(57)【要約】本発明は、亜硫酸塩を除去するための酵素法に関する。詳細には本発明は、組成物中に存在する亜硫酸塩をチオ硫酸塩に変換するための方法であって、３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素（３−ＭＳＴ）と、前記３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素の基質と、を前記組成物中に導入することを含む、方法に関する。本発明は、特に医薬、化粧料、食品及び化学の分野、並びに亜硫酸塩の使用を含む任意の分野において用いられ得る。
2020503876.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組成物を処置するための方法であって、亜硫酸塩を変換するために、３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素（３−ＭＳＴ）と、前記３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素の基質と、を前記組成物中に導入することを含む、方法。
【請求項２】
組成物中に存在する亜硫酸塩をチオ硫酸塩に変換するための方法であって、３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素（３−ＭＳＴ）と、前記３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素の基質と、を前記組成物中に導入することを含む、方法。
【請求項３】
前記３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素が、組換え体である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素が、ペプチド配列中に以下の３つの配列：
ＲＸａＷＷＭ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３）
ＣＧＳＧＶＴＡＸｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４）
ＧＨＩＸｃＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５）
（ここで、Ｘａは、Ａ、Ｖ又はＬであり、Ｘｂは、Ａ又はＣであり、Ｘｃは、Ｐ又はＥである）を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素が、大腸菌由来である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素が、配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２、５、６及び７を含む群から選択されるペプチド配列のタンパク質である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記組成物が、農業食品組成物、医薬組成物、化粧料組成物又は獣医学的組成物である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素の前記基質が、３−メルカプトピルビン酸塩を含む群から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記組成物中に存在する亜硫酸塩に対する前記基質の化学量論比が、最大で１：１である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、亜硫酸塩を除去するための酵素法に関する。詳細には本発明は、組成物中に存在する亜硫酸塩をチオ硫酸塩に変換するための方法であって、３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素（３−ＭＳＴ）と、前記３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素の基質と、を前記組成物中に導入することを含む、方法に関する。
【０００２】
本発明は、特に医薬、化粧料、農業食品及び化学の分野、並びに亜硫酸塩の使用を含む任意の分野において、適用を有する。
【０００３】
以下の記述において、角括弧（［］）の中の参照は、本文書の末尾に表された参考資料のリストを指す。
【背景技術】
【０００４】
亜硫酸塩は、安価であり、非常に広範囲の作用及び／又は効果を有するため、工業界において広く使用される化合物である。詳細には亜硫酸塩は、抗酸化剤、防腐剤及び／又は抗オキシダーゼ特性のために用いられる。
【０００５】
様々な技術分野、特に農業食品分野における使用のために、亜硫酸塩の効果及びヒトによるその忍容性が、ますます研究されている。特に、亜硫酸塩の過剰消費は、健康に有害な影響を導き得ること、及び不耐性又は毒性の影響を誘導し得ることが、実証されている。
【０００６】
食品添加物としての亜硫酸塩の評価が、２００８年にＷＨＯにより実施されており、食品における前記亜硫酸塩の使用方法、及び亜硫酸塩が添加され得る前記食品の消費方法が異なるため、食事全体の亜硫酸塩暴露が国により異なることが示された。亜硫酸塩は、特にアルコール性飲料、特にワイン、及び非アルコール性飲料に存在するが、豚肉製品、特にソーセージ、ドライフルーツ、ナッツ及び加工ポテトの中にも存在することが示されている。
【０００７】
許容できる１日摂取量が決定され、０〜０．７ｍｇ／ｋｇ体重（世界保健機関）とされる。
【０００８】
食物及び薬物などの日常生活の製品における亜硫酸塩の存在は、多量の１日量の吸収をもたらし、重篤性の低い結果としての頭痛、アレルギー及び喘息などの健康問題から、最も重篤な例では心臓血管問題及び癌、例えば脳腫瘍及び／又は肝臓腫瘍のリスク上昇を誘発する可能性がある（Ｓｈｉｈ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７７，  Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ［１］；  Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｏｃｃｕｐａｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｈｅａｌｔｈ［２］；
Ｏｚｓｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４，  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｈｅａｌｔｈ［３］）。加えて、亜硫酸塩は、１０種の重大な食物アレルゲンのうちの１種として列挙された（カナダ政府、公衆衛生庁（Ｈｅａｌｔｈ  Ａｇｅｎｃｙ））。
【０００９】
農業食品中の亜硫酸塩の存在は、およそ１００万人のフランス人が現在、過度に高い摂取量を有するため、今日の公衆衛生問題と見なされ得る（２０１２年９月にＩｎｓｅｅ［フランス国立統計経済研究所］及びＡｎｓｅｓ［フランス食品環境労働衛生安全庁］によ
り実施された研究）。ＦｒａｎｃｅＡｇｒｉＭｅｒにより資金調達され、ＩＦＶ（フランス・ぶどう・ワイン研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｆｒａｎｃａｉｓ  ｄｅ  ｌａ  ｖｉｇｎｅ  ｅｔ  ｄｕ  Ｖｉｎ））及びＩＮＲＡ（フランス国立農学研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｄｅ  ｌａ  Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ  Ａｇｒｏｎｏｍｉｑｕｅ））などの複数の技術パートナーとのグループにより共同研究されたフランス国家プログラム（２００９年以降）の関連において、特にワインにおいて、亜硫酸塩の最終量を減少させる目的で、長年にわたり調査研究が実施されてきた。
【００１０】
したがって、亜硫酸の量／存在を減少させて、先行技術のこれらの欠陥、短所及び障害を克服するための手段、特に分野、特に食品、医薬などの分野にかかわらず組成物中の亜硫酸塩含量の制御を可能にする方法を見出すことが、現実に求められている。
【００１１】
先行技術には、組成物中の亜硫酸塩含量を減少させる試みで、使用／試験される方法／装置、テストされる工程が存在する。
【００１２】
例えば、ワイン製造分野において、模索された１つのアプローチは、ワイン作製工程において亜硫酸の使用を減少させる目的で生産の様々な経路／方法をテストすることであり、その中期的目的は、亜硫酸の最終濃度を５０〜１００ｍｇ／Ｌの間まで低下させることである（ＩＦＶにより開発）。別のアプローチは、亜硫酸塩を１種又は複数の化合物（複数可）、例えばアスコルビン酸、リゾチーム又はソルビン酸などの短鎖脂肪酸で置換える試みである。しかしこれらの様々な化合物は、亜硫酸塩の技術的効果の全てを再現／獲得することができない。したがってそれらは、効果的置換え、特に同一の置換えを可能にしない。加えてそれらは、組成物の特性、そして特に組成物の、特にワインの、感覚受容特性の改変及び有害変化を誘発する場合がある、又は誘発する（ＩＦＶ及びＩＮＲＡ）。
【００１３】
模索された別のアプローチは、組成物からの、特に製造後の最終生成物からの亜硫酸塩の回収／除去である。例えば１つの方策は、クロマトグラフィー法を用いて、工程の終了時にワイン中に存在する亜硫酸塩への結合と、それによる亜硫酸塩の除去を可能にすることからなる（ＷＯ２０１５／０５１１８７［４］）。この技術により、遊離亜硫酸塩のみの除去が可能になり、他の必須成分の除去をもたらすことができる。
【００１４】
別の方策は、亜硫酸塩を硫酸塩に変換する酵素、例えば亜硫酸オキシダーゼを用いることからなる（ＷＯ２０１５／０５１１８７［４］）。しかしこの反応は可逆性があり、平衡がシフトする可能性があり、したがってこの方法は、硫酸塩から亜硫酸塩を生成する可能性がある。加えて、亜硫酸塩オキシダーゼの安定性は、相対的であり、特にこの酵素は、亜硫酸塩が防腐添加剤として添加される場合のように、低ｐＨで使用するのに十分に安定していない。急速な亜硫酸塩除去活性を有する別の酵素：亜硫酸リダクターゼが、提案された。しかし得られた生成物は、組成物の特性、そして特に感覚受容性を大きく悪化させる硫化水素である（Ｈｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５，  Ｎａｔｕｒｅ［５］）。
【００１５】
例えば該組成物への化合物及び／又は酵素の添加を介する、亜硫酸塩の酸化のための別の方法も、想定された。しかしこれらの方法は、組成物の特性、特に感覚受容性の効率、及び／又は起こり得る悪化のために、限定される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
したがって、特に組成物中に存在する、亜硫酸塩の量／存在を減少させて、先行技術のこれらの欠陥、短所及び障害を克服するための手段、特に該組成物の特性を負に変化させることなく亜硫酸塩を除去／亜硫酸塩の量を減少させるための手段を見出すことが、現実
に求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の目的は、具体的には亜硫酸塩をチオ硫酸塩に非常に効率的に変換する３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素（３−ＭＳＴ）を提供することにより、この要件に適うことである。
【００１８】
特に本発明者らは、驚くべきことに、３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素（３−ＭＳＴ）が亜硫酸塩から別の化合物への変換を可能にすることを実証した。
【００１９】
本発明者らは、特に、組成物を処置するための方法であって、３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素（３−ＭＳＴ）と、前記３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素の少なくとも１種の基質と、を前記組成物中に導入することを含む、方法を提供する。
【００２０】
言い換えれば、本発明者らは、組成物を処置するための方法であって、前記組成物中に存在する亜硫酸塩を変換するために、３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素（３−ＭＳＴ）と、前記３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素の少なくとも１種の基質と、を前記組成物中に導入することを含む、方法を提供する。
【００２１】
本発明の主題はまた、組成物中に存在する亜硫酸塩を変換するための方法であって、３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素（３−ＭＳＴ）と、前記３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素の基質と、を前記組成物中に導入することを含む、方法である。
【００２２】
本発明者らはまた、組成物中に存在する亜硫酸塩をチオ硫酸塩に変換するための方法であって、３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素（３−ＭＳＴ）と、前記３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素の基質と、を前記組成物中に導入することを含む、方法を提供する。
【００２３】
特に本発明者らは、驚くべきことに、３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素（３−ＭＳＴ）が基質の存在下で亜硫酸塩をチオ硫酸塩に変換する反応の触媒を可能にすることを実証した。
【００２４】
本発明者らはまた、驚くべきことに、大腸菌の３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素（３−ＭＳＴ）によるチオ硫酸塩への亜硫酸塩の変換が不可逆性であることを実証した。
【００２５】
本発明者らは、驚くべきことに、３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素（３−ＭＳＴ）によるチオ硫酸塩への亜硫酸塩の変換が不可逆的な化学量論的反応であり、有利には該組成物中に存在する亜硫酸塩の所与の量及び／又は該亜硫酸塩の全ての変換を可能にすることを実証した。図１は、３−メルカプトピルビン酸塩（３−ＭＰ）及び亜硫酸塩の存在下で３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素（３−ＭＳＴ）により触媒された酵素反応のスキームである。
【００２６】
本出願において、用語「組成物の処置」は、存在する亜硫酸をチオ硫酸塩に変換するための、３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素と、前記３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素の基質と、を組成物中に導入することを意味するものとする。
【００２７】
本出願において、表現「３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素と、前記３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素の基質と、を組成物中に導入すること」は、３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素と、前記３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素の基質と、を該組成物中に導入する、当業者に知られる任意の適切な手段を意味するものとする。該導入は
、例えばシリンジタイプの装置を用いた、組成物中への注射により、又は組成物を噴霧することにより、３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素と、前記３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素の基質と、を組成物中に注ぐことにより実行され得る。当業者は、彼らの一般的知識により、処置される組成物に従って３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素の導入を適合させる方法を知っているであろう。
【００２８】
本出願において、３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素は、当業者に知られる任意の適切な形態で導入され得る。例えばそれは、粉末、例えば凍結乾燥、カプセル化若しくは非カプセル化粉末の形態で、溶液中で、例えば生理食塩水中で、又は緩衝溶液中で、導入され得る。
【００２９】
本出願において、３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素の基質は、当業者に知られる任意の適切な形態で導入され得る。例えばそれは、粉末、例えば凍結乾燥、カプセル化若しくは非カプセル化粉末の形態で、溶液中で、例えば生理食塩水中で、又は緩衝溶液中で、導入され得る。本出願において、該３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素は、単離されたタンパク質及び／又は組換えタンパク質であってもよい。それは、例えば動物から、昆虫から、細菌から、真菌から、植物から、好極限性微生物から、そして／又は古細菌から単離された３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素であってもよい。それは、ペプチド配列中に以下の３つの配列：
ＲＸａＷＷＭ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３）
ＣＧＳＧＶＴＡＸｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４）
ＧＨＩＸｃＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５）
（ここで、Ｘａは、Ａ、Ｖ又はＬであり、Ｘｂは、Ａ又はＣであり、Ｘｃは、Ｐ又はＥである）を含む３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素であってもよい。
【００３０】
本発明者らは、実際に、３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素がそれらの各配列内に共通してこれらの配列を含み、該酵素の一過性過硫化物中間体を通して進行することにより、３−メルカプトピルビン酸塩（３−ＭＰ）などのドナー基質から亜硫酸塩への硫黄の移動のための反応を触媒し得ることを実証した（図１）。この反応は、無臭、無色で非毒性の生成物であるピルビン酸塩及びチオ対硫酸塩の形成をもたらす。
【００３１】
本出願において、３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素は、ペプチド配列中に１つ又は複数の突然変異（複数可）を含む組換え酵素であってもよい。それは、例えば疎水性アミノ酸による少なくとも１種の酸性アミノ酸の置換えを含む、３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素であってもよい。該３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素は、疎水性側鎖を含むアミノ酸、例えばアラニン、バリン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン及び／又はトリプトファンによる酸性アミノ酸、例えばアスパラギン酸又はグルタミン酸の置換えを含む、組換え酵素であってもよい。それは、例えばアラニンによる、ペプチド配列の１７位にあるアスパラギン酸の置換を含む、大腸菌３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素であってもよい。それは、例えば添付の配列表の配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２、５、６若しくは７の３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素、並びに／又は配列が配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３、１４及び１５のペプチドを含むタンパク質であってもよい。
【００３２】
本発明者らは、驚くべきことに、アラニンによる、大腸菌３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素の１７位のアスパラギン酸の置換が、酵素生成収率の上昇を可能にすることを実証した。例えば大腸菌細胞における生成の場合、このＤ１７Ａ突然変異体の生成／精製収率は、該酵素の野生型よりも１０倍大きい。
【００３３】
本発明において、３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素は、本発明において用いられ
る３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素をコードするヌクレオチド配列、例えば配列が配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２、５、６又は７のタンパク質を含む群から選択される配列のペプチドである配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３、１４及び１５のペプチドを含むタンパク質から得ることができる。それは、例えば配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１、８、９、１０、１１及び１２を含む群から選択される配列を含む、又はその配列からなる核酸であってもよい。
【００３４】
本発明において、３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素をコードする該ヌクレオチド配列（複数可）は、独立して発現に適した発現ベクター内に含有されてもよい。
【００３５】
本発明において、本発明において用いられる３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素の１つをコードするヌクレオチド配列、例えば配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１、８、９、１０、１１及び１２を含む群から選択されるヌクレオチド配列を含むベクター。該ベクターは、組換えタンパク質を生成するために当業者に知られるベクターの１つであってもよい。それは一般には、特に用いられる細胞宿主の機能として選択される。該ベクターは、例えばカタログの
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｍｅｇａ．ｃｏｍ／ｖｅｃｔｏｒｓ／ｍａｍｍａｌｉａｎ＿ｅｘｐｒｅｓｓ＿ｖｅｃｔｏｒｓ．ｈｔｍ［６］若しくは
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｑｉａｇｅｎ．ｃｏｍ／ｏｖｅｒｖｉｅｗ／ｑｉａｇｅｎｅｓ．ａｓｐｘ？ｇａｗ＝ＰＲＯＴＱＩＡｇｅｎｅｓ０８０７＆ｇｋｗ＝ｍａｍｍａｌｉａｎ＋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ［７］、又はその他に
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｃｂｔ．ｃｏｍ／ｃｈａｐ＿ｅｘｐ＿ｖｅｃｔｏｒｓ．ｐｈｐ？ｔｙｐｅ＝ｐＣｒｕｚＴＭ％２０Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ％２０Ｖｅｃｔｏｒｓ［８］に列挙されたベクターから選択されてもよい。それは、例えば文書ＷＯ８３／００４２６１［９］に記載された発現ベクターであってもよい。
【００３６】
本発明の核酸又は本発明のベクターは、特に３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素の生成のために、用いられ得る。したがって本発明はまた、３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素の１つをコードする核酸配列、又は３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素の１つをコードするベクターを含む縮油細胞に関する。
【００３７】
該宿主細胞又は細胞宿主は、本発明による３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素をコードするヌクレオチド配列を含む上述のベクターからの本発明の３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素の生成に適した任意の宿主であってもよい。
【００３８】
本発明の目的では、用語「宿主細胞」は、原核又は真核細胞を意味するものとする。組換えタンパク質の発現に一般に用いられる宿主細胞としては、特に、大腸菌又はバチルス属の菌種などの細菌の細胞、サッカロマイセス・セレビシエなどの酵母の細胞、アスペルギルス・ニガーなどの真菌の細胞、昆虫細胞、及び細胞株ＨＥＫ２９３、ＰＥＲ−Ｃ６、ＣＨＯなどの哺乳動物細胞（特にヒト細胞）その他が挙げられる。原核及び真核細胞の形質転換は、当業者に周知の技術、例えばリポフェクション、電気穿孔、ヒートショック、又は化学的方法である。当業者は、形質転換される細胞に応じて、選択された宿主細胞の形質転換に必要となる手段を容易に決定することができよう。したがって宿主細胞に発現ベクターを導入するための発現ベクター及び方法は、選択された宿主細胞に従って選択されよう。発現ベクターにより形質転換された宿主細胞は、例えば組換え形態において、対応するタンパク質を生成するであろう。当業者は、該宿主細胞が、例えばウェスタンブロット技術を利用して、タンパク質、例えば組換えタンパク質を生成することを、容易に検証することができる。
【００３９】
したがって本発明はまた、先に定義されたベクターを用いた宿主細胞の形質転換と、前
記形質転換された細胞のインキュベーションと、により３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素を生成するための方法に関する。
【００４０】
この方法において、該宿主細胞は、当業者に公知の任意の適切な細胞であってもよい。それは、例えば先に定義された宿主細胞であってもよい。
【００４１】
本発明によれば、該形質転換は、当業者に公知の任意の方法により実施され得る。原核及び真核細胞の形質転換は、当業者に周知の技術、例えばリポフェクション、電気穿孔、ヒートショック、又は化学的方法である。当業者は、形質転換される細胞に応じて、選択された宿主細胞の形質転換に必要となる手段を容易に決定することができよう。
【００４２】
本発明によれば、該インキュベーションは、当業者に公知の任意の方法により実施され得る。原核及び真核細胞のインキュベーション／培養は、当業者に周知の技術である。当業者は、細胞に応じて、選択された宿主細胞のインキュベーション／培養に求められる必須の手段、培地、時間及び温度条件を容易に決定することができよう。
【００４３】
本発明によれば、該生成方法は、形質転換及び形質転換細胞の培養／インキュベーションの後に、３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素の精製のステップを含んでいてもよい。
【００４４】
生成された前記３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素の精製は、当業者に公知の任意の手段により実施され得る。それは、例えば電気穿孔、分子ふるい、超遠心分離、例えば硫酸アンモニウムを用いた、示差沈殿（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）、限外濾過、膜若しくはゲル濾過、イオン交換、疎水性相互作用による分離、又は例えばＩＭＡＣ式の、アフィニティークロマトグラフィーから選択される技術であってもよい。
【００４５】
本発明において、該組成物中に導入される３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素の量は、１００〜５００ｎＭの間、例えば２５０〜５００ｎＭであってもよい。もちろん当業者は、彼らの一般的知識により、該組成物中に導入される３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素の量を適合させる方法を知っているであろう。
【００４６】
本発明において、本発明による方法は、３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素と、前記３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素の基質と、の導入の後に、該組成物におけるインキュベーションのステップを含んでいてもよい。本発明において、該インキュベーションは、１〜６０分間、例えば１〜５分間の時間で実施されてもよい。
【００４７】
本発明において、該インキュベーションは、３〜３５℃、例えば４〜３０℃の温度で実施されてもよい。
【００４８】
本発明において、該組成物は、当業者に公知の任意の組成物であってもよい。それは、例えば化学組成物、農業食品組成物、医薬組成物、化粧料組成物及び／又は獣医学的組成物であってもよい。
【００４９】
本発明において、該組成物は、当業者に公知の任意の液体形態であってもよい。それは、例えば水性溶液、アルコール性溶液、又は水性・アルコール性溶液であってもよい。
【００５０】
本発明において、該農業食品組成物は、例えば液体であり、当業者に公知であり、亜硫酸塩を含み得る、任意の農業食品組成物であってもよい。それは、例えばアルコール性組成物、例えば白ワイン、赤ワイン、ロゼワイン、シャンパン、ビール及び／又はサイダー
、食物、例えばピクルス、トマトソース、ケチャップ、マスタード、ゼリー、缶詰の果物、果汁、フルーツサラダ、フルーツシロップ、缶詰の野菜、ビネガー、ビネグレットソース、並びにスープであってもよい。それはまた、食物、例えば備蓄物を料理するための組成物であってもよい。
【００５１】
本発明において、該医薬組成物は、亜硫酸塩を含み得る当業者に公知の任意の医薬組成物であってもよい。それは、例えば液体組成物／配合物及び／又は水和可能な乾燥組成物、例えば再水和される粉末の形態の、静脈内投与のための組成物、経口組成物、皮膚への塗布用の生成物、及び／又は当業者に公知の任意の投与のための生成物であってもよい。
【００５２】
本発明において、該獣医学的組成物は、亜硫酸塩を含み得る当業者に公知の任意の獣医学的組成物であってもよい。例えばそれは、例えば当業者に公知の液体及び／又は水和可能な乾燥組成物、例えば再水和される粉末である、任意の獣医学的組成物であってもよい。
【００５３】
本発明において、該化粧料組成物は、亜硫酸塩を含み得る当業者に公知の任意の化粧料組成物であってもよい。それは、例えばシャワーゲル又はセルフタンニング剤であってもよい。
【００５４】
本発明において、用語「３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素の基質」は、当業者に公知の任意の基質を意味するものとする。それは、例えば３−メルカプトピルビン酸塩、又は３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素で過硫化物中間体の形成をもたらす任意の硫黄含有化合物であってもよい。
【００５５】
本発明において、組成物中に導入される基質、例えば３−メルカプトピルビン酸塩の最大量は、該組成物中に存在する亜硫酸塩の量に対応してもよい。本発明において、前記組成物中に存在する亜硫酸塩に対する前記基質の化学量論比は、最大で１：１であってもよい。例えば１．２５ｍｍｏｌの亜硫酸塩を含有する組成物１Ｌの場合、該組成物中に導入される３−メルカプトピルビン酸塩の最大量は、１．２５ｍｍｏｌである。もちろん当業者は、彼らの一般的知識により、該組成物中に導入される３−メルカプトピルビン酸塩の量を適合させる方法を知っているであろう。
【００５６】
本発明において、本発明による方法は、３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素及び／又はその基質を組成物中に導入する前に、該組成物中に存在する亜硫酸塩の濃度及び／又は量を測定する先行のステップを含んでいてもよい。
【００５７】
本発明において、該組成物中に存在する亜硫酸塩の濃度及び／又は量の測定は、当業者に知られる任意の適切な方法により実施されてもよい。それは、例えば市販の方法及び／又は装置、例えばアイルランドのＭｅｇａｚｙｍｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社により販売されるＳＯキット（Ｂｅｕｔｌｅｒ，  Ｈ．  Ｏ．  （１９８８）．  Ｓｕｌｐｈｉｔｅ  Ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ［１０］）、又はＭａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ社により販売されるＱｕａｎｔｏｆｉｘ  Ｓｕｌｆｉｔ（登録商標）ストリップであってもよい。亜硫酸塩の量はまた、前記方法の適用前に、例えばワイン製造業界で現在用いられている、従来法により、例えばエノール製造学における参照法であるＦｒａｎｚ  Ｐａｕｌ法を用いて（Ｃｈａｎｔａｌ  Ｂｏｎｄｅｒ
ａｎｄ  Ｒａｙｍｏｎｄ  Ｓｙｌｖｅｓｔｒｅ，  Ｐｒａｔｉｑｕｅｒ  ｌｅｓ  ｃｏｎｔｒｏｌｅｓ  ｅｎ  ｏｅｎｏｌｏｇｉｅ  ［Ｃａｒｒｙｉｎｇ  ｏｕｔ  ｔｅｓｔｓ
ｉｎ  ｅｎｏｌｏｇｙ］［１１］）、そして／又は例えばアイルランドのＭｅｇａｚｙｍｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社により販売される、化学的キットを用いることにより計測されてもよい。
【００５８】
当業者は、彼らの一般的知識により、亜硫酸塩の濃度／量を組成物の機能として測定するための方法を適合させる方法を知っているであろう。
【００５９】
本発明において、組成物中に存在する亜硫酸塩に対する、組成物中に導入される３−メルカプトピルビン酸塩のモル比のパーセンテージは、０．０１％〜１００％、例えば２５％〜１００％の範囲内であってもよい。
【００６０】
本発明者らは、チオ硫酸塩への亜硫酸塩の変換のための反応が、３−メルカプトピルビン酸塩の量と１：１の化学量論を有することを実証した。本発明者らはまた、該組成物中に存在する亜硫酸塩の所与の量を変換する可能性を実証した。
【００６１】
言い換えれば、本発明の方法はまた、チオ硫酸塩に変換される亜硫酸塩の量、及び該方法の実行後に該組成物中に存在する可能な残量も精密に制御することが可能である。
【００６２】
加えて、本発明の方法は、基質が３−メルカプトピルビン酸塩である場合に、該組成物におけるピルビン酸塩の生成を可能にする。特に農業食品組成物、医薬組成物、化粧料組成物及び獣医学的組成物における、ピルビン酸塩の形成は、色、臭い、及び／又は考えられる毒性に関して影響を有さない。言い換えれば、該方法から得られたピルビン酸塩及びチオ硫酸塩は、無臭、無色で非毒性である（ＦＤＡ  ｒｅｐｏｒｔ  ｏｎ  ｔｈｉｏｓｕｌｆａｔｅ  ２２３−７５−２００４，  １９７５［１２］）。
【００６３】
さらに、該方法から得られた生成物は、該組成物の本質的特徴、例えば外観、風味特性、臭覚特性を負に改変しない。
【００６４】
本発明による方法はまた、有利には感覚受容性を変化させない組成物の獲得を可能にする。言い換えれば、本発明による方法は、適用される組成物の感覚受容性を改変しない。
【００６５】
さらに、本発明による方法は、有利にはカルシフィラキシーに対する処置に使用されるチオ硫酸塩の生成を可能にする（Ａｒｒｅｓｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６，  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ［１３］）。加えて、チオ硫酸塩は、抗酸化効果により、例えば米国で用いられるような、アルコール性組成物の安定化に用いられる。
【００６６】
したがって本発明は、有利には用いられる組成物の安定性の改善を可能にする。
【００６７】
他の利点は、例示として与えられた添付の図に示される以下の実施例を読むことにより当業者にさらに明白となろう。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】３−メルカプトピルビン酸塩が硫黄供与基質として用いられ、亜硫酸塩が受容体として用いられて、ピルビン酸塩及びチオ硫酸塩の形成をもたらす、３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素の触媒機構を表すスキームである。
【図２】大腸菌３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素の精製の様々なステップを示したＳＤＳ−１２．５％ＰＡＧＥタンパク質ゲルの写真である。ＭＷの列は、分子量マーカーに対応し、ＳＳＯの列は、細菌細胞溶解後に得られた可溶性画分に対応し、Ｃ６５％の列は、６５％硫酸アンモニウムの存在下で沈殿後に得られた不溶性画分に対応し、Ｐｈ−Ｓｅｐｈの列は、Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（登録商標））の後に得られた画分に対応し、Ｑ−Ｓｅｐｈの列は、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ陰イオン交換クロマトグラフィー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（登録商標））の後に得られた画分に対応する。
【図３】２種の酵素の使用を含み、それらの酵素のそれぞれが反応ステップを触媒する、ＳＯキットの原理を表す簡素化されたスキームである。最初のステップは、亜硫酸オキシダーゼを含み（反応１）、２番目は、ＮＡＤＨペルオキシダーゼを含む（反応２）。
【図４】未処置の白ワイン試料（黒色の曲線。白ワインのみ）、並びに２μＭの３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素及び亜硫酸塩に対して化学量論量（１：１）の３−メルカプトピルビン酸塩での処置後の白ワイン試料（上の曲線。白ワイン＋３−ＭＳＴ＋３−ＭＰ）の、時間の関数としての３４０ｎｍでの吸光度のモニタリングを表す。
【図５】亜硫酸塩に対して化学量論量（１：１）の３−メルカプトピルビン酸塩での処置後の白ワイン試料（黒色の曲線。白ワインのみ）、２μＭの３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素での処置後の白ワイン試料（白ワイン＋３−ＭＳＴ）、並びに２μＭの３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素及び亜硫酸塩に対して化学量論量（１：１）の３−メルカプトピルビン酸塩での処置後の白ワイン試料（上の曲線。白ワイン＋３−ＭＳＴ＋３−ＭＰ）の、時間の関数としての３４０ｎｍでの吸光度のモニタリングを表す。
【図６】未処置の白ワイン試料（黒色の曲線。白ワインのみ）、２μＭの３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素と１／４（曲線：１／４の３−ＭＰ）、１／２（曲線：１／２の３−ＭＰ）及び３／４（曲線：３／４の３−ＭＰ）の３−メルカプトピルビン酸塩／亜硫酸塩比とでの処置後の白ワイン試料の、時間の関数としての３４０ｎｍでの吸光度のモニタリングを表す。
【図７】時間（ｘ軸）の関数としての前記工程での処置後の残留亜硫酸塩のパーセンテージ（ｙ軸）を表すグラフである。
【図８】未処置の赤ワイン試料（黒色の曲線。赤ワインのみ）、並びに０．５μＭの３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素及び亜硫酸塩に対して化学量論量（１：１）の３−メルカプトピルビン酸塩での処置後の赤ワイン試料（上の曲線。赤ワイン＋３−ＭＳＴ＋３−ＭＰ）の、時間の関数としての３４０ｎｍでの吸光度のモニタリングを表す。
【図９】０．５μＭの３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素と、０（曲線：０  ３−ＭＰ／亜硫酸塩）、１／２（曲線：１／２の３−ＭＰ／亜硫酸塩）及び１（曲線：Ｓｅｐｔａｎｅｓｔ＋３−ＭＳＴ＋３−ＭＰ）の３−メルカプトピルビン酸塩／亜硫酸塩比の３−メルカプトピルビン酸塩とでの処置後の局所麻酔（Ｓｅｐｔａｎｅｓｔ（登録商標））の、時間の関数としての３４０ｎｍでの吸光度のモニタリングを表す。
【図１０】保存されたアミノ酸と、アラニンに突然変異された該アミノ酸の位置（アスパラギン酸１７）を実証する、３種の３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素（３−ＭＳＴ）：大腸菌３−ＭＳＴ（コードＰＤＢ  １ＵＲＨ）、ヒト３−ＭＳＴ（コードＰＤＢ  ４ＪＧＴ）及び大型リーシュマニア３−ＭＳＴ（コードＰＤＢ  １０ＫＧ）のタンパク質配列及び二次構造のアライメントを表す。
【図１１】大腸菌３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素の野生型及びＤ１７Ａ突然変異体の生成に用いられるｐＥＴ２０ｂ  ３−ＭＳＴベクターのスキームを表す。ｐＥＴ２０ｂ  ３−ＭＳＴ構築物は、市販されるＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）のｐＥＴ２０ｂから得られた組み換えベクターである。
【図１２】大腸菌３ｍｓｔ遺伝子のコード領域の配列に対応する。大腸菌３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素のＤ１７Ａ突然変異体の獲得を可能にする突然変異されたコドンが、下線を付されており、灰色で強調されている。
【図１３】大腸菌３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素の野生型のタンパク質配列である。下線を付されて、灰色で強調されたアスパラギン酸は、大腸菌３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素のＤ１７Ａ突然変異体においてアラニンに突然変異されたアミノ酸に対応する。
【図１４】ｐＥＴ２０ｂ  ３−ＭＳＴ発現ベクターで実施された部位特異的突然変異誘発の際に用いられたフォワード（ａ）及びリバース（ｂ）ヌクレオチドプライマーの配列を含む。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００６９】
実施例１：大腸菌３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素Ｄ１７Ａの生成及び精製
大腸菌３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素Ｄ１７Ａをコードするプラスミドを、該酵素の野生型をコードするプラスミドの部位特異的突然変異誘発により得た（図１１、１２、１３及び１４）。
【００７０】
大腸菌３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素のＤ１７Ａ突然変異体を、ｐＥＴ２０ｂ
３−ＭＳＴ発現ベクターでの大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌の形質転換により生成した。ｐＥＴ２０ｂ  ３−ＭＳＴ  １００ｎｇでのＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセル５０μＬの形質転換を、３０分間の氷中での混合物のインキュベーション、及びその後のヒートショック（４２℃で３０秒間）により実施した。その後、該混合物を用いて、アンピシリン（２００ｍｇ／Ｌ）を補充されたＬＢ培地  ５０ｍＬの予備培養物を接種した。振とうを伴った３７℃での一夜インキュベーションの後、アンピシリン（２００ｍｇ／Ｌ）を補充されたＬＢ培地  ４Ｌを１／１００で接種して、振とうしながら３７℃に配置した。６００ｎｍでの光学密度が、０．６に達したら、１ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を添加することにより発現を誘導した。その後、細胞を振とうしながら３７℃で３時間配置し、その後、３０００ｇでの遠心分離により回収した。細胞ペレットを、１０ｍＭ  ＤＴＴ、２０Ｕ／ｍＬベンゾナーゼ及び４ｍＭ  ＭｇＳＯ４を含有するＴＥ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８）２０ｍＬに取り出した。細胞溶解を、４℃及び出力４０Ｗ／回で時間の５０％の間に２分ずつ２回、音波処理することにより実施した。細胞残屑を、１７０００ｇで４５分間の遠心分離により除去した。
【００７１】
該酵素を、以下の３つのステップを含むプロトコルを用いて精製した：
−  硫酸アンモニウムでの沈殿：音波処理後に得られた可溶性画分を、４℃で穏やかに撹拌しながら６５％硫酸アンモニウム（ＡＳ）飽和にした。この濃度で、タンパク質が沈殿し、その後、１７０００ｇでの４５分間の遠心分離の後に、ペレットをＴＥ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ  ８）２０ｍＬに取り出した。
−  Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（登録商標））：硫酸アンモニウムを、１Ｍの濃度が得られるまでタンパク質溶液に徐々に添加した。この溶液をその後、濾過して（０．２μｍ）、その後、ＴＥ緩衝液、１Ｍ  ＡＳで予備平衡されたＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ疎水性相互作用カラムに注入した。溶出を、硫酸アンモニウムの低下勾配により（１Ｍから０Ｍへ）実施した。回収された画分を、ＳＤＳ−１２．５％ＰＡＧＥ電気泳動により分析し、３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素を含有する画分をひとまとめにし、その後、ＴＥ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ  ８）で一晩透析した。
−  Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ陰イオン交換クロマトグラフィー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（登録商標））：透析後に、タンパク質溶液を０．２μｍで濾過し、その後、ＴＥ緩衝液で予備平衡されたＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ陰イオン交換クロマトグラフィーカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（登録商標））に注入した。溶出を、ＫＣｌの上昇勾配（０Ｍから１Ｍへ）を適用することにより実施した。３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素を含有する画分を、ＳＤＳ−１２．５％ＰＡＧＥ電気泳動により同定し、その後、ひとまとめにして、ＹＭ１０膜（１０ｋＤａ閾値）を用いたＡｍｉｃｏｎセルでの限外濾過により濃縮した。こうして精製されたタンパク質溶液を、タンパク質を沈殿させるために７０％の硫酸アンモニウム飽和にして、それを５ｍＭ  ＤＴＴの存在下、−２０℃で貯蔵した。
【００７２】
図２は、大腸菌３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素の精製ステップそれぞれの後に得られた試料の移動後のＳＤＳ−１２．５％ＰＡＧＥタンパク質ゲルの写真である。この図は、均質に精製された３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素の獲得を実証する様々な
精製ステップを明確に示している。
【００７３】
実施例２：白ワイン中に存在する亜硫酸塩の除去
用いられた３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素は、先の実施例１で得られた、精製された大腸菌３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素のＤ１７Ａ突然変異体であった。
【００７４】
この試験は、辛口白ワイン（Ｃｏｌｏｍｂａｒｄ  Ｓａｕｖｉｇｎｏｎ、Ｃｏｔｅ  ｄｅ  Ｇａｓｃｏｇｎｅ、４４３３０  ラ・シャンペル＝ウラン、フランス）で実施した。このワイン中の亜硫酸塩濃度を１６０ｍｇ／Ｌと測定した後、亜硫酸オキシダーゼキット（ＳＯキット）（Ｍｅｇａｚｙｍｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、アイルランド）  を用いて処置した（黒色の曲線。図４）。亜硫酸塩の量は、分光光度計（ＳＡＦＡＳ  ＵＶｍｃ２）を用いて測定された３４０ｎｍでの光学密度の差（ΔＯＤ３４０ｎｍ）により与えられる。
【００７５】
光学密度は、硫酸塩に変換された亜硫酸塩の量（反応１、図３）と相関する、ＮＡＤ＋に酸化されたＮＡＤＨの量（反応２、図３）のモニタリングを可能にするため、３４０ｎｍで測定した。言い換えれば、光学密度の低下は、亜硫酸オキシダーゼによる亜硫酸塩の酸化に対応し、こうして亜硫酸塩の存在が実証される。
【００７６】
ＳＯキットは、ワイン中の総亜硫酸塩、即ち遊離亜硫酸塩及び有機分子と結び付いた亜硫酸塩の量のアッセイを可能にする。前記方法は、総亜硫酸塩を除去するという利点を有し、実際のところ、ｐＨ１．５〜５の胃の中で一旦結び付いた形態は、放出されて、生物体内で排出を必要とする少なからぬ亜硫酸塩供給源を構成する。該方法が、総亜硫酸塩の除去を可能にすれば、それは、遊離亜硫酸塩形態の除去により化学平衡が結合された亜硫酸塩の分解に向かうシフト、つまり最終的に、亜硫酸塩の全体的除去をもたらすことを意味する（Ｇｒｉｇｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９５０，  Ｔｒａｉｔｅ  ｄｅ  ｃｈｉｍｉｅ  ｏｒｇａｎｉｑｕｅ  ［Ｔｒｅａｔｉｓｅ  ｏｎ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ［１４］）。
【００７７】
３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素が、効果的にチオ硫酸塩への亜硫酸塩の変換を可能にするか否かを決定するために、白ワイン２５ｍＬを、２μＭの３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素、及び亜硫酸塩に対して化学量論で１：１の３−メルカプトピルビン酸塩と混合した。全混合物を、２５℃の温度で５分間インキュベートして、３４０ｎｍでの光学密度を測定した。図４は、得られた結果を表す。
【００７８】
光学密度を測定したが、もはや吸収にはいずれの低下もなく、ワイン中に存在する亜硫酸塩の全ての除去が証明され、チオ硫酸塩への亜硫酸塩の返還が実証された（曲線：白ワイン＋３−ＭＳＴ＋３−ＭＰ。図４）。３−メルカプトピルビン酸塩基質の非存在下、又は酵素の非存在下で実施された同様の実験が、ワイン中の亜硫酸塩の量の降下をもたらさないため、亜硫酸塩の除去が実際に酵素の酵素活性に関連することが、様々な対照により示される。得られた結果を、図５に表す（それぞれ、曲線：白ワイン＋３−ＭＳＴ、及び白ワイン＋３−ＭＰ）。
【００７９】
白ワインからの遊離亜硫酸塩の除去は、ストリップ（Ｑｕａｎｔｏｆｉｘ（登録商標）
Ｓｕｌｆｉｔｅ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を用いることによっても実証された（結果は開示しない）。
【００８０】
その一方で、この方法の後の亜硫酸塩の量は、
ａ．  硫酸の添加及び加熱による強力かつ積極的な酸性化により、これらの条件下で亜硫酸塩へのチオ硫酸の不均化をもたらす必要があるため、Ｆｒａｎｚ  Ｐａｕｌ法、
ｂ．  チオール基に特異的な試薬を含有するため化学的キットの使用；実際に、チオ硫酸塩及び該酵素は、測定を歪める「寄生」反応の供給源を構成するチオラート基を有する、
などのワイン製造業界で現在用いられている従来法により計測することができなかった。
【００８１】
本発明による例示的方法を実行した後の亜硫酸塩のアッセイを、定量的な特異的アッセイ法を構成するＳＯキット（Ｍｅｇａｚｙｍｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、アイルランド）を用いて、そしてストリップ（Ｑｕａｎｔｏｆｉｘ（登録商標）Ｓｕｌｆｉｔｅ，
Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を用いて実施して、定量的テストとしてのこの方法の検証を可能にした。
【００８２】
上述の通り、ＳＯキットは、ワイン中の総亜硫酸塩、即ち遊離亜硫酸塩及び有機分子と結び付いた亜硫酸塩の量のアッセイを可能にする。このアッセイは、推奨されるプロトコルに従って、ガラス容器内で蒸留水１．３ｍＬ、緩衝液２５０μＬ、被験試料１００μＬ、ＮＡＤＨ  １００μＬ及びＮＡＤＨペルオキシダーゼ１０μＬを混合することにより実施した。吸光度の安定化の後、亜硫酸オキシダーゼ１０μＬを添加して、３４０ｎｍでの吸光度の変動を測定した。
【００８３】
用いられる３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素の最適濃度を決定するために、テストを、亜硫酸塩に対して化学量論量の３−メルカプトピルビン酸塩と、様々な濃度の３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素と、の存在下で実施した。３４０ｎｍでの光学密度を、反応物を混合した直後に測定した。
【００８４】
白ワイン試料中の亜硫酸塩の濃度は、１６０ｍｇ／Ｌであった。この方法の実行後の残留亜硫酸塩濃度の測定を、ＳＯキットを用いて実施した。様々な濃度の３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素の存在下で得られた結果を、以下の表１及び図５に表す。
【００８５】
【表１】
2020503876.tif 000003
【００８６】
先に実証された通り、３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素は、白ワイン中に存在する亜硫酸塩の除去を可能にし、５００ｎＭ濃度の酵素は、存在する亜硫酸塩の全ての除去を可能にする。
【００８７】
加えて、様々な濃度の３−メルカプトピルビン酸塩及び５００ｎＭの３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素の存在下でのテストを、白ワイン試料で実施した。特に１／４、１／２及び３／４の３−メルカプトピルビン酸塩／亜硫酸塩モル比をテストした。この方法の実行後の残留亜硫酸塩濃度の測定を、ＳＯキットを用いて実施した。様々な濃度の３−メルカプトピルビン酸塩の存在下で得られた結果を、以下の表２及び図６に表す。
【００８８】
【表２】
2020503876.tif 000004
【００８９】
先の表２及び図６に実証された通り、本発明による方法は、有利には最終亜硫酸塩濃度の制御も可能にする。
【００９０】
言い換えれば、本発明による方法は、有利には所与の値への組成物／試料中の亜硫酸塩濃度の改変、又は組成物、例えばワインの中に存在する亜硫酸塩の排除／変換を可能にする。
【００９１】
最後に、チオ硫酸塩は、化学的に安定した分子である。ワイン中での安定性の検証を、実施した。そのために、処置後の亜硫酸塩の残量を、以下の方法に従って時間の関数として測定した：除去方法が、先に記載されたものと同じプロトコル（５００ｎＭの３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素と、化学量論量の３−メルカプトピルビン酸塩／亜硫酸塩）に従ってワイン２５ｍＬ容量に適用されたら、試料を周囲温度で２週間貯蔵し、残留亜硫酸塩の量を、定期的時間間隔で、即ち３日ごとに定量した。得られた結果から、１７時間（又は２週間。結果は示さない）の期間にわたり、ワイン中のチオ硫酸塩の不均化による亜硫酸塩の放出がないことが示される（図７）。
【００９２】
言い換えれば、本発明による方法は、組成物中で亜硫酸塩をチオ硫酸塩に改変することにより亜硫酸塩の除去を可能にし、その改変は、時間を経ても安定している。
【００９３】
実施例３：赤ワイン中の亜硫酸塩の除去
この実施例において、該組成物は、赤ワイン（Ｃｏｒｂｉｅｒｅｓ、フランス）であった。赤ワイン中に存在するタンニンは、亜硫酸塩定量法（上述のＳＯキット）を妨害するため、該組成物中の亜硫酸塩の消失を実証するためにはタンニンを除去する必要があった。
【００９４】
亜硫酸塩を除去するための方法を、以下のプロトコルに従って赤ワインで実施した：５００ｎＭの３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素、化学量論量の３−メルカプトピルビン酸塩／このワイン中に存在する亜硫酸塩。タンニンを、以下の方法に従ってポリビニルポリピロリドン（ＰＶＰＰ）の存在下での沈殿により除去した：赤ワイン試料１０ｍＬをＰＶＰＰ  ０．２ｇで処置し、４０００ｇでの遠心分離を５分間実施した。このステップを、３回繰り返した。
【００９５】
この方法の実行前及び実行後の亜硫酸濃度の測定を、実施例１に記載されたものと同じプロトコルに従ってＳＯキットを用いて実施した。得られた結果を、図８に表す。赤ワイン中の亜硫酸塩濃度は、１００ｍｇ／Ｌであった（黒色の曲線。赤ワインのみ）。５００ｎＭの３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素及び化学量論量の３−メルカプトピルビン酸塩の添加が、亜硫酸塩の除去を可能にした（上の曲線。赤ワイン＋３−ＭＳＴ＋３−ＭＰ）。
【００９６】
この実施例から、本発明による方法が赤ワイン中に存在する亜硫酸塩の除去を可能にすることが、明白に実証される。
【００９７】
実施例４：麻酔薬中の亜硫酸塩の除去
この実施例において、該組成物は、１／１０００００のアドレナリン、４０ｍｇ／Ｌのアルチカイン塩酸塩（Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ  Ｓｅｐｔｏｄｏｎｔ）を含む局所麻酔薬（Ｓｅｐｔａｎｅｓｔ（登録商標））４０ｍｇ／ｍＬであった。
【００９８】
該組成物から亜硫酸塩を除去するための方法を、以下のプロトコルに従って実施した：５００ｎＭの３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素、化学量論量の３−メルカプトピルビン酸塩／組成物中に存在する亜硫酸塩。
【００９９】
この方法の実行前及び実行後の亜硫酸濃度を、実施例１に記載されたものと同じプロトコルに従ってＳＯキットを用いて測定した。得られた結果を、図９に表す。該組成物中の亜硫酸塩濃度は、４１０ｍｇ／Ｌであった（曲線：０  ３−ＭＰ／亜硫酸塩）。５００ｎＭの３−メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素及び化学量論量の３−メルカプトピルビン酸塩の添加が、本発明により組成物中に存在する亜硫酸塩の全体的除去を可能にした（曲線：Ｓｅｐｔａｎｅｓｔ＋３−ＭＳＴ＋３−ＭＰ）。
【０１００】
加えて、該方法を、１／２比の３−メルカプトピルビン酸塩／亜硫酸塩（ｍｏｌ／ｍｏｌ）で実施した（図９。曲線：１／２の３−ＭＰ／亜硫酸塩）。実証された通り、組成物中に存在する亜硫酸塩の半量が、チオ硫酸塩に変換される。
【０１０１】
したがってこの実施例から、本発明による方法が、存在する亜硫酸塩の量を減少させるための医薬組成物の処置を可能にすることが明白に実証される。
【０１０２】
参考資料のリスト
1.  Shih et al., 1977, The New England Journal of Medicine.
2.  Andersson et al., 2013, International Archives of Occupational and Environmental Health.
3.  Ozsoy et al., 2014, Toxicology and Industrial Health.
4.  WO 2015/051187.
5.  Hermann et al., 2015, "The octahaem MccA is a haem c-copper sulfite reductase" Nature 520, 706-709
6.  http://www.promega.com/vectors/mammalian_express_vectors.htm.
7.  http://www.qiagen.com/overview/qiagenes.aspx?gaw=PROTQIAgenes0807&gkw=mammalian+expression 
8.  http://www.scbt.com/chap_exp_vectors.php?type=pCruzTM%20Expression%20Vectors.
9.  WO 83/004261
10.  Beutler, H. O., 1988, Sulphite In Methods of Enzymatic Analysis.
11.  Bondet and Sylvestre, 2005, Pratiquer les controles en oenologie [Carrying out tests in enology].
12.  FDA report regarding sodium thiosulfate, SCOGS-52, 1975.
13.  Arrestier et al., 2016, Medicine, 95 (6). 
14.  Grignard et al., 1950, Traite de chimie organique [Treatise on organic chemistry], 769-770.
【図１】
2020503876.tif 000005
【図２】
2020503876.tif 000006
【図３】
2020503876.tif 000007
【図４】
2020503876.tif 000008
【図５】
2020503876.tif 000009
【図６】
2020503876.tif 000010
【図７】
2020503876.tif 000011
【図８】
2020503876.tif 000012
【図９】
2020503876.tif 000013
【図１０】
2020503876.tif 000014
【図１１】
2020503876.tif 000015
【図１２】
2020503876.tif 000016
【図１３】
2020503876.tif 000017
【図１４】
2020503876.tif 000018
【配列表】
2020503876000001.app
【国際調査報告】
2020503876.tif 000019
2020503876.tif 000020
2020503876.tif 000021
2020503876.tif 000022
2020503876.tif 000023
2020503876.tif 000024