(57)【要約】三次元又はそれ以上の次元における蛍光分子の位置及び配向のマップを生成する三次元蛍光偏光励起のためのシステム及び方法を開示する。
2020527246.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光ビームを放射するための光源と、
前記光ビームを偏光ビームに変換するための第１の偏光光学系と、
前記偏光ビームを第１の偏光ビームと第２の偏光ビームに分割するビームスプリッタと、
前記第１の偏光ビームが第１の角度に沿って試料を照射することで第１の蛍光発光を生成するように、第１の軸に沿って配向された第１の対物レンズと、
前記第２の偏光ビームが、前記第１の角度に対して平行でない第２の角度で前記試料を照射することで第２の蛍光発光を生成するように、第２の軸に沿って配向された第２の対物レンズと、を含み、
前記第１の対物レンズが前記第２の蛍光発光を検出するように配向されており、前記第２の対物レンズが前記第１の蛍光発光を検出するように配向されている、蛍光顕微鏡システム。
【請求項２】
前記第２の蛍光発光から画像を受け取るために前記第１の対物レンズと連通している第１の検出器と、
前記第１の蛍光発光から画像を受け取るために前記第２の対物レンズと連通している第２の検出器と、
をさらに含む、請求項１に記載の蛍光顕微鏡システム。
【請求項３】
前記第１の対物レンズの前記第１の軸と、及び前記第２の対物レンズの前記第２の軸とに対して非平行の関係である第３の軸に沿って配向された第３の対物レンズをさらに含み、前記第３の検出器は、前記試料からの第３の蛍光発光を検出する、請求項１に記載の蛍光顕微鏡システム。
【請求項４】
前記第３の対物レンズは、前記第３の蛍光発光から画像を受け取るための第３の検出器と連通している、請求項２に記載の蛍光顕微鏡システム。
【請求項５】
前記第１の検出器及び前記第２の検出器は、前記第１の対物レンズからの前記第２の蛍光発光及び前記第２の対物レンズからの前記第１の蛍光発光の画像を受信するためのプロセッサとそれぞれ通信する、請求項２に記載の蛍光顕微鏡システム。
【請求項６】
前記第３の検出器は、前記第３の対物レンズからの前記第３の蛍光発光の画像を受信するためのプロセッサと通信する、請求項４に記載の蛍光顕微鏡システム。
【請求項７】
前記試料を照射する前に前記第１の偏光ビームの偏光をさらに変更するための前記第１の対物レンズに関連する第２の偏光光学系と、
前記試料を照射する前に前記第２の偏光ビームの偏光をさらに変更するための前記第２の対物レンズに関連する第２の偏光光学系と、
をさらに含む、請求項１に記載の蛍光顕微鏡システム。
【請求項８】
前記第１の偏光光学系が、波長板、偏光子、及び液晶を含む、請求項１に記載の蛍光顕微鏡システム。
【請求項９】
前記第１の偏光ビームを前記第１の対物レンズに向け直すために前記ビームスプリッタと連通する第１のダイクロイックミラーと、
前記第２の偏光ビームを前記第２の対物レンズに向け直すために前記ビームスプリッタと連通する第２のダイクロイックミラーと、
をさらに含む、請求項１に記載の蛍光顕微鏡システム。
【請求項１０】
前記第１の対物レンズ及び前記第２の対物レンズは、前記第１の偏光ビーム及び前記第２の対物レンズをそれぞれ交互に用いて前記試料を照射する、請求項１に記載の蛍光顕微鏡システム。
【請求項１１】
前記第１の対物レンズ及び前記第２の対物レンズが、それぞれ前記第１及び第２の蛍光発光を交互の順序で検出する、請求項１に記載の蛍光顕微鏡システム。
【請求項１２】
前記第２の対物レンズによって検出される前記第１の蛍光発光は、前記第２の対物レンズの前記第２の軸に対して非平行な関係にある第１の平面に沿って配向され、
前記第１の対物レンズによって検出される前記第２の蛍光発光は、前記第１の対物レンズの前記第１の軸に対して非平行な関係にある第２の平面に沿って配向される、請求項１に記載の蛍光顕微鏡システム。
【請求項１３】
前記プロセッサが、前記第１の対物レンズ及び前記第２の対物レンズによってそれぞれ検出された前記第１の蛍光発光及び前記第２の蛍光発光に基づいて、１つ又は複数の三次元構造に結合した励起双極子の配向分布を生成する、請求項５に記載の蛍光顕微鏡システム。
【請求項１４】
レーザ光ビームを放射するためのレーザ源と、
前記レーザ光ビームを偏光ビームに変換するための第１の偏光光学系と、
前記偏光ビームを第１の偏光ビームと第２の偏光ビームに分割するビームスプリッタと、
前記第１の偏光ビームが第１の角度に沿って試料を照射することで第１の複数の励起双極子から第１の蛍光発光を生成するように、第１の軸に沿って配向された第１の対物レンズと、
前記第２の偏光ビームが前記第１の角度に対して平行でない第２の角度で前記試料を照射することで第２の複数の励起双極子から第２の蛍光発光を生成するように第２の軸に沿って配向された第２の対物レンズと、を含み、
前記第１の対物レンズは前記第１の軸に対して垂直な角度で配向された前記第１の複数の励起双極子を検出するように配向され、前記第２の対物レンズは前記第２の軸に対して垂直な角度で配向された前記第２の複数の励起双極子を検出するように配向される、蛍光顕微鏡システム。
【請求項１５】
前記第１の対物レンズは前記第１の軸に対して平行な角度で配向された前記第１の複数の励起双極子を検出しないように配向され、前記第２の対物レンズは前記第２の軸に対して平行な角度で配向された前記第２の複数の励起双極子を検出しないように配向される、請求項１４に記載の蛍光顕微鏡システム。
【請求項１６】
レーザ光ビームを生成するステップと、
前記レーザ光ビームを偏光ビームに変換するステップと、
前記偏光ビームを第１の偏光ビームと第２の偏光ビームに分割するステップと、
第１の角度に沿って配向された第１の対物レンズを介して試料を照射することで第１の蛍光発光を生成するステップと、
前記第１の角度に対して平行でない第２の角度に配向された第２の対物レンズを介して前記試料を照射することで、第２の蛍光発光を生成するステップと、を含み、
前記第１の軸に対して非平行な関係にある平面に沿って配向された前記第２の対物レンズを介して前記第２の蛍光発光の第１の複数の励起双極子を検出し、前記第２の軸に対して非平行な関係にある第２の平面に沿って配向された前記第１の対物レンズを介して前記第１の蛍光発光の第２の複数の励起双極子を検出する、
試料からの蛍光発光によって生成される励起双極子の位置及び配向を決定する方法。
【請求項１７】
前記レーザ光ビームの偏光状態が任意に変更される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
各偏光状態について１つ以上の検出器を介して前記第１及び第２の蛍光発光の一連の画像を収集するステップ、をさらに含む、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記第１及び第２の複数の励起双極子のそれぞれの位置及び配向を決定するために、前記第１及び第２の蛍光発光の前記収集された一連の画像を処理するステップ、をさらに含む、請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
前記第１及び第２の蛍光発光の前記収集された一連の画像を処理するときに、再構成アルゴリズムが適用される、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は三次元蛍光偏光励起のためのシステム及び方法に関し、特に、三次元以上の蛍光分子の位置及び配向のマップを生成する蛍光顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光タンパク質を含むほとんどの蛍光体は双極子として光を吸収し、発する。これは、蛍光体の位置だけでなく、蛍光体及び蛍光体が結合する分子集合体の配向も明らかにする可能性を作り出す。偏光蛍光を励起及び／又は検出する装備を有する偏光顕微鏡は、この可能性をすでに利用している。分子集合体の配向及び運動は、細胞機能又は疾患の方向性を決定する。例えば、創傷治癒又は転移の際の方向性細胞移動は、移動方向へ向かう正味の力を生成するパターン化されたアクチンネットワークの流れに依存する。
【０００３】
分子配向は、双極子励起のための偏光又は双極子放射の偏光分析のいずれか、又はその両方を使用することによって明らかになる。しかしながら、現在の顕微鏡は単一の観察方向から試料を照射し、画像化している。したがって、励起光及び発せられた蛍光の偏光は、図２Ａ及び２Ｂに示されるように、照射／観察方向に対して垂直な平面に主に限定される。照射／観察方向に対して平行な双極子は、効率的に励起も検出もできず、したがって、三次元構造に結合した蛍光体の完全な配向分布を決定することを困難にするか、又は不可能にさえする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本開示の様々な態様は、とりわけ、これらの観察を念頭に置いて考案され、開発されたものである。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】図１は、本開示の一態様による蛍光顕微鏡システムの一実施形態を示す簡略図である。
【０００６】
【図２】図２Ａは、従来の落射蛍光顕微鏡の概略図を示し、図２Ｂは、本開示の一態様による、従来のデュアルビュー選択的平面照射顕微鏡システムの概略図を示す。
【０００７】
【図３】図３Ａ及び３Ｂは、本開示の一態様による、偏光分解励起によって生成された蛍光強度の落射検出を使用して三次元双極子配向を得るための測定スキームを示す。
【０００８】
【図４】図４Ａ及び４Ｂは、本開示の一態様による、偏光分解励起によって生成された蛍光強度の直交検出を使用して三次元双極子配向を得るための別の測定スキームを示す。
【０００９】
【図５】図５Ａは、照射光の異なる偏光で得られた撮像ボリュームに対応する最大強度投影画像を示す画像であり、図５Ｂは、本開示の一態様による、結果として得られる再構成を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
対応する参照符号は、図面中の対応する要素を示す。図面で使用される見出しは、特許請求の範囲を限定するものではない。
【００１１】
本明細書に記載されるように、試料から発せられる蛍光色素の双極子モーメントが双極子の三次元配向に関わりなく励起され得るように、蛍光偏光画像化を拡張するためのシステム及び方法を開示する。一態様では、双極子は複数の方向から励起され、それによって、双極子が検出対物レンズの軸（伝播）軸に沿って好ましくない向きになっている場合であっても、試料の励起が複数の向きに沿って起こることを保証する。一実施形態では、デュアルビュー倒立選択的平面照射顕微鏡（ｄｉＳＰＩＭ）を使用して、試料を照射し、試料から、互いに対して非平行な関係にある２つの異なる方向から発せられる、結果として生じる偏光蛍光発光を検出する。一実施形態では、試料の偏光分解励起及び発せられた偏光蛍光の落射検出が、試料を励起し、発せられた蛍光を検出するために使用される同じ励起／検出対物レンズの焦点面に沿って励起双極子の三次元配向を捕捉する。一実施形態では、試料から発せられる蛍光の励起及び非平行検出の交互シーケンスにおける試料の偏光分解励起は、それぞれの検出対物レンズの軸平面又は子午面における励起双極子の三次元配向の投影の実質的に大部分を捕捉する。一実施形態では、システムが１つ又は複数の対物レンズによって検出された試料によって発せられた偏光蛍光発光において検出された各励起双極子の位置及び三次元配向に関連するデータを捕捉するために、１つ又は複数の検出器と動作可能に通信するプロセッサを含む。プロセッサは、照射されている試料から発せられた蛍光発光において検出された各ボクセルにおける励起双極子の三次元方向及び位置を計算するように操作可能である。いくつかの実施形態では、システムがプロセッサが１つ又は複数の検出器によって検出された各励起双極子の位置及び三次元配向を決定することができるように、異なる励起偏光を有する複数の画像を捕捉する。図面を参照すると、照射された試料の各ボクセルの三次元双極子配向及び位置を決定するためのシステムの実施形態が示されており、図１〜図４に１００として一般的に示されている。
【００１２】
図１を参照すると、１００で示される蛍光顕微鏡システムの一実施形態が示されている。一態様では、蛍光顕微鏡システム１００は、照射されている試料１１４から発せられる蛍光発光における励起双極子の位置及び配向を決定するように操作可能である。
【００１３】
いくつかの実施形態では、蛍光顕微鏡システム１００は、光ビーム１０１を偏光１０３に偏光させるための第１の偏光光学系１２９によって偏光された光ビーム１０１を放射するための、光源１０２を含む。いくつかの実施形態では、第１の偏光光学系１２９は、光ビーム１０１を偏光させるために、波長板、偏光子、及び／又は１つ又は複数の液晶を含むことができる。いくつかの実施形態では、光源１０２はレーザ光ビームを放射するためのレーザであってもよいが、他の実施形態では、光源１０２は偏光可能な光ビームを放射するランプなどの他の光源であってもよい。
【００１４】
いくつかの実施形態では、偏光１０３はビームスプリッタ１０６によって分割偏光１０３Ａ及び１０３Ｂに分割されてもよい。いくつかの実施形態では、分割偏光１０３Ａは、第１の軸３００に沿って試料１１４を照射するために、分割偏光１０３Ａを分割偏光１０３Ｃにさらに偏光させるための第２の偏光光学系１３０を含み得る第１の対物レンズ１０８を介して第１のダイクロイックミラー１３４によって方向転換される。図示のように、分割偏光１０３Ｂは、第１の軸３００に対して直交関係にある第２の軸３０２に沿って試料１１４を照射するために、分割偏光１０３Ｂを分割偏光１０３Ｄにさらに偏光させるための第３の偏光光学系１３２を含み得る第２の対物レンズ１１０を介してダイクロイックミラー１３６によって方向転換される。
【００１５】
試料１１４が照射されると、試料１１４から第１の軸３００に実質的に直交する平面に沿って発せられる偏光蛍光発光１０５は、第１の対物レンズ１０８によって検出されるが、試料から第１の軸３００に実質的に平行な平面に沿って発せられる偏光蛍光発光１０５は、第１の対物レンズ１０８によって検出されない。さらに、試料１１４から第２の軸３０２に実質的に直交する平面に沿って発せられる偏光蛍光発光１０５は、第２の対物レンズ１１０によって検出されるが、試料１１４から第２の軸３０２に実質的に平行な平面に沿って発せられる偏光蛍光発光１０５は、第２の対物レンズ１１０によって検出されない。この構成では、第１の対物レンズ１０８と第２の対物レンズ１１０との間の直交関係により、蛍光顕微鏡システム１００は励起双極子を、それらの配向軸に関係なく検出することができる。他の実施形態では、第１の対物レンズ１０８及び第２の対物レンズ１１０は、互いに対して平行でない角度で配向されてもよい。
【００１６】
一構成では、第１の対物レンズ１０８によって検出された偏光蛍光発光１０５は、第１の検出器１１６による検出のために、第１の管レンズ１２２を通して第１のダイクロイックミラー１３４によって方向転換されてもよい。さらなる構成では、第２の対物レンズ１１０によって検出された蛍光発光１０５が第２の検出器１１８による検出のために、第２の管レンズ１２４を通って第２のダイクロイックミラー１３６によって方向転換されてもよい。
【００１７】
いくつかの実施形態では、第３の対物レンズ１１２を、試料１１４の平面３０４の下に配置し、第１の軸３００及び第２の軸３０２に対してそれぞれ１３５度の角度を形成する第３の軸３０６に沿って配向してもよい。第３の対物レンズ１１２は、試料１１４の平面３０４の下で、試料１１４の平面３０４に垂直な角度で発せられる蛍光発光１０５を検出するように機能する。いくつかの実施形態では、第３の対物レンズ１１２によって検出された蛍光発光１０５は、第３の検出器１２０による検出のために、第３の管レンズ１２６を通して撮像されてもよい。いくつかの実施形態では、第３の対物レンズ１１２が第１の軸３００及び第２の軸３０２に対してそれぞれ平行でない角度で配向されてもよい。
【００１８】
いくつかの実施形態では、第１の検出器１１６、第２の検出器１１８、及び第３の検出器１２０はそれぞれ、第１の検出器１１６、第２の検出器１１８、及び第３の検出器１２０から捕捉された蛍光発光１０５の画像に基づいて励起双極子の位置及び三次元配向を計算するための１つ又は複数のアルゴリズムを利用する１つ又は複数のプロセッサ１２８と動作可能に通信する。
【００１９】
いくつかの実施形態では、第１及び第２の対物レンズ１０８及び１１０は、例えば、ニコンＮＡ０．８レンズ、ニコンＮＡ０．８レンズ、ニコンＮＡ１．１レンズ、スペシャルオプティクス社ＮＡ０．７１レンズとすることができるが、他のタイプ又は種類の対物レンズも考えられる。
【００２０】
いくつかの実施形態では、蛍光顕微鏡システム１００は、落射検出動作モード（図２Ａ）又は直交検出動作モード（図２Ｂ）のいずれかで動作することができる。図２Ａに示す落射検出動作モードでは、単一の対物レンズ、例えば、第１の対物レンズ１０８が偏光光線を軸Ａに沿った方向に集束させて試料１１４を照射し、次いで、同じ対物レンズが試料によって発せられた結果として生じる蛍光発光を検出する。この検出モードでは、第１の対物レンズ１０８の軸に対して垂直な平面に沿って試料によって発せられた偏光蛍光発光が第１の対物レンズ１０８によって検出される。
【００２１】
図３Ａ及び３Ｂに示すように、落射検出動作モードでは、蛍光顕微鏡システム１００が同じ対物レンズ、例えば、第１の対物レンズ１０８を照射し、次いで、第１の対物レンズ１０８の軸３００に対して非平行な関係にある平面３０４に沿って配向された放射双極子の偏光蛍光発光を検出する。この構成では、第２の対物レンズ１１０は、第１の対物レンズ１０８が試料１１４を照射し結果として生じる偏光蛍光発光を検出するときは、不使用状態である。交互に、第１の対物レンズ１０８が照射及び検出のシーケンスを完了すると、第２の対物レンズ１１０が試料１１４を照射し、次いで、第２の対物レンズ１１０に対して平行に配向されていない励起双極子の偏光蛍光発光を検出する。換言すれば、第１の対物レンズ１０８は第２の対物レンズ１１０によって検出できない励起双極子の偏光蛍光発光を検出し、その逆も同様である。
【００２２】
図２Ｂに示す直交検出動作モードでは、二つの対物レンズ構成がそれぞれの検出対物レンズの軸に対して垂直な平面に沿って交互に、照射し、結果として生じる偏光蛍光発光を検出する。具体的には、第１の対物レンズ１０８が試料１１４を照射し、次いで第２の対物レンズ１１０が第２の対物レンズ１１０の軸に対して非平行な関係にある平面に沿って配向された励起双極子を検出する。次に、交互に、第２の対物レンズ１１０が試料１１４を照射し、第１の対物レンズ１０８が、第１の対物レンズ１０８の軸に対して非平行な関係にある平面に沿って配向された励起双極子を検出する。このようにして、第１及び第２の対物レンズ１０８及び１１０は、それぞれの対物レンズの軸に直接平行でない軸に沿って配向された励起双極子を検出することができ、その結果、第１及び第２の対物レンズ１０８及び１１０は集合的に、任意の特定の配向に沿って整列された励起双極子を検出することができる。
【００２３】
図４Ａ及び図４Ｂに示すように、直交検出動作モードでは、蛍光顕微鏡システム１００が上述の２つの対物レンズ構成を利用して、それぞれの検出対物レンズの軸に対して非平行な関係にある平面に沿って交互に、照射し、配向された励起双極子の結果として生じる蛍光発光を検出する。図４Ａを参照すると、第１の動作シーケンスにおいて、第１の対物レンズ１０８は第１の対物レンズ１０８の軸３００に沿って試料１１４を照射し、試料１１４から発せられる蛍光発光を生成する。次に、第２の対物レンズ１１０は、第２の対物レンズ１１０の軸３０２に対して非平行な関係にある平面に沿って配向された励起双極子からの蛍光発光を検出する。図４Ｂを参照すると、第２の動作シーケンスにおいて、第２の対物レンズ１１０は第２の対物レンズ１１０の軸３０２に沿って試料１１４を照射し、試料１１４から発せられる蛍光発光を生成する。次いで、第１の対物レンズ１０８は、第１の対物レンズ１０８の軸３００に対して非平行な関係にある平面に沿って配向された励起双極子からの蛍光発光を検出する。励起双極子は第１の対物レンズ１０８又は第２の対物レンズ１１０のいずれかに対して平行でない関係にある平面に沿って配向されるので、照射及び検出の交互のシーケンスは蛍光顕微鏡システム１００がそれぞれの励起双極子の配向に関わりなく、励起双極子によって発せられる蛍光発光を検出することを可能にする。
【００２４】
いくつかの実施形態では、プロセッサ１２８が第１の対物レンズ１０８、第２の対物レンズ１１０、及び第３の対物レンズ１１２によってそれぞれ検出された第１の蛍光発光、第２の蛍光発光、及び第３の蛍光発光の画像に基づいて、各励起双極子の位置及び配向を生成する。そのようなものとして、プロセッサ１２８は、少なくとも三次元配向で１つ以上の三次元構造に結合された検出された励起双極子の配向分布を生成する。
【００２５】
さらに、レーザ光ビーム１０１の偏光状態は、第１の偏光光学系１２９、第２の偏光光学系１３０及び／又は第３の偏光光学系１３２によって任意に変更することができる。検出器１２８は、各偏光状態について、第１、第２、及び／又は第３の蛍光発光１０５の画像を収集することができる。
【００２６】
いくつかの実施形態ではビームスプリッタ１０６は必要とされず、第１、第２、及び第３の対物レンズ１０８、１１０、及び１１２のそれぞれは、必ずしも他の２つの光源１０２から必ずしも独立しているわけではない専用光源１０１を有することができる。
【００２７】
［試験］
プロトタイプの顕微鏡システムを、この方法を実施に移すことができるように構築した。プロトタイプ顕微鏡システムは、各対物レンズを通して偏光励起を生成するための偏光光学系を装備した非対称対物レンズ（図１に示す第１及び第２の対物レンズ１１０及び１０８に対応する、ニコンＮＡ１．１、スペシャルオプティクス社０．７１ＮＡ）を有するデュアルビュー倒立ＳＰＩＭを含んでいた。この方法を実証するため、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ファロイジンで免疫染色したアクチンフィラメントを画像化した。この標識はアクチンフィラメントに強く結合し、結合したフィラメントの相対配向及び分極励起に依存する強く分極した蛍光を生成する。８つの容積積スタックを得たが、まず、１０８の異なる配向（０°、４５°、９０°、及び１３５°、図５の実施例、左側）によって導入された偏光照射で試料を励起し、１１０を通して蛍光を収集し、次にこの過程を、１１０を通して偏光照射（配向０°、４５°、９０°、及び１３５°、１０８を通して蛍光を収集）によって繰り返すことによって得た。
【００２８】
次に、各ボクセルの平均配向を予測するアルゴリズムを利用して、プロセッサ上で再構成を実行した。このアルゴリズムは、励起及び放射プロセスのモデルを使用して、平均双極子配向と機材によって測定された強度との間の関係を推測する。測定された強度から平均双極子配向を回復するために、物体を球面調和関数に展開し、角周波数空間における線形化再構成問題を解いた。図５Ａに示すように、例示的な生データ（固定Ｕ２０２細胞中のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）ファロイジン標識アクチン）は、照射光の異なる偏光（ＮＡ０．７１対物レンズ（第１の対物レンズ１０８）を通して導入され、ＮＡ１．１対物レンズ（第２の対物レンズ１１０）を通して収集された）で得られた撮像容積に対応する最大強度投影画像を示す。入力照射の向きは、各画像への挿入図に示されている。このデータに加えて、第１の対物レンズ１０８を介して収集された（第２の対物レンズ１１０を介して異なる向きで励起された）４つの容積の追加のセットが再構成アルゴリズムへの入力データを形成する。図５Ｂは再構成の結果を示している。データからの例示的な投影は、各ボクセル内の向き（ブラウングリフ）を示す。一態様では、再構成が照射の異なる向きで捕捉されたマルチビュー蛍光画像から向きを導出することを可能にする。
【００２９】
以上から、特定の実施形態を図示し、説明したが、当業者には明らかなように、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、様々な修正を行うことができることを理解されたい。そのような変更及び修正は、添付の特許請求の範囲に定義される本発明の範囲及び教示の範囲内である。
【図１】
2020527246.tif 000003
【図２Ａ】
2020527246.tif 000004
【図２Ｂ】
2020527246.tif 000005
【図３Ａ】
2020527246.tif 000006
【図３Ｂ】
2020527246.tif 000007
【図４Ａ】
2020527246.tif 000008
【図４Ｂ】
2020527246.tif 000009
【図５Ａ−５Ｂ】
2020527246.tif 000010
【国際調査報告】
2020527246.tif 000011
2020527246.tif 000012