(57)【要約】  組換え治療用タンパク質からガラクチンおよび金属カチオンなどの他の宿主細胞夾雑物を除去するための、工業生産目的に適した、夾雑物から関心対象のグリコシル化組換えタンパク質を精製する方法が開示される。
2020531411.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
夾雑物から関心対象のグリコシル化組換えタンパク質を精製する方法であって、以下の工程：
（ａ）プロテインＡマトリックスに、ほぼ中性のｐＨで、関心対象の前記グリコシル化組換えタンパク質（ＰＯＩ）およびガレクチン宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）夾雑物を含む宿主細胞培養上清またはろ液を負荷する工程であって、前記ＰＯＩが、免疫グロブリンＦｃドメインのＣＨ２およびＣＨ３ドメインならびにガレクチン−３夾雑物が可逆的に結合した１つ以上の末端β−ガラクトシル残基を含む、工程；
（ｂ）前記ＰＯＩが結合した前記プロテインＡマトリックスを、１〜３Ｍの塩化カルシウムを含む約ｐＨ６．０〜６．５の緩衝液で洗浄する工程；
（ｃ）約ｐＨ４未満のクエン酸またはクエン酸塩を含む緩衝液で前記ＰＯＩを前記プロテインＡマトリックスから溶出液プールに溶出する工程であって、
（ｉ）前記溶出液プールがｐＨ３．３〜３．７のｐＨ範囲よりも塩基性である場合、前記溶出液プールをクエン酸でｐＨ３．３〜３．７に滴定し、および
（ｉｉ）任意で、ウイルス不活性化に十分な期間、前記溶出液プールをｐＨ３．３〜３．７に保持する工程；
（ｄ）（ｃ）からの前記溶出液プール中の前記ＰＯＩを、ｐＨ５．０〜５．５で、約２〜１５ｍＳの低伝導率緩衝液中の陽イオン交換マトリックスに結合する工程；
（ｅ）前記陽イオン交換マトリックスから、最大約４０〜１００ｍＳまで次第に高くなる伝導率の電解質濃度勾配で、前記ＰＯＩをＣＥＸ溶出液プールに溶出する工程；ならびに
（ｆ）前記ＣＥＸ溶出液プールを、ｐＨ５．０〜６．０の高伝導率緩衝液中の疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）マトリックスに負荷し、前記ＨＩＣマトリックスを洗浄し、それによって前記ＰＯＩを前記ガレクチンＨＣＰ夾雑物から分離する工程
を含む方法。
【請求項２】
（ｂ）において、前記ＰＯＩが結合している前記プロテインＡマトリックスを洗浄する工程が、２〜２．７Ｍの塩化カルシウムを含む緩衝液を使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＰＯＩが、アフリベルセプト、アレファセプト、エタネルセプト、アバタセプト、ベラトセプト、ｒＦＶＩＩＩＦｃ、ｒＦＶＩＸＦｃ、およびリロナセプトから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＰＯＩがアフリベルセプトである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ガレクチンＨＣＰ夾雑物がガレクチン−３である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記宿主細胞培養上清またはろ液が金属カチオン夾雑物をさらに含み、および前記ＰＯＩが前記金属カチオン夾雑物からも分離される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記金属カチオン夾雑物が、アルミニウム、バリウム、カルシウム、コバルト、銅、亜鉛、鉄、マグネシウム、マンガン、水銀、ニッケル、およびストロンチウムカチオンから選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記金属カチオン夾雑物が鉄カチオンである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
（ｃ）からの前記溶出液プール中の前記ＰＯＩを陽イオン交換マトリックスに結合する前に、前記溶出液プールを、珪藻土によるろ過を含む深層ろ過に供する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記珪藻土がクエン酸緩衝液で前処理された、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２０１７年８月１７日に米国特許商標庁に提出された米国仮特許出願第６２／５４６，５５８号の優先権を主張する。
【０００２】
配列表
【０００３】
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子出願され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０１８年８月１４日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、ＪＵＳＴ０３８１＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、４，１４８バイトのサイズである。
【背景技術】
【０００４】
１．発明の分野
【０００５】
本発明は、組換え生産されたタンパク質を夾雑宿主細胞タンパク質および金属イオンから精製する方法に関する。
【０００６】
２．関連技術の議論
【０００７】
組換え治療用タンパク質の工業生産では、厳格な規制基準を満たすために夾雑宿主細胞タンパク質および金属イオンを関心対象のタンパク質から効果的に除去する必要がある。
【０００８】
グリコシル化組換えタンパク質が末端β−ガラクトシル残基に富む場合、それらのガラクトシド残基に可逆的に結合した宿主細胞タンパク質ガレクチンから組換えタンパク質を精製することは重要な問題である。
【０００９】
ガレクチンは、β−ガラクトシドに特異的に結合することができる動物レクチンである。１２種類のガレクチンが脊椎動物において記述されており、それらは３つの異なるサブグループに属する：プロトタイプ（例えば、ガレクチン−１、−２、−７、−１０、−１３、−１４）、タンデムリピート（例えば、ガレクチン−４、−８、−９、−１２）およびキメラガレクチン（例えば、ガレクチン−３）。これらのガレクチンタンパク質は、細胞相互作用および宿主細胞における悪性形質転換に関与すると報告されている。（例えば、Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  ＲＤ  ａｎｄ  Ｌｉｕ  ＦＴ，Ｇａｌｅｃｔｉｎｓ，Ｉｎ：Ｖａｒｋｉ  Ａ，Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  ＲＤ，Ｅｓｋｏ  ＪＤ，Ｆｒｅｅｚｅ  ＨＨ，Ｓｔａｎｌｅｙ  Ｐ，Ｂｅｒｔｏｚｚｉ  ＣＲ，Ｈａｒｔ  ＧＷ，Ｅｔｚｌｅｒ  ＭＥ，ｅｄｉｔｏｒｓ．Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（ＮＹ）：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；２００９．Ｃｈａｐｔｅｒ  ３３；Ｇｉｔｔ，ＭＡ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇａｌｅｃｔｉｎ−４  ａｎｄ  ｇａｌｅｃｔｉｎ−６  ａｒｅ  ｔｗｏ  ｃｌｏｓｅｌｙ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｌｅｃｔｉｎｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｒａｃｔ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７３（５）：２９５４−６０（１９９８）；Ｂｉｄｏｎ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇａｌｅｃｔｉｎ−８：ａ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｓｕｂ−ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｇａｌｅｃｔｉｎｓ（Ｒｅｖｉｅｗ），Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．８（３）：２４５−５０（２００１）；Ｈａｄａｒｉ，ＹＲ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇａｌｅｃｔｉｎ−８．Ａ  ｎｅｗ  ｒａｔ  ｌｅｃｔｉｎ，ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｇａｌｅｃｔｉｎ−４，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７０（７）：３４４７−５３（１９９５）；Ｓａｔｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎｓ  ａｎｄ  ａ  ｌｉｎｋｅｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｏｆ  ｇａｌｅｃｔｉｎ−９  ａｓ  ｔｏ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ  ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １２（３）：１９１−９７（２００２）；Ｙａｎｇ，ＲＹ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｇａｌｅｃｔｉｎ−１２，ａ  ｎｅｗ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇａｌｅｃｔｉｎ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７６（２３）：２０２５２−６０（２００１）；Ｒａｍａｓｗａｍｙ，Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  ｇａｌａｃｔｏｓｅ−ｂａｓｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｇａｌｅｃｔｉｎ−７，ＦＥＢＳ  Ｊ．２０１５  Ｊａｎ；２８２（２）：３７２−８７（２０１５）；Ｐａｔｎａｉｋ，ＳＫ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｎ−ｇｌｙｃａｎｓ  ａｒｅ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｆｏｒ  ｇａｌｅｃｔｉｎ−１，−３，ａｎｄ−８  ｏｎ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ  ｃｅｌｌｓ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏ��ｙ  １６（４）：３０５−１７（２００６）参照）。
【００１０】
ガレクチン‐３は約３０ｋＤａの分子量であり、β−ガラクトシドの特異的結合を可能にする約１３０アミノ酸の炭水化物認識結合ドメイン（ＣＲＤ）を含む。ガレクチン−３が結合すると報告されているタンパク質には、ラミニン、フィブロネクチン、ヘンシン、エラスチン、ＩＶ型コラーゲン、テネイシン−Ｃ、テネイシン−Ｒ、インテグリンα１β１、α４β７、α６β１、およびαＭβ１、ＶＥＧＦＲ２、ＮＧ２、およびアミノペプチダーゼＮがある。（Ｆｕｎａｓａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇａｌｅｃｔｉｎ−３  ｉｎ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２４（１０）：８８６−８９１（２０１４））。宿主細胞タンパク質であるガレクチン−３は、組換え生産された第ＩＸ因子タンパク質の夾雑物であると報告された。（Ｂｌｏｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇａｌｅｃｔｉｎ−３  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅｓ  ｔｈｅ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ，Ｂｌｏｏｄ  １０８：１０３８（２００６）。
【００１１】
アフリベルセプトは、典型的には末端β−ガラクトシル残基に富む、もう１つ別の組換え治療用タンパク質である。アフリベルセプトタンパク質には、２つの主要な成分：ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に融合した、ヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体１および２の細胞外ドメイン由来のＶＥＧＦ結合部分が含まれる。（Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｗｉｔｈ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，国際公開第００／７５３１９  Ａ１号；米国特許第７０７０９５９Ｂ２号参照）。米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は２０１１年１１月にアフリベルセプトの市販を承認し、欧州医薬品庁（ＥＭＡ）は２０１２年１１月に承認した。アフリベルセプトは、Ｅｙｌｅａ（登録商標）（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）の商品名で、眼の障害または疾患、例えば、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）後の黄斑浮腫、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、網膜静脈分枝閉塞症（ＢＲＶＯ）、血管新生型（滲出型）加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、近視性脈絡膜血管新生による視力障害、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、ＤＭＥを有する患者における糖尿病性網膜症（ＤＲ）、および血管新生型加齢黄斑変性（ＡＭＤ）の治療における眼科薬として使用されている。ｚｉｖ−アフリベルセプトは、Ｚａｌｔｒａｐ（登録商標）（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）の商品名で、転移性結腸直腸癌の治療のための静脈内注入薬として開発された。
【００１２】
構造的には、アフリベルセプトは約９６．９キロダルトン（ｋＤａ）のタンパク質分子量を有する二量体糖タンパク質である。およそ１５％のグリコシル化が含まれ、およそ１１５ｋＤａの総分子量を与えている。一次配列によって予測される各ポリペプチド鎖上の５つの推定Ｎ−グリコシル化部位はすべて炭水化物で占められている可能性があり、末端シアル酸残基の不均一性を含むある程度の鎖の不均一性を示し得る。しかし、ＣＨＯ細胞によって産生されるアフリベルセプトは、ガレクチン−３の結合標的である末端β−ガラクトシル残基に富む可能性がある。
【００１３】
組換えタンパク質を精製して、ガレクチンおよび金属イオンなどの他の宿主細胞夾雑物を除去するための、工業生産目的に適した有効で経済的な方法は、本発明が提供する切実な必要である。
【発明の概要】
【００１４】
本発明は、関心対象のグリコシル化組換えタンパク質を夾雑物から精製する方法に関する。この方法は以下の工程を含む：
（ａ）プロテインＡマトリックスに、ほぼ中性のｐＨで、関心対象のグリコシル化組換えタンパク質（ＰＯＩ）およびガレクチン宿主細胞タンパク質夾雑物を含む宿主細胞培養上清またはろ液を負荷する工程であって、ここで、ＰＯＩは、免疫グロブリンＦｃドメインのＣＨ２およびＣＨ３ドメインならびにガレクチン宿主細胞タンパク質夾雑物が可逆的に結合している１つ以上の末端β−ガラクトシル残基を含む、工程；
（ｂ）ＰＯＩが結合したプロテインＡマトリックスを、１〜３Ｍの塩化カルシウムを含む約ｐＨ６．０〜６．５の緩衝液で洗浄する；
（ｃ）約ｐＨ４未満のクエン酸またはクエン酸塩を含む緩衝液でＰＯＩをプロテインＡマトリックスから溶出液プールに溶出する工程であって、
（ｉ）溶出液プールがｐＨ３．３〜３．７のｐＨ範囲よりも塩基性である場合、溶出液プールをクエン酸でｐＨ３．３〜３．７に滴定し、および
（ｉｉ）任意で、ウイルス不活性化に十分な期間（典型的には３０〜９０分、ただしウイルス不活性化のウイルスパネル検証によって必要に応じて経験的に）溶出液プールをｐＨ３．３〜３．７に保持する工程；
（ｄ）（ｃ）からの溶出液プール中のＰＯＩを、ｐＨ５．０〜５．５で、約２〜１５ミリシーメンス（ｍＳ）の低伝導率緩衝液中の陽イオン交換マトリックスに結合する工程；
（ｅ）陽イオン交換マトリックスから、最大約４０〜１００ｍＳまで次第に高くなる伝導率の電解質濃度勾配でＰＯＩをＣＥＸ溶出液プールに溶出する工程；ならびに
（ｆ）ＣＥＸ溶出液プールを、ｐＨ５．０〜６．０の高伝導率緩衝液中の疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）マトリックスに負荷し、ＨＩＣマトリックスを洗浄する工程。本発明の方法は、β−ガラクトシル結合ガレクチン宿主細胞タンパク質夾雑物（１または複数）および金属カチオン夾雑物などの他の望ましくない夾雑物からＰＯＩを分離する。
【００１５】
アフリベルセプト、アレファセプト、エタネルセプト、アバタセプト、ベラトセプト、ｒＦＶＩＩＩＦｃ、ｒＦＶＩＸＦｃ、およびリロナセプトなどの、しかしこれらに限定されないグリコシル化組換え治療用タンパク質は、本発明の方法を使用して工業規模でそのような夾雑物から精製することができる。
【００１６】
前述の概要は、本発明のすべての態様を定義することを意図するものではなく、追加の態様が「実施形態の詳細な説明」などの他の項に記載されている。本文書全体が統一された開示として関連付けられることを意図しており、特徴の組合せが本文書の同じ文、段落、または節の中に一緒に見出されない場合でも、本明細書に記載される特徴のすべての組合せが企図されることが理解されるべきである。
【００１７】
上記に加えて、本発明は、追加の態様として、上記の特定の段落によって定義される変形よりも何らかの点で範囲が狭い本発明のすべての実施形態を含む。例えば、本発明の特定の態様は属として説明され、属のすべての成員は個々に本発明の態様であることが理解されるべきである。また、属として説明されるかまたは属の成員を選択する態様は、その属の２つ以上の成員の組合せを包含すると理解されるべきである。本出願人（１人または複数）は、本明細書に記載される本発明の全範囲を発明したが、本出願人は、他者の先行技術の研究に記載された主題について特許請求することを意図しない。したがって、特許請求の範囲内の法定の先行技術が特許庁または他の団体もしくは個人によって本出願人の注意を喚起される場合、本出願人は、そのような特許請求の範囲の主題を再定義して、そのような法定の先行技術または法定の先行技術の明らかな変形をそのような特許請求の範囲から明確に除外するために、適用される特許法に基づく修正権を行使する権利を留保する。そのような修正された特許請求の範囲によって定義される本発明の変形も、本発明の態様として意図される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、ＮａＣｌ勾配溶出にわたるサイズ排除クロマトグラフィによる製品濃度およびＨＭＷレベルを分析したＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＳＯ３−ＣＥＸクロマトグラフィ画分からのデータの比較を示す。
【００１９】
【図２】図２は、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＳＯ３−ＣＥＸ勾配溶出画分からのデータ：製品濃度、ＨＭＷ、累積製品収率および累積プール単量体（純度）の比較を示す。垂直の破線は、９０％の収率を達成するための収集終了（ＥＯＣ）目標を示す。
【００２０】
【図３】図３は、個々のＣＥＸ溶出勾配画分におけるガレクチン−３および総宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）レベルの比較を示す。短いダッシュの水平な線は、ＣＥＸ負荷物の総ＣＨＯ  ＨＣＰレベルを示す。長いダッシュの水平な線は、ＣＥＸプールの総ＣＨＯ  ＨＣＰレベルを示す。
【００２１】
【図４Ａ】図４Ａは、ｐＨ４．５で操作したＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＳＯ３−充填ＲｏｂｏＣｏｌｕｍｎ（登録商標）からの個々の画分の擬似クロマトグラムとガレクチン−３濃度の結果を示す。菱形は製品濃度（ｇ／Ｌ）を表し、四角形はガレクチン−３濃度（ｎｇ／ｍｇ）を表し、三角形はガレクチン−３濃度（ｎｇ／ｍＬ）を表す。
【００２２】
【図４Ｂ】図４Ｂは、ｐＨ５．０で操作したＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＳＯ３−充填ＲｏｂｏＣｏｌｕｍｎ（登録商標）の個々の画分の擬似クロマトグラムとガレクチン−３濃度の結果を示す。菱形は製品濃度（ｇ／Ｌ）を表し、四角形はガレクチン−３濃度（ｎｇ／ｍｇ）を表し、三角形はガレクチン−３濃度（ｎｇ／ｍＬ）を表す。
【００２３】
【図４Ｃ】図４Ｃは、ｐＨ５．５で操作したＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＳＯ３−充填ＲｏｂｏＣｏｌｕｍｎ（登録商標）からの個々の画分の擬似クロマトグラムとガレクチン−３濃度の結果を示す。菱形は製品濃度（ｇ／Ｌ）を表し、四角形はガレクチン−３濃度（ｎｇ／ｍｇ）を表し、三角形はガレクチン−３濃度（ｎｇ／ｍＬ）を表す。
【００２４】
【図４Ｄ】図４Ｄは、ｐＨ６．０で操作したＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＳＯ３−充填ＲｏｂｏＣｏｌｕｍｎ（登録商標）からの個々の画分の擬似クロマトグラムとガレクチン−３濃度の結果を示す。菱形は製品濃度（ｇ／Ｌ）を表し、四角形はガレクチン−３濃度（ｎｇ／ｍｇ）を表し、三角形はガレクチン−３濃度（ｎｇ／ｍＬ）を表す。
【００２５】
【図５Ａ】図５Ａは、ｐＨ４．５で操作したＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＣＯＯ−充填ＲｏｂｏＣｏｌｕｍｎ（登録商標）からの個々の画分の擬似クロマトグラムとガレクチン−３濃度の結果を示す。菱形は製品濃度（ｇ／Ｌ）を表し、四角形はガレクチン−３濃度（ｎｇ／ｍｇ）を表し、三角形はガレクチン−３濃度（ｎｇ／ｍＬ）を表す。
【００２６】
【図５Ｂ】図５Ｂは、ｐＨ５．０で操作したＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＣＯＯ−充填ＲｏｂｏＣｏｌｕｍｎ（登録商標）からの個々の画分の擬似クロマトグラムとガレクチン−３濃度の結果を示す。菱形は製品濃度（ｇ／Ｌ）を表し、四角形はガレクチン−３濃度（ｎｇ／ｍｇ）を表し、三角形はガレクチン−３濃度（ｎｇ／ｍＬ）を表す。
【００２７】
【図５Ｃ】図５Ｃは、ｐＨ５．５で操作したＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＣＯＯ−充填ＲｏｂｏＣｏｌｕｍｎ（登録商標）からの個々の画分の擬似クロマトグラムとガレクチン−３濃度の結果を示す。菱形は製品濃度（ｇ／Ｌ）を表し、四角形はガレクチン−３濃度（ｎｇ／ｍｇ）を表し、三角形はガレクチン−３濃度（ｎｇ／ｍＬ）を表す。
【００２８】
【図５Ｄ】図５Ｄは、ｐＨ６．０で操作したＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＣＯＯ−充填ＲｏｂｏＣｏｌｕｍｎ（登録商標）からの個々の画分の擬似クロマトグラムとガレクチン−３濃度の結果を示す。菱形は製品濃度（ｇ／Ｌ）を表し、四角形はガレクチン−３濃度（ｎｇ／ｍｇ）を表し、三角形はガレクチン−３濃度（ｎｇ／ｍＬ）を表す。
【００２９】
【図６】図６は、ＣＥＸ樹脂スクリーニングの工程収率パーセントと純度パーセント（単量体製品）の比較を示す。Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＳＯ３−の結果を中空記号で表し、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＣＯＯ−の結果を中実記号で表す。菱型はｐＨ４．５を表し、四角形はｐＨ５．０を表し、三角形はｐＨ５．５を表し、円はｐＨ６．０を表す。
【００３０】
【図７】図７は、ＣＥＸ樹脂スクリーニングの工程収率パーセントとガレクチン−３除去パーセントの比較を示す。Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＳＯ３−の結果を中空記号で表し、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＣＯＯ−の結果を中実記号で表す。菱型はｐＨ４．５を表し、四角形はｐＨ５．０を表し、三角形はｐＨ５．５を表し、円はｐＨ６．０を表す。
【００３１】
【図８Ａ】図８Ａは、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＳＯ３−樹脂の収率パーセントに対するｐＨおよび塩濃度の影響を表す等高線図を示す。
【００３２】
【図８Ｂ】図８Ｂは、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＳＯ３−樹脂のＳＥＣによる純度パーセントに対するｐＨおよび塩濃度の影響を表す等高線図を示す。
【００３３】
【図８Ｃ】図８Ｃは、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＳＯ３−樹脂のガレクチン−３濃度（ｎｇ／ｍｇ）に対するｐＨおよび塩濃度の影響を表す等高線図を示す。
【００３４】
【図９Ａ】図９Ａは、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＣＯＯ−樹脂の収率パーセントに対するｐＨおよび塩濃度の影響を表す等高線図を示す。
【００３５】
【図９Ｂ】図９Ｂは、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＣＯＯ−樹脂のＳＥＣによる純度パーセントに対するｐＨおよび塩濃度の影響を表す等高線図を示す。
【００３６】
【図９Ｃ】図９Ｃは、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＣＯＯ−樹脂のガレクチン−３濃度（ｎｇ／ｍｇ）に対するｐＨおよび塩濃度の影響を表す等高線図を示す。
【００３７】
【図１０】図１０は、個々のＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＳＯ３−溶出勾配画分のガレクチン−３レベルの比較を示す。円は各画分のタンパク質濃度（ｇ／Ｌ）を表し、四角形は多属性質量分析法（ＭＡＭ）による各画分のガレクチン−３レベル（ｐｐｍ）を表し、三角形はＥＬＩＳＡによって決定した各画分のガレクチン−３レベル（ｐｐｍ）を表す。負荷物中のガレクチン−３のレベル（ｐｐｍ）を小さなダッシュ（ＥＬＩＳＡによって測定）と大きなダッシュ（ＭＡＭによって測定）として示す。
【００３８】
【図１１Ａ】図１１Ａは、ｐＨ５．０の酢酸ナトリウムとＮａＣｌで実施したＲｏｂｏＣｏｌｕｍｎ（登録商標）でのＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  Ｈｉｇｈ  Ｓｕｂからの個々の画分の擬似クロマトグラム、塩濃度およびガレクチン−３濃度を示す。菱形は製品濃度（ｇ／Ｌ）を表し、実線は塩濃度を表し、円はガレクチン−３濃度（ｎｇ／ｍＬ）を表す。
【００３９】
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、ｐＨ６．０のＭＥＳナトリウムおよびＮａＣｌで実施したＲｏｂｏＣｏｌｕｍｎ（登録商標）でのＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  Ｈｉｇｈ  Ｓｕｂからの個々の画分の擬似クロマトグラム、塩濃度およびガレクチン−３濃度を示す。菱形は製品濃度（ｇ／Ｌ）を表し、実線は塩濃度を表し、円はガレクチン−３濃度（ｎｇ／ｍＬ）を表す。
【００４０】
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、ｐＨ５．０のクエン酸ナトリウムで実施したＲｏｂｏＣｏｌｕｍｎ（登録商標）でのＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  Ｈｉｇｈ  Ｓｕｂからの個々の画分の擬似クロマトグラム、塩濃度およびガレクチン−３濃度を示す。菱形は製品濃度（ｇ／Ｌ）を表し、実線は塩濃度を表し、円はガレクチン−３濃度（ｎｇ／ｍＬ）を表す。
【００４１】
【図１１Ｄ】図１１Ｄは、ｐＨ６．０のクエン酸ナトリウムで実施したＲｏｂｏＣｏｌｕｍｎ（登録商標）でのＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  Ｈｉｇｈ  Ｓｕｂからの個々の画分の擬似クロマトグラム、塩濃度およびガレクチン−３濃度を示す。菱形は製品濃度（ｇ／Ｌ）を表し、実線は塩濃度を表し、円はガレクチン−３濃度（ｎｇ／ｍＬ）を表す。
【００４２】
【図１１Ｅ】図１１Ｅは、ｐＨ５．０の酢酸ナトリウムと硫酸ナトリウムで実施したＲｏｂｏＣｏｌｕｍｎ（登録商標）でのＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  Ｈｉｇｈ  Ｓｕｂからの個々の画分の擬似クロマトグラム、塩濃度およびガレクチン−３濃度を示す。菱形は製品濃度（ｇ／Ｌ）を表し、実線は塩濃度を表し、円はガレクチン−３濃度（ｎｇ／ｍＬ）を表す。
【００４３】
【図１１Ｆ】図１１Ｆは、ｐＨ６．０のＭＥＳナトリウムと硫酸ナトリウムで実施したＲｏｂｏＣｏｌｕｍｎ（登録商標）でのＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  Ｈｉｇｈ  Ｓｕｂからの個々の画分の擬似クロマトグラム、塩濃度およびガレクチン−３濃度を示す。菱形は製品濃度（ｇ／Ｌ）を表し、実線は塩濃度を表し、円はガレクチン−３濃度（ｎｇ／ｍＬ）を表す。
【００４４】
【図１１Ｇ】図１１Ｇは、ｐＨ６．０のリン酸ナトリウムで実施したＲｏｂｏＣｏｌｕｍｎ（登録商標）でのＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  Ｈｉｇｈ  Ｓｕｂからの個々の画分の擬似クロマトグラム、塩濃度およびガレクチン−３濃度を示す。菱形は製品濃度（ｇ／Ｌ）を表し、実線は塩濃度を表し、円はガレクチン−３濃度（ｎｇ／ｍＬ）を表す。
【００４５】
【図１１Ｈ】図１１Ｈは、ｐＨ７．０のリン酸ナトリウムで実施したＲｏｂｏＣｏｌｕｍｎ（登録商標）でのＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  Ｈｉｇｈ  Ｓｕｂからの個々の画分の擬似クロマトグラム、塩濃度およびガレクチン−３濃度を示す。菱形は製品濃度（ｇ／Ｌ）を表し、実線は塩濃度を表し、円はガレクチン−３濃度（ｎｇ／ｍＬ）を表す。
【００４６】
【図１２Ａ】図１２Ａは、ｐＨ５．０の酢酸ナトリウムとＮａＣｌで実施したＲｏｂｏＣｏｌｕｍｎ（登録商標）でのＴｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍからの個々の画分の擬似クロマトグラム、塩濃度およびガレクチン−３濃度を示す。菱形は製品濃度（ｇ／Ｌ）を表し、実線は塩濃度を表し、円はガレクチン−３濃度（ｎｇ／ｍＬ）を表す。
【００４７】
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、ｐＨ６．０のＭＥＳナトリウムとＮａＣｌで実施したＲｏｂｏＣｏｌｕｍｎ（登録商標）でのＴｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍからの個々の画分の擬似クロマトグラム、塩濃度およびガレクチン−３濃度を示す。菱形は製品濃度（ｇ／Ｌ）を表し、実線は塩濃度を表し、円はガレクチン−３濃度（ｎｇ／ｍＬ）を表す。
【００４８】
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、ｐＨ５．０のクエン酸ナトリウムで実施したＲｏｂｏＣｏｌｕｍｎ（登録商標）でのＴｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍからの個々の画分の擬似クロマトグラム、塩濃度およびガレクチン−３濃度を示す。菱形は製品濃度（ｇ／Ｌ）を表し、実線は塩濃度を表し、円はガレクチン−３濃度（ｎｇ／ｍＬ）を表す。
【００４９】
【図１２Ｄ】図１２Ｄは、ｐＨ６．０のクエン酸ナトリウムで実施したＲｏｂｏＣｏｌｕｍｎ（登録商標）でのＴｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍからの個々の画分の擬似クロマトグラム、塩濃度およびガレクチン−３濃度を示す。菱形は製品濃度（ｇ／Ｌ）を表し、実線は塩濃度を表し、円はガレクチン−３濃度（ｎｇ／ｍＬ）を表す。
【００５０】
【図１２Ｅ】図１２Ｅは、ｐＨ５．０の酢酸ナトリウムと硫酸ナトリウムで実施したＲｏｂｏＣｏｌｕｍｎ（登録商標）でのＴｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍからの個々の画分の擬似クロマトグラム、塩濃度およびガレクチン−３濃度を示す。菱形は製品濃度（ｇ／Ｌ）を表し、実線は塩濃度を表し、円はガレクチン−３濃度（ｎｇ／ｍＬ）を表す。
【００５１】
【図１２Ｆ】図１２Ｆは、ｐＨ６．０のＭＥＳナトリウムと硫酸ナトリウムで実施したＲｏｂｏＣｏｌｕｍｎ（登録商標）でのＴｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍからの個々の画分の擬似クロマトグラム、塩濃度およびガレクチン−３濃度を示す。菱形は製品濃度（ｇ／Ｌ）を表し、実線は塩濃度を表し、円はガレクチン−３濃度（ｎｇ／ｍＬ）を表す。
【００５２】
【図１２Ｇ】図１２Ｇは、ｐＨ６．０のリン酸ナトリウムで実施したＲｏｂｏＣｏｌｕｍｎ（登録商標）でのＴｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍからの個々の画分の擬似クロマトグラム、塩濃度およびガレクチン−３濃度を示す。菱形は製品濃度（ｇ／Ｌ）を表し、実線は塩濃度を表し、円はガレクチン−３濃度（ｎｇ／ｍＬ）を表す。
【００５３】
【図１２Ｈ】図１２Ｈは、ｐＨ７．０のリン酸ナトリウムで実施したＲｏｂｏＣｏｌｕｍｎ（登録商標）でのＴｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍからの個々の画分の擬似クロマトグラム、塩濃度およびガレクチン−３濃度を示す。菱形は製品濃度（ｇ／Ｌ）を表し、実線は塩濃度を表し、円はガレクチン−３濃度（ｎｇ／ｍＬ）を表す。
【００５４】
【図１３】図１３は、異なるＷａｓｈ  ２緩衝液でのＲｏｂｏＣｏｌｕｍｎ（登録商標）スクリーニングからのプロテインＡ溶出液プールの鉄レベルを表す。
【００５５】
【図１４】図１４は、示されているように、より高いクエン酸塩濃度を含むＷａｓｈ  ２緩衝液でのＲｏｂｏＣｏｌｕｍｎ（登録商標）スクリーニングからのプロテインＡ溶出液プールの鉄レベルを表す。
【００５６】
【図１５】図１５は、製品の鉄濃度に対する溶出時のクエン酸塩および低ｐＨ保持の影響を分析するためのプロテインＡ低ｐＨウイルス不活性化実験の概略図を示す。
【００５７】
【図１６】図１６は、プロテインＡ  Ｗａｓｈ  ２緩衝液、プロテインＡ溶出緩衝液、および低ｐＨウイルス不活性化滴定剤としてのクエン酸塩を評価するＲｏｂｏＣｏｌｕｍｎ（登録商標）スクリーニングからのＣＥＸ溶出液プールの鉄レベルを示す。白いバーは、鉄が検出されなかったことを示す。
【００５８】
【図１７】図１７は、安定性を高めるために３０°Ｃに保持した、高い鉄試料と低い鉄試料のそれぞれの経時的な高分子量（ＨＭＷ）レベルの比較を示す。
【００５９】
【図１８】図１８は、製剤化された高い鉄試料（工程１）と低い鉄試料（工程２）の視覚的な比較を示す。
【００６０】
【図１９】図１９は、ＣＨＯガレクチン−３および鉄から関心対象のグリコシル化組換えタンパク質を精製するために使用される本発明の方法の例示的な実施形態の概略フロー図を示す。
【００６１】
【図２０】図２０は、ＩＣＰ−ＭＳによって定量化した水および緩衝液試料中の鉄の濃度（μｇ／Ｌ）を示す。
【００６２】
【図２１】図２１は、ＩＣＰ−ＭＳによって定量化した水および緩衝液試料中の銅の濃度（μｇ／Ｌ）を示す。
【００６３】
【図２２】図２２は、ＩＣＰ−ＭＳによって定量した水および緩衝液試料中の亜鉛の濃度（μｇ／Ｌ）を示す。
【００６４】
【図２３】図２３は、水フラッシュおよびクエン酸緩衝液フラッシュからの珪藻土（ＤＥ）深層フィルタ画分で観察された鉄の濃度（μｇ／Ｌ）を示す。
【００６５】
【図２４】図２４は、水フラッシュおよびクエン酸緩衝液フラッシュからの珪藻土（ＤＥ）深層フィルタ画分で観察された銅の濃度（μｇ／Ｌ）を示す。
【００６６】
【図２５】図２５は、水フラッシュおよびクエン酸緩衝液フラッシュからの珪藻土（ＤＥ）深層フィルタ画分で観察された亜鉛の濃度（μｇ／Ｌ）を示す。
【００６７】
【図２６】図２６は、本明細書の例５に記載されるように、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィ工程とＣＥＸクロマトグラフィ工程の間に、深層フィルタの珪藻土を介した平衡緩衝液（ＥＱ）またはクエン酸緩衝液フラッシュのいずれかによる任意の深層ろ過工程を組み込んだ実験シーケンスの概略図である。
【００６８】
【図２７】図２７は、異なるプロテインＡ溶出条件と深層フィルタフラッシュ条件を用いてプロテインＡ、深層フィルタおよびＣＥＸプールで観察された鉄のレベル（ｐｐｍ）を示す。
【００６９】
【図２８】図２８は、異なるプロテインＡ溶出条件と深層フィルタフラッシュ条件を用いてプロテインＡ、深層フィルタおよびＣＥＸプールで観察された銅のレベル（ｐｐｍ）を示す。
【００７０】
【図２９】図２９は、異なるプロテインＡ溶出条件と深層フィルタフラッシュ条件を用いてプロテインＡ、深層フィルタおよびＣＥＸプールで観察された亜鉛のレベル（ｐｐｍ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
本明細書で使用される項の見出しは構成目的のみのためであり、説明される主題を限定すると解釈されるべきではない。
【００７２】
定義
【００７３】
本明細書で特に定義されない限り、本出願に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈上特に要求されない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの」および「その」は、文脈上明らかに異なる指示がない限り、複数の指示対象を含む。例えば、「１つのタンパク質」への言及は複数のタンパク質を含み、「１つの細胞」への言及は複数の細胞の集団を含む。
【００７４】
本発明は、関心対象のグリコシル化組換えタンパク質を夾雑物から精製する方法に関する。関心対象のグリコシル化組換えタンパク質は、少なくとも免疫グロブリンＦｃドメインのＣＨ２およびＣＨ３ドメインならびに１つ以上の末端β−ガラクトシル残基を含む。そのようなグリコシル化組換えタンパク質の一例は、商業的にＥｙｌｅａ（登録商標）としても知られるアフリベルセプトである。アフリベルセプトは、典型的には組換えＤＮＡ発現技術によって最も好都合に生産される、アフリベルセプトアミノ酸配列（配列番号１）を有する２つの同一の融合ポリペプチド鎖の集合体である。アフリベルセプトのアミノ酸配列は以下のとおりである：
【化１】
2020531411.tif 000003
【００７５】
本発明のｒｅｌジスルフィド架橋は、配列番号１の以下のアミノ酸位置のシステイン残基（上記の配列番号１に示す下線を付したシステイン（Ｃ）残基）の間に予想される：
【００７６】
３０−７９（鎖内）
【００７７】
１２４−１８５（鎖内）
【００７８】
２１１−２１１（鎖間）
【００７９】
２１４−２１４（鎖間）
【００８０】
２４６−３０６（鎖内）
【００８１】
３５２−４１０（鎖内）。
【００８２】
アフリベルセプトの２つの融合ポリペプチド鎖は、配列番号１のアミノ酸位置２１１および２１４でジスルフィド結合によって共有結合している。融合タンパク質は、典型的には、配列番号１の３６、６８、１２３、１９６、および２８２の位置のアスパラギン残基（上記の配列番号１に示す太字／イタリック体のアスパラギン（Ｎ）残基）で共有結合したＮ−グリカン（培養条件に依存して末端β−ガラクトシル残基を有し得る）でグリコシル化されている。本発明の範囲内の「アフリベルセプト」には、融合ポリペプチド鎖の一方または両方が、追加のカルボキシ末端リジン（Ｋ）残基を有する配列番号１のアミノ酸配列を有するかまたは有さない実施形態も含まれる。
【００８３】
関心対象の他のグリコシル化組換えタンパク質（または「ＰＯＩ」）には、アレファセプト、エタネルセプト、アバタセプト、ベラトセプト、ｒＦＶＩＩＩＦｃ、ｒＦＶＩＸＦｃ、およびリロナセプト、ならびに様々な治療用ペプチボディが含まれ得るが、これらに限定されない。
【００８４】
関心対象のグリコシル化組換えタンパク質は、本発明の方法によるさらなる処理のために、最初はバッチまたは灌流（連続フローバイオプロセシング）宿主細胞培養上清もしくはろ液（例えば、透析ろ過および／または限外ろ過および／またはウイルスろ過の１つ以上の工程後）に含まれる。所望する場合は、本発明の方法の工程を適用する前または後に、関心対象のグリコシル化組換えタンパク質の調製に追加の精製工程を適用することもできる。例えば、ＰＯＩは、必要に応じて、例えば透析ろ過、限外ろ過、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、陽イオン交換（ＣＥＸ）もしくは陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィ、または関心対象の抗原もしくはプロテインＡもしくはプロテインＧをアフィニティリガンドとして使用するアフィニティクロマトグラフィを用いて、１つまたはいくつかの工程によって精製することができる。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、またはγ４重鎖に基づくポリペプチドを含むタンパク質を精製するのに使用することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３（１９８３））。プロテインＧは、すべてのマウスアイソタイプおよびヒトγ３に推奨される（Ｇｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．５：１５６７１５７５（１９８６））。アフィニティリガンドが結合するマトリックスは、ほとんどの場合アガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。制御細孔ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定したマトリックスは、アガロースで達成できるよりも速い流速と短い処理時間を可能にする。タンパク質がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．）が精製のために有用である。回収するタンパク質に依存して、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および硫酸アンモニウム沈殿などのタンパク質精製の他の手法も、可能な選択肢である。
【００８５】
夾雑物から関心対象のグリコシル化組換えタンパク質を精製する本方法は、関心対象のグリコシル化組換えタンパク質（ＰＯＩ）を含むバッチまたは灌流宿主細胞培養上清もしくはろ液を、ほぼ中性のｐＨで、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィマトリックス（すなわちプロテインＡマトリックス）に負荷することを含む。「プロテインＡ」は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）の細胞壁に元々認められるおよそ４２ｋＤａの表面タンパク質である；プロテインＡは黄色ブドウ球菌のｓｐａ遺伝子によってコードされ、黄色ブドウ球菌におけるその発現は、ＤＮＡトポロジー、細胞浸透圧、およびＡｒｌＳ−ＡｒｌＲと呼ばれる２成分系によって制御される。（Ｆｏｕｒｎｉｅｒ，Ｂ．，ａｎｄ  Ｋｌｉｅｒ，Ａ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｓｕｐｅｒｃｏｉｌｉｎｇ  ｗｈｉｃｈ  ｉｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ＡｒｌＳ−ＡｒｌＲ  ｔｗｏ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５０：３８０７−１９（２００４）参照）。プロテインＡ（Ｓｐａ遺伝子産物）は、免疫グロブリンに結合するその能力のために、生化学的研究および産業において有用である。プロテインＡは、３ヘリックスバンドルに折り畳まれた５つの相同なＩｇ結合ドメインからなる。各ドメインは、多くの哺乳動物種のタンパク質、中でも特にＩｇＧに結合することができる。結晶学的精密化により、プロテインＡの主要な結合部位は、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインの間のＦｃ領域にあることが示されている。（Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ，Ｊ．，Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ  ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ  ａｎｄ  ａｔｏｍｉｃ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  Ｆｃ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｗｉｔｈ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｂ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｆｒｏｍ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ａｔ  ２．９−  ａｎｄ  ２．８−Ａ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０（９）：２３６１−７０（１９８１））。さらに、プロテインＡは、ヒトＶＨ３遺伝子ファミリーのＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片を含むヒトＩｇＧ分子に結合する。（Ｓａｓｓｏ  ＥＨ，Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ  ＧＪ，Ｍａｎｎｉｋ  Ｍ，Ｈｕｍａｎ  ＩｇＡ  ａｎｄ  ＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２  ｔｈａｔ  ｂｉｎｄ  ｔｏ  ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｂｅｌｏｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  ＶＨＩＩＩ  ｓｕｂｇｒｏｕｐ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１４７（６）：１８７７−８３（１９９１）参照）。プロテインＡは、典型的には免疫学、生物学的研究、および産業用途で使用するために工業発酵において生産および精製される。天然（または未変性）プロテインＡは黄色ブドウ球菌で培養でき、上述した５つの相同な抗体結合領域および細胞壁付着のためのＣ末端領域を含む。典型的には大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）で産生されるプロテインＡの組換え形態も、本発明の目的のために有用である。本発明で使用するために、プロテインＡマトリックスは様々な実施形態で��業的に入手することができる（例えば、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈからの黄色ブドウ球菌由来のＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  ＳｃｉｅｎｃｅｓからのＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）プロテインＡ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（登録商標）プロテインＡ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（登録商標）ＬＸ、およびＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＦＦ；ＥＭＤ  ＭｉｌｌｉｐｏｒｅからのＥｓｈｍｕｎｏ（登録商標）ＡプロテインＡ；Ｔｏｓｏｈ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅからのＴｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）ＡＦ−ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのＰＯＲＯＳ（登録商標）プロテインＡ；ＲｅｐｌｉｇｅｎからのＣａｐｔｉｖＡ（登録商標）プロテインＡアフィニティ樹脂）。プロテインＡの組換え形態は、一般に５つの相同な抗体結合ドメインを含むが、本発明の目的のために、基質、例えば、樹脂（限定されないが、アガロースなど）への共有結合を促進するために構造の他の部分を変化させることができる。プロテインＡマトリックスは、タンパク質の精製に有用なカラムに配置または充填され得る。工業用途のためにその特性を改善するように改変された単一ドメインの多量体（典型的には四量体、五量体または六量体）であるプロテインＡの操作された形態も、本発明でのプロテインＡマトリックスにおいて有用である。
【００８６】
「マトリックス」という用語には、本発明の方法の目的のための関連するクロマトグラフィリガンド（例えば、プロテインＡもしくは他のアフィニティクロマトグラフィリガンド、荷電部分、または疎水性部分など）を担持する、樹脂、ビーズ、ナノ粒子、ナノファイバー、ヒドロゲル、膜、およびモノリス、または任意の他の物理的マトリックスが包含される。
【００８７】
関心対象のグリコシル化組換えタンパク質を含むバッチ宿主細胞培養物または灌流（連続フローバイオプロセシング）宿主細胞培養物、上清もしくはろ液は、関心対象のグリコシル化組換えタンパク質（ＰＯＩ）の１つ以上の末端β−ガラクトシル残基に可逆的に結合したガレクチン宿主細胞夾雑物も含む。「ガレクチン」という用語は、通常は可溶性形態で生じるβ−ガラクトシド結合レクチンを意味する。様々なガレクチンは、多種多様な動物細胞型によって発現され、それらの炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）のアミノ酸配列によって識別できる。３つのサブグループが存在する：（ｉ）結合してホモ二量体を形成し得る単一ＣＲＤを含むプロトタイプガレクチン；（ｉｉ）単一ＣＲＤと、プロリン、グリシン、およびチロシン残基に富む大きなアミノ末端ドメインを有することを特徴とするキメラガレクチン、例えば、ガレクチン−３；ならびに（ｉｉｉ）共有結合で架橋された、または典型的には長さが５から５０超のアミノ酸残基の範囲の小さなペプチド結合ドメインによって連結された、少なくとも２つのＣＲＤが単一ポリペプチド内に存在するタンデムリピートガレクチン。さらに、ガレクチン転写物の多くは、差別的にスプライシングされて異なるアイソフォームを生成し得る。ガレクチンの例には、エレクトロレクチンおよび様々なＳ型（スルフヒドリル依存性）ガレクチンが含まれる。いくつかの例には、ガレクチン−１、ガレクチン−３、ガレクチン−４、ガレクチン−６、ガレクチン−７、ガレクチン−８、ガレクチン−９、ガレクチン−１０、ガレクチン−１２、ガレクチン−１３、およびガレクチン−１４が含まれるが、これらに限定されない。（例えば、Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  ＲＤ  ａｎｄ  Ｌｉｕ  ＦＴ，Ｇａｌｅｃｔｉｎｓ，Ｉｎ：Ｖａｒｋｉ  Ａ，Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  ＲＤ，Ｅｓｋｏ  ＪＤ，Ｆｒｅｅｚｅ  ＨＨ，Ｓｔａｎｌｅｙ  Ｐ，Ｂｅｒｔｏｚｚｉ  ＣＲ，Ｈａｒｔ  ＧＷ，Ｅｔｚｌｅｒ  ＭＥ，ｅｄｉｔｏｒｓ．Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（ＮＹ）：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；２００９．Ｃｈａｐｔｅｒ  ３３；Ｇｉｔｔ，ＭＡ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇａｌｅｃｔｉｎ−４  ａｎｄ  ｇａｌｅｃｔｉｎ−６  ａｒｅ  ｔｗｏ  ｃｌｏｓｅｌｙ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｌｅｃｔｉｎｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｒａｃｔ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７３（５）：２９５４−６０（１９９８）；Ｂｉｄｏｎ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇａｌｅｃｔｉｎ−８：ａ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｓｕｂ−ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｇａｌｅｃｔｉｎｓ（Ｒｅｖｉｅｗ），Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．８（３）：２４５−５０（２００１）；Ｈａｄａｒｉ，ＹＲ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇａｌｅｃｔｉｎ−８．Ａ  ｎｅｗ  ｒａｔ  ｌｅｃｔｉｎ，ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｇａｌｅｃｔｉｎ−４，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７０（７）：３４４７−５３（１９９５）；Ｓａｔｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎｓ  ａｎｄ  ａ  ｌｉｎｋｅｒ  ｐ��ｐｔｉｄｅ  ｏｆ  ｇａｌｅｃｔｉｎ−９  ａｓ  ｔｏ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ  ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １２（３）：１９１−９７（２００２）；Ｙａｎｇ，ＲＹ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｇａｌｅｃｔｉｎ−１２，ａ  ｎｅｗ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇａｌｅｃｔｉｎ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７６（２３）：２０２５２−６０（２００１）；Ｒａｍａｓｗａｍｙ，Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  ｇａｌａｃｔｏｓｅ−ｂａｓｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｇａｌｅｃｔｉｎ−７，ＦＥＢＳ  Ｊ．２０１５  Ｊａｎ；２８２（２）：３７２−８７（２０１５）；Ｐａｔｎａｉｋ，ＳＫ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｎ−ｇｌｙｃａｎｓ  ａｒｅ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｆｏｒ  ｇａｌｅｃｔｉｎ−１，−３，ａｎｄ  −８  ｏｎ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ  ｃｅｌｌｓ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １６（４）：３０５−１７（２００６）参照）。
【００８８】
「ガレクチン−３」は、ハムスターもしくはハムスター由来の細胞、マウスもしくはマウス由来の細胞、またはヒトもしくはヒト由来の細胞などの、しかしこれらに限定されない哺乳動物細胞のβ−ガラクトシド結合タンパク質である。この宿主細胞レクチンは、哺乳動物種の細胞に広く分布している。（例えば、Ｍｅｈｕｌ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，１８２５０−１８２５８（１９９４）；Ｍｅｈｕｌ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｏｓｓ‐ｌｉｎｋｉｎｇ  ｏｆ  ｇａｌｅｃｔｉｎ  ３，ａ  ｇａｌａｃｔｏｓｅ‐ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ，ｂｙ  ｔｉｓｓｕｅ‐ｔｙｐｅ  ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ３６０：１６０‐１６４（１９９５）；Ｒｅｌｊｉｃ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ＩｇＡ  ｂｉｎｄｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｇａｌｅｃｔｉｎ−３／Ｍａｃ−２  ｌｅｃｔｉｎ  ｆｒｏｍ  ｍｏｕｓｅ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，９３：１，５１（２００４）；Ｈｅｎｒｉｃｋ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｓｕｂｓｉｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇａｌｅｃｔｉｎｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｓｕｇａｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｔ  ｔｈｅ  ｎｏｎｒｅｄｕｃｉｎｇ  ｅｎｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｇａｌａｃｔｏｓｅ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｌｉｇａｎｄｓ：ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ，  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｇａｌｅｃｔｉｎ−３，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ８（１）：４５−５７（１９９８）；Ｄｕｍｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇａｌｅｃｔｉｎ−３：Ａｎ  ｏｐｅｎ−ｅｎｄｅｄ  ｓｔｏｒｙ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １７６０：６１６−６３５（２００６）参照）。
【００８９】
「夾雑物」または「不純物」という用語は、精製される組換えタンパク質の試料中に存在する、精製される関心対象の組換えタンパク質以外の、任意の外来性または好ましくない分子またはイオン、特にＤＮＡ、ＲＮＡ、またタンパク質などの生体高分子を指す。夾雑物には、例えば、精製される組換えタンパク質を分泌する宿主細胞からの他のタンパク質、例えば、夾雑ガレクチン宿主細胞タンパク質（例えば、ガレクチン−３）、または金属カチオン、例えば、アルミニウムカチオン（例えば、Ａｌ（ＩＩＩ））、バリウムカチオン、カルシウムカチオン、コバルトカチオン（例えば、Ｃｏ（ＩＩ））、銅カチオン、鉄カチオン（例えば、Ｆｅ（ＩＩ）もしくはＦｅ（ＩＩＩ））、亜鉛カチオン、マグネシウムカチオン、マンガンカチオン、水銀カチオン、ニッケルカチオン、および／またはストロンチウムカチオンが含まれる。タンパク質の天然環境または培地の夾雑成分は、タンパク質の診断的または治療的使用を妨げる物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性（例えば、ポリヌクレオチド、脂質、炭水化物）溶質が含まれ得る。典型的には、「単離されたタンパク質」は、所与の試料の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、または少なくとも約５０％を構成する。いくつかの実施形態では、関心対象のタンパク質、例えば、アフリベルセプト融合タンパク質は、還元または非還元条件下で、任意で染色、例えば、クマシーブルーまたは銀染色を使用して、（１）タンパク質の９５重量％超、最も好ましくは９９重量％超まで、または（２）ＳＤＳ−ＰＡＧＥもしくは他の適切な手法によって均一まで精製される。単離された組換えタンパク質は、組換え細胞内でインサイチューを含む。しかし、典型的には、関心対象の単離されたタンパク質（例えば、アフリベルセプト）は、少なくとも１つの精製工程によって調製される。純度および不純物レベルは、ＣＥ−ＳＤＳ、ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡ、ガレクチンＥＬＩＳＡ、多属性質量分析（ＭＡＭ）、質量分析による金属分析、および／またはＤＮＡのＱＰＣＲを含むがこれらに限定されない任意の適切なアッセイを使用して評価される。
【００９０】
本発明の方法を実施する過程でタンパク質の安定性を測定するための様々な分析技術が当技術分野で利用可能であり、例えば、Ｗａｎｇ，Ｗ．（１９９９），Ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｑｕｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．１８５：１２９−１８８に総説されている。安定性は、選択した期間、選択した温度で測定することができる。例えば、製剤が実際に２〜８°Ｃで保存される場合、一般に製剤は３０°Ｃで少なくとも１ヶ月間、または４０°Ｃで少なくとも１週間、および／または２〜８°Ｃで少なくとも２年間安定でなければならない。迅速なスクリーニングのために、タンパク質を含む溶液または製剤を３０〜４０℃で２週間〜１ヶ月間保持し、その時点でタンパク質の安定性を測定する。通常の保存温度（３０〜４０°Ｃ）よりも高い温度でのこの保存は、より長期間にわたるより慣例的な冷蔵温度での保存で生じる状態をシミュレートするものであり、「加速安定性」と称される。
【００９１】
タンパク質の「安定な」溶液または製剤は、その中のタンパク質が、タンパク質、例えば、組換えアフリベルセプトタンパク質の精製および／または処理（例えば、限外ろ過、透析ろ過、もしくは他のろ過工程、クロマトグラフィ工程、低ｐＨウイルス不活性化、バイアル充填、輸送、および／または保存）の際にその物理的安定性および／または化学的安定性および／または生物学的活性を本質的に保持するものである。合わせて、特定の物理的条件、例えば、温度およびｐＨの下での特定の溶液または製剤における関心対象のタンパク質の物理的、化学的および生物学的安定性は、タンパク質の「安定性」を具体化する。例えば、氷点下の温度で保存されたタンパク質は、化学的、物理的または生物学的活性に有意な変化がないと予想されるが、４０°Ｃで保存されたタンパク質は、その物理的、化学的および生物学的活性の変化を有すると予想され、変化の程度はタンパク質の保存時間に依存する。タンパク質製剤の形状も変化の割合に影響を及ぼし得る。例えば、凝集体の形成はタンパク質濃度によって大きく影響され、タンパク質濃度が高いほどより高い割合の凝集が観察される。賦形剤も医薬品の安定性に影響を与えることが知られており、例えば塩の添加は一部のタンパク質の凝集率を高めるが、スクロースなどの他の賦形剤は保存中の凝集率を低下させることが公知である。不安定性はｐＨによっても大きく影響され、修飾の種類とｐＨ依存性に応じてより高いおよびより低い分解速度を生じさせる。
【００９２】
タンパク質は、色および／もしくは透明度の目視検査で、またはＵＶ光散乱もしくはサイズ排除クロマトグラフィによって、または他の適切な方法で測定されるように、二次および／もしくは三次構造（すなわち固有の構造）の変化、または凝集、ならびに／または沈殿および／もしくは変性の最小限の兆候を示す場合、「その物理的安定性を保持する」。タンパク質の物理的不安定性、すなわち物理的安定性の喪失は、オリゴマー化によって引き起こされ得、二量体およびより高次の凝集体、肉眼では見えないおよび目に見える粒子の形成、ならびに沈殿をもたらす。物理的な劣化の程度は、関心対象の分解物の種類に応じて様々な手法を用いて確認することができる。二量体およびより高次の可溶性凝集体は、サイズ排除クロマトグラフィを使用して定量化できるが、肉眼では見えない粒子は、光散乱、光遮蔽または他の適切な技術を使用して定量化し得る。一実施形態では、タンパク質の安定性は、溶液中のアフリベルセプト単量体タンパク質の割合に従って決定され、分解（例えば、断片化）および／または凝集タンパク質の割合は低い。
【００９３】
所与の時点での化学的安定性が、共有結合が形成または切断されず、タンパク質成分の一次構造の変化を生じさせないものである場合、タンパク質は医薬製剤中で「その化学的安定性を保持する」。一次構造の変化は、タンパク質の二次および／または三次および／または四次構造の改変をもたらし、凝集体の形成または既に形成された凝集体の逆転をもたらし得る。典型的な化学修飾には、異性化、脱アミド化、Ｎ末端環化、骨格加水分解、メチオニン酸化、トリプトファン酸化、ヒスチジン酸化、β脱離、ジスルフィド形成、ジスルフィドスクランブリング、ジスルフィド切断、およびＤ−アミノ酸の形成を含む一次構造の変化をもたらす他の変化が含まれ得る。化学的不安定性、すなわち化学的安定性の喪失は、イオン交換クロマトグラフィ、キャピラリー等電点電気泳動、ペプチド消化物の分析、および複数の種類の質量分析技術を含む様々な技術によって調べ得る。化学的安定性は、タンパク質の化学的に変化した形態を検出および定量することによって評価できる。化学的変化には、例えばサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび／またはマトリックス支援レーザー脱離イオン化／飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ  ＭＳ）を使用して評価できるサイズ変化（例えばクリッピング）が含まれる。他の種類の化学変化には、イオン交換クロマトグラフィ、キャピラリー等電点電気泳動、またはペプチドマッピングなどの、しかしこれらに限定されない電荷に基づく方法によって評価できる電荷の変化（例えば脱アミド化の結果として生じるもの）が含まれる。
【００９４】
物理的および／または化学的安定性の喪失は、修飾および修飾されるタンパク質に依存して、関心対象の生物学的活性の増加または減少のいずれかとして、生物学的活性の変化をもたらし得る。所与の時点でのタンパク質の生物学的活性が、医薬製剤が調製された時点で示された生物学的活性の約３０％以内である場合、タンパク質は医薬製剤中で「その生物学的活性を保持する」。活性がその出発値の７０％未満である場合、活性は減少したとみなされる。生物学的アッセイには、リガンド結合、効力、細胞増殖、またはそのバイオ医薬品活性の他の代替測定などの、インビボおよびインビトロベースのアッセイの両方が含まれる。一例として、アフリベルセプトの生物学的活性は、ＥＬＩＳＡによる胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）への結合またはＶＥＧＦＡ依存性ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）増殖の阻害などのインビトロリガンド結合アッセイを使用して推定することができる。
【００９５】
本発明の目的のための関心対象の組換えタンパク質（例えば、アフリベルセプト、アレファセプト、エタネルセプト、アバタセプト、ベラトセプト、ｒＦＶＩＩＩＦｃ、ｒＦＶＩＸＦｃ、およびリロナセプト）は、典型的には組換え発現技術によって生産される。「組換え」という用語は、物質（例えば、核酸またはポリペプチド）がヒトの介入によって人為的または合成的に（すなわち非自然に）改変されていることを示す。改変は、その天然環境もしくは状態内の、またはその天然環境もしくは状態から取り出された物質に対して実施され得る。例えば、「組換え核酸」は、例えば、クローニング、ＤＮＡシャフリングまたは他の周知の分子生物学的手順の間に、核酸を組み換えることによって作製されるものである。そのような分子生物学的手順の例は、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８２）に見出される。「組換えＤＮＡ分子」は、そのような分子生物学的手法によって連結されたＤＮＡのセグメントからなる。本明細書で使用される「組換えタンパク質」または「組換えポリペプチド」という用語は、組換えＤＮＡ分子を使用して発現されるタンパク質分子を指す。「組換え宿主細胞」は、組換え核酸を含むおよび／または発現する細胞である。例えば、アフリベルセプト融合タンパク質の発現に有用な組換えＤＮＡ分子は、例えば、Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、米国特許第７，０７０，９５９  Ｂ２号；および国際公開第００／７５３１９  Ａ１号によって記述されている。
【００９６】
「天然に生じる」という用語は、ポリペプチド、核酸、宿主細胞などの生物学的物質に関連して本明細書に存在する場合、自然界に見出される物質を指す。
【００９７】
「制御配列」または「制御シグナル」という用語は、特定の宿主細胞において、それが連結されているコード配列の発現およびプロセシングに影響を与えることができるポリヌクレオチド配列を指す。そのような制御配列の性質は宿主生物に依存し得る。特定の実施形態では、原核生物の制御配列は、プロモータ、リボソーム結合部位、および転写終結配列を含み得る。真核生物の制御配列は、１つまたは複数の転写因子認識部位を含むプロモータ、転写エンハンサー配列またはエレメント、ポリアデニル化部位、および転写終結配列を含み得る。制御配列は、リーダ配列および／または融合パートナー配列を含むことができる。プロモータおよびエンハンサーは、転写に関与する細胞タンパク質と特異的に相互作用するＤＮＡの短い配列からなる（Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３６：１２３７（１９８７））。プロモータおよびエンハンサーエレメントは、酵母、昆虫および哺乳動物細胞ならびにウイルスの遺伝子を含む様々な真核生物源から単離されている（類似の制御エレメント、すなわちプロモータは、原核生物にも見出される）。特定のプロモータおよびエンハンサーの選択は、関心対象のタンパク質を発現するためにどの細胞種を使用するかに依存する。一部の真核生物プロモータおよびエンハンサーは幅広い宿主範囲を有するが、他のものは限られた細胞種のサブセットで機能する（総説については、Ｖｏｓｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１１：２８７（１９８６）およびＭａｎｉａｔｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３６：１２３７（１９８７）参照）。
【００９８】
「プロモータ」は、ＲＮＡポリメラーゼが結合して１つ以上の下流の構造遺伝子によるメッセンジャーＲＮＡの転写を開始させる部位を含むＤＮＡの領域である。プロモータは、同じ鎖上およびＤＮＡの上流（センス鎖の５’領域側）で、遺伝子の転写開始部位の近くに位置する。プロモータは、典型的には約１００〜１０００ｂｐの長さである。
【００９９】
「エンハンサー」は、１つ以上の活性化タンパク質（転写因子）と結合して遺伝子の転写を活性化することができるＤＮＡの短い（５０〜１５００ｂｐ）領域である。
【０１００】
本明細書で使用される「作動可能な組合せで」、「作動可能な順序で」および「作動可能に連結された」という用語は、所与の遺伝子の転写および／または所望のタンパク質分子の合成を指令することができる核酸分子が生成されるような方法での核酸配列の連結を指す。この用語は、機能性タンパク質が生成されるような方法でのアミノ酸配列の連結も指す。例えば、タンパク質コード配列に「作動可能に連結された」ベクター中の制御配列は、制御配列の転写活性と適合性の条件下でタンパク質コード配列の発現が達成されるように、タンパク質コード配列に連結されている。
【０１０１】
「ポリペプチド」および「タンパク質」は、本明細書では互換的に使用され、ペプチド結合を介して共有結合した２つ以上のアミノ酸の分子鎖を含む。この用語は、製品の特定の長さを指すものではない。したがって、「ペプチド」および「オリゴペプチド」は、ポリペプチドの定義内に含まれる。これらの用語は、ポリペプチドの翻訳後修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化などを含む。さらに、タンパク質断片、類似体、突然変異または変異タンパク質、融合タンパク質などがポリペプチドの意味に含まれる。これらの用語は、公知のタンパク質工学技術を使用して組換えによって発現され得る１つ以上のアミノ酸類似体または非標準もしくは非天然アミノ酸が含まれる分子も包含する。さらに、融合タンパク質は、周知の有機化学技術によって本明細書に記載されるように誘導体化することができる。
【０１０２】
ポリペプチド（例えば、融合タンパク質、免疫グロブリン、または抗体）の「変異体」は、別のポリペプチド配列と比べて、１つ以上のアミノ酸残基がそのアミノ酸配列に挿入されている、それから欠失されている、および／またはそれに置換されているアミノ酸配列を含む。変異体は融合タンパク質を含む。
【０１０３】
「融合タンパク質」という用語、例えばアフリベルセプト融合タンパク質は、タンパク質が複数の親タンパク質またはポリペプチドに由来するポリペプチド成分を含むことを示す。典型的には、融合タンパク質は、あるタンパク質由来のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列が、異なるタンパク質由来のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列にインフレームで付加されており、任意でリンカーによって分離されている「融合遺伝子」から発現される。次いで、融合遺伝子は、単一のタンパク質として組換え宿主細胞によって発現され得る。
【０１０４】
「分泌」タンパク質は、分泌シグナルペプチド配列の結果として小胞体（ＥＲ）、分泌小胞、または細胞外空間を指向することができるタンパク質、ならびに必ずしもシグナル配列を含まずに細胞外空間に放出されるタンパク質を指す。分泌タンパク質が細胞外空間に放出された場合、分泌タンパク質は細胞外プロセシングを受けて「成熟」タンパク質を生成することができる。細胞外空間への放出は、エキソサイトーシスおよびタンパク質分解切断を含む多くの機構によって起こり得る。いくつかの他の実施形態では、関心対象のアフリベルセプト融合タンパク質は、分泌タンパク質として宿主細胞によって合成され得、その後、細胞外空間および／または培地からさらに精製され得る。
【０１０５】
本明細書で使用される場合、宿主細胞において組換えＤＮＡ技術によって生産されるタンパク質に関して「可溶性」とは、水溶液中に存在するタンパク質であり、タンパク質がツインアルギニンシグナルアミノ酸配列を含む場合、可溶性タンパク質はグラム陰性菌宿主の細胞周辺腔に排出されるか、または分泌可能な真核生物宿主細胞によってもしくは適切な遺伝子（例えば、ｋｉｌ遺伝子）を有する細菌宿主によって培地に分泌される。したがって、可溶性タンパク質は、宿主細胞内部の封入体には見出されないタンパク質である。あるいは、状況に応じて、可溶性タンパク質は、細胞膜に組み込まれた状態では見出されない、またはインビトロで、生理学的条件下で関心対象の水性緩衝液に他のタンパク質なしで懸濁した場合、有意の量の不溶性凝集体を形成することなく（すなわち総タンパク質の１０％未満、典型的には約５％未満の凝集体を形成する）生理学的条件下で水性緩衝液に溶解するまたは溶解することができるタンパク質であり、そのような緩衝液は、尿素、塩酸グアニジニウム、または過塩素酸リチウムなどの界面活性剤またはカオトロピック剤を含まない。これに対して、不溶性タンパク質は、宿主細胞中の細胞質顆粒（封入体と呼ばれる）内に変性した形態で存在するタンパク質であり、またはやはり文脈に応じて、不溶性タンパク質は、細胞質膜、ミトコンドリア膜、葉緑体膜、小胞体膜などを含むがこれらに限定さない細胞膜中に存在するか、もしくは生理学的条件下で関心対象の水性緩衝液に他のタンパク質なしで（生理学的に適合性の温度で）懸濁した場合、生理学的条件下のインビトロ水性緩衝液中で有意の量の不溶性凝集体を形成する（すなわち総タンパク質の約１０％以上の凝集体を形成する）タンパク質であり、そのような緩衝液は、尿素、塩酸グアニジニウム、過塩素酸リチウムなどの界面活性剤またはカオトロピック剤を含まない。
【０１０６】
「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、２つ以上のヌクレオチド残基を含む一本鎖および二本鎖ヌクレオチドポリマーの両方を含む。ポリヌクレオチドを含むヌクレオチド残基は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドまたはいずれかの種類のヌクレオチドの修飾形態であり得る。前記修飾には、ブロモウリジンおよびイノシン誘導体などの塩基修飾、２’，３’−ジデオキシリボースなどのリボース修飾、ならびにホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホロセレノアート、ホスホロジセレノアート、ホスホロアニロチオアート、ホスホルアニラダートおよびホスホロアミダートなどのヌクレオチド間結合修飾が含まれる。
【０１０７】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、２００個以下のヌクレオチド残基を含むポリヌクレオチドを意味する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは１０〜６０塩基の長さである。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０〜４０ヌクレオチドの長さである。オリゴヌクレオチドは、例えば、突然変異遺伝子の構築に使用するために、一本鎖または二本鎖であり得る。オリゴヌクレオチドは、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。オリゴヌクレオチドは、検出アッセイのために、放射性標識、蛍光標識、ハプテンまたは抗原性標識を含む標識を含むことができる。オリゴヌクレオチドは、例えばＰＣＲプライマー、クローニングプライマーまたはハイブリダイゼーションプローブとして使用し得る。
【０１０８】
本明細書で互換的に使用される「ポリヌクレオチド配列」または「ヌクレオチド配列」または「核酸配列」は、文脈に応じて、オリゴヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、ＤＮＡ、およびＲＮＡ、核酸、またはヌクレオチド残基の一次配列を表す文字列中のヌクレオチド残基の一次配列である。任意の特定のポリヌクレオチド配列から、所与の核酸または相補的ポリヌクレオチド配列のいずれかを決定することができる。一本鎖または二本鎖であり得、センスまたはアンチセンス鎖を表すゲノムまたは合成起源のＤＮＡまたはＲＮＡが含まれる。別段の指定がない限り、本明細書で論じる任意の一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側末端は５’末端である；二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側方向は５’方向と称される。新生ＲＮＡ転写物の５’から３’への付加方向は転写方向と称される；ＲＮＡ転写物の５’末端に対して５’側にある、ＲＮＡ転写物と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域は「上流配列」と称される；ＲＮＡ転写物の３’末端に対して３’側にある、ＲＮＡ転写物と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域は「下流配列」と称される。
【０１０９】
本明細書で使用される場合、「単離された核酸分子」または「単離された核酸配列」は、（１）核酸の天然源において通常付随する少なくとも１つの夾雑核酸分子から同定および分離された核酸分子、または（２）関心対象の核酸の配列を決定できるようにクローニングされた、増幅された、タグ付けされた、もしくは他の方法でバックグラウンド核酸から区別された核酸分子のいずれかである。単離された核酸分子は、自然界で認められる形態または環境以外のものである。ただし、単離された核酸分子は、例えば核酸分子が天然の細胞とは異なる染色体位置にある場合は、免疫グロブリン（例えば、抗体）を通常発現する細胞に含まれる核酸分子を包含する。
【０１１０】
本明細書で使用される場合、「〜をコードする核酸分子」、「〜をコードするＤＮＡ配列」、および「〜をコードするＤＮＡ」という用語は、デオキシリボ核酸の鎖に沿ったデオキシリボヌクレオチドの順序または配列を指す。これらのデオキシリボヌクレオチドの順序は、ｍＲＮＡ鎖に沿ったリボヌクレオチドの順序を決定し、またポリペプチド（タンパク質）鎖に沿ったアミノ酸の順序も決定する。したがって、ＤＮＡ配列はＲＮＡ配列およびアミノ酸配列をコードする。
【０１１１】
「遺伝子」という用語は、生物学的機能に関連する任意の核酸を指すために広く使用される。遺伝子は、典型的にはコード配列およびそのようなコード配列の発現に必要な調節配列を含む。「遺伝子」という用語は、特定のゲノム配列または組換え配列、およびその配列によってコードされるｃＤＮＡまたはｍＲＮＡに適用される。遺伝子には、例えば他のタンパク質に対する認識配列を形成する非発現核酸セグメントも含まれる。非発現調節配列には、転写因子などの調節タンパク質が結合して、隣接または近傍配列の転写をもたらす、転写制御エレメントが含まれる。
【０１１２】
「遺伝子の発現」または「核酸の発現」は、ＤＮＡのＲＮＡへの転写（任意でＲＮＡの修飾、例えば、スプライシングを含む）、ＲＮＡのポリペプチドへの翻訳（場合によりポリペプチドの翻訳後修飾を含み得る）、または文脈によって示される転写と翻訳の両方を意味する。
【０１１３】
発現カセットは、組換え発現技術の典型的な特徴である。発現カセットは、関心対象のタンパク質をコードする遺伝子、例えば、アフリベルセプト融合タンパク質配列をコードする遺伝子を含む。真核生物「発現カセット」とは、哺乳動物細胞などの真核細胞におけるタンパク質の産生を可能にする発現ベクターの一部を指す。真核生物「発現カセット」には、ｍＲＮＡ転写のための真核細胞で作動可能なプロモータ、関心対象のタンパク質（１つまたは複数）をコードする１つ以上の遺伝子、およびｍＲＮＡの終結およびプロセシングシグナルが含まれる。発現カセットは、有用には、コード配列の中に、選択マーカーとして有用な遺伝子を含むことができる。発現カセットでは、プロモータは、関心対象の外因性タンパク質をコードするオープンリーディングフレームの５’側に作動可能に連結されている；ポリアデニル化部位は、オープンリーディングフレームの３’側に作動可能に連結されている。発現カセットが作動可能なままである限り、他の適切な制御配列も含まれ得る。オープンリーディングフレームは、任意で複数の関心対象のタンパク質のコード配列を含むことができる。
【０１１４】
本明細書で使用される場合、構造遺伝子に関して使用される場合の「コード領域」または「コード配列」という用語は、ｍＲＮＡ分子の翻訳の結果として新生ポリペプチドに認められるアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を指す。コード領域は、真核生物では、５’側が開始メチオニンをコードするヌクレオチドトリプレット「ＡＴＧ」に接し、３’側が終止コドンを特定する３つのトリプレット（すなわちＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ）の１つに接している。
【０１１５】
組換え発現技術は、典型的には発現カセットを含む組換え発現ベクターの使用を含む。
【０１１６】
「ベクター」という用語は、タンパク質コード情報を宿主細胞に移入するために使用される任意の分子または実体（例えば、核酸、プラスミド、バクテリオファージまたはウイルス）を意味する。
【０１１７】
本明細書で使用される「発現ベクター」または「発現構築物」という用語は、所望のコード配列および特定の宿主細胞における作動可能に連結されたコード配列の発現に必要な適切な核酸制御配列を含む組換えＤＮＡ分子を指す。発現ベクターは、転写、翻訳に影響を与えるまたはそれを制御する配列、およびイントロンが存在する場合は、それに作動可能的に連結されたコード領域のＲＮＡスプライシングに影響を与える配列を含むことができるが、これらに限定されない。原核生物での発現に必要な核酸配列には、プロモータ、任意でオペレータ配列、リボソーム結合部位、および場合により他の配列が含まれる。真核細胞は、プロモータ、エンハンサー、終止およびポリアデニル化シグナルを利用することが公知である。分泌シグナルペプチド配列はまた、所望する場合、細胞から関心対象のポリペプチドをより容易に単離するために、発現されたポリペプチドが組換え宿主細胞によって分泌され得るように、任意で、関心対象のコード配列に作動可能に連結された発現ベクターによってコードされ得る。そのような技術は、当技術分野で周知である。（例えば、Ｇｏｏｄｅｙ，Ａｎｄｒｅｗ  Ｒ．；ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，米国特許第５，３０２，６９７号；Ｗｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ，米国特許第６，０２２，９５２号および米国特許第６，３３５，１７８号；Ｕｅｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒｅｏｆ，米国特許第７，０２９，９０９号；Ｒｕｂｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２７  ｈｕｍａｎ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，米国特許出願第２００３／０１０４４００  Ａ１号）。関心対象のマルチサブユニットタンパク質の発現のために、それぞれが異なるサブユニット単量体のコード配列を含む適切な数と割合の別々の発現ベクターを使用して、宿主細胞を形質転換することができる。他の実施形態では、単一の発現ベクターを使用して、関心対象のタンパク質の異なるサブユニットを発現させることができる。
【０１１８】
組換え発現技術は、典型的には組換え発現ベクターを含む哺乳動物宿主細胞を含む。
【０１１９】
「宿主細胞」という用語は、核酸で形質転換されている、または形質転換することができ、それによって関心対象の遺伝子またはコード配列を発現する細胞を意味する。この用語には、関心対象の遺伝子が存在する限り、子孫の形態または遺伝子構成が元の親細胞と同一であるか否かにかかわらず、親細胞の子孫が含まれる。組換えアフリベルセプト融合タンパク質を生産するために、多数の利用可能な周知の宿主細胞のいずれかを本発明の実施において使用し得る。特定の宿主の選択は、当技術分野で認識されている多くの因子に依存する。これらには、例えば選択された発現ベクターとの適合性、ＤＮＡ分子によってコードされるペプチドの毒性、形質転換の速度、ペプチドの回収の容易さ、発現特性、生物学的安全性およびコストが含まれる。すべての宿主が特定のＤＮＡ配列の発現に等しく有効ではあり得ないとの理解を持って、これらの因子のバランスをとらなければならない。これらの一般的なガイドライン内で、培養中の有用な微生物宿主細胞には、細菌（大腸菌種など）、酵母（サッカロミセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）など）ならびに他の真菌細胞、藻類または藻類様細胞、昆虫細胞、植物細胞、哺乳動物（ヒトを含む）細胞、例えば、ＣＨＯ細胞およびＨＥＫ−２９３細胞が含まれる。修飾はＤＮＡレベルでも行うことができる。ペプチドをコードするＤＮＡ配列は、選択された宿主細胞とより適合性のコドンに変更し得る。大腸菌については、最適化されたコドンが当技術分野で公知である。制限部位を排除するまたはサイレント制限部位を含むようにコドンを置換することができ、これは、選択された宿主細胞でのＤＮＡのプロセシングに役立ち得る。次に、形質転換された宿主を培養および精製する。宿主細胞は、所望の化合物が発現されるように、従来の発酵条件下で、例えば、バッチモードまたは連続灌流モードで培養し得る。そのような発酵条件は当技術分野で周知である。
【０１２０】
有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞（例えば、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ６１）、ＤＸＢ−１１、ＤＧ−４４、およびチャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））を含むチャイニーズハムスター卵巣細胞；ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胚腎臓株（２９３細胞または懸濁培養での増殖のためにサブクローニングされた２９３細胞（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝癌細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ  ５細胞もしくはＦＳ４細胞；または哺乳動物骨髄腫細胞である。
【０１２１】
「細胞」、「細胞株」、および「細胞培養物」は、しばしば互換的に使用され、本明細書におけるそのような呼称はすべて細胞子孫を含む。例えば、ＣＨＯ細胞に「由来する」細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞の細胞子孫であり、何世代もによって元の初代細胞親から除去され得、形質転換子孫細胞も含まれ得る。形質転換体および形質転換細胞には、移入の回数にかかわらず一次対象細胞およびそれから誘導された培養物が含まれる。また、意図的または偶発的な突然変異のために、すべての子孫のＤＮＡ含有量が厳密に同一ではない可能性があることも理解される。最初に形質転換された細胞でスクリーニングされたものと同じ機能または生物学的活性を有する突然変異子孫は含まれる。
【０１２２】
宿主細胞は、ポリペプチド（標的結合タンパク質を含む）の生産のために上記の核酸またはベクターで形質転換またはトランスフェクトされ、プロモータを誘導する、形質転換体を選択する、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために必要に応じて改変された従来の栄養培地で培養される。さらに、選択マーカーによって分離された転写ユニットの複数のコピーを有する新規ベクターおよびトランスフェクトされた細胞株は、抗体などのポリペプチドの発現に特に有用である。
【０１２３】
「トランスフェクション」という用語は、細胞による外来または外因性ＤＮＡの取り込みを意味し、外因性ＤＮＡが細胞膜の内部に導入されている場合、細胞は「トランスフェクト」されている。多くのトランスフェクション技術が当技術分野で周知であり、本明細書に開示されている。例えば、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９７３，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，前出；Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｇｅｎｅ  １３：１９７参照。そのような技術を使用して、１つ以上の外因性ＤＮＡ部分を適切な宿主細胞に導入することができる。
【０１２４】
「形質転換」という用語は、細胞の遺伝的特性の変化を指し、細胞は、新しいＤＮＡまたはＲＮＡを含むように改変されている場合、形質転換されている。例えば、細胞は、トランスフェクション、形質導入、または他の技術を介して新しい遺伝物質を導入することによってその天然の状態から遺伝的に改変される場合、形質転換される。トランスフェクションまたは形質導入後、形質転換ＤＮＡは、細胞の染色体に物理的に組み込まれることによってその細胞のＤＮＡと組み換わり得るか、または複製されずにエピソームエレメントとして一過性に維持され得るか、またはプラスミドとして独立して複製し得る。形質転換ＤＮＡが細胞の分裂と共に複製される場合、細胞は「安定に形質転換されて」いるとみなされる。
【０１２５】
本発明において関心対象のグリコシル化組換えタンパク質またはＰＯＩ（例えば、組換えアフリベルセプト融合ポリペプチド）を生産するために使用される宿主細胞は、様々な培地で培養し得る。ハムＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ））、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）およびダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ））などの市販の培地は、宿主細胞を培養するのに適している。さらに、Ｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４  （１９７９），Ｂａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０），米国特許第４，７６７，７０４号；同第４，６５７，８６６号；同第４，９２７，７６２号；同第４，５６０，６５５号；または同第５，１２２，４６９号；国際公開第９０１０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号；またはＵ米国特許第３０，９８５号に記載されている培地のいずれかを宿主細胞の培地として使用し得る。これらの培地はいずれも、培地中または培地上の細胞の生理学的条件が宿主細胞による関心対象のタンパク質の発現を促進するように、ホルモンおよび／または他の成長因子（インスリン、トランスフェリン、もしくは上皮成長因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩など）、緩衝液（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシンおよびチミジンなど）、抗生物質（Ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ（商標）薬など）、微量元素（通常、マイクロモル範囲の最終濃度で存在する無機化合物として定義される）、ならびにグルコースまたは等価のエネルギー源を必要に応じて添加し得る；任意の他の必要な補充物も、当業者に公知の適切な濃度で含まれ得る。温度（必ずしもではないが、典型的には約３７°Ｃ）、ｐＨ（必ずしもではないが、典型的には約ｐＨ６．５〜７．５）、酸素化などの培養条件は、関心対象のタンパク質の発現のために選択された宿主細胞で以前に使用されたものであり、当業者には明らかであろう。培養培地は、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）などの適切な量の血清を含むことができ、または好ましくは、宿主細胞は無血清培地での培養に適合させることができる。いくつかの実施形態では、水性培地は液体であり、そのため宿主細胞は液体培地内の細胞懸濁液で培養される。宿主細胞は、バッチ細胞培養または連続（灌流）細胞培養システムで有用に増殖させることができる。
【０１２６】
他の実施形態では、哺乳動物宿主細胞を、例えば寒天またはアガロースを含む固体または半固体水性培地で培養して、細胞が接着して接着層を形成する培地または基質表面を形成することができる。
【０１２７】
宿主細胞を培養すると、組換えポリペプチドは細胞内、細胞周辺腔で産生され得るか、または培地に直接分泌され得る。アフリベルセプトなどのポリペプチドが細胞内で産生される場合、最初の工程として、宿主細胞または溶解断片のいずれかである微粒子デブリが、例えば遠心分離、深層ろ過または限外ろ過によって除去される。
【０１２８】
緩衝液または他の結合／反応アッセイ試薬のインキュベーションに関する「生理学的条件下」とは、非共有結合反応などの生化学反応が起こることを可能にする温度、ｐＨ、およびイオン強度の条件下でのインキュベーションを意味する。典型的には、温度は室温または最大約３７°Ｃまでの周囲温度で、ｐＨ６．５〜７．５である。
【０１２９】
物質の組成物の「生理学的に許容される塩」、例えば、関心対象のタンパク質の塩、例えば融合タンパク質もしくは抗体などの免疫グロブリンの塩、または関心対象の任意の他のタンパク質の塩は、薬学的に許容されることが公知であるかまたはそのことが後日に発見される任意の塩（１つまたは複数）を意味する。薬学的に許容される塩のいくつかの非限定的な例は、酢酸塩；トリフルオロ酢酸塩；塩酸塩および臭化水素酸塩などのハロゲン化水素酸塩；硫酸塩；クエン酸塩；マレイン酸塩；酒石酸塩；グリコール酸塩；グルコン酸塩；コハク酸塩；メシル酸塩；ベシル酸塩；ペンタガロイルグルコース（ＰＧＧ）および没食子酸エピガロカテキン（ＥＧＣＧ）などの没食子酸エステルの塩（没食子酸は３，４，５トリヒドロキシ安息香酸としても知られる）、硫酸コレステリル、パモ酸塩、タンニン酸塩およびシュウ酸塩の塩である。
【０１３０】
「反応混合物」は、生理学的なインキュベーション条件下で、共有結合または非共有結合反応などの関心対象のインビトロ生化学反応が起こることを可能にする、必要なすべての試薬および因子を含む水性混合物である。
【０１３１】
ポリヌクレオチドの「ドメイン」または「領域」（本明細書では互換的に使用される）は、最大で完全なポリヌクレオチドまでおよび完全なポリヌクレオチドを含むが、典型的には完全なポリヌクレオチド未満を含む、ポリヌクレオチド全体の任意の部分である。ドメインは、必ずしもそうである必要はないが、ポリヌクレオチド鎖の残りの部分とは独立して折り畳まれることができ（例えば、ＤＮＡヘアピン折り畳み）、および／またはコード領域もしくは調節領域などの特定の生物学的、生化学的、もしくは構造的機能もしくは位置と関連付けることができる。
【０１３２】
タンパク質の「ドメイン」または「領域」（本明細書では互換的に使用される）は、最大で完全なタンパク質までおよび完全なタンパク質を含むが、典型的には完全なタンパク質未満を含む、タンパク質全体の任意の部分である。ドメインは、必ずしもそうである必要はないが、タンパク質鎖の残りの部分とは独立して折り畳まれることができ、および／または特定の生物学的、生化学的、もしくは構造的機能もしくは位置（例えば、リガンド結合ドメイン、またはサイトゾル、膜貫通もしくは細胞外ドメイン）と関連付けることができる。
【０１３３】
アフリベルセプト融合タンパク質などの、しかしこれに限定されない関心対象の組換えタンパク質の定量化は、タンパク質の生産またはタンパク質精製工程の収率の追跡において（またはアフリベルセプトもしくは他の関心対象の治療用タンパク質を含む原薬または医薬品のロットリリースアッセイのために）、しばしば有用または必要である。したがって、関心対象のタンパク質に特異的に結合する抗体、特にモノクローナル抗体は、これらの目的のために有用であり得る。
【０１３４】
「抗体」または互換的に「Ａｂ」という用語は、最も広い意味で使用され、完全に構築された抗体、モノクローナル抗体（ヒト、ヒト化またはキメラ抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および所望の生物学的活性を示す限り、前記抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、抗原に結合することができる抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖抗体、ダイアボディ）が含まれる。化学的に誘導体化された抗体を含む、無傷の分子および／または断片の多量体または凝集体が企図される。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２、または任意のアロタイプを含む、あらゆるアイソタイプクラスまたはサブクラスの抗体が企図される。異なるアイソタイプは異なるエフェクター機能を有し得る；例えばＩｇＧ１およびＩｇＧ３アイソタイプは抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有し得る。
【０１３５】
「単離された」タンパク質、例えば、アフリベルセプト融合タンパク質または関心対象の他の組換えタンパク質は、その天然環境またはそれが産生細胞によって分泌された培地の１つ以上の成分から同定され、分離されているものである。いくつかの実施形態では、単離されたタンパク質は、その治療、診断、予防、研究または他の使用を妨げる、その天然環境または培養培地環境で見出されるタンパク質またはポリペプチドまたは他の夾雑物を実質的に含まない。
【０１３６】
分子をプロテインＡまたはプロテインＡマトリックスに「結合する」または「結合すること」という用語は、適切な条件（例えば、ｐＨおよび選択された塩／緩衝液組成物）下で、関与し得る親和性の物理的機構に関わりなく、それらの条件下でのプロテインＡへの結合親和性によってプロテインＡマトリックス（例えばプロテインＡ樹脂）内またはその上に分子が可逆的に固定化されるように、分子をプロテインＡに曝露することを意味する。（例えば、Ｊｅｎｄｅｂｅｒｇ，Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｔｏ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｉｎ  Ｇ  Ｄｏｅｓ  Ｎｏｔ  Ｉｎｖｏｌｖｅ  Ｈｅｌｉｘ  Ｕｎｗｉｎｄｉｎｇ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５（１）：２２−３１（１９９６）；Ｎｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ  ｏｎ  Ｎａｎｏｓｅｎｓｏｒ  Ａｒｒａｙ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，８７（１６）：８１８６−８１９３（２０１５）参照）。
【０１３７】
分子をイオン交換マトリックス（例えば、ＣＥＸ樹脂などのＣＥＸマトリックス）に「結合する」または「結合すること」という用語は、適切な条件（例えば、ｐＨおよび選択された塩／緩衝液組成物）下で、分子とイオン交換マトリックスの荷電基（１つまたは複数）（すなわち荷電リガンド）との間のイオン相互作用によってイオン交換マトリックス内またはその上に分子が可逆的に固定化されるように、分子をイオン交換マトリックスに曝露することを意味する。
【０１３８】
「緩衝液」または「緩衝溶液」という用語は、その共役酸塩基範囲の作用によるｐＨの変化に抗する溶液を指す。約ｐＨ４から約ｐＨ６．５の範囲でｐＨを制御する有用な緩衝液の例には、酢酸塩、ＭＥＳ、クエン酸塩、トリス、ビス−トリス、ヒスチジン、アルギニン、コハク酸塩、クエン酸塩、グルタミン酸塩、および乳酸塩、もしくはこれらの２つ以上の組合せ、または他の鉱酸もしくは有機酸緩衝液が含まれる；リン酸塩は有用な緩衝液の別の例である。ナトリウム、アンモニウム、およびカリウムカチオンを含む塩は、しばしば緩衝液を作成するのに使用される。
【０１３９】
「負荷緩衝液」または「平衡緩衝液」という用語は、タンパク質製剤（例えば、バッチもしくは灌流培養上清もしくはろ液、または関心対象のタンパク質を含む溶出液プール）を、場合によってプロテインＡマトリックス、イオン交換マトリックス（例えば、ＣＥＸマトリックスもしくはＡＥＸマトリックス）上に、または疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）マトリックス上に負荷するために、タンパク質製剤と混合される緩衝液および塩（１つまたは複数）を指す。この緩衝液は、タンパク質を負荷する前にマトリックスを平衡させるため、およびタンパク質を負荷した後に洗浄するためにも使用される。
【０１４０】
「洗浄緩衝液」という用語は、本明細書では、タンパク質製剤の負荷後および関心対象のタンパク質の溶出前またはフロースルー後に、場合によってプロテインＡマトリックスまたはイオン交換マトリックス（例えば、ＣＥＸマトリックスもしくはＡＥＸマトリックス）、または疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）マトリックスを通過する緩衝液を指すために使用される。洗浄緩衝液は、所望のタンパク質の実質的な溶出を伴わずに１つ以上の夾雑物を除去するのに役立ち得るか、または非結合タンパク質を洗い流すために使用できる。
【０１４１】
「溶出緩衝液」または「溶出液」という用語は、マトリックスに可逆的に結合した関心対象のタンパク質（ＰＯＩ）を溶出するために使用される緩衝液を指す。本明細書で使用される場合、「溶液」という用語は、水を含む、緩衝溶液または非緩衝溶液のいずれかを指す。
【０１４２】
「溶出プール」または「溶出液プール」という用語は、関心対象の組換えタンパク質を含む、マトリックスから溶出された物質を意味する。
【０１４３】
プロテインＡマトリックスまたはイオン交換マトリックス（例えば、ＣＥＸマトリックス）または疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）マトリックスに関して「負荷する」という用語は、タンパク質製剤（例えば、バッチもしくは灌流培養上清もしくはろ液、または関心対象のタンパク質を含む溶出液プール）をプロテインＡマトリックスまたはイオン交換マトリックスまたはＨＩＣマトリックスに負荷することを意味する。
【０１４４】
プロテインＡマトリックスまたはイオン交換マトリックス（例えば、ＣＥＸマトリックス）または疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）マトリックスに関して「洗浄する」という用語は、適切な緩衝液を、場合によってプロテインＡマトリックスまたはイオン交換マトリックスまたはＨＩＣマトリックスに通過させることを意味する。
【０１４５】
夾雑物から関心対象のグリコシル化組換えタンパク質を精製する本発明の方法は、ＰＯＩが可逆的に結合したプロテインＡマトリックスを、１〜３Ｍの塩化カルシウムを含む約ｐＨ６．０〜６．５の緩衝液で洗浄することを含む。より好ましくは、洗浄緩衝液中の塩化カルシウムの濃度は、２〜２．７Ｍ塩化カルシウム、例えば約２．０Ｍ、約２．１Ｍ、約２．２Ｍ、約２．３Ｍ、約２．４Ｍ、約２．５Ｍ、約２．６Ｍ、または約２．７Ｍ塩化カルシウムである。
【０１４６】
プロテインＡマトリックスまたはイオン交換マトリックス（例えば、ＣＥＸマトリックス）から分子（例えば所望の組換えタンパク質または夾雑物）を「溶出する」という用語は、典型的には溶出緩衝液をプロテインＡマトリックスまたはイオン交換マトリックスに通過させることによって、そのような物質から分子を取り出すことを意味する。
【０１４７】
タンパク質精製に関連して使用される「分離する」または「単離する」という用語は、所望のタンパク質と第２のタンパク質または他の夾雑物もしくは不純物の両方を含む混合物中の第２のタンパク質または他の夾雑物もしくは不純物から、所望のタンパク質の分子の少なくとも大部分が、第２のタンパク質または他の夾雑物もしくは不純物の分子の少なくとも大部分を含む混合物の部分から取り出されるように、所望のタンパク質を分離することを指す。
【０１４８】
関心対象の組換えタンパク質（すなわち「ＰＯＩ」）および１つ以上の夾雑物を含む組成物または溶液から所望のタンパク質を「精製する」または「精製すること」という用語は、組成物または溶液から少なくとも１つの夾雑物を除去する（完全にまたは部分的に）ことによって組成物または溶液中の所望の組換えタンパク質の純度を高めることを意味する。
【０１４９】
「治療用生物学的製剤」という用語は、ヒトの疾患または状態の予防、治療、または治癒に適用できるタンパク質を意味する。治療用生物学的製剤の例には、モノクローナル抗体、天然タンパク質（例えば、受容体、リガンド、ホルモン、酵素もしくはサイトカイン）の組換え形態、融合タンパク質、ペプチボディ、ならびに／または、例えば、ＬＤＬ受容体Ａドメイン、トロンボスポンジンドメイン、サイログロブリンドメイン、トレフォイル／ＰＤドメイン、ＶＥＧＦ結合ドメイン、ＥＧＦドメイン、アナトドメイン、ノッチ／ＬＮＲドメイン、ＤＳＬドメイン、インテグリンβドメイン、およびＣａ−ＥＧＦドメインから選択されるドメインに基づく単量体ドメイン結合タンパク質が含まれる。
【０１５０】
「ペプチボディ」という用語は、抗体ＣＨ１、ＣＬ、ＶＨおよびＶＬドメイン、ならびにＦａｂおよびＦ（ａｂ）２を除く抗体Ｆｃドメイン（すなわち少なくともＣＨ２およびＣＨ３抗体ドメイン）を含む融合タンパク質分子を指し、ここで、Ｆｃドメインは１つ以上のペプチド、好ましくは薬理学的に活性なペプチドに結合している。ペプチボディの生産は、一般的にＰＣＴ国際公開第００／２４７８２号に記載されている。
【０１５１】
「陽イオン交換マトリックス」または「ＣＥＸマトリックス」という用語は、負に帯電しており、固相上または固相中を通過する水溶液中のカチオンと交換するための遊離カチオンを有する固相を指す。負電荷は、１つ以上の荷電リガンドを、例えば共有結合によって固相に付着させることによって提供し得る。あるいはまたはさらに、電荷は固相の固有の特性であり得る（例えば全体的に負の電荷を有するシリカの場合のように）。陽イオン交換（「ＣＥＸ」）マトリックス（例えば、ＣＥＸ樹脂）は、タンパク質の精製に有用なカラムに配置または充填され得る。ＣＥＸは、タンパク質の高分子量（ＨＭＷ）種、ならびに宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、および残留プロテインＡを除去するための有効な工程である（Ｚｅｉｄ，ｅｔ  ａｌ．，（２００８）．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １０２，９７１−９７６；Ｙｉｇｚａｗ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００９），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０，４２１−４２６；Ｇａｇｎｏｎ，Ｐ．，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．１９９６：Ｖａｌｉｄａｔｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．；Ｓｔｅｉｎ，Ａ．，ａｎｄ  Ｋｉｅｓｅｗｅｔｔｅｒ，Ａ．（２００７）．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ  ８４８，１５１−１５８；Ｓｔａｂｙ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００６），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  １１１８，１６８−１７９）。一般に、ＣＥＸは、標的分子のｐＩ未満のｐＨで、低伝導率条件下でタンパク質がＣＥＸマトリックス（例えば、ＣＥＸ樹脂）に結合する結合溶出モード（ＢＥＭ）で操作される。次いで、結合したタンパク質の溶出は、典型的には伝導率を上げるおよび／またはｐＨシフトを誘導することによって達成される。これは、直線勾配または所定の条件への段階溶出のいずれかで実施することができる。不純物、特にＨＭＷ種は、しばしばｍＡｂ生成物よりも強く結合し、溶出条件およびプール収集基準を調整することによって主要な所望の画分から分離できる（Ｙｉｇｚａｗ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００９）前出；Ｇａｇｎｏｎ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）前出；Ｐａｂｓｔ，Ｔ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００９）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  １２１６，７９５０−７９５６）。市販されている有用なＣＥＸマトリックスの例には、ＥＭＤ  ＭｉｌｌｉｐｏｒｅからのＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＣＯＯ−、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＳＯ３−、またはＥｓｈｍｕｎｏ  Ｓ（登録商標）；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  ＳｃｉｅｎｃｅｓからのＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＦＦまたはＣａｐｔｏ（商標）Ｓ；およびＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのＰＯＲＯＳ（登録商標）ＸＳ；Ｔｏｓｏｈ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅからのＴｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）Ｓｕｌｆａｔｅ−６５０−Ｆが含まれるが、これらに限定されない。
【０１５２】
「陰イオン交換マトリックス」または「ＡＥＸマトリックス」という用語は、正に帯電しており、固相上または固相中を通過する水溶液中のアニオンと交換するための遊離アニオンを有する固相を指す。電荷は、１つ以上の正に帯電したリガンドを、例えば共有結合によって固相に付着させることによって提供し得る。あるいはまたはさらに、電荷は固相の固有の特性であり得る。陰イオン交換（「ＡＥＸ」）マトリックス（例えば、ＡＥＸ樹脂）は、タンパク質の精製に有用なカラムに配置または充填され得る。
【０１５３】
「疎水性相互作用クロマトグラフィマトリックス」または「ＨＩＣマトリックス」という用語は、物質の表面疎水性に基づいて、物質と差別的に相互作用する固相材料またはマトリックスを指す。（例えば、Ｑｕｅｉｒｏｚ，Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８７（２）：１４３−５９（２００１）；Ｃｈｅｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ａｎｄ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｒｅｓｉｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ  １１７７（２）：２７２−８１（２００８）参照）。種々の適切なＨＩＣマトリックスが市販されており、例えば、Ｂｉｏ−ＲａｄからのＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ（登録商標）ｔ−ＢｕｔｙｌなどのＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ（登録商標）ＨＩＣ樹脂；Ｔｏｓｏｈ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅからのＴｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）Ｂｕｔｙｌ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）Ｈｅｘｙｌ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）Ｈｅｘｙｌ  ６５０ＣまたはＴｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）Ｐｈｅｎｙｌ；ＥＭＤ  ＭｉｌｌｉｐｏｒｅからのＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ  ｐｈｅｎｙｌ  ６５０；およびＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  ＳｃｉｅｎｃｅｓからのＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  Ｈｉｇｈ  ＳｕｂまたはＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  Ｌｏｗ  Ｓｕｂが挙げられる。ＨＩＣ部分を含むマルチモーダル樹脂も、本発明の方法を実施するための有用なＨＩＣマトリックスとなり得る。ＨＩＣマトリックス（例えば、ＨＩＣ樹脂）は、タンパク質の精製に有用なカラムに配置または充填され得る。
【０１５４】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち集団を構成する個々の抗体は、少量存在し得る潜在的な自然発生突然変異を除いて同一である。標的結合タンパク質であるモノクローナル抗体は非常に特異的な結合剤であり、典型的には異なるエピトープに対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体製剤とは対照的に、個々の抗原部位またはエピトープを指向する。モノクローナル抗体の非限定的な例には、マウス、ウサギ、ラット、ニワトリ、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体、完全に構築された抗体、多重特異性抗体（二重特異性抗体を含む）、抗原に結合することができる抗体断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ、一本鎖抗体、ダイアボディ）、マキシボディ、ナノボディ、および所望の生物学的活性を示す限り、前述のＣＤＲを含む組換えペプチド、またはその変異体もしくは誘導体が含まれる。
【０１５５】
「モノクローナル」という修飾語は、抗体の実質的に均一な集団から得られるという抗体の特徴を示し、特定の方法による抗体の生産を必要とするものと解釈されるべきではない。例えば、モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって最初に記述されたハイブリドーマ法によって作製し得るか、または組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号参照）によって作製し得る。「モノクローナル抗体」はまた、例えばＣｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載されている技術を使用してファージ抗体ライブラリから単離してもよい。
【０１５６】
「免疫グロブリン」という用語は、それぞれが軽鎖（ＬＣ）に共有結合した２本の二量体重鎖（ＨＣ）；単一の非二量体化免疫グロブリン重鎖および共有結合した軽鎖（ＨＣ＋ＬＣ）、またはキメラ免疫グロブリン（軽鎖＋重鎖）−Ｆｃヘテロ三量体（いわゆる「ヘミボディ」）を含む完全な抗体を包含する。「免疫グロブリン」はタンパク質であるが、必ずしも標的結合タンパク質ではない。
【０１５７】
「抗体」では、各四量体が２組の同一のポリペプチド鎖対からなり、それぞれの対は約２２０アミノ酸（約２５ｋＤａ）の一本の「軽」鎖と約４４０アミノ酸（約５０〜７０ｋＤａ）の一本の「重」鎖を有する。各鎖のアミノ末端部分には、主に抗原認識に関与する約１００〜１１０個以上のアミノ酸の「可変」（「Ｖ」）領域が含まれる。各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能に関与する定常領域を定義する。可変領域は異なる抗体間で異なる。定常領域は異なる抗体間で同じである。各重鎖または軽鎖の可変領域内には、標的結合タンパク質である抗体の場合、抗原に対する抗体の特異性を決定するのに役立つ３つの超可変サブ領域が存在する。超可変領域の間の可変ドメイン残基はフレームワーク残基と呼ばれ、一般に異なる抗体間である程度相同である。免疫グロブリンは、重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて異なるクラスに割り当てることができる。ヒト軽鎖は、カッパ（κ）およびラムダ（λ）軽鎖に分類される。軽鎖および重鎖内で、可変領域と定常領域は約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって結合され、重鎖は約１０個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。一般的に、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ  ｅｄ．Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））参照。「抗体」は、組換えによって作製された抗体、およびグリコシル化されているかまたはグリコシル化されていない抗体も包含する。
【０１５８】
「軽鎖」または「免疫グロブリン軽鎖」という用語は、完全長軽鎖および結合特異性を付与するのに十分な可変領域配列を有するその断片を含む。完全長軽鎖は、可変領域ドメインＶＬと定常領域ドメインＣＬを含む。軽鎖の可変領域ドメインは、ポリペプチドのアミノ末端にある。軽鎖はκ鎖とλ鎖を含む。
【０１５９】
「重鎖」または「免疫グロブリン重鎖」という用語は、完全長重鎖および結合特異性を付与するのに十分な可変領域配列を有するその断片を含む。完全長重鎖は、可変領域ドメインＶＨと３つの定常領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む。ＶＨドメインはポリペプチドのアミノ末端にあり、ＣＨドメインはカルボキシル末端にあり、ＣＨ３がポリペプチドのカルボキシ末端に最も近い。重鎖は、ミュー（μ）、デルタ（δ）、ガンマ（γ）、アルファ（α）、およびイプシロン（ε）に分類され、それぞれ抗体のアイソタイプをＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとして定義する。重鎖は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４サブタイプを含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２サブタイプを含む）、ＩｇＭならびにＩｇＥを含む、任意のアイソタイプであり得る。これらのいくつかは、さらにサブクラスまたはアイソタイプ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２に分類し得る。異なるＩｇＧアイソタイプは、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）などの異なるエフェクター機能（Ｆｃ領域によって媒介される）を有し得る。ＡＤＣＣでは、抗体のＦｃ領域は、ナチュラルキラーおよびマクロファージなどの免疫エフェクター細胞の表面のＦｃ受容体（ＦｃγＲ）に結合し、標的細胞の食作用または溶解をもたらす。ＣＤＣでは、抗体は、細胞表面で補体カスケードを惹起することによって標的細胞を死滅させる。
【０１６０】
「Ｆｃ領域」、または本明細書で互換的に使用される「Ｆｃドメイン」もしくは「免疫グロブリンＦｃドメイン」は、完全な抗体において抗体のＣＨ１およびＣＨ２ドメインを含む２つの重鎖断片を含む。２つの重鎖断片は、２つ以上のジスルフィド結合によって、およびＣＨ３ドメインの疎水性相互作用によって結合されている。
【０１６１】
「サルベージ受容体結合エピトープ」という用語は、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期の延長に関与するＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープを指す。
【０１６２】
抗体の構造および生成の詳細な説明については、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｏｔｈ，Ｄ．Ｂ．，ａｎｄ  Ｃｒａｉｇ，Ｎ．Ｌ．，Ｃｅｌｌ，９４：４１１−４１４（１９９８）参照。簡単に述べると、重鎖および軽鎖免疫グロブリン配列をコードするＤＮＡを生成する工程は、主に発生中のＢ細胞で起こる。様々な免疫グロブリン遺伝子セグメントの再編成と結合の前に、Ｖ、Ｄ、Ｊおよび定常（Ｃ）遺伝子セグメントは、一般に単一の染色体上で比較的近接して見出される。Ｂ細胞の分化中、Ｖ、Ｄ、Ｊ（または軽鎖遺伝子の場合はＶとＪのみ）遺伝子セグメントの適切な各ファミリーメンバーの１つが、重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子の機能的に再編成された可変領域を形成するように組み換えられる。この遺伝子セグメントの再編成工程は連続的であると考えられる。最初に、重鎖Ｄ−Ｊ結合が作製され、続いて重鎖Ｖ−ＤＪ結合および軽鎖Ｖ−Ｊ結合が作製される。Ｖ、ＤおよびＪセグメントの再編成に加えて、軽鎖のＶセグメントとＪセグメントが結合している位置および重鎖のＤセグメントとＪセグメントが結合している位置での可変組換えによって、免疫グロブリン重鎖と軽鎖の一次レパートリにさらなる多様性が生じる。軽鎖におけるそのような変動は、典型的にはＶ遺伝子セグメントの最後のコドンおよびＪセグメントの最初のコドン内で生じる。結合における同様の不正確さは、ＤセグメントとＪＨセグメントの間の重鎖染色体上で生じ、１０ヌクレオチドにも及び得る。さらに、ゲノムＤＮＡによってコードされないＤとＪＨ遺伝子セグメントの間、およびＶＨとＤ遺伝子セグメントの間にいくつかのヌクレオチドが挿入され得る。これらのヌクレオチドの付加は、Ｎ領域の多様性として公知である。可変領域遺伝子セグメントにおけるそのような再編成およびそのような結合の間に起こり得る可変組換えの正味の影響は、一次抗体レパートリの生成である。
【０１６３】
「超可変」領域という用語は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、相補性決定領域またはＣＤＲからのアミノ酸残基［すなわち、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ｔｈ  Ｅｄ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）によって記載されている、軽鎖可変ドメインの残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインの残基３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３）］を含む。単一のＣＤＲでさえも、すべてのＣＤＲを含む抗原結合部位全体よりも低い親和性ではあるが、抗原を認識して結合し得る。「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、超可変領域残基以外の可変領域残基である。
【０１６４】
超可変「ループ」からの残基の代替的な定義は、軽鎖可変ドメインの残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）および９１〜９６（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインの残基２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）および９６〜１０１（Ｈ３）としてＣｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）によって記述されている。
【０１６５】
「標的結合タンパク質」（ＴＢＰ）という用語は、アフリベルセプト、アレファセプト、エタネルセプト、アバタセプト、ベラトセプト、ｒＦＶＩＩＩＦｃ、ｒＦＶＩＸＦｃ、およびリロナセプト、または抗体もしくは抗体の免疫学的に機能性の断片、ならびにＣＤＲまたは関心対象の標的部分に特異的に結合するような所望の標的結合特性を有する他のリガンド結合部分を含む。
【０１６６】
一般に、標的結合タンパク質は、同様の結合アッセイ条件下で、他の無関係な標的に対する親和性と比較して、その標的部分またはリガンドに対して有意により高い結合親和性を有し、その結果としてその標的部分またはリガンドを識別できる場合、関心対象の標的部分またはリガンドに「特異的に結合する」。典型的には、解離定数（ＫＤ）が１０−８Ｍ以下である場合、標的結合タンパク質はその標的に「特異的に結合する」と言われる。標的結合タンパク質は、ＫＤが１０−９Ｍ以下である場合は「高親和性」で、ＫＤが１０−１０Ｍ以下である場合は「非常に高い親和性」で標的に特異的に結合する。
【０１６７】
「同一性」という用語は、配列を整列して比較することによって決定される、２つ以上のポリペプチド分子または２つ以上の核酸分子の配列間の関係を指す。「同一性パーセント」とは、比較する分子のアミノ酸またはヌクレオチド間の同一残基のパーセントを意味し、比較する分子の最小のサイズに基づいて計算される。これらの計算のために、整列内のギャップ（ある場合）は、特定の数学モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち「アルゴリズム」）によって対処しなければならない。整列した核酸またはポリペプチドの同一性を計算するために使用できる方法には、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．），１９８８，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．），１９９３，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ，（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．），１９９４，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ：Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，１９８７，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．），１９９１，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ；およびＣａｒｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．４８：１０７３に記載されているものが含まれる。例えば、配列同一性は、２つのポリペプチドのアミノ酸の位置の類似性を比較するために一般的に使用される標準的な方法によって決定することができる。ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡなどのコンピュータプログラムを使用して、２つのポリペプチドまたは２つのポリヌクレオチド配列をそれぞれの残基の最適な一致のために整列させる（一方もしくは両方の配列の全長に沿って、または一方もしくは両方の配列の所定の部分に沿って）。これらのプログラムはデフォルトのオープニングペナルティおよびデフォルトのギャップペナルティを提供し、ＰＡＭ  ２５０［標準的なスコアリングマトリックス；Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐ．３（１９７８）参照］などのスコアリングマトリックスは、コンピュータプログラムと共に使用することができる。例えば、同一性パーセントは次のように計算することができる：同一の一致の合計数に１００を乗じ、次いで一致したスパン内の長い方の配列の長さと、２つの配列を整列するために長い方の配列に導入したギャップの数の合計で除する。同一性パーセントの計算では、比較する配列を、配列間で最大の一致が得られるように整列する。
【０１６８】
ＧＣＧプログラムパッケージは、同一性パーセントを決定するために使用できるコンピュータプログラムであり、このパッケージにはＧＡＰが含まれる（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１２：３８７；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）。コンピュータアルゴリズムＧＡＰを使用して、配列同一性パーセントを決定する２つのポリペプチドまたは２つのポリヌクレオチドを整列させる。配列を、それぞれのアミノ酸またはヌクレオチドの最適な一致（アルゴリズムによって決定される「一致したスパン」）のために整列する。ギャップオープニングペナルティ（平均対角の３倍として計算し、「平均対角」は使用されている比較行列の対角の平均である；「対角」は特定の比較行列によって各完全アミノ酸一致に割り当てられるスコアまたは数である）およびギャップ伸長ペナルティ（通常はギャップオープニングペナルティの１／１０倍）、ならびにＰＡＭ  ２５０またはＢＬＯＳＵＭ  ６２などの比較行列をアルゴリズムと共に使用する。特定の実施形態では、標準的な比較マトリックス（ＰＡＭ  ２５０比較マトリックスについてはＤａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５：３４５−３５２；ＢＬＯＳＵＭ  ６２比較マトリックスの場合はＨｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：１０９１５−１０９１９参照）もアルゴリズムによって使用される。
【０１６９】
ＧＡＰプログラムを使用してポリペプチドまたはヌクレオチド配列の同一性パーセントを決定するための推奨パラメータには、以下のものが含まれる：
【０１７０】
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３；
【０１７１】
比較行列：前出のＨｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２からのＢＬＯＳＵＭ  ６２；
【０１７２】
ギャップペナルティ：１２（ただし、末端ギャップペナルティなし）
【０１７３】
ギャップ長ペナルティ：４
【０１７４】
類似性の閾値：０
【０１７５】
２つのアミノ酸配列を整列させるための特定の整列スキームは、２つの配列の短い領域のみの一致をもたらす可能性があり、２つの完全長配列間に有意な関係がない場合でも、この小さな整列領域は非常に高い配列同一性を有し得る。したがって、選択した整列方法（ＧＡＰプログラム）は、所望する場合、標的ポリペプチドの少なくとも５０個の連続するアミノ酸にわたる整列をもたらすように調整することができる。
【０１７６】
関心対象のタンパク質（例えば、アフリベルセプト、アレファセプト、エタネルセプト、アバタセプト、ベラトセプト、ｒＦＶＩＩＩＦｃ、ｒＦＶＩＸＦｃ、およびリロナセプト）に関連して使用される場合の「修飾」という用語は、１つ以上のアミノ酸変化（置換、挿入または欠失を含む）；化学修飾；治療薬または診断薬への結合による共有結合修飾；標識化（例えば、放射性核種または様々な酵素による）；ＰＥＧ化（ポリエチレングリコールによる誘導体化）などのポリマー共有結合、ならびに非天然アミノ酸の化学合成による挿入または置換を含むが、これらに限定されない。当業者に公知の方法によって、タンパク質は、「操作され」たタンパク質のコード配列が発現カセットに含める前に、改善された標的親和性、選択性、安定性、および／または製造可能性のために「操作され」得るまたは修飾され得る。
【０１７７】
アフリベルセプト、アレファセプト、エタネルセプト、アバタセプト、ベラトセプト、ｒＦＶＩＩＩＦｃ、ｒＦＶＩＸＦｃ、およびリロナセプトなどの関心対象のタンパク質に関連して使用される場合の「誘導体」という用語は、治療薬または診断薬への結合、標識化（例えば、放射性核種または様々な酵素による）、ＰＥＧ化（ポリエチレングリコールによる誘導体化）などのポリマー共有結合、ならびに非天然アミノ酸の化学合成による挿入または置換によって共有結合的に修飾されたタンパク質を指す。
【０１７８】
ＤＮＡのクローニング
【０１７９】
ＤＮＡのクローニングは、標準的な技術を使用して実施される（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｇｕｉｄｅ，Ｖｏｌｓ  １−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ参照）。例えば、ｃＤＮＡライブラリは、ポリＡ＋ｍＲＮＡ、好ましくは膜結合ｍＲＮＡの逆転写によって構築でき、このライブラリを、ヒト免疫グロブリンポリペプチド遺伝子配列に特異的なプローブを使用してスクリーニングし得る。しかし、一実施形態では、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、関心対象の免疫グロブリン遺伝子セグメント（例えば、軽鎖または重鎖可変セグメント）をコードするｃＤＮＡ（または完全長ｃＤＮＡの一部）を増幅する。増幅された配列は、任意の適切なベクター、例えば、発現ベクター、ミニ遺伝子ベクター、またはファージディスプレイベクターに容易にクローニングすることができる。関心対象のポリペプチドのある部分の配列、例えば、アフリベルセプト融合ポリペプチド配列を決定することが可能である限り、使用する特定のクローニング方法は重要ではないことが理解されよう。
【０１８０】
抗体核酸の１つの供給源は、関心対象の抗原で免疫化した動物からＢ細胞を得て、それを不死細胞に融合することによって生成されるハイブリドーマである。あるいは、免疫動物のＢ細胞（または脾臓全体）から核酸を単離することができる。抗体をコードする核酸のさらに別の供給源は、例えばファージディスプレイ技術によって生成されたそのような核酸のライブラリである。関心対象のペプチド、例えば、所望の結合特性を有する可変領域ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、パニングなどの標準的な技術によって同定することができる。
【０１８１】
ＤＮＡの配列決定は、標準的な手法を使用して実施される（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｇｕｉｄｅ，Ｖｏｌｓ  １−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ＰｒｅｓｓおよびＳａｎｇｅｒ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５４６３−５４６７参照）。クローン化した核酸の配列を遺伝子およびｃＤＮＡの公開された配列と比較することによって、当業者は、配列決定された領域に応じて、容易に決定することができるであろう。遺伝子配列情報の１つの供給源は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤである。
【０１８２】
単離されたＤＮＡは、制御配列に作動可能に連結するかまたは発現ベクターに導入することができ、これらを、さもなければ関心対象の組換えタンパク質を産生しない宿主細胞にトランスフェクトして、組換え宿主細胞におけるタンパク質の合成を指令する。免疫グロブリンおよび他のタンパク質の組換え生産は、当技術分野で周知である。
【０１８３】
核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に置かれている場合、作動可能に連結されている。例えば、プレ配列もしくは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結されている；プロモータもしくはエンハンサーは、配列の転写に影響を与える場合、コード配列に作動可能に連結されている；または、リボソーム結合部位は、翻訳を促進するように位置付けられている場合、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、作動可能に連結されているとは、連結されているＤＮＡ配列が連続していること、分泌リーダーの場合は、連続しており、読み取り相にあることを意味する。ただし、エンハンサーは連続している必要はない。連結は、好都合な制限部位での結合によって達成される。そのような部位が存在しない場合は、合成オリゴヌクレオチドアダプタまたはリンカーを従来の慣例に従って使用する。
【０１８４】
多くのベクターが当技術分野で公知である。ベクター成分には、そのすべてが当技術分野で周知である、以下の１つ以上が含まれ得る：シグナル配列（例えば発現されるタンパク質の分泌を指令し得る）、複製起点、１つ以上の選択マーカー遺伝子（例えば抗生物質または他の薬剤耐性を付与し得る、栄養要求性欠損を補完し得る、または培地で得られない重要な栄養素を供給し得る）、エンハンサーエレメント、プロモータ、および転写終結配列。
【０１８５】
水および他の成分の純度。本発明で使用される水および他のすべての成分は、好ましくは、関心対象の法的管轄区域においてそのような医薬組成物および薬剤に求められる適用法令または薬局方基準、例えば、米国薬局方（ＵＳＰ）、欧州薬局方、日本薬局方、または中国薬局方などを満たす純度レベルのものである。例えば、ＵＳＰによれば、注射用蒸留水は、製品の内毒素含有量が制御されなければならない非経口製剤および他の製剤の生産において、ならびに特定の機器および非経口製品と接触する成分の洗浄などの他の医薬用途で賦形剤として使用される；注射用蒸留水を生成するための供給源または給水の最低品質は、米国環境保護庁（Ｕ．Ｓ．  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｇｅｎｃｙ）（ＥＰＡ）、ＥＵ、日本、またはＷＨＯによって定義される飲料水である。
【０１８６】
患者に投与する前に、関心対象の治療用組換えタンパク質は、無菌性、内毒素またはウイルス夾雑物の欠如などの、関心対象の法的管轄区域において医薬組成物および薬剤に求められる適用法令または薬局方基準を満たすべきである。
【０１８７】
緩衝液系
【０１８８】
夾雑物から関心対象のグリコシル化組換えタンパク質を精製する本発明の方法で使用される緩衝液（１つまたは複数）は、約５〜１００ｍＭ濃度の範囲の緩衝液を含み得る。本発明の方法を実施するための適切な緩衝系は、リン酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、トリス緩衝液、ビス−トリス緩衝液、ヒスチジン緩衝液、アルギニン緩衝液、酢酸緩衝液、コハク酸緩衝液、クエン酸緩衝液、グルタミン酸緩衝液、および乳酸緩衝液から選択することができ、または、緩衝液はこれらの緩衝液系の２つ以上の組合せであり得る。本発明のいくつかの有用な実施形態は、約５ｍＭ〜約２０ｍＭの範囲の緩衝液濃度を有し、他の実施形態は、約５〜約１０ｍＭの緩衝液濃度を有する。
【０１８９】
使用される緩衝液は、任意で、約０．００１（ｗ／ｖ）〜約０．１％（ｗ／ｖ）の濃度で非イオン性界面活性剤を含み得る。有用な非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、Ｂｒｉｊ（登録商標）３５（すなわちポリエチレングリコールドデシルエーテル）、ポロキサマー１８８（すなわちプルロニックＦ６８；ポリエチレン−ポリプロピレングリコール；ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー；ポリ（エチレンオキシド−コ−ポリプロピレンオキシド））、またはＴｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００（すなわち４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェニル−ポリエチレングリコール））であり得る。アルキルサッカライドまたはアルキルグリコシド（例えば、Ａｅｇｉｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＬＬＣによってＰｒｏＴｅｋ（登録商標）の商品名で市販されている；例えば、Ｍａｇｇｉｏ，Ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ  Ａｌｋｙｌｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  Ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ，米国特許第８，１３３，８６３  Ｂ２号参照）も、本発明を実施するための「非イオン性界面活性剤」に包含される。
【０１９０】
電解質
【０１９１】
夾雑物から関心対象のグリコシル化組換えタンパク質を精製する本発明の方法は、プロテインＡマトリックスからのＰＯＩの溶出から生じる溶出液プール中のＰＯＩを、ｐＨ５．０〜５．５の低伝導率緩衝液中の陽イオン交換マトリックスに結合する工程を含む。これは、典型的には約２〜１５ｍＳの伝導率を有する緩衝液である。任意で、プロテインＡマトリックスからの溶出液プール中のＰＯＩを陽イオン交換マトリックスに結合する前に、溶出液プールを、珪藻土による深層ろ過に供することができる。好ましくは、任意の深層ろ過工程で使用される珪藻土は、使用前に約０．１Ｍ〜約１Ｍクエン酸塩のクエン酸緩衝液（約ｐＨ４〜約ｐＨ６の緩衝液）でフラッシュすることによって前処理した。この前処理クエン酸緩衝液フラッシュは、任意の深層ろ過で使用される珪藻土から、いくつかの付着した金属カチオンを有意に除去することができる。
【０１９２】
陽イオン交換マトリックスへの結合後、ＰＯＩを、陽イオン交換マトリックスから、最大約４０〜１００ｍＳまで次第に高くなる伝導率の電解質濃度勾配（直線または段階勾配）でＣＥＸ溶出液プールに溶出する。したがって、ＣＥＸ溶出に適した勾配範囲は、２〜１００ｍＳの伝導率範囲を有する。特定のＰＯＩに応じて、有効な勾配範囲は２〜７０ｍＳであり得、例えばアフリベルセプトを精製するための有用な勾配範囲は、約１５ｍＳ〜最大約６６ｍＳまでの範囲で緩衝液の伝導率を増加させ得る。伝導率を調整するための有用な電解質には、塩化ナトリウム、塩化カリウム、および硫酸ナトリウムが含まれる。
【０１９３】
本発明の方法の次の工程は、ｐＨ５．０〜６．０の高伝導率緩衝液中の疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）マトリックスにＣＥＸ溶出液プールを負荷し、ＨＩＣマトリックスを洗浄する（数倍量の高伝導率緩衝液、例えば、典型的には３倍以上のカラム容量で）ことである。ＨＩＣ負荷のための高伝導率緩衝液は、典型的には約４０〜１００ｍＳの伝導率である。ＨＩＣ洗浄緩衝液は、高伝導率のＨＩＣ負荷緩衝液と同じ緩衝液でも異なる緩衝液でもよいが、伝導率が同じかそれ以上で、ｐＨ５．０〜６．０であるべきである。伝導率を調整するための有用な電解質には、塩化ナトリウム、塩化カリウム、および硫酸ナトリウムが含まれる。
【０１９４】
本発明の例示的な実施形態
【０１９５】
さらなる例示として、以下の番号付けされた実施形態が本発明に包含される：
【０１９６】
実施形態１：夾雑物から関心対象のグリコシル化組換えタンパク質を精製する方法であって、以下の工程：
（ａ）プロテインＡマトリックスに、ほぼ中性のｐＨで、関心対象のグリコシル化組換えタンパク質（ＰＯＩ）およびガレクチン宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）夾雑物を含む宿主細胞培養上清またはろ液を負荷する工程であって、ここで、ＰＯＩは、免疫グロブリンＦｃドメインのＣＨ２およびＣＨ３ドメインならびにガレクチン−３夾雑物が可逆的に結合した１つ以上の末端β−ガラクトシル残基を含む、工程；
（ｂ）ＰＯＩが結合したプロテインＡマトリックスを、１〜３Ｍの塩化カルシウムを含む約ｐＨ６．０〜６．５の緩衝液で洗浄する工程；
（ｃ）約ｐＨ４未満のクエン酸またはクエン酸塩を含む緩衝液でＰＯＩをプロテインＡマトリックスから溶出液プールに溶出する工程であって、
（ｉ）溶出液プールがｐＨ３．３〜３．７のｐＨ範囲よりも塩基性である場合、溶出液プールをクエン酸でｐＨ３．３〜３．７に滴定し、および
（ｉｉ）任意で、ウイルス不活性化に十分な期間、溶出液プールをｐＨ３．３〜３．７に保持する工程；
（ｄ）（ｃ）からの溶出液プール中のＰＯＩを、ｐＨ５．０〜５．５で、約２〜１５ｍＳの低伝導率緩衝液中の陽イオン交換マトリックスに結合する工程；
（ｅ）陽イオン交換マトリックスから、最大約４０〜１００ｍＳまで次第に高くなる伝導率の電解質濃度勾配で、ＰＯＩをＣＥＸ溶出液プールに溶出する工程；ならびに
（ｆ）ＣＥＸ溶出液プールを、ｐＨ５．０〜６．０の高伝導率緩衝液中の疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）マトリックスに負荷し、ＨＩＣマトリックスを洗浄し、それによってＰＯＩをガレクチンＨＣＰ夾雑物から分離する工程
を含む方法。
【０１９７】
実施形態２：（ｂ）において、ＰＯＩが結合しているプロテインＡマトリックスを洗浄する工程が、２〜２．７Ｍの塩化カルシウムを含む緩衝液を使用する、実施形態１に記載の方法。
【０１９８】
実施形態３：ＰＯＩがアフリベルセプト、アレファセプト、エタネルセプト、アバタセプト、ベラトセプト、ｒＦＶＩＩＩＦｃ、ｒＦＶＩＸＦｃ、およびリロナセプトから選択される、実施形態１〜２に記載の方法。
【０１９９】
実施形態４：ＰＯＩがアフリベルセプトである、実施形態１〜３に記載の方法。
【０２００】
実施形態５：ガレクチンＨＣＰ夾雑物がガレクチン−３である、実施形態１〜４に記載の方法。
【０２０１】
実施形態６：宿主細胞培養上清またはろ液が金属カチオン夾雑物をさらに含み、ＰＯＩが金属カチオン夾雑物からも分離される、実施形態１〜５に記載の方法。
【０２０２】
実施形態７：金属カチオン夾雑物が、アルミニウム、バリウム、カルシウム、コバルト、銅、亜鉛、鉄、マグネシウム、マンガン、水銀、ニッケル、およびストロンチウムカチオンから選択される、実施形態１〜６に記載の方法。
【０２０３】
実施形態８：金属カチオン夾雑物が鉄カチオンである、実施形態１〜７に記載の方法。
【０２０４】
実施形態９：（ｃ）からの溶出液プール中のＰＯＩを陽イオン交換マトリックスに結合する前に、溶出液プールを、珪藻土によるろ過を含む深層ろ過に供する工程をさらに含む、実施形態１〜８に記載の方法。
【０２０５】
実施形態１０：珪藻土がクエン酸緩衝液で前処理された、実施形態１〜９に記載の方法。
【０２０６】
以下の実施例は例示であり、いかなる形でも本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【０２０７】
例１：材料および方法
【０２０８】
ＰＯＩは患者への最終的な投与を意図していないため、本明細書で説明するすべての実験で使用する水は、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）Ｉｎｔｅｇｒａｌ  Ｗａｔｅｒ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｅｒｃｋ）を用いて精製した。
【０２０９】
ＣＨＯガレクチン除去試験：
【０２１０】
ハイスループットスクリーニング（「ＨＴＳ」）。下流のＨＴＳ試験を、Ｔｅｃａｎ  Ｆｒｅｅｄｏｍ  ＥＶＯ（登録商標）ロボット液体ハンドリングシステム（Ｔｅｃａｎ  ＵＳ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ，ＮＣ，ＵＳＡ）を使用して実施した。ロボット液体ハンドリングシステムは、自動化されたマイクロクロマトグラフィを容易にするためにＴｅ−Ｃｈｒｏｍコンポーネントで構成された。濃度と濁度の測定は、内蔵マイクロプレートリーダで実施した。樹脂は、Ａｔｏｌｌ（Ｗｅｉｎｇａｒｔｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から予備充填された４５０μＬのＲｏｂｏＣｏｌｕｍｎｓ（登録商標）として入手した；８つのこのようなカラムを、実験に応じて、結合溶出（ＢＥＭ）モードまたはフロースルー（ＦＴ）モードのいずれかで並行して操作した。
【０２１１】
プロテインＡクロマトグラフィ。ＨＴＳプロテインＡ洗浄スクリーニング試験を、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（登録商標）プロテインＡ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）を含むＲｏｂｏＣｏｌｕｍｎｓ（登録商標）を使用してＢＥＭで実施した。カラムを平衡化緩衝液（２５ｍＭトリス、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で平衡化させ、次いで収集した細胞培養液を樹脂１リットルあたりおよそ１０ｇまで負荷した。負荷後、平衡化緩衝液（「ＥＱ」）を使用した３倍カラム容量（「ＣＶ」）の平衡化洗浄工程を実施した。次に、実験比較のために、各カラムを以下の洗浄緩衝液の１つで洗浄した：
２５ｍＭトリス、４８０ｍＭラクトース  ｐＨ７．３；
２５ｍＭ  ＭＥＳ、２Ｍ  ＣａＣｌ２  ｐＨ６．０；
２５ｍＭ  ＭＥＳ、２Ｍ  ＣａＣｌ２  ｐＨ６．５；
２５ｍＭトリス、２Ｍ  ＣａＣｌ２  ｐＨ７．０；
２５ｍＭ  ＭＥＳ、７５０ｍＭアルギニン  ｐＨ６．０；
２５ｍＭ  ＭＥＳ、７５０ｍＭアルギニン  ｐＨ６．５；または
２５ｍＭトリス、７５０ｍＭアルギニン  ｐＨ７．０。
【０２１２】
２番目の実験は、４倍カラム容量について２５ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ６で緩衝した塩化カルシウム（０．２５〜２．６３Ｍ）の漸増濃度によるＷａｓｈ  ２条件を使用して実施した。次いで、３回目の洗浄は２倍カラム容量のＥＱで実施した。カラムを、４倍カラム容量の２５ｍＭクエン酸塩ｐＨ３．６を使用して９６ディープウェルプレート（Ｑｉａｇｅｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）に溶出した。２Ｍトリス塩基を使用して、その後の溶出プールをｐＨ５に中和した。各カラムからの溶出プールの製品濃度を、ＣＨＯガレクチン−３タンパク質標準品を用いて製造者が推奨するプロトコルを使用して、分析プロテインＡ  ＨＰＬＣおよびガレクチン−３  ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）によって測定した。
【０２１３】
ＣＥＸクロマトグラフィ。ＨＴＳ  ＮａＣｌ溶出勾配スクリーニングを、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＳＯ３−またはＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＣＯＯ−（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）を含むＲｏｂｏＣｏｌｕｍｎｓ（登録商標）を使用して、２０ｃｍ／時で実施した。ＣＥＸカラムは、負荷の前に目標ｐＨ（ｐＨ４．５〜６．０）および伝導率（およそ３〜８ｍＳ／ｃｍ）に平衡化させた。平衡化後、１５〜３０ｇ／Ｌの樹脂をカラムに負荷した。平衡化緩衝液での洗浄工程に続いて、カラムを段階的塩化ナトリウム勾配で溶出した。溶出画分（１ＣＶ／画分）を、２８０ｎｍの吸光度（Ａ２８０）による製品濃度分析とサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）による純度、ガレクチン−３特異的ＥＬＩＳＡ、および製造者が推奨するプロトコルを使用したＣＨＯ宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）特異的ＥＬＩＳＡ（Ｃｙｇｎｕｓ，Ｓｏｕｔｈｐｏｒｔ，ＮＣ）を含むさらなる分析のために、９６ディープウェルプレート（Ｑｉａｇｅｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）に収集した。個々の画分からの結果を使用して、擬似クロマトグラムを作成した。各画分からの累積結果を使用して、収率と物質収支を計算した。
【０２１４】
Ａｋｔａｅｘｐｌｏｒｅｒ  １００またはＡｋｔａｐｕｒｉｆｉｅｒ  １００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）液体クロマトグラフィシステムを使用して、ベンチスケールのクロマトグラフィ実験を実施した。Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＳＯ３−（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）およびＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＣＯＯ−樹脂を、およそ１５〜２０ｃｍの床高さまで１．１５ｃｍ  ＩＤまたは３．２ｃｍ  ＩＤのＶａｎｔａｇｅカラム（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）に充填した。実験は１４０〜１８０ｃｍ／時で実施した。ＣＥＸカラムを、負荷の前におよそ６ｍＳ／ｃｍの伝導率の酢酸ナトリウム緩衝液中でｐＨ５．０またはｐＨ５．５に平衡化させた。次に、中和したプロテインＡ溶出液プールをおよそ２０〜３０ｇ／Ｌ樹脂までカラムに負荷し、平衡化緩衝液で洗浄し、１０〜２０ＣＶについてカラム容量（ＣＶ）あたり５０ｍＭ  ＮａＣｌによってＮａＣｌ濃度を漸増する直線勾配で溶出した。クロマトグラフィの実施中、カラム溶出液のｐＨ、伝導率、および吸光度をモニターした。溶出期の間、画分を収集し、Ａ２８０、ＳＥＣ、ＣＨＯ  ＨＣＰ特異的ＥＬＩＳＡ、およびガレクチン−３特異的ＥＬＩＳＡによって製品濃度を測定した。プールの回収率と純度を個々の画分から計算さした。
【０２１５】
ＨＩＣクロマトグラフィ。ＨＴＳ  ＮａＣｌ勾配スクリーニングを、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍ（Ｔｏｓｏｈ，Ｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｕｓｓｉａ，ＰＡ，ＵＳＡ）およびＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  Ｈｉｇｈ  Ｓｕｂ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）を充填したＲｏｂｏＣｏｌｕｍｎｓ（登録商標）を使用して実施した。カラムに、ＮａＣｌで調整した中和プロテインＡプールを樹脂１リットルあたり製品２５ｇ（ｇ／Ｌｒ）まで負荷した。溶出塩勾配は、高塩濃度から低塩濃度まで段階的に実施した。スクリーニングした緩衝液／塩条件には、酢酸ナトリウム／ＮａＣｌ、ＭＥＳナトリウム／ＮａＣｌ、酢酸ナトリウム／硫酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムおよびリン酸ナトリウムが含まれた。すべての工程は２０ｃｍ／時で実施した。フロースルー画分および溶出画分を、タンパク質濃度（Ａ２８０およびＳＥＣによる）について、およびガレクチン−３特異的ＥＬＩＳＡによって分析した。
【０２１６】
ＨＴＳ  ＨＩＣ製品フロースルースクリーニングを、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍを充填したＲｏｂｏＣｏｌｕｍｎｓ（登録商標）を使用して、２０ｃｍ／時で実施した。負荷物は、中和したプロテインＡ溶出液プール材料であり、これを１ＣＶの増分で７０〜１２５ｇ／Ｌ樹脂までカラムに適用した。６〜９ＣＶの洗浄量も、１ＣＶ増分で実施した。画分を収集し、タンパク質濃度について分光学的に（Ａ２８０）、およびガレクチン−３特異的ＥＬＩＳＡによって分析した。
【０２１７】
ベンチスケールの実験を、内径（ＩＤ）１．１５ｃｍ×床高さ２５ｃｍ〜ＩＤ  ３．２ｃｍ×床高さ２５ｃｍの範囲のサイズのＶａｎｔａｇｅ（登録商標）Ｌクロマトグラフィカラムに充填したＴｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍ樹脂を使用して１８０ｃｍ／時で、Ａｋｔａｐｕｒｉｆｉｅｒ  １００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で実施した。カラムに１００〜１２５ｇ／Ｌｒを負荷した。フロースルー製品プールは、画分として収集するかまたはＵＶ吸光度に基づいて収集した。画分またはフロースルー洗浄／製品プール試料を、Ａ２８０、ＳＥＣ、ＣＨＯ  ＨＣＰ特異的ＥＬＩＳＡ、およびガレクチン−３特異的ＥＬＩＳＡによってタンパク質濃度について分析した。
【０２１８】
鉄除去試験：
【０２１９】
プロテインＡクロマトグラフィ。ＨＴＳプロテインＡ洗浄スクリーニングを、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（登録商標）プロテインＡを充填したＲｏｂｏＣｏｌｕｍｎｓ（登録商標）を使用して、４５ｃｍ／時で実施した。カラムに１２ｇ／Ｌｒを負荷し、３ＣＶのＥＱで洗浄し、続いて２回目の洗浄（Ｗａｓｈ  ２）では４ＣＶの異なる緩衝液条件で洗浄した。スクリーニングしたＷａｓｈ  ２緩衝液は以下の条件を含んだ：
５０ｍＭクエン酸ナトリウム  ｐＨ６．０；
５０ｍＭクエン酸ナトリウム  ｐＨ７．０；
２００ｍＭクエン酸ナトリウム  ｐＨ６．０；
２００ｍＭクエン酸ナトリウム  ｐＨ７．０；
１２５ｍＭトリス、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４；
２５ｍＭトリス、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４；
２５ｍＭトリス、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０；または
２５Ｍトリス、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０。
Ｗａｓｈ  ２の後に、さらなる３ＣＶの平衡化緩衝液で洗浄した。上記のように、Ｗａｓｈ  ２および溶出画分をタンパク質濃度について分析した。これらの画分は、従来の誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ−ＭＳ）アッセイを使用して、鉄レベルについＢｒｏｏｋｓ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ，ＵＳＡ）によっても分析された。
【０２２０】
ベンチスケールのプロテインＡ、低ｐＨウイルス不活性化（「ＶＩ」）、およびＣＥＸ実験。主要なプロテインＡ  Ｗａｓｈ  ２条件を、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（登録商標）プロテインＡを充填した内径１．１５ｃｍ×カラム高さ２５ｃｍのカラムを使用して２５０ｃｍ／時で、Ａｋｔａｐｕｒｉｆｉｅｒ  １００でベンチスケールで実施した。カラムに、収集した細胞培養液（ＨＣＣＦ）を１９ｇ／Ｌ樹脂まで負荷した。洗浄緩衝液の量は、Ｗａｓｈ  １では２ＣＶのＥＱ、Ｗａｓｈ  ３では３ＣＶのＷａｓｈ  ２および３ＣＶのＥＱに低減した。２つの異なるＷａｓｈ  ２条件を比較した：ＥＱ緩衝液（２５ｍＭトリス、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）および５００ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．５。両方ともｐＨ３．６の１００ｍＭ酢酸ナトリウムと２５ｍＭクエン酸ナトリウムの溶出緩衝液も比較した。溶出プールを２つのアリコートに分けた。１つのアリコートを、２Ｍクエン酸を使用して３．５のより低いｐＨに滴定し、６０分間保持して、低ｐＨウイルス不活性化（ＶＩ）操作をシミュレートし、２Ｍトリス塩基を使用してｐＨ５．０に中和した。２番目のアリコートは、２Ｍトリス塩基を使用してｐＨ５．０への中和のみを行った。
【０２２１】
生じた４つの製品プール、すなわち：低ｐＨ保持あり／なしの酢酸ナトリウム溶出および低ｐＨ保持あり／なしのクエン酸ナトリウム溶出プールを、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＣＯＯ−を充填したＲｏｂｏＣｏｌｕｍｎｓ（登録商標）を使用したＨＴ−ＣＥＸクロマトグラフィによって精製した。カラムに２０ｇ／Ｌｒまで負荷し、１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ  ５．５）緩衝液中、４０ｍＭ  ＮａＣｌ／ＣＶの勾配で段階的にＮａＣｌ溶出勾配を実施した。すべての工程は２０ｃｍ／時で実施した。画分をプールし、Ａ２８０によってタンパク質濃度について分析した。すべての工程からの試料を、誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ−ＭＳ）によって鉄について分析した。
【０２２２】
例２：アフリベルセプトからのＣＨＯガレクチン−３の除去
【０２２３】
プロテインＡクロマトグラフィ洗浄スクリーニング実験。「Ｗａｓｈ  ２」として２Ｍ  ＣａＣｌ２または７５０ｍＭアルギニン緩衝液を含む緩衝液を使用して、ＣＨＯガレクチン−３とアフリベルセプト間の相互作用を妨げることができるかどうかを判定するためにＨＴＳスクリーニング実験を実施した。実験は、Ｔｅｃａｎ液体ハンドラーで８つのＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（登録商標）プロテインＡ充填ＲｏｂｏＣｏｌｕｍｎｓ（登録商標）を使用して実施した。カラム平衡化、負荷後のＷａｓｈ  １およびＷａｓｈ  ３を、平衡化緩衝液（「ＥＱ」；２５ｍＭトリス、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を使用して実施した。溶出は、２５ｍＭクエン酸塩、ｐＨ３．６を使用して実施し、すべてのプールを２Ｍトリス塩基でｐＨ５．０に中和した。アフリベルセプトを含む収集した細胞培養液を負荷のために使用し、すべてのカラムに同じ製品質量を負荷した。Ｗａｓｈ  ２については、ガレクチン−３結合に関して競合できるβ−ガラクトース部分が含まれているため、４８０ｍＭのラクトースを陽性対照として使用した。平衡化緩衝液（ＥＱ；２５ｍＭトリス、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）をＷａｓｈ  ２陰性対照として使用した。ラクトース含有緩衝液は、ＥＱと比較して２対数のガレクチン−３を除去することができた（以下の表１）。２Ｍ  ＣａＣｌ２洗浄は、ＥＱよりも１対数多いガレクチン−３を除去し、ｐＨ６．０およびｐＨ６．５では有意な製品損失は観察されなかった。ｐＨ  ７．０での２Ｍ  ＣａＣｌ２洗浄によって有意な量の製品が除去され、このｐＨがこの特定の製品にとって理想的ではないことを示した。アルギニン洗浄は、ＥＱと比較して０．５対数をわずかに超えるガレクチン−３を除去し、ｐＨ６．０およびｐＨ６．５での洗浄中に有意な収量損失が観察されたが、ｐＨ７．０では観察されなかった。
【０２２４】
表１．最初のプロテインＡのＷａｓｈ  ２スクリーニングの結果。ＨＣＣＦ＝収集した細胞培養液；ＮＡ＝該当せず；ＥＱ＝平衡化緩衝液、すなわち２５ｍＭトリス、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４。
【表１】
2020531411.tif 000004
【０２２５】
２回目の実験は、有効なガレクチン−３除去が予想できる塩化カルシウムの範囲を推定するために、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（登録商標）プロテインＡ充填ＲｏｂｏＣｏｌｕｍｎｓ（登録商標）を使用して上記のように実施した。Ｗａｓｈ  ２のＣａＣｌ２濃度を、ｐＨ６．０の２０ｍＭ  ＭＥＳで緩衝した０．２５Ｍ〜２．６３Ｍで試験した。ＥＱを陰性対照として使用した。結果を以下の表２に示す。対照条件と比較して、プロテインＡ工程の収率は最大２．４０Ｍ  ＣａＣｌ２まで一貫していた。より高いＣａＣｌ２濃度では、工程収率の低下が観察され、試験に使用された製品（アフリベルセプト）に特異的である可能性が最も高いが、他の分子では必ずしも観察されない。工程収率とは無関係に、収集した細胞培養液（ＨＣＣＦ）と比較した場合、ガレクチン−３クリアランスは試験した条件全体にわたって高かった。ＣａＣｌ２洗浄なしのプロテインＡ溶出液プールのガレクチン−３濃度と比較すると、０．２５Ｍ  ＣａＣｌ２ではガレクチン−３の除去が全くなく、０．５Ｍ  ＣａＣｌ２ではガレクチン−３の除去は４％のみであった。１．０Ｍ  ＣａＣｌ２では、さらなるガレクチン−３の除去は控えめ（２４％）であった。２．０〜２．６３ＭのＣａＣｌ２では、さらに４２〜５２％のガレクチン−３の除去が観察された。このグリコシル化組換えタンパク質分子では、対照と比較して、１．０Ｍ以上の濃度でＣａＣｌ２洗浄を使用することによってガレクチン−３のさらなる除去を達成できることが観察された。この実験で、最大２．６３ＭのＣａＣｌ２で有効なガレクチン−３除去が起こることも観察された。これらの実験結果から、ガレクチン−３の除去にはさらに高いＣａＣｌ２濃度（塩化カルシウムの溶解度によって制限される）が有効であり得ると予想される。同様に、ガレクチン−３とＰＯＩの間の相互作用に依存して、他のグリコシル化組換えタンパク質製品にはより低いＣａＣｌ２濃度が有用である可能性がある。本発明の方法の実施において、適切なＣａＣｌ２濃度の選択は、関心対象のタンパク質の工程収率とガレクチンクリアランスの望ましいバランスを含む。
【０２２６】
表２．プロテインＡのＷａｓｈ  ２  ＣａＣｌ２スクリーニング試験の結果。ＮＡ＝該当せず。
【表２】
2020531411.tif 000005
【０２２７】
ＣＥＸクロマトグラフィスクリーニング実験。高い回収率を維持しながら、凝集産物および特定のタンパク質ガレクチン−３を含むＣＨＯ宿主細胞タンパク質の適切な除去をもたらす操作条件を同定するために、ＣＥＸ樹脂を使用した初期実験をベンチスケールで実施した。１０ＣＶのＮａＣｌ溶出勾配を使用したＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＳＯ３−によるスクリーニング試験は、高い収率が達成可能であるが、およそ９０％の収率で高分子量（ＨＭＷ）種においてわずかな（＜２０％）減少があることを示した。図１は、二量体、オリゴマー、および総ＨＭＷを重ね合わせたＣＥＸクロマトグラムを示す。図２は、計算された溶出液プール純度と全溶出液プールのＨＭＷ含有量を重ね合わせたＣＥＸクロマトグラムを示す。
【０２２８】
このＣＥＸの実施がガレクチン−３も除去できるかどうかを判定するために、ペプチドマップに基づく多属性法（「ＭＡＭ」；Ｒｏｇｅｒｓ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｍｕｌｔｉ−ａｔｔｒｉｂｕｔｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ｑｕａｌｉｔｙ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，ｍＡｂｓ，７（５）：８８１−８９０（２０１５））を使用して、溶出画分中のガレクチン−３レベルを調べ、定量した（以下の表３）。さらに、表３は、Ｃｙｇｎｕｓ  ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡで測定した総ＣＨＯ宿主細胞タンパク質の濃度を示す。図３は、様々なＮａＣｌ溶出勾配画分におけるガレクチン−３、一般的な宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、および関心対象の製品の比較を示す。
【０２２９】
Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＳＯ３−カラムから溶出した個々の画分の分析は、ＰＯＩと共溶出するＨＣＰおよびガレクチン−３が少量存在することを示した。しかし、８０％を超えるＰＯＩが溶出した後、総ＨＣＰとガレクチン−３の両方の溶出が急激に増加した。これは、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＳＯ３−が、高い製品回収率を維持しながら、有意な量のガレクチン−３を製品から分離できることを示す。さらに、ガレクチン−３の溶出傾向は総ＨＣＰの溶出傾向を反映しており、製品負荷で観察されたＨＣＰの大部分がガレクチン−３であったことを意味する。これはさらに、Ｃｙｇｎｕｓ  ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡによって検出された宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）除去がガレクチン−３除去の良好な指標であることを意味する。
【０２３０】
Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＳＯ３−がガレクチン−３の除去をある程度提供できるという観察に基づき、ＨＴＳを使用してガレクチン−３の除去を改善するためのＣＥＸ操作条件をスクリーニングした。これらの試験では、Ｔｅｃａｎ液体ハンドリングシステムを使用して、強陽イオン交換体Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＳＯ３−および弱陽イオン交換体Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＣＯＯ−をそれぞれＲｏｂｏＣｏｌｕｍｎｓ（登録商標）で、ｐＨ４．５、５．０、５．５、および６．０でスクリーニングした。カラムに３０ｇ／Ｌの樹脂を負荷し、２０ＣＶにわたって５０ｍＭ／ＣＶの段階的ＮａＣｌ勾配で溶出した。溶出勾配の画分を収集し、ＥＬＩＳＡによって製品濃度およびガレクチン−３濃度を測定した（図４Ａ〜図４Ｄおよび図５Ａ〜図５Ｄ）。
【０２３１】
Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＳＯ３−およびＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＣＯＯ−でのＰＯＩとガレクチン−３の相対的保持率の比較は、より低いｐＨでは、ガレクチン−３がＰＯＩ溶出ピークの尾部に溶出することを明らかにした。ｐＨが、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＣＯＯ−でｐＨ５．０に、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＳＯ３−でｐＨ５．５に上昇すると、ガレクチン−３の溶出は勾配のより早期にシフトし、したがってＰＯＩ溶出ピークと重なった。Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＣＯＯ−の場合、ガレクチン−３はｐＨ４．５勾配でＰＯＩからのある程度の分離を示したが、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＳＯ３−と比較すると控えめであった。
【０２３２】
サイズ排除クロマトグラフィによる製品回収率と製品単量体％の比較を図６に示す。ＥＬＩＳＡによる製品回収率とガレクチン−３除去を図７に示す。
【０２３３】
表３．個々のＣＥＸ溶出勾配画分中のガレクチン−３および総ＣＨＯ  ＨＣＰ濃度。ＨＣＰ＝宿主細胞タンパク質；ＮＡ＝該当せず；ＮＴ＝試験せず；ＭＡＭ＝質量分析の多属性法（Ｒｏｇｅｒｓ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，ｍＡｂｓ，７（５）：８８１−８９０（２０１５）参照）
【表３】
2020531411.tif 000006
【０２３４】
これらの実験中、高分子量（ＨＭＷ）種の全体的な除去もＳＥＣによってモニターし、両方の樹脂について、高収率と高製品純度の両方を達成できる広範囲の操作条件が存在することが認められた。予想外ではないが、１００％の工程収率に近づくと、製品純度が低下したが、すべての条件下で純度は９８％を超えた。
【０２３５】
統計ソフトウェアパッケージ（ＪＭＰ、ＳＡＳ、バージョン１２．１．０、２０１５）を使用して、工程収率、ガレクチン−３除去、およびＣＥＸプールのＨＭＷ含有量についての回帰分析も実施し、工程設定値を定義するための予測モデルを作成した。ＳＥＣによる収率、ガレクチン−３濃度、および純度の等高線図を、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＳＯ３−については図８Ａ〜Ｃに、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＣＯＯ−については図９Ａ〜Ｃに示す。負荷試料のＨＭＷおよびガレクチン−３濃度は、それぞれ１．２％および１３．８ｎｇ／ｍｇであった。
【０２３６】
予想外ではないが、ｐＨまたは溶出ＮａＣｌ強度が増加すると、強陽イオン交換体と弱陽イオン交換体の両方の工程収率が上昇した。さらに、ＳＥＣによる純度は、試験した条件の範囲全体にわたって高かった。試験した両方の樹脂について、ガレクチン−３の除去はｐＨを下げることによって改善された。Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＣＯＯ−の場合、ガレクチン−３の最良の除去はｐＨ４．５においてであったが、操作ウィンドウは小さく、ｐＨ５．０以上でわずかに除去された。Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＳＯ３−はガレクチン−３除去のより大きな操作ウィンドウを有しており、ｐＨ４．５〜５．５でクリアランスが観察された。Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＳＯ３−の最適な操作ｐＨは、低いｐＨでのＣＥＸの操作を回避しながらガレクチン−３の除去を最大化するためにｐＨ５．０付近であると考えられた。
【０２３７】
ＣＥＸ  Ｒｏｂｏｃｏｌｕｍｎ（登録商標）スクリーニングのガレクチン−３除去結果を、ｐＨ５．０で操作したＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＳＯ３−カラムを使用してベンチスケールで確認した。ベンチスケールカラムのＣＥＸ方法はＲｏｂｏＣｏｌｕｍｎｓ（登録商標）と同様で、ｐＨ５．０の酢酸ナトリウム緩衝液中の０〜１Ｍ  ＮａＣｌの２０ＣＶ溶出勾配を使用した。勾配溶出の結果を図１０に示す。負荷物質は、質量分析多属性法（「ＭＡＭ」；Ｒｏｇｅｒｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｍｕｌｔｉ−ａｔｔｒｉｂｕｔｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ｑｕａｌｉｔｙ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，ｍＡｂｓ  ７（５）：８８１−８９０（２０１５））では５７．５ｎｇ／ｍｇのガレクチン‐３、およびガレクチン‐３  ＥＬＩＳＡでは５．６ｍｇ／ｍｇを含んだ。勾配がおよそ５００ｍＭナトリウムを上回る場合、溶出ピークの尾部はガレクチン−３に富んでいたが、ピークの主要部分はいくらかのガレクチン−３除去を示した。ＣＥＸプール中のガレクチン−３のレベルは、溶出の終了時に収集するピークの割合を増やすことによってさらに制御することができる。
【０２３８】
ＨＩＣクロマトグラフィスクリーニング。ガレクチン−３除去のための２つのＨＩＣ樹脂：Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｈｉ−ＳｕｂおよびＴｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍを評価するために、ＲｏｂｏＣｏｌｕｍｎｓ（登録商標）によるＨＴＳスクリーニングを使用した。これらの樹脂を、ｐＨ５．０の酢酸ナトリウム緩衝液とＮａＣｌまたは硫酸ナトリウム、ｐＨ６．０のＭＥＳナトリウム緩衝液とＮａＣｌまたは硫酸ナトリウム、ｐＨ５．０および６．０のクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．０および７．０のリン酸ナトリウムを用いて結合溶出モードでスクリーニングした。プロテインＡ精製アフリベルセプトの負荷物質は、ＥＬＩＳＡで１８ｎｇ／ｍｇのガレクチン−３を含み、これを２５ｇ／Ｌの樹脂に負荷した。高塩から低塩への塩勾配を使用して、結合製品を溶出させた。フロースルー、洗浄、および溶出勾配ピークの画分をガレクチン−３  ＥＬＩＳＡによって分析した。結果を図１１Ａ〜図１１Ｈおよび図１２Ａ〜図１２Ｈに示す。この製品は、試験したいずれの条件でもＨＩＣ樹脂のどちらにも強く結合しなかった。しかし、両方の樹脂がある程度のレベルのガレクチン−３を除去した。Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍは、検出可能なガレクチン−３を含む画分がごくわずかであったので、ガレクチン−３の最も堅固なクリアランスを有していた。
【０２３９】
最も堅固なガレクチン−３除去を有するＢｕｔｙｌ  ６５０Ｍの最適なｐＨおよび塩の操作範囲を決定するために、２回目のＲｏｂｏＣｏｌｕｍｎ（登録商標）スクリーニングを実施した。ガレクチン−３は製品よりも樹脂により強く結合するようであったため、この実験は製品フロースルーモードで実施した。２つの異なるレベルのＮａＣｌを４つの異なるｐＨで評価した。ｐＨ５．０および５．５では、酢酸ナトリウムを緩衝液として使用した。ｐＨ６．０および６．５では、ＭＥＳナトリウムを緩衝液として使用した。負荷物質は、洗浄液と同じｐＨおよび塩濃度になるように調整し、カラムに最大１００ｇ／Ｌの樹脂を負荷した。フロースルーの画分を収集し、増加する負荷レベルを表すミニプールをガレクチン−３について分析した。さらに、負荷後の洗浄液を収集し、２つの画分で分析し、初期画分は製品ウォッシュアウトの大部分を含み、後期画分はウォッシュアウトのテーリング部分を含んだ。結果を以下の表４に示す。この結果は、Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍ樹脂によるガレクチン３の除去にはより高い塩濃度とより低いｐＨが最適であり、ｐＨ５．０で完全なクリアランスを示すことを指示する。ガレクチン−３のブレイクスルーは負荷レベルが高くなるにつれて増加し始めるが、ガレクチンの除去は１００ｇ／Ｌの樹脂負荷でも依然として有意であり、ガレクチンの大半または全部が負荷後洗浄中もカラムに結合したままであると考えられる。
【０２４０】
表４．Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍ樹脂を使用したＲｏｂｏＣｏｌｕｍｎ（登録商標）フロースルースクリーニングからの画分の特異的ＥＬＩＳＡによって決定したガレクチン−３レベル。ＬＯＱ＝アッセイの定量限界。
【表４】
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【０２４１】
ハイスループットフロースルースクリーニングの結果をベンチスケールのＢｕｔｙｌ  ６５０Ｍカラムで確認した。カラムに、ｐＨ５．０の４００ｍＭ  ＮａＣｌで調整したＣＥＸプールを負荷した。１２５ｇ／Ｌ樹脂まで収集したフロースルーの画分、および負荷後洗浄液をガレクチン−３  ＥＬＩＳＡによって分析した（以下の表５参照）。
【０２４２】
表５．Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍ樹脂を使用したベンチスケールフロースルースクリーニングからの画分のＥＬＩＳＡによるガレクチン−３レベル。ＬＯＱ＝アッセイの定量限界。
【表５】
2020531411.tif 000008
【０２４３】
例３：鉄カチオンの除去による組換えタンパク質の精製
【０２４４】
プロテインＡクロマトグラフィスクリーニング。Ｔｅｃａｎ液体ハンドラーで８つのＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（登録商標）プロテインＡ充填カラムを使用して、鉄を除去するためのＷａｓｈ  ２条件のハイスループットＲｏｂｏＣｏｌｕｍｎ（登録商標）スクリーニングを実施した。カラムを平衡化し、鉄を含む収集した細胞培養液（ＨＣＣＦ）を同様に負荷し、続いて平衡化緩衝液（ＥＱ：２５ｍＭトリス、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で洗浄した。次に、各カラムを、クエン酸塩およびＥＤＴＡなどの公知の金属キレート化合物からなる異なる二次洗浄液で洗浄し、ＥＱを陰性対照として使用した。二次洗浄に続いてＥＱで洗浄し、低ｐＨ緩衝液を使用して製品を溶出させた。溶出プールをＩＣＰ−ＭＳによる鉄定量に供した（図１３）。すべての溶出プールは有意の量の鉄を含み、ＥＱ条件は最も高いレベルであり、２００ｍＭクエン酸塩のＷａｓｈ  ２条件はおよそ２００ｐｐｍの除去を示した。ＥＤＴＡ  Ｗａｓｈ  ２はわずかな除去のみを提供した。
【０２４５】
Ｗａｓｈ  ２緩衝液中のより高いレベルのクエン酸塩がより多くの鉄を除去できるかどうかを判定するために２回目のＲｏｂｏＣｏｌｕｍｎ（登録商標）洗浄スクリーニングを実施した。結果を図１４に示す。クエン酸塩のレベルを上げると、ＩＣＰ−ＭＳによって測定されたように、有意に多くの鉄除去をもたらした。興味深いことに、ｐＨ５．５の低ｐＨ条件は、ｐＨ６．０と比較して鉄の除去をわずかに改善し、より低いｐＨがクエン酸塩による鉄キレート化を改善し得ることを示した。
【０２４６】
クエン酸塩と低ｐＨの複合効果の観察により、低ｐＨ溶出工程でクエン酸塩を使用する利点と、その後のウイルス不活性化のための低ｐＨ保持の利点を比較する試験を実施した（図１５の実験の概略図参照）。２００ｍＭクエン酸塩のＷａｓｈ  ２またはＥＱのＷａｓｈ  ２のいずれかで、ｐＨ３．６の２５ｍＭクエン酸塩溶出を使用して２つのベンチスケールのプロテインＡ実験を実施した。得られた溶出プールのアリコートを２つに分け、各溶出プールの半分を、クエン酸を使用して１時間のウイルス不活性化保持のためにｐＨ３．５に滴定し、残りの半分をｐＨ５．０に中和した。その後の４つのプールはすべてＣＥＸ  ＲｏｂｏＣｏｌｕｍｎｓ（登録商標）にかけ、キレート化された鉄を製品から除去した。ＣＥＸプールを、ＥＱ  Ｗａｓｈ  ２および酢酸ナトリウム溶出を使用した対照ＣＥＸプールと共にＩＣＰ−ＭＳ分析に供した（図１６参照）。結果は、クエン酸塩溶出の追加が、製品に結合した鉄の量を有意に減少させたことを明らかにする。さらに、クエン酸塩洗浄、溶出、および低ｐＨウイルス不活性化の組合せは、検出限界以下までの鉄の除去をもたらした。
【０２４７】
次に、鉄の存在が製品の安定性に影響を与えるかどうかを酢酸塩判定するために、高鉄プール（ＥＱ  Ｗａｓｈ  ２、溶出、低ｐＨ  ＶＩなし）および低鉄プール（クエン酸塩Ｗａｓｈ  ２、クエン酸塩溶出、クエン酸低ｐＨ  ＶＩ）の試料を加速安定性に置いた。試料を、４０ｇ／Ｌの濃度で１０ｍＭホスファート、４０ｍＭ  ＮａＣｌ、５％（ｗ／ｖ）スクロースおよび０．０３％ＰＳ−２０に製剤化し、３０°Ｃに保持した。２週間ごとの時点で、分析ＳＥＣによって高分子量（ＨＭＷ）種について試験した。データを図１７に示す。高鉄試料は、低鉄試料と比較して、ＨＭＷの増加率が大きく、茶色がかった色も有していた（図１８参照）。高鉄試料の色は茶色／黄色４標準（ＢＹ４）に相当し、低鉄試料の色は茶色／黄色５および６標準（ＢＹ５およびＢＹ６）の間である。
【０２４８】
例４：下流工程にわたるガレクチンおよび金属カチオンの除去
【０２４９】
組換えアフリベルセプトからのＣＨＯガレクチン−３および鉄カチオンの除去によるグリコシル化組換えアフリベルセプトの精製を、本発明の例示的実施形態と組み合わせて、上記で概説した技術のいくつかを組み込んだ３カラム下流工程にわたって評価した。概略的に、工程の流れを図１９に示す。
【０２５０】
クロマトグラフィの実行は、上記の例１に記載されているようにベンチスケールで行い、カラムに次の容量：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａについては１９ｇ／Ｌ樹脂、ＣＥＸには３０ｇ／Ｌ樹脂、およびＨＩＣには１００ｇ／Ｌ樹脂を負荷した。ガレクチン−３除去のために、工程には、プロテインＡ工程用の２Ｍ  ＣａＣｌ２のＷａｓｈ  ２、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＳＯ３−樹脂によるｐＨ５．０のＣＥＸクロマトグラフィ、およびＢｕｔｙｌ  ６５０Ｍ樹脂によるＨＩＣ工程が含まれた。鉄を除去するために、工程には、鉄をキレート化して製品から除去するために、プロテインＡの２５ｍＭクエン酸塩溶出およびウイルス不活性化のためのクエン酸滴定が含まれた。次に、キレート化された鉄をＣＥＸ工程によって除去した。
【０２５１】
結果は、ガレクチン−３が、収集した細胞培養液（ＨＣＣＦ）中の＞６６７ｐｐｍからＨＩＣプール中の検出不能レベルまで、この工程によって有効に除去されることを明らかにする（以下の表６参照）。ＨＩＣ工程が最も有効であったが、プロテインＡおよびＣＥＸ工程も有意に寄与した。鉄も、ＨＣＣＦ中の１０２２ｐｐｂからＣＥＸプール中の５ｐｐｂまで、有効に除去された。
【０２５２】
プロテインＡ／ＶＩとＣＥＸ工程の組合せは鉄の除去に寄与した。これらのデータは、上記で概説した方法の工程が、ガレクチン−３および鉄カチオン不純物の有意な除去を提供したことを実証する。
【０２５３】
表６．夾雑物であるＣＨＯガレクチン−３および鉄を除去するために開発された本発明の３カラム法の実施形態によって精製された製品プール中のＣＨＯガレクチン−３および鉄レベル。ＶＩ＝ウイルス不活性化。
【表６】
2020531411.tif 000009
【０２５４】
例５：工程における金属カチオン夾雑物の他の発生源の除去
【０２５５】
水および緩衝液試料の金属分析。工程における鉄および他の金属夾雑物の潜在的な発生源を理解するために、水および緩衝液試料を上記のようにＩＣＰ−ＭＳによって鉄、銅および亜鉛について評価した。結果をそれぞれ図２０、図２１、および図２２に示す。水試料は、３つの金属の非常に低いレベルから検出不能までのレベルを有していたが、２Ｍクエン酸および５００ｍＭクエン酸緩衝液は、有意のレベルの鉄汚染に加えて、いくらかの銅および亜鉛を示した。クエン酸緩衝液はクエン酸よりも鉄のレベルが高く、クエン酸ナトリウム成分は酸形態よりも金属汚染が多い可能性があることを示唆した。クエン酸塩は金属キレート剤であるため、これらの化学物質の製造中に金属汚染が発生する可能性がある。
【０２５６】
珪藻土深層フィルタの金属汚染。珪藻土（ＤＥ）深層フィルタが金属カチオン汚染の発生源であり得るかどうかを判定するために、０．００２３ｃｍ２のＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ａ１ＨＣ深層フィルタを使用してフィルタフラッシュ試験を実施した。フィルタを３０Ｌ／ｍ２の水、続いて＞１００Ｌ／ｍ２の５００ｍＭクエン酸塩ｐＨ５．５でフラッシュした。各フラッシュ中にろ液の４〜５の４ｍＬ画分を収集し、ＩＣＰ−ＭＳによって鉄、銅および亜鉛について分析した。結果をそれぞれ図２３、図２４、および図２５に示す。水フラッシュで、いくらかの鉄、銅および亜鉛カチオンがフィルタから溶出し、フィルタを通して１０Ｌ／ｍ２の水をフラッシュした後、これらの金属のレベルはベースラインに戻った。その後、フィルタを０．５Ｍクエン酸塩ｐＨ５．５でフラッシュすると、高レベルの鉄（＞６０００μｇ／Ｌ）を含む３つすべての金属のさらなる溶出が生じた。これらのデータは、クエン酸緩衝液がフィルタからのさらなる金属カチオンをキレート化できる可能性が高いことを示す。〜５０Ｌ／ｍ２の緩衝液の後、金属レベルはベースライン（すなわち緩衝液中に存在する金属のレベル）に戻った。これらの結果は、ＤＥが、鉄を含む金属カチオン汚染の重要な発生源であり得ることを示唆し、これは、クエン酸塩含有溶出緩衝液の使用またはウイルス不活性化のためのクエン酸の使用によるプロテインＡプール中のクエン酸塩の存在によって悪化し得る。
【０２５７】
様々なプロテインＡ溶出および深層フィルタフラッシュ緩衝液を使用した鉄、銅および亜鉛カチオン除去の評価。プロテインＡクロマトグラフィ、Ａ１ＨＣ深層フィルタによる深層ろ過、およびＣＥＸクロマトグラフィの３つの一連の工程を使用して、関心対象のタンパク質から鉄、銅および亜鉛カチオンを除去する本発明の方法の能力を評価した（図２６）。実験の一環として、２つの異なるプロテインＡ溶出緩衝液、すなわち１００ｍＭ酢酸塩、ｐＨ３．６および２５ｍＭクエン酸塩、ｐＨ３．６、ならびに２つの異なる深層フィルタフラッシュ緩衝液、すなわち平衡化（ＥＱ）緩衝液単独（１００ｍＭ酢酸塩、ｐＨ５．０）および５００ｍＭクエン酸塩、ｐＨ５．５とそれに続くＥＱフラッシュの金属除去への影響を試験した。鉄、銅および亜鉛カチオンレベルを、ＩＣＰ−ＭＳを使用してプロテインＡ溶出液プール（「ＰｒｏＡプール」）、深層ろ過に供したプロテインＡ溶出液プール（「深層ろ過プール」）、およびＣＥＸ溶出液プール（「ＣＥＸプール」）において定量した；結果をそれぞれ図２７、図２８、および図２９に示す。
【０２５８】
プロテインＡ溶出のために１００ｍＭ酢酸緩衝液を使用すると、２５ｍＭクエン酸緩衝液溶出と比較して、プロテインＡ溶出液プール中の鉄および亜鉛カチオンのより低いレベルをもたらしたが、銅のレベルは低く、変化しなかった。プールを深層フィルタでろ過した場合、おそらくフィルタからの鉄カチオン汚染のために、すべての場合に鉄のレベルが増加した。深層フィルタを５００ｍＭクエン酸緩衝液でプレフラッシュすることによって前処理すると、深層フィルタプールの鉄レベルが低下し、その条件と１００ｍＭ酢酸塩プロテインＡ溶出緩衝液の組合せは、鉄カチオンの量のさらなる減少を提供した。銅および亜鉛カチオンのレベルは、すべての深層ろ過条件下で低いままであった。
【０２５９】
ＣＥＸクロマトグラフィによる深層フィルタプール中のＰＯＩの精製は、約１ｐｐｍの鉄を含むすべての条件で、有意の量の鉄カチオンを除去した。亜鉛および銅カチオンについては、すべての条件が、深層フィルタプールで観察されるものと同様の低いレベル（１〜２ｐｐｍ）であった。合わせて考慮すると、これらのデータは、クエン酸緩衝液深層フィルタの前処理フラッシュと組み合わせた１００ｍＭ酢酸塩プロテインＡ溶出緩衝液の使用が、深層フィルタプール段階を介した精製工程における鉄カチオン汚染を有意に減少できることを示す。亜鉛カチオンレベルは、プロテインＡ溶出液プール段階での酢酸緩衝液プロテインＡ溶出によって減少したが、銅カチオンレベルはすべての条件で低いままであり、比較的影響を受けなかった。
【配列表フリーテキスト】
【０２６０】
配列番号１  ＜２２３＞人工配列の記載：合成ポリペプチド
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１１Ｇ】
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【図１１Ｈ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１２Ｇ】
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【図１２Ｈ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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