(57)【要約】本明細書において提供されるのは、LDL-Rにより媒介されるコレステロールクリアランス経路に関与するタンパク質因子、例えばPCSK9、APOC3、LDL-R、またはIDOLに、機能喪失型変異を導入する系、組成物および方法である。機能喪失型変異は、本明細書において記載されるCRISPR／Cas9ベースの核酸塩基エディターを用いて導入することができる。本明細書においてさらに提供されるのは、高い循環コレステロールレベルに関連する状態を処置する組成物および方法である。
2020503027.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（PCSK9）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを編集する方法であって、PCSK9をコードするポリヌクレオチドを、以下：
（ｉ）（ａ）ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメイン；および（ｂ）シトシンデアミナーゼドメインを含む融合タンパク質；ならびに
（ｉｉ）（ｉ）の融合タンパク質をPCSK9をコードするポリヌクレオチド中の標的シトシン（Ｃ）塩基にターゲティングするガイドヌクレオチド配列
と接触させることを含み、
ここで、接触させることは、融合タンパク質による標的Ｃ塩基の脱アミノ化をもたらし、これは、PCSK9をコードするポリヌクレオチドにおけるシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への変更をもたらす、
前記方法。
【請求項２】
ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質が、ニッカーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ニッカーゼが、Cas9ニッカーゼである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
Cas9ニッカーゼが、配列番号１におけるＤ１０Ａ変異またはＨ８４０Ａ変異に対応する変異を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
Cas9ニッカーゼが、配列番号１におけるＤ１０Ａ変異に対応する変異を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメインが、ヌクレアーゼ不活性型Cas9（dCas9）ドメイン、ヌクレアーゼ不活性型Cpf1ドメイン、ヌクレアーゼ不活性型アルゴノートドメイン、およびそのバリアントからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメインが、ヌクレアーゼ不活性型Cas9（dCas9）ドメインである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
dCas9ドメインのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＤ１０Ａおよび／またはＨ８４０Ａに対応する変異を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
dCas9ドメインのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＤ１０Ａ変異に対応する変異を含み、およびここでdCas9ドメインは、配列番号１のアミノ酸８４０に対応する位置においてヒスチジンを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメインが、ヌクレアーゼ不活性型Cpf1（dCpf1）ドメインを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
dCpf1ドメインが、AcidaminococcusまたはLachnospiraceaeの種からのものである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメインが、ヌクレアーゼ不活性型アルゴノート（dAgo）ドメインを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
dAgoドメインが、Natronobacterium gregoryi（dNgAgo）からのものである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
シトシンデアミナーゼドメインが、アポリポタンパク質Ｂ−mRNA編集複合体（APOBEC）ファミリーデアミナーゼを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
シトシンデアミナーゼが、APOBEC1、APOBEC2、APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3C、APOBEC3D、APOBEC3F、APOBEC3Gデアミナーゼ、APOBEC3Hデアミナーゼ、APOBEC4デアミナーゼ、活性化誘導デアミナーゼ（ＡＩＤ）、およびpmCDA1からなる群より選択される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
シトシンデアミナーゼが、配列番号２７１〜２９２および３０３のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
（ｉ）の融合タンパク質が、Gamタンパク質をさらに含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
Gamタンパク質が、配列番号２０３０〜２０５８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
（ａ）の融合タンパク質が、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤（UGI）ドメインをさらに含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
UGIドメインが、配列番号３０４のアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
シトシンデアミナーゼドメインが、ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメインのＮ末端に融合している、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
UGIドメインが、ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメインのＣ末端に融合している、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
シトシンデアミナーゼとガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメインとが、任意のリンカーを介して融合している、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
UGIドメインが、任意のリンカーを介してdCas9ドメインに融合している、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
融合タンパク質が、構造ＮＨ２−［シトシンデアミナーゼドメイン］−［任意のリンカー配列］−［ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメイン］−［任意のリンカー配列］−［UGIドメイン］−ＣＯＯＨを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
リンカーが、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１９９８）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３０８）、（Ｇ）ｎ、（ＥＡＡＡＫ）ｎ（配列番号３０９）、（ＧＧＳ）ｎ、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号３１０）、または（ＸＰ）ｎモチーフ、またはこれらのうちのいずれかの組み合わせを含み、ここでｎは、独立して１〜３０の整数であり、ここでＸは、任意のアミノ酸である、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
リンカーが、アミノ酸配列ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号３１０）を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
リンカーが（ＧＧＳ）ｎであり、ここでｎは、１、３、または７である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
融合タンパク質が、配列番号１０または２９３〜３０２のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
PCSK9タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、コード鎖および相補鎖を含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
PCSK9タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、コード領域および非コード領域を含む、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
ＣからＴへの変更が、PCSK9をコードするポリヌクレオチドのコード配列において起こる、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
ＣからＴへの変更が、PCSK9タンパク質における変異をもたらす、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
PCSK9タンパク質における変異が、機能喪失型変異である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
変異が、表３において列記される変異から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ガイドヌクレオチド配列が、表３において列記されるガイドヌクレオチド配列から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
機能喪失型変異が、短縮化された、または非機能的なPCSK9タンパク質をもたらすPCSK9コード配列中の未成熟停止コドンを導入する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
未成熟停止コドンが、ＴＡＧ（Amber）、ＴＧＡ（Opal）、またはＴＡＡ（Ochre）である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
未成熟停止コドンが、コード鎖上の第１のＣの脱アミノ化を介するＣＡＧからＴＡＧへの変更から生じる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
未成熟停止コドンが、コード鎖上の第１のＣの脱アミノ化を介するＣＧＡからＴＧＡへの変更から生じる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
未成熟停止コドンが、コード鎖上の第１のＣの脱アミノ化を介するＣＡＡからＴＡＡへの変更から生じる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
未成熟停止コドンが、相補鎖上の第２のＣの脱アミノ化を介するＴＧＧからＴＡＧへの変更から生じる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
未成熟停止コドンが、相補鎖上の第３のＣの脱アミノ化を介するＴＧＧからＴＧＡへの変更から生じる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
未成熟停止コドンが、コード鎖上のＣの脱アミノ化および相補鎖上のＣの脱アミノ化を介する、ＣＧＧからＴＧＡへ、またはＣＧＡからＴＡＡへの変更から生じる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
ガイドヌクレオチド配列が、表６において列記されるガイドヌクレオチド配列（配列番号９３８〜１１２３）から選択される、請求項３７〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
タンデムな未成熟停止コドンが導入される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４７】
変異が、Ｗ１０Ｘ−Ｗ１１Ｘ、Ｑ９９Ｘ−Ｑ１０１Ｘ、Ｑ３４２Ｘ−Ｑ３４４Ｘ、およびＱ５５４Ｘ−Ｑ５５５Ｘからなる群より選択され、ここでＸは、停止コドンである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
未成熟停止コドンが、構造不安定化変異の後に導入される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４９】
不安定化する変異が、Ｐ５３０Ｓ／Ｌ、Ｐ５８１Ｓ／Ｌ、およびＰ６１８Ｓ／Ｌからなる群より選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
未成熟停止コドンが、Ｑ５３１Ｘ、Ｒ５８２Ｘ、およびＱ６１９Ｘからなる群より選択され、ここでＸが停止コドンである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
未成熟停止コドンを導入するために用いられるガイドヌクレオチド配列が、配列番号９３８〜１１２３から選択され、およびここで、構造不安定化変異を導入するために用いられるガイドヌクレオチド配列が、配列番号５７９〜９３７から選択される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
変異が、PCSK9タンパク質の折りたたみを不安定化する、請求項３４に記載の方法
【請求項５３】
変異が、表４において列記される変異から選択される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
ガイドヌクレオチド配列が、表４において列記されるガイドヌクレオチド配列（配列番号５７９〜９３７）から選択される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
ＣからＴへの変更が、PCSK9をコードするポリヌクレオチドの非コード領域におけるスプライシング部位において起こる、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
ＣからＴへの変更が、イントロン−エクソン接合部において起こる、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
ＣからＴへの変更が、スプライシングドナー部位において起こる、請求項５５に記載の方法
【請求項５８】
ＣからＴへの変更が、スプライシングアクセプター部位において起こる、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
ＣからＴへの変更が、開始コドン（ＡＵＧ）中のＧ塩基と対形成している塩基において起こる、請求項５５に記載の方法。
【請求項６０】
ＣからＴへの変更が、PCSK9のmRNA成熟を防止するか、またはPCSK9の発現を抑止する、請求項５５〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
ガイドヌクレオチド配列が、表８において列記されるガイドヌクレオチド配列（配列番号１１２４〜１３０９）から選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
PAM配列が、変更されているＣの３’に位置する、請求項１〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
PAM配列が、変更されているＣの５’に位置する、請求項１〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
PAM配列が、ＮＧＧ、ＮＧＡＮ、ＮＧＮＧ、ＮＧＡＧ、ＮＧＣＧ、ＮＮＧＲＲＴ、ＮＧＧＮＧ、ＮＧＲＲＮ、ＮＮＮＲＲＴ、ＮＮＮＧＡＴＴ、ＮＮＡＧＡＡ、およびＮＡＡＡＣからなる群より選択され、ここで、Ｙはピリミジンであり、Ｒはプリンであり、およびＮは任意の核酸塩基である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
PAM配列が、ＮＮＴ、ＮＮＮＴ、およびＹＮＴからなる群より選択され、ここで、Ｙはピリミジンであり、およびＮは任意の核酸塩基である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
標的Ｃ塩基の３’に位置するPAM配列は存在しない、請求項１〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
標的Ｃ塩基の５’に位置するPAM配列は存在しない、請求項１〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
標的Ｃ塩基の３’または５’に位置するPAM配列は存在しない、請求項１〜６１のいずれか一項に記載の方法
【請求項６９】
少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の変異が、ＰＣＳＫ９をコードするポリヌクレオチド中に導入される、請求項１〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
ガイドヌクレオチド配列が、RNA（gRNA）である、請求項１に記載の方法。
【請求項７１】
ガイドヌクレオチド配列が、ssDNA（gDNA）である、請求項１に記載の方法。
【請求項７２】
アポリポタンパク質Ｃ３（APOC3）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを編集する方法であって、APOC3をコードするポリヌクレオチドを、以下：
（ｉ）（ａ）ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメイン；および（ｂ）シトシンデアミナーゼドメインを含む融合タンパク質；ならびに
（ｉｉ）（ｉ）の融合タンパク質をAPOC3をコードするポリヌクレオチド中の標的シトシン（Ｃ）塩基にターゲティングするガイドヌクレオチド配列、
と接触させることを含み、
ここで、接触させることは、融合タンパク質による標的Ｃ塩基の脱アミノ化をもたらし、これが、APOC3をコードするポリヌクレオチドにおいてシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への変更をもたらす、
前記方法。
【請求項７３】
ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質が、ニッカーゼである、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
ニッカーゼがCas9ニッカーゼである、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
Cas9ニッカーゼが、配列番号１におけるＤ１０Ａ変異またはＨ８４０Ａ変異に対応する変異を含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
Cas9ニッカーゼが、配列番号１におけるＤ１０Ａ変異に対応する変異を含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメインが、ヌクレアーゼ不活性型Cas9（dCas9）ドメイン、ヌクレアーゼ不活性型Cpf1ドメイン、ヌクレアーゼ不活性型アルゴノートドメイン、およびそのバリアントからなる群より選択される、請求項７２に記載の方法。
【請求項７８】
ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメインが、ヌクレアーゼ不活性型Cas9（dCas9）ドメインである、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
dCas9ドメインのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＤ１０Ａおよび／またはＨ８４０Ａに対応する変異を含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
dCas9ドメインのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＤ１０Ａ変異に対応する変異を含み、およびここで、dCas9ドメインが、配列番号１のアミノ酸８４０に対応する位置においてヒスチジンを含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
ＣからＴへの変更が、APOC3タンパク質において変異をもたらす、請求項７２に記載の方法。
【請求項８２】
APOC3タンパク質における変異が、機能喪失型変異である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
変異が、表１４において列記される変異から選択される、請求項８１または８２に記載の方法。
【請求項８４】
ガイドヌクレオチド配列が、表１４において列記されるガイドヌクレオチド配列（配列番号１８０５〜１８５５）から選択される、請求項７２〜８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
ＣからＴへの変更が、APOC3をコードするポリヌクレオチドのスプライシング部位において起こる、請求項７２〜８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
ＣからＴへの変更が、イントロン−エクソン接合部において起こる、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
ＣからＴへの変更が、スプライシングドナー部位において起こる、請求項８５に記載の方法。
【請求項８８】
ＣからＴへの変更が、スプライシングアクセプター部位において起こる、請求項８５に記載の方法。
【請求項８９】
ＣからＴへの変更が、開始コドン（ＡＵＧ）におけるＧ塩基と対形成しているＣ塩基において起こる、請求項８５に記載の方法。
【請求項９０】
ＣからＴへの変更が、APOC3のmRNA成熟を防止するか、またはAPOC3の発現を抑止する、請求項８５〜８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
ガイドヌクレオチド配列が、表１５において列記されるガイドヌクレオチド配列（配列番号１８５６〜１９０６）から選択される、請求項８５〜８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
低密度リポタンパク質受容体（LDL-R）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを編集する方法であって、LDL-Rをコードするポリヌクレオチドを、以下：
（ｉ）（ａ）ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメイン；および（ｂ）シトシンデアミナーゼドメインを含む融合タンパク質；ならびに
（ｉｉ）（ｉ）の融合タンパク質をLDL-Rをコードするポリヌクレオチド中の標的シトシン（Ｃ）塩基にターゲティングするガイドヌクレオチド配列、
と接触させることを含み、
ここで、接触させることは、融合タンパク質による標的Ｃ塩基の脱アミノ化をもたらし、これが、ＬＤＬＲをコードするポリヌクレオチドにおいてシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への変更をもたらす、
前記方法。
【請求項９３】
ガイドヌクレオチド配列が、配列番号１７９２〜１７９９から選択される、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
誘導性のLDL受容体分解剤（IDOL）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを編集する方法であって、IDOLをコードするポリヌクレオチドを、以下：
（ｉ）（ａ）ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメイン；および（ｂ）シトシンデアミナーゼドメインを含む融合タンパク質；ならびに
（ｉｉ）（ｉ）の融合タンパク質をIDOLをコードするポリヌクレオチド中の標的Ｃ塩基にターゲティングするガイドヌクレオチド配列
と接触させることを含み、
ここで、接触させることは、融合タンパク質による標的Ｃ塩基の脱アミノ化をもたらし、これが、IDOLをコードするポリヌクレオチドにおいてシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への変更をもたらす、
前記方法。
【請求項９５】
ガイドヌクレオチド配列が、配列番号１７８８〜１７９１から選択される、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
in vitroで行われる、請求項１〜９５に記載の方法。
【請求項９７】
培養細胞中で行われる、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
in vivoで行われる、請求項１〜９５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９９】
哺乳動物において行われる、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
哺乳動物がげっ歯類である、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
哺乳動物がヒトである、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（PCSK9）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを編集する方法であって、PCSK9をコードするポリヌクレオチドを、（ａ）プログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメイン；および（ｂ）デアミナーゼドメインを含む融合タンパク質と接触させることを含み、
ここで、接触させることが、融合タンパク質による標的塩基の脱アミノ化をもたらし、これが、PCSK9をコードするポリヌクレオチドにおける塩基変更をもたらす、
前記方法。
【請求項１０３】
プログラミング可能なDNA結合ドメインが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）ドメインを含む、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
プログラミング可能なDNA結合ドメインが、転写活性化因子様エフェクター（TALE）ドメインを含む、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０５】
プログラミング可能なDNA結合ドメインが、ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメインである、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０６】
プログラミング可能なDNA結合ドメインが、ヌクレアーゼ不活性型Cas9ドメイン、ヌクレアーゼ不活性型Cpf1ドメイン、ヌクレアーゼ不活性型アルゴノートドメイン、およびそのバリアントからなる群より選択される、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
プログラミング可能なDNA結合ドメインが、ガイドヌクレオチド配列と関連している、請求項１０５または１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
デアミナーゼが、シトシンデアミナーゼである、請求項１０２〜１０７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０９】
標的塩基が、シトシン（Ｃ）塩基であり、標的Ｃ塩基の脱アミノ化が、Ｃからチミン（Ｔ）への変更をもたらす、請求項９４に記載の方法。
【請求項１１０】
以下：
（ｉ）（ａ）ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメイン；および（ｂ）シトシンデアミナーゼドメインを含む融合タンパク質；ならびに
（ｉｉ）（ｉ）の融合タンパク質をプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（PCSK9）タンパク質をコードするポリヌクレオチドにターゲティングするガイドヌクレオチド配列
を含む、組成物。
【請求項１１１】
以下：
（ｉ）（ａ）ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメイン；および（ｂ）シトシンデアミナーゼドメインを含む融合タンパク質；
（ｉｉ）（ｉ）の融合タンパク質をプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（PCSK9）タンパク質をコードするポリヌクレオチドにターゲティングするガイドヌクレオチド配列；ならびに
（ｉｉ）（ｉ）の融合タンパク質をアポリポタンパク質Ｃ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドにターゲティングするガイドヌクレオチド配列
を含む、組成物。
【請求項１１２】
以下：
（ｉ）（ａ）ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメイン；および（ｂ）シトシンデアミナーゼドメインを含む融合タンパク質；
（ｉｉ）（ｉ）の融合タンパク質をプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（PCSK9）タンパク質をコードするポリヌクレオチドにターゲティングするガイドヌクレオチド配列；
（ｉｉｉ）（ｉ）の融合タンパク質をアポリポタンパク質Ｃ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドにターゲティングするガイドヌクレオチド配列；ならびに
（ｉｖ）（ｉ）の融合タンパク質を低密度リポタンパク質受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチドにターゲティングするガイドヌクレオチド配列
を含む、組成物。
【請求項１１３】
以下：
（ｉ）（ａ）ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメイン；および（ｂ）シトシンデアミナーゼドメインを含む融合タンパク質；
（ｉｉ）（ｉ）の融合タンパク質をプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（PCSK9）タンパク質をコードするポリヌクレオチドにターゲティングするガイドヌクレオチド配列；
（ｉｉｉ）（ｉ）の融合タンパク質をアポリポタンパク質Ｃ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドにターゲティングするガイドヌクレオチド配列；
（ｉｖ）（ｉ）の融合タンパク質を低密度リポタンパク質受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチドにターゲティングするガイドヌクレオチド配列；ならびに
（ｖ）（ｉ）の融合タンパク質をLDL受容体タンパク質の誘導性分解剤をコードするポリヌクレオチドにターゲティングするガイドヌクレオチド配列
を含む、組成物。
【請求項１１４】
ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質が、ニッカーゼである、請求項１１０〜１１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１５】
ニッカーゼが、Cas9ニッカーゼである、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
Cas9ニッカーゼが、配列番号１におけるＤ１０Ａ変異またはＨ８４０Ａ変異に対応する変異を含む、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
Cas9ニッカーゼが、配列番号１におけるＤ１０Ａ変異に対応する変異を含む、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
（ｉｉ）のガイドヌクレオチド配列が、配列番号３３６〜１３０９から選択される、請求項１１０〜１１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１９】
（ｉｉｉ）のガイドヌクレオチド配列が、配列番号１８０６〜１９０６から選択される、請求項１１１〜１１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２０】
（ｉｖ）のガイドヌクレオチド配列が、配列番号１７９２〜１７９９から選択される、請求項１１２〜１１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２１】
（ｖ）のガイドヌクレオチド配列が、配列番号１７８８〜１７９１から選択される、請求項１１３〜１１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２２】
請求項１１０〜１２１のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸および請求項９６〜１０３のいずれか一項に記載のガイドヌクレオチド配列を含む、組成物。
【請求項１２３】
薬学的に受入可能なキャリアをさらに含む、請求項１１０〜１２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２４】
LDL受容体により媒介されるLDLコレステロールのクリアランスをブーストする方法であって、それを必要とする対象に、請求項１１０〜１２３のいずれか一項に記載の組成物の治療有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項１２５】
対象における循環コレステロールレベルを低下させる方法であって、それを必要とする対象に、請求項１１０〜１２３のいずれか一項に記載の組成物の治療有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項１２６】
状態を処置する方法であって、それを必要とする対象に、請求項１１０〜１２３のいずれか一項に記載の組成物の治療有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項１２７】
状態が、高コレステロール血症、上昇した総コレステロールレベル、上昇した低密度リポタンパク質（LDL）レベル、上昇したLDL−コレステロールレベル、低下した高密度リポタンパク質レベル、脂肪肝、冠動脈心疾患、虚血、脳卒中、末梢血管疾患、血栓症、２型糖尿病、高い血圧上昇、アテローム動脈硬化症、肥満、アルツハイマー病、神経変性、またはこれらの組み合わせである、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
請求項１１０〜１２３のいずれか一項に記載の組成物を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１６年１２月２３日に出願された米国仮出願、U.S.S.N. 62/438,869に対する35 U.S.C.§119（e）下における優先権を主張し、当該仮出願は、本明細書において参考として援用される。
【０００２】
政府の支援
本発明は、国立衛生研究所（ＮＩＨ）により付与された助成金番号GM065865下において政府の支援によりなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
肝臓タンパク質であるプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（PCSK9）は、分泌型の球状の自己活性化型セリンプロテアーゼであって、LDL粒子のエンドサイトーシスの間にエンドソーム小胞内で低密度リポタンパク質受容体（LDL-R）とのｐＨ依存的な相互作用を架橋するタンパク質結合アダプターとして作用し、LDL-Rの細胞表面へのリサイクルを防止し、LDL−コレステロールクリアランスの低下をもたらす。PCSK9がLDL-Rにより媒介されるLDLコレステロールのクリアランスをブーストする機能を遮断または阻害することは、製薬業界において多大な関心を得てきた。しかし、in vivoでPCSK9の保護的バリアントおよび機能喪失型変異体を作製する現在の方法は、コレステロールレベルを調節するように改変する必要がある細胞の数の多さに起因して、非効率的であった。他の懸念は、ゲノム編集により引き起こされ得るオフターゲット効果、ゲノムの不安定性、または発癌性の修飾に関するものである。
【発明の概要】
【０００４】
本明細書において提供されるのは、機能喪失型PCSK9バリアントを生成するために、PCSK9タンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えばDNA）を改変するための、系、組成物、キット、および方法である。本明細書においてまた提供されるのは、機能喪失型変異体を作製するために、LDLR、IDOL、またはAPOC3／C5タンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えばDNA）を改変するための、系、組成物、キット、および方法である。変異体を作製するための方法は、CRISPR／Cas9ベースの塩基編集技術に依存する。本明細書において記載される正確なターゲティング方法は、操作されたヌクレアーゼを用いてPCSK9のゲノムでの遺伝子座または本明細書において記載される他の遺伝子座において無作為的なインデルを作製するという、先に提案された戦略より優れている。方法はまた、オフターゲット効果の可能性が低いことに起因して、より好ましい安全性プロフィールを有する。したがって、本明細書において記載される塩基編集方法は、癌遺伝子の活性化または腫瘍抑制因子の不活化を含むゲノム安定性に対して、低い影響を有する。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法を用いて作製された機能喪失型バリアント（例えば、PCSK9、LDLR、IDOL、またはAPOC3／C5バリアント）は、心保護的機能を有する。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法を用いて作製された機能喪失型バリアント（例えば、PCSK9、LDLR、IDOL、またはAPOC3／C5バリアント）は、LDLレベルを低下させる。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法を用いて作製された機能喪失型バリアント（例えば、PCSK9、LDLR、IDOL、またはAPOC3／C5バリアント）は、LDLコレステロールレベルを低下させる。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法を用いて作製された機能喪失型バリアント（例えば、PCSK9、LDLR、IDOL、またはAPOC3／C5バリアント）は、全体的なコレステロールレベルを低下させる。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法を用いて作製された機能喪失型バリアント（例えば、PCSK9、LDLR、IDOL、またはAPOC3／C5バリアント）は、HDLレベルを増大させる。
【０００５】
本開示のいくつかの側面は、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（PCSK9）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを編集する方法を提供し、該方法は、PCSK9をコードするポリヌクレオチドを、（ｉ）（ａ）ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメイン；および（ｂ）シトシンデアミナーゼドメインを含む融合タンパク質；および（ｉｉ）（ｉ）の融合タンパク質をPCSK9をコードするポリヌクレオチド中の標的シトシン（Ｃ）塩基にターゲティングするガイドヌクレオチド配列と接触させることを含み、ここで、接触させることは、融合タンパク質による標的Ｃ塩基の脱アミノ化をもたらし、これは、PCSK9をコードするポリヌクレオチドにおけるシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への変更をもたらす。
【０００６】
いくつかの態様において、ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメインは、ヌクレアーゼ不活性型Cas9（dCas9）ドメイン、ヌクレアーゼ不活性型Cpf1ドメイン、ヌクレアーゼ不活性型アルゴノートドメイン、ならびにこれらのバリアントおよび組み合わせからなる群より選択される。いくつかの態様において、ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメインは、ヌクレアーゼ不活性型Cas9（dCas9）ドメインである。いくつかの態様において、dCas9ドメインのアミノ酸配列は、配列番号１におけるＤ１０Ａおよび／またはＨ８４０Ａ変異に対応する変異を含む。いくつかの態様において、Cas9ニッカーゼが用いられる。いくつかの態様において、Cas9ニッカーゼのアミノ酸配列は、配列番号１におけるＤ１０Ａ変異に対応する変異を含み、およびここで、dCas9ドメインは、配列番号１のアミノ酸８４０に対応する位置においてヒスチジンを含む。
【０００７】
いくつかの態様において、ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメインは、ヌクレアーゼ不活性型Cpf1（dCpf1）ドメインを含む。いくつかの態様において、dCpf1ドメインは、AcidaminococcusまたはLachnospiraceaeの種からのものである。
【０００８】
いくつかの態様において、ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメインは、ヌクレアーゼ不活性型アルゴノート（dAgo）ドメインを含む。いくつかの態様において、dAgoドメインは、Natronobacterium gregoryiからのものである（dNgAgo）。
【０００９】
非限定的な例のセットとして、本明細書において記載されるCas9ドメインを含む融合タンパク質のうちのいずれかは、CasX、CasY、Cpf1、C2c1、C2c2、C2c3、およびアルゴノートなどの、別のガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質を、Cas9ドメインの位置において用いることができる。これらは、タンパク質のヌクレアーゼ不活性型バリアントであり得る。ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質として、限定することなく、Cas9（例えば、dCas9およびnCas9）、saCas9（例えば、saCas9d、saCas9n、saKKH Cas9）、CasX、CasY、Cpf1、C2c1、C2c2、C2C3、アルゴノート、および本明細書において記載される好適なタンパク質のうちのいずれかが挙げられる。いくつかの態様において、本明細書において記載される融合タンパク質は、Gamタンパク質、ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質、およびシチジンデアミナーゼドメインを含む。
【００１０】
いくつかの態様において、シトシンデアミナーゼドメインは、アポリポタンパク質Ｂ−mRNA編集複合体（APOBEC）ファミリーデアミナーゼを含む。いくつかの態様において、シトシンデアミナーゼは、APOBEC1デアミナーゼ、APOBEC2デアミナーゼ、APOBEC3Aデアミナーゼ、APOBEC3Bデアミナーゼ、APOBEC3Cデアミナーゼ、APOBEC3Dデアミナーゼ、APOBEC3Fデアミナーゼ、APOBEC3Gデアミナーゼ、APOBEC3Hデアミナーゼ、APOBEC4デアミナーゼ、活性化誘導デアミナーゼ（AID）、およびpmCDA1からなる群より選択される。いくつかの態様において、シトシンデアミナーゼは、配列番号２７１〜２９２および３０３のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
【００１１】
いくつかの態様において、（ａ）の融合タンパク質は、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤（UGI）ドメインをさらに含む。いくつかの態様において、シトシンデアミナーゼドメインは、ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメインのＮ末端に融合している。いくつかの態様において、UGIドメインは、ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメインのＣ末端に融合している。
【００１２】
いくつかの態様において、シトシンデアミナーゼは、任意のリンカーを介して、ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメインに融合している。いくつかの態様において、UGIドメインは、任意のリンカーを介して、dCas9ドメインに融合している。いくつかの態様において、融合タンパク質は、構造：ＮＨ２−［シトシンデアミナーゼドメイン］−［任意のリンカー配列］−［ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメイン］−［任意のリンカー配列］−［UGIドメイン］−ＣＯＯＨを含む。
【００１３】
いくつかの態様において、リンカーは、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１９９８）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３０８）、（Ｇ）ｎ、（ＥＡＡＡＫ）ｎ（配列番号３０９）、（ＧＧＳ）ｎ、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号３１０）、または（ＸＰ）ｎモチーフ、またはこれらのうちのいずれかの組み合わせを含み、ここで、ｎは、独立して１〜３０の整数であり、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸である。いくつかの態様において、リンカーは、アミノ酸配列ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号３１０）を含む。いくつかの態様において、リンカーは、（ＧＧＳ）ｎであり、ここで、ｎは、１、３、または７である。
【００１４】
いくつかの態様において、融合タンパク質は、配列番号１０および２９３〜３０２のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
【００１５】
いくつかの態様において、PCSK9タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、コード鎖および相補鎖を含む。いくつかの態様において、PCSK9タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、コード領域および非コード領域を含む。
【００１６】
いくつかの態様において、ＣからＴへの変更は、PCSK9をコードするポリヌクレオチドのコード配列において、またはこれのコード鎖上で起こる。いくつかの態様において、ＣからＴへの変更は、PCSK9タンパク質において変異をもたらす。いくつかの態様において、PCSK9タンパク質における変異は、機能喪失型変異である。いくつかの態様において、変異は、表３において列記される変異から選択される。いくつかの態様において、本発明において有用なガイドヌクレオチド配列は、表３において列記されるガイドヌクレオチド配列から選択される。
【００１７】
いくつかの態様において、機能喪失型変異は、PCSK9コード配列中に、短縮化された、または非機能的なPCSK9タンパク質をもたらす未成熟停止コドンを導入する。いくつかの態様において、未成熟停止コドンは、ＴＡＧ（Amber）、ＴＧＡ（Opal）、またはＴＡＡ（Ochre）である。
【００１８】
いくつかの態様において、未成熟停止コドンは、コード鎖上の第１のＣの脱アミノ化を介するＣＡＧからＴＡＧへの変更から生じる。いくつかの態様において、未成熟停止コドンは、コード鎖上の第１のＣの脱アミノ化を介するＣＧＡからＴＧＡへの変更から生じる。いくつかの態様において、未成熟停止コドンは、コード鎖上の第１のＣの脱アミノ化を介するＣＡＡからＴＡＡへの変更から生じる。いくつかの態様において、未成熟停止コドンは、相補鎖上の第２のＣの脱アミノ化を介するＴＧＧからＴＡＧへの変更から生じる。いくつかの態様において、未成熟停止コドンは、相補鎖上の第３のＣの脱アミノ化を介するＴＧＧからＴＧＡへの変更から生じる。いくつかの態様において、未成熟停止コドンは、コード鎖上のＣの脱アミノ化および相補鎖上のＣの脱アミノ化を介する、ＣＧＧからＴＧＡへ、またはＣＧＡからＴＡＡへの変更から生じる。いくつかの態様において、ガイドヌクレオチド配列は、表６において列記されるガイドヌクレオチド配列（配列番号９３８〜１１２３）から選択される。
【００１９】
いくつかの態様において、タンデムな未成熟停止コドンが導入される。いくつかの態様において、変異は、Ｗ１０Ｘ−Ｗ１１Ｘ、Ｑ９９Ｘ−Ｑ１０１Ｘ、Ｑ３４２Ｘ−Ｑ３４４Ｘ、およびＱ５５４Ｘ−Ｑ５５５Ｘからなる群より選択され、ここで、Ｘは、停止コドンである。連続する変異のためのガイドヌクレオチド配列は、表６において見出すことができる。
【００２０】
いくつかの態様において、未成熟停止コドンは、構造不安定化変異の後に導入される。いくつかの態様において、変異は、Ｐ５３０Ｓ／Ｌ−Ｑ５３１Ｘ、Ｐ５８１Ｓ／Ｌ−Ｒ５８２Ｘ、およびＰ６１８Ｓ／Ｌ−Ｑ６１９Ｘからなる群より選択され、ここで、Ｘは、停止コドンである。いくつかの態様において、未成熟停止コドンを導入数するために用いられるガイドヌクレオチド配列は、配列番号９３８〜１１２３から選択され、およびここで、構造不安定化変異を導入するために用いられるガイドヌクレオチド配列は、配列番号５７９〜９３７から選択される。いくつかの態様において、変異は、PCSK9タンパク質の折りたたみを不安定化する。
【００２１】
いくつかの態様において、変異は、表４において列記される変異から選択される。いくつかの態様において、ガイドヌクレオチド配列は、表４において列記されるガイドヌクレオチド配列（配列番号５７９〜９３７）から選択される。
【００２２】
いくつかの態様において、ＣからＴへの変更は、PCSK9をコードするポリヌクレオチドの非コード領域におけるスプライシング部位において起こる。いくつかの態様において、ＣからＴへの変更は、イントロン−エクソン接合部において起こる。いくつかの態様において、ＣからＴへの変更は、スプライシングドナー部位において起こる。いくつかの態様において、ＣからＴへの変更は、スプライシングアクセプター部位において起こる。いくつかの態様において、ＣからＴへの変更は、開始コドン（ＡＵＧ）中のＧ塩基と対形成しているＣ塩基において起こる。いくつかの態様において、ＣからＴへの変更は、PCSK9のmRNA成熟を防止するか、またはPCSK9の発現を抑止する。いくつかの態様において、ガイドヌクレオチド配列は、表８において列記されるガイドヌクレオチド配列（配列番号１１２４〜１３０９）から選択される。
【００２３】
いくつかの態様において、PAM配列は、変更されているＣの３’に位置し、例えば、PAMは、ＮＧＧ、ＮＧＡＮ、ＮＧＮＧ、ＮＧＡＧ、ＮＧＣＧ、ＮＮＧＲＲＴ、ＮＧＲＲＮ、ＮＮＮＲＲＴ、ＮＧＧＮＧ、ＮＮＮＧＡＴＴ、ＮＮＡＧＡＡ、およびＮＡＡＡＣからなる群より選択され、ここで、Ｙはピリミジンであり、Ｒはプリンであり、およびＮは任意の核酸塩基である。いくつかの態様において、PAM配列は、変更されているＣの５’に位置し、例えば、PAMは、ＮＮＴ、ＮＮＮＴ、およびＹＮＴからなる群より選択され、ここで、Ｙはピリミジンであり、およびＮは任意の核酸塩基である。いくつかの態様において、標的Ｃ塩基の５’または３’のいずれかに位置するPAM配列は存在しない。
【００２４】
いくつかの態様において、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の変異が、PCSK9をコードするポリヌクレオチド中に導入される。
【００２５】
いくつかの態様において、ガイドヌクレオチド配列は、RNA（ガイドRNAまたはgRNA）である。いくつかの態様において、ガイドヌクレオチド配列は、ssDNA（ガイドDNAまたはgDNA）である。
【００２６】
本開示の他の側面は、アポリポタンパク質Ｃ３（APOC3）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを編集する方法を提供し、該方法は、APOC3をコードするポリヌクレオチドを、以下：（ｉ）（ａ）ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメイン；および（ｂ）シトシンデアミナーゼドメインを含む融合タンパク質；および（ｉｉ）（ｉ）の融合タンパク質をAPOC3をコードするポリヌクレオチド中の標的シトシン（Ｃ）塩基にターゲティングするガイドヌクレオチド配列と接触させることを含み、ここで、接触させることは、融合タンパク質による標的Ｃ塩基の脱アミノ化をもたらし、これが、APOC3をコードするポリヌクレオチドにおいてシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への変更をもたらす。いくつかの態様において、ガイドヌクレオチド配列は、配列番号１８０６〜１９０６から選択される。
【００２７】
本開示の他の側面は、低密度リポタンパク質受容体（LDL-R）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを編集する方法を提供し、該方法は、LDL-Rをコードするポリヌクレオチドを、（ｉ）（ａ）ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメイン；および（ｂ）シトシンデアミナーゼドメインを含む融合タンパク質；および（ｉｉ）（ｉ）の融合タンパク質をLDL-Rをコードするポリヌクレオチド中の標的シトシン（Ｃ）塩基にターゲティングするガイドヌクレオチド配列と接触させることを含み、ここで、接触させることは、融合タンパク質による標的Ｃ塩基の脱アミノ化をもたらし、これが、LDLRをコードするポリヌクレオチドにおいてシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への変更をもたらす。いくつかの態様において、ガイドヌクレオチド配列は、配列番号１７９２〜１７９９から選択される。
【００２８】
本開示の他の側面は、誘導性のLDL受容体分解剤（Inducible Degrader of the LDL receptor：IDOL）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを編集する方法を提供し、該方法は、IDOLをコードするポリヌクレオチドを、（ｉ）（ａ）ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメイン；および（ｂ）シトシンデアミナーゼドメインを含む融合タンパク質；および（ｉｉ）（ｉ）の融合タンパク質をIDOLをコードするポリヌクレオチド中の標的Ｃ塩基にターゲティングするガイドヌクレオチド配列と接触させることを含み、ここで、接触させることは、融合タンパク質による標的Ｃ塩基の脱アミノ化をもたらし、これが、IDOLをコードするポリヌクレオチドにおいてシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への変更をもたらす。いくつかの態様において、ガイドヌクレオチド配列は、配列番号１７８８〜１７９１から選択される。
【００２９】
いくつかの態様において、方法は、in vitroで行われる。いくつかの態様において、方法は、培養細胞中で行われる。いくつかの態様において、方法は、in vivoで行われる。いくつかの態様において、方法は、ex vivoで行われる。
【００３０】
いくつかの態様において、方法は、哺乳動物において行われる。いくつかの態様においては、哺乳動物は、げっ歯類である。いくつかの態様において、哺乳動物は、霊長類である。いくつかの態様において、哺乳動物は、ヒトである。いくつかの態様において、方法は、対象の器官、例えば肝臓において行われる。
【００３１】
本開示の他の側面は、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（PCSK9）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを編集する方法を提供し、該方法は、PCSK9をコードするポリヌクレオチドを、（ａ）プログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメイン；および（ｂ）デアミナーゼドメインを含む融合タンパク質と接触させることを含み、ここで、接触させることは、融合タンパク質による標的塩基の脱アミノ化をもたらし、これが、PCSK9をコードするポリヌクレオチドにおける塩基変更をもたらす。
【００３２】
いくつかの態様において、プログラミング可能なDNA結合ドメインは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）ドメインを含む。いくつかの態様において、プログラミング可能なDNA結合ドメインは、転写活性化因子様エフェクター（TALE）ドメインを含む。いくつかの態様において、プログラミング可能なDNA結合ドメインは、ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメインである。
【００３３】
いくつかの態様において、プログラミング可能なDNA結合ドメインは、ヌクレアーゼ不活性型Cas9ドメイン（例えば、dCas9およびnCas9）、ヌクレアーゼ不活性型Cpf1ドメイン、ヌクレアーゼ不活性型アルゴノートドメイン、およびそのバリアントからなる群より選択される。いくつかの態様において、プログラミング可能なDNA結合ドメインは、CasX、CasY、C2c1、C2c2、またはC2c3ドメイン、またはそのバリアントである。いくつかの態様において、プログラミング可能なDNA結合ドメインは、saCas9（例えば、saCas9d、saCas9n、saKKH Cas9）ドメイン、またはそのバリアントである。いくつかの態様において、プログラミング可能なDNA結合ドメインは、ガイドヌクレオチド配列に関連している。いくつかの態様において、デアミナーゼは、シトシンデアミナーゼである。いくつかの態様において、標的塩基は、シトシン（Ｃ）塩基であり、標的Ｃ塩基の脱アミノ化は、Ｃからデオキシウリジン（ｄＵ）への変更をもたらし、その後、標的Ｃの場所におけるチミン（Ｔ）の導入が起こる。いくつかの態様において、本明細書において記載される融合タンパク質は、Gamタンパク質、ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合ドメイン、およびシチジンデアミナーゼドメインを含む。
【００３４】
本開示のいくつかの側面は、（ｉ）（ａ）ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメイン；および（ｂ）シトシンデアミナーゼドメインを含む融合タンパク質；および（ｉｉ）（ｉ）の融合タンパク質をプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（PCSK9）タンパク質をコードするポリヌクレオチドにターゲティングするガイドヌクレオチド配列を含む、組成物を提供する。いくつかの態様において、（ｉ）の融合タンパク質は、Gamタンパク質をさらに含む。
【００３５】
本開示の他の側面は、（ｉ）（ａ）ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメイン；および（ｂ）シトシンデアミナーゼドメインを含む融合タンパク質；（ｉｉ）（ｉ）の融合タンパク質をプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（PCSK9）タンパク質をコードするポリヌクレオチドにターゲティングするガイドヌクレオチド配列；ならびに（ｉｉ）（ｉ）の融合タンパク質をアポリポタンパク質Ｃ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドにターゲティングするガイドヌクレオチド配列を含む、組成物を提供する。いくつかの態様において、（ｉ）の融合タンパク質は、Gamタンパク質をさらに含む。
【００３６】
本開示の他の側面は、（ｉ）（ａ）ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメイン；および（ｂ）シトシンデアミナーゼドメインを含む融合タンパク質；（ｉｉ）（ｉ）の融合タンパク質をプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（PCSK9）タンパク質をコードするポリヌクレオチドにターゲティングするガイドヌクレオチド配列；（ｉｉｉ）（ｉ）の融合タンパク質をアポリポタンパク質Ｃ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドにターゲティングするガイドヌクレオチド配列；ならびに（ｉｖ）（ｉ）の融合タンパク質を低密度リポタンパク質受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチドにターゲティングするガイドヌクレオチド配列を含む、組成物を提供する。いくつかの態様において、（ｉ）の融合タンパク質は、Gamタンパク質をさらに含む。
【００３７】
本開示の他の側面は、以下を含む組成物を提供する：（ｉ）（ａ）ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメイン；および（ｂ）シトシンデアミナーゼドメインを含む融合タンパク質；（ｉ）の融合タンパク質をプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（PCSK9）タンパク質をコードするポリヌクレオチドにターゲティングするガイドヌクレオチド配列；いくつかの態様においては、（ｉ）の融合タンパク質をアポリポタンパク質Ｃ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドにターゲティングするガイドヌクレオチド配列；いくつかの態様においては、（ｉ）の融合タンパク質を低密度リポタンパク質受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチドにターゲティングするガイドヌクレオチド配列；および、いくつかの態様においては、（ｉ）の融合タンパク質をLDL受容体タンパク質の誘導性分解剤をコードするポリヌクレオチドにターゲティングするガイドヌクレオチド配列。いくつかの態様において、（ｉ）の融合タンパク質は、Gamタンパク質をさらに含む。
【００３８】
いくつかの態様において、（ｉｉ）のガイドヌクレオチド配列は、配列番号３３６〜１３０９から選択される。いくつかの態様において、（ｉｉｉ）のガイドヌクレオチド配列は、配列番号１８０６〜１９０６から選択される。いくつかの態様において、（ｉｖ）のガイドヌクレオチド配列は、配列番号１７９２〜１７９９から選択される。いくつかの態様において、（ｖ）のガイドヌクレオチド配列は、配列番号１７８８〜１７９１から選択される。
【００３９】
本開示の他の側面は、本明細書において記載される融合タンパク質およびガイドヌクレオチド配列をコードする核酸を含む、組成物を提供する。いくつかの態様において、組成物は、薬学的に受入可能なキャリアをさらに含む。
【００４０】
本開示の他の側面は、LDL受容体により媒介されるLDLコレステロールのクリアランスをブーストする方法を提供し、該方法は、それを必要とする対象に、本明細書において記載される組成物の治療有効量を投与することを含む。
【００４１】
本開示の他の側面は、対象における循環コレステロールレベルを低下させる方法を提供し、該方法は、それを必要とする対象に、本明細書において記載される組成物の治療有効量を投与することを含む。
【００４２】
本開示の他の側面は、状態を処置する方法を提供し、該方法は、それを必要とする対象に、本明細書において記載される組成物の治療有効量を投与することを含む。いくつかの態様において、状態は、高コレステロール血症、上昇した総コレステロールレベル、上昇した低密度リポタンパク質（LDL）レベル、上昇したLDL−コレステロールレベル、低下した高密度リポタンパク質レベル、脂肪肝、冠動脈心疾患、虚血、脳卒中、末梢血管疾患、血栓症、２型糖尿病、高い血圧上昇、アテローム動脈硬化症、肥満、アルツハイマー病、神経変性、またはこれらの組み合わせである。
【００４３】
本明細書においてさらに提供されるのは、本明細書において記載される組成物を含むキットである。
【００４４】
本発明のある態様の詳細は、以下に記載されるとおりのある態様の詳細な説明において記載される。本発明の他の特徴、目的および利点は、定義、例、図面および請求の範囲から明らかであろう。
【００４５】
添付の図面は、本明細書の一部を構成し、本発明のいくつかの態様を説明し、記載と一緒に、本発明の原理を説明するために役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１Ａ】図１Ａは、LDL受容体（LDL-R）分解の増大をもたらす、低密度リポタンパク質（LDL）コレステロールの上昇に関連するヒト集団において同定された、天然に存在する機能獲得型（GOF）バリアント、ならびに、より低いLDLコレステロールおよび心保護に関連する有益な機能喪失型（LOF）表現型を示す他のバリアントを示す、プレ−プロ−PCSK9オープンリーディングフレームを表す。赤色で強調したバリアントは、機構的に確認されている。重要な触媒部位の残基を示す３ｂ。
【００４７】
【図１Ｂ】図１Ｂは、触媒性三連残基（Asp186、His226およびSer386）、ならびにPCSK9のタンパク質分解性の自己活性化、プロテアーゼ不活化、またはLDL-R結合アフィニティーに影響を及ぼすGOF（Ｓ１２７Ｒ、Ｆ２１６Ｌ、Ｄ３７４Ｙ）またはLOFバリアント（Ｒ４６Ｌ、ΔＲ９７、Ｌ２５３Ｆ、Ａ４３３Ｔ）を生じる選択された残基の位置を示す、切断されていないプロ−プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（PCSK9）（PDB：1R6Vに基づく）のモデルである（表１および２を参照）。
【００４８】
【図１Ｃ】図１Ｃは、Ｘ線共構造（PDB：3BPS）において観察されたPCSK9とLDL-RのEGF-Aドメインとの間の相互作用を示す１９。
【００４９】
【図２】図２は、肝細胞におけるPCSK9の、LDLのエンドサイトーシスの後で細胞表面へのLDL-Rのリサイクルを妨げる基本的な機能のスキームである。製薬の部門においてPCSK9の機能を遮断するための複数の戦略が探索されており（表１２）、これは、ＦＤＡにより承認された２つの抗PCSK9抗体治療剤、第２〜３相における、および前臨床相における他の抗体：アドネクチン、ペプチド、小分子、アンチセンスオリゴ、およびRNA干渉を含む。
【００５０】
【図３Ａ】図３Ａは、スプライシング部位：ドナー部位、枝分かれ部位またはアクセプター部位を変更することによりPCSK9のmRNA成熟およびタンパク質産生を防止するための戦略を示す。
【００５１】
【図３Ｂ−３Ｄ】図３Ｂ〜３Ｄは、ヒトスプライセオソームのイントロン枝分かれ部位、ドナーおよびアクセプター部位のコンセンサス配列を示し、これは、ドナーおよびアクセプター部位のグアノシンが、相補鎖上のＣ−＞Ｔ反応の塩基編集のための優れた標的であることを示唆している。
【００５２】
【図４】図４は、PCSK9についてのタンパク質およびオープンリーディングフレームの配列を示す。灰色で強調した残基は、表４（未成熟停止コドン）、または表５（不安定化バリアント）に対応する。この図における最上部のレベルのヌクレオチド配列は、配列番号１９９０を表す。この図における第２のレベルのアミノ酸配列は、配列番号１９９１を表す。
【００５３】
【図５】図５は、PCSK9のゲノム配列であり、エクソン（大文字）およびイントロン（小文字）を示す。エクソン／イントロン接合部における重要なヌクレオチドに下線を付す。この図は、配列番号１９９４を表す。
【００５４】
【図６】図６は、PAMおよび標的配列の相対的な位置の番号付けスキームを示すグラフである。この図は、配列番号１９９５を表す。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
定義
本明細書においておよび請求の範囲において用いられる場合、文脈が明らかに別を示さない限り、単数形「a」、「an」、および「the」は、単数および複数の参照を含む。したがって、例えば、「剤（an agent）」についての参照は、単一の剤および複数のかかる剤を含む。
【００５６】
「コレステロール」とは、全動物細胞により生合成される脂質分子を指す。特定の理論に拘束されることは望まないが、コレステロールは、膜構造の完全性および流動性の両方を維持するために必要とされる、全動物細胞膜の必須の構造構成成分である。コレステロールは、動物細胞が（膜の完全性および細胞のバイアビリティーを保護するために）細胞壁を不要とすることを可能にし、それにより、（その細胞壁により制限されている細菌および植物細胞とは異なり）動物細胞が形状を変化させ、動物が動くことを可能にしている。動物細胞の構造のためのその重要性に加えて、コレステロールはまた、ステロイドホルモンおよび胆汁酸の生合成のための前駆体として役立つ。コレステロールは、全ての動物により合成される主要なステロールである。脊椎動物において、肝細胞は、典型的には、他の細胞より多くの量を産生する。それは、一般的には、原核細胞（細菌および古細菌）の間では不在である。
【００５７】
全ての動物細胞は、膜構造および他の用途の両方のためにコレステロールを生成し、相対的な産生速度は、細胞の方および臓器の機能により異なる。一日の全コレステロール産生量のうちの約２０％は、肝臓において起こる：より高い合成速度の他の部位は、腸、副腎、および生殖器を含む。肝臓はコレステロールを胆汁中に排出し、これは次いで胆嚢中に保存される。胆汁は、胆汁酸塩を含み、これは、消化管において脂肪を可溶化し、脂肪分子、ならびに脂溶性ビタミンＡ、Ｄ、ＥおよびＫの腸吸収を補助する。コレステロールは、体内でリサイクルされる。典型的には、肝臓により排出されたコレステロールのうちの約５０％は、小腸により血流中に再吸収される。
【００５８】
単離された分子として、コレステロールは、水中では最小限でのみ溶解する；それは、（水ベースの）血流中に、低い濃度においてのみ溶解する。代わりに、コレステロールは、リポタンパク質中で輸送される；リポタンパク質は、外側の両親媒性タンパク質と脂質とによる複雑な円盤状の粒子であって、その外向きの構造は水溶性であり、内向きの表面は脂溶性である；すなわち乳化を介する輸送。リポタンパク質粒子は、それらの密度に基づいて分類される：低密度リポタンパク質（LDL）、超低密度リポタンパク質（VLDL）、高密度リポタンパク質（HDL）、カイロミクロンなど。トリグリセリドおよびコレステロールエステルは、内部に運搬される。両親媒性であるリン脂質およびコレステロールは、リポタンパク質粒子の単層表面において輸送される。
【００５９】
表面LDL受容体は、コレステロール吸収のプロセスの間に内部移行し、およびその合成は、SREBPにより制御され、当該タンパク質は、細胞内でのその濃度に従って、コレステロールのde novoでの合成を制御する。豊富なコレステロールを有する細胞は、LDL粒子における粒子新たなコレステロールが取り込まれることを防ぐために、そのLDL受容体合成が遮断される。逆に、細胞がコレステロールを欠損する場合には、LDL受容体合成は促進される。
【００６０】
いかなる特定の理論にも拘束されることは望まないが、この生理学的プロセスが制御されなくなった場合、過剰なLDL粒子が、LDL受容体による取り込みのための機会を伴わずに、血中を移動する。これらのLDL粒子は、酸化されて、スカベンジャー受容体を通してマクロファージにより取り込まれ、これは次いで、充満して泡沫細胞を形成する。これらの泡沫細胞は、しばしば、血管壁において捕捉され、アテローム硬化性プラーク形成に寄与する。コレステロール恒常性における差異は、初期アテローム動脈硬化症（頸動脈内中膜複合体厚）の発症に影響を及ぼす。これらのプラークは、心発作、脳卒中、および他の深刻な医学的問題の主要な原因であり、いわゆるLDLコレステロール（実際にはリポタンパク質）と「悪玉」コレステロールとの関連をもたらす。
【００６１】
「プロタンパク質コンバターゼスブチリシン／ケキシン９型（PCSK9）」とは、ヒトにおいてPCSK9遺伝子によりコードされる酵素を指す。PCSK9は、低密度リポタンパク質（LDL）粒子のための受容体に結合する。肝臓においては、LDL受容体は、エンドサイトーシス経路を通してLDL粒子を血流から取り除く。PCSK9がLDL受容体に結合する場合、受容体は、リソソーム経路に向かって流れ、タンパク質分解酵素により破壊され、これが、所与のLDL受容体が、血液からLDL粒子を取り込むことができる回数を制限している。したがって、PCSK9活性を遮断することは、より多くのLDL受容体がリサイクルされて肝細胞の表面上に存在することをもたらし得、より多くのLDLコレステロールを血液から取り除くであろう。したがって、PCSK9を遮断することにより、血液コレステロールレベルを低下させることができる。PCSK9のオルトログは、多くの種にわたり見出される。PCSK9は、ペプチド鎖のセクションがその活性を遮断するので、最初に合成されたときには不活性なプレプロ酵素である：プロタンパク質コンバターゼは、セクションを取り除いて酵素を活性化する。プロ−PCSK9は、分泌型の球状のセリンプロテアーゼであって、そのＮ末端プロ−ドメインを、PCSK9の強力な内在型阻害剤にタンパク質分解により自己プロセッシングすることができ、これは、その触媒部位を遮断する。コレステロール恒常性におけるPCSK9の役割は、医学的に利用されてきた。PCSK9を遮断する薬物は、低密度リポタンパク質コレステロール（LDL-C）の血液レベルを低下させることができる。最初の２つのPCSK9阻害剤、アリロクマブおよびエボロクマブは、コレステロールを低下させることについて２０１５年に米国食品医薬品局により承認されたが、スタチンおよび他の薬物は不十分であった。
【００６２】
「低密度リポタンパク質（LDL）」は、リポタンパク質の、最も低密度（より低い比重量の粒子）から最も高密度（より大きな比重量の粒子）までの５つの主要な群：カイロミクロン、超低密度リポタンパク質（VLDL）、低密度リポタンパク質（LDL）、中密度リポタンパク質（IDL）、および高密度リポタンパク質（HDL）のうちの１つを指す。リポタンパク質は、身体の中で細胞外液中で脂質（脂肪）を輸送し、それにより、脂肪が利用可能となり、受容体により媒介されるエンドサイトーシスを介して、体内で広く細胞により取り込まれることを促進する。リポタンパク質は、複数のタンパク質からなる複雑な粒子、典型的には８０〜１００個のタンパク質／粒子（LDLおよびより大きな粒子については単一のアポリポタンパク質Ｂにより構築される）である。単一のLDL粒子は、直径約２２０〜２７５オングストロームであり、典型的には、その内部に含まれる脂肪分子の数および混合物によりサイズが異なる３，０００〜６，０００個の脂肪分子／粒子を輸送する。運搬される脂質は、全ての脂肪分子を含み、コレステロール、リン脂質、およびトリグリセリドがドミナントである；各々の量は、相当に異なる。リポタンパク質は、血液から採取することができる。
【００６３】
いかなる特定の理論にも拘束されることは望まないが、LDL粒子は、それらが内皮に侵入して酸化された場合に、心血管疾患のリスクを提起する。なぜならば、酸化形態は、より容易にプロテオグリカンにより保持されるからである。複雑なセットの生化学反応が、LDL粒子の酸化を制御し、主に内皮における壊死細胞のデブリおよびフリーラジカルの存在により刺激される。LDL粒子の濃度の増大は、動脈壁内のアテローム動脈硬化の蓄積の速度の経時的な増大に強力に関連し、これは最終的に、何十年も後に、突然のプラーク破裂をもたらし、動脈の開口部内での凝結、または開口部の狭小化もしくは閉鎖、すなわち、心血管疾患、脳卒中、および他の血管疾患の合併症を引き起こす。
【００６４】
「低密度リポタンパク質（LDL）受容体」とは、８３９個のアミノ酸のモザイクタンパク質（２１アミノ酸のシグナルペプチドの除去の後で）であって、コレステロールリッチなLDL粒子のエンドサイトーシスを媒介するものを指す。それは、LDL粒子の外側のリン脂質層中に包埋されているアポタンパク質Ｂ１００を認識する細胞表面受容体である。受容体はまた、カイロミクロン残遺物およびVLDL残遺物（IDL）中で見出されるapoEタンパク質をも認識する。ヒトにおいて、LDL受容体タンパク質は、LDLR遺伝子によりコードされる。LDL受容体複合体は、細胞表面上のクラスリン被覆ピット（または芽（bud））において存在し、これは、アダプチンを介してLDL−コレステロールに結合した場合、摘まみ取られて細胞内でクラスリン被覆小胞を形成する。これが、LDL−コレステロールが結合して、エンドサイトーシスとして知られるプロセスにおいて内部移行することを可能にする。このプロセスは、全ての有核細胞において起こるが、主に肝臓において起こる。肝臓は、循環からのLDLのうちの約７０％を取り除く。
【００６５】
「誘導性のLDL受容体分解剤（IDOL）」とは、LDL受容体をエンドソームにおいてユビキチン化して、当該受容体を分解のためにリソソームのコンパートメントへと導く、ユビキチンリガーゼを指す。IDOLは、細胞内コレステロールの増大に応答して、LXR／RXRにより転写的に上方制御される。IDOLの薬理学的阻害は、血漿LDL受容体密度を増大させることにより、血漿LDLコレステロールを低下させることができる。
【００６６】
「アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ（APOC3）」とは、ヒトにおいてはAPOC3遺伝子によりコードされるタンパク質である。APOC3は、超低密度リポタンパク質（VLDL）の構成成分である。APOC3は、リポタンパク質リパーゼおよび肝臓リパーゼを阻害する。それはまた、トリグリセリドリッチな粒子の肝臓による取り込みを阻害すると考えられている。APOC3レベルの増大は、高トリグリセリド血症の発症を誘導する。最近のエビデンスは、脂質リッチな条件下において肝細胞からのトリグリセリドリッチなVLDL粒子の会合および分泌を促進することにおける、細胞内でのAPOC3の役割を示唆する。しかし、ヒトapoC3コード配列における２つの天然に存在する点変異、A23TおよびK58Eは、トリグリセリドリッチなVLDL粒子の細胞内での会合および肝細胞からの分泌を消失させることが示されている。
【００６７】
用語「Gamタンパク質」とは、本明細書において用いられる場合、一般に、二本鎖核酸（例えば、二本鎖DNA）の二本鎖切断部の１つ以上の末端に結合することができるタンパク質を指す。いくつかの態様において、Gamタンパク質は、二本鎖切断の部位において核酸の１つ以上の鎖の分解を防止または阻害する。いくつかの態様において、Gamタンパク質は、バクテリオファージMuからの天然に存在するGamタンパク質または天然に存在しないそのバリアントである。
【００６８】
用語「機能喪失型変異」または「不活化変異」とは、低い機能を有するかまたは機能を有さない（部分的にまたは完全に不活化されている）遺伝子生成物をもたらす変異を指す。対立遺伝子が機能の完全な喪失を有する場合（ヌル対立遺伝子）、それはしばしば、ミューラー型モルフスキーマにおいて、無形質変異と称される。かかる変異に関連する表現型は、ほとんどの場合は劣勢である。例外は、生物がハプロイドである場合、またはより少ない投与量の正常な遺伝子生成物が、正常な表現型のために十分でない場合（これは、ハプロ不全と称される）である。
【００６９】
用語「保護的変異」または「保護的バリアント」とは、野生型遺伝子に対して対立する効果または機能を有する遺伝子生成物をもたらす変異を指す。これはしばしば、ミューラー型モルフスキーマにおいて反形質変異と称される。かかる変異に関連する表現型は、ほとんどの場合は優性である。例外は、生物がハプロイドである場合、またはより少ない投与量の反形質遺伝子生成物が、野生型表現型を無効化するために十分でない場合である。
【００７０】
用語「機能獲得型変異」または「活性化変異」とは、その効果が、より強力になる（増強された活性化）か、または異なる異常な機能により取って代わられるように、遺伝子生成物を変更する変異を指す。機能獲得型変異はまた、新形質変異としても言及され得る。新たな対立遺伝子が作製される場合、新たに作製された対立遺伝子ならびにオリジナルを含むヘテロ接合体は、新たな対立遺伝子を発現し、当該変異を優性表現型として遺伝的に定義する。
【００７１】
「高コレステロール血症」は、脂質異常症とも称され、血中における高レベルのコレステロールの存在である。それは、高い血中脂質および「高リポタンパク血症」（血中のリポタンパク質のレベルの上昇）の形態である。血中の非HDLコレステロールおよびLDLのレベルの上昇は、食事、肥満、遺伝性の（遺伝子の）疾患（家族性高コレステロール血症におけるLDL受容体変異など）、または糖尿病および低活動性甲状腺などの他の疾患の存在の結果であり得る。
【００７２】
「低コレステロール血症」とは、血中の異常に低いレベルのコレステロールの存在を指す。高い総コレステロール（高コレステロール血症）の存在は、心血管疾患と相関するが、身体のコレステロールの産生の欠損もまた、有害な結果をもたらし得る。
【００７３】
用語「ゲノム」とは、細胞または生物の遺伝子材料を指す。それは、典型的には、DNA（またはRNAウイルスの場合にはRNA）を含む。ゲノムは、遺伝子、コード領域、非コードDNA、ならびにミトコンドリアおよび葉緑体のゲノムを含む。ゲノムは、典型的には、細胞または生物中に人工的に導入される遺伝子材料を含まず、例えば、細菌中にトランスフォームされるプラスミドは、細菌のゲノムの一部ではない。
【００７４】
「プログラミング可能なDNA結合タンパク質」とは、ゲノム中の任意の所望されるヌクレオチド配列を標的とするようにプログラミングすることができるDNA結合タンパク質を指す。DNA結合タンパク質を、所望されるヌクレオチド配列に結合するようにプログラミングするために、DNA結合タンパク質を、その結合特異性を変更するように修飾することができる；例えば、ジンクフィンガーDNA結合ドメイン、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、または転写活性化因子様エフェクタータンパク質（TALE）。ZFNは、ジンクフィンガーDNA結合ドメインをDNA切断ドメインに融合させることにより作製された人工制限酵素である。ジンクフィンガードメインは、所望される特異的なDNA配列を標的とするように操作することができ、このことは、ジンクフィンガーが、複雑なゲノム中のユニークな配列に結合することを可能にする。転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）は、DNAの特異的な配列を切断するように操作することができる、操作された制限酵素である。これらは、TALエフェクターDNA結合ドメインをヌクレアーゼドメイン（例えばFok1）に融合させることにより作製される。転写活性化因子様エフェクター（TALE）は、特に任意の所望されるDNA配列に結合するように、操作することができる。当業者は、ZFNおよびTALEをプログラミングするための方法に精通している。例えば、かかる方法は、Maeder, et al., Mol. Cell 31（2）：294-301, 2008；Carroll et al., Genetics Society of America, 188（4）：773-782, 2011；Miller et al., Nature Biotechnology 25（7）：778-785, 2007；Christian et al., Genetics 186（2）：757-61, 2008；Li et al., Nucleic Acids Res. 39（1）：359-372, 2010；およびMoscou et al., Science 326（5959）：1501, 2009において記載され、これらの各々は、本明細書において参考として援用される。
【００７５】
「ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質」とは、DNAに結合することができるタンパク質、ポリペプチド、またはドメインを指し、その標的DNA配列への結合は、ガイドヌクレオチド配列により媒介される。したがって、ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質は、ガイドヌクレオチド配列に結合することが理解される。「ガイドヌクレオチド」は、標的配列に対して相補的であり、DNA結合タンパク質を標的配列に誘導することができる、RNAまたはDNA分子（例えば、単鎖DNAまたはssDNA分子）であってよい。したがって、ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質は、RNAによりプログラミング可能なDNA結合タンパク質（例えばCas9タンパク質）、またはssDNAによりプログラミング可能なDNA結合タンパク質（例えばアルゴノートタンパク質）であってよい。「プログラミング可能」とは、DNA結合タンパク質を、ガイドヌクレオチドが標的とする任意のDNA配列に結合するようにプログラミングすることができることを意味する。例示的なガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質として、これらに限定されないが、Cas9（例えば、dCas9およびnCas9）、saCas9（例えば、saCas9d、saCas9d、saKKH Cas9）CasX、CasY、Cpf1、C2c1、C2c2、C2c3、アルゴノート、および本明細書において記載される任意の他の好適なタンパク質、またはそのバリアントが挙げられる。
【００７６】
いくつかの態様において、ガイドヌクレオチド配列は、単一のヌクレオチド分子として存在し、以下の２つのドメインを含む：（１）標的核酸に対する相同性を共有するドメイン（例えば、そしてガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質の標的への結合を指揮する）；および（２）ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質に結合するドメイン。いくつかの態様において、ドメイン（２）は、tracrRNAとして知られる配列に対応し、ステムループ構造を含む。例えば、いくつかの態様において、ドメイン（２）は、Jinek et al., Science 337：816-821（2012）において提供されるようなtracrRNAと同一であるかまたはこれと相同であり、これは本明細書において参考として援用される。gRNAの他の例（例えば、ドメイン２を含むもの）は、米国特許出願公開US20160208288および米国特許出願公開US20160200779において見出すことができ、これらの各々は、本明細書において参考として援用される。
【００７７】
ガイドヌクレオチド配列は、標的DNA配列にハイブリダイズするので、ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質は、原則的に、ガイドヌクレオチド配列に対して相補的な任意の配列に対して特異的に結合することができる。Cas9などのガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質を部位特異的切断のために（例えば、ゲノムを修飾するために）用いる方法は、当該分野において公知である（例えば、Cong, L. et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339, 819-823（2013）；Mali, P. et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 339, 823-826（2013）；Hwang, W.Y. et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature biotechnology 31, 227-229（2013）；Jinek, M. et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife 2, e00471（2013）；Dicarlo, J.E. et al. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic acids research（2013）；Jiang, W. et al. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature biotechnology 31, 233-239（2013）を参照；これらの各々は、本明細書において参考として援用される）。
【００７８】
本明細書において用いられる場合、用語「Cas9」または「Cas9ヌクレアーゼ」とは、Cas9タンパク質、そのフラグメント、またはバリアントを含む、RNAガイド型ヌクレアーゼを指す。Cas9ヌクレアーゼはまた、ときにcasn1ヌクレアーゼまたはCRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeat）関連ヌクレアーゼとも言及される。CRISPRは、可動性（mobile）遺伝子エレメント（ウイルス、転位性エレメント、および接合型プラスミド）に対する防御を提供する適応免疫システムである。CRISPRクラスターは、スペーサー、前駆（antecedent）可動性エレメントに相補的な配列、および核酸に侵入する標的（target invading nucleic acids）を含有する。CRISPRクラスターは、転写されプロセシングされてCRISPR RNA（crRNA）になる。ＩＩ型CRISPRシステムにおいて、プレcrRNA（pre-crRNA）の正しいプロセシングは、トランスにコードされた小型RNA（trans-encoded small RNA）（tracrRNA）、内在性リボヌクレアーゼ３（rnc）、およびCas9タンパク質を要求する。tracrRNAは、リボヌクレアーゼ３に補助される（aided）プレcrRNAのプロセシングのためのガイドとして働く。その後、Cas9／crRNA／tracrRNAは、スペーサーに相補的な直鎖状または環状のdsDNA標的を、エンドヌクレアーゼにより（endonucleolytically）切断する。crRNAに相補的ではない標的鎖は、先ずエンドヌクレアーゼにより切られ、次いで３’−５’エキソヌクレアーゼにより（exonucleolytically）トリミングされる。自然界において、DNA結合およびＤＮＡ切断は、典型的には、タンパク質および両方のRNAを要求する。しかしながら、単一のガイドGNRA（「sgRNA」または単に「gRNA」）は、crRNAとtracrRNAとの両面を単一のGNRA種に組み込むように操作され得る。例えば、Jinek et al., Science 337：816-821（2012）を参照；これは、本明細書において参考として援用される。
【００７９】
Cas9ヌクレアーゼの配列および構造は、当業者に周知である（例えば、Ferretti et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 98：4658-4663（2001）；Deltcheva E. et al., Nature 471：602-607（2011）；およびJinek et al., Science 337：816-821（2012）を参照；これらの各々は、本明細書において参考として援用される）。Cas9のオルトログは、限定されないがS. pyogenesおよびS. thermophilusを含む多様な種において記載されている。さらなる好適なCas9ヌクレアーゼおよび配列は、本開示に基づいて当業者に明らかとなり、かかるCas9ヌクレアーゼおよび配列は、Chylinski et al.,（2013）RNA Biology 10：5, 726-737において開示される生物および遺伝子座からのCas9配列を含む；これらは、本明細書において参考として援用される。いくつかの態様において、野生型Cas9は、Streptococcus pyogenesからのCas9に対応する（ＮＣＢＩ参照配列：NC_002737.2、配列番号５（ヌクレオチド）；およびUniport参照配列：Q99ZW2、配列番号１（アミノ酸）。
Streptococcus pyogenes Cas9（野生型）ヌクレオチド配列
【数１−１】
2020503027.tif 000003
【数１−２】
2020503027.tif 000004
【数１−３】
2020503027.tif 000005
（配列番号５）
Streptococcus pyogenes Cas9（野生型）タンパク質配列
【数２】
2020503027.tif 000006
（配列番号１）（一重下線：HNHドメイン；二重下線：RuvCドメイン）
【００８０】
いくつかの態様において、野生型Cas9は、Streptococcus pyogenesからのCas9に対応する（ＮＣＢＩ参照配列：NC_017053.1、配列番号２００３（ヌクレオチド）；配列番号２００４（アミノ酸））：
【数３−１】
2020503027.tif 000007
【数３−２】
2020503027.tif 000008
（配列番号２００３）
【数４−１】
2020503027.tif 000009
【数４−２】
2020503027.tif 000010
（配列番号２００４）（一重下線：HNHドメイン；二重下線：RuvCドメイン）
【００８１】
いくつかの態様において、野生型Cas9は、Streptococcus pyogenesからのCas9に対応するか、またはこれを含む（配列番号２００５（ヌクレオチド）および／または配列番号２００６（アミノ酸））：
【数５−１】
2020503027.tif 000011
【数５−２】
2020503027.tif 000012
（配列番号２００５）
【数６−１】
2020503027.tif 000013
【数６−２】
2020503027.tif 000014
（配列番号２００６）（一重下線：HNHドメイン；二重下線：RuvCドメイン）
【００８２】
いくつかの態様において、野生型Cas9は、Streptococcus AureusからのCas9に対応する。
S. aureus Cas9野生型（配列番号６）
【数７】
2020503027.tif 000015
（配列番号６）
【００８３】
いくつかの態様において、野生型Cas9は、Streptococcus thermophilusからのCas9に対応する。
Streptococcus thermophilus野生型CRISPR3 Cas9（St3Cas9）
【数８】
2020503027.tif 000016
（配列番号７）
Streptococcus thermophilus CRISPR1 Cas9野生型（St1Cas9）
【数９−１】
2020503027.tif 000017
【数９−２】
2020503027.tif 000018
（配列番号８）
【００８４】
いくつかの態様において、Cas9は：Corynebacterium ulcerans（NCBI Refs：NC_015683.1、NC_017317.1）；Corynebacterium diphtheria（NCBI Refs：NC_016782.1、NC_016786.1）；Spiroplasma syrphidicola（NCBI Ref：NC_021284.1）；Prevotella intermedia（NCBI Ref：NC_017861.1）；Spiroplasma taiwanense（NCBI Ref：NC_021846.1）；Streptococcus iniae（NCBI Ref：NC_021314.1）；Belliella baltica（NCBI Ref：NC_018010.1）；Psychroflexus torquisl（NCBI Ref：NC_018721.1）；Listeria innocua（NCBI Ref：NP_472073.1）、Campylobacter jejuni（NCBI Ref：YP_002344900.1）、もしくはNeisseria meningitidis（NCBI Ref：YP_002342100.1）からのCas9、または例１（配列番号１１〜２６０）において列記される任意の他の生物からのCas9を言う。
【００８５】
いくつかの態様において、Cas9のフラグメントを含むタンパク質が提供される。例えば、いくつかの態様において、タンパク質は、２つのCas9ドメイン：（１）Cas9のgRNA結合ドメイン；または（２）Cas9のDNA切断ドメインのうちの１つを含む。いくつかの態様において、Cas9またはそのフラグメントを含むタンパク質は、「Cas9バリアント」として言及される。Cas9バリアントは、Cas9またはそのフラグメントに対して相同性を共有する。例えば、Cas9バリアントは、野生型Cas9に対して、少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、少なくとも約９９．５％同一、または少なくとも約９９．９％同一である。いくつかの態様において、Cas9バリアントは、野生型Cas9と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０個、またはそれより多くのアミノ酸の変更を有していてもよい。いくつかの態様において、Cas9バリアントは、Cas9のフラグメント（例えば、gRNA結合ドメインまたはDNA切断ドメイン）を、当該フラグメントが、野生型Cas9の対応するフラグメントに対して少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、少なくとも約９９．５％同一、または少なくとも約９９．９％同一であるように、含む。いくつかの態様において、フラグメントは、対応する野生型Cas9のアミノ酸の長さのうちの、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％である。いくつかの態様において、フラグメントは、少なくとも１００アミノ酸の長さである。いくつかの態様において、フラグメントは、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも５００、少なくとも５５０、少なくとも６００、少なくとも６５０、少なくとも７００、少なくとも７５０、少なくとも８００、少なくとも８５０、少なくとも９００、少なくとも９５０、少なくとも１０００、少なくとも１０５０、少なくとも１１００、少なくとも１１５０、少なくとも１２００、少なくとも１２５０、または少なくとも１３００アミノ酸の長さである。
【００８６】
本開示の融合タンパク質においてガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメインとして用いられるために、Cas9タンパク質は、ヌクレアーゼ不活性である必要がある。ヌクレアーゼ不活性型Cas9タンパク質は、交換可能に「dCas9」タンパク質として言及され得る（ヌクレアーゼ「不活性型（dead）」Cas9であるため）。不活性なDNA切断ドメインを有するCas9タンパク質（またはそのフラグメント）を作製するための方法は、公知である（例えば、Jinek et al., Science. 337：816-821（2012）；Qi et al.,（2013）Cell. 28；152（5）：1173-83を参照；これらの各々は、本明細書において参考として援用される）。例えば、Cas9のDNA切断ドメインは、２つのサブドメイン、HNHヌクレアーゼサブドメインおよびRuvC1サブドメインを含むことが知られている。HNHサブドメインは、gRNAに対して相補的な鎖を切断し、一方、RuvC1サブドメインは、非相補鎖を切断する。これらのサブドメイン中の変異により、Cas9のヌクレアーゼ活性をサイレンシングすることができる。例えば、変異Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａは、S. pyogenes Cas9のヌクレアーゼ活性を完全に不活化する（Jinek et al., Science. 337：816-821（2012）；Qi et al., Cell. 28；152（5）：1173-83（2013））。
dCas9（Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａ）
【数１０−１】
2020503027.tif 000019
【数１０−２】
2020503027.tif 000020
（配列番号２）（一重下線：HNHドメイン；二重下線：RuvCドメイン）。
【００８７】
本開示のdCas9は、完全に不活性なCas9または部分的に不活性なCas9を包含する。例えば、dCas9が、不活化された２つのヌクレアーゼドメインのうちの一方を有する一方で、他方のヌクレアーゼドメインは活性なままであってもよい。かかる部分的に活性なCas9はまた、ターゲティングされたDNA配列の一方の鎖を切断するその能力に起因して、「Cas9ニッカーゼ」としても言及され得る。本開示による使用のために好適なCas9ニッカーゼは、活性なHNHドメインおよび不活性なRuvCドメインを有し、標的DNAの鎖のうちsgRNAにより結合されているもののみを切断することができる（これは、シチジン脱アミノ化を介して編集される鎖の反対の鎖である）。本開示のCas9ニッカーゼは、RuvCドメインを不活化する変異、例えばＤ１０Ａ変異を含んでもよい。RuvCドメインを不活化する任意の変異、例えば、RuvCドメインにおける挿入、欠失、または単一もしくは複数のアミノ酸置換が、Cas9ニッカーゼ中に含まれ得ることが理解されるべきである。本明細書において記載されるCas9ニッカーゼにおいて、RuvCドメインが不活化されている一方で、HNHドメインは活性なままである。したがって、Cas9ニッカーゼは、RuvCドメインを不活化する変異（例えばＤ１０Ａ）以外の変異を含んでもよいが、一方で、それらの変異は、HNHドメインの活性に影響を及ぼさない。非限定的なCas9ニッカーゼの例において、位置８４０におけるヒスチジンは、不変のままである。本開示のために好適な例示的なCas9ニッカーゼの配列を、以下に提供する。
S. pyogenes Cas9ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）
【数１１−１】
2020503027.tif 000021
【数１１−２】
2020503027.tif 000022
（配列番号３）（一重下線：HNHドメイン；二重下線：RuvCドメイン）
S. aureus Cas9ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）
【数１２】
2020503027.tif 000023
（配列番号４）
【００８８】
用語「dCas9」または「ヌクレアーゼ不活性型Cas9」が本明細書において用いられる場合、それは、HNHおよびRuvCドメインの両方において不活性であるCas9バリアントならびにCas9ニッカーゼを指すことが理解される。例えば、本開示において用いられるdCas9は、配列番号２または配列番号３において記載されるアミノ酸配列を含んでもよい。いくつかの態様において、dCas9は、RuvCまたはHNHドメインを不活化する他の変異を含んでもよい。Cas9を不活化するさらなる好適な変異は、本開示および当該分野における知識に基づいて当業者には明らかとなり、本開示の範囲内である。かかるさらなる例示的な好適なヌクレアーゼ不活性型Cas9ドメインとして、これらに限定されないが、Ｄ８３９Ａおよび／またはＮ８６３Ａ（例えば、Prashant et al., Nature Biotechnology. 2013；31（9）：833-838を参照；これは、本明細書において参考として援用される）、またはＫ６０３Ｒ（例えば、Chavez et al., Nature Methods 12, 326-328, 2015を参照；これは、本明細書において参考として援用される）が挙げられる。用語、Cas9、dCas9、またはCas9のバリアントはまた、任意の生物からのCas9、dCas9、またはCas9のバリアントを包含する。また理解されるのは、任意の生物からのdCas9、Cas9ニッカーゼ、または他の適切なCas9バリアントを、本開示により用いることができることである。
【００８９】
「デアミナーゼ」とは、例えば加水分解を通して、分子からのアミン基の除去、または脱アミノ化を触媒する酵素を指す。いくつかの態様において、デアミナーゼは、それぞれ、シチジン（Ｃ）からウリジン（Ｕ）への、デオキシシチジン（ｄＣ）からデオキシウリジン（ｄＵ）への、または５−メチル−シチジンからチミジン（Ｔ、５−メチル−Ｕ）への脱アミノ化を触媒する、シチジンデアミナーゼである。その後のDNA修復機構は、Komor et al（Nature, Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage, 533, 420-424（2016）；これは、本明細書において参考として援用される）において記載されるとおり、ｄＵが確実にＴにより置き換えられるようにする。いくつかの態様において、デアミナーゼは、シトシンからウラシル（例えばRNAにおいて）またはチミン（例えばDNAにおいて）への変換を触媒および促進するシトシンデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼは、ヒト、チンパンジー、ゴリラ、サル、ウシ、イヌ、ラットまたはマウスなどの生物からの天然に存在するデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼは、生物からの天然に存在するデアミナーゼのバリアントであり、当該バリアントは、天然には存在しない。例えば、いくつかの態様において、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、生物からの天然に存在するデアミナーゼに対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一である。
【００９０】
「シトシンデアミナーゼ」とは、化学反応「シトシン＋Ｈ２Ｏ＜−＞ウラシル＋ＮＨ３」または「５−メチル−シトシン＋Ｈ２Ｏ＜−＞チミン＋ＮＨ３」を触媒する酵素を指す。反応式から明らかであり得るとおり、かかる化学反応は、ＣからＵ／Ｔへの核酸塩基変更をもたらす。遺伝子に関して、かかるヌクレオチド変更または変異は、次いで、タンパク質におけるアミノ酸変更をもたらし得、これは、タンパク質の機能に、例えば、機能喪失型または機能獲得型の影響を及ぼし得る。その後のDNA修復機構は、Komor et al.（Nature, Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage, 533, 420-424（2016）；これは、本明細書において参考として援用される）において記載されるとおり、DNA中のウラシル塩基が確実にＴにより置き換えられるようにする。
【００９１】
シトシンデアミナーゼの１つの例示的な好適なクラスは、制御された有益な様式において変異誘発を開始させるために役立つ１１個のタンパク質を包含する、シトシンデアミナーゼのアポリポタンパク質Ｂ−mRNA編集複合体（apolipoprotein B mRNA-editing complex：APOBEC）ファミリーである。アポリポタンパク質Ｂ編集複合体３（APOBEC3）酵素は、ヒト細胞に、逆転写されたウイルスssDNAにおけるシトシンの脱アミノ化を介して、特定のHIV-1株に対する保護を提供する。これらのシトシンデアミナーゼは、全て、触媒活性のために、Ｚｎ２＋配位モチーフ（Ｈｉｓ−Ｘ−Ｇｌｕ−Ｘ２３−２６−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｘ２−４−Ｃｙｓ；配列番号１９９６）および結合した水分子を必要とする。グルタミン酸残基は、脱アミノ化反応における求核攻撃のために水分子を水酸化亜鉛に対して活性化するように作用する。各々のファミリーメンバーは、その特定の「ホットスポット（hotspot）」、例えば、hAIDについてはＷＲＣ（ＷはＡまたはＴであり、ＲはＡまたはＧである）、またはhAPOBEC3FについてはＴＴＣにおいて優先的に脱アミノ化する。最近のAPOBEC3Gの触媒ドメインの結晶構造は、６本のαヘリックスに挟まれた５本鎖βシートコアを含む二次構造を明らかにし、これは、ファミリー全体にわたり保存されていると考えられる。活性な中心ループが、ssDNA結合および「ホットスポット」のアイデンティティーを決定することの両方の原因であることが示されている。これらの酵素の過剰発現は、ゲノム不安定性およびがんに関連付けられており、したがって、配列特異的なターゲティングの重要性を強調している。別の好適なシトシンデアミナーゼは、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（AID）であり、これは、転写依存的な、鎖に偏りがある様式においてssDNAにおけるシトシンをウラシルに変換することにより、抗体の成熟の原因となる。
【００９２】
用語「塩基エディター」または「核酸塩基エディター」とは、本明細書において用いられる場合、広く、本明細書において記載される融合タンパク質のうちのいずれかを指す。いくつかの態様において、核酸塩基エディターは、標的塩基を、それを異なる塩基に変換するように正確に脱アミノ化することができ、例えば、塩基エディターは、核酸配列中のＣ塩基を標的として、ＣをＴ塩基に変換することができる。いくつかの態様において、塩基エディターは、シチジンデアミナーゼに融合した、Cas9（例えば、dCas9およびnCas9）、CasX、CasY、Cpf1、C2c1、C2c2、C2c3、またはアルゴノートタンパク質を含む。例えば、いくつかの態様において、塩基エディターは、シトシンデアミナーゼ−dCas9融合タンパク質であってよい。いくつかの態様において、塩基エディターは、シトシンデアミナーゼ−Cas9ニッカーゼ融合タンパク質であってよい。いくつかの態様において、塩基エディターは、デアミナーゼ−dCas9−UGI融合タンパク質であってよい。いくつかの態様において、塩基エディターは、UGI−デアミナーゼ−dCas9融合タンパク質であってよい。いくつかの態様において、塩基エディターは、UGI−デアミナーゼ−Cas9ニッカーゼ融合タンパク質であってよい。いくつかの態様において、塩基エディターは、APOBEC1−dCas9−UGI融合タンパク質であってよい。いくつかの態様において、塩基エディターは、APOBEC1−Cas9ニッカーゼ−UGI融合タンパク質であってよい。いくつかの態様において、塩基エディターは、APOBEC1−dCpf1−UGI融合タンパク質であってよい。いくつかの態様において、塩基エディターは、APOBEC1−dNgAgo−UGI融合タンパク質であってよい。いくつかの態様において、塩基エディターは、シチジンデアミナーゼに融合したCasXタンパク質を含む。いくつかの態様において、塩基エディターは、シチジンデアミナーゼに融合したCasYタンパク質を含む。いくつかの態様において、塩基エディターは、シチジンデアミナーゼに融合したCpf1タンパク質を含む。いくつかの態様において、塩基エディターは、シチジンデアミナーゼに融合したC2c1タンパク質を含む。いくつかの態様において、塩基エディターは、シチジンデアミナーゼに融合したC2c2タンパク質を含む。いくつかの態様において、塩基エディターは、シチジンデアミナーゼに融合したC2c3タンパク質を含む。いくつかの態様において、塩基エディターは、シチジンデアミナーゼに融合したアルゴノートタンパク質を含む。いくつかの態様において、本明細書において記載される融合タンパク質は、Gamタンパク質、ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質、およびシチジンデアミナーゼドメインを含む。いくつかの態様において、塩基エディターは、シチジンデアミナーゼに融合したCasXタンパク質に融合したGamタンパク質を含む。いくつかの態様において、塩基エディターは、シチジンデアミナーゼに融合したCasYタンパク質に融合したGamタンパク質を含む。いくつかの態様において、塩基エディターは、シチジンデアミナーゼに融合したCpf1タンパク質に融合したGamタンパク質を含む。いくつかの態様において、塩基エディターは、シチジンデアミナーゼに融合したC2c1タンパク質に融合したGamタンパク質を含む。いくつかの態様において、塩基エディターは、シチ���ンデアミナーゼに融合したC2c2タンパク質に融合したGamタンパク質を含む。いくつかの態様において、塩基エディターは、シチジンデアミナーゼに融合したC2c3タンパク質に融合したGamタンパク質を含む。いくつかの態様において、塩基エディターは、シチジンデアミナーゼに融合したアルゴノートタンパク質に融合したGamタンパク質を含む。いくつかの態様において、塩基エディターは、シチジンデアミナーゼに融合したsaCas9タンパク質に融合したGamタンパク質を含む。本明細書において記載される核酸塩基エディターの非限定的な例示的な配列を、例１、配列番号２９３〜３０２において提供する。かかる核酸塩基エディターおよびゲノム編集のためにそれらを用いる方法は、当該分野において、例えば、米国特許9,068,179、米国特許出願公開US 20150166980、US20150166981、US20150166982、US20150166984およびUS20150165054、ならびに米国仮出願、U.S.S.N. 62/245,828、62/279,346、62/311,763、62/322,178、62/357,352、62/370,700および62/398,490において、ならびにKomor et al., Nature, Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage, 533, 420-424（2016）において記載されており、これらの各々は、本明細書において参考として援用される。
【００９３】
用語「標的部位」または「標的配列」とは、核酸分子（例えばDNA分子）中の、本明細書において提供される融合タンパク質により脱アミノ化される配列を指す。いくつかの態様において、標的配列は、ポリヌクレオチド（例えばDNA）であり、ここで、ポリヌクレオチドは、コード鎖および相補鎖を含む。 「コード鎖」および「相補鎖」の意味は、本明細書において用いられる場合、当該分野における当該用語の一般的な意味と同じである。いくつかの態様において、標的配列は、哺乳動物のゲノムにおける配列である。いくつかの態様において、標的配列は、ヒトのゲノムにおける配列である。いくつかの態様において、標的配列は、非ヒト動物のゲノムにおける配列である。用語「標的コドン」とは、塩基エディターにより編集され、脱アミノ化を介して異なるコドンに変換される、アミノ酸コドンを指す。用語「標的塩基」とは、塩基エディターにより編集され、脱アミノ化を介して異なる塩基に変換されるヌクレオチド塩基を指す。いくつかの態様において、コード鎖中の標的コドンが編集される（例えば、脱アミノ化される）。いくつかの態様において、相補鎖中の標的コドンが編集される（例えば、脱アミノ化される）。
【００９４】
用語「ウラシルグリコシラーゼ阻害剤」または「UGI」とは、本明細書において用いられる場合、ウラシル−DNAグリコシラーゼ塩基除去修復酵素を阻害することができるタンパク質を指す。
【００９５】
用語「リンカー」とは、本明細書において用いられる場合、２つの分子または部分、例えば融合タンパク質の２つのドメイン、例えば、ヌクレアーゼ不活性型Cas9ドメインおよび核酸編集ドメイン（例えばデアミナーゼドメイン）などを連結する化学基または分子を指す。いくつかの態様において、リンカーは、RNAによりプログラミング可能なヌクレアーゼのgRNA結合ドメイン（Cas9ヌクレアーゼドメインを含む）と、核酸編集ドメイン（例えばデアミナーゼドメイン）の触媒ドメインとを連結する。いくつかの態様において、リンカーは、RNAによりプログラミング可能なヌクレアーゼ（例えばCas9）のgRNA結合ドメインとGamタンパク質とを連結する。いくつかの態様において、リンカーは、RNAによりプログラミング可能なヌクレアーゼ（例えばCas9）のgRNA結合ドメインとUGIドメインとを連結する。いくつかの態様において、リンカーは、UGIドメインとGamタンパク質とを連結する。いくつかの態様において、リンカーは、核酸編集ドメイン（例えばデアミナーゼドメイン）の触媒ドメインとUGIドメインとを連結する。いくつかの態様において、リンカーは、核酸編集ドメイン（例えばデアミナーゼドメイン）の触媒ドメインとGamタンパク質とを連結する。典型的には、リンカーは、２つの基、分子、ドメイン、または他の部分の間に位置するか、これらに隣接し、共有結合を介して各々に連結し、それにより２つを連結する。いくつかの態様において、リンカーは、アミノ酸または複数のアミノ酸（例えば、ペプチドまたはタンパク質）である。いくつかの態様において、リンカーは、有機の分子、基、ポリマー（例えば、非天然のポリマー、非ペプチド性ポリマー）、または化学部分である。いくつかの態様において、リンカーは、２〜１００アミノ酸長、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、４５〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、１００〜１５０、または１５０〜２００アミノ酸長である。より長いまたはより短いリンカーもまた、企図される。
【００９６】
本明細書において用いられる用語「変異」は、別の残基による配列、例えば核酸もしくはアミノ酸配列中の残基の置換、または配列中の１つ以上の残基の欠失もしくは挿入を言う。典型的には、本明細書において、変異は、元々の残基、次に配列中における残基の位置および新たに置換された残基のアイデンティティーを同定することによって記載される。本明細書において提供されるアミノ酸置換（変異）を作るための種々の方法は当分野において周知であり、例えばGreen and Sambrook, Molecular Cloning：A Laboratory Manual (4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012))によって提供されている。
【００９７】
本明細書において用いられる用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、核酸塩基と酸部分とを含む化合物、例えば、ヌクレオシド、ヌクレオチド、またはヌクレオチドのポリマーを言う。典型的には、ポリマー核酸、例えば３つ以上のヌクレオチドを含む核酸分子は直鎖状分子であり、その中の隣接するヌクレオチド同士はホスホジエステル結合によって違いにリンクされている。いくつかの態様において、「核酸」は個々の核酸残基を言う（例えば、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシド）。いくつかの態様において、「核酸」は、３つ以上の個々のヌクレオチド残基を含むオリゴヌクレオチド鎖を言う。本明細書において用いられる用語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチドのポリマー（例えば、ひとつながりの少なくとも３ヌクレオチド）を言うために交換可能に用いられ得る。いくつかの態様において、「核酸」はRNAならびに一本および／または二本鎖DNAを包摂する。核酸は、天然に、例えばゲノム、転写物、mRNA、tRNA、rRNA、siRNA、snRNA、プラスミド、コスミド、染色体、染色分体、または他の天然に存在する核酸分子の文脈で存在し得る。他方で、核酸分子は、天然に存在しない分子、例えば、組換体DNAもしくはRNA、人工染色体、操作されたゲノム、またはその断片、あるいは合成DNA、RNA、DNA/RNAハイブリッドであり得、あるいは、天然に存在しないヌクレオチドまたはヌクレオシドを包含する。さらにその上に、用語「核酸」、「DNA」、「RNA」、および／または類似の用語は、核酸アナログ、例えばホスホジエステル骨格以外を有するアナログを包含する。核酸は、天然のソースから精製、組換発現システムを用いて産生および任意に精製、化学合成などされ得る。適切なところでは、例えば化学合成された分子のケースにおいては、核酸は、ヌクレオシドアナログ、例えば化学修飾された塩基または糖を有するアナログ、および骨格改変を含み得る。核酸配列は、別様に示されない限り５’から３’方向に提示される。いくつかの態様において、核酸は、天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン）；ヌクレオシドアナログ（例えば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、および２−チオシチジン）；化学修飾された塩基；生物学的に改変された塩基（例えば、メチル化塩基）；インターカレーションされた塩基；修飾された糖（例えば、２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）；および／または修飾されたリン酸基（例えば、ホスホロチオエートおよび５’−Ｎ−ホスホロアミダイト結合）であるか、またはそれを含む。
【００９８】
用語「タンパク質」、「ペプチド」、および「ポリペプチド」は本明細書においては交換可能に用いられ、ペプチド（アミド）結合によって一緒にリンクされたアミノ酸残基のポリマーを言う。用語は、いずれかのサイズ、構造、または機能のタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドを言う。典型的には、タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは少なくとも３アミノ酸の長さであろう。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、個々のタンパク質またはタンパク質のコレクションを言い得る。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチド中のアミノ酸の１つ以上は、例えば、化学的実体、例えば炭水化物基、ヒドロキシル基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、コンジュゲーション、官能化、または他の改変のためのリンカーなどの追加によって改変され得る。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、単分子でもまたあり得、または多分子複合体であり得る。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、天然に存在するタンパク質またはペプチドの単に断片であり得る。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、天然に存在、組換体、もしくは合成、またはそのいずれかの組み合わせであり得る。本明細書において用いられる用語「融合タンパク質」は、少なくとも２つの異なるタンパク質からのタンパク質ドメインを含むハイブリッドポリペプチドを言う。１つのタンパク質は、融合タンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）部分またはカルボキシ末端（Ｃ末端）部分（protein）に位置し得、それゆえにそれぞれ「アミノ末端融合タンパク質」または「カルボキシ末端融合タンパク質」を形成する。タンパク質は、異なるドメイン、例えば、核酸編集タンパク質の核酸結合ドメイン（例えば、標的部位へのタンパク質の結合を導くCas9のgRNA結合ドメイン）および核酸切断ドメインまたは触媒ドメインを含み得る。いくつかの態様において、タンパク質は、核酸、例えばRNAとの複合体であるか、またはそれと会合している。本明細書において提供されるタンパク質のいずれかは、当分野において公知のいずれかの方法によって産生され得る。例えば、本明細書において提供されるタンパク質は組換体タンパク質発現および精製によって産生され得、これはペプチドリンカーを含む融合タンパク質に特に適している。組換体タンパク質発現および精製のための方法は周知であり、Green and Sambrook, Molecular Cloning：A Laboratory Manual (4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012))に記載されているものを包含し、これは参照によって本明細書に組み込まれる。
【００９９】
用語「対象」とは、本明細書において用いられる場合、個々の生物、例えば、個々の哺乳動物を指す。いくつかの態様において、対象は、ヒトである。いくつかの態様において、対象は、非ヒト哺乳動物である。いくつかの態様において、対象は、非ヒト霊長類である。いくつかの態様において、対象は、げっ歯類（例えば、マウス、ラット）である。いくつかの態様において、対象は、家畜化された動物である。いくつかの態様において、対象は、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ネコまたはイヌである。いくつかの態様において、対象は、研究動物である。いくつかの態様において、対象は、遺伝子操作された、例えば、遺伝子操作された非ヒト対象である。対象は、いずれの性別であってもよく、発達の任意の段階であってよい。
【０１００】
タンパク質または核酸の文脈において本明細書において用いられる用語「組換体」は、天然に存在せず、ヒトによる操作の産物であるタンパク質または核酸を言う。例えば、いくつかの態様において、組換体タンパク質または核酸分子は、いずれかの天然に存在する配列と比較して少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、または少なくとも７つの変異を含むアミノ酸またはヌクレオチド配列を含む。本明細書において記載される融合タンパク質（例えば塩基エディター）は、組み換えにより作製される。当業者は、組み換え技術に精通している。
【０１０１】
「イントロン」とは、最終的なRNA生成物の成熟化の間にRNAスプライシングにより取り除かれる、遺伝子中の任意のヌクレオチド配列を指す。用語、イントロンとは、遺伝子中のDNA配列、およびRNA転写物中の対応する配列の両方を指す。RNAスプライシングの後で最終的な成熟RNA中で一緒に連結される配列は、エクソンである。イントロンは、ほとんどの生物および多くのウイルスの遺伝子中で見出され、タンパク質を生成するもの、リボソームRNA（rRNA）、およびトランスファーRNA（tRNA）を含む広範な遺伝子において位置を特定することができる。イントロンを含む遺伝子からタンパク質が生成される場合、転写の後かつ翻訳の前のRNAのプロセッシング経路の一部として、RNAスプライシングが起こる。
【０１０２】
「エクソン」とは、RNAスプライシングによりイントロンが取り除かれた後にその遺伝子により産生される最終的な成熟RNAの一部となるであろう、遺伝子の任意の部分を指す。用語、エクソンとは、遺伝子中のDNA配列、およびRNA転写物中の対応する配列の両方を指す。RNAスプライシングにおいて、イントロンは取り除かれ、エクソンは、成熟メッセンジャーRNAを生成することの一部として、共有結合により互いに連結される。
【０１０３】
「スプライシング」とは、新たに合成されたメッセンジャーRNA転写物（また一次mRNA転写物としても言及される）のプロセッシングを指す。スプライシングの後で、イントロンは取り除かれて、エクソンは、デコートされてタンパク質に翻訳される完全なオープンリーディングフレームを含む成熟mRNA分子を形成するために、一緒に連結される（ライゲーションされる）。核でコードされる遺伝子について、スプライシングは、核内において、転写と同時に、または転写の直後に起こる。RNAスプライシングの分子機構は、例えば、Pagani et al., Nature Reviews Genetics 5, 389-396, 2004；Clancy et al., Nature Education 1（1）：31, 2011；Cheng et al., Molecular Genetics and Genomics 286（5-6）：395-410, 2014；Taggart et al., Nature Structural & Molecular Biology 19（7）：719-2, 2012において広範に記載されており、これらの各々の内容は、本明細書において参考として援用される。当業者は、RNAスプライシングの機構に精通している。
【０１０４】
「選択的スプライシング」とは、複数のタンパク質をコードする単一の遺伝子をもたらす遺伝子発現の間の制御されたプロセスを指す。このプロセスにおいて、遺伝子の特定のエクソンを、その遺伝子から産生される最終的なプロセッシングされたメッセンジャーRNA（mRNA）中に含めるかまたはこれから除外することができる。その結果、選択的にスプライシングされたmRNAから翻訳されるタンパク質は、それらのアミノ酸配列において、およびしばしばそれらの生物学的機能において差異を含む。注目すべきことに、選択的スプライシングは、ヒトゲノムが、その２０，０００個のタンパク質をコードする遺伝子から予測されるよりも多くのタンパク質の合成を指揮することを可能にする。選択的スプライシングは、ときにまた、ディファレンシャルスプライシングとも称される。選択的スプライシングは、真核生物における正常な現象として起こり、ここでそれは、ゲノムによりコードされ得るタンパク質の生物多様性を著しく増大する；ヒトにおいては、多重エクソン遺伝子のうちの約９５％は、選択的にスプライシングはされる。選択的スプライシングの多数の様式が観察され、そのうち最も一般的なものは、エクソンスキッピングである。この様式において、特定のエクソンを、いくつかの条件下において、または特定の組織において、mRNA中に含めることができ、他のものにおいては除外することができる。スプライシングにおける異常なバリエーションもまた、疾患に関連付けられる；ヒトの遺伝子障害の大部分が、スプライシングバリアントから生じる。異常なスプライシングバリアントはまた、がんの発症の原因となると考えられ、スプライシング因子の遺伝子は、異なる型のがんにおいて、しばしば変異する。選択的スプライシングの制御はまた、当該分野において、例えば、Douglas et al., Annual Review of Biochemistry 72（1）：291-336, 2003；Pan et al., Nature Genetics 40（12）：1413-1415, 2008；Martin et al., Nature Reviews 6（5）：386-398, 2005；Skotheim et al., The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 39（7-8）：1432-49, 2007において記載され、これらの各々は、本明細書において参考として援用される。
【０１０５】
「コードフレーム（coding frame）」または「オープンリーディングフレーム」とは、ポリペプチドをコードするコドンの区間を指す。DNAは、３つのヌクレオチドのグループ（コドン）において解釈されるので、DNA鎖は、３つの異なる読み枠を有する。DNA分子の二重らせんは、２本の逆平行鎖を有し、したがって、各々が３つの読み枠を有する２本の鎖により、６つの可能な読み枠の翻訳が存在する。機能的なタンパク質は、翻訳が正しいコードフレームにおいて進行した場合に産生され得る。オープンリーディングフレームにおける１つまたは２つの塩基の挿入または欠失は、コードフレームのシフトを引き起こし、これはまた、「フレームシフト変異」としても言及される。フレームシフト変異は、典型的には、未成熟な翻訳終了および／または短縮化された、または非機能的なタンパク質をもたらす。
【０１０６】
これらのおよび他の例示的な置換成分は、詳細な説明、例および請求の範囲においてより詳細に記載される。本発明は、上の例示的な置換成分のリストにより限定されることを決して意図しない。
【０１０７】
ある態様の詳細な説明
本明細書において開示されるのは、単独で、および循環のコレステロールおよびトリグリセリドレベルを相乗的に改善することができる他の保護的遺伝子バリアントと組み合わせて、LDL受容体により媒介されるLDLコレステロールのクリアランスをブーストするための、肝臓タンパク質プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（PCSK9）の、操作された、および天然に存在する保護的バリアントを作製するための、新規のゲノム／塩基編集の系、方法および組成物である。
【０１０８】
プロタンパク質コンバターゼスブチリシン−ケキシン９型（PCSK9）は、別名、神経アポトーシス制御コンバターゼ１（「NARC-I」）は、分泌型スブチラーゼファミリーの９番目のメンバーとして同定されたプロテイナーゼＫ様スブチラーゼ（subtilase）である。PCSK9の遺伝子は、ヒト染色体Ip33-p34.3に局在する。PCSK9は、例えば、肝細胞、腎臓間葉系細胞、回腸（intestinal ileum）および結腸の上皮、ならびに胚の終脳ニューロンを含む、増殖および分化を行うことができる細胞において発現する。例えば、Seidah et al., 2003 PNAS 100：928-933を参照；これは、本明細書において参考として援用される。
【０１０９】
PCSK9の元々の合成は、７２ｋＤａの、不活性な酵素前駆体、または酵素の形態におけるものであり、これは、小胞体（「ＥＲ」）において、その機能性を活性化するために、自己触媒性の分子内プロセッシングを経験する。この内部プロセッシングイベントは、ＳＳＶＦＡＱ↓ＳＩＰモチーフにおいて起こることが報告されており、ＥＲからの脱出の要件として報告されている。「↓」は、切断部位を示す。Benjannet et al., 2004 J. Biol. Chem. 279：48865-48875、およびSeidah et al., 2003 PNAS 100：928-933を参照；これらの各々は、本明細書において参考として援用される。切断されたタンパク質は、次いで分泌される。切断されたペプチドは、活性化され分泌された酵素と会合したままである。ヒトPCSK9の遺伝子配列は、約２２ｋｂ長であり、６９２アミノ酸のタンパク質をコードする１２個のエクソンを有し、例えば受託番号NP_777596.2において見出すことができる。ヒト、マウスおよびラットのPCSK9核酸配列が受託されている；それぞれ、例えば、GenBankアクセッション番号：AX127530（またAX207686）、AX207688およびAX207690を参照。翻訳されたタンパク質は、ＮＨ２末端においてシグナルペプチドを含み、細胞および組織において、小胞体において全長タンパク質の約７４ｋＤａのチモーゲン（前駆体）形態が見出される。細胞における初期プロセッシングの間に、約１４ｋＤａのプロドメインペプチドが、自己触媒的に切断されて、触媒ドメイン、およびしばしばシステイン−ヒスチジンリッチドメイン（CHRD）としても言及されるＣ末端ドメインを含む、成熟した約６０ｋＤａのタンパク質を生じる。この約６０ｋＤａの形態のPCSK9は、肝細胞から分泌される。分泌された形態のPCSK9は、生理学的に活性な種であると考えられるが、約６０ｋＤａの形態の細胞内での機能的役割は、除外されていない。
野生型PCSK9遺伝子（＞gi|299523249|ref|NM_174936.3| Homo sapiensプロタンパク質コンバターゼスブチリシン／ケキシン９型（PCSK9）、転写物バリアント１、配列番号１９９０）
【数１３−１】
2020503027.tif 000024
【数１３−２】
2020503027.tif 000025
ヒトPCSK9アミノ酸配列（配列番号１９９１）
【数１４】
2020503027.tif 000026
マウスPCSK 9アミノ酸配列（配列番号１９９２）
【数１５−１】
2020503027.tif 000027
【数１５−２】
2020503027.tif 000028
ラットPCSK9アミノ酸配列（配列番号１９９３）
【数１６】
2020503027.tif 000029
【０１１０】
PCSK9は、肝細胞および神経細胞の分化において役割を有すると考えられており、胚の肝臓において高度に発現し、コレステロールの恒常性に強力に関与していると考えられてきた。最近の研究は、コレステロールの生合成またはPCSK9についての取り込みにおける特別な役割を示唆する。コレステロールを給餌されたラットの研究において、Maxwellらは、PCSK9が、コレステロール生合成に関与する３つの他の遺伝子と同様の様式において下方制御されることを見出した（Maxwell et al., 2003 J Lipid Res. 44：2109-2119；これは、本明細書において参考として援用される）。興味深いことに、やはり、PCSK9の発現も、コレステロール代謝に関与する他の遺伝子によって観察されるように、ステロール制御エレメント結合タンパク質（「SREBP」）により制御された。これらの知見は、後に、かかる制御が、リポタンパク質代謝に関与する他の遺伝子の非常に典型的なものであったことを示したPCSK9の転写制御の研究により支持された；Dubuc et al., 2004 Arterioscler. Thromb. Vase. Biol 24：1454-1459；これは、本明細書において参考として援用される。PCSK9の発現は、スタチンにより薬物のコレステロール低下効果に起因する様式において、上方制御された。さらに、PCSK9のプロモーターは、コレステロール制御に関与する２つの保存部位、ステロール制御エレメントおよびSpI部位を有した。アデノウイルスによるPCSK9の発現は、循環LDLの注目すべき時間依存的な増大をもたらすことが示されている（Benjannet et al., 2004 J Biol Chem. 279：48865-48875；これは、本明細書において参考として援用される）。さらに、PCSK9遺伝子を欠失したマウスは、より高いレベルの肝臓LDL受容体を有し、より迅速に血漿からLDLを排除する；Rashid et al., 2005 Proc. Natl Acad. Sci. USA 102：5374- 5379；これは、本明細書において参考として援用される。
【０１１１】
最近、一過性にPCSK9を遺伝子導入されたHepG2細胞からの培地は、遺伝子導入されていないHepG2細胞に導入した場合に、細胞表面LDLRおよびLDLの内部移行の量を減少させることが報告された；Cameron et al., 2006 Human MoI Genet. 15：1551-1558を参照；これは、本明細書において参考として援用される。PCSK9またはPCSK9により作用する因子のいずれかが分泌されて、遺伝子導入された細胞および遺伝子導入されていない細胞の両方において、LDLRを分解することができることが、結論付けられた。より最近になって、HepG2細胞の培地に添加された精製PCSK9が、細胞表面LDLRの数を、用量および時間依存的な様式において減少させる効果を有することが示された；Lagace et al., 2006 J Clin. Invest. 116：2995-3005；これらは、本明細書において参考として援用される.
【０１１２】
多数のPCSK9バリアントは、以下を含むがこれらに限定されないいくつかの特許刊行物において開示および／または請求されている：PCT公開番号WO2001031007、WO2001057081、WO2002014358、WO2001098468、WO2002102993、WO2002102994、WO2002046383、WO2002090526、WO2001077137、およびWO2001034768；米国公開番号US 2004/0009553およびUS 2003/0119038、ならびに欧州公開番号EP 1 440 981、EP 1 067 182、およびEP 1 471 152；これらの各々は、本明細書において参考として援用される。
【０１１３】
Ｓ１２７Ｒ、Ｎ１５７Ｋ、Ｆ２１６Ｌ、Ｒ２１８Ｓ、およびＤ３７４Ｙを含むいくつかのＰＣＳＫ９の変異体形態は、よく特徴づけられており、Ｓ１２７Ｒ、Ｆ２１６Ｌ、およびＤ３７４Ｙは、常染色体優性高コレステロール血症（ADH）に関連付けられている。Benjannetら（J. Biol. Chem., 279（47）：48865-48875（2004））は、Ｓ１２７ＲおよびＤ３７４Ｙ変異が、ＥＲにおいてプロセッシングされて活性な分泌型チモーゲンを形成するプロPCSK9のレベルの著しい低下をもたらすことを示した。結果として、野生型PCSK9は、LDL受容体の代謝回転速度を増大させ、LDLクリアランスの阻害を引き起こし（Maxwell et al., PNAS, 102（6）：2069-2074（2005）；Benjannet et al.、およびLalanne et al）、一方、PCSK9の常染色体優性変異は、LDLRのレベルの増大循環LDLのクリアランスの増大、および対応する血漿コレステロールレベルの低下をもたらすと考えられる。Rashid et al., PNAS, 102（15）：5374-5379（2005）；Abifadel et al., 2003 Nature Genetics 34：154-156；Timms et al., 2004 Hum. Genet. 114：349-353；およびLeren, 2004 Clin. Genet. 65：419-422を参照；これらの各々は、本明細書において参考として援用される。
【０１１４】
後に公開されたAbifadelらのＳ１２７Ｒ変異の研究は、かかる変異を有する患者が、より高い血漿中の総コレステロールおよびapoB100を示し、これは、以下に起因することを報告した：（1）apoB100含有リポタンパク質、例えば低密度リポタンパク質（「LDL」）、超低密度リポタンパク質（「VLDL」）および中密度リポタンパク質（「IDL」）の過剰産生、ならびに（2）これに関連する前記リポタンパク質のクリアランスまたは転換の減少。まとめると、上で参照した研究は、PCSK9が、LDL産生の制御において役割を果たすという事実を証明する。PCSK9の発現または上方制御は、LDLコレステロールの血漿レベルの増大と関連し、PCSK9の阻害または発現の欠失は、低いLDLコレステロールの血漿レベルと関連する。重要なことに、PCSK9の配列バリエーションに関連するLDLコレステロールのレベルの低下は、冠動脈心疾患に対して保護を付与した；Cohen et al., 2006 N. Engl. J. Med. 354：1264-1272。
【０１１５】
Lalanneらは、PCSK9においてＳ１２７Ｒ変異を有する２人の患者において、LDLの異化が損なわれ、アポリポタンパク質Ｂ含有リポタンパク質の合成が増強されたことを示した（J. Lipid Research, 46：1312-1319（2005））。Sunらもまた、PCSK9の変異体形態もまた、アポリポタンパク質Ｂ分泌を増大させるその効果の結果として、異常に重篤な優性高コレステロール血症の原因となることのエビデンスを提供した（Sun et al., Hum. Mol. Genet., 14（9）：1161-1169（2005））。これらの結果は、マウスにおけるアデノウイルスにより媒介されるPCSK9の過剰発現が、LDL受容体の量の劇的な減少に起因して、重篤な高コレステロール血症をもたらすことを示した、より早期の結果（Dubuc et al., Thromb. Vasc. Biol., 24：1454-1459（2004））に加えて、PCSK9の変異体形態もまた、LDL受容体のレベルを低下させることを示す結果（Park et al., J. Biol. Chem., 279：50630-50638（2004）と一致した。肝臓由来細胞を含む細胞株における、およびマウスの肝臓におけるin vivoでのPCSK9の過剰発現は、LDLRのmRNAレベルを変化させることなく、LDLRのタンパク質レベルおよびLDLRの機能的活性の顕著な低下をもたらす（Maxwell et al., Proc. Nat. Amer. Sci., 101：7100-7105（2004）；Benjannet S. et al., J. Bio. Chem. 279：48865-48875（2004））。
【０１１６】
PSCK9の阻害への多様な治療的アプローチが提案されており、これらは以下を含む：遺伝子サイレンシング剤、例えばRNAiによるPSCK9合成の阻害；モノクローナル抗体、小ペプチドまたはアドネクチンによるPCSK9のLDLRへの結合の阻害；および小分子阻害剤によるPCSK9自己触媒的プロセッシングの阻害。これらの戦略は、Hedrick et al., Curr Opin Investig Drugs 2009；10：938-46；Hooper et al., Expert Opin Biol Ther, 2013；13：429-35；Rhainds et al., Clin Lipid, 2012；7：621-40；Seidah et al, Expert Opin Ther Targets 2009；13：19-28；およびSeidah et al., Nat Rev Drug Discov 2012；11：367-83において記載されており、これらの各々は、本明細書において参考として援用される。
【０１１７】
PCSK9変異体を作製するための戦略
本開示のいくつかの側面は、PCSK9遺伝子中に変異を導入するためにPCSK9タンパク質をコードするポリヌクレオチドを編集する系、組成物および方法を提供する。本明細書において記載される遺伝子編集方法は、米国特許9,068,179、米国特許出願公開US20150166980、US20150166981、US20150166982、US20150166984、およびUS20150165054、ならびに米国仮出願62/245828、62/279346、62/311,763、62/322178、62/357352、62/370700、および62/398490において、ならびにKomor et al., Nature, Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage, 533, 420-424（2016）において記載されるような核酸塩基エディターに依存し、これらの各々は、本明細書において参考として援用される。
【０１１８】
核酸塩基エディターは、PCSK9遺伝子中の標的塩基を正確に編集することにおいて高度に効率的であり、DNA二本鎖切断は、遺伝子編集のために必要ではなく、それにより、ゲノム不安定性を低下させ、他のゲノム編集方法により引き起こされ得る、起こり得る発がん性修飾を防止する。本明細書において記載される核酸塩基エディターは、単一の塩基を標的としてこれを修飾するようにプログラミングすることができる。いくつかの態様において、標的塩基は、シトシン（Ｃ）塩基であり、核酸塩基エディターによる脱アミノ化を介してチミン（Ｔ）塩基に変換され得る。
【０１１９】
PCSK9タンパク質をコードするポリヌクレオチドを編集するために、ポリヌクレオチドを、本明細書において記載される核酸塩基エディターと接触させる。いくつかの態様において、PCSK9をコードするポリヌクレオチドを、核酸塩基エディターおよびガイドヌクレオチド配列と接触させ、ここで、ガイドヌクレオチド配列は、核酸塩基エディターを、PCSK9をコードするポリヌクレオチドにおける標的塩基（例えばＣ塩基）にターゲティングする。
【０１２０】
いくつかの態様において、PCSK9をコードするポリヌクレオチドは、細胞のゲノムDNAにおけるPCSK9遺伝子座である。いくつかの態様において、細胞は、培養細胞である。いくつかの態様において、細胞は、in vivoのものである。いくつかの態様において、細胞は、in vitroでのものである。いくつかの態様において、細胞は、ex vivoのものである。いくつかの態様において、細胞は、哺乳動物からのものである。いくつかの態様において、哺乳動物は、ヒトである。いくつかの態様において、哺乳動物は、げっ歯類である。いくつかの態様において、げっ歯類は、マウスである。いくつかの態様において、げっ歯類は、ラットである。
【０１２１】
当業者により理解されるであろうように、PCSK9をコードするポリヌクレオチドは、コード鎖および相補鎖を含むDNA分子、例えば、ゲノムにおけるPCSK9遺伝子座であってよい。したがって、PCSK9をコードするポリヌクレオチドはまた、コード領域（例えばエクソン）および非コード領域（例えばイントロンまたはスプライシング部位）を含んでもよい。いくつかの態様において、標的塩基（例えばＣ塩基）は、PCSK9をコードするポリヌクレオチド（例えばPCSK9遺伝子座）のコード領域（例えばエクソン）に位置している。したがって、コード領域における塩基の変換は、PCSK9タンパク質配列においてアミノ酸変更、すなわち変異をもたらし得る。いくつかの態様において、変異は、機能喪失型変異である。いくつかの態様において、機能喪失型変異は、天然に存在する機能喪失型変異、例えば、Ｇ１０６Ｒ、Ｌ２５３Ｆ、Ａ４４３Ｔ、Ｒ９３Ｃである。いくつかの態様において、機能喪失型変異は、操作されたもの（すなわち、天然に存在しない）、例えば、Ｇ２４Ｄ、Ｓ４７Ｆ、Ｒ４６Ｈ、Ｓ１５３Ｎ、Ｈ１９３Ｙなどである。
【０１２２】
いくつかの態様において、標的塩基は、PCSK9遺伝子の非コード領域、例えばイントロンまたはスプライシング部位に位置する。いくつかの態様において、標的塩基は、スプライシング部位に位置し、かかる標的塩基の編集は、PSCK9 mRNAの選択的スプライシングを引き起こす。いくつかの態様において、選択的スプライシングは、機能喪失型PCSK9変異体をもたらす。いくつかの態様において、選択的スプライシングは、PSCK9 mRNAにおける未成熟停止コドンの導入をもたらし、これは、短縮化された不安定なPCSK9タンパク質をもたらす。いくつかの態様において、折りたたみが損なわれたPCSK9変異体が産生される。
【０１２３】
本開示を用いる作製のために特に有用なPCSK9バリアントは、単独で、または当該経路に関与する他の遺伝子、例えばAPOC3、LDL-RもしくはIdolと組み合わせて、LDL受容体により媒介されるLDLコレステロールのクリアランスをブーストすることができる機能喪失型バリアントである。いくつかの態様において、本開示の方法を用いて作製されるPCKS9の機能喪失型バリアントは、細胞において効率的に発現する。いくつかの態様において、本開示の方法を用いて作製されるPCKS9の機能喪失型バリアントは、活性化されて、排出され、パラクリン機構において修飾されていない細胞からのクラスリン被覆ピットに結合し、それにより野生型PCSK9タンパク質と競合する。いくつかの態様において、PCSK9の機能喪失型バリアントは、LDL-R結合領域中の、LDL-Rタンパク質と直接接触を行う残基において、変異を含む。いくつかの態様において、LDL-R結合領域中の、LDL-Rタンパク質と直接接触を行う残基は、Ｒ１９４、Ｒ２３７、Ｆ３７９、Ｓ３７２、Ｄ３７４、Ｄ３７５、Ｄ３７８、Ｒ４６、Ｒ２３７およびＡ４４３からなる群より選択される。
【０１２４】
本明細書において記載されるとおり、機能喪失型PCSK9バリアントは、野生型PCSK9タンパク質と比較して低下した活性を有し得る。PCSK9活性とは、PCSK9タンパク質の当該分野における任意の既知の生物学的活性を指す。例えば、いくつかの態様において、PCSK9活性とは、そのプロテアーゼ活性を指す。いくつかの態様において、PCSK9活性とは、細胞の分泌経路を通して分泌されるその能力を指す。いくつかの態様において、PCSK9活性とは、クラスリン被覆小胞においてタンパク質結合アダプターとして作用するその能力を指す。いくつかの態様において、PCSK9活性とは、LDL受容体と相互作用するその能力を指す。いくつかの態様において、PCSK9活性とは、LDL受容体のリサイクルを防止するその能力を指す。これらの例は、限定的であることを意図しない。
【０１２５】
いくつかの態様において、機能喪失型PCSK9バリアントの活性は、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９９％、またはそれ以上に低下させることができる。いくつかの態様において、機能喪失型PCSK9バリアントは、野生型PCSK9タンパク質と比較して、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、１％以下、またはそれより低い活性を有する。PCSK9活性を決定するための非限定的な例示的なアッセイは、当該分野において、例えば米国特許出願公開US20120082680において記載されており、これらは、本明細書において参考として援用される。
【０１２６】
PCSK9遺伝子を編集するために、PCSK9遺伝子（ポリヌクレオチド分子）を、核酸塩基エディターと接触させてもよく、ここで、核酸塩基エディターは、その標的配列に結合して、所望される塩基を編集する。例えば、核酸塩基エディターを、PCSK9遺伝子の編集が所望される細胞（例えば肝細胞）において発現させてもよく、それにより、PCSK9遺伝子の核酸塩基エディターとの接触が可能になる。いくつかの態様において、核酸塩基エディターの、PCSK9中のその標的配列への結合は、ガイドヌクレオチド配列、例えば、PCSK9遺伝子における標的配列の鎖のうちの一方に対して相補的であるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド分子により媒介される。したがって、ガイドヌクレオチド配列を設計することにより、核酸塩基エディターは、PCSK9遺伝子における任意の標的塩基を編集するようにプログラミングすることができる。いくつかの態様において、ガイドヌクレオチド配列は、編集が所望される細胞において核酸塩基エディターと共発現される。
【０１２７】
本明細書において提供されるのは、塩基編集を介して提供することができる非限定的な例示的なPCSK9の機能喪失型バリアント（表１および図１）およびそれらを作製するための戦略である。
表１．例示的な機能喪失型PCSK9変異
【表１】
2020503027.tif 000030
【０１２８】
コドン変更
本明細書において記載される核酸塩基エディターを用いて、いくつかのアミノ酸コドンを、当該コドン中の標的塩基の脱アミノ化を介して、異なるコドンに変換することができる。例えば、いくつかの態様において、シトシン（Ｃ）塩基は、シトシンデアミナーゼドメイン（例えば、APOBEC1またはAID）を含む核酸塩基エディターによる脱アミノ化を介して、チミン（Ｔ）塩基に変換される。脱アミノ化（例えば、APOBEC1またはAIDなどのシトシンデアミナーゼによる）を介するＣからＴへの変更の間に、シトシンは、初めにウリジン（Ｕ）に変換され、Ｇ：Ｕミスマッチをもたらすことは、注目に値する。Ｇ：Ｕミスマッチは、次いで、DNA修復および複製経路によりＴ：Ａ対に変換されて、それにより、元のシトシンの位置においてチミンを導入する。当業者が精通しているとおり、アミノ酸コドン中の塩基の変換は、当該コドンがコードするアミノ酸の変更をもたらし得る。シトシンデアミナーゼは、脱アミノ化を介して、シトシン（Ｃ）塩基をチミン（Ｔ）塩基に変換することができる。したがって、Ｃ塩基を含むアミノ酸コドンについて、Ｃ塩基を直接Ｔに変換することができることが想起される。例えば、ロイシンコドン（ＣＴＣ）を、コード鎖上の第１のＣの脱アミノ化を介して、ＴＴＣ（フェニルアラニン）コドンに変換することができる。グアニン（Ｇ）塩基を含むアミノ酸コドンについて、Ｃ塩基が相補鎖上に存在する；そして、Ｇ塩基は、相補鎖上のＣの脱アミノ化を介して、アデノシン（Ａ）に変換することができる。例えば、
【化１】
2020503027.tif 000031
（Ｍｅｔ／Ｍ）コドンは、相補鎖上の第３のＣの脱アミノ化を介して、
【化２】
2020503027.tif 000032
（Ｉｌｅ／Ｉ）コドンに変換することができる。いくつかの態様において、あるコドンを異なるコドンに変換するために、２つのＣからＴへの変更が必要とされる。本開示の核酸塩基エディターによりPCSK9をコードするポリヌクレオチドにおいて行うことができる可能な変異の非限定的な例を、表２においてまとめる。
表２．PCSK9遺伝子における塩基編集を介する例示的なコドン変更
【表２−１】
2020503027.tif 000033
【表２−２】
2020503027.tif 000034
【０１２９】
いくつかの態様において、その標的配列に結合して所望される塩基を編集するために、核酸塩基エディターは、そのガイドヌクレオチド配列（例えばガイドRNA）に依存する。いくつかの態様において、ガイドヌクレオチド配列は、gRNA配列である。gRNAは、典型的には、Cas9への結合を可能にするtracrRNAフレームワーク、および本明細書において開示される融合タンパク質に配列特異性を付与するガイド配列を含む。いくつかの態様において、ガイドRNAは、構造５’−［ガイド配列］−ｇｕｕｕｕａｇａｇｃｕａｇａａａｕａｇｃａａｇｕｕａａａａｕａａａｇｇｃｕａｇｕｃｃｇｕｕａｕｃａａｃｕｕｇａａａａａｇｕｇｇｃａｃｃｇａｇｕｃｇｇｕｇｃｕｕｕｕｕ−３’（配列番号１９９７）を含み、ここで、ガイド配列は、標的配列に対して相補的な配列を含む。ガイド配列は、典型的には、約２０ヌクレオチド長である。例えば、ガイド配列は、１５〜２５ヌクレオチド長であってもよい。いくつかの態様において、ガイド配列は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド長である。かかる好適なガイドRNA配列は、典型的には、編集されるべき標的ヌクレオチドの上流または下流５０ヌクレオチド以内の核酸配列に対して相補的なガイド配列を含む。
【０１３０】
特異的変異を誘導するために核酸塩基エディターをその標的配列にターゲティングするために用いることができるガイド配列を、表３において提供する。本明細書において提示される変異およびガイド配列は、は、単に説明を目的とするものであって、限定的であることを意図しないことが、理解されるべきである。
表３．コドン変更を介する例示的なPCSK9の機能喪失型変異
【表３−１】
2020503027.tif 000035
【表３−２】
2020503027.tif 000036
【表３−３】
2020503027.tif 000037
【表３−４】
2020503027.tif 000038
【表３−５】
2020503027.tif 000039
【表３−６】
2020503027.tif 000040
*一重下線は、コード鎖上のＣからＴへの変更を示す。
二重下線は、相補鎖上のＣからＴへの変更を示す。
ガイド配列（ガイドRNAの、核酸塩基エディターを標的配列にターゲティングする部分）が提供され、これは、完全なガイドRNA配列を作製するために、本明細書において提供される任意のtracrRNAフレームワーク配列と共に用いることができる。
ａ）BE型：SpBE3 = APOBEC1-SpCas9n-UGI；VQR-SpBE3 = APOBEC1-VQR-SpCas9n-UGI；EQR-SpBE3 = APOBEC1-EQR-SpCas9n-UGI；VRER-SpBE3 = APOBEC1-VRER-SpCas9n-UGI；SaBE3 = APOBEC1-SaCas9n-UGI；KKH-SaBE3 = APOBEC1-KKH-SaCas9n-UGI；St3BE3 = APOBEC1-St3Cas9n-UGI；St1BE3 = APOBEC1-St1Cas9n-UGI.
【０１３１】
いくつかの態様において、本明細書において記載される方法を用いて生成される機能喪失型PCSK9バリアントは、Ｒ４６Ｃ変異（ＣＧＴをＴＧＴへ）を含み、これは、天然の保護的バリアントＲ４６Ｌを模倣する。PCSK9のＲ４６Ｌバリアントは、コレステロール低下効果を有すること、および心筋梗塞の早期発症のリスクを低下させることが特徴づけられている。例えば、Strom et al., Clinica Chimica Acta, Volume 411, Issues 3-4, 2, Pages 229-233, 2010；Saavedra et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol., 34（12）：2700-5, 2014；Cameron et al., Hum. Mol. Genet., 15（9）：1551-1558, 2006；およびBonnefond et al., Diabetologia, Volume 58, Issue 9, pp 2051-2055, 2015を参照；これらの各々は、本明細書において参考として援用される。
【０１３２】
いくつかの態様において、本明細書において記載される方法を用いて生成される機能喪失型PCSK9バリアントは、Ｌ２５３Ｆ変異（ＣＴＣをＴＴＣへ）を含む。PCSK9のＬ２５３Ｆバリアントは、血漿LDL−コレステロールレベルを低下させることが示されている。例えば、Kotowski et al., Am J Hum Genet., 78（3）：410-422, 2006；Zhao et al., Am J Hum Genet., 79（3）：514-523, 2006；Huang et al., Circ Cardiovasc Genet., 2（4）：354-361, 2009；およびHampton et al., PNAS, vol 104, No. 37, 14604-14609, 2007を参照；これらの各々は、本明細書において参考として援用される。
【０１３３】
いくつかの態様において、本明細書において記載される方法を用いて生成される機能喪失型PCSK9バリアントは、Ａ４４３Ｔ変異（ＧＣＣをＡＣＣへ）を含む。PCSK9のＡ４４３Ｔ変異体は、血漿LCL−コレステロールレベルの低下と関連することが示されている。例えば、Mayne et al., Lipids in Health and Disease, 2013-12：70, 2013；Allard et al., Hum Mutat., 26（5）：497, 2005；Huang et al., Circ Cardiovasc Genet., 2（4）：354-361, 2009；およびBenjannet et al., Journal of Biological Chemistry, Vol. 281, No. 41, 2006を参照；これらの各々は、本明細書において参考として援用される。
【０１３４】
いくつかの態様において、本明細書において記載される方法を用いて生成される機能喪失型PCSK9バリアントは、Ｒ９３Ｃ変異（ＣＧＣをＴＧＣへ）を含む。PCSK9のＲ９３Ｃバリアントは、血漿LCL−コレステロールレベルの低下と関連することが示されている。例えば、Mayne et al., Lipids in Health and Disease, 2013-12：70, 2013；Miyake et al., Atherosclerosis, 196（1）：29-36, 2008；およびTang et al., Nature Communications, 6, Article number：10206, 2015を参照；これらの各々は、本明細書において参考として援用される。
【０１３５】
いくつかの態様において、正しく折りたたまれ、かつ活性なPCSK9タンパク質のレベルを低下させることにより、細胞のPCSK9活性を低下させることができる。野生型PCSK9タンパク質中に不安定化変異を導入することにより、タンパク質の誤った折りたたみまたは非活性化を引き起こすことができる。本明細書において記載される１つ以上の不安定化変異を含むPCSK9バリアントは、野生型PCSK9タンパク質と比較して低い活性を有し得る。例えば、本明細書において記載される１つ以上の不安定化変異を含むPCSK9バリアントの活性は、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、またはそれより多く低下され得る。
【０１３６】
さらに、本開示はまた、機能獲得型PCSK9バリアントの効果を相殺するための、不安定化変異の使用を企図する。機能獲得型PCSK9バリアント（例えば、図１Ａにおいて記載される機能獲得型バリアント）は、当該分野において記載されており、高コレステロール血症に関連することが見出される（例えば、Peterson et al., J Lipid Res. 2008 Jun；49（6）：1152-1156；Benjannet et al., J Biol Chem. 2012 Sep 28；287（40）：33745-55；Abifadel et al., Atherosclerosis. 2012 Aug；223（2）：394-400；およびCameron et al., Hum. Mol. Genet.（1 May 2006）15（9）：1551-1558において；これらの各々は、本明細書において参考として援用される）。不安定化変異をこれらの機能獲得型PCSK9バリアント中に導入することにより、これらの機能獲得型バリアントの誤った折りたたみおよび非活性化を引き起こすことができ、それにより、機能獲得型変異により引き起こされる過剰活性を相殺することができる。さらに、LDL-Rにより媒介されるコレステロールクリアランス経路におけるいくつかの他の重要な因子、例えばLDL-R、APOBまたはAPOCにおける機能獲得型変異もまた、当該分野において記載されている。したがって、本明細書において記載される組成物および方法を用いて、機能獲得型変異の有害な効果を相殺するために、これらの因子において不安定化変異を作製することもまた、本開示の範囲内である。
【０１３７】
したがって、本開示はさらに、PCSK9タンパク質の誤った折りたたみまたはPCSK9タンパク質の構造的不安定化を引き起こす変異を提供する。本明細書において記載される方法を用いて作成することができる非限定的な例示的なPCSK9の不安定化変異を、表４において示す。
表４．タンパク質の折りたたみを不安定化するための例示的なPCSK9バリアント
【表４−１】
2020503027.tif 000041
【表４−２】
2020503027.tif 000042
【表４−３】
2020503027.tif 000043
【表４−４】
2020503027.tif 000044
【表４−５】
2020503027.tif 000045
【表４−６】
2020503027.tif 000046
【表４−７】
2020503027.tif 000047
【表４−８】
2020503027.tif 000048
【表４−９】
2020503027.tif 000049
*ガイド配列（ガイドRNAの、核酸塩基エディターを標的配列にターゲティングする部分）が提供され、これは、完全なガイドRNA配列を作製するために、本明細書において提供される任意のtracrRNAフレームワーク配列と共に用いることができる。
ａ）BE型：SpBE3 = APOBEC1-SpCas9n-UGI；VQR-SpBE3 = APOBEC1-VQR-SpCas9n-UGI；EQR-SpBE3 = APOBEC1-EQR-SpCas9n-UGI；VRER-SpBE3 = APOBEC1-VRER-SpCas9n-UGI；SaBE3 = APOBEC1-SaCas9n-UGI；KKH-SaBE3 = APOBEC1-KKH-SaCas9n-UGI；St3BE3 = APOBEC1-St3Cas9n-UGI；St1BE3 = APOBEC1-St1Cas9n-UGI.
【０１３８】
いくつかの態様において、本明細書において記載される１つより多くの変異を含むPCSK9バリアントが企図される。例えば、本明細書において記載される方法を用いて、表３および４から選択される１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれより多くの変異を含むPCSK9バリアントを生成することができる。PCSK9遺伝子において複数の変異を作製するために、各々のガイドヌクレオチド配列が１つの標的塩基を標的とする、複数のガイドヌクレオチド配列を用いてもよい。核酸塩基エディターは、ガイドヌクレオチド配列により指示される各々の、および全ての塩基を編集することができる。例えば、１つの遺伝子編集反応において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれより多くのガイドヌクレオチド配列を用いてもよい。いくつかの態様において、ガイドヌクレオチド配列は、RNA（例えばgRNA）である。いくつかの態様において、ガイドヌクレオチド配列は、単鎖DNA分子である。
【０１３９】
未成熟停止コドン
本開示のいくつかの側面は、PCSK9遺伝子を、生成されている全長の機能的PCSK9タンパク質の量を減少させるように編集する戦略を提供する。いくつかの態様において、PCSK9遺伝子のコード配列中に、正常な停止コドンの上流に、停止コドンを導入してもよい（「未成熟停止コドン」として言及される）。未成熟停止コドンは、未成熟な翻訳停止を引き起こし、その代わりに、短縮化された非機能的タンパク質をもたらし、ナンセンス変異依存mRNA分解経路を介してmRNAの迅速な分解を誘導する。例えば、Baker et al., Current Opinion in Cell Biology 16（3）：293-299, 2004；Chang et al., Annual Review of Biochemistry 76：51-74, 2007；およびBehm-Ansmant et al., Genes & Development 20（4）：391-398, 2006を参照；これらの各々は、本明細書において参考として援用される。
【０１４０】
本明細書において記載される核酸塩基エディターは、いくつかのアミノ酸コドンを停止コドン（例えばＴＡＡ、ＴＡＧまたはＴＧＡ）に変換するために用いることができる。例えば、シトシンデアミナーゼドメインを含む核酸塩基エディターは、脱アミノ化を介して、シトシン（Ｃ）塩基をチミン（Ｔ）塩基に変換することができる。したがって、Ｃ塩基を含むアミノ酸コドンについて、Ｃ塩基をＴに変換することができることが想起される。例えば、ＣＡＧ（Ｇｌｎ／Ｑ）コドンを、コード鎖上の第１のＣの脱アミノ化を介して、ＴＡＧ（amber）コドンに変更することができる。グアニン（Ｇ）塩基を含むセンスコドンについて、Ｃ塩基が相補鎖上に存在する；そして、Ｇ塩基は、相補鎖上のＣの脱アミノ化を介して、アデノシン（Ａ）に変換することができる。例えば、
【化３】
2020503027.tif 000050
コドンを、相補鎖上の第２のＣの脱アミノ化を介して、
【化４】
2020503027.tif 000051
コドンに変換することができる。いくつかの態様において、コドンをナンセンスコドンに変換するために、２つのＣからＴへの変更が必要とされる。例えば、
【化５】
2020503027.tif 000052
コドンは、コード鎖上の第１のＣの脱アミノ化および相補鎖上の第２のＣの脱アミノ化を介して、
【化６】
2020503027.tif 000053
コドンに変換される。塩基編集を介して停止コドンに変更することができるコドンの非限定的な例を、表５において提供する。
表５．停止コドンへの変換
【表５】
2020503027.tif 000054
*一重下線：コード鎖上の変更
二重下線：相補鎖上の変更
【０１４１】
したがって、本開示は、PCSK9遺伝子において未成熟停止コドンに変換することができるアミノ酸コドンの非限定的な例を提供する。いくつかの態様において、停止コドンの導入は、標的残基が可動性ループにおいて位置する場合に、短縮化を生じることにおいて、有効であり得る。いくつかの態様において、互いに隣接する２つのコドンは、いずれも、停止コドンに変換することができ、これは、互いに隣接する２つの停止コドンをもたらす（また、「タンデム停止コドン」としても言及される）。「隣接する」とは、２つの停止コドンの間に存在するアミノ酸が５個以下であることを意味する。例えば、２つの停止コドンは、互いに直接隣接する（間に０個のアミノ酸）か、または間に１、２、３、４または５個のアミノ酸を有する。タンデム停止コドンの導入は、短縮化および非機能的PCSK9変異を生じることにおいて、特に有用であり得る。導入することができるタンデム停止コドンの非限定的な例として、Ｗ１０Ｘ−Ｗ１１Ｘ、Ｑ９９Ｘ−Ｑ１０１Ｘ、Ｑ３４２Ｘ−Ｑ３４４Ｘ、およびＱ５５４Ｘ−Ｑ５５５Ｘが挙げられ、ここで、Ｘは、停止コドンを示す。いくつかの態様において、短縮化PCSK9タンパク質を効果的に生成するために、停止コドンは、構造不安定化変異（例えば、表２において列記される構造不安定化変異）の後に導入してもよい。その後に停止コドンが続く構造不安定化変異の非限定的な例として、Ｐ５３０Ｓ／Ｌ−Ｑ５３１Ｘ、Ｐ５８１Ｓ／Ｌ−Ｒ５８２Ｘ、およびＰ６１８Ｓ／Ｌ−Ｑ６１９Ｘが挙げられ、ここで、Ｘは、停止コドンを示す。
【０１４２】
本明細書において記載される核酸塩基エディターにより停止コドンに変更することができる例示的なコドン、および用いることができるガイドヌクレオチド配列を、表６において列記する。例は、単に説明を目的とするものであって、限定的であることを意図しない。
表６．塩基編集を介するPCSK9遺伝子中への未成熟停止コドンの導入
【表６−１】
2020503027.tif 000055
【表６−２】
2020503027.tif 000056
【表６−３】
2020503027.tif 000057
【表６−４】
2020503027.tif 000058
【表６−５】
2020503027.tif 000059
*ループ／リンカー領域において見出される残基を、＋または＋＋で標識する。
ガイド配列（ガイドRNAの、核酸塩基エディターを標的配列にターゲティングする部分）が提供され、これは、完全なガイドRNA配列を作製するために、本明細書において提供される任意のtracrRNAフレームワーク配列と共に用いることができる。
ａ）BE型：SpBE3 = APOBEC1-SpCas9n-UGI；VQR-SpBE3 = APOBEC1-VQR-SpCas9n-UGI；EQR-SpBE3 = APOBEC1-EQR-SpCas9n-UGI；VRER-SpBE3 = APOBEC1-VRER-SpCas9n-UGI；SaBE3 = APOBEC1-SaCas9n-UGI；KKH-SaBE3 = APOBEC1-KKH-SaCas9n-UGI；St3BE3 = APOBEC1-St3Cas9n-UGI；St1BE3 = APOBEC1-St1Cas9n-UGI.
【０１４３】
PCSK9遺伝子の非コード領域における標的塩基−スプライシングバリアント
本開示のいくつかの側面は、PCSK9 mRNAの成熟および産生を防止することにより、細胞のPCSK9活性を低下させる戦略を提供する。いくつかの態様において、かかる戦略は、PCSK9遺伝子におけるスプライシング部位の変更を伴う。変更されたスプライシング部位は、変更されたスプライシングおよびPCSK9 mRNAの成熟化をもたらし得る。例えば、いくつかの態様において、変更されたスプライシング部位は、エクソンのスキッピングをもたらし、これは次いで、短縮化されたタンパク質生成物または変更されたリーディングフレームをもたらす。いくつかの態様において、変更されたスプライシング部位は、インフレームの停止コドンがイントロンにおいて翻訳中のリボソームと出会った場合に、イントロン配列の翻訳および未成熟な翻訳終了をもたらし得る。いくつかの態様において、開始コドンが編集され、タンパク質の翻訳が、次のＡＴＧコドンを開始させ、これは、正確なコードフレームでなくともよい。
【０１４４】
スプライシング部位は、典型的には、イントロンドナー部位、ラリアット分枝点、およびイントロンアクセプター部位を含む。当業者は、スプライシングの機構に精通している。図３において説明されるとおり、イントロンドナー部位は、ＧＧＧＴＲＡＧＴのコンセンサス配列を有し、イントロンドナー部位のコンセンサス配列においてＧ塩基と対形成しているＣ塩基を、本明細書において記載される核酸塩基エディターによる標的として、それによりイントロンドナー部位を変更してもよい。ラリアット分枝点はまた、コンセンサス配列、例えばＹＴＲＡＣを有し、ここで、Ｙはピリミジンであり、Ｒはプリンである。ラリアット分枝点のコンセンサス配列におけるＣ塩基を、本明細書において記載される核酸塩基エディターによる標的としてもよく、これは、その後のエクソンのスキッピングをもたらす。イントロンアクセプター部位は、ＹＮＣＡＧＧのコンセンサス配列を有し、ここで、Ｙはピリミジンであり、Ｎは任意のヌクレオチドである。イントロンアクセプター部位のコンセンサス配列のＣ塩基、およびイントロンアクセプター部位のコンセンサス配列においてＧ塩基と対形成しているＣ塩基を、本明細書において記載される核酸塩基エディターによる標的として、それによりイントロンアクセプター部位を変更してもよく、これは次いで、エクソンのスキッピングをもたらす。PCSK9遺伝子のスプライシング部位を変更する一般的な戦略を、表７において記載する。
表７．塩基編集を介する例示的なイントロン−エクソン接合部の変更
【表７】
2020503027.tif 000060
【０１４５】
本明細書において記載されるとおり、ヒトPCSK9についての遺伝子配列（配列番号１９９０）は、約２２ｋｂの長さであり、１２個のエクソンおよび１１個のイントロンを含む。エクソン−イントロン接合部の各々は、PCSK9 mRNAのプロセッシングおよび成熟化を妨害するために変更することができる。したがって、表８において提供されるのは、本明細書において記載される核酸塩基エディターを用いてPCSK9遺伝子において行うことができる変更、および各変更のために用いることができるガイド配列の非限定的な例である。
表８．塩基編集を介するPCSK9遺伝子におけるイントロン／エクソン接合部の変更
【表８−１】
2020503027.tif 000061
【表８−２】
2020503027.tif 000062
【表８−３】
2020503027.tif 000063
【表８−４】
2020503027.tif 000064
【表８−５】
2020503027.tif 000065
*ガイド配列（ガイドRNAの、核酸塩基エディターを標的配列にターゲティングする部分）が提供され、これは、完全なガイドRNA配列を作製するために、本明細書において提供される任意のtracrRNAフレームワーク配列と共に用いることができる。
ａ）BE型：SpBE3 = APOBEC1-SpCas9n-UGI；VQR-SpBE3 = APOBEC1-VQR-SpCas9n-UGI；EQR-SpBE3 = APOBEC1-EQR-SpCas9n-UGI；VRER-SpBE3 = APOBEC1-VRER-SpCas9n-UGI；SaBE3 = APOBEC1-SaCas9n-UGI；KKH-SaBE3 = APOBEC1-KKH-SaCas9n-UGI；St3BE3 = APOBEC1-St3Cas9n-UGI；St1BE3 = APOBEC1-St1Cas9n-UGI.
【０１４６】
高い特異性および低いオフターゲット結合を伴う効率的な塩基編集のためのガイドRNA配列のスコア付け
本明細書において参考として援用されるKomor et al., Nature, 533, 420-424（2016）において記載されるように、塩基編集を用いて効率的かつ特異的なゲノム修飾を達成するためには、それに対して特定の相補的なガイドRNA配列を作製することができる標的Ｃ、および、必要な場合には、シチジンデアミナーゼ（例えば、Cas9、dCas9、Cas9n、Cpf1、NgAgoなど）に融合したDNA結合ドメインにマッチする近接するPAMを含むゲノム配列の賢明な選択を必要とする。ガイドRNA配列およびPAMの優先度は、プログラミング可能なDNA結合ドメイン（例えば、Cas9、dCas9、Cas9n、Cpf1、NgAgoなど）のゲノム標的配列を定義する。いくつかのゲノム配列の反復性の性質、ならびにゲノム全体にわたって短い配列が現れる確率論的な頻度に起因して、ゲノム中の全ての他の配列に対する１、２、３、４またはそれより多くのミスマッチを考慮して、最も低い数の潜在的なオフターゲット部位を有する塩基エディターをプログラミングするためのガイドRNAを同定することが必要であり、これは、Hsu et al（Nature biotechnology, 2013, 31（9）：827-832）、Fusi et al（bioRxiv 021568；doi：http：//dx.doi.org/10.1101/021568）、Chari et al（Nature Methods, 2015, 12（9）：823-6）、Doench et al（Nature Biotechnology, 2014, 32（12）：1262-7）、Wang et al（Science, 2014, 343（6166）：80-4）、Moreno-Mateos et al（Nature Methods, 2015, 12（10）：982-8）、Housden et al（Science Signaling, 2015, 8（393）：rs9）、Haeussler et al,（Genome Biol. 2016；17：148）において記載されるとおりであり、これらの各々は、本明細書において参考として援用される。ガイドRNAと標的DNAとの間のバルジの形成の可能性もまた考えられ得、これは、Bae et al（Bioinformatics, 2014, 30, 1473-5）において記載されるとおりであり、これは、本明細書において参考として援用される。表３〜８から選択されるガイドRNAについての計算される特異性スコアの非限定的な例を、表９〜１３において示す。DNA結合ドメインのプログラミング効率に影響する他の計算されるパラメーターはが示され、これは、Housden et al（Science Signaling, 2015, 8（393）：rs9）、Farboud et al（Genetics, 2015, 199（4）：959-71）において記載されるとおりであり、これらの各々は、本明細書において参考として援用される。
【表９−１】
2020503027.tif 000066
【表９−２】
2020503027.tif 000067
【表９−３】
2020503027.tif 000068
【表９−４】
2020503027.tif 000069
【表９−５】
2020503027.tif 000070
【表９−６】
2020503027.tif 000071
【表９−７】
2020503027.tif 000072
【表１０−１】
2020503027.tif 000073
【表１０−２】
2020503027.tif 000074
【表１０−３】
2020503027.tif 000075
【表１０−４】
2020503027.tif 000076
【表１０−５】
2020503027.tif 000077
【表１０−６】
2020503027.tif 000078
【表１０−７】
2020503027.tif 000079
【表１０−８】
2020503027.tif 000080
【表１０−９】
2020503027.tif 000081
【表１０−１０】
2020503027.tif 000082
【表１０−１１】
2020503027.tif 000083
【表１１−１】
2020503027.tif 000084
【表１１−２】
2020503027.tif 000085
【表１１−３】
2020503027.tif 000086
【表１１−４】
2020503027.tif 000087
【表１１−５】
2020503027.tif 000088
【表１１−６】
2020503027.tif 000089
【表１２−１】
2020503027.tif 000090
【表１２−２】
2020503027.tif 000091
【表１２−３】
2020503027.tif 000092
【表１２−４】
2020503027.tif 000093
【表１２−５】
2020503027.tif 000094
【０１４７】
他の保護的バリアント
LDL-Rにより媒介されるコレステロールクリアランス経路は、複数のプレイヤーを含む。この経路に関与するタンパク質因子の非限定的な例として、アポリポタンパク質Ｃ３（APOC3）、LDL受容体（LDL-R）、および誘導性のLDL受容体分解剤タンパク質（IDOL）が挙げられる。これらのタンパク質因子およびそれらのそれぞれの機能は、当該分野において記載されている。さらに、これらの因子の機能喪失型バリアントは、同定されて特徴づけられており、心保護的機能を有することが決定されている。例えば、Jorgensen et al., N Engl J Med 2014；371：32-41July 3, 2014；Scholtz1 et al., Hum. Mol. Genet.（1999）8（11）：2025-2030；De Castro-Oros et al., BMC Medical Genomics, 20147：17；およびGu et al., J Lipid Res. 2013, 54（12）：3345-57を参照；これらの各々は、本明細書において参考として援用される。
【０１４８】
したがって、本開示のいくつかの側面は、本明細書において記載される核酸塩基エディターおよび戦略を用いるAPOC3（例えば、A43TおよびR19X）、LDL-R、ならびにIDOL（例えば、R266X）の機能喪失型バリアントの作成を提供する。かかるバリアントおよびそれらを作製するために用いることができるガイド配列の非限定的な例を、表１３において提供する。
表１３．APOC3、LDL-R、およびIDOLの機能喪失型バリアント
【表１３】
2020503027.tif 000095
*ガイド配列（ガイドRNAの、核酸塩基エディターを標的配列にターゲティングする部分）が提供され、これは、完全なガイドRNA配列を作製するために、本明細書において提供される任意のtracrRNAフレームワーク配列と共に用いることができる。
ａ）BE型：SpBE3 = APOBEC1-SpCas9n-UGI；VQR-SpBE3 = APOBEC1-VQR-SpCas9n-UGI；EQR-SpBE3 = APOBEC1-EQR-SpCas9n-UGI；VRER-SpBE3 = APOBEC1-VRER-SpCas9n-UGI；SaBE3 = APOBEC1-SaCas9n-UGI；KKH-SaBE3 = APOBEC1-KKH-SaCas9n-UGI；St3BE3 = APOBEC1-St3Cas9n-UGI；St1BE3 = APOBEC1-St1Cas9n-UGI.
APOC3アミノ酸配列（NC_000011.9 GRCh37.p5、配列番号１８００）
MQPRVLLVVALLALLASARASEAEDASLLSFMQGYMKHATKTAKDALSSVQESQVAQQARGWVTDGFSSLKDYWSTVKDKFSEFWDLDPEVRPTSAVAA
対応するコドンに割り当てられたアミノ酸残基を示すAPOC3 cDNA配列。塩基編集の標的となる残基の例に、下線を付す（ヌクレオチド配列：配列番号１８０１、タンパク質配列：配列番号１８０２）。
【数１７】
2020503027.tif 000096
非コード領域およびイントロン（小文字）ならびにエクソン（大文字）を示すAPOC3ゲノム配列（配列番号１８０３）。塩基編集の標的となるスプライシングに関与する塩基の例に、下線を付す。
【数１８−１】
2020503027.tif 000097
【数１８−２】
2020503027.tif 000098
IDOLアミノ酸配列（配列番号１８０４）
【数１９】
2020503027.tif 000099
LDL-Rアミノ酸配列（配列番号１８０５）
【数２０】
2020503027.tif 000100
【０１４９】
本明細書において記載される核酸塩基エディターを用いてAPOC3遺伝子において作製することができる機能喪失型変異もまた提供される。機能喪失型変異を生成する戦略は、PCSK9のために用いられたもの（例えば、未成熟停止コドン、不安定化変異、スプライシングの変更など）と同様である。APOC3変異およびガイドRNA配列を、表１４〜１６において列記する。
表１４．コドン変更および未成熟停止コドンを介する例示的なAPOC3の保護的な機能喪失型変異
【表１４−１】
2020503027.tif 000101
【表１４−２】
2020503027.tif 000102
*ガイド配列（ガイドRNAの、核酸塩基エディターを標的配列にターゲティングする部分）が提供され、これは、完全なガイドRNA配列を作製するために、本明細書において提供される任意のtracrRNAフレームワーク配列と共に用いることができる。
ａ）BE型：SpBE3 = APOBEC1-SpCas9n-UGI；VQR-SpBE3 = APOBEC1-VQR-SpCas9n-UGI；EQR-SpBE3 = APOBEC1-EQR-SpCas9n-UGI；VRER-SpBE3 = APOBEC1-VRER-SpCas9n-UGI；SaBE3 = APOBEC1-SaCas9n-UGI；KKH-SaBE3 = APOBEC1-KKH-SaCas9n-UGI；St3BE3 = APOBEC1-St3Cas9n-UGI；St1BE3 = APOBEC1-St1Cas9n-UGI.
表１５．APOC3遺伝子における塩基編集を介するイントロン／エクソン接合部の変更
【表１５−１】
2020503027.tif 000103
【表１５−２】
2020503027.tif 000104
*ガイド配列（ガイドRNAの、核酸塩基エディターを標的配列にターゲティングする部分）が提供され、これは、完全なガイドRNA配列を作製するために、本明細書において提供される任意のtracrRNAフレームワーク配列と共に用いることができる。
ａ）BE型：SpBE3 = APOBEC1-SpCas9n-UGI；VQR-SpBE3 = APOBEC1-VQR-SpCas9n-UGI；EQR-SpBE3 = APOBEC1-EQR-SpCas9n-UGI；VRER-SpBE3 = APOBEC1-VRER-SpCas9n-UGI；SaBE3 = APOBEC1-SaCas9n-UGI；KKH-SaBE3 = APOBEC1-KKH-SaCas9n-UGI；St3BE3 = APOBEC1-St3Cas9n-UGI；St1BE3 = APOBEC1-St1Cas9n-UGI.
【表１６−１】
2020503027.tif 000105
【表１６−２】
2020503027.tif 000106
【表１６−３】
2020503027.tif 000107
【表１６−４】
2020503027.tif 000108
【表１６−５】
2020503027.tif 000109
【０１５０】
いくつかの態様において、LDLにより媒介されるコレステロールクリアランス経路における１つより多くのタンパク質因子中への機能喪失型変異の同時導入が提供される。例えば、いくつかの態様において、機能喪失型変異は、PCSK9およびAPOC3中に同時に導入することができる。いくつかの態様において、機能喪失型変異は、PCSK9およびLDL-R中に同時に導入することができる。いくつかの態様において、機能喪失型変異は、PCSK9およびIODL中に同時に導入することができる。いくつかの態様において、機能喪失型変異は、APOC3およびIODL中に同時に導入することができる。いくつかの態様において、機能喪失型変異は、LDL-RおよびAPOC3中に同時に導入することができる。いくつかの態様において、機能喪失型変異は、LDL-RおよびIDOL中に同時に導入することができる。いくつかの態様において、機能喪失型変異は、PCSK9、APOC3、LDL-RおよびIDOL中に同時に導入することができる。１つより多くのタンパク質中に機能喪失型変異を同時に導入するために、複数のガイドヌクレオチド配列が用いられる。
【０１５１】
本明細書においてさらに提供されるのは、本明細書において記載されるLDL-Rにより媒介されるコレステロールクリアランス経路に関与するタンパク質因子のうちのいずれかにおける、新規かつまだ特徴づけられていない変異の作成のための方法である。例えば、これらのタンパク質因子のゲノムでの部位における全ての可能なPAM配列について、ガイドヌクレオチド配列のライブラリーを設計して、これらのタンパク質において変異を作製するために用いることができる。タンパク質バリアントの機能は、評価することができる。機能喪失型バリアントを同定する場合、変異を作製するために用いられる特異的なgRNAは、編集されたゲノムでの部位のシークエンシングを介して、例えばDNAディープシークエンシングを介して、同定することができる。
【０１５２】
核酸塩基エディター
本明細書において記載される機能喪失型PCSK9バリアントを作製する方法は、核酸塩基エディターの使用により可能になる。本明細書において記載されるとおり、核酸塩基エディターは、（ｉ）プログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメイン；および（ｉｉ）デアミナーゼドメインを含む融合タンパク質である。塩基エディターにおいて任意のプログラミング可能なDNA結合ドメインを用いることができることが理解されるべきである。
【０１５３】
いくつかの態様において、プログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメインは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）または転写活性化因子様エフェクタードメイン（TALE）のDNA結合ドメインを含む。いくつかの態様において、プログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメインは、ガイドヌクレオチド配列によりプログラミングすることができ、したがって、「ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメイン」として言及される。いくつかの態様において、ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質は、ヌクレアーゼ不活性型Cas9、またはdCas9である。dCas9は、本明細書において用いられる場合、そのヌクレアーゼ活性において完全に不活性であるか、またはそのヌクレアーゼ活性において部分的に不活性なCas9（例えばCas9ニッカーゼ）を包含する。したがって、いくつかの態様において、ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質は、Cas9ニッカーゼである。いくつかの態様において、ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質は、ヌクレアーゼ不活性型Cpf1である。いくつかの態様において、ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質は、ヌクレアーゼ不活性型アルゴノートである。
【０１５４】
いくつかの態様において、ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質は、dCas9ドメインである。いくつかの態様において、ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質は、Cas9ニッカーゼである。いくつかの態様において、dCas9ドメインは、配列番号２または配列番号３のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、dCas9ドメインは、本明細書において提供されるCas9ドメインのうちのいずれか１つ（例えば、配列番号１１〜２６０）に対して、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号１におけるＤ１０Ｘ（Ｘは、Ｄ以外の任意のアミノ酸である）および／またはＨ８４０Ｘ（Ｘは、Ｈ以外の任意のアミノ酸である）に対応する変異を含む。いくつかの態様において、dCas9ドメインは、本明細書において提供されるCas9ドメインのうちのいずれか１つ（例えば、配列番号１１〜２６０）に対して、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号１におけるＤ１０Ａおよび／またはＨ８４０Ａに対応する変異を含む。いくつかの態様において、Cas9ニッカーゼは、本明細書において提供されるCas9ドメインのうちのいずれか１つ（例えば、配列番号１１〜２６０）に対して、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号１におけるＤ１０Ｘ（Ｘは、Ｄ以外の任意のアミノ酸である）に対応する変異、および配列番号１における位置８４０に対応する位置においてヒスチジンを含む。いくつかの態様において、Cas9ニッカーゼは、本明細書において提供されるCas9ドメインのうちのいずれか１つ（例えば、配列番号１１〜２６０）に対して、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号１におけるＤ１０Ａに対応する変異、および配列番号１における位置８４０に対応する位置においてヒスチジンを含む。いくつかの態様において、それぞれ配列番号２または配列番号３に対して少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、少なくとも約９９．５％同一、または少なくとも約９９．９％であり、配列番号１におけるＤ１０Ａおよび／またはＨ８４０Ａに対応する変異を含む、dCas9またはCas9ニッカーゼのバリアントまたはホモログ（例えば、それぞれ配列番号２または配列番号３のバリアント）が提供される。いくつかの態様において、配列番号２よりも、約５アミノ酸、約１０アミノ酸、約１５アミノ酸、約２０アミノ酸、約２５アミノ酸、約３０アミノ酸、約４０アミノ酸、約５０アミノ酸、約７５アミノ酸、約１００アミノ酸、またはそれより多く、長いまたは短いアミノ酸配列を有する、Cas9のバリアント（例えば、配列番号２のバリアント）が提供され、ただし、当該dCas9バリアントは、配列番号１におけるＤ１０Ａおよび／またはＨ８４０Ａに対応する変異を含む。いくつかの態様において、配列番号３よりも、約５アミノ酸、約１０アミノ酸、約１５アミノ酸、約２０アミノ酸、約２５アミノ酸、約３０アミノ酸、約４０アミノ酸、約５０アミノ酸、約７５アミノ酸、約１００アミノ酸、またはそれより多く、長いまたは短いアミノ酸配列を有する、Cas9ニッカーゼのバリアント（例えば、配列番号３のバリアント）が提供され、ただし、当該dCas9バリアントは、配列番号１における、Ｄ１０Ａに対応する変異を含み、位置８４０に対応する位置においてヒスチジンを含む。
【０１５５】
さらなる好適なヌクレアーゼ不活性型dCas9ドメインは、本開示および当該分野における知識に基づいて当業者に明らかであり、本開示の範囲内である。かかるさらなる例示的な好適なヌクレアーゼ不活性型Cas9ドメインとして、これらに限定されないが、Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ、Ｄ１０Ａ／Ｄ８３９Ａ／Ｈ８４０Ａ、Ｄ１０Ａ／Ｄ８３９Ａ／Ｈ８４０Ａ／Ｎ８６３Ａ変異体ドメイン（例えば、Prashant et al., Nature Biotechnology. 2013；31（9）：833-838を参照；これは、本明細書において参考として援用される）、またはＫ６０３Ｒ（例えば、Chavez et al., Nature Methods 12, 326-328, 2015を参照；これは、これは、本明細書において参考として援用される）が挙げられる。
【０１５６】
いくつかの態様において、本明細書において記載される核酸塩基エディターは、Cas9ドメインとDNAの糖−リン酸骨格との間の静電相互作用が、野生型Cas9ドメインと比較して減少したCas9ドメインを含む。いくつかの態様において、Cas9ドメインは、Cas9ドメインとDNAの糖−リン酸骨格との間の会合を減少させる、１つ以上の変異を含む。いくつかの態様において、本明細書において記載される核酸塩基エディターは、dCas9（例えば、Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａ変異を有するもの）またはCas9ニッカーゼ（例えば、Ｄ１０Ａ変異を有するもの）を含み、ここで、当該dCas9またはCas9ニッカーゼは、配列番号１において提供されるアミノ酸配列のＮ４９７Ｘ、Ｒ６６１Ｘ、Ｑ６９５Ｘ、および／またはＱ９２６Ｘ変異のうちの１つ以上、または配列番号１１〜２６０において提供されるアミノ酸配列のうちのいずれかにおける対応する変異をさらに含み、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸である。いくつかの態様において、本明細書において記載される核酸塩基エディターは、dCas9（例えば、Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａ変異を有するもの）またはCas9ニッカーゼ（例えば、Ｄ１０Ａ変異を有するもの）を含み、ここで、当該dCas9またはCas9ニッカーゼは、配列番号１において提供されるアミノ酸配列のＮ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、および／またはＱ９２６Ａ変異のうちの１つ以上、または配列番号１１〜２６０において提供されるアミノ酸配列のうちのいずれかにおける対応する変異をさらに含む。いくつかの態様において、dCas9ドメイン（例えば、本明細書において提供される核酸塩基エディターのうちのいずれかのもの）は、配列番号２〜９のうちのいずれかにおいて記載されるようなアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、核酸塩基エディターは、配列番号２９３〜３０２および３２１のうちのいずれかにおいて記載されるようなアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、Cas9ドメイン（例えば、本明細書において提供される融合タンパク質のうちのいずれかのもの）は、配列番号９において記載されるようなアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、融合タンパク質は、配列番号３２１において記載されるようなアミノ酸配列を含む。高フィデリティーを有するCas9ドメインは、公知であり、当業者には明らかであろう。例えば、高フィデリティーを有するCas9ドメインは、Kleinstiver, B.P., et al.「High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects.」Nature 529, 490-495（2016）；およびSlaymaker, I.M., et al.「Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity.」Science 351, 84-88（2015）において記載されており；各々の全内容は、本明細書において参考として援用される。
【０１５７】
本明細書において提供される塩基エディター、例えば、塩基エディター２（BE2）または塩基エディター３（BE3）は、本明細書において記載されるようなCas9ドメインを、高フィデリティー塩基エディター、例えば、高フィデリティー塩基エディター２（HF-BE2）または高フィデリティー塩基エディター３（HF-BE3）を生成するように修飾することにより、高フィデリティー塩基エディターへと変換することができることが理解されるべきである。いくつかの態様において、塩基エディター２（BE2）は、デアミナーゼドメイン、dCas9ドメイン、およびUGIドメインを含む。いくつかの態様において、塩基エディター３（BE3）は、デアミナーゼドメイン、nCas9ドメイン、およびUGIドメインを含む。
Cas9とDNA骨格との間の静電相互作用が減少しているCas9バリアント
【数２１−１】
2020503027.tif 000110
【数２１−２】
2020503027.tif 000111
（配列番号９、配列番号１に対する変異に、太字および下線を付す）
高フィデリティー核酸塩基エディター（HF-BE3）
【数２２】
2020503027.tif 000112
（配列番号３２１）
【０１５８】
Cas9は、標的DNA配列におけるCRISPR反復配列中の短いモチーフ（PAMモチーフ）を認識する。「PAMモチーフ」、または「プロトスペーサー隣接モチーフ」とは、本明細書において用いられる場合、CRISPRの細菌の獲得免疫系においてCas9ヌクレアーゼにより標的とされるDNA配列のすぐ後に続くDNA配列を指す。PAMは、浸潤性のウイルスまたはプラスミドの構成成分であるが細菌のCRISPR遺伝子座の構成成分ではない。天然においては、Cas9は、PAM配列が続いてない場合は、標的DNA配列に首尾よく結合しないかまたはこれを切断しないであろう。PAMは、必須のターゲティング構成成分であり（細菌のゲノムにおいては見出されない）、これは、細菌自体を非自己DNAと区別し、それによりCRISPR遺伝子座がヌクレアーゼにより標的とされて破壊されることを防止する。
【０１５９】
野生型Streptococcus pyogenes Cas9は、正準のPAM配列（５’−ＮＧＧ−３’）を認識する。他のCas9ヌクレアーゼ（例えば、Streptococcus thermophiles、Staphylococcus aureus、Neisseria meningitidis、またはTreponema denticolaorからのCas9）およびそれらのCas9バリアントは、当該分野において、異なる、またはより緩やかなPAM必要性を有することが記載されている。例えば、Kleinstiver et al., Nature 523, 481-485, 2015；Klenstiver et al., Nature 529, 490-495, 2016；Ran et al., Nature, Apr 9；520（7546）：186-191, 2015；Kleinstiver et al., Nat Biotechnol, 33（12）：1293-1298, 2015；Hou et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 110（39）：15644-9, 2014；Prykhozhij et al., PLoS One, 10（3）：e0119372, 2015；Zetsche et al., Cell 163, 759-771, 2015；Gao et al., Nature Biotechnology, doi：10.1038/nbt.3547, 2016；Want et al., Nature 461, 754-761, 2009；Chavez et al., doi：dx.doi.org/10.1101/058974；Fagerlund et al., Genome Biol. 2015；16：25, 2015；Zetsche et al., Cell, 163, 759-771, 2015；およびSwarts et al., Nat Struct Mol Biol, 21（9）：743-53, 2014において、これらの各々は、本明細書において参考として援用される。
【０１６０】
したがって、本開示のガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質は、限定することなく、ＮＧＧ、ＮＧＡＮ、ＮＧＮＧ、ＮＧＡＧ、ＮＧＣＧ、ＮＮＧＲＲＴ、ＮＧＲＲＮ、ＮＮＮＲＲＴ、ＮＮＮＧＡＴＴ、ＮＮＡＧＡＡＷ、ＮＡＡＡＣ、ＴＴＮ、ＴＴＴＮ、およびＹＴＮを含む多様なPAM配列を認識することができ、ここで、Ｙはピリミジンであり、Ｎは任意の核酸塩基である。
【０１６１】
異なるＰＡＭ特異性を有するRNAによりプログラミング可能なDNA結合タンパク質の一例は、プレボテラ属（Prevotella）およびフランシセラ（Francisella）由来のクラスター化され、規則的に間隔が空いている短い回分配列リピート（Cpf1）である。Cas9と同様に、Cpf1もまたクラス２のCRISPRエフェクター（class 2 CRISPR effector）である。Cpf1が、Cas9とは別個の特徴との強固なＤＮＡ干渉を仲介することが示されている。Cpf1は、tracrRNAを欠いている単一RNA誘導型エンドヌクレアーゼであり、Ｔ−リッチプロトスペーサー隣接モチーフ（ＴＴＮ、ＴＴＴＮ、またはＹＴＮ）を利用する。さらに、Cpf1はスタガーDNAの二本鎖切断を介してDNAを切断する。１６のCpf1−ファミリータンパク質の中で、AcidaminococcusおよびLachnospiraceae由来の２つの酵素がヒト細胞において効率的なゲノム編集活性を有することが示されている。
【０１６２】
ガイドヌクレオチド配列−プログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメインとして使用され得るヌクレアーゼ−不活性Cpf1（dCpf1）バリアントもまた本開示において役立つ。Cpf1タンパク質は、Cas9のRuvCドメインと同様であるRuvC様エンドヌクレアーゼドメインを有するが、HNHエンドヌクレアーゼドメインは有しておらず、Cpf1のＮ末端がCas9のアルファ−ヘリックス認識ローブ（lobe）を有していない。Cpf1のRuvC様ドメインが両DNA鎖を切断する要因であることおよびRuvC様ドメインの不活性化がCpf1のヌクレアーゼ活性を不活性にすることがZetsche et al., Cell, 163, 759-771, 2015（参照により本明細書に組み込まれている）に示されていた。例えば、Francisella novicida Cpf1（配列番号１０）におけるＤ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ、またはＤ１２５５Ａに対応する変異は、Cpf1のヌクレアーゼ活性を不活性にする。いくつかの態様において、本開示のdCpf1は、配列番号１０におけるＤ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ、Ｄ１２５５Ａ、Ｄ９１７Ａ／Ｅ１００６Ａ、Ｄ９１７Ａ／Ｄ１２５５Ａ、Ｅ１００６Ａ／Ｄ１２５５Ａ、またはＤ９１７Ａ／Ｅ１００６Ａ／Ｄ１２５５Ａに対応する変異を含む。Cpf1のRuvCドメインを不活性にするいずれかの変異、例えば、置換変異、欠失、または挿入は、本開示に従って使用され得る。
【０１６３】
したがって、いくつかの態様において、ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質は、ヌクレアーゼ不活性型Cpf1（dCpf1）である。いくつかの態様において、dCpf1は、配列番号２６１〜２６７または２００７〜２０１４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、dCpf1は、配列番号１０に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号１０におけるＤ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ、Ｄ１２５５Ａ、Ｄ９１７Ａ／Ｅ１００６Ａ、Ｄ９１７Ａ／Ｄ１２５５Ａ、Ｅ１００６Ａ／Ｄ１２５５Ａ、またはＤ９１７Ａ／Ｅ１００６Ａ／Ｄ１２５５Ａに対応する変異を含む。他の細菌種からのCpf1もまた、本開示に従って用いることができる。
野生型Francisella novicida Cpf1（配列番号１０）（Ｄ９１７、Ｅ１００６、およびＤ１２５５に、太字および下線を付す）
【数２３−１】
2020503027.tif 000113
【数２３−２】
2020503027.tif 000114
Francisella novicida Cpf1 D917A（配列番号２６１）（Ａ９１７、Ｅ１００６、およびＤ１２５５に、太字および下線を付す）
【数２４】
2020503027.tif 000115
Francisella novicida Cpf1 E1006A（配列番号２６２）（Ｄ９１７、Ａ１００６、およびＤ１２５５に、太字および下線を付す）
【数２５−１】
2020503027.tif 000116
【数２５−２】
2020503027.tif 000117
Francisella novicida Cpf1 D1255A（配列番号２６３）（Ｄ９１７、Ｅ１００６、およびＡ１２５５に、太字および下線を付す）
【数２６】
2020503027.tif 000118
Francisella novicida Cpf1 D917A/E1006A（配列番号２６４）（Ａ９１７、Ａ１００６、およびＤ１２５５に、太字および下線を付す）
【数２７】
2020503027.tif 000119
Francisella novicida Cpf1 D917A/D1255A（配列番号２６５）（Ａ９１７、Ｅ１００６、およびＡ１２５５に、太字および下線を付す）
【数２８−１】
2020503027.tif 000120
【数２８−２】
2020503027.tif 000121
Francisella novicida Cpf1 E1006A/D1255A（配列番号２６６）（Ｄ９１７、Ａ１００６、およびＡ１２５５に、太字および下線を付す）
【数２９】
2020503027.tif 000122
Francisella novicida Cpf1 D917A/E1006A/D1255A（配列番号２６７）（Ａ９１７、Ａ１００６、およびＡ１２５５に、太字および下線を付す）
【数３０−１】
2020503027.tif 000123
【数３０−２】
2020503027.tif 000124
【０１６４】
いくつかの態様において、ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質は、Acidaminoccous種からのCpf1タンパク質である（AsCpf1）。Acidaminococcus種からのCpf1タンパク質は、先に記載されており、当業者には明らかであろう。例示的なAcidaminococcus Cpf1タンパク質（AsCpf1）として、限定することなく、本明細書において提供されるAsCpf1タンパク質のうちのいずれかが挙げられる。
野生型AsCpf1−残基Ｒ９１２を太い下線において示し、残基６６１〜６６７を斜体および下線において示す。
【数３１】
2020503027.tif 000125
（配列番号２００７）
AsCpf1（Ｒ９１２Ａ）−残基Ａ９１２を太い下線において示し、残基６６１〜６６７を斜体および下線において示す。
【数３２−１】
2020503027.tif 000126
【数３２−２】
2020503027.tif 000127
（配列番号２００８）
【０１６５】
いくつかの態様において、ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質は、Lachnospiraceae種からのCpf1タンパク質である（LbCpf1）。Lachnospiraceae種からのCpf1タンパク質は、先に記載されており、当業者には明らかであろう。例示的なLachnospiraceae Cpf1タンパク質（LbCpf1）として、限定することなく、本明細書において提供されるAsCpf1タンパク質のうちのいずれかが挙げられる。
野生型LbCpf1−残基Ｒ８３６およびＲ１１３８を、太い下線において示す。
【数３３−１】
2020503027.tif 000128
【数３３−２】
2020503027.tif 000129
（配列番号２００９）
LbCpf1（Ｒ８３６Ａ）−残基Ａ８３６を、太い下線において示す。
【数３４】
2020503027.tif 000130
（配列番号２０１０）
LbCpf1（Ｒ１１３８Ａ）−残基Ａ１１３８を、太い下線において示す。
【数３５−１】
2020503027.tif 000131
【数３５−２】
2020503027.tif 000132
（配列番号２０１１）
【０１６６】
いくつかの態様において、Cpf1タンパク質は、無能化された（crippled）Cpf1タンパク質である。本明細書において用いられる場合、「無能化Cpf1」タンパク質は、野生型Cpf1タンパク質と比較して減弱化されたヌクレアーゼ活性を有するCpf1タンパク質である。いくつかの態様において、無能化Cpf1タンパク質は、優先的に、非標的鎖よりも効率的に標的鎖を切断する。例えば、Cpf1タンパク質は、優先的に、二本鎖核酸分子のうちの編集されるべきヌクレオチドが存在する鎖を切断する。いくつかの態様において、無能化Cpf1タンパク質は、優先的に、標的鎖よりも効率的に非標的鎖を切断する。例えば、Cpf1タンパク質は、優先的に、二本鎖核酸分子のうちの編集されるべきヌクレオチドが存在しない鎖を切断する。いくつかの態様において、無能化Cpf1タンパク質は、優先的に、それが非標的鎖を切断するよりも少なくとも５％より効率的に、標的鎖を切断する。いくつかの態様において、無能化Cpf1タンパク質は、優先的に、それが非標的鎖を切断するよりも、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％効率的に、標的鎖を切断する。
【０１６７】
いくつかの態様において、無能化Cpf1タンパク質は、天然に存在しないCpf1タンパク質である。いくつかの態様において、無能化Cpf1タンパク質は、野生型Cpf1タンパク質と比較して、１つ以上の変異を含む。いくつかの態様において、無能化Cpf1タンパク質は、野生型Cpf1タンパク質と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の変異を含む。いくつかの態様において、無能化Cpf1タンパク質は、配列番号２００９において、または別のCpf1タンパク質における対応するアミノ酸において記載されるように、Ｒ８３６Ａ変異を含む。同様の結果を達成するために、配列番号２００９のＲ８３６Ａと相同な残基（例えば、対応するアミノ酸）を含むCpf1をまた、変異させることができることが、理解されるべきである。いくつかの態様において、無能化Cpf1タンパク質は、配列番号２００９において、または別のCpf1タンパク質における対応するアミノ酸において記載されるようなＲ１１３８Ａ変異を含む。いくつかの態様において、無能化Cpf1タンパク質は、配列番号２００７において、または別のCpf1タンパク質における対応するアミノ酸において記載されるようなＲ９１２Ａ変異を含む。いかなる特定の理論にも拘束されることは望まないが、配列番号２００９（LbCpf1）の残基Ｒ８３８および配列番号２００７（AsCpf1）の残基Ｒ９１２は、対応する（例えば相同な）残基の例である。例えば、配列番号２００７と２００９との間のアラインメントの一部は、Ｒ９１２とＲ８３８とが対応する残基であることを示す。
【数３６】
2020503027.tif 000133
【０１６８】
いくつかの態様において、本明細書において提供されるCpf1タンパク質のうちのいずれかは、１つ以上のアミノ酸の欠失を含む。いくつかの態様において、本明細書において提供されるCpf1タンパク質のうちのいずれかは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のアミノ酸の欠失を含む。いかなる特定の理論にも拘束されることは望まないが、Cpf1においてはらせん領域が存在し、これは、AsCpf1（配列番号２００７）の残基６６１〜６６７を含み、これは、Cpf1に融合しているデアミナーゼ（例えばAPOBEC）の機能を妨害し得る。この領域は、アミノ酸配列ＫＫＴＧＤＱＫを含む。したがって、本開示の側面は、Cpf1中のこのらせん領域を妨害する変異（例えば欠失）を含むCpf1タンパク質を提供する。いくつかの態様において、Cpf1タンパク質は、配列番号２００７における以下の残基の１つ以上の欠失、または別のCpf1タンパク質における１つ以上の対応する欠失を含む：Ｋ６６１、Ｋ６６２、Ｔ６６３、Ｇ６６４、Ｄ６６５、Ｑ６６６、およびＫ６６７。いくつかの態様において、Cpf1タンパク質は、配列番号２００７におけるＴ６６３およびＤ６６５の欠失、または別のCpf1タンパク質における対応する欠失を含む。いくつかの態様において、Cpf1タンパク質は、配列番号２００７におけるＫ６６２、Ｔ６６３、Ｄ６６５、およびＱ６６６の欠失、または別のCpf1タンパク質における対応する欠失を含む。いくつかの態様において、Cpf1タンパク質は、配列番号２００７におけるＫ６６１、Ｋ６６２、Ｔ６６３、Ｄ６６５、Ｑ６６６およびＫ６６７の欠失、または別のCpf1タンパク質における対応する欠失を含む。
AsCpf1（Ｔ６６３およびＤ６６５の欠失）
【数３７−１】
2020503027.tif 000134
【数３７−２】
2020503027.tif 000135
（配列番号２０１２）
AsCpf1（Ｋ６６２、Ｔ６６３、Ｄ６６５およびＱ６６６の欠失）
【数３８】
2020503027.tif 000136
（配列番号２０１３）
AsCpf1（Ｋ６６１、Ｋ６６２、Ｔ６６３、Ｄ６６５、Ｑ６６６およびＫ６６７の欠失）
【数３９−１】
2020503027.tif 000137
【数３９−２】
2020503027.tif 000138
（配列番号２０１４）
【０１６９】
いくつかの態様において、本開示のガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメインは、PAM配列に対する必要性を有しない。かかるガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質の一例は、Natronobacterium gregoryiからのアルゴノートタンパク質であってよい（NgAgo）。NgAgoは、ssDNAガイド型エンドヌクレアーゼである。NgAgoは、それをその標的部位へと誘導する約２４ヌクレオチドの５’がリン酸化されたssDNA（gDNA）に結合し、gDNAにおいてDNA二本鎖切断を作製するであろう。Cas9とは対照的に、NgAgo−gDNA系は、プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）を必要としない。ヌクレアーゼ不活性型NgAgo（dNgAgo）を用いることにより、標的とすることができるコドンを著しく拡大することができる。NgAgoの特徴づけおよび使用は、Gao et al., Nat Biotechnol. Epub 2016 May 2. PubMed PMID：27136078；Swarts et al., Nature. 507（7491）（2014）：258-61；およびSwarts et al., Nucleic Acids Res. 43（10）（2015）：5120-9において記載されており、これらの各々は、本明細書において参考として援用される。Natronobacterium gregoryiアルゴノートの配列を、配列番号２７０において提供する。
野生型Natronobacterium gregoryiアルゴノート（配列番号２７０）
【数４０】
2020503027.tif 000139
【０１７０】
いくつかの態様において、ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質は、アルゴノートタンパク質の原核生物ホモログである。アルゴノートタンパク質の原核生物ホモログは公知であり、例えば、Makarova et al., “Prokaryotic homologs of Argonaute proteins are predicted to function as key components of a novel system of defense against mobile genetic elements”, Biol Direct. 2009 Aug 25;4:29. doi：10.1186/1745-6150-4-29において記載されており、これは参照によって本明細書により組み込まれる。いくつかの態様において、ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質は、Marinitoga piezophilaアルゴノート（MpAgo）タンパク質である。CRISPR−関連Marinitoga piezophilaアルゴノート（MpAgo）タンパク質は、５’−リン酸化ガイドを使用して、単一鎖標的配列を切断する。５’ガイドは、すべての公知のアルゴノートにより用いられる。MpAgo-RNA複合体の結晶構造は、５’リン酸相互作用を妨げる残基を含むガイド鎖結合部位を示している。このデータは、５’−ヒドロキシル化ガイドについての非カノニカルな特異性を伴うアルゴノートサブクラスの進化を示唆している。例えば、Kaya et al., “A bacterial Argonaute with noncanonical guide RNA specificity”, Proc Natl Acad Sci U S A. 2016 Apr 12;113(15):4057-62を参照し、その内容全体を参照によって本明細書に組み込まれる。他のアルゴノートタンパク質は、本明細書において記載される融合タンパク質（例えば塩基エディター）のうちのいずれかにおいて、例えばデアミナーゼ（例えば、シチジンデアミナーゼ）を標的核酸（例えばssRNA）に誘導するために用いることができることが、理解されるべきである。
【０１７１】
いくつかの態様において、ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質は、微生物CRISPR-Casシステムの単一エフェクターである。微生物CRISPR-Casシステムの単一エフェクターは、Cas9、Cpf1、C2c1、C2c2、およびC2c3を包含するが、これに限定されない。典型的に、微生物CRISPR-Casシステムは、クラス１およびクラス２システムに分割される。クラス１システムは、マルチサブユニットエフェクター複合体を有し、一方クラス２システムは、単一タンパク質エフェクターを有する。Cas9およびCpf1はクラス２エフェクターである。Cas9およびCpf1に加えて、３つの別個のクラス２CRISPR-Casシステム（C2c1、C2c2、およびC2c3）が、Shmakov et al., “Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR Cas Systems”, Mol. Cell, 2015 Nov 5; 60(3)：385-397に記載されており、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。C2c1およびC2c3の２つのシステムのエフェクターは、Cpf1に関するRuvC様エンドヌクレアーゼドメインを含有する。第３のシステム、C2c2は、２つの予測されるHEPN RNaseドメインを有するエフェクターを含有する。成熟したCRISPR RNAの生産は、C2c1によるCRISPR RNAの生産とは異なり、tracrRNAとは独立である。C2c1は、DNA切断についてCRISPR RNAおよびtracrRNAの両方に依存している。細菌のC2c2は、その活性型RNA単一鎖RNA分解活性とは別個にCRISPR RNAの成熟について独特なRNase活性を所有することを示されている。これらのRNase機能は、互いにおよび、Cpf1のCRISPR RNAプロセシング挙動とは異なる。例えば、East-Seletsky, et al., “Two distinct RNase activities of CRISPR-C2c2 enable guide RNA processing and RNA detection”, Nature, 2016 Oct 13;538(7624):270-273を参照し、その内容全体は、参照によって本明細書に組み込まれる。Leptotrichia shahiiにおけるC2c2のインビトロ生化学的分析は、C2c2が単一CRISPR RNAによる誘導型であり、相補的プロトスペーサーを運搬するｓｓＲＮＡ標的を切断するようプログラムされ得ることを示している。２つの保存されたHEPNドメインにおける触媒残基は、切断を仲介する。触媒残基における変異は、触媒不活性型RNA結合タンパク質を生成する。例えば、Abudayyeh et al., “C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector”, Science, 2016 Aug 5; 353(6299)を参照し、その内容全体は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１７２】
Alicyclobaccillus acidoterrastris C2c1（AacC2c1）の結晶構造は、キメラ単一−分子ガイドRNA（sgRNA）と複合していると報告されている。例えば、Liu et al., “C2c1-sgRNA Complex Structure Reveals RNA-Guided DNA Cleavage Mechanism”, Mol. Cell, 2017 Jan 19;65(2):310-322を参照し、これは、参照によって本明細書に組み込まれる。結晶構造はまた、Alicyclobacillus acidoterrestris C2c1において三重複合体として標的DNAに結合したものについて報告している。例えば、Yang et al., “PAM-dependent Target DNA Recognition and Cleavage by C2C1 CRISPR-Cas endonuclease”, Cell, 2016 Dec 15;167(7):1814-1828を参照し、その内容全体は、参照によって本明細書に組み込まれている。標的および非標的DNA鎖の両方で、AacC2c1の触媒能力のあるコンホメーションは、捕捉され、標的DNAのスタガー７ヌクレオチド切断の結果生じるC2c1-仲介切断と、単一RuvC触媒ポケット内に独立して位置する。C2c1三重複合体と前もって同定されたCas9およびCpf1の対照物との間の構造の比較は、CRISPR−Cas9システムにより使用されたメカニズムの多様性を説明している。
【０１７３】
いくつかの態様において、本明細書において提供される融合タンパク質のうちのいずれかの、ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質は、C2c1、C2c2、またはC2c3タンパク質である。いくつかの態様において、ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質は、C2c1タンパク質である。いくつかの態様において、ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質は、C2c2タンパク質である。いくつかの態様において、ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質は、C2c3タンパク質である。いくつかの態様において、ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質は、天然に存在するC2c1、C2c2、またはC2c3タンパク質に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質は、天然に存在するC2c1、C2c2、またはC2c3タンパク質である。いくつかの態様において、ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質は、配列番号２０１５〜２０１７のうちのいずれか１つに対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質は、配列番号２０１５〜２０１７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。他の細菌種からのC2c1、C2c2、またはC2c3もまた、本開示に従って用いることができることが、理解されるべきである。
C2c1（uniprot.org/uniprot/T0D7A2#）
sp|T0D7A2|C2C1_ALIAG CRISPR関連エンドヌクレアーゼC2c1 OS=Alicyclobacillus acidoterrestris（株ATCC 49025 / DSM 3922 / CIP 106132 / NCIMB 13137 / GD3B）GN=c2c1 PE=1 SV=1
【数４１】
2020503027.tif 000140
（配列番号２０１５）
C2c2（uniprot.org/uniprot/P0DOC6）
＞sp|P0DOC6|C2C2_LEPSD CRISPR関連エンドリボヌクレアーゼC2c2 OS=Leptotrichia shahii（株DSM 19757 / CCUG 47503 / CIP 107916 / JCM 16776 / LB37）GN=c2c2 PE=1 SV=1
【数４２】
2020503027.tif 000141
（配列番号２０１６）
C2c3、翻訳元＞CEPX01008730.1 マリンメタゲノムのゲノムアセンブリTARA_037_MES_0.1-0.22, contig TARA_037_MES_0.1-0.22_scaffold22115_1、全ゲノムショットガン配列
【数４３】
2020503027.tif 000142
（配列番号２０１７）
【０１７４】
いくつかの態様において、本明細書において提供される融合タンパク質のうちのいずれかの、ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質は、単細胞原核微生物の区分および界を構成する古細菌（例えば、ナノ古細菌（nanoarchaea））からのCas9である。いくつかの態様において、ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質は、CasXまたはCasYであり、これらは、例えば、Burstein et al.,「New CRISPR-Cas systems from uncultivated microbes.」Cell Res. 2017 Feb 21. doi：10.1038/cr.2017.21において記載されており、これは、本明細書において参考として援用される。ゲノム分解メタゲノミクス（genome-resolved metagenomics）を用いて、多数のCRISPR-Cas系を同定し、これは、生命の古細菌の区分において初めに報告されたCas9を含んだ。この多様なCas9タンパク質は、活性なCRISPR-Cas系の一部としてナノ古細菌において見出された。細菌においては、２つの先には未知であった系、CRISPR-CasXおよびCRISPR-CasYを発見し、これは、これまでに発見されたうちで最もコンパクトな系である。いくつかの態様において、Cas9とは、CasX、またはCasXのバリアントを指す。いくつかの態様において、Cas9とは、CasY、またはCasYのバリアントを指す。他のＲＮＡガイド型DNA結合タンパク質を、ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質として用いることができ、これらは本開示の範囲内であることを、理解すべきである
【０１７５】
いくつかの態様において、本明細書において提供される融合タンパク質のうちのいずれかのガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質は、CasXまたはCasYタンパク質である。いくつかの態様において、ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質は、CasXタンパク質である。いくつかの態様において、ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質は、CasYタンパク質である。いくつかの態様において、ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質は、天然に存在するCasXまたはCasYタンパク質に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質は、天然に存在するCasXまたはCasYタンパク質である。いくつかの態様において、ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質は、配列番号２０１８〜２０２０のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質は、配列番号２０１８〜２０２０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。他の細菌種からのCasXおよびCasYもまた、本開示に従って用いることができることが、理解されるべきである。
CasX（uniprot.org/uniprot/F0NN87；uniprot.org/uniprot/F0NH53）
＞tr|F0NN87|F0NN87_SULIH CRISPR関連Casxタンパク質OS=Sulfolobus islandicus（株HVE10/4）GN=SiH_0402 PE=4 SV=1
【数４４】
2020503027.tif 000143
（配列番号２０１８）
＞tr|F0NH53|F0NH53_SULIR CRISPR関連タンパク質、Casx OS=Sulfolobus islandicus（株REY15A）GN=SiRe_0771 PE=4 SV=1
【数４５】
2020503027.tif 000144
（配列番号２０１９）
CasY（ncbi.nlm.nih.gov/protein/APG80656.1）
＞APG80656.1 CRISPR関連タンパク質CasY［未培養のParcubacteria群の細菌］
【数４６】
2020503027.tif 000145
（配列番号２０２０）
【０１７６】
縮減されたPAM排他性を有するCas9ドメイン
本開示のいくつかの側面は、異なるPAM特異性を有するCas9ドメインを提供する。典型的には、Cas9タンパク質、例えばS. pyogenesからのCas9（spCas9）は、具体的な核酸領域に結合するためには古典的NGG PAM配列を要求する。これは、ゲノム中の所望の塩基を編集する能力を限定し得る。いくつかの態様において、本明細書において提供される塩基編集融合タンパク質は、正確な場所に置かれることを必要とし得、例えば標的塩基は４塩基領域（例えば、「脱アミノ化ウインドウ」）内に置かれ、これがPAMのおよそ１５塩基上流である。Komor, A.C., et al., "Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage" Nature 533, 420-424 (2016)参照。その内容全体はここで参照によって組み込まれる。従って、いくつかの態様において、本明細書において提供される融合タンパク質のいずれかは、古典的（例えばNGG）PAM配列を含有しないヌクレオチド配列に結合することができるCas9ドメインを含有し得、緩やかなPAM要件を有する（PAMless Cas9）。PAMless Cas9は、配列番号１において提供されるようなStreptococcus pyogenes Cas9と比較して、その３’末端において古典的PAM（例えばNGG）を含まない標的配列に対して、増大した活性、例えば、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１，０００倍、少なくとも５，０００倍、少なくとも１０，０００倍、少なくとも５０，０００倍、少なくとも１００，０００倍、少なくとも５００，０００倍、または少なくとも１，０００，０００倍、増大した活性を示す。非古典的PAM配列に結合するCas9ドメインは当分野において記載されており、当業者には明らかであろう。例えば、非古典的PAM配列に結合するCas9ドメインはKleinstiver, B. P., et al., "Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities" Nature 523, 481-485 (2015)；およびKleinstiver, B. P., et al., "Broadening the targeting range of Staphylococcus aureus CRISPR-Cas9 by modifying PAM recognition" Nature Biotechnology 33, 1293-1298 (2015)に記載されており；それぞれの内容全体はここで参照によって組み込まれる。また、米国仮出願62/245828、62/279346、62/311763、62/322178、および62/357332を参照；これらの各々は、本明細書において参考として援用される。いくつかの態様において、本開示において有用なdCas9またはCas9ニッカーゼは、PAM用件を緩和する変異、例えば、配列番号１におけるＡ２６２Ｔ、Ｋ２９４Ｒ、Ｓ４０９Ｉ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｍ６９４ＩまたはＥ１２１９Ｖに対応する変異をさらに含んでもよい。
【０１７７】
いくつかの態様において、Cas9ドメインはStaphylococcus aureusからのCas9ドメインである（SaCas9）。いくつかの態様において、SaCas9ドメインは、ヌクレアーゼ活性なSaCas9、ヌクレアーゼ不活性型SaCas9（SaCas9d）、またはSaCas9ニッカーゼ（SaCas9n）である。いくつかの態様において、SaCas9はアミノ酸配列配列番号２０２１を含む。いくつかの態様において、SaCas9は、配列番号２０２１のN579X変異、または限定されないが配列番号１〜２６０、２００４または２００６を含む本明細書において開示されるCas9タンパク質によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含み、XはN以外のいずれかのアミノ酸である。いくつかの態様において、SaCas9は、配列番号２０２１のN579A変異、または配列番号１〜２６０、２００４または２００６によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含む。いくつかの態様において、SaCas9ドメイン、SaCas9dドメイン、またはSaCas9nドメインは、非古典的PAMを有する核酸配列（seuqnce）に結合し得る。いくつかの態様において、SaCas9ドメイン、SaCas9dドメイン、またはSaCas9nドメインは、NNGRRT PAM配列を有する核酸配列に結合し得る。いくつかの態様において、SaCas9ドメインは、配列番号２０２１のE781X、N967X、およびR1014X変異の１つ以上、または限定されないが配列番号１〜２６０、２００４または２００６を含む本明細書において提供されるCas9アミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含み、Xはいずれかのアミノ酸である。いくつかの態様において、SaCas9ドメインは、配列番号２０２１のE781K、N967K、およびR1014H変異の１つ以上、または限定されないが配列番号１〜２６０、２００４または２００６を含む本明細書において提供されるCas9アミノ酸配列のいずれかにおける１つ以上の対応する変異を含む。いくつかの態様において、SaCas9ドメインは、配列番号２０２１のE781K、N967K、またはR1014H変異、または限定されないが配列番号１〜２６０、２００４または２００６を含む本明細書において提供されるCas9アミノ酸配列のいずれかにおける１つ以上の対応する変異を含む。
【０１７８】
いくつかの態様において、本明細書で提供される融合タンパク質のいずれかのCas9ドメインは、配列番号２０１２１〜２０２４または２６８のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一である。いくつかの態様において、本明細書で提供される融合タンパク質のいずれかのCas9ドメインは、配列番号２０１２１〜２０２４または２６８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、本明細書で提供される融合タンパク質のいずれかのCas9ドメインは、配列番号２０１２１〜２０２４または２６８のいずれか１つのアミノ酸配列からなる。
例示的なSaCas9配列
【数４７−１】
2020503027.tif 000146
【数４７−２】
2020503027.tif 000147
（配列番号２０２１）
配列番号２０２１の残基Ｎ５７９に下線を付し太字とし、これは、変異して（例えばＡ５７９に）SaCas9ニッカーゼを生じてもよい。
例示的なSaCas9d配列
【数４８】
2020503027.tif 000148
（配列番号２０２２）
配列番号２０２２の残基Ａ１０は、配列番号Ｅ１のＤ１０から変異してヌクレアーゼ不活性型SaCas9dを生じてもよく、これに下線を付し太字とする。
例示的なSaCas9n配列
【数４９−１】
2020503027.tif 000149
【数４９−２】
2020503027.tif 000150
（配列番号２０２３）
配列番号２０２３の残基Ａ５７９は、配列番号２０２１のＮ５７９から変異してSaCas9ニッカーゼを生じてもよく、これに下線を付し太字とする。
例示的なSaKKH Cas9
【数５０】
2020503027.tif 000151
（配列番号２０２４）
配列番号２０２４の残基Ａ５７９は、配列番号２０２１のＮ５７９から変異してSaCas9ニッカーゼを生じてもよく、これに下線を付し太字とする。配列番号２０２４の残基Ｋ７８１、Ｋ９６７およびＨ１０１４は、配列番号２０２１のＥ７８１、Ｎ９６７およびＲ１０１４から変異してSaKKH Cas9を生じてもよく、これに下線を付し、斜体とする。
KKH-nCas9（Ｄ１０Ａ／Ｅ７８２Ｋ／Ｎ９６８Ｋ／Ｒ１０１５Ｈ）S. aureus Cas9ニッカーゼ
【数５１−１】
2020503027.tif 000152
【数５１−２】
2020503027.tif 000153
（配列番号２６８）
【０１７９】
いくつかの態様において、Cas9ドメインは、Streptococcus pyogenesからのCas9ドメイン（SpCas9）である。いくつかの態様において、SpCas9ドメインは、ヌクレアーゼ活性なSpCas9、ヌクレアーゼ不活性型SpCas9（SpCas9d）、またはSpCas9ニッカーゼ（SpCas9n）である。いくつかの態様において、SpCas9は、配列番号２０２５のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、SpCas9は、配列番号２０２５のＤ９Ｘ変異、または本明細書において提供されるCas9アミノ酸配列のうちのいずれかにおける対応する変異を含み、これは、これらに限定されないが、配列番号１〜２６０、２００４または２００６を含み、ここで、Ｘは、Ｄ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの態様において、SpCas9は、配列番号２０２５のＤ９Ａ変異、または本明細書において提供されるCas9アミノ酸配列のうちのいずれかにおける対応する変異を含み、これは、これらに限定されないが、配列番号１〜２６０、２００４または２００６を含む。いくつかの態様において、SpCas9ドメイン、SpCas9dドメイン、またはSpCas9nドメインは、非古典的PAMを有する核酸配列に結合することができる。いくつかの態様において、SpCas9ドメイン、SpCas9dドメイン、またはSpCas9nドメインは、NGG、NGAまたはNGCG PAM配列を有する核酸配列に結合することができる。いくつかの態様において、SpCas9ドメインは、配列番号２０２５のＤ１１３４Ｘ、Ｒ１３３４Ｘ、およびＴ１３３６Ｘ変異のうちの１つ以上、または本明細書において提供されるCas9アミノ酸配列のうちのいずれかにおける対応する変異を含み、これは、これらに限定されないが、配列番号１〜２６０、２００４または２００６を含み、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸である。いくつかの態様において、SpCas9ドメインは、配列番号２０２５のＤ１１３４Ｅ、Ｒ１３３４ＱおよびＴ１３３６Ｒ変異のうちの１つ以上、または本明細書において提供されるCas9アミノ酸配列のうちのいずれかにおける対応する変異を含み、これは、これらに限定されないが、配列番号１〜２６０、２００４または２００６を含む。いくつかの態様において、SpCas9ドメインは、配列番号2025のD1134E、R1334Q、およびT1336R変異、または本明細書において提供されるCas9アミノ酸配列のうちのいずれかにおける対応する変異を含み、これは、これらに限定されないが、配列番号１〜２６０、２００４または２００６を含む。いくつかの態様において、SpCas9ドメインは、配列番号２０２５のＤ１１３４Ｘ、Ｒ１３３４Ｘ、およびＴ１３３６Ｘ変異のうちの１つ以上、または本明細書において提供されるCas9アミノ酸配列のうちのいずれかにおける対応する変異を含み、これは、これらに限定されないが、配列番号１〜２６０、２００４または２００６を含み、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸である。いくつかの態様において、SpCas9ドメインは、配列番号２０２５のＤ１１３４Ｖ、Ｒ１３３４Ｑ、およびＴ１３３６Ｒ変異のうちの１つ以上、または本明細書において提供されるCas9アミノ酸配列のうちのいずれかにおける対応する変異を含み、これは、これらに限定されないが、配列番号１〜２６０、２００４または２００６を含む。いくつかの態様において、SpCas9ドメインは、配列番号２０２５のＤ１１３４Ｖ、Ｒ１３３４Ｑ、およびＴ１３３６Ｒ変異、または本明細書において提供されるCas9���ミノ酸配列のうちのいずれかにおける対応する変異を含み、これは、これらに限定されないが、配列番号１〜２６０、２００４または２００６を含む。いくつかの態様において、SpCas9ドメインは、配列番号２０２５のＤ１１３４Ｘ、Ｇ１２１７Ｘ、Ｒ１３３４Ｘ、およびＴ１３３６Ｘ変異の１つ以上、または本明細書において提供されるCas9アミノ酸配列のうちのいずれかにおける対応する変異を含みこれは、これらに限定されないが、配列番号１〜２６０、２００４または２００６を含み、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸である。いくつかの態様において、SpCas9ドメインは、配列番号２０２５のＤ１１３４Ｖ、Ｇ１２１７Ｒ、Ｒ１３３４Ｑ、およびＴ１３３６Ｒ変異のうちの１つ以上、または本明細書において提供されるCas9アミノ酸配列のうちのいずれかにおける対応する変異を含み、これは、これらに限定されないが、配列番号１〜２６０、２００４または２００６を含む。いくつかの態様において、SpCas9ドメインは、配列番号２０２５のＤ１１３４Ｖ、Ｇ１２１７Ｒ、Ｒ１３３４Ｑ、およびＴ１３３６Ｒ変異、または本明細書において提供されるＣａｓ９アミノ酸配列のうちのいずれかにおける対応する変異を含み、これは、これらに限定されないが、配列番号１〜２６０、２００４または２００６を含む。
【０１８０】
いくつかの態様において、本明細書において提供される融合タンパク質のうちのいずれかのCas9ドメインは、配列番号２０２５〜２０２９または２０００〜２００２のうちのいずれか１つに対して、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一なアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、本明細書において提供される融合タンパク質のうちのいずれかのCas9ドメインは、配列番号２０２５〜２０２９または２０００〜２００２のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、本明細書において提供される融合タンパク質のうちのいずれかのCas9ドメインは、配列番号２０２５〜２０２９または２０００〜２００２のうちのいずれか１つのアミノ酸配列からなる。
例示的なSpCas9
【数５２−１】
2020503027.tif 000154
【数５２−２】
2020503027.tif 000155
（配列番号２０２５）
例示的なSpCas9n
【数５３】
2020503027.tif 000156
（配列番号２０２６）
VRER-Cas9（Ｄ１１３５Ｖ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｅ／Ｔ１３３７Ｒ）S. pyogenes Cas9
【数５４】
2020503027.tif 000157
（配列番号２０２７）（一重下線：HNHドメイン；二重下線：RuvCドメイン）
VRER-nCas9（Ｄ１０Ａ／Ｄ１１３５Ｖ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｅ／Ｔ１３３７Ｒ）S. pyogenes Cas9ニッカーゼ
【数５５−１】
2020503027.tif 000158
【数５５−２】
2020503027.tif 000159
（配列番号２０００）（一重下線：HNHドメイン；二重下線：RuvCドメイン）
VQR-Cas9（Ｄ１１３５Ｖ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ）S. pyogenes Cas9
【数５６】
2020503027.tif 000160
（配列番号２０２８）（一重下線：HNHドメイン；二重下線：RuvCドメイン）
VQR-nCas9（Ｄ１０Ａ／Ｄ１１３５Ｖ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ）S. pyogenes Cas9ニッカーゼ
【数５７−１】
2020503027.tif 000161
【数５７−２】
2020503027.tif 000162
（配列番号２００１）（一重下線：HNHドメイン；二重下線：RuvCドメイン）
EQR-Cas9（Ｄ１１３５Ｅ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ）S. pyogenes Cas9
【数５８】
2020503027.tif 000163
（配列番号２０２９）（一重下線：HNHドメイン；二重下線：RuvCドメイン）
EQR-nCas9（Ｄ１０Ａ／Ｄ１１３５Ｅ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ）S. pyogenes Cas9ニッカーゼ
【数５９−１】
2020503027.tif 000164
【数５９−２】
2020503027.tif 000165
（配列番号２００２）（一重下線：HNHドメイン；二重下線：RuvCドメイン）
【０１８１】
本明細書において記載される核酸塩基エディターにおける使用のために好適な他の非限定的な例示的なCas9バリアント（代替的なPAM要件を有するdCas9、Cas9ニッカーゼおよびCas9バリアントを含む）、およびそれらのそれぞれの配列を、以下に提供する。
Streptococcus thermophilus CRISPR1 Cas9（St1Cas9）ニッカーゼ（D9A）
【数６０】
2020503027.tif 000166
（配列番号２６９）
Streptococcus thermophilus CRISPR3Cas9（St3Cas9）ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）
【数６１】
2020503027.tif 000167
（配列番号１９９９）
【０１８２】
デアミナーゼドメイン
いくつかの態様において、本開示において有用な核酸塩基エディターは、（ｉ）ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメイン；および（ｉｉ）デアミナーゼドメインを含む。いくつかの態様において、融合タンパク質のデアミナーゼドメインは、シトシンデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼは、APOBEC1デアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼは、ラットAPOBEC1である。いくつかの態様において、デアミナーゼは、ヒトAPOBEC1である。いくつかの態様において、デアミナーゼは、APOBEC2デアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼは、APOBEC3Aデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼは、APOBEC3Bデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼは、APOBEC3Cデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼは、APOBEC3Dデアミナーゼである。いくつかの態様においては、APOBEC3Fデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼは、APOBEC3Gデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼは、APOBEC3Hデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼは、APOBEC4デアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼは、活性化誘導デアミナーゼ（AID）である。いくつかの態様において、デアミナーゼは、ヤツメウナギCDA1（pmCDA1）である。いくつかの態様において、デアミナーゼは、ヒトAPOBEC3Gまたはその機能的フラグメントである。いくつかの態様において、デアミナーゼは、ヒトAPOBEC3GにおけるD316R/D317R変異に対応する変異を含む、APOBEC3Gバリアントである。例示的に、本開示の方法により用いることができる非限定的なシトシンデアミナーゼ配列を、以下の例１において提供する。
【０１８３】
いくつかの態様において、シトシンデアミナーゼは、野生型デアミナーゼまたは配列番号２７１〜２９２および３０３において記載されるようなデアミナーゼである。いくつかの態様において、本明細書において提供される融合タンパク質のシトシンデアミナーゼドメインは、デアミナーゼおよびデアミナーゼに対して相同なタンパク質のフラグメントを含む。例えば、いくつかの態様において、デアミナーゼドメインは、配列番号２７１〜２９２および３０３のいずれかにおいて記載されるアミノ酸配列のフラグメントを含んでもよい。いくつかの態様において、デアミナーゼドメインは、配列番号２７１〜２９２および３０３のいずれかにおいて記載されるアミノ酸配列に対して相同なアミノ酸配列、または配列番号２７１〜２９２および３０３のいずれかにおいて記載されるアミノ酸配列のフラグメントに対して相同なアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、デアミナーゼ、デアミナーゼのフラグメント、もしくはデアミナーゼの相同体を含むタンパク質またはデアミナーゼは、「デアミナーゼバリアント」として言及される。デアミナーゼバリアントは、デアミナーゼ、またはそのフラグメントに対して相同性を共有する。例えば、デアミナーゼバリアントは、野生型デアミナーゼまたは配列番号２７１〜２９２および３０３のうちのいずれかにおいて記載されるデアミナーゼに対して、少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、少なくとも約９９．５％同一、または少なくとも約９９．９％である。いくつかの態様において、デアミナーゼバリアントは、フラグメントが、野生型デアミナーゼまたは配列番号２７１〜２９２および３０３のうちのいずれかにおいて記載されるようなデアミナーゼの対応するフラグメントに対して、少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、少なくとも約９９．５％同一、または少なくとも約９９．９％となるような、デアミナーゼのフラグメントを含む。いくつかの態様において、シトシンデアミナーゼは、配列番号２９１または配列番号２９２において記載されるようなＡＰＯＢＥＣ３Ｇバリアントに対して、少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、少なくとも約９９．５％同一、または少なくとも約９９．９％同一であり、配列番号２９０におけるＤ３１６Ｅ／Ｄ３１７Ｒ変異に対応する変異を含む。
【０１８４】
いくつかの態様において、シトシンデアミナーゼドメインは、ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメインのＮ末端に融合している。例えば、融合タンパク質は、ＮＨ２−［シトシンデアミナーゼ］−［ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメイン］−ＣＯＯＨの構造を有していてもよい。上の一般的構造において用いられる『］−［』は、任意のリンカー配列の存在を示す。用語「リンカー」とは、本明細書において用いられる場合、２つの分子または部分、例えば融合タンパク質の２つのドメイン、例えばdCas9ドメインおよびシトシンデアミナーゼドメインなどを連結する化学基または分子を指す。典型的には、リンカーは、２つの基、分子、または他の部分の間に位置するか、またはこれらに隣接し、共有結合を介して各々に連結し、それにより２つを連結するいくつかの態様において、リンカーは、アミノ酸または複数のアミノ酸（例えば、ペプチドまたはタンパク質）である。いくつかの態様において、リンカーは、有機の分子、基、ポリマー、または化学部分である。いくつかの態様において、リンカーは、５〜１００アミノ酸長、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、４５〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、１００〜１５０、または１５０〜２００アミノ酸長である。より長いまたはより短いリンカーもまた、企図される。
【０１８５】
いくつかの態様において、シトシンデアミナーゼドメインとCas9ドメインとは、リンカーを介して互いに融合する。デアミナーゼドメイン（例えば、APOBEC1）とCas9ドメインとの間で多様なリンカーの長さおよび可動性を用いることができる。例えば、特定の用途のためのデアミナーゼ活性のための最適な長さを達成するために、以下のように変化する：形態（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１９９８）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３０８）、（ＧＧＳ）ｎ、および（Ｇ）ｎの非常に可動性が高いリンカーから、形態（ＥＡＡＡＫ）ｎ（配列番号３０９）、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号３１０）のより強固なリンカー（例えば、Guilinger et, al., Nat. Biotechnol. 2014；32（6）：577-82を参照；全内容は、本明細書において参考として援用される）、（ＸＰ）ｎ、またはこれらのうちのいずれかの組み合わせ、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸であり、ｎは、独立して１〜３０の整数である。いくつかの態様において、ｎは、独立して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０であるか、または１つより多くのリンカーもしくは１つより多くのリンカーモチーフが存在する場合、任意のこれらの組み合わせである。いくつかの態様において、リンカーは、（ＧＧＳ）ｎモチーフを含み、ここで、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５である。いくつかの態様において、リンカーは、（ＧＧＳ）ｎモチーフを含み、ここで、ｎは、１、３、または７である。いくつかの態様において、リンカーは、アミノ酸配列ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号３１０）を含み、これはまた、XTENリンカーとしても言及される。いくつかの態様において、リンカーは、ＡＧＶＦ、ＧＦＬＧ、ＦＫ、ＡＬ、ＡＬＡＬ、またはＡＬＡＬＡを含む群から選択されるアミノ酸配列を含むが、これらに限定されない。いくつかの態様において、好適なリンカーのモチーフおよび立体配置は、Chen et al., Fusion protein linkers: property, design and functionality. Adv Drug Deliv Rev. 2013；65（10）：1357-69において記載されるものを含み、これは、本明細書において参考として援用される。いくつかの態様において、リンカーは、以下のアミノ酸配列のうちのいずれかを含んでもよい：ＶＰＦＬＬＥＰＤＮＩＮＧＫＴＣ（配列番号３１１）、ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ（配列番号３１２）、ＳＩＶＡＱＬＳＲＰＤＰＡ（配列番号３１３）、ＭＫＩＩＥＱＬＰＳＡ（配列番号３１４）、ＶＲＨＫＬＫＲＶＧＳ（配列番号３１５）、ＧＨＧＴＧＳＴＧＳＧＳＳ（配列番号３１６）、ＭＳＲＰＤＰＡ（配列番号３１７）、ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ（配列番号３１２）、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡ（配列番号３１８）、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＧＧＳＧＧＳ（配列番号３１９）、またはＧＧＳＭ（配列番号３２０）。さらなる好適なリンカー配列は、本開示に基づいて当業者に明らかとなるであろう。
【０１８６】
所望される標的Ｃ塩基を首尾よく編集するために、Cas9とAPOBECとの間のリンカーを、Komor et al., Nature, 533, 420-424（2016）において記載されるように最適化してもよく、これは、本明細書において参考として援用される。塩基編集のための番号付けスキームは、DNA結合ドメイン（例えば、Cas9、nCas9、dCas9）がゲノムでの部位に結合した場合に生じるプログラミング可能なガイドRNA配列により置き換えられた、DNAの一本鎖伸長部（Ｒ−ループ）中の標的Ｃの予測される位置に基づく（図６を参照）。便利なことに、標的Ｃのすぐ周囲の配列はまた、ガイドRNAの配列にマッチする。塩基編集のための番号付けスキームは、標準的な２０マーのプログラミング可能な配列に基づき、位置「２１」をPAM配列の第１のDNA塩基として定義し、その結果、位置「１」は、２０マーのプログラミング可能なガイドRNA配列の５’末端にマッチする第１のDNA塩基に割り当てられる。したがって、全てのCas9バリアントについて、位置「２１」は、PAM配列（例えば、NGG、NGAN、NGNG、NGAG、NGCG、NNGRRT、NGRRN、NNNRRT、NNNGATT、NNAGAA、NAAAC）の第１の塩基として定義される。より長いプログラミング可能なガイドRNA配列が用いられる場合（例えば、２１マー）、５’末端の塩基には、「−１」から始まって次第に減少する負の数が割り当てられる。PAM配列の位置が異なるか、またはPAM配列を必要としない他のDNA結合ドメインについて、プログラミング可能なガイドRNA配列は、番号付けのための参照として用いられる。３ａａのリンカーは、２〜５つの塩基編集ウィンドウを生じる（例えば、位置２１におけるPAM配列に対して相対的な位置２、３、４、または５）。９ａａのリンカーは、３〜６つの塩基編集ウィンドウを生じる（例えば、位置２１におけるPAM配列に対して相対的な位置３、４、５、または６）。１６ａａのリンカー（例えば、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号３１０）リンカー）は、４〜７つの塩基編集ウィンドウを生じる（例えば、位置２１におけるPAM配列に対して相対的な位置４、５、６、または７）。２１ａａのリンカーは、５〜８つの塩基編集ウィンドウを生じる（例えば、位置２１におけるPAM配列に対して相対的な位置５、６、７、８）。これらのウィンドウの各々は、異なる標的とされるＣ塩基を編集するために有用であり得る。例えば、標的とされたＣ塩基は、隣接PAM配列から異なる距離にあってもよく、リンカーの長さを変化させることにより、所望されるＣ塩基の正確な編集が確実となる。当業者は、CRISPR／Cas9技術の教示、特に、米国仮出願、U.S.S.N. 62/245828、62/279346、62/311,763、62/322178、62/357352、62/370700および62/398490の、ならびにKomor et al., Nature, Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage, 533, 420-424（2016）における教示（これらの各々は、本明細書において参考として援用される）に基づいて、その目的のために編集ウィンドウを決定し、所望されるＣ塩基の正確なターゲティングのためのシトシンデアミナーゼ−dCas9タンパク質のリンカーを正しく設計することができるであろう。
【０１８７】
異なるCas9ドメインは、異なる編集ウィンドウをもたらし得るので、所望される標的Ｃ塩基を首尾よく編集するために、デアミナーゼドメイン（例えば、APOBEC1）に結合させるための適切なCas9ドメインを選択することができる。これは、米国仮出願、U.S.S.N. 62/245,828、62/279,346、62/311,763、62/322,178、62/357,352、62/370,700、および62/398,490において、ならびにKomor et al., Nature, 533, 420-424（2016）において記載されるとおりであり、これらの各々は、本明細書において参考として援用される。例えば、APOBEC1-XTEN-SaCas9n-UGIは、１〜１２個の塩基編集ウィンドウを生じる（例えば、位置２０〜２６におけるNNNRRT PAM配列に対して相対的な位置１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２）。当業者は、CRISPR/Cas9技術の教示に基づいて、その目的のために編集ウィンドウを決定し、所望されるＣ塩基の正確なターゲティングのために、必要とされるCas9の相同体およびシトシンデアミナーゼに結合したリンカーを決定することができるであろう。
【０１８８】
いくつかの態様において、本開示において有用な融合タンパク質は、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤（UGI）ドメインをさらに含む。「ウラシルグリコシラーゼ阻害剤」とは、ウラシル−DNAグリコシラーゼの活性を阻害するタンパク質を指す。脱アミノ化により誘導されるＣからＴへの塩基変更は、Ｕ：Ｇヘテロ二本鎖をもたらし、これは、細胞のDNA修復応答を引き起こす。ウラシルDNAグリコシラーゼ（UDG）は、細胞におけるDNAからのＵの除去を触媒し、塩基除去修復を開始させ、最も一般的な結果として、Ｕ：Ｇ対のＣ：Ｇ対への復帰変異が起こる。したがって、かかる細胞のDNA修復応答は、細胞における核酸塩基編集効率の低下の原因となり得る。ウラシルDNAグリコシラーゼ阻害剤（UGI）は、ヒトUDG活性を強力に遮断することが当該分野において公知である。Komor et al., Nature（2016）において記載されるとおり、UGIドメインをシチジンデアミナーゼ−dCas9融合タンパク質に融合させることは、UDGの活性を低下させ、編集効率を著しく増強した。
【０１８９】
好適なUGIタンパク質およびヌクレオチド配列は、本明細書において提供され、さらなる好適なUGI配列は、当該分野において公知であり、例えば、Wang et al., Uracil-DNA glycosylase inhibitor gene of bacteriophage PBS2 encodes a binding protein specific for uracil-DNA glycosylase. J. Biol. Chem. 264:1163-1171(1989)；Lundquist et al., Site-directed mutagenesis and characterization of uracil-DNA glycosylase inhibitor protein. Role of specific carboxylic amino acids in complex formation with Escherichia coli uracil-DNA glycosylase. J. Biol. Chem. 272:21408-21419(1997)；Ravishankar et al., X-ray analysis of a complex of Escherichia coli uracil DNA glycosylase (EcUDG) with a proteinaceous inhibitor. The structure elucidation of a prokaryotic UDG.  Nucleic Acids Res. 26:4880-4887(1998)；およびPutnam et al., Protein mimicry of DNA from crystal structures of the uracil-DNA glycosylase inhibitor protein and its complex with Escherichia coli uracil-DNA glycosylase. J. Mol. Biol. 287:331-346(1999)において公開されるものを含み、これらの各々は、本明細書において参考として援用される。いくつかの態様において、UGIは、以下のアミノ酸配列を含む：
桿菌ファージPBS2（バクテリオファージPBS2）ウラシル−DNAグリコシラーゼ阻害剤
ＭＴＮＬＳＤＩＩＥＫＥＴＧＫＱＬＶＩＱＥＳＩＬＭＬＰＥＥＶＥＥＶＩＧＮＫＰＥＳＤＩＬＶＨＴＡＹＤＥＳＴＤＥＮＶＭＬＬＴＳＤＡＰＥＹＫＰＷＡＬＶＩＱＤＳＮＧＥＮＫＩＫＭＬ（配列番号３０４）
【０１９０】
いくつかの態様において、UGIタンパク質は、野生型UGIまたは配列番号３０４において記載されるUGIを含む。いくつかの態様において、本開示において有用なUGIタンパク質は、UGIのフラグメントおよびUGIまたはUGIフラグメントに対して相同なタンパク質を含む。例えば、いくつかの態様において、UGIは、配列番号３０４において記載されるアミノ酸配列のフラグメントを含む。いくつかの態様において、UGIは、配列番号３０４において記載されるアミノ酸配列に対して相同なアミノ酸配列、または配列番号３０４において記載されるアミノ酸配列のフラグメントに対して相同なアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、UGIもしくはUGIのフラグメントまたはUGIもしくはUGIフラグメントの相同体を含むタンパク質は、「UGIバリアント」として言及される。UGIバリアントは、UGI、またはそのフラグメントに対して相同性を共有する。例えば、UGIバリアントは、野生型UGIまたは配列番号３０４において記載されるUGIに対して、少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、少なくとも約９９．５％同一、または少なくとも約９９．９％同一である。いくつかの態様において、UGIバリアントは、フラグメントが、野生型UGIまたは配列番号３０４において記載されるUGIの対応するフラグメントに対して、少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、少なくとも約９９．５％同一、または少なくとも約９９．９％同一となるような、UGIのフラグメントを含む。
【０１９１】
さらなるタンパク質は、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤であってもよいことが、理解されるべきである。例えば、ウラシル−DNAグリコシラーゼ塩基除去修復酵素を阻害（例えば、立体的に遮断する）ことができる他のタンパク質は、本開示の範囲内である。いくつかの態様において、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤は、DNAに結合するタンパク質である。いくつかの態様において、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤は、単一鎖DNAに結合するタンパク質である。例えば、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤は、Erwinia tasmaniensis単一鎖結合タンパク質であり得る。いくつかの態様において、単一鎖結合タンパク質は、アミノ酸配列（配列番号３０５）を含む。いくつかの態様において、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤はウラシルに結合するタンパク質である。いくつかの態様において、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤は、DNA中のウラシルに結合するタンパク質である。いくつかの態様において、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤は、触媒不活性型ウラシルDNA−グリコシラーゼタンパク質である。いくつかの態様において、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤は、DNAからウラシルを切除しない触媒不活性型ウラシルDNA-ク゛リコシラーゼタンパク質である。例えば、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤は、UdgXである。いくつかの態様において、UdgXはアミノ酸配列（配列番号３０６）を含む。別の例として、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤は、触媒不活性型UDGである。いくつかの態様において、触媒不活性型UDGはアミノ酸配列（配列番号３０７）を含む。他のウラシルグリコシラーゼ阻害剤は当業者にとって明らかであり、本開示の範囲内であることが理解されるべきである。いくつかの態様において、融合タンパク質は、ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質、シチジンデアミナーゼドメイン、Gamタンパク質、およびUGIドメインを含む。いくつかの態様において、ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質（例えば、Cas9ドメイン）、シチジンデアミナーゼ、およびGamタンパク質を含む、本明細書において提供される融合タンパク質のうちのいずれかは、さらに、直接的に、またはリンカーを介して、UGIドメインに融合していてもよい。本開示はまた、さらにUGIドメインに融合した、シチジンデアミナーゼおよびGamタンパク質に融合した、Cas9ニッカーゼ−核酸編集ドメインを含む、融合タンパク質を企図する。
Erwinia tasmaniensis SSB（熱安定性単鎖DNA結合タンパク質）
ＭＡＳＲＧＶＮＫＶＩＬＶＧＮＬＧＱＤＰＥＶＲＹＭＰＮＧＧＡＶＡＮＩＴＬＡＴＳＥＳＷＲＤＫＱＴＧＥＴＫＥＫＴＥＷＨＲＶＶＬＦＧＫＬＡＥＶＡＧＥＹＬＲＫＧＳＱＶＹＩＥＧＡＬＱＴＲＫＷＴＤＱＡＧＶＥＫＹＴＴＥＶＶＶＮＶＧＧＴＭＱＭＬＧＧＲＳＱＧＧＧＡＳＡＧＧＱＮＧＧＳＮＮＧＷＧＱＰＱＱＰＱＧＧＮＱＦＳＧＧＡＱＱＱＡＲＰＱＱＱＰＱＱＮＮＡＰＡＮＮＥＰＰＩＤＦＤＤＤＩＰ（配列番号３０５）
UdgX（DNA中でウラシルに結合するが、これを除去しない）
ＭＡＧＡＱＤＦＶＰＨＴＡＤＬＡＥＬＡＡＡＡＧＥＣＲＧＣＧＬＹＲＤＡＴＱＡＶＦＧＡＧＧＲＳＡＲＩＭＭＩＧＥＱＰＧＤＫＥＤＬＡＧＬＰＦＶＧＰＡＧＲＬＬＤＲＡＬＥＡＡＤＩＤＲＤＡＬＹＶＴＮＡＶＫＨＦＫＦＴＲＡＡＧＧＫＲＲＩＨＫＴＰＳＲＴＥＶＶＡＣＲＰＷＬＩＡＥＭＴＳＶＥＰＤＶＶＶＬＬＧＡＴＡＡＫＡＬＬＧＮＤＦＲＶＴＱＨＲＧＥＶＬＨＶＤＤＶＰＧＤＰＡＬＶＡＴＶＨＰＳＳＬＬＲＧＰＫＥＥＲＥＳＡＦＡＧＬＶＤＤＬＲＶＡＡＤＶＲＰ（配列番号３０６）
UDG（触媒的に不活性なヒトUDG、DNA中でウラシルに結合するが、これを除去しない）
ＭＩＧＱＫＴＬＹＳＦＦＳＰＳＰＡＲＫＲＨＡＰＳＰＥＰＡＶＱＧＴＧＶＡＧＶＰＥＥＳＧＤＡＡＡＩＰＡＫＫＡＰＡＧＱＥＥＰＧＴＰＰＳＳＰＬＳＡＥＱＬＤＲＩＱＲＮＫＡＡＡＬＬＲＬＡＡＲＮＶＰＶＧＦＧＥＳＷＫＫＨＬＳＧＥＦＧＫＰＹＦＩＫＬＭＧＦＶＡＥＥＲＫＨＹＴＶＹＰＰＰＨＱＶＦＴＷＴＱＭＣＤＩＫＤＶＫＶＶＩＬＧＱＥＰＹＨＧＰＮＱＡＨＧＬＣＦＳＶＱＲＰＶＰＰＰＰＳＬＥＮＩＹＫＥＬＳＴＤＩＥＤＦＶＨＰＧＨＧＤＬＳＧＷＡＫＱＧＶＬＬＬＮＡＶＬＴＶＲＡＨＱＡＮＳＨＫＥＲＧＷＥＱＦＴＤＡＶＶＳＷＬＮＱＮＳＮＧＬＶＦＬＬＷＧＳＹＡＱＫＫＧＳＡＩＤＲＫＲＨＨＶＬＱＴＡＨＰＳＰＬＳＶＹＲＧＦＦＧＣＲＨＦＳＫＴＮＥＬＬＱＫＳＧＫＫＰＩＤＷＫＥＬ（配列番号３０７）
【０１９２】
いくつかの態様において、UGIドメインは、融合タンパク質においてdCas9ドメインのＣ末端に融合している。したがって、融合タンパク質は、以下の構造を有するであろう：ＮＨ２−［シトシンデアミナーゼ］−［ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメイン］−［UGI］−ＣＯＯＨ。いくつかの態様において、UGIドメインは、シトシンデアミナーゼドメインのＮ末端に融合している。したがって、融合タンパク質は、以下の構造を有するであろう：ＮＨ２−［UGI］−［シトシンデアミナーゼ］−［ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメイン］−ＣＯＯＨ。いくつかの態様において、UGIドメインは、ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメインとシトシンデアミナーゼドメインとの間で融合している。したがって、融合タンパク質は、以下の構造を有するであろう：ＮＨ２−［シトシンデアミナーゼ］−［UGI］−［ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメイン］−ＣＯＯＨ。本明細書において記載されるリンカー配列はまた、UGIドメインのシトシンデアミナーゼ−dCas9融合タンパク質への融合のために有用であり得る。
【０１９３】
いくつかの態様において、融合タンパク質は、以下の構造を含む：
［シトシンデアミナーゼ］−［任意のリンカー配列］−［ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質］−［任意のリンカー配列］−［UGI］；
［シトシンデアミナーゼ］−［任意のリンカー配列］−［UGI］−［任意のリンカー配列］−［ ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質］；
［UGI］−［任意のリンカー配列］−［シトシンデアミナーゼ］−［任意のリンカー配列］−［ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質］；
［UGI］−［任意のリンカー配列］−［ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質］−［任意のリンカー配列］−［シトシンデアミナーゼ］；
［ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質］−［任意のリンカー配列］−［シトシンデアミナーゼ］−［任意のリンカー配列］−［UGI］；または
［ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質］−［任意のリンカー配列］−［UGI］−［任意のリンカー配列］−［シトシンデアミナーゼ］。
【０１９４】
いくつかの態様において、融合タンパク質は、以下の構造を含む：
［シトシンデアミナーゼ］−［任意のリンカー配列］−［Cas9ニッカーゼ］−［任意のリンカー配列］−［UGI］；
［シトシンデアミナーゼ］−［任意のリンカー配列］−［UGI］−［任意のリンカー配列］−［Cas9ニッカーゼ］；
［UGI］−［任意のリンカー配列］−［シトシンデアミナーゼ］−［任意のリンカー配列］−［Cas9ニッカーゼ］；
［UGI］−［任意のリンカー配列］−［Cas9ニッカーゼ］−［任意のリンカー配列］−［シトシンデアミナーゼ］；
［Cas9ニッカーゼ］−［任意のリンカー配列］−［シトシンデアミナーゼ］−［任意のリンカー配列］−［UGI］；または
［Cas9ニッカーゼ］−［任意のリンカー配列］−［UGI］−［任意のリンカー配列］−［シトシンデアミナーゼ］。
【０１９５】
いくつかの態様において、本明細書において提供される融合タンパク質は、核局在化配列（NLS）をさらに含む。いくつかの態様において、NLSは、融合タンパク質のＮ末端に融合している。いくつかの態様において、NLSは、融合タンパク質のＣ末端に融合している。いくつかの態様において、NLSは、UGIタンパク質のＮ末端に融合している。いくつかの態様において、NLSは、UGIタンパク質のＣ末端に融合している。いくつかの態様において、NLSは、ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメインのＮ末端に融合している。いくつかの態様において、NLSは、ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメインのＣ末端に融合している。いくつかの態様において、NLSは、シトシンデアミナーゼのＮ末端に融合している。いくつかの態様において、NLSは、デアミナーゼのＣ末端に融合している。いくつかの態様において、NLSは、１つ以上のリンカーを介して融合タンパク質に融合している。いくつかの態様において、NLSは、リンカーなしで融合タンパク質に融合している。非限定的な例示的なNLS配列は、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１９８８）またはＭＤＳＬＬＭＮＲＲＫＦＬＹＱＦＫＮＶＲＷＡＫＧＲＲＥＴＹＬＣ（配列番号１９８９）であってよい。
【０１９６】
本開示のいくつかの側面は、ガイドヌクレオチド配列（例えば、ガイドRNAまたはgRNA）に会合した、本明細書において記載される核酸塩基エディターを提供する。gRNAは、２つ以上のRNAの複合体として、または単一のRNA分子として存在することができる。単一のRNA分子として存在するgRNAは、シングルガイドRNA（sgRNA）としても言及され得るが、「gRNA」は、単一の分子として、または２つ以上の分子の複合体として存在するガイドRNAを指すように、交換可能に用いられる。典型的には、単一のRNA種として存在するgRNAは、２つのドメインを含む：（１）標的核酸に対して相同性を共有する（例えば、およびCas9複合体の標的への結合を指揮する）ドメイン；および（２）Cas9タンパク質に結合するドメイン。いくつかの態様において、ドメイン（２）は、tracrRNAとして知られる配列に対応し、ステムループ構造を含む。例えば、いくつかの態様において、ドメイン（２）は、tracrRNAに対して同一または相同であり、これはJinek et al., Science 337：816-821（2012）において提供されるとおりであり、これは、本明細書において参考として援用される。gRNA（例えばドメイン２を含むもの）の他の例は、２０１３年９月６日に出願された米国仮特許出願、U.S.S.N. 61/874,682、表題「Switchable Cas9 Nucleases And Uses Thereof」、および２０１３年９月６日に出願された米国仮特許出願、U.S.S.N. 61/874,746、表題「Delivery System For Functional Nucleases」において見出すことができ、各々は、本明細書によりその全体において参考として援用される。gRNAは、標的部位を補完するヌクレオチド配列を含み、これは、ヌクレアーゼ／RNA複合体の前記標的部位への結合を媒介し、ヌクレアーゼ：RNA複合体に配列特異性をもたらす。これらのタンパク質は、原則として、ガイドRNAにより特定される任意の配列に対してターゲティングされることができる。Cas9などのRNAによりプログラミング可能なヌクレアーゼを、部位特異的切断のために（例えば、ゲノムを修飾するために）使用する方法は、当該分野において公知である（例えば、Cong, L. et al. Science 339, 819-823（2013）；Mali, P. et al. Science 339, 823-826（2013）；Hwang, W.Y. et al. Nature biotechnology 31, 227-229（2013）；Jinek, M. et al. eLife 2, e00471（2013）；Dicarlo, J.E. et al. Nucleic acids research（2013）；Jiang, W. et al. Nature biotechnology 31, 233-239（2013）を参照；これらの各々は、本明細書において参考として援用される）。特に、本開示の融合タンパク質をその標的配列にターゲティングして、標的とされたＣ塩基を脱アミノ化するために用いることができるガイドヌクレオチド配列（例えば、sgRNA）の例は、Komor et al., Nature,  533, 420-424（2016）において記載され、これは、本明細書において参考として援用される。
【０１９７】
ガイドヌクレオチド配列（例えばsgRNA）の具体的な構造は、その標的配列、および標的配列の下流のPAM配列の総体的な距離に依存する。当業者は、標的配列は、脱アミノ化するために標的とされる各々のおよび全てのＣについて異なるので、ガイドヌクレオチド配列の統合的な構造は示されないことを理解するであろう。
【０１９８】
しかし、本開示は、当業者が、目的の標的配列に対してかかる教示を用いることができるように、ガイドヌクレオチド配列、例えばsgRNAを設計する方法におけるガイドラインを提供する。gRNAは、典型的には、Cas9の結合を可能にするtracrRNAフレームワーク、および本明細書において開示される融合タンパク質に配列特異性を付与するガイド配列を含む。いくつかの態様において、ガイドRNAは、構造５’−［ガイド配列］−tracrRNA−３’を含む。非限定的な例示的なtracrRNA配列を、表１７において示す。
表１７．TracrRNAのオルトログおよび配列
【表１７】
2020503027.tif 000168
gRNAのガイド配列は、標的配列に対して相補的な配列を含む。ガイド配列は、典型的には、約２０ヌクレオチド長である。例えば、ガイド配列は、１５〜２５ヌクレオチド長であってもよい。いくつかの態様において、ガイド配列は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド長である。いくつかの態様において、ガイド配列は、２５ヌクレオチド長より長い。かかる好適なガイドRNA配列は、典型的には、編集されるべき標的ヌクレオチドの上流または下流５０ヌクレオチド以内の核酸配列に対して相補的なガイド配列を含む。
【０１９９】
いくつかの態様において、ガイドRNAは、約１５〜１００ヌクレオチド長であり、標的配列に対して相補的な少なくとも１０個の連続するヌクレオチドの配列を含む。いくつかの態様において、ガイドRNAは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０ヌクレオチド長である。いくつかの態様において、ガイドRNAは、標的配列に対して相補的な１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０個の連続するヌクレオチドの配列を含む。
【０２００】
本明細書において記載される方法を用いてLDLR媒介型コレステロールクリアランス経路において遺伝子を編集するために、核酸塩基エディターおよび／またはガイドヌクレオチド配列を、編集が起こる細胞（例えば肝細胞）中に導入する。いくつかの態様において、核酸塩基エディターおよび／またはガイドヌクレオチド配列をコードする核酸分子（例えば発現ベクター）を、細胞中に送達し、細胞において核酸塩基エディターおよび／またはガイドヌクレオチド配列の共発現をもたらす。核酸塩基エディターおよび／またはガイドヌクレオチド配列をコードする核酸分子を、当該分野において公知の任意の方法、例えば、遺伝子導入（例えば、カチオン性リポソームにより媒介される遺伝子導入）、形質導入（例えば、ウイルス感染を介して）およびエレクトロポレーションを用いて、細胞中に送達してもよい。いくつかの態様において、単離された核酸塩基エディター／gRNA複合体を送達する。当業者は、単離されたタンパク質を細胞に送達する方法に精通している。例えば、gRNAとの複合体中の単離された核酸塩基エディターを、その細胞への侵入を促進する過給された細胞浸透性タンパク質またはペプチドに会合させる（例えば、ＰＣＴ出願公開WO2010129023および米国特許出願公開US20150071906において記載される；本明細書において参考として援用される）。いくつかの態様において、gRNAとの複合体中の単離された核酸塩基エディターは、カチオン性遺伝子導入試薬、例えば、Thermofisher Scientific製のリポフェクタミンCRISPRMAX Cas9遺伝子導入試薬により送達することができる。いくつかの態様において、核酸塩基エディターとgRNAとは、別々に送達してもよい。当業者は、核酸分子または単離されたタンパク質を送達する方法に精通している。
【０２０１】
Gamを含む融合タンパク質
本開示のいくつかの側面は、Gamタンパク質を含む融合タンパク質を提供する。本開示のいくつかの側面は、Gamタンパク質をさらに含む塩基エディターを提供する。塩基エディターは、当該分野において公知であり、例えば、２０１５年６月１８日に公開された米国特許出願公開番号：US-2015-0166980；２０１５年６月１８日に公開されたUS-2015-0166981；２０１５年６月１８日に公開されたUS-2015-0166984；２０１５年６月１８日に公開されたUS-2015-01669851；２０１６年１０日２０日に公開されたUS-2016-0304846；２０１７年５月４日に公開されたUS-2017-0121693-A1；および２０１５年６月１８日に公開されたＰＣＴ出願公開番号：WO 2015/089406；および２０１７年４月２７日に公開されたWO 2017/070632において、先に記載されている；これらの各々の全内容は、本明細書により参考として援用される。当業者は、本開示に基づいて、Gamタンパク質をさらに含む塩基エディターを作製する方法を理解するであろう。
【０２０２】
いくつかの態様において、本開示は、ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質およびGamタンパク質を含む融合タンパク質を提供する。いくつかの態様において、本開示は、シチジンデアミナーゼドメインおよびGamタンパク質を含む融合タンパク質を提供する。いくつかの態様において、本開示は、UGIドメインおよびGamタンパク質を含む融合タンパク質を提供する。いくつかの態様において、本開示は、ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質、シチジンデアミナーゼドメインおよびGamタンパク質を含む融合タンパク質を提供する。いくつかの態様において、本開示は、ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質、シチジンデアミナーゼドメインGamタンパク質およびUGIドメインを含む融合タンパク質を提供する。
【０２０３】
いくつかの態様において、Gamタンパク質は、DNA中の二本鎖切断部に結合して、当該二本鎖切断部におけるDNAの分解を防止または阻害するタンパク質である。いくつかの態様において、Gamタンパク質は、バクテリオファージMuによりコードされ、これは、DNA中の二本鎖切断部に結合する。いかなる特定の理論にも拘束されることは望まないが、Muは、細菌のゲノムの間でそれ自身を転位させ、転位のプロセスにおいて二本鎖切断部を保護するためにGamを用いる。Gamは、二本鎖切断部を修復するためための姉妹染色体との相同組み換えを遮断するために用いることができ、これは、ときに細胞死を引き起こす。ＵＶに暴露された細胞の生存率は、Gamを発現する細胞およびrecBが変異している細胞についてのものと類似する。このことは、GamがDNA修復を遮断することを示す（Cox, 2013）。Gamタンパク質は、したがって、Cas9媒介型の細胞死を促進することができる（Cui et al., 2016）。GamGFPは、二本鎖切断を標識するために用いられるが、Gamタンパク質は類似の真核生物タンパク質Kuと競合するので、これは真核細胞においては困難であり得る（Shee et al., 2013）。
【０２０４】
Gamは、非相同DNA末端連結に関与する２つの真核生物タンパク質である、Ku70およびKu80に関連する（Cui et al., 2016）。Gamは、Kuの両方のサブユニット（Ku70およびKu80）と配列相動性を有し、KuのコアDNA結合領域と類似の構造を有し得る。Mu Gamに対するオルトログは、Haemophilus influenzae、Salmonella typhi、Neisseria meningitidisおよび腸管出血性O157：E. coliのH7株の細菌ゲノムにおいて存在する（d’Adda di Fagagna et al., 2003）。Gamタンパク質は、例えば、Cox, Proteins pinpoint double strand breaks. eLife. 2013；2：e01561.；Cui et al., Consequences of Cas9 cleavage in the chromosome of Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 2016 May 19；44（9）：4243-51. doi：10.1093/nar/gkw223. Epub 2016 Apr 8.；d’Adda di Fagana et al., The Gam protein of bacteriophage Mu is an orthologue of eukaryotic Ku. EMBO Rep. 2003 Jan；4（1）：47-52.；and Shee et al., Engineered proteins detect spontaneous DNA breakage in human and bacterial cells. Elife. 2013 Oct 29；2：e01222. doi：10.7554/eLife.01222において先に記載されており；これらの各々の内容は、本明細書において参考として援用される。
【０２０５】
いくつかの態様において、Gamタンパク質は、DNAにおける二本鎖切断部に結合して、二本鎖切断部におけるDNAの分解を防止または阻害するタンパク質である。いくつかの態様において、Gamタンパク質は、任意の生物（例えば細菌）、例えば、本明細書において提供される生物のうちのいずれかからの、天然に存在するGamタンパク質である。いくつかの態様において、Gamタンパク質は、生物からの天然に存在するGamタンパク質のバリアントである。いくつかの態様において、Gamタンパク質は、天然に存在しない。いくつかの態様において、Gamタンパク質は、天然に存在するGamタンパク質に対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一である。いくつかの態様において、Gamタンパク質は、本明細書において提供されるGamタンパク質のうちのいずれか（例えば、配列番号２０３０）に対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一である。例示的なGamタンパク質を、以下に提供する。いくつかの態様において、Gamタンパク質は、配列番号２０３０〜２０５８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、Gamタンパク質は、本明細書において提供されるGamタンパク質のうちのいずれかの短縮化されたバージョンである。いくつかの態様において、短縮化されたGamタンパク質は、全長Gamタンパク質と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、６、１７、１８、１９、または２０個のＮ末端アミノ酸残基を失っている。いくつかの態様において、短縮化されたGamタンパク質は、全長Gamタンパク質と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、６、１７、１８、１９、または２０個のＣ末端アミノ酸残基を失っていてもよい。いくつかの態様において、Gamタンパク質は、Ｎ末端メチオニンを含まない。
【０２０６】
いくつかの態様において、Gamタンパク質は、本明細書において提供されるGamタンパク質のうちのいずれかに対して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５、９８％、９９％、または９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、Gamタンパク質は、本明細書において提供されるGamタンパク質のうちのいずれか１つと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０個、またはそれより多くの変異を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、Gamタンパク質は、本明細書において提供されるGamタンパク質のうちのいずれかと比較して、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、または少なくとも１７０個の同一の連続するアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、Gamタンパク質は、本明細書において提供されるGamタンパク質のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、Gamタンパク質は、配列番号２０３０〜２０５８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列からなる。
バクテリオファージMuからのGam
ＡＫＰＡＫＲＩＫＳＡＡＡＡＹＶＰＱＮＲＤＡＶＩＴＤＩＫＲＩＧＤＬＱＲＥＡＳＲＬＥＴＥＭＮＤＡＩＡＥＩＴＥＫＦＡＡＲＩＡＰＩＫＴＤＩＥＴＬＳＫＧＶＱＧＷＣＥＡＮＲＤＥＬＴＮＧＧＫＶＫＴＡＮＬＶＴＧＤＶＳＷＲＶＲＰＰＳＶＳＩＲＧＭＤＡＶＭＥＴＬＥＲＬＧＬＱＲＦＩＲＴＫＱＥＩＮＫＥＡＩＬＬＥＰＫＡＶＡＧＶＡＧＩＴＶＫＳＧＩＥＤＦＳＩＩＰＦＥＱＥＡＧＩ（配列番号２０３０）
＞WP_001107930.1：多種の宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam［Enterobacteriaceae］
ＭＡＫＰＡＫＲＩＫＳＡＡＡＡＹＶＰＱＮＲＤＡＶＩＴＤＩＫＲＩＧＤＬＱＲＥＡＳＲＬＥＴＥＭＮＤＡＩＡＥＩＴＥＫＦＡＡＲＩＡＰＩＫＴＤＩＥＴＬＳＫＧＶＱＧＷＣＥＡＮＲＤＥＬＴＮＧＧＫＶＫＴＡＮＬＶＴＧＤＶＳＷＲＶＲＰＰＳＶＳＩＲＧＭＤＡＶＭＥＴＬＥＲＬＧＬＱＲＦＩＲＴＫＱＥＩＮＫＥＡＩＬＬＥＰＫＡＶＡＧＶＡＧＩＴＶＫＳＧＩＥＤＦＳＩＩＰＦＥＱＥＡＧＩ（配列番号２０３１）
＞CAA27978.1：未命名のタンパク質生成物［Escherichia virus Mu］
ＭＡＫＰＡＫＲＩＫＳＡＡＡＡＹＶＰＱＮＲＤＡＶＩＴＤＩＫＲＩＧＤＬＱＲＥＡＳＲＬＥＴＥＭＮＤＡＩＡＥＩＴＥＫＦＡＡＲＩＡＰＩＫＴＤＩＥＴＬＳＫＧＶＱＧＷＣＥＡＮＲＤＥＬＴＮＧＧＫＶＫＴＡＮＬＶＴＧＤＶＳＷＲＶＲＰＰＳＶＳＩＲＧＭＤＡＶＭＥＴＬＥＲＬＧＬＱＲＦＶＲＴＫＱＥＩＮＫＥＡＩＬＬＥＰＫＡＶＡＧＶＡＧＩＴＶＫＳＧＩＥＤＦＳＩＩＰＦＥＱＥＡＧＩ（配列番号２０５８）
＞WP_001107932.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam［Escherichia coli］
ＭＡＫＰＡＫＲＩＫＳＡＡＡＡＹＶＰＱＮＲＤＡＶＩＴＤＩＫＲＩＧＤＬＱＲＥＡＳＲＬＥＴＥＭＮＤＡＩＡＥＩＴＥＫＦＡＡＲＩＡＰＬＫＴＤＩＥＴＬＳＫＧＶＱＧＷＣＥＡＮＲＤＥＬＴＮＧＧＫＶＫＴＡＮＬＶＴＧＤＶＳＷＲＶＲＰＰＳＶＳＩＲＧＭＤＡＶＭＥＴＬＥＲＬＧＬＱＲＦＩＲＴＫＱＥＩＮＫＥＡＩＬＬＥＰＫＡＶＡＧＶＡＧＩＴＶＫＳＧＩＥＤＦＳＩＩＰＦＥＱＥＡＧＩ（配列番号２０３２）
＞WP_061335739.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam［Escherichia coli］
ＭＡＫＰＡＫＲＩＫＳＡＡＡＡＹＶＰＱＮＲＤＡＶＩＴＤＩＫＲＩＧＤＬＱＲＥＡＳＲＬＥＴＥＭＮＤＡＩＡＥＩＴＥＫＦＡＡＲＩＡＰＩＫＴＤＩＥＴＬＳＫＧＶＱＧＷＣＥＡＮＲＤＥＬＴＮＧＧＫＶＫＴＡＮＬＩＴＧＤＶＳＷＲＶＲＰＰＳＶＳＩＲＧＭＤＡＶＭＥＴＬＥＲＬＧＬＱＲＦＩＲＴＫＱＥＩＮＫＥＡＩＬＬＥＰＫＡＶＡＧＶＡＧＩＴＶＫＳＧＩＥＤＦＳＩＩＰＦＥＱＥＡＧＩ（配列番号２０３３）
＞WP_001107937.1：多種の宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam［Enterobacteriaceae］＞EJL11163.1：バクテリオファージMu Gam様ファミリータンパク質［Shigella sonnei str. Moseley］＞CSO81529.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質［Shigella sonnei］＞OCE38605.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam［Shigella sonnei］＞SJK50067.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質［Shigella sonnei］＞SJK19110.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質［Shigella sonnei］＞SIY81859.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質［Shigella sonnei］＞SJJ34359.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質［Shigella sonnei］＞SJK07688.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質［Shigella sonnei］＞SJI95156.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質［Shigella sonnei］＞SIY86865.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質［Shigella sonnei］＞SJJ67303.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質［Shigella sonnei］＞SJJ18596.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質［Shigella sonnei］＞SIX52979.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質［Shigella sonnei］＞SJD05143.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質［Shigella sonnei］＞SJD37118.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質［Shigella sonnei］＞SJE51616.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質［Shigella sonnei］
ＭＡＫＰＡＫＲＩＲＮＡＡＡＡＹＶＰＱＳＲＤＡＶＶＣＤＩＲＲＩＧＤＬＱＲＥＡＡＲＬＥＴＥＭＮＤＡＩＡＥＩＴＥＫＹＡＳＱＩＡＰＬＫＴＳＩＥＴＬＳＫＧＶＱＧＷＣＥＡＮＲＤＥＬＴＮＧＧＫＶＫＴＡＮＬＶＴＧＤＶＳＷＲＱＲＰＰＳＶＳＩＲＧＶＤＡＶＭＥＴＬＥＲＬＧＬＱＲＦＩＲＴＫＱＥＩＮＫＥＡＩＬＬＥＰＫＡＶＡＧＶＡＧＩＴＶＫＳＧＩＥＤＦＳＩＩＰＦＥＱＥＡＧＩ（配列番号２０３４）
＞WP_001107930.1：多種の宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam［Enterobacteriaceae］
ＭＡＫＰＡＫＲＩＫＳＡＡＡＡＹＶＰＱＮＲＤＡＶＩＴＤＩＫＲＩＧＤＬＱＲＥＡＳＲＬＥＴＥＭＮＤＡＩＡＥＩＴＥＫＦＡＡＲＩＡＰＩＫＴＤＩＥＴＬＳＫＧＶＱＧＷＣＥＡＮＲＤＥＬＴＮＧＧＫＶＫＴＡＮＬＶＴＧＤＶＳＷＲＶＲＰＰＳＶＳＩＲＧＭＤＡＶＭＥＴＬＥＲＬＧＬＱＲＦＩＲＴＫＱＥＩＮＫＥＡＩＬＬＥＰＫＡＶＡＧＶＡＧＩＴＶＫＳＧＩＥＤＦＳＩＩＰＦＥＱＥＡＧＩ（配列番号２０３５）
＞CAA27978.1 未命名のタンパク質生成物［EscherichiaウイルスMu］
ＭＡＫＰＡＫＲＩＫＳＡＡＡＡＹＶＰＱＮＲＤＡＶＩＴＤＩＫＲＩＧＤＬＱＲＥＡＳＲＬＥＴＥＭＮＤＡＩＡＥＩＴＥＫＦＡＡＲＩＡＰＩＫＴＤＩＥＴＬＳＫＧＶＱＧＷＣＥＡＮＲＤＥＬＴＮＧＧＫＶＫＴＡＮＬＶＴＧＤＶＳＷＲＶＲＰＰＳＶＳＩＲＧＭＤＡＶＭＥＴＬＥＲＬＧＬＱＲＦＶＲＴＫＱＥＩＮＫＥＡＩＬＬＥＰＫＡＶＡＧＶＡＧＩＴＶＫＳＧＩＥＤＦＳＩＩＰＦＥＱＥＡＧＩ（配列番号２０３６）
＞WP_001107932.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam［Escherichia coli］
ＭＡＫＰＡＫＲＩＫＳＡＡＡＡＹＶＰＱＮＲＤＡＶＩＴＤＩＫＲＩＧＤＬＱＲＥＡＳＲＬＥＴＥＭＮＤＡＩＡＥＩＴＥＫＦＡＡＲＩＡＰＬＫＴＤＩＥＴＬＳＫＧＶＱＧＷＣＥＡＮＲＤＥＬＴＮＧＧＫＶＫＴＡＮＬＶＴＧＤＶＳＷＲＶＲＰＰＳＶＳＩＲＧＭＤＡＶＭＥＴＬＥＲＬＧＬＱＲＦＩＲＴＫＱＥＩＮＫＥＡＩＬＬＥＰＫＡＶＡＧＶＡＧＩＴＶＫＳＧＩＥＤＦＳＩＩＰＦＥＱＥＡＧＩ（配列番号２０３７）
＞WP_061335739.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam［Escherichia coli］
ＭＡＫＰＡＫＲＩＫＳＡＡＡＡＹＶＰＱＮＲＤＡＶＩＴＤＩＫＲＩＧＤＬＱＲＥＡＳＲＬＥＴＥＭＮＤＡＩＡＥＩＴＥＫＦＡＡＲＩＡＰＩＫＴＤＩＥＴＬＳＫＧＶＱＧＷＣＥＡＮＲＤＥＬＴＮＧＧＫＶＫＴＡＮＬＩＴＧＤＶＳＷＲＶＲＰＰＳＶＳＩＲＧＭＤＡＶＭＥＴＬＥＲＬＧＬＱＲＦＩＲＴＫＱＥＩＮＫＥＡＩＬＬＥＰＫＡＶＡＧＶＡＧＩＴＶＫＳＧＩＥＤＦＳＩＩＰＦＥＱＥＡＧＩ（配列番号２０３８）
＞WP_089552732.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam［Escherichia coli］
ＭＡＫＰＡＫＲＩＫＮＡＡＡＡＹＶＰＱＳＲＤＡＶＶＣＤＩＲＲＩＧＤＬＱＲＥＡＡＲＬＥＴＥＭＮＤＡＩＡＥＩＴＥＫＹＡＳＱＩＡＰＬＫＴＳＩＥＴＩＳＫＧＶＱＧＷＣＥＡＮＲＤＥＬＴＮＧＧＫＶＫＴＡＮＬＶＴＧＤＶＳＷＲＱＲＰＰＳＶＳＩＲＧＶＤＡＶＭＥＴＬＥＲＬＧＬＱＲＦＩＲＴＫＱＥＩＮＫＥＡＩＬＬＥＰＫＡＶＡＧＶＡＧＩＴＶＫＳＧＩＥＤＦＳＩＩＰＦＥＱＥＡＧＩ（配列番号２０３９）
＞WP_042856719.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam［Escherichia coli］＞CDL02915.1：推定宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質［Escherichia coli IS35］
ＭＡＫＰＡＫＲＩＫＮＡＡＡＡＹＶＰＱＳＲＤＡＶＶＣＤＩＲＲＩＧＤＬＱＲＥＡＡＲＬＥＴＥＭＮＤＡＩＡＤＩＴＥＫＹＡＳＱＩＡＰＬＫＴＳＩＥＴＬＳＫＧＶＱＧＷＣＥＡＮＲＤＥＬＴＮＧＧＫＶＫＴＡＮＬＶＴＧＤＶＳＷＲＱＲＰＰＳＶＳＩＲＧＶＤＡＶＭＥＴＬＥＲＬＧＬＱＲＦＩＲＴＫＱＥＩＮＫＥＡＩＬＬＥＰＫＡＶＡＧＶＡＧＩＴＶＫＳＧＩＥＤＦＳＩＩＰＦＥＱＥＡＧＩ（配列番号２０４０）
＞WP_001129704.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam［Escherichia coli］＞EDU62392.1：バクテリオファージMu Gam様タンパク質［Escherichia coli 53638］
ＭＡＫＳＡＫＲＩＲＮＡＡＡＡＹＶＰＱＳＲＤＡＶＶＣＤＩＲＲＩＧＮＬＱＲＥＡＡＲＬＥＴＥＭＮＤＡＩＡＥＩＴＥＫＦＡＡＲＩＡＰＬＫＴＤＩＥＴＬＳＫＧＶＱＧＷＣＥＡＮＲＤＥＬＴＮＧＧＫＶＫＴＡＮＬＶＴＧＤＶＳＷＲＱＲＰＰＳＶＳＩＲＧＶＤＡＶＭＥＴＬＥＲＬＧＬＱＲＦＩＲＴＫＱＥＩＮＲＥＡＩＬＬＥＰＫＡＶＡＧＶＡＧＩＴＶＫＳＧＩＥＤＦＳＩＩＰＦＥＱＤＡＧＩ（配列番号２０４１）
＞WP_001107936.1：多種の宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam［Enterobacteriaceae］＞EGI94970.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質gam［Shigella boydii 5216-82］＞CSR34065.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質［Shigella sonnei］＞CSQ65903.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質［Shigella sonnei］＞CSQ94361.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質［Shigella sonnei］＞SJK23465.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質［Shigella sonnei］＞SJB59111.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質［Shigella sonnei］＞SJI55768.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質［Shigella sonnei］＞SJI56601.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質［Shigella sonnei］＞SJJ20109.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質［Shigella sonnei］＞SJJ54643.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質［Shigella sonnei］＞SJI29650.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質［Shigella sonnei］＞SIZ53226.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質［Shigella sonnei］＞SJA65714.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質［Shigella sonnei］＞SJJ21793.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質［Shigella sonnei］＞SJD61405.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質［Shigella sonnei］＞SJJ14326.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質［Shigella sonnei］＞SIZ57861.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質［Shigella sonnei］＞SJD58744.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質［Shigella sonnei］＞SJD84738.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質［Shigella sonnei］＞SJJ51125.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質［Shigella sonnei］＞SJD01353.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質［Shigella sonnei］＞SJE63176.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質［Shigella sonnei］
ＭＡＫＰＡＫＲＩＲＮＡＡＡＡＹＶＰＱＳＲＤＡＶＶＣＤＩＲＲＩＧＤＬＱＲＥＡＡＲＬＥＴＥＭＮＤＡＩＡＥＩＴＥＫＹＡＳＱＩＡＰＬＫＴＳＩＥＴＬＳＫＧＶＱＧＷＣＥＡＮＲＤＥＬＴＮＧＧＫＶＫＴＡＮＬＶＴＧＤＶＳＷＲＱＲＰＰＳＶＳＩＲＧＶＤＡＶＭＥＴＬＥＲＬＧＬＱＲＦＩＲＴＫＱＥＩＮＫＥＡＩＬＬＥＰＫＡＶＡＧＶＡＧＩＴＶＫＳＧＩＥＤＦＳＩＩＰＦＥＱＤＡＧＩ（配列番号２０４２）
＞WP_050939550.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam［Escherichia coli］＞KNF77791.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam［Escherichia coli］
ＭＡＫＰＡＫＲＩＫＮＡＡＡＡＹＶＰＱＳＲＤＡＶＶＣＤＩＲＲＩＧＤＬＱＲＥＡＡＲＬＥＴＥＭＮＤＡＩＡＥＩＴＥＫＹＡＳＱＩＡＰＬＫＴＳＩＥＴＬＳＫＧＶＱＧＷＣＥＡＮＲＤＥＬＴＮＧＧＫＶＫＴＡＮＬＶＴＧＤＶＳＷＲＬＲＰＰＳＶＳＩＲＧＶＤＡＶＭＥＴＬＥＲＬＧＬＱＲＦＩＣＴＫＱＥＩＮＫＥＡＩＬＬＥＰＫＶＶＡＧＶＡＧＩＴＶＫＳＧＩＥＤＦＳＩＩＰＦＥＱＥＡＧＩ（配列番号２０４３）
＞WP_085334715.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam［Escherichia coli］＞OSC16757.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam［Escherichia coli］
ＭＡＫＰＶＫＲＩＲＮＡＡＡＡＹＶＰＱＳＲＤＡＶＶＣＤＩＲＲＩＧＤＬＱＲＥＡＡＲＬＥＴＥＭＮＤＡＩＡＥＩＴＥＫＹＡＳＱＩＡＰＬＫＴＳＩＥＴＬＳＫＧＩＱＧＷＣＥＡＮＲＤＥＬＴＮＧＧＫＶＫＴＡＮＬＶＴＧＤＶＳＷＲＱＲＰＰＳＶＳＩＲＧＶＤＡＶＭＥＴＬＥＲＬＧＬＱＲＦＩＲＴＫＱＥＩＮＫＥＡＩＬＬＥＰＫＡＶＡＧＶＡＧＩＴＶＫＳＧＩＥＤＦＳＩＩＰＦＥＱＥＡＧＩ（配列番号２０４４）
＞WP_065226797.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam［Escherichia coli］＞ANO88858.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam［Escherichia coli］＞ANO89006.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam［Escherichia coli］
ＭＡＫＰＡＫＲＩＲＮＡＡＡＡＹＶＰＱＳＲＤＡＶＶＣＤＩＲＷＩＧＤＬＱＲＥＡＶＲＬＥＴＥＭＮＤＡＩＡＥＩＴＥＫＹＡＳＲＩＡＰＬＫＴＲＩＥＴＬＳＫＧＶＱＧＷＣＥＡＮＲＤＥＬＴＮＧＧＫＶＫＴＡＮＬＶＴＧＤＶＳＷＲＱＲＰＰＳＶＳＩＲＧＶＤＡＶＭＥＴＬＥＲＬＧＬＱＲＦＩＲＴＫＱＥＩＮＫＥＡＩＬＬＥＰＫＡＶＡＧＶＡＧＩＴＶＫＳＧＩＥＤＦＳＩＩＰＦＥＱＥＡＧＩ（配列番号２０４５）
＞WP_032239699.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam［Escherichia coli］＞KDU26235.1：バクテリオファージMu Gam様ファミリータンパク質［Escherichia coli 3-373-03_S4_C2］＞KDU49057.1：バクテリオファージMu Gam様ファミリータンパク質［Escherichia coli 3-373-03_S4_C1］＞KEL21581.1：バクテリオファージMu Gam様ファミリータンパク質［Escherichia coli 3-373-03_S4_C3］
ＭＡＫＳＡＫＲＩＲＮＡＡＡＴＹＶＰＱＳＲＤＡＶＶＣＤＩＲＲＩＧＤＬＱＲＥＡＡＲＬＥＴＥＭＮＤＡＩＡＥＩＴＥＫＹＡＳＱＩＡＰＬＫＴＳＩＥＴＬＳＫＧＩＱＧＷＣＥＡＮＲＤＥＬＴＮＧＧＫＶＫＴＡＮＬＶＴＧＤＶＳＷＲＱＲＰＰＳＶＳＩＲＧＶＤＡＶＭＥＴＬＥＲＬＧＬＱＲＦＩＲＴＫＱＥＩＮＫＥＡＩＬＬＥＰＫＡＶＡＧＶＡＧＩＴＶＫＳＧＩＥＤＦＳＩＩＰＦＥＱＥＡＧＩ（配列番号２０４６）
＞WP_080172138.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam［Salmonella enterica］
ＭＡＫＳＡＫＲＩＫＳＡＡＡＴＹＶＰＱＳＲＤＡＶＶＣＤＩＲＲＩＧＤＬＱＲＥＡＡＲＬＥＴＥＭＮＤＡＩＡＥＩＴＥＫＹＡＳＱＩＡＰＬＫＴＳＩＥＴＬＳＫＧＶＱＧＷＣＥＡＮＲＤＥＬＴＮＧＧＫＶＫＳＡＮＬＶＴＧＤＶＱＷＲＱＲＰＰＳＶＳＩＲＧＶＤＡＶＭＥＴＬＥＲＬＧＬＱＲＦＩＲＴＫＱＥＩＮＫＥＡＩＬＬＥＰＫＡＶＡＧＶＡＧＩＴＶＫＳＧＩＥＤＦＳＩＩＰＦＥＱＥＡＧＩ（配列番号２０４７）
＞WP_077134654.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam［Shigella sonnei］＞SIZ51898.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質［Shigella sonnei］＞SJK07212.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質［Shigella sonnei］
ＭＡＫＳＡＫＲＩＲＮＡＡＡＡＹＶＰＱＳＲＤＡＶＶＣＤＩＲＲＩＧＮＬＱＲＥＡＡＲＬＥＴＥＭＮＤＡＩＡＥＩＴＥＫＹＡＳＱＩＡＰＬＫＴＳＩＥＴＬＳＫＧＶＱＧＷＣＥＡＮＲＤＥＬＴＮＧＧＫＶＫＴＡＮＬＶＴＧＤＶＳＷＲＱＲＰＰＳＶＳＩＲＧＶＤＡＶＭＥＴＬＥＲＬＧＬＱＲＦＩＲＴＫＱＥＩＮＫＥＡＩＬＬＥＰＫＡＶＡＧＶＡＧＩＴＶＫＳＧＩＥＤＦＳＩＩＰＦＥＱＤＡＧＩ（配列番号２０４８）
＞WP_000261565.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam［Shigella flexneri］＞EGK20651.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質gam［Shigella flexneri K-272］＞EGK34753.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質gam［Shigella flexneri K-227］
ＭＶＶＳＡＩＡＳＴＰＨＤＡＶＶＣＤＩＲＲＩＧＤＬＱＲＥＡＡＲＬＥＴＥＭＮＤＡＩＡＥＩＴＥＫＤＡＳＱＩＡＰＬＫＴＳＩＥＴＬＳＫＧＶＱＧＷＣＥＡＮＲＤＥＬＴＮＧＧＫＶＫＴＡＮＬＶＴＧＤＶＳＷＲＱＲＰＰＳＶＳＩＲＧＶＤＡＶＭＥＴＬＥＲＬＧＬＱＲＦＩＲＴＫＱＥＩＮＫＥＡＩＬＬＥＰＫＡＶＡＧＶＡＧＩＴＶＫＳＧＩＥＤＦＳＩＩＰＦＥＱＥＡＧＩ（配列番号２０４９）
＞ASG63807.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam［Kluyvera georgiana］
ＭＶＳＫＰＫＲＩＫＡＡＡＡＮＹＶＳＱＳＲＤＡＶＩＴＤＩＲＫＩＧＤＬＱＲＥＡＴＲＬＥＳＡＭＮＤＥＩＡＶＩＴＥＫＹＡＧＬＩＫＰＬＫＡＤＶＥＭＬＳＫＧＶＱＧＷＣＥＡＮＲＤＤＬＴＳＮＧＫＶＫＴＡＮＬＶＴＧＤＩＱＷＲＩＲＰＰＳＶＳＶＲＧＰＤＡＶＭＥＴＬＴＲＬＧＬＳＲＦＩＲＴＫＱＥＩＮＫＥＡＩＬＮＥＰＬＡＶＡＧＶＡＧＩＴＶＫＳＧＩＥＤＦＳＩＩＰＦＥＱＴＡＤＩ（配列番号２０５０）
＞WP_078000363.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam［Edwardsiella tarda］
ＭＡＳＫＰＫＲＩＫＳＡＡＡＮＹＶＳＱＳＲＤＡＶＩＩＤＩＲＫＩＧＤＬＱＲＥＡＴＲＬＥＳＡＭＮＤＥＩＡＶＩＴＥＫＹＡＧＬＩＫＰＬＫＡＤＶＥＭＬＳＫＧＶＱＧＷＣＥＡＮＲＤＥＬＴＣＮＧＫＶＫＴＡＮＬＶＴＧＤＩＱＷＲＩＲＰＰＳＶＳＶＲＧＰＤＳＶＭＥＴＬＬＲＬＧＬＳＲＦＩＲＴＫＱＥＩＮＫＥＡＩＬＮＥＰＬＡＶＡＧＶＡＧＩＴＶＫＴＧＶＥＤＦＳＩＩＰＦＥＱＴＡＤＩ（配列番号２０５１）
＞WP_047389411.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam［Citrobacter freundii］＞KGY86764.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam［Citrobacter freundii］＞OIZ37450.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam［Citrobacter freundii］
ＭＶＳＫＰＫＲＩＫＡＡＡＡＮＹＶＳＱＳＫＥＡＶＩＡＤＩＲＫＩＧＤＬＱＲＥＡＴＲＬＥＳＡＭＮＤＥＩＡＶＩＴＥＫＹＡＧＬＩＫＰＬＫＴＤＶＥＩＬＳＫＧＶＱＧＷＣＥＡＮＲＤＥＬＴＳＮＧＫＶＫＴＡＮＬＶＴＧＤＩＱＷＲＩＲＰＰＳＶＡＶＲＧＰＤＡＶＭＥＴＬＬＲＬＧＬＳＲＦＩＲＴＫＱＥＩＮＫＥＡＩＬＮＥＰＬＡＶＡＧＶＡＧＩＴＶＫＳＧＶＥＤＦＳＩＩＰＦＥＱＴＡＤＩ（配列番号２０５２）
＞WP_058215121.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam［Salmonella enterica］＞KSU39322.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam［Salmonella enterica subsp. enterica］＞OHJ24376.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam［Salmonella enterica］＞ASG15950.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam［Salmonella enterica subsp. enterica serovar Macclesfield str. S-1643］
ＭＡＳＫＰＫＲＩＫＡＡＡＡＬＹＶＳＱＳＲＥＤＶＶＲＤＩＲＭＩＧＤＦＱＲＥＩＶＲＬＥＴＥＭＮＤＱＩＡＡＶＴＬＫＹＡＤＫＩＫＰＬＱＥＱＬＫＴＬＳＥＧＶＱＮＷＣＥＡＮＲＳＤＬＴＮＧＧＫＶＫＴＡＮＬＶＴＧＤＶＱＷＲＶＲＰＰＳＶＴＶＲＧＶＤＳＶＭＥＴＬＲＲＬＧＬＳＲＦＩＲＩＫＥＥＩＮＫＥＡＩＬＮＥＰＧＡＶＡＧＶＡＧＩＴＶＫＳＧＶＥＤＦＳＩＩＰＦＥＱＳＡＴＮ（配列番号２０５３）
＞WP_016533308.1：ファージ：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam［Pasteurella multocida］＞EPE65165.1：ファージ：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam［Pasteurella multocida P1933］＞ESQ71800.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam［Pasteurella multocida subsp. multocida P1062］＞ODS44103.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam［Pasteurella multocida］＞OPC87246.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam［Pasteurella multocida subsp. multocida］＞OPC98402.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam［Pasteurella multocida subsp. multocida］
ＭＡＫＫＡＴＲＩＫＴＴＡＱＶＹＶＰＱＳＲＥＤＶＡＳＤＩＫＴＩＧＤＬＮＲＥＩＴＲＬＥＴＥＭＮＤＫＩＡＥＩＴＥＳＹＫＧＱＦＳＰＩＱＥＲＩＫＮＬＳＴＧＶＱＦＷＡＥＡＮＲＤＱＩＴＮＧＧＫＴＫＴＡＮＬＩＴＧＥＶＳＷＲＶＲＮＰＳＶＫＩＴＧＶＤＳＶＬＱＮＬＫＩＨＧＬＴＫＦＩＲＶＫＥＥＩＮＫＥＡＩＬＮＥＫＨＥＶＡＧＩＡＧＩＫＶＶＳＧＶＥＤＦＶＩＴＰＦＥＱＥＩ（配列番号２０５４）
＞WP_005577487.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam［Aggregatibacter actinomycetemcomitans］＞EHK90561.1：ファージ：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam［Aggregatibacter actinomycetemcomitans RhAA1］＞KNE77613.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam［Aggregatibacter actinomycetemcomitans RhAA1］
ＭＡＫＳＡＴＲＶＫＡＴＡＱＩＹＶＰＱＴＲＥＤＡＡＧＤＩＫＴＩＧＤＬＮＲＥＶＡＲＬＥＡＥＭＮＤＫＩＡＡＩＴＥＤＹＫＤＫＦＡＰＬＱＥＲＩＫＴＬＳＮＧＶＱＹＷＳＥＡＮＲＤＱＩＴＮＧＧＫＴＫＴＡＮＬＶＴＧＥＶＳＷＲＶＲＮＰＳＶＫＶＴＧＶＤＳＶＬＱＮＬＲＩＨＧＬＥＲＦＩＲＴＫＥＥＩＮＫＥＡＩＬＮＥＫＳＡＶＡＧＩＡＧＩＫＶＩＴＧＶＥＤＦＶＩＴＰＦＥＱＥＡＡ（配列番号２０５５）
＞WP_090412521.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam［Nitrosomonas halophila］＞SDX89267.1：Mu様プロファージ：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam［Nitrosomonas halophila］
ＭＡＲＮＡＡＲＬＫＴＫＳＩＡＹＶＰＱＳＲＤＤＡＡＡＤＩＲＫＩＧＤＬＱＲＱＬＴＲＴＳＴＥＭＮＤＡＩＡＡＩＴＱＮＦＱＰＲＭＤＡＩＫＥＱＩＮＬＬＱＡＧＶＱＧＹＣＥＡＨＲＨＡＬＴＤＮＧＲＶＫＴＡＮＬＩＴＧＥＶＱＷＲＱＲＰＰＳＶＳＩＲＧＱＱＶＶＬＥＴＬＲＲＬＧＬＥＲＦＩＲＴＫＥＥＶＮＫＥＡＩＬＮＥＰＤＥＶＲＧＶＡＧＬＮＶＩＴＧＶＥＤＦＶＩＴＰＦＥＱＥＱＰ（配列番号２０５６）
＞WP_077926574.1：宿主−ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam［Wohlfahrtiimonas幼虫］
ＭＡＫＫＲＩＫＡＡＡＴＶＹＶＰＱＳＫＥＥＶＱＮＤＩＲＥＩＧＤＩＳＲＫＮＥＲＬＥＴＥＭＮＤＲＩＡＥＩＴＮＥＹＡＰＫＦＥＶＮＫＶＲＬＥＬＬＴＫＧＶＱＳＷＣＥＡＮＲＤＤＬＴＮＳＧＫＶＫＳＡＮＬＶＴＧＫＶＥＷＲＱＲＰＰＳＩＳＶＫＧＭＤＡＶＩＥＷＬＱＤＳＫＹＱＲＦＬＲＴＫＶＥＶＮＫＥＡＭＬＮＥＰＥＤＡＫＴＩＰＧＩＴＩＫＳＧＩＥＤＦＡＩＴＰＦＥＱＥＡＧＶ（配列番号２０５７）
【０２０７】
組成物
本開示の側面は、PCSK9をコードするポリヌクレオチドを編集するために用いることができる組成物に関する。いくつかの態様において、編集は、in vitroで行われる。いくつかの態様において、編集は、培養細胞において行われる。いくつかの態様において、編集は、in vivoで行われる。いくつかの態様において、編集は、哺乳動物において行われる。いくつかの態様において、哺乳動物は、ヒトである。いくつかの態様において、哺乳動物は、げっ歯類であってもよい。いくつかの態様において、編集は、ex vivoで行われる。
【０２０８】
いくつかの態様において、組成物は、以下を含む：（ｉ）（ａ）ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメイン；および（ｂ）シトシンデアミナーゼドメインを含む融合タンパク質；および（ｉｉ）（ｉ）の融合タンパク質をプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（PCSK9）タンパク質をコードするポリヌクレオチドにターゲティングするガイドヌクレオチド配列。いくつかの態様において、（ｉ）の融合タンパク質は、Gamタンパク質をさらに含む。
【０２０９】
いくつかの態様において、組成物は、以下を含む：（ｉ）（ａ）ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメイン；および（ｂ）シトシンデアミナーゼドメインを含む融合タンパク質；（ｉｉ）（ｉ）の融合タンパク質をプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（PCSK9）タンパク質をコードするポリヌクレオチドにターゲティングするガイドヌクレオチド配列；ならびに（ｉｉ）（ｉ）の融合タンパク質をアポリポタンパク質Ｃ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドにターゲティングするガイドヌクレオチド配列。いくつかの態様において、（ｉ）の融合タンパク質は、Gamタンパク質をさらに含む。
【０２１０】
いくつかの態様において、組成物は、以下を含む：（ｉ）（ａ）ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメイン；および（ｂ）シトシンデアミナーゼドメインを含む融合タンパク質；（ｉｉ）（ｉ）の融合タンパク質を核酸分子プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（PCSK9）タンパク質をコードするポリヌクレオチドにターゲティングするガイドヌクレオチド配列；（ｉｉｉ）（ｉ）の融合タンパク質をアポリポタンパク質Ｃ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドにターゲティングするガイドヌクレオチド配列；ならびに（ｉｖ）（ｉ）の融合タンパク質を核酸分子低密度リポタンパク質受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチドにターゲティングするガイドヌクレオチド配列。いくつかの態様において、（ｉ）の融合タンパク質は、Gamタンパク質をさらに含む。
【０２１１】
いくつかの態様において、組成物は、以下を含む：（ｉ）（ａ）ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメイン；および（ｂ）シトシンデアミナーゼドメインを含む融合タンパク質；（ｉｉ）（ｉ）の融合タンパク質をプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（PCSK9）タンパク質をコードするポリヌクレオチドにターゲティングするガイドヌクレオチド配列；（ｉｉｉ）（ｉ）の融合タンパク質をアポリポタンパク質Ｃ３タンパク質をコードする核酸分子ポリヌクレオチドにターゲティングするガイドヌクレオチド配列；（ｉｖ）（ｉ）の融合タンパク質を低密度リポタンパク質受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチドにターゲティングするガイドヌクレオチド配列；および（ｖ）（ｉ）の融合タンパク質をLDL受容体タンパク質の誘導性分解剤をコードするポリヌクレオチドにターゲティングするガイドヌクレオチド配列。いくつかの態様において、（ｉ）の融合タンパク質は、Gamタンパク質をさらに含む。
【０２１２】
PCSK9をコードするポリヌクレオチドを編集するために本明細書において記載される組成物において用いられるガイドヌクレオチド配列は、配列番号３３６〜１３０９から選択される。APOC3をコードするポリヌクレオチドを編集するために本明細書において記載される組成物において用いられるガイドヌクレオチド配列は、配列番号１８０６〜１９０６から選択される。LDLRをコードするポリヌクレオチドを編集するために本明細書において記載される組成物において用いられるガイドヌクレオチド配列は、配列番号１７９２〜１７９９から選択される。IDOLをコードするポリヌクレオチドを編集するために本明細書において記載される組成物において用いられるガイドヌクレオチド配列は、配列番号１７８８〜１７９１から選択される。いくつかの態様において、組成物は、記載される融合タンパク質をコードする核酸および本明細書において記載されるガイドヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、本明細書において記載される組成物は、薬学的に受入可能なキャリアをさらに含む。いくつかの態様において、核酸塩基エディター（すなわち、融合タンパク質）およびgRNAは、２つの異なる組成物において提供される。
【０２１３】
ここで使用されるとき、用語「薬学的に許容可能な担体」は、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、製造助剤（例えば、潤滑剤、タルクマグネシウム、カルシウムまたは亜鉛ステアラート、ステアリン酸）などの薬学的に許容可能な材料、組成物またはビヒクル、または、化合物を身体の１つの部位（例えば送達部位）から別の部位（例えば器官、組織または身体の一部）に運搬または輸送することに関与する溶媒封入材料を意味する。薬学的に許容可能な担体は、製剤の他の成分と適合性であり、そして対象の組織に有害ではない（例えば、生理学的適合性、無菌性、生理学的ｐＨなど）という意味で「許容可能」である。薬学的に許容可能な担体として役立ち得る材料のいくつかの例は、以下を含む：（１）ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖；（２）コーンスターチおよびポテトスターチなどのデンプン；（３）カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、微結晶セルロースおよび酢酸セルロースなどのセルロースおよびその誘導体；（４）粉末トラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、およびタルク等の潤滑剤；（８）カカオバター、座剤用ワックス等の賦形剤；（９）ラッカセイ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油および大豆油などの油；（１０）プロピレングリコールなどのグリコール；（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等のポリオール；（１２）オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；（１３）寒天；（１４）水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム等の緩衝剤；（１５）アルギン酸；（１６）発熱物質を含まない水；（１７）等張食塩水；（１８）リンガー溶液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝溶液；（２１）ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリ無水物；（２２）ポリペプチドおよびアミノ酸などの増量剤；（２３）血清アルブミン、ＨＤＬおよびＬＤＬなどの血清成分；（２２）エタノールなどのＣ２〜Ｃ１２アルコール；および（２３）医薬製剤に使用される他の非毒性適合性物質。湿潤剤、着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、芳香剤、防腐剤および酸化防止剤もまた製剤中に存在することができる。用語「賦形剤」、「担体」、「薬学的に許容可能な担体」などは、ここでは互換的に使用される。
【０２１４】
いくつかの態様において、組成物中の本開示の核酸塩基エディターおよびガイドヌクレオチドは、注射により、カテーテルにより、坐剤により、またはインプラントにより投与され、インプラントは、多孔質、非多孔質、またはゼラチン質材料であり、これは、シアラスティック（sialastic）膜などの膜、または線維を含む。いくつかの態様において、注射は、肝臓に指向される。
【０２１５】
他の態様において、核酸塩基エディターおよびガイドヌクレオチドは制御された放出システムで送達される。一態様において、ポンプを使用することができる（例えば、Langer, 1990, Science 249:1527-1533; Sefton, 1989, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574を参照）。別の態様において、ポリマー材料を使用することができる。（例えば、Medical Applications of Controlled Release (Langer and Wise eds., CRC Press, Boca Raton, Fla., 1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance (Smolen and Ball eds., Wiley, New York, 1984); Ranger and Peppas, 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61を参照。またLevy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105も参照。）他の制御された放出系は、例えば、上記のLangerに論じられている。
【０２１６】
典型的な態様において、医薬組成物は、対象、例えばヒトへの静脈内または皮下投与に適した医薬組成物として日常的な手順に従って製剤化される。典型的には、注射による投与のための組成物は、無菌の等張性の水性緩衝液である。必要に応じて医薬は、可溶化剤、および、注射部位の痛みを和らげるためのリグノカインなどの局所麻酔薬も含み得る。一般に、成分は別々に供給されるか、または例えば活性薬剤の量を示すアンプルまたはサシェなどの密封容器中の乾燥凍結乾燥粉末または無水濃縮物などの単位剤形として一緒に混合されて供給される。医薬を注入により投与する場合、滅菌医薬品グレードの水または生理食塩水を含む注入ボトルを用いて投薬することができる。医薬を注射により投与する場合、成分を投与前に混合することができるように、注射用滅菌水または食塩水のアンプルを提供することができる。
【０２１７】
全身投与用の医薬組成物は、液体、例えば、無菌食塩水、乳酸加リンガー液またはハンクス液であり得る。さらに、医薬組成物は固体形態であり、使用直前に再溶解または懸濁することができる。凍結乾燥形態もまた企図される。
【０２１８】
医薬組成物は、非経口投与にも適している、リポソームまたは微結晶などの脂質粒子またはベシクル内に含有させることができる。粒子は、組成物がその中に含まれている限り、単層または多層などの任意の好適な構造であり得る。 化合物は、フソジェニック脂質ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、低レベル（５〜１０モル％）のカチオン性脂質を含有する「安定化プラスミド−脂質粒子」（ＳＰＬＰ）中に捕捉され、そしてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）コーティングによって安定化され得る（Zhang Y. P. et al., Gene Ther. 1999, 6:1438-47）。Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−アンモニウムメチルサルフェート、または「ＤＯＴＡＰ」などの正荷電脂質は、かかる粒子およびベシクルに特に好ましい。かかる脂質粒子の調製はよく知られている。例えば、米国特許第4,880,635号；第4,906,477号；第4,911,928号；第4,917,951号；第4,920,016号；および第4,921,757号を参照。
【０２１９】
本開示の医薬組成物は、例えば単位用量として投与または包装することができる。本開示の医薬組成物に関して使用される場合の用語「単位用量」は、対象に対する単位投与量として好適な物理的に別々の単位を指し、各単位は、必要な希釈剤、すなわち、担体またはビヒクルに関連して、所望の治療効果を生じるように計算された既定量の活性材料を含む。
【０２２０】
いくつかの態様において、本明細書において記載される核酸塩基エディターまたはガイドヌクレオチドは、治療剤部分、例えば抗炎症剤に抱合していてもよい。かかる治療剤部分を、例えばＦｃドメインを含むポリペプチドに抱合させるための技術は、周知である；例えば、Amonら、「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy」（Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy、Reisfeldら（編）、1985年、pp. 243-56、Alan R. Liss, Inc.中）；Hellstromら、「Antibodies For Drug Delivery」（Controlled Drug Delivery（第２版）、Robinsonら（編）、1987年、pp. 623-53、Marcel Dekker, Inc.中）；Thorpe、「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review」（Monoclonal Antibodies '84：Biological And Clinical Applications、Pincheraら（編）、1985年、pp. 475-506中）；「Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy」、（Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwinら（編）、1985年、pp. 303-16, Academic Press中）；およびThorpeら（1982年）「The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates」、Immunol. Rev., 62：119-158を参照。
【０２２１】
さらに、本開示の組成物は、キットに組み立てられてもよい。いくつかの態様において、キットは、本明細書において記載される核酸塩基エディターの発現のための核酸ベクターを含む。いくつかの態様において、キットは、核酸塩基エディターを所望される標的配列にターゲティングするためのガイドヌクレオチド配列の発現のための、適切なガイドヌクレオチド配列（例えば、gRNA）または核酸ベクターをさらに含む。
【０２２２】
本明細書において記載されるキットは、本明細書において記載される方法を行うための構成成分を収容する１つ以上の容器、および任意に使用の説明を含んでもよい。本明細書において記載されるキットのうちのいずれかは、アッセイ方法を行うために必要とされる構成成分をさらに含んでもよい。キットの各々の構成成分は、適用可能である場合は、液体の形態において（例えば溶液において）、または固体の形態において（例えば乾燥粉末）提供されてもよい。ある場合において、構成成分のうちのいくつかは、例えば、好適な溶媒または他の種（例えば、水または特定の有機溶媒）（これらはキットと共に提供されても、提供されなくてもよい）の添加により、再構成可能であるか、他に（例えば、活性形態に）処理可能である。
【０２２３】
いくつかの態様において、キットは、任意に、提供される構成成分の使用のための説明および／または促進物（promotion）を含んでもよい。本明細書において用いられる場合、「説明」は、説明および／または促進物の構成成分を定義し得、典型的には、ユーザーが、説明がキットに関連するものであることを明らかに理解するように、本開示のパッケージング上の、またはこれに関連した、書面の説明を含む。説明はまた、任意の様式において提供される、任意の口頭または電子的な説明、例えば、視聴覚的（例えば、ビデオテープ、ＤＶＤなど）、インターネット、および／またはwebベースのコミュニケーションなどを含んでもよい。書面の説明は、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関により定められた様式におけるものであってよく、これはまた、動物への投与のための製造、使用または販売の機関による承認を反映していてもよい。明細書において用いられる場合、,「促進される（promoted）」とは、ビジネスを行う全ての方法を含み、これは、教育の方法、病院および他の臨床施設、科学研究、薬物の発見または開発、学術研究、製薬業の活動を含み、これは、医薬品の販売、および広告または他の促進活動を含み、これは、本開示に関連する任意の様式における書面、口頭および電子的コミュニケーションを含む。さらに、キットは、本明細書において記載されるような特定の用途に依存して、他の構成成分を含んでもよい。
【０２２４】
キットは、本明細書において提供される構成成分のうちのいずれか１つ以上を、１つ以上の容器中で含んでもよい。構成成分は、無菌調製し、シリンジ中にパッケージングし、保冷で輸送してもよい。あるいは、それを、貯蔵のためのバイアルまたは他の容器中に収容してもよい。第２の容器が、無菌調製された他の構成成分を有していてもよい。あるいは、キットは、あらかじめ混合され、バイアル、チューブまたは他の容器中で輸送される活性剤を含んでもよい。
【０２２５】
キットは、ブリスターパウチ、シュリンクラップされたパウチ、真空密封可能なパウチ、密封可能な熱成型されたトレイ、または類似のパウチもしくはトレイの形態などの、多様な形態を有していてもよく、パウチ内に緩く包装した付属品、１つ以上のチューブ、容器、箱またはバッグを含む。キットは、付属品を添加した後で殺菌してもよく、それにより、容器中の個々の付属品を、他の方法で開封することを可能にする。キットは、任意の適切な滅菌技術、例えば放射線照射殺菌、加熱殺菌、または当該分野において公知の他の殺菌方法を用いて殺菌することができる。キットはまた、特定の用途に依存して、他の構成成分、例えば、容器、細胞培地、塩、バッファー、試薬、シリンジ、針、消毒剤を適用または除去するためのガーゼなどのファブリック、使い捨て手袋、投与前の剤のための支持体などを含んでもよい。
【０２２６】
治療剤
本明細書において記載される組成物は、それを必要とする対象に、治療有効量において、高い循環コレステロールレベルに関連する状態を処置するために、投与してもよい。本明細書において記載される組成物および方法を用いて処置することができる、高い循環コレステロールレベルに関連する状態
として、限定することなく、以下が挙げられる：高コレステロール血症、上昇した総コレステロールレベル、上昇した低密度リポタンパク質（LDL）レベル、上昇したLDL−コレステロールレベル、低下した高密度リポタンパク質レベル、脂肪肝、冠動脈心疾患、虚血、脳卒中、末梢血管疾患、血栓症、２型糖尿病、高い血圧上昇、アテローム動脈硬化症、肥満、アルツハイマー病、神経変性、およびこれらの組み合わせ。組成物およびキットは、対象において循環コレステロールレベルを低下させることにおいて有効であり、それにより状態を処置する。
【０２２７】
「治療有効量」とは、本明細書において用いられる場合、単独で、または１つ以上の他の治療剤と組み合わせて、対象に対して治療効果を与えるために必要とされる、本開示の各々の治療剤の量を指す。当業者により認識されるとおり、処置されている特定の状態、状態の重篤度、年齢、身体的状態、サイズ、性別および体重を含む個々の対象のパラメーター、処置の期間、同時治療（あれば）の性質、投与の特定の経路、および、健康管理者の知識および専門知識の範囲内である同様の要因に依存して、有効量は変化する。これらの要因は、当業者には周知であり、慣用的な実験のみを用いて取り組むことができる。一般に、個々の構成成分またはこれらの組み合わせの最大用量、すなわち、健全な医学的判断に従った最も高い安全な用量を用いることが好ましい。しかし、当業者により理解されるであろうが、対象は、医学的理由、精神的理由、または実質的に全ての他の理由のために、より低い用量または耐用可能な用量を主張する場合がある。半減期などの経験的考慮は、一般に、投与量の決定に寄与するであろう。例えば、ヒト化抗体または完全ヒト抗体からの領域を含むポリペプチドなどのヒト免疫系に適合性の治療剤は、ポリペプチドの半減期を延長するために、およびポリペプチドが宿主の免疫系により攻撃されることを防ぐために、用いることができる。
【０２２８】
投与の頻度は、治療の経過にわたり決定および調整することができ、一般に、必ずしもではないが、疾患の処置および／または抑制および／または寛解および／または遅延に基づく。あるいは、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの持続的な連続放出処方物が適切である場合がある。持続放出を達成するための多様な処方物およびデバイスは、当該分野において公知である。いくつかの態様において、投与量は、１日１回、２日に１回、３日に１回、４日に１回、５日に１回、または６日に１回である。いくつかの態様において、投与頻度は、１週間に１回、２週間に１回、４週間に１回、５週間に１回、６週間に１回、７週間に１回、８週間に１回、９週間に１回、もしくは１０週間に１回；または１か月に１回、２か月に１回、もしくは３か月に１回、またはそれより長くである。この治療の進行は、慣用的な技術およびアッセイにより、容易にモニタリングされる。
【０２２９】
投与レジメン（用いられるポリペプチドを含む）は、経時的に変更することができる。いくつかの態様において、正常な体重の成人の対象について、約０．０１〜１０００ｍｇ／ｋｇの範囲の用量を投与することができる。いくつかの態様において、用量は、１〜２００ｍｇである。特定の投与レジメン、すなわち、用量、タイミングおよび反復は、特定の対象および対象の病歴、ならびにポリペプチドまたはポリヌクレオチドの特性（ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの半減期、および当該分野において周知の他の考慮点など）に依存するであろう。
【０２３０】
本開示の目的のために、本明細書において記載されるとおりの治療剤の適切な投与量は、使用される特定の剤（またはその組成物）、処方および投与の経路、疾患の型および重篤度、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドが予防目的または治療目的のいずれのために投与されるか、先の治療、対象の病歴、およびアンタゴニストに対する応答、および主治医の慎重さに依存するであろう。典型的には、医師は、所望される結果を達成する投与量に達するまで、ポリペプチドを投与するであろう。
【０２３１】
１つ以上のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの投与は、例えば、患者の生理学的状態、投与の目的が治療的であるか予防的であるか、および熟練の医師にとって公知の他の要因に依存して、連続的であっても間欠的であってもよい。ポリペプチドの投与は、本質的に、予め選択された期間にわたって連続的であってもよく、または、一連の間隔を空けた用量、例えば、疾患を発症する前、発症中、または発症後のいずれかであってもよい。本明細書において用いられる場合、用語「処置すること」とは、ポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、またはポリペプチドもしくはポリヌクレオチドを含む組成物の、それを必要とする対象への適用または投与を指す。
【０２３２】
「それを必要とする対象」とは、疾患、疾患の症状または疾病素因を有する個体であって、当該疾患、疾患の症状または疾病素因を治癒させる（cure）か、治す（heal）か、緩和する（alleviate）か、軽減する（relieve）か、変化させるか、治療する（remedy）か、寛解させる（ameliorate）か、改善するか、またはこれに影響を及ぼす目的を有するものを指す。いくつかの態様において、対象は、高コレステロール血症を有する。いくつかの態様において、対象は、哺乳動物である。いくつかの態様において、対象は、非ヒト霊長類である。いくつかの態様において、対象は、ヒトである。疾患を緩和させることは、疾患の発症もしくは進行を遅延させること、または疾患の重篤度を低下させることを含む。疾患を緩和させることは、必ずしも治癒的な結果を必要としない。
【０２３３】
そこにおいて用いられる場合、疾患の発症を「遅延させること」とは、疾患の進行を、延期させるか、妨害するか、遅める（slow）か、遅らせる（retard）か、安定化させるか、および／または延期させることを意味する。遅延は、病歴および／または処置されている個体に依存して、多様な時間の長さのものであってよい。疾患の発症を「遅延させる」かもしくは緩和する、または疾患の開始（onset）を遅延させる方法は、当該方法を用いない場合と比較して、所与の時間枠において疾患の１つ以上の症状を発症する可能性を低下させるか、および／または、所与の時間枠において症状の程度を軽減する方法である。かかる比較は、典型的には、統計学的に有意な結果を生じるために十分に多くの数の対象を用いる臨床研究に基づく。
【０２３４】
疾患の「発症」または「進行」は、初期症状および／またはその後に続く疾患の進行を意味する。疾患の発症は、当該分野において周知の標準的な臨床技術を用いて検出可能であり、評価することができる。しかし、発症はまた、検出不可能であり得る進行を指す。本開示の目的のために、発症または進行とは、症状の生物学的経過を指す。「発症」は、発生（occurrence）、再発および開始を含む。
【０２３５】
本明細書において用いられる場合、疾患の「開始」または「発生」は、最初の開始および／または再発を含む。医学の分野における当業者に公知の慣用的な方法を用いて、処置されるべき疾患の型または疾患の部位に依存して、単離されたポリペプチドまたは医薬組成物を対象に投与することができる。この組成物はまた、他の慣用的な経路を介して投与することができ、例えば、経口で、非経口で、吸入スプレーにより、局所的に、直腸内で、鼻内で、頬側内で、膣内で、または移植されたリザーバを介して、投与することができる。
【０２３６】
用語「非経口的」とは、本明細書において用いられる場合、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑膜内、胸骨内、くも膜下内、病巣内、および頭蓋内注射または注入技術を含む。加えて、それは、注射可能なデポーの投与の経路、例えば１、３または６か月のデポーによる注射可能または生分解性の材料および方法を介して対象に投与することができる。
【０２３７】
宿主細胞および生物
本開示の他の側面は、例えばin vitroでの編集のための、核酸塩基エディターの産生および／または単離のための、宿主細胞および生物を提供する。宿主細胞は、一般に、核酸塩基エディターおよび本明細書において記載される翻訳系の構成成分を発現するように操作される。いくつかの態様において、宿主細胞は、核酸塩基エディターおよび翻訳系の構成成分をコードするベクターを含み（例えば、形質転換されているか、形質導入されているか、または遺伝子導入され）、これは、例えばクローニングベクターまたは発現ベクターであってよい。ベクターは、例えば、プラスミド、細菌、ウイルス、ネイキッドのポリヌクレオチド、または抱合型ポリヌクレオチドの形態であってよい。ベクターは、細胞および／または微生物中に、標準的な方法により導入され、これは、エレクトロポレーション、ウイルスベクターによる感染、小さいビーズまたは粒子の中または表面上のいずれかに核酸を有する小粒子による高速弾道学的浸透（high velocity ballistic penetration）（Klein et al., Nature 327, 70-73（1987））を含む。いくつかの態様において、宿主細胞は、原核細胞である。いくつかの態様において、宿主細胞は、真核細胞である。いくつかの態様において、宿主細胞は、細菌細胞である。いくつかの態様において、宿主細胞は、酵母細胞である。いくつかの態様において、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの態様において、宿主細胞は、ヒト細胞である。いくつかの態様において、宿主細胞は、培養細胞である。いくつかの態様において、宿主細胞は、組織または生物の中にある。
【０２３８】
操作された宿主細胞は、例えばスクリーニングのステップ、プロモーターの活性化または形質転換体の選択などの活動のために適切であるように改変した、慣用的な栄養培地中で培養してもよい。これらの細胞は、任意に、トランスジェニック生物中で培養してもよい。
【０２３９】
標的核酸を細菌細胞中に導入するいくつかの周知の方法が利用可能であり、本開示において、これらのうちのいずれを用いてもよい。これらは、以下を含む：レシピエント細胞とDNAを含む細菌プロトプラストとの融合、エレクトロポレーション、微粒子衝撃法（projectile bombardment）、およびウイルスベクターによる感染（以下でさらに議論される）など。本開示のDNAコンストラクトを含むプラスミドの数を増幅するために、細菌細胞を用いてもよい。細菌を、対数期まで増殖させて、細菌中のプラスミドを当該分野において公知の多様な方法により単離することができる（例えば、Sambrookを参照）。加えて、細菌からのプラスミドの精製のための多くのキットが市販されている（例えば、EasyPrep（商標）、FlexiPrep（商標）、いずれもPharmacia Biotech製；StrataClean（商標）、Stratagene製；およびQIAprep（商標）、Qiagen製を参照）。単離および精製されたプラスミドを、次いでさらに、他のプラスミドを生成するように操作し、細胞に遺伝子導入するために用いるか、関連するベクター中に組み込んで生物に感染させる。典型的なベクターは、転写および翻訳の終結因子、転写および翻訳の開始配列、ならびに特定の標的核酸の発現の制御のために有用なプロモーターを含む。ベクターは、任意に、少なくとも１つの独立した終結因子の配列、真核生物または原核細胞または両方においてカセットの複製を可能にする配列（例えば、シャトルベクター）、ならびに、原核生物および真核生物の両方の系のための選択マーカーを含む、遺伝子発現カセットを含む。ベクターは、原核生物、真核生物、または好ましくは両方における複製および組み込みのために好適である（Giliman & Smith, Gene 8：81（1979）；Roberts, et al., Nature, 328：731（1987）；およびSchneider, B., et al., Protein Expr. Purifi 6435：10（1995）を参照）。
【０２４０】
クローニングのために有用なバクテリオファージは、例えばATCCにより提供される。例えば、ATCCにより刊行されたThe ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophage（1992）Ghernaら（編）。シークエンシング、クローニングおよび分子生物学の他の側面のためのさらなる基本的手順、ならびに根底にある理論的考察もまた、Watson et al.（1992）Recombinant DNA Second Edition Scientific American Books, NYにおいて見出される。
【０２４１】
例えば、細胞の単離および培養のための（例えば、その後の核酸の単離のための）他の有用な参考文献として、Freshney（1994）Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, third edition, Wiley- Liss, New Yorkおよびそれにおいて引用される参考文献；Payne et al.（1992）Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY；Gamborg and Phillips（編）（1995）Plant Cell. Tissue and Organ Culture；Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer- Verlag（Berlin Heidelberg New York）およびAtlas and Parks（編）The Handbook of Microbiological Media（1993）CRC Press, Boca Raton, FLが挙げられる。加えて、本質的にあらゆる核酸（および標準的であっても非標準的であっても実質的にあらゆる標識された核酸）を、多様な商業的ソース、例えばThe Midland Certified Reagent Company（mcrc@oligos.com）、The Great American Gene Company（www.genco.com）、ExpressGen Inc.（www.expressgen.com）、Operon Technologies Inc.（Alameda, CA）、および他多数のうちのいずれかからカスタムでまたは標準的に注文することができる。
【０２４２】
さらなる詳細がなくとも、当業者は、上の記載に基づいて、本開示をその最大限の範囲まで利用することができると考えられる。以下の具体的な態様は、したがって、単に説明的なものとして解釈されるべきであり、決して本開示の残りを限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書において引用される全ての刊行物は、本明細書において言及される目的または主題のために参考として援用される。
【０２４３】
例
本明細書において記載される発明がより完全に理解され得るために、以下の例を記載する。本願において記載される合成例は、本明細書において提供される化合物および方法を説明するために提供され、決してそれらの範囲を限定する者として解釈されるべきではない。
【０２４４】
例１：ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメイン、デアミナーゼ、および塩基エディター
好適なガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメインの非限定的な例が提供される。本開示は、Cas9バリアント、例えば１つ以上の生物からのCas9タンパク質を提供し、これは１つ以上の変異を含み得る（例えば、ｄCas9またはCas9ニッカーゼを創るため）。いくつかの態様において、下でアステリスク（ａｓｔｅｒｅｋ）によって同定されているCas9タンパク質のアミノ酸残基の１つ以上は、変異させられ得る。いくつかの態様において、配列番号１によって提供されるアミノ酸配列のＤ１０および／またはＨ８４０残基、または配列番号１１〜２６０によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異は、変異している。いくつかの態様において、配列番号１によって提供されるアミノ酸配列のＤ１０残基、または配列番号１１〜２６０によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異は、Ｄ以外のいずれかのアミノ酸残基に変異している。いくつかの態様において、配列番号１によって提供されるアミノ酸配列のＤ１０残基、または配列番号１１〜２６０によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異は、Ａに変異している。いくつかの態様において、配列番号１によって提供されるアミノ酸配列のＨ８４０残基、または配列番号１１〜２６０によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する残基は、Ｈである。いくつかの態様において、配列番号１によって提供されるアミノ酸配列のＨ８４０残基、または配列番号１１〜２６０によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異は、Ｈ以外のいずれかのアミノ酸残基に変異している。いくつかの態様において、配列番号１によって提供されるアミノ酸配列のＨ８４０残基、または配列番号１１〜２６０によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異は、Ａに変異している。いくつかの態様において、配列番号１によって提供されるアミノ酸配列のＤ１０残基、または配列番号１１〜２６０によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する残基は、Ｄである。
【０２４５】
種々の種からのいくつものCas9配列をアラインメントして、配列番号１または配列番号１１のＤ１０およびＨ８４０の対応する相同なアミノ酸残基が他のCas9タンパク質中に同定され、相同なアミノ酸残基の対応する変異を有するCas9バリアントの生成を許し得るかどうかを決定した。アラインメントはNCBI Constraint-based Multiple Alignment Tool（COBALT（st-va.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobaltにおいてアクセス可能）を用いて、次のパラメータによって実施した。アラインメントパラメータ：Gap Penalties -11, -1；End-Gap Penalties -5, -1。ＣＤＤパラメータ：Use RPS BLAST on；Blast E-value 0.003；Find Conserved columns and Recompute on。クエリクラスタリングパラメータ：Use query clusters on；Word Size 4；Max cluster distance 0.8；Alphabet Regular。
【０２４６】
４つのCas9配列の例示的なアラインメントを下に提供する。アラインメント中のCas9配列は、配列１（Ｓ１）：配列番号１１|WP_010922251|gi 499224711|II型CRISPR RNA誘導型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus pyogenes］；配列２（Ｓ２）：配列番号１２|WP_039695303|gi 746743737|II型CRISPR RNA誘導型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus gallolyticus］；配列３（Ｓ３）：配列番号１３|WP_045635197|gi 782887988|II型CRISPR RNA誘導型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus mitis］; 配列４（Ｓ４）：配列番号１４|5AXW_A|gi 924443546|Staphylococcus Aureus Cas9である。ＨＮＨドメイン（太字かつ下線）およびRuvCドメイン（枠囲み）が４つの配列のそれぞれについて同定されている。Ｓ１中のアミノ酸残基１０および８４０とアラインメントされた配列中の相同なアミノ酸とは、それぞれのアミノ酸残基の次のアステリスクによって同定されている。
【数６２−１】
2020503027.tif 000169
【数６２−２】
2020503027.tif 000170
【数６２−３】
2020503027.tif 000171
【０２４７】
アラインメントは、当分野において公知のアラインメントプログラムおよびアルゴリズムを用いて、参照配列または参照残基とアラインメントするアミノ酸配列または残基を同定することによって、参照Cas9アミノ酸配列またはアミノ酸残基に対して相同であるアミノ酸配列およびアミノ酸残基が、異なる種からのCas9配列を包含するがこれに限定されないCas9配列バリアントから同定され得るということを実証している。本開示は、配列番号１１〜１４中のアステリスクによって同定されているアミノ酸残基の１つ以上（例えば、それぞれＳ１、Ｓ２、Ｓ３、およびＳ４）がここに記載されるように変異した、Cas9バリアントを提供する。配列番号１１〜１４においてアステリスクによって同定されている残基に対応する配列番号１のCas9の残基Ｄ１０およびＨ８４０は、ここにおいて「相同な」または「対応する」残基と言われる。かかる相同な残基は、例えば上に記載されているように配列アラインメントによって、参照配列または残基とアラインメントする配列または残基を同定することによって同定され得る。類似に、ここにおける配列番号１中の同定された変異、例えば配列番号１の残基１０および８４０の変異に対応するCas9配列の変異は、ここにおいて「相同な」または「対応する」変異と言われる。例えば、上の４つのアラインメントされた配列について、配列番号１またはＳ１（配列番号１１）のＤ１０Ａ変異に対応する変異は、Ｓ２ではＤ１１Ａ、Ｓ３ではＤ１０Ａ、Ｓ４ではＤ１３Ａであり；配列番号１またはＳ１（配列番号１１）のＨ８４０Ａに対応する変異は、Ｓ２ではＨ８５０Ａ、Ｓ３ではＨ８４２Ａ、Ｓ４ではＨ５６０Ａである。
【０２４８】
異なる種からの合計２５０個のCas9配列（配列番号１１〜２６０）が提供される。配列番号１の残基１０および８４０に対して相同なアミノ酸残基は、上で概要を述べたものと同じ様式において同定することができる。これらのCas9配列の全てを、本開示に従って用いることができる。
WP_010922251.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus pyogenes］配列番号１１
WP_039695303.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus gallolyticus］配列番号１２
WP_045635197.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus mitis］配列番号１３
5AXW_A：Cas9、A鎖、結晶構造［Staphylococcus Aureus］配列番号１４
WP_009880683.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus pyogenes］配列番号１５
WP_010922251.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus pyogenes］配列番号１６
WP_011054416.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus pyogenes］配列番号１７
WP_011284745.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus pyogenes］配列番号１８
WP_011285506.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus pyogenes］配列番号１９
WP_011527619.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus pyogenes］配列番号２０
WP_012560673.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus pyogenes］配列番号２１
WP_014407541.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus pyogenes］配列番号２２
WP_020905136.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus pyogenes］配列番号２３
WP_023080005.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus pyogenes］配列番号２４
WP_023610282.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus pyogenes］配列番号２５
WP_030125963.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus pyogenes］配列番号２６
WP_030126706.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus pyogenes］配列番号２７
WP_031488318.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus pyogenes］配列番号２８
WP_032460140.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus pyogenes］配列番号２９
WP_032461047.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus pyogenes］配列番号３０
WP_032462016.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus pyogenes］配列番号３１
WP_032462936.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus pyogenes］配列番号３２
WP_032464890.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus pyogenes］配列番号３３
WP_033888930.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus pyogenes］配列番号３４
WP_038431314.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus pyogenes］配列番号３５
WP_038432938.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus pyogenes］配列番号３６
WP_038434062.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus pyogenes］配列番号３７
BAQ51233.1：CRISPR関連タンパク質、Csn1ファミリー［Streptococcus pyogenes］配列番号３８
KGE60162.1：仮説上のタンパク質MGAS2111_0903［Streptococcus pyogenes MGAS2111］配列番号３９
KGE60856.1：CRISPR関連エンドヌクレアーゼタンパク質［Streptococcus pyogenes SS1447］配列番号４０
WP_002989955.1：多種：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus］配列番号４１
WP_003030002.1：多種：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus］配列番号４２
WP_003065552.1：多種：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus］配列番号４３
WP_001040076.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus agalactiae］配列番号４４
WP_001040078.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus agalactiae］配列番号４５
WP_001040080.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus agalactiae］配列番号４６
WP_001040081.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus agalactiae］配列番号４７
WP_001040083.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus agalactiae］配列番号４８
WP_001040085.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus agalactiae］配列番号４９
WP_001040087.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus agalactiae］配列番号５０
WP_001040088.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus agalactiae］配列番号５１
WP_001040089.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus agalactiae］配列番号５２
WP_001040090.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus agalactiae］配列番号５３
WP_001040091.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus agalactiae］配列番号５４
WP_001040092.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus agalactiae］配列番号５５
WP_001040094.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus agalactiae］配列番号５６
WP_001040095.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus agalactiae］配列番号５７
WP_001040096.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus agalactiae］配列番号５８
WP_001040097.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus agalactiae］配列番号５９
WP_001040098.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus agalactiae］配列番号６０
WP_001040099.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus agalactiae］配列番号６１
WP_001040100.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus agalactiae］配列番号６２
WP_001040104.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus agalactiae］配列番号６３
WP_001040105.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus agalactiae］配列番号６４
WP_001040106.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus agalactiae］配列番号６５
WP_001040107.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus agalactiae］配列番号６６
WP_001040108.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus agalactiae］配列番号６７
WP_001040109.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus agalactiae］配列番号６８
WP_001040110.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus agalactiae］配列番号６９
WP_015058523.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus agalactiae］配列番号７０
WP_017643650.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus agalactiae］配列番号７１
WP_017647151.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus agalactiae］配列番号７２
WP_017648376.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus agalactiae］配列番号７３
WP_017649527.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus agalactiae］配列番号７４
WP_017771611.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus agalactiae］配列番号７５
WP_017771984.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus agalactiae］配列番号７６
CFQ25032.1：CRISPR関連タンパク質［Streptococcus agalactiae］配列番号７７
CFV16040.1：CRISPR関連タンパク質［Streptococcus agalactiae］配列番号７８
KLJ37842.1：CRISPR関連タンパク質Csn1［Streptococcus agalactiae］配列番号７９
KLJ72361.1：CRISPR関連タンパク質Csn1［Streptococcus agalactiae］配列番号８０
KLL20707.1：CRISPR関連タンパク質Csn1［Streptococcus agalactiae］配列番号８１
KLL42645.1：CRISPR関連タンパク質Csn1［Streptococcus agalactiae］配列番号８２
WP_047207273.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus agalactiae］配列番号８３
WP_047209694.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus agalactiae］配列番号８４
WP_050198062.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus agalactiae］配列番号８５
WP_050201642.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus agalactiae］配列番号８６
WP_050204027.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus agalactiae］配列番号８７
WP_050881965.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus agalactiae］配列番号８８
WP_050886065.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus agalactiae］配列番号８９
AHN30376.1：CRISPR関連タンパク質Csn1［Streptococcus agalactiae 138P］配列番号９０
EAO78426.1：網状赤血球結合タンパク質［Streptococcus agalactiae H36B］配列番号９１
CCW42055.1：CRISPR関連タンパク質、SAG0894ファミリー［Streptococcus agalactiae ILRI112］配列番号９２
WP_003041502.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus anginosus］配列番号９３
WP_037593752.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus anginosus］配列番号９４
WP_049516684.1：CRISPR関連タンパク質Csn1［Streptococcus anginosus］配列番号９５
GAD46167.1：仮説上のタンパク質ANG6_0662［Streptococcus anginosus T5］配列番号９６
WP_018363470.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus caballi］配列番号９７
WP_003043819.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus canis］配列番号９８
WP_006269658.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus constellatus］配列番号９９
WP_048800889.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus constellatus］配列番号１００
WP_012767106.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus dysgalactiae］配列番号１０１
WP_014612333.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus dysgalactiae］配列番号１０２
WP_015017095.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus dysgalactiae］配列番号１０３
WP_015057649.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus dysgalactiae］配列番号１０４
WP_048327215.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus dysgalactiae］配列番号１０５
WP_049519324.1：CRISPR関連タンパク質Csn1［Streptococcus dysgalactiae］配列番号１０６
WP_012515931.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus equi］配列番号１０７
WP_021320964.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus equi］配列番号１０８
WP_037581760.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus equi］配列番号１０９
WP_004232481.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus equinus］配列番号１１０
WP_009854540.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus gallolyticus］配列番号１１１
WP_012962174.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus gallolyticus］配列番号１１２
WP_039695303.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus gallolyticus］配列番号１１３
WP_014334983.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus infantarius］配列番号１１４
WP_003099269.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus iniae］配列番号１１５
AHY15608.1：CRISPR関連タンパク質Csn1［Streptococcus iniae］配列番号１１６
AHY17476.1：CRISPR関連タンパク質Csn1［Streptococcus iniae］配列番号１１７
ESR09100.1：仮説上のタンパク質IUSA1_08595［Streptococcus iniae IUSA1］配列番号１１８
AGM98575.1：CRISPR関連タンパク質Cas9/Csn1、サブタイプII/NMEMI［Streptococcus iniae SF1］配列番号１１９
ALF27331.1：CRISPR関連タンパク質Csn1［Streptococcus intermedius］配列番号１２０
WP_018372492.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus massiliensis］配列番号１２１
WP_045618028.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus mitis］配列番号１２２
WP_045635197.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus mitis］配列番号１２３
WP_002263549.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus mutans］配列番号１２４
WP_002263887.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus mutans］配列番号１２５
WP_002264920.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus mutans］配列番号１２６
WP_002269043.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus mutans］配列番号１２７
WP_002269448.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus mutans］配列番号１２８
WP_002271977.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus mutans］配列番号１２９
WP_002272766.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus mutans］配列番号１３０
WP_002273241.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus mutans］配列番号１３１
WP_002275430.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus mutans］配列番号１３２
WP_002276448.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus mutans］配列番号１３３
WP_002277050.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus mutans］配列番号１３４
WP_002277364.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus mutans］配列番号１３５
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WP_002279859.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus mutans］配列番号１３７
WP_002280230.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus mutans］配列番号１３８
WP_002281696.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus mutans］配列番号１３９
WP_002282247.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus mutans］配列番号１４０
WP_002282906.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus mutans］配列番号１４１
WP_002283846.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus mutans］配列番号１４２
WP_002287255.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus mutans］配列番号１４３
WP_002288990.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus mutans］配列番号１４４
WP_002289641.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus mutans］配列番号１４５
WP_002290427.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus mutans］配列番号１４６
WP_002295753.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus mutans］配列番号１４７
WP_002296423.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus mutans］配列番号１４８
WP_002304487.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus mutans］配列番号１４９
WP_002305844.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus mutans］配列番号１５０
WP_002307203.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus mutans］配列番号１５１
WP_002310390.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus mutans］配列番号１５２
WP_002352408.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus mutans］配列番号１５３
WP_012997688.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus mutans］配列番号１５４
WP_014677909.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus mutans］配列番号１５５
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WP_019313659.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus mutans］配列番号１５７
WP_019314093.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus mutans］配列番号１５８
WP_019315370.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus mutans］配列番号１５９
WP_019803776.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus mutans］配列番号１６０
WP_019805234.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus mutans］配列番号１６１
WP_024783594.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus mutans］配列番号１６２
WP_024784288.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus mutans］配列番号１６３
WP_024784666.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus mutans］配列番号１６４
WP_024784894.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus mutans］配列番号１６５
WP_024786433.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus mutans］配列番号１６６
WP_049473442.1：CRISPR関連タンパク質Csn1［Streptococcus mutans］配列番号１６７
WP_049474547.1：CRISPR関連タンパク質Csn1［Streptococcus mutans］配列番号１６８
EMC03581.1：仮説上のタンパク質SMU69_09359［Streptococcus mutans NLML4］配列番号１６９
WP_000428612.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus oralis］配列番号１７０
WP_000428613.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus oralis］配列番号１７１
WP_049523028.1：CRISPR関連タンパク質Csn1［Streptococcus parasanguinis］配列番号１７２
WP_003107102.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus parauberis］配列番号１７３
WP_054279288.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus phocae］配列番号１７４
WP_049531101.1：CRISPR関連タンパク質Csn1［Streptococcus pseudopneumoniae］配列番号１７５
WP_049538452.1：CRISPR関連タンパク質Csn1［Streptococcus pseudopneumoniae］配列番号１７６
WP_049549711.1：CRISPR関連タンパク質Csn1［Streptococcus pseudopneumoniae］配列番号１７７
WP_007896501.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus pseudoporcinus］配列番号１７８
EFR44625.1：CRISPR関連タンパク質、Csn1ファミリー［Streptococcus pseudoporcinus SPIN 20026］配列番号１７９
WP_002897477.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus sanguinis］配列番号１８０
WP_002906454.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus sanguinis］配列番号１８１
WP_009729476.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus sp. F0441］配列番号１８２
CQR24647.1：CRISPR関連タンパク質［Streptococcus sp. FF10］配列番号１８３
WP_000066813.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus sp. M334］配列番号１８４
WP_009754323.1 ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus sp. taxon 056］配列番号１８５
WP_044674937.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus suis］配列番号１８６
WP_044676715.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus suis］配列番号１８７
WP_044680361.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus suis］配列番号１８８
WP_044681799.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Streptococcus suis］配列番号１８９
WP_049533112.1：CRISPR関連タンパク質Csn1［Streptococcus suis］配列番号１９０
WP_029090905.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Brochothrix thermosphacta］配列番号１９１
WP_006506696.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Catenibacterium mitsuokai］配列番号１９２
AIT42264.1：Cas9hc：NLS：HA［クローニングベクターpYB196］配列番号１９３
WP_034440723.1：ＩＩ型CRISPRエンドヌクレアーゼCas9［Clostridiales bacterium S5-A11］配列番号１９４
AKQ21048.1：Cas9［CRISPR媒介型遺伝子ターゲティングベクターp（bhsp68-Cas9）］配列番号１９５
WP_004636532.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Dolosigranulum pigrum］配列番号１９６
WP_002364836.1：多種：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Enterococcus］配列番号１９７
WP_016631044.1：多種：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Enterococcus］配列番号１９８
EMS75795.1：仮説上のタンパク質H318_06676［Enterococcus durans IPLA 655］配列番号１９９
WP_002373311.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Enterococcus faecalis］配列番号２００
WP_002378009.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Enterococcus faecalis］配列番号２０１
WP_002407324.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Enterococcus faecalis］配列番号２０２
WP_002413717.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Enterococcus faecalis］配列番号２０３
WP_010775580.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Enterococcus faecalis］配列番号２０４
WP_010818269.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Enterococcus faecalis］配列番号２０５
WP_010824395.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Enterococcus faecalis］配列番号２０６
WP_016622645.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Enterococcus faecalis］配列番号２０７
WP_033624816.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Enterococcus faecalis］配列番号２０８
WP_033625576.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Enterococcus faecalis］配列番号２０９
WP_033789179.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Enterococcus faecalis］配列番号２１０
WP_002310644.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Enterococcus faecium］配列番号２１１
WP_002312694.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Enterococcus faecium］配列番号２１２
WP_002314015.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Enterococcus faecium］配列番号２１３
WP_002320716.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Enterococcus faecium］配列番号２１４
WP_002330729.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Enterococcus faecium］配列番号２１５
WP_002335161.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Enterococcus faecium］配列番号２１６
WP_002345439.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Enterococcus faecium］配列番号２１７
WP_034867970.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Enterococcus faecium］配列番号２１８
WP_047937432.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Enterococcus faecium］配列番号２１９
WP_010720994.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Enterococcus hirae］配列番号２２０
WP_010737004.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Enterococcus hirae］配列番号２２１
WP_034700478.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Enterococcus hirae］配列番号２２２
WP_007209003.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Enterococcus italicus］配列番号２２３
WP_023519017.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Enterococcus mundtii］配列番号２２４
WP_010770040.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Enterococcus phoeniculicola］配列番号２２５
WP_048604708.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Enterococcus sp. AM1］配列番号２２６
WP_010750235.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Enterococcus villorum］配列番号２２７
AII16583.1：Cas9エンドヌクレアーゼ［発現ベクターpCas9］配列番号２２８
WP_029073316.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Kandleria vitulina］配列番号２２９
WP_031589969.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Kandleria vitulina］配列番号２３０
KDA45870.1：CRISPR関連タンパク質Cas9/Csn1、サブタイプII/NMEMI［Lactobacillus animalis］配列番号２３１
WP_039099354.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Lactobacillus curvatus］配列番号２３２
AKP02966.1：仮説上のタンパク質ABB45_04605［Lactobacillus farciminis］配列番号２３３
WP_010991369.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Listeria innocua］配列番号２３４
WP_033838504.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Listeria innocua］配列番号２３５
EHN60060.1：CRISPR関連タンパク質、Csn1ファミリー［Listeria innocua ATCC 33091］配列番号２３６
EFR89594.1：crispr関連タンパク質, Csn1ファミリー［Listeria innocua FSL S4-378］配列番号２３７
WP_038409211.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Listeria ivanovii］配列番号２３８
EFR95520.1：crispr関連タンパク質Csn1［Listeria ivanovii FSL F6-596］配列番号２３９
WP_003723650.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Listeria monocytogenes］配列番号２４０
WP_003727705.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Listeria monocytogenes］配列番号２４１
WP_003730785.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Listeria monocytogenes］配列番号２４２
WP_003733029.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Listeria monocytogenes］配列番号２４３
WP_003739838.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Listeria monocytogenes］配列番号２４４
WP_014601172.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Listeria monocytogenes］配列番号２４５
WP_023548323.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Listeria monocytogenes］配列番号２４６
WP_031665337.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Listeria monocytogenes］配列番号２４７
WP_031669209.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Listeria monocytogenes］配列番号２４８
WP_033920898.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Listeria monocytogenes］配列番号２４９
AKI42028.1：CRISPR関連タンパク質［Listeria monocytogenes］配列番号２５０
AKI50529.1：CRISPR関連タンパク質［Listeria monocytogenes］配列番号２５１
EFR83390.1：crispr関連タンパク質Csn1［Listeria monocytogenes FSL F2-208］配列番号２５２
WP_046323366.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Listeria seeligeri］配列番号２５３
AKE81011.1：Cas9［植物多重ゲノム編集ベクターpYLCRISPR/Cas9Pubi-H］配列番号２５４
CUO82355.1：細菌において保存されているまだ特徴づけられていないタンパク質［Roseburia hominis］配列番号２５５
WP_033162887.1：ＩＩ型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9［Sharpea azabuensis］配列番号２５６
AGZ01981.1：Cas9エンドヌクレアーゼ［合成コンストラクト］配列番号２５７
AKA60242.1：ヌクレアーゼ欠損Cas9［合成コンストラクト］配列番号２５８
AKS40380.1：Cas9［合成プラスミドpFC330］配列番号２５９
4UN5_B：Cas9、Ｂ鎖、結晶構造、配列番号２６０
【０２４９】
好適なデアミナーゼドメインの非限定的な例を提供する。
ヒトAID
【数６３】
2020503027.tif 000172
（配列番号３０３）（下線：核局剤シグナル；二重下線：核外輸送シグナル）
マウスAID
【数６４】
2020503027.tif 000173
（配列番号２７１）（下線：核局剤シグナル；二重下線：核外輸送シグナル）
イヌAID
【数６５】
2020503027.tif 000174
（配列番号２７２）（下線：核局剤シグナル；二重下線：核外輸送シグナル）
ウシAID
【数６６】
2020503027.tif 000175
（配列番号２７３）（下線：核局剤シグナル；二重下線：核外輸送シグナル）
マウスAPOBEC-3
【数６７】
2020503027.tif 000176
（配列番号２７４）（斜体：核酸編集ドメイン）
ラットAPOBEC-3
【数６８】
2020503027.tif 000177
（配列番号２７５）（斜体：核酸編集ドメイン）
アカゲザルAPOBEC-3G
【数６９】
2020503027.tif 000178
（配列番号２７６）（斜体：核酸編集ドメイン；下線：細胞質局在シグナル）
チンパンジーAPOBEC-3G
【数７０】
2020503027.tif 000179
（配列番号２７７）（斜体：核酸編集ドメイン；下線：細胞質局在シグナル）
ミドリザルAPOBEC-3G
【数７１】
2020503027.tif 000180
（配列番号２７８）（斜体：核酸編集ドメイン；下線：細胞質局在シグナル）
ヒトAPOBEC-3G
【数７２−１】
2020503027.tif 000181
【数７２−２】
2020503027.tif 000182
（配列番号２７９）（斜体：核酸編集ドメイン；下線：細胞質局在シグナル）
ヒトAPOBEC-3F
【数７３】
2020503027.tif 000183
（配列番号２８０）（斜体：核酸編集ドメイン）
ヒトAPOBEC-3B
【数７４】
2020503027.tif 000184
（配列番号２８１）（斜体：核酸編集ドメイン）
ヒトAPOBEC-3C：
【数７５】
2020503027.tif 000185
（配列番号２８２）（斜体：核酸編集ドメイン）
ヒトAPOBEC-3A：
【数７６】
2020503027.tif 000186
（配列番号２８３）（斜体：核酸編集ドメイン）
ヒトAPOBEC-3H：
【数７７−１】
2020503027.tif 000187
【数７７−２】
2020503027.tif 000188
（配列番号２８４）（斜体：核酸編集ドメイン）
ヒトAPOBEC-3D
【数７８】
2020503027.tif 000189
（配列番号２８５）（斜体：核酸編集ドメイン）
ヒトAPOBEC-1
【数７９】
2020503027.tif 000190
（配列番号２８６）
Mouse APOBEC-1
【数８０】
2020503027.tif 000191
（配列番号２８７）
Rat APOBEC-1
【数８１】
2020503027.tif 000192
（配列番号２８８）
ヤツメウナギCDA1（pmCDA1）
【数８２】
2020503027.tif 000193
（配列番号２８９）
ヒトAPOBEC3G D316R_D317R
【数８３−１】
2020503027.tif 000194
【数８３−２】
2020503027.tif 000195
（配列番号２９０）
ヒトAPOBEC3G 鎖Ａ
【数８４】
2020503027.tif 000196
（配列番号２９１）
ヒトAPOBEC3G 鎖Ａ D120R_D121R
【数８５】
2020503027.tif 000197
（配列番号２９２）
【０２５０】
融合タンパク質／核酸塩基エディターの非限定的な例を提供する。
Escherichia coli発現のためのHis6-rAPOBEC1-XTEN-dCas9（配列番号２９３）
【数８６】
2020503027.tif 000198
哺乳動物発現のためのrAPOBEC1-XTEN-dCas9-NLS（配列番号２９４）
【数８７−１】
2020503027.tif 000199
【数８７−２】
2020503027.tif 000200
哺乳動物発現のためのhAPOBEC1-XTEN-dCas9-NLS（配列番号２９５）
【数８８】
2020503027.tif 000201
rAPOBEC1-XTEN-dCas9-UGI-NLS（配列番号２９６）
【数８９−１】
2020503027.tif 000202
【数８９−２】
2020503027.tif 000203
rAPOBEC1-XTEN-Cas9ニッカーゼ-UGI-NLS（BE3、配列番号２９７）
【数９０】
2020503027.tif 000204
pmCDA1-XTEN-dCas9-UGI（細菌）（配列番号２９８）
【数９１−１】
2020503027.tif 000205
【数９１−２】
2020503027.tif 000206
pmCDA1-XTEN-nCas9-UGI-NLS（哺乳動物コンストラクト）（配列番号２９９）：
【数９２】
2020503027.tif 000207
huAPOBEC3G-XTEN-dCas9-UGI（細菌）（配列番号３００）
【数９３−１】
2020503027.tif 000208
【数９３−２】
2020503027.tif 000209
huAPOBEC3G-XTEN-nCas9-UGI-NLS（哺乳動物コンストラクト）（配列番号３０１）
【数９４】
2020503027.tif 000210
huAPOBEC3G（D316R_D317R）-XTEN-nCas9-UGI-NLS（哺乳動物コンストラクト）（配列番号３０２）
【数９５−１】
2020503027.tif 000211
【数９５−２】
2020503027.tif 000212
【０２５１】
例２：循環コレステロールおよび脂質レベルを改善するためにPCSK9および他の肝臓タンパク質を修飾するためのCRISPR／Cas9ゲノム／塩基編集方法
循環中のコレステロールの約７０％は、低密度リポタンパク質（LDL）中で輸送され、これは、肝臓においてLDL受容体（LDL-R）媒介型エンドサイトーシスにより排出され、これに加えて内在性コレステロール生合成経路の下方制御がもたらされる。PCSK9は、分泌型の球状のセリンプロテアーゼであって、そのＮ末端プロドメインをタンパク質分解性自己プロセッシングして、その触媒部位を永久に遮断する強力な内在性阻害剤とすることができる（図１Ａ〜１Ｃ）。PCSK9の機能を遮断するために用いられる医薬剤のリストは、表１２において見出すことができる。成熟PCSK9は、分泌経路を通して排出され、クラスリン被覆小胞においてタンパク質結合アダプターとして作用して、LDL粒子のエンドサイトーシスの間にLDL受容体とのｐＨ依存性相互作用を架橋し、これが、LDL受容体の細胞表面へのリサイクルを防止する（図２）１。PCSK9のノックアウトマウスモデルは、著しく低い循環コレステロールレベルを示し２、これは、細胞表面上のLDLRの提示の増強および肝細胞によるLDL粒子の取り込みの増加に起因する。ヒトゲノム全体に関連する研究は、高コレステロール血症患者において有害なPCSK9の機能獲得型バリアント３、ならびに、低コレステロール血症の個体において有益な機能喪失型および不安定なPCKS9バリアントを同定した（図１Ａ〜１Ｃ、表１）３ｂ、ｃ、４。既知のヒトPCSK9バリアントのリストは、表１８において見出すことができる。
【０２５２】
過去１０年間にわたり、製薬業界において、抗体、小分子、ペプチド性リガンド、RNA干渉、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む多様な戦略を用いてPCSK9とLDLRとの間の相互作用を抑制する、多大な関心が存在した（図２）。最近、第１世代のCRISPR/Cas9ツールを用いて、in vivoで、マウスモデルにおいて、PCSK9遺伝子が切断されてきた５。しかし、コレステロールレベルを調節する必要がある細胞の数の多さに起因して、ゲノム編集処置により引き起こされ得る、低頻度のオフターゲットのゲノム不安定性および発がん性の修飾についての差し迫った懸念が存在する６。臨床的適用に向けてのギャップを埋めることは、PCSK9を治療上の利益を最大化するように修飾するために、安全かつ効率的な戦略を必要とするであろう（表１）。ここで開示されるPCSK9の修飾について正確にターゲティングされた方法は、先に提案された、操作されたヌクレアーゼを用いてPCSK9のゲノム部位において無作為的なインデルを作製する戦略よりも優れている可能性があり６、これは、CRISPR/Cas9７、ならびにdCas9−Fok1融合物８、Cas9ニッカーゼ対９、TALEN、ジンクフィンガーヌクレアーゼなど１０を含む。さらに、BE2またはBE3などの「塩基エディター」に基づく戦略１１は、オフターゲットシトシン脱アミノ化がゲノム安定性に対して有する相対的に低い影響（癌遺伝子の活性化または腫瘍抑制因子の不活化を含む１３）に起因して１２、より好ましい安全性プロフィールを有する場合がある。
【０２５３】
重要なことに、PCSK9は、肝細胞により細胞外培地中に分泌され１４、そこでそれは、隣接する肝細胞のLDL受容体に対するパラクリン因子として、隣接する肝細胞のLDL受容体に対してシスで作用する１４。
in vivoでの組織中への遺伝子／タンパク質送達の不完全な浸透に起因して、PCSK9遺伝子のコピーのうちの相当な画分は、未修飾／野生型であり続ける１５。したがって、パラクリン機構において改変されていない細胞から効率的に発現され、自己活性化され、細胞外輸送されてクラスリン被覆ピットに会合するPCSK9の機能喪失型バリアントは、ゲノム／塩基編集治療剤のために優先されるべきである。
【０２５４】
この慎重に較正されたPCSK9の機能喪失型戦略は、LDL-R結合領域、および特にEGF-Aドメインと直接接触を行う（図１Ａ〜１Ｃ）重要な残基、例えばＰＣＳＫ９残基Ｒ１９４、Ｒ２３７、Ｆ３７９、ベータシートＳ３７２〜Ｄ３７４、Ｃ３７５〜３７８ジスルフィドなど（表３）のバリアント、ならびに全体的な折りたたみに影響を及ぼす操作されたおよび天然に存在するバリアント、例えば残基Ｒ４６およびＲ２３７、およびＡ４４３（表３）を操作することにより達成することができる。この治療戦略は、中性のPCSK9バリアントを有する高コレステロール血症患者にとって有益であろうが、PCSK9、LDLR、APOBなどの有害な機能獲得型変異のキャリアについてはさらにより有益であろう（例えば、PCSK9-D374Y、図１Ａ〜１Ｃ）１ｂ。さらに、複数のガイドRNAのin vivoでの投与は、他の潜在的に相乗的な遺伝子修飾、例えば、APOC3についての希少な心保護的対立遺伝子（Ａ４３ＴおよびＲ１９Ｘ）１６、IDOL／MYLIP機能喪失型対立遺伝子Ｒ２６６Ｘ１７、および遺伝子発現を上昇させるLDL-R非コードバリアント（表９）１８の同時導入を可能にする。
【０２５５】
最後に、レポーター遺伝子の発現を変更するか、または細胞表面上により多くのLDL-Rを提示する塩基編集反応をプログラミングしたガイドRNAを発見するための、レポーター／標識方法およびDNAディープシークエンシングを用いるFACSソーティングとカップリングされた、ゲノム部位における全ての可能なPAMのために設計されたガイドRNAライブラリーで、細胞をin vitroで処置することにより、PCSK9の新たな心保護的バリアントを同定することができる。ゲノム全体にわたる関連性研究により（LDL-R、IDOL、APOC3／C5などについても同様に）同定された、これらの新たなPCSK9バリアント、ならびに他の心保護的対立遺伝子は、本明細書において記載されるガイドRNAによりプログラミング可能な塩基編集反応の型（表２および３）を用いて再現することができる。
【０２５６】
重要なことに、停止コドンの導入は、可動性ループ中の残基を標的とする場合に短縮化を生じることにおいて最も有効であることが予測され得るか、または、１つのガイドRNA BE複合体（ガイドRNAを青色で強調する）を用いて前進的に、タンデムに編集され得る。未成熟停止コドンのPCSK9中へのタンデム導入の例として、Ｗ１０Ｘ−Ｗ１１Ｘ、Ｑ９９Ｘ−Ｑ１０１Ｘ、Ｑ３４２Ｘ−Ｑ３４４Ｘ、Ｑ５５４Ｘ−Ｑ５５５Ｘが挙げられる。同様に、構造不安定化バリアントの後に停止コドンが続くこともまた、有効であり得る；例えば、Ｐ５３０Ｓ／Ｌ−Ｑ５３１Ｘ、Ｐ５８１Ｓ／ＬＲ５８２Ｘ、Ｐ６１８Ｓ／Ｌ−Ｑ６１９Ｘ（ガイドRNAを赤色で強調する）。ループ／リンカー領域中で見出される残基を、＋または＋＋で標識する。
表１８．LOVDデータベースからの既知のヒトPCSK9のバリアントのリスト
赤色：ガイドRNAによりプログラムされたゲノム／塩基編集反応を用いてマッチした／模倣された修飾
【表１８−１】
2020503027.tif 000213
【表１８−２】
2020503027.tif 000214
【表１８−３】
2020503027.tif 000215
【表１８−４】
2020503027.tif 000216
表１９．PCSK9の機能を遮断するための医薬剤の例
【表１９−１】
2020503027.tif 000217
【表１９−２】
2020503027.tif 000218
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18. (a) Scholtz, C. L.; Peeters, A. V.; Hoogendijk, C. F.; Thiart, R.; de Villiers, J. N.; Hillermann, R.; Liu, J.; Marais, A. D.; Kotze, M. J., Mutation -59c-->t in repeat 2 of the LDL receptor promoter: reduction in transcriptional activity and possible allelic interaction in a South African family with familial hypercholesterolaemia. Human molecular genetics 1999, 8 (11), 2025-30; (b) Gretarsdottir, S.; Helgason, H.; Helgadottir, A.; Sigurdsson, A.; Thorleifsson, G.; Magnusdottir, A.; Oddsson, A.; Steinthorsdottir, V.; Rafnar, T.; de Graaf, J.; Daneshpour, M. S.; Hedayati, M.; Azizi, F.; Grarup, N.; Jorgensen, T.; Vestergaard, H.; Hansen, T.; Eyjolfsson, G.; Sigurdardottir, O.; Olafsson, I.; Kiemeney, L. A.; Pedersen, O.; Sulem, P.; Thorgeirsson, G.; Gudbjartsson, D. F.; Holm, H.; Thorsteinsdottir, U.; Stefansson, K., A Splice Region Variant in LDLR Lowers Non-high Density Lipoprotein Cholesterol and Protects against Coronary Artery Disease. PLoS genetics 2015, 11 (9), e1005379; (c) van Zyl, T.; Jerling, J. C.; Conradie, K. R.; Feskens, E. J., Common and rare single nucleotide polymorphisms in the LDLR gene are present in a black South African population and associate with low-density lipoprotein cholesterol levels. Journal of human genetics 2014, 59 (2), 88-94; (d) De Castro-Oros, I.; Perez- Lopez, J.; Mateo-Gallego, R.; Rebollar, S.; Ledesma, M.; Leon, M.; Cofan, M.; Casasnovas, J. A.; Ros, E.; Rodriguez-Rey, J. C.; Civeira, F.; Pocovi, M., A genetic variant in the LDLR promoter is responsible for part of the LDL-cholesterol variability in primary hypercholesterolemia. BMC medical genomics 2014, 7, 17. 
19. Kwon, H. J.; Lagace, T. A.; McNutt, M. C.; Horton, J. D.; Deisenhofer, J., Molecular basis for LDL receptor recognition by PCSK9. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2008, 105 (6), 1820-5. 
20. Dewpura, T.; Raymond, A.; Hamelin, J.; Seidah, N. G.; Mbikay, M.; Chretien, M.; Mayne, J., PCSK9 is phosphorylated by a Golgi casein kinase-like kinase ex vivo and circulates as a phosphoprotein in humans. The FEBS journal 2008, 275 (13), 3480-93.  
【０２５７】
均等物および範囲
請求項において、「a」、「an」、および「the」などの冠詞は、そうでないと示されていない限り、または文脈から明らかでない限り、１以上を意味し得る。グループの１以上のメンバーの間の「or」を含む請求項または説明は、そうでないと示されていない限り、または文脈から明らかでない限り、１またはすべてのグループメンバーが所与の製品またはプロセスに存在し、用いられ、またはそうでなければ関連がある場合に満足すると考えられる。発明は、そのグループの正確に１のメンバーが所与の製品またはプロセスに存在し、用いられ、またはそうでなければ関連がある態様を含む。発明は、１より多く、またはすべてのグループメンバーが、所与の製品またはプロセスに存在し、用いられ、またはそうでなければ関連する態様も含む。
【０２５８】
さらに、本発明は、１つ以上の限定要因、要素、節、および説明的用語が、別の請求項に導入される、列記される請求項のうちの１つ以上からの全てのバリエーション、組み合わせ、および順列を包含する。例えば、別の請求項に従属する任意の請求項は、同じ基礎請求項に従属する任意の他の請求項において見出される１つ以上の限定要因を含むように改変することができる。要素がリストとして、例えばマーカッシュ群形式において提示される場合、要素の各々の下位群もまた開示され、任意の要素を群から除外することができる。一般的に、本発明または本発明の側面が、特定の要素および／または特徴を含むものとして言及される場合、本発明または本発明の側面のある態様は、かかる要素および／または特徴からなるか、またはこれらから本質的になることが、理解されるべきである。単純化を目的として、これらの態様は、本明細書において、特に文言としては（haec verba）記載されていない。
【０２５９】
また、用語「含むこと（comprising）」および「含むこと（containing）」は、オープンであることを意図され、さらなる要素またはステップの包含を許容することに留意する。範囲が示される場合、エンドポイントが含まれる。さらに、別段に示されるかまたは別段に文脈および当業者の理解から明らかでない限り、範囲として表される値は、本発明の異なる態様において記述される範囲内の任意の特定の値または部分範囲を、文脈が明らかに別を示さない限り、当該範囲の下限の単位の１０分の１まで想定し得る。
【０２６０】
本願は、多様な発行された特許、公開された特許出願、学術文献、および他の刊行物を参照し、これらの全ては、本明細書において参考として援用される。援用される参考文献のうちのいずれかと本明細書との間に矛盾が存在する場合、本明細書が支配すべきである。加えて、先行技術の範囲内に該当する本発明の任意の特定の態様は、請求項のうちの任意の１つ以上から明示的に除外することができる。かかる態様は、当業者に公知であるとみなされるので、除外が本明細書において明示的に記載されない場合であっても、それらを除外することができる。本発明の任意の特定の態様は、任意の理由のために、先行技術の存在に関連するか否かにかかわらず、任意の請求項から除外することができる。
【０２６１】
当業者は、本明細書において記載される特定の態様に対する多くの均等物を認識するか、または慣用的な実験のみを用いてこれらを確認することができるであろう。本明細書において記載される態様の範囲は、上の説明に限定されることを意図しないが、むしろ、添付の請求の範囲において記載される。当業者は、以下の請求の範囲において定義されるとおりの、本発明の精神または範囲から逸脱することなく、この説明に対する多様な変更および改変を行い得ることを理解するであろう。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図５−６】
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【図５−７】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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