(57)【要約】  本発明によれば、硫酸塩還元菌（ＳＲＢ）の濃度を決定する方法が提供される。この方法は、試験バイアルの群で標準増殖培地を調製することと、試験バイアルのそれぞれに塩化第一鉄四水和物（ＦＣＴＨ）を添加することと、試料部分を試験バイアルの群の第１の試験バイアルに添加することと、試験群内の後続のバイアルに以前のバイアルからの流体を順次注入することにより、試料部分を順次に希釈することと、試験バイアルの群をインキュベートすることとを含み、インキュベートされた試験バイアル内の流体の黒化は、ＳＲＢの閾値数の存在を示す。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
硫酸塩還元菌（ＳＲＢ）の濃度を決定する方法であって、
試験バイアルの群でＳＲＢ増殖培地を調製することと、
前記試験バイアルのそれぞれに塩化第一鉄四水和物（ＦＣＴＨ）を添加することと、
試験された試料を前記試験バイアルの群の第１の試験バイアルに添加することと、
前記群内の後続のバイアルに以前のバイアルからの流体を順次注入することにより、前記試験された試料を順次に希釈することと、
前記試験バイアルの群をインキュベートすることと、を含み、
１つのインキュベートされた試験バイアル内の流体の視覚的な黒化が、ＳＲＢの閾値数の存在を示す、方法。  
【請求項２】
前記ＦＣＴＨを追加する前に、前記試験バイアル群内の前記ＳＲＢ増殖培地に鉄源を添加することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＦＣＴＨが、９ミリリットルのＳＲＢ増殖培地当たり０．０１グラムの用量で添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＦＣＴＨが、８ミリリットルのＳＲＢ増殖培地および１ｍｌの試験された試料に、０．５〜１ミリリットルの溶液として添加される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＦＣＴＨの添加を補正するために、ＳＲＢ増殖培地のｐＨを調節することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
順次希釈のステップが、混合試験試料を既に含むバイアルから１ミリリットルを抜き取り、抜き取った１ミリリットルを次の連続バイアルに注入することにより実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記試験バイアルの群が、５〜７日間インキュベートされる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記試験バイアルの群が、摂氏３７度でインキュベートされる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
試験試料中の硫酸塩還元菌（ＳＲＢ）の濃度を決定するための試験キットであって、
ＳＲＢ増殖培地を含む試験バイアルの群と、
前記試験バイアルに添加するための塩化第一鉄四水和物（ＦＣＴＨ）を含む鉄添加剤と、を備え、
決定中に、試験試料が前記試験バイアルの群の第１の試験バイアルに添加され、前記試験試料が前記群の残りのバイアルで順次希釈され、
希釈試料および鉄添加剤を有する前記試験バイアルのインキュベーション後、前記群内の前記試験バイアルのいずれかの流体の視覚的な黒化が、閾値レベルを超えるＳＲＢ濃度を示す試験キット。
【請求項１０】
前記バイアルが、８ミリリットルのＳＲＢ増殖培地および０．５〜１ミリリットルのＦＣＴＨで満たされている、請求項９に記載の試験キット。
【請求項１１】
前記第１の試験バイアルに１ミリリットルの試験試料が注入される、請求項９に記載の試験キット。
【請求項１２】
前記ＳＲＢ増殖培地のｐＨが、鉄添加剤を補正するように調節される、請求項９に記載の試験キット。
【請求項１３】
硫酸塩還元菌（ＳＲＢ）の濃度を決定する方法であって、
試験バイアルでＳＲＢ増殖培地を調製することと、
前記試験バイアルに塩化第一鉄四水和物（ＦＣＴＨ）を添加することと、
試験された試料を前記試験バイアルに添加することと、
前記試験バイアルをインキュベートすることと、を含み、
インキュベートされた試験バイアル内の流体の視覚的な黒化が、ＳＲＢの閾値数の存在を示す方法。  
【請求項１４】
前記ＳＲＢ増殖培地が試験バイアルの群で調製され、前記塩化第一鉄四水和物（ＦＣＴＨ）が前記試験バイアルのそれぞれに添加され、前記試験された試料が前記試験バイアルの群の第１の試験バイアルに添加され、前記方法が、
前記群内の後続のバイアルに以前のバイアルからの流体を順次注入することにより、前記試験された試料を順次に希釈するステップと、
前記試験バイアルの群をインキュベートするステップと、を含み、
希釈試料および鉄添加剤を有する前記試験バイアルのインキュベーション後、前記群内の前記試験バイアルのいずれかの流体の視覚的な黒化が、閾値レベルを超えるＳＲＢ濃度を示す、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
異なる希釈度を有する前記試験バイアルの結果として、硫化鉄の存在を示す視覚的黒化が試料中で視覚的に検出される希釈度に従って、各試験バイアルに存在するＳＲＢの数が推定され得る、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
最確数（ＭＰＮ）法を使用してＳＲＢ濃度を推定するステップをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＦＣＴＨが、１００ｍｌの蒸留水中に１ｇのＦｅＣｌ２．４Ｈ２Ｏを添加することにより作製される鉄原液を含み、０．５ｍｌの前記鉄原液が、８ミリリットルの前記ＳＲＢ増殖培地および１ｍｌの試験された試料に添加される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＳＲＢ増殖培地が、以下の成分： 
【表１】
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を含む水溶液を含む、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、構造モニタリングの検出の分野に関する。より具体的には、本発明は、石油産業で使用されるインフラストラクチャ金属構造の劣化および腐食損傷を引き起こす硫酸塩還元菌（ＳＲＢ）のモニタリングに関する。
【背景技術】
【０００２】
石油産業では、インフラ設備上に微生物のコロニーが成長する可能性がある。特に、硫酸塩還元菌（ＳＲＢ）の成長は、ＳＲＢが硫酸塩を硫化物に還元する能力があるため、石油産業にとって問題である。硫化物は、腐食、注入井の詰まり、ガスおよび／または油の酸性化、ならびに有毒な硫化水素の増加に寄与することが分かっている。これらの問題は、設備の故障、硫化物を除去するために必要な追加の設備、微生物の増殖を制御するための殺生物剤の使用、および硫化鉄堆積物を除去または防止するために使用される追加の化学物質により、生産コストを大幅に引き上げる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
従来、石油産業は、フィールド試料からＳＲＢ増殖を検出するために、最確数（ＭＰＮ）法を使用している。ＭＰＮ法は遅く、最終読取値を報告するのに最大２８日かかる場合がある。この方法の別の欠点は、低密度の生存ＳＲＢ細胞を検出できないことである。したがって、ＳＲＢは、ＭＰＮ法の検出限界未満であるために検出されずに試料に存在する可能性がある。
【０００４】
直接顕微鏡法は迅速な代替方法であるが、生きている細菌と死んだ細菌を区別しない。他のＳＲＢ試験キットも利用可能であるが、これらのキットには、長い試験時間および低い感度の点で、固有の関連する欠点がある。したがって、硫酸塩還元菌およびその成長の検出を改善する、油田の厳しさに容易に適合し、高い感度を有するＳＲＢ検出方法が必要である。
【０００５】
本明細書でなされた開示が提示するのは、これらおよび他の考察に関するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明によれば、硫酸塩還元菌（ＳＲＢ）の濃度を決定する方法が提供される。この方法は、試験バイアルの群で標準増殖培地を調製することと、試験バイアルのそれぞれに塩化第一鉄四水和物（ＦＣＴＨ）を添加することと、試料部分を試験バイアルの群の第１の試験バイアルに添加することと、試験群内の後続のバイアルに以前のバイアルからの流体を順次注入することにより、試料部分を順次に希釈することと試験バイアルの群をインキュベートすることとを含み、インキュベートされた試験バイアル内の流体の黒化は、ＳＲＢの閾値数の存在を示す。
【０００７】
いくつかの実施形態において、本発明によるＳＲＢの濃度を決定する方法は、ＦＣＴＨを添加する前に、試験バイアルの群内の標準増殖培地に鉄源を添加することを含む。いくつかの実施形態において、ＦＣＴＨは、９ミリリットルの標準増殖培地当たり０．０１グラムの用量で添加される。いくつかの実装において、ＦＣＴＨは、８ミリリットルの標準増殖培地および１ｍｌの試験された試料に、０．５〜１ミリリットルの溶液として添加される。
【０００８】
他の実施形態において、本発明によるＳＲＢの濃度を決定する方法は、約７．６であるＦＣＴＨの添加を補正するために標準増殖培地のｐＨを調節することを含む。さらなる実施形態において、連続希釈のステップは、混合試験試料を既に含むバイアルから１ミリリットルを抜き取り、抜き取ったミリリットルを次の連続バイアルに注入することにより実行される。いくつかの実装において、その試験バイアルの群は、５〜７日間インキュベートされる。いくつかの実装において、試験バイアルは、摂氏３７度でインキュベートされ得る。
【０００９】
本発明はまた、試験試料中の硫酸塩還元菌（ＳＲＢ）の濃度を決定するための試験キットを提供する。試験キットの実施形態は、標準増殖培地を含む試験バイアルの群と、試験バイアルに添加するための塩化第一鉄四水和物（ＦＣＴＨ）を含む鉄添加剤とを備える。決定中に、試験試料が試験バイアルの群の第１の試験バイアルに添加され、試験試料は群の残りのバイアルで順次に希釈される。希釈試料および鉄添加剤を有する試験バイアルのインキュベーション後、群内の試験バイアルのいずれかの流体の黒化は、閾値レベルを超えるＳＲＢ濃度を示す。
【００１０】
いくつかの実施形態において、バイアルは、８ミリリットルの標準増殖培地および０．５〜１ミリリットルのＦＣＴＨで満たされている。いくつかの実装において、第１の試験バイアルに１ミリリットルの試験試料が注入される。さらに、標準増殖培地のｐＨは、ＦＣＴＨ鉄添加剤を約７．６に補正するように調節され得る。
【００１１】
これらおよび他の態様、特徴、および利点は、本発明の特定の実施形態の以下の説明、ならびに添付の図面および特許請求の範囲から理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の一実施形態による、ＦＣＴＨ添加剤を用いたフィールド試料中の硫酸塩還元菌の存在および量を決定するための試験群および対照群を調製する方法のフローチャートである。
【図２】本発明の実施形態による、ＦＣＴＨ鉄添加剤を試験群に適用してＳＲＢ濃度の試験を準備する方法のフローチャートである。
【図３】本発明の一実施形態による、ＦＣＴＨを添加した試験試料の連続希釈プロセスの概略図である。
【図４】本発明の方法を使用したＳＲＢの３つの例示的な試験の結果の概略図である。
【図５】先行技術による、希釈試験結果をＳＲＢ濃度の推定値に対して較正するために使用される表である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
試料に存在するＳＲＢの数をより迅速かつ正確に試験するために、標準細菌増殖培地への添加剤として鉄化合物である塩化第一鉄四水和物（ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）（「ＦＣＴＨ」）が使用される試験プロトコルが開示されている。本明細書に記載のように、この添加剤は標準培地の補足培地として作用し、ＳＲＢ検出感度を増加させるだけでなく、ＳＲＢ成長の迅速な検出も提供する。特に、本明細書に記載のように、ＳＲＢの検出の本方法は、ＳＲＢが存在することを試験者に警告するための視覚的な手掛かりに依存し、より具体的には、ＳＲＢの存在は、硫化鉄の懸濁液により増殖培地が黒くなったことにより明らかになる。
【００１４】
このプロトコルは、ＳＲＢの増殖をサポートするためにＡＰＩ  ＲＰ  ３８６等の標準培地を使用することから開始し、ＦＣＴＨを順次に希釈して添加する。インキュベーション後、ＦＣＴＨはＳＲＢによる硫化鉄の生成を促進し、培地を暗色化し、ＳＲＢの存在のマーカーを提供する。異なる希釈度を有するバイアルを使用すると、試料中で硫化鉄の暗色化が視覚的に検出される（すなわち増殖培地が黒くなる）希釈度に応じて、存在するＳＲＢの数が推定され得る。ＦＣＴＨの添加は、１ミリリットル当たり約１０４〜１０５細胞まで検出下限を改善する。
【００１５】
図１は、本発明によるフィールド試料中の硫酸塩還元菌の存在および量を決定するための試験群および対照群を調製する方法の実施形態のフローチャートである。ステップ１０１で、方法が開始する。ステップ１０２では、試料がフィールド機器（例えば、石油パイプライン、坑井、貯蔵容器）から収集され、試料がＳＲＢを含むかどうか、もしそうであれば、それらが含むＳＲＢの量が決定される。第２のステップ１０４では、鉄添加剤が調製される。いくつかの実装において、このステップは、１グラムのＦＣＴＨを１００ｍｌの蒸留水に溶解し、溶液をアルゴンガスでパージしてから、溶液を約１５分間密閉してオートクレーブ処理することを含む（濃度１０ｍｇ／ｍｌの鉄添加剤溶液が得られる）。
【００１６】
ステップ１０６では、標準的ＳＲＢ増殖培地（「標準培地」）が調製される。いくつかの実装において、標準培地は、水および以下の表１に示される成分を使用して調製される。
【表１】
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【００１７】
標準培地の調製中に、培地の作製に使用される水の塩分を調節して、試料の塩分に一致させることができる（例えば、同様の塩分を含む水（合成または濾過した元の水）が使用され得る）。さらに、標準培地のｐＨは鉄の存在に合わせて調節され得る。例えば、鉄補充物を含まない調製培地のｐＨは、鉄１ｍｌの補充物を含む標準培地のｐＨと比較され得る。２つの培地のｐＨが著しく異なる場合、鉄補充物を含む標準培地のｐＨを調節して、鉄補充物を含まない標準培地のｐＨに一致させることができる。一般に、表１に記載されている成分は、沈殿を回避し嫌気性条件を維持するために個別に調製され得る。
【００１８】
標準培地が調製され、塩分が調節された後、ステップ１０８において、それぞれ鉄釘等の鉄源もまた加えられたバイアルの群に、一定量の標準培地を分配することによって試験対照群が作製される。次いで、バイアルは密封される。特定の実装において、９ｍｌの標準培地が８個以上のバイアルに分配される。ステップ１１０では、それぞれ釘等の鉄源およびＦＣＴＨもまた加えられたバイアルの第２の群（「試験群」）に、少量の標準培地を分配することにより同様に試験群が調製される。次いで、試験群バイアルも密封される。特定の実装において、８ｍｌの標準培地が試験群のバイアルに分配される。次いで、ＦＣＴＨ（１ｇ／ｍｌの溶液）を含む０．５ｍｌのスタック溶液が試験群に添加される。
【００１９】
図２は、ＦＣＴＨ鉄添加剤を試験群に適用して、ＳＲＢ濃度の試験を準備する方法のフローチャートである。ステップ２０１で、方法が開始する。ステップ２０２では、試験バイアルがオートクレーブまたは同様の滅菌装置で１時間滅菌される。滅菌後、ステップ２０４で、試験群の第１のバイアルに試験される試料１．０ｍｌが注入され、次いで溶液が完全に混合される。ステップ２０６では、混合物１ｍｌが第１のバイアルから抽出され、次いでこれが試験群の次のバイアルに添加される。このようにして、連続バイアルが試料の希釈部分（すなわち１０分の１の濃度）を受ける。ステップ２０８では、試験群内の８つ以上のバイアル全てに試料の一部が植菌されたと判断されるまで、順次添加および抽出のプロセスが繰り返される。このプロセスは図３に概略的に示されている。示されるように、試験群は６つのバイアル３０２、３０４、３０６、３０８、３１０、および３１２を含む。６つのバイアルが示されているが、これは単に説明を簡単にするためであり、より少ない、または好ましくはより多い数のバイアルを使用することができる。バイアル３０２〜３１２に流体を注入し、バイアル３０２〜３１２から流体を引き出すことができるシリンジ３１５が示されている。第１のバイアル３０２は、９ｍｌの流体を含み、１ｍｌの試料を注入され、１：１０の試料／流体比、または元の試料濃度の１０分の１が得られる。１ｍｌの流体がバイアル３０２から引き出され、バイアル３０４に注入されると、バイアル３０４は、元の試料濃度の１０分の１、または１：１００の試料／流体比を効果的に含む。バイアルから１ｍｌの流体を順番に抜き取り、抜き取った流体を次の順番のバイアルに注入するプロセス中に、試料／流体比は幾何学的に減少し、バイアル３０６は１：１０００の比、バイアル３０８は１：１０，０００の比、バイアル３１０は１：１００，０００の比、バイアル３１２は１：１，０００，０００の比を有する。
【００２０】
試験群の植菌後、ステップ２１０で、０．５ｍｌ等の量のＦＣＴＨが（希釈試料を含む）バイアルの全てに添加され（例えば注入により）、得られた溶液は完全に混合される。ステップ２１２では、順次に希釈された試験群のバイアルは、摂氏３７度である期間インキュベートされる。インキュベーションの好ましい期間は５〜７日間であり、２８日間を要する一般的な方法よりも少なくとも７５％短縮される。インキュベーション後、ステップ２１４で、試験群のバイアル内の培地が硫化鉄の懸濁液により黒くなったときに、ＳＲＢの存在が明らかになり、その程度が決定される。
【００２１】
図４は、異なる元の試料の３つの例示的な試料試験、試験１、試験２および試験３を示す概略図である。示されるように、試験１では、４つのバイアル４０２、４０４、４０６、および４０８内の流体が黒く示されており、ＳＲＢの閾値濃度を示している（２つのバイアル４１０、４１２内の流体は黒くなっていないように示され、ＳＲＢ濃度がバイアル４１０、４１２において閾値よりも低いことを示している）。バイアル４０２、４０４、４０６、および４０８は、それぞれ１０−１、１０−２、１０−３、および１０−４試料／流体比を表し、一方バイアル４１０および４１２は、それぞれ１０−５および１０−６試料／流体比を表している。これは、元の試料の１：１０，０００希釈レベルを超えると、硫化鉄の生成による流体の黒化を引き起こすには不十分なＳＲＢ濃度があることを示す。同様に、試験２では、４つのバイアル４２２、４２４、４２６、および４２８内の流体は黒く示されており、これもＳＲＢの閾値濃度を示しているが、２つのバイアル４３０、４３２内の流体は黒くなっていないように示され、ＳＲＢ濃度がバイアル４３０、４３２において閾値よりも低いことを示している。バイアル４２２、４２４、４２６、および４２８は、それぞれ１０−１、１０−２、１０−３、および１０−４試料／流体比を表し、一方バイアル４３０および４３２は、それぞれ１０−５および１０−６試料／流体比を表している。試験２も同様に、元の１：１０，０００希釈レベルを超えると、硫化鉄の生成による流体の黒化を引き起こすには不十分なＳＲＢ濃度があることを示す。したがって、試験１および２では、１０−４希釈レベルでの流体の黒化は、試験で使用された元の試料のＳＲＢの程度を示し、これは試験１および試験２で使用された元の試料中に存在するＳＲＢの濃度の測定値に変換され得る。
【００２２】
黒化が発生する希釈レベルは、最確数（ＭＰＮ）較正法を使用して、試料中の１ｍｌ当たりのＳＲＢ数の推定値に十分な精度で変換され得る。ＭＰＮ較正法は、標準希釈試験の結果が生物濃度の推定値で較正されるテーブルを利用する。例として、次の例は、どのようにしてこの方法が使用されるかを示す。試料が採取され、ＳＲＢ濃度の３つの連続希釈試験で使用される。バイアルの結果をすぐ下の表２に示すが、「＋」は黒化を示し、「−」は黒化なしを示す。試験結果から、試料中のＳＲＢ濃度の推定値を提供するために、５回目、６回目、７回目の希釈が選択される。表２に示されるように、３つの試験は全て１０−５レベルで陽性であり（図５のＭＰＮテーブルでは１０−Ｎ）、２つの試験は１０−６レベルで陽性であり（ＭＰＮテーブルでは１０−Ｎ＋１）、１つの試験は１０−７レベルで陽性であった（ＭＰＮテーブルでは１０−Ｎ＋２）。ＭＰＮテーブルのこの３−２−１パターンをＭＰＮ推定値に一致させると、値は１．５になる。希釈係数を掛けると、元の試料中の値は１．５×１０５ＳＲＢになる。
【表２】
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【００２３】
対照的に、試験３では、バイアル４４２、４４４、４４６のうち３つだけの流体が黒くなっており、ＳＲＢの閾値濃度を示しているが、２つのバイアル４４８、４５０、４５２内の流体は黒くなっていないように示され、ＳＲＢ濃度がバイアル４４８、４５０、および４５２において閾値よりも低いことを示している。バイアル４４２、４４４、および４４６は、それぞれ１０−１、１０−２、および１０−３試料／流体比を表し、一方バイアル４４８、４５０、および４５２は、それぞれ１０−４、１０−５、および１０−６試料／流体比を表している。したがって、試験３は試験１および２とは異なり、元の１：１，０００希釈レベル（１：１０，０００レベルとは対照的に）を超えると、硫化鉄の生成による流体の黒化を引き起こすには不十分なＳＲＢ濃度があることを示す。
【００２４】
いくつかの試験が行われ、異なる塩分およびＳＲＢ培養物を有する様々な種類の水試料が使用された。ＳＲＢ培養物は、様々な場所、つまりＡｂｕ  Ａｌｉの給水、Ａｂｕ  Ａｌｉの処理水、硬水およびＵｔｈｍａｎｉｙａｈの給水から調製および分離された。異なる体積（すなわち０．１ｍｌおよび０．２ｍｌ）のＳＲＢ培養物を１００ｍｌの蒸留水に注入した。その後、全体積から１ｍｌを植菌物として使用し、ＭＰＮ試験を行った。この植菌は、異なる塩分濃度で行われた。表１〜６は、様々な試験例、より具体的には以下を記載している。実施例１：ＳＲＢ培養物（３５％のＱＳＷ）−ａ）０．１ｍｌのＳＲＢ／１００蒸留水；およびｂ）０．２ｍｌのＳＲＢ／１００蒸留水；実施例２：ＳＲＢ培養物（１００％のＱＳＷ）−ａ）０．１ｍｌのＳＲＢ／１００蒸留水；およびｂ）０．２ｍｌのＳＲＢ／１００蒸留水；実施例３：Ａｂｕ  Ａｌｉの給水井（３５％のＱＳＷ）；実施例４：Ａｂｕ  Ａｌｉの処理水（１００％のＱＳＷ）；実施例５：硬水試料（１００％のＱＳＷ）；および実施例６：Ｕｔｈｍａｎｉｙａｈの水試料（１００％のＱＳＷ）。
【００２５】
実験は以下の条件下で行われた：各試験試料について、２つの３連の１６希釈ＭＰＮシリーズが試験された。一方のＭＰＮセットは標準ＳＲＢ培地（各バイアルに９ｍｌの培地）を使用し、他方のＭＰＮセットは鉄添加剤１ｍｌを標準培地に添加することにより調製され、鉄添加剤の添加後に各バイアル内に９ｍｌの培地をもたらした。１ｍｌの水試料を１６の希釈シリーズに３回植菌した。試料を３５℃で２８日間インキュベートした。増殖を毎日チェックし、鉄添加剤（ＩＣ）がＳＲＢの増殖を促進するかどうかを確認するために、試料（培養物）が黒くなった日を記録した。２８日後、最終ＭＰＮ読取りおよびデータ変換が行われ、これは鉄添加剤がＳＲＢ検出感度を改善するかどうかを示す。
【００２６】
下記の表２は、３５％のＱｕｒａｙｙａｈ海水（ＱＳＷ）中の０．１ｍｌのＳＲＢ培養物に０．１ｍｌおよび０．５ｍｌの鉄化合物を添加した場合および添加しない場合の標準ＭＰＮ方法（本明細書に記載）を使用した結果のＳＲＢ増殖を示す。下のデータは、元の試料の列に表される鉄化合物（ＩＣ）の非存在下では、１日（すなわち１日目）のインキュベーション後に２．３ＳＲＢ／ｍｌの低い増殖が検出されたことを示している。２日後、ＳＲＢ増殖は２３０ＳＲＢ／ｍｌに増加したが、２８日のインキュベーション期間の終わりまでこのレベルに維持された。しかしながら、０．１ｍｌの鉄化合物（ＩＣ）を添加すると、結果は１日（１日目）のインキュベーション後に２．３ＳＲＢ／ｍｌが検出されたことを示している。２日後、ＳＲＢ増殖は２．３×１０４ＳＲＢ／ｍｌに増加し、２８日のインキュベーション期間の終わりまでこのレベルに維持された。０．５ｍｌの鉄化合物（ＩＣ）を添加しても、同様の結果が検出された。したがって、結果は、１日のインキュベーション後に２．３ＳＲＢ／ｍｌが検出されたことを示している。２日後、ＳＲＢ増殖は２．３×１０５ＳＲＢ／ｍｌに増加し、２８日のインキュベーション期間の終わりまで維持された。したがって、試験結果は、鉄化合物（ＩＣ）がＳＲＢ増殖を促進するだけでなく、ＳＲＢの検出感度も改善することを示している。
【表３】
2020522255.tif 000005
【００２７】
表３は、３５％のＱｕｒａｙｙａｈ海水（ＱＳＷ）中の０．２ｍｌのＳＲＢ培養物に０．１ｍｌおよび０．５ｍｌの鉄化合物を添加した場合および添加しない場合のＳＲＢ培養結果を示す。データは、鉄化合物の非存在下では、１日のインキュベーション後に２．３ＳＲＢ／ｍｌの低い増殖が検出されたことを示している。２日後、ＳＲＢ増殖は２３０ＳＲＢ／ｍｌに増加し、２８日のインキュベーション期間の終わりまでこのレベルに維持された。しかしながら、０．１ｍｌの鉄化合物を添加すると、結果は、１日のインキュベーション後に２．３ＳＲＢ／ｍｌが検出されたことを示している。２日後、ＳＲＢ増殖は２．３×１０３ＳＲＢ／ｍｌに増加し、２８日のインキュベーション期間の終わりまで維持された。０．５ｍｌの鉄化合物を添加すると、同等の結果が検出された。結果は、１日のインキュベーション後に２３０ＳＲＢ／ｍｌが検出されたことを示している。その後、ＳＲＢ増殖は２．３×１０４ＳＲＢ／ｍｌに増加し、２８日のインキュベーション期間の終わりまで維持された。したがって、試験結果は、鉄化合物（ＩＣ）がＳＲＢ増殖を促進するだけでなく、ＳＲＢの検出感度も改善することを示している。
【表４】
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【００２８】
表４は、１００％のＱｕｒａｙｙａｈ海水（ＱＳＷ）中の０．１ｍｌのＳＲＢ培養物に０．５ｍｌの鉄化合物を添加した場合および添加しない場合のＳＲＢ培養結果を示す。結果は、鉄化合物の非存在下では、１日のインキュベーション後に２．３ＳＲＢ／ｍｌの低い増殖が検出されたことを示している。２日後、ＳＲＢ増殖は２．３×１０２ＳＲＢ／ｍｌに増加した。その後、ＳＲＢ増殖は３日目に２．３×１０４ＳＲＢ／ｍｌに増加した。その後、ＳＲＢ増殖は５日目に２．３×１０１２ＳＲＢ／ｍｌまで大幅に増加し続け、インキュベーション期間の終わりまでこのレベルに維持された。０．５ｍｌの鉄化合物を添加しても、同様の結果が検出された。１日のインキュベーション後、ＳＲＢ増殖は２．３ＳＲＢ／ｍｌで検出された。２日後、ＳＲＢ増殖は２．３×１０２ＳＲＢ／ｍｌに増加し、次いで２日後に２．３×１０４ＳＲＢ／ｍｌにそれぞれ増加した。５日目に、ＳＲＢ増殖は２．３×１０１７ＳＲＢ／ｍｌに増加し、２８日のインキュベーション期間の終わりまでこのレベルに維持された。したがって、試験結果は、鉄化合物（ＩＣ）がＳＲＢ増殖を促進するだけでなく、ＳＲＢの検出感度も改善することを示している。
【表５】
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【００２９】
表５の結果は、１００％のＱｕｒａｙｙａｈ海水（ＱＳＷ）中の０．２ｍｌのＳＲＢ培養物に０．５ｍｌの鉄化合物を添加した場合および添加しない場合のＳＲＢ培養結果を示す。結果は、鉄化合物を添加していない元の試料では、インキュベーションの最初の２日間、ＳＲＢ増殖が検出限界を下回っていたことを示している。４日目に２３ＳＲＢ／ｍｌへのごくわずかな増加が検出され、インキュベーション期間の終わりまでこのレベルに継続された。０．１ｍｌの鉄化合物を添加しても、同じ結果が検出された。インキュベーションの最初の２日間、ＳＲＢ増殖は検出限界を下回っていた。しかし、４日目に２３ＳＲＢ／ｍｌへのごくわずかな増加が検出され、インキュベーション期間の終わりまでこのレベルが持続した。しかしながら、０．５ｍｌの鉄化合物を添加すると、ＳＲＢ増殖は１日のインキュベーション後、検出限界を下回った。しかし２日後、結果はＳＲＢ増殖が２．３ＳＲＢ／ｍｌにわずかに増加したことを示している。その後に、ＳＲＢ増殖は３日目に２．３×１０２ＳＲＢ／ｍｌに増加し、４日後に再び２．３×１０４ＳＲＢ／ｍｌに増加し、２８日のインキュベーション期間の終わりまでこのレベルに維持された。したがって、試験結果は、鉄化合物（ＩＣ）がＳＲＢ増殖を促進するだけでなく、ＳＲＢの検出感度も改善することを示している。
【表６】
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【００３０】
Ａｂｕ  Ａｌｉ給水井−８４０（３５％のＱＳＷ）のＳＲＢ結果を表６に示す。この試験は、０．５ｍｌにおいて、０．５ｍｌの鉄化合物を添加した場合および添加しない場合のＳＲＢ増殖を検出するように設計された。結果は、鉄化合物を添加していない元の試料では、ＳＲＢ増殖が２８日のインキュベーション期間中に検出限界を下回っていることを示していた。０．５ｍｌの鉄化合物を添加しても、同じ結果が検出された。５日目まで、ＳＲＢ増殖は検出限界を下回っていた。しかしながら、ＳＲＢ増殖は徐々に２．３ＳＲＢ／ｍｌに増加し、次いで５日後および１０日後にそれぞれ２．３×１０２ＳＲＢ／ｍｌに増加し、２８日のインキュベーション期間の終わりまでこのレベルに維持された。したがって、試験結果は、鉄化合物（ＩＣ）がＳＲＢ増殖を促進するだけでなく、ＳＲＢの検出感度も改善することを示している。
【表７】
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【００３１】
硬水試料のＳＲＢ結果を表７に示す。結果は、鉄化合物の添加がない場合（元の試料）、ＳＲＢ増殖が２８日間検出限界を下回っていたことを示している。さらに、０．２ｍｌの鉄化合物を添加しても、同じ結果が検出された。ＳＲＢ増殖は、２８日間検出限界を下回っていた。しかしながら、０．５ｍｌの鉄化合物を添加すると、ＳＲＢ増殖は最初の５日間は検出限界を下回っていた。しかし６日後、ＳＲＢ増殖は２．３ＳＲＢ／ｍｌにわずかに増加し、２８日のインキュベーション期間の終わりまでこのレベルに維持された。
【表８】
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【００３２】
表８は、０．２ｍｌおよび０．５ｍｌの鉄化合物を添加した場合および添加しない場合の硬水試料のＳＲＢ結果を示す。結果は、鉄化合物の添加がない場合、ＳＲＢ増殖が全インキュベーション期間中に検出限界を下回っていたことを示している。０．２ｍｌの鉄化合物を添加しても、同じ結果が検出された。ＳＲＢ増殖は、２８日間検出限界を下回っていた。しかしながら、０．５ｍｌの鉄化合物を添加すると、ＳＲＢ増殖は最初の２日間は検出限界を下回っていた。しかし、４日後、ＳＲＢ増殖は２．３ＳＲＢ／ｍｌにわずかに増加し、２８日のインキュベーション期間の終わりまでこのレベルに維持された。
【表９】
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【００３３】
本発明によるＳＲＢ濃度を決定する方法は、現在の技術に対するいくつかの利点を提供する。この方法により、典型的には、既知の細菌増殖培養の検出限界を下回る非常に低濃度の生存ＳＲＢ細胞の検出が可能になる。さらに、この方法は、休止状態のＳＲＢ、特に標準的な手順では再増殖できず、典型的にはもはや生きていないと誤って認識されるＳＲＢの迅速な再活性化を提供する。重要なことに、これらの方法により、一般に５〜７日以内の迅速な増殖の検出を可能にし、これは、標準培地を使用した油田試料からのＳＲＢの増殖に必要な時間（すなわち最長２８日）より少なくとも７５％短い時間である。
【００３４】
出願人は、本開示および本明細書に含まれる例によって裏付けられるように、追加のＦＣＴＨがＳＲＢの活性を向上および増強し、休眠ＳＲＢを活性化することを発見した。
【００３５】
本明細書で説明されるように、本発明は、鉄化合物（ＩＣ）の形態の培地補充物を対象とし、これは、最確数ＭＰＮ法に使用されるＳＲＢ標準培地に添加された塩化第一鉄四水和物（ＦｅＣｌ２．４Ｈ２Ｏ）である。以下が観察された。
１．鉄化合物は、ＳＲＢ検出感度を高め、ＳＲＢ増殖の検出を促進するための補助培地として機能する。
２．鉄化合物の添加後のＳＲＢの迅速な増殖および検出（通常５〜７日以内）。
３．鉄化合物の非存在下では、ＭＰＮ法は非常に低い密度の生存ＳＲＢ細胞を検出できない。
４．鉄化合物の非存在下では、ＭＰＮ法は休止状態のＳＲＢの再活性化が非常に遅い。
５．異なる体積の鉄化合物の添加が効果的であった。しかしながら、ＩＣ鉄原液からの０．５ｍｌ（１００ｍｌの蒸留水中の１ｇのＦｅＣｌ２．４Ｈ２Ｏ）が、１つの好ましい有効量であった。
６．ＩＣの量は５０〜５５ｍｇ／Ｌの範囲となり得る。
【００３６】
本発明の方法により提供されるＳＲＢの迅速な検出は、微生物制御キット、ツールおよび処置プログラム（例えば殺生物剤処置）の設計に適用することができる。これらの方法により、処置の迅速な評価および調節、ＳＲＢ制御の最大化、および運用コストの大幅な削減が可能となる。さらに、本発明の方法は、手順で使用される化学物質の適用による環境への影響を最小限に抑えるのに役立ち、そのような適用を最適化するのに役立つ。
【００３７】
本明細書に開示されたいずれの構造および機能の細目も、システムおよび方法を限定するものとして解釈されるべきではなく、むしろ、当業者に、方法を実装するための１つ以上のやり方を教示するための典型的な実施形態および／または構成として提供されていることを理解されたい。
【００３８】
図面中の類似の数字が、いくつかの図を通して類似の要素を表し、図に関連して説明され、示された構成要素および／またはステップの全てが、全ての実施形態または構成に必要とされるわけではないことをさらに理解されたい。
【００３９】
本明細書に使用されている専門用語は、特定の実施形態のみを説明する目的のものであり、本発明を限定することを意図されるものではない。本明細書で使用される際、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上、他の意味を示すことが明らかな場合を除き、複数形も含むことが意図されるものである。「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（備える）」および／または「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（備える）」という用語は、本明細書で使用する際、述べた特徴、整数、ステップ、作業、要素、および／または構成要素の存在を明示するが、１つ以上の他の特徴、整数、ステップ、作業、要素、構成要素、および／またはそれらの群の存在または追加を排除しないことがさらに理解されるであろう。
【００４０】
上述の方法ステップは、本発明の範囲から逸脱することなく、異なる順序で実行することができる。例えば、鉄添加剤は、標準増殖培地の調製後に調製することができる。
【００４１】
また、本明細書に使用されている表現および専門用語は、説明目的のものであり、限定するものと見なされるべきではない。本明細書における「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含む）」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（備える）」、または「ｈａｖｉｎｇ（有する）」、「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ（含む）」、「ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ（伴う）」、およびそれらの異形の使用は、それ以降に挙げられた項目、およびその均等物、ならびに追加項目を包含することを目的としている。
【００４２】
例示的な実施形態を参照して本発明を説明したが、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な変更を行い、その要素を等価物で置き換えることができることを当業者は理解するであろう。さらに、本発明の本質的な範囲から逸脱することなく、特定の機器、状況、または材料を本発明の教示に適合させるための多くの修正が当業者には理解されよう。したがって、本発明が、本発明を実施するのに向けて考えられた最良の形態として開示された特定の実施形態に限定されず、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれる全ての実施形態を含むようになることが意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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