に用いることができる抗生物質耐性遺伝子が、当技術分野ではよく知られている。大腸菌では、例えば、ペニシリン(例えばアンピシリン)、テトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、スペクチノマイシン、又はエリスロマイシンに対する耐性を付与する公知の遺伝子があるが、これらに限定されない。しかしながら、上述のように、抗生物質耐性遺伝子を大規模発酵に対して使用することは、一般的に望ましくない。この目的に好適な好ましい選択マーカーは、必須又は条件的に必須であるタンパク質をコードする内因性(天然の)又は外来遺伝子である。この場合、該遺伝子が重複中の適切な照準に、例えば重複した遺伝子の2つのコピーの間の接合部に挿入される前又は後に、野生型遺伝子はその天然の座位から変異される又は欠失される。例えば、トリオースリン酸イソメラーゼをコードする天然のtpiA遺伝子は、遺伝子操作又は古典的遺伝学方法を通して変異によって、欠失されうる又は実質的に不活性化されうる。不活性化された内因性tpiA遺伝子を有する微生物の細胞は、炭素源としてグルコース又は別の糖を含有する最少培地中で成長することができない。しかしながら、tpiA変異体は、LB(ルリア培地)等の富化培地中では増殖されうる。一旦、外来のtpiA遺伝子カセット(非天然の座位に組み込まれるように設計されたカセット)が、機能性tpiA遺伝子を欠く株の遺伝子重複の中へ挿入されてしまえば、子孫株は、炭素源としてグルコース又は他の糖を含む最少培地中で成長する能力を回復することとなり、結果として、遺伝子重複は安定して維持されることとなる。更に遺伝子重複を安定して維持する別の手法は、タンパク質をコードする外来遺伝子、又は選択可能な表現型を付与する一連のタンパク質をコードするオペロン若しくは他の遺伝子のセットの使用を含む。例えば、遺伝子重複を獲得した微生物株が、ショ糖の代謝に関与する1つ又は複数のタンパク質をコードする遺伝子が存在しないために炭素源としてショ糖を資化する能力を欠くならば、ショ糖資化のために必要な1つ又は複数のタンパク質をコードする遺伝子カセットを、遺伝子重複中へ挿入してもよく、次いで、唯一の炭素源としてショ糖を含有する培地中で得られた株を成長させることによって、重複は安定して維持されうる。
【００６６】
遺伝子重複を安定的に維持するために特定の選択マーカーを使用する決定は、環境の完全性に依存する。例えば、グルコースが所望の炭素源である場合、選択マーカーとして、ショ糖資化遺伝子の使用は適切ではないこととなる。抗生物質耐性遺伝子は、遺伝子重複を安定化するのに十分に機能しうるものの、高価な抗生物質を使用する必要性を回避するために、また、感染の可能性のある抗生物質耐性遺伝子の大規模生産を回避するために、一般的には、選択マーカーとして、tpiA等の必須又は条件的必須遺伝子を使用することが好ましい。
【００６７】
代謝的進化は、典型的には、最少培地中における嫌気性又は微好気性発酵等の、特定の設定条件下で実施される(例えば、Jantama等、2008年a;Jantama等2008年b;(Zhu、Tan等、2014年);米国特許第8,691,539号;米国特許第8,871,489号;国際公開特許出願WO2011063055A2を参照されたい)。しかしながら、本発明において、進化した株を第2の設定条件に、例えば好気性培養に曝すことによって、第2の設定条件下での成長がなければ生じることが期待されないはずの更なる有益な進化が、予想外にもたらされうることが発見された。下記に示した実施例では、111個の遺伝子の大きな重複(「B重複」)が祖先株KJ122-RYの培養における発酵条件の第2の設定の間に生じており、この重複は、株を第2の設定条件下で成長させていなければ、生じることはなかったと考えられる。B重複をもたらしうる唯一の理論的な一連の事象は、以下の通りである。まず、転移性のIS4エレメントが、自らをmenC遺伝子の中央に挿入した。menC遺伝子は、メナキノンの生合成に必要な酵素をコードする、menFDHBCEオペロンの5番目の遺伝子である。メナキノンは、嫌気的成長の間に大腸菌及び他の微生物によって使用される電子伝達体である。menCにおける変異によって、最少グルコース培地で嫌気的成長はほとんどできなくなる(Guest、1977年)。KJ122の代謝的進化は、最少グルコース培地において微好気性条件下で行われたため、menCヌル変異体は成長上不利と考えられるため、menC中へのIS4の挿入が進化の間に生じたということはなさそうである。B重複をもたらす第2の工程において、大腸菌CrooksゲノムのGenbank版(受託番号NC_010468)においてEcolC_1276と注釈付けされたIS4のコピーとmenC遺伝子におけるIS4のコピーとの間の111遺伝子領域は、おそらく2つの上述のIS4のコピーの間の不等乗換えによって、正確に重複していた。この得られた中間体株は、依然として機能性menC遺伝子を欠失していると考えられ、よって、この場合もやはり、この事象が微好気性進化の間に生じていたということはなさそうである。このことは、研究大学の実験室から得られ、本明細書でKJ122-RYと名付けたKJ122の最初の分離株が、B重複を有していなかったということと一致する。第3の工程において、B重複の第2のコピーの末端のmenCにおけるIS4エレメントが正確に削除されて、機能性menC遺伝子が回復し、これによって、得られた株KJ122-F475は、微好気性条件下で十分に成長することが可能となる(これらの工程の略図版として図4を参照されたい)。KJ122-RY及びKJ122-F475等の株を、最少グルコース培地中で好気的にペトリ皿上及び振盪フラスコ中で成長させて、-80℃の冷凍保存株を作製し、7リットル発酵用の接種原を作製することは、発明者らの標準的な操作である。したがって、B重複をもたらす最初の2工程は、これらの好気的成長期間中に起きたに違いないと考えられる。B重複は、別々に少なくとも3回生じているため、発明者らは、重複を生じるための選択圧、例えば、第2の設定の発酵条件下で、重複DNA配列中に含有される遺伝子のうちの1つ又は複数の遺伝子の2つのコピーを有するという選択優位性があったに違いないと推論した。第3の工程はおそらく、溶存酸素濃度が比較的低く、微好気性条件が優勢であった場合、振盪フラスコ培養の間に一度に起こり、その結果、menC遺伝子の機能性コピーを再生する圧がもたらされる。B重複の形成をもたらした一連の事象が、微好気性条件下で微生物を培養した後に、好気性条件下で微生物を培養した結果として生じたのに対し、新規株KJ-122-F475をもたらす最終工程(下記を参照されたい)、すなわち、menC遺伝子からのIS4エレメントの正確な欠失は、株が微好気性条件に再度曝されたときに起こった可能性がある。したがって、その最終形態のB重複の形成及び定着等の有益な遺伝学的事象は、微生物をまず微好気性条件下で培養し、次いで、続けて好気性条件下で培養する結果、又は微生物をまず好気性条件下で培養し、次いで、続けて嫌気性若しくは微好気性条件下で培養する結果、生じうるものである。
【００６８】
望ましい表現型と関連した安定した遺伝子重複を有する微生物株を生成してしまえば、この株を出発点として使用して、付加価値化学物質の商業生産用に改良された微生物株を構築することができる。別の手法において、望ましい表現型と関連した遺伝子重複を、例えば交配によって、付加価値生化学物質を産生するように既に遺伝子操作された微生物株へ導入すること、又は更なる望ましい形質を、既に重複を含有するKJ122-F475等の株へ導入することもまた可能である。
【実施例】
【００６９】
(実施例1)
様々なKJ122保存株及びファージ耐性派生体のゲノム構造
Table 1(表1)に、幾つかのファージ耐性派生体を含む最初の大腸菌KJ122株に由来する様々な異なる保存株によって得られた、ゲノム構造及びコハク酸力価の概要を示す。Table 1(表1)中に記載した7株はすべて、Illumina社(San Diego、California、米国)からの技術を使用して全ゲノム配列決定を行い、ゲノムのデータは、Lasergene Genomic Suiteソフトウエアパッケージ(DNAStar社、Madison、WI)を使用して解析した。DNA配列データ分析から、「KJ122-F475」と名付けた(「KJ122-F」と称することもある)特定の保存株が、予想外に、その親株である大腸菌Crooksと比較して2つの多重遺伝子重複を獲得していたことが明らかとなった(図1)。これらの2つの多重遺伝子重複は、本明細書において、「A重複」及び「B重複」と称される。また、B重複を含む株は、本明細書において、「B+」である、とも称する。
【００７０】
A重複は66個の遺伝子を含み、B重複は111個の遺伝子を含んでいた。挿入エレメントIS4は、B重複における反復配列の接合部に見つかった(図2)。IS4は、自身のコピーを作り、このコピーを染色体中のランダムな位置に挿入することができる。Table 1(表1)に示したスクシネート力価及びA重複及び/又はB重複の有無パターンからは、一部の株、例えばKJ122-F475によって生じたより高いスクシネート力価に、B重複が単独で関わっていることが強く示唆された。更に、グルコースの促進拡散移入に依存し、酢酸塩副産物を有意にほとんど産生しない株MH141(WO2015/013334を参照されたい)を代謝的進化に供して新規株FES33を得たところ、ゲノムDNAシーケンシングによって明らかとなった唯一の変化は、正確に同じB重複の獲得であった。FES33は、流加発酵において一貫してより高いスクシネート力価を示したため、この観察によって、B重複がより高いスクシネート力価に貢献するという主張が更に裏付けられた。最後に、KJ122-RYのファージ耐性派生体、株MYR585-4Eは、B重複とスクシネート力価の上昇とを別々に獲得しており、これはまた、B重複がスクシネート力価の上昇を担っているという仮説を更に裏付けるものである。
【００７１】
Table 2(表2)に、本発明に関する様々な株を列挙する。B重複と唯一の炭素源としてのショ糖で成長する能力とを組み合わせることが望ましかったため、株SD14のrrsG::cscBAK特徴を組み合わせることを試みた(KJ122-RY rrsG::cscBAK;WO2012/082720を参照されたい)。2つの特徴を組み合わせる最初の試みは、SD14でP1vir形質導入ファージを増殖させ、最少ショ糖プレート上で選択してKJ122-F475に形質導入することによって行われた。多くのショ糖+形質導入体が得られたが、すべて、B重複が失われており(プライマーBY296及びBY297を使用して識別PCRによって示された)、これは、B重複が、不安定であり、おそらく重複の2つのコピーの単純な相同組換え(ループアウト)、又は重複の2つのコピー間の不等乗換えによって失われる可能性があることを実証している。成功した第2の試みは、rrsG::cscBAK対立遺伝子をSD14からKJ122-F475に移入する公知の組換えDNA形質転換法を用いた。すなわち、プラスミドpKD46でファージラムダレッド組換えシステムの組込み(Table 3(表3)を参照されたい)を行った後、組込み目標部位に隣接相同を含有する線状DNAを用いて形質転換を行った(Jantama等、2008年a;Jantama等、2008年b)。これによって、rrsG::cscBAK対立遺伝子及びB重複が、基本的には非両立性ではないことがうまく実証された。
【００７２】
B重複の潜在的な不安定性及び消失を考慮すると、消失に抗ってB重複を安定化する方法を考案することが望ましくなった。本明細書において開示したように、所望の安定化は、1つのコピーに戻るB重複の崩壊によって、挿入された選択マーカーの消失がもたらされることになるように、B重複の2つのコピー間の接合部に、必須遺伝子カセット又は条件的必須遺伝子カセット等の選択マーカーを挿入することによって達成されうる。条件的選択マーカーの具体的な例としては、(1)cscBAKオペロン、これは、株のバックグラウンドにおいてショ糖資化遺伝子が非存在下である場合、最少ショ糖培地での成長に必須である(WO2012/082720を参照されたい)、及び(2)大腸菌CrooksのtpiA遺伝子等のトリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子、これは、最少グルコース培地での成長には必須であるが、LB(ルリア培地)等の富化培地での成長には必須ではない。当業者であれば、幅広い種類の選択マーカー並びに/又は遺伝子カセット及び/若しくはオペロンが、縦列遺伝子重複又は縦列多重遺伝子重複の安定化のために、本明細書に記載した様式に類似の様式で使用されうることを理解するであろう。唯一の必要条件は、選択マーカー又は遺伝子カセットが、少なくとも1つの生育条件下での成長に必須であるということである(すなわち、必須又は条件的に必須である)。この他の例としては、ハウスキーピング遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、栄養要求性補完遺伝子、及び宿主株が成長できない栄養供給源で、例えば、ショ糖、キシロース、尿素、アセトアミド、又は硫酸塩で成長する能力を付与する遺伝子である。当業者であれば、選択マーカーは、親生物生来のものである必要はないことを理解するであろう。例えば、親又は宿主生物において機能しうる異種の生物由来のトリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子又はDNA配列を、選択マーカーとして使用してもよい。
【００７３】
(実施例2)
コハク酸生産株におけるB重複のPCR識別
2つのプライマー(BY296及びBY297)を、B重複のPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)識別のために設計した。これらの2つのプライマーは、図3に図示したように、それぞれ、B重複の接合部位のすぐ上流及び下流でハイブリダイズする。BY296は、B重複の3'末端付近の遺伝子である大腸菌C_1386遺伝子の3'末端(終止コドンから35bp上流)からプライミングする。BY297は、B重複の第2の遺伝子である大腸菌C_1277遺伝子の3'末端に配置される。
【００７４】
PCRは、NEB製造業者の推奨に従って、(単一コロニー又は液体細胞培養液からの)1マイクロリットルのDNAテンプレート、2つのプライマー(BY296及びBY297)、Quick-Load(登録商標)Taq 2XMaster Mix(New England Biolabs社、Ipswitch、Massachusetts、米国)、及びPCRグレード水を含む、総作業体積50μlで実施した。PCRプログラムには、94oCで3分の初期変性工程に続き、94oC、30秒間、55oC、30秒間、及び68oC、2分間が35サイクル、次いで、68oCで10分間の最終伸長が含まれる。PCR生成物は、アガロースゲル電気泳動によって分析した。B重複陽性株から1788bpの断片が生成され、陰性対照株又はテンプレートを加えない対照PCRによって生成された断片はない。1788bpのPCR生成物から、B重複が2つのコピーが隣接する縦列重複であることを示された。PCR生成物及びゲノムDNAシーケンシングからは、IS4挿入エレメントが、B重複の2つのコピー間の接合部に存在することを示しており、更に、重複が生じえた機序を示唆される(図2を参照されたい)。重複に含まれない配列から、類似しているが明らかに異なるサイズの断片を生成する適切なプライマーを使用して、対照PCR反応を、PCRの方法及び条件が適切に作用していることを示すために使用してもよい。
【００７５】
(実施例3)
様々な細菌株に関する詳細
本発明において構築された様々な細菌株に関する詳細を、Table 2(表2)に示す。本発明において使用したプラスミドのリストを、Table 3(表3)に示す。プライマー及び遺伝子に関する配列情報を、Tables 4(表4)及びTables 5(表5)に示す。
【００７６】
(実施例4)
安定化したB重複を含む株の構築
図5及び図6に、B重複が実施例1で記載したように安定化されている、様々な株の構築を示す。安定化された株はすべて、ラムダレッドリコンビナーゼシステムにより支援される線状DNAを用いる組込み型形質転換の既知の方法を使用し、次に相同組込みについて選択し、次に正確な組込みについて識別PCRを行うことによって、且つ/又は代謝的進化によって構築した(Jantama等、2008年a;Jantama等、2008年b)。
【００７７】
(実施例5)
B重複の安定化
B重複及びB重複の接合部に取り込まれた選択マーカーcscBAKを含有する株XZ174の18個の個別のコロニー、並びに、B重複を含有するが、B重複の接合部に取り込まれた安定化選択マーカーを含有しない株XZ132の13個の個別のコロニーを、約50世代の間、炭素源としてショ糖を含有する液体培養液中で好気的に成長させた。次いで、プライマーBY296及びBY297を使用する識別PCRによって、反応開始部位の間にcscBAKオペロンを含む余分の4キロベースのDNAに対応するために68oCでの伸長時間を2分から6分に延ばしたこと以外は上述と同様に、各培養液をB重複の存在について試験した。安定化した株XZ174からの18個の培養物はすべて、B重複及び選択マーカーを保持して、5.8キロベースのPCR生成物をもたらしたのに対し、株XZ132については、B重複は安定化されておらず、13個の培養物のうちの2つがB重複を失っていた。このように、B重複の2つのコピー間の接合部における選択マーカーが、まさにB重複のコピー数を安定させていた。
【００７８】
(実施例6)
様々な大腸菌株によるショ糖発酵
本特許出願に記載した3種の異なる大腸菌株を、最少培地の唯一の炭素源としてショ糖を使用して、7リットル発酵槽で成長させ、それらの発酵能をモニターした。これらの発酵のための発酵方法の詳細は、Table 1(表1)に示した詳細と同様に、米国特許第9,845,513号に既述されている。この発酵試験の結果を、Table 5(表5)に示す。示した数値は、独立した2つの発酵の平均である。B重複を含有する2つの株(XZ132及びXZ174)はいずれも、力価、収量、及び発酵時間に関して、B重複を含有しない対照株SD14より良好な性能を発揮した。
【００７９】
(実施例7)
3つ以上のコピーをもたらす重複
場合によって、DNA配列の重複は、縦列するDNA配列の3つ以上のコピーをもたらすことがある(Fierro、Barredo等、1995年)。コピーの数は、幾つかの適切な方法のいずれかによって、例えば、生のIlluminaプラットフォームデータにおけるリード頻度の検討、生のPacBioデータの直接観察(重複が大きくない場合)、定量的PCR、制限消化及びアガロースゲル電気泳動、又は全染色体の電気泳動(重複が比較的大きい場合)によって、決定されうる。n個のコピーの重複がある場合、n個のコピーすべての安定化は、上記の実施例1で説明したように、重複の隣接するペア各々の間に選択マーカーを取り込むことによって達成されうる。重複のn個のコピーが、好ましくはn-1個の選択マーカーで安定化されうるように、重複の隣接するペア各々に対して、(以前に使用した他のどのマーカーとも無関係に選択されうるマーカーである)違う選択マーカーを使用することが好ましい。多様な必須遺伝子を条件的に必要となるようにさせうるため、多様な利用可能な選択マーカーがあり、よって、重複の多くのコピーが安定化されうる。例えば、pyrF遺伝子は、安定化されることが望まれる重複を含有する大腸菌株から、変異(好ましくは欠失)によって不活性化され得、これによって、株の成長はウラシル付加依存性となる。第2の工程において、株をウラシルの非存在下で成長させる場合、重複配列の隣接するペアの接合部での機能性pyrF遺伝子(天然又は異種のいずれかのホモログ)の取り込みは、次いで、重複の該ペアを安定させることとなる。したがって、例えば、重複が、大腸菌株において重複DNAの3つのコピーを含有するならば、tipA遺伝子を第1のペアに対する選択マーカーとして使用することができ、pyrF遺伝子を第2のペアに対して使用することができる。ほどんどの微生物に多数の生合成経路遺伝子があることを考慮すると、この概念を拡張し、繰り返すことによって、多数の重複したコピーを安定化することができる。同様に、TPI、URA3、及びその他の生合成酵母遺伝子を、酵母において同様の方法で使用することができる。理論上、単純な栄養要求性が見出されうる、又は構築されうる遺伝子はいずれも、このようにして利用されうる。
【００８０】
(実施例8)
B重複の更なる増強
B重複に起因するスクシネート力価の上昇を説明する1つの考えられる機序は、B重複が、メナキノン生合成オペロンの最初の4つの遺伝子、menFDHBの第2のコピーをもたらすということ、及びこれらの遺伝子の発現が増加されたことによりメナキノンの濃度が上昇し、この結果、細胞の嫌気性又は微好気性条件下で成長する能力が高められるというものである。しかしながら、IS4エレメントがmenC遺伝子の中央に挿入したため、menオペロンの最後の2つの遺伝子menCEは、B重複中で重複されていない。したがって、menオペロンの完全な第2のコピーを与えるための、図4に線描したようなB重複の第1のコピーの3'末端におけるmenCEの無傷のコピーの挿入は、細胞のメナキノンを合成する能力を更に高めるはずである。このような挿入は、相同組換えにより線状DNA断片を染色体へ組み込む当技術分野で公知の方法、例えば、第1の工程において、B重複接合部のmenCとIS4との間の境界にcat,sacBカセットを組み込み、クロラムフェニコール耐性について選択し、次いで、第2の工程において、再構成されたmenCE遺伝子カセットを、ショ糖を含有するプレート上でのsacB遺伝子に対する対抗選択により組み込むことによって、容易に成し遂げられうる(Jantama等、2008年a;Jantama等、2008年b;(Zhu、Tan等、2014年);及び米国特許第8,691,539号)。再構成されたmenCEカセットは、適切な隣接相同、例えば、menC遺伝子の5'末端の上流の約500塩基対及びIS4の5'末端の約500塩基対を、含有することになる。
【００８１】
(実施例9)
酵母における重複の安定化
クルイベロマイセス・マルキシアヌス(Kluyveromyces marxianus)のゲノム配列から、PDR12と注釈付けされた遺伝子が重複として存在することを見て取ることができる。サッカロマイセス・セレビシエにおける研究から、Pdr12pは、弱有機酸耐性のために必要な弱酸誘導性多剤排出トランスポーターであることが既知である。サッカロマイセス・セレビシエ株におけるPDR12の欠失によって、乳酸による阻害に対する感受性が増加した(Nygard、Mojzita等、2014年)。したがって、K.マルキシアヌスにおけるPDR12ホモログの重複は、低いpHでの有機酸に対するその並外れた耐性にとって重要でありえたと推論されうる(特許出願WO2014/043591)。PDR12重複の消失を防ぐために、酵母の発酵によって有機酸を産生するように操作されている株においてPDR12重複を安定化させることは、したがって、論理的である。これは、上記で示した実施例と同様に、PDR12遺伝子の第1のコピーの終止コドンから約380塩基対下流のPsiI制限部位に選択マーカーを挿入することによって行われうる。すべての工程において、識別PCRによって、正しい構造を確認する。第1の工程では、URA3コード配列を、株DMKU3等のPDR12重複を含有する祖先K.マルキシアヌス株から、線状の欠失カセット(配列番号11)で形質転換し、上記のような5-フルオロオロチン酸に対する耐性について選択することによって欠失させる。第2の工程では、K.マルキシアヌスTPI遺伝子のコピーを、以下のように、PRD12重複の重複接合部に挿入する。第2のカセット(例えば、配列番号12)は、以下のDNA配列を列記した順で連結させる。(1)PDR12遺伝子の5'コピーの終止コドンからPsiI制限部位までの380塩基対配列のコピーを含む、上流の隣接相同、(2)自身のプロモーター及びターミネーターを含む、TPI遺伝子のコピー、(3)重要ではない機能をコードし、宿主株のどの配列に対しても相同性がない、任意の300塩基対DNA配列のコピー(「配列X」)、(4)自身のプロモーター及びターミネーターを含む、サッカロマイセス・セレビシエURA3遺伝子のコピー、(5)配列Xの第2のパラレルなコピー、及び(6)上記の、PRD12遺伝子の5'コピーから、3'がちょうど下流のPsiI制限部位までである400塩基対配列のコピー。このカセットを、形質転換し、ウラシルを欠く最少グルコース培地で選択することによって組み込む。第3の工程では、得られた株を、1g/Lの5-フルオロオロチン酸及び1リットル当たり24mgのウラシルを含有するプレート当たり約108細胞で平板培養して、URA3遺伝子に対して対抗選択し、配列Xの2つのパラレルなコピーの間の組換えによって、それを削除する。第4の工程では、天然の座位にあるTPI遺伝子を以下のように欠失させる。カセットは、以下のDNA配列を列記した順で含んで構築する(配列番号13):(1)上記の第2の工程において使用したTPI1遺伝子と共に運ばれたプロモーターと全くオーバーラップしない、天然ではTPI1プロモーターのすぐ上流の500塩基対のコピー、(2)自身のプロモーター及びターミネーターを含む、サッカロマイセス・セレビシエURA3遺伝子のコピー、(3)上記の工程2において使用されたTPI1ターミネーターから、天然ではすぐ下流の500塩基対のコピー。次いで、このカセットを、ウラシルを欠く最少グルコース培地を含有するプレート上で選択することによって、第3の工程4からの該株へ組み込む。得られた株は、天然の座位からPDR12遺伝子の2つ��コピー間の接合部に移植された、自身のプロモーター及びターミネーターを含むTPI1遺伝子を含有することとなる。TPI1遺伝子の天然のコピーは、サッカロマイセス・セレビシエURA3遺伝子で置換されているであろう。当業者であれば、上記の構築がPDR12重複を安定させる方法の一例にすぎないこと、及び多くのその他の機能的に等価の手法が可能であることを理解されよう。
【００８２】
(実施例10)
本発明の概括
本明細書において開示した実施例では、宿主生物として大腸菌又はK.マルキシアヌス、及び所望の生成物としてコハク酸を使用したが、当業者は、相同組換え及び不等乗換えが、これについて調べられている微生物の事実上すべてにおいて公知の現象であることを理解されよう。したがって、本明細書において開示した方法及び原理は、多くの微生物及び多くのDNA配列に適用されうるものであり、唯一の制約は、ここでは、外来DNAを微生物へ導入する方法が、例えば、形質転換、形質導入、トランスフェクション、又は交配によるということである。例えば、ザイゴサッカロマイセス・バイリー(Zygosaccharomyces bailii)は、低いpHで有機酸に対して耐性であることがよく知られている酵母であるが、PDR12との相同性が高い遺伝子の3つのコピーを縦列して含有する。これらの3つの縦列重複遺伝子は、GenBank受託番号HG316458においてBN860_04456g、BN860_04478g、及びBN860_04500gと名付けられており、Z.バイリー株CLIB 213のゲノム配列のスキャホールド5を開示している。この3つのコピーは、本明細書に記載したように、各々ペアの間に選択マーカーを組み込むことによって安定化されうる。
【００８３】
上記に示した具体的な実施例は、コハク酸を産生するように操作されており、B重複と名付けられた機能性DNA配列の重複によって改良された大腸菌の株を必要とする。しかしながら、本明細書において開示した原理は、機能性DNA配列の縦列重複がスクリーニング、選択、又は代謝的進化によって生成され得、識別PCR、DNAシーケンシング、ゲル電気泳動、又は機能検定(例えば、コードされた遺伝子の酵素検定、又は発酵からの生成物の力価)によって明らかにされうるあらゆる微生物に対して適用されうる。このような重複は、一旦、明らかにされれば、本明細書において開示したように、重複配列の隣接するコピーの間に好適な選択マーカーを取り込むことによって、安定化させて、増幅されたコピー数を維持することができる。これは、選択マーカーと、重複配列の間の接合部を取り囲む配列に相同な(好ましくは同一な)隣接配列とを含むDNA配列を、例えば、重複配列の隣接するペアの間の接合部での選択マーカーの組込みをもたらす形質転換及び前記隣接配列と重複接合部を取り囲む配列の間の相同組換えによって取り込むことができる、あらゆる微生物において達成されうる。入ってくるDNAの非相同末端結合が、選択マーカーを用いた形質転換における相同性により誘導される組込みより頻繁である微生物では、前記非相同末端結合を担う1つ又は複数の遺伝子、例えば、クルイベロマイセス・マルキシアヌスのNEJ1、KU70、KU80、又はLIG4遺伝子のうちの1つ又は複数を、最初に変異させる(好ましくは欠失させる)ことが有効である。選択マーカーによる形質転換において染色体の組込みが比較的まれな事象である、大腸菌等の幾つかの微生物では、最初に相同組換えの頻度を高める機能、例えば、pKD46又はpCP225に含有されるような、バクテリオファージラムダ由来red遺伝子を与えることが有効である(Table 3(表3)、Jantama等、2008年a、及びJantama等、2008年bを参照されたい)。本発明の適用のために好ましい微生物は、エシェリキア属菌(Escherichia)、クレブシエラ属菌(Klebsiella)、サッカロマイセス属菌、ペニシリウム属菌(Penicillium)、バチルス属菌、イッサチェンキア属菌(lssatchenkia)、ピキア属菌(Pichia)、カンジダ属菌(Candida)、コリネバクテリウム属菌(Corynebacterium)、ストレプトマイセス属菌(Streptomyces)、アクチノマイセス属菌(Actinomyces)、クロストリジウム属菌(Clostridium)、アスペルギルス属菌(Aspergillus)、トリコデルマ属菌(Trichoderma)、リゾープス属菌(Rhizopus)、ムコール属菌(Mucor)、ラクトバチルス属菌(Lactobacillus)、ザイゴサッカロマイセス属菌(Zygosaccharomyces)、又はクルイベロマイセス属菌(Kluyveromyces)から選択される微生物等の、商業目的のために有用であることが既知である微生物である。
【００８４】
【表１】
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【００８５】
【表２Ａ】
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【００８６】
【表２Ｂ】
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【００８７】
【表３】
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【００８８】
【表４Ａ】
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【００８９】
【表４Ｂ】
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【００９０】
【表４Ｃ】
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【００９１】
【表５】
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【００９２】
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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