(57)【要約】本発明は、マンノースオリゴ糖を含む組成物、及びそのような組成物の製造工程に関する。本発明は更に、ヒトまたは動物の治療に用いるためのマンノースオリゴ糖を含む組成物に関する。【選択図】図１
2020527334.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶性であることを特徴とするマンノースオリゴ糖組成物。
【請求項２】
０．１ｗｔ％ｄｂ未満のβグルカンを含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記マンノースオリゴ糖含有率が３０ｗｔ％ｄｂ以上であることを更に特徴とする、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４】
ジマンノース（ｄｉｍａｎｎｏｓｅ）含有率が１０〜３５ｗｔ％ｄｂであることを更に特徴とする、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
フルクトース含有率が０．５〜１０ｗｔ％ｄｂであることを更に特徴とし、好ましくはマンノース含有率が５〜２５ｗｔ％ｄｂであることを更に特徴とし、好ましくはグルコース含有率が１〜１５ｗｔ％ｄｂであることを更に特徴とする、請求項１〜４に記載の組成物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物と、更なる食物成分、動物飼料成分もしくはペットフード成分とを含む食料品、動物飼料製品またはペットフード製品。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物が、１回以上の給仕で、ヒト、動物もしくはペットの体重１ｋｇ当たり０．０１〜０．０２ｇの組成物を提供するのに十分な量で存在する、請求項６に記載の食料品、動物飼料製品またはペットフード製品。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物が、前記食料品、動物飼料製品もしくはペットフード製品の重量を基準にして０．１〜０．５ｗｔ％、好ましくは０．１〜０．４ｗｔ％、より好ましくは０．１〜０．３ｗｔ％、更により好ましくは０．１〜０．２ｗｔ％の量で存在する、請求項６に記載の食料品、動物飼料製品またはペットフード製品。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物が、前記食料品、動物飼料製品もしくはペットフード製品の重量を基準にして０．０１〜０．０５ｗｔ％、好ましくは０．０１〜０．０３ｗｔ％、より好ましくは０．０１〜０．０２ｗｔ％の量で存在する、請求項６に記載の食料品、動物飼料製品またはペットフード製品。
【請求項１０】
マンノースオリゴ糖を含む組成物の製造方法であって、以下のステップ：
ａ）  酸性化触媒の存在下、１８０℃〜２４０℃、好ましくは１９５℃〜２４０℃の温度でマンノースをマイクロリアクターに通して前記マンノースを重縮合することにより、マンノオリゴ糖含有組成物を生成するステップと、
ｂ）  任意に、前記マンノオリゴ糖組成物を中和及び／または脱色するステップと、
ｃ）  前記マンノオリゴ糖組成物を収集するステップと、
を含み、前記酸性化触媒が、好ましくはクエン酸、硫酸またはリン酸であることを特徴とする、前記方法。
【請求項１１】
ステップａ）の最中の前記マイクロリアクター内でのマンノースの滞留時間が５〜２０秒である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ヒトまたは動物の治療のための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
ヒトもしくは動物における腸粘膜への細菌付着の低減もしくは防止、及び／または体重増加の改善、及び／または飼料摂取の改善、及び／または体重増加の改善、及び／または糞便の質の改善のための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物または動物。
【請求項１４】
動物の成長能力の改善のための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項１５】
ヒトもしくは動物の体内または体表における微生物または細菌による汚染の低減、あるいは感染の低減、好ましくはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ及び／またはＥ．ｃｏｌｉによる汚染の低減のための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項１６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のマンノースオリゴ糖組成物を含む化粧品、パーソナルケア製品または医薬製品であって、前記化粧品が好ましくは化粧クリーム、化粧ローションもしくは口紅であり、前記パーソナルケア製品が好ましくはオーラルケア製品、ヘアケア製品、スキンケア製品もしくは衛生製品であり、あるいは前記医薬製品が好ましくは消毒剤もしくは防腐剤バームである、前記化粧品、パーソナルケア製品または医薬製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年６月１４日に出願された欧州特許出願第１７１７５９８１．４号の利益を主張するものであり、その全体は本明細書において参照により援用されている。
【０００２】
本発明は、マンノースオリゴ糖を含む組成物、及びそのような組成物の製造工程に関する。本発明は更に、本発明の組成物を含む動物飼料に関する。本発明は更に、ヒトもしくは動物の治療、特に成長及び／または飼料利用の促進及び／またはヒト及び動物における細菌感染の低減に使用するための、本発明による組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
ヒト、家畜、養殖魚及びペットにおける健康全般、特に腸の健康の改善を図るための栄養補給剤に対しては既存の需要が存在する。
【０００４】
世界的な人口増大に伴い、ヒトが消費する動物性タンパク質の需要は増加の一途をたどっている。動物生産産業は、より多くの動物を繁殖させるための課題に直面している。この課題を遂行する手段が、動物の個体数増加だけでなく、動物の成長能力増強、及び動物の健康の全体的な改善である。動物農場経営を成功させるための主要因とされるのが、動物の健康及び動物の成長能力である。特に、動物の成長能力に関して不可欠な要素は、胃腸の健康及び胃腸の健全性であり、これを達成する目的に飼料添加物が使用される。重要な懸案事項としては、それ以外にも細菌汚染が挙げられ、その細菌汚染は特に家禽及び豚に当てはまる。細菌汚染への対抗を目的に動物農場経営において繁用されている方法は、例えば細菌の殺滅（抗生物質によって為されるような殺滅）を行う代わりに、有害な細菌が腸管表面に付着するのを防ぐ結合メカニズムを通して動物における所望されない細菌集団を激減させる物質を使用することである。
【０００５】
また、食品安全性上の重要な懸案事項とされ、対処及び低減を要するものの代表例が、食品における細菌汚染である。特に、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ及びＥ．ｃｏｌｉによる汚染は、食物供給連鎖における重要な懸案事項となっている。
【０００６】
マンノースオリゴ糖組成物は、健康全般、特に腸の健康を改善することで知られている。現在市販されている既存のマンノースオリゴ糖（またはマンノオリゴ糖もしくはＭＯＳ）組成物としては、例えば酵母エキス類（酵母細胞壁抽出物、生コーヒー豆抽出物、コンニャク抽出物がその大部分を占める）などのあらゆる抽出物が挙げられ、それらＭＯＳ組成物はいずれも、高純度の組成物ではなくしかも組成に一貫性がないという欠点が見られる。この欠点は酵母細胞壁抽出物に特に当てはまり、結果として、動物におけるそれらＭＯＳ組成物の作用は至極予測困難となっており、その効果はかなりの変動を生ずる。また、それらの組成物の大部分は水に不溶である。結果として、それらＭＯＳ組成物を液体飼料及び飲料水中に適用することは実用的ではなく、したがって制限的である。更に、そのようなマンノースオリゴ糖組成物の製造工程は、多くの廃水流を生ずることから、それによる環境影響は無視できない。
【０００７】
ＷＯ２０１５／１６０８１８（Ａ１）号は、可溶性酵母細胞壁ＭＯＳを含む濃縮酵母細胞壁組成物の生産に関する。
【０００８】
それゆえ、高効率の飼料添加物を提供することに対するニーズが尚存在することは明らかである。また、環境により優しい方法で生産される飼料添加物を提供することに対するニーズもある。本発明はこれらのニーズに対処している。
【発明の概要】
【０００９】
第１の態様において、本発明は、マンノースオリゴ糖を含む組成物（「本発明のマンノースオリゴ糖組成物」）で、しかも水溶性であることを特徴とする、前記組成物に関する。
【００１０】
更なる態様において、本発明は、本発明のマンノースオリゴ糖組成物と更なる食物成分と動物飼料成分もしくはペットフード成分とを含む食料品、動物飼料製品、魚飼料製品またはペットフード製品に関する。
【００１１】
更なる態様において、本発明は、本発明のマンノースオリゴ糖組成物と更なるパーソナルケア成分もしくは医薬成分とを含む、パーソナルケア組成物または医薬組成物に関する。
【００１２】
更なる態様において、本発明は、本発明のマンノースオリゴ糖組成物を含む化粧品、パーソナルケア製品または医薬製品に関する。
【００１３】
更なる態様において、本発明は、マンノースオリゴ糖を含む組成物を製造する工程であって、以下のステップ：
ａ）  酸性化触媒の存在下、１８０℃〜２４０℃、好ましくは１９５℃〜２４０℃の温度でマンノースをマイクロリアクターに通してマンノースを重縮合することにより、マンノオリゴ糖含有組成物を生成するステップと、
ｂ）  任意に、マンノオリゴ糖組成物を中和及び／または脱色するステップと、
ｃ）  任意に、マンノオリゴ糖組成物を精製するステップと、
ｄ）  マンノオリゴ糖組成物を収集するステップと、
を含むことを特徴とする工程に関する。
【００１４】
更なる態様では、本発明は、ヒトもしくは動物の治療を用途とした本発明のマンノースオリゴ糖組成物の使用、またはヒトもしくは動物の治療に用いられるマンノースオリゴ糖組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は胃酸の状態に関係なく、本発明によるＭＯＳ組成物は飼料酵素では分解されないことを実証している。
【図２】図２は階層的クラスタリング分析の結果示している。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本明細書中の様々な要素もしくは構成要素を説明するための「ａ」または「ａｎ」の使用は、あくまで便宜を図り、且つ本発明の一般的な意味を与えることを用途とするものにすぎない。この説明は、１つまたは少なくとも１つを含み、単数形には複数形も含まれるが、そうでないことが明白な場合はその限りではないことと解釈すべきである。
【００１７】
本説明において、マンノースオリゴ糖、マンノオリゴ糖、及びＭＯＳという用語は、同一物を記述するために同義に用いられている。マンノースオリゴ糖は、ＤＰが３以上であるマンノースのオリゴ糖として定義される。ＤＰとは、重合度、すなわちオリゴ糖の中に存在するモノマーの数を指す。マンノースオリゴ糖中のモノマーは、マンノースである。本発明のマンノースオリゴ糖組成物は、ＤＰが３以上であるマンノースオリゴ糖を含み、マンノース二糖の供給源であり、更にマンノース単糖を含み得ることを特徴とする。ＨＰＬＣ分析（ＩＳＯ  １０５０４：１９９８−１０）を実施することにより、ＤＰ１、ＤＰ２、ＤＰ３以上などの、マンノースオリゴ糖組成物中に存在する様々な糖の量及び種類を判別できる。
【００１８】
本発明については、添付の特許請求の範囲に定義されている。本発明の少なくとも１つの態様は、既存のＭＯＳ組成物に比べて、本発明によるマンノースオリゴ糖を含む組成物（「本発明の組成物」または「本発明のマンノースオリゴ糖組成物」）がヒト及び動物に及ぼす効果には、改善が施されてきたという所見に基づく。本発明のＭＯＳ組成物は、とりわけ、ヒトにおける身体能力に対する効果の改善、動物における成長能力に対する効果の改善、更に消化器の健康に対する効果の改善、細菌／病原体負荷制御、特に細菌結合、免疫系に対する影響の改善、プレバイオティクス効果の改善、抗細菌効果の改善、抗微生物効果の改善など、現在公知のＭＯＳ組成物を凌駕する効果が認められる。
【００１９】
本発明は、水溶性であることを特徴とする、マンノースオリゴ糖を含む組成物に関する。本発明の組成物は、溶解度が２０％以上、より好ましくは３０％以上、更により好ましくは４０％以上、尚更により好ましくは５０％以上、尚更により好ましくは６０％以上である。それゆえ、本発明の組成物の溶解度は、２０〜９０％、より好ましくは３０〜８５％、尚更により好ましくは４０〜８０％、尚更により好ましくは５０〜７５％、最も好ましくは６０〜７５％の範囲であり得る。溶解度は、本明細書中の下記試験Ａに従って測定してもよい。
試験Ａ
−  測定対象組成物の１０ｗｔ％水溶液を用意し、４０℃に加熱して、１時間４０℃のままに保持する。
−  その後、本組成物を孔径０．４５μｍのフィルターで濾過し、不溶物質を全て除去して、濾液を回収する。
−  続いて、濾液をＨＰＬＣ分析（ＩＳＯ  １０５０４：１１９８−１０）にかけて結果を記録する。
−  溶解度は％で表され、初期１０ｗｔ％水溶液中の乾燥物質に対する濾液中の総糖類含有量に対応する。
【００２０】
本発明によるＭＯＳ組成物は、水に容易に溶解することが可能であり、清澄な水溶液を生ずる。
【００２１】
本発明のＭＯＳ組成物は、好ましくはβグルカン含有率が０．１ｗｔ％ｄｂ未満、好ましくは０．０１ｗｔ％ｄｂ未満、より好ましくは０．００１ｗｔ％ｄｂ未満であり、最も好ましくは本発明のＭＯＳ組成物はβグルカン不含であることを更に特徴とする。先行技術のマンノースオリゴ糖は、典型的に、マンノースオリゴ糖：βグルカン１：１の比率で、大量のβグルカンを含有する。これらの組成物は、βグルカン含有率が高いことから、免疫系に影響を及ぼすものと考えられている。本発明の組成物は免疫系に対して効果を有するという驚くべき発見が為されてきた。この効果は、上記のように本発明の組成物のβグルカン含有率が極少量であるか不含である場合でさえも、先行技術の組成物を用いて得られる効果に匹敵し得る。
【００２２】
更に、ＭＯＳ組成物は、コンニャクもしくはコーヒー豆などの酵母または植物繊維由来のものでないことを特徴とする。
【００２３】
好ましくは、本発明のＭＯＳ組成物は、マンノースオリゴ糖含有率が本組成物の乾燥基準（ｄｂ）で３０重量％（ｗｔ％）以上、好ましくは４０ｗｔ％以上、より好ましくは５０ｗｔ％以上、更により好ましくは６０ｗｔ％以上、尚更により好ましくは６５ｗｔ％以上、尚更により好ましくは７０ｗｔ％以上、尚更により好ましくは８０ｗｔ％以上であることを更に特徴とする。
【００２４】
本発明のＭＯＳ組成物は、マンノース二糖（ＤＰ２）の供給源とされることが好ましい。ゆえに、本発明のＭＯＳ組成物は、好ましくはＤＰ２含有率が１０〜３５ｗｔ％ｄｂ、好ましくは１５〜３０ｗｔ％ｄｂ、好ましくは２０〜２５ｗｔ％ｄｂである。ＤＰ２含有率が約３０ｗｔ％ｄｂの場合もあれば、ＤＰ２含有率が約３１ｗｔ％ｄｂの場合もあれば、ＤＰ２含有率が約３２ｗｔ％ｄｂの場合もあれば、ＤＰ２含有率が約３３ｗｔ％ｄｂの場合もあれば、ＤＰ２含有率が約３４ｗｔ％ｄｂの場合もあれば、ＤＰ２含有率が約３５ｗｔ％ｄｂの場合もある。
【００２５】
更に、ＭＯＳ組成物は、フルクトース含有量が最大で１０ｗｔ％ｄｂ、例えば０．５〜１０ｗｔ％ｄｂ、好ましくは最大５ｗｔ％ｄｂ、より好ましくは最大３ｗｔ％ｄｂ、より好ましくは最大１ｗｔ％ｄｂであり得る。
【００２６】
更に、ＭＯＳ組成物は、マンノース含有量が５〜５０ｗｔ％ｄｂ、好ましくは５〜２５ｗｔ％ｄｂであり得る。
【００２７】
更に、ＭＯＳ組成物は、グルコース含有量が１〜１５ｗｔ％ｄｂ、好ましくは５〜１０ｗｔ％ｄｂであり得る。
【００２８】
ＭＯＳ組成物の乾燥物質を、その用途のニーズに応ずるように適合させてもよい。乾燥物質は、少なくとも７０ｗｔ％、好ましくは少なくとも７５ｗｔ％、より好ましくは少なくとも８０ｗｔ％、更により好ましくは少なくとも９０ｗｔ％、尚更により好ましくは少なくとも９５ｗｔ％、例えば９５〜９９ｗｔ％であり得る。ＭＯＳ組成物は、意図された使用目的に応じて粉末または液体のいずれかの形態で保存できる。本発明のＭＯＳ組成物は、粉末形態では安定した黄色がかった白色の自由流動性粉末である。
【００２９】
更に、ＭＯＳ組成物は、マンノースオリゴ糖がα−及びβ−１，６及びα−１，３型結合が大部分を占めることを特徴とし得る。好ましくは、少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％、更により好ましくは少なくとも８０％の結合がα−及びβ−１、６及びα−１，３型結合である。糖類中に存在する可能性のある結合を測定する方法は、パルスアンペロメトリック検出による高性能陰イオン交換（ＨＰＡＥ−ＰＡＤ）など様々な種類のものが、当該技術分野において周知である。
【００３０】
本発明によるＭＯＳ組成物を動物に給餌した場合に前記組成物によって動物の成長能力が良好化される効果のあることが見出されてきた。動物の成長能力は、動物の体重増加及び飼料摂取であると理解されている。特に、本発明のＭＯＳ組成物は、ＤＰ２が２５ｗｔ％ｄｂ以上、例えば２５〜３０ｗｔ％ｄｂであり、動物の成長能力に対する効果に更に改善が施されていることを特徴とする。より具体的には、本発明のＭＯＳ組成物は、ＤＰ３＋含有量が４０ｗｔ％ｄｂ以下、例えば３５〜４０ｗｔ％ｄｂであり、動物の成長性能に対する効果に更に改善が施されていることを特徴とする。
【００３１】
更に、本発明によるＭＯＳ組成物は、免疫系を調節する能力、すなわち免疫細胞またはマクロファージの応答を調節する能力を有することも見出されてきた。それゆえ、本発明は更に、免疫細胞またはマクロファージの応答の調節に使用するための、本発明によるＭＯＳ組成物に関する。本発明は更に、免疫細胞またはマクロファージの応答を調節するための、本発明によるＭＯＳ組成物の使用に関する。
【００３２】
更に、本発明によるＭＯＳ組成物が上皮細胞の増殖を増強させることも見出されてきた。ＭＯＳ組成物は、腸細胞の増殖を刺激することにより、腸粘膜などの動物粘膜の病変を修復するのに有用である。それゆえ、本発明は更に、上皮細胞の増殖増強に用いるための、本発明によるＭＯＳ組成物に関する。本発明は更に、上皮細胞の増殖増強を目的とする、本発明によるＭＯＳ組成物の使用に関する。
【００３３】
更に、本発明によるＭＯＳ組成物は、ヒトもしくは動物の体内または体表における病原体負荷、特に細菌もしくは微生物負荷、及び／または感染を低減するのに有用であることも見出されてきた。したがって、本発明は更に、ヒトもしくは動物の体内または体表における、特に動物もしくはヒトの胃腸管における病原体負荷、特に細菌もしくは微生物負荷、及び／または感染の低減に使用するための、本発明によるＭＯＳ組成物に関する。本発明は更に、ヒトもしくは動物の体内または体表における病原体負荷、特に細菌または微生物負荷、及び／または感染を低減させるための、本発明によるＭＯＳ組成物の使用に関する。
【００３４】
本発明は更に、ヒトもしくは動物の体内または体表における抗菌処置に使用するための、本発明によるＭＯＳ組成物に関する。本発明はまた、ヒトもしくは動物の体内または体表における抗菌処置（治療的または非治療的）時の本発明のＭＯＳ組成物の使用に関する。そのような治療剤は、例えば、スキンケア製品もしくは医薬製品のような、化粧品またはパーソナルケア製品の形態であり得る。
【００３５】
特に、ＤＰ２が約２２ｗｔ％ｄｂ、例えば１５〜２５ｗｔ％ｄｂであり、ＤＰ３＋が約５０ｗｔ％ｄｂ、例えば４５〜６０ｗｔ％ｄｂであることを特徴とするＭＯＳ組成物、また特に、ＤＰ２含有率が１０〜２０ｗｔ％ｄｂであり、ＤＰ３＋含有率が５５〜７５ｗｔ％ｄｂ、例えば６０ｗｔ％ｄｂ以上、６０〜７０ｗｔ％ｄｂ、好ましくは６５〜７０ｗｔ％ｄｂであることを特徴とするＭＯＳ組成物は、動物におけるＥ．ｃｏｌｉ感染及び／またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ感染の低減に有用である。
【００３６】
本発明は更に、ヒトまたは動物を治療するための、本明細書に記載のＭＯＳ組成物の使用に関する。本発明は更に、ヒトまたは動物の治療に使用するための、本明細書に記載のＭＯＳ組成物に関する。それゆえ、本明細書に記載のＭＯＳ組成物はまた、ヒトまたは動物を治療するための薬剤中に／薬剤として使用しても差し支えない。
【００３７】
本発明は更に、動物の成長能力改善を用途とするＭＯＳ組成物の非治療的使用をはじめとする、動物の成長能力改善を用途とする、本明細書に記載のＭＯＳ組成物の使用に関する。また、本明細書に記載のＭＯＳ組成物を、薬剤中に／薬剤として使用することによって、動物の成長能力改善を図ることが可能である。ＭＯＳ組成物は飼料添加物として使用しても差し支えない。
【００３８】
本発明は更に、ヒト及び動物における微生物もしくは細菌汚染の低減、あるいは感染の低減、好ましくはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ及び／またはＥ．ｃｏｌｉ汚染の低減を用途とする、本発明のＭＯＳ組成物の使用に関する。それゆえ、本発明はまた、ヒトもしくは動物の体内または体表における微生物もしくは細菌汚染の低減に使用するための、または感染の低減に使用するための、好ましくはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ及び／またはＥ．ｃｏｌｉ汚染の低減に使用するための、本明細書に記載のＭＯＳ組成物を対象とする。特に、約２２％ＤＰ２及び５０％ＤＰ３＋（＋／−１％）のＭＯＳ組成物が有用とされ、また、ＤＰ３＋が６０％を超えるＭＯＳ組成物も有用とされる。
【００３９】
本発明は更に、ヒトもしくは動物の体重増加の改善、及び／または飼料摂取の改善、及び／または体重の改善、及び／または糞便の質の改善のための、本明細書に記載のＭＯＳ組成物に関し、これには、ヒトもしくは動物の体重増加の改善、及び／または飼料摂取の改善、及び／または体重の改善、及び／または糞便の質の改善におけるＭＯＳ組成物の治療的及び非治療的使用の両方が含まれる。
【００４０】
本発明は更に、腸粘膜への細菌付着を低減または防止するための、本明細書に記載のＭＯＳ組成物に関し、これには、腸粘膜への細菌の付着を低減または防止するのに使用するための、本明細書に記載のＭＯＳ組成物が包含される。
【００４１】
動物は、家禽（鶏、シチメンチョウ及びウズラなど）、豚、反芻動物類、ウマ類、水生動物類（例えばサケやマスのような魚、及びエビなど）、またはペットであることが好ましい。動物は、家禽または豚であることがより好ましい。下記実施例のセクションで例示するようなｉｎ  ｖｉｖｏ治験で明らかにされてきたように、本発明によるＭＯＳ組成物を摂取することは動物の胃腸の健康に有益であり、それにより動物の成長能力が増強される。
【００４２】
本発明は更に、本発明のＭＯＳ組成物と更なる食物成分と動物飼料成分もしくはペットフード成分とを含む食料品、動物飼料製品またはペットフード製品に関する。
【００４３】
本発明のＭＯＳ組成物を使用する利点は、容易に溶解することができ、取り扱い及び／または投与をより良好に行えるという点であり、このため、少なくとも１種の液体成分（飲料等の液状食品など）を使用する多くの用途、あるいは動物用飲料水等の液体飼料中に使用するのに極めて適している。ＭＯＳ組成物は、乾燥混合物への取り込みも容易に行うことができる。
【００４４】
食料品は、ビスケット、クッキー、シリアルバー、朝食用シリアル、クラッカー、ケーキ、パン、マフィン、ペストリー、揚げ菓子・焼き菓子及びそれらに類するものなどの焼成製品であり得る。
【００４５】
食料品を、ソース、プリン、スープなどの便宜品としてもよい。
【００４６】
食料品は、チョコレート、チョコレート様製品、ソフトキャンディ、ハードキャンディ、ハードボイルドキャンディ、プレスキャンディ、ガム、チューインガム、ゼリー、マシュマロ、ロゼンジ、タブレット、キャラメル、ヌガー、プラリネ、タフィー、ファッジ、フォンダン、マジパン及びそれらに類するものなどの菓子製品であり得る。
【００４７】
食料品は飲料であり得る。飲料には、任意のシロップもしくは任意のアルコール及び非アルコール、炭酸及び非炭酸、または飲用に適した液剤、例えば、水、ビール、レモネード、コーディアル、アイスティー、フルーツジュースのほか、シリアルベースの飲料、アーモンドベースもしくは他のナッツベースの飲料、大豆ベースの飲料、米ベースの飲料及びそれらに類するものなどの野菜ベースの飲料が包含されるだけでなく、濃縮飲料及び粉末飲料もまた包含される。濃縮飲料とは、液体形態であるかまたは本質的に乾燥混合物形態であるかのいずれかの濃縮物を指す。濃縮飲料は通常、炭酸水もしくは非炭酸水のいずれかで構成または希釈したときに、飲用に適した飲料組成物または最終飲料を提供するように調合される。粉末飲料は、炭酸水もしくは非炭酸水または牛乳で最終飲料を構成するのに適している。
【００４８】
食料品は、牛乳、ホエー、ヨーグルト、及びそれらを主原料とする飲料、ココアベースの乳製品飲料、発酵デザート（フレッシュチーズ調製物、飲料製品など）、アイスクリーム、ミルクシェーク、フローズンヨーグルト、中性乳製品デザート（プリン、フラン、クリームデザート、ホイップデザートなど）、及びフレーバーヨーグルト調製物（例えば果物不含のフルーツヨーグルト）、冷凍乳製品デザート及びそれらに類するものなどの乳製品であり得る。
【００４９】
食料品は、離乳食、幼児食、及び栄養補給剤とされる場合もある。
【００５０】
食料品はまた、高齢者のニーズに対応するように特別に設計された食品であり得る。
【００５１】
動物飼料製品は、豚、好ましくは仔豚、もしくは鶏に給餌するために設計された飼料製品、例えばブロイラー鶏飼料もしくは産卵用鶏飼料、またはサケもしくはマスなどの魚用飼料であり得る。動物飼料はまた、ウマ用飼料とされる場合もある。前記豚用飼料、鶏用飼料、魚用飼料またはウマ用飼料は、本発明のＭＯＳ組成物に次いで、そのような動物用飼料に典型的もしくは具体的に使用される飼料成分を含む。典型的及び具体的な動物飼料組成物は、動物飼料を調製する当業者に認識されている。ＭＯＳ組成物は、補足飼料として使用するのにも極めて好適であり、可溶性であることから、例えば飲料水にも難なく添加できる。飼料製品の更なる飼料成分は、他の炭水化物ならびに繊維、例えばグルカン、アラビノキシランオリゴ糖、タンパク質、脂肪、ビタミン、ミネラル及びそれらに類するものであり得る。動物種に応じて飼料組成物が異なり、好適な飼料組成物を調合する方法は当業者に理解されている。
【００５２】
ＭＯＳ組成物は、好ましくは、１日１回以上の給仕でヒト、動物もしくはペットの体重１ｋｇ当たり０．０１〜２０ｇ、好ましくは０．０１〜１０ｇのＭＯＳ組成物が供給されるような量で、食料品、動物飼料製品またはペットフード製品中に存在する。好ましくは、特に動物もしくはペット用のＭＯＳ組成物は、１日１回以上の給仕で動物の体重１ｋｇ当たりＭＯＳ組成物０．０１〜０．０２ｇが供給されるような量で動物飼料製品またはペットフード製品中に存在する。特に、食物、動物飼料もしくはペットフードは、食料品、動物飼料製品またはペットフード製品の重量を基準にして本ＭＯＳ組成物の０．０２〜０．６ｗｔ％を構成し得る。
【００５３】
一態様において、食物、動物飼料もしくはペットフード、好ましくは豚飼料は、食料品、動物飼料製品もしくはペットフード製品の重量を基準にして０．１〜０．５ｗｔ％、好ましくは０．１〜０．４ｗｔ％、更により好ましくは０．１〜０．３ｗｔ％、尚更により好ましくは０．１〜０．２ｗｔ％の本発明のＭＯＳ組成物を含む。
【００５４】
別の態様において、食物、動物飼料またはペットフード（家禽飼料であることが好ましい）は、食料品、動物飼料製品もしくはペットフード製品の重量を基準にして０．０１〜０．０５ｗｔ％、好ましくは０．０１〜０．０４ｗｔ％、更により好ましくは０．０１〜０．０３ｗｔ％、尚更により好ましくは０．０１〜０．０２ｗｔ％の本発明のＭＯＳ組成物を含む。
【００５５】
更に、本発明は、特に抗菌特性を有する製品において、本発明のＭＯＳ組成物と更なる化粧品成分とを含む化粧品に関する。化粧品は、化粧クリーム、化粧ローション、口紅、及びそれらに類するものであり得る。好ましくは、化粧品は、化粧品の重量を基準にして０．０１〜３０ｗｔ％、好ましくは０．０１〜２０ｗｔ％、より好ましくは１〜１５ｗｔ％、更により好ましくは５〜１０ｗｔ％の本ＭＯＳ組成物を含み得る。本発明はまた、化粧品におけるＭＯＳ組成物の使用にも関する。特に、本発明はまた、抗菌特性を有する化粧品におけるＭＯＳ組成物の使用にも関する。
【００５６】
本発明はまた、特に抗菌特性を有する製品において、本発明のＭＯＳ組成物と更なるパーソナルケア製品成分とを含むパーソナルケア製品に関する。パーソナルケア製品は、ボディローション、オーラルケア製品（マウスウォッシュ、歯磨き粉、及びそれらに類するもの）、ヘアケア製品、衛生製品、例えばハンドジェル、ウェットハンドタオルまたはワイプ（ベビーワイプ、インティメイトワイプ、クレンジングメイクアップ除去ワイプ）及びそれらに類するものであり得る。また、パーソナルケア製品には、クレンジングローション、洗浄液、フェイスクリーム、ハンドクリーム、ボディローション、保湿液、にきび治療製品、デオドラント及びそれらに類するものなどの、スキンケア製品が包含される。パーソナルケア製品は、好ましくはパーソナルケア製品の重量を基準にして０．０１〜３０ｗｔ％、好ましくは０．０１〜２０ｗｔ％、より好ましくは１〜１５ｗｔ％、更により好ましくは５〜１０ｗｔ％の本ＭＯＳ組成物を含み得る。本発明はまた、パーソナルケア製品における本発明によるＭＯＳ組成物の使用に関する。特に、本発明によるＭＯＳ組成物は、抗菌特性を有するパーソナルケア製品に有用である。
【００５７】
本発明はまた、本発明のＭＯＳ組成物と更なる医薬成分とを含む医薬製品に関する。パーソナルケア製品をハンドクリームとしてもよい。医薬製品には、消毒剤、防腐剤バーム及びそれらに類するものが含まれる。
【００５８】
好ましくは、医薬製品は、医薬製品の重量を基準にして０．０１〜２０ｗｔ％の本ＭＯＳ組成物を含み得る。
【００５９】
本発明は更に、マンノオリゴ糖組成物の製造工程であって、以下のステップ：
ａ）  酸性化触媒の存在下、１８０℃〜２４０℃、好ましくは１９５℃〜２４０℃の温度でマンノースをマイクロリアクターに通してマンノースを重縮合することにより、マンノースオリゴ糖含有組成物を生成するステップと、
ｂ）  任意に、マンノオリゴ糖組成物を中和及び／または脱色するステップと、
ｃ）  任意に、マンノオリゴ糖組成物を精製するステップと、
ｄ）  マンノオリゴ糖組成物を収集するステップと、
を含む、前記工程に関する。
【００６０】
マンノースは、マンノース含有組成物、マンノース単離物、マンノース溶液またはこれらの混合物であり得る。マンノースは水性マンノース溶液とすることが好ましい。マンノース水溶液中のマンノース濃度は重要ではないが、マンノース水溶液を粘度要件と一致するようにできるだけ濃縮することが有利である。更に、マンノース水溶液は、乾燥物質を１０〜９０ｗｔ％、好ましくは乾燥物質を１５〜８０ｗｔ％、より好ましくは乾燥物質を４０〜７０ｗｔ％、更に好ましくは乾燥物質を５０〜６０ｗｔ％含むことが有利である。マンノース水溶液は、乾燥物質を７５〜９０ｗｔ％含むことが最も好ましい。
【００６１】
酸性化触媒の使用量は、好ましくはマンノース：酸性化触媒１００：０．００５〜１００：２０、より好ましくは１００：０．５〜１００：１０、更により好ましくは１００：１〜１００：５のマンノースに対する重量比である。
【００６２】
酸性化触媒はクエン酸、硫酸及び／またはリン酸とすることが好ましい。
【００６３】
酸性化触媒は、マンノースと混合してからマイクロリアクターに通すことが好ましい。
【００６４】
ステップａ）の温度は好ましくは１８０℃〜２３０℃、より好ましくは１９５℃〜２３０℃、より好ましくは１９５℃〜２２０℃、更により好ましくは１９５℃〜２１０℃であり、尚更により好ましくは１９５℃〜２００℃とされる。
【００６５】
ステップａ）の間にマンノース含有組成物がマイクロリアクター内に滞留する時間は、好ましくは５〜２０秒、より好ましくは１０〜１５秒である。
【００６６】
ステップａ）の前に、マンノースを、酸性化触媒の存在下、上記のステップａ）の温度よりも低い温度で第１のマイクロリアクターに通すことが好ましい。前記低い温度は、好ましくは１００℃〜１８０℃、より好ましくは１２０℃〜１７５℃、更により好ましくは１４０℃〜１７０℃、尚更により好ましくは１５０℃〜１６５℃である。このステップの最中に何らかの重縮合が既に実行されている可能性がある。第１のマイクロリアクター内でのマンノース含有組成物の滞留時間は、好ましくは５秒以下、好ましくは４秒以下、より好ましくは３秒以下、更により好ましくは２秒以下、例えば０．５〜２秒または０．５〜１秒といったように極めて短い。
【００６７】
第１のマイクロリアクター及びステップａ）のマイクロリアクターは、同じ構成を有する場合もあれば、類似している場合もある。例えば、工程をバッチ式で実行する場合、マイクロリアクター同士が同一物である場合さえある。本発明の方法は、バッチ式、半連続式、パルス式または連続式で実行することが可能であり、連続式で実行するのが好ましい。
【００６８】
ゆえに、本発明は好ましくは、
ａ０）  酸性化触媒の存在下１００℃〜１８０℃の温度でマイクロリアクターにマンノースを通すことにより、加熱されたマンノースを得るステップと、
ａ）  酸性化触媒の存在下、１８０℃〜２４０℃、好ましくは１９５℃〜２４０℃の温度で加熱マンノースをマイクロリアクターで重縮合させるステップと、
ｂ）  任意に、マンノオリゴ糖組成物を中和及び／または脱色するステップと、
ｃ）  任意に、マンノオリゴ糖組成物を精製するステップと、
ｄ）  マンノオリゴ糖組成物を収集するステップと、
を含み、酸性化触媒が、好ましくはクエン酸、硫酸及び／またはリン酸であることを特徴とする工程に関するものである。
【００６９】
マンノオリゴ糖組成物を収集する前に、あるいはステップｃ）及び／またはｄ）の後に、必要に応じてマンノオリゴ糖組成物の温度を低下させるための冷却ステップを実行してもよい。
【００７０】
マンノオリゴ糖組成物は中和されていることが好ましい。マンノオリゴ糖組成物がｐＨ４〜７に達するまで、本組成物の中和を実行してもよい。これにより、例えば経時的な加水分解が少なくなるので、製品の組成がほとんど変化しないかまたは無変化になり、結果として、製品の安定性を増強するうえで有利である。この場合、本製品はまた、酸または酸性条件に敏感な他の成分と併用するのが好適であるという利点もある。中和は、任意の好適なベースで実行できる。特にマンノオリゴ糖組成物を食物中に使用する必要のある場合、そしておそらく飼料中及びペットフード中にも使用する必要があると考えられる場合、苛性及び／または水酸化カリウムを塩基とするのが好ましい。
【００７１】
マンノオリゴ糖組成物の中和、またはマンノオリゴ糖組成物の脱色のいずれかを実行するかあるいはその両方を実行することが可能であることに留意すべきである。
【００７２】
マンノオリゴ糖組成物は精製されていることが好ましい。生成されたマンノオリゴ糖組成物の精製は、一連の陰イオン性及び陽イオン性樹脂、及び／または活性炭などの研磨機に通すことによって実行することも、及び／またはクロマトグラフィーによって実行することもできる。特に、精製の実行によって、組成物からマンノースの一部または全部を除去してもよい。この除去は、マンノオリゴ糖組成物を食品用途に用いる場合に特に有利である。
【００７３】
本発明は更に、本発明の工程により得られるＭＯＳ組成物に関する。事実上、そのようなＭＯＳ組成物は、なかんずく、本明細書において考察されているように効果に改善が施されている。
【００７４】
本発明については、下記の非限定的な実施例により例証する。
【実施例】
【００７５】
実施例１：ＭＯＳ組成物の生成
乾燥基準で９０ｗｔ％＋／−２％のマンノースを含むマンノース溶液（Ｃａｒｇｉｌｌ製Ｃ＊ＴｒｕＳｗｅｅｔ  ０１６Ｋｏ）を、乾燥基準で１００：３の重量比で固体クエン酸とブレンドする。結果として得られた溶液を、乾燥物質が８５％＋／−１％に達するまで薄膜蒸発器を介して蒸発させる。次に、溶液をマイクロ熱交換器（Ｋｒｅｕｚｘｔｒｏｍ−ｒｅａｋｔｏｒｍｏｄｕｌ  １６９４−Ｘ−１９．０，ＫＩＴ，ＩＭＶＴ）にポンプ圧送し、全体的な滞留時間を２秒未満にして、一定流量１５ｋｇ／時で溶液を１６５℃に加熱する。次に、材料を第２のマイクロ熱交換器（Ｋｒｅｕｚｘｔｒｏｍ−ｒｅａｋｔｏｒｍｏｄｕｌ  ２１５５−Ａ−４．０，ＫＩＴ，ＩＷＶＴ）を介して１９５℃の温度で１１秒間ポンプ圧送し、そこで主要な重縮合反応を行う。
【００７６】
結果として得られた重縮合生成物（マンノースオリゴ糖組成物）をアルカリ水で希釈して、固形分５０ｗｔ％且つｐＨ５＋／−０．２の溶液を得る。次に、溶液を５０℃に冷却する。ＨＰＬＣ分析（ＩＳＯ  １０５０４：１９９８−１０）から明らかなように、マンノオリゴ糖、すなわちＤＰ３＋の含有量は４０ｗｔ％である。
【００７７】
実施例２：ＭＯＳ組成物の生成
乾燥基準で９０ｗｔ％＋／−２％のマンノース含有マンノース溶液（Ｃａｒｇｉｌｌ製Ｃ＊ＴｒｕＳｗｅｅｔ  ０１６Ｋｏ）を、乾燥基準で１００：３の重量比で固体クエン酸とブレンドする。結果として得られた溶液を、乾燥物質が８５％＋／−１％に達するまで薄膜蒸発器で蒸発させる。次に、溶液をマイクロ熱交換器（Ｋｒｅｕｚｘｔｒｏｍ−ｒｅａｋｔｏｒｍｏｄｕｌ  １６９４−Ｘ−１９．０，ＫＩＴ，ＩＭＶＴ）にポンプ圧送し、全体的な滞留時間を２秒未満にし、一定の流量１５ｋｇ／時で溶液を１７０℃に加熱する。次に、この物質を２００℃の温度で１１秒間、第２のマイクロ熱交換器（Ｋｒｅｕｚｘｔｒｏｍ−ｒｅａｋｔｏｒｍｏｄｕｌ  ２１５５−Ａ−４．０，ＫＩＴ，ＩＷＶＴ）にポンプ圧送し、そこで主な重縮合反応を行う。
【００７８】
結果として得られた重縮合生成物（マンノースオリゴ糖組成物）をアルカリ水で希釈して、固形分が５０ｗｔ％でｐＨが５＋／−０．２の溶液を得る。次に、溶液を５０℃に冷却する。ＨＰＬＣ分析（ＩＳＯ  １０５０４：１９９８−１０）から明らかなように、マンノオリゴ糖、つまりＤＰ３＋の含有量が５０ｗｔ％である。
【００７９】
実施例３：比較実施例
本発明によるＭＯＳ（それぞれ実施例１及び２に従って製造された組成物Ａ及び組成物Ｂ）を、市場で入手可能なＭＯＳ組成物（試料Ｃ〜試料Ｉ）で酵母由来のものと比較する。
【００８０】
溶解度は上記の試験Ａに従って定量化されている。
【００８１】
結果から明らかなように、全ての市販の酵母由来試料の溶解度は４ｗｔ％未満であり、この値は本発明の製品の溶解度を優に下回っている。
【００８２】
【表１】
2020527334.tif 000003
【００８３】
酸及び飼料酵素に対する安定性
酵母から抽出された市販のＭＯＳ（ＢｉｏＭＯＳ（登録商標））の試料、及び実施例１に従って製造された本発明のＭＯＳ組成物の試料を、胃酸を刺激する条件下（最初の３０分間はｐＨ２にて、次いでｐＨ７にて）または中性ｐＨ７にて、飼料中に商業的に使用されている２種のキシラナーゼ使用及び不使用で、４１℃（鶏の生理的内部温度）で２時間インキュベートする。緩衝液中の酵素の用量は、供給業者の飼料に関する推奨事項に基づいて調整され、同じ条件下、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにてキシラン試料中で機能することが事前に立証済みである。図１の結果が実証しているように、胃酸の状態に関係なく、本発明によるＭＯＳ組成物は飼料酵素では分解されない。ＢｉｏＭＯＳ（登録商標）は不溶性のままであり、ＨＰＬＣで分析できなかったため、その結果は得られなかった。
【００８４】
実施例４：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｅｘ−ｖｉｖｏ試験
本発明によるマンナンオリゴ糖（ＭＯＳ）の効果を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて市販の酵母由来ＭＯＳの効果と比較した。
【００８５】
最小阻害濃度（ＭＩＣ）
第１のアッセイでは、病原細菌であるＥ．ｃｏｌｉ及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａの成長に対し異なる濃度のＭＯＳが及ぼした影響にアクセスし、各材料の最小阻害濃度（ＭＩＣ）を定量化した。異なる希釈率の材料を、１０×ＣＦＵの各病原細菌（Ｅ．ｃｏｌｉまたはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ）でスパイクされた９６ウェルプレート上のウェルに添加した。プレートを４８時間インキュベートし、コロニー形成単位（ＣＦＵ）を各ウェルのプレート計数により定量化して、純粋培地の％として計算した。ＭＩＣアッセイの結果は、表２及び表３に報告されている。
【００８６】
【表２】
2020527334.tif 000004
【００８７】
【表３】
2020527334.tif 000005
【００８８】
これらの結果は、ＭＯＳ組成物Ａ及びＢが溶液中に１％を超える濃度で添加されると、細菌の増殖が２０％阻害され始めるときの、ＭＩＣを示す。５０％超の細菌阻害効果は、１０％を上回る濃度でのみ達成された（表２及び表３）。これらの所見を根拠とすれば、本発明のＭＯＳ組成物は、Ｅ．ｃｏｌｉ及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａを直接殺滅する能力が限られていることから、殺菌性ではないことを結論付けることができる。酵母由来のＭＯＳ試料、ＣＥＬＭＡＮＡＸ（商標）及びＳａｆＭａｎｎａｎ（登録商標）では、本発明によるＭＯＳと比較して同等な阻害能力は見受けられなかった。それらによる阻害は濃度が１０％に達したときに限り見られた。一方、本発明のＭＯＳ組成物とは対照的に、それ未満の濃度ではＥ．ｃｏｌｉ及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａに対する効果または成長刺激効果は見られなかった（表２）。
【００８９】
バイオフィルム形成の阻害
本発明によるＭＯＳ組成物及びいくつかの市販の酵母由来ＭＯＳが非生物的表面上の細菌バイオフィルム形成に対して及ぼす効果を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験する。異なる希釈率（１０％、１％、０．１％、及び０．０１％）の化合物を、１０×ＣＦＵの各病原細菌（Ｅ．ｃｏｌｉまたはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ）でスパイクされた９６ウェルプレートのウェルに添加する。プレートを３７℃で４８時間インキュベートする。各ウェル上の液体を除去し、ウェルをＰＢＳ緩衝液で洗浄した後、プラスチック表面に付着されているバイオフィルム細胞をクリスタルバイオレットで染色し、エタノールで溶出させる。分光光度計で、色素の色強度を４９０波長における吸光度（ＯＤ）として測定する。この値を、ブランク対照（緩衝溶液、濃縮培地、及び接種済細菌）の％として計算する。これらの測定の結果は、表４で確認できる。
【００９０】
【表４】
2020527334.tif 000006
【００９１】
結果から明らかなように、本発明のＭＯＳ組成物は、バイオフィルム形成を用量依存的様式で阻害し得る。まず０．０１％という低濃度では阻害率４０％超、溶液濃度１０％ではＥ．ｃｏｌｉに対し阻害率７９％、及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａに対し阻害率９２％が達成される。酵母由来のＭＯＳが１０％濃度では阻害効果が約７０％だけに限られることが認められたのに対し、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの場合、それ未満の濃度でバイオフィルム形成の刺激が高いことさえ見受けられた（表４）。
【００９２】
ｅｘ−ｖｉｖｏでの腸表面に対する病原体付着の阻害
本発明によるＭＯＳ組成物、ならびに市販の酵母由来ＭＯＳ（ＣＥＬＭＡＮＡＸ（商標）及びＳａｆＭａｎｎａｎ（登録商標））が、Ｅ．ｃｏｌｉ及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａの生腸細胞表面付着能力に対して与える干渉を、２通りの異なるアッセイを用いて評価した。このアッセイでは、実際の鳥から採取された盲腸組織を、Ｕｓｓｉｎｇチャンバー内に載置して使用した。上皮の内腔側を、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＳａｌｍｏｎｅｌｌａと特定濃度の試験品とを含有するリンゲルベースの緩衝液と共に、３７℃でインキュベートした。９０分間のインキュベート時間後に、表面の洗浄、均質化及び播種を行い、組織に付着された病原細菌を列挙する。これらのアッセイの結果を、表５〜表８に示す。
【００９３】
【表５】
2020527334.tif 000007
【００９４】
【表６】
2020527334.tif 000008
【００９５】
【表７】
2020527334.tif 000009
【００９６】
【表８】
2020527334.tif 000010
【００９７】
表５に示す結果から明らかなように、腸上皮表面へのＳａｌｍｏｎｅｌｌａの付着は、いずれのＭＯＳ含有材料によっても低減することが可能である。ＭＯＳ供給源によっては、他の供給源よりも高効率のものもあった。腸上皮細胞への病原体の付着をＭＯＳが低減させる能力は、若鶏（ブロイラー）と成鶏（産卵用鶏）の両方において確証されたが、効果の度合いはブロイラー若鶏（表６）の方が明白であった。これらの結果は、以降の試験において本発明により提案されたＭＯＳ組成物に関して更に確証された（表７）。表８に示すように、この接着効果の低下は用量依存的である。それに基づき、ｉｎ  ｖｉｖｏ治験用に最小用量０．０２％が推奨された。
【００９８】
実施例５：ｉｎ  ｖｉｖｏでの免疫調節治験
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのマクロファージ培養を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを実行する。本発明による２つのＭＯＳ組成物（組成物Ａ及びＢ）に、マクロファージを曝露させる。細胞をプロトタイプと共に１時間インキュベートしてから、１μｇ／ｍｌ  ＬＰＳ（または培地偽対照）を添加し、ＥＬＩＳＡ試験キットを使用して１８時間インキュベートした後でサイトカインを測定する。ＥＬＩＳＡを２回繰り返す。ＬＳＰ添加前後の実験結果を、それぞれ表９及び表１０に示す。
【００９９】
【表９】
2020527334.tif 000011
【０１００】
【表１０】
2020527334.tif 000012
【０１０１】
マクロファージサイトカインＴＮＦ−α、ＩＬ−８及びＩＬ−１０は、ＭＯＳ組成物ＡまたはＢへの曝露で増加したのに対し、これら両方のＭＯＳ組成物によって、ＩＬ−６生成は対照培地と比較して減少した（表９）。マクロファージがＬＰＳに感作されると、ＭＯＳの存在下で全てのサイトカインが増加する（表１０）。これらの結果は、本発明によるＭＯＳ組成物がｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫系に対し直接的な効果を及ぼすことを示唆するものである。
【０１０２】
フォローアップ試験で、仔豚にＭＯＳ組成物Ｂを給餌し、この食餌中のＭＯＳ組成物Ｂ用量を漸増させていく（０〜０．４％）。離乳後２２日目に豚合計８０頭を対象に、処置毎に豚８頭からヘパリン処理済血液を採取する。末梢血単核細胞は、フィコール勾配を使用して単離される。細胞を播種し、ＬＰＳで刺激して、免疫応答をＴＮＦαのＥＬＩＳＡ（ｐｇ／ｍｌ）で測定する。これらの結果を、表１１に示す。
【０１０３】
【表１１】
2020527334.tif 000013
【０１０４】
ＭＯＳ組成物Ｂが仔豚マクロファージの反応に及ぼす影響は、ＬＰＳ感作なしでは少なかったが、ＬＰＳ感作下では直線的増加が見られた。つまり、ＭＯＳ組成物Ｂは、疾病に感作された仔豚の免疫応答を、ＴＮＦ−α応答の調節によって増強させる。
【０１０５】
実施例６：ｉｎ  ｖｉｖｏでのＧＩの健康改善
本発明によるＭＯＳ組成物（組成物Ａ及びＢ）が腸粘膜細胞に対して及ぼす直接的な影響を、管腔腸腸細胞表面を模倣したｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃ２Ｂｅ１細胞株培養モデルを用いて調査した。プレート上で増殖された細胞に粘膜様表面を形成させ、続いて、これらの細胞を、培地中に濃度０．２％で溶解された化合物と共にインキュベートした。血清制限条件下、細胞を製品で４〜５日間処理した。
【０１０６】
ＢｒｄＵ  ＥＬＩＳＡを用いて増殖の量を測定し、増殖細胞に取り込まれたＢｒｄＵの量を測定する（増殖率が高いほど、細胞のＤＮＡ中に検出されるＢｒｄＵ数が多くなる）。増殖のレベルは、試験ウェルのＢｒｄＵ取り込みを培地のみを有する対照のＢｒｄＵ取り込みで除算した比率として表される。１に等しい値は、培地単独の平均と等価であり、無応答を意味する。二度の別々の機会に、アッセイを３回繰り返す。上皮増殖因子（ＥＧＦ）と呼ばれる細胞増殖に影響を及ぼすことで知られる化合物を、２通りの異なる濃度（１０及び１００）の陽性対照で使用する。結果は表１２で確認できる。
【０１０７】
【表１２】
2020527334.tif 000014
【０１０８】
腸の健康の評価は、酵母由来のＭＯＳならびにＭＯＳ組成物Ａ及びＢが腸の微生物プロファイルに及ぼす効果を比較することによって行う。第１日目からＭＯＳを給餌された１７日齢のブロイラー鶏の盲腸から採取された試料を、選択された腸内微生物１００個に対し１６Ｓ  ＤＮＡプローブを用いてプリントされたカスタムマイクロアレイを使用して分析した。２つの市販の酵母由来ＭＯＳ製品を、食餌（ＢｉｏＭｏｓ（登録商標）及びＣＥＬＭＡＮＡＸ（商標））の０．０２％で給餌し、実施例１に従って製造された本発明による１つのＭＯＳを、食餌（ｄｂで３５％ＤＰ２及び４０％ＤＰ３＋）の０．０２％で給餌する（濃度に基づく結果を表８に示す）。これら３つのＭＯＳ供給源とＭＯＳ不含陰性対照の食餌とで有意に異なる細菌ＤＮＡの平均相対量を、ＡＮＯＶＡで分析しＪＭＰ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓソフトウェアを用いてクラスター化した。階層的クラスタリング分析の結果を、図２に示す。
【０１０９】
図２の結果に基づいて了解されるように、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａなどの病原細菌を含有するクラスター１内の細菌は、全てのＭＯＳ製品によって所望される程度に低減される。ただし、この低減を達成するため、各ＭＯＳ製品は、異なるクラスター（ＢｉｏＭＯＳ（登録商標）のクラスター２、ＣＥＬＭＡＮＡＸ（商標）のクラスター４、及び本発明の実施例１のＭＯＳ組成物のクラスター３）から採取された細菌を同時的に増加させる。
【０１１０】
実施例７：ｉｎ  ｖｉｖｏでの成長能力の増強
鶏
第１の研究（治験１）は、本発明の実施例１及び実施例２によるＭＯＳ組成物を市販の酵母由来ＭＯＳと比較する目的で設計されたものである。また、実施例１に記載の工程（デキストロース及びソルビトールを反応物として用いた工程）に類似する工程で生成されたポリデキストロースも添加することによって、これらの組成物がポリマンノースであることの重要性を明らかにした。実施例１及び実施例２のＭＯＳ組成物を、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓに感作されたブロイラー鶏の食餌中に２通りの極端な用量（０．０２及び２％）で添加し、一方、酵母由来のＭＯＳ（ＣＥＬＭＡＮＡＸ（商標）及びＢｉｏＭＯＳ（登録商標））を、食餌中に推奨用量０．２％で添加した。盲腸の性能パラメータ及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａレベルは、２８日齢で測定された。結果は表１３で確認できる。
【０１１１】
【表１３】
2020527334.tif 000015
【０１１２】
２０日齢ブロイラーの性能は０．０２％の組成物Ａによって最高に達し、その結果、対照と比較してＥＰＩ（死亡率を除く）、体重、体重増加、及び飼料摂取量が改善された。組成物Ａは他の治療剤と比較して数値的に全ての鳥に対し優位であり、組成物Ａ  ２．００％、組成物Ｂ（任意の用量）、ポリデキストロース（任意の用量、ただしＥＰＩは死亡率を除く）を与えられた鳥に対し統計的に優位であった。酵母由来のＭＯＳと比較して、体重、体重増加または飼料摂取量が組成物Ａと同様であったのは、ＣＥＬＭＡＮＡＸ（商標）だけに限られていた。飼料利用率における差異は、飼料摂取量における差異と相関していたことから、これら性能上の差異が事実上、飼料摂取量に起因するものと結論付けて差し支えない。ＭＯＳ組成物Ａ及びＢならびにＣＥＬＭＡＮＡＸ（商標）は、対照鳥と比較した場合に盲腸のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ数への影響が少ないのに対し、酵母由来のＢｉｏＭＯＳ（登録商標）はＳａｌｍｏｎｅｌｌａの存在を増強させる（表１３）。これらの結果は、ＭＯＳ製品が殺菌性ではないにもかかわらず一部の酵母由来ＭＯＳは病原細菌の増殖を促進する可能性があるというｉｎ  ｖｉｔｒｏでの観察と一致している（表２）。
【０１１３】
治験１の結果に基づいて、ブロイラー鶏の食餌に添加されるＭＯＳ組成物Ａの最適用量が同定されるように設計されたのが、用量反応試験（治験２）である。試験された用量は、０．０１〜１．００％の範囲に及んだ。表１４に示す結果から明らかなように、ＭＯＳ組成物Ａの効果は、体重、１日増体量、飼料摂取量及び飼料摂取量比に対して本質的に２次的であり、最適用量は０．０２％とされる。これらの結果から、高純度のＭＯＳ供給源を給餌した場合に重要とされるのは用量であることが確証され、同定された用量はまたｉｎ  ｖｉｔｒｏの結果（表８）、及び治験１の結果（表１３）とも一致した。
【０１１４】
【表１４】
2020527334.tif 000016
【０１１５】
２通りの追加の動物給餌試験を使用して、家禽の食餌中の組成物Ａが推奨用量０．０２％であることを確証する。第３の研究（治験３）では、抗生物質成長促進剤クロルテトラサイクリン（ＣＴＣ）使用または不使用の組成物Ａを、食餌中に給餌して試験する。メンドリ第４の研究（治験４）では、１８〜３０週齢の産卵期間中に産卵用雌鶏に同じ製品及び用量を給餌して試験する。これらの研究の結果は、それぞれ表１５及び表１６で確認できる。
【０１１６】
【表１５】
2020527334.tif 000017
【０１１７】
【表１６】
2020527334.tif 000018
【０１１８】
治験３の結果（表１５）から明らかなように、本発明で提示された抗生物質成長促進剤ＣＴＣとＭＯＳ組成物Ａの両方（用量０．０２％）によって、添加剤不使用の対照治療剤と比較してブロイラー鶏の性能全般が良好化された。更に、抗生物質増殖促進剤ＣＴＣとＭＯＳ組成物Ａと併用した結果、個別に効果を発揮した場合と比較して性能が共生的に更に改善された（表１５）。これらの結果に基づいて、本発明において提示されるＭＯＳ組成物Ａを、抗生物質成長促進剤使用または不使用の食餌に配合することで、ブロイラー鶏の性能に有益な効果をもたらすものと結論付けることができる。
【０１１９】
治験４（表１６）の結果から明らかなように、産卵用雌鶏の食餌に配合されたＭＯＳ組成物ＡもしくはＢは、平均１日飼料摂取量またはほとんどの卵の特性（卵重量、卵白重量、卵黄重量、卵殻厚または死亡率）に影響を及ぼさない。この研究期間（１８〜１０週齢）中に、卵殻厚は、ＭＯＳ組成物Ａによって大幅に減少したが、産卵用雌鶏の卵質に対するリスクにはならない。本発明に記載のＭＯＳを産卵用雌鶏に給餌した場合に観察された主な効果は、産卵数が増加したこと、及び飼料から卵への転換率が改善されたことであった（表１６）。この効果は、ＭＯＳ組成物Ａの方が組成物Ｂよりも明白であった。
【０１２０】
豚
仔豚の研究（治験５）を実施し、本発明（組成物Ａ及びＢ）由来のマンナンオリゴ糖を市販の酵母由来製品ＢｉｏＭＯＳ（登録商標）と共に給餌した場合の効果を比較した。この同じ治験を用いて、仔豚の食餌に添加されるＭＯＳ組成物ＡまたはＢの最適用量を特定した。試験５の結果を表１７に示す。
【０１２１】
【表１７】
2020527334.tif 000019
【０１２２】
治験５の結果から明らかなように、酵母由来ＭＯＳ（ＢｉｏＭＯＳ（登録商標））またはＭＯＳ組成物Ａが仔豚の性能に影響を及ぼさなかったのに対して、本発明のＭＯＳ組成物Ｂは体重、平均１日増体量及び平均飼料摂取量に２次的効果を及ぼした（表１７）。仔豚の食餌に含まれるＭＯＳ組成物Ｂの最適用量は、０．２％である。
【図１】
2020527334.tif 000020
【図２】
2020527334.tif 000021
【国際調査報告】
2020527334.tif 000022
2020527334.tif 000023