(57)【要約】  本発明は、アダプター鋳型オリゴヌクレオチド上で修飾標的ポリヌクレオチドを作成し、標的配列の１つまたは２つの鎖にタグ付けすることを伴う、ポリヌクレオチドを伸長させるため、およびポリヌクレオチドのシーケンシングライブラリーを調製するための方法、組成物およびキットに関する。シーケンシングライブラリーは、超並列シーケンシングに適しており、複数の二本鎖核酸分子を含む。
2020512845.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一本鎖３’末端を有する標的ポリヌクレオチドの集団を伸長させる方法において、
（ｉ）標的ポリヌクレオチドをアダプター鋳型オリゴヌクレオチド（ＡＴＯ）とインキュベートするステップであって、前記ＡＴＯは、
（ａ）３’ランダム配列；
（ｂ）ＡＴＯを伸長不能にするブロッカーを有する３’末端；および
（ｃ）ランダム配列の５’にあるユニバーサル配列
を有し、前記標的ポリヌクレオチドがＡＴＯの３’ランダム配列にハイブリダイズする、ステップ；
（ｉｉ）前記ＡＴＯを鋳型として使用して、標的ポリヌクレオチドのポリメラーゼ伸長を実行し、それによって３’ユニバーサル配列を有する伸長標的ポリヌクレオチドを作成するステップ；
を含む、方法
【請求項２】
（ｉｉｉ）前記修飾標的ポリヌクレオチドの第１の相補配列（ＣＳ）を作成するステップをさらに含み、第１のＣＳの作成が、修飾標的ポリヌクレオチドを鋳型として使用する３’ユニバーサル配列からのポリメラーゼ伸長を含む、請求項１に記載の方法。
ことができる。
【請求項３】
前記第１のＣＳの作成するためのポリメラーゼ伸長は、
（ａ）ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むＡＴＯ上で伸長させることにより生成された修飾標的ポリヌクレオチド中の二本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーター領域からのＲＮＡポリメラーゼを使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写；
（ｂ）自己プライミングによる３’ステムループ構造の伸長；または
（ｃ）３’ユニバーサル配列にハイブリダイズしたプライマーの伸長
のいずれかである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
修飾標的ポリヌクレオチドの第１の相補鎖（ＣＳ）を作成する前または後に、過剰のＡＴＯが除去または消化される、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記第１のＣＳが請求項１に記載の方法を用いて伸長され、３’ユニバーサル配列を有する伸長された第１の相補配列が生成される、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記第１のＣＳがＤＮＡリガーゼを用いて伸長されて該第１のＣＳにアダプターが連結される、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記第１のＣＳまたは修飾された第１のＣＳにハイブリダイズしたプライマーを伸長させ、それによって第２のＣＳを形成することをさらに含み、第１のＣＳまたは修飾された第１のＣＳにハイブリダイズした前記プライマーは、標的特異的部分またはユニバーサル配列、あるいは３’標的特異的部分と５’ユニバーサル配列の両方を含む、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｉｉ）で用いられるポリメラーゼが３’→５’ エキソヌクレアーゼ活性を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
一本鎖核酸の集団からシーケンシングライブラリーを調製する方法であって、
（ａ）請求項１に記載の方法を実行して３’ユニバーサル配列を有する伸長された標的ポリヌクレオチドを作成するステップ；
（ｂ）請求項２に記載の方法を実行して第１の相補配列を作成するステップ；
（ｃ）５’ユニバーサル配列および３’ユニバーサル配列を有する第２の相補配列を作成するステップであって、５’ユニバーサル配列と３’ユニバーサル配列は異なりかつ互いに対して相補的ではないステップ、および
（ｄ）前記２つのユニバーサル配列を標的とするプライマーを用いて前記第１の相補配列および第２の相補配列を増幅し、それによって異なる配列の既知のユニバーサル末端を有する二本鎖ヌクレオチド断片のシーケンシングライブラリーを調製するステップ
を含む、方法。
【請求項１０】
一本鎖３’末端を有する標的ポリヌクレオチドがＲＮＡまたはＤＮＡであり、該ＤＮＡまたはＲＮＡが、ＦＦＰＥサンプル、循環セルフリー核酸、またはバイサルファイトで処理したサンプルに由来する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ポリヌクレオチドを伸長させるためのアダプター鋳型オリゴヌクレオチド（ＡＴＯ）であって、
（ａ）３〜３６「Ｎ」塩基の３’ランダム配列；
（ｂ）ＡＴＯを拡張不能にするブロッカーを有する３’末端；
（ｃ）ランダム配列の５’にあるユニバーサル配列；
（ｄ）任意選択で、ＡＴＯを３’エキソヌクレアーゼ切断に対して耐性にする修飾ヌクレオチドまたはリンケージ；および
（ｅ）ＡＴＯを分解可能にする部分
を含む、アダプター鋳型オリゴヌクレオチド（ＡＴＯ）。
【請求項１２】
前記分解可能にする部分がウラシルヌクレオチド、リボヌクレオチドまたは制限酵素認識配列である、請求項１１に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド（ＡＴＯ）。
【請求項１３】
ＡＴＯを３’エキソヌクレアーゼ切断に対して耐性にする修飾ヌクレオチドまたはリンケージがホスホロチオアートリンケージである、請求項１１または請求項１２に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド（ＡＴＯ）。
【請求項１４】
前記ユニバーサル配列が、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターとして機能することができる配列を含む、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド（ＡＴＯ）。
【請求項１５】
ＡＴＯが５’ステム部分配列を含み、該５’ステム部分配列は、前記ユニバーサル配列の一部または全部に相補的または部分的に相補的であり、それによってステムループ構造を形成することができる、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド（ＡＴＯ）。
【請求項１６】
ＡＴＯが、５’から３’の順序で、５’ステム部分、ＲＮＡポリメラーゼ配列、プライミング部位配列、一本鎖オーバーハング、３’ランダム配列、およびブロッカーを有する３’末端を含む、請求項１５に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
前記ステムループ構造がコピー不能なリンケージを含む、請求項１５または請求項１６に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
前記コピー不能なリンケージが、Ｃ３スペーサー、トリエチレングリコールスペーサー、１８原子ヘキサエチレングリコールスペーサー、または２’−ジデオキシリボース（ｄＳｐａｃｅｒ）である、請求項１７に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
３’末端が、少なくとも１つのリボヌクレオチド、少なくとも１つのデオキシヌクレオチド、Ｃ３スペーサー、リン酸、ジデオキシヌクレオチド、アミノ基、および逆向きデオキシチミジン（inverted deoxythymidine）からなる群より選択される部分でブロックされている、請求項１１〜１８のいずれか一項に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
請求項１１〜１８のいずれか一項に記載のＡＴＯ、および３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを含む、ポリヌクレオチドを伸長させるための組成物。
【請求項２１】
ＡＴＯが請求項１１〜１９のいずれか一項に記載されるものである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１１〜１９のいずれか一項に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド（ＡＴＯ）、３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ、およびＮＧＳプラットフォームに適合するプライマーを含む、ポリヌクレオチドのライブラリーを作成するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的ポリヌクレオチドを伸長させるための方法および組成物に関する。アダプター配列が一本鎖核酸の３’末端に付加される。
【背景技術】
【０００２】
次世代ＤＮＡシーケンシングは、臨床医学および基礎研究に革命をもたらすことを約束する。しかしながら、この技術は、１回の実験で数千億のヌクレオチドのＤＮＡ配列を作成する能力を備えているが、〜１％のエラー率が、数億のシーケンシングミスをもたらす。腫瘍または混合微生物集団などの遺伝的に異質な混合物を「ディープシーケンシング」する場合、これら散在するエラーは極めて問題になる。
【０００３】
シーケンシング精度の限界を克服するために、いくつかの方法が報告されている。デュプレックスシーケンシング(duppex sequencing)（非特許文献１）もその１つである。このアプローチは、ＤＮＡ二重鎖の２本の鎖のそれぞれに独立してタグ付けしてシーケンシング（塩基配列決定）を行うことにより、エラーを大幅に減らす。２本の鎖は相補的であるため、真の突然変異は両方の鎖の同じ位置に見られる。対照的に、ＰＣＲまたはシーケンシングエラーは、１本の鎖にのみに変異をもたらすため、技術的エラーとして割り引くことができる。Ｓａｆｅ−Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（「Ｓａｆｅ−ＳｅｑＳ」）と呼ばれる別のアプローチがＫｉｎｄｅらによって報告されている（非特許文献２）。このアプローチの鍵は、（ｉ）各鋳型分子への一意の識別子（ＵＩＤ）の割り当て、（ｉｉ）それぞれ一意にタグ付けされた鋳型分子の増幅によるＵＩＤファミリーの作成、および（ｉｉｉ）増幅産物の冗長シーケンシングである。同じＵＩＤを持つＰＣＲ断片は、それらの９５％以上に同一の変異が含まれている場合にのみ、突然変異体（「スーパーミュータント」）と見なされる。特許文献１〜３は、異なる開始ポリヌクレオチドの数を決定／推定するために縮重塩基領域を付加させたポリヌクレオチドをシーケンシングする方法について記載する。しかしながら、これらの方法は、標的化アンプリコン(targeted amplicon)シーケンシングに容易に使用できず、また縮重塩基領域を取り付けるためにライゲーションを伴うことが多い。標的化アンプリコンベースのエンリッチメントおよびシーケンシングのために、融合または転座イベントを容易にシーケンシングすることはできない。さらには、プライマー部位は配列決定されないため、一部の領域をシーケンシング不能として失うことなくホットスポットの領域をカバーするための適切なプライマーペアを設計することが困難な場合がある。単一チューブでのマルチプレックス増幅の場合に、オーバーラップ領域を増幅できず、標的ポリヌクレオチドのプライマー結合領域中のシーケンシング情報が失われる。血漿ＤＮＡ、スモールＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡなどの小さなサイズの標的断片の場合、プライマー配列を設計する余地がないため、一対のプライマーを設計するのも困難である。
【０００４】
標的化次世代シーケンシング(targeted next generation sequencing)は、しばしば大きく複雑な断片の解析を伴い、これはマルチプレックスＰＣＲ（単一ＰＣＲ反応での異なる標的ＤＮＡ配列の同時増幅）によって達成される。しかしながら、マルチプレックスＰＣＲで得られる結果は、増幅産物のアーチファクトによって複雑になることがよくある。それらアーチファクトには、反応の失敗による偽陰性の結果や、非特異的プライミングイベントによる偽陽性の結果（スプリアス生成物の増幅など）が含まれる。非特異的プライミングの可能性は追加のプライマーペアごとに増加するため、個々のプライマーセットが加えられるときに必要に応じて条件を変更しなければならない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第８，７２２，３６８号
【特許文献２】米国特許第８，６８５，６７８号
【特許文献３】米国特許第８，７４２，６０６号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Schmitt, et al PNAS 109: 14508-14513
【非特許文献２】PNAS 2011 Jun 7;108(23):9530-5
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語を以下に定義する。
【０００８】
本明細書で使用する「サンプル」は、核酸を含むかまたは含むと考えられるあらゆる物質を指し、個体（単数または複数）から単離された組織または体液のサンプルを含む。特に、核酸サンプルは、ウイルス、細菌、真菌、植物および動物から選択される単一細胞、生物、または生物の組合せから得ることができる。好ましくは、核酸サンプルは哺乳動物から得られる。好ましい実施形態では、哺乳動物はヒトである。核酸サンプルは、対象の体液検体または組織生検検体から、あるいは培養細胞から得ることができる。体液は、全血、血清、血漿、尿、痰、胆汁、便、骨髄、リンパ液、精液、乳房滲出液、胆汁、唾液、涙液、気管支洗浄液、胃洗浄液、脊髄液、滑液、腹水、胸水、および羊水から選択することができる。「個々のサンプル」は単一細胞でもよく、それは１つのＴ細胞または１つのＢ細胞であってよく、また一方で複数のサンプルは血液サンプル中の多くの血液細胞であってもよい。
【０００９】
本明細書で使用される「ヌクレオチド配列」という用語は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドまたは他の核酸のホモポリマーまたはヘテロポリマーのいずれかを指す。
【００１０】
本明細書で使用される「ヌクレオチド」という用語は、一般にヌクレオチド配列のモノマー成分を指すが、モノマーは、ヌクレオチドに加えて、ヌクレオシドおよび／またはヌクレオチドアナログ、および／またはアミノ修飾ヌクレオシドなどの修飾ヌクレオシドであってもよい。さらに、「ヌクレオチド」には、天然に存在しないアナログ構造も含まれる。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、または他の核酸であってもよい。
【００１１】
本明細書で使用される場合、「核酸」という用語は、共有結合により互いに連結した少なくとも２つのヌクレオチドを指す。核酸は一般にホスホジエステル結合を含むが、場合によっては、代替の骨格を有する核酸アナログが含まれる。核酸は、指定されるように、一本鎖でも二本鎖でもよく、または二本鎖配列と一本鎖配列の両方の部分を含んでもよい。核酸は、ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡの両方、ＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡの混合物、またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドであってよく、核酸は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの任意の組合せ、ならびにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチンなどを含む塩基の任意の組合せを含む。「ＤＮＡ配列」または「ＲＮＡ配列」への言及には、一本鎖および二本鎖の両方のＤＮＡまたはＲＮＡが含まれ得る。特定の配列は、文脈がそうでないことを示さない限り、そのような配列の一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、そのような配列とその相補体との二重鎖（二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ）および／またはそのような配列の相補体を指す。
【００１２】
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は「核酸」のタイプであり、一般に、プライマー、または検出されるべきオリゴマー断片を指す。「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語の間には、その長さに意図的な違いはなく、これらの用語は互換的に使用される。「核酸」、「ＤＮＡ」、および「ＲＮＡ」、ならびに同様の用語には、核酸アナログも含まれる。オリゴヌクレオチドは、必ずしも既存のまたは自然発生の配列から物理的に得られるわけではなく、化学合成、ＤＮＡ複製、逆転写、またはそれらの組合せを含む任意の方法で作成することができる。
【００１３】
本明細書で使用される場合、用語「標的配列」、「標的核酸」、「標的ポリヌクレオチド」、および「目的の核酸」は互換的に使用され、増幅、検出またはその両方のいずれかを受けるべき所望の領域、あるいは相補的オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、例えばブロッキングオリゴマー、とのハイブリダイゼーションの対象、またはプライマー伸長プロセスの対象である所望の領域を指す。標的配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、それらのアナログ、またはそれらの組合せから構成されてよい。標的配列は、一本鎖でも二本鎖でもよい。伸長プロセスでは、オリゴヌクレオチド（鋳型）とハイブリダイゼーション二重鎖を形成する標的ポリヌクレオチドは「プライマー」と呼ばれる場合があり、またはプライマーとハイブリダイゼーション二重鎖を形成する標的核酸は「鋳型（またはテンプレート）」と呼ばれる場合もある。鋳型は、相補的なポリヌクレオチドの合成のためのパターンとしての役割を果たす。標的配列は、原核生物、真核生物、植物、動物、およびウイルスを含むがこれらに限定されない任意の生きているまたは一度は生きていた生物に由来するもの、ならびに合成および／または組換え標的配列、あるいはそれらの組合せであってもよい。
【００１４】
本明細書で使用される「プライマー」は、自然に発生したかまたは合成により作成されたかにかかわらず、核酸鎖に相補的であるプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下、すなわち、ヌクレオチドおよび重合のための作用物質の存在下において適切な温度で適切なバッファー中に置かれたときに、合成開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを指す。そのような条件には、適切なバッファー（「バッファー」は、補因子であるかあるいはｐＨ、イオン強度などに影響を及ぼす物質を含む）中、適切な温度で、４種類以上の異なるデオキシリボヌクレオシド三リン酸、ならびにＤＮＡポリメラーゼ、および／またはＲＮＡポリメラーゼ、および／または逆転写酵素などの重合誘導剤が存在することが含まれる。本明細書におけるプライマーは、伸長される各特定配列の鎖に実質的に相補的であるように選択される。これは、プライマーがそれぞれの鎖とハイブリダイズするのに十分に相補的でなければならないことを意味する。非相補的ヌクレオチドが存在していてもよい。
【００１５】
本明細書で使用する「相補的」という用語は、二重鎖核酸複合体を形成するための通常のワトソン・クリックの法則に従って、２つのヌクレオチド配列が、それらのプリンおよび／またはピリミジン塩基を介した水素結合により、ランダムにまたは設計により互いに配列特異的に結合する能力を指す。それはまた、修飾ヌクレオチド、またはデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドのアナログ、またはそれらの組合せを含み得るヌクレオチド配列が、通常のワトソン・クリックの法則以外により配列特異的に互いに結合して、代替核酸二重鎖構造を形成する能力も指すことができる。
【００１６】
本明細書で使用される「ハイブリダイゼーション」と「アニーリング」という用語は交換可能であり、互いに相補的な２つのヌクレオチド配列が結合して二重鎖配列またはセグメントを形成するプロセスを指す。
【００１７】
「二重鎖(duplex)」と「二本鎖(double-stranded)」という用語は交換可能であり、核酸の２つの相補配列間のハイブリダイゼーションの結果として形成される構造を意味する。このような二重鎖は、２つのＤＮＡセグメント同士の、２つのＲＮＡセグメント同士の、あるいはＤＮＡセグメントとＲＮＡセグメントの、またはＲＮＡとＤＮＡの混合物から構成される２つのセグメント同士の相補的結合によって形成され、後者の構造はハイブリッド二重鎖とも呼ばれる。そのような二重鎖のいずれかまたは両方のメンバーは、修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログ、ならびにヌクレオシドアナログを含むことができる。本明細書に開示されるように、そのような二重鎖は、１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドのサンプル配列への結合の結果として形成される。
【００１８】
本明細書で使用される場合、「野生型核酸」、「通常の核酸」、「通常のヌクレオチドを有する核酸」、「野生型ＤＮＡ」および「野生型鋳型」という用語は交換可能に使用され、正常または改変されていないと考えられるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを指す。
【００１９】
本明細書で使用される「突然変異ポリヌクレオチド」、「突然変異核酸」、「バリアント核酸」、および「バリアントヌクレオチドを有する核酸」という用語は、対応する野生型ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列とは異なるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを指す。野生型ポリヌクレオチドと比較した突然変異ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の違いは、ヌクレオチド「突然変異」、「バリアントヌクレオチド」、または「変異」と呼ばれる。「バリアントヌクレオチド」という用語は、１つまたは複数のヌクレオチドの置換、欠失、挿入、メチル化、および／または修飾の変化も指す。
【００２０】
本明細書で使用される「増幅」は、核酸配列の混合物内の特定の核酸配列の濃度またはコピー数を増加させるための任意の増幅手順の使用を意味する。増幅は線形増幅または指数関数的増幅であってよい。
【００２１】
「増幅産物」または「アンプリコン」という用語は、増幅法でプライマーを使用してポリメラーゼにより増幅されたＤＮＡまたはＲＮＡの断片を指す。
【００２２】
「プライマー伸長産物」という用語は、反応において１つまたは１対のプライマーを使用してポリメラーゼにより伸長されたＤＮＡまたはＲＮＡの断片を指し、その反応は、例えば第一鎖ｃＤＮＡ合成などのワンパス(one-pass)伸長、または線形増幅であり得る多重サイクル(multiple cycles)の伸長、またはｃＤＮＡ合成、またはＰＣＲなどの指数関数的増幅であり得る多サイクルの伸長を含むことができる。
【００２３】
「適合する（compatible）」という用語は、大規模並列シーケンシングプラットフォームで使用されるＰＣＲプライマー配列／シーケンシングプライマー配列と同一または実質的に同一、相補的、実質的に相補的、または類似のプライマー配列またはプライマー配列の部分を指す。
【００２４】
本発明の実施は、特に明記しない限り、分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡ技術の従来の技術を用いるが、それらは当業者の技術の範囲内である。一態様では、本発明は、ポリヌクレオチドのライブラリーを作成するための除去可能な鋳型オリゴヌクレオチド（ＲＴＯ）を提供し、そのＲＴＯは、
（ａ）３’ランダム配列；
（ｂ）ＲＴＯを伸長不能（non-extendible）にするブロッカー部分が付加された３’末端；
（ｃ）ランダム配列の５’にあるユニバーサル配列；および
（ｂ）作用物質(agent)によって認識可能なヌクレオチド配列／修飾（ＮＳＭ）；
を含み、ＲＴＯは鋳型として機能し、反応産物に組み込まれず、反応後に破壊／除去され、
ヌクレオチド配列／修飾はＲＴＯの除去を容易にする。
【００２５】
一実施形態では、３’ブロッカー部分とＮＳＭは同じである。３’ブロッカー部分とＮＳＭはビオチンであってよく、作用物質はアビジンまたはストレプトアビジンである。ＮＳＭは、例えば鎖切断をもたらす消化により、またはアフィニティー精製により、ＲＴＯの除去を可能にする。ＲＴＯ分子は、伸長反応後の反応でＲＴＯを分解可能にするまたは非干渉性でかつ非競合性にするＮＳＭ部分を含み、この部分は、ＲＴＯの消化／除去を容易にする作用物質によって認識可能である。
【００２６】
あるいは、除去可能な鋳型オリゴヌクレオチド(removable template oligonucleotide)（ＲＴＯ）は、アダプター鋳型オリゴヌクレオチド（ＡＴＯ）と呼ばれる。用語ＲＴＯおよびＡＴＯは交換可能に使用することができ、ポリメラーゼ伸長によって既知の配列を追加するように標的を修飾するために、標的の末端を伸長させるための鋳型として機能するオリゴヌクレオチドを指す。アダプター鋳型オリゴヌクレオチド（ＡＴＯ）または除去可能な鋳型オリゴヌクレオチド（ＲＴＯ）という用語は、集団の各メンバー間での共通（ユニバーサル）領域とランダムな可変配列（Ｎとして言及され、Ｎは４つの各塩基である）を有する配列の集団を指す。したがって、アダプター鋳型オリゴヌクレオチド（ＡＴＯ）の集団は、３’末端のランダムな性質によって異なる複数の配列を指す。
【００２７】
本開示は、ポリヌクレオチドを伸長させるためのアダプター鋳型オリゴヌクレオチド（ＡＴＯ）を提供し、そのＡＴＯは、
（ａ）３’ランダム配列；
（ｂ）ＡＴＯを伸長不能にするブロッカーが付加された３’末端；および
（ｃ）ランダム配列の５’にあるユニバーサル配列
を含み、
ＡＴＯは、ポリメラーゼによる伸長反応を導く鋳型として機能する。
【００２８】
ユニバーサル配列という用語は、その５’末端からランダムまたは標的特異的配列の最初のヌクレオチドまでのＡＴＯ全体を指し、すべてのＡＴＯに存在する「ユニバーサル配列」であることから命名されている。
【００２９】
ＡＴＯ分子は、伸長反応後の反応でＡＴＯを分解可能にするまたは非干渉性および非競合性にする部分をさらに含むことができ、この部分は、ＡＴＯの消化／除去を容易にする作用物質によって認識可能である。
【００３０】
本開示は、ポリヌクレオチドを伸長させるためのアダプター鋳型オリゴヌクレオチド（ＡＴＯ）を提供し、そのＡＴＯは、
（ａ）３〜３６個の「Ｎ」塩基の３’ランダム配列；
（ｂ）ＡＴＯを伸長不能にするブロッカーを有する３’末端；
（ｃ）ランダム配列の５’にあるユニバーサル配列；
（ｄ）ＡＴＯを３’エキソヌクレアーゼ切断に耐性にする任意選択の修飾ヌクレオチドまたはリンケージ(linkage)；および
（ｅ）ＡＴＯを分解可能にする部分
を含む。
【００３１】
一実施形態では、その部分はウラシルヌクレオチドであり、作用物質はｄＵ−グリコシラーゼ、またはｄＵ−グリコシラーゼおよびプリン／アピリミジンエンドヌクレアーゼであり、これは第１の（最初の）伸長反応後にＡＴＯを消化／除去することができる。
【００３２】
別の実施形態では、その部分はリボヌクレオチドであり、リボヌクレオチドは、オリゴ合成中に任意のヌクレオチドまたはすべてのヌクレオチドの代わりにＡＴＯに組み込まれる；ここで、作用物質はリボヌクレアーゼであり、それは第１の伸長反応後にＡＴＯを消化／除去することができる。
【００３３】
ＡＴＯはＲＮＡオリゴ、ＤＮＡオリゴ、またはＤＮＡオリゴとＲＮＡオリゴの組合せであってよい。
【００３４】
ＡＴＯは、１つまたは複数の異なるＡＴＯの組合せであってよい。ＡＴＯの組合せは配列が異なっていてよい。組み合わせたＡＴＯは設計が異なっていてよい。組み合わせたＡＴＯは機能が異なっていてよい。本明細書では、「ＡＴＯ」という用語は、１つまたは複数のＡＴＯの組合せ、ＡＴＯの任意の配列、ＡＴＯ設計特徴の任意の組合せを有するＡＴＯの任意の設計、機能の任意の組合せを有するＡＴＯの任意の組合せを指すことができる。１つまたは複数のＡＴＯの組合せを使用する場合、使用されるＡＴＯによってユニバーサル配列内に変動がある場合があり、ユニバーサル配列という用語はこれらの場合にも使用される。
【００３５】
別の実施形態では、分解性部分は制限酵素認識配列であり、作用物質は制限酵素である。
【００３６】
ユニバーサル配列は、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含んでいてよい。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ、またはそれらの組合せなど、任意のＲＮＡポリメラーゼを使用できる。ユニバーサル配列は、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列および／またはプロモーター配列の３’に位置するプライミング部位の両方を含んでよい。プライミング部位は、後続の増幅のためのプライマー結合配列を提供する。
【００３７】
ユニバーサル配列は、二本鎖または部分的に二本鎖であってもよい。ユニバーサル配列を二本鎖領域として保護することにより、標的ポリヌクレオチドおよびＡＴＯのランダム化された３’末端とのハイブリダイゼーションが防止される。一実施形態では、ＡＴＯは、ユニバーサル配列の全部または一部に相補的または部分的に相補的な５’ステム部分配列を含み、それはステムループ構造またはスプリットステムループ構造を形成することができる。ＡＴＯ分子は、５’から３’の順序で、５’ステム部分、ＲＮＡポリメラーゼ配列、プライミング部位配列、および３’ランダム／縮重配列、ランダム／縮重配列と特異的配列との混合、または配列特異的配列を含むことができる。ＲＮＡポリメラーゼ配列は、ループ部分、またはステムの一部およびループの一部、またはステムに位置してよい。ループ部分は、コピー不能なリンケージを含んでいてよい。あるいは、ループ部分は、コピー不能なリンケージを含まなくてもよい。あるいは、ステム部分は、コピー不能なリンケージを含んでもよい。ステム部分の５’が追加配列を含む場合、コピー不能なリンケージがステム部分と追加配列との間に存在してよい。あるいは、ステム部分は、コピー不能なリンケージを含まなくてもよい。別の実施形態において、５’ステム部分はコピー不能なリンケージを含む。コピー不能なリンケージは、Ｃ３スペーサーホスホロアミダイト、またはトリエチレングリコールスペーサー、または１８原子ヘキサエチレングリコールスペーサー、または１’，２’−ジデオキシリボース（ｄＳｐａｃｅｒ）の群から選択することができるが、これらに限定されない。
【００３８】
二本鎖ステム部分は、非相補的領域を含むことができ、ユニバーサル配列鎖にある非相補的領域は、ランダム、縮重配列、または特別に設計されたミスマッチを含む。ステム部分は、１つまたは複数のコピー不能なリンケージによって分離された２つまたはそれ以上のスプリットセクション（または分割セクション）を形成し得る。ステム部分は、ミスマッチ塩基対の１つまたは領域によって分離された２つ以上のスプリットセクションを形成してもよい。
【００３９】
別の実施形態では、ＡＴＯは、ユニバーサル配列を含む下側の鎖の全部または一部に相補的または部分的に相補的である上側の別個の（下側の鎖と一体になっていない）鎖（upper separate strand）を含む。上側の別個の鎖の５’末端は、リン酸基(phosphate group)を含んでもよい。
【００４０】
ＡＴＯは、ＡＴＯの任意の場所に付加されたアフィニティー結合部分を含んでもよい。アフィニティー結合部分はビオチンであってよい。
【００４１】
ＡＴＯのユニバーサル配列は、追加の一意の識別子（ＵＩＤ）配列として機能するランダム配列または配列特異的配列を含むことができる。ＵＩＤ配列は、ＡＴＯのステム内に存在してよい。ＵＩＤ配列は、ＡＴＯのループ内に存在してよい。ＵＩＤ配列は、ＡＴＯのステムおよびループ内に存在してよく、２つ以上のＵＩＤがＡＴＯのステムおよび／またはループ内に存在してもよい。
【００４２】
ＡＴＯ配列は、任意の位置に非標準(non-canonical)ヌクレオチド（非ｄＡ、非ｄＧ、非ｄＴ、非ｄＣ）を含むことができ、これは自然発生のまたは人工のヌクレオチドである。非標準ヌクレオチドはユニバーサルヌクレオチドであってもよい。非標準ヌクレオチドはイノシン塩基を含んでもよい。３’ランダム配列は、一部または完全に非標準ヌクレオチドを含んでもよい。ユニバーサル配列は、一部に非標準ヌクレオチドを含んでもよく、または完全に非標準ヌクレオチドから構成されてもよい。
【００４３】
ＡＴＯの３’末端は、ＤＮＡポリメラーゼの３’エキソヌクレアーゼ活性に対してＡＴＯを耐性にする修飾ヌクレオチドまたは修飾リンケージを含んでもよい。修飾リンケージには、ホスホロチオアート結合が含まれる。
【００４４】
ＡＴＯは、ランダム配列の３’に、標的ポリヌクレオチドの特定場所にハイブリダイズすることができる特異的配列、または特定の標的用には設計されていない特異的配列をさらに含んでいてよく、３’ランダム／縮重配列の一部は、ポリヌクレオチドがポリメラーゼによって伸長される際の鋳型として機能する。ＡＴＯの３’ランダム配列は、特別に設計された特異的配列によって２つ以上の部分に分離されてよく、３’ランダム／縮重／標的特異的配列の一部は、標的ポリヌクレオチドがポリメラーゼによって伸長される際の鋳型として機能する。
【００４５】
本開示は、少なくとも１つの核酸ポリメラーゼと、記載の任意の組合せまたは混合物の１つまたは複数のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド（ＡＴＯ）とを含む組成物をさらに提供する。核酸ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼもしくはＲＮＡポリメラーゼ、または逆転写酵素、またはＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素の任意の組合せの混合物であってよい。好ましくは、ポリメラーゼは鎖置換活性を有する。ポリメラーゼは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有していてよい。ポリメラーゼは、１つ以上の異なるＤＮＡポリメラーゼの混合物、または１つ以上のＲＮＡポリメラーゼ、または１つ以上のＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼの組合せであってよい。ポリメラーゼは、鋳型依存性ポリメラーゼであり、鋳型非依存性ポリメラーゼではない。
【００４６】
本開示は、標的ポリヌクレオチドの伸長方法であって、ＡＴＯを鋳型として用いて標的ポリヌクレオチドの３’末端を伸長させるのに十分な条件下で、標的ポリヌクレオチドを本明細書に記載の組成物と共にインキュベートすることを含み（「ＡＴＯ反応と呼ばれる）、ＡＴＯが標的ポリヌクレオチドの任意の場所または特定の場所にハイブリダイズすることができる方法を提供する。別の態様では、その方法は、標的ポリヌクレオチドの伸長後にＡＴＯを分解することをさらに含む。
【００４７】
第１のＡＴＯ反応は、標的ポリヌクレオチドがプライマーとして伸長され、ＡＴＯが鋳型として働く伸長反応であってよい。あるいは、第１のＡＴＯ反応は、標的ポリヌクレオチドが伸長され、ＡＴＯの５’ステム部分または上側の鎖と連結される伸長−ライゲーション反応（ニックフィリング反応（nick filling reaction））であってもよい。あるいは、第１の反応は、標的ポリヌクレオチドがＡＴＯの３’ランダム配列部分にハイブリダイズし、ＡＴＯの５’ステム部分または上側の鎖と直接連結されるライゲーションのみの反応であってもよい。
【００４８】
ＡＴＯは、ＡＴＯを分解可能にする部分を含み、この部分は、ＡＴＯの消化／除去を容易にする作用物質によって認識可能である。あるいは、ＡＴＯは、伸長反応後の反応においてＡＴＯを非干渉性および／または非競合性にする部分を含む。
【００４９】
一部の実施形態では、ＡＴＯ分子はｄＵ塩基である部分を含み、ｄＵ−グリコシラーゼとのインキュベーション（脱塩基部位を作成する）およびその後の８０℃超の温度でのインキュベーション（脱塩基部位内に切断を導入する）によって、あるいはｄＵ−グリコシラーゼとアプリン／アピリミジンエンドヌクレアーゼとの混合物によって、分解可能である。提供される方法および組成物は、ｄＵ塩基を有するＡＴＯ、およびＡＴＯ分子を分解するためのｄＵ−グリコシラーゼとのインキュベーションを含み、またはｄＵ−グリコシラーゼとのインキュベーションおよびその後の８０℃超温度でのインキュベーションがＡＴＯ分子を分解し、またはＡＴＯをｄＵ−グリコシラーゼとアプリン／アピリミジンエンドヌクレアーゼとの混合物とインキュベートする。さらなる態様において、ＡＴＯはリボヌクレオチドを含み、リボヌクレアーゼ活性に十分な条件下でリボヌクレアーゼにより分解可能である。関連する態様において、リボヌクレアーゼは、ＲＮａｓｅ  Ｈ、ＲＮａｓｅ  ＨＩＩ、ＲＮａｓｅ  Ａ、およびＲＮａｓｅ  Ｔ１からなる群より選択される。
【００５０】
他の実施形態では、その部分は修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログであってもよい。修飾ヌクレオチドは、非標準ヌクレオチド（非ｄＡ、非ｄＧ、非ｄＴ、非ｄＣ）であってよく、これは自然発生のまたは人工のヌクレオチドである。非標準ヌクレオチドは、ユニバーサルヌクレオチドであってもよい。非標準ヌクレオチドはイノシン塩基を含むことができ、イノシンはＡＴＯの配列のグアニン位置を置換するために使用され、他の残基はあまり頻繁に組み込まれないという期待および理解のもとで、デオキシイノシンはＤＮＡポリメラーゼによる成長中の新生鎖へのｄＣの取り込みを優先的に導く。
【００５１】
修飾ヌクレオチド／アナログは、５’ユニバーサル配列（５’ユニバーサル部分）、または３’ランダム／縮重部分に存在してよく、あるいは修飾ヌクレオチド／アナログは、５’ユニバーサル部分と３’ランダム配列（３’ランダム部分）の両方に存在してもよい。
【００５２】
この部分は、塩基対合の結合を弱くしているか、または第１のＡＴＯ伸長反応後に分解可能／除去可能な修飾であってもよい。結合が弱いため、ＡＴＯは、次の反応で同じ鋳型に結合するのに通常のプライマーに干渉または競合できない。また、作用物質により消化されるため、ＡＴＯは後続の反応を妨害できない。
【００５３】
標準的な標準塩基対合よりも弱い塩基対合の分子間水素結合を提供する修飾は、任意の自然発生のヌクレオチドまたは人工ヌクレオチドアナログであってよい。ＡＴＯで使用される好ましい自然発生の非標準ヌクレオチドはイノシンであり、これはｄＧに置き換わってｄＣと対合するために使用され得るが、ｄＧ：ｄＣよりも弱い。
【００５４】
核酸アナログは、自然発生のＲＮＡおよびＤＮＡに類似した（構造的に類似した）化合物である。核酸は、ヌクレオチドの鎖であり、その鎖は３つの部分：リン酸骨格、リボースまたはデオキシリボースのいずれかであるペントース糖（五炭糖）、および４つの核酸塩基の内の１つ：で構成される。アナログでは、これらのいずれかが変更されている。典型的には、アナログ核酸塩基は、とりわけ、異なる塩基対合および塩基スタッキング特性を付与する。例として、４つのすべての標準塩基と対合できるユニバーサル塩基、および鎖の特性に影響を及ぼすリン酸−糖骨格アナログが挙げられる。ポリヌクレオチドの任意の場所にハイブリダイズする、鋳型として機能するＡＴＯの３’ランダム部分は、１つまたは複数のユニバーサル塩基を含むことができる。
【００５５】
ユニバーサル塩基は、４つのＤＮＡ塩基のいずれも、弱い塩基対相互作用に置き換えることができるアナログ化合物である。一般的に使用されるユニバーサル塩基は、３−ニトロピロール、５−ニトロインドール、または２’−デオキシイノシンである。イノシンは、他の対合よりもｄＩ：ｄＣが優先されるヌクレオチドハイブリダイゼーションにわずかなバイアス（偏り）を示す。
【００５６】
標準(canonical)塩基は、グリコシド結合から最も離れた窒素原子を取り囲む炭素にカルボニル基またはアミン基のいずれかを有することができ、水素結合（アミンとケトン、プリンとピリミジン）を介してそれら塩基が塩基対を形成（ワトソン−クリック塩基対合）することを可能にする。
【００５７】
ユニバーサル塩基は、任意の他の塩基と無差別に対合できるが、一般に、配列の融解温度を大幅に低下させる；例として、２’−デオキシイノシン（ヒポキサンチンデオキシヌクレオチド）およびその誘導体、ニトロアゾールアナログ、および疎水性の芳香族非水素結合塩基が含まれる（強力なスタッキング効果）。この開示は、アニーリング温度がＡＴＯのユニバーサル部分のＴｍよりも高い後続の反応をＡＴＯが妨害しないように、通常のオリゴヌクレオチドよりも低いＴｍを有するイノシン含有ＡＴＯを作成するためにこの特性を検討した。
【００５８】
自然発生の塩基であるデオキシイノシンは、最初の「ユニバーサル」塩基と考えられた−他の自然発生の塩基Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴと塩基対を形成できることを意味する。実際に、デオキシイノシンに関する研究は、デオキシイノシンがデオキシグアノシンの特定のアナログとして機能することを示すが、デオキシイノシンはデオキシグアノシンのように自己凝集はしない。
【００５９】
ＡＴＯのユニバーサル部分の弱い対合ヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログおよび／または修飾リンケージを含み、それらは、イノシン、ジノシン、またはホスホロチオアートリンケージ、メチルホスホナートリンケージであってよいが、これらに限定されない。自然発生のヌクレオチドまたはリンケージと比較して弱い対合を提供する限り、ヌクレオチドまたは／およびリンケージのあらゆる修飾を使用することができる。ＡＴＯのユニバーサル部分の弱い対合は、後続の反応で使用されるプライマーと比較的なものであってよい。弱い対合のヌクレオチドが通常の天然ヌクレオチドである場合、後続の反応で使用されるプライマーは、修飾ヌクレオチドまたは／および修飾リンケージである強い対合のヌクレオチドを含むことができる。強いまたは弱い対合能力を提供する修飾ヌクレオチドには、限定はされないが、ＬＮＡ、Ｏ−ｍｅ  ＲＮＡ、２−アミノ−ｄＡ、２−チオール−ｄＴ、２−アミノプリン、２’フルオロＲＮＡ塩基、ＡＰ−ｄＣ、ｄＣおよびｄＴのＣ５−プロピンおよびメチルアナログ、デオキシイノシン、デオキシウリジン、または超塩基(superbase)ヌクレオチド（Ｅｐｏｃｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）が含まれる。
【００６０】
ＡＴＯは、ユニバーサル配列の一部に相補的な５’ステム部分配列を含むことができ、それはステムループ構造を形成することができ、
ループ部分は、コピー不能なリンケージを含んでもよく、
コピー不能なリンケージは、Ｃ３スペーサーホスホロアミダイト、またはトリエチレングリコールスペーサー、または１８原子ヘキサエチレングリコールスペーサー、または１’，２’−ジデオキシリボース（ｄＳｐａｃｅｒ）の群から選択できるが、それらに限定されない。
【００６１】
５’ステム部分配列は、５’ユニバーサル配列の一部、好ましくはランダム配列に隣接する部分に、相補的または実質的に相補的な配列を含むことができる。一実施形態では、ループ部分は、コピー不能なリンケージを含むことができ、ＡＴＯ反応におけるポリメラーゼは、鎖置換活性または５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を含んでいてよい。標的ポリヌクレオチドは、ＡＴＯの３’ランダム／縮重／標的特異的配列のみにハイブリダイズし、５’ユニバーサル配列にはハイブリダイズしないことが望ましい。これは、ステムループ構造によって達成され、ステムループ構造は、ＡＴＯ反応で標的ポリヌクレオチドがＡＴＯのユニバーサル配列にハイブリダイズするのを防ぐ。ＡＴＯ反応では、標的ポリヌクレオチドは３’ランダム配列にハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、またはＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素の任意の組合せの混合物によって伸長される。伸長された鎖はステム部分に置き換わり(displace)、コピー不能のリンケージで停止する。加えて、第１のＡＴＯ反応に続く反応では、ステムループ構造はＡＴＯが修飾標的ポリヌクレオチドへの結合と競合するのを防ぐため、加えられたプライマーはいずれも、増幅のために修飾標的ポリヌクレオチドに効率的に結合できる。この実施形態では、ステム部分およびコピー不能なリンケージは、ＡＴＯ反応後の反応においてＡＴＯを非干渉性および非競合性にする部分として機能する。ＡＴＯは、ウラシルヌクレオチドまたはリボヌクレオチドなどの他の修飾を含んでも含まなくてもよく、これらはＡＴＯ反応後に消化することができる。
【００６２】
別の実施形態では、ＡＴＯのループ部分は、ウラシルヌクレオチドまたはリボヌクレオチドなどの消化され得るヌクレオチドを含んでいてよい。ＡＴＯ反応では、標的ポリヌクレオチドは、３’ランダム配列にハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。伸長された鎖は、５’リン酸基を含むステム鎖の５’末端と出会い、ＤＮＡリガーゼにより連結される。この反応は、ポリメラーゼＩまたはクレノウラージフラグメントなどのニックフィリング活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、およびＤＮＡリガーゼを含む。ＡＴＯ分子は、複数のウラシルヌクレオチド、またはリボヌクレオチドを含んでもよい。ＡＴＯ反応後にＡＴＯ分子を消化することができる。
【００６３】
さらに別の実施形態では、ＡＴＯのループ部分は、ウラシルヌクレオチドまたはリボヌクレオチドなどの消化可能なヌクレオチドを含むことができる。第１の反応では、標的ポリヌクレオチドは、ステム鎖の５’末端に隣接する３’ランダム配列にハイブリダイズし、ＤＮＡリガーゼによりステム鎖の５’末端に連結される。５’ユニバーサル配列部分は、複数のウラシルヌクレオチド、またはリボヌクレオチドを含んでもよい。第１の反応後に、５’ユニバーサル配列部分を消化することができる。
【００６４】
さらに別の実施形態では、ＡＴＯは、ユニバーサル配列の一部または全体に相補的または実質的に相補的である上側の別個の鎖を含み、それらは部分的二本鎖構造を形成することができる。標的ポリヌクレオチドは、ＡＴＯの３’ランダム配列にのみハイブリダイズし、５’ユニバーサル配列にはハイブリダイズしないことが望ましい。これは、上側の鎖によって提供される二本鎖構造によって達成され、その二本鎖構造は、第１のＡＴＯ反応で標的ポリヌクレオチドがＡＴＯのユニバーサル配列にハイブリダイズするのを防ぐ。ＡＴＯは、ウラシルヌクレオチド、またはリボヌクレオチドなどの他の修飾を含んでもよく、これらは第１の反応後に消化することができる。第１のＡＴＯ反応では、標的ポリヌクレオチドは３’ランダム配列にハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。伸長された鎖は、上側の鎖に置き換わることができる。あるいは、伸長された鎖は、５’末端に５’リン酸基を有する上側の鎖の５’末端と出会い、ＤＮＡリガーゼにより連結される。この反応は、ポリメラーゼＩまたはクレノウラージフラグメントなどのニックフィリング活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、およびＤＮＡリガーゼを含む。５’ユニバーサル配列部分は、複数のウラシルヌクレオチド、またはリボヌクレオチドを含んでもよい。第１の反応後に、５’ユニバーサル配列部分を消化することができる。別の態様では、第１の反応において、標的ポリヌクレオチドは、上側の鎖の５’末端に近い３’ランダム配列にハイブリダイズし、ＤＮＡリガーゼにより上側の鎖の５’末端に連結される。５’ユニバーサル配列部分、ならびに３’ランダム部分は、複数のウラシルヌクレオチドを含んでもよい。第１の反応後に、ＡＴＯ分子を消化することができる。
【００６５】
ライゲーションが用いられる実施形態では、上側の別個の鎖の５’末端はリン酸基を含んでよく、上側の別個の鎖の３’末端はビオチンを含んでよい。ライゲーションなしで伸長が用いられる実施形態では、上側の別個の鎖の５’末端はリン酸基を含まず、上側の別個の鎖の３’末端はビオチンを含まないが、上側の別個の鎖は、ウラシルヌクレオチドなどの消化可能なヌクレオチドを含んでよい。
【００６６】
ランダム配列部分はいずれの長さであってもよく、３〜４８ヌクレオチドの範囲、好ましくは３〜３６ヌクレオチドの範囲、または最も好ましくは１２〜３０ヌクレオチドの範囲の長さを有していてよい。具体的には、ランダム配列部分は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、またはそれより多くのヌクレオチドを有する。ランダム配列は、完全にランダムなヌクレオチドを含んでもよく、４つのヌクレオチドのいずれも任意の位置に存在することができる。あるいは、いくつかの場所に縮重ヌクレオチドが存在してもよい。ランダム配列部分は、いくつかの特定の位置にいくつかの特定の（ランダムではない）ヌクレオチドを含む場合があり、例えば、３’末端ヌクレオチドは、Ｔ残基、またはＡ残基、またはＧ残基、またはＣ残基などの特定のヌクレオチドであってよい。その特定の３’末端ヌクレオチドは、ビオチン、スペーサーまたはリン酸ブロッカーなどの修飾を簡単かつ安価に付加するために選択される。ランダム配列は、縮重もしくは半縮重ヌクレオチド、または完全にランダムなヌクレオチド、ならびに特定のヌクレオチドを含むことができ、ランダムなヌクレオチドが優勢に存在する。ランダム配列は、自然発生のまたは人工の修飾ヌクレオチドも含んでいてよい。これらの修飾ヌクレオチドは、上記のようなユニバーサル塩基であってよい。ランダム配列は、配列全体をＣおよびＧ残基が豊富なものにする（５０％超のヌクレオチドがＣおよびＧで構成されることを意味する）、またはＡおよびＴ残基が豊富なものにする（５０％超のヌクレオチドがＡとＴで構成されることを意味する）など、配列のバイアスを有していてよい。ランダム配列は、部分的または完全に、標的特異的配列で置き換えてもよい。
【００６７】
ＡＴＯは、非ストリンジェントな条件でランダム配列を介して標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズするが、その際にポリヌクレオチドの３’末端がランダム配列にハイブリダイズし、一実施形態では、ＡＴＯを鋳型として使用して伸長される。
【００６８】
説明したように、ランダム配列は、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズして、ＡＴＯを鋳型として使用して標的ポリヌクレオチドの伸長を導く鋳型としての機能を提供する。加えて、ランダム配列は、次世代シーケンシングにおいてＵＩＤ（一意の識別子、分子バーコード）としての第２の機能も提供する。
【００６９】
別の実施形態では、ＡＴＯ分子は、ランダム配列部分の３’に位置する３’追加特異的配列を含んでいてよい。３’追加特異的配列は、標的ポリヌクレオチドの特定の位置にハイブリダイズすることができる配列を含んでもよい。３’追加特異的配列は、制限酵素認識配列を含むことができ、それによって、標的配列にハイブリダイズしたときに、標的ポリヌクレオチドに酵素によるニッキングを生じさせることができる。
【００７０】
ＡＴＯの３’末端に、ＡＴＯを伸長不能にするブロッカー基を付加してよい。任意のブロッカー基を使用できる。一般に、意図的にＡＴＯの伸長が必要なため３’をブロックしないで伸長を可能にする場合を除き、ＡＴＯの３’末端は「ブロック」されてＡＴＯがプライマーとして機能するのを防止する。「ブロッキング」は、ビオチンまたはリン酸基などの化学部分を最後のヌクレオチドの３’ヒドロキシルに結合させることにより達成でき、これは、選択される基によって、ＡＴＯ反応後のそれに続くＡＴＯの除去または捕獲のためのアフィニティーキャプチャー部分としても機能することにより、二重の目的を果たすことができる。ブロッキングは、３’ＯＨを除去することによって、またはジデオキシヌクレオチドなどの３’ＯＨを欠くヌクレオチドを使用することによっても達成できる。ブロッキング基は、少なくとも１つのリボヌクレオチド、少なくとも１つのデオキシヌクレオチド、Ｃ３スペーサー、リン酸基、ジデオキシヌクレオチド、アミノ基、および逆位デオキシチミジンからなる群より選択することができる。
【００７１】
ＡＴＯ反応は、好ましくは３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを含み、したがって、ＡＴＯ分子は、好ましくは、ポリメラーゼによる消化を防ぐ修飾ヌクレオチドまたは修飾リンケージを３’末端に含む。任意の耐性のある修飾を使用できる。一例では、３’末端が、従来のホスホジエステルの代わりにホスホロチオアートなどの耐性部分を含むように、この位置で、最後のヌクレオチド、好ましくは最後の２つのヌクレオチドの間に修飾リンケージを含む。
【００７２】
一実施形態において、５’ユニバーサル配列部分は、標的ポリヌクレオチドの伸長のための鋳型としての機能を提供する配列の一部であり、その伸長産物は、ライゲーションによるシーケンシングライブラリー調製のためのアダプターの付加に相当する。しかしながら、伸長された配列−アダプター様は新たに合成され、追加のオリゴは付加されない。５’ユニバーサル配列部分は、プライマー配列またはプライマー結合配列を含み、これは次（または第３）世代のシーケンシング（ＮＧＳ）または他の大規模並列シーケンシングに適合する。例えば、５’ユニバーサル配列部分は、イルミナ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）プラットフォーム用のシーケンシングプライマー配列、および／またはイルミナプラットフォーム用のアンカープライマー配列を含んでいてよい。
【００７３】
５’ユニバーサル配列部分は、ステムループまたはヘアピン構造を形成してもよく、ステム部分の末端はランダム配列部分の５’末端に近い。ステムの５’末端は、５’オーバーハング（または突出部分）を形成することができる。ステム部分の長さは任意選択であってよい。ステム部分は、３〜３０ヌクレオチド、好ましくは４〜２４ヌクレオチドの範囲の任意の長さを有することができる。ステム部分は完全に二本鎖であってよく、あるいは好ましくは完全には二本鎖でない。ステム部分は、非対合領域を含んでいてよい。非対合領域は、ＮＧＳでＵＩＤ（分子バーコード）の機能を果たすランダム配列を含むことができる。ステム部分は、例えば制限酵素部位などの酵素により認識可能でかつ切断可能な配列を含むことができる。ステム構成は、ユニバーサル配列の標的ポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを防ぐことができる。ループ部分は任意の長さを有していてよい。ループ部分は、０〜３６ヌクレオチド、好ましくは１〜３０ヌクレオチドの範囲の任意の長さであってよい。ループは、例えば脱塩基部位、ヘキシエチレングリコール（ＨＥＧ）モノマー、１８原子ヘキサエチレングリコールスペーサー、または１’，２’−ジデオキシリボース（ｄＳｐａｃｅｒ）などの、ポリメラーゼによってコピー不能なヌクレオチドアナログまたは他の化学リンケージで部分的にまたは完全に構成されていてよい。コピー不能なリンカーは、ＡＴＯの５’部分でのポリメラーゼ媒介伸長を防ぐ。
【００７４】
ＡＴＯ分子は、２’−デオキシチミジン５’−一リン酸（ｄＴＭＰ）、２’−デオキシグアノシン５’−一リン酸（ｄＧＭＰ）、２’−デオキシアデノシン５’−一リン酸（ｄＡＭＰ）、２’−デオキシシチジン５’−一リン酸（ｄＣＭＰ）、２’−デオキシウリジン５’−一リン酸（ｄＵＭＰ）、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、塩基アナログ、およびそれらの組合せからなる群より選択されるヌクレオチドを含む。ＡＴＯは、本明細書で定義される修飾ヌクレオチドまたはリンケージ修飾を含むことも企図されている。
【００７５】
修飾オリゴヌクレオチドまたは修飾ポリヌクレオチドは、オリゴ−ポリヌクレオチド中のヌクレオチド単位の１つまたは複数の糖および／または１つまたは複数のヌクレオチドリンケージが「天然に存在しない」基で置換されているものを含んでいてよい。一態様では、この実施形態は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を想定している。ＰＮＡ化合物では、ポリヌクレオチドの糖骨格は、アミド含有骨格で置き換えられる。修飾オリゴ−ポリヌクレオチド骨格は、リン原子を含んでいてよく、例えば、ホスホロチオアート、キラルなホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルホスホナートおよび他のアルキルホスホナートが含まれる。修飾オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、１つまたは複数の置換糖部分を含んでもよい。さらなる修飾には、Ｉｓｏ−ｄＣやＩｓｏ−ｄＧなどの遺伝子コードを伸長するものが含まれるが、これらに限定されない。Ｉｓｏ−ｄＣとＩｓｏ−ｄＧは、それぞれシトシンとグアニンの化学的バリアントである。Ｉｓｏ−ｄＣはＩｓｏ−ｄＧと水素結合するが、ｄＧとは水素結合しない。同様に、Ｉｓｏ−ｄＧはＩｓｏ−ｄＣと塩基対を形成するが、ｄＣとは結合しない。一態様において、糖の修飾には、ロックド核酸（Locked Nucleic Acid）（ＬＮＡ）が含まれる。
【００７６】
標的ポリヌクレオチドは、ランダムにまたは特異的に、あるいはランダムと特異的の組合せにより、自然にまたは人工的に断片化されてよく、断片化された標的ポリヌクレオチドの３’末端は、ＡＴＯのランダム配列または標的特異的配列とのハイブリダイゼーション後に伸長される。標的ポリヌクレオチドのランダムな３’末端配列とランダムな鋳型上での伸長部分との組合せにより、シーケンシングリードをファミリーにグループ分けするのに使用できる一意の識別子（ＵＩＤ、分子バーコード）配列が提供される。さらに、ＡＴＯは、ユニバーサル配列内に位置する１つまたは複数の追加のＵＩＤを含んでいてよい。追加のＵＩＤは、ステム部分およびランダム配列部分の５’の近くのループ内に配置してよい。追加のＵＩＤは、３’ランダム配列とループとの間のどこかステム内に配置されてよい。追加のＵＩＤの長さは任意選択であってよい。追加のＵＩＤは、任意の長さを有してよく、２〜４８ヌクレオチドの範囲の長さを有することができ、好ましくは３〜３６ヌクレオチドの範囲を有する。追加のＵＩＤは完全にランダムなヌクレオチドを含んでよく、４つのヌクレオチドのいずれが任意の１つの場所に存在してもよい。あるいは、一部の場所に縮重ヌクレオチドが存在してもよい。
【００７７】
ＡＴＯ分子は、作用物質によって認識可能でかつ切断可能な非標準ヌクレオチド、アナログ、または修飾を含むことができる。非標準ヌクレオチドは、ｄＵＭＰ、ｄＩＭＰ、および５−ＯＨ−Ｍｅ−ｄＣＭＰからなる群より選択される。非標準ヌクレオチドの塩基部分を切断できる作用物質は、Ｎ−グリコシラーゼ酵素である。Ｎ−グリコシラーゼは、ウラシルＮ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）、ヒポキサンチン−Ｎ−グリコシラーゼ、およびヒドロキシメチルシトシン−Ｎ−グリコシラーゼからなる群より選択される。非標準ヌクレオチドがｄＵＭＰである場合、非標準ヌクレオチドの塩基部分を切断できる酵素はＵＮＧである。非標準ヌクレオチドがｄＵＭＰの場合、非標準ヌクレオチドの塩基部分を切断できる酵素はＵＮＧであり、ホスホジエステル骨格がＤＭＥＤで切断される。一実施形態では、ウラシルヌクレオチドは、チミンヌクレオチドの代わりにオリゴ合成中にＡＴＯに組み込まれる。非標準ヌクレオチドを含むＡＴＯは、２つ以上の異なる非標準ヌクレオチドの存在下で合成することができ、それにより、２つ以上の異なる非標準ヌクレオチドを含むＡＴＯが合成される。非標準ヌクレオチドを含むＡＴＯが、３つの標準ヌクレオチドと非標準ヌクレオチド、または４つすべての標準ヌクレオチドと非標準ヌクレオチドの存在下で合成される場合、非標準ヌクレオチドはＡＴＯ反応後にＡＴＯを分解するに適した比率で提供される。典型的には、塩基除去修復酵素は、ＤＮＡグリコシラーゼ、ＡＰエンドヌクレアーゼおよびデオキシホスホジエステラーゼからなる群より選択できる。好ましくは、ＤＮＡグリコシラーゼは、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ、３−メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ、ピリミジン水和物−ＤＮＡグリコシラーゼ、ＦａＰｙ−ＤＮＡグリコシラーゼおよびチミンミスマッチ−ＤＮＡグリコシラーゼからなる群より選択することができる。より好ましくは、ＤＮＡグリコシラーゼはウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼである。ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）またはウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）は、６塩基対超の一本鎖および二本鎖ＤＮＡからの遊離ウラシルの放出を触媒する酵素である。
【００７８】
一実施形態では、ＡＴＯ分子はリボヌクレオチドを含むことができ、リボヌクレオチドは、オリゴ合成中に任意のヌクレオチドまたはすべてのヌクレオチドの代わりにＡＴＯに組み込まれる；ここで、作用物質はＲＮａｓｅであり、それはＡＴＯ反応後のＡＴＯを分解／除去することができる。ＡＴＯは、全長がＲＮＡであってよく、あるいは部分的にＲＮＡで作成されたものでもよい。ＡＴＯの任意の部分がＲＮＡであってよく、ユニバーサル配列部分がＲＮＡであることが好ましい。
【００７９】
別の実施形態では、ＡＴＯ配列は制限酵素認識配列を含むことができ、これはユニバーサル配列中または３’の追加の特異的配列中に位置する；ここで、作用物質は制限酵素であり、それはＡＴＯ反応後にＡＴＯを分解／除去することができる。制限酵素認識配列は、ＡＴＯのステム部分に位置してよく、ステム部分は制限酵素により切断され得る。
【００８０】
別の実施形態では、ＡＴＯ分子は、ＡＴＯの任意の位置に付加されたアフィニティー結合部分を含んでよく；ここで、作用物質はタンパク質または抗体であり、これらはＡＴＯ反応後にＡＴＯを除去することができる。例えば、アフィニティー結合部分はビオチンであり；作用物質はアビジンまたはストレプトアビジンである。ある実施形態において、ＡＴＯは、ＡＴＯ反応後の反応混合物からのＡＴＯのアフィニティー除去を可能にするＡＴＯの５’または３’末端または任意の内部位置に組み込まれた１つまたは複数の部分を含んでいてよい。好ましいアフィニティー部分は、同族リガンドと特異的に相互作用できるものである。例えば、アフィニティー部分には、ビオチン、ジゴキシゲニンなどが含まれる。捕獲基の他の例には、リガンド、受容体、抗体、ハプテン、酵素、あるいは抗体またはアプタマーによって認識可能な化学基が含まれる。アフィニティー部分は、任意の所望の基体／固体支持体に固定化することができる。所望の基体の例には、例えば、粒子、ビーズ、磁気ビーズ、光トラップビーズ(optically trapped beads)、マイクロタイタープレート、スライドガラス、紙、テストストリップ、ゲル、他のマトリックス、ニトロセルロース、またはナイロンが含まれる。例えば、捕捉部分がビオチンである場合、基体はストレプトアビジンを含むことができる。一部の場合において、固体支持体はビーズである。ビーズの例には、ストレプトアビジンビーズ、アガロースビーズ、磁気ビーズ、抗体結合ビーズ（例えば、抗免疫グロブリンマイクロビーズ）、プロテインＡ結合ビーズ、プロテインＧ結合ビーズ、プロテインＡ／Ｇ結合ビーズ、プロテインＬ結合ビーズ、オリゴｄＴ結合ビーズ、シリカビーズ、シリカ様ビーズ、抗ビオチンマイクロビーズ、および抗フルオロクロムマイクロビーズが含まれるが、これらに限定されない。
【００８１】
ＲＴＯのランダム配列の一部は一意の識別子（ＵＩＤ）配列として機能するが、ＲＴＯはユニバーサル配列部分にある追加のＵＩＤを含んでもよい。
【００８２】
本開示は、ポリヌクレオチドのライブラリーを作成する方法であって、
（ｉ）サンプル由来の標的ポリヌクレオチドをプライマーとして使用し、かつ上記のＲＴＯのいずれか１つの除去可能な鋳型オリゴヌクレオチド（ＲＴＯ）を鋳型として使用して、修飾標的ポリヌクレオチドを作成するステップ；
（ｉｉ）ＲＴＯを除去するステップ；および
（ｉｉｉ）ユニバーサル配列を含む第１プライマーを使用して、修飾標的ポリヌクレオチドの第１の相補配列（ＣＳ）を作成するステップ；
を含み、
前記作成するステップは、ポリメラーゼによって、鋳型にハイブリダイズしたプライマーを伸長させることを含む、方法を提供する。
【００８３】
したがって、本開示は、一本鎖３’末端を有する標的ポリヌクレオチドの集団を伸長させる方法において、
（ｉ）標的ポリヌクレオチドをアダプター鋳型オリゴヌクレオチド（ＡＴＯ）とインキュベートするステップであって、ＡＴＯは、
（ａ）３’ランダム配列；
（ｂ）ＡＴＯを伸長不能にするブロッカーを有する３’末端；および
（ｃ）ランダム配列の５’にあるユニバーサル配列
を有し、標的ポリヌクレオチドは、ＡＴＯの３’ランダム配列にハイブリダイズする、ステップ；
（ｉｉ）ＡＴＯを鋳型として使用して標的ポリヌクレオチドのポリメラーゼ伸長を実行し、それにより３’ユニバーサル配列を有する伸長標的ポリヌクレオチドを作成するステップ；
を含む、方法を提供する。この方法は、（ｉｉｉ）修飾標的ポリヌクレオチドの第１の相補配列（ＣＳ）を作成するステップであって、第１のＣＳの作成が、修飾標的ポリヌクレオチドを鋳型として使用する３’ユニバーサル配列からのポリメラーゼ伸長を含むステップをさらに含むことができる。
【００８４】
本開示は、ポリヌクレオチドを伸長させる方法であって、
（ｉ）標的ポリヌクレオチドを上記の組成物とインキュベートすることにより修飾標的ポリヌクレオチドを作成するステップを含み、酵素的な第１のＡＴＯ反応において、標的ポリヌクレオチドの３’末端はアダプター鋳型オリゴヌクレオチド（第１のＡＴＯ）の３’ランダム配列にハイブリダイズし、標的ポリヌクレオチドの３’末端がＡＴＯを鋳型として使用して伸長され、３’オーバーハング末端が存在する場合、伸長が生じる前に標的ポリヌクレオチドの３’末端がトリミングされる、方法を提供する。
【００８５】
一実施形態では、修飾ポリヌクレオチドは、ＡＴＯ上での３’末端の伸長後、任意選択で、一本鎖修飾ポリヌクレオチドの環状化をもたらす一本鎖ＤＮＡ環状化リガーゼとインキュベートされる。
【００８６】
この方法は、（ｉｉ）修飾標的ポリヌクレオチドの第１の相補配列（ＣＳ）を作成するステップをさらに含む。
【００８７】
ステップ（ｉｉ）は、修飾標的ポリヌクレオチドを、１ラウンドの増幅のための鋳型として、連続ラウンドの増幅のための鋳型として、精製ステップによって分けられる連続ラウンドの増幅の鋳型として、使用することを含んでいてよい。
【００８８】
一実施形態では、前記第１のＣＳの作成は、第１プライマーを使用しかつ修飾標的ポリヌクレオチドを鋳型として使用する伸長を含み、第１プライマーは、修飾標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし、ポリメラーゼによって伸長される。第１プライマーは、修飾標的ポリヌクレオチドの３’伸長ユニバーサル領域にアニールする。第１プライマーは、ＮＧＳプラットフォームに適合する追加の配列、例えば、必要な配列を含む５’テール（5’ tail）を含んでもよい。
【００８９】
別の実施形態では、前記第１のＣＳの作成は、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むＡＴＯ上で伸長させることにより生成される修飾標的ポリヌクレオチドの二本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーター領域を使用して、ＲＮＡポリメラーゼを用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を行うことを含む。別の実施形態では、ＡＴＯの消化および／または除去後にヌクレオチドを修飾標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズさせることにより、修飾標的ポリヌクレオチドの二本鎖ＲＮＡポリメラーゼが生成される。
【００９０】
さらに別の実施形態では、前記第１のＣＳの作成は、修飾標的ポリヌクレオチドを熱変性させ、修飾標的ポリヌクレオチドの３’ステムループ構造を自己アニールさせ、さらに自己プライミングにより伸長させて第１のＣＳを形成することを含む
【００９１】
さらに別の実施形態では、第１のＣＳの作成は、修飾標的ポリヌクレオチドにアニールする標的特異的プライマー、およびポリメラーゼによる伸長を含む。標的特異的プライマーは、目的の標的配列にアニールする。第１のＣＳの二本鎖末端をアダプターに連結することができる。
【００９２】
この方法は、修飾標的ポリヌクレオチドの第１の相補配列（ＣＳ）を作成する前または後に、ＡＴＯを消化することをさらに含んでもよい。
【００９３】
この方法は、修飾標的ポリヌクレオチドの第１の相補配列（ＣＳ）を作成する前または後に、アフィニティーキャプチャーをさらに含んでもよい。
【００９４】
第１のＡＴＯ反応において、この方法は伸長およびライゲーションを含むことができ、ＤＮＡポリメラーゼは標的の３’末端を伸長し、ＤＮＡリガーゼは伸長した標的配列をＡＴＯの５’ステム部分またはＡＴＯの上側の別個の鎖に連結する。
【００９５】
この方法は、第１のＣＳを上記の組成物とインキュベートすることにより修飾された第１のＣＳを作成することをさらに含んでもよく、第１のＣＳの３’末端は、酵素的な第２のＡＴＯ反応において、アダプター鋳型オリゴヌクレオチド（第２のＡＴＯ）の３’ランダム配列にハイブリダイズし、第１のＣＳの３’末端はＡＴＯを鋳型として使用して伸長され、３’オーバーハングが存在する場合、伸長が生じる前に第１のＣＳの３’末端がトリミングされ、第２のＡＴＯは第１のＡＴＯとは異なる５’ユニバーサル配列を含む。
【００９６】
この方法は、ステップ（ｉｉ）の産物にアダプターを連結することにより、修飾された第１のＣＳを作成することをさらに含んでもよい。
【００９７】
この方法は、第１のＣＳまたは修飾された第１のＣＳにハイブリダイズした第２プライマーを伸長させることによって、第２のＣＳを作成することをさらに含んでよく、第２プライマーは、標的特異的部分またはユニバーサル配列、あるいは３’標的特異的部分と５’ユニバーサル配列の両方を含む。
【００９８】
この方法は、修飾標的ポリヌクレオチド反応を２つの別個の反応に分離することをさらに含んでもよく、各反応は、修飾標的ポリヌクレオチドのユニバーサル領域に相補的なプライマーを含み、１つの反応は、標的配列のフォワード鎖に相補的な標的特異的第２プライマーまたは標的特異的プライマーのプールを含み、第２の反応は、標的配列のリバース鎖に相補的な標的特異的第２プライマーまたは標的特異的プライマーのプールを含み、標的配列のフォワード鎖とリバース鎖は相補的である。
【００９９】
別の実施形態では、標的特異的プライマーのプールはプライマーの混合物を含むことができ、個々のプライマーは異なる標的のフォワード鎖またはリバース鎖のいずれかを標的とすることができ、最終プールはフォワード鎖およびリバース鎖の両方の異なる領域を標的とすることができる。ここで、標的配列のフォワード鎖とリバース鎖は相補的であり、フォワード鎖およびリバース鎖を標的とする２つのプライマーは、それらがＰＣＲのプライマーとして一緒に作用することができて望ましくないＰＣＲ産物の生成をもたらす場合には同じプールに加えられないことを考慮する限りでは、フォワード標的特異的プライマーとリバース標的特異的プライマーは２つの異なるプライマープールに分けられる。さらに、「フォワード」および／または「リバース」プールへのすべての言及は、上述したように、各プールがフォワード鎖とリバース鎖の両方を標的とするプライマーを含むことを可能にする。
【０１００】
この方法はさらに、修飾標的ポリヌクレオチドのユニバーサル領域に相補的なプライマーをハイブリダイズさせ、次いで１または複数ラウンドの線形増幅を実行し、第１の相補配列（ＣＳ）を作成することを含んでもよい。線形増幅反応産物は２つの別個の反応に分離され、各反応は修飾標的ポリヌクレオチドのユニバーサル領域に相補的なプライマーを含み、１つの反応は標的配列のフォワード鎖に相補的な標的特異的第２プライマーまたは標的特異的プライマーのプールを含み、第２の反応は標的配列のリバース鎖に相補的な標的特異的第２プライマーまたは標的特異的プライマーのプールを含み、標的配列のフォワード鎖とリバース鎖は相補的である。
【０１０１】
この方法は、二本鎖標的ポリヌクレオチドの末端修復ステップと、それに続く二本鎖アダプターのライゲーションをさらに含んでもよい。次に、ライゲーション産物を、標的ポリヌクレオチドライゲーション産物のユニバーサル領域に相補的なプライマーとハイブリダイズさせ、次いで１または複数ラウンドの線形増幅を実行する。線形増幅反応産物は２つの別個の反応に分けられ、各反応は修飾標的ポリヌクレオチドのユニバーサル領域に相補的なプライマーを含み、１つの反応は標的配列のフォワード鎖に相補的な標的特異的第２プライマーまたは標的特異的プライマーのプールを含み、第２の反応は標的配列のリバース鎖に相補的な標的特異的第２プライマーまたは標的特異的プライマーのプールを含む。標的配列のフォワード鎖とリバース鎖は相補的である。
【０１０２】
サンプル中の標的ポリヌクレオチドが二本鎖であり、第２プライマーが標的特異的プライマーである場合、標的特異的増幅のためのＡＴＯ反応後の反応は、ＡＴＯ反応産物または線形増幅された第１のＣＳ産物を２つの別個の反応に分割することを含んでよく、フォワード反応は標的配列のフォワード鎖に相補的な標的特異的第２プライマーを含み、リバース反応は標的配列のリバース鎖に相補的な標的特異的第２プライマーを含み、標的配列のフォワード鎖とリバース鎖は相補的である。
【０１０３】
一態様では、第１のＣＳの作成は、ポリヌクレオチドの３’伸長ユニバーサル部分を標的とするユニバーサルプライマーである第１プライマーを使用するワンパス伸長または線形増幅を含む。線形増幅は、１〜３０サイクル、２〜２５サイクル、３〜２４サイクル、４〜２３サイクル、５〜２２サイクル、６〜２１サイクル、７〜２０サイクル、８〜１９サイクル、９〜１８サイクル、または１０〜１７サイクルを有していてよい。
【０１０４】
別の態様において、第１のＣＳの作成は、標的がＲＮＡである場合、逆転写酵素を使用する逆転写反応を含む。
【０１０５】
この方法は、第１プライマーおよび第２プライマーを使用する指数関数的増幅をさらに含んでいてよい。第１プライマーは、修飾標的ポリヌクレオチドの３’伸長ユニバーサル部分を標的とするユニバーサルプライマーであってよい；第２プライマーは、第１のＣＳの３’伸長ユニバーサル部分を標的とするユニバーサルプライマーであってよい。あるいは、第２プライマーは、第１のＣＳの目的の特定領域にアニールする標的特異的プライマーである。第２プライマーは、目的の複数の配列領域を標的とする複数プライマーのセットであってよい。第２プライマーが標的特異的プライマーである場合、第２プライマーを使用した線形増幅または指数関数的増幅の後に、ネスト化（nested)標的特異的第３プライマーがさらなる増幅に使用される。
【０１０６】
第１プライマー、第２プライマー、または第３プライマーは、サンプルバーコード（ＳＢＣ）配列、およびＮＧＳプラットフォームとの適合性に必要な追加のユニバーサル配列を含んでいてよい。
【０１０７】
この方法は、第１のＡＴＯ反応の前に、標的ポリヌクレオチドを断片化、または断片化／タグ付けすることを含んでもよい。
【０１０８】
一実施形態では、前記の標的ポリヌクレオチドの断片化および／またはタグ付けは、二本鎖ポリヌクレオチドを、トランスポゾンＤＮＡに結合したトランスポザーゼと接触させることを含み、トランスポゾンＤＮＡはトランスポザーゼ結合部位およびユニバーサル配列を含み、トランスポザーゼ／トランスポゾンＤＮＡ複合体は、二本鎖ポリヌクレオチド上の標的位置に結合し、二本鎖ポリヌクレオチドを複数の二本鎖断片に切断し、各二本鎖断片は、二本鎖断片の各５’末端に結合したトランスポゾンＤＮＡを有する。この方法は、第１のＡＴＯ反応の前に断片化された標的ポリヌクレオチドを熱変性することをさらに含む。トランスポザーゼはＴｎ５トランスポザーゼであってもよい。トランスポゾンＤＮＡはバーコード配列を含んでもよく、またプライミング部位を含んでもよい。トランスポゾンＤＮＡは、二本鎖１９ｂｐ  Ｔｎｐ結合部位およびオーバーハングを含み、オーバーハングはＵＩＤおよびプライミング部位を含むことができる。トランスポゾンＤＮＡは、二本鎖１９ｂｐ  Ｔｎｐ結合部位、および核酸ステムループ構造を含む。結合したトランスポザーゼは、第１のＡＴＯ反応の前に二本鎖断片から除去することができる。Ｔｎ５トランスポザーゼは、トランスポゾンＤＮＡと複合体を形成し、Ｔｎ５トランスポザーゼ／トランスポゾンＤＮＡ複合体は、二本鎖ゲノムＤＮＡに沿って標的位置に結合し、二本鎖ゲノムＤＮＡを複数の二本鎖断片に切断する。トランスポゾンＤＮＡは、一方の端部に二本鎖１９ｂｐ  Ｔｎ５トランスポザーゼ（Ｔｎｐ）結合部位を含み、さらにバーコード領域、プライミング部位およびその他の配列を含む長い一本鎖オーバーハングを含む。転位すると、ＴｎｐとトランスポゾンＤＮＡは互いに結合し、二量体化してトランスポソームを形成する。次いで、トランスポソームは、標的ポリヌクレオチドをランダムに捕捉するか、そうでなければ標的ポリヌクレオチドに結合する。次に、トランスポソーム中のトランスポザーゼがゲノムＤＮＡを切断し、１つのトランスポザーゼが上側の鎖を切断し、１つのトランスポザーゼが下側の鎖を切断して、ＤＮＡ断片を作成する。したがって、トランスポゾンＤＮＡはポリヌクレオチドにランダムに挿入され、転位／挿入部位の両端に９ｂｐのギャップが残る。その結果、上側の鎖の５’位置にトランスポゾンＤＮＡ  Ｔｎｐ結合部位が付着し、かつ下側の鎖の５’位置にトランスポゾンＤＮＡ  Ｔｎｐ結合部位が付着したＤＮＡ断片が得られる。
【０１０９】
別の実施形態では、前記の標的ポリヌクレオチドの断片化は、二本鎖ＤＮＡを、ガイドＲＮＡに結合したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素と接触させることを含み、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／ガイドＲＮＡ複合体は、ガイドＲＮＡの配列によって決定される標的ポリヌクレオチドの領域に結合する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／ガイドＲＮＡ／ＤＮＡ複合体は、ガイドＲＮＡが標的とする配列によって決定される二本鎖切断を引き起こす。別の実施形態では、一本鎖切断のみが誘導される。
【０１１０】
前記断片化は、ゲノム編集ツールを用いる標的断片化（targeted fragmentation）の使用を含んでよい。ゲノム編集ツールは、クラスター化された規則正しく間隔を空けた短いパリンドロームリピート（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）、およびＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（CRISPR-associated protein 9）酵素（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）を含んでよい。酵素はクラスＩに属するものでよい。クラスＩ酵素は、タイプＩ、タイプＩＩＩ、またはタイプＩＶの酵素である。酵素はクラスＩＩに属するものでもよい。クラスＩＩ酵素は、タイプＩＩ、タイプＶ、またはタイプＶＩの酵素である。酵素は、クラスＩ酵素およびクラスＩＩ酵素の任意の組合せを含むことができる。この組合せは、タイプＩ、タイプＩＩ、タイプＩＩＩ、タイプＩＶ、タイプＶ、またはタイプＶＩの酵素の任意の組合せを含むことができる。ガイドＲＮＡのプールを使用して、ゲノムの複数の領域を標的にして、ＤＮＡ切断を引き起こす。ＤＮＡ切断は、一本鎖切断であっても二本鎖切断であってもよい。ＤＮＡ切断は二本鎖切断と一本鎖切断の組合せであってもよい。そのプールは、任意の数のガイドＲＮＡで構成される。
【０１１１】
別の実施形態では、前記の標的ポリヌクレオチドの断片化およびタグ付けは、一本鎖標的ポリヌクレオチドを、５’ユニバーサル配列および３’ランダム配列を含むランダムプライマーと接触させ、そのランダムプライマーを標的ポリヌクレオチド上で伸長させて５’タグ付き断片化ポリヌクレオチドを作成することを含む。
【０１１２】
標的ポリヌクレオチドまたは断片化された標的ポリヌクレオチドは、遊離３’ヒドロキシル基を含む。標的ポリヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡ、または一本鎖ＲＮＡ、または一本鎖ＲＮＡと一本鎖ＤＮＡの組合せであってよい。
【０１１３】
一実施形態は、ポリヌクレオチドを伸長させる方法であって、
標的ポリヌクレオチドを、ＤＮＡポリメラーゼ、および３’エキソヌクレアーゼ活性に対して耐性を有するように３’末端がブロックおよび修飾されている３’ランダム配列を含む上記のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド（ＡＴＯ）と混合するステップ；
アニーリングを促進する条件下で前記混合物をインキュベートし、３’オーバーハング末端が存在する場合はそれをトリミングし、伸長させて修飾標的ポリヌクレオチドを作成するステップ；および
任意選択で、ＡＴＯを分解するステップ
を含む方法を提供する。
【０１１４】
一実施形態は、シーケンシングライブラリーを作成する方法であって、
標的ポリヌクレオチドを、ＤＮＡポリメラーゼ、および３’エキソヌクレアーゼ活性に対して耐性を有するように３’末端がブロックおよび修飾されている３’ランダム配列を含む上記のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド（ＡＴＯ）と混合するステップ
アニーリングを促進する条件下で前記混合物をインキュベートし、３’オーバーハング末端が存在する場合はそれをトリミングし、伸長させて修飾標的ポリヌクレオチドを作成するステップ；
任意選択で、ＡＴＯを分解するステップ;および
ＮＧＳプラットフォームに適合するプライマーを使用して、１ラウンド、２ラウンド、またはそれ以上のラウンドの線形および／または指数関数的増幅で、修飾標的ポリヌクレオチドを増幅するステップ；
を含む方法を提供する。
【０１１５】
この方法は、混合の前に標的ポリヌクレオチドを断片化することをさらに含む。標的ポリヌクレオチドは、自然発生の断片化ポリヌクレオチドであってよい。自然発生の断片化ポリヌクレオチドは、血漿の循環セルフリー核酸(circulating cell free nucleic acid)であってよい。前記の標的ポリヌクレオチドの断片化は、二本鎖ポリヌクレオチドを、トランスポゾンＤＮＡに結合したトランスポザーゼと接触させることを含んでもよく、トランスポゾンＤＮＡはトランスポザーゼ結合部位およびユニバーサル配列を含み、トランスポザーゼ／トランスポゾンＤＮＡ複合体は二本鎖ポリヌクレオチド上の標的位置に結合し、二本鎖ポリヌクレオチドを複数の二本鎖断片に切断し、各二本鎖断片は、二本鎖断片の各５’末端に結合したトランスポゾンＤＮＡを有する。
【０１１６】
さらに、シーケンシングライブラリーを作成する方法であって、
ＡＴＯ鋳型上で一本鎖標的ポリヌクレオチドを伸長させることにより、上記のＡＴＯおよび組成物に従って一本鎖標的ポリヌクレオチドにアダプター配列を付加するステップ；およびＮＧＳプラットフォームに適合するプライマーを使用して、アダプターでタグ付けられた標的ポリヌクレオチドを増幅するステップを含み、ＡＴＯはユニバーサル部分にアダプター配列を含む、方法を提供する。アダプター配列は、核酸断片の増幅とシーケンシングの両方のためのプライミング配列を提供し、一部の態様では、次世代シーケンシングアプリケーションのために使用される。さらなる態様において、「アダプター配列」は、ＲＮＡ分子の生成のためのプロモーター配列として使用され、プロモーター配列は、限定されないが、例えば、Ｔ７プロモーター配列またはＳＰ６プロモーター配列である。
【０１１７】
本開示は、ポリヌクレオチドのライブラリーを作成する方法であって、
（ｉ）標的ポリヌクレオチドの３’末端にアダプター配列を付加する酵素的な第１の反応において、上記のＡＴＯ（第１のＡＴＯ）のいずれか１つのアダプター鋳型オリゴヌクレオチド（ＡＴＯ）の３’ランダム配列にハイブリダイズするサンプル由来の標的ポリヌクレオチドを使用して、修飾標的ポリヌクレオチドを作成するステップ；および
（ｉｉ）ユニバーサル配列を含む第１プライマーと、鋳型としての前記修飾標的ポリヌクレオチドとを使用して、修飾標的ポリヌクレオチドの第１の相補配列（ＣＳ）を作成するステップであって、第１プライマーが鋳型にハイブリダイズしてポリメラーゼによって伸長されるステップ
を含む方法を提供する。
【０１１８】
標的ポリヌクレオチドは、自然にまたは人工的に断片化されていることが好ましい。標的ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、スモールＲＮＡ、またはマイクロＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）、またはそれらの任意の組合せなどの任意の核酸であってよい。標的ポリヌクレオチドは、複数の標的ポリヌクレオチドを含んでいてよい。複数の標的ポリヌクレオチドのそれぞれは、異なる配列または同じ配列を含んでもよい。１つ以上の標的ポリヌクレオチドまたは複数の標的ポリヌクレオチドは、バリアント配列を含んでいてよい。
【０１１９】
ＤＮＡおよび／またはＲＮＡのいずれかである標的ポリヌクレオチドおよびＡＴＯのタイプに応じて、方法は逆転写またはプライマー伸長を利用できる。プライマー伸長反応は、単一のプライマー伸長ステップであってよい。プライマー伸長反応は、１つまたは複数の個々のプライマーを１回伸長させることを含むことができる。プライマー伸長反応は、１ステップで１つまたは複数の個々のプライマーを伸長させることを含むことができる。ステップ（ｉ）において、標的ポリヌクレオチドの３’末端またはトリミングされた３’末端がプライマーとして機能し、それはＡＴＯを鋳型として使用して伸長され、ステップ（ｉｉ）において、伸長または増幅プライマーは、標的ポリヌクレオチドの３’伸長部分にアニールする第１プライマーである。
【０１２０】
一実施形態では、ステップ（ｉ）において、プライマーとして機能する標的ポリヌクレオチドの３’末端を、ランダムに断片化されまたは特異的に断片化されていてよいその配列の３’末端を介してＡＴＯにハイブリダイズさせ、３’オーバーハングが存在する場合にはポリメラーゼの３→５’エキソヌクレアーゼ活性により３’オーバーハングをトリミングして除去し、さらにＡＴＯを鋳型として使用して伸長させて、修飾標的ポリヌクレオチドを作成する。ＡＴＯの３’ランダム配列部分のランダム性の性質により、標的ポリヌクレオチドの３’末端とＡＴＯとの間の完全なハイブリダイゼーションは容易に達成できない場合があり、低いストリンジェントな条件が適用される。例えば、高濃度のＡＴＯを使用してもよく、４℃などの低温のハイブリダイゼーションを使用してもよく、および／または複数サイクル（multiple cycles）の伸長を使用してもよく、および／またはより長いハイブリダイゼーション時間を使用してもよい。伸長は、任意のポリメラーゼおよび／または任意の逆転写酵素、あるいは異なるポリメラーゼの混合物によって行うことができる。好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼは３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有し、それにより、存在する場合にはあらゆる３’オーバーハングが消化され（トリミングされ）、伸長させることができる。ＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換活性を含んでいてよく、それによってＡＴＯ分子のステムループ構造と二本鎖ユニバーサル部分が開かれてコピー可能になる。あるいは、ＤＮＡポリメラーゼは５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を含んでよく、それによってＡＴＯ分子のステムループ構造の５’末端と二本鎖ユニバーサル部分が消化され、ＡＴＯの下側の鎖がコピーされる。ＤＮＡポリメラーゼは低温で活性であることが好ましい。ポリメラーゼは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性および／または鎖置換活性を有することができる異なるポリメラーゼの混合物を含んでいてよい。本明細書に開示の方法を実施するために使用できるポリメラーゼとして、Ｄｅｅｐ  ＶｅｎｔＲ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＬｏｎｇＡｍｐ（商標）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＶｅｎｔＲ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｙＮＡｚｙｍｅ（商標）ＩＩ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉｒｅ（商標）Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｃｒｉｍｓｏｎ  ＬｏｎｇＡｍｐ（商標）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｙＮＡｚｙｍｅ（商標）ＥＸＴ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＬｏｎｇＡｍｐ（商標）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ  ｗｉｔｈ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｔａｑ（Ｍｇ−ｆｒｅｅ）バッファー、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ  ｗｉｔｈ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｔａｑ  バッファー、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ  ｗｉｔｈ  ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ  ＩＩ（Ｍｇ−ｆｒｅｅ）バッファー、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ  ｗｉｔｈ  ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ  バッファー、Ｃｒｉｍｓｏｎ  Ｔａｑ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｃｒｉｍｓｏｎ  Ｔａｑ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ  ｗｉｔｈ（Ｍｇ−ｆｒｅｅ）バッファー、ＶｅｎｔＲ（登録商標）（エキソ−）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｈｅｍｏ  ＫｌｅｎＴａｑ（商標）、Ｄｅｅｐ  ＶｅｎｔＲ（商標）（エキソ−）ＤＮＡポリメラーゼ、ＰｒｏｔｏＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＡＭＶ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ、ＰｒｏｔｏＳｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｍ−ＭｕＬＶ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、完全長、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、ラージフラグメント、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ  ｗｉｔｈ  ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ  バッファー、９°  Ｎｍ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｃｒｉｍｓｏｎ  Ｔａｑ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｃｒｉｍｓｏｎ  Ｔａｑ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ  ｗｉｔｈ（Ｍｇ−ｆｒｅｅ）バッファー、Ｄｅｅｐ  ＶｅｎｔＲ（商標）（エキソ−）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ  ＶｅｎｔＲ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｙＮＡｚｙｍｅ（商標）ＥＸＴ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｙＮＡｚｙｍｅ（商標）ＩＩ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｈｅｍｏ  ＫｌｅｎＴａｑ（商標）、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ  ＩＶ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）γ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ＩＩ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ＩＩＩ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＶｅｎｔＲ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＶｅｎｔＲ（登録商標）（エキソ−）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、ラージフラグメント、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、ラージフラグメント、ＤＮＡポリメラーゼ  Ｉ（大腸菌）、ＤＮＡポリメラーゼ  Ｉ、ラージ（クレノウ）フラグメント、クレノウフラグメント（３’→５’エキソ−）、ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ（非修飾）、逆転写酵素（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）およびＲＮＡポリメラーゼ、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素、ｐｈｉ６  ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ、およびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定はされない。
【０１２１】
本開示の方法を実施するために使用され得るリガーゼには、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ、大腸菌ＤＮＡリガーゼ、および大腸菌ＲＮＡリガーゼが含まれるが、これらに限定されない。
【０１２２】
温度の熱サイクル：アニーリング、伸長、および変性：を通して、複数サイクルの伸長を実行することができる。修飾標的ポリヌクレオチドは、伸長された３’部分を有し、その部分は、ランダム配列とプライマーの結合部位を提供するユニバーサル配列とを含むことができる。伸長された３’部分は、追加のＵＩＤも含むことができる。
【０１２３】
一実施形態では、ステップ（ｉ）において、ＡＴＯのユニバーサル部分がイノシンなどの弱い対合ヌクレオチドを含む場合、第１の伸長反応後のＡＴＯの除去は必要ない場合がある。そうでなければ、反応混合物からのＡＴＯの除去または消化が、任意の手段によって実行され得る。例えば、ＡＴＯがウラシル残基を含む場合、ＡＴＯはＵＮＧ消化によって消化／除去される；ＡＴＯがＲＮＡを含む場合、ＡＴＯはＲＮａｓｅ消化により消化／除去される；ＡＴＯが制限酵素部位を含む場合、ＡＴＯは制限酵素消化により消化／除去される；または、ＡＴＯがビオチンを含む場合、ＡＴＯはストレプトアビジンビーズに捕捉することにより除去される。別の実施形態では、ＡＴＯがヘアピン／ステムループ構造を含む場合（図３Ｂおよび３Ｃ）、ＡＴＯのヘアピン構造は、ＡＴＯが修飾標的ポリヌクレオチドの３’伸長部分にハイブリダイズすることをできなくするため、ＡＴＯを消化したり反応混合物から除去したりする必要がない場合がある。
【０１２４】
一実施形態では、第１のＡＴＯ反応はプライマー伸長反応であり、標的ポリヌクレオチドがプライマーとして機能し、ＤＮＡポリメラーゼによってＡＴＯ鋳型上で伸長される。ＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換活性または５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を含むことができ、伸長中にステムループ構造が開かれるか、あるいは上側のＡＴＯ鎖が置換または消化される。任意のポリメラーゼを使用でき、例えば、クレノウエキソ−ポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、またはＴ４  ＤＮＡポリメラーゼなどを使用できる。
【０１２５】
別の実施形態では、第１の反応は伸長−ライゲーション反応であり、ＤＮＡポリメラーゼは標的を伸長し、ＤＮＡリガーゼは伸長された標的配列をＡＴＯの５’ステム部分またはＡＴＯの上側の鎖に連結する。任意のＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡリガーゼを使用でき、例えばクレノウラージフラグメント、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを使用できる。
【０１２６】
別の実施形態では、第１の反応はライゲーション反応であり、ＤＮＡリガーゼが標的ポリヌクレオチドをＡＴＯの５’ステム部分またはＡＴＯの上側の鎖に連結させる。任意のＤＮＡリガーゼを使用でき、例えばＴ４  ＤＮＡリガーゼを使用できる。
【０１２７】
第１の反応後、この方法は、ＡＴＯの一部を消化する、またはアフィニティーキャプチャー（または親和性捕捉）によりＡＴＯの一部を除去することを含んでいてよい。
【０１２８】
この方法は、アダプター配列を第１のＣＳの３’末端に付加する酵素反応において、上記のＡＴＯのいずれか１つの第２のＡＴＯの３’ランダム配列にハイブリダイズする第１のＣＳを使用することにより、修飾された第１のＣＳを作成することを含んでいてよく、第２のＡＴＯは、第１のＡＴＯとは異なる５’ユニバーサル配列を含む。
【０１２９】
この方法は、二本鎖アダプターをステップ（ｉｉ）の産物に連結することにより、修飾された第１のＣＳを作成することをさらに含んでいてよい。
【０１３０】
ＡＴＯの消化／除去に続くステップにおいて、またはＡＴＯの消化／除去なしに、修飾標的ポリヌクレオチドの第１の相補配列（ＣＳ）の作成が実行される。第１の相補配列（ＣＳ）は、プライマー伸長により生成される。プライマーは、修飾標的ポリヌクレオチドの３’伸長部分にハイブリダイズして伸長できるユニバーサルプライマーであってよい。ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＲＮＡとＤＮＡの組合せであり得る標的ポリヌクレオチドのタイプに応じて、方法は、ＤＮＡポリメラーゼおよび／または逆転写酵素による逆転写および／またはプライマー伸長を利用することができる。プライマー伸長反応は、単一のプライマー伸長ステップであってよい。あるいは、プライマー伸長反応は、第１のプライマーを使用する複数サイクルの線形増幅であってもよい。生成される第１のＣＳは、５’ユニバーサル配列および標的ポリヌクレオチドの３’相補配列を含む。第１プライマーは、ＡＴＯのユニバーサル配列部分と同一または実質的に同一の３’ユニバーサル配列を含む。第１プライマーは、シーケンシングプラットフォームに適合する５’の別のユニバーサル配列部分をさらに含むことができる。第１プライマーは、３’ユニバーサル配列と５’の別のユニバーサル部分との間にサンプルバーコード配列（ＳＢＣ）をさらに含むことができる。
【０１３１】
一実施形態では、この方法は、プライマーとして第１のＣＳを使用し、かつ鋳型として上記のオリゴのいずれか１つの第２のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド（ＡＴＯ）を使用して、修飾された第１のＣＳを作成することをさらに含む。第１のＣＳの３’末端は、ＡＴＯ鋳型上で伸長されて、３’末端に第２のユニバーサル配列を含む伸長された第１のＣＳが生成され、第２のＡＴＯの除去の後に、２つのユニバーサルプライマーを使用して第１のＣＳをＰＣＲ増幅することができる。
【０１３２】
別の実施形態では、この方法は、第１のＣＳまたは修飾された第１のＣＳにハイブリダイズした第２プライマーを伸長させ、それによって第２のＣＳを形成するステップをさらに含み、第２プライマーは、標的特異的部分またはユニバーサル配列、あるいは３’標的特異的部分と５’ユニバーサル配列の両方を含む。一態様では、第２プライマーが標的特異的プライマーである場合、それは５’ユニバーサル配列と共にまたは５’ユニバーサル配列なしで、３’標的特異的部分を含むことができる。第２プライマーを使用する伸長は、ワンパス伸長、または複数サイクルの線形増幅であってよい。あるいは、ステップ（ｉｉ）とこのステップは、第１プライマーを使用して第１のＣＳを生成しかつ第２プライマーを使用して第２のＣＳを形成する１つの単一ＰＣＲ反応に一体化され、第１のＣＳと第２のＣＳは第１のＰＣＲサイクルの後に同時に生成される。ＰＣＲ反応または線形増幅の後に、その産物を精製してもよく、あるいは一本鎖特異的ヌクレアーゼ消化によりプライマーを除去する。第１プライマーがサンプルバーコードを含む場合、複数のサンプルから精製されたＰＣＲ産物を一緒にプールしてよい。（プールされた）精製ＰＣＲ産物または精製線形増幅産物は、第１のＣＳのためのネスト化標的特異的第３プライマー、および第２のＣＳのためのユニバーサルプライマーを使用して、さらにＰＣＲ増幅される。第１のＣＳのためのネスト化標的特異的第３プライマーは、３’標的特異的部分および５’ユニバーサル配列部分を含み、５’ユニバーサル配列部分はＮＧＳプラットフォームに適合する。その後、ＰＣＲ産物は精製され、シーケンシング可能な状態になる。別の態様では、第２プライマーが標的特異的プライマーである場合、第２プライマーは３’標的特異的部分および５’ユニバーサル部分を含むことができ、５’ユニバーサル部分はＮＧＳプラットフォームに適合する。ステップ（ｉｉ）とこのステップは、第１プライマーを使用して第１のＣＳを生成しかつ第２プライマーを使用して第２のＣＳを形成する１つの単一ＰＣＲ反応に一体化され、第１のＣＳと第２のＣＳは、第１のＰＣＲサイクルの後に同時に生成される。ＰＣＲ産物は精製され、シーケンシング可能な状態になる。
【０１３３】
サンプル中の元の標的ポリヌクレオチドが二本鎖である場合、第１のＣＳにハイブリダイズした第２プライマーを伸長させる反応を、２つの別個の反応に分けてよく、フォワード反応は標的配列のフォワード鎖に相補的な標的特異的第２プライマーを含み、リバース反応は標的配列のリバース鎖に相補的な標的特異的第２プライマーを含み、標的配列のフォワード鎖とリバース鎖は相補的である。
【０１３４】
ステップ（ｉ）または（ｉｉ）において、伸長は、第１プライマーまたは第２プライマーを使用するワンパス伸長または線形増幅を含むことができる。ステップ（ｉｉ）において、伸長は、第１プライマーおよび第２プライマーを使用する指数関数的増幅を含むことができる。
【０１３５】
第１プライマーは、サンプルバーコード（ＳＢＣ）配列、およびＮＧＳプラットフォームに適合する追加の５’ユニバーサル配列を含んでいてよい。
【０１３６】
一態様では、本開示は、標的ポリヌクレオチドを伸長させる方法であって、標的ポリヌクレオチドを、ポリメラーゼ酵素、およびＮＧＳアダプター配列および切断可能配列を含むＡＴＯ分子と混合する；トリミングおよび伸長反応を実行し、ポリメラーゼを熱不活性化し、次いで一本鎖特異的環状化リガーゼ酵素とインキュベートする；任意選択で、開裂反応またはリバースプライマーおよびフォワードプライマーを用いる増幅反応を含め、環状分子を完成した線状ＮＧＳライブラリー分子に変形させるためにそれらのいずれか一方が行われる；ことを含む方法を提供する。
【０１３７】
別の態様では、本方法は、標的ポリヌクレオチドを伸長させる方法であって、標的ポリヌクレオチドを、ポリメラーゼ酵素、およびＮＧＳアダプター配列を含むＡＴＯと混合する；トリミングおよび伸長反応を実行し、次いでユニバーサルＮＧＳアダプター配列に相補的な第１プライマー、ＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰとインキュベーションして伸長反応を実行して、ＣＳおよび二本鎖基質分子を作成する；Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、およびＮＧＳアダプター配列と切断された相補体と３’リン酸とを含む２つのオリゴヌクレオチドをアニールすることにより形成された平滑末端またはＴテールを有するアダプターを用いて、ライゲーションを実行し、一方のオリゴヌクレオチドが修飾標的ポリヌクレオチド分子の５’リン酸に連結されて線状ＮＧＳライブラリー分子を完成させることを含む、方法を提供する。
【０１３８】
本開示はさらに、標的ポリヌクレオチドの配列を正確に決定する方法であって、
（ｉ）上記の方法のいずれか１つの増幅された第２のＣＳの少なくとも１つをシーケンシングするステップ；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）からの同じＵＩＤを含む少なくとも２つの配列を整列させる、および／または各反応が二重鎖標的配列の一方の鎖または相補鎖の配列情報を作成する２つの反応の同じ標的配列を整列させるステップ；および
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）に基づいて２つの反応のコンセンサス配列および／または同一のバリアント配列を決定するステップであって、コンセンサス配列および／またはバリアント配列が標的ポリヌクレオチド配列を正確に表すステップ
を含む方法を提供する。
【０１３９】
本開示はさらに、上記のＡＴＯのいずれか１つのアダプター鋳型オリゴヌクレオチド（ＡＴＯ）と、ＮＧＳプラットフォームに適合するプライマーとを含む、ポリヌクレオチドのライブラリーを作成するためのキットを提供する。
【０１４０】
キットは上記の組成物を含む。
【０１４１】
ポリヌクレオチドのライブラリーを作成するためのキットは、上記のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド（ＡＴＯ）と、ポリメラーゼと、ＮＧＳプラットフォームに適合するプライマーとを含む。
【０１４２】
標的ポリヌクレオチドは、以下に記載のポリヌクレオチド、修飾ポリヌクレオチドまたはそれらの組合せである。標的ポリヌクレオチドは、様々な実施形態において、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの組合せである。別の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、化学的に処理された核酸であり、ＮＧＳによりメチル化状態を検出するために基質ポリヌクレオチドがバイサルファイト処理されたＤＮＡである実施形態が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４３】
標的ポリヌクレオチドは、天然供給源から得られるか、または合成のものであってもよい。天然供給源は、原核生物または真核生物からのＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡである。例えば、限定するものではないが、供給源は、ヒト、マウス、ウイルス、植物、または細菌であってよい。様々な態様において、標的ポリヌクレオチドは、マイクロアレイを含むアッセイおよび次世代核酸シーケンシング用のライブラリーの作成で使用するためのアダプター配列で３’末端において伸長される。
【０１４４】
標的ポリヌクレオチドの供給源がゲノムＤＮＡまたはＲＮＡまたはその両方である場合、一部の実施形態では、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡまたはその両方は、伸長される前に断片化される。ゲノムＤＮＡ／ＲＮＡの断片化は、当業者に知られている一般的な手順であり、例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡをせん断（噴霧）することにより、エンドヌクレアーゼでＤＮＡ／ＲＮＡを切断することにより、ＤＮＡ／ＲＮＡを超音波処理することにより、ＤＮＡ／ＲＮＡを加熱することにより、アルファ、ベータ、ガンマまたは他の放射線源を使用したＤＮＡ／ＲＮＡの照射によって、光によって、金属イオンの存在下でのＤＮＡ／ＲＮＡの化学的切断によって、ラジカル切断によって、およびそれらの組合せによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われるが、それらに限定されない。ゲノムＤＮＡ／ＲＮＡの断片化は、ｉｎ  ｖｉｖｏでも生じ、例えば、アポトーシス、放射線および／またはアスベストへの暴露により生じるが、これらに限定されない。本明細書で提供される方法によれば、標的ポリヌクレオチドの集団は均一なサイズである必要はない。したがって、本開示の方法は、異なるサイズの標的ポリヌクレオチド断片の集団と共に使用するのに有効である。
【０１４５】
本明細書で使用する「標的ポリヌクレオチド相補配列（ＣＳ）」は、標的配列に相補的な配列またはその相補体（標的配列に相補的な配列の相補体）を含むポリヌクレオチドである。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド相補配列は、第１の相補配列を含む。「第１の相補配列」は、標的ポリヌクレオチドから逆転写されるかまたは標的ポリヌクレオチド上でのプライマー伸長反応から形成されるポリヌクレオチド、あるいはＲＮＡポリメラーゼによって修飾標的ポリヌクレオチドからの二本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーターから転写されるＲＮＡポリヌクレオチドである。修飾標的ポリヌクレオチドは、ランダム配列とユニバーサル配列とを含むＡＴＯ上で伸長された標的ポリヌクレオチドである。
【０１４６】
標的ポリヌクレオチド相補配列は、第二の相補配列を含む。「第２の相補配列」は、第１の相補配列に相補的な配列を含むポリヌクレオチドである。標的ポリヌクレオチド相補配列は、ＵＩＤを含んでいてよい。例えば、第１の相補配列は、ＡＴＯのランダム配列により、およびランダムに断片化された標的ポリヌクレオチドの３’末端部分により提供されるＵＩＤを含むことができる。
【０１４７】
第２または第３プライマーは、複数の第２または第３プライマーのセットであってよい。複数の第２または第３プライマーの各第２または第３プライマーは同時に伸長され、同じ反応チャンバー内で伸長される。
【０１４８】
標的特異的第２プライマーを使用する増幅ステップは、２つの反応：フォワード反応とリバース反応：に分けることができる。フォワード反応は、１つのサンプル由来の複数の標的ＣＳの第１鎖にアニールする複数の標的特異的第２プライマーのフォワードセットを含み、リバース反応は、同じサンプル由来の複数の標的ＣＳの第２鎖にアニールする複数の標的特異的第２プライマーのリバースセットを含む。ネスト化ＰＣＲ(nested PCR)においてＰＣＲ産物を作成するために使用されるプライマーは、第１プライマーの５’ユニバーサル配列部分を標的とするユニバーサルプライマー、および複数の標的配列の第２鎖にアニールする複数の標的特異的プライマーの第３のセットを含むことができ、第３のセットの標的特異的プライマー（内側プライマー）は、標的特異的第２プライマー（外側プライマー）のセットに対してネスト化される。フォワード反応とリバース反応のユニバーサルプライマーは同じであってよい。
【０１４９】
反応混合物は、２つ以上のサンプル（２つのサンプル、３つのサンプル、または４つ以上のサンプル、あるいは１０より多いサンプルであってよい）のための複数の反応を含んでいてよい。異なるサンプルを一緒に並行して処理することができる。各サンプルは、２つの反応：フォワード反応とリバース反応：を含んでいてよい。異なるサンプルの反応（すべてのフォワード反応、またはすべてのリバース反応）は、好ましくは、ステップ（ｉｉ）の後に混合され、各サンプルのアイデンティティは、ＳＢＣを有する第１プライマーによる増幅で割り当てられる。ステップ（ｉｉ）の後のすべてのフォワード反応またはリバース反応を、１つの混合物で処理することができる。
【０１５０】
この方法はさらに、標的配列の異なる鎖を表すフォワード反応およびリバース反応から得られるＮＧＳのリード（読み取り断片）を解析することを含み、それは、（ｉ）同じランダム配列識別子（ＵＩＤ）配列を含むファミリーにグループ分けし；（ｉｉ）標的配列が多数派メンバーと一致しない１つまたは複数のヌクレオチド位置を有する同じファミリーの標的配列を除外し；さらに（ｉｉｉ）標的配列の異なる鎖を表す２つの反応で同じ突然変異が現れるか否かを調べることにより、エラー訂正された(error-corrected)コンセンサス配列を作成することを含む。
【０１５１】
この方法は、標的配列の２つの異なる鎖を表すフォワード反応およびリバース反応から得られるＮＧＳのリードを解析することをさらに含み、それは同じランダム配列識別子（ＵＩＤ）配列を含むファミリーにグループ分けすることによりコンセンサス配列を作成し；さらにファミリーの数をカウントすることを含む。この方法は、サンプル中に存在する元の標的核酸の数の正確なカウンティングをもたらす。
【０１５２】
この方法を使用して開始分子を定量することができ、他のサンプルと比較した、またはフォワード反応とリバース反応とを比較した、標的配列のＵＩＤファミリーのカウンティングが、正確なカウンティング情報をもたらすことができる。
【０１５３】
ＵＩＤの目的は２つある。１つ目は、元の各ＤＮＡまたはＲＮＡ鋳型分子に一意のＵＩＤを割り当てることである。２つ目は、一意にタグ付けされた各鋳型の増幅であり、これにより、同一のＵＩＤ配列を有する多くの娘分子が生成される（ＵＩＤファミリーとして定義される）。増幅に使用される鋳型分子に突然変異が先在する場合、その変異は、そのＵＩＤを含むすべての娘分子に存在するはずである。
【０１５４】
ユニバーサルプライマーは、あらゆるエキソヌクレアーゼ活性に耐性にするために、１つ、または２つ、またはそれ以上の末端ホスホロチオアートを含んでよい。ユニバーサルプライマーはまた、ＮＧＳフローセル（例えば、イルミナＧＡ  ＩＩｘフローセル）へのハイブリダイゼーションに必要な５’グラフト配列を含んでもよい。最後に、それらは、グラフト配列とユニバーサルタグ配列との間にインデックス配列を含んでもよい。このインデックス配列は、複数の異なる個体からのＰＣＲ産物をシーケンサーの同じフローセルコンパートメントにおいて同時に分析することを可能にする。
【０１５５】
サンプルの標的核酸配列は、バリアントヌクレオチドを含む核酸断片または遺伝子を含んでもよく、障害関連ＳＮＰ／欠失／挿入、染色体再編成、トリソミー、またはがん遺伝子、作用物質耐性遺伝子、および病原性遺伝子からなる群より選択することができる。障害関連遺伝子には、がん関連遺伝子および遺伝性疾患に関連する遺伝子が含まれ得るが、これらに限定されない。サンプルは、ゲノムＤＮＡ、循環核酸、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、スモールＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはＦＦＰＥ  ＤＮＡもしくはＲＮＡであってよい。
【０１５６】
標的ポリヌクレオチド配列の診断領域内のバリアントヌクレオチドは、１つまたは複数のヌクレオチド置換、染色体再編成、欠失、挿入、および／または異常なメチル化を含むことができる。
【０１５７】
ＤＮＡのメチル化は、ゲノムの重要なエピジェネティック修飾である。異常なＤＮＡのメチル化は、腫瘍抑制遺伝子のサイレンシングを引き起こす可能性があり、さまざまなヒトがん細胞でよく見られる。標的ポリヌクレオチド中の異常なメチル化の存在を検出するために、本方法の実施前に予備処置を行う必要がある。核酸サンプルを、バイサルファイト処理によって化学的に修飾することが好ましく、それによって、シトシンはウラシルに変換されるが、メチル化シトシンは変換されない（すなわち、５−メチルシトシンは、この処理に耐性であり、シトシンのままである）。これらの修飾により、この方法は標的核酸における異常なメチル化の検出に適用できる。別の実施形態では、バイサルファイト処理による修飾は、ＡＴＯ反応後に生じる。別の実施形態では、バイサルファイト処理による修飾は、第１のＣＳの生成後に生じる。
【０１５８】
本開示は、異なる標的核酸配列の複数の遺伝子座における突然変異または多型の存在および／または量および／または頻度について生物学的サンプルを分析する方法を提供する。別の態様では、本開示は、例えばトリソミーなどの染色体異常について生物学的サンプルを分析する方法を提供する。ＡＴＯ反応の後に、次世代シーケンシング、デジタルＰＣＲ、マイクロアレイ、またはその他のハイスループット分析を行うことができる。標的遺伝子座の多重化の数は、５を超える、または１０を超える、または３０を超える、または５０を超える、または１００を超える、または５００を超える、１０００を超える、さらには２０００を超える数であってよい。
【０１５９】
例えば、サンプル中に１つまたは２つの突然変異体が存在するなど、突然変異体がサンプル中に非常に低濃度で存在する場合、サンプル核酸を２つの反応に分けた後、１つの反応のみが突然変異体を含むことがある。２つの反応からの２本の鎖配列の比較は、１つの反応のみが変異を含み得ることを明らかにすることができる。２つ以上のリードファミリーが同じ変異を含む場合、その変異が１つの反応のみに現れる場合でも、真の変異として分類される。
【０１６０】
別の実施形態では、修飾標的ポリヌクレオチドを、１または複数の後続ラウンドの増幅のためにサンプル核酸を２つの反応に分割する前に、線形または指数関数的増幅により増幅させることができる。すべての元の分子のコピー数の増加により、２つの反応からの２本の鎖配列の比較が突然変異の存在を明らかにする可能性が高くなる。
【０１６１】
別の実施形態では、修飾標的ポリヌクレオチドは２つの反応に分割されず、２本の鎖のうちの１本のみが突然変異の存在について調べられる。
【０１６２】
別の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは２つの反応に分割されず、両方の鎖が別々に連続的に増幅されて両方の鎖の分析を可能にする。
【０１６３】
死にかけている腫瘍細胞から血流へのセルフリーＤＮＡの放出は、さまざまなタイプのがんの患者でよく実証されている。循環腫瘍ＤＮＡは、悪性腫瘍の存在を検出したり、治療反応を追跡したり、再発を監視したりするための非侵襲的バイオマーカーとして使用できることが研究により示されている。しかしながら、現在の検出方法にはかなりの制限がある。次世代シーケンシング（ＮＧＳ）法は、従来の方法のほんの一部の時間とコストで数千億塩基対の同時シーケンシングを可能にすることにより、ゲノム探索に革命をもたらした。しかしながら、エラー率は〜１％であるため、腫瘍や血漿などの遺伝的に異質な混合物におけるまれな変異体を特定することを目的とする場合に許容できない数億のシーケンシングミスをもたらす。本発明の方法は、これらシーケンシング精度の限界を克服する。ｃｆＤＮＡを含む突然変異は、比較的過剰なバックグラウンドの野生型ＤＮＡによって不明瞭になる；検出は困難であることが証明されている。この方法では、元の各ＤＮＡ二重鎖に個別にタグ付けしてシーケンシングすることにより、エラーを大幅に低減する。
【０１６４】
本発明の方法は、大規模並列シーケンシングの精度を実質的に改善することができる。このアプローチは、ＤＮＡ鋳型の集団中のまれな突然変異体を同定するのに容易に使用できる。サンプル中の１つの標的鋳型の２本の鎖は、それぞれ一意にタグ付けされ、独立してシーケンシングされる。２本の鎖の配列を比較すると、お互いに一致するかまたは不一致になる。一致すると、突然変異を真陽性としてスコア付けする信頼をもたらす。
【０１６５】
シーケンシングの後、同一のＵＩＤタグ配列を共有することにより、各リードファミリーのメンバーが同定およびグループ分けされる。次に、一意にＵＩＤタグ付けされたファミリーの配列と標的配列の１本または２本の鎖を比較して、コンセンサス配列を作成する。このステップは、シーケンシングまたはＰＣＲ中に導入されたランダムエラーを除外して、それぞれが一本鎖ＤＮＡの個々の分子に由来する配列のセットをもたらす。
【０１６６】
希少ＤＮＡバリアントの高感度検出への適用に加えて、標的特異的プライマーのバーコード化ランダム配列識別子は、相対的または絶対的なＤＮＡおよび／またはＲＮＡのコピー数を正確に決定する単一分子カウンティングにも使用できる。主要な増幅の前にタグ付けが行われるため、比例代表が増幅バイアスによるゆがみの影響を受けないならば、母集団におけるバリアントの相対存在量を正確に評価できる。
【０１６７】
本発明の方法は、各標的配列にランダム配列識別子をタグ付けして、２本の鎖をシーケンシングすることにより、エラーを大幅に低減する。分析は、シーケンシングされた一意にタグ付けされた配列をグループ分けし；標的配列がファミリーの多数派メンバーと一致しない１つ以上のヌクレオチド位置を有する同じファミリーの標的配列を除外し；さらに２つの集団に現れる同じ突然変異を真の突然変異とすることにより、エラー訂正されたコンセンサス配列を提供する。
【０１６８】
この方法は、ＦＦＰＥまたは血液などの任意のサンプルにおける変異を検出するために使用できる。サンプル中に存在する元の分子を反映するシーケンシングリードの正確なカウンティングは、コピー数の変動に関する情報または染色体異常の出生前診断に関する情報を提供する。
【０１６９】
本発明の方法で使用される試薬は、キットにパッケージングすることができる。キットは、個別の容器または単一のマスター混合容器内に、ＡＴＯ、ポリメラーゼ、プライマーを含む。キットは、例えば、バッファー、ｄＮＴＰ、および／または重合手段などの伸長、増幅、エンリッチメントのために必要な、および例えば酵素などの検出分析のために必要な、他の適切にパッケージされた試薬および材料、ならびにアッセイを実施するための指示書も含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【０１７０】
【図１Ａ】例示的な実施形態の概略図を示す。標的ポリヌクレオチド（ＰＣＲ産物、またはＤＮＡ、またはＲＮＡ、またはそれらの混合物）は二本鎖であってよく、２本の鎖のうちの１本のみが示されている（フォワード鎖）。
【図１Ｂ】図１Ａの続きである。
【図１Ｃ】図１Ｂの続きである。
【図１Ｄ】図１Ｃの続きである。
【図２−１】例示的な実施形態の概略図を示す。
【図２−２】図２−１の続きである。
【図２−３】図２−２の続きである。
【図２−４】図２−３の続きである。
【図２−５】図２−４の続きである。
【図３−１】例示的な実施形態の概略図を示す。
【図３−２】図３−１の続きである。
【図３−３】図３−２の続きである。
【図３−４】図３−３の続きである。
【図４】例示的な実施形態の概略図を示す。ヌクレアーゼを使用した酵素的断片化プロセス、または超音波処理によるＤＮＡの物理的せん断は、トランスポザーゼを使用した断片化で置き換えることができる。
【図５】例示的な実施形態の概略図を示す。標的ポリヌクレオチド（ＰＣＲ産物、または任意の供給源のＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはそれらの任意の混合物）は二本鎖であってもよく、２本の鎖のうちの１本のみが示されている（フォワード鎖）。
【図６】例示的な実施形態の概略図を示す。標的ポリヌクレオチド（ＰＣＲ産物、または任意の供給源のＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはそれらの任意の混合物）は二本鎖であってもよく、２本の鎖のうちの１本のみが示されている（フォワード鎖）。
【図７】例示的な実施形態の概略図を示す。標的ポリヌクレオチド（ＰＣＲ産物、または任意の供給源のＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはそれらの任意の混合物）は二本鎖であってもよく、２本の鎖のうちの１本のみが示されている（フォワード鎖）。
【図８−１】例示的な実施形態の概略図を示す。標的ポリヌクレオチド（ＰＣＲ産物、またはＤＮＡ、またはＲＮＡ、またはそれらの任意の混合物）は二本鎖であってもよく、２本の鎖のうちの１本のみが示されている（フォワード鎖）。
【図８−２】図８−１の続きである。
【図９】例示的な実施形態の概略図を示す。標的ポリヌクレオチド（ＰＣＲ産物、または任意の供給源のＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはそれらの任意の混合物）は二本鎖であってもよく、２本の鎖のうちの１本のみが示されている（フォワード鎖）。
【図１０】例示的な実施形態の概略図を示す。標的ポリヌクレオチド（ＰＣＲ産物、または任意の供給源のＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはそれらの任意の混合物）は二本鎖であってもよく、２本の鎖のうちの１本のみが示されている（フォワード鎖）。
【図１１−１】例示的な実施形態の概略図を示す。標的ポリヌクレオチドの３’伸長が生じて修飾標的を生成する効率を測定するために、ポリヌクレオチド定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）が使用された。
【図１１−２】例示的な実施形態の概略図を示す。標的ポリヌクレオチドの３’伸長が生じて修飾標的を生成する効率を測定するために、ポリヌクレオチド定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）が使用された。
【図１２】例示的な実施形態の概略図を示す。標的ポリヌクレオチド（ＰＣＲ産物、または任意の供給源のＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはそれらの任意の混合物）は二本鎖であってもよく、２本の鎖のうちの１本のみが示されている（フォワード鎖）。
【図１３−１】、例示的な実施形態の概略図を示す。開始材料からシーケンシングデータの分析まで、標的化アンプリコン次世代シーケンシングパネルの生成に使用されるすべてのステップが示されている。標的ポリヌクレオチド（ＰＣＲ産物、またはＤＮＡ、またはＲＮＡ、またはそれらの任意の混合物）は二本鎖であってもよく、２本の鎖のうちの１本のみが示されている（フォワード鎖）。
【図１３−２】図１３−１の続きである。
【図１３−３】図１３−２の続きである
【図１４−１】例示的な実施形態の概略図を示す。開始材料から最終ライブラリーまでの全ゲノムＤＮＡライブラリーの作成に使用されるすべてのステップが示されている。標的ポリヌクレオチド（ＰＣＲ産物、またはＤＮＡ、またはＲＮＡ、またはそれらの任意の混合物）は二本鎖であってもよく、２本の鎖のうちの１本のみが示されている（フォワード鎖）。
【図１４−２】図１４−１の続きである。
【図１５】例示的な実施形態の概略図を示す。標的ポリヌクレオチド（ＰＣＲ産物、またはＤＮＡ、またはＲＮＡ、またはそれらの任意の混合物）は二本鎖であってもよく、２本の鎖のうちの１本のみが示されている（フォワード鎖）。
【図１６−１】例示的な実施形態の概略図を示す。標的ポリヌクレオチド（ＰＣＲ産物、またはＤＮＡ、またはＲＮＡ、またはそれらの任意の混合物）は二本鎖であってもよく、２本の鎖のうちの１本のみが示されている（フォワード鎖）。
【図１６−２】図１６−１の続きである。
【図１６−３】図１６−２の続きである。
【図１７】例示的な実施形態の概略図を示す。ＤＮＡ標的ポリヌクレオチドが示されている。ヌクレアーゼを使用した酵素的断片化のプロセス、または超音波処理によるＤＮＡの物理的せん断のプロセス、またはトランスポザーゼの使用によるプロセスは、Ｃａｓ遺伝子のタイプＩ、タイプＩＩ、タイプＩＩＩまたはその組合せとＣＲＩＳＰＲサブタイプの酵素などのゲノム編集ツールの個別または多重ターゲティングに置き換えることができる。
【図１８】例示的な実施形態の概略図を示す。標的ポリヌクレオチド（ＰＣＲ産物、またはＤＮＡ、またはＲＮＡ、またはそれらの任意の混合物）は二本鎖であってもよく、２本の鎖のうちの１本のみが示されている（フォワード鎖）。
【図１９】例示的な実施形態の概略図を示す。標的ポリヌクレオチド（ＰＣＲ産物、またはＤＮＡ、またはＲＮＡ、またはそれらの任意の混合物）は二本鎖であってもよく、２本の鎖のうちの１本のみが示されている（フォワード鎖）。
【発明を実施するための形態】
【０１７１】
図１Ａは、例示的な実施形態の概略図を示す。標的ポリヌクレオチド（ＰＣＲ産物、またはＤＮＡ、またはＲＮＡ、またはそれらの混合物）は二本鎖であってよく、２本の鎖のうちの１本のみが示されている（フォワード鎖）。ステップ（ｉ）において、ＡＴＯ分子を、１つまたは複数の位置で一本鎖標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズさせる。標的ポリヌクレオチドの３’末端は、ＡＴＯの３’ランダム配列部分にハイブリダイズし、３’オーバーハングが存在する場合はトリミングされ、ＡＴＯを鋳型として使用して伸長される。この伸長により、ＵＩＤとしてのランダム配列とプライミング部位としての３’ユニバーサル配列とを含む修飾標的ポリヌクレオチドが生成される。ステップ（ｉ）の後に、ＡＴＯは消化されまたはアフィニティーキャプチャーによって除去される。一部の実施形態では、ＡＴＯは消化も除去もされない。ステップ（ｉｉ）では、第一のユニバーサルプライマーが加えられて修飾標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし、伸長されて第一の相補配列（ＣＳ）を生成する。
【０１７２】
図１Ｂは、例示的な実施形態の概略図を示す。ステップ（ｉ）において、ＡＴＯを、１つまたは複数の位置で一本鎖標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズさせる。標的ポリヌクレオチドの３’末端は、ＡＴＯの３’ランダム配列部分にハイブリダイズし、３’オーバーハングが存在する場合はトリミングされ、ＡＴＯを鋳型として使用して伸長される。ＡＴＯはステムループ構造を含み、ループ部分はコピー不能なリンケージを含む。伸長は、５’ステム部分配列に置き換わり、コピー不能なリンケージで停止する。この伸長により、ＵＩＤとしてのランダム配列とプライミング部位としての３’ユニバーサル配列とを含む修飾標的ポリヌクレオチドが生成される。ステップ（ｉ）の後に、ＡＴＯは消化されまたはアフィニティーキャプチャーによって除去される。一部の実施形態では、ＡＴＯは消化も除去もされない。ステップ（ｉｉ）では、第一のユニバーサルプライマーが加えられて修飾標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし、伸長されて第一の相補配列（ＣＳ）を生成する。
【０１７３】
図１Ｃは、例示的な実施形態の概略図を示す。ステップ（ｉ）において、ＡＴＯを、１つまたは複数の位置で一本鎖標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズさせる。標的ポリヌクレオチドの３’末端は、ＡＴＯの３’ランダム配列部分にハイブリダイズし、３’オーバーハングが存在する場合はトリミングされ、ＡＴＯを鋳型として使用して伸長される。ＡＴＯはステムループ構造を含み、ループ部分は、ウラシルヌクレオチドなどの消化可能または切断可能な修飾を含み、ヘアピンの破壊を可能にする。伸長鎖は、５’ステム部分配列に出会い、５’リン酸基を含む５’ステム部分に連結される。伸長−ライゲーションにより、ＵＩＤとしてのランダム配列とプライミング部位としての３’ユニバーサル配列とを含む修飾標的ポリヌクレオチドが生成される。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドの１本の鎖の３’末端は、ＡＴＯの５’ステム部分に直接隣接するＡＴＯの３’ランダム配列部分にハイブリダイズし、ＤＮＡライゲーションによってＡＴＯの５’ステム部分に連結される。このライゲーションは、ＤＮＡポリメラーゼを使用せずに行うことができる。ステップ（ｉ）の後に、ＡＴＯは修飾部分で切断され、ＡＴＯの下側は消化されまたはアフィニティーキャプチャーによって除去され得る。ステップ（ｉｉ）では、第一のユニバーサルプライマーが加えられて修飾標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし、伸長されて第一の相補配列（ＣＳ）を生成する。
【０１７４】
図１Ｄは、例示的な実施形態の概略図を示す。反応のステップ（ｉ）において、ＡＴＯを、１つまたは複数の位置で一本鎖標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズさせる。標的ポリヌクレオチドの１本の鎖の３’末端は、ＡＴＯの３’ランダム配列部分にハイブリダイズし、３’オーバーハングが存在する場合はトリミングされ、ＡＴＯを鋳型として使用して伸長される。ＡＴＯは二本鎖構造を含み、ＡＴＯのユニバーサル部分は、アニールして二本鎖領域を形成するように設計された２つの配列（ランダム配列を含むＡＴＯの下側部分、および別個の上側部分）で形成される。標的ヌクレオチドの伸長は、鎖置換活性または５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって上側配列に置き換わりまたはそれを消化する。この伸長により、ＵＩＤとしてのランダム配列とプライミング部位としての３’ユニバーサル配列とを含む修飾標的ポリヌクレオチドが生成される。ＡＴＯは第１の反応後に消化され得る。一部の態様では、標的ポリヌクレオチドの１本の鎖の３’末端は、ＡＴＯの３’ランダム配列部分にハイブリダイズし、３’オーバーハングが存在する場合はトリミングされ、ＡＴＯを鋳型として使用して伸長される。伸長鎖は５’上側配列に出会い、５’リン酸基を含む５’上側配列に連結される。伸長−ライゲーションにより、ＵＩＤとしてのランダム配列とプライミング部位としての３’ユニバーサル配列とを含む修飾標的ポリヌクレオチドが生成される。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドの一本の鎖の３’末端は、ＡＴＯの上側部分の５’末端に直接隣接するＡＴＯの３’ランダム配列部分にハイブリダイズし、ＤＮＡリガーゼによってＡＴＯの上側部分の５’に連結される。このライゲーションは、ＤＮＡポリメラーゼを使用せずに行うことができる。ステップ（ｉ）の後に、ＡＴＯまたはＡＴＯの下側部分は、消化またはアフィニティーキャプチャーによって除去され得る。ステップ（ｉｉ）では、第１のユニバーサルプライマーが加えられて修飾標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし、伸長されて第１の相補配列（ＣＳ）を作成する。
【０１７５】
図２は、例示的な実施形態の概略図を示す。
【０１７６】
（Ａ）標的特異的第２プライマーが提供されて第１のＣＳにハイブリダイズし、伸長されて第２のＣＳを生成する。標的特異的第２プライマーは、３’標的特異的部分と５’ユニバーサル部分とを含む。伸長は、ワンパス伸長、複数サイクルの線形増幅、または第１プライマーと第２プライマーの両方を使用したＰＣＲ増幅であってよい。任意選択で、ＮＧＳプラットフォームに適合するユニバーサルプライマーを使用して、第２のＣＳをさらにＰＣＲ増幅することができる。
【０１７７】
（Ｂ）標的特異的第２プライマーが提供されて第１のＣＳにハイブリダイズし、伸長されて第２のＣＳを生成する。標的特異的第２プライマーは、５’ユニバーサル部分と共にまたは５’ユニバーサル部分なしで、３’標的特異的部分を含む。伸長は、ワンパス伸長、複数サイクルの線形増幅、または第１プライマーと第２プライマーの両方を使用したＰＣＲ増幅であってよい。第２のＣＳは、ネスト化標的特異的第３プライマーと、ＮＧＳプラットフォームに適合するユニバーサルプライマーとを使用してさらにＰＣＲ増幅される。任意選択で、ＮＧＳプラットフォームに適合するユニバーサルプライマーを使用して、第２のＣＳをさらにＰＣＲ増幅することができる。
【０１７８】
（Ｃ）第１プライマーは、標的ポリヌクレオチドの追加されたアダプター配列にアニールし、伸長されて第１のＣＳの二本鎖ＤＮＡを生成する。第１のＣＳの二本鎖ＤＮＡは、ＤＮＡリガーゼによる二本鎖ライゲーションによってアダプターに連結される。ＣＳ鎖のみが連結される必要がある。ライゲーション産物は、任意選択で、固体支持体にアフィニティーキャプチャーにより捕捉することができる。ライゲーション後、２つのユニバーサルプライマーによって産物を増幅することができる。
【０１７９】
（Ｄ）標的ポリヌクレオチドをバイサルファイト処理し、それによって非メチル化シトシン（Ｃ）はウラシルに変換され、メチル化シトシンはそのままである。ＡＴＯは、１つまたは複数の場所で一本鎖標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズする。標的ポリヌクレオチドの一本の鎖の３’末端は、ＡＴＯの３’ランダム配列部分にハイブリダイズし、３’オーバーハングが存在する場合はトリミングされ、ＡＴＯを鋳型として使用して伸長される。この伸長により、ＵＩＤとしてのランダム配列とプライミング部位としての３’ユニバーサル配列とを含む修飾標的ポリヌクレオチドが生成される。ＡＴＯは第１の反応後に消化され得る。修飾標的ポリヌクレオチドはユニバーサルプライマーとハイブリダイズし、このプライマーの３’は、追加の５’ユニバーサル配列の有無にかかわらず修飾標的ポリヌクレオチドのユニバーサル配列にハイブリダイズするように設計されており、また修飾標的ポリヌクレオチドは標的特異的プライマーのプールまたは１つともハイブリダイズし、このプライマーは追加の５’ユニバーサル部分と共にまたは追加の５’ユニバーサル部分なしで３’標的特異的部分を含む。その混合物を、ユニバーサルプライマーと標的特異的プライマーの両方を使用した１または複数サイクルのＰＣＲ増幅で増幅する。この増幅産物は、次世代シーケンシングで直接使用することができ、あるいはさらに処理して次世代シーケンシングに適した生成物にすることもできる。
【０１８０】
（Ｅ）ＡＴＯを、１つまたは複数の場所で一本鎖標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズさせる。標的ポリヌクレオチドの１本の鎖の３’末端は、ＡＴＯの３’ランダム配列部分にハイブリダイズし、３’オーバーハングが存在する場合はトリミングされ、ＡＴＯを鋳型として使用して伸長される。この伸長により、ＵＩＤとしてのランダム配列とプライミング部位としての３’ユニバーサル配列とを含む修飾標的ポリヌクレオチドが生成される。ＡＴＯは第１の反応後に消化され得る。修飾標的ポリヌクレオチドは、続いてバイサルファイト処理を受ける。修飾標的ポリヌクレオチドはユニバーサルプライマーとハイブリダイズし、このプライマーの３’は、追加の５’ユニバーサル配列の有無にかかわらず修飾標的ポリヌクレオチドのユニバーサル配列にハイブリダイズするように設計されており、また修飾標的ポリヌクレオチドは標的特異的プライマーのプールまたは１つともハイブリダイズし、このプライマーは追加の５’ユニバーサル部分と共にまたは追加の５’ユニバーサル部分なしで３’標的特異的部分を含む。その混合物を、ユニバーサルプライマーと標的特異的プライマーの両方を使用した１または複数サイクルのＰＣＲ増幅で増幅する。この増幅産物は、次世代シーケンシングで直接使用することができ、あるいはさらに処理して次世代シーケンシングに適した生成物にすることもできる。
【０１８１】
（Ｆ）第１のＣＳを第２のＡＴＯとハイブリダイズさせ、第１のＣＳの３’末端にアダプター配列が追加された修飾された第１のＣＳが生成される。第１のＣＳは、ビオチンを含む第１プライマーを使用する線形増幅により生成され得る。任意選択で、線形増幅の後、第１のＣＳはアビジンによりアフィニティーキャプチャーされ、第１のＣＳでないものは洗浄により除去される。第２のＡＴＯが加えられ、第１の反応として伸長反応が繰り返される。伸長反応後、未反応産物が洗い流され、産物はユニバーサル配列の両端を標的とする２つのユニバーサルプライマーによって増幅される。第１のＣＳの５’末端を標的とするユニバーサルプライマーは、ネスト化プライマーであってよい。
【０１８２】
（Ｇ）修飾標的ポリヌクレオチドは１つまたは複数のアリコートに分割され、各アリコートはユニバーサルプライマーと組み合わせられ、このプライマーの３’部分は修飾標的ポリヌクレオチドのユニバーサル配列にハイブリダイズするように設計され、かつ次世代シーケンシングに必要な配列を含む５’テールを有しており、また異なる標的特異的プライマーまたは標的特異的プライマーのプールが加えられ、そのプライマーは標的ポリヌクレオチドの標的領域を増幅するように設計されている。標的特異的プライマーは、次世代シーケンシングに必要な配列を含む５’ユニバーサル部分と共に、３’標的特異的部分を含む。この混合物を、ユニバーサルプライマーと標的特異的プライマーの両方を使用した１または複数サイクルのＰＣＲ増幅で増幅する。この増幅の産物は、それぞれが元のポリヌクレオチドの標的領域が増幅されたＰＣＲ産物となり、さらに次世代シーケンシングに適合するのに必要なすべての配列を含む。
【０１８３】
（Ｈ）修飾標的ポリヌクレオチドはユニバーサルプライマーと組み合わせられ、このプライマーは、追加の５’ユニバーサル配列の有無にかかわらず修飾標的ポリヌクレオチドのユニバーサル配列にハイブリダイズするように設計されており、また標的特異的プライマーまたは標的特異的プライマーのプールが加えられる。標的特異的プライマーは、５’ユニバーサル配列と共にまたは５’ユニバーサル配列なしで、３’標的特異的配列を含む。この混合物を、ユニバーサルプライマーと標的特異的プライマーの両方を使用して、１または複数サイクルのＰＣＲ増幅で増幅する。この増幅の産物は、３’および５’ユニバーサル配列を有するまたは有さない、元のポリヌクレオチドの標的領域が増幅されたＰＣＲ断片になる。第１のＰＣＲ反応からの最早不要となった試薬を除去するために第１の増幅産物を精製してもよい。ＰＣＲ産物は、第２のネスト化ユニバーサルプライマー、および異なるネスト化標的特異的プライマーまたはネスト化標的特異的プライマーのプールと組み合わせられ、第２のネスト化ユニバーサルプライマーの３’部分は第１のＰＣＲ産物のユニバーサル配列にハイブリダイズするように設計され、かつ次世代シーケンシングに必要な配列を含む５’テールを有しており、ネスト化標的特異的プライマーは、次世代シーケンシングに必要な配列を含む５’ユニバーサル部分と共に３’標的特異的部分を含む。この混合物を、ユニバーサルプライマーと標的特異的プライマーの両方を使用した１または複数サイクルのＰＣＲ増幅で増幅する。この増幅の産物は、元のポリヌクレオチドの標的領域が増幅されたＰＣＲ産物であり、また次世代シーケンシングに適合するのに必要なすべての配列を含む。
【０１８４】
図３は、例示的な実施形態の概略図を示す。（Ａ）アダプター鋳型オリゴには、（Ａ−Ｔ）に記載されている設計構成要素の任意の組合せに加えて、３’ランダム配列、縮重配列、ヌクレオチドバイアスのあるランダム配列、または標的特異的配列；ＡＴＯを伸長不能にするブロッカー部分が付加されたまさに３’末端；ランダム配列の５’にあるユニバーサル配列；および、作用物質によって認識可能なヌクレオチド配列／修飾（ＮＳＭ）であってよい部分；を含むＡＴＯが含まれる。
【０１８５】
（Ｂ）アダプター鋳型オリゴには、（Ａ−Ｔ）に記載されている設計構成要素の任意の組合せに加えて、ヘアピン／ステムループ構造を含み、ステム部分配列が指示されるＡＴＯが含まれる。ループ部分は、コピー不能なリンケージ、または切断可能なヌクレオチドを含んでもよい。
【０１８６】
（Ｃ）アダプター鋳型オリゴには、（Ａ−Ｔ）に記載されている設計構成要素の任意の組合せに加えて、ヘアピン／ステムループ構造を含み、ステム部分配列が指示されるＡＴＯが含まれる。ステム部分は、コピー不能なリンケージまたは切断可能なヌクレオチドを含んでもよい。
【０１８７】
（Ｄ）アダプター鋳型オリゴには、（Ａ−Ｕ）に記載されている設計構成要素の任意の組合せに加えて、ヘアピン／ステムループ構造を含み、ステム部分配列が指示されるＡＴＯが含まれる。ステム部分は、コピー不能なリンケージまたは切断可能なヌクレオチドを含んでもよい。ループ領域は、一意の識別子として機能することができる、ランダム配列、縮重配列、ヌクレオチドバイアスのあるランダム配列、または標的特異的配列を含んでもよい。
【０１８８】
（Ｅ）アダプター鋳型オリゴには、（Ａ−Ｊ）に記載されている設計構成要素の任意の組合せに加えて、ＡＴＯの下側の鎖の全体または一部に相補的または実質的に相補的な上側の別個の鎖を含む２本の別個の鎖を有し、ＡＴＯの下側の鎖が（Ａ）のＡＴＯに相当するように設計されたＡＴＯが含まれる。
【０１８９】
（Ｆ）アダプター鋳型オリゴには、（Ａ−Ｕ）に記載されている設計構成要素の任意の組合せに加えて、ユニバーサル部位が、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターとして機能するように設計された配列で完全にまたは部分的に構成されているＡＴＯが含まれる。
【０１９０】
（Ｇ）アダプター鋳型オリゴには、（Ａ−Ｕ）に記載されている設計構成要素の任意の組合せに加えて、ユニバーサル部位が、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターとして機能するように設計された配列と、プライミング部位として機能するように設計された別個の配列とで部分的に構成されているＡＴＯが含まれる。
【０１９１】
（Ｈ）アダプター鋳型オリゴには、（Ａ−Ｕ）に記載されている設計構成要素の任意の組合せに加えて、ヘアピン／ステムループ構造を含み、ステム部分配列が指示され、ループ部分は、コピー不能なリンケージ、切断可能なヌクレオチドを含んでいてよく、かつＲＮＡポリメラーゼプロモーターとして機能するように設計された配列を有する、ＡＴＯが含まれる。
【０１９２】
（Ｉ）アダプター鋳型オリゴには、（Ａ−Ｕ）に記載されている設計構成要素の任意の組合せに加えて、ヘアピン／ステムループ構造を含み、ステム部分が、ランダム配列、縮重配列、またはヌクレオチドバイアスのあるランダム配列によって分離された２つまたはそれ以上の領域に分離され、コピー不能なリンケージまたは同等の長さのランダム配列、縮重配列、またはヌクレオチドバイアスのあるランダム配列によってその間がつながれているＡＴＯが含まれる。
【０１９３】
（Ｊ）アダプター鋳型オリゴには、（Ａ−Ｕ）に記載されている設計構成要素の任意の組合せに加えて、標的特異的であるように設計された３’配列と、標的特異的配列の５’にあるランダム配列、縮重配列、またはヌクレオチドバイアスのあるランダム配列と、ランダム配列の５’にあるユニバーサル配列とを含むＡＴＯが含まれる。
【０１９４】
（Ｋ）アダプター鋳型オリゴには、（Ａ−Ｕ）に記載されている設計構成要素の任意の組合せに加えて、下側の鎖が、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターとして機能するように設計された配列と、プライミング部位として機能するように設計された別個の配列とから部分的に構成されるユニバーサル部位を含み、かつ上側の鎖が、二本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを形成できる下側の鎖に部分的または完全に相補的な第２のオリゴであるＡＴＯが含まれる。
【０１９５】
（Ｌ）アダプター鋳型オリゴには、（Ａ−Ｕ）に記載されている設計構成要素の任意の組合せに加えて、ヘアピン／ステムループ構造を含み、ステム部分配列が指示されるＡＴＯが含まれる。ループ領域は、一意の識別子として作用することができる、ランダム配列、縮重配列、ヌクレオチドバイアスのあるランダム配列、または標的特異的配列を含んでいてよく、かつコピー不能なリンケージ、または切断可能なヌクレオチドを含んでいてよい。
【０１９６】
（Ｍ）アダプター鋳型オリゴには、（Ａ−Ｕ）に記載されている設計構成要素の任意の組合せに加えて、ヘアピン／ステムループ構造を含み、ステム部分配列が指示されるＡＴＯが含まれる。ステム部分は、コピー不能なリンケージまたは切断可能なヌクレオチドを含んでもよい。ループ領域は、一意の識別子として機能することができる、ランダム配列、縮重配列、ヌクレオチドバイアスのあるランダム配列、または標的特異的配列を含んでもよい。
【０１９７】
（Ｎ）アダプター鋳型オリゴには、（Ａ−Ｕ）に記載されている設計構成要素の任意の組合せに加えて、ヘアピン／ステムループ構造を含み、ステム部分が、ランダム配列、縮重配列、またはバイアスのあるランダム配列によって分離された２つまたはそれ以上の領域に分離され、コピー不能なリンケージまたは同等の長さのランダム配列、縮重配列、またはヌクレオチドバイアスのあるランダム配列によってその間がつながれているＡＴＯが含まれる。ループ部分は、コピー不能なリンケージまたは切断可能なヌクレオチドを含んでもよい。
【０１９８】
（Ｏ）アダプター鋳型オリゴには、（Ａ−Ｕ）に記載されている設計構成要素の任意の組合せに加えて、３’ランダム配列、縮重配列、またはヌクレオチドバイアスを伴うランダム配列、およびＡＴＯの伸長を可能にするプライマーとしての使用に適したまさに３’末端を有するＡＴＯが含まれる。
【０１９９】
（Ｐ）アダプター鋳型オリゴには、（Ａ−Ｕ）に記載されている設計構成要素の任意の組合せに加えて、３’標的特異的配列と、ＡＴＯの伸長を可能にするプライマーとしての使用に適したまさに３’末端を有するＡＴＯが含まれる。
【０２００】
（Ｑ）アダプター鋳型オリゴには、（Ａ−Ｕ）に記載されている設計構成要素の任意の組合せに加えて、ヘアピン／ステムループ構造を含み、ステム部分配列が指示されるＡＴＯが含まれる。ループ部分は、コピー不能なリンケージまたは切断可能なヌクレオチドを含んでもよい。ＡＴＯの５’は、リン酸などのライゲーションアクセプターで構成される。
【０２０１】
（Ｒ）アダプター鋳型オリゴには、（Ａ−Ｕ）に記載されている設計構成要素の任意の組合せに加えて、ヘアピン／ステムループ構造を含み、ステム部分配列が指示されるＡＴＯが含まれる。ループ部分は、コピー不能なリンケージまたは切断可能なヌクレオチドを含んでもよい。ＡＴＯの５’は、ビオチンなどのアフィニティー精製部分で構成される。
【０２０２】
（Ｓ）アダプター鋳型オリゴには、（Ａ−Ｕ）に記載されている設計構成要素の任意の組合せに加えて、リン酸などのライゲーションアクセプターで構成される５’を有する線状（linear) ＡＴＯが含まれる。
【０２０３】
（Ｔ）アダプター鋳型オリゴには、（Ａ−Ｕ）に記載されている設計構成要素の任意の組合せに加えて、ビオチンなどのアフィニティー精製部分で構成される５’を有する線状ＡＴＯが含まれる。
【０２０４】
（Ｕ）アダプター鋳型オリゴには、（Ａ−Ｕ）に記載されている設計構成要素の任意の組合せに加えて、伸長を防ぐために３’ブロックされたランダム配列と、５’リン酸のみで構成される線状ＡＴＯが含まれる。
【０２０５】
図４は、例示的な実施形態の概略図を示す。ヌクレアーゼを使用した酵素的断片化プロセス、または超音波処理によるＤＮＡの物理的せん断は、トランスポザーゼを使用した断片化で置き換えることができる。ステップ（ｉ）では、標的二本鎖ポリヌクレオチド（ＤＮＡ）をトランスポゾンＤＮＡおよびトランスポザーゼと共にインキュベートする。ランダム転位反応が完了すると、標的ポリヌクレオチドは、トランスポゾンＤＮＡの複数のコピーを含むようになり、それによって標的ポリヌクレオチド上の遊離３’末端と、トランスポゾンＤＮＡの遊離５’末端とが生成される。ステップ（ｉｉ）では、ＡＴＯ分子を、１つまたは複数の位置で一本鎖標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズさせる。標的ポリヌクレオチドの１本の鎖のランダム転位の結果として生成された遊離３’末端は、ＡＴＯの３’ランダム配列部分にハイブリダイズし、３’オーバーハングが存在する場合はトリミングされ、ＡＴＯを鋳型として使用して伸長される。この伸長により、トランスポゾンＤＮＡからの５’ユニバーサル配列、トランスポゾンＤＮＡの３’にある標的ポリヌクレオチド領域、標的ポリヌクレオチドの３’にあるＵＩＤとしてのランダム配列、およびプライミング部位としての３’第２ユニバーサル配列を含む、修飾標的ポリヌクレオチドが生成される。ステップ（ｉｉ）の後に、ＡＴＯは消化されまたはアフィニティーキャプチャーによって除去される。一部の実施形態では、ＡＴＯは消化も除去もされない。ステップ（ｉｉｉ）において、修飾標的ポリヌクレオチドは、相補鎖（ＣＳ）生成、ＰＣＲ増幅またはその他のダウンストリームプロセスのための出発物質として使用される。
【０２０６】
図５は、例示的な実施形態の概略図を示す。標的ポリヌクレオチド（ＰＣＲ産物、または任意の供給源のＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはそれらの任意の混合物）は二本鎖であってもよく、２本の鎖のうちの１本のみが示されている（フォワード鎖）。ステップ（ｉ）において、ＡＴＯ分子を、１つまたは複数の位置で一本鎖標的ポリヌクレオチド配列にランダムにハイブリダイズさせる。ステップ（ｉｉ）では、標的ポリヌクレオチドを鋳型として使用して、ＡＴＯ分子の３’末端が伸長される。この伸長により、５’ユニバーサル配列、ＵＩＤとしてのランダム配列、および３’末端に標的ポリヌクレオチドのコピーを含む修飾標的ポリヌクレオチドのコピーが生成される。ステップ（ｉｉ）の後に、修飾標的ポリヌクレオチドのコピーは精製され、未使用のＡＴＯが除去される。一部の実施形態では、ＡＴＯは消化も除去もされない。ステップ（ｉｉｉ）では、第２のＡＴＯを、１つまたは複数の位置で修飾標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズさせる。修飾標的ポリヌクレオチドのコピーの３’末端は、ＡＴＯの３’ランダム配列部分にハイブリダイズし、３’オーバーハングが存在する場合はトリミングされ、ＡＴＯを鋳型として使用して伸長される。この伸長により、プライミング部位として機能できる３’および５’ユニバーサル部位を含み、これらの内部にはＵＩＤとしての２つの異なるランダム配列があり、中心には標的ポリヌクレオチドのコピーがあるデュアル修飾標的ポリヌクレオチドが生成される。
【０２０７】
図６は、例示的な実施形態の概略図を示す。標的ポリヌクレオチド（ＰＣＲ産物、または任意の供給源のＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはそれらの任意の混合物）は二本鎖であってもよく、２本の鎖のうちの１本のみが示されている（フォワード鎖）。ステップ（ｉ）において、標的特異的配列を用いて設計されたＡＴＯ分子を、１つまたは複数の位置で一本鎖標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズさせる。ステップ（ｉｉ）では、標的ポリヌクレオチドを鋳型として使用して、ＡＴＯ分子の３’末端が伸長される。この伸長により、５’ユニバーサル配列、ＵＩＤとしてのランダム配列、および３’末端に標的ポリヌクレオチドのコピーを含む修飾標的ポリヌクレオチドのコピーが生成される。ステップ（ｉｉ）の後に、修飾標的ポリヌクレオチドのコピーは精製され、未使用のＡＴＯが除去される。一部の実施形態では、ＡＴＯは消化も除去もされない。ステップ（ｉｉｉ）では、第２のＡＴＯを、１つまたは複数の位置で修飾標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズさせる。修飾標的ポリヌクレオチドコピーの３’末端は、ＡＴＯの３’ランダム配列部分にハイブリダイズし、３’オーバーハングが存在する場合はトリミングされ、ＡＴＯを鋳型として使用して伸長される。この伸長により、プライミング部位として機能できる３’および５’ユニバーサル部位を含み、これらの内部にはＵＩＤとしての２つの異なるランダム配列があり、中心には標的ポリヌクレオチドのコピーがあるデュアル修飾標的ポリヌクレオチドが生成される
【０２０８】
図７は、例示的な実施形態の概略図を示す。標的ポリヌクレオチド（ＰＣＲ産物、または任意の供給源のＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはそれらの任意の混合物）は二本鎖であってもよく、２本の鎖のうちの１本のみが示されている（フォワード鎖）。ステップ（ｉ）では、一本鎖標的ポリヌクレオチドが１つまたは複数の位置でＡＴＯ分子にランダムにハイブリダイズする前に、標的ポリヌクレオチドが断片化される。標的ポリヌクレオチドの３’末端は、ＡＴＯの３’ランダム配列部分にハイブリダイズし、３’オーバーハングが存在する場合はトリミングされ、ＡＴＯを鋳型として使用して伸長される。この伸長により、ＵＩＤとしてのランダム配列とプライミング部位としての３’ユニバーサル配列とを含む修飾標的ポリヌクレオチドが生成される。
【０２０９】
図８は、例示的な実施形態の概略図を示す。（ａ）標的ポリヌクレオチド（ＰＣＲ産物、またはＤＮＡ、またはＲＮＡ、またはそれらの任意の混合物）は二本鎖であってもよく、２本の鎖のうちの１本のみが示されている（フォワード鎖）。ステップ（ｉ）では、一本鎖標的ポリヌクレオチドが１つまたは複数の位置でＡＴＯ分子にランダムにハイブリダイズする前に、標的ポリヌクレオチドが断片化され、ＡＴＯはＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含む。標的ポリヌクレオチドの３’末端は、ＡＴＯの３’ランダム配列部分にハイブリダイズし、３’オーバーハングが存在する場合はトリミングされ、ＡＴＯを鋳型として使用して伸長される。この伸長により、標的ポリヌクレオチドとＡＴＯの間の二本鎖配列の領域を含む修飾標的ポリヌクレオチドが生成され、その領域はＵＩＤとしてのランダム配列と、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む３’ユニバーサル配列とを含む。ステップ（ｉ）の後に、任意選択で修飾標的ポリヌクレオチドは精製され、未使用のＡＴＯが除去される。一部の実施形態では、ＡＴＯは消化も除去もされない。ステップ（ｉｉ）では、修飾標的ポリヌクレオチドの二本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを使用して、修飾標的ポリヌクレオチドのＲＮＡコピー（第１の相補配列）が生成される。
【０２１０】
（ｂ）標的ポリヌクレオチド（ＰＣＲ産物、または任意の供給源のＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはそれらの混合物）は二本鎖であってもよく、２本の鎖のうちの１本のみが示されている（フォワード鎖）。ステップ（ｉ）では、一本鎖標的ポリヌクレオチドが１つまたは複数の位置でＡＴＯ分子にランダムにハイブリダイズする前に、標的ポリヌクレオチドが断片化され、ＡＴＯはＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含む。標的ポリヌクレオチドの３’末端は、ＡＴＯの３’ランダム配列部分にハイブリダイズし、３’オーバーハングが存在する場合はトリミングされ、ＡＴＯを鋳型として使用して伸長される。この伸長により、ＵＩＤとしてのランダム配列と、修飾標的ポリヌクレオチドの３’末端にヘアピンを形成できる相補領域を含むプライミング部位としての３’ユニバーサル配列とを含む、修飾標的ポリヌクレオチドが生成される。ステップ（ｉ）の後に、ＡＴＯは消化されまたはアフィニティーキャプチャーによって除去される。一部の実施形態では、ＡＴＯは消化も除去もされない。ステップ（ｉｉ）では、修飾標的ポリヌクレオチドの３’末端は、それ自身にアニールすることにより小さなヘアピンを形成でき、それによって３’末端はプライマーとして機能し、伸長されると二本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む第１の相補配列が生成される。ステップ（ｉｉｉ）では、修飾標的ポリヌクレオチドの二本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを使用して、修飾標的ポリヌクレオチドのＲＮＡコピー（第１の相補配列）が生成される。
【０２１１】
図９は、例示的な実施形態の概略図を示す。標的ポリヌクレオチド（ＰＣＲ産物、または任意の供給源のＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはそれらの任意の混合物）は二本鎖であってもよく、２本の鎖のうちの１本のみが示されている（フォワード鎖）。ステップ（ｉ）では、１本鎖標的ポリヌクレオチドが１つまたは複数の位置でＡＴＯ分子にランダムにハイブリダイズする前に、標的ポリヌクレオチドが断片化される。標的ポリヌクレオチドの３’末端は、ＡＴＯの３’ランダム配列部分にハイブリダイズし、３’オーバーハングが存在する場合はトリミングされ、ＡＴＯを鋳型として使用して伸長される。伸長により、ＵＩＤとしてのランダム配列と、修飾標的ポリヌクレオチドの３’末端にヘアピンを形成できる相補領域を含むプライミング部位としての３’ユニバーサル配列とを含む修飾標的ポリヌクレオチドが生成される。ステップ（ｉ）の後に、ＡＴＯは消化されまたはアフィニティーキャプチャーによって除去される。一部の実施形態では、ＡＴＯは消化も除去もされない。ステップ（ｉｉ）では、修飾標的ポリヌクレオチドの３’端は、それ自身にアニールすることにより小さなヘアピンを形成でき、それによって３’末端はプライマーとして機能し、伸長されると第１の相補配列が生成される。
【０２１２】
図１０は、例示的な実施形態の概略図を示す。標的ポリヌクレオチド（ＰＣＲ産物、または任意の供給源のＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはそれらの任意の混合物）は二本鎖であってもよく、２本の鎖のうちの１本のみが示されている（フォワード鎖）。ステップ（ｉ）では、１本鎖標的ポリヌクレオチドが１つまたは複数の位置でＡＴＯ分子にランダムにハイブリダイズする前に、標的ポリヌクレオチドが断片化される。標的ポリヌクレオチドの３’末端は、ＡＴＯの３’ランダム配列部分にハイブリダイズし、３’オーバーハングが存在する場合はトリミングされ、ＡＴＯを鋳型として使用して伸長される。この伸長により、ＵＩＤとしてのランダム配列と、プライミング部位としての３’ユニバーサル配列とを含む修飾標的ポリヌクレオチドが生成される。ステップ（ｉ）の後に、ＡＴＯは消化されまたはアフィニティーキャプチャーによって除去される。一部の実施形態では、ＡＴＯは消化も除去もされない。ステップ（ｉｉ）では、標的特異的プライマーが修飾標的ポリヌクレオチドに加えられ、修飾標的ポリヌクレオチドの５’末端に到達するまでポリメラーゼにより伸長される。ステップ（ｉｉｉ）では、二本鎖アダプターを適切な酵素とともに修飾標的ポリヌクレオチドと混合し、その後、アダプターを修飾標的ポリヌクレオチドの５’二本鎖ＤＮＡに連結させる。
【０２１３】
図１１は、例示的な実施形態の概略図を示す。標的ポリヌクレオチドの３’伸長が生じて修飾標的を生成する効率を測定するために、ポリヌクレオチド定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）が使用された。使用した標的ポリヌクレオチドは、既知の長さおよび配列の一本鎖ＤＮＡオリゴ、内部コントロール（ＩＣ）であった。また、１０％の量の内部コントロール（ＩＣ）である既知の長さおよび配列の一本鎖ＤＮＡオリゴと混合したゲノムＤＮＡも標的ポリヌクレオチドとして使用した。修飾標的ポリヌクレオチドが生成されると、それら両方が３つの異なるｑＰＣＲ反応のための鋳型として独立して使用され、１つは標的ポリヌクレオチド配列内に位置する２つのプライマー（フォワードプライマーおよびリバースプライマー１）を用い、もう１つは、標的ポリヌクレオチド内に位置するプライマーと、修飾標的ポリヌクレオチドに追加されたユニバーサル配列中にあるプライマーと（フォワードプライマーおよびリバースプライマー２）を用い、別の１つは、標的ポリヌクレオチド内に位置するプライマーと、修飾標的ポリヌクレオチドと相同ではないテールを有する、修飾標的ポリヌクレオチドに追加されたユニバーサル配列の末端にあるプライマーと（フォワードプライマーおよびリバースプライマー３）を用い、それら反応のすべてに標的ポリヌクレオチド内に位置するデュアルラベルｑＰＣＲプローブ（プローブ）が含まれていた。ＩＣ内とユニバーサル配列内に位置するプライマーペアにおいて蛍光増幅シングルが検出された「ＣＴ」値と比較した、ＩＣコントロール特異的プライマーにおいて蛍光増幅シングルが検出された「ＣＴ」値が、標的ポリヌクレオチド３’伸長の効率の比例指標を与える。「ＣＴ」値は非常に類似しているため、効率は５０〜１００％と解釈できる。
【０２１４】
図１２は、例示的な実施形態の概略図を示す。標的ポリヌクレオチド（ＰＣＲ産物、または任意の供給源のＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはそれらの任意の混合物）は二本鎖であってもよく、２本の鎖のうちの１本のみが示されている（フォワード鎖）。ステップ（ｉ）では、１本鎖標的ポリヌクレオチドが１つまたは複数の位置でＡＴＯ分子にランダムにハイブリダイズする前に、標的ポリヌクレオチドが断片化される。標的ポリヌクレオチドの３’末端は、ＡＴＯの３’ランダム配列部分にハイブリダイズし、３’オーバーハングが存在する場合はトリミングされ、ＡＴＯを鋳型として使用して伸長される。この伸長により、ＵＩＤとしてのランダム配列と、修飾標的ポリヌクレオチドの３’末端にヘアピンを形成できる相補的領域を含むプライミング部位としての３’ユニバーサル配列とを含む修飾標的ポリヌクレオチドが生成される。ステップ（ｉｉ）において、修飾標的ポリヌクレオチドの３’末端は、それ自身にアニールすることにより小さなヘアピンを形成できる。ステップ（ｉｉｉ）では、３’末端がプライマーとして機能し、伸長されると第１の相補鎖が生成される。ステップ（ｉｉｉ）の後に、ＡＴＯは消化されまたはアフィニティーキャプチャーによって除去される。一部の実施形態では、ＡＴＯは消化も除去もされない。ステップ（ｉｖ）では、第１のＣＳの二本鎖ＤＮＡは、ＤＮＡリガーゼによる二本鎖ライゲーションによってアダプターに連結される。ステップ（ｖ）では、反応混合物をｄＵ−グリコシラーゼ、アプリン／アピリミジンエンドヌクレアーゼ、およびＳ１ヌクレアーゼの混合物とインキュベートすることにより、残ったＡＴＯが消化され、ヘアピンが切断される。最終二本鎖産物を、適合する次世代シーケンサー（例えば、ＭｉＳｅｑ）でのシーケンシングに直接使用する。
【０２１５】
図１３は、例示的な実施形態の概略図を示す。開始材料からシーケンシングデータの分析まで、標的化アンプリコン次世代シーケンシングパネルの生成に使用されるすべてのステップが示されている。標的ポリヌクレオチド（ＰＣＲ産物、またはＤＮＡ、またはＲＮＡ、またはそれらの任意の混合物）は二本鎖であってもよく、２本の鎖のうちの１本のみが示されている（フォワード鎖）。ステップ（ｉ）において、標的ポリヌクレオチドは酵素的に断片化される。ステップ（ｉｉ）では、断片化された標的ポリヌクレオチドのサイズ分布が、高感度バイオアナライザチップを使用して決定される。ステップ（ｉｉｉ）において、断片化された標的ポリヌクレオチドを１つまたは複数の位置でＡＴＯ分子にランダムにハイブリダイズさせる。標的ポリヌクレオチドの３’末端は、ＡＴＯの３’ランダム配列部分にハイブリダイズし、３’オーバーハングが存在する場合はトリミングされ、ＡＴＯを鋳型として使用して伸長される。この伸長により、ＵＩＤとしての３’ランダム配列と、プライミング部位としての３’ユニバーサル配列とを含む修飾標的ポリヌクレオチドが生成される。ステップ（ｉｉｉ）において、ＡＴＯは消化されまたはアフィニティーキャプチャーによって除去される。一部の実施形態では、ＡＴＯは消化も除去もされない。ステップ（ｉｖ）では、修飾標的ポリヌクレオチド、ＡＴＯのユニバーサル部位に結合するように設計されたユニバーサルプライマー、遺伝子特異的プライマーのプール、適切なバッファー、適切な酵素、ｄＮＴＰ、およびその他の添加物が組み合わせられて、修飾標的ポリヌクレオチドを指数関数的に増幅させるために使用される。ステップ（ｖ）では、ＰＣＲ産物が精製される。ステップ（ｖｉ）では、第１のＰＣＲ産物、ＰＣＲ産物のユニバーサル部位に結合するように設計された第２のユニバーサルプライマー、第２のネスト化された遺伝子特異的プライマーのプール、適切なバッファー、適切な酵素、ｄＮＴＰ、およびその他の添加物が組み合わせられて、修飾標的ポリヌクレオチドを指数関数的に増幅させるために使用される。ステップ（ｖｉｉ）では、第２のＰＣＲ産物が精製される。ステップ（ｖｉｉｉ）では、高感度バイオアナライザチップを使用して、最終シーケンシングライブラリーのサイズ分布が決定された。ライブラリーは、１５０ｂｐのペアエンドシーケンシングを備えたＭｉＳｅｑシーケンサーを使用してシーケンシングされた。その後、ｂｗａアライナーとカスタムデータフィルタリングＰｙｔｈｏｎスクリプトの組合せを使用して、シーケンシングデータを解析した。データ図（Ｈ）は、ＭｉＳｅｑによって作成されたシーケンシングデータから抽出されたインサートのサイズの分布を表し、（Ｉ）は、指数関数的増幅で使用されるプール中に存在するすべてのプライマーにわたるリード（読み取り）の分布を表し、（Ｊ）は少なくとも３つのリードがあるファミリーサイズのシーケンシングデータ中に認められる「バーコードファミリー」の数を示す。
【０２１６】
図１４は、例示的な実施形態の概略図を示す。開始材料から最終ライブラリーまでの全ゲノムＤＮＡライブラリーの作成に使用されるすべてのステップが示されている。標的ポリヌクレオチド（ＰＣＲ産物、またはＤＮＡ、またはＲＮＡ、またはそれらの任意の混合物）は二本鎖であってもよく、２本の鎖のうちの１本のみが示されている（フォワード鎖）。ステップ（ｉ）において、標的ポリヌクレオチドは酵素的に断片化される。ステップ（ｉｉ）では、断片化された標的ポリヌクレオチドのサイズ分布が、高感度バイオアナライザチップを使用して決定される。ステップ（ｉｉｉ）において、断片化された標的ポリヌクレオチドを１つまたは複数の位置でＡＴＯ分子にランダムにハイブリダイズさせる。標的ポリヌクレオチドの３’末端は、ＡＴＯの３’ランダム配列部分にハイブリダイズし、３’オーバーハングが存在する場合はトリミングされ、ＡＴＯを鋳型として使用して伸長される。この伸長により、ＵＩＤとしての３’ランダム配列と、プライミング部位としての３’ユニバーサル配列とを含む修飾標的ポリヌクレオチドが生成される。ステップ（ｉｉｉ）において、ＡＴＯは消化されまたはアフィニティーキャプチャーによって除去される。一部の実施形態では、ＡＴＯは消化も除去もされない。ステップ（ｉｖ）では、修飾標的ポリヌクレオチド、ＡＴＯのユニバーサル部位に結合するように設計されたユニバーサルプライマー、適切なバッファー、適切な酵素、ｄＮＴＰ、およびその他の添加物が組み合わせられて、修飾標的ポリヌクレオチドを線形増幅して第１のＣＳ（相補配列）を作成するために使用される。その後、産物は任意選択で精製される。ステップ（ｖ）では、線形ＣＳを、１つまたは複数の位置でＡＴＯ分子にランダムにハイブリダイズさせる。線形ＣＳの３’末端は、ＡＴＯの３’ランダム配列部分にハイブリダイズし、３’オーバーハングが存在する場合はトリミングされ、ＡＴＯを鋳型として使用して伸長される。この伸長により、各末端に、ＵＩＤとしてのランダム配列と、プライミング部位としての異なる３’および５’ユニバーサル配列とを含む修飾されたＣＳが生成される。ステップ（ｖｉ）では、ＡＴＯが消化されまたはアフィニティーキャプチャーによって除去される。一部の実施形態では、ＡＴＯは消化も除去もされない。ステップ（ｖｉｉ）では、修飾されたＣＳ産物、修飾されたＣＳ産物の５’および３’末端にあるユニバーサル部位に結合するように設計された２つの異なるユニバーサルプライマー、必要なバッファー、酵素、ｄＮＴＰ、およびその他の添加物が組み合わせられて、修飾されたＣＳ産物を指数関数的に増幅するために使用される。ステップ（ｖｉｉｉ）では、第２のＰＣＲ産物が精製される。ステップ（ｉｘ）では、高感度バイオアナライザチップを使用して、最終シーケンシングライブラリーのサイズ分布を決定した。
【０２１７】
図１５は、例示的な実施形態の概略図を示す。標的ポリヌクレオチド（ＰＣＲ産物、またはＤＮＡ、またはＲＮＡ、またはそれらの任意の混合物）は二本鎖であってもよく、２本の鎖のうちの１本のみが示されている（フォワード鎖）。ステップ（ｉ）において、一本鎖標的ポリヌクレオチドを、１つまたは複数の位置でＡＴＯ分子にランダムにハイブリダイズさせる。標的ポリヌクレオチドの３’末端は、ＡＴＯの３’ランダム配列部分にハイブリダイズし、３’オーバーハングが存在する場合はトリミングされ、ＡＴＯを鋳型として使用して伸長される。この伸長により、ＵＩＤとしての可変長ランダム配列と、プライミング部位としての３’ユニバーサル配列とを含む修飾標的ポリヌクレオチドが生成される。ステップ（ｉｉ）において、修飾標的ポリヌクレオチドは精製され、未使用のＡＴＯが除去される。一部の実施形態では、ＡＴＯは消化も除去もされない。ステップ（ｉｉｉ）では、修飾標的ポリヌクレオチド、ＰＣＲ産物のユニバーサル部位に結合するように設計されたユニバーサルプライマー、遺伝子特異的プライマー、適切なバッファー、適切な酵素、ｄＮＴＰ、およびその他の添加物が組み合わせられて、修飾標的ポリヌクレオチドを指数関数的に増幅するために使用される。
【０２１８】
図１６は、例示的な実施形態の概略図を示す。標的ポリヌクレオチド（ＰＣＲ産物、またはＤＮＡ、またはＲＮＡ、またはそれらの任意の混合物）は二本鎖であってもよく、２本の鎖のうちの１本のみが示されている（フォワード鎖）。
【０２１９】
（Ａ）修飾標的ポリヌクレオチドは、２つのほぼ等しいアリコートに分割される。これらの各アリコートにユニバーサルプライマーが加えられる。このプライマーの３’は、修飾標的ポリヌクレオチドのユニバーサル配列にハイブリダイズするように設計されており、かつ次世代シーケンシングに必要な配列を含む５’テールを有している。各アリコートに、異なる標的特異的プライマーまたは標的特異的プライマーのプールが加えられ、各プールのプライマーは、標的ポリヌクレオチドの標的領域のフォワード鎖またはリバース鎖のいずれかを増幅するように設計されている。標的特異的プライマーは、次世代シーケンシングに必要な配列を含む５’ユニバーサル部分と共に、３’標的特異的部分を含む。２つの別個の混合物は、ユニバーサルプライマーと標的特異的プライマーの両方を使用した複数サイクルのＰＣＲ増幅で増幅される。この増幅の産物は、それぞれが元のポリヌクレオチドの鎖の一方または他方を増幅したＰＣＲ産物の２つの別個のプールになり、次世代シーケンシングに適合するのに必要なすべての配列を含む。
【０２２０】
（Ｂ）修飾標的ポリヌクレオチドは、２つのほぼ等しいアリコートに分割される。これらの各アリコートにユニバーサルプライマーが加えられ、このプライマーは、追加の５’ユニバーサル配列の有無にかかわらず修飾標的ポリヌクレオチドのユニバーサル配列にハイブリダイズするように設計されている。各アリコートに、異なる標的特異的プライマーまたは標的特異的プライマーのプールが加えられ、各プール中のプライマーは、標的ポリヌクレオチドの標的領域のフォワード鎖またはリバース鎖のいずれかを増幅するように設計されている。標的特異的プライマーは、５’ユニバーサル配列と共にまたは５’ユニバーサル配列なしで、３’標的特異的配列を含む。２つの別個の混合物は、ユニバーサルプライマーと標的特異的プライマーのプールの両方を使用した複数サイクルのＰＣＲ増幅で増幅される。この増幅の産物は、３’および５’ユニバーサル配列を有するまたは有さない、それぞれが元のポリヌクレオチドの鎖の一方または他方を増幅したＰＣＲ産物の２つの別個のプールになる。第１のＰＣＲ反応からの最早不要となった試薬を除去するために第１の増幅産物を精製してもよい。ＰＣＲ産物の２つの別個のプールのそれぞれを、第２のユニバーサルプライマー；第１のＰＣＲで使用されたユニバーサルプライマーまたはネスト化ユニバーサルプライマーであって、このプライマーの３’は第１のＰＣＲ産物のユニバーサル配列にハイブリダイズするように設計されておりかつ次世代シーケンシングに必要な配列を含む５’テール有するユニバーサルプライマー；および次世代シーケンシングに必要な配列を含む５’ユニバーサル部分と共に３’標的特異的部分を含む異なるネスト化標的特異的プライマーまたはネスト化標的特異的プライマーのプール；と組み合わせる。２つの別個の混合物は、ユニバーサルプライマーと標的特異的プライマーのプールの両方を使用した複数サイクルのＰＣＲ増幅で増幅される。この増幅の産物は、それぞれが元のポリヌクレオチドの一方または他方の鎖を増幅したＰＣＲ産物の２つの別個のプールであり、次世代シーケンシングに適合するのに必要なすべての配列を含む。
【０２２１】
（Ｃ）修飾標的ポリヌクレオチドはユニバーサルプライマーと組み合わせられ、このプライマーは追加の５’ユニバーサル配列の有無にかかわらず修飾標的ポリヌクレオチドのユニバーサル配列にハイブリダイズするように設計されている。次いで、修飾標的ポリヌクレオチドは、１または複数ラウンドの増幅により線形増幅される。線形増幅反応物からの最早不要となった試薬を除去するために、線形増幅産物を精製してもよい。線形増幅産物は、２つのほぼ等しいアリコートに分割される。これらの各アリコートにユニバーサルプライマーが加えられ、このプライマーの３’は修飾標的ポリヌクレオチドのユニバーサル配列にハイブリダイズするように設計されており、かつ次世代シーケンシングに必要な配列を含む５’テールを有する。各アリコートに、異なる標的特異的プライマーまたは標的特異的プライマーのプールが加えられ、各プールは、標的ポリヌクレオチドのフォワード鎖またはリバース鎖のいずれかの標的領域を増幅するように設計されたプライマーを含む。標的特異的プライマーは、次世代シーケンシングに必要な配列を含む５’ユニバーサル部分と共に、３’標的特異的部分を含む。２つの別個の混合物は、ユニバーサルプライマーとプライマープールの両方を使用した複数サイクルのＰＣＲ増幅で増幅される。この増幅の産物は、それぞれが元のポリヌクレオチドの鎖の一方または他方を増幅したＰＣＲ産物の２つの別個のプールであり、次世代シーケンシングに適合するのに必要なすべての配列を含む。
【０２２２】
（Ｄ）修飾標的ポリヌクレオチドはユニバーサルプライマーと組み合わせられ、このプライマーは、追加の５’ユニバーサル配列の有無にかかわらず修飾標的ポリヌクレオチドのユニバーサル配列にハイブリダイズするように設計されている。次いで、修飾標的ポリヌクレオチドは、１または複数ラウンドの増幅により線形増幅される。第１のＰＣＲ反応からの最早不要となった試薬を除去するために線形増幅産物を精製してもよい。線形増幅産物は、２つのほぼ等しいアリコートに分割される。これらの各アリコートにユニバーサルプライマーが加えられ、このプライマーは、追加の５’ユニバーサル配列の有無にかかわらず修飾標的ポリヌクレオチドのユニバーサル配列にハイブリダイズするように設計されている。各アリコートに、異なる標的特異的プライマーまたは標的特異的プライマーのプールが加えられ、各プールは標的ポリヌクレオチドのフォワード鎖またはリバース鎖のいずれかの標的領域を増幅するように設計されたプライマーを含む。標的特異的プライマーは、５’ユニバーサル配列と共にまたは５’ユニバーサル配列なしで、３’標的特異的配列を含む。２つの別個の混合物は、ユニバーサルプライマーとプライマープールとの両方を使用した複数サイクルのＰＣＲ増幅で増幅される。この増幅の産物は、３’および５’ユニバーサル配列を有するまたは有さない、それぞれが元のポリヌクレオチドの鎖の一方または他方を増幅したＰＣＲ産物の２つの別個のプールになる。第１のＰＣＲ反応からの最早不要となった試薬を除去するために第１の増幅産物を精製してもよい。ＰＣＲ産物の２つの別個のプールのそれぞれを、第２のネスト化ユニバーサルプライマーまたは第１の増幅で使用されたユニバーサルプライマーであって、このプライマーの３’は第１のＰＣＲ産物のユニバーサル配列にハイブリダイズするように設計されかつ次世代のシーケンシングに必要な配列を含むテールを有するユニバーサルプライマー；および次世代のシーケンシングに必要な配列を含む５’ユニバーサル部分と共に３’標的特異的部分を含む、異なるネスト化標的特異的プライマーまたはネスト化標的特異的プライマーのプール；と組み合わせる。２つの別個の混合物は、ユニバーサルプライマーとプライマープールの両方を使用した複数サイクルのＰＣＲ増幅で増幅される。この増幅の産物は、それぞれが元のポリヌクレオチドの鎖の一方または他方を増幅したＰＣＲ産物の２つの別個のプールであり、次世代シーケンシングに適合するのに必要なすべての配列を含む。
【０２２３】
（Ｅ）修飾標的ポリヌクレオチドはユニバーサルプライマーと組み合わせられ、このプライマーは、追加の５’ユニバーサル配列の有無にかかわらず修飾標的ポリヌクレオチドのユニバーサル配列にハイブリダイズするように設計されており、標的特異的プライマーまたは標的特異的プライマーのプールが加えられ、このプライマーは標的ポリヌクレオチドのフォワード鎖またはリバース鎖を増幅するように設計されている。標的特異的プライマーは、５’ユニバーサル配列と共にまたは５’ユニバーサル配列なしで、３’標的特異的配列を含む。この混合物は、ユニバーサルプライマーと標的特異的プライマーの両方を使用した複数サイクルのＰＣＲ増幅で増幅される。この増幅の産物は、３’および５’ユニバーサル配列を有するまたは有さない、元のポリヌクレオチドの鎖の一方または他方を増幅したＰＣＲ産物のプールである。第１の増幅産物は精製され、未使用の一本鎖プライマーがすべて除去される。精製された第１の増幅産物はユニバーサルプライマーと組み合わせられ、このプライマーは、追加の５’ユニバーサル配列の有無にかかわらず修飾標的ポリヌクレオチドのユニバーサル配列にハイブリダイズするように設計されており、標的特異的プライマーまたは標的特異的プライマーのプールが加えられ、この標的特異的プライマーは、第１の増幅反応で標的にされなかった標的ポリヌクレオチドのフォワード鎖またはリバース鎖を増幅するように設計されている。フォワード鎖が第１の反応で標的にされた場合、第２の反応ではリバースが標的にされる。標的特異的プライマーは、５’ユニバーサル配列と共にまたは５’ユニバーサル配列なしで、３’標的特異的配列を含む。この混合物は、ユニバーサルプライマーと標的特異的プライマーの両方を使用した複数サイクルのＰＣＲ増幅で増幅される。第２の増幅産物は精製され、未使用のプライマーがすべて除去される。第２の増幅産物は、２つのほぼ等しいアリコートに分割される。これらの各アリコートに第２のユニバーサルプライマーが加えられ、このプライマーの３’は、修飾標的ポリヌクレオチドのユニバーサル配列にハイブリダイズするように設計され、かつ次世代シーケンシングに必要な配列を含む５’テールを有している。各アリコートに、異なるネスト化標的特異的プライマーまたはネスト化標的特異的プライマーのプールが加えられ、そのプライマーは標的ポリヌクレオチドのフォワード鎖またはリバース鎖のいずれかを増幅するように設計されている。標的特異的プライマーは、次世代シーケンシングに必要な配列を含む５’ユニバーサル部分と共に、３’標的特異的部分を含む。２つの別個の混合物は、ユニバーサルプライマーと標的特異的プライマーの両方を使用した複数サイクルのＰＣＲ増幅で増幅される。この増幅の産物は、それぞれが元のポリヌクレオチドの鎖のいずれかを増幅したＰＣＲ産物の２つの別個のプールになり、次世代シーケンシングに適合するのに必要なすべての配列を含む。
【０２２４】
（Ｆ）修飾標的ポリヌクレオチドはユニバーサルプライマーと組み合わせられ、このプライマーは、追加の５’ユニバーサル配列を有する修飾標的ポリヌクレオチドのユニバーサル配列にハイブリダイズするように設計されており、標的特異的プライマーまたは標的特異的プライマーのプールが加えられ、このプライマーは、標的ポリヌクレオチドのフォワード鎖またはリバース鎖を増幅するように設計されている。標的特異的プライマーは、５’ユニバーサル配列と共に、３’標的特異的配列を含む。この混合物は、ユニバーサルプライマーと標的特異的プライマーの両方を使用した複数サイクルのＰＣＲ増幅で増幅される。この増幅の産物は、５’および３’のユニバーサル配列を有する、元のポリヌクレオチドの鎖の一方または他方をそれぞれ増幅したＰＣＲ産物のプールになる。第１の増幅産物は精製され、未使用のプライマーがすべて除去される。精製された第１の増幅産物はユニバーサルプライマーと組み合わせられ、このプライマーは、追加の５’ユニバーサル配列を有する修飾標的ポリヌクレオチドのユニバーサル配列にハイブリダイズするように設計されており、標的特異的プライマーまたは標的特異的プライマーのプールが加えられ、この標的特異的プライマーは、第１の増幅反応で標的にされなかった標的ポリヌクレオチドのフォワード鎖またはリバース鎖を増幅するように設計されている。フォワード鎖が第１の反応で標的にされた場合、第２の反応ではリバース鎖が標的にされる。標的特異的プライマーは、５’ユニバーサル配列と共に、３’標的特異的配列を含む。この混合物は、ユニバーサルプライマーと標的特異的プライマーの両方を使用した複数サイクルのＰＣＲ増幅で増幅される。第２の増幅産物は精製され、未使用のプライマーがすべて除去される。第２の増幅産物は２つのユニバーサルプライマーと混合され、それらプライマーの３’は、増幅産物の３’および５’のユニバーサル配列にハイブリダイズするように設計されており、かつ次世代シーケンシングに必要な配列を含む５’テールを有している。２つの混合物は、両方のユニバーサルプライマーを使用した複数サイクルのＰＣＲ増幅で増幅される。この増幅の産物は、それぞれが元のポリヌクレオチドの両方の鎖を独立して増幅したＰＣＲ産物のプールになり、次世代シーケンシングに適合するのに必要なすべての配列を含む。
【０２２５】
図１７は、例示的な実施形態の概略図を示す。ＤＮＡ標的ポリヌクレオチドが示されている。ヌクレアーゼを使用した酵素的断片化のプロセス、または超音波処理によるＤＮＡの物理的せん断のプロセス、またはトランスポザーゼの使用によるプロセスは、Ｃａｓ遺伝子のタイプＩ、タイプＩＩ、タイプＩＩＩまたはその組合せとＣＲＩＳＰＲサブタイプの酵素などのゲノム編集ツールの個別または多重ターゲティングに置き換えることができる。例として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素をＤＮＡ、および１つ以上のガイドＲＮＡの混合物とともにインキュベートする。これにより、ＤＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素、およびガイドＲＮＡが結合し、ガイドＲＮＡはＤＮＡの二本鎖または一本鎖切断を標的にする。次いで、標的断片化ＤＮＡは精製され、第１のＡＴＯ反応などの任意の後続のダウンストリームプロセスで使用できる。
【０２２６】
図１８は、例示的な実施形態の概略図を示す。標的ポリヌクレオチド（ＰＣＲ産物、またはＤＮＡ、またはＲＮＡ、またはそれらの任意の混合物）は二本鎖であってもよく、２本の鎖のうちの１本のみが示されている（フォワード鎖）。ステップ（ｉ）では、ＡＴＯ分子を、１つまたは複数の位置で一本鎖標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズさせる。標的ポリヌクレオチドの３’末端は、ＡＴＯの３’ランダム配列部分にハイブリダイズし、３’オーバーハングが存在する場合はトリミングされ、ＡＴＯを鋳型として使用して伸長される。この伸長により、ＵＩＤとしてのランダム配列を含む修飾標的ポリヌクレオチドが生成される。ステップ（ｉ）の後に、ＡＴＯは消化されまたはアフィニティーキャプチャーによって除去される。一部の実施形態では、ＡＴＯは消化も除去もされない。ステップ（ｉｉ）において、標的ポリヌクレオチドは、末端修復プロセス、続いて二本鎖アダプターとのライゲーションを受ける。このライゲーション反応の産物は、短い５’連結配列と、より長いユニバーサル３’連結配列とを含む修飾標的ポリヌクレオチドとなる。これを、ダウンストリームプロセスで使用できる。
【０２２７】
図１９は、例示的な実施形態の概略図を示す。標的ポリヌクレオチド（ＰＣＲ産物、またはＤＮＡ、またはＲＮＡ、またはそれらの任意の混合物）は二本鎖であってもよく、２本の鎖のうちの１本のみが示されている（フォワード鎖）。この描写は、ポリヌクレオチドの伸長のためのプライマーとして、ＲＮＡではなくＤＮＡのみを使用するポリメラーゼの能力を利用している。第１のラウンドでは、ＡＴＯ分子を、１つまたは複数の位置で一本鎖標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズさせる。標的ポリヌクレオチドの３’末端は、ＡＴＯの３’ランダム配列部分にハイブリダイズし、３’オーバーハングが存在する場合はトリミングされ、ＡＴＯを鋳型として使用し、ＲＮＡプライマーを使用できないポリメラーゼを使用して、ＤＮＡのみが伸長される。ＡＴＯは、消化されまたはアフィニティーキャプチャーによって除去される。一部の実施形態では、ＡＴＯは消化も除去もされない。修飾標的ＤＮＡポリヌクレオチドの３’末端は、それ自身にアニールすることにより小さなヘアピンを形成することができ、それによって３’末端はプライマーとして機能し、伸長されると第１の相補配列が生成される。ヘアピンを有する二本鎖ＤＮＡは、ＡＴＯハイブリダイゼーションの第２ラウンド中に優先的に二重鎖を再形成させるように作用する。標的ＲＮＡポリヌクレオチドの３’末端は、ＡＴＯの３’ランダム配列部分にハイブリダイズし、ＡＴＯを鋳型として使用しかつポリメラーゼを使用して伸長される。修飾標的ＲＮＡポリヌクレオチドの３’末端は、それ自身にアニールすることにより小さなヘアピンを形成することができ、それによって３’末端はプライマーとして機能し、伸長されると第１の相補配列が生成される。その後、ヘアピンを消化できる。結果として得られるＤＮＡ；ＤＮＡおよびＲＮＡ；ＤＮＡハイブリッドは、さらなるダウンストリームプロセスのための鋳型を形成できる。ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを選択的に増幅して、ＤＮＡ、またはＲＮＡ、またはＤＮＡ＋ＲＮＡシーケンシングライブラリーを作成するなど。
【０２２８】
以下の記載は箇条（clause）として提供されており、請求項と見なされるべきではない。第１の態様によれば、本発明は以下を提供する。
【０２２９】
１．ポリヌクレオチドのライブラリーを作成するための除去可能な鋳型オリゴヌクレオチド（ＲＴＯ）であって、
（ａ）３’ランダム配列；
（ｂ）ＲＴＯを伸長不能にするブロッカー部分が付加された３’末端；
（ｃ）ランダム配列の５’にあるユニバーサル配列；および
（ｄ）作用物質によって認識可能なヌクレオチド配列／修飾（ＮＳＭ）
を含み、ＲＴＯは鋳型として機能し、反応産物に組み込まれず、反応後に破壊／除去され、
ＮＳＭはＲＴＯの除去を容易にする、除去可能な鋳型オリゴヌクレオチド。
【０２３０】
２．ＮＳＭがウラシルヌクレオチドであり、ウラシルヌクレオチドはチミンヌクレオチドの代わりにオリゴ合成中にＲＴＯに組み込まれ、作用物質はウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＮＧ）であり、反応終了後にＲＴＯを破壊／除去することができる、箇条１に記載の除去可能な鋳型オリゴヌクレオチド。
【０２３１】
３．ＮＳＭがリボヌクレオチドであり、リボヌクレオチドは任意のヌクレオチドまたはすべてのヌクレオチドの代わりにオリゴ合成中にＲＴＯに組み込まれ、作用物質はＲＮａｓｅであり、反応終了後にＲＴＯを破壊／除去することができる、箇条１に記載の除去可能な鋳型オリゴヌクレオチド。
【０２３２】
４．ＮＳＭが、ユニバーサル配列中に位置する制限酵素認識配列であり、作用物質は制限酵素であり、反応終了後にＲＴＯを破壊／除去することができる、箇条１に記載の除去可能な鋳型オリゴヌクレオチド。
【０２３３】
５．ＮＳＭが、ＲＴＯの任意の場所に付着したアフィニティー結合部分であり、作用物質はタンパク質または抗体であり、反応終了後にＲＴＯを除去することができる、箇条１に記載の除去可能な鋳型オリゴヌクレオチド。
【０２３４】
６．アフィニティー結合部分がビオチンであり、作用物質はアビジンである、箇条５に記載の除去可能な鋳型オリゴヌクレオチド。
【０２３５】
７．ＲＴＯが、ユニバーサル配列中に位置する追加の一意の識別子（ＵＩＤ）配列を含む、箇条１〜６のいずれか１つに記載の除去可能な鋳型オリゴヌクレオチド。
【０２３６】
８．ＲＴＯがステムループ構造を形成する部分を含む、箇条１〜７のいずれか１つに記載の除去可能な鋳型オリゴヌクレオチド。
【０２３７】
９．ポリヌクレオチドのライブラリーを作成する方法であって、
（ｉ）サンプル由来の標的ポリヌクレオチドをプライマーとして使用し、かつ鋳型として箇条１〜８のいずれか１つに記載の除去可能な鋳型オリゴヌクレオチド（ＲＴＯ）を使用して、修飾標的ポリヌクレオチドを作成するステップ；
（ｉｉ）ＲＴＯを除去するステップ；および
（ｉｉｉ）ユニバーサル配列を含む第１プライマーを使用して、修飾標的ポリヌクレオチドの第１の相補配列（ＣＳ）を作成するステップ
を含み、前記作成するステップは、ポリメラーゼによって、鋳型にハイブリダイズしたプライマーを伸長させることを含む、方法。
【０２３８】
１０．前記第１の相補配列をプライマーとして使用し、かつ箇条１〜８のいずれか１つに記載の第２の除去可能な鋳型オリゴヌクレオチド（ＲＴＯ）を鋳型として使用して、修飾された第１のＣＳを作成するステップをさらに含む、箇条９に記載の方法。
【０２３９】
１１．第１のＣＳまたは修飾された第１のＣＳにハイブリダイズした第２プライマーを伸長させ、それによって第２のＣＳを形成するステップをさらに含み、第２プライマーは、標的特異的部分またはユニバーサル配列、あるいは３’標的特異的部分と５’ユニバーサル配列の両方を含む、箇条９または１０に記載の方法。
【０２４０】
１２．サンプル中の標的ポリヌクレオチドが二本鎖である場合、第１のＣＳにハイブリダイズした第２プライマーを伸長させることは、第１のＣＳを２つの別個の反応に分割することを含み、第１の反応は、標的配列の第１鎖に相補的な標的特異的第２プライマーを含み、かつ第２反応は、標的配列の第２鎖に相補的な標的特異的第２プライマーを含み、標的配列の第１鎖および第２鎖は相補的である、箇条１１に記載の方法。
【０２４１】
１３．伸長させることが、第１プライマーまたは第２プライマーを使用する線形増幅を含む、箇条１１または１２に記載の方法。
【０２４２】
１４．伸長させることが、第１プライマーおよび第２プライマーを使用する指数関数的増幅を含む、箇条１１または１２に記載の方法。
【０２４３】
１５．第１プライマーが、サンプルバーコード（ＳＢＣ）配列と、ＮＧＳプラットフォームに適合する追加のユニバーサル配列とを含む、箇条９〜１４のいずれか１つに記載の方法。
【０２４４】
１６．第２プライマーが標的特異的プライマーである場合、第２プライマーを使用した線形増幅または指数関数的増幅の後に、ネスト化標的特異的第３プライマーがさらなる増幅のために使用される、箇条９〜１５のいずれか１つに記載の方法。
【０２４５】
１７．標的ポリヌクレオチドの配列を正確に決定する方法であって、
（ｉ）箇条９〜１６のいずれか１つの増幅された第２のＣＳの少なくとも１つをシーケンシングするステップ；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）からの同じＵＩＤを含む少なくとも２つの配列を整列させる、および／または各反応が二重鎖標的配列の一方の鎖または相補鎖の配列情報をそれぞれ作成する２つの反応の同じ標的配列を整列させるステップ；
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）に基づいて２つの反応のコンセンサス配列および／または同一のバリアント配列を決定するステップであって、コンセンサス配列および／またはバリアント配列が標的ポリヌクレオチド配列を正確に表すステップ
を含む、方法。
【０２４６】
１８．箇条１〜８のいずれか１つに記載の取り外し可能な鋳型オリゴヌクレオチド（ＲＴＯ）と、ＮＧＳプラットフォームに適合するプライマーとを含む、ポリヌクレオチドのライブラリーを作成するためのキット。
【０２４７】
第２の態様によれば、本発明は以下を提供する。
【０２４８】
１．ポリヌクレオチドのライブラリーを作成するためのアダプター鋳型オリゴヌクレオチド（ＡＴＯ）であって、
（ａ）３’ランダム配列；
（ｂ）ＡＴＯを伸長不能にするブロッカー部分が付加された３’末端；
（ｃ）ランダム配列の５’にあるユニバーサル配列；および
（ｄ）ＡＴＯを非干渉性および非競合性にするヌクレオチド配列／修飾（ＮＳＭ）；
を含み、該ＡＴＯは、第１の伸長反応を導く鋳型として機能し、反応産物に組み込まれない、アダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０２４９】
２．ＮＳＭは、非標準ヌクレオチド（非ｄＡ、非ｄＧ、非ｄＴ、非ｄＣ）であり、それは自然発生のまたは人工のヌクレオチドである、箇条１のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０２５０】
３．非標準ヌクレオチドはユニバーサルヌクレオチドである、箇条２に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０２５１】
４．非標準ヌクレオチドがイノシン塩基を含み、イノシンはＡＴＯの配列中の通常のグアニン位置を置換するために使用され、デオキシイノシンはＤＮＡポリメラーゼによる成長中の新生鎖へのｄＣの取り込みを優先的に導く、箇条２に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０２５２】
５．ＮＳＭは、ＡＴＯの消化／除去を容易にする作用物質によって認識可能である、箇条１に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０２５３】
６．ＮＳＭはウラシルヌクレオチドであり、ウラシルヌクレオチドはオリゴ合成中にチミンヌクレオチドの代わりにＡＴＯに組み込まれ、作用物質はウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＮＧ）であり、それは第１の伸長反応が終了した後にＡＴＯを破壊／除去することができる、箇条５に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０２５４】
７．ＮＳＭはリボヌクレオチドであり、リボヌクレオチドはオリゴ合成中に任意のヌクレオチドまたはすべてのヌクレオチドの代わりにＡＴＯに組み込まれ、作用物質はＲＮａｓｅであり、それは第１の伸長反応が終了した後にＡＴＯを破壊／除去することができる、箇条５に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０２５５】
８．ＮＳＭはユニバーサル配列中に位置する制限酵素認識配列であり、作用物質は制限酵素であり、それは第１の伸長反応が終了した後にＡＴＯを破壊／除去できる、箇条５に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０２５６】
９．ＮＳＭは、ＡＴＯの任意の場所に付着したアフィニティー結合部分であり、作用物質はタンパク質または抗体であり、それは第１の伸長反応が終了した後にＡＴＯを除去することができる、箇条５に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０２５７】
１０．アフィニティー結合部分はビオチンであり、作用物質はアビジンである、箇条９に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０２５８】
１１．ＡＴＯがユニバーサル配列中に位置する追加の一意の識別子（ＵＩＤ）配列を含む、箇条１〜１０のいずれか１つに記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０２５９】
１２．ＡＴＯがステムループ構造を形成する部分を含む、箇条１〜１０のいずれか１つに記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０２６０】
１３．ポリヌクレオチドのライブラリーを作成する方法であって、
（ｉ）プライマーとしてサンプル由来の標的ポリヌクレオチドを使用し、鋳型として箇条１〜１２のいずれか１つに記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド（ＡＴＯ）を使用して、修飾標的ポリヌクレオチドを作成するステップ；および
（ｉｉ）ユニバーサル配列を含む第１プライマー、および鋳型として修飾標的ポリヌクレオチドを使用して、修飾標的ポリヌクレオチドの第１の相補配列（ＣＳ）を作成するステップ；
を含み、作成するステップは、鋳型にハイブリダイズしたプライマーをポリメラーゼによって伸長させることを含む、方法。
【０２６１】
１４．第１の相補配列をプライマーとして使用し、かつ箇条１〜１２のいずれか１つに記載の第２のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド（ＡＴＯ）を鋳型として使用して、修飾された第１のＣＳを作成し、さらに該第１のＣＳをＡＴＯ鋳型上で伸長させることをさらに含む、箇条１３に記載の方法。
【０２６２】
１５．ステップ（ｉ）が、ＡＴＯを除去することをさらに含む、箇条１３に記載の方法。
【０２６３】
１６．第１のＣＳまたは修飾された第１のＣＳにハイブリダイズした第２プライマーを伸長させ、それによって第２のＣＳを形成することをさらに含み、第２プライマーは標的特異的部分またはユニバーサル配列、あるいは３’標的特異的部分と５’ユニバーサル配列の両方を含む、箇条１３、１４または１５に記載の方法。
【０２６４】
１７．サンプル中の標的ポリヌクレオチドが二本鎖である場合、第１のＣＳにハイブリダイズした第２プライマーを伸長させることは、第１のＣＳを２つの別個の反応に分割することを含み、第１の反応は、標的配列の第１鎖に相補的な標的特異的第２プライマーを含み、第２の反応は、標的配列の第２鎖に相補的な標的特異的第２プライマーを含み、標的配列の第１鎖と第２鎖は相補的である、箇条１６に記載の方法。
【０２６５】
１８．伸長させることが線形増幅を含む、箇条１３、１４、１６または１７に記載の方法。
【０２６６】
１９．伸長させることが、第１プライマーおよび第２プライマーを使用する指数関数的増幅を含む、箇条１６に記載の方法。
【０２６７】
２０．第１プライマーが、サンプルバーコード（ＳＢＣ）配列と、ＮＧＳプラットフォームに適合する追加のユニバーサル配列とを含む、箇条１３〜１９のいずれか１つに記載の方法。
【０２６８】
２１．第２プライマーが標的特異的プライマーである場合、第２プライマーを使用する線形または指数関数的増幅の後に、ネスト化標的特異的第３プライマーがさらなる増幅に使用される、箇条１３〜１９のいずれか１つに記載の方法。
【０２６９】
２２．標的ポリヌクレオチドの配列を正確に決定する方法であって、
（ｉ）箇条１３〜２１のいずれか１つに記載の増幅された第２のＣＳの少なくとも１つをシーケンシングするステップ；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）からの同じＵＩＤを含む少なくとも２つの配列を整列させる、および／または各反応が二重鎖標的配列の１本の鎖または相補鎖の配列情報をそれぞれ作成する２つの反応の同じ標的配列を整列させるステップ；および
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）に基づいて２つの反応のコンセンサス配列および／または同一のバリアント配列を決定するステップであって、コンセンサス配列および／またはバリアント配列が標的ポリヌクレオチド配列を正確に表すステップ
を含む、方法。
【０２７０】
２３．箇条１〜１２のいずれか１つに記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド（ＡＴＯ）と、ＮＧＳプラットフォームに適合するプライマーとを含む、ポリヌクレオチドのライブラリーを作成するためのキット。
【０２７１】
第３の態様によれば、本発明は以下を提供する。
【０２７２】
１．ポリヌクレオチドのライブラリーを作成するためのアダプター鋳型オリゴヌクレオチド（ＡＴＯ）であって、
（ａ）３’ランダム配列；
（ｂ）ＡＴＯを伸長不能にするブロッカー部分が付加された３’末端；
（ｃ）ランダム配列の５’にあるユニバーサル配列；および
（ｄ）ヌクレオチド配列／修飾（ＮＳＭ）；
を含み、該ＡＴＯは第１の反応を導く鋳型として機能し、ＡＴＯのすべてまたは一部は第１の反応産物に組み込まれず、ＮＳＭは、第１の反応後の反応においてＡＴＯを非干渉性および非競合性にする、アダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０２７３】
２．ＮＳＭは非標準ヌクレオチド（非ｄＡ、非ｄＧ、非ｄＴ、非ｄＣ）であり、それは自然発生のまたは人工のヌクレオチドである、箇条１のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０２７４】
３．非標準ヌクレオチドはユニバーサルヌクレオチドである、箇条２に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０２７５】
４．非標準ヌクレオチドがイノシン塩基を含み、イノシンはＡＴＯの配列中のグアニン位置を置換するために使用され、デオキシイノシンはＤＮＡポリメラーゼによる成長中の新生鎖へのｄＣの取り込みを優先的に導く、箇条２に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０２７６】
５．ＮＳＭは、ＡＴＯの消化／除去を容易にする作用物質によって認識可能である、箇条１に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０２７７】
６．ＮＳＭはウラシルヌクレオチドであり、ウラシルヌクレオチドはオリゴ合成中にチミンヌクレオチドの代わりにＡＴＯに組み込まれ、作用物質はウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＮＧ）であり、それは第１の伸長反応が終了した後にＡＴＯを破壊／除去することができる、箇条５に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０２７８】
７．ＮＳＭはリボヌクレオチドであり、リボヌクレオチドはオリゴ合成中に任意のヌクレオチドまたはすべてのヌクレオチドの代わりにＡＴＯに組み込まれ、作用物質はＲＮａｓｅであり、それは第１の伸長反応が終了した後にＡＴＯを破壊／除去することができる、箇条５に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０２７９】
８．ＮＳＭはユニバーサル配列中に位置する制限酵素認識配列であり、作用物質は制限酵素であり、それは第１の伸長反応が終了した後にＡＴＯを破壊／除去できる、箇条５に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０２８０】
９．ＮＳＭは、ＡＴＯの任意の場所に付着したアフィニティー結合部分であり、作用物質はタンパク質または抗体であり、それは第１の伸長反応が終了した後にＡＴＯを除去することができる、箇条５に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０２８１】
１０．アフィニティー結合部分はビオチンであり、作用物質はアビジンである、箇条９に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０２８２】
１１．ＡＴＯがユニバーサル配列中に位置する追加の一意の識別子（ＵＩＤ）配列を含む、箇条１〜１０のいずれか１つに記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０２８３】
１２．ＡＴＯが、ステムループ構造を形成することができる、ユニバーサル配列の一部に相補的な５’ステム部分配列を含む、箇条１に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０２８４】
１３．ループ部分がコピー不能なリンケージを含む、箇条１２に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０２８５】
１４．コピー不能なリンケージが、Ｃ３スペーサーホスホロアミダイト、またはトリエチレングリコールスペーサー、または１８原子ヘキサエチレングリコールスペーサー、または１’、２’−ジデオキシリボース（ｄＳｐａｃｅｒ）である、箇条１３に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０２８６】
１５．ループ部分が消化可能なヌクレオチドを含む、箇条１２に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０２８７】
１６．ステム部分配列の５’末端がリン酸基を含む、箇条１２に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０２８８】
１７．ＡＴＯが、部分的に二本鎖構造を形成することができる、ユニバーサル配列の一部に相補的である上側の別個の鎖を含む、箇条１に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０２８９】
１８．上側の別個の鎖が消化可能なヌクレオチドを含む、箇条１７に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０２９０】
１９．上側の別個の鎖の５’末端がリン酸基を含む、箇条１７に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０２９１】
２０．上側の別個の鎖の３’末端がビオチンを含む、箇条１７に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０２９２】
２１．ポリヌクレオチドのライブラリーを作成する方法であって、
（ｉ）標的ポリヌクレオチドの３’末端にアダプター配列を付加する酵素的な第１の反応において、箇条１〜箇条２０のいずれか１つに記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド（ＡＴＯ）（第１のＡＴＯ）の３’ランダム配列にハイブリダイズするサンプル由来の標的ポリヌクレオチドを使用して、修飾標的ポリヌクレオチドを作成するステップ；および
（ｉｉ）ユニバーサル配列を含む第１プライマーと、鋳型として修飾標的ポリヌクレオチドを使用して、修飾標的ポリヌクレオチドの第１相補配列（ＣＳ）を作成するステップであって、第１プライマーが、鋳型にハイブリダイズしてポリメラーゼによって伸長されるステップ
を含む、方法。
【０２９３】
２２．第１の反応がプライマー伸長反応であり、標的ポリヌクレオチドが、プライマーとして機能し、ＤＮＡポリメラーゼによってＡＴＯ鋳型上で伸長される、箇条２１に記載の方法。
【０２９４】
２３．ＤＮＡポリメラーゼが鎖置換活性を有し、伸長中に、ステムループ構造が開かれるか、またはＡＴＯの上側の鎖が置き換えられる、箇条２２に記載の方法。
【０２９５】
２４．第１の反応が伸長−ライゲーション反応であり、ＤＮＡポリメラーゼが標的を伸長させ、ＤＮＡリガーゼが、伸長された標的配列をＡＴＯの５’ステム部分またはＡＴＯの上側の鎖に連結する、箇条２２に記載の方法。
【０２９６】
２５．第１の反応がライゲーション反応であり、ＤＮＡリガーゼが標的配列をＡＴＯの５’ステム部分またはＡＴＯの上側の鎖に連結する、箇条２２に記載の方法。
【０２９７】
２６．第１の反応の後に、ＡＴＯの一部を消化するか、またはアフィニティーキャプチャーによりＡＴＯの一部を除去することをさらに含む、箇条２１に記載の方法。
【０２９８】
２７．アダプター配列を３’に付加する酵素反応において、箇条１〜２０のいずれか１つに記載の第２のＡＴＯの３’ランダム配列にハイブリダイズする第１のＣＳを使用して、修飾された第１のＣＳを作成することをさらに含み、第２のＡＴＯは、第１のＡＴＯと比較して異なる５’ユニバーサル配列を含む、箇条２１に記載の方法。
【０２９９】
２８．ステップ（ｉｉ）の産物に二本鎖アダプターを連結することにより修飾された第１のＣＳを作成することをさらに含む、箇条２１に記載の方法。
【０３００】
２９．第１のＣＳまたは修飾された第１のＣＳにハイブリダイズした第２プライマーを伸長させ、それによって第２のＣＳを形成することをさらに含み、第２プライマーは標的特異的部分またはユニバーサル配列、あるいは３’標的特異的部分と５’ユニバーサル配列の両方を含む、箇条２１、２７または２８に記載の方法。
【０３０１】
３０．サンプル中の標的ポリヌクレオチドが二本鎖であり、かつ第２プライマーが標的特異的プライマーである場合、第１のＣＳにハイブリダイズした第２プライマーを伸長させることは、第１のＣＳを２つの別個の反応に分割することを含み、フォワード反応は、標的配列のフォワード鎖に相補的な標的特異的第２プライマーを含み、リバース反応は、標的配列のリバース鎖に相補的な標的特異的第２プライマーを含み、標的配列のフォワード鎖とリバース鎖は補完的である、箇条２９に記載の方法。
【０３０２】
３１．第１のＣＳを作成することが、１〜３０サイクルでの線形増幅を含む、箇条２１〜３０のいずれか１つに記載の方法。
【０３０３】
３２．第１のＣＳを作成することは、標的がＲＮＡである場合、逆転写酵素を使用する逆転写反応を含む、箇条２１〜３１のいずれか１つに記載の方法。
【０３０４】
３３．伸長させることが、第１プライマーおよび第２プライマーを使用する指数関数的増幅を含む、箇条２１〜３２のいずれか１つに記載の方法。
【０３０５】
３４．第２プライマーが標的特異的プライマーである場合、第２プライマーを使用した線形増幅または指数関数的増幅の後に、ネスト化標的特異的第３プライマーがさらなる増幅に使用される、項２１〜３３のいずれか１つに記載の方法。
【０３０６】
３５．ユニバーサルアダプター配列を標的とする第１プライマーまたは第４プライマーが、サンプルバーコード（ＳＢＣ）配列と、ＮＧＳプラットフォームに適合する追加のユニバーサル配列とを含む、箇条２１〜３４のいずれか１つに記載の方法。
【０３０７】
３６．標的ポリヌクレオチドの配列を正確に決定する方法であって、
（ｉ）箇条２１〜３５のいずれか１つに記載の増幅された第１のＣＳまたは第２のＣＳの少なくとも１つをシーケンシングするステップ；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）からの同じＵＩＤを含む少なくとも２つの配列の整列させる、および／または各反応が二重鎖標的配列の１本の鎖または相補鎖の配列情報をそれぞれ作成する２つの反応の同じ標的配列を整列させるステップ；および
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）に基づいて２つの反応のコンセンサス配列および／または同一のバリアント配列を決定するステップであって、コンセンサス配列および／またはバリアント配列が標的ポリヌクレオチド配列を正確に表すステップ
を含む、方法。
【０３０８】
３７．箇条１〜３６のいずれか１つに記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド（ＡＴＯ）と、ＮＧＳプラットフォームに適合するプライマーとを含む、ポリヌクレオチドのライブラリーを作成するためのキット。
【０３０９】
第４の態様によれば、本発明は以下を提供する。
【０３１０】
１．ポリヌクレオチドを伸長させるためのアダプター鋳型オリゴヌクレオチド（ＡＴＯ）であって、
（ａ）３’ランダム配列；
（ｂ）ＡＴＯを伸長不能にするブロッカー部分が付加された３’末端；および
（ｃ）ランダム配列の５’にあるユニバーサル配列
を含み、該ＡＴＯはポリメラーゼによる伸長反応を導く鋳型として機能する。
【０３１１】
２．ＡＴＯを分解可能にするまたは伸長反応後の反応においてＡＴＯを非干渉性および非競合性にする部分をさらに含み、該部分がＡＴＯの消化／除去を容易にする作用物質によって認識可能である、箇条１に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０３１２】
３．前記部分はウラシルヌクレオチドであり、作用物質はｄＵ−グリコシラーゼを含み、それは第１の伸長反応後にＡＴＯを消化／除去することができる、箇条２に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０３１３】
４．前記部分はリボヌクレオチドであり、リボヌクレオチドはオリゴ合成中に任意のヌクレオチドまたはすべてのヌクレオチドの代わりにＡＴＯに組み込まれ、作用物質はリボヌクレアーゼであり、それは第１の伸長反応後にＡＴＯを消化／除去することができる、箇条２に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０３１４】
５．ＡＴＯはＲＮＡオリゴである、箇条１に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０３１５】
６．ＡＴＯはＤＮＡオリゴである、箇条１に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０３１６】
７．ＡＴＯは、ＤＮＡオリゴとＲＮＡオリゴとの組合せである、箇条１に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０３１７】
８．前記部分は制限酵素認識配列であり、作用物質は制限酵素である、箇条２に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０３１８】
９．ユニバーサル配列が、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターとして機能することができる配列を含む、箇条１に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０３１９】
１０．ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、またはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼである、箇条９に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０３２０】
１１．ユニバーサル配列が、５’ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列と、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列の３’に位置するプライミング部位とを含む、箇条９に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０３２１】
１２．ユニバーサル配列は、二本鎖または部分的に二本鎖である、箇条１に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０３２２】
１３．ＡＴＯが、ステムループ構造を形成することができる、ユニバーサル配列の一部または全部に相補的または部分的に相補的な５’ステム部分配列を含む、箇条１２に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０３２３】
１４．ＡＴＯが、５’から３’の順に、５’ステム部分、ＲＮＡポリメラーゼ配列、プライミング部位配列、および３’ ランダム／縮重配列を含む、箇条１３に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０３２４】
１５．ＲＮＡポリメラーゼ配列がループ部分に位置する、箇条１３に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０３２５】
１６．ループ部分がコピー不能なリンケージを含む、箇条１３に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０３２６】
１７．ループ部分がコピー不能なリンケージを含まない、箇条１３に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０３２７】
１８．ステム部分の５’が追加の配列を含む場合、ステム部分と追加の配列との間にコピー不能なリンケージが存在する、箇条１３に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０３２８】
１９．５’ステム部分がコピー不能なリンケージを含む、箇条１３に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０３２９】
２０．コピー不能なリンケージは、Ｃ３スペーサーホスホロアミダイト、またはトリエチレングリコールスペーサー、または１８原子ヘキサエチレングリコールスペーサー、または１’、２’−ジデオキシリボース（ｄＳｐａｃｅｒ）である、箇条１３〜１９に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０３３０】
２１．二本鎖ステム部分が非相補的領域を含み、ユニバーサル配列鎖における非相補的領域がランダム配列を含む、箇条１３に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０３３１】
２２．ステム部分が、１つまたは複数のコピー不能なリンケージによって分離された２つ以上のスプリットセクションを形成する、箇条１３に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０３３２】
２３．ステム部分が、ミスマッチ塩基対の１つまたは領域によって分離された２つ以上のスプリットセクションを形成する、箇条１３に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０３３３】
２４．ＡＴＯが、ユニバーサル配列に相補的または部分的に相補的である上側の別個の鎖を含む、箇条１２に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０３３４】
２５．上側の別個の鎖の５’末端がリン酸基を含む、箇条２４に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０３３５】
２６．ＡＴＯが、ＡＴＯの任意の場所に付着したアフィニティー結合部分をさらに含む、箇条１に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０３３６】
２７．アフィニティー結合部分はビオチンである、箇条２６に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０３３７】
２８．５’末端がリン酸基を含む、前述の箇条のいずれか１つに記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０３３８】
２９．ユニバーサル配列が、追加の一意の識別子（ＵＩＤ）配列として機能するランダム配列を含む、前述の箇条のいずれか１つに記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０３３９】
３０．ＡＴＯが、ループセクション内に追加のＵＩＤを含む、箇条２９に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０３４０】
３１．ＡＴＯが、ステムセクション内に追加のＵＩＤを含む、箇条２９に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０３４１】
３２．ＡＴＯ配列が、非標準ヌクレオチド（非ｄＡ、非ｄＧ、非ｄＴ、非ｄＣ）を含み、それは自然発生のまたは人工ヌクレオチドである、箇条１に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０３４２】
３３．非標準ヌクレオチドはユニバーサルヌクレオチドである、箇条３２に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０３４３】
３４．非標準ヌクレオチドがイノシン塩基を含む、箇条３２に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０３４４】
３５．３’ランダム配列が非標準ヌクレオチドを含む、箇条３２に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０３４５】
３６．ユニバーサル配列が非標準ヌクレオチドを含む、箇条３２に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０３４６】
３７．３’末端が、ＤＮＡポリメラーゼの３’エキソヌクレアーゼ活性に対してＡＴＯを耐性にする修飾ヌクレオチドまたは修飾リンケージを含む、箇条１に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０３４７】
３８．修飾リンケージはホスホロチオアートリンケージである、箇条３７に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【０３４８】
３９．ランダム配列の３’に特異的配列をさらに含み、その特異的配列はポリヌクレオチドの特異的配列とハイブリダイズすることができ、３’ランダム／縮重配列の一部は、ポリヌクレオチドがポリメラーゼによって伸長される鋳型として機能する。箇条１に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド
【０３４９】
４０．少なくとも１つの核酸ポリメラーゼと、前述の箇条のいずれか１つに記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド（ＡＴＯ）とを含む組成物。
【０３５０】
４１．核酸ポリメラーゼはＤＮＡポリメラーゼである、箇条４０に記載の組成物。
【０３５１】
４２．ＤＮＡポリメラーゼが鎖置換活性を有する、箇条４１に記載の組成物。
【０３５２】
４３．ＤＮＡポリメラーゼが３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する、箇条４１に記載の組成物。
【０３５３】
４４．ＤＮＡポリメラーゼは鋳型依存性ポリメラーゼであり、鋳型非依存性ポリメラーゼではない、箇条４１に記載の組成物。
【０３５４】
４５．標的ポリヌクレオチドを伸長させる方法であって、
（ｉ）標的ポリヌクレオチドを前述の箇条のいずれか１つに記載の組成物とインキュベートすることにより修飾標的ポリヌクレオチドを作成するステップであって、酵素的な第１のＡＴＯ反応において、標的ポリヌクレオチドの３’末端がアダプター鋳型オリゴヌクレオチド（第１のＡＴＯ）の３’ランダム配列にハイブリダイズし、ＡＴＯを鋳型として使用して標的ポリヌクレオチドの３’末端が伸長され、３’オーバーハング末端が存在する場合、伸長が生じる前に標的ポリヌクレオチドの３’末端がトリミングされるステップを含む、方法。
【０３５５】
４６．（ｉｉ）修飾標的ポリヌクレオチドの第１の相補配列（ＣＳ）を作成するステップをさらに含む、箇条４５に記載の方法。
【０３５６】
４７．第１のＣＳを作成することは、第１プライマーを使用しかつ鋳型として修飾標的ポリヌクレオチドを使用する伸長を含み、第１プライマーは鋳型にハイブリダイズして、ポリメラーゼにより伸長される、箇条４６に記載の方法。
【０３５７】
４８．第１のＣＳを作成することは、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むＡＴＯ上で伸長させることにより生成される修飾標的ポリヌクレオチドの二本鎖プロモーター領域からのＲＮＡポリメラーゼを使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を含む、箇条４６に記載の方法。
【０３５８】
４９．第１のＣＳを作成することは、修飾標的ポリヌクレオチドを熱変性させ、修飾標的ポリヌクレオチドの３’ステムループ構造をアニールさせ、さらに自己プライミングにより伸長させて第１のＣＳを形成することを含む、箇条４６に記載の方法。
【０３５９】
５０．第１のＣＳを作成することは、修飾標的ポリヌクレオチドへの標的特異的プライマーのアニーリングおよびポリメラーゼによる伸長を含む、箇条４６に記載の方法。
【０３６０】
５１．修飾標的ポリヌクレオチドの第１の相補配列（ＣＳ）を作成する前または後に、ＡＴＯを消化することをさらに含む、箇条４６〜５０のいずれか１つに記載の方法。
【０３６１】
５２．修飾標的ポリヌクレオチドの第１の相補配列（ＣＳ）を作成する前または後に、アフィニティーキャプチャーをさらに含む、箇条４６〜５１のいずれか１つに記載の方法。
【０３６２】
５３．第１のＡＴＯ反応が伸長およびライゲーションを含み、ＤＮＡポリメラーゼが標的の３’末端を伸長し、さらにＤＮＡリガーゼが伸長された標的配列をＡＴＯの５’ステム部分またはＡＴＯの上側の別個の鎖に連結する、箇条４５に記載の方法。
【０３６３】
５４．箇条３５〜３９のいずれかに記載の組成物と共に第１のＣＳをインキュベートして修飾された第１のＣＳを作成することをさらに含み、酵素的な第２のＡＴＯ反応において、第１のＣＳの３’末端がアダプター鋳型オリゴヌクレオチド（第２のＡＴＯ）の３’ランダム配列にハイブリダイズし、第１のＣＳの３’末端がＡＴＯを鋳型として使用して伸長され、３’オーバーハングが存在する場合、伸長が生じる前に第１のＣＳの３’末端がトリミングされ、第２のＡＴＯは第１のＡＴＯとは異なる５’ユニバーサル配列を含む、箇条４６に記載の方法。
【０３６４】
５５．ステップ（ｉｉ）の産物にアダプターを連結して修飾された第１のＣＳを作成することをさらに含む、箇条４６に記載の方法。
【０３６５】
５６．第１のＣＳまたは修飾された第１のＣＳにハイブリダイズした第２プライマーを伸長させ、それによって第２のＣＳを形成することをさらに含み、第２プライマーが標的特異的部分またはユニバーサル配列、あるいは３’標的特異的部分と５’ユニバーサル配列の両方を含む、箇条４６〜５５のいずれか１つに記載の方法。
【０３６６】
５７．サンプル中の標的ポリヌクレオチドが二本鎖であり、かつ第２プライマーが標的特異的プライマーである場合、第１のＣＳにハイブリダイズした第２プライマーを伸長させることは、第１のＣＳを２つの別個の反応に分割することを含み、フォワード反応は標的配列のフォワード鎖に相補的な標的特異的第２プライマーを含み、リバース反応は標的配列のリバース鎖に相補的である標的特異的第２プライマーを含み、標的配列のフォワード鎖とリバース鎖は相補的である、箇条５６に記載の方法。
【０３６７】
５８．第１のＣＳを作成することが、１〜３０サイクルまたはそれ以上での線形増幅を含む、箇条４７に記載の方法。
【０３６８】
５９．第１のＣＳを作成することは、標的がＲＮＡである場合、逆転写酵素を使用する逆転写反応を含む、箇条４７または４９のいずれか１つに記載の方法。
【０３６９】
６０．第１プライマーおよび第２プライマーを使用する指数関数的増幅をさらに含む、箇条５６〜５９のいずれか１つに記載の方法。
【０３７０】
６１．第２プライマーが標的特異的プライマーである場合、第２プライマーを使用した線形増幅または指数関数的増幅の後に、ネスト化標的特異的第３プライマーがさらなる増幅に使用される、箇条５６〜６０のいずれか１つに記載の方法。
【０３７１】
６２．第１プライマーまたは第３プライマーが、サンプルバーコード（ＳＢＣ）配列と、ＮＧＳプラットフォームに適合する追加のユニバーサル配列とを含む、箇条５６〜６１のいずれか１つに記載の方法。
【０３７２】
６３．第１のＡＴＯ反応の前に標的ポリヌクレオチドを断片化することを含む、箇条４５に記載の方法。
【０３７３】
６４．前記標的ポリヌクレオチドの断片化は、二本鎖ポリヌクレオチドをトランスポゾンＤＮＡに結合したトランスポザーゼと接触させることを含み、トランスポゾンＤＮＡはトランスポザーゼ結合部位およびユニバーサル配列を含み、トランスポザーゼ／トランスポゾンＤＮＡ複合体が二本鎖ポリヌクレオチド上の標的位置に結合して、二本鎖ポリヌクレオチドを複数の二本鎖断片に切断し、各二本鎖断片は、二本鎖断片の各５’末端に結合したトランスポゾンＤＮＡを有する、箇条６３に記載の方法。
【０３７４】
６５．前記断片化は、ゲノム編集ツールを用いる標的断片化の使用を含む、箇条６３に記載の方法。
【０３７５】
６６．前記ゲノム編集ツールは、規則正しく間隔を空けてクラスター化された短いパリンドロームリピートおよびＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９酵素（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）を含む、箇条６５に記載の方法。
【０３７６】
６７．第１のＡＴＯ反応の前に、断片化された標的ポリヌクレオチドを熱変性することを含む、箇条６３に記載の方法。
【０３７７】
６８．トランスポザーゼがＴｎ５トランスポザーゼである、箇条６４に記載の方法。
【０３７８】
６９．標的ポリヌクレオチドの断片化およびタグ付けは、一本鎖ポリヌクレオチドを、５’ユニバーサル配列および３’ランダム配列を含むランダムプライマーと接触させ、標的ポリヌクレオチド上でランダムプライマーを伸長させて５’タグ付き断片化ポリヌクレオチドを作成することを含む、箇条６３に記載の方法。
【０３７９】
７０．標的ポリヌクレオチドが遊離３’ヒドロキシル基を含む、箇条４５に記載の方法。
【０３８０】
７１．標的ポリヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡ、または一本鎖ＲＮＡ、または一本鎖ＲＮＡと一本鎖ＤＮＡの組合せである、箇条４５に記載の方法。
【０３８１】
７２．ポリヌクレオチドを伸長させる方法であって、
標的ポリヌクレオチドを、ＤＮＡポリメラーゼ、および３’エキソヌクレアーゼ活性に対して耐性を有するように３’末端がブロックおよび修飾されている３’ランダム配列を含むアダプター鋳型オリゴヌクレオチド（ＡＴＯ）と混合するステップ；
アニーリングを促進する条件下で前記混合物をインキュベートし、３’オーバーハング末端が存在する場合はそれをトリミングし、伸長させて修飾標的ポリヌクレオチドを作成するステップ；および
任意選択で、ＡＴＯを分解するステップ
を含む、方法。
【０３８２】
７３．シーケンシングライブラリーを作成する方法であって、
標的ポリヌクレオチドを、ＤＮＡポリメラーゼ、および３’エキソヌクレアーゼ活性に対して耐性を有するように３’末端がブロックおよび修飾されている３’ランダム配列を含むアダプター鋳型オリゴヌクレオチド（ＡＴＯ）と混合するステップ
アニーリングを促進する条件下で前記混合物をインキュベートし、３’オーバーハング末端が存在する場合はそれをトリミングし、伸長させて修飾標的ポリヌクレオチドを作成するステップ；
任意選択で、ＡＴＯを分解するステップ; および
ＮＧＳプラットフォームに適合するプライマーを使用して、修飾標的ポリヌクレオチドを増幅するステップ；
を含む、方法。
【０３８３】
７４．混合の前に標的ポリヌクレオチドを断片化することを含む、箇条７３に記載の方法。
【０３８４】
７５．標的ポリヌクレオチドは自然発生の断片化ポリヌクレオチドである、箇条７３に記載の方法。
【０３８５】
７６．自然発生の断片化ポリヌクレオチドは血漿の循環セルフリー核酸である、箇条７５に記載の方法。
【０３８６】
７７．前記標的ポリヌクレオチドの断片化が、二本鎖ポリヌクレオチドをトランスポゾンＤＮＡに結合したトランスポザーゼと接触させることを含み、トランスポゾンＤＮＡはトランスポザーゼ結合部位およびユニバーサル配列を含み、トランスポザーゼ／トランスポゾンＤＮＡ複合体が二本鎖ポリヌクレオチド上の標的位置に結合して、二本鎖ポリヌクレオチドを複数の二本鎖断片に切断し、各二本鎖断片は、二本鎖断片の各５’末端に結合したトランスポゾンＤＮＡを有する、箇条７４に記載の方法。
【０３８７】
７８．シーケンシングライブラリーを作成する方法であって、
ＡＴＯ上で一本鎖標的ポリヌクレオチドを伸長させることにより、箇条４５〜６９のいずれか１つに記載される一本鎖標的ポリヌクレオチドにアダプター配列を付加するステップ；および
ＮＧＳプラットフォームに適合するプライマーを使用して、アダプタータグ付き標的ポリヌクレオチドを増幅するステップ
を含む、方法。
【０３８８】
７９．条項１〜４４のいずれか１つに記載の組成物を含むキット。
【０３８９】
８０．箇条１〜４１のいずれか１つに記載されるアダプター鋳型オリゴヌクレオチド（ＡＴＯ）、ポリメラーゼ、およびＮＧＳプラットフォームに適合するプライマーを含む、ポリヌクレオチドのライブラリーを作成するためのキット。
【実施例】
【０３９０】
実施例１
標的ポリヌクレオチドとしてデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を使用し、例えば、限定はされないが、ループが化学的スペーサー（例えば、限定はされないが、Ｃ３スペーサー、Ｃ１８スペーサー）を含むステムループ構造を有するアダプター鋳型オリゴを使用して次世代シーケシングライブラリー（例えば、限定はされないが、イルミナ社の次世代シーケンサー（Illumina Next Generation Sequencers）に適合する）を作成する。
【０３９１】
材料
標的ポリヌクレオチド、ヒトｇＤＮＡ（ＢＩＯ−３５０２５）
ＤＮＡ断片化酵素、ＫＡＰＡ  Ｆｒａｇ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ、７９６２５１７００１）
アダプター鋳型オリゴ（ＡＴＯ）、１−０１４、１−０１５、１−０１６、１−０１７、１−０１８（表１）
ＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０２７３Ｌ）
ＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼバッファー（ＮＥＢ、Ｍ０２７３Ｌ）
ＤＮＡポリメラーゼＩ、ラージ（クレノウ）フラグメント（ＮＥＢ、Ｍ０２１０Ｌ）
ＤＮＡポリメラーゼＩ、ラージ（クレノウ）フラグメント（ＮＥＢ、Ｍ０２１２Ｌ）
ｄＮＴＰ（ＮＥＢ、Ｎ０４４７）
ＵＳＥＲ（登録商標）Ｅｎｚｙｍｅ（ＮＥＢ、Ｍ５５０５Ｓ）
Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０５３０Ｓ）
Ｐｈｕｓｉｏｎバッファー（ＮＥＢ、Ｍ０５３０Ｓ）
プライマー、２−００１、２−００２、２−００３（表２）
硫酸アンモニウム（ＳＩＧＭＡ、Ａ４４１８）
Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ａ６３８８１）
Ａｇｉｌｅｎｔのバイオアナライザ高感度キット（製品ＩＤ  ５０６７−４６２６）
【０３９２】
方法
アダプター鋳型オリゴのデオキシリボ核酸へのアニーリング
断片化または非断片化一本鎖または二本鎖の任意の長さの適切な量のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を、適切な量のアダプター鋳型オリゴ（ＡＴＯ）（例えば、限定はされないが、適切なバッファー中でヘアピンを形成するオリゴ）と混合する。この例では、図１４のセクション（Ａ）に示すように、Ｆｒａｇ  Ｋｉｔを使用してヒトｇＤＮＡを断片化し、１００〜４００ｂｐの断片化ＤＮＡを作成する。合計２５ｎｇを、合計２００ｐｍｏｌｅのＡＴＯとなるように４つのＡＴＯ（１−００１、１−００２、１−００３、１−００４）のそれぞれ５０ｐｍｏｌｅとＨ２Ｏ中で混合し、１５μｌの最終体積にする。混合物を、適切な温度（この例では９５℃）で、適切な時間（この例では２分間）、または二本鎖核酸を一本鎖に変性させることができる他の温度または時間で、加熱する。続いて、図１４のセクション（Ｂ）に示すように、核酸とＡＴＯの混合物を、この例では４℃に２分間、または核酸とＡＴＯとの間のアニーリングを促進できる他の適切な温度または時間まで、冷却する。
【０３９３】
アダプター鋳型オリゴを鋳型とする標的ポリヌクレオチドのそれ自身をプライマーとして使用する伸長
プルーフリーディング活性を有するまたはプルーフリーディング活性を有さない、鎖置換活性を有するまたは鎖置換活性を有さない、適切な量のＤＮＡポリメラーゼ（例えば、限定はされないが、Ｂｓｔポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ラージ（クレノウ）フラグメント、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、またはＰｈｕｓｉｏｎ）を適切なバッファーおよび適切なｄＮＴＰと混合したものを、ＤＮＡ−ＡＴＯ混合物と組み合わせる。この例では、合計２．５単位のクレノウと２．５単位のＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼ、２μｌの１０ｘＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼバッファー、および１０ｎｍｏｌｅの各ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ／ｄＴＴＰ／ｄＣＴＰ／ｄＧＴＰ）を、ＤＮＡ−ＡＴＯ混合物と組み合わせて２０μｌの最終体積にする。この例では、ＤＮＡポリメラーゼとバッファーの存在下で標的核酸とＡＴＯとのアニーリングをさらに促進するために、混合物を２５℃未満の温度で３０分間、または核酸とＡＴＯとの間のアニーリングを促進できる他の適切な温度または時間でインキュベートする。この例では、ＡＴＯ配列を鋳型として使用して標的ポリヌクレオチドの伸長を開始するために、インキュベーション温度を、３７℃に３０分間、またはＤＮＡポリメラーゼ活性を促進できる他の適切な温度に上げる。産物は修飾標的ポリヌクレオチドである。図１４のセクション（Ｃ）に示すとおり。
【０３９４】
アダプター鋳型オリゴの分解
アダプター鋳型オリゴは、例えば、限定はされないが、ｄＵ−グリコシラーゼとアプリン／アピリミジンエンドヌクレアーゼとの組合せの添加により選択的に分解され、この例では、２単位のＵＳＥＲ酵素が２０μｌの修飾標的ポリヌクレオチド反応混合物に加えられ、その後、この例では、３７℃で３０分間および次いで２５℃で１５分間、または酵素活性を促進できる他の適切な温度と時間で、順次インキュベートする。任意選択で、分解されたＡＴＯを任意の適切な精製方法を使用して除去してもよい。図１４のセクション（Ｄ）に示すとおり。
【０３９５】
修飾標的ポリヌクレオチドのワンパス伸長または線形増幅
精製または未精製の標的ポリヌクレオチド伸長産物（修飾標的ポリヌクレオチド）を、標的ＤＮＡ分子の３’に現在存在する保存（ユニバーサル）配列に相補的なプライマー、プルーフリーディング活性を有するまたはプルーフリーディング活性を有さないＤＮＡポリメラーゼ（例えば、限定はされないが、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ）、適切なバッファー、および適切なｄＮＴＰと組み合わせる。この例では、精製または未精製のＵＳＥＲ処理された修飾標的ポリヌクレオチドのすべてを、標的ＤＮＡ分子の３’末端に現在存在するユニバーサル配列に相補的な５０ｐｍｏｌのプライマー（２−００１）、２単位のＰｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ、１０μｌの５ｘＰｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼバッファー、および１２ｎｍｏｌの各ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ／ｄＴＴＰ／ｄＣＴＰ／ｄＧＴＰ）と組み合わせる。次に、その混合物を熱サイクル処理して、標的核酸伸長産物をワンパス伸長させるかまたは線形増幅して第１の相補配列（ＣＳ）を作成する。この例では、９８℃で３０秒間；９８℃で５秒間、６０℃で１分間および７２℃で１分間を５サイクル；その後に７２℃で２分間である。次いで、任意選択で、例えば磁気ビーズを使用するなど、任意の適切な方法で線形ＣＳ産物を精製することができる。図１４のセクション（Ｅ）に示すとおり。
【０３９６】
第２のアダプター鋳型オリゴの第１の相補鎖へのアニーリング
第１のＣＳ産物を、適切なバッファー中において、適切な量の第２のアダプター鋳型オリゴ（例えば、限定はされないが、ヘアピンを形成するオリゴ）と混合する。この例では、第１のＣＳ産物を２００ｐｍｏｌｅのＡＴＯ（１−０１８）とＨ２Ｏ中で混合し、最終体積１５μｌにする。その混合物を、適切な温度（この例では９５℃）で、適切な時間（この例では２分間）、または二本鎖核酸を一本鎖に変性させることができる他の温度または時間で、加熱する。その後、核酸とＡＴＯの混合物を、この例では４℃に２分間、または核酸とＡＴＯ間のアニーリングを促進することができる他の適切な温度または時間まで、冷却する。図１４のセクション（Ｆ）に示すとおり。
【０３９７】
修飾された第１の相補鎖を形成するための、第２のアダプター鋳型オリゴを鋳型とする第１の相補鎖のそれ自身をプライマーとして使用する伸長
プルーフリーディング活性を有するまたはプルーフリーディング活性を有さない、鎖置換活性を有するまたは鎖置換活性を有さない、適切な量のＤＮＡポリメラーゼ（例えば、限定はされないが、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、またはＰｈｕｓｉｏｎ）を適切なバッファーおよび適切なｄＮＴＰと混合したものを、ＤＮＡ−ＡＴＯ混合物と組み合わせる。この例では、合計２．５単位のクレノウと２．５単位のＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼ、２μｌの１０ｘＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼバッファー、および１０ｎｍｏｌｅの各ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ／ｄＴＴＰ／ｄＣＴＰ／ｄＧＴＰ）をＤＮＡ−ＡＴＯ混合物と合わせて、最終体積２０μｌにする。ＤＮＡポリメラーゼおよびバッファーの存在下で標的核酸とＡＴＯとのアニーリングをさらに促進するために、この例の混合物を、２５℃未満の温度で３０分間、または核酸とＡＴＯとの間のアニーリングを促進できる他の適切な温度または時間で、インキュベートする。この例では、ＡＴＯ配列を鋳型として使用する標的核酸の伸長を促進するために、インキュベーション温度を３７℃に３０分間、またはＤＮＡポリメラーゼ活性を促進できる他の適切な温度に上げる。図１４のセクション（Ｇ）に示すとおり。
【０３９８】
アダプター鋳型オリゴの分解
アダプター鋳型オリゴは、例えば、限定はされないが、ｄＵ−グリコシラーゼとアプリン／アピリミジンエンドヌクレアーゼとの組合せの添加により選択的に分解され、この例では、２単位のＵＳＥＲ酵素を２０μｌの修飾標的ポリヌクレオチド反応混合物に加え、その後、この例では、３７℃で３０分間および次いで２５℃で１５分間、または酵素活性を促進できる他の適切な温度と時間で、順次インキュベートする。任意選択で、分解されたＡＴＯを任意の適切な精製方法を使用して除去してもよい。図１４のセクション（Ｈ）に示すとおり。
【０３９９】
ＰＣＲによる修飾された第１の相補鎖産物の指数関数的増幅
精製または未精製の修飾された第１のＣＳ産物を、２つのプライマー、プルーフリーディングポリメラーゼ（例えば、限定はされないが、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｑ５）、適切なバッファー、および適切なｄＮＴＰ、ならびにその他の適切なまたは必要な添加物質（例えば、限定はされないが、ＤＭＳＯ、ベタイン、および硫酸アンモニウム）と組み合わせる。２つのプライマーのうちの１つは、第１のＡＴＯを用いて形成された伸長と配列類似性を有し、かつそれに結合するように設計されており、さらに次世代シーケンシング技術を使用したシーケンシングに適合しかつそれに必要な配列（例えば、限定はされないが、Ｐ５またはＰ７アダプター配列、患者／サンプルインデックス配列、イルミナ社の次世代シーケンサーとの適合性のためのイルミナまたはカスタムリード１またはリード２配列）を含み、２つ目のプライマーは、第２のＡＴＯを用いて形成された伸長と配列類似性を有し、かつそれに結合するように設計されており、さらに次世代シーケンシング技術を使用したシーケンシングに適合しかつそれに必要な配列（例えば、Ｐ５またはＰ７アダプター配列、患者／サンプルインデックス配列、イルミナ社の次世代シーケンサーとの適合性のためのイルミナまたはカスタムリード１またはリード２配列）を含む。この例では、精製された修飾された第１のＣＳ産物を、５０ｐｍｏｌｅずつの２つのプライマー（２−００２、２−００３）、２単位のＰｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ、１０μｌの５ｘＰｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼバッファー、１０ｎｍｏｌの各ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ／ｄＴＴＰ／ｄＣＴＰ／ｄＧＴＰ）、および１μｍｏｌｅの硫酸アンモニウムと組み合わせて、最終体積５０μｌにする。次に、その混合物を熱サイクル処理して、修飾された第１のＣＳ産物を指数関数的に増幅する。この例では、９８℃で３０秒間；９８℃で５秒間、６０℃で１分間および７２℃で１分間を１２サイクル；その後、７２℃で２分間である。次いで、増幅産物を、例えば磁気ビーズを使用するなど、任意の適切な方法により精製することができる。最終増幅産物は、例えば、イルミナプラットフォームでの次世代シーケンシングに適合する。図１４のセクション（Ｉ）に示すとおり。
【０４００】
結果
アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）社のバイオアナライザ高感度キットを使用して、最終完成シーケンシングライブラリー（final complete sequencing library）を評価して、ライブラリー調製の最終産物が、投入材料のサイズ分布から予測されるものと同等のサイズ分布を有することを実証することができた。図１４のセクション（Ｊ）に示すとおり。
【０４０１】
結論
断片化されたｇＤＮＡを使用する第１のＡＴＯ反応と、複数の第１相補鎖を作成するための線形増幅プロセスと、線形増幅産物を標的ポリヌクレオチドとして使用する第２のＡＴＯ反応と、それに続くグローバルな増幅とを組み合わせることにより、シーケンシングライブラリーの作成に使用することに関してこの技術的アプローチの検証に成功した。
【０４０２】
実施例２
標的ポリヌクレオチドとしてデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を使用し、例えば、限定はされないが、化学的スペーサー（例えば、限定はされないが、Ｃ３スペーサー、Ｃ１８スペーサー）を用いて形成されたヘアピンを有するアダプター鋳型オリゴを使用して標的化アンプリコン次世代シーケンサーライブラリー（例えば、限定はされないが、イルミナ社の次世代シーケンサーに適合する）を作成する。
【０４０３】
材料
標的ポリヌクレオチド、ヒトｇＤＮＡ（ＢＩＯ−３５０２５）
ＤＮＡ断片化酵素、ＫＡＰＡ  Ｆｒａｇ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ、７９６２５１７００１）
アダプター鋳型オリゴ（ＡＴＯ）、１−００６（表１）
ＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０２７３Ｌ）
ＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼバッファー（ＮＥＢ、Ｍ０２７３Ｌ）
ＤＮＡポリメラーゼＩ、ラージ（クレノウ）フラグメント（ＮＥＢ、Ｍ０２１０Ｌ、Ｍ０２１２Ｌ）
ｄＮＴＰ（ＮＥＢ、Ｎ０４４７）
Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０５３０Ｓ）
Ｐｈｕｓｉｏｎバッファー（ＮＥＢ、Ｍ０５３０Ｓ）
ＵＳＥＲ（登録商標）Ｅｎｚｙｍｅ（ＮＥＢ、Ｍ５５０５Ｓ）
プライマー、２−００４、２−００５（表２）
硫酸アンモニウム（ＳＩＧＭＡ、Ａ４４１８）
Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ａ６３８８１）
アジレントのバイオアナライザ高感度キット（製品ＩＤ５０６７−４６２６）
ＳＹＢＲ（商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｉ核酸ゲル染色（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓ７５６３）
【０４０４】
方法
アダプター鋳型オリゴのデオキシリボ核酸へのアニーリング
実施例１と同様に、合計２５ｎｇの断片化標的ポリヌクレオチドを、合計１００ｐｍｏｌのＡＴＯとなるように１００ｐｍｏｌのＡＴＯ１−００６とＨ２Ｏ中で混合し、７．５μｌの最終体積にする。図１３のセクション（Ａ）および（Ｂ）に示すとおり。
【０４０５】
アダプター鋳型オリゴを鋳型とする標的デオキシリボ核酸のそれ自身をプライマーとして使用する伸長
実施例１と同様に、合計１．２５単位のクレノウと１．２５単位のＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼ、１μｌの１０ｘＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼバッファー、および５ｎｍｏｌｅの各ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ／ｄＴＴＰ／ｄＣＴＰ／ｄＧＴＰ）を、ＤＮＡ−ＡＴＯ混合物と組み合わせて１０μｌの最終体積にする。図１３のセクション（Ｃ）に示すとおり。
【０４０６】
アダプター鋳型オリゴの分解
実施例１と同様。図１３のセクション（Ｄ）に示すとおり。
【０４０７】
ＰＣＲによる修飾標的ポリヌクレオチドの第１の指数関数的増幅
精製または未精製の修飾標的ポリヌクレオチドを、元々ＡＴＯに存在して現在は標的ポリヌクレオチドの３’末端に存在するユニバーサル配列に相補的なユニバーサルプライマー、目的の突然変異を含むＤＮＡの領域（例えば、限定はされないが、一塩基多型、インデル、ＤＮＡ融合）を標的とするように設計された標的特異的プライマーのプール、プルーフリーディング活性を有するまたはプルーフリーディング活性を有さない適切な量のＤＮＡポリメラーゼ（例えば、限定はされないが、ＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼ、またはＰｈｕｓｉｏｎ）、適切なバッファー、適切なｄＮＴＰ、およびその他の適切または必要な添加物（例えば、ＤＭＳＯ、ベタイン、および硫酸アンモニウム）と混合する。この例では、５μｌの修飾標的ポリヌクレオチド、５０ｐｍｏｌｅの２−００４、１００ｐｍｏｌｅの標的特異的プライマーのプール、１２ｎｍｏｌｅの各ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ／ｄＴＴＰ／ｄＣＴＰ／ｄＧＴＰ）、２単位のＰｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ、１０μｌの５ｘＰｈｕｓｉｏｎバッファー、および１μｍｏｌｅの硫酸アンモニウムを合わせて、５０μｌの最終体積にした。次に、この混合物を熱サイクル処理して、標的核酸伸長産物の選択領域を増幅する。この例では、９８℃で１分間；９８℃で５秒間、６０℃で５分間および７２℃で３０秒を１５サイクル；続いて７２℃で２分間である。次に、任意選択で、例えば磁気ビーズを使用するなど、任意の適切な方法で増幅産物を精製することができ、この例では、図１３のセクション（Ｅ）に示すように、ＰＣＲ産物を３０μｌに溶出させた。
【０４０８】
ＰＣＲによる第１の指数関数的増幅産物の任意選択的な第２の指数関数的増幅
精製された第１の指数関数的増幅産物を、次世代シーケシング技術を使用したシーケンシングに適合しかつそれに必要な配列（例えば、限定はされないが、Ｐ５またはＰ７アダプター配列、患者／サンプルインデックス配列、イルミナ社の次世代シーケンサーとの適合性のためのイルミナまたはカスタムリード１またはリード２配列）を含む、第１のユニバーサルプライマーによって導入されたユニバーサル配列と配列類似性を有し、かつそれに結合するように設計された第２のネスト化ユニバーサルプライマー；目的の突然変異を含むＤＮＡの領域を標的とし、次世代シーケシング技術に適合しかつその適合に必要な配列（例えば、限定はされないが、Ｐ５またはＰ７アダプター配列、患者／サンプルインデックス配列、イルミナ社の次世代シーケンサーとの適合性のためのイルミナまたはカスタムリード１またはリード２配列）を含む、第１のプライマープールを含むかそれに対してネスト化された、ＤＮＡの領域を標的にするように設計された標的化プライマーの第２のプール；プルーフリーディングポリメラーゼ（例えば、限定はされないが、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｑ５）；適切なバッファー；適切なｄＮＴＰ；およびその他の適切なまたは必要な添加物（例えば、制限はされないが、ＤＭＳＯ、ベタイン、および硫酸アンモニウム）と組み合わせる。この例では、１０μｌの精製された第１の増幅産物、１２．５ｐｍｏｌｅの２−００５、５０ｐｍｏｌｅのネスト化標的特異的プライマーのプール、５ｎｍｏｌの各ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ／ｄＴＴＰ／ｄＣＴＰ／ｄＧＴＰ）、１単位のＰｈｕｓｉｏｎＤＮＡポリメラーゼ、５μｌの５ｘＰｈｕｓｉｏｎバッファー、１ｘＳＹＢＲｇｒｅｅｎ、および０．５μｍｏｌｅの硫酸アンモニウムを合わせて、２５μｌの最終体積にした。次に、その混合物を熱サイクル処理して、第１の指数関数的増幅産物の選択領域を増幅する。図１３のセクション（Ｆ）に示すように、この例では、９８℃で１分間；９８℃で５秒間、６０℃で５分間、および７２℃で３０秒間を１５サイクル；その後７２℃で２分間であった。次に、例えば磁気ビーズを使用するなど、任意の適切な方法で増幅産物を精製することができ、それは適合する技術に基づき次世代シーケンシングに適したものとなる。この例では、図１３のセクション（Ｇ）に示すように、サイズ分布を決定し、ＭｉＳｅｑで１５０ｂｐのペアエンドリードを作成するために使用する前に、第２の指数関数的増幅産物をビーズ精製した。
【０４０９】
結果
第１および第２の指数関数的増幅の組合せにより、修飾標的ポリヌクレオチドの標的領域をうまく増幅し、標的化アンプリコンライブラリーを作成することができた。第２の指数関数的増幅反応にＳＹＢＲｇｒｅｅｎを含めることにより、最終ライブラリー生成物の増幅率のモニタリングを可能とし、融解曲線分析は、鋳型なしのコントロールと比較して、その方法全体が実質的により高分子量の生成物を作成できたことを示した。アジレント社のバイオアナライザ高感度キット（製品ＩＤ５０６７−４６２６）を使用して、最終完成シーケンシングライブラリーを評価して、ライブラリー調製の最終産物が、投入材料のサイズ分布から予測されるものと同等のサイズ分布を有することを実証することができた。ＭｉＳｅｑを用いてプールされたランの一環としてシーケンシングデータを作成するためにこのライブラリーを使用して、３６０万よりわずかに多いリード（読み取り）を作成した。そのリードを、ｂｗａを使用して参照サンプルにマッピングし、９８％のマッピング率が得られた。マッピングされたペアエンドリードのインサートサイズを調べると、２６ｂｐ（２５ｂｐ以下のインサートは除外された）からほぼ４００ｂｐまでのインサート分布を表す。図１３のセクション（Ｈ）に示すように、ピークインサートサイズは約１００ｂｐである。図１３のセクション（Ｉ）に示すように、各標的特異的プライマーの効率の検査は、各プライマー部位にマッピングされるシーケンシング結果のリード数をカウントすることによって行われた。これにより、標的部位の全体にわたり均一なカバレッジが明らかになった。セクション（Ｊ）に示すように、ＵＩＤの組み込みにより、「バーコードファミリー」を作成することができ、標的部位あたりのファミリー数をカウントすることができた。これにより、ちょうど１０００を超えるバーコードファミリーの最大カウントが示された。
【０４１０】
結論
断片化されたｇＤＮＡを使用する第１のＡＴＯ反応と、標的特異的プライマーのプールおよび第２のネスト化標的特異的プライマーのプールを使用する２ラウンドの指数関数的増幅プロセスとを組み合わせることにより、鎖特異的標的化アンプリコンベースのシーケシングライブラリーの作成に使用することに関してこの技術的アプローチの検証に成功した。イルミナ社のＭｉＳｅｑシーケンサーで最終ライブラリー生成物のシーケンシングに成功し、最終ライブラリー製品に、我々がその中に組み込むように設計した構成要素がシーケンシングに必要な正しい順序で含まれていることが確認された。データ分析は、すべてのプライマーについて同様のエンリッチメントレベルで、２００を超える異なる標的領域のマルチプレックス増幅（多重増幅）に成功したことを示した。プライマー部位のそれぞれについてバーコードファミリーの数を比較すると、すべての部位にわたりほんのわずかな変動しか示さず、ＡＴＯ反応において標的配列に基づきバイアスがほとんどないかまたはまったくないことを示した。
【０４１１】
実施例３
標的ポリヌクレオチドとしてデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を使用し、例えば、限定はされないが、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターと互換性がありかつＲＮＡポリメラーゼプロモーターとして機能できる配列とヌクレオチド配列によって形成されたヘアピンとを含むアダプター鋳型オリゴを使用して、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを組み込んでＤＮＡのＲＮＡでの増幅を駆動する。
【０４１２】
材料
標的ポリヌクレオチド、ヒトｇＤＮＡ（ＢＩＯ−３５０２５）
ＤＮＡ断片化酵素、ＫＡＰＡ  Ｆｒａｇ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ、７９６２５１７００１）
アダプター鋳型オリゴ（ＡＴＯ）、１−０１２（表１）
ＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０２７３Ｌ）
ＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼバッファー（ＮＥＢ、Ｍ０２７３Ｌ）
ＤＮＡポリメラーゼＩ、ラージ（クレノウ）フラグメント（ＮＥＢ、Ｍ０２１０Ｌ、Ｍ０２１２Ｌ）
ｄＮＴＰ（ＮＥＢ、Ｎ０４４７）
ＵＳＥＲ（登録商標）Ｅｎｚｙｍｅ（ＮＥＢ、Ｍ５５０５Ｓ）
Ｔ７−Ｓｃｒｉｂｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ＲＮＡ  ＩＶＴ  Ｋｉｔ（ＣＥＬＬＳＣＲＩＰＴ、Ｃ−ＡＳ３１０７）
【０４１３】
方法
アダプター鋳型オリゴのデオキシリボ核酸へのアニーリング
ＡＴＯが、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターと互換性がありかつＲＮＡポリメラーゼプロモーターとして機能できる配列（例えば、限定はされないが、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６プロモーター配列）を含むことを除いて実施例１と同様であり、この例では、ＡＴＯはＴ７プロモーターを含むＡＴＯ１−０１２である。
【０４１４】
アダプター鋳型オリゴを鋳型とする標的デオキシリボ核酸のそれ自身をプライマーとして使用する伸長
実施例１と同様である。
【０４１５】
ＲＮＡポリメラーゼを使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写
精製または未精製の標的デオキシリボ核酸伸長（修飾ポリヌクレオチド）産物を、適切なバッファー、適切なＮＴＰ、他の適切な添加物（例えば、限定はされないが、ＤＴＴ）、および適切なＲＮＡポリメラーゼ（例えば、限定はされないが、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが使用される場合、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ）と、ＲＮＡポリメラーゼの活性を促進するのに適切な時間および温度で組み合わせる。この例では、５μｌの精製された修飾標的ポリヌクレオチドと、市販のキットを取扱説明書に従って使用し、ＣＥＬＬＳＣＲＩＰＴ（商標）Ｔ７−Ｓｃｒｉｂｅ（商標）Ｓｔａｎｄａｒｄ  ＲＮＡ  ＩＶＴ  ＫＩＴを、３７℃で１８時間、最終体積２０μｌでインキュベートした。生成されたＲＮＡを、高感度Ｑｕｂｉｔ３試薬を使用して定量化し、合計１０７ｎｇ／μｌが測定され、一晩１８時間のインキュベーションから生成されたＲＮＡの合計量は２０３５ｎｇであった。その後、そのＲＮＡは、例えば、限定はされないが、ＲＮＡ次世代シーケンシング、ｃＤＮＡ合成、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ｑＰＣＲ、またはその他の適切なダウンストリームプロセスなど、任意の適切なＲＮＡベースのダウンストリームアプリケーションのための投入材料を形成できる。
【０４１６】
結果
二本鎖のときにＲＮＡポリメラーゼのプロモーターとして機能するように設計された配列を含むＡＴＯを、修飾標的ポリヌクレオチドを作成するための第１のＡＴＯ反応で使用した。その産物をｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応で使用して合計２μｇのＲＮＡが生成されたため、この第１の反応は成功したと判断できる。
【０４１７】
結論
ＲＮＡポリメラーゼプロモーターとして機能するように設計されたヌクレオチド配列を、ＡＴＯの設計にうまく組み込むことができる。第１のＡＴＯ伸長の後、修飾標的ポリヌクレオチドの一部は二本鎖となり、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む。次に、この二本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを使用して、標的ポリヌクレオチドをＤＮＡではなくＲＮＡで増幅させることができる。これにより、少量のＤＮＡを迅速かつロバストにＲＮＡで増幅させることができ、ＲＮＡ−ＳｅｑやｃＤＮＡ合成を含む多くのダウンストリームアプリケーションでの鋳型として使用できる。
【０４１８】
実施例４
標的ポリヌクレオチドとしてデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を使用し、例えば、限定はされないが、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターと互換性がありかつＲＮＡポリメラーゼプロモーターとして機能できる配列とヌクレオチド配列によって形成されたヘアピンとを含むアダプター鋳型オリゴ（ＡＴＯ）、およびそのＡＴＯに相補的である第２のオリゴを使用して、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを組み込んでＤＮＡのＲＮＡでの増幅を駆動する。
【０４１９】
材料
標的ポリヌクレオチド、ヒトｇＤＮＡ（ＢＩＯ−３５０２５）
ＤＮＡ断片化酵素、ＫＡＰＡ  Ｆｒａｇ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ、７９６２５１７００１）
アダプター鋳型オリゴ（ＡＴＯ）、１−０１９、１−０２０（表１）
ＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０２７３Ｌ）
ＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼバッファー（ＮＥＢ、Ｍ０２７３Ｌ）
ＤＮＡポリメラーゼＩ、ラージ（クレノウ）フラグメント（ＮＥＢ、Ｍ０２１０Ｌ、Ｍ０２１２Ｌ）
ｄＮＴＰ（ＮＥＢ、Ｎ０４４７）
ＵＳＥＲ（登録商標）Ｅｎｚｙｍｅ（ＮＥＢ、Ｍ５５０５Ｓ）
Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ａ６３８８１）
Ｔ７−Ｓｃｒｉｂｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ＲＮＡ  ＩＶＴ  Ｋｉｔ（ＣＥＬＬＳＣＲＩＰＴ、Ｃ−ＡＳ３１０７）
【０４２０】
方法
アダプター鋳型オリゴのデオキシリボ核酸へのアニーリング
ＡＴＯ１−０１９を使用したことを除き、実施例３と同様である。
【０４２１】
アダプター鋳型オリゴを鋳型とする標的デオキシリボ核酸のそれ自身をプライマーとして使用する伸長
実施例１と同様である。
【０４２２】
アダプター鋳型オリゴの分解
実施例１と同様である。
【０４２３】
二本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの生成
精製または未精製の標的デオキシリボ核酸伸長産物を、元々ＡＴＯに存在して現在は標的ＤＮＡ分子に存在する保存配列に相補的な配列と組み合わせる。この例では、１５μｌの精製された修飾標的ポリヌクレオチド、および１００ｐｍｏｌｅの１−０２０を、２０μｌの最終体積のＨ２Ｏ中に含める。その混合物を、適切な温度（この例では９５℃）で、二本鎖核酸の一本鎖への変性を促進するのに必要な適切な時間（この例では２分間）、加熱する。次いで、混合物を冷却して、修飾標的ポリヌクレオチドと標的デオキシリボ核酸伸長相補オリゴとの間で二本鎖複合体の形成を可能にする。この例では室温（２５℃）で少なくとも５分間である。
【０４２４】
ＲＮＡポリメラーゼを使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写
実施例３と同様である。
【０４２５】
結果
二本鎖であるときにＲＮＡポリメラーゼのプロモーターとして機能するように設計された配列を含むＡＴＯを、修飾標的ポリヌクレオチドを作成するための第１のＡＴＯ反応で使用した。その産物をｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応で使用してＲＮＡが生成されたため、この第１の反応は成功したと判断できる。
【０４２６】
結論
ＲＮＡポリメラーゼプロモーターとして機能するように設計されたヌクレオチド配列は、ＡＴＯの設計にうまく組み込むことができる。第１のＡＴＯ伸長の後、ＡＴＯは消化されて除去され、相補的オリゴが修飾標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし、修飾標的ポリヌクレオチドの一部は二本鎖となり、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む。次に、この二本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを使用して、標的ポリヌクレオチドをＤＮＡではなくＲＮＡで増幅させることができる。これにより、少量のＤＮＡを迅速かつロバストにＲＮＡで増幅させることができ、ＲＮＡ−ＳｅｑやｃＤＮＡ合成を含む多くのダウンストリームアプリケーションでの鋳型として使用できる。
【０４２７】
実施例５
標的ポリヌクレオチドとしてデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を使用し、例えば、限定はされないが、ランダムな特別に設計されたまたは特別に選択された配列によって分離された部分的にまたは完全に相補的な２つの短いステム領域を用いて形成されたヘアピン（ステムループ）構造を有するアダプター鋳型オリゴを使用して、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを組み込んでＤＮＡのＲＮＡでの増幅をもたらす。
【０４２８】
材料
標的ポリヌクレオチド、ヒトｇＤＮＡ（ＢＩＯ−３５０２５）
ＤＮＡ断片化酵素、ＫＡＰＡ  Ｆｒａｇ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ、７９６２５１７００１）
アダプター鋳型オリゴ（ＡＴＯ）、１−０２１（表１）
ＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０２７３Ｌ）
ＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼバッファー（ＮＥＢ、Ｍ０２７３Ｌ）
ＤＮＡポリメラーゼＩ、ラージ（クレノウ）フラグメント（ＮＥＢ、Ｍ０２１０Ｌ、Ｍ０２１２Ｌ）
ｄＮＴＰ（ＮＥＢ、Ｎ０４４７）
Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０５３０Ｓ）
Ｐｈｕｓｉｏｎバッファー（ＮＥＢ、Ｍ０５３０Ｓ）
ＵＳＥＲ（登録商標）Ｅｎｚｙｍｅ（ＮＥＢ、Ｍ５５０５Ｓ）
Ｓ１ヌクレアーゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＥＮ０３２１）
Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ａ６３８８１）
Ｔ７−Ｓｃｒｉｂｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ＲＮＡＩＶＴ  ＫＩＴ（ＣＥＬＬＳＣＲＩＰＴ、Ｃ−ＡＳ３１０７）
【０４２９】
方法
アダプター鋳型オリゴのデオキシリボ核酸へのアニーリング
ＡＴＯ（１−０２１）が、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターとして機能するように設計された配列に加えて、ランダムな特別に設計されたまたは特別に選択された配列によって分離された部分的にまたは完全に相補的な２つの短い領域を用いて形成されたヘアピンを含むことを除いて、実施例３と同様である。
【０４３０】
アダプター鋳型オリゴを鋳型とする標的デオキシリボ核酸のそれ自身をプライマーとして使用する伸長
実施例３と同様である。
【０４３１】
二本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む二本鎖標的デオキシリボ核酸伸長産物の作成
修飾標的ポリヌクレオチド反応混合物を、追加のプルーフリーディング活性を有するまたはプルーフリーディング活性を有さない耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼ、またはＰｈｕｓｉｏｎなど）と組み合わせ、さらに適切なバッファーおよび適切なｄＮＴＰと混合する。この例では、２０μｌの修飾標的ポリヌクレオチド反応混合物、２単位のＰｈｕｓｉｏｎＤＮＡポリメラーゼ、６μｌの５ｘＰｈｕｓｉｏｎバッファー、５ｎｍｏｌの各ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ／ｄＴＴＰ／ｄＣＴＰ／ｄＧＴＰ）を最終体積３０μｌ中に含める。その混合物を、適切な温度（この例では９５℃）で、適切な時間（この例では２分間）、または二本鎖核酸を一本鎖に変性させることができる他の温度または時間で、加熱する。次に、サンプルを冷却して、標的デオキシリボ核酸伸長産物内およびＡＴＯオリゴ内の相補的な領域（例えば、限定はされないが、部分的にまたは完全に相補的な２つの領域を含むことによりヘアピンを形成するヌクレオチド配列）を自己アニールさせる。この例では室温（２５℃）で５分間である。修飾標的デオキシリボ核酸伸長産物の３’領域は、小さなヘアピンを形成して自己アニールする。その後、３’末端を完全に伸長させるのに必要な適切な時間のあいだ温度を適切な温度に上げ（この例では７２℃で１０分間である）、その際に３’末端は、伸長を開始して２本の相補鎖を分離するヘアピンを有する完全にまたは部分的に二本鎖である標的デオキシリボ核酸伸長産物を形成するためのプライマーとして機能するであろう。
【０４３２】
任意選択によるアダプター鋳型オリゴの分解
実施例１と同様である。
【０４３３】
ＲＮＡポリメラーゼを使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写
実施例３と同様である。
【０４３４】
結果
二本鎖であるときにＲＮＡポリメラーゼのプロモーターとして機能するように設計された配列と内部ヘアピンを形成する配列とを含むＡＴＯを、修飾標的ポリヌクレオチドを作成するための第１のＡＴＯ反応で使用した。その産物をｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応で使用してＲＮＡが生成されたため、この第１の反応は成功したと判断できる。
【０４３５】
結論
ＲＮＡポリメラーゼプロモーターとして機能するように設計されたヌクレオチド配列は、内部ヘアピンおよび伸長と組み合わせて、ＡＴＯの設計にうまく組み込むことができる。第１のＡＴＯ伸長の後、ＡＴＯが消化されて除去された後、相補的な領域が再アニールおよび伸長することができ、ヘアピンを有する二本鎖修飾標的ポリヌクレオチドが生成されることを示した。次に、この二本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを使用して、標的ポリヌクレオチドをＤＮＡではなくＲＮＡで増幅させることができる。これにより、少量のＤＮＡを迅速かつロバストにＲＮＡで増幅させることができ、ＲＮＡ−ＳｅｑやｃＤＮＡ合成を含む多くのダウンストリームアプリケーションでの鋳型として使用できる。
【０４３６】
実施例６
標的ポリヌクレオチドとしてデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を使用し、例えば、限定はされないが、ランダムな特別に設計されたまたは特別に選択された配列によって分離された部分的にまたは完全に相補的な２つの短い領域を用いて形成されたヘアピンを有するアダプター鋳型オリゴを使用して、次世代シーケンシングライブラリー（例えば、限定はされないが、イルミナの次世代シーケンサーに適合する）を作成する。
【０４３７】
材料
標的ポリヌクレオチド、ヒトｇＤＮＡ（ＢＩＯ−３５０２５）
ＤＮＡ断片化酵素、ＫＡＰＡ  Ｆｒａｇ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ、７９６２５１７００１）
アダプター鋳型オリゴ（ＡＴＯ）、１−０１３、１−０２２（表１）
ＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０２７３Ｌ）
ＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼバッファー（ＮＥＢ、Ｍ０２７３Ｌ）
ＤＮＡポリメラーゼＩ、ラージ（クレノウ）フラグメント（ＮＥＢ、Ｍ０２１０Ｌ、Ｍ０２１２Ｌ）
ｄＮＴＰ（ＮＥＢ、Ｎ０４４７）
Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０５３０Ｓ）
Ｐｈｕｓｉｏｎバッファー（ＮＥＢ、Ｍ０５３０Ｓ）
ＵＳＥＲ（登録商標）Ｅｎｚｙｍｅ（ＮＥＢ、Ｍ５５０５Ｓ）
Ｓ１ヌクレアーゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＥＮ０３２１）
Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ａ６３８８１）
プライマー  ２−００２、２−００３（表２）
【０４３８】
方法
アダプター鋳型オリゴのデオキシリボ核酸へのアニーリング
ＡＴＯ（１−０１３）が、ランダムな特別に設計されたまたは特別に選択された配列によって分離された部分的にまたは完全に相補的な２つの短い領域を用いて形成されたヘアピンとして機能するように設計された配列を有することを除いて実施例１と同様である。
【０４３９】
アダプター鋳型オリゴを鋳型とする標的デオキシリボ核酸のそれ自身をプライマーとして使用する伸長
実施例１と同様である。
【０４４０】
二本鎖修飾標的ポリヌクレオチドの作成
実施例５と同様である。
【０４４１】
アダプター鋳型オリゴの分解およびヘアピン分解
Ｓ１ヌクレアーゼを追加して、実施例５と同様に行った。これは、ＥＤＴＡを添加し、さらに７０℃で１０分間、またはＳ１ヌクレアーゼの不活性化をもたらす同様の温度と時間でインキュベートすることによりＳ１を不活性化させる追加の不活化ステップを必要とする場合がある。
【０４４２】
二本鎖修飾標的ポリヌクレオチドのワンパス伸長または線形増幅による第１のＣＳの作成
実施例１と同様である。
【０４４３】
第１のＣＳへの第２のアダプター鋳型オリゴのアニーリング
ＡＴＯ（１−０２２）が、ランダムな特別に設計されたまたは特別に選択された配列によって分離された部分的にまたは完全に相補的な２つの短い領域を用いて形成されたヘアピンとして機能するように設計された配列を有することを除いて実施例１と同様である。
【０４４４】
第２のアダプター鋳型オリゴを鋳型とする第１のＣＳ自身をプライマーとして使用する第１のＣＳの伸長による修飾された第１のＣＳの形成
実施例１と同様である。
【０４４５】
二本鎖修飾標的ポリヌクレオチドの作成
実施例５と同様である。
【０４４６】
アダプター鋳型オリゴの分解およびヘアピン分解
上記のとおりである。
【０４４７】
ＰＣＲによる修飾された第１のＣＳの指数関数的増幅
実施例１と同様である。
【０４４８】
結果
この実施例を使用して、修飾標的ポリヌクレオチドおよび修飾された第１のＣＳの自己アニーリングおよび伸長を使用して、完成全ゲノム次世代シーケンシングライブラリーをもたらす最終指数関数的増幅のための鋳型を作成できることを示すことができる。
【０４４９】
結論
断片化されたｇＤＮＡを使用する第１のＡＴＯ反応と、二本鎖ＤＮＡを作成するための自己アニーリングおよび伸長プロセスと、複数の第１の相補鎖を作成するためのワンパス伸長または線形増幅と、線形増幅産物を標的ポリヌクレオチドとして使用する第２のＡＴＯ反応と、それに続くグローバルな増幅とを組み合わせることにより、シーケンシングライブラリーの作成で使用することに関してこの技術的アプローチの検証に成功した。
【０４５０】
実施例７
標的ポリヌクレオチドとしてデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を使用し、例えば、限定はされないが、ランダムな特別に設計されたまたは特別に選択された配列によって分離された部分的にまたは完全に相補的な２つの短い領域を用いて形成されたヘアピンを有するアダプター鋳型オリゴと、二本鎖のまたは部分的に二本鎖の通常のアダプターとを使用して、次世代シーケンシングライブラリー（例えば、限定はされないが、イルミナの次世代シーケンサーに適合する）を作成する。
【０４５１】
材料
標的ポリヌクレオチド、ヒトｇＤＮＡ（ＢＩＯ−３５０２５）
ＤＮＡ断片化酵素、ＫＡＰＡ  Ｆｒａｇ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ、７９６２５１７００１）
アダプター鋳型オリゴ（ＡＴＯ）、１−０２２（表１）
ＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０２７３Ｌ）
ＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼバッファー（ＮＥＢ、Ｍ０２７３Ｌ）
ＤＮＡポリメラーゼ  Ｉ、ラージ（クレノウ）フラグメント（ＮＥＢ、Ｍ０２１０Ｌ、Ｍ０２１２Ｌ）
ｄＮＴＰｓ（ＮＥＢ、Ｎ０４４７）
Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０５３０Ｓ）
Ｐｈｕｓｉｏｎバッファー（ＮＥＢ、Ｍ０５３０Ｓ）
ＵＳＥＲ（登録商標）Ｅｎｚｙｍｅ（ＮＥＢ、Ｍ５５０５Ｓ）
Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０２０２Ｓ）
【０４５２】
方法
アダプター鋳型オリゴのデオキシリボ核酸へのアニーリング
ＡＴＯ（１−０２２）が、ランダムな特別に設計されたまたは特別に選択された配列によって分離された部分的にまたは完全に相補的な２つの短い領域を用いて形成されたヘアピンとして機能するように設計された配列を有することを除いて実施例１と同様である。
【０４５３】
アダプター鋳型オリゴを鋳型とする標的デオキシリボ核酸のそれ自身をプライマーとして使用する伸長
実施例１と同様である。
【０４５４】
二本鎖修飾標的ポリヌクレオチドの作成
実施例５と同様である。
【０４５５】
二本鎖標的デオキシリボ核酸伸長産物の末端への二本鎖アダプターのライゲーション
精製または未精製の二本鎖修飾標的ポリヌクレオチドを、適切な量の平滑末端または３’Ｔヌクレオチドオーバーハング末端の完全に二本鎖であるか部分的に二本鎖のヘアピン有するまたは有さないアダプター、適切な量のリガーゼ（例えば、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ）、適切なバッファー、および任意のその他の必要な試薬と混合する。この実施例では、１５μｌの精製二本鎖修飾標的ポリヌクレオチド、５０ｎｍｏｌｅのアダプター、１００単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ、２μｌの１０ｘリガーゼバッファーを２０μｌの最終体積中に含める。すべての二本鎖標的核酸伸長産物の末端への完全なライゲーションを可能にする適切な温度と適切な時間、その混合物をインキュベートする。この例では、２５℃で３０分間であり、または酵素活性を促進することができる他の適切な温度および時間である。
【０４５６】
任意選択的なアダプター鋳型オリゴの分解およびヘアピン分解
実施例６と同様である。
【０４５７】
ＰＣＲによる連結された伸長産物の指数関数的増幅
実施例１と同様である。
【０４５８】
結果
この実施例を使用して、修飾標的ポリヌクレオチドの自己アニーリングおよび伸長を使用して二本鎖の第１のＣＳを作成し、その利用可能な末端にアダプターを連結することにより、完成全ゲノム次世代シーケンシングライブラリーをもたらす最終指数関数的増幅のための鋳型を作成できることを示すことができる。
【０４５９】
結論
断片化されたｇＤＮＡを使用する第１のＡＴＯ反応と、二本鎖ＤＮＡを作成するための自己アニーリングおよび伸長プロセスと、第２の二本鎖ＤＮＡ産物を作成するための二本鎖アダプターの露出末端へのライゲーションと、それに続くグローバルな増幅とを組み合わせることにより、シーケンシングライブラリーの作成で使用することに関してこの技術的アプローチの検証に成功した。
【０４６０】
実施例８
標的ポリヌクレオチドとしてデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を使用し、例えば、限定はされないが、ランダムな特別に設計されたまたは特別に選択された配列によって分離された部分的にまたは完全に相補的な２つの短い領域を用いて形成されたヘアピンを有するアダプター鋳型オリゴと、二本鎖のまたは部分的に二本鎖の通常のアダプターとを使用して、「ＰＣＲ」フリーの次世代シーケンシングライブラリー（例えば、限定はされないが、イルミナの次世代シーケンサーに適合する）を作成する。
【０４６１】
材料
標的ポリヌクレオチド、ヒトｇＤＮＡ（ＢＩＯ−３５０２５）
ＤＮＡ断片化酵素、ＫＡＰＡ  Ｆｒａｇ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ、７９６２５１７００１）
アダプター鋳型オリゴ（ＡＴＯ）、１−０２３（表１）
ＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０２７３Ｌ）
ＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼバッファー（ＮＥＢ、Ｍ０２７３Ｌ）
ＤＮＡポリメラーゼＩ、ラージ（クレノウ）フラグメント（ＮＥＢ、Ｍ０２１０Ｌ、Ｍ０２１２Ｌ）
ｄＮＴＰ（ＮＥＢ、Ｎ０４４７）
Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０５３０Ｓ）
Ｐｈｕｓｉｏｎバッファー（ＮＥＢ、Ｍ０５３０Ｓ）
ＵＳＥＲ（登録商標）Ｅｎｚｙｍｅ（ＮＥＢ、Ｍ５５０５Ｓ）
Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ａ６３８８１）
Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０２０２Ｓ）
【０４６２】
方法
アダプター鋳型オリゴのデオキシリボ核酸へのアニーリング
ＡＴＯ（１−０２３）が、Ｐ５またはＰ７アダプター配列、患者／サンプルインデックス配列、イルミナ社の次世代シーケンサーとの適合性のためのイルミナまたはカスタムリード１またはリード２配列を含み、部分的にまたは完全に相補的な２つの領域を含むことによりヘアピンを形成する配列を有することを除いて、実施例１と同様である。
【０４６３】
アダプター鋳型オリゴを鋳型とする標的ポリヌクレオチドのそれ自身をプライマーとして使用する伸長
実施例１と同様である。
【０４６４】
二本鎖標的デオキシリボ核酸伸長産物の作成
実施例５と同様である。
【０４６５】
二本鎖標的デオキシリボ核酸伸長産物の末端へのアダプターのアニーリングおよびライゲーション
実施例７と同様である。
【０４６６】
任意選択的なアダプター鋳型オリゴの分解およびヘアピン分解
実施例６と同様である。
【０４６７】
結果
この実施例を使用して、修飾標的ポリヌクレオチドの自己アニーリングおよび伸長を使用して二本鎖の第１のＣＳを作成し、その利用可能な末端にアダプターを連結することにより、「指数関数的ＰＣＲ」フリーの次世代シーケンシング用の鋳型をうまく作成できることを示すことができる。
【０４６８】
結論
断片化されたｇＤＮＡを使用する第１のＡＴＯ反応と、二本鎖ＤＮＡを作成するための自己アニーリングおよび伸長プロセスと、第２の二本鎖ＤＮＡ産物を作成するための二本鎖アダプターの露出末端へのライゲーションとを組み合わせることにより、「指数関数的ＰＣＲ」フリーの次世代シーケンシングに関してこの技術的アプローチの検証に成功した。
【０４６９】
実施例９
標的ポリヌクレオチドとしてデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を使用し、例えば、限定はされないが、ループが化学的スペーサー（例えば、限定はされないが、Ｃ３スペーサー、Ｃ１８スペーサー）を含むヘアピン（ステムループ構造）を有するアダプター鋳型オリゴと、二本鎖のまたは部分的に二本鎖の通常のアダプターとを使用して、標的化アンプリコン次世代シーケンサーライブラリー（例えば、限定はされないが、イルミナ社の次世代シーケンサーに適合する）を作成する。
【０４７０】
材料
標的ポリヌクレオチド、ヒトｇＤＮＡ（ＢＩＯ−３５０２５）
ＤＮＡ断片化酵素、ＫＡＰＡ  Ｆｒａｇ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ、７９６２５１７００１）
アダプター鋳型オリゴ（ＡＴＯ）、１−０２３（表１）
ＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０２７３Ｌ）
ＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼバッファー（ＮＥＢ、Ｍ０２７３Ｌ）
ＤＮＡポリメラーゼＩ、ラージ（クレノウ）フラグメント（ＮＥＢ、Ｍ０２１０Ｌ、Ｍ０２１２Ｌ）
ｄＮＴＰ（ＮＥＢ、Ｎ０４４７）
Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０５３０Ｓ）Ｐｈｕｓｉｏｎバッファー（ＮＥＢ、Ｍ０５３０Ｓ）
ＵＳＥＲ（登録商標）Ｅｎｚｙｍｅ（ＮＥＢ、Ｍ５５０５Ｓ）
Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０２０２Ｓ）
Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ａ６３８８１）
プライマー  ２−００６（表２）
【０４７１】
方法
アダプター鋳型オリゴのデオキシリボ核酸へのアニーリング
ＡＴＯのヘアピンが化学スペーサー１−０２４によって作られていることを除き実施例８と同様である。
【０４７２】
アダプター鋳型オリゴを鋳型とする標的ポリヌクレオチドのそれ自身をプライマーとして使用する伸長
実施例１と同様である。
【０４７３】
アダプター鋳型オリゴの分解
実施例１と同様である。
【０４７４】
線形伸長による二本鎖修飾標的ポリヌクレオチドの作成
精製された標的核酸伸長産物を、修飾された標的ＤＮＡ分子の３’末端に現在存在する保存配列に相補的なオリゴヌクレオチドプライマー、ポリメラーゼ（例えば、限定はされないが、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ）、適切なバッファー、および適切なｄＮＴＰと組み合わせる。この例では、標的ＤＮＡ分子に現在存在する保存配列に相補的な５０ｐｍｏｌのプライマー（２−００６）、２単位のＰｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ、６μｌの５ｘＰｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼバッファー、１２ｎｍｏｌの各ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ／ｄＴＴＰ／ｄＣＴＰ／ｄＧＴＰ）、１５μｌの精製修飾標的ポリヌクレオチドを、３０μｌの最終体積中に含める。その混合物を、この例では６０〜７２℃で３０分間、または酵素活性を促進してオリゴヌクレオチドを伸長して平滑末端またはＡテールを有する二本鎖ＤＮＡ産物を作成することができる他の適切な温度および時間で、インキュベートする。その後、産物を任意の適切な精製方法を使用して精製してもよい。
【０４７５】
二本鎖標的デオキシリボ核酸伸長産物の末端への通常のアダプターのライゲーション
実施例８と同様である。
【０４７６】
結果
この実施例を使用して、第１のＡＴＯ反応、１ラウンドの伸長、および通常のアダプターのライゲーションの組合せを使用して、ＰＣＲフリーの次世代シーケンシング用の鋳型をうまく作成できることを示すことができる。
【０４７７】
結論
断片化されたゲノムＤＮＡを使用する第１のＡＴＯ反応と、第１のＡＴＯ反応と、ＡＴＯの除去およびユニバーサル配列に相補的なオリゴのアニーリングと、ワンパス線形伸長と、それに続く修飾標的ポリヌクレオチドの５’末端への二本鎖アダプターのライゲーションとを組み合わせることにより、「ＰＣＲ」フリー次世代シーケンシングに関してこの技術的アプローチの検証に成功した
【０４７８】
実施例１０
標的ポリヌクレオチドとしてデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を使用し、例えば、限定はされないが、一本鎖アダプター鋳型オリゴを使用して、次世代シーケンサーライブラリー（例えば、限定はされないが、イルミナ社の次世代シーケンサーに適合する）を作成する。
【０４７９】
材料
標的ポリヌクレオチド、ヒトｇＤＮＡ（ＢＩＯ−３５０２５）
ＤＮＡ断片化酵素、ＫＡＰＡ  Ｆｒａｇ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ、７９６２５１７００１）
アダプター鋳型オリゴ（ＡＴＯ）、１−０２５、１−０２６（表１）
ＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０２７３Ｌ）
ＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼバッファー（ＮＥＢ、Ｍ０２７３Ｌ）
ＤＮＡポリメラーゼＩ、ラージ（クレノウ）フラグメント（ＮＥＢ、Ｍ０２１０Ｌ、Ｍ０２１２Ｌ）
ｄＮＴＰ（ＮＥＢ、Ｎ０４４７）
Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０５３０Ｓ）
Ｐｈｕｓｉｏｎバッファー（ＮＥＢ、Ｍ０５３０Ｓ）
ＵＳＥＲ（登録商標）Ｅｎｚｙｍｅ（ＮＥＢ、Ｍ５５０５Ｓ）
Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ａ６３８８１）
プライマー  ２−００２、２−００３（表２）
【０４８０】
方法
アダプター鋳型オリゴのデオキシリボ核酸へのアニーリング
ＡＴＯが１本鎖の１−０２５であることを除いて、実施例１と同様である。
【０４８１】
アダプター鋳型オリゴを鋳型とする標的ポリヌクレオチドのそれ自身をプライマーとして使用する伸長
実施例１と同様である。
【０４８２】
アダプター鋳型オリゴの分解
実施例１と同様である。
【０４８３】
修飾標的ポリヌクレオチドの線形増幅
実施例１と同様である。
【０４８４】
第２のアダプター鋳型オリゴの第１の相補鎖へのアニーリング
ＡＴＯが一本鎖である１−０２６であることを除いて実施例１と同様である。
【０４８５】
修飾された第１の相補鎖を形成するための、第２のアダプター鋳型オリゴを鋳型とする第１の相補鎖のそれ自身をプライマーとして使用する伸長
実施例１と同様である。
【０４８６】
第２のアダプター鋳型オリゴの分解
実施例１と同様である。
【０４８７】
ＰＣＲによる第２のアダプター鋳型伸長産物の指数関数的増幅
実施例１と同様である。
【０４８８】
結果
一本鎖ＡＴＯを使用して、実施例１で詳述したものと同様のゲノム次世代シーケンシングライブラリーの完成に成功したことを示すことができる。
【０４８９】
結論
断片化されたｇＤＮＡを使用する第１のＡＴＯ反応と、複数の第１の相補鎖を作成するための線形増幅プロセスと、線形増幅産物を標的ポリヌクレオチドとして使用する第２のＡＴＯ反応と、それに続くグローバルな増幅とを組み合わせることにより、シーケンシングライブラリーの作成で使用することに関してこの技術的アプローチの検証に成功した。
【０４９０】
実施例１１
標的ポリヌクレオチドとしてデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を使用し、例えば、限定はされないが、２つの相補鎖に分離されたアダプター鋳型オリゴを使用して、次世代シーケンシングライブラリー（例えば、限定はされないが、イルミナ社の次世代シーケンサーに適合する）を作成する。
【０４９１】
材料
標的ポリヌクレオチド、ヒトｇＤＮＡ（ＢＩＯ−３５０２５）
ＤＮＡ断片化酵素、ＫＡＰＡ  Ｆｒａｇ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ、７９６２５１７００１）
アダプター鋳型オリゴ（ＡＴＯ）、１−０２７、１−０２８、１−０２９、１−０３０（表１）
ＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０２７３Ｌ）
ＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼバッファー（ＮＥＢ、Ｍ０２７３Ｌ）
ＤＮＡポリメラーゼＩ、ラージ（クレノウ）フラグメント（ＮＥＢ、Ｍ０２１０Ｌ、Ｍ０２１２Ｌ）
ｄＮＴＰ（ＮＥＢ、Ｎ０４４７）
Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０５３０Ｓ）
Ｐｈｕｓｉｏｎバッファー（ＮＥＢ、Ｍ０５３０Ｓ）
ＵＳＥＲ（登録商標）Ｅｎｚｙｍｅ（ＮＥＢ、Ｍ５５０５Ｓ）
Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ａ６３８８１）
Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０２０２Ｓ）
プライマー  ２−００２、２−００３（表２）
【０４９２】
方法
アダプター鋳型オリゴのデオキシリボ核酸へのアニーリング
ＡＴＯが２つの１本鎖オリゴ１−０２７と１−０２８の等モル混合物であることを除いて、実施例１と同様である。
【０４９３】
アダプター鋳型オリゴを鋳型とする標的デオキシリボ核酸のそれ自身をプライマーとして使用する伸長、およびライゲーション
実施例１と同様であるが、加えて、反応がＤＮＡリガーゼを含む。標的ポリヌクレオチドの３’末端が、ＡＴＯにハイブリダイズしてＡＴＯの上側の鎖のリン酸化５’末端に直接隣接する場合、標的ポリヌクレオチドの３’末端は、伸長の必要なしにＡＴＯの上側の鎖の５’末端に連結される。標的ポリヌクレオチドの３’末端が、ＡＴＯにハイブリダイズしてＡＴＯの上側の鎖のリン酸化５’末端からある程度離れた位置にある場合は、標的ポリヌクレオチドの３’末端はＤＮＡポリメラーゼによって伸長され、そしてＡＴＯの上側の鎖の５’末端に連結される。この例では、反応は、実施例１の伸長成分に加えて、１００単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ、２．５μｌの１０ｘＤＮＡリガーゼバッファーを、最終体積２５μｌ中に含む。その混合物を適切な温度および適切な時間でインキュベートして、標的ポリヌクレオチドまたはその伸長産物の３’末端と、ＡＴＯの上側の別個の鎖またはＡＴＯのステム構造のステム部分の５’末端であるアダプター鋳型補足オリゴとのライゲーションまたは伸長−ライゲーションを可能にする。この例では、２５℃で３０分間、または酵素活性を促進できる他の適切な温度と時間である。
【０４９４】
アダプター鋳型オリゴの分解
実施例１と同様である。
【０４９５】
任意選択的な修飾標的ポリヌクレオチドの線形増幅
実施例１と同様である。
【０４９６】
任意選択的な第２のアダプター鋳型オリゴの第１の相補鎖へのアニーリング
ＡＴＯが２つの１本鎖オリゴ１−０２９と１−０３０の等モル混合物であることを除いて実施例１と同様である。
【０４９７】
この実施例における前のステップと同様に、修飾された第１の相補鎖を形成するための、第２のアダプター鋳型オリゴを鋳型とする第１の相補鎖のそれ自身をプライマーとして使用する伸長、およびライゲーション
実施例１および上記と同様である。
【０４９８】
第２のアダプター鋳型オリゴの分解
実施例１と同様である。
【０４９９】
ＰＣＲによる第２のアダプター鋳型伸長産物の指数関数的増幅
実施例１と同様である。
【０５００】
結果
２つの相補鎖に分離されたＡＴＯを使用して、実施例１で詳述したものと同様のゲノム次世代シーケンシングライブラリーの完成に成功したことを示すことができる。
【０５０１】
結論
断片化されたｇＤＮＡを使用する第１のＡＴＯ反応と、複数の第１の相補鎖を作成するための線形増幅プロセスと、線形増幅産物を標的ポリヌクレオチドとして使用する第２のＡＴＯ反応と、それに続くグローバルな増幅とを組み合わせることにより、シーケンシングライブラリーの作成で使用することに関してこの技術的アプローチの検証に成功した。
【０５０２】
実施例１２
標的ポリヌクレオチドとしてデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を使用し、例えば、限定はされないが、ループが化学的スペーサー（例えば、限定はされないが、Ｃ３スペーサー、Ｃ１８スペーサー）を含むヘアピン（ステムループ）を有し、かつＡＴＯの３’末端が標的特異的配列を含む標的特異的アダプター鋳型オリゴ（ＡＴＯ）を使用して、標的化アンプリコン次世代シーケンサーライブラリー（例えば、限定はされないが、イルミナ社の次世代シーケンサーに適合する）を作成する。３’標的特異的配列は、標的ポリヌクレオチドとＡＴＯとの間のハイブリダイゼーションを導くために使用される。ＡＴＯは、他の実施例で説明されているように、３’標的特異的配列と５’ユニバーサル配列との間に通常の３’ランダム配列を含んでいてよく、またはこの３’ランダム配列はアニーリングのための鋳型としてではなく純粋にＵＩＤとして機能し得るため短い３’ランダム配列を含んでいてよく、または３’ランダム配列を含まなくてもよい。５’ユニバーサル配列は、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含むことができる。
【０５０３】
材料
標的ポリヌクレオチド、ヒトｇＤＮＡ（ＢＩＯ−３５０２５）
ＤＮＡ断片化酵素、ＫＡＰＡ  Ｆｒａｇ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ、７９６２５１７００１）
アダプター鋳型オリゴ（ＡＴＯ）、様々なＡＴＯ。
ＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０２７３Ｌ）
ＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼバッファー（ＮＥＢ、Ｍ０２７３Ｌ）
ＤＮＡポリメラーゼＩ、ラージ（クレノウ）フラグメント（ＮＥＢ、Ｍ０２１０Ｌ、Ｍ０２１２Ｌ）
ｄＮＴＰ（ＮＥＢ、Ｎ０４４７）
Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０５３０Ｓ）
Ｐｈｕｓｉｏｎバッファー（ＮＥＢ、Ｍ０５３０Ｓ）
ＵＳＥＲ（登録商標）Ｅｎｚｙｍｅ（ＮＥＢ、Ｍ５５０５Ｓ）
硫酸アンモニウム（ＳＩＧＭＡ、Ａ４４１８）
Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ａ６３８８１）
プライマー  ２−００２、２−００３（表２）
【０５０４】
方法
アダプター鋳型オリゴプールのデオキシリボ核酸へのアニーリング
ＡＴＯが、３’末端に標的特異的配列を有する２００種類の異なるＡＴＯのプールであることを除いて、実施例１と同様である。
【０５０５】
アダプター鋳型オリゴを鋳型とする標的デオキシリボ核酸のそれ自身をプライマーとして使用する伸長
実施例１と同様である。標的ポリヌクレオチドの３’末端は、ＡＴＯとハイブリダイズしたときにオーバーハングになる場合があるため、伸長が生じる前にＤＮＡポリメラーゼの３’エキソヌクレアーゼによってそのオーバーハングがトリミングされる。
【０５０６】
アダプター鋳型オリゴの分解
実施例１と同様である。
【０５０７】
ＰＣＲによるアダプター鋳型伸長産物の第１の指数関数的増幅
実施例１と同様である。
【０５０８】
最終シーケンシングライブラリーを作成するためのＰＣＲによる第１の指数関数的増幅産物の第２の指数関数的増幅
実施例１と同様である。
【０５０９】
結果
３’標的特異的配列を有するＡＴＯのプールを使用することにより、実施例２で詳述したものと同様の、標的化アンプリコン次世代シーケンシングライブラリーの完成に成功したことを示すことができる。
【０５１０】
結論
断片化されたｇＤＮＡおよびＡＴＯのプールを使用する第１のＡＴＯ反応と、２ラウンドの標的特異的増幅のプロセスとを組み合わせることにより、標的次世代シーケンシングライブラリーの作成で使用することに関してこの技術的アプローチの検証に成功した。
【０５１１】
実施例１３
標的ポリヌクレオチドとしてデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を使用し、例えば、限定はされないが、ループが化学的スペーサー（例えば、限定はされないが、Ｃ３スペーサー、Ｃ１８スペーサー）を含むヘアピン（ステムループ）を有する標的特異的アダプター鋳型オリゴを使用して、単回ラウンドのＰＣＲにおいて、標的化アンプリコン次世代シーケンサーライブラリー（例えば、限定はされないが、イルミナ社の次世代シーケンサーに適合する）を作成する。
【０５１２】
材料
標的ポリヌクレオチド、ヒトｇＤＮＡ（ＢＩＯ−３５０２５）
ＤＮＡ断片化酵素、ＫＡＰＡ  Ｆｒａｇ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ、７９６２５１７００１）
アダプター鋳型オリゴ（ＡＴＯ）、１−０１４、１−０１５、１−０１６、１−０１７。
ＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０２７３Ｌ）
ＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼバッファー（ＮＥＢ、Ｍ０２７３Ｌ）
ＤＮＡポリメラーゼＩ、ラージ（クレノウ）フラグメント（ＮＥＢ、Ｍ０２１０Ｌ、Ｍ０２１２Ｌ）
ｄＮＴＰ（ＮＥＢ、Ｎ０４４７）
Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０５３０Ｓ）
Ｐｈｕｓｉｏｎバッファー（ＮＥＢ、Ｍ０５３０Ｓ）
ＵＳＥＲ（登録商標）Ｅｎｚｙｍｅ（ＮＥＢ、Ｍ５５０５Ｓ）
プライマー  ２−００３（表２）
Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ａ６３８８１）
硫酸アンモニウム（ＳＩＧＭＡ、Ａ４４１８）
ＳＹＢＲ（商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｉ核酸ゲル染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓ７５６３）
５’テール：ＡＡＴ  ＧＡＴ  ＡＣＧ  ＧＣＧ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＧＡＧ  ＡＴＣ  ＴＡＣ  ＡＣＴ  ＣＴＴ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＣＡＣ  ＧＡＣ  ＧＣＴ  ＣＴＴ  ＣＣＧ  ＡＴＣ  Ｔ：を有する標的特異的プライマーのプール
【０５１３】
方法
アダプター鋳型オリゴプールのデオキシリボ核酸へのアニーリング
それぞれ５０ｎｍｏｌｅの１−０１４、１−０１５、１−０１６、および１−０１７の各ＡＴＯのプールを使用したことを除き、実施例２と同様である。
【０５１４】
アダプター鋳型オリゴを鋳型とする標的ポリヌクレオチドのそれ自身をプライマーとして使用する伸長
実施例２と同様である。
【０５１５】
アダプター鋳型オリゴの分解
実施例２と同様である。
【０５１６】
最終シーケンシングライブラリーを作成するためのＰＣＲによる線形伸長産物の指数関数的増幅
精製された修飾標的ポリヌクレオチドを、ＡＴＯによって導入された保存配列と配列類似性を有しかつそれに結合するように設計され、次世代シーケシング技術を使用するシーケンシングに適合しかつそれに必要な配列（例えば、限定はされないが、Ｐ５またはＰ７アダプター配列、患者／サンプルインデックス配列、イルミナ社の次世代シーケンサーとの適合性のためのイルミナまたはカスタムリード１またはリード２配列）を含む、ユニバーサルプライマー；目的の突然変異を含むＤＮＡの領域を標的とするＡＴＯオリゴのプールに近接するＤＮＡの領域を標的にするように設計され、かつ次世代シーケシング技術に適合しかつその適合に必要な配列（例えば、限定はされないが、Ｐ５またはＰ７アダプター配列、患者／サンプルインデックス配列、イルミナ社の次世代シーケンサーとの適合性のためのイルミナまたはカスタムリード１またはリード２配列）を含む、プライマーのプール；プルーフリーディングポリメラーゼ（例えば、限定はされないが、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｑ５）；適切なバッファー；適切なｄＮＴＰ；およびその他の適切なまたは必要な添加物（例えば、制限はされないが、ＤＭＳＯ、ベタイン、および硫酸アンモニウム）と組み合わせる。この例では、２０μｌの精製修飾標的ポリヌクレオチド、２５ｐｍｏｌｅの２−００３、合計１００ｐｍｏｌｅの標的特異的プライマーのプール、１０ｎｍｏｌｅの各ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ／ｄＴＴＰ／ｄＣＴＰ／ｄＧＴＰ）、１単位のＰｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ、１０μｌの５ｘＰｈｕｓｉｏｎバッファー、１ｘＳＹＢＲｇｒｅｅｎ、および１μｍｏｌｅの硫酸アンモニウムを合わせて、最終体積５０μｌにした。次に、その混合物を熱サイクル処理して、選択した領域を増幅する。この例では、９８℃で１分間；９８℃で５秒間、６０℃で５分間および７２℃で３０秒間を１５サイクル；その後７２℃を２分間である。次に、例えば磁気ビーズを使用するなど、任意の適切な方法で増幅産物を精製することができ、それは適合する技術に基づき次世代シーケンシングに適したものとなる。
【０５１７】
結果
実施例２に示した２ラウンドではなく、１ラウンドの指数関数的増幅を使用して、標的化アンプリコンの次世代シーケンシングライブラリーを作成することができた。
【０５１８】
結論
断片化されたｇＤＮＡを使用する第１のＡＴＯ反応と、標的特異的プライマーのプールおよびユニバーサルプライマーを使用する１ラウンドの指数関数的増幅プロセスとを組み合わせることにより、鎖特異的標的化アンプリコンベースのシーケンシングライブラリーの作成で使用することに関してこの技術的アプローチの検証に成功した。
【０５１９】
実施例１４
標的ポリヌクレオチドとしてリボ核酸（ＲＮＡ）を使用し、例えば、限定はされないが、ヘアピンを有するアダプター鋳型オリゴを使用して、次世代シーケンシングライブラリー（例えば、限定はされないが、イルミナの次世代シーケンサーに適合する）を作成する。
【０５２０】
材料
アダプター鋳型オリゴ（ＡＴＯ）、１−０１４、１−０１５、１−０１６、１−０１７、１−０１８
ＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０２７３Ｌ）
ＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼバッファー（ＮＥＢ、Ｍ０２７３Ｌ）
ＤＮＡポリメラーゼＩ、ラージ（クレノウ）フラグメント（ＮＥＢ、Ｍ０２１０Ｌ、Ｍ０２１２Ｌ）
ｄＮＴＰ（ＮＥＢ、Ｎ０４４７ｓ）Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０５３０Ｓ）
Ｐｈｕｓｉｏｎバッファー（ＮＥＢ、Ｍ０５３０Ｓ）
ＵＳＥＲ（登録商標）Ｅｎｚｙｍｅ（ＮＥＢ、Ｍ５５０５Ｓ）
ＡＭＶ逆転写酵素（ＮＥＢ、Ｍ０２７７Ｓ）
Ａｎｔａｒｃｔｉｃホスファターゼ（ＮＥＢ、Ｍ０２８９Ｓ）
Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ａ６３８８１）
プライマー  ２−００１、２−００２、２−００３（表２）
【０５２１】
方法
アダプター鋳型オリゴのリボ核酸へのアニーリング
２５ｎｇの断片化メッセンジャーＲＮＡを標的ポリヌクレオチドとして使用したことを除き実施例１と同様である。
【０５２２】
アダプター鋳型オリゴを鋳型とする標的リボ核酸のそれ自身をプライマーとして使用する伸長
選択したＤＮＡポリメラーゼがＲＮＡプライマーおよび任意選択的な追加の５単位のＡｎｔａｒｃｔｉｃホスファターゼを使用できることを確認することを追加して、実施例１と同様である。
【０５２３】
アダプター鋳型オリゴの分解
消化／除去ステップがＲＮＡを非特異的に分解しないことを確認することを追加して、実施例１と同様である。
【０５２４】
逆転写酵素による修飾標的ポリヌクレオチドのワンパス伸長または線形増幅
精製または未精製の修飾標的ポリヌクレオチドを、標的ＲＮＡ分子の３’末端に現在存在する保存（ユニバーサル）配列に相補的なプライマー、逆転写酵素（例えば、限定はされないが、Ｍ−ＭｕＬＶ、またはＡＭＶ逆転写酵素）、適切なバッファー、および適切なｄＮＴＰと組み合わせる。この例では、精製修飾標的ポリヌクレオチドを、５０ｎｍｏｌｅの２−００１、１０単位のＡＭＶ逆転写酵素、２μｌの１０ｘＡＭＶバッファー、１０ｎｍｏｌｅの各ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ／ｄＴＴＰ／ｄＣＴＰ／ｄＧＴＰ）と混合する。次に、その混合物をインキュベートしてｃＤＮＡ（第１のＣＳ）を作成する（この例では４２℃で３０分間）。次いで、逆転写産物または線形増幅産物を、例えば磁気ビーズを使用するなど、任意の適切な方法で精製することができる。
【０５２５】
第２のアダプター鋳型オリゴの第１の相補鎖へのアニーリング
実施例１と同様である。
【０５２６】
修飾された第１の相補鎖を形成するための、第２のアダプター鋳型オリゴを鋳型とする第１の相補鎖のそれ自体をプライマーとして使用する伸長
実施例１と同様である。
【０５２７】
第２のアダプター鋳型オリゴの分解
実施例１と同様である。
【０５２８】
ＰＣＲによる第２のアダプター鋳型伸長産物の指数関数的増幅
実施例１と同様である。
【０５２９】
結果
ＲＮＡを標的ポリヌクレオチドとして使用して、実施例１の方法と同様の方法により、リード重複および低頻度変異検出を評価するためのＵＩＤを含むＲＮＡシーケンシングライブラリーを作成し、より正確な定量のために分子カウンティングを改善することができた。
【０５３０】
結論
断片化されたメッセンジャーＲＮＡを使用する第１のＡＴＯ反応と、複数の第１の相補鎖を作成するための逆転写酵素を使用する線形増幅プロセスと、第１の相補鎖を標的ポリヌクレオチドとして使用する第２のＡＴＯ反応と、それに続くグローバルな増幅とを組み合わせることにより、ＲＮＡシーケンシングライブラリーの作成で使用することに関してこの技術的アプローチの検証に成功した。
【０５３１】
実施例１５
標的ポリヌクレオチドとしてデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を使用し、例えば、限定はされないが、化学的スペーサー（例えば、限定はされないが、Ｃ３スペーサー、Ｃ１８スペーサー）を用いて形成されたヘアピンを有するＲＮＡアダプター鋳型オリゴを使用して、次世代シーケンサーライブラリー（例えば、限定はされないが、イルミナ社の次世代シーケンサーに適合する）を作成する。
【０５３２】
材料
標的ポリヌクレオチド、ヒトｇＤＮＡ（ＢＩＯ−３５０２５）
ＤＮＡ断片化酵素、ＫＡＰＡ  Ｆｒａｇ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ、７９６２５１７００１）
アダプター鋳型オリゴ（ＡＴＯ）、１−０３１、１−０３２。
ｄＮＴＰ（ＮＥＢ、Ｎ０４４７ｓ）
Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０５３０Ｓ）
Ｐｈｕｓｉｏｎバッファー（ＮＥＢ、Ｍ０５３０Ｓ）
ＵＳＥＲ（登録商標）Ｅｎｚｙｍｅ（ＮＥＢ、Ｍ５５０５Ｓ）
プライマー、２−００１、２−００２、２−００３（表２）
ＡＭＶ逆転写酵素（ＮＥＢ、Ｍ０２７７Ｓ）
ＲＮａｓｅ  Ｈ（ＮＥＢ、Ｍ０２９７Ｓ）
Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ａ６３８８１）
【０５３３】
方法
アダプター鋳型オリゴのデオキシリボ核酸へのアニーリング
２００ｐｍｏｌｅのＲＮＡ  ＡＴＯ（１−０３１）を使用することを除いて、実施例１と同様である。
【０５３４】
ＲＮＡアダプター鋳型オリゴを鋳型とする標的デオキシリボ核酸のそれ自身をプライマーとして使用する伸長
１０単位のＡＭＶ逆転写酵素と２μｌの１０ｘＡＭＶバッファーを使用し、４２℃で３０分間の伸長温度を使用することを除いて、実施例１と同様である。
【０５３５】
アダプター鋳型オリゴの分解
アダプター鋳型オリゴを、ＲＮＡｓｅ（例えば、ＲＮａｓｅ  Ｈ、ＲＮａｓｅ  ＨＩＩ、ＲＮａｓｅ  Ａ、ＲＮａｓｅ  Ｔｌ）の添加、続く３７℃で３０分間、またはＲＮＡ−ＡＴＯの分解をもたらすその他の適切な温度または時間でのインキュベーションにより、選択的に分解する。この例では、１０単位のＲＮａｓｅ  Ｈを２０の修飾標的ポリヌクレオチドと混合して３７℃で３０分間インキュベートし、さらに６５℃で２０分間インキュベートすることにより不活性化する。任意選択で、分解されたＡＴＯを任意の適切な精製方法を使用して除去することができる。
【０５３６】
修飾標的ポリヌクレオチドの線形増幅
実施例１と同様である。
【０５３７】
第２のアダプター鋳型オリゴの第１の相補鎖へのアニーリング
２００ｐｍｏｌｅのＲＮＡ  ＡＴＯ（１−０３２）を使用することを除いて、実施例１と同様である。
【０５３８】
修飾された第１の相補鎖を形成するための、第２のアダプター鋳型オリゴを鋳型とする第１の相補鎖のそれ自身をプライマーとして使用する伸長
１０単位のＡＭＶ逆転写酵素、および２μｌの１０ｘＡＭＶバッファーを使用し、４２℃で３０分間の伸長温度を使用することを除いて、実施例１と同様である。
【０５３９】
第２のアダプター鋳型オリゴの分解
先に述べた「アダプター鋳型オリゴの分解」ステップと同様である。
【０５４０】
ＰＣＲによる第２のアダプター鋳型伸長産物の指数関数的増幅
実施例１と同様である。
【０５４１】
結果
ＲＮＡ  ＡＴＯと、実施例１に類似する方法を使用して、リード重複および低頻度変異検出を評価するためのＵＩＤを含むシーケンシングライブラリーを作成できた。
【０５４２】
結論
ＲＮＡ  ＡＴＯおよび断片化ｇＤＮＡを使用する第１のＡＴＯ反応と、複数の第１の相補鎖を作成するための線形増幅プロセスと、第２のＲＮＡ  ＡＴＯおよび標的ポリヌクレオチドとして線形増幅産物を使用する第２のＡＴＯ反応と、それに続くグローバルな増幅とを組み合わせることにより、シーケンシングライブラリーの作成で使用することに関してこの技術的アプローチの検証に成功した。
【０５４３】
実施例１６
標的ポリヌクレオチドとしてリボ核酸（ＲＮＡ）を使用し、例えば、限定はされないが、化学的スペーサー（例えば、限定はされないが、Ｃ３スペーサー、Ｃ１８スペーサー）を用いて形成されたヘアピンを有するアダプター鋳型オリゴを使用して、転写開始部位を決定する。
【０５４４】
材料
アダプター鋳型オリゴ（ＡＴＯ）、１−０１４。
ＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０２７３Ｌ）
ＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼバッファー（ＮＥＢ、Ｍ０２７３Ｌ）
ＤＮＡポリメラーゼＩ、ラージ（クレノウ）フラグメント（ＮＥＢ、Ｍ０２１０Ｌ、Ｍ０２１２Ｌ）
ｄＮＴＰ（ＮＥＢ、Ｎ０４４７）
Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０５３０Ｓ）
Ｐｈｕｓｉｏｎバッファー（ＮＥＢ、Ｍ０５３０Ｓ）
ＵＳＥＲ（登録商標）Ｅｎｚｙｍｅ（ＮＥＢ、Ｍ５５０５Ｓ）
Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ａ６３８８１）
プライマー、２−００３（表２）
ＡＭＶ逆転写酵素（ＮＥＢ、Ｍ０２７７Ｓ）
【０５４５】
方法
標的特異的逆転写によるｃＤＮＡの作成
任意の長さの断片化されたまたは断片化されていない適切な量のリボ核酸（ＲＮＡ）を、転写開始部位が特定されていないＲＮＡ（例えば、限定はされないが、メッセンジャーＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、または非コードＲＮＡ）のある領域を標的とする適切な量の遺伝子特異的プライマーと、適切なバッファー中において混合する。この例では、１００ｎｇのｍＲＮＡを、１０ｐｍｏｌｅの標的特異的プライマー、１０単位のＡＭＶ逆転写酵素、２μｌの１０ｘＡＭＶバッファー、１０ｎｍｏｌｅの各ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ／ｄＴＴＰ／ｄＣＴＰ／ｄＧＴＰ）と組み合わせて、最終体積２０μｌにする。その混合物を、適切な温度（この例では６５℃）で、適切な時間（この例では２分間）、または二本鎖核酸を変性させて一本鎖にすることができる他の温度または時間で加熱する。続いて、核酸および標的特異的プライマーを、この例では２５℃に５分間、または核酸と遺伝子特異的プライマーとの間のアニーリングおよび逆転写を促進できる他の適切な温度または時間まで、冷却する。次に、この混合物をインキュベートしてｃＤＮＡを作成する。この例では、４２℃で３０分間インキュベートする。次いで、例えば磁気ビーズを使用するなど、任意の適切な方法により、ｃＤＮＡを精製することができる。
【０５４６】
アダプター鋳型オリゴのｃＤＮＡへのアニーリング
実施例１と同様である。
アダプター鋳型オリゴを鋳型とするｃＤＮＡのそれ自身をプライマーとして使用する伸長
実施例１と同様である。
【０５４７】
アダプター鋳型オリゴの分解
実施例１と同様である。
【０５４８】
最終シーケンシングライブラリーを作成するためのＰＣＲによる標的相補的デオキシリボ核酸伸長産物の指数関数的増幅
修飾されたｃＤＮＡを、ＡＴＯによって導入された保存配列に相補的なユニバーサルプライマー、第１の遺伝子特異的プライマーに近接するｍＲＮＡの領域を標的とするように設計された第２プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、限定はされないが、ＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼ、またはＰｈｕｓｉｏｎ）、適切なバッファー、適切なｄＮＴＰ、およびその他の適切なまたは必要な添加物（例えば、ＤＭＳＯ、ベタイン、および硫酸アンモニウム）と組み合わせる。この例では、５μｌのｃＤＮＡ、１０ｐｍｏｌｅの２−００３、１０ｐｍｏｌｅの標的特異的プライマー、２単位のＰｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ、１０μｌの５ｘＰｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼバッファー、および１０ｎｍｏｌｅの各ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ／ｄＴＴＰ／ｄＣＴＰ／ｄＧＴＰ）を、最終体積５０μｌ中に含める。次に、その混合物を熱サイクル処理して、標的核酸伸長産物を指数関数的に増幅する。この例では、９８℃で３０秒間；９８℃で５秒間、６０℃で１分間および７２℃で１分間を２５サイクル；続いて、７２℃で２分間である。次いで、例えば磁気ビーズを使用するなど、任意の適切な方法により、増幅産物を精製することができる。精製された産物は、主要産物を同定するためのゲル電気泳動、クローニングおよびシーケンシングなどのダウンストリームプロセスで使用することができ、あるいは、形質転換およびコロニー選択後の適合するクローニングシステムおよびシーケンシングに直接使用することもできる。
【０５４９】
最終シーケンシングライブラリーを作成するためのＰＣＲによる標的相補的デオキシリボ核酸伸長産物の指数関数的増幅
これは、前のステップと一緒に、または前のステップの代わりに行うことができる。その方法は、標的特異的プライマーが、次世代シーケシング技術に適合しかつ必要な配列（例えば、限定はされないが、Ｐ５またはＰ７アダプター配列、患者／サンプルインデックス配列、イルミナ社の次世代シーケンサーとの適合性のためのイルミナまたはカスタムリード１またはリード２配列）を含む５’テールを必要とすることを除いて、前のステップと同様である。例えば磁気ビーズを使用するなど、任意の適切な方法により、増幅産物を精製することができ、それは適合する技術に基づき次世代シーケンシングに適したものとなる。
【０５５０】
結果
遺伝子特異的プライマーを使用して、ＡＴＯ反応の鋳型として使用されるｃＤＮＡをうまく作成し、その産物は、２つの追加のプライマーと共に使用したときに、イルミナの機械でシーケンシングすることができるライブラリーを作成し、その結果は、選択した転写産物の転写開始部位を明らかにした。
【０５５１】
結論
ｍＲＮＡの５’付近のプライマーを使用する遺伝子特異的ｃＤＮＡ生成を組み合わせることにより、選択した遺伝子の転写開始部位を特定するためにこの技術をうまく適合させることができた。すべての可能な転写開始部位を同定するのに必要なリード数が少ないという事実を考えると、小さな出力の機械であっても、全シーケンシングの実行は不要である。次世代シーケンシングに適合する産物を作成するアプローチは、かなりの深さを必要とする、または多数の転写開始部位を同定するためにマルチプレックスで非常に多数の遺伝子特異的プライマーを必要とする別のライブラリーへの小さなスパイクイン(spike in)として使用するのに最適である。
【０５５２】
実施例１７
デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）とリボ核酸（ＲＮＡ）の混合物を標的ＤＮＡとして使用し、例えば、限定はされないが、化学的スペーサー（例えば、限定はされないが、Ｃ３スペーサー、Ｃ１８スペーサー）を用いて形成されたヘアピンを有するアダプター鋳型オリゴを使用して、ＤＮＡとＲＮＡを組合せた次世代シーケンサーライブラリー（例えば、限定はされないが、イルミナ社の次世代シーケンサーに適合する）を作成する。
【０５５３】
材料
標的ポリヌクレオチド、ヒトｇＤＮＡ（ＢＩＯ−３５０２５）
ＤＮＡ断片化酵素、ＫＡＰＡ  Ｆｒａｇ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ、７９６２５１７００１）
アダプター鋳型オリゴ（ＡＴＯ）、１−０１４、１−０１５、１−０１６、１−０１７、１−０１８（表１）
ＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０２７３Ｌ）
ＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼバッファー（ＮＥＢ、Ｍ０２７３Ｌ）
ＤＮＡポリメラーゼＩ、ラージ（クレノウ）フラグメント（ＮＥＢ、Ｍ０２１０Ｌ、Ｍ０２１２Ｌ）
ｄＮＴＰ（ＮＥＢ、Ｎ０４４７）
Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０５３０Ｓ）
Ｐｈｕｓｉｏｎバッファー（ＮＥＢ、Ｍ０５３０Ｓ）
ＵＳＥＲ（登録商標）Ｅｎｚｙｍｅ（ＮＥＢ、Ｍ５５０５Ｓ）
プライマー、２−００１、２−００２、２−００３（表２）
Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ａ６３８８１）
硫酸アンモニウム（ＳＩＧＭＡ、Ａ４４１８）
ＡＭＶ逆転写酵素（ＮＥＢ、Ｍ０２７７Ｓ）
【０５５４】
方法
アダプター鋳型オリゴの核酸へのアニーリング
標的ポリヌクレオチドがＲＮＡとＤＮＡの混合物であることを除いて、実施例１と同様である。
【０５５５】
アダプター鋳型オリゴを鋳型とする標的核酸のそれ自身をプライマーとして使用する伸長
ポリメラーゼがＲＮＡプライマーを使用できることを確認することを追加して、実施例１と同様である。
【０５５６】
アダプター鋳型オリゴの分解
実施例１と同様である。
【０５５７】
アダプター鋳型伸長産物のワンパス伸長または線形増幅
１０単位のＡＭＶ逆転写酵素を追加して、実施例１と同様である。
【０５５８】
第１の相補鎖を形成するための第２のアダプター鋳型オリゴのアニーリング
実施例１と同様である。
【０５５９】
修飾された第１相補鎖を形成するための、第２のアダプター鋳型オリゴを鋳型とする第１の相補鎖のそれ自身をプライマーとして使用する伸長
実施例１と同様である。
【０５６０】
第２のアダプター鋳型オリゴの分解
実施例１と同様である。
【０５６１】
ＰＣＲによる第２のアダプター鋳型伸長産物の指数関数的増幅
実施例１と同様である。
【０５６２】
結果
実施例１と同様の方法を使用して、ＲＮＡとＤＮＡの両方を組合せて、ＰＣＲの重複を除去するのに適しまた低頻度変異を同定するエラーを訂正するのに適したＵＩＤを含む次世代シーケンシングライブラリーを作成することができた。
【０５６３】
結論
ＤＮＡとＲＮＡを組み合わせて混合シーケンシングライブラリーを作成できることにより、特に、すべての標的ポリヌクレオチドについてＵＩＤを含む技術の固有の性質を考えると、多くの潜在的な適用が可能になる。例えば、ＲＮＡとＤＮＡの両方をシーケンシングすることで、突然変異の比較分析が可能になる。
【０５６４】
実施例１８
デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）とリボ核酸（ＲＮＡ）の混合物を標的ＤＮＡとして使用し、例えば、限定はされないが、ランダムな特別に設計されたまたは特別に選択された配列によって分離された部分的にまたは完全に相補的な２つの短い領域を用いて形成されたヘアピンを有し、シーケンシング後の分子の分離のためにＲＮＡとＤＮＡ分子に異なる一意の識別子を割り当てるマルチプルなアダプター鋳型オリゴを使用して、ＤＮＡとＲＮＡを組合せた次世代シーケンサーライブラリー（例えば、限定はされないが、イルミナの次世代シーケンサーに適合する）を作成する。
【０５６５】
材料
標的ポリヌクレオチド、ヒトｇＤＮＡ（ＢＩＯ−３５０２５）
ＤＮＡ断片化酵素、ＫＡＰＡ  Ｆｒａｇ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ、７９６２５１７００１）
ＤＮＡポリメラーゼＩ、ラージ（クレノウ）フラグメント（ＮＥＢ、Ｍ０２１０Ｌ、Ｍ０２１２Ｌ）
アダプター鋳型オリゴ（ＡＴＯ）、１−０１３、１−０３３、１−０３６（表１）
ｄＮＴＰ（ＮＥＢ、Ｎ０４４７）
Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０５３０Ｓ）
Ｐｈｕｓｉｏｎバッファー（ＮＥＢ、Ｍ０５３０Ｓ）
Ｄｅｅｐ  ＶｅｎｔＲ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０２５８Ｓ）
Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＳＩＧＭＡ、０００００００１１４８００２２００１）
ＵＳＥＲ（登録商標）Ｅｎｚｙｍｅ（ＮＥＢ、Ｍ５５０５Ｓ）
Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ａ６３８８１）
プライマー、２−００２，２−００３（表２）
硫酸アンモニウム（ＳＩＧＭＡ、Ａ４４１８）
ＡＭＶ逆転写酵素（ＮＥＢ、Ｍ０２７７Ｓ）
【０５６６】
方法
アダプター鋳型オリゴの核酸へのアニーリング
ＡＴＯ１−０３３が使用されることを除いて、実施例１と同様である。
【０５６７】
アダプター鋳型オリゴを鋳型とするリボ核酸ではなく標的デオキシリボ核酸のそれ自身をプライマーとして使用する特異的伸長
ＤＮＡプライマーを使用できるがＲＮＡプライマーは使用できない、プルーフリーディング活性を有するまたはプルーフリーディング活性を有さない適切な量のＤＮＡポリメラーゼ（例えば、限定はされないが、Ｄｅｅｐ  ＶｅｎｔＲ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＬｏｎｇＡｍｐ（登録商標）Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼ、またはＯｎｅＴａｑ（登録商標）Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ＤＮＡポリメラーゼ）を適切なバッファーおよび適切なｄＮＴＰと混合したものを、ＤＮＡ／ＲＮＡ  ＡＴＯ混合物と組み合わせる。この例では、合計２単位のＤｅｅｐ  ＶｅｎｔＲ  ＤＮＡポリメラーゼ、２μｌの１ＯｘＤｅｅｐ  ＶｅｎｔＲ  ＤＮＡポリメラーゼバッファー、１０ｎｍｏｌの各ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ／ｄＴＴＰ／ｄＣＴＰ／ｄＧＴＰ）、およびＤＮＡ−ＡＴＯ混合物を組合せて、最終体積２０μｌにする。ＤＮＡポリメラーゼおよびバッファーの存在下で、標的核酸とＡＴＯのアニーリングをさらに促進させるために、この例では、混合物を２５℃未満の温度で３０分間、または核酸とＡＴＯとの間のアニーリングを促進できる他の適切な温度または時間で、インキュベートする。ＡＴＯ配列を鋳型として使用して標的ポリヌクレオチドの伸長を開始するために、この例では、インキュベーション温度を３０分間３７℃まで上げ、またはＤＮＡポリメラーゼ活性を促進できる他の適切な温度に上げる。その産物は修飾標的ポリヌクレオチドである。
【０５６８】
二本鎖修飾標的ポリヌクレオチドの作成
実施例５と同様である。
【０５６９】
アダプター鋳型オリゴの分解
実施例１と同様である。
【０５７０】
第２のアダプター鋳型オリゴの核酸へのアニーリング
ＡＴＯ１−０３６が使用されることを除いて実施例１と同様である。
【０５７１】
アダプター鋳型オリゴを鋳型とする標的リボ核酸伸長産物のそれ自身をプライマーとして使用する伸長
ＲＮＡプライマーを使用することができるプルーフリーディング活性を有するまたはプルーフリーディング活性を有さない適切な量のＤＮＡポリメラーゼ（例えば、限定はされないが、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ）を適切なバッファーおよび適切なｄＮＴＰと混合したものを、ＤＮＡ／ＲＮＡ  ＡＴＯの混合物と組み合わせる。この例では、合計２．５単位のクレノウ、２μｌの１０ｘクレノウバッファー、および１０ｎｍｏｌｅの各ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ／ｄＴＴＰ／ｄＣＴＰ／ｄＧＴＰ）をＤＮＡ−ＡＴＯ混合物と合わせて２０μｌの最終体積にする。ＤＮＡポリメラーゼおよびバッファーの存在下で標的核酸とＡＴＯのアニーリングをさらに促進させるために、この例では、混合物を２５℃未満の温度で３０分間、または核酸とＡＴＯとの間のアニーリングを促進できる他の適切な温度または時間で、インキュベートする。ＡＴＯ配列を鋳型として使用して標的ポリヌクレオチドの伸長を開始させるために、この例では、インキュベーション温度を３７℃まで３０分間上げ、またはＤＮＡポリメラーゼ活性を促進できる他の適切な温度に上げる。その産物は修飾標的ポリヌクレオチドである。
【０５７２】
二本鎖標的リボ核酸伸長産物の作成
ポリメラーゼとして１０単位のＡＭＶ逆転写酵素を添加したことを除き、実施例５と同様である。
【０５７３】
アダプター鋳型オリゴの分解およびヘアピン分解
実施例５と同様である。
【０５７４】
二重鎖標的デオキシリボ核酸およびリボ核酸の伸長産物のワンパス伸長または線形増幅
７０℃の伸長温度で、２．５単位のＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼおよびＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼバッファーを使用することを除き、実施例１と同様である。
【０５７５】
第３のアダプター鋳型オリゴの伸長産物または線形増幅産物へのアニーリング
ＡＴＯ１−０２２が使用されることを除いて実施例１と同様である。
【０５７６】
２のアダプター鋳型伸長産物を形成するための、第３のアダプター鋳型オリゴを鋳型とする線形伸長産物のそれ自身をプライマーとして使用する伸長
実施例１と同様である。
【０５７７】
第３のアダプター鋳型オリゴの分解
実施例１と同様である。
【０５７８】
ＰＣＲによる第２のアダプター鋳型伸長産物の指数関数的増幅
実施例１と同様である。
【０５７９】
結果
実施例１と同様の方法を使用して、ＲＮＡとＤＮＡの両方を組合せて、ＰＣＲの重複を除去するのに適しまた低頻度変異を同定するエラーを訂正するのに適したＵＩＤを含む次世代シーケンシングライブラリーを作成することができた。
【０５８０】
結論
ＤＮＡ標的ポリヌクレオチドから生じるリードとＲＮＡ標的ポリヌクレオチドから生じるリードとをバイオインフォマティクス分析中に分離する能力と組み合わせて、ＤＮＡとＲＮＡを組合せて混合シーケンシングライブラリーを作成できることにより、特に、すべての標的ポリヌクレオチドについてＵＩＤを含む技術の固有の性質を考えると、多くの潜在的な適用が可能になる。例えば、ＲＮＡとＤＮＡの両方をシーケンシングすることで、突然変異の比較分析が可能になる。また、ＤＮＡ  ＡＴＯとＲＮＡ  ＡＴＯに異なるアダプターを使用して、最終的なシーケンシングライブラリー中のＤＮＡコピーを増やすためにそれらを別々に増幅させることもできる。
【０５８１】
実施例１９
標的ポリヌクレオチドとしてデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を使用し、ヘアピン（例えば、限定はされないが、ランダムな特別に設計されたまたは特別に選択された配列によって分離された部分的にまたは完全に相補的な２つの短い領域を用いて形成された）を有するアダプター鋳型オリゴと、ヘアピンに結合した二本鎖アダプターとを使用して、ローリングサークル増幅に適した鋳型を作成する。
【０５８２】
材料
標的ポリヌクレオチド、ヒトｇＤＮＡ（ＢＩＯ−３５０２５）
ＤＮＡ断片化酵素、ＫＡＰＡ  Ｆｒａｇ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ、７９６２５１７００１）
ＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０２７３Ｌ）
ＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼバッファー（ＮＥＢ、Ｍ０２７３Ｌ）
ＤＮＡポリメラーゼＩ、ラージ（クレノウ）フラグメント（ＮＥＢ、Ｍ０２１０Ｌ、Ｍ０２１２Ｌ）
アダプター鋳型オリゴ（ＡＴＯ）、１−０１３（表１）
ｄＮＴＰ（ＮＥＢ、Ｎ０４４７）
Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０５３０Ｓ）
Ｐｈｕｓｉｏｎバッファー（ＮＥＢ、Ｍ０５３０Ｓ）
ＵＳＥＲ（登録商標）Ｅｎｚｙｍｅ（ＮＥＢ、Ｍ５５０５Ｓ）
Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０２０２Ｓ）
Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ａ６３８８１）
【０５８３】
方法
アダプター鋳型オリゴのデオキシリボ核酸へのアニーリング
実施例１と同様である。
【０５８４】
アダプター鋳型オリゴを鋳型とする標的デオキシリボ核酸のそれ自身をプライマーとして使用する伸長
実施例１と同様である。
【０５８５】
二本鎖標的デオキシリボ核酸伸長産物の作成
実施例５と同様である。
【０５８６】
アダプター鋳型オリゴの分解
実施例１と同様である。
【０５８７】
二本鎖アダプターの二本鎖標的デオキシリボ核酸伸長産物の末端へのアニーリングおよびライゲーション
アダプターがヘアピンを形成することを追加して、実施例５と同様である。
【０５８８】
結果
ヘアピンを形成できるＡＴＯとヘアピンを有するアダプターとの組合せを使用して、環状修飾標的ポリヌクレオチドをうまく作成した。
【０５８９】
結論
環状標的ポリヌクレオチドを作成する能力により、ローリングサークル増幅が可能になり、それは特定のダウンストリームプロセスに必要な非常に長い産物の作成を可能にする。
【０５９０】
実施例２０
デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を標的ポリヌクレオチドとして使用し、化学スペーサー（例えば、限定はされないが、Ｃ３スペーサー、Ｃ１８スペーサー）を用いて形成されたヘアピンを有するアダプター鋳型オリゴを使用してローリングサークル増幅に適した鋳型を作成するが、相補領域を含む少なくとも２つのアダプター鋳型オリゴを使用する必要があり、それら相補領域はアニールすることができ、伸長を可能にするための露出した３’末端を有する短い二本鎖ＤＮＡを生成する。
【０５９１】
材料
標的ポリヌクレオチド、ヒトｇＤＮＡ（ＢＩＯ−３５０２５）
ＤＮＡ断片化酵素、ＫＡＰＡ  Ｆｒａｇ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ、７９６２５１７００１）
ＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０２７３Ｌ）
ＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼバッファー（ＮＥＢ、Ｍ０２７３Ｌ）
ＤＮＡポリメラーゼＩ、ラージ（クレノウ）フラグメント（ＮＥＢ、Ｍ０２１０Ｌ、Ｍ０２１２Ｌ）
アダプター鋳型オリゴ（ＡＴＯ）、１−０３４、１−０３５（表１）
ｄＮＴＰ（ＮＥＢ、Ｎ０４４７）
Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０５３０Ｓ）
Ｐｈｕｓｉｏｎバッファー（ＮＥＢ、Ｍ０５３０Ｓ）
ＵＳＥＲ（登録商標）Ｅｎｚｙｍｅ（ＮＥＢ、Ｍ５５０５Ｓ）
【０５９２】
方法
アダプター鋳型オリゴのデオキシリボ核酸へのアニーリング
ＡＴＯの使用を追加して、実施例１と同様である。
【０５９３】
アダプター鋳型オリゴを鋳型とする標的デオキシリボ核酸のそれ自身をプライマーとして使用する伸長
実施例１と同様である。
【０５９４】
アダプター鋳型オリゴの分解
実施例１と同様である。
【０５９５】
修飾標的ポリヌクレオチドのワンパス伸長または線形増幅
実施例１と同様である。
【０５９６】
第１の相補鎖への第２のアダプター鋳型オリゴのアニーリング
ＡＴＯの使用を追加して、実施例１と同様である。
【０５９７】
修飾された第１の相補鎖を形成するための、第２のアダプター鋳型オリゴを鋳型とする第１の相補鎖のそれ自身をプライマーとして使用する伸長
実施例１と同様である。
【０５９８】
第２のアダプター鋳型オリゴの分解
実施例１と同様である。
【０５９９】
３’末端がプライマーとして機能するＤＮＡの二本鎖領域を作成するための第２の伸長産物の自己アニーリング
精製された伸長産物を、適切なバッファー中において、適切な温度（この例では９５℃）で、適切な時間（この例では２分間）、または二本鎖核酸を変性して一本鎖にすることができる他の温度または時間で加熱する。次いで、伸長産物を、この例では２５℃に２分間、または伸長産物の両端に存在する相補的な領域の間でのアニーリングを促進できる他の適切な温度または時間まで、冷却する。現在の環状ＤＮＡ分子を、環状ＤＮＡのローリングサークル増幅の鋳型として使用できる。
【０６００】
結果
実施例１９と同様に、３’末端がさらなるローリングサークル増幅のためのプライミング部位として機能することができる環状産物を作成することに成功した。
【０６０１】
結論
環状標的ポリヌクレオチドを作成する能力により、ローリングサークル増幅が可能になり、それは特定のダウンストリームプロセスに必要な非常に長い産物の作成を可能にする。追加のプライマーが必要ないことは、環状ＤＮＡの自己アニーリングとの競合を回避できることを意味する。
【０６０２】
実施例２１
ＰＣＲ産物を標的ポリヌクレオチドとして使用し、例えば、限定はされないが、化学スペーサー（例えば、限定はされないが、Ｃ３スペーサー、Ｃ１８スペーサー）を用いて形成されたヘアピンを有するアダプター鋳型オリゴを使用して、単一（または複数）アンプリコン高多様性次世代シーケンサーライブラリー（例えば、限定はされないが、イルミナの次世代シーケンサーに適合する）を作成する。
【０６０３】
材料
アダプター鋳型オリゴ（ＡＴＯ）、１−０１４（表１）
ＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０２７３Ｌ）
ＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼバッファー（ＮＥＢ、Ｍ０２７３Ｌ）
ＤＮＡポリメラーゼＩ、ラージ（クレノウ）フラグメント（ＮＥＢ、Ｍ０２１０Ｌ、Ｍ０２１２Ｌ）
ｄＮＴＰ（ＮＥＢ、Ｎ０４４７）
Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０５３０Ｓ）
Ｐｈｕｓｉｏｎバッファー（ＮＥＢ、Ｍ０５３０Ｓ）
ＵＳＥＲ（登録商標）Ｅｎｚｙｍｅ（ＮＥＢ、Ｍ５５０５Ｓ）
プライマー、２−００３（表２）
硫酸アンモニウム（ＳＩＧＭＡ、Ａ４４１８）
Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ａ６３８８１）
【０６０４】
方法
アダプター鋳型オリゴのＰＣＲ産物へのアニーリング
標的ポリヌクレオチドがＰＣＲ産物であることを除いて、実施例１と同様である。
【０６０５】
アダプター鋳型オリゴを鋳型とする標的ＰＣＲ産物のそれ自身をプライマーとして使用する伸長
実施例１と同様である。
【０６０６】
アダプター鋳型オリゴの分解
実施例１と同様である。
【０６０７】
最終シーケンシングライブラリーを作成するためのＰＣＲによる線形伸長産物の指数関数的増幅
ユニバーサルプライマーの１つを、次世代シーケシング技術に適合しかつ必要な配列（例えば、限定はされないが、Ｐ５またはＰ７アダプター配列、患者／サンプルインデックス配列、イルミナ社の次世代シーケンサーとの適合性のためのイルミナまたはカスタムリード１またはリード２配列）を含む５’テールを有する標的特異的プライマーに置き換えたことを除いて、実施例１と同様である。
【０６０８】
結果
実施例１と同様の方法で、単一ＰＣＲアンプリコンを標的ポリヌクレオチドとして使用して、次世代シーケンシングライブラリーの作成に成功した。
【０６０９】
結論
ＡＴＯを使用して見られるランダムプライミングと組み合わせて、ＰＣＲアンプリコンをライブラリーで直接使用できることは、単一アンプリコンまたは高類似性のアンプリコンのプールから、高多様性シーケンシングライブラリーを作成できることを意味する。これは、多数の高類似性アンプリコンが使用される環境サンプルのための用途を有する。
【０６１０】
実施例２２
デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を標的ポリヌクレオチドとして使用し、２つの標的化アンプリコン次世代シーケンサーライブラリー（例えば、限定はされないが、イルミナ社の次世代シーケンサーに適合する）を作成する。
【０６１１】
材料
標的ポリヌクレオチド、ヒトｇＤＮＡ（ＢＩＯ−３５０２５）
ＤＮＡ断片化酵素、ＫＡＰＡ  Ｆｒａｇ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ、７９６２５１７００１）
アダプター鋳型オリゴ（ＡＴＯ）、１−００６（表１）
ＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０２７３Ｌ）
ＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼバッファー（ＮＥＢ、Ｍ０２７３Ｌ）
ＤＮＡポリメラーゼＩ、ラージ（クレノウ）フラグメント（ＮＥＢ、Ｍ０２１０Ｌ、Ｍ０２１２Ｌ）
ｄＮＴＰ（ＮＥＢ、Ｎ０４４７）
Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０５３０Ｓ）
Ｐｈｕｓｉｏｎバッファー（ＮＥＢ、Ｍ０５３０Ｓ）
ＵＳＥＲ（登録商標）Ｅｎｚｙｍｅ（ＮＥＢ、Ｍ５５０５Ｓ）
プライマー、２−００４、２−００５（表２）
硫酸アンモニウム（ＳＩＧＭＡ、Ａ４４１８）
Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ａ６３８８１）
【０６１２】
方法
アダプター鋳型オリゴのデオキシリボ核酸へのアニーリング法
実施例１と同様である。
【０６１３】
アダプター鋳型オリゴを鋳型とする標的デオキシリボ核酸のそれ自身をプライマーとして使用する伸長
実施例１と同様である。
【０６１４】
アダプター鋳型オリゴの分解
実施例１と同様である。
【０６１５】
標的特異的プライマーの２つの異なるプールを使用するＰＣＲによるアダプター鋳型伸長産物の第１の指数関数的増幅
修飾標的ポリヌクレオチドを２つの等しいアリコートに分割することを除き、実施例２と同様であり、分割の結果、後続の各反応における標的ポリヌクレオチドのコピー数が約５０％減少するためすべての感度が低下し、各アリコートは、もともとＡＴＯに存在して現在は修飾標的ＤＮＡ分子の３’末端に存在する保存配列に相補的であるユニバーサルプライマー、および２つの異なるプライマープール（ここでは「プールｌａ」および「プール２ａ」と称する）のうちの１つと組み合わせられ、プライマープールｌは、目的の変化を含むＤＮＡの標的領域の一方のＤＮＡ鎖を標的にするように設計され、プール２はその標的領域の相補鎖を標的にするように設計されている。
【０６１６】
ＰＣＲによる第１の指数関数的増幅産物の第２の指数関数的増幅
ネスト化プライマーの２つの別個のプールが使用されることを除き、実施例２と同様であり、ネスト化プライマーのプール（プール１ｂまたはプール２ｂ）は、第１のプライマープール（プール１ａまたはプール２ａ）に関連するＤＮＡの領域を標的とするように設計され、目的の突然変異を含むＤＮＡの領域を標的とし、さらに次世代シーケシング技術に適合しかつ必要な配列（例えば、限定はされないが、Ｐ５またはＰ７アダプター配列、患者／サンプルインデックス配列、イルミナ社の次世代シーケンサーとの適合性のためのイルミナまたはカスタムリード１またはリード２配列）を含む。
【０６１７】
結果
実施例２の方法を、プライマーの各プールがフォワードまたはリバースの１本鎖を標的とする２つの別個のプライマープールに適用することに成功した。プール内のすべてのプライマーがそれらの標的をさまざまな効率で増幅でき、バーコードファミリーを作成したときにすべての標的で一貫した効率が見られることを示すことができた。
【０６１８】
結論
投入標的ポリヌクレオチドを２つの別個の分析プールに分割することによる最大効率の低下を受け入れると、標的ポリヌクレオチドの両方の鎖を独立して調べることができ、これにより、変異の存在を両方のプライマープールにおいて見つけることができ、したがって両方のプールで見つかった変異が何等かの種類のエラーである可能性が大幅に減るため、さらなるレベルのエラー訂正および変異が正しいことの確信のために両方の鎖で同定された変異を比較することを可能にする。
【０６１９】
実施例２３
あらゆる感度損失の可能性を大いに低減させて、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を標的ポリヌクレオチドとして使用して２つの標的化アンプリコン次世代シーケンサーライブラリー（例えば、限定はされないが、イルミナ社の次世代シーケンサーに適合する）を作成する。
【０６２０】
材料
標的ポリヌクレオチド、ヒトｇＤＮＡ（ＢＩＯ−３５０２５）
ＤＮＡ断片化酵素、ＫＡＰＡ  Ｆｒａｇ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ、７９６２５１７００１）
アダプター鋳型オリゴ（ＡＴＯ）、１−００６（表１）
ＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０２７３Ｌ）
ＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼバッファー（ＮＥＢ、Ｍ０２７３Ｌ）
ＤＮＡポリメラーゼＩ、ラージ（クレノウ）フラグメント（ＮＥＢ、Ｍ０２１０Ｌ、Ｍ０２１２Ｌ）
ｄＮＴＰ（ＮＥＢ、Ｎ０４４７）
Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０５３０Ｓ）
Ｐｈｕｓｉｏｎバッファー（ＮＥＢ、Ｍ０５３０Ｓ）
ＵＳＥＲ（登録商標）Ｅｎｚｙｍｅ（ＮＥＢ、Ｍ５５０５Ｓ）
プライマー、２−００４、２−００５（表２）
硫酸アンモニウム（ＳＩＧＭＡ、Ａ４４１８）
Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ａ６３８８１）
【０６２１】
方法
アダプター鋳型オリゴのデオキシリボ核酸へのアニーリング
実施例１と同様である。
【０６２２】
アダプター鋳型オリゴを鋳型とする標的デオキシリボ核酸のそれ自身をプライマーとして使用する伸長
実施例１と同様である。
【０６２３】
アダプター鋳型オリゴの分解
実施例１と同様である。
【０６２４】
修飾標的ポリヌクレオチドの線形増幅
実施例１と同様である。
【０６２５】
二本鎖ＤＮＡの各鎖を標的とする標的特異的プライマーの２つの異なるプールを用いるＰＣＲによる第１の相補鎖の第１の指数関数的増幅
第１の相補鎖が鋳型として使用され、２つのプールに分割されることを除いて、実施例２２と同様である。
【０６２６】
ＰＣＲによる第１の指数関数的増幅産物の第２の指数関数的増幅
実施例２２と同様である。
【０６２７】
結果
実施例２および２２と同様に、標的化アンプリコン次世代シーケンシングライブラリーの作成に成功した。
【０６２８】
結論
重要なこととしてＵＩＤの組み込みの後に元の標的ポリヌクレオチドを増幅するため、修飾標的ポリヌクレオチドの線形増幅のこの実施例のアプローチを使用して、実施例２２の方法の限界を克服することができる。これは、鎖特異的増幅の２つ以上のプールを、各プールの最大効率を理論的に低下させることなく使用できることを意味する。
【０６２９】
実施例２４
標的ポリヌクレオチドとしてデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を使用し、例えば、限定はされないが、化学スペーサー（例えば、限定はされないが、Ｃ３スペーサー、Ｃ１８スペーサー）を用いて形成されたヘアピンを有するアダプター鋳型オリゴを使用して、１つのチューブで２つの標的化アンプリコン次世代シーケンサーライブラリー（例えば、限定はされないが、イルミナの次世代シーケンサーに適合する）を作成する。
【０６３０】
材料
標的ポリヌクレオチド、ヒトｇＤＮＡ（ＢＩＯ−３５０２５）
ＤＮＡ断片化酵素、ＫＡＰＡ  Ｆｒａｇ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ、７９６２５１７００１）
アダプター鋳型オリゴ（ＡＴＯ）、１−００６（表１）
ＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０２７３Ｌ）
ＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼバッファー（ＮＥＢ、Ｍ０２７３Ｌ）
ＤＮＡポリメラーゼＩ、ラージ（クレノウ）フラグメント（ＮＥＢ、Ｍ０２１０Ｌ、Ｍ０２１２Ｌ）
ｄＮＴＰ（ＮＥＢ、Ｎ０４４７）
Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０５３０Ｓ）
Ｐｈｕｓｉｏｎバッファー（ＮＥＢ、Ｍ０５３０Ｓ）
ＵＳＥＲ（登録商標）Ｅｎｚｙｍｅ（ＮＥＢ、Ｍ５５０５Ｓ）
プライマー、２−００４、２−００５（表２）
硫酸アンモニウム（ＳＩＧＭＡ、Ａ４４１８）
Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ａ６３８８１）
エキソヌクレアーゼＩ（ＮＥＢ、Ｍ０２９３Ｓ）
【０６３１】
方法
アダプター鋳型オリゴのデオキシリボ核酸へのアニーリング
実施例１と同様である。
【０６３２】
アダプター鋳型オリゴを鋳型とする標的デオキシリボ核酸のそれ自身をプライマーとして使用する伸長
実施例１と同様である。
【０６３３】
アダプター鋳型オリゴの分解
実施例１と同様である。
【０６３４】
標的特異的プライマーの第１のプールを使用するＰＣＲによるアダプター鋳型伸長産物の第１の指数関数的増幅
実施例２２で使用した２つのプライマープールの内の１つを用いて、実施例２と同様である。
【０６３５】
第１の指数関数的増幅反応混合物からの未使用プライマーの除去
第１の指数関数的増幅産物を、一本鎖特異的ヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼＩ）と、ある温度（例えば、３７℃）で、ある時間（例えば、１５分）、または指数関数的増幅産物中に存在するすべての一本鎖ＤＮＡの分解を生じる酵素活性をもたらすことができる他の適切な時間または温度で、混合する。この実施例では、２０単位のエキソヌクレアーゼＩを第１の増幅産物に添加し、３７℃で２５分間インキュベートした。次いで、一本鎖特異的ヌクレアーゼを不活性化できる温度（この例では８０℃）および時間（この例では１５分間）、反応混合物をインキュベートすることにより、一本鎖特異的ヌクレアーゼを不活性化することができる。任意選択で、その後、例えば磁気ビーズを使用するなど、任意の適切な方法により増幅産物を精製することができる。
【０６３６】
標的特異的プライマーの第１のプールを用いるＰＣＲによるアダプター鋳型伸長産物の二次指数関数的増幅
標的特異的プライマーの異なる第２のプールが用いられることを除いて、第１の指数関数的増幅と同様である。
【０６３７】
第２の指数関数的増幅反応混合物からの未使用プライマーの除去
第１の未使用プライマーの除去と同様である。
【０６３８】
ＰＣＲによる第２の指数関数的増幅産物の第３の指数関数的増幅
この例では、鋳型が第２の増幅の産物であることを除いて、実施例２２の第２の指数関数的増幅と同様であり、その産物は２つの等しいアリコートに分割される。
【０６３９】
結果
実施例２、２２、２３と同様に、標的化アンプリコン次世代シーケンシングライブラリーの作成に成功した。
【０６４０】
結論
重要なこととしてＵＩＤの組み込みの後に元の標的ポリヌクレオチドを増幅するため、この例での２つの連続指数関数的増幅のアプローチを使用して、実施例２２の方法の限界を克服できる。これは、各プールの最大効率を理論的に低下させることなく、鎖特異的増幅の２つ以上のプールを使用できることを意味する。
【０６４１】
実施例２５
２４５ｘ２のプライマーペアを含む、がん突然変異ホットスポットパネルが設計された。そのパネルは、ヒトがん遺伝子で頻繁に変異するゲノムの「ホットスポット」領域からアンプリコンライブラリーを調製するために使用されるプライマーの４つのプールを含む。ホットスポットパネルは、５０のがん遺伝子と腫瘍抑制遺伝子から約３，０００のＣＯＳＭＩＣ突然変異をカバーする２４５アンプリコンを増幅するように設計された。
ＡＢＬｌ  ＥＺＨ２          ＪＡＫ３    ＰＴＥＮ
ＡＫＴ１  ＦＢＸＷ７        ＩＤＨ２    ＰＴＰＮ１１
ＡＬＫ    ＦＧＦＲ１        ＫＤＲ      ＲＢＩ
ＡＰＣ    ＦＧＦＲ２        ＫＩＴ      ＲＥＴ
ＡＴＭ    ＦＧＦＲ３        ＫＲＡＳ    ＳＭＡＤ４
ＢＲＡＦ  ＦＬＴ３  ＭＥＴ  ＳＭＡＲＣＢ１
ＣＤＨ１  ＧＮＡ１１        ＭＬＨ１    ＳＭＯ
ＣＤＫＮ２Ａ      ＧＮＡＳ  ＭＰＬ      ＳＲＣ
ＣＳＦ１ＲＧＮＡＱ  ＮＯＴＣＨ１        ＳＴＫ１１
ＣＴＮＮＢ１      ＨＮＦ１Ａ            ＮＰＭ１  ＴＰ５３
ＥＧＦＲ  ＨＲＡＳ  ＮＲＡＳ  ＶＨＬ
ＥＲＢＢ２          ＩＤＨ１  ＰＤＧＦＲＡ
ＥＲＢＢ４          ＪＡＫ２  ＰＩＫ３ＣＡ
Ｆｐ５プールは、第１のセットのフォワードプライマーを含み、それはテールのない標的特異的プライマーである；
Ｆｐ７プールは、第２のセットのフォワードプライマーを含み、それは、構造：５’テール（ユニバーサル）−標的特異的：を有するネスト化プライマーである；
Ｒｐ５プールは、第１のセットのリバースプライマーを含み、それはテールのない標的特異的プライマーである；
Ｒｐ７プールは、第２のセットのリバースプライマーを含み、それは、構造：５’テール（ユニバーサル）−標的特異的：を有するネスト化プライマーである。
各プールは２４５のプライマーを含む。
【０６４２】
第１の反応では、ＡＴＯをサンプルの標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズさせる。標的ポリヌクレオチドは、ＡＴＯを鋳型として使用して伸長される。この伸長により、修飾標的ポリヌクレオチドが生成され、これはＵＩＤとしてのランダム配列と３’ユニバーサル配列とを含む。
【０６４３】
第２の反応では、第１のユニバーサルプライマーおよび標的特異的プライマーのＦｐ５プールまたはＲｐ５プールを加えて、修飾標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズさせ、標的配列をＰＣＲ増幅させる。第３の反応は、ネスト化標的特異的プライマー（Ｆｐ７またはＲｐ７）およびユニバーサルプライマーを使用することにより行う。
【０６４４】
その後、各タグ付きアンプリコンライブラリーを小さな残留ＤＮＡ断片から精製し、ＤＮＡ濃度を決定した。次に、これら精製されかつ個別にタグ付けされたアンプリコンライブラリーを等モルプールして、アンプリコンプールまたはシーケンシングサンプルをもたらした。
【０６４５】
すべてのプライマーは、ＥｕｒｏｆｉｎｓまたはＥｕｒｏｇｅｎｔｅｃによって合成され、１０μＭに希釈された。ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、またはＮＥＢから購入した。
【０６４６】
【表１−１】
2020512845.tif 000003
【表１−２】
2020512845.tif 000004
【表１−３】
2020512845.tif 000005
【表１−４】
2020512845.tif 000006
【０６４７】
【表２】
2020512845.tif 000007
【図１Ａ】
2020512845.tif 000008
【図１Ｂ】
2020512845.tif 000009
【図１Ｃ】
2020512845.tif 000010
【図１Ｄ】
2020512845.tif 000011
【図２−１】
2020512845.tif 000012
【図２−２】
2020512845.tif 000013
【図２−３】
2020512845.tif 000014
【図２−４】
2020512845.tif 000015
【図２−５】
2020512845.tif 000016
【図３−１】
2020512845.tif 000017
【図３−２】
2020512845.tif 000018
【図３−３】
2020512845.tif 000019
【図３−４】
2020512845.tif 000020
【図４】
2020512845.tif 000021
【図５】
2020512845.tif 000022
【図６】
2020512845.tif 000023
【図７】
2020512845.tif 000024
【図８−１】
2020512845.tif 000025
【図８−２】
2020512845.tif 000026
【図９】
2020512845.tif 000027
【図１０】
2020512845.tif 000028
【図１１−１】
2020512845.tif 000029
【図１１−２】
2020512845.tif 000030
【図１２】
2020512845.tif 000031
【図１３−１】
2020512845.tif 000032
【図１３−２】
2020512845.tif 000033
【図１３−３】
2020512845.tif 000034
【図１４−１】
2020512845.tif 000035
【図１４−２】
2020512845.tif 000036
【図１５】
2020512845.tif 000037
【図１６−１】
2020512845.tif 000038
【図１６−２】
2020512845.tif 000039
【図１６−３】
2020512845.tif 000040
【図１７】
2020512845.tif 000041
【図１８】
2020512845.tif 000042
【図１９】
2020512845.tif 000043
【国際調査報告】
2020512845.tif 000044
2020512845.tif 000045
2020512845.tif 000046