(57)【要約】  キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように改変された操作されたナチュラルキラー細胞を提供する。この細胞は、必要に応じて、腫瘍特異的細胞傷害性および腫瘍部位へのホーミングを改善する他の改変を含む。また、癌を有する患者を治療するために、操作されたナチュラルキラー細胞を使用する方法もまた企図される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ３８発現癌の治療に使用するための、ＣＤ３８に対するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞。
【請求項２】
前記ＮＫ細胞がＥ−セレクチンリガンドを発現する、請求項１に記載の使用するためのＮＫ細胞。
【請求項３】
前記ＮＫ細胞がＨＥＣＡ−４５２抗体を結合する、請求項１または２に記載の使用するためのＮＫ細胞。
【請求項４】
前記ＮＫ細胞がＫＨＹＧ−１細胞である、先行する請求項のいずれかに記載の使用するためのＮＫ細胞。
【請求項５】
前記ＣＤ３８  ＣＡＲが、ダラツムマブよりもＣＤ３８に対してより低い親和性を有する、先行する請求項のいずれかに記載の使用するためのＮＫ細胞。
【請求項６】
前記ＣＤ３８  ＣＡＲ発現ＮＫ細胞が、ＣＤ３８発現癌細胞に対するそれらの親和性と比較して、ＣＤ３８を発現する正常（非悪性）細胞に対して減少した親和性を有する、先行する請求項のいずれかに記載の使用するためのＮＫ細胞。
【請求項７】
前記ＣＤ３８発現癌が血液癌である、先行する請求項のいずれかに記載の使用するためのＮＫ細胞。
【請求項８】
前記ＣＤ３８発現癌が多発性骨髄腫（ＭＭ）である、先行する請求項のいずれかに記載の使用するためのＮＫ細胞。
【請求項９】
前記ＣＤ３８  ＣＡＲが、配列番号１または配列番号７を含む重鎖可変領域を含む、先行する請求項のいずれかに記載の使用するためのＮＫ細胞。
【請求項１０】
前記ＣＤ３８  ＣＡＲが、配列番号２９、３０および３１中の重鎖ＣＤＲの１つまたはそれ以上あるいは全てを含む、先行する請求項のいずれかに記載の使用するためのＮＫ細胞。
【請求項１１】
前記ＣＤ３８  ＣＡＲが、配列番号３２、３３および３４中の重鎖ＣＤＲの１つまたはそれ以上あるいは全てを含む、先行する請求項のいずれかに記載の使用するためのＮＫ細胞。
【請求項１２】
前記ＣＤ３８  ＣＡＲが、配列番号２３または配列番号２８を含む軽鎖可変領域を含む、先行する請求項のいずれかに記載の使用のためのＮＫ細胞。
【請求項１３】
前記ＣＤ３８  ＣＡＲが、配列番号３５、３６および３７中の軽鎖ＣＤＲの１つまたはそれ以上あるいは全てを含む、先行する請求項のいずれかに記載の使用するためのＮＫ細胞。
【請求項１４】
前記ＣＤ３８  ＣＡＲが、配列番号３８、３９および４０中の軽鎖ＣＤＲの１つまたはそれ以上あるいは全てを含む、先行する請求項のいずれかに記載の使用するためのＮＫ細胞。
【請求項１５】
前記ＣＤ３８  ＣＡＲが、配列番号４１、配列番号４２および配列番号４３から選択される１つまたはそれ以上の共刺激ドメインを含む、先行する請求項のいずれかに記載の使用するためのＮＫ細胞。
【請求項１６】
前記ＮＫ細胞が、野生型ＴＲＡＩＬと比べて、ＴＲＡＩＬ細胞死受容体に対して増大した親和性を有するＴＲＡＩＬ改変体を発現するように改変されている、先行する請求項のいずれかに記載の使用するためのＮＫ細胞。
【請求項１７】
ＣＤ３８に対するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＫＨＹＧ−１細胞を含む組成物。
【請求項１８】
前記ＣＤ３８  ＣＡＲが、配列番号３２、３３および３４中の重鎖ＣＤＲの１つまたはそれ以上あるいは全てを含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ＣＤ３８  ＣＡＲが、配列番号３５、３６および３７中の軽鎖ＣＤＲの１つまたはそれ以上あるいは全てを含む、請求項１７または１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ＮＫ細胞が、野生型ＴＲＡＩＬと比べて、ＴＲＡＩＬ細胞死受容体に対して増大した親和性を有するＴＲＡＩＬ改変体を発現するように改変されている、請求項１７から１９のいずれかに記載の組成物。
【請求項２１】
前記ＣＤ３８  ＣＡＲが、配列番号１を含む重鎖可変領域および配列番号２３を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１７から２０のいずれかに記載の組成物。
【請求項２２】
前記組成物が医薬組成物である、請求項１７から２１のいずれかに記載の組成物。
【請求項２３】
ＣＤ３８に対するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を患者に投与することにより、ＣＤ３８発現癌を治療する方法。
【請求項２４】
前記ＮＫ細胞がＥ−セレクチンリガンドを発現する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＮＫ細胞がＨＥＣＡ−４５２抗体に結合する、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＮＫ細胞がＫＨＹＧ−１細胞である、請求項２３から２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記癌が血液癌である、請求項２３から２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記ＣＤ３８発現癌が多発性骨髄腫（ＭＭ）である、請求項２３から２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記ＣＤ３８  ＣＡＲが、配列番号１または配列番号７を含む重鎖可変領域を含む、請求項２３から２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記ＣＤ３８  ＣＡＲが、配列番号２９、３０および３１中の重鎖ＣＤＲの１つまたはそれ以上あるいは全てを含む、請求項２３から２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記ＣＤ３８  ＣＡＲが、配列番号３２、３３、および３４中の重鎖ＣＤＲの１つまたはそれ以上あるいは全てを含む、請求項２３から３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記ＣＤ３８  ＣＡＲが、配列番号２３または配列番号２８を含む軽鎖可変領域を含む、請求項２３から３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
前記ＣＤ３８  ＣＡＲが、配列番号３５、３６および３７中の軽鎖ＣＤＲの１つまたはそれ以上あるいは全てを含む、請求項２３から３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
前記ＣＤ３８  ＣＡＲが、配列番号３８、３９および４０中の軽鎖ＣＤＲの１つまたはそれ以上あるいは全てを含む、請求項２３から３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
前記ＣＤ３８  ＣＡＲが、配列番号４１、配列番号４２および配列番号４３から選択される１つまたはそれ以上の共刺激ドメインを含む、請求項２３から３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
前記ＮＫ細胞が、野生型ＴＲＡＩＬと比べて、ＴＲＡＩＬ細胞死受容体に対して増大した親和性を有するＴＲＡＩＬ改変体を発現するように改変されている、請求項２３から３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
ＣＤ３８に対するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を患者に投与することによってＣＤ３８発現多発性骨髄腫を治療する方法であって、該ＣＤ３８  ＣＡＲが、配列番号１を含む重鎖可変領域および配列番号２３を含む軽鎖可変領域を含む、方法。
【請求項３８】
ＣＤ３８に対するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を患者に投与することによってＣＤ３８発現多発性骨髄腫を治療する方法であって、該ＣＤ３８  ＣＡＲが、配列番号１を含む重鎖可変領域および配列番号２３を含む軽鎖可変領域を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌を治療するための改変ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞またはＮＫ細胞株を用いた治療方法に関する。治療方法および細胞組成もまた、特に血液癌の治療において、本発明の一部を形成する。
【背景技術】
【０００２】
ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）は、自然免疫機能において役割を果たす末梢血リンパ球である。ＮＫ細胞は、健康な細胞とウイルス感染細胞または形質転換（癌性）細胞との間の識別を担う様々な活性化および抑制性受容体を発現する。Ｔ細胞とは異なり、ＮＫ細胞は抗原非依存的に標的細胞に細胞傷害作用を及ぼす。結果として、ＮＫ細胞は抗原プライミングを必要とせず、そして特異的抗原の非存在下で強い細胞毒性を示し得る。
【０００３】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、細胞傷害性Ｔ細胞を特定の細胞型および組織に標的化するために最近開発された。ほとんどのＣＡＲは、抗体由来の抗原認識ドメイン、ならびにＴ細胞シグナル伝達に関与する免疫シグナル伝達タンパク質由来の膜貫通および細胞内部分を有し、したがって、標的細胞集団に発現している標的抗原に結合するＴ細胞の細胞傷害機能の活性化を可能にする。
【０００４】
より詳細には、ＣＡＲは、免疫エフェクター細胞、本発明の場合にはＮＫ細胞に特定の抗原特異性を導入する組換え抗原受容体である。ＣＡＲは、免疫エフェクター細胞に導入された外因性ポリヌクレオチドから発現された規定のポリペプチド配列を含む。キメラ抗原受容体は、リーダー配列、標的ドメイン、膜貫通ドメイン、および１つまたはそれ以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。適切には、標的ドメインは抗体分子に由来し、ＣＡＲに抗原特異性を付与する抗体分子由来の１つまたはそれ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。適切には、本発明の操作されたＮＫ細胞において使用するためのＣＡＲの標的ドメインは一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。ｓｃＦｖは、免疫グロブリン軽鎖の可変鎖部分、および柔軟なリンカーポリペプチドによって分離された免疫グロブリン重鎖分子を含む。柔軟なポリペプチドリンカーは、重鎖および軽鎖が互いに会合し、そして免疫グロブリン抗原結合ドメインを再構成することを可能にする。
【０００５】
ＮＫ−ＣＡＲ細胞を用いた代替的なそして好ましくは改善された癌療法に対する必要性が存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、ＮＫ細胞のみに依存する治療方法よりも癌の治療においてより効果的なＮＫ−ＣＡＲ細胞およびＮＫ−ＣＡＲ細胞株を提供することである。より特定の実施形態は、自己標的化のような細胞ベースの治療方法に共通の問題を回避する一方で、同定された癌（例えば、血液癌）の治療方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ＣＤ３８発現癌の治療に使用するためのＣＤ３８に対するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を提供する。
【０００８】
本発明はさらに、ＣＤ３８に対するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＫＨＹＧ−１細胞を含む組成物を提供する。
【０００９】
本発明はさらに、ＣＤ３８に対するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を患者に投与することによりＣＤ３８発現癌を治療する方法を提供する。
【００１０】
本発明は、少なくとも１つのキメラ抗原受容体を用いて操作された初代細胞および細胞株の両方のＮＫ細胞を含む医薬組成物を提供する。これらの組成物は、固形腫瘍および血液（血液）癌の両方の癌の治療に有用である。その使用方法および製造方法も記載されている。本明細書に記載の医薬組成物は、キメラ抗原受容体を発現する、初代ＮＫ細胞およびＫＨＹＧ−１などのＮＫ細胞株を含む。適切には、ＣＡＲは癌関連抗原を標的とする。例えば、癌関連抗原は、ＣＤ３８、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ−７、ＴＮＦＲＳＦ１７／ＢＣＭＡ、ＳＹＮＤ１／ＣＤ１３８、ＣＤ２２９、ＣＤ４７、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＣＤ１２３／ＩＬ３−ＲＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、メソテリン、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、Ｔｎ抗原、ＮＥＵ５ＧＣ、ＮｅｕＧｃＧＭ３、ＧＤ２、ＣＬＬ−１、またはＨＥＲＶ−Ｋを含み得る。ある特定の実施形態では、キメラ抗原受容体はＣＤ３８に特異的であり得る。場合により、ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞の細胞傷害活性の増加をもたらす少なくとも１つの他の改変を含む。適切には、改変は、チェックポイント抑制因子（checkpoint inhibior）の発現の欠失もしくは減少、またはＴＲＡＩＬもしくはＤＲ４もしくはＤＲ５などのＴＲＡＩＬ受容体に対してより高い親和性を有するＴＲＡＩＬ改変体の発現の増加を含む。有利には、本発明の操作されたＮＫ細胞は、Ｅ−セレクチンリガンドの発現増加、および／またはＤＲ４、ＤＲ５、またはその両方などのＴＲＡＩＬ受容体の発現減少を示す。これらの操作されたＮＫ細胞は、静脈内経路による養子免疫伝達によって癌と診断された個体を治療するために使用することができる。これらのＮＫ細胞は、ＣＡＲを発現するポリヌクレオチド／ベクターおよび／またはＮＫ細胞の細胞傷害活性を活性化する分子（例えば、改変体ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）タンパク質）のウイルス形質導入またはエレクトロポレーションによる、あるいはｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的化メカニズムを介して抑制性受容体の発現を欠失または減少させるベクターによることを含む、当技術分野で公知の様々な方法で操作することができる。ＮＫ細胞は、初代細胞または初代ＮＫ細胞の機能および特徴のいくつかを保持する樹立ＮＫ細胞株であり得る。具体的な実施形態では、操作されたＮＫ細胞株は、ＫＨＹＧ−１細胞、またはＮＫ−９２のような一般的な細胞とは異なる、Ｅ−セレクチンリガンド高発現、およびＴＡＲＩＬ受容体ＤＲ４およびＤＲ５の低発現などの品質を有するＫＨＹＧ−１様細胞である。養子移入は、自己（同系）または異種（同種異系）ＮＫ細胞を用いることができる。
【００１１】
本発明は、操作されたナチュラルキラー細胞を含む医薬組成物を提供する。操作されたナチュラルキラー細胞は、Ｅ−セレクチンリガンドの高レベルの細胞表面発現を示す。操作されたナチュラルキラー細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。特定の実施形態では、操作されたナチュラルキラー細胞は、ＨＥＣＡ−４５２抗体によって結合される抗原について２５％を超える陽性である複数の操作されたナチュラルキラー細胞を含む。特定の実施形態では、操作されたナチュラルキラー細胞はＴＲＡＩＬ受容体の低レベルの細胞表面発現を示し、ここでＴＲＡＩＬ受容体はＴＮＦＲＳＦ１０Ａ（ＤＲ４）またはＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ（ＤＲ５）を含む。特定の実施形態では、操作されたナチュラルキラー細胞は、初代の操作されたナチュラルキラー細胞を含む。特定の実施形態では、操作されたナチュラルキラー細胞は、形質転換された操作されたナチュラルキラー細胞株を含む。特定の実施形態では、形質転換された操作されたナチュラルキラー細胞株はＮＫ−９２細胞株またはＫＨＹＧ−１細胞株である。特定の実施形態では、形質転換された操作されたナチュラルキラー細胞株はＫＨＹＧ−１細胞株である。特定の実施形態では、ＣＡＲは癌関連抗原に特異的に結合する。特定の実施形態において、癌関連抗原は、ＣＤ３８、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ−７、ＴＮＦＲＳＦ１７／ＢＣＭＡ、ＳＹＮＤ１／ＣＤ１３８、ＣＤ２２９、ＣＤ４７、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＣＤ１２３／ＩＬ３−ＲＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、メソテリン、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、Ｔｎ抗原、ＮＥＵ５ＧＣ、ＮｅｕＧｃＧＭ３、ＧＤ２、ＣＬＬ−１、またはＨＥＲＶ−Ｋを含む。適切には、癌関連抗原は血液癌関連抗原を含む。適切には、血液癌関連抗原は、ＣＤ３８、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ−７、ＴＮＦＲＳＦ１７／ＢＣＭＡ、ＳＹＮＤ１／ＣＤ１３８、ＣＤ２２９、ＣＤ４７、ＣＤ１２３／ＩＬ３−ＲＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、またはＣＬＬ−１を含む。適切には、血液癌関連抗原はＣＤ３８を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号１〜６のいずれか１つに記載のものと少なくとも８０％同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号１〜６のいずれか１つに記載のものと少なくとも９０％同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号１〜６のいずれか１つに記載のものと少なくとも９５％同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号１〜６のいずれか１つに記載のものと少なくとも９８％同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号１〜６のいずれか１つに記載のものと同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号１および２に記載のものと少なくとも９０％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号１および２に記載のものと少なくとも９５％同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号１および２に記載のものと少なくとも９８％同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号１および２に記載のものと同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号３および４に記載のものと少なくとも９０％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号３および４に記載のものと少なくとも９５％同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号３および４に記載のものと少なくとも９８％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号３および４に記載のものと同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号５および６に記載のものと少なくとも９０％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号５および６に記載のものと少なくとも９５％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号５および６に記載のものと少なくとも９８％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号５および６に記載のものと同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲはヒトＣＤ８αポリペプチドを含む。適切には、ＣＡＲはＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、またはヒト４−１ＢＢポリペプチドを含む。適切には、ＣＡＲはヒト４−１ＢＢポリペプチドを含む。適切には、ＣＡＲはヒトＣＤ３ζポリペプチドを含む。適切には、ＣＡＲは、ダラツムマブよりもＣＤ３８に対して低い親和性を示す抗体に由来する標的ドメインを含む。さらなる局面では、操作されたナチュラルキラー細胞は、第二のキメラ抗原受容体をさらに含み、該第二のキメラ抗原受容体は、ＣＤ３８、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ−７、ＴＮＦＲＳＦ１７／ＢＣＭＡ、ＳＹＮＤ１／ＣＤ１３８、ＣＤ２２９、ＣＤ４７、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＣＤ１２３／ＩＬ３−ＲＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、メソテリン、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、Ｔｎ抗原、ＮＥＵ５ＧＣ、ＮｅｕＧｃＧＭ３、ＧＤ２、ＣＬＬ−１、またはＨＥＲＶ−Ｋを含む。さらなる局面では、操作されたナチュラルキラー細胞は、変異型ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）ポリペプチドをさらに含み、ここで変異型ＴＲＡＩＬポリペプチドは、シグナル伝達の増加を誘導するか、またはＴＲＡＩＬリガンドに対する結合親和性の増加を有する。適切には、ＴＲＡＩＬリガンドはＴＮＦＲＳＦ１０Ａ（ＤＲ４）またはＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ（ＤＲ５）を含む。適切には、変異型ＴＲＡＩＬポリペプチドはヒトＴＲＡＩＬのＤ２６９Ｈ／Ｅ１９５Ｒ変異を含む。適切には、変異型ＴＲＡＩＬポリペプチドは、ヒトＴＲＡＩＬのＧ１３１Ｒ／Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ変異を含む。適切には、ＣＡＲまたは変異型ＴＲＡＩＬポリペプチドは、操作されたナチュラルキラー細胞のゲノムに組み込まれる。適切には、操作されたナチュラルキラー細胞は、チェックポイント抑制性受容体の活性の欠失または低下をさらに含む。適切には、チェックポイント抑制性受容体はＣＤ８５ｄ、ＣＤ８５ｊ、ＣＤ９６、ＣＤ１５２、ＣＤ１５９ａ、ＣＤ２２３、ＣＤ２７９、ＣＤ３２８、ＳＩＧＬＥＣ９、ＴＩＧＩＴまたはＴＩＭ−３を含む。適切には、チェックポイント抑制性受容体はＣＤ９６、ＣＤ１５２、またはＣＤ３２８を含��。適切には、チェックポイント抑制性受容体はＣＤ９６を含む。適切には、チェックポイント抑制性受容体はＣＤ１５２を含む。適切には、チェックポイント抑制性受容体はＣＤ３２８を含む。適切には、チェックポイント抑制性受容体は、操作されたナチュラルキラー細胞ゲノムから全体的にまたは部分的に欠失されるか、あるいは染色体レベルでの１つまたはそれ以上のヌクレオチドの挿入または欠失によって破壊される。適切には、操作されたナチュラルキラー細胞は、チェックポイント抑制性受容体を標的とするｓｉＲＮＡを含む。適切には、医薬組成物は薬学的に許容可能な担体、安定剤、または賦形剤をさらに含む。適切には、医薬組成物は腹腔内投与用に処方される。適切には、医薬組成物は腹腔内投与用に処方される。適切には、医薬組成物は癌の治療に使用するためのものである。適切には、癌は白血病、リンパ腫、または骨髄腫を含む。適切には、癌は多発性骨髄腫を含む。
【００１２】
本発明は、操作されたナチュラルキラー細胞を含む医薬組成物を被験体に投与する工程を含む、癌を有する被験体を治療する方法を提供し、ここで操作されたナチュラルキラー細胞は、Ｅ−セレクチンリガンドの高レベルの細胞表面発現を示す。ここで、操作されたナチュラルキラー細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。特定の実施形態では、操作されたナチュラルキラー細胞は、ＨＥＣＡ−４５２抗体によって結合される抗原について２５％を超える陽性である複数の操作されたナチュラルキラー細胞を含む。特定の実施形態では、操作されたナチュラルキラー細胞はＴＲＡＩＬ受容体の低レベルの細胞表面発現を示し、ここで、ＴＲＡＩＬ受容体はＴＮＦＲＳＦ１０Ａ（ＤＲ４）またはＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ（ＤＲ５）を含む。特定の実施形態では、操作されたナチュラルキラー細胞は、初代の操作されたナチュラルキラー細胞を含む。特定の実施形態では、操作されたナチュラルキラー細胞は、形質転換された操作されたナチュラルキラー細胞株を含む。特定の実施形態では、形質転換された操作されたナチュラルキラー細胞株はＮＫ−９２細胞株またはＫＨＹＧ−１細胞株である。特定の実施形態では、形質転換された操作されたナチュラルキラー細胞株はＫＨＹＧ−１細胞株である。特定の実施形態では、ＣＡＲは癌関連抗原に特異的に結合する。特定の実施形態において、癌関連抗原は、ＣＤ３８、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ−７、ＴＮＦＲＳＦ１７／ＢＣＭＡ、ＳＹＮＤ１／ＣＤ１３８、ＣＤ２２９、ＣＤ４７、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＣＤ１２３／ＩＬ３−ＲＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、メソテリン、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、Ｔｎ抗原、ＮＥＵ５ＧＣ、ＮｅｕＧｃＧＭ３、ＧＤ２、ＣＬＬ−１、またはＨＥＲＶ−Ｋを含む。適切には、癌関連抗原は血液癌関連抗原を含む。適切には、血液癌関連抗原は、ＣＤ３８、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ−７、ＴＮＦＲＳＦ１７／ＢＣＭＡ、ＳＹＮＤ１／ＣＤ１３８、ＣＤ２２９、ＣＤ４７、ＣＤ１２３／ＩＬ３−ＲＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、またはＣＬＬを含む。適切には、血液癌関連抗原はＣＤ３８を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号１〜６のいずれか１つに記載のものと少なくとも８０％同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号１〜６のいずれか１つに記載のものと少なくとも９０％同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号１〜６のいずれか１つに記載のものと少なくとも９５％同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号１〜６のいずれか１つに記載のものと少なくとも９８％同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号１〜６のいずれか１つに記載のものと同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号１および２に記載のものと少なくとも９０％同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号１および２に記載のものと少なくとも９５％同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号１および２に記載のものと少なくとも９８％同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号１および２に記載のものと同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号３および４に記載のものと少なくとも９０％同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号３および４に記載のものと少なくとも９５％同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号３および４に記載のものと少なくとも９８％同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号３および４に記載のものと同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号５および６に記載のものと少なくとも９０％同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号５および６に記載のものと少なくとも９５％同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号５および６に記載のものと少なくとも９８％同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号５および６に記載のものと同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲはヒトＣＤ８αポリペプチドを含む。適切には、ＣＡＲはＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、またはヒト４−１ＢＢポリペプチドを含む。適切には、ＣＡＲはヒト４−１ＢＢポリペプチドを含む。適切には、ＣＡＲはヒトＣＤ３ζポリペプチドを含む。適切には、ＣＡＲは、ダラツムマブよりもＣＤ３８に対して低い親和性を示す抗体に由来する標的ドメインを含む。さらなる局面では、操作されたナチュラルキラー細胞は、第二のキメラ抗原受容体をさらに含み、該第二のキメラ抗原受容体は、ＣＤ３８、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ−７、ＴＮＦＲＳＦ１７／ＢＣＭＡ、ＳＹＮＤ１／ＣＤ１３８、ＣＤ２２９、ＣＤ４７、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＣＤ１２３／ＩＬ３−ＲＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、メソテリン、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、Ｔｎ抗原、ＮＥＵ５ＧＣ、ＮｅｕＧｃＧＭ３、ＧＤ２、ＣＬＬ−１、またはＨＥＲＶ−Ｋを含む。さらなる局面では、操作されたナチュラルキラー細胞は、変異型ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）ポリペプチドをさらに含み、ここで変異型ＴＲＡＩＬポリペプチドは、シグナル伝達の増加を誘導するか、またはＴＲＡＩＬリガンドに対する結合親和性の増加を有する。適切には、ＴＲＡＩＬリガンドはＴＮＦＲＳＦ１０Ａ（ＤＲ４）またはＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ（ＤＲ５）を含む。適切には、変異型ＴＲＡＩＬポリペプチドはヒトＴＲＡＩＬのＤ２６９Ｈ／Ｅ１９５Ｒ変異を含む。適切には、変異型ＴＲＡＩＬポリペプチドは、ヒトＴＲＡＩＬのＧ１３１Ｒ／Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ変異を含む。適切には、ＣＡＲまたは変異型ＴＲＡＩＬポリペプチドは、操作されたナチュラルキラー細胞のゲノムに組み込まれる。適切には、操作されたナチュラルキラー細胞は、チェックポイント抑制性受容体の活性の欠失または低下をさらに含む。適切には、チェックポイント抑制性受容体はＣＤ８５ｄ、ＣＤ８５ｊ、ＣＤ９６、ＣＤ１５２、ＣＤ１５９ａ、ＣＤ２２３、ＣＤ２７９、ＣＤ３２８、ＳＩＧＬＥＣ９、ＴＩＧＩＴまたはＴＩＭ−３を含む。適切には、チェックポイント抑制性��容体はＣＤ９６、ＣＤ１５２、またはＣＤ３２８を含む。適切には、チェックポイント抑制性受容体はＣＤ９６を含む。適切には、チェックポイント抑制性受容体はＣＤ１５２を含む。適切には、チェックポイント抑制性受容体はＣＤ３２８を含む。適切には、チェックポイント抑制性受容体は、操作されたナチュラルキラー細胞ゲノムから全体的にまたは部分的に欠失されるか、あるいは染色体レベルでの１つまたはそれ以上のヌクレオチドの挿入または欠失によって破壊される。適切には、操作されたナチュラルキラー細胞は、チェックポイント抑制性受容体を標的とするｓｉＲＮＡを含む。適切には、チェックポイント抑制性受容体は、操作されたナチュラルキラー細胞ゲノムから欠失される。適切には、医薬組成物は薬学的に許容可能な担体、安定剤、または賦形剤をさらに含む。適切には、医薬組成物は静脈内投与用に処方される。適切には、医薬組成物は腹腔内投与用に処方される。適切には、医薬組成物は癌の治療に使用するためのものである。適切には、癌は白血病、リンパ腫、または骨髄腫を含む。適切には、癌は多発性骨髄腫を含む。適切には、医薬組成物は、プロテアソーム阻害剤の投与前、投与中または投与後に投与される。適切には、医薬組成物は、低用量メトロノームシクロホスファミド治療計画の前、その間、またはその後に投与される。
【００１３】
本発明は、操作されたナチュラルキラー細胞を含む医薬組成物の製造方法を提供し、ここで操作されたナチュラルキラー細胞はＥ−セレクチンリガンドの高レベルの細胞表面発現を示す。操作されたナチュラルキラー細胞はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。該方法はナチュラルキラー細胞を、該ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドとインキュベートする工程を含む。適切には、ポリヌクレオチドはウイルスベクターを含む。適切には、ウイルスベクターはレンチウイルスである。適切には、ウイルスベクターはレトロウイルスである。適切には、ポリヌクレオチドはｍＲＮＡを含む。適切には、ポリヌクレオチドは操作されたナチュラルキラー細胞のゲノムに組み込まれる。適切には、操作されたナチュラルキラー細胞は、操作されたナチュラルキラー細胞のフコシル化を増加させるために化学物質で処理される。適切には、操作されたナチュラルキラー細胞は、ＨＥＣＡ−４５２抗体によって結合された抗原に対して２５％を超える陽性である複数の操作されたナチュラルキラー細胞を含む。適切には、操作されたナチュラルキラー細胞はＴＲＡＩＬ受容体の低レベルの細胞表面発現を示し、ここでＴＲＡＩＬ受容体はＴＮＦＲＳＦ１０Ａ（ＤＲ４）またはＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ（ＤＲ５）を含む。適切には、操作されたナチュラルキラー細胞は、初代ナチュラルキラー細胞を含む。適切には、操作されたナチュラルキラー細胞は、形質転換されたナチュラルキラー細胞株を含む。適切には、形質転換されたナチュラルキラー細胞株はＮＫ−９２細胞株またはＫＨＹＧ−１細胞株である。適切には、形質転換されたナチュラルキラー細胞株はＫＨＹＧ−１細胞株である。適切には、ＣＡＲは癌関連抗原に特異的に結合する。適切には、癌関連抗原は、ＣＤ３８、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ−７、ＴＮＦＲＳＦ１７／ＢＣＭＡ、ＳＹＮＤ１／ＣＤ１３８、ＣＤ２２９、ＣＤ４７、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＣＤ１２３／ＩＬ３−ＲＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、メソテリン、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、Ｔｎ抗原、ＮＥＵ５ＧＣ、ＮｅｕＧｃＧＭ３、ＧＤ２、ＣＬＬ−１、またはＨＥＲＶ−Ｋを含む。適切には、癌関連抗原は血液癌関連抗原を含む。適切には、血液癌関連抗原は、ＣＤ３８、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ−７、ＴＮＦＲＳＦ１７／ＢＣＭＡ、ＳＹＮＤ１／ＣＤ１３８、ＣＤ２２９、ＣＤ４７、ＣＤ１２３／ＩＬ３−ＲＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、またはＣＬＬ−１を含む。適切には、血液癌関連抗原はＣＤ３８を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号１〜６のいずれか１つに記載のものと少なくとも８０％同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号１〜６のいずれか１つに記載のものと少なくとも９０％同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号１〜６のいずれか１つに記載のものと少なくとも９５％同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号１〜６のいずれか１つに記載のものと少なくとも９８％同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号１〜６のいずれか１つに記載のものと同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号１および２に記載のものと少なくとも９０％同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号１および２に記載のものと少なくとも９５％同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号１および２に記載のものと少なくとも９８％同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号１および２に記載のものと同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号３および４に記載のものと少なくとも９０％同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号３および４に記載のものと少なくとも９５％同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号３および４に記載のものと少なくとも９８％同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号３および４に記載のものと同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号５および６に記載のものと少なくとも９０％同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号５および６に記載のものと少なくとも９５％同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号５および６に記載のものと少なくとも９８％同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号５および６に記載のものと同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲはヒトＣＤ８αポリペプチドを含む。適切には、ＣＡＲはＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、またはヒト４−１ＢＢポリペプチドを含む。適切には、ＣＡＲはヒト４−１ＢＢポリペプチドを含む。適切には、ＣＡＲはヒトＣＤ３ζポリペプチドを含む。適切には、ＣＡＲは、ダラツムマブよりもＣＤ３８に対して低い親和性を示す抗体に由来する標的ドメインを含む。さらなる局面では、操作されたナチュラルキラー細胞は、第二のキメラ抗原受容体をさらに含み、該第二のキメラ抗原受容体は、ＣＤ３８、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ−７、ＴＮＦＲＳＦ１７／ＢＣＭＡ、ＳＹＮＤ１／ＣＤ１３８、ＣＤ２２９、ＣＤ４７、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＣＤ１２３／ＩＬ３−ＲＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、メソテリン、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、Ｔｎ抗原、ＮＥＵ５ＧＣ、ＮｅｕＧｃＧＭ３、ＧＤ２、ＣＬＬ−１、またはＨＥＲＶ−Ｋを含む。さらなる局面では、操作されたナチュラルキラー細胞は、変異型ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）ポリペプチドをさらに含み、ここで変異型ＴＲＡＩＬポリペプチドは、シグナル伝達の増加を誘導するか、またはＴＲＡＩＬリガンドに対する結合親和性の増加を有する。適切には、ＴＲＡＩＬリガンドはＴＮＦＲＳＦ１０Ａ（ＤＲ４）またはＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ（ＤＲ５）を含む。適切には、変異型ＴＲＡＩＬポリペプチドはヒトＴＲＡＩＬのＤ２６９Ｈ／Ｅ１９５Ｒ変異を含む。適切には、変異型ＴＲＡＩＬポリペプチドは、ヒトＴＲＡＩＬのＧ１３１Ｒ／Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ変異を含む。適切には、ＣＡＲまたは変異型ＴＲＡＩＬポリペプチドは、操作されたナチュラルキラー細胞のゲノムに組み込まれる。適切には、この方法��、操作されたナチュラルキラー細胞をチェックポイント抑制性受容体の活性を欠失または低下させるポリヌクレオチドとインキュベートする工程をさらに含む。適切には、チェックポイント抑制性受容体はＣＤ８５ｄ、ＣＤ８５ｊ、ＣＤ９６、ＣＤ１５２、ＣＤ１５９ａ、ＣＤ２２３、ＣＤ２７９、ＣＤ３２８、ＳＩＧＬＥＣ９、ＴＩＧＩＴまたはＴＩＭ−３を含む。適切には、チェックポイント抑制性受容体はＣＤ９６、ＣＤ１５２、またはＣＤ３２８を含む。適切には、チェックポイント抑制性受容体はＣＤ９６を含む。適切には、チェックポイント抑制性受容体はＣＤ１５２を含む。適切には、チェックポイント抑制性受容体はＣＤ３２８を含む。適切には、チェックポイント抑制性受容体は、操作されたナチュラルキラー細胞ゲノムから全体的にまたは部分的に欠失されるか、あるいは染色体レベルでの１つまたはそれ以上のヌクレオチドの挿入または欠失によって破壊される。適切には、操作されたナチュラルキラー細胞は、チェックポイント抑制性受容体を標的とするｓｉＲＮＡを含む。適切には、この方法は、操作されたナチュラルキラー細胞を薬学的に許容可能な担体、安定剤、または賦形剤と混合する工程をさらに含む。
【００１４】
本明細書に記載の特定の局面では、操作されたナチュラルキラー細胞を含む医薬組成物であって、操作されたナチュラルキラー細胞がＦＵＴ６またはＦＵＴ７タンパク質の高レベルの発現を示し、操作されたナチュラルキラー細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。適切には、操作されたナチュラルキラー細胞は、ＦＵＴ６またはＦＵＴ７タンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。適切には、ＣＡＲは癌関連抗原に特異的に結合する。適切には、癌関連抗原は、ＣＤ３８、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ−７、ＴＮＦＲＳＦ１７／ＢＣＭＡ、ＳＹＮＤ１／ＣＤ１３８、ＣＤ２２９、ＣＤ４７、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＣＤ１２３／ＩＬ３−ＲＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、メソテリン、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、Ｔｎ抗原、ＮＥＵ５ＧＣ、ＮｅｕＧｃＧＭ３、ＧＤ２、ＣＬＬ−１、またはＨＥＲＶ−Ｋを含む。適切には、癌関連抗原は血液癌関連抗原を含む。適切には、血液癌関連抗原は、ＣＤ３８、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ−７、ＴＮＦＲＳＦ１７／ＢＣＭＡ、ＳＹＮＤ１／ＣＤ１３８、ＣＤ２２９、ＣＤ４７、ＣＤ１２３／ＩＬ３−ＲＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、またはＣＬＬ−１を含む。適切には、血液癌関連抗原はＣＤ３８を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号１〜６のいずれか１つに記載のものと少なくとも８０％同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号１〜６のいずれか１つに記載のものと少なくとも９０％同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号１〜６のいずれか１つに記載のものと少なくとも９５％同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号１〜６のいずれか１つに記載のものと少なくとも９８％同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号１〜６のいずれか１つに記載のものと同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号１および２に記載のものと少なくとも９０％同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号１および２に記載のものと少なくとも９５％同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号１および２に記載のものと少なくとも９８％同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号１および２に記載のものと同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号３および４に記載のものと少なくとも９０％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号３および４に記載のものと少なくとも９５％同一の標的ドメインアミノ酸を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号３および４に記載のものと少なくとも９８％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号３および４に記載のものと同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号５および６に記載のものと少なくとも９０％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号５および６に記載のものと少なくとも９５％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号５および６に記載のものと少なくとも９８％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号５および６に記載のものと同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲはヒトＣＤ８αポリペプチドを含む。適切には、ＣＡＲは、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、またはヒト４−１ＢＢポリペプチドに由来する細胞内ドメインを含む。適切には、ＣＡＲは、ヒト４−１ＢＢポリペプチドに由来する細胞内ドメインを含む。適切には、ＣＡＲはヒトＣＤ３ζポリペプチド由来の細胞内ドメインを含む。適切には、ＣＡＲは、ダラツムマブよりもＣＤ３８に対して低い親和性を示す抗体に由来する標的ドメインを含む。さらなる局面では、操作されたナチュラルキラー細胞は、第二のキメラ抗原受容体をさらに含み、該第二のキメラ抗原受容体は、ＣＤ３８、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ−７、ＴＮＦＲＳＦ１７／ＢＣＭＡ、ＳＹＮＤ１／ＣＤ１３８、ＣＤ２２９、ＣＤ４７、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＣＤ１２３／ＩＬ３−ＲＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、メソテリン、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、Ｔｎ抗原、ＮＥＵ５ＧＣ、ＮｅｕＧｃＧＭ３、ＧＤ２、ＣＬＬ−１、またはＨＥＲＶ−Ｋを含む。
【００１５】
本明細書で提供される特定の局面において、操作されたナチュラルキラー細胞を含む医薬組成物を被験体に投与する工程を含む、癌を有する被験体を治療する方法であり、ここで操作されたナチュラルキラー細胞はＦＵＴ６またはＦＵＴ７タンパク質の高レベルの発現を示し、操作されたナチュラルキラー細胞がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。適切には、操作されたナチュラルキラー細胞は、ＦＵＴ６またはＦＵＴ７タンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。適切には、ＣＡＲは癌関連抗原に特異的に結合する。適切には、癌関連抗原は、ＣＤ３８、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ−７、ＴＮＦＲＳＦ１７／ＢＣＭＡ、ＳＹＮＤ１／ＣＤ１３８、ＣＤ２２９、ＣＤ４７、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＣＤ１２３／ＩＬ３−ＲＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、メソテリン、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、Ｔｎ抗原、ＮＥＵ５ＧＣ、ＮｅｕＧｃＧＭ３、ＧＤ２、ＣＬＬ−１、またはＨＥＲＶ−Ｋを含む。適切には、癌関連抗原は血液癌関連抗原を含む。適切には、血液癌関連抗原は、ＣＤ３８、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ−７、ＴＮＦＲＳＦ１７／ＢＣＭＡ、ＳＹＮＤ１／ＣＤ１３８、ＣＤ２２９、ＣＤ４７、ＣＤ１２３／ＩＬ３−ＲＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、またはＣＬＬ−１を含む。適切には、血液癌関連抗原はＣＤ３８を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号１〜６のいずれか１つに記載のものと少なくとも８０％同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号１〜６のいずれか１つに記載のものと少なくとも９０％同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号１〜６のいずれか１つに記載のものと少なくとも９５％同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号１〜６のいずれか１つに記載のものと少なくとも９８％同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号１〜６のいずれか１つに記載のものと同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号１および２に記載のものと少なくとも９０％同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号１および２と少なくとも９５％同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号１および２に記載のものと少なくとも９８％同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号１および２に記載のものと同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号３および４に記載のものと少なくとも９０％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号３および４に記載のものと少なくとも９５％同一の標的ドメインアミノ酸を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号３および４に記載のものと少なくとも９８％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号３および４に記載のものと同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号５および６に記載のものと少なくとも９０％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号５および６に記載のものと少なくとも９５％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号５および６に記載のものと少なくとも９８％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号５および６に記載のものと同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲはＣＤ８αポリペプチドを含む。適切には、ＣＡＲは、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、またはヒト４−１ＢＢポリペプチドを含む。適切には、ＣＡＲはヒト４−１ＢＢポリペプチドを含む。適切には、ＣＡＲはヒトＣＤ３ζポリペプチドを含む。適切には、ＣＡＲは、ダラツムマブよりもＣＤ３８に対して低い親和性を示す抗体に由来する標的ドメインを含む。さらなる局面では、操作されたナチュラルキラー細胞は、第二のキメラ抗原受容体をさらに含み、該第二のキメラ抗原受容体は、ＣＤ３８、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ−７、ＴＮＦＲＳＦ１７／ＢＣＭＡ、ＳＹＮＤ１／ＣＤ１３８、ＣＤ２２９、ＣＤ４７、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＣＤ１２３／ＩＬ３−ＲＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、メソテリン、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、Ｔｎ抗原、ＮＥＵ５ＧＣ、ＮｅｕＧｃＧＭ３、ＧＤ２、ＣＬＬ−１、またはＨＥＲＶ−Ｋを含む。
【００１６】
好ましくは、ＣＤ３８−ＣＡＲ発現ＮＫ細胞は、ＣＤ３８発現癌細胞に対するそれらの親和性と比較して、ＣＤ３８を発現する正常（悪性でない）細胞に対する親和性が低い。これは、例えば、癌細胞が正常細胞よりも高レベルのＣＤ３８を発現するため、および／またはＣＤ３８−ＣＡＲが癌細胞上に発現したＣＤ３８の特定の形態に対して親和性を増大させるか、および／または正常細胞上に発現したＣＤ３８の特定の形態に対して親和性を減少させるからである。癌細胞に対するＣＤ３８−ＣＡＲ発現ＮＫ細胞の親和性の増加は、正常細胞に対するＣＤ３８−ＣＡＲ発現ＮＫ細胞の親和性と比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも１００％であることが好ましい。正常細胞に対するＣＤ３８−ＣＡＲ発現ＮＫ細胞の親和性の減少は、癌細胞に対するＣＤ３８−ＣＡＲ発現ＮＫ細胞の親和性と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも１００％であることが好ましい。癌細胞に対するＣＤ３８−ＣＡＲ発現ＮＫ細胞の親和性の増加は、正常細胞に対するＣＤ３８−ＣＡＲ発現ＮＫ細胞の親和性よりも少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、より好ましくは少なくとも１０００倍大きいことが好ましい。正常細胞に対するＣＤ３８−ＣＡＲ発現ＮＫ細胞の親和性の減少は、癌細胞に対するＣＤ３８−ＣＡＲ発現ＮＫ細胞の親和性よりも少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、より好ましくは少なくとも１０００倍小さいことが好ましい。好ましくは、ＣＤ３８−ＣＡＲ発現ＮＫ細胞は正常ＣＤ３８発現細胞に対して低親和性を有し、ここで「低親和性」とは、ＣＤ３８（例えば多発性骨髄腫細胞）の（正常細胞と比較して）発現が増加した標的癌細胞に対して細胞傷害性応答を効果的に開始するのに十分高いが、正常なＣＤ３８発現細胞に対する細胞傷害性応答の開始を回避するのに十分に低い親和性を有すると定義される。
【００１７】
本明細書で提供される特定の局面では、操作されたナチュラルキラー細胞を含む医薬組成物を製造する方法であって、該操作されたナチュラルキラー細胞はＦＵＴ６またはＦＵＴ７タンパク質の高レベルの発現を示し、該操作されたナチュラルキラー細胞はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含み、その方法はナチュラルキラー細胞を、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドとインキュベートする工程を含む、方法である。適切には、操作されたナチュラルキラー細胞は、ＦＵＴ６またはＦＵＴ７タンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。適切には、ＣＡＲは癌関連抗原に特異的に結合する。適切には、癌関連抗原は、ＣＤ３８、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ−７、ＴＮＦＲＳＦ１７／ＢＣＭＡ、ＳＹＮＤ１／ＣＤ１３８、ＣＤ２２９、ＣＤ４７、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＣＤ１２３／ＩＬ３−ＲＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、メソテリン、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、Ｔｎ抗原、ＮＥＵ５ＧＣ、ＮｅｕＧｃＧＭ３、ＧＤ２、ＣＬＬ−１、またはＨＥＲＶ−Ｋを含む。適切には、癌関連抗原は血液癌関連抗原を含む。適切には、血液癌関連抗原は、ＣＤ３８、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ−７、ＴＮＦＲＳＦ１７／ＢＣＭＡ、ＳＹＮＤ１／ＣＤ１３８、ＣＤ２２９、ＣＤ４７、ＣＤ１２３／ＩＬ３−ＲＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、またはＣＬＬ−１を含む。適切には、血液癌関連抗原はＣＤ３８を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号１〜６のいずれか１つに記載のものと少なくとも８０％同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号１〜６のいずれか１つに記載のものと少なくとも９０％同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号１〜６のいずれか１つに記載のものと少なくとも９５％同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号１〜６のいずれか１つに記載のものと少なくとも９８％同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号１〜６のいずれか１つに記載のものと同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号１および２に記載のものと少なくとも９０％同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号１および２に記載のものと少なくとも９５％同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号１および２に記載のものと少なくとも９８％同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号１および２に記載のものと同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号３および４に記載のものと少なくとも９０％同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号３および４に記載のものと少なくとも９５％同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号３および４に記載のものと少なくとも９８％同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号３および４に記載のものと同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号５および６に記載のものと少なくとも９０％同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号５および６に記載のものと少なくとも９５％同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号５および６に記載のものと少なくとも９８％同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号５および６に記載のものと同一の標的ドメインアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲはヒトＣＤ８αポリペプチドを含む。適切には、ＣＡＲはＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、またはヒト４−１ＢＢポリペプチドを含む。適切には、ＣＡＲはヒト４−１ＢＢポリペプチドを含む。適切には、ＣＡＲはヒトＣＤ３ζポリペプチドを含む。適切には、ＣＡＲは、ダラツムマブよりもＣＤ３８に対して低い親和性を示す抗体に由来する標的ドメインを含む。さらなる局面では、操作されたナチュラルキラー細胞は、第二のキメラ抗原受容体をさらに含み、該第二のキメラ抗原受容体は、ＣＤ３８、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ−７、ＴＮＦＲＳＦ１７／ＢＣＭＡ、ＳＹＮＤ１／ＣＤ１３８、ＣＤ２２９、ＣＤ４７、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＣＤ１２３／ＩＬ３−ＲＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、メソテリン、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、Ｔｎ抗原、ＮＥＵ５ＧＣ、ＮｅｕＧｃＧＭ３、ＧＤ２、ＣＬＬ−１、またはＨＥＲＶ−Ｋを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】図１Ａは、本発明のキメラ抗原受容体の非限定的な概略図を示す。図は一定の縮尺では描かれていない。
【図１Ｂ】図１Ｂは、本発明のキメラ抗原受容体の標的ドメインの非限定的な概略図を示す。図は一定の縮尺では描かれていない。
【図２Ａ】図２Ａ〜Ｂは、フローサイトメトリーによって分析した場合の、ＫＨＹＧ−１細胞（Ａ）およびＮＫ−９２細胞（Ｂ）へのＨＥＣＡ−４５２抗体の結合を図示する。
【図２Ｂ】図２Ａ〜Ｂは、フローサイトメトリーによって分析した場合の、ＫＨＹＧ−１細胞（Ａ）およびＮＫ−９２細胞（Ｂ）へのＨＥＣＡ−４５２抗体の結合を図示する。
【図３】図３は、ＮＫ−９２細胞と比較した場合のＳＤＦ−１勾配に沿ったＫＨＹＧ−１細胞の遊走を示す。
【図４Ａ】図４Ａ〜Ｂは、フローセル内のＫＨＹＧ−１細胞（Ａ）およびＮＫ−９２細胞（Ｂ）の移動を観察するビデオからの静止フレームを示す図である。失速しているかゆっくり移動している細胞にはアスタリスクが付いている。
【図４Ｂ】図４Ａ〜Ｂは、フローセル内のＫＨＹＧ−１細胞（Ａ）およびＮＫ−９２細胞（Ｂ）の移動を観察するビデオからの静止フレームを示す図である。失速しているかゆっくり移動している細胞にはアスタリスクが付いている。
【図５】図５は、ＣＴＬＡ４の欠失を標的とするために使用されるｇＲＮＡ構築物（発現ベクター）を示す。
【図６】図６は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ｇＲＮＡでのトランスフェクション前後の、親および変異ＬＩＲ２  ＤＮＡのゲル電気泳動バンドを示す図である。
【図７】図７は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ｇＲＮＡでのトランスフェクション前後の、親および変異ＣＴＬＡ４  ＤＮＡのゲル電気泳動バンドを示す図である。
【図８Ａ】図８Ａ〜Ｂは、フローサイトメトリーによって分析された、ｓｉＲＮＡを用いたＫＨＹＧ−１細胞中のＣＤ９６のノックダウンを図示する。２つの独立した実験が示されている（ＡおよびＢ）。
【図８Ｂ】図８Ａ〜Ｂは、フローサイトメトリーによって分析された、ｓｉＲＮＡを用いたＫＨＹＧ−１細胞中のＣＤ９６のノックダウンを図示する。２つの独立した実験が示されている（ＡおよびＢ）。
【図９】図９は、異なるエフェクター対標的比でのＣＤ９６の減少を伴うＫＨＹＧ−１細胞による殺傷の増加を示す。
【図１０】図１０は、フローサイトメトリーによって分析された、ｓｉＲＮＡを用いたＫＨＹＧ−１細胞におけるＣＤ３２８のノックダウンを示す。
【図１１】図１１は、異なるエフェクター対標的比でのＣＤ３２８の減少を伴うＫＨＹＧ−１細胞による殺傷の増加を示す。
【図１２】図１２は、フローサイトメトリーによって分析したところ、ＫＨＹＧ−１細胞がＴＲＡＩＬの発現が低いかまたは全くないことを示す。
【図１３】図１３は、フローサイトメトリーによって分析した、野生型および改変体ＴＲＡＩＬでトランスフェクトした細胞における細胞表面ＴＲＡＩＬ発現の増加を示す図である。
【図１４】図１４は、フローサイトメトリーによって分析された、野生型および改変体ＴＲＡＩＬでトランスフェクトされた細胞における細胞表面１０７ａ発現の増加を示す。
【図１５】図１５は、野生型または改変体ＴＲＡＩＬをトランスフェクトしたＫＨＹＧ−１細胞の生存率を示す。
【図１６】図１６は、異なるＮＫ細胞株におけるＴＲＡＩＬ受容体の発現（ＫＨＹＧ１（上４つ）とＮＫ−９２（下４つ））を示す。
【図１７】図１７は、野生型ＴＲＡＩＬまたは改変体ＴＲＡＩＬを発現するＫＨＹＧ−１細胞がＫ５６２細胞のアポトーシスに対して及ぼす効果を示す。
【図１８】図１８は、野生型ＴＲＡＩＬまたは改変体ＴＲＡＩＬを発現するＫＨＹＧ−１細胞がＲＰＭＩ８２２６細胞のアポトーシスに対して及ぼす効果を示す。
【図１９】図１９は、野生型ＴＲＡＩＬまたは改変体ＴＲＡＩＬを発現するＫＨＹＧ−１細胞がＭＭ１．Ｓ細胞のアポトーシスに対して及ぼす効果を示す。
【図２０】図２０は、ＲＰＭＩ８２２６細胞およびＭＭ１．Ｓ細胞上のＤＲ５発現のＦＡＣＳプロットをそれぞれ示し、ここでＤＲ５発現に対するボルテゾミブ処理の効果を示す。
【図２１】図２１は、ＴＲＡＩＬ改変体を伴う（下２つ）または伴わない（中央２つ）ＫＨＹＧ−１細胞と共培養したボルテゾミブ前処理／未処理ＭＭ１．Ｓ細胞におけるアポトーシスの２つのＦＡＣＳプロットを示す。
【図２２】図２２は、多発性骨髄腫細胞系ＵＭ９を様々な低親和性ＣＤ３８  ＮＫ  ＣＡＲで処理した効果を示す。
【図２３】図２３および２４は、原発性多発性骨髄腫細胞を様々な低親和性ＣＤ３８  ＮＫ  ＣＡＲで処理した効果を示す。
【図２４】図２３および２４は、原発性多発性骨髄腫細胞を様々な低親和性ＣＤ３８  ＮＫ  ＣＡＲで処理した効果を示す。
【図２５】図２５および２６は、それらのＣＤ３８およびＣＤ１３８の発現に従ってゲ−ト制御された細胞サブセットＦＡＣＳを示し、低親和性ＣＤ３８  ＣＡＲは癌性細胞を効果的に標的とするが非癌性細胞を標的としないことを示す。
【図２６】図２５および２６は、それらのＣＤ３８およびＣＤ１３８の発現に従ってゲ−ト制御された細胞サブセットＦＡＣＳを示し、低親和性ＣＤ３８  ＣＡＲは癌性細胞を効果的に標的とするが非癌性細胞を標的としないことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
（特定の定義）
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないことを指示しない限り、複数の言及を含む。本明細書における「または」へのいかなる言及も、特に明記しない限り「および／または」を包含することを意図している。
【００２０】
本明細書で用いられるように、用語「約」は、述べられた量に例えば１０％、５％、または１％近い量を指す。
【００２１】
本明細書で用いられるように、用語「個体」、「被験体」、および「患者」は互換的に使用され、そして癌または他の新生物と診断されたかまたは罹患していると疑われるヒトを含む。
【００２２】
本明細書において、他に述べられない限り、１つまたは複数のＮＫ細胞への言及は、ＮＫ細胞株および初代ＮＫ細胞の両方を包含する。
【００２３】
本明細書中で使用されるように、用語「ＮＫ細胞株」は、１つまたはそれ以上のナチュラルキラー細胞特性を保持する任意の形質転換細胞株または不死化細胞株をいう。例えば、特定の実施形態では、保持される１つまたはそれ以上のナチュラルキラー細胞特性は、ＣＤ５６発現、キラ−細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）発現、またはＫ５６２細胞などの標的細胞株に対する抗原非依存性細胞傷害性である。一般的なＮＫ細胞株は、例えば、ＮＫ−９２またはＫＨＹＧ−１細胞株である。
【００２４】
（ナチュラルキラー細胞）
操作されたナチュラルキラー細胞は、それらを操作されていないナチュラルキラー細胞と区別する１つまたはそれ以上の操作を含む。適切には、操作されたナチュラルキラー細胞は、キメラ抗原受容体、ＴＲＡＩＬ改変体、ＦＵＴ６またはＦＵＴ７タンパク質のいずれか１つまたはそれ以上をコードするポリヌクレオチドを含むか、またはチェックポイント抑制因子の発現の欠失もしくは減少を含むポリヌクレオチドを含むという点で操作されている。本発明の操作されたナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）は、初代細胞または樹立細胞株を含む任意のＮＫ細胞集団から作製され得る。適切には、ＮＫ細胞はヒトＮＫ細胞である。ヒトにおける初代ナチュラルキラー細胞は細胞表面マーカーＣＤ５６を発現し、そして特定の実施形態において、操作されたナチュラルキラー細胞は、非限定的な例としてフローサイトメトリーにより決定されるようにＣＤ５６陽性細胞から産生され得る。適切には、ナチュラルキラー細胞は、自己供給源（供給源細胞およびレシピエントの同じ遺伝的背景）、または異種供給源（供給源細胞およびレシピエントの異なる遺伝的背景）由来であり得る。適切には、ＮＫ細胞は、細胞選別または磁気ビーズなどの方法を使用して、ドナーの末梢血または治療される個体から単離される。ドナーから単離されたＮＫ細胞は、インターロイキン２およびインターロイキン１５中で７日間より多く培養することによりエクスビボで拡大（expand）させることができる。ＮＫ細胞はまた、当技術分野において公知の方法を用いてインビトロ培養において幹細胞または前駆細胞から分化させることもできる。適切には、ＮＫ細胞は骨髄由来幹細胞から分化する。適切には、ＮＫ細胞は成体多能性細胞から分化する。適切には、ＮＫ細胞は胚性幹細胞から分化する。
【００２５】
操作されたＮＫ細胞はまた、形質転換ＮＫ細胞株から作製され得る。適切には、形質転換ＮＫ細胞株はヒト細胞株である。使用され得る一般的なＮＫ細胞株は、ＮＫ−９２細胞株（ＡＴＣＣから入手可能；ＣＲＬ−２４９７）、またはＫＨＹＧ−１細胞株である。適切には、操作されたＮＫ細胞株はＫＨＹＧ−１細胞株から作製される。Ｙａｇｉｔａら、「Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  （ＫＨＹＧ−１）  ｆｒｏｍ  ａ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃａｒｒｙｉｎｇ  ａ  ｐ５３  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ」，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １４（５）：９２２−３０を参照のこと。ＣＤ５６の発現などの一般的なＮＫ細胞株間の共通点にもかかわらず、異なる細胞株は、細胞ベースの治療法の開発に関して他のＮＫ細胞株と比較して特定のＮＫ細胞株のより大きい適合性を可能にし得る異なる表現型および遺伝子型形質を有する（例えば、改変体ＴＲＡＩＬタンパク質を発現するＣＡＲ  ＮＫ細胞またはＮＫ細胞）。適切には、操作されたＮＫ細胞株はＮＫ−９２細胞株またはその誘導体を含まない。
【００２６】
本明細書に記載の特定の実施形態では、操作されたＮＫ細胞は血液悪性腫瘍の治療に有用である。このような治療を容易にするために、特定の実施形態では、細胞は骨髄へのホーミングの増加を示す。適切には、操作されたＮＫ細胞は高レベルのＥ−セレクチンリガンド発現を示す。Ｅ−セレクチンは、ＣＤ６２抗原様ファミリーメンバーＥ（ＣＤ６２Ｅ）；内皮−白血球接着分子１（ＥＬＡＭ−１）；または白血球−内皮細胞接着分子２（ＬＥＣＡＭ２）としても知られている。Ｅ−セレクチンは、細胞表面上のＥ−セレクチンリガンドに結合する。これは四糖類シアリルルイスＸ（ＳＬｅｘ）を発現する糖タンパク質および／または糖脂質である。ＳＬｅｘは、α−フコシルトランスフェラーゼ、α２−３−シアリルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシルトランスフェラーゼ、およびＮ−アセチル−β−グルコサミニルトランスフェラーゼの複合作用によって合成される。ＨＥＣＡ−４５２抗体はＥ−セレクチンリガンドを認識する。適切には、操作されたＮＫ細胞は、ＨＥＣＡ−４５２抗体で陽性に染色される少なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上の細胞を示す操作されたＮＫ細胞の集団を含む。適切には、操作されたＮＫ細胞は、ＨＥＣＡ−４５２抗体で陽性に染色される少なくとも５０％またはそれ以上の細胞を示すＮＫ細胞の集団を含む。適切には、操作されたＮＫ細胞は、ＨＥＣＡ−４５２抗体で陽性に染色される少なくとも７５％またはそれ以上の細胞を示すＮＫ細胞の集団を含む。適切には、操作されたＮＫ細胞は、ＨＥＣＡ−４５２抗体で陽性に染色される少なくとも８０％またはそれ以上の細胞を示すＮＫ細胞の集団を含む。適切には、操作されたＮＫ細胞は、ＨＥＣＡ−４５２抗体で陽性に染色される少なくとも９０％またはそれ以上の細胞を示すＮＫ細胞の集団を含む。陽性は、例えば、蛍光結合ＨＥＣＡ−４５２抗体を用いてインビトロで細胞を染色し、ＨＥＣＡ−４５２染色細胞をアイソタイプ対照染色細胞と比較するフローサイトメトリーによって陽性を分析することによって評価することができる。適切には、ＨＥＣＡ−４５２陽性を示す操作されたＮＫ細胞の集団は、細胞表面タンパク質のフコシル化を増加させるために化学的に処理されている。適切には、この化学処理は、ＧＤＰ−フコース基質およびアルファ１，３フコシルトランスフェラーゼＶＩ酵素を含む。
【００２７】
適切には、操作されたＮＫ細胞は糖操作されている。適切には、操作されたＮＫ細胞は高レベルのＥ−セレクチンリガンドを示す。適切には、高レベルのＥ−セレクチンリガンドは、アイソタイプ対照抗体結合と比較してＨＥＣＡ−４５２抗体結合の少なくとも６倍の増加によって示される。適切には、高レベルのＥ−セレクチンリガンドは、アイソタイプ対照抗体結合と比較してＨＥＣＡ−４５２抗体結合の少なくとも７倍の増加によって示される。適切には、高レベルのＥ−セレクチンリガンドは、アイソタイプ対照抗体結合と比較してＨＥＣＡ−４５２抗体結合の少なくとも８倍の増加によって示される。適切には、高レベルのＥ−セレクチンリガンドは、アイソタイプ対照抗体結合と比較してＨＥＣＡ−４５２抗体結合の少なくとも９倍の増加によって示される。適切には、高レベルのＥ−セレクチンリガンドは、アイソタイプ対照抗体結合と比較してＨＥＣＡ−４５２抗体結合の少なくとも１０倍の増加によって示される。適切には、高レベルのＥ−セレクチンリガンドは、アイソタイプ対照抗体結合と比較して、ＨＥＣＡ−４５２抗体結合の少なくとも２０倍の増加によって示される。適切には、高レベルのＥ−セレクチンリガンドは、アイソタイプ対照抗体結合と比較してＨＥＣＡ−４５２抗体結合の少なくとも５０倍の増加によって示される。適切には、高レベルのＥ−セレクチンリガンドは、アイソタイプ対照抗体結合と比較してＨＥＣＡ−４５２抗体結合の少なくとも１００倍の増加によって示される。この結合の増加は、例えば、フローサイトメトリーを使用してアイソタイプ対照抗体のものに対し、ＨＥＣＡ−４５２抗体結合の平均蛍光強度を比較することによって分析され得る。適切には、高レベルのＨＥＣＡ−４５２抗体結合を示すＮＫ細胞はＫＨＹＧ−１細胞株である。適切には、高レベルのＨＥＣＡ−４５２結合を示す操作されたＮＫ細胞の集団は、細胞表面タンパク質のフコシル化またはシアル化を増加させるために化学的に処理されている。適切には、この化学処理は、ＧＤＰ−フコース基質およびアルファ１，３フコシルトランスフェラーゼＶＩ酵素を含む。適切には、ＮＫ細胞は、ＦＵＴ６、ＦＵＴ７、またはその両方を発現することによって高レベルのＨＥＣＡ−４５２抗体結合を示すように操作されている。適切には、ＦＵＴ６またはＦＵＴ７発現は、ｍＲＮＡまたはＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターを、低レベルのＨＥＣＡ−４５２抗体結合を示すＮＫ細胞、例えばＮＫ−９２細胞に導入することによって達成される。適切には、ＮＫ−９２細胞などの不死化ＮＫ細胞株は、ＦＵＴ６、ＦＵＴ７、またはその両方をコードする核酸で安定的にトランスフェクトされ得る。適切には、ＦＵＴ６またはＦＵＴ７の高レベルの発現は、ｍＲＮＡ、ウエスタンブロット、または酵素アッセイによってモニタリングされるように、ＦＵＴ６またはＦＵＴ７の発現または活性の少なくとも２、５、または１０倍の増加である。適切には、操作されたＮＫ細胞はＣＤ６５を発現する。適切には、操作されたＮＫ細胞は複数のＣＤ６５を発現する。
【００２８】
適切には、操作されたＮＫ細胞はＴＲＡＩＬ受容体の低レベルの細胞表面発現を含む。適切には、ＴＲＡＩＬ受容体はＤＲ４またはＤＲ５である。適切には、ＴＲＡＩＬ受容体の低レベルの細胞表面発現は、検出可能なＴＲＡＩＬ受容体活性の欠如を含む。適切には、ＴＲＡＩＬ受容体の低レベルの細胞表面発現は、アイソタイプ対照に匹敵する抗ＴＲＡＩＬ抗体反応性によって示されるレベルを含む。適切には、ＴＲＡＩＬ受容体の低レベルの細胞表面発現は、アイソタイプ対照と比較して５倍未満である抗ＴＲＡＩＬ抗体反応性によって示されるレベルを含む。適切には、低レベルの細胞表面ＴＲＡＩＬ受容体は、アイソタイプ対照と比較して２倍未満である抗ＴＲＡＩＬ抗体反応性によって示されるレベルを含む。細胞表面ＴＲＡＩＬ受容体発現は、例えば、実施例に詳述されているようにフローサイトメトリーを用いて定量することができる。
【００２９】
（キメラ抗原受容体）
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、免疫エフェクター細胞に特定の抗原特異性を導入することを意図した組換え抗原受容体である。ＣＡＲは、一過的にまたはゲノムに組み込まれてのいずれかで、免疫エフェクター細胞に導入された外因性ポリヌクレオチドから発現された規定のポリペプチド配列を含む。一般的なＣＡＲの概略図を図１Ａに示す。キメラ抗原受容体は、リーダー配列１０１、標的ドメイン１０２、膜貫通ドメイン１０３、および１つまたはそれ以上の細胞内シグナル伝達ドメイン（１０４および１０５）を含む。適切には、標的ドメインは抗体分子に由来し、ＣＡＲに抗原特異性を付与する抗体分子由来の１つまたはそれ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。適切には、本発明の操作されたＮＫ細胞に使用するためのＣＡＲの標的ドメインは、図１Ｂに示されるように単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。ｓｃＦｖは、免疫グロブリン軽鎖１０６の可変鎖部分、および柔軟なリンカーポリペプチド１０７によって分離された免疫グロブリン重鎖分子１０８を含む。重鎖および軽鎖の順序は限定的ではなく、逆にすることができる。柔軟なポリペプチドリンカーは、重鎖および軽鎖が互いに会合し、そして免疫グロブリン抗原結合ドメインを再構成することを可能にする。適切には、軽鎖可変領域は３つのＣＤＲを含み、重鎖可変領域は３つのＣＤＲを含む。適切には、標的ドメインに使用するためのＣＤＲは任意の種（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ）の抗体分子に由来し、ＣＤＲ間のフレームワーク領域はヒト化されているか、またはヒトフレームワーク領域と少なくとも８５％、９０％、９５または９９％同一である配列を含む。
【００３０】
ＣＡＲの標的ドメインがｓｃＦｖを含む場合、免疫グロブリン軽鎖および免疫グロブリン重鎖は様々な長さのポリペプチドリンカーによって連結されている。適切には、ポリペプチドリンカーは、１０アミノ酸以上の長さを含む。適切には、ポリペプチドリンカーは、１０、１５、２０、または２５アミノ酸より多い長さを含む。適切には、ポリペプチドリンカーは、３０アミノ酸以下の長さを含む。適切には、ポリペプチドリンカーは、１５、２０、２５、または３０アミノ酸未満の長さを含む。適切には、ポリペプチドリンカーは、１０〜３０アミノ酸長を含む。適切には、ポリペプチドリンカーは、１０〜２５アミノ酸長を含む。適切には、ポリペプチドリンカーは１０〜２０アミノ酸長を含む。適切には、ポリペプチドリンカーは、１０〜１５アミノ酸長を含む。適切には、ポリペプチドリンカーは１５〜３０アミノ酸長を含む。適切には、ポリペプチドリンカーは、２０〜３０アミノ酸長を含む。適切には、ポリペプチドリンカーは、２５〜３０アミノ酸長を含む。適切には、ポリペプチドリンカーは親水性アミノ酸を含む。適切には、ポリペプチドリンカーは親水性アミノ酸からなる。適切には、ポリペプチドリンカーはアミノ酸配列ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧを含む。適切には、ポリペプチドリンカーはＧ４Ｓ配列（ＧＧＧＧＳ）を含む。Ｇ４Ｓリンカーは、リンカーの柔軟性およびプロテアーゼ耐性を可能にする。適切には、Ｇ４Ｓリンカーは、ポリペプチドリンカー中で１、２、３、４、５、６、７、または８回連続して繰り返される。
【００３１】
本発明のＣＡＲは、ＮＨ２末端リーダー配列１０１をさらに含む。リーダー配列（シグナルペプチドとしても知られる）は、発現されたＣＡＲ構築物が小胞体（ＥＲ）に入り込み、細胞表面を標的とすることを可能にする。リーダー配列はＥＲで切断され、成熟細胞表面ＣＡＲはリーダー配列を有しない。一般に、リーダー配列の長さは５〜３０アミノ酸の範囲であり、そして一連の疎水性アミノ酸を含む。適切には、リーダー配列は、５、１０、１５、２０、または２５より多い長さのアミノ酸を含む。適切には、リーダー配列は、１０、１５、２０、２５、または３０未満の長さのアミノ酸を含む。適切には、リーダー配列は任意の分泌タンパク質に由来する配列を含む。適切には、リーダー配列はＣＤ８αリーダー配列に由来する配列を含む。
【００３２】
本発明のＣＡＲは、膜貫通ドメインをさらに含む。図１Ａの特徴１０３を参照のこと。膜貫通ドメインは、疎水性アミノ酸残基を含み、そしてＣＡＲが操作されたＮＫ細胞の細胞膜に固定されることを可能にする。適切には、膜貫通ドメインは膜貫通タンパク質に由来するアミノ酸配列を含む。適切には、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のα、β、またはζ鎖の膜貫通ドメイン、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、およびＣＤ１５４に由来するアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲはＣＤ８の膜貫通ドメインに由来するアミノ酸配列を有する膜貫通を含む。適切には、ＣＡＲは、ヒトＣＤ８αの膜貫通ドメインに由来するアミノ酸配列を有する膜貫通ドメインを含む。
【００３３】
本発明のＣＡＲは、１つまたはそれ以上の細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む。図１Ａの特徴１０４および１０５を参照のこと。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲの効力を増大させ、そして免疫細胞シグナル伝達に関与するタンパク質に由来する細胞内シグナル伝達ドメインを含む。適切には、１つまたはそれ以上の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζＣＤ２８、ＯＸ−４０、４−１ＢＢ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、またはそれらの任意の組み合わせに由来する細胞内シグナル伝達ドメインを含む。適切には、１つまたはそれ以上の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζＣＤ２８、ＯＸ−４０、４−１ＢＢ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、２Ｂ４（ＣＤ２４４）のいずれか２つ、またはそれらの任意の組み合わせに由来する細胞内シグナル伝達ドメインを含む。適切には、ＣＡＲは、ＣＤ３ζおよび４−１ＢＢ由来の少なくとも２つの細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【００３４】
本発明のＣＡＲはまた、標的ドメインと膜貫通ドメインとの間に位置するヒンジ領域を含み得る。ヒンジ領域は親水性アミノ酸を含み、細胞表面に対する標的ドメインの柔軟性を可能にする。適切には、ヒンジ領域は５、１０、１５、２０、２５、または３０より多いアミノ酸を含む。適切には、ヒンジ領域は１０、１５、２０、２５、３０、または３５未満のアミノ酸を含む。
【００３５】
本発明のＣＤ３８  ＣＡＲは、配列番号１を含む重鎖可変領域を含む結合ドメインを有することが好ましい。必要に応じて、重鎖可変領域は配列番号７を含む。ＣＤ３８  ＣＡＲ結合ドメインは、配列番号２３または配列番号２８を含む軽鎖可変領域を含む。
【００３６】
実施例の好ましいＣＤ３８  ＣＡＲは、配列番号１を含む重鎖可変領域および配列番号２３を含む軽鎖可変領域を含む結合ドメインを有する。
【００３７】
ＣＤ３８  ＣＡＲ結合ドメインは、配列番号２９、配列番号３０および配列番号３１から選択される１つまたはそれ以上あるいは全ての重鎖ＣＤＲを含むことが好ましい。必要に応じて、ＣＡＲは配列番号３２、配列番号３３および配列番号３４から選択される１つまたはそれ以上あるいは全ての重鎖ＣＤＲを含む。
【００３８】
ＣＤ３８  ＣＡＲ結合ドメインは、配列番号３５、配列番号３６および配列番号３７、または配列番号３８、配列番号３９および配列番号４０から選択される１つまたはそれ以上あるいは全ての軽鎖ＣＤＲを含むことが好ましい。
【００３９】
好ましくは、上記の重鎖および軽鎖のフラグメントおよび改変体は、実質的に同じＣＤ３８結合活性を有するＣＡＲ結合ドメインを提供し、ここでフラグメントは、切断されている、および／またはアミノ酸が欠失および／または改変されているペプチドを含む。本発明による任意の断片／改変体は、実施例の好ましいＣＡＲの結合活性の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％を保持することが好ましい。本発明による任意のフラグメント／改変体は、好ましいＣＡＲの結合活性を１０％より多く、２０％より多く、５０％より多く、好ましくは１００％以下で越えない結合活性を有することがさらに好ましい。
【００４０】
ＣＤ３８  ＣＡＲ結合ドメインは、配列番号１と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％の配列相同性を有する重鎖可変領域を含むことが好ましい。必要に応じて、ＣＤ３８  ＣＡＲは、配列番号７と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％の配列相同性を有する重鎖可変領域を含む。
【００４１】
ＣＤ３８  ＣＡＲ結合ドメインは、配列番号２３または配列番号２８と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％の配列相同性を有する軽鎖可変領域を含むことが好ましい。
【００４２】
ＣＤ３８  ＣＡＲ結合ドメインは、配列番号２９、配列番号３０および配列番号３１と少なくとも７０％、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％の配列相同性を有する１つまたはそれ以上あるいは全ての重鎖ＣＤＲを含むことが好ましい。必要に応じて、ＣＤ３８  ＣＡＲは、配列番号３２、配列番号３３および配列番号３４と少なくとも７０％、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％の配列相同性を有する重鎖ＣＤＲの１つまたはそれ以上あるいは全てを含む。
【００４３】
ＣＤ３８  ＣＡＲ結合ドメインは、配列番号３５、配列番号３６および配列番号３７、または配列番号３８、配列番号３９および配列番号４０と少なくとも７０％、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％の配列相同性を有する１つまたは以上あるいは全ての軽鎖ＣＤＲを含むことが好ましい。
【００４４】
ＣＤ３８  ＣＡＲは、配列番号４１、配列番号４２および配列番号４３から選択される１つまたはそれ以上の共刺激ドメインを含むことが好ましい。ＣＡＲは、配列番号４１、配列番号４２または配列番号４３と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％の配列相同性を有する共刺激ドメインを含むことが好ましい。
【００４５】
ＣＤ３８  ＣＡＲ結合ドメインは、長さが少なくとも６０アミノ酸、少なくとも７０アミノ酸、少なくとも８０アミノ酸、少なくとも９０アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも１１０アミノ酸、より好ましくは少なくとも１２０アミノ酸である配列番号１の断片である配列を含む重鎖可変領域を含むことが好ましい。必要に応じて、ＣＤ３８  ＣＡＲは、長さが少なくとも６０アミノ酸、少なくとも７０アミノ酸、少なくとも８０アミノ酸、少なくとも９０アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも１１０アミノ酸、より好ましくは少なくとも１２０アミノ酸である配列番号７の断片である配列を含む重鎖可変領域を含む。
【００４６】
ＣＤ３８  ＣＡＲ結合ドメインは、長さが少なくとも５０アミノ酸、少なくとも６０アミノ酸、少なくとも７０アミノ酸、少なくとも８０アミノ酸、少なくとも９０アミノ酸、より好ましくは少なくとも１００アミノ酸である配列番号２３または配列番号２８の断片である配列を含む軽鎖可変領域を含むことが好ましい。
【００４７】
（ＣＡＲ標的ドメイン）
適切には、本明細書で提供される「癌関連抗原」は、正常細胞によって発現されるよりも大きい程度まで癌性細胞によって発現される癌の分子マーカーを言う。癌関連抗原は一般にタンパク質またはそれに由来するポリペプチドであるが、グリカン、脂質、または他の有機小分子であり得る。さらに、癌抗原は、正常細胞と比較して癌細胞によって示される翻訳後プロセシング、例えばタンパク質グリコシル化、タンパク質脂質化、タンパク質リン酸化、またはタンパク質アセチル化の増加または減少を介して生じ得る。癌関連抗原の非限定的な例は、ＣＤ３８、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ−７、ＴＮＦＲＳＦ１７／ＢＣＭＡ、ＳＹＮＤ１／ＣＤ１３８、ＣＤ２２９、ＣＤ４７、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＣＤ１２３／ＩＬ３−ＲＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、メソテリン、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、Ｔｎ抗原、ＮＥＵ５ＧＣ、ＮｅｕＧｃＧＭ３、ＧＤ２、ＣＬＬ−１、ＨＥＲＶ−Ｋを含む。
【００４８】
適切には、本明細書で提供される「血液癌関連抗原」は、白血病、リンパ腫、骨髄腫によって、血液細胞で発現されるよりも高い程度で発現される癌の分子マーカーを言う。血液癌関連抗原は一般にタンパク質またはそれに由来するポリペプチドであるが、グリカン、脂質、または他の有機小分子であり得る。さらに、血液癌抗原は、正常細胞と比較して白血病、リンパ腫、または骨髄腫細胞によって示される翻訳後プロセシング、例えば、タンパク質グリコシル化、タンパク質脂質化、タンパク質リン酸化、またはタンパク質アセチル化の増加または減少を介して起こり得る。血液癌関連抗原の非限定的な例には、ＣＤ３８、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ−７、ＴＮＦＲＳＦ１７／ＢＣＭＡ、ＳＹＮＤ１／ＣＤ１３８、ＣＤ２２９、ＣＤ４７、ＣＤ１２３／ＩＬ３−ＲＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＧＤ２、ＣＬＬ−１、ＨＥＲＶ−Ｋが挙げられる。血液癌の非限定的な例には、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、有毛細胞白血病、Ｔ細胞性リンパ球性白血病、多発性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫、軽鎖骨髄腫、または大顆粒状リンパ球性白血病が挙げられる。
【００４９】
適切には、操作されたＮＫ細胞は、細胞表面タンパク質に特異的に結合する標的ドメインを有するＣＡＲを含む。適切には、操作されたＮＫ細胞は、２つまたはそれ以上の異なる細胞表面タンパク質に特異的に結合する標的ドメインを有する２つまたはそれ以上のＣＡＲＳを含む。適切には、ＣＡＲ標的ドメインは癌性細胞の細胞表面上の癌関連抗原に特異的に結合する。適切には、ＣＡＲは、ＣＤ３８、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ−７、ＴＮＦＲＳＦ１７／ＢＣＭＡ、ＳＹＮＤ１／ＣＤ１３８、ＣＤ２２９、ＣＤ４７、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＣＤ１２３／ＩＬ３−ＲＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、メソセリン、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、Ｔｎ抗原、ＮＥＵ５ＧＣ、ＮｅｕＧｃＧＭ３、ＧＤ２、ＣＬＬ−１、ＨＥＲＶ−Ｋに特異的に結合する。
【００５０】
環状ＡＤＰリボースヒドロラーゼとしても知られているＣＤ３８は、主に免疫細胞上に見出される細胞表面糖タンパク質である。ＣＤ３８は細胞内カルシウムの調節に関与しており、白血病、骨髄腫、そして多くの固形腫瘍を含む多くの異なる癌にて過剰発現される。適切には、本発明の操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ３８に特異的な標的ドメイン１０２を有するＣＡＲを発現する。適切には、ＣＤ３８  ＣＡＲは、配列番号１〜６のいずれか１つに記載のものと少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＤ３８  ＣＡＲは、配列番号１〜６のいずれか１つに記載のものと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＤ３８  ＣＡＲは、配列番号１〜６のいずれか１つに記載のものと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＤ３８  ＣＡＲは、配列番号１〜６のいずれか１つに記載のものと少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＤ３８  ＣＡＲは、配列番号１〜６のいずれか１つに記載のものと少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＤ３８  ＣＡＲは、配列番号１〜６のいずれか１つに記載のものと同一の配列を含む。
【００５１】
適切には、操作されたＮＫ細胞は、配列番号１に記載のアミノ酸配列および配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む標的ドメインを有するＣＡＲを発現する。適切には、ＣＡＲは、配列番号１に記載のものと８０％同一のアミノ酸配列、および配列番号２に記載のものと８０％同一のアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは配列番号１に記載のものと９０％同一のアミノ酸配列、および配列番号２に記載のものと９０％同一のアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号１に記載のものと９５％同一のアミノ酸配列、および配列番号２に記載のものと９５％同一のアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号１に記載のものと９８％同一のアミノ酸配列、および配列番号２に記載のものと９８％同一のアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号１に記載のものと９９％同一のアミノ酸配列、および配列番号２に記載のものと９９％同一のアミノ酸配列を含む。適切には、配列番号１および配列番号２は、柔軟なポリペプチドリンカーによって連結されている。適切には、柔軟なポリペプチドリンカーは、配列番号１に記載のポリペプチドのＣＯＯＨ末端を配列番号２に記載のポリペプチドのＮＨ２末端に連結する。適切には、柔軟なポリペプチドリンカーは、配列番号２に記載のポリペプチドのＣＯＯＨ末端を配列番号１に記載のポリペプチドのＮＨ２末端に連結する。
【００５２】
適切には、操作されたＮＫ細胞は、配列番号３に記載のアミノ酸配列、および配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む標的ドメインを有するＣＡＲを発現する。適切には、ＣＡＲは、配列番号３に記載のアミノ酸配列と８０％同一のアミノ酸配列、および配列番号４に記載のアミノ酸配列と８０％同一のアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号３に記載のものと９０％同一のアミノ酸配列、および配列番号４に記載のものと９０％同一のアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号３に記載のものと９５％同一のアミノ酸配列、および配列番号４に記載のものと９５％同一のアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号３に記載のものと９８％同一のアミノ酸配列、および配列番号４に記載のものと９８％同一のアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号３に記載のものと９９％同一のアミノ酸配列、および配列番号４に記載のものと９９％同一のアミノ酸配列を含む。適切には、配列番号３および配列番号４は、柔軟なポリペプチドリンカーによって連結されている。適切には、柔軟なポリペプチドリンカーは、配列番号３に記載のポリペプチドのＣＯＯＨ末端を配列番号４に記載のポリペプチドのＮＨ２末端に連結する。適切には、柔軟なポリペプチドリンカーは、配列番号４に記載のポリペプチドのＣＯＯＨ末端を配列番号３に記載のポリペプチドのＮＨ２末端に連結する。
【００５３】
適切には、操作されたＮＫ細胞は、配列番号５に記載のアミノ酸配列、および配列番号６に記載のアミノ酸配列を含む標的ドメインを有するＣＡＲを発現する。適切には、ＣＡＲは、配列番号５に記載のアミノ酸配列と８０％同一のアミノ酸配列、および配列番号６に記載のアミノ酸配列と８０％同一のアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号５に記載のものと９０％同一のアミノ酸配列、および配列番号６に記載のものと９０％同一のアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号５に記載のものと９５％同一のアミノ酸配列、および配列番号６に記載のものと９５％同一のアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号５に記載のものと９８％同一のアミノ酸配列、および配列番号６に記載のものと９８％同一のアミノ酸配列を含む。適切には、ＣＡＲは、配列番号５に記載のものと９９％同一のアミノ酸配列、および配列番号６に記載のものと９９％同一のアミノ酸配列を含む。適切には、配列番号５および配列番号６は、柔軟なポリペプチドリンカーによって連結されている。適切には、柔軟なポリペプチドリンカーは、配列番号５に記載のポリペプチドのＣＯＯＨ末端を配列番号６に記載のポリペプチドのＮＨ２末端に連結する。適切には、柔軟なポリペプチドリンカーは、配列番号６に記載のポリペプチドのＣＯＯＨ末端を配列番号５に記載のポリペプチドのＮＨ２末端に連結する。
【００５４】
本発明の操作されたＮＫ細胞は、最適な癌応答に対して調整されている親和性を示す一方で、非癌性または非腫瘍細胞上で発現されるＣＤ３８に対する反応性も最小限に抑えるＣＤ３８特異的ＣＡＲを含み得る。ダラツムマブは、ＣＤ３８受容体に対して高い親和性を示すモノクローナル抗体である。適切には、ＣＡＲは、ダラツムマブよりもＣＤ３８に対して低い親和性を示す抗体に由来する標的ドメインを含む。適切には、ＣＡＲは、ダラツムマブよりもＣＤ３８に対して２５％低い親和性を示す抗体に由来する標的ドメインを含む。適切には、ＣＡＲは、ダラツムマブよりもＣＤ３８に対して５０％低い親和性を示す抗体に由来する標的ドメインを含む。適切には、ＣＡＲは、ダラツムマブよりもＣＤ３８に対して２倍低い親和性を示す抗体に由来する標的ドメインを含む。抗体親和性は、例えば表面プラズモン共鳴（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ）の使用により測定され得る。
【００５５】
（二重特異的ＣＡＲ）
操作されたＮＫ細胞は二重特異的であり得、すなわち二重特異的ＣＡＲまたは複数の異なるＣＡＲを発現し得、それらの親和性は２つの異なるリガンド／抗原に対するものである。二重特異的ＣＡＲ−ＮＫは、癌細胞上の潜在的な結合部位の数を増加させるために、あるいはＮＫ−ＣＡＲに特異的なリガンドを発現する他の免疫エフェクター細胞に癌細胞を局在化させるために使用され得る。癌治療における使用のために、二重特異的ＣＡＲは、標的腫瘍細胞およびエフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞またはマクロファージ）に結合し得る。したがって、例えば、多発性骨髄腫の場合、二重特異的ＣＡＲはＴ細胞抗原（例えばＣＤ３など）および腫瘍細胞マーカー（例えばＣＤ３８など）に結合し得る。あるいは、二重特異的ＣＡＲは、標的腫瘍細胞に対するＮＫ細胞の全体的な結合親和性を増大させる、２つの別々の腫瘍細胞マーカーに結合し得る。これは、標的抗原のうちの１つを下方制御することによって癌細胞が耐性を発達させる危険性を減少させ得る。この場合の例は、多発性骨髄腫では、ＣＤ３８とＣＳ−１／ＳＬＡＭＦ７の両方に結合するＣＡＲである。ＣＡＲによって適切に標的化されている別の腫瘍細胞マーカーは、ＣＤ４７によって例示される、腫瘍上の「自らを食べない」タイプのマーカーである。
【００５６】
本発明の操作されたＮＫ細胞は、二重特異的ＣＡＲまたは同じＮＫ細胞によって発現される複数のＣＡＲを含み得る。これにより、ＮＫ細胞は２つの異なる抗原を同時に標的にすることができる。適切には、二重特異的ＣＡＲは、以下の抗原のいずれか２つに対して特異性を有する：ＣＤ３８、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ−７、ＴＮＦＲＳＦ１７／ＢＣＭＡ、ＣＤ１２３／ＩＬ３−ＲＡ、ＳＹＮＤ１／ＣＤ１３８、ＣＤ２２９、ＣＤ４７、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、メソテリン、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、Ｔｎ抗原、ＮＥＵ５ＧＣ、ＮｅｕＧｃＧＭ３、ＧＤ２、ＣＬＬ−１、ＣＤ１２３、ＨＥＲＶ−Ｋ。適切には、ＣＡＲ  ＮＫ細胞の二重特異的性質は、腫瘍抗原および他の免疫細胞、例えばＴ細胞または樹状細胞への結合を可能にし得る。適切には、ＣＡＲ  ＮＫ細胞の二重特異的性質は、ＰＤＬ−１またはＣＤ４７などのチェックポイント抑制因子への結合を可能にし得る。適切には、第一のＣＡＲはＣＤ３８特異性を有し、第二のＣＡＲはＳＬＡＭＦ−７、ＢＣＭＡ、ＣＤ１３８、ＣＤ２２９、ＰＤＬ−１、またはＣＤ４７のいずれかに対して特異性を有する。適切には、第一のＣＡＲはＣＤ３８に対する特異性を有し、そして第二のＣＡＲはＳＬＡＭＦ−７、ＢＣＭＡ、ＣＤ１３８、ＣＤ２２９に対する特異性を有する。適切には、第一のＣＡＲはＣＤ３８に対する特異性を有し、そして第二のＣＡＲはＳＬＡＭＦ−７に対する特異性を有する。適切には、第一のＣＡＲはＣＤ３８に対する特異性を有し、そして第二のＣＡＲはＢＣＭＡに対する特異性を有する。適切には、第一のＣＡＲはＣＤ３８に対する特異性を有し、そして第二のＣＡＲはＣＤ１３８に対する特異性を有する。適切には、第一のＣＡＲはＣＤ３８に対する特異性を有し、第二のＣＡＲはＣＤ２２９に対する特異性を有する。
【００５７】
（ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド）
腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー１０としても知られるＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）は、アポトーシスの開始を通して細胞死を誘導するタンパク質リガンドである。アポトーシスは、癌細胞を含む多くの異なる種類の細胞の細胞表面上に発現されるＴＲＡＩＬ受容体へのＴＲＡＩＬの結合を介して開始される。本発明の操作されたＮＫ細胞は、細胞死誘導受容体ＤＲ４、ＤＲ５または両方に対するその結合親和性を増加させ、一方でＤｃＲ１またはＤｃＲ２のようなデコイ受容体に対する結合親和性を低下させるために、野生型ＴＲＡＩＬタンパク質配列から少なくとも１つのアミノ酸残基によって改変された改変体ＴＲＡＩＬポリペプチドを発現し得る。適切には、操作されたＮＫ細胞はＣＡＲおよび改変体ＴＲＡＩＬポリペプチドを発現する。適切には、ＴＲＡＩＬ改変体は１つまたはそれ以上のＴＲＡＩＬ受容体に対して増加した結合親和性を示す。適切には、ＴＲＡＩＬ改変体はＴＲＡＩＬ受容体ＤＲ４に対して増加した結合親和性を示す。適切には、ＴＲＡＩＬ改変体はＴＲＡＩＬ受容体ＤＲ５に対して増加した結合親和性を示す。適切には、ＴＲＡＩＬ改変体はＴＲＡＩＬ受容体ＤＲ４およびＤＲ５に対して増加した結合親和性を示す。野生型ＴＲＡＩＬは、ＤＲ４について２ｎＭより多い、ＤＲ５について５ｎＭより多い、デコイ受容体ＤｃＲ１について２０ｎＭより多いＫＤ（ＷＯ２００９／０７７８５７；表面プラズモン共鳴により測定）、またはＤＲ４について約５０〜１００ｎＭ、ＤＲ５について１〜１０ｎＭ、およびＤｃＲ１について１７５〜２２５ｎＭ（Ｔｒｕｎｅｈ、Ａ．ら、２０００；等温滴定熱量測定およびＥＬＩＳＡにより測定）を有することが典型的に知られている。したがって、ＤＲ４に対する増加した親和性はそれぞれ２ｎＭ未満または５０ｎＭ未満のＫＤとして適切に定義され、一方ＤＲ５に対する増加した親和性はそれぞれ５ｎＭ未満または１ｎＭ未満のＫＤとして適切に定義される。デコイ受容体ＤｃＲ１に対する親和性の低下は、それぞれ５０ｎＭより多いまたは２２５ｎＭより多いＫＤとして適切に定義される。いずれにせよ、ＴＲＡＩＬ改変体／変異体によって示される親和性の増加または減少は、野生型ＴＲＡＩＬによって示されるベースラインの親和性に対するものである。適切には、ＴＲＡＩＬ受容体に対するＴＲＡＩＬ改変体の親和性は、野生型ＴＲＡＩＬによって示される親和性と比較して少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％または５０％増加する。特定の実施形態では、ＴＲＡＩＬ改変体は、標的細胞におけるカスパーゼ８の活性化によって測定されるように、野生型と比較してアポトーシスを増加させる。適切には、ＴＲＡＩＬ改変体は、標的細胞において野生型と比較してカスパーゼ８の活性化を少なくとも２倍増加させる。適切には、ＴＲＡＩＬ受容体改変体は、Ｄ２６９Ｈ、Ｓ１５９Ｒ、Ｅ１９５Ｒ、Ｇ１３１Ｒ、Ｎ１９９Ｒ、Ｋ２０１Ｈ、またはそれらの任意の組み合わせを含むヒトＴＲＡＩＬのアミノ酸変異を含む。適切には、ＴＲＡＩＬ受容体改変体は、ヒトＴＲＡＩＬの２アミノ酸変異、Ｄ２６９ＨおよびＥ１９５Ｒを含む。適切には、ＴＲＡＩＬ受容体改変体はＤ２６９Ｈ変異を含む。適切には、ＴＲＡＩＬ受容体改変体はＥ１９５Ｒ変異を含む。適切には、ＴＲＡＩＬ受容体改変体は、ヒトＴＲＡＩＬの３アミノ酸変異、Ｇ１３１Ｒ、Ｎ１９９Ｒ、およびＫ２０１Ｈを含む。適切には、変異型ＴＲＡＩＬ受容体は初代Ｔ細胞またはＴ細胞株上に発現される。適切には、ＴＲＡＩＬ受容体は、Ｔ細胞株にトランスフェクトされているポリヌクレオチドによってコードされる。
【００５８】
（チェックポイント抑制性受容体）
チェックポイント抑制性受容体は、Ｔ細胞およびＮＫ細胞などの免疫エフェクター細胞の表面上に発現され、そしてこれらの細胞の細胞傷害性を負に調節する。チェックポイント抑制性受容体の例としては、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４およびＣＤ９６が挙げられ、それらは全てＮＫ細胞上で発現される。適切には、操作されたＮＫ細胞は、チェックポイント抑制性受容体機能の低下または欠如を含む。適切には、機能が低下または欠如しているチェックポイント抑制性受容体は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ−３）、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）、ＳＩＧＬＥＣ９、ＴＩＧＩＴおよび／またはＴＩＭ−３の１つまたそれ以上あるいは全てを含む。適切には、チェックポイント抑制性受容体は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、またはＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）のうちの１つまたはそれ以上を含む。適切には、ＮＫ細胞細胞は、２つまたはそれ以上のチェックポイント抑制性受容体について減少したまたは存在しないチェックポイント抑制性受容体機能を含む。適切には、２つまたはそれ以上のチェックポイント抑制性受容体は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、またはＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）を含む。適切には、ＮＫ細胞は、３つのチェックポイント抑制性受容体について減少したまたは存在しないチェックポイント抑制性受容体機能を示す。適切には、３つのチェックポイント抑制性受容体は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、またはＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）を含む。適切には、操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ３８  ＣＡＲ、およびチェックポイント抑制性受容体の欠失または減少を含む。適切には、操作されたＮＫ細胞はＣＤ３８  ＣＡＲ、改変体ＴＲＡＩＬタンパク質、およびチェックポイント抑制性受容体の欠失または減少を含む。
【００５９】
適切には、操作されたＮＫ細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＴＡＬＥＮ機構を介した遺伝子欠失によってチェックポイント抑制性受容体を減少させるように改変されている。適切には、操作されたＮＫ細胞はＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）の遺伝子欠失を含む。適切には、操作されたＮＫ細胞はＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）の遺伝子欠失を含む。適切には、操作されたＮＫ細胞はＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）の遺伝子欠失を含む。適切には、操作されたＮＫ細胞はＣＤ２７９（ＰＤ−１）の遺伝子欠失を含む。適切には、操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、またはＣＤ２７９（ＰＤ−１）のうちの任意の２つ以上の遺伝子欠失を含む。適切には、操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、またはＣＤ２７９（ＰＤ−１）のうちの任意の３つまたはそれ以上の遺伝子欠失を含む。適切には、操作されたＮＫ細胞は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡによるチェックポイント抑制性受容体発現を減少させるように改変されている。適切には、操作されたＮＫ細胞はＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）の発現減少を含む。適切には、操作されたＮＫ細胞はＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）の発現減少を含む。適切には、操作されたＮＫ細胞はＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）の発現減少を含む。適切には、操作されたＮＫ細胞はＣＤ２７９（ＰＤ−１）の発現減少を含む。適切には、操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、またはＣＤ２７９（ＰＤ−１）のうちの任意の２つまたはそれ以上の発現の減少を含む。適切には、操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、またはＣＤ２７９（ＰＤ−１）のうちの任意の３つまたはそれ以上の発現の減少を含む。
【００６０】
適切には、上述したように、ＨＥＣＡ−４５２抗体の結合によって証明される高レベルのＥ−セレクチンリガンドを発現する操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ３８  ＣＡＲ、ＴＲＡＩＬ改変体ポリペプチド、あるいはチェックポイント抑制性受容体の欠失または減少を含む。適切には、高レベルのＥ−セレクチンリガンドを発現する操作されたＮＫ細胞はＣＤ３８  ＣＡＲおよびＴＲＡＩＬ改変体ポリペプチドを含む。適切には、高レベルのＥ−セレクチンリガンドを発現する操作されたＮＫ細胞はＣＤ３８  ＣＡＲおよびチェックポイント抑制性受容体の欠失または減少を含む。適切には、高レベルのＥ−セレクチンリガンドを発現する操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ３８  ＣＡＲ、ＴＲＡＩＬ改変体ポリペプチド、および１つまたはそれ以上のチェックポイント抑制因子の欠失または減少を含む。適切には、ＣＤ３８  ＣＡＲは、配列番号１〜６のいずれか１つに記載のものと少なくとも８０％同一の標的ドメイン配列を含む。適切には、ＣＤ３８  ＣＡＲは、配列番号１〜６のいずれか１つに記載のものと少なくとも９０％同一の標的ドメイン配列を含む。適切には、ＣＤ３８  ＣＡＲは、配列番号１〜６のいずれか１つに記載のものと少なくとも９５％同一の配列を含む。適切には、ＣＤ３８  ＣＡＲは、配列番号１〜６のいずれか１つに記載のものと少なくとも９８％同一の配列を含む。適切には、ＣＤ３８  ＣＡＲは、配列番号１〜６のいずれか１つに記載のものと少なくとも９９％同一の配列を含む。適切には、ＣＤ３８  ＣＡＲは、配列番号１〜６のいずれか１つに記載のものと同一の配列を含む。適切には、ＴＲＡＩＬ受容体改変体は、ヒトＴＲＡＩＬの２アミノ酸変異、Ｄ２６９ＨおよびＥ１９５Ｒを含む。適切には、ＴＲＡＩＬ受容体改変体は、ヒトＴＲＡＩＬの３アミノ酸変異、Ｇ１３１Ｒ、Ｎ１９９Ｒ、およびＫ２０１Ｈを含む。適切には、ＴＲＡＩＬ受容体改変体はＤ２６９Ｈ変異を含む。適切には、ＴＲＡＩＬ受容体改変体はＥ１９５Ｒ変異を含む。適切には、チェックポイント抑制性受容体は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ−３）、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）、ＳＩＧＬＥＣ９、ＴＩＧＩＴ、および／またはＴＩＭ−３の１つまたはそれ以上あるいは全てである。
【００６１】
適切には、ＨＥＣＡ−４５２抗体の結合によって証明される高レベルのＥ−セレクチンリガンドを発現する操作されたＮＫ細胞はＫＨＹＧ−１細胞である。適切には、ＫＨＹＧ−１細胞はＣＤ３８  ＣＡＲ、ＴＲＡＩＬ改変体ポリペプチド、あるいはチェックポイント抑制性受容体の機能の欠失または低下を含む。適切には、ＫＨＹＧ−１細胞はＣＤ３８  ＣＡＲおよびＴＲＡＩＬ改変体ポリペプチドを含む。適切には、ＫＨＹＧ−１細胞はＣＤ３８  ＣＡＲ、およびチェックポイント抑制性受容体の機能の欠失または低下を含む。適切には、ＫＨＹＧ−１細胞はＣＤ３８  ＣＡＲ、ＴＲＡＩＬ改変体ポリペプチド、およびチェックポイント抑制性受容体の機能の欠失または低下を含む。適切には、ＣＤ３８  ＣＡＲは、配列番号１〜６のいずれか１つに記載のものと少なくとも８０％同一の標的ドメイン配列を含む。適切には、ＣＤ３８  ＣＡＲは、配列番号１〜６のいずれか１つに記載のものと少なくとも９０％同一の標的ドメイン配列を含む。適切には、ＣＤ３８  ＣＡＲは、配列番号１〜６のいずれか１つに記載のものと少なくとも９５％同一の配列を含む。適切には、ＣＤ３８  ＣＡＲは、配列番号１〜６のいずれか１つに記載のものと少なくとも９８％同一の配列を含む。適切には、ＣＤ３８  ＣＡＲは、配列番号１〜６のいずれか１つに記載のものと少なくとも９９％同一の配列を含む。適切には、ＣＤ３８  ＣＡＲは、配列番号１〜６のいずれか１つに記載のものと同一の配列を含む。適切には、ＴＲＡＩＬ受容体改変体は、ヒトＴＲＡＩＬの２アミノ酸変異、Ｄ２６９ＨおよびＥ１９５Ｒを含む。適切には、ＴＲＡＩＬ受容体改変体は、ヒトＴＲＡＩＬの３アミノ酸変異、Ｇ１３１Ｒ、Ｎ１９９Ｒ、およびＫ２０１Ｈを含む。適切には、ＴＲＡＩＬ受容体改変体はＤ２６９Ｈ変異を含む。適切には、ＴＲＡＩＬ受容体改変体はＥ１９５Ｒ変異を含む。適切には、チェックポイント抑制性受容体は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ−３）、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）、ＳＩＧＬＥＣ９、ＴＩＧＩＴ、および／またはＴＩＭ−３の１つまたはそれ以上あるいは全てである。
【００６２】
（操作されたナチュラルキラー細胞の作製方法）
操作されたナチュラルキラー細胞は、当技術分野において公知のいくつかの異なる技術を使用して作製され得る。適切には、ＣＤ３８  ＣＡＲまたはＴＲＡＩＬ改変体タンパク質は、ウイルスベクターに挿入されているポリヌクレオチドによってコードされる。適切には、ウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、またはレトロウイルスを含む。適切には、ウイルスベクターはレンチウイルスまたはレトロウイルスを含む。適切には、ウイルスベクターはレンチウイルスを含む。適切には、ウイルスベクターはレトロウイルスを含む。ウイルスベクターを用いて初代ＮＫ細胞またはＮＫ細胞株に形質導入することができる。適切には、ウイルスベクターを用いて初代ＮＫ細胞に形質導入することができる。適切には、ウイルスベクターを用いてＮＫ細胞株に形質導入することができる。適切には、ウイルスベクターを用いてＮＫ−９２細胞に形質導入することができる。適切には、ウイルスベクターを用いてＫＨＹＧ−１細胞に形質導入することができる。適切には、細胞は、エレクトロポレーション、ウイルスベクター、またはインビボでの使用に適合する脂質ベースのトランスフェクション試薬のような上記の方法のいずれかを用いて一過性にトランスフェクトされ得る。
【００６３】
適切には、ＣＤ３８  ＣＡＲまたはＴＲＡＩＬ改変体タンパク質は、ポリヌクレオチドによってコードされる。適切には、ポリヌクレオチドはＤＮＡプラスミドまたは線状化ＤＮＡポリヌクレオチドである。適切には、ポリヌクレオチドはｍＲＮＡ分子である。これらのポリヌクレオチドのいずれも、エレクトロポレーションによって初代ＮＫ細胞集団またはＮＫ細胞株に導入することができる。例えば、ＭａｘＣｙｔｅ  Ｆｌｏｗ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎプラットフォームを使用して、操作されたＮＫ細胞を生成することができる。
【００６４】
チェックポイント抑制性受容体の欠失または発現減少を含む操作されたナチュラルキラー細胞は、当技術分野において公知のいくつかの異なる技術を用いて作製され得る。受容体は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的化メカニズム（ｇＲＮＡ標的化ヌクレオチドを使用）を使用して欠失または減少させることができる。ｇＲＮＡは初代ＮＫ細胞または細胞株にトランスフェクトされ得る。適切には、ｇＲＮＡは、初代ＮＫ細胞、または初代細胞の集団にトランスフェクトされ、その結果、集団におけるチェックポイント抑制性受容体の発現が低下する。適切には、ｇＲＮＡはＮＫ細胞株にトランスフェクトされる。適切には、ｇＲＮＡはＫＨＹＧ−１細胞株にトランスフェクトされ、チェックポイント抑制性受容体のホモ接合性欠失を含むクローンが選択される。
【００６５】
（ナチュラルキラー細胞の投与方法）
本発明は、被験体への静脈内投与に適した操作されたＮＫ細胞の製剤を含む医薬組成物を想定する。本発明の医薬組成物は、ＣＡＲを発現するＮＫ細胞または複数のＮＫ細胞を含み、必要に応じてＮＫ細胞は、ＴＲＡＩＬ改変体またはチェックポイント抑制因子の欠失を含み得る。適切には、ＣＡＲ発現ＮＫ細胞は、投与のために許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤と共に処方される。そのような組成物は、例えば中性緩衝生理食塩水、通常の生理食塩水、またはリン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液を含み得る。適切には、医薬組成物は、グルコース、デキストロース、ラクトース、ガラクトース、マンノース、スクロースまたはマンニトールなどの炭水化物を含み得る。適切には、医薬組成物は、タンパク質、ポリペプチド、またはアミノ酸（グリシンなど）を含む。適切には、医薬組成物は追加の安定剤および保存料（抗酸化剤など）、キレート剤（例えばＥＤＴＡまたはＥＧＴＡ）、あるいはグルタチオンを含む。適切には、ＮＫ細胞は、−７０℃未満などの低温でグリセロール中に保存されている凍結ストックから拡大させる。適切には、ＮＫ細胞は、インターロイキン２およびインターロイキン１５などのサイトカインを用いて拡大され、そして１週間以上培養される。
【００６６】
適切には、投与されるＮＫ細胞および細胞株は、細胞を受容する個体への投与の前にガンマ線照射される。適切には、細胞は、細胞がインビボで増殖および分裂するのを防ぐために照射される。適切には、細胞は少なくとも５Ｇｙ、１０Ｇｙ、２０Ｇｙ、３０Ｇｙ、４０Ｇｙ、５０Ｇｙまたはそれ以上の線量で照射される。適切には、細胞は、２０Ｇｙ、３０Ｇｙ、４０Ｇｙ、５０Ｇｙ、６０Ｇｙ以下の線量で照射される。適切には、細胞は、それらのインビボ半減期が約７、６、５、４、３、２、または１日未満になるように処理される。適切には、細胞および細胞株は、細胞分裂を妨げるかまたは細胞に対して有毒であるタンパク質を発現する自殺遺伝子を含み、半減期の短縮を可能にし、または化合物の投与時に細胞を死滅させることを可能にする。一般的な自殺遺伝子の例には、ヘルペスチミジンキナーゼおよび誘導性カスパーゼ９が含まれる。ヘルペスチミジンキナーゼを含む細胞は、アシクロビルまたはガンシクロビルなどの抗ヘルペス抗ウイルス薬を使用して死滅させることができる。
【００６７】
本発明の主題である操作されたＮＫ細胞は、特定の癌または新生物の進行を予防するかまたは寛解を誘導するのに十分な量で投与され得る。適切には、操作されたＮＫ細胞は、約１×１０６細胞／ｍ２、約１×１０７細胞／ｍ２、約１×１０８細胞／ｍ２、約１×１０９細胞／ｍ２、および約１×１０１０細胞／ｍ２の量で投与される。適切には、操作されたＮＫ細胞は、約１×１０６〜約１×１０１０細胞／ｍ２の量で投与される。適切には、操作されたＮＫ細胞は、約１×１０７〜約１×１０１０細胞／ｍ２の間の量で投与される。適切には、操作されたＮＫ細胞は、約１×１０８〜約１×１０１０細胞／ｍ２の量で投与される。適切には、操作されたＮＫ細胞は、約１×１０９〜約１×１０１０細胞／ｍ２の量で投与される。適切には、操作されたＮＫ細胞は、約１×１０７〜約１×１０９細胞／ｍ２の量で投与される。適切には、操作されたＮＫ細胞は、約１×１０７〜約１×１０８細胞／ｍ２の量で投与される。適切には、操作されたＮＫ細胞は、約１×１０８〜約１×１０９細胞／ｍ２の量で投与される。操作されたＮＫ細胞は、毎日、毎週、または毎月投与され得る。適切には、細胞は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上の週にわたって毎週投与される。適切には、毎週の投与後、操作されたＮＫ細胞を維持のために毎月投与され得る。細胞は治療される癌に適した方法で投与され得る。例えば、血液癌の場合、細胞は静脈内投与され得る。例えば、固形組織癌については、細胞は腫瘍内または腹腔内に投与され得る。
【００６８】
（治療アジュバント）
操作されたＮＫ細胞の投与の前、それと同時に、またはその後に治療アジュバントを投与すると、治療の有効性を高めることができる。適切には、アジュバントは、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン８（ＩＬ−８）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）、またはプロテアソーム阻害剤を含む。適切には、プロテアソーム阻害剤はボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、イクサゾミブ、またはそれらの組み合わせである。適切には、ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、またはプロテアソーム阻害剤のいずれかが、操作されたＮＫ細胞の投与の前に患者に投与され得る。適切には、ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、またはプロテアソーム阻害剤のいずれかが、操作されたＮＫ細胞の投与中に患者に投与され得る。適切には、ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、またはプロテアソーム阻害剤のいずれかが、操作されたＮＫ細胞の投与後に患者に投与され得る。適切には、ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５の活性は、ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、およびＩＬ−１５受容体に対する非インターロイキンアゴニストによって供給され得る。例えば、インターロイキン１２アゴニストは、ＡＬＴ−８０３またはＡＬＴ−８０１であり得る。インターロイキン１５アゴニストはＮＩＺ９８５であり得る。
【００６９】
適切には、操作されたＮＫ細胞は、操作されたＮＫ細胞の投与の前に、インターロイキン１２、インターロイキン１５、またはプロテアソーム阻害剤と共にインキュベートされ得る。適切には、ＣＤ３８  ＣＡＲ  ＮＫ細胞は、投与前にインターロイキン１２、インターロイキン１５、またはボルテゾミブとインキュベートされ得る。適切には、ＴＲＡＩＬ改変体ＮＫ細胞は、投与前にＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、またはプロテアソーム阻害剤とインキュベートされ得る。適切には、インキュベ−ションは少なくとも４、６、８、１２、または２４時間である。
【００７０】
本発明の治療方法は、操作されたＮＫ細胞による治療を改善するためのアジュバントとしての低用量シクロホスファミドの投与を想定する。シクロホスファミドは経口的にまたは静脈内に投与され得る。適切には、シクロホスファミドはメトロノーム様式で、例えば持続的な低用量のシクロホスファミドで投与される。適切には、シクロホスファミドは、１週間、２週間、３週間、４週間、またはそれ以上、１日にまたは隔日に約１００ｍｇから約２５ｍｇの間の用量で経口投与される。適切には、シクロホスファミドは、１週間、２週間、３週間、４週間、またはそれ以上、１日に約５０ｍｇの用量で経口投与される。適切には、シクロホスファミドは、１週間、２週間、３週間、４週間、またはそれ以上、週に約１０００ｍｇ〜約２５０ｍｇの間の用量で静脈内投与される。適切には、シクロホスファミドは、１週間、２週間、３週間、４週間、またはそれ以上、週に約７５０ｍｇ、５００ｍｇ、２５０ｍｇまたはそれ以下の用量で静脈内投与される。適切には、シクロホスファミドは、操作されたＮＫ細胞の投与前に投与され、操作されたＮＫ細胞が投与されると中止される。適切には、シクロホスファミドは、操作されたＮＫ細胞の投与と１、２、３、４、５、または６ヶ月まで重複するように投与される。適切には、シクロホスファミドは、操作されたＮＫ細胞の投与と同時に投与される。
【００７１】
本発明の治療方法は、操作されたＮＫ細胞による治療を改善するためのアジュバントとしてのメタロプロテアーゼ阻害剤の投与を想定する。適切には、メタロプロテアーゼ阻害剤は、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、チゲサイクリン、デメクロサイクリン、メタサイクリン、クロールテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、リメサイクリン、メクロサイクリン、またはロリテトラサイクリンなどのテトラサイクリン系抗生物質である。適切には、テトラサイクリン系抗生物質はドキシサイクリンである。適切には、本発明の操作されたＮＫ細胞で治療されるべき個体は、１日当たり約５０ｍｇ〜約３００ｍｇの濃度、または１日当たり約１００ｍｇ〜２００ｍｇの濃度にてドキシサイクリンで前処置されるかまたは同時に処置される。ドキシサイクリンは経口的にまたは静脈内に投与され得る。適切には、個体は操作されたＮＫ細胞と同時にドキシサイクリンで治療され得る。
【００７２】
本発明の治療方法は、操作されたＮＫ細胞による殺傷に対して細胞を感受性にし、操作されたＮＫ細胞と共にまたは人工ＮＫ細胞とは別に患者に投与することができるさらなるアジュバントを想定する。例えば、癌細胞はＴＲＡＩＬ誘導アポトーシスに耐性があり得る。適切には、アジュバントは、ＴＲＡＩＬ誘導アポトーシスに対する感受性を回復させる小分子である。適切には、この化合物はＳＭＡＣ模倣物（例えばＴＬ３２７１１、ＬＣＬ１６１、ＧＤＣ−０９１７、ＨＧＳ１０２９）；ＮＦ−κＢ阻害剤（例えば（−）−ＤＨＭＥＱ、ＰＢＳ−１０８６、ＩＴ−６０３、またはＩＴ−９０１）；ネジル化阻害剤（例えばＭＬＮ４９２４）；ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤（例えば、パノビノスタット、ボリノスタット、ロミデプシン、キダミド、ベリノスタット、バルプロ酸、モセチノスタット、アベキシノスタット、エチノスタット、ＳＢ９３９、ジビノスタット、キシノスタット、レスミノスタット）である。アポトーシス抑制タンパク質の阻害剤（例えば、ＢＣＬ−２阻害剤（例えば、ベネトクラックス（ＡＢＴ−１９９）、またはオバクラックス（ＧＸ１５−０７０））；サバイビン阻害剤（例えばＹＭ１５またはシェパルジン））である治療アジュバントもまた想定される。適切には、アジュバントは、操作されたＮＫ細胞の投与の前に投与される。適切には、アジュバントは、操作されたＮＫ細胞の投与と同時に投与される。
【００７３】
（治療適応症）
本発明のＣＤ３８  ＣＡＲを発現する操作されたナチュラルキラー細胞は癌の治療的処置に有用である。適切には、癌は血液（血液）癌を含む。適切には、血液癌は多発性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫、または軽鎖骨髄腫を含む。適切には、血液癌は白血病である。適切には、白血病は、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、有毛細胞性白血病、Ｔ細胞性リンパ球性白血病、または大顆粒リンパ性白血病を含む。
【００７４】
適切には、治療される癌は固形組織腫瘍である。適切には、固形組織腫瘍は、肝細胞癌を含む肝腫瘍；肺腫瘍；非小細胞肺癌；膵臓腺癌または膵臓の腺房細胞癌を含む膵臓腫瘍；大腸癌；胃癌；腎細胞癌（ＲＣＣ）および移行細胞癌（ＴＣＣ、尿路上皮細胞癌としても知られる）を含む腎臓癌；卵巣癌；前立腺癌；乳癌；または子宮頸癌；である。
【００７５】
（一般のＣＡＲ）
適切には、本明細書に記載されているのは、操作されたＮＫ細胞である。適切には、操作されたＮＫ細胞は高レベルのＥ−セレクチンリガンドを示す。適切には、高レベルのＥ−セレクチンリガンド結合を示す操作されたＮＫ細胞は、ＮＫ−９２細胞よりも高いレベルのＨＥＣＡ−４５２結合を示す。適切には、操作されたＮＫ細胞はキメラ抗原受容体を含む。適切には、キメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞は、さらに改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む。適切には、キメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞は、さらに改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含み、ここで改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子は３アミノ酸変異を含む：Ｇ１３１Ｒ、Ｎ１９９Ｒ、およびＫ２０１Ｈ。適切には、キメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞はさらに改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含み、ここで改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子は２アミノ酸変異を含む：Ｄ２６９ＨおよびＥ１９５Ｒ。適切には、キメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、チェックポイント抑制因子分子の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、キメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、キメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、キメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＴＬＡ−４の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、キメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、キメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）、ＣＴＬＡ−４、およびＣＤ２７９（ＰＤ−１）から選択される少なくとも２つのチェックポイント抑制因子の発現の欠失または減少をさらに含む。
【００７６】
（癌関連抗原）
適切には、本明細書に記載されているのは、操作されたＮＫ細胞である。適切には、操作されたＮＫ細胞は高レベルのＥ−セレクチンリガンドを示す。適切には、高レベルのＥ−セレクチンリガンド結合を示す操作されたＮＫ細胞は、ＮＫ−９２細胞よりも高いレベルのＨＥＣＡ−４５２結合を示す。適切には、操作されたＮＫ細胞は、癌関連抗原に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む。適切には、癌関連抗原に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞は、さらに改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む。適切には、癌関連抗原に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞は、さらに改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含み、ここで改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子は３アミノ酸変異を含む：Ｇ１３１Ｒ、Ｎ１９９Ｒ、およびＫ２０１Ｈ。適切には、癌関連抗原に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞はさらに改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含み、ここで改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子は２アミノ酸変異を含む：Ｄ２６９ＨおよびＥ１９５Ｒ。適切には、癌関連抗原に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、チェックポイント抑制因子分子の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、癌関連抗原に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、癌関連抗原に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、癌関連抗原に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＴＬＡ−４の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、癌関連抗原に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、癌関連抗原に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）、ＣＴＬＡ−４、およびＣＤ２７９（ＰＤ−１）から選択される少なくとも２つのチェックポイント抑制因子の発現の欠失または減少をさらに含む。
【００７７】
（血液癌関連抗原）
適切には、本明細書に記載されているのは、操作されたＮＫ細胞である。適切には、操作されたＮＫ細胞は高レベルのＥ−セレクチンリガンドを示す。適切には、高レベルのＥ−セレクチンリガンド結合を示す操作されたＮＫ細胞は、ＮＫ−９２細胞よりも高いレベルのＨＥＣＡ−４５２結合を示す。適切には、操作されたＮＫ細胞は、血液癌関連抗原に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む。適切には、血液癌関連抗原に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞は、さらに改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む。適切には、血液癌関連抗原に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞は、さらに改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含み、ここで改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子は３アミノ酸変異を含む：Ｇ１３１Ｒ、Ｎ１９９Ｒ、およびＫ２０１Ｈ。適切には、血液癌関連抗原に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞はさらに改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含み、ここで改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子は２アミノ酸変異を含む：Ｄ２６９ＨおよびＥ１９５Ｒ。適切には、血液癌関連抗原に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、チェックポイント抑制因子分子の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、血液癌関連抗原に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、血液癌関連抗原に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、血液癌関連抗原に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＴＬＡ−４の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、血液癌関連抗原に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、血液癌関連抗原に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）、ＣＴＬＡ−４、およびＣＤ２７９（ＰＤ−１）から選択される少なくとも２つのチェックポイント抑制因子の発現の欠失または減少をさらに含む。
【００７８】
（ＣＤ３１９）
適切には、本明細書に記載されているのは、操作されたＮＫ細胞である。適切には、操作されたＮＫ細胞は高レベルのＥ−セレクチンリガンドを示す。適切には、高レベルのＥ−セレクチンリガンド結合を示す操作されたＮＫ細胞は、ＮＫ−９２細胞よりも高いレベルのＨＥＣＡ−４５２結合を示す。適切には、操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ−７に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む。適切には、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ−７に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞は、さらに改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む。適切には、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ−７に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞は、さらに改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含み、ここで改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子は３アミノ酸変異を含む：Ｇ１３１Ｒ、Ｎ１９９Ｒ、およびＫ２０１Ｈ。適切には、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ−７に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞はさらに改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含み、ここで改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子は２アミノ酸変異を含む：Ｄ２６９ＨおよびＥ１９５Ｒ。適切には、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ−７に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、チェックポイント抑制因子分子の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ−７に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ−７に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ−７に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＴＬＡ−４の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ−７に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ−７に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）、ＣＴＬＡ−４、およびＣＤ２７９（ＰＤ−１）から選択される少なくとも２つのチェックポイント抑制因子の発現の欠失または減少をさらに含む。
【００７９】
（ＴＮＦＲＳＦ１７）
適切には、本明細書に記載されているのは、操作されたＮＫ細胞である。適切には、操作されたＮＫ細胞は高レベルのＥ−セレクチンリガンドを示す。適切には、高レベルのＨＥＣＡ  Ｅ−セレクチンリガンド結合を示す操作されたＮＫ細胞は、ＮＫ−９２細胞よりも高いレベルのＨＥＣＡ−４５２結合を示す。適切には、操作されたＮＫ細胞は、ＴＮＦＲＳＦ１７／ＢＣＭＡに特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む。適切には、ＴＮＦＲＳＦ１７／ＢＣＭＡに特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞は、さらに改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む。適切には、ＴＮＦＲＳＦ１７／ＢＣＭＡに特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞は、さらに改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含み、ここで改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子は３アミノ酸変異を含む：Ｇ１３１Ｒ、Ｎ１９９Ｒ、およびＫ２０１Ｈ。適切には、ＴＮＦＲＳＦ１７／ＢＣＭＡに特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞はさらに改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含み、ここで改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子は２アミノ酸変異を含む：Ｄ２６９ＨおよびＥ１９５Ｒ。適切には、ＴＮＦＲＳＦ１７／ＢＣＭＡに特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、チェックポイント抑制因子分子の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＴＮＦＲＳＦ１７／ＢＣＭＡに特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＴＮＦＲＳＦ１７／ＢＣＭＡに特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＴＮＦＲＳＦ１７／ＢＣＭＡに特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＴＬＡ−４の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＴＮＦＲＳＦ１７／ＢＣＭＡに特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＴＮＦＲＳＦ１７／ＢＣＭＡに特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）、ＣＴＬＡ−４、およびＣＤ２７９（ＰＤ−１）から選択される少なくとも２つのチェックポイント抑制因子の発現の欠失または減少をさらに含む。
【００８０】
（ＣＤ１２３）
適切には、本明細書に記載されているのは、操作されたＮＫ細胞である。適切には、操作されたＮＫ細胞は高レベルのＥ−セレクチンリガンドを示す。適切には、高レベルのＥ−セレクチンリガンド結合を示す操作されたＮＫ細胞は、ＮＫ−９２細胞よりも高いレベルのＨＥＣＡ−４５２結合を示す。適切には、操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ１２３／ＩＬ３−ＲＡに特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む。適切には、ＣＤ１２３／ＩＬ３−ＲＡに特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞は、さらに改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む。適切には、ＣＤ１２３／ＩＬ３−ＲＡに特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞は、さらに改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含み、ここで改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子は３アミノ酸変異を含む：Ｇ１３１Ｒ、Ｎ１９９Ｒ、およびＫ２０１Ｈ。適切には、ＣＤ１２３／ＩＬ３−ＲＡに特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞はさらに改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含み、ここで改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子は２アミノ酸変異を含む：Ｄ２６９ＨおよびＥ１９５Ｒ。適切には、ＣＤ１２３／ＩＬ３−ＲＡに特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、チェックポイント抑制因子分子の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＣＤ１２３／ＩＬ３−ＲＡに特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＣＤ１２３／ＩＬ３−ＲＡに特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＣＤ１２３／ＩＬ３−ＲＡに特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＴＬＡ−４の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＣＤ１２３／ＩＬ３−ＲＡに特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＣＤ１２３／ＩＬ３−ＲＡに特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）、ＣＴＬＡ−４、およびＣＤ２７９（ＰＤ−１）から選択される少なくとも２つのチェックポイント抑制因子の発現の欠失または減少をさらに含む。
【００８１】
（ＣＤ１３８）
適切には、本明細書に記載されているのは、操作されたＮＫ細胞である。適切には、操作されたＮＫ細胞は高レベルのＥ−セレクチンリガンドを示す。適切には、高レベルのＥ−セレクチンリガンド結合を示す操作されたＮＫ細胞は、ＮＫ−９２細胞よりも高いレベルのＨＥＣＡ−４５２結合を示す。適切には、操作されたＮＫ細胞は、ＳＹＮＤ１／ＣＤ１３８に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む。適切には、ＳＹＮＤ１／ＣＤ１３８に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞は、さらに改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む。適切には、ＳＹＮＤ１／ＣＤ１３８に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞は、さらに改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含み、ここで改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子は３アミノ酸変異を含む：Ｇ１３１Ｒ、Ｎ１９９Ｒ、およびＫ２０１Ｈ。適切には、ＳＹＮＤ１／ＣＤ１３８に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞はさらに改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含み、ここで改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子は２アミノ酸変異を含む：Ｄ２６９ＨおよびＥ１９５Ｒ。適切には、ＳＹＮＤ１／ＣＤ１３８に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、チェックポイント抑制因子分子の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＳＹＮＤ１／ＣＤ１３８に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＳＹＮＤ１／ＣＤ１３８に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＳＹＮＤ１／ＣＤ１３８に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＴＬＡ−４の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＳＹＮＤ１／ＣＤ１３８に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＳＹＮＤ１／ＣＤ１３８に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）、ＣＴＬＡ−４、およびＣＤ２７９（ＰＤ−１）から選択される少なくとも２つのチェックポイント抑制因子の発現の欠失または減少をさらに含む。
【００８２】
（ＣＤ２２９）
適切には、本明細書に記載されているのは、操作されたＮＫ細胞である。適切には、操作されたＮＫ細胞は高レベルのＥ−セレクチンリガンドを示す。適切には、高レベルのＥ−セレクチンリガンド結合を示す操作されたＮＫ細胞は、ＮＫ−９２細胞よりも高いレベルのＨＥＣＡ−４５２結合を示す。適切には、操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ２２９に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む。適切には、ＣＤ２２９に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞は、さらに改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む。適切には、ＣＤ２２９に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞は、さらに改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含み、ここで改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子は３アミノ酸変異を含む：Ｇ１３１Ｒ、Ｎ１９９Ｒ、およびＫ２０１Ｈ。適切には、ＣＤ２２９に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞はさらに改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含み、ここで改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子は２アミノ酸変異を含む：Ｄ２６９ＨおよびＥ１９５Ｒ。適切には、ＣＤ２２９に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、チェックポイント抑制因子分子の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＣＤ２２９に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＣＤ２２９に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＣＤ２２９に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＴＬＡ−４の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＣＤ２２９に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＣＤ２２９に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）、ＣＴＬＡ−４、およびＣＤ２７９（ＰＤ−１）から選択される少なくとも２つのチェックポイント抑制因子の発現の欠失または減少をさらに含む。
【００８３】
（ＣＤ４７）
適切には、本明細書に記載されているのは、操作されたＮＫ細胞である。適切には、操作されたＮＫ細胞は高レベルのＥ−セレクチンリガンドを示す。適切には、高レベルのＥ−セレクチンリガンド結合を示す操作されたＮＫ細胞は、ＮＫ−９２細胞よりも高いレベルのＨＥＣＡ−４５２結合を示す。適切には、操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ４７に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む。適切には、ＣＤ４７に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞は、さらに改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む。適切には、ＣＤ４７に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞は、さらに改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含み、ここで改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子は３アミノ酸変異を含む：Ｇ１３１Ｒ、Ｎ１９９Ｒ、およびＫ２０１Ｈ。適切には、ＣＤ４７に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞はさらに改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含み、ここで改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子は２アミノ酸変異を含む：Ｄ２６９ＨおよびＥ１９５Ｒ。適切には、ＣＤ４７に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、チェックポイント抑制因子分子の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＣＤ４７に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＣＤ４７に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＣＤ４７に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＴＬＡ−４の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＣＤ４７に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＣＤ４７に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）、ＣＴＬＡ−４、およびＣＤ２７９（ＰＤ−１）から選択される少なくとも２つのチェックポイント抑制因子の発現の欠失または減少をさらに含む。
【００８４】
（ＣＤ２０）
適切には、本明細書に記載されているのは、操作されたＮＫ細胞である。適切には、操作されたＮＫ細胞は高レベルのＥ−セレクチンリガンドを示す。適切には、高レベルのＥ−セレクチンリガンド結合を示す操作されたＮＫ細胞は、ＮＫ−９２細胞よりも高いレベルのＨＥＣＡ−４５２結合を示す。適切には、操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ２０に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む。適切には、ＣＤ２０に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞は、さらに改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む。適切には、ＣＤ２０に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞は、さらに改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含み、ここで改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子は３アミノ酸変異を含む：Ｇ１３１Ｒ、Ｎ１９９Ｒ、およびＫ２０１Ｈ。適切には、ＣＤ２０に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞はさらに改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含み、ここで改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子は２アミノ酸変異を含む：Ｄ２６９ＨおよびＥ１９５Ｒ。適切には、ＣＤ２０に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、チェックポイント抑制因子分子の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＣＤ２０に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＣＤ２０に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＣＤ２０に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＴＬＡ−４の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＣＤ２０に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＣＤ２０に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）、ＣＴＬＡ−４、およびＣＤ２７９（ＰＤ−１）から選択される少なくとも２つのチェックポイント抑制因子の発現の欠失または減少をさらに含む。
【００８５】
（ＣＤ１９）
適切には、本明細書に記載されているのは、操作されたＮＫ細胞である。適切には、操作されたＮＫ細胞は高レベルのＥ−セレクチンリガンドを示す。適切には、高レベルのＥ−セレクチンリガンド結合を示す操作されたＮＫ細胞は、ＮＫ−９２細胞よりも高いレベルのＨＥＣＡ−４５２結合を示す。適切には、操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ１９に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む。適切には、ＣＤ１９に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞は、さらに改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む。適切には、ＣＤ１９に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞は、さらに改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含み、ここで改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子は３アミノ酸変異を含む：Ｇ１３１Ｒ、Ｎ１９９Ｒ、およびＫ２０１Ｈ。適切には、ＣＤ１９に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞はさらに改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含み、ここで改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子は２アミノ酸変異を含む：Ｄ２６９ＨおよびＥ１９５Ｒ。適切には、ＣＤ１９に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、チェックポイント抑制因子分子の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＣＤ１９に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＣＤ１９に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＣＤ１９に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＴＬＡ−４の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＣＤ１９に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＣＤ１９に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）、ＣＴＬＡ−４、およびＣＤ２７９（ＰＤ−１）から選択される少なくとも２つのチェックポイント抑制因子の発現の欠失または減少をさらに含む。
【００８６】
（ＣＤ２２）
適切には、本明細書に記載されているのは、操作されたＮＫ細胞である。適切には、操作されたＮＫ細胞は高レベルのＥ−セレクチンリガンドを示す。適切には、高レベルのＥ−セレクチンリガンド結合を示す操作されたＮＫ細胞は、ＮＫ−９２細胞よりも高いレベルのＨＥＣＡ−４５２結合を示す。適切には、操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ２２に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む。適切には、ＣＤ２２に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞は、さらに改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む。適切には、ＣＤ２２に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞は、さらに改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含み、ここで改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子は３アミノ酸変異を含む：Ｇ１３１Ｒ、Ｎ１９９Ｒ、およびＫ２０１Ｈ。適切には、ＣＤ２２に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞はさらに改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含み、ここで改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子は２アミノ酸変異を含む：Ｄ２６９ＨおよびＥ１９５Ｒ。適切には、ＣＤ２２に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、チェックポイント抑制因子分子の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＣＤ２２に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＣＤ２２に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＣＤ２２に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＴＬＡ−４の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＣＤ２２に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＣＤ２２に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）、ＣＴＬＡ−４、およびＣＤ２７９（ＰＤ−１）から選択される少なくとも２つのチェックポイント抑制因子の発現の欠失または減少をさらに含む。
【００８７】
（ＭＵＣ１）
適切には、本明細書に記載されているのは、操作されたＮＫ細胞である。適切には、操作されたＮＫ細胞は高レベルのＥ−セレクチンリガンドを示す。適切には、高レベルのＥ−セレクチンリガンド結合を示す操作されたＮＫ細胞は、ＮＫ−９２細胞よりも高いレベルのＨＥＣＡ−４５２結合を示す。適切には、操作されたＮＫ細胞は、ＭＵＣ１に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む。適切には、ＭＵＣ１に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞は、さらに改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む。適切には、ＭＵＣ１に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞は、さらに改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含み、ここで改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子は３アミノ酸変異を含む：Ｇ１３１Ｒ、Ｎ１９９Ｒ、およびＫ２０１Ｈ。適切には、ＭＵＣ１に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞はさらに改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含み、ここで改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子は２アミノ酸変異を含む：Ｄ２６９ＨおよびＥ１９５Ｒ。適切には、ＭＵＣ１に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、チェックポイント抑制因子分子の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＭＵＣ１に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＭＵＣ１に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＭＵＣ１に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＴＬＡ−４の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＭＵＣ１に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＭＵＣ１に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）、ＣＴＬＡ−４、およびＣＤ２７９（ＰＤ−１）から選択される少なくとも２つのチェックポイント抑制因子の発現の欠失または減少をさらに含む。
【００８８】
（ＭＵＣ１６）
適切には、本明細書に記載されているのは、操作されたＮＫ細胞である。適切には、操作されたＮＫ細胞は高レベルのＥ−セレクチンリガンドを示す。適切には、高レベルのＥ−セレクチンリガンド結合を示す操作されたＮＫ細胞は、ＮＫ−９２細胞よりも高いレベルのＨＥＣＡ−４５２結合を示す。適切には、操作されたＮＫ細胞は、ＭＵＣ１６に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む。適切には、ＭＵＣ１６に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞は、さらに改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む。適切には、ＭＵＣ１６に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞は、さらに改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含み、ここで改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子は３アミノ酸変異を含む：Ｇ１３１Ｒ、Ｎ１９９Ｒ、およびＫ２０１Ｈ。適切には、ＭＵＣ１６に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞はさらに改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含み、ここで改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子は２アミノ酸変異を含む：Ｄ２６９ＨおよびＥ１９５Ｒ。適切には、ＭＵＣ１６に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、チェックポイント抑制因子分子の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＭＵＣ１６に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＭＵＣ１６に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＭＵＣ１６に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＴＬＡ−４の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＭＵＣ１６に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＭＵＣ１６に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）、ＣＴＬＡ−４、およびＣＤ２７９（ＰＤ−１）から選択される少なくとも２つのチェックポイント抑制因子の発現の欠失または減少をさらに含む。
【００８９】
（Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ）
適切には、本明細書に記載されているのは、操作されたＮＫ細胞である。適切には、操作されたＮＫ細胞は高レベルのＥ−セレクチンリガンドを示す。適切には、高レベルのＥ−セレクチンリガンド結合を示す操作されたＮＫ細胞は、ＮＫ−９２細胞よりも高いレベルのＨＥＣＡ−４５２結合を示す。適切には、操作されたＮＫ細胞は、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕに特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む。適切には、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕに特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞は、さらに改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む。適切には、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕに特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞は、さらに改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含み、ここで改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子は３アミノ酸変異を含む：Ｇ１３１Ｒ、Ｎ１９９Ｒ、およびＫ２０１Ｈ。適切には、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕに特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞はさらに改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含み、ここで改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子は２アミノ酸変異を含む：Ｄ２６９ＨおよびＥ１９５Ｒ。適切には、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕに特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、チェックポイント抑制因子分子の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕに特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕに特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕに特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＴＬＡ−４の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕに特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕに特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）、ＣＴＬＡ−４、およびＣＤ２７９（ＰＤ−１）から選択される少なくとも２つのチェックポイント抑制因子の発現の欠失または減少をさらに含む。
【００９０】
（上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ））
適切には、本明細書に記載されているのは、操作されたＮＫ細胞である。適切には、操作されたＮＫ細胞は高レベルのＥ−セレクチンリガンドを示す。適切には、高レベルのＥ−セレクチンリガンド結合を示す操作されたＮＫ細胞は、ＮＫ−９２細胞よりも高いレベルのＨＥＣＡ−４５２結合を示す。適切には、操作されたＮＫ細胞は、ＥＧＦＲに特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む。適切には、ＥＧＦＲに特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞は、さらに改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む。適切には、ＥＧＦＲに特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞は、さらに改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含み、ここで改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子は３アミノ酸変異を含む：Ｇ１３１Ｒ、Ｎ１９９Ｒ、およびＫ２０１Ｈ。適切には、ＥＧＦＲに特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞はさらに改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含み、ここで改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子は２アミノ酸変異を含む：Ｄ２６９ＨおよびＥ１９５Ｒ。適切には、ＥＧＦＲに特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、チェックポイント抑制因子分子の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＥＧＦＲに特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＥＧＦＲに特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＥＧＦＲに特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＴＬＡ−４の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＥＧＦＲに特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＥＧＦＲに特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）、ＣＴＬＡ−４、およびＣＤ２７９（ＰＤ−１）から選択される少なくとも２つのチェックポイント抑制因子の発現の欠失または減少をさらに含む。
【００９１】
（メソテリン）
適切には、本明細書に記載されているのは、操作されたＮＫ細胞である。適切には、操作されたＮＫ細胞は高レベルのＥ−セレクチンリガンドを示す。適切には、高レベルのＥ−セレクチンリガンド結合を示す操作されたＮＫ細胞は、ＮＫ−９２細胞よりも高いレベルのＨＥＣＡ−４５２結合を示す。適切には、操作されたＮＫ細胞は、メソテリンに特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む。適切には、メソテリンに特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞は、さらに改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む。適切には、メソテリンに特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞は、さらに改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含み、ここで改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子は３アミノ酸変異を含む：Ｇ１３１Ｒ、Ｎ１９９Ｒ、およびＫ２０１Ｈ。適切には、メソテリンに特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞はさらに改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含み、ここで改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子は２アミノ酸変異を含む：Ｄ２６９ＨおよびＥ１９５Ｒ。適切には、メソテリンに特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、チェックポイント抑制因子分子の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、メソテリンに特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、メソテリンに特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、メソテリンに特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＴＬＡ−４の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、メソテリンに特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、メソテリンに特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）、ＣＴＬＡ−４、およびＣＤ２７９（ＰＤ−１）から選択される少なくとも２つのチェックポイント抑制因子の発現の欠失または減少をさらに含む。
【００９２】
（ＣＬＬ−１）
適切には、本明細書に記載されているのは、操作されたＮＫ細胞である。適切には、操作されたＮＫ細胞は高レベルのＥ−セレクチンリガンドを示す。適切には、高レベルのＥ−セレクチンリガンド結合を示す操作されたＮＫ細胞は、ＮＫ−９２細胞よりも高いレベルのＨＥＣＡ−４５２結合を示す。適切には、操作されたＮＫ細胞は、ＣＬＬ−１に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む。適切には、ＣＬＬ−１に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞は、さらに改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む。適切には、ＣＬＬ−１に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞は、さらに改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含み、ここで改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子は３アミノ酸変異を含む：Ｇ１３１Ｒ、Ｎ１９９Ｒ、およびＫ２０１Ｈ。適切には、ＣＬＬ−１に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞はさらに改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含み、ここで改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子は２アミノ酸変異を含む：Ｄ２６９ＨおよびＥ１９５Ｒ。適切には、ＣＬＬ−１に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、チェックポイント抑制因子分子の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＣＬＬ−１に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＣＬＬ−１に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＣＬＬ−１に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＴＬＡ−４の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＣＬＬ−１に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＣＬＬ−１に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）、ＣＴＬＡ−４、およびＣＤ２７９（ＰＤ−１）から選択される少なくとも２つのチェックポイント抑制因子の発現の欠失または減少をさらに含む。
【００９３】
（ＣＤ３８）
適切には、本明細書に記載されているのは、操作されたＮＫ細胞である。適切には、操作されたＮＫ細胞は高レベルのＥ−セレクチンリガンドを示す。適切には、高レベルのＥ−セレクチンリガンド結合を示す操作されたＮＫ細胞は、ＮＫ−９２細胞よりも高いレベルのＨＥＣＡ−４５２結合を示す。適切には、操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ３８に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む。適切には、ＣＤ３８に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞は、さらに改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む。適切には、ＣＤ３８に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞は、さらに改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含み、ここで改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子は３アミノ酸変異を含む：Ｇ１３１Ｒ、Ｎ１９９Ｒ、およびＫ２０１Ｈ。適切には、ＣＤ３８に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞はさらに改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含み、ここで改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子は２アミノ酸変異を含む：Ｄ２６９ＨおよびＥ１９５Ｒ。適切には、ＣＤ３８に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、チェックポイント抑制因子分子の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＣＤ３８に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＣＤ３８に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＣＤ３８に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＴＬＡ−４の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＣＤ３８に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＣＤ３８に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）、ＣＴＬＡ−４、およびＣＤ２７９（ＰＤ−１）から選択される少なくとも２つのチェックポイント抑制因子の発現の欠失または減少をさらに含む。
【００９４】
（ＣＤ３８（配列番号１および２））
適切には、本明細書に記載されているのは、操作されたＮＫ細胞である。適切には、操作されたＮＫ細胞は高レベルのＥ−セレクチンリガンドを示す。適切には、高レベルのＥ−セレクチンリガンド結合を示す操作されたＮＫ細胞は、ＮＫ−９２細胞よりも高いレベルのＨＥＣＡ−４５２結合を示す。適切には、操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ３８に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む。適切には、ＣＤ３８に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞は、配列番号１に記載のものと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、および配列番号２に記載のものと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＣＡＲ標的ドメインを含む。適切には、ＣＤ３８に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞は、配列番号１に記載のものと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列、および配列番号２に記載のものと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むＣＡＲ標的ドメインを含む。適切には、ＣＤ３８に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞は、配列番号１に記載のものと少なくとも９８％同一のアミノ酸配列、および配列番号２に記載のものと少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含むＣＡＲ標的ドメインを含む。適切には、ＣＤ３８に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞は、配列番号１に記載のものと同一のアミノ酸配列、および配列番号２に記載のものと同一のアミノ酸配列を含むＣＡＲ標的ドメインを含む。適切には、ＣＤ３８に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞は、配列番号１に記載のものと同一のアミノ酸配列、および配列番号２に記載のものと同一のアミノ酸配列を含むＣＡＲ標的ドメインを含む。適切には、ＣＤ３８に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞は、さらに改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む。適切には、ＣＤ３８に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞は、さらに改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含み、ここで改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子は３アミノ酸変異を含む：Ｇ１３１Ｒ、Ｎ１９９Ｒ、およびＫ２０１Ｈ。適切には、ＣＤ３８に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞はさらに改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含み、ここで改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子は２アミノ酸変異を含む：Ｄ２６９ＨおよびＥ１９５Ｒ。適切には、ＣＤ３８に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、チェックポイント抑制因子分子の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＣＤ３８に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＣＤ３８に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＣＤ３８に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＴＬＡ−４の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＣＤ３８に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＣＤ３８に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）、ＣＴＬＡ−４、およびＣＤ２７９（ＰＤ−１）から選択される少なくとも２つのチェックポイント抑制因子の発現の欠失または減少をさらに含む。
【００９５】
（ＣＤ３８（配列番号３および４））
適切には、本明細書に記載されているのは、操作されたＮＫ細胞である。適切には、操作されたＮＫ細胞は高レベルのＥ−セレクチンリガンドを示す。適切には、高レベルのＥ−セレクチンリガンド結合を示す操作されたＮＫ細胞は、ＮＫ−９２細胞よりも高いレベルのＨＥＣＡ−４５２結合を示す。適切には、操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ３８に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む。適切には、ＣＤ３８に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞は、配列番号３に記載のものと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、および配列番号４に記載のものと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＣＡＲ標的ドメインを含む。適切には、ＣＤ３８に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞は、配列番号３に記載のものと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列、および配列番号４に記載のものと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むＣＡＲ標的ドメインを含む。適切には、ＣＤ３８に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞は、配列番号３に記載のものと少なくとも９８％同一のアミノ酸配列、および配列番号４に記載のものと少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含むＣＡＲ標的ドメインを含む。適切には、ＣＤ３８に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞は、配列番号３に記載のものと同一のアミノ酸配列、および配列番号４に記載のものと同一のアミノ酸配列を含むＣＡＲ標的ドメインを含む。適切には、ＣＤ３８に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞は、配列番号３に記載のものと同一のアミノ酸配列、および配列番号４に記載のものと同一のアミノ酸配列を含むＣＡＲ標的ドメインを含む。適切には、ＣＤ３８に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞は、さらに改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む。適切には、ＣＤ３８に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞は、さらに改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含み、ここで改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子は３アミノ酸変異を含む：Ｇ１３１Ｒ、Ｎ１９９Ｒ、およびＫ２０１Ｈ。適切には、ＣＤ３８に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞はさらに改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含み、ここで改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子は２アミノ酸変異を含む：Ｄ２６９ＨおよびＥ１９５Ｒ。適切には、ＣＤ３８に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、チェックポイント抑制因子分子の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＣＤ３８に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＣＤ３８に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＣＤ３８に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＴＬＡ−４の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＣＤ３８に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＣＤ３８に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）、ＣＴＬＡ−４、およびＣＤ２７９（ＰＤ−１）から選択される少なくとも２つのチェックポイント抑制因子の発現の欠失または減少をさらに含む。
【００９６】
（ＣＤ３８（配列番号５および６））
適切には、本明細書に記載されているのは、操作されたＮＫ細胞である。適切には、操作されたＮＫ細胞は高レベルのＥ−セレクチンリガンドを示す。適切には、高レベルのＥ−セレクチンリガンド結合を示す操作されたＮＫ細胞は、ＮＫ−９２細胞よりも高いレベルのＨＥＣＡ−４５２結合を示す。適切には、操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ３８に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む。適切には、ＣＤ３８に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞は、配列番号５に記載のものと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、および配列番号６に記載のものと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＣＡＲ標的ドメインを含む。適切には、ＣＤ３８に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞は、配列番号５に記載のものと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列、および配列番号６に記載のものと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むＣＡＲ標的ドメインを含む。適切には、ＣＤ３８に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞は、配列番号５に記載のものと少なくとも９８％同一のアミノ酸配列、および配列番号６に記載のものと少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含むＣＡＲ標的ドメインを含む。適切には、ＣＤ３８に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞は、配列番号５に記載のものと同一のアミノ酸配列、および配列番号６に記載のものと同一のアミノ酸配列を含むＣＡＲ標的ドメインを含む。適切には、ＣＤ３８に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞は、配列番号５に記載のものと同一のアミノ酸配列、および配列番号６に記載のものと同一のアミノ酸配列を含むＣＡＲ標的ドメインを含む。適切には、ＣＤ３８に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞は、さらに改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む。適切には、ＣＤ３８に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞は、さらに改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含み、ここで改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子は３アミノ酸変異を含む：Ｇ１３１Ｒ、Ｎ１９９Ｒ、およびＫ２０１Ｈ。適切には、ＣＤ３８に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含む操作されたＮＫ細胞はさらに改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含み、ここで改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子は２アミノ酸変異を含む：Ｄ２６９ＨおよびＥ１９５Ｒ。適切には、ＣＤ３８に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、チェックポイント抑制因子分子の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＣＤ３８に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＣＤ３８に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＣＤ３８に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＴＬＡ−４の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＣＤ３８に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）の発現の欠失または減少をさらに含む。適切には、ＣＤ３８に特異的に結合するキメラ抗原受容体および改変体ヒトＴＲＡＩＬ分子を含む操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）、ＣＴＬＡ−４、およびＣＤ２７９（ＰＤ−１）から選択される少なくとも２つのチェックポイント抑制因子の発現の欠失または減少をさらに含む。
【００９７】
本発明は、特に、以下の実施形態を提供する：
１．操作されたナチュラルキラー細胞を含む医薬組成物であって、該操作されたナチュラルキラー細胞が、好ましくは、Ｅ−セレクチンリガンドの高レベルの細胞表面発現を示し、ここで該操作されたナチュラルキラー細胞がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、医薬組成物。
２．前記操作されたナチュラルキラー細胞が、ＨＥＣＡ−４５２抗体により結合される抗原に対して２５％より多くが陽性である複数の操作されたナチュラルキラー細胞を含む、実施形態１の医薬組成物。
３．前記操作されたナチュラルキラー細胞が、ＴＲＡＩＬ受容体の低レベルの細胞表面発現を示し、ここで該ＴＲＡＩＬ受容体がＴＮＦＲＳＦ１０Ａ（ＤＲ４）またはＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ（ＤＲ５）を含む、実施形態１の医薬組成物。
４．前記操作されたナチュラルキラー細胞が、初代ナチュラルキラー細胞を含む、実施形態１から３のいずれかの医薬組成物。
５．前記操作されたナチュラルキラー細胞が、形質転換ナチュラルキラー細胞株を含む、実施形態１から３のいずれかの医薬組成物。
６．前記形質転換ナチュラルキラー細胞株が、ＮＫ−９２細胞株またはＫＨＹＧ−１細胞株である、実施形態５の医薬組成物。
７．前記形質転換ナチュラルキラー細胞株が、ＫＨＹＧ−１細胞株である、実施形態５の医薬組成物。
８．前記ＣＡＲが、癌関連抗原に特異的に結合する、実施形態１から７のいずれかの医薬組成物。
９．前記癌関連抗原が、ＣＤ３８、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ−７、ＴＮＦＲＳＦ１７／ＢＣＭＡ、ＳＹＮＤ１／ＣＤ１３８、ＣＤ２２９、ＣＤ４７、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＣＤ１２３／ＩＬ３−ＲＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、メソテリン、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、Ｔｎ抗原、ＮＥＵ５ＧＣ、ＮｅｕＧｃＧＭ３、ＧＤ２、ＣＬＬ−１、またはＨＥＲＶ−Ｋを含む、実施形態８の医薬組成物。
１０．前記癌関連抗原が、血液癌関連抗原を含む、実施形態８の医薬組成物。
１１．前記血液癌関連抗原が、ＣＤ３８、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ−７、ＴＮＦＲＳＦ１７／ＢＣＭＡ、ＳＹＮＤ１／ＣＤ１３８、ＣＤ２２９、ＣＤ４７、ＣＤ１２３／ＩＬ３−ＲＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、またはＣＬＬ−１を含む、実施形態１０の医薬組成物。
１２．前記血液癌関連抗原が、ＣＤ３８を含む、実施形態１０の医薬組成物。
１３．前記ＣＡＲが、配列番号１から６のいずれかに記載のものと少なくとも８０％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１２の医薬組成物。
１４．前記ＣＡＲが、配列番号１から６のいずれかに記載のものと少なくとも９０％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１２の医薬組成物。
１５．前記ＣＡＲが、配列番号１から６のいずれかに記載のものと少なくとも９５％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１２の医薬組成物。
１６．前記ＣＡＲが、配列番号１から６のいずれかに記載のものと少なくとも９８％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１２の医薬組成物。
１７．前記ＣＡＲが、配列番号１から６のいずれかに記載のものと少なくとも同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１２の医薬組成物。
１８．前記ＣＡＲが、配列番号１および２に記載のものと少なくとも９０％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１２の医薬組成物。
１９．前記ＣＡＲが、配列番号１および２に記載のものと少なくとも９５％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１２の医薬組成物。
２０．前記ＣＡＲが、配列番号１および２に記載のものと少なくとも９８％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１２の医薬組成物。
２１．前記ＣＡＲが、配列番号１および２に記載のものと同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１２の医薬組成物。
２２．前記ＣＡＲが、配列番号３および４に記載のものと少なくとも９０％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１２の医薬組成物。
２３．前記ＣＡＲが、配列番号３および４に記載のものと少なくとも９５％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１２の医薬組成物。
２４．前記ＣＡＲが、配列番号３および４に記載のものと少なくとも９８％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１２の医薬組成物。
２５．前記ＣＡＲが、配列番号３および４に記載のものと同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１２の医薬組成物。
２６．前記ＣＡＲが、配列番号５および６に記載のものと少なくとも９０％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１２の医薬組成物。
２７．前記ＣＡＲが、配列番号５および６に記載のものと少なくとも９５％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１２の医薬組成物。
２８．前記ＣＡＲが、配列番号５および６に記載のものと少なくとも９８％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１２の医薬組成物。
２９．前記ＣＡＲが、配列番号５および６に記載のものと同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１２の医薬組成物。
３０．前記ＣＡＲが、ヒトＣＤ８αタンパク質に由来する膜貫通ドメインを含む、実施形態１から２９のいずれかの医薬組成物。
３１．前記ＣＡＲが、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、２Ｂ４（ＣＤ２４４）またはヒト４−１ＢＢタンパク質を含む、実施形態１から３０のいずれかの医薬組成物。
３２．前記ＣＡＲが、ヒト４−１ＢＢタンパク質を含む、実施形態１から３１のいずれかの医薬組成物。
３３．前記ＣＡＲが、ヒトＣＤ３ζタンパク質を含む、実施形態１から３２のいずれかの医薬組成物。
３４．前記ＣＡＲが、ダラツムマブよりもＣＤ３８に対して低い親和性を示す抗体に由来する標的ドメインを含む、実施形態１から３３のいずれかの医薬組成物。
３５．さらに第二のキメラ抗原受容体を含み、該第二のキメラ抗原受容体が、ＣＤ３８、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ−７、ＴＮＦＲＳＦ１７／ＢＣＭＡ、ＳＹＮＤ１／ＣＤ１３８、ＣＤ２２９、ＣＤ４７、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＣＤ１２３／ＩＬ３−ＲＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、メソテリン、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、Ｔｎ抗原、ＮＥＵ５ＧＣ、ＮｅｕＧｃＧＭ３、ＧＤ２、ＣＬＬ−１、またはＨＥＲＶ−Ｋを含む、実施形態１から３４のいずれかの医薬組成物。
３６．さらに変異型ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）ポリペプチドを含み、該変異型ＴＲＡＩＬポリペプチドが、シグナル伝達の増大を誘導するか、またはＴＲＡＩＬリガンドへの増大した結合親和性を保有する、実施形態１から３５のいずれかの医薬組成物。
３７．前記ＴＲＡＩＬリガンドが、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ（ＤＲ４）またはＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ（ＤＲ５）を含む、実施形態３６の医薬組成物。
３８．前記変異型ＴＲＡＩＬポリペプチドが、ヒトＴＲＡＩＬのＤ２６９Ｈ／Ｅ１９５Ｒ変異を含む、実施形態３６の医薬組成物。
３９．前記変異型ＴＲＡＩＬポリペプチドが、ヒトＴＲＡＩＬのＧ１３１Ｒ／Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ変異を含む、実施形態３６の医薬組成物。
４０．前記ＣＡＲまたは前記変異型ＴＲＡＩＬポリペプチドが、操作されたナチュラルキラー細胞のゲノムに組み込まれている、実施形態１から３９のいずれかの医薬組成物。
４１．前記操作されたナチュラルキラー細胞が、チェックポイント抑制性受容体の活性の欠失または低下をさらに含む、実施形態１から４０のいずれかの医薬組成物。
４２．前記チェックポイント抑制性受容体が、ＣＤ８５ｄ、ＣＤ８５ｊ、ＣＤ９６、ＣＤ１５２、ＣＤ１５９ａ、ＣＤ２２３、ＣＤ２７９、ＣＤ３２８、ＳＩＧＬＥＣ９、ＴＩＧＩＴまたはＴＩＭ−３を含む、実施形態４１の医薬組成物。
４３．前記チェックポイント抑制性受容体が、ＣＤ９６、ＣＤ１５２またはＣＤ３２８を含む、実施形態４２の医薬組成物。
４４．前記チェックポイント抑制性受容体が、ＣＤ９６を含む、実施形態４２の医薬組成物。
４５．前記チェックポイント抑制性受容体が、ＣＤ１５２を含む、実施形態４２の医薬組成物。
４６．前記チェックポイント抑制性受容体が、ＣＤ３２８を含む、実施形態４２の医薬組成物。
４７．前記チェックポイント抑制性受容体が、前記操作されたナチュラルキラー細胞ゲノムから全体もしくは一部が欠失しているか、または染色体レベルで１つもしくはそれ以上のヌクレオチドの挿入もしくは欠失によって破壊されている、実施形態４１から４６のいずれかの医薬組成物。
４８．前記操作されたナチュラルキラー細胞が、チェックポイント抑制性受容体を標的とするｓｉＲＮＡを含む、実施形態４１から４６のいずれかの医薬組成物。
４９．薬学的に許容可能なキャリア、安定剤、または賦形剤をさらに含む、実施形態１から４８のいずれかの医薬組成物。
５０．前記医薬組成物が、腹腔内投与用に処方されている、実施形態４９の医薬組成物。５１．静脈内投与用に処方されている、実施形態４９の医薬組成物。
５２．癌治療に用いられる、実施形態１から５１のいずれかの医薬組成物。
５３．前記癌が、白血病、リンパ腫、または骨髄腫を含む、実施形態５２の医薬組成物。
５４．前記癌が、多発性骨髄腫を含む、実施形態５２の医薬組成物。
５５．癌を有する被験体を治療する方法であって、該被験体に、操作されたナチュラルキラー細胞を含む医薬組成物を投与する工程を含み、該操作されたナチュラルキラー細胞が、Ｅ−セレクチンリガンドの高レベルの細胞表面発現を示し、ここで該操作されたナチュラルキラー細胞がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、方法。
５６．前記操作されたナチュラルキラー細胞が、ＨＥＣＡ−４５２抗体により結合される抗原に対して２５％より多くが陽性である複数の操作されたナチュラルキラー細胞を含む、実施形態５５の方法。
５７．前記操作されたナチュラルキラー細胞が、ＴＲＡＩＬ受容体の低レベルの細胞表面発現を示し、ここで該ＴＲＡＩＬ受容体がＴＮＦＲＳＦ１０Ａ（ＤＲ４）またはＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ（ＤＲ５）を含む、実施形態５５の方法。
５８．前記操作されたナチュラルキラー細胞が、初代ナチュラルキラー細胞を含む、実施形態５５から５７のいずれかの方法。
５９．前記操作されたナチュラルキラー細胞が、形質転換ナチュラルキラー細胞株を含む、実施形態５５から５７のいずれかの方法。
６０．前記形質転換ナチュラルキラー細胞株が、ＮＫ−９２細胞株またはＫＨＹＧ−１細胞株である、実施形態５９の方法。
６１．前記形質転換ナチュラルキラー細胞株が、ＫＨＹＧ−１細胞株である、実施形態５９の方法。
６２．前記ＣＡＲが、癌関連抗原に特異的に結合する、実施形態５５から６１のいずれかの方法。
６３．前記癌関連抗原が、ＣＤ３８、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ−７、ＴＮＦＲＳＦ１７／ＢＣＭＡ、ＳＹＮＤ１／ＣＤ１３８、ＣＤ２２９、ＣＤ４７、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＣＤ１２３／ＩＬ３−ＲＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、メソテリン、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、Ｔｎ抗原、ＮＥＵ５ＧＣ、ＮｅｕＧｃＧＭ３、ＧＤ２、ＣＬＬ−１、またはＨＥＲＶ−Ｋを含む、実施形態６２の方法。
６４．前記癌関連抗原が、血液癌関連抗原を含む、実施形態６２の方法。
６５．前記血液癌関連抗原が、ＣＤ３８、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ−７、ＴＮＦＲＳＦ１７／ＢＣＭＡ、ＳＹＮＤ１／ＣＤ１３８、ＣＤ２２９、ＣＤ４７、ＣＤ１２３／ＩＬ３−ＲＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、またはＣＬＬ−１を含む、実施形態６４の方法。
６６．前記血液癌関連抗原が、ＣＤ３８を含む、実施形態６４の方法。
６７．前記ＣＡＲが、配列番号１から６のいずれかに記載のものと少なくとも８０％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態６６の方法。
６８．前記ＣＡＲが、配列番号１から６のいずれかに記載のものと少なくとも９０％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態６６の方法。
６９．前記ＣＡＲが、配列番号１から６のいずれかに記載のものと少なくとも９５％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態６６の方法。
７０．前記ＣＡＲが、配列番号１から６のいずれかに記載のものと少なくとも９８％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態６６の方法。
７１．前記ＣＡＲが、配列番号１から６のいずれかに記載のものと同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態６６の方法。
７２．前記ＣＡＲが、配列番号１および２に記載のものと少なくとも９０％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態６６の方法。
７３．前記ＣＡＲが、配列番号１および２に記載のものと少なくとも９５％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態６６の方法。
７４．前記ＣＡＲが、配列番号１および２に記載のものと少なくとも９８％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態６６の方法。
７５．前記ＣＡＲが、配列番号１および２に記載のものと同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態６６の方法。
７６．前記ＣＡＲが、配列番号３および４に記載のものと少なくとも９０％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態６６の方法。
７７．前記ＣＡＲが、配列番号３および４に記載のものと少なくとも９５％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態６６の方法。
７８．前記ＣＡＲが、配列番号３および４に記載のものと少なくとも９８％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態６６の方法。
７９．前記ＣＡＲが、配列番号３および４に記載のものと同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態６６の方法。
８０．前記ＣＡＲが、配列番号５および６に記載のものと少なくとも９０％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態６６の方法。
８１．前記ＣＡＲが、配列番号５および６に記載のものと少なくとも９５％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態６６の方法。
８２．前記ＣＡＲが、配列番号５および６に記載のものと少なくとも９８％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態６６の方法。
８３．前記ＣＡＲが、配列番号５および６に記載のものと同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態６６の方法。
８４．前記ＣＡＲが、ヒトＣＤ８タンパク質に由来する膜貫通ドメインを含む、実施形態５５から８３のいずれかの方法。
８５．前記ＣＡＲが、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、２Ｂ４（ＣＤ２４４）またはヒト４−１ＢＢタンパク質を含む、実施形態５５から８４のいずれかの方法。
８６．前記ＣＡＲが、ヒト４−１ＢＢタンパク質を含む、実施形態５５から８５のいずれかの方法。
８７．前記ＣＡＲが、ヒトＣＤ３ζタンパク質を含む、実施形態５５から８６のいずれかの方法。
８８．前記ＣＡＲが、ダラツムマブよりもＣＤ３８に対して低い親和性を示す抗体に由来する標的ドメインを含む、実施形態５５から８７のいずれかの方法。
８９．前記操作されたナチュラルキラー細胞が、さらに第二のキメラ抗原受容体を含み、ここで該第二のキメラ抗原受容体が、ＣＤ３８、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ−７、ＴＮＦＲＳＦ１７／ＢＣＭＡ、ＳＹＮＤ１／ＣＤ１３８、ＣＤ２２９、ＣＤ４７、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＣＤ１２３／ＩＬ３−ＲＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、メソテリン、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、Ｔｎ抗原、ＮＥＵ５ＧＣ、ＮｅｕＧｃＧＭ３、ＧＤ２、ＣＬＬ−１、またはＨＥＲＶ−Ｋを含む、実施形態５５から８８のいずれかの方法。
９０．前記操作されたナチュラルキラー細胞が、さらに変異型ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）ポリペプチドを含み、ここで該変異型ＴＲＡＩＬポリペプチドが、シグナル伝達の増大を誘導するか、またはＴＲＡＩＬリガンドへの増大した結合親和性を保有する、実施形態５５から８９のいずれかの方法。
９１．前記ＴＲＡＩＬリガンドが、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ（ＤＲ４）またはＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ（ＤＲ５）を含む、実施形態９０の方法。
９２．前記変異型ＴＲＡＩＬポリペプチドが、ヒトＴＲＡＩＬのＤ２６９Ｈ／Ｅ１９５Ｒ変異を含む、実施形態９０の方法。
９３．前記変異型ＴＲＡＩＬポリペプチドが、ヒトＴＲＡＩＬのＧ１３１Ｒ／Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ変異を含む、実施形態９０の方法。
９４．前記ＣＡＲまたは前記変異型ＴＲＡＩＬポリペプチドが、操作されたナチュラルキラー細胞のゲノムに組み込まれている、実施形態５５から９３のいずれかの方法。
９５．前記操作されたナチュラルキラー細胞が、チェックポイント抑制性受容体の活性の欠失または低下をさらに含む、実施形態５５から９４のいずれかの方法。
９６．前記チェックポイント抑制性受容体が、ＣＤ８５ｄ、ＣＤ８５ｊ、ＣＤ９６、ＣＤ１５２、ＣＤ１５９ａ、ＣＤ２２３、ＣＤ２７９、ＣＤ３２８、ＳＩＧＬＥＣ９、ＴＩＧＩＴまたはＴＩＭ−３を含む、実施形態９５の方法。
９７．前記チェックポイント抑制性受容体が、ＣＤ９６、ＣＤ１５２またはＣＤ３２８を含む、実施形態９６の方法。
９８．前記チェックポイント抑制性受容体が、ＣＤ９６を含む、実施形態９７の方法。
９９．前記チェックポイント抑制性受容体が、ＣＤ１５２を含む、実施形態９７の方法。
１００．前記チェックポイント抑制性受容体が、ＣＤ３２８を含む、実施形態９７の方法。
１０１．前記チェックポイント抑制性受容体が、前記操作されたナチュラルキラー細胞ゲノムから全体もしくは一部が欠失しているか、または染色体レベルで１つもしくはそれ以上のヌクレオチドの挿入もしくは欠失によって破壊されている、実施形態４１または４６の方法。
１０２．前記操作されたナチュラルキラー細胞が、チェックポイント抑制性受容体を標的とするｓｉＲＮＡを含む、実施形態９５から１０１のいずれかの方法。
１０３．前記チェックポイント抑制性受容体が、前記操作されたナチュラルキラー細胞ゲノムから欠失している、実施形態９５から１０２のいずれかの方法。
１０４．前記医薬組成物が、薬学的に許容可能なキャリア、安定剤、または賦形剤をさらに含む、実施形態５５から１０３のいずれかの方法。
１０５．前記医薬組成物が、静脈内投与用に処方されている、実施形態１０４の方法。
１０６．前記医薬組成物が、腹腔内投与用に処方されている、実施形態１０４の方法。
１０７．前記癌が、白血病、リンパ腫、または骨髄腫を含む、実施形態５５から１０６のいずれかの方法。
１０８．前記癌が、多発性骨髄腫を含む、実施形態５５から１０７のいずれかの方法。
１０９．前記医薬組成物が、プロテオソーム阻害剤の投与の前、間、または後に投与される、実施形態５５から１０８のいずれかの方法。
１１０．前記医薬組成物が、低用量メトロノミックシクロホスファミド治療レジメの前、間、または後に投与される、実施形態５５から１０８のいずれかの方法。
１１１．操作されたナチュラルキラー細胞を含む医薬組成物を作製する方法であって、該操作されたナチュラルキラー細胞が、Ｅ−セレクチンリガンドの高レベルの細胞表面発現を示し、ここで該操作されたナチュラルキラー細胞がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含み、ここで該方法が、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドと共にナチュラルキラー細胞をインキュベートする工程を含む、方法。
１１２．前記操作されたナチュラルキラー細胞が、ＨＥＣＡ−４５２抗体により結合される抗原に対して２５％より多くが陽性である複数の操作されたナチュラルキラー細胞を含む、実施形態１１１の方法。
１１３．前記操作されたナチュラルキラー細胞が、ＴＲＡＩＬ受容体の低レベルの細胞表面発現を示し、ここで該ＴＲＡＩＬ受容体がＴＮＦＲＳＦ１０Ａ（ＤＲ４）またはＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ（ＤＲ５）を含む、実施形態１１１の方法。
１１４．前記操作されたナチュラルキラー細胞が、初代ナチュラルキラー細胞を含む、実施形態１１１から１１３のいずれかの方法。
１１５．前記操作されたナチュラルキラー細胞が、形質転換ナチュラルキラー細胞株を含む、実施形態１１１から１１３のいずれかの方法。
１１６．前記形質転換ナチュラルキラー細胞株が、ＮＫ−９２細胞株またはＫＨＹＧ−１細胞株である、実施形態１１５の方法。
１１７．前記形質転換ナチュラルキラー細胞株が、ＫＨＹＧ−１細胞株である、実施形態１１５の方法。
１１８．前記ＣＡＲが、癌関連抗原に特異的に結合する、実施形態１１１から１１７のいずれかの方法。
１１９．前記癌関連抗原が、ＣＤ３８、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ−７、ＴＮＦＲＳＦ１７／ＢＣＭＡ、ＳＹＮＤ１／ＣＤ１３８、ＣＤ２２９、ＣＤ４７、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＣＤ１２３／ＩＬ３−ＲＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、メソテリン、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、Ｔｎ抗原、ＮＥＵ５ＧＣ、ＮｅｕＧｃＧＭ３、ＧＤ２、ＣＬＬ−１、またはＨＥＲＶ−Ｋを含む、実施形態１１８の方法。
１２０．前記癌関連抗原が、血液癌関連抗原を含む、実施形態１１８の方法。
１２１．前記血液癌関連抗原が、ＣＤ３８、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ−７、ＴＮＦＲＳＦ１７／ＢＣＭＡ、ＳＹＮＤ１／ＣＤ１３８、ＣＤ２２９、ＣＤ４７、ＣＤ１２３／ＩＬ３−ＲＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、またはＣＬＬ−１を含む、実施形態１２０の方法。
１２２．前記血液癌関連抗原が、ＣＤ３８を含む、実施形態１２０の方法。
１２３．前記ＣＡＲが、配列番号１から６のいずれかに記載のものと少なくとも８０％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１２２の方法。
１２４．前記ＣＡＲが、配列番号１から６のいずれかに記載のものと少なくとも９０％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１２２の方法。
１２５．前記ＣＡＲが、配列番号１から６のいずれかに記載のものと少なくとも９５％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１２２の方法。
１２６．前記ＣＡＲが、配列番号１から６のいずれかに記載のものと少なくとも９８％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１２２の方法。
１２７．前記ＣＡＲが、配列番号１から６のいずれかに記載のものと同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１２２の方法。
１２８．前記ＣＡＲが、配列番号１および２に記載のものと少なくとも９０％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１２２の方法。
１２９．前記ＣＡＲが、配列番号１および２に記載のものと少なくとも９５％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１２２の方法。
１３０．前記ＣＡＲが、配列番号１および２に記載のものと少なくとも９８％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１２２の方法。
１３１．前記ＣＡＲが、配列番号１および２に記載のものと同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１２２の方法。
１３２．前記ＣＡＲが、配列番号３および４に記載のものと少なくとも９０％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１２２の方法。
１３３．前記ＣＡＲが、配列番号３および４に記載のものと少なくとも９５％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１２２の方法。
１３４．前記ＣＡＲが、配列番号３および４に記載のものと少なくとも９８％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１２２の方法。
１３５．前記ＣＡＲが、配列番号３および４に記載のものと同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１２２の方法。
１３６．前記ＣＡＲが、配列番号５および６に記載のものと少なくとも９０％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１２２の方法。
１３７．前記ＣＡＲが、配列番号５および６に記載のものと少なくとも９５％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１２２の方法。
１３８．前記ＣＡＲが、配列番号５および６に記載のものと少なくとも９８％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１２２の方法。
１３９．前記ＣＡＲが、配列番号５および６に記載のものと同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１２２の方法。
１４０．前記ＣＡＲが、ヒトＣＤ８αタンパク質に由来する膜貫通ドメインを含む、実施形態１１１から１３９のいずれかの方法。
１４１．前記ＣＡＲが、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、２Ｂ４（ＣＤ２４４）またはヒト４−１ＢＢタンパク質を含む、実施形態１１１から１４０のいずれかの方法。
１４２．前記ＣＡＲが、ヒト４−１ＢＢタンパク質を含む、実施形態１１１から１４１のいずれかの方法。
１４３．前記ＣＡＲが、ヒトＣＤ３ζタンパク質を含む、実施形態１１１から１４２のいずれかの方法。
１４４．前記ＣＡＲが、ダラツムマブよりもＣＤ３８に対して低い親和性を示す抗体に由来する標的ドメインを含む、実施形態１１１から１４３のいずれかの方法。
１４５．前記操作されたナチュラルキラー細胞を第二のキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドと共にインキュベートする工程をさらに含み、該第二のキメラ抗原受容体が、ＣＤ３８、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ−７、ＴＮＦＲＳＦ１７／ＢＣＭＡ、ＳＹＮＤ１／ＣＤ１３８、ＣＤ２２９、ＣＤ４７、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＣＤ１２３／ＩＬ３−ＲＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、メソテリン、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、Ｔｎ抗原、ＮＥＵ５ＧＣ、ＮｅｕＧｃＧＭ３、ＧＤ２、ＣＬＬ−１、またはＨＥＲＶ−Ｋを含む、実施形態１１１から１４４のいずれかの方法。
１４６．前記操作されたナチュラルキラー細胞を変異型ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと共にインキュベートする工程をさらに含み、ここで該変異型ＴＲＡＩＬポリペプチドが、シグナル伝達の増大を誘導するか、またはＴＲＡＩＬリガンドへの増大した結合親和性を保有する、実施形態１１１から１４５のいずれかの方法。
１４７．前記ＴＲＡＩＬリガンドが、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ（ＤＲ４）またはＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ（ＤＲ５）を含む、実施形態１４６の方法。
１４８．前記変異型ＴＲＡＩＬポリペプチドが、ヒトＴＲＡＩＬのＤ２６９Ｈ／Ｅ１９５Ｒ変異を含む、実施形態１４６の方法。
１４９．前記変異型ＴＲＡＩＬポリペプチドが、ヒトＴＲＡＩＬのＧ１３１Ｒ／Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ変異を含む、実施形態１４６の方法。
１５０．前記ＣＡＲまたは前記変異型ＴＲＡＩＬポリヌクレオチドが、操作されたナチュラルキラー細胞のゲノムに組み込まれている、実施形態１１１から１４９のいずれかの方法。
１５１．前記操作されたナチュラルキラー細胞をチェックポイント抑制性受容体の活性を欠失または低下するポリヌクレオチドと共にインキュベートする工程をさらに含む、実施形態１１１から１５０のいずれかの方法。
１５２．前記チェックポイント抑制性受容体が、ＣＤ８５ｄ、ＣＤ８５ｊ、ＣＤ９６、ＣＤ１５２、ＣＤ１５９ａ、ＣＤ２２３、ＣＤ２７９、ＣＤ３２８、ＳＩＧＬＥＣ９、ＴＩＧＩＴまたはＴＩＭ−３を含む、実施形態１５１の方法。
１５３．前記チェックポイント抑制性受容体が、ＣＤ９６、ＣＤ１５２またはＣＤ３２８を含む、実施形態１５１の方法。
１５４．前記チェックポイント抑制性受容体が、ＣＤ９６を含む、実施形態１５３の方法。
１５５．前記チェックポイント抑制性受容体が、ＣＤ１５２を含む、実施形態１５３の方法。
１５６．前記チェックポイント抑制性受容体が、ＣＤ３２８を含む、実施形態１５３の方法。
１５７．前記チェックポイント抑制性受容体が、前記操作されたナチュラルキラー細胞ゲノムから全体もしくは一部が欠失しているか、または染色体レベルで１つもしくはそれ以上のヌクレオチドの挿入もしくは欠失によって破壊されている、実施形態１１１から１５６のいずれかの方法。
１５８．前記操作されたナチュラルキラー細胞が、チェックポイント抑制性受容体を標的とするｓｉＲＮＡを含む、実施形態１１１から１５７のいずれかの方法。
１５９．前記ポリヌクレオチドが、ウイルスベクターを含む、実施形態１１１から１５８のいずれかの方法。
１６０．前記ウイルスベクターが、レンチウイルスである、実施形態１５９の方法。
１６１．前記ウイルスベクターが、レトロウイルスである、実施形態１５９の方法。
１６２．前記ポリヌクレオチドが、ｍＲＮＡを含む、実施形態１１１から１６１のいずれかの方法。
１６３．前記ポリヌクレオチドが、前記操作されたナチュラルキラー細胞のゲノムに組み込まれている、実施形態１１１から１６２のいずれかの方法。
１６４．前記細胞が、前記操作されたナチュラルキラー細胞のフコシル化を増大させるように化学物質で処理されている、実施形態１１１から１６３のいずれかの方法。
１６５．前記操作されたナチュラルキラー細胞を薬学的に許容可能なキャリア、安定剤、または賦形剤と混合する工程をさらに含む、実施形態１１１から１６３のいずれかの方法。
１６６．操作されたナチュラルキラー細胞を含む医薬組成物であって、該操作されたナチュラルキラー細胞が、ＦＵＴ６またはＦＵＴ７タンパク質の発現を示し、ここで該操作されたナチュラルキラー細胞がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、医薬組成物。
１６７．前記操作されたナチュラルキラー細胞が、ＦＵＴ６またはＦＵＴ７タンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、実施形態１６６の医薬組成物。
１６８．前記ＣＡＲが、癌関連抗原に特異的に結合する、実施形態１６６の医薬組成物。
１６９．前記癌関連抗原が、ＣＤ３８、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ−７、ＴＮＦＲＳＦ１７／ＢＣＭＡ、ＳＹＮＤ１／ＣＤ１３８、ＣＤ２２９、ＣＤ４７、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＣＤ１２３／ＩＬ３−ＲＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、メソテリン、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、Ｔｎ抗原、ＮＥＵ５ＧＣ、ＮｅｕＧｃＧＭ３、ＧＤ２、ＣＬＬ−１、またはＨＥＲＶ−Ｋを含む、実施形態１６７の医薬組成物。
１７０．前記癌関連抗原が、血液癌関連抗原を含む、実施形態１６７の医薬組成物。
１７１．前記血液癌関連抗原が、ＣＤ３８、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ−７、ＴＮＦＲＳＦ１７／ＢＣＭＡ、ＳＹＮＤ１／ＣＤ１３８、ＣＤ２２９、ＣＤ４７、ＣＤ１２３／ＩＬ３−ＲＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、またはＣＬＬ−１を含む、実施形態１７０の医薬組成物。
１７２．前記血液癌関連抗原が、ＣＤ３８を含む、実施形態１７０の医薬組成物。
１７３．前記ＣＡＲが、配列番号１から６のいずれかに記載のものと少なくとも８０％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１７２の医薬組成物。
１７４．前記ＣＡＲが、配列番号１から６のいずれかに記載のものと少なくとも９０％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１７２の医薬組成物。
１７５．前記ＣＡＲが、配列番号１から６のいずれかに記載のものと少なくとも９５％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１７２の医薬組成物。
１７６．前記ＣＡＲが、配列番号１から６のいずれかに記載のものと少なくとも９８％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１７２の医薬組成物。
１７７．前記ＣＡＲが、配列番号１から６のいずれかに記載のものと同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１７２の医薬組成物。
１７８．前記ＣＡＲが、配列番号１および２に記載のものと少なくとも９０％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１７２の医薬組成物。
１７９．前記ＣＡＲが、配列番号１および２に記載のものと少なくとも９５％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１７２の医薬組成物。
１８０．前記ＣＡＲが、配列番号１および２に記載のものと少なくとも９８％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１７２の医薬組成物。
１８１．前記ＣＡＲが、配列番号１および２に記載のものと同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１７２の医薬組成物。
１８２．前記ＣＡＲが、配列番号３および４に記載のものと少なくとも９０％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１７２の医薬組成物。
１８３．前記ＣＡＲが、配列番号３および４に記載のものと少なくとも９５％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１７２の医薬組成物。
１８４．前記ＣＡＲが、配列番号３および４に記載のものと少なくとも９８％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１７２の医薬組成物。
１８５．前記ＣＡＲが、配列番号３および４に記載のものと同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１７２の医薬組成物。
１８６．前記ＣＡＲが、配列番号５および６に記載のものと少なくとも９０％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１７２の医薬組成物。
１８７．前記ＣＡＲが、配列番号５および６に記載のものと少なくとも９５％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１７２の医薬組成物。
１８８．前記ＣＡＲが、配列番号５および６に記載のものと少なくとも９８％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１７２の医薬組成物。
１８９．前記ＣＡＲが、配列番号５および６に記載のものと同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１７２の医薬組成物。
１９０．癌を有する被験体を治療する方法であって、該被験体に、操作されたナチュラルキラー細胞を含む医薬組成物を投与する工程を含み、該操作されたナチュラルキラー細胞が、ＦＵＴ６またはＦＵＴ７タンパク質の発現を示し、ここで該操作されたナチュラルキラー細胞がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、方法。
１９１．前記操作されたナチュラルキラー細胞が、ＦＵＴ６またはＦＵＴ７タンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、実施形態１９０の方法。
１９２．前記ＣＡＲが、癌関連抗原に特異的に結合する、実施形態１９０の方法。
１９３．前記癌関連抗原が、ＣＤ３８、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ−７、ＴＮＦＲＳＦ１７／ＢＣＭＡ、ＳＹＮＤ１／ＣＤ１３８、ＣＤ２２９、ＣＤ４７、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＣＤ１２３／ＩＬ３−ＲＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、メソテリン、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、Ｔｎ抗原、ＮＥＵ５ＧＣ、ＮｅｕＧｃＧＭ３、ＧＤ２、ＣＬＬ−１、またはＨＥＲＶ−Ｋを含む、実施形態１９２の方法。
１９４．前記癌関連抗原が、血液癌関連抗原を含む、実施形態１９２の方法。
１９５．前記血液癌関連抗原が、ＣＤ３８、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ−７、ＴＮＦＲＳＦ１７／ＢＣＭＡ、ＳＹＮＤ１／ＣＤ１３８、ＣＤ２２９、ＣＤ４７、ＣＤ１２３／ＩＬ３−ＲＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、またはＣＬＬ−１を含む、実施形態１９４の方法。
１９６．前記血液癌関連抗原が、ＣＤ３８を含む、実施形態１９５の方法。
１９７．前記ＣＡＲが、配列番号１から６のいずれかに記載のものと少なくとも８０％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１９６の方法。
１９８．前記ＣＡＲが、配列番号１から６のいずれかに記載のものと少なくとも９０％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１９６の方法。
１９９．前記ＣＡＲが、配列番号１から６のいずれかに記載のものと少なくとも９５％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１９６の方法。
２００．前記ＣＡＲが、配列番号１から６のいずれかに記載のものと少なくとも９８％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１９６の方法。
２０１．前記ＣＡＲが、配列番号１から６のいずれかに記載のものと同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１９６の方法。
２０２．前記ＣＡＲが、配列番号１および２に記載のものと少なくとも９０％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１９６の方法。
２０３．前記ＣＡＲが、配列番号１および２に記載のものと少なくとも９５％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１９６の方法。
２０４．前記ＣＡＲが、配列番号１および２に記載のものと少なくとも９８％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１９６の方法。
２０５．前記ＣＡＲが、配列番号１および２に記載のものと同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１９６の方法。
２０６．前記ＣＡＲが、配列番号３および４に記載のものと少なくとも９０％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１９６の方法。
２０７．前記ＣＡＲが、配列番号３および４に記載のものと少なくとも９５％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１９６の方法。
２０８．前記ＣＡＲが、配列番号３および４に記載のものと少なくとも９８％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１９６の方法。
２０９．前記ＣＡＲが、配列番号３および４に記載のものと同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１９６の方法。
２１０．前記ＣＡＲが、配列番号５および６に記載のものと少なくとも９０％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１９６の方法。
２１１．前記ＣＡＲが、配列番号５および６に記載のものと少なくとも９５％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１９６の方法。
２１２．前記ＣＡＲが、配列番号５および６に記載のものと少なくとも９８％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１９６の方法。
２１３．前記ＣＡＲが、配列番号５および６に記載のものと同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態１９６の方法。
２１４．操作されたナチュラルキラー細胞を含む医薬組成物を作製する方法であって、該操作されたナチュラルキラー細胞が、ＦＵＴ６またはＦＵＴ７タンパク質の発現を示し、ここで該操作されたナチュラルキラー細胞がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含み、ここで該方法が、該ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドと共にナチュラルキラー細胞をインキュベートする工程を含む、方法。
２１５．前記操作されたナチュラルキラー細胞が、ＦＵＴ６またはＦＵＴ７タンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、実施形態２１４の方法。
２１６．前記ＣＡＲが、癌関連抗原に特異的に結合する、実施形態２１４の方法。
２１７．前記癌関連抗原が、ＣＤ３８、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ−７、ＴＮＦＲＳＦ１７／ＢＣＭＡ、ＳＹＮＤ１／ＣＤ１３８、ＣＤ２２９、ＣＤ４７、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＣＤ１２３／ＩＬ３−ＲＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、メソテリン、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、Ｔｎ抗原、ＮＥＵ５ＧＣ、ＮｅｕＧｃＧＭ３、ＧＤ２、ＣＬＬ−１、またはＨＥＲＶ−Ｋを含む、実施形態２１６の方法。
２１８．前記癌関連抗原が、血液癌関連抗原を含む、実施形態２１６の方法。
２１９．前記血液癌関連抗原が、ＣＤ３８、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ−７、ＴＮＦＲＳＦ１７／ＢＣＭＡ、ＳＹＮＤ１／ＣＤ１３８、ＣＤ２２９、ＣＤ４７、ＣＤ１２３／ＩＬ３−ＲＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、またはＣＬＬ−１を含む、実施形態２１８の方法。
２２０．前記血液癌関連抗原が、ＣＤ３８を含む、実施形態２１８の方法。
２２１．前記ＣＡＲが、配列番号１から６のいずれかに記載のものと少なくとも８０％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態２２０の方法。
２２２．前記ＣＡＲが、配列番号１から６のいずれかに記載のものと少なくとも９０％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態２２０の方法。
２２３．前記ＣＡＲが、配列番号１から６のいずれかに記載のものと少なくとも９５％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態２２０の方法。
２２４．前記ＣＡＲが、配列番号１から６のいずれかに記載のものと少なくとも９８％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態２２０の方法。
２２５．前記ＣＡＲが、配列番号１から６のいずれかに記載のものと同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態２２０の方法。
２２６．前記ＣＡＲが、配列番号１および２に記載のものと少なくとも９０％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態２２０の方法。
２２７．前記ＣＡＲが、配列番号１および２に記載のものと少なくとも９５％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態２２０の方法。
２２８．前記ＣＡＲが、配列番号１および２に記載のものと少なくとも９８％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態２２０の方法。
２２９．前記ＣＡＲが、配列番号１および２に記載のものと同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態２２０の方法。
２３０．前記ＣＡＲが、配列番号３および４に記載のものと少なくとも９０％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態２２０の方法。
２３１．前記ＣＡＲが、配列番号３および４に記載のものと少なくとも９５％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態２２０の方法。
２３２．前記ＣＡＲが、配列番号３および４に記載のものと少なくとも９８％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態２２０の方法。
２３３．前記ＣＡＲが、配列番号３および４に記載のものと同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態２２０の方法。
２３４．前記ＣＡＲが、配列番号５および６に記載のものと少なくとも９０％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態２２０の方法。
２３５．前記ＣＡＲが、配列番号５および６に記載のものと少なくとも９５％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態２２０の方法。
２３６．前記ＣＡＲが、配列番号５および６に記載のものと少なくとも９８％同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態２２０の方法。
２３７．前記ＣＡＲが、配列番号５および６に記載のものと同一である標的ドメインアミノ酸配列を含む、実施形態２２０の方法。
【実施例】
【００９８】
本発明は、添付の図面を参照しながら実施例において説明される。
【００９９】
（実施例１：ＮＫ細胞株ＫＨＹＧ−１は、ＮＫ−９２細胞株よりも高いレベルのＥ−セレクチンリガンドの発現を示す）
異なるＮＫ細胞株上のＥ−セレクチンリガンドの発現を決定するために、１０％ＦＢＳおよびＩＬ−２（１０ｎｇ／ｍｌ）を補充したＲＰＭＩ  １６４０培地中でＮＫ−９２およびＫＨＹＧ−１細胞を培養した。細胞を培養液から取り出し、洗浄し、そしてＰＥ結合ＨＥＣＡ−４５２抗体またはＰＥアイソタイプ対照で染色した。次いで、細胞をフローサイトメーターに流し、そして平均蛍光強度（ＭＦＩ）を対照と比較して各細胞株について決定した。図２Ａは代表的な実験であり、アイソタイプ対照２０１と比較した場合、ＫＨＹＧ−１細胞がはるかに高いＨＥＣＡ−４５２反応性２０２を示すことを示す（ＭＦＩが２７７２対２２１）。図２Ｂは、アイソタイプ対照２０３と比較した場合に低いＨＥＣＡ−４５２反応性２０４を示すＮＫ−９２細胞での反対の結果を示す（ＭＦＩが５４５対１２１）。
【０１００】
（実施例２：ＮＫ細胞株ＫＨＹＧ−１は、減少したＥ−セレクチンリガンドのインビトロ表現型を示す）
この増加したＨＥＣＡ−４５２反応性がＫＨＹＧ−１およびＮＫ−９２細胞の遊走における表現型の違いに翻訳されるかどうかを決定するために、インビトロで試験した。最初に、間質由来因子−１（ＳＤＦ−１）勾配に沿った遊走を調べた。図３は、ＫＨＹＧ−１細胞（左の棒）がＮＫ−９２細胞（右の棒）と比較した場合、遊走において約６倍の増加を示したことを示す。さらに、Ｅ−セレクチンコーティングフローセル中の遊走をモニターした。図４ＡおよびＢは、フローセルアッセイ中に撮影されたビデオの静止フレームショットを示す。図４Ａは、多くのＫＨＹＧ−１細胞がフローセルアッセイにおいて不動であるかまたは非常に遅い動きを示すことを示す（アスタリスク）。反対に、図４Ｂは、ＮＫ−９２がフローセルのフレームを通って妨げられずに流れることを示す。
【０１０１】
（遊走アッセイ）
対数増殖期のＮＫ−９２またはＫＨＹＧ１細胞を回収し、洗浄し、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２を含有する無血清培地（ＫＨＹＧ１ではＲＰＭＩ１６４０、ＮＫ−９２ではａＭＥＭ）に懸濁し、４時間飢餓状態にした。１００ｎｇ／ｍＬのＳＤＦ１および１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２を含有する６００μＬの無血清培地を各ウェルに添加し（１２ウェルプレートの場合）、次いで１００μＬの飢餓細胞懸濁液を、孔サイズが５．０μｍである上部の遊走チャンバー（Ｃｏｓｔａｒ；Ｃｏｒｎｉｎｇ）にロードした。次いで細胞をＣＯ２インキュベーター中で３７℃の細胞で４時間培養した。４時間後、下部区画（遊走した細胞を含む）中の培地を回収し、そしてＢＤ  ＡｃｃｕｒｉＴＭ  Ｃ６フローサイトメーターを使用することによって細胞数を計数した。
【０１０２】
（フローセル／ローリングアッセイ）
ローリングアッセイを、Ｍｉｒｕｓ  Ｅｖｏ  ＮａｎｏＰｕｍｐ（Ｃｅｌｌｉｘ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）を使用して、８チャンネルマイクロ流体バイオチップ（Ｃｅｌｌｉｘ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｄｕｂｌｉｎ、アイルランド）中で実施した。バイオチップのチャンネルＶｅｎａ８  Ｆｌｕｏｒ＋（Ｃｅｌｌｉｘ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）を、１ｍＭ  ＣａＣｌ２を補充したＴｒｉｓ・ＨＣｌ  ｐＨ７．４中の１５μｇ／ｍＬのＥ−セレクチン（ＰｅＰｒｏｔｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、米国）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。各チャンネルを１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）で、または指示した場合は１５μｇ／ｍＬの抗Ｅ−セレクチン遮断抗体（クローンＢＢＩＧ−Ｅ１、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ；Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、米国）でブロックし、アッセイの前に３７℃で１時間インキュベートした。細胞を洗浄し、ローリングアッセイ緩衝液（１％熱不活性化ＦＢＳ（ウシ胎児血清）、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび１ｍＭ  ＣａＣｌ２を添加した、フェノールレッドを含まないＲＰＭＩ  １６４０培地）中に２×１０６細胞／ｍｌにて再懸濁した。８０μＬの細胞懸濁液をマイクロチャネルにロードし、ローリングアッセイを室温にて０．５ダイン／ｃｍ２で実行した。細胞を、ＡＸ１０Ｖｅｒｔ．Ａ１顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ＧｍｂＨ）のＡ−Ｐｌａｎ  １０Ｘ／０．２５対物レンズ（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ＧｍｂＨ；Ｊｅｎａ、ドイツ）を使用して、チャネルに沿って５つの異なる位置でモニターした。０１  ＱＩＣｌｉｃｋ  Ｆ−Ｍ−１２  Ｍｏｎｏ  １２ビットカメラ（ＱＩｍａｇｉｎｇ；Ｓｕｒｒｅｙ、カナダ）を使用して、位置ごとに３０フレームを互いに０．５秒で収集した。画像はＶｅｎａ  Ｆｌｕｘアッセイソフトウェア（Ｃｅｌｌｉｘ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）を用いて取得し、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ｐｒｅｍｉｅｒｅソフトウェア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、米国）を用いて分析した。ローリングセルは、その直径より多くに相当する距離を移動するセルとして定義した。１チャンネル当たり５つの異なる位置の全細胞数を計数し、次いで全チャンネルの平均数を計算した。
【０１０３】
（実施例３：ＮＫ細胞株ＫＨＹＧ−１のインビボホーミング）
インビボマウスモデルでは、ＮＫ細胞の遠隔の骨髄窪み（ｎｉｃｈｅｓ）へのホーミングを追跡する。これは骨髄のインビボ共焦点顕微鏡またはフローサイトメトリー分析を使用して行う。骨髄ホーミングについて分析される細胞株は、ＫＨＹＧ−１（高ＨＥＣＡ−４５２結合）およびＮＫ−９２高（低ＨＥＣＡ−４５２結合）である。両方の細胞株を同じマウスに注射するが、競合的な骨髄ホーミング分析を行うために２つの異なるフルオロフォアで標識する。１つの時点（４、８、１２、２４時間など）で観察する。
【０１０４】
ＮＫ細胞を蛍光染料（Ｃａｌｃｅｉｎ  ＡＭまたはＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ  Ｄｙｅｓ）で標識する。次に、ＢＭへのホーミングは、Ｚｅｉｓｓ  ７１０共焦点システム（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｍｉｃｒｏｉｍａｇｉｎｇ、Ｊｅｎａ、ドイツ）を使用してインビボで画像化するか、またはＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩフローサイトメーターを使用して定量化する。共焦点では、皮膚弁をマウスの頭皮に作製し、その下にある背側の頭蓋骨表面を露出させる。腫瘍の画像を、インビボ共焦点顕微鏡を使用して約１時間のセッションでキャプチャする。細胞詳細を有する画像を、１０×の０．４５ＮＡ  Ｐｌａｎ−Ａｐｏ対物レンズ（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｍｉｃｒｏｉｍａｇｉｎｇ）を使用して、頭蓋骨の表面から２５０μｍまでの深さで無傷のマウス頭蓋骨を通して得る。複数の撮像深度が取得され、最大強度のｚ投影をＩｍａｇｅ  Ｊで実行し、画像を併合する。ＧＦＰは、アルゴンレーザーの４８８ｎｍラインで励起する。６３３ｎｍのレーザーで励起したＥｖａｎｓ  Ｂｌｕｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用いて血管を画像化する。放出シグナルを、Ｚｅｉｓｓの内部の共焦点Ｑｕａｓａｒ検出器によって収集する。
【０１０５】
（実施例４：多発性骨髄腫に対するＣＤ３８  ＣＡＲ発現ＮＫ細胞のインビボでの効力）
（高、中、低親和性ＣＤ３８  ＣＡＲを用いてＫＨＹＧ−１細胞を形質導入する）
第２世代のＣＤ３８  ＣＡＲ構築物を、異なる親和性（高、中および低）の標的ドメインを用いて生成する。ＣＡＲはまた、ＣＤ３ζおよび４−１ＢＢ共刺激ドメインを含み、形質導入マーカーとして分離されたΔＮＧＦＲ（ＣＡＲ形質導入細胞を追跡するために使用されるマーカー遺伝子）に２Ａ配列によって連結されている。どちらのタイプの構築物がＫＨＹＧ−１細胞をよりよく形質導入するかはよく知られていないので、異なる親和性のＣＤ３８  ＣＡＲをレンチまたはレトロウイルス構築物として生成する。配列番号１〜６に由来するＣＡＲ標的ドメインの配列を使用する。この問題に取り組むパイロット実験の結果に応じて、ＫＨＹＧ−１細胞に異なるＣＤ３８  ＣＡＲ構築物を形質導入し、それらを高純度に選択して、以下に記載のように多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞株に対するそれらの機能的効力を試験する。
【０１０６】
機能試験段階において、増殖（proliferation）および拡大（expansion）についてＣＡＲ形質導入ＫＨＹＧ−１細胞をモニターし（細胞計数）、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ３、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／３、ＫＩＲ３ＤＬ１およびＮＫＧ２Ａ発現を０日目、１週目、３週目および６週目（拡大の終期）にモニターする。アポトーシスマーカーのアネキシン−Ｖの発現もまた調査される。ＣＡＲ  Ｔ細胞はそれらの活性化状態にもかかわらずＣＤ３８を発現しないことを観察したので、別の重要な表現型パラメーターはＣＤ３８の発現である。続けて、ＣＤ３８＋ＭＭ細胞に対するそれらのＣＤ３８依存性の増殖能およびサイトカイン（ＩＦＮγおよびＴＮＦα）分泌能を評価する（ＣＦＳＥアッセイ）。ＢＬＩに基づく細胞傷害性アッセイを、種々のルシフェラーゼ形質導入ＭＭ細胞株に対するＣＤ３８  ＣＡＲ  ＮＫ細胞の細胞傷害性活性を測定するために使用する。標的細胞としてＮＫ細胞感受性Ｋ５６２細胞株も使用する。
【０１０７】
ＵＭ９（高ＣＤ３８）対Ｕ２６６（ＣＤ３８陰性）で刺激した際のＮＫ細胞のＣＤ３８依存性脱顆粒を、フローサイトメトリーを使用してΔＮＧＦＲ陽性ＣＡＲ  ＮＫ細胞の表面上のＣＤ１０７ａのアップレギュレーションを分析することによってアッセイする。初代ＭＭ細胞に対する細胞傷害性反応性を、前述のように、患者由来のＢＭＭＮＣを用いたＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイにおいて評価する。手短に言えば、ＣＤ３８  ＣＡＲ  ＮＫ細胞を、５〜５０％のＭＭ細胞を含有するＢＭＭＮＣと異なるエフェクター対標的比で共培養する。２４〜４８後に、ＭＭ細胞の生存を、定量的フローサイトメトリーを使用してＣＤ１３８陽性形質細胞の計数によって評価する。細胞傷害活性は、前述のようにこれらの生存データから推定される。
【０１０８】
研究のこの段階では、非悪性ＣＤ３８陽性造血細胞に対する反応性を決定することも重要である。これは、健康な個人または患者のＰＢＭＣまたはＢＭＭＮＣを用いたＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイによって評価される。ＣＤ３８  ＣＡＲ  ＮＫ細胞をＰＢＭＣまたはＢＭＭＮＣと２４〜４８時間インキュベートした後、ＣＤ３４＋造血前駆細胞（ＢＭＭＮＣサンプル中のみ）、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ１４＋単球、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞、ＣＤ１９／２０＋Ｂ細胞を含む非悪性造血細胞の生存を、単一プラットフォームの定量的ＦＡＣＳ分析で決定する。これら全てのアッセイにおいて、モックベクター形質導入ＮＫ細胞を陰性対照として使用し、初期に樹立したＣＤ３８  ＣＡＲＴ細胞を陽性対照として使用する。
【０１０９】
（ＴＲＡＩＬ改変体（ＴＲＡＩＬｖ）およびＴＲＡＩＬ野生型（ＴＲＡＩＬｗｔ）を用いて、最も適したＣＤ３８  ＣＡＲ  ＮＫ−９２細胞を形質導入する。）
（ＴＲＡＩＬｖおよびＴＲＡＩＬｗｔを用いて最も適したＣＤ３８  ＣＡＲ  ＫＨＹＧ−１細胞を形質導入する）
正常なＣＤ３８＋細胞に影響を与えずにＭＭ細胞を殺傷するのに最良であるＣＤ３８  ＣＡＲ  ＮＫ細胞を選択し、さらに野生型ＴＲＡＩＬおよびＴＲＡＩＬ改変体構築物を用いて形質導入する。上記の同様の設定において、これらの細胞をＤＲ５＋ＣＤ３８＋、ＤＲ５＋ＣＤ３８−、ＤＲ５−ＣＤ３８＋、ＤＲ５−、ＣＤ３８−のＭＭ細胞株に対して試験し、これらのＣＤ３８およびＤＲ−５依存性細胞傷害活性を比較し、それらの標的細胞特異性を比較した。初代ＭＭ細胞もまた、これらの細胞に対する感受性について調べる。誘導性ＴＲＡＩＬｖ構築物を生成するために、最小（ｍ）ＣＭＶプロモーターおよびＮＦＡＴ転写応答エレメント（ＴＲＥ）の縦列反復の制御下で、複製不能ＶＳＶ−ｇシュードタイプ自己不活性化レンチウイルス構築物中にＴＲＡＩＬｖ遺伝子をクローニングする。このようにして、ＣＡＲ誘発時にＴＲＡＩＬｖの迅速な転写を可能にし、それはＮＦＡＴ制御下で遺伝子発現を誘導する。その結果、ＣＡＲが誘発されると、ＣＤ３ζドメインはＮＦＡＴを活性化し、それは次にＴＲＡＩＬｖの迅速な転写および続く発現を誘導する。生成された細胞を、ＣＤ３８  ＣＡＲ依存性ＴＲＡＩＬｖ発現についてまず評価する。この誘導性遺伝子のオン／オフ動態を調べた後、細胞を、上記と同様の設定で、ＤＲ５＋ＣＤ３８＋、ＤＲ５＋ＣＤ３８−、ＤＲ５−ＣＤ３８＋、ＤＲ５−、ＣＤ３８−のＭＭ細胞株、ならびに初代ＭＭ細胞を殺傷する能力について調べる。
【０１１０】
（インビボでの抗ＭＭ効力およびＭＭ対正常造血細胞の識別能において最良のＣＤ３８  ＣＡＲを評価する）
この段階では、インビトロで機能する最良のＣＤ３８  ＣＡＲ  ＮＫ細胞のインビボでの安全性および抗ＭＭ効力を決定する。最良のＣＤ３８  ＣＡＲ（およびＴＲＡＩＬｖ）で形質導入されたＮＫ細胞のインビボ活性を、ヒトＭＭ腫瘍がヒト化微小環境で増殖する本発明者らの最近開発されたＲａｇ２−／−γｃ−／−に基づく異種移植モデル（ヒト骨髄由来ＭＳＣでコーティングされている足場の皮下接種によって生成される）において評価する。手短に言えば、このモデルにおいて、ＣＤ３８陽性ＵＭ−９およびＣＤ３８陰性Ｕ２６６  ＭＭ腫瘍を、ヒト化ＢＭ微小環境において樹立する。ＢＬＩによるヒト化足場へのＭＭ腫瘍の生着を証明した後（通常は接種後１〜２週間）、マウスをｉＣａｓｐ９−ＣＤ３８  ＣＡＲ  ＮＫ細胞で処置する。細胞を、漸増用量で静脈投与により、または足場内に注入する（合計用量が３、６および３０×１０６細胞／マウス（静脈内）；１、５、３、９×１０６細胞（足場内））。全ＣＡＲ  ＮＫ細胞用量を３回に分け、各用量を１週間間隔で投与する。腫瘍量をＢＬＩによってモニターする。モック形質導入ＮＫ細胞およびＣＤ３８  ＣＡＲＴ細胞をそれぞれ陰性対照および陽性対照として使用する。
【０１１１】
（実施例５：ＣＤ３８  ＣＡＲ  ＮＫ細胞受容体による多発性骨髄腫治療のためのプロトコル）
上記のように、ＣＤ３８  ＣＡＲ  ＮＫ細胞は、異なる種類の癌を有する個体に投与することができる。以下のプロトコルを、多発性骨髄腫を有する患者の治療に使用するために開発した。多発性骨髄腫などのＣＤ３８陽性癌を有する患者の診断後、患者への投与の前に、改変ＮＫ細胞のアリコートを解凍および培養することができる。あるいは、本明細書に記載のように、ＣＤ３８  ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを保有するレンチウイルス、またはＣＡＲをコードするｍＲＮＡを用いたエレクトロポレーションを用いて一過性トランスフェクションを調製することができる。エレクトロポレーションの場合、ＭａｘＣｙｔｅ  Ｆｌｏｗ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎプラットフォームは、臨床での高速大規模トランスフェクションを達成するための適切なソリューションを提供する。ＣＤ３８  ＣＡＲ発現ＮＫ細胞をトランスフェクトした後、それを培養してＣＡＲの発現を可能にし、次いで患者に静脈内投与する。
【０１１２】
（実施例６：多発性骨髄腫および急性骨髄性白血病に対する、ＮＫ細胞を発現するＴＲＡＩＬ改変体のインビトロ効力）
多発性骨髄腫（ＭＭ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、および腎細胞癌（ＲＣＣ）は、消耗性であり、そしてしばしば致死性の悪性腫瘍である。ＲＣＣ、ＭＭおよびＡＭＬは、ＮＫ細胞ＴＲＡＩＬを含む複数のエフェクター経路を介してＮＫ細胞の細胞傷害性を受けやすい。ボルテゾミブによる悪性細胞の処理は多くの悪性腫瘍におけるＤＲ５発現をアップレギュレートし、ＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスに対するそれらの感受性を増強する。重要なことに、ＥＢＶ−ＬＣＬを用いてエクスビボで拡大させたＮＫ細胞は、ＴＲＡＩＬの表面発現を実質的にアップレギュレートし、さらに、ボルテゾミブに曝露された腫瘍のＮＫ細胞媒介性腫瘍殺傷を増強する。したがって、全長の変異型ＤＲ５に特異的なＴＲＡＩＬ改変体を発現させるＮＫ細胞の遺伝子改変は、顆粒媒介細胞傷害性とは無関係に、ＮＫ細胞の腫瘍特異的細胞傷害性を増強し得る。さらに、ボルテゾミブ（ＤＲ５をアップレギュレートする）に曝露された腫瘍は、これらの遺伝子改変ＮＫ細胞による殺傷に対して非常に感受性になると予測される。
【０１１３】
（インビトロ実験計画）
ＤＲ−５特異的組換えＴＲＡＩＬ（ｒｈＴＲＡＩＬ  Ｄ２６９Ｈ／Ｅ１９５Ｒ）を発現するように遺伝子改変されたエクスビボ拡大ＮＫ細胞（ＧＭＰ条件およびＳＭＩ−ＬＣＬフィーダー細胞株を用いて拡大されたＮＫ細胞）を、インビトロでそれらがＲＣＣ、ＡＭＬおよびＭＭ腫瘍標的に対するＮＫ細胞媒介殺傷を増強し得るかどうか、さらには、腫瘍標的をボルテゾミブで前処理することによって腫瘍殺傷を改善できるかどうかを知るために調べる。腫瘍細胞傷害性実験を、ＤＲ−５（ボルテゾミブ処理でアップレギュレートされ得る）を発現することが知られている一連の腫瘍細胞株に対してエクスビボで拡大させたＮＫ細胞と共に、クロム放出アッセイ（ＣＲＡ）およびＮＫ細胞脱顆粒アッセイ（ＣＤ１０７ａ）を用いてインビトロで行う。ＮＫ細胞集団の間でＮＫ細胞腫瘍殺傷が異なって行われるかどうかを同定するために、異なるＮＫ細胞調製物を利用する腫瘍細胞傷害性アッセイを行う。集団は以下を含む：ａ）新たに単離されたＮＫ細胞；ｂ）一晩ＩＬ−２活性化したＮＫ細胞；ｃ）ＥＢＶ−ＬＣＬフィーダー細胞を用いた１４日間のエクスビボ拡大ＮＫ細胞；ｄ）ＤＲ−５特異的組換えＴＲＡＩＬを発現させるためにＭａｘｃｙｔｅ  ＧＴシステムを用いてｍＲＮＡをエレクトロポレーションした１４日間のエクスビボで拡大させたＮＫ細胞；ならびにｅ）ＤＲ−５特異的組換えＴＲＡＩＬを発現させるためにレンチウイルスベクター（ＬＶ）を用いて形質導入された１４日間のエクスビボ拡大ＮＫ細胞。
【０１１４】
ＴＲＡＩＬ表面発現を最適化するために、形質導入の様々なＭＯＩを試験する。目標は以下の通りである：ａ）ＮＫ細胞形質導入（インビトロ）後の４週間にわたるＴＲＡＩＬ表面発現の動態を定義する；ｂ）ＮＫ細胞形質導入後の複数の期間にわたるＴＲＡＩＬを介したＮＫ細胞腫瘍殺傷の動態を定義する；ｃ）ＮＫ細胞の表現型、サイトカイン分泌能、および機能的細胞傷害性に対するＤＲ−５特異的ＴＲＡＩＬ形質導入の効果を評価する；インビトロでのＮＫ細胞増殖に対するＤＲ−５特異的ＴＲＡＩＬ形質導入の効果を評価する；そしてｄ）ＮＫ細胞生存率に対するＤＲ−５特異的ＴＲＡＩＬ形質導入の効果を評価する。
【０１１５】
ＮＫ細胞のトランスフェクションを最適化して組換えＴＲＡＩＬを発現させるために、ＤＲ−５特異的組換えＴＲＡＩＬをコードする様々な濃度のｍＲＮＡを試験する（インビトロ）。その目的は次のとおりである：ａ）ｍＲＮＡトランスフェクション後４〜７日間にわたる組換えＴＲＡＩＬ発現の動態を定義する；ｂ）対照として表面発現ＣＤ３４をコードするｍＲＮＡでトランスフェクトしたＮＫ細胞に対し、ＴＲＡＩＬ発現のこれらの動態を比較する；ｃ）１週間にわたるＤＲ−５組換えＴＲＡＩＬを用いたＮＫ細胞のトランスフェクション後のＴＲＡＩＬを介したＮＫ細胞腫瘍殺傷の動態を定義する；ｄ）ＮＫ細胞の表現型、サイトカイン分泌能、および機能的細胞傷害性に対するＤＲ−５特異的ＴＲＡＩＬ  ｍＲＮＡトランスフェクションの効果を評価する；ｅ）インビトロでのＮＫ細胞増殖に対するＤＲ−５特異的ＴＲＡＩＬ  ｍＲＮＡトランスフェクションの効果を評価する；ｆ）ＮＫ細胞生存率に対するＤＲ−５特異的ＴＲＡＩＬ  ｍＲＮＡトランスフェクションの効果を評価する。また、ＤＲ５受容体の腫瘍表面発現をアップレギュレートするようにボルテゾミブで前処理されたＲＣＣ、ＭＭおよびＡＭＬ腫瘍標的＋／−に対して、ＮＫ細胞（遺伝子操作対野生型）を標的とする。
【０１１６】
（インビボ実験計画）
次に、ＤＲ−５特異的組換えＴＲＡＩＬを発現するように遺伝子改変されたエクスビボ拡大ＮＫ細胞を試験して、それらがインビボでＲＣＣ、ＡＭＬおよびＭＭ腫瘍標的に対するＮＫ細胞殺傷を増強できるかどうかを調べる。ＤＲ−５特異的組換えＴＲＡＩＬを発現するように遺伝子改変されたエクスビボ拡大ＮＫ細胞をＭＭ１Ｓ腫瘍担持マウス（ＮＳＧ）に養子注入して、生物発光イメージング（ＢＬＩ）を用いて処置なしおよび処置ありのマウスの結果を比較する。条件には、新鮮なＩＬ−２活性化および拡大ＮＫ細胞、ならびにウイルス形質導入およびｍＲＮＡトランスフェクションを介してＤＲ−５特異的組換えＴＲＡＩＬを発現するように遺伝子改変された拡大ＮＫ細胞が含まれる。同じアプローチを、ＳＡＵＪ−Ｌｕｃを有するＲＣＣにおいて、およびＭＯＬＭ１４−Ｌｕｃを有するマウスのＡＭＬにおいて評価する。ルシフェラーゼで形質導入された腫瘍標的により、これらのモデルにおける腫瘍量を評価するためにＢＬＩイメージングを使用することが可能になる。
【０１１７】
治療のタイミングが結果に影響を与えるかどうかを調査する。ＴＲＡＩＬの表面発現がピークになる時点まで、ｍＲＮＡトランスフェクション後のＮＫ細胞の注入を遅らせることに対して、ＮＫ細胞をｍＲＮＡトランスフェクションの直後に注入する。腫瘍のインビボＮＫ細胞殺傷に対する外因性ＩＬ−２および／またはＩＬ−１５投与の影響もまた調査される。組換えＤＲ−５特異的ＴＲＡＩＬを発現するように遺伝子改変されたＮＫ細胞による腫瘍の殺傷に対するボルテゾミブでの動物の前処置の影響を調査する。我々はまた、どちらかを受けた拡大ＮＫ細胞集団を用いてＤＲ−５を発現するように遺伝子改変されたエクスビボ拡大ＮＫ細胞を用いてＭＭおよびＡＭＬにおける上記インビボ実験を評価する：ａ）遺伝子組換え；ｂ）培養の変更；またはｃ）骨髄へのホーミングを改善するためのエクスビボ操作。
【０１１８】
（実施例７：抑制性受容体機能のノックアウト）
（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）
抑制性受容体機能を除去した細胞を以下のように調製した。ｇＲＮＡ構築物を、ＮＫ細胞のヒトゲノム中の「古典的」抑制性受容体ＬＩＲ２および「チェックポイント」抑制性受容体ＣＴＬＡ４をコードする遺伝子を標的とするように設計および調製した。次いで、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集を使用して、ＬＩＲ２およびＣＴＬＡ４標的遺伝子をノックアウトした。
【０１１９】
各標的遺伝子について２つのｇＲＮＡ候補を選択し、そしてＫ５６２細胞におけるそれらの切断効率を決定した。ｇＲＮＡ候補の配列を表１に示す。
【０１２０】
【表１】
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【０１２１】
Ｋ５６２細胞を調製したｇＲＮＡ構築物でトランスフェクトし（図５）、続いてＰＣＲ増幅のために回収した。ＧＦＰ発現の存在を用いて、ｇＲＮＡ構築物のＫ５６２細胞への組み込みの成功を報告した。これにより、Ｃａｓ９遺伝子の発現、したがってＬＩＲ２およびＣＴＬＡ４遺伝子の発現をノックアウトする能力が確認された。ｇＲＮＡ構築物の切断活性を、インビトロミスマッチ検出アッセイを用いて決定した。Ｔ７Ｅ１エンドヌクレアーゼＩは、不完全にマッチしたＤＮＡを認識して切断し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９トランスフェクションおよび非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の後に、親のＬＩＲ２およびＣＴＬＡ４遺伝子を変異遺伝子と比較することを可能にする。
【０１２２】
図６は、ｇ９およびｇ１８のｇＲＮＡ配列を用いてＬＩＲ２遺伝子をノックアウトした後のアガロースゲル電気泳動後に得られたバンドを示す。各変異に対応する３つのバンドは、親遺伝子（６０１）と、トランスフェクション後のＤＮＡ配列におけるミスマッチの検出後に生じる２つの鎖（６０２および６０３）に対応する。ｇ９  ｇＲＮＡ配列は１１％のトランスフェクションの成功率をもたらしたが、ｇ１８  ｇＲＮＡは１０％をもたらした。
【０１２３】
図７は、ｇ７およびｇ１５のｇＲＮＡ配列を用いてＣＴＬＡ４遺伝子をノックアウトした後のアガロースゲル電気泳動後に得られたバンドを示す。７０１は親バンドを示し、７０２、７０３は、ミスマッチ検出後に得られた２つのバンドを示す。ｇ７  ｇＲＮＡ配列は３２％のトランスフェクション成功率をもたらしたが、ｇ１５  ｇＲＮＡは２６％をもたらした。
【０１２４】
Ｋ５６２細胞におけるＬＩＲ２およびＣＴＬＡ４のノックアウトが成功した後、ＫＨＹＧ−１細胞をｇＲＮＡ構築物でトランスフェクトした。ホモ接合性欠失を有するＫＨＹＧ−１誘導体クローンを選択した。Ｃａｓ９／ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＣ）発現ベクターをこの目的に使用した。抗生物質ピューロマイシンに対するそれらの耐性に基づいて、首尾よくトランスフェクトされた細胞を選択した。
【０１２５】
（Ｃａｓ９  ＲＮＰ）
ＮＫ細胞におけるチェックポイント抑制性受容体のノックアウトのために使用された別のプロトコルは、Ｃａｓ９  ＲＮＰトランスフェクションのそれであった。このプロトコルを使用する利点は、同様のトランスフェクション効率が達成可能であったが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プロトコルのＤＮＡプラスミドを使用した場合と比較して毒性が有意に低いことであった。各トランスフェクション実験のために１×１０６個のＫＨＹＧ１細胞を回収した。細胞をＰＢＳで洗浄し、遠心分離機で遠心した。次いで上清を捨てた。次いで、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＰ（ＲＮＡ結合タンパク質）材料を以下のように調製した：（１）必要な合成ｃｒＲＮＡおよびｔＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎから購入）の２０μＭ溶液を調製した；（２）４μｌのｃｒＲＮＡ（２０μＭ）と４μｌのｔＲＮＡ（２０μＭ）を一緒に混合した；（３）次いで混合物を２μｌのＣａｓ９タンパク質（５μｇ／μｌ）に添加した；（４）全成分を混合し、室温で１０分間インキュベートした。Ｎｅｏｎ（登録商標）トランスフェクションシステムに従って、細胞をＣａｓ９  ＲＮＰと混合し、以下のパラメーターを用いてエレクトロポレーションを行った：電圧、１４５０ｖ；パルス幅、３０ｍｓ；パルス数：１。次いで、細胞を増殖培地（ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含む）を含む１２ウェルプレートの１つのウェルに移した。細胞を４８〜７２時間後に回収し、Ｔ７エンドヌクレアーゼアッセイおよび／またはＳａｎｇｅｒ配列決定により遺伝子編集効率を確認した。インデルの存在が確認され、ＫＨＹＧ１細胞におけるＣＴＬＡ４、ＰＤ１およびＣＤ９６のノックアウトが成功したことを示している。
【０１２６】
（部位特異的ヌクレアーゼ）
ＮＫ細胞におけるチェックポイント抑制性受容体のノックアウトのために使用された別のプロトコルは、ＸＴＮ  ＴＡＬＥＮトランスフェクションのそれであった。このプロトコルを使用する利点は、野生型ＣＲＩＳＰＲと比較して特に高いレベルの特異性が達成可能であることであった。
【０１２７】
（ステップ１：試薬の調製）
ＫＨＹＧ−１細胞を、トランスフェクション効率、単一細胞クローニング効率および核型／コピー数を含む特定の属性についてアッセイした。次いで、細胞を供給元の推奨に従って培養した。ノックアウトされているチェックポイント抑制性受容体に応じて、ヌクレアーゼを少なくとも２対のＸＴＮ  ＴＡＬＥＮのカスタムデザインによって調製した。カスタムデザインのステップは、遺伝子座の評価、コピー数および機能的評価（すなわち相同体、オフターゲット評価）を含む。
【０１２８】
（ステップ２：細胞株操作）
細胞をステップ１のヌクレアーゼでトランスフェクトした。高レベルの切断を得るためにこのステップを３回まで繰り返し、そして各トランスフェクションの前に培養物を分割しそして中間培養物を維持した。各トランスフェクションの数日後に最初のスクリーニングが行われた。細胞プールをＣｅｌ−１アッセイにより切断効率について試験した。反復トランスフェクション後に切断レベルが許容レベルまたはプラトーに達した後、細胞を単一細胞クローニングの準備ができていると見なした。プールした細胞を９６ウェルプレートの１ウェルあたり１細胞に選別した。各プールのプレート数は、ステップ１で決定した単一細胞クローニング効率に依存した。プレートを放置し、３〜４週間インキュベートした。
【０１２９】
（ステップ３：スクリーニングおよび拡大）
細胞が９６ウェルプレート中でコンフルエントになったら、培養物を統合し、そして三連の９６ウェルプレートに分割した。１つのプレートをバックアップとして凍結し、１つのプレートをクローンの拡大を続けるために再プレートし、そして最終プレートを遺伝子型確認のために使用した。遺伝子型プレート中の各クローンをｑＰＣＲシグナルの喪失について分析した。これは全ての対立遺伝子が改変されたことを示す。陰性クローンをＰＣＲ増幅し、クローン化してインデルの性質および野生型またはインフレームインデルの欠如を決定した。確認されたノックアウトを有するクローンを、せいぜい１つの２４ウェルプレートにまとめ、そしてさらに拡大させた。典型的には、５個までの個々のクローンについて１バイアルあたり１×１０６個の細胞を含有する５〜１０個の凍結クリオバイアルをノックアウトあたりに作製した。
【０１３０】
（ステップ４：検証）
細胞を無菌条件下で貯蔵した。全てのバンク細胞の基本的な放出基準は、生存細胞数（凍結前および解凍後）、ＳＴＲによる同一性の確認、基本的な無菌性保証およびマイコプラズマ試験を含んだ。必要に応じて他の放出基準を適用した（核型、表面マーカーの発現、高レベルの無菌性、転写産物またはタンパク質のノックアウト評価など）。
【０１３１】
（実施例８：ＲＮＡｉを介したチェックポイント抑制性受容体ＣＤ９６機能のノックダウン）
ＫＨＹＧ−１細胞におけるＣＤ９６のｓｉＲＮＡノックダウンは、エレクトロポレーションによって行われた。Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを、Ｌｏｎｚａ社のＡｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ＩＩと組み合わせて使用した。細胞株での使用に適しており、分裂細胞と非分裂細胞の両方をうまくトランスフェクトでき、最大９０％のトランスフェクション効率を達成するからである。対照ｓｉＲＮＡ（カタログ番号：ｓｃ−３７００７）およびＣＤ９６  ｓｉＲＮＡ（カタログ番号：ｓｃ−４５４６０）は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手した。１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含有する抗生物質を含まないＲＰＭＩ−１６４０をヌクレオフェクション後の培養に使用した。染色のためにマウス抗ヒトＣＤ９６−ＡＰＣ（カタログ番号：３３８４０９）をＢｉｏｌｅｇｅｎｄから入手した。
【０１３２】
２０μＭのｓｉＲＮＡストック溶液を調製した。凍結乾燥したｓｉＲＮＡ二重鎖を、ＦＩＴＣ−対照／対照−ｓｉＲＮＡに対し３３μｌのＲＮＡｓｅフリー水（ｓｉＲＮＡ希釈緩衝液：ｓｃ−２９５２７）中に、標的遺伝子ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ  ＣＤ９６）については１６５μｌのＲＮＡｓｅフリー水中に、再懸濁した。管を９０℃で１分間加熱し、次いで３７℃で６０分間インキュベートした。その後、必要になるまでｓｉＲＮＡストックを−２０℃で保存した。
【０１３３】
細胞は対数増殖期になければならないので、ＫＨＹＧ−１細胞をヌクレオフェクションの１〜２日前に継代した。Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液を室温に加温した（サンプル当たり１００μｌ）。血清および補充物を含有する培地のアリコートもまた、５０ｍｌ管中で３７℃に予熱した。血清および補充物を含む培地１．５ｍｌを添加することによって６ウェルプレートを調製した。プレートを加湿した３７℃／５％ＣＯ２インキュベーター中でプレインキュベートした。１００μｌのＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ溶液中の２×１０６細胞を４μｌの２０μＭ  ｓｉＲＮＡ溶液（１．５μｇ  ｓｉＲＮＡ）と穏やかに混合した。混合中の気泡は避けた。混合物をＡｍａｘａ認定キュベットに移し、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキュベットホルダーに入れ、プログラムＵ−００１を選択した。プログラムを終了させ、キュベット内のサンプルを直ちに取り出した。次いで、５００μｌの予め平衡化した培地を各キュベットに添加した。次いで、各キュベット中のサンプルを、調製した６ウェルプレートの対応するウェルに静かに移して、１ウェルあたり２ｍｌの最終容量を確立した。次いで、トランスフェクション分析が行われるまで、細胞を加湿した３７℃／５％ＣＯ２インキュベーター中でインキュベートした。ＣＤ９６発現レベルを測定するために、エレクトロポレーションの１６〜２４時間後にフローサイトメトリー分析を行った。このエレクトロポレーションプロトコルを複数回実施した。図８Ａおよび８Ｂは、このプロトコルが、対照ｓｉＲＮＡ８０２でトランスフェクトされたＫＨＹＧ−１細胞（８Ａにおいて２４０９の平均蛍光強度；８Ｂにおいて３００２の平均蛍光強度）と比較して、信頼できるＣＤ９６ノックダウン８０１（８Ａにおいて１１０７の平均蛍光強度；８Ｂにおいて８１０の平均蛍光強度）をもたらしたことを示す。アイソタイプは８００  ８０２で示される（８Ａでは９０の平均蛍光強度；８Ｂでは７６の平均蛍光強度）。
【０１３４】
（実施例９：ＣＤ９６ノックダウンによるＮＫ細胞の増強された細胞傷害性）
ＣＤ９６ノックダウンありおよびノックダウンなしのＫＨＹＧ−１細胞を、異なるエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比でＫ５６２細胞と共培養した。細胞傷害性は、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒからのＤＥＬＦＩＡ  ＥｕＴＤＡ細胞傷害性キット（カタログ番号：ＡＤ０１１６）を使用して、共培養の４時間後に測定した。標的細胞Ｋ５６２を１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび抗生物質を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地中で培養した。９６ウェルＶ底プレート（カタログ番号：８３．３９２６）をＳＡＲＳＴＥＤＴから購入した。エッペンドルフ遠心分離機５８１０Ｒ（プレートローター付き）を用いてプレートをスピンダウンさせた。ＶＡＲＩＯＳＫＡＮ  ＦＬＡＳＨ（ＳｃａｎＩｔソフトウェア２．４．３を含む）を使用して、溶解したＫ５６２細胞によって生成された蛍光シグナルを測定した。Ｋ５６２細胞を培地で洗浄し、細胞数を培地で１×１０６細胞／ｍＬに調整した。２〜４ｍＬの細胞を５μｌのＢＡＴＤＡ試薬に添加し、そして３７℃で１０分間インキュベートした。細胞内で、エステル結合は加水分解されて親水性リガンドを形成し、これはもはや膜を通過しない。細胞を１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ロードしたＫ５６２細胞を洗浄した。１ｍＭのプロベネシド（Ｓｉｇｍａ  Ｐ８７６１）を含有する培地を用いてこれを３〜５回繰り返した。最後の洗浄後、細胞ペレットを培地に再懸濁し、そして約５×１０４細胞／ｍＬに調整した。バックグラウンド、自然放出および最大放出の検出のためにウェルを準備した。１：１から２０：１までの範囲のエフェクター対標的比を生成するために、１００μＬのロードした標的細胞（５，０００細胞）をＶ底プレートのウェルに移し、１００μＬのエフェクター細胞（ＫＨＹＧ−１細胞）を様々な細胞濃度で添加した。プレートを１００×ｇで１分間遠心分離し、そして３７℃の加湿５％ＣＯ２雰囲気中で４時間インキュベートした。最大放出ウェルについては、培地を回収する１５分前に１０μＬの溶解緩衝液を各ウェルに添加した。プレートを５００×ｇで５分間遠心した。２０μＬの上清を平底９６ウェルプレートに移し、２００μＬの予熱したユーロピウム溶液を加えた。これをプレートシェーカーを用いて室温で１５分間インキュベートした。Ｋ５６２細胞がＫＨＹＧ−１細胞によって溶解されるにつれて、それらは培地中にリガンドを放出する。このリガンドは次にユウロピウム溶液と反応し、溶解細胞の量と直接相関する蛍光キレートを形成する。次に、ＶＡＲＩＯＳＫＡＮ  ＦＬＡＳＨを用いて時間分解蛍光光度計で蛍光を測定した。以下の式を用いて比放出（specific release）を計算した：％比放出＝実験放出−自然放出／最大放出−自然放出。Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６．０４ソフトウェアを用いて統計分析を行った。対応のあるｔ検定を用いて、ｓｉＲＮＡ  ＣＤ９６ノックダウンＫＨＹＧ−１細胞と対照群との間の差を比較した（ｎ＝３）。比放出は、ＣＤ９６ノックダウンＫＨＹＧ−１細胞を含む共培養物において有意に増加することが見出された。これは、全てのＥ：Ｔ比で当てはまった（図９を参照）。蛍光は細胞溶解と直接相関するので、ＫＨＹＧ−１細胞におけるＣＤ９６発現のノックダウンは、それらがＫ５６２癌標的��胞を殺傷する能力の増加をもたらすことを確認した。
【０１３５】
（実施例１０：ＣＤ３２８（Ｓｉｇｌｅｃ−７）ノックダウンによるＮＫ細胞の細胞傷害性の増強）
（ＮＫ−９２細胞におけるＣＤ３２８のｓｉＲＮＡ媒介ノックダウン）
（材料、試薬および器具）
対照ｓｉＲＮＡ（カタログ番号：ｓｃ−３７００７）およびＣＤ３２８  ｓｉＲＮＡ（カタログ番号：ｓｃ−１０６７５７）を、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒＴＭ  Ｄｅｖｉｃｅ（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ＩＩ、Ｌｏｎｚａ）を用いてＮＫ−９２細胞において高い細胞生存率（＞７５％）で最大９０％のトランスフェクション効率を達成するために、Ｌｏｎｚａ製のＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒＴＭ  Ｋｉｔ  Ｔを使用した。抗生物質を含まない、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含むＲＰＭＩ−１６４０を、ヌクレオフェクション後培養に使用した。マウス抗ヒトＣＤ３２８−ＡＰＣ（カタログ番号：３３９２０６）をＢｉｏｌｅｇｅｎｄから購入した。
【０１３６】
（プロトコル）
１０μＭのｓｉＲＮＡストック溶液を作製する。凍結乾燥したｓｉＲＮＡ二本鎖を、ＦＩＴＣ−対照／対照−ｓｉＲＮＡに対し６６μｌのＲＮＡｓｅフリー水（ｓｉＲＮＡ希釈緩衝液：ｓｃ−２９５２７）中に、標的遺伝子ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ  ＣＤ３２８）についてはＲＮＡｓｅフリー水３３０μｌ中に、再懸濁する。管を９０℃で１分間加熱する。３７℃で６０分間インキュベートする。直接使用しない場合は、ｓｉＲＮＡストックを−２０℃で保存する。１つのヌクレオフェクションサンプルが含む（１００μｌの標準キュベット用）。細胞数：２×１０６細胞。ｓｉＲＮＡ：４μｌの１０μＭストック。Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液：１００μｌ。
【０１３７】
（ヌクレオフェクション）
必要な数の細胞を培養する。（ヌクレオフェクションの１または２日前に継代する。細胞は対数増殖期になければならない）。各サンプル用のｓｉＲＮＡを準備する。Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液を室温に予熱する（サンプルあたり１００μｌ）。血清および補充物を含む培地のアリコートを５０ｍｌ管内で３７℃に予熱する。血清および補充物を含む培地１．５ｍｌで満たすことによって６ウェルプレートを準備し、加湿３７℃／５％ＣＯ２インキュベーターでプレートをプレインキュベートする。細胞培養物のアリコートを取り、細胞密度を決定するために細胞数を数える。必要な数の細胞を１５００ｒｐｍで５分間遠心する。残りの培地が細胞ペレットを覆わないように上清を完全に捨てる。細胞ペレットを室温のＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液に２×１０６細胞／１００μｌの終濃度で再懸濁する。細胞生存率および遺伝子導入効率が低下するため、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液に１５〜２０分より長く保存することは避ける。細胞懸濁液１００μｌをｓｉＲＮＡと混合する。サンプルをＡｍａｘａ認定キュベットに移す。サンプルがキュベットの底を覆っていることを確認し、ピペッティング中の気泡を避ける。青いキャップでキュベットを閉じる。適切なＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒプログラム（ＮＫ−９２細胞の場合はＡ−０２４）を選択する。キュベットをキュベットホルダーに挿入し（ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒＩＩ：カルーセルを時計回りに最終位置まで回転させる）、「ｘ」ボタンを押してプログラムを開始する。細胞への損傷を避けるために、プログラムが終了したらすぐにキュベットからサンプルを取り出す（ディスプレイに「ＯＫ」と表示されている）。５００μｌの予熱した培地をキュベットに加え、準備した６ウェルプレートにサンプルを移す。加湿３７℃／５％ＣＯ２インキュベーターで細胞をインキュベートする。１６〜２４時間後にフローサイトメトリー分析および細胞傷害性アッセイを行う。
【０１３８】
（結果）
上記のプロトコルに従い、そしてＮＫ−９２細胞におけるＣＤ３２８発現レベルのフローサイトメトリー分析を行った。１つの代表的な実験の結果を図１０に示し、成功したノックダウンを確認した（対照ｓｉＲＮＡ１００１について３０４８の平均蛍光強度；ＣＤ３２８  ｓｉＲＮＡ１００２について６７９の平均蛍光強度）。
【０１３９】
（ＣＤ３２８のノックダウンが細胞傷害性を高める）
（材料、試薬および器具）
蛍光増強リガンド（カタログ番号：ＡＤ０１１６）に基づくＤＥＬＦＩＡ  ＥｕＴＤＡ細胞傷害性キットをＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒから購入した。標的細胞Ｋ５６２を１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび抗生物質を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地中で培養した。９６ウェルＶ底プレート（カタログ番号：８３．３９２６）をＳＡＲＳＴＥＤＴから購入した。エッペンドルフ遠心分離機５８１０Ｒ（プレートローター付き）を用いてプレートをスピンダウンさせた。ＶＡＲＩＯＳＫＡＮ  ＦＬＡＳＨ（ＳｃａｎＩｔソフトウェア２．４．３を使用）を使用して、溶解したＫ５６２細胞によって生成された蛍光シグナルを測定した。
【０１４０】
（プロトコル）
標的Ｋ５６２細胞に蛍光増強リガンドＤＥＬＦＩＡ  ＢＡＴＤＡ試薬をロードする。Ｋ５６２細胞を培地で洗浄し、細胞数を培地で１×１０６細胞／ｍＬに調整する。２〜４ｍＬの細胞を５μｌのＢＡＴＤＡ試薬に加え、３７℃で１０分間インキュベートする。１５００ｒｐｍで５分間スピンダウンして、ロードしたＫ５６２細胞を１ｍＭプロベネシド（Ｓｉｇｍａ  Ｐ８７６１）を含有する培地で３〜５回洗浄する。最後の洗浄後、細胞ペレットを培地に再懸濁し、約５×１０４細胞／ｍＬに調整する。
【０１４１】
（細胞傷害性アッセイ）
バックグラウンドの検出、自然放出および最大放出のためのウェルをセットアップする。１００μＬのロードした標的細胞（５，０００細胞）をＶ底プレートにピペットで入れる。さまざまな細胞濃度の１００μＬのエフェクター細胞（ＮＫ−９２）を加える。エフェクター：標的比は、１：１から２０：１の範囲である。プレートを１００ｘｇのＲＣＦで１分間スピンダウンする。３７℃の加湿５％ＣＯ２雰囲気中で２時間インキュベートする。最大放出ウェルについては、培地を回収する１５分前に各ウェルに１０μＬの溶解緩衝液を加える。プレートを５００×ｇで５分間スピンダウンする。２０μＬの上清を平底９６ウェルプレートに移し、２００μＬの予熱したユーロピウム溶液を加え、プレートシェーカーを用いて１５分間室温でインキュベートする。ＶＡＲＩＯＳＫＡＮ  ＦＬＡＳＨを使用して時間分解蛍光光度計で蛍光を測定する。以下の式を用いて比放出を計算した：％比放出＝実験放出−自然放出／最大放出−自然放出
【０１４２】
（結果）
上記に従って、ＣＤ３２８ノックダウンの細胞傷害性に対する効果を決定した。１つの代表的実験の結果を図１１に示す。見られるように、標的細胞に対する細胞傷害性は、ＣＤ３２８ノックダウンを有する細胞において増加した。
【０１４３】
（実施例１１：チェックポイント抑制性受容体のノックダウン／ノックアウトによる血液癌治療のためのプロトコル）
上記の実施例で実証されたように、チェックポイント抑制性受容体機能は様々な方法でノックダウンまたはノックアウトすることができる。以下のプロトコルを、血液癌患者の治療に使用するために開発した。本発明で適切に治療された癌患者の診断後、患者への投与前に改変ＮＫ細胞のアリコートを解凍および培養することができる。あるいは、一過性変異は、例えば、上記のように１日または２日以内にｓｉＲＮＡを用いて調製され得る。ＭａｘＣｙｔｅ  Ｆｌｏｗ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎプラットフォームは、診療所での高速大規模トランスフェクションを達成するための適切なソリューションを提供する。特定のチェックポイント抑制性受容体の除去は、他のものよりも有益であり得る。これは患者および癌による。このため、必要に応じて癌を生検し、癌細胞をエクスビボで培養で増殖させる。したがって、異なるチェックポイント抑制性受容体改変を有する一連のＮＫ細胞を、特定の癌に対する細胞傷害性について試験することができる。この工程は、治療のために最も適切なＮＫ細胞またはその誘導体を選択するために使用され得る。改変が成功した後、患者への静脈内および／または腫瘍内注射のために細胞を適切な担体（例えば生理食塩水）に再懸濁する。
【０１４４】
（実施例１２：ＴＲＡＩＬ／ＴＲＡＩＬ改変体のＫＨＹＧ−１ノックイン）
トランスフェクション後のそれらの生存率および癌細胞を殺す能力を評価するために、ＫＨＹＧ−１細胞をＴＲＡＩＬおよびＴＲＡＩＬ改変体の両方を用いてトランスフェクトした。使用されたＴＲＡＩＬ改変体は、ＷＯ２００９／０７７８５７に記載されているものである。それは、Ｄ２６９Ｈ／Ｅ１９５Ｒ変異を含む野生型ＴＲＡＩＬ遺伝子によってコードされている。この変異は、両方のデコイ受容体（ＤｃＲ１およびＤｃＲ２）に対する親和性を減少させながら、ＴＲＡＩＬ改変体のＤＲ５に対する親和性を有意に増大させる。
【０１４５】
（ベースラインＴＲＡＩＬ発現）
ＫＨＹＧ−１細胞におけるベースラインＴＲＡＩＬ（ＣＤ２５３）発現をフローサイトメトリーを用いてアッセイした。マウス抗ヒトＣＤ２５３−ＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号：３０８２１０）およびアイソタイプ対照（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号：４００１２２）を用いて細胞サンプルを染色し、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーターで分析した。ＫＨＹＧ−１細胞を、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）／ストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍＬ）およびＩＬ−２（１０ｎｇ／ｍＬ）を含有するＲＰＭＩ  １６４０培地中で培養した。０．５〜１．０×１０６細胞／試験を遠心分離（１５００ｒｐｍ×５分）によって収集し、上清を吸引した。細胞（単細胞懸濁液）を４ｍＬの氷冷ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、０．５〜１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ３アジ化ナトリウム）で洗浄した。細胞を１００μＬの氷冷ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、５μＬの抗体を各管に添加し、氷上で３０分間インキュベートした。細胞を１５００ｒｐｍで５分間の遠心分離により３回洗浄した。次に細胞を５００μＬの氷冷ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、一時的に氷上で暗所に保った。続いて細胞をフローサイトメーター（ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ）で分析し、生成したデータをＦｌｏｗＪｏ  ７．６．２ソフトウェアを用いて処理した。図１２に見られるように、ＦＡＣＳ分析は、ＫＨＹＧ−１細胞表面上のＴＲＡＩＬの弱いベースライン発現を示した。
【０１４６】
（エレクトロポレーションによるＴＲＡＩＬ／ＴＲＡＩＬ改変体ノックイン）
野生型ＴＲＡＩＬ  ｍＲＮＡおよびＴＲＡＩＬ改変体（Ｄ２６９Ｈ／１９５Ｒ）ｍＲＮＡをＴｒｉＬｉｎｋ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって合成し、等分して−８０℃として保存した。マウス抗ヒトＣＤ２５３−ＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号：３０８２１０）およびアイソタイプ対照（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号：４００１２２）、およびマウス抗ヒトＣＤ１０７ａ−ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅカタログ番号：１２−１０７９−４２）およびアイソタイプ対照（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅカタログ番号：１２−４７１４）抗体を用いて細胞サンプルを染色し、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーターで分析した。ＤＮＡ染料ＳＹＴＯＸ−Ｇｒｅｅｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号：Ｓ７０２０；５ｍＭ  ＤＭＳＯ溶液）を使用した。ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒＴＭ  Ｄｅｖｉｃｅ（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ＩＩ、Ｌｏｎｚａ）を用いてＫＨＹＧ−１細胞において高い細胞生存率で最大９０％のトランスフェクション効率を達成するために、ＬｏｎｚａからのＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒＴＭ  Ｋｉｔ  Ｔを使用した。ヌクレオフェクション後の培養には、１０％ＦＢＳ、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、およびＩＬ−２（１０ｎｇ／ｍＬ）を含む抗生物質非含有ＲＰＭＩ  １６４０を使用した。
【０１４７】
細胞は対数増殖期になければならないので、ＫＨＹＧ−１およびＮＫ−９２細胞をヌクレオフェクションの１または２日前に継代した。Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液を室温に予め温め（サンプル当たり１００μｌ）、血清および補充物を含む培地のアリコートと共に５０ｍＬ管中で３７℃においた。血清および補充物を含有する１．５ｍＬの培養培地を充填することによって６ウェルプレートを調製し、そして加湿した３７℃／５％ＣＯ２インキュベーター中でプレインキュベートした。細胞培養物のアリコートを調製し、細胞密度を決定するために細胞を数えた。上清を完全に捨てる前に、必要な数の細胞を１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。細胞ペレットを室温のＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液に２×１０６細胞／１００μｌの最終濃度になるように再懸濁した（最長懸濁時間＝２０分）。１００μｌの細胞懸濁液を１０μｇのｍＲＮＡ（１０μＬ未満のＲＮＡ量）と混合した。サンプルをＡｍａｘａ認定キュベットに移した（サンプルがキュベットの底を覆っていることを確認し、気泡を避ける）。適切なＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒプログラムを選択した（すなわち、ＫＨＹＧ−１細胞についてはＵ−００１）。次いでキュベットをキュベットホルダーに挿入した。５００μｌの予熱した培地をキュベットに添加し、そして細胞への損傷を避けるために、プログラムが終了した直後に、調製した６ウェルプレートにサンプルを移した。細胞を加湿した３７℃／５％ＣＯ２インキュベーター中でインキュベートした。フローサイトメトリー分析および細胞傷害性アッセイをエレクトロポレーションの１２〜１６時間後に行った。フローサイトメトリー染色を上記のように行った。図１３および１４に見られるように、ＴＲＡＩＬ／ＴＲＡＩＬ改変体およびＣＤ１０７ａ（ＮＫ活性化マーカー）の発現はトランスフェクション後に増加し、ＴＲＡＩＬ遺伝子のＫＨＹＧ−１細胞へのノックインの成功を確認した。
【０１４８】
図１５は、エレクトロポレーションによるトランスフェクションの前および後のＫＨＹＧ−１細胞生存率の証拠を提供する。ＴＲＡＩＬ／ＴＲＡＩＬ改変体による細胞のトランスフェクション後の細胞生存率に統計的に有意な差が観察されないことが分かる。このことは、野生型または改変体ＴＲＡＩＬの発現が細胞に対して毒性がないことを確認する。この観察は、ＮＫ−９２細胞における対応する知見（これは、ＴＲＡＩＬ改変体遺伝子ノックインが細胞に対して傷害性であることを示唆する（データは示さず））と矛盾する。それにもかかわらず、これは、ＮＫ−９２細胞表面上のＴＲＡＩＬ受容体ＤＲ４およびＤＲ５の比較的高い発現レベルによって説明される可能性が高い（図１６参照）。
【０１４９】
（ＫＨＹＧ−１細胞の細胞傷害性に対するＴＲＡＩＬ／ＴＲＡＩＬ改変体の効果）
マウス抗ヒトＣＤ２−ＡＰＣ抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎカタログ番号：５６０６４２）を使用した。アネキシンＶ−ＦＩＴＣ抗体（ＩｍｍｕｎｏＴｏｏｌｓカタログ番号：３１４９００１３）を使用した。ＤＮＡ色素ＳＹＴＯＸ−Ｇｒｅｅｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号：Ｓ７０２０）を使用した。２４ウェル細胞培養プレート（ＳＡＲＳＴＥＤＴ  ＡＧカタログ番号：８３．３９２２）を使用した。骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２、多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ８２２６およびＭＭ１．Ｓを標的細胞として使用した。Ｋ５６２、ＲＰＭＩ８２２６、ＭＭ１．Ｓを、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよびペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）／ストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍＬ）を含有するＲＰＭＩ  １６４０培地中で培養した。上記で説明したように、ＫＨＹＧ−１細胞をＴＲＡＩＬ／ＴＲＡＩＬ改変体でトランスフェクトした。標的細胞を洗浄し、１５００ｒｐｍで５分間の遠心分離によりペレット化した。トランスフェクトしたＫＨＹＧ−１細胞を０．５×１０６／ｍＬに希釈した。次いで、標的細胞密度を、１：１のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比を生成するために、予め温めたＲＰＭＩ  １６４０培地中で調整した。次いで、０．５ｍＬのＫＨＹＧ−１細胞および０．５ｍＬの標的細胞を２４ウェル培養プレート中で混合し、そして加湿した３７℃／５％ＣＯ２インキュベーター中に１２時間置いた。次にフローサイトメトリー分析を用いてＫＨＹＧ−１細胞の細胞傷害性をアッセイした。共培養細胞（異なる時点で）を洗浄し、次いでアネキシンＶ結合緩衝液を用いてＣＤ２−ＡＰＣ抗体（５μＬ／試験）、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ（５μＬ／試験）およびＳＹＴＯＸ−Ｇｒｅｅｎ（５μＬ／試験）で染色した。ＦｌｏｗＪｏ  ７．６．２ソフトウェアを用いてデータをさらに分析した。ＣＤ２陽性およびＣＤ２陰性ゲートを設定した。これらはそれぞれＫＨＹＧ−１細胞および標的細胞集団を表す。次いで、ＣＤ２陰性集団中のアネキシンＶ−ＦＩＴＣおよびＳＹＴＯＸ−Ｇｒｅｅｎ陽性細胞をＴＲＡＩＬ誘導アポトーシスについて分析した。
【０１５０】
図１７、１８および１９は、３つの標的細胞株：Ｋ５６２（図１７）、ＲＰＭＩ８２２６（図１８）およびＭＭ１．Ｓ（図１９）についてのアポトーシスに対するＴＲＡＩＬまたはＴＲＡＩＬ改変体を発現する両方のＫＨＹＧ−１細胞の効果を示す。全ての標的細胞集団にとって、ＫＨＹＧ−１細胞上のＴＲＡＩＬ発現が、正常なＫＨＹＧ−１細胞（ＴＲＡＩＬでトランスフェクトされていない）と比較した場合、アポトーシスのレベルを増加させたことは明らかである。さらに、ＫＨＹＧ−１細胞上のＴＲＡＩＬ改変体発現は、野生型ＴＲＡＩＬをトランスフェクトしたＫＨＹＧ−１細胞と比較した場合、全ての標的細胞株においてアポトーシスをさらに増加させた。
【０１５１】
ＴＲＡＩＬ改変体を発現する本発明の細胞は、細胞死受容体ＤＲ５に対してより高い親和性を示すことから、癌療法において有意な利点を提供する。本発明のこれらの細胞によって攻撃されると、癌細胞は、特定の経路を介して死を回避するための防御的戦略の進展を妨げられる。したがって、本発明の細胞はそれらがそのような状況において細胞傷害性を維持するように改変されるので、癌はＴＲＡＩＬデコイ受容体をアップレギュレートすることによってＴＲＡＩＬ誘導性細胞死を効果的に回避することはできない。
【０１５２】
（実施例１３：ノックインされたＴＲＡＩＬ改変体を有するＮＫ細胞を用いた血液癌治療のためのプロトコル）
実施例６で上述したように、ＫＨＹＧ−１細胞をＴＲＡＩＬ改変体でトランスフェクトした。以下のプロトコルを、血液癌を有する患者の治療に使用するために開発した。
【０１５３】
本発明で適切に治療された癌を有する患者の診断に続いて、ＤＲ５誘導剤（例えば、ボルテゾミブ）は、改変ＮＫ細胞の投与前に投与され、それ故、癌におけるＤＲ５の発現をアップレギュレートするために低用量で使用され、改変ＮＫ細胞療法をより効果的にする。次いで、改変ＮＫ細胞のアリコートを解凍し、培養し、そして患者に投与する。治療に使用されるＮＫ細胞によって発現されるＴＲＡＩＬ改変体は野生型ＴＲＡＩＬよりもデコイ受容体に対する親和性が低いため、癌細胞表面上の細胞死受容体の結合が増加し、したがって結果として癌細胞アポトーシスが増加する。上記のプロトコルを実施する前の別の選択肢は、癌を生検し、癌細胞をエクスビボで培養することである。このステップは、ＤＲ５誘導剤が所与の患者に適切であるかどうかを判定するのを助けるために、特に高レベルのデコイ受容体、および／または低レベルの細胞死受容体を発現する癌を同定するために使用され得る。このステップはまた、上記のプロトコルによる治療中に実行され得る。所与の癌は、例えば、ＤＲ５の発現を減少させるように適応することが可能であり得るので、治療の途中でＤＲ５誘導剤による治療が適切となり得る。
【０１５４】
（実施例１４：ＮＫ細胞ＴＲＡＩＬ媒介細胞傷害性に対するプロテアソーム阻害の効果）
ボルテゾミブ（Ｂｔ）は、多発性骨髄腫（ＭＭ）の治療に有用なプロテアソーム阻害剤（化学療法様薬物）である。ボルテゾミブは、ＭＭ細胞を含むいくつかの異なる種類の癌細胞上でＤＲ５発現をアップレギュレートすることが知られている。ボルテゾミブへの曝露の有無にかかわらずＭＭ細胞を標的化するために使用する前に、実施例１２に上記したように、ＫＨＹＧ−１細胞をＴＲＡＩＬ改変体でトランスフェクトした。
【０１５５】
（ボルテゾミブ誘発ＤＲ５発現）
ボルテゾミブをＭｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓから購入した。マウス抗ヒトＤＲ５−ＡＦ６４７（カタログ番号：５６５４９８）をＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから購入した。染色した細胞サンプルをＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩで分析した。プロトコルは以下を含んだ：（１）ＭＭ細胞株ＲＰＭＩ８２２６およびＭＭ１．Ｓを、５％ＣＯ２雰囲気中、３７℃にて、２ｍＭのＬ−グルタミン、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２４ｍＭの重炭酸ナトリウム、０．０１％の抗生物質および１０％ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）中で増殖させた。（２）ＭＭ細胞を１×１０６／ｍＬ、２ｍＬ／ウェルで６ウェルプレートに播種した。（３）次いで、ＭＭ細胞を異なる用量のボルテゾミブで２４時間処理した。（４）ボルテゾミブ処理／未処理ＭＭ細胞におけるＤＲ５発現をフローサイトメトリーにより分析した（図２０）。図２０に示されるように、低用量ボルテゾミブ処置は、両方のＭＭ細胞株においてＤＲ５発現を増加させることが見出された：ＲＰＭＩ  ８２２６細胞では（上）、１０ｎｍボルテゾミブを用いて、ＭＦＩが２７３から６７９になり、ＭＭ１．Ｓ細胞では（下）、２．５ｎｍのボルテゾミブを用いて、ＭＦＩが２１４から６６２になった。ＤＲ５のアップレギュレーションは、アポトーシスのわずかな誘導と関連していた（データは示さず）。しかし、毒性が高いため、ＤＲ５発現は高用量のボルテゾミブではアップレギュレートできず、その結果ほとんどのＭＭ細胞が死滅することがわかった。
【０１５６】
（癌細胞のボルテゾミブ誘導感作）
実施例１２で上述したように、ＫＨＹＧ−１細胞にＴＲＡＩＬ改変体（ＴＲＡＩＬ  Ｄ２６９Ｈ／Ｅ１９５Ｒ）をトランスフェクトした。プロトコルは以下のステップを含んだ（１）ボルテゾミブ処理／未処理ＭＭ１．Ｓ細胞を標的細胞として使用した。ＭＭ１．Ｓ細胞を２．５ｎＭのボルテゾミブ（右列）またはビヒクル（左列）で２４時間処理した。（２）ＴＲＡＩＬ改変体ｍＲＮＡのエレクトロポレーションの６時間後に、ＫＨＹＧ−１細胞を１２ウェルプレート中でＭＭ細胞と共に培養した。洗浄後、細胞濃度を１×１０６／ｍＬに調整した後、ＫＨＹＧ−１細胞とＭＭ１．Ｓ細胞を培養物に対して１：１の比率で混合し、１２時間培養した。（３）ＫＨＹＧ−１細胞の細胞傷害性のフローサイトメトリー分析を行った。共培養細胞を集め、洗浄し、そして次にアネキシンＶ結合緩衝液を用いてＣＤ２−ＡＰＣ抗体（５μＬ／試験）、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ（５μＬ／試験）およびＳＹＴＯＸ−Ｇｒｅｅｎ（５μＬ／試験）で染色した。（４）ＦｌｏｗＪｏ  ７．６．２ソフトウェアを用いてデータをさらに分析した。ＣＤ２陰性集団はＭＭ１．Ｓ細胞を表す。ＫＨＹＧ−１細胞はＣＤ２に対し強い陽性である。最後に、ＣＤ２陰性集団におけるアネキシンＶ−ＦＩＴＣおよびＳＹＴＯＸ−Ｇｒｅｅｎ陽性細胞を分析した。アポトーシスのフローサイトメトリー分析を、ＴＲＡＩＬ改変体を用いて／用いずにエレクトロポレーションしたＫＨＹＧ−１細胞と共培養したボルテゾミブ前処理／未処理ＭＭ１．Ｓ細胞において行った。図２１に示すように、ボルテゾミブは、ＴＲＡＩＬ改変体を発現するＫＨＹＧ−１細胞に対するＭＭ細胞の感受性（４７．９％殺傷から７０．５％殺傷）を、野生型ＴＲＡＩＬを発現する細胞（４１．８％殺傷から５１．４％殺傷）に対してはるかに高い程度に誘導した。したがって、データは、ＤＲ５発現を誘導した薬剤が、モデルにおいて癌細胞に対する細胞傷害性を増大させるのに有効であり、それ故に本発明の癌治療を増強するのに有用であり得ることを示した。
【０１５７】
（実施例１５：ＣＡＲ構築物の生成）
可変重鎖および軽鎖コード領域をｐｃＤＮＡ３．３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベースのベクターｐ３３Ｇ１ｆおよびｐ３３Ｋａｐｐａにそれぞれクローニングした。全ての低親和性抗体は、以前に記載されているように（Ｖｉｎｋら、２０１４）、２９３ｆｅｃｔｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＨＥＫ２９３Ｆ細胞において高親和性ＣＤ３８抗体（ＷＯ２０１１１５４４５３およびＷＯ２００６０９９８７５に記載）由来の重鎖（配列番号１）およびランダム生殖細胞株軽鎖発現ベクター由来の軽鎖を個々に同時トランスフェクトすることによって、無血清条件下で作製した。無細胞上清を回収し、抗体濃度をＯｃｔｅｔ  ＩｇＧ定量化（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）によって決定した。この軽鎖交換は、ダラツムマブと比較して、ＣＤ３８に対する親和性が低減した抗体（この場合はｓｃＦｖ）をもたらす。
【０１５８】
親和性を測定し、Ｏｃｔｅｔ  ＨＴＸ装置（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）のバイオレイヤー干渉法を用いてランク付けした。抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ捕捉バイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）に、ＣＤ３８に対する異なる重鎖および軽鎖の組み合わせを含む１型ヒトＩｇＧ（ｈＩｇＧ１）を１，０００秒間ロードした。ベースライン（１００秒）の後、Ｓａｍｐｌｅ  Ｄｉｌｕｅｎｔ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）中のＮ末端Ｈｉｓタグ付きＣＤ３８（Ｈｉｓ−ＣＤ３８、１００ｎＭ）の細胞外ドメインの結合（１，０００秒）および解離（１，０００秒）を決定した。計算のために、アミノ酸配列に基づくＨｉｓ−ＣＤ３８の理論分子量、すなわち３０．５ｋＤａを使用した。実験を、１，０００ｒｐｍ、３０℃で振とうしながら行った。１：１モデルおよび局所完全適合を使用し、１，０００秒の結合時間および２５０秒の解離時間で、データ分析ソフトウェアｖ８．０（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）でデータを分析した。データトレースは、ＩｇＧ１−３００３−０２８ＷＴを装填しサンプル希釈剤のみとインキュベートした４つの参照バイオセンサーの平均を差し引くことによって補正した。ｙ軸をベースラインの最後の５秒間に合わせ、ステップ間補正とＳａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙフィルタリングを適用した。
【０１５９】
Ｔｅｃａｎ  Ｅｖｏ  ２００リキッドハンドラーを使用して、ヒトＣＤ３８特異的抗体についての均質結合アッセイを１，５３６ウェルマイクロタイタープレート中で用量反応的に実施した。ヒトＣＤ３８を一過性に発現するＣＨＯ細胞、ＣＨＯ  ｗｔバックグラウンド対照、および精製ビオチン化ヒスチジンタグ化ヒトＣＤ３８でコーティングしたストレプトアビジンビーズへのＩｇＧ１抗体の結合を、二次ポリクローナルヤギＩｇＧ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７コンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で検出した。並行して、精製ビオチン化ｈｉｓタグ化ヒトＣＤ３８でコーティングしたストレプトアビジンビーズへのＩｇＧ１抗体の結合もまた、一価二次ヤギＦａｂ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＤｙＬｉｇｈｔ  ６４９コンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を用いて評価した。ＩｇＧ１サンプルを標準化し、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３発現培地（ＧＩＢＣＯ）で希釈した。２ｍＬの希釈サンプルを、それぞれ２００ｎｇ／ｍＬのＩｇＧコンジュゲートまたは３００ｎｇ／ｍＬのＦａｂコンジュゲートの二次コンジュゲートを含有する５ｍＬの細胞懸濁液またはビーズ懸濁液に添加した。細胞懸濁液をＦＭＡＴ緩衝液（ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、および０．０２％アジ化ナトリウム）＋０．０７５％プルロニックＦ−６８中で調製した。ビーズ懸濁液をＨＢＢ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．４］、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．５％ＢＳＡ、および０．０１％アジ化ナトリウム＋０．０７５％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８）中で調製した。暗所で室温（ＲＴ）で８時間インキュベートした後、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ８２００  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、５０カウントカットオフ値を適用して蛍光シグナルを記録した。得られた全蛍光強度データを処理し、ＡｃｔｉｖｉｔｙＢａｓｅソフトウェア（ＩＤＢＳ）を用いて可視化した。
【０１６０】
選択された可変軽鎖Ｂ１（配列番号２３）および可変重鎖（配列番号１）を、相同性アームを含むプライマー（配列番号８〜２２）を用いたＰＣＲを用いて増幅し、そしてＧｉｂｓｏｎアセンブリ（ＮＥＢ）を用いて両方の鎖をＧ４Ｓリンカーと連結させて組み合わせた。Ｚｈａｏら（２０１５）にＴ細胞について記載されているように、生成されたｓｃＦｖをＳＦＧレトロウイルスベクターにクローニングし、続いてＣＤ８ａ膜貫通ドメインおよび下記の共刺激ドメインの１つにクローニングした。ＣＡＲ構築物を２Ａ配列によって短縮型ＮＧＦＲまたはｄｓＲｅｄ配列に連結した（Ｋｉｍら、２０１１）。
【０１６１】
（実施例１６：レトロウイルス粒子の生成）
Ｐｈｏｅｎｉｘ−Ａｍｐｈｏパッケージング細胞を、ＣＡＲ構築物、ｇａｇ−ｐｏｌ（ｐＨＩＴ６０）、およびエンベロープ（ｐＣＯＬＴ−ＧＡＬＶ）ベクター（Ｒｏｃｈｅ）を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後および３日後に、レトロウイルス粒子を含む無細胞上清を回収し、直接形質導入に使用した。
【０１６２】
ＫＨＹＧ−１細胞を、レトロネクチン（Ｔａｋａｒａ）被覆プレート上でのスピノキュレーションを用いてレトロウイルス形質導入した。１６時間後に２回目の形質導入を行った。形質導入の７２時間後に、ＣＤ３８発現をフローサイトメトリーによって決定した。形質導入したＫＨＹＧ−１細胞を培養した。１週間後、ＣＡＲ形質導入ＮＫ細胞を照射（５Ｇｙ）ＵＭ９細胞（エフェクター対標的［Ｅ：Ｔ］比１：３）で刺激するかまたは機能的に試験した。
【０１６３】
（実施例１７：ＭＭ患者および健康な個体由来の初代細胞）
５％〜４０％の悪性形質細胞を含むＢＭ単核細胞（ＭＮＣ）を、ＭＭ患者のＢＭ吸引液からフィコール−パック密度遠心分離によって単離し、直接使用するかまたは使用するまで液体窒素中で凍結保存した。ＰＢＭＣ／ＭＮＣは、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ密度遠心分離によって健康な血液バンクドナーのＢｕｆｆｙコートから単離された。全ての初代サンプルは、インフォームドコンセントおよび医療倫理委員会による承認の後に得た。
【０１６４】
（実施例１８：ＣＤ３８−ＣＡＲ発現ＮＫ細胞の増強された細胞傷害性）
ＣＤ３８に対する低親和性キメラ抗原受容体（ＣＤ３８−ＣＡＲ）を含むまたは含まないＫＨＹＧ−１細胞を異なるエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比でＵＭ９細胞と共培養した。ＣＤ３８−ＣＡＲ  ＫＨＹＧ−１細胞の３つの改変体を試験した：ＢＢｚ  Ｂ１、２８ｚ  Ｂ１および２８ｚ  ＢＢＬ  Ｂ１。これらの改変体は、共刺激ドメイン４１ＢＢ−ＣＤ３ζ、ＣＤ２８−ＣＤ３ζおよびＣＤ２８／４−１ＢＢプラスリガンドにそれぞれ対応する（４１ＢＢ＝配列番号４２；ＣＤ３ζ＝配列番号４１；およびＣＤ２８＝配列番号４３）。
【０１６５】
細胞傷害性を、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒからのＤＥＬＦＩＡ  ＥｕＴＤＡ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｔｙｅｌｌ  Ｋｉｔ（カタログ番号：ＡＤ０１１６）を使用して、共培養の４時間後に測定した。標的細胞ＵＭ９を、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび抗生物質を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地中で培養した。９６ウェルＶ底プレート（カタログ番号：８３．３９２６）をＳＡＲＳＴＥＤＴから購入した。エッペンドルフ遠心分離機５８１０Ｒ（プレートローター付き）を用いてプレートを回転させた。ＶＡＲＩＯＳＫＡＮ  ＦＬＡＳＨ（ＳｃａｎＩｔソフトウェア２．４．３を含む）を使用して、溶解したＵＭ９細胞によって生成された蛍光シグナルを測定した。ＵＭ９細胞を培地で洗浄し、細胞数を培地で１×１０６細胞／ｍＬに調整した。２〜４ｍＬの細胞を５μｌのＢＡＴＤＡ試薬に添加し、そして３７℃で１０分間インキュベートした。細胞内で、エステル結合は加水分解されて親水性リガンドを形成し、これはもはや膜を通過しない。細胞を１５００ｒｐｍで５分間遠心分離して、ロードしたＵＭ９細胞を洗浄した。１ｍＭのプロベネシド（Ｓｉｇｍａ  Ｐ８７６１）を含有する培地を用いてこれを３〜５回繰り返した。最後の洗浄後、細胞ペレットを培地に再懸濁し、そして約５×１０４細胞／ｍＬに調整した。バックグラウンド、自然放出および最大放出の検出のためにウェルを準備した。１００μＬのロードした標的細胞（５，０００細胞）をＶ底プレートのウェルに移し、１００μＬのエフェクター細胞（ＫＨＹＧ−１細胞）を様々な細胞濃度で添加して、０．５：１から２：１までの範囲のＥ：Ｔ比を得た。プレートを１００×ｇで１分間遠心分離し、そして３７℃の加湿５％ＣＯ２雰囲気中で４時間インキュベートした。最大放出ウェルについては、培地を回収する１５分前に１０μＬの溶解緩衝液を各ウェルに添加した。プレートを５００×ｇで５分間遠心した。２０μＬの上清を平底９６ウェルプレートに移し、２００μＬの予熱したユーロピウム溶液を加えた。これをプレートシェーカーを用いて室温で１５分間インキュベートした。ＵＭ９細胞はＫＨＹＧ−１細胞によって溶解されるので、それらは培地にリガンドを放出する。このリガンドは次にユウロピウム溶液と反応し、溶解細胞の量と直接相関する蛍光キレートを形成する。次に、ＶＡＲＩＯＳＫＡＮ  ＦＬＡＳＨを用いて時間分解蛍光光度計で蛍光を測定した。以下の式を用いて比放出を計算した：比放出＝実験放出−自然放出／最大放出−自然放出。Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６．０４ソフトウェアを用いて統計分析を行った。対応のあるｔ検定を使用して、ＣＤ３８−ＣＡＲ  ＫＨＹＧ−１細胞と対照群との間の差を比較した。
【０１６６】
（生物発光イメージングに基づく細胞傷害性アッセイ）
ＣＤ３８によるＬｕｃ−ＧＦＰ形質導入ヒト悪性細胞株の溶解を決定すること。
【０１６７】
形質導入の７〜１０日後のＣＡＲ  ＮＫ細胞、モックまたはＣＤ３８−ＣＡＲ  ＮＫ細胞の段階希釈液を悪性細胞株と共インキュベートした。１６〜２４時間後、生残悪性細胞によって生成されたルシフェラーゼシグナルを、１２５ｍｇ／ｍＬのカブトムシルシフェリン（Ｐｒｏｍｅｇａ）の添加後１５分以内にＧｌｏＭａｘ  ９６  Ｍｉｃｒｏ−ｐｌａｔｅ  Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。溶解細胞％＝１（処理ウェル中の生物発光イメージング［ＢＬＩ］シグナル／未処理ウェル中のＢＬＩシグナル）１００％。
【０１６８】
細胞の約５０％のみが形質導入に成功したにもかかわらず、ＣＤ３８−ＣＡＲ  ＫＨＹＧ−１細胞を含有する共培養物において、比放出が有意に増加することが見出された。これは、Ｅ：Ｔ比が０．５：１でＣＤ３８−ＣＡＲ  ＫＨＹＧ−１細胞を４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ共刺激ドメインと共に用いた場合を除いて、全てのＥ：Ｔ比でそうであった（図２２参照）。ＣＤ３８−ＣＡＲを保有するエフェクター細胞のより高純度のサンプルにおいて、より強力な細胞傷害性効果が予想され得る。蛍光は細胞溶解と直接相関するので、ＫＨＹＧ−１細胞におけるＣＤ３８−ＣＡＲ発現はＵＭ９癌標的細胞を殺傷するそれらの能力の増加をもたらすことが確認された。
【０１６９】
（フローサイトメトリーに基づく細胞傷害性アッセイ）
形質導入の７〜１０日後、ＣＤ３８−ＣＡＲ−ＫＨＹＧ−１細胞の段階希釈物をＶｉｏｌｅｔトレーサー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）で標識したＢＭ−ＭＮＣまたはＰＢＭＣと共に１４時間インキュベートした。フローカウントフルオロスフェア（Ｂｅｃｋｍａｎ  ７５４７０５３）を添加した後、細胞を採取し、ＣＤ３８および／またはＣＤ１３８について染色した。次いで生存細胞をフローカウント均等化測定により定量的に分析した。分析された標的細胞集団が未処理サンプル中に５００個を超える生存細胞を含んでいた場合に限り、細胞溶解百分率を以下のように計算した：溶解細胞％＝１（処理ウェル中の生存標的細胞の絶対数／未処理ウェル中の生存標的細胞の絶対数）１００％。
【０１７０】
２つのタイプのゲートを用いて初代ＭＭ細胞を分析した：非常に明るいＣＤ１３８＋／ＣＤ３８＋細胞対全てのＣＤ１３８＋／ＣＤ３８細胞（図２５および２６参照）。サブセット間の結果では、差異は最小であり、有意ではなかった。初代ＭＭ細胞はＣＤ３８−ＣＡＲ−ＫＨＹＧ−１誘導細胞死に対して感受性があった。図２３および２４に見られるように、ＣＤ２８−ＣＤ３ゼータを含有するＣＡＲを使用した場合（２８ｚＢ１）、初代ＭＭ細胞の最も顕著な殺傷が観察された。ＣＤ３８＋／ＣＤ１３８−細胞（正常な非悪性ＣＤ３８発現細胞）の殺傷は、最小限であるかまたは全く観察されなかった（図２５および２６参照）。それ故、この細胞は、ＣＡＲ−ＮＫ細胞によって標的とされないようであった。
【０１７１】
したがって、「低親和性」ＣＤ３８  ＣＡＲ−ＮＫ細胞は、ＣＤ３８を発現する正常な非悪性細胞において有害なオンターゲットオフ癌効果を引き起こすことなく、ＣＤ３８発現癌細胞を標的として殺傷する能力を有することが示された。
【０１７２】
本明細書では本発明の好ましい実施形態を示し説明してきたが、そのような実施形態は例としてのみ提供されていることは当業者には明らかである。本発明から逸脱することなく、多数の変形、変更、および置換が当業者に生じ得る。本明細書中に記載された本発明の実施形態に対する様々な代替物が本発明を実施する際に使用され得ることを理解されたい。
【０１７３】
【表２】
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【０１７４】
【表３】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年8月3日(2018.8.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ３８発現癌の治療に使用するための、ＣＤ３８に対するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞であって、該ＣＡＲが、ＣＤ３８に対してダラツムマブの親和性よりも少なくとも２５％低いＣＤ３８に対する親和性を有する、使用するためのＮＫ細胞。
【請求項２】
前記ＮＫ細胞がＥ−セレクチンリガンドを発現する、請求項１に記載の使用するためのＮＫ細胞。
【請求項３】
前記ＮＫ細胞がＨＥＣＡ−４５２抗体を結合する、請求項１または２に記載の使用するためのＮＫ細胞。
【請求項４】
前記ＮＫ細胞がＫＨＹＧ−１細胞である、先行する請求項のいずれかに記載の使用するためのＮＫ細胞。
【請求項５】
前記ＣＤ３８  ＣＡＲ発現ＮＫ細胞が、ＣＤ３８発現癌細胞に対するそれらの親和性と比較して、ＣＤ３８を発現する正常（非悪性）細胞に対して減少した親和性を有する、先行する請求項のいずれかに記載の使用するためのＮＫ細胞。
【請求項６】
前記ＣＤ３８発現癌が血液癌である、先行する請求項のいずれかに記載の使用するためのＮＫ細胞。
【請求項７】
前記ＣＤ３８発現癌が多発性骨髄腫（ＭＭ）である、先行する請求項のいずれかに記載の使用するためのＮＫ細胞。
【請求項８】
前記ＣＤ３８  ＣＡＲが、配列番号１または配列番号７を含む重鎖可変領域を含む、先行する請求項のいずれかに記載の使用するためのＮＫ細胞。
【請求項９】
前記ＣＤ３８  ＣＡＲが、配列番号２９、３０および３１中の重鎖ＣＤＲの１つまたはそれ以上あるいは全てを含む、先行する請求項のいずれかに記載の使用するためのＮＫ細胞。
【請求項１０】
前記ＣＤ３８  ＣＡＲが、配列番号３２、３３および３４中の重鎖ＣＤＲの１つまたはそれ以上あるいは全てを含む、先行する請求項のいずれかに記載の使用するためのＮＫ細胞。
【請求項１１】
前記ＣＤ３８  ＣＡＲが、配列番号２３または配列番号２８を含む軽鎖可変領域を含む、先行する請求項のいずれかに記載の使用のためのＮＫ細胞。
【請求項１２】
前記ＣＤ３８  ＣＡＲが、配列番号３５、３６および３７中の軽鎖ＣＤＲの１つまたはそれ以上あるいは全てを含む、先行する請求項のいずれかに記載の使用するためのＮＫ細胞。
【請求項１３】
前記ＣＤ３８  ＣＡＲが、配列番号３８、３９および４０中の軽鎖ＣＤＲの１つまたはそれ以上あるいは全てを含む、先行する請求項のいずれかに記載の使用するためのＮＫ細胞。
【請求項１４】
前記ＣＤ３８  ＣＡＲが、配列番号４１、配列番号４２および配列番号４３から選択される１つまたはそれ以上の共刺激ドメインを含む、先行する請求項のいずれかに記載の使用するためのＮＫ細胞。
【請求項１５】
前記ＮＫ細胞が、野生型ＴＲＡＩＬと比べて、ＴＲＡＩＬ細胞死受容体に対して増大した親和性を有するＴＲＡＩＬ改変体を発現するように改変されている、先行する請求項のいずれかに記載の使用するためのＮＫ細胞。
【請求項１６】
ＣＤ３８に対するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を患者に投与することにより、ＣＤ３８発現癌を治療する方法であって、該ＣＡＲが、ＣＤ３８に対してダラツムマブの親和性よりも少なくとも２５％低いＣＤ３８に対する親和性を有する、方法。
【請求項１７】
前記ＮＫ細胞がＥ−セレクチンリガンドを発現する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＮＫ細胞がＨＥＣＡ−４５２抗体に結合する、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＮＫ細胞がＫＨＹＧ−１細胞である、請求項１６から１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記癌が血液癌である、請求項１６から１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記ＣＤ３８発現癌が多発性骨髄腫（ＭＭ）である、請求項１６から２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記ＣＤ３８  ＣＡＲが、配列番号１または配列番号７を含む重鎖可変領域を含む、請求項１６から２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記ＣＤ３８  ＣＡＲが、配列番号２９、３０および３１中の重鎖ＣＤＲの１つまたはそれ以上あるいは全てを含む、請求項１６から２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記ＣＤ３８  ＣＡＲが、配列番号３２、３３、および３４中の重鎖ＣＤＲの１つまたはそれ以上あるいは全てを含む、請求項１６から２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記ＣＤ３８  ＣＡＲが、配列番号２３または配列番号２８を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１６から２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記ＣＤ３８  ＣＡＲが、配列番号３５、３６および３７中の軽鎖ＣＤＲの１つまたはそれ以上あるいは全てを含む、請求項１６から２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記ＣＤ３８  ＣＡＲが、配列番号３８、３９および４０中の軽鎖ＣＤＲの１つまたはそれ以上あるいは全てを含む、請求項１６から２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記ＣＤ３８  ＣＡＲが、配列番号４１、配列番号４２および配列番号４３から選択される１つまたはそれ以上の共刺激ドメインを含む、請求項１６から２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記ＮＫ細胞が、野生型ＴＲＡＩＬと比べて、ＴＲＡＩＬ細胞死受容体に対して増大した親和性を有するＴＲＡＩＬ改変体を発現するように改変されている、請求項１６から２８のいずれかに記載の方法。
【国際調査報告】
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