(57)【要約】【課題】腫瘍予防のための酵母を用いた免疫療法の提供。【解決手段】本発明は、１種以上の腫瘍抗原を細胞壁に発現する免疫療法用酵母の作製方法に関する。また、本発明の方法を実施して得ることができる免疫療法用酵母にも関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫療法用酵母を作製する方法であって、
ａ）１種以上の腫瘍抗原と、必要に応じて、樹状細胞を標的化するためのポリペプチド又はタンパク質とを細胞壁に発現する遺伝子組換え酵母を得る工程と、
ｂ）上記遺伝子組換え酵母を透過処理して、免疫療法用酵母を得る工程と
を有しており、上記透過処理工程の前又は後に上記酵母を不活化する工程を有していてもよい方法。
【請求項２】
工程ａ）は、下記式（Ｉａ）で表される１種以上の融合タンパク質を細胞壁に発現する遺伝子組換え酵母を得る工程である、請求項１に記載の方法。
［樹状細胞を標的化するためのポリペプチド又はタンパク質］ｎ−［腫瘍抗原］ｘ−［ペプチドリンカー］ｍ−［上記遺伝子組換え酵母の細胞壁へ繋留するためのポリペプチド又はタンパク質］    （Ｉａ）
（式中、ｎは０又は１であり、ｍは０又は１であり、ｘは１〜３００、好ましくは１〜５０の整数である。）
【請求項３】
工程ａ）は、
ａ１）下記式（ＩＩａ）又は（ＩＩｂ）で表される核酸配列を有する１種以上のベクターを酵母に導入して、下記式（Ｉａ）で表される１種以上の融合タンパク質を細胞壁に発現する遺伝子組換え酵母を得る工程と、
ａ２）上記融合タンパク質を上記遺伝子組換え酵母の細胞壁に発現させるのに適した条件下で上記遺伝子組換え酵母を培養する工程と
を有する、請求項１又は２に記載の方法。
［上記遺伝子組換え酵母の細胞壁へアドレッシングするためのポリペプチドをコードする核酸配列］−［樹状細胞を標的化するためのポリペプチド又はタンパク質をコードする核酸配列］ｎ−［腫瘍抗原をコードする核酸配列］ｘ−［ペプチドリンカーをコードする核酸配列］ｍ−［上記遺伝子組換え酵母の細胞壁へ繋留するためのポリペプチド又はタンパク質をコードする核酸配列］    （ＩＩａ）
（式中、ｎは０又は１であり、ｍは０又は１であり、ｘは１〜３００、好ましくは１〜５０の整数である。）
［樹状細胞を標的化するためのポリペプチド又はタンパク質をコードする核酸配列］ｎ−［腫瘍抗原をコードする核酸配列］ｘ−［ペプチドリンカーをコードする核酸配列］ｍ−［上記遺伝子組換え酵母の細胞壁へ繋留するためのポリペプチド又はタンパク質をコードする核酸配列］−［上記遺伝子組換え酵母の細胞壁へアドレッシングするためのポリペプチドをコードする核酸配列］    （ＩＩｂ）
（式中、ｎは０又は１であり、ｍは０又は１であり、ｘは１〜３００、好ましくは１〜５０の整数である。）
［樹状細胞を標的化するためのポリペプチド又はタンパク質］ｎ−［腫瘍抗原］ｘ−［ペプチドリンカー］ｍ−［上記遺伝子組換え酵母の細胞壁へ繋留するためのポリペプチド又はタンパク質］    （Ｉａ）
（式中、ｎは０又は１であり、ｍは０又は１であり、ｘは１〜３００、好ましくは１〜５０の整数である。）
【請求項４】
上記酵母は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｏｇａｔａｅａ属又はＣａｎｄｉｄａ属、好ましくはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属から選択され、好ましくはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
上記繋留ポリペプチド又はタンパク質は、上記酵母の細胞壁に発現される酵母ポリペプチド又はタンパク質であり、好ましくはＡｇａ２ｐ又はＳｅｄ１ｐから選択される、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
上記遺伝子組換え酵母は、水／エタノール混合液で透過処理される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
上記樹状細胞を標的化するためのポリペプチド又はタンパク質は、ＤＥＣ−２０５タンパク質に特異的に結合できる抗体、ＤＥＣ−２０５タンパク質に特異的に結合できる抗体のフラグメント、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ細菌のプラスミノーゲン活性化因子（ＰＬＡ）、又はＹｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ細菌のプラスミノーゲン活性化因子（ＰＬＡ）に由来する配列から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
上記腫瘍抗原は、Ｍｅｌａｎ−Ａ、チロシナーゼ、ｇｐ１００、ＭＡＧＥＡ１、ＭＡＧＥＡ１０、ＭＡＧＥＡ１１、ＭＡＧＥＡ１２、ＭＡＧＥＡ２、ＭＡＧＥＡ２Ｂ、ＭＡＧＥＡ３、ＭＡＧＥＡ４、ＭＡＧＥＡ６、ＭＡＧＥＡ８、ＭＡＧＥＡ９、ＭＡＧＥＢ１；ＭＡＧＥＢ１０、ＭＡＧＥＢ１６、ＭＡＧＥＢ１８、ＭＡＧＥＢ２、ＭＡＧＥＢ３、ＭＡＧＥＢ４、ＭＡＧＥＢ５、ＭＡＧＥＢ６、ＭＡＧＥＢ６Ｂ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ  １抗原（ＮＹ−ＥＳＯ−１）、ＭＡＧＥＣ１、ＭＡＧＥＣ２、Ｌ抗原（ＬＡＧＥ）、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、Ｐ５３、ＫＲＡＳ、ＣＥＡ、ＷＴ１、ＭＵＣ１、ＳＡＲＴ３、ＳＵＲＶＩＶＩＮ２Ｂ、ＲＮＦ４３／ＴＯＭＭ３４、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＢＲＡＦ、ＰＩ３Ｋ、ＡＰＣ、ＢＡＸ、β２ミクログロブリン、テロメラーゼ又はＮＲＡＳから選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法を実施して得ることができる免疫療法用酵母。
【請求項１０】
（ｉ）Ｍｅｌａｎ−Ａ、チロシナーゼ、ｇｐ１００、ＭＡＧＥＡ１、ＭＡＧＥＡ１０、ＭＡＧＥＡ１１、ＭＡＧＥＡ１２、ＭＡＧＥＡ２、ＭＡＧＥＡ２Ｂ、ＭＡＧＥＡ３、ＭＡＧＥＡ４、ＭＡＧＥＡ６、ＭＡＧＥＡ８、ＭＡＧＥＡ９、ＭＡＧＥＢ１；ＭＡＧＥＢ１０、ＭＡＧＥＢ１６、ＭＡＧＥＢ１８、ＭＡＧＥＢ２、ＭＡＧＥＢ３、ＭＡＧＥＢ４、ＭＡＧＥＢ５、ＭＡＧＥＢ６、ＭＡＧＥＢ６Ｂ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ  １抗原（ＮＹ−ＥＳＯ−１）、ＭＡＧＥＣ１、ＭＡＧＥＣ２、Ｌ抗原（ＬＡＧＥ）、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、Ｐ５３、ＫＲＡＳ、ＣＥＡ、ＷＴ１、ＭＵＣ１、ＳＡＲＴ３、ＳＵＲＶＩＶＩＮ２Ｂ、ＲＮＦ４３／ＴＯＭＭ３４、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＢＲＡＦ、ＰＩ３Ｋ、ＡＰＣ、ＢＡＸ、β２ミクログロブリン、テロメラーゼ又はＮＲＡＳから選択されるのが好ましい１種以上の腫瘍抗原と、
（ｉｉ）必要に応じて、樹状細胞を標的化するためのポリペプチド又はタンパク質と
を細胞壁に発現する遺伝子組換え及び透過処理された免疫療法用酵母。
【請求項１１】
下記式（Ｉａ）で表される融合タンパク質を細胞壁に発現する請求項１０に記載の酵母。
［樹状細胞を標的化するためのポリペプチド又はタンパク質］ｎ−［腫瘍抗原］ｘ−［ペプチドリンカー］ｍ−［上記遺伝子組換え酵母の細胞壁へ繋留するためのポリペプチド又はタンパク質］    （Ｉａ）
（式中、ｎは０又は１であり、ｍは０又は１であり、ｘは１〜３００、好ましくは１〜５０の整数である。）
【請求項１２】
上記樹状細胞を標的化するためのポリペプチド又はタンパク質は、ＤＥＣ−２０５タンパク質に特異的に結合できる抗体、ＤＥＣ−２０５タンパク質に特異的に結合できる抗体のフラグメント、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ細菌のプラスミノーゲン活性化因子（ＰＬＡ）、又はＹｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ細菌のプラスミノーゲン活性化因子（ＰＬＡ）に由来する配列から選択される、請求項１０又は１１に記載の酵母。
【請求項１３】
請求項９〜１２のいずれか１項に記載の酵母と、医薬的に許容される担体とを含む免疫療法用組成物。
【請求項１４】
さらに治療薬を含む請求項１３に記載の免疫療法用組成物。
【請求項１５】
薬剤に使用される請求項９〜１２のいずれか１項に記載の酵母又は請求項１３又は１４に記載の組成物。
【請求項１６】
がんの治療又は予防に使用される請求項９〜１２のいずれか１項に記載の酵母又は請求項１３又は１４に記載の組成物。
【請求項１７】
上記がんは固形がん、好ましくはメラノーマ又は結腸がんである、請求項１６に記載の、がんの治療又は予防に使用される請求項９〜１２のいずれか１項に記載の酵母又は請求項１３又は１４に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１種以上の腫瘍抗原を細胞壁に発現する免疫療法用酵母の作製方法に関する。また、本発明の方法を実施して得ることができる免疫療法用酵母にも関する。
【背景技術】
【０００２】
がんの治療は、免疫療法を含む様々な治療法を結集する分野である。免疫療法において、受動免疫療法と能動免疫療法とは区別され、後者は特異的であっても非特異的であってもよい。能動免疫療法の利点の１つは、化学療法型の治療法とは異なり、血液脳関門を越えられることにある。
【０００３】
実際、リンパ球が血液脳関門を越えて遊走できることが明らかとなっている（非特許文献１）。
【０００４】
血液脳関門を越えるという上記利点の他に、免疫療法は、概して、従来の抗がん療法に比べて有害作用が少なく、このことは特に特異的免疫療法において実証されている。このため、免疫療法は、既に非常に衰弱した患者における重症ステージＩＩＩ又はＩＶの転移性がんの治療に特に適している。
【０００５】
抗ＰＤ−１抗体及び／又は抗ＣＴＬＡ４抗体等の非特異的能動免疫療法によって、患者の生存期間中央値は著しく向上する。しかしながら、上記治療は少数の患者にしか利益をもたらさず、自己免疫疾患等の顕著な免疫学的副作用を伴う。自己免疫疾患のリスクを解消し、有効性を向上させるために、一定の腫瘍抗原に対する特異的能動免疫療法が開発された。この新しい免疫療法では、樹状細胞が主要なプレーヤーである。樹状細胞は、がん細胞に対する自然免疫応答及び適応応答の両方を調整するからである。したがって、特異的能動免疫療法の目的の１つは、この樹状細胞を刺激して腫瘍反応性Ｔリンパ球、キラーＴリンパ球又は細胞傷害性Ｔリンパ球を産生させることである。これらのＴリンパ球の作用は、腫瘍サイズの退縮を誘導して腫瘍の消失にまで至らせることができると共に、免疫記憶を誘導して再発を抑えることである。
【０００６】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母は、特異的能動免疫療法におけるベクターとしての使用に成功している。該酵母は、樹状細胞を誘導するための優れた補助剤となり、その結果、樹状細胞が細胞傷害性Ｔリンパ球を活性化して、がん細胞を破壊させるからである。樹状細胞の活性化を可能にするために、酵母は、標的とされる腫瘍抗原を産生しなければならない。特許文献１には、免疫応答を変化させることができる少なくとも１種の化合物を発現するように遺伝子組換えされた非病原性酵母の使用が記載されており、この遺伝子組換え酵母は、哺乳類に投与した場合、細胞性応答及び液性応答の両方を刺激するのに有効であることが明らかにされている。特許文献２には、様々な腫瘍抗原を細胞質基質に発現できる酵母が記載されており、該酵母全体を熱で殺菌してから注射することが記載されている。特許文献３には、細胞質基質ではなく表面に腫瘍抗原を発現する酵母の使用が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第５８３０４６３号明細書
【特許文献２】米国特許第８７３４７７８号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００８／０１７１０５９号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｌａｒｏｃｈｅｌｌｅ  Ｃ．，Ａｌｖａｒｅｚ  ＪＩ，Ｐｒａｔ  Ａ．，Ｈｏｗ  ｄｏ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｅｌｌｓ  ｏｖｅｒｃｏｍｅ  ｔｈｅ  ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２０１１  Ｄｅｃ  １；５８５（２３）：３７７０−８０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
それでもなお、特に既存の免疫療法用酵母と比較して、有効であり、且つ／又は望ましくない副作用が少ない新しい抗がん療法が求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、１種以上の腫瘍抗原を細胞壁に発現するように遺伝子組換えされた酵母を透過処理した場合、予想外にも、該腫瘍に対する細胞傷害性Ｔリンパ球を効果的に刺激できることを確認した。
【００１１】
本発明の主題は、免疫療法用酵母を作製する方法であって、
ａ）１種以上の腫瘍抗原と、必要に応じて、樹状細胞を標的化するためのポリペプチド又はタンパク質とを細胞壁に発現する遺伝子組換え酵母を得る工程と、
ｂ）上記遺伝子組換え酵母を透過処理して、免疫療法用酵母を得る工程と
を有しており、上記透過処理工程の前又は後に上記酵母を不活化する工程を有していてもよい方法である。
【００１２】
本発明の別の主題は、本発明に係る作製方法を実施して得ることができる免疫療法用酵母である。
【００１３】
本発明の別の主題は、
（ｉ）Ｍｅｌａｎ−Ａ、チロシナーゼ、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ−Ｂ１、ＭＡＧＥＡ１、ＭＡＧＥＡ１０、ＭＡＧＥＡ１１、ＭＡＧＥＡ１２、ＭＡＧＥＡ２、ＭＡＧＥＡ２Ｂ、ＭＡＧＥＡ３、ＭＡＧＥＡ４、ＭＡＧＥＡ６、ＭＡＧＥＡ８、ＭＡＧＥＡ９、ＭＡＧＥＢ１；ＭＡＧＥＢ１０、ＭＡＧＥＢ１６、ＭＡＧＥＢ１８、ＭＡＧＥＢ２、ＭＡＧＥＢ３、ＭＡＧＥＢ４、ＭＡＧＥＢ５、ＭＡＧＥＢ６、ＭＡＧＥＢ６Ｂ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ  １抗原（ＮＹ−ＥＳＯ−１）、ＭＡＧＥＣ１、ＭＡＧＥＣ２、Ｌ抗原（ＬＡＧＥ）、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、Ｐ５３、ＫＲＡＳ、ＣＥＡ、ＷＴ１、ＭＵＣ１、ＳＡＲＴ３、ＳＵＲＶＩＶＩＮ２Ｂ、ＲＮＦ４３／ＴＯＭＭ３４、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＢＲＡＦ、ＰＩ３Ｋ、ＡＰＣ、ＢＡＸ、β２ミクログロブリン、テロメラーゼ又はＮＲＡＳから選択されるのが好ましい１種以上の腫瘍抗原と、
（ｉｉ）必要に応じて、樹状細胞を標的化するためのポリペプチド又はタンパク質と
を細胞壁に発現する遺伝子組換え及び透過処理された免疫療法用酵母に関する。
【００１４】
本発明の別の主題は、本発明に係る免疫療法用酵母と、医薬的に許容される担体とを含む免疫療法用組成物である。
【００１５】
本発明の別の主題は、薬剤として、特にがんの治療又は予防に使用される本発明に係る酵母又は本発明に係る組成物に関する。
【００１６】
定義
「ペプチド」とは、通常２〜９個のアミノ酸を有するアミノ酸配列を意味している。「ポリペプチド」とは、通常１０〜１００個のアミノ酸を有するアミノ酸配列を意味している。「タンパク質」とは、通常１００個を超えるアミノ酸を有するアミノ酸配列を意味するしている。
【００１７】
「酵母」とは、細胞壁、細胞膜、核及びミトコンドリアで構成され、出芽又は分裂による無性生殖が可能である任意の単細胞真菌又は真核微生物を意味している。よく知られた酵母としては、Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）及びＤｅｕｔｅｒｏｍｙｃｅｔｅｓが挙げられる。「酵母」という用語は、単数としても複数としても理解される。
【００１８】
「遺伝子組換え酵母」とは、酵母において１種以上のペプチド、ポリペプチド及び／又はタンパク質を産生させるために１種以上の核酸配列（又は導入遺伝子）を一過的又は最終的に導入して、遺伝形質を人為的に改変した酵母を意味している。上記導入遺伝子は、遺伝子組換え酵母と同種の核酸配列（繋留ポリペプチド等）、遺伝子組換え酵母とは別種の酵母の核酸配列（繋留ポリペプチド等）、又は別の原核若しくは真核生物種の核酸配列（腫瘍抗原等）に由来するものであってもよい。本発明の文脈において、上記導入遺伝子は、例えば、下記式（Ｉａ）で表される１種以上の融合タンパク質をコードするものであってもよい。
［樹状細胞を標的化するためのポリペプチド又はタンパク質］ｎ−［腫瘍抗原］ｘ−［ペプチドリンカー］ｍ−［上記遺伝子組換え酵母の細胞壁へ繋留するためのポリペプチド又はタンパク質］    （Ｉａ）
（式中、ｎは０又は１であり、ｍは０又は１であり、ｘは１〜３００、好ましくは１〜５０、好ましくは１〜９、好ましくは１〜５の整数である。）
【００１９】
したがって、「１種以上の腫瘍抗原を細胞壁に発現する遺伝子組換え酵母」とは、酵母の細胞壁に１種以上の腫瘍抗原、例えば式（Ｉａ）の融合タンパク質をコードする１種以上の核酸配列を導入して、遺伝形質を人為的に改変した酵母である。本明細書において、「遺伝子組換え酵母」及び「改変酵母」という用語は置き替え可能である。
【００２０】
「腫瘍抗原」とは、腫瘍タンパク質に由来するタンパク質の全体若しくは一部であって、腫瘍に対する液性及び／又は細胞性免疫応答を引き起こすことができるものを意味している。有利には、上記腫瘍抗原は、Ｍｅｌａｎ−Ａ、チロシナーゼ、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ−Ｂ１、ＭＡＧＥＡ１、ＭＡＧＥＡ１０、ＭＡＧＥＡ１１、ＭＡＧＥＡ１２、ＭＡＧＥＡ２、ＭＡＧＥＡ２Ｂ、ＭＡＧＥＡ３、ＭＡＧＥＡ４、ＭＡＧＥＡ６、ＭＡＧＥＡ８、ＭＡＧＥＡ９、ＭＡＧＥＢ１；ＭＡＧＥＢ１０、ＭＡＧＥＢ１６、ＭＡＧＥＢ１８、ＭＡＧＥＢ２、ＭＡＧＥＢ３、ＭＡＧＥＢ４、ＭＡＧＥＢ５、ＭＡＧＥＢ６、ＭＡＧＥＢ６Ｂ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ  １抗原（ＮＹ−ＥＳＯ−１）、ＭＡＧＥＣ１、ＭＡＧＥＣ２、Ｌ抗原（ＬＡＧＥ）、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、Ｐ５３、ＫＲＡＳ、ＣＥＡ、ＷＴ１、ＭＵＣ１、ＳＡＲＴ３、ＳＵＲＶＩＶＩＮ２Ｂ、ＲＮＦ４３／ＴＯＭＭ３４、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＢＲＡＦ、ＰＩ３Ｋ、ＡＰＣ、ＢＡＸ、β２ミクログロブリン、テロメラーゼ又はＮＲＡＳから選択される。
【００２１】
オボアルブミンは、本発明の目的のための腫瘍抗原ではないが、オボアルブミンタンパク質のエピトープがマウスのＭＨＣ  Ｉ及びＭＨＣ  ＩＩに結合することから、非常に多くの実験において抗原モデルとして使用されている。オボアルブミンのエピトープを最もよく特徴付けるものの１つは、その非常に特異的な免疫原性、すなわち上記エピトープを標的とした免疫応答を引き起こすことができる能力である。特異的なインビボ免疫応答を特徴付けるために、ＯＶＡ残基２５７〜２６４を特異的に認識するＯＶＡに特異的なＴリンパ球を有するＯＴ−１遺伝子導入マウスが利用できる。特異的な免疫応答は、ＯＶＡ２５７〜２６４エピトープに特異的なＴリンパ球のＢ３Ｚハイブリドーマ細胞株を用いてインビトロでも調べることができる。
【００２２】
「細胞壁に発現された」とは、酵母の細胞壁に提示されることを意味している。本発明の文脈において、細胞壁に発現された抗原は、繋留タンパク質又はポリペプチド等を介して酵母の細胞壁に繋留された抗原である。
【００２３】
「透過処理された酵母」又は「透過処理酵母」とは、細胞壁及び／又は細胞膜の透過（又は穿孔）を目的とした化学的、酵素的又は機械的処理を施された酵母を意味している。酵母の細胞壁及び／又は細胞膜の透過を行う手段は当業者に周知であり、該手段を使用して特に難なく透過処理酵母を得ることができる。酵母全体の透過処理によって、その細胞質基質（Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｏｆ  ｙｅａｓｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｃａｔａｌａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｕｓｉｎｇ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ，Ｔｒａｗｃｚｙｎｓｋａ  ｅｔ  ａｌ，２０１５）及び／又はペリプラズムに含まれるタンパク質にアクセスできる。細胞膜の透過を可能にする処理によって、酵素基質又は物質等の小分子は自由に拡散できるが、細胞質基質中のタンパク質の大部分は維持される細孔を形成することで、酵母の細胞膜を改変する（Ｐａｒｍｊｉｔ  Ｓ．Ｐａｎｅｓａｒ，Ｒｅｅｂａ  Ｐａｎｅｓａｒ，Ｒａｍ  Ｓ．Ｓｉｎｇｈ  ａｎｄ  Ｍａｎａｖ  Ｂ．Ｂｅｒａ，２００７．Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｙｅａｓｔ  Ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｏｌｖｅｎｔｓ  ｆｏｒ  β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２：３４−４１）。酵母の細胞壁は、もともと、約７０ｋＤａまでのタンパク質に対して透過性がある。したがって、本発明において「透過処理する」という用語は、酵母の細胞壁の透過性を増加させることも意味している。例えば、ｐ−ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）と共に３０分間インキュベートした酵母の４０５ｎｍの吸光度を測定することで、酵母が透過処理されたかどうかを決定できる。上記条件下、４０５ｎｍの吸光度が０．１以上、例えば０．２以上であれば、酵母は透過処理されている。ｐＮＰＰは、酵母の細胞質基質にもともと存在する酵素であるアルカリホスファターゼの基質である。ｐＮＰＰは、未透過処理酵母の細胞質基質へは透過しない。一方、酵母が透過処理されると、ｐＮＰＰは酵母内に侵入し、細胞質基質に存在するアルカリホスファターゼにより加水分解される。その後、加水分解されたｐＮＰＰは黄色を呈するため、４０５ｎｍの吸光度により読み取ることができる（Ａ  ｒａｐｉｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｗｈｏｌｅ  ｙｅａｓｔ  ｃｅｌｌｓ，Ｇａｌａｂｏｖａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊｕｎｅ  ２００８，Ｌｅｔｔｅｒｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １６（３）：１６１−１６３）。実施例９に、酵母が透過処理されたかどうかを決定できる試験の詳細なプロトコルを示す。
【００２４】
「免疫療法用酵母」とは、ヒト又は動物において液性又は細胞性免疫応答を誘導することにより、がんを治療又は予防できる酵母を意味している。
【００２５】
酵母を作製する方法
本発明の主題は、免疫療法用酵母を作製する方法であって、
ａ）１種以上の腫瘍抗原と、必要に応じて、樹状細胞を標的化するためのポリペプチド又はタンパク質とを細胞壁に発現する遺伝子組換え酵母を得る工程と、
ｂ）上記遺伝子組換え酵母を透過処理して、免疫療法用酵母を得る工程と
を有しており、上記透過処理工程の前又は後に上記酵母を不活化する工程を有していてもよい方法である。
【００２６】
上記方法が不活化工程を有する場合、不活化工程及び透過処理工程を実施する順序は限定されない。
【００２７】
したがって、特定の実施形態によれば、本発明に係る方法は、
ａ）１種以上の腫瘍抗原と、必要に応じて、樹状細胞を標的化するためのポリペプチド又はタンパク質とを細胞壁に発現する遺伝子組換え酵母を得る工程と、
ｂ）上記遺伝子組換え酵母を不活化する工程と、
ｃ）上記不活化した遺伝子組換え酵母を透過処理して、免疫療法用酵母を得る工程と
を有する。
【００２８】
別の特定の実施形態によれば、本発明に係る方法は、
ａ）１種以上の腫瘍抗原と、必要に応じて、樹状細胞を標的化するためのポリペプチド又はタンパク質とを細胞壁に発現する遺伝子組換え酵母を得る工程と、
ｂ）上記遺伝子組換え酵母を透過処理する工程と、
ｃ）上記透過処理した遺伝子組換え酵母を不活化して、免疫療法用酵母を得る工程と
を有する。
【００２９】
有利には、酵母の細胞壁に発現された腫瘍抗原は、酵母のペリプラズムではなく、酵母の外部環境に向かって配向している。酵母の外部に向かって配向していると、酵母の貪食後に、樹状細胞のプロテアーゼによって腫瘍抗原がより迅速に分解されるため、キラーリンパ球に対して腫瘍抗原を交差提示しやすくなる（Ｈｏｗｌａｎｄ，Ｗｉｔｔｒｕｐ，Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｐｈａｇｏｓｏｍｅ  Ａｒｅ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｔｏ  Ｃｒｏｓｓ−Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  １；１８０（３）：１５７６）。
【００３０】
不活化工程は、酵母を不活化することを目的とする。「酵母を不活化する」とは、酵母の細胞分裂による増殖を停止させる処理を意味している。酵母の不活化は、微生物を不活化するための当業者に公知の任意手段によって実施できる。有利には、不活化によって、酵母を固定することもできる。有利には、酵母は、ＰＢＳ中０．５％（ｖ／ｖ）のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で不活化される。
【００３１】
透過処理工程は、細胞壁及び／又は細胞膜の透過をもたらす化学的、酵素的又は機械的処理を用いて実施される。特定の実施形態において、遺伝子組換え酵母は、溶媒、例えば極性溶媒で透過処理される。上記溶媒は、エタノール、ソルビトール、２−メルカプトエタノール、ベンゼン、ｎ−ブタノール、ｎ−プロパノール、トリトンＸ１００、イソプロパノール、メタノール、トルエン、アセトン、又は酢酸リチウムと水酸化ナトリウムとの混合物から選択してもよい。別の特定の実施形態において、遺伝子組換え酵母は、酵素、例えばβ−１，３−グルカナーゼ（βＧｌｕ）で透過処理される。別の特定の実施形態において、遺伝子組換え酵母は、該酵母を凍結融解サイクルに供することで機械的に透過処理される（Ｈｏｎｇ−ｗｅｉ  Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ＆Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ）。好ましい実施形態において、遺伝子組換え酵母は、エタノール又はイソプロパノール、例えばエタノール５０％と水５０％との混合液（体積／体積（ｖ／ｖ））で、例えば約１５分間、約２０分間又は約２５分間透過処理される。
【００３２】
本発明に係る方法の特定の実施形態において、工程ａ）は、下記式（Ｉａ）で表される１種以上の融合タンパク質を細胞壁に発現する遺伝子組換え酵母を得る工程である。
［樹状細胞を標的化するためのポリペプチド又はタンパク質］ｎ−［腫瘍抗原］ｘ−［ペプチドリンカー］ｍ−［上記遺伝子組換え酵母の細胞壁へ繋留するためのポリペプチド又はタンパク質］    （Ｉａ）
式中、ｎは０又は１であり、ｍは０又は１であり、ｘは１〜３００、好ましくは１〜５０、好ましくは１〜９、好ましくは１〜５、例えば１〜４、１〜３、１〜２、例えば１、２、３、４、５の整数である。
【００３３】
本明細書の文脈において、ｘが１を超える整数である場合、すなわちｘが２〜３００の整数である場合、各腫瘍抗原は同一であっても異なっていてもよい。例えば、各腫瘍抗原は全て異なっていてもよい。
【００３４】
本明細書の文脈において、ｘが１を超える整数である場合、すなわちｘが２〜３００の整数である場合、各腫瘍抗原は、リンカーであるペプチドにより分離されていてもされていなくてもよい。
【００３５】
本明細書の文脈において、ｘが１を超える整数である場合、すなわちｘが２〜３００の整数である場合、各腫瘍抗原は同一であっても異なっていてもよい。例えば、ｘ＝２である場合、該腫瘍抗原は２つのＭＡＧＥＡ１抗原であってもよく、あるいは１つのＭＡＧＥＡ１抗原と１つのＭＡＧＥＡ２抗原であってもよい。この実施形態において、各腫瘍抗原は、順々に配置されていてもよく、あるいはこれらの腫瘍抗原を互いに接続するペプチド配列により分離されていてもよい。
【００３６】
融合タンパク質は先行技術に広く記載されている。「融合タンパク質」とは、異なるペプチド、ポリペプチド及び／又はタンパク質の組合せにより得られるタンパク質である。融合タンパク質は、キメラタンパク質とも呼ばれる。
【００３７】
特定の実施形態において、工程ａ）は、
ａ１）下記式（ＩＩａ）又は（ＩＩｂ）で表される核酸配列を有する１種以上のベクターを酵母に導入して、下記式（Ｉａ）で表される１種以上の融合タンパク質を細胞壁に発現する遺伝子組換え酵母を得る工程と、
ａ２）上記融合タンパク質を上記遺伝子組換え酵母の細胞壁に発現させるのに適した条件下で上記遺伝子組換え酵母を培養する工程と
を有する。
［上記遺伝子組換え酵母の細胞壁へアドレッシングするためのポリペプチドをコードする核酸配列］−［樹状細胞を標的化するためのポリペプチド又はタンパク質をコードする核酸配列］ｎ−［腫瘍抗原をコードする核酸配列］ｘ−［ペプチドリンカーをコードする核酸配列］ｍ−［上記遺伝子組換え酵母の細胞壁へ繋留するためのポリペプチド又はタンパク質をコードする核酸配列］    （ＩＩａ）
（式中、ｎは０又は１であり、ｍは０又は１であり、ｘは１〜３００、好ましくは１〜５０、好ましくは１〜９、好ましくは１〜５、例えば１〜４、１〜３、１〜２、例えば１、２、３、４、５の整数である。）
［樹状細胞を標的化するためのポリペプチド又はタンパク質をコードする核酸配列］ｎ−［腫瘍抗原をコードする核酸配列］ｘ−［ペプチドリンカーをコードする核酸配列］ｍ−［上記遺伝子組換え酵母の細胞壁へ繋留するためのポリペプチド又はタンパク質をコードする核酸配列］−［上記遺伝子組換え酵母の細胞壁へアドレッシングするためのポリペプチドをコードする核酸配列］    （ＩＩｂ）
（式中、ｎは０又は１であり、ｍは０又は１であり、ｘは１〜３００、好ましくは１〜５０、好ましくは１〜９、好ましくは１〜５、例えば１〜４、１〜３、１〜２、例えば１、２、３、４、５の整数である。）
［樹状細胞を標的化するためのポリペプチド又はタンパク質］ｎ−［腫瘍抗原］ｘ−［ペプチドリンカー］ｍ−［上記遺伝子組換え酵母の細胞壁へ繋留するためのポリペプチド又はタンパク質］    （Ｉａ）
（式中、ｎは０又は１であり、ｍは０又は１であり、ｘは１〜３００、好ましくは１〜５０、好ましくは１〜９、好ましくは１〜５、例えば１〜４、１〜３、１〜２、例えば１、２、３、４、５の整数である。）
【００３８】
本発明の目的のため、「ベクター」という用語は、最も広い意味で解釈されるべきである。具体的には、「ベクター」とは、核酸配列を酵母に導入してその発現、複製及び／又は該酵母のゲノムへの組込みを行うのに使用される運搬体を指す。様々な種類のベクターが当業者に広く知られており、あらゆる種類のベクターを本発明の文脈において使用できる。ベクターはプラスミドとも呼ばれる。実施例に記載されるように、プラスミドは、酵母において相同組換えできるように直線化されていてもよい。
【００３９】
各核酸配列は、Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ法によってベクターにおいて組み合わせることができる（Ｅｎｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，ＰＬｏｓ  Ｏｎｅ及びＥＰ２３９５０８７）。この方法によれば、特定部位を認識してその認識部位の外側で核酸配列を切断するＩＩｓ型制限酵素であるエンドヌクレアーゼを使用して、単一の反応で複数の核酸配列を方向性をもたせて同時に消化し、組み合わせることができる。酵母のゲノムへの核酸配列（すなわちベクター）の導入は、複製法又は組込み法で実施される。組込み法の場合、核酸配列は、酵母のゲノム中に安定的に挿入される。複製法の場合、核酸配列は、複製プラスミドを使用して酵母中に一過的に挿入される。
【００４０】
「上記遺伝子組換え酵母の細胞壁へアドレッシングするためのポリペプチド」又は「アドレッシングポリペプチド」によって、上記遺伝子組換え酵母の細胞壁へ融合タンパク質（Ｉａ）をアドレッシングできる。そして、この細胞壁へのアドレッシングによって、融合タンパク質を上記遺伝子組換え酵母の細胞壁に繋留することができる。有利には、アドレッシングポリペプチドをコードする核酸配列は、融合タンパク質（Ｉａ）をコードする核酸配列（ＩＩａ）又は（ＩＩｂ）の３’末端に位置する。したがって、アドレッシングポリペプチドは、融合タンパク質（Ｉａ）のＮ末端にあることが有利である。特定の実施形態において、アドレッシングポリペプチドは、もともと繋留タンパク質又はポリペプチド（例えばＡｇａ２ｐ配列）中に存在する。別の特定の実施形態において、繋留タンパク質又はポリペプチドがもともとアドレッシングポリペプチドを含まない場合（例えばＳｅｄ１ｐ配列）、アドレッシングポリペプチドは、融合タンパク質（Ｉａ）をコードする核酸配列に人為的に付加される。特定の実施形態において、繋留タンパク質又はポリペプチドがもともとアドレッシングポリペプチドを含まない場合、アドレッシングポリペプチドは、酵母フェロモンに由来する「プレプロα因子リーダーペプチド」（Ｍｆ（α）１ｐ）である。Ｍｆ（α）１ｐをコードする核酸配列は配列番号１２である。
【００４１】
工程ａ２）は、酵母の生存率及び複製率を確保する任意の培地で実施できる。酵母培地は当業者に周知である。例えば、グルコース培地又はガラクトース培地が挙げられる。
【００４２】
特定の実施形態において、ベクターは、繋留タンパク質又はポリペプチドと腫瘍抗原との結合を形成するペプチドリンカーをコードする核酸配列を含む。したがって、この実施形態において、核酸配列（ＩＩａ）又は（ＩＩｂ）は、ペプチドリンカーをコードする核酸配列を含む（すなわち、ペプチドリンカーをコードする核酸配列のｍ＝１）。
【００４３】
「ペプチドリンカー」又は「ペプチドリンカーアーム」とは、ポリペプチド又はタンパク質を別のポリペプチド又はタンパク質と接続するアミノ酸配列を意味している。本発明の文脈において、ペプチドリンカーは、繋留ポリペプチド又はタンパク質と腫瘍抗原とを接続する。特定の実施形態において、ペプチドリンカーは、４つのグリシン及びセリンからなるＧ４Ｓ（ＧＧＧＧＳ）である。Ｇ４Ｓリンカーは、柔軟性及びプロテアーゼ耐性を有するため、タンパク質工学において一般的に使用されている。
【００４４】
また、ベクターは、例えばｃ−ｍｙｃタグ等のタンパク質タグ（又はタグ）をコードする核酸配列を含んでいてもよい。したがって、融合タンパク質は、端部にタグを含んでいてもよい。タグを使用すると、酵母の細胞壁に発現された抗原を検出することができる。
【００４５】
特定の実施形態において、酵母は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｏｇａｔａｅａ属又はＣａｎｄｉｄａ属から選択される。有利には、酵母は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属から選択され、好ましくはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、そのヒト又は動物に対する安全性が多くの研究で示されていることから、特に有利である。その一例として、ＩＮＶＳＣ１酵母（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が挙げられる。また、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、ヒト又は動物に投与した際に許容性があることでよく知られている。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、硫黄及びビタミンと併用して鼻炎又は慢性鼻咽頭炎の治療に特に使用されており、その目的は、鼻及び喉の粘膜の炎症を抑えることである。また、この酵母は、ワクチン（例えばＢ型肝炎ワクチン）等の産生系としても使用されている。
【００４６】
繋留ポリペプチド又はタンパク質によって、遺伝子組換え酵母の細胞壁に融合タンパク質（Ｉａ）を保持することができる。有利には、繋留ポリペプチド又はタンパク質は、酵母の細胞壁にもともと発現されるポリペプチド又はタンパク質である。繋留ポリペプチド又はタンパク質は、選択した酵母種によりもともと発現されるポリペプチド又はタンパク質、あるいは外来ポリペプチド又はタンパク質、すなわち選択した酵母種により発現されないポリペプチド又はタンパク質、例えば遺伝子組換え対象として選択された酵母種とは異なる酵母種によりもともと発現されるポリペプチド又はタンパク質から選択してもよい。有利には、繋留ポリペプチド又はタンパク質は、Ａｇａ２ｐ、Ｓｅｄ１ｐ、Ｃｗｐ１ｐ、Ｃｗｐ２ｐ、Ｆｌｏ１ｐ  Ｃ、Ｔｉｐ１ｐ又はＴｉｒ１ｐ／Ｓｒｐ１ｐから選択される酵母ポリペプチド又はタンパク質である。好ましい実施形態において、繋留ポリペプチド又はタンパク質は、Ａｇａ２ｐ又はＳｅｄ１ｐから選択される。Ａｇａ２ｐをコードする核酸配列は配列番号１０であり、Ｓｅｄ１ｐをコードする核酸配列は配列番号１１である。
【００４７】
Ａｇａ２ｐポリペプチドを融合タンパク質（Ｉａ）で使用する場合、遺伝子組換え酵母がＡｇａ１ｐも発現することが必要である。実際、Ａｇａ１ｐは酵母の細胞壁に組み込まれ、Ａｇａ２ｐはジスルフィド架橋を介してＡｇａ１ｐに結合する（図１及び図２参照）。遺伝子組換え対象として選択された酵母は、もともとＡｇａ１ｐを発現するものであってもよい。それでもなお、繋留ポリペプチド又はタンパク質がＡｇａ２ｐである場合、本発明に係る方法は、Ａｇａ１ｐをコードする核酸配列を酵母に導入することを含むことが好ましい。このＡｇａ１ｐをコードする核酸配列は、工程ａ１）のベクター、又は酵母にさらに導入される別のベクターにより保持されていてもよい。Ａｇａ１ｐをコードする核酸配列は配列番号９である。
【００４８】
特定の実施形態において、工程ａ）で使用されるベクターは、樹状細胞を標的化するためのポリペプチド又はタンパク質をコードする核酸配列をさらに含む。したがって、この実施形態において、核酸配列（ＩＩａ）又は（ＩＩｂ）は、樹状細胞を標的化するためのポリペプチド又はタンパク質をコードする核酸配列を含む（すなわち、樹状細胞を標的化するためのポリペプチド又はタンパク質をコードする核酸配列のｎ＝１）。
【００４９】
「樹状細胞を標的化するためのポリペプチド又はタンパク質」とは、本質的にペプチドであり、本発明の免疫療法用酵母及びヒト又は動物樹状細胞を結びつけることができる任意の分子を意味している。このように結び付けることで、樹状細胞は免疫療法用酵母を取り込むことができ、その結果、該酵母の細胞壁に発現された腫瘍抗原を取り込むことができる。すなわち、標的化ポリペプチド又はタンパク質によって、免疫療法用酵母とヒト又は動物樹状細胞との相互作用を促進できる。この相互作用によって、腫瘍抗原のエンドサイトーシスを促進でき、結果として樹状細胞による該腫瘍抗原のＴリンパ球への提示を促進できる。
【００５０】
樹状細胞を標的化するためのポリペプチド又はタンパク質には、樹状細胞エンドサイトーシス受容体、例えばＤＥＣ２０５（ＣＤ２０５）受容体に特異的に結合できるあらゆるポリペプチド又はタンパク質が含まれる。
【００５１】
特定の実施形態において、樹状細胞を標的化するためのポリペプチド又はタンパク質は、
・ＤＥＣ２０５（ＣＤ２０５）受容体に対する（すなわち、特異的に結合できる）抗体又は抗体フラグメント；あるいは
・Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ細菌のプラスミノーゲン活性化因子（ＰＬＡ）、又はＹｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ細菌のプラスミノーゲン活性化因子（ＰＬＡ）に由来する配列
から選択される。ＰＬＡは、もともとＣＤ２０５に結合することが知られている。
【００５２】
抗体フラグメントは、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ及びＦ（ａｂ’）２フラグメント；二重特異性抗体；線状抗体；一本鎖抗体（ｓｃＦｖ等）から選択してもよい。好ましくは、本発明に係る抗体フラグメントはｓｃＦｖ、例えば配列番号１３の配列で表されるＣＤ２０５に対するｓｃＦｖである。
【００５３】
ＣＤ２０５タンパク質は、マクロファージマンノース受容体及び関連受容体に対して相同性を有する２０５ｋＤａの膜内在性糖タンパク質である。ＣＤ２０５は、細胞外間隙で捕捉された抗原を特定の抗原プロセシングコンパートメントに向かわせるために樹状細胞及び胸腺の上皮細胞により使用されるエンドサイトーシスマルチレクチン受容体である。Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓのプラスミノーゲン活性化因子（ＰＬＡ）は、該細菌の発達に重要な役割を果たすプロテアーゼである。Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓは、プラスミノーゲン活性化因子（ＰＬＡ）を介してＤＥＣ２０５受容体を使用することで、マウスに播種できることが示されている（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００８  Ｎｏｖ  １４；２８３（４６）：３１５１１−２１）。
【００５４】
特定の実施形態において、プラスミノーゲン活性化因子（ＰＬＡ）は、対応する全配列又は部分配列又は変異した全配列又は変異した部分配列であってもよい。部分及び／又は変異ＰＬＡ配列は、ＰＬＡ由来配列ともいう。
【００５５】
特定の実施形態において、免疫療法用酵母の細胞壁に発現される腫瘍抗原は、固形又は液性腫瘍の抗原、好ましくは固形腫瘍の抗原から選択される。有利には、腫瘍抗原は、Ｍｅｌａｎ−Ａ、チロシナーゼ、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ−Ｂ１、ＭＡＧＥＡ１、ＭＡＧＥＡ１０、ＭＡＧＥＡ１１、ＭＡＧＥＡ１２、ＭＡＧＥＡ２、ＭＡＧＥＡ２Ｂ、ＭＡＧＥＡ３、ＭＡＧＥＡ４、ＭＡＧＥＡ６、ＭＡＧＥＡ８、ＭＡＧＥＡ９、ＭＡＧＥＢ１；ＭＡＧＥＢ１０、ＭＡＧＥＢ１６、ＭＡＧＥＢ１８、ＭＡＧＥＢ２、ＭＡＧＥＢ３、ＭＡＧＥＢ４、ＭＡＧＥＢ５、ＭＡＧＥＢ６、ＭＡＧＥＢ６Ｂ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ  １抗原（ＮＹ−ＥＳＯ−１）、ＭＡＧＥＣ１、ＭＡＧＥＣ２、Ｌ抗原（ＬＡＧＥ）、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、Ｐ５３、ＫＲＡＳ、ＣＥＡ、ＷＴ１、ＭＵＣ１、ＳＡＲＴ３、ＳＵＲＶＩＶＩＮ２Ｂ、ＲＮＦ４３／ＴＯＭＭ３４、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＢＲＡＦ、ＰＩ３Ｋ、ＡＰＣ、ＢＡＸ、β２ミクログロブリン、テロメラーゼ又はＮＲＡＳから選択される。
【００５６】
免疫療法用酵母
本発明の別の主題は、本発明に係る方法を実施して得ることができる免疫療法用酵母である。
【００５７】
本発明の別の主題は、
（ｉ）Ｍｅｌａｎ−Ａ、チロシナーゼ、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ−Ｂ１、ＭＡＧＥＡ１、ＭＡＧＥＡ１０、ＭＡＧＥＡ１１、ＭＡＧＥＡ１２、ＭＡＧＥＡ２、ＭＡＧＥＡ２Ｂ、ＭＡＧＥＡ３、ＭＡＧＥＡ４、ＭＡＧＥＡ６、ＭＡＧＥＡ８、ＭＡＧＥＡ９、ＭＡＧＥＢ１；ＭＡＧＥＢ１０、ＭＡＧＥＢ１６、ＭＡＧＥＢ１８、ＭＡＧＥＢ２、ＭＡＧＥＢ３、ＭＡＧＥＢ４、ＭＡＧＥＢ５、ＭＡＧＥＢ６、ＭＡＧＥＢ６Ｂ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ  １抗原（ＮＹ−ＥＳＯ−１）、ＭＡＧＥＣ１、ＭＡＧＥＣ２、Ｌ抗原（ＬＡＧＥ）、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、Ｐ５３、ＫＲＡＳ、ＣＥＡ、ＷＴ１、ＭＵＣ１、ＳＡＲＴ３、ＳＵＲＶＩＶＩＮ２Ｂ、ＲＮＦ４３／ＴＯＭＭ３４、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＢＲＡＦ、ＰＩ３Ｋ、ＡＰＣ、ＢＡＸ、β２ミクログロブリン、テロメラーゼ又はＮＲＡＳから選択されるのが好ましい１種以上の腫瘍抗原と、
（ｉｉ）必要に応じて、樹状細胞を標的化するためのポリペプチド又はタンパク質と
を細胞壁に発現する遺伝子組換え及び透過処理された免疫療法用酵母である。
【００５８】
好ましくは、本発明に係る免疫療法用酵母は、遺伝子組換え、透過処理及び不活化されている。
【００５９】
特定の実施形態において、本発明の酵母は、下記式（Ｉａ）で表される融合タンパク質を細胞壁に発現する。
［樹状細胞を標的化するためのポリペプチド又はタンパク質］ｎ−［腫瘍抗原］ｘ−［ペプチドリンカー］ｍ−［上記遺伝子組換え酵母の細胞壁へ繋留するためのポリペプチド又はタンパク質］    （Ｉａ）
式中、ｎは０又は１であり、ｍは０又は１であり、ｘは１〜３００、好ましくは１〜５０、好ましくは１〜９、好ましくは１〜５、例えば１〜４、１〜３、１〜２、例えば１、２、３、４、５の整数である。
【００６０】
特定の実施形態において、樹状細胞を標的化するための物質は、ＤＥＣ−２０５タンパク質に特異的に結合できる抗体、ＤＥＣ−２０５タンパク質に特異的に結合できる抗体のフラグメント、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ細菌のプラスミノーゲン活性化因子（ＰＬＡ）、又はＹｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ細菌のプラスミノーゲン活性化因子（ＰＬＡ）に由来する配列から選択される。樹状細胞を標的化するための物質は上述したものである。
【００６１】
上述した通り、
・ｘが１を超える整数である場合、すなわちｘが２〜３００の整数である場合、各腫瘍抗原は同一であっても異なっていてもよい。例えば、各腫瘍抗原は全て異なっていてもよい；
・ｘが１を超える整数である場合、すなわちｘが２〜３００の整数である場合、各腫瘍抗原は、リンカーであるペプチドにより分離されていてもされていなくてもよい；且つ／又は
・ｘが１を超える整数である場合、すなわちｘが２〜３００の整数である場合、各腫瘍抗原は同一であっても異なっていてもよい。例えば、ｘ＝２である場合、該腫瘍抗原は２つのＭＡＧＥＡ１抗原であってもよく、あるいは１つのＭＡＧＥＡ１抗原と１つのＭＡＧＥＡ２抗原であってもよい。この実施形態において、各腫瘍抗原は、順々に配置されていてもよく、あるいはこれらの腫瘍抗原を互いに接続するペプチド配列により分離されていてもよい。
【００６２】
免疫療法用組成物
本発明の別の主題は、上述した酵母と医薬的に許容される担体とを含む免疫療法用組成物である。
【００６３】
「免疫療法用組成物」とは、ヒト又は動物に投与した際に疾患の予防又は治療を意図した組成物であって、液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答を刺激できる１種以上の成分を含む組成物を意味している。液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答を刺激できる成分としては、腫瘍抗原、ウイルス、細菌又は酵母等の微生物の他、細胞可溶化物、樹状細胞、遺伝子組換え細胞傷害性リンパ球、サイトカイン、免疫系チェックポイント阻害剤が挙げられる。
【００６４】
より具体的には、本発明に係る免疫療法用組成物は、がんの予防又は治療を意図したものである。特に、免疫療法用組成物は細胞性免疫応答を刺激できる。細胞性免疫応答は、直接細胞傷害性を発揮する免疫系の細胞、すなわち非自己抗原を発現する標的細胞を破壊できる細胞の介入により特徴付けられる。細胞傷害性を有する免疫系の細胞は、ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞及び細胞傷害性Ｔリンパ球に代表される。細胞傷害性Ｔリンパ球は、感染病原体に感染された細胞のアポトーシスにより細胞死を誘導できるか、又はがん細胞の細胞死を誘導できるＴリンパ球のサブセットである。
【００６５】
免疫応答を生じさせるために、抗原は、抗原提示細胞に保持されたクラスＩ又はＩＩの主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の分子によってそれぞれＣＤ８＋Ｔリンパ球（細胞溶解応答）又はＣＤ４＋Ｔリンパ球（補助応答）に提示されなければならない。抗原提示細胞のなかでも、樹状細胞は最良の能力を有しており、ナイーブＴリンパ球を活性化できるだけでなく、ＭＨＣクラスＩ又はＩＩ分子との関連で抗原の提示により細胞溶解性の細胞性及び液性応答を誘導できる。抗原の異化工程は、樹状細胞成熟の段階と厳密に相関している。末梢組織に集中した未成熟樹状細胞のみが貪食し、可溶粒子状抗原のエンドサイトーシスを引き起こすことができるが、この段階では、抗原をＴリンパ球に提示することはできない。なぜなら、そのリソソームにＭＨＣ分子が保持されているからである。一方、上記樹状細胞の成熟プロセスは、炎症シグナル及びＣＤ４０−Ｌ／ＣＤ４０分子対により制御されているが、形態変化、膜へのＭＨＣクラスＩ及びＩＩ分子の再配置、リンパ球同時刺激分子の発現、とりわけ末梢組織から神経節及び脾臓への樹状細胞の遊走を伴う。これらの器官において、成熟樹状細胞は、ペプチドに分解され且つＭＨＣ−Ｉ分子と複合化した抗原をＴリンパ球に提示できる。
【００６６】
免疫療法用組成物に含まれる免疫療法用酵母は、樹状細胞と相互作用でき、Ｔリンパ球の活性化により細胞性免疫応答を刺激できる。したがって、免疫応答の結果、生理的反応が標的腫瘍のサイズの退縮として現れる。インビボにおいて、動物の場合、腫瘍サイズは、立方ミリメートル（ｍｍ３）で測定され、治療手段により処理された腫瘍のサイズの退縮は、一般的に未処理腫瘍のサイズに対するパーセントで評価される。ヒト患者の場合、腫瘍サイズの退縮は、処理前に最初に検出された腫瘍に対するパーセントで測定される。
【００６７】
「医薬的に許容される担体」（「賦形剤」ともいう）とは、薬剤に含まれる又は薬剤の製造に使用される活性成分以外の任意成分を意味している。賦形剤の機能は、活性成分を運搬して、それにより安定性、生物製剤特性、外観、患者の許容性及び／又は製造し易さ等の製品の特定の性質に寄与することである。免疫療法用組成物の剤形は、通常、いくつかの賦形剤を含む。これらとして、水（精製水又は注射用水）、アルコール（エタノール、グリコール、グリセロール又はポリエチレングリコール）、ゲル化剤（ガム等）、藻類抽出物質、タンパク質、セルロース及びその誘導体、並びに合成ゲル化剤等の親水性賦形剤が挙げられる。また、天然起源又は半合成起源のグリセリド等の親油性賦形剤や、脂肪酸、脂肪酸アルコール、炭化水素、シリコーン等の非グリセロール親油性賦形剤も挙げられる。また、イオン性、アニオン性、カチオン性又は両性界面活性剤、非イオン性界面活性剤等の乳化賦形剤も挙げられる。さらに、糖類（スクロース、グルコース、フルクトース、ラクトース、ソルビトール、デンプン）、鉱物（例えば、コロイダルシリカ、タルク、カオリン、酸化チタン）等の他の成分も賦形剤として利用できる。
【００６８】
特定の実施形態において、本発明の免疫療法用組成物はさらに治療薬を含む。有利には、治療薬は、抗がんポリペプチド又は化学療法薬から選択される。また、多糖類、脂質誘導体、ビタミン、核酸又はアプタマーであってもよい。
【００６９】
抗がんポリペプチドは、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、抗体、抗体フラグメント、アゴニスト、アンタゴニスト又は増殖因子から選択してもよい。このリストは網羅されているものではない。
【００７０】
化学療法薬は当業者に周知である。それらはいくつかの群、すなわち、アルキル化剤、紡錘体剤、紡錘体毒（ビンカアルカロイド及び関連物質）、紡錘体安定化剤（タキサン）、代謝拮抗薬、プロテオソーム阻害剤又はトポイソメラーゼ阻害剤に分類される。有利には、化学療法薬は、シクロホスファミド、ドセタキセル（タキサンファミリー）、ドキソルビシン（アントラサイクリンファミリー）、エピルビシン（アントラサイクリンファミリー）、フルオロウラシル（５−ＦＵとも呼ばれる）、メトトレキサート、パクリタキセル（タキサンファミリー）、アントラサイクリン、カペシタビン、エリブリン、ゲムシタビン又はビノレルビンから選択される。このリストは網羅されているものではない。
【００７１】
本発明の別の主題は、薬剤として、より具体的にはがんの治療又は予防に使用される本発明に係る免疫療法用酵母又は本発明に係る免疫療法用組成物である。
【００７２】
「がん」とは、身体の任意部分に影響を与え得る大きな疾患群を意味するものであり、それらに共通する特徴の１つは、他の器官へ伝播して転移と呼ばれるものを生じ得る異常細胞の急速且つ制御不能な増殖である。「がん」という用語は、固形がん及び液性がん（造血系がんとも呼ばれる）を含み、後者には白血病及びリンパ腫が含まれる。特定の実施形態において、がんは固形がんである。固形がんはあらゆる組織で発生し得る。細胞腫と肉腫とは区別される。好ましい実施形態において、がんは、メラノーマ、扁平上皮がん、乳がん、頭頸部がん、甲状腺がん、軟部組織肉腫、骨肉腫、精巣がん、前立腺がん、卵巣がん、膀胱がん、皮膚がん、脳がん、脈管肉腫、血管肉腫、乳突蜂巣腫瘍、肝臓がん、肺がん、膵臓がん、胃腸がん、腎細胞がん、及びこのリストに由来する全ての転移がんから選択される。本発明の好ましい実施形態において、固形がんはメラノーマであり、表在拡大型黒色腫、結節性メラノーマ、Ｄｕｂｒｅｕｉｌｈメラノーマ又は末端黒子型黒色腫や、これらに関連し得る転移型であろうと構わない。本発明の別の好ましい実施形態において、固形がんは結腸がんである。有利には、固形がんがメラノーマである場合、免疫療法用酵母は、Ｍｅｌａｎ−Ａ、チロシナーゼ、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ−Ｂ１、ＭＡＧＥＡ１、ＭＡＧＥＡ１０、ＭＡＧＥＡ１１、ＭＡＧＥＡ１２、ＭＡＧＥＡ２、ＭＡＧＥＡ２Ｂ、ＭＡＧＥＡ３、ＭＡＧＥＡ４、ＭＡＧＥＡ６、ＭＡＧＥＡ８、ＭＡＧＥＡ９、ＭＡＧＥＢ１、ＭＡＧＥＢ１０、ＭＡＧＥＢ１６、ＭＡＧＥＢ１８、ＭＡＧＥＢ２、ＭＡＧＥＢ３、ＭＡＧＥＢ４、ＭＡＧＥＢ５、ＭＡＧＥＢ６、ＭＡＧＥＢ６Ｂ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ  １抗原（ＮＹ−ＥＳＯ−１）、ＭＡＧＥＣ１、ＭＡＧＥＣ２、Ｌ抗原（ＬＡＧＥ）、ＴＲＰ−１又はＴＲＰ−２から選択される１種以上の抗原を細胞壁に発現する。固形がんが結腸がんである場合、免疫療法用酵母は、Ｐ５３、ＫＲＡＳ、ＣＥＡ、ＷＴ１、ＭＵＣ１、ＳＡＲＴ３、ＳＵＲＶＩＶＩＮ２Ｂ、ＲＮＦ４３／ＴＯＭＭ３４、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＢＲＡＦ、ＰＩ３Ｋ、ＡＰＣ、ＢＡＸ、β２ミクログロブリン、テロメラーゼ又はＮＲＡＳから選択される１種以上の抗原を細胞壁に発現することが有利である。
【００７３】
本発明に係る免疫療法用酵母又は免疫療法用組成物は、筋肉内、腹腔内、静脈内若しくは皮下注射、経口又は呼吸／肺経路で投与してもよい。剤形は投与方法に応じて適合される。当業者には、選択した投与経路に適した剤形に適合させる方法が明らかである。例えば、経口投与の場合、剤形は、口腔内分散錠等の錠剤、カプセル、ゲルカプセル、経口液剤から選択してもよい。経肺投与の場合、剤形は、スプレー又は吸入用製品の形態であってもよい。有利には、免疫療法用酵母又は免疫療法用組成物は、皮下注射により投与される。特定の実施形態において、本発明に係る免疫療法用酵母又は組成物は、週に１回以上、又は月に１回以上の割合でヒト又は動物に投与され、各投与量は、１ＹＵ（酵母ユニット（Ｙｅａｓｔ  Ｕｎｉｔ））を酵母１０７個とすると、０．１〜２００ＹＵ、好ましくは０．１〜２ＹＵ、又は０．１〜５ＹＵ、又は０．１〜１０ＹＵ、又は１〜１０ＹＵ、１０〜２０ＹＵ、２０〜３０ＹＵ、３０〜４０ＹＵ、４０〜５０ＹＵ、又は５０及び１００ＹＵ、１００及び１５０ＹＵ、又は１５０ＹＵ及び２００ＹＵである。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】オボアルブミンに由来するＯＶＡ１抗原を表すポリペプチドＭＥＱＬＥＳＩＩＮＦＥＫＬＴＥＷＴＳＡ（配列番号１４）を細胞壁に発現する酵母を示す図である。上記抗原は、ジスルフィド架橋によりＡｇａ１ｐと結合した繋留ポリペプチドＡｇａ２ｐを介して酵母の細胞壁に発現される。ＯＶＡ１抗原は、４つのグリシン及びセリンで構成されたＧ４Ｓリンカーを介して繋留ポリペプチドに結合している。ｃ-ｍｙｃは、遺伝子組換え酵母の細胞壁にＯＶＡ１抗原が発現されていることを検出及び確認できるタグである。
【図２】オボアルブミンに由来するＯＶＡ１抗原を表すポリペプチドＭＥＱＬＥＳＩＩＮＦＥＫＬＴＥＷＴＳＡ（配列番号１４）を細胞壁に発現する酵母を示す図である。上記抗原は、繋留タンパク質Ｓｅｄ１ｐを介して酵母の細胞壁に発現される。ＯＶＡ１抗原は、４つのグリシン及びセリンで構成されたＧ４Ｓリンカーを介して繋留ポリペプチドに結合している。ｃ-ｍｙｃは、遺伝子組換え酵母の細胞壁にＯＶＡ１抗原が発現されていることを検出及び確認できるタグである。
【図３】オボアルブミンに由来するＯＶＡ１抗原を表すポリペプチドＭＥＱＬＥＳＩＩＮＦＥＫＬＴＥＷＴＳＡ（配列番号１４）を細胞壁に発現する酵母を示す図である。上記抗原は、ジスルフィド架橋によりＡｇａ１ｐと結合した繋留ポリペプチドＡｇａ２ｐを介して酵母の細胞壁に発現される。ＯＶＡ１抗原は、４つのグリシン及びセリンで構成されたＧ４Ｓリンカーを介して繋留ポリペプチドに結合している。上記酵母は、ＤＥＣ−２０５受容体に対する抗体のＳｃＦｖフラグメント（ＳｃＦｖ抗ＤＥＣ２０５）も細胞壁に発現する。ｃ-ｍｙｃは、酵母の細胞壁にＯＶＡ１抗原が発現されていることを検出及び確認できるタグである。
【図４】オボアルブミンに由来するＯＶＡ１抗原を表すポリペプチドＭＥＱＬＥＳＩＩＮＦＥＫＬＴＥＷＴＳＡ（配列番号１４）を細胞壁に発現する酵母を示す図である。上記抗原は、繋留タンパク質Ｓｅｄ１ｐを介して酵母の細胞壁に発現される。ＯＶＡ１抗原は、４つのグリシン及びセリンで構成されたＧ４Ｓリンカーを介して繋留ポリペプチドに結合している。上記酵母は、ＤＥＣ−２０５受容体に対する抗体のＳｃＦｖフラグメント（ＳｃＦｖ抗ＤＥＣ２０５）も細胞壁に発現する。ｃ-ｍｙｃは、酵母の細胞壁にＯＶＡ１抗原が発現されていることを検出及び確認できるタグである。
【図５】Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ法によりベクターに核酸配列を組み合わせることを示す図である。
【図６】Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ法により組み合わされたベクターを示す図である。
【図７】ｃ−ｍｙｃタグに対する抗体を使用して酵母の細胞壁にＯＶＡ１ペプチドが発現されていることを示すフローサイトメトリースペクトルである。
【図８】樹状細胞が細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔリンパ球に対して抗原ＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＯＶＡ２５７−２６４）を交差提示した際の細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔリンパ球の活性化を、抗原ＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＯＶＡ２５７−２６４）の投与量の増加（０ｎＭ〜１０ｎＭ）に応じて示す図である。抗原ＳＩＩＮＦＥＫＬは遊離状態、すなわち酵母の細胞壁に結合しておらず、野生型酵母が、ＭＯＩ（感染多重度）が２０のアジュバントとして使用されている。
【図９】透過処理又は未透過処理酵母を使用した樹状細胞による交差提示の際の細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔリンパ球の活性化を示す図である。Ａ）未透過処理（点）及び透過処理（線）野生型酵母、Ｂ）細胞質基質にＯＶＡ１抗原を発現する未透過処理（点）及び透過処理（線）酵母、Ｃ）繋留タンパク質Ｓｅｄ１ｐを介して細胞壁にＯＶＡ１を発現する未透過処理（点）及び透過処理（線）酵母、Ｄ）繋留タンパク質Ｓｅｄ１ｐを用いて細胞壁にＯＶＡ１抗原及び抗ＤＥＣ２０５  ＳｃＦｖフラグメントを発現する酵母、Ｅ）繋留ポリペプチドＡｇａ２ｐを介して細胞壁にＯＶＡ１抗原及び抗ＤＥＣ２０５  ＳｃＦｖフラグメントを発現する酵母を、組込みプラスミドと組み合わせたものである。
【図１０】皮下注射した５×１０５個のＢ１６−ＯＶＡ（ＭＯ５）メラノーマ細胞によってＤ０に腫瘍負荷した際のマウスにおける腫瘍増殖を立方メートル（ｍｍ３）で示すグラフである。野生型マウス（野生型：ＷＴ）は〇で表示する。繋留タンパク質Ｓｅｄ１ｐを介して抗ＤＥＣ−２０５  ＳｃＦｖと融合したＯＶＡ１を細胞壁に発現する透過処理酵母で処理したマウスは△で表示する。１ＹＵ（１×１０７個の酵母）の投与量を３回（腫瘍負荷の７日前に腹腔内、腫瘍負荷の３日前に皮下、その後、腫瘍負荷の３日後に皮下）注射した。
【図１１】図１０に示したのと同じ腫瘍負荷後のマウスの生存率を示すグラフである。野生型マウス（野生型：ＷＴ）は〇で表示する。繋留タンパク質Ｓｅｄ１ｐを介して抗ＤＥＣ−２０５  ＳｃＦｖと融合したＯＶＡ１を細胞壁に発現する透過処理酵母で処理したマウスは△で表示する。
【図１２】ＡＨ−１に由来するＡＨ１Ａ５抗原を表すポリペプチドＳＰＳＹＡＹＨＱＦ（配列番号１５）を細胞壁に発現する酵母を示す図である。上記抗原は、繋留タンパク質Ｓｅｄ１ｐを介して酵母の細胞壁に発現される。ＡＨ１Ａ５抗原は、４つのグリシン及びセリンで構成されたＧ４Ｓリンカーを介して繋留ポリペプチドに結合している。ｃ-ｍｙｃは、遺伝子組換え酵母の細胞壁にＡＨ１Ａ５抗原が発現されていることを検出及び確認できるタグである。上記酵母は、ＤＥＣ−２０５受容体に対する抗体のＳｃＦｖフラグメント（ＳｃＦｖ抗ＤＥＣ２０５又はＳｃＦｖ  ＤＥＣ２０５）も細胞壁に発現する。
【図１３】ＴＲＰ１抗原を表すポリペプチドＴＡＰＤＮＬＧＹＭ（配列番号１６）を細胞壁に発現する酵母を示す図である。上記抗原は、繋留タンパク質Ｓｅｄ１ｐを介して酵母の細胞壁に発現される。ＴＲＰ１抗原は、４つのグリシン及びセリンで構成されたＧ４Ｓリンカーを介して繋留ポリペプチドに結合している。ｃ-ｍｙｃは、遺伝子組換え酵母の細胞壁にＴＲＰ１抗原が発現されていることを検出及び確認できるタグである。上記酵母は、ＤＥＣ−２０５受容体に対する抗体のＳｃＦｖフラグメント（ＳｃＦｖ抗ＤＥＣ２０５又はＳｃＦｖ  ＤＥＣ２０５）も細胞壁に発現する。
【図１４】ＴＲＰ２抗原を表すポリペプチドＳＶＹＤＦＦＶＷＬ（配列番号１７）を細胞壁に発現する酵母を示す図である。上記抗原は、繋留タンパク質Ｓｅｄ１ｐを介して酵母の細胞壁に発現される。ＴＲＰ２抗原は、４つのグリシン及びセリンで構成されたＧ４Ｓリンカーを介して繋留ポリペプチドに結合している。ｃ-ｍｙｃは、遺伝子組換え酵母の細胞壁にＴＲＰ２抗原が発現されていることを検出及び確認できるタグである。上記酵母は、ＤＥＣ−２０５受容体に対する抗体のＳｃＦｖフラグメント（ＳｃＦｖ抗ＤＥＣ２０５又はＳｃＦｖ  ＤＥＣ２０５）も細胞壁に発現する。
【図１５】それぞれＴＲＰ１、ＯＶＡ１及びＴＲＰ２抗原を表すポリペプチドＴＡＰＤＮＬＧＹＭ（配列番号１６）、ＭＥＱＬＥＳＩＩＮＦＥＫＬＴＥＷＴＳＡ（配列番号１４）及びＳＶＹＤＦＦＶＷＬ（配列番号１７）を細胞壁に発現する酵母を示す図である。上記抗原は、繋留タンパク質Ｓｅｄ１ｐを介して酵母の細胞壁に発現される。上記抗原は、４つのグリシン及びセリンで構成されたＧ４Ｓリンカーを介して繋留ポリペプチドに結合しており、Ｇ４Ｓリンカーにより互いに分離されている。ｃ-ｍｙｃは、遺伝子組換え酵母の細胞壁に上記抗原が発現されていることを検出及び確認できるタグである。上記酵母は、ＤＥＣ−２０５受容体に対する抗体のＳｃＦｖフラグメント（ＳｃＦｖ抗ＤＥＣ２０５又はＳｃＦｖ  ＤＥＣ２０５）も細胞壁に発現する。
【図１６Ａ】抗ｃ−ｍｙｃ抗体を使用した、抗原ＡＨ１Ａ５を細胞壁に発現する酵母のフローサイトメトリースペクトルである。
【図１６Ｂ】抗ｃ−ｍｙｃ抗体を使用した、抗原ＴＲＰ１を細胞壁に発現する酵母のフローサイトメトリースペクトルである。
【図１６Ｃ】抗ｃ−ｍｙｃ抗体を使用した、抗原ＴＲＰ２を細胞壁に発現する酵母のフローサイトメトリースペクトルである。
【図１６Ｄ】抗ｃ−ｍｙｃ抗体を使用した、抗原ＯＶＡ１−ＴＲＰ１−ＴＲＰ２を細胞壁に発現する酵母のフローサイトメトリースペクトルである。
【図１７】異なる方法で処理し、ｐ−ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）に接触させた酵母の４０５ｎｍの吸光度を示す図である。ｐＮＰＰは、酵母の細胞質基質にもともと存在する酵素であるアルカリホスファターゼの基質である。ｐＮＰＰは、未透過処理酵母の細胞質基質へは透過しない。一方、酵母が透過処理されると、ｐＮＰＰは酵母内に侵入し、細胞質基質に存在するアルカリホスファターゼによって加水分解される。その後、加水分解されたｐＮＰＰは黄色を呈するため、４０５ｎｍの吸光度により読み取ることができる。
【図１８】異なる方法で処理し、ｐ−ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）に接触させた酵母の４０５ｎｍの吸光度を示す図である。ｐＮＰＰは、酵母の細胞質基質にもともと存在する酵素であるアルカリホスファターゼの基質である。ｐＮＰＰは、未透過処理酵母の細胞質基質へは透過しない。一方、酵母が透過処理されると、ｐＮＰＰは酵母内に侵入し、細胞質基質に存在するアルカリホスファターゼによって加水分解される。その後、加水分解されたｐＮＰＰは黄色を呈するため、４０５ｎｍの吸光度により読み取ることができる。
【図１９】樹状細胞の存在下、抗原ＭＥＱＬＥＳＩＩＮＦＥＫＬＴＥＷＴＳＡ（配列番号１４）を細胞壁に発現する酵母の交差提示の際の細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔリンパ球の活性化を示す図である。上記酵母は、異なる方法で処理して透過処理又は未透過処理細胞を得た。
【００７５】
以下の実施例は本発明の実施形態を示すが、下記実施例は例として示したものであり、特許請求の範囲を限定するものではない。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００７６】
実施例１：酵母に導入されるプラスミドの構築（図５及び６）
Ａｂｏｌｉｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ｉＳＳＢ、フランス、エヴリー、ジェノポール）によって２種類のプラスミド（組込みプラスミド及び複製プラスミド）が作製された。
【００７７】
複製プラスミドの場合、２ミクロンの酵母複製起点を含むエピソーマルプラスミドフラグメント、選択マーカーＵＲＡ３（配列番号４）及びアンピシリン耐性をＧｉｂｓｏｎ法（Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、ＮＥＢ製）で組み合わせた後、図５及び６に記載の方法に従ってＧｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ法によりインサートでプラスミドを形質転換した。
【００７８】
組込みプラスミドの場合、図５及び６に記載の方法に従ってＧｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ法により、遺伝子組換え酵母のゲノムとの相同組換え部位を含む２つのプラスミド、選択マーカーＵＲＡ３（配列番号４）及びＴＲＰ１（配列番号８）、並びにカナマイシン耐性遺伝子を形質転換した。
【００７９】
上記２つのプラスミドは、以下のフラグメントを用いてＧｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ法により組み合わせた。
・Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの染色体ＩＩに存在する配列から合成した酵母遺伝子ＧＡＬ１の誘導性プロモーター（配列番号１）。
・「Ｐａｒｔｓ  ｉＧＥＭ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ」の「ＢｉｏＢｒｉｃｋ」から抽出した、科学界で広く使用されている遺伝子ターミネーターであるＣＹＣ１遺伝子のターミネーター（配列番号２）。遺伝子組換え酵母で発現される組換えタンパク質をコードする遺伝子の転写末端をポリメラーゼに示すことができる。
・文献「Ｓｈｏｒｔ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ，Ｃｕｒｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈ  Ｂｉｏ．２０１５  Ｊｕｌ  １７；４（７）：８２４−３２」においてＴ２７と表されたターミネーターの配列を用いて、組換えタンパク質の産生を増加させるためにＣＹＣ１ターミネーターの上流に配置された合成ターミネーターＴ２７（配列番号３）を合成した。ＣＹＣ１ターミネーターの作用を増強するものである。
・ＵＲＡ３遺伝子をそのプロモーター及びターミネーターと共に酵母ゲノムから抽出した（配列番号４）。
・カナマイシン耐性抗生物質（Ｋａｎ）及び細菌複製起点ｐＭＢ１は、プラスミドｐＳＢ１Ｋ３に由来する（配列番号５）。
・黄色蛍光レポーター遺伝子ＹＦＰ  Ｎｏ．ＢＢａ＿Ｅ００３０並びにプロモーターｐＬＡＣ  Ｎｏ．ＢＢａ＿Ｒ００１０及びターミネーターＮｏ．ＢＢａ＿Ｂ００１５は、いずれもカタログ「ｐａｒｔｓ  ｉＧＥＭ  ｒｅｇｉｓｔｒｙ」から入手した。
・Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１２による文献においてＸＩ−２ＵＰ（配列番号６）及びＸＩ−２ＤＯＷＮ（配列番号７）と名付けられた挿入部位を酵母のゲノムを用いて増幅した。
【００８０】
「挿入部位」と名付けられたヌクレオチド配列を使用することで、遺伝子組換え酵母において相同組換えにより組換えヌクレオチド配列の染色体組込みを行うことができる（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｄｏｌｙｌｇｌｕｃｏｓｉｎｏｌａｔｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｍｕｌｔｉ−ｇｅｎｅ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  ａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｌａｔｆｏｒｍ，Ｍｅｔａｂ  Ｅｎｇ．２０１２  Ｍａｒ；１４（２）：１０４−１１），Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎ  ＭＤ，Ｂｕｒｏｎ  ＬＤ，Ｓａｌｏｍｏｎｓｅｎ  Ｂ，Ｏｌｓｅｎ  ＣＥ，Ｈａｎｓｅｎ  ＢＧ，Ｍｏｒｔｅｎｓｅｎ  ＵＨ，Ｈａｌｋｉｅｒ  ＢＡ）。
【００８１】
プラスミドにおいて融合タンパク質をコードする核酸配列をＧｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ法により挿入するために、ＢｓａＩ切断部位及び末端相補的プライマーを含む核酸配列を合成した。本発明を実施するために使用されるプライマー対の一例は、インサートの５’がＧＧＴＣＴＣＴＡＡＴＧ（配列番号１８）、インサートの３’がＧＡＧＴＴＧＡＧＡＣＣ（配列番号１９）である。これらのプライマーは、前後に挿入される断片とのみ適合するため、全てのフラグメントが単一の連結反応において混合されて正しい順番に組み合わせられる（図５及び図６）。インサートは、例えば以下から構成される。
・繋留・アドレッシングポリペプチドＡｇａ２ｐをコードする核酸配列、ＯＶＡ１ペプチド（腫瘍抗原モデル）をコードする核酸配列、及びｃ−ｍｙｃをコードする配列；
・繋留ポリペプチドＳｅｄ１ｐをコードする核酸配列、ペプチドＡＨ１−Ａ５（結腸がん抗原）をコードする核酸配列、ｃ−ｍｙｃをコードする配列、標的化ポリペプチドＳｃＦｖ  ＤＥＣ−２０５をコードする配列、及び「プレプロα因子リーダーペプチド」と名付けられた酵母フェロモンタンパク質Ｍｆ（α）１ｐに由来するアドレッシングポリペプチドをコードする核酸配列；
・繋留ポリペプチドＳｅｄ１ｐをコードする核酸配列、ペプチドＴＲＰ１（メラノーマ抗原）をコードする核酸配列、ｃ−ｍｙｃをコードする配列、標的化ポリペプチドＳｃＦｖ  ＤＥＣ−２０５をコードする配列、及び「プレプロα因子リーダーペプチド」と名付けられた酵母フェロモンタンパク質Ｍｆ（α）１ｐに由来するアドレッシングポリペプチドをコードする核酸配列；
・繋留ポリペプチドＳｅｄ１ｐをコードする核酸配列、ペプチドＴＲＰ２（メラノーマ抗原）をコードする核酸配列、ｃ−ｍｙｃをコードする配列、標的化ポリペプチドＳｃＦｖ  ＤＥＣ−２０５をコードする配列、及び「プレプロα因子リーダーペプチド」と名付けられた酵母フェロモンタンパク質Ｍｆ（α）１ｐに由来するアドレッシングポリペプチドをコードする核酸配列；
・繋留ポリペプチドＳｅｄ１ｐをコードする核酸配列、ペプチドＯＶＡ１、ＴＲＰ１及びＴＲＰ２をコードする核酸配列、ｃ−ｍｙｃをコードする配列、標的化ポリペプチドＳｃＦｖ  ＤＥＣ−２０５をコードする配列、並びに「プレプロα因子リーダーペプチド」と名付けられた酵母フェロモンタンパク質Ｍｆ（α）１ｐに由来するアドレッシングポリペプチドをコードする核酸配列；
・「プレプロα因子リーダーペプチド」と名付けられた酵母フェロモンタンパク質Ｍｆ（α）１ｐに由来するアドレッシングポリペプチドをコードする核酸配列、ペプチドＯＶＡ１及びｃ−ｍｙｃをコードする核酸配列、並びに繋留タンパク質Ｓｅｄ１ｐをコードする核酸配列。
【００８２】
Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ法により組み合わせる方法は以下の通りである。
１ｍｌ当たり４０００００ユニットまで濃縮したＴ４ＤＮＡリガ―ゼ１μｌをＴ４ＤＮＡリガーゼ１０×バッファー２μｌ、１ｍｌ当たり２００００ユニットまで濃縮した高忠実度の制限酵素ＢｓａＩ  １μｌ、挿入する各ヌクレオチド配列（配列１〜８）５０ｎｇ、及びヌクレオチドインサートを受け入れるプラスミド５０ｎｇと混合した。反応媒体は、脱イオン水を２５μｌまで補った。その後、下記プロトコルに従って、酵素ＢｓａＩによる切断の酵素反応（３７℃のサイクル）、並びに消化されたヌクレオチド配列及びＴ４リガーゼ酵素により消化されたプラスミドの連結（１６℃のサイクル）が行われるように反応媒体を異なる温度サイクルに供した。
第一工程：９８℃２分
第二工程（３２回繰り返す）：３７℃３０秒
１６℃３０秒
第三工程：６５℃１０分
第四工程：１２℃１０分
【００８３】
上記温度サイクル後に得られたＧｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ溶液を使用して細菌形質転換を行った。反応体積１０μｌを採取し、コンピテント細菌である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５−Ａｌｐｈａ  Ｈｉｇｈ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ、ＮＥＢ製）２０μｌと接触させた。好適な選択抗生物質であるカナマイシン又はアンピシリンを含む培地に細菌を画線した。３７℃で２４時間培養後、単離したコロニーを上記と同じ選択抗生物質を含む培地を使用して３７℃で液体培養した。２４時間後、細菌培養液２ｍｌを採取して、プラスミドを精製した。全てのプラスミドをコロニーＰＣＲで調べ、Ｓａｎｇｅｒ法で配列決定して、正しく組み合わされていることを確認した。
【００８４】
その後、酵素ＡｖｒＩＩにより組込みプラスミドを消化して、相同組換えできるように直線化した。次に、この直線化した組込みプラスミドを使用して酢酸リチウム法によりＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＩＮＶＳＣ１酵母（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を形質転換した（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｙｅａｓｔ  ｂｙ  ｌｉｔｈｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ／ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｃａｒｒｉｅｒ  ＤＮＡ／ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｍｅｔｈｏｄ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２００２：３５０：８７−９６，Ｇｉｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ）。手短に言えば、酵母を対数増殖期までＹＰＡＤ（グルコース２０ｇ／ｌ、酵母エキス１０ｇ／ｌ、バクトペプトン２０ｇ／ｌ）で培養し、その後、３０００ｇで５分間遠心分離を行って回収し、滅菌水で洗浄し、以下の溶液：ＰＥＧ４０００（５０％（ｗ／ｖ））２４０μｌ、１．０Ｍ  ＬｉＡｃ３６μｌ、一本鎖サケ精子ＤＮＡ５０μｌ（２．０ｍｇ／ｍｌ）、形質転換するプラスミド３４μｌで形質転換した。この形質転換溶液に懸濁した酵母を４２℃の浴中に２５分間置いた。１３０００ｇで１分間遠心分離を行った後、酵母をＹＰＡＤ培地に１時間再懸濁してから、酵母に挿入されたプラスミドに対する選択培地を含むシャーレに画線した。その後、遺伝子組換え酵母のゲノム抽出及びインサート特異的ＰＣＲによって染色体挿入を確認した（Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  ｆｒｏｍ  ｙｅａｓｔｓ  ｆｏｒ  ＰＣＲ−ｂａｓｅｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ５０：３２５−３２８（２０１１），Ｌｏｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ）。手短に言えば、６００ｎｍの光学濃度ＯＤ＝０．４で培養した酵母１００μｌを遠心分離した後、２００ｍＭ酢酸リチウム（ＬｉＡｃ）１％ＳＤＳ溶液１００μｌに再懸濁し、ボルテックスし、７０℃で５分間インキュベートした。９６％エタノール３００μｌを添加してＤＮＡを沈殿させ、溶液をボルテックスし、１３０００ｇで３分間遠心分離した。上清を除去し、７０％エタノール５００μｌでペレットを洗浄してから、滅菌水１００μｌに再懸濁した。その後、上清１μｌを、各ゲノムインサートに特異的なプライマーを使用したＰＣＲに供した。
【００８５】
実施例２：免疫療法用酵母の作製（図１〜４）
記載した全ての実施例において、４重栄養要求性酵母（ＵＲＡ、ＴＲＰ、ＨＩＳ、ＬＥＵ）であるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＩＮＶＳＣ１酵母（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を使用した。酢酸リチウム法により実施例１に記載のプラスミドで形質転換を行った後に繋留ポリペプチド又はタンパク質、アドレッシングポリペプチド及び標的化タンパク質又はペプチドと共に１種以上の腫瘍抗原を発現するように酵母を遺伝子組換えした。組換え酵母の選択では、アミノ酸ＵＲＡ又はＴＲＰを含まない選択培地を使用した。まず、グルコース２０ｇ／ｌ、アミノ酸を含まない酵母窒素ベース６．７ｇ／ｌ、ヒスチジン、ロイシン及びトリプトファンの各アミノ酸０．７ｇ／ｌを含む選択培地を使用して酵母を定常期まで３０℃で培養した。その後、酵母を４０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）で洗浄してから、ガラクトース２０ｇ／ｌ、アミノ酸を含まない酵母窒素ベース６．７ｇ／ｌ、ヒスチジン、ロイシン及びトリプトファンの各アミノ酸０．７ｇ／ｌを含む誘導選択培地に再懸濁した。その後、酵母を２０℃で２０時間培養して、ガラクトースにより組換えタンパク質の発現を誘導した。
【００８６】
透過処理では、酵母を０．５％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で１０分間固定し、ＰＢＳで洗浄してから、エタノール５０％と水５０％との混合液（ｖ／ｖ）で１５分間処理し、再びＰＢＳで洗浄した。
【００８７】
図１に、ｃ-ｍｙｃタグと融合したＯＶＡ１抗原をコードする核酸配列と、繋留・アドレッシングポリペプチドＡｇａ２ｐをコードする核酸配列（配列番号１０）とを含む第一ベクターにより形質転換された遺伝子組換え酵母の例を示す。Ａｇａ２ｐは、第一ベクターと共に同時形質転換した第二ベクターを用いて産生され、且つ酵母の細胞壁に繋留されたタンパク質Ａｇａ１ｐ（配列番号９）にジスルフィド架橋を介して結合していた。
【００８８】
図２には、ｃ-ｍｙｃタグと融合したＯＶＡ１抗原と、繋留タンパク質Ｓｅｄ１ｐ（配列番号１１）とを含む単一ベクターにより形質転換された遺伝子組換え酵母の例を示す。
【００８９】
図３には、標的化ポリペプチドＳｃＦｖ  ＤＥＣ２０５と融合したＯＶＡ１抗原をコードする核酸配列と、ｃ-ｍｙｃタグをコードする核酸配列と、繋留・アドレッシングポリペプチドＡｇａ２ｐをコードする核酸配列とを含む第一ベクターにより遺伝子組換えされた酵母の例を示す。Ａｇａ２ｐは、第一ベクターと共に酵母に同時形質転換した第二ベクターを用いて産生され、且つ酵母の細胞壁に繋留されたタンパク質Ａｇａ１ｐにジスルフィド架橋を介して結合していた。
【００９０】
図４には、酵母フェロモンに由来する「プレプロα因子リーダーペプチド」Ｍｆ（α）１ｐであるＮ末端アドレッシングポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号１２）と、標的化ポリペプチドＳｃＦｖ  ＤＥＣ２０５をコードする核酸配列（配列番号１３）と、ｃ-ｍｙｃタグと融合したＯＶＡ１抗原をコードする核酸配列と、繋留タンパク質Ｓｅｄ１ｐをコードする核酸配列とを含む単一ベクターにより形質転換された遺伝子組換え酵母の例を示す。
【００９１】
交差提示アッセイ中に樹状細胞により抗原が好適にプロセシングされるように、オボアルブミンタンパク質の天然隣接配列を合成により上記ペプチドに付加した：ＭＥＱＬＥＳＩＩＮＦＥＫＬＴＥＷＴＳＡ（配列番号１４）。隣接配列と組み合わせたペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬはＯＶＡ１を表す。繋留ポリペプチド又はタンパク質とＯＶＡ１との間にＧ４Ｓリンカーを配置した。このリンカーは、４つのグリシン及び１つのセリンで構成されたアミノ酸鎖（ＧＧＧＧＳ）である。酵母表面で複合体を検出できるように、タンパク質タグであるｃ-ｍｙｃも付加した。
【００９２】
酵母表面への融合タンパク質のアドレッシングには、Ｎ末端分泌シグナルが必要であった。Ａｇａ２ｐを含む融合タンパク質の場合、このたんぱく質は必要な分泌シグナルを既に含んでいた。Ｓｅｄ１ｐをＣ末端に含む融合タンパク質の場合、酵母フェロモンに由来する「プレプロα因子リーダーペプチド」Ｍｆ（α）１ｐ核酸配列（配列番号１２）によりコードされたアドレッシングポリペプチドを使用して、融合タンパク質のＮ末端に追加の分泌シグナルを付加した。標的化ポリペプチドＳｃＦｖ抗ＤＥＣ２０５は、上述したＧｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ法を用いてインサートに付加して（図３及び４）（配列番号１３）、表面に発現されるＯＶＡ１抗原と融合させることができる。
【００９３】
実施例３：酵母表面でのペプチド発現のモニタリング（図７）
遺伝子組換え酵母の表面に発現されるＯＶＡ１ペプチドの発現は、細胞質基質に同抗原を有する酵母を陰性対照として使用して分光フローサイトメトリーにより確認した。実施例２に記載したガラクトースでの誘導後に、１ｍｌ当たり１×１０７細胞の濃度の酵母を２％ＰＦＡ溶液に懸濁した。その後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで洗浄した。洗浄後、１：１００の割合で抗ｃ-ｍｙｃ一次抗体（Ｍｙｃ．Ａ７、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）と共に室温で１時間培養した。１％ＢＳＡを含むＰＢＳで３回洗浄後、１：５０の割合で抗ＩｇＧ１二次抗体（Ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ１、ＰＥ−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）と共に室温で１時間インキュベートした。洗浄後、ＰＥ−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ優先チャネルにおいて分光フローサイトメトリーを実施した。
【００９４】
結果を図７に示す。この図は、図２に記載した例に従って構築した酵母の表面にＯＶＡ１ペプチドが発現されていることを示す。抗ｃ-ｍｙｃ抗体によって、表面にＯＶＡ１抗原を発現している酵母を検出できる。酵母が細胞質基質に抗原を発現している場合、フローサイトメトリーでは検出されない。図２のコンストラクトの場合、５０％の酵母が表面にＯＶＡ１を発現する。
【００９５】
結論：
分光フローサイトメトリーから、まず、酵母の細胞壁にＯＶＡ１抗原が有効に繋留されていることが明らかとなった。また、試験した実験条件下、融合タンパク質の標識抗体は酵母内に侵入できなかったが、これにより、酵母の外部に対してＯＶＡ１抗原が提示されたことが明らかとなった。
【００９６】
実施例４：野生型酵母の存在下、遊離したＯＶＡ１抗原が樹状細胞により提示されることによる細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔリンパ球の活性化の測定
この実施例では、ＯＶＡ１抗原がＣＤ８＋Ｔリンパ球を活性化できることを、酵母によるその発現とは独立して示す。抗原は、樹状細胞を介してＣＤ８＋Ｔリンパ球に交差提示された。細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔリンパ球の活性化は、β−ガラクトシダーゼ及びその基質の１つであるＣＰＲＧ（クロロフェノールレッド−β−ガラクトピラノシド）を使用して比色試験によって測定した。
【００９７】
上記試験には、樹状細胞源、ＣＤ８＋Ｔリンパ球源、及び表面に抗原を発現するように改変された未透過処理酵母が必要である。樹状細胞として、ＭｕｔｕＤＣ株に由来するマウス樹状細胞（ローザンヌ大学より入手）を使用した。この細胞株は、抗原を交差提示でき、且つキラーリンパ球（ＫＬ）を活性化できる能力を保持する不死化した脾臓ＣＤ８α樹状細胞に由来する。１０％ＦＣＳ、ＨＥＰＥＳ、５０μＭ  ２−メルカプトエタノール、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、及び５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地を使用して、ＭｕｔｕＤＣ株の細胞を３７℃、５％ＣＯ２で培養した。
【００９８】
使用したＴリンパ球は、Ｂ３Ｚハイブリドーマに由来する。ペプチドＯＶＡ２５７−２６４（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）に対して特異的な細胞株であるＢ３Ｚハイブリドーマは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｃｕｒｉｅ（パリ第５大学）より提供された。該細胞は、ＩＬ−２（インターロイキン２）プロモーターの制御下でβ−ガラクトシダーゼを産生する特徴を有する。１０％ＦＣＳ、Ｇｌｕｔａｍａｘ、ＨＥＰＥＳ、５０μＭ  ２−メルカプトエタノール、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、及び５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地を使用して、Ｂ３Ｚ細胞を３７℃、５％ＣＯ２で培養した。
【００９９】
野生型酵母の存在下、ＯＶＡ２５７−２６４（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）ペプチドを樹状細胞と５時間混合した。丸底９６ウェルプレートに１ウェル当たり５００００細胞の量で樹状細胞を配置した。次に、１ウェル当たり１０００００細胞の量でＢ３Ｚ株のリンパ球を３７℃、５％ＣＯ２で１８時間添加した。その後、プレートを洗浄し、ＰＢＳ、９ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１２５％ＮＰ４０、及び０．１５ｍＭクロロフェノールレッド−β−ガラクトピラノシドを含む溶解バッファー１２０μｌを添加して、Ｔリンパ球により産生されたβ−ガラクトシダーゼの活性を測定した。赤色に変化した後、ＣｌａｒｉｏＳｔａｒプレートリーダーを使用して５８０ｎｍの赤色蛍光を読み取った。図８には、樹状細胞により交差提示されると、ＯＶＡ２５７−２６４（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）抗原がＣＤ８＋Ｔリンパ球の活性化を誘導できることを示す。
【０１００】
陽性対照としてＯＶＡ２５７−２６４（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）ペプチドの投与量を増やして、アッセイを行った。
【０１０１】
結論：
このアッセイから、ＭｕｔｕＤＣ株に由来する樹状細胞を使用すると、アジュバントの存在下、腫瘍抗原の交差提示を行うことができることが明らかとなった。また、このアッセイから、上記樹状細胞の存在下、キラーリンパ球のＢ３Ｚ細胞株が活性化されたことが明らかとなった。Ｂ３Ｚの活性化は、樹状細胞に最初に供給された抗原の量に比例して、β−ガラクトシダーゼの産生により達成された。
【０１０２】
実施例５：透過処理又は未透過処理酵母の細胞壁に発現されるＯＶＡ１抗原が樹状細胞により提示されることによる細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔリンパ球の活性化の測定
実施例４の実験条件を実施例５に適用できる。条件の違いは、細胞壁に抗原を発現するように遺伝子組換えされた酵母を透過処理したもの又はしないものを使用することにある。
【０１０３】
透過処理若しくは未透過処理野生型酵母、又は細胞質基質にＯＶＡ１抗原を有する遺伝子組換え酵母、又は細胞壁にＯＶＡ１抗原を有する遺伝子組換え酵母をＭｕｔｕＤＣ株の細胞と共に６０：１（ＭＯＩ６０、感染多重度）の割合で５時間培養した。その後、Ｂ３Ｚ株のリンパ球を添加した。酵母を０．５％ＰＦＡにより１０分間処理し、ＰＢＳで洗浄してから、エタノール（エタノール５０％、ＰＢＳ５０％）で１５分間処理し、再びＰＢＳで洗浄することで、上述したように透過処理を行った後、ＭｕｔｕＤＣと共培養した。表面に抗原を発現する透過処理酵母では、相乗作用が現れ（図９）、リンパ球の活性化が著しく向上した。図９に示されるように、細胞壁に抗原を有する遺伝子組換え酵母は、細胞質基質に抗原を有する酵母に比べてＣＤ８＋Ｔリンパ球の強い活性化を誘導する。また、透過処理は、細胞質基質にＯＶＡ１抗原を産生する酵母に対しては何の影響も及ぼさなかった。一方、細胞壁にＯＶＡ１抗原を発現する透過処理酵母は、未透過処理酵母と比較してＣＤ８＋Ｔリンパ球の活性化を著しく向上させる。未透過処理酵母と比較した透過処理酵母による活性化の増加率は３３％〜２５５％である。
【０１０４】
結論：
この交差提示アッセイから、遺伝子組換え及び透過処理された酵母は、細胞壁にＯＶＡ抗原を発現する場合、同じく細胞壁にＯＶＡ抗原を発現する未透過処理酵母と比較して、キラーリンパ球を非常に著しく活性化することが明らかとなった。
【０１０５】
実施例６：マウスにおけるメラノーマ腫瘍の増殖及び生存率の測定
ｓｃＦｖ抗ＤＥＣ２０５抗体フラグメントと連結させたＯＶＡ１抗原を細胞壁に有する透過処理酵母を与えたマウスにおいてメラノーマの増殖を測定した。
【０１０６】
ポーランド科学アカデミーの生命倫理委員会に従って６〜８週齢の雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスを維持及び処理した。
【０１０７】
ＲＰＭＩ＋Ｇｌｕｔａｍａｘ＋１０％ＦＣＳ＋５０μＭ  ２−メルカプトエタノール＋Ｓｔｒｅｐ／Ｐｅｎ＋２ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８＋６０μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢを用いてメラノーマ細胞株ＭＯ５（Ｂ１６−ＯＶＡ、パリ第５大学、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｃｕｒｉｅ、Ｏ．Ｌａｎｔｚ教授より入手）を３７℃、５％ＣＯ２で培養した。ＭＯ５株は、オボアルブミン（ＯＶＡ）を遺伝子導入したＢ１６メラノーマ株である。
【０１０８】
マウスを腫瘍負荷の７日前に腹腔内免疫した後、腫瘍負荷の３日前及び腫瘍負荷の３日後に皮下免疫した。各注射時の単回投与量は、ＰＢＳ１００μｌ中１ＹＵである。腫瘍負荷中、マウスには、１×１０５のＭＯ５をＰＢＳ１００μｌで皮下投与した。コントロールは、野生型酵母（ＷＴ）で免疫したマウスである。１実験群当たり５匹のマウスを使用した。腫瘍体積は、式（ａ×ａ×ｂ）／２（式中、ａは最短腫瘍軸、ｂは最長腫瘍軸（ミリメートル）である）を用いて評価した。腫瘍が１５００ｍｍ３を超えた瀕死マウスは屠殺した。
【０１０９】
腫瘍負荷の１４日後、ＤＥＣ２０５−ＯＶＡ１−ＳＥＤを発現する透過処理酵母で免疫したマウスの平均腫瘍体積は４３．１ｍｍ３であるのに対して、野生型酵母（ＷＴ）で免疫したマウスでは平均腫瘍体積が１６２．５ｍｍ３であり、すなわち前者は平均で３．７７分の１の腫瘍体積であった（図１０）。エラーバーは、１実験群当たりの平均腫瘍体積の標準偏差を表す。
【０１１０】
腫瘍負荷の２０日後、ＤＥＣ２０５−ＯＶＡ１−ＳＥＤを発現する透過処理酵母で免疫したマウスの８０％は生存したのに対して、野生型酵母（ＷＴ）で免疫したマウスでは２０％であった（図１１）。
【０１１１】
結論：
樹状細胞を標的化するためのポリペプチドであるｓｃＦｖ  ＤＥＣ２０５と融合したＯＶＡ１抗原を有する透過処理酵母を用いてマウスにワクチン接種することによって、野生型酵母を用いてワクチン接種したマウスと比較して、マウスの腫瘍増殖を著しく低下させ、生存率を著しく増加させることができた。
【０１１２】
実施例７：腫瘍抗原ＡＨ１−Ａ５、ＴＲＰ１、ＴＲＰ２又はＯＶＡ１−ＴＲＰ１−ＴＲＰ２を細胞壁に発現する免疫療法用酵母の作製
４重栄養要求性酵母（ＵＲＡ、ＴＲＰ、ＨＩＳ、ＬＥＵ）であるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＩＮＶＳＣ１酵母（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を使用した。酢酸リチウム法により実施例１に記載のプラスミドで形質転換を行った後に繋留ポリペプチド、アドレッシングポリペプチド及び標的化ポリペプチドと共に１種以上の腫瘍抗原（ＡＨ１−Ａ５、ＴＲＰ１、ＴＲＰ２又はＯＶＡ１−ＴＲＰ１−ＴＲＰ２）を発現するように酵母を遺伝子組換えした。
【０１１３】
組換え酵母の選択では、アミノ酸ＵＲＡ又はＴＲＰを含まない選択培地を使用した。まず、グルコース２０ｇ／ｌ、「アミノ酸を含まない酵母窒素ベース」培地６．７ｇ／ｌ、「ウラシル及びトリプトファンを含まない酵母合成ドロップアウト培地」である選択培地１．８５ｇ／ｌを含む選択培地を使用して組換え酵母を定常期まで３０℃で培養した。「ウラシル及びトリプトファンを含まない酵母合成ドロップアウト培地」は、以下で構成される培地である。
・アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、ミオイノシトール、イソロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、チロシン、バリンの各アミノ酸７６ｍｇ
・ロイシン３８０ｍｇ
・アデニン１８ｍｇ
・パラアミノ安息香酸８ｍｇ
【０１１４】
その後、組換え酵母を４０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）で洗浄してから、ガラクトース２０ｇ／ｌ、「アミノ酸を含まない酵母窒素ベース」培地６．７ｇ／ｌ、並びに「ウラシル及びトリプトファンを含まない酵母合成ドロップアウト培地」である選択培地１．８５ｇ／ｌに再懸濁した。酵母を３０℃で４８時間培養して、ガラクトースにより組換えタンパク質の発現を誘導した。
【０１１５】
その後、組換え酵母を４０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）で洗浄してから、以下の方法で処理した。
ａ）エタノール５０％と水５０％との混合液（ｖ／ｖ）に２５分間再懸濁し、さらにＰＢＳで洗浄する（エタノールでの透過処理）；
ｂ）イソプロパノール５０％と水５０％との混合液（ｖ／ｖ）に２５分間再懸濁し、さらにＰＢＳで洗浄する（イソプロパノールでの透過処理）；
ｃ）２％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）溶液に１０分間再懸濁し、ＰＢＳで洗浄してから、エタノール５０％と水５０％との混合液（ｖ／ｖ）に２５分間再懸濁し、さらにＰＢＳで洗浄する（ＰＦＡでの固定後にエタノールでの透過処理）；
ｄ）２％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）溶液に１０分間再懸濁し、ＰＢＳで洗浄してから、イソプロパノール５０％と水５０％との混合液（ｖ／ｖ）に２５分間再懸濁し、さらにＰＢＳで洗浄する（ＰＦＡでの固定後にイソプロパノールでの透過処理）；又は
ｅ）エタノール５０％と水５０％との混合液（ｖ／ｖ）に２５分間再懸濁し、さらにＰＢＳで洗浄してから、２％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）溶液に１０分間再懸濁し、さらにＰＢＳで洗浄する（エタノールでの透過処理後にＰＦＡでの固定）。
【０１１６】
各コンストラクトにおいて使用した腫瘍抗原は以下である。
・ＡＨ１Ａ５（ＧＰ７０  ４２３−４３１の改変）：非変異抗原ＡＨ−１（ＳＰＳＹＶＹＨＱＦ、配列番号２０）は、マウス結腸直腸癌細胞株ＣＴ２６に対してＣＤ８＋応答を誘発するｇｐ７０  ４２３−４３１に由来する免疫優性Ｈ−２Ｌｄ抗原である（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ａｎｔｉｇｅｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｗｉｔｈ  Ａｌｔｅｒｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｈａｔ  Ｓｔａｂｉｌｉｚｅ  ｔｈｅ  ＭＨＣ−Ｐｅｐｔｉｄｅ−ＴＣＲ  Ｃｏｍｐｌｅｘ，Ｓｌａｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ｖｏｌ  １３，５２９−５３８，Ｏｃｔｏｂｅｒ，２０００）。ｇｐ７０は、マウスの大部分の正常な組織には無症状である。ＣＤ８＋の誘導に関わらず、天然ＡＨ−１抗原は、ＴＣＲに対するそのエピトープの親和性が低いため、ＣＴ２６腫瘍に対して免疫を行うことができない。したがって、ＴＣＲに対する親和性を高め、且つＭＨＣＩ経路でマウスを免疫することができるＡＨ−１のクリプティックペプチド（ＧＰ７０  ４２３−４３１の改変）が使用される。本実施例で使用した腫瘍抗原は、配列ＳＰＳＹＡＹＨＱＦ（配列番号１５）のクリプティックペプチド（ＡＨ１Ａ５）である。
・ＴＲＰ２（１８０−１８８）：チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ２）は、メラノーマの進行に役割を果たすメラニン形成細胞の色素沈着に関与するタンパク質である。本実施例で使用した腫瘍抗原は、配列ＳＶＹＤＦＦＶＷＬ（配列番号１７）のクリプティックペプチド（ＴＲＰ２）である。
・ＴＲＰ１（４５５−４６３）：チロシナーゼ関連タンパク質１（ＴＲＰ１）は、糖タンパク質ｇｐ７５（Ｔｙｒｐ１／ｇｐ７５）としても知られており、メラノーマの進行に役割を果たすメラニン形成細胞の色素沈着に関与するタンパク質である。本実施例で使用した腫瘍抗原は、配列ＴＡＰＤＮＬＧＹＭ（配列番号１６）のクリプティックペプチド（ＴＲＰ１）である。
【０１１７】
繋留ポリペプチドと腫瘍抗原との間にＧ４Ｓリンカーを配置した。このリンカーは、連続した４つのグリシン及び１つのセリンで構成されたアミノ酸鎖である。また、ＯＶＡ１−ＴＲＰ１−ＴＲＰ２抗原を発現する酵母の各抗原の間にＧ４Ｓリンカーを配置した。また、酵母の表面で複合体を検出できるように、繋留ポリペプチドと腫瘍抗原との間にタンパク質タグであるｃ−ｍｙｃを付加した。標的化ポリペプチドＳｃＦｖ抗ＤＥＣ２０５も付加し、さらに、酵母フェロモンに由来する「プレプロα因子リーダーペプチド」Ｍｆ（α）１ｐ核酸配列（配列番号１２）によりコードされたアドレッシングポリペプチドを使用して標的化ポリペプチドＳｃＦｖ抗ＤＥＣ２０５のＮ末端に追加の分泌シグナルペプチドも付加した。
【０１１８】
このようにして、以下の４種類の遺伝子組換え酵母を得た。
１）融合タンパク質［ｓｃＦｖ  ＤＥＣ２０５］−［Ｇ４Ｓ］−［ＡＨ１Ａ５］−［Ｃ−ＭＹＣ］−［Ｇ４Ｓ］−［ＳＥＤ１Ｐ］を細胞壁に発現する酵母（図１２）；
２）融合タンパク質［ｓｃＦｖ  ＤＥＣ２０５］−［Ｇ４Ｓ］−［ＴＲＰ１］−［Ｃ−ＭＹＣ］−［Ｇ４Ｓ］−［ＳＥＤ１Ｐ］を細胞壁に発現する酵母（図１３）；
３）融合タンパク質［ｓｃＦｖ  ＤＥＣ２０５］−［Ｇ４Ｓ］−［ＴＲＰ２］−［Ｃ−ＭＹＣ］−［Ｇ４Ｓ］−［ＳＥＤ１Ｐ］を細胞壁に発現する酵母（図１４）；
４）融合タンパク質［ｓｃＦｖ  ＤＥＣ２０５］−［Ｇ４Ｓ］−［ＴＲＰ２］−［Ｇ４Ｓ］−［ＯＶＡ１］−［Ｇ４Ｓ］−［ＴＲＰ１］−［Ｃ−ＭＹＣ］−［Ｇ４Ｓ］−［ＳＥＤ１Ｐ］を細胞壁に発現する酵母（図１５）。
【０１１９】
実施例８：酵母表面での融合タンパク質発現のモニタリング
腫瘍抗原ＡＨ１Ａ５、ＴＲＰ１、ＴＲＰ２又はＯＶＡ１−ＴＲＰ１−ＴＲＰ２を発現する実施例７で得られた４種類の遺伝子組換え酵母をサイトメトリーによってアッセイして、実際に各腫瘍抗原を細胞壁に発現していることを確認した。
【０１２０】
ガラクトースで酵母の誘導を行った後、１ｍｌ当たり１×１０７細胞の濃度の酵母を２％ＰＦＡ溶液に１０分間懸濁した。その後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで酵母を洗浄した。洗浄後、１：１００の割合で抗ｃ−ｍｙｃ一次抗体（マウス一次ＩｇＧ２ａ抗体、ＭＡ１−１６６３７、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製）と共に室温で１時間培養した。１％ＢＳＡを含むＰＢＳで３回洗浄後、１：５０の割合で酵母を抗ＩｇＧ２ａ二次抗体（マウス二次ＩｇＧ２ａ抗体、３１８６３、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製）と共に室温で１時間インキュベートし、ＰＥ優先チャネルにおいて分光フローサイトメトリーを実施した。
【０１２１】
抗ｃ-ｍｙｃ抗体を用いることで、細胞壁に各融合タンパク質を発現している酵母を分光フローサイトメトリーにより検出できる。試験した実験条件下、融合タンパク質の標識抗体は酵母内に侵入できなかったが、これにより、抗原が酵母のペリプラズムではなく、酵母の外部環境に向かって配向していることを明らかにできた。
【０１２２】
４種類の遺伝子組換え酵母の結果を以下のように図１６に示す。
・図１６Ａ：３４％の酵母が、融合タンパク質［ｓｃＦｖ  ＤＥＣ２０５］−［Ｇ４Ｓ］−［ＡＨ１Ａ５］−［Ｃ−ＭＹＣ］−［Ｇ４Ｓ］−［ＳＥＤ１Ｐ］を細胞壁に発現する；
・図１６Ｂ：１５％の酵母が、融合タンパク質［ｓｃＦｖ  ＤＥＣ２０５］−［Ｇ４Ｓ］−［ＴＲＰ２］−［Ｇ４Ｓ］−［ＯＶＡ１］−［Ｇ４Ｓ］−［ＴＲＰ１］−［Ｃ−ＭＹＣ］−［Ｇ４Ｓ］−［ＳＥＤ１Ｐ］を細胞壁に発現する；
・図１６Ｃ：９％の酵母が、融合タンパク質［ｓｃＦｖ  ＤＥＣ２０５］−［Ｇ４Ｓ］−［ＴＲＰ２］−［Ｃ−ＭＹＣ］−［Ｇ４Ｓ］−［ＳＥＤ１Ｐ］を細胞壁に発現する；
・図１６Ｄ：１３％の酵母が、融合タンパク質［ｓｃＦｖ  ＤＥＣ２０５］−［Ｇ４Ｓ］−［ＴＲＰ１］−［Ｃ−ＭＹＣ］−［Ｇ４Ｓ］−［ＳＥＤ１Ｐ］を細胞壁に発現する。
【０１２３】
上記図には、実施例７で得られた酵母の細胞壁に腫瘍抗原ＡＨ１Ａ５、ＴＲＰ１、ＴＲＰ２及びＯＶＡ１−ＴＲＰ１−ＴＲＰ２が発現されていることが示される。
【０１２４】
結論：
分光フローサイトメトリーから、酵母の細胞壁に１つの腫瘍抗原を有する融合タンパク質が効果的に繋留されていることと、酵母の細胞壁に複数の腫瘍抗原を有する融合タンパク質が効果的に繋留されていることとが明らかとなった。
【０１２５】
実施例９：透過処理酵母の特性決定アッセイ
透過処理酵母の特性決定アッセイでは、酵母の細胞質基質にもともと存在する酵素であるアルカリホスファターゼを使用する。その基質であるｐ−ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）は、酵素活性に比例して、加水分解後に４０５ｎｍの吸光度で読み取ることができる黄色を呈する（Ａ  ｒａｐｉｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｗｈｏｌｅ  ｙｅａｓｔ  ｃｅｌｌｓ，Ｇａｌａｂｏｖａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊｕｎｅ  ２００８，Ｌｅｔｔｅｒｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １６（３）：１６１−１６３）。酵母が透過処理されていると、ｐＮＰＰ基質は酵母内に侵入し、アルカリホスファターゼにより加水分解され、４０５ｎｍで吸光度シグナルを生成する。透過処理されていない酵母は、ｐＮＰＰに対して透過性がない。
【０１２６】
三角フラスコ中、酵母完全培地を使用して、２５０ｒｐｍで撹拌しながら野生型Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母を３０℃で飽和するまで培養した。３０００ｇで５分間遠心分離して酵母を回収した後、ＰＢＳで１回洗浄し、６００ｎｍの光学濃度ＯＤ＝１でＰＢＳに再懸濁した。その後、異なる酵母サンプルに以下の処理を施した。
・ｌｉｖｉｎｇ：未処理；
・ＰＦＡ：２％ＰＦＡ溶液で１０分間固定する（ＰＦＡ）；
・ＰＦＡ＋ｅｔｈａｎｏｌ：２％ＰＦＡ溶液で１０分間固定し、ＰＢＳで洗浄してから、５０％エタノール溶液（ｖ／ｖ）で２５分間透過処理する；
・ｅｔｈａｎｏｌ＋ＰＦＡ：５０％エタノール溶液（ｖ／ｖ）で２５分間透過処理し、ＰＢＳで洗浄してから、２％ＰＦＡ溶液で１０分間固定する；
・ＰＦＡ＋ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ：２％ＰＦＡ溶液で１０分間固定し、ＰＢＳで洗浄してから、５０％イソプロパノール溶液（ｖ／ｖ）で２５分間透過処理する；
・ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ：５０％イソプロパノール溶液（ｖ／ｖ）で２５分間透過処理する；
・ｅｔｈａｎｏｌ：５０％エタノール溶液（ｖ／ｖ）で２５分間透過処理する；又は
・ＵＶ：ＵＶ架橋を実施できるＨＬ−２０００ＨｙｂｒｉＬｉｎｋｅｒにおいて９９９Ｊ／ｃｍ２で２回照射し、この２回の照射間に均質化を行う。
【０１２７】
上述した通り処理した異なる酵母サンプルの溶液１００μｌを採取し、ｐ−ニトロフェニルリン酸溶液（Ｐ７９９８  ＳＩＧＭＡ−Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｙｅｌｌｏｗ（ｐＮＰＰ）Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＥＬＩＳＡ）１５０μｌと混合した。混合物を室温で３０分間インキュベートした。３０分後に３Ｍ  ＮａＯＨ３５μｌで反応を停止させた。酵母を４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清１００μｌを取り除いて、その４０５ｎｍの吸光度を読み取った。使用したブランクはｐＮＰＰ単独である。
【０１２８】
結果を図１７及び１８に示す。
【０１２９】
結論：
上記アッセイから、ＰＦＡで固定してもしなくても、イソプロパノール又はエタノールで処理することによって、酵母を透過処理できることが確認された。また、上記アッセイから、ＵＶ照射又はＰＦＡでの固定では、酵母を透過処理できないことが明らかとなった。
【０１３０】
実施例１０：細胞壁にＯＶＡ１抗原を有する酵母に異なる透過処理を施した場合の細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔリンパ球の活性化の測定
細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔリンパ球の活性化は、実施例４に記載したように、β−ガラクトシダーゼ及びその基質の１つであるＣＰＲＧ（クロロフェノールレッド−β−ガラクトピラノシド）を使用して比色試験によって測定した。
【０１３１】
材料：樹状細胞、ＣＤ８＋Ｔリンパ球、及び細胞壁に抗原を発現する未透過処理遺伝子組換え酵母。
【０１３２】
樹状細胞として、ＭｕｔｕＤＣ株に由来するマウス樹状細胞（ローザンヌ大学より入手）を使用した。この細胞株は、抗原を交差提示でき且つキラーリンパ球（ＫＬ）を活性化できる能力を保持する不死化した脾臓ＣＤ８α樹状細胞に由来する。１０％ＦＣＳ、ＨＥＰＥＳ、５０μＭ２−メルカプトエタノール、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、及び５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地を使用して、ＭｕｔｕＤＣ株の細胞を３７℃、５％ＣＯ２で培養した。
【０１３３】
使用したＣＤ８＋Ｔリンパ球は、Ｂ３Ｚハイブリドーマに由来するものであった。ペプチドＯＶＡ２５７−２６４（ＳＩＩＮＦＥＫＬ、配列番号２１）に対して特異的な細胞株であるＢ３Ｚハイブリドーマは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｃｕｒｉｅ（パリ第５大学）より提供された。該細胞は、ＩＬ−２（インターロイキン２）プロモーターの制御下でβ−ガラクトシダーゼを産生する特徴を有する。１０％ＦＣＳ、Ｇｌｕｔａｍａｘ、ＨＥＰＥＳ、５０μＭ  ２−メルカプトエタノール、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、及び５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地を使用して、Ｂ３Ｚ細胞を３７℃、５％ＣＯ２で培養した。丸底９６ウェルプレートに１ウェル当たり１０００００細胞の量で樹状細胞を配置した。
【０１３４】
未透過処理遺伝子組換え酵母は、ｓｃＦｖ  ＤＥＣ２０５と融合したＯＶＡ１抗原（ｓｃＦｖ  ＤＥＣ２０５−ＯＶＡ１−ＳＥＤ）を細胞壁に発現するものであるが、実施例２に従って作製した（図４）。この酵母に以下の処理を施した。
・ｌｉｖｉｎｇ：未処理；
・ＰＦＡ：２％ＰＦＡ溶液で１０分間固定する（ＰＦＡ）；
・ＰＦＡ＋ｅｔｈａｎｏｌ：２％ＰＦＡ溶液で１０分間固定し、ＰＢＳで洗浄してから、５０％エタノール溶液（ｖ／ｖ）で２５分間透過処理する；
・ｅｔｈａｎｏｌ＋ＰＦＡ：５０％エタノール溶液（ｖ／ｖ）で２５分間透過処理し、ＰＢＳで洗浄してから、２％ＰＦＡ溶液で１０分間固定する；
・ＰＦＡ＋ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ：２％ＰＦＡ溶液で１０分間固定し、ＰＢＳで洗浄してから、５０％イソプロパノール溶液（ｖ／ｖ）で２５分間透過処理する；
・ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ：５０％イソプロパノール溶液（ｖ／ｖ）で２５分間透過処理する；
・ｅｔｈａｎｏｌ：５０％エタノール溶液（ｖ／ｖ）で２５分間透過処理する；又は
・ＵＶ：ＵＶ架橋を実施できるＨＬ−２０００ＨｙｂｒｉＬｉｎｋｅｒにおいて９９９Ｊ／ｃｍ２で２回照射し、この２回の照射間に均質化を行う。
その後、３０：１（ＭＯＩ３０、感染多重度）の割合でＭｕｔｕＤＣ株の細胞と共に５時間培養した。
【０１３５】
次に、１ウェル当たり１０００００個の量でＢ３Ｚ株のリンパ球を３７℃、５％ＣＯ２で１８時間添加した。その後、プレートを洗浄し、溶解バッファー（ＰＢＳ、９ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１２５％ＮＰ４０、及び０．１５ｍＭクロロフェノールレッド−β−ガラクトピラノシドを含む）１２０μｌを添加して、ＣＤ８＋Ｔリンパ球により産生されたβ−ガラクトシダーゼの活性を測定した。赤色に変化した後、ＣｌａｒｉｏＳｔａｒプレートリーダーを使用して５７５ｎｍの赤色吸光度を読み取った。
【０１３６】
結果を図１９に示す。
【０１３７】
結論：
この交差提示試験によって、透過処理酵母（不活化したもの又はしていないもの）がキラーリンパ球を著しく活性化できることが示された。透過処理酵母で得られた活性化は、未透過処理酵母（ＰＦＡ又はＵＶ）で得られた活性化よりもはるかに大きいものであった。特に、何の処理も施さなかった酵母（ｌｉｖｉｎｇ）と同様に、ＵＶ処理した酵母がキラーリンパ球を活性化できなかったことに注目すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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