(57)【要約】  本発明は、治療剤及び組成物、特に、多重特異性免疫グロブリン可変ドメインを含む治療剤の半減期を増大するための、血清アルブミンに高い親和性で結合する、免疫グロブリン可変ドメインを含むポリペプチドに関する。また、本発明の血清アルブミン結合免疫グロブリン可変ドメインを含むポリペプチドを製造するための方法も本明細書において提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫グロブリン可変ドメイン（ＩＶＤ）を含むポリペプチドであって、ＩＶＤは、血清アルブミンと結合し、ＩＶＤのアミノ酸配列は、以下の構造：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を含み、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列番号４、８、９、１０又は１１のいずれかの中に存在するようなＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域から選択される、ポリペプチド。
【請求項２】
ＣＤＲ１が配列番号１を含み、ＣＤＲ２が配列番号２を含み、ＣＤＲ３が配列番号３を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
フレームワーク３（ＦＲ３）領域のアミノ酸配列が、配列番号４のＦＲ３配列に対応する、又は、ＦＲ３領域のアミノ酸配列が、（Ｋａｂａｔ番号付けに従って）位置７３及び７４のアミノ酸が任意のアミノ酸であり、位置７８のアミノ酸がＶ若しくはＬであり、位置７９のアミノ酸がＨ若しくはＹであり、並びに／又は、位置８２ｂのアミノ酸がＴ若しくはＳである、配列番号４のヒト化変異体のＦＲ３配列に対応する、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
配列番号４又は配列番号４のヒト化変異体のアミノ酸配列を含むＩＶＤを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
（Ｋａｂａｔ番号付けに従って）位置７９のＦＲ３アミノ酸がＹである、及び／又は、位置８２ｂのＦＲ３アミノ酸がＳである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
配列番号４のヒト化変異体のアミノ酸配列を含むＩＶＤを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
配列番号４のヒト化変異体が、配列番号８、９、１０、１１、１５、１６若しくは１７、又はそのさらなるヒト化変異体である、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
さらなるヒト化変異体が、少なくとも１つのさらなるアミノ酸において、（Ｋａｂａｔ番号付けに従って）位置１でＥ又はＤに、位置５でＶに、位置１４でＰに、位置７３で任意のアミノ酸に、位置７４で任意のアミノ酸に、位置７８でＬに、又は位置１０８でＬに、置換された配列番号４、８、９、１０、１１、１５、１６又は１７を含む請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項９】
ＩＶＤコンジュゲートであり、ＩＶＤがＣＤＲ１のリシン残基を介してカップリングされている、請求項１〜８のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１０】
ＩＶＤが、薬物にコンジュゲートされている、請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
治療用部分の半減期を増大するために使用するための、請求項１〜１０のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のポリペプチド及び治療用部分を含む治療剤であって、治療剤の半減期が、ポリペプチドを伴わない治療用部分の半減期と比較して長いことを特徴とする、血清半減期が増大された治療剤。
【請求項１３】
医薬として使用するための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のポリペプチド又は請求項１２の治療剤。
【請求項１４】
請求項１〜１１のいずれかに記載のポリペプチド及び少なくとも１種の治療用部分を含む多重特異性構築物。
【請求項１５】
治療用部分が、ＩＶＤ、免疫グロブリン単一可変ドメイン又はその断片を含む、請求項１４に記載の多重特異性構築物。
【請求項１６】
ポリペプチドが、リンカー又はスペーサーを介して少なくとも１種の治療用部分に連結されている、請求項１４又は１５のいずれか一項に記載の多重特異性構築物。
【請求項１７】
請求項１〜１１のいずれかに記載のポリペプチド若しくは請求項１４〜１６のいずれかに記載の多重特異性構築物をコードするヌクレオチド配列又は核酸。
【請求項１８】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の多重特異性構築物、又は請求項１７に記載のヌクレオチド配列若しくは核酸を含む宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１〜１１のいずれかに記載の少なくとも１種のポリペプチド、請求項１２に記載の治療剤、請求項１４〜１６のいずれかに記載の多重特異性構築物、及び任意選択的に少なくとも１種の薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項２０】
血清アルブミン結合ポリペプチドを製造する方法であって、
ｉ．好適な発現系において、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の多重特異性構築物、又は請求項１７に記載のヌクレオチド配列若しくは核酸を発現させるステップと、
ｉｉ．血清アルブミン結合ポリペプチドを精製するステップと
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、治療剤及び組成物の、特に、多重特異性免疫グロブリン可変ドメインを含む治療剤の半減期を増大するための、血清アルブミンに高い親和性で結合する、免疫グロブリン可変ドメインを含むポリペプチドに関する。また、本発明の血清アルブミン結合免疫グロブリン可変ドメインを含むポリペプチドを製造する方法も、本明細書において提供される。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体、抗体断片及びワクチン、ホルモン、増殖因子、サイトカイン、血液凝固因子、酵素、融合タンパク質並びにその他のタンパク質など、ますます多数のタンパク質治療剤が開発されており、全抗体及び５０ｋＤａ未満の分子量を有するＦｃ融合タンパク質を除いて、それらの多くは、腎濾過及び分解によって迅速に排除され、その結果、短い血漿半減期となる。この弱点によって、治療効果を保証するために、高用量かつ頻繁な投薬が必要となり、結果として相当な負の副作用を伴うこととなり、このことは、例えば、糖尿病へのインスリン又は多発性硬化症を患っている患者におけるインターフェロン薬のような、治療剤の頻繁な全身投与を伴う患者にとって、特に有害である。半減期拡大戦略の調査は、明白な治療上の利益並びに経済的利益ゆえに、バイオテクノロジー及び製薬産業によってますます注目を集めていることがわかっている。
【０００３】
血清アルブミン及びＩｇＧ分子などのいくつかの血漿タンパク質は、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ、Ｂｒａｍｂｅｌｌ受容体）を介した再利用機序ゆえに、２〜４週間の範囲（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ、２００９年）の並外れて長い半減期を有する（Ｃｈａｕｄｈｕｒｙら、２００３年；Ｒｏｏｐｅｎｉａｎ及びＡｋｉｌｅｓｈ、２００７年）。細胞によって取り込まれるアルブミン及びＩｇＧは、初期エンドソームの酸性環境において、ｐＨ依存的な様式でＦｃＲｎと結合する。この結合は、アルブミン及びＩｇＧをリソソームコンパートメントにおける分解から逸脱させ、それらを原形質膜に再度向かわせ、ここで、中性ｐＨのために血漿中に放出されて戻される。この機序は、例えば、アルブミン又はＩｇＧのＦｃ領域との融合によってタンパク質の半減期を延長するために、利用されてきた。半減期拡大には、血清アルブミンもまた、アルブミンと非共有結合によって相互作用する能力を有するモジュールを介して、関与することができる。これらのアプローチにおいて、アルブミン結合部分は、治療用タンパク質とコンジュゲートされるか、又は遺伝子的に融合される。アルブミンに対して固有の親和性を有する分子だけでなく、ペプチド、抗体断片、代替足場並びにアルブミン結合活性を示すように作製及び選択された小さい化学物質などのその他の分子も含め、広範な種々の部分が使用されてきた。
【０００４】
ラクダ科の動物は、軽鎖を欠き（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎら、１９９３年）、その単一Ｎ末端ドメインを有する機能的抗体、ＶＨＨを産生し、これは、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）とも呼ばれ、ドメイン対合を必要とせず抗原と結合する。このようなＶＨＨは、その小さなサイズ、高い安定性、遺伝子融合による修飾の容易さ及び微生物における良好な産生レベルゆえに、興味深い治療的可能性を提示する。しかし、ＶＨＨの小さなサイズはまた、患者に投与される場合には、循環からのその迅速なクリアランスゆえに、治療的に不利な点でもある。他方、このことはまた、ＶＨＨを半減期拡大分子とカップリングする機会又は特定の薬物（例えば、抗体−薬物コンジュゲートの形成）若しくはトレーサーとカップリングする機会も提供する。種々のカップリング法は、当技術分野で記載されており（例えば、特に、モノクローナル抗体の修飾の分野において適用されており）、これらの技術は、例えば、それぞれ、第一級アミン基（リシン残基及びＮ末端）を介するか、又はシステインを介するか、アシル化若しくはアルキル化による、コンジュゲーションに焦点を当てている。
【０００５】
マウス及びラットでは、血清アルブミンの天然半減期は、およそ１．５〜２．５日であり、種々の血清アルブミン結合剤が、同等の半減期（すなわち、およそ２日）を示すことがわかっている。マウスアルブミンに対して特異的なＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）は、２つの拮抗的抗ＥＧＦＲ  Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）と融合して、二重特異的三価分子を生成し、それによって半減期を１から４４時間までに増大し、動物モデルにおいてＥＧＦＲ陽性腫瘍の成長を効率的に遅延させた（Ｒｏｏｖｅｒｓら、２００７年）。しかし、前臨床研究に関して、ラットの代謝生理学は、マウスのものよりもヒトに近く、このためラットが、薬物の薬物動態／薬力学的特徴及びヒト毒性学を研究するためのより良好な種となる。さらに、マウスと比較したラットのより大きなサイズによって、洗練された外科的操作が可能となり、並びに最適な実験的読取りのためのより大容量の血液／ＣＳＦ及び組織が入手可能となる。現在、遺伝子修飾されたラットモデルはまた、薬物有効性及び安全性研究を可能にし、それによって、安全性研究を行うための前臨床研究において、効力として、同一の系統及び種において本質的にラットがマウスよりもより橋渡し的になる。例えば、Ｈｏｅｆｍａｎら（２０１５年）によって研究されるように、げっ歯類、霊長類及びヒトなどの異なる種におけるアルブミン結合剤の半減期は、有効性研究において最適な投薬を可能にし、所望の曝露を達成して、より信頼できる種間曝露予測を可能にするために重要である。したがって、治療標的種、すなわち、ヒトにおける血清アルブミン結合タンパク質の半減期だけでなく、前臨床開発設定における対象の各動物種におけるアルブミンについても、依拠することは明らかに重要である。治療用タンパク質の半減期を延長するために、ヒトアルブミンに対して十分に高い親和性を有する血清アルブミン結合剤又はポリペプチドを見出すことだけでなく、前臨床結果の成功率及び応用可能性を増大するために、げっ歯類などの頻繁に使用される試験動物において最も高い親和性又は最も長い半減期を有するそれらの血清アルブミン結合剤を同定することは、有利であろう。
【０００６】
ＶＨＨは、一価の又は多価若しくは多重特異性構造を有するその小さなサイズのために、及びＶＨＨ標的化血清アルブミン抗原との融合によって治療用タンパク質半減期を延長する可能性のために、治療的標的化にとって有利である。血清アルブミン結合ＶＨＨの別の例が、血清アルブミンに対する、特に、ヒト血清アルブミンに対するＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）を記載するＡｂｌｙｎｘ  Ｎ．Ｖ．（ＷＯ２００４／０４１８６５及びＷＯ２００６／１２２７８７）によって提供され、これは、患者における前記（治療用）タンパク質の半減期を増大するために、その他の（治療用）タンパク質（例えば、所望の標的に対する１種以上のその他のＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標））に連結され得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００４／０４１８６５号
【特許文献２】国際公開第２００６／１２２７８７号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ、２００９年
【非特許文献２】Ｃｈａｕｄｈｕｒｙら、２００３年
【非特許文献３】Ｒｏｏｐｅｎｉａｎ及びＡｋｉｌｅｓｈ、２００７年
【非特許文献４】Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎら、１９９３年
【非特許文献５】Ｒｏｏｖｅｒｓら、２００７年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、結論として、血清アルブミン結合ＶＨＨは、おそらくはＶＨＨも、血清アルブミン結合ＶＨＨの融合パートナーとして、ヒトにおいてだけではなく試験種においても、治療用タンパク質の半減期を増大するのに興味深いものであり、非ヒト霊長類におけるより大規模な研究又はフォローアップ臨床研究の前の、より広範な前臨床データ収集を可能にする。このような血清アルブミン結合ＶＨＨは、新規治療剤のより信頼できる、容易な開発を可能にする。また、ＶＨＨはまた、例えば、抗体−薬物コンジュゲートとして腫瘍標的化において有用であると示されたので（Ｆａｎｇら、２０１６年）、血清アルブミンとの結合機能を妨げることなくコンジュゲートされ得る特定のＶＨＨ及び理想的には、新規治療剤の効率的なＲ＆Ｄを増大する前記の２つの特性の組合せを同定することが望ましい。最後に、治療的使用のために開発されるべきＶＨＨはまた、それらの生化学的特性に関して適したものでなくてはならない。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、血清アルブミンと結合し、相補性決定領域（ＣＤＲ）のうちの１つの中に存在するグリコシル化部位の突然変異の際に、驚くべきことに、その血清アルブミン結合親和性を保持しており、さらに、ラット血清アルブミンに対して極めて高い親和性を実証した、新規ＶＨＨの作製及び特性決定に関する。さらに、前記新規血清アルブミン結合ＶＨＨは、導入されたリシン及びコンジュゲートをカップリングした後、ＣＤＲ１においてセリンのリシンへの突然変異が行われても、その血清アルブミン結合親和性、したがって、インビボ半減期拡大能が保持されたので、高い抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）能を有する。
【００１１】
本発明の第１の態様は、免疫グロブリン可変ドメイン（ＩＶＤ）を含むポリペプチドに関し、前記ＩＶＤは、ＢｉｏＬａｙｅｒ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙによって決定される通り血清アルブミンに高い親和性で結合し、前記ＩＶＤは、共通構造ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４に従うアミノ酸配列を含み、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）は、ＳＡ１＿Ｓ３０ＫＶＨＨ（配列番号４）又はそのヒト化変異体（ｈ１〜ｈ４：配列番号：８〜１１、図５）中に存在するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域によって表される。図１には、ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋを考慮したＣＤＲ領域のアノテーションが示されている。特に、前記ＣＤＲ領域は、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ、ＭａｃＣａｌｌｕｍ又はＩＭＴＧ法によって決定される。血清アルブミンに対する特異的親和性は、一実施形態では、ヒト血清アルブミン、代替として、ラット、マウス及びカニクイザル血清アルブミンである。一実施形態では、ポリペプチドは、ＣＤＲが、ＣＤＲ１について配列番号１のアミノ酸配列、ＣＤＲ２について配列番号２のアミノ酸配列及びＣＤＲ３について配列番号３のアミノ酸配列によって定義されるＩＶＤを含む。
【００１２】
さらなる一実施形態では、本発明のポリペプチドは、ＣＤＲが本明細書において記載されるように定義されるＩＶＤを含み、ＦＲ３領域は、ＳＡ１＿Ｓ３０ＫのＦＲ３領域又はＳＡ１＿Ｓ３０Ｋのヒト化変異体のＦＲ３アミノ酸配列によって定義され、ＦＲ３領域は、適用されるアノテーションに従って定義され（図１）、ＩＶＤの位置７３及び７４は、任意のアミノ酸であってよく、位置７８は、Ｖ又はＬであってよく、位置７９は、Ｈ又はＹであり、及び／又は位置８２ｂは、Ｔ又はＳである（Ｋａｂａｔ番号付けに従って）。一実施形態では、ＦＲ３配列は、配列番号１８に対応するＡｂＭのアノテーションに従って定義され、位置７４はＳであり、位置７９はＹであり、及び／又は位置８２ｂはＳである。
【００１３】
別の実施形態では、血清アルブミン結合ＩＶＤを含む前記ポリペプチドは、ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ（配列番号４）のアミノ酸配列又はそのヒト化変異体を含むＩＶＤに関する。
【００１４】
別の実施形態は、本発明の前記ＩＶＤを含むポリペプチドに関し、位置７９のＦＲ３アミノ酸配列は、チロシン（Ｙ）であり、及び／又は位置８２ｂのアミノ酸配列は、セリン（Ｓ）である（Ｋａｂａｔ番号付けに従って）。一実施形態では、ポリペプチドは、ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ（又は配列番号４）のヒト化変異体である前記ＦＲ３アミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含むＩＶＤを含む。特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、それぞれ、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１５、配列番号１６又は配列番号１７に表されるようなＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ  ｈ１〜ｈ７のヒト化変異体を含む。より詳しくは、ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋは、代替として、少なくとも１つの置換によってヒト化されてもよく、又は前記ヒト化変異体は、位置１の、Ｅ又はＤへの、位置５の、Ｖへの、位置１４の、Ｐへの、位置７３の、任意のアミノ酸への、位置７４の、任意のアミノ酸への、位置７８の、Ｌへの、又は位置１０８の、Ｌへの（Ｋａｂａｔ番号付けに従って、また、図５（「代替ｈ」）に提示される）少なくとも１つのさらなる置換をさらに含んでいてもよい。特定の実施形態では、前記血清アルブミン結合ＩＶＤを含む前記ポリペプチドは、ＩＶＤコンジュゲートであり、前記ＩＶＤは、ＣＤＲ１中に存在するリシン残基を介して、より特には、配列番号１の位置１に示されるように、前記コンジュゲートとカップリングされている。より特定の実施形態では、前記コンジュゲートは薬物である。
【００１５】
一実施形態は、治療用部分の半減期を増大するために使用するための本発明の前記ポリペプチドに関する。代替的な実施形態は、血清半減期が増大した治療剤に関し、前記薬剤が本発明のポリペプチド及び治療用部分を含むことを特徴とし、治療剤の血清半減期は、本発明のポリペプチドを有さない薬剤と比較してより長い。別の実施形態は、医薬として使用するために、本発明のポリペプチド又は本発明のポリペプチドを含む治療剤を適用する。
【００１６】
第２の態様において、本発明は、前記血清アルブミン結合免疫グロブリン可変ドメイン（ＩＶＤ）を含む前記ポリペプチド及び少なくとも１種の治療用部分を含む多重特異性構築物に関する。別の実施形態は、治療用部分がＩＶＤ又はその断片を含む、前記多重特異性構築物に関する。より特定の実施形態では、治療用部分は、免疫グロブリン単一可変ドメイン又はその断片を含む。さらにより特定には、一実施形態では、前記ポリペプチドは、リンカー又はスペーサーを介して少なくとも１種の治療用部分に連結される。
【００１７】
本発明の別の態様は、本発明のポリペプチド又は多重特異性構築物をコードするヌクレオチド配列又は核酸を提供する。その他の実施形態は、本発明によるポリペプチド、多重特異性構築物又はヌクレオチド配列又は核酸を含む宿主細胞に関する。
【００１８】
さらなる実施形態は、本明細書において記載されるものなどの少なくとも１種のポリペプチド、多重特異性構築物又は治療剤及び任意選択的に少なくとも１種の薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む医薬組成物を開示する。
【００１９】
本発明の最終態様は、血清アルブミン結合ポリペプチドを製造する方法であって、ｉ）好適な発現系における前記ポリペプチド、前記多重特異性構築物又は前記ヌクレオチド配列又は核酸の組換え発現のステップ及びｉｉ）前記アルブミン結合ＩＶＤを含む前記血清アルブミン結合ポリペプチドを得るための前記の発現された血清アルブミン結合ポリペプチドの単離又は精製のステップを含む、方法に関する。
【００２０】
記載される図面は、単に模式的なものであり、制限するものではない。図面では、要素の一部のサイズは、例示目的で、誇張され、縮尺通りに描かれていない場合もある。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】血清アルブミン結合ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ  ＶＨＨ及びＣＤＲアノテーションのアミノ酸配列を示す図である。アミノ酸のＫａｂａｔ番号付けが示されており、ＣＤＲは、ＭａｃＣａｌｌｕｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９６年）第２６２巻、７３２〜７４５頁に記載されるように、接触解析及び結合部位トポグラフィーに基づいて示されている。代替ＣＤＲアノテーション（ＡｂＭ、Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ）に対応する領域も示されている。
【図２】ビオチン化ＳＡ１、Ａｌｂ８及びＳＡ１＿Ｓ３０Ｋの、ヒト血清アルブミンとの結合を示すＥＬＩＳＡを示す図である。
【図３】マウスにおけるＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ  ＶＨＨの薬物動態プロファイルを示す図である。マウスにおける１０ｍｇ／ｋｇでの静脈内（ｉｖ）又は腹膜内（ｉｐ）注射の際のＶＨＨ−ＧＦＰ−ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋの血漿中濃度。
【図４】精製ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋヒト化ＶＨＨ変異体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す図である。５μｇのロードされたＮｂのクマシー染色ゲル。左から右に：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｐａｇｅｒｕｌｅｒ事前染色マーカー、精製ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ  ｈ１、ｈ２、ｈ３、ｈ４ＶＨＨ（それぞれ、さらなるＨｉｓ−タグを有する配列番号８、９、１０、１１）。
【図５】ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ  ＶＨＨ及びヒト化変異体のアラインメントを示す図である。ＣＤＲ領域は、図１においてアノテートされるように灰色で示されている。ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋのアミノ酸配列は、Ｋａｂａｔに従って番号付けされている。ヒト化変異体ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ＿ｈ１〜ｈ４（それぞれ配列番号８〜１１に対応するｈ１、ｈ２、ｈ３及びｈ４）におけるアミノ酸置換が、ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋの配列とのアラインメントにおいて示されている。さらに、可能性のある代替ヒト化位置／置換が、「代替ｈ」と示される行に示されており、この行に提示されている置換の、上記で提示される任意の配列（ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ、ｈ１〜ｈ４）と一緒の任意の組合せは、ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ（配列番号４）の、又はＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ＿ｈ１（配列番号８）の、ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ＿ｈ２（配列番号９）、ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ＿ｈ３（配列番号１０）、ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ＿ｈ４（配列番号１１）の（さらに）ヒト化された変異体を含む。
【図６−１】ヒト参照コンセンサス配列と比較したヒトＩＧＨＶ３生殖系列対立遺伝子のアラインメントを示す図である。ここでは、ＩＧＨＶ３−３０、ＩＧＨＶ３−３３、ＩＧＨＶ３−ＮＬ１、ＩＧＨＶ３−９、ＩＧＨＶ３−２５、ＩＧＨＶ３−４３及びＩＧＨＶ３−２０の対立遺伝子が比較されている（本出願においてアミノ酸配列、配列番号１９〜１５７に対応する）。配列は、ＩＭＧＴデータベースに、又はＴｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ＦａｃｔｓＢｏｏｋ（Ｌｅｆｒａｎｃ  ａｎｄ  Ｌｅｆｒａｎｃ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、２００１年）に見られる。
【図６−２】ヒト参照コンセンサス配列と比較したヒトＩＧＨＶ３生殖系列対立遺伝子のアラインメントを示す図である。ここでは、ＩＧＨＶ３−３０、ＩＧＨＶ３−３３、ＩＧＨＶ３−ＮＬ１、ＩＧＨＶ３−９、ＩＧＨＶ３−２５、ＩＧＨＶ３−４３及びＩＧＨＶ３−２０の対立遺伝子が比較されている（本出願においてアミノ酸配列、配列番号１９〜１５７に対応する）。配列は、ＩＭＧＴデータベースに、又はＴｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ＦａｃｔｓＢｏｏｋ（Ｌｅｆｒａｎｃ  ａｎｄ  Ｌｅｆｒａｎｃ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、２００１年）に見られる。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明を、特定の実施形態に関して、ある特定の図面を参照して説明するが、本発明はそれに制限されず、特許請求の範囲によってのみ制限される。特許請求の範囲における任意の参照符号は、範囲を制限するものと解釈されてはならない。もちろん、本発明の任意の特定の実施形態に従って、必ずしもすべての態様又は利点が達成され得るわけではないということは理解されるべきである。したがって、例えば、当業者は、本発明は、本明細書において教示されるような１つの利点又は利点の群を達成又は最適化する様式で実施され、行われ得るが、必ずしも、本明細書において教示又は示唆され得るようなその他の態様又は利点を達成しないと認識する。
【００２３】
本発明は、組織化及び操作方法の両方について、その特性及び利点と一緒に、添付の図面とともに読まれる場合に以下の詳細な説明を参照することによって、最も良く理解され得る。本発明の態様及び利点は、本明細書において以下に記載される実施形態の参照から明らかとなり、解明される。本明細書を通じて「一実施形態（ｏｎｅ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」又は「一実施形態（ａｎ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」への言及は、その実施形態とともに記載される特定の特性、構造又は特徴が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書を通じて種々の場所における語句「一実施形態（ｏｎｅ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）において」又は「一実施形態（ａｎ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）において」の出現は、必ずしもすべて同一の実施形態を参照しないが、その場合もある。同様に、当然のことではあるが、本発明の例示的実施形態、本発明の種々の特性の説明は、本開示を合理化する目的で、及び種々の本発明の態様のうちの１つ以上の理解を目的として、単一の実施形態、図又はその説明に一緒にまとめられることもある。しかし、この開示の方法は、特許請求される本発明は、各特許請求の範囲において明確に列挙されるものより多くの特性を必要とするという意図を反映すると解釈されてはならない。むしろ、以下の特許請求の範囲が反映するように、本発明の態様は、単一の前記の開示される実施形態のすべての特性より少ないものにある。
【００２４】
単数名詞に言及する場合に、不定冠詞又は定冠詞、例えば「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」が使用される場合には、別に具体的に明記されない限り、これは複数のその名詞を含む。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」が、本説明及び特許請求の範囲において使用される場合には、その他の要素又はステップを排除しない。さらに、本説明において、及び特許請求の範囲において、用語、第１の、第２の、第３のなどは、同様の要素を区別するために使用され、必ずしも連続的又は時間的順序を説明するためではない。そのように使用される用語は、適当な状況下で互換的であること及び本明細書において記載される本発明の実施形態は、本明細書において記載又は例示されるものの他の順序で操作可能であることは理解されるべきである。以下の用語又は定義は、単に、本発明の理解に役立つように提供される。本明細書において具体的に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての用語は、本発明の技術分野における当業者にとってのものと同一の意味を有する。実施者は、当技術分野における定義及び用語について、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第４版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｓｖｉｅｗ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２０１２）；及びＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（付録１１４）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２０１６）に特に指示される。本明細書において提供される定義は、当業者に理解されるものよりも小さい範囲を有すると解釈されてはならない。
【００２５】
定義
「約」とは、本明細書において、量、持続期間などといった測定可能な値に言及する場合に、指定値からの±２０％又は±１０％、より好ましくは、±５％、さらにより好ましくは、±１％、いっそうより好ましくは、±０．１％の変動を包含するものとし、そのようなものとして、変動は、開示される方法を実施するのに適当である。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド配列」、「ＤＮＡ配列」又は「核酸分子」は、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのいずれかの任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。この用語は、単に分子の一次構造を指す。したがって、この用語は、二本鎖及び一本鎖ＤＮＡ並びにＲＮＡを含む。また、この用語は、公知の種類の修飾、例えば、メチル化、天然に存在するヌクレオチドのうちの１つ以上の類似体による「キャップ」置換も含む。「コード配列」とは、適当な調節配列の制御下に置かれる場合に、ｍＲＮＡに転写される、及び／又はポリペプチドに翻訳される、ヌクレオチド配列である。コード配列の境界は、５’末端の翻訳開始コドン及び３’末端の翻訳停止コドンによって決定される。コード配列は、限定されるものではないが、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、組換えヌクレオチド配列又はゲノムＤＮＡを含むことができ、ここで、イントロンは、同様にある特定の状況下で存在し得る。本明細書において使用される「遺伝子」は、遺伝子のプロモーター領域並びにコード配列の両方を含む。ゲノム配列（可能性のあるイントロンを含む）並びにプロモーター配列に作動可能に連結されているスプライシングされたメッセンジャーに由来するｃＤＮＡの両方を指す。
【００２７】
用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、「ペプチド」は、アミノ酸残基のポリマー（本明細書において３文字又は１文字コードで示され、各３又は１文字は、標準コードに従ってアミノ酸残基を命名する）並びにその変異体及び合成類似体をさらに指すために互換可能に使用される。したがって、これらの用語は、１個以上のアミノ酸残基が、合成の天然に存在しないアミノ酸、例えば、対応する天然に存在するアミノ酸の化学的類似体であるアミノ酸ポリマー並びに天然に存在するアミノ酸ポリマーに当てはまる。この用語はまた、ポリペプチドの翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、リン酸化及びアセチル化も含む。「タンパク質ドメイン」は、タンパク質中の別個の機能的及び／又は構造的ユニットである。通常、タンパク質ドメインは、特定の機能又は相互作用の責任を負い、タンパク質の全体的な役割に貢献する。ドメインは、種々の生物学的背景で存在する可能性があり、同様のドメインは、異なる機能を有するタンパク質において見られることもある。「組換えポリペプチド」とは、組換え技術を使用して、すなわち、組換え又は合成ポリヌクレオチドの発現によって作製されたポリペプチドを意味する。キメラポリペプチド又はその生物学的に活性な部分が組換えによって生成されている場合には、培養培地を実質的に含まない、すなわち、培養培地は、タンパク質調製物の容量の約２０％未満、より好ましくは、約１０％未満、最も好ましくは、約５％未満に相当することも好ましい。「単離された」又は「精製された」は、その天然状態において通常付随する構成要素を実質的に又は本質的に含まない材料を意味する。例えば、本明細書で使用される場合、「単離されたポリペプチド」又は「精製されたポリペプチド」は、天然に存在する状態においてそれに隣接する分子から精製されているポリペプチド、例えば、前記の単離されたタンパク質に隣接する生産宿主中に存在する分子から回収されている血清アルブミン結合ＩＶＤタンパク質を含むタンパク質を指す。このような単離された又は純粋なタンパク質はまた、アミノ酸化学合成によって作製され得る、又は組換え生産によって作製され得る。
【００２８】
用語「融合タンパク質」とは、２つ以上の別個の（ポリ−）ペプチド又はタンパク質を、好ましくは、ヘッドトゥーテール（すなわち、Ｎ末端からＣ末端又はその逆）で接合し、結果として、元のタンパク質の各々に由来する機能的特性を有する単一タンパク質が得られることによって作出されたタンパク質を指す。本明細書で使用される場合、用語「に融合された」とは、特に、例えば、組換えＤＮＡ技術による遺伝子融合を指す。融合物は、２つのタンパク質間で直接的に作製されてもよく、又はリンカーを介して作製されてもよい。
【００２９】
本明細書で使用される場合、用語「検出可能な標識又はタグ」とは、本明細書において記載された単離された若しくは精製された（ポリ−）ペプチドの検出及び／又は単離、精製及び／又は固定化を可能にする検出可能な標識又はタグを指し、これらの目的のための当技術分野で公知の任意の標識／タグを含むものとする。特に好ましいものとして、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリ（Ｈｉｓ）（例えば、６ｘ  Ｈｉｓ又はＨｉｓ６）、Ｓｔｒｅｐ−タグ（登録商標）、Ｓｔｒｅｐ−タグＩＩ（登録商標）及びＴｗｉｎ−Ｓｔｒｅｐ−タグ（登録商標）などの親和性タグ、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）及びＳＵＭＯなどの可溶化タグ、ＦＬＡＧ−タグなどのクロマトグラフィータグ、Ｖ５−タグ、ｍｙｃ−タグ及びＨＡ−タグなどのエピトープタグ、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰなど）及び蛍光色素（例えば、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ、クマリン及びシアニン）などの蛍光標識タグ（すなわち、フルオロクロム／−フォア）、ルシフェラーゼなどの発光標識又はタグ並びに（その他の）酵素標識（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ又はグルコースオキシダーゼ）がある。また、前記の標識又はタグの任意の組合せも含まれる。単離された（ポリ−）ペプチドは、例えば、半減期拡大モジュールに融合又はコンジュゲートされてもよい、又は半減期拡大モジュール自体として機能してもよい。このようなモジュールは、当業者には公知であり、例えば、アルブミン、アルブミン結合ドメイン、免疫グロブリンのＦｃ領域／ドメイン、免疫グロブリン結合ドメイン、ＦｃＲｎ結合モチーフ及びポリマーが挙げられる。特に好ましいポリマーとして、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ヒアルロン酸、ポリシアル酸及びＰＥＧミメティックペプチド配列が挙げられる。単離された（ポリ−）ペプチドの凝集を防ぐ修飾も、当業者に公知であり、例えば、１個以上の疎水性アミノ酸、好ましくは、表面に露出している疎水性アミノ酸の、１個以上の親水性アミノ酸との置換が挙げられる。一実施形態では、前記の任意の単離された（ポリ−）ペプチド又はその免疫原性変異体又は免疫原性断片であり、最大１０、９、８、７、６、５、４、３又は２個の、好ましくは、５、４、３又は２個の疎水性アミノ酸、好ましくは、表面に露出している疎水性アミノ酸の、親水性アミノ酸との置換を含む。好ましくは、単離された（ポリ−）ペプチドのその他の特性、例えば、その免疫原性は、このような置換によって損なわれない。
【００３０】
用語「野生型」とは、天然に存在する供給源から単離された遺伝子又は遺伝子産物を指す。野生型遺伝子は、集団において最も頻繁に観察され、したがって、任意選択で遺伝子の「普通の」又は「野生型」形態と呼ばれるものである。対照的に、用語「修飾された」、「突然変異体」又は「変異体」とは、野生型遺伝子又は遺伝子産物と比較した場合に、配列中、翻訳後修飾及び／又は機能的特性（すなわち、変更された特徴）における修飾を示す遺伝子又は遺伝子産物を指す。天然に存在する突然変異体が単離されることがあり、これらは、それらが野生型遺伝子又は遺伝子産物と比較した場合に変化した特徴を有するという事実によって同定されるということを留意されたい。
【００３１】
本明細書で使用される場合、用語「アミノ酸同一性」とは、配列が、比較ウィンドウにわたってアミノ酸ごとに同一である程度を指す。したがって、「配列同一性のパーセンテージ」は、２つの最適にアラインされた配列を比較ウィンドウにわたって比較すること、両配列中に同一アミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ及びＭｅｔ）が生じる位置数を決定して、対応している位置数を得ること、対応している位置数を比較ウィンドウ中の位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）によって除すること及び結果に１００を乗じて、配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出される。「置換」又は「突然変異」とは、本明細書において、１つ以上のアミノ酸又はヌクレオチドを、それぞれ、親のタンパク質又はその断片のアミノ酸配列又はヌクレオチド配列と比較して異なるアミノ酸又はヌクレオチドによって置き換えることに起因する。タンパク質又はその断片はタンパク質の活性に対して実質的に効果を有さない保存的アミノ酸置換を有し得るということは、理解される。
【００３２】
「結合」とは、任意の相互作用を意味し、直接である場合も間接である場合もある。直接相互作用は、結合パートナー間の接触を含意する。間接相互作用は、相互作用パートナーが３つ以上の化合物の複合体において相互作用する、任意の相互作用を意味する。相互作用は、１つ以上の架橋分子の助けを借りて完全に間接的である場合も、パートナー間に依然として直接接触があり、１種以上の化合物のさらなる相互作用によって安定化されるように部分的に間接的である場合もある。本明細書で使用される場合、用語「特異的に結合する」とは、抗体に関して、特異的抗原を認識するが、サンプル中のその他の分子を実質的に認識又は結合しない抗体を意味する。例えば、１種に由来する抗原と特異的に結合する抗体はまた、１種以上の種に由来する抗原とも結合し得る。しかし、このような交差種反応性自体は、抗体の分類を特異的に変えない。いくつかの場合には、用語「特異的結合」又は「特異的に結合する」は、抗体、タンパク質又はペプチドの、第２の化学種との相互作用を参照して、相互作用が、化学種の特定の構造（例えば、抗原決定基又はエピトープ）の存在に依存的であることを意味するように使用され得、例えば、抗体は、タンパク質を全般的にではなく、特異的タンパク質構造を認識し、結合する。抗体がエピトープ「Ａ」に対して特異的である場合には、標識された「Ａ」及び抗体を含有する反応中のエピトープＡ（又は遊離、未標識Ａ）を含有する分子の存在は、抗体に結合される標識されたＡの量を低減させる。
【００３３】
本明細書で使用される場合、用語「抗体」とは、抗原と特異的に結合する免疫グロブリン（Ｉｇ）分子を指す。抗体は、天然供給源由来の若しくは組換え供給源由来の無傷の免疫グロブリンであってもよく、無傷の免疫グロブリンの免疫反応性部分であってもよい。抗体は、通常、免疫グロブリン分子の四量体である。本明細書で使用される場合、用語「免疫グロブリンドメイン」とは、抗体鎖（例えば、従来の４鎖抗体の、又は重鎖抗体の鎖など）の球状領域又は本質的にこのような球状領域からなるポリペプチドを指す。免疫グロブリンドメインは、それらが、任意選択的に従来のジスルフィド結合によって安定化された、２つのβシートに配置された約７の逆平行β鎖の２層のサンドイッチからなる、抗体分子の免疫グロブリンフォールディング特徴を保持することを特徴とする。
【００３４】
本明細書で使用される場合、用語「免疫グロブリン可変ドメイン」（「ＩＶＤ」と略される）とは、当技術分野及び本明細書において以下、それぞれ「フレームワーク領域１」又は「ＦＲ１」と、「フレームワーク領域２」又は「ＦＲ２」と、「フレームワーク領域３」又は「ＦＲ３」と、及び「フレームワーク領域４」又は「ＦＲ４」と呼ばれる本質的に４つの「フレームワーク領域」からなり、フレームワーク領域は、当技術分野及び本明細書において以下、それぞれ「相補性決定領域１」又は「ＣＤＲ１」と、「相補性決定領域２」又は「ＣＤＲ２」と、及び「相補性決定領域３」又は「ＣＤＲ３」と呼ばれる３つの「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」によって中断される免疫グロブリンドメインを意味する。したがって、免疫グロブリン可変ドメインの一般構造又は配列は、以下のとおりに示され得る：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４。抗原−結合部位を保持することによって抗原に対して抗体に特異性を付与するものは免疫グロブリン可変ドメイン（ＩＶＤ）である。
【００３５】
用語「免疫グロブリン単一可変ドメイン」（「ＩＳＶＤ」と略される）は、用語「単一可変ドメイン」と同等であり、抗原結合部位が単一免疫グロブリンドメイン上に存在し、それによって形成される分子を定義する。これによって、免疫グロブリン単一可変ドメインは、２つの免疫グロブリンドメイン、特に、２つの可変ドメインが相互作用して抗原結合部位を形成する「従来の」免疫グロブリン又はその断片とは異なって設定される。通常、従来の免疫グロブリンでは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が相互作用して抗原結合部位を形成する。この場合には、ＶＨ及びＶＬの両方の相補性決定領域（ＣＤＲ）が抗原結合部位に貢献する、すなわち、合計６つのＣＤＲが、抗原結合部位形成に関与する。上記の定義を考慮して、従来の４鎖抗体の抗原結合ドメイン（当技術分野で公知のＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ又はＩｇＥ分子など）又はこのような従来の４鎖抗体に由来するＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ジスルフィド連結しているＦｖ若しくはｓｃＦｖ断片などのＦｖ断片又はダイアボディー（すべて当技術分野で公知の）の抗原結合ドメインは、通常、免疫グロブリン単一可変ドメインとは考えられないが、これは、これらの場合には、それぞれの抗原のエピトープとの結合が、通常、１つの（単一）免疫グロブリンドメインによって生じるのではなく、それぞれの抗原のエピトープと接合して結合する軽鎖及び重鎖可変ドメインなどの一対の（会合している）免疫グロブリンドメインによって、すなわち、免疫グロブリンドメインのＶＨ−ＶＬ対によって生じるからである。対照的に、免疫グロブリン単一可変ドメインは、さらなる免疫グロブリン可変ドメインと対合することなく抗原のエピトープと特異的に結合可能である。免疫グロブリン単一可変ドメインの結合部位は、単一ＶＨ／ＶＨＨ又はＶＬドメインによって形成される。したがって、免疫グロブリン単一可変ドメインの抗原結合部位は、３つ以下のＣＤＲによって形成される。そのようなものとして、単一可変ドメインは、単一抗原結合ユニット（すなわち、単一抗原結合ドメインが、別の可変ドメインと相互作用して、機能的抗原結合ユニットを形成する必要がないような、本質的に単一可変ドメインからなる機能的抗原結合ユニット）を形成可能である限り、軽鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＬ配列）又はその好適な断片、又は重鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＨ配列又はＶＨＨ配列）又はその好適な断片であり得る。本発明の一実施形態では、免疫グロブリン単一可変ドメインは、重鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＨ配列）であり、より詳しくは、免疫グロブリン単一可変ドメインは、従来の４鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列又は重鎖抗体に由来する重鎖可変ドメインであり得る。例えば、免疫グロブリン単一可変ドメインは、（単一）ドメイン抗体（又は（単一）ドメイン抗体として使用するのに適しているアミノ酸配列）、「ｄＡｂ」又はｄＡｂ（又はｄＡｂとして使用するのに適しているアミノ酸配列）又はＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）（本明細書において定義されるような、また限定されるものではないが、ＶＨＨを含む）、その他の単一可変ドメイン又はそのいずれか１つの任意の好適な断片であり得る。特に、免疫グロブリン単一可変ドメインは、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）（本明細書において定義されるような）又はその好適な断片であり得る。注記：Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）及びＮａｎｏｃｌｏｎｅ（登録商標）は、Ａｂｌｙｎｘ  Ｎ．Ｖによって登録された商標である。Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）の一般的な説明については、以下のさらなる説明並びに本明細書において列挙される先行技術、例えば、ＷＯ２００８／０２００７９に記載されるものなどを参照されたい。ＩＶＤ又はＩＳＶＤ配列の番号付けは、別に明確に記載されない限り、Ｋａｂａｔ命名法に従って本明細書に記載されている。
【００３６】
「ＶＨＨドメイン」はまた、ＶＨＨ、ＶＨＨドメイン、ＶＨＨ抗体断片及びＶＨＨ抗体としても知られ、元々は「重鎖抗体」の抗原結合免疫グロブリン（可変）ドメインとして記載されていた（すなわち、「軽鎖を欠く抗体」の；Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎら（１９９３年）Ｎａｔｕｒｅ第３６３巻：４４６〜４４８頁）。用語「ＶＨＨドメイン」は、これらの可変ドメインを、従来の４鎖抗体中に存在する重鎖可変ドメイン（本明細書において「ＶＨドメイン」と呼ばれる）から、及び従来の４鎖抗体中に存在する軽鎖可変ドメイン（本明細書において「ＶＬドメイン」と呼ばれる）から区別するように選択されている。ＶＨＨ及びＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）のさらなる説明のために、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓによる総説（Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  第７４巻：２７７〜３０２頁、２００１年）並びに全般的な背景技術として記載されている以下の特許出願を参照されたい：Ｖｒｉｊｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ  ＢｒｕｓｓｅｌのＷＯ９４／０４６７８、ＷＯ９５／０４０７９及びＷＯ９６／３４１０３；ＵｎｉｌｅｖｅｒのＷＯ９４／２５５９１、ＷＯ９９／３７６８１、ＷＯ００／４０９６８、ＷＯ００／４３５０７、ＷＯ００／６５０５７、ＷＯ０１／４０３１０、ＷＯ０１／４４３０１、ＥＰ１１３４２３１及びＷＯ０２／４８１９３；Ｖｌａａｍｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｕｔ  ｖｏｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ（ＶＩＢ）のＷＯ９７／４９８０５、ＷＯ０１／２１８１７、ＷＯ０３／０３５６９４、ＷＯ０３／０５４０１６及びＷＯ０３／０５５５２７；Ａｌｇｏｎｏｍｉｃｓ  Ｎ．Ｖ．及びＡｂｌｙｎｘ  Ｎ．Ｖ．のＷＯ０３／０５０５３１；Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｆ  ＣａｎａｄａによるＷＯ０１／９０１９０；Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  ＡｎｔｉｂｏｄｙｓによるＷＯ０３／０２５０２０（＝ＥＰ１４３３７９３）並びにＡｂｌｙｎｘ  Ｎ．Ｖ．によるＷＯ０４／０４１８６７、ＷＯ０４／０４１８６２、ＷＯ０４／０４１８６５、ＷＯ０４／０４１８６３、ＷＯ０４／０６２５５１、ＷＯ０５／０４４８５８、ＷＯ０６／４０１５３、ＷＯ０６／０７９３７２、ＷＯ０６／１２２７８６、ＷＯ０６／１２２７８７及びＷＯ０６／１２２８２５及びＡｂｌｙｎｘ  Ｎ．Ｖ．によってさらに公開された特許出願。これらの参考文献に記載されるように、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）（特に、ＶＨＨ配列及び部分的にヒト化されたＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標））は、１つ以上のフレームワーク配列における１つ以上の「ホールマーク残基」の存在によって特に特性決定され得る。Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）ヒト化及び／又はラクダ化並びにその他の修飾、一部又は断片、誘導体又は「Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）融合物」、多価構築物（リンカー配列のいくつかの限定されない例を含む）並びにＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）及びそれらの調製物の半減期を増大するための種々の修飾を含むＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）のさらなる説明は、例えば、ＷＯ０８／１０１９８５及びＷＯ０８／１４２１６４に見出される。
【００３７】
「ドメイン抗体」は、「Ｄａｂ」、「ドメイン抗体」及び「ｄＡｂ」としても知られ（用語「ドメイン抗体」及び「ｄＡｂ」は、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ企業グループによって商標として使用されている）は、例えば、ＥＰ０３６８６８４、Ｗａｒｄら（Ｎａｔｕｒｅ第３４１巻：５４４〜５４６頁、１９８９年）、Ｈｏｌｔら（Ｔｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ第２１巻：４８４〜４９０頁、２００３年）及びＷＯ０３／００２６０９並びに、例えば、Ｄｏｍａｎｔｉｓ  ＬｔｄのＷＯ０４／０６８８２０、ＷＯ０６／０３０２２０、ＷＯ０６／００３３８８及びその他の公開された特許出願に記載されている。ドメイン抗体は、本質的に、非ラクダ科哺乳動物、特に、ヒト４鎖抗体のＶＨ又はＶＬドメインに対応している。エピトープと、単一抗原結合ドメインとして、すなわち、それぞれＶＬ又はＶＨドメインと対を形成することなく結合するために、例えば、ヒト単一ＶＨ又はＶＬドメイン配列のライブラリーを使用することによるこのような抗原結合特性の特異的選択が必要である。ドメイン抗体は、ＶＨＨのように、およそ１３〜およそ１６ｋＤａの分子量を有し、完全ヒト配列に由来する場合には、例えば、ヒトにおける治療的使用のためのヒト化を必要としない。単一可変ドメインは、サメのある特定の種に由来し得る（例えば、いわゆる「ＩｇＮＡＲドメイン」例えば、ＷＯ０５／１８６２９を参照のこと）ということも注記しなければならない。
【００３８】
ドメイン抗体及びＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）（ＶＨＨドメイン及びヒト化ＶＨＨドメインを含む）などの免疫グロブリン単一可変ドメインは、１つ以上のＣＤＲのアミノ酸配列に１つ以上の変更を導入することであって、変更が、それぞれの親分子と比較して、得られた免疫グロブリン単一可変ドメインの、そのそれぞれの抗原に対する親和性の改善をもたらすことによって親和性成熟に付されることができる。本発明の親和性成熟した免疫グロブリン単一可変ドメイン分子は、例えば、Ｍａｒｋｓら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ第１０巻：７７９〜７８３頁、１９９２年）、Ｂａｒｂａｓら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、ＵＳＡ第９１巻：３８０９〜３８１３頁、１９９４年）、Ｓｈｉｅｒら（Ｇｅｎｅ第１６９巻：１４７〜１５５頁、１９９５年）、Ｙｅｌｔｏｎら（Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１５５巻：１９９４〜２００４頁、１９９５年）、Ｊａｃｋｓｏｎら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１５４巻：３３１０〜９頁、１９９５年）、Ｈａｗｋｉｎｓら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第２２６巻：８８９  ８９６頁、１９９２年）、Ｊｏｈｎｓｏｎ及びＨａｗｋｉｎｓ（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９６年）によって記載されるような当技術分野で公知の方法によって調製され得る。ドメイン抗体又はＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）などの免疫グロブリン単一可変ドメインから出発してポリペプチドを設計／選択及び／又は調製するプロセスはまた、本明細書において、前記免疫グロブリン単一可変ドメインを「フォーマットする（ｆｏｒｍａｔｔｉｎｇ）」とも呼ばれ、ポリペプチドの一部とされている免疫グロブリン単一可変ドメインは、前記ポリペプチド「にフォーマットされている」又は「のフォーマットにある」と言われる。免疫グロブリン単一可変ドメインがフォーマットされ得る方法の例及び例えば、グリコシル化を避けるためのこのようなフォーマットの例は、本開示に基づいて当業者に明らかである。
【００３９】
ドメイン抗体及びＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）（ＶＨＨドメインを含む）などの免疫グロブリン単一可変ドメインは、ヒト化、すなわち、最も近いヒト生殖系列配列との配列同一性の程度の増大に付されることができる。特に、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）（ＶＨＨドメインを含む）などのヒト化免疫グロブリン単一可変ドメインは、全般的にはこれまでの段落において定義されたようなものであるが、ヒト化置換（本明細書においてさらに定義される）である、及び／又はそれに対応する少なくとも１個のアミノ酸残基が存在する（特に、少なくとも１つのフレームワーク残基）免疫グロブリン単一可変ドメインであり得る。潜在的に有用なヒト化置換は、天然に存在するＶＨＨ配列のフレームワーク領域の配列を、１つ以上の密接に関連するヒトＶＨ配列の対応するフレームワーク配列と比較することによって確実にされることができ、その後、そのように決定された１つ以上の潜在的に有用なヒト化置換（又はその組合せ）は、前記ＶＨＨ配列に導入される（本明細書においてさらに記載されるような、それ自体公知の任意の方法で）ことができ、得られたヒト化ＶＨＨ配列は、標的に対する親和性について、安定性について、発現の容易さ及びレベルについて、並びに／又はその他の望ましい特性について試験されることができる。このようにして、制限された程度の試行錯誤によって、その他の好適なヒト化置換（又はその好適な組合せ）が、当業者によって決定され得る。また、以前記載されたものに基づいて、免疫グロブリン単一可変ドメイン（そのフレームワーク領域）、例えば、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）（ＶＨＨドメインを含む）は、部分的にヒト化又は完全にヒト化されてもよい。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「血清アルブミン結合剤」又は「血清アルブミン結合ポリペプチド」は、血清アルブミンと特異的に結合可能なタンパク質ベースの薬剤である。種々の実施形態では、血清アルブミン結合剤は、血清アルブミンの全長及び／又は成熟形態及び／又はアイソフォーム及び／又はスプライス変異体及び／又は断片及び／又は任意のその他の天然に存在する若しくは合成類似体、変異体又は突然変異体と結合できる。種々の実施形態では、本発明の血清アルブミン結合剤は、単量体、二量体、三量体、四量体、ヘテロ二量体、多量体及び関連形態を含む血清アルブミンの任意の形態と結合できる。一実施形態では、血清アルブミン結合剤は、血清アルブミンの単量体形態と結合する。一実施形態では、本血清アルブミン結合ポリペプチドは、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含む抗原結合部位を有する免疫グロブリン可変ドメインを含む。一実施形態では、前記抗原結合部位は、血清アルブミンに存在する１つ以上のエピトープを認識する。種々の実施形態では、血清アルブミン結合剤は、全長抗体又はその断片を含む。一実施形態では、血清アルブミン結合剤は、単一ドメイン抗体又は免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含む。特定の実施形態では、血清アルブミン結合剤は、ラットの血清アルブミンと結合する（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０２７７０、配列番号１４）。特定の実施形態では、血清アルブミン結合剤は、マウスの血清アルブミンと結合する（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０７７２４、配列番号１３）。特定の実施形態では、血清アルブミン結合剤は、ヒト血清アルブミンと結合する（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０２７６８、配列番号１２）。
【００４１】
本明細書において互換可能に使用される用語「対象」、「個体」又は「患者」とは、療法又は予防が望まれる任意の対象、特に、脊椎動物対象、さらにより詳しくは、哺乳動物対象を指す。本発明の範囲内に入る好適な脊椎動物として、霊長類、鳥類、魚類、爬虫類、家畜動物（例えば、ヒツジ、ウシ、ウマ、ロバ、ブタ）、実験室試験動物（例えば、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター）、コンパニオン動物（例えば、ネコ、イヌ）及び捕獲性野生動物（例えば、キツネ、シカ、ディンゴ）が挙げられるが、それらに制限されない。しかし、前記の用語は、症状が存在することを含意しないことは理解される。用語「治療」又は「治療すること」又は「治療する」は、互換可能に使用されることができ、徴候、症状、障害、状態又は疾患の進行又は重症度を減速する、中断する、阻む、制御する、停止するが、必ずしも、すべての疾患が関連する徴候、症状、状態又は障害の完全排除を含まない治療的介入によって定義される。本明細書で使用される場合、用語「医薬」とは、療法において、すなわち、疾患又は障害の予防又は治療において使用される物質／組成物を指す。本発明によれば、用語「疾患」又は「障害」とは、任意の病理学的状態、特に、本明細書に定義されるような疾患又は障害を指す。
【００４２】
詳細な説明
第１の態様において、本発明は、免疫グロブリン可変ドメイン（ＩＶＤ）を含むポリペプチドに関し、前記ＩＶＤは、血清アルブミンと特異的に結合する。前記ＩＶＤは、特に、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４の一般構造を含む。種々の実施形態では、本発明の血清アルブミン結合ポリペプチドは、ヒト血清アルブミン（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０２７６８、配列番号１２）の全長及び／又は成熟形態及び／又はアイソフォーム及び／又はスプライス変異体及び／又は断片及び／又は単量体及び／又は二量体及び／又は四量体形態及び／又は任意のその他の天然に存在する若しくは合成類似体、変異体又は突然変異体（単量体及び／又は二量体及び／又は四量体形態を含む）に対する結合親和性を提供し、平衡解離定数（ＫＤ）によって記載され得る。種々の実施形態では、本発明の血清アルブミン結合ポリペプチドは、ラット血清アルブミン（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０２７７０、配列番号１４）の全長及び／又は成熟形態及び／又はアイソフォーム及び／又はスプライス変異体及び／又は断片及び／又は単量体及び／又は二量体及び／又は四量体形態及び／又は任意のその他の天然に存在する若しくは合成類似体、変異体又は突然変異体（単量体及び／又は二量体及び／又は四量体形態を含む）に対する結合親和性を提供し、平衡解離定数（ＫＤ）によって記載され得る。種々の実施形態では、本発明の血清アルブミン結合ポリペプチドは、マウス血清アルブミン（Ｕｎｉｐｒｏｔ  ＰＰ０７７２７、配列番号１３）の全長及び／又は成熟形態及び／又はアイソフォーム及び／又はスプライス変異体及び／又は断片及び／又は単量体及び／又は二量体及び／又は四量体形態及び／又は任意のその他の天然に存在する若しくは合成類似体、変異体又は突然変異体（単量体及び／又は二量体及び／又は四量体形態を含む）に対する結合親和性を提供し、平衡解離定数（ＫＤ）によって記載され得る。
【００４３】
配列番号１２は、全長ヒト血清アルブミン（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０２７６８）のアミノ酸配列を表す。
【００４４】
配列番号１２：ヒト血清アルブミン（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０２７６８）
【００４５】
【化１】
2020527352.tif 000002
【００４６】
配列番号１３は、全長マウス血清アルブミン（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０７７２４）のアミノ酸配列を表す。
【００４７】
配列番号１３：マウス血清アルブミン（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０７７２４）
【００４８】
【化２】
2020527352.tif 000003
【００４９】
配列番号１４は、全長ラット血清アルブミン（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０２７７０）のアミノ酸配列を表す。
【００５０】
配列番号１４：ラット血清アルブミン（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０２７７０）
【００５１】
【化３】
2020527352.tif 000004
【００５２】
本発明は、ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ（配列番号４）の、又はそのヒト化変異体、例えば、ｈ１、ｈ２、ｈ３、ｈ４（配列番号８〜１１）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域を特徴とする３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を有するアミノ酸配列を含む血清アルブミン結合ＩＶＤを含むポリペプチドに関する。
【００５３】
配列番号４は、全長ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ  ＶＨＨのアミノ酸配列を表す。
【００５４】
配列番号４：ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ
【００５５】
【化４】
2020527352.tif 000005
【００５６】
一実施形態では、血清アルブミン結合ＩＶＤを含む前記ポリペプチドは、ラット血清アルブミンに対して高親和性を有し、前記親和性は、ベンチマーク（Ａｂｌｙｎｘ  Ｎ．Ｖ．のＡｌｂ８抗血清アルブミンＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）；実施例を参照のこと）に対するものよりも少なくとも１０００倍高い、又はＫＤは、少なくとも１０００倍低く、好ましくは、前記親和性は、ベンチマークに対してよりも少なくとも５０００倍高い、又は前記ＫＤは、５０００倍低い。
【００５７】
特定の実施形態は、タンパク質を含む前記ＩＶＤは、ラット血清アルブミンと４０ｐＭ未満の高い親和性（ＫＤ）で結合することを提供する。用語「親和性」とは、抗体などの免疫グロブリンが、抗原及び抗体の平衡をそれらの結合によって形成される複合体の存在に向けてシフトするように、抗原と結合する程度を指す。したがって、抗原及び抗体が相対的に等しい濃度で組み合わされる場合には、高い親和性の抗体は、高濃度の得られる複合体に向けて平衡をシフトするように利用可能な抗原と結合する。そのため結合親和性は、ＩＶＤ及び抗原、この場合には、血清アルブミン間の結合相互作用の強度であり、通常、平衡解離定数（ＫＤ）によって測定され、報告され、これは、二分子の相互作用の強度を評価し、ランクづけるために使用される。ＫＤ値が小さいほど、リガンドのその標的に対する結合親和性は大きい。結合親和性及び解離定数を測定すること又は決定することは、ＢｉｏＬａｙｅｒ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ（ＢＬＩ）を介して、又は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって行われ得るが、例えば、ＥＬＩＳＡ、ゲルシフトアッセイ、プルダウンアッセイ、平衡透析、分析用超遠心分離及び分光学的アッセイを介しても行われ得る。親和性を決定するための別の方法として、例えば、互いに相互作用する任意の２つの生体分子、例えば、Ｉｇ／抗原結合間の結合親和性を測定し、ミリモル及びナノモル範囲でＫＤ値並びに分子間相互作用の特性決定において重要な結合化学量論及び結合熱力学を測定できる、直接的な標識不含アッセイである、等温滴定熱量測定法（ＩＴＣ）を介したものがある。ＩＴＣは、広範囲の相互作用の研究を可能にし、高い定量的ＫＤ値を送達するので、相互作用解析の「ゴールドスタンダード」と記載されている。
【００５８】
別の実施形態は、Ｂｉｏｌａｙｅｒ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙによって決定されるような４０ｐＭ未満の親和性での血清アルブミンとの、好ましくは、ラット血清アルブミンとの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）結合に関する。
【００５９】
配列番号５は、全長ＳＡ１  ＶＨＨのアミノ酸配列を表す。
【００６０】
配列番号５：ＳＡ１
【００６１】
【化５】
2020527352.tif 000006
【００６２】
ＳＡ１  ＶＨＨと比較した場合、ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ中の１つのアミノ酸置換が、ラット血清アルブミンに対する親和性を２０倍又は少なくとも１０倍増大した。さらに、ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋのマウス血清アルブミン結合はまた、ＳＡ１  ＶＨＨに対してと比較して少なくとも２倍又は少なくとも１．５倍高い親和性である３００ｐＭ未満のＫＤ値を有する、高い親和性のものであると示した。ベンチマークＶＨＨ、Ａｌｂ８との比較において、マウス及びラットの両方だけでなくカニクイザルの血清アルブミンも、かなり高い親和性でＳＡ１＿Ｓ３０Ｋと結合し、開発及び前臨床資産を改善する機会を提供する。
【００６３】
そのため、代替の一実施形態では、ラット血清アルブミンに対して高い親和性を有するＩＶＤを含むポリペプチドは、ベンチマーク（Ａｂｌｙｎｘ  Ｎ．Ｖ．のＡｌｂ８抗血清アルブミンＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標））のラット血清アルブミンよりも少なくとも１０００倍高い親和性又は少なくとも１０００倍低いＫＤを有する、好ましくは、ベンチマーク（Ａｂｌｙｎｘ  Ｎ．Ｖ．のＡｌｂ８抗血清アルブミンＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標））のラット血清アルブミンよりも少なくとも５０００倍高い親和性を有するポリペプチドである。
【００６４】
驚くべきことに、グリコシル化部位を除去するためにただ１つの突然変異を導入すること及び突然変異部位が位置３０のＣＤＲ１中に位置していることによって（図１）、ヒト血清アルブミンに対する親和性は保持されることができ、ＳＡ１及びＡｌｂ８対照について観察される親和性に近い約０．９ｎＭのＫＤ値を有し（表４）、さらに、ラット及びマウス血清アルブミンに対する結合親和性の一層大幅な増大さえも、ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ突然変異体変異体について観察された。ラット及びマウス血清アルブミンは、約９０％同一性のアミノ酸配列における高い相同性を示し、ヒト及びラット血清アルブミン間の相同性も極めて高く、７３％の同一性を有し、これは、このようなラット血清アルブミンに対する親和性の増大という知見を真に驚くべきものにする。この驚くべき特性は、ラット及びマウスにおいて行われた前臨床安全性及び有効性研究の多くが、マウスにおいてＰＫが、ＫＤ値によって反映される極めて高い親和性に対応するおよそ３０時間の半減期をもたらした実施例７においても示されるように、より長い半減期から利益を得ることができるという利点を有する。
【００６５】
種々の実施形態では、タンパク質は、少なくとも約１μＭ、約９００ｎＭ、約８００ｎＭ、約７００ｎＭ、約６００ｎＭ、約５００ｎＭ、約４００ｎＭ、約３００ｎＭ、約２００ｎＭ、約１００ｎＭ、約９０ｎＭ、約８０ｎＭ、約７０ｎＭ、約６０ｎＭ、約５０ｎＭ、約４０ｎＭ、約３０ｎＭ、約２０ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約２．５ｎＭ、約１ｎＭ、約９５０ｐＭ、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４５０ｐＭ、約４００ｐＭ、約３５０ｐＭ、約３００ｐＭ、約２５０ｐＭ、約２００ｐＭ、約１５０ｐＭ、約１００ｐＭ、約５０ｐＭ、約３０ｐＭ、約２５ｐＭ、約２０ｐＭ、約１５ｐＭ、約１０ｐＭ、約５ｐＭ、又は少なくとも約１ｐＭのラット血清アルブミン（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０２７７０、配列番号１４）の全長及び／又は成熟形態及び／又はアイソフォーム及び／又はスプライス変異体及び／又は断片及び／又は任意のその他の天然に存在する若しくは合成類似体、変異体又は突然変異体（単量体及び／又は二量体及び／又は四量体形態を含む）との結合についての親和性（ＫＤ）を有するＩＶＤを含む。
【００６６】
その他の実施形態では、タンパク質は、少なくとも約１μＭ、約９００ｎＭ、約８００ｎＭ、約７００ｎＭ、約６００ｎＭ、約５００ｎＭ、約４００ｎＭ、約３００ｎＭ、約２００ｎＭ、約１００ｎＭ、約９０ｎＭ、約８０ｎＭ、約７０ｎＭ、約６０ｎＭ、約５０ｎＭ、約４０ｎＭ、約３０ｎＭ、約２０ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約２．５ｎＭ、約１ｎＭ、約９５０ｐＭ、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４５０ｐＭ、約４００ｐＭ、約３５０ｐＭ、約３００ｐＭ、約２５０ｐＭ、約２００ｐＭ、約１５０ｐＭ、約１００ｐＭ、約５０ｐＭ、約３０ｐＭ、約２５ｐＭ、約２０ｐＭ、約１５ｐＭ、約１０ｐＭ、約５ｐＭ、又は少なくとも約１ｐＭのマウス血清アルブミン（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０７７２４、配列番号１３）の全長及び／又は成熟形態及び／又はアイソフォーム及び／又はスプライス変異体及び／又は断片及び／又は任意のその他の天然に存在する若しくは合成類似体、変異体又は突然変異体（単量体及び／又は二量体及び／又は四量体形態を含む）との結合についての親和性（ＫＤ）を有するＩＶＤを含む。
【００６７】
さらに、代替的な実施形態では、タンパク質は、少なくとも約１μＭ、約９００ｎＭ、約８００ｎＭ、約７００ｎＭ、約６００ｎＭ、約５００ｎＭ、約４００ｎＭ、約３００ｎＭ、約２００ｎＭ、約１００ｎＭ、約９０ｎＭ、約８０ｎＭ、約７０ｎＭ、約６０ｎＭ、約５０ｎＭ、約４０ｎＭ、約３０ｎＭ、約２０ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約２．５ｎＭ、約１ｎＭ、約９５０ｐＭ、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４５０ｐＭ、約４００ｐＭ、約３５０ｐＭ、約３００ｐＭ、約２５０ｐＭ、約２００ｐＭ、約１５０ｐＭ、約１００ｐＭ、約５０ｐＭ、約３０ｐＭ、約２５ｐＭ、約２０ｐＭ、約１５ｐＭ、約１０ｐＭ、約５ｐＭ、又は少なくとも約１ｐＭのヒト血清アルブミン（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０２７６８、配列番号１２）の全長及び／又は成熟形態及び／又はアイソフォーム及び／又はスプライス変異体及び／又は断片及び／又は任意のその他の天然に存在する若しくは合成類似体、変異体又は突然変異体（単量体及び／又は二量体及び／又は四量体形態を含む）との結合についての親和性（ＫＤ）を有するＩＶＤを含む。前記ヒト血清アルブミン結合親和性が、ＳＡ１と比較してそのＣＤＲ１中にリシン置換を含有する（図１）ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ変異体ＶＨＨにおいてと依然として同様であることは、極めて予測されなかったものであり、さらに、以下に論じられるように本発明の利点を提供する。
【００６８】
さらに、代替的な実施形態では、タンパク質は、少なくとも約１μＭ、約９００ｎＭ、約８００ｎＭ、約７００ｎＭ、約６００ｎＭ、約５００ｎＭ、約４００ｎＭ、約３００ｎＭ、約２００ｎＭ、約１００ｎＭ、約９０ｎＭ、約８０ｎＭ、約７０ｎＭ、約６０ｎＭ、約５０ｎＭ、約４０ｎＭ、約３０ｎＭ、約２０ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約２．５ｎＭ、約１ｎＭ、約９５０ｐＭ、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４５０ｐＭ、約４００ｐＭ、約３５０ｐＭ、約３００ｐＭ、約２５０ｐＭ、約２００ｐＭ、約１５０ｐＭ、約１００ｐＭ、約５０ｐＭ、約３０ｐＭ、約２５ｐＭ、約２０ｐＭ、約１５ｐＭ、約１０ｐＭ、約５ｐＭ、又は少なくとも約１ｐＭのカニクイザル血清アルブミン（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ａ２Ｖ９２４）の全長及び／又は成熟形態及び／又はアイソフォーム及び／又はスプライス変異体及び／又は断片及び／又は任意のその他の天然に存在する若しくは合成類似体、変異体又は突然変異体（単量体及び／又は二量体及び／又は四量体形態を含む）との結合についての親和性（ＫＤ）を有するＩＶＤを含む。
【００６９】
さらに、代替的な実施形態では、タンパク質は、少なくとも約１０μＭ、約９μＭ、約８μＭ、約７μＭ、約６μＭ、約５μＭ、約５μＭ、約５μＭ、約５μＭ、約１μＭ、約９００ｎＭ、約８００ｎＭ、約７００ｎＭ、約６００ｎＭ、約５００ｎＭ、約４００ｎＭ、約３００ｎＭ、約２００ｎＭ、約１００ｎＭ、約９０ｎＭ、約８０ｎＭ、約７０ｎＭ、約６０ｎＭ、約５０ｎＭ、約４０ｎＭ、約３０ｎＭ、約２０ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約２．５ｎＭ、約１ｎＭ、約９５０ｐＭ、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４５０ｐＭ、約４００ｐＭ、約３５０ｐＭ、約３００ｐＭ、約２５０ｐＭ、約２００ｐＭ、約１５０ｐＭ、約１００ｐＭ、約５０ｐＭ、約３０ｐＭ、約２５ｐＭ、約２０ｐＭ、約１５ｐＭ、約１０ｐＭ、約５ｐＭ、又は少なくとも約１ｐＭのウサギ血清アルブミン（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ４９０６５）の全長及び／又は成熟形態及び／又はアイソフォーム及び／又はスプライス変異体及び／又は断片及び／又は任意のその他の天然に存在する若しくは合成類似体、変異体又は突然変異体（単量体及び／又は二量体及び／又は四量体形態を含む）との結合についての親和性（ＫＤ）を有するＩＶＤを含む。
【００７０】
さらに、代替的な実施形態では、タンパク質は、少なくとも約１μＭ、約９００ｎＭ、約８００ｎＭ、約７００ｎＭ、約６００ｎＭ、約５００ｎＭ、約４００ｎＭ、約３００ｎＭ、約２００ｎＭ、約１００ｎＭ、約９０ｎＭ、約８０ｎＭ、約７０ｎＭ、約６０ｎＭ、約５０ｎＭ、約４０ｎＭ、約３０ｎＭ、約２０ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約２．５ｎＭ、約１ｎＭ、約９５０ｐＭ、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４５０ｐＭ、約４００ｐＭ、約３５０ｐＭ、約３００ｐＭ、約２５０ｐＭ、約２００ｐＭ、約１５０ｐＭ、約１００ｐＭ、約５０ｐＭ、約３０ｐＭ、約２５ｐＭ、約２０ｐＭ、約１５ｐＭ、約１０ｐＭ、約５ｐＭ、又は少なくとも約１ｐＭのウマ血清アルブミン（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ３５７４７）の全長及び／又は成熟形態及び／又はアイソフォーム及び／又はスプライス変異体及び／又は断片及び／又は任意のその他の天然に存在する若しくは合成類似体、変異体又は突然変異体（単量体及び／又は二量体及び／又は四量体形態を含む）との結合についての親和性（ＫＤ）を有するＩＶＤを含む。
【００７１】
さらに、代替的な実施形態では、タンパク質は、少なくとも約１μＭ、約９００ｎＭ、約８００ｎＭ、約７００ｎＭ、約６００ｎＭ、約５００ｎＭ、約４００ｎＭ、約３００ｎＭ、約２００ｎＭ、約１００ｎＭ、約９０ｎＭ、約８０ｎＭ、約７０ｎＭ、約６０ｎＭ、約５０ｎＭ、約４０ｎＭ、約３０ｎＭ、約２０ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約２．５ｎＭ、約１ｎＭ、約９５０ｐＭ、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４５０ｐＭ、約４００ｐＭ、約３５０ｐＭ、約３００ｐＭ、約２５０ｐＭ、約２００ｐＭ、約１５０ｐＭ、約１００ｐＭ、約５０ｐＭ、約３０ｐＭ、約２５ｐＭ、約２０ｐＭ、約１５ｐＭ、約１０ｐＭ、約５ｐＭ、又は少なくとも約１ｐＭのイヌ血清アルブミン（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ４９８２２）の全長及び／又は成熟形態及び／又はアイソフォーム及び／又はスプライス変異体及び／又は断片及び／又は任意のその他の天然に存在する若しくは合成類似体、変異体又は突然変異体（単量体及び／又は二量体及び／又は四量体形態を含む）との結合についての親和性（ＫＤ）を有するＩＶＤを含む。
【００７２】
本発明は、ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ（配列番号４）の、又はそのヒト化変異体、例えば、ｈ１、ｈ２、ｈ３、ｈ４（配列番号８〜１１）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域を特徴とする３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を有するアミノ酸配列を含む血清アルブミン結合ＩＶＤを含むポリペプチドに関し、ＳＡ１Ｓ３０Ｋ又はその変異体を考慮したＣＤＲアノテーションが図１に表されている。ＭａｃＣａｌｌｕｍ、ＡｂＭ、Ｃｈｏｔｈｉａ又はＩＭＧＴアノテーションは、ＣＤＲ領域を同定するために適用可能である。Ｋａｂａｔは、ＣＤＲ１の定義には適用可能ではないが、これは、このアノテーションが、特定のリシン残基を含んでいないからである。特定の実施形態では、ＣＤＲ１は、配列番号１のアミノ酸配列を含む、又は配列番号１のアミノ酸配列であり、ＣＤＲ２は、配列番号２のアミノ酸配列を含む、又は配列番号２のアミノ酸配列であり、ＣＤＲ３は、配列番号３のアミノ酸配列を含む、又は配列番号３のアミノ酸配列である。前記の後者のＣＤＲ領域は、ＭａｃＣａｌｌｕｍら（１９９６年）定義（図１も参照のこと）に従って決定されている。例えば、ＭａｃＣａｌｌｕｍらにおいて定義されるような配列番号１、２及び３によって提供されるような前記ＣＤＲ、特に、ＣＤＲ１の貢献は、ラット血清アルブミンについての高い親和性の独特の特性を提供する。
【００７３】
配列番号１は、ＳＡ１＿Ｓ３０ＫのＣＤＲ１領域のアミノ酸配列を表す（ＣＤＲは、ＭａｃＣａｌｌｕｍら、１９９６年に従ってアノテートされた）。
【００７４】
配列番号１：ＣＤＲ１  ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ
ＫＥＹＶＭＧ
【００７５】
配列番号２は、ＳＡ１＿Ｓ３０ＫのＣＤＲ２領域のアミノ酸配列を表す（ＣＤＲは、ＭａｃＣａｌｌｕｍら、１９９６年に従ってアノテートされた）。
【００７６】
配列番号２：ＣＤＲ２  ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ
ＦＶＡＡＩＳＷＳＡＧＮＩＹ
【００７７】
配列番号３は、ＳＡ１＿Ｓ３０ＫのＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を表す（ＣＤＲは、ＭａｃＣａｌｌｕｍら、１９９６年に従ってアノテートされた）。
【００７８】
配列番号３：ＣＤＲ３  ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ
ＡＡＧＲＹＳＡＷＹＶＡＡＹＥＹＤ
【００７９】
ＩＶＤのアミノ酸残基の番号付けのために、種々の番号付けスキームが適用され得る。例えば、番号付けは、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．及びＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，Ｓ．、第２３１巻（１〜２号）、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９９年の論文において、図１も参照のこと、ラクダ科の動物に由来するＶＨＨドメインに適用されるようにＫａｂａｔ番号付けシステムに従って実施されてもよく、本出願を通じて使用される（別に記載されない限り）。ＶＨＨドメインと類似の方法においても適用され得るＶＨドメインのアミノ酸残基を番号付ける代替法は、当技術分野で公知である。ＦＲ及びＣＤＲ配列の記述もまた、Ｋａｂａｔ番号付けを使用することによって行われ得るが、ＭａｃＣａｌｌｕｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９６年）第２６２巻、７３２〜７４５頁に記載されるような接触解析及び結合部位トポグラフィーに基づく指定など、当技術分野におけるその他の方法も同様に適用され、これは、本説明、配列アノテーション及び本発明の特許請求の範囲においても踏襲される（図１及び配列番号１〜３及びＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ  ＶＨＨについては配列番号４）。ＡｂＭ（ＡｂＭは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌに記載されるようなＯｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌｔｄ．の抗体モデリングパッケージである）、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ、１９８７年）、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔら、１９９１年）及びＩＭＧＴ（ＬｅＦｒａｎｃ、２０１４年）に従ったＣＤＲのアノテーションは、わずかに異なり、図１に同様に提供される情報についてである。注目すべきは、ＶＨドメインについて、及びＶＨＨドメインについて当技術分野で周知のように、各ＣＤＲ中のアミノ酸残基の総数は、異なることがあり、Ｋａｂａｔ番号付けによって示されるアミノ酸残基の総数に対応しない場合がある（すなわち、Ｋａｂａｔ番号付けに従う１つ以上の位置が、実際の配列では占有されていない場合もある、又は実際の配列は、Ｋａｂａｔ番号付けによって可能とされる数よりも多くのアミノ酸残基を含有する場合があるということである）。これは、全般的に、Ｋａｂａｔに従った番号付けは、実際の配列中のアミノ酸残基の実際の番号付けに対応する場合も、対応しない場合もあるということを意味する。ＶＨドメイン及びＶＨＨドメイン中のアミノ酸残基の総数は、通常、１１０〜１２０の範囲であり、１１２〜１１５の間であることが多い。しかし、本明細書に記載される目的上、より小さくより長い配列も適している場合があるということは留意しなければならない。
【００８０】
一実施形態では、本明細書において記載されるポリペプチドは、本明細書において記載されるような前記ＣＤＲを含み、ＭａｃＣａｌｌｕｍ  ＣＤＲアノテーションを考慮して配列番号１８に記載されるような、配列番号４（ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ）のＦＲ３領域アミノ酸配列に対応するアミノ酸配列をそのＦＲ３領域にさらに含む血清アルブミン結合ＩＶＤを含む。別の実施形態では、本明細書において記載されるポリペプチドは、配列番号４のヒト化変異体に対応するＦＲ３領域を含み、前記ＦＲ３領域は、位置７３及び７４に、任意のアミノ酸が存在してもよい、及び／又は位置７８にバリン若しくはロイシンが存在し、及び／又はアミノ酸位置７９に、ヒスチジン又はチロシンが存在し、及び／又は位置８２ｂに、トレオニン若しくはセリンが存在するアミノ酸配列を有する（Ｋａｂａｔ番号付けに従って）。
【００８１】
配列番号１８は、ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ由来のＦＲ３のアミノ酸配列を表し（ＣＤＲは、ＭａｃＣａｌｌｕｍら、１９９６年に従ってアノテートされている）、配列番号４の残基６０〜９６に対応する。
配列番号１８：ＦＲ３  ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ
ＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＸＸＫＮＴＶＨＬＱＭＮＴＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣ
一実施形態では、ＸＸはＮＡであり（ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋに対応するＦＲ３について）、その他の実施形態では、ＸＸはＮＳであり（ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ＿ｈ１−７に対応するＦＲ３について）、その他の実施形態では、ＸＸは任意のアミノ酸である（ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋのさらなるヒト化変異体）。
【００８２】
別の実施形態では、前記ポリペプチドは、配列番号４、又はＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ  ＶＨＨのアミノ酸配列を含むＩＶＤを含む。
【００８３】
別の実施形態では、前記ポリペプチドは、配列番号４の、又はＳＡ１＿Ｓ３０Ｋのヒト化変異体のアミノ酸配列を含む本発明に従うＩＶＤを含む。本発明の前記ヒト化変異体を得るために、当業者は、配列番号７に記載されるようにヒト由来の最も近いヒト相同体配列、ＶＨ３−２３（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｐ０１７６４．２）／Ｊ５を解析し、通常の「ホールマーク」ＶＨＨ残基又はＣＤＲ領域に影響を及ぼすことなく、ＳＡ１＿Ｓ３０ＫのＦＲ領域中のアミノ酸残基をよりヒト様の配列に置換した。
【００８４】
配列番号７は、全長ＶＨ３−２３／Ｊ５ヒトＶＨＨ（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０１７６４．２）のアミノ酸配列を表す。
【００８５】
配列番号７：ＶＨ３−２３／Ｊ５
【００８６】
【化６】
2020527352.tif 000007
【００８７】
非限定的な例が、本出願の実施例８に提供されており、配列番号８〜１１に表されている（図５では、ｈ１〜ｈ４として示されている）。さらなる代替例が、図５に（「代替ｈ」として）、またさらに配列番号１５〜１７に提供されている。
【００８８】
配列番号８は、全長ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋヒト化変異体１  ＶＨＨのアミノ酸配列を表す。
【００８９】
配列番号８：ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ＿ｈｕｍａｎ１
【００９０】
【化７】
2020527352.tif 000008
【００９１】
配列番号９は、全長ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋヒト化変異体２  ＶＨＨのアミノ酸配列を表す。
【００９２】
配列番号９：ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ＿ｈｕｍａｎ２
【００９３】
【化８】
2020527352.tif 000009
【００９４】
配列番号１０は、全長ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋヒト化変異体３  ＶＨＨのアミノ酸配列を表す。
【００９５】
配列番号１０：ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ＿ｈｕｍａｎ３
【００９６】
【化９】
2020527352.tif 000010
【００９７】
配列番号１１は、全長ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋヒト化変異体４  ＶＨＨのアミノ酸配列を表す。
【００９８】
配列番号１１：ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ＿ｈｕｍａｎ４
【００９９】
【化１０】
2020527352.tif 000011
【０１００】
配列番号１５は、全長ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋヒト化変異体５  ＶＨＨのアミノ酸配列を表す。
【０１０１】
配列番号１５：ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ＿ｈｕｍａｎ５
【０１０２】
【化１１】
2020527352.tif 000012
【０１０３】
配列番号１６は、全長ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋヒト化変異体６  ＶＨＨのアミノ酸配列を表す。
【０１０４】
配列番号１６：ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ＿ｈｕｍａｎ６
【０１０５】
【化１２】
2020527352.tif 000013
【０１０６】
配列番号１７は、全長ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋヒト化変異体７  ＶＨＨのアミノ酸配列を表す。
【０１０７】
配列番号１７：ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ＿ｈｕｍａｎ７
【０１０８】
【化１３】
2020527352.tif 000014
【０１０９】
ヒト化配列変異体は、抗原結合親和性並びに生化学的及び生物物理的特性を含む元のＶＨＨの好都合な特性を保持しなくてはならない。ヒト化変異体ｈ１、ｈ２、ｈ３及びｈ４を解析する場合には（実施例８〜１０を参照のこと）、驚くべき観察結果は、融点、熱安定性の尺度の明確な増大に関係しており、これは、位置７９でのＨからＹへの、及び位置８２ｂでのＴからＳへのアミノ酸の置換に明確に連結づけられ得る。各置換は、融点の４℃の増大に貢献し（ｈ２及びｈ３）、両置換を含有するｈ４変異体において、ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋと比較した８℃への増大の協同的効果が観察された。公知のＶＨＨ中のそれらの位置は、それぞれそれらのアミノ酸Ｙ及びＳを示すが、ここで、特定のＣＤＲと組み合わせて、血清アルブミン結合ポリペプチドの改善された安定性が定義されていることが考慮される。そのため、一実施形態は、前記ＦＲ３領域が位置７９にＹを有する、及び／又は位置８２ｂにＳを有するポリペプチドに関する。
【０１１０】
注目すべきは、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン、特に、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）は、それらの最も広い意味で、特定の生物学的供給源に、又は特定の調製方法に限定されないことである。例えば、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン、特に、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）は、全般的に、（１）天然に存在する重鎖抗体のＶＨＨドメインを単離することによって、（２）天然に存在するＶＨＨドメインをコードするヌクレオチド配列の発現によって、（３）天然に存在するＶＨＨドメインの「ヒト化」によって、又はこのようなヒト化ＶＨＨドメインをコードする核酸の発現によって、（４）既存の抗体との結合を低減するような天然に存在するＶＨＨドメインの「突然変異」によって、又はこのような突然変異されたＶＨＨドメインをコードする核酸の発現によって、（５）動物種、特に、哺乳動物種、例えば、ヒトに由来する天然に存在するＶＨドメインの「ラクダ化」によって、又はこのようなラクダ化ＶＨドメインをコードする核酸の発現によって、（６）当技術分野において記載されるような「ドメイン抗体」又は「Ｄａｂ」の「ラクダ化」によって、又はこのようなラクダ化ＶＨドメインをコードする核酸の発現によって、（７）それ自体公知のタンパク質、ポリペプチド又はその他のアミノ酸配列を調製するための合成又は半合成技術を使用することによって、（８）それ自体公知の核酸合成のための技術を使用するＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）をコードする核酸を調製し、続いてこのように得られた核酸の発現によって、及び／又は（９）前記のうちの任意の１以上の組合せによって得ることができる。
【０１１１】
やはり、注目すべきは、本発明のヒト化免疫グロブリン単一可変ドメインは、それ自体公知の任意の好適な様式で（すなわち、上記のポイント（１）〜（９）の下で示されるように）得ることができ、したがって、出発材料として天然に存在するＶＨＨドメインを含むポリペプチドを使用して得られたポリペプチドに厳密に制限されないことである。
【０１１２】
ヒト化免疫グロブリン単一可変ドメイン、特に、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）は、対応する天然に存在するＶＨＨドメインと比較して低減された免疫原性などのいくつかの利点を有し得る。ヒト化とは、ヒト患者における投与の際に免疫原性が微量である、又は非存在であるように突然変異されることを意味する。このようなヒト化は、一般に、天然に存在するＶＨＨの配列中の１個以上のアミノ酸残基を、ヒトＶＨ３ドメインなどのヒトＶＨドメイン中の同一位置に生じるアミノ酸残基と置き換えることを含む。本発明に従って単一ドメイン抗体をヒト化することは、１個以上のアミノ酸を、そのポリペプチドがその通常の特徴を失うことなく、例えば、ヒトコンセンサス配列中に見られるようなそれらのヒト対応物によって置き換えるステップを含む、すなわち、ヒト化は、得られるポリペプチドの抗原結合能に大幅に影響を及ぼさない。ヒト化置換は、得られるヒト化ポリペプチドが、本明細書において定義されるような好都合な特性を依然として保持するように選択されなくてはならない。当業者ならば、一方でヒト化置換によって提供される好都合な特性と、他方で天然に存在するＶＨＨドメインの好都合な特性の間の所望の又は好適なバランスを最適化する、又は達成するヒト化置換又はヒト化置換の好適な組合せを選択することが可能である。
【０１１３】
このような方法は、当業者（ｓｋｉｌｌｅｄ  ａｄｄｒｅｓｓｅｅ）に公知である。ヒトコンセンサス配列は、ヒト化のための標的配列として使用され得るが、その他の手段もまた、当技術分野で公知である。１つの代替は、標的配列におけるヒト化に好適な残基の同定のために前記アラインメントを使用するための、当業者が、いくつかのヒト生殖系列対立遺伝子をアラインする方法、例えば、限定されるものではないが、図６に示されるＩＧＨＶ３対立遺伝子のアラインメントなどを含む。また、標的配列に最も相同なヒト生殖系列対立遺伝子のサブセットも、好適なヒト化残基を同定するための出発点としてアラインされ得る。あるいは、ＶＨＨは、ヒト対立遺伝子中のその最も近い相同体を同定するために解析され（実施例８におけるように）、ヒト化構築物設計のために使用される。ラクダ科の動物のＶＨＨに適用されるヒト化技術も、単独又は組合せのいずれかでの特定のアミノ酸の置換を含む方法によって実施され得る。前記置換は、文献から及び公知のヒト化研究から公知であるもの並びに天然ＶＨＨ配列と比較したヒトコンセンサス配列又は対象のＶＨＨ配列に最も類似しているヒト対立遺伝子に基づいて選択され得る。ＷＯ０８／０２００７９の表Ａ−５〜Ａ−８において与えられるＶＨＨエントロピー及びＶＨＨ可変性に関するデータからわかるように、フレームワーク領域中のいくつかのアミノ酸残基が、ヒト及びラクダ科の動物の間でその他のものよりも保存されている。全般的に、本発明は、その最も広い意味で、これらに限定されないが、任意の置換、欠失又は挿入は、好ましくはあまり保存されていない位置で行われる。また、全般的に、アミノ酸置換は、アミノ酸欠失又は挿入を上回って好ましい。例えば、ラクダ科の動物の単一ドメイン抗体のヒト様クラスは、通常、ヒト起源の、又はその他の種に由来する従来の抗体に見られる疎水性ＦＲ２残基を含有するが、親水性におけるこの損失を、二本鎖抗体に由来するＶＨ中に存在する保存されたトリプトファン残基を置換する位置１０３でのその他の置換によって補償する。そのようなものとして、これら２つのクラスに属するペプチドは、ヒトＶＨフレームワーク領域に対して高いアミノ酸配列相同性を示し、前記ペプチドは、それからの不要な免疫応答を予測することなく、さらなるヒト化の負荷を伴わずにヒトに直接的に投与され得る。実際、いくつかのラクダ科の動物のＶＨＨ配列は、ヒトＶＨフレームワーク領域に対して高い配列相同性を示し、したがって、前記ＶＨＨは、それからの免疫応答を予測することなく、さらなるヒト化の負荷を伴わずに患者に直接的に投与され得る。
【０１１４】
その他のＶＨＨ配列は、実際、通常、対象に投与された場合に標的タンパク質と反応するのに好都合な条件を有する変異体につながるヒト化技術を必要とする。ヒト化置換は、得られたヒト化アミノ酸配列及び／又はＶＨＨが、本明細書において定義されるようなＶＨＨの好都合な特性を依然として保持するように選択されなければならない。当業者ならば、一般に、本明細書における開示に基づいて、任意選択的に、例えば、制限された数の可能性のあるヒト化置換を導入すること及びこのように得られたＶＨＨの特性に対するそれらの影響を決定することを含み得る、制限された程度の実験の後に、好適なヒト化置換又は好適なヒト化置換の組合せ決定し、選択することができる。一般に、ヒト化の結果として、本発明のアミノ酸配列及び／又はＶＨＨは、より「ヒト様」になり得るが、本明細書において記載されるような本発明のＶＨＨの好都合な特性を依然として保持する。結果として、このようなヒト化アミノ酸配列及び／又はＶＨＨは、対応する天然に存在するＶＨＨドメインと比較して低減された免疫原性など、いくつかの利点を有し得る。ヒト化の際に、既存の抗体（例えば、ＷＯ２０１２／１７５７４１及びＷＯ２０１５／１７３３２５が参照される）との結合が低減されたポリペプチドを作製するための好適な突然変異、特に、置換が、例えば、位置１１、１３、１４、１５、４０、４１、４２、８２、８２ａ、８２ｂ、８３、８４、８５、８７、８８、８９、１０３又は１０８のうちの少なくとも１つで導入され得る。
【０１１５】
本発明のアミノ酸配列及び／又はＶＨＨは、任意のフレームワーク残基（複数可）で、例えば、１個以上のホールマーク残基（本明細書において定義されるような）で、又は１個以上のその他のフレームワーク残基（すなわち、非ホールマーク残基）又はそれらの任意の好適な組合せで適宜ヒト化され得る。本発明のアミノ酸配列、ＶＨＨ又はポリペプチドを発現するために使用される宿主生物に応じて、このような欠失及び／又は置換はまた、当業者の能力の範囲内にあるように、翻訳後修飾のための１つ以上の部位（例えば、１つ以上のグリコシル化部位）が除去されるような方法で設計され得る。あるいは、置換又は挿入は、官能基（本明細書において記載されるような）の付着のための１つ以上の部位を導入するように、例えば、部位特異的ペグ化を可能にするように設計され得る。
【０１１６】
いくつかの場合には、位置３７、４４、４５及び／又は４７の親水性特徴を有する通常のラクダ科の動物のホールマーク残基のうちの少なくとも１個が置き換えられる（ＷＯ２００８／０２００７９表Ａ−０３を参照のこと）。ヒト化の別の例として、位置１、５、１１、１４、１６及び／又は２８などのＦＲ１中の残基の置換、位置７３、７４、７５、７６、７８、７９、８２ｂ、８３、８４、９３及び／又は９４などのＦＲ３中の残基の置換並びに位置１０３、１０４、１０８及び／又は１１１などのＦＲ４中の残基の置換が挙げられる（ＷＯ２００８／０２００７９表Ａ−０５〜Ａ０８、Ｋａｂａｔに従ったすべての番号付け）。
【０１１７】
一実施形態では、本明細書において記載されるポリペプチドは、配列番号４のヒト化変異体のアミノ酸配列を含む血清アルブミン結合ＩＶＤを含む。あるいは、ＩＶＤは、配列番号８〜１１又は配列番号１５〜１７のアミノ酸配列又はそのさらなるヒト化変異体を含む。配列番号４のヒト化変異体又は配列番号８〜１１及び１５〜１７のさらなるヒト化を決定するために使用されるヒト化アプローチは、代替として、図６に表されるようにヒト生殖系列対立遺伝子とアラインされたヒトコンセンサスに基づく。どのアミノ酸残基が置換に適しているかを導き出すには、種々の方法が適している。図６のアラインメントに提供されたヒト配列に基づいて、本発明のＶＨＨをヒト化するために、以下の位置（Ｋａｂａｔ番号付けに従って）が置換される可能性が高い：ＦＲ１中、位置１（Ｅ、Ｑ）；位置５（Ｖ又はＬ）、位置１１（Ｌ又はＶ）、位置１３（Ｑ、Ｋ、Ｒ）、位置１４（Ｐ）、位置１６（Ｇ、Ｒ）及び位置２９（Ｉ、Ｆ、Ｖ）；ＦＲ２中、位置３７（Ｆ、Ｖ、Ｉ、Ａ）；ＦＲ３中、位置５９（Ｙ、Ｇ、Ｎ、Ｄ、Ｅ、Ｈ）、位置６１（Ｄ、Ａ、Ｇ）、位置６２（Ｓ、Ｐ）、位置７３（Ｎ、Ｄ）、位置７４（Ａ、Ｓ）、位置７７（Ｔ、Ｓ）、位置８３（Ｒ、Ｋ）、位置８４（Ａ、Ｔ）、位置８７（Ｔ、Ｍ）、位置８９（Ｖ、Ｌ）；ＦＲ４中、位置１０８（Ｑ、Ｌ）。治療的適用（治療剤又は多重特異性構築物）において本発明の血清アルブミン結合ＩＶＤが、Ｎ末端に位置する場合には、Ｎ末端は、位置１にＤを含有しなくてはならない（例えば、配列番号８、９、１０又は１１と比較したＥ１Ｄ突然変異）。
【０１１８】
図５は、実施例８〜１０にも例示される、ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ  ＶＨＨの、ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ  ＶＨＨのいくつかのヒト化版（ｈ１〜４、配列番号８〜１１に表される）とのアラインメント又はＳＡ１＿Ｓ３０Ｋのヒト化のための代替選択肢（図５中、代替ｈ）を提供する。ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋとヒト化版の間の主な相違は、位置１：ＱからＥ／Ｄへ；位置５：ＱからＶへ；位置１４：ＡからＰへ；位置７３：Ｎから任意のアミノ酸（Ｘ）へ又は位置７４：ＡからＳ又は任意のアミノ酸へ；位置７８：ＶからＬへ；位置７９：ＨからＹへ；位置８２ｂ：ＴからＳへ；及び／又は位置１０８：ＱからＬへである。
【０１１９】
また、本明細書において定義されるような本発明の免疫グロブリン可変ドメイン（ＩＶＤ）又は免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）、特に、ＶＨＨ又はＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）の天然又は合成類似体、突然変異体、変異体、対立遺伝子、部分又は断片（本明細書においてまとめて「変異体」と呼ばれる）、特に、配列番号４のＶＨＨの変異体又は配列番号４のヒト化ＶＨＨ変異体も本発明の範囲内にある。したがって、本発明の一実施形態によれば、用語「本発明の免疫グロブリン可変ドメイン」又は「本発明のＶＨＨ」はその最も広い意味において、このような変異体をカバーする。一般に、このような変異体では、本明細書において定義されるような本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインに対して１個以上のアミノ酸残基が置き換え、欠失及び／又は付加、比較され得る。このような置換、挿入又は欠失は、ＦＲのうちの１つ以上において及び／又はＣＤＲ（配列番号１〜３）のうちの１つ以上において行われ得、特に、配列番号４の免疫グロブリン可変ドメインのＦＲ及びＣＤＲの変異体において行われ得る。本明細書で使用される場合、変異体とは、各フレームワーク領域又は任意のフレームワーク領域及び各相補性決定領域又は任意の相補性決定領域が、参照配列中の対応する領域と、ＰＩＬＥＵＰ及びＢＬＡＳＴなどのアルゴリズムを利用することによって電子工学的に測定され得るような、少なくとも８０％の同一性、好ましくは、少なくとも８５％の同一性、より好ましくは、９０％の同一性、いっそうより好ましくは、９５％の同一性又はさらにいっそうより好ましくは、９９％の同一性を示す配列である。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を介して公的に利用可能である。免疫グロブリン可変ドメインの１つ以上の配列のＣＤＲのアミノ酸配列のアミノ酸同一性の程度を決定するために、フレームワーク領域を形成するアミノ酸残基は無視されることは理解される。同様に、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインの１つ以上の配列のＦＲのアミノ酸配列のアミノ酸同一性の程度を決定するために、相補性領域を形成するアミノ酸残基は無視される。このような免疫グロブリン可変ドメインの変異体は、それらが改善された効力／親和性を有し得るので特に有利であり得る。非限定的な例によって、置換は、例えば、保存的置換であり得る、及び／又はアミノ酸残基は、別のＶＨＨドメイン中の同一位置に天然に存在する別のアミノ酸残基によって置き換えられ得る。したがって、本発明の免疫グロブリン可変ドメインの特性を改善する、又は少なくとも、本発明のＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）の所望の特性から、又はその所望の特性のバランス若しくは組合せから過剰に（すなわち、免疫グロブリン単一可変ドメインがその意図される使用にもはや適していない程度に）減じない任意の１つ以上の置換、欠失若しくは挿入又はそれらの任意の組合せは、本発明の範囲内に含まれる。当業者ならば、一般に、好適な置換、欠失若しくは挿入又は好適なそれらの組合せを、本明細書における開示に基づいて���任意選択的に、例えば、制限された数の可能性のある置換を導入すること及びこのように得られた免疫グロブリン可変ドメインの特性に対するそれらの影響を決定することを含み得る制限された程度の慣例的な実験の後に決定及び選択できる。
【０１２０】
さらなる一実施形態では、本明細書において記載されるようなポリペプチドは、本明細書において記載されるようなＩＶＤを含み、前記のものは、ＩＶＤコンジュゲートである。本明細書で使用される場合、用語「とコンジュゲートされた」とは、特に、安定な共有結合をもたらす化学的及び／又は酵素的コンジュゲーションを指す。「ＩＶＤコンジュゲート」又は「ＩＳＶＤコンジュゲート」は、本明細書において「コンジュゲートされる部分」又は「コンジュゲート」とさらに定義される特定の部分とカップリングされている（又は、当技術分野では同等の用語であるコンジュゲートされている若しくは接続されている）本発明のＩＶＤ又はＩＳＶＤを含むポリペプチドと呼ばれる。ＩＶＤコンジュゲート又はＩＳＶＤコンジュゲートを得るためのカップリングは、ＩＶＤ又はＩＳＶＤ中に存在する特定のアミノ酸（例えば、リシン、システイン）を介して起こり得る。本明細書で使用される場合、用語「コンジュゲートされる部分」又は「コンジュゲート」は、特定の生物学的又は特異的機能活性を有する作用物質（例えば、タンパク質（例えば、第２のＩＶＤ又はＩＳＶＤ）、ヌクレオチド配列、脂質、（その他の）炭水化物、ペプチド、薬物部分（例えば、細胞傷害性薬物、抗体−薬物コンジュゲート又はペイロード）、トレーサー及び検出剤）を含む。例えば、本発明のポリペプチド及びコンジュゲートされる部分を含むＩＶＤ又はＩＳＶＤコンジュゲートは、本発明のコンジュゲートしていないＩＶＤ又はＩＳＶＤポリペプチドと比較して、少なくとも１つのさらなる機能又は特性を有する。例えば、本発明のポリペプチドと、コンジュゲートされる部分である細胞傷害性薬物を含むＩＶＤ又はＩＳＶＤコンジュゲートは、第２の機能として（すなわち、ＩＶＤ又はＩＳＶＤポリペプチドによって付与される抗原結合、特定の場合には、血清アルブミン結合に加えて）薬物細胞毒性を有する結合ポリペプチドの形成をもたらす。さらに別の例では、本発明の治療用部分などの第２の結合ポリペプチドのＩＶＤ又はＩＳＶＤポリペプチドとのコンジュゲーションは、さらなる結合特性を付与し得る。コンジュゲートされる部分が遺伝子によってコードされた治療用若しくは診断用タンパク質又はヌクレオチド配列である特定の実施形態では、コンジュゲートされる部分は、当技術分野で周知のペプチド合成又は組換えＤＮＡ法のいずれかによって合成又は発現され得る。コンジュゲートされる部分が遺伝子によってコードされていないペプチド、例えば、薬物部分である別の態様では、コンジュゲートされる部分は、人工的に合成されても、天然供給源から精製されてもよい。
【０１２１】
特定の実施形態では、コンジュゲーションは、ＣＤＲ１のリシン又は配列番号１の第１のリシン残基あるいは配列番号４の位置３０に存在するリシンを含む。コンジュゲーションは、当技術分野で記載される任意の方法によって実施されてもよく、いくつかの非限定的な例示的実施形態は、実施例の節で概説される。ある特定の実施形態では、コンジュゲートされる部分は、すなわち、抗炎症、抗がん、細胞傷害性、抗感染（例えば、抗真菌、抗菌、抗寄生虫、抗ウイルスなど）及び麻酔治療剤を含む種々の治療剤を含む。具体的な実施形態では、コンジュゲートされる部分は、毒性薬物に変換されるプロドラッグを変換可能である酵素である。毒性薬剤（例えば、毒素、細胞傷害性薬物、放射性核種）も治療目的で好適なものである場合があり、がん療法において特に有用である。
【０１２２】
本発明の特定の実施形態では、前記ＩＶＤは、薬物又はペイロードにコンジュゲートされる。原理の証明として、本発明は、具体的な一実施形態においてビオチンとのコンジュゲーションを提供する。このようなビオチン化ＩＶＤコンジュゲートは、血清アルブミン結合親和性について解析され、前記ペイロードのＣＤＲ１領域中のリシン残基とのコンジュゲーションは、その結合親和性に影響を及ぼさなかったことを確認した。さらに、より大きなペイロード（例えば、マーカータンパク質としてのセイヨウワサビペルオキシダーゼ）をカップリングすることは、ヒト並びにラット及びマウスなどのげっ歯類において、位置３０のＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ中のリシンが、血清アルブミン結合又は半減期拡大の機能を保持しながらペイロードコンジュゲーション部位として適しているという原理のさらなる証明を示す。
【０１２３】
ＩＶＤ−コンジュゲートのさらなる具体例は、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である。原則では、治療目的で適しているどの薬剤も本明細書において想定される。記載されるような治療剤は、通常、小分子又は生物製剤であるが、治療剤はまた、当業者に明確でなくてはならない別の起源のものであってもよく、本発明は、それに限定されてはならない。それらのＡＤＣ薬物は、主に腫瘍学治療学に、制限された程度ではあるが、感染性疾患（Ｂｅｓｓｉｒｅら、２０１６年）などのその他の領域にも焦点が当てられた現在活発な研究領域であり、一般に、３つの主要な構成要素：腫瘍細胞表面抗原を選択的に標的化するための抗体（又はＩＶＤ）、細胞傷害性ペイロード及びこれら２つの部分を接続するリンカーユニットからなり、この場合にはまた、血清アルブミン結合ＩＶＤを構成する。ＡＤＣは、細胞表面抗原と結合するとエンドサイトーシスによって内部移行され、その後、エンドソーム及び／又はリソソームに輸送される。これらのコンパートメントでは、抗体異化作用によって、又はプロテアーゼによるリンカーの切断、ｐＨによって引き起こされる加水分解又はジスルフィド還元によってのいずれかで細胞傷害性ペイロード部分が放出される。切断可能なリンカーを有するＡＤＣについては、切断トリガーは、使用されるリンカーの性質によって、通常は決定される。例えば、よく使用される切断可能なリンカーである、バリン−シトルリンｐ−アミノベンジルカルバメート（ｖｃ−ＰＡＢＣ）は、細胞内システインプロテアーゼカテプシンＢの基質である。切断可能なリンカーＡＤＣは、通常、活性部分として未修飾ペイロードを放出する。しかし、切断可能ではないリンカーＡＤＣは、迅速な化学的又は酵素的な放出の機序を含有せず、代わりに、活性種の放出のために抗体の分解に頼る。これらのＡＤＣは、化学的リンカーの、又はリンカーの全くない宿主のいずれも含有することができ、通常、抗体又はＩＶＤからリンカーを伴う細胞傷害性ペイロード及び１種以上のアミノ酸を放出する。
【０１２４】
ある特定の実施形態では、ＩＶＤ−コンジュゲートは、リシンとコンジュゲート又はコンジュゲート部分との間にリンカーを含む。ある特定のリンカーは、その他のものよりも有用であり、具体的なリンカーの使用は、適用に応じて変わる。一般に、本発明に従ってＩＶＤとコンジュゲートされる部分とを連結するために、当技術分野で公知の種々のリンカーが使用され得る。明らかであるはずであるが、所望の放出プロファイルを達成するために切断可能な及び切断可能ではないリンカーが使用され得る。一般に、最適なリンカー及びコンジュゲーション化学の組合せは、各独特のファセット：ＩＶＤ、コンジュゲートされる部分及び治療されるべき疾患のプロファイルを関連付けるために独特に調整されなければならない。本明細書において使用される抗体−薬物コンジュゲート及びリンカーについての概説については、例えば、ＭｃＣｏｍｂｓ及びＯｗｅｎ（２０１５年）並びにＬｕら、（２０１６年）並びにがん及び感染性疾患の治療のためのコンジュゲートにおいて有用な新規第四級アンモニウム塩リンカーを説明するＰｉｌｌｏｗ（２０１７年）による最近の概説を参照のこと。さらにその他の好適なスペーサー又はリンカーは、当業者に明確であり、一般に当技術分野で使用される任意のリンカー又はスペーサーであり得る。具体的な態様では、リンカー又はスペーサーは、医薬使用のために意図される適用において使用するのに適している。例えば、リシンとコンジュゲートとの間のリンカーはまた、ある特定の態様では、好適なアミノ酸配列、特に、１〜５０の間の、より詳しくは、１〜３０の間のアミノ酸残基のアミノ酸配列であり得る。このようなアミノ酸配列のいくつかの例として、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ＧＳ）リンカーが挙げられる。さらにその他の好適なリンカーは、一般に、有機化合物又はポリマー、特に、医薬使用のためのポリペプチドにおいて使用するのに好適なものを含む。例えば、抗体ドメインを連結するためにポリ（エチレングリコール）部分が使用されてきた（例えば、ＷＯ０４／０８１０２６を参照のこと）。本発明の範囲内に、リンカーの長さ、可動性の程度及び／又はその他の特性が、それだけには限らないが、特異的標的の親和性、特異性又はアビディティーを含む本発明の最終ＩＶＤコンジュゲートの特性に対して幾分か影響を及ぼし得ることが包含される。本明細書における開示に基づいて、当業者ならば、任意選択的に、幾分か制限された慣例的な実験の後に、本発明の具体的ＩＶＤにおいて使用するための最適なリンカーを決定できる。例えば、第１及び第２の標的に対するビルディングブロックを含む本発明の多価又は多重特異性ＩＶＤでは、リンカーの長さ及び可動性は、好ましくは、各ビルディングブロックがその同族標的と結合するのを可能にするようなものである。やはり、本明細書における開示に基づいて、当業者ならば、任意選択的に、幾分か制限された慣例的な実験の後に、本発明の特定のＩＶＤにおいて使用するための最適なリンカーを決定できる。最後に、２種以上のリンカーが本発明のＩＶＤにおいて使用される場合には、これらのリンカーは、同一であっても異なっていてもよい。やはり、本明細書における開示に基づいて、当業者ならば、任意選択的に、幾分か制限された慣例的な実験の後に、本発明の特定のポリペプチドにおいて使用するための最適なリンカーを決定できる。
【０１２５】
さらに別の実施形態では、本発明は、本発明のＩＶＤコンジュゲートを製造する方法を提供する。一般に、このような方法は、本発明のＩＶＤをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを、選択した好適な細胞に導入することと、続いて、しばらくの間ＩＶＤポリペプチドを発現させること、ＩＶＤポリペプチドを精製すること及び特定のコンジュゲートされる部分を、精製ＩＶＤポリペプチドに連結することによって開始する。カップリング法自体は、一般にインビトロで実施される。特定のコンジュゲートされる部分を本発明のＩＶＤポリペプチドに連結するために当技術分野でいくつかの可能性が存在する。一般的に言われる、カップリング反応を行うための化学的、酵素的及び組み合わされた化学−酵素的コンジュゲーション戦略がある。特定の実施形態では、本発明のＩＶＤ−コンジュゲートを含むポリペプチドは、循環半減期を調節するために、又はＩＶＤ安定性を増大するために、選択的標的化のために、ＩＶＤ−コンジュゲートの免疫原性を調節するために、又は検出目的のために使用される。さらに別の実施形態では、本発明のＩＶＤ−コンジュゲートは、医薬として使用される。
【０１２６】
実際、本発明のさらなる態様は、治療用部分の半減期を増大するために使用するための、血清アルブミン結合ＩＶＤを含む本発明の前記ポリペプチドに関する。
【０１２７】
現在、生物治療剤の半減期拡大は、アルブミン結合又は融合、免疫グロブリンＦｃ領域との融合及びペグ化を利用する戦略によって支配される（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎ、２０１６年）。したがって、治療用部分又は生物学的製剤の半減期拡大又は半減期増大のための、本発明の血清アルブミン結合ポリペプチドの使用は、前記発明の確かに極めて幸先の良い適用である。実際、本発明の治療用部分は、血清アルブミン結合ポリペプチドを、基本的にいずれの種類の分子であってもよく、好ましくは、タンパク質である、又はより具体的には、ＩＶＤを含む前記治療用部分に連結すること又はカップリングすることによって提供される。前記のカップリングすること又は連結することは、ＣＤＲ１中のリシンを介してであり得るが、同様に本発明のＩＶＤ又はポリペプチドのＮ−若しくはＣ−末端などのその他の残基を介してもよい。
【０１２８】
一実施形態は、前記薬剤（より大きなポリペプチド又は高分子であり得る）が、本発明のＩＶＤを含むポリペプチド及びさらに治療用部分を含むことを特徴とする血清半減期が増大した治療剤にさらに関する。前記治療剤は、本発明の血清アルブミン結合ポリペプチドを欠く同一治療剤と比較してより長い半減期を有することを特徴とする。
【０１２９】
本発明の血清アルブミンと結合するＩＶＤを含む本発明のポリペプチド又は本発明の治療剤はまた、種々の実施形態において、医薬として使用するために適用される。
【０１３０】
具体的な実施形態では、医薬としての前記使用は、血清アルブミン結合親和性を含むＩＶＤに加えて、前記ポリペプチド内の治療用部分の存在に関する。前記実施形態では、本発明は代替として、多重特異性構築物を提供する。
【０１３１】
より詳しくは、前記多重特異性構築物は、本発明の血清アルブミン結合ＩＶＤを有する前記ポリペプチド及び少なくとも１種の治療用部分を含む。したがって、前記多重特異性若しくは多価構築物又はポリペプチドは、血清アルブミンに対して親和性を有する少なくとも１つの抗原結合部位及びある特定の実施形態では、治療上関連するタンパク質を標的化する抗原結合部位も含む少なくとも１つのより治療上有用な部分を含む。前記治療用部分がＩＶＤを含む実施形態では、本発明は、融合された可変ドメイン、例えば、多価及び／又は多重特異性構築物を含む。１以上のＶＨＨドメインを含有する多価及び多重特異性ポリペプチド並びにそれらの調製については、Ｃｏｎｒａｔｈら（２００１年）並びに例えば、ＷＯ９６／３４１０３及びＷＯ９９／２３２２１が参照される。あるいは、実施形態は、前記治療用部分が、ＩＶＤ又はＩＳＶＤの断片を含む多重特異性又は多価構築物に関する。最後に、種々の実施形態は、ポリペプチドが、リンカー又はスペーサーを介して少なくとも１種の治療用部分に連結されている、本発明の多重特異性又は多価構築物に関する。
【０１３２】
本発明の別の態様では、本発明のポリペプチド又は本発明の多重特異性構築物をコードする、ヌクレオチド配列又は核酸又は核酸分子が提供される。
【０１３３】
代替的な実施形態は、前記ヌクレオチド配列を含むベクターに関する。本明細書で使用される場合、用語「ベクター」は、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター、例えば、ラムダファージ、ウイルスベクター、例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ若しくはバキュロウイルスベクター又は人工染色体ベクター、例えば細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）若しくはＰ１人工染色体（ＰＡＣ）を含む当業者に公知の任意のベクターを含む。前記ベクターは、発現並びにクローニングベクターを含む。発現ベクターは、プラスミド並びにウイルスベクターを含み、一般に、所望のコード配列及び特定の宿主生物（例えば、細菌、酵母、植物、昆虫又は哺乳動物）における、又はインビトロ発現系における作動可能に連結されたコード配列の発現に必要な適当なＤＮＡ配列を含有する。通常、「発現ベクター」は、発現可能なプロモーター又は調節ヌクレオチド配列が、調節ヌクレオチド配列が、関連しているヌクレオチド配列の転写又は発現を調節可能であるようにｍＲＮＡをコードするヌクレオチド配列又はＤＮＡ領域に作動可能に連結されている、又はそれと関連しているヌクレオチド配列を含む。通常、ベクターの調節ヌクレオチド配列又はプロモーターは、天然に見られるように関連するヌクレオチド配列に作動可能に連結されておらず、したがって、それに作動可能に連結しているＤＮＡ領域のコード配列に対して異種である。本明細書で使用される場合、用語「作動可能に（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ）」又は「作動可能に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）」「連結されている」とは、プロモーター配列が対象の遺伝子の転写を開始可能であるような、発現可能なプロモーター配列と対象のＤＮＡ領域又は遺伝子間の機能的連結を指し、また、真核細胞における転写の適当な終結を保証する、対象の遺伝子と転写終結配列間の機能的連結を指す。クローニングベクターは、一般に、ある特定の所望のＤＮＡ断片を遺伝子操作し、増幅するために使用され、所望のＤＮＡ断片の発現に必要とされる機能的配列を欠く場合もある。
【０１３４】
別の実施形態は、本発明によって提供されるポリペプチド又は多重特異性構築物又は核酸配列又は分子を含む宿主細胞又は発現宿主に関する。用語「宿主細胞」、「発現宿主」又は「宿主」とは、組換え法で対象のタンパク質又は核酸を発現するために使用される細胞システムを指す。宿主細胞は、単細胞生物由来の細胞ではない、真核細胞を指す「より高度な真核細胞」に関連し得る。言い換えれば、より高度な真核細胞は、ヒト細胞株又は別の哺乳動物細胞株（例えば、ＣＨＯ細胞株）などの多細胞真核生物に由来する（又は、細胞培養物の場合には、それから誘導される）細胞である。通常、より高度な真核細胞は、真菌細胞ではない。特に、一般には、この用語は、哺乳動物細胞、ヒト細胞株及び昆虫細胞株を指す。より詳しくは、この用語は、脊椎動物細胞、さらにより詳しくは、哺乳動物細胞又はヒト細胞を指す。本明細書において記載されるようなより高度な真核細胞は、通常、細胞培養物（例えば、ＨＥＫ又はＣＨＯ細胞株などの細胞株）の一部であるが、これは常に厳密に必要とされない（例えば、植物細胞の場合には、組換えタンパク質を産生するために、植物自体が使用され得る）。宿主細胞はまた、本明細書で使用される場合、糸状菌細胞又は酵母細胞が意味される「低級真核細胞」に関する場合もある。酵母細胞は、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の種（例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）の種（例えば、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ））、アルクスラ属（Ａｒｘｕｌａ）の種（例えば、アルクスラ・アデニニボランス（Ａｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ））、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）の種（例えば、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）の種（例えば、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ））又はピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）としてこれまでは名付けられており、古い命名法の下でより公知であり、本明細書においてもさらに使用されるコマガタエラ・ファフィ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐｈａｆｆｉｉ）（Ｋｕｒｔｚｍａｎ、２００９年）に由来するものであり得る。具体的な実施形態によれば、低級真核細胞は、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）の細胞であり、最も詳しい実施形態では、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）である。具体的な実施形態では、糸状菌細胞は、ミセリオプトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）（Ｄｙａｄｉｃ社によるＣ１としても知られる）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の種（例えば、アスペルギルス・ニジュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ））、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）の種（例えば、���ザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ））、ヒポクレア属（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）及びトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の種（例えば、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ））である。「原核細胞」と関連する宿主細胞は、通常、細菌細胞のような非病原性原核生物、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）及びバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の種などを指す。
【０１３５】
本発明の別の態様は、本発明の血清アルブミン結合特性を有するＩＶＤを含む少なくとも１種のタンパク質又は少なくとも１種の本発明の治療剤又は少なくとも１種の本発明の多重特異性構築物及び任意選択的に少なくとも１種の薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む医薬組成物に関する。
【０１３６】
本発明は、したがって、薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤及び血清アルブミンと結合し、任意選択的に別の治療的若しくは診断的部分にもコンジュゲートされた、多重特異性構築物中の、又はＣＤＲ１中のリシンを介して薬物にコンジュゲートされた、ＩＶＤ又はＩＶＤコンジュゲートを含む薬学的に有効な量のポリペプチドからなる医薬組成物を含む。「担体」又は「アジュバント」、特に「薬学的に許容される担体」又は「薬学的に許容されるアジュバント」は、それ自体が、組成物を受け取る個体にとって有害である抗体の生成を誘導せず、保護も誘発しない、任意の好適な賦形剤、希釈剤、担体及び／又はアジュバントである。「薬学的に許容される」は、生物学的又はその他の点で望ましくないものではない材料を意味する、すなわち、材料は、何らかの望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく、又は含有される医薬組成物のその他の構成要素のいずれかと有害な様式で相互作用することなく、化合物とともに個体に投与され得る。薬学的に許容される担体は、好ましくは、有効成分の有効活性と一致する濃度で患者にとって相対的に非毒性であり、非侵害性であり、その結果、担体に起因するいずれの副作用も有効成分の有益な効果を損なわない担体である。好ましくは、薬学的に許容される担体又はアジュバントは、抗原によって誘発される免疫応答を増強する。好適な担体又はアジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔｉａ）は、通常、以下の包括的でないリスト中に含まれる１種以上の化合物を含む：タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマーなどの大きなゆっくりと代謝される高分子及び不活性ウイルス粒子。本明細書で使用される場合、用語「賦形剤」は、医薬組成物中に存在する可能性があり、有効成分ではないすべての物質、例えば、塩、結合剤（例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、トレハロース、ソルビトール、マンニトール）、滑沢剤、増粘剤、界面活性剤、保存剤、乳化剤、バッファー物質、安定化剤、矯味剤又は着色剤を含むと意図される。「希釈剤」、特に、「薬学的に許容される媒体」は、水、生理食塩水、生理学的塩溶液、グリセロール、エタノールなどの媒体を含む。湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝物質、保存剤などの補助物質も、このような媒体に含まれ得る。
【０１３７】
本発明の薬学的に有効な量のポリペプチド又はコンジュゲート及び薬学的に許容される担体は、好ましくは、治療されている特定の状態に対して結果をもたらす又は影響を発揮する量である。一般に、「治療上有効な量」、「治療上有効な用量」及び「有効量」とは、所望の結果（単数又は複数）を達成するのに必要とされる量を意味する。当業者ならば、血清アルブミン及び／又は本発明のポリペプチド中に存在するその他の治療部分を介してその他の抗原と結合するポリペプチドの効力及びしたがって「有効量」は変わり得ることを認識する。当業者ならば、抗体の効力を容易に評価できる。
【０１３８】
本発明のポリペプチド及びコンジュゲート並びに薬学的に許容される担体は、当技術分野で周知の薬学的に許容される担体とともに、即時放出、持続放出及び徐放調製物を含む任意の有効な従来の投与形態を使用して投与されてもよく、また当業者に共通して知られるもののいずれかなどの任意の好適な経路によって投与されてもよい。療法のために、本発明の医薬組成物は、標準技術に従って任意の患者に投与され得る。投与は、経口的に、非経口的に、局所的に、経鼻的に、眼内に、くも膜下腔内に、脳室内に、舌下に、直腸に、経膣的になど任意の適当な様式によってであり得る。ナノテクノロジー及びエアゾール及び吸入剤としての製剤のさらにその他の技術も、本発明の範囲内である。投与量及び投与の頻度は、年齢、性別及び患者の状態、その他の薬物の同時投与、禁忌及び臨床医によって考慮されるべきその他のパラメータに応じて変わる。本発明の医薬組成物は、貯蔵のために凍結乾燥され、使用に先立って好適な担体で再構成されてもよい。凍結乾燥又は液体として調製された場合、本発明の医薬組成物に生理学的に許容される担体、賦形剤、安定剤が添加される必要がある（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  第２２版、Ａｌｌｅｎ，Ｌｏｙｄ  Ｖ，Ｊｒ．編（２０１２年）。リン酸、クエン酸及びその他の有機酸などのバッファー、ビタミンＣなどの抗酸化薬、小ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなどのタンパク質、ＰＶＰなどの親水性ポリマー、アミノアセテート、グルタミン酸、アスパラギン、アルギニン、リシンなどのアミノ酸、グリコース（ｇｌｙｃｏｓｅ）、二糖及びグルコース、マンノース又はデキストリンなどのその他の炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、マンニトール、ソルビトールなどの糖アルコール、Ｎａ＋などの対イオン及び／又はＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）若しくはＰＥＧなどの界面活性剤などを含む、担体、賦形剤及び安定剤の投与量及び濃度は、対象（ヒト、マウス及びその他の哺乳動物）にとって安全でなければならない。本発明の医薬組成物を含有する調製物は、注射の前に滅菌されなければならない。この手順は、凍結乾燥及び再構成の前後に滅菌濾過膜を使用して行われ得る。医薬組成物は通常、滅菌アクセスポートを備えた容器、例えば、コルクを備えたｉ．ｖ．溶液ボトル中に充填される。
【０１３９】
本発明のさらなる態様は、血清アルブミン結合ポリペプチドを製造する方法であって、
ｉ．好適な発現系又は宿主細胞において、ポリペプチド、多重特異性構築物又は本発明の前記ポリペプチド若しくは多重特異性構築物をコードするヌクレオチド配列若しくは核酸を発現させるステップ、及び
ｉｉ．前記血清アルブミン結合ポリペプチドを精製又は単離するステップ
を含む方法に関する。
【０１４０】
前記の発現されたポリペプチドの精製又は単離を用いて、例えば、制限するものではないが、中でも、アフィニティークロマトグラフィー、アフィニティー精製などの親和性ベースの精製、免疫沈降、タンパク質検出、免疫化学、表面ディスプレイが意味され、すべて当技術分野で周知である。
【０１４１】
別の実施形態では、本発明は、対象における治療剤の半減期を延長する方法であって、本発明の医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。
【０１４２】
本発明のさらに別の態様は、本発明のポリペプチド、多重特異性構築物又は核酸を含むキットに関する。キットは、バッファー、分子タグ、ベクター構築物、参照サンプル材料などの試薬並びに好適な固体支持体、細胞、核酸などの組合せをさらに含み得る。このようなキットは、本明細書において記載されるような本発明の適用のいずれにとっても有用であり得る。
【０１４３】
また、本発明に従う血清アルブミン結合親和性を有するＩＶＤを含むポリペプチドを含む固体支持体又は樹脂が本発明の範囲内に包含される。好適な固体支持体の非限定的な例として、ビーズ、カラム、スライド、チップ又はプレートが挙げられる。より詳しくは、固体支持体は、微粒子（例えば、一般に抽出カラムにおいて使用されるビーズ又は顆粒）又は平坦、ひだ状若しくは中空ファイバー若しくはチューブであり得るシート形態（例えば、メンブレン又はフィルター、ガラス又はプラスチックスライド、マイクロタイターアッセイプレート、ディップスティック、キャピラリー充填デバイスなど）であり得る。以下のマトリックスが例として与えられるが包括的ではなく、このような例として、シリカ（多孔性非晶質シリカ）、すなわち、Ｂｉｏｔａｇｅ（Ｄｙａｘ  Ｃｏｒｐ．の一部門）によって供給される６０Ａ不規則シリカ（３２〜６３ｕｍ又は３５〜７０ｕｍ）を含有するカートリッジのＦＬＡＳＨシリーズ、アガロース又はポリアクリルアミド支持体、例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈによって供給されるセファロースレンジの製品、又はＢｉｏ−ａｄによって供給されるＡｆｆｉ−Ｇｅｌ支持体を挙げることができる。さらに、Ｂｉｏ−Ｒａｄによって供給される圧力安定性Ａｆｆｉ−Ｐｒｅｐ支持体などのマクロ多孔質ポリマーがある。利用され得るその他の支持体として、デキストラン、コラーゲン、ポリスチレン、メタクリル酸、アルギン酸カルシウム、制御細孔ガラス、アルミニウム、チタン及び多孔質セラミックスが挙げられる。あるいは、固体表面は、質量依存性センサーの一部、例えば、表面プラズモン共鳴検出器を含み得る。市販の支持体のさらなる例は、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｓａｔｉｏｎ、Ｒ．Ｆ．Ｔａｙｌｏｒ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、（１９９１年）において論じられている。固定化は、当技術分野で公知の技術を使用する非共有又は共有のいずれかであり得る。
【０１４４】
本発明の遺伝子操作された細胞及び方法について、本明細書において特定の実施形態、特定の構成並びに材料及び／又は分子が論じられてきたが、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、形態及び詳細において種々の変法又は改変が行われ得るということは理解されるべきである。以下の実施例は、特定の実施形態をより良好に例示するために提供され、それらは、本出願を制限すると考えられてはならない。本出願は、特許請求の範囲によってのみ制限される。
【実施例】
【０１４５】
［実施例１］  血清アルブミン結合ＶＨＨ  ＳＡ１の非グリコシル化変異体の作製及びオフ速度決定。
ヒトアルブミン結合ＶＨＨ  ＳＡ１（ＷＯ２０１４／０３７４１９；本出願配列番号５）は、位置２８〜３０のＮＩＳグリコシル化コンセンサス配列の存在に基づいて位置２８に推定Ｎ−グリコシル化部位を含有する。ＳＡ１がピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）において発現された場合、この部位は、部分グリコシル化する傾向があることが示された。したがって、位置３０のセリンをリシンアミノ酸に突然変異することによって、グリコシル化コンセンサス配列を有さないＳＡ１突然変異体変異体を設計した、ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ（配列番号４）。
【０１４６】
このＳＡ１突然変異体変異体ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ並びにまた血清アルブミンと結合するベンチマークＶＨＨ（ＥＰ１８８８６４１Ｂ１からのＡＬＢ８、配列番号６２）及びその非突然変異形態ＳＡ１を、ｐＨＥＮ６ｃ発現ベクターに（Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら、１９９７年）、ｐｅｌＢリーダーシグナル配列（ＶＨＨペリプラズム輸送のため）とＣ末端ヘキサヒスチジン（Ｈｉｓ６）タグとの間にサブクローニングした。ベクターを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＷＫ６に電気形質転換し、ＬＢ−寒天アンピシリンプレートに接種した。クローンを１ｍＬのＴＢ＋アンピシリン培地に播種した。５時間後、１ｍＭのＩＰＴＧを用いてＶＨＨ産生を誘導した。一晩産生した後、細胞培養物を遠心分離し、細胞をＴＥＳバッファー（Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０＋スクロース及びＥＤＴＡ）に再懸濁した。２時間インキュベートした後、水を添加し、さらに４時間インキュベートした。細菌を遠心分離によって回収し、その後、ペリプラズム抽出物（ＰＥ）を−８０℃で直ちに凍結した。
【０１４７】
すべてのＰＥを、中性ｐＨのバッファー（ＰＢＳ）及び低ｐＨのバッファー（７５ｍＭ  酢酸Ｎａ、ｐＨ５．５）での１／４希釈でオフ速度ランキングについて解析した（表１）。オフ速度は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）コートＯｃｔｅｔ  ＡＲ２Ｇセンサー（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｎｏｔｅ  ２６に詳述されたように、ＨＳＡがｐＨ５．０で２０μｇ／ｍＬでつながれた）を使用してＯｃｔｅｔ  ＲＥＤ９６（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）機器でＢｉｏＬａｙｅｒ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙによって解析した。
【０１４８】
両ｐＨ条件での観察された結合レベルに基づいて、アミノ酸、ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ突然変異体変異体の両ｐＨ条件でのオフ速度及び生物物理的特性をさらなる解析に適していると結論付けた。
【０１４９】
【表１】
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【０１５０】
［実施例２］  ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ突然変異体変異体ＶＨＨの組換え発現及び精製での収率。
ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ変異体を１ＬのＴＢ培地（３ボトル）中で発現させ、ＳＡ１非突然変異ＶＨＨ並びにＡｌｂ８ベンチマークと比較した。各ＶＨＨについて５ｍＬのＬＢ＋アンピシリンで小規模で一晩の培養を開始した。これらを使用して、３３０ｍＬのＴＢ＋アンピシリン／グルコースを有する３つのシェーカーフラスコに接種した。培養物のＯＤ６００が、０．８に到達した時点で、１ｍＭのＩＰＴＧ（最終濃度）を添加することによって培養物を誘導した。翌日、細胞を遠沈し、ペレットを秤量した。ほとんどの培養物は、２０より高いＯＤ６００に成長し、遠心分離後に透明な上清を有していた。
【０１５１】
１２ｍＬのＴＥＳバッファー中でペレットを３時間インキュベートし、次いで、１８ｍＬの水を添加することによって、ペレットに浸透圧ショックを与えた。４℃で一晩インキュベートした後、遠心分離によってＰＥを集めた。次いで、ペレットに再度浸透圧ショックを与えた。すべての抽出物を集めた後、個別のＰＥ各々に１ｍＬのＨｉｓ選択マトリックス（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した。混合物を４℃で１時間インキュベートし、その後、空のカラム中に集めた。２回目にＰＥをカラム上に再度アプライした後、ＰＢＳ＋２０ｍＭイミダゾールを用いてマトリックスを洗浄した。最後に、ＰＢＳ＋０．５Ｍイミダゾールを添加することによってＶＨＨを溶出し、１ｍＬ画分を集めた。この固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）後に得られたこれらの画分を、集めたＶＨＨの量を計測するために２８０ｎｍのナノドロップで測定した。相当な量のタンパク質を含有する画分をプールし、ゲル濾過（ＧＦ）カラムにロードした。ＶＨＨモノマーピークから得たすべての画分を集め、プールした。最終ＶＨＨ収率は、表２に列挙されている。
【０１５２】
際立ったことに、ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ変異体は、元のＳＡ１  ＶＨＨと比較して、またベンチマークＡｌｂ８と比較して高い収率を示した。
【０１５３】
【表２】
2020527352.tif 000016
【０１５４】
［実施例３］  ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ突然変異体変異体ＶＨＨの熱安定性。
安定性が、ＳＡ１と比較して精製ＶＨＨにおける突然変異によって影響を受けるか否かを解析するために、ＶＨＨ  ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ突然変異体変異体の熱安定性を決定した。０．５℃の間でＳｙｐｒｏ  Ｏｒａｎｇｅ取り込みについて、０．５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で熱安定性を決定した。Ｂｉｏｒａｄ  Ｒｅａｌｔｉｍｅ  ＰＣＲ機器でＳｙｐｒｏ  Ｏｒａｎｇｅ取り込みをモニタリングした。得られた値を、Ｂｏｌｔｚｍａｎｎシグモイドフィットを使用してフィッティングした。このフィットに基づいて、各ＶＨＨの融点（Ｔｍ）を決定した（表３）。ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋは、非突然変異ＳＡ１と比較して同様の熱安定性を示し、ベンチマークと比較してかなり高い熱安定性を示した。
【０１５５】
【表３】
2020527352.tif 000017
【０１５６】
［実施例４］  血清アルブミンに対するＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ突然変異体変異体ＶＨＨの親和性
ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ突然変異体変異体並びに元のＳＡ１  ＶＨＨ及びベンチマークＡｌｂ８について、ＢｉｏＬａｙｅｒ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ（Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ９６機器、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）によってヒト、カニクイザル、マウス、ラット、モルモット、ウサギ及びウシ血清アルブミンに対する親和性を決定した。この目的のために、ＨＳＡについて実施例１に記載されるように、各種の血清アルブミンをＡＲ２Ｇセンサー（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）につないだ。
【０１５７】
最初のプロファイリングに基づいて、１００ｎＭから１．５ｎＭに段階的に１／２希釈したベンチマークＶＨＨ  Ａｌｂ８の、ＳＡ１の及びＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ変異体の全動態プロファイルを決定した。しかし、ウサギアルブミンとの低い親和性相互作用のために、このアルブミンについては、１６００ｎＭで出発する濃度を使用して２５ｎＭに低下させた。各ＶＨＨの得られた値は、表４に示されている。
【０１５８】
ヒト血清アルブミンに対する親和性は、試験したすべてのＶＨＨについて同等である。ウシアルブミンは、いずれのＶＨＨに対しても検出可能な結合親和性を示さなかった。
【０１５９】
ベンチマークと比較して、ＳＡ１及びＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ  ＶＨＨのカニクイザル（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ａ２Ｖ９２４）、マウス（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０７７２４、配列番号１３）及びラットアルブミン（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０２７７０、配列番号１４）親和性は、有意に高かった。また、驚くべきことに、ＳＡ１と比較してＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ突然変異体変異体のラット及びマウスアルブミンに対する親和性が改善された。
【０１６０】
【表４】
2020527352.tif 000018
【０１６１】
結論として、ラットアルブミンに対するＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ  ＶＨＨ（すなわち、配列番号４に表されるＶＨＨ）の親和性（ＫＤ）は、０．０２ｎＭ又は２０ｐＭであると示され、これは、ＳＡ１（２０倍低い）又はＡｌｂ８（１０，０００倍低い）などのその他のＶＨＨと比較するとかなり高い。あまりはっきりしないが、マウス血清アルブミンに対する、０．２９ｎＭ又は２９０ｐＭであるＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ  ＶＨＨの親和性（ＫＤ）も、ＳＡ１（２倍低い）又はＡｌｂ８（１５倍低い）と比較して高い。
【０１６２】
［実施例５］  ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ突然変異体変異体ＶＨＨのビオチン化
非突然変異対照ＳＡ１  ＶＨＨ及びＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ突然変異体変異体ＶＨＨを、ビオチン／ＶＨＨの５／１モル比でビオチンを用いて標識した（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ製の「Ｎｏ  Ｗｅｉｇｈ」ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ビオチンキット）。ＥＬＩＳＡを用いて結合活性を最初に評価し、続いて、ＢｉｏＬａｙｅｒ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ（ＯｃｔｅｔＲＥＤ９６機器、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）によって親和性決定を行った。
【０１６３】
１）ＥＬＩＳＡ：手短にＨＳＡをコーティングし（ＯＮ、４℃、５μｇ／ｍＬ、炭酸バッファー）、その後、１％カゼインを用いてプレートをブロッキングした（室温、１時間）。続いて、ビオチン化ＶＨＨの段階（０．５対数）希釈物を３μｇ／ｍＬの出発濃度でインキュベートした（２時間、室温、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−０．１％カゼイン）。最後に、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（１時間、室温、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−０．１％カゼイン）及びＯＰＤ基質を用いてビオチン化ＶＨＨ結合を検出した。１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を添加することによって呈色反応を停止し、４９０ｎＭでＯＤを読み取った。ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を使用してインキュベーション間に洗浄ステップを行った。
【０１６４】
２）親和性：実施例１に記載されたように、ＨＳＡをｏｃｔｅｔ  ＡＲ２Ｇチップにコーティングした。これまでのデータに基づいて、ＳＡ１及びＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ  ＶＨＨを１００ｎＭから１．５ｎＭに段階的に１／２希釈して使用した。
【０１６５】
観察されたＥＬＩＳＡシグナルは、ビオチン化ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ  ＶＨＨ変異体について明確に高く（図２）、これは、位置３０のさらなるリシン残基と関連している可能性が高い。このリシンは、ＣＤＲ１（配列番号１、ＭａｃＣａｌｌｕｍらのＣＤＲ定義に従う、Ｃｈｏｔｈｉａ又はＡｂＭ）の一部であるが、このビオチン化は、ビオチン化ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ  ＶＨＨのＨＳＡに対する親和性に顕著には影響を及ぼさなかった（表５：２倍未満のＫＤ又はｋｏｎ又はｋｏｆｆの変化）。
【０１６６】
【表５】
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【０１６７】
［実施例６］  ウマ、イヌ、ネコ及びブタにおけるＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ突然変異体変異体の交差反応性
ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ突然変異体変異体ＶＨＨ及び元のＳＡ１  ＶＨＨは、いくつかのアルブミンと結合したと示され、これは、ヒト及び実験室動物モデル血清半減期拡大のために興味深い。これらのＶＨＨが、獣医学適用において使用するものであるか否かを明らかにするために、ここで、それらをイヌ、ネコ、ウマ及びブタ血清アルブミンで結合について試験した。ウシアルブミンは、非反応性を証明した（実施例４を参照のこと）。これらの実験のために、ベンチマークＨＳＡ  Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）（ＡＬＢ８）を参照した。
【０１６８】
異なるアルブミンをＯｃｔｅｔ  ＡＲ２Ｇ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒにコーティングし、ＢｉｏＬａｙｅｒ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ（Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ９６機器；Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）を使用してＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ、ＳＡ１及びＡＬＢ８結合の動態結合プロファイルを計測するために使用した。
【０１６９】
Ｏｃｔｅｔ  ＡＲ２Ｇチップでのアルブミンのコーティング
１０ｍｇの凍結乾燥したネコ、イヌ、ウマ又はブタ血清（ＨＳＡ）アルブミン（Ｓｉｇｍａ）を、１ｍＬのＰＢＳ（１０μｇ／μＬ）に再懸濁した。これを、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ  Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄ９６機器とともにＦｏｒｔｅｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｎｏｔｅ  ２６に詳述されたようにＡＲ２Ｇ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒの「リガンドスカウティング固定化条件」プロトコールにおいて２０μｇ／ｍＬで使用した。ｐＨ５．０及びｐＨ４．０条件のみを試験した。ＨＳＡコーティングされたチップをＰＢＳ中、１０００ｎＭ  ＳＡ１  ＶＨＨ溶液と接触させることによってコーティングの品質を調べた。要約すると、ＨＳＡのコーティングは、ネコ、ウマ及びブタについてｐＨ５．０で、ウマについてｐＨ４．０で最も効率的であった。
【０１７０】
結合動態学決定
上記のコーティング条件を使用して、結合研究のために各アルブミンを用いて８つのＡＲ２Ｇチップの３カラムをコーティングした。ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ、ＳＡ１及びＡＬＢ８  ＶＨＨを、８００、４００、２００、１００、５０、２５、１２．５及び０ｎＭの濃度にＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で希釈した。これらの濃度を、アルブミンチップに６００秒間接触させて、会合を測定し、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０を含有するウェル中で９００秒間インキュベートして、解離を測定した。
【０１７１】
データ獲得後、Ｏｃｔｅｔ  Ｄａｔａ解析ソフトウェアｖ９．０を使用してプロファイルを解析した。値に１：１結合モデルを適用し、その結果、ウマ及びイヌ血清アルブミンを含む実験のＫｏｎ、Ｋｏｆｆ及びＫＤパラメータが得られた（表６）。ネコ及びブタ血清アルブミンではＶＨＨのいずれについても結合は観察できなかった。ウマ及びイヌの両方で、約１００ｎＭのＫＤが観察され、ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ及びＳＡ１  ＶＨＨの両方についておよそ１ｘ１０−２／ｓの高いオフ速度を有していた。ウマ血清アルブミンでは、両方のＶＨＨは、約５ｘ１０４のＫｏｎを有する。イヌ血清アルブミンでは、これは１．５ｘ１０５でわずかに高い。ウマ及びイヌアルブミンの両方でＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ及びＳＡ１  ＶＨＨは、同等の結合特性を有する。ＡＬＢ８ベンチマークＶＨＨは、試験されたアルブミンのいずれとも結合しなかった。
【０１７２】
結論
ベンチマークＶＨＨ  ＡＬＢ８は、ネコ、イヌ、ウマ又はブタ血清アルブミンと結合しなかったが、元のＳＡ１  ＶＨＨ並びに突然変異変異体ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋは、ウマ及びイヌ血清アルブミンに対して交差反応性を示した。約１０−７のＫＤを有する低い親和性しか観察されず、これは、特に、およそ１０−２／ｓの極めて高いオフ速度のためであった。ただし、ウマでの５ｘ１０４のオン速度及びイヌ血清アルブミンでの１０５は、良好な値と考えられ得る。
【０１７３】
【表６】
2020527352.tif 000020
【０１７４】
［実施例７］  マウスにおけるＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ突然変異体変異体ＶＨＨの薬物動態学プロファイル
ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ変異体ＶＨＨの、その他のタンパク質の半減期延長する能力を評価するために、融合タンパク質を作製した。構築物は、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、ＧＳリンカー及びＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ  ＶＨＨと結合しているＶＨＨからなっており、さらにＶＨＨ−ＧＦＰ−ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ（配列番号６）と呼ばれる。このタンパク質をピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）において発現させ、２ステップ手順で発酵培地から精製した。陽イオン交換（ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を介した捕獲ステップの後、タンパク質をサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって少なくとも９５％純度の無傷のタンパク質に精製した。最後に、タンパク質を、ＰＢＳ中５ｍｇ／ｍＬに濃縮し、滅菌濾過した。ＧＰＦ（ＫＤ  ０．５ｎＭ）及びヒト血清アルブミン（ＫＤ  ５ｎＭ）両方に対する親和性を評価することによって、融合タンパク質の機能を確認した。
【０１７５】
ＰＫ研究を、１２匹の成体雄マウス（雄のＲｊＯｒｌ：Ｓｗｉｓｓ  ＣＤ−１）の２群で実施した。第１の群は、１０ｍｇ／ｋｇと同等のＶＨＨ−ＧＦＰ−ＳＡ２６の用量を静脈内注射によって受け取った。第２の群は、同一用量を、腹膜内注射によって受け取った。以下の時点で各群の３匹の動物から血液サンプルを採取した：０．０８３（動物１〜３）、０．２５（動物４〜６）、１（動物７〜９）、３（動物１０〜１２）、８（動物１〜３）、２４（動物３〜６）、７２（動物７〜９）及び１６８（動物９〜１２）時間。Ｋ−ＥＤＴＡ血液を遠心分離（３０００ｘｇ、４℃で１０分）まで氷上で保存し、最終血漿サンプルを−２０°で凍結した。各血漿サンプルにおいてＶＨＨ−ＧＦＰ−ＳＡ２６の濃度を定量した後（図３）、静脈内及び腹膜内注射の最終半減期をそれぞれ３０．３及び３６．２時間と算出した。ＶＨＨのみと結合するＧＦＰでの半減期は、このＶＨＨは、マウスにおいていずれの標的とも結合しないので、マウスにおける０．５〜１．５時間の通常のＶＨＨ半減期と同様であると推定される（Ｈｏｅｆｍａｎら、２０１５年；Ｈｕａｎｇら、２００８年）。したがって、これらのデータから、ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ突然変異体変異体が、その他のタンパク質の半減期を延長することにおいて実質的に強力であることが確認される。
【０１７６】
［実施例８］  ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋのヒト化
ヒトＶＨドメインとの相同性を改善するために、ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ変異体ＶＨＨ配列を、最も近いヒト相同体配列ヒトＶＨ３−２３（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｐ０１７６４．２）／Ｊ５（配列番号７）とアラインした。ほとんどのＶＨＨ配列中で共通である通常の残基は、これらがＶＨＨ特性にとって重要であると考えられるので、多くの場合変化されないままである。しかし、あまり通常ではないように見えるフレームワーク領域中の突然変異は、それらのそれぞれの位置でヒトアミノ酸に向けて突然変異される。配列番号４のヒト化変異体の非限定的な例として、配列番号８〜１１によって提供されるようにＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ変異体ＶＨＨについて４種の異なるヒト化配列を作製し、これらは、精製のためのＣ末端ヘキサヒスチジンタグを含む（実施例１と同様）。ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ  ＶＨＨに使用された方法に従って（実施例１及び２を参照のこと）、４種すべての変異体を製造し、精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで純粋なモノマーとして同定した（図４）。第２に、それらのヒト及び動物血清アルブミンとの結合の親和性（実施例４において実施されたような）を解析した。
【０１７７】
表７では、ヒト又はカニクイザル血清アルブミンに対する親和性の損失は観察されず、さらなる解析に好適な４種のヒト化変異体が得られたと示されている。
【０１７８】
【表７】
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【０１７９】
［実施例９］  ヒト化ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ  ＶＨＨ変異体の熱安定性
ヒト化変異体の熱安定性を解析し（実施例３において実施されるように）、４種のヒト化変異体すべてが、ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ  ＶＨＨと比較して同等又はより高い融点（Ｔｍ）を実証することが明らかとなった（表８）。
【０１８０】
【表８】
2020527352.tif 000022
【０１８１】
より詳細に見ると、２個のアミノ酸置換の貢献が融点ＴＭを有意に高め、したがって、ヒト化変異体の熱安定性を改善し、ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ  ＶＨＨと比較して、ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ＿ｈ２及びＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ＿ｈ３についてＴｍの４℃の増大が観察され、ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ＿ｈ４について合計８℃の増大がさらに観察された。熱安定性のこの上昇に寄与する置換は、図５から導くことができ、位置７９（Ｋａｂａｔ番号付け）のヒスチジン（Ｈ）のチロシン（Ｙ）への置換並びに位置８２ｂのトレオニン（Ｔ）のセリン（Ｓ）への置換が、ヒト化ＶＨＨに対して協同的安定化効果をもたらした。置換の各々が４℃のＴｍの増大に貢献し（ｈ２及びｈ３を参照のこと）、ｈ４における両置換の組合せは、ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ  ＶＨＨと比較して８℃の増大をもたらした（表８）。
【０１８２】
結論として、Ｈ７９Ｙ及びＴ８２ｂＳの両方とも、ＶＨＨの融点を４℃増大し、組合せでのＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ  ＶＨＨと比較した８℃の増大は、少なくとも３種のヒト化変異体（ｈ２、ｈ３及びｈ４）が、非ヒト化配列と比較して熱安定性の改善を実証することを示す。
【０１８３】
［実施例１０］  ヒト化ＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ  ＶＨＨ変異体の溶解度
ＶＨＨの溶解度を２つの異なるアプローチによって、一方で、主に排除容量効果によってタンパク質を沈殿させるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の添加による見かけのタンパク質溶解度の測定によって（Ｔｏｐｒａｎｉら、ＪＰｈａｒｍＳｃｉ、２０１６年）、他方、反復凍結融解後の可溶性タンパク質含量の測定を介して解析した。
【０１８４】
ＶＨＨ調製物を市販の濃縮デバイス（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ、ＰＥＳ、３Ｋ、ＭＷＣＯ；５〜６ｍＬ）を使用して濃縮した。各ステップの前後でのタンパク質濃度を、ナノドロップ機器でＯＤ２８０ｎｍで解析した。
【０１８５】
第１の試験、ＰＥＧ沈殿試験のために、４ｍｇ／ｍＬのＶＨＨサンプルを、等容量の０、１０、２０又は４０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ１００００と混合して、０、５、１０及び２０％（ｗ／ｖ）の最終ＰＥＧ濃度を達成した。一晩インキュベートした後、サンプルを９６ウェル濾過プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ（登録商標）ＨＴＳ  ＧＶ  ０．２２μｍ親水性Ｄｕｒａｐｏｒｅ（登録商標）ＰＶＤＦメンブレン）中で遠心分離し、濃度決定（ＯＤ２８０ｎｍ）、濁度（ＯＤ３２０ｎｍ）及び凝集評価（ＯＤ５００ｎｍ、ＯＤ６００ｎｍ）のために濾液を集めた。濾過前の濁度を評価するために未濾過サンプルを維持した。
【０１８６】
第２の凍結解凍試験のために、３ｍｇ／ｍｌ濃度のＶＨＨサンプルを、５回の凍結（−８０℃）及び解凍（室温）サイクル（凍結：４時間又は一晩；解凍１時間）に付した。５回目のサイクル後、９６ウェルフィルタープレートでの濾過の前後にＯＤ２８０ｎｍ、ＯＤ３２０ｎｍ、ＯＤ５００ｎｍ及びＯＤ６００ｎｍを測定し、凍結−解凍サイクルの時間の間４℃で保存した参照サンプルと比較した。
【０１８７】
【表９】
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【０１８８】
表９は、ＶＨＨを最大１．５ｍｇ／ｍＬ最終濃度の濃度で試験した場合に、ＰＥＧ水排除試験を使用する溶解度に関して種々のＶＨＨの間に大きな相違が観察されなかったことを実証する。
【０１８９】
【表１０】
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【０１９０】
表１０は、凍結／解凍サイクルについても、ＶＨＨサンプル間で相違は認められなかったことを示す。
【０１９１】
そのため、結論として、すべてのヒト化変異体の溶解度は、少なくともＳＡ１＿Ｓ３０Ｋ  ＶＨＨについてと同程度に高い。
【０１９２】
【表１１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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