(57)【要約】  切断型ヒトＣＤ１９をコードする腫瘍溶解性ポックスウイルスは、キメラ抗原レセプターを併用して、固形腫瘍の治療に用いられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能的シグナル伝達ドメインが欠損した、切断型ヒトＣＤ１９をコードするヌクレオチド配列を含む、組換え腫瘍溶解性ウイルスであって、前記切断型ＣＤ１９をコードする前記ヌクレオチド配列が、プロモーターに作動可能に連結された、ウイルス。
【請求項２】
腫瘍溶解性ウイルスがポックスウイルスである、請求項１に記載の、組換え腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項３】
ポックスウイルスが、キメラポックスウイルスである、請求項２に記載の、組換え腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項４】
キメラポックスウイルスが、牛痘ウイルス（ｃｏｗｐｏｘ  ｖｉｒｕｓ）Ｂｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルス（ｒａｃｃｏｏｎｐｏｘ  ｖｉｒｕｓ）Ｈｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルス（ｒａｂｂｉｔｐｏｘ  ｖｉｒｕｓ）Ｕｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスLederle-Chorioallantoic株、ワクシニアウイルスＡＳ株、羊痘ウイルス（ｏｒｆ  ｖｉｒｕｓ）ＮＺ２株、及び偽牛痘ウイルス（ｐｓｅｕｄｏｃｏｗｐｏｘ  ｖｉｒｕｓ）ＴＪＳ株からなる群から選択される、少なくとも２つのポックスウイルス株の、少なくとも１００個の連続したヌクレオチドを含む、請求項３に記載の、組換え腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項５】
切断型ヒトＣＤ１９をコードするヌクレオチド配列を除く部分が、配列番号１、又は配列番号２と少なくとも７０％同一である、請求項１に記載の、組換え腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項６】
プロモーターが、ウイルス初期プロモーターである、請求項１に記載の、組換え腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項７】
前記プロモーターがポックスウイルス初期プロモーターである、請求項２に記載の、組換え腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項８】
がん患者を処置する方法であって、以下の：
請求項１に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルスを患者に投与する工程；及び、同時に、又はその後、
ヒトＣＤ１９を標的とする、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞集団を患者に投与する工程、
を含む、方法。
【請求項９】
Ｔ細胞集団が、前記ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターで形質導入された、Ｔ細胞を含む、請求項８に記載の、方法。
【請求項１０】
Ｔ細胞集団が、前記ＣＡＲをコードするＲＮＡ分子で形質転換された、Ｔ細胞を含む、請求項９に記載の、方法。
【請求項１１】
Ｔ細胞集団が、組換え腫瘍溶解性ウイルスの投与後、１〜２０日、投与される、請求項９に記載の、方法。
【請求項１２】
Ｔ細胞集団が、組換え腫瘍溶解性ウイルスの投与後、５〜１００日、投与される、請求項９に記載の、方法。
【請求項１３】
腫瘍溶解性ウイルスが、前記切断型ヒトＣＤ１９をコードするヌクレオチド配列の挿入により改変された、セネカバレーウイルス分離株Ｉ（Seneca  Valley  Virus  Isolate  I）である、請求項１に記載の、組換え腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１４】
腫瘍溶解性ウイルスが、前記切断型ヒトＣＤ１９をコードするヌクレオチド配列の挿入により改変された、タリモジェン  ラヘルパレプベク（Talimogene  Laherparepvec）である、請求項１に記載の、組換え腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１５】
腫瘍溶解性ウイルスが、前記切断型ヒトＣＤ１９をコードするヌクレオチド配列の挿入により改変された、Ｉｍｙｌｙｇｉｃである、請求項１に記載の、組換え腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１６】
配列番号１、又は配列番号２と、少なくとも７０％の配列同一性があるヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の、組換え腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１７】
配列番号１、又は配列番号２のヌクレオチド配列を含むが、チミジンキナーゼ遺伝子を欠損する、請求項１に記載の、組換え腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１８】
ＣＤ１９ｔをコードするヌクレオチド配列が、Ｊ２Ｒ遺伝子座に挿入される、請求項１６、又は１７に記載の、組換え腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１９】
がんが、固形腫瘍である、請求項８に記載の、方法。
【請求項２０】
固形腫瘍が、卵巣がん、又は膵がんである、請求項１９に記載の、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
［０００１］  がんは、米国における死因の第２位を占める。近年、免疫チェックポイント阻害剤、キメラ抗原レセプターを備えるＴ細胞（ＣＡＲ  Ｔ細胞）、及び腫瘍溶解性ウイルスを含む、がん免疫療法が大きく進展した。腫瘍溶解性ウイルスは、健康な細胞を損傷せずに、がん細胞に感染し、そのがん細胞中で複製し、最終的にはそのがん細胞を死滅させる、天然由来の、又は遺伝子改変された、ウイルスである。
【０００２】
［０００２］  腫瘍溶解性ウイルスは、健康な細胞を損傷せずに、がん細胞に感染し、そのがん細胞中で複製し、最終的にはそのがん細胞を死滅させる、天然由来の、又は遺伝子改変された、ウイルスである（非特許文献１，２）。メラノーマが切除不能なＩＩＩＢ期、ＩＩＩＣ期、又はＩＶ期の患者４３６人を対象とした、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスＴ−ＶＥＣの、最近完了した第ＩＩＩ相臨床試験では、主要な評価項目が満たされ、Ｔ−ＶＥＣを投与された患者で持続的な効果が認められたのは、１６．３％であったのに対し、ＧＭ−ＣＳＦを投与された患者では２．１％であったこと、が報告された（非特許文献３）。本臨床試験の結果に基づき、ＦＤＡは２０１５年１０月２７日にＴ−ＶＥＣを承認した。
【０００３】
［０００３］  アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス１、ニューカッスル病ウイルス、レオウイルス、麻疹ウイルス、コクサッキーウイルス、セネカバレーウイルス、ワクシニアウイルス等、少なくとも８つの異なる種由来の腫瘍溶解性ウイルス構築物が、臨床試験の様々な段階で試験されている。腫瘍溶解性ウイルスは、がん患者では忍容性が良好であることが、明らかである。しかしながら、単独治療としての腫瘍溶解性ウイルスの臨床的利益は、限られている（非特許文献５）。腫瘍溶解性ウイルスの安全性に関する懸念により、前臨床試験、及び臨床試験で共に用いられてきたのは、（天然で無毒であるか、又は遺伝子工学により弱毒化されているかのいずれかの）高度に弱毒化された腫瘍溶解性ウイルスのみである。現在では、腫瘍溶解性ウイルスの安全性が十分に確立されたため、抗腫瘍効果を最大に発揮しうる腫瘍溶解性ウイルスを設計し、試験することができるようになった。強力な腫瘍崩壊効果を発揮する、腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍抗原を多量に放出することで、強力な免疫療法効果をもたらす。
【０００４】
［０００４］  ポックスウイルスファミリーの原型であるワクシニアウイルスは、天然痘ワクチンとして用いられ、１９及び２０世紀だけで５億人が死亡したと推定される天然痘を、根絶した。すなわち、紛れもなく、最も成功した、生きた生物製剤である。ワクシニアウイルスの安全性は、世界中の何百万人もの人々で、十分に実証された。ワクシニアウイルスはまた、実験室でウイルス性腫瘍溶解が示された、最初の腫瘍溶解性ウイルスである。腫瘍溶解性ウイルスとしてのワクシニアウイルスは、多くの臨床試験で検証されており、末期がん患者での忍容性が良好であることが示されてきた（非特許文献２）。いくつかの研究では、腫瘍溶解活性に関して、ワクシニアウイルスはアデノウイルスより優れていることが示された（非特許文献６）が、当該アデノウイルスは、最もよく研究されてきた腫瘍溶解性ウイルス種の１つであり、中国で、がん治療に承認された、最初の腫瘍溶解性ウイルスである（非特許文献７）。ワクシニアウイルスの他、アライグマポックスウイルス（ｒａｃｃｏｏｎｐｏｘ  ｖｉｒｕｓ）（非特許文献８）、羊痘ウイルス（ｏｒｆ  ｖｉｒｕｓ）（非特許文献９）、粘液腫ウイルス（ｍｙｘｏｍａ  ｖｉｒｕｓ）（非特許文献１０）等の、ポックスウイルスファミリーの他のウイルスもまた、腫瘍溶解性ウイルスとして、検証された。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Chen NG & Szalay AA (2011)Oncolytic virotherapy of cancer. Cancer Managment in Man: Chemotherapy,Biological Therapy, Hyperthermia and Supporting Measures, Cancer Growth andProgression, ed Minev BR (Springer, New York), Vol 13, pp 295-316.
【非特許文献２】Chen NG & Szalay AA (2010)Oncolytic vaccinia virus: a theranostic agent for cancer. Future Virol.5(6):763-784.
【非特許文献３】Andtbacka RH, et al. (2015)Talimogene Laherparepvec Improves Durable Response Rate in Patients WithAdvanced Melanoma. J Clin Oncol 33(25):2780-2788.
【非特許文献４】Anonymous (2015) First OncolyticViral Therapy for Melanoma. Cancer discovery.
【非特許文献５】Russell SJ, Peng KW, & Bell JC(2012) Oncolytic virotherapy. Nat Biotechnol 30(7):658-670.
【非特許文献６】Thorne SH, et al. (2007) Rationalstrain selection and engineering creates a broad-spectrum, systemicallyeffective oncolytic poxvirus, JX-963. J Clin Invest 117(l l):3350-3358.
【非特許文献７】Yu W & Fang H (2007) Clinicaltrials with oncolytic adenovirus in China. Curr Cancer Drug Targets 7(2):141-148.
【非特許文献８】Evgin L, et al. (2010) PotentOncolytic Activity of Raccoonpox Virus in the Absence of Natural Pathogenicity.Mol Ther.
【非特許文献９】Rintoul JL, et al. (2012) ORFV: anovel oncolytic and immune stimulating parapoxvirus therapeutic. Mol Ther20(6): 1148-1157.
【非特許文献１０】Chan WM & McFadden G (2014)Oncolytic Poxviruses. Annu Rev Virol 1(1): 119-141.
【発明の概要】
【０００６】
［０００５］  本明細書の記載は、配列番号１、又は配列番号２と、少なくとも７０％（８０％、８５％、９０％、９５％、９８％）の配列同一性がある（又は、ＴＫ遺伝子の欠損により改変された、配列番号１、又は配列番号２と、少なくとも７０％（８０％、８５％、９０％、９５％、９８％）の配列同一性がある）ヌクレオチド配列、及びさらに、ヒトＣＤ１９、又はその部分をコードするヌクレオチド配列、を含む、組換えキメラポックスウイルス、に関する。当該組換えポックスウイルスは腫瘍溶解性であり、特定のがん細胞に感染することができ、かつ、当該細胞を殺傷することができる。また、感染細胞に、細胞表面ＣＤ１９（又は、細胞表面に発現されることができる、ＣＤ１９の部分）を発現させることもできる。ＣＤ１９が発現すると、ＣＤ１９を標的とするＣＡＲ  Ｔ細胞（ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞）による殺傷に対して細胞が脆弱になる。すなわち、組換えキメラポックスウイルス、又はＣＤ１９の全体、又は部分をコードする導入遺伝子を含む、他の腫瘍溶解性ウイルス（まとめて「ＣＤ１９を発現する腫瘍溶解性ウイルス」）を、ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞とともに、又は連続して、投与することにより、様々ながんを治療することができる。場合によっては、ＣＤ１９を発現する腫瘍溶解性ウイルスで最初に処置した後、細胞が感染し、ＣＤ１９を発現できるようになるまで時間が経過した後（例えば、１、２、３、４、５日以上）、ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞で処置するのが、好ましい。一方、又は両方の処置を繰り返すことができる。
【０００７】
［０００６］  一態様では、導入遺伝子、例えば、ヒトＣＤ１９（ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ  Ｐ１５３９１）の全体、又は部分をコードする、発現カセット中の導入遺伝子を含む、組換え腫瘍性ウイルスが提供される。ＣＤ１９の発現部分とは、細胞表面に発現されることができ、かつ、抗ＣＤ１９抗体によって認識されうる部分をいう。
【０００８】
［０００７］  他の態様では、治療が必要な被験体のがんを処置する方法であって、本明細書に記載のキメラポックスウイルスを、及び、同時に、又はその後、ＣＤ１９を標的とするＣＡＲを発現するＴ細胞を、治療有効量で、被験体に投与する工程を含み、当該被験体のがんを処置する、方法が提供される。いくつかの実施形態では、がんは、例えば、Ｂ細胞がん、ＡＬＬ、ＣＬＬ、又はＢ−ＮＨＬ、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、又はマントル細胞リンパ腫である。
【０００９】
［０００８］  一態様では、配列番号１、又は配列番号２と、少なくとも７０％（８０％、８５％、９０％、９５％又は９８％）の配列同一性があるヌクレオチド配列としては：（ｉ）牛痘ウイルス（ｃｏｗｐｏｘ  ｖｉｒｕｓ）Ｂｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルス（ｒａｃｃｏｏｎｐｏｘ  ｖｉｒｕｓ）Ｈｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルス（ｒａｂｂｉｔｐｏｘ  ｖｉｒｕｓ）Ｕｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスLederle-Chorioallantoic株、ワクシニアウイルスＡＳ株、羊痘ウイルス（ｏｒｆ  ｖｉｒｕｓ）ＮＺ２株、及び偽牛痘ウイルス（ｐｓｅｕｄｏｃｏｗｐｏｘ  ｖｉｒｕｓ）ＴＪＳ株からなる群から選択される、少なくとも２つのポックスウイルス株由来の核酸断片；（ｉｉ）１又はそれ以上の抗がん核酸配列；又は（ｉｉｉ）検出可能な部分をコードする核酸配列があげられる。
【００１０】
［０００９］  他の態様では、配列番号１と、少なくとも７０％（８０％、８５％、９０％、９５％又は９８％）の配列同一性があるヌクレオチド配列としては：（ｉ）牛痘ウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスLederle-Chorioallantoic株、及びワクシニアウイルスＡＳ株由来の核酸断片；（ｉｉ）１又はそれ以上の抗がん核酸配列；又は（ｉｉｉ）検出可能な部分をコードする核酸配列があげられる。
【００１１】
［００１０］  他の態様では、配列番号２と、少なくとも７０％の配列同一性があるヌクレオチド配列としては：（ｉ）羊痘ウイルスＮＺ２株、及び偽牛痘ウイルスＴＪＳ株由来の核酸断片；（ｉｉ）１又はそれ以上の抗がん核酸配列；又は（ｉｉｉ）検出可能な部分をコードする核酸配列があげられる。
【００１２】
［００１１］  他の態様では、配列番号３と、少なくとも７０％（８０％、８５％、９０％、９５％又は９８％）の配列同一性があるヌクレオチド配列としては：（ｉ）牛痘ウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスLederle-Chorioallantoic株、及びワクシニアウイルスＡＳ株由来の核酸断片；（ｉｉ）１又はそれ以上の抗がん核酸配列；又は（ｉｉｉ）検出可能な部分をコードする核酸配列があげられる。
【００１３】
［００１２］  一態様では、配列番号１、又は配列番号２と、少なくとも７０％（８０％、８５％、９０％、９５％又は９８％）の配列同一性があるヌクレオチド配列としては：（ｉ）牛痘ウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスLederle-Chorioallantoic株、ワクシニアウイルスＡＳ株、羊痘ウイルスＮＺ２株、及び偽牛痘ウイルスＴＪＳ株からなる群から選択される、少なくとも２つのポックスウイルス株由来の核酸断片；（ｉｉ）１又はそれ以上の抗がん核酸配列；（ｉｉｉ）１又はそれ以上の核酸結合配列；又は（ｉｖ）検出可能な部分をコードする核酸配列があげられる。
【００１４】
［００１３］  他の態様では、配列番号１と、少なくとも７０％（８０％、８５％、９０％、９５％又は９８％）の配列同一性があるヌクレオチド配列としては：（ｉ）牛痘ウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスLederle-Chorioallantoic株、ワクシニアウイルスＡＳ株由来の核酸断片；（ｉｉ）１又はそれ以上の抗がん核酸配列；（ｉｉｉ）１又はそれ以上の核酸結合配列；又は（ｉｖ）検出可能な部分をコードする核酸配列があげられる。
【００１５】
［００１４］  他の態様では、配列番号２と、少なくとも７０％（８０％、８５％、９０％、９５％又は９８％）の配列同一性があるヌクレオチド配列としては：（ｉ）羊痘ウイルスＮＺ２株、及び偽牛痘ウイルスＴＪＳ株由来の核酸断片；（ｉｉ）１又はそれ以上の抗がん核酸配列；（ｉｉｉ）１又はそれ以上の核酸結合配列；又は（ｉｖ）検出可能な部分をコードする核酸配列があげられる。
【００１６】
［００１５］  他の態様では、配列番号３と、少なくとも７０％（８０％、８５％、９０％、９５％又は９８％）の配列同一性があるヌクレオチド配列としては：（ｉ）牛痘ウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスLederle-Chorioallantoic株、ワクシニアウイルスＡＳ株由来の核酸断片；（ｉｉ）１又はそれ以上の抗がん核酸配列；（ｉｉｉ）１又はそれ以上の核酸結合配列；又は（ｉｖ）検出可能な部分をコードする核酸配列があげられる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】［００１６］  キメラオルソポックスウイルス分離株＃３３（配列番号１）及び＃１７は、各々親の野生型ウイルス株、及び対照ウイルスＧＬＶ−１ｈ６８、及びＯｎｃｏＶＥＸ  ＧＦＰと比較して、優れたがん細胞殺傷能があることを示すグラフである。
【図２】［００１７］  キメラパラポックスウイルス分離株＃１８９（配列番号２）は、親の野生型ウイルス株、及び対照ウイルスＧＬＶ−１ｈ６８、及びＯｎｃｏＶＥＸ  ＧＦＰと比較して、優れたがん細胞殺傷能があることを示すグラフである。
【図３】［００１８］  キメラオルソポックスウイルス分離株＃１７及び＃３３（配列番号１）は、各々親の野生型ウイルス株、及び対照ウイルスＧＬＶ−１ｈ６８、及びＯｎｃｏＶＥＸ  ＧＦＰと比較して、膵臓がん細胞株において強力ながん細胞殺傷能があることを示すグラフである。
【図４】［００１９］  キメラパラポックスウイルス分離株＃１８９（配列番号２）は、親の野生型ウイルス株、及び対照ウイルスＧＬＶ−１ｈ６８、及びＯｎｃｏＶＥＸ  ＧＦＰと比較して、膵臓がん細胞株において強力ながん細胞殺傷能があることを示すグラフである。
【図５】［００２０］  キメラウイルス分離株＃３３（配列番号１）、及び＃１８９（配列番号２）は、胃がん細胞株において優れた細胞殺傷能を示す。がん細胞に、各ウイルスを、ＭＯＩを０．０１、０．１、及び１．０で感染させた。感染９６時間後の細胞生存率を、胃細胞株ＭＫＮ−４５（Ａ）、ＯＣＵＭ−２Ｍ（Ｂ）、ＫＡＴＯ−３（Ｃ）のＭＯＩに対してプロットしたグラフである。
【図６】［００２１］  フローサイトメトリーで測定した、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８の親株、及びＣＤ１９ｔ株の、ＣＤ１９発現を示すグラフである。
【図７】［００２２］  本明細書に記載の実験で用いられる、ＣＤ１９  ＣＡＲの模式図である。
【図８】［００２３］  ＣＤ１９  ＣＡＲの存在を示す、切断型ＥＧＦＲ発現を、フローサイトメトリーにより測定したグラフである。
【図９】［００２４］  ＭＤＡ−ＭＢ−４６８腫瘍と、Ｍｏｃｋ、又はＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞のいずれか、及び、３３−ＣＤ１９ｔウイルスの共培養物を染色し、フローサイトメトリーにより分析して、標的細胞上のＣＤ１９ｔ発現を決定した図である。上段：ＣＤ１９  ＣＡＲＴ細胞の処置なし。下段：ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞による処置あり。
【図１０】［００２５］  ３３−ＣＤ１９ｔウイルスを用いた４８時間の長期殺傷実験で採取した上清から、ＩＬ‐２（下）とＩＦＮ‐γ（上）のＴ細胞産生を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）で検出したグラフである。
【図１１】［００２６］  ウイルス処理から２４、４８、及び７２時間後の、ＭｏｃｋとＣＡＲ  Ｔ細胞を比較した、腫瘍殺傷アッセイの細胞培養画像（１０ｘ）である。
【図１２】［００２７］  ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞の長期殺傷アッセイ：Ｍｏｃｋ、又はＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞、及び３３−ＣＤ１９ｔウイルスを細胞に曝露から、（Ａ）２４時間後、（Ｂ）４８時間後、（Ｃ）７２時間後で、培養物を分析し、ウイルス対照（左）と比較した、ＣＤ１９ｔ発現、及び腫瘍殺傷率％を測定した結果を示すグラフである。
【図１３】［０００１］  腫瘍溶解性ウイルスは、ＣＤ１９ｔを効果的に固形腫瘍に送達し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞を活性化しことを示す図である。（Ａ）ワクシニア腫瘍溶解性ウイルス［ＣＦ３３（ＳＥ）ｈＣＤ１９ｔ］の模式図であり、Ｊ２Ｒ遺伝子座に挿入され、チミジンキナーゼ遺伝子と置換された、合成初期プロモーター（ＰＳＥ）の制御下における、切断型ヒトＣＤ１９（ＣＤ１９ｔ）の取り込みを示す。（Ｂ）ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞を、ＯＶ１９ｔを、ＭＯＩを０．０２５（左）、及び１（中央）で、２４時間感染させた細胞、又はレンチウイルスを形質導入してＣＤ１９ｔを安定発現させた細胞（右）の免疫蛍光顕微鏡の写真である。画像の倍率は１０ｘ、挿入画像の倍率は４０ｘである。（Ｃ）ＭＯＩが上昇する、ＯＶ１９ｔ感染２４時間後にフローサイトメトリーで測定した、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８腫瘍細胞上のＣＤ  １９ｔの細胞表面発現、及びワクシニアウイルスの細胞内発現を示すＦＡＣＳプロットを示す図である。（Ｄ）ＭＤＡ−ＭＢ−４６８腫瘍細胞と、ＭＯＩが示されたＯＶ１９ｔで共培養２４時間、４８時間、及び７２時間後の、ＣＤ１９ｔ（左）、ワクシニア（中央）、及び生存率（右）の定量を行った実験結果を示すグラフである。（Ｅ）腫瘍細胞との共培養２４時間後、エフェクター：腫瘍（Ｅ：Ｔ）の比を１：２で、かつＯＶ１９ｔの示したＭＯＩでの処理の有無により、Ｍｏｃｋ（非形質導入）、又はＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞上で発現した、ＣＤ２５（左）及びＣＤ１３７（右）を定量した、実験結果を示すグラフである。
【図１４】［０００２］  ＯＶ１９ｔ腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍細胞における、ＣＤ１９ｔの発現を促進することができ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化、及び細胞傷害性を再志向することを示すグラフである。（Ａ）ＭＤＡ−ＭＢ−４６８腫瘍細胞との共培養１６時間後、Ｅ：Ｔ比１：１、かつＯＶ１９ｔの示したＭＯＩでの処理の有無により、ＣＤ８＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞における、細胞表面ＣＤ１０７ａ（左）、及び細胞内ＩＦＮｙ発現（右）について、代表的なフローサイトメトリー分析を行ったグラフである。（Ｂ）ＯＶ１９ｔの示したＭＯＩでの処理の有無により、共培養２４、４８、７２時間後に採取した上清中のＩＦＮｙ産生をＥＬＩＳＡで測定したグラフである。（Ｃ）ＯＶ１９ｔの示したＭＯＩで処理された、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８腫瘍細胞との共培養２４、４８、又は７２時間後に、Ｍｏｃｋ、又はＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞を比較する、フローサイトメトリーによって評価した腫瘍殺傷アッセイの結果を示すグラフである。（Ｄ）（Ｃ）に記載の殺傷アッセイにおける腫瘍細胞上のＣＤ１９ｔ発現を示すグラフである。（Ｅ）ＯＶ１９ｔの示したＭＯＩで処理された、腫瘍細胞とＴ細胞との共培養から採取した上清のウイルス力価を示すグラフである。
【図１５】［０００３］  ＴＮＢＣ異種移植モデルにおける、ＯＶ１９ｔとＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞の併用療法の抗腫瘍効果を示す図である。（Ａ）マウスに皮下ＭＤＡＭＢ−４６８腫瘍（５×１０６細胞）を生着させ、マウス当たり０、１０５、１０６、又は１０７プラーク形成単位（ｐｆｕ）で腫瘍内処理し、処理後３日目（左）、７日目（中央）、又は１０日目（右）に、採取して、フローサイトメトリーにより、ＣＤ１９ｔ発現の定量を行った。（＋）は、上記のとおり、レンチウイルスで形質導入された、ＣＤ１９ｔを安定発現した、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８腫瘍を示す。（Ｂ）試験０日目に、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（５ｘ１０６細胞）の皮下腫瘍があるＮＳＧマウスを、３６日目にＯＶ１９ｔ（１０７ｐｆｕ）で処理し、４６日目に、当該マウスを、Ｍｏｃｋ、又はＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞（５ｘ１０６細胞）のいずれかで処理した場合の、腫瘍体積（ｍｍ３）を示すグラフである。（Ｃ）（Ｂ）に記載の、ｉｎ  ｖｉｖｏ実験の７３日目における平均腫瘍体積を示すグラフである。（Ｄ）難治性固形腫瘍へのＣＡＲ標的導入のためのＯＶを用いる、併用療法の概念を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
［００２８］  本明細書は、ヒトＣＤ１９の全体、又は部分を発現する組換え腫瘍溶解性ウイルスに関する。当該ウイルスは、腫瘍溶解性、又は他の腫瘍溶解性ウイルスであるキメラポックスウイルス組成物由来である。適当な組換え腫瘍溶解性ウイルスは、２０１７年８月９日に出願され、参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／４６１６３に記載されるように、ヒトＣＤ１９、又はその部分をコードする配列を含む、発現カセットを、キメラウイルス、又は他の腫瘍溶解性ウイルスに挿入することにより、作製することができる。
【００１９】
［００２９］  用語「組換え」は、例えば、細胞、又は核酸、タンパク質、又はベクターに参照して用いられる場合、細胞、核酸、タンパク質、又はベクターが、異種の核酸、若しくはタンパク質の導入により、又は天然の核酸、若しくはタンパク質の改変により、改変されたか、又は当該細胞がそのように改変された細胞に由来することをいう。
【００２０】
［００３０］  用語「ウイルス」又は「ウイルス粒子」は、ウイルス学における、通常の意味に従って用いられ、ウイルスゲノム（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、一本鎖、二本鎖）、ウイルスカプシド、及び関連タンパク質、を含むビリオン、並びにエンベロープを備えるウイルス（例えば、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス）の場合、脂質、及び場合により宿主細胞膜成分を含むエンベロープ、及び／又はウイルスタンパク質をいう。
【００２１】
［００３１］  用語「ポックスウイルス」は、ウイルス学における、通常の意味に従って用いられ、脊椎動物、及び無脊椎動物に感染し、当該宿主の細胞質中で複製することができる、ポックスウイルス科の種をいう。いくつかの実施形態では、ポックスウイルスビリオンは、直径が約２００ｎｍ、長さが約３００ｎｍの大きさで、通常、１３０〜３７５キロベースの、ＤＮＡの単一の線状二本鎖のセグメントにゲノムが存在する。用語ポックスウイルスとしては、ポックスウイルス科のすべての属があげられる（例えば、ベータエントモポックスウイルス（betaentomopoxvirus）、ヤタポックスウイルス（yatapoxvirus）、セルビドポックスウイルス（cervidpoxvirus）、ガンマエントポックスウイルス（gammaentomopoxvirus）、レポリポックスウイルス（leporipoxvirus）、スイポックスウイルス（suipoxvirus）、molluscipoxvirus、crocodylidpoxvirus、アルファエントモポックスウイルス（alphaentomopoxvirus）、カプリポックスウイルス（capripoxvirus）、オルソポックスウイルス、アビポックスウイルス（avipoxvirus）、及びパラポックスウイルス）が、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、当該ポックスウイルスは、オルソポックスウイルス（例えば、天然痘ウイルス、ワクシニアウイルス、牛痘ウイルス、サル痘ウイルス）、パラポックスウイルス（例えば、羊痘ウイルス、偽牛痘ウイルス、ウシ流行性口内炎ウイルス（bovine  popular  stomatitis  virus））、ヤタポックスウイルス（例えば、タナポックスウイルス、ヤバサル腫瘍ウイルス（yaba  monkey  tumor  virus））、又はmolluscipoxvirus（例えば、伝染性軟属腫ウイルス）である。いくつかの実施形態では、当該ポックスウイルスは、オルソポックスウイルス（例えば、牛痘ウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスLederle-Chorioallantoic株、又はワクシニアウイルスＡＳ株）である。いくつかの実施形態では、ポックスウイルスはパラポックスウイルス（例えば、羊痘ウイルスＮＺ２株、又は偽牛痘ウイルスＴＪＳ株）である。
【００２２】
［００３２］  用語「キメラ」は、キメラポックスウイルスに関連して用いられる場合、ウイルス学における、通常の意味に従って用いられ、２又はそれ以上の異なる微生物（例えば、同一のサブファミリー由来の２つのウイルス、異なるサブファミリー由来の２つのウイルス）に由来する、核酸断片を結合して作製される、ハイブリッド微生物（例えば、キメラポックスウイルス）をいう。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの核酸断片は各々、複製に必要な必須遺伝子を含む。その実施形態を含む本明細書で提供されるキメラポックスウイルスは、１又はそれ以上の導入遺伝子（すなわち、ウイルスゲノムが固有に備えるのではない核酸配列）を含んでよい。例えば、その実施形態を含む本明細書で提供されるキメラポックスウイルスとしては、抗がん核酸配列、核酸結合配列、検出可能な部分をコードする核酸配列、又はそれらのいかなる組合せがあげられうる。いくつかの実施形態では、キメラポックスウイルスは、抗がん核酸配列、核酸結合配列、及び検出可能な部分をコードする核酸配列を含む核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラポックスウイルスは、抗がん核酸配列、及び検出可能な部分をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラポックスウイルスは、核酸結合配列、及び検出可能な部分をコードする核酸配列を含む核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラポックスウイルスは、抗がん核酸配列、及び核酸結合配列を含む核酸配列を含む。
【００２３】
［００３３］  用語「牛痘ウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株」は、その一般的な通常の意味に従って用いられ、同一、又は類似の名称のウイルス株、並びにその機能的断片、及びその相同体をいう。当該用語は、牛痘ウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株の活性を（例えば、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％以内）維持する、組換え、又は天然の牛痘ウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、又はその変異体を含む。当該用語は、組換え、又は天然の牛痘ウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、又はその変異体を包含し、そのゲノムは牛痘ウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株ゲノムと、配列同一性がある（例えば、牛痘ウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株ゲノムと、約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又は１００％の同一性がある）。牛痘ウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株は、牛痘ウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株の活性、発現、細胞標的化、又は感染能を調節する（例えば、牛痘ウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株と比較すると、増加、又は減少する）突然変異アミノ酸がある変異体をいう。牛痘ウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株は、本明細書に記載のように改変することができる。いくつかの実施形態では、牛痘ウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株は、ＡＴＣＣ（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）参照番号ＡＴＣＣ  ＶＲ−３０２（商標）によって同定されたウイルス株、その変異体、又は相同体をいう。
【００２４】
［００３４］  用語「アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株」は、その一般的な通常の意味に従って用いられ、同一、又は類似の名称のウイルス株、並びにその機能的断片、及びその相同体をいう。当該用語は、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株の活性を（例えば、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％以内）維持する、組換え、又は天然のアライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、又はその変異体を含む。当該用語は、組換え、又は天然のアライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、又はその変異体を包含し、そのゲノムは、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株ゲノムと、配列同一性がある（例えば、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株ゲノムと、約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又は１００％の同一性がある）。アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株は、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株の活性、発現、細胞標的化、又は感染能を調節する（例えば、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株と比較すると、増加、又は減少する）突然変異アミノ酸がある変異体をいう。アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株は、本明細書に記載のように改変することができる。いくつかの実施形態では、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株は、ＡＴＣＣ参照番号ＡＴＣＣ  ＶＲ−８３８（商標）によって同定されたウイルス株、その変異体又は相同体をいう。
【００２５】
［００３５］  用語「ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株」は、その一般的な通常の意味に従って用いられ、同一、又は類似の名称のウイルス株、並びにその機能的断片、及びその相同体をいう。当該用語は、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株の活性を（例えば、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％以内）維持する、組換え、又は天然のウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、又はその変異体を含む。当該用語は、組換え、又は天然のウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、又はその変異体を包含し、そのゲノムは、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株ゲノムと、配列同一性がある（例えば、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株と、約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又は１００％の同一性がある）。ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株は、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株の活性、発現、細胞標的化、又は感染能を調節する（例えば、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株と比較すると、増加、又は減少する）突然変異アミノ酸がある変異体をいう。ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株は、本明細書に記載のように改変することができる。いくつかの実施形態では、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株は、ＡＴＣＣ参照番号ＡＴＣＣ  ＶＲ−１５９１（商標）によって同定されたウイルス株、その変異体又は相同体をいう。
【００２６】
［００３６］  用語「ワクシニアウイルスＷＲ株」は、その一般的な通常の意味に従って用いられ、同一、又は類似の名称のウイルス株、並びにその機能的断片、及びその相同体をいう。当該用語は、ワクシニアウイルスＷＲ株の活性を（例えば、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％以内）維持する、組換え、又は天然のワクシニアウイルスＷＲ株、又はその変異体を含む。当該用語は、組換え、又は天然のワクシニアウイルスＷＲ株、又はその変異体を包含し、そのゲノムは、ワクシニアウイルスＷＲ株ゲノムと、配列同一性がある（例えば、ワクシニアウイルスＷＲ株と、約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又は１００％の同一性がある）。ワクシニアウイルスＷＲ株は、ワクシニアウイルスＷＲ株の活性、発現、細胞標的化、又は感染能を調節する（例えば、ワクシニアウイルスＷＲ株と比較すると、増加、又は減少する）突然変異アミノ酸がある変異体をいう。ワクシニアウイルスＷＲ株は、本明細書に記載のように改変することができる。いくつかの実施形態では、ワクシニアウイルスＷＲ株は、ＡＴＣＣ参照番号ＡＴＣＣ  ＶＲ−１３５４（商標）によって同定されたウイルス株、その変異体又は相同体をいう。
【００２７】
［００３７］  用語「ワクシニアウイルスＩＨＤ株」は、その一般的な通常の意味に従って用いられ、同一、又は類似の名称のウイルス株、並びにその機能的断片、及びその相同体をいう。当該用語は、ワクシニアウイルスＩＨＤ株の活性を（例えば、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％以内）維持する、組換え、又は天然のワクシニアウイルスＩＨＤ株、株、又はその変異体を含む。当該用語は、組換え、又は天然のワクシニアウイルスＩＨＤ株、又はその変異体を包含し、そのゲノムは、ワクシニアウイルスＩＨＤ株ゲノムと、配列同一性がある（例えば、ワクシニアウイルスＩＨＤ株と、約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又は１００％の同一性がある）。ワクシニアウイルスＩＨＤ株は、ワクシニアウイルスＩＨＤ株の活性、発現、細胞標的化、又は感染能を調節する（例えば、ワクシニアウイルスＩＨＤ株と比較すると、増加、又は減少する）突然変異アミノ酸がある変異体をいう。ワクシニアウイルスＩＨＤ株は、本明細書に記載のように改変することができる。いくつかの実施形態では、ワクシニアウイルスＩＨＤ株は、ＡＴＣＣ参照番号ＡＴＣＣ  ＶＲ−１５６（商標）によって同定されたウイルス株、その変異体又は相同体をいう。
【００２８】
［００３８］  用語「ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株」は、その一般的な通常の意味に従って用いられ、同一、又は類似の名称のウイルス株、並びにその機能的断片、及びその相同体をいう。当該用語は、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株の活性を（例えば、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％以内）維持する、組換え、又は天然のワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、又はその変異体を含む。当該用語は、組換え、又は天然のワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、又はその変異体を包含し、そのゲノムは、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株と、配列同一性がある（例えば、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株と、約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又は１００％の同一性がある）。ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株は、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株の活性、発現、細胞標的化、又は感染能を調節する（例えば、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株と比較すると、増加、又は減少する）突然変異アミノ酸がある変異体をいう。ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株は、本明細書に記載のように改変することができる。いくつかの実施形態では、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株は、ＡＴＣＣ参照番号ＡＴＣＣ  ＶＲ−１５４９（商標）によって同定されたウイルス株、その変異体又は相同体をいう。
【００２９】
［００３９］  用語「ワクシニアウイルスＣＬ株」は、その一般的な通常の意味に従って用いられ、同一、又は類似の名称のウイルス株、並びにその機能的断片、及びその相同体をいう。当該用語は、ワクシニアウイルスＣＬ株の活性を（例えば、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％以内）維持する、組換え、又は天然のワクシニアウイルスＣＬ株、又はその変異体を含む。当該用語は、組換え、又は天然のワクシニアウイルスＣＬ株、又はその変異体を包含し、そのゲノムは、ワクシニアウイルスＣＬ株ゲノムと、配列同一性がある（例えば、ワクシニアウイルスＣＬ株と、約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又は１００％の同一性がある）。ワクシニアウイルスＣＬ株は、ワクシニアウイルスＣＬ株の活性、発現、細胞標的化、又は感染能を調節する（例えば、ワクシニアウイルスＣＬ株と比較すると、増加、又は減少する）突然変異アミノ酸がある変異体をいう。ワクシニアウイルスＣＬ株は、本明細書に記載のように改変することができる。いくつかの実施形態では、ワクシニアウイルスＣＬ株は、ＡＴＣＣ参照番号ＡＴＣＣ  ＶＲ−１７７４（商標）によって同定されたウイルス株、その変異体又は相同体をいう。
【００３０】
［００４０］  用語「ワクシニアウイルスLederle-Chorioallantoic株」は、その一般的な通常の意味に従って用いられ、同一、又は類似の名称のウイルス株、並びにその機能的断片、及びその相同体をいう。当該用語は、ワクシニアウイルスLederle-Chorioallantoic株の活性を（例えば、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％以内）維持する、組換え、又は天然のワクシニアウイルスLederle-Chorioallantoic株、又はその変異体を含む。当該用語は、組換え、又は天然のワクシニアウイルスLederle-Chorioallantoic株、又はその変異体を包含し、そのゲノムは、ワクシニアウイルスLederle-Chorioallantoic株ゲノムと、配列同一性がある（例えば、ワクシニアウイルスLederle-Chorioallantoic株と、約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又は１００％の同一性がある）。ワクシニアウイルスLederle-Chorioallantoic株は、ワクシニアウイルスLederle-Chorioallantoic株の活性、発現、細胞標的化、又は感染能を調節する（例えば、ワクシニアウイルスLederle-Chorioallantoic株と比較すると、増加、又は減少する）突然変異アミノ酸がある変異体をいう。ワクシニアウイルスLederle-Chorioallantoic株は、本明細書に記載のように改変することができる。いくつかの実施形態では、ワクシニアウイルスＷＲ株は、ＡＴＣＣ参照番号ＡＴＣＣ  ＶＲ−１１８（商標）によって同定されたウイルス株、その変異体又は相同体をいう。
【００３１】
［００４１］  用語「ワクシニアウイルスＡＳ株」は、その一般的な通常の意味に従って用いられ、同一、又は類似の名称のウイルス株、並びにその機能的断片、及びその相同体をいう。当該用語は、ワクシニアウイルスＡＳ株の活性を（例えば、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％以内）維持する、組換え、又は天然のワクシニアウイルスＡＳ株、又はその変異体を含む。当該用語は、組換え、又は天然のワクシニアウイルスＡＳ株、又はその変異体を包含し、そのゲノムは、ワクシニアウイルスＡＳ株ゲノムと、配列同一性がある（例えば、ワクシニアウイルスＷＲ株と、約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又は１００％の同一性がある）。ワクシニアウイルスＡＳ株は、ワクシニアウイルスＡＳ株の活性、発現、細胞標的化、又は感染能を調節する（例えば、ワクシニアウイルスＡＳ株と比較すると、増加、又は減少する）突然変異アミノ酸がある変異体をいう。ワクシニアウイルスＡＳ株は、本明細書に記載のように改変することができる。いくつかの実施形態では、ワクシニアウイルスＡＳ株は、ＡＴＣＣ参照番号ＡＴＣＣ  ＶＲ−２０１０（商標）によって同定されたウイルス株、その変異体又は相同体をいう。
【００３２】
［００４２］  用語「羊痘ウイルスＮＺ２株」は、その一般的な通常の意味に従って用いられ、同一、又は類似の名称のウイルス株、並びにその機能的断片、及びその相同体をいう。当該用語は、羊痘ウイルスＮＺ２株の活性を（例えば、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％以内）維持する、組換え、又は天然の羊痘ウイルスＮＺ２株、又はその変異体を含む。当該用語は、組換え、又は天然の羊痘ウイルスＮＺ２株、又はその変異体を包含し、そのゲノムは、羊痘ウイルスＮＺ２株と、配列同一性がある（例えば、ワクシニアウイルスＷＲ株と、約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又は１００％の同一性がある）。羊痘ウイルスＮＺ２株は、羊痘ウイルスＮＺ２株の活性、発現、細胞標的化、又は感染能を調節する（例えば、羊痘ウイルスＮＺ２株と比較すると、増加、又は減少する）突然変異アミノ酸がある変異体をいう。羊痘ウイルスＮＺ２株は、本明細書に記載のように改変することができる。いくつかの実施形態では、羊痘ウイルスＮＺ２株  は、ＡＴＣＣ参照番号ＡＴＣＣ  ＶＲ−１５４８（商標）によって同定されたウイルス株、その変異体又は相同体をいう。
【００３３】
［００４３］  「偽牛痘ウイルスＴＪＳ株」は、その一般的な通常の意味に従って用いられ、同一、又は類似の名称のウイルス株、並びにその機能的断片、及びその相同体をいう。当該用語は、偽牛痘ウイルスＴＪＳ株の活性を（例えば、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％以内）維持する、組換え、又は天然の偽牛痘ウイルスＴＪＳ株、又はその変異体を含む。当該用語は、組換え、又は天然の偽牛痘ウイルスＴＪＳ株、又はその変異体を包含し、そのゲノムは、偽牛痘ウイルスＴＪＳ株と、配列同一性がある（例えば、ワクシニアウイルスＷＲ株と、約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又は１００％の同一性がある）。偽牛痘ウイルスＴＪＳ株は、偽牛痘ウイルスＴＪＳ株の活性、発現、細胞標的化、又は感染能を調節する（例えば、偽牛痘ウイルスＴＪＳ株と比較すると、増加、又は減少する）突然変異アミノ酸がある変異体をいう。偽牛痘ウイルスＴＪＳ株は、本明細書に記載のように改変することができる。いくつかの実施形態では、偽牛痘ウイルスＴＪＳ株は、ＡＴＣＣ参照番号ＡＴＣＣ  ＶＲ−６３４（商標）によって同定されたウイルス株、その変異体又は相同体をいう。
【００３４】
［００４４］  いくつかの実施形態では、牛痘ウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株は、牛痘ウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株  ＡＴＣＣ  ＶＲ−３０２（商標）である。いくつかの実施形態では、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株は、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株  ＡＴＣＣ  ＶＲ−８３８（商標）である。いくつかの実施形態では、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株は、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株  ＡＴＣＣ  ＶＲ−１５９１（商標）である。いくつかの実施形態では、ワクシニアウイルスＷＲ株は、ワクシニアウイルスＷＲ株ＡＴＣＣ  ＶＲ−１３５４（商標）である。いくつかの実施形態では、ワクシニアウイルスＩＨＤ株は、ワクシニアウイルスＩＨＤ株ＡＴＣＣ  ＶＲ−１５６（商標）である。いくつかの実施形態では、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株は、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株ＡＴＣＣ  ＶＲ−１５４９（商標）である。いくつかの実施形態では、ワクシニアウイルスＣＬ株は、ワクシニアウイルスＣＬ株ＡＴＣＣ  ＶＲ−１７７４（商標）である。いくつかの実施形態では、ワクシニアウイルスLederle-Chorioallantoic株は、ワクシニアウイルスLederle-Chorioallantoic株  ＡＴＣＣ  ＶＲ−１１８（商標）である。いくつかの実施形態では、ワクシニアウイルスＡＳ株は、ワクシニアウイルスＡＳ株ＡＴＣＣ  ＶＲ−２０１０（商標）である。いくつかの実施形態では、羊痘ウイルスＮＺ２株は、羊痘ウイルスＮＺ２株ＡＴＣＣ  ＶＲ−１５４８（商標）である。いくつかの実施形態では、偽牛痘ウイルスＴＪＳ株は、偽牛痘ウイルスＴＪＳ株ＡＴＣＣ  ＶＲ６３４（商標）である。
【００３５】
Ｉ．  キメラポックスウイルス組成物
［００４５］  一態様では、配列番号１、又は配列番号２と、少なくとも７０％（７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は９９％）の配列同一性があるヌクレオチド配列、及び細胞表面に発現しうる、ヒトＣＤ１９、又はその部分、をコードするヌクレオチド配列、を含むキメラポックスウイルスが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１、又は配列番号２と、少なくとも７０％同一性がある配列としては、牛痘ウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスLederle-Chorioallantoic株、ワクシニアウイルスＡＳ株、羊痘ウイルスＮＺ２株、及び偽牛痘ウイルスＴＪＳ株を含む群から選択される、少なくとも２つのポックスウイルス株由来のヌクレオチド配列（「核酸断片」）があげられる。
【００３６】
［００４６］  本明細書に記載の、キメラ腫瘍溶解性ポックスウイルスは、機能的シグナル伝達ドメインを欠損するが、細胞外ドメイン、及び膜貫通ドメインを含む、切断型ヒトＣＤ１９（ＣＤ１９ｔ）をコードする、導入遺伝子を含む。当該切断型ヒトＣＤ１９は、以下のアミノ酸配列である配列番号Ｃ：
【００３７】
【化１】
2020530303.tif 000002
（又は、少なくとも当該配列番号と、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一の配列）を含む。ある場合には、当該ＣＤ１９ｔは、配列番号Ｃのアミノ酸２２〜３２３を含むか、又はからなる。配列番号３のアミノ酸１〜２１は、シグナル伝達ドメインであり、異なるシグナル伝達ドメインで、置換できる。すなわち、当該腫瘍崩壊ウイルスは、発現制御配列（例えば、初期プロモーター）に作動可能に連結された、切断型ヒトＣＤ１９をコードするヌクレオチド配列、を含む配列を含む。
【００３８】
［００４７］  いくつかの実施形態では、当該核酸断片は、牛痘ウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスLederle-Chorioallantoic株、及びワクシニアウイルスＡＳ株に由来する。
【００３９】
［００４８］  いくつかの実施形態では、当該核酸配列は、牛痘ウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、及びアライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株由来の核酸断片を含む。いくつかの実施形態では、当該核酸配列は、牛痘ウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、及びウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株由来の核酸断片を含む。いくつかの実施形態では、当該核酸配列は、牛痘ウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、及びワクシニアウイルスＷＲ株由来の核酸断片を含む。いくつかの実施形態では、当該核酸配列は、牛痘ウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、及びワクシニアウイルスＩＨＤ株由来の核酸断片を含む。いくつかの実施形態では、当該核酸配列は、牛痘ウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、及びワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株由来の核酸断片を含む。いくつかの実施形態では、当該核酸配列は、牛痘ウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、及びワクシニアウイルスＣＬ株由来の核酸断片を含む。いくつかの実施形態では、当該核酸配列は、牛痘ウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、及びワクシニアウイルスLederle-Chorioallantoic株由来の核酸断片を含む。いくつかの実施形態では、当該核酸配列は、牛痘ウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、及びワクシニアウイルスＡＳ株由来の核酸断片を含む。いくつかの実施形態では、当該核酸配列は、牛痘ウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、及び羊痘ウイルスＮＺ２株由来の核酸断片を含む。いくつかの実施形態では、当該核酸配列は、牛痘ウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、及び偽牛痘ウイルスＴＪＳ株由来の核酸断片を含む。
【００４０】
［００４９］  いくつかの実施形態では、核酸配列は、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、及びワクシニアウイルスＷＲ株由来の核酸断片を含む。いくつかの実施形態では、核酸配列は、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、及びワクシニアウイルスＩＨＤ株由来の核酸断片を含む。いくつかの実施形態では、核酸配列は、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、及びワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株由来の核酸断片を含む。いくつかの実施形態では、核酸配列は、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、及びワクシニアウイルスＣＬ株由来の核酸断片を含む。いくつかの実施形態では、核酸配列は、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、及びワクシニアウイルスLederle-Chorioallantoic株由来の核酸断片を含む。いくつかの実施形態では、核酸配列は、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、及びワクシニアウイルスＡＳ株由来の核酸断片を含む。いくつかの実施形態では、核酸配列は、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、及び羊痘ウイルスＮＺ２株由来の核酸断片を含む。いくつかの実施形態では、核酸配列は、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、及び偽牛痘ウイルスＴＪＳ株由来の核酸断片を含む。
【００４１】
［００５０］  いくつかの実施形態では、核酸配列は、ワクシニアウイルスＷＲ株、及びワクシニアウイルスＩＨＤ株由来の核酸断片を含む。いくつかの実施形態では、核酸配列は、ワクシニアウイルスＷＲ株、及びワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株由来の核酸断片を含む。いくつかの実施形態では、核酸配列は、ワクシニアウイルスＷＲ株、及びワクシニアウイルスＣＬ株由来の核酸断片を含む。いくつかの実施形態では、核酸配列は、ワクシニアウイルスＷＲ株、及びワクシニアウイルスLederle-Chorioallantoic株由来の核酸断片を含む。いくつかの実施形態では、核酸配列は、ワクシニアウイルスＷＲ株、及びワクシニアウイルスＡＳ株由来の核酸断片を含む。いくつかの実施形態では、核酸配列は、ワクシニアウイルスＷＲ株、及び羊痘ウイルスＮＺ２株由来の核酸断片を含む。いくつかの実施形態では、核酸配列は、ワクシニアウイルスＷＲ株、及び偽牛痘ウイルスＴＪＳ株由来の核酸断片を含む。
【００４２】
［００５１］  いくつかの実施形態では、核酸配列は、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、及びワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株由来の核酸断片を含む。いくつかの実施形態では、核酸配列は、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、及びワクシニアウイルスＣＬ株由来の核酸断片を含む。いくつかの実施形態では、核酸配列は、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、及びワクシニアウイルスLederle-Chorioallantoic株由来の核酸断片を含む。いくつかの実施形態では、核酸配列は、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、及びワクシニアウイルスＡＳ株由来の核酸断片を含む。いくつかの実施形態では、核酸配列は、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、及び羊痘ウイルスＮＺ２株由来の核酸断片を含む。いくつかの実施形態では、核酸配列は、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、及び偽牛痘ウイルスＴＪＳ株由来の核酸断片を含む。
【００４３】
［００５２］  いくつかの実施形態では、核酸配列は、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、及びワクシニアウイルスＣＬ株由来の核酸断片を含む。いくつかの実施形態では、核酸配列は、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、及びワクシニアウイルスLederle-Chorioallantoic株由来の核酸断片を含む。いくつかの実施形態では、核酸配列は、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、及びワクシニアウイルスＡＳ株由来の核酸断片を含む。いくつかの実施形態では、核酸配列は、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、及び羊痘ウイルスＮＺ２株由来の核酸断片を含む。いくつかの実施形態では、核酸配列は、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、及び偽牛痘ウイルスＴＪＳ株由来の核酸断片を含む。
【００４４】
［００５３］  いくつかの実施形態では、核酸配列は、ワクシニアウイルスＣＬ株、及びワクシニアウイルスLederle-Chorioallantoic株由来の核酸断片を含む。いくつかの実施形態では、核酸配列は、ワクシニアウイルスＣＬ株、及びワクシニアウイルスＡＳ株由来の核酸断片を含む。いくつかの実施形態では、核酸配列は、ワクシニアウイルスＣＬ株、及び羊痘ウイルスＮＺ２株由来の核酸断片を含む。いくつかの実施形態では、核酸配列は、ワクシニアウイルスＣＬ株、及び偽牛痘ウイルスＴＪＳ株由来の核酸断片を含む。
【００４５】
［００５４］  いくつかの実施形態では、核酸配列は、ワクシニアウイルスLederle-Chorioallantoic株、及びワクシニアウイルスＡＳ株由来の核酸断片を含む。いくつかの実施形態では、核酸配列は、ワクシニアウイルスLederle-Chorioallantoic株、及び羊痘ウイルスＮＺ２株由来の核酸断片を含む。いくつかの実施形態では、核酸配列は、ワクシニアウイルスLederle-Chorioallantoic株、及び偽牛痘ウイルスＴＪＳ株由来の核酸断片を含む。
【００４６】
［００５５］  いくつかの実施形態では、核酸配列は、ワクシニアウイルスＡＳ株、及び羊痘ウイルスＮＺ２株由来の核酸断片を含む。いくつかの実施形態では、核酸配列は、ワクシニアウイルスＡＳ株、及び偽牛痘ウイルスＴＪＳ株由来の核酸断片を含む。いくつかの実施形態では、核酸配列は、羊痘ウイルスＮＺ２株、及び偽牛痘ウイルスＴＪＳ株由来の核酸断片を含む。
【００４７】
ＩＩ．  ＣＤ１９を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
［００５６］  これまで、米国特許第７，４４６，１７９号、及びPark  et  al.  2016  Blood  128:4035を含む、様々なＣＤ１９  ＣＡＲの報告があり、それらに記載されているものを用いることができる。ＣＤ１９  ＣＡＲとしては、ＣＤ１９と結合するｓｃＦｖ、例えば、ＦＭＣ６３（Zola  et  al.  1991  Immunol  Cell  Biol  69:411）、又はＳＪ２５Ｃ１（Bejcek  et  al.  1995  Cancer  Research  55:2346）をあげることができ、これらはいずれも商業的に利用可能である。
【００４８】
［００５７］  本明細書に記載されるのは、ＣＡＲをコードする核酸分子であって、当該ＣＡＲは、以下の：ＣＤ１９を標的とするｓｃＦｖ（例えば、以下の配列番号Ｄ
【００４９】
【化２】
2020530303.tif 000003
）、又は１〜５（例えば、１、又は２）のアミノ酸が改変（例えば、置換）された、その変異体；ＣＤ４膜貫通ドメイン、又は１〜５（例えば、１、又は２）のアミノ酸が改変（例えば、置換）された、その変異体、ＣＤ８膜貫通ドメイン、又は１〜５（例えば、１、又は２）のアミノ酸が改変（例えば、置換）された、その変異体、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、又は１〜５（例えば、１、又は２）のアミノ酸が改変（例えば、置換）された、その変異体、ＣＤ３ゼータ膜貫通ドメイン、又は１〜５（例えば、１、又は２）のアミノ酸が改変（例えば、置換）された、その変異体、から選択される膜貫通ドメイン；共刺激ドメイン、例えば、ＣＤ２８共刺激ドメイン、又は１〜５（例えば、１、又は２）のアミノ酸が改変（例えば、置換）された、その変異体；４−１ＢＢ共刺激ドメイン、又は１〜５（例えば、１、又は２）のアミノ酸が改変（例えば、置換）された、その変異体；又は、ＣＤ２８共刺激ドメイン、又は１〜５（例えば、１、又は２）のアミノ酸が改変（例えば、置換）された、その変異体、及び４−１ＢＢ共刺激ドメイン、又は１〜５（例えば、１、又は２）のアミノ酸が改変（例えば、置換）された、その変異体；並びに、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン、又は１〜５（例えば、１、又は２）のアミノ酸が改変（例えば、置換）された、その変異体、を含む。
【００５０】
［００５８］  様々な実施形態では、共刺激ドメインは、ＣＤ２８共刺激ドメイン、又は１〜５（例えば、１、又は２）のアミノ酸が改変（例えば、置換）された、その変異体、４−１ＢＢ共刺激ドメイン、又は１〜５（例えば、１、又は２）のアミノ酸が改変（例えば、置換）された、その変異体、ＯＸ共刺激ドメイン、又は１〜５（例えば、１、又は２）のアミノ酸が改変（例えば、置換）された、その変異体、からなる群から選択される。ある実施形態では、４−１ＢＢ共刺激ドメイン、又は１〜５（例えば、１、又は２）のアミノ酸が改変（例えば、置換）された、その変異体、が存在する。いくつかの実施形態では、２つの共刺激ドメイン、例えば、ＣＤ２８共刺激ドメイン、又は１〜５（例えば、１、又は２）のアミノ酸が改変（例えば、置換）された、その変異体、及び４−１ＢＢ共刺激ドメイン、又は１〜５（例えば、１、又は２）のアミノ酸が改変（例えば、置換）された、その変異体が存在する。様々な実施形態では、１〜５（例えば、１、又は２）のアミノ酸の改変は、置換である。
【００５１】
［００５９］  いくつかの場合には、共刺激ドメインと、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインの間、及び／又は２つの共刺激ドメインの間に、１〜６のアミノ酸の短い配列（例えば、ＧＧ  Ｇ）が存在する。
【００５２】
［００６０］  さらなる実施形態では、当該ＣＡＲは、ＣＤ１９を標的とするｓｃＦｖ；ＣＤ２８共刺激ドメイン、又は１〜５（例えば、１、又は２）のアミノ酸が改変された、その変異体、４−１ＢＢ共刺激ドメイン、又は１〜５（例えば、１、又は２）のアミノ酸が改変された、その変異体、ＯＸ共刺激ドメイン、又は１〜５（例えば、１、又は２）のアミノ酸が改変された、その変異体、からなる群から選択される２つの異なる共刺激ドメイン；ＣＤ２８共刺激ドメイン、又は１〜２のアミノ酸が改変された、その変異体、４−１ＢＢ共刺激ドメイン、又は１〜２のアミノ酸が改変された、その変異体、ＯＸ共刺激ドメイン、又は１〜２のアミノ酸が改変された、その変異体、からなる群から選択される２つの異なる共刺激ドメイン；ＣＤ１９ｓｃＦｖ、又は１〜２のアミノ酸が改変された、その変異体；ＣＤ４膜貫通ドメイン、又は１〜２のアミノ酸が改変された、その変異体、ＣＤ８膜貫通ドメイン、又は１〜２のアミノ酸が改変された、その変異体、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、又は１〜２のアミノ酸が改変された、その変異体、ＣＤ３ゼータ膜貫通ドメイン、又は１〜２のアミノ酸が改変された、その変異体、から選択される膜貫通ドメイン；共刺激ドメイン、例えば、ＣＤ２８共刺激ドメイン、又は１〜５（１、又は２）のアミノ酸が改変（例えば、置換）された、その変異体；４−１ＢＢ共刺激ドメイン、又は１〜５（１、又は２）のアミノ酸が改変（例えば、置換）された、その変異体；又は、ＣＤ２８共刺激ドメイン、又は１〜５（例えば、１、又は２）のアミノ酸が改変（例えば、置換）された、その変異体、及び４−１ＢＢ共刺激ドメイン、又は１〜５（例えば、１、又は２）のアミノ酸が改変（例えば、置換）された、その変異体；並びに、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン、又は１〜２のアミノ酸が改変された、その変異体；ＣＤ１９ｓｃＦｖ、又はその変異体と、膜貫通ドメインとの間に位置するスペーサー領域（例えば、当該スペーサー領域は、配列番号２〜１２及び４２（表３）からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は１〜５（例えば、１、又は２）のアミノ酸が改変された、その変異体を含む）；ＩｇＧヒンジ領域を含む、当該スペーサー；１〜１５０のアミノ酸を含む、当該スペーサー領域；スペーサー不存在；配列番号２４のアミノ酸配列を含む、４−１ＢＢシグナル伝達ドメイン、配列番号２１のアミノ酸配列を含む、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン、及び当該共刺激ドメインと当該ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン、又はその変異体との間に位置する３〜１５個のアミノ酸のリンカー、を含む。共刺激ドメインが２つの場合の特定の実施形態では、１つは４−１ＢＢ共刺激ドメインであり、もう１つはＣＤ２８、及びＣＤ２８ｇｇから選択される共刺激ドメインである。いくつかの実施形態では、様々な実施形態では、１〜５（例えば、１、又は２）のアミノ酸の改変は、置換、例えば、保存的置換である。
【００５３】
［００６１］  本明細書の開示はまた、キメラ抗原レセプターをコードする発現カセットを含むベクターにより、形質導入されたヒトＴ細胞の集団であって、当該キメラ抗原レセプターが：ＣＤ１９を標的とするｓｃＦｖ；ＣＤ４膜貫通ドメイン、又は１〜５（例えば、１、又は２）のアミノ酸が改変（例えば、置換）された、その変異体、ＣＤ８膜貫通ドメイン、又は１〜５（例えば、１、又は２）のアミノ酸が改変（例えば、置換）された、その変異体、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、又は１〜５（例えば、１、又は２）のアミノ酸が改変（例えば、置換）された、その変異体、ＣＤ３ゼータ膜貫通ドメイン、又は１〜５（例えば、１、又は２）のアミノ酸が改変（例えば、置換）された、その変異体、から選択される膜貫通ドメイン；共刺激ドメイン、例えば、ＣＤ２８共刺激ドメイン、又は１〜５（例えば、１、又は２）のアミノ酸が改変（例えば、置換）された、その変異体；４−１ＢＢ共刺激ドメイン、又は１〜５（例えば、１、又は２）のアミノ酸が改変（例えば、置換）された、その変異体；又は、ＣＤ２８共刺激ドメイン、又は１〜５（例えば、１、又は２）のアミノ酸が改変（例えば、置換）された、その変異体、及び４−１ＢＢ共刺激ドメイン、又は１〜５（例えば、１、又は２）のアミノ酸が改変（例えば、置換）された、その変異体；並びに、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン、又は１〜５（例えば、１、又は２）のアミノ酸が改変（例えば、置換）された、その変異体、を含む。様々な実施形態では、当該ヒトＴ細胞の集団は、中心記憶Ｔ細胞（ＴＣＭ細胞）を含み、例えば、ヒトＴ細胞のうち、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％が、ＴＣＭ細胞であるか、又は当該Ｔ細胞の集団は、中心記憶Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞、及び幹中心記憶細胞（ＴＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ細胞）を含み、例えば、当該Ｔ細胞の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％が、ＴＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ細胞である。いずれの場合も、当該Ｔ細胞集団は、ＣＤ４＋細胞、及びＣＤ８＋細胞をともに含む（例えば、ＣＤ３＋Ｔ細胞の少なくとも２０％が、ＣＤ４＋であり、かつ、ＣＤ３＋Ｔ細胞の少なくとも３％が、ＣＤ８＋であり、かつ、少なくとも７０、８０、又は９０％がＣＤ４＋、又はＣＤ８＋である；当該ＣＤ３＋細胞の、少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％が、ＣＤ４＋であり、当該ＣＤ３＋細胞の、少なくとも４％、５％、８％、１０％、２０％が、ＣＤ８＋細胞である）。
【００５４】
［００６２］  本明細書の記載はまた、患者のがんを処置する方法であって、自己、又は同種ヒトＴ細胞の集団（例えば、中心記憶Ｔ細胞（ＴＣＭ細胞）、又は少なくとも当該細胞の２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％は、中心記憶Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞、及び幹中心記憶細胞の組合せ（すなわち、Ｔ細胞はＴＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ細胞）を含む、自己又は同種Ｔ細胞）を、投与する工程を含む方法である。いずれの場合も、Ｔ細胞の集団は、キメラ抗原レセプターをコードする発現カセットを含むベクターによって形質導入された、ＣＤ４＋細胞、及びＣＤ８＋細胞をともに含む（例えば、ＣＤ３＋Ｔ細胞の少なくとも２０％が、ＣＤ４＋であり、かつ、ＣＤ３＋Ｔ細胞の少なくとも３％が、ＣＤ８＋であり、かつ、少なくとも７０、８０、又は９０％がＣＤ４＋、又はＣＤ８＋である；当該ＣＤ３＋細胞の、少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％が、ＣＤ４＋であり、当該ＣＤ３＋細胞の、少なくとも４％、５％、８％、１０％、２０％が、ＣＤ８＋細胞である）。
【００５５】
［００６３］  ＣＤ１９  ＣＡＲは、ＣＤ１９結合ドメイン（例えば、ＣＤ１９ｓｃＦｖ）と膜貫通ドメインとの間に位置するスペーサー領域を含むことができる。様々な、異なるスペーサーを用いることができる。それらのいくつかとして、ヒトＦｃ領域の少なくとも部分、例えば、ヒトＦｃ領域のヒンジ部分、又はＣＨ３ドメイン、又は、それらの変異体があげられる。以下の表１は、本明細書に記載のＣＡＲで用いられうる、様々なスペーサーを提供する。
表１：スペーサーの例
【００５６】
【表１】
2020530303.tif 000004
［００６４］  いくつかのスペーサー領域は、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）ヒンジ領域、すなわち、免疫グロブリンのＣＨＩドメインとＣＨ２ドメインとの間にある当該配列、例えば、ＩｇＧ４  Ｆｅヒンジ、又はＣＤ８ヒンジの、全体、又は部分を含む。いくつかのスペーサー領域は、免疫グロブリンのＣＨ３ドメイン及びＣＨ２ドメインをともに、又はＣＨ３ドメインを含む。免疫グロブリン由来の配列は、１又はそれ以上のアミノ酸の改変、例えば、１、２、３、４、又は５の置換、例えば、オフターゲット結合を低下させる置換、を含むことができる。
【００５７】
［００６５］  「アミノ酸の改変」とは、タンパク質又はペプチド配列における、アミノ酸の置換、挿入、及び／又は欠失を意味し、「アミノ酸の置換」、又は「置換」とは、親ペプチド、又はタンパク質配列における、特定の位置のアミノ酸を、他のアミノ酸で置換することをいう。置換は、得られるタンパク質中のアミノ酸を、非保存的（すなわち、コドンを、特定の大きさ、又は特性があるアミノ酸のグループに属するアミノ酸から、他のグループに属するアミノ酸に、変化させることにより）に、又は保存的（すなわち、コドンを、特定の大きさ、又は特性があるアミノ酸のグループに属するアミノ酸から、同一グループに属するアミノ酸に、変化させることにより）に、変化させるように行うことができる。そのような保存的な変化では、一般に、結果として生じるタンパク質の構造、及び機能の変化はより少なくなる。以下は、様々なアミノ酸グループ分けの例である：１）非極性Ｒ基があるアミノ酸：アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン；２）非荷電の極性Ｒ基があるアミノ酸：グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン；３）荷電の極性Ｒ基があるアミノ酸（ｐＨ６．０で負に荷電）：アスパラギン酸、グルタミン酸；（４）塩基性アミノ酸（ｐＨ６．０で正に荷電）：リジン、アルギニン、ヒスチジン（ｐＨ６．０）。他のグループ分けとしては、フェニル基があるアミノ酸：フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンであってよい。
【００５８】
［００６６］  本明細書で考察される、免疫グロブリンにおけるアミノ酸の位置に関する、番号付けは、ＥＵインデックス、又はＥＵ番号付けスキームに従う（本明細書中にその全体が援用される、Kabat et al. 1991 Sequences of
Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., United States Public Health
Service, National Institutes of Health, Bethesda）。当該ＥＵインデックス、又はＫａｂａｔの文献に記載されるＥＵインデックス、又はＥＵ番号付けスキームは、ＥＵ抗体の番号付けをいう（Edelman et al. 1969 Proc Natl Acad
Sci USA 63:78-85）。
【００５９】
［００６７］  様々な膜貫通ドメインを用いることができる。表２には、適当な膜貫通ドメインの例が収録される。スペーサードメインが存在する場合、膜貫通ドメインは、当該スペーサードメインのカルボキシ末端に位置する。
【００６０】
表２：  膜貫通ドメインの例
【００６１】
【表２】
2020530303.tif 000005
［００６８］  本明細書に記載のＣＡＲの多くは、１又はそれ以上の（例えば、２つの）共刺激ドメインを含む。当該共刺激ドメインは、膜貫通ドメインと、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインとの間に位置する。表３には、適当な共刺激ドメインと、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインの配列が収録される。
【００６２】
表３：  ＣＤ３ゼータドメインと共刺激ドメインの例
【００６３】
【表３】
2020530303.tif 000006
【実施例１】
【００６４】
がんの腫瘍溶解性免疫療法用の新規で強力なキメラポックスウイルス
［００６９］  以下に、組換えウイルスに感染した細胞で、ヒトＣＤ１９を発現する、組換えキメラポックスウイルスの調製に用いうる、腫瘍溶解性アンカーである、キメラポックスウイルスを記載する。当該組換えウイルスはがん細胞に感染し、ＣＤ１９を発現させるからである。当該感染細胞は、ＣＤ１９指向性のＣＡＲにより、標的化されることができる。
【００６５】
［００７０］  組換えポックスウイルスを作製するのに用いられる、キメラポックスウイルスでは、異なるウイルス種由来の好ましい特徴が組み合わせられうるため、個々の野生型ウイルスよりも優れる。オルソポックスウイルスとパラポックスウイルスは抗原的に異なり、本研究で生成された、強力なキメラオルソポックスウイルスと強力なキメラパラポックスウイルスは、同じ治療計画で組み合わせると、最大の治療効果を達成しうる。２０１７年８月９日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／４６１６３号で詳細に説明されるように、分離株＃３３（配列番号１）、及び＃１８９（配列番号２）を含むキメラポックスウイルスを、キメラオルソポックスウイルス、及びキメラパラポックスウイルスのプールから生成した。分離株＃３３、及び＃１８９を含む、いくつかのキメラオルソポックスウイルス、及びパラポックスウイルス分離株の殺傷能は、各親野生型ウイルスと比較して、ＮＣＩ６０がん細胞株のパネルでは、優れていた。
【００６６】
［００７１］  キメラウイルスプールの生成及び各キメラウイルスの単離
牛痘ウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ＣＬ、Lederle-Chorioallantoic株、及びワクシニアウイルスＡＳ株を、各ウイルスの感染多重度（ＭＯＩ）を０．０１で、ＣＶ−１細胞に共感染させて、キメラオルソポックスウイルスのプールを作製した。ＭＤＢＫ細胞を羊痘ウイルスＮＺ２株、及び偽牛痘ウイルスＴＪＳ株に、ＭＯＩを０．１で共感染させて、キメラパラポックスウイルスのプールを作製した。本出願人のパイロット実験では、ＣＶ−１細胞は、本実験で用いた全てのオルソポックスウイルスに感受性であり、羊痘ウイルス、及び偽牛痘ウイルスは、ともにＭＤＢＫ細胞に感染して、プラークを形成することを示す。
【００６７】
［００７２］  キメラオルソポックスウイルスプールに感染したＣＶ−１細胞、及びキメラパラポックスウイルスプールに感染したＭＤＢＫ細胞から、１００のキメラオルソポックスウイルスプラーク、及び１００のキメラパラポックスウイルスプラークを、各々採取した。これらの２００のプラークをさらに２回、各細胞でプラーク精製し、クローン精製した個々のキメラウイルス分離株を２００株得た。ウイルス分離株♯１４−１１３は、キメラオルソポックスウイルス分離株であり、ウイルス分離株♯１１４−２１３は、キメラパラポックスウイルス分離株である。
【００６８】
［００７３］  ＮＣＩ−６０細胞株におけるハイスループットスクリーニングによる新規の強力なキメラポックスウイルス分離株の同定
キメラオルソポックスウイルス２００株、及びキメラパラポックスウイルス２００株、並びに親ウイルス株１１株、及び対照腫瘍溶解性ウイルス２株（ＧＬＶ−１ｈ６８、及びＯｎｃｏＶＥＸ  ＧＦＰ）の腫瘍細胞殺傷活性を評価し、ＮＣＩ−６０細胞株のパネルで比較した（表４）。ＧＬＶ−１ｈ６８は、最もよく研究されている腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの１つであり、現在臨床開発中である。ＯｎｃｏＶＥＸ  ＧＦＰは、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス１型であり、かつ、ＦＤＡが承認した最初の腫瘍溶解性ウイルスである、Ｔ−ＶＥＣと骨格が同じである。各細胞株を、各ウイルスにＭＯＩを０．０１で感染させた。感染９６時間後の細胞生存率を、ＭＴＳアッセイを用いて、測定した。このハイスループットスクリーニング実験で用いたウイルス量（ＭＯＩ  ０．０１）を意図的に低くして、強力な新規ウイルス分離株が目立つように最適化して、接着細胞株（ＮＣＩ−６０パネルの細胞株の大部分は接着細胞である）における細胞殺傷能を比較した。しかしながら、懸濁細胞株で、有意かつ一貫した細胞殺傷能を観察するには、このウイルス量は低すぎた。そこで、６つの白血病細胞株からの結果は、ウイルス比較分析には含めなかった。
【００６９】
［００７４］  表４．ＮＣＩ−６０細胞株のカタログ
【００７０】
【表４】
2020530303.tif 000007
2020530303.tif 000008
2020530303.tif 000009
［００７５］  １００の新規キメラオルソポックスウイルス分離株のうち、分離株＃１７（配列番号３）、及び＃３３（配列番号１）の細胞殺傷能は、ＮＣＩ−６０固形腫瘍細胞株において、親のオルソポックスウイルス株９株、及び対照ウイルス２株よりも、有意に優れていた（図１）。新規パラポックスウイルス分離株１００株のうち、分離株＃１８９（配列番号２）の細胞殺傷能は顕著であり、２つの親パラポックスウイルス株、及び対照ウイルスの細胞殺傷能よりも、有意に良好であった（図２）。３つの新規キメラウイルス分離株（＃１７、＃３３、＃１８９）はいずれも、ＭＯＩが０．０１という低値でも、大多数のＮＣＩ−６０固形がん細胞株で、有意な細胞死を惹起した。一般に、オルソポックスウイルス株、及びキメラオルソポックスウイルス株は、ＭＯＩが０．０１という低レベルで、パラポックスウイルス株、及びキメラパラポックスウイルス株よりも、がん細胞の殺傷効果が強かった。
【００７１】
［００７６］  新規ポックスウイルス分離株＃３３、及び＃１８９のゲノムＤＮＡを、精製ビリオンから単離し、１０００ｘを上回る範囲で、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｈｉｓｅｑ  ２５００を用いた次世代シークエンシングを行った。ギャップをＰＣＲ増幅し、サンガー配列決定により配列決定した。＃３３ゲノムの１８９，４１５塩基対（ｂｐｓ）を、完全に配列決定し、１８９のゲノムで、１３８，２０３ｂｐｓが得られた。ＧｅｎＢａｎｋに対する初期ＢＬＡＳＴ（Intitial  BLAST）では、＃３３、及び＃１８９のゲノム配列がともに、ＧｅｎＢａｎｋのどのゲノム配列とも同一ではないことが示された。＃３３は、オルソポックスウイルス株のうち、ワクシニアウイルス株に最も近い。＃１８９は、親パラポックスウイルスの１つである羊痘ウイルスＮＺ２株に、極めて近い。羊痘ウイルスＮＺ２株で同定されたすべてのＯＲＦのヌクレオチド配列は、＃１８９のものと同一である。羊痘ウイルスＮＺ２株と比較すると、＃１８９のゲノムの６７５５位に１の「Ｇ」が挿入されている。逆方向末端反復領域には、１の反復配列エレメントのコピーが欠失し、＃１８９ゲノムに１の他の反復配列エレメントのコピーが挿入されている。全体として、＃３３及び＃１８９はいずれも、新規で固有なポックスウイルス分離株である。
【００７２】
［００７７］  全てのがん細胞株を、ＲＰＭＩ−１６４０（Mediatech、Manassas、VA）で増殖させた。アフリカミドリザル腎線維芽細胞（ＣＶ−１）、及び牛腎上皮細胞（ＭＤＢＫ）をAmerican  Type  Culture  Collection（ＡＴＣＣ；  Rockville,MD,USA）から入手し、ＤＭＥＭ（Mediatech,Manassas,VA）で増殖させた。全ての培地に、１０％ＦＢＳ（Mediatech,Manassas,VA）、及び１％ペニシリン−ストレプトマイシン溶液（Mediatech,Manassas,VA）を添加した。細胞を５％ＣＣ下、３７℃で培養した。
【００７３】
［００７８］  ウイルス：牛痘ウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ＣＬ、Lederle-Chorioallantoic株、及びワクシニアウイルスＡＳ株、又は羊痘ウイルスＮＺ２株、偽牛痘ウイルスＴＪＳ株は、ＡＴＣＣから購入した。すべてのオルソポックスウイルス株は、ＣＶ−１細胞で増殖させ、滴定した。パラポックスウイルス株を、ＭＤＢＫ細胞で、増殖させ、滴定した。
【００７４】
［００７９］  キメラオルソポックスウイルス及びキメラパラポックスウイルスのプールの生成、ならびに個々のクローン性キメラウイルス分離株の分離：牛痘ウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、Ｅｌｓｔｒｅｅ株、ＣＬ株、Lederle-Chorioallantoic株、及びワクシニアウイルスＡＳ株を、ウイルス当たり０．０１の感染多重度（ＭＯＩ）で、ＣＶ−１細胞に共感染させて、キメラオルソポックスウイルスのプールを、生成した。ＭＤＢＫ細胞を、羊痘ウイルスＮＺ２株、及び偽牛痘ウイルスＴＪＳ株にＭＯＩを０．１で共感染させて、キメラパラポックスウイルスのプールを作製した。感染３日後に感染細胞を採取した。初期キメラオルソポックスウイルスプールを、さらに、ＣＶ−１細胞で、０．１のＭＯＩで３回、継代し、初期キメラパラポックスウイルスプールを、さらに、ＭＤＢＫ細胞で、０．１のＭＯＩで３回、継代した。３回さらに継代した。１００のキメラオルソポックスウイルスプラークを、最終キメラオルソポックスウイルスプールに感染したＣＶ−１細胞から採取し、１００のキメラパラポックスウイルスプラークを、最終キメラパラポックスウイルスプールに感染したＭＤＢＫ細胞から、採取した。当該２００のプラークをさらに２回、各細胞でプラーク精製し、クローン精製したキメラウイルス分離株２００株を各々得た。
【００７５】
［００８０］  ＮＣＩ−６０がん細胞株、並びにＰＡＮＣ１、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２、ＢｘＰＣ３、ＦＧ、Ｃａｐａｎ−２、及びＳｕ．８６．８６を含む膵がん細胞株のパネルを、滅菌条件下、ｅｐＭｏｔｉｏｎ５０７５液体ハンドラー（Eppendorf）を用いて、９６穴プレート（固形腫瘍細胞株は、３０００細胞／穴、白血病細胞株は、５０００細胞／穴）に分注し、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２下、３７℃で一晩インキュベートした。その後、細胞を、ＭＯＩを０．０１で、キメラオルソポックスウイルス及びキメラパラポックスウイルス分離株２００株、並びに親ウイルス１１株、及び対照腫瘍溶解性ウイルスＧＬＶ−１ｈ６８、及びＯｎｃｏＶＥＸ  ＧＦＰ２株に共感染させた。ＭＴＳアッセイ（Promega）を用いて、感染９６時間後の細胞生存率を測定した。自動化ＢＭＧ  ＰＨＥＲＡＳＴＡプレートリーダー（BMG  Labtech）を用いて、４９０ｎｍでの吸光度を、測定した。各実験を二重に行った。Ｍｏｃｋ感染細胞の細胞生存率を１００％とした。
【００７６】
［００８１］  ＭＫ  −４５、ＯＣＵＭ−２Ｍ、及びＫＡＴＯ−３の各細胞を、一穴当たり３，０００細胞の濃度で９６穴プレートに播種し、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２下、３７℃で一晩インキュベートした。細胞を、ＭＯＩを０．０１、０．１、及び１で、＃３３、＃１８９、ＧＬＶ−１ｈ６８、及びＯｎｃｏＶＥＸ  ＧＦＰに感染させた。ＭＴＳアッセイを用いて、３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２下で、細胞生存率を、４日間毎日モニターした。
【００７７】
［００８２］  WizardゲノムDNA精製キット（Promega）を用いて、精製ビリオンから＃３３、及び＃１８９のゲノムＤＮＡを抽出し、超音波処理を行って、断片化した。ライブラリーの調製には、ＫＡＰＡ  ＬＴＰライブラリー調製キットを用いた。配列決定は、Illumina  Hiseq  2500を用いて行った。
【実施例２】
【００７８】
膵がん細胞株におけるハイスループットスクリーニング
［００８３］  ＮＣＩ−６０がん細胞株は、８つの異なる臓器由来の固形がんしか含まない（表４参照）。ＮＣＩ−６０がん細胞株から得られた結果が、他の臓器の固形がんで再現されることを検討するため、６種類の膵がん細胞株（ＢｘＰＣ３、ＦＧ、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２、Ｃａｐａｎ−２、ＰＡＮＣ−１、及びＳＵ．８６．８６）に、ＮＣＩ−６０がん細胞株のハイスループットスクリーニングで用いたウイルスと同じウイルスを、ＭＯＩを０．１で、感染させた。ＭＴＳアッセイを用いて、感染９６時間後の細胞生存率を再度測定した。全てのキメラオルソポックスウイルス分離株のうち、キメラオルソポックスウイルス分離株＃１７、及び＃３３の細胞殺傷能が最良であり、全てのキメラパラポックスウイルス分離株のうち、キメラパラポックスウイルス分離株＃１８９の細胞殺傷能が最良であった。表５、図３、及び図４に示すように、それらは、各親ウイルス株、並びに対照ウイルスＧＬＶ−１ｈ６８、及びＯｎｃｏＶＥＸ  ＧＦＰの膵臓がん細胞株の殺傷能よりも、すべて良好であった。すなわち、ＮＣＩ−６０がん細胞株で得られた結果の、膵臓がん細胞株のパネルにおける再現性は、極めて良好であった。
表５：膵がん細胞の生存
【００７９】
【表５】
2020530303.tif 000010
【実施例３】
【００８０】
新規キメラオルソポックスウイルス分離株＃３３及びキメラパラポックスウイルス分離株＃１８９は、胃がん細胞株において強力な細胞殺傷能を呈する
［００８４］  ＮＣＩ−６０がん細胞株、及び膵がん細胞株パネルのハイスループットスクリーニングの結果に基づき、新たなキメラオルソポックスウイルス分離株＃３３、及びキメラパラポックスウイルス分離株＃１８９を選択して、さらなる特徴付けに供した。分離株＃３３、及び＃１８９の腫瘍細胞殺傷活性を、３つの胃がん細胞株でさらに検討した。ＭＫＮ−４５、ＯＣＵＭ−２Ｍ、及びＫＡＴＯ−３細胞を、ＭＯＩを０．０１、０．１、及び１で、＃３３、＃１８９、ＧＬＶ−１ｈ６８、及びＯｎｃｏＶＥＸ  ＧＦＰで感染させた。ＭＴＳアッセイを用いて、細胞生存率を、４日間毎日モニターした。ＭＫＮ−４５、及びＯＣＵＭ−２Ｍ細胞株は、＃３３株に対して最も感受性が高く、ＯｎｃｏＶＥＸ  ＧＦＰに対する感受性は中程度であり、ＧＬＶ−１ｈ６８に対する感受性は最も低かった。一方、ＫＡＴＯ−３は、０．０１の低ＭＯＩで、ＯｎｃｏＶＥＸ  ＧＦＰに対して最も感受性が高かったが、＃３３、＃１８９、及びＯｎｃｏＶＥＸ  ＧＦＰは、高ＭＯＩ（０．１、及び１）では、ＫＡＴＯ−３細胞を等しく殺傷した。ＫＡＴＯ‐３細胞は、ＧＬＶ−１ｈ６８に対して最も感受性が低かった。全体として、＃３３は、最も効率的に胃がん細胞株を殺傷させた一方で、ＧＬＶ−１ｈ６８の胃がん細胞株の殺傷能は、最低であった（図５Ａ〜Ｃ）。
【００８１】
［００８５］  表６（略語として、ＩＭＶ：細胞内成熟ウイルス；ＩＥＶ：細胞内エンベロープウイルス；ＥＥＶ：細胞外エンベロープウイルス）に示されるように、すべての配列決定がなされたＣｈＰＶに存在する９０個の遺伝子は、公知の機能と共にリストアップされている。遺伝子は、ＶＡＣＶ−ＣＯＰに対応する遺伝子にちなんで命名される。星印＊は、２つのＥｎＰＶにも存在する遺伝子を示す。表３は、その全体が全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれるＧｕｂｓｅｒら（Gubser,  C,  Hue,  S.,  Kellam,  P.,  and  Smith,  G.L.(2004).  Poxvirus  genomes:  a  phylogenetic  analysis.  J  Gen  Virol  85,  105-117）から編集される。
【００８２】
［００８６］  表６．コードポックスウイルスの最小遺伝子相補体（Complement）
【００８３】
【表６】
2020530303.tif 000011
【００８４】
【表７】
2020530303.tif 000012
【実施例４】
【００８５】
組換えキメラポックスウイルスの構築
外来遺伝子発現カセットを＃３３キメラポックスウイルスゲノムへ挿入するシャトルベクターの構築
［００８７］  チミジンキナーゼ（ＴＫ）シャトルベクターを構築するために、Q5  High-Fidelity  2X  Master  Mix（New  England  Biolabs,Ipswich,ＭＡ）、及び以下のプライマー：
【００８６】
【化３】
2020530303.tif 000013
を用いて、＃３３ゲノムＤＮＡ由来の＃３３キメラポックスウイルスの７ＸＴ遺伝子の左右の隣接配列を、ＰＣＲで増幅した。２つの断片を、オーバーラッピング伸長による遺伝子スプライシング法を用いて、連結した。得られた断片をＮｄｅｌ、及びＥｃｏＲＩで消化し、同一切断型プラスミドｐＧＰＴにクローニングして、ｐ３３ＮＣ−ＴＫを得た。シャトルベクター中のＴＫの隣接配列を、配列決定により確認した。ｐ３３ＮＣ−ＴＫは、Ｓａｃｌ、Ｓａｉｌ、ＢａｍＨＩ、Ｎｈｅｌ、及びＮｏｔｌで分離したTKの左右の隣接配列、並びに一過性優性選択マーカーとしての、ワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）初期プロモーターｐ７．５Ｅにより駆動される大腸菌グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）遺伝子を含む。
【００８７】
［００８８］  Ｆ１４．５Ｌシャトルベクターも同様に、構築した。＃３３キメラポックスウイルスのＦ１４．５Ｌ遺伝子の左右の隣接配列を、Q5  High-Fidelity  2X  Master  Mix（New  England  Biolabs,Ipswich,ＭＡ）、及び以下のプライマー：
【００８８】
【化４】
2020530303.tif 000014
を用いて、＃３３ゲノムＤＮＡからＰＣＲで増幅した。２つの断片を、オーバーラッピング伸長による遺伝子スプライシング法を用いて、連結した。得られた断片を、Ｎｄｅｌ、及びＥｃｏＲＩで消化し、同一切断型プラスミドｐＧＰＴにクローニングして、ｐ３３ＮＣ−Ｆ１４．５Ｌを得た。シャトルベクター中のＦ１４．５Ｌの隣接配列を、配列決定により確認した。ｐ３３ＮＣ−Ｆ１４．５Ｌは、Ｈｉｎｄｌｌ、Ｓａｃｌ、Ｘｈｏｌ、ＢａｍＨＩ、Ｎｈｅｌ、及びＮｏｔｌで分離したＦ１４．５Ｌの左右の隣接配列、並びに一過性優性選択マーカーとしての、ＶＡＣＶ初期プロモーターｐ７．５Ｅにより駆動される大腸菌ｇｐｔ遺伝子を含む。
【実施例５】
【００８９】
ＣＤ１９ｔを発現する組換えキメラポックスウイルスは、ＣＤ１９を標的とするＣＡＲの標的を提供する
［００８９］  以下の実験では、２つの乳がん細胞株、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８ｗｔ（トリプルネガティブ乳がん細胞株）、親株、及びシグナル伝達ドメイン（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８−ＣＤ１９ｔ）欠損切断型ヒトＣＤ１９を発現するように改変されたＭＤＡ−ＭＢ−４６８の変異体を、用いた。図６に示すように、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８−ＣＤ１９ｔはＣＤ１９ｔを発現する。ＣＤ１９を標的とするＣＡＲを発現するように改変されたＴ細胞（以下により詳細に記載）も用いた。これらのＴ細胞によって発現されるＣＡＲは、図７に模式的に示されるが、ＣＤ１９を標的とするｓｃＦｖ、及びＩｇＧ４スペーサー、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８共刺激ドメイン、及びＣＤ３ゼータを含む。このＣＡＲ、及び切断ＥＧＦＲをコードする配列を、レンチウイルスベクターに挿入し、この組換えベクターを用いて、ＰＢＭＣを形質導入した。切断型ＥＧＦＲは、ＣＡＲの発現のマーカーとして、用いることができる。図８に示すように、Mock形質転換ＰＢＭＣ、及びＣＤ１９  ＣＡＲを発現する組換えレンチウイルスで形質転換されたＰＢＭＣによる、ＥＧＦＲ発現を、切断型ＥＧＦＲと比較すると、当該形質転換細胞は、導入遺伝子を効果的に発現することが示される。
【００９０】
［００９０］  キメラポックスウイルス＃３３を、切断型ＣＤ１９組換え腫瘍溶解性ウイルス（３３−ＣＤ１９ｔ）を発現するように設計した。ＣＤ１９を発現しない、ＭＤＡ−ＭＢ−４８腫瘍細胞を、異なるＭＯＩで、組換え腫瘍溶解性ウイルス３３−ＣＤ１９ｔ、及び模擬Mock形質転換Ｔ細胞に曝露した。図９の上のパネルに示されるように、組換え腫瘍溶解性ウイルス３３−ＣＤ１９ｔのレベルが高まると、ＣＤ１９発現が高まり、細胞数が低下した。図９の下のパネルは、ＭＤＡ−ＭＢ−４８腫瘍細胞を、異なるＭＯＩで、組換え腫瘍溶解性ウイルス３３−ＣＤ１９ｔ、及びＣＤ１９標的化ＣＡＲを発現する、形質転換Ｔ細胞に曝露した場合の結果を示す。ＣＤ１９ｔを発現するＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞の数は、大幅に減少したことが明らかである。
【００９１】
［００９１］  図１０は、長期殺傷アッセイにおける、ＩＬ−２（下段）、及びＩＦＮ−γ（上段）のレベルを測定した実験結果を示す。本実験では、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞を、組換え腫瘍溶解性ウイルス３３−ＣＤ１９ｔのみ；組換え腫瘍溶解性ウイルス３３ＣＤ１９ｔ、及びMock形質転換Ｔ細胞；又は、組換え腫瘍溶解性ウイルス３３−ＣＤ１９ｔ及びＣＤ１９標的ＣＡＲを発現する形質転換Ｔ細胞に曝露した。
【００９２】
［００９２］  図１１は、細胞殺傷アッセイで得られた細胞培養物の一連の画像である。本実験では、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞を、Mock形質転換Ｔ細胞、又はＣＤ１９標的ＣＡＲを発現する形質転換Ｔ細胞の存在下で、ＭＯＩ＝１の組換え腫瘍溶解性ウイルス３３−ＣＤ１９ｔに、曝露した。当該画像の上部は、組換え腫瘍溶解性ウイルス３３−ＣＤ１９ｔの非存在下で培養されたＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞、又はＣＤ１９標的ＣＡＲを発現する形質転換されたＴ細胞のいずれかである。
【００９３】
［００９３］  図１２は、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞、又はＭＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、組換え腫瘍溶解性ウイルス３３−ＣＤ１９ｔのみ（異なるＭＯＩで）；組換え腫瘍溶解性ウイルス３３−ＣＤ１９ｔ（異なるＭＯＩで）、及びMock形質転換Ｔ細胞；又は組換え腫瘍溶解性ウイルス３３−ＣＤ１９ｔ（異なるＭＯＩで）、及びＣＤ１９標的ＣＡＲを発現する形質転換Ｔ細胞、と共に培養した、長期細胞殺傷アッセイの結果を示す。腫瘍細胞殺傷、及びＣＤ１９ｔ発現を測定した。
【００９４】
［００９４］  総じて、本実施例の実験から、１）組換え腫瘍溶解性ウイルス３３−ＣＤ１９ｔに曝露されたＭＤＡ−ＭＢ−４８細胞におけるＣＤ１９ｔ発現は、ＭＯＩが増えると、高まる；２）ＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞の存在下で組換え腫瘍溶解性ウイルス３３−ＣＤ１９ｔに曝露されたＭＤＡ−ＭＢ−４８細胞のＴ細胞は、ＭＯＩが増えると、ＩＬ−２、及びＩＦＮ−γの産生レベルが高まる；及び、３）ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、組換え腫瘍溶解性ウイルス３３−ＣＤ１９１に曝露されたＭＤＡ−ＭＢ−４８細胞に効能がある、ことが示された。
【実施例６】
【００９５】
ＣＤ１９ｔを発現する組換えキメラポックスウイルスを、ＣＤ１９  ＣＡＲと併用すると、ＴＮＢＣ異種移植モデルに効果を発揮する
［００９５］  図１３に示すように、腫瘍溶解性ウイルスは、ＣＤ１９ｔを固形腫瘍に効果的に送達し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞を活性化させることができる。図１３パネルＡは、ワクシニア腫瘍溶解性ウイルス［ＣＦ３３−（ＳＥ）ｈＣＤ１９ｔ］の概略図であり、Ｊ２Ｒ遺伝子座に、チミジンキナーゼ遺伝子を置換して、挿入された合成初期プロモーター（ＰＳＥ）の制御下での、切断型ヒトＣＤ１９（ＣＤ１９ｔ）の取り込みを示す。図１３パネルＢは、ＯＶ１９ｔを、ＭＯＩを０．０２５（左）、及びＭＯＩを１（中央）で、２４時間感染させたＭＤＡＭＢ−４６８細胞、又はレンチウイルスを形質導入してＣＤ１９ｔを安定発現させた細胞（右）の、免疫蛍光顕微鏡検査を示す。画像の倍率は１０ｘ、挿入画像の倍率は４０ｘである。図１３パネルＣは、ＭＯＩを増加させた、ＯＶ１９ｔ感染２４時間後のフローサイトメトリーで測定した、ＭＤＡ−ＭＢ４６８腫瘍細胞上のＣＤ１９ｔの細胞表面発現、及びワクシニアウイルスの細胞内発現を示す、ＦＡＣＳプロットのセットである。図１３パネルＤは、ＯＶ１９ｔを、示されたＭＯＩで共培養してから、２４、４８、及び７２時間後の、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８腫瘍細胞のＣＤ１９ｔ（左）、ワクシニア（中央）、及び生存率（右）の定量を示す。パネルＥは、Ｍｏｃｋ  （非形質導入）、又はＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞を、エフェクター：腫瘍（E:T）比率１：２で、ＯＶ１９ｔの示したＭＯＩでの処理の有無により、腫瘍細胞と共培養してから２４時間後の、ＣＤ２５（左）、及びＣＤ１３７（右）発現の定量を示す。
【００９６】
［００９６］  図１４に示されるように、ＯＶ１９ｔ腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍細胞におけるＣＤ１９ｔの発現を推進でき、これにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、ＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化、及び細胞毒性が再志向される。図１４パネルＡは、Ｅ：Ｔ比を１：１、ＯＶ１９ｔの示したＭＯＩでの処理の有無により、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８腫瘍細胞との共培養１６時間後の、CD8+CAR+T細胞における、細胞表面ＣＤ１０７ａ（左）、及び細胞内ＩＦＮｙ発現（右）を示す、代表的なフローサイトメトリー分析である。図１４パネルBは、ＯＶ１９ｔの示したＭＯＩでの処理の有無により、共培養２４、４８、及び７２時間後に収集した上清を、ＥＬＩＳＡで測定した、ＩＦＮｙ産生を示す。図１４パネルＣは、Ｍｏｃｋ、又はＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞を、ＯＶ１９ｔの示したＭＯＩでの処理の有無により、ＭＤＡＭＢ−４６８腫瘍細胞との共培養２４、４８、又は７２時間後に比較する、フローサイトメトリーによって評価した、腫瘍殺傷アッセイを示す。図１４パネルＤは、パネルＣに記載された殺傷アッセイでの腫瘍細胞上のＣＤ１９ｔ発現を示し、パネルＤは、OV１９ｔを示したＭＯＩで処理した腫瘍細胞、及びＴ細胞の共培養で、収集した上清におけるウイルス力価を示す。
【００９７】
［００９７］  図１５に示すように、ＯＶ１９ｔとＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞との併用療法は、ＴＮＢＣ異種移植モデルで、効果が示された。図１５パネルＡは、マウスを皮下ＭＤＡ−ＭＢ−４６８腫瘍（５×１０６細胞）で生着させ、１匹当たり０、１０５、１０６、又は１０７プラーク形成単位（ｐｆｕ）で腫瘍内処理し、処理後３日目（左）、７日目（中央）、又は１０日目（右）に回収し、フローサイトメトリーにより、ＣＤ１９ｔ発現の定量化を行ったことを示す。（＋）は、予めレンチウイルスで形質導入してＣＤ１９１を安定発現させたＭＤＡ−ＭＢ−４６８腫瘍を示す。図１５パネルＢは、０日目に、皮下にＭＤＡ−ＭＢ４６８腫瘍（５ｘ１０６細胞）があるＮＳＧマウスを、３６日目に、ＯＶ１９ｔ（１０７ｐｆｕ）で処理した、腫瘍体積（ｍｍ３）を示す。４６日目、マウスを、Ｍｏｃｋ、又はＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞（５ｘ１０６細胞）のいずれかで処理した。図１５パネルＣは、パネルＢに記載されたin  vivo実験における、７３日目の平均腫瘍体積を示す。図１５パネルＤは、難治性固形腫瘍にＣＡＲ標的を導入するためにＯＶを利用する併用療法の概念を示す概略図である。
【図１】
2020530303.tif 000015
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１５Ａ】
2020530303.tif 000041
【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｅ】
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【国際調査報告】
2020530303.tif 000045
2020530303.tif 000046