(57)【要約】  本発明は、哺乳動物α−ディフェンシンおよび／またはβ−ディフェンシンの投与によって気道過敏性を低下させること、肺コンプライアンスを上昇させること、肺の炎症を減少させること、気管支肺胞洗浄液中の炎症性細胞数を減少させること、およびサイトカイン産生を低下させることに基づく、喘息、軽度間欠型喘息、軽度持続型喘息、中等度持続型喘息、重度持続型喘息、好酸球性喘息、好中球性喘息、ステロイド治療抵抗性喘息、喘息持続状態、肺炎、気管支拡張症、ＣＯＰＤ、サルコイドーシスおよび肺癌の処置または防止の方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
呼吸器系の炎症性疾患の処置および／または予防の方法であって、少なくとも１種類のディフェンシンの経口投与または肺内投与を含み、好ましくは対象が喘息に罹患している、方法。
【請求項２】
前記疾患が、軽度間欠型喘息、軽度持続型喘息、中等度持続型喘息、重度持続型喘息、好酸球性喘息、好中球性喘息、ステロイド治療抵抗性喘息、喘息持続状態、気管支拡張症、慢性閉塞性肺障害（ＣＯＰＤ）、気管支炎、肺炎および肺気腫、サルコイドーシス、肺線維症からなる群から選択され、好ましくはステロイド治療抵抗性喘息であり、少なくとも１種類のディフェンシンの投与を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
炎症が、肺癌によって引き起こされる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
肺の組織炎症、気管支肺胞洗浄液中の炎症性細胞数を低減すること、肺組織ホモジェネート中の炎症性サイトカイン産生の正常化およびサイトカインストームの防止／処置によって免疫系のバランスを回復させることを含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
その必要がある対象において肺コンプライアンスを増加させること、気道過敏性を低下させること、および／またはピークフローを増加させることを含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
肺微生物叢のおよび／または肺微生物叢からの、遺伝子の豊富さ、門の数を増加させること、酪酸塩産生および／またはトリプトファン産生を増加させること、酢酸塩産生を減少させることを含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
肺中の正常微生物叢を維持することおよび／または安定化することを含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
１秒間努力呼気肺活量（ＦＥＶ１）および／または最大呼気速度（ＰＥＦＲ）を増加させること、またはＰＥＦＲ変動を減少させることを含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記ディフェンシンが、ＨＤ５、ＨＤ６、ｈＢＤ１、ｈＢＤ２、切断型ｈＢＤ２、ｈＢＤ３およびｈＢＤ４からなる群から選択される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、組成物中に含まれ、前記組成物が、２種類のディフェンシンなど、３種類のディフェンシンなどの、２種類以上のディフェンシンを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記２種類のディフェンシンが、ｈＢＤ２およびＨＤ５である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記組成物が、医薬組成物である、請求項１０〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ディフェンシンが、細胞貫通ペプチド（ＣＰＰ）、アルブミン結合部分（ＡＢＭ）、検出可能部分（Ｚ）、および半減期延長ペプチドからなる群から選択される少なくとも１つの追加部分を更に含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記追加部分が、半減期延長ペプチドである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記半減期延長ペプチドが、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）、トランスフェリン、アルブミン（ＨＡＳ）、ＸＴＥＮ（登録商標）またはＰＥＧ、ホモアミノ酸ポリマー（ＨＡＰ）、プロリン−アラニン−セリンポリマー（ＰＡＳ）、またはエラスチン様ペプチド（ＥＬＰ）、ヒアルロン酸、絨毛ゴナドトロピン（ＣＧ）β鎖のカルボキシ端ペプチド（ＣＴＰ）などの負に荷電した高度にアシル化されたペプチド、ヒトＩｇＧ、およびＣＨ３（ＣＨ２）ｎＣＯ−（ここでｎは８〜２２である）に結合できる分子からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記対象が、日常症状など、持続性症状などの、１週間につき＞２回の喘息症状を呈する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記対象が、活動に影響を及ぼす発作など、身体活動を制限する発作などの、異なる強度の喘息発作を呈する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記対象が、数日間持続する１週間あたり＞２回の症状など、頻繁な夜間症状などの、１ヵ月につき＞２回の夜間喘息症状を呈する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記対象が、６０〜８０％のＦＥＶ１など、＜６０％のＦＥＶ１などの、＜８０％の１秒間努力呼気肺活量（ＦＥＶ１）を呈する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記対象が、２０〜３０％のＰＥＦＲ変動など、＞３０％のＰＥＦＲ変動など、＞６０％のＰＥＦＲ変動などの、＞２０％の変動がある最大呼気速度（ＰＥＦＲ）を呈する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ディフェンシンが、糖質コルチコイド、β作動薬、ロイコトリエン受容体アンタゴニスト、テオフィリン、抗生物質、リファキシミン、化学療法もしくは免疫療法、免疫抑制薬、プレバイオティクス、プロバイオティクス、トリプトファン、短鎖脂肪酸、ＨＮＰ−１、ＨＮＰ−２、ＨＮＰ−３、ＨＮＰ−４、カテリシジン、ラクトフェリン、ラクトフェリシン、リゾチーム、糞便移植またはこれらの任意の組合せとの組み合わせで投与される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
１日投与量が、０．５〜５ｍｇディフェンシン／ｋｇなど、１〜２ｍｇディフェンシン／ｋｇなど、１日あたり１．２ｍｇディフェンシン／ｋｇなどの、０．１〜１０ｍｇディフェンシン／ｋｇである、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ディフェンシンが、少なくとも１日２回など、少なくとも１日３回など、少なくとも１日４回など、少なくとも１日５回または継続的になど、少なくとも１日１回投与される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記肺内投与が、気管内、気管支内、または気管支肺胞上皮である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記肺内投与が、吸入器、ネブライザー、または気化器によるものである、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記肺癌が、小細胞肺癌または非小細胞肺癌であって、所望により前記癌が、放射線療法によって、化学療法および／または手術によって処置されている、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
先行請求項のいずれか一項に記載の処置の方法における使用のためのディフェンシンポリペプチド。
【請求項２８】
先行請求項のいずれか一項において定義される障害の処置のための薬剤の調製のためのディフェンシンポリペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物α−ディフェンシンおよび／またはβ−ディフェンシンの投与によるサイトカイン産生の正常化およびサイトカインストームの防止によって、気道過敏性を低下させること、肺コンプライアンスを上昇させること、肺の炎症を減少させること、血管周囲または気管支周囲の炎症を減少させること、気管支肺胞洗浄液中の炎症性細胞数を減少させること、および免疫系のバランスを回復させることに基づき、喘息、軽度間欠型喘息、軽度持続型喘息、中等度持続型喘息、重度持続型喘息、好酸球性喘息、好中球性喘息、ステロイド治療抵抗性喘息、喘息持続状態、肺炎、気管支拡張症、ＣＯＰＤおよび肺癌を含む肺の炎症性疾患を処置または防止する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
喘息は、慢性炎症、気道過敏性ならびに再発性の喘鳴、咳および息切れの症状を特徴とする気道の異質性の炎症性障害である。喘息は、全世界で３億人が罹患している大きな公共の健康問題であり、過去３０年にわたって特に西欧諸国で有病率が大幅に増加している（Ｃｏｓｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１）。しかし、病因のメカニズムは見つからないままである。ステロイドおよび長時間作用性β作動薬との併用療法が喘息処置の中心である。これらの療法は急性炎症症状およびサイトカイン放出を効率的に抑制するが、疾患の予防法または治療法は今のところ存在しない。
【０００３】
軽度から中等度のアレルギー性喘息は一般に、ＩｇＥ産生に関連する活性化Ｔｈ２リンパ球および好酸球浸潤、粘液分泌細胞、肥厚および化生、気道壁のリモデリングならびに気道過敏性（ＡＨＲ）からなる急性または慢性の気道炎症を特徴とする。ＡＨＲは、メタコリンなどの非特異的な収縮刺激性刺激物質に対する応答性の増加および気道の狭窄を特徴とする（Ｈａｎｓｂｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１）。Ｔｈ２細胞は、特に、それらのサイトカインＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−１３の分泌を通じて、疾患の様々な病理学的特徴に寄与する。
【０００４】
重度喘息、好中球性喘息またはステロイド治療抵抗性喘息は、軽度から中等度のアレルギー性喘息と異なる病理学的特徴を有し、Ｔｈ１７細胞が寄与する可能性がある混合されたＴｈ２／Ｔｈ１表現型を特徴とする。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ、ＩＬ−１７およびＩＬ−２７が増加し、好中球（好酸球ではなく）の流入または喘息のこの亜型に特徴的な混合顆粒球の気道浸潤を引き起こし得る。喘息のこの亜型に罹患した患者は糖質コルチコイド処置に抵抗性であり、細菌およびウイルス感染の両方が疾患の誘発およびの進行に関係付けられている（Ｈａｎｓｂｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）。また、喘息の患者およびアトピー性皮膚炎に罹患した患者は、非アトピー性の個体と比較して感染症、例えば肺炎を発症する傾向が強い。
【０００５】
単一のサイトカインを標的とすることによって喘息を処置するというコンセプト、例えば、抗ＩＬ−４；抗ＩＬ−５；抗ＴＮＦ−αは、限定的な成功を収めた。実際に、現在の中心的な療法であるステロイド療法は、広範な炎症誘発性経路を抑制することによって作用すると考えられている（Ｈａｎｓｂｒｏ  ｅｔ  ａｌ、２０１１）。
【０００６】
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）
ＣＯＰＤは、２０２０年までに全世界で第４位の主な死亡原因になると予測されている、大きな公共の健康問題である。有毒な粒子およびガスの持続的な吸入が主要な危険因子であり、喫煙はこの種のリスクの最も良い例であるものの、喫煙者のわずか１５％が、ＣＯＰＤを発症する（Ｆｌｅｔｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｐｅｔｏ，１９７７）。喫煙者は、機能不全の免疫系を有する（Ｂｏｕｌｏｕｋａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）ものの、ＣＯＰＤの発症および疾患重症度の増加は徐々に炎症細胞負荷を悪化させる（Ｈｏｇｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。
【０００７】
マイクロバイオーム
幼児の微生物叢は、最初は様々な身体部位全体で均一であり、その後の数日および数週間で部位特異的共同体へと変わる。健常な成人の肺マイクロバイオームは、バクテロイデス、ファーミキューテスおよびプロテオバクテリア門が優位を占め、主たる微生物叢は、シュードモナス、レンサ球菌、プレボテラ、フゾバクテリウム、ベーヨネラ、ヘモフィルス、ナイセリアおよびポルフィロモナスから構成される（Ｃｈａｒｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１１）。喘息患者の間で、対照と比較してプロテオバクテリア（特にヘモフィルス、モラクセラおよびナイセリア）およびファーミキューテス（特にラクトバチルス種）の頻度の増加およびバクテロイデス門（特にプレボテラ）の頻度の減少が観察された（Ｈｉｌｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。同様に疫学的データは、消化管微生物叢が喘息の乳児と非喘息の乳児の間で異なることを示す（Ｐｅｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。
【０００８】
ディフェンシン
ディフェンシンは、健常なマイクロバイオームを維持し潜在的な病原体の発生を防ぐように働く有力な自然宿主防御の１つを代表する（Ｗｅｈｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ，２００２およびＳａｌｚｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，２００７）。ディフェンシンは、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、真菌および古細菌に対する抗微生物活性ならびに抗炎症活性を有するペプチドである。ディフェンシン、特にｈＢＤ２は、炎症性腸疾患の処置における治療可能性を示した（ＷＯ２０１０／００７１６６；ＷＯ２０１３／００７５９６）。
【０００９】
結論として、肺の炎症性疾患に罹患している対象の新規な処置法が必要である。自ら薬剤を投与、例えば吸引できる患者のための気道を通して投与できる処置薬が特に必要であり、かつ効率的に薬剤を吸入できない患者に対する他の投与経路による処置法が必要である。
【発明の概要】
【００１０】
本発明者らは驚くべきことに、哺乳動物ディフェンシンが、気道過敏性（ＡＨＲ）を低下させ気道コンプライアンス（Ｃｄｙｎ）を増加させる能力；肺炎症を減少させる能力；気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）中の好中球数、好酸球数およびマクロファージ数を低下させるならびに肺細胞中のＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３を減少させる能力を有することを実証した。本発明者らは、喘息モデルでの組織炎症パラメータを減少させる効能、例えば血管周囲炎症および気管支周囲炎症を減少させる効能も実証した。
【００１１】
データは、哺乳動物ディフェンシンの投与が喘息、ＣＯＰＤおよびサルコイドーシスの主要な特徴の正常化または減少をもたらし、したがって喘息、軽度間欠型喘息、軽度持続型喘息、中等度持続型喘息、重度持続型喘息、好酸球性喘息、好中球性喘息、ステロイド治療抵抗性喘息、喘息持続状態、肺炎、気管支拡張症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）およびサルコイドーシスを含む肺の炎症性疾患の処置または防止において有用であることを示す。
【００１２】
驚くべきことに、ディフェンシンの経口投与および鼻腔内投与が、試験された少なくとも一部のパラメータについて同程度に有効であることが、ハウスダストダニアレルギーのマウスモデルにおいて実証された。これは、薬剤を吸入するのが困難な対象への経口投与による炎症性肺疾患の処置への可能性を開く。実施例において実証されるように、マウスを卵白アルブミン（ＯＶＡ）に感作しＣ．ムリダルムに感染させる喘息のステロイド非感受性マウスモデルにおいて、およびマウスをハウスダストダニ（ＨＤＭ）＋フロイントアジュバントで免疫しＨＤＭを負荷するステロイド感受性マウスモデルにおいて、ヒトβ−ディフェンシン２（ｈＢＤ２）の投与は、ＡＨＲを低下させること、Ｃｄｙｎを増加させること、肺の組織炎症を減少させること、ＢＡＬＦ中の炎症性細胞数を減少させること、および炎症性サイトカイン産生を減少させることが可能である。ｈＢＤ２による処置なしでは、動物は、ＡＨＲの劇的な増加、Ｃｄｙｎの減少、肺組織の炎症性組織変化、白血球数、特に好中球、好酸球およびマクロファージの増加および炎症性サイトカイン濃度の増加を特徴とする喘息を発症する。
【００１３】
これらの知見から、本発明者らは肺の炎症の処置におけるディフェンシンの広く一般的な使用も検討する。肺の炎症を引き起こし得る条件の例は、肺癌、サルコイドーシスおよび抗微生物処置、化学療法、免疫療法、免疫抑制療法、および放射線療法を含むがこれらに限定されない宿主防御に影響を及ぼす種々のタイプの医学的処置を含む。
【００１４】
本発明者らは、ディフェンシンがサイトカインレベルを完全に正常化することによって免疫系のバランスを回復させ、これにより、例えば所与のサイトカインをノックアウトするインターロイキン抗体または、自然免疫系の全身的抑制をもたらす全身的免疫抑制による現在の喘息処置とは反対にサイトカインストームを防止することを実験的に示した。したがって、ディフェンシンは、現在の処置法の有望な代替法となる。
【００１５】
更に本発明者らは、ディフェンシンが、肺に直接的に投与された場合だけでなく、更に重要なことに、そして驚くべきことに、消化管に単に経口投与された場合でも、肺においてその効果を発揮できることを実証した。
【００１６】
喘息発作の処置でのならびに維持療法のための経口投与は、世界中の喘息患者の生活を楽にするであろう。
【００１７】
したがって、一態様では、免疫系のバランス回復、サイトカイン産生の正常化およびサイトカインストームの防止を含む呼吸器系の炎症性疾患を処置および／または予防する方法であって、少なくとも１種類のディフェンシンの経口投与または肺内投与を含み、好ましくは対象が喘息に罹患している、方法が提供される。
【００１８】
他の態様では、軽度間欠型喘息、軽度持続型喘息、中等度持続型喘息、重度持続型喘息、好酸球性喘息、好中球性喘息、ステロイド治療抵抗性喘息、喘息持続状態、気管支拡張症、気管支炎、ＣＯＰＤ、サルコイドーシス、肺炎および気腫、肺線維症からなる群から選択される疾患、好ましくはステロイド治療抵抗性喘息を処置および／または防止する方法であって、少なくとも１種類のディフェンシンの投与を含む、方法が提供される。
【００１９】
対象において肺癌を処置および／または防止する方法であって、当該対象への少なくとも１種類のディフェンシンの投与を含む、方法および、その必要がある対象において肺の組織炎症、血管周囲および気管支血管の炎症、気管支肺胞洗浄液中の炎症性細胞数および／または肺組織ホモジェネート中の炎症性サイトカイン産生を低減する方法であって、当該対象への少なくとも１種類のディフェンシンの投与を含む、方法が更に提供される。
【００２０】
更に他の態様では、その必要がある対象において、肺の組織炎症、気管支肺胞洗浄液中の炎症性細胞数を低減する方法、肺組織ホモジェネート中の炎症性サイトカイン産生の正常化によって免疫系のバランスを回復させる方法およびサイトカインストームを防止／処置する方法であって、当該対象への少なくとも１種類のディフェンシンの投与を含む、方法が提供される。
【００２１】
別の態様では、その必要がある対象において、肺コンプライアンスを増加させる方法、気道過敏性を低下させる方法および／またはピークフローを増加させる方法であって、当該対象への少なくとも１種類のディフェンシンの投与を含む、方法が提供される。
【００２２】
その必要がある対象において、１秒間努力呼気肺活量（ＦＥＶ１）および／または最大呼気速度（ＰＥＦＲ）を増加させる方法またはＰＥＦＲ変動を減少させる方法であって、当該対象への少なくとも１種類のディフェンシンの投与を含む、方法。
【００２３】
少なくとも１種類のディフェンシンを対象に投与することによって、その必要がある対象において遺伝子の豊富さ、門の数を増加させることができ、酪酸塩および／またはトリプトファンの産生を増加させることができ、肺微生物叢からの酢酸塩の産生を減少させることができる。
【００２４】
更に、その必要がある対象において、肺の正常微生物叢を維持および／または安定化する方法、重要な共生細菌の出現度および存在量ならびに短鎖脂肪酸および／または酪酸塩および／またはトリプトファン産生株を増加させる方法であって、当該対象への少なくとも１種類のディフェンシンの投与を含む、方法が提供される。
【００２５】
他の態様では、本開示は、本明細書に記載の任意の方法による処置法で使用するためのディフェンシンポリペプチドおよび本明細書で定義される障害の処置のための薬剤の調製のためのディフェンシンポリペプチドの使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】マウスを卵白アルブミンで感作しＣ．ムリダルムに感染させる、喘息のマウスステロイド非感受性モデル（Ｅｓｓｉｌｆｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）における哺乳動物α−ディフェンシンおよび／またはβ−ディフェンシンの効果を検討するための実験設定の概要である。
【図２】マウスをハウスダストダニ（ＨＤＭ）＋フロイントアジュバントで免疫しＨＤＭを負荷する、喘息のマウスステロイド感受性モデルにおける哺乳動物β−ディフェンシンの効果を検討するための実験設定の概要である。
【図３ａ】ヒトβ−ディフェンシン１〜４のＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ（２．１）多重配列アラインメントである。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメントにおいて、＊は単一の完全に保存された残基を有する位置を示し、：は以下の「強い」グループの１つが完全に保存されることを示し：Ｓ，Ｔ，Ａ；Ｎ，Ｅ，Ｑ，Ｋ；Ｎ，Ｈ，Ｑ，Ｋ；Ｎ，Ｄ，Ｅ，Ｑ；Ｑ，Ｈ，Ｒ，Ｋ；Ｍ，Ｉ，Ｌ，Ｖ；Ｍ，Ｉ，Ｌ，Ｆ；Ｈ，Ｙ；Ｆ，Ｙ，Ｗ、．は以下の「より弱い」グループの１つが完全に保存されることを示す：Ｃ，Ｓ，Ａ；Ａ，Ｔ，Ｖ；Ｓ，Ａ，Ｇ；Ｓ，Ｔ，Ｎ，Ｋ；Ｓ，Ｔ，Ｐ，Ａ；Ｓ，Ｇ，Ｎ，Ｄ；Ｓ，Ｎ，Ｄ，Ｅ，Ｑ，Ｋ；Ｎ，Ｄ，Ｅ，Ｑ，Ｈ，Ｋ；Ｎ，Ｅ，Ｑ，Ｈ，Ｒ，Ｋ；Ｖ，Ｌ，Ｉ，Ｍ；Ｈ，Ｆ，Ｙ。
【図３ｂ】ＨＤ５およびＨＤ６のＣｌｕｓｔａｌアラインメントである。
【図４】卵白アルブミン／Ｃ．ムリダルムマウスステロイド非感受性喘息モデルにおける、ｈＢＤ２の鼻腔内投与後の気道過敏性である。Ｙ軸は、Ｒｎ―気道に固有の抵抗単位（４５０呼吸／分の呼吸数での８ｍＬ／ｋｇの一回換気量）を示す。＊＊＊＊は、マン・ホイットニー検定を使用してｐ＜０．０５のｐ値を有する統計学的有意差を示す。
【図５ａ−５ｂ】ハウスダストダニマウスステロイド感受性喘息モデルにおけるｈＢＤ２のそれぞれ鼻腔内投与（図５ａ）および経口投与（図５ｂ）後の気道過敏性である。生理食塩水は、負荷されない対照である。ＨＤＭ／媒体は、媒体で処置されたハウスダストダニが負荷され対照である。「ｈＢＤ２  ＩＮ  １．２ｍｐｋ」は、１．２ｍｇ／ｋｇで鼻腔内に投与されたｈＢＤ２である。５ｍｐｋは、５ｍｇ／ｋｇである。図５ａの記号：●−媒体  ＩＮ；■−ｈＢＤ２  ＩＮ  １．２ｍｐｋ；▲−生理食塩水；◆−ｈＢＤ２  ＩＮ  ５ｍｐｋ。図５ｂの記号：●−ＨＤＭ／媒体  ＩＮ；■−生理食塩水；▲−ＨＤＭ／デキサメタゾン；◆−ＨＤＭ／ｈＢＤ２  １．２ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ．
【図６ａ−６ｂ】ハウスダストダニマウスステロイド感受性喘息モデルにおけるｈＢＤ２のそれぞれ鼻腔内投与（図６ａ）および経口投与（図６ｂ）後の肺コンプライアンスである。図６ａの記号：●−媒体  ＩＮ；■−ｈＢＤ２  ＩＮ  １．２ｍｐｋ；▲−生理食塩水；◆−ｈＢＤ２  ＩＮ  ５ｍｐｋ。図６ｂの記号：●−ＨＤＭ／媒体  ＩＮ；■−生理食塩水；▲−ＨＤＭ／デキサメタゾン；◆−ＨＤＭ／ｈＢＤ２  １．２ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ．
【図７】卵白アルブミン／Ｃ．ムリダルムマウスステロイド非感受性喘息モデルにおけるｈＢＤ２の鼻腔内投与後のＢＡＬＦ中の総細胞数および細胞分画数である。図の記号：Ａ：ＳＰＧ／ＳａｌＢ：ＳＰＧ／ＯｖａＣ：ＳＰＧ／Ｏｖａ／ＤｅｘＤ：Ｃｍｕ／ＳａｌＥ：Ｃｍｕ／ＯｖａＦ：Ｃｍｕ／Ｏｖａ／ＤｅｘＧ：Ｃｍｕ／Ｏｖａ／ｈＢＤ２Ｈ：Ｃｍｕ／Ｏｖａ／ｈＢＤ２／Ｄｅｘ
【表１】
2020512287.tif 000002
【図８ａ−８ｂ】ハウスダストダニマウスステロイド感受性喘息モデルにおけるｈＢＤ２のそれぞれ鼻腔内投与および経口投与後のＢＡＬＦ中の総細胞数および差異的細胞数である。図８ａは、ｈＢＤ２を経口処置した動物を示す。図８ｂは、ｈＢＤ２を鼻腔内投与した動物からの結果を示す。結果を平均値±ＳＥＭとして示す。＊：ｐ＜０．０５（媒体群に対する有意差、対応のない検定（ｕｎｐａｉｒｅｄ  ｔｅｓｔ））。図の記号：生理食塩水  ＩＮは、負荷されない未処置の対照である。ＨＤＭ／媒体は、未処置であるがＨＤＭを負荷された動物を示す。ＨＤＭは、ハウスダストダニを負荷された動物である。ＰＯは経口投与であり、ＩＮは鼻腔内投与である。＊が付されたカラムは、媒体処置対照と統計的に有意に異なる。
【図９−１８】ハウスダストダニマウスステロイド感受性喘息モデルにおけるｈＢＤ２のそれぞれ鼻腔内投与および経口投与後のＩＦＮ−γ（図９）、ＴＮＦ−α（図１０）、ＩＬ−１β（図１１）、ＩＬ−４（図１２）、ＩＬ−５（図１３）、ＩＬ−６（図１４）、ＩＬ−８（図１５）、ＩＬ−９（図１６）、ＩＬ−１０（図１７）およびＩＬ−１３（図１８）のサイトカイン濃度を示す図である。各々の図は、左に鼻腔内群および右に経口群からのデータを有する。結果を平均値±ＳＥＭとしてｐｇ／ｍＬで示す。＊：ｐ＜０．０５（媒体群に対する有意差、マン・ホイットニー検定）。
【図１９】ハウスダストダニマウスステロイド感受性喘息モデルにおけるｈＢＤ２のそれぞれ鼻腔内投与および経口投与後のＨ＆Ｅ／ＰＡＳ標本による肺組織像である。左上パネル：未処置かつ負荷されない対照；右上パネル：未処置かつＨＤＭ負荷された対照；左下パネル：ＨＤＭ負荷され、ｈＢＤ２で経口処置；右下パネル：ＨＤＭ負荷され、ｈＢＤ２で鼻腔内処置。５０倍拡大図。
【図２０】ハウスダストダニマウスステロイド感受性喘息モデルにおけるｈＢＤ２のそれぞれ鼻腔内投与および経口投与後の肺の炎症の重症度である。＊：ｐ＜０．０５（媒体群に対する有意差、マン・ホイットニー検定）；＃：ｐ＜０．０５（媒体群に対する有意差、ウィルコクソンの符号順位検定）。
【図２１】ハウスダストダニマウスステロイド感受性喘息モデルにおけるｈＢＤ２のそれぞれ鼻腔内投与および経口投与後の血管周囲および気管支周囲の炎症である。◆：好酸球；□：単球。＊：ｐ＜０．０５（好酸球の血管周囲浸潤について媒体群に対する有意差、マン・ホイットニー検定）；＃：ｐ＜０．０５（好酸球および単球の血管周囲／気管支周囲の浸潤について媒体群に対する有意差、ウィルコクソンの符号順位検定）。
【図２２】雌性ＮＭＲＩマウスへの４ｍｇ／ｋｇ  ｈＢＤ２の経口投与後の薬理動態データである。Ｙ軸は、ｈＢＤ２をμｇ／ｇ組織で示す。結果を、群平均値±ＳＥＭとして示す。
【図２３】１ｍｇ／ｋｇのそれぞれ皮下投与および静脈内投与後のｈＢＤ２の薬理動態データである。Ｙ軸は、ｈＢＤ２をμｇ／ｍＬで示す。異なる曲線は、異なる実験および検査法（ＨＰＬＣおよびＥＬＩＳＡ）を表す。
【図２４】１６．５ｍｇ／ｋｇのそれぞれ皮下投与および静脈内投与後の「ｈＢＤ２−アルブミンＮ末端融合物」の薬理動態データである。Ｙ軸は、融合タンパク質の濃度をμｇ／ｍＬで示す。結果は４匹のマウスの平均／サンプリング時間±ＳＤである。
【図２５】１６．５ｍｇ／ｋｇのそれぞれ皮下投与および静脈内投与後の「ｈＢＤ２−アルブミンＣ末端融合物」の薬理動態データである。Ｙ軸は、融合タンパク質の濃度をμｇ／ｍＬで示す。結果は４匹のマウスの平均／サンプリング時間±ＳＤである。
【図２６】「ｈＢＤ２−アルブミンＣ末端融合物」の静脈内投与による実験の間の疾患活動性インデックススコアの経過である。結果を、群あたり９〜１０匹の動物の平均値±平均値の標準誤差として示す。所与の日付での対照（媒体）群の値からの有意差を＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１；＊＊＊：Ｐ＜０．００１として示す（ノンパラメトリックなデータのクラスカル・ワリスの検定）。Ａｌｂｕｃｕｌｔ（登録商標）は、ＮｏｖｏＺｙｍｅｓ  Ａ／Ｓから入手可能な組換えアルブミンである。グラフに化合物の記載がない場合は、化合物はｈＢＤ２−アルブミンＣ末端融合物である。
【図２７】「ｈＢＤ２−アルブミンＣ末端融合物」の近位大腸の組織学スコアである。近位大腸試料の組織学スコア。結果を群あたりｎ＝９〜１０動物の平均値±平均値の標準誤差として示す。所与の日付での対照（媒体）群の値からの有意差を＊＊＊：Ｐ＜０，００１；＊：Ｐ＜０，０５（ノンパラメトリックなデータのクラスカル・ワリスの検定＋Ｄｕｎｎの事後検定）として示す。Ａｌｂｕｃｕｌｔ（登録商標）は、ＮｏｖｏＺｙｍｅｓ  Ａ／Ｓから入手可能な組換えアルブミンである。グラフに化合物の記載がない場合は、化合物はｈＢＤ２−アルブミンＣ末端融合物である。
【図２８】マウスをハウスダストダニ（ＨＤＭ）＋フロイントアジュバントで免疫しＨＤＭ負荷する、マウスステロイド感受性モデルにおいて喘息の予防のための哺乳動物ディフェンシンの効果を検討するための実験設定の概要である。
【図２９】ハウスダストダニマウスステロイド感受性喘息モデルにおけるｈＢＤ２のそれぞれ予防的な鼻腔内投与および経口投与後の気道過敏応答性である。
【図３０】ハウスダストダニマウスステロイド感受性喘息モデルにおけるｈＢＤ２のそれぞれ予防的な鼻腔内投与および経口投与後の肺コンプライアンスである。
【図３１】ハウスダストダニマウスステロイド感受性喘息モデルにおけるｈＢＤ２の予防的経口投与後のＢＡＬＦ中の好中球数である。＊：ｐ＜０．０５（媒体群に対する有意差、マン・ホイットニー検定）。
【図３２−３７】ハウスダストダニマウスステロイド感受性喘息モデルにおけるｈＢＤ２の予防的経口投与後の肺ホモジェネート中のＴＮＦ−α（図３２）、ＩＬ−４（図３３）、ＩＬ−５（図３４）、ＩＬ−６（図３５）、ＩＬ−９（図３６）およびＩＬ−１３（図３７）のサイトカイン濃度（ｐｇ／ｍＬ）である。結果を平均値±ＳＥＭとして示す。＊：ｐ＜０．０５（媒体群に対する有意差、マン・ホイットニー検定）。
【図３８−３９】高脂肪食マウスモデルにおける微生物叢の組成に対する哺乳動物ディフェンシン（ＨＤ５、ｈＢＤ２およびＨＤ５＋ｈＢＤ２）の効果を検討するための実験設定の概要である。
【図４０】高脂肪食マウスモデルにおけるＨＤ５、ｈＢＤ２およびＨＤ５＋ｈＢＤ２の経口投与による予防処置後の微生物存在量の属解析である。
【図４１】高脂肪食マウスモデルにおけるＨＤ５およびｈＢＤ２の経口投与による予防処置後の小腸でのアロバキュラムの存在量である。
【図４２】高脂肪マウスモデルにおけるｈＢＤ２の経口投与による予防処置後の大腸での乳酸菌科の存在量を示す図である。
【図４３】高脂肪食マウスモデルにおけるｈＢＤ２の経口投与による予防処置の４週間後（左パネル）および１０週間後（右パネル）後の大腸でのバルネシエラの相対的存在量を示す図である。
【図４４】高脂肪食マウスモデルにおけるＨＤ５およびｈＢＤ２の経口投与による治療介入後の大腸でのアロプレボテラの相対的存在量を示す図である。
【図４５】高脂肪食マウスモデルにおけるＨＤ５またはｈＢＤ２の経口投与による治療介入後の小腸（左パネル）および大腸（右パネル）でのビフィドバクテリア科の相対的存在量を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
定義
ディフェンシン：本明細書で使用する場合、用語「ディフェンシン」は、抗微生物ペプチドのディフェンシン類に属するポリペプチドを指す。ディフェンシンは、健常なマイクロバイオームを維持し潜在的な病原体の発生を防ぐように働く有力な自然宿主防御の１つを代表する（Ｗｅｈｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ，２００２およびＳａｌｚｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，２００７）。ディフェンシンは、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、真菌および古細菌に対する抗微生物活性ならびに抗炎症活性を有するペプチドである。
【００２８】
ヒトディフェンシンは、それらの３つの分子内システインジスルフィド結合のトポロジーに基づいて、α−ディフェンシンおよびβ−ディフェンシンへと分類される、小さいカチオン性ペプチドである。α−ディフェンシンは、好中性顆粒において発現されるもの（ＨＮＰ１−４）、および小腸陰窩のパネート細胞によって発現されるもの（ＨＤ５およびＨＤ６またはＤＥＦＡ５およびＤＥＦＡ６）へと更に細かく分類され得る。β−ディフェンシン（ＤＥＦＢｎ）は皮膚、眼、中耳、口、気管、肺、消化管、泌尿生殖器系、腎臓、膣、肝臓、膵臓および乳腺を含む様々な組織および器官における上皮細胞によって主に産生される。ディフェンシンの例は、全てα−ディフェンシン類に属する、ヒト腸α−ディフェンシン５（ＨＤ５；配列番号５）、ヒト腸α−ディフェンシン６（ＨＤ６；配列番号６）、ヒト好中球ペプチド１（ＨＮＰ−１）、ヒト好中球ペプチド２（ＨＮＰ−２）、ヒト好中球ペプチド３（ＨＮＰ−３）；またヒトβ−ディフェンシン１（ｈＢＤ１；配列番号１）；ヒトβ−ディフェンシン２（ｈＢＤ２；配列番号２）；ヒトβ−ディフェンシン３（ｈＢＤ３；配列番号３）；ヒトβ−ディフェンシン４（ｈＢＤ４；配列番号４）；および切断型ヒトβ−ディフェンシン２（配列番号７）を含む。
【００２９】
ＷＯ２０１３／０２６７９４は、切断型ｈＢＤ２および非切断型ｈＢＤ２が同様の生物活性を有することを実証する。
【００３０】
ディフェンシンは前駆体として発現され、細胞外空間へ分泌される前にシグナルペプチドの切断によって、および場合によりプロペプチドの切断によってもプロセシングされる。最も特徴付けされているヒトβ−ディフェンシンファミリーのメンバーはｈＢＤ１〜４である。一部のヒトディフェンシン（例えばｈＢＤ１）は構成的に産生されるが、他（例えばｈＢＤ２、ｈＢＤ３およびｈＢＤ４）は炎症性サイトカインまたは外来性微生物産物によって誘導される。前述の特定配列は、予測される成熟生物活性ディフェンシンを示す。プロセシングは細胞間で異なる場合があること、および得られる分泌型成熟ペプチドは予測配列と１個または２個のＣまたはＮ末端アミノ酸が異なり得るが依然として生物活性を保持することが、当業者によって理解されるであろう。
【００３１】
同一性：２つのアミノ酸配列間または２つのヌクレオチド配列間の関連性は、パラメータ「同一性」によって説明される。２つのアミノ酸配列間の同一性の程度は、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルプログラム（Ｒｉｃｅら，２０００，ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｏｒｇ）、好ましくはバージョン３．０．０以降、に実装されるようなニードルマン−ウンシュアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）を用いて決定される。使用される任意のパラメータは、１０のギャップ・オープン・ペナルティ（ｇａｐ  ｏｐｅｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）、０．５のギャップ・エクステンション・ペナルティ（ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）、およびＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換行列である。ニードル標識された「最長同一性」（−ｎｏｂｒｅｉｆオプションを用いて得られる）のアウトプットをパーセント同一性として使用し、（同一残基×１００）／（アラインメント長−アラインメントにおけるギャップの全数）として計算する。
【００３２】
正常微生物叢：本明細書で使用する場合、用語「正常微生物叢」は、共生バランス失調でない微生物叢を示す。正常微生物叢は、遺伝子の大きな豊富さを有することによって特徴付けられる。正常腸微生物叢は、バクテロイデス、フィーカリバクテリウム、ロゼブリア、ブラウティア、ルミノコッカス、コプロコッカス、ビフィドバクテリウム、メタノブレビバクター、ラクトバチルス、コプロコッカス、クロストリジウム、アッカーマンシア、ユーバクテリウム属に属する細菌を含むことによって特徴付けられる。
【００３３】
正常肺微生物叢は、バクテロイデス、ファーミキューテスおよびプロテオバクテリア属に属する細菌を含むことによって特徴付けられ、主たる微生物叢は、シュードモナス、レンサ球菌、プレボテラ、フゾバクテリウム、ベーヨネラ、ヘモフィルス、ナイセリアおよびポルフィロモナスから構成される。
【００３４】
処置：本明細書で使用する場合、用語「処置」および「処置する」は、症状、疾患または障害に対抗するための患者の管理および看護を指す。本用語は患者が患う所与の症状に対する処置の全範囲を含むと意図され、症状または合併症を軽減または緩和する；症状、疾患または障害の進行を遅らす；症状、疾患または障害を治療または消失させる；および／または症状、疾患または障害を予防するための活性化合物の投与などであり、ここで「予防する」または「予防」は、活性化合物を妨げ、低下させて症状または合併症の発症のリスクを防止または低下するための患者の管理および看護を指すと理解されるべきである。治療されるべき患者は、好ましくは哺乳動物、特にヒトである。治療されるべき患者は様々な年齢であり得る。
【００３５】
患者：患者は、肺の炎症性障害などの特定の障害と診断されたか、または肺の炎症性障害などの障害を示す特定の症状を有する対象である。
【００３６】
哺乳動物α−ディフェンシンおよび哺乳動物β−ディフェンシン
本開示は、特に喘息、軽度間欠型喘息、軽度持続型喘息、中等度持続型喘息、重度持続型喘息、好酸球性喘息、好中球性喘息、ステロイド治療抵抗性喘息、喘息持続状態、気管支拡張症およびＣＯＰＤの処置における哺乳動物α−ディフェンシンおよび／またはβ−ディフェンシン、例えばヒトβディフェンシン、より好ましくはヒト科ディフェンシンの使用に関する。
【００３７】
一実施形態において、哺乳動物α−ディフェンシンおよび／またはβ−ディフェンシンは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７のアミノ酸配列のいずれかと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性の程度を有する。他の実施形態では、ディフェンシンは、配列番号１〜７のうちの１つと１０個未満、例えば８個未満、例えば５個未満、例えば４個未満、例えば３個未満、例えば２個未満のアミノ酸が異なる。
【００３８】
好ましい態様において、ヒトα−ディフェンシンは、α−ディフェンシン５（配列番号５）および／またはα−ディフェンシン６（配列番号６）からなる。好ましい実施形態では、哺乳動物β−ディフェンシンは、ヒトβ−ディフェンシン１（配列番号１）、ヒトβ−ディフェンシン２（配列番号２）、ヒトβ−ディフェンシン３（配列番号３）、ヒトβ−ディフェンシン４（配列番号４）または切断型ヒトβ−ディフェンシン２（配列番号７）からなる。
【００３９】
好ましい実施形態では、ヒトα−ディフェンシンは、配列番号５のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性の程度を有する。好ましい実施形態では、ヒト哺乳動物α−ディフェンシンは、αディフェンシン５（配列番号５）からなる。好ましい実施形態では、ヒトβ−ディフェンシンは、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性の程度を有する。好ましい実施形態では、ヒトβ−ディフェンシンは、ヒトβ−ディフェンシン２（配列番号２）または切り詰め型ヒトβ−ディフェンシン２（配列番号７）からなる。
【００４０】
更に別の実施形態では、哺乳動物α−ディフェンシンは、ヒトα−ディフェンシンおよび／またはマウスα−ディフェンシン、ならびにそれらの機能的に同等な変異体からなる。好ましくは、哺乳動物α−ディフェンシンは、ヒトα−ディフェンシン５、ヒトα−ディフェンシン６およびそれらの機能的に同等な変異体からなる。より好ましくは、哺乳動物α−ディフェンシンはヒトα−ディフェンシン５、およびその機能的に同等な変異体またはオーソログからなる。
【００４１】
より更なる実施形態では、哺乳動物のβ−ディフェンシンはヒトβ−ディフェンシンおよび／またはマウスβ−ディフェンシン、ならびにそれらの機能的に同等な変異体からなる。好ましくは、哺乳動物β−ディフェンシンは、ヒトβ−ディフェンシン１、ヒトβ−ディフェンシン２、ヒトβ−ディフェンシン３、ヒトβ−ディフェンシン４およびそれらの機能的に同等な変異体からなる。より好ましくは、哺乳動物β−ディフェンシンは、ヒトβ−ディフェンシン２およびそれらの機能的に同等な変異体またはオーソログからなる。
【００４２】
一実施形態では、本方法はそのような処置を必要とする対象への、少なくとも１種類の哺乳動物α−ディフェンシンの有効量を投与することを含む。
【００４３】
哺乳動物（例えばヒト）α−ディフェンシンまたはβ−ディフェンシンの「機能的に同等な変異体」は、元の哺乳動物（例えばヒト）α−ディフェンシンおよび／またはβ−ディフェンシンと肺または腸における微生物叢に対するほとんど同じの効果を示す、改変された哺乳動物（例えばヒト）α−ディフェンシンまたはβ−ディフェンシンである。哺乳動物（例えばヒト）ディフェンシンの機能的に同等な変異体は、哺乳動物（例えばヒト）ディフェンシンアミノ酸配列（例えば配列番号１〜７のいずれか）と比較して１〜５個のアミノ酸改変、好ましくは１〜４個のアミノ酸改変、より好ましくは１〜３個のアミノ酸改変、最も好ましくは１〜２個のアミノ酸改変、特に１個のアミノ酸改変を含んでよい。好ましくは、哺乳動物β−ディフェンシンについて、配列番号２を有するヒトβ−ディフェンシン２または切り詰め型ヒトβ−ディフェンシン２（配列番号７）と比較し、α−ディフェンシンについて、ＨＤ５（配列番号５）と比較する。
【００４４】
本明細書において、用語「改変」は、哺乳動物（例えばヒト）ディフェンシンの任意の化学的改変を意味する。１つまたは２つ以上の改変は、１個または２個以上のアミノ酸の置換、欠失および／または挿入、ならびに１つまたは２つ以上のアミノ酸側鎖の交換；またはアミノ酸配列において類似の特性を有する非天然アミノ酸の使用であり得る。特に、１つまたは２つ以上の改変は、Ｃ末端のアミド化などのアミド化であり得る。好ましくは、アミノ酸の改変はマイナーなものであり、すなわち、ポリペプチドのフォールディングおよび／または活性に大きな影響を与えない保存的アミノ酸の置換または挿入；単一の欠失；小規模なアミノ末端またはカルボキシル末端の伸長；またはポリヒスチジンタグ、抗原性エピトープまたは結合ドメインなどの、正味電荷を変化させることもしくは別の機能によって精製を容易にするわずかな伸長である。１つの実施形態では、ポリヒスチジンタグ、抗原エピトープまたは結合ドメインなどのわずかな伸長は、最大で約２０〜２５個の残基の小リンカーペプチドによって哺乳動物（例えばヒト）α−ディフェンシンまたはβ−ディフェンシンに付着され、当該リンカーは制限酵素切断部位を含んでよい。
【００４５】
図３におけるＣｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメントを使用して、どのアミノ酸残基をタンパク質の生物活性に実質的に影響を及ぼすことなく置換できるかを予測できる。配列は、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ２．１（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏ，ｍｅ．ｊｐ／ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／）および以下の設定：Ｇａｐ  Ｏｐｅｎ  Ｐｅｎａｌｔｙ：１０、Ｇａｐ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ｐｅｎａｌｔｙ：０，０５、Ｗｅｉｇｈｔ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ：ＮＯ、タンパク質の親水性残基：ＧＰＳＮＤＱＥ、親水性ギャップ：あり、ウェイトマトリックス：ＢＬＯＳＵＭ（ＰＲＯＴＥＩＮ用）を使用してアラインメントした。以下のグループ（Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ，「強い」保存グループ）内の置換は保存的置換と考えられる：Ｓ，Ｔ，Ａ；Ｎ，Ｅ，Ｑ，Ｋ；Ｎ，Ｈ，Ｑ，Ｋ；Ｎ，Ｄ，Ｅ，Ｑ；Ｑ，Ｈ，Ｒ，Ｋ；Ｍ，Ｉ，Ｌ，Ｖ；Ｍ，Ｉ，Ｌ，Ｆ；Ｈ，Ｙ；Ｆ，Ｙ，Ｗ。以下のグループ（Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ，「弱い」保存グループ）内の置換は半保存的置換と考えられる：Ｃ，Ｓ，Ａ；Ａ，Ｔ，Ｖ；Ｓ，Ａ，Ｇ；Ｓ，Ｔ，Ｎ，Ｋ；Ｓ，Ｔ，Ｐ，Ａ；Ｓ，Ｇ，Ｎ，Ｄ；Ｓ，Ｎ，Ｄ，Ｅ，Ｑ，Ｋ；Ｎ，Ｄ，Ｅ，Ｑ，Ｈ，Ｋ；Ｎ，Ｅ，Ｑ，Ｈ，Ｒ，Ｋ；Ｖ，Ｌ，Ｉ，Ｍ；Ｈ，Ｆ，Ｙ。
【００４６】
保存的置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジンおよびヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸およびアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミンおよびアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシンおよびバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン）、および小さいアミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、トレオニンおよびメチオニン）のグループ内でなされる置換である。一般的に特定の活性を変化させないアミノ酸置換は、当該技術分野において公知であり、例えば、ＮｅｕｒａｔｈおよびＨｉｌｌ（１９７９）によって記載されている。最も一般的に生じる交換は、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、およびＡｓｐ／Ｇｌｙである。
【００４７】
２０個の標準的アミノ酸に加えて、非標準的アミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン、６−Ｎ−メチルリシン、２−アミノイソ酪酸、イソバリン、およびα−メチルセリン）を、野生型ポリペプチドのアミノ酸残基と置換してもよい。限定された数の非保存的アミノ酸、遺伝子コードをコードしないアミノ酸、および非天然アミノ酸を、アミノ酸残基と置換してもよい。「非天然アミノ酸」はタンパク質合成後に改変されており、かつ／またはそれらの側鎖で標準アミノ酸のものとは異なる化学的構造を有する。非天然アミノ酸は、化学合成され得、好ましくは市販されており、ピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、３−メチルプロリンおよび４−メチルプロリン、ならびに３，３−ジメチルプロリンを含む。
【００４８】
哺乳動物α−ディフェンシンおよび／またはβ−ディフェンシン中の必須アミノ酸は、部位特異的変異誘発またはアラニンスキャニング変異誘発などの、当該技術分野において公知の方法によって特定できる（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５）。後者の技術では、単一アラニン変異が分子中の全ての残基で導入され、得られる変異分子を生物活性（すなわち、気道過敏応答性に対する活性またはサイトカイン、例えば、ＴＮＦ−α活性の抑制）について試験して、分子の活性に重要であるアミノ酸残基を特定する。Ｈｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：４６９９−４７０８も参照のこと。必須アミノ酸の同一性はまた、哺乳動物α−ディフェンシンおよび／またはβ−ディフェンシンと関連するポリペプチドとの同一性の分析からも推測できる（図３におけるＣｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメントを参照）。
【００４９】
単一または複数のアミノ酸置換は、Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４１：５３−５７、Ｂｏｗｉｅ  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：２１５２−２１５６、ＷＯ９５／１７４１３、またはＷＯ９５／２２６２５によって開示されるものなどの変異誘発、組換えおよび／またはシャフリングの既知の方法、それに続く関連したスクリーニング法を使用して実施および試験できる。使用され得る他の方法は、エラープローンＰＣＲ、ファージディスプレイ（例えば、Ｌｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０：１０８３２−１０８３７；ＵＳ  ５，２２３，４０９；ＷＯ  ９２／０６２０４）、および領域特異的突然変異誘発（ｒｅｇｉｏｎ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｇｅｎｅ  ４６：１４５；Ｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，ＤＮＡ  ７：１２７）を含む。所与の置換の結果が確信をもって予測できない場合、誘導体を本明細書における前述の方法にしたがって容易に分析して、生物活性の有無を決定してもよい。
【００５０】
長時間作用性ディフェンシン
α−ディフェンシンまたはβ−ディフェンシンの半減期は、α−ディフェンシンまたはβ−ディフェンシンを別の部分または分子と融合または複合化させること、すなわち、薬理学的に許容される分子に連結された長期作用性の生物学的に活性なα−ディフェンシンまたはβ−ディフェンシンを構築することによって延長されてよく、これは、複合化α−ディフェンシンまたはβ−ディフェンシンと同様に投与される非複合化α−ディフェンシンまたはβ−ディフェンシンの生体内での血漿半減期と比べて大幅に増加された、α−ディフェンシンまたはβ−ディフェンシンの生体内での血漿内半減期を提供する。
【００５１】
長時間作用性生物活性α−ディフェンシンまたはβ−ディフェンシンは、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）、トランスフェリン、アルブミン（ＨＡＳ）、ＸＴＥＮ（登録商標）；またはＰＥＧ、ホモアミノ酸ポリマー（ＨＡＰ）、プロリン−アラニン−セリンポリマー（ＰＡＳ）、またはエラスチン様ペプチド（ＥＬＰ）、ヒアルロン酸、絨毛ゴナドトロピン（ＣＧ）β鎖のカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）などの負に荷電した高度にアシル化されたペプチド、ヒトＩｇＧ、およびＣＨ３（ＣＨ２）ｎＣＯ−（ここでｎは８〜２２である）への結合を有する分子から選択される薬理学的に許容される分子に連結された哺乳動物α−ディフェンシンもしくはその類似体または哺乳動物β−ディフェンシンもしくはその類似体を含む。
【００５２】
α−ディフェンシン類似体またはβ−ディフェンシン類似体は非哺乳動物起源のものであってもよく、有機小分子、ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質から選択されてもよい。
【００５３】
α−ディフェンシンまたはβ−ディフェンシン作用薬は、先行技術文献に記載されている様々な方法、限定せずに述べると、二官能性リンカーによる化学的結合、α−ディフェンシンまたはβ−ディフェンシンなどのディフェンシンのＮ末端またはＣ末端をアルブミンまたはアルブミン類似体などの薬理学的に許容される分子に結合することによる遺伝子技術的などで、薬理学的に許容される分子に連結されてよい。特に、ヒトアルブミンなどのアルブミンまたはアルブミン類似体のＮ末端は、α−ディフェンシンまたはβ−ディフェンシンのＣ末端、あるいはα−ディフェンシンまたはβ−ディフェンシンのＮ末端に結合されてよく；あるいはヒトアルブミンなどのアルブミンのＣ末端は、α−ディフェンシンまたはβ−ディフェンシンのＣ末端、あるいはα−ディフェンシンまたはβ−ディフェンシンのＮ末端に結合されてよい。リンカー配列を、アルブミンとα−ディフェンシン鎖またはβ−ディフェンシン鎖の間に挿入できる。
【００５４】
α−またはβ−ディフェンシン作用薬は、安定なリンカーまたはより不安定なリンカーを介して薬学的に許容される分子に連結されてよい。いくつかのリンカーは当技術分野において既知であり、二官能性ＰＥＧ分子（例えば、Ｐａｉｇｅ  ｅｔ．ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．１２，ｎｏ．１２，１９９５を参照のこと）、加水分解性リンカー（Ｓｈｅｃｈｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２００５，１６：９１３−９２０、およびＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１３，Ｎｏｓ．１−２，Ｊｕｎｅ  ２００７、ならびにＷ０２００９０９５４７９）、ＰＤＰＨおよびＥＭＣＨ（例えば、Ｗ０２０１００９２１３５を参照のこと）を含む。α−ディフェンシンまたはβ−ディフェンシン作用薬の薬理学的に許容される分子への化学的複合化（２つ以上の分子の連結）が機能的なα−ディフェンシンまたはβ−ディフェンシン活性を強く低下させる特定の場合では、機能的なα−またはβ−ディフェンシン作用薬を放出できる、より不安定なリンカーを使用することが好ましいかもしれない。
【００５５】
半減期延長はまた、リジンに対するγ−Ｌ−グルタミルスペーサーなどのスペーサーおよびＣ−１８脂肪二酸鎖によるペプチド骨格のアシル化によって達成されてもよい。脂肪二酸側鎖およびスペーサーは、アルブミンへの強固であるが可逆的な結合を仲介し、注射部位からの放出を遅らせ、腎クリアランスを低下させる。
【００５６】
方法および使用
ヒトβ−ディフェンシン２は、気道過敏性を低下させる；肺コンプライアンスを上昇させる；肺炎症を減少させる；ＢＡＬＦの好中球数、好酸球数およびマクロファージ数を低下させるならびに、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３濃度の正常化によって免疫系のバランスを回復させサイトカインストームを防止できることが見出され、これにより、肺の炎症性疾患、例えば喘息およびＣＯＰＤの予防または処置のための薬剤として強力な活性を示す。
【００５７】
驚くべきことに、ディフェンシンの非経口投与および経口投与が肺の炎症性疾患を処置するのに有効であることが見出された。このことは、本開示の実施例３で実証されるように、ｈＢＤ２が腸から吸収されないことが知られているために予想外である。この知見の利点は、肺活量が低下した患者がディフェンシン薬剤を経口摂取できるということである。人工呼吸器の患者および喘息持続状態の患者などの重症患者を少なくとも１種類のディフェンシンの非経口投与によって処置できることも予想される。
【００５８】
したがって、一態様では、本開示は、少なくとも１種類のディフェンシンの非経口投与または経口投与によって炎症性肺疾患を処置する方法に関する。好ましくは、投与は経口である。経口投与および非経口投与は、呼吸が損なわれた患者または人工呼吸療法を受けている患者に有益である。
【００５９】
別の態様では、このような処置を必要とする対象に哺乳動物ディフェンシンの有効量を投与することによって、軽度間欠型喘息、軽度持続型喘息、中等度持続型喘息、重度持続型喘息、好酸球性喘息、好中球性喘息、ステロイド治療抵抗性喘息、喘息持続状態、肺炎、気管支拡張症、ＣＯＰＤ、サルコイドーシス、肺線維症または肺癌を処置するための方法が提供される。これらの疾患は、肺内投与、経口投与または非経口投与によって処置できる。好ましくは、投与は、肺内または経口である。
【００６０】
提供される方法は、白血球の遊走、例えば、ＢＡＬＦ中の好中球、好酸球およびマクロファージを減少させることによって肺炎症を処置または防止できる。ｈＢＤ２の投与は、ＢＡＬＦ中の特に好中球およびマクロファージを減少させるのに効果的であることが証明された。
【００６１】
本方法は、例えば肺組織ホモジェネート中のＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３のサイトカイン産生を正常化することで免疫系のバランスを回復させ、したがって、本明細書に記載される通り、上述の疾患の１つに罹患している対象のサイトカインストームを防止または処置し得る。好ましくは、本処置方法は、サイトカイン産生の減少をもたらし、ここで当該サイトカインはＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０またはＩＬ−１３である。特に、本方法は、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９およびＩＬ−１３の量を低下させ得る。サイトカインの量は、肺生検またはＢＡＬＦ中で決定できる。
【００６２】
更に本方法は、本明細書に記載される通り、上述の疾患の１つに罹患している対象の気道過敏性を低下させ、肺コンプライアンスを上昇させ得る。
【００６３】
提供される方法は、転写レベルの変化による細菌の表現型ならびに肺細菌叢の構造および組成または肺のメタボロームを変化させることによって、本明細書に記載される通り上述の疾患の１つに罹患している対象の肺の炎症を防止または処置できる。
【００６４】
理論に拘束されるものではないが、経口投与を使用して観察される効果は、いわゆる腸−肺軸によって肺に影響を与え得る消化管微生物相および消化管のメタボロームにおける変化に起因し得る。
【００６５】
喘息、ＣＯＰＤおよび嚢胞性線維症などの慢性肺障害は全て、腸疾患症状の構成要素を示し、このことは、人体のこれらの２つの粘膜部位の間に重要なクロストークがあること、および種々の呼吸器疾患は、気道微生物叢だけでなく腸微生物叢の腸内菌共生バランス失調にも関連していることを示す（Ｍａｒｓｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ，２０１５）。帝王切開出産は、幼少期における腸微生物叢の多様性を低下させ組成を変化させると同時に、小児期の間の喘息体質に関連付けられている（Ｊａｋｏｂｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１４）。幼少期の環境微生物への曝露が喘息を予防する（Ｅｇｅ  ｅｔ  ａｌ，２０１１）が、幼少期ならびに出生前の抗生物質暴露がアレルギー性喘息のリスクを増加させる（Ｍａｒｒａ  ｅｔ  ａｌ  ２００９）ことが見出されている。小児期感染症と喘息およびアレルギーの発症の間の逆相関は長年認識されており、幼少期の感染暴露の減少が免疫寛容の異常および自己免疫症状の増加をもたらす（Ｗｉｌｌｓ−Ｋａｒｐ  ｅｔ  ａｌ，２００１）という「衛生仮説」を生み出した。
【００６６】
補足的な仮説は、西洋化した地域における抗生物質使用および不健康な食事（低繊維、高糖質）に起因する胃腸微生物叢の組成の変動が、粘膜免疫寛容の胃腸マイクロバイオーム媒介メカニズムを妨害するというものである。
【００６７】
共生微生物は、主に、宿主−微生物相互作用を媒介する低分子を産生することによって、自然および適応免疫応答を調整し、病原性刺激に対する活性化閾値に影響を与える（Ｄｏｎｉａ  ａｎｄ  Ｆｉｓｈｂａｃｋ，２０１５）。上皮性関門が微生物を主に消化管に限局するのを確実にする一方で、微生物代謝産物は上皮性関門を透過でき、それらが免疫細胞によって検出される宿主循環系に入り、蓄積するのを可能にする（Ｄｏｒｒｅｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１４）。Ｔｒｏｍｐｅｔｔｅら（２０１３）は、飼料中の発酵性繊維が、消化管微生物叢だけでなく肺微生物叢の組成、特にファーミキューテス対バクテロイデスの比を変化させ、後者は局所および全身の短鎖脂肪酸レベルの増加を引き起こし、次に樹状細胞の生成および機能に影響を与え、これにより、肺の免疫環境を形づくり、アレルギー性炎症の重症度に影響を与えることをマウスにおいて実証した。Ｓｃｈｉｒｍｅｒらは更に、サイトカイン応答の個人間変動が特定の微生物および微生物機能に関連付けられることをヒトゲノム機能解析プロジェクトにおいて実証した。検出された関連性の大多数は、サイトカイン特異的および刺激特異的の両方であり、免疫系が高い特異性で微生物および産物を認識し相互作用すること、およびこれらの微生物因子が特定の免疫表現型に関連することを示唆した。ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ産生能力は、マイクロバイオームによってより強く影響を受けるように思われる一方で、ＩＬ−１β、ＩＬ−６ならびにＴｈ１７由来のＩＬ−１７およびＩＬ−２２などの他のサイトカインは、消化管微生物叢とのより少ないがより特異的な関連性を示した。
【００６８】
更なる態様は、そのような処置を必要とする対象にα−ディフェンシンおよび／またはβ−ディフェンシンの有効量を経口的に投与することおよび／またはβ−ディフェンシンの有効量を投与することによって、軽度間欠型喘息、軽度持続型喘息、中等度持続型喘息、重度持続型喘息、好酸球性喘息、好中球性喘息、ステロイド治療抵抗性喘息、喘息持続状態、肺炎、気管支拡張症、ＣＯＰＤまたは肺癌を予防または処置する方法を提供する。好ましい実施形態では、喘息は、ステロイド治療抵抗性喘息である。一実施形態では、投与は、経口、口腔内、舌下、直腸、腟内、気管内、肺内、鼻腔内、頭蓋内、皮下、静脈内、皮膚または経皮である。好ましくは、投与は、経口または肺内である。経口投与は、呼吸が損なわれた患者または人工呼吸療法を受けている患者に有益であり得る。
【００６９】
α−ディフェンシンおよび／またはβ−ディフェンシンの有効量を、そのような処置を必要とする対象に非経口的に、例えば、皮下または静脈内に投与することによる喘息、軽度間欠型喘息、軽度持続型喘息、中等度持続型喘息、重度持続型喘息、好酸球性喘息、好中球性喘息、ステロイド治療抵抗性喘息、喘息持続状態、気管支拡張症およびＣＯＰＤの処置のための方法が、更に提供される。
【００７０】
本明細書に記載の処置の方法は、少なくとも１種類の哺乳動物α−ディフェンシンおよび／またはβ−ディフェンシンを含む組成物を糖質コルチコイド、β作動薬、ロイコトリエン受容体アンタゴニスト、テオフィリン、抗生物質、リファキシミン、化学療法もしくは免疫療法、免疫抑制薬、プレバイオティクス、プロバイオティクス、トリプトファン、短鎖脂肪酸、ＨＮＰ−１、ＨＮＰ−２、ＨＮＰ−３、ＨＮＰ−４、カテリシジン、ラクトフェリン、ラクトフェリシン、リゾチーム、糞便移植またはこれらの組合せのいずれかと組み合わせて投与することによって施すことができる。本明細書に記載のディフェンシンを使用して抗生物質、化学療法、放射線療法、免疫療法または免疫抑制療法の１つ以上の症状を軽減できる。ディフェンシンは、個別に、またはこれらの治療法の１つ以上と共に投与されてよい。ディフェンシンは、喘息を治療するのに使用できる他の薬剤と共に投与されてもよい。
【００７１】
重要なことに、本開示の方法は、抗生物質処置または化学療法または免疫療法または免疫抑制療法または放射線療法、または肺微生物叢または腸微生物叢への負の影響を有する別の処置を受けた、かつ／または受けている対象の肺における共生バランス失調性の微生物叢／メタボロームの処置、予防または正常化のために使用できる。
【００７２】
肺微生物叢を正常化することは、シュードモナス、レンサ球菌、プレボテラ、フゾバクテリウム、ベーヨネラ、ヘモフィルス、ナイセリアおよびポルフィロモナスから構成される主たる微生物叢と共に、バクテロイデス、ファーミキューテスおよびプロテオバクテリア属に属する肺の細菌の集団を活性化することを含んでよい。
【００７３】
肺微生物叢を正常化することは、メタボロームを、相対的により多くのトリプトファンおよび／または酪酸塩ならびに相対的により少ない酢酸塩を産生するものに変化させることを含んでもよい。
【００７４】
処置される対象は、日常症状、持続性症状などの喘息症状を１週間あたり＜２回呈してよい。
【００７５】
処置される対象は、活動に影響を及ぼす発作、身体活動を制限する発作などの異なる強度の喘息発作を呈してよく、かつ／または数日間持続する１週間あたり＞２回の症状、頻繁な夜間症状などの１ヵ月あたり＞２回の夜間の喘息症状を呈してよい。
【００７６】
一実施形態では、処置される対象は、予測値の＜８０％の１秒間努力呼気肺活量（ＦＥＶ１）、例えば、６０〜８０％のＦＥＶ１、＜６０％のＦＥＶ１を有する。
【００７７】
更に対象は、＞２０％の変動がある最大呼気速度（ＰＥＦＲ）、例えば、２０〜３０％のＰＥＦＲ変動、＞３０％のＰＥＦＲ変動、＞６０％などのＰＥＦＲ変動を有してよい。
【００７８】
本開示の方法によって提供される処置を必要とする対象は、処置前に以下の症状の１つ以上を呈してよい：
軽度間欠型：
１週間につき＜２回の症状
発作間期の無症候性および正常なピークフロー値（ＰＥＦＲ）
異なる強度の短時間の発作
１ヵ月につき＜２回の夜間症状
予測の＞８０％の１秒間努力呼気流量（ＦＥＶ１）またはＰＥＦＲ
＜２０％のＰＥＦＲ変動
軽度持続型：
１週間につき＞２回、ただし１日につき＜１回の症状
活動に影響を及ぼす場合がある増悪
１ヵ月につき＞２回の夜間症状
予測される値の＞８０％のＦＥＶ１
２０％と３０％の間のＰＥＦＲ変動
中等度持続型：
日常症状
短時間作用性β作動薬の毎日の使用
活動に影響を及ぼす発作
１週間につき＞２回かつ数日間持続する場合がある増悪
１週間につき＞１回の夜間症状
予測される値の６０％を超えるが、８０％未満のＦＥＶ１
＞３０％のＰＥＦＲ変動
重度持続型：
継続的な症状
制限された身体活動
頻繁な増悪
頻繁な夜間症状
予測される値の＜６０％のＦＥＶ１
＞６０％のＰＥＦＲ変動
【００７９】
一実施形態では、処置は、処置された対象が重度持続型から中等度持続型、軽度持続型または軽度間欠型に変化するように少なくとも１つの症状の改善をもたらす。処置は、処置された対象が中等度持続型から軽度持続型または軽度間欠型に、または軽度持続型から軽度間欠型に変化するように症状の改善をもたらしてもよい。
【００８０】
他の実施形態では、ディフェンシンは、肺癌に関連した肺の炎症を処置するために使用される。肺癌は、小細胞肺癌または非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）であってよい。ＮＳＣＬＣは、腺癌、有棘細胞癌、大細胞癌および細気管支肺胞上皮癌から選択され得る。肺癌患者に対する１種以上のディフェンシンの投与は、疾患の炎症症状の１つ以上または癌治療の１つ以上の副作用を改善できると予想される。癌治療の副作用は、放射線、化学療法、免疫療法または手術の副作用であり得る。肺の宿主防御を改善することにより少なくとも１種類のα−ディフェンシンおよび／またはβ−ディフェンシンの投与が腫瘍細胞の増殖を減少させる場合もあることが予想される。
【００８１】
インビトロ合成
哺乳動物α−ディフェンシンおよび哺乳動物β−ディフェンシンは、当技術分野で既知の従来法を使用して、生体外合成によって製造され得る。種々の市販の合成装置が利用可能であり、例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｃ．などの自動合成機がある。合成機を使用することによって、天然アミノ酸を非天然アミノ酸、特に、Ｄ−アラニンおよびＤ−イソロイシンなどのＤ−アイソマー（またはＤ−型）、ジアステレオアイソマー、異なる長さまたは官能性を有する側鎖などで置換できる。特定の配列および調製方法は、利便性、経済性、要求される純度などによって決定される。化学的連結を、アミドまたは置換アミン形成、例えば還元的アミノ化のためのアミノ基、チオエーテルまたはジスルフィド形成のためのチオール基、アミド形成のためのカルボキシル基など、結合に都合がよい官能性を含む様々なペプチドまたはタンパク質に付与してよい。必要に応じて、様々な基を合成の間または発現の間にペプチドに導入してよく、それは他の分子へのまたは表面への連結を可能にする。このためシステインがチオエーテルを得るために、ヒスチジンが金属イオン錯体への結合のために、カルボキシル基がアミドまたはエステルを形成するために、アミノ基がアミドを形成するために使用できる、などである。
【００８２】
哺乳動物α−ディフェンシンおよび哺乳動物β−ディフェンシン、あるいはこれらの機能的同等物はまた、組換え合成の従来の方法にしたがって単離および精製されてもよい。組換え合成は、適切な発現ベクターおよび真核生物発現系を用いて実施されてよい。溶液を発現宿主および培地から調製し、存在するディフェンシンをＨＰＬＣ、排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、または他の精製技術を使用して精製してよい。大腸菌におけるヒトβ−ディフェンシン２の組換え発現の方法がＷＯ２０１０／００７１６６（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）に開示されている。
【００８３】
哺乳動物α−ディフェンシンおよびβ−ディフェンシンはまた、対応するｍＲＮＡの投与によって誘導されてもよい。
【００８４】
投与量
ヒトα−ディフェンシンおよびヒトβ−ディフェンシンなどの哺乳動物α−ディフェンシンおよび哺乳動物β−ディフェンシンは好ましくは、肺の炎症全般を処置するのに効果的な量の医薬組成物または軽度間欠型喘息、軽度持続型喘息、中等度持続型喘息、重度持続型喘息、好酸球性喘息、好中球性喘息、ステロイド治療抵抗性喘息、喘息持続状態、気管支拡張症、ＣＯＰＤまたは肺癌の処置に効果的な量の医薬組成物において、好ましくは患者への許容可能な毒性を伴って使用される。ヒトα−ディフェンシンおよびヒトβ−ディフェンシンなどの哺乳動物α−ディフェンシンおよび哺乳動物β−ディフェンシンはまた好ましくは、肺および／または腸の正常な微生物叢の組成を維持するのに、または肺および／または腸の共生バランス失調性微生物叢を処置または正常化するのに効果的な量の医薬組成物において、好ましくは処置を必要とする患者への許容可能な毒性を伴って使用される。
【００８５】
このような処置では、適切な投与量はもちろん、例えば、使用される化合物の化学的性質および薬理動態データ、個々の宿主、投与様式ならびに処置される症状の性質および重症度に応じて変化する。
【００８６】
しかしながら一般的に、哺乳動物、例えばヒトにおける満足のいく結果のためのヒトα−ディフェンシンの望ましい一日投与量は、好ましくは約０．１ｍｇ  ＨＤ５／ｋｇ体重〜約１０ｍｇ  ＨＤ５／ｋｇ体重、より好ましくは約０．５ｍｇ  ＨＤ５／ｋｇ体重〜約１０ｍｇのＨＤ５／ｋｇ体重であり、１ｍｇ  ＨＤ５／ｋｇ体重〜１０ｍｇ  ＨＤ５／ｋｇ体重など、より好ましくは約１．２ｍｇ  ＨＤ５／ｋｇ体重〜約１０ｍｇ  ＨＤ５／ｋｇ体重、好ましくは約１．２ｍｇ  ＨＤ５／ｋｇ体重〜約５ｍｇ  ＨＤ５／ｋｇ体重、更により好ましくは１．２ｍｇ  ＨＤ５／ｋｇ体重であり、例えば、分割量で１日に最大１、２または３回投与される。
【００８７】
一実施形態では、ヒトβ−ディフェンシンの望ましい一日投与量は、好ましくは約０．１ｍｇ  ｈＢＤ２／ｋｇ体重〜約１０ｍｇ  ｈＢＤ２／ｋｇ体重、より好ましくは約０．５ｍｇ  ｈＢＤ２／ｋｇ体重〜約１０ｍｇ  ｈＢＤ２／ｋｇ体重であり、１ｍｇ  ｈＢＤ２／ｋｇ体重〜１０ｍｇ  ｈＢＤ２／ｋｇ体重など、より好ましくは約１．２ｍｇ  ｈＢＤ２／ｋｇ体重〜約１０ｍｇのｈＢＤ２／ｋｇ体重、好ましくは約１．２ｍｇ  ｈＢＤ２／ｋｇ体重〜約５ｍｇ  ｈＢＤ２／ｋｇ体重、更により好ましくは１．２ｍｇ  ｈＢＤ２／ｋｇ体重であり、例えば、分割量で１日に最大１、２または３回投与される。
【００８８】
２種の異なるディフェンシンを１回投与量で投与する場合、投与量は重量基準またはモル基準で決定される等量のまたはほぼ等量の２種のディフェンシンを含んでよい。比率はまた、β−ディフェンシンに対するα−ディフェンシンの比が、重量基準またはモル基準で決定して、１０：１〜１：１０、５：１〜１：５など、例えば２：１〜１：２で変化するように異なってもよい。
【００８９】
好ましい実施形態の化合物は、大型哺乳動物、例えばヒトへ、従来使用されるものと同様の投与量で同様の投与様式により投与され得る。
【００９０】
一実施形態では、本明細書で記載される通り、１日投与量が、０．１〜１０ｍｇディフェンシン／ｋｇ、例えば０．５〜５ｍｇディフェンシン／ｋｇ、例えば１〜２ｍｇディフェンシン／ｋｇ、例えば１日あたり１．２ｍｇディフェンシン／ｋｇである方法が提供される。
【００９１】
ある種の実施形態では、好ましい実施形態の医薬組成物は、ヒトα−ディフェンシンおよび／またはヒトβ−ディフェンシンなどの哺乳動物α−ディフェンシンおよび／または哺乳動物β−ディフェンシンを、単位剤形あたり約０．５ｍｇ以下〜約１５００ｍｇ以上、好ましくは約０．５、０．６、０．７、０．８または０．９ｍｇ〜約１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００または１，０００ｍｇ、より好ましくは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０または２５ｍｇ〜約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００ｍｇの量で含んでよい。ある種の実施形態では、しかし、上記のものより低いまたは高い投与量が好ましくてよい。好適な濃度および投与量は、当業者によって容易に決定され得る。ある種の実施形態では、好ましい実施形態の医薬組成物は、ヒトα−ディフェンシンなどの哺乳動物α−ディフェンシンを含む。ある種の実施形態では、好ましい実施形態の医薬組成物は、ヒトβ−ディフェンシンなどの哺乳動物β−ディフェンシンを含む。更なる実施形態では、好ましい実施形態の医薬組成物は、ヒトα−ディフェンシンおよびヒトβ−ディフェンシンなどの哺乳動物α−ディフェンシンおよび哺乳動物のβ−ディフェンシンを含み、ここで当該α−ディフェンシンおよびβ−ディフェンシンは、モル濃度ベースまたはｍｇ／ｍＬベースで等量で存在する。
【００９２】
一実施形態では、哺乳動物α−ディフェンシンおよび／またはβ−ディフェンシンは、少なくとも１日１回、少なくとも１日２回など、例えば少なくとも１日３回または継続的に投与される。
【００９３】
一実施形態では、哺乳動物α−ディフェンシンおよび／またはβ−ディフェンシンは、持続注入によって静脈内投与されるかまたは、外部人工呼吸器を装着している患者において持続的な機械的人工換気によって肺内投与される。
【００９４】
経口または非経口投与のための製剤化
哺乳動物α−ディフェンシンまたはβ−ディフェンシンは、任意の一般的な経路による投与用に製剤化された組成物中で治療的に使用できる。一実施形態では、少なくとも１種類の哺乳動物β−ディフェンシンの投与は、本開示の方法によれば、一般に鼻腔内である。鼻腔内投与は、肺薬物送達として標準的である。
【００９５】
一実施形態では、少なくとも１種類の哺乳動物α−ディフェンシンおよび／または少なくとも１種類の哺乳動物β−ディフェンシンの投与は、本開示の方法によれば、経口である。
【００９６】
一実施形態では、少なくとも１種類の哺乳動物α−ディフェンシンおよび／または少なくとも１種類の哺乳動物β−ディフェンシンの投与は、本開示の方法によれば、皮下または静脈内である。
【００９７】
いくつかの実施形態では、好ましい実施形態の組成物は、凍結乾燥品として、および再水和化の後に安定性をもたらす適切な賦形剤を使用して凍結乾燥品として製剤化されてよい。ヒトα−ディフェンシンおよび／またはヒトβ−ディフェンシンなどの、哺乳動物α−ディフェンシンおよび／または哺乳動物β−ディフェンシンを含む医薬組成物は、従来の方法により、例えば、混合工程、顆粒化工程、コーティング工程、溶解工程または凍結乾燥工程により製造できる。好ましい実施形態では、哺乳動物α−ディフェンシンおよび／または哺乳動物β−ディフェンシンを含む医薬組成物は、無菌の等張溶液として製剤化される。
【００９８】
薬学的に許容される担体および／または希釈剤は、当業者に既知である。液体溶液として製剤化された組成物に関して、許容される担体および／または希釈剤は、生理食塩水を含み滅菌水が含まれるべきであり、当該組成物は所望により抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および他の一般的な添加剤を含んでよい。
【００９９】
本開示の化合物は、経口投与用の多種多様な製剤に製剤化され得る。固形調製物は、粉末、錠剤、ドロップ、カプセル、カシェ、舐剤、および分散可能な顆粒を含み得る。経口投与に適した他の剤形は、エマルション、シロップ、エリキシル、水溶液、水性懸濁液、歯磨き粉、歯磨きゲル、チューインガムを含む液状調製物、または溶液、懸濁液、およびエマルションなどの液状調製物へと使用直前に変換されることが意図される固形調製物を含み得る。
【０１００】
本開示の化合物は、鼻腔内、皮下または静脈内投与用の多種多様な剤形で製剤化され得る。製剤は、（哺乳動物α−ディフェンシンおよび／または哺乳動物β−ディフェンシンならびに他の任意の有効成分に加えて）担体、増量剤、崩壊剤、流動調整剤、糖および甘味料、香料、保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、溶解剤、浸透圧を調節するための塩、緩衝剤、希釈剤、分散化および界面活性剤、結合剤、滑剤、ならびに／または他の当該技術分野において公知の医薬品用賦形剤を含有できる。当業者は更に、哺乳動物α−ディフェンシンおよび哺乳動物β−ディフェンシンを適切な方法で、およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｅｎｎａｒｏ（１９９０）に記載されるものなどの容認された実施法にしたがって製剤化し得る。
【０１０１】
ヒトα−ディフェンシンおよびヒトβ−ディフェンシンなどの哺乳動物α−ディフェンシンおよび哺乳動物β−ディフェンシンは、単独でまたは１つまたは２つ以上の他の医薬化合物または原薬との併用療法で、例えば、糖質コルチコイド、β作動薬、ロイコトリエン受容体アンタゴニスト、テオフィリン、抗生物質、化学療法もしくは免疫療法またはこれらの組合せと共に、かつ／または１つ以上の薬理学的に許容される賦形剤と共に使用できる。
【０１０２】
気道投与
本開示の組成物を投与するために気道投与を使用してもよい。肺内投与は、肺への局所投与を意味する。本明細書において使用する場合、用語「気管内投与、気管支内投与または肺胞内投与」は、添加される安定剤または他の賦形剤の有無に関わらず、ディフェンシン溶液の点滴注入によって、粉末形態のディフェンシンの適用によって、または、ディフェンシンの吸入によりディフェンシンの気道の適切な部分への到達を可能にすることによってのいずれかに関わらず、エアロゾル化されたかまたは霧状にされた溶液もしくは懸濁液または吸入粉末またはゲルとしてディフェンシンが気管、気管支または肺胞にそれぞれ適用される、このような投与の全ての形態を含む。
【０１０３】
気管支内／肺胞内投与の方法としては、生理学的に許容される組成物としてディフェンシンが溶解された洗浄液を使用する当業者に公知の方法による気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）、または実際に、賦形剤を含有するかまたは含有しない、乾燥形態のディフェンシンを含有する吸入粉末の使用または溶液もしくは懸濁液形態または粉末形態のディフェンシンの気管支鏡検査中の直接適用を含む気管支内投与の任意の他の効果的な形態による方法が挙げられるが、これらに限定されない。気管内投与の方法としては、溶解されたディフェンシンの類似の溶液またはディフェンシン懸濁液による盲目的気管洗浄、またはこの目的に適した任意の噴霧装置の使用により得られる溶解したディフェンシンまたはディフェンシン懸濁液を含有する噴霧液滴の吸入が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０４】
他の実施形態では、気管内投与、気管支内投与または肺胞内投与は製品の吸入を含まないが、ディフェンシンの溶液またはディフェンシンを含有する粉末もしくはゲルの気管または下気道中への滴下注入または適用を含む。
【０１０５】
投与の他の好ましい方法は、以下の装置の使用を含んでよい：
１．圧縮空気／酸素混合物を使用する加圧式噴霧器
２．超音波噴霧器
３．電子マイクロポンプ式噴霧器
４．定量吸入器（ＭＤＩ）
５．乾燥粉末吸入システム（ＤＰＩ）
【０１０６】
エアロゾルを、機械的人工換気（装置１、２および３）中に、ａ）フェイスマスクを介して、またはｂ）挿管された患者において気管内チューブを介して送達してよい。患者が自ら噴霧装置を作動させることができるという条件で、補助なしに患者が装置４および５を使用することもできる。
【０１０７】
ディフェンシンおよび／もしくは機能的ホモログまたはディフェンシンの変異体を含む溶液の好ましい濃度は、ｍｌ溶液あたり約０．１μｇ〜１０００μｇの範囲、ｍｌ溶液あたり約０．１μｇ〜２５０μｇなどの範囲である、
【０１０８】
肺内投与のための医薬組成物
本開示で使用するための医薬組成物または医薬製剤は、薬学的に許容される担体、好ましくは水性担体もしくは希釈剤と組み合わせた、好ましくはそれらに溶解されるディフェンシン、またはペグ化した調製物として、または吸入によるエアロゾルとして投与されるリポソームもしくはナノ粒子の調製物として下気道に運ばれるディフェンシン、または気管支肺胞洗浄としてもしくは盲目的気管内洗浄（ｂｌｉｎｄ  ｉｎｔｒａｔｒａｃｈｅａｌ  ｗａｓｈ）もしくは洗浄（ｌａｖａｇｅ）として気管支鏡を介して投与される洗浄液としてのディフェンシンを含む。種々の水性担体を使用でき、０．９％生理食塩水、緩衝生理食塩水、生理学的適合性緩衝液等を含むがこれらに限定されない。組成物を、当業者に公知の従来技術により滅菌してもよい。得られる水溶液を、使用のために包装でき、または無菌条件下で濾過し凍結乾燥でき、凍結乾燥された調製物は投与前に滅菌水溶液中に溶解される。
【０１０９】
一実施形態では、凍結乾燥したディフェンシン調製物を、例えば単回用量単位で予め包装してもよい。更により好ましい実施形態では、単回用量単位は患者に対して調整される。
【０１１０】
組成物は、薬理学的に許容される補助剤またはアジュバントを含有してよく、ｐＨ調整剤および緩衝剤ならびに／または等張化剤、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムなどを含むがそれらに限定されない。
【０１１１】
製剤は、薬理学的に許容される担体および賦形剤を含有してよく、ミクロスフィア、リポソーム、マイクロカプセル、ナノ粒子などを含む。従来のリポソームは通常、リン脂質（中性のまたは負に荷電した）および／またはコレステロールから構成される。リポソームは、水性区画を囲む脂質二重層に基づく小胞構造体である。リポソームは、それらの生理化学的特性、例えばリン脂質二重層のサイズ、脂質組成、表面電荷および数ならびに流動性の点で異なり得る。リポソーム形成に最も頻繁に使用される脂質は以下のものである：１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（一ナトリウム塩）（ＤＭＰＡ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（一ナトリウム塩）（ＤＰＰＡ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（一ナトリウム塩）（ＤＯＰＡ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセリン）］（ナトリウム塩）（ＤＭＰＧ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセリン）］（ナトリウム塩）（ＤＰＰＧ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセリン）］（ナトリウム塩）（ＤＯＰＧ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ナトリウム塩）（ＤＭＰＳ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン）（ナトリウム塩）（ＤＰＰＳ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ナトリウム塩）（ＤＯＰＳ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（グルタリル）（ナトリウム塩）および１，１’，２，２’−テトラミリストイルカルジオリピン（アンモニウム塩）。別の脂質またはリポソームの修飾剤と組み合わされたＤＰＰＣで構成される製剤は、例えばコレステロールおよび／またはホスファチジルコリンとの組み合わせであることが好ましい。
【０１１２】
長期循環型リポソームは、血管壁の透過性が増加された身体部位で血管外遊出する能力で特徴付けられる。長期循環型リポソームを生成する最も一般的な方法は、親水性ポリマーポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をリポソームの外表面に共有結合させることである。好ましい脂質のいくつかは以下のものである：１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（アンモニウム塩）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−５０００］（アンモニウム塩）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（塩化物塩）（ＤＯＴＡＰ）。
【０１１３】
リポソームに適用可能で有り得る脂質は、Ａｖａｎｔｉ，Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬにより供給される。更に、リポソーム懸濁液は、脂質を貯蔵時のフリーラジカルおよび脂質過酸化による損傷から保護する脂質保護剤を含んでもよい。α−トコフェロール等の脂溶性のフリーラジカル失活剤およびフェリオキサミン等の水溶性の鉄特異的キレート剤が好ましい。
【０１１４】
例えばＳｚｏｋａ他、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７頁（１９８０）、米国特許第４，２３５，８７１号、米国特許第４，５０１，７２８号および米国特許第４，８３７，０２８号に記載されるように、種々の方法をリポソームの調製に使用でき、これらの全ては参照により本願に組み込まれる。別の方法により、サイズが不均一な多重膜小胞が生成される。この方法では、小胞形成脂質を適切な有機溶媒または溶媒系中に溶解し、真空下または不活性ガス下で乾燥して薄い脂質膜を形成する。もし所望であれば、この膜を再度三級ブタノールなどの適切な溶媒に溶解し、その後凍結乾燥して、より容易に水和される粉末様形態のより均質な脂質混合物を形成してもよい。この膜は標的薬剤および標的化成分の水溶液で覆われており、通常は撹拌しつつ１５〜６０分の期間で水和できる。得られる多重薄膜小胞のサイズ分布は、より激しい震盪条件下で脂質を水和することによって、またはデオキシコレートなどの可溶化界面活性剤を添加することによって一層小さなサイズへとシフトさせることができる。
【０１１５】
ミセルは、水溶液中で界面活性剤（疎水性部分および１つ以上のイオン性基または強親水性基を含有する分子）により形成される。
【０１１６】
当業者に公知の一般的な界面活性剤を本発明のミセルに使用できる。好適な界面活性剤としては、ラウリン酸ナトリウム、オレイン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、オクタオキシエチレングリコールモノドデシルエーテル、オクトキシノール９およびＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ−１２７  （Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐ．）が挙げられる。好ましい界面活性剤は、静脈内注射に適合する非イオン性のポリオキシエチレン界面活性剤およびポリオキシプロピレン界面活性剤であり、例えばＴＷＥＥＮ−８０、ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ−６８、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド等である。更に、リポソームの製造において使用するために説明されるもの等のリン脂質を、ミセル形成のために使用してもよい。
【０１１７】
実施例
実施例１
マウスの、感染誘発性の重篤な喘息のステロイド非感受性好中球性アレルギー性気道疾患モデルにおける哺乳動物β−ディフェンシンの有効性の決定および評価（図１）
【０１１８】
材料および方法
処置方法：６〜８週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスをミョウバンアジュバント１ｍｇ含む２００μＬの０．９％生理食塩水中の卵白アルブミン５０μｇに腹腔内（ＩＰ）感作した。マウスに、１２〜１３日目および３３〜３４日目に卵白アルブミン（５０μＬ無菌生理食塩水中１０μｇ）を鼻腔内（ＩＮ）負荷した。１４日目に、マウスに、天然のマウス病原体であるクラミジア・ムリダルム（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｍｕｒｉｄａｒｕｍ）をＩＮ接種した（Ｃｍｕ：１００封入体形成単位、ＡＴＣＣＶＲ−１２３、３０μＬのスクロースリン酸グルタミン酸緩衝液（ＳＰＧ））。デキサメタゾン（ＤＥＸ）を、卵白アルブミン負荷と共に３２〜３４日目にＩＮ投与した（２ｍｇ／ｋｇ；５０μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））。ｈＢＤ２を３０、３２および３４日目にＩＮ投与した（５ｍｇ／ｋｇ；５０μＬのリン酸緩衝生理食塩水）。
【０１１９】
鼻腔内送達によってマウスに投与される薬剤は、気道を経由して肺に達することが予想され、肺内投与の当該技術分野において承認されているモデルである。
【０１２０】
試験：
気道炎症：白血球百分率を、光学顕微鏡を使用して、メイグリュンワルドギムザ染色されたＢＡＬＦ細胞から得た。
【０１２１】
肺機能：ＡＨＲを、Ｓｃｉｒｅｑ  Ｆｌｅｘｉｖｅｎｔ  ＦＸ１システムを使用して麻酔下のカニューレを挿入したマウスで測定した。データを、１０ｍｇ／ｋｇのメタコリンでの気道抵抗として、および用量反応曲線として表す。
【０１２２】
結果
気道炎症：卵白アルブミンで感作し、Ｃ．ムリダルムに感染させたマウスは、総白血球、マクロファージ、リンパ球、好中球およびより小さい程度の好酸球の高度に統計的に有意な増加を起こした。ＩＮでｈＢＤ２処置した群は、好中球数およびより小さい程度のリンパ球の完全な正常化を示し、一方でマクロファージおよび好酸球は変化しなかった。ＩＮでｈＢＤ２に加えてＤＥＸにて処置した群は、好酸球の完全な正常化を示したが、これ以外に相加効果は観察されなかった（図７）。
【０１２３】
肺機能：卵白アルブミンで感作したマウス（Ｏｖａ）は、生理食塩水（Ｓａｌ）（非喘息）対照と比較して、より高いＡＨＲを有した。この差は、統計的に高度に有意である。ＩＮｈＢＤ２処置群（Ｃｍｕ／Ｏｖａ／ｈＢＤ２）は、生理食塩水対照群と同等の完全に正常化したＡＨＲを示した。ＩＮでｈＢＤ２に加えてＤＥＸにて処置した群は生理食塩水対照群と同等の完全に正常化したＡＨＲを示したが、ＤＥＸは相加効果を有しないようであった（図４）。
【０１２４】
結論：この実施例は、鼻腔内投与されたｈＢＤ２が既知の喘息のステロイド治療抵抗性動物モデルにおいて気道過敏性およびＢＡＬＦ中の好中球数を完全に正常化できることを実証する。
【０１２５】
実施例２
アレルギー性喘息のマウスハウスダストダニ／フロインド完全アジュバント誘発モデルにおける経口投与対ＩＮ投与される哺乳動物β−ディフェンシンの有効性の決定および評価（図２）
【０１２６】
材料および方法
処置方法：７〜１０週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを、試験開始の１日前に７つの試験群にランダムに割り当て、ハウスダストダニに皮下（ＳＣ）感作した（２００μＬの生理食塩水中１００μｇのＨＤＭおよび０．９％生理食塩水中のフロインド完全アジュバント）。マウスに次いで、１４日目にＨＤＭを鼻腔内（ＩＮ）負荷した（５０μＬの生理食塩水中２５μｇのＨＤＭ）。デキサメタゾンを、１４日目に経口投与した（１ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤ；５０μＬリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））。ｈＢＤ２を、１４日目にＩＮ投与または経口投与した（１．７ｍｇ／ｋｇ  ＴＩＤ  ＩＮ；０．４ｍｇ／ｋｇ  ＴＩＤ  ＩＮ；０．４ｍｇ／ｋｇ  ＴＩＤ  経口、５０μＬリン酸緩衝生理食塩水）。初回量を、負荷の６０分前に投与し、その後の投与量を約６時間間隔で投与した。
【０１２７】
試験：
気道炎症：負荷の４８時間後に、気管支肺胞洗浄を行い、３つの容量の冷ＰＢＳ（０．４；０．３および０．３ｍＬ（合計１ｍＬ））で肺を洗浄した。総白血球数および白血球百分率を、自動血液分析機Ｓｙｓｍｅｘ  ＸＴ−２０００ｉＶで決定した。
【０１２８】
肺機能：ＨＤＭ負荷の４８時間後を起点として、肺抵抗および肺コンプライアンスの測定を、ＤＳＩ社のＢｕｘｃｏ  Ｆｉｎｅｐｏｉｎｔｅ  ＲＣシステムを使用して、麻酔下のカニューレを挿入したマウスによりメタコリンの負荷後（ＭＣＨ１、３．１２５ｍｇ／ｍＬ；ＭＣＨ２、６．２５ｍｇ／ｍＬ；ＭＣＨ３、１２．５ｍｇ／ｍＬおよびＭＣＨ４、２５ｍｇ／ｍＬ）に実施した。データを、１０ｍｇ／ｋｇのメタコリンでの気道抵抗として、および用量反応曲線として表す。
【０１２９】
サイトカイン分析のための肺の採取：全てのＢＡＬの完了後、肺を胸郭から摘出し、液体窒素中で急速凍結し、ＥＬＩＳＡによるＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＩＦＮγのサイトカイン濃度の分析まで摂氏−８０度にて凍結保存した。
【０１３０】
結果
ＨＤＭ負荷し媒体で処置した動物において、生理食塩水負荷した（非喘息の）マウスと比較して肺抵抗値の増加および肺コンプライアンス値の減少が観察された。両方の媒体処置群（経口および鼻腔内）のマウスにおいて炎症反応が、ＨＤＭおよびアジュバントによる感作の１４日後の単回ＨＤＭ負荷によって引き起こされた。炎症反応は、生理食塩水負荷対照と比較したＢＡＬＦ中の総細胞数、好酸球数、好中球数、マクロファージ数およびリンパ球数の統計的に有意な増加（ｐ＜０．０５）により特徴づけられた。また、肺組織ホモジェネート中の５つのサイトカイン、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−γの濃度分析は、生理食塩水負荷対照と比較してＨＤＭ負荷動物での有意に高いレベルを明らかにした。
【０１３１】
デキサメタゾン処置は、ＢＡＬＦ中の総細胞数および好酸球数を有意に抑制したが、好中球数、マクロファージ数およびリンパ球数は有意に抑制しなかった。細胞データと一致して、デキサメタゾンは、ＨＤＭ／媒体対照と比較して肺組織ホモジェネート中のＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−γのレベルに影響を及ぼさなかった。しかし、デキサメタゾンは好酸球数に関連するＡＨＲ測定値に影響を及ぼした。得られた結果は、このモデルがある程度ステロイド抵抗性であることを示す。
【０１３２】
試験品目ｈＢＤ２は、１４日目における３回の経口適用後および鼻腔内適用後の両方で、ＨＤＭ負荷し媒体で処置した動物と比較して、気道抵抗の増加（図５ａおよび５ｂ）および肺コンプライアンスの減少（図６ａおよび６ｂ）を効果的に抑制した。鼻腔内適用後にいくつかの測定パラメータでより顕著な効果が観察され、例えば、ＢＡＬＦにおける細胞流入において、両方の投与量（０．４ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ  ＴＩＤおよび１．７ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ  ＴＩＤ）が好中球数を有意に抑制した。一方でステロイド標準であるデキサメタゾンは、好中球数を抑制できなかった。同程度の有意な効果が、両方の投与経路について肺組織ホモジェネート中のＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−γサイトカインレベルで観察された（図９、１４、１７）。経口投与されたｈＢＤ２はＴＮＦ−αを有意に低下させたが（図１０）、鼻腔内投与されたｈＢＤ２は対照と有意に違わなかった。図１１は、ＩＬ−１βに対する効果を示す。
【０１３３】
結論：全ての得られた結果は、アレルギー性喘息のハウスダストダニ／フロインド完全アジュバント誘発マウスモデルにおけるｈＢＤ２の明白な抗炎症効果を示す。驚くべきことに、経口投与されたｈＢＤ２も、喘息マウスの喘息処置および炎症軽減において効果的であった。
【０１３４】
実施例３
アレルギー性喘息のマウスハウスダストダニ／フロインド完全アジュバント誘発モデルにおける経口投与対ＩＮ投与される哺乳動物β−ディフェンシンの有効性の決定および評価（図２）
【０１３５】
材料および方法
処置方法：試験開始の１日前に４つの試験群にランダムに割り当てた７〜１０週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ハウスダストダニに皮下（ＳＣ）感作した（２００μＬの生理食塩水中１００μｇのＨＤＭおよび０．９％生理食塩水中のフロインド完全アジュバント）。マウスに、１４日目にＨＤＭを鼻腔内（ＩＮ）負荷した（５０μＬの生理食塩水中２５μｇのＨＤＭ）。ｈＢＤ２を、１４日目にＩＮ投与または経口投与した（０．４ｍｇ／ｋｇ  ＴＩＤ  ＩＮ；０．４ｍｇ／ｋｇ  ＴＩＤ  経口、５０μＬリン酸緩衝生理食塩水）。初回量を、負荷の６０分前に投与し、その後の投与量を約６時間間隔で投与した。
【０１３６】
試験：
肺組織の採取：肺を胸郭から摘出し、液体窒素中で急速凍結し、ＥＬＩＳＡによるＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−８（ＫＣ）、ＩＬ−９およびＩＬ−１３のサイトカイン濃度分析まで摂氏−８０度にて凍結保存した。
【０１３７】
肺を１０％緩衝ホルマリン中で、生体内原位置で膨らませ、胸郭から摘出し、個別に１０％緩衝ホルマリンに入れ、まとめてパラフィン包埋し、薄切し、Ｈ＆Ｅ／ＰＡＳ染色を行った。
【０１３８】
血液採取
全ての終末血液試料は、経静脈採血により採取した。血液を、リチウムヘパリン管に採取し、氷上に置き、直ちに４℃で遠心分離した。血漿を分離し、将来的なＳＣＦＡ分析まで−８０℃で保存した。
【０１３９】
肺組織試料採取
肺を、胸部を穏やかに切開することにより、および胸骨および肋骨の両側部を切り落とすことにより露出させ、摘出した。群あたり最初の６匹の動物からの肺を胸郭から摘出し、液体窒素中で急速凍結し、ＥＬＩＳＡによるサイトカイン濃度の分析まで−８０℃にて凍結保存した。
【０１４０】
群あたり他の８匹の動物からの肺を１０％緩衝ホルマリンにより生体内原位置で膨らませ、胸郭から摘出し、個別に１０％緩衝ホルマリンに入れ、まとめてパラフィン包埋し、薄切し、Ｈ＆Ｅ／ＰＡＳ染色を行った。パラフィンブロックを、ＩＨＣ分析のために保管した。
【０１４１】
読み取り
組織病理学（Ｈ＆Ｅ；ＰＡＳ）（Ｎ＝８／群；合計Ｎ＝３２）
肺組織ホモジェネート中のサイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＫＣ、ＩＬ−９およびＩＬ−１３）（Ｎ＝６／群；合計Ｎ＝２４）
【０１４２】
組織病理学
細胞流入（単核細胞、好酸球、好中球）を、個別に気管支周囲腔／細気管支腔および血管周囲腔についてＨ＆Ｅ染色スライド上で半定量的に以下の通りに評価した：
０  なし
１  少数の散在する炎症性細胞
２  より大きな集合体
３  細胞の顕著な集積
炎症の総合スコアを、全個体のスコアの合計として算出した。
杯細胞化生を、太い気道および末梢気道のレベルで別々に、ＰＡＳ染色したスライドで以下の通りに評価した：
０  基底膜に沿った粘液含有細胞なし
１  基底膜に沿った７５％未満の染色された細胞質を有する少数の陽性細胞
２  基底膜に沿った７５％超える染色された細胞質を有する少数の陽性細胞
３  基底膜に沿った７５％未満の染色された細胞質を有する多数の陽性細胞
４  基底膜に沿った７５％超える染色された細胞質を有する多数の陽性細胞
【０１４３】
統計的評価
データを、ＭＳ  Ｅｘｃｅｌを使用して処理した。統計解析を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン５．０４）を使用して実行した。群間の差を、ｐ＜０．０５の場合統計的に有意であるとみなす。
【０１４４】
選択された組織学的スコア値（データ）の統計解析を、中央値およびノンパラメトリックなマン−ホイットニー検定法を使用して実行した。
【０１４５】
結果
両方の媒体処置群（経口および鼻腔内）のマウスにおいて炎症反応が、ＨＤＭおよびアジュバントによる感作の１４日後の単回ＨＤＭ負荷によって引き起こされた。炎症反応は、生理食塩水負荷対照と比較したＨＤＭ負荷動物における肺組織ホモジェネート中の５つのサイトカイン、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＩＬ−９およびＩＬ−１３の濃度の統計的に有意な増加により、および肺組織の重篤な組織学的炎症性変化により特徴づけられた。
【０１４６】
試験品目ｈＢＤ２は、１４日目における３回の経口適用および鼻腔内適用の後の両方で、ＨＤＭ負荷し媒体で処置した動物と比較して肺組織での組織炎症の増加を効果的に抑制した（図１９、２０、２１）。同程度の有意な効果が、両方の投与経路による肺組織ホモジェネート中のＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＩＬ−９およびＩＬ−１３サイトカインレベルに対し観察された（図１２、１３、１５、１６、１８）。
【０１４７】
結論：全ての得られた結果は、アレルギー性喘息のハウスダストダニ／フロインド完全アジュバント誘発マウスモデルにおけるｈＢＤ２の明白な抗炎症効果を示す。当該効果は、ｈＢＤ２の鼻腔内投与および経口投与の両方を使用して得られた。
【０１４８】
実施例４
ＮＭＲＩマウスへの４ｍｇ／ｋｇ投与の単回経口経管栄養後のｈＢＤ２の薬物動態プロファイルを確立するための薬物動態研究
【０１４９】
材料および方法
処置方法：２１匹の雌性ＮＭＲＩマウスに、投与日に得た個々の体重に応じて栄養管（ｇａｖａｇｅ  ｔｕｂｅ）および１ｍｌシリンジを使用する５ｍｌ／ｋｇの経口経管栄養により投与した。尿を、腹部の鼠径部を穏やかにマッサージすることによりランダムな時点に採取するようにした。第１の血液試料を、顎下腺からの採取法を使用して得た。第２の血液試料を、イソフルランで麻酔されたマウスから採取した。腸試料を、安楽死後に得た。各々のマウスの腹部を切開し、腸管の３つの断片を採取した。
【０１５０】
結果
ｈＢＤ２は、全ての値が＜１０ｐｇ／ｍｌの検出レベル以下であったため血清または尿試料のいずれにおいてもＨＰＬＣによって検出できなかった。これは、ｈＢＤ２がマウスにおいて４ｍｇ／ｋｇの経口投与後に全身的に有効でない（ｎｏｔ  ｓｙｓｔｅｍｉｃａｌｌｙ  ａｖａｉｌａｂｌｅ）ことを示す（図２２）。
【０１５１】
実施例５
雌性ＮＭＲＩマウスへの１ｍｇ／ｋｇのｈＢＤ２（分子量６６４３７Ｄａ）のモル等量の皮下または静脈内投与後のヒト血清アルブミンのＣ末端（分子量７１．３３６Ｄａ）またはＮ末端（分子量７１．６６６Ｄａ）に融合されたｈＢＤ２の薬物動態プロファイルの検討および比較
【０１５２】
材料および方法
処置方法：動物に、個々の体重に応じて１．６５ｍｇ／ｍｌのストック濃度の１０ｍｌ／ｋｇを投与した（３０グラムのマウスで３００μＬ）。第１の血液試料を顎下腺からの採取法を使用して得て、第２の血液試料をソフルランによる麻酔および安楽死後に得た。
【０１５３】
結果
ｈＢＤ２は、１時間の半減期を示し、２つの融合タンパク質は１２時間の半減期を示した。ＡＵＣは、劇的に変化した。腎クリアランスも、ｈＢＤ２の１０ｍｌ／分から２つの融合分子の０．５〜２．２ｍｌ／分へと変化した（図２３、２４、２５）。
【０１５４】
この実施例は、アルブミンへのＣ末端またはＮ末端結合によってｈＢＤ２の半減期を著しく延長できることを実証する。
【０１５５】
実施例６
マウスでの１０日間のデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）投与により誘発される急性大腸炎モデルにおける「ｈＢＤ２−アルブミンＮ末端融合物」の抗炎症効果の決定および評価
【０１５６】
材料および方法
処置方法：無菌２５Ｇ針を使用して「ｈＢＤ２−アルブミンＮ末端」を１０ｍｌ／ｋｇ体重の投与液量で尾静脈を介して静脈内投与または皮下投与した。動物は、１０日連続して毎日１回投与量を受けた。実薬対照であるデキサメタゾン（ＤＥＸ）を、１０ｍｌ／ｋｇ体重の投与液量で１ｍｇ／ｋｇの投与量を一日一回皮下に与えた。
【０１５７】
結果
「ｈＢＤ２−アルブミンＮ末端」による処置は、静脈内経路を介して１．６５ｍｇ／ｋｇの投与量で毎日投与した場合、疾患活動性インデックス（ＤＡＩ）の有意な抑制をもたらした（ｐ＜０．０５）。更にまた、１０日目にＤＡＩスコアの有意な抑制が、「ｈＢＤ２−アルブミンＮ末端」を１．６５ｍｇ／ｋｇの投与量および１２５ｍｇ／ｋｇの投与量でそれぞれ皮下に毎日投与した場合に観察された（ｐ＜０．０５）。
デキストラン硫酸ナトリウムの投与は、組織検査から明らかなように、大腸組織の有意な炎症および損傷をもたらした。「ｈＢＤ２−アルブミンＮ末端」による処置は、この組織損傷のなんらの統計的に有意な減少ももたらさなかったが、同様に、実薬対照であるＤＥＸは、組織傷害を有意に低下できなかった。
本結果は更に、２日目および３日目に一過的に体重が減少するにもかかわらず「ｈＢＤ２−アルブミンＮ末端」で処置した動物において、７日目に有意な体重増加を示した。対照的に、ＤＥＸで処置した動物は、５日目以降非常に有意な体重減少を示した（ｐ＜０．０１）。
【０１５８】
この実施例は、ｈＢＤ２−アルブミンＮ末端融合物が炎症性疾患の動物モデルにおいて生物学的に活性であることを実証する。
【０１５９】
実施例７
マウスでの１０日間のデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）投与により誘発される急性大腸炎モデルにおける「ｈＢＤ２−アルブミンＣ末端融合物」の抗炎症効果の決定および評価
【０１６０】
材料および方法
処置方法：無菌２５Ｇ針を使用して「ｈＢＤ２−アルブミンＣ末端」を１０ｍｌ／ｋｇ体重の投与液量で尾静脈を介して静脈内投与または皮下投与した。動物は、１０日連続して毎日１回投与量を受けた。実薬対照であるプレドニソロン（Ｐｒｅｄ）を、１０ｍｌ／ｋｇ体重の投与液量で１ｍｇ／ｋｇの投与量を一日一回経管栄養により経口的に与えた。
【０１６１】
結果
「ｈＢＤ２−アルブミンＣ末端」による処置は、静脈内経路を介して１．６ｍｇ／ｋｇの投与量で毎日投与した場合、ＤＡＩの有意な抑制をもたらした（ｐ＜０．０５）。更に、「ｈＢＤ２−アルブミンＣ末端」は、静脈内経路により１．６ｍｇ／ｋｇの投与量を０、２、４、６、８および１０日目の隔日に投与した場合にＤＡＩの有意な抑制をもたらした（ｐ＜０．０５）（図２６）。Ｐｒｅｄによる毎日の処置は、９日目にＤＡＩの有意な抑制をもたらした（ｐ＜０．０５）。
デキストラン硫酸ナトリウムの投与は、組織検査から明らかなように、大腸組織の有意な炎症および損傷をもたらした。１．６ｍｇ／ｋｇの投与量の「ｈＢＤ２−アルブミンＣ末端」による処置は、この組織損傷の統計的に有意な減少をもたらした（ｐ＜０．０５）。同様に、０、２、４、６、８および１０日目の１．６ｍｇ／ｋｇおよび１６．５ｍｇ／ｋｇの投与量での「ｈＢＤ２−アルブミンＣ末端」による毎日の処置は、大腸の組織損傷の有意な減少をもたらした（ｐ＜０．０１）（図２７）。実薬対照であるＰｒｅｄによる処置は、大腸近位部の組織傷害を有意に減少できなかったが、遠位大腸の損傷を減少させた（ｐ＜０．０１）。
本結果は更に、「ｈＢＤ２−アルブミンＣ末端」で処置した動物における、有意な体重増加を示した（ｐ＜０．０５）。
【０１６２】
この実施例は、ｈＢＤ２−アルブミンＣ末端融合物が炎症性疾患の動物モデルにおいて生物学的に活性であることを実証する。
【０１６３】
実施例８
【表２】
2020512287.tif 000003
【０１６４】
実施例９
アレルギー性喘息のマウスハウスダストダニ誘発モデルにおける哺乳動物β−ディフェンシンの経口投与による予防処置に対するＩＮ投与による予防処置の有効性の決定および評価  
【０１６５】
材料および方法
処置方法：７〜１０週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを、試験開始の１日前に５つの試験群にランダムに割り当て、ハウスダストダニに皮下（ＳＣ）感作した（２００μＬの生理食塩水中１００μｇのＨＤＭおよび０．９％生理食塩水中のフロインド完全アジュバント）。マウスをｈＢＤ２により１．２ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ（０．４ｍｇ／ｋｇ  ＴＩＤ）の投与量で、１２日目の朝に開始して約６時間間隔で１日３回連続して経口的および鼻腔内にそれぞれ処置した。最終投与量を、１４日目の負荷の１時間前に投与した。総投与数は８回投与またはｈＢＤ２の総投与量は２ｍｇ／ｋｇであった。マウスに次いで、１４日目にＨＤＭを鼻腔内（ＩＮ）負荷した（５０μＬの生理食塩水中２５μｇのＨＤＭ）。
【０１６６】
試験：
気道炎症：負荷の４８時間後に、気管支肺胞洗浄を行い、３つの容量の冷ＰＢＳ（０．４；０．３および０．３ｍＬ（合計１ｍＬ））で肺を洗浄した。総白血球数および白血球百分率を自動血液分析機Ｓｙｓｍｅｘ  ＸＴ−２０００ｉＶで決定した。
【０１６７】
肺機能：ＨＤＭ負荷の４８時間後を起点として、肺抵抗および肺コンプライアンスの測定をメタコリン負荷後（ＭＣＨ１、３．１２５ｍｇ／ｍＬ；ＭＣＨ２、６．２５ｍｇ／ｍＬ；ＭＣＨ３、１２．５ｍｇ／ｍＬおよびＭＣＨ４、２５ｍｇ／ｍＬ）に、ＤＳＩ社のＢｕｘｃｏ  Ｆｉｎｅｐｏｉｎｔｅ  ＲＣシステムを使用して麻酔下のカニューレを挿入したマウスにより実施した。データを、１０ｍｇ／ｋｇのメタコリンでの気道抵抗として、および用量反応曲線として表す。
【０１６８】
サイトカイン分析のための肺の採取：全てのＢＡＬの完了後、肺を胸郭から摘出し、液体窒素中で急速凍結し、ＥＬＩＳＡによる肺ホモジェネート中のＴＮＦ−α、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１３およびＩＬ−３３のサイトカイン濃度分析まで摂氏−８０度にて凍結保存した。
【０１６９】
結果
肺抵抗値の増加および肺コンプライアンス値の減少が、生理食塩水を負荷した（非喘息の）マウスと比較してＨＤＭ負荷し媒体で処置した動物において観察された。両方の媒体処置群（経口および鼻腔内）のマウスにおいて炎症反応が、ＨＤＭによる感作の１４日後の単回ＨＤＭ負荷によって引き起こされた。炎症反応は、生理食塩水負荷対照と比較したＢＡＬＦ中の総細胞数、好酸球数、好中球数、マクロファージ数およびリンパ球数の統計的に有意な増加（ｐ＜０．０５）により特徴づけられた。また、肺組織ホモジェネート中の７つのサイトカイン、ＴＮＦ−α、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１３およびＩＬ−３３の濃度分析は、生理食塩水負荷対照と比較してＨＤＭ負荷動物での有意に高いレベルを明らかにした。
【０１７０】
１２日目〜１４日目に投与されたｈＢＤ２は、１日３回の経口適用後および鼻腔内適用後（８回の投与で合計２．０ｍｇ／ｋｇ）の両方で、ＨＤＭ負荷し媒体で処置した動物と比較して効果的に正常な肺機能を保ち気道抵抗の増加（図２９）および肺コンプライアンスの減少（図３０）を抑制した。ＢＡＬＦでの細胞流入に対する効果が経口適用後に観察され、それは好中球数を有意に抑制した（図３１）が、他の免疫細胞は、喘息において通常観察されるようにＢＡＬＦに移動した。しかし、重要なことに、喘息においてしばしば観察されるサイトカインストームおよび喘息発作の基盤は、特にｈＢＤ２の経口投与後に肺組織ホモジェネート中のサイトカイン濃度の完全な正常化によって防止された。経口投与後のＴＮＦ−α、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９およびＩＬ−１３のサイトカインレベルを図３２〜３７に示す。ｈＢＤ２の鼻腔内投与後にＴＮＦ−α、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９およびＩＬ−１３が減少する傾向があったが、これは対照と統計的に有意に違わなかった。
【０１７１】
結論：全ての得られた結果は、アレルギー性喘息のハウスダストダニ誘発マウスモデルにおけるｈＢＤ２の明白な保護、予防および抗炎症効果を示す。
【０１７２】
実施例１０
ディフェンシンを用いた予防処置による消化管微生物叢の保護および保存
マウス：マウスを群あたり４ケージで、３匹ずつ飼育した。食餌摂取を午後６時の消灯直前に毎日記録した。個々のマウスに、群およびケージ単位で順序を変えて実験手順を実施した。マウスを、ＳＰＦの標準条件で１２時間の明暗周期下にて室温で維持した。処置方法を図３８に記載する。
【０１７３】
食餌：投与のために、平均体重をマウスあたり２５グラムと見積もった。マウスは１日に１匹あたり約３ｇの飼料を食する。
【０１７４】
処置方法：マウスに高脂肪食（ＨＦＤ）または低脂肪（ＬＦ）対照食のいずれかを与えた。ＨＦＤは４つのサブ群：１．ｈＢＤ２、１．ＨＤ５、１．ｈＢＤ２／ＨＤ５、１．ディフェンシン無添加の標準ＨＦＤを含んだ。ディフェンシン濃度は、１日にマウス１ｋｇあたり１．２ｍｇ  ｈＢＤ２であった。ＨＤ５をｈＢＤ２と等モル濃度で与えた。併用群には５０％ｈＢＤ２＋５０％ＨＤ５を与え、そのためディフェンシンの全量は残りの試験群と同等であった。
【０１７５】
試験：
微生物分析を実施して腸の微生物叢を調査した。縦断的な１６Ｓの特徴付けを６０匹のマウスからの４組の試料である合計２４０試料で実施した。各マウスを食餌変更前、食餌変更１週後、食事変更４週後および終了時にサンプリングし、したがってディフェンシン処置の結果としての糞便微生物叢の完全な特徴付けを確実にした。
【０１７６】
結果
微生物叢
ｈＢＤ２は主に微生物の出現度に影響を及ぼし、一方でＨＤ５およびｈＢＤ２＋ＨＤ５は主に微生物存在量に影響を及ぼした。図４０は、異なる投与群における種の相対的存在量を示し、ｈＢＤ２およびＨＤ５の腸微生物叢に対する重大な効果を例示する。アロバキュラムの存在量の統計的に有意な増加が、ＨＤ５による予防後の小腸において観察された（ｐ＜０．０２；図４１）。アロバキュラムは短鎖脂肪酸を産生する種である。短鎖脂肪酸は、ＧＰＣＲ４３により媒介される大腸Ｔｒｅｇ細胞の恒常性の調節において重要な役割を果たす。バルネシエラの存在量の統計的に有意な増加が、ｈＢＤ２による予防処置後の大腸において観察された（ｐ＜０．０３；図４３）。バルネシエラは、入院患者において観察できる抗生物質抵抗性の病原性細菌を除去しその腸管優位を防ぐことができる細菌である。バルネシエラの存在量は、いくつかの免疫調節性細胞の量に対応する。大腸におけるバルネシエラのレベルが高いほど、脾臓および肝臓において計数される周辺帯Ｂ細胞およびインバリアントナチュラルキラーＴ細胞が多くなる。ＩＬ１０−／−マウスにおける大腸炎の発症において、より高いレベルのバルネシエラの系統型が、より低い疾患活動性レベルと相関していた。乳酸菌科の存在量が減少する傾向が、ｈＢＤ２による予防処置後の大腸において観察された（ｐ＝０．１；図４２）。
【０１７７】
結論：肺微生物叢ならびに微生物叢は、喘息において重要な役割を果たしているようである（後者は腸−肺軸によって）。重要な共生細菌の出現度および存在量ならびに大腸Ｔ細胞の恒常性に対するディフェンシンの重大な影響は、ディフェンシンによる経口処置後のアレルギー性喘息マウスにおいて観察される肺効果だけでなく経口投与対鼻腔内投与の後に観察された肺効果の間の差も説明できる。この実施例１０は、αおよびβ−ディフェンシンの両方、特にＨＤ５およびｈＢＤ２が、存在する種の数および細菌の総数に関し微生物叢の組成に対して重大な影響を与えこれにより健常な微生物叢を保護し保存するようであることを示す。より詳しくは、ディフェンシンは、大腸Ｔｒｅｇ細胞の恒常性において重要な役割を果たす短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）を産生する細菌を促進するようである。
【０１７８】
実施例１１
ディフェンシンを用いた介入処置による腸内菌共生バランス失調の処置
【０１７９】
マウスおよび食餌
本実験は、食餌誘発性肥満マウスにおける微生物叢に対するｈＢＤ２およびＨＤ５の効果を明らかにする。マウスが超高脂肪食（エネルギーの６０％が脂肪由来）を給餌される１３週間の馴らし期間を、介入に先行させた。馴らし期間中の最低１２ｇの体重増加（初期体重の約５０％）という基準を満たしたマウスのみを最終分析に組み入れた。この基準を満たさなかったマウスを、ヒエラルキー「維持マウス（ｋｅｅｐｅｒｓ）」としてそれぞれのケージで飼育した。これらは全ての実験的な試験に供されたが、分析からは除外された。
【０１８０】
処置方法：介入前に、全てのマウスをＭＲスキャンした。マウスのケージをそれらの脂肪量に基づいて実験群に割り当てた。以後の全ての測定を、介入前の同一のマウスからのデータと対にした。ＬＦＤ（低脂肪食）参照群の実験を並行して行った。介入の対照として、２つの追加群：１．超高脂肪食および１．低脂肪食を含めた。実験マウスを介入の間、超高脂肪食で飼育した。マウスは１０週間、試験食を受けた。それらは実験の全期間を通して、ケージあたり４匹、群あたり３ケージで共飼育された。全ての試験を、１日に群あたり１ケージで、３日間にわたって実施した。処置方法を図３９に示す。
【０１８１】
試験：試験微生物分析を実施して腸の微生物叢を調査した。縦断的な１６Ｓの特徴付けを６０匹のマウスからの４組の試料である合計２４０試料で実施した。各マウスを食餌変更前、食餌変更１週後、食事変更４週後および終了時にサンプリングし、したがってディフェンシン処置の結果としての糞便微生物叢の完全な特徴付けを確実にした。
【０１８２】
結果
微生物叢
両方のディフェンシンは、細菌の出現度および細菌の欠如に対して重大な影響を及ぼすことを示した。ＨＤ５は大腸におけるアロプレボテラの存在量を統計的に有意に増加させ（ｐ＜０．０２）（図４４）、一方でｈＢＤ２はアロプレボテラの存在量に対して影響を及ぼさなかった。ｈＢＤ２は、小腸においておよび大腸においての両方でビフィドバクテリア科の相対的存在量を劇的にかつ統計的に優位に増加させた（それぞれｐ＜０．０００１およびｐ＜０．０４；図４５）。ＨＤ５は、小腸におけるビフィドバクテリア科の存在量を増加させる傾向があった（図４５）。
【０１８３】
肺微生物叢ならびに腸微生物叢は、喘息において重要な役割を果たしているようである（後者は腸−肺軸によって）。重要な共生細菌の出現度および存在量ならびに大腸Ｔ細胞の恒常性に対するディフェンシンの重大な影響は、ディフェンシンによる経口処置後のアレルギー性喘息マウスにおいて観察される肺効果だけでなく経口投与対鼻腔内投与の後に観察された肺効果の間の差も説明できる。
【０１８４】
結論：この実施例１１は、αおよびβ−ディフェンシンの両方、特にｈＢＤ２およびＨＤ５が、存在する種の数および細菌の総数に関し微生物叢の組成に対して重大な影響を与えこれにより健常な微生物叢を保護し維持するようであることを示す。より詳しくは、ディフェンシンは、大腸Ｔｒｅｇ細胞の恒常性において重要な役割を果たす短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）を産生する細菌を促進するようである。
【０１８５】
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ＷＯ  ９５／２２６２５
ＵＳ  ５，２２３，４０９
ＷＯ  ２０１３／００７５９６
【図１】
2020512287.tif 000004
【図２】
2020512287.tif 000005
【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５ａ】
2020512287.tif 000009
【図５ｂ】
2020512287.tif 000010
【図６ａ】
2020512287.tif 000011
【図６ｂ】
2020512287.tif 000012
【図７】
2020512287.tif 000013
【図８ａ−１】
2020512287.tif 000014
【図８ａ−２】
2020512287.tif 000015
【図８ａ−３】
2020512287.tif 000016
【図８ｂ−１】
2020512287.tif 000017
【図８ｂ−２】
2020512287.tif 000018
【図８ｂ−３】
2020512287.tif 000019
【図９】
2020512287.tif 000020
【図１０】
2020512287.tif 000021
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
2020512287.tif 000034
【図２４】
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【図２５】
2020512287.tif 000036
【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年8月9日(2019.8.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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