(57)【要約】本開示は、ヒドロキシ安息香酸および類似体に基づく新しいミトコンドリア向性抗酸化化合物の設計および合成に関する。さらに、本開示は、例えば、ヒトおよび動物の疾患の分野における、例えばミトコンドリア機能障害またはミトコンドリア欠乏症を治療するためのヒドロキシ安息香酸ベースの誘導体および類似体、ならびに例えば肌の老化を予防または遅らせるための化粧品の方法および使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬における使用のための、式Ｉの化合物： 
【化１】
2020503280.tif 000012
または塩、溶媒和物、水和物、互変異性体、立体異性体。
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、互いに独立して選択され；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、Ｈ、ハロゲン、ヒドロキシル、メチル、メトキシル、アミノ、カルボン酸、またはニトロ基から選択され；
Ｒ６は、２級アミドまたは３級アミドであり；
Ｒ７は、アルキル鎖、アルケニル鎖、アルキニル鎖、置換アリールまたは２級アミドであり；
Ｚ−は、許容されるアニオンである。）
【請求項２】
式Ｉの化合物： 
【化２】
2020503280.tif 000013
または塩、溶媒和物、水和物、互変異性体、立体異性体であり、
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、互いに独立して選択され；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、Ｈ、ハロゲン、ヒドロキシル、メチル、メトキシル、アミノ、カルボン酸、またはニトロ基から選択され；
Ｒ６は、２級アミドまたは３級アミドであり；
Ｒ７は、アルキル鎖、アルケニル鎖、アルキニル鎖、置換アリールまたは２級アミドであり；
Ｚ−は、許容されるアニオンであり；
ただし、以下の化合物を除く。
【化３】
2020503280.tif 000014
【請求項３】
以下の化合物である、請求項１または２に記載の化合物。
【化４】
2020503280.tif 000015
【請求項４】
以下の化合物である、請求項１または２に記載の化合物。
【化５】
2020503280.tif 000016
【請求項５】
Ｒ７が、Ｒ８−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−Ｒ９アミドの２級アミドであり；
Ｒ８およびＲ９が、互いに独立して選択され；
Ｒ８およびＲ９は、アルキル鎖、アルケニル鎖、アルキニル鎖または置換アリールである、前請求項のいずれかに記載の化合物。
【請求項６】
前記置換アリールが、アルカン−アリール置換、アルケン−アリール置換、またはアルキン−アリール置換である、前請求項のいずれかに記載の化合物。
【請求項７】
前記アルカン−アリール置換、前記アルケン−アリール置換、または前記アルキン−アリール置換が、以下である、前請求項のいずれかに記載の化合物。
Ｃ１〜Ｃ６−アルキル、Ｃ３〜Ｃ８−シクロアルキル、Ｃ６〜Ｃ１０−アリール、Ｃ６〜Ｃ１０−アリール−Ｃ１〜Ｃ８−アルキル、Ｃ１〜Ｃ６−アルコキシ、Ｃ６〜Ｃ１０−アリールオキシ、Ｃ６〜Ｃ１０−アリール−Ｃ１〜Ｃ８−アルコキシ、ヒドロキシル、ＣＯ２Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６−アルコキシカルボニル、Ｃ６〜Ｃ１０−アリールオキシカルボニル、Ｃ６〜Ｃ１０−アリール−Ｃ１〜Ｃ８−アルコキシカルボニル、Ｃ１〜Ｃ６−アルキルカルボニル、Ｃ６〜Ｃ１０−アリールカルボニル、Ｃ６〜Ｃ１０−アリール−Ｃ１〜Ｃ８−アルキルカルボニル、Ｃ１〜Ｃ６−アルキルカルボキシ、Ｃ６〜Ｃ１０−アリールカルボキシ、Ｃ１〜Ｃ６−アルキルメルカプチル、Ｃ６〜Ｃ１０−アリールメルカプチル、Ｃ１〜Ｃ６−アルキルメルカプトカルボニル、Ｃ３〜Ｃ８−シクロアルキルメルカプトカルボニル、Ｃ６〜Ｃ１０−アリールメルカプトカルボニル、Ｃ１〜Ｃ６−アルキルメルカプトカルボキシ、Ｃ６〜Ｃ１０−アリールメルカプトカルボキシ、Ｃ１〜Ｃ６−アルキルスルホニル、Ｃ６〜Ｃ１０−アリールスルホニル、Ｃ１〜Ｃ６−アルキルスルホキシ、Ｃ６〜Ｃ１０−アリールスルホキシ；
これらのそれぞれがＣ１〜Ｃ６−アルキル、Ｃ１〜Ｃ６−アルコキシ、ＣＯＯＨで１回または数回置換されており；ＣＯＮＨ２、Ｃ１〜Ｃ６−アルキルで１回または２回置換されており；ＳＯ３Ｈ、アミノ、チオール、ヒドロキシル、ニトロ、シアノ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、ＣＦ３またはＯＣＦ３；
ここで、これらの任意選択の置換基のいくつかは組み合わされて、anellated飽和、不飽和または芳香族のホモ環系またはヘテロ環系を形成し；または
Ｃ１〜Ｃ６−アルキル、Ｃ１〜Ｃ６−アルコキシ、ＣＯＯＨで１回または数回置換されている飽和、不飽和または芳香族複素環；ＣＯＮＨ２、１回または２回置換されている。
【請求項８】
前記アルキル鎖、前記アルケニル鎖または前記アルキニル鎖が、Ｃ１〜Ｃ３０鎖、好ましくはＣ１〜Ｃ１８鎖である、前請求項のいずれかに記載の化合物。
【請求項９】
前記アルキル鎖、前記アルケニル鎖または前記アルキニル鎖が、Ｃ２〜Ｃ１６鎖、好ましくはＣ３〜Ｃ１６鎖、より好ましくはＣ５〜Ｃ１４鎖、さらにより好ましくはＣ６〜Ｃ１４鎖である、前請求項のいずれかに記載の化合物。
【請求項１０】
前記アルキル鎖が、Ｃ５アルキル鎖、Ｃ６アルキル鎖、Ｃ７アルキル鎖、Ｃ８アルキル鎖、Ｃ９アルキル鎖、Ｃ１０アルキル鎖、Ｃ１１アルキル鎖、Ｃ１２アルキル鎖、Ｃ１３アルキル鎖、またはＣ１４アルキル鎖である、前請求項のいずれかに記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒ１およびＲ５が、Ｈである、前請求項のいずれかに記載の化合物。
【請求項１２】
Ｒ２およびＲ３が、ＯＨである、前請求項のいずれかに記載の化合物。
【請求項１３】
Ｒ４が、ＨまたはＯＨである、前請求項のいずれかに記載の化合物。
【請求項１４】
Ｒ７が、Ｃ６アルキル鎖である、前請求項のいずれかに記載の化合物。
【請求項１５】
Ｒ８およびＲ９が、互いに独立してＣ５アルキル鎖またはＣ６アルキル鎖である、前請求項のいずれかに記載の化合物。
【請求項１６】
前記ハロゲンが、Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｉ，Ａｔである、前請求項のいずれかに記載の化合物。
【請求項１７】
前記化合物が、６−（３，４−ジヒドロキシベンズアミド）ヘキシルトリフェニルホスホニウムブロミドである、前請求項のいずれかに記載の化合物。
【請求項１８】
前記化合物が、６−（３，４，５−トリヒドロキシベンズアミド）ヘキシルトリフェニルホスホニウムブロミドである、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１９】
前記化合物が、５−（６−（３，４，５−トリヒドロキシベンズアミド）ヘキシルアミノ）カルボニルペンチル］トリフェニルホスホニウムブロミドである、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２０】
ミトコンドリアの形態およびＯＸＰＨＯＳ酵素の発現の少なくとも１つの調節における使用のための、前請求項のいずれかに記載の化合物。
【請求項２１】
ミトコンドリア障害に関連する症状またはミトコンドリア機能不全またはミトコンドリア疾患に関連する状態に関連する症状の、治療または予防または抑制のための使用のための、前請求項のいずれかに記載の化合物。
【請求項２２】
前記ミトコンドリア障害が、ミオクローヌスてんかん；赤色ぼろ線維ミオクローヌスてんかん；レーベル遺伝性視神経症；神経障害性運動失調症および網膜色素変性症；ミトコンドリアミオパチー、脳症、乳酸アシドーシス、脳卒中；リー症候群；リー様症候群；優性視神経萎縮症；カーンズ−セイヤー症候群；母性遺伝性糖尿病と難聴；Ａｌｐｅｒｓ−Ｈｕｔｔｅｎｌｏｃｈｅｒ症候群；運動失調症ニューロパチースペクトル；慢性進行性外眼筋麻痺；ピアソン症候群；ミトコンドリア神経胃腸脳症；センガース症候群；３−メチルグルタコン酸尿症、感音難聴、脳症およびリー様症候群の神経放射線学的所見；ミオパチー；ミトコンドリアミオパチー；心筋症；複合体ＩＶのサーフェイトタンパク質欠乏によるリー症候群の欠如；ピルビン酸の酸化の乱れとＡＴＰ＋ＰＣＲ産生率を含む、これまでのところ解決されていない遺伝的欠陥を伴う、単離された、または組み合わされたＯＸＰＨＯＳ欠乏症からなる群から選択される障害である、前請求項のいずれかに記載の化合物。
【請求項２３】
前記ミトコンドリア機能障害に関連する状態が、フリードライヒ失調症；尿細管性アシドーシス；パーキンソン病；アルツハイマー病；筋萎縮性側索硬化症；ハンチントン病；発達性広汎性疾患；難聴；聾；糖尿病；老化；ミトコンドリア機能を阻害する薬の副作用からなる群から選択される状態である、前請求項のいずれかに記載の化合物。
【請求項２４】
神経変性疾患、非アルコール性脂肪性肝疾患、腫瘍、癌、腎臓病、強皮症、肝鉄過剰症、肝銅過剰症、脱毛症、ヒト不妊症、急性膵炎、線維筋痛症、ミトコンドリア障害、またはミトコンドリア機能障害またはミトコンドリア疾患に関連する状態の治療または予防または抑制における使用のための、前請求項のいずれかに記載の化合物。
【請求項２５】
神経変性疾患、前記神経変性疾患が、特に筋萎縮性側索硬化症である、の治療または予防における使用のための、前請求項のいずれかに記載の化合物。
【請求項２６】
肝臓癌、膵臓癌または胆道癌である、癌の治療または予防における使用のための、前請求項のいずれかに記載の化合物。
【請求項２７】
非アルコール性脂肪性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎または肝硬変である、非アルコール性脂肪性肝疾患の治療または予防における使用のための、前請求項のいずれかに記載の化合物。
【請求項２８】
腎臓癌または腎不全である、腎臓病の治療または予防における使用のための、前請求項のいずれかに記載の化合物。
【請求項２９】
前記腫瘍疾患が、癌、特に基底細胞癌、骨癌、腸癌、脳腫瘍、乳癌、子宮頸癌、白血病、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、黒色腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、甲状腺癌または胆道癌である、前請求項のいずれかに記載の化合物。
【請求項３０】
抗菌剤として、特に消毒剤として使用するための、前請求項のいずれかに記載の化合物。
【請求項３１】
多能性細胞培養物の維持、細胞培養物の補足として、特に増殖培地化合物として使用するための、前請求項のいずれかに記載の化合物。
【請求項３２】
筋肉プロテクターまたは身体運動後の筋肉回復としての使用のための、前請求項のいずれかに記載の化合物。
【請求項３３】
化粧品、またはサプリメント、または栄養補助食品、すなわち老化防止剤として、または抗シワスキンケア製品として使用するための、前請求項のいずれかに記載の化合物。
【請求項３４】
イメージング研究、特にミトコンドリアイメージング研究を監視するためのプローブとして使用するための、前請求項のいずれかに記載の化合物。
【請求項３５】
前請求項に記載の化合物のいずれかを含む、多能性幹細胞を未分化状態に維持するための細胞培養培地。
【請求項３６】
請求項１〜３５の化合物のいずれかと、薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤、希釈剤、またはそれらの組合せとを含む組成物、好ましくは医薬組成物または化粧品組成物。
【請求項３７】
前記薬学的に許容される担体が、以下のリスト：食塩水、アラビアゴム、ゼラチン、デンプンペースト、タルク、ケラチン、コロイドシリカ、尿素、またはそれらの組合せから選択される、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
前記アジュバントが、以下のリスト：水中油型エマルションアジュバント、アルミニウムアジュバント、ＴＬＲ−４リガンド、サポニン、およびそれらの組合せから選択される、請求項３６または３７に記載の組成物。
【請求項３９】
前記賦形剤が、以下のリスト：グルコース、ラクトース、スクロース、モノステアリン酸グリセロール、塩化ナトリウム、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール、またはそれらの組合せから選択される、請求項３６〜３８のいずれかに記載の組成物。
【請求項４０】
前記医薬組成物が、局所投与、経口投与、非経口投与または注射可能な投与により投与される、請求項３６〜３９のいずれかに記載の組成物。
【請求項４１】
神経変性疾患、非アルコール性脂肪性肝疾患、腫瘍、腎臓病、強皮症、肝鉄過剰症、肝銅過剰症、脱毛症、ヒト不妊症、急性膵炎または線維筋痛症の治療または予防のための方法における使用のための組成物であって、前記医薬組成物は一日量で投与される、請求項３１〜４０のいずれかに記載の組成物。
【請求項４２】
前記一日量が、２０ｍｇ／日または１０ｍｇ／日である、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
請求項１〜３４の化合物または請求項３６〜４２の組成物を含む、ナノキャリア。
【請求項４４】
請求項１〜３４の化合物または請求項３６〜４２の組成物を含む、リポソーム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、ヒドロキシ安息香酸および類似体に基づく新しいミトコンドリア向性抗酸化化合物の設計および合成に関する。さらに、本開示は、例えば、ヒトおよび動物の疾患の分野における、例えばミトコンドリア機能障害またはミトコンドリア欠乏症を治療するための、ヒドロキシ安息香酸ベースの誘導体および類似体の方法および使用、ならびに例えば肌の老化を予防するまたは遅らせるための化粧品に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミトコンドリアは、エネルギー代謝、サイトゾルカルシウム濃度、ＲＯＳ産生、および細胞死経路の調節において極めて重要な役割を果たす。過剰なＲＯＳ産生は、固有の防御機構によって妨げられない場合、脂質、タンパク質および核酸などの細胞成分に酸化的損傷を引き起こす可能性があり、それはその後の壊死またはアポトーシスによる細胞死につながる。
【０００３】
増強された酸化ストレスから生じるミトコンドリア変化は、癌、卒中、心不全、肥満および神経変性疾患などの酸化ストレス関連疾患において重要な役割を果たす１。オルガネラ特異的薬物によるミトコンドリアの標的化は有効な治療戦略であると考えられている。より具体的には、ミトコンドリアへの抗酸化剤の選択的送達を介して細胞のＲＯＳバランスを制御することは、酸化ストレス関連疾患の予防および／または治療のための効果的かつ有望な治療戦略として記載されている２。
【０００４】
ＲＯＳ産生は内因性抗酸化ネットワークによって厳密に調節されるが、その過剰産生はミトコンドリアの酸化的損傷および機能不全をもたらし得る。ミトコンドリアの酸化的機能障害は、複数の代謝経路およびシグナル伝達経路を損ない、アポトーシスまたは壊死を介して細胞死を引き起こす可能性がある。
【０００５】
酸化ストレスおよびミトコンドリア機能不全は、加齢およびいくつかの酸化ストレス関連病状、例えば糖尿病、非アルコール性脂肪肝疾患、心血管疾患、急性膵炎およびアルツハイマー病またはパーキンソン病を含む神経変性疾患、ならびに筋萎縮性側索硬化症に関連している。したがって、ミトコンドリアの酸化的損傷の防止は、今日、疾患の進行を遅らせるための認められた薬理学的戦略である。
【０００６】
病理学的事象において、内因性抗酸化剤防御のプールは、増加した酸化剤産生に対処するのに十分ではないかもしれず、外因性抗酸化剤が内因性防御システムの不十分さを補うだけでなく、全体的な抗酸化反応も改善することを考慮すると、外因性抗酸化剤の投与が、細胞傷害を減少させるのに有益であり得ることが示唆されている。外因性抗酸化剤は、理論的には、異なるレベルで酸化的損傷経路の複雑なネットワークを遮断し、治療効果をもたらし得る。結果として、食事から外因的に獲得される抗酸化剤は、酸化還元細胞恒常性において重要な機能を有し得、そして細胞機能および疾患予防にとって重要であり得る。
【０００７】
疾患の病因におけるミトコンドリアの役割はかなり一致しているが、破壊を防ぐためにその細胞小器官を標的にすることは必ずしも簡単ではない。酸化的損傷の予防／最小化によるミトコンドリア機能の改善は、有効かつ有望な治療戦略である。ＲＯＳ／酸化防止剤比および酸化還元維持を維持することは細胞シグナル伝達にとって重要であるので、機能不全ミトコンドリアへの酸化防止剤の標的化は薬理学的に興味深い。
【０００８】
多数のミトコンドリア標的抗酸化剤、特に担体としてトリフェニルホスホニウム（ＴＰＰ）を使用する抗酸化剤が開発されている。このタイプの親油性カチオンは、内膜電位勾配を利用してミトコンドリア膜を通過し、ミトコンドリアマトリックス内に蓄積することができる３〜５。
【０００９】
最も研究されているミトコンドリア標的化抗酸化剤の一つは、ミトキノン（ＭｉｔｏＱ、ＭｉｔｏＱ１０、［１０−（４，５−ジメトキシ−２−メチル−３，６−ジオキソ−１，４−シクロヘキサジエン−１−イル）デシル］トリフェニルホスホニウムメタンスルホネート）である。ＭｉｔｏＱは、１０炭素アルキル鎖（ｄＴＰＰ）スペーサーとトリフェニルホスホニウム（ＴＰＰ）カチオンとに共有結合した内因性抗酸化剤部分（コエンザイムＱ）によって構成されている。ＭｉｔｏＱはさまざまな病理学的事象、すなわちＣ型肝炎について臨床試験中である。しかし、ＭｉｔｏＱを神経変性疾患の治療薬として使用する臨床試験では残念な結果が得られている４，５。
【００１０】
他の関連するミトコンドリア標的化抗酸化剤は、ＳＫＱ１［１０−（４，５−ジメチル−３，６−ジオキソシクロヘキサ−１，４−ジエン−１−イル）デシル）トリフェニルホスホニウムブロミド）］であり、これはプラストキノン、葉緑体の電子伝達連鎖に関与するキノンに基づく。ＳｋＱ１は、ミトコンドリア内の酸化ストレスを減少させ、ドライアイ状態に対して有意な保護効果を提供することが示された。
【００１１】
それにもかかわらず、治療において、ならびにサプリメントまたは栄養補助食品などの他の用途において、ならびに化粧品分野において使用される、より効果的で安全なミトコンドリアモジュレーターが依然として必要とされている。
【００１２】
ポリフェノールは、ヒトの食事を構成する果物、野菜、穀物および飲料に広く見出される、酸化的ストレスに対する防御に一般に関与する植物の二次代謝産物である。従来の西洋式食事におけるそれらの毎日の食事摂取量は約１ｇと推定された。疫学的研究および関連するメタアナリシスは、ポリフェノールに富む食事の摂取と、癌、糖尿病、心血管疾患および神経変性疾患などの酸化ストレス関連疾患の予防との間の関連を強く示唆した。
【００１３】
フェノール酸サブクラスであるヒドロキシ安息香酸（ＨＢＡ）は、少なくとも１個のヒドロキシル基に結合した７個の炭素原子（Ｃ６−Ｃ１）を含む。いくつかのＨＢＡ誘導体は現在、栄養素の酸化を防止するまたは最小限に抑え、食品の栄養価を維持または向上させるための食品抗酸化添加剤として使用されている。ヒドロキシ安息香酸およびその誘導体は、それらの抗酸化特性のために化粧品および製薬産業において賦形剤としても使用されている。しかしながら、主にそれらの有効性に関連していくつかの欠点が指摘されている。
【００１４】
ＨＢＡの抗酸化活性は、それらのキレート化特性およびフリーラジカル捕捉特性と、すなわち脂質過酸化プロセスを阻害することによって関連している。ＨＢＡ誘導体は、活性酸素種（ＲＯＳ）産生に関与するいくつかの酸化促進酵素の阻害において役割を果たすことができることも現在認識されている。科学的証拠によると、ＨＢＡの抗酸化効果は芳香環上のヒドロキシル基の数と位置に関係している。これらの異なる作用機序は、ＲＯＳ形成の阻害または低減、フリーラジカル連鎖反応の伝播の妨害、またはそれらの開始もしくは反応速度の遅延をもたらし得る。
【００１５】
治療における単独またはアジュバントでのＨＢＡおよびそれらの誘導体の有用性は、生物学的利用能および薬効の限界のために主に制限されている。それらの推定健康増進特性にもかかわらず、経口投与されたポリフェノールの生物学的利用能は、全身療法のために十分な濃度、主にそれらの物理化学的特性（例えば親油性）および広範かつ急速な代謝に関連する問題を許容するには不十分である。ＨＢＡの親油性および安定性を高め、より優れた生物学的利用能を可能にし、ミトコンドリアなどの細胞内標的へのそれらの送達を改善するために、これまでに様々な戦略が開発されてきた。
【００１６】
これらの事実は、本開示によって対処される技術的問題を説明するために開示されている。
【００１７】
一般的な説明
ミトコンドリアは多くの分子にとって魅力的な標的であり、それは異なる病理学の状況においてオルガネラの損傷を最小にすることができる。
【００１８】
増加する証拠は、様々な病理学および老化プロセスにおいて決定的な役割を果たす酸化的ストレス事象をミトコンドリア機能不全が増幅することを示唆している。ミトコンドリア鉄硫黄中心、膜多価不飽和脂肪酸、タンパク質およびミトコンドリアＤＮＡは酸化的損傷を受けやすく、しばしばオルガネラおよび細胞破壊を引き起こす。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本開示は、食事のヒドロキシ安息香酸および類似体（ＡｎｔｉＯｘＢＥＮ）に基づく新しいミトコンドリア向性抗酸化剤の設計および合成を報告する。
【００２０】
天然モデルに基づく有効な抗酸化剤の開発に関連する本開示の一部として、本明細書では、低い細胞毒性プロファイルを維持しながら、強力な抗酸化および鉄キレート化特性を有する、天然食事性ＨＢＡに基づく新規なミトコンドリア指向抗酸化剤の開発を報告する。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本開示は、医薬における使用のための、式Ｉの化合物、または塩、溶媒和物、水和物、互変異性体、立体異性体；好ましくは薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、互変異性体、立体異性体に関する：
【化１】
2020503280.tif 000002
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、互いに独立して選択され；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、Ｈ、ハロゲン、ヒドロキシル、メチル、メトキシル、アミノ、カルボン酸、またはニトロ基から選択され；
Ｒ６は、２級アミドまたは３級アミドであり；
Ｒ７は、アルキル鎖、アルケニル鎖、アルキニル鎖、置換アリールまたは２級アミドであり；
Ｚ−は、許容されるアニオン、好ましくは許容される医薬アニオン、特にハロゲン、さらに特にＣｌである。
【００２２】
本開示は、式Ｉの化合物、または塩、溶媒和物、水和物、互変異性体、立体異性体；好ましくは薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、互変異性体、立体異性体に関する：
【化２】
2020503280.tif 000003
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、互いに独立して選択され；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、Ｈ、ハロゲン、ヒドロキシル、メチル、メトキシル、アミノ、カルボン酸、またはニトロ基から選択され；
Ｒ６は、２級アミドまたは３級アミドであり；
Ｒ７は、アルキル鎖、アルケニル鎖、アルキニル鎖、置換アリールまたは２級アミドであり；
Ｚ−は、許容されるアニオン、好ましくは許容される医薬アニオン、特にハロゲン、さらに特にＣｌであり；
ただし、以下を除く。
【化３】
2020503280.tif 000004
【００２３】
国際純正応用化学連合（ＩＵＰＡＣ）の定義に基づいて、アルキル基は、任意の炭素原子から水素原子を除去することによってアルカンから誘導される一価の基−ＣｎＨ２ｎ＋１として定義される。非分岐アルカンの末端炭素原子から水素原子を除去することによって誘導される基は、直鎖アルキル（ｎ−アルキル）基Ｈ（ＣＨ２）ｎのサブクラスを形成する。基ＲＣＨ２、Ｒ２ＣＨ（ＲはＨでない）、およびＲ３Ｃ（ＲはＨでない）は、それぞれ一級、二級および三級アルキル基である。アリール基は、環炭素原子から水素原子を除去することによってアレーン（単環式および多環式芳香族炭化水素）から誘導される。
【００２４】
「アルキル」は「低級アルキル」を含み、３０個以下の炭素原子を有する炭素フラグメントを網羅するように拡大する。アルキル基の例には、オクチル、ノニル、ノルボルニル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、エイコシル、３，７−ジエチル−２，２−ジメチル−４−プロピルノニル、２−（シクロドデシル）エチル、アダマンチルなどが挙げられる。
【００２５】
「低級アルキル」は、１〜７個の炭素原子のアルキル基を意味する。低級アルキル基の例には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチルおよびｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、２−メチルシクロプロピル、シクロプロピルメチルなどが含まれる。
【００２６】
一実施形態では、式Ｉの化合物は、以下である：
【化４】
2020503280.tif 000005
【００２７】
一実施形態では、式Ｉの化合物は、以下である：
【化５】
2020503280.tif 000006
【００２８】
一実施形態では、
Ｒ７は、Ｒ８−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−Ｒ９アミドの２級アミドであり；
Ｒ８およびＲ９は、互いに独立して選択され；
Ｒ８およびＲ９は、アルキル鎖、アルケニル鎖、アルキニル鎖または置換アリールである。
【００２９】
一実施形態では、置換アリールは、アルカン−アリール置換、アルケン−アリール置換、またはアルキン−アリール置換である。
【００３０】
一実施形態では、アルカン−アリール置換、アルケン−アリール置換、またはアルキン−アリール置換は、以下である。
Ｃ１〜Ｃ６−アルキル、Ｃ３〜Ｃ８−シクロアルキル、Ｃ６〜Ｃ１０−アリール、Ｃ６〜Ｃ１０−アリール−Ｃ１〜Ｃ８−アルキル、Ｃ１〜Ｃ６−アルコキシ、Ｃ６〜Ｃ１０−アリールオキシ、Ｃ６〜Ｃ１０−アリール−Ｃ１〜Ｃ８−アルコキシ、ヒドロキシル、ＣＯ２Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６−アルコキシカルボニル、Ｃ６〜Ｃ１０−アリールオキシカルボニル、Ｃ６〜Ｃ１０−アリール−Ｃ１〜Ｃ８−アルコキシカルボニル、Ｃ１〜Ｃ６−アルキルカルボニル、Ｃ６〜Ｃ１０−アリールカルボニル、Ｃ６〜Ｃ１０−アリール−Ｃ１〜Ｃ８−アルキルカルボニル、Ｃ１〜Ｃ６−アルキルカルボキシ、Ｃ６〜Ｃ１０−アリールカルボキシ、Ｃ１〜Ｃ６−アルキルメルカプチル、Ｃ６〜Ｃ１０−アリールメルカプチル、Ｃ１〜Ｃ６−アルキルメルカプトカルボニル、Ｃ３〜Ｃ８−シクロアルキルメルカプトカルボニル、Ｃ６〜Ｃ１０−アリールメルカプトカルボニル、Ｃ１〜Ｃ６−アルキルメルカプトカルボキシ、Ｃ６〜Ｃ１０−アリールメルカプトカルボキシ、Ｃ１〜Ｃ６−アルキルスルホニル、Ｃ６〜Ｃ１０−アリールスルホニル、Ｃ１〜Ｃ６−アルキルスルホキシ、Ｃ６〜Ｃ１０−アリールスルホキシ；
これらのそれぞれがＣ１〜Ｃ６−アルキル、Ｃ１〜Ｃ６−アルコキシ、ＣＯＯＨで１回または数回置換されており；ＣＯＮＨ２、Ｃ１〜Ｃ６−アルキルで１回または２回置換されており；ＳＯ３Ｈ、アミノ、チオール、ヒドロキシル、ニトロ、シアノ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、ＣＦ３またはＯＣＦ３；
ここで、これらの任意選択の置換基のいくつかは組み合わされて、anellated飽和、不飽和または芳香族のホモ環系またはヘテロ環系を形成し；または
Ｃ１〜Ｃ６−アルキル、Ｃ１〜Ｃ６−アルコキシ、ＣＯＯＨで１回または数回置換されている飽和、不飽和または芳香族複素環；ＣＯＮＨ２、１回または２回置換された。
【００３１】
一実施形態では、アルキル鎖、アルケニル鎖またはアルキニル鎖は、Ｃ１〜Ｃ３０鎖、好ましくはＣ１〜Ｃ１８鎖である。
【００３２】
一実施形態では、アルキル鎖、アルケニル鎖またはアルキニル鎖は、Ｃ２〜Ｃ１６鎖、好ましくはＣ３〜Ｃ１６鎖、より好ましくはＣ５〜Ｃ１４鎖、さらにより好ましくはＣ６〜Ｃ１４鎖である。
【００３３】
一実施形態では、アルキル鎖は、Ｃ５アルキル鎖、Ｃ６アルキル鎖、Ｃ７アルキル鎖、Ｃ８アルキル鎖、Ｃ９アルキル鎖、Ｃ１０アルキル鎖、Ｃ１１アルキル鎖、Ｃ１２アルキル鎖、Ｃ１３アルキル鎖、またはＣ１４アルキル鎖である。
【００３４】
一実施形態では、Ｒ１およびＲ５は、Ｈである。
【００３５】
一実施形態では、Ｒ２およびＲ３は、ＯＨである。
【００３６】
一実施形態では、Ｒ４は、ＨまたはＯＨである。
【００３７】
一実施形態では、Ｒ７は、Ｃ６アルキル鎖である。
【００３８】
一実施形態では、Ｒ８およびＲ９は、互いに独立してＣ５アルキル鎖またはＣ６アルキル鎖である。
【００３９】
一実施形態では、ハロゲンは、Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ，ＩまたはＡｔである。
【００４０】
一実施形態では、化合物は、６−（３，４−ジヒドロキシベンズアミド）ヘキシルトリフェニルホスホニウムブロミドである。
【００４１】
一実施形態では、化合物は、６−（３，４，５−トリヒドロキシベンズアミド）ヘキシルトリフェニルホスホニウムブロミドである。
【００４２】
一実施形態では、化合物は、５−（６−（３，４，５−トリヒドロキシベンズアミド）ヘキシルアミノ）カルボニルペンチル］トリフェニルホスホニウムブロミドである。
【００４３】
本開示はまた、医学、獣医学または化粧品における使用のためにここで開示されている任意の化合物、または関連化合物に関する。
【００４４】
一実施形態において、開示された化合物、または関連化合物は、ミトコンドリアの形態および／またはＯＸＰＨＯＳ酵素の発現のうちの少なくとも１つを調節するために使用されてもよい。
【００４５】
一実施形態では、開示された化合物、または関連化合物は、ミトコンドリア障害に関連する症状、またはミトコンドリア機能不全に関連する症状全般（ミトコンドリア呼吸鎖欠陥に起因する疾患を含む）の治療または予防または抑制に使用できる。
【００４６】
一実施形態では、ミトコンドリア障害は、ミオクローヌスてんかん；赤色ぼろ線維ミオクローヌスてんかん；レーベル遺伝性視神経症；神経障害性運動失調症および網膜色素変性症；ミトコンドリアミオパチー、脳症、乳酸アシドーシス、脳卒中；リー症候群；リー様症候群；優性視神経萎縮症；カーンズ−セイヤー症候群；母性遺伝性糖尿病と難聴；Ａｌｐｅｒｓ−Ｈｕｔｔｅｎｌｏｃｈｅｒ症候群；運動失調症ニューロパチースペクトル；慢性進行性外眼筋麻痺；ピアソン症候群；ミトコンドリア神経胃腸脳症；センガース症候群；３−メチルグルタコン酸尿症、感音難聴、脳症およびリー様症候群の神経放射線学的所見；ミオパチー；ミトコンドリアミオパチー；心筋症；脳ミオパチー、複合体ＩＶのサーフェイトタンパク質欠乏によるリー症候群の欠如；ピルビン酸の酸化の乱れやＡＴＰ＋ＰＣＲ産生率を含む、これまでのところ解決されていない遺伝的欠陥を伴う、単離された、または組み合わされたＯＸＰＨＯＳ欠乏症からなる群から選択される障害である。
【００４７】
一実施形態では、ミトコンドリア機能障害に関連する状態は、フリードライヒ失調症；尿細管性アシドーシス；パーキンソン病；アルツハイマー病；筋萎縮性側索硬化症；ハンチントン病；発達性広汎性疾患；難聴；聾；糖尿病；老化；ミトコンドリア機能を阻害すると薬の副作用からなる群から選択される状態である。
【００４８】
一実施形態では、本開示の化合物、または関連化合物は、神経変性疾患、非アルコール性脂肪性肝疾患、腫瘍、癌、腎臓病、強皮症、肝鉄過剰症、肝銅過剰症、脱毛症、ヒト不妊症、急性膵炎、線維筋痛症、ミトコンドリア障害、またはミトコンドリア機能障害またはミトコンドリア疾患に関連する状態の治療または予防または抑制に使用することができる。
【００４９】
一実施形態では、本開示の化合物、または関連化合物は、神経変性疾患、特に筋萎縮性側索硬化症の治療または予防に使用することができる。
【００５０】
一実施形態では、本開示の化合物、または関連化合物は、癌の治療または予防に使用することができ、その癌は、肝臓癌、膵臓癌または胆道癌である。
【００５１】
一実施形態では、本開示の化合物、または関連化合物は、非アルコール性脂肪性肝疾患の治療または予防に使用することができ、その非アルコール性脂肪性肝疾患は、非アルコール性脂肪性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎、または肝硬変である。
【００５２】
一実施形態では、本開示の化合物、または関連化合物は、腎臓病の治療または予防に使用することができ、その腎臓病は、腎臓癌または腎不全である。
【００５３】
一実施形態では、腫瘍疾患は、癌、特に基底細胞癌、骨癌、腸癌、脳腫瘍、乳癌、子宮頸癌、白血病、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、黒色腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、甲状腺癌または胆道癌であり得る。
【００５４】
一実施形態では、本開示の化合物、または関連化合物は、抗菌剤として、特に消毒剤として使用するためのものであり得る。
【００５５】
一実施形態では、本開示の化合物、または関連化合物は、多能性細胞培養物の維持において、特に細胞培養物の補足として、特に増殖培地化合物として使用するためのものであり得る。
【００５６】
本開示はまた、本開示の化合物のいずれか、または関連化合物を含む、多能性幹細胞を未分化状態に維持するための細胞培養培地に関する。
【００５７】
一実施形態では、本開示の化合物、または関連化合物は、筋肉プロテクターまたは身体運動後の筋肉回復としての使用のためのものであり得る。
【００５８】
一実施形態では、本開示の化合物、または関連化合物は、化粧品、サプリメント、または栄養補助食品、すなわち老化防止剤として、または抗シワスキンケア製品として使用するためのものであり得る。
【００５９】
一実施形態では、本開示の化合物、または関連化合物は、特にミトコンドリアイメージング研究を監視するためのイメージング研究におけるプローブとして使用するためのものであり得る。
【００６０】
本開示はまた、本開示の化合物または関連化合物のいずれかと、１つ以上の薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤、希釈剤、またはそれらの組合せとを含む組成物、好ましくは医薬組成物または化粧品組成物に関する。
【００６１】
一実施形態では、許容される担体は、以下のリストから選択され得る：とりわけ、食塩水、アラビアゴム、ゼラチン、デンプンペースト、タルク、ケラチン、コロイドシリカ、尿素、またはそれらの組合せ。
【００６２】
一実施形態では、アジュバントは、以下のリストから選択され得る：とりわけ、水中油型エマルションアジュバント、アルミニウムアジュバント、ＴＬＲ−４リガンド、サポニン、およびそれらの組合せ。
【００６３】
一実施形態では、賦形剤は以下のリストから選択され得る：とりわけ、グルコース、ラクトース、スクロース、モノステアリン酸グリセロール、塩化ナトリウム、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール、またはそれらの組合せ。
【００６４】
一実施形態では、医薬組成物は、一例として、経口、非経口、吸入または局所を介して投与することができる。非医薬組成物、すなわち化粧品組成物の場合、好ましい経路は局所的である。
【００６５】
一実施形態では、好ましい医薬投与経路は、経口、非経口、筋肉内、静脈内、ｉｎ  ｓｉｔｕ注射、鼻腔内、舌下、気管内、および吸入または局所投与を含むが、これらに限定されない。
【００６６】
一実施形態では、医薬組成物は、例えば、神経変性疾患、非アルコール性脂肪性肝疾患、腫瘍、腎臓病、強皮症、肝鉄過剰症、肝銅過剰症、脱毛症、ヒト不妊症、急性膵炎または線維筋痛症の治療または予防のための方法において使用することができ、ここで、医薬組成物は、１日量で投与される。
【００６７】
一実施形態では、医薬組成物の１日量は、とりわけ、２０ｍｇ／日または１０ｍｇ／日であり得る。
【００６８】
いくつかの実施形態では、投与量または剤形は、例えば、１日に１回、１日に２回、または１日に３回、被験体に投与することができる。他の態様では、用量は、週に１回、月に１回、２ヶ月に１回、年に４回、年に３回、年に２回、または年に１回投与される。
【００６９】
一実施形態では、組成物は、本主題において、免疫療法または任意の薬理学的アプローチを含む他の療法の有効性を改善するのに有効な量で、１つ以上の、本開示の化合物または関連化合物を、主題の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５．７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％含み得る。
【００７０】
いくつかの実施形態では、組成物は、０．１〜１０００ｍｇの用量を含む。例えば、いくつかの実施形態では、製剤は、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、０．９ｍｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１１ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、１３ｍｇ／ｋｇ、１４ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、１６ｍｇ／ｋｇ、１７ｍｇ／ｋｇ、１８ｍｇ／ｋｇ、１９ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ、２５０ｍｇ／ｋｇ、３００ｍｇ／ｋｇ、４００ｍｇ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｋｇ、６００ｍｇ／ｋｇ、７００ｍｇ／ｋｇ、７５０ｍｇ／ｋｇ、８００ｍｇ／ｋｇ、９００ｍｇ／ｋｇ、または１０００ｍｇ／ｋｇの用量を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、１〜１０ｍｇ／ｋｇ、１〜１００ｍｇ／ｋｇ、１〜１０００ｍｇ／ｋｇ、１０〜１００ｍｇ／ｋｇ、１０〜１０００ｍｇ／ｋｇ、１００〜１０００ｍｇ／ｋｇ、１０〜５０ｍｇ／ｋｇ、１０〜２５ｍｇ／ｋｇ、１０〜２０ｍｇ／ｋｇ、５０〜１００ｍｇ／ｋｇ、または１００〜２５０ｍｇ／ｋｇの用量を含む。
【００７１】
本開示はまた、ナノキャリア、例えばリポソームを提供し、ここでナノキャリアは、本開示の化合物、または関連化合物、または組成物を含む。
【００７２】
詳細な説明および特許請求の範囲を通して、「含む」という語およびその語の変形は、他の技術的特徴、付加物、構成要素、またはステップを除外することを意図していない。
【００７３】
ここに開示された解決策のさらなる目的、利点および特徴は、詳細な説明を検討することにより当業者に明らかになるであろうし、または解決策の実施により習得されてもよい。
【００７４】
詳細な説明および特許請求の範囲を通して、「含む」という語およびその語の変形は、他の技術的特徴、付加物、構成要素、またはステップを除外することを意図していない。ここに開示された解決策のさらなる目的、利点および特徴は、詳細な説明を検討することにより当業者に明らかになるであろうし、または解決策の実施により習得されてもよい。
【００７５】
以下の図は、詳細な説明を説明するための好ましい実施形態を提供しており、本開示の範囲を限定するものとして見なされるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】いくつかのミトコンドリア向性抗酸化剤Ａ−ＡｎｔｉＯｘＢＥＮ１およびＡｎｔｉＯｘＢＥＮ２；Ｂ−ＡｎｔｉＯｘＢＥＮ３の開発のために追求された合成戦略。
【図２】安息香酸とその誘導体（ＡｎｔｉＯｘＢＥＮ１、ＡｎｔｉＯｘＢＥＮ２、ＡｎｔｉＯｘＢＥＮ３）とＭｉｔｏＱの鉄キレート特性の評価。参照としてＥＤＴＡ（キレート剤）を使用した。一元配置分散分析を用いて、対照群と比較して統計的に有意であった（Ｐ＜０．０００１、ｎ．ｓ．、有意ではない）。
【図３】（Ａ）ＴＰＰ選択的電極を使用して測定した活性化ラット肝臓ミトコンドリアによるＡｎｔｉＯｘＢＥＮ取り込み。（Ｂ）ラット肝臓ミトコンドリアによるＡｎｔｉＯｘＢＥＮ蓄積比。ＭＩＴ、ミトコンドリア；ＳＵＣ、コハク酸；ＶＡＬ、バリノミシン。
【図４】異なる酸化条件下でのミトコンドリア脂質過酸化に対する安息香酸、ＡｎｔｉＯｘＢＥＮおよびＭｉｔｏＱの効果：（Ａ）ＴＢＡＲＳレベルおよび（Ｂ）酸素消費量に対する変化。対照とＡｎｔｉＯｘＣＩＮ（５μＭ）プレインキュベーション間の比較は、一元配置分散分析を使用することによって実施した。
【図５】ＡＤＰおよびＦｅ２＋によって誘発され、次いで酸素消費された、ＲＬＭ膜の脂質過酸化に対する、（Ａ）カテコール（プロトカテク酸およびＡｎｔｉＯｘＢＥＮ１）または（Ｂ）ピロガロール（ＡｎｔｉＯｘＢＥＮ２およびＡｎｔｉＯｘＢＥＮ３）コアおよび（Ｃ）ｄＴＰＰおよびＭｉｔｏＱを含む、安息香酸およびＡｎｔｉＯｘＢＥＮ誘導体の効果の典型的な記録。
【図６】ミトコンドリア透過性遷移孔（ｍＰＴＰ）の誘導時のミトコンドリア膨潤に対するＡｎｔｉＯｘＢＥＮおよびＭｉｔｏＱの効果。カルシウム添加前に、（Ａ）２．５μＭ、（Ｂ）５μＭおよび（Ｃ）１０μＭのＡｎｔｉＯｘＢＥＮおよびＭｉｔｏＱをＲＬＭと共に５分間プレインキュベートした。対照（Ｃａ２＋のみ）とアッセイ間で一元配置分散分析を用いて比較を行い、そこでＡｎｔｉＯｘＢＥＮ誘導体をＣａ２＋の前にプレインキュベートした。ＣｓＡ−シクロスポリンＡ。
【図７】（Ａ）１０ｍＭグルタミン酸＋５ｍＭリンゴ酸または（Ｂ）５ｍＭコハク酸によって支持されたＲＬＭ呼吸に対するＡｎｔｉＯｘＢＥＮおよびＭｉｔｏＱの効果。白い棒、対照；水平パターンの棒、２．５μＭ、垂直パターンの棒、５μＭ、チェックパターンの棒、１０μＭ。異なる呼吸数／状態に対する統計的有意性は、Ｓｔｕｄｅｎｔの両側ｔ検定を使用して決定した。
【図８】ヒト肝細胞癌細胞（ＨｅｐＧ２）増殖に対するＡｎｔｉＯｘＢＥＮ１（□）、ＡｎｔｉＯｘＢＥＮ２（●）、およびＡｎｔｉＯｘＢＥＮ３（〇）の細胞毒性プロファイル。一元配置分散分析を用いて対照群と比較して統計的に有意。
【００７７】
詳細な説明
【００７８】
一実施形態において、そして一例として、多数のヒドロキシ安息香酸誘導体（ＡｎｔｉＯｘＢＥＮ）の開発のために追求された合成戦略が図１に示される。
【００７９】
一実施形態では、そして一例として、ミトコンドリア向性抗酸化剤ＡｎｔｉＯｘＢＥＮ１およびＡｎｔｉＯｘＢＥＮ２を、図１Ａに示す４段階合成戦略に従って得た。この実施例では、出発物質のジメトキシ安息香酸（１）またはトリメトキシ安息香酸（２）酸を、カップリング剤としてエチルクロロホルメートを使用するアミド化反応によって、二官能化アルキルスペーサー（６−アミノヘキサン−１−オール）に結合させた。第２段階反応は、アルコール官能基（化合物３または４）を良好な脱離基であるハロゲン化物に変換することを目的とした。１，２−ビス（ジフェニルホスフィノ）エタン（ジホス）を用いるＡｐｐｅｌ変性反応により、所望の化合物（５または６）を高収率、特に７０〜９０％で得た。第３段階では、トリフェニルホスフィン（ＰＰｈ３）で置き換えられたＳＮ２反応によりトリフェニルホスホニウム塩（化合物７または８）を得た。ヒドロキシル化類似体（ＡｎｔｉＯｘＢＥＮ１およびＡｎｔｉＯｘＢＥＮ２）の合成は、三臭化ホウ素（ＢＢｒ３）を用いた脱メチル化法によって行った。
【００８０】
一実施形態では、そして一例として、ミトコンドリア向性抗酸化剤ＡｎｔｉＯｘＢＥＮ３を、図１Ｂに示す４段階合成戦略に従って得た。ここでは、トリメトキシ安息香酸（２）をモノ保護ジアミンスペーサーに結合させて誘導体９を得て、次いで、それを酸性媒体中で脱保護して、化合物１０を得た。アミン１０をアミド化反応によってトリフェニルホスホニウムカチオン性化合物１１に結合させた。そこでは、アシル化剤がその場で発生した。次いで、化合物１２をトリブロミド（ＢＢｒ３）溶液を用いて脱メチル化して、ＡｎｔｉＯｘＢＥＮ３を得た。包括的に、中程度の収量が得られている。
【００８１】
一実施形態では、そして一例として、ＡｎｔｉＯｘＢＥＮ抗酸化および酸化還元特性が報告された。プロトカテク酸および没食子酸もまた検討した。ビタミンＥとｔｒｏｌｏｘを標準として使用した。
【００８２】
一実施形態では、ＡｎｔｉＯｘＢＥＮ抗酸化剤ランク付け活性階層を、インビトロ非細胞法によって確立した。選択された全抗酸化剤能力（ＴＡＣ）アッセイ（ＤＰＰＨ、ＡＢＴＳおよびＧＯ）は、抗酸化剤によるｉｎ  ｓｉｔｕラジカル失活の結果としてのラジカル吸光度の減少の分光光度測定を行った。より高い抗酸化活性を有する化合物は、より低いＩＣ５０値を示す。その結果を表１に示す。
【００８３】
抗酸化剤データは、ＡｎｔｉＯｘＢＥＮが有効な抗酸化剤であり、そして達成されたＩＣ５０値が３つの異なるアッセイにおいて同じ傾向をたどったと結論付けることを可能にする。得られたデータから、ピロガロール部分を有する化合物、特にＡｎｔｉＯｘＢＥＮ２およびＡｎｔｉＯｘＢＥＮ３は、カテコール系、特にＡｎｔｉＯｘＢＥＮ１よりも優れた抗酸化活性を示したと結論付けることが可能である。一般に、トリフェニルホスホニウム（ＴＰＰ）脂肪族側鎖の導入は、プロトカテク酸および没食子酸と比較した場合、抗酸化活性のわずかな減少となった。
【００８４】
【表１】
2020503280.tif 000007
【００８５】
一実施形態では、そして一例として、ＡｎｔｉＯｘＢＥＮ酸化還元特性を評価した（表１）。酸化還元電位は、酸化防止剤が水素原子および／または電子をフリーラジカルに供与する能力と相関している。一般に、低い酸化電位（Ｅｐ）は優れた酸化防止性能と関連している。
【００８６】
一実施形態では、ガラス状炭素作用電極を使用して、示差パルスおよびサイクリックボルタンメトリーにより、生理学的ｐＨ７．４で、親酸化防止剤（プロトカテク酸および没食子酸）およびＡｎｔｉＯｘＢＥＮの酸化挙動を評価した。酸化還元データは、プロトカテク酸およびＡｎｔｉＯｘＢＥＮ１がカテコール基の存在に特徴的な酸化還元電位（Ｅｐ）を示した（それぞれＥｐ＝０．２５７および０．２２４Ｖ）と結論付けることを可能にする（表１）。ピロガロール誘導体（没食子酸、ＡｎｔｉＯｘＢＥＮ２、ＡｎｔｉＯｘＢＥＮ３）について、酸化還元電位の有意な減少が観察された（Ｅｐ＝０．１６３〜０．１６８Ｖ）（表１）。
【００８７】
一実施形態では、ミトコンドリア向性抗酸化剤ＡｎｔｉＯｘＢＥＮ１の示差パルスボルタンメトリー調査では、ただ１つの陽極波が観察された。単一のボルタンメトリー波の発生は、親の酸と比較したときに、ＡｎｔｉＯｘＢＥＮ１が電極表面に吸着する傾向が低いことを示していると思われる。没食子酸とその誘導体（ＡｎｔｉＯｘＢＥＮ２とＡｎｔｉＯｘＢＥＮ３）の示差パルスボルタンメトリー調査は、生理学的ｐＨで明確に定義された２つの陽極波の存在を明らかにした。酸化ピークは、それらの構造中に存在するピロガロール単位の酸化に関連している。
【００８８】
一実施形態では、プロトカテク酸およびＡｎｔｉＯｘＢＥＮ１の両方について得られたサイクリックボルタモグラムは、１つの陽極ピークおよび対応する陰極ピークを示す。陽極ピーク電位値と陰極ピーク電位値の差は、不可逆的電子移動過程を示している。サイクリックボルタンメトリー実験は、単一の酸化ピークを示し、逆方向の掃引で明確な還元波は見られず、没食子酸とＡｎｔｉＯｘＢＥＮ２およびＡｎｔｉＯｘＢＥＮ３も不可逆的に酸化されたことを示している。
【００８９】
一実施形態では、得られた結果は、没食子酸、ＡｎｔｉＯｘＢＥＮ２およびＡｎｔｉＯｘＢＥＮ３が、プロトカテク酸およびＡｎｔｉＯｘＢＥＮ１について観察されたものよりも低い酸化還元電位を示したと結論付けることを可能にする。酸化電位の低下は、没食子酸およびその誘導体（ピロガロール単位）中に追加のフェノール基が存在するためであると思われる。余分なヒドロキシル基は酸化によって生成したラジカル中間体の安定化を促進し、それは得られた酸化還元電位の実質的な減少に変換された。
【００９０】
一実施形態では、トリフェニルホスホニウムカチオン側鎖の導入は、ＡｎｔｉＯｘＢＥＮについて得られた酸化還元電位に注目に値する影響を及ぼさない。得られたデータは、実施された構造的修飾がカテコールまたはピロガロール環の電子密度に中程度の効果をもたらすか、あるいは全く影響を及ぼさないことを示唆している。
【００９１】
一実施形態では、ＴＡＣアッセイで得られたデータは、ＡｎｔｉＯｘＢＥＮ酸化還元概要と一致している。全体的な結果は、安息香酸芳香環上に存在するヒドロキシル置換基の数が酸化防止特性および電気化学的特性と直接関係しているという仮定を強化する。
【００９２】
一実施形態では、そして一例として、ＡｎｔｉＯｘＢＥＮ１およびＡｎｔｉＯｘＢＥＮ２の親油特性を、生理学的ｐＨで示差パルスボルタンメトリー（ＤＰＶ）を使用して評価した。生体膜を通るイオン性薬剤の移動を模倣するため、使用した技術はしばしば使用され、これは、そのプロセスが２つの不混和性電解質溶液（ＩＴＩＥＳ）の間の界面で起こるためである。最初に水相中に存在していたイオン性薬物（Ｃ＝０．３２ｍＭ）が、１，６−ジクロロヘキサン（ＤＣＨ）相に転移する転移電位（Ｅｔｒ）は、示差パルスボルタンメトリー（ＤＰＶ）によって測定される。ＩＴＩＥＳモデルでは、薬物の親油性が増すにつれて、転移電位（Ｅｔｒ）は陽性が低下する。
【００９３】
一実施形態では、そして一例として、ＡｎｔｉＯｘＢＥＮ１およびＡｎｔｉＯｘＢＥＮ２の伝達電位（Ｅｔｒ）は、それぞれ０．４０５Ｖおよび０．４９５Ｖであった。データから、ＡｎｔｉＯｘＢＥＮ２（没食子酸に基づくミトコンドリア標的化抗酸化剤）中の追加のＯＨ官能基の存在は、転移電位の増加において翻訳されたＡｎｔｉＯｘＢＥＮ１（プロトカテク酸に基づくミトコンドリア標的化抗酸化剤）と比較して、親水性を増加させたと結論づけられた。予想通り、それらの親水性のためにヒドロキシ安息香酸は浸透しない。
【００９４】
一実施形態では、そして一例として、ＡｎｔｉＯｘＢＥＮキレート特性、すなわち鉄をキレートするそれらの能力が決定された。鉄は、ヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）を生成するＦｅｎｔｏｎおよびＨａｂｅｒ−Ｗｅｉｓｓ反応を触媒することができる酸化還元活性金属であり、それは人間の健康と病気に深刻な影響を与える酸化的損傷事象と結びついている強力な酸化剤種である。ミトコンドリアの鉄恒常性の喪失およびその結果としての鉄の過負荷は、ミトコンドリアの機能不全、ひいては異なる病理に寄与し得ることに注目すること。そのため、金属キレート剤、またはこの機構または複数の機構によって作用する抗酸化剤の使用は、金属誘発毒性を防ぐための治療的アプローチとして機能することができる。異なる作用機序の組み合わせによって、すなわち有害な反応性種の除去によって、水素供与および／または電子移動によって、および／または酸化促進剤遷移金属（すなわちＣｕおよびＦｅ）のキレート化によって作用することができるフェノール系酸化防止剤は、最大の意義であり得る。
【００９５】
一実施形態では、新規のＡｎｔｉＯｘＢＥＮの鉄（ＩＩ）キレート化能力は、参照としてＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を使用するフェロジンアッセイによって評価した。プロトカテク酸、没食子酸およびミトコンドリア向性抗酸化剤であるＭｉｔｏＱの鉄キレート特性も評価した（図２）。それは着色フェロジン−ｆｅ（ＩＩ）錯体の形成を完全に抑制することができるので、ＥＤＴＡは、溶液中で利用可能な全ての鉄をキレート化することができた。
【００９６】
一実施形態では、ＭｉｔｏＱとは対照的に、ＡｎｔｉＯｘＢＥＮ（カテコールまたはピロガロール系）およびヒドロキシ安息香酸は、第一鉄をキレート化することができた（図２）。ヒドロキシ安息香酸（プロトカテク酸および没食子酸）は、鉄を効率的にキレート化することができたが、ピロガロール部分を有するものはより効果的であった。ＡｎｔｉＯｘＢＥＮ（カテコールまたはピロガロール系）もまた、第一鉄をキレート化することができ、ピロガロール部分を有するものはより効果的であった。ＡｎｔｉＯｘＢＥＮのキレート特性は、それぞれの前駆体と比較した場合、ＴＰＰカチオンスペーサーの導入によってある程度影響を受けるように思われる。それでも、ＡｎｔｉＯｘＢＥＮ２とＡｎｔｉＯｘＢＥＮ３は、溶液中に存在する全ての鉄の８０％超えをキレート化することができた。
【００９７】
一実施形態では、そしてＡｎｔｉＯｘＢＥＮの強力な抗酸化能力および鉄キレート化特性に直面して、創薬最適化プログラムの後に、これらの革新的抗酸化剤は、酸化ストレス関連の疾患および状態におけるミトコンドリア鉄過負荷の効果の抑制および／またはミトコンドリア鉄貯蔵の減少に適用され得る薬物候補を導き得ると予測される。
【００９８】
一実施形態では、そして一例として、いくつかのＡｎｔｉＯｘＢＥＮのミトコンドリア取り込みを、膜電位に応答して単離ラット肝臓ミトコンドリア（ＲＬＭ）において評価した。ＡｎｔｉＯｘＢＥＮは、ΔΨによって駆動されるミトコンドリアの内側に蓄積することができる（図３Ａ）。ミトコンドリアマトリックス内の異なるＡｎｔｉＯｘＢＥＮ蓄積の概要を測定した。このプロセスは、スペーサー長の増加および芳香族置換パターンと関連していることがわかった（図３Ｂ）。ピロガロール誘導体ＡｎｔｉＯｘＢＥＮ２について観察された小さな蓄積比は、スペーサー長の増加によって有意に改善された。次の順位付けが達成された：ＡｎｔｉＯｘＢＥＮ２＜ＡｎｔｉＯｘＢＥＮ１＜ＡｎｔｉＯｘＢＥＮ３。すべてのＡｎｔｉＯｘＢＥＮは、ＭｉｔｏＱと同等の蓄積率を示す（図３Ｂ）。
【００９９】
ミトコンドリア膜は、特に酸化されやすい高濃度の多価不飽和脂肪酸を有し、これはそれらがＲＯＳ生成部位の近くに位置しているためである。
【０１００】
一実施形態では、そして一例として、ＲＬＭ膜の脂質過酸化の保護に対するＡｎｔｉＯｘＢＥＮ抗酸化性能を決定した。２つの異なる酸化ストレス剤、ＦｅＳＯ４／Ｈ２Ｏ２／アスコルベートおよびＡＤＰ／ＦｅＳＯ４、ならびに２つのエンドポイント、それぞれＴＢＡＲＳ生成および酸素消費を使用した。ＭｉｔｏＱを参照として使用した（図４および５）。
【０１０１】
一実施形態において、ＦｅＳＯ４／Ｈ２Ｏ２／アスコルベートアッセイにおける没食子酸、ＡｎｔｉＯｘＢＥＮ２およびＡｎｔｉＯｘＢＥＮ３は、ミトコンドリア脂質過酸化の防止において最も有効なミトコンドリア向性安息香酸誘導体であった（図４Ａ）。ＡｎｔｉＯｘＢＥＮ１およびプロトカテク酸は、ＲＬＭにおけるＴＢＡＲＳ形成を防止するのに有効ではなかった（図４Ａ）。ＡＤＰ／ＦｅＳＯ４アッセイでは、どのＡｎｔｉＯｘＢＥＮも脂質過酸化を効果的に防止しなかった（図４Ｂおよび５）。ＲＬＭにおける脂質過酸化を抑制するＡｎｔｉＯｘＢＥＮ対ＭｉｔｏＱの能力は、以下の順で減少した：ＭｉｔｏＱ＞＞ＡｎｔｉＯｘＢＥＮ３と没食子酸とＡｎｔｉＯｘＢＥＮ２はほぼ等しい＞ＡｎｔｉＯｘＢＥＮ１とプロトカテク酸はほぼ等しい。一般に、ピロガロールベースのＡｎｔｉＯｘＢＥＮ（図４および５）は、脂質過酸化膜プロセスを遅らせるのにさらに効果的であった。
【０１０２】
一実施形態では、そして一例として、いくつかのＡｎｔｉＯｘＢＥＮがミトコンドリア透過性遷移細孔（ｍＰＴＰ）開口部に及ぼす影響を評価した。一般に、試験したＡｎｔｉＯｘＢＥＮは、試験した全ての濃度について、ｍＰＴＰ開口にそれ自体効果がなかった。
【０１０３】
一実施形態では、ＡｎｔｉＯｘＢＥＮ３が、ＡｎｔｉＯｘＢＥＮ１、ＡｎｔｉＯｘＢＥＮ２およびＭｉｔｏＱではなく、カルシウム依存性ｍＰＴＰ開口の濃度依存性阻害を引き起こすことが見出された（図６Ａ〜Ｃ）。この効果は、古典的なｍＰＴＰ減感剤であるシクロスポリンＡ（１μＭ）の効果に匹敵し、そしてその抗酸化活性またはカルシウムイオンの可能性のあるキレート化に関連している可能性がある。この性質は、例えば移植における移植片対宿主拒絶反応を防止および治療するために治療上重要であり得、これは通常移植片におけるミトコンドリア破壊を含む。
【０１０４】
細胞代謝は最適なミトコンドリア機能に依存するので、ミトコンドリア機能パラメータに対する化合物の効果はそれらの毒性プロファイルについての情報を与え得る。そこで、ミトコンドリア内膜を損傷することによって、または呼吸鎖、ＡＴＰ合成、ミトコンドリア透過性移行孔（ｍＰＴＰ）プロセスまたは輸出機構を阻害することによってミトコンドリア機能不全を誘発するそれらの能力を評価した。
【０１０５】
一実施形態では、そして一例として、いくつかのＡｎｔｉＯｘＢＥＮおよびＭｉｔｏＱのミトコンドリア生体エネルギー、すなわちＲＬＭΔΨおよび呼吸パラメータに対する毒性効果を測定した。ΔΨは、ミトコンドリア呼吸によって生じる電気化学的勾配の主成分を表し、そして利用可能な全エネルギーの９０％超を占める。ミトコンドリア呼吸アッセイのために、グルタミン酸塩／リンゴ酸塩（錯体Ｉの場合）およびコハク酸塩（錯体ＩＩの場合）を基質として使用した。さらに、呼吸制御比（ＲＣＲ、状態３／状態４呼吸）として知られるミトコンドリア酸化的リン酸化カップリング指数およびＡＤＰ／Ｏ指数（ＡＴＰ合成と酸素消費との間のカップリング）も計算した。ＡｎｔｉＯｘＢＥＮおよびＭｉｔｏＱを抗酸化剤関連濃度で試験し、１０μＭが最高濃度であった。
【０１０６】
一実施形態では、ＭｉｔｏＱについて得られたミトコンドリアの生物エネルギーデータを表２に示した。得られた結果は比較分析に用いた。
【０１０７】
【表２】
2020503280.tif 000008
【０１０８】
一実施形態では、ＭｉｔｏＱが、試験したすべての濃度で、ＲＣＲおよびＡＤＰ／Ｏパラメータの有意な減少を引き起こしたことが観察された（表２）。さらに、ＲＬＭを２．５μＭまでのＭｉｔｏＱ濃度でインキュベートした場合、基質としてグルタミン酸塩／リンゴ酸塩を用いて、状態２、状態４およびオリゴマイシン阻害呼吸の増大ならびに状態３およびＦＣＣＰ非結合呼吸の減少が観察された（図７Ａ）。コハク酸塩を使用した場合、試験した最高濃度のＭｉｔｏＱの存在下でＲＬＭは、完全に切り離されていた（図７Ｂ）。ＭｉｔｏＱの増加した濃度のインキュベーションは、通電時に得られた最大ΔΨの漸進的な減少をもたらした（表２）。ＡＤＰ誘発脱分極後に再分極は生じなかったので、ＡＤＰ添加後のΔΨ崩壊が１０μＭＭｉｔｏＱで観察された（表２）。
【０１０９】
一実施形態では、そして一例として、ＡｎｔｉＯｘＢＥＮの毒性試験で使用した最高濃度は、ＭｉｔｏＱがミトコンドリアの生物エネルギーを完全に破壊したものであった。ＡｎｔｉＯｘＢＥＮ毒性試験のデータを表３〜５に示す。
【０１１０】
一実施形態では、一例として、ＡｎｔｉＯｘＢＥＮは、グルタミン酸塩／リンゴ酸塩活性化の後、わずかなΔΨ用量依存性脱分極（１０〜２０ｍＶ）を引き起こし、一方、コハク酸塩活性化の下で５〜２０ｍＶのわずかな過分極を促進した。それでも、ＡｎｔｉＯｘＢＥＮはＲＬＭΔΨに大きな影響を与えないことに注意することが重要である。
【０１１１】
【表３】
2020503280.tif 000009
【０１１２】
【表４】
2020503280.tif 000010
【０１１３】
【表５】
2020503280.tif 000011
【０１１４】
一実施形態では、そして例として、状態２、状態３、状態４、オリゴマイシン阻害呼吸およびミトコンドリア呼吸アッセイ、ならびにコハク酸塩（基質ＦＣＣＰ刺激呼吸として使用した）についてのＡｎｔｉＯｘＢＥＮおよびＭｉｔｏＱ速度を図７ＡおよびＢに示す。
【０１１５】
一実施形態では、ＡｎｔｉＯｘＢＥＮが用量依存的に呼吸鎖の変化を誘導することが判明した。一般に、ＡｎｔｉＯｘＢＥＮは、主にそれらの親油性に依存しそしてそれらの芳香族パターン（カテコール対ピロガロール）に頼らないプロセスにおいて、２．５μＭより高い濃度で状態２、状態４およびオリゴマイシン−抑制呼吸を増加させた。しかしながら、観察された効果は錯体Ｉ基質を用いることによってより明白であったことを強調しなければならない。（図７ＡおよびＢ）。
【０１１６】
一実施形態では、そして一例として、ＡｎｔｉＯｘＢＥＮが、単離されたＲＬＭの呼吸プロファイルにおける用量依存的変化を誘導することが示された。観察された効果のいくつかは、おそらく膜透過化効果またはプロトン往復活性から生じ得る。この効果は、非リン酸化呼吸の刺激および小さなΔΨ脱分極をもたらし得る。その結果、すべての試験濃度で、ＡｎｔｉＯｘＢＥＮは、ＲＣＲの有意な減少を引き起こした。さらに、ＡＤＰ／Ｏ比の変化によって評価されるように、ＡｎｔｉＯｘＢＥＮ（１０μＭ）もミトコンドリアのリン酸化系に影響を及ぼした。
【０１１７】
一実施形態では、そして一例として、より高い濃度で観察されたＡｎｔｉＯｘＢＥＮミトコンドリア毒性は、スペーサーの親油性および／またはＴＰＰ部分の存在と関連し得、そして、たとえあるとしても、それら（カテコール対ピロガロール）とほとんど関係がない。それでもなお、ＴＰＰカチオンおよび親油性スペーサーの存在は、効率的で時には広範なミトコンドリア蓄積に不可欠である。
【０１１８】
一実施形態では、そして一例として、ミトコンドリア標的抗酸化剤、ＡｎｔｉＯｘＢＥＮおよびＭｉｔｏＱは、より高い濃度で、ミトコンドリア内膜に損傷を引き起こすことによって、または呼吸鎖、ＡＴＰ合成もしくは輸出機構を阻害することによってミトコンドリア呼吸を妨害し得ることが見出された。
【０１１９】
一実施形態では、ＭｉｔｏＱは、５μＭのＲＬＭにおける脂質過酸化を効果的に阻害したが（図４および５）、２．５μＭのＲＬＭのミトコンドリア生体エネルギー装置に毒性を引き起こしたことを強調しなければならない（図７ＡおよびＢおよび表２）。
【０１２０】
一実施形態では、研究中のＡｎｔｉＯｘＢＥＮについて、ＲＬＭ毒性は、それらの機序とは無関係に、抗酸化効果を発揮するのに必要な濃度よりも高い濃度で検出されたと結論付けられた。
【０１２１】
一実施形態では、そして一例として、一般に、ＡｎｔｉＯｘＢＥＮは、ＭｉｔｏＱよりも良好な安全プロファイルを示したと結論付けられた。
【０１２２】
一実施形態では、そして一例として、ＡｎｔｉＯｘＢＥＮの細胞傷害性は、肝細胞癌由来のヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）の単層培養物およびＳＲＢ法を用いて評価した（図８）。データから、ＡｎｔｉＯｘＢＥＮはＨｅｐＧ２細胞に対して低い毒性を示したと結論づけられた（図８）。ＡｎｔｉＯｘＢＥＮ１は、より低い濃度で細胞増殖のわずかな阻害を促進するが、１００μＭより高い濃度では細胞増殖を刺激した。注目すべきことに、２５０μＭより低い濃度では、ＡｎｔｉＯｘＢＥＮ２は、細胞増殖を有意に刺激したが、２５０μＭより高い濃度では細胞増殖を有意に阻害した。ＡｎｔｉＯｘＢＥＮ３は、２５０μＭより高い濃度で、細胞増殖を有意に阻害した。
【０１２３】
一実施形態では、そして一例として、その特性（表１）およびＲＬＭ蓄積率（図３）に基づくＡｎｔｉＯｘＢＥＮ毒性は、化合物の親油性によって媒介され得ると結論付けられた。一般に、ＡｎｔｉＯｘＢＥＮにはＨｅｐＧ２細胞に対する安全域がある。
【０１２４】
一実施形態では、そして一例として、安息香酸（プロトカテク酸および没食子酸）の構造的修飾は、それらのミトコンドリア向性特性の有意な改善をもたらすと結論付けられた。ＡｎｔｉＯｘＢＥＮは、抗酸化活性が高く、ミトコンドリアの蓄積が高く、そして毒性が低い。
【０１２５】
一実施形態では、全体的な結果は、ＡｎｔｉＯｘＢＥＮがオルガネラ膜貫通電位によって駆動されるミトコンドリア内に蓄積され、脂質過酸化を防止し、低い固有毒性を呈することを示した。ＡｎｔｉＯｘＢＥＮは、それらの親化合物、例えばプロトカテク酸および没食子酸よりも高い親油性と、類似の抗酸化および鉄キレート化特性を示す。
【０１２６】
一実施形態では、ＡｎｔｉＯｘＢＥＮは、加齢およびいくつかの病状、例えば糖尿病、非アルコール性脂肪性肝疾患、心血管疾患、急性膵炎およびアルツハイマー病またはパーキンソン病および筋萎縮性側索硬化症を含む神経変性疾患に関連するミトコンドリア酸化ストレスを予防または遅延することを目的とするミトコンドリア向性抗酸化剤である。
【０１２７】
一実施形態では、および例として使用されるＡｎｔｉＯｘＢＥＮシリーズから、ピロガロールベースの類似体は、ミトコンドリア酸化関連障害における治療的用途を有するファーストクラスの薬物の開発のための潜在的な候補であると予測される。
【０１２８】
得るために従った合成手順の例、ならびにいくつかの中間体およびＡｎｔｉＯｘＢＥＮを提供する。
【０１２９】
一実施形態では、化合物の構造的キャラクタリゼーションは、分光分析法によって達成した。１Ｈおよび１３ＣスペクトルＮＭＲスペクトルは室温で取得し、それぞれ４００および１００ＭＨｚで動作するＢｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ＩＩＩで記録した。化学シフトは、内部標準としてのテトラメチルシラン（ＴＭＳ）に対するδ（ｐｐｍ）値で表され、カップリング定数（Ｊ）はＨｚで与えられる。割り当てはＤＥＰＴ（distortionless enhancement by polarization transfer）からも行った（下線付きの値）。質量スペクトル（ＭＳ）は、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｍｉｃｒｏｔｏｆ（ＥＳＩ）またはＶａｒｉａｎ  ３２０−ＭＳ（ＥＩ）装置で記録し、重要なフラグメントのｍ／ｚ（％相対）で表した。
【０１３０】
一実施形態では、反応の進行は、いくつかの比率での、ジクロロメタン、酢酸エチルおよびジクロロメタン／メタノール中のアルミニウムシリカゲルシート６０  Ｆ２５４プレート（Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）上での薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析によって評価した。スポットはＵＶ検出（２５４および３６６ｎｍ）を用いて検出した。フラッシュカラムクロマトグラフィーは、シリカゲル６０（０．０４０〜０．０６３ｍｍ）（Ｃａｒｌｏ  Ｅｒｂａ  Ｒｅａｃｔｉｆｓ  −  ＳＤＳ、フランス）を使用して実施した。
【０１３１】
一実施形態では、ＡｎｔｉＯｘＢＥＮ１およびＡｎｔｉＯｘＢＥＮ２獲得は、図１Ａに示す４段階合成戦略に従って行った。最初に、中間体化合物３および４を以下のように合成した：３，４−ジメトキシ安息香酸（１）または３，４，５−トリメトキシ安息香酸（２）、特に１ｍｍｏｌを、ジクロロメタン、特に４０ｍＬのジクロロメタンに溶解し、トリエチルアミン、特に２ｍｍоｌのトリエチルアミンを添加した。氷浴中に保ったまま、エチルクロロホルメート、特に２ｍｍоｌのエチルクロロホルメートをその撹拌した溶液に滴加した。特に室温で２時間撹拌した後、その混合物を再度冷却し、６−アミノヘキサン−１−オール、特に２ｍｍｏｌの６−アミノヘキサン−１−オールを加えた。その反応物を、特に室温で１０時間撹拌した。その混合物をジクロロメタン、特に３×２０ｍＬで抽出した。有機相を合わせ、水、５％ＮａＨＣＯ３、特に２０ｍＬの５％ＮａＨＣＯ３および１ＭのＨＣｌ、特に２０ｍＬの１ＭのＨＣｌで洗浄した。その有機相を合わせ、乾燥し、そして濾過後、その溶媒を蒸発させて白色の残渣を得た。その反応をＴＬＣ、特にシリカゲル、酢酸エチルで追跡した。
【０１３２】
一実施形態では、Ｎ−（６−ヒドロキシヘキシル）−３，４−ジメトキシベンズアミド（３）のキャラクタリゼーションは以下の通りである。収率７４％。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 1.39-1.41 (4H, m, (CH2)2(CH2)2OH), 1.55-1.63 (4H, m, NCH2CH2(CH2)2CH2), 1.99 (1H, s, OH), 3.40-3.45 (2H, m, NCH2), 3.63 (2H, t, J = 6.5 Hz, CH2OH), 3.91 (6H, s, 2×OCH3), 6.38 (1H, t, J = 5.2 Hz, CONH), 6.85 (1H, d, J = 8.4 Hz, H(5)), 7.29 (1H, dd, J = 8.4 Hz, J = 2.0 Hz, H(6)), 7.43 (1H, d, J = 2.0 Hz, H(2)). 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 25.4 (CH2(CH2)2OH), 26.7 (N(CH2)2CH2), 29.8 (NCH2CH2), 32.6 (CH2CH2OH), 40.0 (NCH2), 56.1 (2×OCH3), 62.7 (CH2OH), 110.4 (C(5)), 110.7 (C(2)), 119.4 (C(6)), 127.5 (C(1)), 149.0 (C(3)), 151.7 (C(4)), 167.3 (CONH). EI-MS m/z (%): 281 (M・＋), 208 (16), 195 (21), 194 (100), 180 (16), 165 (75), 164 (55), 121 (15).
【０１３３】
一実施形態において、Ｎ−（６−ヒドロキシヘキシル）−３，４，５−トリメトキシベンズアミド（４）のキャラクタリゼーションは以下の通りである。収率８２％。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 1.40-1.43 (4H, m, (CH2)2(CH2)2OH), 1.54-1.66 (4H, m, NCH2CH2(CH2)2CH2), 1.81 (1H, s, OH), 3.41-3.46 (2H, m, NCH2), 3.64 (2H, t, J = 6.4 Hz, CH2OH), 3.87 (3H, s, OCH3), 3.89 (6H, s, 2×OCH3), 6.28 (1H, t, J = 5.1 Hz, CONH), 7.00 (2H, s, H(2)およびH(6)); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 25.4 (CH2(CH2)2OH), 26.7 (NCH2CH2CH2), 29.8 (NCH2CH2), 32.6 (CH2CH2OH), 40.1 (NCH2), 56.4 (2×OCH3), 61.0 (OCH3), 62.8 (CH2OH), 104.5 (C(2) および C(6)), 130.4 (C(1)), 140.9 (C(4)), 153.3 (C(3) および C(5)), 167.5 (CONH) および EI-MS m/z (%): 312 (M・＋), 225 (38), 224 (34), 211 (59), 196 (49), 195 (100).
【０１３４】
一実施形態では、ブロモヘキシルベンズアミド化合物５および６を得るための一般的合成手順は以下の通りである：Ｎ−（６−ヒドロキシヘキシル）−３，４−ジメトキシベンズアミド（３）、またはＮ−（６−ヒドロキシヘキシル）−３，４，５−トリメトキシベンズアミド（４）、特に１ｍｍｏｌのヒドロキシヘキシルベンズアミド３、またはヒドロキシヘキシルベンズアミド４、および１，２−ジブロモテトラクロロエタン、特に１ｍｍｏｌの１，２−ジブロモテトラクロロエタンを、ＴＨＦ、特に２０ｍＬのＴＨＦに溶解した。１，２−ビス（ジフェニルホスフィン）エタン（ジホス）、特に０．５ｍｍｏｌを添加した後、その反応を特に室温で２０時間撹拌した。次いで、その反応混合物を、特にセライトパッドを通して濾過した。濾液を蒸発させた後、油状残渣を得た。特に溶出系として酢酸エチルを用いるシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによりその油状物を精製した。その目的化合物を含む画分を集め、溶媒を蒸発させ、そして生成物をｎ−ヘキサンから再結晶させた。その反応をＴＬＣ、特にシリカゲル、酢酸エチルで追跡した。
【０１３５】
一実施形態では、Ｎ−（６−ブロモヘキシル）−３，４−ジメトキシベンズアミド（５）のキャラクタリゼーションは以下の通りである。収率６６％。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 1.38-1.53 (4H, m, (CH2)2(CH2)2Br), 1.59-1.67 (2H, m, NCH2CH2), 1.83-1.90 (2H, m, CH2CH2Br), 3.39-3.46 (4H, m, NCH2(CH2)4CH2Br), 3.92 (6H, s, 2×OCH3), 6.25 (1H, t, J = 5.4 Hz, CONH), 6.85 (1H, d, J = 8.4 Hz, H(5)), 7.27 (1H, dd, J = 8.4 Hz , J = 2.0 Hz, , H(6)), 7.43 (1H, d, J = 2.0 Hz, H(2)); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 26.2 (NCH2CH2CH2), 28.0 (CH2(CH2)2Br), 29.7 (NCH2CH2), 32.7 (CH2CH2Br), 33.9 (CH2Br), 40.0 (NCH2), 56.1 (OCH3×2), 110.3 (C(5)), 110.7 (C(2)), 119.2 (C(6)), 127.5 (C(1)), 149.1 (C(3)), 151.7 (C(4)), 167.2 (CONH) および EI-MS m/z (%): 345 (M・＋), 343 (24), 264 (36), 195 (34), 194 (19), 181 (40), 166 (24), 165 (100).
【０１３６】
一実施形態では、Ｎ−（６−ブロモヘキシル）−３，４，５−トリメトキシベンズアミド（６）のキャラクタリゼーションは以下の通りである。収率７５％。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 1.37-1.52 (4H, m, (CH2)2(CH2)2Br), 1.59-1.66 (2H, m, NCH2CH2), 1.83-1.90 (2H, m, CH2CH2Br), 3.39-3.45 (4H, m, NCH2(CH2)4CH2Br), 3.87 (3H, s, OCH3), 3.88 (6H, s, 2×OCH3), 6.40 (1H, t, J = 5.3 Hz, CONH), 7.01 (2H, s, H(2) および H(6)); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 26.2 (NCH2CH2CH2), 27.9 (CH2(CH2)2Br), 29.6 (NCH2CH2), 32.6 (CH2CH2Br), 33.9 (CH2Br), 40.1 (NCH2), 56.4 (2×OCH3), 61.0 (OCH3), 104.4 (C(2)およびC(6)), 130.3 (C(1)), 140.8 (C(4)), 153.2 (C(3)およびC(5)), 167.3 (CONH) および EM/EI m/z (%): 374 (M・＋), 372 (15), 225 (18), 224 (100), 210 (18), 195 (32), 194 (48).
【０１３７】
一実施形態では、丸底フラスコ内でブロモヘキシルベンズアミド５または６（１ｍｍｏｌ）をトリフェニルホスフィン（ＰＰｈ３）（１ｍｍｏｌ）と混合し、４８時間、約１２０℃の温度に加熱した。その残留物を勾配溶離（酢酸エチル：メタノール）を用いるシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。所望の化合物を含有する画分を集めた後、溶媒を蒸発乾固させた。その反応をＴＬＣ（シリカゲル、酢酸エチル：メタノール（９：１）およびジクロロメタン：メタノール（９：１））で追跡した。
【０１３８】
一実施形態では、６−（３，４−ジメトキシベンズアミド）ヘキシルトリフェニルホスホニウムブロミド（７）のキャラクタリゼーションは以下の通りである。収率６５％。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ = 1.40-1.72 (8H, m, NCH2(CH2)4), 3.33-3.37 (2H, m, CH2P＋Ph3), 3.42-3.49 (2H, m, NCH2), 3.83 (6H, s, 2×OCH3), 6.98 (1H, d, J = 8.5 Hz, H(5)), 7.46 (1H, d, J = 2.1 Hz, H(2)), 7.49 (1H, dd, J = 8.5, J = 2.1 Hz, Hz, H(6)), 7.73-7.89 (15H, m, PPh3); 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ = 22.7 (d, JCP = 51.0 Hz, CH2P＋Ph3), 23.5 (d, JCP = 4.3 Hz, CH2(CH2)2P＋Ph3), 27.2 (CH2(CH2)3P＋Ph3), 30.3 (NCH2CH2), 31.2 (d, JCP = 16.3 Hz, CH2CH2P＋Ph3), 40.8 (NCH2), 56.7 (2×OCH3), 112.0 (C(5)), 112.2 (C(2)), 120.0 (d, JCP= 86.2 Hz, C(1’)), 122.0 (C(6)), 128.1 (C(1)), 131.6 (d, JCP = 12.6 Hz, C(3’) および C(5’)), 134.9 (d, JCP = 10.0 Hz, C(2’) および C(6’)), 136.3 (d, JCP = 3.0 Hz, C(4’)), 150.2 (C(3)), 153.4 (C(4)), 169.5 (CONH) および EI-MS m/z (%): 511 (M・＋), 277 (37), 263 (40), 262 (100), 183 (87), 165 (47), 151 (35), 108 (44), 107 (29), 77 (26), 52 (26).
【０１３９】
一実施形態では、６−（３，４，５−トリメトキシベンズアミド）ヘキシルトリフェニルホスホニウムブロミド（８）のキャラクタリゼーションは以下の通りである。収率７９％。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ = 1.41-1.73 (8H, m, NCH2(CH2)4), 3.37-3.40 (2H, m, CH2P＋Ph3), 3.50-3.56 (2H, m, NCH2), 3.94 (3H, s, OCH3), 3.95 (9H, s, 2×OCH3), 7.28 (2H, s, H(2) および H(6)), 7.75-7.90 (15H, m, PPh3); 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ = 22.5 (d, JCP = 50.8 Hz, CH2P＋Ph3), 23.3 (d, JCP = 4.0 Hz, CH2(CH2)2P＋Ph3), 27.1 (CH2(CH2)3P＋Ph3), 30.0 (NCH2CH2), 30.9 (d, JCP = 16.2 Hz, CH2CH2P＋Ph3), 40.6 (NCH2), 57.0 (2×OCH3), 61.1 (OCH3), 106.0 (C(2) およびC(6)), 119.7 (d, JCP= 86.1 Hz, C(1’)), 130.8 (C(1)), 131.4 (d, JCP = 12.5 Hz, C(3’) および C(5’)), 134.7 (d, JCP = 10.0 Hz, C(2’) および C(6’)), 136.1 (d, JCP= 2.8 Hz, C(4’)), 141.6 (C(4)), 154.1 (C(3) および C(5)), 168.7 (CONH) および EI-MS m/z (%): 448 (M・＋), 446 (41), 278 (35), 277 (81), 276 (27), 275 (58), 263 (29), 262 (100), 185 (31), 184 (25), 183 (94), 152 (21), 108 (36), 96 (53), 94 (54), 77 (24), 58 (41).
【０１４０】
一実施形態では、トリフェニルホスホニウム塩７または８、特に１ｍｍｏｌのトリフェニルホスホニウム塩７、または１ｍｍｏｌのトリフェニルホスホニウム塩８を無水ジクロロメタン、特に１５ｍＬの無水ジクロロメタンに溶解した。その反応混合物をアルゴン下で撹拌し、−７０℃より低い温度に冷却した。ジクロロメタン中の三臭化ホウ素、特に５〜７ｍｍｏｌの三臭化ホウ素１Ｍ溶液をその溶液に添加し、その反応を特に−７０℃で１０分間維持した。室温に達した後、その反応を１２時間続けた。その後、水、特に４０ｍＬの水を慎重に添加することにより反応を終了させた。水を除去した後、得られた生成物をメタノールに溶解し、乾燥し、濾過し、そして溶媒を蒸発させた。その残渣を、特に、勾配溶離を用いるシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー、特にジクロロメタン：メタノールにより精製した。所望の化合物を含有する画分を集めた後、溶媒を蒸発乾固させた。その反応をＴＬＣ、特にシリカゲル、ジクロロメタン：メタノール（９：１）で追跡した。得られた残渣をエチルエーテル／メタノールから結晶化して、対応するトリフェニルホスホニウムブロミド塩を得た。
【０１４１】
一実施形態では、６−（３，４−ジヒドロキシベンズアミド）ヘキシルトリフェニルホスホニウムブロミド（ＡｎｔｉＯｘＢＥＮ１）の構造的キャラクタリゼーションは以下の通りである。収率６０％。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ = 1.35-1.47 (2H, m, N(CH2)4CH2), 1.50-1.75 (6H, m, NCH2(CH2)3), 3.33-3.47 (4H, m, NCH2(CH2)4CH2P＋Ph3), 6.79 (1H, d, J = 8.3 Hz, H(5)), 7.18 (1H, dd, J = 8.3 Hz, J = 2.2 Hz, H(6)), 7.26 (1H, d, J = 2.2 Hz, H(2)), 7.69-7.92 (15H, m, PPh3); 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ = 22.7 (d, JCP = 51.2 Hz, CH2P＋Ph3), 23.4 (d, JCP = 4.5 Hz, CH2(CH2)2P＋Ph3), 27.0 (CH2(CH2)3P＋Ph3), 30.1 (NCH2CH2), 31.0 (d, JCP = 16.2 Hz, CH2CH2P＋Ph3), 40.0 (NCH2), 115.7 (C(5)), 115.8 (C(2)), 120.0 (d, JCP = 86.4 Hz, C(1’)), 120.5 (C(6)), 126.9 (C(1)), 131.5 (d, JCP = 12.5 Hz, C(3’) および C(5’)), 134.8 (d, JCP = 9.9 Hz, C(2’) および C(6’)), 136.3 (d, JCP= 3.0 Hz, C(4’)), 146.3 (C(3)), 150.1 (C(4)), 170.3 (CONH) および ME/ESI m/z (%): 499 (M＋＋H− Br, 51), 498 (M＋−Br, 98), 399 (31), 397 (31), 291 (100), 277 (67).
【０１４２】
一実施形態では、６−（３，４，５−トリヒドロキシベンズアミド）ヘキシルトリフェニルホスホニウムブロミド（ＡｎｔｉＯｘＢＥＮ２）の構造的キャラクタリゼーションは以下の通りである：収率５０％。
1H NMR (400 MHz, DMSO): δ = 1.23-1.50 (8H, m, NCH2(CH2)4), 3.11-3.16 (2H, m, CH2P＋Ph3), 3.54-3.59 (2H, m, NCH2), 6.81 (2H, s, H(2) および H(6)), 7.74-7.91 (15H, m, PPh3), 8.00 (1H, t, J = 5.1 Hz, CONH); 13C NMR (100 MHz, DMSO): δ = 20.2 (d, JCP = 49.8 Hz, CH2P＋Ph3), 21.8 (d, JCP = 4.1 Hz, CH2(CH2)2P＋Ph3), 25.6 (CH2(CH2)3P＋Ph3), 28.9 (NCH2CH2), 29.6 (d, JCP = 16.6 Hz, CH2CH2P＋Ph3), 38.9 (NCH2), 106.7 (C(2) および C(6)), 118.6 (d, JCP= 85.6 Hz, C(1’)), 125.1 (C(1)), 130.3 (d, JCP = 12.4 Hz, C(3’) および C(5’)), 133.6 (d, JCP = 10.1 Hz, C(2’) および C(6’)), 134.9 (d, JCP= 2.7 Hz, C(4’)), 136.1 (C(4)), 145.4 (C(3) および C(5)), 166.3 (CONH) および ME/ESI m/z (%): 526 (M＋＋Na−Br, 62), 515 (M＋＋H−Br, 30), 514 (M＋−Br, 100), 277 (24).
【０１４３】
一実施形態では、ＡｎｔｉＯｘＢＥＮ３は、図１Ｂに示す４段階合成戦略に従って行った。最初に、３，４，５−トリメトキシ安息香酸（２）（５００ｍｇ、２．３ｍｍｏｌ）を４℃でＤＭＦ（３．９ｍＬ）に溶解し、次いでＣＨ２Ｃｌ２（３．９ｍＬ）中の、Ｎ，Ｎ−ジエチルプロパン−２−アミン（０．４２１ｍｌ、２．３ｍＬ）およびＰｙＢＯＰ（１６６８ｍｇ、２．３ｍｍｏｌ）を添加した。その混合物を氷浴中に保ち、０．５時間撹拌した。この後、ｔｅｒｔ−ブチル（６−アミノヘキシル）カルバメート（０．５２９ｍｌ、２．３ｍｍｏｌ）を加え、その混合物を室温まで温めた。その反応を１８時間撹拌しながら続けた。次にその混合物をジクロロメタン（２０ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（２×１０ｍＬ）で洗浄した。その有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして減圧下で濃縮した。その残渣をフラッシュクロマトグラフィー（５０％ＡｃＯＥｔ／石油エーテル）によって精製し、７３％の収率を得た。
【０１４４】
一実施形態では、化合物ｔｅｒｔ−ブチル（６−（３，４，５−トリメトキシベンズアミド）ヘキシル）カルバメート）（９）の構造的キャラクタリゼーションは以下の通りである。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.07 (2H, s, H5, H6), 6.55 (1H, s, H1’), 4.59 (1H, s, H8’), 3.91 (6H, s, 2×OCH3), 3.88 (3H, s, OCH3), 3.43 (2H, dd, J = 13.0, 6.9 Hz, H2’), 3.13 (1H, dd, J = 12.6, 6.2 Hz, H7’), 1.67-1.58 (2H, m, H3’), 1.53-1.32 (15H, m, H4’, H5’, H6’, NHCOOC(CH3)); および 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 167.3 (CONH), 156.3 (NHCOOC(CH3)), 153.3 (C3, C5), 140.9 (C4), 130.4 (C1), 104.5 (C2, C6), 79.3 (NHCOOC(CH3)), 61.0 (OCH3), 56.4 (2×OCH3), 40.0 (C7’), 39.7 (C1’), 30.2 (C2’), 29.5 (C6’), 28.5 (NHCOOC(CH3)), 26.1 (C3’), 25.8 (C4’).
【０１４５】
一実施形態では、Ｎ−（６−アミノヘキシル）−３，４，５−トリメトキシベンズアミド（１０）の合成は以下の通りであった：脱保護工程は、ＣＨ２Ｃｌ２（８ｍｌ）中の９（１ｇ、２．４ｍｍｏｌ）の溶液にＴＦＡ（４ｍｌ）を添加して実施した。その反応を室温で１時間撹拌した。飽和ＮａＨＣＯ３溶液で中和した後、その有機相を分離した。その有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして減圧下で濃縮した。その残渣をフラッシュクロマトグラフィー（１０％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）により９８％の収率で精製した。
【０１４６】
一実施形態では、化合物Ｎ−（６−アミノヘキシル）−３，４，５−トリメトキシベンズアミド（１０）の構造的キャラクタリゼーションは以下の通りである。
1H NMR (400 MHz, MeOD): δ = 7.19 (2H, s, H2, H6), 3.89 (6H, s, 2×OCH3), 3.80 (3H, s, OCH3), 3.39 (1H, t, J = 7.1 Hz, H2), 2.99-2.90 (2H, m, H7), 1.77-1.55 (4H, m, H3, H6), 1.50-1.36 (4H, m, H4, H5); および13C NMR (100 MHz, MeOD): δ = 169.4 (CONH), 154.3 (C3, C5), 141.8 (C4’), 131.1 (C1), 105.9 (C2, C6), 61.2 (OCH3), 56.7 (2×OCH3), 40.8 (C7’), 40.6 (C1’), 30.2 (C6’, 28.4 (C3’), 27.4 (C4’), 27.0 (C5’).
【０１４７】
一実施形態では、［５−（６−（３，４，５−トリメトキシベンズアミド）ヘキシルアミノ）カルボニルペンチル］トリフェニルホスホニウムブロミド（１２）の合成は以下の通りであった：４℃のＤＭＦ（７．４ｍＬ）中の１０（６８９ｍｇ、２．２ｍｍｏｌ）の溶液に、ＣＨ２Ｃｌ２（７．４ｍＬ）中の、Ｎ，Ｎ−ジエチルプロパン−２−アミン（０．４７６ｍＬ、２．７ｍｍｏｌ）およびＰｙＢＯＰ（１５７２ｍｇ、２．７ｍｍｏｌ）を添加した。その混合物を氷浴中に保ち、０．５時間撹拌した。この後、化合物１１（１２１８、２．７ｍｍｏｌ）を添加し、次いでその反応を室温まで加熱した。その反応を２０時間撹拌し続けた。次にその混合物をＡｃＯＥｔ（４０ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（２×１０ｍＬ）で洗浄した。その有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして減圧下で濃縮した。その残渣をフラッシュクロマトグラフィー（１０％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）で精製した。収率：６３％。
【０１４８】
一実施形態では、化合物［５−（６−（３，４，５−トリメトキシベンズアミド）ヘキシルアミノ）カルボニルペンチル］トリフェニルホスホニウムブロミド（１２）の構造的キャラクタリゼーションは以下の通りである。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.85-7.76 (3H, m, H4”), 7.73-7.59 (12H, m, H2”, H3”, H5”, H6”), 7.12 (2H, s, H2, H6), 6.93 (1H, t, J= 5.7 Hz, H1’), 6.26 (1H, t, J = 5.7 Hz, H8’), 3.88 (6H, s, 2×OCH3), 3.85 (1H, s, OCH3), 3.39 (dd, J = 13.2, 6.7 Hz, 1H), 3.19-3.05 (4H, m, H7’, H14’), 2.14 (1H, t, J = 7.1 Hz, H10’), 1.69-1.26 (14H, m, H3’, H4’, H5’, H6’ H11’, H12’, H13’ );および 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 173.3 (C9’), 167.2 (PhCONH), 153.1 (C3, C5), 140.4 (C4), 135.4 (d, JCP = 2.9 Hz, C4”), 133.4 (d, JCP = 9.9 Hz, C2”,C6”), 130.7 (d, JCP = 12.6 Hz, C3”,C5”), 130.4 (C1), 117.9 (d, JCP = 86.2 Hz, C1”), 104.5 (C2, C6), 60.9 (OCH3), 56.4 (2×OCH3), 39.7 (C2’), 39.0 (C7’), 36.3 (C10’), 30.0 (C3’), 29.8 (C6’), 28.9 (d, J = 5.0 Hz, C12’), 26.6 (C4’), 25.9 (C5’), 24.9 (C11’), 22.3 (d, J = 43.5 Hz, C14’), 22.1 (d, J = 12.5 Hz, C13’).
【０１４９】
一実施形態では、［５−（６−（３，４，５−トリヒドロキシベンズアミド）ヘキシルアミノ）カルボニルペンチル］トリフェニルホスホニウムブロミド（ＡｎｔｉＯｘＢＥＮ３）を以下のように合成した。１．０ｇ、１．４ｍｍｏｌを７．６ｍｌの無水ジクロロメタンに溶解した。その反応混合物をアルゴン下で撹拌しそして−７５℃より低い温度に冷却した。三臭化ホウ素（ジクロロメタン中の１Ｍ溶液４．３ｍｌ；４．３ｍｍｏｌ）溶液を滴加し、その反応を−７５℃で１０分間維持した。添加が完了したら、その反応を−７０℃で１０分間保持し、次いで１２時間連続で撹拌しながら室温まで温めた。その後、水（２０ｍＬ）を慎重に添加することにより反応を終了させた。水を除去した後、得られた生成物をメタノールに溶解し、そして無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして溶媒を蒸発させた。その残渣をフラッシュクロマトグラフィー（１０％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）によって精製し、５５％の収率が得られた。
【０１５０】
一実施形態では、化合物［５−（６−（３，４，５−トリヒドロキシベンズアミド）ヘキシルアミノ）カルボニルペンチル］トリフェニルホスホニウムブロミド（ＡｎｔｉＯｘＢＥＮ３）の構造的キャラクタリゼーションは以下の通りである。
1H NMR (400 MHz, MeOD): δ = 7.92 - 7.83 (3H, m, H4”), 7.82-7.70 (12H, m, 12H, m, H2”, H3”, H5”, H6”), 6.83 (2H, s, H2, H6), 3.43-3.34 (2H, m, H14’), 3.33-3.25 (2H, m, H2’), 3.14 (1H, t, J = 6.9 Hz, H7’), 2.15 (1H, t, J = 7.0 Hz, H10’), 1.72-1.28 (14H, m, H3’, H4’, H5’, H6’ H11’, H12’, H13’); 13C NMR (100 MHz, MeOD): δ = 176.3 (C9), 170.5 (PhCOONH), 146.5 (C3, C5), 138.1(C4), 136.1 (d, J= 2.9 Hz, C4”), 134.7 (d, JCP = 10.0 Hz, C2”, C6”), 131.5 (d, JCP = 12.6 Hz, C3”, C4”), 125.4 (C1), 119.7 (d, JCP = 86.3 Hz, C1”), 107.8 (C2, C6), 40.8 (C2’), 40.5 (C7’), 36.2 (C10’), 30.9 (C3’), 30.8 (C6’), 30.2 (C4’), 29.9 (C5’), 27.4 (d, JCP = 2.5 Hz, C12’), 26.1 (C11’), 23.1 (d, JCP = 4.2 Hz, C13’), 22.6 (d, JCP = 51.3 Hz, C14’); ESI /MS m/z (%): 628 (M＋＋H−Br−, 38), 627 (M＋−Br, 100), 556 (35), 547 (46);および ESI /HRMS m/z 計算値 C37H44N2O5P＋ (M＋−Br−): 627.2982;実測値 627.2970.
【０１５１】
ＡｎｔｉＯｘＣＩＮのラジカル捕捉活性は、ＤＰＰＨ・、ＡＢＴＳ・＋およびＧＯ・ラジカルに基づく総抗酸化能アッセイによって評価した。これらすべての方法は、抗酸化剤によるラジカル（ＤＰＰＨ・、ＡＢＴＳ・＋またはＧＯ・）の失活に起因する吸光度の減少の分光光度測定を含む。結果はＩＣ５０で表され、これはラジカルの量を５０％減少させるのに必要な最小抗酸化剤濃度として定義される。抗酸化アッセイは、Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製のマルチプレートリーダー（Ｐｏｗｅｒｗａｖｅ  ＸＳ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ）で行った。
【０１５２】
一実施形態では、ＤＰＰＨラジカル捕捉活性を以下のようにして行った：濃度が増加する（０μＭ〜５００μＭの範囲）試験化合物の溶液をエタノール中で調製した。ＤＰＰＨエタノール溶液（６．８５ｍＭ）も調製し、次いで５１５ｎｍで０．７２±０．０２の吸光度に達するように希釈した。各化合物溶液（２０μＬ）を１８０μＬのＤＰＰＨ・溶液に３連で添加し、５１５ｎｍの吸光度を４５分かけて１分ごとに記録した。ラジカルの阻害率は、１００％のラジカルに相当するブランク（２０μＬのエタノールと１８０μＬのＤＰＰＨ・溶液）と試験化合物溶液との比較を基にした。ＩＣ５０値の決定のために用量反応曲線を確立した。データは３回の独立した実験の平均値±ＳＥＭである。
【０１５３】
一実施形態では、ＡＢＴＳ・＋捕捉活性を以下のように評価した：増加する濃度（１０μＭ〜５００μＭの範囲）の試験化合物のエタノール溶液を調製した。１５０ｍＭの過硫酸カリウム水溶液（１６３μＬ）を１０ｍＬの７ｍＭのＡＢＴＳ水溶液に添加し、続いて１６時間室温で暗所に保存することにより、ＡＢＴＳ・ラジカルカチオン溶液（２．４５ｍＭの最終濃度）を得た。次いで、その溶液をエタノールで希釈して吸光度０．７２±０．０２に到達させた。化合物（２０μＬ）を三連でＡＢＴＳ・＋溶液（１８０μＬ）に添加した後、分光光度測定を１５分かけて毎分行った。ラジカルの阻害率は、１００％のラジカルに相当するブランク（２０μＬのエタノールおよび１８０μＬのＡＢＴＳ・＋溶液）と試験化合物溶液との間の比較を基にした。ＩＣ５０値の決定のために用量反応曲線を確立した。データは３回の独立した実験の平均値±ＳＥＭである。
【０１５４】
一実施形態では、ＧＯ・捕捉活性を以下のように評価した：１０μＭ〜１００μＭの濃度の試験化合物の溶液をエタノール中で調製した。５ｍＭ  ＧＯ・のエタノール溶液を調製し、４２８ｎｍで１．００±０．０２の吸光度に達するように希釈した。ＧＯ・溶液（１８０μＬ）への３連の化合物溶液の添加（２０μＬ）に続いて、暗所で、室温で３０分間にわたって４２８ｎｍでの吸光度測定を行った。ラジカルの阻害率は、１００％のラジカルに相当するブランク（２０μＬのエタノールと１８０μＬのＧＯ・溶液）と試験化合物溶液との間の比較を基にした。ＩＣ５０値の決定のために用量反応曲線を確立した。データは３回の独立した実験の平均値±ＳＥＭである。
【０１５５】
一実施形態では、ＡｎｔｉＯｘＢＥＮの酸化還元特性および親油性特性は、電気化学的技術によって評価した。
【０１５６】
一実施形態では、電気化学分析データは、コンピュータ制御ポテンショスタットＡｕｔｏｌａｂ  ＰＧＳＴＡＴ３０２Ｎ（Ｍｅｔｒｏｈｍ  Ａｕｔｏｌａｂ、ユトレヒト、オランダ）を使用して得た。一般に、サイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）データは、５０ｍＶｓ−１の走査速度で取得した。示差パルスボルタンメトリー（ＤＰＶ）の結果は、４ｍＶのステップ電位、５０ｍＶのパルス振幅および８ｍＶｓ−１の走査速度で得た。電気化学信号は、汎用電気化学システム（ＧＰＥＳ）バージョン４．９、ソフトウェアパッケージによってモニターした。分析信号に対するバックグラウンドノイズの寄与を最小限にするために、すべての電気化学実験は、室温でファラデー箱内に配置された電気化学セル内で行った。
【０１５７】
一実施形態では、ＡｎｔｉＯｘＢＥＮ酸化還元特性の評価プロセスを以下のように実施した：各化合物の原液（１０ｍＭ）を、適切な量をエタノールに溶解することによって調製した。ボルタンメトリー作業溶液は、０．１ｍＭの最終濃度で電気化学セル内で調製した。ｐＨ７．４の支持電解質は、６．２ｍＬの０．２Ｍリン酸水素二カリウムおよび４３．８ｍＬの０．２Ｍリン酸二水素カリウムを１００ｍＬに希釈することによって調製した。ボルタンメトリーデータは、作用電極としてのガラス状炭素電極（ＧＣＥ、ｄ＝２ｍｍ）、白金線の対電極、および飽和Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極からなる３電極システムにおいて得られた。一実施形態では、ＡｎｔｉＯｘＢＥＮの親油特性の評価は以下のようにして行った。電気化学セルは、各相に、２つのＡｇ／ＡｇＣｌ参照電極および２つのＰｔ対電極を含む微小液液界面（μＩＴＩＥＳ）のアレイを有する４電極システムであった。その微孔性膜を４．０ｍＬの水相で満たされたガラスシリンダー上にフルオロシリコーンシーラント（Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  ７３０）で密封し、そこにＡｎｔｉＯｘＢＥＮ溶液のアリコートを加えた。次いで、膜をセルに含まれる有機相に浸した。その有機相参照溶液（２ｍＭのＢＴＰＰＡＣ１＋２ｍＭのＮａＣｌ水溶液）を機械的に安定化した。水性支持電解質溶液は１０ｍＭのｐＨ７．０のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液であった。
【０１５８】
一実施形態では、ＡｎｔｉＯｘＢＥＮ鉄キレート化特性は、Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓのマルチプレートリーダー（Ｐｏｗｅｒｗａｖｅ  ＸＳ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ）で行われる分光光度法フェロジン法によって評価した。
【０１５９】
一実施形態では、ＡｎｔｉＯｘＢＥＮ鉄キレート化特性を以下のように評価した：各ウェルに、酢酸アンモニウム（２０μＭ）中の試験化合物（１００μＭ）および硫酸アンモニウム鉄（ＩＩ）の溶液を添加し、１０分間インキュベートし、その吸光度を５６２ｎｍで読み取った。次に、新しく調製したフェロジン溶液（５ｍＭ）を各ウェルに加えた（９６μＭの最終濃度）。３７℃で１０分間の新しいインキュベーションの後、［Ｆｅ（フェロジン）３］２＋錯体の吸光度を５６２ｎｍで測定した。試験化合物の代わりにＤＭＳＯを用いてブランクウェルを試験した。参照としてＥＤＴＡを使用した。全ての化合物を１００μＭの最終濃度で試験した。最初の測定値の吸光度を試験化合物による吸光度をなくすために最終値まで差し引いた。データは３回の独立した実験の平均±ＳＥＭであり、そしてＦｅ（ＩＩ）キレート化の％として表される（ＥＤＴＡ＝１００％）。
【０１６０】
一実施形態では、ＡｎｔｉＯｘＢＥＮ機能性ミトコンドリア毒性プロファイルの評価を、ラット肝臓ミトコンドリア（ＲＬＭ）で行った。ＲＬＭは、組織ホモジナイズし、続いて２５０ｍＭスクロース、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、および０．１％無脂肪ウシ血清アルブミンを含有する氷冷緩衝液中で分画遠心分離することによって調製した。粗ミトコンドリア調製物を得た後、ペレットを２回洗浄し、洗浄緩衝液（２５０ｍＭスクロースおよび１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）に再懸濁した。タンパク質濃度は、標準としてＢＳＡを使用してビウレットアッセイにより決定した。
【０１６１】
一実施形態では、ミトコンドリアのＡｎｔｉＯｘＢＥＮ取り込みを評価した。
【０１６２】
一実施形態では、活性化ＲＬＭによるＡｎｔｉＯｘＢＥＮミトコンドリアの取り込みを以下のように評価した：ＲＬＭ（０．５ｍｇタンパク質／ｍＬ）を、１ｍＬのＫＣｌ培地（１２０ｍＭ  ＫＣｌ、１０μＬ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ  ７．２および１ｍＭ  ＥＧＴＡ）中、３７℃でＡｎｔｉＯｘＢＥＮと共にインキュベートした。ロテノン（１．５μＭ）の存在下で電極応答を較正するために、各ＡｎｔｉＯｘＢＥＮの５回の連続１μＭ添加を実施した。その後、コハク酸塩（１０ｍＭ）を添加してΔΨを生成した。アッセイの終わりにバリノミシン（０．２μｇ／ｍＬ）を加えてΔΨを消散させた。測定は、テトラフェニルホスホニウムカチオン（ＴＰＰ＋）の分布を測定するイオン選択電極、および参照としてＡｇ／ＡｇＣｌ２電極を用いて行った。ミトコンドリア内蓄積量は、ミトコンドリア内容量が０．５μＬ／ｍｇタンパク質であると仮定した場合のミトコンドリア外培地からミトコンドリア内培地へのＡｎｔｉＯｘＢＥＮの消失およびＴＰＰ化合物のミトコンドリア取り込みについての結合補正によって計算した。
【０１６３】
ＲＬＭ脂質過酸化に対するＡｎｔｉＯｘＢＥＮの結果を評価した。２つの異なる方法を使用した。
【０１６４】
一実施形態では、ＲＬＭ脂質過酸化に対するＡｎｔｉＯｘＢＥＮの効果を、以下のようにチオバルビツール酸反応性種（ＴＢＡＲＳ）アッセイによって測定した：ＲＬＭ（２ｍｇタンパク質／ｍｌ）を、３７℃で、基質として５ｍＭグルタミン酸塩／２．５ｍＭリンゴ酸塩を補充した、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌおよびｐＨ７．６を含む０．８ｍＬの培地中でインキュベートした。ＲＬＭを各ＡｎｔｉＯｘＢＥＮ（５μＭ）と共に５分間インキュベートした後、１００μＭのＦｅＳＯ４／５００μＭのＨ２Ｏ２／５ｍＭのアスコルベートを３７℃で１５分間添加することによってミトコンドリアを酸化ストレス条件に曝した。酸化ストレスにさらした後、ＤＭＳＯ中の２％（ｖ／ｖ）ブチル化ヒドロキシトルエン６０μＬを添加し、続いて過塩素酸３５％（ｖ／ｖ）２００μＬおよび１％（ｗ／ｖ）チオバルビツール酸２００μＬを添加した。次にサンプルを１００℃で１５分間インキュベートし、冷却し、その上清をガラス管に移した。２ｍＬのＭｉｌｉＱ水および２ｍＬのブタン１−オールを加えた後、サンプルを数秒間激しくボルテックスした。二相を分離させた。有機層のアリコート（２５０μＬ）の蛍光をＴＢＡＲＳについてプレートリーダー（λＥｘ＝５１５ｎｍ；λＥｍ＝５５３ｎｍ）で分析した。グルタミン酸塩／リンゴ酸塩で活性化したＲＬＭでのＴＢＡＲＳバックグラウンド産生は無視できるほどであることがわかった。データは、３回の独立した実験の平均値±ＳＥＭであり、そして対照の％として表す（対照＝１００％）。
【０１６５】
一実施形態では、ＲＬＭ脂質過酸化に対するＡｎｔｉＯｘＢＥＮの効果は、以下のように第２の方法論によって測定した：呼吸基質としてグルタミン酸塩／リンゴ酸塩（５ｍＭ／２．５ｍＭ）を使用した、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌおよびｐＨ７．６からなる反応培地１ｍＬの総容量中の２ｍｇＲＬＭの酸素消費量を、クラーク酸素電極を用いて３７℃でモニターした。ＲＬＭを各ＡｎｔｉＯｘＢＥＮ（５μＭ）と共に５分間インキュベートした後、１ｍＭのＡＤＰおよび０．１ｍＭのＦｅＳＯ４（最終濃度）を添加することによって脂質過酸化プロセスを開始した。インキュベーション培地中のＯ２の飽和濃度は、３７℃で２１７μＭであると推定された。酸化促進剤対（１ｍＭ  ＡＤＰ／０．１ｍＭ  ＦｅＳＯ４）によるＲＬＭ膜の過酸化から生じる酸素消費量の経時変化を記録した。トレースは、６回の独立した実験からの平均値±ＳＥＭ記録である。ＡＤＰ／Ｆｅ２＋の添加に続くより遅い酸素消費に関連するタイムラグ相を使用して、脂質過酸化を防止するためのＡｎｔｉＯｘＢＥＮの有効性を測定した。データは、６回の独立した実験からの平均値±ＳＥＭであり、そして対照の％として表す（対照＝１００％）。
【０１６６】
一実施形態では、ミトコンドリア透過性遷移細孔開口に対するＡｎｔｉＯｘＢＥＮの効果を評価した。
【０１６７】
一実施形態では、ミトコンドリア透過性遷移細孔開口に対するＡｎｔｉＯｘＢＥＮの効果を以下のように測定した。ミトコンドリア膨潤は、５４０ｎｍで分光光度的にモニターしたときに、ミトコンドリア懸濁液から散乱した光の変化を測定することによって推定した。漸増濃度のＡｎｔｉＯｘＢＥＮ（２．５〜１０μＭ）を、ＲＬＭ（１ｍｇ）存在下で、反応培地（２００ｍＭスクロース、１ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）、５ｍＭコハク酸塩、および１．５μＭロテノンを添加した１０μＭ  ＥＧＴＡ）に添加し、アッセイ前に５分間インキュベートした。その実験を、毎日滴定される適切な濃度のＣａ２＋（１５〜５０μＭ）を添加することによって開始した。ＰＴＰ脱感作剤であるシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）を添加して、ｍＰＴＰ開口を実証した。反応を連続的に撹拌し、そして温度を３７℃に維持した。データは３回の独立した実験の平均値±ＳＥＭであり、５４０ｎｍでのΔ吸光度として表される。
【０１６８】
一実施形態では、ミトコンドリア呼吸に対するＡｎｔｉＯｘＣＩＮの効果を評価した。
【０１６９】
一実施形態では、ミトコンドリア呼吸に対するＡｎｔｉＯｘＢＥＮ効果の評価を以下のように実施した：単離したＲＬＭの呼吸を、３７℃で磁気撹拌しながら、１ｍＬの恒温水ジャケット付きチャンバ内の適切な記録計に接続したＣｌａｒｋ型酸素電極を用いてポーラログラフで評価した。標準呼吸媒体は、１３０ｍＭスクロース、５０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）および１０μＭ  ＥＧＴＡからなる。漸増濃度のＡｎｔｉＯｘＢＥＮ（２．５〜１０μＭ）を呼吸基質グルタミン酸塩／リンゴ酸塩（それぞれ１０ｍＭおよび５ｍＭ）またはコハク酸塩（５ｍＭ）およびＲＬＭ（１ｍｇ）を含有する反応培地に添加し、アッセイ前に５分間インキュベートした。状態２は、ＡｎｔｉＯｘＢＥＮとの５分間のインキュベーション時間中の呼吸として考えられた。状態３呼吸を誘発するために、１２５ｎｍｏｌのＡＤＰ（グルタミン酸塩／リンゴ酸塩を使用）または７５ｎｍｏｌのＡＤＰ（コハク酸塩を使用）を加えた。状態４を、ＡＤＰリン酸化が終了した後に決定した。その後のオリゴマイシン（２μｇ／ｍｌ）の添加は、ＡＴＰシンターゼを阻害し、そしてオリゴマイシン阻害呼吸状態に由来した。最後に、１μＭのＦＣＣＰを加えて、脱共役呼吸を誘導した。ＲＣＲは、呼吸基質としてグルタミン酸塩−リンゴ酸塩またはコハク酸塩をそれぞれ用いて、対照実験について７．３±０．６および４．１±０．３であった。同じ呼吸基質でＡＤＰ／Ｏ指数は、それぞれ２．６±０．１および１．５±０．１であった。データは、７回の独立した実験の平均±ＳＥＭである。
【０１７０】
一実施形態において、膜貫通電位（ΔΨ）に対するＡｎｔｉＯｘＢＥＮの効果を評価した。
【０１７１】
一実施形態では、ミトコンドリア膜貫通電位（ΔΨ）に対するＡｎｔｉＯｘＢＥＮ効果の評価は、以下のように実施した：ミトコンドリア膜貫通電位（ΔΨ）は、サフラニン（５μＭ）の蛍光変化の評価を通じて推定し、５ｎｍのスリット幅で、４９５および５８６ｎｍの励起および発光波長で作動する分光蛍光計で記録した。漸増濃度のＡｎｔｉＯｘＢＥＮ（２．５〜１０μＭ）を呼吸基質グルタミン酸塩／リンゴ酸塩（それぞれ５ｍＭおよび２．５ｍＭ）またはコハク酸塩（５ｍＭ）およびＲＬＭ（最終体積２ｍＬ中０．５ｍｇ）を含有する反応培地（２００ｍＭスクロース、１ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）および１０μＭ  ＥＧＴＡ）に添加し、アッセイ前に２５℃で５分間インキュベートした。このアッセイでは、サフラニン（５μＭ）およびＡＤＰ（２５ｎｍｏｌ）をそれぞれアッセイの開始および脱分極の誘発に使用した。その後、ミトコンドリアを脱分極させるために１μＭのＦＣＣＰを全ての実験の最後に加えた。０．４μｇのバリノマイシンを補充した２００ｍＭのスクロース、１ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）および１０μＭのＥＧＴＡを含有するＫ＋フリーの反応培地中でＲＬＭをインキュベートしたときに得られた較正曲線を用いて、ΔΨを計算した。ΔΨによって誘導されたサフラニンの蛍光変化の拡大は、標準培地およびＫ＋フリー培地において類似していることが見出された。「再分極」は、添加したＡＤＰの完全リン酸化後の膜電位の回復に対応した。遅延相は、添加されたＡＤＰをリン酸化するのに必要な時間を反映していた。グルタミン酸塩／リンゴ酸塩またはコハク酸塩をそれぞれ使用した場合、単離ＲＬＭは、２２６ｍＶとほぼ等しいΔΨおよび２０２ｍＶとほぼ等しいΔΨ（負の内側）を発生した。データは５回の独立した実験の平均値±ＳＥＭである。
【０１７２】
一実施形態では、ＡｎｔｉＯｘＢＥＮの細胞傷害性プロファイルは、ヒト肝細胞癌ＨｅｐＧ２細胞において評価した。ヒト肝細胞癌ＨｅｐＧ２細胞を、ピルビン酸ナトリウム（０．１１ｇ／Ｌ）、炭酸水素ナトリウム（１．８ｇ／Ｌ）および１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％の抗生物質ペニシリン−ストレプトマイシン１００×溶液を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｄ５６４８）からなる高グルコース培地中で培養した。細胞を５％ＣＯ２の加湿インキュベーター中で３７℃に維持した。ＨｅｐＧ２細胞を４×１０４細胞／ｍＬの密度で播種し、処理前に２４時間増殖させた。
【０１７３】
一実施形態では、細胞傷害性スクリーニングを以下のように実施した：細胞を４８ウェルプレート（２×１０４細胞／５００μＬ）に配置し、次いで２５μＭ〜５００μＭの範囲の濃度のＡｎｔｉＯｘＢＥＮと共に４８時間インキュベートした。インキュベーション後、スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）アッセイを細胞タンパク質含有量の測定に基づく細胞密度決定に使用した。簡単に説明すると、インキュベーション後、培地を除去し、ウェルをＰＢＳ（１×）ですすいだ。細胞を、−２０℃で少なくとも２時間１００％メタノール中の１％酢酸を添加することによって固定した。その後、固定液を捨て、プレートを３７℃のオーブンで乾燥した。１％酢酸溶液中の２５０マイクロリットルの０．５％ＳＲＢを添加し、そして３７℃で１時間インキュベートした。次いでウェルを水中の１％酢酸で洗浄しそして乾燥した。その後、５００μｌのＴｒｉｓ（ｐＨ１０）を添加し、プレートを１５分間撹拌した。最後に、各上清２００μｌを９６ウェルプレートに移し、光学濃度を５４０ｎｍで測定した。データは４つの独立した実験の平均値±ＳＥＭであり、結果は対照の百分率（対照＝１００％）として表され、これはそれぞれの時点で何の処理もしていない細胞密度を表す。
【０１７４】
一実施形態では、すべての生物学的データを以下のように分析した：ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５．０ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ．）において、すべての結果を示された実験の数に対する平均値±ＳＥＭとして表す。データは、２つの平均値の比較のためのＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定、およびＤｕｎｎｅｔの多重比較事後検定による一元配置分散分析によって分析した。最後の検定は、２つより多いグループを１つの独立変数と比較するために使用した。有意性は、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．０００５、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１で認められた。
【０１７５】
本開示は、記載された実施形態に決して限定されるものと見なされるべきではなく、当業者はその修正に対する多くの可能性を予見するであろう。
【０１７６】
上述の実施形態は組み合わせることができる。添付の特許請求の範囲は、本開示の特定の実施形態をさらに説明する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０１７７】
【非特許文献１】Pagano, G., Talamanca, A. A., Castello, G., Cordero, M. D., d’Ischia, M., Gadaleta, M. N., Pallardo, F. V., Petrovic, S., Tiano, L., and Zatterale, A. (2014) Oxidative stress and mitochondrial dysfunction across broad-ranging pathologies: toward mitochondria-targeted clinical strategies. Oxidative medicine and cellular longevity, 2014, 541230.
【非特許文献２】Smith, R. A., Hartley, R. C., Cocheme, H. M., and Murphy, M. P. (2012) Mitochondrial pharmacology. Trends in pharmacological sciences, 33, 341-352.
【非特許文献３】Teixeira, J., Soares, P., Benfeito, S., Gaspar, A., Garrido, J., Murphy, M. P., and Borges, F. (2012) Rational discovery and development of a mitochondria-targeted antioxidant based on cinnamic acid scaffold. Free radical research, 46, 600-611.
【非特許文献４】Reily, C., Mitchell, T., Chacko, B. K., Benavides, G., Murphy, M. P., and Darley-Usmar, V. (2013) Mitochondrially targeted compounds and their impact on cellular bioenergetics. Redox biology, 1, 86-93.
【非特許文献５】Trnka, J., Elkalaf, M., and Andel, M. (2015) Lipophilic triphenylphosphonium cations inhibit mitochondrial electron transport chain and induce mitochondrial proton leak. PloS one, 10, e0121837.
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
2020503280.tif 000024
【図７Ａ−１】
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【図７Ａ−２】
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【図７Ｂ−１】
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【図７Ｂ−２】
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【図８】
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【国際調査報告】
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