(57)【要約】  網膜における桿体遺伝子の発現を減少させるための方法、網膜において桿体遺伝子により発現するタンパク質産物を減少させるための方法、網膜における桿体遺伝子の発現またはそのタンパク質産物を減少させることにより処置可能な疾患または状態を処置するための方法、およびフォトレギュリン３（Ｐｈｏｔｏｒｅｇｕｌｉｎ３；ＰＲ３）を使用することによって対象における網膜の疾患を処置するための方法。
2020530459.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
網膜における桿体遺伝子の発現を減少させるための方法であって、網膜を式（Ｉ）：
【化１】
2020530459.tif 000006
の化合物または製薬学的に許容されるその塩と接触させる工程を含む、方法。
【請求項２】
前記桿体遺伝子はＮｒｌ、Ｎｒ２ｅ３、Ｒｈｏ、およびＧｎａｔ１からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
網膜を接触させる前記工程は、全身投与または硝子体内注射を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記網膜は、人間である対象の網膜である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
網膜における桿体遺伝子の発現を減少させることにより処置可能な疾患または状態を処置するための方法であって、治療的有効量の式（Ｉ）：
【化２】
2020530459.tif 000007
の化合物または製薬学的に許容されるその塩を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項６】
前記疾患または状態は、網膜色素変性、網膜変性、黄斑変性、加齢黄斑変性、スタルガルト型黄斑ジストロフィ（Ｓｔａｒｇａｒｄｔ’ｓ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、網膜ジストロフィ、ソースビー型眼底ジストロフィ（Ｓｏｒｓｂｙ’ｓ  ｆｕｎｄｕｓ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑症、未熟児網膜症、および虚血再灌流関連網膜損傷からなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記網膜の疾患は網膜色素変性である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記化合物を投与する工程は、全身投与または硝子体内注射を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記対象は人間である、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
網膜におけるロドプシンの発現を減少させるための方法であって、網膜を式（Ｉ）：
【化３】
2020530459.tif 000008
の化合物または製薬学的に許容されるその塩で処置する工程を含む、方法。
【請求項１１】
前記網膜は、人間である対象の網膜である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
対象における網膜の疾患を処置する方法であって、治療的有効量の式（Ｉ）：
【化４】
2020530459.tif 000009
の化合物または製薬学的に許容されるその塩を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項１３】
前記網膜の疾患は、網膜色素変性、網膜変性、黄斑変性、加齢黄斑変性、スタルガルト型黄斑ジストロフィ、網膜ジストロフィ、ソースビー型眼底ジストロフィ、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑症、未熟児網膜症、および虚血再灌流関連網膜損傷からなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記網膜の疾患は網膜色素変性である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記対象は人間である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記化合物を投与する工程は、全身投与または硝子体内注射を含む、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との相互参照
本願は、２０１７年８月１０日出願の米国特許出願第６２／５４３，７８２号の利益を主張するものであり、この出願の全体を引用により本明細書に明白に援用する。
【０００２】
配列表に関して
本願に関連する配列表が、紙に印刷した形式ではなく、テキスト形式で提供され、これを引用により本明細書に援用する。配列表を含んだこのテキストファイルのファイル名は、６７００５＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。このテキストファイルは、２ＫＢで、２０１８年８月１０日に作成されたものであり、本明細書の出願と共にＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で提出される。
【０００３】
政府のライセンス権に関して
本発明は、政府の資金援助を受けて実施された（助成金第Ｐ０１  ＧＭ０８１６１９、Ｒ０１  ＥＹ０２１３７４、およびＲ０１  ＥＹ０２１４８２；アメリカ国立衛生研究所）。政府は、本発明について一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
網膜色素変性（ＲＰ）は遺伝性の網膜変性疾患であり、有病率は出生児３，０００〜５，０００人に１人である。約６０種の遺伝子における３，０００超の突然変異がＲＰと関連することが確認されている。こうした突然変異の大部分は、桿体の光受容体の発生および機能に不可欠な遺伝子におけるものである。現在のところ、患者の桿体変性を遅らせるまたは阻止する有効な医学療法は存在しない。
【０００５】
網膜変性を処置する新しい方法として、桿体遺伝子の発現を制御する因子を標的とする方法が浮上している。網膜の発生の研究により、光受容体遺伝子の発現を制御するいくつかの転写因子が同定されている。たとえば、桿体特異的転写因子ＮｒｌまたはＮｒ２ｅ３における機能喪失突然変異により、桿体がむしろ錐体様の性質を獲得する。コンディショナルノックアウトの結果から、遺伝子発現を正常レベルに維持するためには成熟桿体にとってさえＮｒｌが必要だということが示されている。また、条件的欠失（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ）またはウイルスを用いるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９による欠失のうちいずれかでのＮｒｌ欠失により生じる桿体遺伝子の発現の低減が、ＲＰモデルにおける桿体の生存を促進するのに十分であった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
近年、この複雑な機構を、Ｎｒ２ｅ３の小分子モジュレーター（フォトレギュリン（Ｐｈｏｔｏｒｅｇｕｌｉｎ）として知られる）を使用して調節できることが報告された。発生中または成熟した網膜をフォトレギュリン１（ＰＲ１）で処置することによって、桿体遺伝子の発現が低減され、いくつかの錐体遺伝子の発現が増大する。これは、Ｎｒ２ｅ３における遺伝子の機能喪失突然変異とよく類似する。さらに、２種のＲＰマウスモデル（ＲｈｏＰ２３ＨおよびＰｄｅ６ｂＲｄ１突然変異）をＰＲ１で処置すると、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて桿体変性が遅くなる。しかしながら、ＰＲ１のｉｎ  ｖｉｖｏ分析は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるこの化合物の効力、溶解度、および安定性に制限されていた。
【０００７】
ＰＲ１化合物の開発が進展しているにもかかわらず、Ｎｒ２ｅ３を介して働きかつｉｎ  ｖｉｖｏ研究に対応できる化合物が要求されている。本発明は、この要求を満たすことを追求し、関連するさらなる利点を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の概要
一態様において、本発明は、網膜における桿体遺伝子の発現を減少させるための方法を提供する。具体的な実施形態において、桿体遺伝子はＮｒｌ、Ｎｒ２ｅ３、Ｒｈｏ、またはＧｎａｔ１である。
【０００９】
別の一態様において、本発明は、網膜におけるロドプシンの発現を減少させるための方法を提供する。
【００１０】
上記方法において、網膜を式（Ｉ）：
【００１１】
【化１】
2020530459.tif 000003
【００１２】
の化合物または製薬学的に許容されるその塩と接触させる。
上記方法の具体的な実施形態において、網膜を接触させる工程は、全身投与または硝子体内注射を含む。具体的な実施形態において、網膜は、人間である対象の網膜である。
【００１３】
さらなる一態様において、本発明は、網膜における桿体遺伝子の発現を減少させることにより処置可能な疾患または状態を処置するための方法を提供する。
【００１４】
さらに別の一態様において、本発明は、対象における網膜の疾患を処置する方法を提供する。
【００１５】
上記方法において、治療的有効量の式（Ｉ）：
【００１６】
【化２】
2020530459.tif 000004
【００１７】
の化合物または製薬学的に許容されるその塩を、それを必要とする対象に投与する。
上記方法の具体的な実施形態において、疾患または状態または網膜の疾患は、網膜色素変性、網膜変性、黄斑変性、加齢黄斑変性、スタルガルト型黄斑ジストロフィ（Ｓｔａｒｇａｒｄｔ’ｓ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、網膜ジストロフィ、ソースビー型眼底ジストロフィ（Ｓｏｒｓｂｙ’ｓ  ｆｕｎｄｕｓ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑症、未熟児網膜症、および虚血再灌流関連網膜損傷である。具体的な実施形態において、疾患または状態または網膜の疾患は、網膜色素変性である。
【００１８】
上記方法の具体的な実施形態において、化合物を投与する工程は、全身投与または硝子体内注射を含む。具体的な実施形態において、対象は人間である。
【００１９】
図面の説明
【発明の効果】
【００２０】
上述される本発明の態様、および本発明の付随的な利点の多くは、下記の詳細な説明と添付の図面とを参照することによってよりよく理解されるにつれて、より容易に認識されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】フォトレギュリン３（ＰＲ３）の化学構造を例示する。
【図１Ｂ】解離させた網膜細胞の培養物におけるＲｈｏｄｏｐｓｉｎ  ｍＲＮＡの発現に対するＰＲ１およびＰＲ３の用量応答関係を比較したものである。
【図１Ｃ】解離させた網膜細胞の培養物におけるロドプシンタンパク質の発現に対するＰＲ１およびＰＲ３の用量応答関係を比較したものである。
【図１Ｄ】Ｐ１１のマウス由来の完全な網膜を、ＤＭＳＯまたは０．３μＭ  ＰＲ３を含有する培地中に外植し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて３日（３  ＤＩＶ）後、全載標本においてＳオプシン（緑色）およびＤＡＰＩについて染色したものを示す。スケールバーは５０μｍを表す。Ｅ．ＰＲ３で処置した網膜は、ＤＭＳＯで処置した網膜と比較して、腹側の網膜において、視野１００μｍ×１００μｍあたり、より多くのＳオプシン＋の細胞を有していた（ｎ＝３、＊ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定）。
【図１Ｅ】Ｓ−オプシンの発現に及ぼすＰＲ３の効果を定量的に示すグラフである。処置条件は、図１Ｄにおけるものと同じとした。Ｓ−オプシン＋の錐体は、主として、マウスの腹側の網膜中に存在する。ＰＲ３で処置した網膜は、ＤＭＳＯで処置した網膜と比較して、腹側の網膜において、視野１００μｍ×１００μｍあたり、有意により多くのＳオプシン＋の細胞を有していた（ｎ＝３、＊ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定）。
【図１Ｆ】ＰＲ３のＮｒ２ｅ３との結合を調べた等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）研究を例示する。Ｎｒ２ｅ３タンパク質を、発現ベクターｐＶＰ１６により、融合タンパク質として発現させた。この融合タンパク質をＴＥＶと共に４℃において一晩インキュベートし、次いで、イオン交換クロマトグラフィーによりＮｒ２ｅ３からＨｉｓ８−ＭＢＰタグを分離した。等温滴定熱量測定のために、１００ｍＭ  ＰＲ３を、ＭｉｃｒｏＣａｌ  ＩＴＣ−２００（Ｍａｌｖｅｒｎ）に入れた２０ｍＭ  Ｎｒ２ｅ３中に注入した。ＩＴＣにより、ＰＲ３とＮｒ２ｅ３の直接的な相互作用が定性的に示され、ワンサイトモデル（ｏｎｅ  ｓｉｔｅ  ｍｏｄｅｌ）を使用した推定Ｋｄは６７μＭであった。
【図２Ａ】ＤＭＳＯビヒクルまたは１０ｍｇ／ｋｇ  ＰＲ３で処置した野生型マウスのＲＮＡシーケンシングの結果であり、ｌｏｇ倍率変化（ｌｏｇＦＣ）をｌｏｇＲＰＫＭに対してプロットする。桿体の光受容体遺伝子の強い低減を示す。（１条件あたりマウスｎ＝２）
【図２Ｂ】ＲＮＡシーケンシングによって調べた遺伝子発現変化が最大であるもの（大きい方から１００）についての遺伝子オントロジー分析（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｅｏｎｔｏｌｏｇｙ．ｏｒｇ／ｐａｇｅ／ｇｏ−ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ−ａｎａｌｙｓｉｓ）の結果を示す。
【図２Ｃ】１０ｍｇ／ｋｇ  ＰＲ３またはＤＭＳＯビヒクルで処置した野生型マウスの網膜切片の電子顕微鏡写真を比較する。コントロールと比較して、ＰＲ３網膜は、内側および外側部分の発生が抑止されており、ＯＮＬ中のヘテロクロマチン密度が小さかった。スケールバーは、１０μｍ（上）および２μｍ（下）を表す。
【図３Ａ】ＲｈｏｄｏｐｓｉｎＰ２３Ｈマウスにおける光受容体の変性のタイムラインと実験設計とを例示する。
【図３Ｂ】ＲｈｏｄｏｐｓｉｎＰ２３Ｈマウス由来の網膜切片におけるロドプシン、Ｓオプシン、Ｏｔｘ２、および錐体アレスチンの免疫蛍光染色を比較したものであり、ＰＲ３処置の光受容体が保存されていることを示す。スケールバーは５０μｍを表す。
【図３Ｃ】ＯＮＬの中央および周辺におけるＤＡＰＩ＋の細胞の列のカウントを比較したものであり、ＰＲ３処置の光受容体がより多く生存していることを示す（ｎ≧７、＊ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定）。
【図３Ｄ】ＤＭＳＯまたはＰＲ３で処置したＲｈｏｄｏｐｓｉｎＰ２３Ｈマウス由来の全網膜についてのｑＰＣＲを比較したものであり、ＰＲ３処置において、光受容体遺伝子Ｒｅｃｏｖｅｒｉｎ、Ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ、およびＳ  Ｏｐｓｉｎがより多く発現していることを示す（ｎ≧６、＊ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定）。
【図４Ａ】１０ｍｇ／ｋｇ  ＰＲ３またはＤＭＳＯビヒクルで処置したＰ２１のＲｈｏｄｏｐｓｉｎＰ２３Ｈマウスの、暗順応下におけるｂ波の振幅を比較する（ｎ＝４〜８、＊ｐ＜０．０５、ｔ検定）。
【図４Ｂ】ＤＭＳＯビヒクルで処置したマウス１匹の代表的な暗順応下ＥＲＧ波形を比較する。
【図４Ｃ】ＰＲ３で処置したマウス１匹の代表的な暗順応下ＥＲＧ波形を比較する。
【図４Ｄ】１０ｍｇ／ｋｇ  ＰＲ３またはＤＭＳＯビヒクルで処置したＰ２１のＲｈｏｄｏｐｓｉｎＰ２３Ｈマウスの明順応下におけるｂ波の振幅を比較する（ｎ＝４〜８、＊ｐ＜０．０５、ｔ検定）。
【図４Ｅ】コントロール（ＤＭＳＯ）マウス１匹の代表的な明順応下ＥＲＧ波形を比較する。
【図４Ｆ】ＰＲ３で処置したマウス１匹の代表的な明順応下ＥＲＧ波形を比較する。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
発明の詳細な説明
本発明は、網膜における桿体遺伝子の発現を減少させるための方法、網膜において桿体遺伝子により発現するタンパク質産物（たとえば、ロドプシン）を減少させるための方法、網膜における桿体遺伝子の発現またはそのタンパク質産物を減少させることにより処置可能な疾患または状態を処置するための方法、および対象における網膜の疾患を処置するための方法を提供する。上記方法において、網膜または対象は、フォトレギュリン３（ＰＲ３）で処置され、有利な結果として、桿体遺伝子の発現が減少し、これにより、そのタンパク質産物の発現が減少し、その結果として、桿体遺伝子の発現またはそのタンパク質産物を減少させることにより処置可能な疾患または状態が処置される。本明細書中に記載されるとおり、こうした結果から、ＰＲ３が、網膜色素変性（ＲＰ）などの網膜の疾患を処置するのに有効であることが示される。
【００２３】
桿体遺伝子の発現およびそのタンパク質産物を減少させる
一態様において、本発明は、網膜における桿体遺伝子の発現を減少させるための方法を提供する。
【００２４】
一実施形態において、上記方法は、網膜を、ＰＲ３、つまり式（Ｉ）：
【００２５】
【化３】
2020530459.tif 000005
【００２６】
の化合物または製薬学的に許容されるその塩と接触させる工程を含む。
本発明に係る方法の実施において発現が有効に低減される桿体遺伝子には、Ｎｒｌ、Ｎｒ２ｅ３、Ｒｈｏ、Ｇｎａｔ１、およびＰｄｅ６ｂが含まれる。
【００２７】
上記方法の具体的な実施形態において、網膜を接触させる工程は、対象への化合物の全身投与または化合物の硝子体内注射を含む。
【００２８】
別の一態様において、本発明は、桿体遺伝子に由来するタンパク質産物の発現を低減するための方法を提供する。具体的な実施形態において、本発明は、網膜におけるロドプシンの発現を減少させるための方法を提供する。
【００２９】
この方法の一実施形態において、上述されるように、網膜は、式（Ｉ）の化合物または製薬学的に許容されるその塩で処置される。
【００３０】
上記方法の具体的な実施形態において、網膜の処置は、対象への化合物の全身投与または化合物の硝子体内注射を含む。
【００３１】
桿体遺伝子の発現またはそのタンパク質産物を減少させることにより処置可能な疾患または状態の処置
本発明のさらなる一態様において、網膜における桿体遺伝子の発現またはそのタンパク質産物を減少させることにより処置可能な疾患または状態を処置するための方法が提供される。
【００３２】
具体的な実施形態において、上述されるように、上記方法は、治療的有効量の式（Ｉ）の化合物または製薬学的に許容されるその塩を、それを必要とする対象に投与する工程を含む。
【００３３】
網膜における桿体遺伝子の発現またはそのタンパク質産物を減少させることにより処置可能な代表的な疾患または状態は、網膜色素変性、網膜変性、黄斑変性、加齢黄斑変性、スタルガルト型黄斑ジストロフィ（Ｓｔａｒｇａｒｄｔ’ｓ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、網膜ジストロフィ、ソースビー型眼底ジストロフィ（Ｓｏｒｓｂｙ’ｓ  ｆｕｎｄｕｓ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑症、未熟児網膜症、および虚血再灌流関連網膜損傷を含む。一実施形態において、上記処置可能な疾患または状態は、網膜色素変性である。
【００３４】
上記方法の具体的な実施形態において、化合物を投与する工程は、対象への化合物の全身投与または化合物の硝子体内注射を含む。
【００３５】
網膜の疾患の処置
別の一態様において、本発明は、対象における網膜の疾患を処置するための方法を提供する。
【００３６】
具体的な実施形態において、上述されるように、上記方法は、治療的有効量の式（Ｉ）の化合物または製薬学的に許容されるその塩を、それを必要とする対象に投与する工程を含む。
【００３７】
本発明に係る方法により処置可能な代表的な網膜の疾患は、網膜色素変性、網膜変性、黄斑変性、加齢黄斑変性、スタルガルト型黄斑ジストロフィ、網膜ジストロフィ、ソースビー型眼底ジストロフィ、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑症、未熟児網膜症、および虚血再灌流関連網膜損傷を含む。一実施形態において、上記処置可能な疾患または状態は、網膜色素変性である。
【００３８】
上記方法の具体的な実施形態において、化合物を投与する工程は、対象への化合物の全身投与または化合物の硝子体内注射を含む。
【００３９】
処置方法である本発明に係る方法において、用語「治療的有効量」は、必要投与量にて、かつ必要期間にわたって、桿体遺伝子の発現またはそのタンパク質産物のレベルの低減といった所望の治療結果を達成するために有効な量を指す。化合物の治療的有効量は、対象の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに対象において所望の応答を誘発できる化合物の能力などの因子により異なっていてよい。用法は、最適な治療応答を提供できるように調節できる。また、治療的有効量は、投与された化合物が有毒または有害な作用を有する場合でも、そうした作用よりも治療上有益な効果の方が勝るような量である。
【００４０】
注目すべきことに、投与量の値は、緩和しようとする状態の重症度により異なってよい。任意の対象のそれぞれについて、具体的な用法を、それぞれの場合における要求と、組成物を投与するまたは組成物の投与を管理する人の専門的判断とに応じて、経時的に調整できる。本明細書中に記載される投与量の範囲は、例示目的で記載されており、医師が選択し得る投与量の範囲を制限するものではない。組成物中における活性化合物の量は、対象の疾患状態、年齢、性別、および体重などの因子により異なっていてよい。用法は、最適な治療応答を提供できるように調節できる。たとえば、１回のボーラスで投与できる、または、何回かに分けて経時的に投与できる、または、治療状況の緊急性に見合うように用量を増減できる。
【００４１】
上述される方法において、化合物の投与は、対象への局所投与（たとえば、眼への投与）または全身投与であってよい。用語「対象」は、哺乳動物を含むことを意図する。対象の例は、人間、および人間でない哺乳類を含む。本発明の具体的な実施形態において、対象は人間である。
【００４２】
用語「投与する」、「接触させる」、または「処置する」は、化合物または化合物を含む医薬組成物を、対象の全身または対象の特定の部位（たとえば眼）中に運搬する任意の方法を含む。
【００４３】
錐体遺伝子の発現を増大させる方法
さらなる態様において、本発明は、網膜における錐体遺伝子の発現またはそのタンパク質産物を増大させる方法を提供する。
【００４４】
この方法の一実施形態において、上述されるように、網膜を、式（Ｉ）の化合物もしくは製薬学的に許容されるその塩で処置する、またはこれと接触させる。
【００４５】
上記方法の具体的な実施形態において、網膜を処置するまたは接触させる工程は、対象への化合物の全身投与または化合物の硝子体内注射を含む。
【００４６】
上記方法の具体的な実施形態において、網膜を処置するまたは接触させる工程は、対象への化合物の全身投与または化合物の硝子体内注射を含む。
【００４７】
医薬組成物
別の一態様において、本発明は、製薬学的に許容される担体および式（Ｉ）の化合物または製薬学的に許容されるその塩を含む医薬組成物を提供する。
【００４８】
好適な担体には、動物（たとえば、人間である対象）に投与するのに好適なものが含まれる。注射使用に好適な医薬組成物には、滅菌水溶液（たとえば、生理食塩水、デキストロース）および分散液が含まれる。
【００４９】
本発明に係る組成物は、たとえば、不活性な希釈剤もしくは担体と共に、硬質もしくは軟質シェルゼラチンカプセル中に封入した状態で、または圧縮により錠剤として、経口投与できる。経口による治療的投与のために、化合物および組成物は、賦形剤と組み合わせて、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁液剤、シロップ剤、およびオブラートなどの形態で使用できる。このような治療的に有用な組成物中における活性化合物の量は、好適な投与量が得られるように決められる。
【００５０】
本発明に係る組成物は、非経口投与できる。化合物を、薬理学的に許容される塩または遊離塩基として含む溶液を、界面活性剤などの添加剤と好適に混合した水中への溶解によって調製できる。また、分散液は、油中に分散させることによっても調製できる。
【００５１】
フォトレギュリン３（ＰＲ３）を使用するための方法
以下の記載は、本発明に係る方法において有用なフォトレギュリン３（ＰＲ３；Ｎｒ２ｅ３ａの小分子拮抗物質）に関する。
【００５２】
Ｎｒ２ｅ３は、網膜に特異的な核内受容体であり、光受容体遺伝子の発現において重要な制御因子である。桿体遺伝子の発現を制御する手法が、網膜色素変性（ＲＰ）のような網膜変性疾患を処置可能な治療手法として浮上してきた。フォトレギュリン１（ＰＲ１）は、光受容体に特異的な遺伝子の発現を制御するＮｒ２ｅ３の小分子モジュレーターである。光受容体遺伝子の発現をＰＲ１を用いて操作すると、ＲＰモデルであるＲｈｏＰ２３ＨおよびＰｄｅ６ｂＲｄ１において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、網膜変性の進行が遅くなる。しかしながら、ＰＲ１種を使用するｉｎ  ｖｉｖｏ分析は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるこの化合物の効力、溶解度、および安定性に制限されていた。本明細書中に記載されるとおり、構造上関連がなく、ＰＲ１種化合物よりも高い効力を有する化合物であるフォトレギュリン３（ＰＲ３）が同定された。ＲＮＡシーケンシング分析によると、ＰＲ３は、全身に運搬された後、桿体の光受容体遺伝子の発現（たとえば、Ｎｒｌ、Ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ、Ｇｎａｔ１）に大きな影響を及ぼす。ＲＰを治療可能な療法としてのＰＲ３の有効性を判断するために、ＲｈｏＰ２３Ｈマウスを、生後１２〜１４日（Ｐ１２〜Ｐ１４）からＰ２０までＰＲ３またはビヒクルで処置し、Ｐ２１において網膜の構造および機能を評価した。ＰＲ３で処置したＲｈｏＰ２３Ｈマウスは、同腹仔コントロールよりも、暗順応下および明順応下でのＥＲＧ反応が大きく、さらに、光受容体の変性が有意に減少した。これらを合わせると（Ｔｏｇｅｔｈｅｒ）、データから、Ｎｒ２ｅ３シグナル伝達の薬理学的破壊は、ＲＰおよび他の網膜変性疾患を処置するための治療的に有利な手法であり得ることが示唆される。
【００５３】
本明細書中に記載されるＰＲ３処置により、ＲｈｏＰ２３Ｈマウスにおいて網膜が解剖学的および機能的に保存されることが示され、これによって、ＲＰを処置するためのこの治療手法の概念実証が達成される。
【００５４】
Ｎｒ２ｅ３を標的とし得る化合物を見つけるために、以前にルシフェラーゼに基づくアッセイによりトランスフェクションＣＨＯ−Ｓ細胞にて組換えＮｒ２ｅ３と相互作用することが分かっているヒット化合物（ＰｕｂＣｈｅｍ  Ａｓｓａｙ  ＩＤ：６０２２２９、６２４３７８、６２４３９４、および６５１８４９）を、ケモインフォマティクスによる手法を用いてスクリーニングした。１回目のスクリーニングでヒットしたものについて２回目にスクリーニングする際、解離させた一次網膜細胞培養物を使用してＲｈｏｄｏｐｓｉｎをアッセイした。その理由は、Ｒｈｏｄｏｐｓｉｎが、Ｎｒ２ｅ３シグナル伝達の標的として十分に定義されており、桿体の光受容体のみに高レベルで発現しているためである。生後５日（Ｐ５）のマウスから網膜を解離させ、これを、小分子を含有する培地中で培養した。２日間処置した後、細胞を回収してｑＰＣＲ分析に供し、Ｒｈｏｄｏｐｓｉｎの発現を定量した。これらの化合物のうちの１種であるフォトレギュリン３（ＰＲ３；図１Ａ）が、ＤＭＳＯでの処置およびＰＲ１での処置と比較して、すべての濃度でＲｈｏｄｏｐｓｉｎの強い低減を示した（図１Ｂ）。この知見を、免疫蛍光アッセイを用いて、Ｐ５マウスから解離させた網膜培養物におけるロドプシンタンパク質の発現を調べることによって、裏付けた。ｑＰＣＲの結果と同様に、ＰＲ３で処置した結果、ＤＭＳＯビヒクルおよびＰＲ１の場合と比較して、ロドプシンの発現が低減した（図１Ｃ）。
【００５５】
Ｎｒ２ｅ３における突然変異の結果、Ｓオプシン＋の光受容体の数が増加し、桿体遺伝子の発現が低減された。ＰＲ３処置が錐体遺伝子の発現にも影響を及ぼすか否かを判断するために、完全な網膜を、Ｐ１１の野生型マウスから、ＤＭＳＯまたはＰＲ３を含有する培地中に外植して、３日間おいた。完全な網膜をこの実験には使用し、背側および腹側の網膜における変化を独立して評価した。固定および全載免疫染色の後、腹側の網膜におけるＳオプシン＋の細胞をカウントした。Ｎｒ２ｅ３突然変異の場合と同様に、ＰＲ３で処置した結果、腹側の網膜におけるＳオプシン＋の細胞の数が増加した（図１Ｄ〜１Ｅ）。
【００５６】
ＰＲ３は、最初、Ｎｒ２ｅ３−ＮＣＯＲダイマー複合体の切断によりリガンドを同定したルシフェラーゼに基づくアッセイにおいて、Ｎｒ２ｅ３の化学的モジュレーターとして同定された（ＰｕｂＣｈｅｍ  Ａｓｓａｙ  ＩＤ：６０２２２９、６２４３７８、６２４３９４、および６５１８４９）。Ｎｒ２ｅ３とＰＲ３の直接的な相互作用を確認するため、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）を用いた。他のアッセイと矛盾することなく、ＩＴＣによっても、ＰＲ３とＮｒ２ｅ３の直接的な相互作用が定性的に示された（ワンサイトモデル（ｏｎｅ  ｓｉｔｅ  ｍｏｄｅｌ）を用いた推定Ｋｄは６７μＭ；図１Ｆ）。
【００５７】
Ｎｒ２ｅ３シグナル伝達は、桿体の光受容体細胞の運命、発生、成熟、および発現維持にとって重要である。有糸分裂後の網膜細胞における遺伝子発現に及ぼすＰＲ３処置の影響を判断するために、野生型マウスを、Ｐ１２において、ＰＲ３またはビヒクルで全身処置した（腹腔内注射）。Ｐ１３において、注射して２４時間後に網膜を採取し、ＲＮＡシーケンシングによる網羅的トランスクリプトーム分析に供した。桿体の光受容体に特異的な転写物の大部分の減少が観察された（図２Ａおよび２Ｂ）。有糸分裂後の光受容体におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるＮｒｌのコンディショナルノックアウトおよびＮｒｌのノックダウンの場合と同様に、錐体遺伝子の発現における大幅かつ網羅的な増加は観察されなかった。しかしながら、ＣｒｘおよびＯｔｘ２のように、桿体光受容体および錐体光受容体の両方において発現するＮｒ２ｅ３上流の遺伝子は、コントロールとＰＲ３処置とで発現に差異はなかった。これに加えて、他の網膜細胞型において発現する遺伝子については変化は観察されなかったことから、ＰＲ３が光受容体に特異的であることが示され、さらに、細胞死遺伝子または細胞ストレス遺伝子の増加も観察されなかったことから、この化合物が網膜細胞にとって有毒でないことが示された。
【００５８】
電子顕微鏡検査（ＥＭ）により、ＰＲ３処置後の光受容体の形態について、超微細構造的な分析を行なった。野生型マウスの腹腔内に、Ｐ１１から開始して３日間連続で、ビヒクルまたはＰＲ３を注射した。Ｐ１４において、３回目の注射の２４時間後にマウスを安楽死させ、網膜を、ＥＭに供するために処理した。光受容体の外側部分の形成は生後２〜３週の間に始まるが、Ｎｒ２ｅ３において遺伝子の機能喪失突然変異が生じると、桿体の外側部分の形成が損なわれる。ＰＲ３処置によって外側部分の発生が阻止され、ＰＲ３で処置した光受容体の外側部分は、コントロールと比較して著しく切れていた（図２Ｃ）。外顆粒層（ＯＮＬ）核を調べたところ、ＰＲ３処置により光受容体のアポトーシスが誘発されているという徴候は全く観察されず（図２Ｃ）、このことから、桿体の発生に及ぼされる効果は細胞死の増大によるものではないことが示された。興味深いことに、ＰＲ３で処置した網膜の桿体の核は、ＤＭＳＯの場合の網膜と比較して、ヘテロクロマチンが密に詰まった小さな斑を含んでおり（図２Ｃ）、このことは、細胞がむしろ錐体様の性質を獲得しているということと矛盾しない。
【００５９】
近年、ＰＲ１での処置により生じる桿体遺伝子の発現の低減が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＲｈｏＰ２３Ｈの光受容体の変性を遅らせるのに十分であるということが示された。ＲｈｏＰ２３Ｈの突然変異により、桿体の光受容体におけるロドプシンのミスフォールディングが生じ、これにより、折り畳まれていないタンパク質の応答が活性化して、最終的には、桿体および錐体が死に至る。ＲｈｏＰ２３Ｈマウスにおいて、桿体の光受容体の大部分が、生後３週目の終わりまでにアポトーシスを受ける。
【００６０】
光受容体の変性を阻止できるか否かを判断するために、ＲｈｏＰ２３Ｈマウスを、Ｐ１２〜Ｐ１４からＰ２１まで、桿体の光受容体の死が生じる間、ＰＲ３またはビヒクルで処置した（図３Ａ）。Ｐ２１において、ＥＲＧにより視覚機能を評価し、マウスを安楽死させて、組織学的分析およびｑＰＣＲ分析に供した。Ｐ２１において、コントロールＲｈｏＰ２３Ｈマウスは、ＯＮＬ中に光受容体が２〜３列しか残存していなかった（図３Ｂおよび３Ｃ）。桿体は疎であり、錐体はほとんど残存していなかった（Ｓオプシン＋かつ錐体アレスチン＋の光受容体）。コントロールＲｈｏＰ２３Ｈマウスは、ＥＲＧ分析において、暗順応および明順応下におけるｂ波の振幅が微小であった（図４Ａ、４Ｂ、４Ｄ、および４Ｅ）。一方、ＰＲ３で処置したＲｈｏＰ２３Ｈマウス由来の網膜は、ＯＮＬ中に桿体および錐体の光受容体が数列あった（図３Ｂおよび３Ｃ）。ＰＲ３で処置した網膜において生存していた錐体は、ＤＭＳＯコントロールの場合の網膜と比較して、縦長かつ健康であった。組織学的な結果を、ｑＰＣＲによって、コントロールおよびＰＲ３のＲｈｏＰ２３Ｈマウス由来の網膜について確認したところ、処置マウスはＲｅｃｏｖｅｒｉｎおよびＲｈｏｄｏｐｓｉｎの発現がより多いことが分かり、このことから、より多くの光受容体細胞が生存していることが示された（図３Ｄ）。ＰＲ３で処置したＲｈｏＰ２３ＨマウスのＥＲＧ分析では、同腹仔コントロールと比較して、大部分の刺激強度において、暗順応および明順応下でのｂ波の振幅が有意に増大した（図４Ａ、４Ｃ、４Ｄ、および４Ｆ）。合わせると（Ｔｏｇｅｔｈｅｒ）、これらのデータは、ＰＲ３での処置によりこのＲＰモデルにおける光受容体の化学構造的および機能的な変性が阻止された、という結論を裏付けるものである。
【００６１】
本明細書中に記載されるとおり、ＲｈｏＰ２３Ｈマウスにおける光受容体の変性が阻止されたのであるが、このことは、このＲＰモデルをｉｎ  ｖｉｖｏにおいて小分子で処置できたという最初の報告である。光受容体遺伝子の発現が、桿体に特異的な核内受容体Ｎｒ２ｅ３を小分子モジュレーターで標的とすることによって低減した。ＰＲ３での処置によって桿体遺伝子の発現が減少し、これは、ＲｈｏＰ２３Ｈマウスにおいて光受容体を機能的および構造的に保存するのに十分であった。以前の研究で、桿体の光受容体の分化経路を遺伝子操作することが複数のＲＰモデルの処置に有用であり得ることが示されている。成体マウスの桿体におけるＮｒｌの条件的欠失（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ）は、劣性ＲＰのＲｈｏ−／−モデルにおける変性を阻止する。さらに最近、ＡＡＶ−ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるＮｒｌのノックダウンにより、Ｒｈｏ−／−、Ｐｄｅ６ｂＲｄ１０、およびＲｈｏＰ３４７Ｓという３種の異なるＲＰモデルにおいて、光受容体が組織学的および機能的に、長期的に保存された。本明細書中に記載される結果は、この複雑な機構を標的とする小分子が、特に進行性ＲＰモデルにおいて、桿体の変性を遅らせるのにも有効であり、網膜変性の医学療法への新たな経路を提供することを示す。
【００６２】
材料および方法
マウス
Ｃ５７Ｂｌ／６（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｓｔｏｃｋ  Ｎｏ：０００６６４）およびＲｈｏＰ２３Ｈ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｓｔｏｃｋ  Ｎｏ：０１７６２８）の指定月齢のものを使用した。すべてのマウスはワシントン大学比較医学科（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）に収容されていたもので、プロトコールは、ワシントン大学の動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  Ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により承認されたものである。この研究は、眼科視覚研究における動物の使用（Ｕｓｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌｓ  ｉｎ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  ａｎｄ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）についてのＡＲＶＯ（米国視覚眼科研究会議）の声明にしたがって実施した。
【００６３】
フォトレギュリン３
フォトレギュリン３は、以前にスクリーニングされた小分子の中からＳｃｉＦｉｎｄｅｒおよびＰｕｂＣｈｅｍによりＮｒ２ｅ３と相互作用する分子を探すことによって同定した。最初にＣｈｅｍＤｉｖから得て、次いで、最初のスクリーニングの後、実験室で大量に合成および精製した。ｉｎ  ｖｉｖｏ実験のために、マウスの腹腔内に、ＤＭＳＯ中に１０ｍｇ／ｋｇで溶解したＰＲ３を注射した。
【００６４】
解離させた網膜培養物
生後５日（Ｐ５）のマウスから網膜を切り取り、カルシウム非含有マグネシウム非含有ＨＢＳＳ中に希釈した０．５％トリプシンで、３７℃において１０分間かけて処理することによって解離させた。トリプシンを、等体積のＦＢＳの添加により不活性化し、４℃における遠心分離によって細胞をペレット状に沈殿させ、培地中（１％  ＦＢＳ、１％  Ｎ２、１％  Ｂ２７、１％  Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、および０．５％  Ｌ−グルタミンを含有するＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ）に再懸濁した。ｑＰＣＲに供するために、細胞を２４ウェル組織培養プレートに、密度が１ウェルあたり網膜１つとなるように播種した（以降のｑＰＣＲの項を参照）。免疫蛍光アッセイに供するために、細胞を、９６ウェルの黒色フレーム底面透明組織培養プレートに、密度が５ウェルあたり網膜１つとなるように播種した。解離の翌日に、小分子を培地中に希釈して添加した。２日間の処置後、細胞を、４％  ＰＦＡを用いて室温で２０分間固定し、ブロッキング液（１０％正常ウマ血清および０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を１×  ＰＢＳ中に希釈したもの）で室温において１時間ブロッキングして、ロドプシンに対して作成した一次抗体（１：２５０；Ｒｈｏ４Ｄ２、Ｒｏｂｅｒｔ  Ｍｏｌｄａｙ、ブリティッシュコロンビア大学）をブロッキング液中に希釈したものと共に、４℃において一晩インキュベートした。翌日、ウェルを１×  ＰＢＳで洗浄し、次いで、適切な蛍光標識二次抗体種をブロッキング液中に希釈したものと共に、室温で１時間インキュベートした。ウェルを３回洗浄し、ＴｏＰｒｏ３で対比染色して、ＧＥ  Ｔｙｐｈｏｏｎ  ＦＬＡ  ９４００撮像装置を用いてプレート全体を画像化した。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いてプレートをスキャンすることにより光学濃度を測定し、ロドプシンの発現をＴｏＰｒｏ３核染色を用いて補正した。
【００６５】
定量的リアルタイムＰＣＲ
ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して網膜由来のＲＮＡを単離し、ｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用してｃＤＮＡを合成した。ＳＳＯ  Ｆａｓｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して定量的リアルタイムＰＣＲを行なった。分析のために、値をＧａｐｄｈ（ΔＣｔ）を用いて補正し、ＤＭＳＯ処置試料および化合物処置試料の間のΔΔＣｔを、ＤＭＳＯ処置コントロールに対する百分率で表した（１００＊２＾ΔΔＣｔ）。ΔＣｔ値に対してスチューデントｔ検定を行なった。以下のプライマー配列を使用した：Ｇａｐｄｈ（Ｆ：ＧＧＣＡＴＴＧＣＴＣＴＣＡＡＴＧＡＣＡＡ（配列番号１）、Ｒ：ＣＴＴＧＣＴＣＡＧＴＧＴＣＣＴＴＧＣＴＧ（配列番号２））、Ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ（Ｆ：ＣＣＣＴＴＣＴＣＣＡＡＣＧＴＣＡＣＡＧＧ（配列番号３）、Ｒ：ＴＧＡＧＧＡＡＧＴＴＧＡＴＧＧＧＧＡＡＧＣ（配列番号４））、Ｏｐｎ１ｓｗ（Ｆ：ＣＡＧＣＡＴＣＣＧＣＴＴＣＡＡＣＴＣＣＡＡ（配列番号５）、Ｒ：ＧＣＡＧＡＴＧＡＧＧＧＡＡＡＧＡＧＧＡＡＴＧＡ（配列番号６））、Ｒｅｃｏｖｅｒｉｎ（Ｆ：ＡＣＧＡＣＧＴＡＧＡＣＧＧＣＡＡＴＧＧ（配列番号７）、Ｒ：ＣＣＧＣＴＴＴＴＣＴＧＧＧＧＴＧＴＴＴＴ（配列番号８））。
【００６６】
網膜外植片培養
Ｐ１１のＣ５７Ｂｌ／６マウスに由来するＲＰＥ無しの完全な網膜を、ＤＭＳＯまたは０．３μＭ  フォトレギュリン３を含有する培地（１％  ＦＢＳ、１％  Ｎ２、１％  Ｂ２７、１％  Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、および０．５％  Ｌ−グルタミンを含有するＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ）中に入れた０．４μｍ孔の組織培養インサート上に外植した。全培地を一日おきに交換した。外植片を、４％  ＰＦＡを用いて室温で２０分間固定し、ブロッキング液（１０％正常ウマ血清および０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を１×  ＰＢＳ中に希釈したもの）で室温において１時間ブロッキングして、Ｓオプシンに対して作成した一次抗体（１：４００、ＳＣＢＴ、ｓｃ−１４３６３）と共に、４℃において一晩インキュベートした。翌日、外植片を１×  ＰＢＳで洗浄し、次いで、適切な蛍光標識二次抗体種をブロッキング液中に希釈したものと共に一晩インキュベートし、続いて１×  ＰＢＳで洗浄して、ＤＡＰＩ染色を行なった。外植片をスライドガラスに移し、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ−Ｇ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）を使用してカバースリップを載せた。Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＦｌｕｏＶｉｅｗ  ＦＶ１０００を使用して共焦点顕微鏡検査を行なった。設定を固定して撮影した単一面共焦点画像において、細胞をカウントした。
【００６７】
免疫蛍光
眼杯を１×  ＰＢＳ中の４％  ＰＦＡにおいて室温で２０分間固定し、次いで、１×  ＰＢＳ中の３０％スクロースにおいて４℃で一晩凍結保護した。試料をＯＣＴ（サクラファインテック）中に包埋し、ドライアイス上で凍結させ、次いでクライオスタット（Ｌｅｉｃａ）を用いて１６〜１８μｍの切片とした。１×  ＰＢＳ中に１０％正常ウマ血清および０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有する溶液でスライドガラスを室温で１時間ブロッキングし、次いで、一次抗体（Ｒｏｂｅｒｔ  Ｍｏｌｄａｙ（ブリティッシュコロンビア大学）より入手したＲｈｏ４Ｄ２（１：２５０）、ＳＣＢＴ：ｓｃ−１４３６３より入手したＳオプシン（１：４００）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅより入手した錐体アレスチン（ＡＢ１５２８２、１：１，０００）、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓより入手したＯｔｘ２（ＢＡＦ１９７９、１：２００））をブロッキング液中に希釈したものを用いて、４℃において一晩染色した。翌日、スライドガラスを１×  ＰＢＳで３回洗浄し、次いで、蛍光標識二次抗体が希釈されているブロッキング液中において室温で２時間インキュベートし、ＤＡＰＩで染色し、洗浄して、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ−Ｇ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）を使用してカバースリップを載せた。Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＦｌｕｏＶｉｅｗ  ＦＶ１０００を使用して共焦点顕微鏡検査を行なった。設定を固定して撮影した単一面共焦点画像において、細胞をカウントした。網膜中央のカウントを、視神経乳頭に隣接した位置（視神経乳頭から腹側５０μｍ）で行ない、網膜周辺のカウントを、周端から腹側５０μｍで行なった。
【００６８】
等温滴定熱量測定
Ｎｒ２ｅ３タンパク質（ａａ  ９０−４１０）を、発現ベクターｐＶＰ１６（ＤＮＡＳＵプラスミドＩＤ：ＨｓＣＤ０００８４１５４）により、Ｈｉｓ８−ＭＢＰ−ＴＥＶ融合タンパク質として発現させた。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、ＯＤ６００が１となるまで増殖させ、次いで、０．２ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて１６℃において一晩誘導した。細胞を回収し、抽出バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセリン、５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、および１：１，０００で希釈した飽和ＰＭＳＦ）中に再懸濁し、次いで、氷上で超音波処理によって溶解させた。溶解物を４℃において遠心分離し、上清を、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）５ｍＬを含有する平衡化カラムに載せた。カラムを２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、１Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、および４０ｍＭイミダゾールで洗浄し、次いで、タンパク質を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、および１００ｍＭイミダゾールで溶出させた。融合タンパク質をＴＥＶと共に４℃において一晩インキュベートし、次いで、イオン交換クロマトグラフィーによって、ＮＲ２Ｅ３からＨｉｓ８−ＭＢＰタグを分離した。等温滴定熱量測定のために、ＭｉｃｒｏＣａｌ  ＩＴＣ−２００（Ｍａｌｖｅｒｎ）において、５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．５％  ＤＭＳＯ含有の１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ８）中の２０μＭ  Ｎｒ２ｅ３中に１００μＭ  ＰＲ３を注入し、Ｏｒｉｇｉｎ  ７．０ソフトウェアを使用してデータを分析した。
【００６９】
ＲＮＡシーケンシング
ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して網膜からＲＮＡを単離し、Ａｇｉｌｅｎｔ  ４２００  ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎを使用して全ＲＮＡの完全性を調べ、Ｔｒｉｎｅａｎ  ＤｒｏｐＳｅｎｓｅ９６分光光度計を使用して定量した。ＴｒｕＳｅｑ  ＲＮＡ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐ  ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）およびＳｃｉｃｌｏｎｅ  ＮＧＳｘ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して、全ＲＮＡからＲＮＡ配列ライブラリを作製した。Ａｇｉｌｅｎｔ  ４２００  ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎを使用して、ライブラリのサイズ分布を実証した。ライブラリのさらなる品質管理と、プールした指標付きライブラリの混合と、クラスタ最適化とを、Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｑｕｂｉｔ蛍光光度計を使用して行なった。ＲＮＡ配列ライブラリをプールし（４−ｐｌｅｘ）、フローセルのレーン上においてクラスタ形成を行なった。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２５００を高速モードで使用し、ペアエンド５０塩基リード長（ＰＥ５０）のシーケンシング手法によって、シーケンシングを行なった。
【００７０】
電子顕微鏡検査
マウスをＣＯ２で安楽死させ、次いで０．９％生理食塩水、続いて０．１Ｍカコジル酸ナトリウムバッファー中の４％グルタルアルデヒドで灌流した。眼杯を、０．１Ｍカコジル酸ナトリウムバッファー中の４％グルタルアルデヒド中で固定し、０．１Ｍカコジル酸ナトリウムバッファーで洗浄し、次いで２％四酸化オスミウム中で後固定（ｐｏｓｔ−ｆｉｘ）した。固定後、眼杯を水洗し、濃度を段階的に変えたエタノールで脱水して、酸化プロピレン中、次いでエポンアラルダイト（ｅｐｏｎ  ａｒａｉｄｉｔｅ）中においてインキュベートし、６０℃において一晩重合させ、次いで厚さ７０ｎｍの切片とした。ＪＥＯＬ  ＪＥＭ−１２３０電子顕微鏡を使用して画像を得た。
【００７１】
ＥＲＧ
マウスを一晩（１２〜１８時間）暗順応させた。以降の工程はすべて、薄暗い赤色光の下で実施した。マウスを麻酔チャンバ内に入れ、１．５〜３％イソフルランガスで麻酔した。マウスを、麻酔チャンバから、３７℃に維持した加温プラットフォームに移し、イソフルランの流量を一定に維持するためにノーズコーンをつけた。両眼に１％トロピカミドおよび２．５％塩酸フェニレフリンを点眼した。頭頂部の皮下に参照針電極を配置し、尾部の皮下に接地針電極を配置した。両眼に１．５％メチルセルロースを点眼して、両眼の上にコンタクトレンズ電極を配置した。
【００７２】
薄暗い赤色光を消して、プラットフォームを全視野光刺激装置（ＬＫＣ    Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＵＴＡＳ  ＢｉｇＳｈｏｔ  ｇａｎｚｆｅｌｄ）内に配置し、暗順応下、閃光の強度を漸増して照射した。暗順応下における閃光照射の直後に、明順応下における閃光照射を行なった。
【００７３】
ここまで、例示的な実施形態を例示および記載したが、これらの実施形態は、本発明の思想および範囲から逸脱することなく様々に変更できるということが理解される。
【００７４】
排他的な特性または権利を主張する本発明の実施形態を以下のように定義する。
【図１Ａ】
2020530459.tif 000010
【図１Ｂ】
2020530459.tif 000011
【図１Ｃ】
2020530459.tif 000012
【図１Ｄ】
2020530459.tif 000013
【図１Ｅ】
2020530459.tif 000014
【図１Ｆ】
2020530459.tif 000015
【図２Ａ】
2020530459.tif 000016
【図２Ｂ】
2020530459.tif 000017
【図２Ｃ】
2020530459.tif 000018
【図３Ａ】
2020530459.tif 000019
【図３Ｂ】
2020530459.tif 000020
【図３Ｃ】
2020530459.tif 000021
【図３Ｄ】
2020530459.tif 000022
【図４Ａ】
2020530459.tif 000023
【図４Ｂ】
2020530459.tif 000024
【図４Ｃ】
2020530459.tif 000025
【図４Ｄ】
2020530459.tif 000026
【図４Ｅ】
2020530459.tif 000027
【図４Ｆ】
2020530459.tif 000028
【配列表】
2020530459000001.app
【国際調査報告】
2020530459.tif 000029