(57)【要約】  ＧＤＦ１５の新規受容体（ＧＦＲＡＬ）、並びにＧＤＦ１５のアゴニスト又はアンタゴニストの同定又はスクリーニングにおけるこの受容体の使用を特定した。これらのアゴニスト又はアンタゴニスト化合物は、それぞれ細胞及び生体レベルでＧＤＦ１５様効果を増強するか又は抑制するのいずれかのために使用され得、肥満症、２型糖尿病、高血糖症、高インスリン血症、脂質異常症、糖尿病性腎症、又は食欲不振を含む代謝性疾患の治療に使用され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＤＦ１５アゴニスト活性を有する化合物をスクリーニングする方法であって、前記化合物が、ＧＦＲＡＬ媒介シグナル伝達を誘導する能力を有する、前記方法。
【請求項２】
ＧＤＦ１５アンタゴニスト活性を有する化合物をスクリーニングする方法であって、前記化合物が、ＧＦＲＡＬ媒介シグナル伝達を減少させる能力を有する、前記方法。
【請求項３】
前記方法が、
（ａ）ＧＦＲＡＬを含む細胞を試験化合物と接触させる工程と、
（ｂ）ＧＦＲＡＬタンパク質の発現を欠く対照細胞を前記試験化合物と接触させる工程と、
（ｃ）前記試験細胞及び前記対照細胞におけるＧＤＦ１５生物活性のレベルを測定する工程と、
（ｄ）前記試験細胞及び前記対照細胞において、前記試験化合物の存在下で、ＧＤＦ１５生物活性の前記レベルを比較する工程と
を含み、
前記対照細胞と比較した前記試験細胞における前記ＧＤＦ１５生物活性の前記レベルの増加が、前記試験化合物がＧＤＦ１５アゴニスト活性を有することを示し、
前記対照細胞と比較した前記試験細胞における前記ＧＤＦ１５生物活性の前記レベルの低下が、前記試験化合物がＧＤＦ１５アンタゴニスト活性を有することを示す、
請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記方法が、
（ａ）ＧＦＲＡＬタンパク質を発現する試験動物を試験化合物と接触させる工程と、
（ｂ）ＧＦＲＡＬタンパク質の発現を欠く対照動物を前記試験化合物と接触させる工程と、
（ｃ）前記試験動物及び前記対照動物における体重又は食物摂取量を測定する工程と、
（ｄ）前記試験動物及び前記対照動物において、前記試験化合物の存在下で、体重又は食物摂取量を比較する工程と、を含み、
前記対照動物と比較した前記試験動物における前記体重又は食物摂取量の減少が、前記試験化合物がＧＤＦ１５アゴニスト活性を有することを示し、
前記対照動物と比較した前記試験動物における前記体重又は食物摂取量の増加が、前記試験化合物がＧＤＦ１５アンタゴニスト活性を有することを示す、
請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記ＧＤＦ１５生物活性が、チロシンのリン酸化を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記ＧＤＦ１５生物活性が、Ａｋｔのリン酸化を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記ＧＤＦ１５生物活性が、Ｅｒｋ１／２のリン酸化を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記ＧＤＦ１５生物活性が、ＰＬＣγ１のリン酸化を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記ＧＤＦ１５生物活性の前記レベルを測定することが、レポーターシグナルのレベルを測定することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
前記化合物が、化合物のライブラリーの一部である、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項１１】
前記化合物が、組成物である、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項１２】
前記化合物が、融合タンパク質である、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項１３】
ＧＦＲＡＬが、ヒトＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン配列に対して少なくとも９４％の同一性を有する配列を含む、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項１４】
ＧＤＦ１５アゴニスト活性を有する試験化合物をスクリーニングするためのキットであって、ＧＦＲＡＬタンパク質を発現することができる細胞と、ＧＤＦ１５アゴニスト活性を有する試験化合物をスクリーニングするための方法で前記キットを使用するための説明書とを含む、前記キット。
【請求項１５】
前記ＧＦＲＡＬタンパク質を発現することができる細胞が、安定的又は一過性にトランスフェクトされた細胞である、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
ＧＤＦ１５アンタゴニスト活性を有する試験化合物をスクリーニングするためのキットであって、ＧＦＲＡＬタンパク質を発現することができる細胞と、ＧＤＦ１５アンタゴニスト活性を有する試験化合物をスクリーニングするための方法で前記キットを使用するための説明書とを含む、前記キット。
【請求項１７】
前記ＧＦＲＡＬタンパク質を発現することができる細胞が、安定的又は一過性にトランスフェクトされた細胞である、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
請求項１又は２に記載の方法によって同定された化合物の治療有効量を対象に投与することを含む、代謝障害を治療する方法。
【請求項１９】
前記代謝障害が、２型糖尿病、高血糖症、高インスリン血症、肥満症、脂質異常症、及び糖尿病性腎症からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、代謝障害の薬物の研究分野に関する。より具体的には、本発明は、ＧＤＦ１５に作動又は拮抗することができる化合物を同定するための方法、及びこれらの方法を実施するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＧＤＦ１５は、ＴＧＦβファミリーのメンバーであり、２５ｋＤａのホモダイマーとして血漿中を循環する分泌タンパク質である。ＧＤＦ１５の血漿中濃度は、多くの個体で１５０〜１１５０ｐｇ／ｍＬの範囲である（Ｔｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃａｃｈｅｘｉａ  Ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ  Ｍｕｓｃｌｅ．２０１２，３：２３９〜２４３）。ＧＤＦ１５の血漿中濃度は、怪我、心血管系疾患、及びある種のがんの条件下で上昇する。この上昇は、細胞保護的な機構であると考えられている。ＧＤＦ１５の高い血漿中濃度は、がんにおける食欲不振及び悪液質による体重減少、また腎不全及び心不全における体重減少と関連している。臨床試験では、ＧＤＦ１５の濃度は、肥満で非糖尿病の対象におけるインスリン抵抗性の独立予測因子であった（Ｋｅｍｐｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｅｎｄｏ．２０１２，１６７：６７１〜６７８）。双子における研究により、双子のペアにおけるＧＤＦ１５の濃度の差が、そのペアにおけるＢＭＩの差に相関していることが示され、これはＧＤＦ１５がエネルギーホメオスタシスの長期的な調節因子として機能していることを示唆している（Ｔｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１５，１０（７）：ｅ０１３３３６２）。
【０００３】
ＧＤＦ１５は、いくつかの心血管疾患及び他の疾病状態のバイオマーカーとして広く研究されてきたが、ＧＤＦ１５の保護的役割もまた、心筋肥大及び虚血性損傷において記載されている（Ｃｏｌｌｉｎｓｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃａｒｄｉｏｌ．２０１４，２９，３６６〜３７１；Ｋｅｍｐｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２０１１，１７：５８１〜５８９；Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．２００６，９８：３４２〜５０）。ＧＤＦ１５は、１型及び２型糖尿病のマウスモデルにおいて、腎尿細管及び腸への傷害からの保護において重要な役割を果たすことが示されている（Ｍａｚａｇｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１３；３０５：Ｆ１２４９〜Ｆ１２６４）。ＧＤＦ１５は、加齢に伴う感覚及び運動ニューロンの喪失に対する保護作用を有することが示されており、末梢神経傷害後の回復を改善する（Ｓｔｒｅｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００９，２９：１３６４０〜１３６４８；Ｍｅｎｓｃｈｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．２０１２，３５０：２２５〜２３８）。実際、ＧＤＦ１５トランスジェニックマウスは、その同腹のコントロールよりも長い寿命を有することが示されており、これは、この分子が長期生存因子として提供され、有利であることを示唆し得る（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｇｉｎｇ．２０１４，６：６９０〜７００）。
【０００４】
多くの報告で、ＧＤＦ１５タンパク質による処理によりマウスモデルにおいて耐糖能及びインスリン感受性の改善が示されている。ＧＤＦ１５を過剰発現するトランスジェニックマウスの２つの独立した系統は、体重及び体脂肪量の減少、並びに耐糖能の改善を示した（Ｊｏｈｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２００７，１３：１３３３〜１３４０；Ｍａｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１２，７：ｅ３４８６８；Ｃｈｒｙｓｏｖｅｒｇｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｂｅｓｉｔｙ．２０１４，３８：１５５５〜１５６４）。ＧＤＦ１５マウスにおいて全身のエネルギー消費量及び酸化的代謝量の増加が報告されている（Ｃｈｒｙｓｏｖｅｒｇｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４、同上）。これらは、褐色脂肪組織における熱発生遺伝子の発現の増加、及び白色脂肪組織における脂肪分解遺伝子の増加を伴う。ＧＤＦ１５遺伝子を欠損したマウスでは、体重及び体脂肪量が増加した（Ｔｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１３，８（２）：ｅ５５１７４）。ＧＤＦ１５のＦｃ融合タンパク質は、肥満カニクイザルモデルにおいて週１回、６週にわたって投与した場合に体重を減少させ、耐糖能及びインスリン感受性を改善することが示されている（国際公開第２０１３／１１３００８号）。
【０００５】
体重に対するＧＤＦ１５の効果は、食物の摂取量の低減及びエネルギー消費の増加を介して媒介されると考えられている。ＧＤＦ１５は、体重依存性及び非依存性の機構によって血糖コントロールを改善する。
【０００６】
これらの観察を考え合わせると、ＧＤＦ１５の濃度を増加させること、又はＧＤＦ１５のシグナル伝達を調節することは、代謝性疾患の治療法として有用であり得ると考えられる。
【０００７】
以前の報告では、ＴＧＦ−β  ＲＩＩ及びＡＬＫ−５を含む、ＧＤＦ１５の潜在的受容体が記載されている（Ｊｏｈｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２００７，１３：１３３３〜１３４０；Ａｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ２０１６，１２８：５２９〜４１）が、これらの報告は、ＧＤＦ１５と受容体複合体の構成要素との間の直接的相互作用を示す生化学的証拠を欠いている。したがって、ＧＤＦ１５により利用される受容体複合体及び関連するシグナル伝達カスケードは、未知のままである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
当該技術分野において、ＧＤＦ１５の生物学的作用を媒介する細胞標的の同定の必要性が存在する。ＧＤＦ１５受容体及び下流シグナル伝達標的の同定は、代謝性疾患、障害、又は状態のための新しい治療及び予防戦略を開発するのに役立ち得る。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、ＧＤＦ１５の新規受容体、ＧＤＮＦ  ｆａｍｉｌｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａ  ｌｉｋｅ（ＧＦＲＡＬ）を提供することによってこの必要性を満たす。ＧＦＲＡＬは、ＧＤＮＦファミリーの受容体の遠縁のメンバーである。本発明は、それがＧＤＦ１５と結合し、結果として生じる下流のシグナル伝達、及びインビボ活性を示す。
【００１０】
本発明はまた、ＧＤＦ１５アゴニスト活性を有する化合物をスクリーニングする方法であって、その化合物が、ＧＦＲＡＬ媒介シグナル伝達を誘導する能力を有する、方法を提供する。
【００１１】
本発明はまた、ＧＤＦ１５アンタゴニスト活性を有する化合物をスクリーニングする方法であって、当該化合物が、ＧＦＲＡＬ媒介シグナル伝達を減少させる能力を有する、方法を提供する。
【００１２】
一実施形態では、この方法は、以下の工程：（ａ）ＧＦＲＡＬ又はそのフラグメントを含む細胞を試験化合物と接触させる工程と、（ｂ）ＧＦＲＡＬタンパク質又はそのフラグメントの発現を欠く対照細胞を試験化合物と接触させる工程と、（ｃ）試験細胞及び対照細胞におけるＧＤＦ１５生物活性のレベルを測定する工程と、（ｄ）試験細胞及び対照細胞において、試験化合物の存在下で、ＧＤＦ１５生物活性のレベルを比較する工程と、を含み、対照細胞と比較した試験細胞におけるＧＤＦ１５生物活性のレベルの増加が、試験化合物がＧＤＦ１５アゴニスト活性を有することを示し、対照細胞と比較した試験細胞におけるＧＤＦ１５生物活性のレベルの低下が、試験化合物がＧＤＦ１５アンタゴニスト活性を有することを示す。更なる実施形態では、ＧＤＦ１５生物活性は、チロシンのリン酸化、Ａｋｔのリン酸化、Ｅｒｋ１／２のリン酸化、又はＰＬＣγ１のリン酸化を含む。別の実施形態では、ＧＤＦ１５生物活性のレベルを測定する方法は、レポーターシグナルのレベルを測定することを含む。別の実施形態では、試験化合物は、化合物のライブラリーの一部である。別の実施形態では、化合物は組成物である。別の実施形態では、化合物は融合タンパク質である。
【００１３】
別の実施形態では、この方法は、以下の工程：（ａ）ＧＦＲＡＬタンパク質を発現する試験動物を試験化合物と接触させる工程と、（ｂ）ＧＦＲＡＬタンパク質又はそのフラグメントの発現を欠く対照動物を試験化合物と接触させる工程と、（ｃ）試験動物及び対照動物における体重又は食物摂取量を測定する工程と、（ｄ）試験動物及び対照動物において、試験化合物の存在下で、体重又は食物摂取量を比較する工程と、を含み、対照動物と比較した試験動物における体重又は食物摂取量の減少が、試験化合物がＧＤＦ１５アゴニスト活性を有することを示し、対照動物と比較した試験動物における体重又は食物摂取量の増加が、試験化合物がＧＤＦ１５アンタゴニスト活性を有することを示す。別の実施形態では、試験化合物は、化合物のライブラリーの一部である。別の実施形態では、化合物は組成物である。別の実施形態では、化合物は融合タンパク質である。
【００１４】
本発明はまた、ＧＤＦ１５アゴニスト活性を有する試験化合物をスクリーニングするためのキットであって、ＧＦＲＡＬタンパク質を発現することができる細胞と、ＧＤＦ１５アゴニスト活性を有する試験化合物をスクリーニングするための方法でキットを使用するための説明書と、を含む、キットを提供する。一実施形態では、ＧＦＲＡＬタンパク質を発現することができる細胞は、安定的又は一過性にトランスフェクトされた細胞である。
【００１５】
本発明はまた、ＧＤＦ１５アンタゴニスト活性を有する試験化合物をスクリーニングするためのキットであって、ＧＦＲＡＬタンパク質を発現することができる細胞と、ＧＤＦ１５アンタゴニスト活性を有する試験化合物をスクリーニングするための方法でキットを使用するための説明書と、を含む、キットを提供する。一実施形態では、ＧＦＲＡＬタンパク質を発現することができる細胞は、安定的又は一過性にトランスフェクトされた細胞である。
【００１６】
本発明はまた、スクリーニングの方法によって同定された化合物の治療有効量を対象に投与することを含む、代謝障害を治療する方法を提供する。一実施形態では、代謝障害は、２型糖尿病、高血糖症、高インスリン血症、肥満症、脂質異常症、糖尿病性腎症、又は食欲不振からなる群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によって測定された、Ｆｃ−ＧＤＦ１５融合分子又はＦｃ単独のいずれかのＧＦＲＡＬ過剰発現ＨＥＫ２９３Ｆ細胞への結合を示す。灰色線は、無染色細胞を表し、黒色線はＦｃ対照を表し、点線はＦｃ−ＧＤＦ１５融合を表す。最大カウント％は、蛍光光度計によって収集された最大イベントカウントの割合を表し、蛍光強度は、対数スケールを用いて相対蛍光単位で測定されたＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７の蛍光を表す。
【図２】Ｆｃ−ＧＤＦ１５融合分子のＧＦＲＡＬ過剰発現ＨＥＫ２９３Ｆ細胞への用量依存的結合曲線を示すＦＡＣＳデータを示す。
【図３】ＨＳＡ−ＧＤＦ１５リガンドの、ＧＦＲＡＬの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）への用量依存的結合を示す。ログＥＣＬ信号は、任意の単位で測定された、電気化学発光（ＥＣＬ）信号のベース１０対数を表す。
【図４】非融合ＧＤＦ１５及びＨＳＡ−ＧＤＦ１５のＧＦＲＡＬ  ＥＣＤへの結合に関する用量依存性競合を示す。ログＥＣＬ信号は、任意の単位で測定された、電気化学発光（ＥＣＬ）信号のベース１０対数を表す。
【図５】Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙプラットフォームを使用して測定した、野生型又は変異ＨＳＡ−ＧＤＦ１５のＧＦＲＡＬ  ＥＣＤ−Ｆｃへの結合についての無細胞アッセイを示す。ログＥＣＬ信号は、任意の単位で測定された、電気化学発光（ＥＣＬ）信号のベース１０対数を表す。
【図６】野生型又は変異型ＨＳＡ−ＧＤＦ１５のいずれかのＧＦＲＡＬを過剰発現しているＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞への結合を示す。相対蛍光単位で測定した蛍光を３つの３つの３連ウェルの幾何平均として測定した。
【図７】ＧＦＲＡＬを過剰発現しているＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞におけるタンパク質レベルに対するＧＤＦ１５の効果を示す。
【図８】ＧＦＲＡＬを過剰発現しているＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞におけるタンパク質レベルに対するいずれかの野生型の変異体ＧＤＦ１５の効果を示す。
【図９】ＧＦＲＡＬを過剰発現しているＮＧ１０８−１５細胞におけるタンパク質レベルに対するＧＤＦ１５の効果を示す。
【図１０】ｇｆｒａｌを欠くマウスにおけるｇｆｒａｌ発現のレベルを示す。Ｇｆｒａｌ＋／＋：野生型ｇｆｒａｌを有するマウス、ｇｆｒａｌ＋／−：ｇｆｒａｌ欠失についてヘテロ接合性のマウス、ｇｆｒａｌ−／−：ｇｆｒａｌ欠失についてホモ接合性のマウス。
【図１１】ｇｆｒａｌホモ接合型ノックアウトマウス（Ｂ６；１２９Ｓ５−Ｇｆｒａｌｔｍ１Ｌｅｘ）又は野生型同腹仔対照マウスのいずれかにおける１２時間にわたる食物摂取量に対するＧＤＦ１５処置の効果を示す。＊：ｐ＜０．０５（一元配置分散分析及びＴｕｋｅｙ試験を使用してＰＢＳで処理した野生型マウスと比較した場合）。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
開示される内容は、本開示の一部を形成する、添付の図面に関連してなされる以下の詳細な説明を参照することにより、より容易に理解することができる。開示される内容は、本明細書に記載及び／又は表示の内容に限定されないこと、更に、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を例によって説明することのみを目的とし、請求項に記載の内容に限定することを意図しないことを理解されたい。
【００１９】
特別な記述がない限り、動作に関する可能なメカニズム又は形態、あるいは改善の理由についての説明は、説明のみを意図したものである。本開示の内容は、提案されている動作に関するメカニズム又は形態、あるいは改善の理由の是非によって制限されない。
【００２０】
値の範囲が表されている場合、別の実施形態においては、ある特定の値から、及び／又は他の特定の値までが含まれる。更に、範囲で記述される値に関する言及は、その範囲内のあらゆる値を含む。範囲はいずれも包括的であり、組み合わせであってもよい。値が、先行詞「約」を用いて近似値として表現される場合、その特定の値は、別の実施形態を形成することが理解される。特定の数値に関する言及は、文脈上他に明記されない限り、少なくともその特定の値を含むものとする。
【００２１】
本明細書において、明確性のために、別々の実施形態の文脈において記載される、開示された内容の複数の特徴はまた、単一の実施形態において組み合わせて提供されてもよいことを理解されたい。逆に、簡潔のために単一の実施形態として記載された開示される内容の様々な特徴はまた、別個に、又は任意の下位の組み合わせで提供されてもよい。
【００２２】
定義
本明細書で使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は複数を含むものとする。
【００２３】
本明細書及び特許請求の範囲を通して本明細書の諸態様に関する様々な用語が使用される。別途記載のない限り、そのような用語には、当該技術分野におけるそれらの通常の意味が与えられるものとする。その他の具体的に定義される用語は、本明細書に提供される定義と一致する様式で解釈されるものとする。
【００２４】
数値範囲、カットオフ、又は特定の値に言及するときに用いる場合、「約」という用語は、引用した値が、記載値から最大１０％変動し得ることを示すために用いる。したがって、「約」という用語は、規定値からの±１０％以下の変動、±５％以下の変動、±１％以下の変動、±０．５％以下の変動、又は±０．１％以下の変動を包含するために使用する。
【００２５】
本明細書で使用する場合、「アゴニスト」は、例えば、受容体のリガンドを模倣することによって、受容体シグナル伝達経路の活性化を誘導する物質、並びに受容体のリガンドに対する感受性を増強する、例えば、受容体依存性シグナル伝達の特定のレベルを誘導するのに必要なリガンドの濃度を低下させる物質を指す。
【００２６】
用語「アンタゴニスト」は、受容体シグナル伝達経路の活性化を阻害又は減少させる物質を指す。
【００２７】
大まかに言えば、用語「糖尿病」及び「糖尿病性」は、高血糖症及び糖尿によってしばしば特徴付けられる、インスリンの不十分な産生又は利用を伴う炭水化物代謝の進行性疾患を指す。
【００２８】
「有効量」は、必要な投薬量及び期間で所望の結果を得るための有効量を指す。ＧＦＲＡＬに結合するリガンドの有効量は、個体の病態、年齢、性別、及び体重、並びに個体における所望の応答を引き出す抗体の能力などの要因に従って変動し得る。有効量はまた、有益な効果が、薬剤の任意の毒性又は有害効果を上回る量でもある。
【００２９】
本明細書で使用するところの「融合タンパク質」なる用語は、それぞれの部分が異なるタンパク質に由来する、互いに共有結合された２つ以上の部分を有するタンパク質を指す。
【００３０】
本明細書で使用する場合、「ＧＦＲＡＬ」は、配列番号３に示されるポリペプチド配列に対して少なくとも９４％の同一性を有し、ＧＦＲＡＬ機能を有する受容体ポリペプチド、又は配列番号３に示されるポリペプチド配列のフラグメントを指す。いくつかの実施形態では、該ＧＦＲＡＬは、配列番号３に示されるポリペプチド配列に対して少なくとも９５％の同一性を有し、ＧＦＲＡＬ機能を有するか、又は配列番号３に示されるポリペプチド配列のフラグメントを有する。いくつかの実施形態では、該ＧＦＲＡＬは、配列番号３に示されるポリペプチド配列である。他の実施形態では、該ＧＦＲＡＬは、配列番号３０に示されるポリペプチド配列である。いくつかの実施形態では、該ＧＦＲＡＬは、配列番号１９又は配列番号２７などの細胞外ドメインである。本発明の方法で使用されるＧＦＲＡＬ受容体ポリペプチドは、好ましくは哺乳動物である。いくつかの実施形態では、本発明の方法で使用されるＧＦＲＡＬ受容体ポリペプチドは、ヒトである。他の実施形態では、本発明の方法で使用されるＧＦＲＡＬ受容体ポリペプチドは、カニクイザルである。ＧＦＲＡＬはまた、本明細書に開示されるスクリーニング又は合理的薬物設計方法において有用な受容体の誘導体を指す。
【００３１】
本明細書で使用する場合、用語「高血糖症」は、健康な個体と比較して、増加した量のグルコースが対象の血漿中で循環する状態を指す。高血糖症は、本明細書に記載される空腹時の血糖値の測定を含む、当該技術分野において周知の方法を使用して診断することができる。
【００３２】
本明細書で使用する場合、用語「高インスリン血症」は、同時に血糖値が上昇又は正常のいずれかである場合に、循環インスリンのレベルが上昇した状態を指す。高インスリン血症は、高トリグリセリド、高コレステロール、高低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）及び低高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）などの脂質異常症、高尿酸濃度、多嚢胞性卵巣症候群、２型糖尿病、及び肥満症に関連するインスリン抵抗性によって引き起こされ得る。高インスリン血症は、約２μＵ／ｍＬよりも高い血漿インスリン濃度を有すると診断され得る。
【００３３】
「代謝性疾患、障害又は状態」とは、異常代謝に関連するあらゆる障害を指す。本発明の方法に従って治療することができる代謝性疾患、障害又は状態の例としては、限定されるものではないが、２型糖尿病、血糖値の上昇、インスリン濃度の上昇、肥満症、脂質異常症、又は糖尿病性腎症が挙げられる。
【００３４】
本明細書で使用する場合、「組換え」は、組換え法によって調製、発現、作製、又は単離される抗体及び他のタンパク質を含む。
【００３５】
「対象」という用語は、ヒト及び非ヒト動物を意味し、全ての脊椎動物、例えば、哺乳類及び非哺乳類、例えば、非ヒト霊長類、マウス、ウサギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、及び爬虫類を意味する。記載された内容の多くの実施形態では、対象はヒトである。
【００３６】
「治療すること」又は「治療」は、損傷、病態、又は病状の減弱又は改善における、何らかの成功又は成功の兆候を指し、これには、症状の寛解、緩解、減少、病状を患者にとってより許容できるものにすること、変性又は減退速度を遅くすること、変性による最終的な衰弱を和らげること、対象の肉体的又は精神的健康を改善すること、あるいは生存期間の長さを延ばすこと等の、何らかの客観的又は主観的パラメータを含む。治療は、身体検査、神経学的検査、又は精神医学的評価の結果等客観的又は主観的パラメータに基づいて評価されてよい。
【００３７】
ＧＦＲＡＬを使用して、ＧＤＦ１５のアゴニスト及びアンタゴニストをスクリーニングするための方法。
ＧＤＦ１５のアゴニスト又はアンタゴニストいずれかの特性を有するものとしてスクリーニングすることができる化合物の例としては、抗体、抗原結合タンパク質、ポリペプチド、多糖類、リン脂質、ホルモン、プロスタグランジン、ステロイド、芳香族化合物、複素環式化合物、ベンゾジアゼピン、オリゴマーＮ−置換グリシン及びオリゴカルバメートが挙げられる。化合物の大規模なコンビナトリアルライブラリーを、国際公開第９５／１２６０８号、国際公開第９３／０６１２１号、国際公開第９４／０８０５１号、国際公開第９５／３５５０３号、国際公開第９５／３０６４２号に記載されたコード化合成ライブラリー（ＥＳＬ）法によって構築することができる。ペプチドライブラリーを、ファージディスプレイ法により生成することもできる。例えば、米国特許第５，４３２，０１８号を参照されたい。
【００３８】
ＧＤＦ１５のアゴニスト又はアンタゴニストいずれかの特性を有するものとしてスクリーニングすることができる化合物としては、ＧＦＲＡＬのリガンド結合部位に結合する物質、アロステリックな活性を有する物質、並びにリガンド結合部位に関して非競合的に作用する物質が挙げられる。
【００３９】
細胞アッセイは、一般に、ＧＦＲＡＬを発現する細胞（又は、より典型的にはそのような細胞の培養物）を試験化合物と接触させることと、細胞の特性が変化するかどうかを判定することと、を含む。変化は、細胞を化合物と接触させる前及び後の特性のレベルから評価するか、又は対照細胞若しくはＧＦＲＡＬが欠損した細胞集団に対して対照実験を行うことによって評価することができる。測定される特性は、ＲＮＡ発現レベル、タンパク質のレベル、タンパク質の修飾レベル、好ましくはリン酸化、又はレポーターシグナルのレベルであってもよい。
【００４０】
一実施形態では、ＧＤＦ１５のアゴニスト又はアンタゴニストは、受容体ＧＦＲＡＬを表面上に発現する細胞を接触させることによって同定されてもよく、該受容体は、該受容体への化合物の結合に応答して検出可能なシグナルを提供することができる第２の構成要素と関連しており、受容体への結合を可能にする条件下で化合物がスクリーニングされ、任意選択的に標識又は非標識リガンドの存在下で、化合物と受容体の相互作用から生成されるシグナルの存在又は不在を検出することによって、化合物が受容体に結合し、活性化するか、又は阻害するかどうかを決定する。
【００４１】
一般に、そのようなスクリーニング方法は、表面上にＧＦＲＡＬを発現する適切な細胞を提供することを含む。そのような細胞としては、哺乳動物からの細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＨＥＫ（ヒト胎児腎臓）、ＳＫ−Ｎ−ＡＳ、及びショウジョウバエ又は大腸菌の細胞）が挙げられる。具体的には、ＧＦＲＡＬをコードするポリヌクレオチドを使用して、細胞をトランスフェクトし、それによって該受容体を発現させる。ＧＦＲＡＬをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの構築及び該ＧＦＲＡＬ発現ベクターでの細胞のトランスフェクションは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）に記載されている標準的な方法を使用して達成され得る。受容体の発現は、一過性であっても安定的であってもよい。好ましくは、発現は安定的である。より好ましくは、哺乳動物の細胞株は、ＧＦＲＡＬ受容体をコードする核酸配列、例えば配列番号３のポリヌクレオチド、又はそのフラグメント若しくは変異体をコードする核酸配列を含む発現ベクターでトランスフェクトされ、次いで細胞株は、細胞の表面上に受容体が安定的に発現されるように培養培地中で培養される。次いで、発現した受容体を試験化合物と接触させて、リガンドの存在下又は非存在下で、機能応答の結合、刺激又は阻害を観察する。
【００４２】
本明細書に記載されるアッセイは、当該技術分野において知られているとおり、機能性ＧＦＲＡＬを発現する無傷細胞、又はその受容体を含有する細胞膜を利用してもよい。
【００４３】
あるいは、リガンド結合ドメインを含むＧＦＲＡＬ受容体の可溶性部分（すなわち膜結合していない）は、細胞内区画内に可溶性画分で発現されてもよいし、細胞から培地中に分泌されてもよい。発現した可溶性受容体の単離及び精製のための技術は、当該技術分野において周知である。
【００４４】
類似の実験を動物で行うことができる。観察することができる適切な生物活性としては、限定されるものではないが、体重、食物摂取量、経口耐糖能試験、血糖値の測定、インスリン抵抗性の分析、薬物動態分析、毒物動態分析、完全長の融合タンパク質のレベル及び安定性のイムノアッセイ及び質量分析、並びに血漿中でのエクスビボ安定性分析が挙げられる。
【００４５】
本発明の別の実施形態では、ＧＦＲＡＬの薬理学的に活性なリガンドを同定するためのスクリーニングアッセイが提供される。リガンドは、多くの化学的な分類を包含し得るが、典型的には、これらは有機分子である。そのようなリガンドは、タンパク質との構造的相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含み得、典型的には、少なくともアミノ、カルボニル、ヒドロキシル又はカルボキシル基、好ましくは少なくとも２つの官能性化学基を含む。リガンドは、多くの場合、環状炭素若しくは複素環構造、及び／又は上記官能基のうちの１つ以上で置換された芳香族若しくは多芳香族構造を含む。リガンドはまた、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造類似体、又はこれらの組み合わせを含む生体分子も含み得る。
【００４６】
リガンドとしては、例えば、１）Ｉｇテール融合ペプチド及びランダムペプチドライブラリーのメンバーを含む可溶性ペプチドなどのペプチド（例えば、Ｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２〜８４；Ｈｏｕｇｈｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８４〜８６を参照）及びＤ−及び／又はＬ−配置アミノ酸からなるコンビナトリアルケミストリー由来分子ライブラリー、２）ホスホペプチド（例えば、ランダム及び部分的に縮退した、指向性ホスホペプチドのライブラリーのメンバー、例えば、Ｓｏｎｇｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｃｅｌｌ  ７２：７６７〜７７８を参照）、３）抗体（例えば、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、抗イディオタイプ、キメラ、及び単鎖抗体、並びにＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ発現ライブラリーフラグメント、及び抗体のエピトープ結合フラグメント）、並びに４）低有機分子及び低無機分子が挙げられ得る。
【００４７】
リガンドは、合成又は天然化合物のライブラリーを含む多種多様な供給源から得ることができる。合成化合物ライブラリーは、例えば、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｔｒｅｖｉｖｉｌｅｔ，Ｃｏｒｎｗａｌｌ，ＵＫ）、Ｃｏｍｇｅｎｅｘ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、Ｂｒａｎｄｏｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ，Ｎ．Ｈ．）、及びＭｉｃｒｏｓｏｕｒｃｅ（Ｎｅｗ  Ｍｉｌｆｏｒｄ，Ｃｏｎｎ．）から市販されている。希少化学ライブラリーは、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓ．）から市販されている。細菌、真菌、植物又は動物の抽出物を含む天然化合物ライブラリーは、例えば、Ｐａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｏｔｈｅｌｌ，Ｗａｓｈ．）から市販されている。更に、ランダム化オリゴヌクレオチドの発現を含む、多種多様な有機化合物及び生体分子のランダムかつ指向性の合成のための多数の手段が利用可能である。
【００４８】
あるいは、細菌、真菌、植物、及び動物の抽出物の形態である天然化合物のライブラリーを容易に生成することができる。分子ライブラリーの合成のための方法は、容易に入手可能である（例えば、ＤｅＷｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６９０９、Ｅｒｂ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１４２２、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８、Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３、Ｃａｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９、Ｃａｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１、及びｉｎ  Ｇａｌｌｏｐ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３を参照）。更に、天然又は合成化合物ライブラリー及び化合物は、従来の化学的、物理的及び生化学的手段によって容易に修飾することができる（例えば、Ｂｌｏｎｄｅｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：６０を参照）、コンビナトリアルライブラリーを生成するために使用されてもよい。別のアプローチでは、以前に同定された薬理学的物質は、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などの指向性又はランダムな化学修飾を受けることができ、類似体は、ＧＦＲＡＬ調節活性についてスクリーニングすることができる。
【００４９】
コンビナトリアルライブラリーを生成するための多数の方法が当該技術分野において周知であり、生物学的ライブラリー、空間的に指定可能なパラレル固相又は液相ライブラリー、デコンボリューションを要する合成ライブラリー法、「１ビーズ１化合物（one-bead one-compound）」ライブラリー法、及びアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法に関するものを含む。生物学的ライブラリー法は、ポリペプチド又はペプチドライブラリーに限定されるが、他の４種類の方法は、ポリペプチド、ペプチド、非ペプチドオリゴマー、又は化合物の低分子ライブラリーに適用できる（Ｋ．Ｓ．Ｌａｍ，１９９７，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．１２：１４５）。
【００５０】
ライブラリーは、リガンドが結合部位において競合的又は非競合的に結合するかどうかを決定するために、当該技術分野において一般的に知られている方法によって、溶液中でスクリーニングされてもよい。そのような方法としては、溶液中（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，１９９２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２〜４２１）、又はビーズ上（Ｌａｍ，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２〜８４）、チップ上（Ｆｏｄｏｒ，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５〜５５６）、細菌若しくは胞子上（Ｌａｄｎｅｒ  Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，２２３，４０９）、プラスミド上（Ｃｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１８６５〜１８６９）、若しくはファージ上（Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６〜３９０；Ｄｅｖｌｉｎ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４〜４０６；Ｃｗｉｒｌａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：６３７８〜６３８２；Ｆｅｌｉｃｉ，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１〜３１０；Ｌａｄｎｅｒ，上記）のライブラリーのスクリーニングが挙げられ得る。
【００５１】
スクリーニングアッセイが結合アッセイである場合、ＧＦＲＡＬ、又はＧＦＲＡＬ結合リガンドのうちの１つは、標識に結合されてもよく、標識は、検出可能なシグナルを直接的又は間接的に提供することができる。様々な標識としては、放射性同位体、蛍光分子、化学発光分子、酵素、特異的結合分子、粒子、例えば、磁性粒子などが挙げられる。特定の結合分子としては、ビオチン及びストレプトアビジン、ジゴキシン及び抗ジゴキシンなどの対が挙げられる。特定の結合メンバーに関して、相補的なメンバーは、通常、周知の手順に従って、検出を提供する分子で標識されるであろう。
【００５２】
様々な他の試薬が、スクリーニングアッセイに含まれてもよい。これらには、最適なタンパク質タンパク質結合を促すため、かつ／又は非特異反応若しくはバックグラウンド相互作用を低下させるために使用される、塩、例えばアルブミンなどの中性タンパク質、界面活性剤などのような試薬が含まれる。プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤などのアッセイの効率を改善する試薬を使用してもよい。成分は、必要な結合を生成する任意の順序で添加される。インキュベーションは、最適な活性を促す任意の温度、典型的には４℃〜４０℃で行う。インキュベーション期間は、最適な活性のために選択されるが、迅速なハイスループットスクリーニングを促すように最適化されてもよい。通常、０．１〜１時間が十分であろう。一般に、複数のアッセイ混合物は、異なる試験物質濃度と並行して実行されて、これらの濃度に対する差動応答を得る。典型的には、これらの濃度のうちの１つは、陰性対照、すなわち、ゼロ濃度又は検出レベル未満である。
【００５３】
本発明に従って提供されるスクリーニングアッセイは、本明細書に全体が組み込まれる国際出願第９６／０４５５７号に開示されているものに基づく。簡潔に述べると、国際公開第９６／０４５５７号は、標的上の活性部位に結合し、標的においてアゴニスト又はアンタゴニスト活性を有するレポーターペプチドの使用を開示している。これらのレポーターは、組換えライブラリーから同定され、ランダムなアミノ酸配列を有するペプチド、又はランダム化された少なくとも１つのＣＤＲ領域を有する可変抗体領域のいずれかである。レポーターペプチドは、細胞組換え発現系、例えば、大腸菌において又はファージディスプレイによって発現されてもよい（国際公開第９６／０４５５７号及びＫａｙ  ｅｔ  ａｌ．１９９６，Ｍｏｌ．Ｄｉｖｅｒｓ．１（２）：１３９〜４０を参照、この両方が参照により本明細書に組み込まれる）。次いで、ライブラリーから同定されたレポーターを、本発明に従って、治療薬自体としてか、又はレポーターと同様の性質を有し、アゴニスト又はアンタゴニスト活性を提供するための薬物候補として開発され得る他の分子、好ましくは低活性分子をスクリーニングするための競合結合アッセイのいずれかで使用してもよい。好ましくは、これらの低有機分子は、経口活性である。
【００５４】
上記のとおり、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、及び哺乳類ディスプレイライブラリーもまた、ＧＦＲＡＬに結合するリガンドについてスクリーニングすることができる。これらのライブラリーの構築及び分析の詳細、並びに結合剤の生検及び選択の基本的手順が公開されている（例えば、国際公開第９６／０４５５７号；Ｍａｎｄｅｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ−−Ｎｏｖｅｌ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ｐ．Ｇｕｔｔｒｙ（ｅｄ），Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｓｏｕｔｈｂｏｒｏｇｈ，Ｍａｓｓ．，ｐｐ．２３１〜２５４；Ｒａｖｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １６：１９９３〜１９９９、Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６〜３９０、Ｇｒｉｈａｌｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｇｅｎｅ  １６６：１８７〜１９５、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１９９７〜２００１、Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｇｅｎｅ１２８：５９〜６５、Ｃａｒｃａｍｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１１１４６〜１１１５１、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，１９９７，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：６２〜７０、Ｒａｄｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｒｂａｓ，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：５０３〜５０８、を参照、これらの全てが参照により本明細書に組み込まれる）。
【００５５】
周知の薬学的に活性な化合物に対する模倣体の設計は、「リード」化合物に基づく医薬の開発への周知のアプローチである。これは、活性化合物が、合成するのが困難であるか、若しくは高価である場合、又は特定の投与方法に適していない場合（例えば、ペプチドは、一般に、消化管中のプロテアーゼによって急速に分解される傾向があるので、経口組成物のための活性物質として不適切である）に望ましい場合がある。模倣体の設計、合成、及び試験は、一般に、標的特性についての分子の大規模なスクリーニングを避けるために使用される。
【００５６】
所与の標的特性を有する化合物からの模倣体の設計で一般的に取られるいくつかの工程が存在する。最初に、標的特性の決定において重大かつ／又は重要な化合物の特定部分を決定する。ペプチドの場合には、これは、ペプチド中のアミノ酸残基を系統的に変化させることによって（例えば、順次各残基を置換することによって）行うことができる。化合物の活性領域を構成するこれらの部分又は残基は、「ファルマコフォア」として知られている。
【００５７】
ファルマコフォアが見出されると、その構造は、一連の原料からのデータ（例えば、分光技術データ、Ｘ線回折データ、及びＮＭＲ）を使用して、その物性（例えば、立体化学、結合、大きさ、及び／又は電荷）に従ってモデル化される。このモデル化プロセスでは、コンピューターによる分析、類似性マッピング（原子間の結合ではなく、ファルマコフォアの電荷及び／又は容量をモデル化するもの）、及び他の技術を使用することができる。
【００５８】
このアプローチの変形においては、リガンドの三次元構造とその結合パートナーをモデル化する。リガンド及び／又は結合パートナーが結合の構造を変化させ、模倣体の設計においてモデルがこのことを考慮できる場合、これは特に有用となり得る。
【００５９】
次いで、テンプレート分子が選択され、ファルマコフォアを模倣する化学基をそのテンプレートにグラフト化することができる。テンプレート分子及びそれにグラフト化される化学基は、模倣体の合成が容易であり、薬理学的に許容される可能性があり、インビボで分解されず、かつリード化合物の生物活性を維持するように好都合に選択することができる。次いで、見出された模倣体をスクリーニングして、これらが標的特性を示す程度、又はこれらがそれをどの程度阻害するのかを確かめる。次いで、更なる最適化又は改変を行って、インビボ試験又は臨床試験のための１つ以上の最終模倣体に達することができる。
【００６０】
実施形態
実施形態１は、ＧＤＦ１５アゴニスト活性を有する化合物をスクリーニングする方法であって、該化合物が、ＧＦＲＡＬ媒介シグナル伝達を誘導する能力を有する、方法である。
【００６１】
実施形態２は、ＧＤＦ１５アンタゴニスト活性を有する化合物をスクリーニングする方法であって、該化合物が、ＧＦＲＡＬ媒介シグナル伝達を減少させる能力を有する、方法である。
【００６２】
実施形態３は、方法が、以下の工程：
（ａ）ＧＦＲＡＬ又はそのフラグメントを含む細胞を試験化合物と接触させる工程と、
（ｂ）ＧＦＲＡＬタンパク質又はそのフラグメントの発現を欠く対照細胞を試験化合物と接触させる工程と、
（ｃ）試験細胞及び対照細胞におけるＧＤＦ１５生物活性のレベルを測定する工程と、
（ｄ）試験細胞及び対照細胞において、試験化合物の存在下で、ＧＤＦ１５生物活性のレベルを比較する工程と、を含み、
対照細胞と比較した試験細胞におけるＧＤＦ１５生物活性のレベルの増加が、試験化合物がＧＤＦ１５アゴニスト活性を有することを示し、
対照細胞と比較した試験細胞におけるＧＤＦ１５生物活性のレベルの低下が、試験化合物がＧＤＦ１５アンタゴニスト活性を有することを示す、実施形態１又は２に記載の方法である。
【００６３】
実施形態４は、方法が、以下の工程：
（ａ）ＧＦＲＡＬタンパク質を発現する試験動物を試験化合物と接触させる工程と、
（ｂ）ＧＦＲＡＬタンパク質又はそのフラグメントの発現を欠く対照動物を試験化合物と接触させる工程と、
（ｃ）試験動物及び対照動物における体重又は食物摂取量を測定する工程と、
（ｄ）試験動物及び対照動物において、試験化合物の存在下で、体重又は食物摂取量を比較する工程と、を含み、
対照動物と比較した試験動物における体重又は食物摂取量の減少が、試験化合物がＧＤＦ１５アゴニスト活性を有することを示し、
対照動物と比較した試験動物における体重又は食物摂取量の増加が、試験化合物がＧＤＦ１５アンタゴニスト活性を有することを示す、実施形態１又は２に記載の方法である。
【００６４】
実施形態５は、ＧＤＦ１５生物活性が、チロシンのリン酸化を含む、実施形態３に記載の方法である。
【００６５】
実施形態６は、ＧＤＦ１５生物活性が、Ａｋｔのリン酸化を含む、実施形態３に記載の方法である。
【００６６】
実施形態７は、ＧＤＦ１５生物活性が、Ｅｒｋ１／２のリン酸化を含む、実施形態３に記載の方法である。
【００６７】
実施形態８は、ＧＤＦ１５生物活性が、ＰＬＣγ１のリン酸化を含む、実施形態３に記載の方法である。
【００６８】
実施形態９は、ＧＤＦ１５生物活性のレベルを測定することが、レポーターシグナルのレベルを測定することを含む、実施形態３に記載の方法である。
【００６９】
実施形態１０は、化合物が、化合物のライブラリーの一部である、実施形態３又は４に記載の方法である。
【００７０】
実施形態１１は、化合物が、組成物である、実施形態３又は４に記載の方法である。
【００７１】
実施形態１２は、化合物が、融合タンパク質である、実施形態３又は４に記載の方法である。
【００７２】
実施形態１３は、ＧＦＲＡＬが、ヒトＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン配列に対して少なくとも９４％の同一性を有する配列を含む、実施形態３又は４に記載の方法である。
【００７３】
実施形態１４は、ＧＤＦ１５アゴニスト活性を有する試験化合物をスクリーニングするためのキットであって、ＧＦＲＡＬタンパク質を発現することができる細胞と、ＧＤＦ１５アゴニスト活性を有する試験化合物をスクリーニングするための方法でキットを使用するための説明書と、を含む、キットである。
【００７４】
実施形態１５は、ＧＦＲＡＬタンパク質を発現することができる細胞が、安定的又は一過性にトランスフェクトされた細胞である、実施形態１４に記載のキットである。
【００７５】
実施形態１６は、ＧＤＦ１５アンタゴニスト活性を有する試験化合物をスクリーニングするためのキットであって、ＧＦＲＡＬタンパク質を発現することができる細胞と、ＧＤＦ１５アンタゴニスト活性を有する試験化合物をスクリーニングするための方法でキットを使用するための説明書と、を含む、キットである。
【００７６】
実施形態１７は、ＧＦＲＡＬタンパク質を発現することができる細胞が、安定的又は一過性にトランスフェクトされた細胞である、実施形態１６に記載のキットである。
【００７７】
実施形態１８は、実施形態１又は２に記載の方法によって同定された化合物の治療有効量を対象に投与することを含む、代謝障害を治療する方法である。
【００７８】
実施形態１９は、代謝障害が、２型糖尿病、高血糖症、高インスリン血症、肥満症、脂質異常症、糖尿病性腎症、又は食欲不振からなる群から選択される、実施形態１８に記載の方法である。
【００７９】
以下の例は、本発明を例示する。これらの例は本発明の範囲を制限するとして解釈されてはならない。例は図示の目的のために含まれ、本発明は請求項によってのみ限定される。
【００８０】
実施例１．ＧＤＦ１５の結合パートナーの同定
ＤＮＡライブラリーをスクリーニングする２つのアプローチを使用して、ＧＤＦ１５の受容体を同定した。細胞表面の発現及びＦｃ単独鎖（配列番号２）と二量体化されたＦｃ−ＧＤＦ１５融合鎖（配列番号１）からなるヘテロ二量体Ｆｃ−ＧＤＦ１５融合分子に対する結合パートナーのスクリーニングのために、３０４８細胞表面受容体をコードするｃＤＮＡからなるＪａｎｓｓｅｎ内部ライブラリーを使用した。Ｊａｎｓｓｅｎ膜ライブラリーのＤＮＡをトランスフェクトするために、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞を、透明な底部９６ウェルプレート（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）上に、増殖培地（１００μＬ  ＤＭＥＭ、１０％  ＦＢＳ及び２５０μｇ／ｍＬ  Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ、３つの試薬全てＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃによる）中、１ウェルあたり３０，０００細胞の密度で播種した。翌日、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とあらかじめ混合した１００ｎｇのＤＮＡを、細胞プレートの各ウェルに添加した。２４時間後、培地を吸引し、２μｇ／ｍＬのＦｃ−ＧＤＦ１５リガンド（Ｊａｎｓｓｅｎ）、２μｇ／ｍＬのＲ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ標識抗ヒトＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）及び１０μＭのＨｏｅｃｈｓｔ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を含有する５０μＬの検出試薬を各ウェルに添加した。４℃で少なくとも３時間プレートをインキュベートした後、プレートを、適切なフィルターチャネルを使用してＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で撮像した。一次スクリーニングでは、各プレートは、トランスフェクション及び結合の陽性対照としてＦｃγＲ１Ａをトランスフェクトしたウェル、並びにバックグラウンド結合シグナルの対照としてトランスフェクトされていない細胞のウェルを有した。各ウェルを４つの視野で撮像した。画像は、任意の結合が存在するかどうかを判定するために目視検査によって評価された。一次ヒットをスケールアップし、確認スクリーニングのために配列を確認した。確認スクリーニングは一次スクリーニングと同じプロトコルで実施し、別の試験リガンドＨｉｓＴａｇｇｅｄ−ＨＳＡ−ＧＤＦ１５（Ｊａｎｓｓｅｎ）並びに２つの陰性対照リガンド：Ｆｃ分子（Ｊａｎｓｓｅｎ）及びＨｉｓＴａｇｇｅｄ−ＨＳＡ（Ｊａｎｓｓｅｎ）分子を添加して、ヒットの特異性を評価した。ＨＳＡ融合体の検出は、ＨｉｓＴａｇ及びマウス抗Ｈｉｓ抗体（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）、並びにＲ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ標識抗マウス抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）の結合を通して行われ、両方とも検出試薬中２μｇ／ｍＬであった。
【００８１】
３０４８受容体から、一次スクリーニングは、Ｆｃ−ＧＤＦ１５リガンドに結合した４１ヒットを同定し、そのうち６個がＦｃ受容体であった。残りの３５ヒットを確認スクリーニングで試験し、非再現性かつ非特異的なヒットをろ過した。１つのヒット、Ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ  ２（ＮＲＰ２）のみ、Ｆｃ分子単独ではなくＦｃ−ＧＤＦ１５リガンドに結合することが二次スクリーニングにおいて確認された。
【００８２】
並行して、２つの試験を、Ｒｅｔｒｏｇｅｎｉｘ  Ｌｔｄ（Ｗｈａｌｅｙ  Ｂｒｉｄｇｅ，Ｈｉｇｈ  Ｐｅａｋ，Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ，ＵＫ）で、Ｒｅｔｒｏｇｅｎｉｘ’Ｃｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ技術を使用して行って、Ｆｃ−ＧＤＦ１５融合分子の結合パートナーをスクリーニングした。２つの試験を実施して、Ｒｅｔｒｏｇｅｎｉｘの原形質膜タンパク質ライブラリーをスクリーニングし、最初に３５００のタンパク質、次に追加の９９３のタンパク質で、スクリーニングされたタンパク質の総数が４４９３であった。一次スクリーニングの前にバックグラウンドスクリーニングを行って、２、５、及び２０ｕｇ／ｍＬの試験リガンドＦｃ−ＧＤＦ１５の結合のバックグラウンドレベルを検出し、生ＨＥＫ２９３細胞でコーティングされたブランクスライドを用いて、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７抗Ｆｃ抗体を使用して検出された。一次スクリーニングでは、ライブラリー内の各完全長ヒト血漿膜タンパク質をコードするベクターを、Ｒｅｔｒｏｇｅｎｉｘの細胞マイクロアレイスライド上に複製して配列した（「スライドセット」と呼ばれる）。３つの複製スライドセットを一次スクリーンで使用した。対照発現ベクター（ｐＩＲＥＳ−ｈＥＧＦＲ−ＩＲＥＳ−ＺｓＧｒｅｅｎ１）を、全てのスライド上で四重にスポットして、トランスフェクション効率の最小閾値が全てのスライド上で達成又は超過されることを確実にした。ＨＥＫ２９３細胞を、生状態での逆トランスフェクションに使用した。試験リガンドＦｃ−ＧＤＦ１５を、各スライドセットに２０ｕｇ／ｍＬの濃度で添加した。試験リガンドの添加後、細胞固定を行い、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７抗Ｆｃ抗体を結合の検出に使用した。ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェア（ＧＥ）を使用して蛍光画像を分析し、タンパク質の「ヒット」は、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェア上にグリッドされた画像を使用して目視検査により、バックグラウンドレベルと比較して上昇シグナルを示す複製スポットとして定義される。一次スクリーニングで同定されたヒットを確認スクリーニングで試験し、３つの複製一次スクリーニングスライドセットのうちの少なくとも１つにおけるヒットをコードする全てのベクターを新しいスライド上に配列した。結合Ｆｃのための対照サンプルを添加して、一次スクリーニングと同様に確認スクリーニングを行った。ヒトＦｃに融合したヒトＣＴＬＡ４に対するＣＤ８６を過剰発現する細胞の結合は、陽性対照として機能し、Ｆｃのみに対する結合は陰性対照として機能した。
【００８３】
３５００タンパク質を含む第１の試験では、５９ヒットは、「ヒット」を分類するための強度のストリンジェンシーが低い一次スクリーニングから同定された。これらの５９の一次ヒットは、確認スクリーニングにおいて更に調査され、ヒットの３１が再現可能ではなく、一次ヒットの１５は、少なくとも１つの陰性対照との相互作用によって示されるとおり、非特異的であった。残りの１３ヒットは、再現可能かつ特異的であり、非常に弱い又は弱いヒットのいずれかとして分類した。追加の９９３タンパク質を含む第２の試験では、１０の一次ヒットが同定され、それらのうちの９つは、確認スクリーニングにおいて非特異的であることが見出され、１つの残りのヒットは、再現可能かつ特異的であり、弱／中の結合強度を有することが見出された。
【００８４】
Ｊａｎｓｓｅｎ及びＲｅｔｒｏｇｅｎｉｘライブラリーから同定された全ての結合ヒットを表１に列挙する。これらは、真のバインダーであることについて更に調査された。具体的には、ＮＲＰ２のＦｃ−ＧＤＦ１５リガンドへの結合は、ＮＲＰ２を内因的に発現した細胞株、ＣＯＬＯ８２９細胞を使用した場合には再現しなかった（データは示されない）。Ｒｅｔｒｏｇｅｎｉｘスクリーニングの確認によって同定されたヒットを、Ｆｃ−ＧＤＦ１５リガンドへの結合について再試験した。更に、これらのヒットを、ＧＤＦ１５との潜在的な生物学的関連性について注意深く調べた。これまでほとんど研究されていないオーファン受容体であるＧＦＲＡＬを、Ｒｅｔｒｏｇｅｎｉｘスクリーニングで同定した（表１）。それはＧＤＮＦ受容体ファミリーと密接に関連している（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００５；３６１〜３７６）。更に、ＧＤＮＦファミリーのリガンド及びＧＤＦ１５は、同じファミリーのＴＦＧβに属し、構造的相同性を有する（Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２０１１；４７４，３４３〜３４９）。したがって、ＧＦＲＡＬのＧＤＦ１５への結合を十分に調査した。
【００８５】
【表１】
2020503842.tif 000002
【００８６】
実施例２．ＧＦＲＡＬを過剰発現する細胞を使用したＧＤＦ１５結合パートナーの確認
自社設計のＧＦＲＡＬ発現構築物を使用して、結合の確認を繰り返し、続いてＦＡＣＳ分析を行った。ＧＤＮＦ受容体ファミリーの最も近いメンバーと並列した全長ＧＦＲＡＬのＤＮＡをＨＥＫ２９３Ｆ細胞に一過性にトランスフェクトした。
【００８７】
発現構築物の設計
ＣＭＶプロモーターによって駆動される、ｐＵｎｄｅｒ系発現ベクターを使用して、ＧＦＲＡＬ及びＧＦＲαファミリーメンバーの発現構築物を作製した。構築物のコード領域は、強いタンパク質発現及び分泌を駆動することが知られている組換えシグナルペプチド（配列番号１１）、フラグタグ（配列番号１２）及びＧＦＲＡＬの、予測される内因性シグナルペプチドを除いた全長タンパク質（配列番号１３）、ＧＦＲα１（配列番号１４）、ＧＦＲα２（配列番号１５）、ＧＦＲα３（配列番号１６）及びＧＦＲα４（配列番号１７）からなる。Ｋｏｚａｋ配列（配列番号１８）を開始コドンの前に配置した。コード領域は、哺乳類の発現のために最適化されたコドンであり、遺伝子合成及び分子クローニングによって構築物を作製した。同じｐＵｎｄｅｒ系ベクターを使用して、ＧＦＲＡＬ−ＥＣＤ構築物を作製した。予測されたＧＦＲＡＬの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（配列番号１９）の前に、前述の組換えシグナルペプチドが先行し、その後にＣ末端タンパク質タグが続いた。２つの構築物設計を作製し、１つはＣ末端に６ｘＨｉｓ−ｔａｇ及びＡｖｉ−ｔａｇ（配列番号２０）を有し、他方はＣ末端にヒトＩｇＧ１  Ｆｃ、６ｘＨｉｓ−ｔａｇ及びＡｖｉ−ｔａｇを有するものである（ＧＦＲＡＬ  ＥＣＤ−Ｆｃ）。コード領域は、哺乳類の発現のために最適化されたコドンであり、標準的な遺伝子合成及び分子クローニング法を使用して構築物を作製した。
【００８８】
ＧＦＲＡＬ  ＥＣＤタンパク質を、製造者のプロトコルに従ってＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３トランスフェクションキットを使用した一過性トランスフェクションによってＥｘｐｉ２９３（商標）細胞で発現させ、固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、続いてサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって精製した。簡潔に述べると、各タンパク質について、清澄化した細胞上清をＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰカラムに適用し、続いてイミダゾール濃度を増加させた段階的溶出（１０〜５００ｍＭ）を行った。ＧＦＲＡＬ  ＥＣＤを含有する画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより同定し、プールした。１ｘ  ＤＰＢＳ、ｐＨ７．２で平衡化したＨｉＬｏａｄ  ２６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｐｇカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填する前に、タンパク質を０．２μｍ膜を使用してろ過し、適切な容量に濃縮した。高純度でＳＥＣカラムから溶出したタンパク質画分（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定）をプールし、４℃で保存した。タンパク質濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の２８０ｎｍでの吸光度によって測定された。精製されたタンパク質の量を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び解析サイズ排除ＨＰＬＣ（Ｔｏｓｏｈ  ＴＳＫｇｅｌ  ＢｉｏＡｓｓｉｓｔ  Ｇ３ＳＷＸＬ）によって評価した。内毒素レベルを、ＬＡＬアッセイ（Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ｏｆ  Ｃａｐｅ  Ｃｏｄ，Ｉｎｃ．）を使用して測定した。精製されたタンパク質を、１ｘ  ＤＰＢＳ、ｐＨ７．２、４℃で保存した。
【００８９】
一過性トランスフェクション
Ｆｒｅｅ  Ｓｔｙｌｅ（商標）２９３−Ｆ細胞（ＨＥＫ２９３Ｆ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、２９３ｆｅｃｔｉｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、製造業者のプロトコルに従ってトランスフェクトした。簡潔に述べると、ＤＮＡ／２９３ｆｅｃｔｉｎ混合物は、３μｌの１００ｎｇ／μｌのＤＮＡを１７μｌの希釈した２９３ｆｅｃｔｉｎ（１ｍＬのＯｐｔｉＭＥＭに対して３５μｌの２９３ｆｅｃｔｉｎ）を添加することによって作製された。３００ｎｇのＤＮＡと０．６μｌの２９３ｆｅｃｔｉｎとを含有する合計容量２０μｌの得られたＤＮＡ／２９３ｆｅｃｔｉｎ混合物を、室温で２０〜３０分間インキュベートした。次いで、２００μｌの２ｅ６細胞／ｍＬをＤＮＡ／２９３ｆｅｃｔｉｎ混合物に添加し、混合し、次いで蓋をしたディープウェルプレートに移し、ＣＯ２インキュベーター内で、７４５ｒｐｍで２日間振盪した。細胞を回収し、トランスフェクションの２日後にＦＡＣＳ染色を行った。
【００９０】
ＦＡＣＳ結合実験
ＧＦＲＡＬに対するＧＤＦ１５の特異的結合の確認のために、Ｎ−末端フラグ標識ＧＦＲＡＬ、ＧＦＲα１、ＧＦＲα２、ＧＦＲα３又はＧＦＲα４を発現するＨＥＫ２９３Ｆ細胞を、Ｆｃ−ＧＤＦ１５と共にインキュベートし、ＦＡＣＳにより結合を分析した。簡潔に述べると、一過性にトランスフェクトした細胞をトランスフェクションの２日後にスピンダウンし、１ｘ  ＢＤ染色緩衝液（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で洗浄し、５μｇ／ｍＬのＦｃ−ＧＤＦ１５と共に、１ｘ  ＢＤ染色緩衝液（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）中で４℃で１時間インキュベートすることによって処理した。続いて、細胞を洗浄し、Ｆｃ−ＧＤＦ１５結合の検出のために、４℃で３０分間、二次抗体の、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（ＡＦ６４７、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＧを用いて染色した。同じバッチのトランスフェクションからの細胞もまた、細胞表面発現の検出のために、Ｆｃアイソタイプネガティブコントロール、及びＦＩＴＣ標識抗フラッグ抗体（Ｓｉｇｍａ）、及び生死染色のためのＤＡＰＩで染色した。染色した細胞をＢＤ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ  ＬＳＲで分析した。
【００９１】
ＧＤＦ１５、ＨＳＡ−ＧＤＦ１５、及びＦｃ−ＧＤＦ１５の設計、発現、及び精製
ＧＤＦ１５ホモ二量体は、完全長タンパク質（配列番号２１）として設計され、ＥｃｏＲＩ部位及びＦＬＡＧタグ（配列番号２２）は、前述したようにＡｒｇ１９６−Ａｌａ１９７の間の天然のフリン開裂部位の後に挿入された（Ｂａｕｓｋｉｎ  Ａ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）ＥＭＢＯ  Ｊ．１９（１０）：２２１２〜２０）。ＣＭＶプロモーターの制御下で、この発現遺伝子を、哺乳類発現ベクターに挿入した。成熟したＧＤＦ１５ホモ二量体を生成するために、完全長タンパク質を、製造元のプロトコルに従って、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３トランスフェクションキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、細胞内処理のために、Ｅｘｐｉ２９３（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）細胞中で一時的に共発現させた。分泌された成熟型ＧＤＦ１５ホモ二量体を、４℃で１６〜２４時間、抗ＦＬＡＧ（登録商標）Ｍ２親和性樹脂（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）にバッチ結合し、続いて０．１Ｍグリシン、ｐＨ３．５で溶出することによって、清澄化細胞上清から単離した。対象タンパク質を含有するためにＳＤＳ−ＰＡＧＥにより同定された画分をプールし、１ｘＤＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水）、ｐＨ７．２に対して透析し、４℃で保存した。
【００９２】
ＨＳＡ−ＧＤＦ１５は、リンカー（配列番号２４）を介して成熟ＧＤＦ１５（ＡＡ  １９７−３０８）のＮ末端に融合したＨＳＡ（配列番号２３）として設計された。更に、ＥｃｏＲＩ部位及び６ｘＨｉｓ融合物をＨＳＡのＮ末端に添加して、それぞれクローニング及び精製を促進した。最終遺伝子を、マウスＩｇ重鎖分泌タグを有する哺乳類発現ベクターに、ＣＭＶプロモーターの制御下で挿入した。ＨＳＡ−ＧＤＦ１５ホモ二量体を、製造者のプロトコルに従ってＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３トランスフェクションキットを使用した一過性トランスフェクションによってＥｘｐｉ２９３（商標）細胞で発現させ、固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、続いてサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって精製した。簡潔に述べると、清澄化した細胞上清をＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰカラムに適用し、続いてイミダゾール濃度を増加させた段階的溶出（１０〜５００ｍＭ）を行った。ＨＳＡ−ＧＤＦ１５二量体を含有する画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより同定し、プールした。１ｘ  ＤＰＢＳ、ｐＨ７．２で平衡化したＨｉＬｏａｄ  ２６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｐｇカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填する前に、タンパク質を０．２μｍ膜を使用してろ過し、適切な容量に濃縮した。高純度でＳＥＣカラムから溶出したタンパク質画分（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定）をプールし、４℃で保存した。
【００９３】
Ｆｃ−ＧＤＦ１５を生成するために、「ノブ−イン−ホール」戦略を利用し、「ノブ」ＦｃはＴ３６６Ｗ変異を有し、「ホール」Ｆｃは、選択的ヘテロ二量体形成のためのＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を有する。具体的には、ＧＤＦ１５（ＡＡ  １９７−３０８）を、リンカー（配列番号２５）を介して、「ホール」変異でヒトＩｇＧ４  ＦｃのＣ末端に融合させた（「ホール」Ｆｃ−ＧＤＦ１５）。「ノブ」変異を有する相補的ヒトＩｇＧ４（「ノブ」Ｆｃ）は、融合パートナーなしで設計され、「ホール」Ｆｃ−ＧＤＦ１５と組み合わされると、最終的には、各Ｎ末端にＦｃノブ−イン−ホールヘテロ二量体融合を有するＧＤＦ１５ホモ二量体を形成する必要がある。２つの発現遺伝子、「ホール」Ｆｃ−ＧＤＦ１５及び「ノブ」Ｆｃは、別々の哺乳類発現ベクターに、それぞれマウスＩｇ重鎖分泌タグを有し、ＣＭＶプロモーターの制御下で挿入される。タンパク質を、製造者のプロトコルに従って、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３トランスフェクションキットを使用した一過性トランスフェクションによってＥｘｐｉ２９３（商標）細胞で発現させ、プロテインＡ親和性カラム、続いてサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して精製した。簡潔に述べると、清澄化した細胞上清をＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用し、続いて０．１Ｍ  Ｎａ−アセテート、ｐＨ３．５で溶出した。Ｆｃ−ＧＤＦ１５二量体を含有する画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより同定し、プールした。１ｘ  ＤＰＢＳ、ｐＨ７．２で平衡化したＨｉＬｏａｄ  ２６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｐｇカラムに充填する前に、タンパク質を０．２μｍ膜を使用してろ過し、適切な容量に濃縮した。高純度でＳＥＣカラムから溶出したタンパク質画分（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定）をプールし、４℃で保存した。
【００９４】
全タンパク質濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の２８０ｎｍでの吸光度によって測定された。精製されたタンパク質の量を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び解析サイズ排除ＨＰＬＣ（Ｔｏｓｏｈ  ＴＳＫｇｅｌ  ＢｉｏＡｓｓｉｓｔ  Ｇ３ＳＷＸＬ）によって評価した。内毒素レベルを、ＬＡＬアッセイ（Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ｏｆ  Ｃａｐｅ  Ｃｏｄ，Ｉｎｃ．）を使用して測定した。全ての精製されたタンパク質を、１ｘ  ＤＰＢＳ、ｐＨ７．２、４℃で保存した。
【００９５】
結果
結果としては、ＧＦＲＡＬ発現細胞のみが、Ｆｃ−ＧＤＦ１５リガンドに結合するが、Ｆｃ分子単独には結合しないことが示された（図１）。他のＧＤＮＦファミリーメンバー（ＧＦＲα１−４）でトランスフェクトされた細胞は、Ｆｃ−ＧＤＦ１５（データ不掲載）に結合せず、ＧＤＦ１５の結合がＧＦＲＡＬに特異的であることを示す。更に、受容体ＧＦＲα１−４は、レトロゲニックスライブラリーに含まれ、最初のスクリーニングにおいて、これらの受容体に対するＧＤＦ１５の結合が検出されなかった。Ｆｃ−ＧＤＦ１５のＧＦＲＡＬ発現細胞への結合は、用量依存的であり、ＥＣ５０＝０．２５７７ｎＭであった（図２）。
【００９６】
実施例３．細胞を含まないシステムを使用したＧＤＦ１５結合パートナーの確認
ＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）−Ｆｃ融合体のタンパク質を組換えにより作製し、無細胞のプレートベースのフォーマットでＨＳＡ−ＧＤＦ１５リガンドへの結合について試験した。
【００９７】
Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ結合アッセイ
細胞を含まないシステムにおけるＧＤＦ１５−ＧＦＲＡＬ  ＥＣＤの結合を試験するために、プレートベースのアッセイを開発した。簡潔に述べると、ＧＦＲＡＬ  ＥＣＤ−Ｆｃ分子を、ＰＢＳ中４μｇ／ｍＬで４℃で一晩ＭＳＤ標準プレート（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）でコーティングした。翌日、プレートを０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳ中で３回洗浄し、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋブロッキング緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって３０分間ブロッキングした。結合実験のために、０．０２ｐＭ〜１００ｎＭの範囲の濃度でＨＳＡ−ＧＤＦ１５リガンドを１ウェルあたり２５μＬでプレートに加え、１時間インキュベートした。ＨＳＡ−ＧＤＦ１５リガンドとの非融合ＧＤＦ１５の競合実験については、６．２５ｎＭでのＨＳＡ−ＧＤＦ１５の固定濃度を、各ウェルに２５μＬの混合物を添加する前に、１００ｎＭから開始して異なる濃度の非融合ＧＤＦ１５と３０分間あらかじめ混合した。ＰＢＳ−ｔｗｅｅｎで更に３回の洗浄後、１μｇ／ｍＬマウス抗ＨＳＡ抗体（Ｋｅｒａｆａｓｔ  Ｉｎｃ）及び１μｇ／ｍＬのＳｕｌｆｏＴａｇ抗マウス抗体を含有する２５μＬの検出試薬を各ウェルに加え、更に１時間インキュベートした。次いで、プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、プレートリーダー（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｅｃｔｏｒ機器）で読み取る前に、１５０μｌの読み取り緩衝液（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を添加した。各条件を２つのウェルで試験し、平均をプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアで分析した。用量反応曲線に対して、４パラメータ最小二乗法を実施した。
【００９８】
ＨＳＡ−ＧＤＦ１５のＧＦＲＡＬ  ＥＣＤ−Ｆｃへの結合の用量依存曲線はまた、この結合フォーマットにおけるサブｎＭ  ＥＣ５０（０．０２ｎＭ）を示した（図３）。
【００９９】
次に、６．２５ｎＭでのＨＳＡ−ＧＤＦ１５の固定濃度及び１００ｎＭまでの非融合ＧＤＦ１５の濃度の範囲を使用して競合アッセイを実施した。結果は、非融合ＧＤＦ１５濃度が６．２５ｎＭのＨＳＡ−ＧＤＦ１５濃度以上である場合、シグナルの減少によって示される、明確な競合を示した（図４）。最後に、ＧＦＲＡＬ  ＥＣＤ−ＦｃとＧＤＦ１５及びＨＳＡ−ＧＤＦ１５リガンドとの間で表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定を行った。４つの複製を有する３つの独立した実験からの測定された親和性は、ＧＤＦ１５が１９．６±５．０８ｐＭのＫＤを有し、ＨＳＡ−ＧＤＦ１５が３１８±６９ｐＭのＫＤを有することを示した（表２）。非融合とＨＳＡ−融合ＧＤＦ１５との間のＫＤの１６倍の差は、主により遅いｋｄよりもはるかに速いｋａによって寄与され、ＨＳＡ融合分子は、いくつかの立体障害をＧＦＲＡＬ受容体に引き起こし得ることを示唆している。
【０１００】
【表２】
2020503842.tif 000003
【０１０１】
実施例４．生物学的に不活性な変異体のＧＦＲＡＬへの結合
ＧＲＦＡＬはＧＤＮＦ受容体ファミリーに属し、最も近いファミリーメンバーＧＦＲα１−４は全て共受容体としてＲＥＴを有しているので、ＧＤＦ１５に結合するＧＦＲＡＬの潜在的な共受容体についてＲＥＴを研究した。ＧＤＦ１５：ＧＦＲＡＬ：ＲＥＴの相同性モデルに基づく構造を、相互作用するであろうＧＤＦ１５、ＧＦＲＡＬ、及びＲＥＴの潜在的エピトープについて試験した（データは示さない）。モデルによると、カノニカルＩＩ型受容体のそれらの係合においていくつかのＴＧＦ−βスーパーファミリーメンバーによって採用されるものに近いＧＤＦ１５上の表面が、ＧＦＲＡＬ  ＥＣＤのＤ２ドメインと相互作用する可能性が高い。ＧＦＲＡＬとＲＥＴとの間の相互作用は、複数のドメインにわたって分散される可能性が高い。
【０１０２】
ＨＳＡ融合プラットフォーム上のＧＤＦ１５の表面アミノ酸のいくつかの点変異体は、ＧＤＦ１５上の受容体相互作用エピトープの調査のためにＧＤＦ１５生物活性を排除する目的で設計及び生成された（出願番号６２／３３３，８８６を参照）。これらの変異体の分子一体性を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ、及び抗ＧＤＦ１５抗体への結合によって調べた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける同様のサイズバンド、ＨＰＬＣによる同様の保持時間及びピーク形状、並びに野生型ＧＤＦ１５（出願番号６２／３３３，８８６）と比較した複数の抗ＧＤＦ１５抗体に対する同様の結合曲線は、全体的な分子立体配座が点突然変異によって実質的に中断されないことを示唆した。
【０１０３】
次いで、ＨＳＡ−ＧＤＦ１５点突然変異体、１つの生物活性（Ｑ６０Ｗ）及び２つの生物学的不活性（Ｉ８９Ｒ及びＷ３２Ａ）を、無細胞プレートベースの結合アッセイにおけるＧＦＲＡＬ  ＥＣＤ−Ｆｃへの結合について試験した。簡潔に述べると、ＧＦＲＡＬ  ＥＣＤ−Ｆｃ分子を、ＰＢＳ中４μｇ／ｍＬで、４℃で一晩ＭＳＤ標準プレート（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）でコーティングした。翌日、プレートを０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を有するＰＢＳ中で３回洗浄し、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋブロッキング緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって３０分間ブロッキングした。ＨＳＡ−ＧＤＦ１５リガンド及び異なる濃度のその変異体を、ウェル当たり２５μｌでプレートに添加し、１時間インキュベートした。ＰＢＳ−ｔｗｅｅｎで更に３回の洗浄後、１μｇ／ｍＬのマウス抗ＨＳＡ抗体（Ｋｅｒａｆａｓｔ  Ｉｎｃ）及び１μｇ／ｍＬのＳｕｌｆｏＴａｇ抗マウス抗体を含有する２５μＬの検出試薬を各ウェルに加え、更に１時間インキュベートした。次いで、プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、プレートリーダー（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｅｃｔｏｒ機器）で読み取る前に、１５０μｌの読み取り緩衝液（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を添加した。各条件は２つのウェルを有し、平均をプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアで分析した。用量反応曲線に対して、４パラメータ最小二乗法を実施した。
【０１０４】
結果は、生物活性変異体（Ｑ６０Ｗ）が野生型ＨＳＡ−ＧＤＦ１５と同様の結合プロファイルを有していたが、２つの生物学的に不活性な突然変異体は、それらの結合において拡散した。Ｉ８９Ｒ変異体は、ＧＦＲＡＬ  ＥＣＤ−Ｆｃへの結合を完全に喪失し、一方、Ｗ３２Ａ変異体は、野生型とのオーバーラップ結合曲線を有することを示した（図５）。これらの点変異体の結合は、完全長ＧＦＲＡＬでトランスフェクトされた細胞においても特徴付けられた。ＧＦＲＡＬ発現細胞上のＦＡＣＳによる結合結果は、プラトー系ＥＣＤ：２つの生物学的に不活性な突然変異体の外、Ｗ３２Ａ変異体のみであるが、Ｉ８９Ｒ変異体ではない結合結果は、野生型と比較して、蛍光強度の同様の幾何平均を有する（図６）。
【０１０５】
Ｉ８９Ｒ及びＷ３２Ａ変異体の両方が生物学的に不活性であるということを発見すると、Ｉ８９Ｒ変異体のみがＧＦＲＡＬに結合していたことを発見することは、構造モデルと一致する。インシリコ分析は、Ｉ８９残基がＧＦＲＡＬ相互作用エピトープに存在することを示唆しているが、ＲＥＴ共受容体がＷ３２残基の周囲でＧＤＦ１５と有効に相互作用し得ることも示している。これは、Ｗ３２変異体が依然としてＧＦＲＡＬに結合するが、共受容体相互作用の欠如により、それはインビボで生物活性を有さない実験データと一致する。
【０１０６】
実施例５．ＧＦＲＡＬ過剰発現細胞におけるＧＤＦ１５誘導性インビトロシグナル伝達
ＧＤＮＦファミリーリガンドは、特異的ＧＦＲα受容体に結合し、ＲＥＴ受容体チロシンキナーゼの活性化を通じてシグナル伝達する。活性化の際、ＲＥＴは、セリン／トレオニンキナーゼＡｋｔ、マイトジェン活性化プロテインキナーゼＥｒｋ１／２、及びホスホイノシチド特異的ホスホリパーゼＣγ１（ＰＬＣγ１）のリン酸化を含む、複数のシグナル伝達経路を引き起こす複数のチロシン残基上でリン酸化される（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  ２０１４，１４，ｐ．１７３〜１８６に掲載されている）。したがって、ＧＤＦ１５のＧＦＲＡＬへの結合を通じたＲＥＴ媒介シグナル伝達経路の活性化を十分に調査した。
【０１０７】
ＧＦＲＡＬを過剰発現するＳＫ−Ｎ−ＡＳ及びＮＧ１０８−１５細胞を使用して、ＧＤＦ１５刺激のシグナル伝達経路を調査した。細胞としてＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び０．１ｍＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）を添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に維持した。ＮＧ１０８−１５は、神経芽腫（Ｎ１８ＴＧ−２）及びラット神経膠腫（Ｃ６ＢＵ−１）のハイブリッドマウス細胞株である。ＮＧ１０８−１５細胞を、４．５ｇ／Ｌグルコースを用いてＤＭＥＭに維持し、１０％  ＦＢＳ、１０ｍＭヒポキサンチン、０．１ｍＭアミノプテリン、及び１．６ｍＭチミジンを添加した。一過性トランスフェクションの場合、細胞を３０％コンフルエンスで６ウェルプレートに播種し、細胞が約７５〜８０％コンフルエンスに達するまでインキュベートした。製造元の推奨に従って、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭにおいてＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を使用して、ＳＫ−Ｎ−ＡＳ及びＮＧ１０８−１５細胞の一過性トランスフェクションを実施した。細胞を６ウェルプレートで培養し、使用したＤＮＡ対リポフェクタミン２０００の比は、４μｇのＤＮＡ：１０μｌのリポフェクタミン２０００であった。トランスフェクションの約４０時間後に、ホスホシグナル伝達評価を行った。
【０１０８】
タンパク質の発現レベル、又はシグナル伝達タンパク質のリン酸化状態をアッセイするために、ウェスタンブロットを行った。イムノブロット分析のために、細胞を１６時間血清飢餓状態にし、特に明記しない限り、５０ｎｇ／ｍＬの組換えＮＲＴＮ又はＧＤＦ１５で１５分間刺激した。刺激後、細胞を、９０μＬの細胞シグナリングバッファー（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加する前に、氷冷ＰＢＳで２回洗浄した。細胞を、細胞スクレーパを使用して皿から掻き取り、エッペンドルフチューブに移し、氷上で２０分間維持した。試料を３回、１０秒間超音波処理し、次いで４℃で１０分間１６，０００×ｇで遠心分離した。上清を新鮮なチューブに移し、−８０℃で保存した。
【０１０９】
タンパク質濃度を、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）タンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ製）によって測定した。試料緩衝液を溶解物に添加し、９５℃で５分間加熱した後、冷却した。等量のタンパク質をＮｕＰＡＧＥ  ４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上に充填し、ＮｕＰＡＧＥ  ＭＥＳ−ＳＤＳランニング緩衝液中で、１５０ボルトで５０分間稼働させ、その後、ｉＢｌｏｔ転写システム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用してニトロセルロース膜に移した。ＬＩ−ＣＯＲブロッキング緩衝液を用いて膜を６０分間ブロッキングした。異なる抗体について異なる最適希釈で一次抗体インキュベートを実施した。一次抗体の全てのインキュベートを４℃で一晩実施した後、二次抗体（ＬＩ−ＣＯＲからのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０又はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ８００）インキュベートを、１：１００００希釈で１時間室温で実施した。３回洗浄後、膜を、Ｏｄｙｇｓｅｙ  Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＩ−ＣＯＲ）で走査した。
【０１１０】
ＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞は、別のＧＤＮＦファミリーリガンドのＮｅｕｒｔｕｒｉｎ（ＮＲＴＮ）の天然受容体である、ＧＦＲα２及びＲＥＴを内因的に発現する。ＧＦＲＡＬのトランスフェクションなし（図７、左半分）では、ＮＲＴＮを添加するが、ＧＤＦ１５は、ホスホ−Ｔｙｒ、ホスホ−Ａｋｔ、ホスホ−Ｅｒｋ１／２及びホスホ−ＰＬＣγ１に強いバンドを誘導しない。ＧＦＲＡＬをトランスフェクトしたとき（図７、右半分）、非融合ＧＤＦ１５の添加はまた、ホスホ−Ｔｙｒ、ホスホ−Ａｋｔ、ホスホ−Ｅｒｋ１／２及びホスホ−ＰＬＣγ１においてシグナル伝達を誘導する（図７、レーン６とレーン４との比較）。ＨＳＡ−ＧＤＦ１５分子でホスホシグナル伝達を確認した（図８、レーン１０）。しかしながら、Ｗ３２位及びＩ８９位における２つの生物学的に不活性なＧＤＦ１５点突然変異体のＨＳＡ融合は、ＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞内の、ホスホチロシン、ホスホ−Ａｋｔ、ホスホ−Ｅｒｋ１／２、及びホスホ−ＰＬＣγ１のシグナル伝達を誘発しなかった（図８、レーン１１及び１２）。
【０１１１】
ＮＧ１０８−１５細胞は、リガンドＧＤＮＦの天然受容体であるＧＦＲα１及びＲＥＴを内因的に発現する。ＧＦＲＡＬのトランスフェクションなし（図９、左半分）では、ＧＤＮＦを添加するが、ＧＤＦ１５は、ホスホ−Ｔｙｒ、ホスホ−Ａｋｔ、ホスホ−Ｅｒｋ１／２、及びホスホ−ＰＬＣγ１に強いバンドを誘導しない。ＧＦＲＡＬをトランスフェクトしたとき（図９、右半分）、非融合ＧＤＦ１５の添加はまた、ホスホ−Ｔｙｒ、ホスホ−Ａｋｔ、ホスホ−Ｅｒｋ１／２及びホスホ−ＰＬＣγ１においてシグナル伝達を誘導する（図９、レーン６とレーン４との比較）。
【０１１２】
実施例６．ＧＦＲＡＬ受容体はインビボでＧＤＦ１５の効果を媒介する。
Ｂ６のコホート；１２９Ｓ５−Ｇｆｒａｌｔｍ１Ｌｅｘ（Ｇｆｒａｌ−／−）構成的ノックアウト（ＫＯ）マウス、並びに野生型リタテメート対照（Ｇｆｒａｌ＋／＋）マウスを、Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｍｏｄｅｌ  ＴＦ３７５４からの繁殖コロニーから得、Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡで維持した。ＴＦ３７５４モデルは、元々、相同組換えを介してＧｆｒａｌ（ＮＭ＿２０５８４４）のｌａｃＺ／Ｎｅｏカセット標的化エクソン２〜３の挿入を通して、Ｌｅｘｉｃｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｔｈｅ  Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ，ＵＳＡ）で元々生成された。記載の試験で使用した動物は、少なくとも１回Ｃ５７Ｂｌ／６ＮＴａｃマウスに戻し交配した１２９Ｓ５：Ｃ５７Ｂｌ／６ＮＴａｃの混合バックグラウンドであった（〜Ｎ２  Ｂ６）。成人マウスは、Ｔａｃｏｎｉｃ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからＪａｎｓｓｅｎ  Ｒ＆Ｄ、Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈｏｕｓｅ，ＰＡに輸送され、これらは、少なくとも１週間の順応性を許容した。本研究で使用された全ての動物は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ＆  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）（Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｒ＆Ｄ，Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈｏｕｓｅ，ＰＡ）によって承認されたプロトコルに従って維持した。１２時間の光／暗サイクル及びプラスチックの豊富化を有する温度及び湿度制御された室内のペーパビーディングにマウスを収容した。マウスを水に自由にアクセスさせ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｒｏｄｅｎｔ  Ｄｉｅｔ  ＃５００１（ＬａｂＤｉｅｔ，ＵＳＡ）上に維持した。食物摂取量は、ＢｉｏＤＡＱ食品摂取監視システム（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）を使用して測定した。マウスを単独で紙の寝具の上に収容し、４ｍＬ／ｋｇのＰＢＳ又は組換えヒトＧＤＦ１５（ＰＢＳ中４ｎｍｏｌ／ｍＬ）（Ｊａｎｓｓｅｎ  ＢｉｏＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓによって生成）のいずれかの皮下投与の７２時間以上前にＢｉｏＤＡＱケージに順応させた。
【０１１３】
遺伝子型解析
尾部スニップＤＮＡを使用して、マウスの遺伝子型を決定した。以下のプライマー配列：ＴＦ３７５４−１６（配列番号４）、ＴＦ３７５４−１５（配列番号５）、及びＮｅｏ３ｂ（配列番号６）を使用して、ＲＥＤＥｘｔｒａｃｔ−Ｎ−Ａｍｐ（商標）組織ＰＣＲキットプロトコル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に従ってＤＮＡ抽出及び増幅を行った。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル上での電気泳動により分離した。野生型対立遺伝子（ＴＦ３７５４−１６及びＴＦ３７５４−１５）の増幅は１３３塩基対の産物をもたらし、一方標的Ｇｆｒａｌ対立遺伝子（Ｎｅｏ３ｂ及びＴＦ３７５４−１５）の増幅は３３０塩基対の産物をもたらした。
【０１１４】
遺伝子発現
Ｇｆｒａｌの発現パターンを決定するために、組織を、Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡから入手した５ヶ月齢の雄型Ｃ５７Ｂｌ／６Ｎマウスから単離し、小脳、後脳、中脳、視床下部、海馬、皮質、下垂体、白色脂肪死、褐色脂肪、膵臓、肝臓、骨格筋、脾臓、腎臓、心臓、肺、精巣、胃、小腸領域、結腸、胸腺、副腎、腸間膜リンパ節、骨髄、精嚢、及びエピディジスミスの領域。５ｍｍステンレス鋼ビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）を有するＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒを使用して実施した組織ホモジナイズを用いて、ＲＮｅａｓｙ  Ｌｉｐｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）で抽出した。マウスＧｆｒａｌ及び１８Ｓ用のＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現マスターミックス及びＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現を用いて、ＶｉｉＡ（商標）７リアルタイムＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で定量的ＰＣＲを完了した。遺伝子発現の相対量は、対象とする全ての標的遺伝子を含有するプールされたマウス脳ｃＤＮＡの連続希釈から生成された各遺伝子の増幅の標準曲線に基づいて決定した。Ｇｆｒａｌの相対量を１８Ｓの相対量に正規化した。
【０１１５】
Ｇｆｒａｌ発現を、グリトメート対照と比較して、Ｇｆｒａｌノックアウトマウスの脳組織から得られたＲＮＡに対して定量ＰＣＲを用いて解析した。ＲＮＥＡＳＹ  Ｌｉｐｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）でＲＮＡを抽出し、５ｍｍステンレス鋼ビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）を有するＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒを用いて実施した。ｃＤＮＡは、高容量ｃＤＮＡキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して調製した。ＳＹＢＲ（登録商標）遺伝子発現マスターミックス及びエクソン２と３の間の接合部を特異的に標的とする以下のプライマー配列を使用して、ＶｉｉＡ（商標）７リアルタイムＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で定量的ＰＣＲを完了した。ＭＧｆｒａｌ  Ｆｏｒｗａｒｄ（配列番号７）、ｍＧｆｒａｌ  Ｒｅｖｅｒｓｅ（配列番号８）、及びｍＡＲＢＰ順方向（配列番号９）及びｍＡＲＢＰ逆方向（配列番号１０）。
【０１１６】
結果
マウスにおけるｇｆｒａｌ発現の検出は脳に限定され、そして後脳において特異的に濃縮された（図１０）。受容体を欠くマウスを使用してインビボでのＧＦＲＡＬの機能を調査した。受容体の欠失は定量的ＰＣＲによって確認された（図１０）。インビボでのＧＦＲＡＬに対するＧＤＦ１５シグナル伝達の依存性を評価するために、組換えヒトＧＤＦ１５での処置後に、オスのＧＦＲＡＬ  ＫＯマウス及び野生型同腹仔における食物摂取量を測定した。１６ｎｍｏｌ／ｋｇでのＧＤＦ１５の単回皮下投与は、その後の１２時間の食物摂取量を野生型マウスにおいて４０％以上減少させ、この効果はＧＦＲＡＬ  ＫＯマウスにおいては見られなかった（図１１）。
【０１１７】
実施例７．ＨＳＡ−ＧＤＦ１５のカニクイザルＧＦＲＡＬへの結合
ＨＳＡ−ＧＤＦ１５は、リンカー（配列番号２６）を介して成熟ＧＤＦ１５（ＡＡ  １９７−３０８）のＮ末端に融合したＨＳＡ（配列番号２３）として設計された。ＨＳＡ−ＧＤＦ１５を一過性トランスフェクションによってＥｘｐｉ２９３ＴＭ細胞で発現させ、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ樹脂により精製した後、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を行った。簡潔に述べると、細胞上清を、あらかじめ平衡化した（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）ＨＳＡ  ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔカラム（ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  Ｈｕｍａｎ  Ａｌｂｕｍｉｎ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｍａｔｒｉｘ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に充填した。充填後、未結合タンパク質をカラム容量（ＣＶ）の１０倍量のＰＢＳ（ｐＨ７．２）でカラムを洗浄することによって除去した。カラムに結合したＨＳＡ−ＧＤＦ１５を１０ＣＶの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ中の２Ｍ  ＭｇＣｌ２（ｐＨ７．０）で溶出した。ピーク画分をプールし、ろ過（０．２μｍ）し、４℃のＰＢＳ（ｐＨ７．２）に対して透析した。透析後、タンパク質を再びろ過し（０．２μｍ）、適当な体積にまで濃縮した後、２６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）にロードした。高い純度でＳＥＣカラムから溶出したタンパク質画分（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定された）をプールした。
【０１１８】
可溶性組換えＧＦＲＡＬを作製するために、ヒトＧＦＲＡＬ（配列番号１９）又はカニクイザルＧＦＲＡＬ（配列番号２７）のいずれかの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を、６×ＨｉｓタグでヒトＩｇＧ１  Ｆｃに融合するように設計した。Ｃ末端（ヒトについては配列番号２８、カニクイザル融合については配列番号２９を参照）。ＧＦＲＡＬ  ＥＣＤタンパク質を、製造者のプロトコルに従ってＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３トランスフェクションキットを使用した一過性トランスフェクションによってＥｘｐｉ２９３（商標）細胞で発現させ、固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、続いてサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって精製した。簡潔に述べると、各タンパク質について、清澄化した細胞上清をＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰカラムに適用し、続いてイミダゾール濃度を増加させた段階的溶出（１０〜５００ｍＭ）を行った。ＧＦＲＡＬ  ＥＣＤを含有する画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより同定し、プールした。１ｘ  ＤＰＢＳ、ｐＨ７．２で平衡化したＨｉＬｏａｄ  ２６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｐｇカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填する前に、タンパク質を０．２μｍ膜を使用してろ過し、適切な容量に濃縮した。高純度でＳＥＣカラムから溶出したタンパク質画分（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定）をプールし、４℃で保存した。
【０１１９】
ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）使用して表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用い、親和性測定を実施した。アミンカップリング化学反応についての製造元の説明書を使用し、抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を、ＧＬＣチップ（ＢｉｏＲａｄ）の加工アルギン酸ポリマー層にカップリングさせて、バイオセンサ表面を調製した。約５０００ＲＵ（応答単位）のｍＡｂを固定化した。ランニング緩衝液（ＤＰＢＳ＋０．０１％  Ｐ２０＋１００μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ）中にて２５℃で速度実験を実施した。ＨＳＡ−ＧＤＦ１５、ＧＦＲＡＬ  ＥＣＤ−Ｆｃ、又はアイソタイプ対照の結合速度論的実験を行うために、リガンドを５つの濃度（４倍連続希釈）で注射した。５０μＬ／分で３分間会合段階をモニタした後、１５分間緩衝液を流した（解離段階）。１００μＬ／分で１００ｍＭ  Ｈ３ＰＯ４（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を１８秒間ずつ２回流してチップ表面を再生した。回収したデータをＰｒｏｔｅＯｎ  Ｍａｎａｇｅｒソフトウェアを用いて処理した。まず、インタースポットを用いてバックグラウンドについてデータを補正した。次いで、分析物注入用の緩衝液注入を使用して、データのダブルリファレンスサブトラクション（double reference subtraction）を行った。ラングミュア型の１：１結合モデルを用い、データの速度論的分析を実施した。結果を、ｋａ（会合速度）、ｋｄ（解離速度）、及びＫＤ（平衡解離定数）の形で報告した。
【０１２０】
ヒトに対するＨＳＡ−ＧＤＦ１５とヒトＩｇＧ１  Ｆｃに融合したカニクイザルＧＦＲＡＬ受容体細胞外ドメイン（ＧＦＲＡＬ  ＥＣＤ−Ｆｃ）との間の相互作用を決定するために、結合速度論についてＰｒｏｔｅＯｎ  ＳＰＲアッセイにより試験した。表４は、カニクイザルＧＦＲＡＬに対するＨＳＡ−ＧＤＦ１５分子の結合親和性が、ヒトＧＦＲＡＬ（表３）と比較して２倍以内の差があることを示した。
【０１２１】
【表３】
2020503842.tif 000004
【０１２２】
【表４】
2020503842.tif 000005
【図１】
2020503842.tif 000006
【図２】
2020503842.tif 000007
【図３】
2020503842.tif 000008
【図４】
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【図５】
2020503842.tif 000010
【図６】
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【図７】
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【図８】
2020503842.tif 000013
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2020503842.tif 000016
【配列表】
2020503842000001.app
【国際調査報告】
2020503842.tif 000017
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