(57)【要約】  高度に抑制性のヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ／−Ｔｒｅｇの新しい集団を特定した。この集団はＦｏｘｐ３を発現し、かつＩＦＮγ、ＩＬ−１０、ＩＬ−３４およびＴＧＦβを産生してそれらの抑制活性を媒介することを特徴とする。従って、そのようなＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ／−Ｔｒｅｇ集団の拡大増殖および免疫抑制能力を高めることができる方法は治療目的のために非常に望ましい。本発明者らは、ラパマイシンがＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ／−Ｔｒｅｇ集団の拡大増殖および免疫抑制能力を高めることを証明した。従って、本発明は、ラパマイシン化合物の存在下でＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ／−Ｔｒｅｇ集団を培養することを含む、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ／−Ｔｒｅｇ集団の拡大増殖および免疫抑制能力を高める方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラパマイシン化合物の存在下でＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ／−Ｔｒｅｇ集団を培養することを含む、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ／−Ｔｒｅｇ集団の拡大増殖および免疫抑制能力を高める方法。
【請求項２】
前記ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ／−Ｔｒｅｇ細胞集団は、目的の抗原に特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または自己抗原を含むキメラ自己抗体受容体（ＣＡＡＲ）などのＴ細胞受容体またはそのサブユニットもしくは機能的等価物をコードするように遺伝子改変されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ／−Ｔｒｅｇ細胞集団は遺伝子改変されており、かつ機能的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）および／またはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）、例えば、ＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスＩＩの発現を欠いている、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ／−Ｔｒｅｇ細胞集団は治療される前記レシピエント患者の同種異系のＴｒｅｇである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ／−Ｔｒｅｇ細胞集団を抗原提示細胞の存在下で培養する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ラパマイシン化合物を前記拡大増殖の０および７日目または１４日後に培養培地に添加する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ラパマイシン化合物を前記拡大増殖の０および７日目に培養培地に添加し、メチルプレドニソロンなどの別の免疫抑制剤を培養培地に添加する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記培養培地は約４５ｎｇ／ｍｌの量のラパマイシンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
サイトカイン、好ましくはＩＬ−２および／またはＩＬ−１５を、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９および／または２０日目に１回、２回、３回またはそれ以上の回数で前記培養培地にさらに添加する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
抗ＣＤ３抗体および／または抗ＣＤ８抗体を培養の０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９および／または２０日目、好ましくは０日目および／または１１、１２、１３、１４および／または１５日目に前記培養培地に添加する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記培養を、例えば１２日間から最大６〜８週間の間などの少なくとも１２日間、好ましくは１４日間行う、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
それを必要とする患者における移植片拒絶反応またはＧＶＨＤを予防または減少させる方法であって、ラパマイシン化合物と組み合わせた治療的有効量のＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ／−Ｔｒｅｇ集団を前記患者に投与することを含む方法。
【請求項１３】
それを必要とする患者における遺伝性疾患を治療する方法であって、前記患者にラパマイシン化合物と組み合わせた治療的有効量のＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ／−Ｔｒｅｇ集団を投与することを含み、前記遺伝性疾患は、ＩＰＥＸ（免疫調節異常・多腺性内分泌障害・腸疾患・Ｘ連鎖症候群）およびＡＰＥＣＥＤ（自己免疫性多腺性内分泌不全症・カンジダ症・外胚葉ジストロフィー）、Ｂ細胞原発性免疫不全症、マックル・ウェルズ症候群、混合型自己炎症性／自己免疫症候群、ＮＬＲＰ１２関連遺伝性周期性発熱症候群、腫瘍壊死因子受容体１関連周期性症候群）などの自己免疫に関連する免疫系を冒す一遺伝子性遺伝性疾患、ならびにデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、嚢胞性線維症、リソソーム病およびα１−アンチトリプシン欠乏症などの一遺伝子性遺伝性疾患からなる群から選択される方法。
【請求項１４】
シクロスポリンとメチルプレドニソロンとの組み合わせの存在下で前記ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ／−Ｔｒｅｇ集団を培養することを含む、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ／−Ｔｒｅｇ集団の免疫抑制能力を高める方法。
【請求項１５】
シクロスポリンとメチルプレドニソロンとの組み合わせと組み合わせたＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ／−Ｔｒｅｇ集団の治療的に有効な組み合わせを投与することを含む、移植片拒絶反応またはＧＶＨＤを予防または減少させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ／−Ｔｒｅｇ集団の拡大増殖および免疫抑制能力を高めるための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫抑制療法は、ここ数十年の間に長期間の移植片生着を著しく向上させてきたが、未だに同種移植片を慢性の移植片機能不全から予防することができず、移植を受けた患者の福祉の大きな障害のままとなっている。故にここ数年間は、同種移植片生着の向上は、主に慢性移植片拒絶、二次的影響および非特異的免疫抑制が原因で停滞している１。高い抑制能力およびドナー抗原に対する特異性により移植における免疫応答を積極的に制御する制御性細胞集団のヒトにおける同定により、Ｔｒｅｇ／エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）の調節解除を伴う多くの疾患における革命的な治療戦略が生まれた。最近登場した制御性細胞による細胞治療の確立により、自己免疫ならびに骨髄および実質臓器移植における有望な将来の治療法が得られる２−４。いくつかの研究から、抗ＣＤ３−抗ＣＤ２８によりポリクローナル刺激されたＴｒｅｇと比べて、生存、抑制機能の刺激およびそのような抗原を経験したＴｒｅｇの優位性のためにＴＣＲによる抗原認識の重要性が実証されている５−８。ＧＶＨＤおよび実質臓器移植における第Ｉ相研究は、見かけ上の毒性を有しない異なる種類の制御性細胞（異なるＣＤ４＋Ｔｒｅｇ、マクロファージおよびＤＣ）を用いて開始したが、これまでに、動物モデルにおける豊富な文献にも関わらずＣＤ８＋Ｔｒｅｇを用いた臨床試験は存在していない９−１１。ヒトにおけるＣＤ８＋Ｔｒｅｇの翻訳のための１つの限界は、免疫応答を効率的に制限するためのＣＤ４＋Ｔｒｅｇの機能における重要遺伝子であるＦｏｘｐ３１２，１３がＣＤ８＋Ｔｒｅｇおよびその発現について他の表面マーカーまたはサイトカインに従って明確に定義されておらず、かつヒトにおけるＣＤ８＋Ｔｒｅｇの機能が明らかに実証されていないという点であるかもしれない１０，１４−１６。最近では、高度に抑制性のヒトのＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの新しい集団が同定された（国際公開第２０１７／０４２１７０号）。この集団はＦｏｘｐ３を発現し、かつＩＦＮγ、ＩＬ−１０、ＩＬ−３４およびＴＧＦβを産生してそれらの抑制活性を媒介するものとして特徴づけられている。従って、そのようなＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ／−Ｔｒｅｇ集団の拡大増殖および免疫抑制能力を高めることができる方法は治療目的のために非常に望ましい。
【発明の概要】
【０００３】
本発明は、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ／−Ｔｒｅｇ集団の拡大増殖および免疫抑制能力を高めるための方法に関する。特に本発明は特許請求の範囲によって定められている。
【発明を実施するための形態】
【０００４】
本発明者らは、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ／−Ｔｒｅｇがラパマイシンの存在下でより効率的に拡大増殖できることを証明した。さらにラパマイシンは当該集団の免疫抑制能力を高める。
【０００５】
従って、本発明の第１の目的は、ラパマイシン化合物の存在下でＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ／−Ｔｒｅｇ集団を培養することを含む、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ／−Ｔｒｅｇ集団の拡大増殖および免疫抑制能力を高める方法に関する。
【０００６】
本明細書で使用される「制御性Ｔ細胞」または「Ｔｒｅｇ」という用語は、免疫系を調節し、自己抗原への寛容性を維持し、かつ自己免疫疾患を抑止するＴ細胞の亜集団を指す。これらの細胞は一般にエフェクターＴ細胞の誘導および増殖を抑制または下方制御する。
【０００７】
本明細書で使用される「集団」という用語は、細胞の総数の過半数（例えば、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７０％、さらにより好ましくは少なくとも約８０％）が目的の細胞の指定された特性を有し、かつ目的のマーカーを有する（例えば、ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ／−Ｔｒｅｇ細胞集団は高度な抑制機能を有し、かつ目的の特定のマーカーを発現する細胞の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７０％、さらにより好ましくは少なくとも約８０％を含む）細胞集団を指す。
【０００８】
本明細書で使用される当該技術分野で周知の「ＣＤ８」（分化抗原群８）という用語は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の共受容体として機能する膜貫通糖タンパク質を指す。機能するために、ＣＤ８は一対のＣＤ８鎖からなる二量体を形成する。Ｔ細胞におけるＣＤ８の最も一般的な形態はＣＤ８−αおよびＣＤ８−β鎖からなり、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ／−Ｔｒｅｇ細胞は両方の鎖を発現する。天然に生じるヒトＣＤ８−αタンパク質は、受入番号Ｐ０１７３２でＵｎｉＰｒｏｔデータベースにおいて提供されているアミノ酸配列を有する。天然に生じるヒトＣＤ８−βタンパク質は、受入番号Ｐ１０９６６でＵｎｉＰｒｏｔデータベースにおいて提供されているアミノ酸配列を有する。
【０００９】
本明細書で使用される「ＣＤ４５」（ＬＣＡまたはＰＴＰＲＣとしても知られている）という用語は、「Ｓｔｒｅｕｌｉら，１９９６」において以前に記載された異なるアイソフォームで存在する膜貫通糖タンパク質を指す。ＣＤ４５のこれらの異なるアイソフォームは、ＣＤ４５細胞外領域の一部をコードする３つの可変エクソンの選択的スプライシングにより生じるそれらの細胞外ドメイン構造において異なる。ＣＤ４５の各種アイソフォームは異なる細胞外ドメインを有するが、およそ３００個のアミノ酸残基の２つの相同な高度に保存されたホスファターゼドメインを有する同じ膜貫通および細胞質セグメントを有する。天然に生じるヒトＣＤ４５タンパク質は受入番号Ｐ０８５７５でＵｎｉＰｒｏｔデータベースにおいて提供されているアミノ酸配列を有する。本明細書で使用される「ＣＤ４５ＲＣ」という用語はチロシンホスファターゼＣＤ４５のエクソン６スプライスバリアント（エクソンＣ）を指す。ＣＤ４５ＲＣアイソフォームはＢ細胞上ならびにＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞のサブセット上で発現される。本明細書で使用される「ｌｏｗ／−」という用語は、表面マーカーの発現レベルを定量化するための細胞数測定における当業者の一般的な用語であり、表面マーカーが中レベルで発現されていること、または存在しないことを示す。
【００１０】
いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ／−Ｔｒｅｇ細胞集団は、以下でさらに説明されているように、所望の発現産物をコードするように遺伝子改変されている。
【００１１】
「遺伝子改変されている」という用語は、細胞がＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ／−Ｔｒｅｇ細胞の非組み換え集団に天然に存在しない核酸分子、または前記ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ／−Ｔｒｅｇ細胞集団に非天然状態で存在する核酸分子（例えば増幅されている）を含むことを示す。当該核酸分子は前記細胞またはその祖先の中に導入されていてもよい。
【００１２】
ウイルス媒介遺伝子送達、非ウイルス媒介遺伝子送達、裸のＤＮＡ、物理的処理などの多くの手法を使用して、細胞集団を遺伝子改変することができる。この目的のために、核酸は通常、組み換えウイルス、プラスミド、ファージ、エピソーム、人工染色体などのベクターに組み込まれる。遺伝子を運ぶ核酸を細胞に導入することができる手段の例としては、限定されるものではないが、マイクロインジェクション、電気穿孔法、形質導入、またはＤＥＡＥ−デキストラン、リポフェクション、リン酸カルシウムを用いる形質移入あるいは当業者に公知の他の手順が挙げられる。
【００１３】
いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ／−Ｔｒｅｇ細胞集団は、ウイルスベクター（もしくは組み換えウイルス）またはウイルス様粒子（ＶＬＰ）などのベクター粒子を用いて遺伝子改変されている。本実施形態では、異種核酸を例えば組み換えウイルスの中に導入し、次いでこれを使用してＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ／−Ｔｒｅｇ細胞集団を感染させる。異なる種類の組み換えウイルス、特に組み換えレトロウイルスを使用することができる。レトロウイルス感染により細胞のゲノムの中への安定な組み込みが生じるので、レトロウイルスは好ましいベクターである。これは、リンパ球の拡大増殖が対象への注射後にインビトロまたはインビボのいずれかにおいて各細胞分裂での情報伝達のために導入遺伝子が分離中に安定に維持されることを必要とするため、重要な性質である。使用することができるレトロウイルスの種類の例は、腫瘍ウイルス、レンチウイルスまたはスプーマウイルスファミリーのレトロウイルスである。腫瘍ウイルスファミリーの特定の例は、ＭｏＭＬＶ、ＡＬＶ、ＢＬＶまたはＭＭＴＶなどの遅発性腫瘍ウイルス、すなわち非癌遺伝子担体、およびＲＳＶなどの早発性腫瘍ウイルスである。レンチウイルスファミリーの例は、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＦＩＶまたはＣＡＥＶである。欠損性組み換えレトロウイルスを構築するための技術は、文献（国際公開第８９／０７１５０号、国際公開第９０／０２８０６号および国際公開第９４／１９４７８号）に広く記載されている。これらの技術は通常、導入遺伝子を含むレトロウイルスベクターの適当なパッケージング細胞株への導入、およびその後の産生されたウイルスの回収を含み、前記ウイルスはそれらのゲノムに当該導入遺伝子を含む。ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ／−Ｔｒｅｇ細胞集団は、ウイルス上澄みまたは精製したウイルスとのインキュベーションによって、あるいは当該ウイルスのパッケージング細胞と共に前記Ｔｒｅｇ細胞を共培養することによって、あるいはＴｒａｎｓｗｅｌｌ技術などによって、各種プロトコルを用いて組み換えウイルスで感染させることができる。本明細書で使用される「ウイルス様粒子」（ＶＬＰ）という用語は、ウイルス粒子に似た構造を指す。本発明に係るウイルス様粒子は、ウイルスゲノムの全てまたは一部を欠いており、典型的に、かつ好ましくはウイルスゲノムの複製および感染成分の全てまたは一部を欠いているため非複製的である。本明細書で使用される「非複製的」という用語は、ＶＬＰの中に含まれているか含まれていないゲノムを複製することができないことを指す。ＶＬＰは当該技術分野で知られている技術に従って、例えば国際公開第０２／３４８９３号として公表されている国際特許出願に記載されているように調製することができる。
【００１４】
ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ／−Ｔｒｅｇ細胞集団を遺伝子改変するために使用される核酸は、ポリペプチド（例えば、タンパク質、ペプチドなど）やＲＮＡなどの各種生物学的に活性な産物をコードしてもよい。特定の実施形態では、当該核酸は免疫抑制活性を有するポリペプチドをコードする。別の実施形態では、当該核酸は細胞に有害であるか条件付きで有害であるポリペプチドをコードする。好ましい例としては、ＨＳＶ−１ＴＫなどのチミジンキナーゼやシトシンデアミナーゼなど（ヌクレオシド類似体の存在下で毒性を付与する）が挙げられる。
【００１５】
別の好ましいカテゴリの核酸は、目的の抗原に特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または自己抗原を含むキメラ自己抗体受容体（ＣＡＡＲ）などのＴ細胞受容体またはそのサブユニットもしくは機能的等価物をコードするものである。例えば、抗原に特異的な組み換えＴＣＲまたはＣＡＲの発現により、それを必要とする患者における免疫応答を阻害するためのエフェクターＴ細胞に対してより特異的かつ効率的に作用することができるヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ／−Ｔｒｅｇ細胞が生成される。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）設計の基本原理は広範囲に記載されている（例えば「Ｓａｄｅｌａｉｎら，２０１３」）。ＣＡＲは、一般にスペーサ／ヒンジおよび膜貫通ドメインを介して細胞内シグナル伝達ドメインに連結された細胞外抗原認識部分を含む。「第１世代」ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインはＴ細胞活性化部分のみを含む。「第２世代」ＣＡＲの細胞内ドメインは、活性化部分、例えばＣＤ３ζと直列の共刺激部分を含む。共刺激ドメインの例としては、限定されるものではないが、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２７およびＤＡＰ１０が挙げられる。「第３世代」ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＣＤ２８、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦｒ）（ＯＸ４０もしくは４−１ＢＢなど）とＣＤ３ζとの組み合わせなどの、活性化部分と直列の２つの共刺激ドメインを含む。ＣＡＲは一般に、細胞外抗原結合ドメインを、生存および増殖シグナルをサポートするための共刺激内部ドメインと直列のＴ細胞受容体のＣＤ３−ζ鎖に由来する細胞内シグナル伝達ドメインと融合させることによって得られる。ＣＡＲで修飾されたＴ細胞は患者のＭＨＣとは独立して機能し、かつ臨床用途のために容易に産生させることができるので、ＣＡＲをベースとする手法を用いて以下に記載するように病原性抗原を標的にすることは有用である。ＣＡＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメインに融合された自己免疫疾患に関与する自己抗原などの細胞外自己抗原を含む。ＣＡＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインの例としては、限定されるものではないが、ＣＤ１３７ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインなどのＴもしくはＮＫ受容体シグナル伝達ドメインが挙げられる。
【００１６】
いくつかの実施形態では、本発明のＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ／−Ｔｒｅｇ細胞は遺伝子改変されており、細胞内シグナル伝達分子に連結された少なくとも１種のＣＡＲ、１種のＣＡＡＲおよび／または１種の天然受容体を発現する。ＣＡＲの例としては、限定されるものではないが、第１世代ＣＡＲ、第２世代ＣＡＲ、第３世代ＣＡＲ、４つ以上のシグナル伝達ドメイン（共刺激ドメインおよび活性化ドメイン）を含むＣＡＲ、および阻害性ＣＡＲ（ｉＣＡＲ）が挙げられる。
【００１７】
本発明によれば、目的の抗原を認識するＣＡＲの細胞外ドメインは、抗体またはその抗原結合断片などの前記抗原に結合する受容体または受容体の断片を含んでいてもよい。本発明によれば、ＣＡＲの細胞外ドメインは、ヒト抗体またはあらゆる他の生物種に由来する抗体を含んでいてもよい。本明細書で使用される「抗体断片」という用語は、抗原のエピトープと特異的に相互作用する能力を保持する抗体の少なくとも１つの部分を指す。抗体断片の例としては、限定されるものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ抗体断片、ジスルフィドによって連結されたＦｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＨおよびＣＨＩドメインからなるＦｄ断片、直鎖状抗体（ｌｉｎｅａｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、ｓｄＡｂ（ＶＬもしくはＶＨのいずれか）などの単一ドメイン抗体、ラクダ科ＶＨＨドメイン、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片からなる二価の断片などの抗体断片から形成された多特異的抗体、および抗体の単離されたＣＤＲまたは他のエピトープ結合断片が挙げられる。
【００１８】
いくつかの実施形態では、本発明のＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ／−Ｔｒｅｇ細胞は遺伝子改変されており、機能的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）および／またはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）、例えば、ＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスＩＩの発現を欠いている。いくつかの実施形態では、機能的ＴＣＲおよび／またはＨＬＡを欠いている本発明の遺伝子改変されたＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ／−Ｔｒｅｇ細胞は同種異系のＴｒｅｇである。
【００１９】
本明細書で使用される「ラパマイシン化合物」という用語は、米国特許出願公開第２００３／０００８９２３号（これは参照により本明細書に組み込まれる）に定められているラパマイシンコア構造を有する化合物を含み、これは化学的または生物学的に修飾されていてもよいがｍＴＯＲ阻害特性をまだ保持している。いくつかの実施形態では、ラパマイシン化合物はラパマイシンである。その誘導体としては、ラパマイシンのエステル、エーテル、オキシム、ヒドラゾンおよびヒドロキシルアミン、ならびにラパマイシンコア構造上の官能基が例えば還元または酸化によって修飾されている化合物が挙げられる。そのような化合物の薬学的に許容される塩もラパマイシン誘導体であるとみなされる。ラパマイシンのエステルおよびエーテルの具体例は、ラパマイシン核の４２および／または３１位にあるヒドロキシル基のエステルおよびエーテル、ならびに（２７位のケトンの化学的還元後に）２７位にあるヒドロキシル基のエステルおよびエーテルである。オキシム、ヒドラゾンおよびヒドロキシルアミンの具体例は（４２位のヒドロキシル基の酸化後に）４２位にあるケトンおよびラパマイシン核の２７位のケトンのオキシム、ヒドラゾンおよびヒドロキシルアミンである。ラパマイシンの４２位および／または３１位のエステルおよびエーテルの例は、以下の特許：アルキルエステル（米国特許第４，３１６，８８５号）、アミノアルキルエステル（米国特許第４，６５０，８０３号）、フッ素化エステル（米国特許第５，１００，８８３号）、アミドエステル（米国特許第５，１１８，６７７号）、カルバミン酸エステル（米国特許第５，１１８，６７８号）、シリルエーテル（米国特許第５，１２０，８４２号）、アミノエステル（米国特許第５，１３０，３０７号）、アセタール（米国特許第５５１，４１３号）、アミノジエステル（米国特許第５，１６２，３３３号）、スルホン酸および硫酸エステル（米国特許第５，１７７，２０３号）、エステル（米国特許第５，２２１，６７０号）、アルコキシエステル（米国特許第５，２３３，０３６号）、Ｏ−アリール、Ｏ−アルキル、Ｏ−アルケニルおよびＯ−アルキニルエーテル（米国特許第５，２５８，３８９号）、炭酸エステル（米国特許第５，２６０，３００号）、アリールカルボニルおよびアルコキシカルボニルカルバメート（米国特許第５，２６２，４２３号）、カルバメート（米国特許第５，３０２，５８４号）、ヒドロキシエステル（米国特許第５，３６２，７１８号）、ヒンダードエステル（米国特許第５，３８５，９０８号）、複素環式エステル（米国特許第５，３８５，９０９号）、ジェム二置換エステル（米国特許第５，３８５，９１０号）、アミノアルカン酸エステル（米国特許第５，３８９，６３９号）、ホスホリルカルバミン酸エステル（米国特許第５，３９１，７３０号）、カルバミン酸エステル（米国特許第５，４１１，９６７号）、カルバミン酸エステル（米国特許第５，４３４，２６０号）、アミジノカルバミン酸エステル（米国特許第５，４６３，０４８号）、カルバミン酸エステル（米国特許第５，４８０，９８８号）、カルバミン酸エステル（米国特許第５，４８０，９８９号）、カルバミン酸エステル（米国特許第５，４８９，６８０号）、ヒンダードＮ−オキシドエステル（米国特許第５，４９１，２３１号）、ビオチンエステル（米国特許第５，５０４，０９１号）、Ｏ−アルキルエーテル（米国特許第５，６６５，７７２号）、およびラパマイシンのＰＥＧエステル（米国特許第５，７８０，４６２号）に開示されており、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。ラパマイシンの２７−エステルおよびエーテルの例は米国特許第５，２５６，７９０号に開示されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ラパマイシンのオキシム、ヒドラゾンおよびヒドロキシルアミンの例は米国特許第５，３７３，０１４号、第５，３７８，８３６号、第５，０２３，２６４号および第５，５６３，１４５号に開示されており、それらは参照により本明細書に組み込まれる。これらのオキシム、ヒドラゾンおよびヒドロキシルアミンの調製は上に列挙されている特許に開示されている。４２−オキソラパマイシンの調製は米国特許第５，０２３，２６３号に開示されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。「ラパマイシン類似体またはその誘導体」の範囲内の他の化合物としては、例えば国際公開第９８／０２４４１号および本明細書において引用されている参考文献において「ラパログ（ｒａｐａｌｏｇ）」と称されている化合物および化合物クラス、ならびに例えば国際公開第０１／１４３８７号および本明細書において引用されている参考文献において「エピラパログ（ｅｐｉｒａｐａｌｏｇ）」と称されている化合物および化合物クラスが挙げられる。「ラパマイシン誘導体」の範囲内の別の化合物は、ストレプトミセス・ヒグロスコピクス（Ｎｏｖａｒｔｉｓ社）によって製造されているマクロライド抗生物質に由来するエベロリムスすなわち４−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−ラパマイシンである。エベロリムスはサーティカン（Ｃｅｒｔｉｃａｎ）、ＲＡＤ−００１およびＳＤＺ−ＲＡＤとしても知られている。
【００２０】
いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ／−Ｔｒｅｇ細胞集団を抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下で培養する。本明細書で使用される「抗原提示細胞」または「ＡＰＣ」という用語は、好ましくはクラスＩＭＨＣ分子と会合した１つ以上の抗原の提示を誘導することができるインタクトな細胞全体および他の分子（同種異系由来の全て）と、同種異系の免疫応答を誘導することができる全ての種類の単核細胞との両方を含む。好ましくは生存細胞全体をＡＰＣとして使用する。好適なＡＰＣの例は以下に詳細に考察されており、限定されるものではないが、単球、マクロファージ、樹状細胞、単球由来樹状細胞、マクロファージ由来樹状細胞、Ｂ細胞および骨髄性白血病細胞、例えばＴＨＰ−１、Ｕ９３７、ＨＬ−６０またはＣＥＭ−ＣＭ３細胞株などの細胞全体が挙げられる。
【００２１】
典型的には、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ／−Ｔｒｅｇ細胞集団は適当な培養培地で培養する。本明細書で使用される「培地」という用語は、細胞生存度を維持し、かつ増殖を支持する栄養分を含む細胞集団を維持するための培地または細胞集団を培養するための培地（例えば「培養培地」）を指す。当該培地は、塩、緩衝液、アミノ酸、グルコースまたは他の糖（類）、抗生物質、血清もしくは血清代替物、および増殖因子やサイトカインなどの他の成分のいずれかを適当な組み合わせで含有していてもよい。特定の細胞型のために通常使用される培地は当業者に公知である。本発明の培地は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のＲＰＭＩ  １６４０などの市販されている培地をベースにしていてもよい。
【００２２】
いくつかの実施形態では、ラパマイシン化合物を拡大増殖の０および７日目または１４日後に培養培地に添加する。いくつかの実施形態では、ラパマイシン化合物を拡大増殖の０および７日目に培養培地に添加し、かつメチルプレドニソロンなどの別の免疫抑制剤を培養培地に添加する。
【００２３】
いくつかの実施形態では、当該培養培地は約４５ｎｇ／ｍｌの量のラパマイシンを含む。本明細書で使用される「約」という用語は、パラメータ、量および持続時間などの測定可能な値を指す場合、そのような変動が開示されている発明において実施するのに適当である限り、指定された値からの±２０％以下、好ましくは±１５％以下、より好ましくは±１０％以下、さらにより好ましくは±５％以下の変動を包含することが意図されている。当然のことながら、修飾語句「約」が指している値それ自体も具体的かつ好ましくは開示されている。いくつかの実施形態では、当該培養培地は、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４または５５ｎｇ／ｍｌの量のラパマイシンを含む。
【００２４】
いくつかの実施形態では、サイトカイン、好ましくはＩＬ−２および／またはＩＬ−１５を培養の０日目に当該培養培地に添加する。いくつかの実施形態では、サイトカイン、好ましくはＩＬ−２および／またはＩＬ−１５を例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９および／または２０日目に１回、２回、３回またはそれ以上の回数で当該培養培地にさらに添加する。いくつかの実施形態では、サイトカイン、好ましくはＩＬ−２および／またはＩＬ−１５を培養の０日目および５、６、７または８日目に当該培養培地に添加する。いくつかの実施形態では、サイトカイン、好ましくはＩＬ−２および／またはＩＬ−１５を０日目および培養の終了まで２、３または４日ごとに当該培養培地に添加する。
【００２５】
本発明の方法のいくつかの実施形態では、抗ＣＤ３抗体および／または抗ＣＤ２８抗体を培養の０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９および／または２０日目、好ましくは０日目および／または１１、１２、１３、１４および／または１５日目に当該培養培地に添加する。いくつかの実施形態では、０．１〜１０μｇ／ｍｌ、好ましくは０．２５〜４μｇ／ｍｌ、より好ましくは１μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体および／または０．１〜１０μｇ／ｍｌ、好ましくは０．２５〜４μｇ／ｍｌ、より好ましくは１μｇ／ｍＬの抗ＣＤ２８抗体を当該培養培地に添加する。
【００２６】
典型的には、培養は例えば１２日間から最大６〜８週間の間などの少なくとも１２日間、好ましくは１４日間行う。
【００２７】
本発明の方法は、移植片拒絶反応またはＧＶＨＤを予防または減少させるための養子Ｔ細胞移入に特に有用である。
【００２８】
本明細書で使用される「移植片拒絶反応を予防または減少させる」という用語は、免疫移植片拒絶反応の予防または阻害、ならびに免疫移植片拒絶反応の発生または進行を遅らせることを包含することが意図されている。この用語は、患者における移植片の生着を引き延ばすこと、または患者における移植片の不全を回復させることも包含することが意図されている。さらにこの用語は、例えば間質性線維症、慢性移植片動脈硬化症または脈管炎などの免疫拒絶に付随する免疫学的合併症を例えば寛解させるなどの、免疫移植片拒絶反応の症状を寛解させることを包含することが意図されている。本明細書で使用される「移植片拒絶反応」という用語は、急性および慢性移植片拒絶反応の両方を包含する。「急性拒絶反応」は、移植された組織が免疫学的に異質である場合の組織移植レシピエントの免疫系による拒絶反応である。急性拒絶反応は、それらのエフェクター機能を行い、かつ移植片組織を破壊するレシピエントの免疫細胞による移植片組織の浸潤を特徴とする。急性拒絶反応の発生は急であり、かつ一般に移植手術後数週間以内にヒトにおいて生じる。一般に、急性拒絶反応はラパマイシンおよびシクロスポリンなどの免疫抑制剤で阻害または抑制することができる。「慢性拒絶反応」は一般に、急性拒絶反応の免疫抑制が上手く行っている場合であっても生着後数ヶ月から数年以内にヒトにおいて生じる。線維症は全ての種類の臓器移植の慢性拒絶反応における共通因子である。「移植」という用語およびその変形は、移植が同系であるか（ドナーおよびレシピエントが遺伝的に同一である）、同種異系であるか（ドナーおよびレシピエントが異なる遺伝的起源を有するが同じ生物種である）、または異種である（ドナーおよびレシピエントが異なる生物種からのものである）かに関わらず、レシピエントへの移植片（グラフトともいう）の挿入を指す。従って典型的なシナリオでは、宿主はヒトであり、かつ移植片は、同じもしくは異なる遺伝的起源のヒト由来の同系移植片である。別のシナリオでは、移植片は、系統学的に遠く離れている生物種の動物などのそれが移植される生物種とは異なる生物種に由来し、例えば、ヒヒ心臓がヒト宿主に移植される。いくつかの実施形態では、移植片のドナーはヒトである。移植片のドナーは生きているドナーまたは死亡したドナー、すなわち死体ドナーであってもよい。いくつかの実施形態では、移植片は臓器、組織または細胞である。本明細書で使用される「臓器」という用語は、生物の体内で特定の機能または機能群を行う血管付き実質臓器を指す。臓器という用語は、限定されるものではないが、心臓、肺、腎臓、肝臓、膵臓、皮膚、子宮、骨、軟骨、小腸もしくは大腸、膀胱、脳、乳房、血管、食道、卵管、胆嚢、卵巣、膵臓、前立腺、胎盤、脊髄、上肢および下肢を含む肢、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、気管、尿管、尿道、子宮を含む。本明細書で使用される「組織」という用語は、ヒトまたは動物における任意の種類の組織を指し、限定されるものではないが、血管組織、皮膚組織、肝組織、膵臓組織、神経組織、泌尿生殖器組織、胃腸組織、骨および軟骨を含む骨格組織、脂肪組織、腱および靱帯を含む結合組織、羊膜組織、絨毛膜組織、硬膜、心膜、筋肉組織、腺組織、顔組織、眼組織を含む。本発明の特定の実施形態では、移植片は心臓同種移植片である。本明細書で使用される「細胞」という用語は、目的の細胞を多くに含む組成物、好ましくは前記細胞の少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６５％を含む組成物を指す。いくつかの実施形態では、細胞は、骨髄、末梢血または臍帯血に由来する多分化能性造血幹細胞、あるいは心筋細胞、β膵臓細胞、肝細胞、神経細胞などの異なる細胞株の多能性（すなわち、胚性幹細胞（ＥＳ）または人工多能性幹細胞（ｉＰＳ））または多分化能性幹細胞由来分化細胞からなる群から選択される。
【００２９】
いくつかの実施形態では、細胞組成物は、同種異系の造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）のために使用され、従って、通常は骨髄、末梢血または臍帯血に由来する多分化能性造血幹細胞を含む。ＨＳＣＴは白血病およびリンパ腫を有する患者には治療的であり得る。但し、同種異系のＨＣＴの重要な限界は、この治療法を受けたヒトの約３０〜５０％において深刻な形態で生じる移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の発生である。従って本発明の方法によって調製されるＴｒｅｇ細胞集団は、特に移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）を予防または減少させるのに適している。従っていくつかの実施形態では、それを必要とする患者は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）／骨髄増殖性症候群、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫などのリンパ腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）および多発性骨髄腫からなる群から選択される疾患に罹患している。
【００３０】
いくつかの実施形態では、本発明の細胞組成物は、免疫系の活性化が関与し、かつ免疫応答の阻害が有益である遺伝性疾患の治療に特に適している。前記疾患の例としては、限定されるものではないが、ＩＰＥＸ（免疫調節異常・多腺性内分泌障害・腸疾患・Ｘ連鎖症候群）およびＡＰＥＣＥＤ（自己免疫性多腺性内分泌不全症・カンジダ症・外胚葉ジストロフィー）、Ｂ細胞原発性免疫不全症、マックル・ウェルズ症候群、混合型自己炎症性／自己免疫症候群、ＮＬＲＰ１２関連遺伝性周期性発熱症候群、腫瘍壊死因子受容体１関連周期性症候群）などの自己免疫に関連する免疫系を冒す一遺伝子性遺伝性疾患、ならびにデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、嚢胞性線維症、リソソーム病およびα１−アンチトリプシン欠乏症などの一遺伝子性遺伝性疾患が挙げられる。
【００３１】
本発明のさらなる目的は、ラパマイシン化合物と組み合わせたＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ／−Ｔｒｅｇ集団の治療的に有効な組み合わせを投与することを含む、移植片拒絶反応またはＧＶＨＤを予防または減少させる方法に関する。
【００３２】
本発明のさらなる目的は、それを必要とする患者における遺伝性疾患（上に記載されている）を治療する方法であって、ラパマイシン化合物と組み合わせたＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ／−Ｔｒｅｇ集団の治療的に有効な組み合わせを投与することを含む方法に関する。
【００３３】
本明細書で使用される「治療的に有効な組み合わせ」という用語は、移植片拒絶反応またはＧＶＨＤを予防または減少させるのに十分なラパマイシン化合物の量と一緒にしたＴｒｅｇ集団の量を指す。「治療的有効量」は、「向上した治療結果」が生じるような当業者によって日常的に用いられる手順を用いて決定される。但し当然のことながら、本発明の化合物および組成物の総１日使用量は正しい医学的判断の範囲内で担当医によって決定される。任意の特定の対象のための具体的な治療的有効用量レベルは、治療されている疾患および当該疾患の重症度、用いられる具体的な化合物の活性、用いられる具体的な組成物、対象の年齢、体重、健康状態、性別および食事、用いられる具体的なタンパク質の投与時間、投与経路および排泄率、治療の持続期間、用いられる具体的なポリペプチドと組み合わせて使用されるか同時に使用される薬物、および医療分野で周知の同様の因子などの様々な因子によって決まる。例えば、所望の治療効果を達成するのに必要なレベルよりも少ないレベルで本化合物の投与を開始して所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増加させることは十分に当業者の範囲内である。但し、当該製品の１日投与量は成人１日当たり０．０１〜１，０００ｍｇの広範囲にわたって変動させてもよい。典型的には本組成物は、治療される対象への投与量の対症調整のために０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０および５００ｍｇの有効成分を含む。薬は典型的に約０．０１ｍｇ〜約５００ｍｇの有効成分、好ましくは１ｍｇ〜約１００ｍｇの有効成分を含有する。有効量の薬物は、１日０．０００２ｍｇ／ｋｇ体重〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重、特に１日約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重〜７ｍｇ／ｋｇ体重の投与量レベルで通常供給される。
【００３４】
本発明によれば、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ／−Ｔｒｅｇ集団およびラパマイシン化合物は医薬組成物の形態で対象に投与する。典型的には、Ｔｒｅｇ集団およびラパマイシン化合物を薬学的に許容される賦形剤、および任意に生分解性ポリマーなどの持続放出性マトリックスと組み合わせて治療用組成物を形成してもよい。「薬学的に」または「薬学的に許容される」とは、適当であれば哺乳類、特にヒトに投与した場合に副作用、アレルギー反応または他の有害反応を生じない分子実体および組成物を指す。薬学的に許容される担体または賦形剤は、あらゆる種類の非毒性固体、半固体もしくは液体充填剤、希釈液、封入材料または製剤補助剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ａｕｘｉｌｉａｒｙ）を指す。経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、経皮、局所もしくは直腸内投与のための本発明の医薬組成物において、単独または別の有効成分と組み合わせた有効成分は、従来の医薬支持体（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｓｕｐｐｏｒｔ）との混合物として単位投与形態で動物および人間に投与することができる。好適な単位投与形態は、錠剤、ゲルカプセル、粉末、顆粒および経口懸濁液もしくは溶液、舌下および口腔内投与形態などの経口経路形態、エアロゾル、埋込物、皮下、経皮、局所、腹膜内、筋肉内、静脈内、真皮下、経皮、クモ膜下腔内、鼻腔内および直腸内投与形態を含む。典型的には、本医薬組成物は、注射することができる製剤のために薬学的に許容される媒体を含有する。これらは特に等張性の無菌生理食塩水（リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムまたは塩化マグネシウムなど、またはそのような塩の混合物）、あるいは場合によっては滅菌水または生理食塩水を添加すると注射溶液の構成を可能にする乾燥した、特に凍結乾燥した組成物であってもよい。注射可能な用途に適した医薬品形態としては、無菌水溶液もしくは分散液、胡麻油、落花生油または水性プロピレングリコールを含む製剤、および無菌注射溶液もしくは分散液の即時調製のための無菌粉末が挙げられる。全ての場合に、当該形態は無菌でなければならず、かつ容易な注射可能性が存在する程度に流体でなければならない。それは製造および貯蔵条件下で安定でなければならず、かつ細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対抗するように保存されていなければならない。遊離塩基または薬理学的に許容される塩として本発明の化合物を含む溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と好適に混合された水の中で調製することができる。分散液はグリセリン、液体ポリエチレングリコールおよびそれらの混合物および油の中で調製することもできる。通常の貯蔵および使用条件下では、これらの調製物は微生物の増殖を防止するための防腐剤を含有している。Ｔｒｅｇ集団およびラパマイシン化合物は、中性もしくは塩の形態の組成物に製剤化することができる。薬学的に許容される塩としては、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と共に形成されている）および、例えば塩酸またはリン酸などの無機酸、あるいは酢酸、シュウ酸、酒石酸およびマンデル酸などの有機酸と共に形成されているものが挙げられる。また遊離カルボキシル基と共に形成されてい��塩は、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基に由来していてもよい。また当該担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒体であってもよい。適切な流動性は、例えばレシチンなどのコーティングを使用することによって、分散液の場合には必要とされる粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の予防は、各種抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸およびチメロサールなどによって行うことができる。多くの場合に、等張剤、例えば糖または塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射可能な組成物の長期吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを本組成物中に使用することによって生じさせることができる。無菌注射溶液は、活性化合物を必要とされる量で上に列挙されている他の成分のいくつかと共に適当な溶媒の中に組み込み、必要に応じてその後に濾過滅菌して調製する。一般に分散液は、様々な滅菌された有効成分を塩基性分散媒体および上に列挙されているもののうち必要とされる他の成分を含有する無菌媒体の中に組み込んで調製する。無菌注射溶液の調製のための無菌粉末の場合、典型的な調製方法は、有効成分の粉末＋先に無菌濾過したその溶液からのあらゆるさらなる所望の成分が得られる真空乾燥および凍結乾燥技術である。直接注射のためのより多くまたは高度に濃縮された溶液の調製も企図されており、ここでは極めて迅速な浸透を生じさせて高濃度の活性薬剤を小さい腫瘍領域に送達するために溶媒としてのＤＭＳＯの使用が意図されている。製剤化したら、溶液はその剤形に適合可能な方法および治療的に有効な量で投与する。当該製剤は、上に記載した種類の注射溶液などの様々な剤形で容易に投与するが、薬物放出カプセルなども用いることができる。水溶液との形態での非経口投与のために、例えば当該溶液を必要であれば適切に緩衝すべきであり、液体希釈液を最初に十分な生理食塩水またはグルコースにより等張性にすべきである。これらの特定の水溶液は静脈内、筋肉内、皮下および腹膜内投与に特に適している。これに関連して、用いることができる無菌水性媒体は本開示を踏まえれば当業者には公知であろう。治療されている対象の状態に応じて投与量における若干の変動は必ず生じる。投与に対して責任を有する者は、いずれの場合も、個々の対象のために適当な用量を決定する。
【００３５】
本発明者らは、シクロスポリンとメチルプレドニソロンとの組み合わせがＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ／−Ｔｒｅｇ集団の免疫抑制能力を高めることも証明した。
【００３６】
従って、本発明のさらなる目的は、シクロスポリンとメチルプレドニソロンとの組み合わせの存在下でＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ／−Ｔｒｅｇ集団を培養することを含む、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ／−Ｔｒｅｇ集団の免疫抑制能力を高める方法に関する。ラパマイシンの存在下での前記集団の培養のために記載されている全ての実施形態は、シクロスポリンとメチルプレドニソロンとの組み合わせに対して必要な変更を加える。
【００３７】
本発明のさらなる目的は、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ／−Ｔｒｅｇ集団、シクロスポリンおよびメチルプレドニソロンの治療的に有効な組み合わせを投与することを含む、移植片拒絶反応またはＧＶＨＤを予防または減少させる方法にも関する。ラパマイシンと共に記載されている移植片拒絶反応またはＧＶＨＤを予防または減少させる方法のための全ての実施形態はシクロスポリンとメチルプレドニソロンとの組み合わせに対して必要な変更を加える。
【００３８】
本明細書で使用される「シクロスポリン」という用語は、当該技術分野におけるその一般的な意味を有し、かつシクロスポリンＡ、シクロスポリンＡの誘導体、シクロスポリンＡの塩などおよびそれらの混合物を指す。
【００３９】
本明細書で使用される「メチルプレドニソロン」という用語は、当該技術分野におけるその一般的な意味を有し、かつ（６α，１１β）−１１，１７，２１−トリヒドロキシ−６−メチル−プレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオンを指す。
【００４０】
本発明を以下の図および実施例によってさらに例示する。但し、これらの実施例および図は決して本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】細胞療法のためのＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ／−Ｔｒｅｇの拡大増殖。ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ／−ＴｒｅｇをＨＶの新鮮な血液から選別し、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８  ＭＡｂにより１４日間拡大増殖させ、次いでＩＬ−２およびＩＬ−１５および免疫抑制剤が添加されたか添加されていない培地において同種異系のＡＰＣの存在下で７日間培養し、かつ生存について評価した。１を超える値は細胞の増殖を意味する。ｎ＝７。
【図２】Ｔｒｅｇの拡大増殖収率、表現型および抑制活性に対する培養培地へのラパマイシンの添加の効果。図２Ａ：結果は、ラパマイシンが添加されたか添加されていない培地における培養後の０日目に播種された細胞数に対して正規化された７、１４および２０日目に回収された細胞数として表されている。図２Ｂ〜図２Ｄ：ラパマイシンの存在または非存在下で７日間（Ｂ）、１４日間（Ｃ）または２０日間（Ｄ）培養されたＴｒｅｇをＴｒｅｇ関連マーカーの発現について解析した。図２Ｅ（左）：結果は、ラパマイシンの非存在下での培養後のＴｒｅｇによって媒介された抑制率（％）に対して正規化されたラパマイシンの存在下での培養後のＴｒｅｇによって媒介された抑制率（％）として表されている。図２Ｅ（右）：ラパマイシンの非存在下で培養されたＴｒｅｇ（「ｗ  ＮＴで拡大増殖されたＴｒｅｇ」と命名）またはラパマイシンの存在下で培養されたＴｒｅｇ（「ｗ  ｒａｐａで拡大増殖されたＴｒｅｇ」と命名）の非存在下（「ｗ／ｏ  Ｔｒｅｇ」）または存在下で同種異系のＡＰＣに応答したレスポンダーＴ細胞の増殖の代表的なヒストグラム。
【図３】Ｔｒｅｇの拡大増殖収率および抑制活性に対する培養培地へのＣｓＡ、ＭＰＡ、ＭＰｒまたはタクロリムスの添加の効果。図３Ａ：結果は、１種のＩＳ薬物が添加されたか添加されていない培地における培養後の０日目に播種された細胞数に対して正規化された７日目に回収された細胞数として表されている。図３Ｂ〜図３Ｄ：Ｔｒｅｇを１種のＩＳ薬物の存在または非存在下で７日間培養し、次いで同じ薬物または異なる薬物と共に培養し、かつ拡大増殖収率（図３Ｂ）および同種異系のＡＰＣで刺激されたＣＤ４＋ＣＤ２５−エフェクターＴ細胞に対する抑制活性（図３Ｃ〜図３Ｄ）を解析した。図３Ｂ：結果は、０日目に播種された細胞数に対して正規化された１４日目に回収された細胞数として表されている。図３Ｃ：結果は、どんなＩＳ薬物も使用しない培養後のＴｒｅｇによって媒介された抑制率（％）に対して正規化されたＩＳ薬物と共に培養した後のＴｒｅｇによって媒介された抑制率（％）として表されている。図３Ｄ：結果は、各ＩＳ薬物の組み合わせについての拡大増殖スコアの平均の関数としての抑制スコアの平均として表されている。１：１は、どんなＩＳ薬物も使用せずに拡大増殖したＴｒｅｇにより得られた抑制および拡大増殖スコアを意味する。
【図４】Ｔｒｅｇの同種異系活性化および表現型に対するラパマイシン、ＣｓＡ、ＭＰＡ、ＭＰｒまたはタクロリムスの効果。図４Ａ：結果は、Ｉｓ薬物が添加されたか添加されていない培地における培養後の０日目に播種された細胞数に対して正規化された２１日目に回収された細胞数として表されている。図４Ｂ：Ｔｒｅｇを２１日目にＴｒｅｇ関連マーカーの発現について解析した（１４日間の薬物を使用しない拡大増殖および７日間のＩＳが添加された培地での培養）。
【００４２】
実施例１
材料および方法
新鮮もしくは解凍したＰＢＭＣからのＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ／−Ｔｒｅｇを、１０％ＡＢ血清、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（０．１ｍｇ／ｍｌ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、グルタミン（２ｍＭ）、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（１ｍＭ）、非必須アミノ酸（１×）、ＩＬ−２（１０００Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍｌ）が添加されたＲＰＭＩ  １６４０培地に３×１０５／ｍｌで播種し、コーティングした抗ＣＤ３  ｍＡｂ（１μｇ／ｍｌ）、可溶性抗ＣＤ２８  ｍＡｂ（１μｇ／ｍｌ）および／または１：４のＴｒｅｇ：ＡＰＣ比の同種異系のＡＰＣで刺激した。７日目に、拡大増殖した細胞を１．５×１０５／ｍｌで希釈し、コーティングした抗ＣＤ３および可溶性抗ＣＤ２８  ＭＡｂ（それぞれ１μｇ／ｍｌ）で再度刺激した。ＩＬ−２およびＩＬ−１５サイトカインを０、７、１０および１２日目に新たに添加した。シクロスポリンＡ（４５ｎｇ／ｍｌ）、ラパマイシン（４５ｎｇ／ｍｌ）、メチルプレドニソロン（５００ｐｇ／ｍｌ）、タクロリムス（２ｎｇ／ｍｌ）またはミコフェノール酸モフェチル（１μｇ／ｍｌ）などの免疫抑制剤を拡大増殖の０および７日目または１４日間の薬物を使用しない拡大増殖後に培養培地に添加して、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ／−Ｔｒｅｇに対するそれらの毒性および抑制への効果を評価した。１４日目に、拡大増殖したＴｒｅｇを使用前にＰＢＳで洗浄した。７日目に１０倍超まで拡大増殖したＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ／−Ｔｒｅｇに対して抑制活性を試験した。長期間の拡大増殖のために、１４および２１日目にＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ／−ＴｒｅｇおよびＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ１２７ｌｏｗ／−Ｔｒｅｇをコーティングした抗ＣＤ３（１μｇ／ｍｌ）および可溶性抗ＣＤ２８  ＭＡｂ（１μｇ／ｍｌ）で再度刺激し、ＩＬ−２およびＩＬ−１５サイトカインを７〜２８日目の間に２日ごとに新たに添加した。必要な場合には培養培地１×サイトカイン（ＩＬ−２（１０００Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍｌ））を添加した。
【００４３】
結果
本発明者らは、１４日間の拡大増殖後７日目のＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ／−Ｔｒｅｇの生存（図１）または１４日間の拡大増殖時のＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ／−Ｔｒｅｇの拡大増殖収率および抑制機能スコア（図３Ｄ）に対する免疫抑制剤（病院で使用される濃度）の効果を試験した。インビトロでの拡大増殖に対する免疫抑制剤の効果を試験するために、それらを１４日間の間またはその後に単独で添加したか（すなわち、０〜７日目のシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）、次いで７〜１４日目のメチルプレドニソロン（ＭＰｒ）は図３Ｄの左上の角においてＣｓＡ−ＭＰｒとラベルが付されている）、あるいはどんな免疫抑制剤も使用せずに（ＮＴ）添加した。本発明者らは、ラパマイシン（Ｒａｐａ）のみの存在下での１４日間の拡大増殖は、拡大増殖倍数および抑制能力の両方を高めるために最も効率的であること、および最初にラパマイシンおよびその後にメチルプレドニソロンも効率的な組み合わせであるが、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＰＡ）の存在はラパマイシンによる拡大増殖を阻害し、かつ抑制を減少させ（図３Ｄ）、従って、ラパマイシンがインビトロだけでなくインビボでもＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ／−Ｔｒｅｇの拡大増殖および機能を高めるのに有利であり得ることを観察した。
【００４４】
実施例２
方法：新鮮な血液を一人の健康な志願者から採取し、ＰＢＭＣをＦｉｃｏｌｌ遠心分離によって単離し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ−ＦＣＳ−ＥＤＴＡ中２×１０８のＰＢＭＣ／ｍｌで調整し、抗ＣＤ３−ＰｅＣｙ７、抗ＣＤ４−ＰｅｒＣＰＣｙ５．５および抗ＣＤ４５ＲＣ  ＦＩＴＣと共に４℃で３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳ−ＦＣＳ−ＥＤＴＡで洗浄し、６０μｍのティッシュで濾過し、Ｄａｐｉで標識し、かつＦＡＣＳ  Ａｒｉａによりリンパ球の形態、凝集細胞の除外およびＤＡＰＩ−ＣＤ３＋ＣＤ４−ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ／−の発現に基づいて選別した。選別後に細胞を培地で洗浄し、１０％ＡＢ血清、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（０．１ｍｇ／ｍｌ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、グルタミン（２ｍＭ）、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（１ｍＭ）、非必須アミノ酸（１×）、ＩＬ−２（１０００Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍｌ）、抗ＣＤ２８  ＭＡｂ（クローンＣＤ２８．２、可溶性、１μｇ／ｍｌ）が添加され、かつ５０ｎＭのラパマイシンが添加されたか添加されていないＲＰＭＩ  １６４０培地を含む、先に抗ＣＤ３（ＯＫＴ３クローン、ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌ、１ｍｌ／ウェル、３７℃で１時間、次いでＰＢＳで３回洗浄）でコーティングしたｐ６プレートに１０６のＴｒｅｇ／ウェル／３ｍｌで播種した。７および１４日目に、Ｔｒｅｇを回収、計数および洗浄し、かつ１０％ＡＢ血清、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（０．１ｍｇ／ｍｌ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、グルタミン（２ｍＭ）、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（１ｍＭ）、非必須アミノ酸（１×）、ＩＬ−２（１０００Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍｌ）、抗ＣＤ２８  ＭＡｂ（クローンＣＤ２８．２、可溶性、１μｇ／ｍｌ）が添加され、かつ５０ｎＭのラパマイシンが添加されたか添加されていないＲＰＭＩ  １６４０培地を含む、先に抗ＣＤ３（ＯＫＴ３クローン、ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌ、１ｍｌ／ウェル、３７℃で１時間、次いでＰＢＳで３回洗浄）でコーティングしたｐ６プレートに５×１０５のＴｒｅｇ／ウェル／３ｍｌで播種した。７〜２０日目から、サイトカインを２日ごとに新たに添加し、新鮮な培地（１０％ＡＢ血清、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（０．１ｍｇ／ｍｌ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、グルタミン（２ｍＭ）、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（１ｍＭ）、非必須アミノ酸（１×）、ＩＬ−２（１０００Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍｌ）が添加されたＲＰＭＩ  １６４０培地）を増殖率に応じて必要な場合に添加した。抑制活性の評価のために拡大増殖したＴｒｅｇを１４日目に回収した。同じＨＶドナーからのＰＢＭＣを解凍し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ−ＦＣＳ−ＥＤＴＡ中２×１０８のＰＢＭＣ／ｍｌで調整し、抗ＣＤ３−ＰｅＣｙ７、抗ＣＤ４−ＰｅｒＣＰＣｙ５．５および抗ＣＤ２５−ＡＰＣ−Ｃｙ７と共に４℃で３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳ−ＦＣＳ−ＥＤＴＡで洗浄し、６０μｍのティッシュで濾過し、Ｄａｐｉで標識し、かつＦＡＣＳ  Ａｒｉａによりリンパ球の形態、凝集細胞の除外およびＤＡＰＩ−ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５−の発現に基づいて選別し、かつＣＦＳＥ��標識した。ＣＤ３＋細胞枯渇および３５Ｇｙの照射によってＡＰＣを得た。拡大増殖したＴｒｅｇを、１０％ＡＢ血清、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（０．１ｍｇ／ｍｌ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、グルタミン（２ｍＭ）、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（１ｍＭ）および非必須アミノ酸（１×）が添加されたＲＰＭＩ  １６４０培地に１：１：１のＴｒｅｇ：Ｔｅｆｆ：ＡＰＣ比で播種した。５日間の培養後に、Ｔｅｆｆ増殖をＤＡＰＩ−ＣＤ４＋ＣＤ３＋Ｔ細胞におけるＣＦＳＥ解析によって解析した。
【００４５】
結果：Ｔｒｅｇ培養のための培養培地へのラパマイシンの添加により、細胞表現型に影響を与えることなく拡大増殖収率および抑制機能が向上した（図２）。
【００４６】
実施例３
方法：新鮮な血液を一人の健康な志願者から採取し、ＰＢＭＣをＦｉｃｏｌｌ遠心分離によって単離し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ−ＦＣＳ−ＥＤＴＡ中２×１０８のＰＢＭＣ／ｍｌで調整し、抗ＣＤ３−ＰｅＣｙ７、抗ＣＤ４−ＰｅｒＣＰＣｙ５．５および抗ＣＤ４５ＲＣ  ＦＩＴＣと共に４℃で３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳ−ＦＣＳ−ＥＤＴＡで洗浄し、６０μｍのティッシュで濾過し、Ｄａｐｉで標識し、かつＦＡＣＳ  Ａｒｉａによりリンパ球の形態、凝集細胞の除外およびＤＡＰＩ−ＣＤ３＋ＣＤ４−ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ／−の発現に基づいて選別した。選別後に細胞を培地で洗浄し、１０％ＡＢ血清、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（０．１ｍｇ／ｍｌ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、グルタミン（２ｍＭ）、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（１ｍＭ）、非必須アミノ酸（１×）、ＩＬ−２（１０００Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍｌ）、抗ＣＤ２８  ＭＡｂ（クローンＣＤ２８．２、可溶性、１μｇ／ｍｌ）が添加され、かつ免疫抑制剤（シクロスポリンＡ（４５ｎｇ／ｍｌ）、ラパマイシン（４５ｎｇ／ｍｌ）、メチルプレドニソロン（５００ｐｇ／ｍｌ）、タクロリムス（２ｎｇ／ｍｌ）またはミコフェノール酸モフェチル（１μｇ／ｍｌ））が添加されたか添加されていないＲＰＭＩ  １６４０培地を含む、先に抗ＣＤ３（ＯＫＴ３クローン、ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌ、１ｍｌ／ウェル、３７℃で１時間、次いでＰＢＳで３回洗浄）でコーティングしたｐ６プレートに１０６のＴｒｅｇ／ウェル／３ｍｌで播種した。７日目に、Ｔｒｅｇを回収、計数および洗浄し、かつ１０％ＡＢ血清、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（０．１ｍｇ／ｍｌ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、グルタミン（２ｍＭ）、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（１ｍＭ）、非必須アミノ酸（１×）、ＩＬ−２（１０００Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍｌ）、抗ＣＤ２８  ＭＡｂ（クローンＣＤ２８．２、可溶性、１μｇ／ｍｌ）が添加され、かつ免疫抑制剤（シクロスポリンＡ（４５ｎｇ／ｍｌ）、ラパマイシン（４５ｎｇ／ｍｌ）、メチルプレドニソロン（５００ｐｇ／ｍｌ）、タクロリムス（２ｎｇ／ｍｌ）またはミコフェノール酸モフェチル（１μｇ／ｍｌ））（０〜７日目と同じまたは異なる薬物）が添加されたか添加されていないＲＰＭＩ  １６４０培地を含む、先に抗ＣＤ３（ＯＫＴ３クローン、ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌ、１ｍｌ／ウェル、３７℃で１時間、次いでＰＢＳで３回洗浄）でコーティングしたｐ６プレートに５×１０５のＴｒｅｇ／ウェル／３ｍｌで播種した。１０および１２日目に、サイトカインを新たに添加した。抑制活性の評価のために拡大増殖したＴｒｅｇを１４日目に回収した。同じＨＶドナーからのＰＢＭＣを解凍し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ−ＦＣＳ−ＥＤＴＡ中２×１０８のＰＢＭＣ／ｍｌで調整し、抗ＣＤ３−ＰｅＣｙ７、抗ＣＤ４−ＰｅｒＣＰＣｙ５．５および抗ＣＤ２５−ＡＰＣ−Ｃｙ７と共に４℃で３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳ−ＦＣＳ−ＥＤＴＡで洗浄し、６０μｍのティッシュで濾過し、Ｄａｐｉで標識し、かつＦＡＣＳ  Ａｒｉａによりリンパ球の形態、凝集細胞の除外およびＤＡＰＩ−ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５��の発現に基づいて選別し、かつＣＦＳＥで標識した。ＣＤ３＋細胞枯渇および３５Ｇｙの照射によってＡＰＣを得た。拡大増殖したＴｒｅｇを１０％ＡＢ血清、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（０．１ｍｇ／ｍｌ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、グルタミン（２ｍＭ）、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（１ｍＭ）および非必須アミノ酸（１×）が添加されたＲＰＭＩ  １６４０培地に１：１：１のＴｒｅｇ：Ｔｅｆｆ：ＡＰＣ比で播種した。５日間の培養後に、Ｔｅｆｆ増殖をＤＡＰＩ−ＣＤ４＋ＣＤ３＋Ｔ細胞においてＣＦＳＥ解析によって解析した。
【００４７】
結果：Ｔｒｅｇ培養のための培養培地へのラパマイシン、ＣｓＡまたはタクロリムスの添加により、Ｔｒｅｇの拡大増殖収率および抑制活性が向上し、ＭＰＡの添加は、活性および拡大増殖に有害であり、かつメチルプレドニソロンの添加により機能が向上した（図３）。
【００４８】
実施例４
方法：新鮮な血液を一人の健康な志願者から採取し、ＰＢＭＣをＦｉｃｏｌｌ遠心分離によって単離し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ−ＦＣＳ−ＥＤＴＡ中２×１０８のＰＢＭＣ／ｍｌで調整し、抗ＣＤ３−ＰｅＣｙ７、抗ＣＤ４−ＰｅｒＣＰＣｙ５．５および抗ＣＤ４５ＲＣ  ＦＩＴＣと共に４℃で３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳ−ＦＣＳ−ＥＤＴＡで洗浄し、６０μｍのティッシュで濾過し、Ｄａｐｉで標識し、かつＦＡＣＳ  Ａｒｉａによりリンパ球の形態、凝集細胞の除外およびＤＡＰＩ−ＣＤ３＋ＣＤ４−ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ／−の発現に基づいて選別した。選別後に細胞を培地で洗浄し、１０％ＡＢ血清、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（０．１ｍｇ／ｍｌ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、グルタミン（２ｍＭ）、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（１ｍＭ）、非必須アミノ酸（１×）、ＩＬ−２（１０００Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍｌ）、抗ＣＤ２８  ＭＡｂ（クローンＣＤ２８．２、可溶性、１μｇ／ｍｌ）が添加されたＲＰＭＩ  １６４０培地を含む、先に抗ＣＤ３（ＯＫＴ３クローン、ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌ、１ｍｌ／ウェル、３７℃で１時間、次いでＰＢＳで３回洗浄）でコーティングしたｐ６プレートに１０６のＴｒｅｇ／ウェル／３ｍｌで播種した。７日目に、Ｔｒｅｇを回収、計数および洗浄し、かつ１０％ＡＢ血清、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（０．１ｍｇ／ｍｌ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、グルタミン（２ｍＭ）、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（１ｍＭ）、非必須アミノ酸（１×）、ＩＬ−２（１０００Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍｌ）、抗ＣＤ２８  ＭＡｂ（クローンＣＤ２８．２、可溶性、１μｇ／ｍｌ）が添加されたＲＰＭＩ  １６４０培地を含む、先に抗ＣＤ３（ＯＫＴ３クローン、ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌ、１ｍｌ／ウェル、３７℃で１時間、次いでＰＢＳで３回洗浄）でコーティングしたｐ６プレートに５×１０５のＴｒｅｇ／ウェル／３ｍｌで播種した。１０および１２日目に、サイトカインを新たに添加した。１４日目に、拡大増殖したＴｒｅｇを回収し、１０％ＡＢ血清、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（０．１ｍｇ／ｍｌ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、グルタミン（２ｍＭ）、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（１ｍＭ）、非必須アミノ酸（１×）が添加され、免疫抑制剤（シクロスポリンＡ（４５ｎｇ／ｍｌ）、ラパマイシン（４５ｎｇ／ｍｌ）、メチルプレドニソロン（５００ｐｇ／ｍｌ）、タクロリムス（２ｎｇ／ｍｌ）またはミコフェノール酸モフェチル（１μｇ／ｍｌ））が添加されたか添加されておらず、かつサイトカインが添加されたか添加されていない（ＩＬ−２（１０００Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍｌ）が１４、１６、１８および２０日目に添加された）、ＲＰＭＩ  １６４０培地を含むｐ９６プレートに同種異系のＡＰＣ（Ｔｒｅｇ：ＡＰＣ１：４）と共に５×１０５Ｔｒｅｇ／ウェル／２００μｌで播種した。Ｔｒｅｇを２１日目に生存／拡大増殖収率および表現型について解析した。
【００４９】
結果：Ｔｒｅｇ培養のための培養培地の添加は、Ｔｒｅｇの生存および同種異系のＡＰＣに応答したＴｒｅｇ増殖にも影響を与えなかった（図５）。タクロリムスおよびメチルプレドニソロンはそれぞれ、薬物非含有培地と比較してＴｒｅｇによってＩＦＮｇおよびＣＤ１５４発現を有意に減少させた（図４）。
【００５０】
参考文献
本出願全体を通して、各種参考文献は本発明が属する最先端技術について記載している。これらの参考文献の開示は参照によって本開示に組み込まれる。
１．Ｎａｎｋｉｖｅｌｌ，Ｂ．Ｊ．ら，慢性同種移植腎症の自然史（Ｔｈｅ  ｎａｔｕｒａｌ  ｈｉｓｔｏｒｙ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ａｌｌｏｇｒａｆｔ  ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ）．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４９，２３２６−２３３３（２００３）．
２．Ｍｏｒｅａｕ，Ａ．，Ａｌｌｉｏｔ−Ｌｉｃｈｔ，Ｂ．，Ｃｕｔｕｒｉ，Ｍ．Ｃ．＆Ｂｌａｎｃｈｏ，Ｇ．臓器移植における寛容原性樹状細胞療法（Ｔｏｌｅｒｏｇｅｎｉｃ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｏｒｇａｎ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）．Ｔｒａｎｓｐｌ  Ｉｎｔ（２０１６）．
３．Ｃｌｅｍｅｎｔ，Ｍ．ら，ＣＤ８（＋）制御性Ｔ細胞による濾胞性ヘルパーＴ−胚中心Ｂ細胞軸の制御はアテローム性動脈硬化症および三次リンパ器官の発生を制限する（Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔ  ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ  ｈｅｌｐｅｒ−ｇｅｒｍｉｎａｌ  ｃｅｎｔｅｒ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ａｘｉｓ  ｂｙ  ＣＤ８（＋）  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｌｉｍｉｔｓ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｅｒｔｉａｒｙ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｏｒｇａｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １３１，５６０−５７０（２０１５）．
４．Ｓｉｎｇｅｒ，Ｂ．Ｄ．，Ｋｉｎｇ，Ｌ．Ｓ．＆Ｄ’Ａｌｅｓｓｉｏ，Ｆ．Ｒ．免疫療法としての制御性Ｔ細胞（Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ａｓ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５，４６（２０１４）．
５．Ｔｓａｎｇ，Ｊ．Ｙ．ら，同種特異的Ｔｒｅｇ細胞の効力はＴ細胞受容体の機能結合活性と相関しているように思われる（Ｔｈｅ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ｏｆ  ａｌｌｏｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔｒｅｇｓ  ｃｅｌｌｓ  ａｐｐｅａｒｓ  ｔｏ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅ  ｗｉｔｈ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｖｉｄｉｔｙ）．Ａｍ  Ｊ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  １１，１６１０−１６２０（２０１１）．
６．Ｔｓａｎｇ，Ｊ．Ｙ．ら，ＴＣＲ遺伝子導入によってＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇに間接的な同種抗原特異性を付与することはマウスにおける移植寛容に有利である（Ｃｏｎｆｅｒｒｉｎｇ  ｉｎｄｉｒｅｃｔ  ａｌｌｏｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｎ  ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇｓ  ｂｙ  ＴＣＲ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｆａｖｏｒｓ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｉｎ  ｍｉｃｅ）．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１８，３６１９−３６２８（２００８）．
７．Ｓａｇｏｏ，Ｐ．ら，同種抗原特異性を有するヒトの制御性Ｔ細胞はポリクローナルの制御性Ｔ細胞よりも同種免疫による皮膚移植片損傷の強力な阻害剤である（Ｈｕｍａｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ａｌｌｏａｎｔｉｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｒｅ  ｍｏｒｅ  ｐｏｔｅｎｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ａｌｌｏｉｍｍｕｎｅ  ｓｋｉｎ  ｇｒａｆｔ  ｄａｍａｇｅ  ｔｈａｎ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ）．Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ３，８３ｒａ４２（２０１１）．
８．Ｐｉｃａｒｄａ，Ｅ．，Ａｎｅｇｏｎ，Ｉ．＆Ｇｕｉｌｌｏｎｎｅａｕ，Ｃ．同種移植におけるＣＤ８（＋）ＴｒｅｇのＴ細胞受容体特異性（Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ＣＤ８（＋）  Ｔｒｅｇｓ  ｉｎ  ａｌｌｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ３，３５−３７（２０１１）．
９．Ｇｕｉｌｌｏｎｎｅａｕ，Ｃ．ら，ＣＤ４０Ｉｇ治療によりＣＤ８ＣＤ４５ＲＣ  Ｔ細胞、ＩＦＮ−γおよびインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼによって媒介される同種移植片受容が生じる（ＣＤ４０Ｉｇ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ａｌｌｏｇｒａｆｔ  ａｃｃｅｐｔａｎｃｅ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ＣＤ８ＣＤ４５ＲＣ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ，ＩＦＮ−ｇａｍｍａ，ａｎｄ  ｉｎｄｏｌｅａｍｉｎｅ  ２，３−ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ）．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１７，１０９６−１１０６（２００７）．
１０．Ｖｕｄｄａｍａｌａｙ，Ｙ．＆ｖａｎ  Ｍｅｅｒｗｉｊｋ，Ｊ．Ｐ．ＣＤ２８−およびＣＤ２８ｌｏｗＣＤ８＋制御性Ｔ細胞：マウスおよび人間について（ＣＤ２８−  ａｎｄ  ＣＤ２８ｌｏｗＣＤ８＋  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ：Ｏｆ  Ｍｉｃｅ  ａｎｄ  Ｍｅｎ）．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ８，３１（２０１７）．
１１．Ｗａｎｇ，Ｙ．Ｍ．＆Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｓ．Ｉ．ＣＤ８制御性Ｔ細胞：古いものは今では新しい（ＣＤ８  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ：ｗｈａｔ’ｓ  ｏｌｄ  ｉｓ  ｎｏｗ）．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８７，１９２−１９３（２００９）．
１２．Ｈｏｒｉ，Ｓ．，Ｎｏｍｕｒａ，Ｔ．＆Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，Ｓ．転写因子Ｆｏｘｐ３による制御性Ｔ細胞発生の制御（Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｆｏｘｐ３）．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９９，１０５７−１０６１（２００３）．
１３．Ｆｏｎｔｅｎｏｔ，Ｊ．Ｄ．，Ｇａｖｉｎ，Ｍ．Ａ．＆Ｒｕｄｅｎｓｋｙ，Ａ．Ｙ．Ｆｏｘｐ３はＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の発生および機能をプログラムする（Ｆｏｘｐ３  ｐｒｏｇｒａｍｓ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ４＋ＣＤ２５＋  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ）．Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４，３３０−３３６（２００３）．
１４．Ｇｕｉｌｌｏｎｎｅａｕ，Ｃ．，Ｐｉｃａｒｄａ，Ｅ．＆Ａｎｅｇｏｎ，Ｉ．実質臓器移植におけるＣＤ８＋制御性Ｔ細胞（ＣＤ８＋  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｓｏｌｉｄ  ｏｒｇａｎ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｏｒｇａｎ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  １５，７５１−７５６（２０１０）．
１５．Ｎｉｅｄｅｒｋｏｒｎ，Ｊ．Ｙ．ＣＤ８（＋）Ｔ制御性細胞における新しい概念（Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｉｎ  ＣＤ８（＋）  Ｔ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｃｅｌｌｓ）．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０，３２７−３３１（２００８）．
１６．Ｌｉｕ，Ｊ．，Ｃｈｅｎ，Ｄ．，Ｎｉｅ，Ｇ．Ｄ．＆Ｄａｉ，Ｚ．ＣＤ８（＋）ＣＤ１２２（＋）Ｔ細胞：中心記憶細胞の表現型を有する新しく現れた調節因子（ＣＤ８（＋）ＣＤ１２２（＋）  Ｔ−Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｎｅｗｌｙ  Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｗｉｔｈ  Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｍｅｍｏｒｙ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ）．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６，４９４（２０１５）．
【図１】
2020527044.tif 000002
【図２Ａ】
2020527044.tif 000003
【図２Ｂ】
2020527044.tif 000004
【図２Ｃ】
2020527044.tif 000005
【図２Ｄ】
2020527044.tif 000006
【図２Ｅ】
2020527044.tif 000007
【図３Ａ】
2020527044.tif 000008
【図３Ｂ】
2020527044.tif 000009
【図３Ｃ】
2020527044.tif 000010
【図３Ｄ】
2020527044.tif 000011
【図４Ａ】
2020527044.tif 000012
【図４Ｂ】
2020527044.tif 000013
【国際調査報告】
2020527044.tif 000014
2020527044.tif 000015
2020527044.tif 000016