(57)【要約】ポリ（ＡＤＰ−リボース）（ＰＡＲ）は、パーキンソン病（ＰＤ）を含む多くの神経変性疾患に関連するタンパク質である。今日まで、ＰＤを罹患している患者を診断、評価、またはモニタリングするルーチンの臨床検査は開発されていない。患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）中のＰＡＲ濃度を評価し、当該濃度とＰＤの患者の医学的状態とを関連付ける新規の方法が、本願で開示されている。ＰＤのバイオマーカーとしてのＰＡＲの使用も開示されている。
2020522701.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳脊髄液（ＣＳＦ）中のポリ（ＡＤＰ−リボース）（ＰＡＲ）濃度を測定する方法であって、
患者から脳脊髄液のサンプルを採取することと、
前記ＣＳＦサンプルでＰＡＲ−サンドイッチＥＬＩＳＡを行い、それによって、前記ＣＳＦ中の前記ＰＡＲ濃度を測定することとを含んでなる前記方法。
【請求項２】
前記ＣＳＦサンプル中の前記ＰＡＲ濃度を少なくとも１つのコントロールサンプルと比較することをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記サンドイッチＥＬＩＳＡが、少なくとも捕獲抗体および検出抗体を含んでなり、前記捕獲抗体、前記検出抗体、または両方が、抗ＰＡＲモノクローナル抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記捕獲抗体が固体支持体に結合している、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記抗ＰＡＲモノクローナル抗体が、完全ヒト型である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記ＣＳＦサンプル中の前記ＰＡＲ濃度を少なくとも１つのコントロールサンプルと比較することを比色分析法により行う、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記検出抗体がビオチンに結合している、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
パーキンソン病に対する医学的処置の治療有効性を測定する方法であって、
ＰＤに対する少なくとも１つの医学的処置を受けている患者から脳脊髄液（ＣＳＦ）のサンプルを採取することと、
前記ＣＳＦサンプル中のポリ（ＡＤＰ−リボース）（ＰＡＲ）濃度を測定することと、
前記患者の前記ＰＡＲ濃度を、少なくとも１つのコントロールサンプル中のＰＡＲ濃度と比較することとを含んでなる前記方法。
【請求項９】
前記コントロールサンプルが、前記患者から以前のある時期に採取したＣＳＦサンプルである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記コントロールサンプルが、健常ドナーから採取したＣＳＦサンプルである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記患者の前記ＰＡＲ濃度が、前記コントローサンプル中の前記ＰＡＲ濃度よりも高い場合、前記医学的処置が、前記患者にとって有効ではなく、
前記患者の前記ＰＡＲ濃度が、前記コントローサンプル中の前記ＰＡＲ濃度と同じであるか、または低い場合、前記医学的処置が、前記患者にとって有効である、
請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記医学的処置が、前記患者への１種または複数種の薬剤の投与、前記患者への手術の実施、またはそれらの組み合わせである、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＣＳＦサンプル中の前記ＰＡＲ濃度の測定が、サンドイッチＥＬＩＳＡによる、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
パーキンソン病（ＰＤ）の患者の疾患進行をモニタリングする方法であって、
ＰＤに対する少なくとも１つの医学的処置を受けている患者から脳脊髄液（ＣＳＦ）のサンプルを採取することと、
前記ＣＳＦサンプル中のポリ（ＡＤＰ−リボース）（ＰＡＲ）濃度を測定することと、
前記患者の前記ＰＡＲ濃度を、少なくとも１つのコントロールサンプル中のＰＡＲ濃度と比較することとを含んでなる前記方法。
【請求項１５】
前記コントロールサンプルが、前記患者から以前のある時期に採取したＣＳＦサンプルである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記コントロールサンプルが、健常ドナーから採取したＣＳＦサンプルである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記患者の前記ＰＡＲ濃度が、前記コントローサンプル中の前記ＰＡＲ濃度よりも高い場合、前記医学的処置が、前記患者にとって有効ではなく、
前記患者の前記ＰＡＲ濃度が、前記コントローサンプル中の前記ＰＡＲ濃度と同じであるか、または低い場合、前記医学的処置が、前記患者にとって有効である、
請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記医学的処置が、前記患者への１種または複数種の薬剤の投与、前記患者への手術の実施、またはそれらの組み合わせである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＣＳＦサンプル中の前記ＰＡＲ濃度の測定が、サンドイッチＥＬＩＳＡによる、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
パーキンソン病の患者を診断する方法であって、
患者から脳脊髄液（ＣＳＦ）のサンプルを採取することと、
前記ＣＳＦサンプル中のポリ（ＡＤＰ−リボース）（ＰＡＲ）濃度を測定することと、
前記患者の前記ＰＡＲ濃度を、少なくとも１つのコントロールサンプル中のＰＡＲ濃度と比較することとを含んでなる前記方法。
【請求項２１】
前記コントロールサンプルが、前記患者から以前のある時期に採取したＣＳＦサンプルである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記コントロールサンプルが、健常ドナーから採取したＣＳＦサンプルである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記患者の前記ＰＡＲ濃度が、前記コントローサンプル中の前記ＰＡＲ濃度よりも高い場合、前記患者は、ＰＤを発生する高いリスクを有するか、またはＰＤを有し、
前記患者の前記ＰＡＲ濃度が、前記コントローサンプル中の前記ＰＡＲ濃度と同じであるか、または低い場合、前記患者は、ＰＤを発生するリスクを有しないか、またはＰＤを有しない、
請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
パーキンソン病のセラノスティク法であって、
ＰＤに対する少なくとも１つの医学的処置を受けている患者から脳脊髄液（ＣＳＦ）のサンプルを採取することと、
前記ＣＳＦサンプル中のポリ（ＡＤＰ−リボース）（ＰＡＲ）濃度を測定することと、
前記患者の前記ＰＡＲ濃度を、少なくとも１つのコントロールサンプル中のＰＡＲ濃度と比較することとを含んでなる前記方法。
【請求項２５】
前記コントロールサンプルが、前記患者から以前のある時期に採取したＣＳＦサンプルである、請求項２４に記載のセラノスティク法。
【請求項２６】
前記コントロールサンプルが、健常ドナーから採取したＣＳＦサンプルである、請求項２４に記載のセラノスティク法。
【請求項２７】
前記患者の前記ＰＡＲ濃度が、前記コントローサンプル中の前記ＰＡＲ濃度よりも高い場合、前記方法は、前記患者が受けている少なくとも１つの医学的処置を変更することをさらに含んでなり、
前記患者の前記ＰＡＲ濃度が、前記コントローサンプル中の前記ＰＡＲ濃度と同じであるか、または低い場合、前記方法は、前記患者が受けている前記医学的処置を変更しないことをさらに含んでなる、
請求項２５または２６に記載のセラノスティク法。
【請求項２８】
前記ＣＳＦサンプル中の前記ＰＡＲ濃度の測定が、サンドイッチＥＬＩＳＡによる、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【優先権主張】
【０００１】
本願は、２０１７年６月２日に提出された米国仮出願第６２／５１４，３１６号および２０１８年６月１日に提出された米国仮出願第６２／６７９，１６１号の優先権を主張し、あらゆる目的のために、その両方をその全体で参照により援用する。
連邦政府が支援する研究開発に関する陳述
【０００２】
本発明は、国立衛生研究所によって与えられたグラント番号ＮＳ３８３７７およびＵ０１ＮＳ０８２１３３の下で政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
ポリ（ＡＤＰ−リボース）（「ＰＡＲ」）ポリメラーゼ−１（「ＰＡＲＰ−１」）は、ＤＮＡ損傷に応答する重要な核の酵素であり、ＤＮＡ修復に必要である。ＰＡＲＰ−１は、活性化すると、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（「ＮＡＤ＋」）からのＡＤＰ−リボースの転移を触媒し、ＰＡＲＰ−１自体を自己修飾するとともに、ヒストン、ＤＮＡポリメラーゼ、トポイソメラーゼ、および転写因子などの様々な核タンパク質にＰＡＲを結合し、それにより、様々な生理的過程を調節する。ＰＡＲＰ−１の過剰な活性化は、ネクローシスおよびアポトーシスと区別するためにパータナトス（またはＰＡＲＰ−１依存性細胞死）と名付けられた、固有の細胞死プログラムをもたらす。パータナトスは、脳卒中、パーキンソン病、心臓発作、糖尿病、および虚血再灌流障害などの多くの疾患および状態で発生することが知られている。ＰＡＲＰ−１阻害またはＰＡＲＰ−１遺伝子欠失は、脳卒中、外傷、虚血再灌流障害、糖尿病、および神経変性疾患を含む多くの細胞損傷パラダイムのモデルで著しく保護的であり、パータナトスがこれらの障害で顕著な役割を果たすことを示す。
【０００４】
ミトコンドリアタンパク質アポトーシス誘導因子（「ＡＩＦ」）は、パータナトスで重要な役割を果たし、パータナトス中に、ＡＩＦはミトコンドリアから放出され、核に移動する。ＡＩＦは、シトクロムＣのように２つの独立した機能を有するミトコンドリアオキシドレダクターゼである。第１に、ミトコンドリア内で、細胞の生存に関与し、これは、呼吸複合体Ｉの集合または安定化を介すると考えられている。第２に、パータナトス細胞死の促進因子としての機能である。ＡＩＦは、ＰＡＲＰ−１活性化後に細胞質に放出され、最終的に核に入り、細胞死を誘導する。
【０００５】
パーキンソン病（ＰＤ）は、α−ｓｙｎがレーヴィ小体と呼ばれる構造の細胞質内封入体および神経突起に線維として沈着する、年齢と関連する神経変性疾患である。組み換えα−ｓｙｎは、インビトロで凝集して、インビボで見られる繊維に構造が類似した線維を形成することができ、これらのα−ｓｙｎプレフォームド線維（α−ｓｙｎ  ＰＦＦ）は、プリオンに類似した様式：インビトロのニューロン培養物およびマウスの脳に注入した場合のインビボの両方で、広がることができ、病的α−ｓｙｎおよび神経毒性のマーカーであるセリン１２９でのα−ｓｙｎのリン酸化を伴う。α−ｓｙｎの凝集がＰＤの病理の根底にあることは明らかであるが、α−ｓｙｎの異常な凝集を引き起こすもの、ならびにこの凝集によって活性化される細胞損傷および細胞死のメカニズムは、まだ分かっていない。ポリ（ＡＤＰ−リボース）（ＰＡＲ）ポリメラーゼ−１（ＰＡＲＰ−１）およびＰＡＲは、神経障害に関連する細胞死に寄与する主要な役割を果たすため、ここで病的α−ｓｙｎ誘導神経変性におけるＰＡＲＰ−１およびＰＡＲの役割を評価した。
【０００６】
さらに、ＰＤは、ゆっくりと進行する神経変性ＣＮＳ障害であり、遅い動作および動作の減少、筋固縮、安静時振戦、姿勢動揺、認知障害、および痴呆を特徴とする。ＰＤの主な病理学的特徴は、黒質緻密部（ＳＮｐｃ）におけるドーパミン作動性ニューロンの選択的変性ならびに尾状核および被殻におけるその終末の消失である。尾状核および被殻へ突出する黒質ニューロンの消失は、これらの領域でドーパミンを枯渇させる。エビデンスは、遺伝的要因および環境的要因を含む複数の要因が、この神経変性疾患におけるドーパミン作動性神経変性に寄与することを示唆している。
【０００７】
ＰＤの医学的処置は、黒質線条体ニューロンの神経変性プロセスの停止、減速、またはその程度の低減、もしくは最小化（神経保護療法）および生化学的平衡異常の解消（対症療法）を対象としている。ＰＤの対症療法の主な方針は、ドーパミン合成を増加させるか、またはドーパミン受容体活性および前シナプスの空間からのドーパミン放出を刺激すること、ならびに前シナプスの受容体によるドーパミンの再取り込みおよびドーパミンの異化を抑制することである。
【０００８】
現時点ではＰＤの治癒は知られておらず、患者によって治療法への反応が異なるため、医療専門家は患者の疾患の進行を注意深くモニタリングすることが重要である。これにより、医療専門家が、現在の治療が効果的でない場合に、患者が受ける医学的処置を調整または変更することが可能になる。ＰＤの進行をモニタリングする現在の方法は、患者が経験している障害および欠陥のレベルに基づく主観的尺度である。
【０００９】
したがって、医学的処置を微調整するために、ＰＤ患者の治療および進行をより具体的に評価およびモニタリングする必要性が残存している。また、評価の主観的な要素を排除または削減する定量的かつ定性的な尺度の必要性も存在している。
【発明の概要】
【００１０】
第１の態様において、本明細書で開示されているのは、脳脊髄液中のポリ（ＡＤＰ−リボース）（ＰＡＲ）濃度を測定する方法であって、患者から脳脊髄液（ＣＳＦ）のサンプルを採取することと、前記ＣＳＦサンプルでＰＡＲ−サンドイッチＥＬＩＳＡを行い、それによって、前記ＣＳＦ中の前記ＰＡＲ濃度を測定することとを含んでなる前記方法である。
【００１１】
第２の態様において、本明細書で開示されているのは、パーキンソン病に対する医学的処置の治療有効性を測定する方法であって、患者から脳脊髄液（ＣＳＦ）のサンプルを採取することと、前記ＣＳＦサンプル中のポリ（ＡＤＰ−リボース）（ＰＡＲ）濃度を測定することと、前記患者の前記ＰＡＲ濃度を、少なくとも１つのコントロールサンプル中のＰＡＲ濃度と比較することとを含んでなる前記方法である。
【００１２】
また別の態様において、本明細書で開示されているのは、パーキンソン病（ＰＤ）の患者の疾患進行をモニタリングする方法であって、患者から脳脊髄液（ＣＳＦ）のサンプルを採取することと、前記ＣＳＦサンプル中のポリ（ＡＤＰ−リボース）（ＰＡＲ）濃度を測定することと、前記患者の前記ＰＡＲ濃度を、少なくとも１つのコントロールサンプル中のＰＡＲ濃度と比較することとを含んでなり、前記患者がＰＤに対する少なくとも１つの医学的処置を受けている前記方法である。
【００１３】
さらにまた別の態様において、本明細書で開示されているのは、パーキンソン病の患者を診断する方法であって、患者から脳脊髄液（ＣＳＦ）のサンプルを採取することと、前記ＣＳＦサンプル中のポリ（ＡＤＰ−リボース）（ＰＡＲ）濃度を測定することと、前記患者の前記ＰＡＲ濃度を、少なくとも１つのコントロールサンプル中のＰＡＲ濃度と比較することとを含んでなる前記方法である。
【００１４】
さらにまた別の態様において、本明細書で開示されているのは、パーキンソン病のセラノスティク法であって、ＰＤに対する少なくとも１つの医学的処置を受けている患者から脳脊髄液（ＣＳＦ）のサンプルを採取することと、前記ＣＳＦサンプル中のポリ（ＡＤＰ−リボース）（ＰＡＲ）濃度を測定することと、前記患者の前記ＰＡＲ濃度を、少なくとも１つのコントロールサンプル中のＰＡＲ濃度と比較することとを含んでなる前記方法である。
【００１５】
さらにまた別の態様において、本明細書で開示されているのは、ＰＤのバイオマーカーとしての患者のＣＳＦ中のＰＡＲの使用である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】パータナトスにおけるＰＡＲ依存性ＡＩＦ放出のモデルを示す、細胞におけるプロセスの略図である。
【図２】抗ＰＡＲ抗体を用いるサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイの略図および濃度曲線である。
【図３】ＰＤ患者対健常コントロールのＣＳＦ中のＰＡＲ濃度の棒グラフである。
【図４】ＰＤ−正常患者対ＰＤ−認知障害患者におけるＰＡＲ濃度の棒グラフである。
【図５】α−ｓｙｎ  ＰＦＦ処理一次皮質ニューロンにおけるＰＡＲＰ−１の活性化を示す。代表的なウエスタンブロット解析（上）およびＰＡＲ蓄積レベルの定量化（下）。バーは、平均±標準誤差（s.e.m）を表す。一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定（ｎ＝３〜４）。
【図６】ＡＢＴ−８８８（１０μＭ）、ＡＧ−０１４６９９（１μＭ）、またはＢＭＮ  ６７３（１０μＭ）のいずれかで１時間プレインキュベートし、α−ｓｙｎ  ＰＦＦ（５μｇ／ｍｌ）で１４日間さらにインキュベートした一次皮質ニューロンからのHoechstおよびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色の代表画像を示す。スケールバー，２０μｍ。
【図７】細胞死の定量化を示す。バーは、平均±標準誤差（s.e.m）を表す。一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定（ｎ＝３）。
【図８】α−ｓｙｎ  ＰＦＦ誘導ＰＡＲ蓄積の阻害をウエスタンブロット解析により測定したことを示す。
【図９】ＡＡＶ−ｓｇＣｏｎまたはＡＡＶ−ｓｇＰＡＲＰ−１を導入し、α−ｓｙｎ  ＰＦＦで１４日間さらにインキュベートした一次皮質ニューロンからのHoechstおよびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色の代表画像を示す。スケールバー，２０μｍ。
【図１０】細胞死の定量化を示す。バーは、平均±標準誤差（s.e.m）を表す（ｎ＝３）。
【図１１】α−ｓｙｎ  ＰＦＦで１４日間さらにインキュベートしたＷＴまたはＰＡＲＰ−１  ＫＯ一次皮質ニューロンからのHoechstおよびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色の代表画像を示す。スケールバー，２０μｍ。
【図１２】細胞死の定量化を示す。バーは、平均±標準誤差（s.e.m）を表す。一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定（ｎ＝３）。＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．００５，＊＊＊Ｐ＜０．０００５。
【図１３】α−ｓｙｎ  ＰＦＦ注入マウスの線条体におけるＰＡＲ蓄積レベルの代表的なイムノブロットおよび定量化を示す。バーは、平均±標準誤差（s.e.m）を表す。一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定（ｎ＝４）。
【図１４】線条体内α−ｓｙｎ  ＰＦＦまたはＰＢＳ注入後６ヶ月における、α−ｓｙｎ  ＰＦＦを注入したＷＴ、ＰＡＲＰ−１ＫＯ、およびＡＢＴ−８８８を与えたＷＴマウスのＳＮｐｃ  ＤＡニューロンの代表的なＴＨおよびニッスル染色を示す。
【図１５】立体解析の計数を示す。データは、平均±標準誤差（s.e.m）である。一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定（群当たりｎ＝５〜７マウス）。
【図１６】線条体内α−ｓｙｎ  ＰＦＦまたはＰＢＳ注入後６ヶ月での、ＷＴ、ＰＡＲＰ−１  ＫＯ、およびＡＢＴ−８８８を与えたＷＴマウスの線条体における、ＨＰＬＣにより測定したＤＡ濃度を示す。バーは、平均±標準誤差（s.e.m）を表す。一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定（群当たりｎ＝６〜３０マウス）。
【図１７】α−ｓｙｎ  ＰＦＦ注入後１８０日でのポールテストの結果を示す。ポールテストは、ＷＴ、ＰＡＲＰ−１  ＫＯ、またはＡＢＴ−８８８を与えたＷＴマウスで行った。データは、平均±標準誤差（s.e.m）である。一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定（群当たりｎ＝７〜９マウス）。＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．００５，＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１８】α−ｓｙｎ  ＰＦＦ注入後１８０日での握力の結果を示す。握力テストは、ＷＴ、ＰＡＲＰ−１  ＫＯ、またはＡＢＴ−８８８を与えたＷＴマウスで行った。データは、平均±標準誤差（s.e.m）である。一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定（群当たりｎ＝７〜９マウス）。＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．００５，＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１９】ＰＡＲによるα−ｓｙｎ線維化の促進を示す。５ｎＭ精製ＰＡＲの存在下または非存在下で、モノマーα−ｓｙｎを３７℃で指定時間インキュベートした。α−ｓｙｎの線維化を、α−ｓｙｎ抗体を用いるイムノブロッティングにより検出した（上）。データは、平均±標準誤差（s.e.m）である（下）。一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定（ｎ＝３）。
【図２０】ＰＡＲの存在下または非存在下でのα−ｓｙｎ繊維の形成速度を、チオフラビンＴ蛍光によりモニタリングしたことを示す（ｎ＝３）。
【図２１】α−ｓｙｎ繊維についての代表的な透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像を示す。スケールバー，２００ｎｍ。
【図２２】ＰＡＲＰ−１  ＫＯニューロンにおけるＮＭＤＡ誘導α−ｓｙｎ繊維化の抑制を示す。ＷＴまたはＰＡＲＰ−１  ＫＯ胚からの一次皮質ニューロンにＡＡＶ−α−ｓｙｎを導入し、次いで、５００μＭ  ＮＭＤＡで５分間さらにインキュベートした。α−ｓｙｎ繊維化をＮＭＤＡ処理の６時間後にウエスタンブロット解析により検出した。
【図２３】ＰＡＲＰ１阻害薬によるＮＭＤＡ誘導α−ｓｙｎ繊維化の抑制を示す。ＡＡＶ−α−ｓｙｎを導入した一次皮質ニューロンを、１０μＭ  ＡＢＴ−８８８または１μＭ  ＡＧ−０１４６９９で１時間前処理し、５００μＭ  ＮＭＤＡで５分間さらにインキュベートした。α−ｓｙｎ繊維化をＮＭＤＡ処理の６時間後にウエスタンブロット解析により検出した。
【図２４】ＰＫの濃度を増加させて（０〜２．５μｇ／ｍｌ）インキュベートし、α−ｓｙｎ抗体でイムノブロッティングしたα−ｓｙｎ  ＰＦＦまたはＰＡＲ−α−ｓｙｎ  ＰＦＦを示す（上）。定量化は、切断α−ｓｙｎ対未切断α−ｓｙｎの比率を表す（下）。データは、平均±標準誤差（s.e.m）である（下）。一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定（ｎ＝３）。
【図２５】α−ｓｙｎ  ＰＦＦまたはＰＡＲ−α−ｓｙｎ  ＰＦＦで１、４、および７日間処理した一次皮質ニューロンにおけるｐ−α−ｓｙｎ（赤）の代表的な免疫染色を示す。ＤＡＰＩで標準化したｐ−α−ｓｙｎシグナルの定量化（右）。バーは、平均±標準誤差（s.e.m）を表す（下）。一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定（ｎ＝５）。
【図２６】α−ｓｙｎ  ＰＦＦまたはＰＡＲ−α−ｓｙｎ  ＰＦＦで処理した一次皮質ニューロンを１％ＴＸ−１００（ＴＸ可溶）および２％ＳＤＳ（ＴＸ不溶）で経時的に抽出したことを示す。ライセートをα−ｓｙｎ、ｐ−α−ｓｙｎ、およびＧＡＰＤＨ抗体を用いるイムノブロッティングに付した。バーは、平均±標準誤差（s.e.m）を表す。一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定（ｎ＝３）。ＮＤ，不検出。１日目のα−ｓｙｎ  ＰＦＦと比較して＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．００５，＊＊＊Ｐ＜０．０００５。＃Ｐ＜０．０５，＃＃Ｐ＜０．００５，＃＃＃Ｐ＜０．０００５。
【図２７】線条体内ＰＢＳ、α−ｓｙｎ  ＰＦＦ、ＰＡＲ−α−ｓｙｎ  ＰＦＦ、またはＰＡＲ注入後１、３、および６ヶ月でのＷＴマウスのＳＮｐｃ  ＤＡニューロンの代表的なＴＨおよびニッスル染色を示す。
【図２８】立体解析の計数を示す。バーは、平均±標準誤差（s.e.m）を表す。一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定（群当たりｎ＝５〜８マウス）。
【図２９】１、３、および６ヶ月にＨＰＬＣにより測定したＰＢＳ、α−ｓｙｎ  ＰＦＦ、ＰＡＲ−α−ｓｙｎ  ＰＦＦ、またはＰＡＲ注入マウスの線条体におけるＤＡ濃度を示す。バーは、平均±標準誤差（s.e.m）を表す。一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定（群当たりｎ＝４〜６マウス）。
【図３０】線条体内ＰＢＳ、α−ｓｙｎ  ＰＦＦ、ＰＡＲ−α−ｓｙｎ  ＰＦＦ、またはＰＡＲ注入後１、３、および６ヶ月でのＷＴマウスのＳＮｐｃの代表的なｐ−α−ｓｙｎ免疫染色を示す。スケールバー，１００μｍ。
【図３１】ｐ−α−ｓｙｎレベルの定量化を示す。バーは、平均±標準誤差（s.e.m）を表す。一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定（群当たりｎ＝５〜８マウス）。
【図３２】１、３、および６ヶ月にポールテストにより測定したＰＢＳ、α−ｓｙｎ  ＰＦＦ、ＰＡＲ−α−ｓｙｎ  ＰＦＦ、またはＰＡＲ注入マウスの行動異常を示す。データは、平均±標準誤差（s.e.m）である。一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定（群当たりｎ＝９〜１４マウス）。
【図３３】１、３、および６ヶ月に握力テストにより測定したＰＢＳ、α−ｓｙｎ  ＰＦＦ、ＰＡＲ−α−ｓｙｎ  ＰＦＦ、またはＰＡＲ注入マウスの行動異常を示す。データは、平均±標準誤差（s.e.m）である。一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定（群当たりｎ＝９〜１４マウス）。
【図３４】ＰＤ患者のＣＳＦ中のＰＡＲの増加を示す。健常コントロール（ｎ＝３１）およびＰＤ患者（ｎ＝８０）のＣＳＦ中のＰＡＲのレベルをＰＡＲ  ＥＬＩＳＡにより測定した。バーは、平均±標準誤差（s.e.m）を表す。スチューデントのｔ検定とウェルチの補正。
【図３５】ＰＤ患者のＣＳＦ中のＰＡＲの増加を示す。健常コントロール（ｎ＝３３）およびＰＤ患者（ｎ＝２１）のＣＳＦ中のＰＡＲのレベルをＰＡＲ  ＥＬＩＳＡにより測定した。バーは、平均±標準誤差（s.e.m）を表す。スチューデントのｔ検定とウェルチの補正。
【図３６】ＰＤ患者のレーヴィ小体におけるＰＡＲの増加および共局在を示す。ＰＤ患者のＳＮｐｃにおける代表的α−ｓｙｎ（赤）およびＰＡＲ（緑）免疫染色。
【図３７】ＡＢＴ−８８８（１０μＭ）、ＡＧ−０１４６９９（１μＭ）、またはＢＭＮ  ６７３（１０μＭ）のいずれかで１時間プレインキュベートし、α−ｓｙｎ  ＰＦＦで７日間さらにインキュベートした一次皮質ニューロンにおけるｐ−α−ｓｙｎ（赤）の代表画像を示す。核はＤＡＰＩ（青）で染色されている。
【図３８】ＤＡＰＩで標準化したｐ−α−ｓｙｎシグナルの定量化を示す。バーは、平均±標準誤差（s.e.m）を表す。一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定（ｎ＝６）。
【図３９】ＰＡＲＰ阻害薬で１時間前処理し、次いでα−ｓｙｎ  ＰＦＦで７日間インキュベートした一次皮質ニューロンからのデタージェントに可溶性および不溶性の画分におけるα−ｓｙｎの代表的なイムノブロットを示す。
【図４０】ｂ−アクチンに標準化した、デタージェントに不溶性の画分におけるα−ｓｙｎレベルの定量化を示す。バーは、平均±標準誤差（s.e.m）を表す。一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定（ｎ＝３）。
【図４１】ＡＡＶ−ｓｇＰＡＲＰ１に感染した一次皮質ニューロンにおけるα−ｓｙｎ  ＰＦＦ誘導ＰＡＲ蓄積の阻害を示す。
【図４２】ＰＡＲＰ１  ＫＯ胚からの一次皮質ニューロンにおけるα−ｓｙｎ  ＰＦＦ誘導ＰＡＲ蓄積の阻害を示す。
【図４３】ＡＢＴ−８８８（１０μＭ）、ＡＧ−０１４６９９（１μＭ）、またはＢＭＮ  ６７３（１０μＭ）のいずれかで１時間プレインキュベートし、α−ｓｙｎ  ＰＦＦで７日間さらにインキュベートした一次皮質ニューロンにおけるｐ−α−ｓｙｎ（赤）の代表画像を示す。核はＤＡＰＩ（青）で染色されている。
【図４４】ＤＡＰＩで標準化したｐ−α−ｓｙｎシグナルの定量化を示す。バーは、平均±標準誤差（s.e.m）を表す。一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定（ｎ＝６）。
【図４５】α−ｓｙｎ  ＰＦＦで７日間インキュベートしたＷＴまたはＰＡＲＰ１  ＫＯ一次皮質ニューロンからのデタージェントに可溶性および不溶性の画分におけるα−ｓｙｎの代表的なイムノブロットを示す。
【図４６】ｂ−アクチンに標準化した、デタージェントに不溶性の画分におけるα−ｓｙｎレベルの定量化を示す。バーは、平均±標準誤差（s.e.m）を表す。一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定（ｎ＝３）。
【図４７】ＡＢＴ−８８８、Ｚ−ＶＡＤ、ＮＥＣ−１、または３−ＭＡで１時間前処理し、次いでα−ｓｙｎ  ＰＦＦで１４日間さらにインキュベートした一次皮質ニューロンからのHoechstおよびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色の代表画像を示す。スケールバー，２０μｍ。
【図４８】細胞死の定量化を示す。バーは、平均±標準誤差（s.e.m）を表す。一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定（ｎ＝３）。＊Ｐ＜０．０５，＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図４９】α−ｓｙｎ  ＰＦＦ伝播の代表画像を示す。α−ｓｙｎ  ＰＦＦをマイクロ流体デバイスのチャンバー１（Ｃ１）に添加した。１４日目に、３つの全てのチャンバーでＷＴニューロンが存在した場合に、ｐ−α−ｓｙｎがチャンバー２（Ｃ２）およびチャンバー３（Ｃ３）で検出されたが、ｐ−α−ｓｙｎの強度は、Ｃ２におけるＰＡＲＰ−１  ＫＯニューロンおよびＣ３におけるＷＴニューロンでは、非常に低強度であった。スケールバー，１００μｍ。
【図５０】高解像度画像でのｐ−α−ｓｙｎシグナルを示す。スケールバー，１０μｍ。
【図５１】各チャンバーにおけるｐ−α−ｓｙｎレベルの定量化を示す。値は、平均±標準誤差（s.e.m）である。対応のないスチューデントのｔ検定（ｎ＝３）。＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．００５。
【図５２】ミスフォールドしたα−ｓｙｎ、ｐ−α−ｓｙｎ、ＴＨ、ＤＡＴ、ＰＡＲ、およびＰＡＲＰ−１抗体を用いた、ＷＴ、ＰＡＲＰ−１  ＫＯ、およびＡＢＴ−８８８を与えたＷＴマウスからの中脳ライセートの代表的なイムノブロットを示す。
【図５３】ＴＨレベルの定量化を示す。バーは、平均±標準誤差（s.e.m）を表す。一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定（ｎ＝３）。＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．００５，＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図５４】ＤＡＴレベルの定量化を示す。バーは、平均±標準誤差（s.e.m）を表す。一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定（ｎ＝３）。＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．００５，＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図５５】不溶性のα−ｓｙｎレベルの定量化を示す。バーは、平均±標準誤差（s.e.m）を表す。一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定（ｎ＝３）。＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．００５，＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図５６】不溶性のｐ−α−ｓｙｎレベルの定量化を示す。バーは、平均±標準誤差（s.e.m）を表す。一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定（ｎ＝３）。＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．００５，＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図５７】線条体内α−ｓｙｎ  ＰＦＦまたはＰＢＳ注入後６ヶ月での、ＷＴ、ＰＡＲＰ−１  ＫＯ、およびＡＢＴ−８８８を与えたＷＴマウスの線条体における、ＨＰＬＣにより測定した、ＤＡ代謝物であるＤＯＰＡＣの濃度を示す。バーは、平均±標準誤差（s.e.m）を表す。一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定。（群当たりｎ＝５〜１０マウス）。
【図５８】線条体内α−ｓｙｎ  ＰＦＦまたはＰＢＳ注入後６ヶ月での、ＷＴ、ＰＡＲＰ−１  ＫＯ、およびＡＢＴ−８８８を与えたＷＴマウスの線条体における、ＨＰＬＣにより測定した、ＤＡ代謝物である３−ＭＴの濃度を示す。バーは、平均±標準誤差（s.e.m）を表す。一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定。（群当たりｎ＝５〜１０マウス）。
【図５９】線条体内α−ｓｙｎ  ＰＦＦまたはＰＢＳ注入後６ヶ月での、ＷＴ、ＰＡＲＰ−１  ＫＯ、およびＡＢＴ−８８８を与えたＷＴマウスの線条体における、ＨＰＬＣにより測定した、ＤＡ代謝物であるＨＶＡの濃度を示す。バーは、平均±標準誤差（s.e.m）を表す。一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定。（群当たりｎ＝５〜１０マウス）。
【図６０】ＷＴ、ＰＡＲＰ−１  ＫＯ、およびＡＢＴ−８８８を与えたＷＴマウスからのｐ−α−ｓｙｎ免疫染色の代表画像を示す。
【図６１】扁桃体領域におけるｐ−α−ｓｙｎ強度の定量化を示す。バーは、平均±標準誤差（s.e.m）を表す。一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定。（群当たりｎ＝４〜５マウス）。
【図６２】皮質領域におけるｐ−α−ｓｙｎ強度の定量化を示す。バーは、平均±標準誤差（s.e.m）を表す。一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定。（群当たりｎ＝４〜５マウス）。
【図６３】ＳＮｐｃ領域におけるｐ−α−ｓｙｎ強度の定量化を示す。バーは、平均±標準誤差（s.e.m）を表す。一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定。（群当たりｎ＝４〜５マウス）。
【図６４】α−ｓｙｎ  ＰＦＦ注入後１８０日でのポールテストの結果を示す。ポールテストは、ＷＴ、ＰＡＲＰ−１  ＫＯ、またはＡＢＴ−８８８を与えたＷＴマウスで行った。データは、平均±標準誤差（s.e.m）である。一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定（群当たりｎ＝６〜３０マウス）。＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．００５，＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図６５】α−ｓｙｎ  ＰＦＦ注入後１８０日での握力テストの結果を示す。握力テストは、ＷＴ、ＰＡＲＰ−１  ＫＯ、またはＡＢＴ−８８８を与えたＷＴマウスで行った。データは、平均±標準誤差（s.e.ｍ）である。一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定（群当たりｎ＝６〜３０マウス）。＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．００５，＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図６６】α−ｓｙｎ線維化のＰＡＲ介在性促進への温度の影響を示す。５ｎＭ  ＰＡＲの存在下または非存在下で、モノマーα−ｓｙｎを、７２時間、指定温度でインキュベートした。α−ｓｙｎ抗体を用いるイムノブロッティングにより、α−ｓｙｎの繊維化を検出した。
【図６７】ＰＡＲ介在性α−ｓｙｎ繊維化の濃度依存性を示す。インキュベーションから３６時間後に、α−ｓｙｎ繊維化をウエスタンブロット解析により検出した。
【図６８】α−ｓｙｎ繊維化の定量化を示す。バーは、平均±標準誤差（s.e.m）を表す。一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定。
【図６９】３７℃で３６時間５ｎＭのＰＡＲ、ポリ（Ａ）、またはＡＤＰｒを添加することにより生じたα−ｓｙｎ繊維化の代表的なイムノブロットを示す。
【図７０】α−ｓｙｎ繊維化の定量化を示す。バーは、平均±標準誤差（s.e.m）を表す。一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定。
【図７１】ＷＴまたはＰＡＲＰ１  ＫＯ胚からの一次皮質ニューロンにＡＡＶ−α−ｓｙｎを５日間導入し、次いで、ＰＡＲポリマーをBioPorterで６時間運搬したことを示す。α−ｓｙｎ繊維化をウエスタンブロット解析により検出した。
【図７２】α−ｓｙｎ  ＷＴを２４時間トランスフェクトし、次いで、５０μＭ  ＭＮＮＧで１５分間さらにインキュベートしたＷＴまたはＰＡＲＰ１  ＫＯ  ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を示す。ＭＮＮＧ処理の６時間後に、α−ｓｙｎ繊維化をウエスタンブロット解析により検出した。
【図７３】α−ｓｙｎ  Ａ５３Ｔを２４時間トランスフェクトし、次いで、５０μＭ  ＭＮＮＧで１５分間さらにインキュベートしたＷＴまたはＰＡＲＰ１  ＫＯ  ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を示す。ＭＮＮＧ処理の６時間後に、α−ｓｙｎ繊維化をウエスタンブロット解析により検出した。
【図７４】ＷＴまたはＰＡＲＰ１  ＫＯ  ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞にα−ｓｙｎ  ＷＴを２４時間トランスフェクトし、次いで、ＰＡＲポリマーをBioPorterで６時間運搬したことを示す。α−ｓｙｎ繊維化をウエスタンブロット解析により検出した。
【図７５】α−ｓｙｎ  ＷＴを２４時間トランスフェクトしたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を、１０μＭ  ＡＢＴ−８８８または１μＭ  ＡＧ−０１４６９９で１時間前処理し、５０μＭ  ＭＮＮＧで１５分間さらにインキュベートしたことを示す。ＭＮＮＧ処理の６時間後に、α−ｓｙｎ繊維化をウエスタンブロット解析により検出した。バーは、平均±標準誤差（s.e.m）を表す。一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定。＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．００５，＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図７６】α−ｓｙｎ  ＰＦＦまたはＰＡＲ−α−ｓｙｎ  ＰＦＦを０．５μｇ／ｍｌのＰＫでインキュベートし、α−ｓｙｎに対するエピトープ特異的抗体でイムノブロットしたことを示す。
【図７７】精製ＰＡＲポリマーの量を増加させながら、ＰＡＲ−α−ｓｙｎ  ＰＦＦを生じさせたことを示す。一次皮質ニューロンを同量のα−ｓｙｎ  ＰＦＦまたはＰＡＲ−α−ｓｙｎ  ＰＦＦで１４日間処理した。細胞死をHoechstおよびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色により測定した。バーは、平均±標準誤差（s.e.m）を表す。一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定（ｎ＝３〜４）。
【図７８】α−ｓｙｎ  ＰＦＦまたはＰＡＲ−α−ｓｙｎ  ＰＦＦの量を増加させ、４日間処理した一次皮質ニューロンにおけるｐ−α−ｓｙｎ（赤）の代表的な免疫染色を示す。核はＤＡＰＩ（青）で染色されている。
【図７９】ＤＡＰＩで標準化したｐ−α−ｓｙｎシグナルの定量化を示す（ｎ＝５）。一元配置分散分析とテューキーの事後検定。＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．００５，＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図８０】線条体内ＰＢＳ、α−ｓｙｎ  ＰＦＦ、ＰＡＲ−α−ｓｙｎ  ＰＦＦ、またはＰＡＲ注入後１、３、および６ヶ月でのＷＴマウスのＳＮｐｃ  ＤＡニューロンの立体解析の計数を示す。（Ａ）同側のニッスル−ニューロンを計数した。バーは、平均±標準誤差（s.e.m）を表す。一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定（群当たりｎ＝５〜８マウス）。＊Ｐ＜０．０５，＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図８１】線条体内ＰＢＳ、α−ｓｙｎ  ＰＦＦ、ＰＡＲ−α−ｓｙｎ  ＰＦＦ、またはＰＡＲ注入後１、３、および６ヶ月でのＷＴマウスのＳＮｐｃ  ＤＡニューロンの立体解析の計数を示す。対側のＴＨ−ニューロンを計数した。バーは、平均±標準誤差（s.e.m）を表す。一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定（群当たりｎ＝５〜８マウス）。＊Ｐ＜０．０５，＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図８２】線条体内ＰＢＳ、α−ｓｙｎ  ＰＦＦ、ＰＡＲ−α−ｓｙｎ  ＰＦＦ、またはＰＡＲ注入後１、３、および６ヶ月でのＷＴマウスのＳＮｐｃ  ＤＡニューロンの立体解析の計数を示す。ニッスル−陽性ニューロンを計数した。バーは、平均±標準誤差（s.e.m）を表す。一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定（群当たりｎ＝５〜８マウス）。＊Ｐ＜０．０５，＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図８３】ドーパミン代謝の概要図を示す。
【図８４】１、３、および６ヶ月にＨＰＬＣにより測定したＰＢＳ、α−ｓｙｎ  ＰＦＦ、ＰＡＲ−α−ｓｙｎ  ＰＦＦ、またはＰＡＲ注入マウスの対側の線条体におけるＤＡ濃度の有意差はないことを示す。バーは、平均±標準誤差（s.e.m）を表す。一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定。
【図８５】１、３、および６ヶ月にＨＰＬＣにより測定したＰＢＳ、α−ｓｙｎ  ＰＦＦ、ＰＡＲ−α−ｓｙｎ  ＰＦＦ、またはＰＡＲ注入マウスの線条体における同側のＤＯＰＡＣ濃度を示す。バーは、平均±標準誤差（s.e.m）を表す。一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定（群当たりｎ＝４〜６マウス）。＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．００５，＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図８６】１、３、および６ヶ月にＨＰＬＣにより測定したＰＢＳ、α−ｓｙｎ  ＰＦＦ、ＰＡＲ−α−ｓｙｎ  ＰＦＦ、またはＰＡＲ注入マウスの線条体における対側のＤＯＰＡＣ濃度を示す。バーは、平均±標準誤差（s.e.m）を表す。一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定（群当たりｎ＝４〜６マウス）。＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．００５，＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図８７】１、３、および６ヶ月にＨＰＬＣにより測定したＰＢＳ、α−ｓｙｎ  ＰＦＦ、ＰＡＲ−α−ｓｙｎ  ＰＦＦ、またはＰＡＲ注入マウスの線条体における同側の３−ＭＴ濃度を示す。バーは、平均±標準誤差（s.e.m）を表す。一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定（群当たりｎ＝４〜６マウス）。＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．００５，＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図８８】１、３、および６ヶ月にＨＰＬＣにより測定したＰＢＳ、α−ｓｙｎ  ＰＦＦ、ＰＡＲ−α−ｓｙｎ  ＰＦＦ、またはＰＡＲ注入マウスの線条体における対側の３−ＭＴ濃度を示す。バーは、平均±標準誤差（s.e.m）を表す。一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定（群当たりｎ＝４〜６マウス）。＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．００５，＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図８９】１、３、および６ヶ月にＨＰＬＣにより測定したＰＢＳ、α−ｓｙｎ  ＰＦＦ、ＰＡＲ−α−ｓｙｎ  ＰＦＦ、またはＰＡＲ注入マウスの線条体における同側のＨＶＡ濃度を示す。バーは、平均±標準誤差（s.e.m）を表す。一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定（群当たりｎ＝４〜６マウス）。＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．００５，＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図９０】１、３、および６ヶ月にＨＰＬＣにより測定したＰＢＳ、α−ｓｙｎ  ＰＦＦ、ＰＡＲ−α−ｓｙｎ  ＰＦＦ、またはＰＡＲ注入マウスの線条体における対側のＨＶＡ濃度を示す。バーは、平均±標準誤差（s.e.m）を表す。一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定（群当たりｎ＝４〜６マウス）。＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．００５，＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図９１】１、３、および６ヶ月でのＰＢＳ、α−ｓｙｎ  ＰＦＦ、ＰＡＲ−α−ｓｙｎ  ＰＦＦ、またはＰＡＲ注入マウスの線条体におけるＴＨ、ＤＡＴ、およびβ−アクチンの代表的なイムノブロットを示す。
【図９２】β−アクチンに標準化した線条体におけるＴＨおよびＤＡＴレベルの定量化を示す。エラーバーは、平均±標準誤差（s.e.m）を表す。一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定（ｎ＝３〜４）。
【図９３】１、３、および６ヶ月にポールテストにより測定したＰＢＳ、α−ｓｙｎ  ＰＦＦ、ＰＡＲ−α−ｓｙｎ  ＰＦＦ、またはＰＡＲ注入マウスの行動異常を示す。データは、平均±標準誤差（s.e.m）である。一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定。＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．００５，＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図９４】１、３、および６ヶ月に握力テストにより測定したＰＢＳ、α−ｓｙｎ  ＰＦＦ、ＰＡＲ−α−ｓｙｎ  ＰＦＦ、またはＰＡＲ注入マウスの行動異常を示す。データは、平均±標準誤差（s.e.m）である。一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定。＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．００５，＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図９５】ＰＡＲ  ＥＬＩＳＡの確立を示す。ＥＬＩＳＡは、３ｐＭという低いＰＡＲを検出し、５０ｎＭで飽和した。
【図９６】コントロールおよびＰＤ患者の黒質におけるＰＡＲ、ＴＨ、およびβ−アクチンの代表的なイムノブロットを示す。
【図９７】β−アクチンに標準化したＰＡＲおよびＴＨレベルの定量化を示す。エラーバーは、平均±標準誤差（s.e.m）を表す。一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定（ｎ＝５）。＊Ｐ＜０．０５，＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
発明の詳細な説明
すでに、ＰＡＲ−ＡＩＦ相互作用を妨げる薬剤を投与することにより、ＰＡＲＰ−１の活性化後の細胞死を抑制する新規かつ有用なメカニズムが発見された（その全体で参照により援用されているＵＳ  ２０１２０１２２７６５参照）。このようなメカニズムは、パーキンソン病を罹患している患者の治療に有用である。このことに関して、ＰＡＲポリマー結合タンパク質としてのＡＩＦの同定は、ＰＡＲポリマーとＡＩＦとの相互作用を阻害する治療用化合物が、ＰＡＲＰ−１を活性化するストレッサーに対する保護化合物として、単剤療法または併用療法に有用であり得ることを立証する。
【００１８】
この研究の継続として、ＰＤを罹患している患者をモニタリングおよび評価する新規の方法が本明細書に開示されている。ＰＤを罹患している患者に施される医学的処置の有効性をモニタリングおよび評価する新規の方法も開示されている。本明細書に開示されているセラノスティク法により、医療専門家は、疾患の進行を減速または阻止する最良の機会を有する、ＰＤを罹患している患者のための治療計画をより良く開発することができる。
【００１９】
一態様において、本明細書に開示されているのは、脳脊髄液中のポリ（ＡＤＰ−リボース）（ＰＡＲ）濃度を測定する方法であって、患者から脳脊髄液（ＣＳＦ）のサンプルを採取することと、前記ＣＳＦサンプルでＰＡＲ−サンドイッチＥＬＩＳＡを行い、それによって、前記ＣＳＦ中の前記ＰＡＲ濃度を測定することとを含んでなる前記方法である。
【００２０】
いくつかの実施形態において、方法は、ＣＳＦサンプル中のＰＡＲ濃度を、少なくとも１つのコントロールサンプル中のＰＡＲ濃度と比較することをさらに含んでなる。コントロールサンプルは、同じ患者または異なる患者から以前に採取されたＣＳＦサンプルであることができる。いくつかの態様において、複数のコントロールサンプルを使用する。各コントロールサンプルは、同じ患者由来、またはその他全てのコントロールサンプルから独立に選択された異なる患者由来であることができる。
【００２１】
いくつかの態様において、検査サンプルとコントロールサンプルとの比較を可能にし、それにより検査サンプル中のＰＡＲ濃度の測定を可能にするように、コントロールサンプルは、既知濃度のＰＡＲを含む調製済みの標準である。図２に示されているコントロール標準などの調製済みのコントロール標準を使用し、それにより、検査サンプルと得られたコントロール曲線との比較を可能にし、検査サンプル中のＰＡＲ濃度の定量化を可能にし得る。
【００２２】
サンドイッチ−ＥＬＩＳＡの説明は、本明細書の他の箇所に与えられている。いくつかの態様において、捕獲抗体、検出抗体、または両方が、抗ＰＡＲ抗体である。これらは、モノクローナルまたはポリクローナルであり得、これらは、ヒト化されていることがあり得る、またはあり得ない。いくつかの態様において、抗体は、ヒトコンビナトリアル抗体ライブラリーから作製された抗ＰＡＲ抗体である。いくつかの態様において、ヒトコンビナトリアルライブラリーは、Bio-RAD（登録商標）からのHuCAL（登録商標）テクノロジーである。HuCAL（登録商標）テクノロジーの例については、Knappik, A. et al.,  (2000). “Fully synthetic human combinatorial antibody libraries (HuCAL) based on modular consensus frameworks and CDRs randomized with trinucleotides,” J Mol Biol., 296:57-86、およびPrassler, J. et al.,  (2011). “HuCAL PLATINUM, a synthetic Fab library optimized for sequence diversity and superior performance in mammalian expression systems,” J Mol Biol., 413:261-78を参照されたい。これらの両方を、それらの教示について、参照により援用する。
【００２３】
検出抗体は、比色分析または他のアッセイによる検出に適した少なくとも1つの物質に結合している。いくつかの態様において、第１の検出抗体に特異的な第２の検出抗体が使用され、第２の検出抗体は、比色分析または他のアッセイによる検出に適した物質に結合している。いくつかの態様において、比色分析による検出に適した物質は、ビオチンである。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）は、ビオチンに強く結合し、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）と反応して、着色生成物を形成する。いくつかの態様において、比色分析は、患者のＣＳＦサンプル中のＰＡＲ濃度を測定するために、ＨＲＰおよびＴＭＢを使用する。
【００２４】
別の態様において、本明細書で開示されているのは、パーキンソン病に対する医学的処置の治療有効性を測定する方法であって、患者から脳脊髄液（ＣＳＦ）のサンプルを採取することと、前記ＣＳＦサンプル中のポリ（ＡＤＰ−リボース）（ＰＡＲ）濃度を測定することと、前記患者の前記ＰＡＲ濃度を、少なくとも１つのコントロールサンプル中のＰＡＲ濃度と比較することとを含んでなる前記方法である。
【００２５】
いくつかの態様において、コントロールサンプルは、同じ患者から以前に採取されたＣＳＦのサンプルである。以前に採取されたＣＳＦのサンプルは、過去の任意の時点で採取されたものであり得る。例えば、当該サンプルは、現在採取されたサンプルの１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、１２ヶ月、１５ヶ月、１８ヶ月、２１ヶ月、２４ヶ月、２７ヶ月、３０ヶ月、３３ヶ月、または３６ヶ月前に採取されたものであり得る。いくつかの態様において、サンプルは、患者の生涯の任意の時点で採取される。このサンプル採取は、患者の健康状態のルーチンモニタリングの一環として、定期的または反復的に行うことができる。いくつかの態様において、コントロールサンプルは、健常な患者から採取される。本明細書で使用されている健常とは、患者が検査結果に影響を及ぼす可能性のある医学的状態のいかなる症状も示していないことを意味する。いくつかの態様において、健常な患者は、ＰＤまたは同様の神経性疾患のいかかる症状も示していない。
【００２６】
ＰＡＲＰ−１の活性化とＰＡＲの蓄積とがＰＤの神経病理に関係していることが以前に実証されているので、本明細書で開示されているいくつかの態様では、患者のＣＳＦ中のＰＡＲ濃度の増加は、患者がＰＤを有するか、またはＰＤを発生するリスクを有することを示す。いくつかの態様において、患者のＰＡＲ濃度が、同じ患者から以前に採取されたコントロールサンプルよりも高い場合、患者のＰＤが悪化していることを示す。いくつかの態様において、同じ患者から以前に採取されたコントロールサンプルと比較して患者のＰＡＲ濃度が増加していることは、患者が受けている医学的処置が疾患の進行を阻止していないことを示す。
【００２７】
本明細書に開示されている方法および技術を使用して、または別の方法により、ＰＤと以前に診断された患者であって、ＰＤに対する医学的処置を受けている患者において、患者のＰＡＲ濃度が、同じ患者からの以前に採取されたサンプルのＰＡＲ濃度と比較して増加する場合、医学的処置が疾患を阻止していないことを示す。これらの場合、医療専門家は、同じ治療を継続するか、または患者が受けている治療を変更するかどうかを決定することになる。
【００２８】
また別の態様において、本明細書で開示されているのは、ＰＤの患者の疾患進行をモニタリングする方法であって、前記患者から脳脊髄液（ＣＳＦ）のサンプルを採取することと、前記ＣＳＦサンプル中のポリ（ＡＤＰ−リボース）（ＰＡＲ）濃度を測定することと、前記患者の前記ＰＡＲ濃度を、少なくとも１つのコントロールサンプル中のＰＡＲ濃度と比較することとを含んでなる前記方法である。
【００２９】
いくつかの態様において、コントロールサンプルは、同じ患者から以前に採取されたＣＳＦのサンプルである。以前に採取されたＣＳＦのサンプルは、過去の任意の時点で採取されたものであり得る。例えば、当該サンプルは、現在採取されたサンプルの１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、１２ヶ月、１５ヶ月、１８ヶ月、２１ヶ月、２４ヶ月、２７ヶ月、３０ヶ月、３３ヶ月、または３６ヶ月前に採取されたものであり得る。いくつかの態様において、サンプルは、患者の生涯の任意の時点で採取される。このサンプル採取は、患者の健康状態および／または治療のルーチンモニタリングの一環として、定期的または反復的に行うことができる。
【００３０】
ＰＡＲ濃度をより早い時期に同じ患者から採取したサンプルと比較したときに、ＣＳＦ中のＰＡＲ濃度が増加していることは、患者の状態が悪化していることを示す。患者が医学的処置を受けている場合、ＰＡＲ濃度が増加していることは、当該治療が当該患者において有効ではないことを示し得る。ＰＡＲ濃度が同じであるか、または低い場合、患者が受けている治療が、疾患の進行を減速または阻止するのに有効であることを示し得る。ＰＡＲ濃度は、本明細書の他の箇所に開示されているサンドイッチ−ＥＬＩＳＡを使用して測定される。
【００３１】
さらにまた別の態様において、本明細書で開示されているのは、患者がＰＤを発生するリスクを有することを診断または判定する方法であって、前記患者から脳脊髄液（ＣＳＦ）のサンプルを採取することと、前記ＣＳＦサンプル中のポリ（ＡＤＰ−リボース）（ＰＡＲ）濃度を測定することと、前記患者の前記ＰＡＲ濃度を、少なくとも１つのコントロールサンプル中のＰＡＲ濃度と比較することとを含んでなる前記方法である。
【００３２】
当該方法によれば、いくつかの態様では、患者のＣＳＦ中のＰＡＲ濃度が所定の濃度よりも高い場合、患者はＰＤと診断されるか、またはＰＤを発生するリスクを有する。いくつかの態様において、当該所定の濃度は、健常な患者のＣＳＦ中のＰＡＬ濃度である。いくつかの態様において、患者のＣＳＦ中のＰＡＲ濃度の測定を、本明細書の他の箇所に開示されているサンドイッチ−ＥＬＩＳＡを使用して行う。
【００３３】
当該方法によれば、患者が、健常な患者からのコントロールサンプル、または同じ患者から以前に採取したコントロールサンプルよりも高いＰＡＲ濃度を有する場合、当該患者はＰＤと診断されるか、またはＰＤを発生するリスクを有すると判定される。患者のＣＳＦ中のＰＡＲ濃度が、ネガティブコントロールまたは健常な患者のコントロールサンプルのＰＡＲ濃度より低いか、または等しい場合、患者は、現在ＰＤを有していないか、または当該時点ではＰＤを発生するリスクが低い。ＰＤの根本的な原因はまだ不明であるため、患者がＰＤを発生することはないと結論付けることは可能ではない。
【００３４】
本明細書で使用されている用語「セラノスティクス」は、個別化された治療計画または療法を特定の患者のために開発する方法を指す。この言葉は、様々な疾患に対するより具体的で個別化された治療を開発するため、ならびに診断能および治療能を単一の薬剤へ統合するための進行中の臨床上の取り組みを定義する。理論的根拠は、ＰＤおよび癌などの多くの疾患が非常に不均一であり、現在の治療は限られた患者集団または亜集団のみに、および／または疾患進行の特定の段階にのみ有効であるという事実から生じた。診断と治療法を密接に組み合わせることで、個人により特化した治療プロトコルを提供できるため、予後改善をもたらす可能性が高まることが期待された。
【００３５】
ＰＤの標準治療はない。個別化された治療計画は、それぞれの患者のために、患者の症状および全般的な健康状態に基づいて開発される。治療の選択肢には、投薬、手術、およびライフスタイルの変更が含まれる。ＰＤの治療に使用される薬剤の例として、レボドパ、ドーパミンアゴニスト、アマンタジン、抗コリン薬、ＣＯＭＴ阻害薬、およびＭＡＯ−Ｂ阻害薬が挙げられるが、これらに限定されるものではない。外科治療には、脳深部刺激、視床破壊、淡蒼球破壊、および視床下核破壊（subthalamotomy）が含まれるが、これらに限定されるものではない。ライフスタイル治療には、運動および食事が含まれるが、これらに限定されるものではない。多くの患者は、ハーブおよびビタミンのサプリメントを含み得る、いわゆる「代替医療」を試みることが多い。臨床試験では、追加の治療が常に研究されている。いくつかの態様において、患者は、ＰＤに特化した少なくとも１種類の医学的処置を受けている。患者にとって最適な組み合わせを決定するために、患者が複数の異なる種類の医学的処置を受けることは、珍しいことではない。患者にいくつの異なる種類の医学的処置が施されているかに関係なく、本明細書に開示されている方法および技術は、患者のＰＡＲ濃度を評価し、医学的処置またはこれらの治療の組み合わせの治療効率を測定するのに適している。
【００３６】
本明細書では、ＰＤの患者のための個別化された治療計画を医療専門家が開発するのに役立つであろうセラノスティク法も開示されている。当該方法は、ＰＤに対する少なくとも１つの医学的処置を受けている患者から脳脊髄液（ＣＳＦ）のサンプルを採取することと、前記ＣＳＦサンプル中のポリ（ＡＤＰ−リボース）（ＰＡＲ）濃度を測定することと、前記患者の前記ＰＡＲ濃度を、少なくとも１つのコントロールサンプル中のＰＡＲ濃度と比較することとを含んでなる。
【００３７】
医学的処置は、本明細書の他の箇所に開示されている任意の治療であり得るか、または医療専門家によって、もしくは医療専門家の監督下で施される任意の他の治療であり得る。いくつかの態様において、薬剤が効果を有すると予想される期間に少なくともわたって、患者に当該薬剤を投与し、患者のＰＡＲ濃度が増加した場合、当該方法は、薬剤を患者に投与する方法を変更することをさらに含んでなる。薬剤を投与する方法を変更することは、薬剤の用量を増加または減少させることを含んでなり得る；患者が薬剤を摂取する頻度または患者に薬剤を投与する頻度を増加または減少させることを含んでなり得る；患者に投与している特定の薬剤の変更または除外を含んでなり得る。
【００３８】
別の態様において、同じ患者から以前に採取されたＣＳＦのサンプルと比較して患者のＣＳＦ中のＰＡＲ濃度が増加している場合、医療専門家は、患者が受けている医学的処置を、別の治療形態で追加するように変更し得る。例えば、患者が治療として１つ以上の薬剤のみを受けている場合、医療専門家は、外科的代替治療を推奨し得る。あるいは、患者が１つの薬剤（例えば、レボドパ）を受けている場合、医療専門家は、第２の薬剤（例えば、ドーパミンアゴニスト）の追加を推奨し得る。医療専門家が患者の医学的処置を変更する正確な性質は、患者の医療ニーズおよび医療専門家の専門的判断に基づいて個別化されることになる。
【００３９】
本明細書で使用される場合、用語「バイオマーカー」は、国立衛生研究所バイオマーカー定義ワーキンググループ（National Institutes of Health Biomarkers Definitions Working Group）によって確立された定義を指す。「バイオマーカー」は、「正常な生物学的プロセス、病原性プロセス、または治療介入に対する薬理学的応答の指標として客観的に測定および評価される指標」である。本明細書では、ＰＤのバイオマーカーとしての患者のＣＳＦ中のＰＡＲの使用も開示されている。本明細書の他の箇所に開示されている方法は、ＰＤの患者を診断すること、または患者がＰＤのリスクを有するかどうかを判定することに適している。患者のＣＳＦ中のＰＡＲ濃度の上昇は、ＰＤを示すか、または患者がＰＤを発生するリスクを有することを示す。患者がすでにＰＤの症状を示している場合、患者のＣＳＦ中のＰＡＲ濃度の上昇は、患者がＰＤを有することを示唆する。ＰＤの症状には、震えもしくは揺れ、書き方もしくは話し方の変化、嗅覚の喪失、睡眠困難、歩行もしくは移動の困難、動作緩慢、便秘、仮面様顔貌、めまいもしくは失神、または前かがみもしくは猫背が含まれるが、これらに限定されるものではない。ＰＤのこれらの早期の警告症状は、患者のＣＳＦ中のＰＡＲ濃度の上昇と相俟って、患者がＰＤを有することを示唆する。この診断を確認するには、さらに検査が必要な場合がある。本明細書では、ＰＤのバイオマーカーとしてのＰＡＲの使用も開示されている。患者のＣＳＦ中のＰＤ濃度の上昇の検出は、患者がＰＤを有するか、またはＰＤを発生するリスクを有することを示す。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「サンドイッチＥＬＩＳＡ」は、図２に示すように、サンプル抗原検出および定量化に非常に特化した従来のＥＬＩＳＡの異形である。サンドイッチＥＬＩＳＡは、２層の抗体（すなわち、捕獲抗体および検出抗体）間の抗原を定量化する。少なくとも２つの抗体がサンドイッチで作用するため、測定される抗原には、抗体に結合できる少なくとも２つの抗原エピトープが含まれている必要がある。モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を、サンドイッチＥＬＩＳＡシステムの捕獲抗体および検出抗体として使用することができる。モノクローナル抗体は、単一のエピトープを認識し、抗原間の小さな差異の精緻な検出および定量化を可能にするが、できるだけ多くの抗原を捕捉するための捕獲抗体として、ポリクローナル抗体を使用することが多い。サンドイッチＥＬＩＳＡの１つの利点は、サンプル調製の容易性にあり、つまり、分析前にサンプルを精製する必要がない。サンドイッチＥＬＩＳＡの他の利点は、特定の抗原を検出および定量化する技術の感度である。
【００４１】
本明細書に開示されているサンドイッチＥＬＩＳＡのいくつかの態様において、捕獲抗体は、プレート、チップ、または他の物理的構造物上に固定化されている。第２のステップでは、固定化された捕獲抗体を、標的タンパク質を含むサンプルに暴露する。本明細書に記載されている場合、標的タンパク質は、ＰＡＲである。所定期間後、固定化されている捕獲抗体に結合している抗原に結合する第１の検出抗体を添加する。いくつかの実施形態において、第１の検出抗体に結合する第２の検出抗体を添加する。全ての実施形態において、検出抗体の少なくとも１つは、検出可能な基質を含んでなることになる。検出可能な基質は、追加の試薬と反応して検出可能かつ定量可能な生成物を形成する酵素であり得るか、または検出可能な基質は、さらなる反応なしで検出可能であり得る。いくつかの実施形態において、検出可能な基質は、ビオチンである。全ての実施形態において、検出可能な基質は、検出可能かつ定量可能であることになる。いくつかの実施形態において、基質の検出は、比色検出となる。
【００４２】
本明細書に開示されているサンドイッチＥＬＩＳＡでの使用に適したヒト抗体は、当技術分野で知られている。例えば、ヒトモノクローナル抗体の産生用のヒトミエローマ、およびマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株が、当技術分野で記載されている（Kozbor J., Immunol. 133:3001, 1984.; Brodeur et al.,  “Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,” Marcel Dekker, Inc., New York, 1987，これらの両方を、それらの教示について、参照により援用する）。いくつかの態様において、抗体は、ヒトコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、Bio-RAD（登録商標）からのHuCAL（登録商標）テクノロジー）から作製された抗ＰＡＲ抗体である。
【００４３】
α−ｓｙｎ  ＰＦＦがＰＡＲＰの活性化を誘導するかどうかを判定するために、α−ｓｙｎ  ＰＦＦを一次マウス皮質ニューロンに投与した後に、高感度かつ特異的なＰＡＲモノクローナル抗体を使用してＰＡＲのレベルを測定する（図５〜１２）。α−ｓｙｎ  ＰＦＦ（１μｇ／ｍｌ）は、３〜７日目の間にＰＡＲＰ活性化のピークを誘導し、１４日目まで高いままであった（図５）。ＰＡＲの上昇に伴うのは、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色により評価されるニューロンの死滅である（図６および７）。ＰＡＲＰ阻害薬であるＡＢＴ−８８８（ベリパリブ）（１０μＭ）、またはＡＧ−０１４６９９（ルカパリブ）（１μＭ）、またはＢＭＮ  ６７３（タラゾパリブ）（１０μＭ）による皮質ニューロンの処理は、α−ｓｙｎ  ＰＦＦ介在性ＰＡＲＰ活性化および細胞死を抑制する（図６、７、および８）。これらのＰＡＲＰ阻害薬は、免疫染色により評価されるα−ｓｙｎのセリン１２９でのα−ｓｙｎ  ＰＦＦ介在性リン酸化（ｐ−α−ｓｙｎ）（図３７および３８）ならびにイムノブロット解析により示されるα−ｓｙｎ凝集（図３９および４０）も低減し、これらの両方が、α−シヌクレイン症の病理に関連している。ＰＡＲＰ−１はパータナトスで主要な役割を果たすので、ＰＡＲＰ−１に対するガイドＲＮＡを保有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）介在性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９トランスダクションを使用して（図９、１０、および４１）、またはＰＡＲＰ−１ノックダウンからの皮質培養物を使用して（図１１、１２、および４２〜４６）、ＰＡＲＰ−１を皮質ニューロンから欠失させた。ＰＡＲＰ−１の欠失またはノックアウトは、α−ｓｙｎ  ＰＦＦ介在性ＰＡＲＰ活性化および細胞死を抑制する（図９〜１２、４１、および４２）。ＰＡＲＰ１のノックアウトは、ｐ−α−ｓｙｎ免疫染色およびイムノブロット解析により示されるα−ｓｙｎ凝集も低減する（図４３〜４６）。皮質ニューロンの広域スペクトルのカスパーゼ阻害薬Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ（Ｚ−ＶＡＤ）による処理は、α−ｓｙｎ  ＰＦＦ毒性を部分的に低減する。ネクロプトーシス阻害薬ネクロスタチン−１（Ｎｅｃ−１）およびオートファジー阻害薬３−メチルアデニン（３−ＭＡ）は効果を有しなかったが、ＰＡＲＰ阻害薬ＡＢＴ−８８８はα−ｓｙｎ  ＰＦＦ毒性を抑制する（図４７および４８）。ＰＡＲＰ阻害およびＰＡＲＰ−１のノックアウトは、ｐ−α−ｓｙｎ免疫染色の低減により示されているように、病的α−ｓｙｎの蓄積を低減するため、α−ｓｙｎの細胞間伝播を以前に記載されているように評価した。ＰＡＲＰ−１のノックアウトは、病的α−ｓｙｎの細胞間伝播を低減する（図４９〜５１）。これらの結果をまとめると、α−ｓｙｎ  ＰＦＦが、主として、パータナトスによりニューロンを殺滅することと、ＰＡＲＰ−１が病的α−ｓｙｎの生成に寄与することが示唆される。
【００４４】
合成α−ｓｙｎ  ＰＦＦはパータナトスにより一次皮質ニューロンを殺滅するため、パータナトスがα−ｓｙｎ  ＰＦＦの線条体内注入後のＤＡニューロンの消失において役割を担うかどうかを判定する実験を、標準的かつ検証済みのプロトコルを使用して行った（図１３〜１８）。α−ｓｙｎ  ＰＦＦ（５μｇ）の単回線条体内注入は、ＰＡＲレベルの評価によって判定されているように、ＰＡＲＰ活性化を誘導する（図１３）。ＰＡＲＰ−１ノックアウトマウスへのα−ｓｙｎ  ＰＦＦの線条体内注入では、ＰＡＲレベルを上昇させることはできない（図１３）。α−ｓｙｎ  ＰＦＦの単回線条体内注入は、ＷＴマウスへの注入から６ヶ月後にＤＡニューロンの約５０％の消失をもたらす（図１４および１５）。対照的に、α−ｓｙｎ  ＰＦＦのＰＡＲＰ−１ノックアウトマウスへの単回線条体内注入では、ＤＡ細胞の消失を誘導することはできない（図１４および１５）。ＷＴマウスには、ＰＡＲＰ阻害薬ＡＢＴ−８８８（１２５ｍｇ／ｋｇ）を含む飼料も与え、コントロール飼料を与えたマウスと比較した（図１４および１５）。ＡＢＴ−８８８で処理されたマウスは、コントロール飼料のマウスと比較して、α−ｓｙｎ  ＰＦＦの線条体内注入後のＤＡニューロンの消失が有意に少ないことを示す（図１４および１５）。ＡＢＴ−８８８も、α−ｓｙｎ  ＰＦＦの形成によって誘導されるＰＡＲレベルの上昇を低減する（図５２）。チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）およびドーパミントランスポーター（ＤＡＴ）レベルも、ウエスタンブロット解析により測定されているように、α−ｓｙｎ  ＰＦＦに応答してＷＴマウスで低下しているが、ＴＨおよびＤＡＴレベルの低下は、ＰＡＲＰ−１ノックアウトまたはＡＢＴ−８８８処理ＳＴマウスで抑制されている（図５２〜５４）。ＤＡニューロンの消失を伴うのは、ＰＡＲＰ−１ノックアウトマウスでもＡＢＴ−８８８処理マウスでもなく、ＷＴマウスにおけるＨＰＬＣにより測定される線条体ＤＡおよびその代謝物の減少である（図１６、５７、５８、および５９）。線条体内α−ｓｙｎ  ＰＦＦの注入は、ＷＴマウスのＤＡニューロンにおけるｐ−α−ｓｙｎのウエスタンブロット（図５２、５５、および５６）ならびに免疫染色（図６０〜６３）によって評価されているように、α−ｓｙｎ病態をもたらす。α−ｓｙｎ病態は、ＰＡＲＰ−１ノックアウトマウスおよびＡＢＴ−８８８処理ＷＴマウスにおいて、それぞれ、神経変性の不存在および減少と一致して、著しく減少している。α−ｓｙｎ  ＰＦＦの線条体内注入は、ＷＴマウスにおいて、ドーパミン作動性機能の高感度の行動測定であるポールテストで欠損を引き起こすが、ＰＡＲＰ−１ノックアウトマウスおよびＡＢＴ−８８８  ＷＴ処理マウスでは欠損はない（図１７および６４）。また、α−ｓｙｎ  ＰＦＦ注入後のＷＴマウスでは、前肢および後肢の握力と前肢の握力との両方ともが低下するが、ＰＡＲＰ−１ノックアウトでもＡＢＴ−８８８処理ＷＴマウスでも低下はしない（図１８および６５）。まとめると、これらの結果は、線条体α−ｓｙｎ  ＰＦＦ誘導ＤＡニューロン消失が、ＰＡＲＰ−１に依存することを示す。
【００４５】
ＰＡＲが天然変性タンパク質の液体脱混合を引き起こし、それらの凝集をもたらすため、ＰＡＲがα−ｓｙｎ凝集の原因となり、促進することができるかどうかを判定する実験を行った。組み換えα−ｓｙｎを、脳組織で観察される濃度である５ｎＭ  ＰＡＲの存在下および非存在下で、３７℃でインキュベートし、撹拌した。ＰＡＲの非存在下において、高分子量型のα−ｓｙｎが、４時間のインキュベーションという早い時期で観察され、α−ｓｙｎは時間とともに繊維化を続ける（図１９）。様々な分子量型のα−ｓｙｎが７２時間で観察される。ＰＡＲの存在下では、α−ｓｙｎの線維化は、著しく促進され、インキュベーションの２４時間という早い時期に様々な分子量型のα−ｓｙｎが観察される（図１９）。チオフラビンＴ蛍光は、ＰＡＲがα−ｓｙｎの線維化を促進するが、ＰＡＲ単独ではチオフラビンＴ蛍光に影響を与えないことも示す（図２０）。α−ｓｙｎの線維化のＰＡＲ介在性促進に対する温度の影響も評価した（図６６）。ＰＡＲは、ＰＡＲの非存在下ではα−ｓｙｎ線維化を許容しない温度で、α−ｓｙｎの線維化を引き起こす（図６６）。透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）を使用して、α−ｓｙｎ繊維の形成をモニタリングした。１２時間で、ＰＡＲの非存在下でα−ｓｙｎ繊維が形成され始め、３７℃での７２時間の攪拌およびインキュベーション後、完全に形成され、広範になる（図３Ｃ）。対照的に、ＰＡＲの存在下では、α−ｓｙｎは１２時間で広範に繊維化され、２４時間および７２時間でより広範に繊維化されるようになる（図２１）。３６時間で、ＰＡＲ存在下でのα−ｓｙｎ繊維化の濃度依存性をモニタリングした。１ｎＭ  ＰＡＲは、α−ｓｙｎ線維化を促進することができ、５−ｎＭ  ＰＡＲで凝集のピークが起きるが、２０ｎＭ  ＰＡＲはα−ｓｙｎ線維化をそれほどは増加させない（図６７および６８）。ＰＡＲは非常に負に帯電した分子であるため、別の高帯電のポリマーであるＰｏｌｙＡの影響を試験したが、これはα−ｓｙｎ繊維化に影響を与えなかった（図６９および７０）。ＡＤＰリボースモノマーも、α−ｓｙｎ線維化に影響を与えなかった（図６９および７０）。内因性ＰＡＲ形成がα−ｓｙｎ線維化を促進することができるかどうかを判定するために、ＡＡＶ−α−ｓｙｎトランスダクション後のＷＴヒトα−ｓｙｎを過剰発現する一次マウス皮質ニューロンを、毒性量のＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）で処理した。ＷＴ培養物では、ＮＭＤＡ処理は、ＰＡＲイムノブロットによって評価されるＰＡＲＰの活性化およびα−ｓｙｎの付随的凝集をもたらすが、α−ｓｙｎは、ＮＭＤＡで処理したＰＡＲＰ−１  ＫＯ培養物では凝集しなかった（図２２）。BioporterによるＰＡＲの外因性投与は、ＡＡＶ−α−ｓｙｎが導入されたＷＴおよびＰＡＲＰ−１  ＫＯ培養物の両方でα−ｓｙｎの凝集を増加させ（図７１）、ＰＡＲＰ−１ではなくＰＡＲがα−ｓｙｎ凝集を直接的に増加させることができることを示す。２つの異なるＰＡＲＰ阻害薬であるＡＢＴ８８８およびＡＧ０１４６９９は、ＮＭＤＡ投与に応答したα−ｓｙｎ凝集およびＰＡＲＰ活性化を抑制する（図２３）。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞では、強力なＰＡＲＰアクチベータであるＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−���トロソグアニジン（ＭＮＮＧ）が、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞で過剰発現されるＷＴまたはＡ５３Ｔ  α−ｓｙｎの凝集を促進するが、ＭＮＮＧはＰＡＲＰ−１  ＫＯ  ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞には影響を与えなかった（図７２および７３）。ＰＡＲの外因性投与により、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ  ＷＴおよびＳＨ−ＳＹ５Ｙ  ＰＡＲＰ−１  ＫＯ培養物の両方でα−ｓｙｎの凝集が増加した（図７４）。２つの異なるＰＡＲＰ阻害薬であるＡＢＴ８８８およびＡＧ０１４６９９は、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞へのＭＮＮＧ投与に応答したα−ｓｙｎ凝集およびＰＡＲＰ活性化を抑制する（図７５）。
【００４６】
ＰＡＲがα−ｓｙｎ  ＰＦＦの生物物理学的性質を変化させるかどうかを判定するために、α−ｓｙｎ  ＰＦＦおよびＰＡＲの存在下でのα−ｓｙｎ  ＰＦＦ（ＰＡＲ−α−ｓｙｎ  ＰＦＦ）を使用して一連の生化学分析を行った。最初に、α-ｓｙｎ  ＰＦＦのプロテイナーゼＫ（ＰＫ）消化を行い、α−ｓｙｎイムノブロットによりモニタリングした。α−ｓｙｎ  ＰＦＦおよびＰＡＲ−α−ｓｙｎ  ＰＦＦは、ＰＫ消化後に非常に明瞭なバンドパターンを示し、ＰＡＲ−α−ｓｙｎ  ＰＦＦ’はＰＫ濃度の増加に対してより耐性であった（図２４）。ＰＡＲ−α−ｓｙｎ  ＰＦＦは、主にα−ｓｙｎの未消化バンド（１番目のバンド）を示し、高濃度のＰＫでのみ同等の消化バンドを示し、一方、α−ｓｙｎ  ＰＦＦは、低濃度のＰＫ（０．５および１μｇ／ｍｌ）でより小さな断片（２番目〜５番目のバンド）に分解し、これらのバンドは、高濃度のＰＫ（１．５〜２．５μｇ／ｍｌ）で主要になった（図２４）。α−ｓｙｎに対するエピトープ特異的抗体を使用すると、ＰＡＲがα−ｓｙｎ領域の大部分をＰＫ消化に耐性にすることがわかった（図７６）。ＰＡＲ−α−ｓｙｎ  ＰＦＦのＰＫ消化に対する耐性は、ＰＡＲがα−ｓｙｎ  ＰＦＦよりもよりミスフォールドしたコンパクトな構造を有する別のα−ｓｙｎ  ＰＦＦ系の形成を誘導することを示唆する。次いで、α−ｓｙｎ  ＰＦＦとＰＡＲ−α−ｓｙｎ  ＰＦＦで誘導された神経細胞死を、培養ニューロンで比較した。１４日間の処理後、ＰＡＲ−α−ｓｙｎ  ＰＦＦで処理した培養物では、α−ｓｙｎ  ＰＦＦで処理した培養物と比較して、細胞死が促進されている（図７７）。ＰＡＲ自体は、高濃度（２０ｎＭ）でも有意な細胞死を引き起こさない（図７７）。神経病理学の効力をさらに確認するために、様々な濃度のα−ｓｙｎ  ＰＦＦまたはＰＡＲ−α−ｓｙｎ  ＰＦＦの処理後にｐ−α−ｓｙｎ免疫反応性をモニタリングした。Ｐ−α−ｓｙｎ免疫反応性は、２０ｎｇのＰＡＲ−α−ｓｙｎ  ＰＦＦで、５００ｎｇのα−ｓｙｎ  ＰＦＦと同等のレベルで観察され、α−ｓｙｎ  ＰＦＦのＰＡＲ修飾が毒性を２５倍増加させることが示唆された（図７８および７９）。ＰＡＲ−α−ｓｙｎ  ＰＦＦは、高濃度でｐ−α−ｓｙｎ免疫反応性を有意に増加させた（図７８および７９）。α−ｓｙｎ  ＰＦＦまたはＰＡＲ−α−ｓｙｎ  ＰＦＦに暴露された培養ニューロンにおいて、様々な時点でのホスホ−α−ｓｙｎ免疫反応性もモニタリングした。ＰＡＲの非存在下では、α−ｓｙｎ  ＰＦＦ処理は、処理後１日目にかろうじて検出可能なｐ−α−ｓｙｎ免疫反応性をもたらし、一方、ＰＡＲ−α−ｓｙｎ  ＰＦＦ処理は、処理後１日目という早い時期に検出可能なレベルのｐ−α−ｓｙｎ免疫反応性をもたらし、７日目に免疫反応性を著しく高める（図２５）。α−ｓｙｎのイムノブロット解析は、凝集およびリン酸化されたα−ｓｙｎが４日目に検出可能であり、一方、ＰＡＲの非存在下では、これらの種のα−ｓｙｎが処理の７日後にのみ検出可能であることを示す。ＰＡＲの存在下では、凝集型のα−ｓｙｎが増加している（図２６）。
【００４７】
ＰＡＲ−α−ｓｙｎ  ＰＦＦ系がインビボで神経毒性の増強を示すかどうかを判定するために、ＰＡＲ−α−ｓｙｎ  ＰＦＦ（５μｇ）の単回線条体内注入をα−ｓｙｎ  ＰＦＦ（５μｇ）の単回線条体内注入と比較した。ＰＡＲ−α−ｓｙｎ  ＰＦＦ注入後、１か月後にはＳＮｐｃの注入側と同側のＤＡニューロンが消失し、３か月後にはＤＡニューロンが有意に消失する傾向があり、一方で、α−ｓｙｎ  ＰＦＦ注入は、これらの時点では影響を与えない（図２７、２８、および８０）。ＰＡＲ−α−ｓｙｎ  ＰＦＦまたはα−ｓｙｎ  ＰＦＦ注入の６カ月後では、ＤＡニューロンの消失に有意な差異はない（図２７、２８、および８０）。どの時点でも注入側と対側のＤＡニューロンの有意な消失はない（図８１および８２）。ＰＡＲ注入自体は、ＤＡニューロン数に影響を与えない（図２７、２８、および８０）。ＰＡＲ−α−ｓｙｎ  ＰＦＦは、ＨＰＬＣにより測定される線条体ＤＡおよびその代謝物の消失も促進し、α−ｓｙｎ  ＰＦＦとは対照的に、ＰＡＲ−α−ｓｙｎ  ＰＦＦ注入の１ヵ月後に、ＤＡおよびその代謝物の有意な減少が観察されている（図２９および８３〜９０）。ＰＡＲ−α−ｓｙｎ  ＰＦＦまたはα−ｓｙｎ  ＰＦＦ注入の３ヶ月後および６ヶ月後では、ＤＡおよびその代謝物の消失に有意差はない（図２９および８３〜９０）。ＴＨレベルおよびＤＡＴレベルも、注入後３か月では、ウエスタンブロット解析で測定されているように、α−ｓｙｎ  ＰＦＦと比較して、ＰＡＲ−α−ｓｙｎ  ＰＦＦ後に低下し、一方で、６ヶ月では、消失の程度に差異はない（図９１〜９４）。ＤＡニューロンにおけるｐ−α−ｓｙｎの免疫染色により評価されるα−ｓｙｎ病態は、注入後３ヶ月および６ヶ月で、α−ｓｙｎ  ＰＦＦと比較して、ＰＡＲ−α−ｓｙｎ  ＰＦＦによって増加した（図３０および３１）。ＰＡＲ−α−ｓｙｎ  ＰＦＦは、３ヶ月でのＤＡニューロンの消失およびＤＡ欠損と一致して、３ヶ月でのポールテストで欠損を引き起こしたが、α−ｓｙｎ  ＰＦＦまたはＰＡＲを注入したマウスでは有意な欠損はない（図３２および９３）。また、前肢および後肢の握力と前肢の握力との両方ともが、α−ｓｙｎ  ＰＦＦでもＰＡＲでもなくＰＡＲ−α−ｓｙｎ  ＰＦＦ注入マウスで３ヶ月に低下した（図３３および９４）。６ヶ月後では、ＰＡＲ−α−ｓｙｎ  ＰＦＦまたはα−ｓｙｎ  ＰＦＦにより誘導される行動欠損に有意差はない（図３２、３３、９２、および９４）。まとめると、これらの結果は、ＰＡＲ−α−ｓｙｎ  ＰＦＦが、インビボで、α−ｓｙｎ  ＰＦＦよりも実質的により神経毒性があることを示す。
【００４８】
ＰＡＲがＰＤの患者で役割を担うかどうかを判定するために、ＰＡＲに対する高感度ＥＬＩＳＡ（図９５）を使用して、ＰＤの患者対コントロールのＣＳＦにおいて、ＰＡＲレベルをモニタリングした（表１）。２つの独立した患者コホートにおいて、コントロールと比較して、ＰＤ患者で、ＰＡＲレベルが上昇している（図３４および３５）。以前に報告されたように、ＰＡＲのレベルは、コントロールと比較して、ＰＤの患者の黒質で上昇している（図９６および９７、ならびに表２）。ＰＡＲ免疫反応性は、ＰＤ患者のレーヴィ小体において、α−ｓｙｎと共局在している（図３６）。
【００４９】
結果は、α−ｓｙｎ  ＰＦＦが、パータナトスと呼ばれる細胞死プロセスにおいて、ＰＡＲＰ−１の活性化を介して、インビトロおよびインビボの両方で、ニューロンを殺滅することを示す。ＰＡＲＰ−１のノックアウトおよびＰＡＲＰの阻害は、線条体内α−ｓｙｎ  ＰＦＦ注入によって起こる神経変性および行動欠損を抑制する。ネクロプトーシス阻害薬およびオートファジー阻害薬は、α−ｓｙｎ  ＰＦＦ神経毒性に影響を与えず、カスパーゼ阻害による保護は中程度でしかないため、パータナトスの活性化は、α-ｓｙｎ  ＰＦＦ神経変性の主なドライバーであるように見える。α−ｓｙｎ  ＰＦＦは、炎症性メディエーターの活性化を誘導し、炎症性メディエーターの活性化は、細胞死にある程度寄与する可能性があり、広域スペクトルのカスパーゼ阻害薬であるＺＶＡＤによる中程度の神経保護を説明することが知られている。
【００５０】
最近の研究により、α−シヌクレイン症の様々な性質に寄与する、明白な神経毒性、播種能力、および増殖を示すα−ｓｙｎ系の立体構造変異体が同定された。α−ｓｙｎ  ＰＦＦがＰＡＲＰ活性化およびＰＡＲ蓄積を誘導すると、ＰＡＲは、α−ｓｙｎ線維化を促進し、α−ｓｙｎ  ＰＦＦの生化学的性質を変化させて、より毒性の高い系に変換する。この見解と一致して、ＰＡＲ−α−ｓｙｎ  ＰＦＦが親であるα−ｓｙｎ  ＰＦＦと比較して、α−ｓｙｎ凝集および神経毒性の約２５倍の増加を示すことが観察されている。さらに、ＰＡＲ−α−ｓｙｎ  ＰＦＦ注入マウスは、α−ｓｙｎ  ＰＦＦ注入マウスと比較して、疾患の進行および表現型の促進を示す。培養ニューロンおよびマウス脳でのＰＡＲレベルの上昇に加えて、ＰＤのＰＡＲレベルが黒質だけでなくＣＳＦでも上昇していることが観察された。ＰＤ患者のＣＳＦおよび脳におけるＰＡＲの上昇ならびにＰＤ患者の黒質におけるＰＡＲＰ活性化のエビデンスは、ＰＡＲＰ活性化が、パータナトスおよびα−ｓｙｎのより毒性の高い系への変換を介して、ＰＤの発病に寄与することを示唆する。
【００５１】
本明細書は、最良の形態などの本発明を開示するために、また、デバイスまたはシステムの作製および使用、ならびに援用されている方法の実施などの本発明の実施を当業者ができるようにするために、実施例を使用する。本発明の特許性のある範囲は、特許請求の範囲によって定義されており、当業者が思いつく他の実施例を含み得る。このような他の実施例は、特許請求の範囲の文言と異ならない構造要素を有する場合、または特許請求の範囲の文言と実質的ではない差異を有する均等な構造要素を含む場合、特許請求の範囲内にあることが意図されている。
【実施例】
【００５２】
動物
【００５３】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、the Jackson Laboratories（メイン州バー・ハーバー）から得た。ＰＡＲＰ−１  ＫＯマウスを、The Jackson Laboratory（米国メイン州バー・ハーバー）から得た。同腹子のＷＴおよびＰＡＲＰ１  ＫＯマウスを実験に使用した。全ての住居、繁殖、および手順は、実験動物の管理と使用に関するＮＩＨガイド（NIH Guide for the Care and Use of Experimental Animals）に従って実施し、ジョンズホプキンス大学動物実験委員会（Johns Hopkins University Animal Care and Use Committe）によって承認された。
【００５４】
α−ｓｙｎ  ＰＦＦおよびＰＡＲ−α−ｓｙｎ  ＰＦＦの調製
【００５５】
組み換えマウスα−ｓｙｎタンパク質を精製した。α−ｓｙｎをサーモミキサー（３７℃で１，０００ｒｐｍ）（Eppendorf）で絶えず撹拌することにより、ＰＢＳ中でα−ｓｙｎ  ＰＦＦを調製した。７日間のインキュベーション後、α−ｓｙｎ凝集物を、ＰＢＳで０．１ｍｇ／ｍｌに希釈し、３０秒間（０．５秒パルスオン／オフ）１０％の振幅で、超音波処理した（Branson Digital Sonifier，米国コネチカット州ダンベリー）。α−ｓｙｎ  ＰＦＦを使用まで−８０℃に保った。ＰＡＲポリマーの合成および精製を、他の箇所に記載されているように行った。α−ｓｙｎ繊維化反応に５ｎＭまたは指定量のＰＡＲを添加することにより、ＰＡＲ−α−ｓｙｎ  ＰＦＦを調製した。
【００５６】
α−ｓｙｎ  ＰＦＦの定位注入
【００５７】
２〜３ヶ月齢のＷＴおよびＰＡＲＰ１  ＫＯマウスに、ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）の混合物で深麻酔をかけた。ＰＢＳ、α−ｓｙｎ  ＰＦＦ、ＰＡＲ−α−ｓｙｎ  ＰＦＦ、またはＰＡＲを、以下の座標で線条体内に片側注入した（０．４μｌ／分で半球当たり２μｌ）：ブレグマから前後方向（anteroposterior）（ＡＰ）＝＋２．０ｍｍ，内外方向（mediolateral）（ＭＬ）＝±２．０ｍｍ，背腹方向（dorsoventral）（ＤＶ）＝＋２．８ｍｍ。注入後、溶液の完全な吸収のために、針をさらに５分間維持した。手術後、動物をモニタリングし、手術後のケアを施した。注入の１、３、および６ヶ月後に行動試験を実施し、生化学的および組織学的分析のためにマウスを安楽死させた。生化学的研究のために、組織をすぐに切開し、−８０℃で凍結した。組織学的研究のために、マウスをＰＢＳおよび４％ＰＦＡで灌流し、脳を摘出し、その後、４％ＰＦＡで一晩固定し、凍結保護のために３０％ショ糖に移した。
【００５８】
チオフラビンＴ（ＴｈＴ）結合アッセイ
【００５９】
ＰＡＲの存在下または非存在下でのα−ｓｙｎ繊維化を、ＴｈＴ蛍光でモニタリングした。インキュベーション混合物から５μＬのアリコートを様々な時点で採り、ＰＢＳ中２５μＭ  ＴｈＴで１００μＬに希釈し、室温で１０分間インキュベートした。SpectraMaxプレートリーダー（Molecular Devices，カリフォルニア州サニーベール）を用いて、蛍光を４５０ｎｍの励起と５１０ｎｍの発光で記録した。実験は３回ずつ行った。
【００６０】
透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）測定
【００６１】
α−ｓｙｎ  ＰＦＦまたはＰＡＲ−α−ｓｙｎ  ＰＦＦを、グロー放電４００メッシュカーボンコーティング銅グリッド（glow discharged 400 meshed carbon coated copper grids）（Electron Microscopy Sciences）に２分間吸着させ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（５０ｍＭ，ｐＨ７．４）ですばやく２回洗浄し、０．７５％ギ酸ウラニル２滴をそれぞれ３０秒間滴下して浮遊させた。グリッドを乾燥させ、その後、８０ｋＶで作動するPhillips CM 120 TEMでイメージングした。ER-80 CCD（8メガピクセル）を用いて、先進の顕微鏡技術によって、画像をキャプチャし、デジタル化した。
【００６２】
ＰＡＲの細胞内運搬
【００６３】
精製ＰＡＲを、BioPORTER（Genelnatis，カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して、製造元の指示に従って細胞内に運搬した。ＰＡＲポリマーをＰＢＳで所望の濃度に希釈した。希釈溶液を乾燥させたBioPORTER試薬に添加し、穏やかに混合し、次いで、室温で５分間インキュベートした。BioPORTER−ＰＡＲ複合体を、無血清培地で一回洗浄した後の細胞培養物に添加し、３７℃で３〜４時間インキュベートした。その後、培養物を実験に使用した。
【００６４】
組織溶解物調製およびウエスタンブロット解析
【００６５】
ヒト死後脳（表１）またはマウス脳組織をホモジナイズし、溶解バッファー［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％Triton x-100、０．５％ＳＤＳ、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、ホスファターゼインヒビター混合物ＩおよびＩＩ（phosphatase inhibitor mixture I and II）（Sigma-Aldrich，米国ミズーリ州セントルイス）、ならびに完全プロテアーゼインヒビター混合物（complete protease inhibitor mixture）（Roche，米国インディアナ州インディアナポリス）]中でDiax 900ホモジナイザー（Sigma-Aldrich）を使用して調製した。ホモジナイズ後、完全に溶解させるために、サンプルを４℃で３０分間回転させ、ホモジネートを１５，０００ｇで２０分間遠心分離し、上清をさらなる分析に使用した。ＢＣＡアッセイ（Pierce，米国イリノイ州ロックフォード）を使用してタンパク質レベルを定量化し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを使用してサンプルを分離し、ニトロセルロース膜に移した。ＴＢＳ−Ｔ（０．１％Tween-20を含むトリス緩衝生理食塩水）中５％脱脂乳で膜を１時間ブロッキングし、一次抗体を使用してプロービングし（表３）、適当なＨＲＰ標識二次抗体と共にインキュベートした。バンドをＥＣＬ基質により視覚化した。
【００６６】
【表１−１】
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【表１−２】
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【００６７】
細胞培養、トランスフェクション、一次ニューロン培養、および処理
【００６８】
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（ATCC）を、５％ＣＯ２下、３７℃で、１０％ウシ胎児血清およびペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭで培養した。PolyFect試薬（Qiagen）を使用して、製造元の指示に従って、細胞にトランスフェクトをした。ＷＴまたはＰＡＲＰ１  ＫＯ胚からの一次皮質ニューロンを調製した。簡単に説明すると、一次皮質ニューロンを、B-27、０．５ｍＭ  Ｌ−グルタミン、ペニシリン、およびストレプトマイシン（Invitrogen，ニューヨーク州グランドアイランド）を補給したneurobasal培地で胚１６日目に培養した。ニューロンを３〜４日ごとに新鮮な培地に置き換えた。ＡＢＴ−８８８（１０μＭ）、ＡＧ−０１４６９９（１μＭ）、ＢＭＮ６７３（１０μＭ）、Ｚ−ＶＡＤ（２０μＭ）、Ｎｅｃ−１（２０μＭ）、または３−ＭＡ（５００μＭ）で、α−ｓｙｎ  ＰＦＦ処理の１時間前に、ニューロンを前処理した。α−ｓｙｎ  ＰＦＦをインビトロで７日間（ＤＩＶ）添加し、指定時間さらにインキュベートした後、細胞死アッセイまたは生化学実験を行った。ＤＩＶ４〜５に、一次ニューロンをＡＡＶ２−コントロールｓｇＲＮＡまたはＡＡＶ２−ＰＡＲＰ１  ｓｇＲＮＡ(ViGene Bioscineces，米国メリーランド州ロックビル）、およびＡＡＶ−α−ｓｙｎ  ＷＴまたはＡＡＶ−α−ｓｙｎ  Ａ５３Ｔに感染させた。
【００６９】
細胞死評価
【００７０】
一次培養皮質ニューロンをα−ｓｙｎ  ＰＦＦまたはＰＡＲ−α−ｓｙｎ  ＰＦＦで１４日間処理した。７μＭのHoechst33342および２μＭのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（Invitrogen，カリフォルニア州カールズバッド）を用いる染色により、細胞死のパーセントを求めた。自動コンピューター支援ソフトウェア（Axiovision 4.6，Carl Zeiss，米国カリフォルニア州ダブリン）を備えたZeiss顕微鏡で画像を撮り、計数した。
【００７１】
マイクロ流体チャンバー
【００７２】
トリプルコンパートメントマイクロ流体デバイス（Triple compartment microfluidic devices）（TCND1000）をXona Microfluidic, LLC（米国カリフォルニア州ティメキュラ）から得た。カバーガラスを準備してコートし、その後、マイクロ流体デバイスに固定した。約１００，０００のＷＴまたはＰＡＲＰ１  ＫＯニューロンをチャンバーごとに個別に播種した。７ＤＩＶに、０．５ｍｇのα−ｓｙｎ  ＰＦＦをチャンバー１に添加した。流れの方向を制御するために、チャンバー１とチャンバー２との間およびチャンバー２とチャンバー３との間に、培地体積の５０μｌの差異を維持した。α−ｓｙｎ  ＰＦＦ処理後１４日目に、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドを使用して、ニューロンを固定した。次に、ｐ−α−ｓｙｎ抗体を用いる免疫蛍光染色のためにチャンバーを処理した。
【００７３】
行動試験
【００７４】
α−ｓｙｎ  ＰＦＦ注入ＷＴまたはＰＡＲＰ−１  ＫＯマウス、ＡＢＴ−８８８を与えたα−ｓｙｎ  ＰＦＦ注入マウス、およびα−ｓｙｎ  ＰＦＦまたはＰＡＲ−α−ｓｙｎ  ＰＦＦ注入マウスの行動欠損を、ポールテストおよび握力テストにより、屠殺の１週間前に評価した。全ての実験を盲検式で実施した。
【００７５】
ポールテスト。包帯ガーゼで包まれた金属棒（長さ７５ｃｍ、直径９ｍｍ）をポールとして使用した。実際のテストの前に、連続する２日間、マウスをトレーニングし、各トレーニングセッションを、３つのテストトライアルで構成した。マウスをポールの上部から７．５ｃｍに置き、回転する時間およびポールの基部に到達するまでの合計時間を記録した。テストの終了は、基部に４つの全ての足を置くこととして定義した。テストと記録を停止する最大カットオフ時間は、６０秒であった。各トライアル後、迷路を７０％エタノールで洗浄した。
【００７６】
握力テスト。装置（Bioseb，米国）を使用して、マウスによって発生した最大ピーク力を求めることにより、神経筋機能を測定した。それぞれ「前肢」と「前肢および後肢」として記録される前肢または両方の肢で握るように、マウスを金属グリッド上に置いた。尾を優しく引っ張り、マウスが握力を失う前にグリッドに加えられた力を、グラム（ｇ）で表示されるピーク張力として記録した。
【００７７】
ＨＰＬＣを使用するドーパミンおよび誘導体測定
【００７８】
生体アミン濃度は、電気化学検出付き高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ−ＥＣＤ）により測定した。線条体を脳からすばやく摘出し、秤量し、０．０１％ＥＤＴＡを含む氷冷の０．０１ｍＭの過塩素酸中で超音波処理した。６０ｎｇの３，４−ジヒドロキシベンジルアミン（ＤＨＢＡ）を内部標準として使用した。１５，０００ｇで４℃で３０分間遠心分離した後、０．２μｍフィルターを使用して上清を洗い、２０μｌの上清をＨＰＬＣカラム（３ｍｍ×１５０ｍｍ，Ｃ−１８逆相カラム、AcclaimTM Polar Advantage II，Thermo Scientific，米国）でデュアルチャンネルcoulochem III電気化学検出器（dual channel coulochem III electrochemical detector）（Model 5300，ESA, Inc.，米国マサチューセッツ州チェルムズフォード）により分析した。組織ホモジネートのタンパク質濃度を、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（BCA protein assay kit）（Pierce，米国イリノイ州ロックフォード）を使用して測定した。データをタンパク質濃度に標準化し、ｎｇ／ｍｇタンパク質で表した。
【００７９】
免疫組織化学および免疫蛍光
【００８０】
マウスをＰＢＳおよび４％ＰＦＡで灌流し、脳を摘出し、その後、４％ＰＦＡで一晩固定し、凍結保護のために３０％ショ糖に移した。免疫組織化学（ＩＨＣ）および免疫蛍光（ＩＦ）を、４０μｍの厚さの脳の連続切片で行った。一次抗体およびワーキング希釈液は、表２に詳述されている。組織学的研究では、浮遊切片を０．２％Triton X-100を含むＰＢＳ中１０％ヤギ血清でブロッキングし、それぞれ、ＴＨまたはｐ−α−ｓｙｎ抗体とインキュベートし、次いで、ビオチン標識抗ウサギまたはマウス抗体とインキュベートした。３回洗浄後、ＡＢＣ試薬（Vector Laboratories，米国カリフォルニア州）を添加し、SigmaFast ＤＡＢペルオキシダーゼ基質（Sigma-Aldrich）を使用して切片を発色させた。切片をニッスル（０．０９％チオニン）で対比染色した。定量化では、ＳＮｐｃ領域からのＴＨおよびニッスル陽性ＤＡニューロンの両方を、偏りのない細胞計数法である光学フラクショネーターにより、コンピューター制御の電動ステージ（Ludl Electronics，米国ニューヨーク州ホーソン）、Hitachi HV C20カメラ、およびStereo Investigatorソフトウェア（MicroBright-Field，米国バーモント州ウィリストン）を備えたAxiophot顕微鏡写真機（Carl Zeiss）からなるコンピューター支援画像分析システムを使用して、計数した。ＴＨ染色ニューロンの総数およびニッスル計数を分析した。免疫蛍光研究では、ＴＨおよびｐ−α−ｓｙｎ抗体による二重標識切片を、Alexa-fluor 488および594標識二次抗体（Invitrogen，米国カリフォルニア州カールズバッド）の混合物とインキュベートした。蛍光画像を共焦点走査顕微鏡法（LSM710，Carl Zeiss）によって得た。全ての画像をZenソフトウェア（Carl Zeiss）によって処理した。しきい値の信号強度範囲内の選択領域を、ImageJソフトウェアを使用して測定した。
【００８１】
【表２】
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【００８２】
α−ｓｙｎ  ＰＦＦのＰＫ消化
【００８３】
ＰＫ消化を行った。１０マイクログラムのα−ｓｙｎ  ＰＦＦまたはＰＡＲ−α−ｓｙｎ  ＰＦＦをＰＢＳ中０．５〜２．５ｕｇ／ｍｌのＰＫと混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。１ｍＭ  ＰＭＳＦを添加して反応を停止させ、ＳＤＳ−サンプルバッファーで５分間煮沸した。ＰＫ消化産物のバンドを、エピトープ特異的α−ｓｙｎ抗体を使用するイムノブロッティングによって検出した（表３）。
【００８４】
【表３】
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【００８５】
ヒト臨床試験
ヒトＣＳＦサンプルおよびＰＡＲ  ＥＬＩＳＡ
【００８６】
ＮＩＮＤＳパーキンソン病バイオマーカープログラム（ＰＤＢＰ）のジョンズホプキンス大学のサイトでの参加者は、毎年、大規模な臨床試験および認知試験ならびに腰椎穿刺を受けた。ＣＳＦを遠心分離し、アリコートに分け、採取から１時間以内に−８０℃で保存した。モノクローナル抗ＰＡＲ抗体の２つの異なるクローン（＃１９および＃２５）をＰＡＲ  ＥＬＩＳＡに使用した。抗ＰＡＲ抗体（捕獲抗体，クローン＃１９）（５ｕｇ／ｍｌ）を９６ウェルマイクロタイタープレート（NUNC，カタログ番号４６０５１）にコートし、様々な濃度の精製ＰＡＲ（０〜２００ｎＭ，ポジティブコントロール）および正常患者またはＰＤ患者からのＣＳＦサンプルを各ウェルに加え、室温（ＲＴ）で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴ（ＰＢＳバッファー中０．０５％Tween20）でプレートを５回洗浄後、ビオチン化ＰＡＲ抗体（検出抗体，クローン＃２５）をＲＴで１時間インキュベートした。色の変化を、ＨＲＰ標識ストレプトアビジン抗体（Thermo Scientific）により検出した。アッセイは、３ｐＭという低いＰＡＲを検出でき、５０ｎＭで飽和する。
臨床的認知症評価（Clinical Dementia Rating）
【００８７】
臨床的認知症評価（Clinical Dementia Rating）（ＣＤＲ）尺度は、神経変性および認知症の患者に適用し得る、認知および機能パフォーマンスの６つの異なる区分を評価するために使用される、５点尺度である。その教示について参照により援用されている、Hughes CP, Berg L, Danziger WL, Coben LA, Martin RL, “A New Clinical Scale for the Staging of Dementia,” Br J Psychiatry, (1982) 140:566-72を参照されたい。６つの区分は、記憶、見当識、判断力および問題解決、社会適応（community affairs）、家庭および趣味、ならびにパーソナルケアである。全ての患者を、ＣＤＲ尺度および個人面談を使用して評価し、正常認知、軽度認知障害、または認知症であるかどうかを判定した。
【００８８】
スチューデントのt検定を使用して、コントロールとＰＤの個人と、正常認知の個人と認知障害の個人との間でＰＡＲの濃度を比較した。次に、一般化線形モデルにより、ＰＡＲ濃度の変化の決定因子と、ＰＡＲ濃度が認知変化に関連しているかどうかとを評価した。
ヒトコンビナトリアル抗体ライブラリー
【００８９】
HuCAL（登録商標）テクノロジーは、カスタム抗体を得る従来法の代替法を提供する。モノクローナル抗体の作製には、マウス、ウサギ、またはヤギを免疫し、その後脾臓からＢ細胞を取り出して、提示された抗体を回収することが必要であるが、HuCAL（登録商標）テクノロジーにより作製時間が短縮できる。相補性決定領域（ＣＤＲ）、６つの軽鎖可変領域（ＶＬ）、および７つの重鎖（ＶＨ）のライブラリーを使用することにより、インビトロで数十億の抗体を得ることが可能である。これを、バクテリオファージに抗体遺伝子を組み込み、ジスルフィド結合を介して外殻上に抗体を提示させ、それにより表現型と遺伝型の物理的連結を与えるファージディスプレイと組み合わせる。ジスルフィド結合の還元開裂により、抗原への親和性に関係なく、スクリーニング後の抗体の回収が可能になる。AbD Serotecに、合成精製末端ビオチン化ＰＡＲポリマーを提供した。これは、純粋なＰＡＲポリマー（２〜３００ｍｅｒ）の還元的アミノ化により合成した。抗体クローンを、ＡＤＰ−リボースモノマーではなく、ポリマーおよびオリゴマーのみへの結合について選択した。
【００９０】
HuCAL（登録商標）抗体作製プロセスは、磁気ビーズへの共有結合を使用する抗原（ＰＡＲ）の固定化で始まる。続いて、これらをHuCAL（登録商標）ライブラリーとともにインキュベートし、非特異的抗体を洗い流し、特異的抗体−ファージを溶出させる。大腸菌培養物を特異的抗体−ファージからの感染に付し、次のラウンドのファージスクリーニングのために濃縮抗体ライブラリーを得る。これらの濃縮された抗体相からのＤＮＡを回収し、Ｆａｂ発現ベクターにサブクローニングし、大腸菌コロニーに播種してＦａｂ断片を作製する。これに続いて、コロニー採取、一次スクリーニングを行うが、ここでは、３８４マイクロタイタープレートでコロニーを成長させた。抗体の発現を誘導し、培養物を溶解した後、回収した。これらの培養物を、ＥＬＩＳＡにより、末端標識ＰＡＲ抗原でスクリーニングした。次いで、一次スクリーニングからの陽性ヒットをシークエンシングして、特殊な抗体を同定し、再現性のための将来の合成用に保存する。ＰＡＲモノマー結合抗体を選択するために、二次スクリーニングを行った。最後に、発現およびアフィニティークロマトグラフィーによる精製を行って、抗体クローンを得た。
サンドイッチ−ＥＬＩＳＡ
【００９１】
抗ＰＡＲ抗体（捕獲抗体，クローン＃１９）（５μｇ／ｍｌ）を９６ウェルマイクロタイタープレート（NUNC，カタログ番号４６０５１）にコートした。様々な濃度の精製ＰＡＲ（０〜２００ｎＭ，ポジティブコントロール）および正常患者またはＰＤ患者からのＣＳＦサンプルを各ウェルに加え、室温（ＲＴ）で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴ（ＰＢＳバッファー中０．０５％Tween20）でプレートを５回洗浄後、ビオチン化ＰＡＲ抗体（検出抗体，クローン＃２５）をＲＴで１時間インキュベートした。色の変化を、ＨＲＰ標識ストレプトアビジン抗体により検出した。このアッセイは、３ｐＭという低いＰＡＲ濃度を検出し、５０ｎＭで飽和する。
結果
【００９２】
１１０人がベースラインのＣＳＦを与え（８０ＰＤ，３０コントロール）、９４人が第１のフォローアップのＣＳＦを与え（６８ＰＤ，２６コントロール）、７１人が第２のフォローアップのＣＳＦを与え（５１ＰＤ，２０コントロール）、３６人が第３のフォローアップのＣＳＦを与えた（２８ＰＤ，８コントロール）。ベースラインでは、ＰＤとコントロールの両方の平均年齢は、約６６歳（ｐ＝０．７１）であり、ＰＤ患者の６７％が男性であったが、コントロールの３７％が男性であった（ｐ＜０．０１）。平均ＰＤ期間は６．７年であった。最初の３回のビジットでＰＤの個人とコントロールとの間にＰＡＲの平均濃度に差があり、４回目のビジットで差が見られる傾向があった（ビジット１：ＰＤ平均１１２．１３，コントロール平均８７．９９  ｐ＝０．０４，ビジット２：ＰＤ平均１４５．４９，コントロール平均１１０．６３  ｐ＝０．０４；ビジット３：ＰＤ平均１３２．２９，コントロール平均８６．０６  ｐ＝０．０１；ビジット４：ＰＤ平均１５１．８８，コントロール平均１１１．０７  ｐ＝０．０８）。
【００９３】
【表４】
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【００９４】
疾患状態は、年齢、性別、ＭＤＳ−ＵＰＤＲＳ運動スコア（MDS-UPDRS Motor scores）、レボドパ等価換算用量、および認知障害をコントロールした後でも、ＰＡＲ濃度の有意な予測因子であった（ｐ＜０．０１）（図３および４参照）。ビジット２およびビジット４でのＰＡＲ濃度は、ビジット１でのＰＡＲ濃度と有意に異なっていた（ｐ＜０．０１，ｐ＝０．０１）。ＰＤ参加者のみの間で、ＰＡＲ濃度（ｐ＝０．０３）およびＭＤＳ−ＵＰＤＲＳ運動スコア（MDS-UPDRS Motor scores）（ｐ＜０．０１）は、認知機能低下の有意な予測因子であった。
【００９５】
統計解析
【００９６】
全データは、少なくとも３回の独立した実験での平均±標準誤差（s.e.m）として表されている。統計解析をGraphPad Prismを使用して行った。２つの平均値間および複数の平均値間の差を、それぞれ、対応のない両側スチューデントのt検定および分散分析とそれに続くテューキーの事後検定により評価した。有意性は＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５、および＊＊＊Ｐ＜０．００１として評価した。
【００９７】
要約すると、ＰＤ患者とコントロール患者との間でＰＡＲ濃度に有意差があった。また、その後のサンプル採取ビジットでも、患者間でＰＡＲ濃度に有意差があった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１】
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【図８２】
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【図８３】
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【図８４】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７】
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【図８８】
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【図８９】
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【図９０】
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【図９１】
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【図９２】
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【図９３】
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【図９４】
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【図９５】
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【図９６】
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【図９７】
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【国際調査報告】
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