(57)【要約】(i)任意で誘導体化されたグリコペプチド系抗生物質；(ii)ナノ粒子；および(iii)(i)と(ii)を連結する第1のリンカーを含む構築物が提供される。本構築物は、第1のリンカーと(ii)の間に位置する第2のリンカーをさらに含んでもよい。ナノ粒子は、磁気分離用ナノ粒子などの分離用ナノ粒子であってもよい。グリコペプチド系抗生物質は、バンコマイシン；テイコプラニン；オリタバンシン；テラバンシン；クロロエレモマイシン；およびバルヒマイシンからなる群より選択されてもよい。前記構築物に細菌を結合させることにより細菌を試料から分離する方法などの、前記構築物の作製および使用に関連する方法もまた提供される。2020512285.tif 000007
2020512285.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(i)任意で誘導体化されたグリコペプチド系抗生物質；
(ii)ナノ粒子；および
(iii)(i)と(ii)を連結する第1のリンカー
を含む、構築物。
【請求項２】
第1のリンカーと(ii)の間に位置する第2のリンカーをさらに含む、請求項1記載の構築物。
【請求項３】
ナノ粒子が分離用ナノ粒子であり、好ましくは、分離用ナノ粒子が磁性ナノ粒子である、請求項1または2記載の構築物。
【請求項４】
グリコペプチド系抗生物質が、バンコマイシン；テイコプラニン；オリタバンシン；テラバンシン；クロロエレモマイシン；およびバルヒマイシンからなる群より選択される、前記請求項のいずれか一項記載の構築物。
【請求項５】
グリコペプチド系抗生物質がバンコマイシンである、請求項4記載の構築物。
【請求項６】
第1のリンカーが少なくとも部分的に親水性である、前記請求項のいずれか一項記載の構築物。
【請求項７】
第1のリンカーが疎水性である、請求項1〜5のいずれか一項記載の構築物。
【請求項８】
第1のリンカーがポリエチレングリコール(PEG)部分を含む、請求項6記載の構築物。
【請求項９】
好ましくは、PEG部分がPEG3である、請求項8記載の構築物。
【請求項１０】
第1のリンカーが、4個より多い炭素の炭素直鎖を含む、請求項6〜8のいずれか一項記載の構築物。
【請求項１１】
炭素直鎖がC8である、請求項10記載の構築物。
【請求項１１】
第1のリンカーが、C末端カルボキシ部分；一次N末端部分または二次N末端部分；ヒドロキシル部分；フェノール部分；およびバンコサミン部分からなる群より選択される部分を介して、グリコペプチド系抗生物質に連結されている、前記請求項のいずれか一項記載の構築物。
【請求項１２】
第1のリンカーがアミド結合を介してグリコペプチド系抗生物質に連結されている、請求項12記載の構築物。
【請求項１３】
第1のリンカーが1つまたは複数の窒素含有部分を含む、前記請求項のいずれか一項記載の構築物。
【請求項１４】
第1のリンカーが分子の第1の末端に窒素含有部分を含み、該部分がリンカーをグリコペプチド系抗生物質に連結する、請求項13記載の構築物。
【請求項１５】
第1のリンカーが分子の第2の末端に窒素含有部分を含む、請求項13または14記載の構築物。
【請求項１６】
1つまたは複数の窒素含有部分がアミン由来部分および/またはアジド由来部分を含む、請求項13〜15のいずれか一項記載の構築物。
【請求項１７】
第2のリンカーが有機分子である、請求項2〜16のいずれか一項記載の構築物。
【請求項１８】
第2のリンカーがPEG部分を含む、請求項2〜14のいずれか一項記載の構築物。
【請求項１９】
PEG部分がPEG3である、請求項18記載の構築物。
【請求項２０】
第1のリンカーがアジド由来部分を介して第2のリンカーに連結されている、請求項13〜19のいずれか一項記載の構築物。
【請求項２１】
第1のリンカーが第1のリンカーのトリアゾール部分を介して第2のリンカーに連結されている、請求項20記載の構築物。
【請求項２２】
構築物のナノ粒子がタンパク質またはポリマーで不動態化されている、前記請求項のいずれか一項記載の構築物。
【請求項２３】
不動態化が、HSA；CMD；PDEC-デキストラン、およびPDEA-デキストランからなる群より選択されるコーティングによるものである、請求項22記載の構築物。
【請求項２４】
第1のリンカーがコーティングを介してナノ粒子に連結されている、請求項23記載の構築物。
【請求項２５】
第1のリンカーが第2のリンカーを介してナノ粒子に連結され、第2のリンカーがコーティングに付着されている、請求項24記載の構築物。
【請求項２６】
複数のグリコペプチド系抗生物質分子を含む、前記請求項のいずれか一項記載の構築物。
【請求項２７】
中程度または高い局所密度のグリコペプチド系抗生物質分子を有する、請求項26記載の構築物。
【請求項２８】
(i)任意で誘導体化されたグリコペプチド系抗生物質；(ii)ナノ粒子；および(iii)第1のリンカーを入手する工程、ならびに(iii)を用いて(i)と(ii)を連結する工程を含む、構築物を作製する方法。
【請求項２９】
(a)(i)任意で誘導体化されたグリコペプチド系抗生物質；(ii)ナノ粒子；(iii)第1のリンカー；および(iv)第2のリンカーを入手する工程；
(b)(i)を(iii)に連結する工程；
(c)(ii)を(iv)に連結する工程；ならびに
(d)(iii)を(iv)に連結する工程
を含む、構築物を作製する方法。
【請求項３０】
(i)任意で誘導体化されたグリコペプチド系抗生物質；(ii)ナノ粒子；および(iii)(i)と(ii)を連結する第1のリンカーを含む構築物を、微生物またはその成分に結合させる方法であって、
(a)構築物と微生物またはその成分とを組み合わせる工程；ならびに
(b)構築物のグリコペプチド系抗生物質を微生物またはその成分と選択的に結合させることによって、構築物を微生物またはその成分に結合させる工程
を含む、前記方法。
【請求項３１】
構築物を用いて、微生物またはその成分を試料から分離する方法であって、
(ai)任意で、試料が血液試料である場合に、血球を凝集させる工程；
(a)任意で誘導体化されたグリコペプチド系抗生物質；(ii)ナノ粒子；および(iii)(i)と(ii)を連結する第1のリンカーを含む構築物を、微生物またはその成分を含有する試料と組み合わせる工程；
(b)微生物またはその成分を構築物のグリコペプチド系抗生物質に選択的に結合させる工程；ならびに
(c)ナノ粒子を用いて、微生物またはその成分に結合した構築物を試料から選択的に入手し、それによって、構築物を用いて、微生物またはその成分を試料から分離する工程
を含む、前記方法。
【請求項３２】
工程(a)の試料が、生物学的対象から得られた試料である、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
試料が尿、血液、または血液製剤である、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
試料がヒトから得られたものである、請求項32または33記載の方法。
【請求項３５】
工程(a)の微生物がグラム陽性細菌である、請求項30〜34のいずれか一項記載の方法。
【請求項３６】
微生物が病原性である、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
工程(c)が、磁性ナノ粒子である分離用ナノ粒子の磁気捕捉を用いて行われる、請求項30〜36のいずれか一項記載の方法。
【請求項３８】
関心対象の微生物またはその成分の存在について試料をスクリーニングする方法であって、前記方法が、
(a)(i)任意で誘導体化されたグリコペプチド系抗生物質；(ii)ナノ粒子；および(iii)(i)と(ii)を連結する第1のリンカーを含む構築物を、試料と組み合わせる工程；
(b)ナノ粒子を用いて、構築物を試料から選択的に入手する工程；
(c)関心対象の微生物またはその成分が構築物に結合しているかどうか、または結合したかどうかを決定する工程
を含み、
関心対象の微生物またはその成分が構築物に結合しているまたは結合したと決定されることにより、試料が関心対象の微生物またはその成分を含有することが示され、関心対象の微生物またはその成分が構築物に結合していないまたは結合しなかったと決定されることにより、試料が関心対象の微生物またはその成分を含有しないことが示される、前記方法。
【請求項３９】
試料から得られた微生物またはその成分を分析する方法であって、
(a)(i)任意で誘導体化されたグリコペプチド系抗生物質；(ii)ナノ粒子；および(iii)(i)と(ii)を連結する第1のリンカーを含む構築物を、微生物またはその成分を含有する試料と組み合わせる工程；
(b)微生物またはその成分を構築物のグリコペプチド系抗生物質に選択的に結合させる工程；
(c)ナノ粒子を用いて、微生物またはその成分に結合した構築物を試料から選択的に入手し、それによって、微生物またはその成分を試料から入手する工程；
(d)任意で、微生物またはその成分を構築物から分離する工程；ならびに
(e)微生物を分析する工程
を含む、前記方法。
【請求項４０】
工程(e)の分析がMALDI質量分析法による分析を含む、請求項39記載の方法。
【請求項４１】
工程(e)の分析が核酸分析を含む、請求項39記載の方法。
【請求項４２】
工程(e)の分析が蛍光分析を含む、請求項39記載の方法。
【請求項４３】
分析が微生物の特定を含む、請求項39〜42のいずれか一項記載の方法。
【請求項４４】
工程(a)の構築物が、請求項1〜27のいずれか一項記載の構築物である、請求項28〜43のいずれか一項記載の方法。
【請求項４５】
対象における疾患、障害、または状態を診断する方法であって、請求項43に従って、対象から得られた生物学的試料において微生物を特定する工程、および微生物のアイデンティティーに基づき対象における疾患または状態を診断する工程を含む、前記方法。
【請求項４６】
疾患、障害、または状態を処置する方法であって、請求項45記載の方法に従って、疾患、障害、または状態を診断する工程、および診断に基づき疾患または状態を処置する工程を含む、前記方法。
【請求項４７】
微生物を阻害する、制御する、または死滅させる方法であって、請求項1〜27のいずれか一項記載の構築物を微生物と接触させることによって、微生物を阻害する、制御する、または死滅させる工程を含む、前記方法。
【請求項４８】
対象における疾患、障害、または状態を処置または予防するための、請求項1〜27のいずれか一項記載の構築物を含む組成物。
【請求項４９】
対象における疾患、障害、または状態を処置または予防する方法であって、有効量の請求項1〜27のいずれか一項記載の構築物または請求項48記載の組成物を対象に投与することによって、対象における疾患、障害、または状態を処置または予防する工程を含む、前記方法。
【請求項５０】
対象における疾患、障害、または状態を処置または予防するための組成物の製造における、請求項1〜27のいずれか一項記載の構築物の使用。
【請求項５１】
グリコペプチド系抗生物質の活性または効力を増大させる方法であって、グリコペプチド系抗生物質をリンカーに連結する工程を含み、任意で、リンカーを介してグリコペプチド系抗生物質をナノ粒子に連結するさらなる工程を含む、前記方法。
【請求項５２】
リンカーがPEG3またはC8を含む、請求項51記載の方法。
【請求項５３】
リンカーに結合した、任意で誘導体化されたグリコペプチド系抗生物質を含む化合物であって、リンカーが、(i)少なくともPEG3を含むPEG部分；または(ii)少なくとも4個の炭素を含む炭素直鎖を含む、前記化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、微生物結合活性を有する構築物に関する。いくつかの形態では、本発明は、グラム陽性細菌のバイオセパレーションのための構築物、ならびに細菌分析および/または疾患診断の関連方法に関する。本発明はまた、抗菌活性を有する構築物、および微生物制御のための、このような構築物の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
細菌などの微生物は、植物および動物、例えば、ヒトを含む生物の広範囲の疾患または状態の原因となる。前世紀の中頃から抗生物質は細菌性疾患の管理に効果的に用いられてきた。しかしながら、細菌には、抗生物質耐性を発生する、かなりの能力があり、抗生物質耐性細菌によって引き起こされる疾患は、現在、地球規模の重大危機だとみなされている。
【０００３】
菌血症および敗血症(sepsis)(または敗血症(septicaemia))は、微生物(典型的には細菌)が血中に存在する関連状態である。菌血症では、微生物は、例えば、創傷、感染症、または外科的処置によって血液に入る。敗血症では、微生物は血液に入り、そこで複製する。敗血症は、通常、非常に重篤な状態とみなされ、命にかかわることが多い。敗血症は、一般的に、グラム陽性球菌細菌であるブドウ球菌属(Staphylococcus)の種、特に、黄色ブドウ球菌(S.aureus)によって引き起こされる。しかしながら、ストレプトコッカス属(Streptococcus)、およびエンテロコッカス属(Enterococcus)の種を含む他のグラム陽性細菌が敗血症の原因となることがあり、同様に、ある特定のグラム陰性細菌(例えば、エシェリキア属(Escherichia)、シュードモナス属(Pseudomonas)、およびクレブシエラ属(Klebsiella)の種)ならびに菌類、例えば、カンジダ属(Candida)の種も敗血症の原因となることがある。
【０００４】
敗血症を呈している患者にとって、原因となる病原体を特定し、正しい抗生物質を投与し始めるのに要する時間は重要である。血中の微生物(例えば、菌血症)を検出するための現行の方法は、普通、培養に基づく方法である。しかしながらこれらの方法は、高い偽陽性率と、比較的長い診断時間の影響を受けることがある。さらに、病院は、敗血症および他の感染症に関連する、院内感染および多剤耐性細菌(例えば、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌；MRSA)によって引き起こされる重大問題に直面し、このような患者は長期の入院、多くの監視、および高価な、最後の治療選択肢となる抗生物質(last line antibiotics)の使用を必要とする。
【０００５】
上記のことを考慮して、菌血症および/または敗血症の診断に適した新たな微生物検出法が大いに望まれている。さらに、抗生物質の抗菌活性を増大させるための戦略が極めて有益だろう。
【発明の概要】
【０００６】
概要
1つの広い形態において、本発明は、ナノ粒子に連結された、任意で誘導体化されたグリコペプチド系抗生物質を含む構築物に関する。この第1の広い形態の第1の局面では、
(i)任意で誘導体化されたグリコペプチド系抗生物質；
(ii)ナノ粒子；および
(iii)(i)と(ii)を連結する第1のリンカー
を含む構築物が提供される。
【０００７】
この局面の構築物は、以下の一般構造:
A-L1-N
を有してもよく、
式中、
Aは、任意で誘導体化されたグリコペプチド系抗生物質であり、
L1は第1のリンカーであり、
Nはナノ粒子である。
【０００８】
AとL1とNとの間の連結は直接的な連結でもよく、間接的な連結でもよい。
【０００９】
第1の局面の好ましい態様において、前記構築物は、
(i)任意で誘導体化されたグリコペプチド系抗生物質；
(ii)ナノ粒子；
(iii)(i)に連結された第1のリンカー；および
(iv)(ii)に連結された第2のリンカー
を含み、(iii)は(iv)に連結され、(i)は(ii)に連結されている。
【００１０】
この態様の構築物は、以下の一般構造:
A-L1-L2-N
を有してもよく、
式中、
Aは、任意で誘導体化されたグリコペプチド系抗生物質であり、
L1は第1のリンカーであり、
L2は第2のリンカーであり、
Nはナノ粒子である。
【００１１】
AとL1との間の連結；L1とL2との間の連結；およびL2とNとの間の連結は、直接的な連結でもよく、間接的な連結でもよい。好ましい態様において、AとL1との間の連結は直接的な連結である。好ましい態様において、L1とL2との間の連結は直接的な連結である。好ましい態様において、L2とNとの間の連結は間接的な連結である。
【００１２】
適宜、第1の局面の構築物は、微生物またはその成分に結合するためのものであり、任意で誘導体化されたグリコペプチド系抗生物質は微生物またはその成分に結合する。
【００１３】
好ましくは、微生物はグラム陽性細菌である。
【００１４】
いくつかの好ましい態様において、ナノ粒子は分離用ナノ粒子である。好ましくは、分離用ナノ粒子は磁性ナノ粒子である。
【００１５】
ある特定の好ましい態様において、任意で置き換えられるグリコペプチド系抗生物質は、バンコマイシン；テイコプラニン；オリタバンシン；テラバンシン；クロロエレモマイシン(chloroeremomycin)；およびバルヒマイシンからなる群より選択される。特に好ましい一態様において、グリコペプチド系抗生物質はバンコマイシンである。
【００１６】
一部の態様において、前記構築物の第1のリンカーは少なくとも部分的に親水性である。
【００１７】
第1のリンカーが少なくとも部分的に親水性である好ましい態様において、第1のリンカーはポリエチレングリコール(PEG)部分を含む。好ましくは、PEG部分は少なくともPEG3を含む。いくつかの特に好ましい態様において、PEG部分はPEG3またはPEG4である。
【００１８】
一部の態様において、前記構築物の第1のリンカーは疎水性である。
【００１９】
第1のリンカーが疎水性である一部の態様において、第1のリンカーは、4個より多い炭素の炭素直鎖を含む。好ましくは、炭素直鎖はC4〜C12である。特に好ましい一態様において、炭素直鎖はC8である。別の特に好ましい態様において、炭素直鎖はC11である。
【００２０】
好ましい態様において、第1のリンカーは1つまたは複数の窒素含有部分を含む。好ましくは、1つまたは複数の窒素含有部分にはアミン由来部分および/またはアジド由来部分が含まれる。
【００２１】
好ましくは、第1のリンカーは、このリンカーの第1の末端に窒素含有部分を含む。好ましくは、前記部分はアミン由来部分である。好ましくは、前記部分は前記リンカーをグリコペプチド系抗生物質に連結する。窒素含有部分は、第1のリンカーに対する前駆体の第1の末端に由来するアミン基と、グリコペプチド系抗生物質に由来するC末端カルボキシ部分との間に形成されたアミド結合でもよい。
【００２２】
好ましい態様において、第1のリンカーは、前記で示したように、第2のリンカーを介してナノ粒子に連結されている。好ましくは、第2のリンカーは有機分子である。これらの態様において、好ましくは、第1のリンカーは、第1のリンカーの第2の末端に窒素含有部分を含む。好ましい態様において、この部分はアジド由来部分である。好ましくは、第1のリンカーは、第1のリンカーのアジド由来部分を介して第2のリンカーに連結されている。好ましくは、第1のリンカーと第2のリンカーとの間の連結はトリアゾール部分を含む。適宜、トリアゾール部分は、第1のリンカーに対する前駆体の第2の末端に由来するアジド基と、第2のリンカーに対する前駆体のアルキン基との間で形成される。
【００２３】
いくつかの好ましい態様において、第2のリンカーはPEG基を含む。好ましくは、PEG基は少なくともPEG3である。いくつかの特に好ましい態様において、PEG基はPEG3またはPEG4である。
【００２４】
好ましくは、前記構築物のナノ粒子は不動態化されている。態様において、ナノ粒子はコーティングによって不動態化されている。好ましくは、コーティングはタンパク質またはポリマーコーティングである。
【００２５】
態様において、分離用ナノ粒子はヒト血清アルブミン(HSA)で不動態化されている。態様において、分離用ナノ粒子は、カルボキシメチル-PDEC-デキストラン(CMD)を用いたコーティングによって不動態化されている。態様において、分離用ナノ粒子は、PDEC-デキストランを用いたコーティングによって不動態化されている。態様において、分離用ナノ粒子は、PDEA-デキストランを用いたコーティングによって不動態化されている。
【００２６】
好ましくは、分離用ナノ粒子がコーティングによって不動態化されている態様において、第1のリンカーはコーティングを介してナノ粒子に連結されている。前記構築物が第2のリンカーを含む好ましい態様では、説明したように、第2のリンカーがコーティングに付着され、第2のリンカーに第1のリンカーが付着されている。
【００２７】
好ましくは、この局面の構築物は複数のグリコペプチド系抗生物質分子を含む。
【００２８】
好ましくは、この局面の構築物は、中程度または高い局所密度のグリコペプチド系抗生物質分子を有する
【００２９】
第2の局面において、(i)任意で誘導体化されたグリコペプチド系抗生物質；(ii)ナノ粒子；および(iii)第1のリンカーを入手する工程、ならびに(iii)を用いて(i)と(ii)を連結する工程を含む、構築物を作製する方法が提供される。
【００３０】
第2の局面の好ましい態様において、前記方法は、
(a)(i)任意で誘導体化されたグリコペプチド系抗生物質；(ii)ナノ粒子；(iii)第1のリンカー；および(iv)第2のリンカーを入手する工程；
(b)(i)を(iii)に連結する工程；
(c)(ii)を(iv)に連結する工程；ならびに
(d)(iii)を(iv)に連結する工程
を含む。
【００３１】
好ましくは、この局面の方法に従って作製された構築物は、第1の局面の構築物である。
【００３２】
第3の局面において、(i)任意で誘導体化されたグリコペプチド系抗生物質；(ii)ナノ粒子；および(iii)(i)と(ii)を連結する第1のリンカーを含む構築物を、微生物またはその成分に結合させる方法であって、
(a)構築物と微生物またはその成分とを組み合わせる工程；ならびに
(b)構築物のグリコペプチド系抗生物質を微生物またはその成分と選択的に結合させることによって、構築物を微生物またはその成分に結合させる工程
を含む、前記方法が提供される。
【００３３】
好ましくは、前記構築物は、第1の局面または第2の局面の構築物である。
【００３４】
第4の局面において、構築物を用いて、微生物またはその成分を試料から分離する方法であって、
(a)(i)任意で誘導体化されたグリコペプチド系抗生物質；(ii)ナノ粒子；および(iii)(i)と(ii)を連結する第1のリンカーを含む構築物を、微生物またはその成分を含有する試料と組み合わせる工程；
(b)微生物またはその成分を構築物のグリコペプチド系抗生物質に選択的に結合させる工程；ならびに
(c)ナノ粒子を用いて、微生物またはその成分に結合した構築物を試料から選択的に入手し、それによって、前記構築物を用いて、微生物またはその成分を試料から分離する工程
を含む、前記方法が提供される。
【００３５】
好ましくは、工程(a)の試料は、生物学的対象から得られた試料である。好ましくは、前記対象はヒトまたは動物である。一部の態様において、工程(a)の試料は、尿、血小板、血漿、および血清を含む、血液または血液製剤からなる群より選択される。
【００３６】
好ましい態様において、工程(a)の試料は血液試料である。好ましくは、血液試料は、凝集した赤血球を含むか、または赤血球凝集によって得られた試料である。好ましくは、血液試料はヒト血液である。
【００３７】
好ましくは、工程(a)の構築物は、第1の局面または第2の局面の構築物である。
【００３８】
好ましい態様において、工程(a)の構築物はグラム陽性細菌である。いくつかの好ましい態様において、前記微生物は病原性微生物である。
【００３９】
好ましくは、工程(c)は、磁性ナノ粒子である分離用ナノ粒子の磁気捕捉を用いて行われる。
【００４０】
第5の局面において、試料から得られた微生物またはその成分を分析する方法であって、
(a)(i)任意で誘導体化されたグリコペプチド系抗生物質；(ii)ナノ粒子；および(iii)(i)と(ii)を連結する第1のリンカーを含む構築物を、微生物またはその成分を含有する試料と組み合わせる工程；
(b)微生物またはその成分を構築物のグリコペプチド系抗生物質に選択的に結合させる工程；
(c)ナノ粒子を用いて、微生物またはその成分に結合した構築物を試料から選択的に入手し、それによって、微生物またはその成分を試料から入手する工程；ならびに
(d)微生物またはその成分を分析する工程
を含む、前記方法が提供される。
【００４１】
好ましい態様において、工程(a)〜(c)は、第4の局面について示された通りである。
【００４２】
この局面の方法によれば、前記微生物または成分の分析は、好ましくは、微生物の特定を含む。
【００４３】
この局面の方法に従う分析は任意の適切な戦略によるものでよい。いくつかの好ましい態様において、前記分析は、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化(MALDI)質量分析；蛍光に基づく分析；および核酸分析からなる群より選択される。一態様において、前記分析は、微生物の耐性プロファイルを決定する工程を含む。
【００４４】
いくつかの好ましい態様において、分析前に、前記微生物は前記構築物から取り出される。
【００４５】
第6の局面において、関心対象の微生物またはその成分の存在について試料をスクリーニングする方法であって、前記方法が、
(a)(i)任意で誘導体化されたグリコペプチド系抗生物質；(ii)ナノ粒子；および(iii)(i)と(ii)を連結する第1のリンカーを含む構築物を、試料と組み合わせる工程；
(b)ナノ粒子を用いて、構築物を試料から選択的に入手する工程；ならびに
(c)関心対象の微生物またはその成分が構築物に結合しているかどうか、または構築物に結合したかどうかを決定するために分析を行う工程
を含み、
関心対象の微生物またはその成分が構築物に結合しているまたは結合したと決定されることにより、試料が関心対象の微生物またはその成分を含有することが示され、関心対象の微生物またはその成分が構築物に結合していないまたは結合しなかったと決定されることにより、試料が関心対象の微生物またはその成分を含有しないことが示される、前記方法が提供される。
【００４６】
好ましくは、工程(a)の構築物は、第1の局面または第2の局面の構築物である。
【００４７】
好ましい一態様において、この局面に従う試料は、血漿または血小板などの血液製剤である。別の好ましい態様において、この局面に従う試料は尿試料である。
【００４８】
第7の局面において、生物学的対象における疾患、障害、または状態を診断する方法であって、第5の局面の方法に従って、対象から得られた生物学的試料において微生物を特定する工程、および微生物のアイデンティティー(identity)に基づき対象における疾患または状態を診断する工程を含む、前記方法が提供される。
【００４９】
好ましくは、疾患または状態はグラム陽性細菌によって引き起こされる。好ましい一態様において、疾患または状態はグラム陽性細菌感染症である。特に好ましい態様において、疾患または状態は敗血症または尿路感染症より選択される。
【００５０】
第8の局面において、疾患、障害、または状態を処置する方法であって、第7の局面の方法に従って疾患、障害、または状態を診断する工程、および診断に基づき疾患または状態を処置する工程を含む、前記方法が提供される。
【００５１】
第9の局面において、微生物を阻害する、制御する、または死滅させる方法であって、第1の局面の構築物を微生物と接触させることによって、微生物を阻害する、制御する、または死滅させる工程を含む、前記方法が提供される。
【００５２】
好ましくは、前記構築物を微生物と接触させる工程は、前記構築物のグリコペプチド系抗生物質を微生物に選択的に結合させる工程を含む。
【００５３】
好ましくは、微生物はグラム陽性細菌である。
【００５４】
ある特定の態様において、グラム陽性細菌は抗生物質耐性細菌である。ある特定の態様において、前記構築物のグリコペプチド系抗生物質が遊離抗生物質として存在する時に、前記微生物は、前記構築物のグリコペプチド系抗生物質に対して少なくとも部分的な耐性を示す。
【００５５】
第10の局面において、対象における疾患、障害、または状態を処置または予防するための、第1の局面の構築物を含む組成物が提供される。
【００５６】
第11の局面において、対象における疾患、障害、または状態を処置または予防する方法であって、有効量の第1の局面の構築物または第10の局面の組成物を対象に投与し、それによって、対象における疾患、障害、または状態を処置または予防する工程を含む、前記方法が提供される。
【００５７】
第12の局面において、本発明は、対象における疾患、障害、または状態を処置または予防するための組成物の製造における、第1の局面の構築物の使用を提供する。
【００５８】
好ましくは、第10〜第12の局面に従う疾患、障害、または状態は、グラム陽性細菌によって引き起こされる疾患である。いくつかの特に好ましい態様において、疾患は細菌敗血症である。別の特に好ましい態様において、疾患は尿路感染症である。
【００５９】
第13の局面において、本発明は、グリコペプチド系抗生物質の活性または効力を増大させる方法であって、第1のリンカーによってグリコペプチド系抗生物質をナノ粒子に連結する工程を含む、前記方法に関する。好ましい態様において、グリコペプチド系抗生物質、ナノ粒子、および第1のリンカーは第1の局面に示された通りである。
【００６０】
好ましくは、前記方法は、複数のリンカーによって、複数のグリコペプチド系抗生物質分子をナノ粒子に連結する工程を含む。これらの態様において、好ましくは、グリコペプチド系抗生物質は中程度または高い局所密度でナノ粒子に連結されている。
【００６１】
第2の広い形態の第1の局面において、本発明は、第1のリンカーに結合した、任意で誘導体化されたグリコペプチド系抗生物質を含む化合物に関する。この広い形態の化合物は、第1の広い形態の第1の局面の構築物を形成するためにナノ粒子に連結するのに適している。
【００６２】
好ましくは、第2の広い形態のグリコペプチド系抗生物質は、バンコマイシン；テイコプラニン；オリタバンシン；テラバンシン；クロロエレモマイシン；およびバルヒマイシンからなる群より選択される。好ましくは、グリコペプチド系抗生物質はバンコマイシンである。
【００６３】
いくつかの好ましい態様において、第2の広い形態の第1のリンカーはPEG基、好ましくは、少なくともPEG3を含む。
【００６４】
いくつかの好ましい態様において、第1のリンカーは炭素直鎖を含み、炭素直鎖はC4〜C12である。好ましくは、炭素直鎖はC8である。
【００６５】
好ましい態様において、第1のリンカーはアミン由来部分を含む。好ましくは、アミン由来部分は第1のリンカーの第1の末端にある。好ましくは、アミン由来部分は前記リンカーをグリコペプチド系抗生物質に連結する。連結はアミド結合でもよい。
【００６６】
好ましい一態様において、第1のリンカーはアジドまたはアジド由来アジド由来部分を含む。好ましくは、アジドまたはアジド由来部分はグリコペプチド系抗生物質とは反対のリンカーの第2の末端にある。
【００６７】
一部の態様において、前記化合物は第2のリンカーを含む。好ましくは、第2のリンカーは第1の局面について説明された通りである。
【００６８】
第2の広い形態の第2の局面において、第1のリンカーを介して、さらなるバンコマイシン部分に連結された、第2の広い形態の第1の局面の化合物を含む二量体化合物であって、グリコペプチド系抗生物質がバンコマイシンである、二量体化合物が提供される。
【００６９】
好ましい態様において、第2の広い形態のこの局面の二量体化合物は、それぞれの化合物のグリコペプチド系抗生物質がバンコマイシンである、第2の広い形態の第1の局面の2つの連結された化合物を含む。ある特定の態様において、2つの連結された化合物は、炭素直鎖および/またはPEG部分を含む部分を介して連結されている。
【００７０】
一部の態様において、第2の広い形態の第1の局面または第2の局面の化合物は、グリコペプチド系抗生物質と比べて高い活性または効力を有する。
【００７１】
第2の広い形態のさらなる局面は、グリコペプチド系抗生物質の活性または効力を増大させる方法であって、グリコペプチド系抗生物質を第1のリンカーに連結する工程を含む、前記方法を提供する。関連局面は、第1のリンカーによって、あるバンコマイシンと別のバンコマイシンを連結する工程を含む、バンコマイシンの活性または効力を増大させる方法を提供する。
【００７２】
不定冠詞「1つの(a)」および「1つの(an)」は、本明細書において、単数の不定冠詞であると解釈してはならず、不定冠詞が指している1つの対象の複数の対象、もしくは1つの対象より多くの対象を除外するとも解釈してはならないと理解される。例えば、「1つの(an)」抗生物質は、1つの抗生物質、1つもしくは複数の抗生物質、または複数の抗生物質を含む。
【００７３】
文脈上、他の意味が要求されない限り、本明細書で使用する「含む(comprise)」、「含む(comprises)」、および「含む(comprising)」という言葉は、述べられた整数または整数の集まりを含めるが、他の整数または整数の集まりを除外しないことを意味すると理解される。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
本発明が容易に理解され、実行に移され得るようにするために、一例として好ましい態様を添付の図面に照らして説明する。
【図１Ａ】本発明に従う好ましい構築物の合成の模式図を示す。
【図１Ｂ】本発明に従う好ましい構築物の合成の模式図を示す。
【図１Ｃ】本発明に従う好ましい構築物の合成の模式図を示す。
【図１Ｄ】本発明に従う好ましい構築物の合成の模式図を示す。
【図２】バンコマイシンへの第1のリンカーの付加を容易にするための潜在的な部位を示す。
【図３−１】N3-PEG3-Van(「N3-バンコマイシン」と表記した)のNMR特徴付けを示す。1H NMR(600MHz、DMSO-d6)および13C NMR(125MHz、DMSO-d6)。1略語br=ブロード(broad)；d=ダブレット(doublet)；m=マルチプレット(multiplet)；non=ノネット(nonet)；o=オブスキュアード(obscured)；quin=クインテット(quintet)；s=シングレット(singlet)；t=トリプレット(triplet)；v br=ベリーブロード(very broad)；q=カルテット(quartet)。
【図３−２】図３−１の続きの図である。
【図３−３】図３−２の続きの図である。
【図３−４】図３−３の続きの図である。
【図３−５】図３−４の続きの図である。
【図４−１】N3-PEG3-VanのLCおよび-MSを示す。
【図４−２】図４−１の続きの図である。
【図５】動的光散乱によって決定された、凝集した構築物および分散した構築物(NP)の割合を示す。
【図６】A)Ac-Kaa構造、B)N3-NBD構造、C)Fam-Kaa構造を示す。
【図７Ａ】Fam-Kaaの定量検量線を示す。
【図７Ｂ】溶出されたAc-KaaのLCMSの定量検量線を示す。
【図７Ｃ−１】溶出されたAc-KaaのLCおよび-MSを示す。
【図７Ｃ−２】図７Ｃ−１の続きの図である。
【図８】A)N3-NBD色素の蛍光シグナルによって測定した時のDBCO層形成の定量、B)Fam-Kaa結合に基づいた結合体化N3-PEG3-Vanの定量、N3-NBD蛍光によって検出した反応済みシクロオクチンの計算値、またはLCMSによって測定したAc-Kaaの結合、次に、溶出の間の比較を示す。
【図９】本発明の構築物を用いた細菌バイオセパレーションプロセスの模式図を示す。工程1-採血とその後のRBC凝集。工程2-本発明のグラム陽性特異的バイオセパレーション構築物を用いた細菌磁気捕捉と、その後の洗浄および妨害細胞除去。ある特定の用途の場合、このプロセスは、工程3-細菌溶出；工程4-完全な細菌溶解(と、任意で、シリカナノ粒子を用いたDNA捕捉)；ならびに/または工程5-DNA精製、濃度、および溶出をさらに含んでもよい。
【図１０】培養によって評価した時の、血小板からの黄色ブドウ球菌株(ATCC25923)および表皮ブドウ球菌(S.epidermidis)株(ATCC12228)の細菌捕捉効率を示す。前処理を全く行うことなく、血小板から、添加した細菌細胞を捕捉した。捕捉効率は極めて高く、試料に添加した本質的に全ての細菌を捕捉した。捕捉効率の計算値が100％を超えたことは、捕捉工程中に細菌が複製し、これにより、本発明のバイオセパレーション構築物によって新たな娘細菌細胞が捕捉できたためである。データは平均(n=3)±SDを表している。
【図１１】感受性グラム陽性株および耐性グラム陽性株を用いた血液溶液中での捕捉効率を示す。評価した全てのグラム陽性株について捕捉効率は高かった。いくつかの株について捕捉効率の計算値が100％を超えたことは、捕捉工程中に細菌が複製し、これにより、本発明のバイオセパレーション構築物によって新たな娘細菌細胞が捕捉できたためである。表皮ブドウ球菌株の捕捉効率は他の株よりもいくらか低く、高い局所密度の構築物を用いて、感受性株の効率は93％であり、耐性株の効率は77％であった。他の株については、データは低い局所密度の構築物のデータであった。全データは平均(n=3)±SDを表す。
【図１２】バイオセパレーション構築物を用いたグラム陰性大腸菌の捕捉を示す。バイオセパレーション構築物の特異性は高く、大腸菌の捕捉は約3〜4％しかなかった。全データは平均(n=3)±SDを表している。
【図１３Ａ】血球計および細菌培養によって測定した時の全血により誘導されたRBC凝集分析。四角:時間による、添加した全血試料における細菌数に対するRBC凝集の効果(n=3)。丸:時間による、血球計を用いて測定した全血試料におけるRBCおよびWBCの総数の減少(n=4)。データを平均±SDで示した。エラーバーの中には小さすぎてグラフの中で見えないものもある。
【図１３Ｂ】細菌のバイオセパレーションと、その後の細菌溶解、DNA捕捉、およびDNA精製の後に得られたDNA純度。103(cfu/mL)黄色ブドウ球菌を添加したヒト血液試料から得られたDNAのナノドロップ(Nanodrop)測定を示す。
【図１４】A)Qiagenキット(四角)による1μL 109cfu/mL肺炎連鎖球菌(S.pneumoniae)抽出DNAのqPCR CT値と、「Bac-ID」(丸)と呼ぶ本発明の構築物を用いた実施例2に記載のバイオセパレーションとその後のDNA抽出による1μLの109cfu/mL肺炎連鎖球菌抽出DNAのqPCR CT値、B)Qiagen DNeasy Blood and Tissue市販キットを用いた全血中のヒトDNA量(ナノドロップによる)と、Bac-ID法を用いた全血中のヒトDNA量(qPCRによる)の比較(n=4)、C)血中における、およびPBS緩衝液での検出限界におけるQiagen DNeasy Blood and Tissueキットの抽出効率の比較(DNeasy Blood and Tissueキットの最終溶出体積は200μLであり、Bac-ID試料の最終溶出体積は20μLであった)(n=3)を示す。血液試料によるQiagenキットの阻害を評価するために、109黄色ブドウ球菌(cfu/mL)の試料を評価したのはQiagenキットだけであった。Bac-ID法は少ない細菌数で高感度を保証するために開発されたので、高濃度(109黄色ブドウ球菌cfu/mL)の試料をBac-ID法によって評価しなかった。データを平均±SDで示した。エラーバーの中には小さすぎてグラフの中で見えないものもある。
【図１５】A)107、105、103(cfu/mL)、および細菌がない場合のBac-ID抽出細菌DNA(左Y軸)およびヒトDNA量(右Y軸)のqPCR分析(n=3)、B)Bac-IDを用いて、添加した血液から抽出した細菌DNAの感受性グラム陽性グラム陽性qPCR検出および耐性グラム陽性qPCR検出(n=3)、C)黄色ブドウ球菌qPCR CT値検出限界対添加した血液から抽出した培養による細菌細胞数(n=6〜8)、D)<5cfu/mLの6つの黄色ブドウ球菌レプリカ(replicate)試料のqPCR CT値(n=8)を示す。データを平均±SDで示した。エラーバーの中には小さすぎてグラフの中で見えないものもある。
【図１６】1mL血液および10mL血液からのBac-ID抽出細菌DNAのqPCR分析を示す。10mL試料からの102(cfu/mL)(四角)の抽出と並行して、102cfu黄色ブドウ球菌を添加し、1mL(丸)および10mL(三角)から抽出した(n=4)。グラフの中の星は平均を示す(n=4)。示したエラーバーは平均±SDである。
【図１７】Bac-IDを用いた1mLおよび10mLの血液試料抽出からの、増加したインキュベーション時間でのヒトDNA量比較を示す。
【図１８】リピドII末端D-アラニル-D-アラニン残基と、A)結合体化されていないバンコマイシン、B)低い密度のVan-NP、およびC)高い密度のVan-NPのうちの1つの分子との結合比を示した細菌膜損傷仮説。この図は、1分子の結合体化されていないバンコマイシンの結合能力と、局所密度が異なるVan-NPの間に違いがある理由を図示する。
【図１９】カップリングされたN3-PEG3-Vanに結合したFam-Kaaの蛍光、未反応のDBCOに結合したN3-NBDの蛍光、または結合体化されたN3-PEG3-Vanに結合し、次いで溶出しLCMSによって測定したAc-Kaaの濃度に基づく、局所密度が低い本発明の構築物、局所密度が中程度の本発明の構築物、および局所密度が高い本発明の構築物における結合体化されたバンコマイシンの概算値を示す。
【図２０】バンコマイシン感受性株およびバンコマイシン耐性株に対する、遊離バンコマイシン、N3-PEG3-Van(「N3-バンコマイシン」と表記した)、および実施例1に記載の構築物(「Van-NP」と表記した)のMIC値の比較を示す(n=3)。構築物のMIC値は、バンコマイシン密度およびナノ粒子数を考慮した結合体化バンコマイシン含有量の計算値に基づいたものである。
【図２１】4つの異なるVan-NP装填密度(loading density)を用いた、感受性黄色ブドウ球菌および耐性黄色ブドウ球菌を阻害するのに必要なNP濃度間の関係を示す。
【図２２】バンコマイシン装填密度が異なる構築物を対象にした、感受性黄色ブドウ球菌および耐性黄色ブドウ球菌に対するMIC値間の関係を示す。
【図２３】添加した合成Ac-Kaaの存在下での阻害活性阻止によって測定した時の、遊離バンコマイシン；N3-PEG3-Van(「N3-バンコマイシン」と表記した)；ならびに低い密度、中程度の密度、および高い密度のバンコマイシンを有する実施例1に記載の構築物(「Van-NP」と表記した)と細菌リガンドの結合親和性を示す(n=3)。
【図２４】バンコマイシン、および装填密度が異なる構築物(「Van-NP」と表記した)の存在下での、細菌に対するヨウ化プロピジウムの膜透過性を示す(n=3)。
【図２５−１】30分間(A)および90分間(B)インキュベートした後の、異なる局所密度のVan-NP、バンコマイシン、およびN3-バンコマイシンのDiSC3(5)膜透過蛍光値を示す。Van-NPおよびバンコマイシンをMIC濃度で使用した。HSA-NP、0.1％Triton-X、および滅菌水の対照を同じ条件でインキュベートした。(C)バンコマイシン、N3-バンコマイシン、および局所密度が異なるVan-NP(1XMIC)の存在下での、膜透過性を評価する、DiSC3(5)色素の正規化された蛍光値。データ(n=2)を平均±SDで示した。エラーバーの中には小さすぎてグラフの中で見えないものもある。
【図２５−２】図２５−１の続きの図である。
【図２６】高い密度のVan-NP(0.05μg/mL、MICより少ない)を用いて処理した後に破裂した細菌膜(矢印)の透過型電子顕微鏡画像(JEOL1011)(スケールバーは1μmである)を示す。
【図２７】バンコマイシンおよび密度が異なるVan-NP(1XMIC)の存在下での全細胞ATP漏出濃度を示す。全データ(n=2)を平均±SDで示した。エラーバーの中には小さすぎてグラフの中で見えないものもある。
【図２８】本発明の態様に従う、グリコペプチド系抗生物質と第1のリンカーを含む、ある特定の好ましい化合物の構造を示す。A)N3-C8-Van、B)N3-PEG3-Van。
【図２９】2組の本発明の磁性ナノ粒子と別個の蛍光ナノ粒子を用いたグラム陽性蛍光検出の説明図を示す。
【図３０】血液試料からの様々な濃度の黄色ブドウ球菌株の蛍光検出を示す(n=3)。
【図３１】本発明のバンコマイシン-リンカー-バンコマイシン二量体化合物を示す。
【図３２】本発明のバンコマイシン-リンカー-バンコマイシン二量体化合物の合成の模式図を示す。
【図３３】N3-PEG3-Van二量体(21a；「Vanco-PEG-3-Tz-6C二量体」と表記した)およびN3-C8-Van二量体(21b；「バンコ-8C-Tz-6C」二量体と表記した)を対象にし、遊離バンコマイシンと比較した様々なグラム陽性細菌株に対するMIC値の比較を示す。
【図３４】PCT/AU2015/050564に記載の結合体化プロセスの模式図を示す。
【図３５】ポリマー多層を形成するための、PDEAデキストランポリマーと磁性ナノ粒子およびナノゴールドの反応の模式図を示す。
【図３６】PDEAデキストランポリマーを用いた結合体化が行われたナノ粒子上でのFam-Kaa結合を用いたバンコマイシン表面濃度の評価を示す。(A)一様目盛、(B)対数目盛。
【図３７】A)PDEAデキストランポリマーを用いて機能を持たせたバンコマイシンナノ粒子、およびB)HSAを用いて機能を持たせたバンコマイシンナノ粒子を用いた黄色ブドウ球菌(ATCC25923)の捕捉を示す。これらのアプローチの両方を用いて機能を持たせたMNPは黄色ブドウ球菌を選択的に濃縮することに成功した。
【図３８】PEG3を含む第1のリンカー、C3を含む第1のリンカー、またはC8を含む第1のリンカーを有する構築物を対象にしたバンコマイシン表面濃度の尺度としてのFam-Kaa蛍光を示す。
【図３９】PEG3を含む第1のリンカー(A)、C8を含む第1のリンカー(B)、またはC3を含む第1のリンカー(C)を有する構築物を用いたグラム陽性細菌捕捉を示す。
【図４０】黄色ブドウ球菌、肺炎連鎖球菌、E.フェシウム(E.faecium)、およびE.フェカリス(E.faecalis)に対するバンコマイシンおよびバンコマイシン付加物N3-PEG3-Van、N3-C3-Van、およびN3-C8-Vanの最小阻止濃度(MIC)を示す。
【図４１】PDEAデキストランポリマーアプローチを用いて磁性ナノ粒子に結合体化されたN3-PEG3-Vanの模式図を示す。
【図４２】エルマン反応による磁性ナノ粒子表面にあるチオールの評価を示す。PDEAポリマーを後で付加してナノ粒子表面にポリマー単層を構築するために、MNPはシスタミン塩酸塩を用いて首尾良くチオール化された。
【図４３】ナノゴールドの吸光度スペクトルを用いた、多層ポリマー形成中の金取り込みの定性的評価を示す。多層作製に使用したナノゴールドは520nmで最大に吸収される。上清のODが減少することで、ナノゴールドがポリマー層に取り込まれたことが分かる。従って、このことは、効率的なブロッキングと、その後の結合体化のために磁性ナノ粒子表面にポリマー多層が形成されたことを間接的に保証する。
【発明を実施するための形態】
【００７５】
詳細な説明
本発明は、グリコペプチド系抗生物質とナノ粒子を含む構築物の設計および作製に関する。このような構築物は、バイオセパレーション用の構築物および抗菌活性のある構築物を含む。本発明はまた、このような構築物を形成するためのナノ粒子への連結に適した、第1のリンカーおよび/または第2のリンカーに結合した、任意で誘導体化されたグリコペプチド系抗生物質を含む、化合物または「付加物」にも関する。
【００７６】
本発明は、少なくとも部分的には、このような構築物が、生物学的試料中にある微生物を分離および/または検出を検出するのに重要な利益を提供し得るという認識に基づいている。さらに、本発明は、少なくとも部分的には、グリコペプチド系抗生物質とナノ粒子を含むこのような構築物が、対応する抗生物質そのものと比較して大幅に高い活性または効力を有し得るという驚くべき発見に基づいている。
【００７７】
本発明はまた、少なくとも部分的には、本明細書に記載の構築物を用いた、グラム陽性細菌の結合に驚くほど役に立つ設計パラメータの発見にも基づいている。特に、驚いたことに、グリコペプチド系抗生物質をナノ粒子に連結するために、ある特定のリンカーを使用することには、グラム陽性細菌に対する、このような構築物の結合効率にとって特別の利益があると見出された。結合効率への、このような利益は、本発明の構築物を用いて、グラム陽性細菌を試料から分離することへの利益、および/またはグラム陽性細菌に対する本発明の構築物の抗菌活性への利益につながり得る。
【００７８】
構築物
本発明の構築物は、ナノ粒子に連結された、任意で誘導体化されたグリコペプチド系抗生物質を含む。文脈上、他の意味が要求されない限り、本明細書で使用する「連結する」、「連結」、「連結された」などの用語は直接的な連結(例えば、直接的な結合)または間接的な連結(例えば、1つまたは複数の他の分子または部分を介した連結)を含むと理解される。
【００７９】
本発明の一局面は、(i)任意で誘導体化されたグリコペプチド系抗生物質；(ii)ナノ粒子；および(iii)(i)と(ii)を連結する第1のリンカーを含む構築物に関する。
【００８０】
本明細書で使用する「誘導体化された」グリコペプチド系抗生物質は、1つまたは複数の改変または変化、例えば、既存の官能基の変換および一時的な保護基の導入などを含むグリコペプチド系抗生物質を広範囲に含む。この用語はまた全ての塩形態と含むともみなされる。好ましくは、誘導体化されたグリコペプチド系抗生物質は、誘導体化されていない、または改変されていない対応するグリコペプチド系抗生物質の1つまたは複数の生物学的活性の少なくとも一部を保持する生物学的に活性な誘導体である。グリコペプチド系抗生物質の生物学的活性はグラム陽性細菌結合および/または抗菌活性を含んでもよいが、それに限定されるわけではない。
【００８１】
いくつかの好ましい態様において、誘導体化されたグリコペプチド系抗生物質は、1つまたは複数の生物学的活性の少なくとも10％；20％；30％；40％；50％；60；70％；80％；または90％を保持する。生物学的に活性な誘導体をもたらし得るグリコペプチド系抗生物質の改変の一例については、当業者は、参照により本明細書に組み入れられる、Malabarba et al. (1997) Medicinal Research Reviews, 17(1) 69-137に向けられる。
【００８２】
この局面の構築物は、以下の一般構造:
A-L1-N
を有してもよく、
式中、
Aは、任意で誘導体化されたグリコペプチド系抗生物質であり、
L1は第1のリンカーであり、
Nはナノ粒子である。
【００８３】
AとL1との間の連結およびL1とNとの間の連結は、前記のような直接的な連結でもよく間接的な連結でもよいと理解される。好ましい態様において、AとL1との間の連結は直接的な連結である。好ましい態様において、L1とNとの間の連結は間接的な連結である。
【００８４】
この局面の好ましい態様において、前記構築物は、
(i)任意で誘導体化されたグリコペプチド系抗生物質；
(ii)ナノ粒子；
(iii)(i)に連結された第1のリンカー；および
(iv)(ii)に連結された第2のリンカー
を含み、(iii)は(iv)に連結され、(i)は(ii)に連結されている。
【００８５】
この局面の構築物は、以下の一般構造:
A-L1-L2-N
を有してもよく、
式中、
Aは、任意で誘導体化されたグリコペプチド系抗生物質であり、
L1は第1のリンカーであり、
L2は第2のリンカーであり、
Nはナノ粒子である。  
【００８６】
AとL1との間の連結、L1とL2との間の連結、およびL2とNとの間の連結は、前記のような直接的な連結でもよく間接的な連結でもよいと理解される。好ましい態様において、AとL1との間の連結は直接的な連結である。好ましい態様において、L1とL2との間の連結は直接的な連結である。好ましい態様において、L2とNとの間の連結は間接的な連結である。
【００８７】
前記構築物のナノ粒子がコーティングで不動態化されている本発明の態様において、第1の局面の構築物は、以下:
A-V-L1-W-L2-X-P-Z-N
の通りに図示することができ、
式中、
Aは、任意で誘導体化されたグリコペプチド系抗生物質であり、
Vは、第1のリンカー(L1)をAに連結する、L1の官能基であり、
Wは、L1を第2のリンカー(L2)に連結する、L1の官能基であり、
Xは、L2をPに連結する、L2の官能基であり、
Pは不動態化コーティングであり、
Zは、PをNに連結する官能基であり、
Nはナノ粒子である。好ましくは、
Vはアミド結合を含み、
Wはトリアゾールを含み、
Xはアミド結合またはジスルフィド結合を含み、
Pはヒト血清アルブミン(HSA)またはポリマーコーティングを含み、
Zはアミド結合および/またはジスルフィド結合を含む。
【００８８】
または、ある特定の態様では、本発明の構築物は、以下:
A-V-R1-W-R2-X-N
の通りに図示することができ、
式中、
Aは、任意で誘導体化されたグリコペプチド系抗生物質であり、
V-R1-Wは、第1の末端にある官能基V、第2の末端にあるW、および内部部分R1を含む第1のリンカーであり、
R2-Xは、部分R2および官能基Xを含む第2のリンカーであり、
Nはナノ粒子である。好ましくは、
Vは、第1のリンカーをAに連結するアミド結合を含み、
R1は、PEGN部分(下記で説明する)および/または炭素直鎖を含み、
Wは、第1のリンカーと、第2のリンカーのR2を連結するトリアゾールを含み、R2は、PEGN部分および/または炭素直鎖を含み、
Xは、第2のリンカーをナノ粒子に連結する、アミド結合および/またはジスルフィド結合を含む。
【００８９】
特に好ましい本発明の構築物の構造は、以下:
A-V-PEG3-W-DBCO-Y-PEG4-X-P-Z-N
の通りに図示することができ、
式中、
A、V、W、X、およびNは、直前の態様について述べられた通りであり、
V-PEG3-Wは、第1の末端にあるV(アミド結合)および第2の末端にあるW(トリアゾール)ならびに内部PEG3部分を含む、第1のリンカーであり、
DBCO-Y-PEG4-Xは、第1の末端にあるジベンゾシクロオクチル(DBCO)-誘導体(これに関連して以下、DBCOと呼ぶ)および第2の末端にある官能基X(アミド結合)、内部PEG4部分、ならびにDBCOとPEG4の間に位置する部分Yを含む、第2のリンカーであり、
P-Z-Nは、不動態化されたナノ粒子(N)であり、Pは不動態化コーティングであり、Zは、PをNに連結する官能基である。
【００９０】
好ましくは、
アミド結合Xは、第2のリンカーを、不動態化されたナノ粒子の不動態化コーティングに直接連結し、
Yは、DBCOおよびPEG4を連結するアミド結合を含み、
Pはヒト血清アルブミン(HSA)であり、
Zは、NをPに直接連結するアミド結合を含む。
【００９１】
前記で示した形態A-V-PEG3-W-DBCO-Y-PEG4-X-P-Z-Nにおける構築物の例示的な態様を図1Dに示した。
【００９２】
この局面の範囲内にある別の代わりの構築物において、第1のリンカーは、不動態化されたナノ粒子およびグリコペプチド系抗生物質に直接連結されてもよい。この代わりの構築物の好ましい態様において、第1のリンカーは、ジスルフィド基を介して、不動態化されたナノ粒子に結合される。一部の態様において、第1のリンカーは、チオエーテル結合を介して、不動態化されたナノ粒子に結合される。このような一部の態様において、チオエーテル結合はポリマーコーティングのチオール基と、第1のリンカーに対する前駆体の第2の末端に由来するマレイミド部分との反応によって形成されてもよい。この代わりの構築物の好ましい態様は必ず第2のリンカーを含む必要があるとは限らないと理解される。
【００９３】
このような代わりの構築物の中には、
A-V-L1-U-P-Z-N
の一般構造を有するものがあってもよく、
式中、
Aは、任意で誘導体化されたグリコペプチド系抗生物質であり、
Vは、第1のリンカー(L1)をAに連結する、L1の官能基であり、
Pはポリマーコーティングであり、
Nはナノ粒子であり、
Uは、L1をPに連結するジスルフィド結合および/またはチオエーテル結合を含み、
Zは、NをPに連結するアミド結合および/またはジスルフィド結合を含む。
この構築物の範囲内にある、ある特定の態様は、
A-CONH-L1-U-P-SS-CH2CH2-NHCO-N；
A-CONH-L1-U-P-SS-PEG3-NHCO-N；および
A-CONH-L1-U-P-SS-N
を含む。
【００９４】
この局面の構築物の個々の成分(例えば、上記で示したL1；L2；A；およびN)をつなぐ官能基(例えば、上記で示したV、W、およびX)は、前記構築物の特定の成分の官能基であると、または前記構築物の特定の成分に属すると本明細書において説明されてもよいと理解される。この指定は、前記構築物を形成するのに使用され得る前駆体成分、例えば、本明細書において説明される好ましい態様における前駆体成分について限定するものではないと理解される。すなわち、官能基が、ある特定の成分に属するという説明は、その官能基と、その成分の前駆体との特定の関係を意味するものではない。
【００９５】
バイオセパレーション
本発明のいくかの好ましい構築物は、グラム陽性細菌などの微生物を試料から分離するために最適化され、本明細書において「バイオセパレーション構築物」と呼ばれることがある。いくつかの好ましい態様において、バイオセパレーション構築物は、グラム陽性細菌病原体をヒト血液試料から分離するために最適化され、ヒト血液試料は、血小板および血漿試料などの血液製剤を含むと理解される。いくつかの好ましい態様において、バイオセパレーション構築物は、グラム陽性細菌病原体を尿試料から分離するために最適化される。
【００９６】
しかしながら、本発明のこのようなバイオセパレーション構築物には、病原性グラム陽性細菌と非病原性グラム陽性細菌の両方を任意の適切な試料から分離するための用途があり得ると理解される。このような試料は、実験室試料、例えば、人工培養物；および環境試料、例えば、土壌および水試料を含んでもよい。このような試料また、植物および動物に由来する試料を含む任意の適切な生物学的試料を含んでもよい。
【００９７】
特に、ヒト試料の他に動物試料に関して、試料は、別の霊長類(例えば、類人猿およびサル)；イヌ；ネコ；有蹄類(例えば、ウマ、ウシ、およびブタ)；または鳥類に由来してもよいが、それに限定されるわけではない。動物は、家畜(例えば、ウマ、ウシ、およびヒツジ)、コンパニオンアニマル(例えば、イヌおよびネコ)、実験動物(例えば、マウス、ラット、およびモルモット)、または興行(performance)動物(例えば、競走馬、グレーハウンド、およびラクダ)でもよいが、それに限定されるわけではない。動物試料は哺乳動物種または非哺乳動物種の動物試料でもよい。
【００９８】
さらに、血液および尿試料の他に、動物試料は任意の適切な試料でよいと理解される。例えば、試料は、筋肉；上皮組織試料；結合組織試料；または神経組織試料を含む動物組織試料でもよい。
【００９９】
さらに、本明細書に記載のバイオセパレーション構築物は、主として、グラム陽性細菌の分離を目的とするが、グリコペプチド系抗生物質に結合する他の微生物の分離も本発明の範囲内にあると理解される。非限定的な例として、ある特定のグリコペプチド系抗生物質は真菌増殖を阻害することが示されているが、阻害機構(と、特に、これが、真菌成分との結合を伴うかどうか)は少なくとも多くの場合で今のところ分かっていない。
【０１００】
下記のように、この局面の好ましい構築物はリピドIIおよび/またはペプチドグリカンに結合し、任意で誘導体化されたグリコペプチド系抗生物質がリピドIIおよび/またはペプチドグリカンに結合する。リピドIIおよび/またはペプチドグリカンに結合する、この局面の、このような構築物は、典型的に、前記で示したようなグラム陽性微生物のバイオセパレーションに適しているが、このような構築物はまた、典型的に、起源に関係なく、リピドIIおよび/またはペプチドグリカンそのもののバイオセパレーションにも適していると容易に理解される。但し、前記構築物の任意で誘導体化されたグリコペプチド系抗生物質がリピドIIおよび/またはペプチドグリカンに接近し、結合することができるものとする。リピドIIおよび/またはペプチドグリカンは、微生物からの抽出などの任意の適切な手段によって、または合成生成によって入手または作製された後にバイオセパレーションされ得ると理解される。
【０１０１】
抗菌活性
本発明のいくかの好ましい構築物は、前記構築物のグリコペプチド単独と比較して抗菌活性または効力を増大させるか、または強化するために最適化される。このような構築物は本明細書において「抗菌性構築物」と呼ばれることがある。好ましいこのような抗菌性構築物は、グラム陽性細菌の阻害、制御、または死滅に最適化される。しかしながら、グリコペプチド系抗生物質の影響を受ける他の任意の微生物(例えば、ある特定の菌類)に対する活性の増加または強化も本発明の範囲内にあると理解される。
【０１０２】
本発明の一部の構築物はバイオセパレーション構築物と抗菌性構築物の両方であり得ると理解される。
【０１０３】
グリコペプチド系抗生物質
本明細書で使用する「グリコペプチド系抗生物質」は、(i)微生物に結合する少なくともいくらかの能力、および/または(ii)微生物の成長、増殖、もしくは生存を阻害する少なくともいくらかの能力を有するグリコシル化ペプチドだと理解される。本明細書で使用する、微生物の成長、増殖、および/または生存を阻害する能力は一般的に「抗菌」活性と呼ばれることがある。
【０１０４】
典型的に、グリコペプチド系抗生物質は環式ペプチドまたは多環式ペプチドを含む。グリコペプチド系抗生物質は、典型的には、微生物の非リボソーム起源と一致する特性を有する。しかしながら、起源に関係なく、全ての適切な化合物が、例えば、単離された天然化合物および合成により生成された化合物または組換え化合物が、本明細書において使用するグリコペプチド系抗生物質という用語に含まれると理解される。本発明の目的で、「単離された」とは、天然状態から取り出されている材料または他の方法でヒトによる操作に供されている材料を意味する。単離された材料は、天然状態で、その材料に通常付随する成分を実質的または本質的に含まなくてもよく、天然状態で、その材料に通常付随する成分と共に人工的な状態にあるように操作されてもよい。
【０１０５】
本発明の構築物のグリコペプチド系抗生物質は、好ましくは、グラム陽性細菌に結合する能力を有する。グリコペプチド系抗生物質は、典型的には、細菌細胞壁内のペプチドグリカンおよびペプチドグリカンのリピドII前駆体に結合すると当業者に理解される。典型的に、グリコペプチド系抗生物質はグラム陽性細菌に選択的に結合し、グラム陰性細菌に対する結合活性は少ないか、または無い。
【０１０６】
前記構築物のグリコペプチド系抗生物質は任意の適切なグリコペプチド系抗生物質でよい。態様において、グリコペプチド系抗生物質は、バンコマイシン；テイコプラニン；オリタバンシン；テラバンシン；ダルババンシン；クロロエレモマイシン；およびバルヒマイシンからなる群より選択される。特に好ましい一態様において、グリコペプチド系抗生物質はバンコマイシンである。
【０１０７】
典型的に、グリコペプチド系抗生物質によるグラム陽性細菌の細胞壁ペプチドグリカンの結合はかなり非種特異的または非株特異的に起こると理解される。すなわち、グリコペプチド系抗生物質は、一般的に、集団としてグラム陽性細菌に対して広範囲の結合活性を有する。さらに、グリコペプチド系抗生物質は、一般的に、グラム陽性細菌が抗生物質感受性か抗生物質耐性かに関係なくグラム陽性細菌に結合すると理解される。
【０１０８】
下記のように、ある特定の態様では、本発明の構築物(バイオセパレーション構築物と呼ばれる時もある)は、グラム陽性細菌を試料から得るように設計され、グリコペプチド系抗生物質がグラム陽性細菌を前記構築物に結合させる。このような態様では、グリコペプチド系抗生物質の結合は、結合したグラム陽性細菌の成長、増殖、または生存を阻害してもよく、阻害しなくてもよいと理解される。
【０１０９】
下記のように、本発明のバイオセパレーション構築物を用いて得られた微生物は任意の適切な下流用途に用いられ得る。一部の下流用途(例えば、ヌクレオチド配列決定)の場合、バイオセパレーション構築物を用いて得られた微生物の生存は下流用途にとって意義があまりなくてもよく、全くなくてもよいと理解される。他の下流用途の場合、生存可能な微生物または生存不可能な微生物が好ましい場合がある。従って、これらの態様の場合、関心対象の微生物の生存を維持するように最適化された適切な抗生物質が選択されてもよく、関心対象の微生物の生存を破壊するように最適化された適切な抗生物質が選択されてもよい。
【０１１０】
さらに、本発明のある特定の態様に従う構築物(抗菌性構築物と呼ばれる時もある)は、前記構築物のグリコペプチド系抗生物質が結合する微生物、典型的にグラム陽性細菌を阻害するか、または死滅させるように設計されていると理解される。従って、これらの態様の場合、関心対象の微生物に対して少なくとも部分的な抗菌活性を有するように最適化された適切な抗生物質が選択される場合がある。
【０１１１】
ナノ粒子
本発明の構築物のナノ粒子は様々な適切な形をとることができる。
【０１１２】
構築物がバイオセパレーション構築物である態様では、ナノ粒子は、試料からの前記構築物の分離を容易にするように設計される。このようなナノ粒子は「分離用ナノ粒子」と呼ばれることがある。本明細書で使用する「分離用ナノ粒子」という用語は、試料から選択的に取り出すのを可能にする適切な特性を有する任意のナノスケール粒子を指すと理解される。分離用ナノ粒子の適切な特性は、少なくとも部分的に、前記構築物が選択的に取り出される試料がどういったものかに左右される。適宜、分離用粒子は、試料の他の成分とは異なる構造的特性および/または化学的特性を有する。
【０１１３】
好ましくは、分離用ナノ粒子は磁性ナノ粒子である。磁性ナノ粒子は任意の適切な形をとってもよく、「磁性粒子(magnetic grain)」などの磁性成分を含有するナノ粒子を含むと理解される。このような磁性ナノ粒子は様々な適切な材料から形成することができる。磁性ナノ粒子において使用するための、いくつかの好ましい材料には鉄、ニッケル、およびコバルトが含まれるが、それに限定されるわけではない。本発明には「超常磁性」ナノ粒子が特に好ましい。このようなナノ粒子は、担体液体の中にある、小さな、熱によって攪拌される磁石を含む(「強磁性流体」として知られる)。超常磁性ナノ粒子の総説については、当業者は、Neuberger et al. (2005) Journal of Magnetism and Magnetic Materials. 293(1) 483-496(参照により本明細書に組み入れられる)に向けられる。
【０１１４】
典型的に、本発明の磁性ナノ粒子は直径が約1nm〜約500nmである。いくつかの好ましい態様において、前記構築物の磁性ナノ粒子の直径は、約75nm；100nm；125nm；150nm；175nm；200nm；225nm；250nm；および275nmを含む約50nm〜約300nmである。
【０１１５】
前記構築物が抗菌性構築物である本発明の態様において、ナノ粒子は、分離用ナノ粒子、例えば、上記のような磁性ナノ粒子でもよい。
【０１１６】
前記構築物が抗菌性構築物である好ましい態様において、ナノ粒子は、治療送達に適したナノ粒子である。これらの態様において、ナノ粒子は、生分解性ナノ粒子、例えば、タンパク質；多糖類；および合成生分解性ポリマーの1つまたは複数から形成された生分解性ナノ粒子でもよい。治療送達用のナノ粒子の概略については、当業者は、Nanoscale Materials in Targeted Drug Delivery, Theragnosis and Tissue Regeneration (Springer 2016, Sudesh Kumar Yadav Ed.)、およびその中にある「Biodegradable Nanoparticles and Their In Vivo Fate」(これは参照により本明細書に組み入れられる)を参照するように言われる。
【０１１７】
本発明の構築物のナノ粒子の表面は、適宜、前記構築物の別の成分へのナノ粒子の付着を可能にする1つまたは複数の官能基を含む。特に好ましい一態様において、官能基はカルボキシル基である。
【０１１８】
一部の態様において、官能基は、第1のリンカーへの分離用ナノ粒子の直接的な付着を容易にしてもよい。他の態様において、官能基は、第2のリンカーへの分離用ナノ粒子の直接的な付着を容易にしてもよい。
【０１１９】
特に好ましい態様において、分離用ナノ粒子は不動態化されている。これらの態様において、好ましくは、分離用ナノ粒子の表面の官能基はナノ粒子の不動態化を容易にする(例えば、図1を参照されたい)。分離用ナノ粒子の表面が不動態化されている本発明の好ましい態様では、不動態化によってナノ粒子の表面への非特異的結合が低減すると理解される。特に、本発明の構築物の分離用ナノ粒子の表面の不動態化によって、非グラム陽性細菌成分の非特異的結合が低減する場合がある。さらに、不動態化コーティングは複数の層を含んでもよいと理解される。
【０１２０】
不動態化は、典型的には、分離用ナノ粒子の表面のコーティングを介したものである。適宜、コーティングは、分離用ナノ粒子の表面にある官能基と反応させることで分離用ナノ粒子の表面に付着される。適宜、コーティング上にある官能基は、第1のリンカーまたは第2のリンカーへの分離用ナノ粒子の付着を容易にする。適切な官能基には、カルボキシル基、アミン基、チオール基、およびマレイミド基が含まれ得る。
【０１２１】
一部の態様において、コーティングはタンパク質コーティングである。特に好ましい一態様において、タンパク質コーティングはヒト血清アルブミン(HSA)である。この態様において、好ましくは、HSAはアミド部分を介してナノ粒子に付着されている(例えば、図1を参照されたい)。
【０１２２】
一部の態様において、コーティングポリマーコーティングである。態様において、ポリマーコーティングは、カルボキシメチル-PDEC-デキストラン(CMD)であるか、またはカルボキシメチル-PDEC-デキストラン(CMD)を含む。態様において、ポリマーコーティングは、PDEC-デキストランであるか、またはPDEC-デキストランを含む。態様において、ポリマーコーティングは、2-(ピリジニルジチオ)エタンアミン(PDEA)-デキストランであるか、または2-(ピリジニルジチオ)エタンアミン(PDEA)-デキストランを含む。態様において、ポリマーコーティングは、ナノ金属成分を含んでもよく、ナノ金属成分は、複数のポリマー層の結合において結合し得る。ポリマーコーティングは、アミド部分および/またはジスルフィド部分を介してナノ粒子に付着されてもよい。
【０１２３】
ポリマーコーティングが、ナノ金粒子の形をとるナノ金属成分と結合した複数のPDEA-デキストラン層を含有する特に好ましい態様を実施例7において説明する。
【０１２４】
第1のリンカー
本発明の構築物の第1のリンカーは、グリコペプチド系抗生物質とナノ粒子との間の連結を容易にする。
【０１２５】
驚くべきことに、ある特定の第1のリンカーを含む構築物はグラム陽性細菌との結合に有利なことが本発明について見出された。理論に拘束されるつもりはないが、実験観察に基づいて、少なくとも部分的に親水性の分子が、本発明の構築物を用いて捕捉するのに特に有効であり得ると考えられた。特に、部分的に親水性または親水性のリンカー、例えば、PEGを含むリンカーは、水性環境中であまり輪になることなく、または全く輪になることなく、グリコペプチド系抗生物質に長い、つなぎ鎖(tether)を提供し得る。
【０１２６】
第1のリンカーが少なくとも部分的に親水性である特に好ましい態様において、前記リンカーは、ポリエチレングリコール(PEG)基を含む。当業者により容易に理解されるように、PEG分子は、本発明の構築物のように、もっと大きな分子の内部にある時には、形態Ra-(O-CH2-CH2)n-で表されることがある。式中、「n」はPEG単量体の数であり、Raは、PEGを連結する炭素鎖である。本明細書で使用するPEG分子は形態「PEGN」で表されてもよく、式中、「N」はPEG単量体の数である。
【０１２７】
Raは、C2〜C4、またはより好ましくは、C2炭素直鎖を含むことが特に好ましい。このようなPEG含有部分は形態-(CH2)m(O-CH2-CH2)n-をとってもよく、式中、「m」は2〜4個の炭素であり、例えば、-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)3-である。炭素直鎖、例えば、C2鎖が隣接する、PEG部分の特定の側面または末端の決定は、PEG-炭素直鎖分子の「開始」すなわち「最初の末端」だとみなされる、組み合わされるPEG-炭素直鎖分子の末端によって決まる場合があると理解される。
【０１２８】
好ましくは、PEG基は、少なくともPEG3である。好ましくは、PEG基は、PEG4；PEG5；PEG6；PEG7；PEG8；およびPEG9を含むPEG3〜PEG10の範囲にある。いくつかの特に好ましい態様において、PEG基はPEG3またはPEG4である。
【０１２９】
部分的に親水性の第1のリンカーは、他の成分を含んでもよいと理解される。一部の態様において、部分的に親水性の第1のリンカーは疎水性成分を含んでもよい。一部の態様において、疎水性成分は炭素直鎖でもよい。炭素直鎖は、C3；C4；C5；C6；C7；C8；C9；C10；C11；C12；C13；およびC14を含むC2〜C15鎖でもよいが、それに限定されるわけではない。
【０１３０】
ある特定の疎水性リンカーも、本発明の構築物に従って適しているか、または望ましい場合がある。疎水性リンカーが用いられる場合、少なくとも、特定の直鎖の長さを含む分子の方が、本発明の構築物を用いて捕捉するのに有効な場合があると認められている。
【０１３１】
ある特定の態様において、前記リンカーは、少なくとも4個の炭素の炭素直鎖を含む疎水性分子である。好ましくは、炭素直鎖は、C5；C6；C7；C8；C9；C10；C11；C12；C13；C14；C15；C16；C17；C18；およびC19を含むC4〜C20であるか、または好ましくはC6〜C10である。
【０１３２】
一部の態様において、炭素直鎖は、C6〜C16；C6〜C14；C8〜C14；C8〜12；C8〜10；またはC10〜12でもよい。特に好ましい一態様において、炭素直鎖はC8である。別の特に好ましい態様において、炭素直鎖はC11である。炭素直鎖は、アルカン、アルケン、またはアルキンでもよいが、それに限定されるわけではないと理解される。
【０１３３】
理論に拘束されるつもりはないが、C8およびC11など直鎖の長さが長くなると、ナノ粒子とバンコマイシン構造の間の距離が広がると考えられている。これにより、付着された部分がバンコマイシン活性を破壊する可能性、および/またはバンコマイシンがナノ粒子特性に影響を及ぼす可能性が小さくなり得るという仮説が立てられる。
【０１３４】
第1のリンカーがグリコペプチド系抗生物質に直接連結されるか、または直接結合されることが本発明に従って好ましい(例えば、図1を参照されたい)。
【０１３５】
本発明の構築物の一部の態様において、第1のリンカーは、C末端カルボキシ部分；一次N末端部分または二次N末端部分；ヒドロキシル部分；フェノール部分；およびアミン部分からなる群より選択される部分との反応を介してグリコペプチド系抗生物質に連結されてもよい。好ましくは、第1のリンカーはアミド基を介してグリコペプチド系抗生物質に連結されている。
【０１３６】
好ましい態様において、第1のリンカーは、1つまたは複数の窒素含有部分を含む。窒素含有部分は任意の適切な部分でもよい。窒素含有部分は1つまたは複数の窒素を含有してもよい。いくつかの好ましい態様において、窒素含有部分は、1〜6個の窒素、または好ましくは1〜3個の窒素を含有する。窒素含有部分は直鎖部分でもよく、複素環式部分を含む環式部分でもよい。
【０１３７】
特に好ましい態様において、1つまたは複数の窒素含有部分は、アミン由来部分および/またはアジド由来部分を含む。アミン由来部分およびアジド由来部分とは、前記構築物にある関連する連結結合または連結部分の実際の官能基が何であっても、少なくとも部分的に、アミンまたはアジドを相補的な反応性官能基と一緒にすることによって得られたことが意図される。例えば、前記構築物にあるアミド結合は、アミンとカルボキシ基の反応から形成された可能性があるのでアミン由来部分と呼ぶことができる。この用語は、アミンまたは他の関連する基が、最終構築物を形成する反応の前に前記リンカー、グリコペプチド系抗生物質、またはナノ粒子に対する前駆体に存在した状況をカバーする。
【０１３８】
好ましくは、第1のリンカーは、このリンカーの第1の末端に窒素含有部分を含む。好ましくは、前記部分はアミン由来部分である。好ましくは、前記部分は前記リンカーをグリコペプチド系抗生物質に連結する。好ましくは、連結は直接的な連結である。
【０１３９】
アミン由来部分は、前記構築物の一部を形成する別の成分と結合する時に、アミンから得られたと理解される。さらに、アミン由来部分の具体的なアイデンティティーは、典型的には、アミン由来部分と結合する前記構築物の成分によって決まると理解される。
【０１４０】
アミン由来部分がグリコペプチド系抗生物質のC末端カルボキシ部分によってグリコペプチド系抗生物質に結合する好ましい態様において、アミン由来部分はアミドである(例えば、図1を参照されたい)。
【０１４１】
アミン由来部分が第1級アミン基または第2級アミン基によってグリコペプチド系抗生物質に結合する一部の態様において、アミン由来部分は尿素である。
【０１４２】
アミン由来部分がヒドロキシル基またはフェノール基によってグリコペプチド系抗生物質に結合する一部の態様において、アミン由来部分はウレタンである。
【０１４３】
好ましくは、第1のリンカーはリンカーの第2の末端に窒素含有部分を含む。好ましい態様において、前記部分はアジド由来部分である。これらの態様において、好ましくは、アジド由来部分は、下記で説明するように前記構築物の第2のリンカーに連結されている。好ましくは、連結は直接的な連結である。
【０１４４】
アジド由来部分は、前記構築物の別の成分と結合する時にアジドから得られたと理解される。さらに、アジド由来部分の具体的なアイデンティティーは、典型的には、アジド由来部分と結合する前記構築物の成分によって決まると理解される。
【０１４５】
いくつかの好ましい態様において、アジド由来部分はトリアゾール部分である。好ましくは、トリアゾール部分は前記構築物の第2のリンカーに直接連結されている(例えば、図1を参照されたい)。図1を見たら、当業者は、第1のリンカー前駆体のアジド基(図1B)と、第2のリンカー前駆体のジベンゾシクロオクチル部分のアルキン基(図1C)を反応させることで、第1のリンカーのトリアゾール分子を形成できることを容易に理解する。
【０１４６】
さらに、もう一つの選択肢として、トリアゾール部分は、例えば、第1のリンカーの第2の末端に由来するアルキン基と、第2のリンカーに対する前駆体のアジド基との間に形成されてもよいことが容易に理解される。好ましくは、第1のリンカーおよび第2のリンカーの前駆体に由来するトリアゾールの形成は迅速な、または「クリック(click)」反応化学によって成し遂げられる(例えば、実施例を参照されたい)。トリアゾール形成の状況でのクリック化学を含むクリック化学の概要については、当業者は、参照により本明細書に組み入れられる、Kolb et al (2003) Drug Discovery Today, 8(24)1128-1137に向けられる。
【０１４７】
代わりの態様において、第1のリンカーは第1の末端および/または第2の末端にスルフィド部分および/またはマレイミド部分を含んでもよい。このような一部の態様において、第1のリンカーはスルフィドおよび/またはマレイミドを介して第2のリンカーに連結されている。このような一部の態様において、第1のリンカーはスルフィドおよび/またはマレイミドを介してナノ粒子に連結されている。
【０１４８】
第2のリンカー
前記構築物の特に好ましい態様において、第1のリンカーは、前記のように第2のリンカーを介してナノ粒子に連結されている。好ましくは、第2のリンカーは有機分子である。
【０１４９】
前記のような、いくつかの好ましい態様において、第2のリンカーは、アルキン部分を含む前駆体から形成することができる。特に好ましいこのような一態様において、アルキン部分は、ひずんだ(strained)シクロアルキンである。好ましくは、シクロアルキンはシクロオクチンである。好ましくは、シクロオクチンはジベンゾシクロオクチン(DBCO)である(例えば、図1を参照されたい)。前記のように、第1のリンカー前駆体のアジド基は第2のリンカー前駆体のアルキン基(例えば、ジベンゾシクロオクチンのアルキン基)と反応して第1のリンカーのトリアゾール部分を形成し得ると容易に理解される。この場合、第1のリンカーのトリアゾール部分は第1のリンカーおよび第2のリンカーを連結する(例えば、図1Dを参照されたい)。
【０１５０】
いくつかの好ましい態様において、第2のリンカーはPEG部分を含む。好ましくは、PEG部分は少なくともPEG3である。好ましくは、PEG基は、PEG4；PEG5；PEG6；PEG7；PEG8；およびPEG9を含むPEG3〜PEG10の範囲にある。いくつかの特に好ましい態様において、PEG基はPEG3またはPEG4である。
【０１５１】
第2のリンカーがアルキン由来部分(例えば、DBCO)およびPEG部分(例えば、PEG4)を含む特に好ましい態様において、アルキン由来部分はアミド含有直鎖有機分子を介してPEG部分に連結されている(例えば、図1Cおよび1Dを参照されたい)。好ましくは、第1のアミド結合は直鎖有機分子の第1の末端をアルキン由来部分に連結する。好ましくは、第2のアミド結合は直鎖有機分子の第2の末端をPEG部分に連結する。
【０１５２】
好ましくは、第2のリンカーのPEG部分は前記構築物のナノ粒子のコーティングに結合される。好ましい態様において、PEG部分はアミド結合を介してナノ粒子のHSAコーティングに結合される(例えば、図1を参照されたい)。
【０１５３】
グリコペプチド系抗生物質の局所密度
この局面の構築物は、典型的には、1個のナノ粒子に結合した複数のグリコペプチド系抗生物質分子を含むが、それに限定されるわけではないと理解される。第1のリンカーが、ナノ粒子(または、好ましくは、そのコーティング)に付着された第2のリンカーにグリコペプチド系抗生物質を連結する態様において、典型的には、前記構築物は、ナノ粒子に付着された複数の第2のリンカーと、それぞれの第1のリンカーおよび第2のリンカーを介してナノ粒子に付着された複数のグリコペプチド系抗生物質を含む。
【０１５４】
ある特定の好ましい態様において、本発明の構築物は、ナノ粒子に結合したグリコペプチドの最小密度、すなわち、最小「局所密度」を有する。これに関連して「局所密度」とは、ナノ粒子の単位表面積あたりの、機能的に活性なグリコペプチド系抗生物質分子の数(分子/μm2)と定義される。
【０１５５】
ある特定の態様において、本発明の構築物は、約20；30；40；50；60；70；80；90；100；200；300；400；500；600；700；800；900；1000；2000；3000；4000；5000；6000；7000；8000；9000；10000；20000；30000；40000；50000；60000；70000；80000；および90000を含む、約10〜約100000分子/μm2の局所密度を有してもよい。
【０１５６】
一部の態様において、本発明の構築物の局所密度は、1μm2あたり100個以下〜約4000個の分子である。この範囲内の局所密度は「低い」局所密度と定義される。
【０１５７】
一部の態様において、本発明の構築物の局所密度は、1μm2あたり4000個超〜9000個未満の分子である。この範囲内の局所密度は「中程度の」局所密度と呼ばれる。
【０１５８】
一部の態様において、本発明の構築物の局所密度は、1μm2あたり9000個超〜約20000個の分子、またはさらに多くの分子である。この範囲内の局所密度は「高い」局所密度と呼ばれる。
【０１５９】
いくつかの特に好ましい態様において、本発明の構築物は中程度の局所密度を有する。いくつかの特に好ましい態様において、本発明の構築物は高い局所密度を有する。
【０１６０】
図20〜25に関連して実施例3に示したように、局所密度が中程度の構築物または高い構築物は、グラム陽性細菌との結合および/またはグラム陽性細菌の阻害について特に望ましい特徴を有する場合がある。
【０１６１】
バイオセパレーション方法
本発明の別の局面は、試料から微生物を得るための、本発明の構築物を使用するバイオセパレーション方法に関する。前記方法は、
(a)(i)任意で誘導体化されたグリコペプチド系抗生物質；(ii)ナノ粒子；および(iii)(i)と(ii)を連結する第1のリンカーを含む構築物を、微生物またはその成分を含有する試料と組み合わせる工程；
(b)グリコペプチド系抗生物質を介して構築物を微生物またはその成分に選択的に結合させる工程；ならびに
(c)ナノ粒子を介して、微生物またはその成分に結合した構築物を試料から選択的に入手し、それによって、微生物またはその成分を試料から入手する工程
を含む。
【０１６２】
前記構築物は、好ましくは、前記のようなバイオセパレーション構築物である。
【０１６３】
前記のように、ある特定の特に好ましい本発明の態様は、ヒト血液試料からのバイオセパレーションに関する。しかしながら、この局面の方法はこれに限定されず、潜在的に、前記のような植物および動物を含む生物学的試料の他に、実験試料または環境試料(例えば、汚染水試料)を含む任意の適切な試料と共に用いられてもよいと理解される。
【０１６４】
好ましくは、工程(a)の試料は、生物学的対象から得られた試料である。好ましくは、対象はヒトまたは前記のような動物である。好ましい一態様において、試料は尿である。別の好ましい態様において、試料は、血小板、血漿、および血清を含む、血液または血液製剤である。好ましくは、血液または血液製剤はヒト血液である。
【０１６５】
選択的な細菌捕捉を容易にするために、工程(a)の試料に、緩衝液などのさらなる試薬が添加されてもよいと理解される。
【０１６６】
工程(a)の試料が血液試料である、いくつかの好ましい態様において、血液試料は、凝集した赤血球(RBC)および/または白血球(WBC)を含む。これらの態様において、前記方法は、好ましくは、前記構築物を試料と組み合わせる前に、血液試料中の血球を凝集させる工程(ai)をさらに含む。
【０１６７】
本発明の構築物を用いたグラム陽性細菌の最適なバイオセパレーションを成し遂げるために、血液試料中にある血球の凝集が典型的に必要なことが決定されている。好ましい態様において、赤血球および/または白血球を凝集する工程(ai)は化学的凝集を含む。好ましくは、化学的凝集はデキストランポリマーの添加を含む。いくつかの好ましい態様において、化学的凝集はグルコースの添加を含む。
【０１６８】
ある特定の態様において、工程(ai)に従う化学的凝集は、約10:1〜約1:10の、0.1％D-グルコースを加えたデキストランポリマー溶液の添加を含む。好ましくは、この溶液は約1:1溶液である。一部の態様において、この溶液は、血小板添加溶液(SSP+)などの他の成分を含んでもよい。
【０１６９】
いくつかの好ましい態様において、化学的凝集は室温(約22℃)でのインキュベーションを含む。好ましくは、インキュベーションは、少なくとも、5分間；10分間；15分間；20分間；25分間；30分間；35分間；40分間；45分間；50分；55分間；または60分間にわたる。一部の態様において、インキュベーションは、少なくとも、2時間；3時間；4時間；または5時間にわたる。
【０１７０】
いくつかの好ましい態様において、化学的凝集は、血液試料中に溶解状態で存在する全RBC(すなわち、凝集していないRBC)を少なくとも70％；80％；90％；95％；または99％低減する。いくつかの好ましい態様において、化学的凝集は、血液試料中に溶解状態にある全WBC(すなわち、凝集していないWBC)を少なくとも70％；80％；90％；95％；または99％低減する。いくつかの特に好ましい態様において、化学的凝集は、血液試料中に溶解状態にあるRBCおよびWBCを少なくとも90％；95％；または98％低減する。
【０１７１】
本実施例に示したように、化学的凝集は、本発明の構築物を用いたバイオセパレーション前に血球を凝集させるのに極めて有効なことが示されている。さらに、物理的な凝集工程(例えば、遠心分離)も用いられる場合があるが、このような工程典型的に肉体労働を必要とし、自動化しにくい場合があるので好ましくないと理解される。さらに、遠心分離工程は高レベルの細菌細胞凝集をもたらし得る。
【０１７２】
上記のように、本発明の好ましい態様はグラム陽性細菌のバイオセパレーションに関する。好ましくは、この局面の方法の工程(b)に従って選択的に結合される微生物はグラム陽性細菌である。グラム陽性細菌は病原性細菌でもよく非病原性細菌でもよい。
【０１７３】
この局面の方法の工程(b)に関連して、「選択的に結合させる」または「選択的に結合された」などとは、微生物が、他の試料成分および/または微生物と比較して少なくとも部分的な特異性をもって結合されることを意味すると理解される。さらに、前記のように、グリコペプチド系抗生物質は、典型的には、(例えば、グラム陰性細菌、または非グラム染色細菌、または哺乳動物細胞と比較して)集団としてグラム陽性細菌に選択的に結合すると理解される。従って、文脈上、他の意味が要求されない限り、グラム陽性細菌への結合に関連して、「選択的に結合させる」などは、(特定のグラム陽性細菌種または株に結合するのではなく)少なくとも部分的な特異性をもって集団としてグラム陽性細菌に結合することを指す。
【０１７４】
好ましい態様において、工程(b)に従って結合される微生物は病原性グラム陽性細菌である。好ましくは、病原性グラム陽性病原性細菌は、バチルス属(Bacillus)；クロストリジウム属(Clostridium)；コリネバクテリウム属(Corynebacterium)；エンテロコッカス属；リステリア属；ブドウ球菌属；およびストレプトコッカス属からなる群より選択される。好ましくは、グラム陽性細菌は、球菌、例えば、ブドウ球菌属；またはストレプトコッカス属である。
【０１７５】
いくつかの好ましい態様において、ブドウ球菌属は黄色ブドウ球菌である。黄色ブドウ球菌は、グリコペプチド感受性株(例えば、ATCC25923)；MRSA株(例えば、ATCC43300)；グリコペプチド低感受性(glycopeptide-intermediate)(GISA)株(例えば、ATCC700698)；またはバンコマイシン耐性(VRSA)株(例えば、NARSA VRS4)でもよいが、それに限定されるわけではない。
【０１７６】
一部の態様において、ブドウ球菌属はS.エピダーミス(S.epidermis)である。S.エピダーミスは、グリコペプチド感受性株(例えば、ATCC12228)；またはグリコペプチド低感受性(GISE)株(例えば、NARSA NRS60)でもよいが、それに限定されるわけではない。
【０１７７】
いくつかの好ましい態様において、ストレプトコッカス属は肺炎連鎖球菌である。肺炎連鎖球菌は、グリコペプチド感受性株(例えば、ATCC33400)；またはグリコペプチド耐性株(例えば、ATCC700677)でもよいが、それに限定されるわけではない。
【０１７８】
一部の態様において、エンテロコッカス属はE.フェシウムである。E.フェシウムは、バンコマイシンA(VanA)耐性株(例えば、ATCC51559)またはバンコマイシンB(VanB)耐性株(例えば、ATCC51299)でもよいが、それに限定されるわけではない。
【０１７９】
好ましくは、この局面の方法の工程(c)は、微生物に結合した構築物中にある磁気分離用ナノ粒子を磁気的に捕捉するために磁場を用いて行われる。試料から磁性ナノ粒子を捕捉するための技法は当技術分野において広範囲にわたって述べられている。当業者は、参照により本明細書に組み入れられる、Magnetic Nanoparticles: From Fabrication to Clinical Applications (CRC Press, 2012, Nguyen TK Thanh Ed.)の中の「Ex-Vivo Application of MNP」に向けられる。一般的に、磁気捕捉のために、磁性ナノ粒子を引き付ける外部磁場を、磁性ナノ粒子を含有する試料に適用する。それによって、外部磁場は磁性ナノ粒子を引き付け、磁場に逆らってナノ粒子を安定させる。次いで、試料の他の成分を、典型的には、中身を空ける(tipping)、吸引する、または洗浄する(例えば、適切な緩衝液を用いて洗浄する)などの物理的手段によって除去することができる。
【０１８０】
この局面の工程(c)に従う分離用ナノ粒子の分離は、試料(例えば、ヒト血液または血漿試料)からの微生物(例えば、病原性グラム陽性細菌)の分離を容易にすると理解される。微生物がこの局面の方法に従って分離されると、潜在的に、任意の適切な下流用途のために使用することができる。適切な用途には、下記で説明する分析および/または微生物を増殖するための実験室での培養が、このようなことが望ましい場合に含まれるが、それに限定されるわけではない。
【０１８１】
微生物を分析する方法
さらなる局面において、本発明は、試料中の微生物またはその成分を分析する方法であって、
(a)(i)任意で誘導体化されたグリコペプチド系抗生物質；(ii)ナノ粒子；および(iii)(i)と(ii)を連結する第1のリンカーを含む構築物を、微生物またはその成分を含有する試料と組み合わせる工程；
(b)グリコペプチド系抗生物質を介して、構築物を微生物またはその成分に選択的に結合させる工程；
(c)ナノ粒子を介して、微生物またはその成分に結合した構築物を試料から選択的に入手し、それによって、微生物またはその成分を試料から入手する工程；ならびに
(d)微生物またはその成分を分析する工程
を含む、前記方法を提供する。
【０１８２】
適宜、この局面の方法に従う工程(a)〜(c)は、本発明に従うバイオセパレーション方法について上記で説明した通りである。上記のように、微生物は、好ましくは、グラム陽性細菌、好ましくは、病原性グラム陽性細菌であるが、それに限定されるわけではない。試料は好ましくはヒト血液または血漿試料であるが、それに限定されるわけではない。
【０１８３】
この局面の方法に従って行われる分析は任意の望ましい分析でよいと理解される。非限定的な例として、分析は、生化学的分析(例えば、微生物の組成の決定)；視覚的分析(例えば、微生物の電子顕微鏡)；または遺伝子分析(例えば、微生物の核酸配列または遺伝子発現分析)でもよい。
【０１８４】
この局面の方法によれば、分析は微生物の特定を含むことが特に好ましい。
【０１８５】
典型的に、この局面の方法は、分析前にバイオセパレーション構築物から微生物またはその成分を取り出す、さらなる工程を含むが、それに限定されるわけではない。
【０１８６】
いくつかの好ましい態様において、この局面に従う構築物からの微生物またはその成分の分離は、pHを下げる工程、および/または構築物を熱処理する工程を伴う。いくつかの好ましい態様において、pHの低下は、弱酸、例えば、酢酸；シュウ酸；リン酸；亜硝酸；フッ化水素酸；およびメタン酸の添加によって行われるが、それに限定されるわけではない。好ましくは、酸は酢酸である。好ましい態様では、pHを、約2を含む約1〜約3pH単位分だけ下げる。特に好ましい一態様では、pHを約7〜約4または約5下げる。
【０１８７】
いくつかの好ましい態様において、熱処理の温度は、約55℃；60℃；65℃；70℃；および75℃を含む約50℃〜約80℃である。好ましくは、熱処理は約65℃である。
【０１８８】
いくつかの好ましい態様において、熱処理の期間は、約10分；15分；20分；および25分を含む約5分〜約30分である。好ましくは、熱処理は約20分である。
【０１８９】
さらに、または代わりに、前記構築物からの微生物またはその成分の分離は、当技術分野において周知のような超音波処理を伴ってもよい。
【０１９０】
一部の態様において、この局面の方法は、分析前に微生物を溶解して内部成分を放出する、さらなる工程を含んでもよい。下記の核酸分析には、典型的には、分析前に微生物の溶解が必要とされる。
【０１９１】
微生物が核酸分析によって分析される態様では、前記方法は、下記で説明するようにDNA捕捉および/またはDNA精製のさらなる工程を含んでもよいと理解される。微生物が核酸分析によって分析される特に好ましい形態では、前記方法は、完全な細菌溶解(例えば、65℃、20分間の加熱を用いる)、細菌タンパク質変性(例えば、塩酸グアニジンを用いる)、ならびに磁性ナノ粒子を用いたDNA捕捉および/または磁性DNA精製のさらなる工程を含んでもよい。
【０１９２】
特に好ましい一態様において、この局面の方法に従う分析は質量分析法によって行われる。この局面に従って微生物を分析するための質量分析法の好ましい形は、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化(MALDI)質量分析法を使用する形である。典型的に、MALDI技法はMALDI-飛行時間型(TOF)法であるが、それに限定されるわけではない。当業者により理解されるように、MALDI分析中に試料は表面に沈着され、同時に付着されたマトリックスの結晶に取り込まれ、パルスレーザービームとの相互作用によってイオンが気相中に直接脱離される。次いで、イオンは、適切な質量分析計を用いて分析される。MALDIおよびMALDI-TOFの概要については、当業者は、参照により本明細書に組み入れられる、Karas et al.(2003) Chemical Reviews. 103(2) 427-440に向けられる。
【０１９３】
タンパク質の特定および特徴付けには、MALDI質量分析法アプローチが一般的に用いられる。「タンパク質」とはアミノ酸重合体を意味する。アミノ酸は、当技術分野においてよく理解されているような天然アミノ酸または非天然アミノ酸、D-アミノ酸またはL-アミノ酸でもよい。一部の態様では、微生物の特定には、MALDIまたはMALDI-TOF質量分析法による微生物のタンパク質特徴付けが用いられる。MALDIを用いてグラム陽性細菌などの微生物を特定するための様々なアプローチが開発されてきた。このアプローチは無傷の微生物細胞または微生物細胞抽出物のいずれかが関与してもよいと理解される。このようなアプローチの総説については、当業者は、参照により本明細書に組み入れられる、Singhal et al.(2015) Frontiers in Microbiology. 6 791に向けられる。MALDI質量分析法はまた、この局面に従って分析された微生物の耐性プロファイルを特定するのにも用いられる場合がある。
【０１９４】
別の特に好ましい態様において、この局面の方法に従う分析は核酸分析である。本明細書で使用する「核酸」という用語は、一本鎖または二本鎖のDNAおよびRNAを指定する。DNAはゲノムDNAおよびcDNAを含む。RNAは、mRNA、RNA、RNAi、siRNA、cRNA、および自己触媒RNAを含む。核酸はまたDNA-RNAハイブリッドでもよい。核酸は、A、G、C、T、またはU塩基を含むヌクレオチドを通常含むヌクレオチド配列を含む。しかしながら、ヌクレオチド配列は、イノシン、メチルシトシン、メチルイノシン、メチルアデノシン、および/またはチオウリジンなどの他の塩基を含んでもよいが、それに限定されるわけではない。
【０１９５】
核酸分析は、当技術分野において周知のようなヌクレオチド配列決定または遺伝子発現分析でもよい。この局面の方法に従って微生物を特定するには核酸配列決定が特に望ましい。
【０１９６】
当業者により容易に理解されるように、核酸配列決定のための様々な技法が存在する。これらの技法には、Sanger配列決定(Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences. 74(12) 5463-5467)およびその自動化バージョン、ならびに典型的に「次世代(Next Generation)」配列決定法(Mardis (2013) Annual Review of Analytical Chemistry. 6 287-303)と呼ばれる新技術が含まれる。最近、ナノポアシークエンス(nanopore sequence)、特に、Oxford Nanoporeシステム(「MinION」を含む)が、かなりの評価と、ヌクレオチド配列決定のための最適化を受けた。Oxford Nanopore MinIONシステムを用いた配列決定の概略については、当業者は、Lu et al (2016) Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 14(5) 265-279に向けられる。
【０１９７】
微生物がヌクレオチド配列決定を用いて特定される、この方法の態様によれば、ヌクレオチド配列決定は、次世代技法、例えば、ナノポア配列決定を用いる配列決定であることが特に好ましい。
【０１９８】
ナノポア配列決定、特に、MinIONシステムの特徴(迅速な配列決定および「リアルタイム」分析のための比較的小さなサイズおよび容積を含む)により、ナノポア配列決定は、診断分析、例えば、ヒト血液試料におけるグラム陽性細菌の特定に特に望ましい場合がある(この点に関する概要については、当業者は、参照により本明細書に組み入れられる、Pennisi (2016) Science. 351(6275) 800-801に向けられる)。従って、特に好ましい一態様では、ヌクレオチド配列決定はナノポア配列決定である。好ましくは、ナノポア配列決定は携帯型ナノポアシーケンサー、例えば、MinIONシステムを用いた配列決定であるが、それに限定されるわけではない。
【０１９９】
この局面の方法に従ってDNA分析およびRNA分析が両方とも適していると理解される。典型的に、RNA配列分析(「RNA-seq」と呼ばれる時もある)は、RNAテンプレートから作製されたcDNAを配列決定することによって行われる。ヌクレオチドの特定の他に、遺伝子発現分析のためにRNA配列決定またはcDNA配列決定を、これが望ましい場合に使用できると理解される。
【０２００】
さらに、この方法に従う核酸分析は核酸配列増幅が関与してもよいと理解される。本明細書で使用する「核酸配列増幅」には、例えば、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGYの第15章、Ausubelら編(John Wiley & Sons NY USA 1995-2001)に記載のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、鎖置換増幅(SDA)；例えば、国際出願WO92/01813および国際出願WO97/19193に記載のローリングサークル複製(RCR)；例えば、Sooknanan et al. 1994, Biotechniques 17 1077に記載の核酸配列ベース増幅(NASBA)；例えば、国際出願WO89/09385およびCURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGYの第15章、前記に記載のリガーゼ連鎖反応(LCR)；例えば、Tyagi et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 5395記載のQ-βレプリカーゼ増幅と、例えば、国際公報WO2004/02025に記載のヘリカーゼ依存増幅などの技法が含まれるが、これに限定されない。
【０２０１】
ある特定の次世代配列決定技法は核酸配列決定前に核酸配列増幅を伴う。様々な次世代配列決定アプローチに適用可能な特定の試料調製法が公知であり、広範囲にわたって、例えば、Illumina(http://www.illumina.com/techniques/sequencing/ngs-library-prep.htmlを参照されたい)；Pacific Biosystems(http://www.pacb.com/products-and-services/consumables/pacbio-rs-ii-consumables/sample-and-template-preparation-kits/)；およびApplied Biosystems(https://www.neb.com/applications/library-preparation-for-next-generation-sequencing/ion-torrent-dna-library-preparation)の知的財産権によって保護されている配列決定技術に利用可能な試料調製キット用の製造業者の説明書において説明されている。
【０２０２】
さらに、本発明に従う核酸配列分析には、典型的には、次世代配列決定技法が好ましいが、他の核酸分析技法も適している場合があると理解される。このような技法には、当技術分野において周知のような、関心対象の微生物を標的とするプライマーを用いた診断PCRおよびRT-PCR(核酸定量および/または遺伝子発現分析に使用することができる、リアルタイムRT-PCRまたはqPCRを含む)が含まれる。
【０２０３】
別の態様において、この局面に従う分析は、蛍光に基づく分析でもよい。
【０２０４】
好ましくは、これらの態様において、前記方法は、蛍光タグまたはプローブを微生物またはその成分に結合させる、さらなる工程を含む。蛍光タグまたはプローブは、好ましくは、微生物特異的リガンドに連結された蛍光分子または蛍光ナノ粒子を含む。
【０２０５】
態様において、蛍光ナノ粒子は蛍光色素を含む。特に好ましい態様において、蛍光ナノ粒子は量子ドットであるか、または量子ドットを含む。量子ドットを生物学的材料の蛍光検出に適用する総説については、当業者は、参照により本明細書に組み入れられる、Medintz et al (2005) Nature Materials, 4 435-446に向けられる。
【０２０６】
微生物特異的リガンドは任意の適切なリガンドでよい。好ましい態様において、微生物特異的リガンドは抗体である。
【０２０７】
一般的に、これらの態様では、本発明の構築物の結合に加えて、適切な微生物または成分が存在したら、微生物またはその成分に蛍光タグまたはプローブが結合する。それによって、微生物またはその成分の分析(例えば、特定)にタグまたはプローブからの蛍光シグナルを使用することができる。
【０２０８】
これらの態様に従って、蛍光タグまたはプローブは、任意の適切な段階で、例えば、工程(a)〜(c)のいずれかの間に、もしくは工程(a)〜(c)の前に、または工程(c)の後に微生物またはその成分および本発明の構築物と組み合わせることができると理解される。
【０２０９】
蛍光タグに結合したグラム陽性細菌に結合した本発明の構築物の模式図を図29に示した。
【０２１０】
さらに、適切な処置(例えば、抗生物質処置)を容易にするために、この局面に従う分析は微生物の耐性プロファイルの特定も伴ってもよいと理解される。抗生物質耐性プロファイルを決定するための技法は、当技術分野において周知である。例として、当業者は、参照により本明細書に組み入れられる、Reller et al (2009) Clinical Infectious Disease, 49(11) 1749-1755に向けられる。
【０２１１】
本発明のこの局面の範囲内にある、微生物捕捉および分析のある特定の例示的な態様は、参照により本明細書に組み入れられる、Hassan et al (2018) Biosensors and Bioelectronics, 99 (2018) 150-155に記載されている。
【０２１２】
試料または生成物をスクリーニングする方法
さらなる局面において、本発明は、関心対象の微生物またはその成分の存在について試料をスクリーニングする方法であって、前記方法が、
(a)(i)任意で誘導体化されたグリコペプチド系抗生物質；(ii)ナノ粒子；および(iii)(i)と(ii)を連結する第1のリンカーを含む構築物を、試料と組み合わせる工程；ならびに
(b)ナノ粒子を用いて、構築物を試料から選択的に入手する工程；ならびに
(c)関心対象の微生物またはその成分が構築物に結合しているかどうか、または構築物に結合したかどうかを決定するために分析を行う工程
を含み、
関心対象の微生物またはその成分が構築物に結合しているまたは結合したと決定されることにより、試料が関心対象の微生物またはその成分を含有することが示され、関心対象の微生物またはその成分が構築物に結合していないまたは結合しなかったと決定されることにより、試料が関心対象の微生物またはその成分を含有しないことが示される、前記方法を提供する。
【０２１３】
この局面に従う試料は、前記のような任意の適切な試料でよい。ある特定の好ましい態様において、この局面に従うスクリーニングは、対象、例えば、ヒトまたは動物対象に投与しようとする製品の微生物汚染の評価を目的としている。このような製品は、例えば、食品；美容製品；および薬学的製品または医学的製品を含む広範囲の製品のいずれでもよい。ある特定の態様において、スクリーニング前に、試料は、細菌と前記構築物のグリコペプチド系抗生物質との結合を妨害する成分を除去するように処理されてもよい。
【０２１４】
特に好ましい一態様において、この局面に従う試料は血液または血液製剤である。好ましい一態様において、この局面に従う試料は血漿製剤である。好ましい一態様において、この局面に従う試料は血小板製剤である。
【０２１５】
試料が、赤血球および/または白血球を含有する血液または血液製剤である態様において、好ましくは、赤血球および/または白血球は工程(a)の前に凝集される。
【０２１６】
疾患または状態を診断する方法
本発明の別の局面は、疾患または状態を診断する方法に関する。前記方法は、直前の局面について説明されたように、対象の試料中にある微生物を分析して病原体を特定する工程、および微生物のアイデンティティーに基づいて疾患または状態を診断する工程を含む。
【０２１７】
好ましくは、疾患または状態はグラム陽性細菌感染症である。好ましくは、病原性グラム陽性病原性細菌は、バチルス属；クロストリジウム属；コリネバクテリウム属；エンテロコッカス属；リステリア属；ブドウ球菌属；およびストレプトコッカス属からなる群より選択される。好ましくは、グラム陽性細菌は、球菌、例えば、ブドウ球菌属；またはストレプトコッカス属である。
【０２１８】
いくつかの好ましい態様において、ブドウ球菌属は黄色ブドウ球菌である。黄色ブドウ球菌は、グリコペプチド感受性株(例えば、ATCC25923)；MRSA株(例えば、ATCC43300)；グリコペプチド低感受性(GISA)株(例えば、ATCC700698)；またはバンコマイシン耐性(VRSA)株(例えば、NARSA VRS4)でもよいが、それに限定されるわけではない。
【０２１９】
一部の態様において、ブドウ球菌属はS.エピダーミスである。S.エピダーミスは、グリコペプチド感受性株(例えば、ATCC12228)；またはグリコペプチド低感受性(GISE)株(例えば、NARSA NRS60)でもよいが、それに限定されるわけではない。
【０２２０】
いくつかの好ましい態様において、ストレプトコッカス属は肺炎連鎖球菌である。肺炎連鎖球菌は、グリコペプチド感受性株(例えば、ATCC33400)；またはグリコペプチド耐性株(例えば、ATCC700677)でもよいが、それに限定されるわけではない。
【０２２１】
一部の態様において、エンテロコッカス属はE.フェシウムである。E.フェシウムは、バンコマイシンA(VanA)耐性株(例えば、ATCC51559)またはバンコマイシンB(VanB)耐性株(例えば、ATCC51299)でもよいが、それに限定されるわけではない。
【０２２２】
ある特定の態様において、疾患または状態は、呼吸器系の細菌感染症(例えば、肺炎)；消化管の細菌感染症(例えば、胃腸炎)；洞の細菌感染症(例えば、副鼻腔炎)；耳の細菌感染症(例えば、中耳炎)；神経系の細菌感染症(例えば、髄膜炎)；皮膚の細菌感染症(例えば、蜂巣炎)；または内分泌系の細菌感染症(例えば、細菌性膵炎)からなる群より選択されてもよい。
【０２２３】
特に好ましい一態様において、疾患または状態は菌血症である。別の特に好ましい態様において、疾患または状態は細菌敗血症である。好ましい一態様において、疾患または状態は、黄色ブドウ球菌によって引き起こされる細菌敗血症である。
【０２２４】
別の特に好ましい態様において、疾患または状態は尿路感染症である。
【０２２５】
好ましくは、対象は、ヒトまたは前記のような動物対象である。特に好ましい態様において、対象はヒトである。
【０２２６】
上記のように、菌血症および/または細菌敗血症の現行の診断方法は、通常、細菌培養に頼る(他の多くの細菌性疾患の現行の診断方法も細菌培養に頼る)。細菌培養を伴う方法は、培養および診断のための期間が、例えば10〜24時間とかなり長いことと、偽陽性率が比較的高いことを含めて重大な欠点を有する場合がある。
【０２２７】
本発明の態様は、試料中にある微生物もしくはその成分を特定する時間、および/またはこの特定に基づき疾患もしくは状態を診断する時間について特別な利点を有する場合がある。
【０２２８】
いくつかの好ましい態様において、本発明の直前の局面に従う微生物またはその成分の特定は、10時間未満；9時間未満；8時間未満；7時間未満；6時間未満；5時間未満；4時間未満；3時間未満；2時間未満；または1時間未満で行うことができる。
【０２２９】
いくつかの特に好ましい態様において、この局面の方法に従う疾患または状態の診断は、10時間未満；9時間未満；8時間未満；7時間未満；6時間未満；5時間未満；4時間未満；3時間未満；2時間未満；または1時間未満で行うことができる。
【０２３０】
本発明の態様は、試料中にある微生物を特定するための偽陽性率および/またはこの特定に基づく疾患もしくは状態の診断について特別な利点を有する場合がある。
【０２３１】
いくつかの好ましい態様において、直前の局面に従う微生物の特定の偽陽性率は10％未満；9％未満；8％未満；7％未満；6％未満；5％未満；4％未満；3％未満；2％未満；または1％未満である。
【０２３２】
いくつかの好ましい態様において、この局面の方法に従う疾患または状態の診断の偽陽性率は10％未満；9％未満；8％未満；7％未満；6％未満；5％未満；4％未満；3％未満；2％未満；または1％未満である。
【０２３３】
本発明の関連局面は、疾患または状態を処置する方法であって、前記のように疾患または状態を診断する工程、および診断に基づき疾患または状態を処置する工程を含む、前記方法を提供する。
【０２３４】
この局面の方法に従う適切な処置の特定の形は、診断された特定の疾患または状態に関連すると理解される。処置の特定の形はまた、疾患または状態の原因となる微生物の抗生物質耐性プロファイルと関連してもよく、これは、(例えば、本明細書に記載のような分析によって、または他の任意の適切な方法によって)決定される。
【０２３５】
典型的に、疾患がグラム陽性細菌感染症である好ましい態様において、処置は抗生物質の投与を含む。いくつかの好ましい態様において、抗生物質は、クロキサシリン；ジクロキサシリン；メトロシリン(methlocillin)；ナフシリン；オキサシリン；セファゾリン；セフォキシチン；セフロキシム；セフェピム；セフォペラゾン；セフォタキシム；セフタジジム；セフチゾキシム；セフトリアクソン；トリメトプリム；スルファメトキサゾール；アモキシシリン；クラブラン酸；ペニシリン；ペニシリンG；ストレプトマイシン；アモキシシリン；クリンダマイシン；ドキシサイクリン；エトロニダゾール(etronidazole)；リファンピン；リネゾリド；ダプトマイシン；ダルババンシン；オリタバンシン；テラバンシン；テジゾリド；セフタロリン；およびバンコマイシン、またはその組み合わせからなる群より選択される。いくつかの特に好ましい態様において、抗生物質はバンコマイシンである。
【０２３６】
疾患または状態が黄色ブドウ球菌感染である、ある特定の好ましい態様において、抗生物質は、トリメトプリム；スルファメトキサゾール；クリンダマイシン；バンコマイシン；ドキシサイクリン；ミノサイクリン；リネゾリド；リファンピン；ダプトマイシン；ダルババンシン；オリタバンシン；テラバンシン；テジゾリド；セフタロリン；またはその組み合わせからなる群より選択される。
【０２３７】
この局面の方法は、診断および初期処置、例えば、抗生物質の初期投与に要する時間について特別の利点を有する可能性がある。いくつかの好ましい態様において、この局面の方法に従う診断および初期処置は、10時間未満；9時間未満；8時間未満；7時間未満；6時間未満；5時間未満；4時間未満；3時間未満；2時間未満；または1時間未満で行うことができる。
【０２３８】
グリコペプチド系抗生物質-リンカー化合物
本発明はまた、第1のリンカーに結合した、任意で誘導体化されたグリコペプチド系抗生物質を含む、化合物または「付加物」も提供する。このような本発明の付加物は、前記のような構築物を形成するためにナノ粒子に連結するのに適している。
【０２３９】
好ましくは、このような付加物のグリコペプチド系抗生物質は、バンコマイシン；テイコプラニン；オリタバンシン；テラバンシン；クロロエレモマイシン；およびバルヒマイシンからなる群より選択される。好ましくは、グリコペプチド系抗生物質はバンコマイシンである。
【０２４０】
第1のリンカーは、好ましくは、前記のような第1のリンカーである。
【０２４１】
好ましくは、本発明のこの形態の第1のリンカーは、PEG部分、好ましくは、少なくともPEG3を含む。好ましくは、PEG基は、PEG4；PEG5；PEG6；PEG7；PEG8；およびPEG9を含むPEG3〜PEG-10の範囲のPEG基である。いくつかの特に好ましい態様において、PEG基はPEG3またはPEG4である。
【０２４２】
一部の態様において、前記リンカーは炭素直鎖を含み、好ましくは、炭素直鎖は、C4〜C15、例えば、C5；C6；C7；C8；C9；C10；C11；C12；C13；およびC14である。特に好ましい態様において、炭素直鎖はC8である。他の特に好ましい態様において、炭素直鎖はC11である。
【０２４３】
一部の態様において、前記リンカーは、C末端カルボキシ部分；一次N末端部分または二次N末端部分；ヒドロキシル部分；フェノール部分；およびバンコサミン部分からなる群より選択される部分を介して、グリコペプチド系抗生物質に連結されてもよい。
【０２４４】
好ましくは、前記リンカーはアミド結合を介してグリコペプチド系抗生物質に連結されている。
【０２４５】
好ましい態様において、前記リンカーは、1つまたは複数の窒素含有部分を含む。好ましくは、1つまたは複数の窒素含有部分には、アミン由来部分；アジド部分；アジド由来部分；およびトリアゾール部分からなる群より選択される部分が含まれる。
【０２４６】
好ましくは、前記リンカーは、この分子の第1の末端に窒素含有部分を含む。好ましくは、前記部分はアミン由来部分である。好ましくは、前記部分は前記リンカーをグリコペプチド系抗生物質に連結する。
【０２４７】
好ましくは、前記リンカーは、この分子の第2の末端に窒素含有部分を含む。一部の態様において、前記部分はアジド部分またはアジド由来部分である。
【０２４８】
いくつかの好ましい態様において、この局面の付加物は、前記のような第2のリンカーを含む。
【０２４９】
バンコマイシン-リンカー-バンコマイシン化合物
さらに、本発明は、第1の任意で誘導体化されたバンコマイシンが、リンカーによって、第2の任意で誘導体化されたバンコマイシンに連結されている二量体化合物を提供する。
【０２５０】
さらに具体的には、本発明は、前記化合物のグリコペプチド系抗生物質がバンコマイシンである、さらなるバンコマイシン部分に連結された直前の局面の付加物を提供する。好ましい態様において、本発明のこの局面の二量体化合物は、それぞれの化合物のグリコペプチド系抗生物質がバンコマイシンである、直前の局面の2つの連結された付加物を含む。
【０２５１】
ある特定の態様において、2つの連結された化合物は、炭素直鎖および/またはPEG部分を含む部分を介して連結されている。ある特定の態様において、前記部分は、それぞれの末端にアミド結合を含む炭素直鎖である。
【０２５２】
この局面の特に好ましい一態様を図31に示した。
【０２５３】
グリコペプチド系抗生物質の活性を増大させる方法
別の局面において、本発明は、グリコペプチド系抗生物質の活性または効力を増大させるか、または強化する方法であって、グリコペプチド系抗生物質を第1のリンカーに連結する工程を含む、前記方法を提供する。前記方法は、任意で、第1のリンカーを介してグリコペプチド系抗生物質をナノ粒子に連結するさらなる工程を含んでもよい。好ましい態様において、グリコペプチド系抗生物質、ナノ粒子、および第1のリンカーは、本発明の構築物について前記で説明された通りである。
【０２５４】
適宜、グリコペプチド系抗生物質を第1のリンカーに連結すると、前記のような付加物が形成される。適宜、グリコペプチド系抗生物質をナノ粒子に連結すると、前記のような構築物が形成される。
【０２５５】
好ましい態様において、グリコペプチド系抗生物質は、バンコマイシン；テイコプラニン；オリタバンシン；テラバンシン；クロロエレモマイシン；およびバルヒマイシンからなる群より選択される。特に好ましい一態様において、グリコペプチド系抗生物質はバンコマイシンである。
【０２５６】
好ましくは、グリコペプチド系抗生物質の活性または効力はグラム陽性細菌に向けられる。好ましくは、前記細菌は病原性グラム陽性細菌である。この局面に従う特に好ましいグラム陽性細菌は、本発明に従う疾患または状態を診断する方法について上記で説明された通りである。
【０２５７】
ある特定の態様において、グラム陽性細菌はバンコマイシン感受性細菌またバンコマイシン耐性細菌である。バンコマイシン耐性細菌は、VanA、VanB、VanC、VanD、またはVanE耐性細菌でもよい。好ましくは、バンコマイシン耐性細菌は黄色ブドウ球菌；E.フェシウム；およびE.フェカリスからなる群より選択される。ある特定の態様において、前記微生物は、遊離のグリコペプチド系抗生物質または連結されていないグリコペプチド系抗生物質に対して少なくとも部分的な耐性を示す。
【０２５８】
以下に示すように、驚くべきことに、グリコペプチドをリンカーに連結すると、もしくはリンカーを介してグリコペプチドをナノ粒子に連結すると、抗生物質の最小阻止濃度(MIC)が大幅に減少する、ならびに/または細菌膜に対する結合アビディティもしくは強度および細菌膜透過性が増加することが見出された。
【０２５９】
いくつかの好ましい局面において、抗生物質の活性または効力の増加または強化は、上記のようなグラム陽性微生物などの特定の微生物に対する抗生物質のMICの減少である。
【０２６０】
いくつかの好ましい態様において、MICの減少は、遊離抗生物質または連結されていない抗生物質と比べた、少なくとも1/5；1/10；1/15；1/20；1/25；1/30；1/35；1/40；または1/45の減少を含む、少なくとも約1/50〜1/2の減少である。
【０２６１】
好ましい態様において、前記方法は、リンカーを介してグリコペプチド系抗生物質をナノ粒子に連結する任意の工程を含まず、前記リンカーはC8炭素直鎖を含む。
【０２６２】
前記方法が、リンカーを介してグリコペプチド系抗生物質をナノ粒子に連結する任意の工程を含む好ましい態様において、リンカーはC8炭素直鎖またはPEG3部分を含む。
【０２６３】
微生物を阻害する方法
本発明の別の局面は、微生物を阻害する、制御する、または死滅させる方法であって、微生物を、前記のような本発明の構築物、付加物、または二量体と接触させ、それによって、微生物を阻害する、制御する、または死滅させる工程を含む、前記方法を提供する。
【０２６４】
好ましくは、微生物はグラム陽性細菌である。好ましくは、グラム陽性細菌は病原性グラム陽性細菌である。この局面に従う特に好ましいグラム陽性細菌は、本発明に従う疾患または状態を診断する方法について上記で説明した通りである。
【０２６５】
ある特定の態様において、グラム陽性細菌はバンコマイシン耐性細菌である。バンコマイシン耐性細菌は、VanA、VanBまたはVanC、VanDまたはVanE耐性細菌でもよい。好ましくは、バンコマイシン耐性細菌は黄色ブドウ球菌；E.フェシウム；およびE.フェカリスからなる群より選択される。ある特定の態様において、前記微生物は、遊離のグリコペプチド系抗生物質または連結されていないグリコペプチド系抗生物質に対して少なくとも部分的な耐性を示す。
【０２６６】
疾患を処置または予防するための組成物および方法
さらなる局面において、本発明は、対象における疾患、障害、または状態を処置または予防するための、前記のような本発明の構築物、付加物、または二量体を含む組成物を提供する。
【０２６７】
前記組成物は、適宜、1種類または複数種の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含有してもよい。「薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤」とは、全身投与において安全に用いられ得る、固体または液体の増量剤、希釈剤、またはカプセル化物質を意味する。
【０２６８】
特定の投与経路に応じて、当技術分野において周知の様々な担体を使用することができる。これらの担体は、糖、デンプン、セルロースおよびその誘導体、麦芽、ゼラチン、タルク、硫酸カルシウム、植物油、合成油、ポリオール、アルギン酸、リン酸緩衝液、乳化剤、等張食塩水および塩、例えば、塩酸塩、臭化物、および硫酸塩を含む鉱酸塩、有機酸、例えば、酢酸、プロピオン酸、およびマロン酸、ならびに発熱物質を含まない水を含む群より選択されてもよい。薬学的に許容される担体、希釈剤、および賦形剤について説明する有用な参考文献は、参照により本明細書に組み入れられる、Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co. N.J. USA, 1991)である。
【０２６９】
この局面に従う組成物の剤形には、錠剤、分散剤、懸濁液、注射剤、溶液、油、シロップ、トローチ、カプセル、坐剤、エアゾール剤、経皮パッチなどが含まれる。これらの剤形はまた、この目的専用に設計された徐放装置、またはこのやり方で付加的に働くように改変された他の形態の移植片を注射または移植する工程も含んでもよい。治療剤の徐放は、治療剤を、例えば、アクリル樹脂、ろう、高級脂肪族アルコール、ポリ乳酸およびポリグリコール酸、ならびにある特定のセルロース誘導体、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロースを含む疎水性ポリマーでコーティングすることによって行われてもよい。さらに、徐放は、他のポリマーマトリックス、リポソーム、および/またはマイクロスフェアを用いて行われてもよい。
【０２７０】
経腸投与、経口投与、または非経口投与に適した本発明の組成物は、カプセル、サシェ、または錠剤などの別個の単位として提示されてもよく、それぞれの単位は、散剤もしくは顆粒剤として、または水性液体、非水性液体、水中油型エマルジョン、もしくは油中水型液体エマルジョンに溶解した溶液もしくは懸濁液として、予め決められた量の1種類または複数種の本発明の治療剤を含む。このような組成物は任意の調剤方法によって調製することができるが、全ての方法は、上記のような1種類または複数種の薬剤を、1種類または複数種の必要な成分を構成する担体と結びつける工程を含む。一般的に、前記組成物は、均一かつ密接に本発明の薬剤を液体担体もしくは超微粒子状の固体担体またはその両方と混合し、次いで、必要であれば、生成物を望ましい提示物(presentation)に成型することによって調製される。
【０２７１】
疾患、障害、または状態の処置または予防を必要とする対象における疾患、障害、または状態を処置または予防する方法であって、前記のような、有効量の本発明の構築物、付加物、二量体、または組成物を対象に投与する工程を含む、前記方法も提供される。
【０２７２】
患者に本発明の構築物または組成物を提供するために任意の安全な投与経路を用いることができる。例えば、経腸経路、経口経路、直腸経路、非経口経路、舌下経路、頬経路、静脈内経路、関節内経路、筋肉内経路、皮内経路、皮下経路、吸入経路、眼内経路、腹腔内経路、脳室内経路、経皮経路などが用いられてもよい。
【０２７３】
前記構築物または組成物は、投与製剤と適合するやり方で、かつ薬学的に有効な量で投与することができる。本発明の文脈において、患者に投与される用量は、患者において、適切な期間にわたって有益な応答をもたらすのに十分なものでなければならない。投与される薬剤の量は、医師の判断によって決まる要因である年齢、性別、体重を含む処置しようとする対象、およびその身体全体の健康状態に左右されることがある。
【０２７４】
処置方法および薬学的組成物は、ヒトおよび非ヒト哺乳動物、例えば、家畜(例えば、ウマ、ウシ、およびヒツジ)、コンパニオンアニマル(例えば、イヌおよびネコ)、実験動物(例えば、マウス、ラット、およびモルモット)、ならびに興行動物(例えば、競走馬、グレーハウンド、およびラクダ)を含むが、それに限定されるわけではない哺乳動物の予防的処置または治療的処置に適用可能な場合があることも理解される。
【０２７５】
好ましくは、これらの態様に従う疾患または状態はグラム陽性細菌によって引き起こされる。この局面に従う特に好ましいグラム陽性細菌は、本発明に従う疾患または状態を診断する方法について上記で説明した通りである。
【０２７６】
ある特定の態様において、疾患または状態は、呼吸器系の細菌感染症(例えば、肺炎)；消化管の細菌感染症(例えば、胃腸炎)；洞の細菌感染症(例えば、副鼻腔炎)；耳の細菌感染症(例えば、中耳炎)；神経系の細菌感染症(例えば、髄膜炎)；皮膚の細菌感染症(例えば、蜂巣炎)；内分泌系の細菌感染症(例えば、細菌性膵炎)；または尿路の細菌感染症(例えば、尿路感染症)からなる群より選択されてもよい。
【０２７７】
特に好ましい一態様において、疾患または状態は菌血症である。別の特に好ましい態様において、疾患または状態は細菌敗血症である。これらの態様において、好ましくは、疾患または状態は、黄色ブドウ球菌または表皮ブドウ球菌によって引き起こされる細菌敗血症である。
【０２７８】
別の特に好ましい態様において、疾患または状態は尿路感染症である。好ましい態様において、疾患または状態は、黄色ブドウ球菌または表皮ブドウ球菌によって引き起こされる細菌敗血症である。これらの態様において、好ましくは、疾患または状態は、黄色ブドウ球菌または表皮ブドウ球菌によって引き起こされる尿路感染症である。
【実施例】
【０２７９】
実施例1.構築物の作製
本発明に従う構築物を図1に図示したように作製した。バンコマイシンのC末端カルボキシレートとアジド-PEG3-アミン(N3-PEG3-NH2)のアミンとの間でアミド結合を形成することによって、アジド-PEG3-アミンの第1のリンカーに付着されたバンコマイシンを合成した。この付加物を以下、N3-PEG3-Vanと呼ぶ。次いで、N3-PEG3-Vanを、下記で説明する第2のリンカーを介して磁性ナノ粒子にカップリングした。バンコマイシンとナノ粒子の首尾一貫したカップリングを確かなものにするために、下記のように、分子構築の各工程を注意深く特徴付けた。
【０２８０】
N3-PEG3-Vanの合成
バンコマイシンのリガンド結合領域はヘプタペプチドバックボーンにある。従って、バンコマイシンの結合能力を大幅に損なうことなくナノ粒子へのカップリングを容易にするために、この領域外の多数の領域に第1のリンカーを潜在的に付加することができると認識された(図2)。到達可能な官能基を有する部位には、C末端カルボキシ基、バンコサミンならびにN末端Leu第1級アミン基および第2級アミン基、ならびにヒドロキシル基およびフェノール基が含まれる。これらの部位は全て、バンコマイシン誘導体を作製するために以前に用いられている。
【０２８１】
本実施例のために、DMF中で、ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート(PyBOP)およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)の存在下で塩酸バンコマイシンをN3-PEG3-NH2と反応させる、N3-PEG3-NH2とバンコマイシンC末端カルボキシル基の間のアミドカップリングによってN3-PEG3-Vanを合成した。具体的には、ジメチルホルムアミド(DMF)(30mL)に溶解した、塩酸バンコマイシン(567mg、3.82x10-4mol)、PyBOP(219mg、4.20x10-4mol)、およびN3-PEG3-NH2(N3(CH2CH2O)3CH2CH2NH2、100mg、4.58x10-4mol)を溶解するまで攪拌した。N,N-ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)(532μL、3.05x10-3mol)を反応混合物にゆっくりと添加した。反応物を室温で2時間撹拌し、その後に減圧下で溶媒を除去した。他の標準アミド結合カップリング条件も使用することができる(図1を参照されたい)。
【０２８２】
前記化合物を調製用HPLCで精製して、白色固体としてN3-PEG3-Van(168mg、23％収率)を得た。調製用HPLCを調製用カラム(Agilent Eclipse XDB-フェニル、30x100mm、5μm粒径)と勾配溶出(流速20mL/min、室温。溶離剤として、水に溶解した0.05％ギ酸およびアセトニトリルに溶解した0.05％ギ酸を使用。勾配予定表:20分間にわたって5〜50％のB、洗浄液)を用いるAgilent Technologies(1260 Infinity)機器によって行った。結果として生じたN3-PEG3-VanをNMRおよびLCMSによって特徴付けた(図3〜4)。
【０２８３】
分離用ナノ粒子の調製
本実施例のために、カルボキシル化超常磁性170nmナノ粒子(EMD Millipore, M1-020/50)を前記構築物に使用した。生物学的液体の中に配置した時の非特異的相互作用を軽減するために(すなわち、ナノ粒子を不動態化するために)、カルボジイミドカルボキシル活性化によってナノ粒子表面にヒト血清アルブミン(HSA)の単層を結合させた。
【０２８４】
具体的には、製造業者に従って、カルボジイミドEDC(EDAC)およびスルホ-NHS(N-ヒドロキシスルホスクシンイミド)反応を用いて、超常磁性カルボキシル化ナノ粒子をヒト血清アルブミン(HSA)でコーティングした。HSAの量を[1]に従って求めた。簡単に述べると、500uLのカルボキシル化ナノ粒子の場合、両方とも6.25mgのスルホ-NHS(Thermo Scientific)およびカルボジイミドEDC(Chem-Impex International Inc)を氷冷MES(2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸ナトリウム塩)緩衝液pH5.0(Sigma Aldrich)に溶解した。15分後に、MPをPBSP(リン酸緩衝食塩水、0.1％ pluronic F-127(Sigma Aldrich))緩衝液で素早く洗浄し、次いで、PBSPに溶解した50mgのヒト血清アルブミン(HSA)(Sigma Aldrich)を添加し、混合しながら室温で2時間インキュベートした。次いで、ナノ粒子を洗浄し、PBSP緩衝液に懸濁した。
【０２８５】
ナノ粒子上にHSA層が生じたことをビシンコニン酸アッセイ(BCA)によってBCAキット(Thermo Scientific)を用いて評価し、標準HSAタンパク質(約2x106個のHSA分子/μm2)の希釈系列を用いて定量した。
【０２８６】
第2のリンカーと分離用ナノ粒子とのカップリング
不動態化された磁性ナノ粒子の表面にあるHSA分子を用いて、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)活性化ジベンゾシクロオクチン(DBCO)親水性PEGの形をした第2のリンカー前駆体を構築物のナノ粒子にカップリングした。具体的には、500μLのHSA-MP(50mg/mL)を、DMSOに溶解した12.5μLのNHS-PEG4-NH-CO-CH2-CH2-CO-DBCOリンカー(100mg/mL)と室温で2時間反応させることによって、不動態化されたHSAコーティングナノ粒子を(NHS)活性化NHS-PEG4-NH-CO-CH2-CH2-CO-DBCO(Click Chemistryツール)とカップリングし、次いで、洗浄した。第2のリンカーとカップリングした磁性ナノ粒子を以下、DBCO-PEG4-ナノ粒子と呼ぶ。
【０２８７】
1％DMSOに溶解した5μLのDBCO-PEG4-ナノ粒子を1μLのN3-NBD蛍光色素(0.1mg/mL、インハウス)と銅フリークリック化学でリン酸緩衝液中で37℃で1時間インキュベートして反応させることによって、DBCO層を定量した。次いで、フルオロフォアをカップリングしたナノ粒子をPBSPで3回洗浄し、最終体積として100μLに再懸濁し、蛍光を、Tecan M 1000 Proプレートリーダーによって460nmの励起、および540nmの発光で非結合ナノ粒子の陰性対照を用いて測定した。
【０２８８】
N3-PEG3-VanとDBCO-PEG4-ナノ粒子とのカップリング
最終構築物(本明細書ではVan-NPとも呼ぶ)を形成するために、N3-PEG3-VanをDBCO-PEG4-ナノ粒子に連結した(図1を参照されたい)。アジド基とアルキン基の環状付加からトリアゾール基を形成することによって2種類の成分が連結されるように、N3-PEG3-Vanのアジド基をDBCO-PEG4-ナノ粒子のDBCO(アルキン)基と反応させた。具体的には、NHS-PEG4-DBCOとカップリングした洗浄済みの磁性ナノ粒子(すなわち、DBCO-PEG4-ナノ粒子)を、PBSP中で、様々な濃度のN3-PEG3-Van(最終濃度0.125〜3mg/mL)と銅フリークリック化学で37℃で4時間インキュベートすることによって結合体化した。従って、本明細書に記載のように、磁性ナノ粒子を、第1のリンカーおよび第2のリンカーを介してバンコマイシンに連結した。
【０２８９】
DBCO-PEG4-ナノ粒子は、その表面に、複数のNHS-PEG4-DBCO含有第2のリンカーが付着されていると予想されたと理解される。さらに、最終バイオセパレーション構築物が、典型的には、複数のバンコマイシン分子とカップリングした1個のナノ粒子から成り立つように、複数の個々のN3-PEG3-Van第1のリンカーが、それぞれの第2のリンカーを介してDBCO-PEG4-ナノ粒子に結合していると予想されたと理解される。
【０２９０】
本実施例のために、バイオセパレーション構築物は、バンコマイシン分子の3つの異なる局所密度:高い密度；中程度の密度；および低い密度を用いて作製された。前記のように、これに関連して「局所密度」とは、単位表面積あたりの、機能的に活性な分子の数(バンコマイシン分子/μm2)と定義される。本実施例のために、ビーズが、表面粗さがほとんどない球体だと仮定すると、ビーズ1個あたりの表面積は約0.1μm2であった。
【０２９１】
局所密度を変えるために、DBCO-PEG4-ナノ粒子の量を一定に保ちながらN3-PEG3-Vanを異なるバッチで変えた。最初にナノ粒子と反応するNHS-PEG4-DBCOの量を変えることでも密度を変えることができると理解される。これらの実験の間に、高いバンコマイシン装填濃度では、可逆的なナノ粒子凝集が観察され、超音波に曝露することで凝集は簡単に消えた。動的光散乱(DLS)を用いて、連続的に増加するバンコマイシン装填の流体力学的体積の進化(evolution)をモニタリングし、それに応じて平均粒径が増加することが見出された(図5)。これらの観察はいずれも、バンコマイシンが高濃度(約745mol/dm3)でナノ粒子内二量体およびナノ粒子間二量体を形成する傾向があることに起因し得ると仮定された。
【０２９２】
局所密度を評価するために、未反応のDBCO分子(すなわち、DBCO-PEG4-ナノ粒子)にN3-NBDが結合する量を定量することによって、N3-PEG3-VanとDBCO-PEG4-ナノ粒子との結合効率を間接的に測定した(図6)。さらに、活性のある結合体化バンコマイシンを、2つの方法:1)バンコマイシン結合リガンドに付着されたフルオロフォア(カルボキシフルオレセイン、Fam)、Fam-Lys-D-Ala-D-Ala(Fam-Kaa；(Mimotopesが受注合成した。PBS中で100μg/mL)の蛍光測定、および2)バイオセパレーション構築物とインキュベートした後に溶出されたAc-KaaのLCMS分析を用いて機能的に定量した(図6)。Ac-Kaa(N-アセチル-L-Lys-D-Ala-D-Ala)は、グリコペプチド結合に関与するリピドIIのペプチド成分を模倣する合成バンコマイシン標的リガンドである。
【０２９３】
バンコマイシンカップリング効率の蛍光間接定量の場合、1μLのバイオセパレーション構築物(ナノ粒子濃度=25mg/mL)を200μLのFam-Kaa(100μg/mL)と回転しながら37℃で1時間インキュベートした。次いで、ナノ粒子をPBSPで3回洗浄し、最終体積として100μLのPBSPに再懸濁した。蛍光を、Tecan M 1000 Proプレートリーダーによって500nmの励起、および520nmの発光で測定した。これにより、バンコマイシンとカップリングしたDBCO分子の量を定量することができた。未反応のDBCO分子の初回測定から差し引くとDBCO分子/μm2の量が評価される。
【０２９４】
蛍光Fam-Kaa直接測定の場合、同様に、全てのVan-NPバッチからの一定量をFam-Kaaとインキュベートした。結合しなかった色素を複数の洗浄工程で除去し、次いで、洗浄されたナノ粒子の蛍光強度を参照曲線と比較することによって、ナノ粒子と共有結合した活性のあるバンコマイシンの表面密度を評価することができた(図7)。
【０２９５】
溶出されたAc-KaaのLCMS分析の場合も、25μLの調製済みバイオセパレーション構築物バッチ(ナノ粒子濃度50mg/mL)を25μLの過剰濃度のAc-Kaa(10mg/mL)と回転しながら37℃で1時間インキュベートした。次いで、ナノ粒子をPBSPで3回洗浄し、50μLの100mM HCLに再懸濁し、室温で15分間インキュベートした。次いで、上清をPBSPで1:1に希釈し、Ac-Kaaの濃度をLCMSで測定した(図7)。
【０２９６】
3種類全ての方法によってバンコマイシン局所密度定量から同様の結果が得られたが(図8)、Fam-KaaおよびN3-NBD蛍光に基づくアッセイの方が高感度であり、必要とされるNPは、それぞれ、LCMS方法の1/50および1/10であった。さらなる議論のために、Fam-Kaa測定に基づく局所密度について言及する。
【０２９７】
実施例2.構築物を用いたバイオセパレーションおよび細菌特定
本発明の構築物を用いる試料からのバイオセパレーションおよび細菌特定に使用した戦略の模式図を図9に示した。この戦略は、
(1)試料の収集および調製；および
(2)本発明のバイオセパレーション構築物を用いた細菌磁気捕捉と、その後の洗浄および妨害細胞の除去
の工程を含む。
【０２９８】
血液試料に対する、下記のような妨害細胞の除去に関して、妨害細胞(赤血球および白血球)の大部分が、凝集工程を含む工程(1)の間に除去される。次いで、工程(2)では、少量の残存している妨害ヒト細胞が除去される。
【０２９９】
工程2の後に、任意で、工程(3)細菌溶出が行われてもよい。
【０３００】
工程(2)または(3)の後に、前記のように任意の適切な戦略を用いて細菌を特定することができる。
【０３０１】
細菌DNAまたは他の細胞内容物を分析する用途、例えば、図9に図示したようにバイオセパレーション構築物を用いて捕捉した細菌のヌクレオチド配列を分析する用途の場合、戦略は、工程4および/または5:
(4)細菌溶解および細胞内容物の抽出；
(5)細胞内容物の精製
をさらに含んでもよい。
【０３０２】
本発明のバイオセパレーション構築物を用いたグラム陽性細菌のバイオセパレーションのための代表的な方法および結果の詳細を本実施例に示した。
【０３０３】
細菌株
以下のグラム陽性細菌株:黄色ブドウ球菌感受性(ATCC25923株)；黄色ブドウ球菌MRSA(ATCC43300株)；黄色ブドウ球菌GISA(ATCC700698株)；黄色ブドウ球菌VRSA(NARSA VRS4株)；スタフィロコッカス・エピダーミス(Staphylococcus epidermis)感受性(ATCC12228株)；S.エピダーミスGISE(NARSA NRS60株)；肺炎連鎖球菌感受性(ATCC33400株)；肺炎連鎖球菌耐性(ATCC700677株)のバイオセパレーションを評価した。
【０３０４】
細菌株をニュートリエントブロス(nutrient broth)上で37℃で培養し、OD600計算に基づいて、必要とされる濃度まで希釈した。OD600=0.5が109cfu/mLに対応すると仮定した。本発明の構築物を用いてバイオセパレーションを評価するための試料を調製するために、実施されている実験に応じて規定された量の細菌を試料に添加した。細菌装填(インプット)のレベルを検証するために、細菌細胞の副次試料(約100CFU)を栄養寒天上で培養した。
【０３０５】
血小板試料からの細菌のバイオセパレーション
実施例1に記載の構築物を用いた細菌のバイオセパレーション(この代わりに、本明細書では「細菌捕捉」または「細菌細胞捕捉」と呼ぶ)の効率を、黄色ブドウ球菌感受性および表皮ブドウ球菌感受性を含有する血小板試料において評価した。
【０３０６】
2μLの170nmバイオセパレーション構築物を、細菌を添加した各血小板試料に添加し、沈降を防ぐために回転/振盪しながら試料を37℃で1時間インキュベートした。チューブをマグネチックラック(magnetic rack)の上に2〜5分間置くことで、バイオセパレーション構築物に結合した細菌細胞を1mL試料体積から抽出した。次いで、バイオセパレーション構築物に結合した細菌を、滅菌PBSP(リン酸緩衝液食塩水、0.1％ pluronic F-127)で3回、磁気的に洗浄した。次いで、バイオセパレーション構築物を100μLの滅菌PBS緩衝液に再懸濁した。次いで、得られた細菌を栄養寒天上で培養し、37℃で24時間インキュベートした。
【０３０７】
バイオセパレーション効率を、cfu/mLの単位で、インプットプレートと比較したアウトプットプレートの計数コロニーの計算値に基づいて計算した。図10に示したように、バイオセパレーション効率は、評価した両細菌株について極めて高かった。
【０３０８】
血液試料からの細菌のバイオセパレーション
実施例1に記載の構築物を用いた細菌のバイオセパレーションの効率を、黄色ブドウ球菌感受性；黄色ブドウ球菌MRSA；黄色ブドウ球菌GISA；黄色ブドウ球菌VRSA；スタフィロコッカス・エピダーミス感受性；S.エピダーミスGISE；肺炎連鎖球菌感受性；および肺炎連鎖球菌耐性を含有する血液試料において評価した。
【０３０９】
これらの細菌を添加するための血液試料を調製するために、滅菌全血試料を1:1比のRBC凝集溶液(SSP+溶液に溶解した2％(w/v)デキストラン-T500、0.2％(w/v)D-グルコース)で処理し、室温で沈殿させた。次いで、1mLの上清血液溶液を、きれいな滅菌エッペンドルフチューブに移し、上記のように、インプット検証用に培養した細胞の副次試料を添加した。
【０３１０】
このアプローチを用いた凝集により妨害血球が低減した程度を決定するために、異なる時点で血液細胞内容物の数値に対する凝集の効果を血球計を用いて実施した。1mLあたりの全RBC数は10分で80％減少し、1mLあたりの全WBC数は20分で98％減少したことが観察された。さらに、インキュベーション時間を長くすると(30〜40分)、妨害細胞は99％細胞/mLまで減少した。本実施例の場合、20分の凝集を使用した。しかしながら、試料体積がもっと多ければ(例えば、10mLまたは20mL)、凝集時間を5時間まで延ばしてもよい。
【０３１１】
次いで、凝集後、バイオセパレーション構築物を細菌添加試料に添加し、捕捉のための処理を、血小板試料について上記で述べたように行った。バイオセパレーション効率を、血小板試料と同様にcfu/mLの単位で、インプットプレートと比較したアウトプットプレートの計数コロニーの計算値に基づいて計算した。血小板試料と同様に、図11に示したように、バイオセパレーション効率は、評価した全ての細菌株において極めて高かった。
【０３１２】
さらに、前記構築物を用いたグラム陽性細菌のバイオセパレーションの特異性を評価するために、グラム陰性である大腸菌(ATCC25922株)を添加した試料を、上記のように、試みられた細菌捕捉に供した。図12に示したように、グラム陰性大腸菌の非特異的捕捉は少なかった。
【０３１３】
細菌溶出
上記の試料に由来する、細菌に結合し、磁気的に分離した構築物を100μLの酢酸(100mM、pH4)に再懸濁し、65℃で20分間インキュベートした。溶液のpHを下げることで構築物から細菌を溶出した。20分間インキュベートした後に、磁場下で磁気分離するためにエッペンドルフをマグネチックラックの上に置き、上清を新しい滅菌エッペンドルフに移した。
【０３１４】
磁気的に捕捉した細菌細胞のレプリカを滅菌PBSPに再懸濁し、LB寒天プレート上で継代培養し、細菌数の対照として37℃で24時間インキュベートした。
【０３１５】
細菌溶解、DNA捕捉、およびqPCR検出
上記のように、一部の下流用途(例えば、ヌクレオチド配列決定)には細菌溶解とDNA捕捉が望ましい。本実施例のために、細菌溶解を、前記で示したように捕捉後に行い、その後に、溶解した細菌からDNAを入手および精製した。
【０３１６】
さらに、試料中のグラム陽性細菌から得られたDNAの効率を、(A)本発明の構築物による捕捉を用いた、本明細書に記載のプロセスに従うバイオセパレーションと、それに続く細菌溶解とDNA精製；(B)市販のQiagen「DNeasy Blood and Tissue」キットを用いたDNA抽出；ならびに(C)QiagenキットとPBS緩衝液を用いたDNA抽出との間で比較した。
【０３１７】
細菌溶解およびDNA抽出のために、溶出した細菌試料を65℃でさらに20分間、さらにインキュベートした。次いで、100μLの13MグアニジンHCl含有溶液(最終濃度: 6.5M Gu HCl(Sigma Aldrich)、10mM Tris HCl pH8.0(Invitrogen)、1mM EDTA pH8.0(Invitrogen)、5mM Tris塩基pH10.7(Astral Scientific))を添加した。混合後、6μLの磁性シリカ粒子(MagPrep(登録商標)Silica HS, Merck)を添加し、ボルテックスで混合し、回転しながら37℃で15分間インキュベートした。DNAに結合した磁性シリカを80％イソプロパノール(Merck)で2回、磁気的に洗浄した。次いで、20μLの100mM TrisHCl(pH9.0)を添加し、65℃で15分間インキュベートすることによってDNA溶出を可能にした。溶出した20μLのDNAを滅菌エッペンドルフに移し、-20℃で保管した。
【０３１８】
Qiagenキット(PBS緩衝液を使用する、またはPBS緩衝液を使用しない)を用いたDNA抽出を製造業者の説明書に従って行った。
【０３１９】
本明細書に記載のプロセスに従って捕捉した細菌DNAのレベルと、Qiagenキットを用いて捕捉した細菌DNAのレベルを評価および比較するために、qPCRを、細菌DNAに特異的なプライマーを用いて行った。さらに、それぞれのアプローチによって試料から捕捉したヒトDNAのレベルを定量した。
【０３２０】
具体的には、2μMプライマー濃度と、1μLのゲノムDNA(100ng/μL、対照)あるいは本明細書に記載のプロセスを用いて得られた試験DNA試料、またはQiagenキットとPBS緩衝液を用いて得られた試験DNA試料もしくはQiagenキットを用いて得られた試験DNA試料を含むマスターミックス(1X)中に、Sybrグリーン(SYBR(登録商標)Select Master Mix, Life Technology)を使用した。qPCRサイクルは、以下の通り:95℃10分、その後に、95℃15秒、55℃20秒、および72℃30秒の40サイクル、次いで、95℃15秒、60℃1分、および95℃15秒の融解サイクルであった。
【０３２１】
全ての結果を、黄色ブドウ球菌のゲノムDNAおよびヒトDNAの増幅された段階希釈液の検量線と比べて定量した。細菌を検出するために、Gmk遺伝子を、以下のプライマー
2020512285.tif 000003
によって増幅した。ヒトDNAを、同じプロトコールであるが、以下のプライマー:
2020512285.tif 000004
を用いて評価した。
【０３２２】
結果を図13〜17に示した。図13から明らかなように、高い純度および濃度のDNAを、バイオセパレーションと、その後の溶解とDNA処理(この代わりに、図面および本実施例では「Bac-ID」とも呼ぶ)によって得た。図14Aおよび図14Cから明らかなように、Bac-IDは、典型的には、Qiagenキットと緩衝液とを用いた抽出またはQiagenキットを用い緩衝液を用いない抽出よりも、黄色ブドウ球菌を添加した血液試料からグラム陽性細菌DNAを得るための感度が高かった。さらに、予想していた通り、Bac-IDによって、かなり低濃度のヒトDNAが生じた(図14Bおよび図17)。図14Cでは、血液試料によるQiagenキットの阻害を評価するために、Qiagenキットだけ109黄色ブドウ球菌(cfu/mL)の試料を評価した。本実施例では、高濃度(109黄色ブドウ球菌cfu/mL)の試料をBac-ID法で評価しなかった。
【０３２３】
さらに、図15Bから明らかなように、Bac-IDによって、本実施例のために評価した全ての種および株(すなわち、黄色ブドウ球菌感受性；黄色ブドウ球菌MRSA；黄色ブドウ球菌GISA；黄色ブドウ球菌VRSA；スタフィロコッカス・エピダーミス感受性；S.エピダーミスGISE；肺炎連鎖球菌感受性；および肺炎連鎖球菌耐性)からグラム陽性DNAが効果的に得られた。さらに、検出されたDNAの量は、試料に添加した細菌の量および濃度と相関した(図15Cおよび図16)。さらに、得られた細菌DNAの量についてのBac-ID法の同時再現性は高かった(図15D)。図16は、同じ抽出効率で、試料体積がもっと多い方法が適用可能なことを証明する。図17は、凝集時間を延ばすと、一部の用途において必要とされ得るヒトDNA量が減少することを証明する。
【０３２４】
実施例3.構築物の抗菌活性および結合活性
実施例1に記載のように作製された構築物を、バンコマイシン感受性黄色ブドウ球菌およびバンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌ならびにバンコマイシン耐性エンテロコッカス属(VRE)に対する最小阻止濃度(MIC)、結合アビディティ、および細菌膜透過性について評価した。驚くべきことに、下記で詳述するように、中程度の局所密度の構築物および高い局所密度の構築物は、感受性株および耐性株の両方に対して、かなり低いMICを示し、高い結合アビディティおよび細菌膜透過性も示すことが見出された。中程度の密度および高い密度のVan-NPは、細菌細胞壁上で複数の、強力に局在する結合事象を可能にするのに対して、この薬物が溶解状態にある時には、ブラウン拡散が結合事象を広い表面積にわたってランダム化するという仮説が立てられる。従って、ナノキャリア表面での高い薬物密度によって、急速な、かつ局在する膜損傷が引き起こされた(図18)。
【０３２５】
本実施例では、低いバンコマイシン局所密度の構築物、中程度のバンコマイシン局所密度の構築物、および高いバンコマイシン局所密度の構築物の最小阻止効果(minimum inhibitory effect)(MIC)(図19)をバンコマイシン感受性株および耐性株に対して評価した。MICを求めるためのバンコマイシン含有量は、実施例1に記載のFam-Kaaアッセイに基づいて計算した。バンコマイシン含有量は0.5〜30μg/mLであった。コーティングされたナノ粒子そのものが抗菌活性を有さないことを確認するために、MIC研究では、陽性対照として実施例1に記載のHSAコーティング磁性ナノ粒子(HSA-ナノ粒子)を使用した。
【０３２６】
中程度のバンコマイシン局所密度および高いバンコマイシン局所密度では、耐性株および感受性株それぞれに対して前記構築物による細菌増殖阻害が生じたのに対して、HSA-ナノ粒子を用いた時には微生物増殖に起因する濁りが観察された。注目すべきことに、本発明者らは、感受性黄色ブドウ球菌および耐性黄色ブドウ球菌ならびにVanAおよびVanB耐性エンテロコッカス属株に対して試験した時に、前記構築物を用いたMICにおいて、N3-PEG3-Vanと比較して14倍から＞100倍の改善、非改変バンコマイシンと比較して2倍から18倍の改善を観察した(図20および図21)。この著しいバンコマイシン効力強化から、細菌阻害は局所密度の影響を受け、上記の株に対する活性は遊離バンコマイシンと比較して大幅に改善したことが分かった。
【０３２７】
この現象をさらに調べるために、ある特定の局所密度のバンコマイシンについて、構築物内にあるナノ粒子の濃度を滴定し(200〜5mg/mL)、ある特定の局所密度のバンコマイシンについて細菌増殖を阻害するのに必要な構築物の濃度を計算した。結果から、バンコマイシン局所密度と、阻害に必要な構築物の数との間には間接的な関係があることが分かった。すなわち、バンコマイシン感受性株およびバンコマイシン耐性株の両方について、密度が大きくなるほど、必要とされる構築物は少なくなった(図21)。
【０３２８】
各株に対するMIC値を、結合体化バンコマイシン含有量に基づいて(バンコマイシン装填と、阻害に必要な構築物の数に基づいて)計算すると、MICは、局所密度が増加すると共に変化することが見出された(図22および表1)。バンコマイシン感受性黄色ブドウ球菌株(ATCC25923)の場合、低い密度(2.18x102バンコマイシン/μm2)では0.55μg/mLというMICが検出されたが、構築物の数は多かった(25mg/mLナノ粒子)。局所密度を2.41x103バンコマイシン/μm2または3.94x103バンコマイシン/μm2に上げるには、少ない数の構築物が必要とされ(それぞれ、15mg/mLおよび12.5mg/mL)、それぞれ、3.3μg/mLバンコマイシンおよび4.5μg/mLバンコマイシンに対応するMIC値が得られた。耐性黄色ブドウ球菌株(NARSA VRS-1)の場合、中程度の密度Van-NP(25mg/mLナノ粒子で6.28x103バンコマイシン/μm2)では12.4μg/mLバンコマイシンというMICが得られたのに対して、高い局所密度(17.5mg/mLナノ粒子で9.56x103バンコマイシン/μm2)では15.2μg/mLという高いMICが得られた。
【０３２９】
対照的に、低バンコマイシン密度構築物は、非常に多い数のナノ粒子を用いても耐性株の増殖を阻害することができなかった。この結果から、MIC値は、ナノ粒子表面でのバンコマイシン局所密度とナノ粒子数(従って、構築物の数)の結果であると証明される。この結果は、総合して、効率的に死滅させるための細菌膜上で起こる結合事象の数を表している。株の耐性プロファイルに応じて特定の局所密度が必要とされ、耐性が高い株では高い局所密度が必要とされる。しかしながら、ある特定の株の場合、局所密度が可能な限り小さくなると、(結合体化バンコマイシン含有量の計算値に基づいて)最も小さいMIC値が得られる。
【０３３０】
遊離バンコマイシンと比較して向上したバンコマイシン構築物の薬物効力の裏にある基本的機構を解明するために、細菌リガンド標的に対するバンコマイシン、N3-PEG3-Van、および構築物(Van-NP)の結合親和性をリガンド置換アッセイを用いて試験した。これにより、抗菌活性を抑止するには、どれくらいの競合Ac-Kaaリガンド濃度が必要かを評価することが可能になった。広範囲のAc-Kaaモル過剰の存在下で試験化合物を10倍のMICで評価した。Ac-Kaaによる置換は、リピドIIの天然細菌Kaa標的に対する親和性の違いを証明するために用いられる[4]-[5]。この実験のデザインは、バンコマイシン分子が細菌増殖を阻害するのではなくAc-Kaaとの結合に有利に働くのに必要なAc-Kaa濃度を計算することに基づいている。すなわち、必要とされるAc-Kaa濃度が高いほどバンコマイシン細菌結合親和性が大きい。
【０３３１】
結果から、バンコマイシン、N3-PEG3-Van、および低バンコマイシン密度構築物は細菌リガンドに対して同じ親和性を有し、>2倍モル過剰のAc-Kaa(バンコマイシン分子量に基づく)が細菌増殖をもたらすことが分かった(図23)。しかしながら、中程度のバンコマイシン密度構築物および高いバンコマイシン密度構築物は、細菌に結合するために、さらに強い親和性を示し、細菌阻害を克服するためには、それぞれ、>4および64モル過剰のAc-Kaaが必要である(図23)。これらの知見から、グリコペプチド系抗生物質構築物の局所密度の増加と細菌結合親和性の間には直接の関係があることが証明される。
【０３３２】
細菌細胞壁損傷の程度を決定するために、本発明者らは、ヨウ化プロピジウムの存在下で、黄色ブドウ球菌を、(MICの20倍の)バンコマイシンおよび(MICの10倍の)異なる局所密度の構築物とインキュベートし、蛍光を経時的に測定した。ヨウ化プロピジウム(PI)は、細菌核酸内容物に結合した時の蛍光増加によって細菌生存および膜完全性を評価する蛍光色素である[6]。注目すべきことに、バンコマイシンは10時間後に膜損傷を全く示さなかったのに対して、全ての局所密度の構築物が1時間のインキュベーション後にPI膜透過を示した(図24)。
【０３３３】
高い局所密度の構築物は、低い密度のVan-NPおよび中程度の密度のVan-NP(2200)と比較して多量の蛍光シグナル(2800)を示した。このことから、高度に局在する薬物によって、かなり多くの膜漏出が誘発されたことが分かる。驚くべきことに、低い局所密度の構築物は、早期の膜損傷(蛍光増加が他のVan-NP密度での20〜25分と比較して最初の5分で見られた)を引き起こした。これは、結合事象および結合反応速度の増加につながる、中程度の密度のVan-NPおよび高い密度のVan-NP(NP濃度:10mg/mL)と比較して多数のNP(NP濃度:25mg/mL)に起因するかもしれない。
【０３３４】
これらの結果から、複数のバンコマイシン分子が、同時に一点の表面領域において膜を局所的に、かつ激しく損傷させる高い結合アビディティを引き起こすという高い局所密度の構築物の膜損傷仮説が裏付けられる。この高い密度のVan-NPの膜損傷増加は、細胞壁が厚い耐性細菌に対する構築物親和性を高め、VanA耐性株およびVanB耐性株におけるリピドII標的リガンドの改変を補償する可能性が高い。
【０３３５】
要約すると、驚くべきことに、実施例1に記載の構築物において抗生物質がナノ粒子上に制御されて結合体化されることで、感受性株および耐性株の両方に対してMIC(結合体化された抗生物質含有量に基づく)が改善し、抗生物質効力が強化され、最適な局所密度は細菌株によって決まることが本実施例から明らかになった。前記構築物は細菌結合標的に対して親和性の増加を示し、高い局所密度の構築物は2時間でかなりの細菌膜損傷を誘導した。これと比較して、遊離抗生物質は10時間後でも損傷を示さなかった。結果として、容易に利用可能な抗生物質を生体適合性ナノキャリア上に固定化するようにナノテクノロジーを設計することによって、現行の抗生物質を用いてスーパーバグを標的化する新たな可能性がある。この発見は、薬物耐性に立ち向かうための潜在的影響力があり、新たな耐性機構の発生を阻止する可能性がある。
【０３３６】
実施例4.グリコペプチド系抗生物質およびリンカーを含む化合物
バンコマイシンとリンカーを含む、ある特定の化合物が設計されており、本明細書に記載の構築物を作製するための使用に特に有益だと考えられる。
【０３３７】
このような化合物の1つが、実施例1に記載のようなN3-PEG3-Vanである。N3-PEG3-Vanの構造を図28Bに示した。
【０３３８】
別のこのような化合物は、C8直鎖の形をしたリンカーと組み合わされたバンコマイシンであり、C8鎖の第1の末端にはアミン部分があり、第1の末端と反対の第2の末端にはアジド部分がある。アミン部分は、バンコマイシンとC末端カルボキシ部分によって直接連結されている(図28A)。この化合物を本明細書においてN3-C8-Vanと呼ぶ。
【０３３９】
実施例5.構築物を用いた蛍光細菌特定
本実施例では、蛍光カルボキシル化ナノ粒子(0.2μm青色蛍光粒子(365/415), Life Technology)を、前記で説明したようにHSAでコーティングした。次いで、500μLのHSA-MP(50mg/mL)を、DMSOに溶解した12.5μLリンカー(100mg/mL)と室温で2時間反応させることによって、蛍光NPをNHS-PEG4-アジドリンカー(Click Chemistryツール)とカップリングし、次いで、洗浄した。抗黄色ブドウ球菌抗体(Thermo Fisher)を、Zeba spin desalting column(MWCO 7KDa, Thermo Fisher)を用いて製造業者の説明書に従ってPBSに対して緩衝液交換した。20倍モル過剰のNHS-PEG4-DBCOリンカーを、緩衝液交換した抗体に添加し、室温で1時間インキュベートした。過剰なリンカーを除去し、抗体を、Zeba spin desalting columnを用いて精製した。次いで、DBCOによって改変された抗体をアジド蛍光ナノ粒子とカップリングし、37℃で3時間インキュベートした。抗体結合蛍光ナノ粒子を洗浄した。
【０３４０】
血液試料を前記のように凝集させ、102〜105cfu/mLの黄色ブドウ球菌(ATCC25923)濃度範囲を添加した(n=3)。添加した血液試料にVan-NP(2μL)および抗黄色ブドウ球菌抗体-蛍光NP(1μL)を添加し、サンドイッチを形成することで捕捉細菌を標識するために1.5時間インキュベートした(図29)。次いで、ナノ粒子に結合した細菌を洗浄し、100μLのPBSPに再懸濁し、蛍光を、Tecan M 1000 Proプレートリーダーによって365nmの励起、および416nmの発光で、添加していない試料である陰性対照を用いて測定した(図30)。LoD(検出限界)を以下の式:LoD=N+(3xSD)によって計算した。
【０３４１】
実施例6.バンコマイシン二量体の合成および評価
図32は、本発明のバンコマイシン-リンカー-バンコマイシン二量体の合成の模式図を提供する。PEGリンカーはアルキルリンカーと比較して親水性を改善するのに役立つ可能性があるので、N3-PEG3-Van(4)化合物(前記で説明した)はバンコマイシン二量体の調製に特に望ましいと考えられた。バンコマイシン二量体を作製するために、さらなるbis-アルキン部分(20)を利用して2つのN3-PEG3-Van化合物を一緒に連結した。bis-アルキン部分(20)を作製するために、アジピン酸(19)を、DMF中で、HCTUおよびDIPEAの存在下でプロパルギルアミンとカップリングした。次いで、DMF/t-BuOH/H2O中で触媒としてCuSO4、NaASb、およびHOAcを用いるCuAACによって、bis-アルキンリンカー(20)を過剰量のN3-PEG3-Vanとマイクロ波反応の下で50℃で30〜60分間反応させて、バンコマイシン二量体(21a)を得た。さらに、図32でさらに説明するように、同様のプロセスを用いて、N3-C8-Van(3)化合物(前記で説明した)を用いて二量体(21b)を作製した。
【０３４２】
図33に図示したように、様々なグラム陽性細菌種および株に対する二量体21aおよび21b(ならびに対照として遊離バンコマイシン)のMICを評価した。図33では、N3-PEG3-Van二量体(21a)を「バンコ-3PEG-Tz-6C二量体」と表記し、N3-C8-Van二量体(21b)をバンコ-8C-Tz-6C二量体と表記した。本実施例に従ってMIC評価に使用したプロトコールは以下の通りであった。細菌株をミュラー・ヒントンブロス(MHB)(Bacto laboratories、カタログ番号211443)中で37℃で一晩培養した。次いで、培養物を新鮮なMHBブロスで40倍希釈し、37℃で2〜3時間インキュベートした。前記化合物を、NBS 96ウェルマイクロタイタープレート(Corning 3461非結合表面)のウェルにわたって0.06μg/mL〜128μg/mLの濃度で2倍段階希釈し、2回繰り返してプレートした。結果として得られた対数期中期(mid-log phase)培養物を1x106CFU/mLまで希釈し、次いで、50μLを化合物含有96ウェルプレートの各ウェルに添加して、5X105CFU/mLの細胞密度と0.03μg/mL〜64μg/mLの最終化合物濃度を得た。プレートに蓋をし、37℃で22時間インキュベートした。MICを視覚で求めた。MICは、目に見える増殖を示さない最低濃度と定義した。反復の合計が4つになるように、2回繰り返す各評価を全て二度行った。試験プレートごとに一列の細菌だけの陽性対照と、培地だけの陰性対照を含めた。
【０３４３】
遊離バンコマイシンと二量体21aおよび21bの間には活性に違いがあることが観察された。注目すべきことに、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌VRS4 NARSAに対して二量体21aの活性増加(すなわち、MIC低下)が観察された(が、二量体21bでは観察されなかった)(図33)。さらに、二量体21aおよび二量体21bは両方ともバンコマイシン感受性E.フェシウム(ATCC35667株)およびE.フェカリス(ATCC29212株)に対して活性の増加(MICの低下)を示した(図33)。このことから、本発明の二量体には、少なくともある特定の状況での抗菌的使用に特別の利益があり得ることが分かる。
【０３４４】
実施例7.ポリマーを用いたグリコペプチド-リンカー付加物の結合体化
実施例1に示したHSAに基づく結合体化アプローチの他に、PCT/AU2015/050564に示したプロセスに従うプロセスを用いた磁性ナノ粒子へのN3-PEG3-Vanの結合体化も行われている(図34に図示した)。
【０３４５】
図35に示したように、PDEAデキストランポリマーをチオール化磁性ナノ粒子と反応させてナノ粒子表面に単層を形成した。次いで、ナノゴールド(741957, Sigma Aldrich)と、追加のPDEAデキストランポリマーを反応させてポリマー多層を形成した。その後に、上記および[7]と同様に、このポリマーコーティングナノ粒子にN3-PEG3-Vanを結合体化した。このポリマーアプローチを用いて磁性ナノ粒子に結合体化したN3-PEG3-Vanの模式図を図41に示した。
【０３４６】
材料および方法
-必要な材料
●MP:EMD Millipore, M1-020/50
●チオールPEGアミン(PG2-AMTH-5k, Nanocs)
●NHS-PEG-DBCO, ClickChemistryTools#AZ103
●緩衝液A:CHES, 100mM, pH9, 0.1％Pluronic F127
●緩衝液B:100mM MES pH5, 0.01％Pluronic F127
●緩衝液C:10 mM PBS pH7.4, 0.1％Pluronic F127
●シスタミン二塩酸塩、C121509 ALDRICH
●金ナノ粒子(741957, Sigma Aldrich)
●EDC(1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩), 77149, ThermoFisher Scientific
●スルホ-NHS(N-ヒドロキシスルホスクシンイミド), 24510, ThermoFisher Scientific
【０３４７】
-方法
1.COOH MNPのチオール化
-50mgのシスタミンを0.5mLの緩衝液Cに溶解する
-0.5mLのMPを低タンパク質結合エッペンドルフチューブに入れる
緩衝液Bで2回洗浄する。ソニックバスでしっかりと超音波処理する
-6.25mgのEDCおよび6.25mgのスルホ-NHSを、それぞれのエッペンドルフチューブに添加する。
両化合物とも感湿性であり、従って、グローブボックスの中で分取し、パラフィルムをはって冷凍庫/冷蔵庫の中で保管する。使用直前に、(氷上で)冷緩衝液Bで100mg/mLに希釈し、62.5μLを粒子に添加する
重要:最初にスルホ-NHSを入れ、次いで、EDCを入れる。少なくとも2分間、超音波処理する。
-オービタルシェーカー上で室温で15分間インキュベートする
-緩衝液Aで3回、素早く洗浄する
-500μLの以前に調製したシスタミンを添加し、4℃で3時間インキュベートする
-緩衝液Aで3回洗浄し、0.5mLの最終体積に懸濁する
-エルマン反応によって表面に作製したチオールを評価する
1.1エルマン反応を用いたMNP表面にあるチオール評価の手順
-5μLのチオール化MNPを250μLの10mM Tris pH7.5および5μLのエルマン試薬(Tris緩衝液中で10mM)に添加する
-RTで30分間インキュベートし、412nmで上清のODを読み取った後に、MNPを磁気的にプルダウンする
-システアミン塩酸塩を用いて作成した検量線と比較してチオールを定量する
2.ポリマー多層の作製
-1μLの13mg/mL PDEAポリマーを添加する
-RTで1時間インキュベートする
-10μLの金ナノ粒子(10nm； 741957, Sigma Aldrich)を添加する
-4℃でO/Nインキュベートする
-MNPを磁気的にプルダウンし、金ナノ粒子取り込みの定性評価(2.1、下記)のために上清とっておく
-緩衝液Cで3回洗浄し、0.5mLの最終体積に懸濁する
2.1このプロジェクトに用いた金ナノ粒子は520nmで吸収ピークを有する
-取り込み工程から50μLの上清を採取し、多層作製中に添加した同体積のナノゴールドと比較する
-インプットと比較して上清中にナノゴールドが減少したことは、ポリマーにナノゴールドが首尾良く取り込まれて表面に多層が形成されたことを意味する(図43を参照されたい)
3.PG2-AMTH-5k
-PG2-AMTH-5kをDMSOに溶解して100mg/mLで分取し、-20℃で保管する
-12.5μLのPG2-AMTH-5kを各エッペンドルフチューブに添加する。RTで1時間インキュベートし、緩衝液Cで3回洗浄する。最終体積0.5mL
4.NHS-PEG-DBCO
-AZ103をDMSOに溶解して100mg/mLで分取し、-20℃で保管する
-12.5μLのAZ103を各エッペンドルフチューブに添加する。RTで1時間インキュベートし、緩衝液Cで3回洗浄する。最終体積0.5mL
5.バンコマイシンPEG N3のCuフリークリック
-バンコマイシンPEG N3の原液を100％DMSOに溶解して10mg/mLで調製し、-20℃で保管する
-20μLのバンコマイシンPEG N3を50mg/mL で150μLのMPに添加する。37℃で4時間反応させる
-緩衝液Cで3回洗浄する
【０３４８】
結果
ポリマーアプローチを用いてHSAでコーティングしたナノ粒子の表面にあるバンコマイシンの濃度を、実施例1および[8]に記載のFam-Kaa結合アプローチを用いて比較した。図36から分かるように、評価された表面濃度は、それぞれの場合において実質的に同じであった。しかしながら、コーティングされた微粒子とのバックグラウンド(非特異的)結合は、このポリマーアプローチを用いて作製されたものについては少ないことが認められた(図36(B))。
【０３４９】
さらに、ポリマーアプローチおよびHSAアプローチを用いて作製されたナノ粒子を用いた細菌捕捉(黄色ブドウ球菌)を比較した。図37に示したように、両タイプの粒子とも黄色ブドウ球菌を選択的に濃縮することに成功した。
【０３５０】
実施例8.C3リンカー、C8リンカー、およびPEGリンカーを用いたグリコペプチド表面濃度および細菌捕捉の比較
実施例1に記載の構築物に加えて、さらなる構築物を同じやり方であるが、第1のリンカーにPEG3の代わりにC3またはC8を組み込んで作製した。
【０３５１】
これらの各粒子のバンコマイシン表面濃度の評価を、実施例1に述べたようにFam-Kaa結合を用いて行った。図38から分かるように、実質的に同じバンコマイシン濃度を含む同じ条件下で。PEG3含有リンカーを用いると、C3含有リンカーおよびC8含有リンカーのバンコマイシン表面濃度よりも高いバンコマイシン表面濃度が生じた。
【０３５２】
さらに、PEG3構築物、C8構築物、およびC3構築物を用いた、上記のようなグラム陽性細菌(黄色ブドウ球菌GP01)の捕捉を評価した。図39から分かるように、全ての構築物が、103〜107cfu/mL添加細胞の濃度で緩衝液(PBS pH7.4)から細菌を捕捉するのに成功した。しかしながら、PEG3構築物だけが、低濃度の細菌インプット(10cfu/mLおよび102cfu/mL)から細菌を捕捉すると観察された。
【０３５３】
さらに、捕捉後、上清に存在する細菌の数にかなりの違いがあった。具体的には、PEG3構築物(A)の上清には細菌がほとんど特定されなかったか、または全く特定されなかったのに対して、C8構築物(B)およびC3構築物(C)の上清については、かなりの量の細菌が特定された。
【０３５４】
理論に拘束されないが、PEG3構築物による、観察された優れた細菌捕捉は、これらの構築物の高いバンコマイシン表面濃度に関連するという仮説が立てられる。
【０３５５】
実施例9.バンコマイシン付加物の抗菌活性
N3-PEG3-Van付加物の他に、N3-C3-VanおよびN3-C8-Van付加物を、実施例1に記載のように同じように合成した。次いで、バンコマイシンおよびこれらの付加物の最小阻止濃度の形での抗菌活性を、実施例3に記載のように同じように評価および比較した。結果を図40に示した。
【０３５６】
図40から分かるように、いくつかのグラム陽性細菌株(黄色ブドウ球菌MRSA株、および肺炎連鎖球菌、E.フェカリス、およびE.フェシウム株を含む)に対して、N3-C8-Van付加物はバンコマイシンと比較して(MIC減少の形で)活性増加を示した。
【０３５７】
本明細書全体を通して、目的は、本発明を、いずれか1つの態様または特徴の特定の集まりに限定することなく、本発明の好ましい態様を説明することであった。本発明から逸脱することなく、説明および例示された態様に様々な変化または変更を加えることができる。
【０３５８】
本明細書において言及された、それぞれの特許および科学文書、コンピュータプログラムおよびアルゴリズムの開示は、その全体が参照により組み入れられる。
【０３５９】
参考文献
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【０３６０】
表
(表１)ナノ粒子濃度およびバンコマイシン密度と黄色ブドウ球菌株に対するMICとの比較
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
2020512285.tif 000011
【図２】
2020512285.tif 000012
【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ−１】
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【図７Ｃ−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【国際調査報告】
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