(57)【要約】本発明は、ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）および可溶性エポキシドヒドロラーゼ（ｓＥＨ）の新規二重調節剤に関する。本発明の調節剤は、ＦＸＲのアゴニストおよびｓＥＨの阻害剤（アンタゴニスト）としての二重活性を有する化合物を提供するために設計された。本発明はまた、ＦＸＲおよびｓＥＨに関連した疾患、例えば代謝障害、具体的には非アルコール性脂肪肝または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）に罹患している対象を治療するための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
2020524178.tif 000051
を有する化合物、またはその異性体、プロドラッグもしくは誘導体、またはこれらの化合物の薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物：
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４が、独立して、Ｈ、非置換、一置換または多置換のＣ１〜Ｃ１８アルキルまたはヘテロアルキル（ここでアルキルは直鎖、分岐、または環式である）、非置換、一置換または多置換のＣ１〜Ｃ１８アルケニルまたはヘテロアルケニル（ここでアルケニルは直鎖、分岐、または環式である）、非置換、一置換または多置換のアリールまたはヘテロアリール、非置換、一置換または多置換のベンジル基、アシル基、例えばホルミル、アセチル、トリクロロアセチル、フマリル、マレイル、スクシニル、ベンゾイル、または分岐した、ヘテロ原子で置換された、もしくはアリールで置換されたアシル基、糖または別のアセタール、およびスルホニル基から選択され、かつ／あるいはＲ２、Ｒ３および／またはＲ４が一緒になって、非置換、一置換または多置換の環、好ましくは芳香環を形成し、
Ｚが、任意の置換を有するかまたは有しないＣである。
【請求項２】
Ｒ２が、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、好ましくは分岐アルキル、より好ましくは−Ｃ（ＣＨ３）３であり、好ましくはＲ３が、Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＭｅであり、好ましくはＲ４が、Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＭｅである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ１が、一置換または多置換アリールである、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ１が、以下の群：
2020524178.tif 000052
のうちのいずれかから選択される、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ１が、
2020524178.tif 000053
からなる群から選択され、
ＺがＣであり、Ｒ２が−Ｃ（ＣＨ３）３であり、Ｒ３がＨである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ１が、
2020524178.tif 000054
からなる群から選択され、
ＺがＣであり、Ｒ３がＨまたはＯＨであり、Ｒ４がＨまたはＯＨであり、特にＲ３およびＲ４が両方ともＯＨであることはなく、Ｒ２が、−Ｃ（ＣＨ３）３、−Ｎ（ＣＨ３）２から選択されるか、またはＲ２が、以下の構造：
2020524178.tif 000055
のうちのいずれかである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）アゴニストおよび可溶性エポキシドヒドロラーゼ（ｓＥＨ）阻害剤である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
疾患の治療に使用するための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
前記疾患が、ＦＸＲおよびｓＥＨに関連した障害である、請求項８に記載の使用のための化合物。
【請求項１０】
前記疾患が、代謝障害、好ましくは高脂肪食によって引き起こされるかまたはそれに関連した代謝障害である、請求項８に記載の使用のための化合物。
【請求項１１】
前記疾患が、肝疾患、例えば非アルコール性脂肪性肝疾患または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物を生成するための方法。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物を、薬学的に許容される担体および／または賦形剤とともに含む、薬学的組成物。
【請求項１４】
ＦＸＲおよびｓＥＨの同時調節のための方法であって、請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物または請求項１３に記載の薬学的組成物を対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項１５】
前記対象が、疾患、好ましくは代謝疾患に罹患している、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記化合物を前記対象に投与することによって、前記対象の前記疾患を治療する方法である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
調節が、ＦＸＲの活性化およびｓＥＨの阻害である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
投与することが、治療有効量の前記化合物を前記対象に投与することを含む、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
対象における疾患を治療する方法であって、治療有効量の請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物または請求項１３に記載の薬学的組成物を前記対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項２０】
前記対象が、哺乳動物、好ましくはマウス、ラット、ロバ、ウマ、ネコ、イヌ、モルモット、サル、類人猿であるか、または好ましくはヒト患者である、請求項１４〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記疾患が、代謝障害、好ましくは高脂肪食によって引き起こされるかまたはそれに関連した代謝障害である、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記疾患が、肝疾患、例えば非アルコール性脂肪性肝疾患または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である、請求項１６〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）および可溶性エポキシドヒドロラーゼ（ｓＥＨ）の新規二重調節剤に関する。本発明の調節剤は、ＦＸＲのアゴニストおよびｓＥＨの阻害剤（アンタゴニスト）としての二重活性を有する化合物を提供するために設計された。本発明はまた、ＦＸＲおよびｓＥＨに関連した疾患、例えば代謝障害、具体的には非アルコール性脂肪肝または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）に罹患している対象を治療するための方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
説明
過栄養および座りがちの生活様式から生じる非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、特に西洋文化社会および世界中の成人にますます影響を及ぼしている。最近では、世界で最大３人に１人の成人がＮＡＦＬＤを有し、最大１５％が非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）に進行すると推定されている。最も驚くことに、最大１１％の青年がＮＡＦＬＤを患っていると考えられている。したがって、代謝症候群の肝臓における発現とみなされることの多いＮＡＦＬＤおよびＮＡＳＨの疾患群は、健康への深刻な脅威である。しかしながら、現在のＮＡＦＬＤ治療には限界があり、薬理学的オプションが不十分である。したがって、ＮＡＦＬＤおよびＮＡＳＨを治療するための新規の薬理学的介入が、緊急に必要とされている（Ｒｉｎｅｌｌａ，Ｍ．Ｅ．Ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ  Ｆａｔｔｙ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ：Ａ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｒｅｖｉｅｗ．ＪＡＭＡ  ２０１５，３１３（２２），２２６３−２２７３、Ｇａｗｒｉｅｈ，Ｓ．；Ｃｈａｌａｓａｎｉ，Ｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ  Ｆａｔｔｙ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ．Ｓｅｍｉｎ．Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓ．２０１５，３５（３），３３８−３４８、Ｃｈａｌａｓａｎｉ，Ｎ．；Ｙｏｕｎｏｓｓｉ，Ｚ．；Ｌａｖｉｎｅ，Ｊ．Ｅ．；Ｄｉｅｈｌ，Ａ．Ｍ．；Ｂｒｕｎｔ，Ｅ．Ｍ．；Ｃｕｓｉ，Ｋ．；Ｃｈａｒｌｔｏｎ，Ｍ．；Ｓａｎｙａｌ，Ａ．Ｊ．Ｔｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｎｏｎ−Ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  Ｆａｔｔｙ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，ａｎｄ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏ−ｌｏｇｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２０１２，５５（６），２００５−２０２３）。
【０００３】
インビボモデルおよび臨床試験により、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨの治療について治療可能性のあるいくつかの戦略が特定された。特に、内在性ＦＸＲアゴニストであるケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ、１ｂ）から開発されたオベチコール酸（６α−エチル−ＣＤＣＡ、ＯＣＡ、１ａ）が、ＮＡＳＨ治療における臨床効果を既に明らかにしているため（Ａｄｏｒｉｎｉ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｆａｒｎｅｓｏｉｄ  Ｘ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｏ  Ｔｒｅａｔ  Ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ  Ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ  ２０１２，１７（１７−１８），９８８−９９７、Ｎｅｕｓｃｈｗａｎｄｅｒ−Ｔｅｔｒｉ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ｆａｒｎｅｓｏｉｄ  Ｘ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｏｂｅｔｉｃｈｏｌｉｃ  Ａｃｉｄ  ｆｏｒ  Ｎｏｎ−Ｃｉｒｒｈｏｔｉｃ，Ｎｏｎ−Ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  Ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ（ＦＬＩＮＴ）：Ａ  Ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｒｅ，Ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ，Ｐｌａｃｅｂｏ−Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｔｒｉａｌ．Ｌａｎｃｅｔ  ２０１４，３８５（９９７２），９５６−９６５）、ファルネソイドＸ核内受容体（ＦＸＲ）（Ａｒａｂ，Ｊ．Ｐ．；Ｋａｒｐｅｎ，Ｓ．Ｊ．；Ｄａｗｓｏｎ，Ｐ．Ａ．；Ａｒｒｅｓｅ，Ｍ．；Ｔｒａｕｎｅｒ，Ｍ．Ｂｉｌｅ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ  Ｆａｔｔｙ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２０１７，６５（１），３５０−３６２）は、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨの治療法に対する非常に有望な標的であると思われる。ＦＸＲは、肝臓、腸および腎臓において主に見出されるリガンド活性化転写因子であり、胆汁酸によって生理学的に活性化される（Ｍａｋｉｓｈｉｍａ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｌｅ  Ａｃｉｄｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９９，２８４（５４１８），１３６２−１３６５、Ｐａｒｋｓ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｌｅ  Ａｃｉｄｓ：Ｎａｔｕｒａｌ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｆｏｒ  ａｎ  Ｏｒｐｈａｎ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９９，２８４（５４１８），１３６５−１３６８、Ｗａｎｇ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  Ｂｉｌｅ  Ａｃｉｄｓ  Ａｒｅ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＦＸＲ／ＢＡＲ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １９９９，３（５），５４３−５５３）。これは胆汁酸、脂質およびグルコースホメオスタシスに関与するいくつかの遺伝子を制御することによって代謝調節物質として作用し、蓄積する胆汁酸の毒性レベルを感知することによって重要な肝臓保護物質として作用する（Ｇａｄａｌｅｔａ，Ｒ．Ｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｉｓｓｕｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＦＸＲ  ｉｎ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ２０１４，１８５１，３０−３９、Ｐｅｌｌｉｃｃｉａｒｉ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ；Ｆａｒｎｅｓｏｉｄ  Ｘ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ：Ｆｒｏｍ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｔｏ  Ｐｏｔｅｎｔｉａ��  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２００５，４８（１７），５３８３−５４０３）。
【０００４】
臨床試験により、ＯＣＡ（１ａ）治療後のＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨの改善された組織学的特徴および臨床マーカー、ならびに改善された代謝パラメータが報告されており、これにより、ＦＸＲは脂肪肝障害および潜在的に他の代謝疾患を治療するための標的として確認された（Ｍｕｄａｌｉａｒ，Ｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｎｄ  Ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆａｒｎｅｓｏｉｄ  Ｘ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａｇｏｎｉｓｔ  Ｏｂｅｔｉｃｈｏｌｉｃ  Ａｃｉｄ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｔｙｐｅ  ２  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ａｎｄ  Ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ  Ｆａｔｔｙ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ２０１３，１４５（３），５７４−５８２．ｅ１）。しかしながら、ＦＸＲ活性化は、コレステロールの胆汁酸への代謝変換における律速酵素であるコレステロール７α−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ７Ａ１）の抑制につながるため、ＦＸＲの完全活性化は、望ましくないコレステロールの蓄積を引き起こし得る。１ｃなどの典型的なＦＸＲアゴニストよりも低い最大効能を有する部分的ＦＸＲアゴニズムが、コレステロールホメオスタシスを妨害することなくＦＸＲ活性化の望ましい効果を利用するための有望な概念であると思われる（Ｍｅｒｋ，Ｄ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｈｒａｎｉｌｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｓ  Ｎｏｖｅｌ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｆｏｒ  Ｆａｒｎｅｓｏｉｄ  Ｘ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＦＸＲ）．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１４，２２（８），２４４７−２４６０、Ｍｅｒｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｏｆ  Ａｎｔｈｒａｎｉｌｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  Ａｓ  Ｆａｒｎｅｓｏｉｄ  Ｘ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  Ｈｉｇｈｌｙ  Ｐｏｔｅｎｔ  Ｐａｒｔｉａｌ  Ｆａｒｎｅｓｏｉｄ  Ｘ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａｇｏｎｉｓｔ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１４，５７（１９），８０３５−８０５５、Ｍｅｒｋ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｆａｒｎｅｓｏｉｄ  Ｘ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｌｉｇａｎｄｓ：Ｆｒｏｍ  Ａｇｏｎｉｓｔｓ  ａｎｄ  Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ｔｏ  Ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ．Ｆｕｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１２，４（８），１０１５−１０３６）。
【０００５】
可溶性エポキシドヒドロラーゼ（ｓＥＨ）は、アラキドン酸代謝のＣＹＰ経路の下流酵素であり、また、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨおよび他の代謝疾患、例えば２型糖尿病の治療において有望である（Ｓｈｅｎ，Ｈ．Ｃ．；Ｈａｍｍｏｃｋ，Ｂ．Ｄ．Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｅｐｏｘｉｄｅ  Ｈｙｄｒｏｌａｓｅ：Ａ  Ｔａｒｇｅｔ  ｗｉｔｈ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１２，５５（５），１７８９−１８０８、Ｎｅｗｍａｎ，Ｊ．Ｗ．  ｅｔ  ａｌ；Ｅｐｏｘｉｄｅ  Ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ：Ｔｈｅｉｒ  Ｒｏｌｅｓ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｌｉｐｉｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｐｒｏｇ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．２００５，４４（１），１−５１、Ｉｍｉｇ，Ｊ．Ｄ．Ｅｐｏｘｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｅｐｏｘｉｄｅ  Ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｉｎ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．２０１２，９２（１），１０１−１３０、Ｈｕａｎｇ，Ｈ．；Ｗｅｎｇ，Ｊ．；Ｗａｎｇ，Ｍ．−Ｈ．ＥＥＴｓ／ｓＥＨ  ｉｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ａｎｄ  Ｏｂｅｓｉｔｙ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ  Ｏｔｈｅｒ  Ｌｉｐｉｄ  Ｍｅｄｉａｔ．２０１６，１２５，８０−８９）。これは、アラキドン酸からＣＹＰ酵素によって形成されたエポキシエイコサトリエン酸（ＥＥＴ）を、各ジヒドロキシエイコサトリエン酸（ＤＨＥＴ）に変換する。ＥＥＴは、強固な抗炎症活性を呈するため、ｓＥＨ阻害は、抗炎症戦略を構成する。ｓＥＨは、身体全体、特に心臓、肝臓および腎臓において高レベルで発現される。ＮＡＳＨのマウスモデルからの最近の結果は、ｓＥＨノックアウトまたは阻害が、高脂肪食下での肝脂肪蓄積および肝炎を低減することを明らかにした。
【０００６】
ＮＡＳＨは、２型糖尿病または肥満などの様々な危険因子に関連し、脂肪症、肝炎および線維症を含む多様な兆候を有する。したがって、いくつかの実験的戦略はＮＡＳＨにおける治療効果を明らかにし（Ｓａｎｙａｌ，Ａ．Ｊ．Ｎｏｖｅｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ｆｏｒ  Ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ．Ｃｌｉｎ．Ｒｅｓ．Ｈｅｐａｔｏｌ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２０１５，３９  Ｓｕｐｐｌ  １，Ｓ４６−５０、Ｍｉｌｉｃ，Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ  Ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ：Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ｔｏ  Ｏｐｔｉｍｉｚｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｏｐｔｉｏｎｓ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．Ｄｅｖｅｌ．Ｔｈｅｒ．２０１５，９，４８３５−４８４５．）、この多因子疾患に対して、その別個の病理学的因子を治療する複数の治療機序を用いて対抗することが妥当であると思われている。しかしながら、その結果として多数の薬物を用いる多剤療法は、不利益であり、例えば複雑かつ問題のある薬物間相互作用および追加の副作用をもたらす。多数の所望の治療機序に対応する多標的剤は、多剤薬理学の多くの欠点を回避することができる。
【０００７】
ＮＡＳＨの進行および脂質蓄積を低減することにおけるＦＸＲ活性化の臨床効果ならびにｓＥＨ阻害の肝臓への抗炎症効果および抗脂肪症効果に照らして、ＦＸＲおよびｓＥＨの二重調節は、相乗効果を生じ得る、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨを治療するための有望な戦略であると思われる。したがって、本発明の目的は、ＦＸＲに対する部分的アゴニスト活性およびｓＥＨに対する阻害能力を有する二重調節剤を提供することである。
【発明の概要】
【０００８】
上記の問題は、式Ｉ：
2020524178.tif 000002
を有する化合物、またはその異性体、ラセミ化合物、プロドラッグもしくは誘導体、またはこれらの化合物の薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物によって解決される：
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４が、独立して、Ｈ、非置換、一置換または多置換のＣ１〜Ｃ１８アルキルまたはヘテロアルキル（ここでアルキルは直鎖、分岐、または環式である）、非置換、一置換または多置換のＣ１〜Ｃ１８アルケニルまたはヘテロアルケニル（ここでアルケニルは直鎖、分岐、または環式である）、非置換、一置換または多置換のアリールまたはヘテロアリール、非置換、一置換または多置換のベンジル基、アシル基、例えばホルミル、アセチル、トリクロロアセチル、フマリル、マレイル、スクシニル、ベンゾイル、または分岐した、ヘテロ原子で置換された、もしくはアリールで置換されたアシル基、糖または別のアセタール、およびスルホニル基から選択され、かつ／あるいはＲ２、Ｒ３および／またはＲ４が一緒になって、非置換、一置換または多置換の環、好ましくは芳香環を形成し、
Ｚが、任意の置換を有するかまたは有しないＣ、好ましくはＨまたはアルキルで置換されたＣである。
【０００９】
いくつかの好ましい実施形態では、Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、好ましくは分岐アルキル、より好ましくは−Ｃ（ＣＨ３）３基であり、好ましくはＲ３は、Ｈ、−ＯＨまたはＯＭｅであり、好ましくはＲ４は、Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＭｅである。
【００１０】
別の好ましい実施形態では、化合物は、本明細書に開示される化合物４ａ、４ｂ、６、７、９、１４、１６、１９、２９、３３、３６、４２および４５を除く、上記の定義された化合物群である。この点において、本出願の実施例セクションにおいて表１〜８に開示される他の（上記を除く）化合物のうちのいずれか１つがさらに好ましい。いくつかの実施形態では、表８の化合物が好ましい。
【００１１】
好ましい一実施形態では、上記化合物中のＲ３およびＲ４は、Ｈである。
【００１２】
いくつかの実施形態では、Ｒ１は、式ＩＩ：
2020524178.tif 000003
を有する基であって、式中、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、独立して、Ｈ、非置換、一置換または多置換のＣ１〜Ｃ１８アルキルまたはヘテロアルキル（ここでアルキルは直鎖、分岐、または環式である）、非置換、一置換または多置換のＣ１〜Ｃ１８アルケニルまたはヘテロアルケニル（ここでアルケニルは直鎖、分岐、または環式である）、非置換、一置換または多置換のアリールまたはヘテロアリール、非置換、一置換または多置換のベンジル基、アシル基、例えばホルミル、アセチル、トリクロロアセチル、フマリル、マレイル、スクシニル、ベンゾイル、または分岐した、ヘテロ原子で置換された、もしくはアリールで置換されたアシル基、糖または別のアセタール、および非置換、一置換または多置換のアミドまたはスルホニル基から選択される。
【００１３】
好ましくは、Ｒ６およびＲ７は、Ｈまたはハロゲン、好ましくはＦまたはＣｌから選択されるハロゲンである。最も好ましくは、Ｒ６はＨであり、Ｒ７はＨ、ＦまたはＣｌである。
【００１４】
好ましくは、Ｒ５は、カルボン酸、またはテトラゾール、スルホンアミド、アミド（例えば有機アミド、スルホンアミドもしくはホスホルアミド）等を含むがこれらに限定されない典型的な生物学的等価体などの好適なカルボン酸代替物を含む、任意の長さの側鎖である。
【００１５】
本明細書で使用される場合、「生物学的等価体」という用語は、化学部分に関し、これはその生物活性に対して著しい影響を及ぼすことなく、活性化合物の分子中の別の部分に取って代わる。例えば、薬品としてのその安定性などの活性化合物の他の特性は、このようにして影響され得る。
【００１６】
カルボキシ（ＣＯＯＨ）基の生物学的等価体部分として、特に、窒素、酸素および硫黄から選択される１〜４個のヘテロ原子を有する５員複素環式基、例えば１，３，４−オキサジアゾリル、１，２，３−オキサジアゾリル、１，２，５−オキサジアゾリル、１，２，４−オキサジアゾリル、１，３，４−チアジアゾリル、１，２，４−チアジアゾリル、１，２，３−チアジアゾリル、１，２，５−チアジアゾリル、フリル、チエニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、イソキサゾリル、イソチアゾリルおよびＮ−置換テトラゾリル等を挙げることができる。５員複素環式基は、フェニル、ピリジニル、直鎖または分岐アルキル基、アミノ基、ヒドロキシ基、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、トリフルオロチオメトキシ、アルコキシおよびチオアルコキシを含む群から選択される１つまたは２つの置換基で置換されていてもよい。
【００１７】
また、カルボキシ（ＣＯＯＨ）基の生物学的等価体部分として、フェニル、ならびに、窒素、酸素および硫黄から選択される１〜４個のヘテロ原子を有する６員複素環式基、例えばピリジニル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、トリアジニル、テトラジニル等を挙げることができる。フェニルおよび６員複素環式基は、フェニル、ピリジニル、直鎖または分岐アルキル基、アミノ基、ヒドロキシ基、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、トリフルオロチオメトキシ、アルコキシおよびチオアルコキシを含む群から選択される１つまたは２つの置換基で置換されていてもよい。
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態では、Ｒ１は、以下の置換基のうちのいずれかから選択される。
2020524178.tif 000004
【００１９】
最も好ましくは、本発明の化合物は上記の式Ｉを有し、式中、Ｒ１は、
2020524178.tif 000005
からなる群から選択され、
ＺはＣであり、Ｒ２は−Ｃ（ＣＨ３）３であり、Ｒ４、Ｒ３は、Ｈである。
【００２０】
別の実施形態では、式Ｉを有する上記の化合物がさらに好ましく、式中、Ｒ１は、
2020524178.tif 000006
からなる群から選択され、ＺはＣであり、Ｒ３はＨまたはＯＨであり、Ｒ４はＨまたはＯＨであり、特にＲ３およびＲ４が両方ともＯＨであることはなく、Ｒ２は、−Ｃ（ＣＨ３）３、−Ｎ（ＣＨ３）２から選択されるか、またはＲ２は、以下：
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のうちのいずれかである。
【００２１】
ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）アゴニストおよび可溶性エポキシドヒドロラーゼ（ｓＥＨ）阻害剤である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物。
【００２２】
薬学的に許容されないアニオンを有する塩も同様に、薬学的に許容される塩の調製もしくは精製のためおよび／または非治療的用途、例えばインビトロでの用途における使用のための有用な中間体として本発明の範囲の一部を形成する。本発明の化合物はまた、様々な多形体で、例えば非晶質および結晶性多形体として存在し得る。本発明の化合物のすべての多形体は、本発明の範囲内であり、本発明のさらなる態様である。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「ファルネソイドＸ受容体」または「ＦＸＲ」という用語は、例えば、選択的スプライスアイソフォームおよび天然に存在するアイソフォームを含む、そのような受容体のすべての哺乳類形態を指す（例えば、Ｒ．Ｍ．Ｈｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ２００２，２９０，３５を参照）。代表的なＦＸＲ種としては、限定されないが、受容体のラット（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿２１７４５）形態、マウス（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０９１０８）形態およびヒト（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０５１２３）形態が挙げられる。
【００２４】
「可溶性エポキシドヒドロラーゼ（ｓＥＨ）」という用語は、ヒトにおいてＥＰＨＸ２遺伝子（ＨＧＮＣ：３４０２）によってコードされる二官能性酵素を指すことが意図されている。ｓＥＨは、エポキシドヒドロラーゼファミリーのメンバーである。サイトゾルおよびペルオキシソームの両方に見られるこの酵素は、特定のエポキシドに結合し、それらを対応するジオールに変換する。
【００２５】
別の態様では、本発明はまた、本明細書に開示される新規の化合物を合成するための方法を提供する。
【００２６】
本発明の化合物は、特に、対象における疾患を治療する方法において有用である。好ましくは、本発明により治療される疾患は、ＦＸＲおよびｓＥＨに関連した障害である。
【００２７】
したがって、ＦＸＲおよびｓＥＨを同時に調節するための方法もまた提供され、この方法は、本明細書で前述されるＦＸＲおよびｓｈｅの二重調節剤を対象または細胞に投与するステップを含む。
【００２８】
次いで、別の態様は、対象における疾患を治療する方法に関し、この方法は、治療有効量の本発明の化合物または本発明の薬学的組成物を、対象に投与するステップを含む。
【００２９】
本開示の文脈において、「対象」という用語は、好ましくは哺乳類、好ましくはマウス、ラット、ロバ、ウマ、ネコ、イヌ、モルモット、サル、類人猿または好ましくはヒト患者、例えば、本明細書に記載される障害に罹患している患者に関する。
【００３０】
好ましい実施形態では、疾患または障害は、代謝障害、好ましくは高脂肪食によって引き起こされるかまたはそれに関連した代謝障害である。
【００３１】
肝疾患は、肝臓の損傷または肝臓の疾患の一種である。１００種類を超える肝疾患が存在する。最も広く知られているのは以下のとおりである：肝蛭症、肝炎、アルコール性肝疾患、脂肪性肝疾患、肝硬変、肝臓、胆汁、硬化性胆管炎、小葉中心壊死、バッド・キアリ症候群、遺伝性肝疾患（体内の鉄の蓄積に関与するヘモクロマトーシスおよびウィルソン病）、トランスサイレチン関連遺伝性アミロイドーシス、ならびにジルベール症候群。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「肝疾患」という用語は、肝臓に影響を及ぼす任意の疾患または障害を指す。肝疾患の例としては、アラジール症候群、アルコール関連肝臓病、α１アンチトリプシン欠乏症、自己免疫性肝炎、良性肝腫瘍、胆道閉鎖症、肝硬変、ガラクトース血症、ジルベール症候群、ヘモクロマトーシス、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、肝細胞癌、肝性脳症、肝嚢胞、肝臓癌、新生児黄疸、非アルコール性脂肪性肝疾患（非アルコール性脂肪肝および非アルコール性脂肪性肝炎を含む）、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）、ライ症候群、Ｉ型糖原貯蔵症、ならびにウィルソン病が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】
「非アルコール性脂肪肝」または「非アルコール性脂肪性肝疾患」（ＮＡＦＬＤ）という用語は、過剰なアルコール摂取に起因せずに肝臓内に脂肪が蓄積したときに起こる、脂肪肝の一因である病態を指す。ＮＡＦＬＤは、インスリン抵抗性および代謝症候群に関し、体重減量、メトホルミンおよびチアゾリジンジオンなどの、他のインスリン抵抗性状態（例えば、２型糖尿病）のために本来開発された治療に応答し得る。ＮＡＦＬＤは、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）および非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）として細分類され得る。ＮＡＳＨは、ＮＡＦＬＤのより極端な形態であり、原因不明の肝硬変の主な原因とみなされている。
【００３４】
ＮＡＦＬＤを有する大部分の患者は、症状をほとんどまたは全く有しない。患者は、疲労、倦怠感および右上腹部の鈍い不快感を訴える場合がある。希ではあるが、軽度黄疸が認められる場合がある。より一般的には、ＮＡＦＬＤは、日常的な血液検査において腹部肝機能検査後に診断される。ＮＡＦＬＤは、インスリン抵抗性および代謝症候群（肥満、複合型高脂血症、糖尿病（ＩＩ型）および高血圧）に関連している。一般的な所見は、上昇した肝酵素、および脂肪症を示す肝臓超音波検査である。また超音波検査を使用して、胆石の問題（胆石症）を除外する場合もある。肝生検（組織検査）は、ＮＡＳＨを他の形態の肝疾患から決定的に区別するものとして広く受け入れられている唯一の検査であり、それを使用して、炎症および結果として生じる線維症の重症度を評価することができる。
【００３５】
非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）は、一般的な、多くの場合「サイレントな」肝疾患である。ＮＡＳＨにおける主な特徴は、炎症および損傷を伴う、肝臓内の脂肪である。ＮＡＳＨを有する大部分の人々は、体調が良く、肝臓に問題があることに気づかない。それにもかかわらず、ＮＡＳＨは深刻であり得、肝硬変につながり得、この場合、肝臓が永久的に損傷され、傷跡が残り、適切に機能することができなくなる。
【００３６】
ＮＡＳＨは通常、日常的な血液検査パネルに含まれる肝臓検査において、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）またはアスパルテートアミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）などの上昇を有することが見出された人において最初に疑われる。さらなる評価により肝疾患の明らかな理由が示されない場合、および肝臓のｘ線または画像解析が脂肪を示す場合、ＮＡＳＨが疑われる。ＮＡＳＨの決定的な診断を提供し、それを単なる脂肪肝と区別する唯一の手段は、肝生検である。ＮＡＳＨは、生検から、肝細胞の炎症および損傷を伴う脂肪が観察された場合に診断される。組織が炎症および損傷のない脂肪を示す場合、ＮＡＦＬまたはＮＡＦＬＤと診断される。現在、血液検査もスキャンも、この情報を確実に提供することができない。
【００３７】
したがって、本発明の化合物で治療される好ましい疾患は、非アルコール性脂肪性肝疾患または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）などの肝疾患である。
【００３８】
本明細書で使用される場合、「治療有効量」という用語は、例えば、研究者または医師によって調べられる、組織、系、動物またはヒトの生物学的または医学的応答を引き出す化合物の量を意味する。さらに、「治療有効量」という用語は、そのような量を受けなかった対応する対象と比較して、疾患、障害もしくは副作用の改善された治療、治癒、予防もしくは寛解、または疾患もしくは障害の進行速度の減少をもたらす任意の量を意味する。
【００３９】
さらに別の態様では、薬学的に許容される担体および／または賦形剤とともに本発明の化合物を含む薬学的組成物が提供される。
【００４０】
本発明の化合物（複数可）はまた、さらなる活性成分と組み合わせて投与することもできる。所望の生物学的効果を達成するために必要とされる式Ｉの化合物の量は、多くの因子、例えば、選択される特定の化合物、使用目的、投与形態および患者の臨床状態に依存する。
【００４１】
１日用量は、一般に、体重１キログラムあたり１日０．３ｍｇ〜１００ｍｇ（典型的に、３ｍｇ〜５０ｍｇ）の範囲、例えば３〜１０ｍｇ／ｋｇ／日である。静脈内用量は、例えば０．３ｍｇ〜１．０ｍｇ／ｋｇの範囲であってよく、体重１キログラムあたり毎分１０ｎｇ〜１００ｎｇの注入として好適に投与することができる。これらの目的のための好適な輸液は、例えば１ミリリットルあたり０．１ｎｇ〜１００ｍｇ、典型的に１ｎｇ〜１００ｍｇを含有し得る。単一用量は、例えば、１ｍｇ〜１０ｇの活性成分を含有し得る。したがって、注射用アンプルは、例えば、１ｍｇ〜１００ｍｇを含有してよく、経口投与可能な単一用量製剤、例えば錠剤またはカプセルは、例えば１．０〜１０００ｍｇ、典型的に１０〜６００ｍｇを含有し得る。上述の病態の治療の場合、式Ｉの化合物自体を化合物として使用してもよいが、それらは好ましくは、適合する担体とともに薬学的組成物の形態で存在する。当然のことながら、担体は、組成物の他の構成要素と適合性であり患者の健康に有害でないという意味において許容可能でなければならない。担体は、固体もしくは液体または両方であってよく、好ましくは、０．０５重量％〜９５重量％の活性成分を含有し得る単一用量として、例えば錠剤として、化合物とともに製剤化される。他の式Ｉの化合物を含む、他の薬学的に活性な物質も同様に存在し得る。本発明の薬学的組成物は、既知の薬学的方法のうちの１つによって生成することができ、本質的に、成分を薬学的に許容される担体および／または賦形剤と混合することを伴う。
【００４２】
本発明の薬学的組成物は、経口（ｏｒａｌ）、直腸、局所、経口（ｐｅｒｏｒａｌ）（例えば、舌下）および非経口（例えば、皮下、筋肉内、皮内または静脈内）投与に適したものであるが、最も好適な投与形態は、各個々の症例において治療される病態の性質および重症度、ならびに各症例において使用される式Ｉの化合物の性質に依存する。被覆製剤または薬剤形態もまた、本発明の範囲内である。糖被覆製剤および糖被覆徐放製剤もまた、本発明の範囲内である。耐酸性および耐胃液性製剤が優先される。好適な耐胃液性被覆は、酢酸フタル酸セルロース、酢酸フタル酸ポリビニル、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ならびにメタクリル酸およびメタクリル酸メチルのアニオン性ポリマーを含む。経口投与に適した薬学的化合物は、別個の、すなわち単一用量単位の形態、例えばカプセル、カシェ剤、舐剤、フィルム錠剤、糖被覆錠剤、可溶性錠剤、舌下錠剤、経口錠剤または錠剤の形態であってよく、各々が、定義された量の式Ｉの化合物を、粉体もしくは顆粒として、水性もしくは非水性液体中の溶液もしくは懸濁液として、または水中油もしくは油中水エマルジョンとして含有する。これらの組成物は、既述のとおり、活性成分および担体（１種以上の追加成分からなり得る）を接触させるステップを含む、任意の好適な薬学的方法によって調製され得る。組成物は、一般に、活性成分を液体および／または細分された固体担体と均一かつ均質に混合することによって生成され、その後、生成物は、必要に応じて成形される。例えば、錠剤は、化合物の粉体または顆粒を、該当する場合は１種以上の追加成分とともに、圧縮または成型することによって生成され得る。圧縮された錠剤は、易流動性形態、例えば粉体または顆粒などの化合物を錠剤化することによって生成することができ、該当する場合は、好適な機械の中で、結合剤、滑剤、不活性希釈剤（充填剤）および／または１種（もしくは複数種）の界面活性剤／分散剤と混合することができる。成型された錠剤または顆粒は、好適な機械の中で、不活性液体希釈剤で湿らせた粉状化合物を成型することによって生成され得る。
【００４３】
経口（舌下）投与に適した薬学的組成物としては、香味剤、典型的にスクロース、およびアラビアガムまたはトラガカントとともに、式Ｉの化合物を含有する舐剤、ならびにゼラチンおよびグリセロールまたはスクロースおよびアラビアガムなどの不活性基剤中に該化合物を含むトローチ剤が挙げられる。
【００４４】
好ましくは、非経口投与に適した薬学的組成物は、意図されるレシピエントの血液と好ましくは等張である、式Ｉの化合物の滅菌水性調製物を含む。これらの調製物は、好ましくは静脈内投与されるが、投与は、皮下、筋肉内または皮内注射によって行われてもよい。これらの調製物は、好ましくは、化合物を水と混合し、得られた溶液を好適な滅菌プロセス（例えば、蒸気滅菌、滅菌濾過）によって滅菌し、血液と等張にすることによって生成することができる。本発明の注射可能な組成物は、一般に、０．１〜５重量％の活性化合物を含有する。直腸投与に適した薬学的組成物は、好ましくは単一用量坐薬の形態である。これらは、式Ｉの化合物を１種以上の従来の固体担体、例えばココアバターと混合し、得られた混合物を成形することによって生成され得る。
【００４５】
皮膚の局所使用に適した薬学的組成物は、好ましくは軟膏、クリーム、粉体、ローション、ペースト、スプレー、エアロゾルまたは油の形態である。使用され得る担体は、ペトロラタム、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコールおよびこれらの物質のうちの２つ以上の組み合わせである。活性成分は、一般に、組成物の０．１〜１５重量％、例えば０．５〜２％の濃度で存在する。
【００４６】
経皮投与も可能である。経皮使用に適した薬学的組成物は、患者の上皮との密接な長期接触に適した単一パッチの形態であってよい。そのようなパッチは、緩衝化され、該当する場合は接着剤中に溶解および／もしくは分散されるかまたはポリマー中に分散される、水性溶液中に、活性成分を含有する。好適な活性成分濃度は、約１％〜３５％、好ましくは約３％〜１５％である。特定のオプションは、例えばＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２（６）：３１８（１９８６）に記載される電気的輸送またはイオン泳動によって、活性成分が放出されるようにするものである。
【００４７】
本発明は、添付の図面およびシーケンスを参照して以下の実施例においてさらに説明されるが、それらに限定されない。本発明の目的のために、本明細書に引用されるすべての参照文献は、全体が参照により組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】二重調節剤の能力プロットにより、最も強力な部分的ＦＸＲアゴニストとして３０、４６および５４（赤色）が示され、一方で最も高いｓＥＨ阻害能力については３１、４４および５１（青色）が明らかになった。結果として、これらの化合物の構造的特徴を組み合わせて、二重活性を増加させ、５５および５７（緑色、表７）が得られた。
【図２】５７の分子ドッキング：（Ａ）ＦＸＲ−ＬＢＤ（ＰＤＢコード４ＱＥ８）における化合物５７の結合様式。（Ｂ）ｓＥＨ（ＰＤＢコード３Ｉ２８）における化合物５７の結合様式。分子表面は、親油性に従って着色した（緑色：親油性、マゼンタ色：親水性）。選択された側鎖は線として示し、化合物５７は棒として表す。
【図３】５７のインビトロ特性化：（Ａ）選択性プロファイル：ＰＰＡＲγに対する中程度の活性を除いて（ＥＣ５０＝１４．７±０．９μＭ、最大３０±１％）、５７は、関連する核内受容体に対して不活性であり、したがってＦＸＲに対して高度に選択的であった（値は平均±ＳＥＭである。ｎ＝３）。（Ｂ）５７は、１００μＭまでのＨｅｐＧ２細胞に関する一般的なＷＳＴ−１アッセイにおいて、細胞毒性がないことが明らかになった（値は平均±ＳＥＭである。ｎ＝４）。（Ｃ）５７は、許容可能なインビトロマイクロソーム安定性を表し、ウィスターラット肝臓マイクロソームとの６０分のインキュベーション後に５０％超が残存した（値は平均±ＳＥＭである。ｎ＝３）。
【図４】５７の細胞活性の決定：（Ａ）５０μＭのＣＤＣＡ（１ｂ）と比較した、０．１μＭおよび１μＭの５７との８時間または１６時間のインキュベーション後のＨｅｐＧ２細胞におけるＦＸＲ標的遺伝子ｍＲＮＡの定量化：５７は、ＢＳＥＰ、ＳＨＰ、ＰＰＡＲα、ＧＬＵＴ４、ＦＧＦ１９、ＰＤＫ４およびＦＡＢＰ１の濃度依存的部分誘導、ならびにＣＹＰ７Ａ１、ＳＲＥＢＰ１ｃおよびＦＡＳの濃度依存的部分抑制を引き起こした（ビヒクル処理した対照細胞は、１００％として定義される。値は平均±ＳＥＭである。ｎ＝４）。（Ｂ）５７は、ＰＰＡＲγ標的遺伝子であるＣＤ３６およびＦＡＭ３Ａの有意な調節は引き起こさなかった（陽性対照としてのピオグリタゾン（ＰＩＯ）。値は平均±ＳＥＭである。ｎ＝３）。（Ｃ）ＨｅｐＧ２細胞からの細胞ホモジネートにおける可溶性エポキシドヒドロラーゼ活性：二重調節剤５７は、およそ１０ｎＭのＩＣ５０値で細胞ｓＥＨによる１４．１５−ＥＥＴ−ｄ１１の１４．１５−ＤＨＥＴ−ｄ１１への変換を阻害し、０．１ｎＭという低い濃度で統計的に有意な阻害を行う（値は平均±ＳＥＭである。ｎ＝３）。（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）
【図５】５７のインビボ特性化：（Ａ）５７のインビボ薬物動態評価により、二重調節剤の急速な取り込み、高いバイオアベイラビリティ、および中程度だが許容可能な半減期が明らかになった。５７は、体重１キログラムあたり１０ｍｇの単回経口投与の後、およそ３．５時間にわたってＩＣ５０（ｓＥＨ）値およびＥＣ５０（ＦＸＲ）値を超える有効血漿濃度を達成した。（Ｂ）投与後８時間のマウス血漿中のＥＥＴ／ＤＨＥＴ比におけるおよそ２倍の増加は、５７がインビボでｓＥＨを阻害したことを示した。（Ｃ）ビヒクルで処置したマウス（１００％）と比較した、投与後８時間のＦＸＲ標的遺伝子ＢＳＥＰ、ＳＨＰ、ＣＹＰ７Ａ１、ＳＲＥＢＰ１ｃおよびＦＧＦ１５ならびにＰＰＡＲγ標的遺伝子ＦＡＴＰのｍＲＮＡレベルの定量化。５７は、ＢＳＥＰおよびＳＨＰを誘導する傾向を示し、ＣＹＰ７Ａ１をわずかに抑制した。さらに、５７は、ＳＲＥＢＰ１ｃを有意に抑制し、ＦＧＦ１５を有意に誘導した。これは、インビボでのＦＸＲ調節およびＮＡＳＨにおける潜在的に有益な効果を示す。ＰＰＡＲγ標的遺伝子であるＦＡＴＰは、インビボで調節されなかった。（ｎ（ビヒクル）＝３、ｎ（５７）＝６、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）
【図６】（またはスキーム１０）：５７のインビトロ代謝。二重調節剤５７のスルホンアミド部分の加水分解により、代謝産物６９ａ（ＬＣ−ＭＳ−ＭＳによって確認される）が生成され、これは高い二重調節能力を表し、薬力学的活性に寄与し得る。ＬＣ−ＭＳ−ＭＳ分析はまた、ｔｅｒｔ−ブチルベンズアミド残基におけるヒドロキシル化から生じる代謝産物の存在を示す。３つの可能性のある異性体７７、７８および７９のうち、７７および７８は検出不可能であり、７９をもたらすｔｅｒｔ−ブチル基における代謝性ヒドロキシル化を確認した。さらに、５７は、ベンジル置換基の芳香環においてヒドロキシル化される。
【図７】（またはスキーム１）重要なＦＸＲリガンド：オベチコール酸（１ａ）、生理学的アゴニストであるＣＤＣＡ（１ｂ）、および合成参照ＦＸＲアゴニスト（１ｃ）を示す。
【図８】（またはスキーム２）ｓＥＨ阻害剤ＧＳＫ２１８８９３１Ｂ（２）および部分的ＦＸＲアゴニスト３のファルマコフォアをマージすることによるリード化合物５の発見を示す。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００４９】
ＦＸＲおよびｓＥＨに対して強力な二重活性を有する剤を開発するために、本発明者らは、最初にＦＸＲ調節剤の社内ライブラリーの代表的な化合物をスクリーニングしたが、それらの中でｓＥＨに対して阻害能力を有するリード化合物を特定することはできなかった。したがって、本発明者らは、既知の部分的ＦＸＲアゴニストおよび既知のｓＥＨ阻害剤からマージしたファルマコフォアを探索した。いくつかのｓＥＨ阻害剤は、酵素によって切断されるエポキシド部分を模倣するアミドまたは尿素残基を含有する。ファルマコフォアとしてＮ−ベンジルアミド残基を含むｓＥＨ阻害剤ＧＳＫ２１８８９３１Ｂ（２）は、最近報告された１５部分的ＦＸＲアゴニスト（例えば３）といくらかの構造的類似性を共有する。したがって、本発明者らは、両方の化合物に類似する構造的特徴を抽出し、それらを組み合わせて、ｓＥＨ阻害のためのＮ−ベンジルアミド残基およびＦＸＲ活性化のためのカルボン酸基を含有する最小二重ファルマコフォア４ａにした（図８、スキーム２）。化合物４ａは、５０μＭで３７±１％の中程度のｓＥＨ阻害を呈したが、ＦＸＲに対しては不活性であった。テンプレート２のピペリジン部分を組み込んだ４ｂは、さらに低い活性を示し、ｓＥＨおよびＦＸＲに対して不活性であった。しかしながら、本発明者らが４ａおよび４ｂの飽和環を５の芳香族部分で置き換えたとき、本発明者らは、５０μＭの濃度での１２±１％のＦＸＲ活性化および１６±２％のｓＥＨ阻害を伴う所望の二重活性を達成した。低フラグメント様サイズ（ＭＷ２５５Ｄａ）の５について、本発明者らは、この中程度の能力を十分であると考え、ｓＥＨおよびＦＸＲの二重調節剤としての５の構造活性相関（ＳＡＲ）を系統的に調査した（図２）。
【００５０】
実施例１：合成
Ｎ−ベンジルベンズアミド４〜５７および７７〜７８を、スキーム３〜９に従って調製した。アミノメチルベンゼン前駆体５８ａ〜ｊの合成は、ＮＢＳおよびＡＩＢＮを使用した、それぞれのメチルベンゼン誘導体５９ａ〜ｊのブロモメチルベンゼン６０ａ〜ｊへのラジカル臭素化で開始した。その後、ブロモメチルベンゼン６０ａ〜ｊを、アジ化ナトリウムを使用する２ステップのシュタウディンガー反応に適用して、それらの還元のために水中でアジド６１ａ〜ｊおよびトリフェニルホスフィンを生成した。アミノメチルベンゼン誘導体５８ｋは、ＬｉＡｌＨ４を使用した４−アミノ−２−クロロベンゾニトリル６２の還元によって調製した。アミノメチルベンゼン誘導体５８ｌ〜ｗは、市販されていた。その後、５８ａ〜ｗを、ピリジンの存在下で塩化カルボニル６３ａ〜ｏと、またはＥＤＣおよび４−ＤＭＡＰの存在下でカルボン酸６４ａ〜ｆと反応させて、化合物１８、１９、２２、３５、３６、４４、４７〜５１、５４、５５、６８および６９ａ〜ｃ、またはそれらのエステル６５ａ〜ｈを得た（スキーム３）。化合物６８をＢｒＣＨ２ＣＯＯＣＨ３で処理して、エステル６５ｉを生成した。すべてのエステル６５ａ〜ｉを、アルカリ条件下で最終生成物１６、２０および２３〜３２へと加水分解した（スキーム４）。４−アミノ安息香酸（６６）および４−ｔｅｒｔ−ブチルフェニルイソシアネート（６７）から、ＮＥｔ３およびその後の水酸化リチウムによる加水分解によって、尿素２１を調製した（スキーム５）。遊離カルボン酸１８は、塩化アンモニウム、塩化メチルアンモニウムまたは塩化ジメチルアンモニウムおよびＥＤＣ／ＤＭＡＰを使用したアミド３７〜３９の調製に役立った。ＬｉＡｌＨ４による１８の還元によってエチルアルコール誘導体３３を得て、これをＰＣＣでアルデヒド３４へとさらに変換した（スキーム６）。反転アミド４０、４１および５６、反転スルホンアミド４６および５７、ならびにＮ−アシルスルホンアミド４５を、カルボン酸活性化のためにＥＤＣ／ＤＭＡＰを用いて４２、４４および６９ａから生成した。テトラゾール４３は、Ｃｕ２Ｏ触媒下でＮａＮ３の環化付加によってニトリル３６から取得可能であった（スキーム７）。メチルメルカプタン５１のスルホキシド５２およびスルホン５３への酸化は、好適な当量のメタクロロ過安息香酸（ｍＣＰＢＡ、スキーム８）を使用して達成し、最終的に、標準手順に従ったメトキシ誘導体７６ａ〜ｂの調製（スキーム３）およびＢＢｒ３によるそれらの脱メチル化により、フェノール誘導体７７および７８を得た（スキーム９）。
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スキーム３：試薬および条件（ａ）ＮＢＳ、ＡＩＢＮ、ＣＨＣｌ３、還流、４時間（ｂ）ＮａＮ３、ＤＭＦ、８０℃、１６時間（ｃ）ＰＰｈ３、Ｈ２Ｏ、ＴＨＦ、室温、１２時間（ｄ）ＬｉＡｌＨ４、ＴＨＦ、還流、１８時間（ｅ）ピリジン、ＴＨＦ、室温、２時間（ｆ）ＥＤＣ・ＨＣｌ、ＤＭＡＰ、ＣＨＣｌ３、５０℃、６時間（ｇ）ＳＯＣｌ２、ＤＣＭ、ＤＭＦ、還流、４時間。
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スキーム４：試薬および条件（ａ）ＢｒＣＨ２ＣＯＯＣＨ３、ＤＭＦ、Ｋ２ＣＯ３、室温、１８時間（ｂ）ＫＯＨ、Ｈ２Ｏ、ＭｅＯＨ、μｗ、１５分。
2020524178.tif 000010
スキーム５：試薬および条件（ａ）ＤＣＭ、ＮＥｔ３、室温、２４時間（ｂ）ＬｉＯＨ、ＴＨＦ、ＭｅＯＨ、Ｈ２Ｏ、室温、１５時間。
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スキーム６：試薬および条件（ａ）ＬｉＡｌＨ４、ＴＨＦ、室温、１８時間（ｂ）ＰＣＣ、ＤＣＭ、室温、２時間（ｃ）Ｒ２ＮＨ２・Ｃｌ、ＥＤＣ・ＨＣｌ、ＤＭＡＰ、ＣＨＣｌ３、５０℃、４時間。
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スキーム７：試薬および条件（ａ）Ｒ−ＯＨ、ＥＤＣ・ＨＣｌ、ＤＭＡＰ、ＣＨＣｌ３、５０℃、４時間、または塩化メシル、ＴＨＦ、室温、２時間（ｂ）Ｃｕ２Ｏ、ＮａＮ３、ＤＭＦ、ＭｅＯＨ、９０℃、２４時間（ｃ）ＢＢｒ３、ＤＣＭ、０℃〜室温、２時間。
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スキーム８：試薬および条件（ａ）ｍＣＰＢＡ、ＣＨＣｌ３、０℃で２時間または室温で１８時間。
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スキーム９：試薬および条件（ａ）塩化メシル、ＴＨＦ、室温、２時間（ｂ）ＢＢｒ３、ＤＣＭ、０℃〜室温、２時間。
【００５１】
実施例２：生物学的評価
ＦＸＲアゴニスト活性を決定するために、試験化合物４〜５７を、ＨｅＬａ細胞における全長（ｆｌ）ＦＸＲレポーター遺伝子アッセイにおいて特性化した。このアッセイは、胆汁酸塩排出タンパク質（ＢＳＥＰ）由来のＦＸＲ応答エレメントの制御下にホタルルシフェラーゼを含有するレポーター構築物に基づく。ＦＸＲおよびそのヘテロ二量体パートナーであるレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）をＣＭＶプロモーターの制御下にある発現構築物として、ならびに正規化および毒性対照のための構成的に発現されるウミシイタケルシフェラーゼ（ＳＶ４０プロモーター）を、同時導入した。合成ＦＸＲアゴニストＧＷ４０６４（１ｃ）を、参照アゴニストとして使用し、３μＭにおけるそのトランス活性化活性を、１００％活性化として定義した。このアッセイでは、多様な既知のＦＸＲアゴニストを検証し、これらは文献と良く一致する能力をもたらした（ＧＷ４０６４（１ｃ）：ＥＣ５０＝０．５１±０．１６μＭ、ＯＣＡ（１ａ）：ＥＣ５０＝０．１６±０．０２μＭ、およびＣＤＣＡ（１ｂ）：ＥＣ５０＝１８±１μＭ）。十分に特性化されたｓＥＨ阻害剤であるＣＩＵ３６は、ｓＥＨ阻害剤の非特異的作用を除いて、このアッセイにおいて１０μＭでは活性を有していなかった。試験化合物のｓＥＨ阻害能力を、組み換え酵素、およびｓＥＨによって蛍光６−メトキシナフトアルデヒドへと加水分解される蛍光発生ｓＥＨ基質ＰＨＯＭＥ３７を使用して、蛍光ベースのアッセイにおいて定量化した。
【００５２】
実施例３：構造活性相関および構造最適化
ＳＡＲ研究における最初のステップとして（表１）、本発明者らは、５のベンズアミド部分構造のあらゆる位置に追加のメチル基を導入した（６〜８）。すべてのメチル化誘導体６〜８は、弱いｓＥＨ阻害活性を呈したが、ＦＸＲは、８の４−メチル基しか許容せず、これはＦＸＲ結合ポケットが、特にこの方向に追加の空間を提供することを示した。３−メチル基（７）は、メチル化誘導体の中で最も高いｓＥＨ阻害をもたらしたため、本発明者らは、両方の標的に対する改善を組み合わせるために、２つのメチル置換基を含む化合物（９、１０）を調製した。２，４−ジメチル誘導体９は、ほぼ不活性であり、一方で３，４−ジメチル誘導体１０は、改善された二重活性を呈したが、ＦＸＲに対するその最大相対活性化はむしろ低かった。
【００５３】
追加のメチル基は、いずれかの標的に対する能力を著しくは改善しなかったため、本発明者らはまた、ベンズアミド部分上により大きな残基を導入することについて調査し、ビフェニル誘導体１１〜１３を特性化した。３つのビフェニル１１〜１３はすべて、それぞれのメチルベンズアミド６〜８よりも大幅に高い能力を明らかにしたが、能力の順位は変わらなかった。ＦＸＲは、３−置換（１２）は許容したが、４−置換（１３）を好み、ｓＥＨは、３−（１２）および４−ビフェニル誘導体（１３）によって同程度に阻害することができた。
【００５４】
（表１）ＦＸＲおよびｓＥＨに対する４〜１３のインビトロ活性（データは平均±ＳＥＭを表す、ｎ＝３〜６）
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【００５５】
最初のＳＡＲの結果は、５のベンズアミド残基における３−置換および４−置換が、両方の標的によって許容され、最終的に二重能力を改善したことを示唆した。したがって、本発明者らは、様々な３，４−二置換（１４〜１６）ならびに２−ナフチル誘導体１７を調査した（表２）。しかしながら、１４〜１７は、ＦＸＲおよびｓＥＨに対する二重能力の著しい改善はもたらすことができなかった。３，４−ジクロロ（１４）および３，４−ビス（トリフルオロメチル）置換（１６）は、ｓＥＨにしか許容されず、２−ナフチル誘導体１７は、１０よりもＦＸＲに対して低活性であった。３，４−ジメトキシベンズアミド１５のみが、ＥＣ５０値に影響を及ぼすことなくＦＸＲに対する最大相対活性化を改善し、ｓＥＨ活性を弱く阻害したため、好ましかった。
【００５６】
（表２）ＦＸＲおよびｓＥＨに対する１４〜１７のインビトロ活性（データは平均±ＳＥＭを表す、ｎ＝３〜６）
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【００５７】
これまでのところ、４−ビフェニル誘導体１３が、最高の二重能力を明らかにし、両方の標的が、ベンズアミド残基における大きな４−置換基を許容したことを示した（表３）。１８における４−ｔｅｒｔ−ブチル部分の導入は、二重活性のさらなる改善につながったが、ｔｅｒｔ−ブチル模倣体としてのより極性の４−ジメチルアミノベンズアミド１９は、大幅に低い活性であった。２０における、１８の好ましい大きなｔｅｒｔ−ブチル残基と１５の３−メトキシ基との組み合わせは、追加の効果をもたらさなかったため、本発明者らは、さらなる最適化のために４−ｔｅｒｔ−ブチル誘導体１８を選択した。
【００５８】
（表３）ＦＸＲおよびｓＥＨに対する１８〜２０のインビトロ活性（データは平均±ＳＥＭを表す、ｎ＝３〜６）
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【００５９】
１８を新たなリードとして用いて、本発明者らは、次にＮ−ベンジル置換基の最適化に焦点を当てた（表４）。１８のＮ−ベンジルベンズアミド構造を、伝統的なｓＥＨファルマコフォアとしての２１のジフェニル尿素と交換することは、両方の標的によって十分に許容されなかった。同様に、１８の４位から２２の３位へのカルボン酸部分の移行は、能力の顕著な低下を引き起こした。安息香酸（１８）からフェニル酢酸（２３）への側鎖長の変動は、両方の標的に対する能力を減少させたが、フェニルプロピオン酸２４は、１８とほぼ等しい活性をもたらした。このＳＡＲは、以前の研究において観察されたように、１８の水媒介性相互作用および２４による水の置換によって最終的に説明することができる１５。フェノキシ酢酸２５は、ＦＸＲに対してフェニルプロピオン酸２４と同様の活性を呈したが、エーテル残基は、ｓＥＨによって十分に許容されず、阻害能力を約１０分の１に著しく減少させた。
【００６０】
（表４）ＦＸＲおよびｓＥＨに対する２１〜２５のインビトロ活性（データは平均±ＳＥＭを表す、ｎ＝３〜６）
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【００６１】
二重能力の著しい改善は、分子構造およびファルマコフォア特徴間の距離の変動によって達成されなかったため（２１〜２５）、本発明者らは、次に１８の安息香酸芳香環に追加の置換基を導入する可能性を調べた（表５）。２位の置換基（２６〜２８）は、ＦＸＲに対する能力を顕著に増加させ、２−クロロ誘導体２８を非常に強力な部分的ＦＸＲアゴニストとした。しかしながら、ｓＥＨ阻害活性は、同時に著しく低下した。これに対して、漸増する置換基サイズを有する３−置換（２９〜３１）は、ｓＥＨに対する阻害能力に有益であり、３−クロロ安息香酸３１を非常に強力なｓＥＨ阻害剤とした。ＦＸＲに関して、３−メチル置換（２９）は、活性を完全になくし、一方で３−クロロ誘導体３１は、依然として活性であったが、能力は大幅に低下した。３−フルオロ安息香酸３０は、ＦＸＲに対して非常に強力であった。ベンジル位置におけるメチル化（３２）は、ＦＸＲに対するアゴニスト活性を著しく強化したが、予想どおり、ｓＥＨによって許容されなかった。アミド部分は、ＥＥＴのエポキシドおよび酵素の活性部位における攻撃性水分子を模倣するため３４、ベンジル位置における立体障害は、ｓＥＨに対する阻害能力を著しく減少させる。総じて、安息香酸残基上のいくつかの追加の残基は、ＦＸＲまたはｓＥＨに対する活性を改善したが、さらなる置換によって二重能力が生じ、強化され、均衡がとれる位置を特定することはできなかった。
【００６２】
（表５）ＦＸＲおよびｓＥＨに対する２６〜３２のインビトロ活性（データは平均±ＳＥＭを表す、ｎ＝３〜６）
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【００６３】
したがって、本発明者らは、１８のカルボン酸のＳＡＲを調査し、いくつかの代替極性残基および生物学的等価体を導入した（表６）。アルコール３３は、ｓＥＨに対して１８と同程度に強力であったが、ＦＸＲに対して不活性であった。一方でアルデヒド３４は、依然として約１０分の１の低い能力でＦＸＲを活性化したが、１８と比較してｓＥＨに対して著しく強力であった。メチルケトン３５は、両方の標的に対して顕著に改善された活性を示し、ＦＸＲおよびｓＥＨに対するナノモル能力を有する最初の二重調節剤であった。このＳＡＲは、カルボン酸の代わりに、アルコールではなくカルボニル部分が、ＦＸＲ活性化に十分であったこと、およびｓＥＨがこの位置においてより極性の低い基を選好したことを示した。アルデヒド３４の能力の低減は、ｆｌＦＸＲアッセイの細胞状況における低い安定性に起因し得る。ニトリル３６は、ナノモル能力でｓＥＨを阻害したが、ＦＸＲに対して不活性であった。アミド３７〜３９は、中程度に強力なｓＥＨ阻害剤にすぎず、これも同様に、この位置におけるより極性の高い残基が不利であったことを示した。アミド３７〜３９は、ＦＸＲに対して、窒素原子上の置換が増加するにつれて能力を著しく獲得した。第１級アミド３７は、カルボン酸１８よりも大幅に低い活性であったが、Ｎ−メチルアミド３８は、１８と同程度の能力を備えていた。Ｎ，Ｎ−ジメチルアミド３９におけるもう一つのメチル基は、能力をさらに強化した。Ｎ−アセチルアニリン４０におけるアミドの反転は、ＦＸＲアゴニスト活性を低減したが、Ｎ−トリフルオロアセチルアニリン４１における３つのフッ素原子の導入は、非常に好ましく、均衡のとれたナノモル二重調節剤を生成した。遊離アニリン４２は、依然としてｓＥＨを阻害したが、ＦＸＲに対して不活性であった。
【００６４】
カルボン酸の伝統的な生物学的等価体としてのテトラゾール４３は、ＦＸＲに対してわずかに強化された能力を有し、１８と比較して低減されたｓＥＨ阻害活性を伴った。大幅に酸性度の低いスルホンアミド４４は、１８の活性プロファイルを若干反転させ、ＦＸＲよりもｓＥＨに対してより強力であった。４４の酸性度を増加させるために、本発明者らは、Ｎ−アセチルスルホンアミド４５を調製したが、これはＦＸＲに対して不活性であり、４４と比較してｓＥＨに対する能力を著しく失った。４６におけるスルホンアミド残基の反転は、４０におけるアミドの反転と同様の効果を有し、同じく強力な二重調節剤をもたらした。
【００６５】
最後に、本発明者らは、４７において１８のカルボン酸をメトキシ基と交換し、これが驚くべきことに、両方の標的に対して相当な能力をもたらした。エトキシ誘導体４８は、ＦＸＲおよびｓＥＨに対して同程度の能力を明らかにしたが、イソプロピルオキシ類似体４９は、ＦＸＲに対して同程度に活性であったが、不溶性に起因してｓＥＨに関しては特性化することができなかった。トリフルオロメトキシ誘導体５０によって、ｓＥＨに対する能力のわずかな改善が達成され、これは高度でかつ良好に均衡がとれた二重能力を明らかにした。メチルメルカプタン５１における硫黄による酸素の置換によって、およそ０．１μＭにおいて両方の標的に対して半最大活性を有する、さらにより強力な二重調節剤が生成された。メルカプタン５１をスルホキシド５２またはスルホン５３に酸化させた場合、ＦＸＲに対する能力は顕著に低下したが、５２は、ｓＥＨに対して依然として非常に活性であり、５３のみが著しく減少した阻害能力を明らかにした。カルボン酸置換としてのメルカプタンの場合、５４におけるトリフルオロメチル基の導入は、ＦＸＲに対する能力の顕著な増加につながり、ナノモル以下の部分的アゴニストが生成された。しかしながら、トリフルオロメチルメルカプタン５４は、メチルメルカプタン５１と比較して、ｓＥＨに対するわずかに減少した活性を明らかにし、したがって高度ではあるが均衡が十分にとれていない二重能力を備えていた。
【００６６】
（表６）ＦＸＲおよびｓＥＨに対する３３〜５４のインビトロ活性（データは平均±ＳＥＭを表す、ｎ＝３〜６）
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【００６７】
本発明者らの最適化リード化合物１８単独の単一修飾はいずれも、両方の標的に対する能力を低ナノモル値へと改善することができなかったため、本発明者らは、各標的の最も好ましい構造変化を１つの分子において組み合わせる可能性を評価した。標的のうちの１つに対して顕著な活性を有する誘導体を特定するために、本発明者らは、最も強力な化合物のｐＩＣ５０（ｓＥＨ）値対ｐＥＣ５０（ＦＸＲ）値をプロットした（図１）。この能力プロットは、ベンジル部分における３−フルオロ置換（３０）、トリフルオロメチルメルカプタン残基（５４）および反転スルホンアミド４６が、ＦＸＲに対して非常に好ましいことを明らかにした。トリフルオロアセトアミド４１は、４６と構造的に類似し、同じくＦＸＲに対して高い能力を有していたため、組み合わせのために追加で選択した。ｓＥＨ阻害に関して、ベンジル部分における３−クロロ置換（３１）、メチルメルカプタン残基（５１）およびスルホンアミド４４は、他の誘導体から突出していた。５１および５４は、それらの比較的に不良な可溶性のために、またこれら２つの部分をマージすることができなかったため、組み換えについては除外した。代わりに、３０、３１、４１、４４および４６を、構造的組換えのために選択した（表７）。
【００６８】
スルホンアミド４４における３０の３−フッ素原子の導入は、二重調節剤５５をもたらし、これはＦＸＲ能力の予想どおりの増加を明らかにした。しかしながら、この改善は、中程度にすぎず、低ナノモルの能力を有する所望の二重調節剤を生成しなかった。これに対して、Ｎ−（３−クロロフェニル）トリフルオロアセトアミド５６における３１および４１のマージ、ならびにＮ−（３−クロロフェニル）メタンスルホンアミド５７における３１および４６の組み合わせは、両方の標的に対する能力の顕著な上昇を伴っていた。部分的ＦＸＲ活性化について、それぞれ１４±１ｎＭおよび２０．４±４．２ｎＭのＥＣ５０値、ならびにｓＥＨ阻害について、８．９±１．６ｎＭおよび４．１±０．４ｎＭのＩＣ５０値を有し、二重調節剤５６および５７は、最終的に両方の標的に対する所望の低ナノモルの能力を備えていた。これら２つの二重調節剤のうち、５７は、５６（＜０．１μｇ／ｍＬ（ＬＬＯＱ））よりも著しく高い水溶性（１．５μｇ／ｍＬ）を明らかにしたため、さらなるインビトロ評価のために選択した。等温滴定熱量測定（ＩＴＣ、補足図Ｓ７）によって、５７について０．１３μＭのＫｄが明らかになり、エンタルピー結合（ΔＨ＝−１９．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ、ΔＳ＝−３４．０ｃａｌ／ｍｏｌ・Ｋ）が示された。細胞ＥＣ５０値とＫｄとの間の不一致は、結合平衡に著しく影響を及ぼし得る、ＩＴＣ実験における共活性因子の不在に起因していると思われる。高い結合エネルギーは、結合時のＦＸＲ−ＬＢＤにおける潜在的に顕著な立体構造変化から一部生じ得る。
【００６９】
（表７）ＦＸＲおよびｓＥＨに対する５５〜５７のインビトロ活性（データは平均±ＳＥＭを表す、ｎ＝３〜６）
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【００７０】
さらに、以下の追加の化合物を生成し、ＦＸＲ活性化およびｓｈｅ阻害に対するそれらの活性について試験した（表８を参照）。
【００７１】
（表８）ＦＸＲおよびｓＥＨに対する追加の化合物のインビトロ活性（データは平均±ＳＥＭを表す、ｎ＝３〜６）
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【００７２】
以下の手順を使用して、以下の化合物を合成した。
【００７３】
１−（４−アミノ−２−クロロフェニル）メタンアミン（５８ｋ）：ＬｉＡｌＨ４（ＴＨＦ中１Ｍ、１６．４ｍＬ、１６．４ｍｍｏｌ、２．５当量）を０℃に冷却した。３ｍＬのＴＨＦ中の４−アミノ−２−クロロベンゾニトリル６２（１．０ｇ、６．６ｍｍｏｌ、１．０当量）を、混合物にゆっくり添加した。Ｈ２の発生が止まった後、混合物を放置して室温まで温め、次いで１６時間還流した。室温に冷却した後、混合物を１０ｍＬのＴＨＦで希釈し、次いで０℃に冷却した。１ｍＬの１０％  ＮａＯＨ溶液および１．８ｍＬの水を滴下添加した。無色の沈殿物をセライトで濾過し、１５ｍＬのジエチルエーテルで洗浄した。濾液からの有機溶媒の蒸発により、５８ｋを黄色の油として得た（０．７７ｇ、７５％）。
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【００７４】
Ｎ−（４−アミノ−２−クロロベンジル）−４−（ｔｅｒｔ−ブチル）ベンズアミド（６９ａ）：１−（４−アミノ−２−クロロフェニル）メタンアミン５８ｋ（０．３１ｇ、２．０ｍｍｏｌ、１．１当量）を、１０ｍＬのＣＨＣｌ３に溶解し、５ｍＬのＮＥｔ３を添加し、混合物を０℃に冷却した。４−ｔｅｒｔ−ブチルベンゾイルクロリド６３ｏ（０．３５ｍＬ、１．８ｍｍｏｌ、１．０当量）を、１０分間にわたってゆっくり添加し、混合物を室温で２時間撹拌した。次いで、５０ｍＬの１０％塩酸水溶液を添加し、相を分離し、水層を３０ｍＬのＥｔＯＡｃで洗浄した。この水層をＮａ２ＣＯ３溶液でｐＨ１０にし、１回８０ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、溶媒を真空中で蒸発させた。さらなる精製を、ペトロールエーテル／ＥｔＯＡｃ（９０：１０）を移動相として用いるカラムクロマトグラフィーによって行い、６９ａを黄色の固体として得た（０．５７ｇ、９７％）。Ｒｆ（ペトロールエーテル／ＥｔＯＡｃ＝６７：３３）＝０．２６。
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【００７５】
Ｎ−（４−アミノ−２−クロロベンジル）−４−（ｔｅｒｔ−ブチル−２−メトキシ）ベンズアミド（６９ｂ）：４−アミノ−２−クロロベンズアミン（５８ｋ、０．２３ｇ、０．１５ｍｍｏｌ、１．３当量）を、３０ｍＬの乾燥ＣＨＣｌ３に溶解した。４−ＤＭＡＰ（０．１２ｇ、１．１５ｍｍｏｌ、１．００当量）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（０．２４ｇ、１．２７ｍｍｏｌ、１．１０当量）および４−ｔｅｒｔ−ブチル−２−メトキシ安息香酸（６４ｂ、０．２４ｇ、１．１５ｍｍｏｌ、１．０当量）を添加した。混合物を室温で１６時間撹拌した。次いで、２５ｍＬの５％塩酸水溶液を添加し、水層を１５ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、溶媒を真空中で除去した。さらなる精製を、ヘキサン／酢酸エチルからの結晶化によって行い、６９ｂを薄黄色の固体として得た（０．３２４ｇ、８１％）。
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【００７６】
４−（ｔｅｒｔ−ブチル−３−メトキシ）−Ｎ−（２−クロロ−４−（メチルスルホンアミド）ベンジル）ベンズアミド（７６ａ）：Ｎ−（４−アミノ−２−クロロベンジル）−４−（ｔｅｒｔ−ブチル−２−メトキシ）ベンズアミド６９ｂ（０．３２ｇ、０．９３ｍｍｏｌ、１．００当量）を、２０ｍＬのＣＨＣｌ３に溶解し、５ｍＬのピリジンを添加した。塩化メシル（７０、０．０９ｍＬ、１．１２ｍｍｏｌ、１．２０当量）を慎重に添加した。混合物を室温で２時間撹拌した。次いで、１５ｍＬの１０％塩酸水溶液を添加し、３０ｍＬの酢酸エチルによって３回抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、溶媒を真空中で除去した。さらなる精製を、ヘキサン／酢酸エチルからの結晶化によって行い、７６ａを薄茶色の固体として得た（０．１７２ｇ、３５％）。
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【００７７】
４−（ｔｅｒｔ−ブチル−２−ヒドロキシ）−Ｎ−（２−クロロ−４−（メチルスルホンアミド）ベンジル）ベンズアミド（７７）：４−（ｔｅｒｔ−ブチル−２−メトキシ）−Ｎ−（２−クロロ−４−（メチルスルホンアミド）ベンジル）ベンズアミド（７６ａ、０．１７ｇ、０．４０ｍｍｏｌ、１．０当量）を、３０ｍＬのＤＣＭに溶解し、ＢＢｒ３（４．０５ｍＬ、ＤＣＭ中４．０５ｍｍｏｌ、１０．０当量）を０℃で添加した。混合物を室温で１６時間撹拌し、次いで３０ｍＬの氷水中で希釈した。ＮａＨＣＯ３でｐＨを６に調整し、混合物を１回３０ｍＬの酢酸エチルで３回抽出した。合わせた有機層を真空中で濃縮した。さらなる精製を、ヘキサン／酢酸エチルからの結晶化によって行い、７７を無色の固体として得た（０．０９８ｇ、６０％）。
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【００７８】
Ｎ−（４−アミノ−２−クロロベンジル）−４−（ｔｅｒｔ−ブチル−３−メトキシ）ベンズアミド（６９ｃ）：４−アミノ−２−クロロベンズアミン（５８ｋ、０．２３ｇ、０．１５ｍｍｏｌ、１．３当量）を、３０ｍＬの乾燥ＣＨＣｌ３に溶解した。４−ＤＭＡＰ（０．１２ｇ、１．１５ｍｍｏｌ、１．００当量）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（０．２４ｇ、１．２７ｍｍｏｌ、１．１０当量）および４−ｔｅｒｔ−ブチル−３−メトキシ安息香酸（６４ａ、０．２４ｇ、１．１５ｍｍｏｌ、１．０当量）を添加した。混合物を室温で１６時間撹拌した。次いで、２５ｍＬの５％塩酸水溶液を添加し、水層を１回１５ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、溶媒を真空中で除去した。さらなる精製を、ヘキサン／酢酸エチルからの結晶化によって行い、６９ｃを薄黄色の固体として得た（０．３１２ｇ、７８％）。
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【００７９】
４−（ｔｅｒｔ−ブチル−３−メトキシ）−Ｎ−（２−クロロ−４−（メチルスルホンアミド）ベンジル）ベンズアミド（７６ｂ）：Ｎ−（４−アミノ−２−クロロベンジル）−４−（ｔｅｒｔ−ブチル−３−メトキシ）ベンズアミド６９ｃ（０．３１ｇ、０．８９ｍｍｏｌ、１．００当量）を、２０ｍＬのＣＨＣｌ３に溶解し、５ｍＬのピリジンを添加した。塩化メシル７０（０．０７ｍＬ、１．０７ｍｍｏｌ、１．２０当量）を慎重に添加した。混合物を室温で２時間撹拌した。次いで、１５ｍＬの１０％塩酸水溶液を添加し、３０ｍＬの酢酸エチルによって３回抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、溶媒を真空中で除去した。さらなる精製を、ヘキサン／酢酸エチルからの結晶化によって行い、７６ｂを薄茶色の固体として得た（０．３１５ｇ、８３％）。
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【００８０】
４−（ｔｅｒｔ−ブチル−３−ヒドロキシ）−Ｎ−（２−クロロ−４−（メチルスルホンアミド）ベンジル）ベンズアミド（７８）：４−（ｔｅｒｔ−ブチル−３−メトキシ）−Ｎ−（２−クロロ−４−（メチルスルホンアミド）ベンジル）ベンズアミド（７６ｂ、０．３１ｇ、０．７４ｍｍｏｌ、１．０当量）を、５０ｍＬのＤＣＭに溶解し、ＢＢｒ３（７．４０ｍＬ、ＤＣＭ中７．４０ｍｍｏｌ、１０．０当量）を０℃で添加した。混合物を室温で１６時間撹拌し、次いで５０ｍＬの氷水中で希釈した。ＮａＨＣＯ３でｐＨを６に調整し、混合物を１回３０ｍＬの酢酸エチルで３回抽出した。合わせた有機層を真空中で濃縮した。さらなる精製を、ヘキサン／酢酸エチルからの結晶化によって行い、７８を無色の固体として得た（０．１４５ｇ、４８％）。
2020524178.tif 000036
【００８１】
Ｎ−（４−アミノ−２−（トリフルオロメチル）ベンジル）−４−（ｔｅｒｔ−ブチル）ベンズアミド（６９ｄ）：１−（４−アミノ−２−（トリフルオロメチル）フェニル）メタンアミン５８ｚ（０．２５ｇ、１．３ｍｍｏｌ、１．１当量）を、７ｍＬのＣＨＣｌ３に溶解し、７ｍＬのＮＥｔ３を添加し、混合物を０℃に冷却した。４−ｔｅｒｔ−ブチルベンゾイルクロリド６３ｏ（０．２８ｍＬ、１．４ｍｍｏｌ、１．１当量）を、１０分間にわたってゆっくり添加し、混合物を室温で２時間撹拌した。次いで、１０ｍＬの１０％塩酸水溶液を添加し、相を分離し、水層を１０ｍＬのＥｔＯＡｃで洗浄した。この水層をＮａ２ＣＯ３溶液でｐＨ１０にし、１回１０ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、溶媒を真空中で蒸発させた。さらなる精製を、ヘキサン／ＥｔＯＡｃ（９０：１０）を移動相として用いるカラムクロマトグラフィーによって行い、６９ｄを黄色の固体として得た（０．３５ｇ、８４％）。Ｒｆ（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ＝９０：１０）＝０．２７。
2020524178.tif 000037
【００８２】
４−（ｔｅｒｔ−ブチル）−Ｎ−（２−トリフルオロメチル−４−（メチルスルホンアミド）ベンジル）ベンズアミド（８０）：Ｎ−（４−アミノ−２−（トリフルオロメチル）ベンジル）−４−（ｔｅｒｔ−ブチル）ベンズアミド６９ｄ（０．３５ｇ、１．０ｍｍｏｌ、１．００当量）を、５０ｍＬのＴＨＦに溶解し、５ｍＬのピリジンを添加した。塩化メシル（７０、０．２３ｍＬ、３．０ｍｍｏｌ、３．０当量）を慎重に添加した。混合物を室温で一晩撹拌した。次いで、５０ｍＬの１０％塩酸水溶液を添加し、２０ｍＬの酢酸エチルによって３回抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、溶媒を真空中で除去した。さらなる精製を、ヘキサン／ＥｔＯＡｃ（６７：３３）を移動相として用いるカラムクロマトグラフィーによって行い、８０を薄ピンク色の固体として得た（０．０９ｇ、２２％）。Ｒｆ（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ＝６７：３３）＝０．１９。
2020524178.tif 000038
【００８３】
４−（ｔｅｒｔ−ブチル）−Ｎ−（２−クロロ−４−（イソプロピルスルホンアミド）ベンジル）−ベンズアミド（８１）：Ｎ−（４−アミノ−２−クロロベンジル）−４−（ｔｅｒｔ−ブチル）ベンズアミド６９ａ（０．１５４ｇ、０．４９ｍｍｏｌ、１．０当量）を、２０ｍＬのＴＨＦに溶解し、２ｍＬのピリジンを添加した。イソプロピルスルホニルクロリド８６ａ（０．５７ｍＬ、４．８９ｍｍｏｌ、１０当量）を慎重に添加し、混合物を室温で２４時間撹拌した。次いで、１５ｍＬの１０％塩酸水溶液を添加し、混合物を１回３０ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、溶媒を真空中で蒸発させた。さらなる精製を、ヘキサン／ＥｔＯＡｃ（６７：３３）を移動相として用いるカラムクロマトグラフィーによって行い、８１を黄色の固体として得た（０．０４１ｇ、２０％）。Ｒｆ（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ＝６７：３３）＝０．２０。
2020524178.tif 000039
【００８４】
４−（ｔｅｒｔ−ブチル）−Ｎ−（２−クロロ−４−（エチルスルホンアミド）ベンジル）−ベンズアミド（８２）：Ｎ−（４−アミノ−２−クロロベンジル）−４−（ｔｅｒｔ−ブチル）ベンズアミド６９ａ（０．１６ｇ、０．５１ｍｍｏｌ、１．０当量）を、２０ｍＬのＴＨＦに溶解し、２ｍＬのピリジンを添加した。エタンスルホニルクロリド８６ｂ（０．５ｍＬ、５．１ｍｍｏｌ、１０当量）を慎重に添加し、混合物を室温で２４時間撹拌した。次いで、１５ｍＬの１０％塩酸水溶液を添加し、混合物を１回３０ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、溶媒を真空中で蒸発させた。さらなる精製を、ヘキサン／ＥｔＯＡｃ（５０：５０）を移動相として用いるカラムクロマトグラフィーによって行い、８２を黄色の固体として得た（０．１２５ｇ、６０％）。Ｒｆ（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ＝５０：５０）＝０．５１。
2020524178.tif 000040
【００８５】
Ｎ−（４−アミノ−２−クロロベンジル）−４−（ジメチルアミノ）ベンズアミド（６９ｅ）：１−（４−アミノ−１−クロロフェニル）メタンアミン５８ｋ（０．３０ｇ、１．９２ｍｍｏｌ、１．１当量）を、１０ｍＬのＤＭＦに溶解した。１０ｍＬのＮＥｔ３を添加し、混合物を０℃に冷却した。４−ジメチルアミノベンゾイルクロリド６３ｐ（０．３２ｍＬ、１．７３ｍｍｏｌ、１．０当量）を、１０分間にわたってゆっくり添加し、混合物を室温で５時間撹拌した。次いで、５０ｍＬの１０％塩酸水溶液を添加し、相を分離し、水層をＮａ２ＣＯ３溶液でｐＨ１０にし、１回８０ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、溶媒を真空中で蒸発させた。さらなる精製を、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン／ＮＥｔ３（６５：３３：２）を用いるカラムクロマトグラフィーによって行い、６９ｅを黄色の固体として得た（０．２０５ｇ、３９％）。Ｒｆ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン／ＮＥｔ３＝６５：３３：２）＝０．４７。
2020524178.tif 000041
【００８６】
４−（ジメチルアミノ）−Ｎ−（２−クロロ−４−（メチルスルホンアミド）ベンジル）ベンズアミド（８３）：Ｎ−（４−アミノ−２−クロロベンジル）−４−（ジメチルアミノ）ベンズアミド６９ｅ（０．２０４ｇ、０．６７ｍｍｏｌ、１．０当量）を、３０ｍＬのＴＨＦに溶解し、３ｍＬのピリジンを添加した。塩化メシル７０（０．２７ｍＬ、３．３６ｍｍｏｌ、５．０当量）を慎重に添加し、混合物を室温で２時間撹拌した。次いで、１５ｍＬの１０％塩酸水溶液を添加し、混合物を１回３０ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、溶媒を真空中で蒸発させた。さらなる精製を、ＥｔＯＡｃを移動相として使用するカラムクロマトグラフィーによって行った。さらなる結晶化を、ＤＣＭ／ヘキサンおよびアセトン／水中で行い、８３を黄色の固体として得た（０．０６４ｇ、２５％）。Ｒｆ（ＥｔＯＡｃ）＝０．６４。
2020524178.tif 000042
【００８７】
４−（（１−トリフルオロメチル）シクロプロプ−１−イル）安息香酸（６４ｉ）：Ｐｄ（ＯＡｃ）２（０．０４５ｍｍｏｌ、０．０１ｇ、３ｍｏｌ％）、キサントホス（０．０４５ｍｍｏｌ、０．０１ｇ、３ｍｏｌ％）を、１０ｍＬのＤＭＦに溶解した。その後、ギ酸（１０．６ｍｍｏｌ、０．４ｍＬ、７．０当量）および１−ブロモ−４−（１−（トリフルオロメチル）シクロプロプ−１−イル）ベンゼン８７（１．５ｍｍｏｌ、０．４ｇ、１．０当量）を滴下添加した。次いで、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドおよびトリエチルアミンを混合物に添加した。混合物を５０℃で２０時間撹拌した。混合物を室温に冷却した後、１０ｍＬの１０％塩酸水溶液を添加し、混合物を１回３０ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。合わせた有機層を、１回３０ｍＬのＮａ２ＣＯ３飽和水溶液で抽出した。次いで、合わせた水層を、濃縮塩酸でｐＨ１にし、１回３０ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、溶媒を真空中で蒸発させて、さらなる精製なしに６４ｉをベージュ色の固体として得た（０．１７７ｇ、５１％）。
2020524178.tif 000043
【００８８】
Ｎ−（４−アミノ−２−クロロベンジル）−４−（（１−トリフルオロメチル）シクロプロプ−１−イル）−ベンズアミド（６９ｆ）：１−（４−アミノ−１−クロロフェニル）メタンアミン５８ｋ（０．３１ｇ、２．０ｍｍｏｌ、３．０当量）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（０．３１ｇ、２．０ｍｍｏｌ、３．０当量）および４−（ジメチルアミノ）ピリジン（０．６６ｍｍｏｌ、０．０８ｇ、１．０当量）を、１０ｍＬのＣＨＣｌ３および１ｍＬのＤＭＦに溶解した。次いで、５ｍＬのＣＨＣｌ３および０．５ｍＬのＤＭＦに溶解した４−（（１−トリフルオロメチル）シクロプロプ−１−イル）安息香酸６４ｉ（０．１５ｇ、０．６６ｍｍｏｌ、１．０当量）を、１０分間にわたってゆっくり添加し、混合物を６０℃で５時間撹拌した。混合物を室温に冷却した後、１０ｍＬの１０％塩酸水溶液を添加し、相を分離し、水層をＮａ２ＣＯ３溶液でｐＨ１０にし、１回２０ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、溶媒を真空中で蒸発させた。さらなる精製を、ヘキサン／ＥｔＯＡｃ（５７：４３）を移動相として用いるカラムクロマトグラフィーによって行い、６９ｆを黄色の固体として得た（０．１２３ｇ、５０％）。Ｒｆ（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ＝５７：４３）＝０．４５。
2020524178.tif 000044
【００８９】
４−（（１−トリフルオロメチル）シクロプロプ−１−イル）−Ｎ−（２−クロロ−４−（メチルスルホンアミド）ベンジル）ベンズアミド（８４）：Ｎ−（４−アミノ−２−クロロベンジル）−４−（（１−トリフルオロメチル）シクロプロプ−１−イル）−ベンズアミド６９ｆ（０．１ｇ、０．０２８ｍｍｏｌ、１．０当量）を、１５ｍＬのＴＨＦに溶解し、１．５ｍＬのピリジンを添加した。塩化メシル７０（０．２２ｍＬ、２．８ｍｍｏｌ、１０．０当量）を慎重に添加し、混合物を室温で２４時間撹拌した。次いで、１５ｍＬの１０％塩酸水溶液を添加し、混合物を１回３０ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、溶媒を真空中で蒸発させた。さらなる精製を、ヘキサン／ＥｔＯＡｃ（５０：５０）を移動相として用いるカラムクロマトグラフィーによって行い、８４を白色の固体として得た（０．０５２ｇ、４１％）。Ｒｆ（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ＝５０：５０）＝０．３６。
2020524178.tif 000045
【００９０】
Ｎ−（４−アミノ−２−クロロベンジル）−４−（ピロリジン）−ベンズアミド（６９ｇ）  １−（４−アミノ−１−クロロフェニル）メタンアミン５８ｋ（０．４９ｇ、３．１ｍｍｏｌ、３．０当量）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（０．４９ｇ、３．１ｍｍｏｌ、３．０当量）および４−（ジメチルアミノ）ピリジン（１．１ｍｍｏｌ、０．１３ｇ、１．０当量）を、２０ｍＬのＣＨＣｌ３および２ｍＬのＤＭＦに溶解した。次いで、５ｍＬのＣＨＣｌ３および０．５ｍＬのＤＭＦに溶解した４−ピロリジン安息香酸（０．２ｇ、１．１ｍｍｏｌ、１．０当量）を、１０分間にわたってゆっくり添加し、混合物を６０℃で５時間撹拌した。混合物を室温に冷却した後、１０ｍＬの１０％塩酸水溶液を添加し、相を分離し、水層をＮａ２ＣＯ３溶液でｐＨ１０にし、１回２０ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、溶媒を真空中で蒸発させた。さらなる精製を、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（８６：１４）を移動相として用いるカラムクロマトグラフィーによって行い、６９ｇを黄色の固体として得た（０．１００ｇ、２９％）。Ｒｆ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン＝８６：１４）＝０．４５。
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【００９１】
４−（ピロリジン）−Ｎ−（２−クロロ−４−（メチルスルホンアミド）ベンジル）ベンズアミド（８５）：Ｎ−（４−アミノ−２−クロロベンジル）−４−（ピロリジン）−ベンズアミド６９ｇ（０．１ｇ、０．０３ｍｍｏｌ、１．０当量）を、１５ｍＬのＴＨＦに溶解し、２ｍＬのピリジンを添加した。塩化メシル７０（０．１２ｍＬ、１．５５ｍｍｏｌ、５．０当量）を慎重に添加し、混合物を室温で２時間撹拌した。次いで、１５ｍＬの１０％塩酸水溶液を添加し、混合物を１回３０ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、溶媒を真空中で蒸発させた。さらなる精製を、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（６７：３３）を使用するカラムクロマトグラフィーによって行い、８５を白色の固体として得た（０．０３３ｇ、２６％）。Ｒｆ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン＝６７：３３）＝０．３７。
2020524178.tif 000047
【００９２】
実施例４：仮想検査
化合物５７の結合を、リード化合物５が構築されたリガンドを含有するｓＥＨおよびＦＸＲのＸ線構造（ＦＸＲについては、化合物３／ＰＤＢ−ＩＤ：４ＱＥ８、ｓＥＨについては、化合物２／ＰＤＢ−ＩＤ：３Ｉ２８）を使用する分子ドッキングによってコンピュータで分析した。得られた結合様式（図２に示される）は、両方の標的に対するＮ−ベンジルベンズアミド５〜５７のＳＡＲと一致する。ＦＸＲにおける５７の結合様式では（図２Ａ）、ｔｅｒｔ−ブチル部分は、結合ポケットに緊密に適合し、らせんの安定化を通して受容体活性化を媒介する１２。隣接したフェニル環は、親油性ポケットの中に良好に位置付けられ、２位または３位における変動を許容しない。スルホンアミドは、親水性領域を占め、特異的な相互作用を示さず、これはベンジル部分のこの位置における親水性部分の広い許容性を説明する。アミド部分は、有向Ｈ結合を形成せず、これはＦＸＲ  Ｘ線構造４ＱＥ８における参照リガンド３の場合も同様である。メチレン架橋は、Ｌｅｕ２８７に近接して結合され、この位置に追加のメチル基を担持する化合物３２の強化された能力を説明する。塩素原子は、Ｉｌｅ３５２、およびＴｙｒ３６９のフェノール部分（補足図Ｓ１）によって定義された狭いサブポケットの方へ向いており、このサブポケットは、塩素またはフッ素（３０）を許容するが、２９におけるメチル置換基のような純粋に親油性の残基は許容しない。
【００９３】
５７とｓＥＨとの提案された結合様式（図２Ｂ）は、そのアミド基が、触媒残基Ｔｙｒ３８３、Ｔｙｒ４６６およびＡｓｐ３３５と相互作用することを明らかにする。メチレン架橋は、いかなる構造修飾も許容しない狭いトンネル内に位置する。ベンジル部分の塩素置換基は、親油性ポケットの方へ向いており、結合に重要である。ＦＸＲ結合様式と同様に、スルホンアミド部分はより親油性のサブポケットにおいて結合し、特異的な相互作用を形成しない。４−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル残基は、狭い疎水性ポケット内に位置し、芳香環の４位または３位における置換のための空間を提供するが、２位における置換のための空間は提供しない。
【００９４】
関連する核内受容体の中で５７の選択性プロファイルを研究するために、本発明者らは、１０μＭ濃度でのＰＰＡＲ、ＬＸＲ、ＲＸＲ、ＲＡＲ、ＰＸＲおよびＶＤＲに対するその活性を、それぞれの受容体に関するＧａｌ４−ハイブリッドレポーター遺伝子アッセイにおいて決定した（図３Ａ）。５７は、ＰＰＡＲαおよびＰＰＡＲδ、両方のＬＸＲサブタイプ、ならびにＲＸＲαに対して不活性であった。５７は、ＰＰＡＲγに対してのみ弱い部分的アゴニズムを呈し、ＥＣ５０値は１４．７±０．９μＭであったため、核内受容体の中でＦＸＲに対して高度に選択的である（選択性≧７２０）。さらに、５７は、水溶性テトラゾリウム（ＷＳＴ−１）アッセイにおいて最大１００μＭの濃度で細胞毒性活性を表さなかった（図３Ｂ）。代謝安定性を推定するために、５７を、ウィスターラットの肝臓マイクロソームとインキュベートし、これによって、６０分後に化合物の５０％超が残存する、許容可能な安定性が明らかになった（図３Ｃ）。さらに、本発明者らは、５７の代謝変換をインビトロでより詳細に研究し、その代謝産物を特定した（図６、スキーム１０）。ＬＣ−ＭＳ−ＭＳ分析（補足図Ｓ２〜Ｓ６）によると、５７は、アニリン６９ａを生じるスルホンアミド部分の加水分解によって、３つの異性体７７、７８および７９をもたらし得るｔｅｒｔ−ブチルベンズアミド部分におけるヒドロキシル化によって（図６、スキーム１０）、ならびにベンジル置換基の芳香環におけるヒドロキシル化によって代謝される。本発明者らは、ベンズアミド芳香環上にヒドロキシル基を担持する７７および７８を合成したが、両方の異性体は、代謝された残基において検出可能ではなく、７９を５７の代謝産物として確認した。代謝産物６９ａは、相当の能力を保持し、０．０４６±０．００６μＭのＥＣ５０値でＦＸＲを活性化し、０．０４０±０．００６μＭのＩＣ５０値でｓＥＨを阻害する。したがって、代謝産物６９ａは、インビボでの二重調節の薬理学的活性に寄与し得、元の化合物５７の薬理学的効果を延長し得る。
【００９５】
レポーター遺伝子アッセイよりも人工的でない条件下で５７のＦＸＲアゴニスト効果を評価するために、本発明者らはまた、ＨｅｐＧ２ヘパトーマ細胞におけるＦＸＲ標的遺伝子の発現に対する化合物の効果を定量化した（図４Ａ）。この目的で、細胞を５０μＭの内在性ＦＸＲアゴニストＣＤＣＡ（１ｂ）、０．１μＭおよび１μＭの部分的アゴニスト５７、または対照としてのＤＭＳＯ（０．１％）と８時間または１６時間インキュベートし、次いでＦＸＲ標的遺伝子のｍＲＮＡを定量化した。２ΔΔＣｔ方法に従ってデータを分析し、すべての結果を、ハウスキーピング遺伝子であるグリセリンアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の値に対して正規化した。ビヒクル処理された対照細胞の遺伝子発現を、１００％として定義した。５７は、部分的ＦＸＲアゴニストプロファイルを明らかにし、内在性アゴニストＣＤＣＡ（１ｂ）と同様に、しかしより小さい規模で、９つの研究された遺伝子すべてを調整した。胆汁酸塩排出タンパク質（ＢＳＥＰ）の発現は、５７によって中程度に増加しただけであったが、小型ヘテロ二量体パートナー（ｓｍａｌｌ  ｈｅｔｅｒｏ−ｄｉｍｅｒ  ｐａｒｔｎｅｒ（ＳＨＰ））、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体α（ＰＰＡＲα）、線維芽細胞成長因子１９（ＦＧＦ１９）、ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ４（ＰＤＫ４）および肝臓型脂肪酸結合タンパク質（脂肪酸結合タンパク質１、ＦＡＢＰ１）の誘導は、ＣＤＣＡ（１ｂ）の５０〜８０％の規模に達した。さらに、５７は、ＳＨＰの誘導を介してＦＸＲによって間接的に調節される、コレステロール７α−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ７Ａ１）、ステロール調節エレメント結合タンパク質１ｃ（ＳＲＥＢＰ１ｃ）および脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）を抑制した。ＣＹＰ７Ａ１に関して、５７は、部分的アゴニストとして動作し、１ｂよりも少ない抑制をもたらしたが、５７および１ｂによるＳＲＥＢＰ１ｃおよびＦＡＳの抑制は、同程度の規模に達した。すべての遺伝子について、５７は、０．１μＭおよび１μＭで同程度の効果をもたらし、これによりこれらの濃度での飽和を確認した。これに対して、ＰＰＡＲγ標的遺伝子であるスカベンジャー受容体３Ｂ（ＣＤ３６）およびサイトカイン様タンパク質２〜１９（ＦＡＭ３Ａ）は、１０μＭの高い方の濃度においても５７によって顕著には調節されず、これにより化合物の選択性をさらに確認した（図４Ｂ）。
【００９６】
可溶性エポキシドヒドロラーゼの阻害もまた、ＨｅｐＧ２細胞ホモジネート中、より人工的でない状況において、異なる濃度の阻害剤５７の存在下で重水素化ｓＥＨ基質１４．１５−ＥＥＴ−ｄ１１の変換を定量化することによって研究した（図４Ｃ）。化合物は、細胞ｓＥＨの頑強な阻害をもたらし、１ｎＭの濃度においてもＥＥＴ／ＤＨＥＴ比が統計的に有意に増加した。細胞状況において、５７は、ｓＥＨ阻害についておよそ１０ｎＭのＩＣ５０値を明らかにした。
【００９７】
実施例５：インビボ特性化
本発明者らは、５７の高い能力および非常に好ましいインビトロ特性によって促されて、雄の野生型Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスにおける化合物のパイロットインビボ研究を実施した（図５）。インビボでのＦＸＲ活性化およびｓＥＨ阻害に関する薬物動態プロファイルを記録し、薬力学的データを評価するために、６匹のマウスに５７の単回投与を行った（経口、体重１ｋｇあたり１０ｍｇ）。追加の３匹の動物をビヒクル対照とした。
【００９８】
二重調節剤５７は、好ましい経口バイオアベイラビリティ（ｃｍａｘ＝１１８２ｎｇ／ｍＬ）および急速な取り込み（ｔｍａｘ＝０．５ｈ）を示し、中程度の半減期（ｔ１／２＝０．７ｈ）を伴っていた。総じて、５７の単回投与は、およそ３〜４時間にわたってＥＣ５０（ＦＸＲ）値およびＩＣ５０（ｓＥＨ）値を超える有効濃度をもたらした（図５Ａ）。５７の薬力学的効果を評価するために、マウス血漿をＥＥＴ／ＤＨＥＴ比について分析し、ＦＸＲ標的遺伝子の発現を、適用の８時間後にマウスの肝臓において決定した（図５Ｂ）。８．９−および１１．１２−異性体のＥＥＴ／ＤＨＥＴ比は、５７での処置時におよそ２倍増加し、これはｓＥＨ活性がインビボで二重調節剤によって阻害されたことを示した。さらに、ＦＸＲ標的遺伝子の発現は、５７を受けたマウスの肝臓において変化し、ＢＳＥＰ（およそ３倍）、ＳＨＰ（およそ４倍）およびＦＧＦ１５（およそ２．５倍）の増加した発現、ならびに低減したＳＲＥＢＰ１ｃ（およそ５倍）レベルを伴い、これもまたインビボでのＦＸＲ活性化を示唆した（図５Ｃ）。ＣＹＰ７Ａ１  ｍＲＮＡレベルは、わずかな抑制傾向を示した。ＰＰＡＲγ標的遺伝子である脂肪酸輸送タンパク質（ＦＡＴＰ）の発現は、インビボで５７によって影響を受けなかった。したがって、パイロット動物研究は、許容可能な薬物動態を明らかにし、インビボでの５７の二重標的係合を明らかに示した。
【００９９】
肝細胞癌および肝硬変を起こり得る最も深刻な結果として伴うＮＡＳＨの発生の増加は、急速に増大する世界的な健康問題である。肝臓移植は、現在まで使用可能な唯一の有効な治療法であるが、薬理学的オプションに関する研究が非常に集中的である。ＦＸＲアゴニストであるＯＣＡ（１ａ）は、パイプラインを先導し、ＮＡＳＨに対抗する第１の有効な薬物となる見込みが高い。これは臨床試験において、いくつかの代謝的改善を伴い、抗脂肪症および抗線維症効果を呈した６，１２。二重ＰＰＡＲα／δアゴニストであるエラフィブラノールは、第ＩＩ相試験を良好に完了し、治療オプションとしてＯＣＡの後続となり得る３８。依然として、脂肪症、線維症および重要なことに炎症を伴うＮＡＳＨの多因子性質は、関与するすべての因子に対処するより広い治療戦略を必要とし得る。脂肪症に対するＦＸＲ活性化の優れた効能６，１２ならびにｓＥＨ阻害の肝臓への抗脂肪症効果および抗炎症効果に関する有望な報告２３，３９に照らして、本発明者らは、これらの戦略の組み合わせが相乗的であり得ると推測した。したがって、本発明者らは、良好に均衡がとれた活性を有するＦＸＲおよびｓＥＨの非常に強力な二重調節剤を開発した。
【０１００】
本発明者らは、部分的ＦＸＲアゴニストおよびｓＥＨ阻害剤の既知のファルマコフォアをマージすることに成功して、リード構造５を生成し、これは両方の標的に対して弱いものの統計的に有意な活性を表した。このリード化合物の低フラグメント様特性および構造的可撓性は、最適化を達成するための相当の構造的変動を可能にすることから、中程度の活性で十分であると思われた。４つの連続ステップにおいて、本発明者らは、ＦＸＲおよびｓＥＨに対する化合物クラスのＳＡＲを系統的に調査し、二重能力の強力な最適化に至った。しかしながら、本発明者らは、単一標的のいくつかの非常に強力な調節剤を特定したが、両方の標的に対して低ナノモルの能力を有する化合物は、系統的ＳＡＲ研究において発見されなかった。したがって、最終の決定的最適化ステップのために、単一標的に対する最も活性な剤の構造要素を組み合わせ、これが部分的ＦＸＲ活性化について２０．４±４．２ｎＭのＥＣ５０値およびｓＥＨ阻害について４．１±０．４ｎＭのＩＣ５０値を有する非常に強力な二重調節剤としての５７の開発につながった。５７のより広範なインビトロ特性化は、関連核内受容体に対する非常に好ましい選択性プロファイル、および最大１００μＭの濃度で細胞毒性活性がないことを明らかにした。インビトロ代謝の評価において、５７は、中程度に安定していることがわかり、これはインビトロでの中程度の半減期によって確認された。しかしながら、主な代謝産物の詳細な評価および特性化は、５７のスルホンアミド部分の加水分解によって形成されたアニリン６９ａがほぼ同程度の能力を有し、薬理学的に活性であり５７の二重調整効果を延長する可能性があることを示す。
【０１０１】
ＨｅｐＧ２細胞において、５７は、内在性アゴニストであるＣＤＣＡ（１ｂ）と比較して、ＦＸＲ標的遺伝子の部分誘導をもたらした。非形質導入肝臓細胞におけるこの観察、および部分的アゴニスト性調節が１μＭおよび０．１μＭの濃度で同程度であるという事実により、二重調節剤５７の真の部分的ＦＸＲアゴニスト性質が確認された。オベチコール酸（１ａ）の臨床開発６は、完全ＦＸＲアゴニストによる治療時にコレステロールホメオスタシスの妨害を報告しており、これはＦＸＲ標的遺伝子であるコレステロール７αヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ７Ａ１）の強い抑制に起因すると思われる。この酵素は、コレステロールの胆汁酸への代謝変換において第１の律速酵素を構成し、したがって完全ＦＸＲ活性化は、コレステロール排出の主要経路のうちの１つを遮断する。この副作用を回避するために、部分的ＦＸＲ活性化が好ましいと思われる。
【０１０２】
５７による刺激後のＨｅｐＧ２細胞のＦＸＲ標的遺伝子の発現プロファイルは、ＮＡＦＬＤおよびＮＡＳＨに対する有益な効果を示唆する。最近の研究は、ＮＡＦＬＤおよびＮＡＳＨ患者における線維芽細胞因子１９（ＦＧＦ１９）の低減した血清レベルを報告し４０、ＦＧＦ１９による処置は、マウスにおいてインスリン感受性を改善し、体重を低下させ、肝脂肪含有量を減少させた。ＯＣＡ（１ａ）による処置下で、増加したＦＧＦ１９レベルが観察され、これは重要で有益な薬力学的効果とみなされた１２。β酸化による肝脂肪酸分解の主要な調節因子と考えられているＰＰＡＲα４１の誘導と、脂肪酸デノボ合成の低減を引き起こす肝臓ＦＡＳの抑制との組み合わせは、肝脂肪症を低減するために好ましい。とりわけ、ＮＡＦＬＤおよびＮＡＳＨにおける肝脂肪含有量は、遊離脂肪酸によって占められる４。この効果は、糖分解の低減および結果としてエネルギー生成のための脂肪酸利用につながるＰＤＫ４の誘導によってさらに強化され得る４２。肝臓型脂肪酸結合タンパク質（ＦＡＢＰ１）は、多くの生理学的プロセスに関与し、脂質ホメオスタシスに広く影響を及ぼす。肝臓において、ＦＡＢＰ１は、細胞保護的役割を有し、酸化的細胞損傷に対抗する４３。肝細胞における酸化ストレスは、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨの進展および顕性化における主要因子であるため、５７によってもたらされるようなＦＡＢＰ１の強化された発現が、ＮＡＳＨにおいて好ましいと思われる。
【０１０３】
可溶性エポキシドヒドロラーゼに対する５７の阻害能力もまた、ＨｅｐＧ２細胞溶解物中の重水素化ｓＥＨ基質１４．１５−ＥＥＴ−ｄ１１の変換を定量化することによって、より人工的でない状況で研究した。このシステムでは、５７は、１．６±０．５ｎＭのＩＣ５０値を有し、これは組み換えタンパク質に関する無細胞蛍光ベースのアッセイにおいて得られた結果と完全に一致する。したがって、二重調節剤５７は、他のタンパク質および肝細胞からの細胞成分の存在下で、ヒトｓＥＨを阻害することにおいて同程度に強力である。
【０１０４】
本発明者らは、有望なインビトロプロファイルに促され、雄の野生型Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスにおけるパイロットインビボ研究に５７を適用して、二重調節剤の薬物動態および薬力学的効果を評価した。５７は、好ましい速い取り込みおよび経口バイオアベイラビリティを示し、分子はむしろ短い半減期を有していたが、本発明者らは、体重１ｋｇあたり１０ｍｇの単回経口投与後、およそ３．５〜４時間にわたって活性濃度を観察した。５７の適用後８時間のマウス肝臓におけるＦＸＲ標的遺伝子のｍＲＮＡの定量化は、統計的有意性に至ることはわずかにできなかったもののＳＨＰおよびＢＳＥＰの明らかな上方調節の傾向を明らかにし、ならびにＦＧＦ１５およびＳＲＥＢＰ１ｃの発現に対する顕著な効果を明らかにした。ＣＹＰ７Ａ１は、わずかな下方調節傾向を示した。特に、ＢＳＥＰの誘導は、この遺伝子がＦＸＲによってほぼ排他的に調節されるため、インビボでの５７によるＦＸＲの活性化を示す４４−４６。さらに、上述されるように、ＳＲＥＢＰ１ｃの抑制およびＦＧＦ１５の誘導は、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨ治療における好ましい効果を示唆する。インビボでのｓＥＨ阻害に関して、本発明者らは、血漿におけるｓＥＨ基質（ＥＥＴ）対ｓＥＨ生成物（ＤＨＥＴ）の比に対する５７の効果を評価し、これらの比は二重調節剤を受けたマウスにおいてＥＥＴへ著しくシフトした。このＥＥＴの蓄積は、５７がインビボでも同様にｓＥＨを阻害し、ＮＡＳＨにおける有益な効果に高度に寄与するであろう抗炎症活性を呈し得ることを示す。
【０１０５】
低ナノモルの能力でＦＸＲを部分的に活性化しｓＥＨを阻害する、本明細書で報告された二重調節剤５７は、そのような活性を有する最初の化合物である。ＦＸＲ標的遺伝子の発現およびＥＥＴ／ＤＨＥＴ比の調整を伴うその薬力学的効果は、５７が、インビボで両方の標的に到達することを示す。この固有の活性のために、この二重調節剤は、より大きな動物モデルについて、ＮＡＳＨおよび関連する代謝障害または心血管障害におけるその治療効果およびＦＸＲ／ｓＥＨ二重調節の概念を研究するのに完全に適格である。
【０１０６】
材料および方法
化学
一般。すべての化学物質および溶媒は、試薬グレードであり、別途特定されない限り、さらなる精製なしに使用された。すべての反応は、アルゴン雰囲気下オーブン乾燥したガラス容器内、および純粋溶媒中で行った。ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＶ４００、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＶ３００、Ｂｒｕｋｅｒ  ａｍ２５０ｘｐまたはＢｒｕｋｅｒ  ＡＶ５００分光計（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）で記録した。化学シフト（δ）は、基準としてのテトラメチルシラン（ＴＭＳ）に対してｐｐｍ単位で報告され、多重度：ｓ，一重項；ｄ，二重項；ｄｄ，二重項の二重項；ｔ，三重項；ｄｔ，三重項の二重項；ｍ，多重項；近似カップリング定数（Ｊ）は、ヘルツ（Ｈｚ）単位で示される。質量スペクトルは、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）を使用し、ＶＧ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ  ＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）で得られた。高解像度質量スペクトルは、ＭＡＬＤＩ  ＬＴＱ  ＯＲＢＩＴＲＡＰ  ＸＬ計器（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で記録した。化合物純度は、１ｍＬ／分の流量での勾配（Ｈ２Ｏ／ＭｅＯＨ  ８０：２０＋０．１％ギ酸の５分間のイソクラチックから、さらに４５分後のＭｅＯＨ＋０．１％ギ酸、およびさらに１０分間のＭｅＯＨ＋０．１％ギ酸）ならびに２４５ｎｍおよび２８０ｎｍでのＵＶ検出を使用し、ＭｕｌｔｏＨｉｇｈ１００  フェニル−５μ  ２４０＋４ｍｍカラム（ＣＳ−Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｅ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  ＧｍｂＨ，Ｌａｎｇｅｒｗｅｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を備えたＶａｒｉａｎ  ＰｒｏＳｔａｒ  ＨＰＬＣ（ＳｐｅｃｔｒａＬａｂ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，Ｍａｒｋｈａｍ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）で分析した。化合物１６は、ＭＳにおいて分子イオンが見出されなかったため、元素分析によって分析した。生物学的評価のためのすべての最終化合物は、純度≧９５％を有していた。
【０１０７】
二重調節剤５７の調製：
１−（４−アミノ−１−クロロフェニル）メタンアミン（５８ｋ）：ＬｉＡｌＨ４（ＴＨＦ中１Ｍ、１６．４ｍＬ、１６．４ｍｍｏｌ、２．５当量）を０℃に冷却した。３ｍＬのＴＨＦ中の４−アミノ−２−クロロベンゾニトリル６２（１．０ｇ、６．６ｍｍｏｌ、１．０当量）を、混合物にゆっくり添加した。Ｈ２の発生が止まった後、混合物を放置して室温まで温め、次いで１６時間還流した。室温に冷却した後、混合物を１０ｍＬのＴＨＦで希釈し、次いで０℃に冷却した。１ｍＬの１０％  ＮａＯＨ溶液および１．８ｍＬの水を滴下添加した。無色の沈殿物をセライトで濾過し、１５ｍＬのジエチルエーテルで洗浄した。濾液からの有機溶媒の蒸発により、５８ｋを黄色の油として得た（０．７７ｇ、７５％）。
2020524178.tif 000048
【０１０８】
Ｎ−（４−アミノ−２−クロロベンジル）−４−（ｔｅｒｔ−ブチル）ベンズアミド（６９ａ）：１−（４−アミノ−１−クロロフェニル）メタンアミン５８ｋ（０．３１ｇ、２．０ｍｍｏｌ、１．１当量）を、１０ｍＬのＣＨＣｌ３に溶解し、５ｍＬのＮＥｔ３を添加し、混合物を０℃に冷却した。４−ｔｅｒｔ−ブチルベンゾイルクロリド６３ｏ（０．３５ｍＬ、１．８ｍｍｏｌ、１．０当量）を、１０分間にわたってゆっくり添加し、混合物を室温で２時間撹拌した。次いで、５０ｍＬの１０％塩酸水溶液を添加し、相を分離し、水層を３０ｍＬのＥｔＯＡｃで洗浄した。この水層をＮａ２ＣＯ３溶液でｐＨ１０にし、１回につき８０ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、溶媒を真空中で蒸発させた。さらなる精製を、ペトロールエーテル／ＥｔＯＡｃ（９：１）を移動相として用いるカラムクロマトグラフィーによって行い、６９ａを黄色の固体として得た（０．５７ｇ、９７％）。Ｒｆ（ペトロールエーテル／ＥｔＯＡｃ＝２：１）＝０．２６。
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【０１０９】
４−（ｔｅｒｔ−ブチル）−Ｎ−（２−クロロ−４−（メチルスルホンアミド）ベンジル）ベンズアミド（５７）：Ｎ−（４−アミノ−２−クロロベンジル）−４−（ｔｅｒｔ−ブチル）ベンズアミド６９ａ（０．０４ｇ、０．１２ｍｍｏｌ、１．０当量）を、５ｍＬのＣＨＣｌ３に溶解し、０．５ｍＬのピリジンを添加した。塩化メシル７０（０．０２ｍＬ、０．１４ｍｍｏｌ、１．２当量）を慎重に添加し、混合物を室温で２時間撹拌した。次いで、１５ｍＬの１０％塩酸水溶液を添加し、混合物を１回３０ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、溶媒を真空中で蒸発させた。さらなる精製を、ペトロールエーテル／ＥｔＯＡｃ（４：１）を移動相として用いるカラムクロマトグラフィーによって行い、５７を無色の固体として得た（０．０４７ｇ、６６％）。Ｒｆ（ペトロールエーテル／ＥｔＯＡｃ＝２：１）＝０．１３。
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【０１１０】
化合物４〜５６および７７〜７８の調製および特性化、ならびにそれぞれの中間体については、補足情報を参照されたい。
【０１１１】
生物学的評価
全長ＦＸＲトランス活性化アッセイ
プラスミド：ｐｃＤＮＡ３−ｈＦＸＲは、ヒトＦＸＲの配列を含有し、既に他の場所で公開されている４７。ｐＧＬ３ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｆｉｔｃｈｂｕｒｇ，ＷＩ，ＵＳＡ）をレポータープラスミドとして使用し、胆汁酸塩排出タンパク質（ＢＳＥＰ）のプロモーターの短縮構築物を、ルシフェラーゼ遺伝子の前のＳａｃＩ／ＮｈｅＩ切断部位にクローニングした４８。ｐＲＬ−ＳＶ４０（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、形質導入効率および細胞成長の正規化のための対照として形質導入した。ｐＳＧ５−ｈＲＸＲも同様に、他の場所で既に公開されている４９。
【０１１２】
アッセイ手順：ＨｅＬａ細胞を、１０％  ＦＣＳ、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）で補充したＤＭＥＭ高グルコース中、３７℃および５％のＣＯ２で成長させた。形質導入の２４時間前に、ＨｅＬａ細胞を、９６ウェルプレートに、１ウェルあたり８０００細胞の密度で播種した。形質導入の３．５時間前に、培地を、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）および０．５％のチャコール処理済みＦＣＳで補充したＤＭＥＭ高グルコースに変更した。ＢＳＥＰ−ｐＧＬ３、ｐＲＬ−ＳＶ４０ならびに発現プラスミドｐｃＤＮＡ３−ｈＦＸＲおよびｐＳＧ５−ｈＲＸＲによるＨｅＬａ細胞の一過性形質導入は、リン酸カルシウム形質導入方法を使用して実行した。形質導入の１６時間後に、培地を、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）および０．５％のチャコール処理済みＦＣＳで補充したＤＭＥＭ高グルコースに変更した。形質導入の２４時間後に、培地を、フェノールレッドなしで、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）および０．５％チャコール処理済みＦＣＳで補充し、ここでは追加として０．１％  ＤＭＳＯおよびそれぞれの試験化合物または０．１％  ＤＭＳＯ単独を無処置対照として含有する、ＤＭＥＭに変更した。各濃度を三つ組のウェルで試験し、各実験を、独立して少なくとも３回繰り返した。試験化合物との２４時間のインキュベーションに続いて、製造者のプロトコルに従ってＤｕａｌ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用し、ルシフェラーゼ活性について細胞をアッセイした。Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００ルミノメーター（Ｔｅｃａｎ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ，Ｃｒａｉｌｓｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、発光を測定した。形質導入効率および細胞成長の正規化は、ホタルルシフェラーゼデータをウミシイタケルシフェラーゼデータで除算し、１０００を掛けることによって行い、相対光単位（ＲＬＵ）を得た。活性化倍率は、それぞれの濃度での試験化合物の平均ＲＬＵを、無処置対照の平均ＲＬＵで除算することによって得られた。相対活性化は、それぞれの濃度での試験化合物の活性化倍率を、ＦＸＲ完全アゴニストであるＧＷ４０６４（１ｃ）の３μＭでの活性化倍率で除算することによって得られた。ＥＣ５０および平均値の標準誤差は、４パラメータロジスティック回帰を使用し、ＳｉｇｍａＰｌｏｔ  １０．０（Ｓｙｓｔａｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＧｍｂＨ，Ｅｒｋｒａｔｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により、少なくとも３回の独立した実験の平均相対活性化値を用いて算出した。このアッセイは、ＦＸＲアゴニストである１ｂ（ＥＣ５０＝１８±１μＭ，８８±３％の相対最大活性化）、１ａ（ＥＣ５０＝０．１６±０．０２μＭ，８７±３％の相対最大活性化）および１ｃ（ＥＣ５０＝０．５１±０．１６μＭ，３μＭを１００％として定義した）で検証した１５。
【０１１３】
ｓＥＨ活性アッセイ
化合物のｓＥＨ阻害能力は、組み換えヒト酵素を使用し、蛍光ベースの９６ウェルｓＥＨ活性アッセイにおいて決定した５０，５１。ｓＥＨによって蛍光６−メトキシナフトアルデヒドに加水分解され得る、非蛍光ＰＨＯＭＥ（３−フェニルシアノ−（６−メトキシ−２−ナフタレニル）メチルエステル２−オキシラン酢酸；Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を基質とした。組み換えヒトｓＥＨ（最終濃度０．０１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００を含有する０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡを含む、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７）中）を、試験化合物（ＤＭＳＯ中、最終ＤＭＳＯ濃度：１％）と室温で３０分間、プレインキュベートした。次いで、基質を添加し（最終濃度５０μＭ）、基質の加水分解を、Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ２００  Ｐｒｏ（λｅｍ＝３３０ｎｍ、λｅｘ＝４６５ｎｍ）で３０分間（毎分１ポイント）蛍光生成物の形成を測定することによって決定した。ブランク対照（タンパク質なしおよび化合物なし）ならびに陽性対照（化合物なし）を実施した。すべての実験を三つ組で行い、少なくとも３回の独立した実験において繰り返した。ＩＣ５０の算出の場合、漸増する化合物濃度の用量応答曲線を記録した。
【０１１４】
ＰＰＡＲα／γ／δ、ＬＸＲα／β、ＲＸＲα／β／γ、ＲＡＲα／β／γ、ＶＤＲおよびＰＸＲのハイブリッドレポーター遺伝子アッセイ
プラスミド：Ｇａｌ４融合受容体プラスミドであるｐＦＡ−ＣＭＶ−ｈＰＰＡＲα−ＬＢＤ５２、ｐＦＡ−ＣＭＶ−ｈＰＰＡＲγ−ＬＢＤ５２、ｐＦＡ−ＣＭＶ−ｈＰＰＡＲδ−ＬＢＤ５２、ｐＦＡ−ＣＭＶ−ｈＬＸＲα−ＬＢＤ３２およびｐＦＡ−ＣＭＶ−ｈＬＸＲβ−ＬＢＤ３２は、以前に報告されている。それぞれの核内受容体の標準的アイソフォームのヒンジ領域およびリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）（ＵｎｉＰｒｏｔエントリー：ｈＲＸＲα−Ｐ１９７９３、残基２２５〜４６２；ｈＲＸＲβ−Ｐ２８７０２−１、残基２９４〜５３３；ｈＲＸＲγ−Ｐ４８４４３−１、残基２２９〜４６３；ｈＲＡＲα−Ｐ１０２７６−１、残基１７７〜４６２；ｈＲＡＲβ−Ｐ１０８２６−１、残基１７７〜４５５；ｈＲＡＲγ−Ｐ１３６３１−１、残基１７９〜４５４；ｈＶＤＲ−Ｐ１１４７３−１、残基１１９〜４２７；ｈＰＸＲ−Ｏ７５４６９−１、残基１３８〜４３４）をコードするＧａｌ４融合受容体プラスミドｐＦＡ−ＣＭＶ−ｈＲＸＲα−ＬＢＤ、ｐＦＡ−ＣＭＶ−ｈＲＸＲβ−ＬＢＤ、ｐＦＡ−ＣＭＶ−ｈＲＸＲγ−ＬＢＤ、ｐＦＡ−ＣＭＶ−ｈＲＡＲα−ＬＢＤ、ｐＦＡ−ＣＭＶ−ｈＲＡＲβ−ＬＢＤ、ｐＦＡ−ＣＭＶ−ｈＲＡＲγ−ＬＢＤ、ｐＦＡ−ＣＭＶ−ｈＶＤＲ−ＬＢＤおよびｐＦＡ−ＣＭＶ−ｈＰＸＲ−ＬＢＤは、市販のｃＤＮＡ（Ｓｏｕｒｃｅ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ，Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）のＰＣＲ増幅から得られたｃＤＮＡフラグメントを、ｐＦＡ−ＣＭＶベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）のＢａｍＨ１切断部位およびその前に挿入されたＫｐｎＩ切断部位に組み込むことによって構築した。すべての融合受容体のフレームおよび配列は、配列決定によって検証した。ｐＦＲ−Ｌｕｃ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）をレポータープラスミドとして、ｐＲＬ−ＳＶ４０（Ｐｒｏｍｅｇａ）を形質導入効率および細胞成長の正規化のために使用した。
【０１１５】
アッセイ手順：ＨＥＫ２９３  Ｔ細胞を、１０％  ＦＣＳ、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）で補充したＤＭＥＭ高グルコース中、３７℃および５％のＣＯ２で成長させた。形質導入の前日に、ＨＥＫ２９３  Ｔ細胞を９６ウェルプレートに播種した（２．５・１０４細胞／ウェル）。形質導入前に、培地を補充なしのＯｐｔｉ−ＭＥＭに変更した。一過性形質導入は、ｐＦＲ−Ｌｕｃ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＲＬ−ＳＶ４０（Ｐｒｏｍｅｇａ）およびｐＦＡ−ＣＭＶ−ｈＲＸＲα−ＬＢＤを用いて、製造者のプロトコルに従ってリポフェクタミンＬＴＸ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して実行した。形質導入の５時間後に、培地を、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）で補充し、ここでは追加として０．１％  ＤＭＳＯおよびそれぞれの試験化合物または０．１％  ＤＭＳＯ単独を無処置対照として含有する、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭに変更した。各濃度を三つ組で試験し、各実験を、独立して少なくとも３回繰り返した。試験化合物と一晩（１２〜１４時間）インキュベーションした後、製造者のプロトコルに従ってＤｕａｌ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用し、ルシフェラーゼ活性について細胞をアッセイした。Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００ルミノメーター（Ｔｅｃａｎ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ）を用いて、発光を測定した。形質導入効率および細胞成長の正規化は、ホタルルシフェラーゼデータをウミシイタケルシフェラーゼデータで除算し、その値に１０００を掛けることによって行い、相対光単位（ＲＬＵ）を得た。活性化倍率は、それぞれの濃度での試験化合物の平均ＲＬＵを、無処置対照の平均ＲＬＵで除算することによって得られた。相対活性化は、それぞれの濃度での試験化合物の活性化倍率を、それぞれの参照アゴニストの１μＭでの活性化倍率で除算することによって得られた（ＰＰＡＲα：ＧＷ７６４７；ＰＰＡＲγ：ピオグリタゾン；ＰＰＡＲδ：Ｌ１６５，０４１；ＬＸＲα／β：Ｔ０９０１３１７；ＲＸＲ：ベキサロテン；ＲＡＲ：トレチノイン；ＶＤＲ：カルシトリオール；ＰＸＲ：ＳＲ１２８１３）。すべてのハイブリッドアッセイは、上述の参照アゴニストを用いて検証し、文献と一致するＥＣ５０値を得た。
【０１１６】
ＦＸＲ標的遺伝子の定量化（定量的リアルタイムＰＣＲ）
ＦＸＲ標的遺伝子の定量化は、以前に記載されているように行った１５。簡潔に説明すると、ＨｅｐＧ２細胞を、試験化合物５７（０．１μＭおよび１μＭ）または１ｂ（５０μＭ）または無処置対照としての０．１％  ＤＭＳＯ単独と８時間または１６時間インキュベートし、採取し、冷たいリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した後、ＲＮＡ抽出に直接使用した。２マイクログラムの全ＲＮＡを、全ＲＮＡミニキット（Ｒ６８３４−０２、Ｏｍｅｇａ  Ｂｉｏ−Ｔｅｋ，Ｉｎｃ．，Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ，ＵＳＡ）によって、ＨｅｐＧ２細胞から抽出した。高性能ｃＤＮＡ逆転写キット（４３６８８１４、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）を使用し、製造者のプロトコルに従って、ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。ＦＸＲ標的遺伝子の発現は、ＰｏｗｅｒＳＹＢＲＧｒｅｅｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；１２．５μＬ／ウェル）を使用し、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（商標）システム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、定量的リアルタイムＰＣＲ分析によって評価した。プライマーは、補足情報に列挙されている。各試料を二つ組で設定し、少なくとも３回の独立した実験において繰り返した。発現は、比較ΔΔＣｔ方法によって定量化し、グリセリンアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）を参照遺伝子とした。結果（１００％として設定されたビヒクルと比較した発現の平均±ＳＥＭ％変化として表される、ｎ≧４）：ＢＳＥＰ：ＤＭＳＯ：１００；１ｂ（５０μＭ）：５５７±２８；５７（０．１μＭ）：２１６±１８；５７（１μＭ）：２２２±２０。ＳＨＰ：ＤＭＳＯ：１００；１ｂ（５０μＭ）：３６８±３５；５７（０．１μＭ）：２４２±６１；５７（１μＭ）：３１７±７８。ＣＹＰ７Ａ１：ＤＭＳＯ：１００；１ｂ（５０μＭ）：３４±１２；５７（０．１μＭ）：５０±７；５７（１μＭ）：５２±８。ＰＰＡＲα：ＤＭＳＯ：１００；１ｂ（５０μＭ）：２８９±５９；５７（０．１μＭ）：１７０±１１；５７（１μＭ）：２１１±１０。ＳＲＥＢＰ１ｃ：ＤＭＳＯ：１００；１ｂ（５０μＭ）：４５±７；５７（０．１μＭ）：４９±１７；５７（１μＭ）：３６±１２。ＦＡＳ：ＤＭＳＯ：１００；１ｂ（５０μＭ）：３４±１４；５７（０．１μＭ）：２２±８；５７（１μＭ）：３８±１５。ＦＧＦ１９：ＤＭＳＯ：１００；１ｂ（５０μＭ）：４０７±４２；５７（０．１μＭ）：３０９±１０１；５７（１μＭ）：３２５±７７。ＰＤＫ４：ＤＭＳＯ：１００；１ｂ（５０μＭ）：２８４±５０；５７（０．１μＭ）：２５５±５４；５７（１μＭ）：２２６±５７。ＦＡＢＰ１：ＤＭＳＯ：１００；１ｂ（５０μＭ）：２４９±１７；５７（０．１μＭ）：１８３±３４；５７（１μＭ）：１９４±４２。ＣＤ３６：ＤＭＳＯ：１００；ピオグリタゾン（１μＭ）：３５３±４３；５７（１μＭ）：１１９±３３；５７（１０μＭ）：１２９±４２。ＦＡＭ３Ａ：ＤＭＳＯ：１００；ピオグリタゾン（１μＭ）：３１０±６６；５７（１μＭ）：１１２±１２；５７（１０μＭ）：１４２±７。
【０１１７】
細胞ｓＥＨアッセイ
細胞ｓＥＨ代謝活性の定量化は、Ｚｈａらによって記載されているように行った５３。したがって、ＨｅｐＧ２細胞からの１μｇの全細胞ホモジネート（０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡを含有する１００μＬのＰＢＳ中に希釈した）を、異なる濃度の５７、陽性対照としてのＮ−シクロヘキシル−Ｎ′−（４−ヨードフェニル）尿素（ＣＩＵ、１０μＭ）３６または陰性対照としてのビヒクル（最終濃度１％のＤＭＳＯ）と１５分間、３７℃でインキュベートした。２５ｎｇの（±）１４（１５）−ＥＥＴ−ｄ１１（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＵＳＡ）を添加し、インキュベーションを３７℃でさらに１０分間継続した。同様に処理したＰＢＳ（０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含有する）でブランク試験を行った。１００μＬの氷冷メタノールを添加することによって、反応を停止させた。遠心分離（２０００ｒｐｍ、４℃、５分）後、上澄みをＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析し、（±）１４（１５）−ＥＥＴ−ｄ１１および対応する（±）１４（１５）−ＤＨＥＴ−ｄ１１の量を決定した。上澄みからの（±）１４（１５）−ＥＥＴ−ｄ１１および（±）１４（１５）−ＤＨＥＴ−ｄ１１の定量化は、マウス血漿からのＥＥＴおよびＤＨＥＴの定量化について報告された手順に従い、ＬＣ−ＭＳによって行った（下記を参照）。結果（平均（±）１４（１５）−ＥＥＴ−ｄ１１／（±）１４（１５）−ＤＨＥＴ−ｄ１１比±ＳＥＭとして表される；ｎ＝３）：ブランク（細胞なし）：４９９±１２３；ＤＭＳＯ（１％）：６３±１６；ＣＩＵ（１０μＭ）：５１９±５５；５７：０．００１μＭ：１９１±７；０．０１μＭ：３９６±６５；０．１μＭ：４４２±７；１μＭ：６０２±５６；１０μＭ：６１４±９６。
【０１１８】
動物研究
動物および化合物の適用：９匹の雄Ｃ５７ＢＬ／６ＪＲｊマウス（体重２３〜２６ｇ、Ｊａｎｖｉｅｒ  Ｌａｂｓ（Ｆｒａｎｃｅ）から購入した）を、本研究において使用した。動物を温度制御された部屋（２０〜２４℃）に入れ、明１２時間／暗１２時間のサイクルで維持した。食餌および水は自由に摂取可能であった。インライフ（ｉｎ  ｌｉｆｅ）相は、医薬品開発業務受託機関であるＰｈａｒｍａｃｅｌｓｕｓ（Ｓａａｒｂｒｕｃｋｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって行われた。すべての実験手順は、地域の動物愛護当局（Ｌａｎｄｅｓａｍｔ  ｆｕｒ  Ｇｅｓｕｎｄｈｅｉｔ  ｕｎｄ  Ｖｅｒｂｒａｕｃｈｅｒｓｃｈｕｔｚ，Ａｂｔｅｉｌｕｎｇ  Ｌｅｂｅｎｓｍｉｔｔｅｌ−ｕｎｄ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｗｅｓｅｎ，Ｓａａｒｂｒｕｃｋｅｎ）によって承認され、その規定に従って行った。６匹の動物は、１％  ＨＰＭＣ／Ｔｗｅｅｎ  ８０（９９：１）を含有する水中の二重調節剤５７の体重１ｋｇあたり１０ｍｇの単回経口投与を受けた。３匹の動物は、ビヒクル（１％  ＨＰＭＣ／Ｔｗｅｅｎ  ８０（９９：１）を含有する水）を受けた。すべての動物は、研究期間中正常に行動し、有害作用を示さなかった。
【０１１９】
血液および肝臓試料採取：６つの時点で（５７の適用後１５分、３０分、６０分、１２０分、２４０分および４８０分）、６匹の拘束された意識のあるマウスの血液（２０μＬ）を横尾静脈から得た。最後の時点（４８０分）で、マウスをイソフルラン下で麻酔し、血液（約５００μＬ）を後眼窩穿刺によって得た。血液の一部を遠心分離して（６０００ｒｐｍ、１０分、＋４℃）、ＥＥＴ／ＤＨＥＴ比の定量化のための血漿を得て、さらなる評価まで−８０℃で保存した。肝臓回収のために、最後の血液採取後（投与後８時間）に、マウスを頸椎脱臼によって屠殺した。完全な肝臓を即時に急速冷凍し、さらなる評価まで−８０℃で保存した。ビヒクル（１％  ＨＰＭＣ／Ｔｗｅｅｎ  ８０（９９：１））の経口適用を受けた３匹の対照マウスから血漿および肝臓を同様に得た。
【０１２０】
血漿試料からの５７の定量化：較正試料：試験製品のストック溶液（ＤＭＳＯ中１ｍｇ／ｍＬ）を、ＤＭＳＯ中で最終濃度２００μｇ／ｍＬ（開始溶液）に希釈した。さらなるワーキング溶液を、ＤＭＳＯ中でのワーキング溶液の希釈によって調製した。個々のストック溶液を、較正標準およびＱＣの調製に使用した。較正標準およびＱＣは、薬物を含まない２０μＬのブランク血液に、２．４μＬのワーキング溶液を加えることによって調製した。したがって、未知の試料、ゼロ試料およびブランクに、２．４μＬのＤＭＳＯを加えた。較正標準および品質管理は、二つ組で調製した。内部標準（グリセオフルビン、６００ｎｇ／ｍＬ）を含有する４０μＬ量のアセトニトリルを、２２．４μＬの未知の試料、ゼロ試料、較正標準およびＱＣ試料に添加した。内部標準を含まないアセトニトリルを、ブランク試料に添加した。すべての試料を激しく振とうし、６０００ｇで１０分間、室温で遠心分離した。粒子を含まない上澄み（５０μＬ）を等量の水で希釈した。分割量を２００μＬのサンプラーバイアルに移し、その後、１５μＬの注入量でＬＣ  ＭＳに供した。ＬＣ−ＭＳ分析：ＨＰＬＣポンプ流量を６００μＬ／分に設定し、プレカラム（Ｋｉｎｅｔｅｘ  Ｐｈｅｎｙｌ−Ｈｅｘｙｌ，ＳｅｃｕｒｉｔｙＧｕａｒｄ  Ｕｌｔｒａ，２．１ｍｍ）を有するＫｉｎｅｔｅｘ  Ｐｈｅｎｙｌ−Ｈｅｘｙｌ、２．６μｍ、５０×２．１ｍｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ａｓｃｈａｆｆｅｎｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）分析カラムで分離した。水相（Ａ）としての水および０．１％ギ酸ならびに有機相（Ｂ）としての０．１％ギ酸含有アセトニトリルによる勾配溶出を使用した：％Ｂ（ｔ（分））、０（０−０．１）−９７（０．４−１．７）−０（１．８−３．０）。全走査質量スペクトルは、シリンジポンプ注入を使用して陽イオンモードで取得され、プロトン化された準分子イオン［Ｍ＋Ｈ］＋を特定した。イオン量を最大化するために自動調節を行い、一般的なパラメータ設定を使用して特徴的なフラグメントイオンを特定した：イオン移動キャピラリ温度３５０℃、キャピラリ電圧３．８ｋＶ、衝突気体０．８ｍｂａｒアルゴン、シースガス、イオンスイープガスおよび補助ガス圧は、それぞれ２０、２および８（任意単位）であった。薬物動態分析は、Ｋｉｎｅｔｉｃａ  ５．０ソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＵＳＡ）を使用し、非コンパートメントモデルを適用して行った。
【０１２１】
マウス肝臓からのＦＸＲ標的遺伝子ｍＲＮＡの定量化：ＲＴ−ｑＰＣＲのためのマウス肝臓組織の肝細胞単離：肝臓試料を均質化するために、各肝臓の３分の１を、５０ｍＬのＦａｌｃｏｎ管中の、４０μｍ孔径を有するＦａｌｃｏｎ（商標）細胞ストレーナ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｅｒｅｍｂｏｄｅｇｅｍ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）上に置いた。すべての組織を、１０％  ＦＣＳおよび１％  ＰｅｎＳｔｒｅｐを含有するＰＢＳ緩衝液で洗い、５ｍＬの細胞懸濁液が回収されるまで細胞ストレーナに押し通した。試料を１２００ｒｐｍで１０分間、４℃で遠心分離した。上澄みを廃棄し、ペレットを５ｍＬの冷たいＰＢＳ緩衝液で洗浄し、１２００ｒｐｍで１０分間、４℃で再度遠心分離した。上澄みを廃棄した後、細胞ペレットを１ｍＬのＰＢＳに再懸濁し、Ｅ．Ｚ．Ａ．全ＲＮＡキットＩ（Ｏｍｅｇａ  ｂｉｏ−ｔｅｋ  Ｉｎｃ．，Ｎａｒｃｏｓｓ，Ｇｅｏｒｇｉａ，ＵＳＡ）を使用し、動物組織プロトコルに従って、全ＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡを、ｑＲＴ−ＰＣＲに使用し、ＨｅｐＧ２細胞からのｍＲＮＡ定量化について記載したのと同様に処理した（上記を参照）。マウス遺伝子のＰＣＲプライマーを補足情報に列挙する。結果（１００％として設定されたビヒクルと比較した発現の平均±ＳＥＭ％変化として表される。５７の場合ｎ＝６、ビヒクルの場合ｎ＝３）：ＢＳＥＰ：ビヒクル：１０５±２４；５７（１０ｍｇ／ｋｇ）：３１２±１０３。ＳＨＰ：ビヒクル：１０８±２９；５７（１０ｍｇ／ｋｇ）：４１０±１４７。ＣＹＰ７Ａ１：ビヒクル：１０６±２５；５７（１０ｍｇ／ｋｇ）：７０±１１。ＳＲＥＢＰ１ｃ：ビヒクル：８２±１４；５７（１０ｍｇ／ｋｇ）：１７±１０。ＦＧＦ１５：ビヒクル：１１９±１５；５７（１０ｍｇ／ｋｇ）：２５４±９。ＦＡＴＰ：ビヒクル：１０１±１；５７（１０ｍｇ／ｋｇ）：１０５±５。
【０１２２】
マウス血漿試料からのＥＥＴ／ＤＨＥＴ比の分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるエポキシエイコサトリエン酸（ＥＥＴ）およびそれらの代謝産物であるジヒドロキシエポキシエイコサトリエン酸（ＤＨＥＴ）の決定）：抽出された試料の８．９−ＥＥＴ、１１．１２−ＥＥＴおよびそれらのデヒドロ代謝産物の含有量は、液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を用いて分析した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムは、ＡＰＩ５５００  ＱＴｒａｐ（ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含み、ネガティブＥＳＩモードで動作するＴｕｒｂｏ−Ｖ−ソース、Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００バイナリＨＰＬＣポンプおよび脱ガス装置（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ならびに２５μＬのＬＥＡＰシリンジ（Ａｘｅｌ  Ｓｅｍｒａｕ  ＧｍｂＨ，Ｓｐｒｏｃｋｈｏｖｅｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を装備したＨＴＣ  Ｐａｌオートサンプラー（Ｃｈｒｏｍｔｅｃｈ，Ｉｄｓｔｅｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を備えていた。質量分析計のための高純度窒素は、ＮＧＭ２２−ＬＣ／ＭＳ窒素生成器（ｃｍｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｅｓｃｈｂｏｒｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって生成した。すべての化合物は、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ，ＵＳＡ）から得た。２５００ｎｇ／ｍＬの全分析物を含むストック溶液を、メタノール中で調製した。エポキシエイコサトリエン酸およびそれらのデヒドロ代謝産物のさらなる希釈によって、０．１〜２５０ｎｇ／ｍＬの濃度範囲の実用標準を得た。マウス血漿試料の抽出は、液液抽出によって行った。１５０μＬの試料／マトリックスホモジネートを、２０μＬの内部標準（メタノール中２００ｎｇ／ｍＬの濃度の８．９−ＥＥＴ−ｄ８および１１．１２−ＥＥＴ−ｄ８）と緩やかに混合し、６００μＬの酢酸エチルで２回抽出した。標準曲線および品質管理のための試料を調製するために、１５０μＬのＰＢＳを添加し、さらに２０μＬのメタノール、２０μＬの実用標準および２０μＬの内部標準を、１５０μＬのマトリックスホモジネートの代わりに添加した。緩やかな窒素流の下、４５℃の温度で有機溶媒を蒸発させた。残渣を５０μＬのメタノール／水（５０：５０、ｖ／ｖ）で再構成し、１００００ｇで２分間遠心分離し、次いでガラスバイアル（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ，Ｄｕｒｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に移した後、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムに注入した。クロマトグラフィー分離のために、Ｇｅｍｉｎｉ  ＮＸ  Ｃ１８カラムおよびプレカラムを使用した（内径１５０ｍｍ×２ｍｍ、粒径５μｍおよび孔径１１０Å、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ａｓｃｈａｆｆｅｎｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。総実行時間１７．５分、０．５ｍＬ／分移動相の流量で、線形勾配を用いた。移動相は、Ａ  水／アンモニア（１００：０．０５、ｖ／ｖ）およびＢ  アセトニトリル／アンモニア（１００：０．０５、ｖ／ｖ）であった。勾配は、８５％Ａから開始し１２分以内に１０％にし、これを１０％Ａで１分間保持した。０．５分以内に、移動相を８５％Ａに戻し、３．５分間保持してカラムを次の試料のために平衡化した。試料の注入量は２０μＬであった。定量化は、内部標準方法（同位体希釈質量分析）を用い、Ａｎ��ｌｙｓｔソフトウェアＶ１．５．１（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で行った。分析物ピーク面積と内部標準面積との比（ｙ軸）を、濃度（ｘ軸）に対してプロットし、較正曲線を、１／ｃ２加重を伴う最小二乗回帰によって計算した。結果（平均比±ＳＥＭとして表される；５７の場合ｎ＝６、ビヒクルの場合ｎ＝３）：８，９−ＥＥＴ／８，９−ＤＨＥＴ：ビヒクル：０．４０±０．０３；５７（１０ｍｇ／ｋｇ）：０．６３±０．０３。１１，１２−ＥＥＴ／１１，１２−ＤＨＥＴ：ビヒクル：０．１５±０．０１；５７（１０ｍｇ／ｋｇ）：０．２５±０．０３。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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