(57)【要約】  本発明は、ウイルス発現コンストラクトならびに関係するウイルスベクターおよび核酸分子および組成物、ならびにこれらの使用に関し、ここで前記コンストラクトおよびベクターは、哺乳動物における発現に適しており、肝臓、脂肪組織および／または骨格筋において発現する線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）をコードするヌクレオチド配列を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における発現に適しており、肝臓、脂肪組織および／または骨格筋において発現する線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）をコードするヌクレオチド配列を含む、ウイルス発現コンストラクト。
【請求項２】
哺乳動物における発現に適したＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列、ならびに要素ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）およびｅ）：
（ａ）肝臓特異的プロモーター
（ｂ）脂肪組織特異的プロモーター
（ｃ）ユビキタスプロモーターと、肝臓において発現するマイクロＲＮＡの標的配列をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列と、心臓において発現するマイクロＲＮＡの標的配列をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列との組み合わせであって、脂肪組織における特異的発現を可能にするものである、前記組み合わせ
（ｄ）骨格筋プロモーター、ならびに
（ｅ）ユビキタスプロモーターとアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター配列との組み合わせであって、骨格筋における特異的発現を可能にするものである、前記組み合わせ
のうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載のウイルス発現コンストラクト。
【請求項３】
哺乳動物における発現に適したＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列が：
（ａ）配列番号１、２または３のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を持つアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
（ｂ）配列番号４、５、６、７、８、９、１０または１１のヌクレオチド配列と少なくとも６０％の配列同一性を持つヌクレオチド配列
（ｃ）遺伝暗号の縮重のためにヌクレオチド配列（ｂ）の配列と配列が異なるヌクレオチド配列
よりなる群から選択される、請求項１または２に記載のウイルス発現コンストラクト。
【請求項４】
肝臓において発現するマイクロＲＮＡの標的配列をコードするヌクレオチド配列および心臓において発現するマイクロＲＮＡの標的配列をコードするヌクレオチド配列が配列番号１２から３０の配列および／またはそれらの組み合わせよりなる群から選択される、請求項２または３に記載のウイルス発現コンストラクト。
【請求項５】
肝臓特異的プロモーターがヒトα１−アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーターであり、ならびに／または脂肪組織特異的プロモーターがｍｉｎｉ／ａｐ２プロモーターおよび／もしくはｍｉｎｉ／ＵＣＰ１プロモーターであり、ならびに／または骨格筋プロモーターがＣ５−１２プロモーターであり、ならびに／またはユビキタスプロモーターがサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよび／もしくはＣＡＧプロモーターである、請求項２から４のいずれか一項に記載のウイルス発現コンストラクト。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項に記載のウイルス発現コンストラクトを含むウイルスベクターであって、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターであり、好ましくはアデノ随伴ウイルス１（ＡＡＶ１）ベクター、アデノ随伴ウイルス８（ＡＡＶ８）ベクターおよびアデノ随伴ウイルス９（ＡＡＶ９）ベクターよりなる群から選択されるアデノ随伴ウイルスベクターである、前記ウイルスベクター。
【請求項７】
哺乳動物における発現に適しており、肝臓、脂肪組織および／または骨格筋において発現する、哺乳動物コドンに最適化されたＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列により表される核酸分子。
【請求項８】
ヌクレオチド配列が、配列番号４、５、６、７、８、９、１０または１１のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の配列同一性を持つ、請求項７に記載の核酸分子。
【請求項９】
請求項１から５のいずれか一項に規定されるウイルス発現コンストラクトおよび／または請求項６に規定されるウイルスベクターおよび／または請求項７もしくは８に規定される核酸分子を、１または複数の薬学的に許容される添加剤または媒体と一緒に含む、組成物。
【請求項１０】
薬剤としての使用のための、請求項１から５のいずれか一項に規定されるウイルス発現コンストラクトおよび／または請求項６に規定されるウイルスベクターおよび／または請求項７もしくは８に規定される核酸分子および／または請求項９に規定される組成物。
【請求項１１】
代謝障害の処置および／または予防における使用のための、請求項１から５のいずれか一項に規定されるウイルス発現コンストラクトおよび／または請求項６に規定されるウイルスベクターおよび／または請求項７もしくは８に規定される核酸分子および／または請求項９に規定される組成物。
【請求項１２】
代謝障害が糖尿病および／または肥満である、請求項１１に記載のウイルス発現コンストラクトおよび／またはウイルスベクターおよび／または核酸分子および／または組成物。
【請求項１３】
代謝障害がＮＡＳＨである、請求項１１に記載のウイルス発現コンストラクトおよび／またはウイルスベクターおよび／または核酸分子および／または組成物。
【請求項１４】
肝臓の炎症および／または線維症の処置および／または予防における使用のための、請求項１から５のいずれか一項に規定されるウイルス発現コンストラクトおよび／または請求項６に規定されるウイルスベクターおよび／または請求項７もしくは８に規定される核酸分子および／または請求項９に規定される組成物。
【請求項１５】
健康寿命の延伸における使用のための、請求項１から５のいずれか一項に規定されるウイルス発現コンストラクトおよび／または請求項６に規定されるウイルスベクターおよび／または請求項７もしくは８に規定される核酸分子および／または請求項９に規定される組成物。
【請求項１６】
がん、好ましくは肝臓がんの処置および／または予防における使用のための、請求項１から５のいずれか一項に規定されるウイルス発現コンストラクトおよび／または請求項６に規定されるウイルスベクターおよび／または請求項７もしくは８に規定される核酸分子および／または請求項９に規定される組成物。
【請求項１７】
請求項１から５のいずれか一項に規定されるウイルス発現コンストラクトおよび／または請求項６に規定されるウイルスベクターおよび／または請求項７もしくは８に規定される核酸分子および／または請求項９に規定される組成物の使用を含む、代謝障害を予防、遅延、回復、治癒および／または処置する方法。
【請求項１８】
代謝障害が糖尿病および／または肥満である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
代謝障害がＮＡＳＨである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１から５のいずれか一項に規定されるウイルス発現コンストラクトおよび／または請求項６に規定されるウイルスベクターおよび／または請求項７もしくは８に規定される核酸分子および／または請求項９に規定される組成物の使用を含む、肝臓の炎症および／または線維症を予防、遅延、回復、治癒および／または処置する方法。
【請求項２１】
請求項１から５のいずれか一項に規定されるウイルス発現コンストラクトおよび／または請求項６に規定されるウイルスベクターおよび／または請求項７もしくは８に規定される核酸分子および／または請求項９に規定される組成物の使用を含む、健康寿命を延伸する方法。
【請求項２２】
請求項１から５のいずれか一項に規定されるウイルス発現コンストラクトおよび／または請求項６に規定されるウイルスベクターおよび／または請求項７もしくは８に規定される核酸分子および／または請求項９に規定される組成物の使用を含む、がん、好ましくは肝臓がんを予防、遅延、回復、治癒および／または処置する方法。
【請求項２３】
代謝障害を予防、遅延、回復、治癒および／または処置するための薬剤の製造のための、請求項１から５のいずれか一項に規定されるウイルス発現コンストラクトおよび／または請求項６に規定されるウイルスベクターおよび／または請求項７もしくは８に規定される核酸分子および／または請求項９に規定される組成物の使用。
【請求項２４】
代謝障害が糖尿病および／または肥満である、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
代謝障害がＮＡＳＨである、請求項２３に記載の使用。
【請求項２６】
肝臓の炎症および／または線維症を予防、遅延、回復、治癒および／または処置するための薬剤の製造のための、請求項１から５のいずれか一項に規定されるウイルス発現コンストラクトおよび／または請求項６に規定されるウイルスベクターおよび／または請求項７もしくは８に規定される核酸分子および／または請求項９に規定される組成物の使用。
【請求項２７】
健康寿命を延伸するための薬剤の製造のための、請求項１から５のいずれか一項に規定されるウイルス発現コンストラクトおよび／または請求項６に規定されるウイルスベクターおよび／または請求項７もしくは８に規定される核酸分子および／または請求項９に規定される組成物の使用。
【請求項２８】
がん、好ましくは肝臓がんを予防、遅延、回復、治癒および／または処置するための薬剤の製造のための、請求項１から５のいずれか一項に規定されるウイルス発現コンストラクトおよび／または請求項６に規定されるウイルスベクターおよび／または請求項７もしくは８に規定される核酸分子および／または請求項９に規定される組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物における、とりわけヒトにおける代謝障害の処置において使用するための、肝臓の炎症および／もしくは線維症の処置において使用するための、がんの処置において使用するための、ならびに／または健康寿命の延伸において使用するための遺伝子治療組成物を含む医学分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病の罹患率は驚くべき速度で増加しており、世界的に大きな健康問題である。肥満は、インスリン抵抗性および２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）と強く関連している（Ｍｏｌｌｅｒ，Ｄ．Ｅ．，ａｎｄ  Ｆｌｉｅｒ，Ｊ．Ｓ．，１９９１．  Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．  ３２５：９３８−９４８）。そのうえ、肥満は死亡リスクを増加させ（Ｐｅｅｔｅｒｓ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，２００３．  Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．  １３８：２４−３２）、また心疾患、免疫機能障害、高血圧、関節炎、神経変性疾患およびある種のタイプのがんの顕著なリスク因子でもある（Ｒｏｂｅｒｓｔ，Ｄ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，２０１０．  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．  ６１：３０１−３１６；Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ，Ｂ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，１９９３．  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２６８：６８２３−６８２６；Ｗｈｉｔｍｅｒ，Ｒ．Ａ．，２００７．  Ｃｕｒｒ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  Ｒｅｓ．  ４：１１７−１２２）。Ｔ２Ｄおよび肥満の臨床的重要性にもかかわらず、利用できる有効な処置はない。したがって、Ｔ２Ｄ−肥満の蔓延を予防し、これと戦うための新規かつ安全なアプローチへの切迫したニーズがある。近年、肥満はがんの重要なリスク因子であることが広く受け入れられるようになっている（Ｒｏｂｅｒｓｔ，Ｄ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，２０１０．  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．  ６１：３０１−３１６）。近年の肥満の蔓延を考慮すると、肥満に関係したがんリスクは、新規かつ安全なアプローチが切迫して必要な、臨床的に重要な懸念事項である。体重およびインスリン抵抗性の増大は加齢にも関連している。したがって、肥満および糖尿病を予防して回復させるための新規かつ安全なアプローチは、健康寿命を延伸するために必要である。肝線維症は細胞外マトリックスタンパク質、例としてコラーゲンの過剰蓄積であり、主に慢性的な肝臓の炎症に起因する。進行した肝線維症は、肝硬変、門脈圧亢進症および肝不全に至る。それゆえに、新規かつ安全な抗線維化治療薬が必要とされる。
【０００３】
線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）は、主に肝臓によって分泌されるが脂肪組織および膵臓によっても分泌される増殖因子であり（Ｍｕｉｓｅ，Ｅ．Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，２００８．  Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ７４：４０３−４１２）、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）の成長を増加させ、ならびにＢＡＴおよび白色脂肪組織（ＷＡＴ）においてエネルギー消費を刺激する熱産生遺伝子の発現を増加させることが示されている（Ｃｏｓｋｕｎ，Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，２００８．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４９：６０１８−６０２７；Ｆｉｓｈｅｒ，Ｆ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，２０１２．  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ２６：２７１−２８１；Ｋｈａｒｉｔｏｎｅｎｋｏｖ，Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，２００５．  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  １１５：１６２７−１６３５；Ｋｏｎｉｓｈｉ，Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，２０００．  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７５：１２１１９−１２１２２；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，２００２．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４３：１７４１−１７４７；Ｘｕ，Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，２００９．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５８：２５０−２５９）。
【０００４】
遺伝子導入マウスにおけるＦＧＦ２１の過剰発現はそれらのマウスを食餌誘導性肥満から保護し（Ｋｈａｒｉｔｏｎｅｎｋｏｖ，Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，２００５．  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  １１５：１６２７−１６３５）、ｏｂ／ｏｂマウス、ｄｂ／ｄｂマウスもしくは高脂肪食（ＨＦＤ）給餌マウスへの、または肥満ＺＤＦラットへのＦＧＦ２１の投与は脂肪症の強い低減を促し、血中のグルコースおよびトリグリセリドを有意に低下させ、絶食時インスリン（ｉｎｓｕｌｉｎｇ）レベルを減少させ、インスリン感受性を改善した（Ｃｏｓｋｕｎ，Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，２００８．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４９：６０１８−６０２７；Ｋｈａｒｉｔｏｎｅｎｋｏｖ，Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，２００５．  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  １１５：１６２７−１６３５；Ｘｕ，Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，２００９．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５８：２５０−２５９；Ａｄａｍｓ，Ａ．Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，２０１２．  ＰＬｏＳ．Ｏｎｅ．  ７：ｅ３８４３８．；Ｂｅｒｇｌｕｎｄ，Ｅ．Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，２００９．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １５０：４０８４−４０９３）。そのうえ、肥満の糖尿病アカゲザルへのＦＧＦ２１の投与は、空腹時血漿グルコース、フルクトサミン、トリグリセリド、インスリンおよびグルカゴンのレベルを劇的に低減させ、少ないものの有意である体重低下を誘導した（Ｋｈａｒｉｔｏｎｅｎｋｏｖ，Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，２００７．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４８：７７４−７８１）。
【０００５】
天然のＦＧＦ２１タンパク質は、不十分な薬物動態学的特性を呈する。これは半減期が短く、インビボでタンパク質分解されやすく、インビトロで凝集しやすい（Ｈｕａｎｇ，Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，２０１３．  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ．  ３４６（２）：２７０−８０；Ｓｏ，Ｗ．Ｙ．  ａｎｄ  Ｌｅｕｎｇ，Ｐ．Ｓ．  ２０１６．  Ｍｅｄ  Ｒｅｓ  Ｒｅｖ． ３６（４）：６７２−７０４；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．  ａｎｄ  Ｌｉ，Ｙ．  ２０１５．  Ｆｒｏｎｔ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  （Ｌａｕｓａｎｎｅ）．  ６：１６８）。ＦＧＦ２１の半減期を延ばし、安定性および溶解性を改良するため、様々な工学的アプローチが開発されている。現在、２つの人工的ＦＧＦ２１模倣物（ＬＹ２４０５３１９およびＰＦ−０５２３１０２３）がヒトにおいて試験されている。それでもなお、これらのＦＧＦ２１模倣物は複数回の投与を必要とし、患者に著しい負担を与える。そのうえ、人工的ＦＧＦ２１模倣物／アナログは、天然のＦＧＦ２１よりも免疫原性を呈するリスクがより高いこともあり、例としてＬＹ２４０５３１９で処置された患者は、注射部位反応、抗薬物抗体および重篤な過敏反応を生じた（Ｇａｉｃｈ，Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．，２０１３．  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ．  １８（３）：３３３−４０）。
【０００６】
それゆえ、既存の処置の全ての欠点を持たない、糖尿病、ならびに／または肥満、ならびに／または肝臓の炎症および／もしくは線維症、ならびに／またはがん、ならびに／または健康寿命の延伸のための新たな処置へのニ−ズは依然としてある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｍｏｌｌｅｒ，Ｄ．Ｅ．，ａｎｄ  Ｆｌｉｅｒ，Ｊ．Ｓ．，１９９１．  Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．  ３２５：９３８−９４８
【非特許文献２】Ｐｅｅｔｅｒｓ，Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，２００３．  Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．  １３８：２４−３２
【非特許文献３】Ｒｏｂｅｒｓｔ，Ｄ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，２０１０．  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．  ６１：３０１−３１６
【非特許文献４】Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ，Ｂ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，１９９３．  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２６８：６８２３−６８２６
【非特許文献５】Ｗｈｉｔｍｅｒ，Ｒ．Ａ．，２００７．  Ｃｕｒｒ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  Ｒｅｓ．  ４：１１７−１２２
【非特許文献６】Ｍｕｉｓｅ，Ｅ．Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，２００８．  Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ７４：４０３−４１２
【非特許文献７】Ｃｏｓｋｕｎ，Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，２００８．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４９：６０１８−６０２７
【非特許文献８】Ｆｉｓｈｅｒ，Ｆ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，２０１２．  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ２６：２７１−２８１
【非特許文献９】Ｋｈａｒｉｔｏｎｅｎｋｏｖ，Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，２００５．  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  １１５：１６２７−１６３５
【非特許文献１０】Ｋｏｎｉｓｈｉ，Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，２０００．  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７５：１２１１９−１２１２２
【非特許文献１１】Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，２００２．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４３：１７４１−１７４７
【非特許文献１２】Ｘｕ，Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，２００９．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５８：２５０−２５９
【非特許文献１３】Ａｄａｍｓ，Ａ．Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，２０１２．  ＰＬｏＳ．Ｏｎｅ．  ７：ｅ３８４３８．
【非特許文献１４】Ｂｅｒｇｌｕｎｄ，Ｅ．Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，２００９．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １５０：４０８４−４０９３
【非特許文献１５】Ｋｈａｒｉｔｏｎｅｎｋｏｖ，Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，２００７．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４８：７７４−７８１
【非特許文献１６】Ｈｕａｎｇ，Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，２０１３．  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ．  ３４６（２）：２７０−８０
【非特許文献１７】Ｓｏ，Ｗ．Ｙ．  ａｎｄ  Ｌｅｕｎｇ，Ｐ．Ｓ．  ２０１６．  Ｍｅｄ  Ｒｅｓ  Ｒｅｖ．  ３６（４）：６７２−７０４
【非特許文献１８】Ｚｈａｎｇ，Ｊ．  ａｎｄ  Ｌｉ，Ｙ．  ２０１５．  Ｆｒｏｎｔ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  （Ｌａｕｓａｎｎｅ）．  ６：１６８
【非特許文献１９】Ｇａｉｃｈ，Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．，２０１３．  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ．  １８（３）：３３３−４０
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、代謝障害、好ましくは糖尿病および／または肥満に対抗するため、肝臓、脂肪組織および／または骨格筋へのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター媒介性のＦＧＦ２１遺伝子導入に基づく改良された遺伝子治療戦略をデザインした。本発明の遺伝子治療はまた、肝臓の炎症および／または線維症に対抗するためにも用いられ得る。加えて、本発明の遺伝子治療はまた、加齢に関連した代謝障害、好ましくは糖尿病および／または肥満に対抗することによって、健康寿命の延伸のためにも用いられ得る。加えて、本発明の遺伝子治療はまた、がん、好ましくは肝臓がんに対抗するためにも用いられ得る。
【０００９】
単一のベクター遺伝子コンストラクトの作出は天然ＦＧＦ２１のインビボ産生を可能にし、これは免疫原性または他の毒性のリスク低減をもたらすものである。
【００１０】
しかしながら、当業者は、天然ＦＧＦ２１はインビボでタンパク質分解されやすく、および／またはインビボでのクリアランス速度が速いものであり得ることを、当業者は知っている。実験部において試験された全てのベクターは、血流中への安定な天然ＦＧＦ２１の長期持続性分泌を可能にすることができることが見出された。遺伝子導入ベクターの単回投与であっても、効力は保たれる。
【００１１】
それゆえ、天然ＦＧＦ２１のインビボ産生のためのかかるＡＡＶベクターの作出は、実験部において実証されるように、当業者にとって通例的ではない。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
ウイルス発現コンストラクト
第一の態様において、哺乳動物における発現に適しており、肝臓、脂肪組織および／または骨格筋において発現する線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）をコードするヌクレオチド配列を含むウイルス発現コンストラクトが提供される。
【００１３】
「ウイルス発現コンストラクト」、「哺乳動物における発現に適した」、「肝臓」、「脂肪組織」および「骨格筋」の定義は、「一般的定義」というタイトルの記載部分において提供されている。
【００１４】
本発明のウイルス発現コンストラクト中に存在するＦＧＦ２１をコードする好ましいヌクレオチド配列は、配列番号４、５、６、７、８、９、１０または１１と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性を持つ。同一性は、「一般的定義」というタイトルの記載部分において説明されるように、その配列番号の全体にわたって、またはその部分にわたって査定され得る。
【００１５】
本発明のウイルス発現コンストラクト中に存在する、ヒトＦＧＦ２１をコードするより好ましいヌクレオチド配列は、配列番号４、５、６または７と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性を持つ。同一性は、「一般的定義」というタイトルの記載部分において説明されるように、その配列番号の全体にわたって、またはその部分にわたって査定され得る。配列番号４は、ヒトＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列である。配列番号５は、コドン最適化されたヒトＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列、バリアント１である。配列番号６は、コドン最適化されたヒトＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列、バリアント２である。配列番号７は、コドン最適化されたヒトＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列、バリアント３である。バリアント１、バリアント２およびバリアント３は、同じヒトＦＧＦ２１タンパク質をコードしており、異なるコドン最適化アルゴリズムにより得られた。本発明のウイルス発現コンストラクト中に存在する、マウスＦＧＦ２１をコードする別の好ましいヌクレオチド配列は、配列番号８または９と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性を持つ。同一性は、「一般的定義」というタイトルの記載部分において説明されるように、その配列番号の全体にわたって、またはその部分にわたって査定され得る。配列番号８は、マウスＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列である。配列番号９は、コドン最適化されたマウスＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列である。本発明のウイルス発現コンストラクト中に存在する、イヌＦＧＦ２１をコードする別の好ましいヌクレオチド配列は、配列番号１０または１１と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性を持つ。同一性は、「一般的定義」というタイトルの記載部分において説明されるように、その配列番号の全体にわたって、またはその部分にわたって査定され得る。配列番号１０は、イヌＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列である。配列番号１１は、コドン最適化されたイヌＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列である。ＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列は、任意のＦＧＦ２１遺伝子もしくはＦＧＦ２１コーディング配列、好ましくはヒト、マウスもしくはイヌに由来するものであってもよく；または好ましくはヒト、マウスもしくはイヌに由来する変異ＦＧＦ２１遺伝子もしくはＦＧＦ２１コーディング配列、もしくはコドン最適化されたＦＧＦ２１遺伝子もしくはＦＧＦ２１コーディング配列であってもよい。
【００１６】
本明細書中で用いられるＦＧＦ２１は、当業者に知られているＦＧＦ２１の活性を少なくとも検出可能なレベルで発揮する。ＦＧＦ２１の活性は、インスリン感受性を向上させることである。この活性は、実験部において、好ましくは例８または９において記載されるように、インスリン負荷試験を用いて査定することができる。
【００１７】
ある実施形態において、哺乳動物における発現に適したＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列が：
（ａ）配列番号１、２または３のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を持つアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
（ｂ）配列番号４、５、６、７、８、９、１０または１１のヌクレオチド配列と少なくとも６０％の配列同一性を持つヌクレオチド配列
（ｃ）遺伝暗号の縮重のためにヌクレオチド配列（ｂ）の配列と配列が異なるヌクレオチド配列
よりなる群から選択される、上記のウイルス発現コンストラクトが提供される。
【００１８】
哺乳動物における発現に適したＦＧＦ２１をコードする好ましいヌクレオチド配列は、配列番号１、２または３と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性を持つアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。同一性は、「一般的定義」というタイトルの記載部分において説明されるように、その配列番号の全体にわたって、またはその部分にわたって査定され得る。配列番号１は、ヒトのＦＧＦ２１のアミノ酸配列である。配列番号２は、マウスのＦＧＦ２１のアミノ酸配列である。配列番号３は、イヌのＦＧＦ２１のアミノ酸配列である。
【００１９】
ある実施形態において、哺乳動物における発現に適したＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列ならびに要素ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）およびｅ）：
（ａ）肝臓特異的プロモーター
（ｂ）脂肪組織特異的プロモーター
（ｃ）ユビキタスプロモーターと、肝臓において発現するマイクロＲＮＡの標的配列をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列と、心臓において発現するマイクロＲＮＡの標的配列をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列との組み合わせであって、脂肪組織における特異的発現を可能にするものである、前記組み合わせ
（ｄ）骨格筋プロモーター、ならびに
（ｅ）ユビキタスプロモーターとアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター配列との組み合わせであって、骨格筋における特異的発現を可能にするものである、前記組み合わせ
のうちの少なくとも１つを含む、上記のウイルス発現コンストラクトが提供される。
【００２０】
「肝臓において発現するマイクロＲＮＡの標的配列」または「肝臓において発現するｍｉＲＮＡの標的配列」または「肝臓において発現するマイクロＲＮＡの結合部位」とは、肝臓において発現するマイクロＲＮＡの少なくとも一部に相補的であるまたは部分的に相補的であるヌクレオチド配列をいう。同様に、「心臓において発現するマイクロＲＮＡの標的配列」または「心臓において発現するｍｉＲＮＡの標的配列」または「心臓において発現するマイクロＲＮＡの結合部位」とは、心臓において発現するマイクロＲＮＡの少なくとも一部に相補的であるまたは部分的に相補的であるヌクレオチド配列をいう。本明細書中で規定される肝臓において発現するマイクロＲＮＡの一部または心臓において発現するマイクロＲＮＡの一部とは、前記マイクロＲＮＡの少なくとも５個または少なくとも６個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を意味する。結合部位配列は、発現したマイクロＲＮＡの少なくとも一部との完全な相補性を持つことができ、これは、配列が完全マッチであることができてミスマッチが生じないものであり得ることを意味する。あるいは、結合部位配列は、発現したマイクロＲＮＡの少なくとも一部と部分的に相補的であることができ、これは、１個のミスマッチ／５、６個の連続したヌクレオチドが生じ得ることを意味する。部分的に相補的な結合部位は、好ましくは、マイクロＲＮＡのシード領域と完全なまたは完全に近い相補性を含有し、これは、マイクロＲＮＡのシード領域とその結合部位との間にミスマッチがない（完全な相補性）または１個のミスマッチ／５、６個の連続したヌクレオチド（完全に近い相補性）が生じ得ることを意味する。マイクロＲＮＡのシード領域は、そのマイクロＲＮＡの約ヌクレオチド２から約ヌクレオチド８までであるマイクロＲＮＡの５’領域（すなわち６個のヌクレオチド）からなる。本明細書中で規定される一部は、好ましくは、前記マイクロＲＮＡのシード領域である。肝臓において発現するマイクロＲＮＡまたは心臓において発現するマイクロＲＮＡの標的配列を含有するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の分解は、ＲＮＡ干渉経路を通じたもの、またはｍＲＮＡの直接的な翻訳制御（阻害）を介するものであり得る。本発明は、導入遺伝子またはコードされるタンパク質の発現の阻害においてｍｉＲＮＡにより最終的に利用される経路によって限定されるものではない。
【００２１】
本発明との関連において、肝臓において発現するマイクロＲＮＡの標的配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１２または１４〜２３と少なくとも６０％の配列同一性または類似性を持つヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列により置き換えられ得る。より好ましいヌクレオチド配列は、配列番号１２または１４〜２３と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性を持つ。同一性は、「一般的定義」というタイトルの記載部分において説明されるように、その配列番号の全体にわたって、またはその部分にわたって査定され得る。１つの実施形態において、肝臓において発現するマイクロＲＮＡの標的配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１２と少なくとも６０％の配列同一性または類似性を持つヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列により置き換えられ得る。より好ましいヌクレオチド配列は、配列番号１２と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性を持つ。さらなる実施形態において、肝臓において発現するマイクロＲＮＡの標的配列をコードする、配列番号１２または１４〜２３において規定されるヌクレオチド配列の少なくとも１コピーが、本発明のウイルス発現コンストラクト中に存在する。さらなる実施形態において、肝臓特異的マイクロＲＮＡの標的配列をコードする、配列番号１２または１４〜２３において規定されるヌクレオチド配列の２、３、４、５、６、７または８コピーが、本発明のウイルス発現コンストラクト中に存在する。好ましい実施形態において、ｍｉＲＴ１２２ａ（配列番号１２）をコードするヌクレオチド配列の１、２、３、４、５、６、７または８コピーが、本発明のウイルス発現コンストラクト中に存在する。
【００２２】
本明細書中で用いられる肝臓において発現するマイクロＲＮＡの標的配列は、当業者に知られている肝臓において発現するマイクロＲＮＡの標的配列の活性を少なくとも検出可能なレベルで発揮する。肝臓において発現するマイクロＲＮＡの標的配列の活性は、その同族である肝臓において発現するマイクロＲＮＡに結合することであり、および導入遺伝子に作動的に連結されたときに肝臓における導入遺伝子発現の標的解除を媒介することである。この活性は、実験部において記載されるように、ｑＰＣＲにより肝臓における導入遺伝子の発現レベルを測定することによって査定することができる。
【００２３】
本発明との関連において、心臓において発現するマイクロＲＮＡの標的配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１３または２３〜３０と少なくとも６０％の配列同一性または類似性を持つヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列により置き換えられ得る。好ましいヌクレオチド配列は、配列番号１３または２３〜３０と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性を持つ。同一性は、「一般的定義」というタイトルの記載部分において説明されるように、その配列番号の全体にわたって、またはその部分にわたって査定され得る。１つの実施形態において、心臓において発現するマイクロＲＮＡの標的配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１３と少なくとも６０％の配列同一性または類似性を持つヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列により置き換えられ得る。好ましいヌクレオチド配列は、配列番号１３と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性を持つ。さらなる実施形態において、心臓において発現するマイクロＲＮＡの標的配列をコードする、配列番号１３または２３〜３０において規定されるヌクレオチド配列の少なくとも１コピーが、本発明のウイルス発現コンストラクト中に存在する。さらなる実施形態において、心臓特異的マイクロＲＮＡの標的配列をコードする、配列番号１３または２３〜３０において規定されるヌクレオチド配列の２、３、４、５、６、７または８コピーが、本発明のウイルス発現コンストラクト中に存在する。好ましい実施形態において、ｍｉＲＴ１（配列番号１３）をコードするヌクレオチド配列の１、２、３、４、５、６、７または８コピーが、本発明のウイルス発現コンストラクト中に存在する。
【００２４】
心臓において発現するマイクロＲＮＡの標的配列の活性は、その同族である心臓において発現するマイクロＲＮＡに結合することであり、および導入遺伝子に作動的に連結されたときに心臓における導入遺伝子発現の標的解除を媒介することである。この活性は、実験部において記載されるように、ｑＰＣＲにより心臓における導入遺伝子の発現レベルを測定することによって査定することができる。
【００２５】
ある実施形態において、肝臓において発現するマイクロＲＮＡの標的配列をコードするヌクレオチド配列および心臓において発現するマイクロＲＮＡの標的配列をコードするヌクレオチド配列が配列番号１２から３０の配列および／またはそれらの組み合わせよりなる群から選択される、上記のウイルス発現コンストラクトが提供される。
【００２６】
１つの実施形態において、肝臓において発現するマイクロＲＮＡの標的配列をコードする配列番号１２または１４〜２３において規定されるヌクレオチド配列の少なくとも１コピー、および心臓において発現するマイクロＲＮＡの標的配列をコードする配列番号１３または２３〜３０において規定されるヌクレオチド配列の少なくとも１コピーが、本発明のウイルス発現コンストラクト中に存在する。さらなる実施形態において、肝臓において発現するマイクロＲＮＡの標的配列をコードする配列番号１２または１４〜２３において規定されるヌクレオチド配列の２、３、４、５、６、７または８コピー、および心臓において発現するマイクロＲＮＡの標的配列をコードする配列番号１３または２３〜３０において規定されるヌクレオチド配列の２、３、４、５、６、７または８コピーが、本発明のウイルス発現コンストラクト中に存在する。さらなる実施形態において、ｍｉＲＴ１２２ａ（配列番号１２）をコードするヌクレオチド配列の１、２、３、４、５、６、７または８コピー、およびｍｉＲＴ１（配列番号１３）をコードするヌクレオチド配列の１、２、３、４、５、６、７または８コピーが、本発明のウイルス発現コンストラクト中に組み合わされる。さらなる実施形態において、ｍｉＲＴ１２２ａ（配列番号１２）をコードするヌクレオチド配列の４コピー、およびｍｉＲＴ１（配列番号１３）をコードするヌクレオチド配列の４コピーが、本発明のウイルス発現コンストラクト中に組み合わされる。
【００２７】
定義「プロモーター」、「肝臓特異的プロモーター」、「脂肪組織特異的プロモーター」、「ユビキタスプロモーター」、「骨格筋プロモーター」は、「一般的定義」というタイトルの記載部分において提供されている。
【００２８】
好ましいユビキタスプロモーターは、ＣＡＧプロモーターである。
【００２９】
本発明との関連において、ＣＡＧプロモーターのヌクレオチド配列は、配列番号４４と少なくとも６０％の配列同一性または類似性を持つヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列により置き換えられ得る。好ましいヌクレオチド配列は、配列番号４４と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性を持つ。同一性は、「一般的定義」というタイトルの記載部分において説明されるように、その配列番号の全体にわたって、またはその部分にわたって査定され得る。
【００３０】
別の好ましいユビキタスプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターである。
【００３１】
本発明との関連において、ＣＭＶプロモーターのヌクレオチド配列は、配列番号４５と少なくとも６０％の配列同一性または類似性を持つヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列により置き換えられ得る。好ましいヌクレオチド配列は、配列番号４５と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性を持つ。同一性は、「一般的定義」というタイトルの記載部分において説明されるように、その配列番号の全体にわたって、またはその部分にわたって査定され得る。
【００３２】
好ましくは、前記ＣＭＶプロモーターは、イントロン配列と一緒に用いられる。この関連において、イントロン配列は、配列番号４３と少なくとも６０％の配列同一性または類似性を持つヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列により置き換えられ得る。好ましいヌクレオチド配列は、配列番号４３と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性を持つ。同一性は、「一般的定義」というタイトルの記載部分において説明されるように、その配列番号の全体にわたって、またはその部分にわたって査定され得る。
【００３３】
好ましい肝臓特異的プロモーターは、ヒトα１−アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーターである。
【００３４】
本発明との関連において、ｈＡＡＴプロモーターのヌクレオチド配列は、配列番号４７と少なくとも６０％の配列同一性または類似性を持つヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列により置き換えられ得る。好ましいヌクレオチド配列は、配列番号４７と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性を持つ。同一性は、「一般的定義」というタイトルの記載部分において説明されるように、その配列番号の全体にわたって、またはその部分にわたって査定され得る。
【００３５】
好ましくは、前記ｈＡＡＴプロモーターは、イントロン配列と一緒に用いられる。好ましいイントロン配列は、アポリポタンパク質Ｅからの肝細胞制御領域（ＨＣＲ）エンハンサーである。最も好ましいイントロン配列は、配列番号５３において規定されるアポリポタンパク質ＥからのＨＣＲエンハンサーである。この関連において、イントロン配列は、配列番号５３と少なくとも６０％の配列同一性または類似性を持つヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列により置き換えられ得る。好ましいヌクレオチド配列は、配列番号５３と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性を持つ。同一性は、「一般的定義」というタイトルの記載部分において説明されるように、その配列番号の全体にわたって、またはその部分にわたって査定され得る。ある実施形態において、前記ｈＡＡＴプロモーターは、イントロン配列の１、２、３、４または５コピーと一緒に用いられる。好ましい実施形態において、前記ｈＡＡＴプロモーターは、配列番号５３において規定されるアポリポタンパク質ＥからのＨＣＲエンハンサーの１、２、３、４または５コピーと一緒に用いられる。
【００３６】
他の肝臓特異的プロモーターは、アルブミンプロモーター、主要尿タンパク質プロモーター、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）プロモーター、肝臓富化タンパク質アクティベータープロモーター（ｌｉｖｅｒ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、トランスチレチンプロモーター、チロキシン結合グロブリンプロモーター、アポリポタンパク質Ａ１プロモーター、肝臓脂肪酸結合タンパク質プロモーターおよびフェニルアラニンヒドロキシラーゼプロモーターである。
【００３７】
脂肪組織特異的プロモーターは、脂肪細胞タンパク質２（ａＰ２、脂肪酸結合タンパク質４（ＦＡＢＰ４）としても知られる）プロモーター、ＰＰＡＲｙプロモーター、アディポネクチンプロモーター、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）プロモーター、ヒトアロマターゼチトクロムｐ４５０（ｐ４５０ａｒｏｍ）に由来するプロモーター  ｍｉｎｉ／ａＰ２プロモーター（脂肪特異的なａＰ２エンハンサーおよび基本のａＰ２プロモーターから構成される）、脱共役タンパク質１（ＵＣＰ１）プロモーター、ｍｉｎｉ／ＵＣＰ１プロモーター（脂肪特異的なＵＣＰ１エンハンサーおよび基本のＵＣＰ１プロモーターから構成される）、アディプシンプロモーター、レプチンプロモーターまたはＦｏｘａ−２プロモーターである。好ましい脂肪組織特異的プロモーターは、ｍｉｎｉ／ａＰ２プロモーター（配列番号５４）およびｍｉｎｉ／ＵＣＰ１プロモーター（配列番号５５）である。この関連において、脂肪組織特異的プロモーター配列は、配列番号５３または配列番号５４と少なくとも６０％の配列同一性または類似性を持つヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列により置き換えられ得る。好ましいヌクレオチド配列は、配列番号５３または配列番号５４と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性を持つ。同一性は、「一般的定義」というタイトルの記載部分において説明されるように、その配列番号の全体にわたって、またはその部分にわたって査定され得る。
【００３８】
好ましい骨格筋プロモーターは、ミオシン軽鎖プロモーター、ミオシン重鎖プロモーター、デスミンプロモーター、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、平滑筋アルファ−アクチンプロモーター、ＣＫ６プロモーター、Ｕｎｃ−４５ミオシンシャペロンＢプロモーター、ＭＣＫエンハンサーのコピーと組み合わせた基本のＭＣＫプロモーター、Ｅｎｈ３５８ＭＣＫプロモーター（ＭＣＫエンハンサーとＭＣＫ遺伝子の３５８ｂｐ近位プロモーターとの組み合わせ）である。最も好ましい骨格筋プロモーターは、配列番号５６において規定されるＣ５−１２プロモーターである。この関連において、骨格筋プロモーター配列は、配列番号５６と少なくとも６０％の配列同一性または類似性を持つヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列により置き換えられ得る。好ましいヌクレオチド配列は、配列番号５６と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性を持つ。同一性は、「一般的定義」というタイトルの記載部分において説明されるように、その配列番号の全体にわたって、またはその部分にわたって査定され得る。
【００３９】
本明細書中で用いられるプロモーターは（特にそのプロモーター配列が所与の配列番号と極小の同一性パーセンテージを持つものとして規定されるとき）、当業者に知られているプロモーターの活性を少なくとも発揮するものである。かかる活性の定義については「一般的定義」というタイトルの記載部分を参照されたい。好ましくは、所与の配列番号と極小の同一性パーセンテージを持つものとして規定されるプロモーターは、当業者に知られているアッセイにおいて査定されるように、それに作動可能に連結されるヌクレオチド配列（すなわちＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列）の転写を制御するものである。本発明との関連において、前記プロモーターは、上で規定されるＦＧＦ２１ヌクレオチド配列に作動的に連結している。１つの実施形態において、プロモーターは、細胞特異的および／または組織特異的であり、好ましくは肝臓、脂肪組織および／または骨格筋に特異的である。
【００４０】
それゆえ、いくつかのウイルス発現コンストラクトが本発明によって包含される：
哺乳動物における発現に適したＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列を含み、および要素ａ）を含むウイルス発現コンストラクト、
哺乳動物における発現に適したＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列を含み、および要素ｂ）を含むウイルス発現コンストラクト、
哺乳動物における発現に適したＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列を含み、および要素ｃ）を含むウイルス発現コンストラクト、
哺乳動物における発現に適したＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列を含み、および要素ｄ）を含むウイルス発現コンストラクト、
哺乳動物における発現に適したＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列を含み、および要素ｅ）を含むウイルス発現コンストラクト、
哺乳動物における発現に適したＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列を含み、ならびに要素ｂ）および要素ｃ）のヌクレオチド配列を含むウイルス発現コンストラクト、
哺乳動物における発現に適したＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列を含み、ならびに要素ｅ）および要素ｃ）のヌクレオチド配列を含むウイルス発現コンストラクト。
【００４１】
ある実施形態において、肝臓特異的プロモーターがヒトα１−アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーターであり、ならびに／または脂肪組織特異的プロモーターがｍｉｎｉ／ａｐ２プロモーターおよび／もしくはｍｉｎｉ／ＵＣＰ１プロモーターであり、ならびに／または骨格筋プロモーターがＣ５−１２プロモーターであり、ならびに／またはユビキタスプロモーターがサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよび／もしくはＣＡＧプロモーターである、本明細書中に記載されるウイルス発現コンストラクトが提供される。
【００４２】
ある実施形態において、哺乳動物における発現に適したＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列および要素ａ）を含み、肝臓特異的プロモーターがｈＡＡＴプロモーター（配列番号４７）である、ウイルス発現コンストラクトが包含される。
【００４３】
好ましい実施形態において、哺乳動物における発現に適したＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列および要素ａ）を含み、ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１である、ウイルス発現コンストラクトが包含される。このコンストラクトは、例えば図６Ａ中にＩＴＲ２−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１−ｐｏｌｙＡ−ＩＴＲ２として描写されるウイルス発現コンストラクトを含有し；この発現コンストラクトの配列は配列番号３４中に含まれる。
【００４４】
このコンストラクトについて、実施例３は、驚くべきことに、静脈内投与後の高くかつ安定な肝臓特異的発現を明らかにする。発現は、１年までの間、安定であることが示された（実施例１２）。肥満および糖尿病の回復および処置についての広範囲に及ぶ有益な治療効果が、ｏｂ／ｏｂマウス（実施例３および１１）、高脂肪食（ＨＦＤ）給餌マウス（実施例４、１２〜１４）および老齢のＨＦＤ給餌マウス（実施例５、１２〜１４）において示される。実施例１１および１６はまた、脂肪肝、肝炎および肝線維症の著しい改善を明らかにする。実施例１５は、肥満に関連したＷＡＴの炎症の改善を示す。実施例１７は、治療の長期的安全性を指し示す。実施例１８は、肝臓腫瘍の予防における有益な効果を明らかにする。実施例１９は、Ｉ型糖尿病のモデルにおける治療可能性を示す。
【００４５】
ある実施形態において、哺乳動物における発現に適したＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列および要素ｂ）を含み、脂肪組織特異的プロモーターがｍｉｎｉ／ａＰ２プロモーター（配列番号５４）および／またはｍｉｎｉ／ＵＣＰ１プロモーター（配列番号５５）である、ウイルス発現コンストラクトが包含される。
【００４６】
ある実施形態において、哺乳動物における発現に適したＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列および要素ｃ）を含み、ユビキタスプロモーターがＣＡＧプロモーター（配列番号４４）であり、肝臓において発現するマイクロＲＮＡの標的配列をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列が配列番号１２または１４〜２３よりなる群から選択され、ならびに心臓において発現するマイクロＲＮＡの標的配列をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列が配列番号１３または２３〜３０よりなる群から選択される、ウイルス発現コンストラクトが包含される。
【００４７】
好ましい実施形態において、哺乳動物における発現に適したＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列および要素ｃ）を含み、ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｍｉＲＴまたはＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｍｉＲＴである、ウイルス発現コンストラクトが包含される。表記ｄｍｉＲＴおよびｄｏｕｂｌｅｍｉＲＴは等価である。これらのコンストラクトは、例えば図１Ａ中にＩＴＲ２−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−４ｘ  ｍｉＲＴ１２２ａ−４ｘ  ｍｉＲＴ１−ｐｏｌｙＡ−ＩＴＲ２として描写されるウイルス発現コンストラクトを含有し；この発現コンストラクトの配列は配列番号３２中に含まれる。
【００４８】
これらのコンストラクトについて、実施例１〜２は、驚くべきことに、ｅＷＡＴ内投与後の高くかつ安定な脂肪特異的発現を明らかにする。肥満および糖尿病の予防、回復および処置のための広範囲に及ぶ有益な治療効果が、正常マウス（実施例１）およびｏｂ／ｏｂマウス（実施例２および１０）において示される。実施例１０はまた、脂肪肝の著しい改善を明らかにする。
【００４９】
ある実施形態において、哺乳動物における発現に適したＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列および要素ｄ）を含み、骨格筋プロモーターがＣ５−１２プロモーター（配列番号５６）である、ウイルス発現コンストラクトが包含される。
【００５０】
ある実施形態において、哺乳動物における発現に適したＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列および要素ｅ）を含み、ユビキタスプロモーターがＣＭＶプロモーター（配列番号４５）であり、ならびにＡＡＶ血清型がＡＡＶ１である、ウイルス発現コンストラクトが包含される。
【００５１】
好ましい実施形態において、哺乳動物における発現に適したＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列および要素ｅ）を含み、ＡＡＶ１−ＣＭＶ−ｍｏＦＧＦ２１である、ウイルス発現コンストラクトが包含される。このコンストラクトは、例えば図１１Ａ中にＩＴＲ２−ＣＭＶ−ｍｏＦＧＦ２１−ｐｏｌｙＡ−ＩＴＲ２として描写されるウイルス発現コンストラクトを含有し；この発現コンストラクトの配列は配列番号３６中に含まれる。
【００５２】
このコンストラクトについて、実施例２０は、筋肉内投与後の高くかつ安定な骨格筋特異的発現を明らかにする。肥満および糖尿病の予防、回復および処置のための広範囲に及ぶ有益な治療効果が、ＨＦＤ給餌マウス（実施例６および２１）において示される。実施例２０は、肥満および糖尿病を予防することによる有益な健康寿命延伸効果を明らかにする。
【００５３】
ある実施形態において、哺乳動物における発現に適したＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列ならびに要素ｂ）および要素ｃ）のヌクレオチド配列を含み、脂肪組織特異的プロモーターがｍｉｎｉ／ａＰ２プロモーター（配列番号５４）および／またはｍｉｎｉ／ＵＣＰ１プロモーター（配列番号５５）である、ウイルス発現コンストラクトが包含される。
【００５４】
ある実施形態において、哺乳動物における発現に適したＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列ならびに要素ｅ）および要素ｃ）のヌクレオチド配列を含み、ユビキタスプロモーターがＣＭＶプロモーター（配列番号４５）であり、ならびにＡＡＶ血清型がＡＡＶ１である、ウイルス発現コンストラクトが包含される。
【００５５】
本発明の全てのコンストラクトは、従来技術のもの、例えばＺｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ  １５（２０１７）  １７３−１８３において開示されるもの、特に肝臓特異的プロモーター、好ましくはｈＡＡＴである要素ａ）、ならびに／またはユビキタスプロモーターと肝臓において発現するマイクロＲＮＡの標的配列をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列、好ましくはｍｉＲＴ１２２ａと心臓において発現するマイクロＲＮＡの標的配列をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列、好ましくはｍｉＲＴ１との組み合わせであって、脂肪組織における特異的発現を可能にする組み合わせである要素ｃ）、ならびに／またはユビキタスプロモーター、好ましくはＣＭＶとアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター配列、好ましくはＡＡＶ１との組み合わせであって、骨格筋における特異的発現を可能にする組み合わせである要素ｅ）を含むものなどよりも、魅力的である。Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．は、伸長因子１ａ（ＥＦ１ａ）プロモーターの制御下にある野生型マウスＦＧＦ２１コーディング配列（ＥＦ１ａ−ｍＦＧＦ２１）を開示している（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ  １５（２０１７）  １７３−１８３）。このコンストラクトは、実施例２３および２４において本発明のコンストラクトと比較された。全てのインビトロおよびインビボでの実験において、本発明の全ての発現カセットおよびＡＡＶベクターは、標的の組織または細胞型におけるＦＧＦ２１のより多い発現およびオフターゲットの組織におけるＦＧＦ２１のより少ない発現を媒介しており、このことは本発明の発現カセットおよびＡＡＶベクターのより高い効率、同様により高い組織特異性を実証するものである。加えて、コンストラクトＣＭＶ−ｍｏＦＧＦ２１およびＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｏｕｂｌｅ  ｍｉＲＴはまた、ＥＦ１ａ−ｍＦＧＦ２１と比べて、ＨＥＫ２９３細胞においてより多いタンパク質産生および培養培地への分泌を媒介した。そのうえ、ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１およびＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１はまた、ＥＦ１ａ−ｍＦＧＦ２１およびＡＡＶ８−ＥＦ１ａ−ｍＦＧＦ２１よりも多くのＦＧＦ２１の血流への分泌を媒介した。
【００５６】
「一般的定義」というタイトルの記載部分において詳細に説明されるように、付加的な配列が本発明のウイルス発現コンストラクト中に存在し得る。好ましい付加的配列としては、逆位末端配列（ＩＴＲ）、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（配列番号５０）、ウサギβ−グロビンポリアデニル化シグナル（配列番号５１）、ＣＭＶエンハンサー配列（配列番号４６）およびアポリポタンパク質ＥからのＨＣＲエンハンサー（配列番号５３）が挙げられる。本発明との関連内で、「ＩＴＲ」は、１つの５‘ＩＴＲおよび１つの３’ＩＴＲを包含することが意図され、各々ＡＡＶのゲノムに由来する。好ましいＩＴＲは、ＡＡＶ２からのものであり、配列番号４８（５‘ＩＴＲ）および配列番号４９（３’ＩＴＲ）により表される。本発明との関連内で、ＣＭＶエンハンサー配列（配列番号４６）およびＣＭＶプロモーター配列（配列番号４５）を２つの別々の配列としてまたは単一の配列（配列番号５２）として用いることが包含される。
【００５７】
これらの付加的配列の各々は、本発明のウイルス発現コンストラクト中に存在し得る（例えば図１、２、３、４、５、６、７、８および９中に描写されるように、また図１１、３１および３２中に描写されるように）。
【００５８】
ある実施形態において、先に規定される、哺乳動物における発現に適したＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列ならびに要素ａ）および／またはｂ）および／またはｃ）および／またはｄ）および／またはｅ）のうちの少なくとも１つを含むウイルス発現コンストラクトは：
−  前記コンストラクトの発現カセットに隣接するＩＴＲ、
−  ＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列の３‘に位置するＳＶ４０もしくはウサギβ−グロビンポリアデニル化シグナル、および／または
−  ＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列の５’に位置するＣＭＶエンハンサー配列もしくはＨＣＲエンハンサー配列
をさらに含む。
【００５９】
好ましい実施形態において、先に規定される、哺乳動物における発現に適したＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列ならびに要素ａ）および／またはｂ）および／またはｃ）および／またはｄ）および／またはｅ）のうちの少なくとも１つを含むウイルス発現コンストラクトは、前記コンストラクトの発現カセットに隣接するＩＴＲをさらに含み、ならびに：
−  ＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列の３‘に位置するＳＶ４０もしくはウサギβ−グロビンポリアデニル化シグナル、および／または
−  ＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列の５’に位置するＣＭＶエンハンサー配列もしくはＨＣＲエンハンサー配列
をさらに含んでもよい。
【００６０】
これらの配列は、実験部で、本明細書中で特定されるいくつかのコンストラクトにおいて用いられた。
【００６１】
それゆえ、１つの実施形態において、上で規定されるこれらの好ましいウイルス発現コンストラクトの各々について、ＩＴＲ、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ウサギβ−グロビンポリアデニル化シグナル、ＣＭＶエンハンサー配列、アポリポタンパク質ＥからのＨＣＲエンハンサー配列よりなる群から選択される付加的配列が存在し得る。
【００６２】
好ましい実施形態において、ウイルス発現コンストラクトは、哺乳動物における発現に適したＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列ならびに要素ａ）および／またはｂ）および／またはｃ）および／またはｄ）および／またはｅ）のうちの少なくとも１つを含み、ここでＩＴＲ、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ウサギβ−グロビンポリアデニル化シグナル、ＣＭＶエンハンサー配列、ＨＣＲエンハンサー配列よりなる群から選択される付加的配列が存在する。好ましいＩＴＲは、配列番号４８（５’ＩＴＲ）および配列番号４９（３’ＩＴＲ）により表されるＡＡＶ２のものである。
【００６３】
好ましいウイルス発現コンストラクトは、要素ａ）および／またはｂ）および／またはｃ）および／またはｄ）および／またはｅ）を含み、発現カセットが５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲに隣接するようになっている。
【００６４】
他の好ましいウイルス発現コンストラクトは、要素ａ）および／またはｂ）および／またはｃ）および／またはｄ）および／またはｅ）を含み、発現カセットが５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲに隣接するようになっている。加えて、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルが存在する。
【００６５】
他の好ましいウイルス発現コンストラクトは、要素ａ）および／またはｂ）および／またはｃ）および／またはｄ）および／またはｅ）を含み、発現カセットが５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲに隣接するようになっている。加えて、ウサギβ−グロビンポリアデニル化シグナルが存在する。
【００６６】
他の好ましいウイルス発現コンストラクトは、要素ａ）および／またはｂ）および／またはｃ）および／またはｄ）および／またはｅ）を含み、発現カセットが５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲに隣接するようになっている。加えて、ＣＭＶエンハンサー配列が存在する。
【００６７】
他の好ましいウイルス発現コンストラクトは、要素ａ）および／またはｂ）および／またはｃ）および／またはｄ）および／またはｅ）を含み、発現カセットが５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲに隣接するようになっている。加えて、アポリポタンパク質ＥからのＨＣＲエンハンサー配列が存在する。
【００６８】
最も好ましいデザインされたウイルス発現コンストラクトとしては：
コンストラクトＢ（配列番号３２を含むヌクレオチド配列により表される）、
コンストラクトＤ（配列番号３４を含むヌクレオチド配列により表される）、
コンストラクトＦ（配列番号３６を含むヌクレオチド配列により表される）、
コンストラクトＧ（配列番号３７を含むヌクレオチド配列により表される）、
コンストラクトＨ（配列番号３８を含むヌクレオチド配列により表される）、
コンストラクトＩ（配列番号３９を含むヌクレオチド配列により表される）、
コンストラクトＪ（配列番号４０を含むヌクレオチド配列により表される）、
コンストラクトＫ（配列番号４１を含むヌクレオチド配列により表される）、
コンストラクトＬ（配列番号４を含むヌクレオチド配列により表される２）
が挙げられる。
【００６９】
当業者が理解するように、これらのウイルス発現コンストラクトの各々は、ＡＡＶ２からの２個のＩＴＲ（すなわち配列番号４８（５’ＩＴＲ）および配列番号４９（３’ＩＴＲ））を既に含んでいる。
【００７０】
コンストラクトＢおよびＧは、ウサギβ−グロビンポリアデニル化シグナルを含む。コンストラクトＦは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＣＭＶエンハンサー配列およびキメライントロンのヌクレオチド配列（ヒトβ−グロビンおよび免疫グロブリン重鎖遺伝子からのイントロンから構成される）を含む。コンストラクトＤ、Ｈ〜Ｌは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＨＣＲエンハンサー配列およびキメライントロンのヌクレオチド配列（ヒトβ−グロビンおよび免疫グロブリン重鎖遺伝子からのイントロンから構成される）を含む。
【００７１】
「一般的定義」というタイトルの一般部において説明されるように、本出願の全体を通して、本明細書中でデザインされる好ましいコンストラクトを表す具体的なヌクレオチド配列の配列番号（例として配列番号Ａ、ＢまたはＣを取り上げる）に言及するたび、これは：
ｉ．  配列番号Ａ、ＢまたはＣと少なくとも６０％の配列同一性または類似性を持つヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列；
ｉｉ．  遺伝暗号の縮重のために（ｉ）の核酸分子の配列と配列が異なるヌクレオチド配列
により置き換えられ得る。
【００７２】
それぞれ所与のヌクレオチド配列とのその同一性パーセンテージ（少なくとも６０％）によって本明細書中に記載される各々のヌクレオチド配列は、さらに好ましい実施形態において、それぞれ所与のヌクレオチドと少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％またはそれより高い同一性を持つ。好ましい実施形態において、配列同一性は、本明細書中で特定される配列の全長を比較することにより決定される。本明細書中で特に指示がない限り、所与の配列番号との同一性は、完全長の（すなわちその全長にわたっての、または全体としての）前記配列に基づく同一性または類似性を意味する。
【００７３】
上で特定される所与の配列番号に対するその最小の同一性（すなわち少なくとも６０％）により規定されるコンストラクトは、このコンストラクトまたはウイルス発現コンストラクトまたはこのコンストラクトを含むウイルスベクターまたはこのコンストラクトもしくはベクターを含む組成物が細胞の中で、好ましくは肝細胞、脂肪組織の細胞または骨格筋の細胞の中でＦＧＦ２１の発現を誘導することができるとき、本発明の範囲内に包含される。ＦＧＦ２１の発現は、当業者に知られている技術を用いて査定することができる。好ましい実施形態において、前記発現は、実験部において実施されるように査定される。
【００７４】
好ましい実施形態において、ウイルス発現コンストラクトは、配列番号４、５、６、７、８、９、１０もしくは１１を含むヌクレオチド配列または配列番号４、５、６、７、８、９、１０もしくは１１と少なくとも６０％の同一性を持つ配列または配列番号４、５、６、７、８、９、１０もしくは１１と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性を持つ配列により表されるものである。
【００７５】
ウイルスベクター
さらなる態様において、上で規定されるウイルス発現コンストラクトを含むウイルスベクターが提供され、ここで前記ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターであり、好ましくはアデノ随伴ウイルス１（ＡＡＶ１）ベクター、アデノ随伴ウイルス８（ＡＡＶ８）ベクターおよびアデノ随伴ウイルス９（ＡＡＶ９）ベクターよりなる群から選択されるアデノ随伴ウイルスベクターである。
【００７６】
「ウイルスベクター」および「アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶベクター）」は、「一般的定義」というタイトルの記載部分においてさらに規定される。
【００７７】
ある実施形態において、本明細書中で先に規定される各要素およびＩＴＲまたはその部分を含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）に基づくゲノムを含むＡＡＶベクターが用いられる。好ましいＩＴＲは、配列番号４８（５’ＩＴＲ）および配列番号４９（３’ＩＴＲ）により表されるＡＡＶ２のものである。
【００７８】
好ましくは、前記ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１ベクター、ＡＡＶ８ベクターまたはＡＡＶ９ベクターである。
【００７９】
本発明のウイルス発現コンストラクトおよびウイルスベクターは、好ましくは、薬剤としての使用のためのものである。薬剤は、好ましくは、代謝障害、好ましくは糖尿病および／または肥満を予防、遅延、治癒、回復および／または処置するためのものである。糖尿病は、１型糖尿病、２型糖尿病または一遺伝子性糖尿病であり得る。別の好ましい実施形態において、薬剤は、肝臓の炎症および／または線維症を予防、遅延、治癒、回復および／または処置するためのものである。なお別の好ましい実施形態において、薬剤は、好ましくは、加齢に関連した代謝障害、好ましくは糖尿病および／または肥満を予防、遅延、治癒、回復および／または処置することによって健康寿命を延伸するためのものである。なお別の好ましい実施形態において、薬剤は、がん、好ましくは肝臓がんを予防、遅延、治癒、回復および／または処置するためのものである。
【００８０】
処置される対象は、高等哺乳動物、例としてネコ、齧歯類（好ましくはマウス、ラット、スナネズミおよびモルモット、より好ましくはマウスおよびラット）、またはイヌ、またはヒトであり得る。
【００８１】
核酸分子
さらなる態様において、哺乳動物における発現に適しており、肝臓、脂肪組織および／または骨格筋において発現する、哺乳動物コドンに最適化されたＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列により表される核酸分子が提供される。
【００８２】
「コドン最適化」の定義は、「一般的定義」というタイトルの記載部分において提供されている。
【００８３】
ある実施形態において、ヌクレオチド配列が配列番号４、５、６、７、８、９、１０または１１のヌクレオチド配列と少なくとも６０％の配列同一性を持つ、上記の核酸分子が包含される。好ましいヌクレオチド配列は、配列番号４、５、６、７、８、９、１０または１１と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性を持つ。
【００８４】
組成物
さらなる態様において、上で規定されるウイルス発現コンストラクトおよび／または上で規定されるウイルスベクターおよび／または上で規定される核酸分子を１または複数の薬学的に許容される添加剤または媒体と一緒に含む組成物が提供される。
【００８５】
この組成物は、好ましくは、遺伝子治療組成物と呼ばれる。好ましくは、組成物は、薬学的に許容される担体、アジュバント、希釈剤、可溶化剤、賦形剤、保存剤および／または添加剤を含む医薬組成物である。
【００８６】
かかる薬学的に許容される担体、賦形剤、保存剤、可溶化剤、希釈剤および／または添加剤は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，２０００中に見いだされ得る。
【００８７】
好ましい実施形態において、前記組成物は、好ましくは、代謝障害、好ましくは糖尿病および／または肥満を予防、遅延、治癒、回復および／または処置するためのものである。糖尿病は、１型糖尿病、２型糖尿病または一遺伝子性糖尿病であり得る。別の好ましい実施形態において、薬剤は、肝臓の炎症および／または線維症を予防、遅延、治癒、回復および／または処置するためのものである。なお別の好ましい実施形態において、薬剤は、好ましくは、加齢に関連した代謝障害、好ましくは糖尿病および／または肥満を予防、遅延、治癒、回復および／または処置することによって健康寿命を延伸するためのものである。なお別の好ましい実施形態において、薬剤は、がん、好ましくは肝臓がんを予防、遅延、治癒、回復および／または処置するためのものである。処置される対象は、高等哺乳動物、例としてネコ、齧歯類（好ましくはマウス、ラット、スナネズミおよびモルモット、より好ましくはマウスおよびラット）、またはイヌ、またはヒトであり得る。
【００８８】
前記ウイルス発現コンストラクト、ウイルスベクターおよび／または核酸分子および／または組成物が抗糖尿病効果および／または抗肥満効果を呈することができるとき、前記ウイルス発現コンストラクト、ウイルスベクターおよび／または核酸分子および／または組成物は、好ましくは、代謝障害、好ましくは糖尿病および／または肥満を予防、遅延、治癒、回復および／または処置するために用いることができると言われる。
【００８９】
前記ウイルス発現コンストラクト、ウイルスベクターおよび／または核酸分子および／または組成物が抗線維効果を呈することができるとき、前記ウイルス発現コンストラクト、ウイルスベクターおよび／または核酸分子および／または組成物は、好ましくは、肝臓の炎症および／または線維症を予防、遅延、治癒、回復および／または処置するために用いることができると言われる。
【００９０】
前記ウイルス発現コンストラクト、ウイルスベクターおよび／または核酸分子および／または組成物が加齢の際に抗糖尿病効果および／または抗肥満効果を呈することができるとき、前記ウイルス発現コンストラクト、ウイルスベクターおよび／または核酸分子および／または組成物は、好ましくは、加齢に関連した代謝障害、好ましくは糖尿病および／または肥満を予防、遅延、治癒、回復および／または処置することによって健康寿命の延伸のために用いることができると言われる。
【００９１】
前記ウイルス発現コンストラクト、ウイルスベクターおよび／または核酸分子および／または組成物が抗がん効果を呈することができるとき、前記ウイルス発現コンストラクト、ウイルスベクターおよび／または核酸分子および／または組成物は、好ましくは、がん、好ましくは肝臓がんを予防、遅延、治癒、回復および／または処置するために用いることができると言われる。
【００９２】
抗糖尿病効果は、血中グルコースの処理が向上したとき、および／または耐糖能が改善されたとき、および／またはインスリン感受性が向上したときに達せられ得る。これは、当業者に知られている技術を用いて、または実験部において行われるように、好ましくは例８もしくは９において査定されるように、査定することができる。この関連において、向上（それぞれ「改善」）とは、当業者に知られているアッセイを用いた、または実験部において行われるアッセイ、例えば血糖、血中インスリンの測定ならびに／もしくはインスリン負荷試験および／もしくはグルコース負荷試験の実施などを用いた、少なくとも検出可能な向上（それぞれ検出可能な改善）を意味する。向上は、アッセイ、例えば血糖、血中インスリンの測定ならびに／またはインスリン負荷試験および／もしくはグルコース負荷試験の実施などを用いた、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも１００％の向上であり得る。
【００９３】
抗肥満効果は、体重、体重増加および／または体脂肪パーセンテージが減少したときに達せられ得る。抗肥満効果はまた、肥満度指数（ＢＭＩ）、ウエスト周囲、ウエストヒップ比（ＷＨＲ）および／またはウエスト身長比（ＷＨｔＲ）が減少したときに達せられ得る。これは、当業者に知られている技術を用いて、または実験部において行われるように査定することができる。この関連において、「減少」（それぞれ「改善」）とは、当業者に知られているアッセイを用いた、または実験部において行われるアッセイを用いた、少なくとも検出可能な減少（それぞれ検出可能な改善）を意味する。抗肥満効果は、個体の体重、ＢＭＩおよび／または組織重量の測定により評価される、肥満の予防と肥満の回復の両方を包含する。
【００９４】
肝臓における抗炎症効果は、マクロファージ浸潤の減少、炎症促進性サイトカインの減少により達せられ得る。これは、当業者に知られている技術を用いて、または実験部において行われるように査定することができる。この関連において、「減少」（それぞれ「改善」）とは、当業者に知られているアッセイを用いた、または実験部において行われるアッセイを用いた、少なくとも検出可能な減少（それぞれ検出可能な改善）を意味する。
【００９５】
肝臓における抗線維効果は、細胞外マトリックスタンパク質蓄積の減少、血液マーカー（例として血漿中のＩＩＩ型コラーゲンＮ末端プロペプチド、ヒアルロン酸、メタロプロテイナーゼ  タイプ１（ＴＩＭＰ−１）の組織阻害剤、ＹＫＬ−４０、血清グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（ＳＧＯＴ）、血清グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＳＧＰＴ）のレベル）の減少により達せられ得る。抗線維効果はまた、線維症評点系、例えばＭｅｔａｖｉｒまたはＩｓｈａｋなどの改善により達せられ得る。これは、当業者に知られている技術を用いて、または実験部において行われるように査定することができる。この関連において、「減少」（それぞれ「改善」）とは、当業者に知られているアッセイを用いた、または実験部において行われるアッセイを用いた、少なくとも検出可能な減少（それぞれ検出可能な改善）を意味する。
【００９６】
健康寿命延伸効果は、本明細書中で先に規定される抗糖尿病および／または抗肥満効果が加齢に関連した代謝障害、好ましくは糖尿病および／または肥満の発症または進行を予防、遅延、治癒、回復または処置するために用いられたときに達せられ得る。健康寿命延伸効果はまた健康寿命の増大により達せられ得て、ここでは代謝障害、好ましくは糖尿病および／または肥満に関連した症候がないまたは低減される。健康寿命延伸効果はまた、協調性およびバランス（ロータロッド試験により査定される）、記憶（物体認識試験により査定される）ならびに／または神経筋共応性（タイトロープ試験により査定される）の改善、ミトコンドリアおよび代謝の悪化の減少（代謝およびミトコンドリア機能に関与する遺伝子、例えばＰＧＣ−１アルファ、ＡＴＰシンターゼおよびＥＲＲアルファなどの発現レベルの測定により査定される）により達せられ得る。これは、当業者に知られている技術を用いて、または実験部において行われるように査定することができる。この関連において、「増大」（それぞれ「改善」）とは、当業者に知られているアッセイを用いた、または実験部において行われるアッセイを用いた、少なくとも検出可能な増大（それぞれ検出可能な改善）を意味する。
【００９７】
抗がん効果は、生涯にわたったがんの累積的発生の減少により達せられ得る。これは、当業者に知られている技術を用いて、または実験部において行われるように査定することができる。この関連において、「減少」（それぞれ「改善」）とは、当業者に知られているアッセイを用いた、または実験部において行われるアッセイを用いた、少なくとも検出可能な減少（それぞれ検出可能な改善）を意味する。
【００９８】
抗糖尿病効果および／または抗肥満効果はまた、医師により査定される典型的な症候（例として膵島炎、ベータ細胞の減少、体重の増加）の進行が減速したときにも認められ得る。典型的症候の減少は、症候発生の進行の減速または症候の完全消失を意味し得る。症候およびそれゆえにまた症候の減少は、種々の方法を用いて査定することができ、この方法は大部分は糖尿病および／または肥満の診断において用いられるものと同じ方法であって、臨床検査（ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ）および通例の臨床検査（ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｔｅｓｔ）を包含する。かかる方法としては、肉眼レベルの方法と顕微鏡レベルの方法の両方、同様に分子レベルの方法、Ｘ線、生化学、免疫組織化学および他のものが挙げられる。
【００９９】
肝臓における抗炎症効果はまた、医師により査定される典型的な症候（例として疲労、感冒様の症候、暗色尿、白色便、腹痛、食欲減退、不明な体重減少、黄疸）の進行が減速したときにも認められ得る。典型的症候の減少は、症候発生の進行の減速または症候の完全消失を意味し得る。症候およびそれゆえにまた症候の減少は、種々の方法を用いて査定することができ、この方法は大部分は肝線維症の診断において用いられるものと同じ方法であって、臨床検査（ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ）および通例の臨床検査（ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｔｅｓｔ）を包含する。かかる方法としては、肉眼レベルの方法と顕微鏡レベルの方法の両方、同様に分子レベルの方法、イメージング方法（弾性撮像、Ｘ線、ＭＲＩ、ＣＴ、超音波検査、血管造影）、生化学、免疫組織化学および他のものが挙げられる。
【０１００】
肝臓における抗線維効果はまた、医師により査定される典型的な症候（例として肝臓の硬さ、黄疸、食欲減退、はっきりとした思考が困難であること、肢または胃の液体貯留、吐き気、不明な体重減少、衰弱）の進行が減速したときにも認められ得る。典型的症候の減少は、症候発生の進行の減速または症候の完全消失を意味し得る。症候およびそれゆえにまた症候の減少は、種々の方法を用いて査定することができ、この方法は大部分は肝線維症の診断において用いられるものと同じ方法であって、臨床検査（ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ）および通例の臨床検査（ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｔｅｓｔ）を包含する。かかる方法としては、肉眼レベルの方法と顕微鏡レベルの方法の両方、同様に分子レベルの方法、イメージング方法（弾性撮像、Ｘ線、ＭＲＩ、ＣＴ、超音波検査、血管造影）、生化学、免疫組織化学および他のものが挙げられる。
【０１０１】
健康寿命延伸効果はまた、医師により査定される加齢に関連した代謝障害の典型的な症候（例としてインスリン抵抗性、耐糖能障害、体重増加）の進行が減速したときにも認められ得る。典型的症候の減少は、症候発生の進行の減速または症候の完全消失を意味し得る。症候およびそれゆえにまた症候の減少は、種々の方法を用いて査定することができ、この方法は大部分は糖尿病および／または肥満の診断において用いられるものと同じ方法であって、臨床検査（ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ）および通例の臨床検査（ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｔｅｓｔ）を包含する。かかる方法としては、肉眼レベルの方法と顕微鏡レベルの方法の両方、同様に分子レベルの方法、Ｘ線、生化学、免疫組織化学および他のものが挙げられる。
【０１０２】
抗がん効果はまた、医師により査定される典型的な症候（例として腫瘍サイズ、不明な体重減少、食欲減退、少量の食事後に大いに満腹感を感じること、吐き気または嘔吐、肝臓肥大、脾臓肥大、腹部または右肩甲骨近傍の痛み、腹部の腫脹または液体貯留、掻痒、黄疸）の進行が減速したときにも認められ得る。典型的症候の減少は、症候発生の進行の減速または症候の完全消失を意味し得る。症候およびそれゆえにまた症候の減少は、種々の方法を用いて査定することができ、この方法は大部分はがんの診断において用いられるものと同じ方法であって、臨床検査（ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ）および通例の臨床検査（ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｔｅｓｔ）を包含する。かかる方法としては、肉眼レベルの方法と顕微鏡レベルの方法の両方、同様に分子レベルの方法、イメージング方法（Ｘ線、ＭＲＩ、ＣＴ、超音波検査、血管造影）、生化学、免疫組織化学および他のものが挙げられる。
【０１０３】
本発明のウイルス発現コンストラクトおよび／またはウイルスベクターおよび／または核酸分子および／または組成物を用いた、少なくとも１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年またはそれより長い処置の後に上で規定される前記症候または特性が減少した（例としてもはや検出可能でない、または減速させた）ならば、本明細書中で規定される薬剤（ウイルス発現コンストラクト、ウイルスベクター、核酸分子、組成物）は、好ましくは、患者または前記患者の細胞、組織もしくは器官の１つの症候または１つの特性を緩和することができる。
【０１０４】
本発明によって使用するための本明細書中で規定されるウイルス発現コンストラクトおよび／またはウイルスベクターおよび／または核酸分子および／または組成物は、代謝障害、例えば糖尿病ならびに／または肥満、肝臓の炎症および／もしくは線維症、加齢に関連した代謝障害、ならびに／またはがんなどに罹患しているまたはこれらを発症するリスクがある個体の細胞、組織および／または器官へのインビボでの投与に適したものであり得て、インビボ、エクスビボまたはインビトロで投与され得る。前記ウイルス発現コンストラクトおよび／またはウイルスベクターおよび／または核酸分子および／または組成物は、代謝障害、例えば糖尿病ならびに／または肥満、肝臓の炎症および／もしくは線維症、加齢に関連した代謝障害、ならびに／またはがんなどに罹患しているまたはこれらを発症するリスクがある個体の細胞、組織および／または器官にインビボで直接的または間接的に投与され得て、インビボ、エクスビボまたはインビトロで直接的または間接的に投与され得る。投与様式は、静脈内、皮下、筋肉内、髄腔内、関節内、脳室内、腹腔内、脂肪組織内、吸入を介した、経口、鼻腔内、肝臓内、内臓内、眼内、耳内、局所（ｔｏｐｉｃ）の投与および／または逆行性管内膵臓投与（ｒｅｔｒｏｇｒａｄｅ  ｉｎｔｒａｄｕｃｔａｌ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）を介したものであり得る。好ましい投与様式は、本出願の一部としての「実施例についての一般的手法」の中に記載されるように、筋肉内、静脈内または脂肪組織内である。
【０１０５】
本発明のウイルス発現コンストラクトおよび／またはウイルスベクターおよび／または核酸分子および／または組成物は、当該技術分野で知られている好適な手段を用いることにより直接的または間接的に投与され得る。既に今までに達成されている進歩を考慮すると、個体または前記個体の細胞、組織、器官に本発明のウイルス発現コンストラクトおよび／またはウイルスベクターおよび／または核酸分子および／または組成物を供給するための手段の改良が予想される。かかる将来の改良は、もちろん、言及された本発明の効果を達成するために取り込まれ得る。ウイルス発現コンストラクトおよび／またはウイルスベクターおよび／または核酸分子および／または組成物は、そのまま個体、前記個体の細胞、組織または器官に送達することができる。疾患または症状に応じて、前記個体の細胞、組織または器官は、本明細書中で先に規定されたものであり得る。本発明のウイルス発現コンストラクトおよび／またはウイルスベクターおよび／または核酸分子および／または組成物が投与されるとき、かかるウイルス発現コンストラクトおよび／またはベクターおよび／または核酸および／または組成物は、送達方法に適合した溶液中に溶解することが好ましい。
【０１０６】
本明細書中に包含されるように、治療的有効用量の上述のウイルス発現コンストラクト、ベクター、核酸分子および／または組成物は、好ましくは単回および固有の用量で、したがって反復の定期的投与を避けて投与される。より好ましくは、単回用量が骨格筋に、脂肪組織にまたは静脈内に投与される。
【０１０７】
さらなる化合物が本発明の組成物中に存在し得る。前記化合物は、組成物の送達を助け得る。以下に好適な化合物のリストが提供される：本明細書中で規定される各構成成分を小胞またはリポソームの中に複合化またはトラップして細胞膜を通して送達する複合体、ナノ粒子、ミセルおよび／またはリポソームを形成する能力がある化合物。これらの化合物の多くは当該技術分野で知られている。好適な化合物は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、またはポリプロピレンイミンまたはポリエチレンイミンコポリマー（ＰＥＣ）および誘導体を包含する類似のカチオン性ポリマー、合成両親媒性物質（ＳＡＩＮＴ−１８）、リポフェクチン（商標）、ＤＯＴＡＰを含む。
【０１０８】
それらの同一性に応じて、当業者は、どの製剤タイプが本明細書中で規定される組成物に最も適しているかを理解する。
【０１０９】
方法／使用
さらなる態様において、薬剤としての使用のための、上で規定されるウイルス発現コンストラクトおよび／または上で規定されるウイルスベクターおよび／または上で規定される核酸分子および／または上で規定される組成物が提供される。
【０１１０】
ある実施形態において、前記ウイルス発現コンストラクトおよび／またはウイルスベクターおよび／または核酸分子および／または組成物は、代謝障害、好ましくは糖尿病および／または肥満の処置および／または予防における使用のために提供される。代謝障害の合併症もまた包含され得る。
【０１１１】
別の実施形態において、前記ウイルス発現コンストラクトおよび／またはウイルスベクターおよび／または核酸分子および／または組成物は、肝臓の炎症および／または線維症の処置および／または予防における使用のために提供される。肝臓の炎症および／または線維症の合併症もまた包含され得る。
【０１１２】
なお別の実施形態において、前記ウイルス発現コンストラクトおよび／またはウイルスベクターおよび／または核酸分子および／または組成物は、好ましくは加齢に関連した代謝障害、好ましくは糖尿病および／または肥満を予防、遅延、治癒、回復および／または処置することによる健康寿命の延伸における使用のために提供される。
【０１１３】
なお別の実施形態において、前記ウイルス発現コンストラクトおよび／またはウイルスベクターおよび／または核酸分子および／または組成物は、がん、好ましくは肝臓がんの処置および／または予防における使用のために提供される。がんの合併症もまた包含され得る。
【０１１４】
さらなる態様において、上で規定されるウイルス発現コンストラクトおよび／または上で規定されるウイルスベクターおよび／または上で規定される核酸分子および／または上で規定される組成物の使用を含む、代謝障害、好ましくは糖尿病および／または肥満ならびにそれらの合併症を予防、遅延、回復、治癒および／または処置する方法が提供される。
【０１１５】
かかる方法は、好ましくは、個体において、前記個体の細胞、組織もしくは器官において代謝障害、例えば糖尿病および／もしくは肥満などの１もしくは複数の症候（複数可）を緩和するためのものであるか、または前記個体の細胞、組織もしくは器官の１もしくは複数の特性（複数可）もしくは症候（複数可）を緩和するものであり、この方法は、前記個体に本明細書中で規定されるウイルス発現コンストラクトおよび／またはウイルスベクターおよび／または核酸分子および／または組成物を投与することを含む。
【０１１６】
さらなる態様において、上で規定されるウイルス発現コンストラクトおよび／または上で規定されるウイルスベクターおよび／または上で規定される核酸分子および／または上で規定される組成物の使用を含む、肝臓の炎症および／または線維症ならびにそれらの合併症を予防、遅延、回復、治癒および／または処置する方法が提供される。
【０１１７】
かかる方法は、好ましくは、個体において、前記個体の細胞、組織もしくは器官において肝臓の炎症および／もしくは線維症の１もしくは複数の症候（複数可）を緩和するためのものであるか、または前記個体の細胞、組織もしくは器官の１もしくは複数の特性（複数可）もしくは症候（複数可）を緩和するものであり、この方法は、前記個体に本明細書中で規定されるウイルス発現コンストラクトおよび／またはウイルスベクターおよび／または核酸分子および／または組成物を投与することを含む。
【０１１８】
さらなる態様において、上で規定されるウイルス発現コンストラクトおよび／または上で規定されるウイルスベクターおよび／または上で規定される核酸分子および／または上で規定される組成物の使用を含む、好ましくは、加齢に関連した代謝障害、好ましくは糖尿病および／または肥満を予防、遅延、治癒、回復および／または処置することにより健康寿命を延伸する方法が提供される。
【０１１９】
かかる方法は、好ましくは、個体において、前記個体の細胞、組織もしくは器官において加齢に関連した代謝障害、例えば糖尿病および／もしくは肥満などの１もしくは複数の症候（複数可）を緩和するためのものであるか、または前記個体の細胞、組織もしくは器官の１もしくは複数の特性（複数可）もしくは症候（複数可）を緩和するものであり、この方法は、前記個体に本明細書中で規定されるウイルス発現コンストラクトおよび／またはウイルスベクターおよび／または核酸分子および／または組成物を投与することを含む。
【０１２０】
さらなる態様において、上で規定されるウイルス発現コンストラクトおよび／または上で規定されるウイルスベクターおよび／または上で規定される核酸分子および／または上で規定される組成物の使用を含む、がん、好ましくは肝臓がんならびにそれらの合併症を予防、遅延、回復、治癒および／または処置する方法が提供される。
【０１２１】
かかる方法は、好ましくは、個体において、前記個体の細胞、組織もしくは器官においてがん、例えば肝臓がんなどの１もしくは複数の症候（複数可）を緩和するためのものであるか、または前記個体の細胞、組織もしくは器官の１もしくは複数の特性（複数可）もしくは症候（複数可）を緩和するものであり、この方法は、前記個体に本明細書中で規定されるウイルス発現コンストラクトおよび／またはウイルスベクターおよび／または核酸分子および／または組成物を投与することを含む。
【０１２２】
本発明との関連において、代謝障害、好ましくは糖尿病および／または肥満を予防、遅延、回復、治癒および／または処置するための薬剤の製造のための、本明細書中で規定されるウイルス発現コンストラクトおよび／またはウイルスベクターおよび／または核酸分子および／または組成物の使用が提供される。
【０１２３】
本発明との関連において、肝臓の炎症および／または線維症を予防、遅延、治癒、回復および／または処置するための薬剤の製造のための、本明細書中で規定されるウイルス発現コンストラクトおよび／またはウイルスベクターおよび／または核酸分子および／または組成物の使用が提供される。
【０１２４】
本発明との関連において、好ましくは、加齢に関連した代謝障害、好ましくは糖尿病および／または肥満を予防、遅延、治癒、回復および／または処置することにより健康寿命を延伸するための薬剤の製造のための、本明細書中で規定されるウイルス発現コンストラクトおよび／またはウイルスベクターおよび／または核酸分子および／または組成物の使用が提供される。
【０１２５】
本発明との関連において、がん、好ましくは肝臓がんを予防、遅延、回復、治癒および／または処置するための薬剤の製造のための、本明細書中で規定されるウイルス発現コンストラクトおよび／またはウイルスベクターおよび／または核酸分子および／または組成物の使用が提供される。
【０１２６】
代謝障害としては、メタボリックシンドローム、糖尿病、肥満、肥満関連併存病、糖尿病関連併存病、高血糖症、インスリン抵抗性、耐糖能障害、脂肪肝、アルコール性肝疾患（ＡＬＤ）、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、冠動脈心疾患（ＣＨＤ）、高脂血症、アテローム性動脈硬化、内分泌疾患（ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｐｈａｔｉｅｓ）、オステオサルコペニア肥満症候群（ＯＳＯ）、糖尿病性腎症（ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｎｅｐｈｒｏｐａｔｙ）、慢性腎症（ＣＫＤ）、心肥大、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害、関節炎、敗血症、眼の新生血管形成、神経変性、認知症が挙げられ、またうつ病、腺腫、癌腫が挙げられ得る。
【０１２７】
糖尿病としては、糖尿病前症、高血糖症、１型糖尿病、２型糖尿病、若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）、一遺伝子性糖尿病、新生児糖尿病、妊娠性糖尿病、不安定型糖尿病、特発性糖尿病、薬物または化学物質誘発性糖尿病、Ｓｔｉｆｆ−ｍａｎ症候群、脂肪萎縮性糖尿病、成人潜在性自己免疫性糖尿病（ＬＡＤＡ）が挙げられる。
【０１２８】
肥満としては、過体重、中枢／上半身肥満、末梢／下半身肥満、病的肥満、オステオサルコペニア肥満症候群（ＯＳＯ）、小児肥満、メンデル（一遺伝子性）症候性肥満、メンデル非症候性肥満、多遺伝子性肥満が挙げられる。
【０１２９】
代謝障害、糖尿病、肥満および処置される対象のタイプは、本明細書中で先に規定されている。
【０１３０】
肝臓の炎症および／または線維症としては、自己免疫性肝炎、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型およびＥ型肝炎を包含するウイルス性肝炎、アルコール性肝炎、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）および肝硬変が挙げられる。
【０１３１】
がんとしては、星状細胞腫、神経膠腫、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、肉腫（軟骨肉腫、線維肉腫、横紋筋肉腫（ｒｈａｂｄｏｍｙｏｓｃａｒｏｍａ）および骨肉腫を包含する）、シュワン腫、精上皮腫、ならびに膀胱、乳房、子宮頸部、結腸、子宮内膜、食道、胆嚢、腎臓、肝臓、肺、卵巣、前立腺、膵臓、直腸、皮膚、胃および甲状腺の癌腫が挙げられる。好ましいがんは、肝臓がん、好ましくは肝細胞癌である。１つの実施形態において、前記方法または使用は、インビトロで、例えば細胞培養を用いて実施される。好ましくは、前記方法または使用は、インビボである。これらの方法／使用の各々の特徴は、本明細書中で既に規定されている。
【０１３２】
本発明のある方法において、ウイルス発現コンストラクトおよび／またはベクターおよび／または核酸分子および／または組成物は、個体において代謝障害、好ましくは糖尿病および／または肥満を処置するために用いられることが知られている付加的な化合物と組み合わされ得る。
【０１３３】
本発明の別の方法において、ウイルス発現コンストラクトおよび／またはベクターおよび／または核酸分子および／または組成物は、肝臓の炎症および／または線維症を処置するために用いられることが知られている付加的な化合物と組み合わされ得る。
【０１３４】
本発明のなお別の方法において、ウイルス発現コンストラクトおよび／またはベクターおよび／または核酸分子および／または組成物は、健康寿命を延伸するために用いられることが知られている付加的な化合物と組み合わされ得る。
【０１３５】
本発明のなお別の方法において、ウイルス発現コンストラクトおよび／またはベクターおよび／または核酸分子および／または組成物は、がん、好ましくは肝臓がんを処置するために用いられることが知られている付加的な化合物と組み合わされ得る。
【０１３６】
好ましい実施形態において、本発明による使用または方法における処置は、繰り返される必要はない。あるいは、本発明による使用または方法において、ウイルス発現コンストラクトまたは前記組成物の前記投与は、毎年または２、３、４、５、６年ごとに繰り返され得る。
【０１３７】
一般的定義
同一性／類似性
本発明との関連において、線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）としてのタンパク質断片またはポリペプチドまたはペプチドまたは派生ペプチドは、アミノ酸配列により表される。
【０１３８】
本発明との関連において、ＦＧＦ２１をコードする核酸分子としての核酸分子は、タンパク質断片またはポリペプチドまたはペプチドまたは派生ペプチドをコードする核酸またはヌクレオチドの配列により表される。核酸分子は、調節性領域を含み得る。
【０１３９】
所与の配列番号（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｉｄｅｎｔｉｔｙ  Ｎｕｍｂｅｒ）（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ））によって本明細書中で特定される各々の核酸分子またはタンパク質断片またはポリペプチドまたはペプチドまたは派生ペプチドまたはコンストラクトは、開示される具体的な配列に限定されるものではないことが理解されるものである。本明細書中で特定される各コーディング配列は、所与のタンパク質断片もしくはポリペプチドもしくはペプチドもしくは派生ペプチドもしくはコンストラクトをコードするか、またはそれ自体がタンパク質断片もしくはポリペプチドもしくはコンストラクトもしくはペプチドもしくは派生ペプチドである。本出願の全体を通して、所与のタンパク質断片またはポリペプチドまたはペプチドまたは派生ペプチドをコードする具体的なヌクレオチド配列の配列番号（例として配列番号Ｘを取り上げる）に言及するたび、これは：
ｉ．  配列番号Ｘと少なくとも６０％の配列同一性もしくは類似性を持つヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列；
ｉｉ．  遺伝暗号の縮重のために（ｉ）の核酸分子の配列と配列が異なるヌクレオチド配列；または
ｉｉｉ．  配列番号Ｘのヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列と少なくとも６０％のアミノ酸同一性または類似性を持つアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
により置き換えられ得る。
【０１４０】
本出願の全体を通して、具体的なアミノ酸配列の配列番号（例として配列番号Ｙを取り上げる）に言及するたび、これは：
配列番号Ｙのアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性または類似性を持つアミノ酸配列を含むポリペプチド
により置き換えられ得る。
【０１４１】
それぞれ所与のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列とのその同一性または類似性パーセンテージ（少なくとも６０％）によって本明細書中に記載される各々のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列は、さらに好ましい実施形態において、それぞれ所与のヌクレオチドまたはアミノ酸配列と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％またはそれより高い同一性または類似性を持つ。好ましい実施形態において、配列同一性または類似性は、本明細書中で特定される配列の全長を比較することにより決定される。本明細書中で特に指示がない限り、所与の配列番号との同一性または類似性は、完全長の（すなわちその全長にわたっての、または全体としての）前記配列に基づく同一性または類似性を意味する。
【０１４２】
ノンコーディングの（すなわちプロモーターのまたは別の調節性領域の）各ヌクレオチド配列は、具体的なヌクレオチド配列の配列番号（例として配列番号Ａを取り上げる）と少なくとも６０％の配列同一性または類似性を持つヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列により置き換えることができる。好ましいヌクレオチド配列は、配列番号Ａと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性を持つ。同一性は、本明細書中で説明されるように、その配列番号の全体にわたって、またはその部分にわたって査定され得る。好ましい実施形態において、かかるノンコーディングヌクレオチド配列、例えばプロモーターなどは、少なくとも、当業者に知られているかかるノンコーディングヌクレオチド配列の活性、例えばプロモーターの活性などを呈するまたは発揮する。
【０１４３】
「配列同一性」は、配列を比較することにより決定される、２個もしくはそれより多くのアミノ酸（ポリペプチドまたはタンパク質）配列間の、または２個もしくはそれより多くの核酸（ポリヌクレオチド）配列間の関係性として本明細書中で規定される。好ましい実施形態において、配列同一性は、２個の所与の配列番号の完全長に基づいて、またはその部分に基づいて算出される。その部分とは、好ましくは、両配列番号の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％を意味する。当該分野において、「同一性」はまた、場合によって、かかる配列の文字列間のマッチにより決定されるアミノ酸または核酸配列間の配列関連性の程度を意味する。
【０１４４】
２個のアミノ酸配列間の「類似性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列およびその保存的アミノ酸置換体を第二のポリペプチドの配列と比較することにより決定される。「同一性」および「類似性」は、公知の方法により容易に算出することができ、この方法としては、限定されるものではないが、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８；  Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３；  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７；  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１；  ａｎｄ  Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）中に記載されるものが挙げられる。
【０１４５】
同一性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間の最大マッチを与えるようにデザインされる。同一性および類似性を決定するための方法は、公開されているコンピュータープログラム中に成文化されている。２個の配列間の同一性および類似性を決定するための好ましいコンピュータープログラム方法としては、例としてＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２（１）：３８７（１９８４））、ＢｅｓｔＦｉｔ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−４１０（１９９０）が挙げられる。ＢＬＡＳＴ  Ｘプログラムは、ＮＣＢＩおよび他のソーズから公開されている（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ  ２０８９４；  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−４１０（１９９０）。周知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも同一性を決定するために用いられ得る。
【０１４６】
ポリペプチド配列比較のための好ましいパラメーターとしては、Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ４８：４４３−４５３（１９７０）；Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．  ８９：１０９１５−１０９１９（１９９２）からのＣｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｍａｔｒｉｘ：ＢＬＯＳＳＵＭ６２；Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｙ：１２；およびＧａｐ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｅｎａｌｔｙ：４が挙げられる。これらのパラメーターを有する有用なプログラムは、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにあるＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐから「Ｏｇａｐ」プログラムとして公開されている。前述のパラメーターは、アミノ酸比較のデフォルトパラメーターである（エンドギャップへのペナルティを伴わない）。
【０１４７】
核酸比較のための好ましいパラメーターとしては、Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ４８：４４３−４５３（１９７０）；Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｍａｔｒｉｘ：ｍａｔｃｈｅｓ＝＋１０，ｍｉｓｍａｔｃｈ＝０；Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｙ：５０；Ｇａｐ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｅｎａｌｔｙ：３が挙げられる。Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷｉｓにあるＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ＧｒｏｕｐからＧａｐプログラムとして利用可能である。上で与えられたのは、核酸比較のデフォルトパラメーターである。
【０１４８】
アミノ酸類似性の程度を決定する際、当業者は、当業者に明らかな、いわゆる「保存的」アミノ酸置換を考慮してもよい。保存的アミノ酸置換とは、類似した側鎖を持つ残基の交換可能性をいう。例えば、脂肪族側鎖を持つアミノ酸のグループはグリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンであり；脂肪族−ヒドロキシル側鎖を持つアミノ酸のグループはセリンおよびスレオニンであり；アミド含有側鎖を持つアミノ酸のグループはアスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族側鎖を持つアミノ酸のグループはフェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンであり；塩基性側鎖を持つアミノ酸のグループはリジン、アルギニンおよびヒスチジンであり；ならびに硫黄含油側鎖を持つアミノ酸のグループはシステインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換のグループは：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリンおよびアスパラギン−グルタミンである。本明細書中に開示されるアミノ酸配列の置換バリアントは、開示された配列中の少なくとも１個の残基が取り除かれていて異なる残基がその位置に挿入されているものである。好ましくは、アミノ酸の変化は保存的である。各々の天然起源アミノ酸についての好ましい保存的置換は、ＡｌａからＳｅｒ；ＡｒｇからＬｙｓ；ＡｓｎからＧｌｎまたはＨｉｓ；ＡｓｐからＧｌｕ；ＣｙｓからＳｅｒまたはＡｌａ；ＧｌｎからＡｓｎ；ＧｌｕからＡｓｐ；ＧｌｙからＰｒｏ；ＨｉｓからＡｓｎまたはＧｌｎ；ＩｌｅからＬｅｕまたはＶａｌ；ＬｅｕからＩｌｅまたはＶａｌ；ＬｙｓからＡｒｇ；ＧｌｎまたはＧｌｕ；ＭｅｔからＬｅｕまたはＩｌｅ；ＰｈｅからＭｅｔ、ＬｅｕまたはＴｙｒ；ＳｅｒからＴｈｒ；ＴｈｒからＳｅｒ；ＴｒｐからＴｙｒ；ＴｙｒからＴｒｐまたはＰｈｅ；およびＶａｌからＩｌｅまたはＬｅｕである。
【０１４９】
遺伝子またはコーディング配列
「遺伝子」または「コーディング配列」または「核酸」または「ヌクレオチド配列」または「核の（ｎｕｃｌｅｉｃ）」とは、特定のタンパク質、例えばＦＧＦ２１などを「コードする」ＤＮＡまたはＲＮＡの領域（転写領域）をいう。コーディング配列は、適切な制御領域、例えばプロモーターなどの制御下に置かれると、転写され（ＤＮＡ）、ポリペプチドに翻訳される（ＲＮＡ）。遺伝子は、いくつかの作動可能に連結された断片、例えばプロモーター、５’リーダー配列、イントロン、コーディング配列および３’非翻訳配列または３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）などを含み得て、これはポリアデニル化部位またはシグナル配列を含む。キメラまたは組換え遺伝子（例えばＦＧＦ２１遺伝子など）は、天然では通常見られない遺伝子、例えばそのプロモーターが天然では転写ＤＮＡ領域の一部または全てと関連がない遺伝子などである。「遺伝子の発現」とは、遺伝子がＲＮＡに転写される、および／または活性タンパク質に転写されるプロセスをいう。
【０１５０】
プロモーター
本明細書中で用いられるとき、用語「プロモーター」とは、１または複数の遺伝子（またはコーディング配列）の転写を制御するように機能する、その遺伝子の転写開始部位の転写方向に対して上流に位置する核酸断片をいい、これは、ＤＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼの結合部位、転写開始部位、ならびに限定されるものではないが転写因子結合部位、リプレッサーおよびアクティベータータンパク質結合部位を包含する任意の他のＤＮＡ配列、ならびにプロモーターからの転写量を調節するように直接的または間接的に作用することが当業者に知られている任意の他のヌクレオチド配列の存在により構造的に特定される。「構成型」プロモーターは、大半の生理的および発生条件下で活性があるプロモーターである。「誘導型」プロモーターは、生理的または発生的条件に応じて調節されるプロモーターである。「器官特異的」または「組織特異的」プロモーターは、それぞれ特異的なタイプの器官または組織において活性があるプロモーターである。器官特異的および組織特異的プロモーターは、主として１つの器官または組織において１または複数の遺伝子（またはコーディング配列）の発現を調節するが、他の器官または組織においても同様に検出可能なレベル（「漏出性」）の発現を許容することができる。他の器官または組織における漏出性発現とは、当業者に知られている標準的アッセイ（例としてＰＣＲ、ウエスタンブロット分析、ＥＬＩＳＡ）により評価される、器官特異的または組織特異的な発現と比べて少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍または少なくとも５倍低いものの、なお検出可能である発現を意味する。漏出性発現が検出され得る器官または組織の最大数は、５、６、７または８個である。「脂肪組織特異的プロモーター」は、脂肪組織において転写を開始する能力があるプロモーターであるが、他の（最大５、６、７または８個の）器官または体の部分において何らかの漏出性発現をなお許容する。脂肪組織における転写は、脂肪組織および脂肪細胞、例えば白色脂肪細胞、褐色脂肪細胞、ベージュ脂肪細胞、前脂肪細胞、間質血管細胞などにおいて検出することができる。「肝臓特異的プロモーター」は、肝臓において転写を開始する能力があるプロモーターであるが、他の（最大５、６、７または８個の）器官または体の部分において何らかの漏出性発現をなお許容する。肝臓における転写は、肝臓組織および肝臓細胞、例えば肝細胞、クッパー細胞および／または卵円形細胞などにおいて検出することができる。同様に、「骨格筋プロモーター」は、骨格筋において転写を開始する能力があるプロモーターであるが、他の（最大５、６、７または８個の）器官または体の部分において何らかの漏出性発現をなお許容する。骨格筋における転写は、骨格筋細胞、例えば筋細胞、筋芽細胞、衛星細胞などにおいて検出することができる。
【０１５１】
「ユビキタスプロモーター」は、生物の実質的に全ての組織、器官および細胞において活性がある。
【０１５２】
ＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列の器官特異的および／または組織特異的な発現のために好適なプロモーターとしては、ヒトα１−アンチトリプシンプロモーター、アポリポタンパク質Ｅからの肝細胞制御領域（ＨＣＲ）エンハンサーと組み合わせたα１−アンチトリプシンプロモーター、アルブミンプロモーター、主要尿タンパク質プロモーター、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）プロモーター、肝臓富化タンパク質アクティベータープロモーター、トランスチレチンプロモーター、チロキシン結合グロブリンプロモーター、アポリポタンパク質Ａ１プロモーター、肝臓脂肪酸結合タンパク質プロモーター、フェニルアラニンヒドロキシラーゼプロモーター、脂肪細胞タンパク質２（ａＰ２、脂肪酸結合タンパク質４（ＦＡＢＰ４）としても知られる）プロモーター、ＰＰＡＲｙプロモーター、アディポネクチンプロモーター、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）プロモーター、ヒトアロマターゼチトクロムｐ４５０（ｐ４５０ａｒｏｍ）に由来するプロモーター  ｍｉｎｉ／ａＰ２プロモーター（脂肪特異的なａＰ２エンハンサーおよび基本のａＰ２プロモーターから構成される）、脱共役タンパク質１（ＵＣＰ１）プロモーター、ｍｉｎｉ／ＵＣＰ１プロモーター（脂肪特異的なＵＣＰ１エンハンサーおよび基本のＵＣＰ１プロモーターから構成される）、アディプシンプロモーター、レプチンプロモーター、Ｆｏｘａ−２プロモーター、ミオシン軽鎖プロモーター、ミオシン重鎖プロモーター、デスミンプロモーター、Ｃ５−１２プロモーター、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、平滑筋アルファ−アクチンプロモーター、ＣＫ６プロモーター、Ｕｎｃ−４５ミオシンシャペロンＢプロモーター、ＭＣＫエンハンサーのコピーと組み合わせた基本のＭＣＫプロモーター、Ｅｎｈ３５８ＭＣＫプロモーター（ＭＣＫエンハンサーとＭＣＫ遺伝子の３５８ｂｐ近位プロモーターとの組み合わせ）が挙げられる。
【０１５３】
作動可能に連結される
「作動可能に連結される」とは、制御配列、例えばプロモーター配列または調節配列などが、好ましくはＦＧＦ２１をコードする目的のヌクレオチド配列に対して、そのプロモーターまたは制御または調節配列が細胞および／または対象における好ましくはＦＧＦ２１をコードする目的ヌクレオチド配列の転写および／または産生もしくは発現を指示するまたはこれらに影響を与えるような位置に適切に置かれた構成として本明細書中で規定される。例えば、プロモーターがコーディング配列の転写または発現を開始または調節することができるならば、そのプロモーターはコーディング配列に作動可能に連結されており、この場合、コーディング配列はプロモーター「の制御下」にあると理解されるものである。コンストラクト内に含まれる１または複数のヌクレオチド配列および／またはエレメントが「任意選択の目的ヌクレオチド配列に作動可能に連結されるように構成される」と本明細書中で規定されるとき、ひとたび前記目的ヌクレオチド配列が前記コンストラクト中に存在すれば、前記ヌクレオチド配列および／またはエレメントは、これらのヌクレオチド配列および／またはエレメントが前記目的ヌクレオチド配列に全て作動可能に連結されるように前記コンストラクト内に構成されるものと理解される。
【０１５４】
ウイルス発現コンストラクト
発現コンストラクトは、細胞内で安定であってエピソームのままであることができるゲノムを保有する。本発明との関連内で、細胞とは、コンストラクトを作製するために用いられる細胞、またはコンストラクトが投与される細胞を包含することを意味し得る。あるいはコンストラクトは、例として相同組換えを通じてまたは別の方法で細胞のゲノムに組み込まれる能力がある。とりわけ好ましい発現コンストラクトは、本明細書中で規定されるＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列が本明細書中で規定されるプロモーターに作動可能に連結されており、前記プロモーターが細胞において前記ヌクレオチド配列（すなわちコーディング配列）の発現を指示する能力を持つものである。好ましくは、前記プロモーターは、特異的器官および／または特異的組織の少なくとも１つの細胞において前記ヌクレオチド配列の発現を指示する。好ましくは、前記プロモーターは、肝臓、脂肪組織および／または骨格筋の少なくとも１つの細胞において前記ヌクレオチド配列の発現を指示する。好ましくは、前記プロモーターは、肝臓、脂肪組織および／または骨格筋の細胞のうちの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、４０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％において発現を指示する。本発明との関連において、肝臓、脂肪組織または骨格筋において発現するＦＧＦ２１とは、他の器官または組織と比べて肝臓、脂肪組織または骨格筋におけるＦＧＦ２１の優先的または優勢な（少なくとも１０％多い、少なくとも２０％多い、少なくとも３０％多い、少なくとも４０％多い、少なくとも５０％多い、少なくとも６０％多い、少なくとも７０％多い、少なくとも８０％多い、少なくとも９０％多い、少なくとも１００％多い、少なくとも１５０％多い、少なくとも２００％またはそれより多い）発現をいう。本出願の全体を通じて、発現との関連において肝臓特異的または脂肪特異的または骨格筋特異的が言及される場合、それぞれ肝臓、脂肪組織または骨格筋を構成する細胞型（複数可）の細胞型特異的な発現も予想される。
【０１５５】
本発明のウイルス発現コンストラクトは、「哺乳動物における発現に適した」形のヌクレオチド配列を含み、これは、ウイルス発現コンストラクトが、発現のために用いられる哺乳動物宿主細胞に基づいて選択される、発現させるヌクレオチド配列に作動的に連結された１または複数の調節性配列を包含することを意味する。好ましくは、発現のために用いられる前記哺乳動物宿主細胞は、ヒト、マウスまたはイヌの細胞である。
【０１５６】
本発明のウイルス発現コンストラクトは、肝臓、脂肪組織および／または骨格筋において発現するヌクレオチド配列を含む。
【０１５７】
本明細書中で用いられるとき、「脂肪組織」とは、成熟脂肪細胞（すなわち脂肪細胞）ならびに小血管、神経組織、リンパ節および間質血管細胞群（ＳＶＦ）の組み合わせから構成される組織である。ＳＶＦは、内皮細胞、線維芽細胞、脂肪細胞前駆細胞（すなわち前脂肪細胞）、および免疫細胞、例えばマクロファージおよびＴ細胞などから構成される。哺乳動物において、２つの異なるタイプの脂肪組織：白色脂肪組織（ＷＡＴ）および褐色脂肪組織（ＢＡＴ）が慣例的に区別されている。哺乳動物において、脂肪組織は多貯蔵器官（ｍｕｌｔｉ−ｄｅｐｏｔ  ｏｒｇａｎ）中に含有される。脂肪の貯蔵部（ｄｅｐｏｔ）としては、限定されるものではないが、精巣上体（ｅｐｉｄｙｄｙｍａｌ）ＷＡＴ（ｅＷＡＴ）、鼠径部ＷＡＴ（ｉＷＡＴ）、後腹膜ＷＡＴ（ｒＷＡＴ）、腸間膜ＷＡＴ（ｍＷＡＴ）、肩甲骨間ＢＡＴ（ｉＢＡＴ）が挙げられる。
【０１５８】
本明細書中で用いられるとき、「骨格筋」とは、筋線維から構成される組織をいう。筋線維（ｍｕｓｃｌｅ  ｆｉｂｅｒ）は、筋線維（ｍｙｏｆｉｂｅｒ）としても知られ、数百個の筋芽細胞の融合に起因する単一の多核または合胞体の細胞であり、これらのうちのいくつかは衛星細胞として知られる未分化細胞として成熟した筋肉内に残存している。個々の筋線維は、筋内膜と呼ばれる結合組織に囲まれている。およそ１０から１００本の筋線維が線維束（ｆａｓｃｉｃｌｅ）または線維束（ｂｕｎｄｌｅ）を形成し、これら自体は筋周膜と呼ばれる別の結合組織層に囲まれている。最終的に、骨格筋は、筋上膜と呼ばれる別の結合組織層に囲まれている線維束の群により形成される。筋線維に加えて、骨格筋は、多数の血管および神経からも構成される。筋肉の端部は、骨膜または他の筋肉の結合組織への筋肉の付着を媒介する高密度な結合組織構造である腱および腱膜に向かって集まる。
【０１５９】
本明細書中で用いられるとき、「肝臓」とは、肝細胞から構成される組織をいう。肝細胞は、肝臓中の細胞の約５０〜７０％に相当する。肝細胞に加えて、肝臓は、内皮細胞、傍類洞細胞、卵円形細胞、クッパー細胞および星状細胞（伊東細胞）から構成される。クッパー細胞により活性化されると、星状細胞は筋線維芽細胞へとトランスフォームする。中心静脈、ならびに肝動脈の前終端枝、肝門脈、胆小管およびリンパ管を含有する門脈路（ｐｏｒｔａｌ  ｔｒａｃｋ）（門脈トライアッド）も肝臓において見出される。
【０１６０】
かかる好ましい発現コンストラクトは、発現カセットを含むと言われる。本明細書中で用いられる発現カセットは、ＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列を含むまたはこれからなり、前記ヌクレオチド配列の発現を指示する能力を持つプロモーターに作動可能に連結されている。ある実施形態において、本明細書中で用いられる発現カセットは、ＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列、プロモーター、ならびに肝臓において発現するマイクロＲＮＡの標的配列をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列および心臓において発現するマイクロＲＮＡの標的配列をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むまたはこれからなる。１つの実施形態において、記載された発現カセットは、それらの同族のマイクロＲＮＡに完全に相補的である、肝臓において発現するマイクロＲＮＡおよび／または心臓において発現するマイクロＲＮＡの標的配列をコードするヌクレオチド配列を含有する。別の実施形態において、記載された発現カセットは、不完全に相補的（１個のミスマッチ／５個の連続したヌクレオチド）である、マイクロＲＮＡ結合部位をコードする１または複数のヌクレオチド配列（複数可）を含有する。なお別の実施形態において、発現カセットは、完全および不完全なマイクロＲＮＡ結合部位をコードする両ヌクレオチド配列を含有し得る。発現カセットは、それゆえ、単一の完全なマイクロＲＮＡ標的部位、複数の完全なマイクロＲＮＡ標的部位、単一の不完全なマイクロＲＮＡ標的部位、複数の不完全なマイクロＲＮＡ標的部位、または完全および不完全なマイクロＲＮＡ標的部位の組み合わせをコードするヌクレオチド配列を用いることにより調節レベルに変化をもたらすように合わせることができる。さらに、異なるマイクロＲＮＡの標的部位をコードするヌクレオチド配列が用いられ得て、それゆえ遺伝子を複数のマイクロＲＮＡにより調節することが可能になる。マイクロＲＮＡの標的配列をコードするヌクレオチド配列の好ましい位置は３’ＵＴＲである。しかしながら、コーディング配列または５’ＵＴＲ配列のいずれかに挿入されたヌクレオチド配列（標的配列をコードするもの）も用いられ得る。
【０１６１】
マイクロＲＮＡの標的配列をコードするヌクレオチド配列の選択は、所望の発現パターンにより決定される。細胞中の内因性マイクロＲＮＡの存在は、前記マイクロＲＮＡの標的配列をコードするヌクレオチド配列を含有する発現コンストラクトからの遺伝子またはコーディング配列の発現を阻害する。所与の細胞型において阻害される目的の遺伝子またはコーディング配列の発現のため、その細胞型中に存在するマイクロＲＮＡにより認識される標的配列をコードするヌクレオチド配列が選ばれる。
【０１６２】
ウイルス発現コンストラクトは、遺伝子治療において用いられることが意図される発現コンストラクトである。これは、本明細書中で後に規定されるウイルスゲノムの一部を含むようにデザインされる
本明細書中で開示される発現コンストラクトは、前記ＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列を好適な細胞、例として培養細胞または多細胞生物の細胞の中で発現させる組換え技術を用いて調製することができ、これは例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７）およびＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１、上記）；などの中に記載され；両文献は参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる。Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ８２：４８８（部位特異的変異導入を記載している）およびＲｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）  Ｎａｔｕｒｅ  ３２８：７３１−７３４またはＷｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８５）  Ｇｅｎｅ  ３４：３１５（カセット変異導入を記載している）も参照されたい。
【０１６３】
典型的に、ＦＧＦ２１をコードする核酸またはヌクレオチド配列は、発現コンストラクトまたは発現ベクター中で用いられる。フレーズ「発現ベクター」または「ベクター」とは、一般に、遺伝子またはコーディング配列に適合した宿主中で遺伝子またはコーディング配列の発現を起こさせる能力を持つヌクレオチド配列をいう。これらの発現ベクターは、典型的に、好適なプロモーター配列を少なくとも包含し、任意選択で転写終結シグナルを包含する。本明細書中に記載される、発現を起こさせるのに必要なまたは役立つ付加的な因子を用いることもできる。ＦＧＦ２１をコードする核酸またはＤＮＡまたはヌクレオチド配列は、インビトロ細胞培養への導入および発現の能力を持つＤＮＡコンストラクト中に組み込まれる。具体的には、ＤＮＡコンストラクトは、原核生物宿主、例えば細菌、例としてＥ．ｃｏｌｉなどの中での複製に適しているか、または培養される哺乳動物、植物、昆虫（例としてＳｆ９）、酵母、真菌または他の真核生物の細胞株の中に導入することができる。
【０１６４】
特定の宿主への導入のために調製されるＤＮＡコンストラクトは、宿主により認識される複製系、所望のポリペプチドをコードする意図されるＤＮＡセグメント、ならびにポリペプチドをコードするセグメントに作動可能に連結される転写および翻訳の開始および終結調節性配列を包含し得る。用語「作動可能に連結される」は、本明細書中で既に規定されている。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、それがコーディング配列の転写を刺激するならば、コーディング配列に作動可能に連結されている。シグナル配列のＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するタンパク質前駆体として発現するならば、ポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結されている。一般に、作動可能に連結されているＤＮＡ配列は近接しており、シグナル配列の場合は近接かつリーディングフレームの中にある。しかしながら、エンハンサーは、それらがその転写を制御するコーディング配列と近接している必要はない。連結は、好都合な制限部位での、もしくはその代わりに挿入されるアダプターもしくはリンカーでのライゲーションにより、または遺伝子合成により達成される。
【０１６５】
適切なプロモーター配列の選択は、一般に、ＤＮＡセグメントの発現のために選択される宿主細胞に依存する。好適なプロモーター配列の例としては、当該技術分野で周知である原核生物および真核生物のプロモーターが挙げられる（例として上記のＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１を参照されたい）。転写調節性配列は、典型的に、宿主により認識される異種のエンハンサーまたはプロモーターを包含する。適切なプロモーター配列の選択は宿主に依存するが、例えばｔｒｐ、ｌａｃおよびファージプロモーター、ｔＲＮＡプロモーターおよび解糖酵素プロモーターなどのプロモーターが知られていて利用可能である（例として上記のＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１を参照されたい）。発現ベクターは、複製系ならびに転写および翻訳の調節性配列を、ポリペプチドをコードするセグメントの挿入部位と一緒に包含する。大半の場合、複製系は、そのベクターを作製するために用いられる細胞（Ｅ．Ｃｏｌｉのような細菌細胞）中でのみ機能する。大半のプラスミドおよびベクターは、ベクターが感染する細胞の中で複製しない。実行可能な細胞株および発現ベクターの組み合わせの例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１、上記）およびＭｅｔｚｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）  Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：３１−３６中に記載される。例えば、好適な発現ベクターは、酵母、例としてＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、ｅ．ｇ．、昆虫細胞、例としてＳｆ９細胞、哺乳動物細胞、例としてＣＨＯ細胞、および細菌細胞、例としてＥ．ｃｏｌｉ中で発現させることができる。細胞は、それゆえに、原核生物または真核生物の宿主細胞であり得る。細胞は、液体培地中または固体培地上での培養に適した細胞であり得る。
【０１６６】
あるいは、宿主細胞は、多細胞生物、例えば遺伝子導入植物または動物などの一部である細胞である。
【０１６７】
ウイルスベクター
ウイルスベクターまたはウイルス遺伝子治療ベクターは、上で規定されるウイルス発現コンストラクトを含むベクターである。
【０１６８】
ウイルスベクターまたはウイルス遺伝子治療ベクターは、遺伝子治療に適したベクターである。遺伝子治療に適したベクターは、Ａｎｄｅｒｓｏｎ  １９９８，Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：２５−３０；Ｗａｌｔｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｔｅｉｎ，２０００，Ｄｒｕｇｓ  ６０：２４９−７１；Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．  ７：３３−４０；Ｒｕｓｓｅｌｌ，２０００，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．  ８１：２５７３−６０４；Ａｍａｄｏ  ａｎｄ  Ｃｈｅｎ，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：６７４−６；Ｆｅｄｅｒｉｃｏ，１９９９，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：４４８−５３；Ｖｉｇｎａ  ａｎｄ  Ｎａｌｄｉｎｉ，２０００，Ｊ．Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．  ２：３０８−１６；Ｍａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｔｏｄａｙ  ３：３９６−４０３；Ｐｅｎｇ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，１９９９，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １０：４５４−７；Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔ，１９９９，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．  ８０：３０４９−６４；Ｒｅｉｓｅｒ，２０００，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ７：９１０−３；およびこれらにおいて引用される参考文献中に記載されている。
【０１６９】
とりわけ好適な遺伝子治療ベクターとしては、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが挙げられる。これらのベクターは、滑膜細胞および肝臓細胞を包含する広範な数の分裂および非分裂細胞型に感染する。アデノウイルスおよびＡＡＶベクターの細胞侵入後のエピソーム性は、上に指し示されるように、これらのベクターを治療用途に適したものにする（Ｒｕｓｓｅｌｌ，２０００，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．  ８１：２５７３−２６０４；Ｇｏｎｃａｌｖｅｓ，２００５，Ｖｉｒｏｌ  Ｊ．  ２（１）：４３）。ＡＡＶベクターは、導入遺伝子発現の非常に安定な長期的発現をもたらすことが知られているため、なおより好ましい（イヌにおいて最大９年間（Ｎｉｅｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ．  ２００９  Ｊａｎ  ２２；１１３（４）：７９７−８０６）およびヒトにおいて約１０年間（Ｂｕｃｈｌｉｓ，Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．  ２０１２  Ｍａｒ  ２９；１１９（１３）：３０３８−４１）。好ましいアデノウイルスベクターは、Ｒｕｓｓｅｌｌ（２０００、上記）により概説されるように、宿主応答を低減させるために改変される。ＡＡＶベクターを用いた遺伝子治療方法は、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．  Ｍａｒｃｈ  ９（印刷より前にＥｐｕｂ）、Ｍａｎｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．  ６（５）：４８２−９０およびＭａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｅｙｅ  １８（１１）：１０４９−５５、Ｎａｔｈｗａｎｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．  ２０１１  Ｄｅｃ  ２２；３６５（２５）：２３５７−６５、Ａｐｐａｒａｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２００５  Ａｐｒ；１６（４）：４２６−３４により記載される。
【０１７０】
別の好適な遺伝子治療ベクターとしてはレトロウイルスベクターが挙げられる。本発明における用途のために好ましいレトロウイルスベクターは、レンチウイルスを基にした発現コンストラクトである。レンチウイルスベクターは、分裂および非分裂細胞に感染してこれらのゲノム中に安定的に組み込まれる能力を持つ（Ａｍａｄｏ  ａｎｄ  Ｃｈｅｎ，１９９９  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：６７４−６）。レンチウイルスを基にした発現コンストラクトの構築および使用のための方法は、米国特許第６，１６５，７８２号、第６，２０７，４５５号、第６，２１８，１８１号、第６，２７７，６３３号および第６，３２３，０３１号、ならびにＦｅｄｅｒｉｃｏ（１９９９，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １０：４４８−５３）およびＶｉｇｎａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００，Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ  ２０００；２：３０８−１６）中に記載される。
【０１７１】
他の好適な遺伝子治療ベクターとしては、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ポリオーマウイルスベクターまたはワクシニアウイルスベクターが挙げられる。
【０１７２】
遺伝子治療ベクターは、発現させるＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列を含み、これにより前記ヌクレオチド配列は適切な調節性配列に作動可能に連結される。かかる調節性配列は、プロモーター配列を少なくとも含む。遺伝子治療ベクターからのＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列の発現に適したプロモーターとしては、例としてＣＭＶプロモーター、例えばマウスモロニー白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、ラウス肉腫ウイルスまたはＨＴＬＶ−１などからのウイルス長鎖末端反復配列プロモーター（ＬＴＲ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、ＣＡＧプロモーター、α１−アンチトリプシンプロモーター、ｍｉｎｉ／ａＰ２プロモーター、ｍｉｎｉ／ＵＣＰ１プロモーター、Ｃ５−１２プロモーターおよび単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーターが挙げられる。
【０１７３】
いくつかの誘導型プロモーター系は、有機または無機の低分子化合物の投与により誘導され得ることが記載されている。かかる誘導型プロモーターとしては、重金属により制御されるもの、例えばメタロチオニン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）プロモーター（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  １９８２  Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９−４２；Ｍａｙｏ  ｅｔ  ａｌ．  １９８２  Ｃｅｌｌ  ２９：９９−１０８）など、ＲＵ−４８６（プロゲステロンアンタゴニスト）により制御されるもの（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  １９９４  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：８１８０−８１８４）、ステロイドにより制御されるもの（Ｍａｄｅｒ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ，１９９３  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５６０３−５６０７）、テトラサイクリンにより制御されるもの（Ｇｏｓｓｅｎ  ａｎｄ  Ｂｕｊａｒｄ  １９９２  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５５４７−５５５１；米国特許第５，４６４，７５８号；Ｆｕｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．  １９９４  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：９３０２−９３０６；Ｈｏｗｅ  ｅｔ  ａｌ．  １９９５  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７０：１４１６８−１４１７４；Ｒｅｓｎｉｔｚｋｙ  ｅｔ  ａｌ．  １９９４  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．  １４：１６６９−１６７９；Ｓｈｏｃｋｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．  １９９５  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：６５２２−６５２６）、およびＶＰ１６活性化ドメインとしてのｔｅｔＲポリペプチドとエストロゲン受容体のリガンド結合ドメインとから構成される複数のキメラトランスアクティベーター（Ｙｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，ＵＳ６，４３２，７０５）により制御されるものが挙げられる。
【０１７４】
遺伝子治療ベクターは、さらなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含んでもよい。
【０１７５】
遺伝子治療ベクターは、好ましくは、本明細書中で規定される組成物または医薬組成物中に製剤化される。この関連において、組成物または医薬組成物は、本明細書中で先に規定される好適な医薬担体を含み得る。
【０１７６】
アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶベクター）
好ましいウイルスベクターまたは好ましい遺伝子治療ベクターは、ＡＡＶベクターである。本明細書中で用いられるＡＡＶベクターは、好ましくは、組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶベクター）を含む。本明細書中で用いられる「ｒＡＡＶベクター」とは、本明細書中で説明される、ＡＡＶ血清型に由来するカプシドタンパク質のタンパク質シェルの中にカプシド形成されるＡＡＶゲノムの一部を含む組換えベクターをいう。ＡＡＶゲノムの一部は、アデノ随伴ウイルス血清型、例えばＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５などに由来する逆位末端配列（ＩＴＲ）を含有し得る。好ましいＩＴＲは、配列番号４８（５’ＩＴＲ）および配列番号４９（３’ＩＴＲ）を含むまたはこれらからなる配列により表されるＡＡＶ２のものである。本発明はまた、好ましくは、５’ＩＴＲとしての配列番号４８と少なくとも８０％（または少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％）の同一性を持つ配列および３’ＩＴＲとしての配列番号４９と少なくとも８０％の同一性を持つ配列の使用を包含する。
【０１７７】
カプシドタンパク質を含むタンパク質シェルは、ＡＡＶ血清型、例えばＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５などに由来するものであり得る。好ましいＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９のカプシドである。好ましいＩＴＲは、ＡＡＶ２からのものである。タンパク質シェルはまた、カプシドタンパク質シェルとも命名され得る。ｒＡＡＶベクターは１つ、または好ましくは全ての野生型ＡＡＶ遺伝子を欠失したものであり得るが、機能的なＩＴＲ核酸配列をなお含み得る。機能的ＩＴＲ配列は、ＡＡＶビリオンの複製、レスキューおよびパッケージングに必要である。ＩＴＲ配列は、野生型配列であり得て、または野生型配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を持ち得て、またはそれらが機能的なままであるかぎり例えばヌクレオチドの挿入、変異、欠失または置換によって変わり得る。この関連において、機能性とは、ゲノムがカプシドシェル中に直接的にパッケージングされ、次いで感染する宿主細胞または標的細胞における発現を可能にする能力をいう。本発明との関連において、カプシドタンパク質シェルは、ｒＡＡＶベクターゲノムＩＴＲと異なる血清型のものであり得る。
【０１７８】
選択された核酸配列により表される核酸分子は、好ましくは、上で特定されるｒＡＡＶゲノムまたはＩＴＲ配列の間に挿入され、これは例えばコーディング配列に作動可能に連結された発現調節性エレメントおよび３’末端配列を含む発現コンストラクトである。前記核酸分子は導入遺伝子と呼ばれることもある。
【０１７９】
「ＡＡＶヘルパー機能」とは、一般に、ｒＡＡＶベクターにトランスで供給される、ｒＡＡＶの複製およびパッケージングに必要とされる相当するＡＡＶ機能をいう。ＡＡＶヘルパー機能は、ｒＡＡＶベクターの中に失われたＡＡＶ機能を補充するが、ＡＡＶ  ＩＴＲ（ｒＡＡＶベクターゲノムにより提供されるもの）を欠いている。ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶの２つの主要なＯＲＦ、すなわちｒｅｐコーディング領域およびｃａｐコーディング領域またはそれらと機能的に実質同一である配列を包含する。ＲｅｐおよびＣａｐ領域は当該技術分野で周知であり、例としてＣｈｉｏｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９，Ｊ．  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ  ７３（２）：１３０９−１３１９）またはＵＳ５，１３９，９４１を参照されたく、これらの文献は参照により本明細書中に組み込まれる。ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶヘルパーコンストラクト上に供給することができる。宿主細胞へのヘルパーコンストラクトの導入は、本明細書中で特定されるｒＡＡＶベクター中に存在するｒＡＡＶゲノムの導入の前またはこれと同時の、例として形質転換、トランスフェクションまたは形質導入によって生じさせることができる。本発明のＡＡＶヘルパーコンストラクトは、それゆえに、一方でｒＡＡＶベクターのカプシドタンパク質シェルのために望まれる、ならびに他方で前記ｒＡＡＶベクター中に存在するｒＡＡＶゲノムの複製およびパッケージングのために望まれる血清型の組み合わせを産生するように選ばれ得る。
【０１８０】
「ＡＡＶヘルパーウイルス」は、ＡＡＶの複製およびパッケージングに必要とされる付加的な機能を提供する。好適なＡＡＶヘルパーウイルスとしては、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス（例えば１型および２型ＨＳＶなど）およびワクシニアウイルスが挙げられる。このヘルパーウイルスにより提供される付加的な機能はまた、ＵＳ６，５３１，４５６中に記載されるようにプラスミドを介して宿主細胞内に導入することができ、この文献は参照により本明細書中に組み込まれる。
【０１８１】
「導入遺伝子」は、細胞の中に新たに導入された遺伝子またはコーディング配列または核酸分子（すなわちＦＧＦ２１をコードする分子）、すなわち、細胞の中に存在し得るが通常は発現しないまたは不十分なレベルでしか発現しないものであり得る遺伝子として本明細書中で規定される。この関連において、「不十分な」とは、前記ＦＧＦ２１が細胞中で発現しているものの、本明細書中で規定される症状および／または疾患がなお発症することができることを意味する。この場合、本発明は、ＦＧＦ２１の過剰発現を許容する。導入遺伝子は、細胞にとって天然である配列、細胞中で自然に生じない配列を含み得て、これは両方の組み合わせを含み得る。導入遺伝子は、細胞中でのＦＧＦ２１をコードする配列の発現のために適切な調節性配列に作動可能に連結され得る、本明細書中で先に特定されるＦＧＦ２１および／または付加的なタンパク質をコードする配列を含有し得る。好ましくは、導入遺伝子は、宿主細胞のゲノム内に組み込まれない。
【０１８２】
「形質導入」とは、ウイルスベクターによるレシピエントの宿主細胞へのＦＧＦ２１の送達をいう。例えば、本発明のｒＡＡＶベクターによる標的細胞の形質導入は、そのベクター中に含有されるｒＡＡＶゲノムの形質導入細胞への導入を導く。「宿主細胞」または「標的細胞」とは、その中へのＤＮＡ送達が起こる細胞、例えば対象の筋肉細胞などをいう。ＡＡＶベクターは、分裂および非分裂細胞のいずれにも形質導入することができる。
【０１８３】
ＡＡＶベクターの生産
導入遺伝子をベクター化するための組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）の生産は、以前に記載されている。Ａｙｕｓｏ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２０１０；１０：４２３−４３６、Ｏｋａｄａ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２００９；２０：１０１３−１０２１、Ｚｈａｎｇ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２００９；２０：９２２−９２９およびＶｉｒａｇ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２００９；２０：８０７−８１７を参照されたい。これらのプロトコールは、本発明のＡＡＶを作出するために用いられ、または適合される。１つの実施形態において、生産細胞株には、本発明のポリヌクレオチド（ＩＴＲに隣接した発現カセットを含むもの）、ならびにｒｅｐおよびｃａｐタンパク質をコードし、ヘルパー機能を提供するコンストラクト（複数可）が一過性でトランスフェクトされる。別の実施形態において、細胞株は、ヘルパー機能を安定的に供給し、本発明のポリヌクレオチド（ＩＴＲに隣接した発現カセットを含むもの）、ならびにｒｅｐおよびｃａｐタンパク質をコードするコンストラクト（複数可）が一過性でトランスフェクトされる。別の実施形態において、細胞株は、ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質ならびにヘルパー機能を安定的に供給し、本発明のポリヌクレオチドが一過性でトランスフェクトされる。別の実施形態において、細胞株は、ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質を安定的に供給し、本発明のポリヌクレオチドおよびヘルパー機能をコードするポリヌクレオチドが一過性でトランスフェクトされる。なお別の実施形態において、細胞株は、本発明のポリヌクレオチド、ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質ならびにヘルパー機能を安定的に供給する。これらのおよび他のＡＡＶ生産系を作製して用いる方法は、当該技術分野において記載されている。Ｍｕｚｙｃｚｋａ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ５，１３９，９４１、Ｚｈｏｕ  Ｘ，ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ５，７４１，６８３、Ｓａｍｕｌｓｋｉ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ６，０５７，１５２、Ｓａｍｕｌｓｋｉ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ６，２０４，０５９、Ｓａｍｕｌｓｋｉ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ６，２６８，２１３、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ  ６，４９１，９０７、Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ６，６６０，５１４、Ｓｈｅｎｋ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ６，９５１，７５３、Ｓｎｙｄｅｒ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ７，０９４，６０４、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ７，１７２，８９３、Ｍｏｎａｈａｎ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ７，２０１，８９８、Ｓａｍｕｌｓｋｉ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ７，２２９，８２３およびＦｅｒｒａｒｉ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ７，４３９，０６５を参照されたい。
【０１８４】
ｒＡＡＶベクター中に存在するｒＡＡＶゲノムは、ＡＡＶ血清型のうちの１つの逆位末端配列領域（ＩＴＲ）のヌクレオチド配列（好ましくは本明細書中で先に開示される血清型ＡＡＶ２のもの）、またはこれと実質的に同一であるヌクレオチド配列、またはこれと少なくとも６０％の同一性を持つヌクレオチド配列、および２つのＩＴＲの間に挿入される（好適な調節性エレメントの制御下にある）ＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列を少なくとも含む。ベクターゲノムは、ｒＡＡＶカプシド内へのベクターゲノムの効率的パッケージングを可能にするために隣接する５’および３’ＩＴＲ配列の使用を必要とする。
【０１８５】
いくつかのＡＡＶ血清型の全ゲノムおよび対応するＩＴＲは塩基配列解析されている（Ｃｈｉｏｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９，Ｊ．  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．７３，Ｎｏ．２，ｐ１３０９−１３１９）。これらは、クローニングすることができ、または例としてＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）から供給されるオリゴヌクレオチド合成機を用いた当該技術分野で知られている化学合成により、もしくは標準的な分子生物学的技術により、作製することができる。ＩＴＲは、ＡＡＶウイルスゲノムからクローニングすることができ、またはＡＡＶ  ＩＴＲを含むベクターから切り取ることができる。ＩＴＲヌクレオチド配列は、標準的分子生物学的技術を用いて、いずれかの末端で１または複数の治療的タンパク質をコードするヌクレオチド配列にライゲーションすることができ、またはＩＴＲ間のＡＡＶ配列を所望のヌクレオチド配列と置き換えることができる。
【０１８６】
好ましくは、ｒＡＡＶベクター中に存在するｒＡＡＶゲノムは、ウイルスタンパク質をコードする何らかのヌクレオチド配列、例えばＡＡＶのｒｅｐ（複製）またはｃａｐ（カプシド）遺伝子などを含まない。このｒＡＡＶゲノムは、マーカーまたはレポーター遺伝子、例えば抗生物質耐性遺伝子、蛍光タンパク質（例としてｇｆｐ）をコードする遺伝子、または当該技術分野で知られている化学的、酵素的もしくは他の方法で検出可能および／もしくは選択可能な生成物（例としてｌａｃＺ、ａｐｈなど）をコードする遺伝子などをさらに含み得る。
【０１８７】
前記ｒＡＡＶベクター中に存在するｒＡＡＶゲノムは、ＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されるプロモーター配列をさらに含む。好ましいプロモーター配列は、骨格筋細胞および／または骨格筋において、肝臓細胞および／または肝臓において、ならびに脂肪細胞および／または脂肪組織において発現を与えるプロモーターである。かかるプロモーターの例としては、本明細書中で先に規定されるＣＭＶ、ＣＡＧ、ｍｉｎｉ／ａＰ２、ｍｉｎｉ／ＵＣＰ１、Ｃ５−１２およびｈＡＡＴプロモーターが挙げられる。
【０１８８】
好適な３’非翻訳配列はまた、ＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。好適な３’非翻訳領域は、天然においてそのヌクレオチド配列に関連しているものであっても、または異なる遺伝子に由来するものであってもよく、例えばＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（配列番号５０）およびウサギβ−グロビンポリアデニル化シグナル（配列番号５１）などである。
【０１８９】
任意選択で、付加的なヌクレオチド配列、例えばシグナル配列、核局在シグナル、発現エンハンサーなどをコードするヌクレオチド配列などが、ＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列（複数可）に作動可能に連結されてもよい。
【０１９０】
コドン最適化
「コドン最適化」とは、本明細書中で用いられるとき、既存のコーディング配列を改変するため、またはコーディング配列をデザインするため、例えば、コーディング配列から転写される転写産物ＲＮＡ分子の発現宿主細胞もしくは生物における翻訳を改善するため、もしくはコーディング配列の転写を改善するために利用されるプロセスをいう。コドン最適化としては、限定されるものではないが、発現宿主生物のコドン選好に適合するように、例えば哺乳動物、好ましくはマウス、イヌまたはヒト発現宿主のコドン選好に適合するように、コーディング配列のためのコドンを選択することを包含するプロセスが挙げられる。コドン最適化はまた、ＲＮＡ安定性および／または翻訳に潜在的に負の影響を与えるエレメント（例として終結配列、ＴＡＴＡボックス、スプライス部位、リボソーム進入部位、反復および／もしくはＧＣリッチ配列ならびにＲＮＡ二次構造または不安定性モチーフ）を除去する。
【０１９１】
本書類において、およびその特許請求の範囲において、動詞「含むこと（ｔｏ  ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」およびその語形変化は、その語の後に続く項目が包含されることを意味するために限定されない意味で用いられるが、具体的に言及されない項目は除外されない。加えて、動詞「なること（ｔｏ  ｃｏｎｓｉｓｔ）」は、「から本質的になること（ｔｏ  ｃｏｎｓｉｓｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」により置き換えられ得て、これは、本明細書中で規定されるウイルス発現コンストラクト、ウイルスベクター、組成物、遺伝子治療組成物が具体的に特定されるものよりほかの付加的な構成成分（複数可）を含み得ることを意味し、前記付加的構成成分（複数可）は本発明の固有特性を変えない。
【０１９２】
加えて、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」による要素への参照は、要素が唯一無二のものであることを文脈が明確に必要としないかぎり、１つより多くの要素が存在する可能性を排除しない。不定冠詞「ａ」または「ａｎ」は、それゆえに、通常は「少なくとも１つ」を意味する。
【０１９３】
語「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」または「約（ａｂｏｕｔ）」は、数値との関連で用いられるとき（約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）１０、約（ａｂｏｕｔ）１０）、好ましくは、値が所与の値１０の前後１％の値であることを意味する。
【０１９４】
本明細書中で引用される全ての特許および参考文献は、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる。本明細書中で特定される各実施形態は、特に指示がない限り、組み合わせてもよい。
【０１９５】
本発明は次の例の中でさらに説明される。これらの例は、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明を明確に説明するために役立つものであるに過ぎない。
【０１９６】
図のレジェンド：
図１．  Ｃ５７Ｂｌ６マウスにおけるＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｍｉＲＴベクターのｅＷＡＴ内投与による肥満の予防。（Ａ）ＡＡＶ−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｏｕｂｌｅｍｉＲＴベクターの略図。発現カセットはＣＡＧプロモーター、コドン最適化されたマウスＦＧＦ２１コーディング配列、ならびに発現カセットの３’非翻訳領域中にクローニングされたｍｉＲＴ１２２ａ配列の４個のタンデムリピートおよびｍｉＲＴ１配列の４個のタンデムリピートを含有した。ＡＡＶ２からのＩＴＲが発現カセットに隣接した。略図は縮尺どおりではない。ＣＡＧ：ニワトリβ−アクチンプロモーター／ＣＭＶエンハンサー；ｐＡ：ｐｏｌｙＡ。（Ｂ）代謝組織中のＦＧＦ２１の発現レベル。Ｃ５７Ｂｌ６マウスのｅＷＡＴ、ｉＷＡＴ、ｉＢＡＴおよび肝臓中のコドン最適化されたマウスＦＧＦ２１コーディング配列の発現レベルをＲＴｑＰＣＲにより測定し、Ｒｐｌｐ０値で正規化した（ｎ＝８〜１１動物／群）。（Ｃ）ＦＧＦ２１の循環レベル（ｎ＝８〜１１動物／群）。（Ｄ−Ｅ）代謝組織中のＦＧＦ２１Ｒ１（Ｄ）およびβ−Ｋｌｏｔｈｏ（Ｅ）の発現レベル。Ｃ５７Ｂｌ６マウスのｅＷＡＴ、ｉＷＡＴ、ｉＢＡＴおよび肝臓中のＦＧＦ２１受容体１（ＦＧＦ２１Ｒ１）およびβ−Ｋｌｏｔｈｏの発現レベルをＲＴｑＰＣＲにより測定し、Ｒｐｌｐ０値で正規化した（ｎ＝７動物／群）。（Ｆ）体重の進展。体重は毎週測定した（ｎ＝８〜１１動物／群）。（Ｇ）動物の代表的イメージ。（Ｈ）組織の重量。ＡＡＶベクターをｅＷＡＴ内に処置した固形飼料給餌Ｃ５７Ｂｌ６マウスおよびＨＦＤ給餌Ｃ５７Ｂｌ６マウスのｅＷＡＴ、ｉＷＡＴ、ｒＷＡＴ、ｍＷＡＴ、ｉＢＡＴおよび肝臓の重量（ｎ＝８〜１１動物／群）。分析は、１０１２ｖｇのＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｏｕｂｌｅｍｉＲＴまたはＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｎｕｌｌベクターのｅＷＡＴ内投与１４週後に実施した。結果は平均値±ＳＥＭとして表現される。ＮＤ、検出されず。ＨＦＤ、高脂肪食。ＡＵ、任意単位。ｅＷＡＴ、精巣上体白色脂肪組織。ｉＷＡＴ、鼠径部白色脂肪組織。ｒＷＡＴ、後腹膜白色脂肪組織。ｍＷＡＴ、腸間膜白色脂肪組織。ｉＢＡＴ  肩甲骨間褐色脂肪組織。＊  ｐ＜０．０５  ｖｓ  ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｎｕｌｌ  固形飼料、＊＊  ｐ＜０．０１  ｖｓ  ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｎｕｌｌ  固形飼料、＊＊＊  ｐ＜０．００１  ｖｓ  ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｎｕｌｌ  固形飼料、＄  ｐ＜０．０５  ｖｓ  ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｎｕｌｌ  ＨＦＤ、＄＄  ｐ＜０．０１  ｖｓ  ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｎｕｌｌ  ＨＦＤ、＄＄＄  ｐ＜０．００１  ｖｓ  ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｎｕｌｌ  ＨＦＤ。
【０１９７】
図２．  ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｏｕｂｌｅｍｉＲＴベクターをｅＷＡＴ内に処置したＣ５７Ｂｌ６マウスの脂肪組織および肝臓の組織分析。（Ａ）ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｏｕｂｌｅｍｉＲＴまたはＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｎｕｌｌベクターをｅＷＡＴ内に処置した固形飼料給餌Ｃ５７Ｂｌ６マウスおよびＨＦＤ給餌Ｃ５７Ｂｌ６マウスの精巣上体白色脂肪組織（ｅＷＡＴ）、鼠径部白色脂肪組織（ｉＷＡＴ）肩甲骨間褐色脂肪組織（ｉＢＡＴ）および肝臓の切片の、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した代表的イメージ。元の倍率×１００。（Ｂ）ｅＷＡＴの白色脂肪細胞の平均面積（ｎ＝４動物／群）。（Ｃ）ｅＷＡＴの白色脂肪細胞の面積の頻度分布（ｎ＝４動物／群）。分析は、１０１２ｖｇのＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｏｕｂｌｅｍｉＲＴまたはＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｎｕｌｌベクターのｅＷＡＴ内投与１４週後に実施した。結果は平均値±ＳＥＭとして表現される。ＨＦＤ、高脂肪食。＊＊  ｐ＜０．０１  ｖｓ  ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｎｕｌｌ  固形飼料、＊＊＊  ｐ＜０．００１  ｖｓ  ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｎｕｌｌ  固形飼料、＄＄  ｐ＜０．０１  ｖｓ  ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｎｕｌｌ  ＨＦＤ、＄＄＄  ｐ＜０．００１  ｖｓ  ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｎｕｌｌ  ＨＦＤ。
【０１９８】
図３．  ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｏｕｂｌｅｍｉＲＴベクターをｅＷＡＴ内に処置したＣ５７Ｂｌ６マウスにおけるエネルギー消費およびインスリン感受性の向上。（Ａ−Ｂ）ＵＣＰ１（Ａ）およびＤｉｏ２（Ｂ）の発現レベル。ｉＷＡＴ中のＵＣＰ１およびＤｉｏ２の発現レベルをＲＴｑＰＣＲにより測定し、Ｒｐｌｐ０値で正規化した（ｎ＝７動物／群）。（Ｃ）エネルギー代謝。エネルギー消費（ＥＥ）は間接的開路熱量計で測定した。酸素消費および二酸化炭素産生を同時にモニターした。データは、ＡＡＶ投与の９週後、明サイクル（基本状態）および暗サイクル（活動期）の間に取得し、体重で調整した（ｎ＝８〜１１動物／群）。（Ｄ）肝臓トリグリセリド含量（ｎ＝８〜１０動物／群）。（Ｅ−Ｆ）血清トリグリセリド（Ｅ）およびコレステロール（Ｆ）レベル（ｎ＝８〜１１動物／群）。（Ｇ）腹腔内インスリン負荷試験。マウスに０．７５Ｕインスリン／ｋｇ体重の腹腔内注射を与え、指し示された時点において血中グルコースレベルを測定した（ｎ＝６〜１１動物／群）。試験は、ＡＡＶ投与の１１週後に実施した。（Ｈ）空腹時インスリン循環レベル。特に指示がない限り、分析は、１０１２ｖｇのＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｏｕｂｌｅｍｉＲＴまたはＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｎｕｌｌベクターのｅＷＡＴ内投与１４週後に実施した。結果は平均値±ＳＥＭとして表現される。ＨＦＤ、高脂肪食。ＴＧ、トリグリセリド。Ｃｈｏｌ、コレステロール。＊  ｐ＜０．０５  ｖｓ  ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｎｕｌｌ  固形飼料、＊＊  ｐ＜０．０１  ｖｓ  ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｎｕｌｌ  固形飼料、＊＊＊  ｐ＜０．００１  ｖｓ  ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｎｕｌｌ  固形飼料、＄  ｐ＜０．０５  ｖｓ  ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｎｕｌｌ  ＨＦＤ、＄＄  ｐ＜０．０１  ｖｓ  ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｎｕｌｌ  ＨＦＤ、＄＄＄  ｐ＜０．００１  ｖｓ  ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｎｕｌｌ  ＨＦＤ。
【０１９９】
図４．  ｏｂ／ｏｂマウスにおけるＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｍｉＲＴベクターのｅＷＡＴ内投与による肥満の回復。（Ａ）代謝組織中のＦＧＦ２１の発現レベル。ｏｂ／ｏｂマウスのｅＷＡＴ、ｉＷＡＴ、ｉＢＡＴおよび肝臓中のコドン最適化されたマウスＦＧＦ２１コーディング配列の発現レベルをＲＴｑＰＣＲにより測定し、Ｒｐｌｐ０値で正規化した。（Ｂ）ＦＧＦ２１の循環レベル。（Ｃ−Ｄ）体重（Ｃ）および体重増加（Ｄ）の進展。体重は毎週測定した。（Ｅ）組織の重量。ＡＡＶベクターをｅＷＡＴ内に処置したｏｂ／ｏｂマウスのｅＷＡＴ、ｉＷＡＴ、ｒＷＡＴ、ｍＷＡＴ、ｉＢＡＴおよび肝臓の重量。分析は、１０１０ｖｇ、５×１０１０ｖｇ、２×１０１１ｖｇもしくは１０１２ｖｇのＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｏｕｂｌｅｍｉＲＴまたは１０１２ｖｇのＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｎｕｌｌベクターのｅＷＡＴ内投与１６週後に実施した。結果は平均値±ＳＥＭとして表現される。ｎ＝７〜８動物／群。ＮＤ、検出されず。ＡＵ、任意単位。ｅＷＡＴ、精巣上体白色脂肪組織。ｉＷＡＴ、鼠径部白色脂肪組織。ｒＷＡＴ、後腹膜白色脂肪組織。ｍＷＡＴ、腸間膜白色脂肪組織。ｉＢＡＴ  肩甲骨間褐色脂肪組織。＊  ｐ＜０．０５  ｖｓ  ＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｎｕｌｌ、＊＊  ｐ＜０．０１  ｖｓ  ＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｎｕｌｌ、＊＊＊  ｐ＜０．００１  ｖｓ  ＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｎｕｌｌ。
【０２００】
図５．  ＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｏｕｂｌｅｍｉＲＴベクターをｅＷＡＴ内に処置したｏｂ／ｏｂマウスにおけるインスリン感受性の改善。（Ａ）腹腔内インスリン負荷試験。ｏｂ／ｏｂマウスに０．７５Ｕインスリン／ｋｇ体重の腹腔内注射を与え、指し示された時点において血中グルコースレベルを測定した。試験は、ＡＡＶ投与の９週後に実施した。（Ｂ）ＡＡＶ投与２月後の空腹時インスリン循環レベル。結果は平均値±ＳＥＭとして表現され、ｎ＝７〜８動物／群である。＊  ｐ＜０．０５  ｖｓ  ＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｎｕｌｌ、＊＊  ｐ＜０．０１  ｖｓ  ＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｎｕｌｌ、＊＊＊  ｐ＜０．００１  ｖｓ  ＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｎｕｌｌ。
【０２０１】
図６．  ｏｂ／ｏｂマウスにおけるＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１−ベクターの静脈内投与による肥満の回復およびグルコース代謝の好転。（Ａ）ＡＡＶ−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターの略図。発現カセットは、ヒトα１−アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーターおよびコドン最適化されたマウスＦＧＦ２１コーディング配列を含有した。ＡＡＶ２からのＩＴＲが発現カセットに隣接した。略図は縮尺どおりではない。ｐＡ：ｐｏｌｙＡ。（Ｂ）ＦＧＦ２１の発現レベル。ｏｂ／ｏｂマウスの肝臓中のコドン最適化されたマウスＦＧＦ２１コーディング配列の発現レベルをＲＴｑＰＣＲにより測定し、Ｒｐｌｐ０値で正規化した。（Ｃ）ＦＧＦ２１の循環レベル。（Ｄ−Ｅ）体重（Ｃ）および体重増加（Ｄ）の進展。体重は毎週測定した。（Ｆ）動物の代表的イメージ。（Ｇ）組織の重量。ＡＡＶベクターを静脈内に処置したｏｂ／ｏｂマウスのｅＷＡＴ、ｉＷＡＴ、ｒＷＡＴ、ｍＷＡＴ、ｉＢＡＴおよび肝臓の重量。（Ｈ）腹腔内インスリン負荷試験。ｏｂ／ｏｂマウスに０．７５Ｕインスリン／ｋｇ体重の腹腔内注射を与え、指し示された時点において血中グルコースレベルを測定した。試験は、ＡＡＶ投与の９週後に実施した。（Ｉ）ＡＡＶ投与３月後の空腹時インスリン循環レベル。特に指示がない限り、分析は、１０１１ｖｇもしくは５×１０１１ｖｇのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１または５×１０１１ｖｇのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌベクターの静脈内投与２０週後に実施した。結果は平均値±ＳＥＭとして表現される。ｎ＝９〜１０動物／群。ＮＤ、検出されず。ＡＵ、任意単位。ｅＷＡＴ、精巣上体白色脂肪組織。ｉＷＡＴ、鼠径部白色脂肪組織。ｒＷＡＴ、後腹膜白色脂肪組織。ｍＷＡＴ、腸間膜白色脂肪組織。ｉＢＡＴ  肩甲骨間褐色脂肪組織。＊  ｐ＜０．０５  ｖｓ  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌ、＊＊  ｐ＜０．０１  ｖｓ  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌ、＊＊＊  ｐ＜０．００１  ｖｓ  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌ。
【０２０２】
図７．  ＨＦＤ給餌Ｃ５７ｂｌ６マウスにおけるＡＡＶ−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターの静脈内投与による肥満の長期的回復。（Ａ）ＦＧＦ２１の循環レベル。（Ｂ−Ｃ）体重（Ｃ）および体重増加（Ｄ）の進展。体重は毎週測定した。分析は、１０１０ｖｇもしくは５×１０１０ｖｇのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１または５×１０１０ｖｇのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌベクターの静脈内投与５２週後に実施した。結果は平均値±ＳＥＭとして表現され、ｎ＝９〜１２動物／群である。＊＊＊  ｐ＜０．００１  ｖｓ  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌ  固形飼料、＄＄  ｐ＜０．０１  ｖｓ  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌ  ＨＦＤ、＄＄＄  ｐ＜０．００１  ｖｓ  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌ  ＨＦＤ。
【０２０３】
図８．  ＨＦＤ給餌Ｃ５７Ｂｌ６マウスにおけるＡＡＶ−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターの静脈内投与によるエネルギー消費およびインスリン感受性の長期的向上。（Ａ）エネルギー代謝。エネルギー消費（ＥＥ）は間接的開路熱量計で測定した。酸素消費および二酸化炭素産生を同時にモニターした。データは、ＡＡＶ投与の４週後、明サイクル（基本状態）および暗サイクル（活動期）の間に取得し、体重で調整した。（Ｂ）腹腔内インスリン負荷試験。Ｃ５７Ｂｌ６マウスに０．７５Ｕインスリン／ｋｇ体重の腹腔内注射を与え、指し示された時点において血中グルコースレベルを測定した。試験は、ＡＡＶ投与の７週後に実施した。（Ｃ）空腹時および給餌時のインスリン循環レベル。結果は平均値±ＳＥＭとして表現され、ｎ＝９〜１２動物／群である。ＨＦＤ、高脂肪食。＊  ｐ＜０．０５  ｖｓ  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌ  固形飼料、＊＊  ｐ＜０．０１  ｖｓ  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌ  固形飼料、＊＊＊  ｐ＜０．００１  ｖｓ  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌ  固形飼料、＄  ｐ＜０．０５  ｖｓ  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌ  ＨＦＤ、＄＄  ｐ＜０．０１  ｖｓ  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌ  ＨＦＤ、＄＄＄  ｐ＜０．００１  ｖｓ  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌ  ＨＦＤ。
【０２０４】
図９．  老齢ＨＦＤ給餌マウスにおけるＡＡＶ−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターの静脈内投与による肥満の回復。（Ａ）ＦＧＦ２１の循環レベル。（Ｂ−Ｃ）体重（Ｂ）および体重増加（Ｃ）の進展。体重は毎週測定した。分析は、１０１０ｖｇ、２×１０１０ｖｇもしくは５×１０１０ｖｇのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１または５×１０１０ｖｇのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌベクターの静脈内投与２１週後に実施した。結果は平均値±ＳＥＭとして表現され、ｎ＝７〜８動物／群である。ＨＦＤ、高脂肪食。＊＊＊  ｐ＜０．０５  ｖｓ  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌ  固形飼料、＄  ｐ＜０．０５  ｖｓ  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌ  ＨＦＤ、＄＄  ｐ＜０．０１  ｖｓ  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌ  ＨＦＤ。＄＄＄  ｐ＜０．００１  ｖｓ  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌ  ＨＦＤ。
【０２０５】
図１０．  老齢ＨＦＤ給餌マウスにおけるＡＡＶ−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターの静脈内投与によるエネルギー消費およびインスリン感受性の向上。（Ａ）エネルギー代謝。エネルギー消費（ＥＥ）は間接的開路熱量計で測定した。酸素消費および二酸化炭素産生を同時にモニターした。データは、ＡＡＶ投与の６週後、明サイクル（基本状態）および暗サイクル（活動期）の間に取得し、体重で調整した。（Ｂ）腹腔内インスリン負荷試験。老齢Ｃ５７Ｂｌ６マウスに０．７５Ｕインスリン／ｋｇ体重の腹腔内注射を与え、指し示された時点において血中グルコースレベルを測定した。試験は、ＡＡＶ投与の９週後に実施した。（Ｃ）空腹時および給餌時のインスリン循環レベル。結果は平均値±ＳＥＭとして表現され、ｎ＝７〜８動物／群である。ＨＦＤ、高脂肪食。＊＊  ｐ＜０．０１  ｖｓ  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌ  固形飼料、＊＊＊  ｐ＜０．００１  ｖｓ  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌ  固形飼料、＄  ｐ＜０．０５  ｖｓ  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌ  ＨＦＤ、＄＄  ｐ＜０．０１  ｖｓ  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌ  ＨＦＤ、＄＄＄  ｐ＜０．００１  ｖｓ  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌ  ＨＦＤ。
【０２０６】
図１１．  Ｃ５７Ｂｌ６マウスにおけるＡＡＶ−ＣＭＶ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターの筋肉内投与による体重減少。（Ａ）ＡＡＶ−ＣＭＶ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターの略図。発現カセットは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよびコドン最適化されたマウスＦＧＦ２１コーディング配列を含有した。ＡＡＶ２からのＩＴＲが発現カセットに隣接した。略図は縮尺どおりではない。ｐＡ：ｐｏｌｙＡ。（Ｂ）循環ＦＧＦ２１レベル。（Ｃ−Ｄ）体重（Ｃ）および体重増加（Ｄ）の進展。体重は毎週測定した。結果は平均値±ＳＥＭとして表現される。ｎ＝６〜７動物／群。＊  ｐ＜０．０５  ｖｓ  ＡＡＶ１−ＣＭＶ−ｎｕｌｌ、＊＊  ｐ＜０．０１  ｖｓ  ＡＡＶ１−ＣＭＶ−ｎｕｌｌ。図中のＦＧＦ２１の標識は、この図のレジェンドに従ってｍｏＦＧＦ２１を指す。
【０２０７】
図１２．  ヒトＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列のコドン最適化によるＦＧＦ２１タンパク質産生の増加。（Ａ）野生型ｈＦＧＦ２１またはコドン最適化されたヒトＦＧＦ２１配列の３つの異なるバージョンをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の培養培地中のｈＦＧＦ２１タンパク質レベル。結果は平均値±ＳＥＭとして表現される。ｎ＝３ウェル／群。ＮＤ、検出されず。＊  ｐ＜０．０５  ｖｓ  非トランスフェクト細胞。
【０２０８】
図１３．  ｏｂ／ｏｂマウスにおけるＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｍｉＲＴベクターのｅＷＡＴ内投与。
【０２０９】
Ａ、Ｂ  ｎｕｌｌまたはＦＧＦ２１をコードするＡＡＶ８ベクターのいずれかを試験する全ての用量でｅＷＡＴ内注射したｏｂ／ｏｂ動物から得られた（Ａ）ｅＷＡＴおよび（Ｂ）肝臓組織切片のヘマトキシリン−エオシン染色の代表的イメージ。スケールバー：ｅＷＡＴについて１００μｍ、肝臓について２００μｍ。
【０２１０】
Ｃ  給餌状態での血糖。
【０２１１】
Ｄ  ＡＡＶ後３月の給餌状態での血中インスリン。
【０２１２】
図中のＦＧＦ２１の標識はｍｏＦＧＦ２１を指す。
【０２１３】
データの情報：全ての値は平均値±ＳＥＭとして表現される。（Ａ、Ｂ）においてｎ＝６〜９動物／群。（Ｃ−Ｈ）においてｎ＝４〜８動物／群。（Ｉ）においてｎ＝６〜８動物／群。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１  対  Ｎｕｌｌ注射群。
【０２１４】
図１４．  ｏｂ／ｏｂマウスのｅＷＡＴへのＦＧＦ２１遺伝子導入の影響。
【０２１５】
Ａ  １１週齢時にＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｎｕｌｌベクターまたはＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｍｉＲＴベクターのいずれかを４つの異なる用量（１×１０１０、５×１０１０、２×１０１１、１×１０１２ｖｇ／マウス）でｅＷＡＴ内注射された２５週齢のｏｂ／ｏｂ動物における血清アディポネクチンレベル。
【０２１６】
Ｂ  （Ａ）におけるものと同じ動物のマクロファージマーカーＦ４／８０のｑＲＴ−ＰＣＲによる発現定量
Ｃ  ＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｍｉＲＴベクターを受けたｏｂ／ｏｂマウスからのｅＷＡＴ切片の、マクロファージ特異的マーカーＭａｃ２についての免疫染色の代表的イメージ。ｎ＝４〜８／群。スケールバー：２００μｍ。
【０２１７】
Ｄ  全てのｅＷＡＴ内処置群における肝臓の重量。
【０２１８】
Ｅ、Ｆ  （Ａ）におけるものと同じコホートにおける給餌状態での肝臓トリグリセリドおよびコレステロール含量。
【０２１９】
図中のＦＧＦ２１の標識は、この図のレジェンドに従ってｍｏＦＧＦ２１を指す。
【０２２０】
データの情報：全ての値は平均値±ＳＥＭとして表現される。（Ａ、Ｂ、Ｄ）においてｎ＝４〜８動物／群。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１  対  ｎｕｌｌ注射ｏｂ／ｏｂ群。
【０２２１】
図１５．  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターで処置されたｏｂ／ｏｂマウスにおける肥満の低減およびインスリン感受性の改善。
【０２２２】
Ａ  ｎｕｌｌまたはＦＧＦ２１をコードするＡＡＶベクターのいずれかを１×１０１１または５×１０１１ｖｇ／マウスで注射されたｏｂ／ｏｂ動物から得られたｅＷＡＴ組織切片のヘマトキシリン−エオシン染色の代表的イメージ。
【０２２３】
Ｂ  全ての群における血清アディポネクチンレベル。
【０２２４】
Ｃ  ｎｕｌｌまたはＦＧＦ２１をコードするＡＡＶベクターのいずれかを１×１０１１または５×１０１１ｖｇ／マウスで注射されたｏｂ／ｏｂ動物から得られた肝臓組織切片のヘマトキシリン−エオシン染色の代表的イメージ。
【０２２５】
Ｄ  給餌時血中グルコースレベル。
【０２２６】
Ｅ  ＡＡＶ後５月での給餌時血清インスリンレベル。
【０２２７】
図中のＦＧＦ２１の標識は、この図のレジェンドに従ってｍｏＦＧＦ２１を指す。
【０２２８】
データの情報：全てのデータは平均値±ＳＥＭで表現される。（Ａ−Ｃ、Ｅ、Ｇ−Ｈ）においてｎ＝９〜１０動物／群。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１  対  ｎｕｌｌ注射ｏｂ／ｏｂ群。
【０２２９】
図１６．  ｏｂ／ｏｂマウスに対するＦＧＦ２１肝臓遺伝子導入の効果。
【０２３０】
Ａ  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターを受けたｏｂ／ｏｂマウスからのｅＷＡＴ切片における、マクロファージ特異的マーカーＭａｃ２についての免疫組織化学。スケールバー：５００μｍ。
【０２３１】
Ｂ、Ｃ  同じマウスコホートにおける炎症マーカーＦ４／８０（Ｂ）およびＴＮＦ−α（Ｃ）のｑＲＴ−ＰＣＲによる発現定量。
【０２３２】
Ｄ、Ｅ  （Ａ）におけるものと同じ実験群に属する動物から得られた肝臓の重量（Ｄ）および代表的イメージ（Ｅ）。
【０２３３】
Ｆ、Ｇ  （Ａ）におけるものと同じコホートにおける給餌状態での肝臓トリグリセリドおよびコレステロール含量。
【０２３４】
図中のＦＧＦ２１の標識は、この図のレジェンドに従ってｍｏＦＧＦ２１を指す。
【０２３５】
データの情報：全ての値は平均値±ＳＥＭとして表現される。（Ｂ、Ｄ−Ｆ、Ｈ−Ｉ）においてｎ＝９〜１０動物／群。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１  対  ｎｕｌｌ注射ｏｂ／ｏｂ群。
【０２３６】
図１７．  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１処置は、ｏｂ／ｏｂマウスの脂肪組織においてグルコース取り込みおよび熱産生に関与する遺伝子の発現を増加させる。
【０２３７】
Ａ、Ｂ  ２月齢時にＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌベクターまたはＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターのいずれかを注射されたｏｂ／ｏｂマウスにおける肝臓ＰＥＰＣＫおよびＧ６ＰａｓｅのｑＲＴ−ＰＣＲによる発現定量。
【０２３８】
Ｃ−Ｆ  （Ａ）におけるものと同じ動物における、ｅＷＡＴ、ｉＷＡＴおよびｉＢＡＴ中のＧＬＵＴ１（Ｃ）、ＧＬＵＴ４（Ｄ）、ＨＫＩ（Ｅ）およびＨＫＩＩ（Ｆ）のｑＲＴ−ＰＣＲによる発現定量。
【０２３９】
Ｇ  （Ａ）におけるものと同じコホートにおける、ｉＢＡＴ中のＵＣＰ１の相対的発現量。
【０２４０】
図中のＦＧＦ２１の標識は、この図のレジェンドに従ってｍｏＦＧＦ２１を指す。
【０２４１】
データの情報：全ての値は平均値±ＳＥＭとして表現される。（Ａ−Ｇ）においてｎ＝９〜１０動物／群。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１  対  ｎｕｌｌ注射ｏｂ／ｏｂ群。
【０２４２】
図１８．  ＡＡＶ８媒介性の肝臓ＦＧＦ２１遺伝子導入はＨＦＤ誘発性肥満に対抗する。
【０２４３】
Ａ  若年成体（上パネル）または成体（下パネル）としてＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターで処置されたマウスから得られた精巣上体（ｅＷＡＴ）、鼠径部（ｉＷＡＴ）および後腹膜（ｒＷＡＴ）白色脂肪組織貯蔵部、肝臓および四頭筋の重量。
【０２４４】
Ｂ  ベクター投与後の異なる時点でのＦＧＦ２１の循環レベル。
【０２４５】
図中のＦＧＦ２１の標識は、この図のレジェンドに従ってｍｏＦＧＦ２１を指す。
【０２４６】
データの情報：全ての値は平均値±ＳＥＭとして表現される。（Ａ−Ｄ）においてｎ＝７〜１０動物／群。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１  対  固形飼料給餌Ｎｕｌｌ注射群。＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１および＃＃＃Ｐ＜０．００１  対  ＨＦＤ給餌Ｎｕｌｌ注射群。ＨＦＤ、高脂肪食。
【０２４７】
図１９．  肝臓へのＦＧＦ２１遺伝子導入はＨＦＤ誘発性肥満に対抗する。
【０２４８】
Ａ、Ｂ  若年成体（Ａ）または成体（Ｂ）において実施された試験の全ての実験群に属する動物の代表的イメージ。
【０２４９】
Ｃ  若年成体（左）または成体（右）としていくつかの用量のＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１で処置された動物から屠殺時に得られた精巣上体白色脂肪（ｅＷＡＴ）パッドの代表的イメージ。
【０２５０】
Ｄ  若年成体（左）または成体（右）として処置された動物から得られた肝臓の代表的イメージ。
【０２５１】
Ｅ  若年成体または成体として処置された動物の肝臓中のＡＡＶに由来するＦＧＦ２１発現。ｑＰＣＲは、コドン最適化されたマウスＦＧＦ２１（ｃｏＦＧＦ２１）のコーディング配列を特異的に検出するプライマーを使用して実施した。
【０２５２】
図中のＦＧＦ２１の標識は、この図のレジェンドに従ってｍｏＦＧＦ２１を指す。
【０２５３】
データの情報：全ての値は平均値±ＳＥＭとして表現される。（Ｅ）においてｎ＝７〜１０動物／群。ＨＦＤ、高脂肪食。ＮＤ、検出されず。
【０２５４】
図２０．  ｉＢＡＴおよびｉＷＡＴにおけるＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１媒介性のエネルギー消費増加および脂肪蓄積減少。
【０２５５】
Ａ  約２月齢からＨＦＤ給餌に供され、２月後にｎｕｌｌまたはＦＧＦ２１をコードするベクターのいずれかで処置された動物（若年成体）におけるオープンフィールド試験を通じた自発運動活性の査定。
【０２５６】
Ｂ  若年成体（左）または成体（右）として処置された動物からのｉＢＡＴ組織切片のヘマトキシリン−エオシン染色。
【０２５７】
Ｃ  （Ａ）におけるものと同じ動物コホートからのｉＢＡＴ中のＵＣＰ１含量のウエスタンブロット分析。代表的イムノブロットが示される（左）。ヒストグラムは２つの異なるイムノブロットの濃度測定分析を描写する（右）。
【０２５８】
Ｄ  若年成体（左）または成体（右）として処置された動物からのｉＷＡＴ組織切片のヘマトキシリン−エオシン染色。
【０２５９】
Ｅ  若年成体または成体としてＨＦＤ給餌を開始してＦＧＦ２１ベクターを受けた動物群における、ｉＷＡＴ中のＰｈｏｓｐｈｏ１のｑＲＴ−ＰＣＲによる発現定量。
【０２６０】
図中のＦＧＦ２１の標識は、この図のレジェンドに従ってｍｏＦＧＦ２１を指す。
【０２６１】
データの情報：全ての値は平均値±ＳＥＭとして表現される。（Ａ−Ｃ）においてｎ＝７〜１０動物／群。（Ｅ）においてｎ＝４動物／群。（Ｇ）においてｎ＝７〜１０動物／群。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１  対  固形飼料給餌Ｎｕｌｌ注射群。＃Ｐ＜０．０５および＃＃＃Ｐ＜０．００１  対  ＨＦＤ給餌Ｎｕｌｌ注射群。ＨＦＤ、高脂肪食。
【０２６２】
図２１．  肝臓への遺伝子導入後１０月でのエネルギー消費。
【０２６３】
Ａ  ２月齢時にＨＦＤ給餌を開始した動物コホートにおけるエネルギー消費を、ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌまたはＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクター送達後１０月で測定した。データは、明サイクルおよび暗サイクルの間に取得した。
【０２６４】
Ｂ  同じ動物コホートからのｉＷＡＴ中のＵＣＰ１含量のウエスタンブロット分析。代表的イムノブロットが示される（左）。グラフは２つの異なるイムノブロットの濃度測定分析を示す（右）。
【０２６５】
Ｃ  若年成体または成体としてＨＦＤ給餌を開始してＦＧＦ２１ベクターを受けた動物群における、ｉＷＡＴ中のＳｅｒｃａ２ｂおよびＲｙＲ２の相対的発現量。
【０２６６】
図中のＦＧＦ２１の標識は、この図のレジェンドに従ってｍｏＦＧＦ２１を指す。
【０２６７】
データの情報：全ての値は平均値±ＳＥＭとして表現される。（Ａ）においてｎ＝７〜１０動物／群。（Ｂ）においてｎ＝４動物／群。（Ｃ）においてｎ＝７〜１０動物／群。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１  対  固形飼料給餌Ｎｕｌｌ注射群。＃＃＃Ｐ＜０．００１  対  ＨＦＤ給餌Ｎｕｌｌ注射群。ＨＦＤ、高脂肪食。
【０２６８】
図２２．  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１媒介性の島過形成の回復。
【０２６９】
Ａ  若年成体としてＨＦＤ給餌を開始してＦＧＦ２１ベクターを受けた動物群における空腹時グルカゴンレベル。
【０２７０】
Ｂ  成体としてＨＦＤ給餌を開始してＦＧＦ２１ベクターを受けた動物群におけるβ細胞量。
【０２７１】
Ｃ  成体として５×１０１０ｖｇ／マウスのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１を受けた動物からの膵臓切片におけるインスリンに対する免疫染色の代表的イメージ。スケールバー：４００μｍ。挿入図スケールバー：１００μｍ。
【０２７２】
Ｄ  若年成体（上段パネル）または成体（下段パネル）として５×１０１０ｖｇ／マウスのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１を受けた動物からの膵臓切片におけるインスリン（濃い灰色）およびグルカゴン（薄い灰色）に対する二重免疫染色の代表的イメージ。スケールバー：１００μｍ。
【０２７３】
図中のＦＧＦ２１の標識は、この図のレジェンドに従ってｍｏＦＧＦ２１を指す。
【０２７４】
データの情報：全ての値は平均値±ＳＥＭとして表現される。（Ａ−Ｃ）においてｎ＝７〜１０動物／群。（Ｄ）においてｎ＝４〜５動物／群。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１  対  固形飼料給餌Ｎｕｌｌ注射群。＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１および＃＃＃Ｐ＜０．００１  対  ＨＦＤ給餌Ｎｕｌｌ注射群。ＨＦＤ、高脂肪食。
【０２７５】
図２３．  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１での処置は耐糖能を改善する。
【０２７６】
Ａ  耐糖能は、若年成体としてＨＦＤ給餌を開始してＦＧＦ２１ベクターを受けたマウス群において、グルコースの腹腔内注射（２ｇ／ｋｇ体重）後に試験した。
【０２７７】
Ｂ  （Ａ）中に示されるグルコース負荷試験の際の血清インスリンレベル。
【０２７８】
データの情報：全てのデータは平均値±ＳＥＭで表現される。（Ａ−Ｄ）においてｎ＝７〜１０動物／群。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１  対  固形飼料給餌Ｎｕｌｌ注射群。＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１および＃＃＃Ｐ＜０．００１  対  ＨＦＤ給餌Ｎｕｌｌ注射群。ＨＦＤ、高脂肪食。
【０２７９】
図２４．  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１処置によるＷＡＴ肥大および炎症の回復。
【０２８０】
Ａ  若年成体（左パネル）または成体（右パネル）として固形飼料またはＨＦＤを給餌してＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌまたは５×１０１０ｖｇ／マウスのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターのいずれかを投与した動物からのｅＷＡＴのヘマトキシリン−エオシン染色の代表的イメージ。ＨＦＤ給餌ｎｕｌｌ注射マウスの脂肪細胞はより大きかったが、ＨＦＤ給餌ＦＧＦ２１処置動物の脂肪細胞はサイズが低減した。スケールバー：１００μｍ。
【０２８１】
Ｂ  若年成体または成体として処置された動物におけるＷＡＴ脂肪細胞の面積の形態計測分析。
【０２８２】
Ｃ、Ｄ  アディポネクチン（Ｃ）およびレプチン（Ｄ）の循環レベル。
【０２８３】
Ｅ  成体として５×１０１０ｖｇ／マウスのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１を受けた動物からのｅＷＡＴ切片におけるマクロファージ特異的マーカーＭａｃ２についての免疫組織化学。顕微鏡写真は、ＨＦＤ給餌ｎｕｌｌ注射動物のｅＷＡＴにおける王冠様構造の存在を示すが（矢印および挿入図）、ＨＦＤ給餌ＦＧＦ２１処置マウスのｅＷＡＴにはない。スケールバー：２００μｍおよび５０μｍ（挿入図）。
【０２８４】
Ｆ−Ｈ  成体としてＨＦＤ給餌を開始してＦＧＦ２１ベクターを受けた動物群における炎症マーカーＦ４／８０（Ｆ）、ＩＬ１−β（Ｇ）およびＴＮＦ−α（Ｈ）のｑＲＴ−ＰＣＲによる発現定量。
【０２８５】
図中のＦＧＦ２１の標識は、この図のレジェンドに従ってｍｏＦＧＦ２１を指す。
【０２８６】
データの情報：全ての値は平均値±ＳＥＭとして表現される。（Ｂ）においてｎ＝４動物／群。（Ｆ−Ｈ）においてｎ＝７〜１０動物／群。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１  対  固形飼料給餌Ｎｕｌｌ注射群。＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１および＃＃＃Ｐ＜０．００１  対  ＨＦＤ給餌Ｎｕｌｌ注射群。ＨＦＤ、高脂肪食。
【０２８７】
図２５．  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１処置動物における脂肪細胞のサイズおよび炎症。
【０２８８】
Ａ  若年成体（上グラフ）または成体（下グラフ）として固形飼料またはＨＦＤ給餌を開始してＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌまたは５×１０１０ｖｇ／マウスのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターのいずれかを受けた動物群における脂肪細胞面積の頻度分布。
【０２８９】
Ｂ  若年成体として試験を開始した動物のｅＷＡＴにおけるＭａｃ２免疫組織化学。ＨＦＤ給餌ｎｕｌｌ注射マウスのｅＷＡＴにおけるマクロファージ浸潤により形成された王冠様構造が矢印により指し示される。スケールバー：２００μｍおよび５０μｍ（挿入図）。
【０２９０】
Ｃ−Ｅ  （Ｂ）におけるものと同じ動物コホートにおける、炎症マーカーＦ４／８０、ＣＤ６８およびＴＮＦ−αのｑＲＴ−ＰＣＲによる相対的発現量。
【０２９１】
図中のＦＧＦ２１の標識は、この図のレジェンドに従ってｍｏＦＧＦ２１を指す。
【０２９２】
データの情報：全ての値は平均値±ＳＥＭとして表現される。（Ａ）においてｎ＝４動物／群。（Ｃ−Ｅ）においてｎ＝７〜１０動物／群。＊＊＊Ｐ＜０．００１  対  固形飼料給餌Ｎｕｌｌ注射群。＃＃＃Ｐ＜０．００１  対  ＨＦＤ給餌Ｎｕｌｌ注射群。ＨＦＤ、高脂肪食。
【０２９３】
図２６．  ＦＧＦ２１をコードするベクターでの処置は、脂肪肝および肝臓の炎症を回復させる。
【０２９４】
Ａ  固形飼料またはＨＦＤを給餌してＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌまたは５×１０１０ｖｇ／マウスのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターのいずれかを投与した動物から得られた肝臓切片のヘマトキシリン−エオシン染色の代表的イメージ。ＨＦＤは肝臓中の脂肪滴蓄積を明らかに誘導し、これは若年成体および成体のいずれにおいてもＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１処置により回復した。スケールバー：１００μｍ。
【０２９５】
Ｂ、Ｃ  同じ動物コホートにおける給餌時の肝臓トリグリセリドおよびコレステロール含量。
【０２９６】
Ｄ  ＨＦＤを給餌してＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌまたは５×１０１０ｖｇ／マウスのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターを受けた動物からの肝臓切片のマクロファージ特異的マーカーＭａｃ−２についての免疫染色。矢印は王冠様構造の存在を指し示す。スケールバー：２００μｍおよび５０μｍ（挿入図）。
【０２９７】
図中のＦＧＦ２１の標識は、この図のレジェンドに従ってｍｏＦＧＦ２１を指す。
【０２９８】
データの情報：全ての値は平均値±ＳＥＭとして表現される。（Ｂ−Ｃ）においてｎ＝７〜１０動物／群。＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１  対  固形飼料給餌Ｎｕｌｌ注射群。＃＃Ｐ＜０．０１  対  ＨＦＤ給餌Ｎｕｌｌ注射群。ＨＦＤ、高脂肪食。
【０２９９】
図２７．  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１媒介性の肝線維症の好転。
【０３００】
５×１０１０ｖｇ／マウスのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌまたはＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターのいずれかを受けたＨＦＤ給餌動物におけるマッソントリクローム染色を通じた肝線維症の分析。ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１処置（右パネル）は、ｎｕｌｌベクターで処置された動物（左パネル）において容易に検出可能なコラーゲン線維（青色）の検出を著しく減少させた。スケールバー：５０μｍ。図中のＦＧＦ２１の標識は、この図のレジェンドに従ってｍｏＦＧＦ２１を指す。
【０３０１】
図２８．  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１処置は肝線維症を改善する。
【０３０２】
Ａ  ５×１０１０ｖｇ／マウスのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌまたはＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターのいずれかを受けたＨＦＤ給餌動物におけるピクロシリウス染色を通じた肝線維症の分析。ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１処置（右パネル）は、ｎｕｌｌベクターで処置された動物（左パネル）において容易に検出可能なコラーゲン線維（黒色）の検出を著しく減少させた。スケールバー：５０μｍ。
【０３０３】
Ｂ、Ｃ  若年成体（Ｂ）または成体（Ｃ）としてＨＦＤ給餌を開始してＦＧＦ２１ベクターを受けた動物群における、肝臓中のコラーゲン１のｑＲＴ−ＰＣＲによる発現定量。
【０３０４】
図中のＦＧＦ２１の標識は、この図のレジェンドに従ってｍｏＦＧＦ２１を指す。
【０３０５】
データの情報：全ての値は平均値±ＳＥＭとして表現される。（Ｂ−Ｃ）においてｎ＝７〜１０動物／群。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１  対  固形飼料給餌Ｎｕｌｌ注射群。＃Ｐ＜０．０５および＃＃＃Ｐ＜０．００１  対  ＨＦＤ給餌Ｎｕｌｌ注射群。ＨＦＤ、高脂肪食。
【０３０６】
図２９．  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１処置動物において骨異常は認められなかった。骨に対するＦＧＦ２１遺伝子導入の長期的効果を、若年成体または成体として最も高い用量（５×１０１０ｖｇ／マウス）のＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターで処置されたＨＦＤ給餌マウスとｎｕｌｌ注射の固形飼料またはＨＦＤ給餌動物との比較により試験した。
【０３０７】
Ａ  鼻先から尾根部までの全長。
【０３０８】
Ｂ  脛骨長。
【０３０９】
Ｃ−Ｏ  ｎｕｌｌまたはＦＧＦ２１をコードするＡＡＶベクターのいずれかを投与したＨＦＤ給餌マウスから屠殺時、すなわち動物が１８月齢の時に得られた脛骨の骨端（Ｃ−Ｊ）および骨幹（Ｋ−Ｏ）のマイクロコンピュータ断層撮影（μＣＴ）分析。
【０３１０】
Ｐ、Ｑ  ＥＬＩＳＡにより測定された循環ＩＧＦＢＰ１（Ｐ）およびＩＧＦ１（Ｑ）のレベル。
【０３１１】
図中のＦＧＦ２１の標識は、この図のレジェンドに従ってｍｏＦＧＦ２１を指す。
【０３１２】
データの情報：全てのデータは平均値±ＳＥＭで表現される。（Ａ、Ｐ−Ｑ）においてｎ＝７〜１０動物／群。（Ｂ−Ｏ）においてｎ＝４動物／群。＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１  対  固形飼料給餌Ｎｕｌｌ注射群。ＨＦＤ、高脂肪食；ＢＭＤ、骨ミネラル密度；ＢＭＣ、骨ミネラル含量；ＢＶ、骨体積；ＢＶ／ＴＶ、骨体積／組織体積比；ＢＳ／ＢＶ、骨表面／骨体積比；Ｔｂ．Ｎ、骨梁数；Ｔｂ．Ｔｈ、骨梁幅；Ｔｂ．Ｓｐ、骨梁間隔。
【０３１３】
図３０．  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターで処置されたＣ５７Ｂｌ６マウスにおける血糖プロファイルの分析。血中グルコースレベルは給餌条件下で評価した。ＡＡＶ、５×１０１０ｖｇまたは２×１０１１ｖｇのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１（それぞれｎ＝１３および１５）または２×１０１１ｖｇのＡＡＶ８−ｎｕｌｌベクター（ｎ＝１５）のＩＶ投与。ＳＴＺ、ストレプトゾトシンでの処置（５×５０ｍｇ／ｋｇ）。結果は平均値＋ＳＥＭである。＊  ｐ＜０．０５；＊＊＊  ｐ＜０．００１  ｖｓ  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−Ｎｕｌｌ。図中のＦＧＦ２１の標識は、この図のレジェンドに従ってｍｏＦＧＦ２１を指す。
【０３１４】
図３１．  健常動物の骨格筋へのＦＧＦ２１の遺伝子導入。
【０３１５】
Ａ  ３×１０１１ｖｇ／マウスのＡＡＶ１−ＣＭＶ−ＮｕｌｌまたはＡＡＶ１−ＣＭＶ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターのいずれかを固形飼料食を給餌した健常動物の骨格筋に注射した４０週後に測定されたＦＧＦ２１の循環レベル。
【０３１６】
Ｂ  ＡＡＶ１−ＣＭＶ−ＮｕｌｌまたはＡＡＶ１−ＣＭＶ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターを筋肉内注射した健常動物の筋肉および肝臓中ののＡＡＶに由来するＦＧＦ２１発現。
【０３１７】
Ｃ  ４０週の追跡期間中の体重の進展。
【０３１８】
Ｄ  異なる筋肉、脂肪パッドおよび肝臓の組織湿重量。
【０３１９】
Ｅ、Ｆ  給餌状態での肝臓トリグリセリドおよびコレステロール含量。
【０３２０】
Ｇ  給餌時血清インスリンレベル。
【０３２１】
Ｈ  インスリン（０．７５ｕｎｉｔｓ／ｋｇ体重）の腹腔内注射を通じて査定され、開始時血中グルコースのパーセンテージとして表されるインスリン感受性。
【０３２２】
図中のＦＧＦ２１の標識は、この図のレジェンドに従ってｍｏＦＧＦ２１を指す。
【０３２３】
データの情報：全ての値は平均値±ＳＥＭとして表現される。（Ａ−Ｈ）においてｎ＝５−７動物／群。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１  対  Ｎｕｌｌ注射群。
【０３２４】
図３２．  ＡＡＶ１媒介性の骨格筋ＦＧＦ２１遺伝子導入はＨＦＤ誘発性肥満およびインスリン抵抗性に対抗する。
【０３２５】
Ａ、Ｂ  ＡＡＶ１−ＣＭＶ−ｍｏＦＧＦ２１で処置された動物の体重（Ａ）および体重増加（Ｂ）の進展。Ｃ５７Ｂｌ６マウスにＨＦＤを約１２週間給餌し、次いで３×１０１１ｖｇ／マウスのＡＡＶ１−ＣＭＶ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターを投与した。コントロールの肥満マウスおよびコントロールの固形飼料給餌マウスは３×１０１１ｖｇのＡＡＶ１−ＣＭＶ−ｎｕｌｌを受けた。
【０３２６】
Ｃ  ベクター投与後異なる時点でのＦＧＦ２１の循環レベル。
【０３２７】
Ｄ、Ｅ  （Ａ、Ｂ）におけるものと同じ動物群における空腹時血中グルコース（Ｄ）および給餌時血清インスリン（Ｅ）のレベル。
【０３２８】
Ｆ  インスリン感受性を、インスリン（０．７５ｕｎｉｔｓ／ｋｇ体重）の腹腔内注射後、全ての実験群において決定した。結果は、開始時血中グルコースレベルのパーセンテージとして算出した。
【０３２９】
図中のＦＧＦ２１の標識は、この図のレジェンドに従ってｍｏＦＧＦ２１を指す。
【０３３０】
データの情報：全ての値は平均値±ＳＥＭとして表現される。（Ａ−Ｆ）においてＨＦＤ給餌マウス  ｎ＝１０動物／群；固形飼料給餌マウス  ｎ＝５動物／群。＊＊＊Ｐ＜０．００１  対  ＨＦＤ給餌ｎｕｌｌ注射群。
【０３３１】
図３３．  ヒトＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列のコドン最適化によるＦＧＦ２１循環レベルのインビボでの増加。野生型ｈＦＧＦ２１またはコドン最適化されたヒトＦＧＦ２１配列の３つの異なるバリアントをコードするプラスミドをハイドロダイナミクス投与したＣ５７Ｂｌ６マウスにおけるｈＦＧＦ２１の循環レベル。結果は平均値±ＳＥＭとして表現される。ｎ＝９〜１０マウス／群。ＮＤ、検出されず。ネガティブコントロール、未処置マウス。＊  ｐ＜０．０５  ｖｓ  非処置マウス。
【０３３２】
図３４．  ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１、ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｏｕｂｌｅｍｉＲＴおよびＣＭＶ−ｍｏＦＧＦ２１発現カセットによるＦＧＦ２１発現レベルのインビトロでの増加。（Ａ）ＥＦ１ａプロモーターの制御下にあるＷＴのマウスＦＧＦ２１コーディング配列（ＥＦ１ａ−ｍＦＧＦ２１）またはＣＭＶプロモーターの制御下にあるコドン最適化されたマウスＦＧＦ２１コーディング配列（ＣＭＶ−ｍｏＦＧＦ２１）またはｍｉＲＴ１２２ａ配列の４個のタンデムリピートおよびｍｉＲＴ１配列の４個のタンデムリピートを伴った、ＣＡＧプロモーターの制御下にあるコドン最適化されたマウスＦＧＦ２１コーディング配列（ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｏｕｂｌｅｍｉＲＴ）をコードするプラスミドをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞におけるＦＧＦ２１の発現レベル。（ＢおよびＣ）（Ａ）におけるものと同じ細胞における細胞内ＦＧＦ２１タンパク質含量（Ｂ）および培養培地中のＦＧＦ２１タンパク質レベル（Ｃ）。（Ｄ）ＥＦ１ａプロモーターの制御下にあるＷＴのマウスＦＧＦ２１コーディング配列（ＥＦ１ａ−ｍＦＧＦ２１）またはＣＭＶプロモーターの制御下にあるコドン最適化されたマウスＦＧＦ２１コーディング配列（ＣＭＶ−ｍｏＦＧＦ２１）をコードするプラスミドをトランスフェクトしたＣ２Ｃ１２細胞におけるＦＧＦ２１の発現レベル。（Ｅ）ＥＦ１ａプロモーターの制御下にあるＷＴのマウスＦＧＦ２１コーディング配列（ＥＦ１ａ−ｍＦＧＦ２１）またはｈＡＡＴプロモーターの制御下にあるコドン最適化されたマウスＦＧＦ２１（ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１）をコードするプラスミドをトランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞におけるＦＧＦ２１の発現レベル。ｑＰＣＲは、ｗｔおよびコドン最適化されたＦＧＦ２１コーディング配列の両方を検出するプライマーを使用して実施した。結果は平均値±ＳＥＭとして表現される。ｎ＝３ウェル／群。ＮＤ、検出されず。＊  ｐ＜０．０５  ｖｓ  コントロール。＃＃＃  ｐ＜０．００１  ｖｓ  ＥＦ１ａ−ｍＦＧＦ２１。
【０３３３】
図３５．  ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１およびＣＭＶ−ｍｏＦＧＦ２１発現カセットによる肝臓ＦＧＦ２１発現およびＦＧＦ２１循環レベルのインビボでの増加。（Ａ）伸長因子１ａ（ＥＦ１ａ）プロモーターの制御下にあるＷＴのマウスＦＧＦ２１コーディング配列（ＥＦ１ａ−ｍＦＧＦ２１）またはＣＭＶプロモーターの制御下にあるコドン最適化されたマウスＦＧＦ２１コーディング配列（ＣＭＶ−ｍｏＦＧＦ２１）またはｈＡＡＴプロモーターの制御下にあるコドン最適化されたマウスＦＧＦ２１コーディング配列（ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１）をコードするプラスミドをハイドロダイナミクス投与したＣ５７Ｂｌ６マウスの肝臓中のＦＧＦ２１の発現レベル。ｑＰＣＲは、ｗｔおよびコドン最適化されたＦＧＦ２１コーディング配列の両方を検出するプライマーを使用して実施した。（Ｂ）（Ａ）におけるものと同じコホートにおけるＦＧＦ２１循環レベル。結果は平均値±ＳＥＭとして表現される。ｎ＝５マウス／群。＊＊  ｐ＜０．０１  ｖｓ．  ＥＦ１ａ−ｍＦＧＦ２１
図３６．  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１による肝臓ＦＧＦ２１発現およびＦＧＦ２１循環レベルのインビボでの増加。（Ａ）１×１０１０ｖｇ、２×１０１０ｖｇまたは５×１０１０ｖｇの、伸長因子１ａ（ＥＦ１ａ）プロモーターの制御下にあるＷＴのマウスＦＧＦ２１コーディング配列をコードするＡＡＶ８ベクター（ＡＡＶ８−ＥＦ１ａ−ｍＦＧＦ２１）またはｈＡＡＴプロモーターの制御下にあるコドン最適化されたマウスＦＧＦ２１（ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１）を静脈内投与したＣ５７Ｂｌ６マウスの肝臓中のＦＧＦ２１発現レベル。ｑＰＣＲは、ｗｔおよびコドン最適化されたＦＧＦ２１コーディング配列の両方を検出するプライマーを使用して実施した。（Ｂ）（Ａ）におけるものと同じコホートにおけるＦＧＦ２１循環レベル。分析はＡＡＶ後２週で実施した。結果は平均値±ＳＥＭとして表現される。ｎ＝４〜５マウス／群。コントロール、未処置マウス。＊＊  ｐ＜０．０１および＊＊＊  ｐ＜０．００１  ｖｓ．  コントロール。＃＃  ｐ＜０．０１および＃＃＃  ｐ＜０．００１  ｖｓ．  ＡＡＶ８−ＥＦ１ａ−ｍＦＧＦ２１
図３７．  ＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｍｉＲＴによる脂肪ＦＧＦ２１発現のインビボでの増加。（Ａ−Ｂ）２×１０１０ｖｇ、５×１０１０ｖｇまたは１×１０１１ｖｇの、伸長因子１ａ（ＥＦ１ａ）プロモーターの制御下にあるＷＴのマウスＦＧＦ２１コーディング配列をコードするＡＡＶ８ベクター（ＡＡＶ８−ＥＦ１ａ−ｍＦＧＦ２１）またはｍｉＲＴ１２２ａ配列の４個のタンデムリピートおよびｍｉＲＴ１配列の４個のタンデムリピートを伴った、ＣＡＧプロモーターの制御下にあるコドン最適化されたマウスＦＧＦ２１コーディング配列をコードするＡＡＶ８ベクター（ＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｏｕｂｌｅｍｉＲＴ）のいずれかをｅＷＡＴ内投与したＣ５７Ｂｌ６マウスのｅＷＡＴ（Ａ）または肝臓（Ｂ）におけるＦＧＦ２１の発現レベル。ｑＰＣＲは、ｗｔおよびコドン最適化されたＦＧＦ２１コーディング配列の両方を検出するプライマーを使用して実施した。分析はＡＡＶ後２週で実施した。結果は平均値±ＳＥＭとして表現される。ｎ＝４〜５マウス／群。コントロール、未処置マウス。ｅＷＡＴ、精巣上体（ｅｐｉｄｙｄｉｍａｌ）白色脂肪組織。＊  ｐ＜０．０５、＊＊  ｐ＜０．０１、ならびに
図３８．  ＡＡＶ１−ＣＭＶ−ｍｏＦＧＦ２１による骨格筋におけるＦＧＦ２１発現のインビボでの増加。（Ａ−Ｂ）５×１０１０ｖｇ、１×１０１１ｖｇまたは３×１０１１ｖｇの、伸長因子１ａ（ＥＦ１ａ）プロモーターの制御下にあるＷＴのマウスＦＧＦ２１コーディング配列をコードするＡＡＶ８ベクター（ＡＡＶ８−ＥＦ１ａ−ｍＦＧＦ２１）またはＣＭＶプロモーターの制御下にあるコドン最適化されたマウスＦＧＦ２１コーディング配列をコードするＡＡＶ１ベクター（ＡＡＶ１−ＣＭＶ−ＦＧＦ２１）のいずれかを筋肉内投与したＣ５７Ｂｌ６マウスの四頭筋（Ａ）または肝臓（Ｂ）におけるＦＧＦ２１の発現レベル。ｑＰＣＲは、ｗｔおよびコドン最適化されたＦＧＦ２１コーディング配列の両方を検出するプライマーを使用して実施した。分析はＡＡＶ後２週で実施した。結果は平均値±ＳＥＭとして表現される。ｎ＝４〜５マウス／群。コントロール、未処置マウス。＊  ｐ＜０．０５、＊＊  ｐ＜０．０１および＊＊＊  ｐ＜０．００１  ｖｓ．  コントロール。＃  ｐ＜０．０５、＃＃  ｐ＜０．０１および＃＃＃  ｐ＜０．００１  ｖｓ．  ＡＡＶ８−ＥＦ１ａ−ｍＦＧＦ２１。
【実施例】
【０３３４】
実施例の一般的手法
対象の特性
雄性Ｃ５７Ｂｌ／６ＪマウスおよびＢ６．Ｖ−Ｌｅｐｏｂ／ＯｌａＨｓｄ（ｏｂ／ｏｂ）マウスを用いた。マウスは標準食（２０１８Ｓ  Ｔｅｋｌａｄ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｄｉｅｔｓ（登録商標），Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｓ．，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳ）または高脂肪食（ＴＤ．８８１３７  Ｈａｒｌａｎ  Ｔｅｋｌａｄ  Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳ）を自由摂取させ、１２時間の明暗サイクル（８：００  ａ．ｍ．に点灯）および安定な温度（２２℃±２）の下で維持した。組織サンプリングのため、マウスを吸入性麻酔薬イソフルラン（ＩｓｏＦｌｏ（登録商標），Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ，ＵＳ）を使って麻酔して断頭した。目的の組織を切除し、−８０℃でまたはホルマリンを使用して分析まで保存した。全ての実験手法は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔ  Ａｕｔｏｎｏｍａ  ｄｅ  ＢａｒｃｅｌｏｎａのＥｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ａｎｉｍａｌ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎにより承認されたものである。
【０３３５】
組換えＡＡＶベクター
血清型１、８または９の一本鎖ＡＡＶベクターは、ＨＥＫ２９３細胞のトリプルトランスフェクションによって標準的な方法に従って作製した（Ａｙｕｓｏ，Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，２０１０．  Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １０（６）：４２３−３６）。細胞を１０個のローラーボトル（８５０ｃｍ２、フラット；Ｃｏｒｎｉｎｇ（商標），Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．，Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳ）中のＤＭＥＭ  １０％ＦＢＳの中で８０％コンフルエンスまで培養し、ＡＡＶ２  ＩＴＲに隣接した発現カセットを保有するプラスミド、ＡＡＶ２  ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ血清型１、８または９のｃａｐ遺伝子を保有するヘルパープラスミド、ならびにアデノウイルスヘルパー機能を保有するプラスミドをリン酸カルシウム法によってコトランスフェクトした。用いた導入遺伝子は：１）発現カセットの３’非翻訳領域中にクローニングされたｍｉＲＴ１２２ａ配列（５’ＣＡＡＡＣＡＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣＡ３’）（配列番号１２）の４個のタンデムリピートおよびｍｉＲＴ１配列（５’ＴＴＡＣＡＴＡＣＴＴＣＴＴＴＡＣＡＴＴＣＣＡ３’）（配列番号１３）の４個のタンデムリピートが付加されたサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサー／ニワトリベータアクチン（ＣＡＧ）プロモーター；２）ＣＭＶプロモーター；または３）ヒトα１−アンチトリプシンプロモーター（ｈＡＡＴ）により駆動される、コドン最適化されたマウス、イヌもしくはヒトのＦＧＦ２１またはｗｔ  ＦＧＦ２１をコードする配列であった。ＣＡＧ、ｈＡＡＴまたはＣＭＶプロモーターを保有するノンコーディングのプラスミドを用いてｎｕｌｌベクターを作製した。ＡＡＶは、ポリエチレングリコール沈殿ステップおよび２回の連続したセシウムクロリド（ＣｓＣｌ）グラジエントに基づく最適化された方法を使用して精製した。この第二世代のＣｓＣｌに基づくプロトコールは、空のＡＡＶカプシドならびにＤＮＡおよびタンパク質の不純物を劇的に低減させた（Ａｙｕｓｏ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，２０１０．  Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １０（６）：４２３−３６）。精製ＡＡＶベクターをＰＢＳに対して透析し、ろ過し、−８０℃で保存した。ウイルスゲノムの力価を、標準曲線として直線状プラスミドＤＮＡを用いてＡＡＶ２参照標準物質について記載されたプロトコールに従って、定量的ＰＣＲにより決定した（Ｌｏｃｋ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｓ  Ｔｈｅｒ．  ２０１０；２１：１２７３−１２８５）。ベクターは、当該技術分野で周知の分子生物学的技術に従って構築した。
【０３３６】
ＡＡＶベクターのインビボｅＷＡＴ内投与
ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射を使用してマウスを麻酔した。精巣上体白色脂肪組織を切除するために開腹を実施した。０．００１％  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）  Ｆ６８（Ｇｉｂｃｏ）を含むＰＢＳ中にＡＡＶベクターを再懸濁し、精巣上体脂肪パッドの中に直接注射した。各精巣上体脂肪パッドに５０μＬのＡＡＶ溶液を２回注射した（１回の注射は睾丸の近くに、もう１回の注射は脂肪パッドの中央に）。腹部を滅菌生理食塩水溶液ですすぎ、２層アプローチを使用して閉じた。
【０３３７】
ＡＡＶベクターの全身投与
適量のＡＡＶ溶液を０．００１％  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）を含む２００μＬのＰＢＳ中で希釈し、送液の瞬間に圧をかけずに外側尾静脈の中に手技的に注射した。注射の前に、動物を２５０Ｗ赤外線加熱ランプ（Ｐｈｉｌｉｐｓ  ＮＶ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ＮＬ）下に数分間置いて血管を拡張させ、尾静脈を見やすくして容易にアクセスできるようにした。プラスチックの保定器（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳ）を用いて注射のために動物を固定した。適切な保定装置を利用したため、麻酔は用いなかった。３０ゲージ針を使用して動物に注射した。
【０３３８】
ＡＡＶベクターの筋肉内投与
ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射を使用してマウスを麻酔した。後肢の毛を剃り、総量１８０μｌのベクターを各後肢の四頭筋、腓腹筋および前脛骨筋（ｔｉｂｉａｌｉｓ  ｃｒａｎｅａｌｉｓ）中に配置した６ヶ所の注射部位に分けて筋肉内注射により投与した。
【０３３９】
免疫組織化学的および形態計測分析
組織をホルマリン（Ｐａｎｒｅａｃ  Ｑｕｉｍｉｃａ）中で２４時間固定し、パラフィン中に包埋し、切片にした。組織試料をヘマトキシリン−エオシンで染色した。画像解析ソフトウェア（ａｎａｌｙＳＩＳ  ３．０；Ｓｏｆｔ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｃｅｎｔｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ，ＰＡ，ＥＥＵＵ）を使用して、１匹の動物あたり１２枚の、モニター付きビデオカメラに接続したＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｅ８００顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用して１０×で取得したヘマトキシリン／エオシンＷＡＴイメージ中の脂肪細胞の面積を決定し、各脂肪細胞面積をμｍ２で定量した。平均脂肪細胞面積を各実験群について算出し、サイズ分類に応じた脂肪細胞の分布をヒストグラムで表した。１群あたり４匹の動物を用いて、１匹の動物あたり少なくとも２５０個の脂肪細胞を解析した。
【０３４０】
免疫組織化学
組織を１０％ホルマリン中で１２〜２４時間固定し、パラフィン中に包埋し、切片にした。切片をラット抗Ｍａｃ２抗体（１：５０；ＣＬ８９４２ＡＰ；Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）、モルモット抗インスリン抗体（１：１００；Ｉ−８５１０；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）またはウサギ抗グルカゴン抗体（１：１００；２１９−０１；Ｓｉｇｎｅｔ  Ｌａｂｓ）と共に４℃で一晩インキュベートした。ビオチン化ウサギ抗ラット抗体（１：３００；Ｅ０４６７；Ｄａｋｏ）、ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８コンジュゲート）（１：２００；Ａ１１０１１；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ヤギ抗モルモットＩｇＧ抗体（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８コンジュゲート）（１：３００；Ａ１１０７３；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）またはペルオキシダーゼに結合したウサギ抗モルモット抗体（１：３００；Ｐ０１４１；Ｄａｋｏ）を二次抗体として用いた。ＡＢＣペルオキシダーゼキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を免疫検出のために用いて、切片をマイヤーヘマトキシリン中で対比染色した。ヘキスト（Ｂ２２６１；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を蛍光検体の核対比染色のために用いた。ピクロシリウスレッド染色およびマッソントリクローム染色を用いて線維症を評価した。膵臓におけるβ細胞面積のパーセンテージを、２００μｍ離れた２つのインスリン染色切片において、１つの切片中のインスリン＋細胞の面積をその切片の膵臓総面積で除算することによって分析した。β細胞量は、以前に記載されているように、膵臓重量にβ細胞面積パーセンテージを乗算することにより算出した（Ｊｉｍｅｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ，２０１１）。
【０３４１】
ＲＮＡ分析
脂肪貯蔵部または肝臓から、それぞれＱＩＡｚｏｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ  ＮＶ，Ｖｅｎｌｏ，ＮＬ）またはＴｒｉｐｕｒｅ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳ）、およびＲＮｅａｓｙ  Ｌｉｐｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｍｉｎｉｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ  ＮＶ，Ｖｅｎｌｏ，ＮＬ）を用いることによって全ＲＮＡを得た。残存ウイルスゲノムを除去するため、全ＲＮＡをＤＮＡｓｅＩ（Ｑｉａｇｅｎ  ＮＶ，Ｖｅｎｌｏ，ＮＬ）で処理した。ＲＴ−ＰＣＲのため、１μｇのＲＮＡ試料をＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（０４３７９０１２００１，Ｒｏｃｈｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を用いて逆転写した。リアルタイム定量的ＰＣＲは、ＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒＩＩ（登録商標）（Ｃｅｐｈｅｉｄ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＵＳＡ）中で、ＥＸＰＲＥＳＳ  ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ  ｑＰＣＲ  ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標），Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｓｌｂａｄ，ＣＡ，ＵＳ）を用いて実施した。データをＲｐｌｐ０値で正規化し、以前に記載されているように分析した（Ｐｆａｆｆｌ，Ｍ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２００１；２９（９）：ｅ４５）。
【０３４２】
ホルモンおよび代謝物のアッセイ
血中グルコースレベルは、Ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ  Ｅｌｉｔｅ（商標）アナライザー（Ｂａｙｅｒ，Ｌｅｖｅｒｋｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して測定した。ＦＧＦ２１の循環レベルは、定量的サンドイッチ酵素イムノアッセイＭｏｕｓｅ／Ｒａｔ  ＦＧＦ−２１  ＥＬＩＳＡキット（ＭＦ２１００，Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｂｉｎｇｄｏｎ，ＵＫ）により決定した。血清インスリン濃度は、Ｒａｔ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  ＥＬＩＳＡサンドイッチアッセイ（９００１０，Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｃｈｅｍ  ＩＮＣ．  Ｄｏｗｎｅｒｓ  Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ  ６０５１５，ＵＳＡ）により決定した。組織から脂質を抽出するため、約１００ｍｇの凍結試料を秤量し、１５ｍｌのクロロホルム：メタノール（２：１）中でホモジナイズした。次いで３ｍｌのＨ２ＳＯ４  ０．０５％を加えることにより脂質相および水相を分離し、それらを４℃で一晩そのままにした。相が分離したら、水性の上相をパスツールピペットを用いて除去し、１ｍｌの下方の脂質相をガラスチューブ中に取り戻した。１ｍｌのクロロホルムおよび１％溶液のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００をガラスチューブに加え、これを浴の中で９０℃でインキュベートすることでクロロホルムを蒸発させた。クロロホルムとＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００との混合物の使用により、あらゆる残存水性粒子を脂質相から除去した。蒸発後、チューブの壁をクロロホルムで洗い流すことで試料を濃縮し、これを再度９０℃で温めることでクロロホルムを蒸発させた。沈降物が完全に乾燥して濃縮されたら、３７℃で５００μｌのＨ２０  ｍｉｌｉＱを添加することによりこれを再懸濁した。最終的にトリグリセリドの量を市販品ＧＰＯ−ＰＡＰ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて決定した。血清トリグリセリドおよびコレステロールは、酵素アッセイキット（Ｈｏｒｉｂａ−ＡＢＸ，Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて分光測定で定量した。全ての生化学パラメーターは、Ｐｅｎｔｒａ  ４００  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｈｏｒｉｂａ−ＡＢＸ）を用いて決定した。
【０３４３】
血糖はＧｌｕｃｏｍｅｔｅｒ  ＥｌｉｔｅＴＭ（Ｂａｙｅｒ）を用いて決定した。グルカゴンレベルはグルカゴンＲａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（＃ＧＬ−３２Ｋ，ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて測定した。アディポネクチン、レプチン、ＩＧＦＢＰ１およびＩＧＦ１は、それぞれＭｏｕｓｅ  Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ  ＥＬＩＳＡキット（８０５６９，Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｃｈｅｍ）、Ｍｏｕｓｅ  Ｌｅｐｔｉｎ  ＥＬＩＳＡキット（９００３０，Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｃｈｅｍ）、ＩＧＦＢＰ１（Ｍｏｕｓｅ）ＥＬＩＳＡキット（ＫＡ３０５４，Ａｂｎｏｖａ）およびｍ／ｒ  ＩＧＦ−Ｉ−ＥＬＩＳＡキット（Ｅ２５，Ｍｅｄｉａｇｎｏｓｔ）を用いて決定した。
【０３４４】
インスリン負荷試験
インスリン負荷試験のため、インスリン（０．７５ＩＵ／ｋｇ体重；Ｈｕｍｕｌｉｎ  Ｒｅｇｕｌａｒ；Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を覚醒している給餌マウスに腹腔内注射した。インスリン注射後の指し示された時点において尾静脈から得られた血液試料中のグルコース濃度を決定した。
【０３４５】
グルコース負荷試験
覚醒しているマウスを一晩（１６時間）絶食させ、グルコース（２ｇ／ｋｇ体重）を腹腔内注射で投与した。指し示された時点において尾静脈血液試料中の血糖を測定した。同時点で静脈血を尾静脈からチューブ（Ｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅ（登録商標）  ＣＢ  ３００，ＳＡＲＳＴＥＤＴ）中に回収し、直ちに遠心分離することで血清を分離し、これを用いてインスリンレベルを測定した。
【０３４６】
酸素測定
間接的開路熱量計（Ｏｘｙｌｅｔ，Ｐａｎｌａｂ，Ｃｏｒｎｅｌｌａ，Ｓｐａｉｎ）を用いて、８個の代謝チャンバー内の酸素消費、二酸化炭素産生を同時にモニターした。マウスを個別にし、代謝チャンバーに２４時間順化させ、さらなる２４時間、各ケージにおいて１５分毎に３分間データを収集した。データは明サイクルおよび暗サイクルから取得し、体重で調整した。エネルギー消費を算出するため、製造業者により提供されたＭｅｔａｂｏｌｉｓｍソフトウェアを用いた。
【０３４７】
ＨＥＫ２９３、Ｃ２Ｃ１２およびＨｅｐＧ２細胞のトランスフェクション
細胞を２４ウェルプレート中で培養し、０．８μｇのＤＮＡ／ウェルを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を用いて製造業者の説明書に従ってトランスフェクトした（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。
【０３４８】
骨分析
骨体積および構造をμＣＴにより評価した。マウス脛骨を中性緩衝ホルマリン（１０％）中で固定し、ｅＸｐｌｏｒｅ  Ｌｏｃｕｓ  ＣＴスキャナー（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ）を２７ミクロンの解像度で用いてスキャンした。４匹のマウス／群において、１ｍｍ３の近位脛骨骨端および１．８ｍｍ３の皮質脛骨骨幹中の骨梁を分析した。骨パラメーターはＭｉｃｒｏＶｉｅｗ  ３Ｄ  Ｉｍａｇｅ  Ｖｉｅｗｅｒ  ＆  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｔｏｏｌを使用して算出した。脛骨の長さは、顆間隆起（ｉｎｔｅｒｃｏｎｄｉｌａｒ  ｅｍｉｎｅｎｃｅ）から内果まで測定した。
【０３４９】
ウエスタンブロット分析
ｉＷＡＴおよびｉＢＡＴをＱＩＡｚｏｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ）中でホモジナイズし、タンパク質画分を製造業者の説明書に従って有機相から分離した。タンパク質を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分け、ウサギポリクローナル抗ＵＣＰ１抗体（ａｂ１０９８３；Ａｂｃａｍ）およびウサギポリクローナル抗α−チューブリン抗体（ａｂ４０７４；Ａｂｃａｍ）を使用したイムノブロット法によって分析した。検出はＥＣＬ  Ｐｌｕｓ検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて実施した。
【０３５０】
オープンフィールド試験
オープンフィールド試験は、以前に報告されたように、９：００ａｍから１：００ｐｍの間に実施した（Ｈａｕｒｉｇｏｔ  ｅｔ  ａｌ，２０１３）。簡潔には、動物を、水平および垂直の運動を検出する２バンドルの光束が交差する明るく照らされたチャンバー（４１×４１×３０ｃｍ）（ＬＥ  ８８１１；Ｐａｎｌａｂ）の中央に置いた。運動活性および探索行動を最初の６分の間に評価した。及んだ合計距離をビデオトラッキングシステム（ＳＭＡＲＴ  Ｊｕｎｉｏｒ；Ｐａｎｌａｂ）を用いて評価した。
【０３５１】
統計解析
全ての値は、平均値±ＳＥＭとして表現される。群間の差は、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定により比較された。差は、ｐ＜０．０５で有意とみなされた。
【０３５２】
実施例
実施例１．  Ｃ５７Ｂｌ６マウスにおけるＡＡＶ−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｍｉＲＴベクターのｅＷＡＴ内投与による肥満および糖尿病の予防
本発明者らは、８週齢の雄性Ｃ５７Ｂｌ６において、ＦＧＦ２１を使用した脂肪組織のＡＡＶ媒介性遺伝子工学が肥満および糖尿病を予防する治療的可能性を評価した。１０１２ウイルスゲノム（ｖｇ）の、ｍｉＲ１２２およびｍｉＲ１の標的部位を包含するＣＡＧユビキタスプロモーターの制御下にあるコドン最適化されたマウスＦＧＦ２１コーディング配列をコードするＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｏｕｂｌｅｍｉＲＴ）（図１Ａ）のｅＷＡＴ内（ｅＷＡＴ：精巣上体白色脂肪組織）投与は、ＦＧＦ２１の脂肪特異的過剰発現（図１Ｂ）を、同様に血流中へのタンパク質の高分泌（図１Ｃ）を媒介した。ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｏｕｂｌｅｍｉＲＴ処置マウスはまた、ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｎｕｌｌベクター（同等の感染力を保持するが導入遺伝子を何らコードしないベクター）と比較して、ｅＷＡＴ中でのＦＧＦ２１受容体１（ＦＧＦ２１Ｒ１）（図１Ｄ）ならびに脂肪組織および肝臓中でのβ−Ｋｌｏｔｈｏ（ＦＧＦ２１共受容体）（図１Ｅ）の過剰発現を示した。ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｏｕｂｌｅｍｉＲＴコンストラクトは配列番号３２中に含まれ、ＣＡＧ−ｎｕｌｌコンストラクトは配列番号３１中に含まれる。
【０３５３】
ｅＷＡＴへのＡＡＶ媒介性のＦＧＦ２１遺伝子導入の後、固形飼料食を給餌したマウスは体重減少を示した（図１Ｆおよび１Ｇ）。高脂肪食（ＨＦＤ）でチャレンジした場合、脂肪組織中でＦＧＦ２１を過剰発現した動物は実験期間中やせたままであったが、ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｎｕｌｌ処置マウスは進行的に肥満になった（図１Ｆおよび１Ｇ）。それらのより低い体重に応じて、固形飼料給餌ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｏｕｂｌｅｍｉＲＴ処置マウスおよびＨＦＤ給餌ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｏｕｂｌｅｍｉＲＴ処置マウスはいずれも脂肪貯蔵部および肝臓の重量減少を示した（図１Ｈ）。
【０３５４】
ヘマトキシリン−エオシン染色による白色脂肪組織の組織分析は、ｅＷＡＴおよびｉＷＡＴ（ｉＷＡＴ：鼠径部白色脂肪組織）中の白色脂肪細胞サイズの減少ならびにｉＷＡＴ中の複数の多房性脂肪細胞を明らかにし、このことはこの貯蔵部の褐変が起こったことを示唆する（図２Ａ）。形態計測分析は、ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｏｕｂｌｅｍｉＲＴ処置マウスにおける白色脂肪細胞の平均面積の減少をさらに確認した（図２Ｂ）。白色脂肪細胞の面積の頻度分布はまた、群間で異なっていた。固形飼料給餌ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｏｕｂｌｅｍｉＲＴ処置マウスおよびＨＦＤ給餌ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｏｕｂｌｅｍｉＲＴ処置マウスは、小さい脂肪細胞数の増加およびより少ない大きい脂肪細胞を提示した（図２Ｃ）。著しいことに、ＨＦＤ給餌ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｏｕｂｌｅｍｉＲＴ処置マウスにおける白色脂肪細胞の面積の頻度分布は、固形飼料給餌ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｎｕｌｌ処置動物のそれとほとんど同一であった（図２Ｃ）。それゆえ、ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｎｕｌｌ処置マウスにおいて認められた脂肪細胞のＨＦＤ誘発性肥大は、ＦＧＦ２１を過剰発現したマウスにおいて妨げられた。ｉＷＡＴ中でのＵＣＰ１およびＤｉｏ２の過剰発現（図３Ａおよび３Ｂ）は、固形飼料給餌ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｏｕｂｌｅｍｉＲＴ処置マウスおよびＨＦＤ給餌ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｏｕｂｌｅｍｉＲＴ処置マウスにおけるｉＷＡＴの褐変をさらに確認した。
【０３５５】
ｉＢＡＴ（ｉＢＡＴ：肩甲骨間褐色脂肪組織）の組織分析は、この貯蔵部での脂質蓄積が、ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｎｕｌｌマウスと比較して、固形飼料給餌ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｏｕｂｌｅｍｉＲＴ処置マウスおよびＨＦＤ給餌ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｏｕｂｌｅｍｉＲＴ処置マウスにおいてより少ないことを示した（図２Ａ）。この結果およびｉＷＡＴの褐変に応じて、明サイクルおよび暗サイクルの間のＨＦＤ給餌ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｏｕｂｌｅｍｉＲＴ処置マウスのエネルギー消費（図３Ｃ）は、ＨＦＤ給餌ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｎｕｌｌマウスのそれよりも高かった。全体として、これらのデータは、ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｏｕｂｌｅｍｉＲＴ処置マウスは熱産生活性が向上していたことを示唆する。
【０３５６】
肝臓組織切片は、固形飼料またはＨＦＤのいずれの下でも、ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｎｕｌｌ処置マウスと比べてＦＧＦ２１を過剰発現したマウスの肝細胞において脂質蓄積の減少を示した（図２Ａ）。したがって、ＨＦＤ給餌ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｏｕｂｌｅｍｉＲＴ処置マウスでは、それらの肝臓トリグリセリド（ＴＧ）含量は正常化された（図３Ｄ）。並行して、ＴＧ、総コレステロール、ＨＤＬ−コレステロールおよびＬＤＬ−コレステロールの循環レベルはＦＧＦ２１を過剰発現したＨＦＤ給餌マウスにおいて正常化された（図３Ｅおよび３Ｆ）。
【０３５７】
ＦＧＦ２１を過剰発現したＨＦＤ給餌マウスはＨＦＤ給餌ＡＡＶ９−ｎｕｌｌ処置マウスよりもインスリン感受性であり（図３Ｇ）、固形飼料給餌ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｏｕｂｌｅｍｉＲＴ処置マウスおよびＨＦＤ給餌ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｏｕｂｌｅｍｉＲＴ処置マウスはいずれも、それらのＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｎｕｌｌ処置の相対物と比較してインスリン循環レベルの減少を示した（図３Ｈ）。
【０３５８】
実施例２．  ｏｂ／ｏｂマウスにおけるＡＡＶ−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｍｉＲＴベクターのｅＷＡＴ内投与による肥満の回復およびグルコース代謝の改善
本発明者らは、１１週齢の雄性ｏｂ／ｏｂマウスにおいて、ＦＧＦ２１を使用した脂肪組織のＡＡＶ媒介性遺伝子工学の抗糖尿病および抗肥満原性の治療的可能性を評価した。このマウスはレプチンシグナル伝達を欠損しており、広く用いられる肥満および糖尿病の遺伝モデルである。この目的を達成するため、用量応答性試験を実施した。ｏｂ／ｏｂマウスに、４つの異なる用量（１０１０ｖｇ、５×１０１０ｖｇ、２×１０１１ｖｇまたは１０１２ｖｇ）のＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｏｕｂｌｅｍｉＲＴベクター（図１Ａ）をｅＷＡＴ中に局所投与した。コントロールとして、ｏｂ／ｏｂ動物に１０１２ｖｇのＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｎｕｌｌベクターをｅＷＡＴ内投与した。
【０３５９】
ＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｏｕｂｌｅｍｉＲＴベクターのｅＷＡＴ内投与は、白色脂肪組織におけるＦＧＦ２１の特異的過剰発現を、同様に血流中へのタンパク質の高分泌を用量依存的に媒介した（図４Ａおよび４Ｂ）。具体的には、１０１２ｖｇの用量のＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｏｕｂｌｅｍｉＲＴベクターは、ｅＷＡＴおよびｉＷＡＴにおけるＦＧＦ２１の非常に強い過剰発現を媒介し（図４Ａ）、最も高い循環ＦＧＦ２１レベルを達成した（図４Ｂ）。対照的に、最も低い投与用量である１０１０ｖｇのＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｏｕｂｌｅｍｉＲＴベクターは、ｅＷＡＴにおけるＦＧＦ２１の非常に中程度の過剰発現のみを生み出し（図４Ａ）、この用量で処置された動物は、ＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｎｕｌｌ処置動物と比較して血清ＦＧＦ２１レベルに差を示さなかったが（図４Ｂ）、これはおそらくＦＧＦ２１がパラクライン−オートクライン様式で作用したためであろう。したがって、ＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｎｕｌｌ処置動物では進行的に体重が増加したが、ＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｏｕｂｌｅｍｉＲＴベクターで処置された動物ではベクターの投与用量に比例した体重増加の減少を示した（図４Ｃおよび４Ｄ）。著しいことに、１０１２ｖｇのＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｏｕｂｌｅｍｉＲＴベクターで処置された動物は、ＡＡＶ投与後最初の２週間の間に約１５％の重量が減少し、その後は開始時体重に達するまで体重は増加した（図４Ｃおよび４Ｄ）。それゆえに、１０１２ｖｇのＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｏｕｂｌｅｍｉＲＴベクターをｅＷＡＴ内投与した動物は、ＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｎｕｌｌ処置動物と比較して、実験終了時に全体重で４０％の差を示した（図４Ｄ）。一致して、１０１２ｖｇのＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｏｕｂｌｅｍｉＲＴベクターで処置された動物は、脂肪症の著しい減少および肝臓重量の６０％低減を示した（図４Ｅ）。ｉＢＡＴ重量は、おそらく熱産生活性の向上のため、このマウスのコホートにおいて増加した（図４Ｅ）。
【０３６０】
５×１０１０ｖｇ、２×１０１１ｖｇまたは１０１２ｖｇのＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｏｕｂｌｅｍｉＲＴベクターで処置された動物は、ＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｎｕｌｌ処置マウスと比較してインスリン感受性の改善を提示した（図５Ａ）。２×１０１１ｖｇまたは１０１２ｖｇのＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｏｕｂｌｅｍｉＲＴベクターで処置された動物はまた、ＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｎｕｌｌベクターで処置されたｏｂ／ｏｂマウスよりも低いインスリン循環レベルを示した（図５Ｂ）。
【０３６１】
実施例３．  ｏｂ／ｏｂマウスにおけるＡＡＶ−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターの静脈内投与による肥満の回復およびグルコース代謝の改善
本発明者らはまた、８週齢の雄性ｏｂ／ｏｂマウスにおいて、肝臓のＡＡＶ媒介性遺伝子工学を使ったＦＧＦ２１循環レベルの増加により仲介される抗糖尿病および抗肥満原性効果を評価した。ｏｂ／ｏｂマウスに、１０１１ｖｇまたは５×１０１１ｖｇの肝臓特異的ヒトα１−アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーターの制御下にあるコドン最適化されたマウスＦＧＦ２１コーディング配列をコードするＡＡＶ８ベクター（ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１）（図６Ａ）を静脈内（ＩＶ）投与した。コントロールとして、ｏｂ／ｏｂ動物に５×１０１１ｖｇのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌベクターをＩＶ投与した。ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１コンストラクトは配列番号３４中に含まれ、ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌコンストラクトは配列番号３３中に含まれる。
【０３６２】
ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターの静脈内投与は、肝臓におけるＦＧＦ２１の特異的過剰発現を、同様に血流中へのタンパク質の高分泌を用量依存的に媒介した（図６Ｂおよび６Ｃ）。具体的には、５×１０１１ｖｇの用量のＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターは、肝臓におけるＦＧＦ２１の非常に強い過剰発現を媒介し（図６Ｂ）、最も高い循環ＦＧＦ２１レベルを達成した（図６Ｃ）。この用量のＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターで処置された動物の体重は、ＡＡＶ投与後最初の２週間の間に約７％減少し、その後にわずかに増加したのに対し、ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌ処置マウスは進行的に重量を増した（図６Ｄ、６Ｅおよび６Ｆ）。１０１１ｖｇのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターを投与したマウスは、ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌ処置動物よりも著しく少なくしか重量が増加しなかった（図６Ｄ、６Ｅおよび６Ｆ）。具体的には、ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌ動物は、１０１１ｖｇのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターで処置された動物の１０％の体重増加と比較して、実験終了時に５０％の体重増加を示した（図６Ｅ）。それらのより低い体重に応じて、肝臓中でＦＧＦ２１を過剰発現した動物は、とりわけ最も高い用量のベクターで処置された動物において、脂肪症の有意な減少を示し、および約６０％の肝臓重量の低減を示した（図６Ｇ）。ｉＢＡＴ重量は両ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１処置マウス群において同様に増加し（図６Ｇ）、これはおそらく、ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌベクターを投与したマウスと比較した、これらの動物におけるより高い熱産生活性のためであろう。
【０３６３】
ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターで処置された動物は、ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌ処置マウスと比較してインスリン感受性の改善およびインスリン循環レベルの減少を示した（図６Ｈおよび６Ｉ）。
【０３６４】
実施例４．  ＨＦＤ給餌マウスにおけるＡＡＶ−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターの静脈内投与による肥満および糖尿病からの長期的回復
本発明者らはまた、肥満Ｃ５７Ｂｌ６マウスにおいて、肝臓のＡＡＶ媒介性遺伝子工学を使ったＦＧＦ２１循環レベルの増加により仲介される抗糖尿病および抗肥満原性効果を評価した。９週齢の雄性Ｃ５７Ｂｌ６マウス（若年成体）にＨＦＤを９週間給餌し、次いで１０１０ｖｇまたは５×１０１０ｖｇのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターをＩＶ投与した（図６Ａ）。ＡＡＶ投与後、ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１処置マウスをＨＦＤで５２週間維持した。コントロールとして、５×１０１０ｖｇのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌを固形飼料給餌Ｃ５７Ｂｌ６マウスおよびＨＦＤ給餌Ｃ５７Ｂｌ６マウスにＩＶ投与した。これらの後者２つのマウスコホートは、その後、固形飼料食またはＨＦＤで維持した。
【０３６５】
ＨＦＤ給餌マウスにおけるＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターの静脈内投与は、血流中へのＦＧＦ２１の高分泌を用量依存的に媒介した（図７Ａ）。
【０３６６】
ＨＦＤ給餌ＡＡＶ８−ｎｕｌｌ処置マウスと１０１０ｖｇのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターを投与したＨＦＤ給餌動物との間に体重の差は認められなかった（図７Ｂおよび７Ｃ）。しかしながら、５×１０１０ｖｇのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターで処置されたＨＦＤ給餌動物は、ＡＡＶ投与後、最初に体重が２０％減少し、次いで固形飼料給餌ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌ処置マウスと同様に進行的に重量が増加した（図７Ｂおよび７Ｃ）。著しいことに、ＡＡＶ投与後９週以降、５×１０１０ｖｇのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターを投与したＨＦＤ給餌動物と固形飼料給餌ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌ処置マウスとの間で全体重および体重増加に統計的有意差は認められなかった（図７Ｂおよび７Ｃ）。
【０３６７】
５×１０１０ｖｇのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターで処置されたＨＦＤ給餌マウスの明サイクルおよび暗サイクルの間のエネルギー消費は、固形飼料給餌ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌマウスおよびＨＦＤ給餌ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌマウスのそれよりも高かった（図８Ａ）。固形飼料給餌ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌ処置動物およびＨＦＤ給餌ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌ処置動物および１０１０ｖｇのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターを投与したマウスの間でエネルギー消費に差は認められなかった（図８Ａ）。全体として、これらのデータは、５×１０１０ｖｇのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１で処置されたマウスは熱産生活性が向上していたことを示唆する。
【０３６８】
１０１０ｖｇのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターで処置された動物は、ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌベクターを投与したＨＦＤ給餌マウスと比較してインスリン感受性の改善を提示し、それらのインスリン感受性はＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌベクターで処置された固形飼料給餌マウスのそれと同様であった（図８Ｂ）。著しいことに、５×１０１０ｖｇのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターを投与した動物は、ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌベクターを投与した固形飼料給餌マウスと比較してインスリン感受性の改善を提示し、インスリン循環レベルの正常化を示した（図８Ｂおよび８Ｃ）。
【０３６９】
実施例５．  老齢ＨＦＤ給餌マウスにおけるＡＡＶ−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターの静脈内投与による肥満および糖尿病の回復
本発明者らはまた、肥満老齢（成体）Ｃ５７Ｂｌ６マウスにおいてＦＧＦ２１の抗糖尿病および抗肥満原性効果を評価した。７．５月齢の雄性Ｃ５７Ｂｌ６マウスにＨＦＤを８週間給餌し、次いで１０１０ｖｇ、２×１０１０ｖｇまたは５×１０１０ｖｇのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターをＩＶ投与した（図６Ａ）。ＡＡＶ投与後、ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１処置マウスをＨＦＤで２２週間維持した。コントロールとして、５×１０１０ｖｇのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌを固形飼料給餌老齢Ｃ５７Ｂｌ６マウスおよびＨＦＤ給餌老齢Ｃ５７Ｂｌ６マウスにＩＶ投与した。これらの後者２つのマウスコホートは、その後、固形飼料食またはＨＦＤで維持した。
【０３７０】
老齢ＨＦＤ給餌マウスにおけるＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターの静脈内投与は、血流中へのＦＧＦ２１の高分泌を用量依存的に媒介した（図９Ａ）。
【０３７１】
ＨＦＤ給餌ＡＡＶ８−ｎｕｌｌ処置マウスと１０１０ｖｇのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターを投与したＨＦＤ給餌動物との間に体重の差は認められなかった（図９Ｂおよび９Ｃ）。しかしながら、２×１０１０ｖｇまたは５×１０１０ｖｇのいずれかのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターで処置されたＨＦＤ給餌動物は、ＡＡＶ投与後、最初に体重がそれぞれ１５％および２０％減少した（図９Ｂおよび９Ｃ）。その後、２×１０１０ｖｇのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターで処置された動物は固形飼料給餌ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌ処置マウスと同様に進行的に重量が増加したが、５×１０１０ｖｇのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターで処置された動物の体重に有意な変化は認められなかった（図９Ｂおよび９Ｃ）。著しいことに、ＡＡＶ投与後３週以降、５×１０１０ｖｇのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターを投与したＨＦＤ給餌動物と固形飼料給餌ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌ処置マウスとの間で全体重および体重増加に統計的有意差は認められなかった（図９Ｂおよび９Ｃ）。
【０３７２】
５×１０１０ｖｇのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターで処置されたＨＦＤ給餌マウスの明サイクルおよび暗サイクルの間のエネルギー消費は、固形飼料給餌ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌマウスおよびＨＦＤ給餌ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌマウスのそれよりも高かった（図１０Ａ）。２×１０１０ｖｇのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターで処置された動物は、明サイクルの間のエネルギー消費の増加、および暗サイクルの間のエネルギー消費の増加傾向を示した（図１０Ａ）。１０１０ｖｇのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターで処置された動物は、暗サイクルの間のエネルギー消費の増加を示した（図１０Ａ）。固形飼料給餌ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌ処置動物およびＨＦＤ給餌ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌ処置動物および１０１０ｖｇのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターを投与したマウスの間で差は認められなかった（図１０Ａ）。全体として、これらのデータは、ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１で処置された老齢マウスは熱産生活性が向上していたことを示唆する。
【０３７３】
１０１０ｖｇまたは２×１０１０ｖｇのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターで処置された動物は、ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌベクターを投与したＨＦＤ給餌マウスと比較してインスリン感受性の改善を提示し、それらのインスリン感受性はＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌベクターで処置された固形飼料給餌マウスのそれと同様であった（図１０Ｂ）。著しいことに、５×１０１０ｖｇのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターを投与した動物は、ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌベクターを投与した固形飼料給餌マウスと比較してインスリン感受性の改善を提示した（図１０Ａ）。１０１０ｖｇ、２×１０１０ｖｇまたは５×１０１０ｖｇのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターで処置された動物は、ＨＦＤ給餌ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌ処置マウスよりも低い空腹時および給餌時インスリン循環レベルを示した（図１０Ｃ）。著しいことに、２×１０１０ｖｇまたは５×１０１０ｖｇのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターをＩＶ投与した老齢動物と固形飼料給餌ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌ処置マウスとの間で給餌時インスリン循環レベルに差は認められなかった（図１０Ｃ）。
【０３７４】
実施例６．  Ｃ５７Ｂｌ６マウスにおけるＡＡＶ−ＣＭＶ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターの筋肉内投与による体重減少の評価
本発明者らはまた、Ｃ５７Ｂｌ６マウスにおいて、骨格筋のＡＡＶ媒介性遺伝子工学によりＦＧＦ２１循環レベルを増加させる治療的可能性を評価した。骨格筋を標的とするため、ＣＭＶプロモーターおよびＡＡＶ１血清型を選択した。ＣＭＶプロモーターはユビキタスプロモーターであるが、ＡＡＶ１カプシドを伴ったその使用は、以前に公開されているように、肝臓に形質導入することなく非常に効率的に骨格筋を標的とすることを可能にする（Ｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ２００６；Ｃａｌｌｅｊａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ２０１３）。
【０３７５】
３×１０１１ｖｇの用量の、ユビキタスＣＭＶプロモーターの制御下にあるコドン最適化されたマウスＦＧＦ２１コーディング配列をコードするＡＡＶ１ベクター（ＡＡＶ１−ＣＭＶ−ｍｏＦＧＦ２１）（図１１Ａ）を、６から１２週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ６マウスの各後肢の四頭筋、腓腹筋および前脛骨筋（ｔｉｂｉａｌｉｓ  ｃｒａｎｅａｌｉｓ）に筋肉内注射（５×１０１０ｖｇ／筋肉）により投与した。コントロールとして、齢を合わせたＣ５７Ｂｌ６動物の同じ筋肉中に３×１０１１ｖｇのＡＡＶ１−ＣＭＶ−ｎｕｌｌベクター（５×１０１０ｖｇ／筋肉）を筋肉内投与した。ＣＭＶ−ｍｏＦＧＦ２１コンストラクトは配列番号３６中に含まれ、ＣＭＶ−ｎｕｌｌコンストラクトは配列番号３５中に含まれる。
【０３７６】
ＡＡＶ１−ＣＭＶ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターの筋肉内投与は、血流中へのＦＧＦ２１の高分泌を媒介した（図１１Ｂ）。ＡＡＶ１−ＣＭＶ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターで処置された動物は、ＡＡＶ１−ＣＭＶ−ｎｕｌｌ処置マウスと比較して体重および体重増加の減少を示した（図１１Ｃおよび１１Ｄ）。
【０３７７】
実施例７．  コドン最適化されたヒトＦＧＦ２１ヌクレオチド配列によるタンパク質産生の増加
コドン最適化がＦＧＦ２１タンパク質産生の増加を媒介することができるかを評価するため、ＨＥＫ２９３細胞に３つの異なるコドン最適化されたヒトＦＧＦ２１ヌクレオチド配列（配列番号：４０〜４２）をコードするプラスミドをトランスフェクトした。コントロールとして、非トランスフェクト細胞および野生型ｈＦＧＦ２１コーディング配列を形質導入した細胞を用いた。３つのコドン最適化されたヒトＦＧＦ２１配列およびＷＴのヒトＦＧＦ２１配列の発現はｈＡＡＴプロモーターの制御下にあった（配列番号４７）。コドン最適化されたヒトＦＧＦ２１バージョン１または３を形質導入した細胞は、野生型またはコドン最適化されたＦＧＦ２１バリアント２と比較してより高レベルのヒトＦＧＦ２１を培養培地中に分泌することができ（図１２）、それゆえにバリアント１および３のコドン最適化によるＦＧＦ２１タンパク質産生の増加を実証する。
【０３７８】
実施例８．  ヒトＦＧＦ２１をコードするＡＡＶベクターの投与によるマウスにおける肥満および糖尿病の回復（ＦＧＦ２１の活性を証明するインビボ実験）
ＨＦＤ給餌マウスをヒトＦＧＦ２１をコードするＡＡＶベクターで処置する。コントロールとして、同じ用量のＡＡＶ−ｎｕｌｌベクターを固形飼料給餌マウスおよびＨＦＤ給餌マウスに投与する。
【０３７９】
ＷＡＴの褐変およびＢＡＴの熱産生活性を誘導する、エネルギー消費を増加させる、ならびにグルコースおよびエネルギー代謝を改善するヒトＦＧＦ２１の能力を評価するため、次の試験を実施する：
−  体重ならびに飼料および液体摂取量の週毎の測定
−  体温の測定
−  間接的熱量測定によるエネルギー消費および呼吸商の測定
−  血糖の測定
−  腹腔内グルコース負荷試験による全身グルコース処理の評価
−  腹腔内インスリン負荷試験によるインスリン感受性の評価
−  以下を包含する、組織および血清試料における分析
−  標的組織および血流中へのヒトＦＧＦ２１過剰発現レベルの検査
−  形態学的および組織分析。
【０３８０】
−  ホルモンおよびサイトカインの循環レベルの決定
−  血清代謝パラメーター、例えば遊離脂肪酸、グリセロール、トリグリセリド、コレステロールおよびケトン体などの決定
−  免疫組織化学による鼠径部脂肪パッド中のベージュ脂肪細胞の存在の検査ならびに古典的な白色、褐色およびベージュ脂肪細胞のマーカーの遺伝子発現によった、褐変能力の評価
実施例９：ＦＧＦ２１活性を査定するためのインビトロアッセイ
ＦＧＦ２１は、３Ｔ３−Ｌ１細胞におけるグルコース取り込みおよびＧＬＵＴ１発現を増加させることが予想される（Ｋｈａｒｉｔｏｎｅｎｋｏｖ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，２００５．  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  １１５：１６２７−１６３５）。
【０３８１】
実施例１０．  ｏｂ／ｏｂマウスにおけるＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｍｉＲＴベクターのｅＷＡＴ内投与による肥満の回復およびグルコース代謝の改善：さらなる知見
本発明者らはさらに、ｏｂ／ｏｂマウスにおいて、ＦＧＦ２１を使用した脂肪組織のＡＡＶ媒介性遺伝子工学の抗糖尿病および抗肥満原性の治療的可能性を評価した（実施例２を参照されたい）。
【０３８２】
ＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｍｉｒＴベクターのｅＷＡＴ内注射を受けたｏｂ／ｏｂマウスは、精巣上体パッドの白色脂肪細胞サイズの低減を示した（図１３Ａ）。循環アディポネクチンレベルも用量と共に増加した（図１４Ａ）。Ｍａｃ２染色を通じて評価されるｅＷＡＴの炎症もベクターの用量の関数として低減し、マクロファージマーカーＦ４／８０の発現も低減した（図１４ＢおよびＣ）。
【０３８３】
ｎｕｌｌベクターまたは最も低い用量のＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｍｉｒＴを注射したｏｂ／ｏｂマウスの肝臓は、肝細胞における脂肪滴の蓄積を示した（図１３Ｂ）。５×１０１０ｖｇ／マウスまたはこれより高い用量のＦＧＦ２１をコードするベクターの投与は、脂肪肝の発症を完全に予防し（図１３Ｂ）、これは器官の重量（図１４Ｄ）ならびにその総トリグリセリドおよびコレステロール含量（図１４ＥおよびＦ）と相関した。５×１０１０ｖｇ／マウスの用量が治療的効力の閾値を表すというさらなる証拠が、血糖および血中インスリンの分析から出た。１×１０１０ｖｇ／マウスの用量は給餌状態で血中グルコースレベルを改変せず、インスリンレベルを部分的に低減させただけだが、５×１０１０ｖｇ／マウス以上の用量は血糖および血中インスリンを完全に正常化した（図１３ＣおよびＤ）。全体として、この例は、脂肪組織においてＦＧＦ２１を過剰発現させることの治療的可能性を確認する。
【０３８４】
実施例１１．  ｏｂ／ｏｂマウスにおけるＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターの静脈内投与による肥満の回復およびグルコース代謝の改善：さらなる知見
本発明者らはさらに、ｏｂ／ｏｂマウスにおいて、ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターの静脈内投与の抗糖尿病および抗肥満原性の治療的可能性を評価した（実施例３を参照されたい）。
【０３８５】
それらのより低い体重と一致して、肝臓中でＦＧＦ２１を過剰発現したｏｂ／ｏｂ動物、とりわけ５×１０１１ｖｇで処置された動物は、白色脂肪細胞の有意なサイズ減少を示した（図１５Ａ）。これは、ｅＷＡＴにおけるＭａｃ２染色の減少ならびにＦ４／８０およびＴＮＦ−αの発現により証明されるように（図１６Ａ−Ｃ）、循環アディポネクチンレベルの用量依存的増加（図１５Ｂ）およびＷＡＴ炎症の減少とパラレルであった。著しいことに、５×１０１１ｖｇで処置されたｏｂ／ｏｂマウスは、ｅＷＡＴ中の「王冠様」構造の著しい低減を示した（図１６Ａ）。
【０３８６】
７月齢のｏｂ／ｏｂマウスは著しい脂肪肝を示したが、ＦＧＦ２１処置ｏｂ／ｏｂマウスの肝臓は肝細胞における脂質の蓄積を示さなかった（図１５Ｃ）。これは、治療的ベクターを受けたｏｂ／ｏｂマウスにおける器官重量の６０％低減（図１６ＤおよびＥ）と、同様に総肝臓トリグリセリドおよびコレステロール含量の著しい低減（図１６ＦおよびＧ）と一致した。両方の用量のＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１で処置されたｏｂ／ｏｂ動物は給餌時血糖の減少も示し、給餌状態でのそれらの血中インスリンは約７０％低減した（図１５ＤおよびＥ）。
【０３８７】
本発明者らは、ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１処置後のｏｂ／ｏｂマウスにおいて認められる循環グルコースレベルの減少が肝糖新生の抑制に起因するものであるかをホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）およびグルコース−６−ホスファターゼ（Ｇ６Ｐａｓｅ）の発現をｑＰＣＲにより測定することによって評価した。ＰＥＰＣＫ発現の増加を示した１×１０１１ｖｇのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１で処置された動物を除いて、ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１処置ｏｂ／ｏｂマウスの肝臓において、これらの酵素の発現変化は認められなかった（図１７ＡおよびＢ）。これらの結果は、肝臓におけるＡＡＶ媒介性の長期的なＦＧＦ２１の発現、およびその後の循環ＦＧＦ２１の増加は、肝グルコース産生を阻害することによってグルコースを低下させなかったことを示唆する。
【０３８８】
ＦＧＦ２１のグルコース低下効果はまた、脂肪細胞によるグルコース取り込みの増加およびエネルギー消費の亢進に帰するものである（Ｘｕ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，２００９．  ＡＪＰ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．  ２９７：Ｅ１１０５−Ｅ１１１４；Ｄｉｎｇ  Ｘ．  ｅｔ  ａｌ．，２０１２．  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ．  １６：３８７−３９３；Ｃａｍａｃｈｏ  Ｒ．Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，２０１３．  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ７１５：４１−４５；Ｅｍａｎｕｅｌｌｉ  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．，２０１４．  Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．  １２４：５１５−５２７；Ｋｈａｒｉｔｏｎｅｎｋｏｖ  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，２００５．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４８：７７４−７８１；Ｈｏｎｄａｒｅｓ  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，２０１０．  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ．  １１：２０６−２１２；Ｓａｍｍｓ  Ｒ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，２０１５．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．  １１：９９１−９９９）。それゆえに、本発明者らは、異なるパッドの脂肪組織（ｉＷＡＴ、ｅＷＡＴおよびｉＢＡＴ）において、グルコース取り込み機構の重要な構成成分、例えばグルコーストランスポーターＧｌｕｔ１およびＧｌｕｔ４、グルコースリン酸化酵素ヘキソキナーゼＩおよびＩＩ（ＨＫＩおよびＨＫＩ）、ならびにｉＢＡＴの場合はＵＣＰ１などの発現をｑＰＣＲによって査定した。ＡＡＶ８−ＦＧＦ２１処置ｏｂ／ｏｂマウスにおいて、Ｇｌｕｔ１の発現はｉＷＡＴおよびｉＢＡＴ中で増加し（図１７Ｃ）、Ｇｌｕｔ４の発現はｅＷＡＴ、ｉＷＡＴおよびｉＢＡＴ中で増加した（図１７Ｄ）。ＨＫＩおよびＨＫＩＩは、ｉＢＡＴ中でのみアップレギュレートされた（図１７ＥおよびＦ）。そのうえ、ＵＣＰ１発現は、高用量のＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターで処置されたｏｂ／ｏｂマウスのｉＢＡＴ中で増加した（図１７Ｇ）。全体として、これらの結果は、ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターでの処置後にｏｂ／ｏｂマウスにおいて認められた血糖の長期的好転が、おそらく白色および褐色脂肪細胞によるグルコース取り込みの増加ならびにｉＢＡＴにおける熱産生の亢進に起因するものであることを示唆する。
【０３８９】
実施例１２．  ＨＦＤ給餌マウスおよびＨＦＤ給餌老齢マウスにおけるＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターの静脈内投与による肥満および糖尿病からの長期的回復：組織重量の減少および１年間までの安定発現
若年成体または成体において実施された試験（実施例４および５を参照されたい）の全ての実験群に属する動物の代表的イメージを図１９Ａ−Ｂ中に示す。
【０３９０】
ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１処置による肥満の回復は、若年成体または成体として処置された動物のいずれにおいても、主要な白色脂肪組織（ＷＡＴ）貯蔵部、例えば精巣上体（ｅＷＡＴ）、鼠径部（ｉＷＡＴ）および後腹膜（ｒＷＡＴ）脂肪パッドなどの重量の用量依存的減少とパラレルであった（図１８Ａおよび図１９Ｃ）。肝臓重量のＨＦＤ誘発性増加は、用いられる最も高い用量のベクターでのＦＧＦ２１遺伝子導入によって完全に正常化されたが、四頭筋の重量は食餌またはＡＡＶ送達により変わらなかった（図１８Ａおよび図１９Ｄ）。
【０３９１】
両齢のＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１処置マウスは、肝臓におけるコドン最適化されたＦＧＦ２１の特異的過剰発現を示し（図１９Ｅ）、これは両マウス群において用量依存的な血流中へのＦＧＦ２１の分泌を、ベクターの単回投与後１年間まで安定であり続けるレベルでもたらす（図１８Ｂ）。
【０３９２】
実施例１３．  ＨＦＤ給餌マウスおよびＨＦＤ給餌老齢マウスにおけるＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターの静脈内投与による肥満および糖尿病からの長期的回復：自発運動活性の向上および熱産生メカニズムの調査
エネルギー消費の増加（実施例４および５を参照されたい）は、ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１送達の１０月後の若年成体として処置された動物においても見られた（図２１Ａ）。
【０３９３】
この知見は、自発運動活性に対するＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１媒介性の効果と一致した。ＡＡＶ８−ｎｕｌｌベクターを受けたＨＦＤを給餌した動物においてオープンフィールド試験中に認められた活動低下と対照的に、若年成体として５×１０１０ｖｇ  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１で処置されたマウスは、固形飼料給餌ｎｕｌｌ注射動物と同程度の自発性の自発運動活性を示した。図２０Ａ中に示されるように、ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１送達の１年後、処置された動物は長い距離を移動し、より少ない時間しか休息せず、未処置のＨＦＤ給餌コントロールよりも多くの遅い運動および速い運動の時間を費やした。
【０３９４】
エネルギー消費の変化が熱産生の変化を反映し得ると考え、本発明者らは、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）の活性化の度合いを評価した。若年成体または成体として５×１０１０ｖｇ  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１で処置された両マウスは、ｉＢＡＴにおける脂質沈着の減少を示した（図２０Ｂ）。ＢＡＴ中のＵＣＰ１タンパク質含量は、若年成体としてＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターで処置されたマウスにおいて用量依存的に増加し（図２０Ｃ）、肝臓へのＦＧＦ２１遺伝子導入により誘導される非シバリング性熱産生の増加と一致した。
【０３９５】
皮下ＷＡＴの褐変は、ベージュ脂肪細胞の出現を特徴としており、エネルギー消費の増加にも関連している（Ｈａｒｍｓ  ＆  Ｓｅａｌｅ，２０１３）。褐変がＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１処置後に認められるエネルギー消費の亢進を説明できるかを評価するため、ｉＷＡＴの組織学的評価を実施した。このパッドの重量減少と一致して（図１８Ａ）、ＨＦＤ給餌ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１処置動物の脂肪細胞はＨＦＤ給餌ｎｕｌｌ注射動物のそれよりも小さかった（図２０Ｄ）。それにもかかわらず、ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターでの処置は、若年成体または成体として処置された動物のいずれにおいても、どの試験用量においても、ｉＷＡＴにおける多房性ベージュ脂肪細胞の検出増加をもたらさなかった（図２０Ｄ）。したがって、ＨＦＤ給餌群間のｉＷＡＴ中ＵＣＰ１タンパク質レベルに統計的有意差はなかった（図２１Ｂ）。
【０３９６】
クレアチニン駆動性基質サイクルおよび筋小胞体Ｃａ２＋−ＡＴＰａｓｅ  ２ｂ（Ｓｅｒｃａ２ｂ）媒介性のカルシウム循環は、ｉＷＡＴにおける熱産生をＵＣＰ１に依存せずに増加させることができる（Ｋａｚａｋ  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，２０１５．  Ｃｅｌｌ  １６３：６４３−６５５；Ｉｋｅｄａ  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，２０１７．  Ｎａｔ．Ｍｅｄ．  ２３：１４５４−１４６５）。クレアチニン駆動性基質サイクルに関与する酵素であるホスファターゼオーファン１（Ｐｈｏｓｐｈｏ１）のより高レベルの発現が、齢を合わせた固形飼料給餌コントロール群およびＨＦＤ給餌コントロール群と比べたときに、５×１０１０ｖｇのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１で処置されたＨＦＤ給餌マウスのｉＷＡＴにおいて認められ（図２０Ｅ）、これはクレアチニン駆動性サイクルの活性がおそらくＦＧＦ２１遺伝子導入の結果として増加したことを示唆する。カルシウム循環依存的な熱産生メカニズムに関して、固形飼料給餌ｎｕｌｌ処置動物またはＨＦＤ給餌ｎｕｌｌ処置動物と比べたとき、ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターで処置された動物のｉＷＡＴにおけるＳｅｒｃａ２ｂの発現レベルの差は検出されなかった（図２１Ｃ）。他方、同サイクルに関与する別の酵素であるリアノジン受容体２（ＲｙＲ２）のｉＷＡＴ発現は、ｎｕｌｌ処置マウスおよびＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１処置マウスの両方においてＨＦＤ給餌によって増加した（図２１Ｃ）。全体として、これらの結果は、カルシウム循環依存的熱産生メカニズムはＡＡＶ−ＦＧＦ２１処置後に認められる全身エネルギー恒常性の改善に関与しないことを示唆する。
【０３９７】
実施例１４．  ＨＦＤ給餌マウスおよびＨＦＤ給餌老齢マウスにおけるＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターの静脈内投与による肥満および糖尿病からの長期的回復：グルカゴンレベル、島過形成および耐糖能
そのうえ、若年成体としてＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターで処置されたＨＦＤ給餌動物は、ＨＦＤ給餌ｎｕｌｌ処置マウスと比べて、グルカゴン循環レベルの減少を示した（図２２Ａ）。
【０３９８】
ＡＡＶ８−ｎｕｌｌ処置マウスはＨＦＤ給餌の結果として島の過形成を生じたのに対し、ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ＦＧＦ２１ベクターで（２×１０１０または５×１０１０ｖｇ／マウスの用量で）処置された動物のβ細胞量は、固形飼料食を給餌したコントロールマウスのそれと同様であった（図２２ＢおよびＣ）。ＨＦＤ給餌ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１処置マウスからの膵臓切片のインスリンおよびグルカゴンについての二重免疫染色は、これらの動物の島におけるα細胞およびβ細胞の正常な分布を示し、島の辺縁部にグルカゴン発現細胞が、中心部にインスリン発現細胞が局在していた（図２２Ｄ）。
【０３９９】
ＦＧＦ２１処置マウスにおいて耐糖能を評価するため、腹腔内グルコース負荷試験（ＧＴＴ）（２ｇグルコース／ｋｇ体重）をＡＡＶ投与の１０週後に実施した。ｎｕｌｌまたはＦＧＦ２１をコードするベクターのいずれかを１×１０１０ｖｇ／マウスの用量で注射したＨＦＤ給餌動物はグルコース不耐性であって、ＧＴＴ中にインスリン循環レベルの著しい増加を示した（図２３ＡおよびＢ）。対照的に、５×１０１０ｖｇ／マウスのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１で処置された動物は、固形飼料給餌コントロールマウスと比べたときにグルコースクリアランスの改善を示した（図２３Ａ）。これら２つの実験群間でインスリンレベルは区別できなかった（図２３Ｂ）。これらの結果は、５×１０１０ｖｇ／マウスのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１で処置されたＨＦＤ給餌マウスにおけるインスリン感受性の改善をさらに確認した。
【０４００】
実施例１５．  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターの静脈内投与によるＨＦＤに関連したＷＡＴ肥大および炎症の回復
ＨＦＤ給餌はＷＡＴ脂肪細胞のサイズ増加を誘導する（Ｓａｔｔａｒ  Ｎ．  ＆  Ｇｉｌｌ  Ｊ．Ｍ．Ｒ．，２０１４．  ＢＭＣ  Ｍｅｄ．  １２：１２３）。ＦＧＦ２１をコードするベクターの投与はこの増加に対抗した（図２４Ａ）。ＷＡＴの形態計測分析は、若年成体として１×１０１０または５×１０１０ｖｇのベクターで処置された動物の、および成体として２×１０１０または５×１０１０ｖｇのベクターで処置されたマウスの白色脂肪細胞の面積が、固形飼料食を給餌した動物のそれと同様であることを明らかにした（図２４Ｂ）。両ＦＧＦ２１処置動物群において、脂肪細胞サイズの再分布があり、より小さい脂肪細胞の割合がより高かった（図２５Ａ）。脂肪症の減少およびＷＡＴ肥大の回復と一致して、処置開始齢にかかわらず、最も高い用量のＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターで処置された動物におけるアディポネクチンおよびレプチンのレベルも正常化された（図２４ＣおよびＤ）。
【０４０１】
肥満はまた、ＷＡＴの炎症を引き起こす（Ｈａｊｅｒ  Ｇ．Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，２００８．  Ｅｕｒ．Ｈｅａｒｔ  Ｊ．  ２９：２９５９−２５７１）。それゆえに、本発明者らは、この組織における炎症をマクロファージ特異的マーカーＭａｃ２についての免疫染色および炎症促進性分子の発現を通じて分析した。ＨＦＤ給餌マウスがｅＷＡＴにおいて「王冠様」構造として表されるマクロファージの存在の増加を示したのに対し、若年成体または成体として５×１０１０ｖｇ  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１で処置された動物にはマクロファージ浸潤の兆候がなかった（図２４Ｅおよび図２５Ｂ）。これは、マクロファージマーカーＦ４８０およびＣＤ６８ならびに炎症促進性サイトカインＴＮＦαおよびＩＬ−１βの発現の正常化とパラレルであって（図２４Ｆ−Ｈおよび図２５Ｃ−Ｅ）、ＦＧＦ２１発現が肥満に関連したＷＡＴの炎症に対抗したことを指し示す。
【０４０２】
実施例１６．  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターの静脈内投与による脂肪肝、肝臓の炎症および線維症の回復
肝臓の組織分析は、ＨＦＤを給餌した全てのｎｕｌｌ処置動物は屠殺時に著しい脂肪肝であったことを示した（図２６Ａ−Ｄ）。対照的に、若年成体または成体として５×１０１０ｖｇ  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１を受けたＨＦＤ給餌マウスは、この病理学的脂質沈着の回復を証明した（図２６Ａ）。これらの組織学的知見は、５×１０１０ｖｇ  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１処置動物の総肝臓トリグリセリドおよびコレステロール含量の著しい低減とパラレルであった（図２６ＢおよびＣ）。加えて、若年成体または成体時にＨＦＤを給餌して５×１０１０ｖｇ  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターで処置した動物は、Ｍａｃ２についての染色の欠失により証明されるように肝臓の炎症の兆候を示さず、このＭａｃ２についての染色はｎｕｌｌ処置ＨＦＤ給餌マウスの肝臓におけるマクロファージの存在の増加を明らかにした（図２６Ｄ）。最終的に、肝臓へのＦＧＦ２１遺伝子導入は肝線維症を回復させた。コラーゲン線維は、ＨＦＤを給餌してコントロールｎｕｌｌベクターを注射した動物からの肝臓切片のピクロシリウスレッド染色またはマッソントリクローム染色の後に容易に検出可能であったのに対し、ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１処置マウスの肝臓中では検出できなかった（図２８Ａおよび図２７）。これらのマウスは、肝臓のコラーゲン１発現の著しい低減も示した（図２８ＢおよびＣ）。全体として、これらの知見は、ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１処置がＨＦＤ誘発性の非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の発症から保護することを指し示した。
【０４０３】
実施例１７．  肝臓指向性ＡＡＶ−ＦＧＦ２１処置の長期的安全性
ＦＧＦ２１での薬理学的処置または遺伝子導入過剰発現は、骨吸収の向上を通じた骨恒常性の撹乱に関連しており、これは骨減少を引き起こすことがある（Ｗｅｉ  Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．，２０１２．  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  １０９：３１４３−３１４８；Ｗａｎｇ  Ｘ．  ｅｔ  ａｌ．，２０１５．  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ．  ２２：８１１−８２４；Ｃｈａｒｏｅｎｐｈａｎｄｈｕ  Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．，２０１７．  Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｍｅｔａｂ．  ３５：１４２−１４９；Ｔａｌｕｋｄａｒ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，２０１６．  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ．  ２３：４２７−４４０；Ｋｉｍ  Ａ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，２０１７．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ，Ｏｂｅｓ．Ｍｅｔａｂ）。肥満および糖尿病の処置のためのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１の治療的可能性を考え、本発明者らは、最も高い用量のベクターで処置された動物の骨に対する遺伝子導入の長期的効果を評価した。屠殺時（約１６．５月齢）、９または２９週齢でＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターを投与された動物において、鼻先から尾根部までの長さおよび脛骨の長さは正常であった（図２９ＡおよびＢ）。本発明者らは次いで、マイクロコンピュータ断層撮影（μＣＴ）により骨構造を調べた。脛骨の近位骨端の分析は、ＨＦＤを給餌して５×１０１０ｖｇ  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１を投与したマウスの骨梁および皮質骨に、ｎｕｌｌベクターで処置された齢を合わせたマウスと比較して有意差がないことを明らかにした。具体的には、骨ミネラル密度（ＢＭＤ）（図２９Ｃ）、骨ミネラル含量（ＢＭＣ）（図２９Ｄ）、骨体積（ＢＶ）（図２９Ｅ）、骨体積／組織体積比（ＢＶ／ＴＶ）（図２９Ｆ）、骨表面／骨体積比（ＢＳ／ＢＶ）（図２９Ｇ）、骨梁数（Ｔｂ．Ｎ）（図２９Ｈ）、骨梁幅（Ｔｂ．Ｔｈ）（図２９Ｉ）または骨梁間隔（Ｔｂ．Ｓｐ）（図２９Ｊ）における差は記録されなかった。同様に、脛骨の骨幹における緻密骨の分析は、ＨＦＤ給餌ｎｕｌｌ注射またはＦＧＦ２１処置群の間でＢＭＣ、ＢＭＤ、ＢＶ、ＢＶ／ＴＶまたはＢＳ／ＢＶに差がないことを示した（図２９Ｋ−Ｏ）。
【０４０４】
ＦＧＦ２１の病理学的効果は、少なくとも部分的に、肝臓によるインスリン様増殖因子結合タンパク質１（ＩＧＦＰＢ１）の産生増加により媒介されることが報告されている（Ｗａｎｇ  Ｘ．  ｅｔ  ａｌ．，２０１５．  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ．  ２２：８１１−８２４）。骨変化の欠如と一致して、高用量のＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１処置は、ｎｕｌｌ注射ＨＦＤ給餌マウスと比べた時に、１２月（若年成体）または６月（成体）早く処置された動物における循環ＩＧＦＢＰ１タンパク質レベルの増加を導かなかった（図２９Ｐ）。循環ＩＧＦ１レベルも全ての実験群において正常であった（図２９Ｑ）。全体として、これらの結果は、肝臓へのＡＡＶ媒介性ＦＧＦ２１遺伝子導入の骨組織に対する安全性を支持する。
【０４０５】
実施例１８．  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターの静脈内投与によるＨＦＤ誘発性肝臓腫瘍の予防
長期のＨＦＤ給餌（＞６０週）は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて肝臓新生物の発生増加に関連している（Ｈｉｌｌ−Ｂａｓｋｉｎ  Ａ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，２００９．  Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．  １８：２９７５−２９８８；Ｎａｋａｇａｗａ  Ｈ．，２０１５．  Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．  ７：２１１０）。本発明者らの試験において、若年成体としてＨＦＤを開始し、これを６０週間維持した動物において、本発明者らはｎｕｌｌベクターを注射した動物の６６．７％（６／９）に肝臓腫瘍を見出した。ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターで処置された動物はＨＦＤ誘発性の肝臓新生物発症から保護された：５×１０１０ｖｇのＦＧＦ２１をコードするベクターで処置された動物の０％（０／８）が腫瘍を示し、最も低い用量（１×１０１０ｖｇ）で処置したコホートにおける発生は４０％（４／１０）であった。固形飼料給餌マウス（０／１１）はいずれも同じ期間中に腫瘍を発症しなかった（表１）。
【０４０６】
表１．  若年成体における肝臓腫瘍発生
【表１】
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【０４０７】
実施例１９．  ＡＡＶ８媒介性の肝臓特異的なＦＧＦ２１過剰発現によるＳＴＺ誘発性高血糖の好転
材料および方法
動物
本発明者らは、９週齢の雄性Ｃ５７ｂｌ６マウスを用いた。マウスは標準食を自由摂取させ、１２時間の明暗サイクル（０８：００時に点灯）の下で維持した。糖尿病誘発のため、マウスは、０．１ｍｏｌ／ｌクエン酸バッファー（ｐＨ  ４．５）中に溶解されたストレプトゾトシン（５０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射を５回、連日で受けた。血中グルコースレベルは、アナライザー（Ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ  Ｅｌｉｔｅ；Ｂａｙｅｒ，Ｌｅｖｅｒｋｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて査定した。動物のケアおよび実験手法は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔ  Ａｕｔｏｎｏｍａ  ｄｅ  ＢａｒｃｅｌｏｎａのＥｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ａｎｉｍａｌ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎにより承認されたものである。
【０４０８】
ＡＡＶベクターのインビボ投与
全身投与のため、ＡＡＶベクターを２００μｌのＰＢＳ中０．００１％  Ｆ６８  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）（Ｇｉｂｃｏ）の中で希釈し、尾静脈を介して注射した。
【０４０９】
結果
ＡＡＶに由来するＦＧＦ２１の１型糖尿病に対する保護的可能性を試験するため、５×１０１０ｖｇまたは２×１０１１ｖｇのｈＡＡＴプロモーターの制御下にあるコドン最適化されたマウスＦＧＦ２１をコードするＡＡＶ８ベクター（ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１）を、雄性９週齢のＣ５７Ｂｌ６マウスにＩＶ投与した。コントロールマウスは、２×１０１１ｖｇのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−Ｎｕｌｌベクターを受けた。ＡＡＶ投与の２週後、全ての動物をストレプトゾトシン（ＳＴＺ）（５０ｍｇ／ｋｇの５用量；１用量／日）で処置することで糖尿病プロセスを起こした。
【０４１０】
血中グルコースレベルの分析は、ｍｏＦＧＦ２１をコードするＡＡＶ８ベクターで処置された動物はＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−Ｎｕｌｌベクターで処置されたＣ５７Ｂｌ６マウスよりも低い循環グルコースレベルを示すことを明らかにした（図３０）。
【０４１１】
実施例２０．  Ｃ５７Ｂｌ６マウスにおけるＡＡＶ−ＣＭＶ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターの筋肉内投与による、加齢に関連した体重増加およびインスリン抵抗性の予防によった健康寿命の延伸
骨格筋（Ｓｋｍ）は容易にアクセスできる組織であり、分泌可能な治療的タンパク質の生産のために用いられている（Ｈａｕｒｉｇｏｔ  Ｖ．  ｅｔ  ａｌ．，２０１０．  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．  １２３：３２５４−３２７１；Ｃａｌｌｅｊａｓ  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，２０１３．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ６２：１７１８−１７２９；Ｊａｅｎ  Ｍ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，２０１７．  Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．  ６：１−７）。Ｓｋｍが循環ＦＧＦ２１の生きた供給源となることができるかを調べるため、最適化されたマウスＦＧＦ２１をＣＭＶプロモーターの制御下に保有する、Ｓｋｍに対して高い向性を示す血清型１のＡＡＶベクター（Ｃｈａｏ  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，２０００．  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．  １０６：１２２１−１２２８；Ｗｕ  Ｚ．  ｅｔ  ａｌ．，２００６．  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．  ８０：９０９３−９１０３；Ｌｉｓｏｗｓｋｉ  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，２０１５．  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ２４：５９−６７）を用いた（ＡＡＶ１−ＣＭＶ−ｍｏＦＧＦ２１）。ベクターを５×１０１０ｖｇ／筋肉の用量で、８週齢のＣ５７Ｂｌ６マウスの両肢の四頭筋、腓腹筋および前脛骨筋に注射した（合計用量、３×１０１１ｖｇ／マウス）。コントロール動物にＡＡＶ１−ＣＭＶ−Ｎｕｌｌベクターを同じ用量で注射した。標準食を給餌した健常マウスの使用は、本発明者らがＦＧＦ２１遺伝子治療の長期的安全性を評価することをさらに可能にした。
【０４１２】
８週齢でＦＧＦ２１をコードするベクターを注射した１１月齢の動物は循環ＦＧＦ２１の著しい増加を示し（図３１Ａ）、これは、３つの注射した筋肉におけるベクターに由来するＦＧＦ２１の高い発現レベルとパラレルであった（図３１Ｂ）。以前の報告と一致して、このベクター血清型、プロモーターおよび投与経路の組み合わせは、肝臓において導入遺伝子の発現を導かなかった（図３１Ｂ）。
【０４１３】
約１０月の追跡期間の終了時、ＡＡＶ１−ＣＭＶ−ｍｏＦＧＦ２１を筋肉内注射したマウスは試験開始時の体重を維持しており、動物の加齢につれて重量が安定して増加したコントロールよりも約３８％痩せていた（図３１Ｃ）。筋肉の重量はＦＧＦ２１遺伝子導入によりほとんど影響を受けなかったが、白色および褐色貯蔵部、同様に肝臓の重量はかなり低減した（図３１Ｄ）。実際に、分析したＷＡＴパッドの重量は＞５０％低減した（図３１Ｄ）。そのうえ、ＡＡＶ１−ＣＭＶ−ｍｏＦＧＦ２１で処置されたマウスは肝臓総トリグリセリド含量の著しい低減を示した（図３１Ｅ）。肝臓コレステロールレベルに変化は認められなかった（図３１Ｆ）。ｎｕｌｌ注射動物と対照的に、ＡＡＶ１−ＣＭＶ−ｍｏＦＧＦ２１で処置された動物は、約１年齢であったときに正常血糖を示し（データは示さず）、血中インスリンが低減した（図３１Ｇ）。したがって、ＦＧＦ２１処置マウスは、試験終了時に著しく改善されたインスリン感受性を示した（図３１Ｈ）。全体として、この試験は、治療的に適切なレベルの循環ＦＧＦ２１を導くＡＡＶベクターの投与は健康面で長期間安全であり、加齢に関連した体重およびインスリン抵抗性の向上を回復させるために用いられ得ることを実証する。
【０４１４】
実施例２１．  ＨＦＤ給餌Ｃ５７Ｂｌ６マウスにおけるＡＡＶ１−ＣＭＶ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターの筋肉内投与による肥満および糖尿病の回復。
【０４１５】
本発明者らは次に、ＡＡＶ１−ＣＭＶ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターのｉｍ投与も肥満およびインスリン抵抗性を回復させることができるかを評価した。この目的を達成するため、２月齢のＣ５７Ｂｌ６マウスに固形飼料またはＨＦＤのいずれかを１２週間給餌した。これらの最初の３月の追跡の際、固形飼料給餌動物の重量は２０％増加した一方、ＨＦＤを給餌した動物は肥満になった（９５％の体重増）（図３２ＡおよびＢ）。ベクターを次いで、５×１０１０ｖｇ／筋肉の用量で、肥満Ｃ５７Ｂｌ６マウスの両肢の四頭筋、腓腹筋および前脛骨筋に注射した（合計用量、３×１０１１ｖｇ／マウス）。コントロールとして、肥満マウスの別のコホートおよび固形飼料給餌マウスのコホートは３×１０１１ｖｇのノンコーディングｎｕｌｌベクター（ＡＡＶ１−ＣＭＶ−ｎｕｌｌ）を受けた。ＡＡＶ送達後、マウスを固形飼料またはＨＦＤ給餌で維持した。ＡＡＶ１−ＣＭＶ−ｍｏＦＧＦ２１で処置された動物は、進行性の体重減少を経験した（図３２ＡおよびＢ）。ＡＡＶ１−ＣＭＶ−ＦＧＦ２１処置による肥満の回復は、ＦＧＦ２１循環レベルの増加とパラレルであった（図３２Ｃ）。
【０４１６】
ＨＦＤを給餌したＮｕｌｌ処置マウスは正常な給餌時血糖を示したが（図３２Ｄ）、高インスリン血であって（図３２Ｅ）、このことはこれらのマウスがインスリン抵抗性を発症していたことを示唆する。対照的に、ＡＡＶ１−ＣＭＶ−ｍｏＦＧＦ２１で処置されたＨＦＤ給餌マウスは、試験終了までに正常血糖および正常血中インスリンであった（図３２ＤおよびＥ）。そのうえ、ＡＡＶ１−ＣＭＶ−ｍｏＦＧＦ２１を投与した動物は、それらのＨＦＤ給餌コントロールよりも強いインスリン感受性を示した（図３２Ｆ）。
【０４１７】
実施例２２．  コドン最適化されたヒトＦＧＦ２１ヌクレオチド配列によるＦＧＦ２１循環レベルの増加。
【０４１８】
コドン最適化がＦＧＦ２１循環レベルの増加を媒介することができるかを評価するため、８週齢の雄性Ｃ５７Ｂｌ６マウスに、ｈＡＡＴプロモーターの制御下にある３つの異なるコドン最適化されたヒトＦＧＦ２１ヌクレオチド配列（配列番号４０〜４２）をコードするプラスミドをハイドロダイナミック注射した。コントロールとして、非処置マウスおよびｈＡＡＴプロモーターの制御下にある野生型ｈＦＧＦ２１コーディング配列をコードするプラスミドをハイドロダイナミック注射したマウスを用いた。
【０４１９】
材料および方法
ハイドロダイナミック尾静脈注射によるマウスへのプラスミドのインビボ送達
プラスミドＤＮＡを生理食塩水中で動物の平均体重（グラム）の約１０％に等しい容量（ｍｌ）に希釈し、外側尾静脈の中に５秒未満（ｌｅｓｓ  ｔａｎ）で手技的に注射した。注射の前に、動物を２５０Ｗ赤外線加熱ランプ（Ｐｈｉｌｉｐｓ）下に数分間置いて血管を拡張させ、尾静脈を見やすくして容易にアクセスできるようにした。プラスチックの保定器（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を用いて注射のために動物を固定した。適切な保定装置を利用するかぎり必要でないため、麻酔は用いなかった。本発明者らは２６Ｇ  ３／８インチのゲージの皮下針（ＢＤ）を用いて動物に注射したが、これは、アクセスする静脈にぴったりと適合する最も大きい実行可能な針ゲージである。
【０４２０】
結果
コドン最適化されたヒトＦＧＦ２１バージョン２または３のいずれかで処置されたマウスは、野生型またはコドン最適化されたＦＧＦ２１バリアント１と比較してより高レベルのヒトＦＧＦ２１を循環中に分泌することができ（図３３、それゆえにバリアント２および３のコドン最適化によるＦＧＦ２１タンパク質産生の増加を実証する。
【０４２１】
実施例２３．  ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１、ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｏｕｂｌｅｍｉＲＴおよびＣＭＶ−ｍｏＦＧＦ２１発現カセットによるＦＧＦ２１の発現およびタンパク質産生レベルのインビトロおよびインビボでの増加
材料および方法
ハイドロダイナミック尾静脈注射によるマウスへのプラスミドのインビボ送達
プラスミドＤＮＡを生理食塩水中で動物の平均体重（グラム）の約１０％に等しい容量（ｍｌ）に希釈し、外側尾静脈の中に５秒未満（ｌｅｓｓ  ｔａｎ）で手技的に注射した。注射の前に、動物を２５０Ｗ赤外線加熱ランプ（Ｐｈｉｌｉｐｓ）下に数分間置いて血管を拡張させ、尾静脈を見やすくして容易にアクセスできるようにした。プラスチックの保定器（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を用いて注射のために動物を固定した。適切な保定装置を利用するかぎり必要でないため、麻酔は用いなかった。本発明者らは２６Ｇ  ３／８インチのゲージの皮下針（ＢＤ）を用いて動物に注射したが、これは、アクセスする静脈にぴったりと適合する最も大きい実行可能な針ゲージである。
【０４２２】
結果
インビトロ
ＨＥＫ２９３細胞に、伸長因子１ａ（ＥＦ１ａ）プロモーターの制御下にあるＷＴのマウスＦＧＦ２１コーディング配列（ＥＦ１ａ−ｍＦＧＦ２１）（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ  １５（２０１７）  １７３−１８３）（配列番号５７）またはＣＭＶプロモーターの制御下にあるコドン最適化されたマウスＦＧＦ２１コーディング配列（ＣＭＶ−ｍｏＦＧＦ２１）またはｍｉＲＴ１２２ａ配列の４個のタンデムリピートおよびｍｉＲＴ１配列の４個のタンデムリピートを伴った、ＣＡＧプロモーターの制御下にあるコドン最適化されたマウスＦＧＦ２１コーディング配列（ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｏｕｂｌｅｍｉＲＴ）をコードするプラスミドをトランスフェクトした。コントロールとして、非トランスフェクト細胞を用いた。ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｏｕｂｌｅｍｉＲＴを形質導入したＨＥＫ２９３細胞は、ＥＦ１ａ−ｍＦＧＦ２１を形質導入した細胞または非形質導入細胞と比較してより高レベルのＦＧＦ２１を発現した（図３４Ａ）。そのうえ、ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｏｕｂｌｅｍｉＲＴを形質導入したＨＥＫ２９３細胞はまた、より高い細胞内ＦＧＦ２１タンパク質含量および培養培地中のより高いＦＧＦ２１タンパク質レベルを示した（図３４ＢおよびＣ）。ＥＦ１ａ−ｍＦＧＦ２１またはＣＭＶ−ｍｏＦＧＦ２１を形質導入したＨＥＫ２９３細胞は同様のレベルのＦＧＦ２１を発現したが（図３４Ａ）、ＣＭＶ−ｍｏＦＧＦ２１を形質導入したＨＥＫ２９３細胞はより高い細胞内ＦＧＦ２１タンパク質含量および培養培地中のより高いＦＧＦ２１タンパク質レベルを示した（図３４ＢおよびＣ）。
【０４２３】
Ｃ２Ｃ１２細胞に、ＥＦ１ａプロモーターの制御下にあるＷＴのマウスＦＧＦ２１コーディング配列（ＥＦ１ａ−ｍＦＧＦ２１）（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ  １５（２０１７）  １７３−１８３）またはＣＭＶプロモーターの制御下にあるコドン最適化されたマウスＦＧＦ２１コーディング配列（ＣＭＶ−ｍｏＦＧＦ２１）をコードするプラスミドをトランスフェクトした。コントロールとして、非トランスフェクト細胞を用いた。ＣＭＶ−ｍｏＦＧＦ２１を形質導入したＣ２Ｃ１２細胞は、ＥＦ１ａ−ｍＦＧＦ２１を形質導入した細胞または非形質導入細胞と比較してより高レベルのＦＧＦ２１を発現した（図３４Ｄ）。
【０４２４】
ＨｅｐＧ２細胞に、ＥＦ１ａプロモーターの制御下にあるＷＴのマウスＦＧＦ２１コーディング配列（ＥＦ１ａ−ｍＦＧＦ２１）（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ  １５（２０１７）  １７３−１８３）またはｈＡＡＴプロモーターの制御下にあるコドン最適化されたマウスＦＧＦ２１をコードするプラスミド（ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１）をトランスフェクトした。コントロールとして、非トランスフェクト細胞を用いた。ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１を形質導入したＨｅｐＧ２細胞は、ＥＦ１ａ−ｍＦＧＦ２１を形質導入した細胞または非形質導入細胞と比較してより高レベルのＦＧＦ２１を発現した（図３４Ｅ）。
【０４２５】
インビボ
８週齢の雄性Ｃ５７Ｂｌ６マウスに、５μｇの、伸長因子１ａ（ＥＦ１ａ）プロモーターの制御下にあるＷＴのマウスＦＧＦ２１コーディング配列（ＥＦ１ａ−ｍＦＧＦ２１）（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ  １５（２０１７）  １７３−１８３）またはＣＭＶプロモーターの制御下にあるコドン最適化されたマウスＦＧＦ２１コーディング配列（ＣＭＶ−ｍｏＦＧＦ２１）またはｈＡＡＴプロモーターの制御下にあるコドン最適化されたマウスＦＧＦ２１コーディング配列（ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１）をコードするプラスミドをハイドロダイナミクス投与した。プラスミド投与の２４時間後の肝臓におけるＦＧＦ２１発現レベル分析は、ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１またはＣＭＶ−ｍｏＦＧＦ２１で処置された動物がＥＦ１ａ−ｍＦＧＦ２１を受けた動物よりもはるかに高レベルのＦＧＦ２１を発現することを明らかにした（図３５Ａ）。加えて、ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１またはＣＭＶ−ｍｏＦＧＦ２１で処置された動物は、ＥＦ１ａ−ｍＦＧＦ２１を受けた動物よりも高いＦＧＦ２１循環レベルを示した（図３５Ｂ）。
【０４２６】
実施例２４．  ＡＡＶ８−Ｅｆ１ａ−ｍＦＧＦ２１と比較したＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１、ＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｏｕｂｌｅｍｉＲＴおよびＡＡＶ１−ＣＭＣ−ｍｏＦＧＦ２１による標的組織におけるＦＧＦ２１発現およびＦＧＦ２１循環レベルのインビボでの増加
肝臓での発現
雄性Ｃ５７Ｂｌ６マウスに、１×１０１０ｖｇ、２×１０１０ｖｇまたは５×１０１０ｖｇの伸長因子１ａ（ＥＦ１ａ）プロモーターの制御下にあるＷＴのマウスＦＧＦ２１コーディング配列をコードするＡＡＶ８ベクター（ＡＡＶ８−ＥＦ１ａ−ｍＦＧＦ２１）または肝臓特異的ｈＡＡＴプロモーターの制御下にあるコドン最適化されたマウスＦＧＦ２１コーディング配列をコードするＡＡＶ８ベクター（ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１）を静脈内投与した。ＡＡＶ投与の２週後、ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１で処置された動物は、ベクターの用量にかかわらず、ＡＡＶ８−ＥＦ１ａ−ｍＦＧＦ２１で処置された動物よりも肝臓中での高いＦＧＦ２１の発現レベルおよび高いＦＧＦ２１循環レベルの両方を示した（図３６ＡおよびＢ）。
【０４２７】
脂肪での発現
雄性Ｃ５７Ｂｌ６マウスに、２×１０１０ｖｇ、５×１０１０ｖｇまたは１×１０１１ｖｇの、伸長因子１ａ（ＥＦ１ａ）プロモーターの制御下にあるＷＴのマウスＦＧＦ２１コーディング配列をコードするＡＡＶ８ベクター（ＡＡＶ８−ＥＦ１ａ−ｍＦＧＦ２１）またはｍｉＲＴ１２２ａ配列の４個のタンデムリピートおよびｍｉＲＴ１配列の４個のタンデムリピートを伴った、ＣＡＧプロモーターの制御下にあるコドン最適化されたマウスＦＧＦ２１コーディング配列をコードするＡＡＶ８ベクター（ＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｏｕｂｌｅｍｉＲＴ）のいずれかをｅＷＡＴ内投与した。ＡＡＶ投与の２週後、ＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｏｕｂｌｅｍｉＲＴで処置された動物は、ＡＡＶ８−ＥＦ１ａ−ｍＦＧＦ２１を投与した動物よりも、ＷＡＴ中で高いＦＧＦ２１の発現レベルを示した（図３７Ａ）。そのうえ、ＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｏｕｂｌｅｍｉＲＴで処置された動物は、ＡＡＶ８−ＥＦ１ａ−ｍＦＧＦ２１を投与した動物よりも肝臓中ではるかに低いＦＧＦ２１の発現を示しており（図３７Ｂ）、このことは、ＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｏｕｂｌｅｍｉＲＴベクターのｅＷＡＴ内投与はオフターゲットの組織における導入遺伝子発現を効率的に排除することを実証する。
【０４２８】
骨格筋での発現
雄性Ｃ５７Ｂｌ６マウスに、５×１０１０ｖｇ、１×１０１１ｖｇまたは３×１０１１ｖｇの、伸長因子１ａ（ＥＦ１ａ）プロモーターの制御下にあるＷＴのマウスＦＧＦ２１コーディング配列をコードするＡＡＶ８ベクター（ＡＡＶ８−ＥＦ１ａ−ｍＦＧＦ２１）またはＣＭＶプロモーターの制御下にあるコドン最適化されたマウスＦＧＦ２１コーディング配列をコードするＡＡＶ１ベクター（ＡＡＶ１−ＣＭＶ−ＦＧＦ２１）のいずれかを筋肉内投与した。ＡＡＶ投与の２週後、ＡＡＶ１−ＣＭＶ−ＦＧＦ２１で処置された動物は、ＡＡＶ８−ＥＦ１ａ−ｍＦＧＦ２１を投与した動物よりも骨格筋中ではるかに高いＦＧＦ２１の発現レベルを示した（図３８Ａ）。そのうえ、ＡＡＶ８−ＥＦ１ａ−ｍＦＧＦ２１で処置された動物は肝臓中でＦＧＦ２１の高発現を示したが、ＡＡＶ１−ＣＭＶ−ＦＧＦ２１ベクターの筋肉内投与は肝臓での導入遺伝子発現を効率的に排除した（図３８Ｂ）。
【０４２９】
配列
配列番号  配列タイプ
１        ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ＦＧＦ２１のアミノ酸配列
２        ムス・ムスクルス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＦＧＦ２１のアミノ酸配列
３        カニス・ルプス・ファミリアリス（ｃａｎｉｓ  ｌｕｐｕｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）ＦＧＦ２１のアミノ酸配列
４        ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ＦＧＦ２１のヌクレオチド配列
５        コドン最適化されたホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ＦＧＦ２１−バリアント１のヌクレオチド配列
６        コドン最適化されたホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ＦＧＦ２１−バリアント２のヌクレオチド配列
７        コドン最適化されたホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ＦＧＦ２１−バリアント３のヌクレオチド配列
８        ムス・ムスクルス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＦＧＦ２１のヌクレオチド配列
９        コドン最適化されたムス・ムスクルス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＦＧＦ２１のヌクレオチド配列
１０      カニス・ルプス・ファミリアリス（ｃａｎｉｓ  ｌｕｐｕｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）ＦＧＦ２１のヌクレオチド配列
１１      コドン最適化されたカニス・ルプス・ファミリアリス（ｃａｎｉｓ  ｌｕｐｕｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）ＦＧＦ２１のヌクレオチド配列
１２      ｍｉＲＴ１２２ａをコードするヌクレオチド配列
１３      ｍｉＲＴ１をコードするヌクレオチド配列
１４      ｍｉＲＴ１５２をコードするヌクレオチド配列
１５      ｍｉＲＴ１９９ａ−５ｐをコードするヌクレオチド配列
１６      ｍｉＲＴ１９９ａ−３ｐをコードするヌクレオチド配列
１７      ｍｉＲＴ２１５をコードするヌクレオチド配列
１８      ｍｉＲＴ１９２をコードするヌクレオチド配列
１９      ｍｉＲＴ１４８ａをコードするヌクレオチド配列
２０      ｍｉＲＴ１９４をコードするヌクレオチド配列
２１      ｍｉＲＴ１２４をコードするヌクレオチド配列
２２      ｍｉＲＴ２１６をコードするヌクレオチド配列
２３      ｍｉＲＴ１２５をコードするヌクレオチド配列
２４      ｍｉＲＴ１３３ａをコードするヌクレオチド配列
２５      ｍｉＲＴ２０６をコードするヌクレオチド配列
２６      ｍｉＲＴ１３０をコードするヌクレオチド配列
２７      ｍｉＲＴ９９をコードするヌクレオチド配列
２８      ｍｉＲＴ２０８−５ｐをコードするヌクレオチド配列
２９      ｍｉＲＴ２０８ａ−３ｐをコードするヌクレオチド配列
３０      ｍｉＲＴ４９９−５ｐをコードするヌクレオチド配列
３１      コンストラクトＡ
３２      コンストラクトＢ
３３      コンストラクトＣ
３４      コンストラクトＤ
３５      コンストラクトＥ
３６      コンストラクトＦ
３７      コンストラクトＧ
３８      コンストラクトＨ
３９      コンストラクトＩ
４０      コンストラクトＪ
４１      コンストラクトＫ
４２      コンストラクトＬ
４３      ヒトβ−グロビンおよび免疫グロブリン重鎖遺伝子からのイントロンから構成されるキメライントロンのヌクレオチド配列
４４      ＣＡＧプロモーターのヌクレオチド配列
４５      ＣＭＶプロモーターのヌクレオチド配列
４６      ＣＭＶエンハンサーのヌクレオチド配列
４７      ｈＡＡＴプロモーターのヌクレオチド配列
４８      短縮型ＡＡＶ２  ５’ＩＴＲ
４９      短縮型ＡＡＶ２  ３’ＩＴＲ
５０      ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル
５１      ウサギβ−グロビンポリアデニル化シグナル
５２      ＣＭＶプロモーターおよびＣＭＶエンハンサー配列
５３      アポリポタンパク質Ｅからの肝細胞制御領域（ＨＣＲ）エンハンサー
５４      ｍｉｎｉ／ａＰ２プロモーター
５５      ｍｉｎｉ／ＵＣＰ１プロモーター
５６      Ｃ５−１２プロモーター
５７      ｐＡＡＶ−ＥＦ１ａ−ｍｍＦＧＦ２１−ｐＡ
ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ＦＧＦ２１のアミノ酸配列（配列番号１）
ＭＤＳＤＥＴＧＦＥＨＳＧＬＷＶＳＶＬＡＧＬＬＬＧＡＣＱＡＨＰＩＰＤＳＳＰＬＬＱＦＧＧＱＶＲＱＲＹＬＹＴＤＤＡＱＱＴＥＡＨＬＥＩＲＥＤＧＴＶＧＧＡＡＤＱＳＰＥＳＬＬＱＬＫＡＬＫＰＧＶＩＱＩＬＧＶＫＴＳＲＦＬＣＱＲＰＤＧＡＬＹＧＳＬＨＦＤＰＥＡＣＳＦＲＥＬＬＬＥＤＧＹＮＶＹＱＳＥＡＨＧＬＰＬＨＬＰＧＮＫＳＰＨＲＤＰＡＰＲＧＰＡＲＦＬＰＬＰＧＬＰＰＡＬＰＥＰＰＧＩＬＡＰＱＰＰＤＶＧＳＳＤＰＬＳＭＶＧＰＳＱＧＲＳＰＳＹＡＳ
ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ＦＧＦ２１のヌクレオチド配列（配列番号４）
ＡＴＧＧＡＣＴＣＧＧＡＣＧＡＧＡＣＣＧＧＧＴＴＣＧＡＧＣＡＣＴＣＡＧＧＡＣＴＧＴＧＧＧＴＴＴＣＴＧＴＧＣＴＧＧＣＴＧＧＴＣＴＴＣＴＧＣＴＧＧＧＡＧＣＣＴＧＣＣＡＧＧＣＡＣＡＣＣＣＣＡＴＣＣＣＴＧＡＣＴＣＣＡＧＴＣＣＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＴＴＣＧＧＧＧＧＣＣＡＡＧＴＣＣＧＧＣＡＧＣＧＧＴＡＣＣＴＣＴＡＣＡＣＡＧＡＴＧＡＴＧＣＣＣＡＧＣＡＧＡＣＡＧＡＡＧＣＣＣＡＣＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＧＧＧＡＧＧＡＴＧＧＧＡＣＧＧＴＧＧＧＧＧＧＣＧＣＴＧＣＴＧＡＣＣＡＧＡＧＣＣＣＣＧＡＡＡＧＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＣＴＧＡＡＡＧＣＣＴＴＧＡＡＧＣＣＧＧＧＡＧＴＴＡＴＴＣＡＡＡＴＣＴＴＧＧＧＡＧＴＣＡＡＧＡＣＡＴＣＣＡＧＧＴＴＣＣＴＧＴＧＣＣＡＧＣＧＧＣＣＡＧＡＴＧＧＧＧＣＣＣＴＧＴＡＴＧＧＡＴＣＧＣＴＣＣＡＣＴＴＴＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＣＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＣＧＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣＴＴＧＡＧＧＡＣＧＧＡＴＡＣＡＡＴＧＴＴＴＡＣＣＡＧＴＣＣＧＡＡＧＣＣＣＡＣＧＧＣＣＴＣＣＣＧＣＴＧＣＡＣＣＴＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＡＡＧＴＣＣＣＣＡＣＡＣＣＧＧＧＡＣＣＣＴＧＣＡＣＣＣＣＧＡＧＧＡＣＣＡＧＣＴＣＧＣＴＴＣＣＴＧＣＣＡＣＴＡＣＣＡＧＧＣＣＴＧＣＣＣＣＣＣＧＣＡＣＴＣＣＣＧＧＡＧＣＣＡＣＣＣＧＧＡＡＴＣＣＴＧＧＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＣＧＡＴＧＴＧＧＧＣＴＣＣＴＣＧＧＡＣＣＣＴＣＴＧＡＧＣＡＴＧＧＴＧＧＧＡＣＣＴＴＣＣＣＡＧＧＧＣＣＧＡＡＧＣＣＣＣＡＧＣＴＡＣＧＣＴＴＣＣＴＧＡ
コドン最適化されたホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ＦＧＦ２１−バリアント１のヌクレオチド配列（配列番号５）
ＡＴＧＧＡＴＴＣＴＧＡＴＧＡＧＡＣＡＧＧＣＴＴＣＧＡＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＴＧＴＧＧＧＴＴＴＣＡＧＴＴＣＴＧＧＣＴＧＧＡＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＧＡＧＣＣＴＧＴＣＡＧＧＣＡＣＡＣＣＣＴＡＴＴＣＣＡＧＡＴＡＧＣＡＧＣＣＣＴＣＴＧＣＴＧＣＡＧＴＴＣＧＧＣＧＧＡＣＡＡＧＴＧＣＧＧＣＡＧＡＧＡＴＡＣＣＴＧＴＡＣＡＣＣＧＡＣＧＡＣＧＣＣＣＡＧＣＡＧＡＣＡＧＡＡＧＣＣＣＡＣＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＧＡＧＡＧＧＡＴＧＧＣＡＣＡＧＴＴＧＧＣＧＧＡＧＣＣＧＣＣＧＡＴＣＡＧＴＣＴＣＣＴＧＡＡＴＣＴＣＴＧＣＴＣＣＡＧＣＴＧＡＡＧＧＣＣＣＴＧＡＡＧＣＣＴＧＧＣＧＴＧＡＴＣＣＡＧＡＴＣＣＴＧＧＧＣＧＴＧＡＡＡＡＣＣＡＧＣＣＧＧＴＴＣＣＴＧＴＧＣＣＡＡＡＧＡＣＣＴＧＡＣＧＧＣＧＣＣＣＴＧＴＡＴＧＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＣＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＡＧＧＣＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＡＧＡＧＡＧＣＴＧＣＴＧＣＴＴＧＡＧＧＡＣＧＧＣＴＡＣＡＡＣＧＴＧＴＡＣＣＡＧＴＣＴＧＡＧＧＣＣＣＡＴＧＧＣＣＴＧＣＣＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＧＡＡＡＣＡＡＧＡＧＣＣＣＴＣＡＣＡＧＡＧＡＴＣＣＣＧＣＴＣＣＴＡＧＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＡＧＡＴＴＴＣＴＧＣＣＴＣＴＴＣＣＴＧＧＡＴＴＧＣＣＴＣＣＴＧＣＴＣＴＧＣＣＡＧＡＧＣＣＴＣＣＴＧＧＡＡＴＴＣＴＧＧＣＴＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＴＧＡＴＧＴＧＧＧＣＡＧＣＴＣＴＧＡＴＣＣＴＣＴＧＡＧＣＡＴＧＧＴＣＧＧＡＣＣＴＡＧＣＣＡＧＧＧＣＡＧＡＴＣＴＣＣＴＡＧＣＴＡＣＧＣＣＴＣＴＴＧＡ
コドン最適化されたホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ＦＧＦ２１−バリアント２のヌクレオチド配列（配列番号６）
ＡＴＧＧＡＣＡＧＣＧＡＴＧＡＡＡＣＣＧＧＧＴＴＣＧＡＧＣＡＣＡＧＣＧＧＴＣＴＧＴＧＧＧＴＧＴＣＣＧＴＧＣＴＧＧＣＣＧＧＡＣＴＧＣＴＣＣＴＧＧＧＡＧＣＣＴＧＴＣＡＧＧＣＧＣＡＣＣＣＣＡＴＣＣＣＴＧＡＣＴＣＣＴＣＧＣＣＧＣＴＧＣＴＧＣＡＡＴＴＣＧＧＣＧＧＡＣＡＡＧＴＣＣＧＣＣＡＧＡＧＡＴＡＣＣＴＧＴＡＣＡＣＣＧＡＣＧＡＣＧＣＣＣＡＧＣＡＧＡＣＣＧＡＡＧＣＣＣＡＣＣＴＧＧＡＡＡＴＴＣＧＧＧＡＧＧＡＣＧＧＧＡＣＴＧＴＧＧＧＡＧＧＣＧＣＴＧＣＡＧＡＴＣＡＧＴＣＡＣＣＣＧＡＧＴＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＣＴＧＡＡＧＧＣＣＴＴＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＧＴＧＡＴＴＣＡＧＡＴＣＣＴＧＧＧＣＧＴＧＡＡＡＡＣＴＴＣＣＣＧＣＴＴＣＣＴＴＴＧＣＣＡＡＣＧＧＣＣＧＧＡＴＧＧＡＧＣＴＣＴＧＴＡＣＧＧＡＴＣＣＣＴＧＣＡＣＴＴＣＧＡＣＣＣＣＧＡＡＧＣＣＴＧＣＴＣＡＴＴＣＣＧＣＧＡＧＣＴＧＣＴＣＣＴＴＧＡＧＧＡＣＧＧＣＴＡＴＡＡＣＧＴＧＴＡＣＣＡＧＴＣＴＧＡＧＧＣＣＣＡＴＧＧＡＣＴＣＣＣＣＣＴＧＣＡＴＣＴＧＣＣＣＧＧＣＡＡＣＡＡＧＴＣＣＣＣＴＣＡＣＣＧＧＧＡＴＣＣＴＧＣＣＣＣＡＡＧＡＧＧＣＣＣＡＧＣＴＣＧＧＴＴＴＣＴＧＣＣＴＣＴＧＣＣＧＧＧＡＣＴＧＣＣＴＣＣＡＧＣＧＴＴＧＣＣＣＧＡＡＣＣＣＣＣＴＧＧＴＡＴＣＣＴＧＧＣＣＣＣＧＣＡＡＣＣＡＣＣＴＧＡＣＧＴＣＧＧＴＴＣＧＴＣＧＧＡＣＣＣＧＣＴＧＡＧＣＡＴＧＧＴＣＧＧＴＣＣＧＡＧＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＴＣＣＣＣＧＴＣＣＴＡＣＧＣＡＴＣＣＴＧＡ
コドン最適化されたホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ＦＧＦ２１−バリアント３のヌクレオチド配列（配列番号７）
ＡＴＧＧＡＴＴＣＣＧＡＣＧＡＡＡＣＴＧＧＡＴＴＴＧＡＡＣＡＴＴＣＡＧＧＧＣＴＧＴＧＧＧＴＣＴＣＴＧＴＧＣＴＧＧＣＴＧＧＡＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＧＧＧＣＴＴＧＴＣＡＧＧＣＴＣＡＣＣＣＣＡＴＣＣＣＴＧＡＣＡＧＣＴＣＣＣＣＴＣＴＧＣＴＧＣＡＧＴＴＣＧＧＡＧＧＡＣＡＧＧＴＧＣＧＧＣＡＧＡＧＡＴＡＣＣＴＧＴＡＴＡＣＣＧＡＣＧＡＴＧＣＣＣＡＧＣＡＧＡＣＡＧＡＧＧＣＡＣＡＣＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＧＧＧＡＧＧＡＣＧＧＡＡＣＣＧＴＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＣＣＧＡＴＣＡＧＴＣＴＣＣＣＧＡＧＡＧＣＣＴＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＡＡＧＧＣＣＣＴＧＡＡＧＣＣＴＧＧＣＧＴＧＡＴＣＣＡＧＡＴＣＣＴＧＧＧＣＧＴＧＡＡＧＡＣＡＴＣＴＣＧＧＴＴＴＣＴＧＴＧＣＣＡＧＣＧＧＣＣＣＧＡＣＧＧＣＧＣＣＣＴＧＴＡＣＧＧＣＴＣＣＣＴＧＣＡＣＴＴＣＧＡＴＣＣＣＧＡＧＧＣＣＴＧＴＴＣＴＴＴＴＡＧＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＧＣＴＡＣＡＡＣＧＴＧＴＡＴＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＣＡＣＡＣＧＧＣＣＴＧＣＣＡＣＴＧＣＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＣＡＡＴＡＡＧＴＣＣＣＣＴＣＡＣＣＧＣＧＡＴＣＣＡＧＣＡＣＣＣＡＧＧＧＧＣＣＣＡＧＣＡＣＧＣＴＴＣＣＴＧＣＣＴＣＴＧＣＣＡＧＧＣＣＴＧＣＣＣＣＣＴＧＣＣＣＴＧＣＣＡＧＡＧＣＣＡＣＣＣＧＧＣＡＴＣＣＴＧＧＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＴＣＣＡＧＡＴＧＴＧＧＧＣＴＣＣＡＧＣＧＡＴＣＣＴＣＴＧＴＣＡＡＴＧＧＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＴＣＡＧＧＧＧＣＧＧＡＧＴＣＣＴＴＣＡＴＡＣＧＣＡＴＣＡＴＡＡ
ｍｉＲＴ１２２ａをコードするヌクレオチド配列（マイクロＲＮＡ  １２２ａの標的配列）（配列番号１２）
５’  ＣＡＡＡＣＡＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣＡ  ３’
ｍｉＲＴ１をコードするヌクレオチド配列（マイクロＲＮＡ  １の標的配列）（配列番号１３）
５’  ＴＴＡＣＡＴＡＣＴＴＣＴＴＴＡＣＡＴＴＣＣＡ  ３’
ｍｉＲＴ１５２をコードするヌクレオチド配列（マイクロＲＮＡ  １５２の標的配列）（配列番号１４）
５’  ＣＣＡＡＧＴＴＣＴＧＴＣＡＴＧＣＡＣＴＧＡ  ３’
ｍｉＲＴ１９９ａ−５ｐをコードするヌクレオチド配列（マイクロＲＮＡ  １９９ａの標的配列）（配列番号１５）
５’  ＧＡＡＣＡＧＧＴＡＧＴＣＴＧＡＡＣＡＣＴＧＧＧ  ３’
ｍｉＲＴ１９９ａ−３ｐをコードするヌクレオチド配列（マイクロＲＮＡ  １９９ａの標的配列）（配列番号１６）
５’  ＴＡＡＣＣＡＡＴＧＴＧＣＡＧＡＣＴＡＣＴＧＴ  ３’
ｍｉＲＴ２１５をコードするヌクレオチド配列（マイクロＲＮＡ  ２１５の標的配列）（配列番号１７）
５’  ＧＴＣＴＧＴＣＡＡＴＴＣＡＴＡＧＧＴＣＡＴ  ３’
ｍｉＲＴ１９２をコードするヌクレオチド配列（マイクロＲＮＡ  １９２の標的配列）（配列番号１８）
５’  ＧＧＣＴＧＴＣＡＡＴＴＣＡＴＡＧＧＴＣＡＧ  ３’
ｍｉＲＴ１４８ａをコードするヌクレオチド配列（マイクロＲＮＡ  １４８ａの標的配列）（配列番号１９）
５’  ＡＣＡＡＡＧＴＴＣＴＧＴＡＧＴＧＣＡＣＴＧＡ  ３’
ｍｉＲＴ１９４をコードするヌクレオチド配列（マイクロＲＮＡ  １９４の標的配列）（配列番号２０）
５’  ＴＣＣＡＣＡＴＧＧＡＧＴＴＧＣＴＧＴＴＡＣＡ  ３’
ｍｉＲＴ１２４をコードするヌクレオチド配列（マイクロＲＮＡ  １２４の標的配列）（配列番号２１）
５’  ＧＧＣＡＴＴＣＡＣＣＧＣＧＴＧＣＣＴＴＡ  ３’
ｍｉＲＴ２１６をコードするヌクレオチド配列（マイクロＲＮＡ  ２１６の標的配列）（配列番号２２）
５’  ＴＣＡＣＡＧＴＴＧＣＣＡＧＣＴＧＡＧＡＴＴＡ  ３’
ｍｉＲＴ１２５をコードするヌクレオチド配列（マイクロＲＮＡ  １２５の標的配列）（配列番号２３）
５’  ＴＣＡＣＡＧＧＴＴＡＡＡＧＧＧＴＣＴＣＡＧＧＧＡ  ３’
ｍｉＲＴ１３３ａをコードするヌクレオチド配列（マイクロＲＮＡ  １３３ａの標的配列）（配列番号２４）
５’  ＣＡＧＣＴＧＧＴＴＧＡＡＧＧＧＧＡＣＣＡＡＡ  ３’
ｍｉＲＴ２０６をコードするヌクレオチド配列（マイクロＲＮＡ  ２０６の標的配列）（配列番号２５）
５’  ＣＣＡＣＡＣＡＣＴＴＣＣＴＴＡＣＡＴＴＣＣＡ  ３’
ｍｉＲＴ１３０をコードするヌクレオチド配列（マイクロＲＮＡ  １３０の標的配列）（配列番号２６）
５’  ＡＴＧＣＣＣＴＴＴＴＡＡＣＡＴＴＧＣＡＣＴＧ  ３’
ｍｉＲＴ９９をコードするヌクレオチド配列（マイクロＲＮＡ  ９９の標的配列）（配列番号２７）
５’  ＣＡＣＡＡＧＡＴＣＧＧＡＴＣＴＡＣＧＧＧＴＴ  ３’
ｍｉＲＴ２０８−５ｐをコードするヌクレオチド配列（マイクロＲＮＡ  ２０８ａの標的配列）（配列番号２８）
５’  ＧＴＡＴＡＡＣＣＣＧＧＧＣＣＡＡＡＡＧＣＴＣ  ３’
ｍｉＲＴ２０８ａ−３ｐをコードするヌクレオチド配列（マイクロＲＮＡ  ２０８ａの標的配列）（配列番号２９）
５’  ＡＣＡＡＧＣＴＴＴＴＴＧＣＴＣＧＴＣＴＴＡＴ  ３’
ｍｉＲＴ４９９−５ｐをコードするヌクレオチド配列（心臓特異的なマイクロＲＮＡ  ４９９の標的配列）（配列番号３０）
５’ＡＡＡＣＡＴＣＡＣＴＧＣＡＡＧＴＣＴＴＡＡ  ３’
ＣＡＧプロモーターのヌクレオチド配列（配列番号４４）
ＧＡＣＡＴＴＧＡＴＴＡＴＴＧＡＣＴＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧＧＧＧＴＣＡＴＴＡＧＴＴＣＡＴＡＧＣＣＣＡＴＡＴＡＴＧＧＡＧＴＴＣＣＧＣＧＴＴＡＣＡＴＡＡＣＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＴＧＡＣＣＧＣＣＣＡＡＣＧＡＣＣＣＣＣＧＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＡＡＴＧＡＣＧＴＡＴＧＴＴＣＣＣＡＴＡＧＴＡＡＣＧＣＣＡＡＴＡＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＧＧＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＣＴＧＣＣＣＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＡＡＧＴＧＴＡＴＣＡＴＡＴＧＣＣＡＡＧＴＡＣＧＣＣＣＣＣＴＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＡＴＧＣＣＣＡＧＴＡＣＡＴＧＡＣＣＴＴＡＴＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＴＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＴＡＣＧＴＡＴＴＡＧＴＣＡＴＣＧＣＴＡＴＴＡＣＣＡＴＧＧＴＣＧＡＧＧＴＧＡＧＣＣＣＣＡＣＧＴＴＣＴＧＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＡＴＣＴＣＣＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣＡＣＣＣＣＣＡＡＴＴＴＴＧＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴＡＴＴＴＴＧＴＧＣＡＧＣＧＡＴＧＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＡＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＡＧＡＧＧＴＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＣＡＡＴＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＣＧＣＴＣＣＧＡＡＡＧＴＴＴＣＣＴＴＴＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＣＣＴＡＴＡＡＡＡＡＧＣＧＡＡＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧＧＡＧＴＣＧＣＴＧＣＧＴＴＧＣＣＴＴＣＧＣＣＣＣＧＴＧＣＣＣＣＧＣＴＣＣＧＣＧＣＣＧＣＣＴＣＧＣＧＣＣＧＣＣＣＧＣＣＣＣＧＧＣＴＣＴＧＡＣＴＧＡＣＣＧＣＧＴＴＡＣＴＣＣＣＡＣＡＧＧＴＧＡＧＣＧＧＧＣＧＧＧＡＣＧＧＣＣＣＴＴＣＴＣＣＴＣＣＧＧＧＣＴＧＴＡＡＴＴＡＧＣＧＣＴＴＧＧＴＴＴＡＡＴＧＡＣＧＧＣＴＴＧＴＴＴＣＴＴＴＴＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＧＴＧＡＡＡＧＣＣＴＴＧＡＧＧＧＧＣＴＣＣＧＧＧＡＧＧＧＣＣＣＴＴＴＧＴＧＣＧＧＧＧＧＧＡＧＣＧＧＣＴＣＧＧＧＧＧＧＴＧＣＧＴＧＣＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＣＧＴＧＧＧＧＡＧＣＧＣＣＧＣＧＴＧＣＧＧＣＴＣＣＧＣＧＣＴＧＣＣＣＧＧＣＧＧＣＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＧＣＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧＣＧＧＧＧＣＴＴＴＧＴＧＣＧＣＴＣＣＧＣＡＧＴＧＴＧＣＧＣＧＡＧＧＧＧＡＧＣＧＣＧＧＣＣＧＧＧＧＧＣＧＧＴＧＣＣＣＣＧＣＧＧＴＧＣＧＧＧＧＧＧＣＴＧＣＧＡＧＧＧＧＡＡＣＡＡＡＧＧＣＴＧＣＧＴＧＣＧＧＧＧＴＧＴＧＴＧＣＧＴＧＧＧＧＧＧＧＴＧＡＧＣＡＧＧＧＧＧＴＧＴＧＧＧＣＧＣＧＴＣＧＧＴＣＧＧＧＣＴＧＣＡＡＣＣＣＣＣＣＣＴＧＣＡＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣＧＡＧＴＴＧＣＴＧＡＧＣＡＣＧＧＣＣＣＧＧＣＴＴＣＧＧＧＴＧＣＧＧＧＧＣＴＣＣＧＴＡＣＧＧＧＧＣＧＴＧＧＣＧＣＧＧＧＧＣＴＣＧＣＣＧＴＧＣＣＧＧＧＣＧＧＧＧＧＧＴＧＧＣＧＧＣＡＧＧＴＧＧＧＧＧＴＧＣＣＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＣＧＣＣＴＣＧＧＧＣＣＧＧＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧＧＣＣＣＣＣＧＧＡＧＣＧＣＣＧＧＣＧＧＣＴＧＴＣＧＡＧＧＣＧＣＧＧＣＧＡＧＣＣＧＣＡＧＣＣＡＴＴＧＣＣＴＴＴＴＡＴＧＧＴＡＡＴＣＧＴＧＣＧＡＧＡＧＧＧＣＧＣＡＧＧＧＡＣＴＴＣＣＴＴＴＧＴＣＣＣＡＡＡＴＣＴＧＴＧＣＧＧＡＧＣＣＧＡＡＡＴＣＴＧＧＧＡＧＧＣＧＣＣＧＣＣＧＣＡＣＣＣＣＣＴＣＴＡＧＣＧＧＧＣＧＣＧＧＧＧＣＧＡＡＧＣＧＧＴＧＣＧＧＣＧＣＣＧＧＣＡＧＧＡＡＧＧＡＡＡＴＧＧＧＣＧＧＧＧＡＧＧＧＣＣＴＴＣＧＴＧＣＧＴＣＧＣＣＧＣＧＣＣＧＣＣＧＴＣＣＣＣＴＴＣＴＣＣＣＴＣＴＣＣＡＧＣＣＴＣＧＧＧＧＣＴＧＴＣＣＧＣＧＧＧＧＧＧＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＧＧＧＣＡＧＧＧＣＧＧＧＧＴＴＣＧＧＣＴＴＣＴＧＧＣＧＴＧＴＧＡＣＣＧＧＣＧＧＣＴＣＴＡＧＡＧＣＣＴＣＴＧＣＴＡＡＣＣＡＴＧＴＴＣＡＴＧＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴＴＴＴＣＣＴＡＣＡＧ
ＣＭＶプロモーターのヌクレオチド配列（配列番号４５）
ＧＴＧＡＴＧＣＧＧＴＴＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＣＣＡＡＴＧＧＧＣＧＴＧＧＡＴＡＧＣＧＧＴＴＴＧＡＣＴＣＡＣＧＧＧＧＡＴＴＴＣＣＡＡＧＴＣＴＣＣＡＣＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＧＧＡＧＴＴＴＧＴＴＴＴＧＧＣＡＣＣＡＡＡＡＴＣＡＡＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＡＡＡＴＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡＣＴＧＣＧＡＴＣＧＣＣＣＧＣＣＣＣＧＴＴＧＡＣＧＣＡＡＡＴＧＧＧＣＧＧＴＡＧＧＣＧＴＧＴＡＣＧＧＴＧＧＧＡＧＧＴＣＴＡＴＡＴＡＡＧＣＡＧＡＧＣＴ
ＣＭＶエンハンサーのヌクレオチド配列（配列番号４６）
ＧＧＣＡＴＴＧＡＴＴＡＴＴＧＡＣＴＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧＧＧＧＴＣＡＴＴＡＧＴＴＣＡＴＡＧＣＣＣＡＴＡＴＡＴＧＧＡＧＴＴＣＣＧＣＧＴＴＡＣＡＴＡＡＣＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＴＧＡＣＣＧＣＣＣＡＡＣＧＡＣＣＣＣＣＧＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＡＡＴＧＡＣＧＴＡＴＧＴＴＣＣＣＡＴＡＧＴＡＡＣＧＣＣＡＡＴＡＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＧＧＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＣＴＧＣＣＣＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＡＡＧＴＧＴＡＴＣＡＴＡＴＧＣＣＡＡＧＴＣＣＧＣＣＣＣＣＴＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＡＴＧＣＣＣＡＧＴＡＣＡＴＧＡＣＣＴＴＡＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＴＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＴＡＣＧＴＡＴＴＡＧＴＣＡＴＣＧＣＴＡＴＴＡＣＣＡＴＧ
ｈＡＡＴプロモーターのヌクレオチド配列（配列番号４７）
ＧＡＴＣＴＴＧＣＴＡＣＣＡＧＴＧＧＡＡＣＡＧＣＣＡＣＴＡＡＧＧＡＴＴＣＴＧＣＡＧＴＧＡＧＡＧＣＡＧＡＧＧＧＣＣＡＧＣＴＡＡＧＴＧＧＴＡＣＴＣＴＣＣＣＡＧＡＧＡＣＴＧＴＣＴＧＡＣＴＣＡＣＧＣＣＡＣＣＣＣＣＴＣＣＡＣＣＴＴＧＧＡＣＡＣＡＧＧＡＣＧＣＴＧＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧＣＣＡＧＧＴＡＣＡＡＴＧＡＣＴＣＣＴＴＴＣＧＧＴＡＡＧＴＧＣＡＧＴＧＧＡＡＧＣＴＧＴＡＣＡＣＴＧＣＣＣＡＧＧＣＡＡＡＧＣＧＴＣＣＧＧＧＣＡＧＣＧＴＡＧＧＣＧＧＧＣＧＡＣＴＣＡＧＡＴＣＣＣＡＧＣＣＡＧＴＧＧＡＣＴＴＡＧＣＣＣＣＴＧＴＴＴＧＣＴＣＣＴＣＣＧＡＴＡＡＣＴＧＧＧＧＴＧＡＣＣＴＴＧＧＴＴＡＡＴＡＴＴＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＣＴＣＣＣＣＣＧＴＴＧＣＣＣＣＴＣＴＧＧＡＴＣＣＡＣＴＧＣＴＴＡＡＡＴＡＣＧＧＡＣＧＡＧＧＡＣＡＧＧＧＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＴＴＣＡＧＧＣＡＣＣＡＣＣＡＣＴＧＡＣＣＴＧＧＧＡＣＡＧＴＧＡＡＴ
短縮型ＡＡＶ２  ５’ＩＴＲ（配列番号４８）
ＧＣＧＣＧＣＴＣ  ＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣ  ＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣ  ＣＧＧＧＣＡＡＡＧＣ  
ＣＣＧＧＧＣＧＴＣＧ  ＧＧＣＧＡＣＣＴＴＴ  ＧＧＴＣＧＣＣＣＧＧ  ＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧ  ＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧ  
ＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧ  ＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡ  ＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴ  ＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴ
短縮型ＡＡＶ２  ３’ＩＴＲ（配列番号４９）
ＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴ  ＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧ  ＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣ  ＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧ  
ＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧ  ＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧ  ＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣ  ＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣ  ＣＧＡＣＧＣＣＣＧＧ  ＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧ  ＧＧＣＧＧＣＣＴＣＡ  ＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣ  ＧＡＧＣＧＣＧＣ
ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（配列番号５０）
ＴＡＡＧＡＴＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧＴＴＴＧＧＡＣＡＡＡＣＣＡＣＡＡＣＴＡＧＡＡＴＧＣＡＧＴＧＡＡＡＡＡＡＡＴＧＣＴＴＴＡＴＴＴＧＴＧＡＡＡＴＴＴＧＴＧＡＴＧＣＴＡＴＴＧＣＴＴＴＡＴＴＴＧＴＡＡＣＣＡＴＴＡＴＡＡＧＣＴＧＣＡＡＴＡＡＡＣＡＡＧＴＴ
ウサギβ−グロビンポリアデニル化シグナル（配列番号５１）
ＧＡＴＣＴＴＴＴＴＣＣＣＴＣＴＧＣＣＡＡＡＡＡＴＴＡＴＧＧＧＧＡＣＡＴＣＡＴＧＡＡＧＣＣＣＣＴＴＧＡＧＣＡＴＣＴＧＡＣＴＴＣＴＧＧＣＴＡＡＴＡＡＡＧＧＡＡＡＴＴＴＡＴＴＴＴＣＡＴＴＧＣＡＡＴＡＧＴＧＴＧＴＴＧＧＡＡＴＴＴＴＴＴＧＴＧＴＣＴＣＴＣＡＣＴＣＧＧＡＡＧＧＡＣＡＴＡＴＧＧＧＡＧＧＧＣＡＡＡＴＣＡＴＴＴＡＡＡＡＣＡＴＣＡＧＡＡＴＧＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＴＴＡＧＡＧＴＴＴＧＧＣＡＡＣＡＴＡＴＧＣＣＣＡＴＡＴＧＣＴＧＧＣＴＧＣＣＡＴＧＡＡＣＡＡＡＧＧＴＴＧＧＣＴＡＴＡＡＡＧＡＧＧＴＣＡＴＣＡＧＴＡＴＡＴＧＡＡＡＣＡＧＣＣＣＣＣＴＧＣＴＧＴＣＣＡＴＴＣＣＴＴＡＴＴＣＣＡＴＡＧＡＡＡＡＧＣＣＴＴＧＡＣＴＴＧＡＧＧＴＴＡＧＡＴＴＴＴＴＴＴＴＡＴＡＴＴＴＴＧＴＴＴＴＧＴＧＴＴＡＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＴＡＡＣＡＴＣＣＣＴＡＡＡＡＴＴＴＴＣＣＴＴＡＣＡＴＧＴＴＴＴＡＣＴＡＧＣＣＡＧＡＴＴＴＴＴＣＣＴＣＣＴＣＴＣＣＴＧＡＣＴＡＣＴＣＣＣＡＧＴＣＡＴＡＧＣＴＧＴＣＣＣＴＣＴＴＣＴＣＴＴＡＴＧＧＡＧＡＴＣ
ＣＭＶプロモーターおよびＣＭＶエンハンサー配列（配列番号５２）
ＧＧＣＡＴＴＧＡＴＴＡＴＴＧＡＣＴＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧＧＧＧＴＣＡＴＴＡＧＴＴＣＡＴＡＧＣＣＣＡＴＡＴＡＴＧＧＡＧＴＴＣＣＧＣＧＴＴＡＣＡＴＡＡＣＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＴＧＡＣＣＧＣＣＣＡＡＣＧＡＣＣＣＣＣＧＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＡＡＴＧＡＣＧＴＡＴＧＴＴＣＣＣＡＴＡＧＴＡＡＣＧＣＣＡＡＴＡＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＧＧＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＣＴＧＣＣＣＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＡＡＧＴＧＴＡＴＣＡＴＡＴＧＣＣＡＡＧＴＣＣＧＣＣＣＣＣＴＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＡＴＧＣＣＣＡＧＴＡＣＡＴＧＡＣＣＴＴＡＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＴＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＴＡＣＧＴＡＴＴＡＧＴＣＡＴＣＧＣＴＡＴＴＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＴＧＣＧＧＴＴＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＣＣＡＡＴＧＧＧＣＧＴＧＧＡＴＡＧＣＧＧＴＴＴＧＡＣＴＣＡＣＧＧＧＧＡＴＴＴＣＣＡＡＧＴＣＴＣＣＡＣＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＧＧＡＧＴＴＴＧＴＴＴＴＧＧＣＡＣＣＡＡＡＡＴＣＡＡＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＡＡＡＴＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡＣＴＧＣＧＡＴＣＧＣＣＣＧＣＣＣＣＧＴＴＧＡＣＧＣＡＡＡＴＧＧＧＣＧＧＴＡＧＧＣＧＴＧＴＡＣＧＧＴＧＧＧＡＧＧＴＣＴＡＴＡＴＡＡＧＣＡＧＡＧＣＴ
アポリポタンパク質Ｅからの肝細胞制御領域（ＨＣＲ）エンハンサー（配列番号５３）
ＣＡＧＡＧＡＧＧＴＣＴＣＴＧＡＣＣＴＣＴＧＣＣＣＣＡＧＣＴＣＣＡＡＧＧＴＣＡＧＣＡＧＧＣＡＧＧＧＡＧＧＧＣＴＧＴＧＴＧＴＴＴＧＣＴＧＴＴＴＧＣＴＧＣＴＴＧＣＡＡＴＧＴＴＴＧＣＣＣＡＴＴＴＴＡＧＧＧＡＣＡＴＧＡＧＴＡＧＧＣＴＧＡＡＧＴＴＴＧＴＴＣＡＧＴＧＴＧＧＡＣＴＴＣＡＧＡＧＧＣＡＧＣＡＣＡＣＡＡＡＣＡＧＣ
ｍｉｎｉａＰ２プロモーター（配列番号５４）
ＧＡＴＴＡ
ＡＣＣＣＧＣＣＡＴＧ  ＣＴＡＣＴＴＡＴＣＴ  ＡＣＴＣＧＡＣＡＴＴ  ＧＡＴＴＡＴＴＧＡＣ  ＴＡＧＧＧＧＡＡＴＴ
ＣＣＡＧＣＡＧＧＡＡ  ＴＣＡＧＧＴＡＧＣＴ  ＧＧＡＧＡＡＴＣＧＣ  ＡＣＡＧＡＧＣＣＡＴ  ＧＣＧＡＴＴＣＴＴＧ
ＧＣＡＡＧＣＣＡＴＧ  ＣＧＡＣＡＡＡＧＧＣ  ＡＧＡＡＡＴＧＣＡＣ  ＡＴＴＴＣＡＣＣＣＡ  ＧＡＧＡＧＡＡＧＧＧ
ＡＴＴＧＡＴＧＴＣＡ  ＧＣＡＧＧＡＡＧＴＣ  ＡＣＣＡＣＣＣＡＧＡ  ＧＡＧＣＡＡＡＴＧＧ  ＡＧＴＴＣＣＣＡＧＡ
ＴＧＣＣＴＧＡＣＡＴ  ＴＴＧＣＣＴＴＣＴＴ  ＡＣＴＧＧＡＴＣＡＧ  ＡＧＴＴＣＡＣＴＡＧ  ＴＧＧＡＡＧＴＧＴＣ
ＡＣＡＧＣＣＣＡＡＡ  ＣＡＣＴＣＣＣＣＣＡ  ＡＡＧＣＴＣＡＧＣＣ  ＣＴＴＣＣＴＴＧＣＣ  ＴＴＧＴＡＡＣＡＡＴ
ＣＡＡＧＣＣＧＣＴＣ  ＣＴＧＧＡＴＧＡＡＣ  ＴＧＣＴＣＣＧＣＣＣ  ＴＣＴＧＴＣＴＣＴＴ  ＴＧＧＣＡＧＧＧＴＴ
ＧＧＡＧＣＣＣＡＣＴ  ＧＴＧＧＣＣＴＧＡＧ  ＣＧＡＣＴＴＣＴＡＴ  ＧＧＣＴＣＣＣＴＴＴ  ＴＣＴＧＴＧＡＴＴＴ
ＴＣＡＴＧＧＴＴＴＣ  ＴＧＡＧＣＴＣＴＴＴ  ＴＣＣＣＣＣＧＣＴＴ  ＴＡＴＧＡＴＴＴＴＣ  ＴＣＴＴＴＴＴＧＴＣ
ＴＣＴＣＴＣＴＴＧＣ  ＴＡＡＡＣＣＴＣＣＴ  ＴＣＧＴＡＴＡＴＡＴ  ＧＣＣＣＴＣＴＣＡＧ  ＧＴＴＴＣＡＴＴＴＣ
ＴＧＡＡＴＣＡＴＣＴ  ＡＣＴＧＴＧＡＡＣＴ  ＡＴＴＣＣＣＡＴＴＧ  ＴＴＴＧＣＣＡＧＡＡ  ＧＣＣＣＣＣＴＧＧＴ
ＴＣＴＴＣＣＴＴＣＴ  ＡＧＡＣＡＣＣＡＧＧ  ＣＡＡＧＧＧＧＣＡＧ  ＧＡＧＧＴＡＡＧＡＧ  ＧＣＡＧＧＡＧＴＣＣ
ＡＴＡＡＡＡＣＡＧＣ  ＣＣＴＧＡＧＡＧＣＣ  ＴＧＣＴＧＧＧＴＣＡ  ＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧ  ＴＣＡＧＡＡ
ｍｉｎｉＵＣＰ１プロモーター（配列番号５５）
ＧＡＣＧＴＣＡＣＡＧ  ＴＧＧＧＴＣＡＧＴＣ  ＡＣＣＣＴＴＧＡＴＣ  ＡＣＡＣＴＧＣＡＣＣ  ＡＧＴＣＴＴＣＡＣＣ
ＴＴＴＣＣＡＣＧＣＴ  ＴＣＣＴＧＣＣＡＧＡ  ＧＣＡＴＧＡＡＴＣＡ  ＧＧＣＴＣＴＣＴＧＧ  ＧＧＡＴＡＣＣＧＧＣ
ＣＴＣＡＣＣＣＣＴＡ  ＣＴＧＡＧＧＣＡＡＡ  ＣＴＴＴＣＴＣＣＣＡ  ＣＴＴＣＴＣＡＧＡＧ  ＧＣＴＣＴＧＡＧＧＧ
ＣＡＧＣＡＡＧＧＴＣ  ＡＧＣＣＣＴＴＴＣＴ  ＴＴＧＧＡＡＴＣＴＡ  ＧＡＡＣＣＡＣＴＣＣ  ＣＴＧＴＣＴＴＧＡＧ
ＣＴＧＡＣＡＴＣＡＣ  ＡＧＧＧＣＡＧＧＣＡ  ＧＡＴＧＣＡＧＣＡＧ  ＧＧＡＡＧＧＧＣＣＴ  ＧＧＧＡＣＴＧＧＧＡ
ＣＧＴＴＣＡＴＣＣＴ  ＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣ  ＴＧＴＧＧＡＡＣＴＴ  ＴＴＣＡＧＣＡＡＣＡ  ＴＣＴＣＡＧＡＡＡＴ
ＣＡＧＡＴＣＧＣＡＣ  ＴＴＡＴＴＣＡＡＡＧ  ＧＡＧＣＣＡＧＧＣＣ  ＣＴＧＣＴＣＴＧＣＧ  ＣＣＣＴＧＧＴＧＧＡ
ＧＧＣＴＣＣＴＣＡＴ  ＧＴＧＡＡＧＡＧＴＧ  ＡＣＡＡＡＡＧＧＣＡ  ＣＣＡＴＧＴＴＧＴＧ  ＧＡＴＡＣＧＧＧＧＣ
ＧＡＡＧＣＣＣＣＴＣ  ＣＧＧＴＧＴＧＴＣＣ  ＴＣＣＡＧＧＣＡＴＣ  ＡＴＣＡＧＧＡＡＣＴ  ＡＧＴＧＣＣＡＡＡＧ
ＣＡＧＡＧＧＴＧＣＴ  ＧＧＣＣＡＧＧＧＣＴ  ＴＴＧＧＧＡＧＴＧＡ  ＣＧＣＧＣＧＴＣＴＧ  ＧＧＡＧＧＣＴＴＧＴ
ＧＣＧＣＣＣＡＧＧＧ  ＣＡＣＧＣＣＣＣＴＧ  ＣＣＧＡＴＴＣＣＣＡ  ＣＴＡＧＣＡＧＧＴＣ  ＴＴＧＧＧＧＧＡＣＣ
ＴＧＧＧＣＣＧＧＣＴ  ＣＴＧＣＣＣＣＴＣＣ  ＴＣＣＡＧＣＡＡＴＣ  ＧＧＧＣＴＡＴＡＡＡ  ＧＣＴＣＴＴＣＣＡＡ
ＧＴＣＡＧＧＧＣＧＣ  ＡＧＡＡＧＴＧＣＣＧ  ＧＧＣＧＡＴＣＣＧＧ  ＧＣＴＴＡＡＡＧＡＧ  ＣＧＡＧＡＧＧＡＡＧ
ＧＧＡＣＧＣＴＣＡＣ  ＣＴＴＴＧＡＧＣＴＣ  ＣＴＣＣＡＣＡＡＡＴ  ＡＧＣＣＣＴＧＧＴＧ  ＧＣＴＧＣＣＡＣＡＧ
ＡＡＧＴＴＣＧＡＡＧ  ＴＴＧＡＧＡＧＴＴＣ  ＧＧ
Ｃ５−１２プロモーター（配列番号５６）
ＣＧＧＣＣＧＴＣＣＧ  ＣＣＴＴＣＧＧＣＡＣ  ＣＡＴＣＣＴＣＡＣＧ  ＡＣＡＣＣＣＡＡＡＴ  ＡＴＧＧＣＧＡＣＧＧ  ＧＴＧＡＧＧＡＡＴＧ
ＧＴＧＧＧＧＡＧＴＴ  ＡＴＴＴＴＴＡＧＡＧ  ＣＧＧＴＧＡＧＧＡＡ  ＧＧＴＧＧＧＣＡＧＧ  ＣＡＧＣＡＧＧＴＧＴ  ＴＧＧＣＧＣＴＣＴＡ
ＡＡＡＡＴＡＡＣＴＣ  ＣＣＧＧＧＡＧＴＴＡ  ＴＴＴＴＴＡＧＡＧＣ  ＧＧＡＧＧＡＡＴＧＧ  ＴＧＧＡＣＡＣＣＣＡ  ＡＡＴＡＴＧＧＣＧＡ
ＣＧＧＴＴＣＣＴＣＡ  ＣＣＣＧＴＣＧＣＣＡ  ＴＡＴＴＴＧＧＧＴＧ  ＴＣＣＧＣＣＣＴＣＧ  ＧＣＣＧＧＧＧＣＣＧ  ＣＡＴＴＣＣＴＧＧＧ
ＧＧＣＣＧＧＧＣＧＧ  ＴＧＣＴＣＣＣＧＣＣ  ＣＧＣＣＴＣＧＡＴＡ  ＡＡＡＧＧＣＴＣＣＧ  ＧＧＧＣＣＧＧＣＧＧ  ＣＧＧＣＣＣＡＣＧＡ
ＧＣＴＡＣＣＣＧＧＡ  ＧＧＡＧＣＧＧＧＡＧ  ＧＣＧＣＣＡ
ｐＡＡＶ−ＥＦ１ａ−ｍｍＦＧＦ２１−ｐＡ（配列番号５７）
ＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡＧＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＧＧＧＣＧＴＣＧＧＧＣＧＡＣＣＴＴＴＧＧＴＣＧＣＣＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧＴＧＣＣＣＧＴＣＡＧＴＧＧＧＣＡＧＡＧＣＧＣＡＣＡＴＣＧＣＣＣＡＣＡＧＴＣＣＣＣＧＡＧＡＡＧＴＴＧＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＧＡＡＣＣＧＧＴＧＣＣＴＡＧＡＧＡＡＧＧＴＧＧＣＧＣＧＧＧＧＴＡＡＡＣＴＧＧＧＡＡＡＧＴＧＡＴＧＴＣＧＴＧＴＡＣＴＧＧＣＴＣＣＧＣＣＴＴＴＴＴＣＣＣＧＡＧＧＧＴＧＧＧＧＧＡＧＡＡＣＣＧＴＡＴＡＴＡＡＧＴＧＣＡＧＴＡＧＴＣＧＣＣＧＴＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＴＴＴＣＧＣＡＡＣＧＧＧＴＴＴＧＣＣＧＣＣＡＧＡＡＣＡＣＡＧＧＴＡＡＧＴＧＣＣＧＴＧＴＧＴＧＧＴＴＣＣＣＧＣＧＧＧＣＣＴＧＧＣＣＴＣＴＴＴＡＣＧＧＧＴＴＡＴＧＧＣＣＣＴＴＧＣＧＴＧＣＣＴＴＧＡＡＴＴＡＣＴＴＣＣＡＣＴＧＧＣＴＧＣＡＧＴＡＣＧＴＧＡＴＴＣＴＴＧＡＴＣＣＣＧＡＧＣＴＴＣＧＧＧＴＴＧＧＡＡＧＴＧＧＧＴＧＧＧＡＧＡＧＴＴＣＧＡＧＧＣＣＴＴＧＣＧＣＴＴＡＡＧＧＡＧＣＣＣＣＴＴＣＧＣＣＴＣＧＴＧＣＴＴＧＡＧＴＴＧＡＧＧＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＧＣＧＣＴＧＧＧＧＣＣＧＣＣＧＣＧＴＧＣＧＡＡＴＣＴＧＧＴＧＧＣＡＣＣＴＴＣＧＣＧＣＣＴＧＴＣＴＣＧＣＴＧＣＴＴＴＣＧＡＴＡＡＧＴＣＴＣＴＡＧＣＣＡＴＴＴＡＡＡＡＴＴＴＴＴＧＡＴＧＡＣＣＴＧＣＴＧＣＧＡＣＧＣＴＴＴＴＴＴＴＣＴＧＧＣＡＡＧＡＴＡＧＴＣＴＴＧＴＡＡＡＴＧＣＧＧＧＣＣＡＡＧＡＴＣＴＧＣＡＣＡＣＴＧＧＴＡＴＴＴＣＧＧＴＴＴＴＴＧＧＧＧＣＣＧＣＧＧＧＣＧＧＣＧＡＣＧＧＧＧＣＣＣＧＴＧＣＧＴＣＣＣＡＧＣＧＣＡＣＡＴＧＴＴＣＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＧＧＣＣＴＧＣＧＡＧＣＧＣＧＧＣＣＡＣＣＧＡＧＡＡＴＣＧＧＡＣＧＧＧＧＧＴＡＧＴＣＴＣＡＡＧＣＴＧＧＣＣＧＧＣＣＴＧＣＴＣＴＧＧＴＧＣＣＴＧＧＣＣＴＣＧＣＧＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＴＣＧＣＣＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＧＧＣＡＡＧＧＣＴＧＧＣＣＣＧＧＴＣＧＧＣＡＣＣＡＧＴＴＧＣＧＴＧＡＧＣＧＧＡＡＡＧＡＴＧＧＣＣＧＣＴＴＣＣＣＧＧＣＣＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＧＡＧＣＴＣＡＡＡＡＴＧＧＡＧＧＡＣＧＣＧＧＣＧＣＴＣＧＧＧＡＧＡＧＣＧＧＧＣＧＧＧＴＧＡＧＴＣＡＣＣＣＡＣＡＣＡＡＡＧＧＡＡＡＡＧＧＧＣＣＴＴＴＣＣＧＴＣＣＴＣＡＧＣＣＧＴＣＧＣＴＴＣＡＴＧＴＧＡＣＴＣＣＡＣＧＧＡＧＴＡＣＣＧＧＧＣＧＣＣＧＴＣＣＡＧＧＣＡＣＣＴＣＧＡＴＴＡＧＴＴＣＴＣＧＡＧＣＴＴＴＴＧＧＡＧＴＡＣＧＴＣＧＴＣＴＴＴＡＧＧＴＴＧＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＴＴＴＴＡＴＧＣＧＡＴＧＧＡＧＴＴＴＣＣＣＣＡＣＡＣＴＧＡＧＴＧＧＧＴＧＧＡＧＡＣＴＧＡＡＧＴＴＡＧＧＣＣＡＧＣＴＴＧＧＣＡＣＴＴＧＡＴＧＴＡＡＴＴＣＴＣＣＴＴＧＧＡＡＴＴＴＧＣＣＣＴＴＴＴＴＧＡＧＴＴＴＧＧＡＴＣＴＴＧＧＴＴＣＡＴＴＣＴＣＡＡＧＣＣＴＣＡＧＡＣＡＧＴＧＧＴＴＣＡＡＡＧＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＣＣＡＴＴＴＣＡＧＧＴＧＴＣＧＴＧＡＧＧＡＡＴＴＴＣＧＡＣＴＧＣＴＡＧＣＡＣＧＣＧＴＧＡＴＡＴＣＡＡＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＧＡＧＡＴＣＴＡＧＡＧＴＴＧＧＧＡＣＣＣＴＧＧＧＡＣＴＧＴＧＧＧＴＣＣＧＡＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＣＴＧＴＣＴＴＣＣＴＧＣＴＧＧＧＧＧＴＣＴＡＣＣＡＡＧＣＡＴＡＣＣＣＣＡＴＣＣＣＴＧＡＣＴＣＣＡＧＣＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＧＴＴＴＧＧＧＧＧＴＣＡＡＧＴＣＣＧＧＣＡＧＡＧＧＴＡＣＣＴＣＴＡＣＡＣＡＧＡＴＧＡＣＧＡＣＣＡＡＧＡＣＡＣＴＧＡＡＧＣＣＣＡＣＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＧＧＧＡＧＧＡＴＧＧＡＡＣＡＧＴＧＧＴＡＧＧＣＧＣＡＧＣＡＣＡＣＣＧＣＡＧＴＣＣＡＧＡＡＡＧＴＣＴＣＣＴＧＧＡＧＣＴＣＡＡＡＧＣＣＴＴＧＡＡＧＣＣＡＧＧＧＧＴＣＡＴＴＣＡＡＡＴＣＣＴＧＧＧＴＧＴＣＡＡＡＧＣＣＴＣＴＡＧＧＴＴＴＣＴＴＴＧＣＣＡＡＣＡＧＣＣＡＧＡＴＧＧＡＧＣＴＣＴＣＴＡＴＧＧＡＴＣＧＣＣＴＣＡＣＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＡＧＧＣＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＡＧＡＧＡＡＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＧＴＴＡＣＡＡＴＧＴＧＴＡＣＣＡＧＴＣＴＧＡＡＧＣＣＣＡＴＧＧＣＣＴＧＣＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＧＣＣＴＣＡＧＡＡＧＧＡＣＴＣＣＣＣＡＡＡＣＣＡＧＧＡＴＧＣＡＡＣＡＴＣＣＴＧＧＧＧＡＣＣＴＧＴＧＣＧＣＴＴＣＣＴＧＣＣＣＡＴＧＣＣＡＧＧＣＣＴＧＣＴＣＣＡＣＧＡＧＣＣＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＣＡＧＧＡＴＴＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＣＣＡＧＡＴＧＴＧＧＧＣＴＣＣＴＣＴＧＡＣＣＣＣＣＴＧＡＧＣＡＴＧＧＴＡＧＡＧＣＣＴＴＴＡＣＡＧＧＧＣＣＧＡＡＧＣＣＣＣＡＧＣＴＡＴＧＣＧＴＣＣＴＧＡＧＡＴＡＴＣＡＡＡＧＡＡＴＴＣＴＡＡＧＣＴＴＧＴＣＧＡＣＧＡＡＴＧＣＡＡＴＴＧＴＴＧＴＴＡＡＴＴＡＡＴＴＧＴＴＡＡＣＴＴＧＴＴＴＡＴＴＧＣＡＧＣＴＴＡＴＡＡＴＧＧＴＴＡＣＡＡＡＴＡＡＡＧＣＡＡＴＡＧＣＡＴＣＡＣＡＡＡＴＴＴＣＡＣＡＡＡＴＡＡＡＧＣＡＴＴＴＴＴＴＴＣＡＣＴＧＣＡＴＴＣＴＡＧＴＴＧＴＧＧＴＴＴＧＴＣＣＡＡＡＣＴＣＡＴＣＡＡＴＧＴＡＴＣＴＴＡＧＴＣＧＡＧＴＴＡＡＴＴＡＡＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＧＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＣＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＧＧＣＧＣＣＴＧＡＴＧＣＧＧＴＡＴＴＴＴＣＴＣＣＴＴＡＣＧＣＡＴＣＴＧＴＧＣＧＧＴＡＴＴＴＣＡＣＡＣＣＧＣＡＴＡＣＧＴＣＡＡＡＧＣＡＡＣＣＡＴＡＧＴＡＣＧＣＧＣＣＣＴＧＴＡＧＣＧＧＣＧＣＡＴＴＡＡＧＣＧＣＧＧＣＧＧＧＴＧＴＧＧＴＧＧＴＴＡＣＧＣＧＣＡＧＣＧＴＧＡＣＣＧＣＴＡＣＡＣＴＴＧＣＣＡＧＣＧＣＣＣＴＡＧＣＧＣＣＣＧＣＴＣＣＴＴＴＣＧＣＴＴＴＣＴＴＣＣＣＴＴＣＣＴＴＴＣＴＣＧＣＣＡＣＧＴＴＣＧＣＣＧＧＣＴＴＴＣＣＣＣＧＴＣＡＡＧＣＴＣＴＡＡＡＴＣＧＧＧＧＧＣＴＣＣＣＴＴＴＡＧＧＧＴＴＣＣＧＡＴＴＴＡＧＴＧＣＴＴＴＡＣＧＧＣＡＣＣＴＣＧＡＣＣＣＣＡＡＡＡＡＡＣＴＴＧＡＴＴＴＧＧＧＴＧＡＴＧＧＴＴＣＡＣＧＴＡＧＴＧＧＧＣＣＡＴＣＧＣＣＣＴＧＡＴＡＧＡＣＧＧＴＴＴＴＴＣＧＣＣＣＴＴＴＧＡＣＧＴＴＧＧＡＧＴＣＣＡＣＧＴＴＣＴＴＴＡＡＴＡＧＴＧＧＡＣＴＣＴＴＧＴＴＣＣＡＡＡＣＴＧＧＡＡＣＡＡＣＡＣＴＣＡＡＣＣＣＴＡＴＣＴＣＧＧＧＣＴＡＴＴＣＴＴＴＴＧＡＴＴＴＡＴＡＡＧＧＧＡＴＴＴＴＧＣＣＧＡＴＴＴＣＧＧＣＣＴＡＴＴＧＧＴＴＡＡＡＡＡＡＴＧＡＧＣＴＧＡＴＴＴＡＡＣＡＡＡＡＡＴＴＴＡＡＣＧＣＧＡＡＴＴＴＴＡＡＣＡＡＡＡＴＡＴＴＡＡＣＧＴＴＴＡＣＡＡＴＴＴＴＡＴＧＧＴＧＣＡＣＴＣＴＣＡＧＴＡＣＡＡＴＣＴＧＣＴＣＴＧＡＴＧＣＣＧＣＡＴＡＧＴＴＡＡＧＣＣＡＧＣＣＣＣＧＡＣＡＣＣＣＧＣＣＡＡＣＡＣＣＣＧＣＴＧＡＣＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＧＧＧＣＴＴＧＴＣＴＧＣＴＣＣＣＧＧＣＡＴＣＣＧＣＴＴＡＣＡＧＡＣＡＡＧＣＴＧＴＧＡＣＣＧＴＣＴＣＣＧＧＧＡＧＣＴＧＣＡＴＧＴＧＴＣＡＧＡＧＧＴＴＴＴＣＡＣＣＧＴＣＡＴＣＡＣＣＧＡＡＡＣＧＣＧＣＧＡＧＡＣＧＡＡＡＧＧＧＣＣＴＣＧＴＧＡＴＡＣＧＣＣＴＡＴＴＴＴＴＡＴＡＧＧＴＴＡＡＴＧＴＣＡＴＧＡＴＡＡＴＡＡＴＧＧＴＴＴＣＴＴＡＧＡＣＧＴＣＡＧＧＴＧＧＣＡＣＴＴＴＴＣＧＧＧＧＡＡＡＴＧＴＧＣＧＣＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＴＴＴＧＴＴＴＡＴＴＴＴＴＣＴＡＡＡＴＡＣＡＴＴＣＡＡＡＴＡＴＧＴＡＴＣＣＧＣＴＣＡＴＧＡＧＡＣＡＡＴＡＡＣＣＣＴＧＡＴＡＡＡＴＧＣＴＴＣＡＡＴＡＡＴＡＴＴＧＡＡＡＡＡＧＧＡＡＧＡＧＴＡＴＧＡＧＴＡＴＴＣＡＡＣＡＴＴＴＣＣＧＴＧＴＣＧＣＣＣＴＴＡＴＴＣＣＣＴＴＴＴＴＴＧＣＧＧＣＡＴＴＴＴＧＣＣＴＴＣＣＴＧＴＴＴＴＴＧＣＴＣＡＣＣＣＡＧＡＡＡＣＧＣＴＧＧＴＧＡＡＡＧＴＡＡＡＡＧＡＴＧＣＴＧＡＡＧＡＴＣＡＧＴＴＧＧＧＴＧＣＡＣＧＡＧＴＧＧＧＴＴＡＣＡＴＣＧＡＡＣＴＧＧＡＴＣＴＣＡＡＣＡＧＣＧＧＴＡＡＧＡＴＣＣＴＴＧＡＧＡＧＴＴＴＴＣＧＣＣＣＣＧＡＡＧＡＡＣＧＴＴＴＴＣＣＡＡＴＧＡＴＧＡＧＣＡＣＴＴＴＴＡＡＡＧＴＴＣＴＧＣＴＡＴＧＴＧＧＣＧＣＧＧＴＡＴＴＡＴＣＣＣＧＴＡＴＴＧＡＣＧＣＣＧＧＧＣＡＡＧＡＧＣＡＡＣＴＣＧＧＴＣＧＣＣＧＣＡＴＡＣＡＣＴＡＴＴＣＴＣＡＧＡＡＴＧＡＣＴＴＧＧＴＴＧＡＧＴＡＣＴＣＡＣＣＡＧＴＣＡＣＡＧＡＡＡＡＧＣＡＴＣＴＴＡＣＧＧＡＴＧＧＣＡＴＧＡＣＡＧＴＡＡＧＡＧＡＡＴＴＡＴＧＣＡＧＴＧＣＴＧＣＣＡＴＡＡＣＣＡＴＧＡＧＴＧＡＴＡＡＣＡＣＴＧＣＧＧＣＣＡＡＣＴＴＡＣＴＴＣＴＧＡＣＡＡＣＧＡＴＣＧＧＡＧＧＡＣＣＧＡＡＧＧＡＧＣＴＡＡＣＣＧＣＴＴＴＴＴＴＧＣＡＣＡＡＣＡＴＧＧＧＧＧＡＴＣＡＴＧＴＡＡＣＴＣＧＣＣＴＴＧＡＴＣＧＴＴＧＧＧＡＡＣＣＧＧＡＧＣＴＧＡＡＴＧＡＡＧＣＣＡＴＡＣＣＡＡＡＣＧＡＣＧＡＧＣＧＴＧＡＣＡＣＣＡＣＧＡＴＧＣＣＴＧＴＡＧＣＡＡＴＧＧＣＡＡＣＡＡＣＧＴＴＧＣＧＣＡＡＡＣＴＡＴＴＡＡＣＴＧＧＣＧＡＡＣＴＡＣＴＴＡＣＴＣＴＡＧＣＴＴＣＣＣＧＧＣＡＡＣＡＡＴＴＡＡＴＡＧＡＣＴＧＧＡＴＧＧＡＧＧＣＧＧＡＴＡＡＡＧＴＴＧＣＡＧＧＡＣＣＡＣＴＴＣＴＧＣＧＣＴＣＧＧＣＣＣＴＴＣＣＧＧＣＴＧＧＣＴＧＧＴＴＴＡＴＴＧＣＴＧＡＴＡＡＡＴＣＴＧＧＡＧＣＣＧＧＴＧＡＧＣＧＴＧＧＧＴＣＴＣＧＣＧＧＴＡＴＣＡＴＴＧＣＡＧＣＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＡＴＧＧＴＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＧＴＡＴＣＧＴＡＧＴＴＡＴＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＧＧＧＡＧＴＣＡＧＧＣＡＡＣＴＡＴＧＧＡＴＧＡＡＣＧＡＡＡＴＡＧＡＣＡＧＡＴＣＧＣＴＧＡＧＡＴＡＧＧＴＧＣＣＴＣＡＣＴＧＡＴＴＡＡＧＣＡＴＴＧＧＴＡＡＣＴＧＴＣＡＧＡＣＣＡＡＧＴＴＴＡＣＴＣＡＴＡＴＡＴＡＣＴＴＴＡＧＡＴＴＧＡＴＴＴＡＡＡＡＣＴＴＣＡＴＴＴＴＴＡＡＴＴＴＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴＡＧＧＴＧＡＡＧＡＴＣＣＴＴＴＴＴＧＡＴＡＡＴＣＴＣＡＴＧＡＣＣＡＡＡＡＴＣＣＣＴＴＡＡＣＧＴＧＡＧＴＴＴＴＣＧＴＴＣＣＡＣＴＧＡＧＣＧＴＣＡＧＡＣＣＣＣＧＴＡＧＡＡＡＡＧＡＴＣＡＡＡＧＧＡＴＣＴＴＣＴＴＧＡＧＡＴＣＣＴＴＴＴＴＴＴＣＴＧＣＧＣＧＴＡＡＴＣＴＧＣＴＧＣＴＴＧＣＡＡＡＣＡＡＡＡＡＡＡＣＣＡＣＣＧＣＴＡＣＣＡＧＣＧＧＴＧＧＴＴＴＧＴＴＴＧＣＣＧＧＡＴＣＡＡＧＡＧＣＴＡＣＣＡＡＣＴＣＴＴＴＴＴＣＣＧＡＡＧＧＴＡＡＣＴＧＧＣＴＴＣＡＧＣＡＧＡＧＣＧＣＡＧＡＴＡＣＣＡＡＡＴＡＣＴＧＴＣＣＴＴＣＴＡＧＴＧＴＡＧＣＣＧＴＡＧＴＴＡＧＧＣＣＡＣＣＡＣＴＴＣＡＡＧＡＡＣＴＣＴＧＴＡＧＣＡＣＣＧＣＣＴＡＣＡＴＡＣＣＴＣＧＣＴＣＴＧＣＴＡＡＴＣＣＴＧＴＴＡＣＣＡＧＴＧＧＣＴＧＣＴＧＣＣＡＧＴＧＧＣＧＡＴＡＡＧＴＣＧＴＧＴＣＴＴＡＣＣＧＧＧＴＴＧＧＡＣＴＣＡＡＧＡＣＧＡＴＡＧＴＴＡＣＣＧＧＡＴＡＡＧＧＣＧＣＡＧＣＧＧＴＣＧＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＧＧＧＧＴＴＣＧＴＧＣＡＣＡＣＡＧＣＣＣＡＧＣＴＴＧＧＡＧＣＧＡＡＣＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＧＡＡＣＴＧＡＧＡＴＡＣＣＴＡＣＡＧＣＧＴＧＡＧＣＴＡＴＧＡＧＡＡＡＧＣＧＣＣＡＣＧＣＴＴＣＣＣＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡＡＧＧＣＧＧＡＣＡＧＧＴＡＴＣＣＧＧＴＡＡＧＣＧＧＣＡＧＧＧＴＣＧＧＡＡＣＡＧＧＡＧＡＧＣＧＣＡＣＧＡＧＧＧＡＧＣＴＴＣＣＡＧＧＧＧＧＡＡＡＣＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＴＴＴＡＴＡＧＴＣＣＴＧＴＣＧＧＧＴＴＴＣＧＣＣＡＣＣＴＣＴＧＡＣＴＴＧＡＧＣＧＴＣＧＡＴＴＴＴＴＧＴＧＡＴＧＣＴＣＧＴＣＡＧＧＧＧＧＧＣＧＧＡＧＣＣＴＡＴＧＧＡＡＡＡＡＣＧＣＣＡＧＣＡＡＣＧＣＧＧＣＣＴＴＴＴＴＡＣＧＧＴＴＣＣＴＧＧＣＣＴＴＴＴＧＣＴＧＧＣＣＴＴＴＴＧＣＴＣＡＣＡＴＧＴ
伸長因子１アルファプロモーター：１５０から１３２７（１１７８ｂｐ）
ムス・ムスクルス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＦＧＦ２１：１３５９から（６３３ｂｐ）
配列番号５７は、短縮型ＡＡＶ２  ５’および３’ＩＴＲおよびＳＶ４０  ｐｏｌｙＡも含有する（既に配列表中に包含されている、配列番号４８、４９および５０）。
【図面の簡単な説明】
【０４３０】
【図１】図１．  Ｃ５７Ｂｌ６マウスにおけるＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｍｉＲＴベクターのｅＷＡＴ内投与による肥満の予防。（Ａ）ＡＡＶ−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｏｕｂｌｅｍｉＲＴベクターの略図。発現カセットはＣＡＧプロモーター、コドン最適化されたマウスＦＧＦ２１コーディング配列、ならびに発現カセットの３’非翻訳領域中にクローニングされたｍｉＲＴ１２２ａ配列の４個のタンデムリピートおよびｍｉＲＴ１配列の４個のタンデムリピートを含有した。ＡＡＶ２からのＩＴＲが発現カセットに隣接した。略図は縮尺どおりではない。ＣＡＧ：ニワトリβ−アクチンプロモーター／ＣＭＶエンハンサー；ｐＡ：ｐｏｌｙＡ。（Ｂ）代謝組織中のＦＧＦ２１の発現レベル。Ｃ５７Ｂｌ６マウスのｅＷＡＴ、ｉＷＡＴ、ｉＢＡＴおよび肝臓中のコドン最適化されたマウスＦＧＦ２１コーディング配列の発現レベルをＲＴｑＰＣＲにより測定し、Ｒｐｌｐ０値で正規化した（ｎ＝８〜１１動物／群）。（Ｃ）ＦＧＦ２１の循環レベル（ｎ＝８〜１１動物／群）。（Ｄ−Ｅ）代謝組織中のＦＧＦ２１Ｒ１（Ｄ）およびβ−Ｋｌｏｔｈｏ（Ｅ）の発現レベル。Ｃ５７Ｂｌ６マウスのｅＷＡＴ、ｉＷＡＴ、ｉＢＡＴおよび肝臓中のＦＧＦ２１受容体１（ＦＧＦ２１Ｒ１）およびβ−Ｋｌｏｔｈｏの発現レベルをＲＴｑＰＣＲにより測定し、Ｒｐｌｐ０値で正規化した（ｎ＝７動物／群）。（Ｆ）体重の進展。体重は毎週測定した（ｎ＝８〜１１動物／群）。（Ｇ）動物の代表的イメージ。（Ｈ）組織の重量。ＡＡＶベクターをｅＷＡＴ内に処置した固形飼料給餌Ｃ５７Ｂｌ６マウスおよびＨＦＤ給餌Ｃ５７Ｂｌ６マウスのｅＷＡＴ、ｉＷＡＴ、ｒＷＡＴ、ｍＷＡＴ、ｉＢＡＴおよび肝臓の重量（ｎ＝８〜１１動物／群）。分析は、１０１２ｖｇのＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｏｕｂｌｅｍｉＲＴまたはＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｎｕｌｌベクターのｅＷＡＴ内投与１４週後に実施した。結果は平均値±ＳＥＭとして表現される。ＮＤ、検出されず。ＨＦＤ、高脂肪食。ＡＵ、任意単位。ｅＷＡＴ、精巣上体白色脂肪組織。ｉＷＡＴ、鼠径部白色脂肪組織。ｒＷＡＴ、後腹膜白色脂肪組織。ｍＷＡＴ、腸間膜白色脂肪組織。ｉＢＡＴ  肩甲骨間褐色脂肪組織。＊  ｐ＜０．０５  ｖｓ  ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｎｕｌｌ  固形飼料、＊＊  ｐ＜０．０１  ｖｓ  ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｎｕｌｌ  固形飼料、＊＊＊  ｐ＜０．００１  ｖｓ  ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｎｕｌｌ  固形飼料、＄  ｐ＜０．０５  ｖｓ  ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｎｕｌｌ  ＨＦＤ、＄＄  ｐ＜０．０１  ｖｓ  ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｎｕｌｌ  ＨＦＤ、＄＄＄  ｐ＜０．００１  ｖｓ  ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｎｕｌｌ  ＨＦＤ。
【図２】図２．  ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｏｕｂｌｅｍｉＲＴベクターをｅＷＡＴ内に処置したＣ５７Ｂｌ６マウスの脂肪組織および肝臓の組織分析。（Ａ）ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｏｕｂｌｅｍｉＲＴまたはＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｎｕｌｌベクターをｅＷＡＴ内に処置した固形飼料給餌Ｃ５７Ｂｌ６マウスおよびＨＦＤ給餌Ｃ５７Ｂｌ６マウスの精巣上体白色脂肪組織（ｅＷＡＴ）、鼠径部白色脂肪組織（ｉＷＡＴ）肩甲骨間褐色脂肪組織（ｉＢＡＴ）および肝臓の切片の、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した代表的イメージ。元の倍率×１００。（Ｂ）ｅＷＡＴの白色脂肪細胞の平均面積（ｎ＝４動物／群）。（Ｃ）ｅＷＡＴの白色脂肪細胞の面積の頻度分布（ｎ＝４動物／群）。分析は、１０１２ｖｇのＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｏｕｂｌｅｍｉＲＴまたはＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｎｕｌｌベクターのｅＷＡＴ内投与１４週後に実施した。結果は平均値±ＳＥＭとして表現される。ＨＦＤ、高脂肪食。＊＊  ｐ＜０．０１  ｖｓ  ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｎｕｌｌ  固形飼料、＊＊＊  ｐ＜０．００１  ｖｓ  ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｎｕｌｌ  固形飼料、＄＄  ｐ＜０．０１  ｖｓ  ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｎｕｌｌ  ＨＦＤ、＄＄＄  ｐ＜０．００１  ｖｓ  ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｎｕｌｌ  ＨＦＤ。
【図３】図３．  ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｏｕｂｌｅｍｉＲＴベクターをｅＷＡＴ内に処置したＣ５７Ｂｌ６マウスにおけるエネルギー消費およびインスリン感受性の向上。（Ａ−Ｂ）ＵＣＰ１（Ａ）およびＤｉｏ２（Ｂ）の発現レベル。ｉＷＡＴ中のＵＣＰ１およびＤｉｏ２の発現レベルをＲＴｑＰＣＲにより測定し、Ｒｐｌｐ０値で正規化した（ｎ＝７動物／群）。（Ｃ）エネルギー代謝。エネルギー消費（ＥＥ）は間接的開路熱量計で測定した。酸素消費および二酸化炭素産生を同時にモニターした。データは、ＡＡＶ投与の９週後、明サイクル（基本状態）および暗サイクル（活動期）の間に取得し、体重で調整した（ｎ＝８〜１１動物／群）。（Ｄ）肝臓トリグリセリド含量（ｎ＝８〜１０動物／群）。（Ｅ−Ｆ）血清トリグリセリド（Ｅ）およびコレステロール（Ｆ）レベル（ｎ＝８〜１１動物／群）。（Ｇ）腹腔内インスリン負荷試験。マウスに０．７５Ｕインスリン／ｋｇ体重の腹腔内注射を与え、指し示された時点において血中グルコースレベルを測定した（ｎ＝６〜１１動物／群）。試験は、ＡＡＶ投与の１１週後に実施した。（Ｈ）空腹時インスリン循環レベル。特に指示がない限り、分析は、１０１２ｖｇのＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｏｕｂｌｅｍｉＲＴまたはＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｎｕｌｌベクターのｅＷＡＴ内投与１４週後に実施した。結果は平均値±ＳＥＭとして表現される。ＨＦＤ、高脂肪食。ＴＧ、トリグリセリド。Ｃｈｏｌ、コレステロール。＊  ｐ＜０．０５  ｖｓ  ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｎｕｌｌ  固形飼料、＊＊  ｐ＜０．０１  ｖｓ  ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｎｕｌｌ  固形飼料、＊＊＊  ｐ＜０．００１  ｖｓ  ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｎｕｌｌ  固形飼料、＄  ｐ＜０．０５  ｖｓ  ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｎｕｌｌ  ＨＦＤ、＄＄  ｐ＜０．０１  ｖｓ  ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｎｕｌｌ  ＨＦＤ、＄＄＄  ｐ＜０．００１  ｖｓ  ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｎｕｌｌ  ＨＦＤ。
【図４】図４．  ｏｂ／ｏｂマウスにおけるＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｍｉＲＴベクターのｅＷＡＴ内投与による肥満の回復。（Ａ）代謝組織中のＦＧＦ２１の発現レベル。ｏｂ／ｏｂマウスのｅＷＡＴ、ｉＷＡＴ、ｉＢＡＴおよび肝臓中のコドン最適化されたマウスＦＧＦ２１コーディング配列の発現レベルをＲＴｑＰＣＲにより測定し、Ｒｐｌｐ０値で正規化した。（Ｂ）ＦＧＦ２１の循環レベル。（Ｃ−Ｄ）体重（Ｃ）および体重増加（Ｄ）の進展。体重は毎週測定した。（Ｅ）組織の重量。ＡＡＶベクターをｅＷＡＴ内に処置したｏｂ／ｏｂマウスのｅＷＡＴ、ｉＷＡＴ、ｒＷＡＴ、ｍＷＡＴ、ｉＢＡＴおよび肝臓の重量。分析は、１０１０ｖｇ、５×１０１０ｖｇ、２×１０１１ｖｇもしくは１０１２ｖｇのＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｏｕｂｌｅｍｉＲＴまたは１０１２ｖｇのＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｎｕｌｌベクターのｅＷＡＴ内投与１６週後に実施した。結果は平均値±ＳＥＭとして表現される。ｎ＝７〜８動物／群。ＮＤ、検出されず。ＡＵ、任意単位。ｅＷＡＴ、精巣上体白色脂肪組織。ｉＷＡＴ、鼠径部白色脂肪組織。ｒＷＡＴ、後腹膜白色脂肪組織。ｍＷＡＴ、腸間膜白色脂肪組織。ｉＢＡＴ  肩甲骨間褐色脂肪組織。＊  ｐ＜０．０５  ｖｓ  ＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｎｕｌｌ、＊＊  ｐ＜０．０１  ｖｓ  ＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｎｕｌｌ、＊＊＊  ｐ＜０．００１  ｖｓ  ＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｎｕｌｌ。
【図５】図５．  ＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｏｕｂｌｅｍｉＲＴベクターをｅＷＡＴ内に処置したｏｂ／ｏｂマウスにおけるインスリン感受性の改善。（Ａ）腹腔内インスリン負荷試験。ｏｂ／ｏｂマウスに０．７５Ｕインスリン／ｋｇ体重の腹腔内注射を与え、指し示された時点において血中グルコースレベルを測定した。試験は、ＡＡＶ投与の９週後に実施した。（Ｂ）ＡＡＶ投与２月後の空腹時インスリン循環レベル。結果は平均値±ＳＥＭとして表現され、ｎ＝７〜８動物／群である。＊  ｐ＜０．０５  ｖｓ  ＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｎｕｌｌ、＊＊  ｐ＜０．０１  ｖｓ  ＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｎｕｌｌ、＊＊＊  ｐ＜０．００１  ｖｓ  ＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｎｕｌｌ。
【図６】図６．  ｏｂ／ｏｂマウスにおけるＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１−ベクターの静脈内投与による肥満の回復およびグルコース代謝の好転。（Ａ）ＡＡＶ−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターの略図。発現カセットは、ヒトα１−アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーターおよびコドン最適化されたマウスＦＧＦ２１コーディング配列を含有した。ＡＡＶ２からのＩＴＲが発現カセットに隣接した。略図は縮尺どおりではない。ｐＡ：ｐｏｌｙＡ。（Ｂ）ＦＧＦ２１の発現レベル。ｏｂ／ｏｂマウスの肝臓中のコドン最適化されたマウスＦＧＦ２１コーディング配列の発現レベルをＲＴｑＰＣＲにより測定し、Ｒｐｌｐ０値で正規化した。（Ｃ）ＦＧＦ２１の循環レベル。（Ｄ−Ｅ）体重（Ｃ）および体重増加（Ｄ）の進展。体重は毎週測定した。（Ｆ）動物の代表的イメージ。（Ｇ）組織の重量。ＡＡＶベクターを静脈内に処置したｏｂ／ｏｂマウスのｅＷＡＴ、ｉＷＡＴ、ｒＷＡＴ、ｍＷＡＴ、ｉＢＡＴおよび肝臓の重量。（Ｈ）腹腔内インスリン負荷試験。ｏｂ／ｏｂマウスに０．７５Ｕインスリン／ｋｇ体重の腹腔内注射を与え、指し示された時点において血中グルコースレベルを測定した。試験は、ＡＡＶ投与の９週後に実施した。（Ｉ）ＡＡＶ投与３月後の空腹時インスリン循環レベル。特に指示がない限り、分析は、１０１１ｖｇもしくは５×１０１１ｖｇのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１または５×１０１１ｖｇのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌベクターの静脈内投与２０週後に実施した。結果は平均値±ＳＥＭとして表現される。ｎ＝９〜１０動物／群。ＮＤ、検出されず。ＡＵ、任意単位。ｅＷＡＴ、精巣上体白色脂肪組織。ｉＷＡＴ、鼠径部白色脂肪組織。ｒＷＡＴ、後腹膜白色脂肪組織。ｍＷＡＴ、腸間膜白色脂肪組織。ｉＢＡＴ  肩甲骨間褐色脂肪組織。＊  ｐ＜０．０５  ｖｓ  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌ、＊＊  ｐ＜０．０１  ｖｓ  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌ、＊＊＊  ｐ＜０．００１  ｖｓ  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌ。
【図７】図７．  ＨＦＤ給餌Ｃ５７ｂｌ６マウスにおけるＡＡＶ−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターの静脈内投与による肥満の長期的回復。（Ａ）ＦＧＦ２１の循環レベル。（Ｂ−Ｃ）体重（Ｃ）および体重増加（Ｄ）の進展。体重は毎週測定した。分析は、１０１０ｖｇもしくは５×１０１０ｖｇのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１または５×１０１０ｖｇのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌベクターの静脈内投与５２週後に実施した。結果は平均値±ＳＥＭとして表現され、ｎ＝９〜１２動物／群である。＊＊＊  ｐ＜０．００１  ｖｓ  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌ  固形飼料、＄＄  ｐ＜０．０１  ｖｓ  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌ  ＨＦＤ、＄＄＄  ｐ＜０．００１  ｖｓ  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌ  ＨＦＤ。
【図８】図８．  ＨＦＤ給餌Ｃ５７Ｂｌ６マウスにおけるＡＡＶ−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターの静脈内投与によるエネルギー消費およびインスリン感受性の長期的向上。（Ａ）エネルギー代謝。エネルギー消費（ＥＥ）は間接的開路熱量計で測定した。酸素消費および二酸化炭素産生を同時にモニターした。データは、ＡＡＶ投与の４週後、明サイクル（基本状態）および暗サイクル（活動期）の間に取得し、体重で調整した。（Ｂ）腹腔内インスリン負荷試験。Ｃ５７Ｂｌ６マウスに０．７５Ｕインスリン／ｋｇ体重の腹腔内注射を与え、指し示された時点において血中グルコースレベルを測定した。試験は、ＡＡＶ投与の７週後に実施した。（Ｃ）空腹時および給餌時のインスリン循環レベル。結果は平均値±ＳＥＭとして表現され、ｎ＝９〜１２動物／群である。ＨＦＤ、高脂肪食。＊  ｐ＜０．０５  ｖｓ  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌ  固形飼料、＊＊  ｐ＜０．０１  ｖｓ  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌ  固形飼料、＊＊＊  ｐ＜０．００１  ｖｓ  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌ  固形飼料、＄  ｐ＜０．０５  ｖｓ  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌ  ＨＦＤ、＄＄  ｐ＜０．０１  ｖｓ  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌ  ＨＦＤ、＄＄＄  ｐ＜０．００１  ｖｓ  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌ  ＨＦＤ。
【図９】図９．  老齢ＨＦＤ給餌マウスにおけるＡＡＶ−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターの静脈内投与による肥満の回復。（Ａ）ＦＧＦ２１の循環レベル。（Ｂ−Ｃ）体重（Ｂ）および体重増加（Ｃ）の進展。体重は毎週測定した。分析は、１０１０ｖｇ、２×１０１０ｖｇもしくは５×１０１０ｖｇのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１または５×１０１０ｖｇのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌベクターの静脈内投与２１週後に実施した。結果は平均値±ＳＥＭとして表現され、ｎ＝７〜８動物／群である。ＨＦＤ、高脂肪食。＊＊＊  ｐ＜０．０５  ｖｓ  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌ  固形飼料、＄  ｐ＜０．０５  ｖｓ  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌ  ＨＦＤ、＄＄  ｐ＜０．０１  ｖｓ  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌ  ＨＦＤ。＄＄＄  ｐ＜０．００１  ｖｓ  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌ  ＨＦＤ。
【図１０】図１０．  老齢ＨＦＤ給餌マウスにおけるＡＡＶ−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターの静脈内投与によるエネルギー消費およびインスリン感受性の向上。（Ａ）エネルギー代謝。エネルギー消費（ＥＥ）は間接的開路熱量計で測定した。酸素消費および二酸化炭素産生を同時にモニターした。データは、ＡＡＶ投与の６週後、明サイクル（基本状態）および暗サイクル（活動期）の間に取得し、体重で調整した。（Ｂ）腹腔内インスリン負荷試験。老齢Ｃ５７Ｂｌ６マウスに０．７５Ｕインスリン／ｋｇ体重の腹腔内注射を与え、指し示された時点において血中グルコースレベルを測定した。試験は、ＡＡＶ投与の９週後に実施した。（Ｃ）空腹時および給餌時のインスリン循環レベル。結果は平均値±ＳＥＭとして表現され、ｎ＝７〜８動物／群である。ＨＦＤ、高脂肪食。＊＊  ｐ＜０．０１  ｖｓ  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌ  固形飼料、＊＊＊  ｐ＜０．００１  ｖｓ  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌ  固形飼料、＄  ｐ＜０．０５  ｖｓ  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌ  ＨＦＤ、＄＄  ｐ＜０．０１  ｖｓ  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌ  ＨＦＤ、＄＄＄  ｐ＜０．００１  ｖｓ  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌ  ＨＦＤ。
【図１１】図１１．  Ｃ５７Ｂｌ６マウスにおけるＡＡＶ−ＣＭＶ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターの筋肉内投与による体重減少。（Ａ）ＡＡＶ−ＣＭＶ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターの略図。発現カセットは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよびコドン最適化されたマウスＦＧＦ２１コーディング配列を含有した。ＡＡＶ２からのＩＴＲが発現カセットに隣接した。略図は縮尺どおりではない。ｐＡ：ｐｏｌｙＡ。（Ｂ）循環ＦＧＦ２１レベル。（Ｃ−Ｄ）体重（Ｃ）および体重増加（Ｄ）の進展。体重は毎週測定した。結果は平均値±ＳＥＭとして表現される。ｎ＝６〜７動物／群。＊  ｐ＜０．０５  ｖｓ  ＡＡＶ１−ＣＭＶ−ｎｕｌｌ、＊＊  ｐ＜０．０１  ｖｓ  ＡＡＶ１−ＣＭＶ−ｎｕｌｌ。図中のＦＧＦ２１の標識は、この図のレジェンドに従ってｍｏＦＧＦ２１を指す。
【図１２】図１２．  ヒトＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列のコドン最適化によるＦＧＦ２１タンパク質産生の増加。（Ａ）野生型ｈＦＧＦ２１またはコドン最適化されたヒトＦＧＦ２１配列の３つの異なるバージョンをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の培養培地中のｈＦＧＦ２１タンパク質レベル。結果は平均値±ＳＥＭとして表現される。ｎ＝３ウェル／群。ＮＤ、検出されず。＊  ｐ＜０．０５  ｖｓ  非トランスフェクト細胞。
【図１３】図１３．  ｏｂ／ｏｂマウスにおけるＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｍｉＲＴベクターのｅＷＡＴ内投与。Ａ、Ｂ  ｎｕｌｌまたはＦＧＦ２１をコードするＡＡＶ８ベクターのいずれかを試験する全ての用量でｅＷＡＴ内注射したｏｂ／ｏｂ動物から得られた（Ａ）ｅＷＡＴおよび（Ｂ）肝臓組織切片のヘマトキシリン−エオシン染色の代表的イメージ。スケールバー：ｅＷＡＴについて１００μｍ、肝臓について２００μｍ。Ｃ  給餌状態での血糖。Ｄ  ＡＡＶ後３月の給餌状態での血中インスリン。図中のＦＧＦ２１の標識はｍｏＦＧＦ２１を指す。データの情報：全ての値は平均値±ＳＥＭとして表現される。（Ａ、Ｂ）においてｎ＝６〜９動物／群。（Ｃ−Ｈ）においてｎ＝４〜８動物／群。（Ｉ）においてｎ＝６〜８動物／群。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１  対  Ｎｕｌｌ注射群。
【図１４】図１４．  ｏｂ／ｏｂマウスのｅＷＡＴへのＦＧＦ２１遺伝子導入の影響。Ａ  １１週齢時にＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｎｕｌｌベクターまたはＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｍｉＲＴベクターのいずれかを４つの異なる用量（１×１０１０、５×１０１０、２×１０１１、１×１０１２ｖｇ／マウス）でｅＷＡＴ内注射された２５週齢のｏｂ／ｏｂ動物における血清アディポネクチンレベル。Ｂ  （Ａ）におけるものと同じ動物のマクロファージマーカーＦ４／８０のｑＲＴ−ＰＣＲによる発現定量Ｃ  ＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｍｉＲＴベクターを受けたｏｂ／ｏｂマウスからのｅＷＡＴ切片の、マクロファージ特異的マーカーＭａｃ２についての免疫染色の代表的イメージ。ｎ＝４〜８／群。スケールバー：２００μｍ。Ｄ  全てのｅＷＡＴ内処置群における肝臓の重量。Ｅ、Ｆ  （Ａ）におけるものと同じコホートにおける給餌状態での肝臓トリグリセリドおよびコレステロール含量。図中のＦＧＦ２１の標識は、この図のレジェンドに従ってｍｏＦＧＦ２１を指す。データの情報：全ての値は平均値±ＳＥＭとして表現される。（Ａ、Ｂ、Ｄ）においてｎ＝４〜８動物／群。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１  対  ｎｕｌｌ注射ｏｂ／ｏｂ群。
【図１５】図１５．  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターで処置されたｏｂ／ｏｂマウスにおける肥満の低減およびインスリン感受性の改善。Ａ  ｎｕｌｌまたはＦＧＦ２１をコードするＡＡＶベクターのいずれかを１×１０１１または５×１０１１ｖｇ／マウスで注射されたｏｂ／ｏｂ動物から得られたｅＷＡＴ組織切片のヘマトキシリン−エオシン染色の代表的イメージ。Ｂ  全ての群における血清アディポネクチンレベル。Ｃ  ｎｕｌｌまたはＦＧＦ２１をコードするＡＡＶベクターのいずれかを１×１０１１または５×１０１１ｖｇ／マウスで注射されたｏｂ／ｏｂ動物から得られた肝臓組織切片のヘマトキシリン−エオシン染色の代表的イメージ。Ｄ  給餌時血中グルコースレベル。Ｅ  ＡＡＶ後５月での給餌時血清インスリンレベル。図中のＦＧＦ２１の標識は、この図のレジェンドに従ってｍｏＦＧＦ２１を指す。データの情報：全てのデータは平均値±ＳＥＭで表現される。（Ａ−Ｃ、Ｅ、Ｇ−Ｈ）においてｎ＝９〜１０動物／群。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１  対  ｎｕｌｌ注射ｏｂ／ｏｂ群。
【図１６】図１６．  ｏｂ／ｏｂマウスに対するＦＧＦ２１肝臓遺伝子導入の効果。Ａ  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターを受けたｏｂ／ｏｂマウスからのｅＷＡＴ切片における、マクロファージ特異的マーカーＭａｃ２についての免疫組織化学。スケールバー：５００μｍ。Ｂ、Ｃ  同じマウスコホートにおける炎症マーカーＦ４／８０（Ｂ）およびＴＮＦ−α（Ｃ）のｑＲＴ−ＰＣＲによる発現定量。Ｄ、Ｅ  （Ａ）におけるものと同じ実験群に属する動物から得られた肝臓の重量（Ｄ）および代表的イメージ（Ｅ）。Ｆ、Ｇ  （Ａ）におけるものと同じコホートにおける給餌状態での肝臓トリグリセリドおよびコレステロール含量。図中のＦＧＦ２１の標識は、この図のレジェンドに従ってｍｏＦＧＦ２１を指す。データの情報：全ての値は平均値±ＳＥＭとして表現される。（Ｂ、Ｄ−Ｆ、Ｈ−Ｉ）においてｎ＝９〜１０動物／群。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１  対  ｎｕｌｌ注射ｏｂ／ｏｂ群。
【図１７】図１７．  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１処置は、ｏｂ／ｏｂマウスの脂肪組織においてグルコース取り込みおよび熱産生に関与する遺伝子の発現を増加させる。Ａ、Ｂ  ２月齢時にＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌベクターまたはＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターのいずれかを注射されたｏｂ／ｏｂマウスにおける肝臓ＰＥＰＣＫおよびＧ６ＰａｓｅのｑＲＴ−ＰＣＲによる発現定量。Ｃ−Ｆ  （Ａ）におけるものと同じ動物における、ｅＷＡＴ、ｉＷＡＴおよびｉＢＡＴ中のＧＬＵＴ１（Ｃ）、ＧＬＵＴ４（Ｄ）、ＨＫＩ（Ｅ）およびＨＫＩＩ（Ｆ）のｑＲＴ−ＰＣＲによる発現定量。Ｇ  （Ａ）におけるものと同じコホートにおける、ｉＢＡＴ中のＵＣＰ１の相対的発現量。図中のＦＧＦ２１の標識は、この図のレジェンドに従ってｍｏＦＧＦ２１を指す。データの情報：全ての値は平均値±ＳＥＭとして表現される。（Ａ−Ｇ）においてｎ＝９〜１０動物／群。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１  対  ｎｕｌｌ注射ｏｂ／ｏｂ群。
【図１８】図１８．  ＡＡＶ８媒介性の肝臓ＦＧＦ２１遺伝子導入はＨＦＤ誘発性肥満に対抗する。Ａ  若年成体（上パネル）または成体（下パネル）としてＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターで処置されたマウスから得られた精巣上体（ｅＷＡＴ）、鼠径部（ｉＷＡＴ）および後腹膜（ｒＷＡＴ）白色脂肪組織貯蔵部、肝臓および四頭筋の重量。Ｂ  ベクター投与後の異なる時点でのＦＧＦ２１の循環レベル。図中のＦＧＦ２１の標識は、この図のレジェンドに従ってｍｏＦＧＦ２１を指す。データの情報：全ての値は平均値±ＳＥＭとして表現される。（Ａ−Ｄ）においてｎ＝７〜１０動物／群。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１  対  固形飼料給餌Ｎｕｌｌ注射群。＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１および＃＃＃Ｐ＜０．００１  対  ＨＦＤ給餌Ｎｕｌｌ注射群。ＨＦＤ、高脂肪食。
【図１９】図１９．  肝臓へのＦＧＦ２１遺伝子導入はＨＦＤ誘発性肥満に対抗する。Ａ、Ｂ  若年成体（Ａ）または成体（Ｂ）において実施された試験の全ての実験群に属する動物の代表的イメージ。Ｃ  若年成体（左）または成体（右）としていくつかの用量のＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１で処置された動物から屠殺時に得られた精巣上体白色脂肪（ｅＷＡＴ）パッドの代表的イメージ。Ｄ  若年成体（左）または成体（右）として処置された動物から得られた肝臓の代表的イメージ。Ｅ  若年成体または成体として処置された動物の肝臓中のＡＡＶに由来するＦＧＦ２１発現。ｑＰＣＲは、コドン最適化されたマウスＦＧＦ２１（ｃｏＦＧＦ２１）のコーディング配列を特異的に検出するプライマーを使用して実施した。図中のＦＧＦ２１の標識は、この図のレジェンドに従ってｍｏＦＧＦ２１を指す。データの情報：全ての値は平均値±ＳＥＭとして表現される。（Ｅ）においてｎ＝７〜１０動物／群。ＨＦＤ、高脂肪食。ＮＤ、検出されず。
【図２０】図２０．  ｉＢＡＴおよびｉＷＡＴにおけるＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１媒介性のエネルギー消費増加および脂肪蓄積減少。Ａ  約２月齢からＨＦＤ給餌に供され、２月後にｎｕｌｌまたはＦＧＦ２１をコードするベクターのいずれかで処置された動物（若年成体）におけるオープンフィールド試験を通じた自発運動活性の査定。Ｂ  若年成体（左）または成体（右）として処置された動物からのｉＢＡＴ組織切片のヘマトキシリン−エオシン染色。Ｃ  （Ａ）におけるものと同じ動物コホートからのｉＢＡＴ中のＵＣＰ１含量のウエスタンブロット分析。代表的イムノブロットが示される（左）。ヒストグラムは２つの異なるイムノブロットの濃度測定分析を描写する（右）。Ｄ  若年成体（左）または成体（右）として処置された動物からのｉＷＡＴ組織切片のヘマトキシリン−エオシン染色。Ｅ  若年成体または成体としてＨＦＤ給餌を開始してＦＧＦ２１ベクターを受けた動物群における、ｉＷＡＴ中のＰｈｏｓｐｈｏ１のｑＲＴ−ＰＣＲによる発現定量。図中のＦＧＦ２１の標識は、この図のレジェンドに従ってｍｏＦＧＦ２１を指す。データの情報：全ての値は平均値±ＳＥＭとして表現される。（Ａ−Ｃ）においてｎ＝７〜１０動物／群。（Ｅ）においてｎ＝４動物／群。（Ｇ）においてｎ＝７〜１０動物／群。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１  対  固形飼料給餌Ｎｕｌｌ注射群。＃Ｐ＜０．０５および＃＃＃Ｐ＜０．００１  対  ＨＦＤ給餌Ｎｕｌｌ注射群。ＨＦＤ、高脂肪食。
【図２１】図２１．  肝臓への遺伝子導入後１０月でのエネルギー消費。Ａ  ２月齢時にＨＦＤ給餌を開始した動物コホートにおけるエネルギー消費を、ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌまたはＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクター送達後１０月で測定した。データは、明サイクルおよび暗サイクルの間に取得した。Ｂ  同じ動物コホートからのｉＷＡＴ中のＵＣＰ１含量のウエスタンブロット分析。代表的イムノブロットが示される（左）。グラフは２つの異なるイムノブロットの濃度測定分析を示す（右）。Ｃ  若年成体または成体としてＨＦＤ給餌を開始してＦＧＦ２１ベクターを受けた動物群における、ｉＷＡＴ中のＳｅｒｃａ２ｂおよびＲｙＲ２の相対的発現量。図中のＦＧＦ２１の標識は、この図のレジェンドに従ってｍｏＦＧＦ２１を指す。データの情報：全ての値は平均値±ＳＥＭとして表現される。（Ａ）においてｎ＝７〜１０動物／群。（Ｂ）においてｎ＝４動物／群。（Ｃ）においてｎ＝７〜１０動物／群。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１  対  固形飼料給餌Ｎｕｌｌ注射群。＃＃＃Ｐ＜０．００１  対  ＨＦＤ給餌Ｎｕｌｌ注射群。ＨＦＤ、高脂肪食。
【図２２】図２２．  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１媒介性の島過形成の回復。Ａ  若年成体としてＨＦＤ給餌を開始してＦＧＦ２１ベクターを受けた動物群における空腹時グルカゴンレベル。Ｂ  成体としてＨＦＤ給餌を開始してＦＧＦ２１ベクターを受けた動物群におけるβ細胞量。Ｃ  成体として５×１０１０ｖｇ／マウスのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１を受けた動物からの膵臓切片におけるインスリンに対する免疫染色の代表的イメージ。スケールバー：４００μｍ。挿入図スケールバー：１００μｍ。Ｄ  若年成体（上段パネル）または成体（下段パネル）として５×１０１０ｖｇ／マウスのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１を受けた動物からの膵臓切片におけるインスリン（濃い灰色）およびグルカゴン（薄い灰色）に対する二重免疫染色の代表的イメージ。スケールバー：１００μｍ。図中のＦＧＦ２１の標識は、この図のレジェンドに従ってｍｏＦＧＦ２１を指す。データの情報：全ての値は平均値±ＳＥＭとして表現される。（Ａ−Ｃ）においてｎ＝７〜１０動物／群。（Ｄ）においてｎ＝４〜５動物／群。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１  対  固形飼料給餌Ｎｕｌｌ注射群。＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１および＃＃＃Ｐ＜０．００１  対  ＨＦＤ給餌Ｎｕｌｌ注射群。ＨＦＤ、高脂肪食。
【図２３】図２３．  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１での処置は耐糖能を改善する。Ａ  耐糖能は、若年成体としてＨＦＤ給餌を開始してＦＧＦ２１ベクターを受けたマウス群において、グルコースの腹腔内注射（２ｇ／ｋｇ体重）後に試験した。Ｂ  （Ａ）中に示されるグルコース負荷試験の際の血清インスリンレベル。データの情報：全てのデータは平均値±ＳＥＭで表現される。（Ａ−Ｄ）においてｎ＝７〜１０動物／群。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１  対  固形飼料給餌Ｎｕｌｌ注射群。＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１および＃＃＃Ｐ＜０．００１  対  ＨＦＤ給餌Ｎｕｌｌ注射群。ＨＦＤ、高脂肪食。
【図２４】図２４．  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１処置によるＷＡＴ肥大および炎症の回復。Ａ  若年成体（左パネル）または成体（右パネル）として固形飼料またはＨＦＤを給餌してＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌまたは５×１０１０ｖｇ／マウスのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターのいずれかを投与した動物からのｅＷＡＴのヘマトキシリン−エオシン染色の代表的イメージ。ＨＦＤ給餌ｎｕｌｌ注射マウスの脂肪細胞はより大きかったが、ＨＦＤ給餌ＦＧＦ２１処置動物の脂肪細胞はサイズが低減した。スケールバー：１００μｍ。Ｂ  若年成体または成体として処置された動物におけるＷＡＴ脂肪細胞の面積の形態計測分析。Ｃ、Ｄ  アディポネクチン（Ｃ）およびレプチン（Ｄ）の循環レベル。Ｅ  成体として５×１０１０ｖｇ／マウスのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１を受けた動物からのｅＷＡＴ切片におけるマクロファージ特異的マーカーＭａｃ２についての免疫組織化学。顕微鏡写真は、ＨＦＤ給餌ｎｕｌｌ注射動物のｅＷＡＴにおける王冠様構造の存在を示すが（矢印および挿入図）、ＨＦＤ給餌ＦＧＦ２１処置マウスのｅＷＡＴにはない。スケールバー：２００μｍおよび５０μｍ（挿入図）。Ｆ−Ｈ  成体としてＨＦＤ給餌を開始してＦＧＦ２１ベクターを受けた動物群における炎症マーカーＦ４／８０（Ｆ）、ＩＬ１−β（Ｇ）およびＴＮＦ−α（Ｈ）のｑＲＴ−ＰＣＲによる発現定量。図中のＦＧＦ２１の標識は、この図のレジェンドに従ってｍｏＦＧＦ２１を指す。データの情報：全ての値は平均値±ＳＥＭとして表現される。（Ｂ）においてｎ＝４動物／群。（Ｆ−Ｈ）においてｎ＝７〜１０動物／群。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１  対  固形飼料給餌Ｎｕｌｌ注射群。＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１および＃＃＃Ｐ＜０．００１  対  ＨＦＤ給餌Ｎｕｌｌ注射群。ＨＦＤ、高脂肪食。
【図２５】図２５．  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１処置動物における脂肪細胞のサイズおよび炎症。Ａ  若年成体（上グラフ）または成体（下グラフ）として固形飼料またはＨＦＤ給餌を開始してＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌまたは５×１０１０ｖｇ／マウスのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターのいずれかを受けた動物群における脂肪細胞面積の頻度分布。Ｂ  若年成体として試験を開始した動物のｅＷＡＴにおけるＭａｃ２免疫組織化学。ＨＦＤ給餌ｎｕｌｌ注射マウスのｅＷＡＴにおけるマクロファージ浸潤により形成された王冠様構造が矢印により指し示される。スケールバー：２００μｍおよび５０μｍ（挿入図）。Ｃ−Ｅ  （Ｂ）におけるものと同じ動物コホートにおける、炎症マーカーＦ４／８０、ＣＤ６８およびＴＮＦ−αのｑＲＴ−ＰＣＲによる相対的発現量。図中のＦＧＦ２１の標識は、この図のレジェンドに従ってｍｏＦＧＦ２１を指す。データの情報：全ての値は平均値±ＳＥＭとして表現される。（Ａ）においてｎ＝４動物／群。（Ｃ−Ｅ）においてｎ＝７〜１０動物／群。＊＊＊Ｐ＜０．００１  対  固形飼料給餌Ｎｕｌｌ注射群。＃＃＃Ｐ＜０．００１  対  ＨＦＤ給餌Ｎｕｌｌ注射群。ＨＦＤ、高脂肪食。
【図２６】図２６．  ＦＧＦ２１をコードするベクターでの処置は、脂肪肝および肝臓の炎症を回復させる。Ａ  固形飼料またはＨＦＤを給餌してＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌまたは５×１０１０ｖｇ／マウスのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターのいずれかを投与した動物から得られた肝臓切片のヘマトキシリン−エオシン染色の代表的イメージ。ＨＦＤは肝臓中の脂肪滴蓄積を明らかに誘導し、これは若年成体および成体のいずれにおいてもＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１処置により回復した。スケールバー：１００μｍ。Ｂ、Ｃ  同じ動物コホートにおける給餌時の肝臓トリグリセリドおよびコレステロール含量。Ｄ  ＨＦＤを給餌してＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌまたは５×１０１０ｖｇ／マウスのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターを受けた動物からの肝臓切片のマクロファージ特異的マーカーＭａｃ−２についての免疫染色。矢印は王冠様構造の存在を指し示す。スケールバー：２００μｍおよび５０μｍ（挿入図）。図中のＦＧＦ２１の標識は、この図のレジェンドに従ってｍｏＦＧＦ２１を指す。データの情報：全ての値は平均値±ＳＥＭとして表現される。（Ｂ−Ｃ）においてｎ＝７〜１０動物／群。＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１  対  固形飼料給餌Ｎｕｌｌ注射群。＃＃Ｐ＜０．０１  対  ＨＦＤ給餌Ｎｕｌｌ注射群。ＨＦＤ、高脂肪食。
【図２７】図２７．  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１媒介性の肝線維症の好転。  ５×１０１０ｖｇ／マウスのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌまたはＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターのいずれかを受けたＨＦＤ給餌動物におけるマッソントリクローム染色を通じた肝線維症の分析。ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１処置（右パネル）は、ｎｕｌｌベクターで処置された動物（左パネル）において容易に検出可能なコラーゲン線維（青色）の検出を著しく減少させた。スケールバー：５０μｍ。図中のＦＧＦ２１の標識は、この図のレジェンドに従ってｍｏＦＧＦ２１を指す。
【図２８】図２８．  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１処置は肝線維症を改善する。Ａ  ５×１０１０ｖｇ／マウスのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｎｕｌｌまたはＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターのいずれかを受けたＨＦＤ給餌動物におけるピクロシリウス染色を通じた肝線維症の分析。ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１処置（右パネル）は、ｎｕｌｌベクターで処置された動物（左パネル）において容易に検出可能なコラーゲン線維（黒色）の検出を著しく減少させた。スケールバー：５０μｍ。Ｂ、Ｃ  若年成体（Ｂ）または成体（Ｃ）としてＨＦＤ給餌を開始してＦＧＦ２１ベクターを受けた動物群における、肝臓中のコラーゲン１のｑＲＴ−ＰＣＲによる発現定量。図中のＦＧＦ２１の標識は、この図のレジェンドに従ってｍｏＦＧＦ２１を指す。データの情報：全ての値は平均値±ＳＥＭとして表現される。（Ｂ−Ｃ）においてｎ＝７〜１０動物／群。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１  対  固形飼料給餌Ｎｕｌｌ注射群。＃Ｐ＜０．０５および＃＃＃Ｐ＜０．００１  対  ＨＦＤ給餌Ｎｕｌｌ注射群。ＨＦＤ、高脂肪食。
【図２９】図２９．  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１処置動物において骨異常は認められなかった。骨に対するＦＧＦ２１遺伝子導入の長期的効果を、若年成体または成体として最も高い用量（５×１０１０ｖｇ／マウス）のＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターで処置されたＨＦＤ給餌マウスとｎｕｌｌ注射の固形飼料またはＨＦＤ給餌動物との比較により試験した。Ａ  鼻先から尾根部までの全長。Ｂ  脛骨長。Ｃ−Ｏ  ｎｕｌｌまたはＦＧＦ２１をコードするＡＡＶベクターのいずれかを投与したＨＦＤ給餌マウスから屠殺時、すなわち動物が１８月齢の時に得られた脛骨の骨端（Ｃ−Ｊ）および骨幹（Ｋ−Ｏ）のマイクロコンピュータ断層撮影（μＣＴ）分析。Ｐ、Ｑ  ＥＬＩＳＡにより測定された循環ＩＧＦＢＰ１（Ｐ）およびＩＧＦ１（Ｑ）のレベル。図中のＦＧＦ２１の標識は、この図のレジェンドに従ってｍｏＦＧＦ２１を指す。データの情報：全てのデータは平均値±ＳＥＭで表現される。（Ａ、Ｐ−Ｑ）においてｎ＝７〜１０動物／群。（Ｂ−Ｏ）においてｎ＝４動物／群。＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１  対  固形飼料給餌Ｎｕｌｌ注射群。ＨＦＤ、高脂肪食；ＢＭＤ、骨ミネラル密度；ＢＭＣ、骨ミネラル含量；ＢＶ、骨体積；ＢＶ／ＴＶ、骨体積／組織体積比；ＢＳ／ＢＶ、骨表面／骨体積比；Ｔｂ．Ｎ、骨梁数；Ｔｂ．Ｔｈ、骨梁幅；Ｔｂ．Ｓｐ、骨梁間隔。
【図３０】図３０．  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターで処置されたＣ５７Ｂｌ６マウスにおける血糖プロファイルの分析。血中グルコースレベルは給餌条件下で評価した。ＡＡＶ、５×１０１０ｖｇまたは２×１０１１ｖｇのＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１（それぞれｎ＝１３および１５）または２×１０１１ｖｇのＡＡＶ８−ｎｕｌｌベクター（ｎ＝１５）のＩＶ投与。ＳＴＺ、ストレプトゾトシンでの処置（５×５０ｍｇ／ｋｇ）。結果は平均値＋ＳＥＭである。＊  ｐ＜０．０５；＊＊＊  ｐ＜０．００１  ｖｓ  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−Ｎｕｌｌ。図中のＦＧＦ２１の標識は、この図のレジェンドに従ってｍｏＦＧＦ２１を指す。
【図３１】図３１．  健常動物の骨格筋へのＦＧＦ２１の遺伝子導入。Ａ  ３×１０１１ｖｇ／マウスのＡＡＶ１−ＣＭＶ−ＮｕｌｌまたはＡＡＶ１−ＣＭＶ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターのいずれかを固形飼料食を給餌した健常動物の骨格筋に注射した４０週後に測定されたＦＧＦ２１の循環レベル。Ｂ  ＡＡＶ１−ＣＭＶ−ＮｕｌｌまたはＡＡＶ１−ＣＭＶ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターを筋肉内注射した健常動物の筋肉および肝臓中ののＡＡＶに由来するＦＧＦ２１発現。Ｃ  ４０週の追跡期間中の体重の進展。Ｄ  異なる筋肉、脂肪パッドおよび肝臓の組織湿重量。Ｅ、Ｆ  給餌状態での肝臓トリグリセリドおよびコレステロール含量。Ｇ  給餌時血清インスリンレベル。Ｈ  インスリン（０．７５ｕｎｉｔｓ／ｋｇ体重）の腹腔内注射を通じて査定され、開始時血中グルコースのパーセンテージとして表されるインスリン感受性。図中のＦＧＦ２１の標識は、この図のレジェンドに従ってｍｏＦＧＦ２１を指す。データの情報：全ての値は平均値±ＳＥＭとして表現される。（Ａ−Ｈ）においてｎ＝５−７動物／群。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１  対  Ｎｕｌｌ注射群。
【図３２】図３２．  ＡＡＶ１媒介性の骨格筋ＦＧＦ２１遺伝子導入はＨＦＤ誘発性肥満およびインスリン抵抗性に対抗する。Ａ、Ｂ  ＡＡＶ１−ＣＭＶ−ｍｏＦＧＦ２１で処置された動物の体重（Ａ）および体重増加（Ｂ）の進展。Ｃ５７Ｂｌ６マウスにＨＦＤを約１２週間給餌し、次いで３×１０１１ｖｇ／マウスのＡＡＶ１−ＣＭＶ−ｍｏＦＧＦ２１ベクターを投与した。コントロールの肥満マウスおよびコントロールの固形飼料給餌マウスは３×１０１１ｖｇのＡＡＶ１−ＣＭＶ−ｎｕｌｌを受けた。Ｃ  ベクター投与後異なる時点でのＦＧＦ２１の循環レベル。Ｄ、Ｅ  （Ａ、Ｂ）におけるものと同じ動物群における空腹時血中グルコース（Ｄ）および給餌時血清インスリン（Ｅ）のレベル。Ｆ  インスリン感受性を、インスリン（０．７５ｕｎｉｔｓ／ｋｇ体重）の腹腔内注射後、全ての実験群において決定した。結果は、開始時血中グルコースレベルのパーセンテージとして算出した。図中のＦＧＦ２１の標識は、この図のレジェンドに従ってｍｏＦＧＦ２１を指す。データの情報：全ての値は平均値±ＳＥＭとして表現される。（Ａ−Ｆ）においてＨＦＤ給餌マウス  ｎ＝１０動物／群；固形飼料給餌マウス  ｎ＝５動物／群。＊＊＊Ｐ＜０．００１  対  ＨＦＤ給餌ｎｕｌｌ注射群。
【図３３】図３３．  ヒトＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列のコドン最適化によるＦＧＦ２１循環レベルのインビボでの増加。野生型ｈＦＧＦ２１またはコドン最適化されたヒトＦＧＦ２１配列の３つの異なるバリアントをコードするプラスミドをハイドロダイナミクス投与したＣ５７Ｂｌ６マウスにおけるｈＦＧＦ２１の循環レベル。結果は平均値±ＳＥＭとして表現される。ｎ＝９〜１０マウス／群。ＮＤ、検出されず。ネガティブコントロール、未処置マウス。＊  ｐ＜０．０５  ｖｓ  非処置マウス。
【図３４】図３４．  ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１、ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｏｕｂｌｅｍｉＲＴおよびＣＭＶ−ｍｏＦＧＦ２１発現カセットによるＦＧＦ２１発現レベルのインビトロでの増加。（Ａ）ＥＦ１ａプロモーターの制御下にあるＷＴのマウスＦＧＦ２１コーディング配列（ＥＦ１ａ−ｍＦＧＦ２１）またはＣＭＶプロモーターの制御下にあるコドン最適化されたマウスＦＧＦ２１コーディング配列（ＣＭＶ−ｍｏＦＧＦ２１）またはｍｉＲＴ１２２ａ配列の４個のタンデムリピートおよびｍｉＲＴ１配列の４個のタンデムリピートを伴った、ＣＡＧプロモーターの制御下にあるコドン最適化されたマウスＦＧＦ２１コーディング配列（ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｏｕｂｌｅｍｉＲＴ）をコードするプラスミドをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞におけるＦＧＦ２１の発現レベル。（ＢおよびＣ）（Ａ）におけるものと同じ細胞における細胞内ＦＧＦ２１タンパク質含量（Ｂ）および培養培地中のＦＧＦ２１タンパク質レベル（Ｃ）。（Ｄ）ＥＦ１ａプロモーターの制御下にあるＷＴのマウスＦＧＦ２１コーディング配列（ＥＦ１ａ−ｍＦＧＦ２１）またはＣＭＶプロモーターの制御下にあるコドン最適化されたマウスＦＧＦ２１コーディング配列（ＣＭＶ−ｍｏＦＧＦ２１）をコードするプラスミドをトランスフェクトしたＣ２Ｃ１２細胞におけるＦＧＦ２１の発現レベル。（Ｅ）ＥＦ１ａプロモーターの制御下にあるＷＴのマウスＦＧＦ２１コーディング配列（ＥＦ１ａ−ｍＦＧＦ２１）またはｈＡＡＴプロモーターの制御下にあるコドン最適化されたマウスＦＧＦ２１（ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１）をコードするプラスミドをトランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞におけるＦＧＦ２１の発現レベル。ｑＰＣＲは、ｗｔおよびコドン最適化されたＦＧＦ２１コーディング配列の両方を検出するプライマーを使用して実施した。結果は平均値±ＳＥＭとして表現される。ｎ＝３ウェル／群。ＮＤ、検出されず。＊  ｐ＜０．０５  ｖｓ  コントロール。＃＃＃  ｐ＜０．００１  ｖｓ  ＥＦ１ａ−ｍＦＧＦ２１。
【図３５】図３５．  ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１およびＣＭＶ−ｍｏＦＧＦ２１発現カセットによる肝臓ＦＧＦ２１発現およびＦＧＦ２１循環レベルのインビボでの増加。（Ａ）伸長因子１ａ（ＥＦ１ａ）プロモーターの制御下にあるＷＴのマウスＦＧＦ２１コーディング配列（ＥＦ１ａ−ｍＦＧＦ２１）またはＣＭＶプロモーターの制御下にあるコドン最適化されたマウスＦＧＦ２１コーディング配列（ＣＭＶ−ｍｏＦＧＦ２１）またはｈＡＡＴプロモーターの制御下にあるコドン最適化されたマウスＦＧＦ２１コーディング配列（ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１）をコードするプラスミドをハイドロダイナミクス投与したＣ５７Ｂｌ６マウスの肝臓中のＦＧＦ２１の発現レベル。ｑＰＣＲは、ｗｔおよびコドン最適化されたＦＧＦ２１コーディング配列の両方を検出するプライマーを使用して実施した。（Ｂ）（Ａ）におけるものと同じコホートにおけるＦＧＦ２１循環レベル。結果は平均値±ＳＥＭとして表現される。ｎ＝５マウス／群。＊＊  ｐ＜０．０１  ｖｓ．  ＥＦ１ａ−ｍＦＧＦ２１
【図３６】図３６．  ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１による肝臓ＦＧＦ２１発現およびＦＧＦ２１循環レベルのインビボでの増加。（Ａ）１×１０１０ｖｇ、２×１０１０ｖｇまたは５×１０１０ｖｇの、伸長因子１ａ（ＥＦ１ａ）プロモーターの制御下にあるＷＴのマウスＦＧＦ２１コーディング配列をコードするＡＡＶ８ベクター（ＡＡＶ８−ＥＦ１ａ−ｍＦＧＦ２１）またはｈＡＡＴプロモーターの制御下にあるコドン最適化されたマウスＦＧＦ２１（ＡＡＶ８−ｈＡＡＴ−ｍｏＦＧＦ２１）を静脈内投与したＣ５７Ｂｌ６マウスの肝臓中のＦＧＦ２１発現レベル。ｑＰＣＲは、ｗｔおよびコドン最適化されたＦＧＦ２１コーディング配列の両方を検出するプライマーを使用して実施した。（Ｂ）（Ａ）におけるものと同じコホートにおけるＦＧＦ２１循環レベル。分析はＡＡＶ後２週で実施した。結果は平均値±ＳＥＭとして表現される。ｎ＝４〜５マウス／群。コントロール、未処置マウス。＊＊  ｐ＜０．０１および＊＊＊  ｐ＜０．００１  ｖｓ．  コントロール。＃＃  ｐ＜０．０１および＃＃＃  ｐ＜０．００１  ｖｓ．  ＡＡＶ８−ＥＦ１ａ−ｍＦＧＦ２１
【図３７】図３７．  ＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｍｉＲＴによる脂肪ＦＧＦ２１発現のインビボでの増加。（Ａ−Ｂ）２×１０１０ｖｇ、５×１０１０ｖｇまたは１×１０１１ｖｇの、伸長因子１ａ（ＥＦ１ａ）プロモーターの制御下にあるＷＴのマウスＦＧＦ２１コーディング配列をコードするＡＡＶ８ベクター（ＡＡＶ８−ＥＦ１ａ−ｍＦＧＦ２１）またはｍｉＲＴ１２２ａ配列の４個のタンデムリピートおよびｍｉＲＴ１配列の４個のタンデムリピートを伴った、ＣＡＧプロモーターの制御下にあるコドン最適化されたマウスＦＧＦ２１コーディング配列をコードするＡＡＶ８ベクター（ＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｍｏＦＧＦ２１−ｄｏｕｂｌｅｍｉＲＴ）のいずれかをｅＷＡＴ内投与したＣ５７Ｂｌ６マウスのｅＷＡＴ（Ａ）または肝臓（Ｂ）におけるＦＧＦ２１の発現レベル。ｑＰＣＲは、ｗｔおよびコドン最適化されたＦＧＦ２１コーディング配列の両方を検出するプライマーを使用して実施した。分析はＡＡＶ後２週で実施した。結果は平均値±ＳＥＭとして表現される。ｎ＝４〜５マウス／群。コントロール、未処置マウス。ｅＷＡＴ、精巣上体（ｅｐｉｄｙｄｉｍａｌ）白色脂肪組織。＊  ｐ＜０．０５、＊＊  ｐ＜０．０１、ならびに
【図３８】図３８．  ＡＡＶ１−ＣＭＶ−ｍｏＦＧＦ２１による骨格筋におけるＦＧＦ２１発現のインビボでの増加。（Ａ−Ｂ）５×１０１０ｖｇ、１×１０１１ｖｇまたは３×１０１１ｖｇの、伸長因子１ａ（ＥＦ１ａ）プロモーターの制御下にあるＷＴのマウスＦＧＦ２１コーディング配列をコードするＡＡＶ８ベクター（ＡＡＶ８−ＥＦ１ａ−ｍＦＧＦ２１）またはＣＭＶプロモーターの制御下にあるコドン最適化されたマウスＦＧＦ２１コーディング配列をコードするＡＡＶ１ベクター（ＡＡＶ１−ＣＭＶ−ＦＧＦ２１）のいずれかを筋肉内投与したＣ５７Ｂｌ６マウスの四頭筋（Ａ）または肝臓（Ｂ）におけるＦＧＦ２１の発現レベル。ｑＰＣＲは、ｗｔおよびコドン最適化されたＦＧＦ２１コーディング配列の両方を検出するプライマーを使用して実施した。分析はＡＡＶ後２週で実施した。結果は平均値±ＳＥＭとして表現される。ｎ＝４〜５マウス／群。コントロール、未処置マウス。＊  ｐ＜０．０５、＊＊  ｐ＜０．０１および＊＊＊  ｐ＜０．００１  ｖｓ．  コントロール。＃  ｐ＜０．０５、＃＃  ｐ＜０．０１および＃＃＃  ｐ＜０．００１  ｖｓ．  ＡＡＶ８−ＥＦ１ａ−ｍＦＧＦ２１。
【図１Ａ】
2020530977.tif 000003
【図１Ｂ】
2020530977.tif 000004
【図１Ｃ】
2020530977.tif 000005
【図１Ｄ】
2020530977.tif 000006
【図１Ｅ】
2020530977.tif 000007
【図１Ｆ】
2020530977.tif 000008
【図１Ｇ】
2020530977.tif 000009
【図１Ｈ】
2020530977.tif 000010
【図２Ａ】
2020530977.tif 000011
【図２Ｂ】
2020530977.tif 000012
【図２Ｃ】
2020530977.tif 000013
【図３Ａ】
2020530977.tif 000014
【図３Ｂ】
2020530977.tif 000015
【図３Ｃ】
2020530977.tif 000016
【図３Ｄ】
2020530977.tif 000017
【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
2020530977.tif 000019
【図３Ｇ】
2020530977.tif 000020
【図３Ｈ】
2020530977.tif 000021
【図４Ａ】
2020530977.tif 000022
【図４Ｂ】
2020530977.tif 000023
【図４Ｃ】
2020530977.tif 000024
【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
2020530977.tif 000032
【図６Ｅ】
2020530977.tif 000033
【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図６Ｉ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
2020530977.tif 000042
【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
2020530977.tif 000044
【図９Ｂ】
2020530977.tif 000045
【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
2020530977.tif 000048
【図１０Ｃ】
2020530977.tif 000049
【図１１Ａ】
2020530977.tif 000050
【図１１Ｂ】
2020530977.tif 000051
【図１１Ｃ】
2020530977.tif 000052
【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
2020530977.tif 000060
【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年1月27日(2020.1.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における発現に適しており、肝臓、脂肪組織および／または骨格筋において発現する線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）をコードするヌクレオチド配列を含む、ウイルス発現コンストラクト。
【請求項２】
哺乳動物における発現に適したＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列、ならびに要素ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）およびｅ）：
（ａ）肝臓特異的プロモーター
（ｂ）脂肪組織特異的プロモーター
（ｃ）ユビキタスプロモーターと、肝臓において発現するマイクロＲＮＡの標的配列をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列と、心臓において発現するマイクロＲＮＡの標的配列をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列との組み合わせであって、脂肪組織における特異的発現を可能にするものである、前記組み合わせ
（ｄ）骨格筋プロモーター、ならびに
（ｅ）ユビキタスプロモーターとアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター配列との組み合わせであって、骨格筋における特異的発現を可能にするものである、前記組み合わせ
のうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載のウイルス発現コンストラクト。
【請求項３】
哺乳動物における発現に適したＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列が：
（ａ）配列番号１、２または３のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を持つアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
（ｂ）配列番号４、５、６、７、８、９、１０または１１のヌクレオチド配列と少なくとも６０％の配列同一性を持つヌクレオチド配列
（ｃ）遺伝暗号の縮重のためにヌクレオチド配列（ｂ）の配列と配列が異なるヌクレオチド配列
よりなる群から選択される、請求項１または２に記載のウイルス発現コンストラクト。
【請求項４】
肝臓において発現するマイクロＲＮＡの標的配列をコードするヌクレオチド配列および心臓において発現するマイクロＲＮＡの標的配列をコードするヌクレオチド配列が配列番号１２から３０の配列および／またはそれらの組み合わせよりなる群から選択される、請求項２または３に記載のウイルス発現コンストラクト。
【請求項５】
肝臓特異的プロモーターがヒトα１−アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーターであり、ならびに／または脂肪組織特異的プロモーターがｍｉｎｉ／ａｐ２プロモーターおよび／もしくはｍｉｎｉ／ＵＣＰ１プロモーターであり、ならびに／または骨格筋プロモーターがＣ５−１２プロモーターであり、ならびに／またはユビキタスプロモーターがサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよび／もしくはＣＡＧプロモーターである、請求項２から４のいずれか一項に記載のウイルス発現コンストラクト。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項に記載のウイルス発現コンストラクトを含むウイルスベクターであって、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターであり、好ましくはアデノ随伴ウイルス１（ＡＡＶ１）ベクター、アデノ随伴ウイルス８（ＡＡＶ８）ベクターおよびアデノ随伴ウイルス９（ＡＡＶ９）ベクターよりなる群から選択されるアデノ随伴ウイルスベクターである、前記ウイルスベクター。
【請求項７】
哺乳動物における発現に適しており、肝臓、脂肪組織および／または骨格筋において発現する、哺乳動物コドンに最適化されたＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列により表される核酸分子。
【請求項８】
ヌクレオチド配列が、配列番号４、５、６、７、８、９、１０または１１のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の配列同一性を持つ、請求項７に記載の核酸分子。
【請求項９】
請求項１から５のいずれか一項に規定されるウイルス発現コンストラクトおよび／または請求項６に規定されるウイルスベクターおよび／または請求項７もしくは８に規定される核酸分子を、１または複数の薬学的に許容される添加剤または媒体と一緒に含む、組成物。
【請求項１０】
薬剤としての使用のための、請求項１から５のいずれか一項に規定されるウイルス発現コンストラクトおよび／または請求項６に規定されるウイルスベクターおよび／または請求項７もしくは８に規定される核酸分子および／または請求項９に規定される組成物。
【請求項１１】
代謝障害の処置および／または予防における使用のための、請求項１から５のいずれか一項に規定されるウイルス発現コンストラクトおよび／または請求項６に規定されるウイルスベクターおよび／または請求項７もしくは８に規定される核酸分子および／または請求項９に規定される組成物。
【請求項１２】
代謝障害が糖尿病および／または肥満である、請求項１１に記載の使用のためのウイルス発現コンストラクトおよび／またはウイルスベクターおよび／または核酸分子および／または組成物。
【請求項１３】
代謝障害がＮＡＳＨである、請求項１１に記載の使用のためのウイルス発現コンストラクトおよび／またはウイルスベクターおよび／または核酸分子および／または組成物。
【請求項１４】
肝臓の炎症および／または線維症の処置および／または予防における使用のための、請求項１から５のいずれか一項に規定されるウイルス発現コンストラクトおよび／または請求項６に規定されるウイルスベクターおよび／または請求項７もしくは８に規定される核酸分子および／または請求項９に規定される組成物。
【請求項１５】
健康寿命の延伸における使用のための、請求項１から５のいずれか一項に規定されるウイルス発現コンストラクトおよび／または請求項６に規定されるウイルスベクターおよび／または請求項７もしくは８に規定される核酸分子および／または請求項９に規定される組成物。
【請求項１６】
がん、好ましくは肝臓がんの処置および／または予防における使用のための、請求項１から５のいずれか一項に規定されるウイルス発現コンストラクトおよび／または請求項６に規定されるウイルスベクターおよび／または請求項７もしくは８に規定される核酸分子および／または請求項９に規定される組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
それゆえ、天然ＦＧＦ２１のインビボ産生のためのかかるＡＡＶベクターの作出は、実験部において実証されるように、当業者にとって通例的ではない。
本発明は一態様において、以下を提供する。
[項目１]
哺乳動物における発現に適しており、肝臓、脂肪組織および／または骨格筋において発現する線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）をコードするヌクレオチド配列を含む、ウイルス発現コンストラクト。
[項目２]
哺乳動物における発現に適したＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列、ならびに要素ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）およびｅ）：
（ａ）肝臓特異的プロモーター
（ｂ）脂肪組織特異的プロモーター
（ｃ）ユビキタスプロモーターと、肝臓において発現するマイクロＲＮＡの標的配列をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列と、心臓において発現するマイクロＲＮＡの標的配列をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列との組み合わせであって、脂肪組織における特異的発現を可能にするものである、前記組み合わせ
（ｄ）骨格筋プロモーター、ならびに
（ｅ）ユビキタスプロモーターとアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター配列との組み合わせであって、骨格筋における特異的発現を可能にするものである、前記組み合わせ
のうちの少なくとも１つを含む、項目１に記載のウイルス発現コンストラクト。
[項目３]
哺乳動物における発現に適したＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列が：
（ａ）配列番号１、２または３のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を持つアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
（ｂ）配列番号４、５、６、７、８、９、１０または１１のヌクレオチド配列と少なくとも６０％の配列同一性を持つヌクレオチド配列
（ｃ）遺伝暗号の縮重のためにヌクレオチド配列（ｂ）の配列と配列が異なるヌクレオチド配列
よりなる群から選択される、項目１または２に記載のウイルス発現コンストラクト。
[項目４]
肝臓において発現するマイクロＲＮＡの標的配列をコードするヌクレオチド配列および心臓において発現するマイクロＲＮＡの標的配列をコードするヌクレオチド配列が配列番号１２から３０の配列および／またはそれらの組み合わせよりなる群から選択される、項目２または３に記載のウイルス発現コンストラクト。
[項目５]
肝臓特異的プロモーターがヒトα１−アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーターであり、ならびに／または脂肪組織特異的プロモーターがｍｉｎｉ／ａｐ２プロモーターおよび／もしくはｍｉｎｉ／ＵＣＰ１プロモーターであり、ならびに／または骨格筋プロモーターがＣ５−１２プロモーターであり、ならびに／またはユビキタスプロモーターがサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよび／もしくはＣＡＧプロモーターである、項目２から４のいずれか一項に記載のウイルス発現コンストラクト。
[項目６]
項目１から５のいずれか一項に記載のウイルス発現コンストラクトを含むウイルスベクターであって、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターであり、好ましくはアデノ随伴ウイルス１（ＡＡＶ１）ベクター、アデノ随伴ウイルス８（ＡＡＶ８）ベクターおよびアデノ随伴ウイルス９（ＡＡＶ９）ベクターよりなる群から選択されるアデノ随伴ウイルスベクターである、前記ウイルスベクター。
[項目７]
哺乳動物における発現に適しており、肝臓、脂肪組織および／または骨格筋において発現する、哺乳動物コドンに最適化されたＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列により表される核酸分子。
[項目８]
ヌクレオチド配列が、配列番号４、５、６、７、８、９、１０または１１のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の配列同一性を持つ、項目７に記載の核酸分子。
[項目９]
項目１から５のいずれか一項に規定されるウイルス発現コンストラクトおよび／または項目６に規定されるウイルスベクターおよび／または項目７もしくは８に規定される核酸分子を、１または複数の薬学的に許容される添加剤または媒体と一緒に含む、組成物。
[項目１０]
薬剤としての使用のための、項目１から５のいずれか一項に規定されるウイルス発現コンストラクトおよび／または項目６に規定されるウイルスベクターおよび／または項目７もしくは８に規定される核酸分子および／または項目９に規定される組成物。
[項目１１]
代謝障害の処置および／または予防における使用のための、項目１から５のいずれか一項に規定されるウイルス発現コンストラクトおよび／または項目６に規定されるウイルスベクターおよび／または項目７もしくは８に規定される核酸分子および／または項目９に規定される組成物。
[項目１２]
代謝障害が糖尿病および／または肥満である、項目１１に記載のウイルス発現コンストラクトおよび／またはウイルスベクターおよび／または核酸分子および／または組成物。
[項目１３]
代謝障害がＮＡＳＨである、項目１１に記載のウイルス発現コンストラクトおよび／またはウイルスベクターおよび／または核酸分子および／または組成物。
[項目１４]
肝臓の炎症および／または線維症の処置および／または予防における使用のための、項目１から５のいずれか一項に規定されるウイルス発現コンストラクトおよび／または項目６に規定されるウイルスベクターおよび／または項目７もしくは８に規定される核酸分子および／または項目９に規定される組成物。
[項目１５]
健康寿命の延伸における使用のための、項目１から５のいずれか一項に規定されるウイルス発現コンストラクトおよび／または項目６に規定されるウイルスベクターおよび／または項目７もしくは８に規定される核酸分子および／または項目９に規定される組成物。
[項目１６]
がん、好ましくは肝臓がんの処置および／または予防における使用のための、項目１から５のいずれか一項に規定されるウイルス発現コンストラクトおよび／または項目６に規定されるウイルスベクターおよび／または項目７もしくは８に規定される核酸分子および／または項目９に規定される組成物。
[項目１７]
項目１から５のいずれか一項に規定されるウイルス発現コンストラクトおよび／または項目６に規定されるウイルスベクターおよび／または項目７もしくは８に規定される核酸分子および／または項目９に規定される組成物の使用を含む、代謝障害を予防、遅延、回復、治癒および／または処置する方法。
[項目１８]
代謝障害が糖尿病および／または肥満である、項目１７に記載の方法。
[項目１９]
代謝障害がＮＡＳＨである、項目１７に記載の方法。
[項目２０]
項目１から５のいずれか一項に規定されるウイルス発現コンストラクトおよび／または項目６に規定されるウイルスベクターおよび／または項目７もしくは８に規定される核酸分子および／または項目９に規定される組成物の使用を含む、肝臓の炎症および／または線維症を予防、遅延、回復、治癒および／または処置する方法。
[項目２１]
項目１から５のいずれか一項に規定されるウイルス発現コンストラクトおよび／または項目６に規定されるウイルスベクターおよび／または項目７もしくは８に規定される核酸分子および／または項目９に規定される組成物の使用を含む、健康寿命を延伸する方法。
[項目２２]
項目１から５のいずれか一項に規定されるウイルス発現コンストラクトおよび／または項目６に規定されるウイルスベクターおよび／または項目７もしくは８に規定される核酸分子および／または項目９に規定される組成物の使用を含む、がん、好ましくは肝臓がんを予防、遅延、回復、治癒および／または処置する方法。
[項目２３]
代謝障害を予防、遅延、回復、治癒および／または処置するための薬剤の製造のための、項目１から５のいずれか一項に規定されるウイルス発現コンストラクトおよび／または項目６に規定されるウイルスベクターおよび／または項目７もしくは８に規定される核酸分子および／または項目９に規定される組成物の使用。
[項目２４]
代謝障害が糖尿病および／または肥満である、項目２３に記載の使用。
[項目２５]
代謝障害がＮＡＳＨである、項目２３に記載の使用。
[項目２６]
肝臓の炎症および／または線維症を予防、遅延、回復、治癒および／または処置するための薬剤の製造のための、項目１から５のいずれか一項に規定されるウイルス発現コンストラクトおよび／または項目６に規定されるウイルスベクターおよび／または項目７もしくは８に規定される核酸分子および／または項目９に規定される組成物の使用。
[項目２７]
健康寿命を延伸するための薬剤の製造のための、項目１から５のいずれか一項に規定されるウイルス発現コンストラクトおよび／または項目６に規定されるウイルスベクターおよび／または項目７もしくは８に規定される核酸分子および／または項目９に規定される組成物の使用。
[項目２８]
がん、好ましくは肝臓がんを予防、遅延、回復、治癒および／または処置するための薬剤の製造のための、項目１から５のいずれか一項に規定されるウイルス発現コンストラクトおよび／または項目６に規定されるウイルスベクターおよび／または項目７もしくは８に規定される核酸分子および／または項目９に規定される組成物の使用。
【国際調査報告】
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