(57)【要約】  本発明は、肺がんの予防または治療のための組成物および方法に関し、当該組成物は、プロガストリンに結合する抗体を含み、当該方法は、プロガストリンに結合する抗体の使用を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺がんの予防または治療における使用のための、プロガストリン結合抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
請求項１に記載の使用のためのプロガストリン結合抗体またはその抗原結合断片であって、前記プロガストリン結合抗体またはその抗原結合断片が、１本鎖抗体、ラクダ化抗体、ＩｇＡ１抗体、ＩｇＡ２抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、ＩｇＧ４抗体、およびＩｇＭ抗体から選択される、プロガストリン結合抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３】
請求項１または２に記載の使用のためのプロガストリン結合抗体またはその抗原結合断片であって、前記プロガストリン結合抗体またはその抗原結合断片が、Ｎ末端抗プロガストリン抗体およびＣ末端抗プロガストリン抗体から選択される、プロガストリン結合抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用のためのプロガストリン結合抗体またはその抗原結合断片であって、前記プロガストリン結合抗体またはその抗原結合断片が、中和抗体である、プロガストリン結合抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用のためのプロガストリン結合抗体またはその抗原結合断片であって、前記抗体が、
・配列番号４、５、および６のアミノ酸配列のそれぞれＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３のうちの少なくとも１つ、優先的には少なくとも２つ、優先的には３つを含んでなる重鎖と、配列番号７、８、および９のアミノ酸配列のそれぞれＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３のうちの少なくとも１つ、優先的には少なくとも２つ、優先的には３つを含んでなる軽鎖とを含んでなる、抗体、
・配列番号１０、１１、および１２のアミノ酸配列のそれぞれＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３のうちの少なくとも１つ、優先的には少なくとも２つ、優先的には３つを含んでなる重鎖と、配列番号１３、１４、および１５のアミノ酸配列のそれぞれＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３のうちの少なくとも１つ、優先的には少なくとも２つ、優先的には３つを含んでなる軽鎖とを含んでなる、抗体、
・配列番号１６、１７、および１８のアミノ酸配列のそれぞれＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３のうちの少なくとも１つ、優先的には少なくとも２つ、優先的には３つを含んでなる重鎖と、配列番号１９、２０、および２１のアミノ酸配列のそれぞれＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３のうちの少なくとも１つ、優先的には少なくとも２つ、優先的には３つを含んでなる軽鎖とを含んでなる、抗体、
・配列番号２２、２３、および２４のアミノ酸配列のそれぞれＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３のうちの少なくとも１つ、優先的には少なくとも２つ、優先的には３つを含んでなる重鎖と、配列番号２５、２６、および２７のアミノ酸配列のそれぞれＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３のうちの少なくとも１つ、優先的には少なくとも２つ、優先的には３つを含んでなる軽鎖とを含んでなる、抗体、
・配列番号２８、２９、および３０のアミノ酸配列のそれぞれＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３のうちの少なくとも１つ、優先的には少なくとも２つ、優先的には３つを含んでなる重鎖と、配列番号３１、３２、および３３のアミノ酸配列のそれぞれＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３のうちの少なくとも１つ、優先的には少なくとも２つ、優先的には３つを含んでなる軽鎖とを含んでなる、抗体、並びに
・配列番号３４、３５、および３６のアミノ酸配列のそれぞれＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３のうちの少なくとも１つ、優先的には少なくとも２つ、優先的には３つを含んでなる重鎖と、配列番号３７、３８、および３９のアミノ酸配列のそれぞれＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３のうちの少なくとも１つ、優先的には少なくとも２つ、優先的には３つを含んでなる軽鎖とを含んでなる、抗体
からなる群から選択される、プロガストリン結合抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用のためのプロガストリン結合抗体またはその抗原結合断片であって、前記抗体が、
・配列番号４１のアミノ酸配列の重鎖と、配列番号４２のアミノ酸配列の軽鎖とを含んでなる、モノクローナル抗体、
・配列番号４３のアミノ酸配列の重鎖と、配列番号４４のアミノ酸配列の軽鎖とを含んでなる、モノクローナル抗体、
・配列番号４５のアミノ酸配列の重鎖と、配列番号４６のアミノ酸配列の軽鎖とを含んでなる、モノクローナル抗体、
・配列番号４７のアミノ酸配列の重鎖と、配列番号４８のアミノ酸配列の軽鎖とを含んでなる、モノクローナル抗体、
・配列番号４９のアミノ酸配列の重鎖と、配列番号５０のアミノ酸配列の軽鎖とを含んでなる、モノクローナル抗体、および
・配列番号５１のアミノ酸配列の重鎖と、配列番号５２のアミノ酸配列の軽鎖とを含んでなる、モノクローナル抗体
からなる群から選択される、プロガストリン結合抗体またはその抗原結合断片。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用のためのプロガストリン結合抗体またはその抗原結合断片であって、前記抗体がヒト化抗体である、プロガストリン結合抗体またはその抗原結合断片。
【請求項８】
請求項７に記載の使用のためのプロガストリン結合抗体またはその抗原結合断片であって、前記抗体が、
・配列番号５３のアミノ酸配列の重鎖可変領域と、配列番号５４のアミノ酸配列の軽鎖可変領域とを含んでなる、ヒト化抗体、
・配列番号５５のアミノ酸配列の重鎖可変領域と、配列番号５６のアミノ酸配列の軽鎖可変領域とを含んでなる、ヒト化抗体、
・配列番号５７、５８、および５９の間で選択されるアミノ酸配列の重鎖可変領域と、配列番号６０、６１、および６２の間で選択されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域とを含んでなる、ヒト化抗体、
・配列番号６３、６４、および６５の間で選択されるアミノ酸配列の重鎖可変領域と、配列番号６６、６７、および６８の間で選択されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域とを含んでなる、ヒト化抗体、
・配列番号６９および７１の間で選択されるアミノ酸配列の重鎖可変領域と、配列番号７０および７２の間で選択されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域とを含んでなる、ヒト化抗体、並びに
・配列番号７５および７６の間で選択されるアミノ酸配列の重鎖可変領域と、配列番号７７および７８の間で選択されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域とを含んでなる、ヒト化抗体
からなる群において選択され、
前記抗体が、ヒト抗体に由来する軽鎖および重鎖の定常領域も含む、プロガストリン結合抗体またはその抗原結合断片。
【請求項９】
請求項７または８に記載の使用のためのプロガストリン結合抗体またはその抗原結合断片であって、前記抗体が、配列番号７１のアミノ酸配列の重鎖可変領域と、配列番号７２のアミノ酸配列の軽鎖可変領域とを含み、前記抗体が、ヒト抗体に由来する軽鎖および重鎖の定常領域も含んでなる、プロガストリン結合抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれか一項に記載の使用のためのプロガストリン結合抗体またはその抗原結合断片であって、前記抗体が、配列番号７３のアミノ酸配列の重鎖と、配列番号７４のアミノ酸配列の軽鎖とを含む、プロガストリン結合抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１１】
肺がんの予防または治療のための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のプロガストリン結合抗体またはその抗原結合断片並びに薬学的に許容される担体および／または賦形剤を含んでなる、医薬組成物。
【請求項１２】
第２の治療剤をさらに含んでなる、請求項１１に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項１３】
請求項１２に記載の使用のための医薬組成物であって、前記剤が、生物学的剤または化学療法剤である、医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１３に記載の使用のための医薬組成物であって、前記生物学的剤が、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体または抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体である、医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１４に記載の使用のための医薬組成物であって、前記化学療法剤が、アルキル化剤、代謝拮抗物質、抗腫瘍抗生物質、有糸分裂阻害物質、クロマチン機能阻害物質、抗血管新生剤、抗エストロゲン物質、抗アンドロゲン物質および免疫調節物質の群において選択される、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がんの予防および治療に関し、特に、肺がんの予防および治療のための方法および組成物に関する。本発明による組成物は、プロガストリン結合分子、特に抗ｈＰＧ抗体を含み、一方、本発明による方法は、プロガストリン結合分子の使用、特に抗ｈＰＧ抗体の使用を含む。
【背景技術】
【０００２】
肺がんは、依然として、世界の中で最も致死的な悪性腫瘍である。外科的治療、全身療法、および放射線療法の向上にもかかわらず、肺がんと診断された全ての患者における５年生存率は、１５から２０％の間にとどまっている。
【０００３】
肺がんは、２つの主なタイプの腫瘍、すなわち、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）および非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）を含む。ＳＣＬＣは、全ての肺がんの１５〜１８％に相当し、一方ＮＳＣＬＣは、肺がんの約８０％〜８５％を占める。その他のタイプの肺がん、例えば、腺様嚢胞がん、リンパ腫、および肉腫、さらに過誤腫などの良性肺腫瘍は、稀である。
【０００４】
小細胞肺がんおよび非小細胞肺がんの治療は異なる。具体的には、ＳＣＬＣは、他の細胞タイプの肺がんよりも化学療法および放射線療法に対する応答性が高い。しかし、ＳＣＬＣは、診断時までに広範囲に播種される傾向があるため、治癒の達成が難しい。これまでのところ、幅広い肺がんの医療現場に移行された分子的バイオマーカーは存在しない。治療はがんの発生に依存し、治療としては、通常、小さな限局性の腫瘍については手術、または化学療法（場合によっては放射線療法と組み合わせる）が挙げられる。
【０００５】
そのため、肺がんの予防または治療のための新たな組成物および方法が依然必要とされている。
【０００６】
これが、本発明の目的である。
【発明の概要】
【０００７】
ここで、本発明は、肺がんの予防または治療で使用するための、プロガストリンに対し特異的に結合する抗体を提供する。また、本発明は、肺がんの予防または治療で使用するための組成物であって、プロガストリンに対し特異的に結合する抗体を含む組成物、並びに肺がんの予防または治療のための方法であって、プロガストリンに結合する抗体を含んでなる組成物の単独での使用、または任意の他の公知の肺がんに対する予防もしくは治療方法と組み合わせての使用を含んでなる、方法も提供する。
【０００８】
本明細書で説明される抗ｈＰＧ抗体、特に中和抗ｈＰＧ抗体は、肺腫瘍細胞のＰＧ依存的増殖を阻害することで、肺がんの治療のための有用な治療剤となる。したがって、抗ｈＰＧ抗体を含んでなる組成物と、肺がんを治療するための抗ｈＰＧ抗体および／または医薬組成物を使用する方法も提供される。医薬組成物は、例えば、非経口、皮下または静脈内注射を含めた、任意の好都合な投与経路向けに製剤化することができ、この医薬組成物は、典型的には、抗ｈＰＧ抗体、および１つ以上の許容される担体、賦形剤、および／または所望の投与様式に好適な希釈剤を含み、また、以下でさらに説明されるような他の任意選択の構成要素を含んでもよい。組成物は、治療的使用向けに、使用しやすいように単位剤形にパッケージングされてもよい。
【０００９】
概して、治療方法は、治療を必要とする対象、例えば、肺がんと診断された対象に、治療的利益をもたらすのに有効な量の抗ＰＧ抗体および／またはその医薬組成物を投与することを含む。治療的利益としては、以下でさらに詳細に説明されるが、肺がんの任意の緩和、例えば、肺がんの進行の緩徐化もしくは停止、肺がんの重症度の低減、肺がんの成長もしくは肺がん細胞の増殖の阻害、肺腫瘍のサイズの低減、および／または肺がん患者におけるＰＧ血清レベルの低減が挙げられる。対象は、ヒトであっても、または家畜化動物（例えば、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ウマ）もしくは非家畜化動物を含めた非ヒトであってもよい。好ましくは、治療される対象は、ヒトである。抗ｈＰＧ抗体療法が有用である対象は、任意の疾患進行ステージにある患者（例えば、肺がんステージ０、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、もしくはＩＶ）、肺がん向け療法を受けている患者（例えば、化学療法、放射線療法、外科的切除）、またはその他の肺がん向け療法を受けている患者であり得る。
【００１０】
また、肺がん幹細胞の成長の阻害を必要とする患者に、当該肺がん幹細胞を阻害するのに有効な量の抗ＰＧ抗体および／またはその医薬組成物を投与することにより、患者における肺がん幹細胞の成長を阻害するための方法も提供される。
【００１１】
複数の態様において、抗ＰＧ抗体は、肺がん幹細胞の増殖の低減、または肺がん幹細胞の分化もしくは細胞死の速度の増殖、または治療される患者におけるプロガストリン血中濃度の低減に有効である。他の態様において、抗ＰＧ抗体および／またはその医薬組成物は、結腸直腸がん幹細胞の成長の阻害に有効な第２の治療剤、例えば、プロガストリン以外に対する特異性を有する抗体、と同時にまたはその後に、投与することができる。
【００１２】
本明細書で説明されるような抗ｈＰＧ抗体を用いた治療は、他の療法と組み合わせても他の療法に付属してもよい。その他の肺がん向け療法における非限定的な例としては、化学療法処置、放射線療法、外科的切除、および本明細書で説明されるような抗体療法が挙げられる。具体的な例において、抗ｈＰＧ抗体は、化学療法剤と組み合わせて投与される。別の具体的な例において、抗ｈＰＧ抗体は、外科的切除に付属して投与される。
【００１３】
また、本発明は、抗ＰＧ抗体と好ましくは薬学的に許容される担体および／または賦形剤とを含む医薬組成物にも関する。一部の態様において、医薬組成物は、第２の治療剤をさらに含む。一部の態様において、第２の治療剤は、生物学的剤または化学療法剤である。生物学的剤の例としては、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体および抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体が挙げられ、一方、化学療法剤は、例えば、アルキル化剤、代謝拮抗物質、抗腫瘍抗生物質、有糸分裂阻害物質、クロマチン機能阻害物質、抗血管新生剤、抗エストロゲン物質、抗アンドロゲン物質、および免疫調節物質などの化合物を含む。
【００１４】
ヒトプレプロガストリンの１０１アミノ酸ペプチド（アミノ酸配列参照：ＡＡＢ１９３０４．１）は、ガストリン遺伝子の一次翻訳産物である。プロガストリンは、プレプロガストリンから最初の２１アミノ酸（シグナルペプチド）を切断することによって形成される。プロガストリンの８０アミノ酸鎖は、さらに、切断および修飾酵素によって処理されて、いくつかの生物学的活性ガストリンホルモン形態：プロガストリンのアミノ酸３８〜７１を含む、ガストリン３４（Ｇ３４）およびグリシン伸長ガストリン３４（Ｇ３４−Ｇｌｙ）、プロガストリンのアミノ酸５５〜７１を含む、ガストリン１７（Ｇ１７）およびグリシン伸長ガストリン１７（Ｇ１７−Ｇｌｙ）となる。
【００１５】
抗ヒトプロガストリン（抗ｈＰＧ）モノクローナル抗体および、診断または療法のためのその使用は、以下の文書：結腸直腸がんについてはＷＯ２０１１／０８３０８８、乳がんについてはＷＯ２０１１／０８３０９０、膵臓がんについてはＷＯ２０１１／０８３０９１、結腸直腸および胃腸がんについてはＷＯ２０１１／１１６９５４、並びに肝臓病態についてはＷＯ２０１２／０１３６０９およびＷＯ２０１１／０８３０８９で説明されている。
【００１６】
本発明は、本明細書に示される詳細な説明と付属の図面とから、より十分に理解されよう。ただし、これらの説明および図面は、例示として示されるに過ぎず、本発明の意図されている範囲を限定しない。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
第１の側面において、本発明は、肺がんの予防または治療で使用するためのプロガストリン結合分子に関する。また、本開示は、前立腺がんの予防または治療における使用のための組成物であって、プロガストリン結合抗体またはその抗原結合断片を含む組成物も提供する。
【００１８】
「プロガストリン結合分子」とは、本明細書において、プロガストリンに結合するが、ガストリン１７（Ｇ１７）、ガストリン３４（Ｇ３４）、グリシン伸長ガストリン１７（Ｇ１７−Ｇｌｙ）、またはグリシン伸長ガストリン３４（Ｇ３４−Ｇｌｙ）には結合しない任意の分子を意味する。本発明のプロガストリン結合分子は、任意のプロガストリン結合分子、例えば、抗体分子または受容体分子であり得る。好ましくは、プロガストリン結合分子は、抗プロガストリン抗体（抗ＰＧ抗体）またはその抗原結合断片である。
【００１９】
「プロガストリン」という用語は、哺乳類プロガストリンペプチド、特にヒトプロガストリンを指す。誤解を避けるため、いかなる指定も伴わない「ヒトプロガストリン」または「ｈＰＧ」という表現は、配列番号１の配列のヒトＰＧを意味する。ヒトプロガストリンは、注目すべきことに、上述の生物学的活性ガストリンホルモン形態には存在しないＮ末端およびＣ末端ドメインを含む。好ましくは、当該Ｎ末端ドメインの配列は、配列番号２によって表される。別の好ましい態様において、当該Ｃ末端ドメインの配列は、配列番号３によって表される。
【００２０】
したがって、第１の態様において、本発明は、プロガストリンに結合するが、他のガストリン遺伝子由来産物のいずれにも結合しない、肺がんの治療における使用のための抗体に関する。
【００２１】
「結合する」、「結合」などは、抗体またはその抗原結合断片が、生理的条件下で比較的安定性である抗原との複合体を形成することを意図している。２つの分子が結合するかどうかを定量するための方法は、当分野で周知されており、例えば、平衡透析法、表面プラズモン共鳴法などが挙げられる。特定の態様において、当該抗体またはその抗原結合断片は、ＢＳＡまたはカゼインなどの非特異的分子に対する結合における親和性よりも少なくとも２倍大きい親和性で、プロガストリンに結合する。より特定の態様において、当該抗体またはその抗原結合断片は、プロガストリンのみに結合する。
【００２２】
「肺がん」という表現は、肺の組織内、通常は気道の内側を覆う細胞内で生じるがんを指す。本明細書で使用する「肺がん」とは、特定の、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）（小細胞がんおよび混合型小細胞がんを含む）並びに非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）（扁平上皮がん、大細胞がん、および腺がん）を包含する。また、その他のタイプの肺がん、例えば、腺様嚢胞がん、リンパ腫、および肉腫、さらに過誤腫などの良性肺腫瘍も、本明細書で使用する肺がんに含まれる。
【００２３】
具体的な態様において、本発明は、肺がんの予防または治療における使用のための抗ＰＧ抗体であって、プロガストリンのアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を含むエピトープを認識する、抗ＰＧ抗体を提供する。
【００２４】
より具体的な態様において、肺がんの予防または治療における使用のための当該抗ＰＧ抗体は、プロガストリンのエピトープを認識し、当該エピトープは、プロガストリンのＮ末端部分のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を含み、当該アミノ酸配列は、ｈＰＧの残基１０〜１４、ｈＰＧの残基９〜１４、ｈＰＧの残基４〜１０、ｈＰＧの残基２〜１０、またはｈＰＧの残基２〜１４に対応するアミノ酸配列を含み得、ｈＰＧのアミノ酸配列は、配列番号１である。
【００２５】
より具体的な態様において、肺がんの予防または治療における使用のための抗ＰＧ抗体は、プロガストリンのエピトープを認識し、当該エピトープは、プロガストリンのＣ末端部分のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を含み、当該アミノ酸配列は、ｈＰＧの残基７１〜７４、ｈＰＧの残基６９〜７３、ｈＰＧの残基７１〜８０（配列番号４０）、ｈＰＧの残基７６〜８０、またはｈＰＧの残基６７〜７４に対応するアミノ酸配列を含み得、ｈＰＧのアミノ酸配列は、配列番号１である。
【００２６】
より特定の態様において、肺がんの予防または治療における使用のための抗ＰＧ抗体は、上述のような方法による定量で、少なくとも５０００ｎＭ、少なくとも５００ｎＭ、１００ｎＭ、８０ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、７ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．５ｎＭ、０．１ｎＭ、５０ｐＭ、１０ｐＭ、５ｐＭ、１ｐＭ、または少なくとも０．１ｐＭのプロガストリンに対する親和性を有する。
【００２７】
好ましくは、肺がんの予防または治療における使用のための抗ＰＧ抗体は、中和抗ＰＧ抗体である。
【００２８】
「中和抗ＰＧ抗体」という表現は、ＰＧに結合しＰＧ依存的シグナリングをブロックして、腫瘍細胞における、特に肺腫瘍細胞におけるＰＧ誘導応答の阻害をもたらす抗体を指す。肺がん細胞のＰＧ誘導応答の阻害は、細胞分化の抑制、細胞死の抑制、および／または細胞増殖の刺激によって媒介され得る。
【００２９】
本明細書で使用する「抗体」とは、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を含むように意図されている。抗体（または「免疫グロブリン」）は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質からなる。各重鎖は、重鎖可変領域（またはドメイン）（本明細書ではＨＣＶＲまたはＶＨと略される）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲまたはＶＬと略される）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬを含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）または「超可変領域」と称される超可変性の領域にさらに再分割され得、これらの領域は、主に抗原のエピトープへの結合を担い、これらの領域の間には、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される、より保存的な領域が散在する。抗体の軽鎖および重鎖内のＣＤＲを同定し、これらの配列を決定する方法は、当業者に周知されている。誤解を避けるため、反対の内容が示されない場合、ＣＤＲという表現は、ＩＭＧＴにより定義される抗体の重鎖および軽鎖の超可変領域を意味する。ＩＭＧＴユニークナンバリングは、フレームワーク領域および相補性決定領域（ＣＤＲ１−ＩＭＧＴ：２７〜３８、ＣＤＲ２）の標準化された境界を提供する。
【００３０】
ＩＭＧＴユニークナンバリングは、任意の抗原受容体、鎖のタイプ、または種における可変ドメインを比較するために定義された［Ｌｅｆｒａｎｃ  Ｍ．−Ｐ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １８，５０９（１９９７）／Ｌｅｆｒａｎｃ  Ｍ．−Ｐ．，Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ，７，１３２−１３６（１９９９）／Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．，Ｐｏｍｍｉｅ，Ｃ．，Ｒｕｉｚ，Ｍ．，Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉ，Ｖ．，Ｆｏｕｌｑｕｉｅｒ，Ｅ．，Ｔｒｕｏｎｇ，Ｌ．，Ｔｈｏｕｖｅｎｉｎ−Ｃｏｎｔｅｔ，Ｖ．ａｎｄ  Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７，５５−７７（２００３）］。ＩＭＧＴユニークナンバリングにおいて、保存アミノ酸は常に同じ位置にあり、例えば、システイン２３（１ｓｔ−ＣＹＳ）、トリプトファン４１（ＣＯＮＳＥＲＶＥＤ−ＴＲＰ）、疎水アミノ酸８９、システイン１０４（２ｎｄ−ＣＹＳ）、フェニルアラニンまたはトリプトファン１１８（Ｊ−ＰＨＥまたはＪ−ＴＲＰ）となる。ＩＭＧＴユニークナンバリングは、フレームワーク領域（ＦＲ１−ＩＭＧＴ：位置１〜２６、ＦＲ２−ＩＭＧＴ：位置３９〜５５、ＦＲ３−ＩＭＧＴ：６６〜１０４、およびＦＲ４−ＩＭＧＴ：１１８〜１２８）および相補性決定領域（ＣＤＲ１−ＩＭＧＴ：２７〜３８、ＣＤＲ２−ＩＭＧＴ：５６〜６５、およびＣＤＲ３−ＩＭＧＴ：１０５〜１１７）の標準化された境界を提供する。ギャップは、占有されていない位置に相当するため、ＣＤＲ−ＩＭＧＴの長さ（括弧の間に示され、ドットで区切られる（例えば、［８．８．１３］））は決定的な情報になる。ＩＭＧＴユニークナンバリングは、ＩＭＧＴ  Ｃｏｌｌｉｅｒｓ  ｄｅ  Ｐｅｒｌｅｓという名称の２Ｄ図式表現［Ｒｕｉｚ，Ｍ．ａｎｄ  Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，５３，８５７−８８３（２００２）／Ｋａａｓ，Ｑ．ａｎｄ  Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２，２１−３０（２００７）］およびＩＭＧＴ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ＤＢにおける３Ｄ構造［Ｋａａｓ，Ｑ．，Ｒｕｉｚ，Ｍ．ａｎｄ  Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．，Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｄ  ＭＨＣ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｄａｔａ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，３２，Ｄ２０８−Ｄ２１０（２００４）］で使用されている。
【００３１】
各ＶＨおよびＶＬは３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端にかけて以下の順：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４に並んでいる。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫グロブリンが、宿主組織または因子（免疫システムの様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的相補システムの第１の構成要素（Ｃｌｑ）を含む）に結合するのを媒介し得る。抗体は、異なるアイソタイプのもの（すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、またはＩｇＭ）であってもよい。
【００３２】
特定の態様において、当該プロガストリン結合抗体またはその抗原結合断片は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、１本鎖抗体、ラクダ化抗体、ＩｇＡ１抗体、ＩｇＡ２抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、ＩｇＧ４抗体、およびＩｇＭ抗体からなる群より選択される。
【００３３】
「ポリクローナル抗体」とは、１つ以上の他の同一ではない抗体の中で、またはこのような抗体の存在下で産生された抗体である。概して、ポリクローナル抗体は、Ｂリンパ球から、同一ではない抗体を産生するいくつかの他のＢリンパ球の存在下で産生される。通常、ポリクローナル抗体は、免疫化された動物から直接取得される。
【００３４】
「モノクローナル抗体」という用語は、ほぼ同質な抗体集団から生じる抗体を指し、この抗体集団は、最小限の割合で見いだされ得るいくつかの考えられる天然存在の変異を除き、同一な抗体を含む。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマなどの単一の細胞クローンの成長から生じ、１つのクラスおよびサブクラスの重鎖と、１つのタイプの軽鎖とによって特徴づけられる。
【００３５】
抗体の「抗原結合断片」という表現は、当該抗体の標的（概して抗原とも呼ばれる）、概して同じエピトープに結合する能力を保持し、かつ、抗体のアミノ酸配列のうちの、少なくとも５個の隣接するアミノ酸残基、少なくとも１０個の隣接するアミノ酸残基、少なくとも１５個の隣接するアミノ酸残基、少なくとも２０個の隣接するアミノ酸残基、少なくとも２５個の隣接するアミノ酸残基、少なくとも４０個の隣接するアミノ酸残基、少なくとも５０個の隣接するアミノ酸残基、少なくとも６０個の隣接するアミノ酸残基、少なくとも７０個の隣接するアミノ酸残基、少なくとも８０個の隣接するアミノ酸残基、少なくとも９０個の隣接するアミノ酸残基、少なくとも１００個の隣接するアミノ酸残基、少なくとも１２５個の隣接するアミノ酸残基、少なくとも１５０個の隣接するアミノ酸残基、少なくとも１７５個の隣接するアミノ酸残基、または少なくとも２００個の隣接するアミノ酸残基のアミノ酸配列を含む、任意のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を示すように意図している。
【００３６】
特定の態様において、当該抗原結合断片は、由来抗体における少なくとも１つのＣＤＲを含む。さらに好ましい態様において、当該抗原結合断片は、由来抗体における２、３、４、または５つのＣＤＲ、より好ましくは由来抗体における６つのＣＤＲを含む。
【００３７】
「抗原結合断片」は、以下に限定されないが、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（ｓｃは１本鎖を指す）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ′）２、Ｆａｂ′、ｓｃＦｖ−Ｆｃ断片もしくはダイアボディー、またはＸＴＥＮ（伸長組換えポリペプチド）もしくはＰＡＳモチーフなどの不規則なペプチドを伴う融合タンパク質、または化学修飾により、例えば、ポリ（アルキレン）グリコールの付加、例えば、ポリ（エチレン）グリコールの付加（「ＰＥＧ化」）（ペグ化断片は、Ｆｖ−ＰＥＧ、ｓｃＦｖ−ＰＥＧ、Ｆａｂ−ＰＥＧ、Ｆ（ａｂ′）２−ＰＥＧ、もしくはＦａｂ′−ＰＥＧと呼ばれる）（「ＰＥＧ」はポリ（エチレン）グリコールを指す）により、もしくはリポソーム内の取込みにより、半減期が増加する任意の断片からなる群において選択され得、当該断片は、本発明における抗体の特徴的ＣＤＲのうちの少なくとも１つを有する。好ましくは、当該「抗原結合断片」は、由来する抗体の可変重鎖または可変軽鎖の部分的配列を含み、当該部分的配列は、由来する抗体と同じ結合特異性と、由来する抗体の標的に対する親和性の、好ましくは少なくとも１／１００、より好ましい方式では少なくとも１／１０に等しい十分な親和性とを保持するのに十分である。
【００３８】
別の特定の態様において、本発明における肺がんの診断のための方法において、対象からの生体試料は、プロガストリンに結合する抗体に接触され、当該抗体は、当業者に公知の免疫化法によって得られたものであり、アミノ酸配列がプロガストリンのアミノ酸配列の全体または一部を含むペプチドを、免疫原として使用する。特に、当該免疫原は、
・アミノ酸配列が、全長プロガストリンのアミノ酸配列、特に、配列番号１の全長ヒトプロガストリンを含むまたはそれからなる、ペプチド、
・アミノ酸配列が、プロガストリンのアミノ酸配列の一部、特に、配列番号１の全長ヒトプロガストリンの一部に対応する、ペプチド、
・アミノ酸配列が、プロガストリンのＮ末端部分の一部または全体のアミノ酸配列に対応する、ペプチド、特に、アミノ酸配列：ＳＷＫＰＲＳＱＱＰＤＡＰＬＧ（配列番号２）を含むまたはそれからなる、ペプチド、並びに
・アミノ酸配列が、プロガストリンのＣ末端部分の一部または全体のアミノ酸配列に対応する、ペプチド、特に、アミノ酸配列：ＱＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹＧＷＭＤＦＧＲＲＳＡＥＤＥＮ（配列番号３）を含むまたはそれからなる、ペプチド、
・アミノ酸配列が、プロガストリンのＣ末端部分の一部のアミノ酸配列に対応する、ペプチド、特に、プロガストリンのアミノ酸７１〜８０に対応するアミノ酸配列ＦＧＲＲＳＡＥＤＥＮ（配列番号４０）を含む、ペプチド
の中で選択されるペプチドを含む。
【００３９】
当業者は、このような免疫化が、所望されるポリクローナルまたはモノクローナル抗体の生成に使用され得ることを了解するであろう。これらのタイプの抗体の各々を取得する方法は、当技術分野で周知されている。したがって、当業者は、任意の所与の抗原に対するポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体の生成方法を容易に選択および実装するであろう。
【００４０】
ヒトプロガストリンのアミノ酸配列１〜１４（Ｎ末端）に対応するアミノ酸配列「ＳＷＫＰＲＳＱＱＰＤＡＰＬＧ」を含む免疫原を使用することにより生成されたモノクローナル抗体の例としては、以下に限定されないが、以下の表１〜表４に記載されるようなｍＡｂ３、ｍＡｂ４、ｍＡｂ１６、およびｍＡｂ１９、およびｍＡｂ２０という名称のモノクローナル抗体が挙げられる。その他のモノクローナル抗体も説明されているが、これらが実際にプロガストリンに結合するかどうかは明確でない（ＷＯ２００６／０３２９８０）。エピトープマッピングの実験結果からは、ｍＡｂ３、ｍＡｂ４、ｍＡｂ１６、およびｍＡｂ１９、およびｍＡｂ２０が当該ｈＰＧ  Ｎ末端アミノ酸配列内のエピトープに特異的に結合することが示されている。配列番号２によって表されるプロガストリンのＮ末端内のエピトープを特異的に認識するポリクローナル抗体は、当技術分野で説明されている（例えば、ＷＯ２０１１／０８３０８８を参照）。
【００４１】
【表１】
2020512366.tif 000002
【００４２】
【表２】
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【００４３】
【表３】
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2020512366.tif 000005
【００４４】
【表４】
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2020512366.tif 000007
【００４５】
ヒトプロガストリンのアミノ酸配列５５〜８０に対応するアミノ酸配列「ＱＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹＧＷＭＤＦＧＲＲＳＡＥＤＥＮ」（プロガストリンのＣ末端部分）を含む免疫原を使用することにより生成され得るモノクローナル抗体の例としては、以下に限定されないが、以下の表５および表６にあるようなｍＡｂ８およびｍＡｂ１３という名称の抗体が挙げられる。エピトープマッピングの実験結果からは、ｍＡｂ１３が当該ｈＰＧ  Ｃ末端アミノ酸配列内のエピトープに特異的に結合することが示されている。
【００４６】
【表５】
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2020512366.tif 000009
2020512366.tif 000010
【００４７】
【表６】
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【００４８】
その他の例としては、配列番号４０のアミノ酸配列を含む免疫原を使用することにより生成される抗ｈＰＧモノクローナルおよび／またはポリクローナル抗体が挙げられる。
【００４９】
「Ｎ末端抗ｈＰＧ抗体」および「Ｃ末端抗ｈＰＧ抗体」という用語は、それぞれ、ｈＰＧのＮ末端部分に位置するアミノ酸を含むエピトープ、またはｈＰＧのＣ末端部分に位置するアミノ酸を含むエピトープに結合する抗体を指す。好ましくは、「Ｎ末端抗ｈＰＧ抗体」という用語は、配列が配列番号２によって表されるプロガストリンのドメインに位置するエピトープに結合する抗体を意味する。別の好ましい態様において、「Ｃ末端抗ｈＰＧ抗体」という用語は、配列が配列番号３によって表されるプロガストリンのドメインに位置するエピトープに結合する抗体を意味する。
【００５０】
「エピトープ」という用語は、抗体が結合する抗原の領域を意味する。エピトープは、構造的または機能的なものとして定義され得る。機能的エピトープは、概して、構造的エピトープのサブセットであり、相互作用の親和性に直接寄与するアミノ酸を有する。エピトープは、立体構造的でもあり得る。ある態様において、エピトープは、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、またはスルホニル基などの分子の化学的活性表面グルーピングである決定基を含むことがあり、またある態様において、エピトープは、特定の３次元構造特性、および／または特定の電荷特性を有することがある。抗体が結合するエピトープの決定は、当業者には公知のエピトープマッピング技法によって実施することができる。エピトープは、タンパク質のアミノ酸配列内に連続的に配置された異なるアミノ酸を含むことがある。また、エピトープは、タンパク質のアミノ酸配列内に連続的に配置されていないアミノ酸を含むこともある。
【００５１】
特定の態様において、当該抗体はモノクローナル抗体であって、
・配列番号４、５、および６のアミノ酸配列のそれぞれＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３のうちの少なくとも１つ、優先的には少なくとも２つ、優先的には３つを含んでなる重鎖、または、配列番号４、５、および６の配列それぞれに対し、最適アラインメント後に少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％、および９８％の同一性を有する配列を含む重鎖と、配列番号７、８、および９のアミノ酸配列のそれぞれＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３のうちの少なくとも１つ、優先的には少なくとも２つ、優先的には３つを含んでなる軽鎖、または、配列番号７、８、および９の配列それぞれに対し、最適アラインメント後に少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％、および９８％の同一性を有する配列を含んでなる軽鎖とを含んでなる、モノクローナル抗体、
・配列番号１０、１１、および１２のアミノ酸配列のそれぞれＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３のうちの少なくとも１つ、優先的には少なくとも２つ、優先的には３つを含んでなる重鎖、または、配列番号１０、１１、および１２の配列それぞれに対し、最適アラインメント後に少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％、および９８％の同一性を有する配列を含む重鎖と、配列番号１３、１４、および１５のアミノ酸配列のそれぞれＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３のうちの少なくとも１つ、優先的には少なくとも２つ、優先的には３つを含んでなる軽鎖、または、配列番号１３、１４、および１５の配列それぞれに対し、最適アラインメント後に少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％、および９８％の同一性を有する配列を含んでなる軽鎖とを含んでなる、モノクローナル抗体、
・配列番号１６、１７、および１８のアミノ酸配列のそれぞれＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３のうちの少なくとも１つ、優先的には少なくとも２つ、優先的には３つを含んでなる重鎖、または、配列番号１６、１７、および１８の配列それぞれに対し、最適アラインメント後に少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％、および９８％の同一性を有する配列を含む重鎖と、配列番号１９、２０、および２１のアミノ酸配列のそれぞれＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３のうちの少なくとも１つ、優先的には少なくとも２つ、優先的には３つを含んでなる軽鎖、または、配列番号１９、２０、および２１の配列それぞれに対し、最適アラインメント後に少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％、および９８％の同一性を有する配列を含んでなる軽鎖とを含んでなる、モノクローナル抗体、
・配列番号２２、２３、および２４のアミノ酸配列のそれぞれＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３のうちの少なくとも１つ、優先的には少なくとも２つ、優先的には３つを含んでなる重鎖、または、配列番号２２、２３、および２４の配列それぞれに対し、最適アラインメント後に少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％、および９８％の同一性を有する配列を含む重鎖と、配列番号２５、２６、および２７のアミノ酸配列のそれぞれＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３のうちの少なくとも１つ、優先的には少なくとも２つ、優先的には３つを含んでなる軽鎖、または、配列番号２５、２６、および２７の配列それぞれに対し、最適アラインメント後に少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％、および９８％の同一性を有する配列を含んでなる軽鎖とを含んでなる、モノクローナル抗体、
・配列番号２８、２９、および３０のアミノ酸配列のそれぞれＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３のうちの少なくとも１つ、優先的には少なくとも２つ、優先的には少なくとも３つを含んでなる重鎖、または、配列番号２８、２９、および３０の配列それぞれに対し、最適アラインメント後に少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％、および９８％の同一性を有する配列を含む重鎖と、配列番号３１、３２、および３３のアミノ酸配列のそれぞれＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３のうちの少なくとも１つ、優先的には少なくとも２つ、優先的には３つを含んでなる軽鎖、または、配列番号３１、３２、および３３の配列それぞれに対し、最適アラインメント後に少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％、および９８％の同一性を有する配列を含んでなる軽鎖とを含んでなる、モノクローナル抗体、並びに
・配列番号３４、３５、および３６のアミノ酸配列のそれぞれＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３のうちの少なくとも１つ、優先的には少なくとも２つ、優先的には３つを含んでなる重鎖、または、配列番号３４、３５、および３６の配列それぞれに対し、最適アラインメント後に少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％、および９８％の同一性を有する配列を含む重鎖と、配列番号３７、３８、および３９のアミノ酸配列のそれぞれＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３のうちの少なくとも１つ、優先的には少なくとも２つ、優先的には３つを含んでなる軽鎖、または、配列番号３７、３８、および３９の配列それぞれに対し、最適アラインメント後に少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％、および９８％の同一性を有する配列を含んでなる軽鎖とを含んでなる、モノクローナル抗体
からなる群において選択される、モノクローナル抗体である。
【００５２】
本発明の意味において、核酸またはアミノ酸の２つの配列間における「パーセンテージ同一性」または「％同一性」とは、最適アラインメントの後に得られる、比較対象となる２つの配列間における同一なヌクレオチドまたはアミノ酸残基のパーセンテージを意味し、このパーセンテージは純粋に統計的であり、２つの配列間における違いはそれらの長さに従ってランダムに分布する。２つの核酸またはアミノ酸配列の比較は、従来的には、最適にアラインメントした後に配列を比較することによって実施し、当該比較は、セグメントにより、または「アラインメントウインドウ」を使用することにより、行うことができる。比較のための配列の最適アラインメントは、手作業による比較に加え、当業者に公知の方法によって実施することができる。
【００５３】
参照アミノ酸配列に対する少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％、および９８％の同一性を示すアミノ酸配列については、好ましい例としては、参照配列、ある修飾、特に、少なくとも１つのアミノ酸の欠失、付加、もしくは置換、短縮または伸長を含有するアミノ酸配列が挙げられる。１つ以上の連続したまたは連続していないアミノ酸の置換の場合において、置換されるアミノ酸が「等価」アミノ酸によって置き換えられる置換が好ましい。ここでの「等価アミノ酸」という表現は、構造的アミノ酸のうちの１つに対し置換される可能性があり、ただし対応する抗体および以下に定義される具体例の生物学的活性を変更しない、任意のアミノ酸を示すように意図されている。
【００５４】
等価アミノ酸は、置換対象のアミノ酸に対する構造的相同性に基づいて、または生成される可能性がある様々な抗体間における生物学的活性の比較試験の結果に基づいて、決定することができる。
【００５５】
より特定の態様において、当該抗体は、
・配列番号４１のアミノ酸配列の重鎖と、配列番号４２のアミノ酸配列の軽鎖とを含んでなる、モノクローナル抗体、
・配列番号４３のアミノ酸配列の重鎖と、配列番号４４のアミノ酸配列の軽鎖とを含んでなる、モノクローナル抗体、
・配列番号４５のアミノ酸配列の重鎖と、配列番号４６のアミノ酸配列の軽鎖とを含んでなる、モノクローナル抗体、
・配列番号４７のアミノ酸配列の重鎖と、配列番号４８のアミノ酸配列の軽鎖とを含んでなる、モノクローナル抗体、
・配列番号４９のアミノ酸配列の重鎖と、配列番号５０のアミノ酸配列の軽鎖とを含んでなる、モノクローナル抗体、および
・配列番号５１のアミノ酸配列の重鎖と、配列番号５２のアミノ酸配列の軽鎖とを含んでなる、モノクローナル抗体
からなる群において選択される、モノクローナル抗体である。
【００５６】
別の特定の態様において、本発明の方法で使用される抗体は、ヒト化抗体である。
【００５７】
本明細書で使用する「ヒト化抗体」という表現は、非ヒト起源の抗体に由来するＣＤＲ領域を含有し、抗体分子の他の部分は１つまたはいくつかのヒト抗体に由来する抗体を意味する。加えて、骨格セグメント残基（フレームワークについてはＦＲと呼ばれる）のいくつかは、当業者に公知の技法（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５，１９８６）に従って、結合親和性を保存するように修飾されてもよい。ヒト化の目的は、ヒトに導入するための異種抗体、例えば、マウス抗体の免疫原性を低減し、その一方で抗体の十分な抗原結合親和性および特異性を維持することである。
【００５８】
本発明のヒト化抗体またはその断片は、当業者に公知の技法（例えば、Ｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．，１５０：２８４４−２８５７，１９９２の文書で説明されている技法）によって調製することができる。このようなヒト化抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの診断またはｉｎ  ｖｉｖｏでの予防的および／もしくは治療的処置を伴う方法で使用するのが好ましい。その他のヒト化技法も、当業者に公知である。実際に、抗体は、ＣＤＲグラフティング（ＥＰ０  ４５１  ２６１；ＥＰ０  ６８２  ０４０；ＥＰ０  ９３９  １２７；ＥＰ０  ５６６  ６４７；ＵＳ５，５３０，１０１；ＵＳ６，１８０，３７０；ＵＳ５，５８５，０８９；ＵＳ５，６９３，７６１；ＵＳ５，６３９，６４１；ＵＳ６，０５４，２９７；ＵＳ５，８８６，１５２；およびＵＳ５，８７７，２９３）、ベニヤリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）またはリサーフェシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（ＥＰ０  ５９２  １０６；ＥＰ０  ５１９  ５９６；Ｐａｄｌａｎ  Ｅ．Ａ．，１９９１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２８（４／５）：４８９−４９８；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  Ｇ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７（６）：８０５−８１４；Ｒｏｇｕｓｋａ  Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ  Ｕ．Ｓ．Ａ．，９１：９６９−９７３）、および鎖シャッフリング（ｃｈａｉｎ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（米国特許第５，５６５，３３２号）を含めた様々な技法を用いて、ヒト化することができる。ヒト抗体は、ファージディスプレイ法を含めた様々な公知の方法によって作製することができる。米国特許第４，４４４，８８７号、第４，７１６，１１１号、第５，５４５，８０６号、および第５，８１４，３１８号；並びに国際特許出願公開番号ＷＯ９８／４６６４５、ＷＯ９８／５０４３３、ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ９８／１６６５４、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９６／３３７３５、およびＷＯ９１／１０７４１も参照。
【００５９】
より特定の態様において、当該抗体は、
・配列番号４、５、および６のアミノ酸配列のそれぞれＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３のうちの少なくとも１つ、優先的には少なくとも２つ、優先的には３つを含んでなる重鎖、または、配列番号４、５、および６の配列それぞれに対し、最適アラインメント後に少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％、および９８％の同一性を有する配列を含む重鎖と、配列番号７、８、および９のアミノ酸配列のそれぞれＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３のうちの少なくとも１つ、優先的には少なくとも２つ、優先的には３つを含んでなる軽鎖、または、配列番号７、８、および９の配列それぞれに対し、最適アラインメント後に少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％、および９８％の同一性を有する配列を含んでなる軽鎖とを含んでなる、ヒト化抗体、
・配列番号１０、１１、および１２のアミノ酸配列のそれぞれＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３のうちの少なくとも１つ、優先的には少なくとも２つ、優先的には３つを含んでなる重鎖、または、配列番号１０、１１、および１２の配列それぞれに対し、最適アラインメント後に少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％、および９８％の同一性を有する配列を含む重鎖と、配列番号１３、１４、および１５のアミノ酸配列のそれぞれＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３のうちの少なくとも１つ、優先的には少なくとも２つ、優先的には３つを含んでなる軽鎖、または、配列番号１３、１４、および１５の配列それぞれに対し、最適アラインメント後に少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％、および９８％の同一性を有する配列を含んでなる軽鎖とを含んでなる、ヒト化抗体、
・配列番号１６、１７、および１８のアミノ酸配列のそれぞれＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３のうちの少なくとも１つ、優先的には少なくとも２つ、優先的には３つを含んでなる重鎖、または、配列番号１６、１７、および１８の配列それぞれに対し、最適アラインメント後に少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％、および９８％の同一性を有する配列を含む重鎖と、配列番号１９、２０、および２１のアミノ酸配列のそれぞれＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３のうちの少なくとも１つ、優先的には少なくとも２つ、優先的には３つを含んでなる軽鎖、または、配列番号１９、２０、および２１の配列それぞれに対し、最適アラインメント後に少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％、および９８％の同一性を有する配列を含んでなる軽鎖とを含んでなる、ヒト化抗体、
・配列番号２２、２３、および２４のアミノ酸配列のそれぞれＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３のうちの少なくとも１つ、優先的には少なくとも２つ、優先的には３つを含んでなる重鎖、または、配列番号２２、２３、および２４の配列それぞれに対し、最適アラインメント後に少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％、および９８％の同一性を有する配列を含む重鎖と、配列番号２５、２６、および２７のアミノ酸配列のそれぞれＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３のうちの少なくとも１つ、優先的には少なくとも２つ、優先的には３つを含んでなる軽鎖、または、配列番号２５、２６、および２７の配列それぞれに対し、最適アラインメント後に少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％、および９８％の同一性を有する配列を含んでなる軽鎖とを含んでなる、ヒト化抗体、
・配列番号２８、２９、および３０のアミノ酸配列のそれぞれＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３のうちの少なくとも１つ、優先的には少なくとも２つ、優先的には３つを含んでなる重鎖、または、配列番号２８、２９、および３０の配列それぞれに対し、最適アラインメント後に少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％、および９８％の同一性を有する配列を含む重鎖と、配列番号３１、３２、および３３のアミノ酸配列のそれぞれＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３のうちの少なくとも１つ、優先的には少なくとも２つ、優先的には３つを含んでなる軽鎖、または、配列番号３１、３２、および３３の配列それぞれに対し、最適アラインメント後に少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％、および９８％の同一性を有する配列を含んでなる軽鎖とを含んでなる、ヒト化抗体、並びに
・配列番号３４、３５、および３６のアミノ酸配列のそれぞれＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３のうちの少なくとも１つ、優先的には少なくとも２つ、優先的には３つを含んでなる重鎖、または、配列番号３４、３５、および３６の配列それぞれに対し、最適アラインメント後に少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％、および９８％の同一性を有する配列を含む重鎖と、配列番号３７、３８、および３９のアミノ酸配列のそれぞれＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３のうちの少なくとも１つ、優先的には少なくとも２つ、優先的には３つを含んでなる軽鎖、または、配列番号３７、３８、および３９の配列それぞれに対し、最適アラインメント後に少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％、および９８％の同一性を有する配列を含んでなる軽鎖とを含んでなる、ヒト化抗体
からなる群において選択され、
ヒト抗体に由来する軽鎖および重鎖の定常領域も含んでなる、ヒト化抗体である。
【００６０】
より特定の別の態様において、当該抗体は、
・配列番号５３のアミノ酸配列の重鎖可変領域と、配列番号５４のアミノ酸配列の軽鎖可変領域とを含んでなる、ヒト化抗体、
・配列番号５５のアミノ酸配列の重鎖可変領域と、配列番号５６のアミノ酸配列の軽鎖可変領域とを含んでなる、ヒト化抗体、
・配列番号５７、５８、および５９の間で選択されるアミノ酸配列の重鎖可変領域と、配列番号６０、６１、および６２の間で選択されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域とを含んでなる、ヒト化抗体、
・配列番号６３、６４、および６５の間で選択されるアミノ酸配列の重鎖可変領域と、配列番号６６、６７、および６８の間で選択されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域とを含んでなる、ヒト化抗体、
・配列番号６９および７１の間で選択されるアミノ酸配列の重鎖可変領域と、配列番号７０および７２の間で選択されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域とを含んでなる、ヒト化抗体、並びに
・配列番号７５および７６の間で選択されるアミノ酸配列の重鎖可変領域と、配列番号７７および７８の間で選択されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域とを含んでなる、ヒト化抗体
からなる群において選択され、
ヒト抗体に由来する軽鎖および重鎖の定常領域も含んでなる、ヒト化抗体である。
【００６１】
より好ましくは、当該抗体は、配列番号７１のアミノ酸配列の重鎖可変領域と、配列番号７２のアミノ酸配列の軽鎖可変領域とを含み、当該抗体は、ヒト抗体に由来する軽鎖および重鎖の定常領域も含んでなる。
【００６２】
いっそうより好ましくは、当該抗体は、配列番号７３のアミノ酸配列の重鎖と、配列番号７４のアミノ酸配列の軽鎖とを含む。
【００６３】
別の側面において、本発明は、さらに、本明細書で説明されるようなプロガストリン結合抗体を含む免疫結合体（互換的に「抗体−薬物結合体」または「ＡＤＣ」と呼ばれる）であって、当該抗体が、１つ以上の細胞傷害性剤、例えば、化学療法剤、薬物、成長阻害剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素活性毒素、またはこれらの断片）、あるいは放射性同位体（すなわち、放射性結合体）に結合している、免疫結合体も提供する。
【００６４】
免疫結合体は、がんの治療における細胞傷害性剤（すなわち、細胞の成長または増殖を殺滅または阻害する薬物）の局所的送達に使用されている（Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｊ．（２００５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ５：５４３−５４９；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３（９）：１１３７−１１４６；Ｐａｙｎｅ，Ｇ．（２００３）ｉ  ３：２０７−２１２；Ｓｙｒｉｇｏｓ  ａｎｄ  Ｅｐｅｎｅｔｏｓ（１９９９）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９：６０５−６１４；Ｎｉｃｕｌｅｓｃｕ−Ｄｕｖａｚ  ａｎｄ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（１９９７）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２６：１５１−１７２；米国特許第４，９７５，２７８号）。非結合薬物の全身投与は、除去を試みる対象の腫瘍細胞だけでなく、正常細胞に対し許容されないレベルの毒性をもたらす恐れがあるが、免疫結合体は、薬物部分を腫瘍に対し標的化送達すること、および腫瘍内での細胞内蓄積を可能にする（Ｂａｌｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｌａｎｃｅｔ（Ｍａｒ．１５，１９８６）  ｐｐ．６０３−０５；Ｔｈｏｒｐｅ（１９８５）“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ，”（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａ．Ｐｉｎｃｈｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ）ｐｐ．４７５−５０６））。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方が、このような戦略に有用であると報告されている（Ｒｏｗｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２１：１８３−８７）。これらの方法で使用される薬物としては、ダウノマイシン、ドキソルビシン、メトトレキサート、およびビンデシン（Ｒｏｗｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）上記参照）が挙げられる。抗体−毒素結合体で使用される毒素としては、ジフテリア毒素などの細菌毒素、リシンなどの植物毒素、ゲルダナマイシンなどの小分子毒素（Ｍａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ（２０００）  Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９２（１９）：１５７３−１５８１；Ｍａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ（２０００）  Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  １０：１０２５−１０２８；Ｍａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ（２００２）  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１３：７８６−７９１）、マイタンシノイド（ＥＰ１３９１２１３；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：８６１８−８６２３）、およびカリチアマイシン（Ｌｏｄｅ  ｅｔ  ａｌ（１９９８）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：２９２８；Ｈｉｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９３）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：３３３６−３３４２）が挙げられる。毒素は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合、またはトポイソメラーゼ阻害を含めた機構により、その細胞傷害効果を発揮し得る。一部の細胞傷害性薬物は、大きな抗体またはタンパク質受容体リガンドに結合した場合は不活性になるまたは活性が低くなる傾向がある。
【００６５】
ある態様において、免疫結合体は、抗体と、化学療法剤またはその他の毒素とを含む。免疫結合体の生成に有用な化学療法剤は、本明細書に記載されている（例えば、上記）。使用され得る酵素活性毒素およびその断片としては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンシンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害物質、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害物質、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテセンが挙げられる。例えば、１９９３年１０月２８日に発行されたＷＯ９３／２１２３２を参照。放射性結合抗体の産生には様々な放射性核種が利用可能である。例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、および１８６Ｒｅが挙げられる。抗体と細胞傷害性剤との結合体は、様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−サクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミノジエステルの二官能性誘導体（例えば、アジプイミド酸ジメチルＨＣｌ）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジサクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアナート（例えば、トルエン２，６−ジイソシアナート）、およびビスー活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を用いて、作製される。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａ  ｅｔ  ａｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８：１０９８（１９８７）で説明されているように調製することができる。炭素１４標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性核種と抗体との結合のための例示的なキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照。
【００６６】
抗体の結合体および１つ以上の小分子毒素、例えば、カリチアマイシン、マイタンシノイド、ドラスタチン、アウロスタチン、トリコテセン、およびＣＣ１０６５、並びに毒素活性を有するこれらの毒素の誘導体も、本明細書で企図されている。
【００６７】
本発明の免疫結合体は、さらにリンカーを含むことができる。
【００６８】
「リンカー」、「リンカー単位」、または「連結」とは、結合タンパク質を少なくとも１つの細胞傷害性剤と共有結合的に付着させる共有結合または原子鎖を含む化学的部分を意味する。
【００６９】
リンカーは、様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−サクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、サクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミノジエステルの二官能性誘導体（例えば、アジプイミド酸ジメチルＨＣｌ）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジサクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアナート（例えば、トルエン２，６−ジイソシアナート）、およびビスー活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を用いて、作製される。炭素−１４標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、細胞傷害性剤と対処システムとの結合のための例示的なキレート剤である。その他の架橋試薬は、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、およびスルホ−ＳＭＰＢ、並びにＳＶＳＢ（サクシンイミジル−（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）であり得、これらは商業的に入手可能である（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．，Ｕ．Ｓ．Ａから入手可能）。
【００７０】
リンカーは、「切断不可能」であっても「切断可能」であってもよい。
【００７１】
別の側面において、本発明は、肺がんの予防または治療における使用のための組成物であって、当該組成物はプロガストリンのアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を含むエピトープを認識する抗体を含んでなる、組成物を提供する。
【００７２】
より具体的な態様において、肺がんの予防または治療における使用のための当該組成物は、プロガストリンのエピトープを認識する抗体を含み、当該エピトープは、プロガストリンのＮ末端部分のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を含み、当該アミノ酸配列は、ｈＰＧの残基１０〜１４、ｈＰＧの残基９〜１４、ｈＰＧの残基４〜１０、ｈＰＧの残基２〜１０、またはｈＰＧの残基２〜１４に対応するアミノ酸配列を含み得、ｈＰＧのアミノ酸配列は、配列番号１である。
【００７３】
より具体的な態様において、肺がんの予防または治療における使用のための組成物は、プロガストリンのエピトープを認識する抗体を含み、当該エピトープは、プロガストリンのＣ末端部分のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を含み、当該アミノ酸配列は、ｈＰＧの残基７１〜７４、ｈＰＧの残基６９〜７３、ｈＰＧの残基７１〜８０（配列番号４０）、ｈＰＧの残基７６〜８０、またはｈＰＧの残基６７〜７４に対応するアミノ酸配列を含み得、ｈＰＧのアミノ酸配列は、配列番号１である。
【００７４】
より特定の態様において、肺がんの予防または治療における使用のための組成物は、上述のような方法による定量で、少なくとも５０００ｎＭ、少なくとも５００ｎＭ、１００ｎＭ、８０ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、７ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．５ｎＭ、０．１ｎＭ、５０ｐＭ、１０ｐＭ、５ｐＭ、１ｐＭ、または少なくとも０．１ｐＭのプロガストリンに対する親和性を有するプロガストリン結合抗体またはその抗原結合断片を含む。
【００７５】
いっそうより特定の態様において、肺がんの予防または治療における使用のための組成物は、プロガストリン結合抗体を含み、当該プロガストリン結合分子またはその抗原結合断片は、中和抗体である。
【００７６】
別の特定の態様において、肺がんの予防または治療における使用のための組成物は、プロガストリン結合抗体を含み、当該プロガストリン結合分子またはその抗原結合断片は、ヒト化抗体である。
【００７７】
特定の態様において、肺がんの予防または治療における使用のための組成物は、プロガストリン結合抗体を含み、当該プロガストリン結合分子またはその抗原結合断片は、１つ以上の細胞傷害性剤に結合しており、例えば、上述のように、化学療法剤、薬物、成長阻害剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素活性毒素、またはこれらの断片）、あるいは放射性同位体（すなわち、放射性結合体）に結合している。
【００７８】
別の特定の態様において、患者に対する肺がんの予防または治療における使用のための組成物は、プロガストリン結合抗体を含み、当該患者は肺がんと診断されており、プロガストリンの濃度は当該患者からの生体試料の方が参照試料よりも高い。好ましくは、当該患者は、抗ＰＧ抗体を当該患者の生体試料に接触させることにより、肺がんと診断されている。
【００７９】
本明細書で使用する「生体試料」とは、核酸またはポリペプチド、例えば、肺がんのタンパク質、ポリヌクレオチド、または転写物の核酸またはポリペプチドを含有する、生体組織または生体液の試料である。このような試料は、プロガストリンの発現レベルの決定を可能にするものでなければならない。プロガストリンは、分泌タンパク質であることが知られている。したがって、プロガストリンタンパク質のレベルを決定するための好ましい生体試料としては、生体液が挙げられる。本明細書で使用する「生体液」とは、生体起源の物質を含む任意の液体を意味する。本発明における使用のための好ましい生体液としては、動物、例えば、哺乳類、好ましくはヒト対象の体液が挙げられる。体液は、以下に限定されないが、血液、血漿、血清、リンパ液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、唾液、汗、および尿を含めた任意の体液とすることができる。好ましくは、このような好ましい液体の生体試料としては、血液試料、血漿試料、または血清試料などの試料が挙げられる。より好ましくは、生体試料は、血液試料である。実際に、このような血液試料は、完全に無害な採血によって患者から取得することができるため、対象が腫瘍を発生するリスクに対する非侵襲的なアセスメントが可能である。
【００８０】
また、がんが固形がんである場合、本明細書で使用する「生体試料」には、試験対象となる患者の固形がん試料も含まれる。このような固形がん試料により、当業者は、本発明のバイオマーカーのレベルに対する任意のタイプの測定を実施することができる。一部の場合において、本発明における方法はさらに、患者から固形がん試料を採取する予備ステップを含み得る。「固形がん試料」とは、腫瘍組織試料を意味する。がん患者であっても、腫瘍の部位である組織は、依然として健康な非腫瘍組織を含む。したがって、「がん試料」は、患者から採取される腫瘍組織に限定されるべきである。当該「がん試料」は、生検試料であっても外科的切除療法から採取された試料であってもよい。
【００８１】
生体試料は、典型的には、真核生物から取得され、最も好ましくは哺乳類、または鳥類、爬虫類、もしくは魚類から取得される。実際に、本明細書で説明される方法に供され得る「対象」は、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ヤギ、ブタ（ｐｉｇ）、ブタ（ｓｗｉｎｅ）、ヒツジ、およびサルを含めた哺乳類動物のいずれか、または鳥類、爬虫類、もしくは魚類とすることができる。好ましくは、対象はヒトであり、ヒト対象は「患者」と呼ばれることがある。
【００８２】
「生体試料を取得する」とは、本明細書では、本発明で説明される方法における使用のための生体試料を取得することを意味する。最も多くの場合、これは、動物から細胞の試料を取り出すことによって行われるが、さらに、予め単離した細胞（例えば、別の者により、別のときに、および／もしくは別の目的で単離されたもの）を使用することにより、または本発明の方法をイン・ビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で実施することにより、遂行することもできる。治療または治療結果の履歴を有する保管組織は、とりわけ有用となる。
【００８３】
この試料は、取得することができ、必要な場合は、当業者に公知の方法に従って調製することができる。特に、この試料が空腹時の対象から採取すべきであることは、当技術分野で周知されている。
【００８４】
より特定の側面において、本発明は、本発明における肺がんの予防または治療における使用のための組成物であって、当該プロガストリン結合抗体またはその抗原結合断片が、Ｎ末端抗プロガストリン抗体およびＣ末端抗プロガストリン抗体の中で選択される、組成物に関する。
【００８５】
本発明の方法における使用のための抗体組成物は、異なる製剤（以下に限定されないが、水性懸濁液が挙げられる）として、様々な経路（以下に限定されないが、非経口、髄腔内、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、点滴、またはボーラス投与が挙げられる）による投与向けに調製することができる。一部の態様において、組成物は、非経口投与向けに、一部の具体的な態様では点滴による静脈内注入向けに、製剤化される。
【００８６】
特定の態様において、本発明における肺がんの予防または治療における使用のための組成物は、本発明の抗プロガストリン抗体が０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約２５０ｍｇ／ｋｇの範囲である有効用量を含み、この用量は、１回投与で、または複数回の間隔を空けた投与にわたり、もたらされ得る。
【００８７】
特定の態様において、本発明における肺がんの予防または治療における使用のための組成物は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、１本鎖抗体、ラクダ化抗体、ＩｇＡ１抗体、ＩｇＡ２抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、ＩｇＧ４抗体、およびＩｇＭ抗体の中で選択されるプロガストリン結合抗体またはその抗原結合断片を含む。好ましくは、当該抗体は、上述された抗体である。より好ましくは、当該抗体は、ヒト化抗体である。
【００８８】
好ましくは、本発明は、本発明における肺がんの予防または治療における使用のための組成物と、薬学的に許容される担体とを含んでなる、医薬組成物に関する。より具体的には、本発明における肺がんの予防または治療における使用のための医薬組成物は、上述のような抗体と、薬学的に許容される担体とを含む。
【００８９】
より特定の側面において、本発明は、本発明における肺がんの予防または治療における使用のための組成物と、薬学的に許容される担体とを含んでなる医薬組成物であって、当該抗プロガストリン抗体が、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜２５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、少なくとも０．００５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．０５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも５０ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも１００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、医薬組成物に関する。別の側面において、本発明は、本発明における肺がんの予防または治療における使用のための組成物と、抗がん療法分子とを含んでなる、部分のキットに関する。
【００９０】
実際に、本明細書で説明されるような抗ＰＧモノクローナル抗体を用いた治療は、他の療法と組み合わせても他の療法に付属してもよい。その他の療法の非限定的な例としては、化学療法処置、放射線療法、外科的切除、および抗体療法が挙げられる。
【００９１】
別の側面において、本発明は、本発明における肺がんの予防または治療における使用のための組成物と、化学療法分子、標的療法分子の中で選択される抗がん療法分子とを含んでなる、部分のキットに関する。
【００９２】
特定の態様において、本発明は、同時、順次、または別々の投与向けに、本発明における肺がんの治療のための組成物と、化学療法分子とを含んでなる、部分のキットに関する。この目的のために有用な化学療法分子としては、以下に限定されないが、葉酸拮抗物質、プリン拮抗物質、ピリミジン拮抗物質、ＤＮＡアルキル化分子、ＤＮＡ架橋薬物、抗生物質、白金錯体、プロテアソーム阻害物質、紡錘体毒物、トポイソメラーゼ阻害物質、チロシンキナーゼ阻害物質などが挙げられる。
【００９３】
別の特定の態様において、本発明は、同時、順次、または別々の投与向けに、本発明における組成物と、別の標的療法分子を含む組成物とを含んでなる、部分のキットに関する。このような標的療法分子としては、以下に限定されないが、ＥＧＦＲを標的とする抗体、例えば、セツキシマブまたはパニツムマブ、ＶＥＧＦを標的とする抗体、例えば、ベバシズマブ、ＨＥＲ２を標的とする抗体、例えば、トラスツズマブまたはペルツズマブ、ＰＤ−１およびＰＤＬ−１を標的とする抗体、例えば、ペムブロリズマブ、ＣＴＬＡ−４を標的とする抗体、例えば、イピリムマブ、ＥＧＦＲを標的とする小分子薬物、例えば、エルロチニブ、ＢＲＡＦを標的とする小分子薬物、例えば、ベムラフェニブまたはダブラフェニブ、ＶＥＧＦを標的とする組換え融合タンパク質、例えば、アフリベルセプトが挙げられる。
【００９４】
別の特定の側面において、本発明は、肺がんの診断のための、プロガストリン結合抗体またはその抗原結合断片の使用に関する。
【００９５】
別の特定の側面において、本発明は、肺がんの予防または治療のための、プロガストリン結合抗体またはその抗原結合断片の使用に関する。
【００９６】
より特定の側面において、本発明は、患者に対する肺がんの予防または治療のための、プロガストリン結合抗体またはその抗原結合断片の使用であって、当該患者の生体試料中のプロガストリン濃度が定量されており、該濃度が参照生体試料のプロガストリン濃度よりも高い、使用に関する。
【００９７】
別の特定の側面において、本発明は、肺がんの再発を予防するための本発明の医薬組成物の使用に関する。したがって、本開示は、ヒトを含めた動物における肺がんの治療および肺がんの再発の予防に有用な方法および組成物を提供する。治療の方法は、肺がんと診断された対象に対し、治療効果をもたらすのに有効な量の、プロガストリンに特異的に結合する抗体を投与することを伴う。抗ＰＧ抗体は、単独で、単剤療法として、または他の治療モダリティー、例えば、腫瘍切除、放射線療法、化学療法、別の抗体を用いた療法などと共に、もしくはそれに付属して、投与することができる。
【００９８】
固形腫瘍は、必ずしも均質な組織ではない。むしろ、一部の腫瘍は、別個の表現型的および機能的特徴を有する複数の異常な細胞タイプを含む。この点において、このような腫瘍は、異常な臓器に類似する。固形腫瘍を含む細胞は、同じ宿主の新たな部位に、または同じまたは異なる種の新たな宿主に移植された場合の、新たな腫瘍の形成を開始可能な程度に関して異なる。この特徴を有する細胞は、腫瘍またはがん開始細胞、または代替的に、腫瘍またはがん幹細胞として知られている。例えば、Ｈａｒｄａｖｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，“Ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ−ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ，ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ，”  Ｔｒａｎｓｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１６，５（３）：２７２−２７９を参照。このような細胞は、腫瘍形成性が高い。
【００９９】
概して、がん幹細胞は、２つの特徴：自己再生する能力と、非幹細胞に分化する娘細胞を生じる能力とによって定義される。自己再生とは、細胞分割を経て、それによって一方または両方の娘細胞が未分化のままとどまり、親細胞と同様の増殖能力を有するまた別のがん幹細胞を生じる産出力を保持する能力である。この特徴により、がん幹細胞は、最終的に、成長する腫瘍を含む多数の細胞を生じさせることができる。また、がん幹細胞は、娘細胞を産生する能力も有し、娘細胞は、分化して多くの固形腫瘍に見いだされるさらに分化した非幹細胞性またはバルクの腫瘍細胞を生じる。したがって、がん幹細胞は、移植されると、複数回の連続移植の後であっても、起源となった腫瘍のタイプを再構成し得る。さらに、がん幹細胞は、増殖パターンの改変および／またはアポトーシス率の低下をもたらす遺伝子変異および／またはエピジェネティックな変化を有すると考えられている。
【０１００】
がん幹細胞は、バルク腫瘍細胞からがん幹細胞を識別する複数の表現型特性に従って同定することができる。腫瘍または細胞株ががん幹細胞を含有するかどうかの評価のために有用な方法は、当業者にはよく知られている。このような方法は、例えば、Ｈａｒｄａｖｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，“Ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ−ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ，ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ，”  Ｔｒａｎｓｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１６，５（３）：２７２−２７９、およびＷＯ２０１２／０１３６０９で説明されている。これらの方法の特定の事例は、本出願の実施例でも説明されている。
【０１０１】
より特定の側面において、本発明は、患者に対する肺がんの予防または治療のための、プロガストリン結合抗体またはその抗原結合断片の使用であって、当該患者が転移を示す、使用に関する。
【０１０２】
いっそうより特定の側面において、本発明は、患者に対する肺がんの予防または治療のための、プロガストリン結合抗体またはその抗原結合断片の使用であって、当該患者が転移を示し、当該患者の生体試料中のプロガストリン濃度が定量されており、その濃度が参照生体試料のプロガストリン濃度よりも高い、使用に関する。
【０１０３】
この組合せを構成する構成成分は、組合せの最大限の有効性を得るように、同時に、別々に、または順次に投与することができ、各投与の持続時間は、急速投与から持続的灌流まで変動する可能性がある。
【０１０４】
本明細書で使用する「同時投与」とは、組成物の２つの化合物を、単一かつ一意の医薬形態で投与することを意味する。本明細書で使用する「別々の投与」とは、本発明における組成物の２つの化合物を、別個の医薬形態で同時に投与することを意味する。本明細書で使用する「順次投与」とは、本発明における組成物の２つの化合物を、それぞれ別個の医薬形態で連続して投与することを意味する。
【０１０５】
本明細書で使用する「治療有効量」とは、疾患の症状の予防、軽減、低減、もしくは緩和、または治療対象の患者の生存期間の延長に有効である、化合物（１つまたは複数）の最小限の濃度または量を意味する。
【０１０６】
別の側面において、本開示は、前立腺がん再発を予防するための方法であって、予防を必要とする対象に、有効量の抗ＰＧ抗体を投与することを含む、方法を提供する。本開示における肝がん再発を予防する方法は、肺がん再発のリスクがある個体に、上述されるＰＧを中和可能な１つ以上の抗ＰＧ抗体を投与することによって遂行される。
【０１０７】
前立腺がん再発の予防を必要とする対象は、過去に肺がんの治療を受け、再び肺がんと診断されるリスクがあるがまだそのように診断されていない個体である。好適な対象としては、過去に、外科的切除、化学療法、または他の任意の療法を含めた任意の手段によって肺がんの治療を受けた対象が挙げられる。
【０１０８】
肺がん再発の有効な予防としては、以下に限定されないが、完全かつ継続中である肺がん再発の不在が挙げられる。一部の態様において、有効な予防は、肺がん再発のリスクがある対象から取得される肺がん腫瘍または肺がん幹細胞が存在しないことによって判定される。一部の態様において、有効な予防は、肺がん再発のリスクがある対象におけるＰＧの血中濃度が増加しないことによって決定される。
【０１０９】
抗ＰＧ治療は、単独で、単剤療法として、または１つ以上の他の治療と組み合わせてもしくはそれに付属して、行うことができる。他の治療としては、以下に限定されないが、外科的切除、および第２の治療剤を用いた治療、例えば、上述のような化学療法剤または抗体を用いた治療が挙げられる。本明細書で提供される併用療法は、患者に少なくとも２つの治療を行うことを含み、その一方は、少なくとも１つの抗ＰＧ抗体を用いた抗ＰＧ治療であり、もう一方は、治療剤または手順を用いた治療である。
【０１１０】
抗ＰＧ抗体および第２の剤は、同時に、連続的に、または別々に投与することができる。本明細書で使用する場合、抗ＰＧ抗体および第２の剤が、同じ日に、例えば、同じ患者の来院時に患者に投与される場合、連続的に投与されるものとされる。連続的な投与は、１、２、３、４、５、６、７、または８時間空けて生じ得る。これに対し、抗ＰＧ抗体および第２の剤が、異なる日に患者に投与される場合は別々に投与されるものとされ、例えば、抗ＰＧ抗体および第２の治療剤は、１日、２日、もしくは３日、１週間、２週間、または１ヵ月の間隔にて投与され得る。本開示の方法において、本開示の抗ＰＧ抗体の投与は、第２の剤の投与の前であっても後であってもよい。非限定的な例として、抗ＰＧ抗体および第２の剤は、ある時間期間の間は同時に投与され、次に第２の時間期間の間、抗ＰＧ抗体および第２の剤の投与が交互に行われてもよい。
【０１１１】
本発明の態様の特徴は、以下の実施例の詳細な説明からさらに明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】細胞増殖アッセイ：ＮＣＩ−Ｈ３５８細胞を、対照抗体、またはＣ末端抗ｈＰＧヒト化抗体である抗ｈＰＧ  Ｈｚ  ８ＣＶ２（ＰＧ  Ｈｚ）で処置した。
【実施例】
【０１１３】
実施例１：抗ｈＰＧ抗体のがん細胞株に対する中和活性
１．１．抗ｈＰＧモノクローナル抗体の中和活性
ＰＧに対するモノクローナル抗体を、肺がんの研究に一般的に使用されプロガストリンを産生および分泌するいくつかの細胞株の増殖を阻害する能力について試験する。異なる抗ｈＰＧモノクローナル抗体を用いて、これらの細胞株の各々からの細胞の生存率を試験する。
【０１１４】
各実験について、６ウェルプレートのウシ胎仔血清を含有する培地中に５０，０００細胞を播種し、８時間インキュベートする。細胞を一晩血清飢餓状態にし、播種の２４時間後（「Ｔ０」時間）から、細胞を、ウシ胎仔血清の不在下で、６連で１２時間ごとに４８時間の間、１〜２０μｇ／ｍｌのモノクローナル対照抗体（モノクローナル抗体抗ピューロマイシン）（ＣＴ  ｍＡｂ）、または１〜２０μｇ／ｍｌの抗ｈＰＧ  ｍＡｂで処置する（当該ｍＡｂは、Ｃ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体またはＮ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体である）。
【０１１５】
当該ｍＡｂは、
・配列番号２８、２９、および３０のアミノ酸配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖と、配列番号３１、３２、および３３のアミノ酸配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖とを含んでなる、抗体、
・配列番号３４、３５、および３６のアミノ酸配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖と、配列番号３７、３８、および３９のアミノ酸配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖とを含んでなる、抗体
の中から選択される、Ｃ末端抗ｈＰＧ抗体であるか、
または、
・配列番号４、５、および６のアミノ酸配列のそれぞれＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖と、配列番号７、８、および９のアミノ酸配列のそれぞれＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖とを含んでなる、モノクローナル抗体、
・配列番号１０、１１、および１２のアミノ酸配列のそれぞれＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖と、配列番号１３、１４、および１５のアミノ酸配列のそれぞれＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖とを含んでなる、抗体、
・配列番号１６、１７、および１８のアミノ酸配列のそれぞれＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖と、配列番号１９、２０、および２１のアミノ酸配列のそれぞれＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖とを含んでなる、抗体、
・配列番号２２、２３、および２４のアミノ酸配列のそれぞれＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖と、配列番号２５、２６、および２７のアミノ酸配列のそれぞれＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖とを含んでなる、抗体
の中から選択される、Ｎ末端抗ｈＰＧ抗体である。
【０１１６】
各実験について、Ｔ０における対照ウェル中の細胞数を計数する。
【０１１７】
具体的には、４８時間時に対照ウェルおよび抗ｈＰＧ  ｍＡｂ処置ウェル両方の生細胞の数を計数し、次に、それぞれの細胞数とＴ０時に定量された細胞数との間の差を計算する。次に、得られた抗ｈＰＧ  ｍＡｂ処置細胞の数を、対照ｍＡｂ処置細胞の数のパーセンテージとして表現する。
【０１１８】
抗ｈＰＧモノクローナル抗体を用いた処置は、対照抗体を用いた処置と比較して細胞数を低減する。一元配置ＡＮＯＶＡをテューキー事後検定と共に用いて、統計的有意性を決定する：＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、および＊＊＊＝ｐ＜０．００１。各細胞株において、抗ｈＰＧ抗体は細胞生存率を低減する。
【０１１９】
１．２．抗ｈＰＧヒト化抗体の細胞生存率に対する中和活性
ＰＧに対するヒト化抗体を、肺がんの研究に一般的に使用されプロガストリンを産生および分泌するいくつかの細胞株の増殖を阻害する能力について試験する。異なる抗ｈＰＧモノクローナル抗体を用いて、これらの細胞株の各々からの細胞の生存率を試験する。
【０１２０】
各実験について、６ウェルプレートのウシ胎仔血清を含有する培地中に５０，０００細胞を播種し、８時間インキュベートする。細胞を一晩血清飢餓状態にし、播種の２４時間後（「Ｔ０」時間）から、細胞を、ウシ胎仔血清の不在下で、６連で１２時間ごとに４８時間の間、１〜２０μｇ／ｍｌのヒト化対照抗体（ＢｉｏＸＣｅｌｌ製の抗ヒトＦｃＧ１）（ＣＴ  Ｈｚ）、または１〜２０μｇ／ｍｌの抗ｈＰＧ  Ｈｚで処置する（当該Ｈｚは、Ｃ末端抗ｈＰＧヒト化抗体またはＮ末端抗ｈＰＧヒト化抗体である）。各実験について、Ｔ０における対照ウェル中の細胞数を計数する。
【０１２１】
具体的には、４８時間時に対照ウェルおよび抗ｈＰＧ  Ｈｚ処置ウェル両方の生細胞の数を計数し、次に、それぞれの細胞数とＴ０時に定量された細胞数との間の差を計算する。次に、得られた抗ｈＰＧ  Ｈｚ処置細胞の数を、対照ｍＡｂ処置細胞の数のパーセンテージとして表現する。
【０１２２】
抗ｈＰＧ  Ｈｚ抗体を用いた処置は、対照抗体を用いた処置と比較して細胞数を低減する。一元配置ＡＮＯＶＡをテューキー事後検定と共に用いて、統計的有意性を決定する：＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、および＊＊＊＝ｐ＜０．００１。各細胞株において、抗ｈＰＧ抗体は細胞生存率を低減する。
【０１２３】
１．３．抗ｈＰＧモノクローナル抗体のがん幹細胞頻度に対する中和活性
ＰＧに対するモノクローナル抗体におけるがん幹細胞（ＣＳＣ）頻度を低減する能力を、極限限界希釈アッセイ（Ｅｘｔｒｅｍｅ  Ｌｉｍｉｔｉｎｇ  Ｄｉｌｕｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）（ＥＬＤＡ）を用いて、肺がんの研究に一般的に使用されプロガストリンを産生および分泌するいくつかの細胞株において試験する。異なる抗ｈＰＧモノクローナル抗体を用いて、これらの細胞株の各々からのＣＳＣ頻度を試験する。
【０１２４】
各実験について、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａフローサイトメーターを用いて、ウェル当たりの固定された細胞濃度にて超低接着（ＵＬＡ）Ｐ９６（９６ウェルプレート）に細胞を播種し、濃度の範囲はウェル当たり１〜５００細胞を使用する。細胞を最大１１日間、Ｍ１１培地（Ｍａｃａｒｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２０１５）を有するＵＬＡプレートで培養し、３日または４日ごとに１〜２０μｇ／ｍｌのモノクローナル対照抗体（モノクローナル抗体抗ピューロマイシン）（ＣＴ  ｍＡｂ）、または１〜２０μｇ／ｍｌの抗ｈＰＧ  ｍＡｂで処置する（当該ｍＡｂは、Ｃ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体またはＮ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体である）。
【０１２５】
具体的には、インキュベートフェーズの最後に、位相差顕微鏡を用いてプレートを観察し、細胞濃度当たりの陽性細胞の数を評価する。最後に、ＥＬＤＡウェブツール（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｗｅｈｉ．ｅｄｕ．ａｕ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｅｌｄａ／）を使用して、各処置群のＣＳＣ頻度を計数し、群間の任意の統計的差について検定する（修正カイ２乗検定）。
【０１２６】
抗ｈＰＧモノクローナル抗体を用いた処置は、対照抗体を用いた処置と比較してＣＳＣ頻度を低減する。
【０１２７】
１．４．抗ｈＰＧヒト化抗体のがん幹細胞頻度に対する中和活性
・球形成アッセイ
ＰＧに対するヒト化抗体におけるがん幹細胞（ＣＳＣ）頻度を低減する能力を、球形成アッセイを用いて、肺がんの研究に一般的に使用されプロガストリンを産生および分泌するいくつかの細胞株において試験する。
【０１２８】
各実験について、２４ウェルの超低接着プレート（ＵＬＡ：ｕｌｔｒａ−ｌｏｗ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）に７００細胞を播種する。細胞を最大７日間、Ｍ１１培地（Ｍａｃａｒｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２０１５）を有するＵＬＡプレートで培養し、３日または４日ごとに２０μｇ／ｍｌのヒト化対照抗体（ＢｉｏＸＣｅｌｌ製の抗ヒトＦｃＧ１）（ＣＴ  Ｈｚ）、または２０μｇ／ｍｌの抗ｈＰＧ  Ｈｚ（ＰＧ  Ｈｚ）で処置する（当該Ｈｚは、Ｃ末端抗ｈＰＧヒト化抗体またはＮ末端抗ｈＰＧヒト化抗体である）。
【０１２９】
具体的には、インキュベートフェーズの最後に明視野顕微鏡でウェルを撮影し、写真を解析し、平均直径が２５μｍを上回る球を計数する。
【０１３０】
抗ｈＰＧヒト化抗体を用いた処置は、対照抗体を用いた処置と比較してＣＳＣ頻度を低減する。
【０１３１】
・極限限界希釈アッセイ
ＰＧに対するヒト化抗体におけるがん幹細胞（ＣＳＣ）頻度を低減する能力を、極限限界希釈アッセイ（ＥＬＤＡ）を用いて、肺がんの研究に一般的に使用されプロガストリンを産生および分泌するいくつかの細胞株において試験する。異なる抗ｈＰＧヒト化抗体を用いて、これらの細胞株の各々からのＣＳＣ頻度を試験する。
【０１３２】
各実験について、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａフローサイトメーターを用いて、ウェル当たりの固定された細胞濃度にて超低接着（ＵＬＡ）Ｐ９６（９６ウェルプレート）に細胞を播種し、濃度の範囲はウェル当たり１〜５００細胞を使用する。細胞を最大１１日間、Ｍ１１培地（Ｍａｃａｒｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２０１５）を有するＵＬＡプレートで培養し、３日または４日ごとに１〜２０μｇ／ｍｌのヒト化対照抗体（ＢｉｏＸＣｅｌｌ製の抗ヒトＦｃＧ１）（ＣＴ  Ｈｚ）、または１〜２０μｇ／ｍｌの抗ｈＰＧ  Ｈｚで処置する（当該Ｈｚは、Ｃ末端抗ｈＰＧヒト化抗体またはＮ末端抗ｈＰＧヒト化抗体である）。
【０１３３】
具体的には、インキュベートフェーズの最後に、位相差顕微鏡を用いてプレートを観察し、細胞濃度当たりの陽性細胞の数を評価する。最後に、ＥＬＤＡウェブツール（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｗｅｈｉ．ｅｄｕ．ａｕ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｅｌｄａ／）を使用して、各処置群のＣＳＣ頻度を計数し、群間の任意の統計的差について検定する（修正カイ２乗検定）。
【０１３４】
抗ｈＰＧヒト化抗体を用いた処置は、対照抗体を用いた処置と比較してＣＳＣ頻度を低減する。
【０１３５】
１．５．抗ｈＰＧモノクローナル抗体のＷＮＴ／βカテニン経路に対する中和活性
ＰＧに対するモノクローナル抗体におけるＷＮＴ／βカテニン経路を阻害する能力を、肺がんの研究に一般的に使用されプロガストリンを産生および分泌するいくつかの細胞株において、読出しとして、周知のＷＮＴ／βカテニン経路標的化遺伝子であるタンパク質サバイビンの発現を用いて試験する。異なる抗ｈＰＧモノクローナル抗体を用いて、これらの細胞株の各々からのサバイビン発現を試験する。
【０１３６】
各実験について、６ウェルプレートのウシ胎仔血清を含有する培地中に５０，０００細胞を播種し、８時間インキュベートする。細胞を一晩血清飢餓状態にし、播種の２４時間後から、細胞を、ウシ胎仔血清の不在下で、４連で１２時間ごとに７２時間の間、１〜２０μｇ／ｍｌのモノクローナル対照抗体（モノクローナル抗体抗ピューロマイシン）（ＣＴ  ｍＡｂ）、または１〜２０μｇ／ｍｌの抗ｈＰＧ  ｍＡｂで処置する（当該ｍＡｂは、Ｃ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体またはＮ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体である）。
【０１３７】
具体的には、処置の７２時間後に細胞を採取し、ＲＩＰＡ緩衝液を用いて総タンパク質を抽出する。次に、ＣＴ  ｍＡｂまたは抗ｈＰＧ  ｍＡｂ処置細胞からの同じ量のタンパク質を、抗サバイビン抗体（モノクローナル抗体、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ製の＃２８０２）およびローディング対照としての抗アクチン抗体（モノクローナル抗体、ＳＩＧＭＡ製の＃Ａ４７００）を用いてウェスタンブロットに供する。Ｓｙｎｇｅｎｅ製のＧＢＯＸ  ｃｈｅｍｉ  ｓｙｓｔｅｍを用いて定量化を実施する。
【０１３８】
抗ｈＰＧモノクローナル抗体を用いた処置は、対照抗体を用いた処置と比較してサバイビン発現を低減する。対応のないスチューデントＴ検定を用いて統計的有意性を決定する：＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、および＊＊＊＝ｐ＜０．００１。
【０１３９】
１．６．抗ｈＰＧヒト化抗体のＷＮＴ／βカテニン経路に対する中和活性
ＰＧに対するヒト化抗体におけるＷＮＴ／βカテニン経路を阻害する能力を、肺がんの研究に一般的に使用されプロガストリンを産生および分泌するいくつかの細胞株において、読出しとして、周知のＷＮＴ／βカテニン経路標的化遺伝子であるタンパク質サバイビンの発現を用いて試験する。異なる抗ｈＰＧヒト化抗体を用いて、これらの細胞株の各々からのサバイビン発現を試験する。
【０１４０】
各実験について、６ウェルプレートのウシ胎仔血清を含有する培地中に５０，０００細胞を播種し、８時間インキュベートする。細胞を一晩血清飢餓状態にし、播種の２４時間後から、細胞を、ウシ胎仔血清の不在下で、４連で１２時間ごとに７２時間の間、１〜２０μｇ／ｍｌのヒト化対照抗体（ＢｉｏＸＣｅｌｌ製の抗ヒトＦｃＧ１）（ＣＴ  Ｈｚ）、または１〜２０μｇ／ｍｌの抗ｈＰＧ  Ｈｚで処置する（当該Ｈｚは、Ｃ末端抗ｈＰＧヒト化抗体またはＮ末端抗ｈＰＧヒト化抗体である）。
【０１４１】
具体的には、処置の７２時間後に細胞を採取し、ＲＩＰＡ緩衝液を用いて総タンパク質を抽出する。次に、ＣＴ  Ｈｚまたは抗ｈＰＧ  Ｈｚ処置細胞からの同じ量のタンパク質を、抗サバイビン抗体（モノクローナル抗体、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ製の＃２８０２）およびローディング対照としての抗アクチン抗体（モノクローナル抗体、ＳＩＧＭＡ製の＃Ａ４７００）を用いてウェスタンブロットに供する。Ｓｙｎｇｅｎｅ製のＧＢＯＸ  ｃｈｅｍｉ  ｓｙｓｔｅｍを用いて定量化を実施する。
【０１４２】
抗ｈＰＧヒト化抗体を用いた処置は、対照抗体を用いた処置と比較してサバイビン発現を低減する。対応のないスチューデントＴ検定を用いて統計的有意性を決定する：＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、および＊＊＊＝ｐ＜０．００１。
【０１４３】
実施例２：抗ｈＰＧ抗体のがん細胞株に対する中和活性
抗ｈＰＧヒト化抗体の細胞生存率に対する中和活性
ＰＧに対するヒト化抗体を、肺がんの研究に一般的に使用されプロガストリンを産生および分泌するいくつかの細胞株（すなわち、ＮＣＩ−Ｈ３５８、Ａ５４９、またはＮＣＩ−Ｈ４６０）の増殖を阻害する能力について試験した。異なる抗ｈＰＧモノクローナル抗体を用いて、これらの細胞株の各々からの細胞の生存率をアッセイした。
【０１４４】
６ウェルプレートのウシ胎仔血清を含有する培地中に２００，０００個のＮＣＩ−Ｈ３５８細胞を播種し、８時間インキュベートした。細胞を一晩血清飢餓状態にした。播種の２４時間後（「Ｔ０」時間）から、細胞を、ウシ胎仔血清の不在下で、１２時間ごとに４８時間の間、２０μｇ／ｍｌのヒト化対照抗体（ＢｉｏＸＣｅｌｌ製の抗ヒトＦｃＧ１）（ＣＴ  Ｈｚ）、または２０μｇ／ｍｌの抗ｈＰＧ  Ｈｚ  ８ＣＶ２（ＰＧ  Ｈｚ）で処置した（当該Ｈｚは、Ｃ末端抗ｈＰＧヒト化抗体である）。各実験について、Ｔ０における対照ウェル中の細胞数を計数した。
【０１４５】
具体的には、４８時間時に対照および抗ｈＰＧ  Ｈｚ処置細胞の両方における生細胞の数を計数した。次に、各細胞数と、Ｔ０における細胞数との間の差を計算した。
【０１４６】
抗ｈＰＧ  Ｈｚ抗体を用いた処置は、対照抗体を用いた処置と比較して細胞数を低減した。ｔ検定を用いて統計的有意差を決定した（＊＊＝ｐ＜０．０１）。各細胞株において、抗ｈＰＧ抗体は、細胞生存率を低減した（図１を参照）。
【０１４７】
参考文献
Yanaoka et al, Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2008, 17(4)
Pepe et al, J Natl Cancer Inst, 2008, Oct., 100(20)
Leja et al, Best Practice & Research Clinical Gastroenterology, 2014, Dec., 28(6)
【図１】
2020512366.tif 000013
【配列表】
2020512366000001.app
【国際調査報告】
2020512366.tif 000014
2020512366.tif 000015
2020512366.tif 000016