(57)【要約】  肺癌の診断を必要とする対象において肺癌を診断する方法を提供する。この方法は、（ａ）末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む対象の生体試料を提供し、（ｂ）表３及び表４に記載の刺激剤からなる群から選択された刺激剤にＰＢＭＣをインビトロで接触させ、（ｃ）前記（ｂ）に従った接触後のＰＢＭＣの代謝活性を測定する、ことを含み、対照試料と比較した際のＰＢＭＣの代謝活性の統計的に有意な変化が肺癌の指標となる方法である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺癌の診断を必要とする対象において肺癌を診断する方法であって、
（ａ）対象の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む生体試料を提供し、
（ｂ）表３及び表４に記載の刺激剤からなる群から選択された刺激剤に前記ＰＢＭＣをインビトロで接触させ、
（ｃ）前記（ｂ）に従った接触後の前記ＰＢＭＣの代謝活性を測定する
ことを含み、対照試料と比較した際の前記ＰＢＭＣの前記代謝活性の統計的に有意な変化が、肺癌の指標となる、方法。
【請求項２】
前記代謝活性の測定は、前記ＰＢＭＣの細胞外酸性化の測定である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞外酸性化の前記測定は、前記ＰＢＭＣの較正済緩衝能を有する細胞外所定溶液内で行う、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記代謝活性の前記測定は、前記刺激剤の濃度の関数として時間依存的であり、酸性化プロファイルをもたらす、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記酸性化プロファイルは、
（ｉ）不揮発性の可溶性代謝産物と揮発性の可溶性代謝産物、
（ｉｉ）不揮発性の可溶性代謝産物、又は
（ｉｉｉ）揮発性の可溶性代謝産物
の分泌に起因する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記（ｉｉ）の前記酸性化プロファイルの測定は、空気曝露チャンバー内で行い、前記（ｉ）の酸性化プロファイルの測定は、空気遮断チャンバー内で行い、前記（ｉｉｉ）の酸性化プロファイルの測定は、前記（ｉ）の酸性化プロファイルから前記（ｉｉ）の酸性化プロファイルを差し引くことで行う、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記刺激剤は、ＮＹ−ＥＳＯ−１、Ｈｅｒ−２ａ、ＣｏｎＡ、ＰＨＡ、ＭＡＧＥ−Ａ３及びグルコースからなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記刺激剤がＮＹ−ＥＳＯ−１である場合、前記測定は空気曝露チャンバー内で行う、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記刺激剤がＨｅｒ−２ａである場合、前記測定は空気曝露チャンバー内で行う、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記刺激剤がＣｏｎＡである場合、前記測定は空気曝露チャンバー内で行う、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記刺激剤がＰＨＡである場合、前記測定は空気遮断チャンバー内で行う、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記刺激剤がＭＡＧＥ−Ａ３である場合、前記測定は空気遮断チャンバー内で行う、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記刺激剤がグルコースである場合、前記測定は空気遮断チャンバー内で行う、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
前記対象は、前記測定の前の少なくとも５年間は、抗癌療法による治療を受けていない、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記測定は、前記刺激剤との接触から少なくとも２０分後に行う、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＰＢＭＣの前記細胞外酸性化の測定は、無毒性の膜非透過性ｐＨプローブを用いて行う、請求項２〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記プローブはヒドロキシピレン−１，３，６−トリスルホン酸（ＨＰＴＳ）である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記対照試料は、前記刺激剤を含むが、前記プローブを含まない前記生体試料である、請求項１６〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記対照試料は、前記刺激剤を含まない前記生体試料である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記代謝活性の測定は３７℃で行う、請求項２〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
肺癌を治療する方法であって、
（ａ）請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法に従って、肺癌を有すると対象を診断し、
（ｂ）前記対象に対して、治療を行うか、又は治療法を選択する
ことを含む方法。
【請求項２２】
治療のモニタリング方法であって、
（ａ）抗肺癌治療によって、肺癌を有する対象を治療し、
（ｂ）対象のＰＢＭＣの代謝活性を下記方法：
（ｉ）表３及び表４に記載の刺激剤からなる群から選択した刺激剤に前記ＰＢＭＣをインビトロで接触させ、
（ｉｉ）前記（ｂ）に従った接触後の前記ＰＢＭＣの代謝活性を測定する
ことを含む方法において、前記ＰＢＭＣの代謝活性が、同一条件下で検査した正常な健康細胞試料の代謝活性に近づいていることをもって、疾患の治療が効果的であることの指標とする、方法。
【請求項２３】
表３又は表４の少なくとも１種の刺激剤と、無毒性の膜非透過性ｐＨプローブとを含むキット。
【請求項２４】
前記抗肺癌治療は免疫療法を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記対象は、肺癌の臨床徴候を示す、請求項１又は２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、その幾つかの実施形態では、肺癌を診断及び治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肺癌は３番目に多く診断される癌であるが、乳癌、前立腺癌及び大腸癌を合わせた場合よりも死亡率が高い。更に、患者の半数以上が局所進行疾患又は転移性疾患と診断されているため、治療の進歩にも関わらず、肺癌からの長期生存率は現在も低いままである。従って、早期治療を可能にし、生存率を改善するため、肺癌のスクリーニングと早期診断を可能にする努力が多くなされている［Smith, R. A. et al. Cancer screening in the United States, 2011. CA. Cancer J. Clin. 61, 8-30 (2011); Moyer, V. A. Screening for Lung Cancer: U.S. Preventive Services Task Force Recommendation Statement. Ann. Intern. Med. 160, 330-338 (2014)］。肺癌のスクリーニングと早期診断に関して米国予防サービス特別調査委員会（ＵＳＰＳＴＦ）が現在推奨している方法は、高リスク集団における胸部低線量コンピュータ断層撮影（ＬＤＣＴ）である。この推奨方法は国立肺スクリーニング試験（ＮＬＳＴ）に基づいており、ＬＤＣＴによるスキャニングによってこの高リスク集団における死亡率が２０％低下することが実証された。しかし、ＬＤＣＴスクリーニングには、放射線被曝や高い偽陽性率、過剰診断等、多くの制限がある。また、ＵＳＰＳＴＦ推奨の対象集団は、米国における９４００万人の元喫煙者と現喫煙者の約１１％に過ぎない。さらにこのような推奨方法では、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）患者等の他の高リスク集団を考慮に入れていないが、１年当たりこれ集団の内の約２．２％が肺癌を発症する。実際、肺癌の早期発見を促進し、より効果的な治療的介入と治癒の可能性を高めることが可能な高精度の他の非侵襲的方法又はバイオマーカーが緊急に必要である。
【０００３】
液体生検は、体液、主に血液試料を使用する癌の非侵襲的検出に向けた新しい戦略である。幾つかの研究には、循環する無細胞腫瘍ＤＮＡ又は非コードＲＮＡの役割を肺癌診断で調査する定量分析が含まれている。一部の方法では、機械学習を利用して診断プロセスを支援し、液体生検から得た共変数について分類子を訓練する。このアプローチには多くの課題が残っており、例えば、血液中で分泌腫瘍成分の頻度が低い、その半減期が短い、細胞／ＤＮＡ断片化、腫瘍細胞変異のばらつきが大きい、腫瘍の起源を確認できない等が挙げられる。重要なのは、現在の方法では悪性腫瘍が主に進行期で検出されており、治療の効果が低いことである。
【０００４】
ワールブルク効果とは、殆どの正常細胞においては、比較的低い解糖率と、その後のミトコンドリアにおけるピルビン酸の酸化によってエネルギーを生成するのとは異なり、殆どの癌細胞におけるエネルギー生成が、主として細胞質における高い解糖率とその後の乳酸産生によって行われるという知見である［Kim JW, Dang CV (2006). "Cancer's molecular sweet tooth and the Warburg effect". Cancer Res. 66 (18): 8927-30］。１９２０年代、オットー・ワールブルクは、癌細胞が正常な分化細胞とは対照的に、細胞プロセスに必要なエネルギーの燃料としてＡＴＰを生成する上で、ミトコンドリアの酸化的リン酸化ではなく主に好気的解糖に依存することを見出した。この歴史的事象は「ワールブルク効果」と称された。オットー・ワールブルクは、この代謝の変化が癌の根本的な原因であると仮定した［Warburg O (1956). "On the origin of cancer cells". Science 123 (3191): 309-14］（この主張は現在ワールブルク仮説として知られている）。約５０年後、ワールブルク効果がインビトロにて活性化リンパ球でも観察された（例えば、Maclver et al. 2008 J. Leukocyte Biology 84:1-9; and DeBerardinis Cell Metabolism 7:11-20を参照）。ワールブルク効果は、例えば、グルコース輸送体（ＧＬＵＴ）の過剰発現によって活性化Ｔ細胞が解糖を急速に過剰誘導する免疫系でも見られた。
【０００５】
ワールブルク効果には重要な医療用途があるが、これは、悪性腫瘍による高好気性解糖を臨床的に利用し、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）によって２−１８Ｆ−２−デオキシグルコース（ＦＤＧ）（放射性修飾ヘキソキナーゼ基質）の取り込みを画像化して癌の治療反応を診断及びモニターするためである（ＷＯ２００７／１０２１４６号も参照）。しかし、これらの方法はハイテク施設やインサイチュの組織生検を必要とするため、面倒で費用が掛かる。
【０００６】
ＷＯ２０１２／１３７２０７号では、細胞の代謝活性（ＭＡ）を測定する方法が教示されている。この方法は、細胞の細胞外環境で
（ｉ）不揮発性の可溶性代謝産物、
（ｉｉ）不揮発性の可溶性代謝産物と揮発性の可溶性代謝産物、又は
（ｉｉｉ）揮発性の可溶性代謝産物
の分泌に起因する時間依存性酸性化プロファイルを独立して測定することを含み、時間依存性酸性化プロファイルの少なくとも１種は細胞の代謝活性を示す。癌の診断にアッセイを利用する臨床方法も提供されている。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の幾つかの実施形態の一様相によれば、肺癌の診断を必要とする対象において肺癌を診断する方法であって、
（ａ）末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む対象の生体試料を提供し、
（ｂ）表３及び表４に記載の刺激剤からなる群から選択された刺激剤にＰＢＭＣをインビトロで接触させ、
（ｃ）上記（ｂ）に従った接触後のＰＢＭＣの代謝活性を測定する
ことを含み、対照試料と比較した際のＰＢＭＣの代謝活性の統計的に有意な変化が、肺癌の指標となる方法を提供する。
【０００８】
本発明の幾つかの実施形態によれば、代謝活性の測定はＰＢＭＣの細胞外酸性化の測定である。
【０００９】
本発明の幾つかの実施形態によれば、細胞外酸性化の測定はＰＢＭＣの較正済緩衝能を有する細胞外所定溶液内で行う。
【００１０】
本発明の幾つかの実施形態によれば、代謝活性は、刺激剤の濃度の関数として時間依存的であり、酸性化プロファイルをもたらす。
【００１１】
本発明の幾つかの実施形態によれば、酸性化プロファイルは、
（ｉ）不揮発性の可溶性代謝産物と揮発性の可溶性代謝産物、
（ｉｉ）不揮発性の可溶性代謝産物、又は
（ｉｉｉ）揮発性の可溶性代謝産物
の分泌に起因する。
【００１２】
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記（ｉｉ）の酸性化プロファイルの測定は、空気曝露チャンバー内で行い、上記（ｉ）の酸性化プロファイルの測定は、空気遮断チャンバー内で行い、上記（ｉｉｉ）の酸性化プロファイルの測定は、（ｉ）の酸性化プロファイルから（ｉｉ）の酸性化プロファイルを差し引くことで行う。
【００１３】
本発明の幾つかの実施形態によれば、刺激剤は、ＮＹ−ＥＳＯ−１、Ｈｅｒ−２ａ、ＣｏｎＡ、ＰＨＡ、ＭＡＧＥ−Ａ３及びグルコースからなる群から選択される。
【００１４】
本発明の幾つかの実施形態によれば、刺激剤がＮＹ−ＥＳＯ−１である場合、測定は空気曝露チャンバー内で行う。
【００１５】
本発明の幾つかの実施形態によれば、刺激剤がＨｅｒ−２ａである場合、測定は空気曝露チャンバー内で行う。
【００１６】
本発明の幾つかの実施形態によれば、刺激剤がＣｏｎＡである場合、測定は空気曝露チャンバー内で行う。
【００１７】
本発明の幾つかの実施形態によれば、刺激剤がＰＨＡである場合、測定は空気遮断チャンバー内で行う。
【００１８】
本発明の幾つかの実施形態によれば、刺激剤がＭＡＧＥ−Ａ３である場合、測定は空気遮断チャンバー内で行う。
【００１９】
本発明の幾つかの実施形態によれば、刺激剤がグルコースである場合、測定は空気遮断チャンバー内で行う。
【００２０】
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＡＵＣ（曲線下面積）が少なくとも０．６の診断精度で診断を行う。
【００２１】
本発明の幾つかの実施形態によれば、肺癌は初期段階（ＴＮＭガイドラインによると１ａ〜２ｂ）の肺癌である。
【００２２】
本発明の幾つかの実施形態によれば、対象は、測定の前の少なくとも５年間は抗癌療法による治療を受けていない。
【００２３】
本発明の幾つかの実施形態によれば、測定は、刺激剤との接触から少なくとも２０分後に行う。
【００２４】
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＰＢＭＣの細胞外酸性化の測定は、無毒性の膜非透過性ｐＨプローブを用いて行う。
【００２５】
本発明の幾つかの実施形態によれば、プローブはヒドロキシピレン−１，３，６−トリスルホン酸（ＨＰＴＳ）である。
【００２６】
本発明の幾つかの実施形態によれば、対照試料は、刺激剤を含むが、プローブを含まない生体試料である。
【００２７】
本発明の幾つかの実施形態によれば、対照試料は、刺激剤を含まない生体試料である。
【００２８】
本発明の幾つかの実施形態によれば、代謝活性の測定は３７℃で行う。
【００２９】
本発明の幾つかの実施形態によれば、生体試料は顆粒球を含まない。
【００３０】
本発明の幾つかの実施形態の一様相によれば、肺癌を治療する方法であって、
（ａ）本明細書に記載の方法に従って、肺癌を有すると対象を診断し、
（ｂ）対象に対して、治療を行うか、又は治療法を選択する
ことを含む方法を提供する。
【００３１】
本発明の幾つかの実施形態の一様相によれば、治療のモニタリング方法であって、
（ａ）抗肺癌治療によって肺癌を有する対象を治療し、
（ｂ）対象のＰＢＭＣの代謝活性を下記方法：
（ｉ）表３及び表４に記載の刺激剤からなる群から選択された刺激剤にＰＢＭＣをインビトロで接触させ、
（ｉｉ）上記（ｂ）に従った接触後のＰＢＭＣの代謝活性を測定する
ことを含む方法において、ＰＢＭＣの代謝活性が、同一条件下で検査した正常な健康細胞試料の代謝活性に近づいていることをもって、疾患の治療が効果的であることの指標とする、方法を提供する。
【００３２】
本発明の幾つかの実施形態の一様相によれば、表３又は表４の少なくとも１種の刺激剤と、無毒性の膜非透過性ｐＨプローブとを含むキットを提供する。
【００３３】
本発明の幾つかの実施形態によれば、抗肺癌治療は免疫療法を含む。
【００３４】
本発明の幾つかの実施形態によれば、対象は肺癌の臨床徴候を示す。
【００３５】
特に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術および／または科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様のまたは等価な方法および材料を、本発明の実施形態の実践または試験に使用することができるが、例示的な方法および／または材料を下記に記載する。矛盾する場合、定義を含む特許明細書が優先する。加えて、材料、方法、および実施例は単なる例示であり、必ずしも限定を意図するものではない。
【００３６】
本発明のいくつかの実施形態について、その例示のみを目的として添付の図面を参照して本明細書に記載する。以下、特に図面を詳細に参照して示す細部は、例示を目的とし、また本発明の実施形態の詳細な説明を目的とすることを強調する。同様に、図面と共に説明を見ることで、本発明の実施形態をどのように実践し得るかが当業者には明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、代謝活性プロファイル（ＭＡＰ）試験プロセスの実施形態を示す図である。
【図２】図２は、研究対象コホートにおける肺癌ステージの分布のグラフ表示である。ステージ０は上皮内腺癌を意味する［Weissferdt, A. & Moran, C. A. Reclassification of early stage pulmonary adenocarcinoma and its consequences. J. Thorac. Dis. 6, S581-8 (2014); Goldstraw, P. et al. Non-small-cell lung cancer. Lancet 378, 1727-1740 (2011)］。「その他」の群にはステージが使用されない肺癌型が含まれる。
【図３】図３は、研究対象コホートにおける様々な組織型の肺癌の頻度を示す円グラフである。
【図４】図４は、計算又は反応速度を示すグラフである。ＰＢＭＣを刺激剤としてのＤ−グルコース（濃度を様々に上昇）と混合し、酸性度の変化を時間の関数として測定した。Ｈ＋の濃度（単位：ｎＭ）を式：１０９−ｐＨを使用して導き出した。
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、刺激剤濃度指数（Ｃ）の関数として反応速度（ｒ）を見た場合の、平均的な肺癌対象（ｎ＝１００、赤色）および健常対象（ｎ＝１００、緑色）の挙動を示すグラフである。特定の刺激剤を各グラフのタイトルに記載し、プレート状態を括弧内に示す。平均値の標準誤差を各データポイントに対して示す。図５Ａ：２個の集団間で差が見出された例。図５Ｂ：有意差が見出されなかった例。
【図６】図６は、予測スコアの棒グラフであり、健常対象および肺癌対象の集団間の分離を示している。このような結果を得るために、データセット全体で予測モデルを訓練し、検証した。
【図７】図７は、２０倍交差検証のＲＯＣ曲線を示すグラフである。
【図８】図８は、肺癌ステージに分類された診断モデルの発見率を示す棒グラフである。フィッシャー直接検定のＰ値を示す。
【図９】図９は、病態群に分類されたモデルの正確度を示す棒グラフである。フィッシャー直接検定のＰ値を示す。
【図１０】図１０は、対象の喫煙習慣に従って分類されたモデルの正確度を示す棒グラフである。喫煙者群には、少なくとも1日1箱の１年の喫煙歴があるが、過去３０日間喫煙していない元喫煙者も含まれる。フィッシャー直接検定のＰ値を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明は、その幾つかの実施形態では、肺癌を診断及び治療する方法に関する。
【００３９】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、必ずしもその用途が、以下の記載に示す、および／または図面および／または実施例で例示する、構成の詳細および要素の配置および／または方法に限定されるものではないことを理解するべきである。本発明は、他の実施形態が可能であり、また、さまざまな手段で実施または実行することが可能である。
【００４０】
本発明の実施形態を実行に移しながら、本発明者らは、非侵襲性血液検査を用いた肺癌診断用の戦略を発明した。従って、本発明の実施形態は、癌の存在が疑われる対象においてＰＢＭＣの代謝活性を分析することによる肺癌の診断に関する。このアッセイでは、肺癌細胞抗原／マイトジェンによるＰＢＭＣのインビトロ刺激を用い、代謝活性の尺度として細胞外酸性化プロファイルを分析する。このアッセイによって、癌の早期発見が可能になるだけでなく、肺癌患者と免疫系活性を高める他の疾患患者との間での臨床的に価値のある識別が得られる。
【００４１】
従って、「液体免疫生検」とも称されるこのアッセイの実施形態は、ＰＢＭＣ細胞外環境の相対酸性化レベルを測定し、疾患状態の指標としての免疫系細胞の代謝活性プロファイル（ＭＡＰ）を明らかにする新規機能試験に言及する。免疫系は非常に感度が高いため、本質的に癌の早期発見に適している。
【００４２】
結果として肺癌試料と健常試料との間で検出された差異は、最終的にＰＢＭＣ亜集団の差異および有病率の差異に起因する可能性があることが示唆された。本アッセイでは、重要な分類子の特徴を抽出するために、最初に生のＭＡＰ試験データを分析し、次に機械学習診断予測モデルの入力パラメータとして使用する。以下の実施例の項で得られた結果は、診断モデルの２０倍交差検証（ＣＶ）結果を示し、ＡＵＣは０．９１であり、９１％の高感度と８０％の特異度を示す。１０倍及び５倍ＣＶ手順を用いた更に厳密な検査では、ＡＵＣが殆ど、もしくは全く減少しないことが明らかになり、これは提示された診断モデルの堅牢性を示す。
【００４３】
このモデルは様々な癌ステージで統計的に均一な感度を示しており、本教示によって早期発見が可能であることが分かる。肺癌の生存率は診断のステージに大きく直接的に依存するため、これは診断上非常に重要である。更に、試験対象におけるＣＯＰＤ共存症の存在は、感度又は特異度のいずれにおいても診断結果に影響を及ぼさないことが示されており、このことから、モデルの結果がこのような病態の影響を受けないことが分かる。ＣＯＰＤは肺発癌のリスクを５倍に増加させるため、この高リスク集団で肺癌を検出できることは、患者の生存率に大きく影響を及ぼす可能性がある。
【００４４】
アッセイの結果は肺での小結節の検出によって裏付けられる。ＣＯＰＤ患者等の高リスクの個人でも使用できる可能性がある。本アプローチは診断ツールとして使用することができ、陰性結果は監視画像診断および不必要な侵襲的処置の回避につながり、陽性結果は早期の救命介入につながる可能性があることが示唆される。ＭＡＰは予想される高い免疫応答を反映すると思われるため、アッセイの実施形態が免疫療法手順に対する免疫応答性のモニタリングに寄与し得ることも示唆される。
【００４５】
従って、本発明の一様相によれば、肺癌の診断を必要とする対象において肺癌を診断する方法であって、
（ａ）末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む対象の生体試料を提供し、
（ｂ）表３及び表４に記載の刺激剤からなる群から選択された刺激剤にＰＢＭＣをインビトロで接触させ、
（ｃ）上記（ｂ）に従った接触後のＰＢＭＣの代謝活性（ＭＡ）を測定する
ことを含み、対照試料と比較した際のＰＢＭＣの代謝活性の統計的に有意な変化が、肺癌の指標となる方法が提供される。
【００４６】
本明細書に記載の方法はいずれも、その方法の実行を目的とした診断キットで使用することができる。
【００４７】
本明細書で使用する「診断する」又は「診断」とは、病態（即ち、肺癌）の有無の確認、病態又は症状の分類、病態の重症度の確認（即ち、病期分類）、病態進行のモニタリング、病態の結果及び／又は回復の見込みの予測、及び特定の疾患に関する対象のスクリーニングを意味する。
【００４８】
本明細書で使用する「肺癌」という用語は、肺でのあらゆる癌性増殖を意味する。幾つかの実施形態では、肺癌は小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）及び非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）であり、これは顕微鏡で観察した際の細胞サイズによって特徴付けられる。他の実施形態では、原発性ＮＳＣＬＣは、殆どが腺癌（気管支肺胞細胞癌を含む）、扁平上皮細胞癌及び大細胞癌を含む。本明細書で使用する「肺癌」という用語は、カルチノイド腫瘍やリンパ腫等のまれな細胞型の肺癌も包含する。幾つかの実施形態では、肺癌患者は、画像診断、生検、病期分類等に基づいて肺癌と診断された患者である。
【００４９】
特定の実施形態によれば、肺癌はＮＳＣＬＣである。
【００５０】
肺癌病期分類は発生源からの癌の伝播の程度の評価である。これは肺癌の予後と可能な治療に影響を及ぼす因子の１種である。
【００５１】
非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）病期分類の評価ではＴＮＭ分類を使用する。これは原発性腫瘍のサイズ、リンパ節転移及び遠隔転移に基づいている。
【００５２】
【表１】
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【００５３】
ＴＮＭ記述子を使用して、潜在癌からステージ０、ＩＡ（１−Ａ）、ＩＢ、ＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢ及びＩＶ（４）までの群が割り当てられる。このステージ群によって治療の選択と予後の推定が容易になる。
【００５４】
【表２】
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【００５５】
小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）は、伝統的に「限局期」（胸部の半分に限定され、単一の耐容放射線療法分野の範囲内）又は「進行期」（より広範囲の疾患）に分類されている。しかし、ＴＮＭ分類と群化は予後の推定に有用である。
【００５６】
ＮＳＣＬＣとＳＣＬＣの両方に関して、２種類の一般的な病期分類評価は臨床的病期分類と外科的病期分類である。臨床的病期分類は根治手術の前に行う。これは画像診断（例えば、ＣＴスキャンやＰＥＴスキャン）の結果と生検結果に基づく。外科的病期分類は手術中又は手術後に評価し、胸部リンパ節の外科的試料採取を含む外科的及び臨床的所見の複合結果に基づく。
【００５７】
これらの方法のいずれかを用いて、本教示に従って診断を確定するか、又は最初の診断を与えることができる。
【００５８】
特定の実施形態によれば、肺癌は初期段階の肺癌（例えば、ＴＮＭの１ａ−２ｂ）である。
【００５９】
本明細書で使用する「対象」という用語は、本発明の方法又はキットによって試験される対象（例えば、ヒト）を意味する。対象は、肺癌を有するリスクがある対象［例えば、遺伝的素因の対象、高齢の対象、癌の病歴及び／又は家族歴を有する対象、ＣＯＰＤに罹患している対象、煙及び／又は他の発癌物質、職業上の危険、環境上の危険に曝されている対象］及び／又は肺癌又は一般的な癌の疑わしい臨床徴候［例えば、持続的な咳、喀血、胸痛、息切れ、胸水、喘鳴、嗄声、再発性気管支炎又は肺炎、骨痛、腫瘍随伴症候群、原因不明の痛み、発汗、原因不明の発熱、食欲不振、貧血及び／又は全身の脱力感に至る原因不明の体重減少］を示す対象とすることができる。これに加えて、またはこれに変えて、対象は、無作為又は代表的な集団の、日常的な健康診断又は日常的な検診を受けている健常なヒト対象とすることができる。対象は、治験又は試験に参加している患者又は対象とすることもできる。対象は、喫煙者、非喫煙者又は元喫煙者とすることができる（実施例５を参照）。本発明の幾つかの実施形態によれば、肺癌は初期段階（ＴＮＭガイドラインによる１ａ−２ｂ）の肺癌である。
【００６０】
本発明の幾つかの実施形態によれば、対象は測定の前の少なくとも２〜５年間は、抗癌療法による治療を受けていない。
【００６１】
本発明の幾つかの実施形態によれば、対象は測定の前の少なくとも２年間は、抗癌療法による治療を受けていない。
【００６２】
本発明の幾つかの実施形態によれば、対象は測定の前の少なくとも３年間は、抗癌療法による治療を受けていない。
【００６３】
本発明の幾つかの実施形態によれば、対象は測定の前の少なくとも４年間は、抗癌療法による治療を受けていない。
【００６４】
本発明の幾つかの実施形態によれば、対象は測定の前の少なくとも５年間は、抗癌療法による治療を受けていない。
【００６５】
本発明の他の実施形態／様相によれば、対象は既に肺癌と診断されているか、又はそのように示唆する診断（例えば、胸部Ｘ線撮影、ＣＴ画像診断、気管支鏡検査、ＣＴ誘導生検及び／又は組織病理学による）を受けており、本アッセイを用いて、診断の確定、治療の最適化、又は治療のモニタリングを行う。
【００６６】
特定の実施形態によれば、対象は癌（例えば、いずれかの癌）とは診断されていない。
【００６７】
別の又は更なる実施形態によれば、対象は、代謝活性の測定の前の少なくとも０．５〜５年間は、抗癌療法（専用療法）による治療を受けていない。
【００６８】
本明細書で使用する「代謝活性経路」とは、エネルギー産生に対する、ミトコンドリアの酸化的リン酸化、嫌気性解糖、好気性解糖及びＮＨ３＋産生の相対的な寄与を意味する。
【００６９】
プロファイルはスパイク構成又は単調飽和挙動を有することができる。
【００７０】
スパイクプロファイルは、通常、受容体を介した代謝活性の刺激を反映し、これは濃度依存の栄養反応と比較してより特異的であると予想される。後者の反応は一般には単調飽和プロファイルである。
【００７１】
本明細書で使用する「細胞」とは、リンパ球（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）及び単球からなる群から選択される白血球、例えば、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を意味する。従って、試料は全血を含むか、又は顆粒球、血小板及び／又は赤血球等の幾つかの血液成分が欠乏した血液、即ち、分画された血液を含むことができる。特定の実施形態によれば、試料は１０００〜１０７個の細胞（例えば、１０４〜１０７個／ｍＬ、例えば、５×１０６個／ｍＬ、例えば、５×１０４個／ｍＬ）を含む。
【００７２】
特定の実施形態によれば、細胞はＰＢＭＣを含む。
【００７３】
特定の実施形態によれば、細胞は純粋なＰＢＭＣ集団、例えば（フィコール等によって）８０％超のものを含む。
【００７４】
赤血球等の血液成分を除去する方法は当技術分野で既知であり、例えば、溶血、遠心分離、沈降、濾過又はそれらの組み合わせが挙げられる。
【００７５】
図１及び以下の実施例の項では、このような分画プロセスの特定の実施形態について説明する。
【００７６】
従って、細胞とは、高度に精製された特定細胞のサブセットを含む単離細胞集団、即ち、Ｔ細胞等の同型細胞集団（例えば、純度８０％超）、又は様々な種類の免疫細胞（例えば、末梢血白血球（ＰＢＬ）や末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）等）を含む異種性細胞集団を意味することがある。
【００７７】
特定の実施形態によれば、細胞は、純粋な細胞集団、即ち、純粋なＰＢＭＣ集団、即ち、７０％超のＰＢＭＣ、８０％超のＰＢＭＣ、９０％超のＰＢＭＣ、９５％超のＰＢＭＣである。
【００７８】
代謝活性の測定はリアルタイムで行うため、細胞が生存可能なままであることが重要である。
【００７９】
特定の実施形態によれば、細胞のアッセイは対象から回収した直後、即ち、血液回収後２〜４時間（例えば、３時間）以内に行う。
【００８０】
他の実施形態によれば、細胞を検査前に保存する（例えば、４℃で保存するか、又は凍結保存する）。幾つかの実施形態によれば、細胞を１８℃で保存する。細胞をプレート上で刺激剤に導入する場合、プレートを氷上（例えば４℃）でロードした後、３７℃で読み取りを行う。
【００８１】
特定の実施形態によれば、細胞は細胞株ではない。
【００８２】
前述のように、細胞を一旦入手したら、インビトロで刺激剤と接触させる。
【００８３】
本明細書で使用する「刺激剤」とは、それに応答して細胞の代謝経路を増加、減少又は変化させるものを意味する。
【００８４】
例えば、細胞がリンパ球である場合、刺激剤はＴＣＲ又はＢＣＲによって認識される抗原であり、クローン増殖又は抗体産生をもたらす。特定の刺激剤又は阻害剤を以下の表３及び表４に記載する。
【００８５】
同一濃度又は異なる濃度の１種以上の刺激剤（例えば、２種、３種、４種）を単一試料又は試料の単一アリコートに使用して、代謝活性を確認することができ、又は必要に応じて本明細書に記載のプロファイルを確認できることが理解されよう。例えば、様々なＨｅｒ２ペプチド又は様々な刺激剤を全て一緒に（例えば、ＰＭＡとＨｅｒ２ペプチド）を使用することができる。
【００８６】
【表３−１】
2020531846.tif 000004
【００８７】
【表３−２】
2020531846.tif 000005
【００８８】
【表３−３】
2020531846.tif 000006
【００８９】
【表４】
2020531846.tif 000007
【００９０】
上述のポリペプチド由来のＭＨＣ制限ペプチド抗原については後述する。
【００９１】
刺激剤は様々な濃度で希釈してもよく、単一の濃度を使用してもよい。
【００９２】
代謝活性の測定は、刺激剤との接触を通して行うことができる。
【００９３】
例えば、刺激剤を添加して直ちに、少なくとも１２０〜１８０分間測定を行うことができる。例えば、刺激剤を細胞に添加した後、測定を１〜２時間（例えば、１．５時間）行うことができる。
【００９４】
特定の実施形態によれば、細胞の代謝活性の測定は、細胞（例えば、ＰＢＭＣ）の細胞外酸性化の測定によって行う。
【００９５】
従って、細胞外酸性化の測定は、ＰＢＭＣの較正済緩衝能を有する細胞外所定溶液中で行う。
【００９６】
特定の実施形態によれば、代謝活性の測定は、酸性化プロファイル（相対酸性化率を表す）を生じさせる刺激剤の濃度の関数として時間依存的である。
【００９７】
特定の実施形態によれば、酸性化プロファイルは、
（ｉ）不揮発性の可溶性代謝産物と揮発性の可溶性代謝産物、
（ｉｉ）不揮発性の可溶性代謝産物、又は
（ｉｉｉ）揮発性の可溶性代謝産物
の分泌に起因する。
【００９８】
特定の実施形態によれば、（ｉｉ）の酸性化プロファイルの測定は空気曝露チャンバー内で行い、（ｉ）の酸性化プロファイルの測定は空気遮断チャンバー内で行い、（ｉｉｉ）の酸性化プロファイルの測定は（ｉ）の酸性化プロファイルから（ｉｉ）の酸性化プロファイルを差し引くことで行う。
【００９９】
従って、特定の実施形態によれば、高感度の測定を実現するために、生理的ｐＨ付近（約７．４）で僅かなｐＨ変化を感知できる無毒性の膜非透過性ｐＨ指示薬／プローブを使用する。
【０１００】
その例としては、レシオメトリックｐＨプローブ、ＣＯ２プローブ、ＮＨ３プローブ、乳酸プローブ、及びその組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態によれば、ｐＨ緩衝条件での高感度にはレシオメトリック技術が必要である。
【０１０１】
本教示に従って使用可能な特定のプローブの例としては、８−ヒドロキシピレン−１，３，６−トリスルホン酸（ＨＰＴＳ）、ＣＦＤＡ及びカルボキシフルオレセインが挙げられるが、これらに限定されない。このようなプローブはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社等より市販されている。
【０１０２】
特定の実施形態によれば、酸性化の測定は、レシオメトリックｐＨプローブである８−ヒドロキシピレン−１，３，６−トリスルホン酸（ＨＰＴＳ）を使用して行う。
【０１０３】
水性緩衝液でｐＫａが約７．３のＨＰＴＳを使用する。ＨＰＴＳはｐＨ依存の吸収シフトを示し、これによって、４５５ｎｍと４０３ｎｍでの励起下で順次測定される５１３ｎｍでの蛍光強度の比の関数としてレシオメトリックｐＨ測定が可能となる。
【０１０４】
細胞外モニタリングは、ナノ粒子にレシオメトリック分子の光学プローブを付着させて細胞内効果を回避することによって容易に行うことができる。
【０１０５】
上述の酸性化プロファイルのいずれも細胞の代謝活性の指標として使用することができる。或いは、測定されたプロファイルの１種のみが細胞の代謝活性を示す。
【０１０６】
検量線は通常、既知のｐＨ値（同じ量のプローブを含む）で作成する。
【０１０７】
検量線は、同じ測定値、例えば、「開放」状態及び／又は「閉鎖」状態（本明細書に記載）について作成し、これによって、２種の励起波長間の比の関数としてｐＨ測定が可能となる。
【０１０８】
特定の実施形態によれば、（同じ条件下で）対照試料に対する代謝活性を決定するには、１種の測定、即ち、密閉（閉鎖）チャンバー又は開放チャンバー内での測定で十分である。
【０１０９】
特定の実施形態によれば、（同じ条件下で）対照試料に対する代謝活性を決定するには、２種の測定、即ち、密閉（閉鎖）チャンバー及び開放チャンバーでの測定で十分である。
【０１１０】
特定の実施形態によれば、（同じ条件下で）対照試料に対する代謝活性を決定するには、全ての測定、即ち、密閉（閉鎖）チャンバー及び開放チャンバー内での測定と減算が必要である。
【０１１１】
本明細書で使用する「独立して測定する」とは、項目（ｉ）、項目（ｉｉ）及び場合によっては項目（ｉｉｉ）を別々に測定することを意味する。しかし、特定の実施形態によれば、（ｉｉｉ）は（ｉ）から（ｉｉ）を差し引いた結果であることが理解されよう。このような個別測定は、（以下の実施例の節に記載のように）並行して行うか、同一であるが別個の細胞試料に対して同時に行うか、又は単一の細胞試料に対して連続的に行うことができる。
【０１１２】
従って、細胞外酸性化プロファイルの測定は酸性化の検量線によって行う。
【０１１３】
代謝活性の測定は、「開放」状態および「閉鎖」状態における細胞の細胞外環境において蛍光測定したｐＨ変化に関連して、累積酸性化（例えば、Ｈ＋濃度：ｎＭ／分）を計算することで行う。特定の実施形態によれば、この測定が細胞の細胞外環境においてのみ行われ、細胞内では行われないことが理解されよう。細胞外ｐＨ測定が好都合であるのは、以下の理由によるものである。即ち、細胞外環境においては、恒常性生理学的調節に起因する一過性の細胞内応答における比較的小さい平均変化に対して、持続した酸性蓄積が存在する；細胞内プロセスによる細胞外プローブの生理学的干渉がない；細胞外レシオメトリック蛍光プローブのシグナル対ノイズ比が比較的高い；蛍光媒体（較正済緩衝能）の調製が細胞操作に対して簡便である；細胞内プローブのかなりの漏出とは対照的にバックグラウンド蛍光がない；動態学的測定が透過化手順を必要とせずに行われ、それによって生細胞のリアルタイムでの分析が可能になる；クエンチング及び酸化の影響に伴う問題が最小限である；そして最後に、同時高スループット動態学的測定が上述の障害を伴わずに可能となる。
【０１１４】
特定の実施形態によれば、ＭＡ試験は較正済緩衝能を有する所定の溶液（全成分が既知である）で行う。
【０１１５】
緩衝能力によって生理学的ｐＨの僅かな変化が確実に生じることは理解されよう。
【０１１６】
特定の実施形態によれば、緩衝液はリン酸緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水１〜１０ｍＭ又は１０ｍＭリン酸緩衝液）である。低細胞濃度での酸性化測定には低濃度緩衝液が必要であることが理解されよう。特定の実施形態によれば、５×１０６個（細胞）／ｍＬ（例えば、精製ＰＢＭＣ）に１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水を使用する。
【０１１７】
特定の実施形態によれば、酸性化プロファイルの測定は、一定の温度、例えば、２０〜４０℃、又は具体的には最適な成長温度、例えば、ＰＢＭＣの場合には３７℃で行う。
【０１１８】
前述のように、全ての測定は対照試料に対して行う。一例は、刺激剤のみがない（基礎状態を表す）試験アッセイであり、この代わりに、または更に細胞なしや、及び／又は細胞および刺激剤なしのアッセイが挙げられる。
【０１１９】
各アッセイでは、同じチャンバー／ウェル又は別々のチャンバー／ウェルで１種以上の刺激剤を使用できることが理解されよう。
【０１２０】
従って、単一の血液試料を複数の刺激剤（例えば、２〜２５種、２〜２０種、２〜１０種、２〜５種、２〜４種）に曝すことができる。
【０１２１】
特定の実施形態によれば、刺激剤は、ＮＹ−ＥＳＯ−１、Ｈｅｒ−２ａ、ＣｏｎＡ、ＰＨＡ、ＭＡＧＥ−Ａ３及びグルコースからなる群から選択される。
【０１２２】
特定の実施形態によれば、刺激剤がＮＹ−ＥＳＯ−１である場合、測定は空気曝露チャンバーで行う。
【０１２３】
特定の実施形態によれば、刺激剤がＨｅｒ−２ａである場合、測定は空気曝露チャンバーで行う。
【０１２４】
特定の実施形態によれば、刺激剤がＣｏｎＡである場合、測定は空気曝露チャンバー内で行う。
【０１２５】
特定の実施形態によれば、刺激剤がＰＨＡである場合、測定は空気遮断チャンバー内で行う。
【０１２６】
特定の実施形態によれば、刺激剤がＭＡＧＥ−Ａ３である場合、測定は空気遮断チャンバー内で行う。
【０１２７】
特定の実施形態によれば、刺激剤がグルコースである場合、測定は空気遮断チャンバー内で行う。
【０１２８】
上述のように、細胞外酸性化プロファイルは、細胞によって分泌される様々な代謝産物の素性の指標となる。
【０１２９】
肺腫瘍は、媒体への乳酸（不揮発性）の分泌を主な特徴とする好気性解糖を優先的に利用する。対照的に、分化した組織は酸化的リン酸化又は嫌気性解糖を利用するため、それぞれ酸素の利用能に応じてＣＯ２（揮発性）又は乳酸を分泌する。
【０１３０】
特定の実施形態によれば、不揮発性の可溶性代謝産物（主に乳酸）の分泌に起因する時間依存性酸性化プロファイルは、空気曝露チャンバー内で得られる。このような条件（「開放」）下では、ＣＯ２とＮＨ３のガス換気が行われるため、乳酸の生成（他の不揮発性有機酸を含む）のみが各ウェル内の同等の酸性蓄積に寄与する。
【０１３１】
特定の実施形態によれば、不揮発性の可溶性代謝産物と揮発性の可溶性代謝産物の分泌による時間依存性酸性化プロファイルは、空気遮断チャンバー内で得られる。密閉状態（「閉鎖」）では、ＣＯ２とＮＨ３は水と平衡状態で反応して炭酸イオンと塩基性アンモニウムイオンを形成する。しかし、この状態では、ＮＨ４＋塩基性陽イオンは、ｐＨ７付近で乳酸陰イオンと炭酸陰イオンの両方によって生じる酸性度を滴定する。
【０１３２】
特定の実施形態によれば、酸性化動態の測定は２０〜１００分で行い、例えば、マルチウェルプレートの空気「開放」及び「閉鎖」状態のモードシーケンス毎に５０分間行う。
【０１３３】
酸性化（＋）と塩基性滴定（−）の適切な速度（Ｖ）により、開放状態（Ｖｏｐｅｎ）と閉鎖状態（Ｖｃｌｏｓｅｄ）で測定された酸性化の合計速度は結合方程式で表される。
Ｖｏｐｅｎ＝Ｖ（乳酸）
Ｖｃｌｏｓｅ＝Ｖ（乳酸）＋Ｖ（炭酸）−Ｖ（アンモニウム塩基）
【０１３４】
この構成を使用すると、揮発性の可溶性代謝産物の分泌に起因する時間依存性酸性化プロファイルは、プロファイル（ｉｉ）−プロファイル（ｉ）の引き算によって計算することができる。
【０１３５】
マルチウェルプレート、マルチウェルプレートリーダー（蛍光シグナル検出用、例えば、ＴＥＣＡＮ社から入手可能）、ＣＣＤカメラを利用した画像解析、又は光ファイバーマトリックスを使用して、高スループットスクリーニングを行うことができる。
【０１３６】
一旦、酸性化プロファイルを取得したら（例えば、刺激剤／阻害剤の有無に関わらず）、そのプロファイルを記録する。同一条件下での（例えば、上述のような）対象の細胞と対照細胞との間の代謝活性の統計的に有意なシフト（即ち、変化）は肺癌の指標となる。
【０１３７】
生データは、結果を分類し、診断に使用される製品の設計を支援する、決定ツリーモデル、ロジスティックモデル、及び／又はサポートベクターマシン（ＳＶＭ）等の分類子を用いる機械学習の対象となる。幾つかの実施形態によれば、コホートの無作為なサブセットでそのような分類子のアンサンブルを訓練した後、ハード投票を使用して個々の予測を集約することにより、バギングを採用することができる。特定の実施形態は、「データ分析」の下の実施例の項に記載されている。
【０１３８】
本発明の一実施形態によれば、得られた酸性化プロファイルを記録し、例えば、コンピュータ可読媒体等でデータベースに保存して、データ操作や計算モデルの構築が可能になる。本明細書で使用する「コンピュータ可読媒体」とは、コンピュータが直接に読み取ってアクセスすることが可能な媒体のいずれかを意味する。そのような媒体としては、フロッピーディスクや、ハードディスク記憶媒体、磁気テープ等の磁気記憶媒体、光ディスクやＣＤ−ＲＯＭ等の光学記憶媒体、ＲＡＭやＲＯＭ等の電気的記憶媒体、及びこれらのカテゴリーのハイブリッド型、例えば、磁気／光学記憶媒体等が挙げられるが、これらに限定されない。適切な記憶媒体の選択と使用は十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１３９】
本明細書で使用する「記録する」とは、コンピュータ可読媒体に情報を保存するプロセスを意味する。
【０１４０】
本明細書に記載の診断方法／キットの実施形態は、許容し得るレベルの臨床精度又は診断精度をもたらす。そのような統計データを使用し、本明細書で「許容し得る程度の診断精度」とは、ＡＵＣ（試験又はアッセイでのＲＯＣ曲線下面積）が少なくとも０．６、望ましくは少なくとも０．６５、より望ましくは少なくとも０．８、好ましくは少なくとも０．８５、より好ましくは少なくとも０．９、最も好ましくは少なくとも０．９５である試験又はアッセイ（例えば、本発明の幾つかの様相で、代謝活性の臨床的に有意な変化／シフトを確認して肺癌の指標とするために用いる試験）として定義される。
【０１４１】
「非常に高度な診断精度」とは、ＡＵＣ（試験又はアッセイでのＲＯＣ曲線下面積）が少なくとも０．７５、０．８０、望ましくは少なくとも０．８５、より望ましくは少なくとも０．８７５、好ましくは少なくとも０．９０、より好ましくは少なくとも０．９２５、最も好ましくは少なくとも０．９５である試験又はアッセイを意味する。
【０１４２】
或いは、本方法は、肺癌の存在又は療法に対する反応を、少なくとも７５％の感度、より好ましくは８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の感度で予測する。
【０１４３】
或いは、本方法は、肺癌の存在又は療法に対する反応を、少なくとも７５％の特異度、より好ましくは８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の特異度で予測する。
【０１４４】
本方法の堅牢性と正確性は、その多くの臨床用途での使用を示唆している。
【０１４５】
従って、肺癌を治療する方法であって、
（ａ）本明細書に記載のように対象が肺癌を有すると診断し、
（ｂ）前記対象に対して、治療を行うか、又は治療法を選択する
ことを含む方法を提供する。
【０１４６】
この方法は、必要に応じ、本明細書に記載のような診断結果を、ゴールドスタンダードとなる方法を用いて確定診断とすることを更に含んでもよい。
【０１４７】
肺癌の治療は通常、疾患のステージと種類に依存する。当業者であれば、利用可能な治療の選択肢を容易に知るであろう。以下に非制限的なリストを示す。
【０１４８】
腫瘍がある肺葉全体を切除する手術は、一般に健康状態が良好な早期癌患者の主な治療法である。手術の目標は、全ての腫瘍細胞を完全に除去して治癒させることである。
【０１４９】
放射線療法（又は照射療法）では、急速に分裂する癌細胞を破壊することが可能な高エネルギーＸ線を照射する。肺癌においては多くの用途があり、
一次治療として、
腫瘍を縮小する手術の前、
手術後、治療部位に残っている癌細胞を除去するため、
脳や体の他の部位に拡がった肺癌を治療するために行う。
【０１５０】
肺葉切除術（肺葉全体の除去）は、肺が十分に機能している時に肺癌を除去するのに認められている処置である。
【０１５１】
小線源療法では、放射線を疾患部位に直接照射する。これは通常、原発腫瘍の切除後に放射性シードを外科的切除の縁に縫合する外科的処置によって行う。
【０１５２】
化学療法では癌細胞に対して毒性のある薬物を使用する。薬物は通常、静脈への直接注射又は大静脈に留置されたカテーテルを介して投与する。化学療法は、顕微鏡的疾患の殺菌のために手術後に行うことが多いが、腫瘍増殖を遅らせ、手術を受けられない患者の症状を緩和することもある。従来の化学療法よりも副作用が少なく、場合によっては同様に効果的な新しい生物剤が使用されている。この治療法は、肺癌の全てのステージで用いられ、高齢者でも健康状態が良好であれば寿命を延ばすことができる。一部の化学療法薬では癌細胞の放射線治療によって腫瘍への損傷が増加する。他の薬物の場合には、腫瘍細胞が放射線治療の影響を最も受けやすいステージに維持されるか、又は放射線療法の後に癌細胞が自ら修復する能力を損なう。
【０１５３】
放射線療法は、集束高エネルギーＸ線（光子）、γ線又は原子粒子の送達である。分裂していない細胞よりも、急速に分裂している細胞（例えば、癌細胞）に対して大きく影響を及ぼす。
【０１５４】
免疫療法では、患者の免疫系を強化する薬物を使用して癌管理を助ける。（全てではないが）一部の研究では、このような薬剤を手術後に投与すると生存率が改善されることが示されている。免疫療法の例としては、モノクローナル抗体、免疫チェックポイント阻害剤、癌ワクチン、及び非特異的免疫療法が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５５】
遺伝子療法では、健康な遺伝子を肺腫瘍に直接送達させると、癌細胞を殺したり、その成長を遅らせたりすることができる。
【０１５６】
血管新生阻害剤は、成長中の癌で新しい血管が形成されるのを防止し、実際に腫瘍の血液供給を停止することができる薬剤である。これは依然として実験的なアプローチのままであるが、副作用を殆ど引き起こさないと思われるため、ある程度有望である。
【０１５７】
適切な治療に向けて患者（例えば、ＥＧＦＲの突然変異）を選択するために、遺伝子検査の評価されている。
【０１５８】
体幹部定位放射線療法（ＳＢＲＴ）では、手術で実現される速度に匹敵する速度で初期段階の腫瘍を制御することができる。
【０１５９】
特定の実施形態によれば、治療は免疫療法によるものであり、上述の薬物は本教示が分析する免疫系に作用するため、本明細書に記載のモニター方法に特に適している可能性がある。
【０１６０】
従って、治療をモニターする方法であって、
（ａ）抗肺癌治療によって肺癌を有する対象を治療することと、
（ｂ）対象のＰＢＭＣの代謝活性の測定を
（ｉ）表３及び表４に記載の刺激剤からなる群から選択された刺激剤に前記ＰＢＭＣをインビトロで接触させ、
（ｉｉ）（ｂ）に従って接触させた前記ＰＢＭＣの代謝活性を測定して行うことを含む方法において、ＰＢＭＣの代謝活性が同一条件下で検査した正常な健康細胞試料の代謝活性にシフトしていることは疾患の治療が効果的であることを示す方法が提供される。例えば、転移相では、ＭＡプロファイルがほぼ正常プロファイルに戻る可能性が示唆される。
【０１６１】
治療方法／治療をモニターする方法又は治療を決定する方法（個別療法）のいずれかを本明細書に記載のように用いて、ＰＢＭＣの代謝活性の決定に関する診断を行うことができる。
【０１６２】
本教示は更に、本明細書に記載の刺激剤（例えば、表３又は表４に記載の刺激剤の内の少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種）を含むキットに言及する。このキットは、本明細書に記載のプローブ、プレート（蛍光検出器での読み取りに適している）、ＰＢＭＣ用の緩衝液及び／又は使用説明書を更に含むことができる。
【０１６３】
パックキットは、例えば、金属箔やプラスチック箔（ブリスターパック等）によって包装することができる。このパックは、医薬品の製造、使用又は販売を規制する政府機関によって規定された形態の容器に関連する通知（この通知は、組成物の形態又はヒトや動物での使用に関する機関による承認を反映している）に合わせることができる。このような通知は、例えば、診断キットに関して米国食品医薬品局によって承認されたラベル表示をすることができる。
【０１６４】
本明細書で使用する「約」は、±１０％または±５％を指す。
【０１６５】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」およびその活用形は、「限定されるものではないが、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」を意味する。
【０１６６】
「からなる」という用語は、「含み、限定される」ことを意味する。
【０１６７】
「から実質的になる」という用語は、組成物、方法または構造が追加の成分、工程および／または部分を含み得ることを意味する。但しこれは、追加の成分、工程および／または部分が、請求項に記載の組成物、方法または構造の基本的かつ新規な特性を実質的に変更しない場合に限られる。
【０１６８】
本明細書において、単数形を表す「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他を示さない限り、複数をも対象とする。例えば、「化合物（a compound）」または「少なくとも１種の化合物」には、複数の化合物が含まれ、それらの混合物をも含み得る。
【０１６９】
本願全体を通して、本発明のさまざまな実施形態は、範囲形式にて示され得る。範囲形式での記載は、単に利便性および簡潔さのためであり、本発明の範囲の柔軟性を欠く制限ではないことを理解されたい。したがって、範囲の記載は、可能な下位の範囲の全部、およびその範囲内の個々の数値を特異的に開示していると考えるべきである。例えば、１〜６といった範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６等の部分範囲のみならず、その範囲内の個々の数値、例えば１、２、３、４、５および６も具体的に開示するものとする。これは、範囲の大きさに関わらず適用される。
【０１７０】
本明細書において数値範囲を示す場合、それは常に示す範囲内の任意の引用数（分数または整数）を含むことを意図する。第１の指示数と第２の指示数「との間の範囲」という表現と、第１の指示数「から」第２の指示数「までの範囲」という表現は、本明細書で代替可能に使用され、第１の指示数および第２の指示数と、それらの間の分数および整数の全部を含むことを意図する。
【０１７１】
本明細書で使用する「方法」という用語は、所定の課題を達成するための様式、手段、技術および手順を意味し、化学、薬理学、生物学、生化学および医療の各分野の従事者に既知のもの、または既知の様式、手段、技術および手順から従事者が容易に開発できるものが含まれるが、これらに限定されない。
【０１７２】
異常な活性、疾病または病態と関連して本明細書で使用する「治療する」という用語は、病態の進行の抑止、実質的な阻害、遅延または逆転、病態の臨床的または審美的な症状の実質的な寛解、あるいは病態の臨床的または審美的な症状の悪化の実質的な予防を含む。
【０１７３】
明確さのために別個の実施形態に関連して記載した本発明の所定の特徴はまた、１つの実施形態において、これら特徴を組み合わせて提供され得ることを理解されたい。逆に、簡潔さのために１つの実施形態に関連して記載した本発明の複数の特徴はまた、別々に、または任意の好適な部分的な組み合わせ、または適当な他の記載された実施形態に対しても提供され得る。さまざまな実施形態に関連して記載される所定の特徴は、その要素なしでは特定の実施形態が動作不能でない限り、その実施形態の必須要件であると捉えてはならない。
【０１７４】
上述したように、本明細書に記載され、特許請求の範囲に請求される本発明のさまざまな実施形態および態様は、以下の実施例によって実験的に支持されるものである。
【実施例】
【０１７５】
ここで、上記の記載と共に本発明を限定することなく説明する以下の実施例に参照する。
【０１７６】
一般に、本明細書で使用する命名法や本発明で利用される実験手順には、分子、生化学、微生物学及び組換えＤＮＡ技術が含まれる。そのような技術は文献で十分に説明されている。例えば、"Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998);米国特許第４，６６６，８２８号、第４，６８３，２０２号、第４，８０１，５３１号、第５，１９２，６５９号及び第５，２７２，０５７号に記載の方法、"Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980)、利用可能なイムノアッセイは特許及び科学文献に広く記載されている（例えば、米国特許第３，７９１，９３２号、第３，８３９，１５３号、第３，８５０，７５２号、第３，８５０，５７８号、第３，８５３，９８７号、第３，８６７，５１７号、第３，８７９，２６２号、第３，９０１，６５４号、第３，９３５，０７４号、第３，９８４，５３３号、第３，９９６，３４５号、第４，０３４，０７４号、第４，０９８，８７６号、第４，８７９，２１９号、第５，０１１，７７１号及び第５，２８１，５２１号参照）、"Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., Eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) and "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996)。これら文献の全てを本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。他の一般的な参考文献はこの文書全体で提供する。そこに記載の手順は、当技術分野で周知であると考えられており、読者の便宜のために提供する。そこに含まれる全ての情報を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。
【０１７７】
研究デザイン、集団統計及びプロトコル
２０１４年６月〜２０１６年１２月の間に、カーメルメディカルセンター（ハイファ）、ランバムメディカルセンター（ハイファ）、スーラスキーメディカルセンター（テルアビブ）の３つの医療センターに対象を登録した。全ての場合において、研究は施設内審査委員会からヘルシンキ承認を受けた（承認番号はそれぞれ０１０５−１３−ＣＭＣ、０２７４−１５−ＲＭＢ、０００９−１３−ＴＬＶ）。対象は専用の同意書を読んで署名した。選択基準には、年齢が１８歳以上９０歳以下、妊娠中ではないこと、採血前に肺癌の治療を受けていないことが挙げられた。除外基準には、過去５年間の何らかの悪性腫瘍の治療、臨床的に確認された活動性感染症又は炎症、免疫系に影響を与える可能性のある薬物治療、授乳又は不妊治療中であること、又は次の条件：ＨＩＶ陽性、Ｂ型肝炎／Ｃ型肝炎、自己免疫疾患、回避できない過敏症及び／又はアレルギーのいずれかが挙げられた。肺癌対象と健常（非肺癌）対象を並行して登録した。肺癌の参考基準は生検又は手術であった。一旦肺癌対象の数が１００に達したら、自動プロセスによって健常対象とマッチさせ、１：１のバランスのコホートとし、年齢、性別及びＣＯＰＤ分布の最適なマッチングを行って、表に記載のように合計試料サイズを２００とした。
【０１７８】
ＰＢＭＣの採取と分離
ＥＤＴＡ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ  ４５５０３６）を含む９ｍＬのＶａｃｕｔｕｂｅに血液試料を採取した。血液細胞の生存率を高めるため、ＰＢＭＣの分離まで、試料は１８℃に設定した恒温容器に輸送した。ＰＢＭＣの単離はＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）キットによって製造元（Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ社）の指示に従って行った。
【０１７９】
ＭＡＰ試験の準備と測定
黒色の非結合、低容量の３８４マルチウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ）の各ウェルに、ＰＢＭＣ溶液（１０μＬ）と８−ヒドロキシピレン−１，３，６−トリスルホン酸（ＨＰＴＳ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｌｔｄ．）を含む１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（１０μＬ）をロードし、１４種の刺激試薬（刺激剤）の内の１種を様々に上昇させた濃度で添加した（エラー！参照元が見つからない）。各ウェルのＨＰＴＳプローブの最終濃度は０．５μＭとし、ＰＢＭＣの最終濃度は１０ｍＭ  ＰＢＳ中５×１０６個（細胞）／ｍＬとした。ＰＢＭＣ代謝活性の結果としてｐＨ変化が生じるように緩衝能力を具体的に適合させた。成人の末梢血中の平均ＰＢＭＣ濃度を反映させるため、各ウェルに５×１０６個（細胞）／ｍＬを播種した。試料は３つのウェルにロードし、最初にＰＢＭＣ試料、続いて刺激剤とし、各ウェルで最終体積を２０μＬとした。更に、各試験では２種の対照を用いた。一方は蛍光ＨＰＴＳプローブのみを含み、細胞と刺激剤を含んでいないものであり、もう一方はＨＰＴＳプローブと細胞を含むが、刺激剤を含まないもの（「基礎状態」を示す）である。酸性化プロセスは、市販の蛍光スキャナー（ＴＥＣＡＮ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００）によって３７℃で約１．５時間モニターした。最初は、プレートシールをせずに（「開放」状態で）酸性化プロセスをスキャナーでモニターし、次にマルチウェルプレートを密閉して（ＴｈｅｒｍａｌＳｅａｌ  ＲＴ（商標）、Ｅｘｃｅｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）ＣＯ２とＮＨ３の換気を回避し、試験の第２相とした（「閉鎖」状態）。プロファイルの分析は順次行った。両方の状態によって、「可溶性」代謝産物と「揮発性」代謝産物のリアルタイム蓄積の測定が可能となる。蛍光強度の測定は、４５５ｎｍと４０３ｎｍの波長での連続励起下で５１３ｎｍにて行った（図１のプロセスの説明を参照）。ＰＢＭＣには顆粒球は含まれていない。
【０１８０】
ＨＰＴＳ蛍光プローブを使用したｐＨの測定
蛍光プローブＨＰＴＳは、無毒性の膜非透過性ｐＨ指示薬であり、水性緩衝液でのｐＫａは約７．３である。ＨＰＴＳはｐＨ依存の吸収シフトを示し、これによって、４５５ｎｍと４０３ｎｍの波長での励起下で順次測定される波長５１３ｎｍでの蛍光強度の比の関数としてレシオメトリックｐＨ測定が可能となる。ＭＡＰ試験で使用した検量線は、０、５μＭのＨＰＴＳを含み、酸又は塩基で滴定して幾つかのｐＨレベル（ｐＨガラス電極で測定）が得られたＰＢＳ溶液で構成された。滴定試料のｐＨ測定と蛍光測定は３７℃で行った。「開放」プレート状態と「閉鎖」プレート状態の両方について検量線を作成し、これによって上述の２種の励起波長間の比の関数としてｐＨ測定が可能になった。
【０１８１】
刺激剤の種類と調製
各試験では、上の表３で詳述したように、ＰＢＭＣの代謝活性プロファイルのモニタリングを基礎状態（刺激試薬がない状態）及び刺激剤、栄養剤又は阻害剤（全て「刺激剤」と称する）の影響下で行った。各刺激剤を緩衝作用溶液で希釈して数種の異なる濃度を得た。刺激剤の選択は、免疫系、肺癌又は一般的な癌との関係によって行った。
【０１８２】
データ分析
全ての集団統計情報と臨床情報、及び生のＭＡＰ試験データは、安全で専用のＰｏｓｔｇｒｅＳＱＬデータベースに保存した。データ分析はＰｙｔｈｏｎを使用して行った。
【０１８３】
生物学的分析の最後に、「開放」プレート状態と「閉鎖」プレート状態の両方の時間の関数として、プレートウェルの生の蛍光測定値を含むデータシートを各対象に割り当てた。検量線を使用して蛍光測定値をｐＨ値に変換した。
【０１８４】
ｓｃｉｋｉｔ−ｌｅａｒｎ  Ｐｙｔｈｏｎライブラリによって実行された決定ツリーを使用して機械学習を行った。交差検証には層化ｋ分割を使用した。バギングの実行は、コホートの無作為なサブセットでツリーのアンサンブルを訓練した後、ハード投票を使用して個々の予測を集約して行った。
【０１８５】
信頼区間（ＣＩ）は二項信頼区間の正規近似を使用して計算した。サブ集団間の差の有意性はフィッシャー直接検定を使用して推定した。
【０１８６】
実施例１
研究デザインと集団統計
肺癌対象１００名と健常対象１００名を年齢と性別についてマッチさせて対象２００名のコホートとした（以下の表５）。健常群には健康な人とＣＯＰＤと診断された人の両方が含まれており、肺癌群には肺癌患者と肺癌及びＣＯＰＤを有する人の両方が含まれていた。両方の群でのＣＯＰＤの有病率はデザインによって類似しており（それぞれ１７％と２１％）、試験がこの条件に対してバイアスがないことが保証された。研究デザインの一環として様々な肺癌ステージの対象が含まれており、初期段階に重きが置かれた（図２）。様々な組織型の肺癌も含まれていた（図３）。
【０１８７】
【表５】
2020531846.tif 000008
【０１８８】
実施例２
診断予測モデルの構築
機械学習法を利用して肺癌対象と健常対象を区別した。これを行う前に、ＭＡＰ試験の生データから重要な特徴を抽出する必要があった。データには、様々な濃度の刺激剤に曝露された際の細胞外環境の酸性化レベルを表す蛍光読み取り値が含まれている。免疫系の生理学的機能の変化に関連する癌の存在は、試験されたＰＢＭＣ試料の様々な代謝活性プロファイルに反映されるという仮説が立てられた。従って、反応速度（ｒ）として定義される時間の関数としての酸性度の変化を様々な刺激剤と濃度に対して計算した（図４）。刺激剤濃度（Ｃ）の関数としてｒの値を見た。多くの濃度で肺癌試料の平均値と健常試料の平均値との間に明確な差が見られた（図５Ａ−Ｂ）。
【０１８９】
幾つかの数学モデルを使用し、少数の係数を用いてＣとｒの関係を示した。一部のモデルでは、異なる刺激剤の相互依存性も考慮されている。各刺激剤での２個の集団間の差を高めるため、決定ツリーの分類子を訓練して対象の臨床状態（「肺癌」又は「健常」）を予測した。最良の数学モデルと最良の分類子パラメータを各刺激剤に対して選択して精度を最大化し、最終予測モデルを決定ツリーのアンサンブルで構成して複数の刺激剤からの予測を考慮した。これをブートストラップ集約（「バギング」）と組み合わせて堅牢な結果を得た。
【０１９０】
実施例３
肺癌対象と健常対象の診断予測
構築モデルによって肺癌対象と健常対象の集団をほぼ完全に分離し（図６）、見かけの性能感度は１００％、特異度は９８％であった。次の段階として、交差検証（ＣＶ）を使用してモデルの予測能力を試験した。具体的には、層化２０倍ＣＶ分析を使用し、１０個の試料（コホートの１／２０）を検証用に除外し、残りを予測モデルの訓練セットとして使用した。このプロセスを、各回で異なる１０個の試料で繰り返し、コホート内の全ての対象に予測が与えられるまで行った。得られる予測は、−１０（強い健康）と１０（強い肺癌）の間のスコアである。次に受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線をプロットし（図７）、陽性カットオフ（又は弁別閾値）を設定して感度と特異度を決定することができた。得られた曲線下面積（ＡＵＣ）は０．９１で、感度は９１％、特異度は８０％（９５％信頼区間はそれぞれ［８７．７％、９４．３％］及び［７５．３％、８４．７％］）であり、カットオフ値は−０．３に設定した（下の表６）。モデルの予測能力を更に試験し、１０倍及び５倍のＣＶ分析も行った（各回でそれぞれ２０個及び４０個の試料を除外した）。その結果、ＡＵＣはそれぞれ０．９１及び０．８６であった。
【０１９１】
【表６】
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【０１９２】
予測モデルは、肺癌の後期及び初期の予測においても同様に強力であると思われる。ステージ１〜２を初期、ステージ３〜４を後期と定義する場合、２種の群間で感度に差は見られない（ｐ＝１．００）。これによって陽性群の結果を各ステージに分類して可視化することができる（図８）。
【０１９３】
実施例４
他の慢性肺疾患からの肺癌の特定
重要な取り組み課題の１つは、本明細書に記載のｍａｐ試験の実施形態によって、健常対象と肺癌対象との区別だけでなく、癌患者と免疫系活性を高める他の疾患の患者との区別もできることである。この目的に向けて、ＣＯＰＤと診断された対象を正常群と肺癌群の両方にほぼ同じ比率で含めた。正確な予測の割合は、健常群（ｐ＝０．７４）と肺癌群（ｐ＝１．００）の両方において、ＣＯＰＤを有する対象と有しない対象との間で類似していることが観察された（図９）。このような結果から、肺癌を特定するＭＡＰテストの能力は、慢性肺併存疾患の存在に影響を受けないことが示唆される。
【０１９４】
本発明をその特定の実施形態との関連で説明したが、多数の代替、修正および変種が当業者には明らかであろう。したがって、そのような代替、修正および変種の全ては、添付の特許請求の範囲の趣旨および広い範囲内に含まれることを意図するものである。
【０１９５】
実施例５
喫煙亜集団と非喫煙亜集団の比較
喫煙習慣は肺癌の発症に大きな影響を与えるため、この変数に関して予測モデルの完全性を検証することが重要である。喫煙者（元喫煙者又は現喫煙者）及び非喫煙者として分類された対象間で正確な予測の割合を比較した。図１０に示すように、対照群（ｐ＝０．３２）と肺癌群（ｐ＝０．６８）の両方で成功率に有意差はなかった（図１０）。このような結果から、肺癌を特定するＭＡＰテストの能力は、試験対象の喫煙習慣に影響を受けないことが示唆される。
【０１９６】
本明細書で言及した全ての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許および特許出願のそれぞれについて具体的且つ個別の参照により本明細書に組み込む場合と同程度に、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。加えて、本願におけるいかなる参考文献の引用または特定は、このような参考文献が本発明の先行技術として使用できることの容認として解釈されるべきではない。また、各節の表題が使用される範囲において、必ずしも限定として解釈されるべきではない。
【配列表フリーテキスト】
【０１９７】
配列番号１：  合成ペプチド
配列番号２：  合成ペプチド
配列番号３：  合成ペプチド
配列番号４：  合成ペプチド
配列番号５：  合成ペプチド
配列番号６：  合成ペプチド
配列番号７：  合成ペプチド
配列番号８：  合成ペプチド
配列番号９：  合成ペプチド
配列番号１０：  合成ペプチド
配列番号１１：  合成ペプチド
配列番号１２：  合成ペプチド
配列番号１３：  合成ペプチド
配列番号１４：  合成ペプチド
配列番号１５：  合成ペプチド
配列番号１６：  合成ペプチド
配列番号１７：  合成ペプチド
配列番号１８：  合成ペプチド
配列番号１９：  合成ペプチド
配列番号２０：  合成ペプチド
配列番号２１：  合成ペプチド
配列番号２２：  合成ペプチド
配列番号２３：  合成ペプチド
配列番号２４：  合成ペプチド
配列番号２５：  合成ペプチド
配列番号２６：  合成ペプチド
配列番号２７：  合成ペプチド
配列番号２８：  合成ペプチド
配列番号２９：  合成ペプチド
配列番号３０：  合成ペプチド
配列番号３１：  合成ペプチド
配列番号３２：  合成ペプチド
配列番号３３：  合成ペプチド
配列番号３４：  合成ペプチド
配列番号３５：  合成ペプチド
配列番号３６：  合成ペプチド
配列番号３７：  合成ペプチド
配列番号３８：  合成ペプチド；１位は５’パルミトイル基
配列番号３９：  合成ペプチド
配列番号４０：  合成ペプチド
配列番号４１：  合成ペプチド
配列番号４２：  合成ペプチド
配列番号４３：  合成ペプチド
配列番号４４：  合成ペプチド
配列番号４５：  合成ペプチド
配列番号４６：  合成ペプチド
配列番号４７：  合成ペプチド
配列番号４８：  合成ペプチド
配列番号４９：  合成ペプチド
配列番号５０：  合成ペプチド
配列番号５１：  合成ペプチド
【図１】
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【図２】
2020531846.tif 000011
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2020531846.tif 000017
【図９】
2020531846.tif 000018
【図１０】
2020531846.tif 000019
【配列表】
2020531846000001.app
【国際調査報告】
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