(57)【要約】  特有の炭水化物プロファイルを有するα−ガラクトシダーゼＡ酵素を含む組成物、並びにそのような酵素を製造及び精製するための方法が記載される。そのような酵素を、それを必要とする対象に投与することにより、ファブリー病を処置、予防、及び／又は緩和する方法も記載されている。そのようなα−ガラクトシダーゼＡ酵素と組み合わせてミガラスタトを含む組成物も記載されている。【選択図】図１１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１又は配列番号２と少なくとも９８％の配列同一性を有するタンパク質を含む、ヒト組換えα−ガラクトシダーゼＡ（ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ）であって、前記タンパク質が、全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも２５％の、モノ−マンノース−６−リン酸であるもの、及び全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも１２％の、ビス−マンノース−６−リン酸であるものを有する、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ。
【請求項２】
前記ｒｈα−Ｇａｌ  Ａが、全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも３０％の、シアル酸を含有するものを有する、請求項１に記載のｒｈα−Ｇａｌ  Ａ。
【請求項３】
前記ｒｈα−Ｇａｌ  Ａが、全Ｎ結合オリゴ糖のうち２０％未満の、中性であるものを有する、請求項１又は２に記載のｒｈα−Ｇａｌ  Ａ。
【請求項４】
配列番号１又は配列番号２と少なくとも９８％の配列同一性を有するタンパク質を含む、ヒト組換えα−ガラクトシダーゼＡ（ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ）であって、前記タンパク質が、全Ｎ結合オリゴ糖のうち１０％未満の、中性であるものを有し、前記タンパク質が
全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも１７％の、単一のシアル酸残基を含有するもの；
全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも２０％の、２つのシアル酸残基を含有するもの；
全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも４０％の、１つ又は２つのシアル酸残基を含有するもの；又は
ｒｈα−Ｇａｌ  Ａホモダイマー１モルあたり少なくとも６モルのシアル酸残基
のうち１つ以上を有する、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ。
【請求項５】
前記ｒｈα−Ｇａｌ  Ａが、
全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも１７％の、単一のシアル酸残基を含有するもの；
全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも２０％の、２つのシアル酸残基を含有するもの；
全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも４０％の、１つ又は２つのシアル酸残基を含有するもの；又は
ｒｈα−Ｇａｌ  Ａホモダイマー１モルあたり少なくとも６モルのシアル酸残基
のうち２つ以上を有する、請求項４に記載のｒｈα−Ｇａｌ  Ａ。
【請求項６】
前記ｒｈα−Ｇａｌ  Ａが、全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも５０％の、シアル酸を含有するものを有する、請求項４又は５に記載のｒｈα−Ｇａｌ  Ａ。
【請求項７】
前記ｒｈα−Ｇａｌ  Ａが、全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも２５％の、モノ−マンノース−６−リン酸（モノ−Ｍ６Ｐ）であるもの、及び全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも６％の、ビス−マンノース−６−リン酸であるものを有する、請求項４〜６のいずれか一項に記載のｒｈα−Ｇａｌ  Ａ。
【請求項８】
前記ｒｈα−Ｇａｌ  Ａが、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａホモダイマー１モルあたり少なくとも７モルのシアル酸残基を有する、請求項４〜７のいずれか一項に記載のｒｈα−Ｇａｌ  Ａ。
【請求項９】
前記ｒｈα−Ｇａｌ  Ａが、全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも２２％の、２つのシアル酸残基を含有するものを有する、請求項４〜８のいずれか一項に記載のｒｈα−Ｇａｌ  Ａ。
【請求項１０】
前記ｒｈα−Ｇａｌ  Ａが、全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも１４％の、ビス−マンノース−６−リン酸であるものを有する、請求項４〜９のいずれか一項に記載のｒｈα−Ｇａｌ  Ａ。
【請求項１１】
組換えヒトα−Ｇａｌ  Ａ（ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ）を含む組換えタンパク質産物の産生方法であって、前記方法が、
配列番号１又は配列番号２と少なくとも９８％の配列同一性を有するタンパク質を含むｒｈα−Ｇａｌ  Ａを分泌する、バイオリアクター中で、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）宿主細胞を培養すること；
前記バイオリアクターから培地を除去すること；
前記培地を濾過して濾液を提供すること；
前記濾液を陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）カラムに充填して前記ｒｈα−Ｇａｌ  Ａを捕捉すること；及び
前記ＡＥＸカラムから前記ｒｈα−Ｇａｌ  Ａを含む第１のタンパク質産物を溶出すること
を含む、方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法により作製された組換えタンパク質産物。
【請求項１３】
薬学的に許容される担体及び請求項１〜１０のいずれか一項に記載のｒｈα−Ｇａｌ  Ａ又は請求項１２に記載の組換えタンパク質産物を含む、医薬組成物。
【請求項１４】
α−Ｇａｌ  Ａの薬理学的シャペロンをさらに含む、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記薬理学的シャペロンがミガラスタト又はその塩である、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記薬理学的シャペロンが塩酸ミガラスタトである、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記医薬組成物が、
約０．５から約２０μＭのｒｈα−Ｇａｌ  Ａ；及び
約５０〜約２０，０００μＭのミガラスタト又はその塩
を含む、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記薬理学的シャペロンが塩酸ミガラスタトである、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記医薬組成物が、
約１〜約１０μＭのｒｈα−Ｇａｌ  Ａ；及び
約１００〜約１０，０００μＭのミガラスタト又はその塩
を含む、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記薬理学的シャペロンが塩酸ミガラスタトである、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記ミガラスタト又はその塩及びｒｈα−Ｇａｌ  Ａが、前記ミガラスタト又はその塩のα−ガラクトシダーゼＡに対するモル比が約１３，０００：１〜約５０：１で存在する、請求項１７又は１９に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記薬理学的シャペロンが塩酸ミガラスタトである、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記組成物が、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内、皮下、又は腹腔内投与用に製剤化される、請求項１３〜２２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
ファブリー病を処置するための方法であって、前記方法が、
（ａ）配列番号１又は配列番号２と少なくとも９８％の配列同一性を有するタンパク質を含む、ヒト組換えα−ガラクトシダーゼＡ（ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ）であって、前記タンパク質が、全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも２５％の、モノ−マンノース−６−リン酸であるもの、及び全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも１２％の、ビス−マンノース−６−リン酸であるものを有する、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ；及び
（ｂ）薬理学的シャペロン
を含む医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、方法。
【請求項２５】
前記ｒｈα−Ｇａｌ  Ａが、全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも３０％の、シアル酸を含有するものを有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ｒｈα−Ｇａｌ  Ａが、全Ｎ結合オリゴ糖のうち２０％未満の、中性であるものを有する、請求項２４又は２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記タンパク質が、全Ｎ結合オリゴ糖のうち１０％未満の、中性であるものを有し、前記タンパク質が、
全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも１７％の、単一のシアル酸残基を含有するもの；
全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも２０％の、２つのシアル酸残基を含有するもの；
全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも４０％の、１つ又は２つのシアル酸残基を含有するもの；又は
ｒｈα−Ｇａｌ  Ａホモダイマー１モルあたり少なくとも６モルのシアル酸残基
のうち１つ以上を有する、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ｒｈα−Ｇａｌ  Ａが、
全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも１７％の、単一のシアル酸残基を含有するもの；
全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも２０％の、２つのシアル酸残基を含有するもの；
全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも４０％の、１つ又は２つのシアル酸残基を含有するもの；又は
ｒｈα−Ｇａｌ  Ａホモダイマー１モルあたり少なくとも６モルのシアル酸残基
のうち２つ以上を有する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ｒｈα−Ｇａｌ  Ａが、全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも５０％の、シアル酸を含有するものを有する、請求項２７又は２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ｒｈα−Ｇａｌ  Ａが、全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも２５％の、モノ−マンノース−６−リン酸であるもの、及び全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも６％の、ビス−マンノース−６−リン酸であるものを有する、請求項２４〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ｒｈα−Ｇａｌ  Ａが、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａホモダイマー１モルあたり少なくとも７モルのシアル酸残基を有する、請求項２４〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ｒｈα−Ｇａｌ  Ａが、全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも２２％の、２つのシアル酸残基を含有するものを有する、請求項２４〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記ｒｈα−Ｇａｌ  Ａが、全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも１４％の、ビス−マンノース−６−リン酸であるものを有する、請求項２４〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記ｒｈα−Ｇａｌ  Ａが約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項２４〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記薬理学的シャペロンが前記ｒｈα−Ｇａｌ  Ａと共製剤化される、請求項２４〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
ｒｈα−Ｇａｌ  Ａを含む前記医薬組成物の投与の４時間以内に、前記患者に前記薬理学的シャペロンを共投与する、請求項２４〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記薬理学的シャペロンが経口投与され、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａを含有する医薬組成物が静脈内投与される、請求項２４〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記薬理学的シャペロンがミガラスタト又はその塩を含む、請求項２４〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記医薬組成物が月に１回から週に１回投与される、請求項２４〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記医薬組成物が隔週で投与される、請求項２４〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記ミガラスタト又はその塩が約１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項３８〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記投与が、細胞を前記薬理学的シャペロンに結合した前記ｒｈα−Ｇａｌ  Ａと接触させることである、請求項２４〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記細胞が前記患者の心臓に位置する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記細胞が前記患者の腎臓に位置する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記細胞が前記患者の皮膚に位置する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
前記薬理学的シャペロンが塩酸ミガラスタトである、請求項２７〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
哺乳動物細胞のリソソームにおけるα−ガラクトシダーゼ−Ａタンパク質の活性レベルを増強する方法であって、前記方法が、前記哺乳動物細胞と、配列番号１又は配列番号２と少なくとも９８％の配列同一性を有するタンパク質を含む、ヒト組換えα−ガラクトシダーゼＡ（ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ）であって、前記タンパク質が、全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも２５％の、モノ−マンノース−６−リン酸であるもの、及び全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも１２％の、ビス−マンノース−６−リン酸であるものを有する、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａとを接触させることを含み、前記ｒｈα−Ｇａｌ  Ａが薬理学的シャペロンに結合している、方法。
【請求項４８】
前記ｒｈα−Ｇａｌ  Ａが、全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも３０％の、シアル酸を含有するものを有する、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記ｒｈα−Ｇａｌ  Ａが、全Ｎ結合オリゴ糖のうち２０％未満の、中性であるものを有する、請求項４７又は４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記タンパク質が、全Ｎ結合オリゴ糖のうち１０％未満の、中性であるものを有し、前記タンパク質が、
全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも１７％の、単一のシアル酸残基を含有するもの；
全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも２０％の、２つのシアル酸残基を含有するもの；
全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも４０％の、１つ又は２つのシアル酸残基を含有するもの；又は
ｒｈα−Ｇａｌ  Ａホモダイマー１モルあたり少なくとも６モルのシアル酸残基
のうち１つ以上を有する、請求項４７〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記ｒｈα−Ｇａｌ  Ａが、
全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも１７％の、単一のシアル酸残基を含有するもの；
全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも２０％の、２つのシアル酸残基を含有するもの；
全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも４０％の、１つ又は２つのシアル酸残基を含有するもの；又は
ｒｈα−Ｇａｌ  Ａホモダイマー１モルあたり少なくとも６モルのシアル酸残基
のうち２つ以上を有する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記ｒｈα−Ｇａｌ  Ａが、全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも５０％の、シアル酸を含有するものを有する、請求項４７〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記ｒｈα−Ｇａｌ  Ａが、全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも２５％の、モノ−マンノース−６−リン酸であるもの、及び全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも６％の、ビス−マンノース−６−リン酸であるものを有する、請求項４７〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記ｒｈα−Ｇａｌ  Ａが、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａホモダイマー１モルあたり少なくとも７モルのシアル酸残基を有する、請求項４７〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記ｒｈα−Ｇａｌ  Ａが、全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも２２％の、２つのシアル酸残基を含有するものを有する、請求項４７〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記ｒｈα−Ｇａｌ  Ａが、全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも１４％の、ビス−マンノース−６−リン酸であるものを有する、請求項４７〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記ｒｈα−Ｇａｌ  Ａが約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項４７〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記薬理学的シャペロンが前記ｒｈα−Ｇａｌ  Ａと共製剤化される、請求項４７〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記哺乳動物細胞を前記ｒｈα−Ｇａｌ  Ａと接触させることが、前記ｒｈα−Ｇａｌ  Ａを含む医薬組成物を投与する４時間以内に、前記薬理学的シャペロンを共投与することを含む、請求項４７〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記薬理学的シャペロンが経口投与され、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａを含有する医薬組成物が静脈内投与される、請求項４７〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記薬理学的シャペロンがミガラスタト又はその塩である、請求項４７〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記医薬組成物が月に１回から週に１回投与される、請求項５９〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記医薬組成物が隔週で投与される、請求項５９〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記細胞が心臓細胞である、請求項４７〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記細胞が腎細胞である、請求項４７〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記細胞が皮膚細胞である、請求項４７〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記接触が、前記ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ及び前記薬理学的シャペロンの投与により実施される、請求項４７〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記投与が、前記薬理学的シャペロン及び前記ｒｈα−Ｇａｌ  Ａの両方の全身投与である、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記薬理学的シャペロン及び前記ｒｈα−Ｇａｌ  Ａの両方が共投与される、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
前記薬理学的シャペロン及び前記ｒｈα−Ｇａｌ  Ａが、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内、皮下、又は腹腔内投与用に製剤化された組成物中に存在する、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記組成物が静脈内投与用に製剤化される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記ミガラスタト又はその塩が約１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項６１〜７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記医薬組成物が、
約０．５から約２０μＭのｒｈα−Ｇａｌ  Ａ；及び
約５０〜約２０，０００μＭのミガラスタト又はその塩
を含む、請求項４７〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
前記医薬組成物が、
約１〜約１０μＭのｒｈα−Ｇａｌ  Ａ；及び
約１００〜約１０，０００μＭのミガラスタト又はその塩
を含む、請求項４７〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
ミガラスタト又はその塩のα−ガラクトシダーゼＡに対する比が、約１３，０００：１〜約５０：１である、請求項７３又は７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記細胞がインビトロである、請求項４７〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記細胞がヒト細胞である、請求項４７〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記細胞が対象内にある、請求項４７〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記対象が必要としている患者である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記細胞が対象の心臓、腎臓又は皮膚に位置する、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記細胞が前記対象の心臓に位置する、請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
前記細胞が前記対象の腎臓に位置する、請求項７９に記載の方法。
【請求項８３】
前記細胞が前記対象の皮膚に位置する、請求項７９に記載の方法。
【請求項８４】
前記対象が、ファブリー病を有すると診断されている、請求項７９〜８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
必要とする患者の臓器におけるグロボトリアオシルセラミド（ＧＬ−３）のレベルを低下させる方法であって、前記方法が、治療有効量の（ｉ）薬理学的シャペロン、並びに（ｉｉ）配列番号１又は配列番号２と少なくとも９８％の配列同一性を有するタンパク質を含む、ヒト組換えα−ガラクトシダーゼＡ（ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ）であって、前記タンパク質が、全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも２５％の、モノ−マンノース−６−リン酸であるもの、及び全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも１２％の、ビス−マンノース−６−リン酸であるものを有する、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ、を含む組成物を前記患者に投与することを含む、方法。
【請求項８６】
前記ｒｈα−Ｇａｌ  Ａが、全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも３０％の、シアル酸を含有するものを有する、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記ｒｈα−Ｇａｌ  Ａが、全Ｎ結合オリゴ糖のうち２０％未満の、中性であるものを有する、請求項８５又は８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記タンパク質が、全Ｎ結合オリゴ糖のうち１０％未満の、中性であるものを有し、前記タンパク質が、
全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも１７％の、単一のシアル酸残基を含有するもの；
全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも２０％の、２つのシアル酸残基を含有するもの；
全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも４０％の、１つ又は２つのシアル酸残基を含有するもの；又は
ｒｈα−Ｇａｌ  Ａホモダイマー１モルあたり少なくとも６モルのシアル酸残基
のうち１つ以上を有する、請求項８５〜８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
前記ｒｈα−Ｇａｌ  Ａが、
全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも１７％の、単一のシアル酸残基を含有するもの；
全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも２０％の、２つのシアル酸残基を含有するもの；
全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも４０％の、１つ又は２つのシアル酸残基を含有するもの；又は
ｒｈα−Ｇａｌ  Ａホモダイマー１モルあたり少なくとも６モルのシアル酸残基
のうち２つ以上を有する、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記ｒｈα−Ｇａｌ  Ａが、全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも５０％の、シアル酸を含有するものを有する、請求項８８又は８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記ｒｈα−Ｇａｌ  Ａが、全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも２５％の、モノ−マンノース−６−リン酸であるもの、及び全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも６％の、ビス−マンノース−６−リン酸であるものを有する、請求項８８〜９０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
前記ｒｈα−Ｇａｌ  Ａが、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａホモダイマー１モルあたり少なくとも７モルのシアル酸残基を有する、請求項８８〜９１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
前記ｒｈα−Ｇａｌ  Ａが、全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも２２％の、２つのシアル酸残基を含有するものを有する、請求項８８〜９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
前記ｒｈα−Ｇａｌ  Ａが、全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも１４％の、ビス−マンノース−６−リン酸であるものを有する、請求項８８〜９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
前記投与が共投与により実施される、請求項８５に記載の方法。
【請求項９６】
前記投与が、前記薬理学的シャペロン及び前記ｒｈα−Ｇａｌ  Ａの両方の全身投与である、請求項８５〜９５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
前記組成物が、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内、皮下、又は腹腔内投与用に製剤化される、請求項８５〜９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
前記組成物が静脈内投与用に製剤化される、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記薬理学的シャペロンがミガラスタト又はその塩である、請求項８５〜９８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
前記医薬組成物が、
約０．５から約２０μＭのｒｈα−Ｇａｌ  Ａ；及び
約５０〜約２０，０００μＭのミガラスタト又はその塩
を含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記医薬組成物が、
約１〜約１０μＭのｒｈα−Ｇａｌ  Ａ；及び
約１００〜約１０，０００μＭのミガラスタト又はその塩
を含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０２】
ミガラスタト又はその塩のα−ガラクトシダーゼＡに対する比が、約１３，０００：１〜約５０：１である、請求項９９〜１０１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０３】
前記臓器が心臓、腎臓又は皮膚である、請求項８５〜１０２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０４】
前記臓器が心臓である、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記臓器が腎臓である、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０６】
前記臓器が皮膚である、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０７】
前記患者が、ファブリー病を有すると診断されている、請求項８５〜１０６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０８】
ファブリー病を処置する方法であって、前記方法が、哺乳動物細胞を有効量の組換えヒトα−ガラクトシダーゼＡ（ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ）と接触させることを含み、前記細胞を前記ｒｈα−Ｇａｌ  Ａと接触させることが、アガルシダーゼベータと接触させることよりも大きいグロボトリアオシルセラミド（ＧＬ−３）の減少をもたらす、方法。
【請求項１０９】
前記接触が、対象に有効量の前記ｒｈα−Ｇａｌ  Ａを投与することである、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
前記細胞が対象内にある、請求項１０８又は１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
前記対象が必要としている患者である、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
ＧＬ−３の前記減少が心臓組織において測定される、請求項１０８〜１１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１３】
ＧＬ−３の前記減少が腎臓組織において測定される、請求項１０８〜１１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１４】
ＧＬ−３の前記減少が皮膚組織において測定される、請求項１０８〜１１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１５】
前記ｒｈα−Ｇａｌ  Ａが薬理学的シャペロンに結合している、請求項１０８〜１１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１６】
前記薬理学的シャペロンがミガラスタト又はその塩である、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
前記ミガラスタト又はその塩が３ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
前記ミガラスタト又はその塩が１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１９】
前記ミガラスタト又はその塩が３０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１２０】
前記ミガラスタト又はその塩が３００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１２１】
前記ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ及び前記薬理学的シャペロンが共投与される、請求項１１５〜１２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２２】
前記ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ及び前記薬理学的シャペロンが共製剤化される、請求項１１５〜１２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２３】
１ｍｇ／ｋｇのｒｈα−Ｇａｌ  Ａの用量が、１ｍｇ／ｋｇの用量でのＧｌａノックアウトマウスへのアガルシダーゼベータの投与よりも大きなＧＬ−３の減少をもたらす、請求項１０８〜１２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２４】
１０ｍｇ／ｋｇのｒｈα−Ｇａｌ  Ａの用量が、１０ｍｇ／ｋｇの用量でのＧｌａノックアウトマウスへのアガルシダーゼベータの投与よりも大きなＧＬ−３の減少をもたらす、請求項１０８〜１２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２５】
Ｇｌａノックアウトマウスへの医薬組成物の投与後のＧＬ−３の前記減少が、アガルシダーゼベータの投与後のＧＬ−３の前記減少よりも少なくとも１０％大きい、請求項１０８〜１２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２６】
Ｇｌａノックアウトマウスへの前記医薬組成物の投与後のＧＬ−３の前記減少が、アガルシダーゼベータの投与後のＧＬ−３の前記減少よりも少なくとも２０％大きい、請求項１０８〜１２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２７】
ファブリー病を処置する方法であって、前記方法が、哺乳動物細胞を有効量の組換えヒトα−ガラクトシダーゼＡ（ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ）と接触させることを含み、前記細胞を前記ｒｈα−Ｇａｌ  Ａと接触させることが、アガルシダーゼベータと接触させることよりも大きい血漿ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の減少をもたらす、方法。
【請求項１２８】
前記接触が、対象に有効量の前記ｒｈα−Ｇａｌ  Ａを投与することである、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
前記細胞が対象内にある、請求項１２７又は１２８に記載の方法。
【請求項１３０】
前記対象が必要としている患者である、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３１】
血漿ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の前記減少が心臓組織において測定される、請求項１２７〜１３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３２】
血漿ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の前記減少が腎臓組織において測定される、請求項１２７〜１３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３３】
血漿ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の前記減少が皮膚組織において測定される、請求項１２７〜１３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３４】
前記ｒｈα−Ｇａｌ  Ａが薬理学的シャペロンに結合している、請求項１２７〜１３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３５】
前記薬理学的シャペロンがミガラスタト又はその塩である、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３６】
前記ミガラスタト又はその塩が３ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３７】
前記ミガラスタト又はその塩が１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３８】
前記ミガラスタト又はその塩が３０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３９】
前記ミガラスタト又はその塩が３００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１４０】
前記ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ及び前記薬理学的シャペロンが共投与される、請求項１３５〜１３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４１】
前記ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ及び前記薬理学的シャペロンが共製剤化される、請求項１３５〜１３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４２】
１ｍｇ／ｋｇのｒｈα−Ｇａｌ  Ａの用量が、１ｍｇ／ｋｇの用量でのＧｌａノックアウトマウスへのアガルシダーゼベータの投与よりも大きな血漿ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の減少をもたらす、請求項１２７〜１４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４３】
１０ｍｇ／ｋｇのｒｈα−Ｇａｌ  Ａの用量が、１０ｍｇ／ｋｇの用量でのＧｌａノックアウトマウスへのアガルシダーゼベータの投与よりも大きな血漿ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の減少をもたらす、請求項１２７〜１４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４４】
Ｇｌａノックアウトマウスへの医薬組成物の投与後の血漿ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の前記減少が、アガルシダーゼベータの投与後の血漿ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の前記減少よりも少なくとも１０％大きい、請求項１２７〜１４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４５】
Ｇｌａノックアウトマウスへの前記医薬組成物の投与後の血漿ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の前記減少が、アガルシダーゼベータの投与後の血漿ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の前記減少よりも少なくとも２０％大きい、請求項１２７〜１４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４６】
ファブリー病を処置する方法であって、前記方法が、哺乳動物細胞を有効量の組換えヒトα−ガラクトシダーゼＡ（ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ）と接触させることを含み、前記細胞を前記ｒｈα−Ｇａｌ  Ａと接触させることが、アガルシダーゼベータと接触させることよりも大きい１つ以上の基質の減少をもたらす、方法。
【請求項１４７】
前記１つ以上の基質がＧＬ−３又は血漿ｌｙｓｏ−Ｇｂ３を含む、請求項１４６に記載の方法。
【請求項１４８】
前記１つ以上の基質がＧＬ−３である、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１４９】
前記１つ以上の基質が血漿ｌｙｓｏ−Ｇｂ３である、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１５０】
前記ｒｈα−Ｇａｌ  Ａが薬理学的シャペロンに結合している、請求項１４６〜１４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５１】
前記薬理学的シャペロンがミガラスタト又はその塩である、請求項１５０に記載の方法。
【請求項１５２】
前記ミガラスタト又はその塩が３ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５３】
前記ミガラスタト又はその塩が１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５４】
前記ミガラスタト又はその塩が３０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５５】
前記ミガラスタト又はその塩が３００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１５１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の原理及び実施形態は、一般に、リソソーム蓄積障害、特にファブリー病の処置のための組換えα−ガラクトシダーゼＡに関する。
【０００２】
配列表の参照
「００７１２８３７．ＴＸＴ」（９Ｋｂ、２０１８年１月１０日作成）として識別される、本明細書と共に提出された配列表テキストファイルは、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
ファブリー病は、α−Ｇａｌ  Ａ遺伝子（Ｇｌａ）の変異の結果として、リソソーム酵素α−ガラクトシダーゼＡ（α−Ｇａｌ  Ａ）の欠損によって引き起こされるスフィンゴ糖脂質代謝の進行性のＸ連鎖先天異常である。Ｘ連鎖性疾患であるにもかかわらず、女性では、様々な程度の臨床症状が発現し得る。ファブリー（Ｆａｂｒｙ）は、まれな疾患であり、発生率は一般人口で男性４０，０００人に１人から１１７，０００人に１人と推定される。さらに、古典的な徴候及び症状を示さないので、診断され得ないファブリー病の後期発症表現型の変異型が存在する。このために、及びファブリー病の新生児のスクリーニングによって、ファブリー病の実際の発生率は、現在推定されているよりも高い可能性があることが示唆される。
【０００４】
腎臓、心臓及び／又は中枢神経系に影響を及ぼす血管疾患のために、未処置のファブリー病患者の平均余命は短縮され、通常４０〜５０代で死亡する。酵素欠乏は、血管内皮及び体全体の内臓組織における基質であるグロボトリアオシルセラミド（ＧＬ−３）の細胞内蓄積をもたらす。スフィンゴ糖脂質沈着に起因する腎機能の漸進的な悪化及び高窒素血症の発症は、通常、生後３０〜５０代で起こるが、２０代で早発する場合もある。腎臓の病変は、ヘミ接合性（男性）患者及びヘテロ接合性（女性）患者の両方に認められる。
【０００５】
心臓病は、ファブリー病の結果として、大部分の男性及び多くの女性において生じる。早期の心臓所見には、左心室拡張、弁膜症及び伝導異常が挙げられる。僧帽弁閉鎖不全は、小児期又は思春期に典型的に存在する最も頻繁な弁膜病変である。脳血管兆候は、主に多巣性小血管関与から生じ、これには、血栓症、一過性虚血発作、脳底動脈虚血及び動脈瘤、てんかん発作、片麻痺、片側感覚消失、失語症、迷路障害、又は脳出血が挙げられる。脳血管兆候の発症の平均年齢は３３．８歳である。性格の変化及び精神病的行動が、年齢の増加とともに現れる場合がある。
【０００６】
ファブリー病は一般的に皮膚症状を呈し、最も一般的には被角血管腫（体のあらゆる領域に存在し得る小さな丘疹）を呈する。被角血管腫は、直径が数ミリメートルまでの大きさの範囲の暗赤色又は紫色の皮膚病変として現れる。病変は通常、青年期又は若年成人期に現れ、年齢とともに増加し得る。その他の皮膚科及び軟部組織に関連する症状には、先端知覚異常、発汗異常（乏汗症及び多汗症）及びリンパ浮腫が含まれる。皮膚血管病変の存在及び程度は、全身性疾患の重症度と相関し得る。
【０００７】
皮膚症状に加えて、患者は、四肢の灼熱痛などの神経障害（先端感覚異常−多くの場合手及び足）を頻繁に経験する。患者はまた、四肢の痛みから始まり、内向きに広がる、数日間持続し得る疼痛発作を経験し得る。神経障害性疼痛は、体性感覚神経系の損傷によって引き起こされる疼痛である。皮膚、上皮組織、骨格筋、骨及び関節、内臓、並びに心血管系のものを含む、多くのタイプの感覚受容器が影響を受ける。
【０００８】
ファブリー病の現在承認されている処置法は、酵素補充療法（ＥＲＴ）である。ファブリー病の処置には、以下の２つのα−Ｇａｌ  Ａ製品：アガルシダーゼアルファ（リプレガル（登録商標）、Ｓｈｉｒｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ）及びアガルシダーゼベータ（ファブラザイム（登録商標）；Ｓａｎｏｆｉ  Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）が、現在入手可能である。ＥＲＴのこれらの２つの形態は、静脈内投与された組換え型の酵素により患者の不十分なα−Ｇａｌ  Ａ活性を補うことを意図している。ＥＲＴは、多くの場面で有効であるが、処置には限界もある。例えば、これら２つのα−Ｇａｌ  Ａ産物が脳卒中の十分なリスクを低下させることは証明されておらず、心筋は緩徐に処置に応答し、腎臓の細胞型の一部からのＧＬ−３排除は限定されたものである。
【０００９】
したがって、ファブリー病を処置することにつきさらなる改善の必要性が残っている。とりわけ、本発明は、既存のＥＲＴに対し改善された組換えヒトアルファ−ガラクトシダーゼＡ（ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ）、及び改善された酵素を薬理学的シャペロンと共に使用する必要のある患者を処置する方法を含む。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の一態様は、ヒト組換えα−ガラクトシダーゼＡ（ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ）に関する。
【００１１】
この態様の様々な実施形態において、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａは、配列番号１又は配列番号２と少なくとも９８％の配列同一性を有するタンパク質を含み、ここで、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａは、全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも２５％の、モノ−マンノース−６−リン酸（モノ−Ｍ６Ｐ）であるもの、及び全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも１２％の、ビス−マンノース−６−リン酸（ビス−Ｍ６Ｐ）であるものを有する。１つ以上の実施形態において、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａは、全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも２５％の、シアル酸を含有するものを有する。１つ以上の実施形態において、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａは、全Ｎ結合オリゴ糖のうち２０％未満の、中性であるものを有する。
【００１２】
この態様の様々な実施形態において、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａは、配列番号１又は配列番号２と少なくとも９８％の配列同一性を有するタンパク質を含み、ここで、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａは、全Ｎ結合オリゴ糖のうち１０％未満の、中性であるものを有する。１つ以上の実施形態において、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａは、全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも５０％の、シアル酸を含有するものを有する。１つ以上の実施形態において、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａは、全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも２５％の、モノ−Ｍ６Ｐであるもの、及び全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも６％の、ビス−Ｍ６Ｐであるものを有する。
【００１３】
１つ以上の実施形態において、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａは、
ａ．全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも１７％の、単一のシアル酸残基を含有するもの；
ｂ．全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも２０％の、２つのシアル酸残基を含有するもの；
ｃ．全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも４０％の、１つ又は２つのシアル酸残基を含有するもの；又は
ｄ．ｒｈα−Ｇａｌ  Ａホモダイマー１モルあたり少なくとも６モルのシアル酸残基
の１つ以上を有する。
【００１４】
１つ以上の実施形態において、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａは、
ａ．全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも１７％の、単一のシアル酸残基を含有するもの；
ｂ．全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも２０％の、２つのシアル酸残基を含有するもの；
ｃ．全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも４０％の、１つ又は２つのシアル酸残基を含有するもの；又は
ｄ．ｒｈα−Ｇａｌ  Ａホモダイマー１モルあたり少なくとも６モルのシアル酸残基
の２つ、３つ、又は４つを有する。
【００１５】
１つ以上の実施形態において、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａは、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａホモダイマー１モルあたり少なくとも７モルのシアル酸残基を有する。
【００１６】
１つ以上の実施形態において、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａは、全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも２２％の、２つのシアル酸残基を含有するものを有する。
【００１７】
１つ以上の実施形態において、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａは、全Ｎ結合オリゴ糖のうち少なくとも１４％の、ビス−マンノース−６−リン酸であるものを有する。
【００１８】
本発明の別の態様は、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａを含む組換えタンパク質産物の産生方法に関する。この態様の様々な実施形態において、方法は、配列番号１又は配列番号２と少なくとも９８％の配列同一性を有するタンパク質を含むｒｈα−Ｇａｌ  Ａを分泌する、バイオリアクター中で、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）宿主細胞を培養すること；バイオリアクターから培地を除去すること；前記培地を濾過して濾液を提供すること；濾液を陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）カラムに充填してｒｈα−Ｇａｌ  Ａを捕捉すること；及びＡＥＸカラムからｒｈα−Ｇａｌ  Ａを含む第１のタンパク質産物を溶出することを含む。１つ以上の実施形態において、第１のタンパク質産物は、最終タンパク質産物（例えば、ＥＲＴとしての使用に適したもの）になる前にさらなる処理及び／又は精製に供される中間タンパク質産物である。他の実施形態において、第１のタンパク質産物は最終的なタンパク質産物である。
【００１９】
本発明の別の態様は、本明細書に記載のプロセスによって作製された組換えタンパク質産物に関する。
【００２０】
本発明の別の態様は、それを必要とする患者に本明細書に記載のｒｈα−Ｇａｌ  Ａ又は本明細書に記載のｒｈα−Ｇａｌ  Ａを含む組換えタンパク質産物を投与する、ファブリー病の処置方法に関する。
【００２１】
本発明の別の態様は、薬学的に許容される担体及び本明細書に記載のｒｈα−Ｇａｌ  Ａ又は本明細書に記載のｒｈα−Ｇａｌ  Ａを含む組換えタンパク質産物を含む、医薬組成物に関する。１つ以上の実施形態において、医薬組成物は、約０．５〜約２０μＭのｒｈα−Ｇａｌ  Ａ及び約５０〜約２０，０００μＭのミガラスタト又はその塩を含む。１つ以上の実施形態において、医薬組成物は、約１〜約１０μＭのｒｈα−Ｇａｌ  Ａ及び約１００〜約１０，０００μＭのミガラスタト又はその塩を含む。１つ以上の実施形態において、ミガラスタト及びｒｈα−Ｇａｌ  Ａは、ミガラスタトのα−ガラクトシダーゼＡに対するモル比が約１３，０００：１〜約５０：１で存在する。
【００２２】
本発明の別の態様は、本明細書に記載の医薬組成物を投与することを含む、ファブリー病を処置する方法に関する。１つ以上の実施形態において、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａは、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
【００２３】
１つ以上の実施形態において、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ、又は組換えタンパク質産物を含む医薬組成物の投与の４時間以内に、患者にα−Ｇａｌ  Ａの薬理学的シャペロンを共投与する。１つ以上の実施形態において、薬理学的シャペロンは、ミガラスタト又はその塩を含む。
【００２４】
１つ以上の実施形態において、薬理学的シャペロンは経口投与され、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａを含有する医薬組成物は静脈内投与される。
【００２５】
１つ以上の実施形態において、薬理学的シャペロンは、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａと共製剤化される。１つ以上の実施形態において、ミガラスタト又はその塩は、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
【００２６】
１つ以上の実施形態において、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ（及び任意選択により、ミガラスタトなどの薬理学的シャペロン）を含む医薬組成物は、月に１回から週に１回投与される。１つ以上の実施形態において、医薬組成物は隔週で投与される。
【００２７】
本発明の別の態様は、本明細書に記載のｒｈα−Ｇａｌ  Ａ、及び任意選択によりミガラスタトなどの薬理学的シャペロンを含む、医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、ファブリー病を処置するための方法に関する。
【００２８】
１つ以上の実施形態において、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａを含む医薬組成物の投与の４時間以内に、患者にα−Ｇａｌ  Ａの薬理学的シャペロンを共投与する。
【００２９】
１つ以上の実施形態において、薬理学的シャペロンは経口投与され、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａを含有する医薬組成物は静脈内投与される。
【００３０】
１つ以上の実施形態において、ミガラスタト又はその塩は、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
【００３１】
１つ以上の実施形態において、医薬組成物は月に１回から週に１回投与される。
【００３２】
１つ以上の実施形態において、医薬組成物は隔週で投与される。
【００３３】
１つ以上の実施形態において、投与は、細胞を薬理学的シャペロンに結合したｒｈα−Ｇａｌ  Ａと接触させることである。
【００３４】
１つ以上の実施形態において、細胞は患者の心臓に位置する。
【００３５】
１つ以上の実施形態において、細胞は患者の腎臓に位置する。
【００３６】
１つ以上の実施形態において、細胞は患者の皮膚に位置する。
【００３７】
１つ以上の実施形態において、薬理学的シャペロンは、塩酸ミガラスタトである。
【００３８】
本発明の別の態様は、哺乳動物細胞のリソソームにおけるα−ガラクトシダーゼ−Ａタンパク質の活性レベルを増強する方法に関し、ここで、方法は、哺乳動物細胞を本明細書に記載のｒｈα−Ｇａｌ  Ａと接触させることを含み、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａは、任意選択により薬理学的シャペロンに結合している。
【００３９】
１つ以上の実施形態において、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａは、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
【００４０】
１つ以上の実施形態において、薬理学的シャペロンは、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａと共製剤化される。
【００４１】
１つ以上の実施形態において、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａを含む医薬組成物の投与の４時間以内に、患者にα−Ｇａｌ  Ａの薬理学的シャペロンを共投与する。
【００４２】
１つ以上の実施形態において、薬理学的シャペロンは経口投与され、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａを含有する医薬組成物は静脈内投与される。
【００４３】
１つ以上の実施形態において、ミガラスタト又はその塩は、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
【００４４】
１つ以上の実施形態において、医薬組成物は月に１回から週に１回投与される。
【００４５】
１つ以上の実施形態において、医薬組成物は隔週で投与される。
【００４６】
１つ以上の実施形態において、細胞は心臓細胞である。
【００４７】
１つ以上の実施形態において、細胞は腎細胞である。
【００４８】
１つ以上の実施形態において、細胞は皮膚細胞である。
【００４９】
１つ以上の実施形態において、接触は、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ及び薬理学的シャペロンの投与により実施される。
【００５０】
１つ以上の実施形態において、投与は、薬理学的シャペロン及びｒｈα−Ｇａｌ  Ａの両方の全身投与である。
【００５１】
１つ以上の実施形態において、薬理学的シャペロン及びｒｈα−Ｇａｌ  Ａの両方が共投与される。
【００５２】
１つ以上の実施形態において、薬理学的シャペロン及びｒｈα−Ｇａｌ  Ａは、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内、皮下、又は腹腔内投与用に製剤化された組成物中に存在する。
【００５３】
１つ以上の実施形態において、組成物は静脈内投与用に製剤化される。
【００５４】
１つ以上の実施形態において、薬理学的シャペロンは、ミガラスタト又はその塩である。
【００５５】
１つ以上の実施形態において、医薬組成物は、約０．５から約２０μＭのｒｈα−Ｇａｌ  Ａ；及び約５０〜約２０，０００μＭのミガラスタト又はその塩を含む。
【００５６】
１つ以上の実施形態において、医薬組成物は、約１〜約１０μＭのｒｈα−Ｇａｌ  Ａ；及び約１００〜約１０，０００μＭのミガラスタト又はその塩を含む。
【００５７】
１つ以上の実施形態において、ミガラスタト又はその塩のα−ガラクトシダーゼＡに対する比は、約１３，０００：１〜約５０：１である。
【００５８】
１つ以上の実施形態において、細胞はインビトロにある。
【００５９】
１つ以上の実施形態において、細胞はヒト細胞である。
【００６０】
１つ以上の実施形態において、細胞は対象内にある。
【００６１】
１つ以上の実施形態において、対象は必要としている患者である。
【００６２】
１つ以上の実施形態において、細胞は対象の心臓、腎臓又は皮膚に位置する。
【００６３】
１つ以上の実施形態において、細胞は対象の心臓に位置する。
【００６４】
１つ以上の実施形態において、細胞は対象の腎臓に位置する。
【００６５】
１つ以上の実施形態において、細胞は対象の皮膚に位置する。
【００６６】
１つ以上の実施形態において、患者はファブリー病を有すると診断されている。
【００６７】
本発明の別の態様は、必要とする患者の臓器におけるＧＬ−３のレベルを低下させる方法に関し、方法は、治療有効量の（ｉ）薬理学的シャペロン及び（ｉｉ）本明細書に記載のｒｈα−Ｇａｌ  Ａを含む組成物を患者に投与することを含む。
【００６８】
１つ以上の実施形態において、投与は共投与により実施される。
【００６９】
１つ以上の実施形態において、投与は、薬理学的シャペロン及びｒｈα−Ｇａｌ  Ａの両方の全身投与である。
【００７０】
１つ以上の実施形態において、組成物は、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内、皮下、又は腹腔内投与用に製剤化される。
【００７１】
１つ以上の実施形態において、組成物は静脈内投与用に製剤化される。
【００７２】
１つ以上の実施形態において、薬理学的シャペロンは、ミガラスタト又はその塩である。
【００７３】
１つ以上の実施形態において、医薬組成物は約０．５から約２０μＭのｒｈα−Ｇａｌ  Ａ；及び約５０〜約２０，０００μＭのミガラスタト又はその塩を含む。
【００７４】
１つ以上の実施形態において、医薬組成物は約１〜約１０μＭのｒｈα−Ｇａｌ  Ａ；及び約１００〜約１０，０００μＭのミガラスタト又はその塩を含む。
【００７５】
１つ以上の実施形態において、ミガラスタト又はその塩のα−ガラクトシダーゼＡに対する比は、約１３，０００：１〜約５０：１である。
【００７６】
１つ以上の実施形態において、臓器は心臓、腎臓又は皮膚である。
【００７７】
１つ以上の実施形態において、臓器は心臓である。
【００７８】
１つ以上の実施形態において、臓器は腎臓である。
【００７９】
１つ以上の実施形態において、臓器は皮膚である。
【００８０】
１つ以上の実施形態において、対象は、ファブリー病を有すると診断されている。
【００８１】
本発明の別の態様は、ファブリー病を処置する方法に関し、方法は、哺乳動物細胞を有効量のｒｈα−Ｇａｌ  Ａと接触させることを含み、ここで、細胞をｒｈα−Ｇａｌ  Ａと接触させることは、ファブラザイム（アガルシダーゼベータ）と接触させることよりも大きいＧＬ−３の減少をもたらす。
【００８２】
１つ以上の実施形態において、接触は、対象に有効量のｒｈα−Ｇａｌ  Ａを投与することである。
【００８３】
１つ以上の実施形態において、細胞は対象内にある。
【００８４】
１つ以上の実施形態において、対象は必要としている患者である。
【００８５】
１つ以上の実施形態において、ＧＬ−３の減少は心臓組織において測定される。
【００８６】
１つ以上の実施形態において、ＧＬ−３の減少は腎臓組織において測定される。
【００８７】
１つ以上の実施形態において、ＧＬ−３の減少は皮膚組織において測定される。
【００８８】
１つ以上の実施形態において、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａは薬理学的シャペロンに結合している。
【００８９】
１つ以上の実施形態において、薬理学的シャペロンは、ミガラスタト又はその塩である。
【００９０】
１つ以上の実施形態において、ミガラスタト又はその塩は、３ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
【００９１】
１つ以上の実施形態において、ミガラスタト又はその塩は、１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
【００９２】
１つ以上の実施形態において、ミガラスタト又はその塩は、３０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
【００９３】
１つ以上の実施形態において、ミガラスタト又はその塩は、３００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
【００９４】
１つ以上の実施形態において、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ及び薬理学的シャペロンは共投与される。
【００９５】
１つ以上の実施形態において、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ及び薬理学的シャペロンは共製剤化される。
【００９６】
１つ以上の実施形態において、１ｍｇ／ｋｇのｒｈα−Ｇａｌ  Ａの用量は、１ｍｇ／ｋｇの用量でのＧｌａノックアウトマウスへのファブラザイム（アガルシダーゼベータ）の投与よりも大きなＧＬ−３の減少をもたらす。
【００９７】
１つ以上の実施形態において、１０ｍｇ／ｋｇのｒｈα−Ｇａｌ  Ａの用量は、１０ｍｇ／ｋｇの用量でのＧｌａノックアウトマウスへのファブラザイム（アガルシダーゼベータ）の投与よりも大きなＧＬ−３の減少をもたらす。
【００９８】
１つ以上の実施形態において、Ｇｌａノックアウトマウスへの医薬組成物の投与後のＧＬ−３の減少は、ファブラザイム（アガルシダーゼベータ）の投与後のＧＬ−３の減少よりも少なくとも１０％大きい。
【００９９】
１つ以上の実施形態において、Ｇｌａノックアウトマウスへの医薬組成物の投与後のＧＬ−３の減少は、ファブラザイム（アガルシダーゼベータ）の投与後のＧＬ−３の減少よりも少なくとも２０％大きい。
【０１００】
本発明の別の態様は、ファブリー病を処置する方法に関し、方法は、哺乳動物細胞を有効量のｒｈα−Ｇａｌ  Ａと接触させることを含み、ここで、細胞をｒｈα−Ｇａｌ  Ａと接触させることは、ファブラザイム（アガルシダーゼベータ）と接触させることよりも大きい血漿ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の減少をもたらす。
【０１０１】
１つ以上の実施形態において、接触は、対象に有効量のｒｈα−Ｇａｌ  Ａを投与することである。
【０１０２】
１つ以上の実施形態において、細胞は対象内にある。
【０１０３】
１つ以上の実施形態において、対象は必要としている患者である。
【０１０４】
１つ以上の実施形態において、血漿ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の減少は心臓組織において測定される。
【０１０５】
１つ以上の実施形態において、血漿ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の減少は腎臓組織において測定される。
【０１０６】
１つ以上の実施形態において、血漿ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の減少は皮膚組織において測定される。
【０１０７】
１つ以上の実施形態において、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａは薬理学的シャペロンに結合している。
【０１０８】
１つ以上の実施形態において、薬理学的シャペロンは、ミガラスタト又はその塩である。
【０１０９】
１つ以上の実施形態において、ミガラスタト又はその塩は、３ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
【０１１０】
１つ以上の実施形態において、ミガラスタト又はその塩は、１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
【０１１１】
１つ以上の実施形態において、ミガラスタト又はその塩は、３０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
【０１１２】
１つ以上の実施形態において、ミガラスタト又はその塩は、３００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
【０１１３】
１つ以上の実施形態において、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ及び薬理学的シャペロンは共投与される。
【０１１４】
１つ以上の実施形態において、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ及び薬理学的シャペロンは共製剤化される。
【０１１５】
１つ以上の実施形態において、１ｍｇ／ｋｇのｒｈα−Ｇａｌ  Ａの用量は、１ｍｇ／ｋｇの用量でのＧｌａノックアウトマウスへのファブラザイム（アガルシダーゼベータ）の投与よりも大きな血漿ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の減少をもたらす。
【０１１６】
１つ以上の実施形態において、１０ｍｇ／ｋｇのｒｈα−Ｇａｌ  Ａの用量は、１つ以上の実施形態における用量でのＧｌａノックアウトマウスへのファブラザイム（アガルシダーゼベータ）の投与よりも大きな血漿ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の減少をもたらし、Ｇｌａノックアウトマウスへの医薬組成物の投与後の血漿ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の減少は、ファブラザイム（アガルシダーゼベータ）の投与後の血漿ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の減少よりも少なくとも１０％大きい。
【０１１７】
１つ以上の実施形態において、Ｇｌａノックアウトマウスへの医薬組成物の投与後の血漿ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の減少は、ファブラザイム（アガルシダーゼベータ）の投与後の血漿ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の減少よりも少なくとも２０％大きい。
【０１１８】
本発明の別の態様は、ファブリー病を処置する方法に関し、方法は、哺乳動物細胞を有効量のｒｈα−Ｇａｌ  Ａと接触させることを含み、ここで、細胞をｒｈα−Ｇａｌ  Ａと接触させることは、ファブラザイム（アガルシダーゼベータ）と接触させることよりも大きい１つ以上の基質の減少をもたらす。
【０１１９】
１つ以上の実施形態において、１つ以上の基質は、ＧＬ−３又は血漿ｌｙｓｏ−Ｇｂ３を含む。
【０１２０】
１つ以上の実施形態において、１つ以上の基質はＧＬ−３である。
【０１２１】
１つ以上の実施形態において、１つ以上の基質は血漿ｌｙｓｏ−Ｇｂ３である。
【０１２２】
１つ以上の実施形態において、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａは薬理学的シャペロンに結合している。
【０１２３】
１つ以上の実施形態において、薬理学的シャペロンは、ミガラスタト又はその塩である。
【０１２４】
１つ以上の実施形態において、ミガラスタト又はその塩は、３ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
【０１２５】
１つ以上の実施形態において、ミガラスタト又はその塩は、１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
【０１２６】
１つ以上の実施形態において、ミガラスタト又はその塩は、３０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
【０１２７】
１つ以上の実施形態において、ミガラスタト又はその塩は、３００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
【０１２８】
本発明のさらなる特徴は、以下の明細書記載及び添付図面から明らかになる：
【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１Ａ】非リン酸化高マンノースグリカン、モノＭ６Ｐグリカン、及びビスＭ６Ｐグリカンを示す。
【図１Ｂ】Ｍ６Ｐ基の化学構造を示す。
【図２Ａ−２Ｂ】図２Ａは、Ｍ６Ｐを有するグリカンを介した、標的組織へのｒｈα−Ｇａｌ  Ａの生産的標的化を示す。図２Ｂは、非標的組織（例えば、肝臓及び脾臓）への、又は非標的組織への非Ｍ６Ｐグリカンの結合による、非生産的な薬物クリアランスを示す。
【図３】懸濁ＣＨＯ−Ｋ１培養物のトランスフェクションに使用される二重発現ベクターを示す。
【図４】ｒｈα−Ｇａｌ  Ａを発現するプラスミドで形質転換されたＣＨＯ細胞プールからの生細胞の密度を示す。
【図５】各細胞プールによって経時的に産生される酵素活性の程度を示す。
【図６Ａ】１５〜１７日目の各細胞プール培養物上清中のＣＩＭＰＲ結合ｒｈα−Ｇａｌ  Ａの程度を示す。
【図６Ｂ】１５〜１７日目の各細胞プール培養物上清中のＣＩＭＰＲ結合ｒｈα−Ｇａｌ  Ａの程度を示す。
【図６Ｃ】１５〜１７日目の各細胞プール培養物上清中のＣＩＭＰＲ結合ｒｈα−Ｇａｌ  Ａの程度を示す。
【図６Ｄ】１５〜１７日目の各細胞プール培養物上清中のＣＩＭＰＲ結合ｒｈα−Ｇａｌ  Ａの程度を示す。
【図６Ｅ】１５〜１７日目の各細胞プール培養物上清中のＣＩＭＰＲ結合ｒｈα−Ｇａｌ  Ａの程度を示す。
【図６Ｆ】１５〜１７日目の各細胞プール培養物上清中のＣＩＭＰＲ結合ｒｈα−Ｇａｌ  Ａの程度を示す。
【図７Ａ】異なる細胞株及び異なる増殖条件のファブラザイム及びｒｈα−Ｇａｌ  ＡのＣＩＭＰＲプロファイルを示す。
【図７Ｂ】異なる細胞株及び異なる増殖条件のファブラザイム及びｒｈα−Ｇａｌ  ＡのＣＩＭＰＲプロファイルを示す。
【図７Ｃ】異なる細胞株及び異なる増殖条件のファブラザイム及びｒｈα−Ｇａｌ  ＡのＣＩＭＰＲプロファイルを示す。
【図７Ｄ】異なる細胞株及び異なる増殖条件のファブラザイム及びｒｈα−Ｇａｌ  ＡのＣＩＭＰＲプロファイルを示す。
【図７Ｅ】異なる細胞株及び異なる増殖条件のファブラザイム及びｒｈα−Ｇａｌ  ＡのＣＩＭＰＲプロファイルを示す。
【図７Ｆ】異なる細胞株及び異なる増殖条件のファブラザイム及びｒｈα−Ｇａｌ  ＡのＣＩＭＰＲプロファイルを示す。
【図８Ａ】ミガラスタトの存在下でのｒｈα−Ｇａｌ  Ａの熱安定性の増加を示す。
【図８Ｂ】ミガラスタトの存在下でのｒｈα−Ｇａｌ  Ａの熱安定性の増加を示す。
【図９】ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析したＰＮＧａｓｅによるグリコシル化除去の程度を示す。
【図１０Ａ】異なる細胞株及び異なる増殖条件のファブラザイム及びｒｈα−Ｇａｌ  Ａのグリカン分析を示す。
【図１０Ｂ】異なる細胞株及び異なる増殖条件のファブラザイム及びｒｈα−Ｇａｌ  Ａのグリカン分析を示す。
【図１０Ｃ】異なる細胞株及び異なる増殖条件のファブラザイム及びｒｈα−Ｇａｌ  Ａのグリカン分析を示す。
【図１０Ｄ】異なる細胞株及び異なる増殖条件のファブラザイム及びｒｈα−Ｇａｌ  Ａのグリカン分析を示す。
【図１０Ｅ】異なる細胞株及び異なる増殖条件のファブラザイム及びｒｈα−Ｇａｌ  Ａのグリカン分析を示す。
【図１０Ｆ】異なる細胞株及び異なる増殖条件のファブラザイム及びｒｈα−Ｇａｌ  Ａのグリカン分析を示す。
【図１１】異なる細胞株及び異なる増殖条件のファブラザイム及びｒｈα−Ｇａｌ  Ａのグリカン比較を示す。
【図１２】ミガラスタトの存在下及び非存在下でのファブラザイム及びｒｈα−Ｇａｌ  Ａの２つのクローンの薬物動態を示す。
【図１３Ａ】ミガラスタトを伴う又は伴わない様々なＥＲＴの単回投与の１日後のＧｌａ  ＫＯマウス心臓（１３Ａ）、腎臓（１３Ｂ）及び皮膚（１３Ｃ）におけるα−Ｇａｌ  Ａ活性を示す。
【図１３Ｂ】ミガラスタトを伴う又は伴わない様々なＥＲＴの単回投与の１日後のＧｌａ  ＫＯマウス心臓（１３Ａ）、腎臓（１３Ｂ）及び皮膚（１３Ｃ）におけるα−Ｇａｌ  Ａ活性を示す。
【図１３Ｃ】ミガラスタトを伴う又は伴わない様々なＥＲＴの単回投与の１日後のＧｌａ  ＫＯマウス心臓（１３Ａ）、腎臓（１３Ｂ）及び皮膚（１３Ｃ）におけるα−Ｇａｌ  Ａ活性を示す。
【図１４Ａ】ミガラスタトを伴う又は伴わない様々なＥＲＴの単回投与の７日後のＧｌａ  ＫＯマウス心臓（１４Ａ）、腎臓（１４Ｂ）、皮膚（１４Ｃ）及び肝臓（１４Ｄ）におけるα−Ｇａｌ  Ａ活性を示す。
【図１４Ｂ】ミガラスタトを伴う又は伴わない様々なＥＲＴの単回投与の７日後のＧｌａ  ＫＯマウス心臓（１４Ａ）、腎臓（１４Ｂ）、皮膚（１４Ｃ）及び肝臓（１４Ｄ）におけるα−Ｇａｌ  Ａ活性を示す。
【図１４Ｃ】ミガラスタトを伴う又は伴わない様々なＥＲＴの単回投与の７日後のＧｌａ  ＫＯマウス心臓（１４Ａ）、腎臓（１４Ｂ）、皮膚（１４Ｃ）及び肝臓（１４Ｄ）におけるα−Ｇａｌ  Ａ活性を示す。
【図１４Ｄ】ミガラスタトを伴う又は伴わない様々なＥＲＴの単回投与の７日後のＧｌａ  ＫＯマウス心臓（１４Ａ）、腎臓（１４Ｂ）、皮膚（１４Ｃ）及び肝臓（１４Ｄ）におけるα−Ｇａｌ  Ａ活性を示す。
【図１５Ａ】ミガラスタトを伴う又は伴わない様々なＥＲＴの単回投与後のＧｌａ  ＫＯマウス心臓（１５Ａ）、腎臓（１５Ｂ）、及び皮膚（１５Ｃ）及び血漿ｌｙｓｏＧｂ３（１５Ｄ）におけるＧＬ−３レベルを示す。
【図１５Ｂ】ミガラスタトを伴う又は伴わない様々なＥＲＴの単回投与後のＧｌａ  ＫＯマウス心臓（１５Ａ）、腎臓（１５Ｂ）、及び皮膚（１５Ｃ）及び血漿ｌｙｓｏＧｂ３（１５Ｄ）におけるＧＬ−３レベルを示す。
【図１５Ｃ】ミガラスタトを伴う又は伴わない様々なＥＲＴの単回投与後のＧｌａ  ＫＯマウス心臓（１５Ａ）、腎臓（１５Ｂ）、及び皮膚（１５Ｃ）及び血漿ｌｙｓｏＧｂ３（１５Ｄ）におけるＧＬ−３レベルを示す。
【図１５Ｄ】ミガラスタトを伴う又は伴わない様々なＥＲＴの単回投与後のＧｌａ  ＫＯマウス心臓（１５Ａ）、腎臓（１５Ｂ）、及び皮膚（１５Ｃ）及び血漿ｌｙｓｏＧｂ３（１５Ｄ）におけるＧＬ−３レベルを示す。
【図１６Ａ】ファブラザイム及び異なるプロセスで産生されたｒｈα−Ｇａｌ  Ａの薬物動態を示す。
【図１６Ｂ】ファブラザイム及び異なるプロセスで産生されたｒｈα−Ｇａｌ  Ａの薬物動態を示す。
【図１７Ａ】ミガラスタトを伴う又は伴わない様々なＥＲＴの単回投与後のＧｌａ  ＫＯマウス心臓（１７Ａ）及び腎臓（１７Ｂ）におけるＧＬ−３レベルを示す。
【図１７Ｂ】ミガラスタトを伴う又は伴わない様々なＥＲＴの単回投与後のＧｌａ  ＫＯマウス心臓（１７Ａ）及び腎臓（１７Ｂ）におけるＧＬ−３レベルを示す。
【図１８Ａ】ミガラスタトを伴う及び伴わない様々な用量でのファブラザイム及びｒｈα−Ｇａｌ  Ａの薬物動態を示す。
【図１８Ｂ】ミガラスタトを伴う及び伴わない様々な用量でのファブラザイム及びｒｈα−Ｇａｌ  Ａの薬物動態を示す。
【図１８Ｃ】ミガラスタトを伴う及び伴わない様々な用量でのファブラザイム及びｒｈα−Ｇａｌ  Ａの薬物動態を示す。
【図１８Ｄ】ミガラスタトを伴う及び伴わない様々な用量でのファブラザイム及びｒｈα−Ｇａｌ  Ａの薬物動態を示す。
【図１８Ｅ】ミガラスタトを伴う及び伴わない様々な用量でのファブラザイム及びｒｈα−Ｇａｌ  Ａの薬物動態を示す。
【図１８Ｆ】ミガラスタトを伴う及び伴わない様々な用量でのファブラザイム及びｒｈα−Ｇａｌ  Ａの薬物動態を示す。
【図１９Ａ】ミガラスタトを伴う又は伴わない様々なＥＲＴの反復投与後のＧｌａ  ＫＯマウス心臓（１９Ａ）、腎臓（１９Ｂ）、及び皮膚（１９Ｃ）及び血漿ｌｙｓｏＧｂ３（１９Ｄ）におけるＧＬ−３レベルを示す。
【図１９Ｂ】ミガラスタトを伴う又は伴わない様々なＥＲＴの反復投与後のＧｌａ  ＫＯマウス心臓（１９Ａ）、腎臓（１９Ｂ）、及び皮膚（１９Ｃ）及び血漿ｌｙｓｏＧｂ３（１９Ｄ）におけるＧＬ−３レベルを示す。
【図１９Ｃ】ミガラスタトを伴う又は伴わない様々なＥＲＴの反復投与後のＧｌａ  ＫＯマウス心臓（１９Ａ）、腎臓（１９Ｂ）、及び皮膚（１９Ｃ）及び血漿ｌｙｓｏＧｂ３（１９Ｄ）におけるＧＬ−３レベルを示す。
【図１９Ｄ】ミガラスタトを伴う又は伴わない様々なＥＲＴの反復投与後のＧｌａ  ＫＯマウス心臓（１９Ａ）、腎臓（１９Ｂ）、及び皮膚（１９Ｃ）及び血漿ｌｙｓｏＧｂ３（１９Ｄ）におけるＧＬ−３レベルを示す。
【図２０Ａ】ミガラスタトを伴う又は伴わない様々なＥＲＴの反復投与後のＧｌａ  ＫＯマウス心臓（２０Ａ）、腎臓（２０Ｂ）及び皮膚（２０Ｃ）におけるα−Ｇａｌ  Ａ活性を示す。
【図２０Ｂ】ミガラスタトを伴う又は伴わない様々なＥＲＴの反復投与後のＧｌａ  ＫＯマウス心臓（２０Ａ）、腎臓（２０Ｂ）及び皮膚（２０Ｃ）におけるα−Ｇａｌ  Ａ活性を示す。
【図２０Ｃ】ミガラスタトを伴う又は伴わない様々なＥＲＴの反復投与後のＧｌａ  ＫＯマウス心臓（２０Ａ）、腎臓（２０Ｂ）及び皮膚（２０Ｃ）におけるα−Ｇａｌ  Ａ活性を示す。
【図２１Ａ】ミガラスタトを伴う又は伴わない様々なＥＲＴの単回投与後のＧｌａ  ＫＯマウス心臓（２１Ａ）、腎臓（２１Ｂ）、皮膚（２１Ｃ）及び血漿ｌｙｓｏＧｂ３（２１Ｄ）におけるＧＬ−３レベルを示す。
【図２１Ｂ】ミガラスタトを伴う又は伴わない様々なＥＲＴの単回投与後のＧｌａ  ＫＯマウス心臓（２１Ａ）、腎臓（２１Ｂ）、皮膚（２１Ｃ）及び血漿ｌｙｓｏＧｂ３（２１Ｄ）におけるＧＬ−３レベルを示す。
【図２１Ｃ】ミガラスタトを伴う又は伴わない様々なＥＲＴの単回投与後のＧｌａ  ＫＯマウス心臓（２１Ａ）、腎臓（２１Ｂ）、皮膚（２１Ｃ）及び血漿ｌｙｓｏＧｂ３（２１Ｄ）におけるＧＬ−３レベルを示す。
【図２１Ｄ】ミガラスタトを伴う又は伴わない様々なＥＲＴの単回投与後のＧｌａ  ＫＯマウス心臓（２１Ａ）、腎臓（２１Ｂ）、皮膚（２１Ｃ）及び血漿ｌｙｓｏＧｂ３（２１Ｄ）におけるＧＬ−３レベルを示す。
【図２２】ヒト対象におけるミガラスタトの静脈内投与の試験のための単回投与コホート設計を示す。
【図２３】ヒト対象におけるミガラスタトの静脈内及び経口投与の試験のためのコホートクロスオーバー設計を示す。
【図２４Ａ】ヒト対象におけるミガラスタト静脈内投与の薬物動態プロファイルを示す。
【図２４Ｂ】ヒト対象におけるミガラスタト静脈内投与の薬物動態プロファイルを示す。
【図２５Ａ】ミガラスタトの静脈内及び経口投与の薬物動態プロファイルの比較を示す。
【図２５Ｂ】ミガラスタトの静脈内及び経口投与の薬物動態プロファイルの比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１３０】
本発明のいくつかの例示的な実施形態を説明する前に、本発明は、以下の説明に記載された構成又はプロセスステップの詳細には限定されないことを理解されたい。本発明は、他の実施形態が可能であり、様々な方法で実施又は実行することができる。
【０１３１】
本発明の様々な態様は、新規組換えヒトα−ガラクトシダーゼＡ（ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ）に関する。本発明の他の態様は、本明細書に記載のプロセスによって産生される組換えタンパク質、並びに医薬組成物、処置方法、及びそのような組換えタンパク質の使用に関する。
【０１３２】
定義
本明細書で使用される用語は、一般に、本発明に関連して且つ各用語が使用される具体的な文脈において、当該技術分野における通常の意味を有する。当業者に追加的な指針を提供するために、特定の用語について以下又は本明細書の他の箇所で説明する。
【０１３３】
本明細書では、文言の説明又は必要な示唆のために、文脈が他に要する場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という単語、又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」又は「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、包括的な意味、すなわち、述べられた特徴の存在を特定するために使用され、本発明の様々な実施形態におけるさらなる特徴の存在又は追加を排除するものではない。
【０１３４】
本明細書で使用される場合、用語「ファブリー病」（アルファ−ガラクトシダーゼＡ欠乏症；アンダーソン・ファブリー病；広汎性体幹被角血管腫；広汎性被角血管腫；セラミドトリヘキソシダーゼ欠乏症；ＧＬＡ欠乏症及び遺伝性異所脂質蓄積症とも称される）は、ヒトアルファ−ガラクトシダーゼＡをコードするＧｌａ遺伝子の突然変異を特徴とする、遺伝的リソソーム蓄積症を指すことが意図される。この用語には、乳児、若年、成人の患者が経験する疾患の全てのステージ及び形態が含まれる。
【０１３５】
本明細書で使用される場合、用語「アルファ−ガラクトシダーゼＡ」（α−Ｇａｌ  Ａ；アルファ−ガラクトシダーゼのＥ．Ｃ．３．２．１．２２ファミリーとしても知られる）は、リソソーム中のアルファ−ガラクトシドを分解するリソソーム酵素を指すことが意図される。ヒトα−ガラクトシダーゼは、糖脂質及び糖タンパク質からの末端アルファ−ガラクトシル部分を加水分解するホモダイマー糖タンパク質である。酵素は主にグロボトリアオシルセラミド（「ＧＬ−３」、Ｇｂ３又はセラミドトリヘキソシドとしても知られる）を加水分解し、メリビオースのガラクトース及びグルコースへの加水分解を触媒することができる。酵素の別の基質は、血漿グロボトリアオシルスフィンゴシン（「血漿ｌｙｓｏ−Ｇｂ３」）である。遺伝子における様々な突然変異は、アルファ−Ｄ−ガラクトシル糖脂質部分の異化の失敗の結果としてファブリー病を引き起こす酵素の合成、処理、及び安定性に影響する。α−ガラクトシダーゼＡは、多糖類、糖脂質、及び糖ペプチドからの末端α−ガラクトース残基の除去を触媒する。Ｇｌａ遺伝子（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）Ｇｅｎｅ  ＩＤ  ２７１７）は、ヒトアルファ−ガラクトシダーゼＡをコードし、２２位にあるＸ染色体の長腕にマッピングされている。本明細書で使用される場合、略語「α−Ｇａｌ  Ａ」は、α−ガラクトシダーゼＡ酵素を指すことが意図される。イタリック体の「Ｇｌａ」は、ヒトα−Ｇａｌ  Ａをコードするヒト遺伝子を指すことが意図される。略語ｒｈα−Ｇａｌ  Ａは、組換えヒトα−Ｇａｌ  Ａを指すことが意図される。現在、ファブリー病患者において、４００を超える突然変異が同定されている。突然変異の最も一般的な形態は、酵素における単一アミノ酸変化につながる。他のタイプの突然変異は、欠失、挿入、未熟停止コドン、フレームシフト突然変異、及びスプライス部位突然変異を含む。
【０１３６】
用語「アガルシダーゼベータ」は、Ｇｅｎｚｙｍｅからファブラザイム（登録商標）という名前で市販されているホモダイマー組換えヒトα−Ｇａｌ  Ａを指すことが意図される。ファブラザイム（アガルシダーゼベータ）はおよそ１００ｋＤａ分子量を有し、推奨用量は１．０ｍｇ／ｋｇ体重であり、２週間ごとにＩＶ注入される。初期注入速度は、０．２５ｍｇ／ｍｉｎ（１５ｍｇ／ｈｒ）以下であることが推奨される。ファブラザイム（アガルシダーゼベータ）に対する輸注反応は、その一部は重度であり、ファブリー病患者において発生している。輸注反応には、発熱、硬直、胸部絞扼感、高血圧、低血圧、掻痒症、筋肉痛、呼吸困難、蕁麻疹、腹痛、及び頭痛が含まれる。患者は注入前に解熱剤を投与されることが推奨される。
【０１３７】
用語「アガルシダーゼアルファ」は、Ｓｈｉｒｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  Ｉｎｃ．からリプレガル（登録商標）という名前で市販されているホモダイマー組換えヒトα−Ｇａｌ  Ａを指すことが意図される。リプレガル（アガルシダーゼアルファ）は、およそ１００ｋＤａのホモダイマーであり、各サブユニットは野生型ヒトα−Ｇａｌ  Ａと同一のアミノ酸配列を有する３９８アミノ酸残基を含有する。リプレガルの推奨用量は、静脈内注入により隔週で０．２ｍｇ／ｋｇである。
【０１３８】
用語「ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ」は、本明細書に記載され、以下の実施例に例示されるような、組換えヒトアルファ−ガラクトシダーゼＡを指すことが意図される。
【０１３９】
本明細書で使用される場合、用語「グリカン」又は「オリゴ糖」は、タンパク質又はポリペプチド上のアミノ酸残基に共有結合した多糖類鎖を指すことが意図される。本明細書で使用される場合、用語「Ｎ−グリカン」、「Ｎ−オリゴ糖」、「Ｎ−結合グリカン」又は「Ｎ−結合オリゴ糖」は、アミノ酸残基の窒素原子に共有結合によってタンパク質又はポリペプチド上のアミノ酸残基に結合した多糖類鎖を指すことが意図される。例えば、Ｎ−グリカンは、アスパラギン残基の側鎖窒素原子に共有結合し得る。グリカンは、１個又は数個の単糖単位を含み得、単糖単位は共有結合して直鎖又は分枝鎖を形成し得る。少なくとも１つの実施形態において、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａに結合したＮ−グリカン単位は、Ｎ−アセチルグルコサミン、マンノース、ガラクトース又はシアル酸からそれぞれ独立して選択される１つ以上の単糖単位を含み得る。タンパク質上のＮ−グリカン単位は、質量分析などの任意の適切な分析技術によって決定し得る。いくつかの実施形態において、Ｎ−グリカン単位は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｖｅｌｏｓ  Ｐｒｏ（商標）質量分析計、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｌｕｍｏｓ  Ｔｒｉｂｉｄ（商標）質量分析計又はＷａｔｅｒｓＸｅｖｏ（登録商標）Ｇ２−ＸＳ  ＱＴｏｆ質量分析計などの機器を利用する液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によって決定され得る。
【０１４０】
本明細書で使用される場合、用語「高マンノースＮ−グリカン」は、１〜６個又はそれを超えるマンノース単位を有するＮ−グリカンを指すことが意図される。少なくとも１つの実施形態において、高マンノースＮ−グリカン単位は、アスパラギン残基に結合したビス（Ｎ−アセチルグルコサミン）鎖を含有し、さらに分枝状ポリマンノース鎖に結合し得る。本明細書で交換可能に使用される場合、用語「Ｍ６Ｐ」又は「マンノース−６−リン酸」は、６位がリン酸化された、すなわち、６位のヒドロキシル基に結合したリン酸基を有する、マンノース単位を指すことが意図される。少なくとも１つの実施形態において、１つ以上のＮ−グリカン単位の１つ以上のマンノース単位が６位でリン酸化されて、マンノース−６−リン酸単位を形成する。少なくとも１つの実施形態において、用語「Ｍ６Ｐ」又は「マンノース−６−リン酸」は、リン酸基上に「キャップ」としてＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を有するマンノースホスホジエステル、及びＧｌｃＮＡｃキャップを欠く露出したリン酸基を有するマンノース単位の両方を指す。少なくとも１つの実施形態において、タンパク質のＮ−グリカンは、ＧｌｃＮＡｃキャップを有する少なくとも１つのＭ６Ｐ基及びＧｌｃＮＡｃキャップを欠く少なくとも１つの他のＭ６Ｐ基を有する複数のＭ６Ｐ基を有し得る。
【０１４１】
本明細書で使用される場合、用語「複合Ｎ−グリカン」は、１つ以上のＮ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、フコース及び／又はシアル酸単位を含むＮ−グリカンを指すことが意図される。少なくとも１つの実施形態において、複合Ｎ−グリカンは、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、フコース及びシアル酸からそれぞれ独立して選択される１つ以上の単糖単位に、１つ又はマンノース単位がさらに結合した高マンノースＮ−グリカンであり得る。
【０１４２】
本明細書で使用される化合物ミガラスタトは、１−デオキシガラクトノジリマイシン（１−ＤＧＪ）、（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ０−２−（ヒドロキシメチル）ピペリジン−３，４，５−トリオールとしても知られ、以下の化学式を有する：
2020503900.tif 000003
【０１４３】
後述するように、ミガラスタトの薬学的に許容される塩も本発明において使用し得る。ミガラスタトの塩を使用する場合、塩の用量は、患者が受けたミガラスタトの用量がミガラスタトの遊離塩基が使用された場合に受けるであろう用量に等しくなるように調整される。ミガラスタトの薬学的に許容される塩の一例は、ミガラスタトＨＣｌ：
2020503900.tif 000004
である。
【０１４４】
用語「ミガラスタト」は、特に反対の指示がない限り、ミガラスタト遊離塩基又はその薬学的に許容される塩（例えば、上記のミガラスタトＨＣｌ）を包含する。
【０１４５】
本明細書で使用される場合、用語「薬理学的シャペロン」又は場合により単に用語「シャペロン」は、α−Ｇａｌ  Ａに特異的に結合し、以下の効果の１つ以上を有するものを指すことが意図される：タンパク質の安定した分子立体構造の形成を促進する；タンパク質の小胞体関連分解を防止するために、小胞体から別の細胞位置、好ましくは天然の細胞位置へのタンパク質の適切な輸送を促進する；構造的に不安定なタンパク質又はミスフォールドタンパク質の凝集を防止する；タンパク質の少なくとも一部の野生型機能、安定性及び／又は活性を回復及び／又は向上させる；及び／又はα−Ｇａｌ  Ａを有する細胞の表現型又は機能を改善する。したがって、α−Ｇａｌ  Ａの薬理学的シャペロンは、α−Ｇａｌ  Ａに結合する分子であり、α−Ｇａｌ  Ａの適切なフォールディング、輸送、非凝集、及び活性をもたらす。本明細書で使用される場合、この用語は、酵素の活性部位に結合する活性部位特異的シャペロン（ＡＳＳＣ）、阻害剤又はアンタゴニスト、及びアゴニストを含むが、これらに限定されるものではない。少なくとも１つの実施形態において、薬理学的シャペロンは、α−Ｇａｌ  Ａの阻害剤又はアンタゴニストであり得る。本明細書で使用される場合、用語「アンタゴニスト」は、α−Ｇａｌ  Ａに結合し、α−Ｇａｌ  Ａの活性を部分的又は完全に遮断、阻害、低減、又は中和する任意の分子を指すことが意図される。少なくとも１つの実施形態において、薬理学的シャペロンはミガラスタトである。別の非限定的なα−Ｇａｌ  Ａの薬理学的シャペロンは、Ｎ−ブチルデオキシガラクトノジリマイシン（ＮＢ−ＤＧＪ）又はその塩である。
【０１４６】
本明細書で使用される場合、用語「活性部位」は、タンパク質の特異的な生物学的活性に関連し且つ必要であるタンパク質の領域を指すことが意図される。少なくとも１つの実施形態において、活性部位は、基質又は他の結合パートナーに結合し、化学結合の形成及び切断に直接関与するアミノ酸残基に寄与する部位であり得る。本発明における活性部位は、酵素の触媒部位、抗体の抗原結合部位、受容体のリガンド結合ドメイン、制御因子の結合ドメイン、又は分泌タンパク質の受容体結合ドメインを包含し得る。活性部位はまた、トランス活性化、タンパク質−タンパク質相互作用、又は転写因子及び制御因子のＤＮＡ結合ドメインを包含し得る。
【０１４７】
本明細書で使用される場合、用語「ＡＵＣ」は、所与の薬物に対する体の経時的総曝露量を評価するための数学的計算を指すことが意図される。対象に投与された薬物の血中濃度が投薬後の時間と共にどのように変化するかをプロットするグラフにおいて、薬物濃度変数はｙ軸上にあり、時間はｘ軸上にある。所定の時間間隔に対する薬物濃度曲線とｘ軸との間の面積は、ＡＵＣ（「曲線下面積」）である。ＡＵＣは、投薬計画のためのガイドとして使用され、体内での異なる薬物の利用可能性のバイオアベイラビリティを比較するために使用される。
【０１４８】
本明細書で使用される場合、用語「Ｃｍａｘ」は、対象への投与後に達成される薬物の最大血漿濃度を指すことが意図される。
【０１４９】
本明細書で使用される場合、用語「ｔｍａｘ」は、対象への投与後に達成される薬物の最大血漿濃度の時間を指すことが意図される。
【０１５０】
本明細書で使用される場合、用語「ｔ１／２」は、最終消失半減期を指すことを意図している。
【０１５１】
本明細書で使用される用語「分布容積」又は「Ｖ」は、血漿中で観測されるのと同じ濃度で投与される薬物の総量を含有するのに必要な理論的容積を指すことが意図され、薬物が血漿でなく体組織に分布する程度を表す。Ｖの値が大きいほど、組織分布の程度が大きいことを示す。「中心分布容積」又は「Ｖｃ」は、血液によって高度に灌流された血液及び組織内の分布容積を指すことが意図される。「末梢分布容積」又は「Ｖ２」は、末梢組織内の分布容積を指すことが意図される。
【０１５２】
本明細書において交換可能に使用される場合、用語「クリアランス」、「全身クリアランス」又は「ＣＬ」は、単位時間当たり投与された薬物が完全に除去される血漿の容積を指すことが意図される。「末梢クリアランス」は、単位時間当たりに投与された薬物がクリアされた末梢組織の容積を指すことが意図される。
【０１５３】
本明細書で使用される場合、「治療有効用量」及び「有効量」は、対象において治療応答を生じる、α−ガラクトシダーゼＡ及び／又は薬理学的シャペロン（例えば、ミガラスタト又はその塩）及び／又はその組み合わせの量を指すことが意図される。治療応答は、本明細書に記載され、及び当該技術分野で公知の、任意の代理臨床マーカー又は症状を含む、ユーザ（例えば、臨床医）が治療に対する有効な応答として認識する任意の応答であり得る。したがって、少なくとも１つの実施形態において、治療応答は、当該技術分野で公知のものなどのファブリー病の１つ以上の症状又はマーカーの改善又は抑制であり得る。ファブリー病の症状又はマーカーにはα−ガラクトシダーゼＡ組織活性の低下；角膜の曇り、手足の灼熱感、皮膚斑点（赤紫色の隆起した病変）、胃腸の問題、食後すぐの頻繁な排便、毛細血管拡張症、疼痛発作、自律神経障害、狭心症、心電図の変化、感覚異常、リンパ浮腫、皮膚病変、被角血管腫、角膜混濁、高血圧、腎不全、先端感覚異常、乏汗症、一過性脳虚血発作、脳卒中、筋力低下、片麻痺、眩暈、難聴、耳鳴り、眼振、頭痛、片側運動失調、運動失調、脚のむくみ、白内障、慢性気道閉塞、呼吸困難、冠動脈性心疾患、心筋梗塞、不整脈、突発性下痢、悪心、嘔吐、タンパク尿が含まれるが、これらに限定されるものではない。α−ガラクトシダーゼＡに対する阻害効果を有するミガラスタトの濃度は、希釈（及び結果として平衡の変化による結合の変化）、バイオアベイラビリティ、及びインビボ投与時のミガラスタトの代謝のために、本発明の目的にとって「有効量」を構成し得ることに留意すべきである。
【０１５４】
本明細書で使用される場合、用語「酵素補充療法」又は「ＥＲＴ」は、非天然の精製酵素を、そのような酵素の欠乏を有する個体に導入することを指すことが意図される。投与されるタンパク質は、天然源から、又は組換え発現により、得ることができる。この用語はまた、その他の点で精製酵素の投与を必要とするか、又は精製酵素の投与から恩恵を受ける個体における精製酵素の導入も指す。少なくとも１つの実施形態において、そのような個体は酵素不全を患っている。導入された酵素は、インビトロで産生された精製組換え酵素、又は例えば胎盤又は動物の乳などの単離された組織又は液体から、又は植物から精製されたタンパク質であってもよい。
【０１５５】
本明細書で使用される場合、用語「併用治療」は、２つ以上の個々の治療が同時に又は連続して投与される任意の治療を指すことが意図される。少なくとも１つの実施形態において、併用治療の結果は、個々に行われる場合の各治療の効果と比較して強化される。強化は、単独で実施した場合の治療によって達成された結果と比較して有利な結果をもたらし得る、様々な治療の効果の任意の改善を含み得る。強化された効果又は結果には、強化された効果が、単独で行われた場合の各治療の相加的効果よりも大きい、相乗的強化；強化された効果が、単独で行われた場合の各治療の相加的効果と実質的に等しい、相加的強化；又は強化された効果が、単独で行われた場合の各治療の相加的効果よりも低いが、単独で行われた場合の各治療の効果より優れている、相乗効果未満が含まれ得る。強化された効果は、処置効果又は結果を測定し得る当該技術分野で公知の任意の手段によって測定し得る。強化された効果は、副作用の頻度又は重症度の低下、又は治療剤の標的外活性の低下を含み得る。
【０１５６】
本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される」は、生理学的に許容され、ヒトに投与される場合に典型的には有害な反応を生じない、分子実体及び組成物を指すことが意図される。好ましくは、本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される」は、連邦又は州政府の規制当局によって承認されているか、又は米国薬局方又は動物、特にヒトにおける使用のための他の一般に認められている薬局方に列挙されることを意味する。
【０１５７】
本明細書で使用される場合、用語「担体」は、化合物と投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、又は溶媒を指すことが意図される。適切な薬学的担体は当該技術分野で公知であり、少なくとも１つの実施形態において、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”第１８版又は他の版に記載されている。
【０１５８】
本明細書で使用される場合、用語「対象」又は「患者」は、ヒト又は非ヒト動物を指すことが意図される。少なくとも１つの実施形態において、対象は哺乳動物である。少なくとも１つの実施形態において、対象はヒトである。
【０１５９】
本明細書で使用される場合、用語「抗薬物抗体」は、対象に投与される薬物、及び対象への薬物の投与に対する体液性免疫応答の少なくとも一部として対象により生成される薬物に、特異的に結合する抗体を指すことが意図される。少なくとも１つの実施形態において、薬物は、治療用タンパク質薬物製品である。対象における抗薬物抗体の存在は、軽度から重度の範囲の免疫応答を起こす可能性があり、これは、アナフィラキシー、サイトカイン放出症候群及び重要な機能を媒介する内因性タンパク質の交差反応性中和を含むがこれらに限定されない生命を脅かす免疫応答を含むが、これに限定されるものではない。さらに又は代替的に、対象における抗薬物抗体の存在は、薬物の有効性を低下させ得る。
【０１６０】
本明細書で使用される場合、用語「約」及び「およそ」は、測定の性質又は精度を考慮して、測定された量に対する許容可能な程度の誤差を指すことが意図される。例えば、誤差の程度は、当分野で理解されているように、測定に関して提供された有効数字の数によって示すことができ、測定に関して報告された最も正確な有効数字の±１の変化を含むが、これに限定されるものではない。典型的な例示的な誤差の程度は、所与の値又は値の範囲の２０パーセント（％）以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内である。あるいは、特に生物系において、用語「約」及び「およそ」は、所与の値の１桁倍以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内の値を意味し得る。本明細書に記載の数値は、他に明記しない限りおよそのものであり、用語「約」又は「およそ」は、明示的に記載されていない場合に推測できることを意味する。
【０１６１】
用語「同時に」は、本明細書で使用される場合、当業者に理解されるように、同時又は前後の合理的な短い時間以内を意味することが意図される。例えば、２つの処置が互いに同時に投与される場合、２つの処置のうちの後の処置の準備に必要な時間を許容するために、１つの処置は他の処置前又は後に投与し得る。したがって、２つの処置の「同時投与」は、１つの処置が２０分以下、約２０分、約１５分、約１０分、約５分、約２分、約１分又は１分未満で他の処置に続くことを含むが、これに限定されるものではない。
【０１６２】
組換えヒトα−ガラクトシダーゼＡ
本発明の様々な実施形態は、特有の炭水化物プロファイルを有する組換えヒトα−ガラクトシダーゼＡ（ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ）に関する。リソソーム酵素補充療法は、一般に、カチオン非依存性マンノース−６−リン酸受容体（ＣＩＭＰＲ）への酵素の結合に依存する。具体的には、特定の炭水化物は、ＣＩＭＰＲ、最も顕著にはＭ６Ｐ、特にビス−Ｍ６Ｐに対し親和性を有する。細胞の表面にＣＩＭＰＲが結合すると、酵素は内部移行し、リソソームに輸送される。リソソームは基質蓄積の主要部位であり、最終的に、基質を分解するのに酵素が必要な部位である。
【０１６３】
ｒｈα−Ｇａｌ  Ａホモダイマーの各鎖には４つの潜在的なＮ結合グリコシル化部位があり、そのうち３つは、典型的にはグリコシル化されている。各グリコシル化部位は、存在するＮ結合オリゴ糖（Ｎ−グリカン）のタイプが不均一であるため、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａは、タンパク質と炭水化物受容体に対する異なる結合親和性を有するＮ−グリカンとの複雑な混合物からなる。１つのＭ６Ｐ基（モノ−Ｍ６Ｐ）を有する高マンノースＮ−グリカンを含有するｒｈα−Ｇａｌ  Ａは、低い（約７，０００ｎＭ）親和性でＣＩＭＰＲに結合する一方、同じＮ−グリカン上に２つのＭ６Ｐ基を含有するｒｈα−Ｇａｌ  Ａ（ビス−Ｍ６Ｐ）は、高い（約２ｎＭ）親和性で結合する。非リン酸化、モノ−Ｍ６Ｐ、及びビス−Ｍ６Ｐグリカンの代表的な構造を図１Ａに示す。Ｍ６Ｐ基は図１Ｂに示される。生産的薬物標的化を図２Ａに示す。
【０１６４】
リン酸化Ｎ−グリカンを有しない組換えタンパク質は、ＣＩＭＰＲに対する親和性を欠く。非リン酸化高マンノースグリカンもまた、マンノース受容体によって除去され得、これはＥＲＴの非生産的クリアランスをもたらす（図２Ｂ）。
【０１６５】
ガラクトース及びシアル酸を含有する他のタイプのＮ−グリカン、複合炭水化物も、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ上に存在する。複合Ｎ−グリカンはリン酸化されないため、ＣＩＭＰＲに対する親和性を有しない。露出したガラクトース残基を有する複合Ｎ−グリカンは、肝細胞のアシアロ糖タンパク質受容体に対して中程度から高い親和性を有し、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａの急速な非生産的クリアランスをもたらす（図２Ｂ）。アシアロ糖タンパク質受容体及びマンノース受容体は、肝細胞で高度に発現され、（とりわけ）露出したガラクトース及びマンノースを有するタンパク質を循環から除去する。アシアロ糖タンパク質受容体を介した酵素吸収のこの非生産的な経路を回避する１つの方法は、末端部位をシアル酸で遮断することである。末端シアル酸を有するタンパク質は、この非生産的な除去経路に供されず、そのため、ＣＩＭＰＲを標的とするために利用できる。
【０１６６】
従来の酵素補充治療剤をリソソームに送達することは非効率的であるため、そのような治療剤は、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａに対する免疫応答の生成を含む問題にしばしば関連する。既存のＥＲＴの投与で報告される最も重篤で最も一般的な副作用は輸注反応である。輸注反応には、頻脈、高血圧、咽頭絞扼感、胸痛／絞扼感、呼吸困難、発熱、悪寒／硬直、腹痛、掻痒症、蕁麻疹、悪心、嘔吐、唇又は耳の浮腫、発疹を含み得る。
【０１６７】
ファブラザイム（アガリダーゼベータ）を投与されている患者の大半はＩｇＧ抗体を発現し、一部はＩｇＥ又は組換え酵素に特異的な皮膚試験応答性を発現する。輸注反応を緩和するために、一部の患者はアセトアミノフェン及び／又は抗ヒスタミン又はステロイドで前処置される。輸注反応を制御する別の戦略は、注入時間を増やすことである。
【０１６８】
異なるＮ結合炭水化物はＥＲＴに望ましい特性を付与するが、グリコシル化部位の数は限られている。したがって、ＥＲＴの設計は、１つの特性又は１つのタイプの炭水化物を選択すると別の特性が犠牲になり得るため、単に望ましい炭水化物の追加という問題ではない。したがって、新規ＥＲＴの開発には多くの困難が存在する。本明細書に記載のｒｈα−Ｇａｌ  Ａ酵素は、ＥＲＴの選択、発現、精製中に、マンノース及びアシアロ糖タンパク質受容体を介した標的外クリアランスの最小化、及びＣＩＭＰＲを介したリソソームへの最大の生産的高親和性標的化を確保するために、グリカンマップを注意深くモニタリングした結果である。
【０１６９】
熱心な試験及び広範な試験により、本発明者らは、多くのタンパク質特性のバランスをとって、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａの非生産的クリアランスを最小化し、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａをリソソームに効率的に標的化した。本明細書に記載のｒｈα−Ｇａｌ  Ａに適用されている特性には、タンパク質の高産生、リン酸化、複合型グリカンの末端シアル酸キャッピング、中性グリカンの低含有量、高い酵素活性、及び血液中の安定性がある。
【０１７０】
少なくとも１つの実施形態において、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で発現し、リプレガル（アガルシダーゼアルファ）又はファブラザイム（アガルシダーゼベータ）の１つ以上のＭ６Ｐ残基を有するＮ−グリカン単位の含有量と比較して増加した含有量の、１つ以上のＭ６Ｐ残基を有するＮ−グリカン単位を含む。本明細書に記載のｒｈα−Ｇａｌ  Ａは、高い親和性（ＫＤ約３ｎＭ）でＣＩＭＰＲに結合することが示されている。本明細書に記載のｒｈα−Ｇａｌ  Ａはインビボで特性評価され、ファブラザイム（アガルシダーゼベータ）（ｔ１／２約７．８分）よりも長い見かけの血漿半減期（ｔ１／２約１３．２分）を有することが示された。
【０１７１】
少なくとも１つの実施形態において、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａは、低レベルの中性グリカン（例えば、１．５〜６％）及び高レベルのビスリン酸化オリゴ糖（例えば、７％〜１４％）の両方を有する。少なくとも１つの他の実施形態において、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａは、非常に高レベルのモノ−リン酸化オリゴ糖（例えば、２５％超）及び非常に高レベルのビス−リン酸化オリゴ糖（例えば、１２％超）を有する。ｒｈα−Ｇａｌ  Ａはまた、シアル酸を含有する非常に高レベルのオリゴ糖（例えば、５０％超）も有し得る。これら及び他の実施形態において、ＥＲＴは、マンノース及びアシアロ糖タンパク質受容体を介した最小の非生産的な対象外クリアランスを有し、一方、ＣＩＭＰＲを介したリソソームへの生産的な高親和性標的化を最大化する。
【０１７２】
少なくとも１つの実施形態において、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａはホモダイマーである。少なくとも１つの実施形態において、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａは、配列番号１に記載の野生型α−Ｇａｌ  Ａの全長４２９アミノ酸配列を有するものとして最初に発現され、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１６０．１に関連付けられる。全長ｒｈα−Ｇａｌ  Ａは、アミノ酸の一部、例えば最初の３１アミノ酸を除去する細胞内プロセシングを受ける。したがって、宿主細胞によって産生及び分泌されるｒｈα−Ｇａｌ  Ａは、細胞内で最初に発現される組換えｒｈα−Ｇａｌ  Ａよりも短いアミノ酸配列を有し得る。少なくとも１つの実施形態において、より短いタンパク質は、シグナルペプチドを含む最初の３１アミノ酸が除去され、したがって３９８個のアミノ酸を有するタンパク質が得られる点で配列番号１と異なるだけの、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有し得る。別の実施形態において、各鎖は、シグナルペプチドを除去する前はおよそ４９ｋＤａであり、シグナルペプチドを除去した後はおよそ４５ｋＤａであり、これはグリカンの追加的な重量に相当するものではない。配列番号１又は配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又はそれを超える欠失、置換及び／又は挿入を有するなどの、アミノ酸の数における他の変更も可能である。いくつかの実施形態において、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ産物は、異なるアミノ酸長を有するｒｈα−Ｇａｌ  Ａ分子の混合物を含む。
【０１７３】
少なくとも１つの実施形態において、ホモダイマーは、およそ９１ｋＤａの分子量を有する７９６個のアミノ酸を有するが、これはグリカンの追加的な重量に相当するものではない。
配列番号１
2020503900.tif 000005
配列番号２
2020503900.tif 000006
配列番号３
2020503900.tif 000007
【０１７４】
少なくとも１つの実施形態において、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａは、タンパク質中の１つ以上のアミノ酸残基において翻訳後及び／又は化学修飾を受ける。例えば、メチオニン及びトリプトファン残基は酸化を受け得る。別の例として、Ｎ末端グルタミンはピログルタミン酸を形成することができる。別の例として、アスパラギン残基は、アスパラギン酸への脱アミノ化を受け得る。さらに別の例として、アスパラギン酸残基はイソアスパラギン酸への異性化を受け得る。さらに別の例として、タンパク質中の不対システイン残基は、遊離グルタチオン及び／又はシステインとジスルフィド結合を形成し得る。したがって、いくつかの実施形態において、酵素は、配列番号１、配列番号２又は配列番号３によってコードされるものに記載されるアミノ酸配列を有するものとして最初に発現され、酵素はこれらの翻訳後及び／又は化学修飾の１つ以上を受ける。そのような改変形態も本開示の範囲内である。
【０１７５】
様々な実施形態において、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａは、配列番号１又は配列番号２と少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％又は９９．５％同一である変異体である。これらの変異体α−ガラクトシダーゼＡアミノ酸配列は、例えば、配列番号１又は配列番号２に記載のアミノ酸配列と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又はそれを超える欠失、置換及び／又は挿入を有するなど、配列番号１又は配列番号２に対して欠失、置換及び／又は挿入を含有してもよい。
【０１７６】
Ｇｌａ及びそのような変異体ヒトＧｌａをコードするポリヌクレオチド配列もまた企図され、本発明によるｒｈα−Ｇａｌ  Ａを組換え発現するために使用され得る。
【０１７７】
ｒｈα−Ｇａｌ  Ａは、好ましくはＣＨＯ細胞によって産生される。配列番号１又は配列番号２と少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％又は９９．５％同一であるものなどの、α−ガラクトシダーゼＡ又は他の変異体α−ガラクトシダーゼアミノ酸配列の対立遺伝子変異体を発現し得るＤＮＡ構築物が構築され、ＣＨＯ細胞で発現され得る。これらの変異体α−ガラクトシダーゼＡアミノ酸配列は、例えば、配列番号１又は配列番号２に記載のアミノ酸配列と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又はそれを超える欠失、置換及び／又は挿入を有するなど、配列番号１又は配列番号２に対して欠失、置換及び／又は挿入を含有してもよい。ＤＮＡ構築物は、配列番号３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は９９．５％同一であり得る。当業者は、そのような変異体α−ガラクトシダーゼアミノ酸配列の産生のためのＣＨＯ細胞の形質転換に適した代替的ベクターを選択し得る。
【０１７８】
ＧＣＧ配列分析パッケージ（ウィスコンシン大学、ウィスコンシン州マディソン）の一部として利用可能なＦＡＳＴＡ又はＢＬＡＳＴを含む、２つの配列間の同一性を計算するために、様々なアライメントアルゴリズム及び／又はプログラムを使用することができ、例えば、デフォルト設定で使用することができる。例えば、本明細書に記載され、好ましくは実質的に同じ機能を示す特定のポリペプチドに対して少なくとも９０％、９５％、９８％又は９９％の同一性を有するポリペプチド、並びにそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが企図される。別段の指示がない限り、類似度スコアはＢＬＯＳＵＭ６２の使用に基づく。ＢＬＡＳＴＰが使用される場合、類似性割合はＢＬＡＳＴＰ陽性スコアに基づき、配列同一性割合はＢＬＡＳＴＰ同一性スコアに基づく。ＢＬＡＳＴＰの「同一性」は、同一の高スコア配列対における総残基の数及び割合を示す；及びＢＬＡＳＴＰの「陽性」は、整列スコアが正の値を有し、互いに類似している残基の数及び割合を示す。これらの同一性又は類似性の程度又は本明細書に開示されるアミノ酸配列との類似性の任意の中程度の同一性を有するアミノ酸配列が企図され、この開示によって包含される。類似のポリペプチドのポリヌクレオチド配列は、遺伝コードを使用して推定され、従来の手段、特に遺伝子コードを使用してそのアミノ酸配列を逆翻訳することによって得ることができる。
【０１７９】
好ましくは、全ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ分子の７０、６５、６０、５５、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、又は５％以下が、１つ以上のＭ６Ｐ残基を有するＮ−グリカン単位を欠くか、又はＣＩＭＰＲに結合する能力が欠如している。あるいは、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ分子の３０，３５，４０，４５，５０，５５，６０，６５，７０，７５，８０，８５，９０，９５，９９％、＜１００％又はそれ以上が、１つ以上のＭ６Ｐ残基を有する少なくとも１つのＮ−グリカン単位を含む、又はＣＩＭＰＲに結合する能力を有する。
【０１８０】
ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ分子は、グリカン上にサブユニットあたり１、２、３、４、５、又は６個のＭ６Ｐ基、又はホモダイマーあたり１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２個のＭ６Ｐ基を有し得る。例えば、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ分子における１つのＮ−グリカンのみがＭ６Ｐ（モノ−リン酸化）を有していてもよく、単一のＮ−グリカンが２つのＭ６Ｐ基（ビス−リン酸化）を有していてもよく、又は同じｒｈα−Ｇａｌ  Ａ分子における２つの異なるＮ−グリカンがそれぞれ単一のＭ６Ｐ基を有していてもよい。ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ分子はまた、Ｍ６Ｐ基を有しないＮ−グリカンを有し得る。別の実施形態において、Ｎ−グリカンは平均で２モル／モルを超えるＭ６Ｐ及び４モル／モルを超えるシアル酸を含み、その結果、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａは平均でｒｈα−Ｇａｌ  Ａ１モルあたり少なくとも２モルのＭ６Ｐ残基、及びｒｈα−Ｇａｌ  Ａホモダイマー１モルあたり少なくとも４モルのシアル酸を含む。平均して、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ上の全グリカンの少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、又は３５％がモノ−Ｍ６Ｐグリカンの形態であってもよく、平均して、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ上の全グリカンの少なくとも約０．５、１、１．５、２．０、２．５、３．０、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０％がビス−Ｍ６Ｐグリカンの形態であり、平均して、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ上の全グリカンの約７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０又は２５％未満がＣＩＭＰＲに結合するリン酸化グリカンを含有しない。
【０１８１】
ｒｈα−Ｇａｌ  Ａは、０．５〜６．０モル／モルｒｈα−Ｇａｌ  Ａホモダイマーの範囲、又は０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、又は６．０モル／モルｒｈα−Ｇａｌ  Ａホモダイマーを含む部分範囲の任意の中間値のＭ６Ｐを担持するＮ−グリカンの平均含有量を有し得る。ｒｈα−Ｇａｌ  Ａを分画して、異なる平均数のモノ−Ｍ６Ｐ含有又はビス−Ｍ６Ｐ含有グリカンを有するｒｈα−Ｇａｌ  Ａ調製物を提供することができ、これにより、特定の画分を選択することによって、又は選択的に異なる画分を組み合わせることによって、標的組織のリソソームへ標的化するｒｈα−Ｇａｌ  Ａのさらなるカスタマイズが可能となる。
【０１８２】
ｒｈα−Ｇａｌ  ＡにおけるＮ−グリカンの最大６０％が完全にシアリル化されていてもよく、例えばＮ−グリカンの最大１０％、２０％、３０％、４０％、５０％又は６０％が完全にシアリル化されていてもよい。いくつかの実施形態において、全Ｎ−グリカンの４〜２０％が完全にシアリル化されている。他の実施形態において、ｒｈα−Ｇａｌ  ＡにおけるＮ−グリカンの５％、１０％、１５％、２０％、２５％又は３０％以下がシアル酸及び末端ガラクトース残基（Ｇａｌ）を有する。この範囲には、全ての中間値及び部分範囲が含まれ、例えば、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａにおける全Ｎ−グリカンの７〜３０％がシアル酸及び末端ガラクトースを運ぶことができる。さらに他の実施形態において、ｒｈα−Ｇａｌ  ＡにおけるＮ−グリカンの５、１０、１５、１６、１７、１８、１９又は２０％以下が末端ガラクトースのみを有し、シアル酸を含有しない。この範囲には、全ての中間値及び部分範囲が含まれ、例えば、組成物中のｒｈα−Ｇａｌ  Ａにおける全Ｎ−グリカンの８〜１９％が、末端ガラクトースのみを有し、シアル酸を含有しない場合がある。
【０１８３】
本発明の他の実施形態において、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａにおける全Ｎ−グリカンの４０、４５、５０、５５又は６０％が複合型Ｎ−グリカンであり；又はｒｈα−Ｇａｌ  Ａにおける全Ｎ−グリカンの１、２、３、４、５、６、７％以下がハイブリッド型Ｎ−グリカンであり；ｒｈα−Ｇａｌ  Ａにおける高マンノース型Ｎ−グリカンの５、１０又は１５％以下が非リン酸化されており；ｒｈα−Ｇａｌ  Ａにおける高マンノース型Ｎ−グリカンの少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０又は３５％がリン酸化されたモノ−Ｍ６Ｐであり；及び／又はｒｈα−Ｇａｌ  Ａにおける高マンノース型Ｎ−グリカンの少なくとも１、２、３、４、５、６又は７％がリン酸化されたビス−Ｍ６Ｐである。これらの値には、全ての中間値及び部分範囲が含まれる。ｒｈα−Ｇａｌ  Ａは、上記の１つ以上の含有量範囲を満たし得る。
【０１８４】
１つ以上の実施形態において、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａは、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ１モルあたり平均で２．０〜９．０モルのシアル酸残基を有するであろう。この範囲には、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５及び９．０モル残基／モルｒｈα−Ｇａｌ  Ａホモダイマーを含む、全ての中間値及び部分範囲が含まれる。理論に拘束されるものではないが、シアル酸残基を有するＮ−グリカン単位の存在は、アシアロ糖タンパク質受容体によるｒｈα−Ｇａｌ  Ａの非生産的クリアランスを防止し得ると考えられる。
【０１８５】
１つ以上の実施形態において、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ上の全Ｎ−グリカンの少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５％は、単一のシアル酸残基を含有する。
【０１８６】
１つ以上の実施形態において、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ上の全Ｎ−グリカンの少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０％は、２つのシアル酸残基を含有する。これらの値には、全ての中間値及び部分範囲が含まれる。
【０１８７】
１つ以上の実施形態において、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ上の全Ｎ−グリカンの少なくとも３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０％は、１つ又は２つのシアル酸残基を含有する。これらの値には、全ての中間値及び部分範囲が含まれる。
【０１８８】
１つ以上の実施形態において、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ上の全Ｎ−グリカンの少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０％は、３つのシアル酸残基を含有する。１つ以上の実施形態において、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ上の全Ｎ−グリカンの３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１又は１０％未満は、３つのシアル酸残基を含有する。これらの値には、全ての中間値及び部分範囲が含まれる。
【０１８９】
１つ以上の実施形態において、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ上の全Ｎ−グリカンの少なくとも０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５又は５％は、４つのシアル酸残基を含有する。１つ以上の実施形態において、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ上の全Ｎ−グリカンの１０、９、８、７、６、５、４．５、４、３．５、３、２．５、２、１．５、１又は０．５％未満は、４つのシアル酸残基を含有する。これらの値には、全ての中間値及び部分範囲が含まれる。
【０１９０】
１つ以上の実施形態において、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ上の全Ｎ−グリカンの２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０又は２５％未満は、中性グリカンである。
【０１９１】
１つ以上の実施形態において、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａは、組換えヒトリソソームタンパク質の一定のＮ−グリコシル化部位にＭ６Ｐ及び／又はシアル酸単位を有する。例えば、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａの２つの同一サブユニットのそれぞれに、３つのＮ結合グリコシル化部位がある。配列番号１の位置：Ａｓｎ−１３９、Ａｓｎ−１９２、Ａｓｎ−２１５及びＡｓｎ−４０８に対応する４つの潜在的なグリコシル化部位がある。同様に、配列番号２の成熟ペプチドの場合、これらの潜在的なグリコシル化部位は、Ａｓｎ−１０８、Ａｓｎ−１６１、Ａｓｎ−１８４及びＡｓｎ−３７７の位置にある。典型的には、最初の３部位のみがグリコシル化される。ｒｈα−Ｇａｌ  Ａの他の変異体は、アスパラギン残基の位置に応じて、同様のグリコシル化部位を有し得る。一般に、タンパク質アミノ酸配列におけるＡＳＮ−Ｘ−ＳＥＲ又はＡＳＮ−Ｘ−ＴＨＲの配列は、潜在的なグリコシル化部位を示すが、例外として、ＸはＨＩＳ又はＰＲＯではあり得ない。
【０１９２】
本発明者らは、ＣＩＭＰＲ及び細胞リソソームを標的とする優れた能力、並びにインビボでの非生産的クリアランスを減少させるグリコシル化パターンを有するｒｈα−Ｇａｌ  Ａが、ＣＨＯ細胞を産生できることを見出した。これらの細胞は、リプレガル（アガルシダーゼアルファ）又はファブラザイム（アガルシダーゼベータ）などの従来の組換えヒトα−ガラクトシダーゼＡ産物よりも、１つ以上のＭ６Ｐ残基を有するＮ−グリカン単位のレベルが有意に高いｒｈα−Ｇａｌ  Ａを発現することができる。これらの細胞によって産生されるｒｈα−Ｇａｌ  Ａは、例えば、以下の実施例に例示されるように、リプレガル（アガルシダーゼアルファ）又はファブラザイム（アガルシダーゼベータ）などの従来のα−ガラクトシダーゼＡよりも、有意に多いＭ６Ｐ及びビス−Ｍ６Ｐ  Ｎ−グリカン残基、及び／又は有意に多いシアル酸Ｎ−グリカン残基、及び／又は有意に少ない中性Ｎ−グリカンを有する。理論に拘束されるものではないが、この特有なグリコシル化により、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ酵素がより効果的に標的細胞に取り込まれることができ、したがって、例えば、はるかに低いＭ６Ｐ及びビス−Ｍ６Ｐ含有量及び／又はより高い中性グリカンの含有量を有するリプレガル（アガルシダーゼアルファ）又はファブラザイム（アガルシダーゼベータ）などの、他の組換えヒトα−ガラクトシダーゼＡ分子よりも効率的に循環から除去され得ると考えられる。本明細書に記載のｒｈα−Ｇａｌ  Ａは、ＣＩＭＰＲに効率的に結合し、腎臓及び心筋によって効率的に取り込まれ、好ましい薬物動態プロファイルを提供しインビボでの非生産的クリアランスを減少させるグリコシル化パターンを有することが示されている。
【０１９３】
本明細書に記載のｒｈα−Ｇａｌ  Ａの特有なグリコシル化は、例えば、リプレガル（アガルシダーゼアルファ）又はファブラザイム（アガルシダーゼベータ）と比較して、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａの免疫原性の低下に寄与し得ることも企図される。当業者によって理解されるように、保存された哺乳動物糖によるタンパク質のグリコシル化は、一般に、生成物の溶解性を高め、生成物の凝集及び免疫原性を減少させる。グリコシル化は、タンパク質の凝集を最小限にし、免疫系からタンパク質免疫原性エピトープを遮断することにより、タンパク質免疫原性を間接的に変化させる（Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ−Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ａｕｇｕｓｔ  ２０１４）。したがって、少なくとも１つの実施形態において、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａの投与は、抗薬物抗体を誘導しない。少なくとも１つの実施形態において、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａの投与は、リプレガル（アガルシダーゼアルファ）又はファブラザイム（アガルシダーゼベータ）の投与によって誘導される抗薬物抗体のレベルよりも対象における抗薬物抗体の発生率を低下させる。
【０１９４】
ｒｈα−Ｇａｌ  Ａを産生するための細胞株の生成方法
高含有量のモノ−Ｍ６Ｐ、高含有量のビス−Ｍ６Ｐ、高含有量のシアル酸及び／又は低含有量の中性グリカンを有するｒｈα−Ｇａｌ  Ａは、ＧｌａをコードするＤＮＡ構築物で宿主細胞を形質転換することにより産生することができる。適切な宿主細胞には、哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ−ＤＧ４４細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、及びＣＨＯ−ＤＸＢ１１細胞などのＣＨＯ細胞が含まれる。ＣＨＯ細胞は以前に組換えヒトα−ガラクトシダーゼＡを作製するために使用されていたが、形質転換ＣＨＯ細胞は、高含有量のモノ−Ｍ６Ｐ、ビス−Ｍ６Ｐ及びシアル酸を含有するグリカンを有する、及び／又は低含有量の中性グリカンを有する組換え酵素を産生するように作製及び培養することができたことは認められなかった。
【０１９５】
宿主細胞をトランスフェクトするための適切なベクターには、配列番号３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％又は１００％同一であるＤＮＡ構築物が含まれ得る。別のＤＮＡ構築物を使用して、配列番号１又は配列番号２と少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％又は１００％同一であるアミノ酸配列を産生してもよい。例示的なベクターには、プラスミドが含まれるが、これに限定されるものではない。ベクターは、プロモーター配列及び／又は選択遺伝子をコードする配列などの他の配列を含み得る。プロモーター配列は、サルウイルス４０（ＳＶ４０）及びヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター遺伝子を含むが、これらに限定されるものではない。選択遺伝子には、ゼオシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子、及びジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子が含まれるが、これらに限定されるものではない。他のプロモーター配列及び選択遺伝子は、当技術分野で公知である。複数のベクターもまた、トランスフェクション、例えば、デュアルベクタートランスフェクションにおいて使用され得る。
【０１９６】
評価のために別々のプールを提供するために、宿主細胞において複数のトランスフェクションが実施され得る。これらのプールは、細胞培養物の生存率、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ発現、及び／又はモノ−Ｍ６Ｐ、ビス−Ｍ６Ｐ、シアル酸及び／又は中性グリカン含有量などのグリカン含有量、などの特定の特性について評価され得る。これらの特性は、トランスフェクション後１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０日など、培養を通じて評価することができる。
【０１９７】
クローンを生成するために望ましい特性を有するプールを選択することができ、これらのクローンは同様の基準（例えば、細胞培養物の生存率、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ発現及び／又はグリカン含有量）に従ってさらに評価することができる。選択されたクローンは、他の条件、異なるスケール（例えば、スピンチューブ又はバイオリアクタースケール）、又は培養中の異なる時点で評価することもできる。
【０１９８】
発現ベクターを生成し、細胞株を生成し、組換え細胞株を産生する方法が一般的に使用されるが、当業者の知識に従って他のものを使用してもよい。例えば、そのような方法は米国特許出願公開第２０１６／０２６４９５３号明細書；国際公開第２０１４／１３７９０３号パンフレット；Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２５，Ｉｓｓｕｅ  ９，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２００７，ｐｐ．４２５−４３２；Ｔｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４（１４），７９７０−７９７５（１９８９）；Ｍａｔｓｕｕｒａ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，８（４）：３２９−３３９（１９９８）；及びＤｉｔｔｅｒｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３４０：７２９−７３６（１９９９）に記載され、これらはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１９９】
発現ベクター
本発明の組換えヒトα−ガラクトシダーゼ−Ａタンパク質をコードする配列（例えば、ｃＤＮＡ）を含有する発現ベクターもまた、本明細書に提供される。例えば、発現ベクターは、配列番号１又は配列番号２と少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、９９％、又は１００％同一）である組換えヒトα−ガラクトシダーゼ−Ａタンパク質をコードする配列（例えば、ｃＤＮＡ）を含み得る。その配列に加えて、発現ベクターは、組換えヒトα−ガラクトシダーゼ−Ａタンパク質をコードする配列（例えば、ｃＤＮＡ）の５’末端に作動可能に連結されたプロモーター（及び任意選択により１つ以上のエンハンサー配列）を含み得る。発現ベクターは、組換えタンパク質をコードする配列（例えば、ｃＤＮＡ）の５’末端に作動可能に連結されたＴＴＧ開始コドンを有するヒトＣＤ５２タンパク質のペプチドをコードする配列、及び組換えタンパク質をコードする配列（例えば、ｃＤＮＡ）の３’末端に作動可能に連結されたポリ（Ａ）認識部位をコードする配列を含み得る。発現ベクターは、哺乳動物選択マーカー（例えば、ヒト又は犬の合成酵素タンパク質）をコードする配列（例えば、ｃＤＮＡ）、及び哺乳動物選択マーカーをコードする配列（例えば、ｃＤＮＡ）の５’末端に作動可能に連結されたプロモーター配列、及び任意選択により、両方が哺乳動物選択遺伝子をコードする配列（例えば、ｃＤＮＡ）の３’末端に作動可能に連結された、ＳＶ４０初期イントロン配列及びｐｏｌｙ（Ａ）シグナル配列を含み得る。発現ベクターは、原核生物選択遺伝子（例えば、アンピシリン耐性遺伝子）をコードする配列の５’末端に作動可能に連結された原核生物プロモーター配列、原核生物の複製起点配列、及び真核生物の複製起点配列のうちの１つ以上（例えば、２つ又は３つ）を含み得る。
【０２００】
組換えヒトα−ガラクトシダーゼ−Ａタンパク質をコードする配列（例えば、ｃＤＮＡ）のに作動可能に連結され得るプロモーター配列（及び任意選択により１つ以上のエンハンサー配列）の非限定的な例としては、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、リボソームタンパク質２１（ｒｐＳ２１）プロモーター、ハムスターβ−アクチンプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（例えば、ＣＭＶ即時型初期プロモーター（例えば、Ｔｅｓｃｈｅｎｄｏｒｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２２：３３２５−３３３０，２００２を参照）、ユビキチンＣ（ＵＢＣ）プロモーター、伸長因子１−ａ（ＥＦ１Ａ）プロモーター、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＣＫ）プロモーター、マウスＣＭＶからのＩＥ２プロモーター／エンハンサー領域（例えば、Ｃｈａｔｅｌｌａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９６：１０６−１１７，２００７を参照）、及びニワトリβ−アクチンプロモーターが挙げられる。本明細書に記載の発現ベクターのいずれかで使用できるヒト遺伝子プロモーターのさらなる非限定的な例は、哺乳動物プロモーターデータベース（Ｗｉｓｔａｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅウェブサイトのｍｒｐｏｍｂｄｂ．ｗｉｓｔｅｒ．ｕｐｅｎｎ．ｅｄｕ）に記載されている。発現ベクターで使用できる哺乳動物プロモーター配列のさらなる例は、当技術分野で公知である。発現プラスミドで使用できるプロモーター及びエンハンサーの１つの非限定的な例は、ＣＭＶエンハンサー（当技術分野ではＣＡＧＧプロモーターとして知られている）を有するニワトリβ−アクチンプロモーターである。本明細書で提供される発現ベクターは、ｒｐＳ２１プロモーター、ハムスターβ−アクチンプロモーター、又はヒト組換えα−ガラクトシダーゼ−Ａタンパク質をコードする配列（例えば、ｃＤＮＡ）の５’末端に作動可能に連結されたＳＶ４０初期プロモーター配列、ヒト組換えα−ガラクトシダーゼ−Ａタンパク質をコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡ）（例えば、本明細書に記載のヒト組換えα−ガラクトシダーゼ−Ａタンパク質をコードする核酸のいずれか）の５’末端に作動可能に連結されたＴＴＧ開始コドンを有するヒトＣＤ５２タンパク質のペプチドをコードする配列、及び組換えヒトα−ガラクトシダーゼ−Ａタンパク質をコードする核酸配列の３’末端に作動可能に連結されたポリ（Ａ）認識部位を含有する配列を含み得る。
【０２０１】
ポリ（Ａ）認識部位配列の非限定的な例は、ウシ成長ホルモンのポリ（Ａ）認識部位である。ヒトのポリ（Ａ）認識部位の構造的特徴は、Ｎｕｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ  ２９：１５２３−１５３６，２０１０に記載される。さらなるポリ（Ａ）認識部位は、当技術分野で周知である。
【０２０２】
いくつかの例において、発現ベクターは、組換えヒトα−ガラクトシダーゼ−Ａタンパク質をコードする配列（例えば、ｃＤＮＡ）の５’末端に両方が作動可能に連結された、ハムスターβ−アクチンプロモーター、及びＴＴＧ開始コドンを有するヒトＣＤ５２タンパク質のペプチドをコードする配列、並びに組換えヒトα−ガラクトシダーゼ−Ａタンパク質をコードする配列（例えば、ｃＤＮＡ）の３’末端に作動可能に連結された、ＳＶ４０初期イントロン、及びポリ（Ａ）認識配列をコードする配列を含む。
【０２０３】
いくつかの発現ベクターは、哺乳動物選択遺伝子をコードする配列を含み得る。哺乳類選択遺伝子の非限定的な例としては、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ヒドロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、グルタミン合成酵素遺伝子、ジヒドロ葉酸耐性遺伝子、及びヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が挙げられる。これらの哺乳動物選択遺伝子をコードする配列の例は、当技術分野で公知である。哺乳動物選択遺伝子をコードする配列の５’末端は、プロモーター（例えば、本明細書に記載の、又は当技術分野で公知の、任意の例示的なプロモーター）に作動可能に連結することができる。
【０２０４】
いくつかの発現ベクター（例えば、本明細書に記載の発現ベクターのいずれか）は、哺乳動物の複製起点配列及び／又は原核生物の複製起点配列を含み得る。哺乳類の複製起点配列は当技術分野で公知である（例えば、Ｔｏｄｏｒｏｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．４：Ｄ８５９−Ｄ５６８，１９９９；Ａｌａｄｊｅｍ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．９：２５４０−２５４７，２００４；Ｈａｍｌｉｎ，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ  １４：６５１−６５９，１９９２）。原核生物の複製起点配列もまた、当技術分野で公知である（例えば、Ｍａｒｃｚｙｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．３：７７５−７８２，１９９３）。
【０２０５】
ベクターの非限定的な例はプラスミドである。本明細書で提供されるプラスミドの非限定的な例を図３に示す。
【０２０６】
発現ベクターはウイルスベクターであり得る。ウイルスベクターの非限定的な例には、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、及びレトロウイルスベクターが含まれる。発現ベクターは、プラスミド又はコスミドでもあり得る。
【０２０７】
宿主細胞
本明細書に記載の組換えヒトα−ガラクトシダーゼ−Ａタンパク質をコードする配列を含む宿主細胞もまた、本明細書に提供される。配列は、プロモーター配列（例えば、本明細書に記載の例示的なプロモーター配列のいずれか、又は当技術分野で公知の任意のウイルス又は哺乳動物プロモーター配列）に作動可能に連結することができる。例えば、組換えヒトα−ガラクトシダーゼ−Ａタンパク質をコードする配列及び組換えヒトα−ガラクトシダーゼ−Ａタンパク質をコードする配列の５’末端に作動可能に連結されたプロモーター配列の配列は、宿主細胞の染色体内に組み込むことができる。他の例において、組換えヒトα−ガラクトシダーゼ−Ａタンパク質をコードする配列及び組換えヒトα−ガラクトシダーゼ−Ａタンパク質をコードする配列の５’末端に作動可能に連結されたプロモーター配列は、宿主細胞内の発現ベクター（例えば、本明細書に記載の発現ベクターのいずれか）中に存在する。
【０２０８】
核酸（例えば、本明細書に記載の核酸又は発現ベクターのいずれか）を細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）に導入する方法は、当技術分野で公知である。例えば、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウムを介したトランスフェクション、ウイルス（例えば、レトロウイルス）の形質導入、ＤＥＡＥデキストランを介した細胞のトランスフェクション、デンドリマーを介したトランスフェクション、ソノポレーション、光学トランスフェクション、インペールフェクション、流体力学的送達、マグネトフェクション、又はバリスティックトランスフェクションを使用して、核酸を細胞内に導入することができる。
【０２０９】
宿主細胞は、任意のタイプの哺乳動物細胞であり得る。例えば、宿主細胞は、細胞株、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えば、ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞、ＣＨＯ−Ｋ１ｓ細胞、Ｃ０２．３１クローン細胞、Ａ１４．１３クローン細胞、Ｃ０２．５７クローン細胞、及びＦ０５．４３クローン細胞）、Ｓｐ２．０、骨髄腫細胞（例えば、ＮＳ／０）、Ｂ細胞、ハイブリドーマ細胞、Ｔ細胞、ヒト胚性腎（ＨＥＫ）細胞（例えば、ＨＥＫ  ２９３Ｅ及びＨＥＫ  ２９３Ｆ）、アフリカミドリザル腎上皮細胞（Ｖｅｒｏ）細胞、又はＭａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ（コッカースパニエル）腎上皮細胞（ＭＤＣＫ）細胞であり得る。本明細書に記載の方法を使用して培養することができるさらなる哺乳動物細胞は、当技術分野で公知である。宿主細胞は、例えば、上皮細胞、内皮細胞、リンパ球、腎臓細胞、肺細胞、Ｔ細胞、骨髄腫細胞、又はＢ細胞であり得る。いくつかの宿主細胞は、懸濁細胞培養物又は接着細胞培養物中で増殖させることができる。
【０２１０】
哺乳類細胞株の生成方法
糖タンパク質の組換え発現に有用な哺乳動物細胞株を生成するための方法もまた、本明細書に提供される。
【０２１１】
糖タンパク質（例えば、本明細書に記載の又は当技術分野で公知の任意の組換えタンパク質）の組換え発現に有用な哺乳動物細胞株を生成する方法であって、（ａ）連続培養後の培養物から単一細胞サブクローン培養物を生成すること、及び許容できるトランスフェクション効率、無血清培地での細胞増殖率、及び組換えタンパク質発現を有するサブクローン培養物を選択すること（例えば、他の試験されたサブクローン培養物と比較して、最高のトランスフェクション効率、細胞増殖率、及び組換えタンパク質発現を有するサブクローン培養物を選択すること）；（ｃ）（ａ）で選択されたサブクローン培養物から単一細胞サブクローン培養物を生成すること；及び（ｄ）許容できるトランスフェクション効率、ピーク細胞密度（例えば、無血清培地でのピーク細胞密度）、増殖特性（例えば、無血清培地での増殖）、体積生産性（ＶＰＲ）、及び組換えタンパク質発現を有する（ｂ）で生成された単一細胞サブクローン培養物を選択すること、を含み、（ｃ）の選択されたサブクローンが、糖タンパク質の組換え発現に有用である（例えば、他の試験されたサブクローン培養物と比較して、最高のトランスフェクション効率、ピーク細胞密度、増殖特性、ＶＰＲ、及び組換えタンパク質発現）を有するサブクローン培養物）、方法も提供される。
【０２１２】
本明細書に記載される方法のいずれかによって産生される哺乳動物細胞又は哺乳動物細胞株もまた、本明細書に提供される。本明細書に記載の方法のいずれかで使用できる血清依存性不死化細胞株の非限定的な例としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、骨髄腫細胞、Ｂ細胞、ハイブリドーマ細胞、Ｔ細胞、ヒト胚性腎（ＨＥＫ）細胞、アフリカミドリザル腎上皮細胞（Ｖｅｒｏ）細胞、及びＭａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ（コッカースパニエル）腎上皮細胞（ＭＤＣＫ）細胞が挙げられる。本明細書に記載の方法のいずれかで使用できる他の血清依存性不死化細胞株は、当技術分野で公知である。例えば、血清依存性不死化細胞株は、上皮細胞株、内皮細胞株、リンパ球細胞株、腎臓細胞株、肺細胞株、Ｔ細胞株、骨髄腫細胞株、又はＢ細胞株であり得る。いくつかの例において、血清依存性不死化細胞株は、懸濁液中で増殖する。他の例において、血清依存性不死化細胞株は、接着細胞培養物中で増殖する。
【０２１３】
いくつかの例において、血清依存性不死化細胞株は、ジヒドロ葉酸レダクターゼを内因的に発現しない。選択されたサブクローン（方法において選択された第１又は第２のサブクローン）は、懸濁液中で増殖することができる。
【０２１４】
不死化された哺乳動物細胞株を培養する方法は、当技術分野で公知である。トランスフェクション効率、無血清培地での細胞増殖率、組換えタンパク質発現、ピーク細胞密度（例えば、ピーク生存細胞密度）、細胞増殖特性、体積生産性、及び産生された組換えタンパク質のグリコシル化プロファイル、を決定するための方法は、当技術分野で周知である。例えば、トランスフェクション効率は、細胞にトランスフェクトされた発現プラスミド中のレポーター遺伝子の発現レベルを検出することで決定することができる（例えば、そのようなレポーター遺伝子の発現は、蛍光アシスト細胞選別を使用して検出することができる）。組換えタンパク質の発現は、例えば、組織培養培地又は細胞内に存在する組換えタンパク質のレベルを、組換えタンパク質に特異的に結合する抗体を使用して検出することにより決定することができる。ピーク細胞密度及び細胞増殖率は、例えば、細胞培養物中の経時的な細胞密度（例えば、生存細胞密度）を測定（例えば、血球計又は他の市販の自動細胞計数器を使用して）することにより、評価することができる。細胞の体積生産性は、細胞培養培地中又は細胞内に経時的に存在する組換えタンパク質のレベルを評価することにより、当技術分野で公知の方法を使用して決定することができる。細胞によって産生された組換え糖タンパク質のグリコシル化プロファイルは、例えば、本明細書の実施例の項に記載されている方法（例えば、２−ａｎｔｈｉｌｉｃ酸（ＡＡ）誘導体化、及び蛍光検出を伴うＨＰＬＣ）のいずれかを使用して、決定することができる。
【０２１５】
当技術分野で周知のように、本明細書に記載の方法により産生される哺乳動物細胞株は、低温（例えば、−２０℃未満、−３０℃未満、−４０℃未満、−５０℃未満、−６０℃未満、−７０℃未満、又は−８０℃未満）で保存することができる。低温での保存のための哺乳動物細胞株のストックを調製する方法は、例えば、Ｈｅｗｉｔｔ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｌ．Ｂｉｏｌ．６４０：８３−１０５，２０１０，ａｎｄ  Ｐｈｅｌａｎ，Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．Ａｐｐｅｎｄｉｘ  ３  ：３Ｇ，２００６）に記載されている。いくつかの例において、本明細書に記載の方法により産生された哺乳動物細胞株は、（例えば、保存前及び／又は保存後に）血清含有及び／又は血清含有培地に曝露されない。いくつかの例において、本明細書に記載の方法により産生される哺乳動物細胞株は、動物由来成分（ＡＤＣ）を含まない培地中でのみ培養される。いくつかの例において、本明細書に記載の方法により産生される哺乳動物細胞株は、無血清、無タンパク質、既知組成の増殖培地中でのみ培養される。
【０２１６】
組換え糖タンパク質の産生方法
組換え糖タンパク質（例えば、組換えヒトα−ガラクトシダーゼ−Ａタンパク質、又は当技術分野で公知の任意の組換え糖タンパク質）を産生する方法もまた、本明細書に提供される。これらの方法は、本明細書に記載の方法のいずれかによって産生された哺乳動物細胞を提供すること、糖タンパク質（例えば、組換えヒトα−ガラクトシダーゼ−Ａタンパク質及び当技術分野で公知の他の糖タンパク質）をコードする配列を含む核酸（例えば、発現ベクター）を細胞に導入すること、糖タンパク質を産生するのに十分な条件下、無血清培地中で細胞を培養すること、及び細胞又は増殖培養培地から糖タンパク質を回収することを含む。また、本明細書に記載の方法のいずれかにより産生される組換え糖タンパク質（例えば、組換えヒトα−ガラクトシダーゼ−Ａタンパク質）も提供される。
【０２１７】
いくつかの場合において、糖タンパク質をコードする配列を含む核酸は、発現ベクター（例えば、本明細書に記載の発現ベクターのいずれか）である。他の例において、糖タンパク質をコードする配列を含む核酸は、哺乳動物細胞の染色体に組み込まれている。
【０２１８】
いくつかの例において、培養はバイオリアクターを使用して実施される。バイオリアクターは、例えば、約１Ｌ〜約１０，０００Ｌ（例えば、約１Ｌ〜約５０Ｌ、約５０Ｌ〜約５００Ｌ、約５００Ｌ〜約１０００Ｌ、５００Ｌ〜約５０００Ｌ、約５００Ｌ〜約１０，０００Ｌ、約５０００Ｌ〜約１０，０００Ｌ、約１Ｌ〜約１０，０００Ｌ、約ＩＬ〜約８，０００Ｌ、約１Ｌ〜約６，０００Ｌ、約１Ｌ〜約５，０００Ｌ、約１００Ｌ〜約５，０００Ｌ、約１０Ｌ〜約１００Ｌ、約１０Ｌ〜約４，０００Ｌ、約１０Ｌ〜約３，０００Ｌ、約１０Ｌ〜約２，０００Ｌ、又は約１０Ｌ〜約１，０００Ｌ）の容量を有し得る。バイオリアクター内に存在する液体培養培地の量は、例えば、約０．５Ｌ〜約５，０００Ｌ（例えば、約０．５Ｌ〜約２５Ｌ、約２５Ｌ〜約２５０Ｌ、約２５０Ｌ〜約５００Ｌ、２５０Ｌ〜約２５００Ｌ、約２５０Ｌ〜約５，０００Ｌ、約２５００Ｌ〜約５，０００Ｌ、約０．５Ｌ〜約５，０００Ｌ、約０．５Ｌ〜約４，０００Ｌ、約０．５Ｌ〜約３，０００Ｌ、約０．５Ｌ〜約２，５００Ｌ、約５０Ｌ〜約２，５００Ｌ、約５Ｌ〜約５０Ｌ、約５Ｌ〜約２，０００Ｌ、約５Ｌ〜約１，５００Ｌ、約５Ｌ〜約１，０００Ｌ、又は約５Ｌ〜約５００Ｌ）であり得る。細胞の培養は、例えば、流加バイオリアクター又は灌流バイオリアクターを使用して、実施することができる。培養は、流加培養又は灌流培養（例えば、バイオリアクター内）により実施することができる。
【０２１９】
当技術分野で知られているように、本明細書に記載のバイオリアクターのいずれかの内部表面、Ｏ２、ＣＯ２、及びＮ２を液体培養培地に散布するための１つ又は複数のポート、及び液体培養培地を撹拌するための撹拌機構。バイオリアクターは、制御された加湿雰囲気（例えば、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％を超える湿度、又は１００％の湿度）で細胞培養物をインキュベートできる。バイオリアクターはまた、バイオリアクターからある量の液体培養培地を除去することができる機械装置、及び任意選択により、バイオリアクターからの液体培養培地の輸送プロセス（例えば、交互接線流（ＡＴＦ）又は接線流濾過（ＴＦＦ）システム）中に液体培養培地から細胞を除去する機械装置内のフィルターを備えることもできる。培養は、バイオリアクター内の液体培養培地を最大で又は約１５％ＣＯ２（例えば、最大で若しくは約１４％ＣＯ２、１２％ＣＯ２、１０％ＣＯ２、８％ＣＯ２、６％ＣＯ２、５％ＣＯ２、４％ＣＯ２、３％ＣＯ２、２％ＣＯ２、又は最大で若しくは約１％ＣＯ２）を含む雰囲気に曝露することを含み得る。
【０２２０】
培養は、約３１℃〜約４０℃の温度で行うことができる。当業者であれば、培養中の特定の時点で、例えば、１時間ごと又は１日ごとに、温度を変更できることを理解するであろう。例えば、バイオリアクターに哺乳類細胞を最初に播種した後、約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、又は約２０日以上で、温度を変更又はシフト（例えば、増加又は減少）することができる。例えば、温度は上方にシフトすることができる（例えば、最大若しくは約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９℃、又は最大若しくは約２０℃の変化）。例えば、温度は下方にシフトすることができる（例えば、０．０５℃を超える、又は約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９℃、又は最大若しくは約２０℃の変化）。培養は、無タンパク質、無血清、既知組成の培地を使用して実施することができる。そのような培地の非限定的な例は、当技術分野で公知であり、市販されている。有用な培養培地の非限定的な例には、例えば、ＣＤ  ＣＨＯ、Ｏｐｔｉ  ＣＨＯ、及びＦｏｒｔｉ  ＣＨＯ（全てＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹから入手可能）、Ｈｙｃｅｌｌ  ＣＨＯ培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．；Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、Ｅｘ−ｃｅｌｌ  ＣＤ  ＣＨＯ  Ｆｕｓｉｏｎ培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）及びＰｏｗｅｒＣＨＯ培地（Ｌｏｎｚａ  Ｇｒｏｕｐ，Ｌｔｄ．；Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）が含まれる。
【０２２１】
哺乳動物細胞は、本明細書に記載の哺乳動物細胞のいずれかであり得る。例えば、哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞であり得る。哺乳動物細胞は、ジヒドロ葉酸還元酵素を内因的に発現しない細胞（例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素を内因的に発現しないＣＨＯ細胞）であり得る。
【０２２２】
組換え糖タンパク質は、酵素（例えば、ヒトα−ガラクトシダーゼ−Ａタンパク質又は当技術分野で公知の他の糖タンパク質）であり得る。いくつかの例において、核酸（例えば、発現ベクター）は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）同一である配列を含む。核酸（例えば、発現ベクター）は、糖タンパク質をコードする核酸の５’末端に作動可能に連結されたプロモーター配列、糖タンパク質をコードする核酸の５’末端に作動可能に連結されたＴＴＧ開始コドンを有するヒトＣＤ５２タンパク質のペプチドをコードする配列、及び糖タンパク質をコードする核酸の３’末端に作動可能に連結されたポリ（Ａ）認識部位をコードする配列を含み得る。例えば、プロモーター配列は、ハムスターｒｐＳ２１プロモーター、ハムスターβ−アクチンプロモーター、及びＳＶ４０初期プロモーターからなる群から選択することができる。ポリ（Ａ）認識部位をコードする配列は、ＳＶ４０初期ポリ（Ａ）認識配列であり得る。いくつかの例において、プロモーター配列は、ハムスターβ−アクチンプロモーターであり得、ポリ（Ａ）認識配列はＳＶ４０初期ポリ（Ａ）認識配列である。いくつかの例において、核酸は、ヒト又はイヌのグルタミン合成酵素をコードする配列（例えば、ここで、ヒト又はイヌのグルタミン合成酵素をコードする核酸の５’末端は、ＳＶ４０初期プロモーターに作動可能に連結され、ヒト又はイヌのグルタミン合成酵素をコードする核酸の３’末端は、ＳＶ４０の初期イントロン及びポリ（Ａ）シグナル配列に作動可能に連結されている）をさらに含む。いくつかの例において、核酸は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）（例えば、ヒト又はマウスＤＨＦＲ）をコードする配列（例えば、ここで、ジヒドロ葉酸還元酵素をコードする核酸の５’末端は、ＳＶ４０初期プロモーターに作動可能に連結され、ジヒドロ葉酸還元酵素をコードする核酸の３’末端は、ＳＶ４０の初期イントロン及びポリ（Ａ）シグナル配列に作動可能に連結されている）をさらに含む。
【０２２３】
培養は、灌流バイオリアクターを使用して実施することができる。灌流培養は、当技術分野で周知であり、バイオリアクターから第１の液体培養培地の第１の体積（例えば、任意の濃度の哺乳動物細胞、例えば、細胞を実質的に含まない第１の液体培養培地の第１の体積を含む）を除去すること、及び第２の液体培養培地の第２の体積を第１の液体培養培地に添加することを含む。除去及び添加は、同時に又は連続的に、又はその２つの組み合わせで実施することができる。さらに、除去及び添加は、連続的に（例えば、任意の所与の期間にわたり（例えば、２４時間にわたり、約１時間〜約２４時間の増加期間にわたり、又は２４時間を超える増加期間にわたり）、バイオリアクター容量又は第１の液体培地の体積の０．１％〜８００％（例えば、１％〜７００％、１％〜６００％、１％〜５００％、１％〜４００％、１％〜３５０％、１％〜３００％、１％〜２５０％、１％〜１００％、１００％〜２００％、５％〜１５０％、１０％〜５０％、１５％〜４０％、８％〜８０％、及び４％〜３０％）の体積を除去及び置換する速度で）、又は定期的に（例えば、３日ごとに１回、隔日で１回、１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、又は１日５回）、又はそれらの任意の組み合わせで実施され得る。定期的に実施される場合、（例えば、約２４時間以内、約１時間〜約２４時間の増加期間以内、又は２４時間を超える増加期間以内に）除去又は置換される体積は、例えば、バイオリアクター容量又は第１の液体培地の体積の０．１％〜８００％（例えば、１％〜７００％、１％〜６００％、１％〜５００％、１％〜４００％、１％〜３００％、１％〜２００％、１％〜１００％、１００％〜２００％、５％〜１５０％、１０％〜５０％、１５％〜４０％、８％〜８０％、及び４％〜３０％）であり得る。除去された第１の液体培養培地の第１の体積、及び添加された第２の液体培養培地の第２の体積は、いくつかの場合において、培養期間の全体又は一部にわたり、各２４時間（又は、代替的には、約１時間〜約２４時間の増加期間、又は２４時間を超える増加期間）にわたっておよそ同じに保たれ得る。当技術分野で公知であるように、第１の液体培養培地の第１の体積が除去される速度（体積／単位時間）及び第２の液体培養培地の第２の体積が添加される速度（体積／単位時間）は変えることができる。第１の液体培養培地の第１の体積が除去される速度（体積／単位時間）及び第２の液体培養培地の第２の体積が添加される速度（体積／単位時間）はほぼ同じであってもよく、異なっていてもよい。
【０２２４】
あるいは、除去される体積及び添加される体積は、培養期間中、各２４時間（又は代替的には、１時間〜約２４時間の増加期間、又は２４時間を超える増加期間）にわたって変化（例えば、徐々に増加）し得る。例えば、培養期間にわたり、各２４時間以内（又は代替的には、約１時間〜２４時間超の増加期間、又は２４時間を超える増加期間）に除去された第１の液体培養培地の第１の体積、及び添加された第２の液体培養培地の体積は、培養期間にわたり、バイオリアクター容量又は第１の液体培養培地の体積の０．５％〜約２０％である体積からバイオリアクター容量又は第１の液体培養培地の体積の約２５％〜約１５０％まで増加され得る（例えば、徐々に、又はずらした増分で）。
【０２２５】
当業者であれば、第１の液体培養培地及び第２の液体培養培地が同じタイプの培地（例えば、無血清又は無血清、無タンパク質の既知組成培地）であり得ることを理解するであろう。他の例において、第１の液体培地と第２の液体培地とは異なり得る。
【０２２６】
第１の液体培養培地の第１の体積は、例えば、機械的システムを使用して、及び／又は体積中に存在する哺乳動物細胞を排除する分子量カットオフを有する滅菌膜を通る体積の浸透又は重力流によって、除去することができる。第２の液体培地の第２の体積は、例えば灌流ポンプにより自動化された方法で、第１の液体培地に添加され得る。いくつかの場合において、第１の液体培養培地の第１の体積（例えば、哺乳動物細胞を実質的に含まない第１の液体培養培地の第１の体積）を除去し、第２の液体培養培地の第２の体積を第１の液体培養培地に添加することは、バイオリアクターへの哺乳動物細胞の播種の少なくとも１時間以内（例えば、２時間以内、３時間以内、４時間以内、５時間以内、６時間以内、７時間以内、８時間以内、９時間以内、１０時間以内、１２時間以内、１４時間以内、１６時間以内、１８時間以内、２４時間以内、３６時間以内、４８時間以内、７２時間以内、９６時間以内、又は９６時間後）には発生しない。
【０２２７】
あるいは、又はさらに、流加バイオリアクターを使用して培養を実施することができる。そのような培養は、当技術分野で公知であり、培養期間の大部分にわたって、第２の液体培養培地の第２の体積の第１の液体培養培地への添加（例えば、定期的又は連続的添加）を含む。第２の液体培養培地の添加は、連続的に（例えば、任意の所与の期間にわたり（例えば、２４時間にわたり、約１時間〜約２４時間の増加期間にわたり、又は２４時間を超える増加期間にわたり）、バイオリアクター容量又は第１の液体培地の体積の０．１％〜３００％（例えば、１％〜２５０％、１％〜１００％、１００％〜２００％、５％〜１５０％、１０％〜５０％、１５％〜４０％、８％〜８０％、及び４％〜３０％）の体積を添加する速度で）、又は定期的に（例えば、３日ごとに１回、隔日で１回、１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、又は１日５回）、又はそれらの任意の組み合わせで実施され得る。定期的に実施される場合、（例えば、約２４時間以内、約１時間〜約２４時間の増加期間以内、又は２４時間を超える増加期間以内に）添加される体積は、例えば、バイオリアクター容量又は第１の液体培地の体積の０．１％〜３００％（例えば、１％〜２００％、１％〜１００％、１００％〜２００％、５％〜１５０％、１０％〜５０％、１５％〜４０％、８％〜８０％、及び４％〜３０％）であり得る。添加された第２の液体培養培地の第２の体積は、いくつかの場合において、培養期間の全体又は一部にわたり、各２４時間（又は、代替的には、約１時間〜約２４時間の増加期間、又は２４時間を超える増加期間）にわたっておよそ同じに保たれ得る。当技術分野で公知であるように、第２の液体培養培地の第２の体積が添加される速度（体積／単位時間）は、培養期間の全体又は一部にわたって変えることができる。例えば、添加される第２の液体培地の体積は、培養期間中、各２４時間（又は代替的には、１時間〜約２４時間の増加期間、又は２４時間を超える増加期間）にわたって変化（例えば、徐々に増加）し得る。例えば、培養期間にわたり、各２４時間以内（又は代替的には、約１時間〜２４時間超の増加期間、又は２４時間を超える増加期間）に添加された第２の液体培養培地の体積は、培養期間にわたり、バイオリアクター容量又は第１の液体培養培地の体積の０．５％〜約２０％である体積からバイオリアクター容量又は第１の液体培養培地の体積の約２５％〜約１５０％まで増加され得る（例えば、徐々に、又はずらした増分で）。第２の液体培養培地の第２の体積が添加される速度（体積／単位時間）は、培養期間の全体又は一部にわたってほぼ同じであり得る。
【０２２８】
当業者であれば、第１の液体培養培地及び第２の液体培養培地が同じタイプの培地（例えば、無タンパク質の培養培地、又は無血清、無タンパク質の既知組成培地）であり得ることを理解するであろう。他の例において、第１の液体培地は、第２の液体培地とは異なるタイプのものであり得る。第２の液体培地の体積は、例えば灌流ポンプにより自動化された方法で、第１の液体培地に添加され得る。
【０２２９】
いくつかの場合において、バイオリアクターへの哺乳動物細胞の播種後、少なくとも１時間後であるが、７日を超えない時まで（バイオリアクターへの哺乳動物細胞の播種後、少なくとも２時間以内、３時間以内、４時間以内、５時間以内、６時間以内、７時間以内、８時間以内、９時間以内、１０時間以内、１２時間以内、１４時間以内、１６時間以内、１８時間以内、２４時間以内、３６時間以内、４８時間以内、７２時間以内、９６時間以内、又は９６時間後であるが、７日を超えない時まで）は、第１の液体培養培地への第２の液体培地の第２の体積の添加は発生しない。流加培養物中の細胞培養培地は、典型的には培養期間の終わりに回収されるが、流加培養物中の細胞培養培地は、培養期間中の１つ以上の時点で回収することもできる。
【０２３０】
当業者であれば、これらの方法を実施するにおいて、本明細書に引用された培養のための様々なパラメータのいずれか（例えば、バイオリアクター、容量、培養物体積を置換する速度又は頻度、攪拌、温度、培養培地、及び／又はＣＯ２濃度）を、任意の組み合わせで使用できることを理解するであろう。
【０２３１】
組換え糖タンパク質を単離するさらなるステップを実施することができる。当技術分野で周知であるように、そのような方法は、糖タンパク質の物理的特性及び活性に応じて異なる。例えば、糖タンパク質の結合特異性（例えば、基質又は抗原結合活性）、正味電荷、及び／又はサイズなどのパラメータは、組換え糖タンパク質を（例えば、培地又は細胞から）単離するためのステップを設計する際に考慮すべきである。以下の方法：親和性カラムクロマトグラフィー、イオン（例えば、カチオン又はアニオン）交換カラムクロマトグラフィー、サイズ排除カラムクロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー、濾過、沈殿、のいずれか１つ以上を使用して、組換え糖タンパク質（例えば、本明細書に記載の方法のいずれかを使用して産生された組換え糖タンパク質）を単離することができる。組換えヒトα−ガラクトシダーゼ−Ａタンパク質を単離するための非限定的な方法は、実施例に記載されている。
【０２３２】
本明細書に記載の方法は、単離された組換え糖タンパク質を薬学的に許容される賦形剤又は緩衝液中（例えば、対象への投与用）に製剤化することをさらに含み得る。これらの方法は、滅菌濾過、ウイルス不活性化、ＵＶ照射、及び／又は凍結乾燥、又はそれらの任意の組み合わせをさらに含み得る。
【０２３３】
ｒｈα−Ｇａｌ  Ａの産生、捕捉、精製
典型的な細胞製造プロセスは、マスター細胞バンクからの凍結保存された細胞の復活から始まる。細胞は小容量バイアル中で解凍され、漸次、より大容量の培養容器に導入されて、シードバイオリアクターへの接種が達成される。次に、シードバイオリアクター内の拡大した細胞集団は、治療用タンパク質が発現される産生バイオリアクターに導入される。
【０２３４】
最適な細胞増殖率、生存率、タンパク質収量、治療用タンパク質の重要な品質属性の維持などの要因に基づいて経験的に決定されたリアクターの選択を備えたリアクターには多くのタイプがある。バッチ、流加、バッチ再フィード又は断続的回収、及び灌流は、現在最も頻繁に使用されるバイオリアクターである。
【０２３５】
バッチ培養は、産生の開始時に培地及び細胞が添加され、産生の実行が終了するまで他の添加なしで培養される、閉鎖系である。細胞の増殖は、誘導期、指数増殖期、定常期、死期の４つの段階で進行する。
【０２３６】
流加細胞培養中、細胞培養成分が枯渇したときにフィード溶液が添加される。フィード溶液は、アミノ酸、ビタミン、及び微量元素を濃縮形態で含有する。したがって、流加培養では、フィード溶液の逐次添加ごとに培養物の量が増加する。
【０２３７】
バッチ再フィード又は断続的回収培養では、培養栄養が枯渇し、細胞が定常期に入ったときに、細胞培養物の一部（細胞を含む）が除去される。回収は２〜４日ごとなど頻繁に実施できるため、この回収方法は不安定なタンパク質に有用である。
【０２３８】
培養物中の細胞は、指数期に高いエネルギーを必要とし、急速にグルコースを乳酸に変換する。高乳酸レベルは細胞の増殖及び生産性に有害である。したがって、産物の品質を確保するためには、乳酸を厳密に制御しなければならない。グルコースのガラクトース又はマンノースへの置換は、これらの糖がより緩徐に代謝されるため、乳酸の蓄積を軽減し得る。増殖動態、細胞生存率、及びタンパク質産生に影響するその他の培養パラメータは、ｐＨ、温度、溶存酸素である。
【０２３９】
初期細胞増殖後、灌流細胞培養では、新鮮な培養培地の添加、及びタンパク質産物を含有する使用済み培養培地の同時除去により、細胞は定常状態に保たれる。培養培地は連続的に補充されるため、バッチ培養よりも灌流培養による方が高い細胞密度が可能である。細胞は培養物中に保持され、産物を含有する使用済み培地は除去される。細胞密度を生産的範囲内に保つために、細胞を含むいくらかの培地が定期的に除去される。灌流培養は、連続プロセスにも適合する。
【０２４０】
生物学的薬剤の産生では、１つの均一なタンパク質ではなく、生物学的プロセスの複雑さを反映した様々なアイソフォームが生成される。グリコシル化、リン酸化、硫酸化、アミド化、酸化、付加物形成、ピログルタメート形成及び異性化を含むタンパク質の変動が生じ得る。アミノ酸突然変異は、遺伝子変異、アミノ酸の誤取り込み、クリッピング、及びＮ末端とＣ末端の不均一性から生じ得る。構造の多様性は、ミスフォールド、凝集、及びジスルフィドスクランブルを含み得る。
【０２４１】
製造中に導入された不純物もまた、タンパク質の安定性、毒性、及び有効性に影響を与え得る。このタイプの不純物には、宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、培地要素、及びウイルス成分が含まれる。
【０２４２】
細胞から分泌されるように設計されたタンパク質は、小胞体を介した転座時にシグナルペプチダーゼによって切断されるシグナル配列を有する。タンパク質変異体は、シグナル配列の切断の不一致によって生成される。Ｎ末端グルタミン酸又はグルタミンは、環化してピログルタメートを形成する。これは、生物学的機能に影響を与え得る、又は与え得ない、タンパク質の遮断につながる。
【０２４３】
タンパク質上に表れる２つの主要なグリコシル化のタイプは、Ｎ結合及びＯ結合グリコシル化である。上記のように、α−ガラクトシダーゼＡはモノマーサブユニット上に４つの潜在的なＮ結合グリコシル化部位を有し、そのうち３つは、典型的にはグリコシル化されている。グリコシル化は、コンセンサス配列ＡＳＮ−Ｘ−ＳＥＲ／ＴＨＲで起こり、ここで、Ｘはヒスチジン又はプロリン以外の任意のアミノ酸である。細胞株は、グリコシル化部位に組み込まれた糖の種類、並びに培養条件及びタンパク質の下流処理に大きな影響を有する。
【０２４４】
システインは比較的反応性の高いアミノ酸であり、不対システインは細胞内や培地内で他のスルフヒドリル基と問題を起こすような方法で反応するか、又はサブユニット内又はサブユニット間結合の形成を引き起こす。
【０２４５】
タンパク質はまた、プロテアーゼ、グリコシダーゼ、及びホスファターゼの制御されない作用の結果として、分解されるか、不良な産物特性を有し得る。
【０２４６】
種々の実施形態において、１つ以上のアニオン交換（ＡＥＸ）カラムを含むタンパク質捕捉システムは、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ、特に高いＭ６Ｐ含有量、高いシアル酸含有量、及び低い中性グリカン含有量を有するｒｈα−Ｇａｌ  Ａの直接的産物捕捉に使用される。特定の理論に縛られることを望まないが、ＡＥＸクロマトグラフィーを使用して濾過された培地からｒｈα−Ｇａｌ  Ａを捕捉することにより、１つ以上のＭ６Ｐ基及び／又はシアル酸基を有する組換えタンパク質のより多い負電荷によって、捕捉された組換えタンパク質産物がより高いＭ６Ｐ含有量及びより高いシアル酸含有量を有することが保証されるものと考えられる。その結果、非リン酸化組換えタンパク質及び宿主細胞の不純物は、高リン酸化組換えタンパク質と同様にカラム樹脂に結合せず、非リン酸化組換えタンパク質及び宿主細胞の不純物はカラムを通過する。従って、ＡＥＸクロマトグラフィーは、ＡＥＸ樹脂に対するＭ６Ｐ含有タンパク質の高い親和性によって、タンパク質産物のＭ６Ｐ含有量を濃縮する（すなわち、より多くのＭ６Ｐを有するタンパク質分子を選択する）ために使用できる。同様に、ＡＥＸクロマトグラフィーは、ＡＥＸ樹脂に対するシアル酸含有タンパク質の親和性によって、タンパク質産物のシアル酸含有量を濃縮する（すなわち、より多くのシアル酸を有するタンパク質分子を選択する）ために使用できる。
【０２４７】
さらに、特定の理論に縛られることを望まないが、ＡＥＸクロマトグラフィーを使用した組換えタンパク質の直接的産物捕捉を行うことで、高いＭ６Ｐ含有量を有する組換えタンパク質が、プロテアーゼ、及びタンパク質の分解及び／又はタンパク質の脱リン酸化が可能な他の酵素を含む培地から除去されることが保証されるものとも考えられる。その結果、高品質の産物が確保される。
【０２４８】
ＡＥＸカラムへの強い結合により、望ましい３つの産物特性：リン酸化酵素、適切にシアリル化された酵素、及び中性グリカンの含有量が低い酵素、が確認される。生理的ｐＨにおいて、リン酸化及びシアリル化は負の電荷を付与し、ＡＥＸカラムへの結合に寄与する。モノ−Ｍ６Ｐ及び／又はビス−Ｍ６Ｐを有する酵素は、ＣＩＭＰＲに結合し、これは次いで酵素をリソソーム（酵素作用部位）に標的化する。適切にシアル化された組換え酵素も、血中でより長い半減期を示す。これは、アシアロ糖タンパク質受容体（大部分が肝細胞に位置する）がタンパク質上の露出したガラクトース残基に結合し、循環からタンパク質を除去するためである。末端糖残基上のシアル酸は、ガラクトースに基づくこの除去機構を遮断する。
【０２４９】
ＡＥＸカラムにおける精製では、細胞培養物上清にこのような特性を有する分子が存在する場合、中性グリカンの含有量が低い、リン酸化／シアリル化酵素が選択される。ＣＩＭＰＲへの結合は、酵素調製物を固定化ＣＩＭＰＲに結合させ、その後、増加する濃度のＭ６Ｐで溶出することにより評価することができる。
【０２５０】
したがって、本発明の１つ又は複数の実施形態は、本明細書に記載の方法によって産生されるｒｈα−Ｇａｌ  Ａなどの、特定レベルの表面モノ−Ｍ６Ｐ及び／又はビス−Ｍ６Ｐ及び／又はシアル酸及び／又は低含有量の中性グリカンを有する組換えα−Ｇａｌ  Ａに関する。そのような方法によって産生されるｒｈα−Ｇａｌ  Ａは、本明細書に記載される特徴のいずれかを有し得る。
【０２５１】
また、本明細書に記載のクロマトグラフィー技術を利用して、細胞上清中に最初から存在する酵素分子と比較して、酵素分子のモノ−Ｍ６Ｐ及び／又はビス−Ｍ６Ｐ及び／又はシアル酸含有量を富化することができる。上記のように、ＡＥＸカラムを使用して、高リン酸化含有量、高シアル酸含有量、低中性グリカン含有量を有する酵素分子を選択することができる。ＣＩＭＰＲカラムなどの他のカラムを使用して、モノ−Ｍ６Ｐ及びビス−Ｍ６Ｐを高含有量で含む酵素を選択的に結合することができる。したがって、宿主細胞が最初からリプレガル（アガルシダーゼアルファ）又はファブラザイム（アガルシダーゼベータ）などの従来の組換えヒトα−ガラクトシダーゼＡ産物に類似したグリカン含有量を有する酵素分子を発現している場合でも、産物の捕捉及び精製中にＡＥＸ及びＣＩＭＰＲカラムを使用することで、細胞上清に最初から存在する酵素分子と比較して、最終組換えタンパク質産物中のモノ−Ｍ６Ｐ及び／又はビス−Ｍ６Ｐ及び／又はシアル酸の含有量を富化し、及び／又は酵素分子の中性グリカン含有量を下げることができる。
【０２５２】
薬理学的シャペロン
ミガラスタト塩酸塩（ＨＣｌ）は、α−Ｇａｌ  Ａの薬理学的シャペロンとして作用する低分子量イミノ糖である。これは、基質のグロボトリアオシルセラミド（ＧＬ−３）から切断される末端ガラクトース基の類似体である。薬理学的シャペロンは、目的のタンパク質標的に結合し、それを安定化して、タンパク質から解離する前に適切な細胞内輸送を回復するのを助けるように設計されており、それにより、リソソーム内で意図した通りに機能できるようにする。このように、ミガラスタトＨＣｌは、強力且つ可逆的なα−Ｇａｌ  Ａの競合阻害剤である。これは、α−Ｇａｌ  Ａの変異体及び野生型に結合し、酵素を安定化し、それにより、リソソームへの適切な輸送のために、正しく折り畳まれたタンパク質が小胞体を通過できるようにする。
【０２５３】
ＥＲＴはリソソームの酸性環境でより安定であるため、血液の比較的中性のｐＨは、酵素補充療法で使用されるリソソームに適応した酵素に適さない環境を呈する。その結果、投与されたＥＲＴの一部が変性し、これはタンパク質に対して指向される免疫応答をプライミングする抗原となる。少なくとも、変性酵素は非有効経路を介して血流から除去される。ミガラスタトは血流中の野生型α−Ｇａｌ  Ａ  ＥＲＴに結合し、より高い活性及びＣＩＭＰＲを介したリソソームへのより大きい取り込みを有する安定化酵素をもたらす。リソソームに蓄積された低ｐＨ及び高濃度の基質は、ミガラスタトＨＣｌの解離を促進し、α−Ｇａｌ  ＡがＧＬ−３に結合しＧＬ−３を分解することを可能にする。
【０２５４】
１つ以上の実施形態において、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａは、ミガラスタトなどの薬理学的シャペロンと共製剤化される。
【０２５５】
１つ以上の実施形態において、共製剤組成物は、約０．０５〜約１００μＭ、又は約０．１〜約７５μＭ、又は約０．２〜約５０μＭ、又は約０．３〜約４０μＭ、又は約０．４〜約３０μＭ、又は約０．５〜約２０μＭ、又は約０．６〜約１５μＭ、又は約０．７〜約１０μＭ、又は約０．８〜約９μＭ、又は約０．９〜約８μＭ、又は約１〜約７μＭ、又は約２〜約６μＭ、又は約３〜約５μＭの濃度でα−Ｇａｌ  Ａを含む。上記の濃度の中間の濃度及び範囲もまた、本出願の一部であることが意図される。
【０２５６】
１つ以上の実施形態において、共製剤組成物は、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、又は１５μＭの濃度でα−Ｇａｌ  Ａを含む。
【０２５７】
１つ以上の実施形態において、共製剤組成物は、約０．００２５〜約５ｍｇ／ｍｌ、又は約０．００５〜約４．５ｍｇ／ｍｌ、又は約０．０２５〜約４ｍｇ／ｍｌ、又は約０．０５〜約３．５ｍｇ／ｍｌ、又は約０．２５〜約３ｍｇ／ｍｌ、又は約０．５〜約２．５ｍｇ／ｍｌ、又は約０．７５〜約２ｍｇ／ｍｌ、又は約１〜約１．５ｍｇ／ｍｌの濃度でα−Ｇａｌ  Ａを含む。上記の濃度の中間の濃度及び範囲もまた、本出願の一部であることが意図される。
【０２５８】
１つ以上の実施形態において、共製剤組成物は、約１０〜約２５，０００μＭ、又は約５０〜約２０，０００μＭ、又は約１００〜約１５，０００μＭ、又は約１５０〜約１０，０００μＭ、又は約２００〜約５，０００μＭ、又は約２５０〜約１，５００μＭ、又は約３００〜約１，０００μＭ、又は約３５０〜約５５０μＭ、又は約４００〜約５００μＭの濃度でミガラスタト又はその塩を含む。上記の濃度の中間の濃度及び範囲もまた、本出願の一部であることが意図される。
【０２５９】
１つ以上の実施形態において、共製剤組成物は、約０．００２〜約５ｍｇ／ｍｌ、又は約０．００５〜約４．５ｍｇ／ｍｌ、又は約０．０２〜約４ｍｇ／ｍｌ、又は約０．０５〜約３．５ｍｇ／ｍｌ、又は約０．２〜約３ｍｇ／ｍｌ、又は約０．５〜約２．５ｍｇ／ｍｌ、又は約１〜約２ｍｇ／ｍｌの濃度でミガラスタト又はその塩を含む。上記の濃度の中間の濃度及び範囲もまた、本出願の一部であることが意図される。
【０２６０】
１つ以上の実施形態において、共製剤組成物は、約５０；１００；１５０；２００；２５０；３００；３５０；４００；４５０；５００；５５０；６００；６５０；７００；７５０；８００；８５０；９００；９５０；１，０００；２，０００；３，０００；４，０００；５，０００；６，０００；７，０００；８，０００；９，０００；１０，０００；１１，０００；１２，０００；１３，０００；１４，０００；１５，０００；１６，０００；１７，０００；１８，０００；１９，０００又は２０，０００μＭの濃度でミガラスタト又はその塩を含む。
【０２６１】
１つ以上の実施形態において、α−Ｇａｌ  Ａ酵素とミガラスタト（又はその塩）を組み合わせて、ミガラスタト対α−Ｇａｌ  Ａ酵素のモル比約１０：１〜約２０，０００：１；又は約２０：１〜約１５，０００：１；又は約５０：１〜約１０，０００：１；又は約１００：１〜約５，０００：１；又は約１５０：１〜約１，０００：１；又は約２００：１〜約５００：１；又は約２５０：１〜約４５０：１；又は約３００：１〜約４００：１を有する共製剤を作成する。上記のモル比の中間のモル比及び範囲もまた、本出願の一部であることが意図される。
【０２６２】
処置方法
本発明は、それを必要とする患者におけるファブリー病を処置する方法を提供し、方法は、本明細書に記載のｒｈα−Ｇａｌ  Ａを患者に投与すること、又は細胞を本明細書に記載のｒｈα−Ｇａｌ  Ａと接触させることを含む。１つ以上の実施形態において、ｒｈα−Ｇａｌ  ＡはＣＨＯ細胞で発現し、リプレガル（アガルシダーゼアルファ）又はファブラザイム（アガルシダーゼベータ）の１つ又は２つのＭ６Ｐ残基を有するＮ−グリカン単位の含有量と比較して増加した含有量の、１つ又は２つのＭ６Ｐ残基を有するＮ−グリカン単位、及び／又は実質的により少ない量の中性グリカンを含む。ｒｈα−Ｇａｌ  Ａを産生する細胞株、発現条件、精製方法は全て、非生産的なターゲティングを最小限に抑え、生産的な標的細胞への取り込みを最大化するグリコシル化タンパク質を有することの潜在的な利点を最大化するために、注意深く選択、評価、精査された。
【０２６３】
本発明は、それを必要とする患者のファブリー病を処置する方法も提供し、方法は、薬理学的シャペロン（例えば、ミガラスタト又はその塩）又はその薬学的に許容される塩を本明細書に記載のｒｈα−Ｇａｌ  Ａと組み合わせて患者に投与することを含む。１つ以上の実施形態において、ｒｈα−Ｇａｌ  ＡはＣＨＯ細胞で発現し、リプレガル（アガルシダーゼアルファ）又はファブラザイム（アガルシダーゼベータ）の１つ又は２つのＭ６Ｐ残基を有するＮ−グリカン単位の含有量と比較して増加した含有量の、１つ又は２つのＭ６Ｐ残基を有するＮ−グリカン単位、及び実質的により少ない量の中性グリカンを含む。別の態様では、本発明は、それを必要とする患者におけるファブリー病の処置のための薬理学的シャペロン（例えば、ミガラスタト又はその塩）及びｒｈα−Ｇａｌ  Ａの組み合わせの使用を提供する。
【０２６４】
本発明はまた、必要とする患者の臓器におけるＧＬ−３のレベルを低下させる方法も提供し、方法は、治療有効量のｒｈα−Ｇａｌ  Ａを含む組成物を、任意選択により薬理学的シャペロンと組み合わせて、患者に投与することを含む。１つ以上の実施形態において、臓器は心臓、腎臓又は皮膚である。
【０２６５】
本発明はまた、ファブリー病を処置する方法も提供し、方法は、哺乳動物細胞を有効量のｒｈα−Ｇａｌ  Ａと、任意選択により薬理学的シャペロンと組み合わせて、接触させることを含み、ここで、細胞をｒｈα−Ｇａｌ  Ａと接触させることは、ファブラザイム（アガルシダーゼベータ）と接触させることよりも大きいＧＬ−３の減少をもたらす。１つ以上の実施形態において、接触は、対象に有効量のｒｈα−Ｇａｌ  Ａを投与することである。
【０２６６】
本発明はまた、ファブリー病を処置する方法も提供し、方法は、哺乳動物細胞を有効量のｒｈα−Ｇａｌ  Ａと、任意選択により薬理学的シャペロンと組み合わせて、接触させることを含み、ここで、細胞をｒｈα−Ｇａｌ  Ａと接触させることは、ファブラザイム（アガルシダーゼベータ）と接触させることよりも大きい血漿ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の減少をもたらす。１つ以上の実施形態において、接触は、対象に有効量のｒｈα−Ｇａｌ  Ａを投与することである。
【０２６７】
本発明はまた、ファブリー病を処置する方法も提供し、方法は、有効量のｒｈα−Ｇａｌ  Ａを、任意選択により薬理学的シャペロンと組み合わせて、患者に投与することを含み、ここで、細胞をｒｈα−Ｇａｌ  Ａと接触させることは、ファブラザイム（アガルシダーゼベータ）と接触させることよりも大きい１つ以上の基質の減少をもたらす。１つ以上の実施形態において、接触は、対象に有効量のｒｈα−Ｇａｌ  Ａを投与することである。１つ以上の実施形態において、基質は、ＧＬ−３及び／又は血漿ｌｙｓｏ−Ｇｂ３を含む。
【０２６８】
本発明はまた、哺乳動物細胞のリソソームにおけるα−ガラクトシダーゼ−Ａタンパク質の活性レベルを増強する方法も提供し、方法は、哺乳動物細胞をｒｈα−Ｇａｌ  Ａと、任意選択により薬理学的シャペロンと組み合わせて、接触させることを含む。１つ以上の実施形態において、接触は、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ及び任意選択により薬理学的シャペロンの投与により実施される。１つ以上の実施形態において、細胞はインビトロにある。
【０２６９】
上記の方法のいずれにおいても、細胞は対象内にあり得る。１つ以上の実施形態において、細胞は対象の心臓に位置する。１つ以上の実施形態において、細胞は対象の腎臓に位置する。１つ以上の実施形態において、細胞は対象の皮膚に位置する。少なくとも１つの実施形態において、薬理学的シャペロン（例えば、ミガラスタト又はその塩）は経口投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミガラスタト又はその塩は、約１００ｍｇ〜約４００ｍｇの経口用量で、又は約１００ｍｇ、約１５０ｍｇ、約２００ｍｇ、約２５０ｍｇ若しくは約３００ｍｇの経口用量で投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミガラスタト又はその塩は、約２３３ｍｇ〜約４００ｍｇの経口用量で投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミガラスタト又はその塩は、約２５０〜約２７０ｍｇの経口用量で、又は約２５０ｍｇ、約２５５ｍｇ、約２６０ｍｇ、約２６５ｍｇ若しくは約２７０ｍｇの経口用量で投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミガラスタト又はその塩は、約２６０ｍｇの経口用量として投与される。
【０２７０】
少なくとも１つの実施形態において、薬理学的シャペロン（例えば、ミガラスタト又はその塩）は、静脈内など、全身投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミガラスタト又はその塩は、約１００ｍｇ〜約４００ｍｇの静脈内用量で、又は約１００ｍｇ、約１２３ｍｇ、約１５０ｍｇ、約２００ｍｇ、約２５０ｍｇ、約３００ｍｇ、約３５０ｍｇ、若しくは約４００ｍｇの静脈内用量で投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミガラスタト又はその塩は、約２３３ｍｇ〜約４００ｍｇの静脈内用量で投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミガラスタト又はその塩は、約２５０〜約２７０ｍｇの静脈内用量で、又は約２５０ｍｇ、約２５５ｍｇ、約２６０ｍｇ、約２６５ｍｇ若しくは約２７０ｍｇの静脈内用量で投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミガラスタト又はその塩は、約２６０ｍｇの静脈内用量として投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミガラスタト又はその塩は、約０．３ｍｇ／ｋｇ〜約３００ｍｇ／ｋｇの静脈内用量で、又は約１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの静脈内用量で投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミガラスタト又はその塩は、約１ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約３．５ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約３５ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ、約７０ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ、約９０ｍｇ／ｋｇ又は約１００ｍｇ／ｋｇの静脈内用量で投与される。
【０２７１】
少なくとも１つの実施形態において、薬理学的シャペロン（例えば、ミガラスタト又はその塩）は皮下投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミガラスタト又はその塩は、約１００ｍｇ〜約４００ｍｇの皮下用量で、又は約１００ｍｇ、約１２３ｍｇ、約１５０ｍｇ、約２００ｍｇ、約２５０ｍｇ、約３００ｍｇ、約３５０ｍｇ、若しくは約４００ｍｇの皮下用量で投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミガラスタト又はその塩は、約２３３ｍｇ〜約４００ｍｇの皮下用量で投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミガラスタト又はその塩は、約２５０〜約２７０ｍｇの皮下用量で、又は約２５０ｍｇ、約２５５ｍｇ、約２６０ｍｇ、約２６５ｍｇ若しくは約２７０ｍｇの皮下用量で投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミガラスタト又はその塩は、約２６０ｍｇの皮下用量として投与される。
【０２７２】
平均体重が約７０ｋｇの成人患者の場合、約１００ｍｇ〜４００ｍｇの範囲又は任意のそれより小さい範囲のミガラスタトの経口用量が適し得ることが、当業者に理解されよう。乳児、小児又は低体重の成人を含むがこれらに限定されない、体重が約７０ｋｇよりも著しく低い患者については、医師によって、より少ない用量が適切であると見なされ得る。したがって、少なくとも１つの実施形態において、ミガラスタト又はその塩は、約２５ｍｇ〜約２００ｍｇの経口用量として、又は約５０ｍｇ、約７５ｍｇ、約１００ｍｇ、１２５ｍｇ、約１５０ｍｇ、約１７５ｍｇ又は約２００ｍｇの経口用量として投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミガラスタト又はその塩は、約６５ｍｇ〜約１９５ｍｇの経口用量として、又は約６５ｍｇ、約１３０ｍｇ若しくは約１９５ｍｇの経口用量として投与される。
【０２７３】
ｒｈα−Ｇａｌ  Ａは、ヒトへの投与に適合した医薬組成物として通常の手順に従って製剤化し得る。例えば、好ましい実施形態において、静脈内投与のための組成物は、滅菌等張水性緩衝液中の溶液である。必要に応じて、組成物はまた、可溶化剤、及び注射部位において痛みを和らげるための局所麻酔剤を含み得る。一般に、成分は、別個に供給されるか、又は単位剤形中で一緒に混合されて、例えば、又は活性物質の量を示すアンプル又はサシェなどの密閉容器中の凍結乾燥粉末又は水を含まない濃縮物として供給される。組成物が注入によって投与される場合、医薬グレードの滅菌水、生理食塩水又はデキストロース／水を含有する注入ボトルで分注し得る。組成物が注射によって投与される場合、投与前に成分が混合され得るように、注射用滅菌水又は生理食塩水のアンプルが提供され得る。
【０２７４】
ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ（又はｒｈα−Ｇａｌ  Ａを含有する組成物又は医薬品）は、適切な経路で投与される。１つ以上の実施形態において、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａは全身投与される。一実施形態において、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａは静脈内投与される。他の実施形態において、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａは、心臓若しくは骨格筋（例えば、筋肉内）又は神経系（例えば、脳への直接注射；脳室内；髄腔内）などの標的組織への直接投与によって投与される。必要に応じて、複数の経路を同時に使用できる。
【０２７５】
ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ（又はｒｈα−Ｇａｌ  Ａを含有する組成物又は医薬）は、治療有効量（例えば、定期的に投与された場合、疾患に関連する症状を改善すること、疾患の発症を予防又は遅延させること、及び／又は疾患の症状の重症度又は頻度を軽減することなどにより、疾患を処置するのに十分な投与量）で投与される。疾患の処置における治療上有効量は、性質及び疾患の影響の程度に依存し、標準的な臨床技術によって決定し得る。さらに、インビトロアッセイ又はインビボアッセイを、任意選択により、最適な投与量範囲の同定を促進するために使用し得る。使用される正確な用量は、投与経路及び疾患の重症度にも依存し、施術者の判断及び各患者の状況に従って決定されるべきである。有効用量は、インビトロ又は動物モデル試験系から誘導された用量応答曲線から外挿し得る。少なくとも１つの実施形態において、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａは、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、典型的には約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内注入によって投与される。少なくとも１つの実施形態において、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａは、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１．０ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２．０ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約３．５ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ又は約１０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内注入によって投与される。特定の個体の有効用量は、個体の必要性に応じて、経時的に変化させる（例えば、増加又は減少させる）ことができる。例えば、身体疾患若しくはストレスを有する時、又は抗αガラクトシダーゼＡ抗体が存在するようになったか若しくは増加する場合、又は疾患の症状が悪化する場合、低減した効果に対抗するために量を増加させるか、輸注反応により引き起こされる合併症を軽減するために減少させることができる。
【０２７６】
ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ（又はｒｈα−Ｇａｌ  Ａを含有する組成物又は医薬）の治療有効量は、性質及び疾患の影響の程度に依存して定期的に、及び継続的に投与される。本明細書で使用される場合、「定期的」な投与は、治療有効量が周期的に投与されることを示す（１回投与とは区別される）。間隔は、標準的な臨床技術によって決定することができる。好ましい実施形態において、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａは毎月、隔月；毎週；毎週２回；又は毎日投与される。あるいは、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａは、任意の適合性のある経路を介して略連続的又は連続的な投与を提供する医療機器の助けを借りて投与される。単一の個体に対する投与間隔は、一定間隔である必要はなく、個体の必要性に応じて、経時的に変化させることができる。例えば、身体疾患若しくはストレスを有する時、抗組換えヒトガラクトシダーゼＡ抗体が存在するようになったか若しくは増加する場合、又は疾患の症状が悪化する場合、投与の間隔を短くするか、又は有効性を改善する若しくは輸注反応を低減するために減少することができる。いくつかの実施形態において、治療有効量の０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５、１０、１５、２０又は３０ｍｇ酵素／ｋｇ体重を、薬理学的シャペロンを伴い又は伴わず、週に２回、毎週又は隔週投与する。
【０２７７】
ｒｈα−Ｇａｌ  Ａは、単位用量のバイアル若しくはシリンジ中、又は静脈内投与のための瓶若しくは袋若しくは医療機器の中など、後の使用のために調製してもよい。ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ、並びに任意選択による賦形剤又はシャペロン若しくは他の薬物などの他の活性成分を含むキットは、包装材料に封入され、再構成、希釈、又はファブリー病に罹患している患者などの処置を必要とする対象を処置する投与のための説明書を伴い得る。
【０２７８】
少なくとも１つの実施形態において、ミガラスタト（又はその塩）及びｒｈα−Ｇａｌ  Ａは、同時に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミガラスタト（又はその塩）及びｒｈα−Ｇａｌ  Ａは、連続的に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミガラスタト（又はその塩）は、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａの投与の前に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミガラスタト（又はその塩）は、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａの投与の３時間未満前に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミガラスタト（又はその塩）は、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａの投与の約２時間前に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミガラスタト（又はその塩）は、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａの投与の２時間未満前に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミガラスタト（又はその塩）は、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａの投与の約１．５時間前に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミガラスタト（又はその塩）は、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａの投与の約１時間前に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミガラスタト（又はその塩）は、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａの投与の約５０分〜約７０分前に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミガラスタト（又はその塩）は、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａの投与の約５５分〜約６５分前に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミガラスタト（又はその塩）は、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａの投与の約３０分前に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミガラスタト（又はその塩）は、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａの投与の約２５分〜約３５分前に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミガラスタト（又はその塩）は、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａの投与の約２７分から約３３分前に投与される。
【０２７９】
少なくとも１つの実施形態において、ミガラスタト（又はその塩）は、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａの投与と同時に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミガラスタト（又はその塩）は、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａの投与の２０分前後以内に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミガラスタト（又はその塩）は、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａの投与の１５分前後以内に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミガラスタト（又はその塩）は、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａの投与の１０分前後以内に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミガラスタト（又はその塩）は、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａの投与の５分前後以内に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミガラスタト（又はその塩）及びｒｈα−Ｇａｌ  Ａは、共製剤化されている。
【０２８０】
少なくとも１つの実施形態において、ミガラスタト（又はその塩）は、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａの投与の後に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミガラスタト（又はその塩）は、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａの投与の最大２時間後に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミガラスタト（又はその塩）は、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａの投与の約３０分後に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミガラスタト（又はその塩）は、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａの投与の約１時間後に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミガラスタト（又はその塩）は、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａの投与の約１．５時間後に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミガラスタト（又はその塩）は、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａの投与の約２時間後に投与される。
【０２８１】
本発明の別の態様は、ファブリー病の併用治療であって、それを必要とする患者における併用治療のためのキットを提供する。キットは、ミガラスタトを含む薬学的に許容される剤形と、本明細書で定義されるｒｈα−Ｇａｌ  Ａを含む薬学的に許容される剤形と、ミガラスタトを含む薬学的に許容される剤形及びｒｈα−Ｇａｌ  Ａを含む薬学的に許容される剤形を、それを必要とする患者に投与するための説明書とを含む。少なくとも１つの実施形態において、ミガラスタトを含む薬学的に許容される剤形は、錠剤又はカプセルを含むが、これに限定されない、本明細書に記載される経口剤形である。少なくとも１つの実施形態において、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａを含む薬学的に許容される剤形は、本明細書に記載の注射に適した滅菌溶液である。少なくとも１つの実施形態において、剤形を投与するための説明書は、本明細書に記載されるように、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａを含む薬学的に許容される剤形を静脈内注入によって投与する前に、ミガラスタトを含む薬学的に許容される剤形を投与するための説明書を含む。
【０２８２】
理論に拘束されるものではないが、ミガラスタトはｒｈα−Ｇａｌ  Ａの薬理学的シャペロンとして作用し、その活性部位に結合すると考えられている。ミガラスタトは、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａのアンフォールディングを減少させ、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａの活性立体構造を安定化し、中性ｐＨでの変性及び不可逆的な不活性化を防止し、循環中で組織に到達して取り込まれるのに十分な長さの生存条件を潜在的に許容することが見出された。しかしながら、ミガラスタトのｒｈα−Ｇａｌ  Ａの活性部位への結合はまた、天然基質であるＧＬ−３が活性部位にアクセスすることを防止することによって、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａの酵素活性の阻害をもたらし得る。ミガラスタト及びｒｈα−Ｇａｌ  Ａが本明細書に記載の条件下で患者に投与される場合、血漿及び組織内のミガラスタト及びｒｈα−Ｇａｌ  Ａの濃度は、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａが組織に取り込まれ、リソソームを標的化するまで安定化される程度であるが、ミガラスタトのクリアランスが迅速であるために、リソソーム内のｒｈα−Ｇａｌ  ＡによるＧＬ−３の加水分解は、ミガラスタトの存在によって過度に阻害されず、酵素は治療的に有用な十分な活性を保持すると考えられる。
【０２８３】
上記の全ての実施形態を組み合わせてもよい。これは、以下に関する特定の実施形態を含む：
薬理学的シャペロン、例えばミガラスタトの性質；及びそれが特異的である活性部位；
投与量、薬理学的シャペロン（例えば、ミガラスタト）の投与経路、及び担体の性質及び市販の組成物の使用を含む医薬組成物のタイプ；
薬の性質、例えば対象において活性が低下又は欠損している内因性タンパク質の対応物であってもよい、治療用タンパク質薬物製品、好適には、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で発現され、リプレガル（アガルシダーゼアルファ）及び／又はファブラザイム（アガルシダーゼベータ）の１つ以上のＭ６Ｐ残基を有するＮ−グリカン単位の含有量と比較して増加した含有量の、１つ以上のＭ６Ｐ残基を有するＮ−グリカン単位を含み、及び／又はリプレガル（アガルシダーゼアルファ）及び／又はファブラザイム（アガルシダーゼベータ）と比較して実質的により少ない量の中性グリカンを含み；好適には、配列番号１、配列番号２に記載のアミノ酸配列、又は配列番号３によってコードされるアミノ酸配列を有する、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ。
ｒｈα−Ｇａｌ  ＡにおけるＮ−グリカン単位の数及びタイプ、例えば、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａに結合したＮ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、フコース、シアル酸又はこれらの組み合わせから形成される複合Ｎ−グリカン；
モノ−Ｍ６Ｐ及び／又はビス−Ｍ６Ｐを形成するｒｈα−Ｇａｌ  Ａにおけるマンノース単位のリン酸化の程度；
補充酵素（ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ）の投与量及び投与経路（例えば静脈内投与、特に静脈内注入又は標的組織への直接投与）及び担体及び治療有効量を含む製剤のタイプ；
薬理学的シャペロン（例えば、ミガラスタト）及びｒｈα−Ｇａｌ  Ａの投与間隔；
治療的応答の性質及び併用治療の結果（例えば、個々に行われる各治療の効果と比較して強化された結果）；
併用治療の投与タイミング、例えば、ミガラスタト及びｒｈα−Ｇａｌ  Ａの同時投与又は逐次投与、例えば、ミガラスタト（又はその塩）が、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａの前、又はｒｈα−Ｇａｌ  Ａの後、又はｒｈα−Ｇａｌ  Ａの投与前又は投与後の一定時間内に投与される場合；及び
処置される患者の性質（例えば、ヒトなどの哺乳動物）及び個体が罹患している病状（例えば、酵素不全）。
【０２８４】
上記リストの任意の実施形態は、リストの他の実施形態の１つ以上と組み合わせてもよい。
【実施例】
【０２８５】
本発明の組成物及びプロセスは、例示のみを意図したものであり、本発明の範囲を限定するものではない、以下の実施例に関連して、よりよく理解されるであろう。開示された実施形態に対する様々な変更及び修正は、当業者にとって明らかであり、本発明のプロセス、製剤及び／又は方法に関連するものを含むがこれらに制限されない、そのような変更及び修正は、本発明の精神及び添付の特許請求の範囲から逸脱することなく行われ得る。
【０２８６】
実施例１：モノ−Ｍ６Ｐ、ビス−Ｍ６Ｐ、及び／又はシアル酸を有するＮ−グリカンを高含有量で含むｒｈα−Ｇａｌ  Ａを産生するＣＨＯ細胞クローンの調製
野生型ヒトアルファ−ガラクトシダーゼＡ（α−Ｇａｌ  Ａ）をコードするＤＮＡを、懸濁ＣＨＯ−Ｋ１細胞へのトランスフェクションのためにデュアルベクター発現システムにクローニングした。ｒｈα−Ｇａｌ  ＡをコードするＤＮＡでＣＨＯ細胞を形質転換するために使用される２つのベクター（例えば、配列番号３）を図３に示す。
【０２８７】
トランスフェクションのために、各ベクターは、Ａｍｐ耐性遺伝子内で切断するＦｓｐＩで線状化された。消化されたＤＮＡをフェノールクロロホルム抽出で精製し、ＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＮＤ２０００）で定量した。線状化したＤＮＡは、コード配列の確認及びトランスフェクションのために送付された。
【０２８８】
ＣＨＯ  Ｋ１宿主細胞を、トランスフェクションの２４時間前に培地Ｍ１（ＣＤ  ＣＨＯ＋４ｍＭグルタミン＋１％ＨＴサプリメント）中、７×１０５細胞／ｍｌで継代培養した。トランスフェクションの日に、宿主細胞培養物をサンプリングし、計数した。
【０２８９】
トランスフェクション中、宿主細胞培養物を水浴（３６．５℃）で約３０分間温めた培地Ｍ１で１０×１０５細胞／ｍｌに希釈し、５ｍｌの希釈した細胞を５０ｍｌスピンチューブに加え、Ｋｕｈｎｅｒインキュベーター内に保った（３６．５℃、湿度８５％、６％ＣＯ２、２２５ＲＰＭ）。
【０２９０】
１２μｇの各ベクター（図３）を、５０ｍｌスピンチューブ中の７７６μｌのＯｐｔｉＰｒｏ（商標）ＳＦＭに添加した。２４μｌのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸ  Ｒｅａｇｅｎｔを第２の５０ｍｌスピンチューブ中の７７６μｌのＯｐｔｉＰｒｏ（商標）ＳＦＭに添加した。ＤＮＡ−ＯｐｔｉＰｒｏ  ＳＦＭ混合物を穏やかに混合しながらＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ＭＡＸ−ＯｐｔｉＰｒｏ  ＳＦＭ混合物に添加し、室温で１０分間インキュベートした。
【０２９１】
希釈された宿主細胞培養物をＫｕｈｎｅｒインキュベーターから取り出し、６６７μｌのＤＮＡ−Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  Ｍａｘ混合物を宿主細胞培養物に添加した。トランスフェクトした細胞培養物をＫｕｈｎｅｒインキュベーター（３６．５℃、湿度８５％、６％ＣＯ２、２２５ＲＰＭ）で６時間インキュベートした。５ｍｌの新鮮なＭ１培地をトランスフェクトした細胞培養物に添加した。
【０２９２】
上記の手順を使用して、合計６回の独立したトランスフェクションを実施した。
【０２９３】
トランスフェクションの４８時間後、各トランスフェクションから細胞を３枚の９６ウェルプレートに、選択培地Ｍ２（培地Ｍ１＋９μｇ／ｍｌブラスチシジン＋４００μｇ／ｍｌゼオシン）中、細胞密度１〜１．６×１０６細胞／ｍｌ及びプレーティング密度３０００〜４０００細胞／１００μＬ／ウェルでプレーティングした。９６ウェルプレートをＣＯ２インキュベーター（３６．５℃、６％ＣＯ２）でインキュベートした。
【０２９４】
プレーティングの３日後又は４日後に、１２０μｌの新鮮な選択培地Ｍ２を９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。続く２〜３週間にわたって、３日又は４日ごとに１５０μｌの細胞上清を等量の新鮮な選択培地に置き換えた。
【０２９５】
６つの安定したＣＨＯプールのうちのいずれが最高の産物属性を提供するかを決定するために、細胞培養物の生存率、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａの発現、及びＣＩＭＰＲへの結合についてプールを比較した。プレーティングのおよそ約１６〜１８日後、大半のウェルが７０％を超えるコンフルエンシーに達したとき、発現分析の２４時間前に１５０μｌの細胞上清を等量の新鮮な選択培地Ｍ２と交換した。
【０２９６】
長期間にわたる生存率を調査するために、細胞プールをパイロット培養で増殖させた。各トランスフェクションからの最高の酵素活性を有する上位９ミニプールが選択され、選択培地Ｍ２でのバッチ再フィードスクリーニングのために、９６ウェルプレートから２４ウェルプレート、６ウェルプレートプレートに増殖させ、スピンチューブに入れた。ミニプールの増殖中にバイアルを凍結させた（凍結保存培地：９０％Ｍ１＋１０％ＤＭＳＯ）。凍結したバイアルを−８０℃の冷凍庫内のｃｒｙｏｂｏｘ冷凍容器に一晩入れ、液体窒素タンクに保存した。
【０２９７】
Ｔ９プールが回収されると、Ｎ−１細胞培養物を、新鮮な産生培地Ｍ３（ＣＤＭ４＋４ｍＭグルタミン＋１％ＨＴサプリメント）中に１：５で希釈することにより、バッチ再フィード培養用に接種して、スピンチューブ中３．８〜５．７×１０５細胞／ｍｌの播種密度を得た（０日目）。プールバッチ再フィード培養物（２０ｍｌ）をＫｕｈｎｅｒ振盪機（３５℃、湿度８５％、６％ＣＯ２、２２５ＲＰＭ）でインキュベートした。３日目から、細胞を遠心沈降させ（３００ＲＰＭ、５分、２５℃）、８０％の上清を新鮮な培地と交換した。生細胞密度が２０×１０６細胞／ｍｌを超えると、特定の量の細胞を増殖に応じて廃棄して、翌日、２５×１０６〜３０×１０６細胞／ｍｌの生細胞密度を目標とした。プールバッチ再フィード培養物を２０日目に遠心分離（３０００ＲＰＭ、１０分、４℃）により回収した。培養の１８日間、各細胞プールの生存率は９０％を超え、生存細胞の密度は約２０〜３０×１０６細胞／ｍｌであった。（図４）。
【０２９８】
ｒｈα−Ｇａｌ  Ａの発現及びＣＩＭＰＲへの結合は、それぞれ４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−ガラクトシド酵素アッセイ（４ＭＵ）及び固定化したカチオン非依存性マンノース−６−リン酸受容体（ＣＩＭＰＲ）を有するカラムへの結合によって評価された。図５は、プール番号２が少なくとも１６日間の細胞培養まで最高レベルのｒｈα−Ｇａｌ  Ａ発現（酵素活性により測定）を維持したことを示す。
【０２９９】
望ましい産物属性は、ＣＩＭＰＲへの高い結合性である。ＣＩＭＰＲへの結合は、蓄積された基質の主要なリザーバであるリソソームへの酵素の取り込み経路を示す。内在化のための正しい受容体にインビボで結合する酵素候補の能力は、各プールからの細胞上清をＣＩＭＰＲカラムに適用することにより推定された（図６Ａ〜６Ｆ）。１５〜１７日目までのプールされた培養物上清を固定化ＣＩＭＰＲ親和性カラムにロードした。０ｍＭから１ｍＭへ、次いで５ｍＭへと増加する濃度の遊離Ｍ６Ｐをカラムに通して、結合した酵素を溶出した。細胞プールのＣＩＭＰＲ結合の程度は、３７％〜５２％の範囲であった（活性により測定）。プール１及び４は５２％の最も高いＣＩＭＰＲ結合を有し、プール２は５１％でわずかに少なかった。したがって、これらのプールは、培養中の同じ時点で、他のプールよりも好ましいＣＩＭＰＲ結合特性を有していた。
【０３００】
上清を、９６ウェルプレートベースのＣＩＭＰＲ結合アッセイで結合についてさらに評価した。要約すると、様々な時点からの上清をＣＩＭＰＲ結合バッファー中１：１００、１：１，０００及び１：１０，０００に希釈し、次いでＣＩＭＰＲ受容体でコーティングしたウェルに添加した。３７℃で１時間インキュベートした後、結合していない酵素を洗い流し、結合した酵素を４ＭＵ酵素活性アッセイで測定した。活性は、結合した酵素のナノグラムに変換され、計算値は希釈に対してプロットされた。プール１及び４は、６つのプールのうち最高（ファブラザイム（アガルシダーゼベータ）と比較して）且つ最も一貫した結合を示した。
【０３０１】
酵素活性データ及びＣＩＭＰＲ結合結果に基づいて、プール１及び４が、さらなるクローンスクリーニングの上位プールとして選択された。
【０３０２】
プール１及び４を解凍し、１週間継代培養した。プレーティングの日に、プレーティング培地を新たに調製し、両方のプールを、細胞密度０．６細胞／３０マイクロリットル／ウェルの３８４ウェルプレートにプレーティングした。全てのプレートの写真は、今後のクローン性の検証のために、プレーティングの日（Ｄ０）、プレーティングの１日後（Ｄ１）、及び２日後（Ｄ２）に撮影された。プレーティングから１週間後、３８４ウェルプレート全ての各ウェルに１５マイクロリットルのＭ２培地を補充した。
【０３０３】
プレーティングの１０日後、全てのプレートを再度スキャンしてクローンの回復を観察した。回収された細胞は、培養密度に基づいて３８４ウェルプレートから９６ウェルプレートに移された。プレーティングのおよそ１５日後、大半のウェルが７０％を超えるコンフルエンシーに達したとき、発現分析の２４時間前に１５０μｌの細胞上清を等量の新鮮な選択培地Ｍ４（ＣＤ  ＣＨＯ＋４ｍＭグルタミン＋１％ＨＴサプリメント＋４μｇ／ｍｌのブラスチシジン＋２００μｇ／ｍｌのゼオシン）と交換した。発現レベルの高いウェルについては、Ｄ０、Ｄ１、及びＤ２の画像を引き出して、クローン性を評価した。Ｄ０〜Ｄ２からの１−２−４細胞期のクローンは、単一細胞に由来するものと考えられる。最高の発現レベル及び良好なクローン性を有する、プール１からの２２クローン及びプール４からの３７クローンをさらに評価するために増殖させた。細胞株発現のこのステージでは、発現レベルは７〜２３μｇ／ｍｌの範囲であった。
【０３０４】
プールスクリーニングステージ中、プール４からのクローンの全体的により高い発現及びプール４のより良い産物品質を考慮して、プール１から最高の発現レベルを有する上位１０クローン、及びプール４から上位２６クローンをＣＩＭＰＲ結合アッセイでスクリーニングした。３６個のクローンを最初に酵素活性について分析した。滴定後、２つの濃度の酵素（１時間あたり１ミリリットルあたり５０及び１００ナノモルの４ＭＵ放出）がＣＩＭＰＲ結合アッセイで試験された。
【０３０５】
さらなる評価のために、高い生産性及び／又は高いＣＩＭＰＲ結合性を有するクローンを選択した。プール１からの４つのクローン及びプール４からの８つのクローンが、スピンチューブでのバッチ再フィード評価のために選択された。
【０３０６】
選択圧力を含有する培地Ｍ４でのバッチ再フィードスクリーニングのために、クローンを９６ウェルプレートから２４ウェルプレート、６ウェルプレートに増殖させ、スピンチューブに入れた。クローンの増殖中にバイアルを凍結させた（凍結保存培地：９０％Ｍ１＋１０％ＤＭＳＯ）。凍結したバイアルを−８０℃の冷凍庫内のｃｒｙｏｂｏｘ冷凍容器に一晩入れ、液体窒素タンクに保存した。
【０３０７】
ウェルプレートからスピンチューブに拡大したクローンが回収されると、Ｎ−１細胞培養物を、新鮮な産生培地Ｍ３中に１：４〜１：５で希釈することにより、バッチ再フィード培養用に接種して、スピンチューブ中４．０〜５．３×１０５細胞／ｍｌの播種密度を得た（０日目）。クローンバッチ再フィード培養物（２０ｍｌ）をＫｕｈｎｅｒ振盪機（３５℃、湿度８５％、６％ＣＯ２、２２５ＲＰＭ）でインキュベートした。３日目から、細胞を遠心沈降させ（３００ＲＰＭ、５分、２５℃）、８０％の上清を新鮮なＭ３培地と交換した。生細胞密度が２０×１０６細胞／ｍｌを超えると、特定の量の細胞を増殖率に応じて廃棄して、翌日、２５×１０６〜３０×１０６細胞／ｍｌの生細胞密度を目標とした。生存率が２０％を下回ったとき、又は１４日目に、プールバッチ再フィード培養物を遠心分離（３０００  ＲＰＭ、１０分、４℃）により回収した。
【０３０８】
収穫された培養物からの上清は、６日目（Ｄ６）から始まる各日に酵素産生について測定された。ＣＩＭＰＲ結合アッセイは、１時間あたり１ミリリットルあたり放出される５０及び１００ナノモルの４−ＭＵへの滴定後、Ｄ６及びＤ９試料で実施された。スピンチューブ試験における増殖特性、酵素生産性、及びＣＩＭＰＲ結合に基づき、さらなる評価のためにいくつかのクローンが選択された。
【０３０９】
上位４クローン、０１−００３、０４−００２、０４−０１８、及び０４−０２３は、細胞増殖性能、酵素産生、及びＣＩＭＰＲ結合能力に基づいて、上位１０クローンから選択された。バイオリアクター試験及び追加的なスピンチューブ試験を使用してクローンをさらに評価し、さらなる開発のために、クローン０１−００３及び０４−０２３をプール１及び４の上位クローンとして選択した。
【０３１０】
実施例２：ｒｈα−Ｇａｌ  ＡのＣＩＭＰＲ親和性の特性評価
組換えα−ガラクトシダーゼＡがインビトロでＣＩＭＰＲカラムに結合する能力は、インビボで受容体に結合し、リソソームを標的とする組換え酵素の能力の指標である。ｒｈα−Ｇａｌ  Ａの２つのクローン（クローン０１−００３及びクローン０４−０２３）を灌流培養により産生し、上記のように固定化ＣＩＭＰＲ親和性カラム（図７）に各酵素を通すことにより結合を決定した。図７Ａ〜７Ｃは、ファブラザイム（アガルシダーゼベータ）の９０％がＣＩＭＰＲカラムに結合し、８０％のｒｈα−Ｇａｌ  Ａ（０１−００３）、及び９６％のｒｈα−Ｇａｌ  Ａ（０４−０２３）がＣＩＭＰＲカラムに結合したことを示す。図７Ｄ〜７Ｆは、ＣＩＭＰＲカラムに対してより高い結合親和性を有する分子を生成するために、どのように発現及び精製を変え得るかを示す。
【０３１１】
実施例３：ミガラスタトによるｒｈα−Ｇａｌ  Ａの安定化
ｒｈα−Ｇａｌ  Ａを安定化するミガラスタトの能力を調査した。図８及び表１に見られるように、ミガラスタトは、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａのアンフォールディングを減少させ、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａの活性立体構造を安定化し、中性ｐＨでの変性及び不可逆的な不活性化を防止し、循環中で組織に到達して取り込まれるのに十分な長さの生存条件を潜在的に許容することが見出された。
【０３１２】
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【０３１３】
実施例４：液体クロマトグラフィーによるｒｈα−Ｇａｌ  Ａクローンのオリゴ糖の特性評価
α−Ｇａｌ  Ａのグリコシル化プロファイルは、血清半減期及びリソソームの標的化にとって非常に重要であり、これはＥＲＴの有効性に大きな影響を及ぼす。リプレガル（アガルシダーゼアルファ）及びファブラザイム（アガルシダーゼベータ）の各モノマーは、典型的には、グリコシル化された３つの部位を有する。各α−Ｇａｌ  Ａ分子上の各グリコシル化部位は、α−Ｇａｌ  Ａ分子の非常に不均一な混合物をもたらし得る様々なタイプのグリカンを有し得る。図１０は、異なるｒｈα−Ｇａｌ  Ａ  ＥＲＴ療法で見出された全グリカンのオリゴ糖プロファイルを提供する。
【０３１４】
臨床効果に影響を与え得るインビトロ及びインビボの特性について詳述するために、両方のクローンによって産生された酵素のグリカンプロファイルを分析した。各α−Ｇａｌ  Ａのタンパク質試料からのグリカンは、標準的な変性及び還元条件下でペプチドＮ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ）によって除去された。脱グリコシル化時により低い見かけの分子量へのシフトを呈するタンパク質を用いて、脱グリコシル化の程度をＳＤＳ−ＰＡＧＥで評価した（図９）。タンパク質骨格からのグリカンの放出に続いて、グリカンはアントラニル酸と反応して２−アントラニル酸誘導体を形成し、これは、次いでアミノカラム上での順相クロマトグラフィーによって分離される。
【０３１５】
アミノカラムでの順相液体クロマトグラフィーは、全てのグリカン型の相対的な存在量を比較するための有益な手法である。保持時間は、電荷密度及び全体のオリゴ糖サイズに影響を受ける。１５〜３０分間で溶出するグリカンは、高マンノース及びアシアロ（ａｓｉａｌｙｏ）複合オリゴ糖からなる中性グリカンである。
【０３１６】
図１０は、０１−００３及び０４−０２３と呼ばれる２タイプのｒｈα−Ｇａｌ  Ａタンパク質の分析の代表例である。異なるＥＲＴから精製されたグリカンを図１０Ａ〜Ｆで比較して、各ＥＲＴで見出されたグリカン構造を決定した。
【０３１７】
高マンノース及びアシアロ（ａｓｉａｌｙｏ）複合オリゴ糖からなる中性グリカンを含むタンパク質は、マンノース受容体又はアシアロ糖タンパク質受容体のいずれかによって循環から迅速に除去される。したがって、組換えヒトα−Ｇａｌ  Ａ上に最小限の高マンノース及びアシアロ（ａｓｉａｌｙｏ）複合オリゴ糖を有することが有益である。
【０３１８】
別の潜在的グリカン型は、リン酸化オリゴ糖である。これらのグリカンは、ＣＩＭＰＲを介してリソソームにＥＲＴを送達するために重要である。リン酸化オリゴ糖は、１つのＭ６Ｐ残基（モノ−Ｍ６Ｐ）又は２つのＭ６Ｐ残基（ビス−Ｍ６Ｐ）を含み得る。ビスリン酸化グリカンは、モノリン酸化よりもＣＩＭＰＲに対する親和性が約３，０００倍大きいため、好ましい。モノリン酸化グリカンは青い星で示され、ビスリン酸化グリカンは１１０〜１２０分で溶出する。モノリン酸化グリカンは、製造中の細胞死から馴化培地中に放出される酸性ホスファターゼによる不完全なリン酸化又は脱リン酸化のいずれかによって形成することができる。
【０３１９】
図１０Ａは、ファブラザイム（アガルシダーゼベータ）からのグリカンを示す。中性グリカン（溶出１５〜３０分）は、全グリカンの約１３％を占め、ビスリン酸化グリカン（溶出１１０〜１２０分）は、全グリカンの約９％を占める。有意な量のモノリン酸化グリカンが存在し、部分的リン酸化又は有意なホスファターゼ分解を示す。
【０３２０】
図１０Ｂは、ファブリーＥＲＴ  ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ  ０４−０２３（細胞株０４−０２３により産生される）からのグリカンを示す。中性グリカンは全グリカンの約３３％を占め、ビスリン酸化グリカンはファブラザイム（アガルシダーゼベータ）よりも高い（１１％）。
【０３２１】
図１０Ｃは、ファブリーＥＲＴ  ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ  ０１−００３（細胞株０１−００３により産生される）からのグリカンを示す。非常に少量の中性グリカンが存在し（６％）、これはマンノース及びアシアロ糖タンパク質受容体を介したクリアランスの減少があろうことを示唆している。しかしながら、この調製物は、血流を介したリソソームの送達に対し負の影響を有する可能性のある、非常に少量のビスリン酸化グリカン（６％）を含有していた。
【０３２２】
図１０Ｄ〜１０Ｆは、低レベルの中性グリカン（１．５〜５％）及び高レベルのビス−リン酸化オリゴ糖（９％〜１４％）の両方を有する分子を生成するために、どのように発現及び精製を変え得るかを示す。ＥＲＴの選択、発現、精製中にグリカンマップを注意深くモニタリングすることにより、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａの産物特性を変化させて、マンノース及びアシアロ糖タンパク質受容体を介した非生産的な対象外クリアランスを最小化し、一方、ＣＩＭＰＲを介したリソソームへの生産的な高親和性標的化を最大化することができる。
【０３２３】
１０Ａ〜１０ＦからのＥＲＴにつきグリカン分布の概要を図１１に示す。
【０３２４】
リプレガル（アガルシダーゼアルファ）、ファブラザイム（アガルシダーゼベータ）、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ  ０４−０２３及びｒｈα−Ｇａｌ  Ａ  ０１−００３につき、グリカンの詳細な比較を以下の表２〜４に提供する。表２は単糖分析の概要を提供し、表３はグリカン「ファミリー」の概要を提供し、表４はグリカン構造の概要を提供する。
【０３２５】
2020503900.tif 000009
【０３２６】
2020503900.tif 000010
【０３２７】
2020503900.tif 000011
【０３２８】
表２〜４からわかるように、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ  ０１−００３及びｒｈα−Ｇａｌ  Ａ  ０４−０２３は、リプレガル（アガルシダーゼアルファ）及びファブラザイム（アガルシダーゼベータ）と構造的に異なる特定の識別される特徴を有する。例えば、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ  ０４−０２３は非常に高いビスＭ６Ｐ含有量を有し、グリカンの１４％超がビス−Ｍ６Ｐを有している。ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ  ０４−０２３も高レベルのモノ−Ｍ６Ｐを有し、グリカンの３０％超がモノ−Ｍ６Ｐ（高マンノース）である。ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ  ０４−０２３も、グリカンの３５％超がシアル酸を有する。
【０３２９】
表５はＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法に由来するｒｈα−Ｇａｌ  Ａ  ０１−００３の個々のグリカンの相対的な存在量を提供し、表６はグリカン構造の概要を提供する。以下の表５では、「ＭＸ」はＸ個のマンノース単位を表し、「ＡＸ」は複合又はハイブリッドグリカンにおけるＸ個のＮ−アセトリグルコサミンアンテナを表し、「ＧＸ」はＸ個のガラクトース単位を表し、「ＳＸ」はＸ個の末端シアル酸単位を表し、「Ｆ」はフコース単位を表し、「Ｐ」はモノ−Ｍ６Ｐ単位を表し、「２（Ｐ）」はビス−Ｍ６Ｐ単位を表し、「Ａｃ」はアセチル単位を表し、「Ｘ（Ａｃ）」はＸ個のアセチルキャップを表し、「ＫＸ」はＸ個のデアミノノイラミン酸単位を表し、「ＳｇＸ」はＸ個のＮ−グリコリルノイラミン酸単位のＸ数を表す。
【０３３０】
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【０３３１】
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【０３３２】
2020503900.tif 000014
【０３３３】
上記の表２〜６で試験され示されているｒｈα−Ｇａｌ  Ａ  ０１−００３は、高ビスＭ６Ｐ（＞１４％）、高モノ−Ｍ６Ｐ（＞２５％）、高シアル酸（＞５０％）及び低中性グリカン（＜７％）を有する。試験したｒｈα−Ｇａｌ  Ａ  ０１−００３はまた、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａタンパク質あたり大量のＭ６Ｐ（＞３ｍｏｌ／ｍｏｌ）及びシアル酸残基（＞５ｍｏｌ／ｍｏｌ）を含む。
【０３３４】
これらの特定のグリコシル化特性の組み合わせは、リン酸化、シアリル化、及び中性グリカン含有量のバランスをとる特有のｒｈα−Ｇａｌ  Ａ酵素を提供するため、市販の酵素よりも標的化が促進され、非生産的クリアランスがより少ない新規酵素を提供する。
【０３３５】
実施例５：ｒｈα−Ｇａｌ  Ａとミガラスタトの組み合わせの薬物動態
ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ  ０１−００３とｒｈα−Ｇａｌ  Ａ  ０４−０２３の薬物動態プロファイル、及びミガラスタトとの組み合わせの効果を比較した（図１２）。酵素（１ｍｇ／ｋｇ）は、３ｍｇ／ｋｇのミガラスタトとの共製剤を伴い又は伴わず、Ｇｌａ  ＫＯマウスに静脈内ボーラス注射で投与された。ファブリー病のＧｌａノックアウト（ＫＯ）マウスモデルは、ファブリー病患者における疾患の病態生理学的プロセスとの高レベルの類似性を示す。血漿酵素活性は、注入後５、１５、及び３０分、並びに注入後１、２、及び２４時間で評価された。処置グループを表７に示す。
【０３３６】
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【０３３７】
図１２は、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ  ０１−００３及びｒｈα−Ｇａｌ  Ａ  ０４−０２３の薬物動態を示す。ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ  ０４−０２３はファブラザイム（アガルシダーゼベータ）と比較して低い薬物動態プロファイルを有し、一方、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ  ０１−００３は２時間にわたり、より高いＡＵＣを示し、これは、他の酵素と比較してこの酵素への全体的な曝露が大きいことを示している。図１２は、血漿中のｒｈα−Ｇａｌ  Ａ  ０１−００３の活性が、ミガラスタトとの共製剤により増強されることも示す。同様に、血漿中のｒｈα−Ｇａｌ  Ａ  ０４−０２３の活性は、ミガラスタトの存在により増加する。
【０３３８】
表８は、Ｇｌａ  ＫＯマウスにおけるファブラザイム（アガルシダーゼベータ）、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ  ０１−００３及びｒｈα−Ｇａｌ  Ａ  ０４−０２３につき、それぞれの半減期及び曲線下面積（ＡＵＣ）を示す。組換え酵素の組織取り込みレベルは、酵素活性アッセイを使用して２４時間で評価された。
【０３３９】
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【０３４０】
図１３Ａは、０１−００３の２４時間後の心臓組織における酵素活性はファブラザイム（アガルシダーゼベータ）のものと類似していたが、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ  ０４−０２３の活性はわずかに低かったことを示す。ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ  ０１−００３及びｒｈα−Ｇａｌ  Ａ  ０４−０２３の両方の２４時間後の心臓における活性は、ミガラスタトの存在により増加した。系統適合野生型マウスに見られる酵素活性のレベルは、コンパレータとして含まれる。興味深いことに、組換え酵素のボーラス注入後、２４時間後の活性レベルは野生型心臓組織で見られるものよりも高くなっている。図１３Ｂは、腎臓における２４時間後の酵素活性が３つ全ての酵素で類似しており、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ  ０１−００３とｒｈα−Ｇａｌ  Ａ  ０４−０２３の両方がミガラスタトの存在によって増加し、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ  ０１−  ００３は野生型レベルに近づいたことを示す。図１３Ｃは、２４時間後の皮膚組織の活性が試験した３つの酵素全てにわたって類似しており、ミガラスタトの存在による影響を受けていないようであることを示す。
【０３４１】
実施例６：ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ変異体の単回投与の有効性比較
血漿ｌｙｓｏ−Ｇｂ３及び組織ＧＬ−３を減少させるｒｈα−Ｇａｌ  Ａ  ０１−００３及びｒｈα−Ｇａｌ  Ａ  ０４−０２３の能力をＧｌａ  ＫＯマウスで評価した。これらの酵素をミガラスタトとの共製剤で組み合わせた場合の基質減少への影響も評価した。マウスに１ｍｇ／ｋｇの酵素をミガラスタト及び血漿ｌｙｓｏ−Ｇｂ３を伴い又は伴わず投与し、酵素投与の７日後に組織ＧＬ−３（心臓、腎臓、及び皮膚）を評価した（表９）。
【０３４２】
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【０３４３】
図１４Ａは、酵素投与の７日後のＧｌａ  ＫＯマウス心臓における組織酵素活性を示す。心臓では、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ  ０１−００３の投与は、ファブラザイム（アガルシダーゼベータ）の投与と同様の酵素活性を７日後にもたらし、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ  ０１−００３へのミガラスタトの添加は酵素活性レベルを有意に増加させた。３つ全ての酵素は、７日後に腎臓で同様の活性を示した（図１４Ｂ）。ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ  ０１−００３へのミガラスタトの添加は、用量を３ｍｇ／ｋｇ（ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ  ０４−０２３ではより高用量）へ増加させるにつれ、腎臓における酵素レベルが有意に増加した。皮膚では、７日後の酵素活性レベルはｒｈα−Ｇａｌ  Ａ  ０４−０２３とファブラザイム（アガルシダーゼベータ）で類似していたが、ミガラスタトを伴う又は伴わないｒｈα−Ｇａｌ  Ａ  ０１−００３ではより高かった（図１４Ｃ）。ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ  ０４−０２３の用量を増加させることは、７日後の皮膚におけるより高い酵素活性レベルにつながる（図１５Ｃ）。ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ  ０４−０２３にミガラスタトを添加するか、又は用量を３ｍｇ／ｋｇに増やすことにより、より高い酵素レベルが観察された（図１４Ｄ）。
【０３４４】
組織における酵素活性の評価に加えて、投与後７日の基質減少の程度が決定された。心臓組織では、１ｍｇ／ｍｇのファブラザイム（アガルシダーゼベータ）と比較して、ミガラスタトを含めると、用量を１ｍｇ／ｋｇから３ｍｇ／ｋｇへ増加させるにつれ（ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ  ０４−０２３）、ＧＬ−３の減少（ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ  ０１−００３及びｒｈα−Ｇａｌ  Ａ  ０４−０２３について）が有意に増強された（図１５Ａ）。腎臓（図１５Ｂ）では、基質の減少を促進した、より高用量の３ｍｇ／ｋｇのｒｈα−Ｇａｌ  Ａ  ０４−０２３を除き、全ての酵素処置はＧＬ−３において同様の減少をもたらす。
【０３４５】
皮膚（図１５Ｃ）では、ミガラスタトと共製剤化されたｒｈα−Ｇａｌ  Ａ  ０４−０２３は、ファブラザイム（アガルシダーゼベータ）単独よりも有意に低い、ＧＬ−３の減少をもたらす。３ｍｇ／ｋｇの用量は、ファブラザイム（アガルシダーゼベータ）単独（１ｍｇ／ｋｇ）と比較した場合、皮膚において有意に低いレベルのＧＬ−３をもたらす。ミガラスタトと共製剤化されたｒｈα−Ｇａｌ  Ａ  ０１−００３（１ｍｇ／ｋｇ）は、ファブラザイム（アガルシダーゼベータ）単独（１ｍｇ／ｋｇ）よりも有意に低い、ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の減少をもたらす。ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ  ０４−０２３（３ｍｇ／ｋｇ）の投与は、ファブラザイム（アガルシダーゼベータ）単独（１ｍｇ／ｋｇ）よりも有意に低い血漿ｌｙｓｏ−Ｇｂ３のレベルをもたらした（図１６Ｄ）。
【０３４６】
この実施例６では、Ｇｌａ  ＫＯマウスにおけるｒｈα−Ｇａｌ  Ａ  ０１−００３の半減期は、ファブラザイム（アガルシダーゼベータ）のおよそ８分、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ  ０４−０２３の４分と比較して、およそ１４分であり、ミガラスタトの添加により、両方のｒｈα−Ｇａｌ  Ａクローンの曝露が改善された。
【０３４７】
薬物動態及び有効性データに基づいて、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ  ０１−００３がさらなる開発のために選択された。
【０３４８】
実施例７：ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ産生のバリエーション
２つの異なる研究で、異なるプロセスで産生されたｒｈα−Ｇａｌ  Ａの薬物動態を比較した。Ｇｌａ  ＫＯマウス（ｎ＝５〜７／グループ）は、１ｍｇ／ｋｇのファブラザイム（アガルシダーゼベータ）又は異なるプロセスで産生されたｒｈα−Ｇａｌ  Ａ  ０１−００３の単回ＩＶボーラス注射を受けた。５、１５、３０、６０、及び１２０分での連続した採血から血漿が収集され、薬物動態はα−Ｇａｌ  Ａ活性によって測定されて決定された。ファブラザイム（アガルシダーゼベータ）及びｒｈα−Ｇａｌ  Ａ  ０１−００３の薬物動態特性が図１６Ａ〜１６Ｂ並びに表１０及び１１に提供される。図１６Ａ及び表１０に示されるｒｈα−Ｇａｌ  Ａは図１０Ｃに示される調製物に対応し、図１６Ｂ及び表１１に示されるｒｈα−Ｇａｌ  Ａは図１０Ｆに示される調製物に対応する。
【０３４９】
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【０３５０】
2020503900.tif 000019
【０３５１】
図１６Ａ及び表１０からわかるように、第１のプロセスに従って産生されたｒｈα−Ｇａｌ  Ａ  ０１−００３は、ファブラザイム（アガルシダーゼベータ）よりも有意に長い半減期を有していた。図１６Ｂ及び表１１からわかるように、第２のプロセスは、ファブラザイム（アガルシダーゼベータ）と同様の見かけの半減期を有するｒｈα−Ｇａｌ  Ａ  ０１−００３のバージョンを産生した。しかしながら、この半減期の短縮は、非生産的クリアランスの増加ではなく、Ｍ６Ｐ含有量の増加による細胞への取り込みの増加によるものと考えられる。図１０Ｃ及び１０Ｆに示されるように、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａの両方の調製物は、低い中性グリカンの含有量を有し（図の左側のピーク）、図１０Ｆのｒｈα−Ｇａｌ  Ａの調製物は、図１０Ｃのｒｈα−Ｇａｌ  Ａの調製物よりも高いビス−Ｍ６Ｐ含量を有していた（図の右側のピーク）。したがって、ＥＲＴは標的化又は非生産的クリアランスにより除去され得るため、ＥＲＴの同様の半減期であっても、必ずしも同様のＥＲＴ産物を示すとは限らないことがこれらの試験により示される。
【０３５２】
製造プロセスのバリエーションによって産生されたｒｈα−Ｇａｌ  Ａ  ０１−００３は、心臓及び腎臓においてα−Ｇａｌ  Ａ基質を減少させることができ、これは、ミガラスタトとの共製剤によって増強された（図１７Ａ及び１７Ｂ）。Ｇｌａ  ＫＯマウスに１ｍｇ／ｋｇの酵素ＩＶを投与し、投与後１週間でＧＬ−３を測定した。ミガラスタトとの共製剤は、ファブラザイム（アガルシダーゼベータ）単独又はｒｈα−Ｇａｌ  Ａ  ０１−００３単独のいずれかよりも大きい基質減少をもたらす。
【０３５３】
実施例８：ミガラスタトを伴う及び伴わないｒｈα−Ｇａｌ  Ａの様々な用量の薬物動態
ミガラスタトを伴う又は伴わない様々な用量のｒｈα−Ｇａｌ  Ａ  ０１−００３の薬物動態を、ファブラザイム（アガルシダーゼベータ）と比較した。酵素は、ミガラスタトとの共製剤を伴い又は伴わず、Ｇｌａ  ＫＯマウス（ｎ＝５；合計で４０；約６ヶ月齢）への単回ボーラス注入で投与された。処置グループを表１２に示す。
【０３５４】
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【０３５５】
５分、１５分、３０分、１時間、及び２時間で、血漿のために連続して顎下採血が行われた。２４時間で剖検を実施し、血漿及び組織を採取した。
【０３５６】
図１８Ａ〜１８Ｆは、ミガラスタトとの共製剤を伴う及び伴わないｒｈα−Ｇａｌ  Ａの様々な用量、並びにファブラザイム（アガルシダーゼベータ）の２つの用量の薬物動態を示す。以下の表１３は、同じ処置グループのそれぞれの半減期を示す。図１８Ａ及び１８Ｂは、全ての処置グループの薬物動態を示す。図１８Ｃは、ファブラザイム（アガリダーゼベータ）、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ単独及び３ｍｇ／ｋｇミガラスタトを伴うｒｈα−Ｇａｌ  Ａの酵素用量１ｍｇ／ｋｇに焦点を当てている。図１８Ｄは、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ単独及び１０ｍｇ／ｋｇミガラスタトを伴うｒｈα−Ｇａｌ  Ａの酵素用量３ｍｇ／ｋｇに焦点を当てている。図１８Ｅは、ファブラザイム（アガルシダーゼベータ）及びｒｈα−Ｇａｌ  Ａの酵素用量１０ｍｇ／ｋｇに焦点を当てている。図１８Ｆは、様々な酵素用量でのファブラザイム（アガルシダーゼベータ）及びｒｈα−Ｇａｌ  Ａ単独の薬物動態に焦点を当てている。
【０３５７】
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【０３５８】
表１３及び図１８Ａ〜１８Ｆからわかるように、各酵素の半減期は用量の増加とともに増加した。ｒｈα−Ｇａｌ  Ａは、用量依存的且つ非線形の薬物動態を示した。同じ用量で、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａはファブラザイム（アガルシダーゼベータ）よりも長い半減期を示す。ミガラスタトとｒｈα−Ｇａｌ  Ａの共製剤もまた、循環中の酵素活性の半減期を本質的に増加させ、ミガラスタトとの共製剤後のｒｈα−Ｇａｌ  Ａの循環半減期は最大２．３倍増加した。
【０３５９】
実施例９：Ｇｌａ  ＫＯマウスにおける投与有効性試験の反復
ミガラスタト及びファブラザイム（アガルシダーゼベータ）を伴う及び伴わないｒｈα−Ｇａｌ  Ａ  ０１−００３の有効性を比較した。酵素は、３ｍｇ／ｋｇのミガラスタトとの共製剤を伴い又は伴わず、Ｇｌａ  ＫＯマウスにボーラス注入で投与された。約１６週齢の雄性Ｇｌａ  ＫＯマウス（ｎ＝８；合計７２）は、隔週のＩＶ投与を２回受けた。処置グループを表１４に示し、結果を図１９Ａ〜１９Ｄ及び２０Ａ〜２０Ｃに示す。
【０３６０】
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【０３６１】
図１９Ａ（心臓）及び図１９Ｂ（腎臓）からわかるように、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ及びファブラザイム（アガルシダーゼベータ）単独で見られる良好な用量応答：１０ｍｇ／ｋｇのファブラザイム（アガルシダーゼベータ）＞３ｍｇ／ｋｇのｒｈα−Ｇａｌ  Ａ＞１ｍｇ／ｋｇのｒｈα−Ｇａｌ  Ａ＝１ｍｇ／ｋｇのファブラザイム（アガルシダーゼベータ）。１ｍｇ／ｋｇのｒｈα−Ｇａｌ  Ａ＋３又は１０ｍｇ／ｋｇミガラスタトの共製剤は、１ｍｇ／ｋｇファブラザイム（アガルシダーゼベータ）と比較してＧＬ−３レベルの有意な低下を示す。３又は１０ｍｇ／ｋｇのミガラスタトと共製剤化された３ｍｇ／ｋｇのｒｈα−Ｇａｌ  Ａは、１０ｍｇ／ｋｇのファブラザイム（アガルシダーゼベータ）と比較して、同様又はわずかに優れたＧＬ−３の減少を達成し、１０ｍｇ／ｋｇのミガラスタト共製剤が最良の結果をもたらすようであった。
【０３６２】
図１９Ｃ（皮膚）及び図１９Ｄ（血漿ｌｙｓｏ−ＧＢ３）からわかるように、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ及びファブラザイム（アガルシダーゼベータ）単独で見られる良好な用量応答：１０ｍｇ／ｋｇのファブラザイム（アガルシダーゼベータ）＞３ｍｇ／ｋｇのｒｈα−Ｇａｌ  Ａ＞１ｍｇ／ｋｇのｒｈα−Ｇａｌ  Ａ≒１ｍｇ／ｋｇのファブラザイム（アガルシダーゼベータ）。１ｍｇ／ｋｇのｒｈα−Ｇａｌ  Ａグループでは、大きな変動があった（１つの外れ値の可能性の高いものを有する）。全体的に、心臓と腎臓と同様の観察。１ｍｇ／ｋｇのｒｈα−Ｇａｌ  Ａ＋３又は１０ｍｇ／ｋｇミガラスタトの共製剤は、１ｍｇ／ｋｇファブラザイム（アガルシダーゼベータ）よりも有意に低いＧＬ−３レベルを示す。３又は１０ｍｇ／ｋｇのミガラスタトと共製剤化された３ｍｇ／ｋｇのｒｈα−Ｇａｌ  Ａは、１０ｍｇ／ｋｇのファブラザイム（アガルシダーゼベータ）と比較して、同様又はわずかに優れたＧＬ−３の減少を達成し、１０ｍｇ／ｋｇのミガラスタト共製剤が最良の結果をもたらすようであった。
【０３６３】
実施例１０：ｒｈα−Ｇａｌ  Ａの様々な用量の単回投与の有効性比較
ミガラスタト及びファブラザイム（アガルシダーゼベータ）を伴う及び伴わないｒｈα−Ｇａｌ  Ａ  ０１−００３の有効性を比較した。酵素は、ミガラスタトとの共製剤を伴い又は伴わず、Ｇｌａ  ＫＯマウスに単回ボーラス注入で投与された。約１８週齢の雄性Ｇｌａ  ＫＯマウス（グループあたり７）は、単回ボーラスＩＶ投与を受け、投与の７日後に剖検が行われた。処置グループを表１５に示し、結果を図２１Ａ〜２１Ｄ及び表１６〜１９に示す。
【０３６４】
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【０３６５】
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【０３６６】
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【０３６７】
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【０３６８】
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【０３６９】
図２１Ａ〜２１Ｄ及び表１６〜１９からわかるように、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ  １ｍｇ／ｋｇ＋ミガラスタト３ｍｇ／ｋｇの共製剤は、１ｍｇ／ｋｇの用量でのファブラザイム（アガルシダーゼベータ）よりも、より大きい基質（ＧＬ−３及びｌｙｓｏ−Ｇｂ３）の減少を有し、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ  ３ｍｇ／ｋｇ＋ミガラスタト１０ｍｇ／ｋｇの共製剤は、１０ｍｇ／ｋｇの高用量のファブラザイム（アガルシダーゼベータ）と同等であった。ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ  １０ｍｇ／ｋｇとミガラスタトの共製剤は、２５ｍｇ／ｋｇの高用量のファブラザイム（アガルシダーゼベータ）と同様の有効性を達成し、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａ  １０ｍｇ／ｋｇ＋ミガラスタト３０ｍｇ／ｋｇの共製剤は、全体的な基質の最大の減少をもたらした。１０ｍｇ／ｋｇのｒｈα−Ｇａｌ  Ａ用量は、１０ｍｇ／ｋｇの同等用量のファブラザイム（アガルシダーゼベータ）よりも大きい基質減少をもたらし、ミガラスタトとの共製剤は基質減少をさらに増強した。
【０３７０】
実施例１１：安全性、忍容性、及び薬物動態を評価するための静脈内投与ミガラスタトの用量漸増
健康なボランティアは、安全性、忍容性、及び薬物動態を評価するために、ＩＶ投与経路でミガラスタトＨＣｌを投与された。健康なボランティアでのミガラスタトＨＣｌのＩＶ投与と比較した経口カプセル投与後のミガラスタトの絶対的バイオアベイラビリティを決定するために、別の試験が実施された。ＩＶ投与後のミガラスタト単独のＰＫ挙動を特性評価することにより、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａとの共製剤におけるミガラスタトＨＣｌの推奨用量をより正確に予測できることが期待された。１５０ｍｇ経口用量の、ＩＶ注入として投与される１５０ｍｇ用量に対する曝露比を決定するために、絶対バイオアベイラビリティアームが追加された。これは、経口からＩＶへのブリッジングが可能かどうかを決定し、ｒｈα−Ｇａｌ  Ａとの共投与及び／又は共製剤のためのＩＶミガラスタトＨＣｌの正確な用量決定を提供するために調査された。主要な目的及び副次的な目的並びにエンドポイントのリストが表２０に提供される。
【０３７１】
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【０３７２】
試験のタイプ：このフェーズ１の試験は、２つの設計からなる単一施設試験であった。コホート１、２、及び３は、健康な対象におけるＩＶ投与ミガラスタトＨＣｌ又はＩＶ投与プラセボの安全性、忍容性、ＰＫを評価するための、無作為化、二重盲検、プラセボ対照、単回漸増用量（ＳＡＤ）ＩＶ試験設計に従って実施された。コホート４は、健康な対象における、ＩＶ投与ミガラスタトＨＣｌと比較した経口投与ミガラスタトＨＣｌの絶対バイオアベイラビリティを評価するために設計された、オープンラベル、無作為化、双方向クロスオーバーアームであった。全てのコホートで、ミガラスタトＨＣｌ（又は該当する場合はプラセボ）のＩＶ注入の期間は、１２５ｍｌ／ｈの一定速度で２時間（±１０分）であった。
【０３７３】
コホート１、２、３：コホート１、２、及び３の対象は、ミガラスタトＨＣｌの単回漸増用量をＩＶ投与された。７人の対象が各コホートに組み入れられた（ミガラスタトＨＣｌに無作為化された５人の対象及びプラセボに無作為化された２人の対象）。コホート１、２、及び３の投与は、次のグループで進める前に安全性と忍容性のレビューを可能にするためにずらされた。したがって、コホート１、２、及び３はそれぞれ２つのサブグループ：グループＡ（ミガラスタトＨＣｌに無作為化された２人の対象及びプラセボに無作為化された１人の対象）及びグループＢ（ミガラスタトＨＣｌに無作為化された３人の対象及びプラセボに無作為化された１人の対象）に分割された。グループＢの対象は、グループＡの投与完了の翌日に投与された。コホート３Ａから出たデータにつき中間ＰＫレビューが実施されたため、コホート３Ａの３１日後に投与された、コホート３Ｂを除く。さらに、注入の開始は、グループＡの対象では６０分、グループＢの対象では３０分ずれていた（図２２を参照）。
【０３７４】
＊全てのコホートで、グループＢの対象の投与はグループＡにおける投与の翌日に開始された。コホート３Ａの中間ＰＫレビューが実施されたため、コホート３Ａの３１日後に投与された、コホート３Ｂを除く。
【０３７５】
コホート４：オープンラベルクロスオーバーアーム（コホート４）を追加して、１５０ｍｇミガラスタトＨＣｌの２時間ＩＶ注入と比較した経口投与１５０ｍｇミガラスタトＨＣｌカプセルの絶対的バイオアベイラビリティを評価した。コホート４は、治験薬投与の間の７日間の休薬期間を伴う２つの連続した処置期間からなっていた（図２３）。コホート４には１０人の対象が組み入れられ、その全員に活性薬物が投与された（プラセボは投与されなかった）。コホート４は、期間１の間に、５人の対象に経口製剤を、５人の対象にＩＶ製剤を投与し、続いて期間２の間に別の製剤を投与するように無作為化された。
＊期間１の間、−１日目から３日目までの全ての評価が実施された。＊＊休薬期間は７日間であった。＊＊＊期間２の間、対象は−１日目から３日目までの全ての評価を繰り返した。
【０３７６】
用量漸増：この漸増設計は、先行する各用量の安全性及び忍容性の評価の後、用量を慎重に増加できるように選択された。ＩＶ投与されるミガラスタトＨＣｌの単回漸増用量には、０．３ｍｇ／ｋｇの開始用量（コホート１）、１．０ｍｇ／ｋｇの中間範囲用量（コホート２）、及び最大許容用量１３．０ｍｇ／ｋｇまでの、緊急安全性、忍容性、ＰＫデータに基づいた、コホート中の任意の時点で許可される最高用量が含まれる。ＣＳＰ改正３．１（附属書１６．１．１及びセクション９．８．１を参照）により、本試験の最高用量（コホート３）は次の制限を超えないと推定された。１１６ｈ＊μｇ／ｍｌ（１１５，９３１ｈ＊ｎｇ／ｍＬ）のミガラスタトＨＣｌ１２５０ｍｇの経口投与後の最大曝露（ＡＵＣ）。
【０３７７】
投与された処置薬：全てのコホートで、ミガラスタトＨＣｌ（又は該当する場合はプラセボ）のＩＶ注入の期間は、１２５ｍｌ／ｈの一定速度で２時間（±１０分）であった。コホート１、２、及び３に組み入れられた対象は、以下の用量のミガラスタトＨＣｌ（ｎ＝５）又はプラセボ（ｎ＝２）のうち１つを受けるように無作為化された。
コホート１（０．３ｍｇ／ｋｇ  ＩＶ）：ミガラスタトＨＣｌ（ｎ＝５）又はプラセボ（ｎ＝２）
コホート２（１．０ｍｇ／ｋｇ  ＩＶ）：ミガラスタトＨＣｌ（ｎ＝５）又はプラセボ（ｎ＝２）
コホート３（１０．０ｍｇ／ｋｇ  ＩＶ）：ミガラスタトＨＣｌ（ｎ＝５）又はプラセボ（ｎ＝２）。
コホート４：期間１：１５０ｍｇのミガラスタトＨＣｌカプセル（ｎ＝５）又はＩＶ注入による１５０ｍｇのミガラスタトＨＣｌ（ｎ＝５）。期間２：１５０ｍｇのミガラスタトＨＣｌカプセル（ｎ＝５）又はＩＶ注入による１５０ｍｇのミガラスタトＨＣｌ（ｎ＝５）
【０３７８】
注入に使用されたミガラスタトＨＣｌは５０ｍｇ／ｍｌであり、プラセボは０．９％塩化ナトリウムであった。経口ミガラスタトＨＣｌは、１５０ｍｇのゼラチン錠剤として投与された。
【０３７９】
試験における用量の選択：現在の単回投与レベルは、ＩＶ投与後の予測されるヒトＰＫ、非臨床的安全マージン、及び有効性のための標的治療的ミガラスタト曝露に基づいて選択された。ヒトにおける０．３ｍｇ／ｋｇのミガラスタトＨＣｌの単回ＩＶ注入の開始は、大きな安全マージンに基づいて選択された（表２１）。同様に、ヒトにおけるミガラスタトＨＣｌの１０ｍｇ／ｋｇ用量は、先の経口ヒトミガラスタト曝露及び前臨床安全マージンによってサポートされた（表２２）。マスバランス試験に基づくと、ミガラスタトの回収率は高く、これはミガラスタトが十分に吸収されていることを示すが、およそ２０％〜２５％は未吸収の薬物に相当し得る。そのため、経口投与後の非吸収薬物の可能性を考慮して、ＩＶ投与後の予測曝露量は１．２５倍程度になると予想された。
【０３８０】
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【０３８１】
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【０３８２】
１５０ｍｇのミガラスタトＨＣｌカプセルの経口投与は、健康なボランティア及びファブリー病患者で実施された先の臨床研究で良好に忍容された。さらに、フェーズ１試験における健康なボランティアへの最大２０００ｍｇのミガラスタトＨＣｌの単回投与は良好に忍容されている。経口投与により、１２５０ｍｇまでのミガラスタトＨＣｌへの線形曝露が実証された。２３人のファブリー病患者で実施されたフェーズ２ａ試験では、１５０ｍｇのミガラスタトＨＣｌの単回経口投与を０．２、０．５、及び１．０ｍｇ／ｋｇのアガルシダーゼと共投与した後、皮膚への活性α−Ｇａｌ  Ａの組織取り込みの改善が示された。さらに、単剤治療プログラムのフェーズ２及びフェーズ３試験において、許容される変異を伴うファブリー病患者に対し、隔日で１５０ｍｇのミガラスタトＨＣｌが安全に投与された。
【０３８３】
コホート１、２、及び３（ＳＡＤ）：０．３〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量のミガラスタトＨＣｌの単回２時間ＩＶ注入の後、典型的には、注入開始後２時間に相当する注入終了時に、ミガラスタトの最大相加平均血漿濃度に達した。ミガラスタトの平均血漿濃度−時間プロファイルは、ミガラスタトＨＣｌのＩＶ用量の増加に続いて、血漿濃度において明確な用量依存的増加を示した。最大値に達した後、ミガラスタト濃度は投与後１２時間まで急速に低下した。より高い用量レベル（０．３ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ）では、明らかに二相性の様式で、ミガラスタト濃度の初期の急速な低下に、より緩やかな低下が続いた（図２４Ａ及び２４Ｂは、それぞれ線形及び対数スケールでの薬物動態を示す）。個々のミガラスタトの血漿濃度−時間プロファイルを組み合わせることにより、試験したＩＶ用量全体で個々のＰＫプロファイルに最小限の個体間差が示された。
【０３８４】
コホート４：１５０ｍｇのミガラスタトＨＣｌの経口投与後、ミガラスタトは投与後０．２５時間〜０．５時間以内に血漿中に出現した（０．２５時間が投与後の最初のサンプリング時点であった）。ミガラスタトの最大相加平均血漿濃度は、典型的には、経口投与後２時間〜４時間で到達した。対象０２２について１．５時間での最初のピーク濃度の後に経口投与後４時間での２番目のさらに高いピーク濃度が続いたことを除いて、大半の対象について単一のピーク血漿濃度が観察された。対象０３０では、経口投与後１時間〜１．５時間の間に同様のプラトー期が観察され、続いて投与後３時間でピーク濃度が観察された。１５０ｍｇのミガラスタトＨＣｌのＩＶ投与後、ＳＡＤデータと同様に、注入終了時（注入開始後２時間に相当する）に、ミガラスタトの最大相加平均血漿濃度に達した。最大相加平均血漿濃度は、ミガラスタトＨＣｌの経口投与後よりもＩＶ投与後でおよそ２倍高かった。最大値に達した後、ミガラスタトＨＣｌの経口投与及び静脈内投与の両方で、ミガラスタト濃度は急速に低下し、その後、明らかに二相性の様式で、より緩やかな低下が続いた（図２５Ａ及び２５Ｂは、それぞれ線形及び対数スケールでの薬物動態を示す）。
【０３８５】
組み合わせられた個々のミガラスタトの血漿濃度−時間プロファイルは、１５０ｍｇのミガラスタトＨＣｌを経口投与した後に、１５０ｍｇのミガラスタトＨＣｌをＩＶ投与した後よりも大きい、個々のＰＫプロファイルにおける個体間差を示した。また、ＰＫプロファイルの個体間差は、０．３〜１０ｍｇ／ｋｇのＩＶ用量範囲の後よりも１５０ｍｇのＩＶ用量の後に顕著であるようであり、これは、おそらく、１５０ｍｇの経口用量後の吸収及びクリアランスの速度及び程度の個体間差に関連しているか、又は、１５０ｍｇのＩＶ用量が個々の対象の体重に対して補正されなかったためである。
【０３８６】
本明細書で参照される特許及び科学文献は、当業者が利用可能な知識を構築するものである。本明細書で引用された全ての米国特許及び公開又は未公開の米国特許出願は、参照により組み込まれる。本明細書で引用された全ての公開された外国特許及び特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で引用される他の全ての公開された参考文献、文書、原稿、及び科学文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０３８７】
本発明は、その好ましい実施形態を参照して特に示され説明されたが、当業者であれば、添付の特許請求の範囲に包含される本発明の範囲から逸脱することなく、形態及び詳細の様々な変更がなされ得ることを理解するであろう。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ−２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６Ａ】
2020503900.tif 000071
【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
2020503900.tif 000073
【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
2020503900.tif 000075
【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１８Ｅ】
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【図１８Ｆ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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