(57)【要約】  本発明は、医療分野に含まれ得る。特に、本発明は、ｉｓｏＡｓｐ７アミロイドβ（Ａβ）に結合し得る抗体及びその抗原結合フラグメント、並びに上記抗体又はその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を提供する。ｉｓｏＡｓｐ７  Ａβは、アルツハイマー病の患者のプラーク中に見出され得るため、アルツハイマー病等のＡβ関連疾患の治療及び／又は予防のために適した標的である。したがって、上記抗体、その抗原結合フラグメント及びいずれかを含む医薬組成物を使用することで、神経変性疾患を治療及び／又は予防することができる。さらに、本発明は、ハイブリドーマ細胞系統、神経変性疾患の診断及び／又は予後診断のための上記抗体又はその抗原結合フラグメントの使用、並びに単離された試料中のｉｓｏＡｓｐ７  Ａβを検出する方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）Ｌ−ｉｓｏＡｓｐ７アミロイドβ（Ａβ）に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントと、
ここで、前記抗体と配列番号４４との間の相互作用のＫＤが、前記抗体と配列番号８との間の相互作用のＫＤよりも少なくとも１０倍小さく、かつ前記ＫＤは、２５℃で表面プラズモン共鳴により測定される；
（ｉｉ）薬学的に許容可能な担体又は希釈剤と、
を含む、医薬組成物。
【請求項２】
医薬として使用されるＬ−ｉｓｏＡｓｐ７  Ａβに特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体と配列番号４４との間の相互作用のＫＤが、前記抗体と配列番号８との間の相互作用のＫＤよりも少なくとも１０倍小さく、かつ前記ＫＤは、２５℃で表面プラズモン共鳴により測定される、抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は医薬として使用される請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
神経変性疾患の治療及び／又は予防に使用されるＬ−ｉｓｏＡｓｐ７  Ａβに特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体と配列番号４４との間の相互作用のＫＤが、前記抗体と配列番号８との間の相互作用のＫＤよりも少なくとも１０倍小さく、かつ前記ＫＤは、２５℃で表面プラズモン共鳴により測定される、抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は神経変性疾患の治療及び／又は予防に使用される請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、前記ＶＬはＬＣＤＲ１ポリペプチド、ＬＣＤＲ２ポリペプチド及びＬＣＤＲ３ポリペプチドを含み、かつＶＨはＨＣＤＲ１ポリペプチド、ＨＣＤＲ２ポリペプチド及びＨＣＤＲ３ポリペプチドを含み、該ポリペプチドは、
（ａ）ＬＣＤＲ１が、ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＲＮＲＫＮＹＬＡ（配列番号９）であり、ＬＣＤＲ２が、ＷＡＳＴＲＤＳ（配列番号１１）であり、ＬＣＤＲ３が、ＫＱＳＹＮＬＲＴ（配列番号１３）であり、ＨＣＤＲ１が、ＧＦＳＬＴＳＹＧＶＨ（配列番号１４）であり、ＨＣＤＲ２が、ＡＬＷＡＳＧＮＴＤＹＳＳＴＬＭＳ（配列番号１５）であり、かつＨＣＤＲ３が、ＤＲＧＩＬＴＧＧＹＦＤＶ（配列番号１７）である、
（ｂ）ＬＣＤＲ１が、ＫＳＳＱＳＬＦＮＳＲＴＲＫＮＹＶＡ（配列番号２７）であり、ＬＣＤＲ２が、ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号２９）であり、ＬＣＤＲ３が、ＫＱＳＹＮＬＲＡ（配列番号３０）であり、ＨＣＤＲ１が、ＧＦＴＦＴＤＹＹＭＳ（配列番号３２）であり、ＨＣＤＲ２が、ＦＩＲＮＫＡＮＧＹＴＴＥＹＳＡＳＶＫＧ（配列番号３４）であり、かつＨＣＤＲ３が、ＤＩＰＴＩＭＤＹ（配列番号３５）である、
（ｃ）ＬＣＤＲ１が、ＫＳＳＱＳＬＬＮＸ１ＲＸ２ＲＫＮＹＬＡ（配列番号１０）であり、ＬＣＤＲ２が、ＷＡＳＴＲＸ３Ｓ（配列番号１２）であり、ＬＣＤＲ３が、ＫＱＳＹＮＬＲＴ（配列番号１３）であり、ＨＣＤＲ１が、ＧＦＳＬＴＳＹＧＶＨ（配列番号１４）であり、ＨＣＤＲ２が、Ｘ４ＬＷＡＳＧＸ５ＴＤＹＸ６ＳＸ７ＬＭＳ（配列番号１６）であり、かつＨＣＤＲ３が、ＤＲＧＩＸ８ＴＧＧＹＦＤＶ（配列番号１８）であり、ここで、Ｘ１はＳ又はＲであり、Ｘ２はＮ又はＴであり、Ｘ３はＤ又はＥであり、Ｘ４はＡ又はＶであり、Ｘ５はＮ又はＲであり、Ｘ６はＳ又はＮであり、Ｘ７はＴ又はＡであり、かつＸ８はＬ、Ｔ又はＭである、及び、
（ｄ）ＬＣＤＲ１が、ＫＳＳＱＸ１ＬＸ２ＮＳＲＴＲＫＮＹＸ３Ａ（配列番号２８）であり、ＬＣＤＲ２が、ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号２９）であり、ＬＣＤＲ３が、Ｘ４ＱＳＹＮＬＲＸ５（配列番号３１）であり、ＨＣＤＲ１が、ＧＦＴＦＸ６ＤＹＹＭＸ７（配列番号３３）であり、ＨＣＤＲ２が、ＦＩＲＮＫＡＮＧＹＴＴＥＹＳＡＳＶＫＧ（配列番号３４）であり、かつＨＣＤＲ３が、ＤＩＰＴＩＭＤＹ（配列番号３５）であり、ここで、Ｘ１はＳ又はＮであり、Ｘ２はＦ又はＬであり、Ｘ３はＶ又はＬであり、Ｘ４はＫ又はＭであり、Ｘ５はＡ又はＴであり、Ｘ６はＴ又はＳであり、かつＸ７はＳ又はＮである、
からなる群より選択される、請求項１に記載の医薬組成物、請求項２若しくは３に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は請求項２若しくは３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、軽鎖（ＬＣ）及び重鎖（ＨＣ）を含み、前記ＬＣ及び前記ＨＣは、
（ａ）配列番号２１のＬＣ及び配列番号２２のＨＣと、
（ｂ）配列番号３８のＬＣ及び配列番号３９のＨＣと、
（ｃ）配列番号２１のＬＣ及び配列番号３９のＨＣと、
（ｄ）配列番号３８のＬＣ及び配列番号２２のＨＣと、
からなる群より選択されるポリペプチドである、請求項１に記載の医薬組成物、請求項２若しくは３に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は請求項２若しくは３に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物、請求項２〜５のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は請求項２〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントである、請求項１、２、３、４及び６のいずれか一項に記載の医薬組成物、請求項２、３、４及び６のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は請求項２、３、４及び６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記組成物は、ドネペジル、ガランタミン、メマンチン、リバスチグミン、β−セクレターゼ阻害剤、γ−セクレターゼモジュレーター、アデュカヌマブ、バピネオズマブ、クレネズマブ、ガンテネルマブ、ソラネズマブのようなｐａｎ−Ａβ特異的抗体の群から選択される追加の抗体及び／又は翻訳後リン酸化若しくはニトロ化されたＡβペプチドに特異性を有する抗体を更に含む、請求項１に記載の医薬組成物又は請求項２〜７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記神経変性疾患は、軽度認知障害、臨床的又は前臨床的アルツハイマー病、ダウン症候群における神経変性、臨床的及び前臨床的アミロイド血管症、進行性核上性麻痺、多発性硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病、パーキンソン病、ＨＩＶ関連認知症、ＡＬＳ（筋萎縮性側索硬化症）、成人発症糖尿病に関連した認知症、老人性心臓アミロイドーシス及び筋変性からなるリストより選択される、請求項３〜８のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント又は請求項３〜８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記神経変性疾患は、臨床的又は前臨床的アルツハイマー病である、請求項３〜９のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント又は請求項３〜９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
神経変性疾患の診断及び／又は予後診断のためのＬ−ｉｓｏＡｓｐ７  Ａβに特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントの使用であって、前記抗体と配列番号４４との間の相互作用のＫＤが、前記抗体と配列番号８との間の相互作用のＫＤよりも少なくとも１０倍小さく、かつ前記ＫＤは、２５℃で表面プラズモン共鳴により測定される、使用。
【請求項１２】
単離された試料を、Ｌ−ｉｓｏＡｓｐ７  Ａβに特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントと接触させる工程を含むｉｓｏＡｓｐ７  Ａβを検出する方法であって、前記抗体と配列番号４４との間の相互作用のＫＤが、前記抗体と配列番号８との間の相互作用のＫＤよりも少なくとも１０倍小さく、かつ前記ＫＤは、２５℃で表面プラズモン共鳴により測定される、方法。
【請求項１３】
前記単離された試料は、単離された血清試料、脳脊髄液試料又は組織試料である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
単離された試料における配列番号１の位置７にＬ−ｉｓｏＡｓｐを含むＡβペプチドのパーセンテージを決定する方法であって、
（ａ）サンドイッチイムノアッセイの使用によりＬ−ｉｓｏＡｓｐ含有ペプチドの量を定量化することと、
ここで、固定化された捕捉抗体又はその抗原結合フラグメントは、Ｌ−ｉｓｏＡｓｐ７  Ａβに特異的に結合し、検出抗体は、配列番号１を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントである；
（ｂ）サンドイッチイムノアッセイの使用によりＡβの総量を定量化することと、
ここで、固定化された捕捉抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントであり、検出抗体は、配列番号１を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントである；
（ｃ）工程（ａ）及び（ｂ）において得られた値を使用することによりパーセンテージ値を決定することと、
を含み、前記Ｌ−ｉｓｏＡｓｐ７  Ａβに特異的に結合する抗体と配列番号４４との間の相互作用のＫＤが、同抗体と配列番号８との間の相互作用のＫＤよりも少なくとも１０倍小さく、かつ前記ＫＤは、２５℃で表面プラズモン共鳴により測定される、方法。
【請求項１５】
前記単離された試料は、単離された血清試料、脳脊髄液試料又は組織試料である、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療分野に含まれ得る。特に、本発明は、ｉｓｏＡｓｐ７アミロイドβ（Ａβ）に結合し得る抗体及びその抗原結合フラグメント、並びに上記抗体又はその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を提供する。上記抗体、その抗原結合フラグメント及び上記医薬組成物を使用することで、神経変性疾患を治療及び／又は予防することができる。さらに、本発明は、ハイブリドーマ細胞系統、神経変性疾患の診断及び／又は予後診断のための上記抗体又はその抗原結合フラグメントの使用、並びに単離された試料中のｉｓｏＡｓｐ７  Ａβを検出する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、中年又は晩年に起こる進行性の難治性の脳の神経傷害である。最初の症状の１つは短期記憶喪失であり、それに続いて行動障害及び見当識障害が起こり、身体機能の喪失に及ぶ。ＡＤは常に死につながり、通常では診断後７年〜１０年で死亡する。
【０００３】
ＡＤ患者には死後に２つの組織学的変化、すなわち老人斑と過剰リン酸化タウタンパク質からなる神経原線維変化とが見られる。前者は、基本的に線維状アミロイドβ（Ａβ）から構成される細胞外沈着物である。Ａβペプチドは、ＡＰＰのタンパク質内分解的開裂により生ずる。ＡβペプチドはＡＰＰの膜貫通領域内に存在するため、疎水性側鎖が多く、その結果として溶解性に乏しい。Ａβペプチドは放出後に、強く凝集する傾向がある。ＡＤ患者においては、Ａβペプチドの生成と分解との間に不均衡があり、Ａβペプチドが凝集して沈着することで、神経細胞死が引き起こされる。ヒトの脳で観察される主なＡβ変異体はＡβ４０及びＡβ４２であるが、プラークにおいてはＮ末端欠損変異体及びその他の翻訳後修飾形も観察される。
【０００４】
２つの異なる型のＡＤ、つまり非常に稀な遺伝性の形態（家族性ＡＤ−ＦＡＤ）と患者の約９５％が罹患する孤発性の形態とが存在する。ＦＡＤは、異常に若年齢で現れるＡＤ症状によって特徴付けられる。プレセニリン１（ＰＳＩ）及びプレセニリン２（ＰＳ２）以外に、ＡＰＰは、ＦＡＤを引き起こし得る３つの既知の遺伝子に属する。これらの遺伝子における突然変異はＡβ産生の増加をもたらし、ＡＤの発症を事実上保証する。しかしながら、Ａβがどのようにその毒性効果を発揮するかは未解明のままである。遺伝的障害として、ＦＡＤは明らかに突然変異遺伝子の機能不全の結果であるが、遅発性の自発性ＡＤの原因はまだ完全には理解されていない。
【０００５】
自発性ＡＤの発症の理由が未知であるだけでなく、世界中の科学者は、ＡＤ患者をできるだけ早期に特定するためにＡＤバイオマーカーを見つけようとしている。ＡＤは、被験者が認知的に正常な発症前期と、軽度認知障害（ＭＣＩ）として知られる前駆期と、患者が日常活動における機能障害又は機能喪失さえも伴う認知症を示す第３期とに分けることができる（非特許文献１、非特許文献２）。これまで、ＡＤのための唯一の高度に予見的なバイオマーカーは、ＦＡＤの病原の遺伝子突然変異である。この遺伝子突然変異は疾患の発症の何年も前に検出され、高齢期にＡＤの発症に進むであろう個体を特定することができる。アルツハイマー病の画像診断を用いた先導的研究（ＡＤＮＩ）では、Ａβアミロイドバイオマーカーがまず異常となり、それに続いて神経変性バイオマーカー（ＣＳＦタウ、ＦＤＧ−ＰＥＴ、ＭＲＩ）に変化が生じ、臨床症状が発症することを示唆するＡＤバイオマーカーの時間的順序のためのモデルが作製された。つまりＡβペプチドは、患者がＭＣＩ期に最初の神経症状を示す前であっても脳内で病理学的濃度まで上昇する。さらに、突然変異だけでなくＡβペプチドの翻訳後修飾もそれらの凝集挙動を加速し得ることから、疾患の重度の進行がもたらされる可能性があることを明らかにすることができた。
【０００６】
Ａβペプチド中に観察される１つの翻訳後修飾は、イソアスパラギン酸（ｉｓｏＡｓｐ）の形成である。アスパルチル残基からのｉｓｏＡｓｐの生成は、ペプチド及びタンパク質の自発的な翻訳後修飾である。この反応は、タンパク質の半減期を決定するとみなされる（非特許文献３、非特許文献４）。それ以外にｉｓｏＡｓｐ形成により、追加のメチレン基がタンパク質又はペプチドの骨格に導入され（非特許文献５、非特許文献６）、結果的にその構造が変化する。この翻訳後修飾は、溶解性、コンフォメーション及び機能のようなタンパク質の特性も変化させ得る。ｉｓｏＡｓｐは、Ｃ末端隣接アミノ酸の側鎖が比較的小さく親水性である配列に最も形成されやすく、この位置に嵩高い又は疎水性の残基が存在する場合には形成される可能性が低い。最も好適なＣ末端隣接アミノ酸はグリシン、セリン及びヒスチジンである（非特許文献７）。
【０００７】
老人斑に不溶性Ａβが沈着した後に、Ａβは位置８にセリン残基を有するので、時間の経過に伴いｉｓｏＡｓｐ７の形成が生ずる可能性がある。ＡＤ患者の脳内のｉｓｏＡｓｐ７  Ａβの存在は１９９３年に初めて記載された（非特許文献８）。ポリクローナル抗ｉｓｏＡｓｐ７  Ａβ抗体を使用することによって、ｉｓｏＡｓｐ７  ＡβがＡＤ脳内の細胞外沈着物及びアミロイド蓄積血管に存在し、プラーク年齢の指標として働くことを明らかにすることができた（非特許文献９、非特許文献１０）。ＡβはＣ１ｑの直接的な結合により古典的補体経路（ＣＣＰ）を活性化することが可能であり、その結果、線維性Ａβタンパク質プラークの部位に反応性グリア細胞が動員される。Velazquezと同僚達は、Ａｓｐ７の異性体化によりＣＣＰ活性化の完全な排除が生ずることを見出した。これは補体系によるプラーク認識を妨げることができた。
【０００８】
ｉｓｏＡｓｐ７修飾はＡβペプチドの凝集に影響しないので（非特許文献１１、非特許文献１２）、この修飾により沈着及びプラーク形成が加速されることはありそうにない。しかしながら、Wakutaniらは、２００４年にＦＡＤの新たな事例、いわゆる日本鳥取型ＦＡＤ（Japanese-Tottori FAD）を記載した。この家族の一部の構成員においては、ＡＰＰ内のミスセンス突然変異（Ｄ６７８Ｎ）がＡβのアスパラギン酸７をアスパラギンに置き換えている（非特許文献１３）。アスパラギン残基は、アスパラギン酸よりも約１０倍速く異性化される（非特許文献１４）。この家系におけるＡＤ症状の発現は、Ａｓｎ７−Ａβによるものではなく、ｉｓｏＡｓｐ７  Ａβの形成の増加によるものである可能性がある。
【０００９】
ＡＤは１００年以上前から知られているが、未だに市場にて利用可能なものは対症療法だけである。Ａβ及びその断片を用いた能動免疫アプローチ並びに抗Ａβ抗体を用いた受動免疫は、種々の動物モデルにおいて有効であった。ヒトへのＡβのワクチン接種はＡβプラークの発生を抑制し、ＡＤ患者のＡβ負荷を軽減した。しかしながら、一部の患者が重度の髄膜脳炎を発症するため（非特許文献１５）又はＡβに対する体液性応答及び細胞性応答が内因性Ａβペプチドに対する強力な免疫応答を生ずるため（非特許文献１６）、臨床研究を中止する必要があった。
【００１０】
その結果、受動免疫は、能動免疫よりも安全で制御可能であるとみなされた。Ａβペプチドを標的とする幾つかの抗体は、ＡＤ患者における受動免疫療法の臨床試験で使用されている。しかしながら、殆どの抗体は、天然の非修飾ペプチドにおける線状エピトープに対するものである。治療研究は良い効果を示したが、アミロイド関連画像異常（ＡＲＩＡ）、発作及び死亡等の副作用を有する（非特許文献１７）。
【００１１】
したがって、アルツハイマー病等のＡβプラーク関連疾患の効果的な治療及び／又は予防のための抗体が求められている。本出願は、関連動物モデルにおいてより有効であることが見出されたため、アルツハイマー病等のＡβプラーク関連疾患の治療及び／又は予防においてより有効であると予想される抗体を提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Petersen (2004) J Intern Med 256:183-94
【非特許文献２】Savva et al. (2009) N Engl J Med 360:2302-2309
【非特許文献３】Robinson and Rudd (1974) Curr Top Cell Regul.8(0):247-95
【非特許文献４】Robinson and Robinson (2001) PNAS 98(3):944-949
【非特許文献５】Aswad et al. (2000) J Pharm Biomed Anal. 21(6):1129-36
【非特許文献６】Geiger and Clarke (1987) J Biol Chem 262:785-794
【非特許文献７】Shimizu et al. (2005) Biol Pharm Bull. 28(9):1590-6
【非特許文献８】Roher et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10836-10840
【非特許文献９】Fonseca et al. (1999) Exp Neurol. 157(2):277-88
【非特許文献１０】Shimizu et al. (2000) Arch Biochem Biophys. 381(2):225-34
【非特許文献１１】Fukuda et al. (1999) Bioorg Med Chem Lett. 9(7):953-6
【非特許文献１２】Shimizu et al. (2002) J Neurosci Res. 70(3):451-61
【非特許文献１３】Wakutani et al. (2004) J Neurol Neurosurg Psychiatry. 75(7):1039-42
【非特許文献１４】Stephenson and Clarke (1989) J Biol Chem 264:6164-6170
【非特許文献１５】Orgogozo et al. (2003) Neurology 61:46 - 54
【非特許文献１６】Holmes et al. (2008) Lancet 372:216 - 223
【非特許文献１７】Moreth et al. (2013) Immun Ageing. 10(1):18
【発明の概要】
【００１３】
ＡＤ患者におけるｉｓｏＡｓｐ７  Ａβの標的化は、抗体が修飾され、老化したＡβペプチドのみに結合するので、新しい有望なアプローチである。したがって、末梢中の合成されたばかりの循環Ａβは殆ど影響されないため、例えば血液又はＣＳＦにおけるＡβ結合を介した活性抗体の損失は妨げられる。これにより、抗体の投与量の減少が可能となり得る。さらに、Ａβ沈着物中のｉｓｏＡｓｐ７修飾種のエピトープ密度は、天然のＡβ変異体と比較して低い。これにより、脳組織内の抗体分布はより良くなり、中枢神経系における血管壁のアミロイド沈着物（脳アミロイド血管症、ＣＡＡ）との反応性がより低くなるため、ＡＲＩＡが防止される。
【００１４】
本明細書では、ｉｓｏＡｓｐ７−Ａβ特異的抗体でのアルツハイマー病状を有するトランスジェニックマウスの処理により、疾患の病状が弱まることが示されている。驚くべきことに、ｉｓｏＡｓｐ特異性の高い抗体の適用は、これらのマウスにおけるｉｓｏＡｓｐ７−Ａβを減少させるだけでなく、アミロイドプラーク及び非ｉｓｏＡｓｐ７修飾Ａβの予想外の減少も示すことが観察された（以下の図９及び図１２を参照）。この結果は、本明細書で初めて示されるように、未修飾（すなわち、位置７にｉｓｏＡｓｐではなくＡｓｐを含む）Ａβを特異的に検出するクローン６Ｅ１０に由来する抗体を使用して得られた（図１）。したがって、両方の抗体を使用して、ｉｓｏＡｓｐ−Ａβ特異的抗体のこの活性の違いを立証することで、アルツハイマー病等のＡβプラーク関連疾患の治療のためのｉｓｏＡｓｐ−Ａβの適用が可能となる。
【００１５】
さらに、ｉｓｏＡｓｐ７修飾Ａβは、総Ａβと比較して少数しか存在しない種であり、マウスではわずか４％しか占めないことも示されている（図９）。この低濃度にもかかわらず、処理後にアミロイドプラークの予想外の減少が観察された（図９、図１１、図１２及び図１５）。この新規知見はＡβ免疫療法の以前の制限を回避するのに役立つかもしれない。
【００１６】
驚くべきことに、本発明の抗体は、図１５Ａに示されるように、３Ｄ６（Ｌ−ｉｓｏＡｓｐ７修飾を有しないＡβ４２ペプチドの残基１〜残基５に結合する抗体）よりも多くの線維性Ａβを除去することが可能であった。このことは、より多量の単量体、オリゴマー及び線維性のｉｓｏＡｓｐ修飾Ａβの除去と関連していると見られる（図１４Ｂ及び図１５Ｂ）。さらに、本発明の抗体は、３Ｄ６と比較して５ｘＦＡＤマウスの治療を改善する（図１７〜図１９を参照）。
【００１７】
したがって、本発明は、ｉｓｏＡｓｐ７アミロイドβ（Ａβ）に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントであって、該抗体と配列番号４４との間の相互作用のＫＤが、該抗体と配列番号８との間の相互作用のＫＤよりも少なくとも１０倍小さい、抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。本発明はまた、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントと薬学的に許容可能な担体又は希釈剤とを含む医薬組成物を提供する。また、本発明は、本発明の抗体若しくはその抗原結合フラグメント又は本発明の医薬組成物の、特に神経変性疾患の治療及び／又は予防のための医薬としての使用を包含する。さらに、本発明は、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントの、神経変性疾患の診断及び／又は予後診断のための使用を提供する。本発明はまた、ハイブリドーマ細胞系統と、単離された試料を本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントと接触させる工程を含むｉｓｏＡｓｐ７  Ａβを検出する方法とを提供する。最後に、本発明は、配列番号１の位置７にＬ−ｉｓｏＡｓｐを含むアミロイドプラーク中のペプチドのパーセンテージを決定する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ドットブロット分析による抗体特異性の調査を示す図である。２μｌのＡβペプチドをニトロセルロースメンブレン上に漸減濃度でスポットし、ブロッキング溶液（ＴＢＳ−Ｔ（ＴＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０（容量／容量））中の５％（重量／容量）のミルク粉末）中で１時間ブロッキングした。抗体Ｋ１１（Ａ）、Ｋ１１９（Ｂ）及び６Ｅ１０（Ｃ）をブロッキング溶液にて１μｇ／ｍｌに希釈し、メンブレンと一緒に１時間インキュベートした後に、ＴＢＳ−Ｔによる５分間の洗浄工程を３回行った。アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）にコンジュゲートされた抗マウス抗体を加えて１時間インキュベートした後に、５分間の洗浄工程を３回行い、引き続き基質のＢＣＩＰ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホスフェート）及びＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリウム）の添加によりＡＰ活性の比色検出を行った。１はｉｓｏｄ７−Ａβ（１−１７）であり、２はｉｓｏＤ７−Ａβ（５−９）ｒｅｐであり、３はＡβ（１−１８）であり、４はｉｓｏＤ７−Ａβ（１−１２）である。注目すべきことに、抗体６Ｅ１０はｉｓｏＡｓｐ修飾Ａβを認識しない。
【図２】ＳＰＲ分析による固定化Ｋ１１と種々のＡβペプチドとの結合定数の測定を示す図である。１５００ＲＵ〜２０００ＲＵの抗体Ｋ１１を、ヤギ抗マウスＩｇＧへの結合によりＣＭ５チップ上に固定化した。単量体Ａβペプチドを様々な濃度で注入した。ＫＤ値はＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアのシングルサイクルカイネティクス解析の使用により計算した。Ａでは、ｉｓｏＤ７−Ａβ（１−１８）を１ｎＭ、３ｎＭ、９ｎＭ、２７ｎＭ、８１ｎＭ及び２４３ｎＭで適用した。Ｂでは、ｉｓｏＤ７−Ａβ（１−１７）を１ｎＭ、３ｎＭ、９ｎＭ、２７ｎＭ、８１ｎＭ及び２４３ｎＭで適用した。Ｃでは、Ａβ（１−１８）を１０ｍＭ、３０ｎＭ、９０ｎＭ、２７０ｎＭ、８１０ｎＭ及び２４３０ｎＭで適用した。
【図３】ＳＰＲ分析による固定化Ｋ１１９とｉｓｏＤ７−Ａβ（１−１８）とのＫＤ値の測定を示す図である。約２０００ＲＵの抗体Ｋ１１９を、ヤギ抗マウスＩｇＧへの結合によりＣＭ５チップ上に固定化した。単量体ｉｓｏＤ７−Ａβ（１−１８）ペプチドを様々な濃度（１ｎＭ、２ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、５００ｎＭ、１μＭ）で注入した。ＫＤ値はＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアのマルチサイクルカイネティクス解析の使用により計算した。
【図４】Ｋ１１と種々のＡβペプチドとの熱力学的キャラクタリゼーションを示す図である。Ｋ１１と種々の抗原との２５℃での熱力学的パラメーターの測定。Ｋ１１を、ＩＴＣバッファー（２５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、２５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）中に溶解されたＡβ−ペプチドに対して透析した。ペプチドを５分毎に以下の濃度で抗体溶液に添加した：Ａでは、５０．８μＭのｉｓｏＤ７−Ａβ（１−１８）を２．５μＭのＫ１１に対して滴定した。Ｂでは、５６．７μＭのＡβ（１−１８）を１１．９μＭのＫ１１に対して滴定した。Ｃでは、２３８μＭのｉｓｏｄ７−Ａβ（１−１７）を１１．９μＭのＫ１１に対して滴定した。上部のグラフは、抗体Ｋ１１による熱量測定セル中での抗原の滴定から生じる熱パルスの生データを示している。下部のグラフは、モル比に対する、注入物１モルにつき正規化された積算された熱パルスを示している。
【図５】等温滴定型熱量測定の使用によるｉｓｏＤ７−Ａβ（１−１８）へのＫ１１９の結合の熱力学的キャラクタリゼーションを示す図である。Ｋ１１９を、ＩＴＣバッファー（２５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、２５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）中に溶解されたペプチドｉｓｏＤ７−Ａβ（１−１８）に対して透析した。４４．９μＭのペプチド溶液を、５分毎に２．２μＭの抗体溶液に添加した。上部のグラフは、抗体Ｋ１１９による熱量測定セル中での抗原の滴定から生じる熱パルスの生データを示している。下部のグラフは、モル比に対する、注入物１モルにつき正規化された積算された熱パルスを示している。
【図６】Ｋ１１の使用による５ｘＦＡＤマウス及び野生型マウス由来の脳試料におけるＡβ凝集体の免疫組織化学的分析を示す図である。様々な年齢の５ｘＦＡＤマウス（Ｂ〜Ｅ及びＧ〜Ｊ）及び１２ヶ月齢の野生型マウス（Ａ及びＦ）由来のパラホルムアルデヒドで処理され凍結保存された脳切片を、抗ｉｓｏＡｓｐ７−Ａβ抗体Ｋ１１（Ａ〜Ｅ）及び市販の抗体６Ｅ１０で処理した後に、ビオチン化抗マウスＩｇＧを適用した。免疫染色を、ＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ−ペルオキシダーゼ（Sigma-Aldrich社）及び発色基質の３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）の添加により行った。Ａ）Ｋ１１で染色された１２ヶ月齢の野生型マウス。Ｂ）Ｋ１１で染色された３ヶ月齢の５ｘＦＡＤマウス。Ｃ）Ｋ１１で染色された６ヶ月齢の５ｘＦＡＤマウス。Ｄ）Ｋ１１で染色された９ヶ月齢の５ｘＦＡＤマウス。Ｅ）Ｋ１１で染色された１２ヶ月齢の５ｘＦＡＤマウス。Ｆ）６Ｅ１０で染色された１２ヶ月齢の野生型マウス。Ｇ）６Ｅ１０で染色された３ヶ月齢の５ｘＦＡＤマウス。Ｈ）６Ｅ１０で染色された６ヶ月齢の５ｘＦＡＤマウス。Ｉ）６Ｅ１０で染色された９ヶ月齢の５ｘＦＡＤマウス。Ｊ）６Ｅ１０で染色された１２ヶ月齢の５ｘＦＡＤマウス。
【図７】種々の抗体を用いた１２ヶ月齢の５ｘＦＡＤマウス由来の脳試料におけるＡβ凝集体の比較染色を示す図である。１２ヶ月齢の５ｘＦＡＤマウス由来のホルムアルデヒドで処理され凍結保存された脳切片を、抗ｉｓｏＡｓｐ７−Ａβ抗体Ｋ１１９（Ａ）、Ｋ１１（Ｂ）、６Ｅ１０（Ｃ）で処理し、及び一次抗体で処理せず（Ｄ）、その後にビオチン化抗マウスＩｇＧを適用した。図７（Ｅ）は、Ｋ１１９による野生型マウスの脳切片の染色を示している。免疫染色を、ＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ−ペルオキシダーゼ（Sigma-Aldrich社）及び発色基質の３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）の添加により行った。
【図８】生物学的試料におけるｉｓｏＡｓｐ７−Ａβ濃度及び総Ａβ濃度の定量化のためのサンドイッチＥＬＩＳＡを示す図である。捕捉抗体Ｋ１１（Ａ）及び３Ｄ６（Ｂ）を、２μｇ／ｍｌに希釈し、マイクロタイタープレートに４℃で一晩固定化した。ブロッキングは室温で２時間行った。ｉｓｏＤ７−Ａβ（１−３０）（配列番号５１）及びＡβ（１−３０）（配列番号５２）を連続希釈し、２連でウェルに加えた。４℃で２時間のインキュベート期間後に、プレートをＴＢＳ−Ｔで６回洗浄した。ＨＲＰにコンジュゲートされた抗Ａβ抗体クローン４Ｇ８を１μｇ／ｍｌの最終濃度で添加し、４℃で１時間インキュベートした。ＴＢＳ−Ｔで洗浄した後にＴＭＢにより発色反応を行い、１．２ＮのＨ２ＳＯ４の添加により停止させた。標準曲線は、４パラメーターロジスティックフィット：ｙ＝（Ａ２＋（Ａ１−Ａ２）／（１＋（ｘ／ｘ０）ｐ）によって４５０ｎｍ／５４０ｎｍで測定された吸光度から計算した。
【図９】Ｋ１１及びアイソタイプコントロールで処理された５ｘＦＡＤマウスの脳からの５ＭのＧｄｍＣｌ画分における総Ａβ（Ａ）ペプチド及びｉｓｏＡｓｐ７−Ａβ（Ｂ）ペプチドの定量化を示す図である。３ヶ月齢の５ｘＦＡＤマウスを５００μｇ、１５０μｇのＫ１１又は５００μｇのアイソタイプコントロールで週に１回腹腔内処理した。処理１２週間後に、マウスを屠殺し、脳の左半球をＴ−Ｐｅｒバッファー中でホモジナイズし、引き続き遠心分離した。得られたペレットを５ＭのＧｄｍＣｌ（１５０ｍｇ／ｍｌ）中に再懸濁し、再び遠心分離し、上清を総Ａβ（Ａ）又はｉｓｏＡｓｐ７−Ａβ（Ｂ）特異的ＥＬＩＳＡに適用した。
【図１０】Ｋ１１及びアイソタイプコントロールで処理された５ｘＦＡＤマウス由来の海馬脳切片におけるｉｓｏＡｓｐ７−Ａβを含む凝集体の免疫組織化学的分析を示す図である。３ヶ月齢の５ｘＦＡＤマウスを５００μｇ、１５０μｇのＫ１１又は５００μｇのアイソタイプコントロールで週に１回腹腔内処理した。処理１２週間後に、マウスを屠殺し、脳の右半球をホルムアルデヒドで処理し、凍結保存し、免疫組織化学的染色のために使用した。海馬区域から３０μｍの切片を作製し、２μｇ／ｍｌのＫ１１と一緒にインキュベートした後に、ビオチン化抗マウスＩｇＧを適用した。免疫染色を、ＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ−ペルオキシダーゼ（Sigma-Aldrich社）及び発色基質の３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）の添加により行った。海馬脳切片における対象領域（ＲＯＩ）を、２μｇ／ｍｌの６Ｅ１０（一般的なＡβのため）及び２μｇ／ｍｌのｉｓｏＡｓｐ７−Ａβ特異的抗体Ｋ１１（ｉｓｏＡｓｐ７−Ａβのため）で染色することにより選択した。全ての写真は、顕微鏡Ｂｉｏｒｅｖｏ  ＢＺ−９０００（Keyence社）の使用により透過光モード及び露出時間１／２００秒で記録した。ｉｓｏＡｓｐ７−Ａβのパーセント面積（ＲＯＩのｉｓｏＤ７（％））を、ＲＯＩの総面積に対してＢＺ  ＩＩ解析プログラムを使用して定量化した。
【図１１】Ｋ１１及びアイソタイプコントロールで処理された５ｘＦＡＤマウス由来の脳試料におけるｉｓｏＡｓｐ７−Ａβを含む凝集体の免疫組織化学的染色を示す図である。３ヶ月齢の５ｘＦＡＤマウスを５００μｇ、１５０μｇのＫ１１又は５００μｇのアイソタイプコントロールで週に１回腹腔内処理した。処理１２週間後にマウスを屠殺した。脳の右半球を使用して、パラホルムアルデヒド処理され凍結保存された脳切片を調製した。脳切片をＫ１１で処理した後に、ビオチン化抗マウスＩｇＧを適用した。免疫染色を、ＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ−ペルオキシダーゼ（Sigma-Aldrich社）及び発色基質の３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）の添加により行った。Ａ）３ヶ月齢の５ｘＦＡＤマウス（ベースラインコントロール）、Ｂ）５００μｇのアイソタイプコントロール抗体で処理された６ヶ月齢の５ｘＦＡＤマウス、Ｃ）１５０μｇのＫ１１で処理された６ヶ月齢の５ｘＦＡＤマウス、Ｄ）５００μｇのＫ１１で処理された６ヶ月齢の５ｘＦＡＤマウス。
【図１２】Ｋ１１及びアイソタイプコントロールで処理された５ｘＦＡＤマウス由来の脳試料におけるＡβ凝集体（抗体６Ｅ１０）の免疫組織化学的染色を示す図である。３ヶ月齢の５ｘＦＡＤマウスを５００μｇ、１５０μｇのＫ１１又は５００μｇのアイソタイプコントロールで週に１回腹腔内処理した。処理１２週間後にマウスを屠殺した。脳の右半球を使用して、パラホルムアルデヒド処理され凍結保存された脳切片を調製した。脳切片を市販の６Ｅ１０抗体で処理した後に、ビオチン化抗マウスＩｇＧを適用した。免疫染色を、ＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ−ペルオキシダーゼ（Sigma-Aldrich社）及び発色基質の３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）の添加により行った。Ａ）３ヶ月齢の５ｘＦＡＤマウス（ベースラインコントロール）、Ｂ）５００μｇのアイソタイプコントロール抗体で処理された６ヶ月齢の５ｘＦＡＤマウス、Ｃ）１５０μｇのＫ１１で処理された６ヶ月齢の５ｘＦＡＤマウス、Ｄ）５００μｇのＫ１１で処理された６ヶ月齢の５ｘＦＡＤマウス。
【図１３】Ｋ１１で処理された５ｘＦＡＤマウス由来の小脳及び脳幹におけるＩｇＧ２ａの定量化を示す図である。３ヶ月齢の５ｘＦＡＤマウスを５００μｇ又は１５０μｇのＫ１１で週に１回腹腔内処理した。処理１２週間後にマウスを屠殺し、小脳及び脳幹をＥＬＩＳＡブロッカー＋Ｔｗｅｅｎ中でホモジナイズし、引き続き遠心分離した。得られた上清をマウスＩｇＧ２ａ特異的ＥＬＩＳＡに適用した。ベースラインは、処理されていない３ヶ月齢の５ｘＦＡＤマウスに相当する。
【図１４】抗Ａβ抗体Ｋ１１、３Ｄ６及びアイソタイプコントロールで処理された５ｘＦＡＤマウスの脳からのＴ−Ｐｅｒ画分における総Ａβ（Ａ）ペプチド及びｉｓｏＤ７−Ａβ（Ｂ）ペプチドの定量化を示す図である。３ヶ月齢の５ｘＦＡＤマウスを３００μｇのＫ１１、３Ｄ６又はアイソタイプコントロールで週に１回腹腔内処理した。処理６ヶ月後にマウスを屠殺し、脳の左半球をＴ−Ｐｅｒバッファー（Thermofisher社）中で５０ｍｇ（脳重量）／ｍｌ（Ｔ−Ｐｅｒバッファー）までホモジナイズした。得られたＴ−Ｐｅｒ画分を総Ａβ及びｉｓｏＡｓｐ７−Ａβ特異的ＥＬＩＳＡに適用した。サンプルサイズは、１群当たり少なくとも１０匹の動物からなっていた（一部の群には１匹又は２匹多い動物が含まれていた）。統計分析は、ボンフェローニの多重比較検定を使用して実施した。＊はｐ≦０．０５を意味する。＊＊はｐ≦０．０１を意味する。＊＊＊はｐ≦０．００１を意味する。
【図１５】抗Ａβ抗体Ｋ１１、３Ｄ６及びアイソタイプコントロールで処理された５ｘＦＡＤマウスの脳からの５ＭのＧｄｍＣｌ画分における総Ａβ（Ａ）ペプチド及びｉｓｏＤ７−Ａβ（Ｂ）ペプチドの定量化を示す図である。３ヶ月齢の５ｘＦＡＤマウスを３００μｇのＫ１１、３Ｄ６及びアイソタイプコントロールで週に１回腹腔内処理した。処理６ヶ月後にマウスを屠殺し、脳の左半球をＴ−Ｐｅｒバッファー（５０ｍｇ／ｍｌ）でホモジナイズし、引き続き遠心分離した。得られたペレットを５ＭのＧｄｍＣｌ（１５０ｍｇ／ｍｌ）中に再懸濁し、再び遠心分離し、上清を総Ａβ及びｉｓｏＡｓｐ７−Ａβ特異的ＥＬＩＳＡにかけた。サンプルサイズは、１群当たり少なくとも１０匹の動物からなっていた（一部の群には１匹又は２匹多い動物が含まれていた）。統計分析は、ボンフェローニの多重比較検定を使用して実施した。＊はｐ≦０．０５を意味する。＊＊はｐ≦０．０１を意味する。＊＊＊はｐ≦０．００１を意味する。
【図１６】３００μｇのＫ１１、３Ｄ６及びアイソタイプコントロールで３８週間にわたり毎週処理された５ｘＦＡＤ動物の高架式十字迷路（ＥＰＭ）試験を示す図である。抗体処理された５ｘＦＡＤ群を、３００μｇのアイソタイプコントロールで処理された野生型動物と比較した。試験動物を、２本の開いたアームと２本の閉じたアームとを備える高架式十字（＋）装置の規定の閉じたアームの端に頭を向けて置いた。その後１０分間の間、試験動物の全ての動きを記録した。Ａでは、開いたアーム内で動物が費やした時間を合計することで、曝露区画（exposed area）における％を計算した。Ｂでは、アーム進入は、開いたアーム内に動物全体（尾を除く）が存在すると定義される。サンプルサイズは、１群当たり少なくとも９匹の動物からなっていた（一部の群には１匹又は２匹多い動物が含まれていた）。統計分析は、ボンフェローニの多重比較検定を使用して実施した。＊はｐ≦０．０５を意味する。＊＊はｐ≦０．０１を意味する。＊＊＊はｐ≦０．００１を意味する。
【図１７】３００μｇのＫ１１、３Ｄ６及びアイソタイプコントロールで３８週間にわたり毎週処理された５ｘＦＡＤ動物の恐怖条件付け試験を示す図である。抗体処理された５ｘＦＡＤ群を、３００μｇのアイソタイプコントロールで処理された野生型動物と比較した。試験動物を、自動式の恐怖条件付けシステムに置き、以下の手順：休止（１８０秒）、音（２８秒）、電気刺激（０．７ｍＡを２秒間）を受けさせた。２４時間後に、試験動物を再び恐怖条件付けシステムに置き、そこに２１０秒間放置してから取り出した。１時間後に動物をコンテナに戻し、それらを１８０秒の休止の後に１８０秒の音（中性刺激）に曝した。恐怖状態は、マウスによる所定の位置でのすくみ行動により表現された。１８０秒の休止の間のすくみ行動時間を計数して、１８０秒の音の間のすくみ行動時間から減算することで、すくみ行動時間の％を得た。サンプルサイズは、１群当たり少なくとも８匹の動物からなっていた（一部の群には１匹又は２匹多い動物が含まれていた）。統計分析は、ボンフェローニの多重比較検定を使用して実施した。＊はｐ≦０．０５を意味する。＊＊はｐ≦０．０１を意味する。＊＊＊はｐ≦０．００１を意味する。
【図１８】３００μｇのＫ１１、３Ｄ６及びアイソタイプコントロールで３８週間にわたり毎週処理された５ｘＦＡＤ動物のポールテストを示す図である。抗体処理された５ｘＦＡＤ群を、３００μｇのアイソタイプコントロールで処理された野生型動物と比較する。動物を５０ｃｍの高さのポール（直径１．５ｃｍ）上で頭を上部に向けて置いた。動物から手を放して、（Ａ）動物が向きを変える（全ての単足が地面へと向けられると定義される）までの時間、及び（Ｂ）動物の全ての足が地面に達するまでの時間を計数した。サンプルサイズは、１群当たり少なくとも１０匹の動物からなっていた（一部の群には１匹又は２匹多い動物が含まれていた）。統計分析は、ボンフェローニの多重比較検定を使用して実施した。＊はｐ≦０．０５を意味する。＊＊はｐ≦０．０１を意味する。＊＊＊はｐ≦０．００１を意味する。
【図１９】３００μｇのＫ１１、３Ｄ６及びアイソタイプコントロールで３８週間にわたり毎週処理された５ｘＦＡＤ動物のモーリスの水迷路試験を示す図である。抗体処理された５ｘＦＡＤ群を、３００μｇのアイソタイプコントロールで処理された野生型動物と比較する。試験動物は、円形のプールに入れられて、水から逃避することを可能にする見えないプラットフォームを見つける必要がある。円形のプールは、４つの等しい四分円に分割されている。試験動物を第１の四分円に入れて、プラットフォームに到達するまでの時間を計数した。少なくとも５分間休止した後に、試験動物を第２の四分円に入れ、同じ手順に曝した。動物を再び休止させた後に、動物を四分円３に入れ、引き続きもう一度休止を行い、動物を再び四分円２に入れた。最後に、試験動物がプラットフォームに到達するまでの時間を計数し、１日当たり４回の試験において全てのマウスについて合計した。グラフは、４日目に動物がプラットフォームに到達するまでの平均試験時間を示している。サンプルサイズは、１群当たり少なくとも１０匹の動物からなっていた（一部の群には１匹又は２匹多い動物が含まれていた）。統計分析は、ボンフェローニの多重比較検定を使用して実施した。＊はｐ≦０．０５を意味する。＊＊はｐ≦０．０１を意味する。＊＊＊はｐ≦０．００１を意味する。
【図２０】Ｋ１１、３Ｄ６及びアイソタイプコントロールの添加後の野生型Ａβ（Ａ）ペプチド及びｉｓｏＤ７−Ａβ（Ｂ）ペプチドの凝集を示す図である。合成の野生型Ａβ（１−４０）ペプチド及びｉｓｏＤ７−Ａβ（１−４０）ペプチドは、それらをヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）中に溶解させることにより単量体化された。ＨＦＩＰを一晩蒸発させ、ペプチドを１容量の０．１ＭのＮａＯＨ中に溶解させた後に、１８容量のＰＢＳ及び１容量の０．１ＭのＨＣｌを添加した。続いて、抗体Ｋ１１、３Ｄ６及びアイソタイプコントロールを５μＭの最終濃度まで添加し、こうして１０μＭのＡβペプチドの濃度に至った。２００μＭのＴｈＴ（チオフラビンＴ）の添加後に、４３５ｎｍ／４８５ｎｍ（励起波長／蛍光波長）の蛍光を、マイクロプレートリーダー（ＦｌｕｏＳｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａ、BMG Labtech社）において振盪条件（６００ｒｐｍ）下にて３７℃でトラッキングした。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
抗体
第１の態様では、本発明は、ｉｓｏＡｓｐ７アミロイドβ（Ａβ）に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントであって、前記抗体と配列番号４４との間の相互作用のＫＤが、前記抗体と配列番号８との間の相互作用のＫＤよりも少なくとも１０倍小さい、抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。好ましい実施形態では、該抗体と配列番号４８との間の相互作用のＫＤは、該抗体と配列番号８との間の相互作用のＫＤよりも少なくとも１０倍小さい。好ましくは、ＫＤは表面プラズモン共鳴又は等温滴定型熱量測定により測定される。より好ましくは、ＫＤは表面プラズモン共鳴により２５℃で測定される。
【００２０】
代替的な態様では、本発明は、ｐＥ３（位置３にＬ−ピログルタミン酸を含む）ｉｓｏＡｓｐ７アミロイドβ（Ａβ）に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントであって、該抗体と配列番号４８との間の相互作用のＫＤが、該抗体と配列番号８との間の相互作用のＫＤよりも少なくとも１０倍小さい、抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【００２１】
配列番号４４は、ｉｓｏＡｓｐ７  Ａβ（１−１８）であり、以下の配列：
ＤＡＥＦＲＨＸＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶ
（ここで、ＸはＬ−ｉｓｏＡｓｐである）を有する。
【００２２】
配列番号８は、Ａβ（１−１８）であり、以下の配列：
ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶ
を有する。
【００２３】
配列番号４８は、ｐＥ３−ｉｓｏＤ７−Ａβ（３−１８）であり、以下の配列：
ＺＦＲＨＸＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶ
（ここで、ＸはＬ−ｉｓｏＡｓｐであり、ＺはＬ−ピログルタミン酸である）を有する。
【００２４】
本明細書で使用される場合に、「抗体」という用語は、少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むタンパク質を指す。抗体という用語には、例えば全長抗体及び成熟抗体が含まれる。例えば、抗体は、重（Ｈ）鎖可変ドメイン配列（本明細書ではＶＨと略される）及び軽（Ｌ）鎖可変ドメイン配列（本明細書ではＶＬと略される）を含み得る。別の例では、抗体分子は、２つの重（Ｈ）鎖可変ドメイン配列及び２つの軽（Ｌ）鎖可変ドメイン配列を含み、それによりＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ、Ｆｄ、Ｆｄ’、Ｆｖ、一本鎖抗体（例えばｓｃＦｖ）、単一可変ドメイン抗体、ダイアボディ（Ｄａｂ）（二価及び二重特異性）及びキメラ（例えばヒト化）抗体のように２つの抗原結合部位が形成され、それらは、全体抗体又はｄｅ  ｎｏｖｏ合成された抗体の組み換えＤＮＡ技術を使用した改変により作製され得る。これらの機能的抗体フラグメントは、それらの各抗原又は受容体と選択的に結合する能力を保持している。抗体及び抗体フラグメントは、限定されるものではないが、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＥを含む抗体の任意のクラス並びに抗体の任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４）に由来し得る。本発明の抗体は、モノクローナル又はポリクローナルであってもよい。抗体はまた、ヒト抗体、ヒト化抗体、ＣＤＲ移植抗体又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで作製された抗体であってもよい。抗体は、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４から選択される重鎖定常領域を有し得る。抗体はまた、例えばκ又はλから選択される軽鎖を有し得る。
【００２５】
抗原結合フラグメントの例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片、すなわちＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン及びＣＨ１ドメインのみからなる一価断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、すなわちヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント、（ｉｉｉ）ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインのみからなるＦｄフラグメント、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬドメイン及びＶＨドメインのみからなるＦｖフラグメント、（ｖ）１つのＶＨドメインのみからなるダイアボディ（ｄＡｂ）フラグメント、（ｖｉ）ラクダ科の又はラクダ化された可変ドメイン、（ｖｉｉ）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、例えばBird et al. (1988) Science 242:423-426及びHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照、（ｖｉｉｉ）単一ドメイン抗体が挙げられる。これらの抗体フラグメントは、当業者に知られる従来の技術を使用して得られ、フラグメントもインタクト抗体と同様に有用性についてスクリーニングされる。
【００２６】
「抗体」という用語には、インタクトな分子が含まれる。抗体の定常領域が改変、例えば突然変異されることで、抗体の特性は変化（例えば、Ｆｃ受容体結合、抗体のグリコシル化、システイン残基の数、エフェクター細胞機能又は補体機能の１つ以上が増加又は減少）し得る。
【００２７】
抗体分子は単一ドメイン抗体でもあり得る。単一ドメイン抗体は、相補性決定領域が単一ドメインポリペプチドの一部である抗体を含み得る。例としては、限定されるものではないが、重鎖抗体、軽鎖を天然に欠いている抗体、従来の４鎖抗体に由来する単一ドメイン抗体、操作された抗体及び抗体に由来するもの以外の単一ドメイン足場が挙げられる。単一ドメイン抗体は、当該技術分野のいずれか又は任意の将来の単一ドメイン抗体であり得る。単一ドメイン抗体は、限定されるものではないが、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、魚、サメ、ヤギ、ウサギ及びウシを含むあらゆる種に由来し得る。本発明の別の態様によれば、単一ドメイン抗体は、軽鎖を欠いている重鎖抗体として知られる天然に存在する単一ドメイン抗体である。そのような単一ドメイン抗体は、例えば国際公開第９４０４６７８号に開示される。明確にするために、軽鎖を天然に欠いている重鎖抗体に由来するこの可変ドメインは、本明細書では４鎖免疫グロブリンの従来のＶＨと区別するためにＶＨＨ又はナノボディとして知られている。そのようなＶＨＨ分子は、ラクダ科の種、例えばラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、アルパカ及びグアナコにおいて産生された抗体に由来し得る。ラクダ科以外の他の種が、軽鎖を天然に欠いている重鎖抗体を産生することができ、そのようなＶＨＨは本発明の範囲内である。
【００２８】
ＶＨ領域及びＶＬ領域は、「フレームワーク領域」（ＦＲ又はＦＷ）と呼ばれるより保存された領域が点在する、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域に細分化することができる。
【００２９】
フレームワーク領域及びＣＤＲの範囲は、多くの方法により正確に定義されている（例えば、Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No.91-3242、Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol.196:901-917、及びOxford Molecular社のＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアにより使用されるＡｂＭ定義を参照）。一般的に、例えばAntibody Engineering Lab Manual（編集：Duebel, S.及びKontermann, R.、Springer出版社、ハイデルベルク）におけるProtein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains.を参照。
【００３０】
本明細書で使用される「相補性決定領域」及び「ＣＤＲ」という用語は、抗原特異性及び結合親和性を与える抗体可変領域内のアミノ酸の配列を指す。一般的に、各重鎖可変領域には３つのＣＤＲが存在し（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）、各軽鎖可変領域には３つのＣＤＲが存在する（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）。
【００３１】
所与のＣＤＲの正確なアミノ酸配列の境界は、Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD（「Ｋａｂａｔ」番号付けスキーム）、Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948（「Ｃｈｏｔｈｉａ」番号付けスキーム）によって記載されたスキームを含む多くのよく知られたスキームのいずれかを使用して決定され得る。本明細書で使用される場合に、「Ｃｈｏｔｈｉａ」番号付けスキームに従って定義されるＣＤＲは、「超可変ループ」と呼ばれることもある。
【００３２】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、単一分子組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性及び親和性を示す。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術によって又はハイブリドーマ技術を使用しない方法（例えば、組み換え法）によって作製することができる。
【００３３】
抗体又はその抗原結合フラグメントは、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であってもよい。他の実施形態では、抗体は組み換えにより産生され、例えばファージディスプレイ法又はコンビナトリアル法により産生され得る。好ましくは、抗体又はその抗原結合フラグメントは、モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【００３４】
抗体を作製するためのファージディスプレイ法及びコンビナトリアル法は、当該技術分野で知られている（例えば、Ladnerらの米国特許第５，２２３，４０９号、Kangらの国際公開第９２／１８６１９号、Dowerらの国際公開第９１／１７２７１号、Winterらの国際公開第９２／２０７９１号、Marklandらの国際公開第９２／１５６７９号、Breitlingらの国際公開第９３／０１２８８号、McCaffertyらの国際公開第９２／０１０４７号、Garrardらの国際公開第９２／０９６９０号、Ladnerらの国際公開第９０／０２８０９号、Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372、Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85、Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281、Griffths et al. (1993) EMBO J 12:725-734、Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226:889-896、Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628、Gram et al. (1992) PNAS 89:3576-3580、Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377、Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137、及びBarbas et al. (1991) PNAS 88:7978-7982に記載され、それらの全ての内容は、引用することにより本明細書の一部をなす）。
【００３５】
１つの実施形態では、抗体は完全ヒト抗体（例えば、ヒト免疫グロブリン配列から抗体を産生するように遺伝子操作されたマウスで作製された抗体）又は非ヒト抗体、例えば齧歯類（マウス又はラット）抗体、ヤギ抗体、霊長類（例えばサル）抗体、ラクダ抗体である。好ましくは、非ヒト抗体は、齧歯類（マウス抗体又はラット抗体）である。齧歯類抗体の産生方法は、当該技術分野で知られている。
【００３６】
ヒトモノクローナル抗体は、マウス系ではなくヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウスを使用して作製され得る。対象の抗原で免疫化されたこれらのトランスジェニックマウスからの脾細胞を使用して、ヒトタンパク質からのエピトープに特異的な親和性を有するヒトｍＡｂを分泌するハイブリドーマを作製する（例えば、Woodらの国際出願の国際公開第９１／００９０６号、KucherlapatiらのＰＣＴ出願の国際公開第９１／１０７４１号、Lonbergらの国際出願の国際公開第９２／０３９１８号、Kayらの国際出願の国際公開第９２／０３９１７号、Lonberg, N. et al.1994 Nature 368:856-859、Green, L.L. et al.1994 Nature Genet. 7:13-21、Morrison, S.L. et al.1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855、Bruggeman et al. 1993 Year Immunol 7:33-40、Tuaillon et al.1993 PNAS 90:3720-3724、Bruggeman et al.1991 Eur J Immunol 21:1323-1326を参照）。
【００３７】
抗体は、可変領域又はその一部、例えばＣＤＲが非ヒト生物、例えばラット又はマウスにおいて作製される抗体であり得る。キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体及びヒト化抗体は、本発明の範囲内である。非ヒト生物、例えばラット又はマウスにおいて作製された後に、例えば可変フレームワーク領域又は定常領域において改変させて、ヒトでの抗原性を低下させた抗体は本発明の範囲内である。
【００３８】
キメラ抗体は、当該技術分野において知られる組み換えＤＮＡ技術によって産生され得る（Robinsonらの国際出願ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９号、Akiraらの欧州特許出願第１８４，１８７号、Taniguchi, M.の欧州特許出願第１７１，４９６号、Morrisonらの欧州特許出願第１７３，４９４号、Neubergerらの国際出願の国際公開第８６／０１５３３号、Cabillyらの米国特許第４，８１６，５６７号、Cabillyらの欧州特許出願第１２５，０２３号、Better et al. (1988 Science 240:1041-1043)、Liu et al. (1987) PNAS 84:3439-3443、Liu et al., 1987, J. Immunol.139:3521-3526、Sun et al. (1987) PNAS 84:214-218、Nishimura et al., 1987, Canc. Res.47:999-1005、Wood et al. (1985) Nature 314:446-449及びShaw et al., 1988, J. Natl Cancer Inst.80:1553-1559を参照）。
【００３９】
ヒト化抗体又はＣＤＲ移植抗体は、ドナーＣＤＲで置き換えられた少なくとも１つ又は２つの、しかし一般的に３つ全てのレシピエントＣＤＲ（免疫グロブリン重鎖及び／又は軽鎖）を有することとなる。抗体は、非ヒトＣＤＲの少なくとも一部で置き換えられてもよく、又はＣＤＲの幾つかだけが非ヒトＣＤＲで置き換えられていてもよい。ｉｓｏＡｓｐ７  Ａβへのヒト化抗体の結合に必要とされる数のＣＤＲを置き換えることだけが必要とされる。好ましくは、ドナーは齧歯類抗体、例えばラット抗体又はマウス抗体であり、レシピエントはヒトフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークである。典型的に、ＣＤＲを提供する免疫グロブリンは「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供する免疫グロブリンは「アクセプター」と呼ばれる。１つの実施形態では、ドナー免疫グロブリンは、非ヒト（例えば齧歯類）免疫グロブリンである。アクセプターフレームワークは、天然に存在する（例えばヒト）フレームワーク若しくはコンセンサスフレームワーク、又はそれらと約８５％以上、好ましくは９０％、９５％、９９％以上同一の配列である。
【００４０】
本明細書で使用される場合に、「コンセンサス配列」という用語は、関連配列のファミリーの中で最も頻繁に存在するアミノ酸（又はヌクレオチド）から形成される配列を指す（例えば、Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany 1987)を参照）。或るタンパク質ファミリーにおいては、コンセンサス配列中の各位置は、該ファミリーのその位置で最も頻繁に存在するアミノ酸によって占められている。２つのアミノ酸が同じ頻度で存在する場合に、どちらかがコンセンサス配列中に含まれ得る。「コンセンサスフレームワーク」とは、コンセンサス免疫グロブリン配列におけるフレームワーク領域を指す。
【００４１】
抗体は、当該技術分野において知られる方法によってヒト化され得る（例えば、Morrison, S. L., 1985, Science 229:1202-1207、Oi et al.よる1986, BioTechniques 4:214、並びにQueenらによる米国特許第５，５８５，０８９号、米国特許第５，６９３，７６１号及び米国特許第５，６９３，７６２号を参照、それらの全ての内容は、引用することにより本明細書の一部をなす）。
【００４２】
ヒト化抗体又はＣＤＲ移植抗体は、ＣＤＲ移植又はＣＤＲ置換によって作製され得て、免疫グロブリン鎖の１つ、２つ又は全てのＣＤＲが置き換えられ得る。例えば、米国特許第５，２２５，５３９号、Jones et al.1986 Nature 321:552-525、Verhoeyan et al.1988 Science 239:1534、Beidler et al.1988 J. Immunol.141:4053-4060、Winterの米国特許第５，２２５，５３９号を参照（それらの全ての内容は、引用することにより明確に本明細書の一部をなす）。Winterは、本発明のヒト化抗体を調製するために使用することができるＣＤＲ移植法を記載しており（１９８７年３月２６日に出願された英国特許出願である英国特許出願公開第２１８８６３８号、Winterの米国特許第５，２２５，５３９号）、それらの内容は、引用することにより明確に本明細書の一部をなす。
【００４３】
また、特定のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたヒト化抗体も、本発明の範囲内である。ドナーからアミノ酸を選択するための基準は、米国特許第５，５８５，０８９号、例えば米国特許第５，５８５，０８９号の第１２欄〜第１６欄、例えば米国特許第５，５８５，０８９号の第１２欄〜第１６欄に記載されており、それらの内容は、引用することにより本明細書の一部をなす。抗体をヒト化するためのその他の技術は、１９９２年１２月２３日に公開されたPadlanらの欧州特許出願公開第５１９５９６号に記載されている。
【００４４】
抗体は、一本鎖抗体であり得る。一本鎖抗体（ｓｃＦＶ）を操作することができる（例えば、Colcher, D. et al. (1999) Ann N Y Acad Sci 880:263-80及びReiter, Y. (1996) Clin Cancer Res 2:245-52を参照）。一本鎖抗体を二量体化又は多量体化して、同じ標的タンパク質の異なるエピトープに対する特異性を有する多価抗体を作製することができる。
【００４５】
更に他の実施形態では、抗体は、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ及びＩｇＥの重鎖定常領域から選択される重鎖定常領域、特に例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４の（例えば、ヒト）重鎖定常領域から選択される重鎖定常領域を有する。別の実施形態では、抗体は、例えばκ又はλの（例えば、ヒト）軽鎖定常領域から選択される軽鎖定常領域を有する。定常領域が改変、例えば突然変異されることで、抗体の特性は変化（例えば、Ｆｃ受容体結合、抗体のグリコシル化、システイン残基の数、エフェクター細胞機能及び／又は補体機能の１つ以上が増加又は減少）し得る。１つの実施形態では、抗体は、エフェクター機能を有し、補体を固定化し得る。他の実施形態では、抗体は、エフェクター細胞を動員しない又は補体を固定化しない。別の実施形態では、抗体は、Ｆｃ受容体に結合する能力が低減されているか又は該能力を有しない。例えば、抗体は、Ｆｃ受容体への結合に対応しないアイソタイプ若しくはサブタイプ、フラグメント又はその他の突然変異体であり、例えば抗体は、突然変異又は欠失したＦｃ受容体結合領域を有する。
【００４６】
抗体の定常領域を改変する方法は、当該技術分野において知られている。改変された機能、例えば細胞上のＦｃＲ又は補体のＣ１成分等のエフェクターリガンドについての改変された親和性を有する抗体は、抗体の定常部分における少なくとも１つのアミノ酸残基を異なる残基と置き換えることにより作製され得る（例えば、欧州特許出願第３８８，１５１号、米国特許第５，６２４，８２１号及び米国特許第５，６４８，２６０号を参照、それらの全ての内容は、引用することにより本明細書の一部をなす）。マウス又は他の種の免疫グロブリンに適用される場合にこれらの機能を低下させる又は排除することとなる同様の種類の改変が記載され得る。
【００４７】
抗体を、誘導体化することができる又は別の機能的分子（例えば、別のペプチド又はタンパク質）に結合させることができる。本明細書で使用される場合に、「誘導体化された」抗体分子は、修飾された抗体分子である。誘導体化の方法としては、限定されるものではないが、蛍光部分、放射性ヌクレオチド、トキシン、酵素又はビオチン等の親和性リガンドの付加が挙げられる。したがって、本発明の抗体分子は、免疫接着分子を含む本明細書に記載される抗体の誘導体化形及びその他には修飾形を含むと解釈される。例えば、抗体分子は、１つ以上の他の分子実体、例えば別の抗体（例えば、二重特異性抗体又はダイアボディ）、検出可能な作用物質、細胞傷害性作用物質、医薬品作用物質及び／又は抗体若しくは抗体部分と別の分子（例えば、ストレプトアビジンコア領域又はポリヒスチジンタグ）との会合を媒介し得るタンパク質若しくはペプチドに機能的に結合され得る（化学的結合、遺伝子融合、非共有結合等）。
【００４８】
誘導体化された抗体分子の１つの種類は、（同じ種類又は例えば二重特異的抗体の作製のために異なる種類の）２つ以上の抗体を架橋させることによって作製される。適切な架橋剤としては、適切なスペーサーによって隔離された２つの反応性が異なる基を有するヘテロ二官能性である架橋剤（例えば、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）又はホモ二官能性である架橋剤（例えば、ジスクシンイミジルスベレート）が挙げられる。そのようなリンカーは、Pierce Chemical Company（イリノイ州、ロックフォード）から入手可能である。
【００４９】
抗体分子は、別の分子実体、典型的には標識又は治療剤（例えば、細胞傷害性作用物質又は細胞増殖抑制剤）又は部分にコンジュゲートされ得る。放射性同位体は、診断用途又は治療用途に使用され得る。そのような放射性同位体としては、限定されるものではないが、ヨウ素（１３１Ｉ又は１２５Ｉ）、イットリウム（９０Ｙ）、ルテチウム（１７７Ｌｕ）、アクチニウム（２２５Ａｃ）、プラセオジム、アスタチン（２１１Ａｔ）、レニウム（１８６Ｒｅ）、ビスマス（２１２Ｂｉ又は２１３Ｂｉ）、インジウム（１１１Ｉｎ）、テクネチウム（９９ｍＴｃ）、リン（３２Ｐ）、ロジウム（１８８Ｒｈ）、硫黄（３５Ｓ）、炭素（１４Ｃ）、トリチウム（３Ｈ）、クロム（５１Ｃｒ）、塩素（３６Ｃｌ）、コバルト（５７Ｃｏ又は５８Ｃｏ）、鉄（５９Ｆｅ）、セレン（７５Ｓｅ）又はガリウム（６７Ｇａ）が挙げられる。例えば診断に使用される標識として有用な放射性同位体としては、ヨウ素（１３１Ｉ又は１２５Ｉ）、インジウム（１１１Ｉｎ）、テクネチウム（９９ｍＴｃ）、リン（３２Ｐ）、炭素（１４Ｃ）及びトリチウム（３Ｈ）又は上記列挙の治療用同位体の１つ以上が挙げられる。
【００５０】
本発明は、放射標識された抗体分子及びそれを標識する方法を提供する。１つの実施形態では、抗体分子を標識する方法が開示される。この方法は、抗体分子をキレート化剤と接触させて、それによりコンジュゲートされた抗体を作製することを含む。コンジュゲートされた抗体は、放射性同位体、例えば１１１インジウム、９０イットリウム及び１７７ルテチウムで放射性標識され、それにより標識された抗体分子が作製される。
【００５１】
抗体分子は、治療剤にコンジュゲートされ得る。抗体は標識され得る。例えば、抗体は、ビオチン分子、酵素又は蛍光体で標識され得る。
【００５２】
「ｉｓｏＡｓｐ７  アミロイドβ」、「ｉｓｏＡｓｐ７  Ａβ」、「ｉｓｏＤ７  Ａβ」及び「ｉｓｏＤ７  アミロイドβ」という用語は、位置７のＡｓｐが異性体化されたアミロイドβ（Ａβ）ポリペプチドを指す。したがって、ｉｓｏＡｓｐ７  Ａβは、配列番号４４を含むＡβポリペプチドを指し、ｉｓｏＡｓｐ７  Ａβに特異的な抗体は、配列番号４４に存在するＬ−ｉｓｏＡｓｐを含むエピトープに選択的に結合することとなる。
【００５３】
「ＫＤ」という用語は、解離定数を指す。好ましい実施形態では、ＫＤは表面プラズモン共鳴又は等温滴定型熱量測定により測定される。好ましくは、ＫＤは表面プラズモン共鳴により２５℃で測定される。
【００５４】
好ましい実施形態では、抗体と配列番号４４との間の相互作用のＫＤは、該抗体と配列番号８との間の相互作用のＫＤよりも少なくとも１００倍小さい。より好ましくは、抗体と配列番号４４との間の相互作用のＫＤは、該抗体と配列番号８との間の相互作用のＫＤよりも少なくとも１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍又は４００倍小さい。好ましくは、ＫＤは表面プラズモン共鳴又は等温滴定型熱量測定により測定される。より好ましくは、ＫＤは表面プラズモン共鳴により２５℃で測定される。
【００５５】
好ましい実施形態では、２５℃での抗体又は抗原結合フラグメントと配列番号４４との相互作用のＫＤは、１００ｎＭ未満である。好ましくは、ＫＤは５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ又は１０ｎＭ未満である。より好ましくは、ＫＤは５０ｎＭ未満である。最も好ましくは、ＫＤは１０ｎＭ未満である。好ましくは、ＫＤは表面プラズモン共鳴又は等温滴定型熱量測定により測定される。より好ましくは、ＫＤは表面プラズモン共鳴により２５℃で測定される。
【００５６】
好ましい実施形態では、前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、前記ＶＬはＬＣＤＲ１ポリペプチド、ＬＣＤＲ２ポリペプチド及びＬＣＤＲ３ポリペプチドを含み、ＶＨはＨＣＤＲ１ポリペプチド、ＨＣＤＲ２ポリペプチド及びＨＣＤＲ３ポリペプチドを含み、該ポリペプチドは、
（ａ）ＬＣＤＲ１が、ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＲＮＲＫＮＹＬＡ（配列番号９）であり、ＬＣＤＲ２が、ＷＡＳＴＲＤＳ（配列番号１１）であり、ＬＣＤＲ３が、ＫＱＳＹＮＬＲＴ（配列番号１３）であり、ＨＣＤＲ１が、ＧＦＳＬＴＳＹＧＶＨ（配列番号１４）であり、ＨＣＤＲ２が、ＡＬＷＡＳＧＮＴＤＹＳＳＴＬＭＳ（配列番号１５）であり、かつＨＣＤＲ３が、ＤＲＧＩＬＴＧＧＹＦＤＶ（配列番号１７）である、
（ｂ）ＬＣＤＲ１が、ＫＳＳＱＳＬＦＮＳＲＴＲＫＮＹＶＡ（配列番号２７）であり、ＬＣＤＲ２が、ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号２９）であり、ＬＣＤＲ３が、ＫＱＳＹＮＬＲＡ（配列番号３０）であり、ＨＣＤＲ１が、ＧＦＴＦＴＤＹＹＭＳ（配列番号３２）であり、ＨＣＤＲ２が、ＦＩＲＮＫＡＮＧＹＴＴＥＹＳＡＳＶＫＧ（配列番号３４）であり、かつＨＣＤＲ３が、ＤＩＰＴＩＭＤＹ（配列番号３５）である、
（ｃ）ＬＣＤＲ１が、ＫＳＳＱＳＬＬＮＸ１ＲＸ２ＲＫＮＹＬＡ（配列番号１０）であり、ＬＣＤＲ２が、ＷＡＳＴＲＸ３Ｓ（配列番号１２）であり、ＬＣＤＲ３が、ＫＱＳＹＮＬＲＴ（配列番号１３）であり、ＨＣＤＲ１が、ＧＦＳＬＴＳＹＧＶＨ（配列番号１４）であり、ＨＣＤＲ２が、Ｘ４ＬＷＡＳＧＸ５ＴＤＹＸ６ＳＸ７ＬＭＳ（配列番号１６）であり、かつＨＣＤＲ３が、ＤＲＧＩＸ８ＴＧＧＹＦＤＶ（配列番号１８）であり、ここで、Ｘ１はＳ又はＲであり、Ｘ２はＮ又はＴであり、Ｘ３はＤ又はＥであり、Ｘ４はＡ又はＶであり、Ｘ５はＮ又はＲであり、Ｘ６はＳ又はＮであり、Ｘ７はＴ又はＡであり、かつＸ８はＬ、Ｔ又はＭである、及び、
（ｄ）ＬＣＤＲ１が、ＫＳＳＱＸ１ＬＸ２ＮＳＲＴＲＫＮＹＸ３Ａ（配列番号２８）であり、ＬＣＤＲ２が、ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号２９）であり、ＬＣＤＲ３が、Ｘ４ＱＳＹＮＬＲＸ５（配列番号３１）であり、ＨＣＤＲ１が、ＧＦＴＦＸ６ＤＹＹＭＸ７（配列番号３３）であり、ＨＣＤＲ２が、ＦＩＲＮＫＡＮＧＹＴＴＥＹＳＡＳＶＫＧ（配列番号３４）であり、かつＨＣＤＲ３が、ＤＩＰＴＩＭＤＹ（配列番号３５）であり、ここで、Ｘ１はＳ又はＮであり、Ｘ２はＦ又はＬであり、Ｘ３はＶ又はＬであり、Ｘ４はＫ又はＭであり、Ｘ５はＡ又はＴであり、Ｘ６はＴ又はＳであり、かつＸ７はＳ又はＮである、
からなる群より選択される。
【００５７】
好ましい実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＶＬ及びＶＨを含み、ここで、ＶＬ及びＶＨは、（ａ）配列番号１９のＶＬ及び配列番号２０のＶＨと、（ｂ）配列番号３６のＶＬ及び配列番号３７のＶＨと、（ｃ）配列番号１９のＶＬ及び配列番号３７のＶＨと、（ｄ）配列番号３６のＶＬ及び配列番号２０のＶＨとからなる群より選択されるポリペプチドである。
【００５８】
配列番号１９は、Ｋ１１中に存在するＶＬ断片であり、以下の配列を有する：
DIVMSQSPTSLAVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSRNRKNYLAWYQQKPGQSPK11IYWASTRDSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCKQSYNLRTFGGGTKLEIK
【００５９】
配列番号２０は、Ｋ１１中に存在するＶＨ断片であり、以下の配列を有する：
QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTSYGVHWVRQPPGKGLEWLGALWASGNTDYSSALMSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCARDRGIMTGGYFDVWGAGTTVTVSS
【００６０】
配列番号３６は、Ｋ１１９中に存在するＶＬ断片であり、以下の配列を有する：
DIVMSQSPSSLAVSAGEKATMSCKSSQSLFNSRTRKNYVAWLQQKPGQSPK11ISWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFALTITNVQAEDLAVYYCKQSYNLRAFGGGTKLEIT
【００６１】
配列番号３７は、Ｋ１１９中に存在するＶＨ断片であり、以下の配列を有する：
EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFTDYYMSWVRQPPGKALEWLGFIRNKANGYTTEYSASVKGRFTISRDNSQSILYLQMNTLRTEDSATYYCTRDIPTIMDYWGQGTSVTVSS
【００６２】
好ましい実施形態では、前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、軽鎖（ＬＣ）及び重鎖（ＨＣ）を含み、前記ＬＣ及び前記ＨＣは、
（ａ）配列番号２１のＬＣ及び配列番号２２のＨＣと、
（ｂ）配列番号３８のＬＣ及び配列番号３９のＨＣと、
（ｃ）配列番号２１のＬＣ及び配列番号３９のＨＣと、
（ｄ）配列番号３８のＬＣ及び配列番号２２のＨＣと、
からなる群より選択されるポリペプチドである。
【００６３】
配列番号２１は、Ｋ１１中に存在するＬＣであり、以下の配列を有する：
DIVMSQSPTSLAVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSRNRKNYLAWYQQKPGQSPK11IYWASTRDSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCKQSYNLRTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
【００６４】
配列番号２２は、Ｋ１１中に存在するＨＣであり、以下の配列を有する：
QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTSYGVHWVRQPPGKGLEWLGALWASGNTDYSSTLMSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCARDRGILTGGYFDVWGAGTTVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
【００６５】
配列番号３８は、Ｋ１１９中に存在するＬＣであり、以下の配列を有する：
DIVMSQSPSSLAVSAGEKATMSCKSSQSLFNSRTRKNYVAWLQQKPGQSPK11ISWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFALTITNVQAEDLAVYYCKQSYNLRAFGGGTKLEITRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
【００６６】
配列番号３９は、Ｋ１１９中に存在するＨＣであり、以下の配列を有する：
EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFTDYYMSWVRQPPGKALEWLGFIRNKANGYTTEYSASVKGRFTISRDNSQSILYLQMNTLRTEDSATYYCTRDIPTIMDYWGQGTSVTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
【００６７】
好ましい実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、２つのＬＣ及び２つのＨＣを含み、ここで、各ＬＣ及び各ＨＣは、（ａ）配列番号２１のＬＣ及び配列番号２２のＨＣと、（ｂ）配列番号３８のＬＣ及び配列番号３９のＨＣと、（ｃ）配列番号２１のＬＣ及び配列番号３９のＨＣと、（ｄ）配列番号３８のＬＣ及び配列番号２２のＨＣとからなる群より選択されるポリペプチドである。
【００６８】
好ましい実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＬＣ及びＨＣを含むヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントであり、ここで、ＬＣは、配列番号５３及び配列番号５５から選択されるポリペプチドを含み、ＨＣは、配列番号６１及び配列番号６３から選択されるポリペプチドを含む。好ましくは、ＬＣは配列番号５３を含み、ＨＣは配列番号６１を含む。
【００６９】
好ましい実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、２つのＬＣ及び２つのＨＣを含むヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントであり、ここで、各ＬＣは、配列番号５３及び配列番号５５から選択されるポリペプチドを含み、各ＨＣは、配列番号６１及び配列番号６３から選択されるポリペプチドを含む。好ましくは、各ＬＣは配列番号５３を含み、各ＨＣは配列番号６１を含む。
【００７０】
配列番号５３は、以下の配列を有する：
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRNRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYNLRTFGQGTKLEIK
【００７１】
配列番号５５は、以下の配列を有する：
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCKSSQSLLNSRNRKNYLAWYQQKPGQAPRLLIYWASTRDSGIPDRFSGSGSGTDYTLTISRLEPEDFAVYYCKQSYNLRTFGGGTKVEIK
【００７２】
配列番号６１は、以下の配列を有する：
QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCAVSGFSLTSYGVHWVRQPPGKGLEWLGALWASGNTDYSSTLMSRVTISVDKSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARDRGILTGGYFDVWGKGTTVTVSS
【００７３】
配列番号６３は、以下の配列を有する：
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYGVHWIRQPPGKGLEWLGALWASGNTDYSSTLMSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDRGILTGGYFDLWGRGTLVTVSS
【００７４】
好ましい実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＬＣ及びＨＣを含むヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントであり、ここで、ＬＣは、配列番号５７及び配列番号５９から選択され、ＨＣは、配列番号６５及び配列番号６７から選択される。好ましくは、ＬＣは配列番号５７であり、ＨＣは配列番号６５である。
【００７５】
好ましい実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、２つのＬＣ及び２つのＨＣを含むヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントであり、ここで、各ＬＣは、配列番号５７及び配列番号５９から選択され、各ＨＣは、配列番号６５及び配列番号６７から選択される。好ましくは、各ＬＣは配列番号５７であり、各ＨＣは配列番号６５である。
【００７６】
配列番号５７は、以下の配列を有する：
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRNRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYNLRTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【００７７】
配列番号５９は、以下の配列を有する：
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCKSSQSLLNSRNRKNYLAWYQQKPGQAPRLLIYWASTRDSGIPDRFSGSGSGTDYTLTISRLEPEDFAVYYCKQSYNLRTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【００７８】
配列番号６５は、以下の配列を有する：
QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCAVSGFSLTSYGVHWVRQPPGKGLEWLGALWASGNTDYSSTLMSRVTISVDKSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARDRGILTGGYFDVWGKGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
【００７９】
配列番号６７は、以下の配列を有する：
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYGVHWIRQPPGKGLEWLGALWASGNTDYSSTLMSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDRGILTGGYFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
【００８０】
好ましい実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、Fraunhofer-Institut fuer Zelltherapie und Immunologie IZI（Perlickstr. 1; 04103 ライプツィヒ、ドイツ）により寄託されたハイブリドーマ細胞系統：
（ａ）ＭＷＴ  １１−１−３（寄託番号：ＤＳＭ  ＡＣＣ３３１４、寄託日：２０１６年１２月１日）、又は、
（ｂ）ＭＷＴ  １１９−８−６（寄託番号：ＤＳＭ  ＡＣＣ３３１６、寄託日：２０１６年１２月１日）、
から取得される又は取得可能である。
【００８１】
ハイブリドーマ細胞系統は、ブダペスト条約に従って寄託されており、ドイツ微生物細胞培養コレクション（ＤＳＭＺ）（Inhoffenstr. 7b, 38124 ブラウンシュバイク、ドイツ）で取得可能である。
【００８２】
好ましい実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【００８３】
別の実施形態では、本発明は、循環及び組織、特に脳内のｉｓｏＡｓｐ７  Ａβペプチドに結合する抗体及びその機能的フラグメントを提供する。本発明の抗体は、単量体、二量体、三量体等、又は多量体形、凝集体、オリゴマー、繊維、フィラメントの形、又はプラークの凝集形のｉｓｏＡｓｐ７  Ａβペプチド分子に結合することが可能である。
【００８４】
更なる実施形態では、本発明は、ｉｓｏＡｓｐ７  Ａβのイソアスパラギン酸修飾に特異的に結合する抗体及びその抗原結合フラグメントを提供する。
【００８５】
医薬組成物
第２の態様では、本発明は、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントと薬学的に許容可能な担体又は希釈剤とを含む医薬組成物を提供する。
【００８６】
本明細書で使用される場合に、「薬学的に許容可能な担体」又は「薬学的に許容可能な希釈剤」は、医薬品投与と適合可能な任意の全ての溶剤、分散媒、コーティング剤、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤を意味する。医薬品活性物質用のそのような媒体及び作用物質の使用は、当該技術分野でよく知られている。許容可能な担体、賦形剤又は安定剤は、使用される投与量及び濃度でレシピエントに対して非毒性であり、本発明の範囲を限定するものではないが、追加の緩衝剤、保存剤、共溶媒、アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤、ＥＤＴＡ等のキレート化剤、金属複合体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）、ポリエステル類等の生分解性ポリマー、ナトリウム、多価糖アルコール等の塩形成対イオン、アラニン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、オルニチン、ロイシン、２−フェニルアラニン、グルタミン酸及びトレオニン等のアミノ酸、ラクチトール、スタキオース、マンノース、ソルボース、キシロース、リボース、リビトール、ミオイニシトース（myoinisitose）、ミオイニシトール（myoinisitol）、ガラクトース、ガラクチトール、グリセロール、シクリトール類（例えば、イノシトール）、ポリエチレングリコール等の有機糖類又は糖アルコール、尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α−モノチオグリセロール及びチオ硫酸ナトリウム等の硫黄含有還元剤、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン又は他の免疫グロブリン等の低分子量タンパク質、並びにポリビニルピロリドン等の親水性ポリマーが挙げられる。
【００８７】
本明細書に記載される医薬組成物は、その他の物質も含有し得る。これらの物質としては、限定されるものではないが、凍結保護剤、凍結乾燥保護剤、界面活性剤、増量剤、酸化防止剤及び安定化剤が挙げられる。幾つかの実施形態では、医薬組成物は凍結乾燥されていてもよい。
【００８８】
本明細書で使用される「凍結保護剤」という用語は、抗体表面から優先的に排除されることにより凍結誘導ストレスに対して抗体に安定性を与える作用物質を含む。凍結保護剤は、一次乾燥及び二次乾燥並びに長期産物貯蔵の間の保護も提供し得る。凍結保護剤の非限定的な例としては、スクロース、グルコース、トレハロース、マンニトール、マンノース及びラクトース等の糖類、デキストラン、ヒドロキシエチルデンプン及びポリエチレングリコール等のポリマー、ポリソルベート等の界面活性剤（例えば、ＰＳ−２０又はＰＳ−８０）並びにグリシン、アルギニン、ロイシン及びセリン等のアミノ酸が挙げられる。生物系における毒性が低い凍結保護剤が一般的に使用される。
【００８９】
１つの実施形態では、凍結乾燥保護剤が本明細書に記載される医薬組成物に添加される。本明細書で使用される「凍結乾燥保護剤」という用語は、非晶質のガラス質マトリックスを提供し、水素結合により抗体表面と結合することで、乾燥過程の間に除去される水分子と置き換えることにより、凍結乾燥又は脱水過程（一次凍結乾燥サイクル及び二次凍結乾燥サイクル）の間に抗体に安定性を与える作用物質を含む。凍結乾燥保護剤は、凍結乾燥サイクルの間の産物の分解を最小限にして長期産物安定性を改善するのを助ける。凍結乾燥保護剤の非限定的な例としては、スクロース又はトレハロース等の糖類、グルタミン酸モノナトリウム、非結晶性グリシン又はヒスチジン等のアミノ酸、ベタイン等のメチルアミン、硫酸マグネシウム等のリオトロピック塩、三価以上の糖アルコール、例えばグリセリン、エリスリトール、グリセロール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール及びマンニトール等のポリオール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、プルロニック類及びそれらの組み合わせが挙げられる。医薬組成物に添加される凍結乾燥保護剤の量は一般に、医薬組成物が凍結乾燥されたときに、許容することができない株の分解をもたらさない量である。
【００９０】
幾つかの実施形態では、増量剤が医薬組成物に含まれる。本明細書で使用される「増量剤」という用語は、医薬製品と直接的に相互作用せずに凍結乾燥産物の構造をもたらす作用物質を含む。薬学的に洗練されたケークを提供することに加えて、増量剤はまた、崩壊温度の変更、凍結融解保護の提供及び長期貯蔵にわたる株安定性の向上に関して有用な品質を与えることもできる。増量剤の非限定的な例としては、マンニトール、グリシン、ラクトース及びスクロースが挙げられる。増量剤は結晶性（例えば、グリシン、マンニトール又は塩化ナトリウム）又は非晶質（例えば、デキストラン、ヒドロキシエチルデンプン）であってもよく、一般的に製剤中で０．５％〜１０％の量で使用される。
【００９１】
Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に記載されるようなその他の薬学的に許容可能な担体、賦形剤又は安定剤が本明細書に記載される医薬組成物中に含まれていてもよいが、但し、それらは医薬組成物の所望の特性に悪影響を及ぼさないものとする。本明細書で使用される場合に、「薬学的に許容可能な担体」は、医薬品投与と適合可能な任意の全ての溶剤、分散媒、コーティング剤、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤を意味する。医薬品作用物質用のそのような媒体及び作用物質の使用は、当該技術分野でよく知られている。許容可能な担体、賦形剤又は安定剤は、使用される投与量及び濃度で、レシピエントに対して非毒性であり、追加の緩衝剤、保存剤、共溶媒、アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤、ＥＤＴＡ等のキレート化剤、金属複合体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）、ポリエステル類等の生分解性ポリマー、ナトリウム、多価糖アルコール等の塩形成対イオン、アラニン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、オルニチン、ロイシン、２−フェニルアラニン、グルタミン酸及びトレオニン等のアミノ酸、ラクチトール、スタキオース、マンノース、ソルボース、キシロース、リボース、リビトール、ミオイニシトース、ミオイニシトール、ガラクトース、ガラクチトール、グリセロール、シクリトール（例えば、イノシトール）、ポリエチレングリコール等の有機糖類又は糖アルコール、尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α−モノチオグリセロール及びチオ硫酸ナトリウム等の硫黄含有還元剤、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン又は他の免疫グロブリン等の低分子量タンパク質並びにポリビニルピロリドン等の親水性ポリマーを含む。
【００９２】
医薬組成物は、経口投与、舌下投与、バッカル投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、腹腔内投与、結膜投与、直腸投与、経皮投与、髄腔内投与、局所投与及び／又は吸入媒介投与用に調製され得る。好ましい実施形態では、医薬組成物は、静脈内投与、筋肉内投与、結膜投与、経皮投与、腹腔内投与及び／又は皮下投与に適した溶液であり得る。代替的な実施形態では、医薬組成物は、髄腔内投与に適したゲル剤又は液剤であり得る。
【００９３】
医薬組成物は、技術水準において知られる一般的な賦形剤及び担体を更に含み得る。固形医薬組成物の場合に、例えば医薬品グレードのマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム等を含む慣用の非毒性の固形担体が使用され得る。注射用の溶液の場合に、医薬組成物は、凍結保護剤、凍結乾燥保護剤、界面活性剤、増量剤、酸化防止剤、安定化剤及び薬学的に許容可能な担体を更に含み得る。エアロゾル投与の場合に、医薬組成物は一般的に、界面活性剤及び噴射剤と一緒に微細化された形で供給される。界面活性剤は、当然ながら非毒性であり、一般的に噴射剤中に可溶性である。そのような作用物質の代表例は、６個〜２２個の炭素原子を含む脂肪酸、例えばカプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレステリン酸（olesteric acid）及びオレイン酸と脂肪族多価アルコール又はその環状無水物とのエステル又は部分エステルである。混合グリセリド又は天然グリセリド等の混合エステルが使用され得る。必要に応じて、例えば鼻腔内送達用のレシチンのような担体も含まれ得る。坐剤の場合に、従来の結合剤及び担体としては、例えば、ポリアルキレングリコール類又はトリグリセリドが挙げられ得る。
【００９４】
好ましい実施形態では、医薬組成物は、ドネペジル、ガランタミン（正：galantamine）、メマンチン、リバスチグミン、β−セクレターゼ阻害剤、γ−セクレターゼモジュレーター、アデュカヌマブ、バピネオズマブ、クレネズマブ、ガンテネルマブ、ソラネズマブのようなｐａｎ−Ａβ特異的抗体の群から選択される追加の抗体及び／又は翻訳後リン酸化若しくはニトロ化されたＡβペプチドに特異性を有する抗体を更に含む。
【００９５】
医学的利用
第３の態様では、本発明は、医薬として使用される、本発明の抗体若しくはその抗原結合フラグメント又は本発明の医薬組成物を提供する。第４の態様では、本発明は、神経変性疾患の治療及び／又は予防に使用される、本発明の抗体若しくはその抗原結合フラグメント又は本発明の医薬組成物を提供する。
【００９６】
本出願で使用される「治療」及び「療法」という用語は、疾患及び／又は症状を治癒及び／又は緩和する目的と共に健康上の問題の改善を目標として使用される一連の衛生的手段、薬理学的手段、外科的手段及び／又は物理的手段を指す。「治療」及び「療法」という用語には、予防法及び治癒法が含まれる。それというのも、両者とも個体又は動物の健康の維持及び／又は回復に向けられるからである。症状、疾患及び廃疾の原因にかかわらず、健康上の問題を軽減及び／又は治癒するために適した医薬の投与は、本出願の文脈内の治療又は療法の形として解釈されるべきである。
【００９７】
本出願で使用される「予防」という用語は、疾患及び／又は症状の発病及び／又は発症を防ぐために使用される一連の衛生的手段、薬理学的手段、外科的手段及び／又は物理的手段を指す。「予防」という用語は未然防止法を包含する。それというのも、未然防止法は動物又は個体の健康を維持するために使用されるからである。
【００９８】
「治療的有効量」という用語は、治療効果を有し、神経疾患を緩和及び／又は治癒することが可能な抗体又はそのフラグメントの量を指す。
【００９９】
「個体」、「患者」又は「被験体」という用語は、本出願において区別なく使用され、決して限定することを意図するものではない。「個体」、「患者」又は「被験体」は、任意の年齢、性別及び身体状態であってもよい。
【０１００】
本発明の文脈において、「神経変性障害」又は「神経変性疾患」という用語は、進行性神経系機能不全を特徴とする任意の遺伝性及び／又は孤発性の状態と解釈される。これらの障害はしばしば、神経系の冒された中枢構造又は末梢構造の萎縮と関連している。好ましい実施形態では、神経変性疾患はＡβ関連疾患である。好ましくは、神経変性疾患は、ｉｓｏＡｓｐ７  Ａβを含むプラークの形成と関連している。
【０１０１】
特定の実施形態では、生体液及び組織中のｉｓｏＡｓｐ７  Ａβペプチドに結合し、それを取り除く又は除去することが可能な本発明の抗体は、ｉｓｏＡｓｐ７  Ａβ含有のプラーク、例えば脳内の拡散斑、老人斑及び脳血管斑の形成と関連する病態の予防及び／又は治療のために有用である。
【０１０２】
本発明の抗体のその免疫学的に反応性のフラグメントを含む本発明の抗体の投与により、上記プラーク又はその他の生物学的複合体からｉｓｏＡｓｐ７  Ａβは取り除かれ又は除去され得る。したがって、本発明のヒト化抗体は、循環、他の体液において容易に輸送され、そして上述のプラーク及び／又はその他の生物学的複合体が形成される部位又はｉｓｏＡｓｐ７  Ａβが損傷作用を示す他の場所に容易に輸送される。
【０１０３】
さらに、本発明の抗体のその免疫学的に反応性のフラグメントを含む本発明の抗体によるプラーク又はその他の生物学的複合体からのｉｓｏＡｓｐ７  Ａβの除去は、プラークの不溶性形の可溶化をもたらすため、脳組織等の冒された組織から完全なプラークが除去される。これはまた神経変性疾患、例えば軽度認知障害（ＭＣＩ）、例えば孤発性アルツハイマー病（ＳＡＤ）又は家族性英国型認知症（ＦＢＤ）及び家族性デンマーク型認知症（ＦＤＤ）等のような家族性アルツハイマー型認知症（ＦＡＤ）のような臨床的又は前臨床的アルツハイマー病（ＡＤ）、ダウン症候群における神経変性及び臨床的又は前臨床的ＣＡＡと診断された患者における認知の改善をもたらし得る。
【０１０４】
好ましい実施形態では、本発明は、神経変性障害を治療及び／又は予防する方法を提供する。好ましくは、該方法は、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントを患者に投与することを含む。
【０１０５】
好ましい実施形態では、本発明は、アルツハイマー病を治療する方法を提供する。好ましくは、該方法は、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントを患者に投与することを含む。
【０１０６】
循環又は他の体液における本発明の抗体又は抗原結合フラグメントのｉｓｏＡｓｐ７  Ａβへの結合は、循環形又は可溶性形のｉｓｏＡｓｐ７  Ａβの除去を更にもたらし得る。ｉｓｏＡｓｐ７  Ａβは、その他の修飾又は非修飾Ａβペプチドに対して高い親和性を有するため、アミロイドプラーク等のオリゴマー構造及び超分子構造の形成がもたらされる。特に、これらのオリゴマー構造は神経毒性が高いことが分かっている。オリゴマー構造の形成は、細胞損傷及び神経細胞の死をもたらす。したがって、循環型又は可溶性型のｉｓｏＡｓｐ７のＡβ又は更にはｉｓｏＡｓｐ７  Ａβを含むオリゴマーの除去は、細胞損傷及び／又は神経毒性の予防につながる。したがって、本発明はまた、神経変性疾患、例えば軽度認知障害（ＭＣＩ）、例えば孤発性アルツハイマー病（ＳＡＤ）又は家族性英国型認知症（ＦＢＤ）及び家族性デンマーク型認知症（ＦＤＤ）等のような家族性アルツハイマー型認知症（ＦＡＤ）のような臨床的又は前臨床的アルツハイマー病（ＡＤ）、ダウン症候群における神経変性及び臨床的又は前臨床的ＣＡＡを予防する方法を提供する。
【０１０７】
本発明は、アミロイド様タンパク質、特にｉｓｏＡｓｐ７のＡβに基づく又はそれと関連するその他の疾患、例えば進行性核上性麻痺、多発性硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病、パーキンソン病、ＨＩＶ関連認知症、ＡＬＳ（筋萎縮性側索硬化症）、成人発症糖尿病に関連した認知症、老人性心臓アミロイドーシス及び黄斑変性を含むその他の疾患を予防及び／又は治療する方法を更に提供する。
【０１０８】
好ましい実施形態では、前記神経変性疾患は、軽度認知障害、臨床的又は前臨床的アルツハイマー病、ダウン症候群における神経変性、臨床的及び前臨床的アミロイド血管症、進行性核上性麻痺、多発性硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病、パーキンソン病、ＨＩＶ関連認知症、ＡＬＳ（筋萎縮性側索硬化症）、成人発症糖尿病に関連した認知症、老人性心臓アミロイドーシス及び筋変性からなるリストより選択される。好ましくは、該疾患は臨床的又は前臨床的アルツハイマー病である。
【０１０９】
ハイブリドーマ細胞系統
第５の態様では、本発明は、以下のように寄託されたハイブリドーマ細胞系統：
（ａ）ＭＷＴ  １１−１−３（寄託番号：ＤＳＭ  ＡＣＣ３３１４、寄託日：２０１６年１２月１日）、及び／又は、
（ｂ）ＭＷＴ  １１９−８−６（寄託番号：ＤＳＭ  ＡＣＣ３３１６、寄託日：２０１６年１２月１日）、
を提供する。
【０１１０】
ＭＷＴ  １１−１−３は、モノクローナル抗体Ｋ１１を分泌し、ＭＷＴ  １１９−８−６は、モノクローナル抗体Ｋ１１９を分泌する。
【０１１１】
代替的な態様では、本発明は、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントのいずれか一つを発現し得るハイブリドーマ細胞系統を提供する。
【０１１２】
本発明はまた、（ｉ）本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸、（ｉｉ）該核酸を含むベクター並びに（ｉｉｉ）該核酸及び／又は該ベクターを含む細胞を提供する。好ましくは、細胞は哺乳動物細胞である。
【０１１３】
診断
第６の態様では、本発明は、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントの、神経変性疾患の診断及び／又は予後診断のための使用を提供する。
【０１１４】
好ましい実施形態では、抗体又は抗原結合フラグメントは、以前に論じられた任意の方法で誘導体化される。例えば、抗体をハイドロジェンペルオキシダーゼに融合させて、ＥＬＩＳＡで使用することで、神経変性疾患を診断及び／又は予後診断することができる。
【０１１５】
本発明は更に、生物学的試料、例えば髄液（脳脊髄液）又は血清試料、好ましくは血清試料又は組織試料におけるＡβ変異体、特にｉｓｏＡｓｐ７  Ａβの定量的測定を可能にする高感度であると共に頑健な検出技術における、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントの使用を想定している。これは、血液中のこれらのｉｓｏＡｓｐ７  Ａβペプチドの存在量が少ないことを考慮すれば非常に大きな課題である。しかしながら、そのような検出技術が利用可能な状態にあることは、薬物スクリーニング及び薬物開発プログラムにおける小分子阻害剤の有効性を研究するための前提条件である。
【０１１６】
第７の態様では、本発明は、単離された試料を本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントと接触させる工程を含むＬ−ｉｓｏＡｓｐ７  Ａβを検出する方法を提供する。
【０１１７】
上記方法は、直接的ＥＬＩＳＡ又は間接的ＥＬＩＳＡ、凝集アッセイ、免疫クロマトグラフィーアッセイ、放射免疫アッセイ、プルダウンアッセイ、免疫蛍光アッセイ又は免疫染色アッセイの方法工程を含み得る。
【０１１８】
好ましい実施形態では、上記方法は、（ａ）サンドイッチイムノアッセイの使用によりＬ−ｉｓｏＡｓｐ７含有ペプチドの量を定量化することを含み、ここで、固定化される捕捉抗体又はその抗原結合フラグメントは、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントであり、検出抗体は、配列番号１を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【０１１９】
好ましい実施形態では、単離された試料は、単離された血清、髄液／脳脊髄液若しくは別の体液又は組織試料である。血清試料が好ましい。
【０１２０】
第８の態様では、本発明は、単離された試料における配列番号１の位置７にＬ−ｉｓｏＡｓｐを含むＡβペプチドのパーセンテージを決定する方法を提供する。好ましい実施形態では、該方法は、（ａ）サンドイッチイムノアッセイの使用によりＬ−ｉｓｏＡｓｐ含有ペプチドの量を定量化することと、
ここで、固定化された捕捉抗体又はその抗原結合フラグメントは、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントであり、検出抗体は、配列番号１を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントである；
（ｂ）サンドイッチイムノアッセイの使用によりＡβの総量を定量化することと、
ここで、固定化された捕捉抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントであり、検出抗体は、配列番号１を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントである；
（ｃ）工程（ａ）及び（ｂ）において得られた値を使用することによりパーセンテージ値を決定することと、
を含む。
【０１２１】
サンドイッチイムノアッセイは、当該技術分野において一般的である。利用可能な文献が沢山存在する。例えば、Cox KL, Devanarayan V, Kriauciunas A, et al. Immunoassay Methods. 2012 May 1 [Updated 2014 Dec 24]. In: Sittampalam GS, Coussens NP, Brimacombe K, et al., editors. Assay Guidance Manual [Internet]. Bethesda (MD): Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences; 2004。https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK92434/から入手可能である。好ましい実施形態では、サンドイッチイムノアッセイは、直接的ＥＬＩＳＡ又は間接的ＥＬＩＳＡである。
【０１２２】
「特異的に結合する」という用語は、非標的化合物よりも少なくとも２倍高い親和性、例えば少なくとも４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍又は１００倍高い親和性で標的に結合する分子（例えば、抗体又は抗体フラグメント）を指す。
【０１２３】
好ましい実施形態では、配列番号１を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１の残基１〜残基６及び残基８〜残基４２により包含される位置のいずれか一つに見られるエピトープに結合する。言い換えれば、エピトープは、配列番号１の位置７にアスパラギン酸を含まない。
【０１２４】
本発明はまた、以下の項目を含む：
［１］ｉｓｏＡｓｐ７アミロイドβ（Ａβ）に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントであって、前記抗体と配列番号４４との間の相互作用のＫＤが、前記抗体と配列番号８との間の相互作用のＫＤよりも少なくとも１０倍小さい、抗体又はその抗原結合フラグメント。
［２］前記抗体と配列番号４４との間の相互作用のＫＤが、前記抗体と配列番号８との間の相互作用のＫＤよりも少なくとも１００倍小さい、項目［１］に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
［３］前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、前記ＶＬはＬＣＤＲ１ポリペプチド、ＬＣＤＲ２ポリペプチド及びＬＣＤＲ３ポリペプチドを含み、かつＶＨはＨＣＤＲ１ポリペプチド、ＨＣＤＲ２ポリペプチド及びＨＣＤＲ３ポリペプチドを含み、該ポリペプチドは、
（ａ）ＬＣＤＲ１が、ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＲＮＲＫＮＹＬＡ（配列番号９）であり、ＬＣＤＲ２が、ＷＡＳＴＲＤＳ（配列番号１１）であり、ＬＣＤＲ３が、ＫＱＳＹＮＬＲＴ（配列番号１３）であり、ＨＣＤＲ１が、ＧＦＳＬＴＳＹＧＶＨ（配列番号１４）であり、ＨＣＤＲ２が、ＡＬＷＡＳＧＮＴＤＹＳＳＴＬＭＳ（配列番号１５）であり、かつＨＣＤＲ３が、ＤＲＧＩＬＴＧＧＹＦＤＶ（配列番号１７）である、
（ｂ）ＬＣＤＲ１が、ＫＳＳＱＳＬＦＮＳＲＴＲＫＮＹＶＡ（配列番号２７）であり、ＬＣＤＲ２が、ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号２９）であり、ＬＣＤＲ３が、ＫＱＳＹＮＬＲＡ（配列番号３０）であり、ＨＣＤＲ１が、ＧＦＴＦＴＤＹＹＭＳ（配列番号３２）であり、ＨＣＤＲ２が、ＦＩＲＮＫＡＮＧＹＴＴＥＹＳＡＳＶＫＧ（配列番号３４）であり、かつＨＣＤＲ３が、ＤＩＰＴＩＭＤＹ（配列番号３５）である、
（ｃ）ＬＣＤＲ１が、ＫＳＳＱＳＬＬＮＸ１ＲＸ２ＲＫＮＹＬＡ（配列番号１０）であり、ＬＣＤＲ２が、ＷＡＳＴＲＸ３Ｓ（配列番号１２）であり、ＬＣＤＲ３が、ＫＱＳＹＮＬＲＴ（配列番号１３）であり、ＨＣＤＲ１が、ＧＦＳＬＴＳＹＧＶＨ（配列番号１４）であり、ＨＣＤＲ２が、Ｘ４ＬＷＡＳＧＸ５ＴＤＹＸ６ＳＸ７ＬＭＳ（配列番号１６）であり、かつＨＣＤＲ３が、ＤＲＧＩＸ８ＴＧＧＹＦＤＶ（配列番号１８）であり、ここで、Ｘ１はＳ又はＲであり、Ｘ２はＮ又はＴであり、Ｘ３はＤ又はＥであり、Ｘ４はＡ又はＶであり、Ｘ５はＮ又はＲであり、Ｘ６はＳ又はＮであり、Ｘ７はＴ又はＡであり、かつＸ８はＬ、Ｔ又はＭである、及び
（ｄ）ＬＣＤＲ１が、ＫＳＳＱＸ１ＬＸ２ＮＳＲＴＲＫＮＹＸ３Ａ（配列番号２８）であり、ＬＣＤＲ２が、ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号２９）であり、ＬＣＤＲ３が、Ｘ４ＱＳＹＮＬＲＸ５（配列番号３１）であり、ＨＣＤＲ１が、ＧＦＴＦＸ６ＤＹＹＭＸ７（配列番号３３）であり、ＨＣＤＲ２が、ＦＩＲＮＫＡＮＧＹＴＴＥＹＳＡＳＶＫＧ（配列番号３４）であり、かつＨＣＤＲ３が、ＤＩＰＴＩＭＤＹ（配列番号３５）であり、ここで、Ｘ１はＳ又はＮであり、Ｘ２はＦ又はＬであり、Ｘ３はＶ又はＬであり、Ｘ４はＫ又はＭであり、Ｘ５はＡ又はＴであり、Ｘ６はＴ又はＳであり、かつＸ７はＳ又はＮである、
からなる群より選択される、項目［１］又は［２］に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
［４］前記抗体又はその抗原結合フラグメントはＶＬ及びＶＨを含み、前記ＶＬ及び前記ＶＨは、
（ａ）配列番号１９のＶＬ及び配列番号２０のＶＨと、
（ｂ）配列番号３６のＶＬ及び配列番号３７のＶＨと、
（ｃ）配列番号１９のＶＬ及び配列番号３７のＶＨと、
（ｄ）配列番号３６のＶＬ及び配列番号２０のＶＨと、
からなる群より選択されるポリペプチドである、項目［１］〜［３］のいずれか一つに記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
［５］前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、軽鎖（ＬＣ）及び重鎖（ＨＣ）を含み、前記ＬＣ及び前記ＨＣは、
（ａ）配列番号２１のＬＣ及び配列番号２２のＨＣと、
（ｂ）配列番号３８のＬＣ及び配列番号３９のＨＣと、
（ｃ）配列番号２１のＬＣ及び配列番号３９のＨＣと、
（ｄ）配列番号３８のＬＣ及び配列番号２２のＨＣと、
からなる群より選択されるポリペプチドである、項目［１］〜［４］のいずれか一つに記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
［６］前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、２つのＬＣ及び２つのＨＣを含み、各ＬＣ及び各ＨＣは、
（ａ）配列番号２１のＬＣ及び配列番号２２のＨＣと、
（ｂ）配列番号３８のＬＣ及び配列番号３９のＨＣと、
（ｃ）配列番号２１のＬＣ及び配列番号３９のＨＣと、
（ｄ）配列番号３８のＬＣ及び配列番号２２のＨＣと、
からなる群より選択されるポリペプチドである、項目［５］に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
［７］上記抗体又はその抗原結合フラグメントは、ハイブリドーマ細胞系統：
（ａ）ＭＷＴ  １１−１−３（寄託番号：ＤＳＭ  ＡＣＣ３３１４、寄託日：２０１６年１２月１日）、又は、
（ｂ）ＭＷＴ  １１９−８−６（寄託番号：ＤＳＭ  ＡＣＣ３３１６、寄託日：２０１６年１２月１日）、
から取得される又は取得可能である、項目［１］〜［６］のいずれか一つに記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
［８］前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントである、項目［１］〜［７］のいずれか一つに記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
［９］項目［１］〜［８］のいずれか一つに記載の抗体又はその抗原結合フラグメントと、薬学的に許容可能な担体又は希釈剤とを含む医薬組成物。
［１０］前記組成物は、ドネペジル、ガランタミン、メマンチン、リバスチグミン、β−セクレターゼ阻害剤、γ−セクレターゼモジュレーター、アデュカヌマブ、バピネオズマブ、クレネズマブ、ガンテネルマブ、ソラネズマブのようなｐａｎ−Ａβ特異的抗体の群から選択される追加の抗体及び／又は翻訳後リン酸化若しくはニトロ化されたＡβペプチドに特異性を有する抗体を更に含む、項目［９］に記載の医薬組成物。
［１１］医薬として使用される、項目［１］〜［８］のいずれか一つに記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント又は項目［９］若しくは［１０］に記載の医薬組成物。
［１２］神経変性疾患の治療及び／又は予防に使用される、項目［１］〜［８］のいずれか一つに記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント又は項目［９］若しくは［１０］に記載の医薬組成物。
［１３］前記神経変性疾患は、軽度認知障害、臨床的又は前臨床的アルツハイマー病、ダウン症候群における神経変性、臨床的及び前臨床的アミロイド血管症、進行性核上性麻痺、多発性硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病、パーキンソン病、ＨＩＶ関連認知症、ＡＬＳ（筋萎縮性側索硬化症）、成人発症糖尿病に関連した認知症、老人性心臓アミロイドーシス及び筋変性からなるリストより選択される、項目［１２］に記載の使用のための抗体若しくはその抗原結合フラグメント又は医薬組成物。
［１４］前記神経変性疾患は、臨床的又は前臨床的アルツハイマー病である、項目［１２］又は［１３］に記載の使用のための抗体若しくはその抗原結合フラグメント又は医薬組成物。
［１５］以下の通りに寄託されたハイブリドーマ細胞系統：
（ａ）ＭＷＴ  １１−１−３（寄託番号：ＤＳＭ  ＡＣＣ３３１４、寄託日：２０１６年１２月１日）、及び／又は、
（ｂ）ＭＷＴ  １１９−８−６（寄託番号：ＤＳＭ  ＡＣＣ３３１６、寄託日：２０１６年１２月１日）。
［１６］神経変性疾患の診断及び／又は予後診断のための、請求項［１］〜［８］のいずれか一つに記載の抗体又はその抗原結合フラグメントの使用。
［１７］ｉｓｏＡｓｐ７  Ａβを検出する方法であって、単離された試料を請求項［１］〜［８］のいずれか一つに記載の抗体又はその抗原結合フラグメントと接触させる工程を含む、方法。
【実施例】
【０１２５】
実施例１：ｉｓｏＡｓｐ７−Ａβに対するモノクローナル抗体の調製及びスクリーニング
目的は、ｉｓｏＡｓｐ７−Ａβ及び位置７にイソアスパラギン酸を含むそのより短いペプチドと反応するが、位置７にアスパラギン酸を有する同じ分子とは反応しないモノクローナル抗体を作製することであった。
【０１２６】
免疫化のために、ペプチドｉｓｏＤ７−Ａβ（１−１２）Ｃｙｓ（配列番号３）及びｉｓｏＤ７−Ａβ（５−９）ｒｅｐＣｙｓ（配列番号４）の混合物を使用した。末端システイン残基のスルフヒドリル基を使用して、ペプチドを担体としての細菌トランスグルタミナーゼ（ＢＴＧ）にコンジュゲートさせた。ＢＴＧを、架橋剤ＳＭＰＨ（スクシンイミジル−６−［（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート］）を使用して活性化させた。
【０１２７】
モノクローナル抗体の作製のために、８週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスを、ペプチド−ＢＴＧコンジュゲートで免疫化した。両方の抗原を等容量のフロイント完全アジュバント（初回刺激）又は不完全アジュバント（追加免疫）中で乳化させることにより調製された油中水エマルジョンで、マウスを腹腔内免疫化した。
【０１２８】
マウスが血清中で十分な抗体力価を示した後に、マウスを頸部脱臼により屠殺した。脾臓を無菌的に摘出し、プールし、ホモジナイズし、ドイツ微生物細胞培養コレクション（DSMZ GmbH社、ブラウンシュバイク）から購入した骨髄腫細胞系統ＳＰ２／０−Ａｇｌ４を使用した細胞融合により不死化させた。
【０１２９】
得られたハイブリドーマクローンを、配列番号３−ＢＳＡコンジュゲート、配列番号４−ＢＳＡコンジュゲート、ｉｓｏＤ７−Ａβ（１−１８）−ＰＥＧ−ビオチン（配列番号５）に結合するが、野生型ペプチドＡβ（１−１８）−ＰＥＧ−ビオチン（配列番号６）に結合しないそれらの能力に従ってスクリーニングした。ＢＳＡにコンジュゲートされた抗原のスクリーニングは、直接酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を介して行った。ペプチドをストレプトアビジン被覆プレートに適用した後に直接ＥＬＩＳＡを行うことにより、ビオチン化抗原への結合を分析した。
【０１３０】
安定的な抗体産生ハイブリドーマを選択し、続いてハイブリドーマのモノクローナル性を保証するために、限外希釈により再度クローニングを行った。ハイブリドーマのサブクローンを、再びＥＬＩＳＡによりスクリーニングし、凍結保存、アイソタイピング及びマイコプラズマ試験に最良のクローンを選択した。
【０１３１】
実施例２：ドットブロット分析によるモノクローナル抗体のキャラクタリゼーション
単純なドットブロットプロトコルを達成することで、抗体の特異性及び交差反応性についての一般概念が得られた。ヒトＡβに基づく以下のペプチド２μｌを、漸減濃度（２００μＭ〜０．０２μＭ）でニトロセルロースメンブレン上にスポッティングした：１  −  ｉｓｏＤ７−Ａβ（１−１７）（配列番号７）；２  −  ｉｓｏＤ７−Ａβ（５−９）ｒｅｐＣｙｓ（配列番号４）；３  −  Ａβ（１−１８）（配列番号８）；４  −  ｉｓｏＤ７−Ａβ（１−１８）（配列番号４４）。分析のために、室温で穏やかに振盪させながらＴＢＳＴ−Ｍ（ＴＢＳＴ（トリス緩衝生理食塩水＋０．０５％（容量／容量）のＴｗｅｅｎ−２０）＋５％（重量／容量）のスキムミルク）で、メンブレンを１時間ブロッキングした。その後に、メンブレンを、等容量のＴＢＳＴ−Ｍにて１μｇ／ｍｌに希釈された抗体Ｋ１１、Ｋ１１９及び６Ｅ１０と一緒に４℃で３時間から一晩インキュベートした。アルカリ性ホスファターゼとコンジュゲートされた抗マウス二次抗体を、標準的な手順に従ってシグナル検出のために使用した。
【０１３２】
結果：
図１Ａ及び図１Ｂに示されるように、Ｋ１１及びＫ１１９は、Ａβペプチドの位置７のＬ−イソアスパラギン酸に特異的である（レーン４）。本発明者らのｉｓｏＡｓｐ７−Ａβ抗体とは対照的に、６Ｅ１０はＡβ（１−１８）に特異的であり、ｉｓｏＡｓｐ７修飾Ａβペプチドを認識しない。Ｋ１１の場合には、対応するＤ−イソアスパラギン酸を有するペプチドの最高濃度で、弱い反応性しか観察されなかった（レーン１）。位置７にアスパラギン酸を含む野生型ペプチド（レーン３）は認識されなかった。ＩｓｏＤ７  Ａβ（１−１８）ペプチド濃度が０．５μＭまで下がると、Ｋ１１により明らかに検出されたが、Ｋ１１９では検出されなかった。
【０１３３】
実施例３：ＳＰＲ分析によるモノクローナル抗体のキャラクタリゼーション
方法：
種々のＡβ種に対するＫ１１及びＫ１１９の結合親和性を、２５℃の温度でＢｉａｃｏｒｅ  ３０００を使用して測定した。分析する抗体Ｋ１１及びＫ１１９をＣＭ５センサーチップ（GE Healthcare社、製品コードＢＲ１０００１２）に結合させるために、約１５０００ＲＵ〜２００００ＲＵのヤギ抗マウスＩｇＧ（Thermo Fisher Scientific社、ＰＡ１  ２８５５５）をまず固定化した。抗マウスＩｇＧを固定化するために、センサーチップのカルボキシメチル化デキストラン表面を、０．１ＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）と０．４ＭのＮ−エチル−Ｎ’−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）とを１：１で混合することにより活性化させた。ＥＤＣ／ＮＨＳを、１０μｌ／分の流速でセンサーチップに１０分間適用した。ヤギ抗マウスＩｇＧを、１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）にて５０μｇ／ｍｌに希釈し、１０μｌ／分の流速で３分間にわたり２回注入した。１Ｍのエタノールアミン（ｐＨ８．５）で１０μｌ／分の流速で７分間にわたり２回不活性化させた後に、０．１Ｍのグリシン（ｐＨ１．７）を、３０μｌ／分の流速でセンサーチップに３分間適用し、続いてＨＢＳ−ＥＰバッファー（GE Healthcare社、製品コードＢＲ１００１８８）による洗浄工程を行った。
【０１３４】
約２０００ＲＵの抗ｉｓｏＡｓｐ７−Ａβ抗体の結合を、１０μｌ／分の流速で行った。これを達成するために、抗体をＨＢＳ−ＥＰバッファーにて２５μｇ／ｍｌに希釈し、センサーチップに適用した後に、ＲＵシグナルが一定になるまでＨＢＳ−ＥＰで洗浄した。
【０１３５】
速度定数を、Ａβペプチドを種々の濃度で適用することにより測定し、組み合わされたデータセットからＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（Biacore AB社）の使用により計算した（図２Ａ及び図３）。
【０１３６】
結果：
表１は、Ｋ１１及びＫ１１９によるｉｓｏＤ７−Ａβ（１−１８）の結合について得られた速度定数を示している。Ｋ１１は、Ｌ−ｉｓｏＡｓｐ含有抗原ｉｓｏＤ７−Ａβ（１−１８）（配列番号４４）に６．３ｎＭのＫＤ値で結合する。Ｋ１１９は、その抗原に対してより低い親和性を有する（６８．５ｎＭのＫＤ値）。Ｄ−イソアスパラギン酸異性体を含むペプチド誘導体ｉｓｏｄ７−Ａβ（１−１７）（配列番号７）及び適切な野生型配列Ａβ（１−１８）（配列番号８）への結合に関しては、ずっと高いＫＤ値が得られた（表２）。両方の抗体は、Ｌ−イソアスパラギン酸７で修飾されたＡβペプチドに対する強力な抗原特異性を共有する。
【０１３７】
表３は、Ｋ１１によるｉｓｏＡｓｐ７−Ａβの結合が、ペプチドの長さに依存しないことを示している。さらに、ＡＤ患者のアミロイドプラークに見られる多くの翻訳後修飾Ａβペプチドを試験した。驚くべきことに、Ｎ末端が位置３のＬ−ピログルタミン酸のみからなる場合（配列番号４８）に、Ｋ１１によるｉｓｏＤ７−Ａβペプチドの結合は増強される。
【０１３８】
【表１】
2020527561.tif 000002
【０１３９】
【表２】
2020527561.tif 000003
【０１４０】
【表３】
2020527561.tif 000004
【０１４１】
実施例４：等温滴定型熱量測定（ＩＴＣ）によるモノクローナル抗体のキャラクタリゼーション
ＳＰＲ分析により得られたＫＤ値を検証し、更にＫ１１のｉｓｏＤ７−Ａβ（１−１８）（配列番号４４）、Ａβ（１−１８）（配列番号８）及びｉｓｏｄ７−Ａβ（１−１７）（配列番号７）への結合カイネティクスをより詳細に分析するために、会合定数ＫＡ、反応エンタルピーΔＨ及び反応エントロピーΔＳを、ＶＰ−ＩＴＣマイクロ熱量計（MicroCal社）を使用して測定した。
【０１４２】
抗体を、ＩＴＣバッファー（２５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、２５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）に対して４℃で一晩透析した。凍結乾燥したペプチドをＩＴＣバッファー中に溶解して、５０μＭ〜２４０μＭの濃度にした。その後に抗体及びペプチドの正確な濃度を、２８０ｎｍでの吸光度及び各吸光係数から計算した。５分毎の抗体溶液中への１×２μｌ及び２１×１４μｌの抗原の滴定により、結合熱を２５℃で記録した。Ａβペプチドの希釈に起因する熱発生を評価するために、これらの値を、規定の条件及び機器設定を使用して透析バッファー中へのペプチドの滴定によって測定した。データのプロットは、MicroCal社のＯＲＩＧＩＮソフトウェアによって行った。計算された結合熱を、抗原の希釈に起因する熱によって補正した。得られた曲線を「Ｏｎｅ  Ｓｅｔ  ｏｆ  Ｓｉｔｅｓ」結合モデルによってフィッティングした。このモデルを使用して、化学量論、会合定数、反応エンタルピー及び反応エントロピーを計算することができる。
【０１４３】
結果：
図４及び図５における上部のグラフは、抗体による熱量測定セル中での抗原の滴定から得られる滴定曲線を示す（Ｋ１１については図４を、Ｋ１１９については図５を参照）。下部のグラフは、モル比に対する、注入物１モルにつき正規化された積算された熱パルスを示している。ＳＰＲ分析とは対照的に、Ｋ１１のＡβ（１−１８）（配列番号８）及びｉｓｏｄ７−Ａβ（１−１７）（配列番号７）への結合は検出されなかった。
【０１４４】
表４には、ｉｓｏＤ７−Ａβ（１−１８）（配列番号４４）に結合するＫ１１及びＫ１１９に関する化学量論、会合定数、反応エンタルピー及び反応エントロピーについての計算値の一覧が示されている。異なる方法から受け取ったカイネティクスパラメーターを比較するために、ＳＰＲ分析及びＩＴＣによって得られたＫＤ値が示されている。
【０１４５】
【表４】
2020527561.tif 000005
【０１４６】
実施例５：マウス脳試料の免疫組織化学（ＩＨＣ）染色
アミロイドプラーク中のｉｓｏＡｓｐ７−Ａβ修飾の同定のための本発明者らの抗体の用法を検証するために、異なる齢の５ｘＦＡＤマウスモデルの動物から脳組織の切片を調製した。５ｘＦＡＤトランスジェニックマウスは、スウェーデン型（Ｋ６７０Ｎ、Ｍ６７１Ｌ）、フロリダ型（Ｉ７１６Ｖ）及びロンドン型（Ｖ７１７Ｉ）のＦＡＤ突然変異を有する突然変異ヒトＡＰＰ（６９５）を、２つのＦＡＤ突然変異のＭ１４６Ｌ及びＬ２８６Ｖを有するヒトＰＳ１と一緒に過剰発現する。これらの突然変異の結果として、それらのマウスはアルツハイマー病の表現型を発生し始める。該マウスは、Oakleyら（Oakley et al., (2006) J. Neurosci. 26(40):10129-40）によって初めて記載され、それ以来数多くの薬理学的評価において使用されている（Ardestani et al., (2017) Neuropharmacology 116:371-386、Ano et al., (2017) J. Biol. Chem. 292(9):3720-3728、Cha et al., (2017) Stem Cells Transl. Med. 6(1):293-305、Torika et al., (2017) Brain Behav. Immun. 64:80-90、MacPherson et al., (2017) Neurobiol. Dis. 102:81-95）。雄及び雌の５ｘＦＡＤマウスをペントバルビタールナトリウムで麻酔した後に、脳を取り出した。脳をパラホルムアルデヒドで固定し、０．１Ｍのリン酸緩衝液中の３０％（重量／容量）のスクロース中で３日間インキュベートし、メチルブタン中で急速凍結させて、更に使用するまで−２０℃で貯蔵した。凍結させた脳を、Ｃｒｙｏｓｔａｒ  ＮＸ７０を使用することにより３０μｍ厚の切片にスライスした。免疫染色を、HSUらにより記載されるアビジンビオチンペルオキシダーゼ複合体（ＡＢＣ）法（HSU et al (1981) J Histochem Cytochem. 29(4):577-80）によって行った。ＴＢＳで５分間にわたり３回洗浄した後に、脳切片を１％（容量／容量）のＨ２Ｏ２、６０％（容量／容量）のメタノール中で３０分間インキュベートした後に、別の洗浄工程とブロッキング溶液（５％（容量／容量）のヤギ血清、ＴＢＳ中の２．３％（容量／容量）のＭ．Ｏ．Ｍ．（商標）ブロッキング試薬に加えて０．３％（容量／容量）のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）中での３０分間のインキュベートを行った。５％（容量／容量）のヤギ血清、ＴＢＳ中の０．１％（容量／容量）のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００中の２μｇ／ｍｌの一次抗体Ｋ１１、Ｋ１１９又は６Ｅ１０（Hiss Diagnostics社）と一緒に４℃で一晩インキュベートを行った。ＴＢＳで５分間にわたり３回洗浄した後に、ビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Thermo Fisher Scientific社）を、２％のＢＳＡを含むＴＢＳにて１：１０００で希釈し、試料と一緒に６０分間インキュベートした。ＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ−ペルオキシダーゼ（Sigma-Aldrich社）を、３回の５分間の洗浄工程の後に２％（容量／容量）のＢＳＡを含むＴＢＳにて１：１０００で添加し、６０分間インキュベートし、その後にＴＢＳで５分間にわたり３回洗浄し、更に０．０５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）で５分間の洗浄工程を行った。発色基質の３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）（０．０５％（重量／容量）のＤＡＢ、０．０５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）中の０．０１５％（容量／容量）のＨ２Ｏ２）を４分間〜７分間にわたり添加した。
【０１４７】
結果：
アミロイドプラーク形成は、生後約６か月で５ｘＦＡＤマウスにおいて生ずる（図６Ｃ及び図６Ｈ）。３ヶ月齢の動物において、ＡβのＮ末端に特異的な抗体６Ｅ１０は、皮質（図６Ｇ、矢印１）、錐体細胞層（図６Ｇ、矢印２）及び扁桃体基底外側部（図６Ｇ、矢印３）における細胞と反応する。これは恐らく、合成されたばかりのＡβ、つまりＡＰＰの形の膜結合型Ａβ種の染色によるものである。６Ｅ１０とは対照的に、ｉｓｏＡｓｐ７−Ａβ特異的抗体Ｋ１１は、沈着Ａβ種と老化Ａβ種とのみからなると思われる細胞外プラークのみを染色する。６Ｅ１０及びＫ１１の陽性染色により示されるアミロイドプラークの量及び増殖は、５ｘＦＡＤマウスの加齢の間に更に進行する（図６Ｃ〜図６Ｅ、図６Ｈ〜図６Ｊ）。野生型マウスの脳にはｉｓｏＡｓｐ７−Ａβ染色は存在しないが（図６Ａ）、抗体６Ｅ１０は、異なる脳領域に分布する単一のＡβ凝集体と反応する（図６Ｆ）。
【０１４８】
図７は、Ｋ１１９（Ａ）、Ｋ１１（Ｂ）、６Ｅ１０（Ｃ）及び二次抗体なし（Ｄ）の１２ヶ月齢の５ｘＦＡＤマウスの脳切片の比較染色を示している。さらに、野生型の脳切片においては、抗体Ｋ１１９によるｉｓｏＡｓｐ７−Ａβ染色は存在しない（Ｅ）。Ｋ１１９は、Ｋ１１と同様の染色結果を示す。
【０１４９】
実施例６：ｉｓｏＡｓｐ７−Ａβ特異的ＥＬＩＳＡにおけるＫ１１の適用
方法：
生物学的試料中のｉｓｏＤ７−Ａβの量を測定するために、間接的なサンドイッチＥＬＩＳＡを確立した。したがって、Ｋ１１をＰＢＳにて２μｇ／ｍｌに希釈し、ポリスチレン製９６ウェルマイクロタイタープレート上に４℃で一晩固定化した。ＥＬＩＳＡ  Ｂｌｏｃｋｅｒ（Thermo Fisher Scientific社）を用いて４℃で２時間ブロッキングを行った。標準曲線の作成のために、合成ｉｓｏＤ７−Ａβ（１−３０）を、ＥＬＩＳＡ  Ｂｌｏｃｋｅｒ＋Ｔｗｅｅｎ（Thermo Fisher Scientific社）で１５０ｐｇ／ｍｌから１．６ｐｇ／ｍｌまで連続希釈し、２連でウェルに加えた。ＥＬＩＳＡ  Ｂｌｏｃｋｅｒ＋Ｔｗｅｅｎで満たされた２つのウェルは、標準曲線値０ｐｇ／ｍｌに相当する。室温で２時間のインキュベート期間後に、プレートをＴＢＳ−Ｔで６回洗浄した。結合されたｉｓｏＤ７−Ａβ種の検出のために、ＨＲＰにコンジュゲートされた抗Ａβ抗体クローン４Ｇ８（Biolegends社）を、ＥＬＩＳＡ  Ｂｌｏｃｋｅｒ＋Ｔｗｅｅｎにて１μｇ／ｍｌの最終濃度に希釈し、試料と一緒に４℃で１時間インキュベートした。ＴＢＳ−Ｔで３回の洗浄工程後に、市販のＨＲＰ基質ＴＭＢ（ＳｕｒｅＢｌｕｅ  Ｒｅｓｅｒｖｅ  ＴＭＢマイクロウェルペルオキシダーゼ基質（１成分）、KPL社）による呈色反応を行い（暗所、室温で３０分間インキュベートする）、その後に１．２ＮのＨ２ＳＯ４を添加することにより停止させた。４５０ｎｍ／５４０ｎｍでの吸光度を、Ｔｅｃａｎ  Ｓｕｎｒｉｓｅプレートリーダーにより測定した。標準曲線は、４パラメーターロジスティックフィット：ｙ＝（Ａ２＋（Ａ１−Ａ２）／（１＋（ｘ／ｘ０）ｐ）によって測定された吸光度から計算した。
【０１５０】
総Ａβの量を決定するために、Ｋ１１に代えて、９６ウェルマイクロタイタープレート上にＡβのＮ末端に特異的な抗体３Ｄ６（ＡＴＣＣマウスハイブリドーマ細胞株ＲＢ９６  ３Ｄ６．３２．２．４）を固定化することにより、比較ＥＬＩＳＡを確立した。３Ｄ６は、ｉｓｏＡｓｐ７修飾とは無関係にＡβ（１−Ｘ）のＮ末端を認識する（図８Ｂを参照）。
【０１５１】
結果：
抗ｉｓｏＤ７−Ａβ特異的抗体Ｋ１１を使用することにより、１．６ｐｇ／ｍｌまでのｉｓｏＤ７−Ａβの定量的検出のために間接的サンドイッチＥＬＩＳＡを開発した。図８Ａは、ｉｓｏＡｓｐ７−Ａβ特異的ＥＬＩＳＡに特徴的な標準曲線を示している。そのグラフは更に、非修飾Ａβペプチドが検出されないことを示している。
【０１５２】
ｉｓｏＡｓｐ７修飾とは無関係にＡβを検出する総Ａβ  ＥＬＩＳＡの開発により、一方でアミロイドプラーク中のｉｓｏＡｓｐ７パーセント含有率の測定を可能にする。他方で、そのＥＬＩＳＡは、非ｉｓｏＡｓｐ７修飾Ａβペプチドに対するＫ１１抗体処理の影響を測定することを可能にする（実施例７＋実施例８を参照）。
【０１５３】
実施例７：５ｘＦＡＤマウスモデルにおけるＫ１１の適用
方法：
Ｋ１１が５ｘＦＡＤマウスモデルにおいてＡβプラーク負荷を低減する能力を評価した。これを行うために、Ｋ１１を、Ｈｅｋ２９３細胞においてＩｇＧ２ａサブタイプと一緒に発現させて、プロテインＧアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
【０１５４】
適切なＫ１１処理用量を決定するために、３ヶ月齢の５ｘＦＡＤマウスを、第１試験においてＰＢＳ中の５００μｇ、１５０μｇのＫ１１又は５００μｇのアイソタイプコントロールで週に１回腹腔内処理した。この最初の試験において、処理１２週間後にマウスを屠殺した。一方の脳の半球を免疫組織染色のために使用し（方法については実施例５を参照）、もう一方をＥＬＩＳＡ分析のために使用し、小脳及び脳幹をＩｇＧ２ａ定量化のために使用した（実施例８を参照）。最後の抗体適用は、脳の調製の７日前に行った。
【０１５５】
海馬脳切片における対象領域（ＲＯＩ）を、２μｇ／ｍｌの６Ｅ１０（一般的なＡβのため）及び２μｇ／ｍｌのｉｓｏＡｓｐ７−Ａβ特異的抗体Ｋ１１（ｉｓｏＡｓｐ７−Ａβのため）で染色することにより選択した。全ての写真は、顕微鏡Ｂｉｏｒｅｖｏ  ＢＺ−９０００（Keyence社）を使用して透過光モード及び露出時間１／２００秒で記録した。ｉｓｏＡｓｐ７−Ａβのパーセント面積（ＲＯＩのｉｓｏＤ７（％））を、ＲＯＩの総面積に対してＢＺ  ＩＩ解析プログラムを使用して定量化した。
【０１５６】
ＥＬＩＳＡ分析のためのマウスの脳を調製するために、脳の左半球を、Ｔ−Ｐｅｒバッファー（Thermo Fisher Scientific社）中でＰｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ  Ｔａｂｌｅｔｓ（Roche社）と一緒にＰｒｅｃｅｌｌｙｓホモジナイザー（VWR社）を使用することによってホモジナイズした後に、１０秒間超音波処理した。ホモジネートを１０００００×ｇで１時間遠心分離した。得られたペレットを５Ｍの塩酸グアニジン（５ＭのＧｄｍＣｌ）中に１５０ｍｇ／ｍｌまで溶解した後に、オーバーヘッドシェーカーにおいて室温で３時間インキュベート工程を行った。遠心分離工程（１０００００×ｇで１時間）の後に、上清を収集し、使用するまで−２０℃で貯蔵した。ＥＬＩＳＡ測定の実施方法の詳細については、実施例６を参照のこと。
【０１５７】
結果：
ｉｓｏＡｓｐ７及び総Ａβ特異的ＥＬＩＳＡを使用することにより、アイソタイプコントロール群と比較したｉｓｏＡｓｐ７−Ａβ及び総Ａβプラーク負荷の用量依存的な減少が示された（図９）。
【０１５８】
Ｋ１１によるプラーク染色後の免疫組織学的評価は、アイソタイプコントロール群と比較したＡβプラーク負荷の明らかな減少も示している（図１０及び図１１）。図１のドットブロット分析により示されているように、市販の抗体６Ｅ１０は、非修飾Ａβペプチドに特異的であり、ｉｓｏＡｓｐ７−Ａβとは反応しない。図１２は、６Ｅ１０を使用することによるＫ１１処理された５ｘＦＡＤマウスの脳切片の免疫組織染色を示す。６Ｅ１０がｉｓｏＡｓｐ７−Ａβを認識しないにもかかわらず、Ｋ１１処理後にＡβプラーク負荷の明らかな減少が見られた。これは、ｉｓｏＡｓｐ７−Ａβの標的化により非修飾の総Ａβプラーク負荷が減少することを明確に裏付けている（図１２）。
【０１５９】
実施例８：５ｘＦＡＤマウスにおけるＫ１１の脳内浸透
５ｘＦＡＤマウスでは小脳及び脳幹はプラーク負荷を有しないか又は非常に低いプラーク負荷しか有しないので、それらのマウスはＩｇＧ２ａ含量の定量化のために使用されている。したがって、小脳及び脳幹を、ＥＬＩＳＡ  Ｂｌｏｃｋｅｒ＋Ｔｗｅｅｎ（Thermo Fisher Scientific社）中でＰｒｅｃｅｌｌｙｓホモジナイザー（VWR社）を使用することによりホモジナイズした後に、２５０００×ｇで３０分間遠心分離した。得られた上清中のタンパク質濃度を、ＢＣＡアッセイ（Thermo Fisher Scientific社）を使用することにより測定した。ＩｇＧ２ａ濃度を、マウスＩｇＧ２ａ特異的ＥＬＩＳＡにより定量化した。したがって、ラット抗マウスＩｇＧ２ａ（BD Bioscience社）をＰＢＳにて１μｇ／ｍｌに希釈し、ポリスチレン製９６ウェルマイクロタイタープレート上に４℃で一晩固定化した。ＥＬＩＳＡ  Ｂｌｏｃｋｅｒ（Thermo Fisher Scientific社）を使用して、室温で２時間ブロッキングを行った。標準曲線の作成のために、組み換えＩｇＧ２ａサブタイプＫ１１を、ＥＬＩＳＡ  Ｂｌｏｃｋｅｒ＋Ｔｗｅｅｎ（Thermo Fisher Scientific社）にて５００ｎｇ／ｍｌから０．７ｎｇ／ｍｌまで連続希釈し、２連でウェルに加えた。ＥＬＩＳＡ  Ｂｌｏｃｋｅｒ＋Ｔｗｅｅｎで満たされた２つのウェルは、標準曲線値０ｐｇ／ｍｌに相当する。室温で２時間のインキュベート期間後に、プレートをＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。結合されたＩｇＧ２ａ分子の検出のために、ヤギ抗マウスＨＲＰ（KPL社）を、ＥＬＩＳＡ  Ｂｌｏｃｋｅｒ＋Ｔｗｅｅｎにて１：５０００で希釈し、試料と一緒に４℃で１時間インキュベートした。呈色反応及び標準曲線の計算については、ｉｓｏＡｓｐ７−Ａβ特異的ＥＬＩＳＡを参照のこと（実施例６）。
【０１６０】
結果：
図１３は、未処理のコントロール群と比較した、Ｋ１１を５ｘＦＡＤマウスに適用した後の脳ＩｇＧ２ａの用量依存的な増加を示している。
【０１６１】
実施例９：５ｘＦＡＤマウスモデルにおけるＫ１１の適用（３８週間の処理）
方法：
実施例７と対照的に、３ヶ月齢の５ｘＦＡＤマウスを、３８週間にわたり３００μｇのＫ１１、３００μｇの３Ｄ６及び３００μｇのアイソタイプコントロールで処理した。ポジティブコントロール抗体３Ｄ６を、マウスハイブリドーマ細胞株ＲＢ９６  ３Ｄ６．３２．２．４（ＡＴＣＣ）における発現後に精製した。１２ヶ月齢の５ｘＦＡＤマウスは野生型動物と比較して著しい記憶欠損を示すので、ＥＬＩＳＡ（実施例６を参照）に加えて、行動試験を実施した。アイソタイプコントロール抗体の一切の影響を排除するために、野生型マウスも１週間当たり３００μｇのアイソタイプコントロールで処理した。
【０１６２】
高架式十字迷路（ＥＰＭ）
ＥＰＭは、試験動物が開放空間を嫌がることに基づく不安の測定のための試験である。試験動物を、２本の開いたアームと２本の閉じたアームとを備える高架式十字（＋）装置（Bioserve GmbH社、ドイツ、ボン）の規定の閉じたアームの端に頭を向けて置いた。その後１０分間の間、試験動物の全ての動きを記録した。開いたアーム内で動物が過ごした時間を合計することで、曝露区画における％を計算した。
【０１６３】
開いたアーム内に動物全体（尾を除く）が存在した場合に、動きをアーム進入として定義した。
【０１６４】
恐怖条件付け（ＦＣ）
ＦＣは、嫌悪刺激（電気ショック）が特定の中立刺激（音）に関連付けられている学習測定のための試験である。学習に成功すると、中立刺激だけで恐怖の状態（すくみ行動）が引き起こされることとなる。試験動物を、自動式の恐怖条件付けシステム（TSE Systems社、ドイツ、バート・ホンブルク）に置き、以下の手順：休止（１８０秒）、音（２８秒）、電気刺激（０．７ｍＡを２秒間）を受けさせた。２４時間後に、試験動物を再び恐怖条件付けシステムに置き、そこに２１０秒間放置して取り出した。１時間後に動物をコンテナに戻し、それらを１８０秒の休止の後に１８０秒の音（中性刺激）に曝した。１８０秒の休止の間のすくみ行動時間を計数して、１８０秒の音の間のすくみ行動時間から減算した。
【０１６５】
ポールテスト：
これは、運動協調性の測定のための試験である。動物を５０ｃｍの高さのポール（直径１．５ｃｍ）の上部に頭を向けて置いた。動物から手を放した直後に、動物が向きを変える（全ての単足が地面へと向けられると定義される）ために要した時間量と、全ての足が地面に達するために要した時間量とを記録した。
【０１６６】
モーリスの水迷路（ＭＷＭ）試験：
これは、空間学習及び記憶の測定のための試験である。試験動物は円形のプールに入れられ、水から逃避することを可能にする見えないプラットフォームを見つける必要があった。それにより、動物はプールの縁にある遠位の目印を参照点として使用して、自分の位置を確認する。円形のプールは、４つの等しい四分円に分割されており、それらは目印によって視覚的に区別することができる。試験動物を第１の四分円に入れて、プラットフォームに到達するまでの時間を計数した。６０秒後にプラットフォームに到達しなかった場合にマウスをそこに誘導した。少なくとも５分間休ませた後に、試験動物を第２の四分円に入れ、同じ手順に曝した。動物を再び休ませた後に、動物を四分円３に入れ、引き続きもう一度休ませ、その次に動物を再び四分円２に入れた。最後に、試験動物がプラットフォームに到達するのにかかった時間を記録し、１日当たり４回の試験において全てのマウスについて合計した。
【０１６７】
結果：
Ｔ−Ｐｅｒ（組織タンパク質抽出試薬、Thermo Fisher Scientific社）は穏やかな界面活性剤を含有し、様々な細胞区画、例えば形質膜から標的タンパク質を抽出することが分かった。Ｔ−Ｐｅｒ画分には、主に単量体及びオリゴマーのＡβペプチドが存在すると想定されている。ＧｄｍＣｌは、折り畳まれたタンパク質構造物の強力な変性剤である。線維構造からのＡβペプチドは、５ＭのＧｄｍＣｌ画分中に溶解されることとなる。
【０１６８】
図１４は、３種の異なる抗体で３８週間処理した後のＴ−Ｐｅｒ画分中のｉｓｏＡｓｐ７−Ａβ及び総Ａβの量を示している。ＥＬＩＳＡの結果は、Ｋ１１で処理された動物におけるｉｓｏＤ７−Ａβの有意な減少を示している（図１４Ｂ）。驚くべきことに、アイソタイプコントロールで処理された動物と比較して、総Ａβレベルも有意に減少している（図１４Ａ）。５ＭのＧｄｍＣｌの脳画分の分析後に、同様の結果が得られた（図１５）。本発明者らの抗ｉｓｏＤ７−Ａβ抗体Ｋ１１で処理された５ｘＦＡＤマウスの脳の左半球において、総Ａβレベル及びｉｓｏＤ７−Ａβレベルが有意に減少している。ポジティブコントロール抗体３Ｄ６での処理により、Ｔ−Ｐｅｒ画分及び５ＭのＧｄｍＣｌ画分においてより低いＡβ含有量も得られたが、統計的有意差はＴ−Ｐｅｒ画分に見られる総Ａβの量についてのみ観察された（図１４Ａ）。
【０１６９】
ＥＰＭ試験は、アイソタイプコントロールで処理された野生型マウスと５ｘＦＡＤマウスとの間に有意差を示している（図１６）。Ｋ１１及び３Ｄ６での処理により、動物が開いたアームで費やした時間の差が減少した（図１６Ａ）。アーム進入の回数を考慮すると、Ｋ１１での処理は、野生型動物で得られた結果と同じ結果に導く（図１６Ｂ）。
【０１７０】
アイソタイプコントロールで処理された５ｘＦＡＤ動物は、恐怖条件付け試験において野生型群と比較して、すくみ行動時間が有意により少ないことを示している（図１７）。Ｋ１１での処理により、野生型動物と有意差がないレベルまですくみ行動時間が増える。３Ｄ６での処理は、総すくみ行動時間に対してより低い効果を有する。
【０１７１】
ポールテストは、アイソタイプコントロールで処理された野生型マウスと５ｘＦＡＤマウスとの間に有意差を示している（図１８）。３Ｄ６による処理は、ポールテストにおいて行動結果に影響を及ぼさない。Ｋ１１処理により、動物が向きを変えるまでの時間（図１８Ａ）と地面に達するまでの時間（図１８Ｂ）とが短縮され、野生型群と比較して非有意差が得られた。
【０１７２】
アイソタイプコントロールで処理された５ｘＦＡＤ動物は、野生型動物と比較して、ＭＷＭ試験においてプラットフォームに到達するまでに有意により長い時間を必要とした（図１９）。３Ｄ６で処理された動物において観察される差は依然として有意であるが、Ｋ１１で処理された動物は、野生型との有意差を示さない。
【０１７３】
実施例１０：Ａβ凝集の阻害
方法：
ペプチドをヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）中に溶解させて、それらの単量体形を得た。ＨＦＩＰを一晩蒸発させ、次いでＡβペプチドを１容量の０．１ＭのＮａＯＨ中に溶解させた後に、１８容量のＰＢＳ及び１容量の０．１ＭのＨＣｌを添加した。引き続き、抗体Ｋ１１、３Ｄ６及びアイソタイプコントロールを５μＭの最終濃度まで添加し、こうして１０μＭのＡβペプチドの最終濃度に至った。２００μＭのＴｈＴ（チオフラビンＴ）の添加後に、４３５ｎｍ／４８５ｎｍ（励起波長／蛍光波長）の蛍光を、マイクロプレートリーダー（ＦｌｕｏＳｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａ、BMG Labtech社）において振盪条件（６００ｒｐｍ）下にて３７℃で測定した。
【０１７４】
結果：
図２０は、抗体Ｋ１１、３Ｄ６及びアイソタイプコントロールの添加の有無による野生型Ａβ（１−４０）（図２０Ａ）及びｉｓｏＤ７−Ａβ（１−４０）（図２０Ｂ）の凝集を示している。Ｎ末端に特異的な抗体３Ｄ６は、野生型Ａβ及びｉｓｏＤ７−Ａβの凝集を阻害する。ｉｓｏＤ７−Ａβ特異的抗体Ｋ１１は、ｉｓｏＤ７−Ａβの凝集を阻害し、野生型Ａβの凝集の遅延を誘導する。アイソタイプコントロール抗体は、両方のＡβペプチドの凝集に影響を及ぼさない。しかしながら、最大ＴｈＴ蛍光シグナルは、野生型Ａβ（１−４０）とＫ１１との相互作用によって増強される（図２０Ａ）。
【０１７５】
実施例１１：ＣＤＲ移植によるクローンＫ１１のヒト化
方法：
Ｋ１１の軽鎖及び重鎖の可変ドメインにおけるＣＤＲの定義は、「Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｃｈｏｔｈｉａ  Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  Ｓｃｈｅｍｅ」（http://www.bioinf.org.uk/abs/）に準拠している。
【０１７６】
移植のために、適切なヒトフレームワーク配列を特定した。これらは、非ヒト抗体と最も高い類似性を有するヒトフレームワーク配列であり、ＩＭＧＴ生殖細胞系ライブラリー（IMGT germline library）（http://www.imgt.org/blast/）に対するＢｌａｓｔ解析の実施により特定した。マウス抗体クローンＫ１１のＣＤＲを各ヒト抗体フレームワークと組み合わせることで、ヒト化抗体を作製した。ヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域は、「インタクトな」抗体のために使用した。軽鎖可変ドメインを、ヒトκ鎖定常領域に融合させた（表５）。
【０１７７】
【表５】
2020527561.tif 000006
【０１７８】
実施例１２：組み換え発現されたヒト化抗体Ｋ１１変異体のキャラクタリゼーション
方法：
クローニング
ヒト化抗体の軽鎖及び重鎖の配列を、哺乳動物発現ベクターｐＶＩＴＲＯ−ｎｅｏに別々にクローニングした。ＶＬフレームワークとＶＨフレームワークとの最適な組み合わせを特定するために、種々のプラスミドの組み合わせを使用して、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞における一過性発現を実施した。
【０１７９】
一過性トランスフェクション及び精製
トランスフェクションは、２×１０６個のＨＥＫ２９３細胞／ｍｌを含む１５ｍｌの培地中で単一のプラスミドの組み合わせ（各プラスミドにつき１μｇ／ｍｌ）と混合された３μｇ／ｍｌのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用することにより行った。６日目に、上清を収集し、プロテインＡクロマトグラフィーで精製した。
【０１８０】
表面プラズモン共鳴測定
測定の間の物質移動及びアビディティー効果を防ぐために、次の手順を使用した。最初に、ポリクローナル抗ヒト抗体をＳＰＲチップにカップリングさせ、続いてＲＵが１０００を超えるまでヒト化抗体をロードした。
【０１８１】
カイネティクス測定を、ｉｓｏＤ７−Ａβ（１−１８）ペプチドの種々の濃度（５ｎＭ〜１０００ｎＭ）で実施した。ｋｏｆｆ及びｋｏｎの速度定数を決定する単純な１：１相互作用モデル（ラングミュアフィット）に従って結果を評価する（表６）。
【０１８２】
結果：
【表６】
2020527561.tif 000007
【０１８３】
ＣＤＲ移植によるＫ１１のヒト化により、祖先マウス抗体Ｋ１１の配列番号４４に対する結合親和性の保存に成功した抗体が得られた（表２によれば６．３ｎＭ）。
【図１】
2020527561.tif 000008
【図２】
2020527561.tif 000009
【図３】
2020527561.tif 000010
【図４】
2020527561.tif 000011
【図５】
2020527561.tif 000012
【図６】
2020527561.tif 000013
【図７】
2020527561.tif 000014
【図８】
2020527561.tif 000015
【図９】
2020527561.tif 000016
【図１０】
2020527561.tif 000017
【図１１】
2020527561.tif 000018
【図１２】
2020527561.tif 000019
【図１３】
2020527561.tif 000020
【図１４】
2020527561.tif 000021
【図１５】
2020527561.tif 000022
【図１６】
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【図１７】
2020527561.tif 000024
【図１８】
2020527561.tif 000025
【図１９】
2020527561.tif 000026
【図２０】
2020527561.tif 000027
【配列表】
2020527561000001.app
【国際調査報告】
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2020527561.tif 000029
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