(57)【要約】  本開示は、ポリヌクレオチドに存在する欠失、挿入、逆位、および転座のようなゲノム再編成の検出を改善するためのシングルエンドシーケンス法を対象にする。第１のプライミング事象は、標的配列の配列決定を可能にし、アダプター上の第２のプライミング事象は、選択的増幅によって増幅およびタグ付けされた配列の同定を可能にする。同一方向のプライミング事象の組合せにより、リードアライメントとゲノム再編成の同定が容易になる。
2020530270.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的特異的バーコードを結合することによる、配列決定のためのポリヌクレオチドを調製する方法であって、
第１の増幅プライマーおよび第２の増幅プライマーでポリヌクレオチドを増幅するステップであって、前記第１の増幅プライマーは前記ポリヌクレオチドの第１のプライミング部位にハイブリダイズし、および前記第１の増幅プライマーは標的特異的バーコードを含み、前記増幅はポリヌクレオチドアンプリコンを生成し、前記ポリヌクレオチドアンプリコンは、目的の前記ポリヌクレオチドおよび前記標的特異的バーコードと同一または相補的な配列を含む、ステップ
を含む方法。
【請求項２】
前記第２の増幅プライマーは、（１）前記第１のプライミング部位から距離を置いて、前記ポリヌクレオチドに結合したアダプターの一部に、または（２）前記ポリヌクレオチドの第２のプライミング部位にハイブリダイズし、前記第２のプライミング部位は前記第１のプライミング部位から距離を置いている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１のプライミング部位から距離を置いて、前記ポリヌクレオチドにアダプターを結合させるステップをさらに含み、前記アダプターは第２のプライミング部位を含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１のプライミング部位は融合遺伝子の一部であり、前記標的特異的バーコードは前記融合遺伝子の一部に特異的である、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記融合遺伝子の一部は、前記融合遺伝子の接合部である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記目的のポリヌクレオチドは、複数の目的のポリヌクレオチドを含み、前記方法は、複数のアダプターを前記複数のポリヌクレオチドに結合させるステップ、それによって複数のアダプター付加ポリヌクレオチドのそれぞれが異なる分子バーコードを含む複数のアダプター付加ポリヌクレオチドを形成するステップを含む、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記目的のポリヌクレオチドは、複数の目的のポリヌクレオチドを含み、前記第１の増幅プライマーは、異なる標的特異的プライマーおよび異なる標的特異的バーコードを有する複数の第１の増幅プライマーを含み、それによって複数のアダプター付加ポリヌクレオチドアンプリコンのそれぞれが異なる標的特異的バーコードを含む複数のアダプター付加ポリヌクレオチドアンプリコンを形成する、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチドアンプリコンまたはアダプター付加ポリヌクレオチドはビオチン部分のような結合パートナーを含む、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
第１のプライマー伸長および第２のプライマー伸長を行うステップにより、第１および第２の位置で前記ポリヌクレオチドアンプリコンを配列決定するステップをさらに含み、前記第１のプライマー伸長および前記第２のプライマー伸長は同一方向に実行される、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１のプライマー伸長および前記第２のプライマー伸長は、別々の配列決定実行中に前記ポリヌクレオチド上で同一方向に実行される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
第１の結合部位を有するポリヌクレオチドにおけるゲノム再編成を検出する組成物またはキットであって、
標的特異的プライマーおよび標的特異的バーコードを含む第１の増幅プライマー、および
第２の増幅プライマー
を含む組成物またはキット。
【請求項１２】
アダプターは第２のプライミング部位およびアダプターバーコードをさらに含み、
前記第２の増幅プライマーは、前記アダプター内の配列に相補的または同一のプライミング配列を含む、請求項１１に記載の組成物またはキット。
【請求項１３】
ポリヌクレオチドにおけるゲノム再編成を検出する方法であって、
第１の増幅プライマーおよび第２の増幅プライマーでポリヌクレオチドを増幅するステップであって、前記第１の増幅プライマーは前記ポリヌクレオチドの第１のプライミング部位にハイブリダイズし、および前記第１の増幅プライマーは標的特異的バーコードを含み、前記増幅は、目的の前記ポリヌクレオチドおよび前記標的特異的バーコードと同一または相補的な配列を含むポリヌクレオチドアンプリコンを生成する、ステップと、
第１のプライマー伸長および第２のプライマー伸長を行うステップにより、第１および第２の位置で前記ポリヌクレオチドアンプリコンを配列決定するステップであって、前記第１のプライマー伸長および前記第２のプライマー伸長は同一方向に実行される、ステップと
を含む方法。
【請求項１４】
前記第１の位置での前記配列決定は、前記目的のポリヌクレオチドの少なくとも一部の配列を提供し、前記第２の位置での前記配列決定は、前記標的特異的バーコードの配列を提供する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１のプライマー伸長および前記第２のプライマー伸長は、別々の配列決定実行中に前記ポリヌクレオチド上で同一方向に実行される、請求項１３または請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記配列決定は次世代シーケンシング（ＮＧＳ）または超並列シーケンシングである、請求項１３から１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
例えば前記第１のプライマー伸長および前記第２のプライマー伸長の前記配列決定から生成されたデータに基づいてゲノム再編成を同定するステップによって、前記ポリヌクレオチドアンプリコンのうちの少なくとも１つのシングルエンドシーケンシングを使用してそのゲノム再編成を検出するステップをさらに含む、請求項１３から１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ゲノム再編成の頻度は約１０％またはそれより低い、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ゲノム再編成は転座である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１のプライマー伸長の前記配列決定から生成された前記データは、ゲノム再編成を決定するために既知のｇＤＮＡ配列のような既知の核酸配列と比較される、請求項１３から１９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年７月１２日に出願された米国非仮特許出願第１５／６４８，２４０号の利益を主張し、その内容は、その内容全体が、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【０００２】
本開示は、融合遺伝子のようなゲノム再編成の検出を改善するための配列決定方法、組成物およびキットに関する。本開示はまた、ゲノム再編成を含む標的ポリヌクレオチドのライブラリー調製方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
核酸配列決定方法を使用してゲノム再編成を同定する能力は、ヒトの遺伝的障害および疾患の検出に非常に有益であることが証明されている。ゲノム再編成は、一般に、１つまたは複数のヌクレオチドの欠失、挿入、逆位、または転座を含む核酸鎖のヌクレオチドの任意の再編成を表し、目的の核酸を配列決定し、配列データを既知の核酸配列のような標準と比較することによって検出できる。次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を使用して、ポリヌクレオチドを迅速に分析し、ポリヌクレオチド内のゲノム再編成を検出できる。ＮＧＳでは、多数の配列を同時に並列分析できる。いくつかのフォーマットでは、ＤＮＡのようなポリヌクレオチドが１つまたは複数のアダプターを介して固体表面に固定され、シグナル強度を高めるために増幅される。一般的に、試料のポリヌクレオチド断片への断片化、１つまたは複数のアダプターによる断片のタグ付け、およびポリヌクレオチド断片の増幅による配列決定のためのライブラリーが調製される。断片は、１つまたは複数の増幅プライマーで増幅され得る。合成フォーマットによる配列決定では、断片は配列決定プライマーとハイブリダイズし、標識ジデオキシヌクレオチドが酵素的に付加される。標識ジデオキシヌクレオチドからのシグナルが検出され、配列を決定するために分析される。
【０００４】
シングルエンドまたはペアエンドシーケンシング法を使用して、目的のポリヌクレオチドを分析してもよい。シングルエンドシーケンシング法は、断片の一方の末端から反対の末端に向かうゲノム断片の配列決定を含む。シングルエンドシーケンシングのリードは、断片の２つの末端のいずれかのｎ塩基対に対応する断片あたり１回のリードを提供し、ここでｎはシーケンシングサイクル数である。一般的に、シングルエンドシーケンシングは、大規模なゲノム再編成および反復配列エレメントの検出にはあまり適していない。融合接合部にまたがるシングルエンドのリードは、融合事象の塩基対の証拠を提供する。しかし融合事象を同定するのに十分な数の塩基対までシングルエンドのリードを確実に進めることは困難である可能性がある。
【０００５】
ペアエンド法は、特定のリード長までの核酸断片の一方の末端から他方の末端までの読み取りと、次いで断片の反対側からの別のラウンドの読み取りを含む。ペアエンド法の場合、フォワード配列リードとリバース配列リードが実行され、データが近接配列としてペアリングされる。配列は、バリアントを同定するために標準試料と照合される。ペアエンドシーケンシング法は、一般にゲノムの再編成を検出するために使用され、これは、このような方法が一般に良好な位置決め情報を提供し、ゲノムに存在する構造再編成の解明を容易にするためである。しかし、多くのシーケンシング機器は、ペアエンドシーケンシングを実行するように構成されておらず、シングルエンドシーケンシングのみが可能になっている。
【０００６】
ＷＯ２００７１３３８３１Ａ２は、標的ポリヌクレオチドに散在するアダプターを使用して標的配列のヌクレオチド配列情報を取得するための方法および組成物について論じている。方法は、標的ポリヌクレオチドまたは断片内の間隔を空けた位置に複数のアダプターを挿入するために使用できる。アダプターは、プライマー伸長、プローブライゲーションなどによってヌクレオチドを同定するもののような、さまざまな配列決定化学を使用して隣接配列を調べるためのプラットフォームとして機能する場合がある。本開示は、既知のアダプター配列を標的配列に挿入するための方法および組成物を含み、これにより、アダプターによる、連続した標的配列の中断がある。本開示は、アダプターの「上流」および「下流」の両方を配列決定することにより、標的配列全体の同定が達成される場合があると述べている。
【０００７】
ＷＯ２０１５１１２９７４Ａ１は、核酸の調製および分析方法に関する態様を論じている。一部の実施形態では、配列分析（例えば、次世代シーケンシングを使用）のための、核酸の調製方法が提供される。
【０００８】
ＷＯ２０１５１４８２１９Ａ１は、標的核酸断片を分析する方法であって、５’から３’へのオーバーハングアダプター領域、プライマーＩＤ領域、配列決定プライマー結合部位、および標的断片の一方の末端に相補的な標的特異的配列領域を含む第１のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、プライマー伸長により、標的の１つの鎖をテンプレートとして使用した第１の鎖を生成すること、任意選択で組み込まれていないプライマーを除去すること、生成された第１の鎖から標的を増幅して増幅産物を産生すること、および増幅産物を検出することを含む方法を論じている。本開示また、固有のプライマーがそのような標的分析方法に有用な理由を論じている。
【０００９】
シングルエンドシーケンシングを使用したゲノム再編成の検出方法の改善は、特にこの方法がハイスループットシーケンシング分析と組み合わせて実用性を有する場合、この分野への有用な貢献となる。
【発明の概要】
【００１０】
ポリヌクレオチドのゲノム再編成を検出するための方法、組成物、およびキットが提供される。本方法、組成物およびキットを使用して、目的の核酸のシングルエンドシーケンシングを使って、ゲノム再編成をより容易にかつ確実に検出することができる。
【００１１】
本発明のこれらおよび他の特徴および利点は、添付の特許請求の範囲と併せて、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
【００１２】
本教示は、添付の図面と共に読まれる場合、以下の詳細な記載から最もよく理解される。特徴は必ずしも縮尺どおりに描かれているわけではない。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】配列決定のためのポリヌクレオチドを調製する方法の実施形態を示す図である。
【図２】配列決定のためのポリヌクレオチドを調製する方法の他の実施形態を示す図である。
【００１４】
定義された専門用語
本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図していないことを理解されたい。定義された用語は、本教示の技術分野で一般的に理解され受け入れられている定義された用語の技術的および科学的意味に追加されている。
【００１５】
明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、およびそれらの通常の意味に加えて、「実質的」または「実質的に」という用語は、当業者の許容範囲内または程度を意味する。例えば、「実質的に解除される」とは、解除が許容可能であると当業者が考えていることを意味する。
【００１６】
明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、およびそれらの通常の意味に加えて、「およそ」および「約」という用語は、当業者の許容範囲内または程度を意味する。「約」という用語は、一般に、示された数のプラスまたはマイナス１５％を表す。例えば、「約１０」は８．７から１．１５の範囲を示す。例えば、「ほぼ同一」とは、比較される項目が同一であると当業者が考えることを意味する。
【００１７】
「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、本明細書で同じ意味で使用され、ヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、または２つの天然に存在する核酸に類似した配列特異的方法で天然に存在する核酸とハイブリダイズすることができる、例えばＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対相互作用に関与することができる合成により産生された化合物（例えば、米国特許第５，９４８，９０２号およびそこに引用された参考文献に記載のＰＮＡ）、で構成される任意の長さ、例えば約１０塩基を超える、約１００塩基を超える、約５００塩基を超える、１０００塩基を超える、最大約１０，０００またはそれ以上の塩基のポリマーを表す。天然に存在するヌクレオチドは、グアニン、シトシン、アデニン、およびチミン（それぞれＧ、Ｃ、Ａ、およびＴ）を含む。明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、ポリヌクレオチドは、特に明記しない限り、アダプター付加ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドアンプリコン、またはアダプター付加ポリヌクレオチドアンプリコンであり得る。アダプター付加ポリヌクレオチドは、目的のポリヌクレオチドにアダプターが追加されているという点で、目的のポリヌクレオチドとは異なる。
【００１８】
本明細書で使用される場合、「標的核酸」または「標的」という用語は、標的核酸配列を含有する核酸を表す。標的核酸は、一本鎖または二本鎖であってもよく、多くの場合二本鎖ＤＮＡである。「標的核酸配列」、「標的配列」または「標的領域」は、本明細書で使用される場合、特異的な配列またはその相補体を意味する。標的配列は、インビトロの核酸内またはインビボの細胞のゲノム内にあってもよく、それは一本鎖または二本鎖核酸の任意の形態であってもよい。
【００１９】
「ハイブリダイゼーション」または「ハイブリダイズする」とは、完全にまたは部分的に相補的な核酸鎖が特定のハイブリダイゼーション条件下で一緒になって、２本の構成鎖が水素結合により連結された二本鎖構造または領域を形成する工程を表す。しかし、一般的に、アデニンとチミンもしくはウラシル（ＡとＴもしくはＵ）またはシトシンとグアニン（ＣとＧ）の間に水素結合が形成され、他の塩基対が形成される場合がある（例えば、Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，”  １１ｔｈ  ｅｄ．，  １９９２）。
【００２０】
「プライマー」という用語は、酵素的に作製されたまたは合成のオリゴヌクレオチドを意味し、ポリヌクレオチドテンプレートと二重鎖を形成すると、核酸合成の開始点として作用し、テンプレートに沿ってその３’末端から伸長し、伸長した二重鎖を形成することができる。伸長過程で追加されたヌクレオチドの配列は、テンプレートポリヌクレオチドの配列によって決定される。プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、または逆転写酵素のいずれかによって触媒されるヌクレオチド重合の開始点として働く。プライマーは、４〜１０００塩基またはそれ以上の長さ、例えば、１０〜５００塩基であってもよい。
【００２１】
本明細書で使用される場合、「プライマー伸長」という用語は、ポリメラーゼを使用して特異的なオリゴヌクレオチドをプライマーにアニーリングすることによるプライマーの伸長を表す。「アダプター」という用語は、目的のポリヌクレオチドに結合して合成ポリヌクレオチドを形成する核酸分子を表す。アダプターは一本鎖または二本鎖であり得、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および／または人工ヌクレオチドを含むことができる。アダプターは、目的のポリヌクレオチドの末端に位置するか、または中央もしくは内部に配置することができる。アダプターは、増幅もしくは配列決定のためのプライミング部位の提供、またはバーコードの追加など、１つまたは複数の機能または特性を目的のポリヌクレオチドに追加できる。例えば、アダプターには、ユニバーサルプライマーおよび／または配列決定のためのプライミング部位を含むユニバーサルプライミング部位を含めることができる。さらなる例として、アダプターには、分子バーコード、試料バーコード、および／または標的特異的バーコードのような、さまざまなタイプのまたはさまざまな目的の１つまたは複数のバーコードを含めることができる。さまざまなアダプターが当分野で知られており、本方法、組成物およびキットで使用するために使用または変更することができる。例えば、アダプターは、ポリヌクレオチドに結合してさまざまな５’末端を持つライブラリーを作成できるＹアダプターを含む。アダプターは、また、Ａアダプターをポリヌクレオチドの一方の末端に結合させ、Ｂアダプターをポリヌクレオチドの反対の末端に結合させる別々の配列（例えばＡ／Ｂアダプター）を含む場合がある。アダプターは、また、ヘアピンループがポリヌクレオチドの末端に結合しているステムループアダプターを含み、一部（一般的にステム）は、増幅または配列決定の前に切断され得る。ライゲーション、トランスポザーゼの使用、ハイブリダイゼーション、および／またはプライマー伸長を含むがこれらに限定されない任意の適した技術によって、アダプターを目的のポリヌクレオチドに結合させることができる。例えば、アダプターを目的のポリヌクレオチドの末端に連結してもよい。他の例として、トランスポザーゼを使用してアダプターを含むトランスポゾンを挿入することにより、アダプターを目的のポリヌクレオチドに結合することができ、それによって、目的のポリヌクレオチドの断片の末端にアダプターが提供される。一部の実施形態では、アダプターは、標的特異的プライマーおよび標的特異的バーコードを含み、標的特異的プライマーのプライマー伸長により、目的のポリヌクレオチド（より詳細には、相補的ポリヌクレオチド）へのアダプターの結合を可能にする。
【００２２】
「配列決定」という用語は、１つまたは複数のヌクレオチドの同一性、すなわち、ヌクレオチドがＧ、Ａ、Ｔ、またはＣであるかどうかを決定することを表す。
【００２３】
「シングルエンドシーケンシング」という用語は、ポリヌクレオチドの一方の末端からのリード（「シングルエンドリード」）を使用してポリヌクレオチドの配列を決定することを意味する。シングルエンドリードは、次世代シーケンシングおよび他の超並列シーケンシング技術を含む、任意の配列決定工程で実行できる。シングルエンドシーケンシングを実行するように構成された機器は、多数の企業から市販されている。例えば、ＩｌｌｕｍｉｎａのＨｉｓｅｑ２５００にはシングルエンド５０ｂｐおよびシングルエンド１００ｂｐのリード長がある。一部の実施形態では、シングルエンドリードの公称長、平均（ａｖｅｒａｇｅ，  ｍｅａｎ）長または絶対長は、少なくとも２０個の連続したヌクレオチド、あるいは少なくとも３０個の連続したヌクレオチド、あるいは少なくとも４０個の連続したヌクレオチド、あるいは少なくとも５０個の連続したヌクレオチドである。一部の実施形態では、シングルエンドリードの公称長、平均（ａｖｅｒａｇｅ，  ｍｅａｎ）長または絶対長は、最大３００個の連続したヌクレオチド、最大２００個の連続したヌクレオチド、あるいは最大１５０個の連続したヌクレオチド、あるいは最大１２０個の連続したヌクレオチド、あるいは最大１００個の連続したヌクレオチドである。前述の最小値と最大値を組み合わせて範囲を形成できる。
【００２４】
本明細書で使用される場合、配列の「部分」または「断片」という用語は、完全な配列よりも小さい配列の任意の部分（例えば、ヌクレオチド部分配列またはアミノ酸部分配列）を表す。ポリヌクレオチドの部分は、任意の長さ、例えば、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００もしくは５００またはそれ以上のヌクレオチド長であり得る。ガイド配列の一部は、ガイド配列の約５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、例えばガイド配列の３分の１またはそれ以下、例えば７、６、５、４、３または２個のヌクレオチド長であり得る。
【００２５】
「融合遺伝子」という用語は、以前は別々であった２つの遺伝子から形成されたポリヌクレオチドを表す。融合遺伝子は、転座、中間部欠損、または染色体逆位の結果として生じる可能性があり、ヒトがん細胞で高頻度に見られる。融合遺伝子は、細胞の正常な調節経路を改変し、および／またはがん細胞の増殖を促進する融合タンパク質に翻訳される融合転写物の発現をもたらす場合がある。遺伝子バリアントはまた、正常な調節経路に影響を及ぼす異常なタンパク質をもたらす場合がある。多くの融合遺伝子ポリヌクレオチドが知られており、さらに多くが発見されている。例えば、ＵＳ２０１００２７９８９０、ＵＳ２０１４０１２０５４０、ＵＳ２０１４０２７２９５６、およびＵＳ２０１４０３１５１９９は、がんおよび他の疾患に関連する多くの融合遺伝子、ならびにそのような融合遺伝子を検出する方法を開示する。本方法、組成物およびキットは、既知の遺伝子融合を検出するために使用できるが、以前は不明であった遺伝子融合を発見するために使用してもよい。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「プライミング部位」という用語は、プライマーにハイブリダイズするように構成されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド内の部位を表し、その結果、隣接配列、またはシングルエンドシーケンシングに十分近接した配列を、プライマー伸長などによって増幅または配列決定できる。プライミング部位は、目的のポリヌクレオチドに生じる配列、またはプライミング部位を含むアダプターを追加することによってポリヌクレオチドに追加される配列であり得る。プライミング部位を含むアダプターは、ライゲーション、トランスポザーゼの使用、プライマー伸長、または他の技術によって追加できる。
【００２７】
本開示では、数値範囲は範囲を定める数字を含める。本開示では、「含む」という語句が見つかれば、その代わりに「から本質的になっている」または「からなっている」という語句を使用してもよいと企図される。例示のために、化学構造および化学式を引き延ばすまたは拡大してもよいことを認識すべきである。
【００２８】
明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、状況が明らかに別の方法で指示しなければ、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」という用語は単数形態および複数形態の両方を含む。したがって、例えば、「プライマー（ａ  ｐｒｉｍｅｒ）」は、１つのプライマーおよび複数のプライマーを含む。本開示では、第１、第２、第３などの用語のような序数は、第１の事象が第２の事象の前に生じることを意味せず（文脈が違った意味を明確に示唆しない限り）、代わりに、異なる事象を互いに区別するために使用される。
【００２９】
特に示さない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示に関する分野で働く人々によって一般に理解されるのと同一の意味を持つ。
【００３０】
本明細書で開示されたように、多数の値の範囲が提供される。下限の単位１０分の１までの各介在値（ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ  ｖａｌｕｅ）は、状況が明らかに別の方法で指示しなければ、その範囲の上限と下限の間でまた具体的に開示されていることが理解される。表示された範囲における任意の表示値または介在値と、その表示された範囲における任意の他の表示値または介在値との間の各々より狭い範囲は、本発明内に包含される。これらの狭い範囲の上限および下限は独立してこの範囲に含まれても、排除されてもよく、狭い範囲において一方の限界を含む、または両方の限界を含む、またはいずれの限界も含まないそれぞれの範囲も、表示範囲においてはっきり限定して排除される任意の限界に応じて本発明に包含される。表示範囲が一つまたは両方の限界を含む場合、これらの含まれた限界のいずれかまたは両方を排除する範囲も、本発明に含まれる。
【００３１】
特に示さない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同一の意味を持つ。本明細書に記載のものと類似または同等の任意の方法および材料を本教示の実施または試験に用いることができるが、いくつかの例となる方法および材料が記載される。
【００３２】
本明細書に引用する特許および刊行物はすべて、明確に引用することにより本明細書の一部をなすものとする。任意の刊行物の引用は提出日以前の開示のためであり、本特許請求の範囲はこのような刊行物に先行する資格がないことを認めると解釈されるべきではない。さらに、提供された刊行物の日付は、実際の出版の日付とは異なり得、これは個別に確認することができる。
【００３３】
当業者が本開示を読むと明らかになるように、本明細書で記載および図示されている個々の実施形態の各々は、個別の構成要素および特徴を有し、これらは、本教示の範囲および精神を逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離するか、または特徴に組み合わせることができる。任意の列挙された方法は、事象が列挙された順序または論理的に可能な任意の他の順序で実行することができる。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
一部の実施形態では、本開示は、標的特異的バーコードを結合することにより配列決定のためのポリヌクレオチドを調製する方法を提供する。方法は、第１の増幅プライマーおよび第２の増幅プライマーでポリヌクレオチドを増幅することを含み、第１の増幅プライマーは第１のプライミング配列および標的特異的バーコードを含み、第１のプライミング配列はポリヌクレオチドの第１のプライミング部位にハイブリダイズする。本増幅はポリヌクレオチドアンプリコンを生成し、ポリヌクレオチドアンプリコンは、目的のポリヌクレオチドおよび標的特異的バーコードと同一または相補的な配列を含む。
【００３５】
第１の増幅プライマーは、標的特異的（すなわち、アダプター付加ポリヌクレオチド内の標的配列に相補的および／またはハイブリダイズする）である、第１の増幅プライマーを含む。第１の増幅プライマーは、標的配列に特異的なバーコード、例えば、融合遺伝子の一部のような遺伝子の一部に特異的なバーコードである標的特異的バーコードをさらに含む。増幅はポリヌクレオチドアンプリコンを生成し、ポリヌクレオチドアンプリコンは、目的のポリヌクレオチドおよび標的特異的バーコードと同一または相補的な配列を含む。第２の増幅プライマーは、（１）第１のプライミング部位から距離を置いて、ポリヌクレオチドに結合したアダプターの一部に、または（２）ポリヌクレオチドの第２のプライミング部位にハイブリダイズし、第２のプライミング部位は第１のプライミング部位から距離を置いている。一部の実施形態では、方法は、アダプターをポリヌクレオチドに結合させてアダプター付加ポリヌクレオチドを形成することをさらに含むことができ、アダプターは第２のプライミング部位および任意選択でアダプターバーコードを含む。一部の実施形態では、第２のプライミング部位はアダプター上にあり、ユニバーサルプライミング部位および／または配列決定プライマーの部位であり、および／または第２のプライマー結合部位はアダプター付加ポリヌクレオチドの５’末端のユニバーサルプライミング部位である。一部の実施形態では、アダプターおよび／または第２のプライミング部位は、ポリヌクレオチド鎖の５’末端にあり、第１のプライミング部位は、鎖の３’末端にある。一部の実施形態では、アダプターバーコードは試料バーコードまたは分子バーコードである。分子バーコードは、目的のポリヌクレオチドのプールに結合したアダプターのセット内で固有のものであるという意味で固有の配列である可能性がある。
【００３６】
一部の実施形態では、本開示は、標的特異的バーコードを結合することにより配列決定のためのポリヌクレオチドライブラリーを調製する方法、組成物およびキットを提供する。ポリヌクレオチドのプールは、第１のセットの増幅プライマーおよび第２のセットの増幅プライマーを使用して増幅され、第１のセットの増幅プライマーはポリヌクレオチドプール内の複数の異なる配列にハイブリダイズし、第１のセットの増幅プライマーのそれぞれは異なる標的特異的バーコードを含む。一部の実施形態では、アダプターバーコードを含むアダプターは、ポリヌクレオチドアンプリコンに結合する。第２のセットの増幅プライマーは、（１）第１のプライミング部位から距離を置いて、ポリヌクレオチドに結合したアダプターの一部に、または（２）ポリヌクレオチドの第２のプライミング部位にハイブリダイズし、第２のプライミング部位は第１のプライミング部位から距離を置いている。第１および第２のセットのプライマーによる増幅は、ポリヌクレオチドアンプリコンのライブラリーを生成する。アダプターをポリヌクレオチドアンプリコンに追加することができる。一部の実施形態では、アダプターは増幅の前に追加され、アダプターは第２のセットの増幅プライマーにハイブリダイズする第２のプライミング部位を含む。一部の実施形態では、アダプターは、例えば、ポリヌクレオチドアンプリコン上の配列決定プライミング部位を提供するために、増幅後に追加される。
【００３７】
複数のポリヌクレオチドアンプリコンのそれぞれは、第１のプライマー伸長および第２のプライマー伸長を行うことにより、２つの位置で配列決定することができ、第１のプライマー伸長および第２のプライマー伸長の配列決定は、アダプター付加ポリヌクレオチドアンプリコンのそれぞれについて同一方向に実行される。ゲノム再編成は、第１のプライマー伸長および第２のプライマー伸長の配列決定から生成されたデータに基づいて同定することができる。
【００３８】
他の実施形態では、本開示は、第１の結合部位を有するポリヌクレオチドにおけるゲノム再編成を検出する組成物またはキットを提供する。組成物およびキットは、第１および第２の増幅プライマーを含む。第１の増幅プライマーは、標的特異的プライマーおよび標的特異的バーコードを含む。組成物およびキットは、アダプターをさらに含むことができる。アダプターは、第２のプライミング部位およびアダプターバーコードを含む。一部の実施形態では、第２の増幅プライマーは、アダプター内の配列に相補的または同一のプライミング配列、例えば第２のプライミング部位を含む。組成物およびキットの一部の実施形態では、第２の増幅プライマーは、（１）第１のプライミング部位から距離を置いて、ポリヌクレオチドに結合したアダプターの一部に、または（２）ポリヌクレオチドの第２のプライミング部位にハイブリダイズし、第２のプライミング部位は第１のプライミング部位から距離を置いている。一部の実施形態では、アダプターおよび／または第２のプライミング部位は、ポリヌクレオチド鎖の５’末端にあり、第１のプライミング部位は、鎖の３’末端にある。
【００３９】
他の実施形態では、本開示はポリヌクレオチドにおけるゲノム再編成を検出する方法、組成物、およびキットを提供する。方法、組成物、およびキットは、第１の増幅プライマーおよび第２の増幅プライマーでポリヌクレオチドを増幅することを含む。第１の増幅プライマーはポリヌクレオチドの第１のプライミング部位にハイブリダイズし、および第１の増幅プライマーは標的特異的バーコードをさらに含む。増幅は、目的のポリヌクレオチドおよび標的特異的バーコードと同一または相補的な配列を含むポリヌクレオチドアンプリコンを生成する。第１のプライマー伸長および第２のプライマー伸長を行うことにより、第１および第２の位置でポリヌクレオチドアンプリコンを配列決定する。第１のプライマー伸長および第２のプライマー伸長は同一方向に実行され得る。
【００４０】
上述の方法では、組成物およびキット、標的特異的バーコードは、遺伝子、遺伝子の一部、融合遺伝子、融合遺伝子の一部、または目的の他のポリヌクレオチドのような標的に特異的である。融合遺伝子は、既知の融合遺伝子の接合部を含む既知の融合遺伝子であり得、および／または融合遺伝子は、疑わしいまたは仮定された融合遺伝子、またはそのような融合遺伝子の接合部であり得る。標的は、目的のポリヌクレオチドにおける欠失、挿入、逆位、および転座のようなゲノム再編成であり得る。一部の実施形態では、標的はｃＤＮＡ接合部またはエクソン接合部である。
【００４１】
一部の実施形態では、第２の増幅プライマーは、アダプターの配列決定プライミング部位であり得る第２のプライミング部位のようなアダプターの一部にハイブリダイズする。一部の実施形態では、アダプター付加ポリヌクレオチドは、５’末端にアダプターおよび／または３’末端に標的特異的バーコードを含む。
【００４２】
一部の実施形態では、目的のポリヌクレオチドは、複数の目的のポリヌクレオチドを含み、方法は複数のアダプターを複数のポリヌクレオチドに結合させ、それによってそれぞれが異なるアダプターバーコードを含む複数のアダプター付加ポリヌクレオチドを形成することを含む。あるいはまたはさらに、目的のポリヌクレオチドは、複数の目的のポリヌクレオチドを含み、ならびに第１の増幅プライマーは、異なる標的特異的プライマーおよび異なる標的特異的バーコードを有する複数の第１の増幅プライマーを含み、それによってそれぞれが異なる標的特異的バーコードを含む複数のアダプター付加ポリヌクレオチドアンプリコンを形成する。
【００４３】
一部の実施形態では、アダプター付加ポリヌクレオチドアンプリコンは、第１のプライマー伸長および第２のプライマー伸長を行うことにより、第１および第２の位置で配列決定され、第１のプライマー伸長および第２のプライマー伸長は同一方向に実行される。一部の実施形態では、第１のプライマー伸長は、第２のプライミング部位のようなアダプターの一部と相補的または同一の第１の配列決定プライマーで実行される。一部の実施形態では、第２のプライマー伸長は、標的特異的バーコードに隣接する部分、または標的特異的バーコードのシングルエンドシーケンシングに十分な近接部分のような第１の増幅プライマーの一部と相補的または同一の第２の配列決定プライマーで実行される。
【００４４】
プライマー伸長による配列決定は、プライマーをポリヌクレオチドアンプリコンにハイブリダイズすること、１つまたは複数の標識ヌクレオチドの添加によってプライマーを伸長し、それによって組み込まれた標識ヌクレオチドを産生すること、および組み込まれた標識ヌクレオチドを検出することによって実行される。配列決定プライマーは、アダプター上の配列と相補的または同一であり得る。一部の実施形態では、第１のプライマー伸長および第２のプライマー伸長は、別々の配列決定実行中にポリヌクレオチド上で同一方向に実行される。一部の実施形態では、配列決定は次世代シーケンシング（ＮＧＳ）または超並列シーケンシングである。第１のプライマー伸長および／または第２のプライマー伸長の配列決定から生成されたデータは、既知のｇＤＮＡ配列のような既知の核酸配列と比較することができる。
【００４５】
本方法、組成物、およびキットは、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、ＲＮＡテンプレート（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはマイクロＲＮＡ（マイクロＲＮＡ））由来の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）、ｍＲＮＡのようなＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、および他のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの配列決定に有用である。ポリヌクレオチドは、微生物、ウイルス、菌類、植物、または哺乳動物のような任意の起源であり得る。
【００４６】
一部の実施形態では、本方法、組成物、およびキットは、目的のポリヌクレオチドにおけるゲノム再編成の存在、位置、または非存在を検出するために使用される。ゲノムの再編成は、欠失、重複、挿入、逆位、または転座などであってもよく、ならびに方法、組成物、およびキットを使用して、特定のゲノム配列または遺伝子が目的のポリヌクレオチドで欠失、重複、挿入、逆位、または転座したかどうかを検出できる。一部の実施形態では、本方法、組成物、およびキットを使用してゲノム欠失を検出する。一部の実施形態では、本方法、組成物、およびキットを使用してゲノム重複を検出する。一部の実施形態では、本方法、組成物、およびキットを使用してゲノム挿入を検出する。一部の実施形態では、本方法、組成物、およびキットを使用してゲノム逆位を検出する。一部の実施形態では、本方法、組成物、およびキットを使用してゲノム転座を検出する。一部の実施形態では、本方法、組成物、およびキットを使用してｇＤＮＡまたはＲＮＡ由来のｃＤＮＡのようなポリヌクレオチドにおけるゲノム再編成を検出する。一部の実施形態では、ゲノム再編成の頻度は約１００％またはそれより低く、あるいは約５０％またはそれより低く、あるいは約１０％またはそれより低く、あるいは約５％またはそれより低く、あるいは約１％またはそれより低い。一部の実施形態では、本方法は、第１のプライマー伸長および第２のプライマー伸長の配列決定から生成されたデータに基づいてゲノム再編成を同定することによって、ポリヌクレオチドアンプリコンのシングルエンドシーケンシングを使用してそのゲノム再編成を検出することをさらに含む。一部の実施形態では、ゲノム再編成は転座である。
【００４７】
ポリヌクレオチドのゲノム再編成を検出するために使用できる配列決定方法が提供される。本方法は、目的の核酸のシングルエンドシーケンシングを利用して、より容易かつ確実にゲノム再編成を検出するために使用できる。本方法は、目的のポリヌクレオチドにおける欠失、挿入、逆位、および転座の検出のための次世代シーケンシング（ＮＧＳ）工程で使用することができる。本方法は、ポリヌクレオチド再編成検出の精度を高めるために、同一方向に第１および第２のプライマー伸長を配列決定することを含む。第１および第２のプライマー伸長からの組み合わせた配列データは、ポリヌクレオチドのゲノム再編成のリードアラインメントおよび同定を容易にする。同一方向に生成されたリードの組合せにより、ポリヌクレオチド内の核酸の相対位置をより正確に同定できる。本方法は、ゲノム内のヌクレオチドの相対位置を同定するシングルエンドシーケンシング工程の能力を改善し、標準的なシングルエンドシーケンシング法と比較して、構造的再編成のより効果的な解明をもたらす。
【００４８】
本方法は、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）工程のようなハイスループットシーケンス法において使用されてもよい。一部の実施形態では、ハイスループットシーケンス法は、ライブラリー調製、固定化、および配列決定の３つのステップを含む。ポリヌクレオチドは一般にランダム断片化を受け、およびアダプターは、断片の一方または両方の末端に連結される。アダプターは、線形アダプター、環状アダプター、またはバブルアダプターであってもよい。配列決定ライブラリー断片は、固体支持体上に固定化され、ポリヌクレオチド配列を調べるために並行配列決定反応が実行される。ハイスループットシーケンス法は、元のポリヌクレオチドのコピーを提供するために、エマルジョンＰＣＲ、ブリッジＰＣＲ、またはローリングサークル増幅を用いる場合がある。
【００４９】
ポリメラーゼはＰＣＲ中にエラーを起こす傾向があり（ヌクレオチドの誤取り込みが最も多い）、これらのエラーが初期のサイクルで発生した場合、配列決定データの分析でバリアントとして現れる。分子バーコードを使用して、ＰＣＲエラーを目的のポリヌクレオチドの実際のバリアントと区別することができる。分子バーコードのコンセプトは、増幅されるプール内の各ポリヌクレオチドが固有の分子バーコードに結合されることである。異なる分子バーコードを持つ配列リードは、元が異なるＤＮＡ分子を表し、一方、同一バーコードを持つリードは、元が同一の分子からのＰＣＲ複製の結果である。縮重塩基領域（ＤＢＲ）と呼ばれる分子バーコードは、米国特許第８，４８１，２９２号（Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ．）に開示される。ＤＢＲは、試料中に存在する分子に結合するランダム配列タグである。ＤＢＲおよび他の分子バーコードにより、試料調製中のＰＣＲエラーを、元のポリヌクレオチドに存在する突然変異や他のバリアントと区別することができる。
【００５０】
ポリヌクレオチドへのアダプターの結合
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドにアダプターが結合してアダプター付加ポリヌクレオチドを形成する。アダプターを、増幅の前または後にポリヌクレオチドに結合させることができ、ならびに一部の実施形態では、ポリヌクレオチドはポリヌクレオチドアンプリコンであり、およびアダプター付加ポリヌクレオチドはアダプター付加ポリヌクレオチドアンプリコンである。ライゲーション、トランスポザーゼの使用、ハイブリダイゼーション、および／またはプライマー伸長のような任意の適した技術によってアダプターを結合させることができる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、一方または両方の末端でアダプターに連結される。ライゲーション反応では、共有結合または連結は、２つ以上のポリヌクレオチド（目的の核酸など）またはオリゴヌクレオチド（アダプターなど）の末端間で形成される。結合または連結の性質は多様であってもよく、ライゲーションは酵素的または化学的に実行されてもよい。通常、ライゲーションは酵素的に行われ、あるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの末端ヌクレオチドの５’炭素と他のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの３’炭素との間にホスホジエステル結合を形成する。一部の実施形態では、アダプターはＹアダプターであり、さまざまな５’末端を持ち、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉｎｉＳｅｑ、ＮｅｘｔＳｅｑ、およびＨｉＳｅｑ３０００／４０００シーケンシング機器での使用に適したＰ５およびＰ７プライミング部位を持つライブラリーを生成できる。
【００５１】
一部の実施形態では、Ａ／Ｂアダプターを目的のポリヌクレオチドに結合させ、Ａアダプターをポリヌクレオチドの一方の末端に結合させ、Ｂアダプターをポリヌクレオチドの反対の末端に結合させる。一部の実施形態では、ランダムライゲーション、またはトランスポザーゼの使用、またはプライマー伸長による増幅によってアダプターを結合させる。ＡアダプターおよびＢアダプターの個々の特性により、シーケンシング手法に含まれる各ポリヌクレオチドには、ＡおよびＢアダプターの両方が含まれることになることが企図される（すなわち、Ａ／Ｂアダプターの組合せとして表される、アダプターのタイプの１つを５’末端に結合し、他のタイプのアダプターをシーケンシングを受ける各ポリヌクレオチドの３’末端に結合する）。ライゲーションステップのランダムな特質によって、Ａ／ＡおよびＢ／Ｂアダプター付加ポリヌクレオチドも産生され、その後の処理ステップを実施して、Ａ／Ｂアダプターの組合せを有する分子のみがシーケンシング手法のために選択および／または含まれることを保証することができる。アダプターの部分を対象にするプライマーを使用してアダプター付加ポリヌクレオチドを増幅し、標的特異的バーコードを結合するための本明細書に記載の増幅の前または後に、目的のポリヌクレオチドの量を増加させることができる。一部の実施形態では、超並列シーケンシングのための完全にシーケンス可能な（ｓｅｑｕｅｎｃａｂｌｅ）ライブラリーを作成するために、アダプターは、ある方法で十分な数のポリヌクレオチドに結合されている。
【００５２】
一部の実施形態では、アダプターはアダプターバーコードを含む。アダプターバーコードは、ポリヌクレオチドの供給源または特質の識別子のような、任意の所望の目的に役立つ。バーコードは一般に、ポリヌクレオチドの同定、グループ化、または処理に使用される配列情報を表す。個々のリード、リードのグループ、プローブに関連するリードのサブセット、エクソンに関連するリードのサブセット、試料もしくは任意の他のグループに関連するリードのサブセット、またはその任意の組合せを同定するために、バーコードを含めることができる。例えば、配列は、バーコード情報を参照することによって、試料、エクソン、プローブセット、またはそれらの組合せによって選別できる（例えば、コンピュータプロセッサを使用して）。バーコード情報を使用してコンティグを組み立てることができる。コンピュータプロセッサは、バーコードを同定し、バーコードをまとめて読み取ることでリードを組み立てることができる。
【００５３】
ポリヌクレオチドを任意の適した機構によって入手してもよい。目的のポリヌクレオチドは、ゲノムデオキシリボ核酸（ｇＤＮＡ）、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、または他のタイプであってもよい。ポリヌクレオチドは、哺乳動物、ウイルス、菌類、もしくは細菌、またはその混合であってもよい。一部の実施形態では、ゲノムＤＮＡのようなポリヌクレオチド鎖は、アダプターをポリヌクレオチドに結合する前に、任意の適した技術を使用して断片化される。当技術分野で既知のように、ポリヌクレオチド鎖は、物理的断片化、酵素的断片化、または化学的せん断断片化を使用して断片化されてもよい。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、超音波処理、音響せん断、または流体力学的せん断のような物理的な断片化方法を使用して断片化される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、制限酵素を使用して断片化される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＤＮａｓｅ  Ｉまたはトランスポザーゼのような酵素を使用して断片化される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、金属カチオンの存在下での加熱消化（ｈｅａｔ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）のような化学的せん断方法を使用して断片化される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、無作為に断片化される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、亜硫酸水素ナトリウムまたは他の化学的修飾因子で処理することができる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド断片を使用してシーケンシングライブラリーに追加する。
【００５４】
ポリヌクレオチド断片は、任意の適した塩基長であってもよい。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド断片は、約３０〜約２，０００の塩基長を有する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド断片は、約３０〜約８００の塩基長を有する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド断片は、約３０〜約５００の塩基長を有する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド断片は、約１００〜約８００の塩基長を有する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド断片は、約２００〜約６００の塩基長を有する。
【００５５】
断片化後、１つまたは複数のアダプターがポリヌクレオチド断片に結合していてもよい。一部の実施形態では、アダプターは、線形アダプター、環状アダプター、またはバブルアダプターである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド少なくとも１つの環状アダプターに連結される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド断片を環状アダプターと接触させて、環状ポリヌクレオチド分子を生成する。一部の実施形態では、増幅過程で、環状ポリヌクレオチド分子のみが増幅される。これらの実施形態のいずれにおいても、アダプターはアダプターバーコードを含むことができる。
【００５６】
標的ポリヌクレオチドの増幅
本方法は、ポリヌクレオチドがアダプターに結合する前および／または後にポリヌクレオチドを増幅することを含む。一部の実施形態では、アダプターは、ポリヌクレオチドの目的の配列の５’末端に位置し、アダプターは目的の配列の増幅のためのプライミング部位を提供する。アダプター付加ポリヌクレオチドは、第１の増幅プライマーおよび第２の増幅プライマーを使用して増幅される。第１の増幅プライマーは、ポリヌクレオチド内の標的配列に対して配列特異性を有し、標的配列（目的のポリヌクレオチド）の一部にハイブリダイズすることができる。第２の増幅プライマーは、アダプターのプライミング部位または目的のポリヌクレオチドの標的特異的プライミング部位にハイブリダイズすることができる。増幅ステップの間、第１の増幅プライマーは標的配列にハイブリダイズし、第２のプライマーはアダプター上の配列プライミング部位にハイブリダイズする。一部の実施形態では、第１の増幅プライマーは、アダプター付加ポリヌクレオチドの５’末端でハイブリダイズする。本方法のプライマーは、ポリヌクレオチドの標的配列との適切なハイブリダイゼーションを提供するために十分に大きくなければならない。
【００５７】
増幅のために、目的のポリヌクレオチドは、標的特異的バーコードを含む第１の増幅プライマーとハイブリダイズする。第１の増幅プライマーは、ポリヌクレオチドの少なくとも一部と相補的である。第１の増幅プライマーは、ポリヌクレオチドの第１のプライミング部位にハイブリダイズする。ポリヌクレオチドは、３’末端に標的配列を含み、任意選択でその後にアダプターが続く。標的配列がアダプター付加ポリヌクレオチドに存在する場合、第１の増幅プライマーはアダプター付加ポリヌクレオチドにハイブリダイズし、それによって標的配列の選択的増幅および検出が可能になる。第１の増幅プライマーは、目的のポリヌクレオチドにおける欠失、挿入、逆位、または転座のようなゲノム再編成に相補的であり得、および／またはハイブリダイズすることができる。一部の実施形態では、第１の増幅プライマーは、ｃＤＮＡ接合部またはエクソン接合部に相補的であり、および／またはハイブリダイズする。一部の実施形態では、第１の増幅プライマーは、既知の融合遺伝子の接合部を含む既知の融合遺伝子、および／または疑わしいもしくは仮定された融合遺伝子、または疑わしいもしくは仮定された融合遺伝子の接合部のような融合遺伝子に相補的であり、および／またはハイブリダイズする。
【００５８】
第２の増幅プライマーは、第１のプライミング部位から距離を置いて、ポリヌクレオチドまたはアダプターにハイブリダイズする。一部の実施形態では、第２の増幅プライマーは、第１のプライミング部位から距離を置いて、ポリヌクレオチドに結合したアダプターの一部にハイブリダイズする。一部の実施形態では、第２の増幅プライマーは、ポリヌクレオチドの第２のプライミング部位にハイブリダイズし、第２のプライミング部位は第１のプライミング部位から距離を置いている。
【００５９】
目的のポリヌクレオチドは、任意の適した方法を使用して増幅してもよい。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して増幅される。一般的に、ＰＣＲは、ポリヌクレオチド鎖の変性（例えば、ＤＮＡ融解）、変性ポリヌクレオチド鎖へのプライマーのアニーリング、および相補的ポリヌクレオチドを合成するためのポリメラーゼによるプライマーの伸長を含む。工程は、一般に、ＤＮＡポリメラーゼ、フォワードおよびリバースプライマー、デオキシヌクレオシド三リン酸、二価カチオン、ならびに緩衝液を必要とする。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、直線的増幅によって増幅される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、エマルジョンＰＣＲ、ブリッジＰＣＲ、またはローリングサークル増幅を使用して増幅される。増幅されたポリヌクレオチドを、適したシーケンス法を使用して塩基対の順序を決定するために分析してもよい。
【００６０】
一部の実施形態では、１つまたは複数のプライマーまたはポリヌクレオチドは、固体支持体上に固定化される。増幅プライマーおよび／またはポリヌクレオチドの固定化は、ポリヌクレオチドの洗浄を促進して、望ましくない種（例えば、デオキシヌクレオチド）を除去することができる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、固体支持体に結合する１つまたは複数のアダプターを含み、ポリヌクレオチドを支持体上に固定化する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、フローセルまたはガラススライドの表面に固定化される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、マイクロタイターウェルまたは磁気ビーズ上に固定化される。一部の実施形態では、固体支持体は、官能基または部分に結合したポリマーでコーティングされていてもよい。一部の実施形態では、固体支持体は、アミノ、ヒドロキシル、もしくはカルボキシル基のような官能基、またはアダプターの結合のためのアビジンもしくはストレプトアビジンのような他の部分を担持してもよい。
【００６１】
ポリヌクレオチドアンプリコンは、アダプター付加ポリヌクレオチドアンプリコンであり得る。一部の実施形態では、アダプター付加ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアンプリコンは、ビオチン部分のような結合パートナーを含む。ポリヌクレオチドに、結合パートナーを含むアダプターを結合させることができ、またはポリヌクレオチドを、結合パートナーを含む１つまたは複数のプライマーを使用して増幅することができる。一部の実施形態では、本方法は、ビオチン化プライマー伸長産物のような相互結合パートナーと固体支持アビジンまたはストレプトアビジンとの複合体を形成することを含む。方法は、また、相互結合パートナーに結合することにより、結合パートナーを含むアダプター付加ポリヌクレオチドを含む試料を濃縮することを含むことができる。タンパク質アビジンおよびストレプトアビジンは、ビオチンおよび特定のビオチンアナログと非常に強力な複合体を形成する。一般的に、ビオチンがそのカルボキシル側鎖を介して第２の分子に結合している場合、結果として生じるコンジュゲートは、アビジンまたはストレプトアビジンによってさらに強力に結合されている。このようなコンジュゲートが調製されると第２の分子は「ビオチン化」されると言われる。一般的に、本方法は、ビオチン化核酸のアビジンまたはストレプトアビジンへの複合体形成、その後の複合体の検出、分析、および／または使用を含む。一部の実施形態では、ビオチン化ポリヌクレオチドは、ストレプトアビジンでコーティングされたフローセルまたはストレプトアビジンでコーティングされた金属ビーズに固定化されている。本方法、組成物およびキットの一部の実施形態では、標的特異的プライマー（例えば、第１の増幅プライマー）は、ビオチン部分のような結合パートナーに結合して、ストレプトアビジンまたはアビジンのような相互結合パートナーに結合することにより、選択または精製を可能にすることができる。有用な結合パートナーは、ビオチン：アビジン、ビオチン：ストレプトアビジン、抗体：抗原、および相補的核酸を含む。一部の実施形態では、標的特異的プライマーは、選択的に増幅されたプールの捕捉を可能にするビオチンのような結合パートナーを含んでもよい。
【００６２】
次世代シーケンシングのためのポリヌクレオチドの調製は、多くの場合、次世代シーケンシングの前に標的濃縮を使用し、１つまたは複数の標的濃縮プロトコールを本方法に含めることができる。１つまたは複数の所望の標的ポリヌクレオチドを濃縮することにより、少ない労力と費用で、および／または高いカバレッジ深度で配列決定をより焦点を合わせることができる。次世代シーケンシングのための現在の濃縮プロトコールの例には、ＡｇｉｌｅｎｔのＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  Ｈｙｂｒｉｄ  ＣａｐｔｕｒｅおよびＩｌｌｕｍｉｎａのＴｒｕＳｅｑ  Ｃａｐｔｕｒｅのようなハイブリダイゼーションベースの捕捉プロトコールが含まれる。他の例には、ＡｇｉｌｅｎｔのＨａｌｏＰｌｅｘ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒのＡｍｐｌｉＳｅｑ、ＩｌｌｕｍｉｎａのＴｒｕＳｅｑ  Ａｍｐｌｉｃｏｎ、およびＲａｉｎｄａｎｃｅのエマルジョン／デジタルＰＣＲのようなＰＣＲベースのプロトコールが含まれる。
【００６３】
一部の実施形態では、両末端にユニバーサルアダプターを有するポリヌクレオチドのライブラリーは、ＰＣＲのような方法を使用して増幅される。カスタムアダプターを含む標的特異的プライマーを反応に追加して、標的配列を増幅することができる。そのような実施形態では、断片の２つのプール、（ａ）両末端にユニバーサルアダプターを持つ断片のプール、および（ｂ）一方の末端または両末端に配列特異的アダプターを使用した選択的増幅によって生成された断片のプール、が生成される。断片の混合プールは、必要に応じて標的濃縮を行うことができる。
【００６４】
本方法、組成物およびキットの一部の実施形態では、増幅のために複数の標的特異的プライマーが用いられる、または提供される。増幅は、シングルプレックスまたはマルチプレックスであり得る。マルチプレックスＰＣＲは、１回のＰＣＲ実験で複数の核酸標的を増幅する分子生物学的技術である。標的配列のマルチプレックス増幅のためのキットは、Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｏｍ  ＮＶより入手可能である。
【００６５】
本方法、組成物およびキットの一部の実施形態では、ポリヌクレオチドアンプリコンは、転位因子（ＴＥ）プロトコールで使用される。トランスポザーゼを使用してアダプターを含むトランスポゾンを挿入することにより、アダプターをアンプリコンに結合することができ、それによって、アンプリコンの断片の末端にアダプターが提供される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは同時に断片化され、バーコード化されてもよい。例えば、トランスポザーゼ（例えば、ＮＥＸＴＥＲＡ）を使用してポリヌクレオチドを断片化し、ポリヌクレオチドにバーコードを追加してもよい。
【００６６】
融合遺伝子
標的特異的プライマーは、任意の既知のまたは疑わしい融合遺伝子の一部と相補的または同一であり得る。例えば、標的特異的プライマーは、ＵＳ２０１００２７９８９０、ＵＳ２０１４０１２０５４０、ＵＳ２０１４０２７２９５６、またはＵＳ２０１４０３１５１９９に開示された融合遺伝子のいずれかと相補的または同一であり得る。さらなる例として、標的特異的プライマーは、以下の融合遺伝子：ＢＣＲ−ＡＢＬ、ＥＭＬ４−ＡＬＫ、ＴＥＬ−ＡＭＬ１、ＡＭＬ１−ＥＴＯ、およびＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧのいずれかと相補的または同一であり得る。あるいは、標的特異的プライマーは、新たに発見された融合遺伝子、またはそのような融合遺伝子の接合部と相補的または同一であり得る。あるいは、標的特異的プライマーは、疑わしいもしくは仮定された融合遺伝子、またはそのような融合遺伝子の接合部と相補的または同一であり得る。
【００６７】
一部の実施形態では、本方法、組成物およびキットは、異なる融合遺伝子のための複数の標的特異的プライマーを含む。例えば、複数の標的特異的プライマーは、ＢＣＲ−ＡＢＬ接合部のための第１の標的特異的プライマー、およびＥＭＬ４−ＡＬＫのための第２の標的特異的プライマーを含むことができる。一部の実施形態では、本方法、組成物およびキットは、単一の融合遺伝子の複数の接合部を含む、単一の融合遺伝子の複数の標的特異的プライマーを含む。例えば、複数の標的特異的プライマーは、第１のＥＭＬ４−ＡＬＫ接合部のための第１の標的特異的プライマー、および第２のＥＭＬ４−ＡＬＫ接合部のための第２の標的特異的プライマーを含むことができる。本方法、組成物およびキットは、第３の標的特異的プライマー、第４の標的特異的プライマー、第５の標的特異的プライマー、第２０の標的特異的プライマーまで、またはさらに多くの標的特異的プライマーを含むことができる。
【００６８】
標的配列の配列決定
増幅後、アダプター付加ポリヌクレオチドアンプリコンを配列決定され得る。例えば、配列決定は、増幅中に生成されたアダプター付加ポリヌクレオチドアンプリコンの第１のプライマー伸長および第２のプライマー伸長によって実行されてもよい。一部の実施形態では、第１および第２のプライマー伸長は、個々のアンプリコンまたは同一のアンプリコンのセットで同一方向に実行される。第１のプライマー伸長は、第１のプライマー（および他のプライマー）からの伸長の結果として組み込まれた塩基を検出することにより配列決定を判定し、ポリヌクレオチドの標的配列、特にアダプターの５’に位置するものの少なくとも一部の決定を可能にする。アダプター付加ポリヌクレオチドは、Ｐ５またはＰ７一次部位のような配列決定プライミング部位を含むことができる。一部の実施形態では、第１のプライマー伸長を使用してアダプターバーコードの配列を検出することもできる。第２のプライマー伸長は、第２のプライマーからの伸長の結果として組み込まれた塩基を検出することにより配列決定を判定し、標的特異的バーコードの検出を可能にする。標的特異的バーコードの配列決定を使用して、目的のポリヌクレオチド内の標的特異的バーコードに特異的な遺伝子または他のポリヌクレオチドの存在および／または位置を実証する。
【００６９】
一部の実施形態では、配列決定は、可逆的ダイターミネーターを用いたシーケンシング−バイ−シンセシス（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）を使用した超並列シーケンシングによって実行される。一部の実施形態では、配列決定は、シーケンシング−バイ−ライゲーション（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｌｉｇａｔｉｏｎ）を使用した超並列シーケンシングによって実行される。一部の実施形態では、配列決定は、単一分子シーケンシングによって実行される。一部の実施形態では、配列決定は、パイロシーケンシングを使用して実行される。
【００７０】
ポリヌクレオチドは、任意の適した反応方法を使用して配列決定されてもよい。一部の実施形態では、単一のヌクレオチド（すなわち、Ｇ、Ａ、Ｔ、またはＣに対応するヌクレオチド）を使用して単一の反応サイクルを行ってもよく、この方法はヌクレオチドが組み込まれているかどうかを検出することを含む。ヌクレオチドが組み込まれている場合、次いでヌクレオチドの同一性が判明する。そのような実施形態では、この方法は、４つすべてのヌクレオチド（すなわち、Ｇ、Ａ、Ｔ、およびＣに対応するヌクレオチド）を連続して循環させることを含む場合があり、ヌクレオチドの１つを組み込む必要がある。そのような実施形態では、ヌクレオチドの付加は、ピロリン酸塩放出、プロトン放出または蛍光、例えば既知の方法を検出することにより検出される場合がある。例えば、一部の実施形態では、チェーンターミネーターヌクレオチドは、末端リン酸標識蛍光ヌクレオチド（すなわち、末端リン酸に結合したフルオロフォアを有するヌクレオチド）であってもよく、同定ステップは、蛍光を読み取ることを含む。他の実施形態では、チェーンターミネーターヌクレオチドは、末端リン酸にクエンチャーを含む蛍光ヌクレオチドであってもよい。そのような実施形態では、ヌクレオチドの取り込みにより、ヌクレオチドからクエンチャーが除去され、それによって蛍光標識を検出できるようになる。他の実施形態では、末端リン酸標識チェーンターミネーターヌクレオチドは、質量タグ、電荷標識（ｃｈａｒｇｅ  ｌａｂｅｌ）、電荷遮断標識（ｃｈａｒｇｅ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｌａｂｅｌ）、化学発光標識、酸化還元標識、または他の検出可能な標識で末端リン酸が標識されていてもよい。
【００７１】
一部の実施形態では、それぞれ異なるフルオロフォアで標識された４つのヌクレオチド（すなわち、Ｇ、Ａ、ＴおよびＣに対応するヌクレオチド）すべてを使用して、単一の反応サイクルを行ってもよい。そのような実施形態では、配列決定ステップは、Ｇ、Ａ、Ｔ、およびＣに対応する４つのチェーンターミネーターを、増幅されたポリヌクレオチドに加えることを含んでもよく、４つのチェーンターミネーターは異なるフルオロフォアを含む。そのような実施形態では、同定ステップは、４つのチェーンターミネーターのどれがプライマーの末端に付加されているかを同定することを含んでもよい。
【００７２】
配列決定ステップは、シングルエンドシーケンシングを使用して実行できる。すなわち、第１のプライマー伸長配列と第２のプライマー伸長配列とが同一方向に読み取られる。一部の実施形態では、シングルエンド対応のゲノムアナライザーを使用して、ポリヌクレオチドを配列決定する。一部の実施形態では、方法は、配列決定反応（すなわち、塩基取り込み）をリアルタイムで連続的にモニタリングすることを含む。これは、鎖伸長反応混合物に「検出酵素」を含めることにより、鎖伸長および検出、またはシグナル生成反応を同時に実行することで簡単に達成される場合がある。一部の実施形態では、鎖伸長反応は最初に第１の反応ステップとして別々に実行され、その後にプライマー伸長産物が検出される別々の「検出」反応が続く。
【００７３】
配列決定データの分析
ゲノム再編成は、第１のプライマー伸長および第２のプライマー伸長の配列決定から生成されたデータに基づいて同定されてもよい。本方法は、第１のプライマー伸長および第２のプライマー伸長の配列決定から生成されたデータに基づいてポリヌクレオチドのゲノム再編成を同定することを含む。第１のプライマー伸長からの配列決定データは、標的配列の塩基対の配列を提供する。アダプターはポリヌクレオチド試料の標的配列と特異的にハイブリダイズするように設計されているため、第２のプライマー伸長からの配列決定データは、アダプターの塩基対の配列を提供し、これは標的配列の存在を示すまたは実証するために使用できる。２つのプライマー伸長によって提供される組み合わせたデータは、ポリヌクレオチドの任意のゲノム再編成を決定するための位置情報を提供する。
【００７４】
第１および第２のプライマー伸長から生成されたデータは、標準試料と比較される。標準試料と、第１および第２のプライマー伸長から生成されたデータとの違いは、研究中の試料にゲノム再編成が存在する可能性があることを示す。標準試料の配列、ならびに標準試料に対する第１のプライマー伸長および第２のプライマー伸長から生成された配列を使用して、任意のゲノム再編成のタイプと位置を同定することができる。
【００７５】
本方法、組成物およびキットを使用して、一般的な欠失症候群に関連するものを含む任意の目的の配列を検出することができる。
【００７６】
［実施例１］
図１は、アダプターおよびバーコードをポリヌクレオチドに結合させることにより配列決定のためのポリヌクレオチドを調製する方法、ならびに本技術により生成されるアダプター付加ポリヌクレオチドおよびアダプター付加ポリヌクレオチドアンプリコンを示す。アダプター付加ポリヌクレオチドは、本発明の実施形態にしたがって、選択的遺伝子増幅を使用して融合事象を検出するために使用され得る。図１では、アダプター付加ポリヌクレオチド１０２は、目的の核酸、この場合、融合遺伝子の接合部を含む。アダプター付加ポリヌクレオチド１０２は、第１の遺伝子１０４および第２の遺伝子１０６を含む。アダプター付加ポリヌクレオチド１０２は、それぞれの末端にアダプター１０８、アダプター１１０も含む。アダプターを、ライゲーションのような任意の適した手法で結合することができる。アダプターのうちの少なくとも１つは、分子バーコードまたは試料バーコードであり得る、アダプターバーコード１１２を含む。
【００７７】
時間Ａで、標的特異的増幅のためにアダプター付加ポリヌクレオチドを調製する。アダプター付加ポリヌクレオチドを変性させて一本鎖ポリヌクレオチドを提供するか、または増幅のために二本鎖ポリヌクレオチドを提供することができる。一部の実施形態では、アダプター付加ポリヌクレオチドは非特異的な方法で増幅される（例えば、アダプター付加ポリヌクレオチドのライブラリーのメンバーに結合したアダプター上のプライミング部位に相補的なプライマーでアダプター付加ポリヌクレオチドを増幅することにより）。一部の実施形態では、アダプター付加ポリヌクレオチドは、一般にアダプター付加ポリヌクレオチドの増幅の前に、上記のように濃縮される。
【００７８】
アダプター付加ポリヌクレオチドは、標的特異的プライマー１１６を含む第１の増幅プライマー１１４との接触のために調製される。標的特異的プライマー１１６は、アダプター付加ポリヌクレオチドに存在することが知られているまたは疑われる配列、例えば、第２の遺伝子１０６内の配列に相補的である。第１の増幅プライマー１１４は、分析される試料または目的のポリヌクレオチドに存在することが知られているまたは疑われる遺伝子または他の標的の一部に特異的な、標的特異的バーコード１１８も含む。これに関連して、遺伝子特異的とは、遺伝子に相補的であることを意味するのではなく、バーコードが遺伝子に特異的に関連付けられていることを意味し、そのため、遺伝子特異的バーコードの配列を検出すると、関連配列が存在することが確実に示される。
【００７９】
時間Ｂで、アダプター付加ポリヌクレオチドは、アダプター付加ポリヌクレオチドアンプリコンのライブラリーを生成するために、第１の増幅プライマー１１４および第２の増幅プライマー１２０の存在下で増幅される。アダプター付加ポリヌクレオチドアンプリコンは、目的の核酸、アダプターまたはその相補体、および遺伝子特異的なバーコードまたはその相補体を含む。説明を簡単にするために、図１は、第１の増幅プライマー１１４および第２の増幅プライマー１２０の１つのセットを示すが、増幅反応は、さまざまな配列に対して多数の標的特異的プライマーを使用することができ、多数の目的の核酸のアンプリコンを生成できる。一部の実施形態では、アダプター付加ポリヌクレオチドは、タグがビオチンまたは他の結合パートナーを含む場合のような、ポリヌクレオチドのプールから濃縮される。
【００８０】
一部の実施形態では（濃縮に加えてまたは濃縮の代わりであってもよい）、ポリヌクレオチド（アダプター付加ポリヌクレオチドを含む）は、外部もしくは内部のプライマーまたはネステッドプライマーで増幅できる。そのような実施形態では、外部プライマー、または増幅の初期のラウンドで使用されたプライマーは、標的特異的バーコードを含む必要のない標的特異的プライマーである。内部プライマーまたは後続の増幅ラウンドのプライマーも標的特異的プライマーであり、標的特異的バーコードを含む。一般的に、ネステッドＰＣＲとは、初期のラウンドで使用されたプライマーに、少なくとも１塩基対分は内部で結合する１つまたは複数の新しいプライマーを使用した、１回または複数の後続ラウンドのＰＣＲ増幅を表す。ネステッドＰＣＲは、後続の反応で、正確な内部配列を持つ前の増幅産物のみを増幅することにより、望ましくない増幅標的の数を減らす。ネステッドＰＣＲは、一般的に、以前の外部プライマー結合部位の完全に内側にプライマーを設計する必要がある。
【００８１】
アダプター付加ポリヌクレオチドアンプリコンは、次いで配列決定され得る。一部の実施形態では、アダプター１０８の第１のプライミング部位１２４に相補的な第１の配列決定プライマー１２２を使用して、少なくとも第１の遺伝子１０４の配列決定のための第１のプライマー伸長を実行する。標識ヌクレオチドが配列決定反応でプライマーに加えられ、アダプター付加ポリヌクレオチドアンプリコンに相補的な第１の伸長配列１２６が生成され、アダプター付加ポリヌクレオチドに関する配列情報が提供される。第１のプライマー伸長は、アダプター付加ポリヌクレオチドアンプリコンの第１の位置で起こる。第１のプライミング部位１２４は、アダプターバーコードを第１の遺伝子１０４と共にまたは別々に配列決定することを望むかどうかに応じて、アダプターバーコードに対して一般に５’または３’であり得る。第２の配列決定プライマー１２８を使用して、少なくとも遺伝子特異的バーコード１１８の配列決定のための第２のプライマー伸長を実行する。第２の配列決定プライマー１２８は、遺伝子特異的バーコード１１８の３’および標的特異的配列１１６の５’である第１の増幅プライマー１１４の部分１３０に相補的である。標識ヌクレオチドが配列決定反応でプライマーに加えられ、遺伝子特異的バーコードに相補的な第２の伸長配列１３２が生成され、遺伝子特異的バーコードに関する配列情報が提供される。上記のように、第１および第２の序数は、第２のプライマーの前に第１のプライマーが使用されることを意味せず、代わりに、異なるプライマーを互いに区別するために使用される。
【００８２】
時間Ｃで、配列決定反応からのデータは、処理され、解釈される。一部の実施形態では、第１の伸長配列１２６は第１の遺伝子の配列であると決定され、第２の伸長配列１３２は第２の遺伝子に関連する遺伝子特異的バーコードの配列であると決定される。これらの決定に基づいて、データは目的の核酸の中で融合遺伝子の存在を示すものとして解釈される。融合遺伝子は、第１の遺伝子および第２の遺伝子の部分を含み、その存在は、第２の遺伝子１０６自体を直接配列決定しなくても決定される。
【００８３】
［実施例２］
図２は、予めアダプターの結合を行うか否かにかかわらず、標的特異的プライマーでポリヌクレオチドを増幅できることを示す。ポリヌクレオチドは、アダプターをポリヌクレオチドに結合させ、続いて標的特異的（図２の左側のワークフロー）、または本技術によって生成されたアダプター付加ポリヌクレオチドおよびアダプター付加ポリヌクレオチドアンプリコンによって、配列決定のために調製され得る。アダプター付加ポリヌクレオチドは、本発明の実施形態にしたがって、選択的遺伝子増幅を使用してゲノム再編成または他の融合事象を検出するために使用され得る。図２では、ポリヌクレオチド２０２は、目的の核酸、この場合、融合遺伝子の接合部を含む。ポリヌクレオチド１０２は、第１の遺伝子２０４および第２の遺伝子２０６を含む。
【００８４】
時間Ａで、標的特異的増幅のためにポリヌクレオチドを調製する。増幅のためには、ポリヌクレオチドを変性させて一本鎖ポリヌクレオチドを提供するか、または二本鎖ポリヌクレオチドを提供することができる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは非特異的な方法で増幅される（例えば、アダプター付加ポリヌクレオチドのライブラリーのメンバーに結合したアダプター上のプライミング部位に相補的なプライマーでポリヌクレオチドを増幅することにより）。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、一般にポリヌクレオチドの増幅の前に、上記のように濃縮される。
【００８５】
ポリヌクレオチドは、標的特異的プライマー２１６を含む第１の増幅プライマー２１４との接触のために調製される。標的特異的プライマー２１６は、ポリヌクレオチドに存在することが知られているまたは疑われる配列、例えば、遺伝子２０６内の配列に相補的である。第１の増幅プライマー２１４は、分析される試料または目的のポリヌクレオチドに存在することが知られているまたは疑われる遺伝子の一部に特異的な、遺伝子特異的バーコード２１８も含む。ポリヌクレオチドは、また、標的特異的プライマー２１７を含む第２の増幅プライマー２１５との接触のために調製される。標的特異的プライマー２１７は、ポリヌクレオチドに存在することが知られているまたは疑われる配列、例えば、遺伝子２０４内の配列に相補的である。第２の増幅プライマー２１５は、また、標的特異的バーコード、試料バーコード、分子バーコード、もしくは他のバーコード、またはバーコードの組合せのようなバーコード２１９を含む。第１および第２の増幅プライマーの一方または両方はアダプターを含む場合がある。
【００８６】
時間Ｂで、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドアンプリコンのライブラリーを生成するために、第１の増幅プライマー２１４および第２の増幅プライマー２１５の存在下で増幅される。ポリヌクレオチドアンプリコンは、目的の核酸、および標的特異的バーコードまたはその相補体を含む。ポリヌクレオチドアンプリコンは、目的の核酸、アダプターまたはその相補体、および標的特異的バーコードまたはその相補体を含むアダプター付加ポリヌクレオチドアンプリコンであり得る。説明を簡単にするために、図２は、第１の増幅プライマー２１４および第２の増幅プライマー２１５の１つのセットを示すが、増幅反応は、さまざまな配列に対して多数の標的特異的プライマーを使用することができ、多数の目的の核酸のアンプリコンを生成できる。
【００８７】
次いで、ポリヌクレオチドアンプリコンを配列決定するか、濃縮、さらなる増幅、および／またはアダプターの結合のような追加の処理ステップを行うことができる。例えば、アダプターをアンプリコンの各末端に結合してアダプター付加ポリヌクレオチドアンプリコンが配列決定プライミング部位を有するように、および／または固体支持体に結合させ得るようにすることができる。時間Ｃでは、ポリヌクレオチドアンプリコンは、固体支持体に結合したプライマーにハイブリダイズし、プライマーは、支持体に結合したポリヌクレオチドアンプリコンの相補体を提供するように伸長されている。アダプター２０８の第１のプライミング部位２２４に相補的な第１の配列決定プライマー２２２を使用して、少なくとも第１の遺伝子２０４の配列決定のための第１のプライマー伸長を実行する。標識ヌクレオチドが配列決定反応でプライマーに加えられ、アダプター付加ポリヌクレオチドアンプリコンに相補的な第１の伸長配列２２６が生成され、アダプター付加ポリヌクレオチドに関する配列情報が提供される。第１のプライマー伸長は、アダプター付加ポリヌクレオチドアンプリコンの第１の位置で起こる。第１のプライミング部位２２４は、アダプターバーコードを第１の遺伝子２０４と共にまたは別々に配列決定することを望むかどうかに応じて、アダプターバーコードに対して一般に５’または３’であり得る。第２の配列決定プライマー２２８を使用して、少なくとも遺伝子特異的バーコード２１８の配列決定のための第２のプライマー伸長を実行する。第２の配列決定プライマー２２８は、遺伝子特異的バーコード２１８の３’および標的特異的配列２１６の５’である第１の増幅プライマー２１４の部分２３０に相補的である。標識ヌクレオチドが配列決定反応でプライマーに加えられ、遺伝子特異的バーコードに相補的な第２の伸長配列２３２が生成され、遺伝子特異的バーコードに関する配列情報が提供される。上記のように、第１および第２の序数は、第２のプライマーの前に第１のプライマーが使用されることを意味せず、代わりに、異なるプライマーを互いに区別するために使用される。
【００８８】
時間Ｃで、配列決定反応からのデータは、処理され、解釈される。一部の実施形態では、第１の伸長配列２２６は第１の遺伝子の配列であると決定され、第２の伸長配列２３２は第２の遺伝子に関連する遺伝子特異的バーコードの配列であると決定される。これらの決定に基づいて、データは目的の核酸の中で融合遺伝子の存在を示すものとして解釈される。融合遺伝子は、第１の遺伝子および第２の遺伝子の部分を含み、その存在は、第２の遺伝子２０６自体を直接配列決定しなくても決定される。
【００８９】
例となる実施形態
実施形態１。標的特異的バーコードを結合することにより配列決定のためのポリヌクレオチドを調製する方法であって、第１の増幅プライマーおよび第２の増幅プライマーでポリヌクレオチドを増幅することであって、第１の増幅プライマーはポリヌクレオチドの第１のプライミング部位にハイブリダイズし、および第１の増幅プライマーは標的特異的バーコードを含み、増幅はポリヌクレオチドアンプリコンを生成し、ポリヌクレオチドアンプリコンは、目的のポリヌクレオチドおよび標的特異的バーコードと同一または相補的な配列を含む、ことを含む方法。
【００９０】
実施形態２。第２の増幅プライマーは、（１）第１のプライミング部位から距離を置いて、ポリヌクレオチドに結合したアダプターの一部に、または（２）ポリヌクレオチドの第２のプライミング部位にハイブリダイズし、第２のプライミング部位は第１のプライミング部位から距離を置いている、実施形態１に記載の方法。
【００９１】
実施形態３。第１のプライミング部位から距離を置いて、ポリヌクレオチドにアダプターを結合させることをさらに含み、アダプターは第２のプライミング部位を含む、実施形態１に記載の方法。
【００９２】
実施形態４。アダプターはさらにアダプターバーコードを含み、アダプターバーコードは試料バーコードまたは分子バーコードである、実施形態３に記載の方法。
【００９３】
実施形態５。第１のプライミング部位は融合遺伝子の一部であり、標的特異的バーコードは融合遺伝子の一部に特異的である、実施形態１から４のいずれか１項に記載の方法。
【００９４】
実施形態６。融合遺伝子の一部は、融合遺伝子の接合部である、実施形態５に記載の方法。
【００９５】
実施形態７。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡテンプレートに由来するゲノム（ｇＤＮＡ）または相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）である、実施形態１から６のいずれか１項に記載の方法。
【００９６】
実施形態８。目的のポリヌクレオチドは、複数の目的のポリヌクレオチドを含み、方法は、複数のアダプターを複数のポリヌクレオチドに結合させること、それによって複数のアダプター付加ポリヌクレオチドのそれぞれが異なる分子バーコードを含む複数のアダプター付加ポリヌクレオチドを形成することを含む、実施形態１から７のいずれか１項に記載の方法。
【００９７】
実施形態９。目的のポリヌクレオチドは、複数の目的のポリヌクレオチドを含み、第１の増幅プライマーは、異なる標的特異的プライマーおよび異なる標的特異的バーコードを有する複数の第１の増幅プライマーを含み、それによって複数のアダプター付加ポリヌクレオチドアンプリコンのそれぞれが異なる標的特異的バーコードを含む複数のアダプター付加ポリヌクレオチドアンプリコンを形成する、実施形態１から８のいずれか１項に記載の方法。
【００９８】
実施形態１０。ポリヌクレオチドアンプリコンまたはアダプター付加ポリヌクレオチドはビオチン部分のような結合パートナーを含む、実施形態１から９のいずれか１項に記載の方法。
【００９９】
実施形態１１。第１のプライマー伸長および第２のプライマー伸長を行うことにより、第１および第２の位置でポリヌクレオチドアンプリコンを配列決定することをさらに含み、第１のプライマー伸長および第２のプライマー伸長は同一方向に実行される、実施形態１から１０のいずれか１項に記載の方法。第１の位置での配列決定は、目的のポリヌクレオチドの少なくとも一部の配列を提供することができ、第２の位置での配列決定は、標的特異的バーコードの配列を提供することができる。
【０１００】
実施形態１２。第１のプライマー伸長および第２のプライマー伸長は、別々の配列決定実行中にポリヌクレオチド上で同一方向に実行される、実施形態１１に記載の方法。
【０１０１】
実施形態１３。配列決定は次世代シーケンシング（ＮＧＳ）または超並列シーケンシングである、実施形態１１に記載の方法。
【０１０２】
実施形態１４。例えば第１のプライマー伸長および第２のプライマー伸長の配列決定から生成されたデータに基づいてゲノム再編成を同定することによって、ポリヌクレオチドアンプリコンのうちの少なくとも１つのシングルエンドシーケンシングを使用してそのゲノム再編成を検出することをさらに含む、実施形態１から１３のいずれか１項に記載の方法。
【０１０３】
実施形態１５。ゲノム再編成の頻度は約１０％またはそれより低い、あるいは５％またはそれより低い、実施形態１４に記載の方法。
【０１０４】
実施形態１６。ゲノム再編成は転座である、実施形態１４に記載の方法。
【０１０５】
実施形態１７。第１のプライマー伸長の配列決定から生成されたデータは、ゲノム再編成を決定するために既知のｇＤＮＡ配列のような既知の核酸配列と比較される、実施形態１４に記載の方法。
【０１０６】
実施形態１８。標的特異的バーコードを結合することにより配列決定のためのポリヌクレオチドライブラリーを調製する方法であって、第１のセットの増幅プライマーおよび第２のセットの増幅プライマーを使用してポリヌクレオチドプールを増幅することを含み、第１のセットの増幅プライマーはポリヌクレオチドプール内の複数の異なる配列にハイブリダイズし、第１のセットの増幅プライマーのそれぞれは異なる標的特異的バーコードを含む、方法。
【０１０７】
実施形態１９。アダプター付加ポリヌクレオチドのライブラリーを生成することをさらに含み、アダプター付加ポリヌクレオチドのそれぞれは、ポリヌクレオチドに結合したアダプターを含み、アダプターは第２のプライミング部位およびアダプターバーコードを含む、実施形態１８に記載の方法。
【０１０８】
実施形態２０。増幅プライマーの第２のセットは、アダプター上の第２のプライミング部位にハイブリダイズし、それによってアダプター付加ポリヌクレオチドアンプリコンを生成する、実施形態１９に記載の方法。
【０１０９】
実施形態２１。第１のプライマー伸長および第２のプライマー伸長を行うことにより、２つの位置で複数のアダプター付加ポリヌクレオチドアンプリコンのそれぞれを配列決定することをさらに含み、第１のプライマー伸長および第２のプライマー伸長の配列決定は、ポリヌクレオチドアンプリコンのそれぞれについて同一方向に実行される、実施形態１８に記載の方法。
【０１１０】
実施形態２２。第１のプライマー伸長および第２のプライマー伸長の配列決定から生成されたデータに基づいてゲノム再編成を同定することをさらに含む、実施形態２１に記載の方法。
【０１１１】
実施形態２３。第１の結合部位を有するポリヌクレオチドにおけるゲノム再編成を検出する組成物またはキットであって、標的特異的プライマーおよび標的特異的バーコードを含む第１の増幅プライマー、および第２の増幅プライマーを含む組成物またはキット。
【０１１２】
実施形態２４。アダプターは第２のプライミング部位およびアダプターバーコードをさらに含み、第２の増幅プライマーは、アダプター内の配列に相補的または同一のプライミング配列を含む、実施形態２３に記載の組成物またはキット。
【０１１３】
実施形態２５。第２の増幅プライマーは、（１）第１のプライミング部位から距離を置いて、ポリヌクレオチドに結合したアダプターの一部に、または（２）ポリヌクレオチドの第２のプライミング部位にハイブリダイズし、第２のプライミング部位は第１のプライミング部位から距離を置いている、実施形態２３に記載の組成物またはキット。
【０１１４】
実施形態２６。アダプターおよび／また第２のプライミング部位は、ポリヌクレオチド鎖の５’末端にあり、第１のプライミング部位は、鎖の３’末端にある、実施形態２４に記載の組成物またはキット。
【０１１５】
実施形態２７。ポリヌクレオチドにおけるゲノム再編成を検出する方法であって、第１の増幅プライマーおよび第２の増幅プライマーでポリヌクレオチドを増幅することであって、第１の増幅プライマーはポリヌクレオチドの第１のプライミング部位にハイブリダイズし、第１の増幅プライマーは標的特異的バーコードをさらに含み、増幅は、目的のポリヌクレオチドおよび標的特異的バーコードと同一または相補的な配列を含むポリヌクレオチドアンプリコンを生成する、ことと、第１のプライマー伸長および第２のプライマー伸長を行うことにより、第１および第２の位置でポリヌクレオチドアンプリコンを配列決定することであって、第１のプライマー伸長および第２のプライマー伸長は同一方向に実行される、こととを含む方法。
【０１１６】
実施形態２８。第１の位置での配列決定は、目的のポリヌクレオチドの少なくとも一部の配列を提供し、第２の位置での配列決定は、標的特異的バーコードの配列を提供する、実施形態２７に記載の方法。
【０１１７】
実施形態２９。第１のプライマー伸長および第２のプライマー伸長は、別々の配列決定実行中にポリヌクレオチド上で同一方向に実行される、実施形態２７または２８に記載の方法。
【０１１８】
実施形態３０。配列決定は次世代シーケンシング（ＮＧＳ）または超並列シーケンシングである、実施形態２７から３９のいずれか１項に記載の方法。
【０１１９】
実施形態３１。例えば第１のプライマー伸長および第２のプライマー伸長の配列決定から生成されたデータに基づいてゲノム再編成を同定することによって、ポリヌクレオチドアンプリコンのうちの少なくとも１つのシングルエンドシーケンシングを使用してそのゲノム再編成を検出することをさらに含む、実施形態２７から３０のいずれか１項に記載の方法。
【０１２０】
実施形態３２。ゲノム再編成の頻度は約１０％またはそれより低い、実施形態３１に記載の方法。
【０１２１】
実施形態３３。ゲノム再編成は転座である、実施形態３１または３２に記載の方法。
【０１２２】
実施形態３４。第１のプライマー伸長の配列決定から生成されたデータは、ゲノム再編成を決定するために既知のｇＤＮＡ配列のような既知の核酸配列と比較される、実施形態２７から３３のいずれか１項に記載の方法。
【０１２３】
本開示に照らして、本教示に沿って方法を実施できることに留意されたい。さらに、さまざまな構成要素、材料、構造およびパラメータは単なる説明および例として含まれ、限定を意味するものではない。本開示に照らして、本教示は、添付された特許請求の範囲内で、他の用途で実施することができ、これらの用途を実施するための構成要素、材料、構造、および設備を決定することができる。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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