(57)【要約】本発明は、ＭＲ１分子に関連した癌細胞によって示された抗原に特異的に結合することができるＴ細胞受容体を発現するＴ細胞を単離する方法に関する。前記方法は、（ａ）Ｔ細胞の調合液を提供するステップ、（ｂ）ＭＲ１タンパク質を発現する癌細胞を用いて調合液と接触するステップ、（ｃ）前記癌細胞に特に反応的なＴ細胞を単離するステップを含む。本発明は、さらに、遺伝子組換え発現ベクターからＴ細胞受容体を認識する選択したＭＲ１を発現するＴ脂肪調合液を準備し、癌の治療におけるこのようなＴ細胞調合液の使用及び核酸をコードするＴ細胞受容及び細胞反応的なＭＲ１の収集方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＲ１分子に関連する癌細胞によって提示される抗原と特異的に結合することができるＴ細胞受容体を発現するＴ細胞を単離する方法であって、
ａ．Ｔ細胞の調製液を提供するステップ、そして
ｂ．接触工程においてＭＲ１を発現する癌細胞とＴ細胞の前記調製液を接触させるステップ、そして
ｃ．単離工程において前記癌細胞と特異的に反応するＴ細胞を単離するステップ
を含むことを特徴とする、前記方法。
【請求項２】
前記接触させるステップは増殖させるステップを含み、単離されたＴ細胞の前記調製液はＭＲ１を発現する癌細胞が存在する状態で増殖することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記増殖させるステップは、ＩＬ−２及び／又はＩＬ−７及び／又はＩＬ−１５が存在する状態で行われることを特徴とする、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記単離するステップは、ＣＤ３、ＣＤ６９、ＣＤ１３７、ＣＤ１５０及び／又はＩＣＯＳから選択される細胞表面マーカに特異的なリガンドを用いて前記Ｔ細胞調製液を染色することを含み、特に前記単離するステップはＣＤ３＋ＣＤ１３７＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ３＋ＣＤ６９＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ３＋ＣＤ１５０＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ３＋ＩＣＯＳ＋Ｔ細胞を選択することを含み、その後に流動細胞解析及び細胞分類、特にＦＡＣＳ又は磁気単離を使用することが行われることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
細胞表面マーカに特異的な前記リガンドが、抗体又は抗体様分子であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記単離するステップが、ＭＲ１を発現する細胞を用いて刺激された場合、ＭＲ１を発現していない細胞を用いた刺激と比較して、ＩＦＮ−γ放出及び／又はＧＭ−ＣＳＦ放出から選択されるサイトカインの２倍の増加発現を示すＴ細胞を選択することを含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
単離するステップにおいて単離されたＴ細胞のＴ細胞受容体をコードする核酸配列を決定することをさらに含むことを特徴とする、請求項１−６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ＭＲ１分子に関連する癌細胞によって提示される抗原と結合することができるＴ細胞受容体を発現するＭＲ１Ｔ細胞の調製液を調製する方法であって、
ａ．患者から獲得された腫瘍サンプルを提供するステップ；
ｂ．前記腫瘍サンプルを
ｉ．各Ｔ細胞クローンがＭＲ１分子と関連する癌細胞によって提示される抗原と特異的に結合することができるＭＲ１Ｔ細胞受容体分子によって特徴付けられる、複数のＴ細胞クローン；又は、
ｉｉ．ＭＲ１Ｔ細胞受容体分子から単離された標識化及び多量体化された複数の可溶性ＴＣＲ
と接触させるステップ、
ｃ．前記腫瘍サンプルと特異的に反応するＭＲ１Ｔ細胞受容体を同定するステップ；
ｄ．Ｔ細胞調製液を提供するステップ；
ｅ．ステップｃにおいて前記腫瘍サンプルと特異的に反応するとして同定されたＴ細胞クローン上で発現されたＭＲ１反応性Ｔ細胞受容体分子をコードする核酸発現コンストラクトを前記Ｔ細胞調製液へ導入し、導入遺伝子Ｔ細胞調製液を産出するステップ
を含むことを特徴とする、前記方法。
【請求項９】
前記Ｔ細胞調製液が同じ患者から獲得される（自己由来の養子Ｔ細胞療法）ことを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｔ細胞調製液が他の患者、特にＨＬＡ一致患者から獲得される（同種異型の養子Ｔ細胞療法）ことを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記患者から獲得された前記Ｔ細胞調製液が患者の末梢血から獲得されること、特に前記Ｔ細胞調製液がＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ５７を含むグループから選択される１又は種々のＴ細胞マーカの発現に関するＰＢＭＣ、特にＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞又はＣＤ３＋ＣＤ２７＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞又はＣＤ３＋ＣＤ２７＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞又はＣＤ３＋ＣＤ２７−ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞又はＣＤ３＋ＣＤ５７−Ｔ細胞又はＣＤ３＋ＣＤ５７＋Ｔ細胞を選択することによって獲得されることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記患者から獲得された前記Ｔ細胞調製液が、腫瘍生検標本から獲得され、次いで生体外で増殖をおこなうことを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
癌、特にＭＲ１発現によって特徴付けられる癌の治療法又は予防方法で用いる、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の方法によって獲得されたＭＲ１特異的Ｔ細胞の調製液。
【請求項１４】
発現ベクターであって、
ａ．機能性Ｔ細胞受容体ヘテロ二量体
又は
ｂ．Ｔ細胞受容体β鎖とともに機能性Ｔ細胞受容体ヘテロ二量体を形成することができるＴ細胞受容体α鎖、及び／又は
ｃ．Ｔ細胞受容体α鎖とともに機能性Ｔ細胞受容体ヘテロ二量体を形成することができるＴ細胞受容体β鎖
又は
ｄ．Ｔ細胞受容体δ鎖とともに機能性Ｔ細胞受容体ヘテロ二量体を形成することができるＴ細胞受容体γ鎖、及び／又は
ｅ．Ｔ細胞受容体γ鎖とともに機能性Ｔ細胞受容体ヘテロ二量体を形成することができるＴ細胞受容体δ鎖
をコードする核酸配列を含むことを特徴とし、
前記Ｔ細胞受容体ヘテロ二量体は、ＭＲ１分子と特異的に結合し、
前記ＭＲ１分子は、腫瘍細胞上に発現され、かつ腫瘍関連抗原を提示し、並びに
特に前記核酸配列は、
ｉ．配列番号２７〜３８から選択される核酸配列である又は含み、及び／又は配列番号１〜１２から選択されるアミノ酸配列をコードする
及び／又は
ｉｉ．配列番号３９〜５０から選択される核酸配列である又は含み、及び／又は配列番号１３〜２４から選択されるアミノ酸配列をコードする
又は
ｉｉｉ．配列番号５１の核酸配列である又は含み、及び／又は配列番号２５のアミノ酸配列をコードする
及び／又は
ｉｖ．配列番号５２の核酸配列である又は含み、及び／又は配列番号２６のアミノ酸配列をコードする
ことを特徴とする、前記発現ベクター。
【請求項１５】
ＭＲ１分子と結合する単離されたＴ細胞受容体タンパク質ヘテロ二量体であって、前記ＭＲ１分子は腫瘍細胞上に発現され、特に該Ｔ細胞受容体タンパク質ヘテロ二量体は、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法によって同定されることを特徴とする、前記Ｔ細胞受容体タンパク質ヘテロ二量体。
【請求項１６】
前記ＭＲ１分子が、腫瘍関連抗原を提示することを特徴とする、請求項１５に記載のＭＲ１分子と結合する単離されたＴ細胞受容体タンパク質ヘテロ二量体。
【請求項１７】
前記単離されたＴ細胞受容体タンパク質は、配列番号１〜１２から選択されるアミノ酸配列及び配列番号１３〜２４から選択されるアミノ酸配列、又は配列番号２５及び２６のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１５又は請求項１６に記載の単離されたＴ細胞受容体タンパク質ヘテロ二量体。
【請求項１８】
前記単離されたＴ細胞受容体タンパク質は、
ａ．配列番号１及び２３
ｂ．配列番号２及び２２
ｃ．配列番号３及び２１
ｄ．配列番号４及び２０
ｅ．配列番号５及び１９
ｆ．配列番号６及び１７
ｇ．配列番号７及び１８
ｈ．配列番号８及び１６
ｉ．配列番号９及び１５
ｊ．配列番号１０及び１４
ｋ．配列番号１１及び１３
ｌ．配列番号１２及び２４、又は、
ｍ．配列番号２５及び２６
から選択されるアミノ酸配列の対を含むことを特徴とする、請求項１７に記載の単離されたＴ細胞受容体タンパク質ヘテロ二量体。
【請求項１９】
請求項１４に記載の発現ベクター又は請求項１５〜１８のいずれか一項に記載のＴ細胞受容体タンパク質ヘテロ二量体を含む組換え細胞であって、前記組換え細胞は、
ａ．末梢血又は
ｂ．腫瘍浸潤リンパ球
から由来するＴ細胞であることを特徴とする、前記組換え細胞。
【請求項２０】
癌、特にＭＲ１発現によって特徴付けられる癌の治療法又は予防方法で用いる、請求項１９に記載の組換え細胞。
【請求項２１】
前記細胞が養子Ｔ細胞免疫治療法によって投与されることを特徴とする、請求項２０に記載の癌の治療法又は予防方法で用いる、組換え細胞。
【請求項２２】
コレクションの各メンバは、哺乳動物細胞において異なるＴ細胞受容体α鎖、Ｔ細胞受容体β鎖又はＴ細胞受容体α鎖及びβ鎖の組合せの発現を促進し、前記組合せは癌抗原を提示するＭＲ１分子に特異的に結合することができることを特徴とする、核酸配列のコレクション。
【請求項２３】
前記コレクションは、配列番号２７〜５２から選択される配列を含み及び／又は前記コレクションは、配列番号１〜２６から選択されるＴ細胞受容体分子（又はα、β、γ又はδ鎖を構成するＴ細胞受容体）をコードする配列を含むことを特徴とする、請求項２２に記載の核酸配列のコレクション。
【請求項２４】
コレクションの各メンバは、導入遺伝子として癌抗原を提示するＭＲ１分子と特異的に結合することができるＴ細胞受容体を発現することを特徴とする、組換えＴ細胞のコレクション。
【請求項２５】
前記コレクションは、請求項１５〜１８に記載のＴ細胞受容体分子を含む細胞を含むことを特徴とする、請求項２４に記載のＴ細胞のコレクション。
【請求項２６】
癌の治療で用いる、哺乳動物細胞において使用可能なプロモータ配列の制御下でＭＲ１をコードする核酸配列を含むことを特徴とする、ＭＲ１発現核酸発現ベクター。
【請求項２７】
前記ＭＲ１発現核酸発現ベクターが、
ａ．請求項１４に記載の発現ベクターを含む組換え細胞又は請求項１５〜１８のいずれか一項に記載のＴ細胞受容体タンパク質ヘテロ二量体の投与、及び／又は
ｂ．請求項８〜１２のいずれか一項に記載の方法によって獲得されるＭＲ１特異的Ｔ細胞の調製液の投与、及び／又は
ｃ．請求項１４に記載の発現ベクターの投与
の前に、同時に、又は後に、投与されることを特徴とする、請求項２６に記載の癌の治療で用いるＭＲ１発現核酸発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】本発明は、非多型抗原提示分子ＭＲ１に制限された腫瘍反応性ヒトＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）の同定に関する。機能的なＴＣＲ転写配列は、任意の添加された外来性抗原がない状態及びＭＲ１依存的様式においてＭＲ１発現腫瘍細胞と反応する、ヒトＴ細胞（発明者によって発見され、ＭＲ１Ｔ細胞と命名された）の新規な集団を代表するクローンから単離された。本発明は、癌治療におけるＭＲ１制限腫瘍反応性ＴＣＲ遺伝子配列の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】Ｔリンパ球は、非多型細胞表面分子によって提示される脂質及びリン酸化されたイソプレノイドを含む、種々の範囲の非ペプチド抗原を検出することができる。これらのＴ細胞の異種混合表現型及び機能特性は、感染、自己免疫及び癌に対する宿主保護において特別な役割を支援する。非ペプチド抗原に特異的なＴ細胞のレパートリーは粘膜関連不変Ｔ（ＭＡＩＴ）細胞を含めることで最近増加し、それは、広範囲の酵母及びバクテリアによって生産された小さなリボフラビン前駆体に応答し、ＭＨＣクラスＩ関連タンパク質ＭＲ１によって提示される。ＭＡＩＴ細胞はヒト血液、腎臓及び腸において頻発し、肝臓中でＴ細胞常在の主要分画を含む。活性化に続き、ＭＡＩＴ細胞は多くの炎症促進性及び免疫調節性のサイトカインを放出し、直接、微生物感染細胞の死滅を媒介することができる。ＭＲ１の役割が微生物代謝産物の提示を越えてＭＡＩＴ細胞まで及ぶかどうかは、未だ知られていない。【０００３】ＭＲ１は、多くの細胞型の表面上に低レベルで発現される非多型ＭＨＣクラスＩ様タンパク質である。ＭＲ１は、多数の種にわたって高度に保存され、ヒト及びマウスＭＲ１はタンパク質レベルで＞９０％の配列相同性を共有する。【０００４】発明者は、ＭＲ１によって提示された腫瘍関連抗原を認識するヒトＴ細胞の存在を提案した。これらの新規なＴ細胞は腫瘍免疫監視に関与し、したがって、癌免疫療法用の新規なツールとなり得る。選択された腫瘍関連抗原に特異的なＴＣＲを発現するように設計されたドナー又は患者由来のＴ細胞を用いた養子療法は、癌患者において臨床的に関係のある抗腫瘍免疫反応を引き起こすような見込みがありかつ安全な戦略となる。しかしながら、これまでに同定された腫瘍関連抗原の大多数は、多型ＭＨＣ分子によって提示されたペプチドである。ＭＨＣ遺伝子の極度な多型は、固有なＭＨＣ対立遺伝子を発現する患者へのこのアプローチの適用を制限する。ＭＲ１のように、分子を提示する非多型抗原に結合された腫瘍抗原を標的とすることは、この制約を克服し、ＭＲ１を発現する腫瘍を有するすべての患者に原則として適用可能であり得る。ＭＲ１提示抗原を認識する腫瘍反応性Ｔ細胞受容体の使用は、同じタイプの提示分子と結合するための腫瘍抗原のクロス競合を除いて、ＭＨＣ提示ペプチド抗原によって伝達される抗腫瘍反応を補完する長所をさらに有し得る。さらに、この戦略は、同じ腫瘍細胞上の異なる性質の抗原を標的とする可能性を提供し、それにより、選択的な免疫圧の下、腫瘍エスケープ変異株の潜在的な発生を最小化し得る。したがって、ＭＲ１提示腫瘍関連抗原の同定及びこれらの抗原を認識するＭＲ１制限ＴＣＲの特徴は、癌免疫療法にとって重要な意味合いを有し得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】この先端技術に基づき、本発明の目的は、癌治療の新規な手段及び方法を提供することである。この目的は、ここで開示される従属クレーム、実施例及び図によって提供されるさらに有利な解決策と共に独立クレームの主題によって達成される。
【課題を解決するための手段】
【０００６】［定義］
本明細書の文脈における用語「ＭＲ１」は、ＭＲ１遺伝子（Ｅｎｔｒｅｚ  ３１４０）又はＭＲ１遺伝子産物（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｑ９５４６０）のいずれかを指す。【０００７】本明細書の文脈における用語「ＭＲ１Ｔ細胞」は、癌細胞によって提示されたＭＲ１分子に特異的に結合することができるＴ細胞受容体を発現するＴ細胞を指す。【０００８】本明細書の文脈における用語「ＭＲ１Ｔ細胞受容体」は、ＭＲ１分子に関連する癌細胞によって提示された抗原に特異的に結合することができるＴ細胞受容体を指す。【０００９】本明細書中において、用語「ポジティブ」は、マーカの発現の文脈において使用された場合、蛍光標識抗体によってアッセイされた抗原の発現を指し、同じ標的に特異的に結合しないアイソタイプ一致抗体での染色との比較における中央蛍光値において、少なくとも３０％より高い（≧３０％）、特に≧５０％又は≧８０％である。そのようなマーカの発現は、マーカの名前に続いて上付きの「プラス」（＋）によって示される、例えばＣＤ４＋。【００１０】本明細書において、用語「ネガティブ」は、マーカの発現の文脈において使用された場合、蛍光標識抗体によってアッセイされた抗原の発現を指し、同じ標的と特異的に結合しないアイソタイプ一致抗体の中央蛍光値よりその中央蛍光値が３０％より低く、特に１５％より低いことを特徴とする。そのようなマーカの発現は、マーカの名前に続いて上付きのマイナス（−）によって示される、例えばＣＤ１２７−。【００１１】用語「抗体」は、免疫グロブリンタイプＧ（ＩｇＧ）、タイプＡ（ＩｇＡ）、タイプＤ（ＩｇＤ）、タイプＥ（ＩｇＥ）又はタイプＭ（ＩｇＭ）を含むが限定されない全ての抗体を指し、任意の抗原結合性フラグメント又はその単一鎖及び関係又は由来するコンストラクトを指す。用語はいわゆるナノボディ又は単一ドメイン抗体を包含し、抗体フラグメントは１つの単量体の可変抗体ドメインから成る。【００１２】［発明の要約］
広い意味において、本発明は癌の治療法に関するものであって、ＭＲ１発現癌細胞に反応するＴ細胞（ＭＲ１Ｔ細胞）から単離されたＴＣＲ配列は、患者のＴ細胞の集団中に遺伝子導入した後に発現される。これらの外来の、遺伝子導入で発現されたＴＣＲ配列は、患者の腫瘍に対する治療法としてＴ細胞へのＭＲ１発現癌細胞の特異的認識を与えるために使用される。【００１３】本発明は、ＭＲ１Ｔ細胞特異的ＴＣＲ遺伝子で形質導入された、Ｔ細胞および複数のＴ細胞を含むＴ細胞調合液を同様にもたらす。特定の実施形態では、ＭＲ１Ｔ細胞ＴＣＲ遺伝子を用いて形質導入されたＴ細胞は、他の治療的介入と組み合わせて養子細胞免疫療法に使用することができる。【００１４】本発明は、また、本発明で使用されたＭＲ１発現癌細胞（ＭＲ１Ｔ細胞）に反応するＴ細胞から単離されたＴＣＲ配列の同定を促進する研究方法にも関する。これは、腫瘍関連抗原を認識するＭＲ１制限Ｔ細胞を単離する方法を包含する。正常なドナー又は癌患者の末梢血からのＴ細胞は、患者の中で同じ型の腫瘍を代表する腫瘍細胞株を用いて刺激される。これらの腫瘍細胞株は、ＭＲ１遺伝子を用いてトランスフェクトされ、したがって、それらの原形質膜上に大量のＭＲ１タンパク質を発現する。活性化Ｔ細胞は、活性化マーカ（例えばＣＤ１３７、ＣＤ１５０、ＣＤ６９、又はＩＣＯＳ）の発現によってソートされ、公表されるとおりクローニングされる（Ｄｅ  Ｌｉｂｅｒｏ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｃｌｏｎｅｓ  ａｎｄ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｅｘｃｉｓｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｂｉｏｐｓｉｅｓ  ｏｒ  ｎｅｅｄｌｅ  ａｓｐｉｒａｔｅｓ．Ｉｎ  ＭＨＣ  １２３−１４０（ＩＲＬ，Ｏｘｆｏｒｄ；１９９７））。個々のクローンは、ＭＲ１制限的様式で、腫瘍細胞を認識するそれらの能力、腫瘍細胞の死滅、及び炎症性サイトカインの放出に関してテストされる。ＭＲ１制限的及び腫瘍特異的Ｔ細胞クローンのＴＣＲ遺伝子が、配列決定及び同定される。【００１５】本発明は、また、本発明者らの以前に確立しているプロトコル（Ｄｅ  Ｌｉｂｅｒｏ、同書中）による、同じ癌組織生検から腫瘍浸潤Ｔ細胞を調整する方法にも関する。個々のＴ細胞クローンを、ＭＲ１タンパク質を発現する腫瘍細胞株のパネルに対してテストする。本発明者らはＭＲ１制限、腫瘍致死及び炎症性サイトカインの放出に関し、最も反応するＴ細胞クローンを研究する。選択されたＴ細胞クローンのＴＣＲ遺伝子を配列決定する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１ＡＢＣＤＥ】ＭＲ１Ｔ細胞は、微生物抗原を認識しない。（Ａ）ＣＣＲＦＳＢ、ＴＨＰ−１及びＡ３７５−ＭＲ１細胞によるＭＲ１の表面発現。グレーヒストグラムは、アイソタイプ一致のコントロールｍＡｂｓで染色したものを示す。Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物のない状態（ｎｏ  Ａｇ）又はある状態（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び／又は抗ＭＲ１ブロックｍＡｂｓ（α−ＭＲ１）のない状態又はある状態での、図１Ａにおける３つの細胞株による、（Ｂ）ＭＲ１Ｔ細胞クローンＤＧＢ１２９又は（Ｃ）ＭＡＩＴ細胞クローンＳＭＣ３の刺激。ＭＡＩＴクローンＳＭＣ３は、健康なドナーのＰＢＭＣから前もって単離され、古典的なＭＡＩＴ表現型及び機能を発現する。カラムはＩＦＮ−γ放出を示す（ｍｅａｎ＋ＳＤ）。抗ＭＲ１  ｍＡｂｓの有無で、合成６，７−ジメチル−８−Ｄ−リビチルマジン（ＲＬ−６，７−ｄｉＭｅ）を添加し、恒常的に表面ＭＲ１を発現しているＴＨＰ−１細胞による（Ｄ）ＤＧＢ１２９  ＭＲ１Ｔ細胞又は（Ｅ）ＳＭＣ３  ＭＲＩＴ細胞の刺激。カラムはｍｅａｎ  ＩＦＮ−γ放出＋ＳＤを示す。データは、４つ（Ａ，Ｂ及びＣ）及び２つ（Ｄ及びＥ）の代表である。＊Ｐ＜０．０５（対応なしスチューデントｔ検定）。
【図２ＡＢＣＤＥ】末梢血Ｔ細胞からのＭＲ１Ｔ細胞クローンの単離ストラテジー。（Ａ）外来性の抗原のない状態でＡ３７５−ＭＲ１細胞と一晩共培養した後に、放射線を照射されたＡ３７５−ＭＲ１細胞と前もって増殖させた精製Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析。左のドットプロットは、生細胞におけるＣＤ３及びＣｅｌｌＴｒａｃｅ  ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）染色を示す。右のドットプロットは、ＣＤ３ポジティブＣＴＶネガティブでゲートされた細胞のＣＤ６９及びＣＤ１３７の発現を示す。矢印は、ゲーティング階層を示す。数は、ゲート内における細胞のパーセンテージを示す。ドナーＡからの細胞は、代表的ドナーとして示される。（Ｂ及びＤ）ドナーＡ及びＢからスクリーニングされたＴ細胞クローンの累積結果。Ｔ細胞クローンは、図２Ａで示されたＣＤ３＋ＣＴＶ−ＣＤ１３７＋ソートされたＴ細胞から生成された。グラフは、個々のクローン（ｘ軸）及びそれらのＩＦＮ−γ放出（ｙ軸）を示し、Ａ３７５−ＭＲ１細胞対Ａ３７５  ＷＴ細胞に応じて分泌されたサイトカインの量の間の比率として表される。各ドットは単一のＴ細胞クローンを表し、同時に指示された実験条件で調べられた。垂直線はＭＲ１制限反応性を示すＴ細胞（すなわち、任意の２のカットオフよりも高いＩＦＮ−γ放出比を示すクローン）の数を示す。結果は、２つの独立した実験の代表である。（Ｃ及びＥ）Ａ３７５  ＷＴ、Ａ３７５−ＭＲ１及び抗ＭＲ１  ｍＡｂｓ（α−ＭＲ１）ブロックのある状態でのＡ３７５−ＭＲ１を用いた刺激後のドナーＡからの１４の代表的なクローン及びドナーＢからの１１のクローンによるＩＦＮ−γ放出。ドットは各クローンによるＩＦＮ−γ放出を示す（複製の培養のｍｅａｎ±ＳＤ）。結果は、３つの独立した実験の代表である。＊Ｐ＜０．０５（対応なしスチューデントｔ検定）。
【図３ＡＢＣＤ】ＭＲ１Ｔ細胞は、健常な個体の血液において共通である。（Ａ）Ａ３７５  ＷＴ又はＡ３７５−ＭＲ１細胞と一晩共培養した後、代表的なドナー（ドナーＣ）から精製されたＴ細胞の流動細胞計測法解析。ドットプロットは、生きているＣＤ３＋細胞上のＣＤ６９及びＣＤ１３７発現を示す。数は、ゲート中の細胞のパーセンテージを示す。（Ｂ）Ａ３７５  ＷＴ又はＡ３７５−ＭＲ１細胞と一晩共培養した後、５人の異なるドナーからのＣＤ６９＋ＣＤ１３７＋Ｔ細胞の頻度。（Ｃ）ドナーＣからのＴ細胞クローン刺激アッセイの累積結果。Ｔ細胞クローンは、図３Ａの右のドットプロットの中で描かれるようなＣＤ３＋ＣＤ６９＋ＣＤ１３７＋ソートされたＴ細胞から生成される。グラフは、テストされたクローンの数（ｘ軸）及びＡ３７５−ＭＲ１対Ａ３７５  ＷＴ細胞に応じて分泌されたサイトカインの量の間の比率として発現されたＩＦＮ−γ放出（ｙ軸）を示す。各ドットは単一のＴ細胞クローンを表し、同時に指示された実験条件で調べられた。垂直線は、ＭＲ１を制限された反応（すなわち、任意の２のカットオフよりも高いＩＦＮ−γ放出比を示すクローン）を表示するＴ細胞の数を示す。結果は２つの独立した実験の代表である。（Ｄ）ドナーＣからの８の代表的なＭＲ１制限Ｔ細胞クローンによる外来性の抗原のない状態における、Ａ３７５ＷＴではないＡ３７５−ＭＲ１の認識。抗ＭＲ１ｍＡＢＳ（α−ＭＲ１）のブロックによるＡ３７５−ＭＲ１細胞と反応するＴ細胞クローンの阻害。ドットは、３つの実験条件中でテストされた各クローンによるＩＦＮ−γ放出（複製の培養のｍｅａｎ±ＳＤ）を表わす。結果は３つの独立した実験の代表である。＊Ｐ＜０．０５（対応なしスチューデントｔ検定）。
【図４ＡＢＣＤＥ】ＭＲ１Ｔ  ＴＣＲ遺伝子導入は、Ａ３７５細胞のＭＲ１制限認識を与える。Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物及び抗ＭＲ１  ｍＡｂｓの有無での（Ａ）ＤＧＢ１２９ＴＣＲを発現するＳＫＷ−３細胞（ＳＫＷ３−ＤＧＢ１２９）及び（Ｂ）ＭＡＩＴ  ＭＲＣ２５  ＴＣＲを発現するＪ．ＲＴ−３Ｔ３．５細胞（Ｊ．ＲＴ３−ＭＡＩＴ）の刺激。抗ＭＲ１  ｍＡｂｓの有無中で、Ａ３７５−ＭＲ１又はＡ３７５  ＷＴ細胞を用いた３つの個々のＭＲ１Ｔ細胞クローン（Ｃ）ＤＧＡ４（ＳＫＷ３−ＤＧＡ４）、（Ｄ）ＤＧＢ７０（ＳＫＷ３−ＤＧＢ７０）及び（Ｅ）ＪＭＡ（ＳＫＷ３−ＪＭＡ）のＴＣＲが発現しているＳＫＷ−３細胞の刺激。形質導入されたＴ細胞の複製の培養のＣＤ６９の中央蛍光値（ＭＦＩ）＋ＳＤが示される。ＡＰＣがない状態で培養された、形質導入されたＴ細胞のＣＤ６９  ＭＦＩも示される。Ａ３７５−ＭＲ１又はＡ３７５  ＷＴ（図示しない）で培養された時、Ｍｏｃｋ形質導入されたＴ細胞は、ＣＤ６９発現のバックグラウンド強度を示した。データは３つの独立した実験の代表である。＊Ｐ＜０．０５（対応なしスチューデントｔ検定）
【図５ＡＢ】ＭＲ１Ｔ細胞クローンによる腫瘍細胞の多種類の特異的認識。（Ａ）抗ＭＲ１ブロックｍＡｂｓ（α−ＭＲ１）の有無で大腸菌溶解物（大腸菌）がない状態（Ａｇなし）又はある状態での代表的なＳＭＣ３  ＭＡＩＴ細胞クローンによってＭＲ１の構成する表面レベルを発現する、４つのヒト細胞株の認識。（Ｂ）抗ＭＲ１  ｍＡｂｓ（α−ＭＲ１）の有無で１３のＭＲ１Ｔ細胞クローンによる図５Ａでのような同じ細型の認識。グラフはＩＦＮ−γ放出を示す（複製の培養のｍｅａｎ±ＳＤを意味する）。
【図６ＡＢＣ】ＭＲ１Ｔ細胞クローンは、微生物のリガンド又は６−ＦＰに反応しない。（Ａ）大腸菌溶解物がある又はない状態において、ＭＲ１を発現するＡ３７５細胞（Ａ３７５−ＭＲ１）又はＭＲ１を発現しないＡ３７５細胞（Ａ３７５  ＷＴ）で共培養された７つのＭＲ１Ｔ細胞クローン及び１つの対照ＭＡＩＴ細胞クローンの応答。抗ＭＲ１  ｍＡｂｓ（α−ＭＲ１）によるＴ細胞クローン反応のブロックも示される。（Ｂ）６−ホルミルプテリン（６−ＦＰ）が存在する中でＷＴ  ＭＲ１分子（Ａ３７５−ＭＲ１）又はＫ４３Ａ変異ＭＲ１分子（Ａ３７５−ＭＲ１  Ｋ４３Ａ）のいずれかを発現するＡ３７５細胞に対するＭＲ１Ｔ細胞クローンの反応。（Ｃ）６−ＦＰがない状態又はある状態のいずれかで、それぞれ大腸菌溶解物又はゾレドロネートの有無で、前もって培養されたＡ３７５−ＭＲ１又はＡ３７５−ＭＲ１  Ｋ４３Ａ細胞を用いた、対照ＭＡＩＴ細胞クローンＭＲＣ２５又は対照ＴＣＲ  Ｖγ９Ｖδ２クローンＧ２Ｂ９の刺激。結果は、複製の培養中で測定されたＩＦＮ−γのｍｅａｎ±ＳＤとして発現される。結果は３つの独立した実験の代表である。＊Ｐ＜０．０５（対応なしスチューデントｔ検定）
【図７ＡＢＣＤＥ】ＭＲ１Ｔ細胞クローンはＡｃ−６−ＦＰを認識しない。（Ａ）アセチル−６−ホルミルプテリン（Ａｃ−６−ＦＰ）がない状態かある状態でのＡ３７５−ＭＲ１細胞クローンの３つの代表的なＭＲ１Ｔ細胞クローンの刺激。（Ｂ）Ａ３７５−ＭＲ１細胞クローンの２つのＭＡＩＴ細胞クローン（ＭＲＣ２５とＳＭＣ３）の刺激は、Ａｃ−６−ＦＰがない状態又はある状態での大腸菌溶解物でパルスした。（Ｃ）Ａ３７５−ＭＲ１細胞は、Ａｃ−６−ＦＰ（２５μｇ／ｍｌ）がない状態又はある状態でゾレドロネート（Ｚｏｌ）で処理され、ＴＣＲ  Ｖγ９Ｖδ２細胞クローン（Ｇ２Ｂ９）を使用して刺激した。（Ｄ）Ａｃ−６−ＦＰ（２５μｇ／ｍｌ）がない状態又はある状態において、Ｋ４３Ａ突然変異体ＭＲ１分子（Ａ３７５−ＭＲ１  Ｋ４３Ａ）を発現するＡ３７５細胞を用いて、Ａで示される３つのＭＲ１Ｔ細胞クローンを刺激する。（Ｅ）Ａ３７５−ＭＲ１  Ｋ４３Ａ細胞によってＢの中で使用される、２つのＭＡＩＴ細胞クローンの刺激は、Ａｃ−６−ＦＰ（２５μｇ／ｍｌ）がない状態又はある状態での大腸菌溶解物でパルスした。結果はＩＦＮ―γ放出のｍｅａｎ±ＳＤとして発現される、複製の培養中で評価され、また３つの独立した実験の代表である。＊Ｐ＜０．０５（対応なしスチューデントｔ検定）
【図８ＡＢＣＤＥＦ】ＭＲ１Ｔ細胞は腫瘍細胞に存在し、ＲＰＭＩ  １６４０培地に由来しない抗原を認識する。いずれも５％ヒト血清が添加されたＲＰＭＩ１６４０又はＰＢＳ中で４日間育成されたＭＲ１過剰発現（Ａ）Ａ３７５（Ａ３７５−ＭＲ１）細胞及び（Ｂ）ＴＨＰ−１（ＴＨＰ１−ＭＲ１）細胞によるＤＧＢ１２９  ＭＲ１Ｔ細胞の刺激。抗ＭＲ１ブロックｍＡｂｓ（α―ＭＲ１）によるＴ細胞クローン反応性の阻害が示される。ＤＧＢ１２９細胞は、（Ｃ）ＴＨＰ−１細胞ライセート又は（Ｄ）生体内で育成されたマウス胸腫瘍ＥＭＴから武運利された分画とローディングされたＡＰＣを認識する。分画Ｅ１及びＥ２は疎水性分子を含み、分画Ｎ１〜Ｎ４は親水性分子を含む。（Ｅ）ＤＧＢ７０  ＭＲ１Ｔ細胞は、ＴＨＰ−１溶解物のＮ３分画と反応する。（Ｆ）可塑性結合組換えＭＲ１上にロードされたＴＨＰ−１由来分画Ｎ３及びＮ４によるＤＧＢ１２９及びＤＧＢ７０細胞の刺激。ＩＦＮ−γ又はＧＭ−ＣＳＦのＴ細胞放出が示される複製の培養のｍｅａｎ±ＳＤ。（３つの独立した実験の代表）。総サイトカイン放出は、パネルＡ、Ｂ、Ｆにおいて示される；バックグラウンドに対する倍数増加はパネルＣ、Ｄ、Ｅで示される。＊Ｐ＜０．０５（対応なしスチューデントｔ検定）
【図９ＡＢＣＤＥＦ】ＭＲ１Ｔ細胞は抗腫瘍反応の差異。ＭＲ１発現腫瘍細胞株ＴＨＰ−１及びＡ３７５は、示されたエフェクタ：ターゲット（Ｅ：Ｔ）比率でＭＲ１Ｔ細胞クローン（Ａ）ＤＧＢ１２９又は（Ｂ）ＤＧＢ７０とともに一晩培養された。グラフは、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ及びプロピジウムヨウ化物染色を使用して流動細胞計測法によって評価され、個々の実験条件におけるアポトーシスの標的細胞の割合を示す。ＭＲ１Ｔ細胞は抗ＣＤ３  ｍＡｂｓを用いた染色によって同定され、解析から除外された。抗ＭＲ１（α−ＭＲ１）ｍＡｂｓによるＭＲ１Ｔ細胞クローン死滅能力の阻害も、１：１のＥ：Ｔ比率で示される。（Ｃ）抗ＭＲ１  ｍＡｂｓ（α−ＭＲ１）の有無で１３のＭＲ１Ｔ細胞クローンによって健常人から単離されたＭｏ−ＤＣの認識。グラフはＩＦＮ−γ放出を示す（複製の培養の±ＳＤ）。（Ｄ）抗ＭＲ１（α−ＭＲ１）ｍＡｂｓがない状態又はある状態での代表的なＤＧＢ１２９  ＭＲ１Ｔ細胞クローンによる３人のドナーからのＭｏ−ＤＣの認識。上清中のＩＦＮ−γ放出は中間の±ＳＤとして示され発現される。（Ｅ）抗ＭＲ１  ｍＡｂｓ（α−ＭＲ１）の有無でＤＧＢ１２９  ＭＲ１Ｔ細胞と共培養した後、Ｍｏ−ＤＣ上での共刺激的な分子ＣＤ８３及びＣＤ８６の流動細胞計測法解析。Ｔ細胞がない状態でＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）を用いて刺激されたＭｏＤＣから成る対照群も示される。数は、各象限中の細胞のパーセンテージを示す。（Ｆ）ＬＳ１７４Ｔ及びＨＣＴ１１６胃腸腫瘍細胞株、並びに抗ＭＲ１  ｍＡｂｓ（α−ＭＲ１）のある状態又はない状態での正常な腸上皮細胞（ＧＥＣ）によるＪＭＡＮ  ＭＲ１Ｔ細胞クローンの刺激。カラムはＩＦＮ−γ放出を示す（複製の培養のｍｅａｎ±ＳＤを意味する）。結果はすべて少なくとも３つの独立した実験の代表である。＊Ｐ＜０．０５（対応なしスチューデントｔ検定）
【図１０ＡＢ】ＭＲ１Ｔ細胞クローンの機能的な不均質。（Ａ）Ａ３７５−ＭＲ１細胞で刺激された、７つの選択されたＭＲ１Ｔ細胞クローンによるＩＦＮ−γ放出。ＥＬＩＳＡの結果は、複製の培養中で測定されたＩＦＮ−γ放出のｍｅａｎ±ＳＤとして表現される。（Ｂ）ＭＲ１Ｔ細胞クローンの機能的な不均質。図１０Ａで示されたＩＦＮ―γのために同じ上清で実行される多重のサイトカインアッセイによる１６の追加のサイトカインの解析。結果は、２つの独立した実験の代表である。
【図１１】図１１は、ＭＲ１Ｔ細胞クローンは多数のケモカイン受容体発現プロフィールを表示する。７つの選択された静止したＭＲ１Ｔ細胞クローンによるＣＸＣＲ３、ＣＣＲ４及びＣＣＲ６表面発現の流動細胞計測法解析。グラフは、対応するアイソタイプ対照のＭＦＩによって染色される特異的なｍＡｂの中央蛍光値（ＭＦＩ）の分割により計算された相対的な蛍光強度を示す。データは２つの独立した実験の代表である。
【図１２】図１２は、ＭＲ１Ｔ細胞は、マウス中のヒト黒色腫肺小結節の数を減少する。免疫無防備のＮＳＧマウスは、ＭＲ１（Ａ３７５−ＭＲ１）を発現するヒト黒色腫Ａ３７５細胞及びＭＲ１Ｔ細胞を注入された。１４日目に、マウスが犠牲にされた。また、肺小結節は墨汁灌流の後に数えられた。Ｐ＜０．０００１（対応なしスチューデントｔ検定）（表１）表１は、選択したＭＲ１反応的なＴ細胞クローンの発現型。（表２）表２は、ＭＲ１Ｔ細胞によって認識された腫瘍細胞系統のリスト。（表３）表３は、ＴＣＲ蛋白質配列のリスト。（表４）表４は、ＴＣＲヌクレオチド配列のリスト。
【発明を実施するための形態】
【００１７】発明の詳述
本発明の第１の態様は、非多型ＭＨＣＩ関連ＭＲ１抗原提示分子と関連する癌細胞によって提示された癌抗原と特異的に結合することができるＴ細胞受容体を発現するＴ細胞を同定及び／又は単離する方法に関する。この方法は以下のステップを含む
ａ．患者又は健康なドナーから単離されたＴ細胞の調合液を提供するステップ、そして、
ｂ．接触するステップにおいて外因性の微生物由来抗原がない状態でＭＲ１タンパク質を発現する癌細胞と、単離されたＴ細胞のこの調合液を接触するステップ、特に共培養するステップ、そして、
ｃ．単離するステップにおいてＭＲ１依存的様式で前記癌細胞に特に反応するＴ細胞を単離するステップ。
【００１８】非腫瘍関連患者の生理的な文脈中のＭＲ１は、細菌のリボフラビン副産物を表し（「外因性の微生物由来抗原」と上述された）、かつ粘膜不変Ｔ細胞にそれらを提示する。
【００１９】特定の実施形態では、接触するステップは増殖するステップを含み、そこでは単離されたＴ細胞の調合液はＭＲ１を発現する癌細胞がある状態で増殖する。特定の実施形態では、癌細胞はＴ細胞と接触させられる前にそれらの成長を妨げるために放射線を照射される。２つの細胞型が長期間共培養中で維持されるのが目的の場合、これは有利だろう。また、癌細胞による培養の異常増殖は極力回避されたい。
【００２０】他の環境において、特に臨床用途において（以下参照）、培養時間が短い場合、癌細胞は放射線の照射なしで使用されてもよい。
【００２１】特定の実施形態では、増殖するステップは、ＩＬ−２、ＩＬ−７及びＩＬ−１５が存在する状態で行なわれる。
【００２２】特定の実施形態では、単離するステップは１以上のリガンド、具体的にはＣＤ３、ＣＤ６９、ＣＤ１３７、ＣＤ１５０及び／又はＩＣＯＳから選択された細胞表面マーカに特異的な１以上の（モノクローナル）抗体を用いて染色するステップを含む。特に好ましい実施形態では、単離するステップは、ＣＤ３＋ＣＤ１３７＋及び／又はＣＤ３＋ＣＤ６９＋及び／又はＣＤ３＋ＣＤ１５０＋及び／又はＣＤ３＋ＴＣＯＳ＋Ｔ細胞を選択するステップを含み、特にＦＡＣＳ又は磁気分離（ＭＡＣＳ）の使用による流動細胞解析及び細胞選別を後に続ける。ここで、マーカのポプジティブ発現（＋）は、同じ細胞を特異的に結合しないアイソタイプ一致抗体で染色することによる中央蛍光値の少なくとも３０％の増加を意味する。換言すると、ＣＤ３及びＣＤ１３７並びに／又はＣＤ３及びＣＤ６９並びに／又はＣＤ３及びＣＤ１５０、並びに／又はＣＤ３及びＩＣＯＳを発現するＴ細胞はＦＡＣＳ又はＭＡＣＳを使用して単離される。当業者は、細胞がＦＡＣＳによって単離される実例では、２つの（又はより多くの）異なるマーカの発現がポジティブな細胞は単一ステップで単離されることができることを承知している。磁気分離が使用される場合、２つの異なるマーカの発現がポジティブな細胞を単離するために、２つの別個のステップを行なわなければならない。
【００２３】単離するステップは、ＭＲ１制限活性を表示するＴ細胞を選択するステップを含む。換言すると、このステップは、ＭＲ１上で提示された抗原によって活性化されるＴ細胞を単離するステップを含む。
【００２４】特定の実施形態では、単離するステップは、ＭＲ１を発現する細胞をもちいた刺激がＭＲ１を発現していない細胞を用いた刺激と比較した場合、ＩＦＮ−γ及び／又はＧＭ−ＣＳＦ放出から選択されるサイトカインの発現が２倍増加したことを示すＴ細胞を選択するステップを含む。
【００２５】当業者は、ＭＲ１発現癌細胞がＭＲ１の上に特定の癌抗原、又は多くの特定の癌抗原を提示することを承知している。
【００２６】特定の実施形態では、単離するステップはＭＲ１を発現する腫瘍細胞を用いた刺激がＭＲ１を発現していない腫瘍細胞（同じ起源又は同じ細胞株）を用いた刺激と比較した場合、ＩＦＮ−γ及び／又はＧＭ−ＣＳＦ放出から選択されるサイトカインの発現が２倍増加したことを示すＴ細胞を選択するステップを含む。
【００２７】反応する細胞は、ＭＲ１発現癌細胞（ＭＲ１制限的様式における癌抗原を提示する）に接触したことに応じて、活性化マーカ（特に前節に引用されたマーカ）を上方制御し、サイトカインを放出し、増殖し始めるものである。
【００２８】換言すると、ＭＲ１制限活性を表示するＴ細胞は、ＭＲ１によって表示された腫瘍関連抗原によって活性化されることができるＴ細胞である。
【００２９】これらの細胞は、マーカ特異的な適切な蛍光標識抗体を用いて染色後、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）によって、又は適切な抗体で標識された磁気ビーズによってソートすることによって分類されることができる（臨床環境中の通常の分類方法である）。
【００３０】特定の実施形態では、単離するステップはそれらの活性状態の機能としてソートされた細胞の個々のクローンを増殖するステップ、そして、ＭＲ１制限活性を表示するＴ細胞クローン、特にＭＲ１を発現する細胞を用いた刺激がＭＲ１を発現していない細胞を用いた刺激と比較した場合、ＩＦＮ−γ及び／又はＧＭ−ＣＳＦ放出から選択されるサイトカインの発現が２倍増加したことを示す細胞を選択するステップを含む。
【００３１】特定の実施形態では、方法は、単離するステップにおいて単離されたＴ細胞のＴ細胞受容体をコードする核酸配列を決定するステップをさらに含む。特定の実施形態では、方法は、単離するステップで単離されたＴ細胞の両方のＴ細胞受容体鎖をコードする２つの核酸配列を決定するステップを含む。
【００３２】本発明の別の態様は、外因性抗原がない状態においてＭＲ１に反応する遺伝子組換えＭＲ１Ｔ細胞の調合液を生産する方法に関する。方法は、第１に、患者の中でどのＴ細胞受容体がＭＲ１発現癌に特異的に反応する可能性が最もありそうか決定するステップ、そして、細胞の中へ導入された発現コンストラクトからこれらの特異的Ｔ細胞受容体遺伝子を発現しているＴ細胞集団を準備するステップ、これらの設計されたＴ細胞を患者に投与するステップを包含する。
【００３３】この方法は、以下のステップを含む。
ａ．患者から得られた腫瘍サンプルを提供するステップ
ｂ．ＭＲ１と反応する、下記のいずれかの複数のＭＲ１Ｔ細胞受容体分子を用いて前記腫瘍サンプルと接触するステップ
−  複数のＴ細胞クローン上で提示され、各Ｔ細胞クローンはＭＲ１に反応するＭＲ１Ｔ細胞受容体分子によって特徴付けられる；又は
−  標識される可溶性ＭＲ１Ｔ細胞受容体分子のようにかつそれらの認識が、非細胞依存的様式で分析される；
ｃ．前記腫瘍サンプルに特異的に反応する多くのＴ細胞クローンを同定するステップ
ｄ．Ｔ細胞調合液、特に同じ患者から得られたＴ細胞調合液を提供するステップ
ｅ．ステップｃにおいて、前記Ｔ細胞調合液中で前記腫瘍サンプルと特異的に反応するとして同定されたＴ細胞クローン上で発現するＭＲ１反応性Ｔ細胞受容体分子をコードする核酸発現コンストラクトを導入するステップ、遺伝子組換えＴ細胞調合液を産出するステップ。
【００３４】したがって、患者に対する遺伝子組換えＴ細胞調合液を、患者に投与することができるかもしれない。
【００３５】特定の実施形態では、前記Ｔ細胞調合液は同じ患者から得られる（自己由来の養子関係のＴ細胞療法）。この方法は、副作用の危険、特に設計されたＴ細胞調合液の内因的なＴ細胞受容体によってドライブされるアロ免疫反応の回避という利点を有する。
【００３６】特定の実施形態では、前記Ｔ細胞調合液は、別の患者、特にＨＬＡ一致患者から得られる（同種異型の養子関係のＴ細胞療法）。ＨＬＡ一致の質に依存する一方、アロ免疫の危険は重要であり得、選択できるあらかじめ作製されたＴ細胞（ＴＣ）調合液を数多く揃える物流及び手続き的な長所は、はるかに高いコスト及び特注の患者個人療法の規定上の障害と比較して、はるかにより大きな患者群集へのこの療法を促進し得る。
【００３７】Ｔ細胞調合液の中へのＭＲ１Ｔ細胞受容体発現コンストラクトの導入は、レンチウイルスの形質導入によって（発明者は、ＭＲ１Ｔ細胞の研究の中で慣例的にそれを使用した）、又はＤＮＡ発現ベクター（プラスミド）又はＲＮＡトランスフェクションの標準分析法によって実現されてもよい。当業者は適切な試験計画書及び手続きを承知している。
【００３８】任意に、遺伝子組換えＴ細胞調合液は、それらの数を増殖するために患者に投与される前に培養液中でしばらくの間維持されてもよく、また任意に、特に所望のＴ細胞集合へそれらの分化を刺激するために患者に投与される前にさらに培養液中でしばらくの間維持されてもよい。
【００３９】特定の実施形態では、前記患者から得られたＴ細胞調合液は患者の末梢血から得られ、特に、前記Ｔ細胞調合液は、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ５７を含むグループから選択された、１つ又はいくつかのＴ細胞マーカの発現に関する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を選択することによって得られる。
【００４０】特定の実施形態では、前記患者から得られたＴ細胞調合液は、腫瘍生検から得られ、その後に生体外での増殖が続く。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、フィトヘマグルチニン、ＩＬ−２、ＩＬ−７及びＩＬ−１５が存在する状態で増殖される。増殖するＴ細胞は、磁気選別によって単離され、設計されたＴ細胞受容体又は腫瘍特異的ＭＲ１制限Ｔ細胞のクローニング及び単離に使用される。単離されたＭＲ１Ｔ細胞は、ＴＣＲ遺伝子クローニングに使用される。
【００４１】複数のＭＲ１特異的Ｔ細胞クローンは手順に先立って準備されることができ、腫瘍の迅速なキャラクタリゼーションの必要が発生する場合は常に、その場限りの使用に関するライブラリ又はパネルの形式で保持することができる。このステップは、本質的に特定の腫瘍実体を認識するＭＲ１特異的Ｔ細胞受容体分子の同定である。
【００４２】代わりに、可溶性ＭＲ１Ｔ  ＴＣＲが生成され、かつ多量体化されてもよい（Ｓｕｂｂｒａｍａｎｉａｎ  ｅｔ  ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２２、１４２９（２００４）を参照）。ＴＣＲ多量体は蛍光色素で標識され、腫瘍生検から単離された腫瘍細胞を染色するのに使用されるだろう。可溶性ＭＲ１Ｔ  ＴＣＲ多量体の結合は、腫瘍細胞を認識するそのＭＲ１Ｔ  ＴＣＲの能力を示し、したがってその患者における遺伝子療法にふさわしいＭＲ１Ｔ  ＴＣＲの選択を容易にするだろう。
【００４３】本発明の別の態様は、機能的なＴ細胞受容体ヘテロ二量体、又はＴ細胞受容体β鎖と共に機能的なＴ細胞受容体ヘテロ二量体を形成することができるＴ細胞受容体α鎖、及び／又はＴ細胞受容体α鎖と共に機能的なＴ細胞受容体ヘテロ二量体を形成することができるＴ細胞受容体β鎖をコードする核酸配列を含む発現ベクターに関し、また転写におよぶ。注目すべきは、さらにＭＲ１特異的γ−δヘテロ二量体が発明者によって発見され、したがって、同様のことがこれらの鎖に当てはまる。
【００４４】発現ベクターがＴ細胞受容体α鎖又はＴ細胞受容体β鎖（又はγ又はδ鎖）をコードする核酸配列を含む実施形態では、前記細胞による機能性Ｔ細胞受容体ヘテロ二量体の発現を可能にするために細胞へ２つの異なる発現ベクター（１つはα鎖（γ鎖）をコードし、１つはβ鎖（δ鎖）をコードする）を導入しなければならない。Ｔ細胞受容体ヘテロ二量体は、ＭＲ１分子と特異的に結合し、前記ＭＲ１分子は腫瘍細胞上で発現され、腫瘍関連抗原を提示する。
【００４５】上記で言及された核酸配列の発現は、哺乳動物細胞、特にヒトＴ細胞において操作可能なプロモータ配列によって制御される。特定の実施形態では、プロモータは本質的に活性化されたプロモータであり、例えば、ＣＭＶ前初期プロモータが分子生物学の中で一般に使用される。特定の他の実施形態では、プロモータは誘導プロモータである。
【００４６】本発明のこの態様の特定の実施形態では、発現ベクター内に含まれた核酸配列が配列番号０２７〜０３８から選択された核酸配列であり又は含み、及び／又は配列番号００１〜０１２（α鎖）から選択されたアミノ酸配列をコードする。
【００４７】本発明のこの態様の特定の実施形態では、発現ベクター内に含まれた核酸配列が配列番号０３９〜０５０から選択された核酸配列であり又は含み、及び／又は配列番号０１３〜０２４（β鎖）から選択されたアミノ酸配列をコードする。
【００４８】特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号０５１によってコードされたＴ細胞受容体γ鎖をコードする又は配列番号０２５によって指定されたＴ細胞受容体γ鎖をコードする。
【００４９】特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号０５２によってコードされたＴ細胞受容体δ鎖をコードする又は配列番号０２６によって指定されたＴ細胞受容体δ鎖をコードする。
【００５０】本発明の別の態様は、機能性Ｔ細胞受容体ヘテロ二量体をコードする核酸配列に関する。Ｔ細胞受容体ヘテロ二量体は、腫瘍関連抗原を提示する腫瘍細胞上で発現された非多型ＭＨＣＩ関連（ＭＲ１）抗原提示分子と特異的に結合する。
【００５１】特定の実施形態では、核酸配列はＴ細胞受容体α鎖をコードしかつ配列番号０２７〜０３８から選択され、又は配列番号００１〜０１２から選択されたアミノ酸配列によって指定されたＴ細胞受容体α鎖をコードする。
【００５２】特定の実施形態では、核酸配列はＴ細胞受容体β鎖をコードし、配列番号０３９〜０５０から選択され、又は配列番号０１３〜０２４から選択されたアミノ酸配列によって指定されたＴ細胞受容体β鎖をコードする。
【００５３】特定の実施形態では、ＭＲ１Ｔ細胞受容体は、ここに開示された１つのα鎖及び１つのβ鎖から構成される。発明者は、驚いたことに機能性ＴＣＲ分子をＭＲ１を認識することができるようにするために、α及びβ鎖が組み合わせられ得ることを発見した。
【００５４】特定の実施形態では、ＭＲ１Ｔ細胞受容体は、次のリストの配列によって指定されるような１つのα鎖及び１つのβ鎖から構成される：
ａ．配列番号００１及び０２３、
ｂ．配列番号００２及び０２２、
ｃ．配列番号００３及び０２１、
ｄ．配列番号００４及び０２０、
ｅ．配列番号００５及び０１９、
ｆ．配列番号００６及び０１７、
ｇ．配列番号００７及び０１８、
ｈ．配列番号００８及び０１６、
ｉ．配列番号００９及び０１５、
ｊ．配列番号０１０及び０１４、
ｋ．配列番号０１１及び０１３、
ｌ．配列番号０１２及び０２４、又は
ｍ．配列番号０２５及び０２６。
【００５５】本発明の別の態様は、非多型ＭＨＣＩ関連ＭＲ１抗原提示分子と結合するＴ細胞受容体タンパク質に関する。ＭＲ１分子は腫瘍細胞上で発現され、腫瘍関連抗原を提示する。特定の実施形態では、非多型ＭＨＣＩ関連ＭＲ１抗原提示分子と結合するＴ細胞受容体タンパク質は、本発明の最初の態様による方法によって同定される。
【００５６】特定の実施形態では、Ｔ細胞受容体タンパク質は、配列番号００１〜０１２から選択されたアミノ酸配列によって特徴付けられたＴ細胞受容体α鎖及び配列番号０１３〜０２４から選択されたアミノ酸配列によって特徴付けられたＴ細胞受容体β鎖を含む。
【００５７】特定の実施形態では、Ｔ細胞受容体タンパク質は、アミノ酸配列配列番号２５によって特徴付けられたＴ細胞受容体γ鎖及びアミノ酸配列番号２６によって特徴付けられたＴ細胞受容体δ鎖を含む。
【００５８】本発明の別の態様は、本発明による発現ベクターを含む組換え細胞及び／又は前節中で指定されるような本発明によるＴ細胞受容体ポリペプチドに関する。当業者は、発現ベクターがＴ細胞受容体α鎖（又はγ鎖）又はＴ細胞受容体β鎖（又はδ鎖）の両方ではなく一方のみをコードする核酸配列を含む場合では、前記細胞による機能性Ｔ細胞受容体ヘテロ二量体の発現を可能にするために組換え細胞へ２つの異なる発現ベクター（１つはα／γ鎖をコードし、１つはβ／δ鎖をコードする）が導入されなければならないことを承知している。特定の実施形態では、組換え細胞は末梢血に由来したＴ細胞である。特定の実施形態では、組換え細胞は腫瘍浸潤リンパ球に由来する。
【００５９】しかし、本発明の別の態様は、癌の療法又は予防の方法で使用される本発明の以前に指定された態様による組換え細胞の使用に関する。方法は、組換え細胞の投与を含む。
【００６０】特定の実施形態では、癌はＭＲ１発現によって特徴付けられる。
【００６１】特定の実施形態では、投与は養子関係のＴ細胞免疫療法によってもたらされる。
【００６２】本発明は、癌の治療法又は再発の予防にさらに関し、本発明による組換え細胞の投与を含む。特定の実施形態では、癌はＭＲ１発現によって特徴付けられる。
【００６３】特定の実施形態では、投与は養子関係のＴ細胞免疫療法によって達成される。
【００６４】本発明は、核酸配列のコレクションにも関し、コレクションの各メンバは異なるＴ細胞受容体α鎖、Ｔ細胞受容体β鎖、Ｔ細胞受容体γ鎖、Ｔ細胞受容体δ鎖又はＴ細胞受容体α鎖及びβ鎖状の組合せ、若しくはＴ細胞受容体γ鎖及びδ鎖状の組合せをコードすることを特徴とし、前記組合せは、癌抗原を提示するＭＲ１分子と特異的に結合することができる。核酸配列は、哺乳動物細胞中でＴ細胞受容体α鎖、β鎖若しくはα及びβ鎖の組合せの発現を促進することができる。
【００６５】そのようなコレクションは、患者から集められたＴ細胞の中への導入に関する遺伝子組換えコンストラクトを選択するのに使用されるだろう。治療法の第１段階において腫瘍によって提示された腫瘍抗原の特定のセットへの反応に適合するのに最適なＴＣＲ配列の同定後、医師は迅速に患者のＴ細胞へ遺伝子導入を達成するためにＧＭＰの下で製造されたそのようなコレクションからあらかじめ生成された発現ベクターを選択する必要があるだろう。
【００６６】特定の実施形態では、コレクションは、配列番号２７〜５２から選択された配列及び／又は配列番号１〜２６から選択されたＴ細胞受容体分子（又はα鎖又はβ鎖、若しくはγ鎖又はδ鎖を構成するＴ細胞受容体）をコードする配列を含む。
【００６７】しかし、本発明の別の態様は組換えＴ細胞のコレクションに関し、コレクションの各メンバは、癌抗原を提示するＭＲ１分子と特異的に結合することができる遺伝子組換えＴ細胞受容体として発現する。特定の実施形態では、コレクションは、本発明のそれぞれの態様によるＴ細胞受容体タンパク質ヘテロ二量体を含む組換えＴ細胞を含む。
【００６８】発明者は、ＭＲ１依存的様式で様々な腫瘍細胞と反応するヒトＭＲ１制限Ｔ細胞の新規な集団を同定し単離した。ＭＲ１Ｔ細胞クローンは、一般に異なる健常人の血液中で見つかり、種々のＴＣＲ遺伝子を発現させて、以前に同定されたＭＲ１の微生物又は葉酸由来のリガンドを認識しなかった。代わりに、それらは、腫瘍細胞から単離され、ＭＲ１によって提示された未知の抗原の種々のセットを認識した。腫瘍細胞に関連した刺激性抗原の同定及びキャラクタリゼーションは、現在進行中である。ＭＲ１Ｔ細胞クローンは異なる型の腫瘍細胞を認識して殺し、したがって、標識された抗腫瘍活性を生体外で表示した。さらに、それらは、Ｔｈ１、Ｔｈ２、及びＴｈ１７サイトカインの異なる組合せを放出し、多数のケモカイン受容体発現プロフィールを表示し、発現型・機能的な多様性を示唆する。重要なことには、対になったＴＣＲα及びβ遺伝子若しくは個々のＭＲ１Ｔ細胞クローンから単離されたＴＣＲγ及びδ遺伝子がＴＣＲ欠損Ｔ細胞へ導入された場合、受容体Ｔ細胞はＭＲ１発現腫瘍細胞を認識する能力を獲得し、それにより、ＭＲ１Ｔ細胞ＴＣＲ遺伝子導入がこの種の腫瘍認識に十分でありかつＭＲ１発現腫瘍細胞を認識するように選択したＴ細胞に指示するために使用され得ることを示す。
【００６９】まとめると、これらの発見は、腫瘍免疫中で種々の潜在的な役割を有する非多型ＭＲ１分子に制限された腫瘍反応性ヒトＴ細胞の新規な機能的に多様な集団を明らかにし、それにより、癌免疫監視及び免疫療法に新規な概念フレームワークを提供する。
【００７０】本明細書では、次の略語が使用される：
ＡＰＣ：抗原提示細胞
β２ｍ：β２ミクログロブリン
ＤＣ：樹状細胞
ＧＭ−ＣＳＦ：顆粒球マクロファージコロニー刺激因子
ＨＰＬＣ：高圧液体クロマトグラフィー
ＩＦＮ−γ：インターフェロン−γ
ｍＡｂ：モノクローナル抗体
ＭＡＩＴ細胞：粘膜関連不変Ｔ細胞
ＭＨＣ：腫瘍組織適合遺伝子複合体
ＭＲ１：ＭＨＣＩ関連分子
ＭＲ１Ｔ細胞：ＭＲ１制限Ｔ細胞
ＰＢＭＣ：末梢血単核細胞
ＴＣＲ：Ｔ細胞受容体
ＴＩＬ：腫瘍浸潤リンパ球
【００７１】本発明は、以下の例及び図によってさらに説明され、それらからさらなる実施形態及び長所が説明される。これらの例は、発明を示すのが目的であり、その範囲を制限するものではない。
【実施例】
【００７２】方法
細胞。次のヒト細胞株がアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から得られた：Ａ３７５（メラノーマ）、ＴＨＰ−１（骨髄単球性白血病）、Ｊ．ＲＴ３−Ｔ３．５（ＴＣＲβ欠損Ｔ細胞白血病）、ＬＳ  １７４Ｔ（結腸腺癌）、ＨＣＴ１１６（結腸癌）、Ｈｕｈ７（肝細胞癌）、ＨＥＫ  ２９３（ヒト胚腎臓）及びＣＣＲＦ−ＳＢ（急性Ｂ細胞リンパ芽球性白血病）。ＳＫＷ−３細胞（ＴＣＲα、β、γ及びδ遺伝子が欠損しているヒトＴ細胞白血病）は、ライプニッツ研究所ＤＳＭＺ・ドイツ微生物細胞培養コレクション（Ｌｅｉｂｎｉｚ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＤＳＭＺ−Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）から得られた。２つの代表的なＭＡＩＴクローン（ＭＲＣ２５及びＳＭＣ３）及び１つのＴＣＲγδクローン（Ｇ２Ｂ９）（Ｇｏｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １９７，１６３−１６８（２００３））は対照細胞としてこの研究の中で使用され、２人の健康なドナーの血液から生成され、以前に記述される（Ｌｅｐｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＮａｔＣｏｍｍｕｎ  ５  ３８６６（２０１４））ような培養液中で維持された。ＭＲ１Ｔ細胞は、「Ｅｔｈｉｋｋｏｍｍｉｓｉｏｎ  Ｎｏｒｄｗｅｓｔ  ｕｎｄ  Ｚｅｎｔｒａｌｓｃｈｗｅｉｚ／ＥＫＮＺ（１３９／１３）」の承認のもと、血液採取の時にインフォームドコンセントがドナーから得られた後に健常人の末梢血から単離された。簡潔に、ネガティブセレクション（ＥａｓｙＳｅｐＴＭＨｕｍａｎ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｋｉｔ、ＳｔｅｍＣｅｌｌ）によって精製されたＴ細胞は、３週間放射線を照射された（８０グレイ）Ａ３７５−ＭＲ１細胞（比率２：１）で週に一度刺激された。ヒトｒＩＬ−２（５Ｕ／ｍｌ；Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ）、ｒＩＬ−７及びｒＩＬ−１５（両方とも５ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）は、各刺激の後に＋２日及び＋５日で加えられた。最後の刺激の１２日後、細胞は洗浄され、そしてＡ３７５−ＭＲ１細胞（比率２：１）と一晩共培養された。その後、ＣＤ３＋ＣＤ６９＋ＣＤ３７＋細胞は、ＰＨＡ（１μｇ／ｍｌ、Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ）、ヒトｒＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ、Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ）及び照射されたＰＢＭＣ（５ｘ１０５細胞／ｍｌ）がある状態で限界希釈法によって分類されクローニングされた。他の実験では、ＭＲ１Ｔ細胞クローンは、Ａ３７５−ＭＲ１細胞（比率２：１）を用いた単一の一晩の刺激を受けてソートされたＣＤ３＋ＣＤ６９＋ＣＤ１３７＋からの同じプロトコルを使用して生成された。Ｔ細胞クローンは同じプロトコルに従い周期的に再度刺激された（Ｌｅｐｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，同書中）。単球及びＢ細胞は、製造者の取扱説明書によってＥａｓｙＳｅｐ  Ｈｕｍａｎ  ＣＤ１４  ａｎｄ  ＣＤ１９  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔｓ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、健康なドナーのＰＢＭＣから精製された（＞９０％  純度）。Ｍｏ−ＤＣは��以前に記述されるとおり（Ｌｅｐｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，同書中）ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４がある状態で培養によって精製されたＣＤ１４＋モノサイトから分化された。ヒト正常腸上皮細胞（ＧＥＣ）は、公表されたプロトコルによる腫瘍のない個体の腸生検から単離された（Ｇｒａｖｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ４１４，２０−３１（２０１４））。【００７３】β２ｍと共有結合で結合されたＭＲ１Ａ遺伝子を発現させる細胞の生成。柔軟なＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーを介してβ２ｍにリンクされたヒトＭＲ１Ａ相補的ＤＮＡコンストラクトは、以前に記述される（Ｌｅｐｏｒｅら、同書中）ようなＰＣＲによって生成された。ＭＲ１Ａ相補的ＤＮＡの中のＫ４３Ａ置換は、次のプライマーを使用して融合コンストラクトへ導入された：ＭＲ１Ｋ４３Ａ＿ｆ  ５’−ＣＴＣＧＧＣＡＧＧＣＣＧＡＧＣＣＡＣＧＧＧＣ（配列番号５３）及びＭＲ１Ｋ４３Ａ＿ｒ  ５’−ＧＣＣＣＧＴＧＧＣＴＣＧＧＣＣＴＧＣＣＧＡＧ（配列番号５４）。得られたＷＴ及び突然変異体コンストラクトは、双方向レンチウイルスベクター（ＬＶ）（Ｌｅｐｏｒｅら、同書中）へクローニングされた。ＨＥＫ２９３細胞は、製造者の取扱説明書に従いＭｅｔａｆｅｃｔｅｎｅＰｒｏ（Ｂｉｏｎｔｅｘ）を使用して、個々のＬＶ−ＭＲ１Ａ−β２ｍコンストラクトで、レンチウイルス・パッケージング・プラスミド  ｐＭＤ２．Ｇ、ｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ及びｐＲＳＶ−ＲＥＶ（Ａｄｄｇｅｎｅ）と共に、トランスフェクトされた。Ａ３７５細胞及びＴＨＰ−１細胞は、８μｇ／ｍｌ  硫酸プロタミンが存在する上清を含むウィルス粒子によるスピンインフェクションによって形質転換された。ＭＲ１の表面発現は流動細胞計測法によって評価され、陽性細胞はＦＡＣＳソートされた。【００７４】可溶性組換えβ２ｍ−ＭＲ１−Ｆｃ融合タンパク質。β２ｍ−ＭＲ１−Ｆｃ融合コンストラクトは、テンプレートとして上記されたヒトＭＲ１Ａ−β２ｍコンストラクトを使用して得られた。β２ｍ−ＭＲ１Ａ遺伝子に相補的なＤＮＡは、プライマーを使用するＰＣＲによって増幅された：β２ｍＸｈｏＩ＿ｆ  ５’−ＣＴＣＧＡＧＡＴＧＴＣＴＣＧＣＴＣＣＧＴＧＧＣＣＴＴＡ（配列番号５５）及びＭＲ１−ＩｇＧ１＿ｒ  ５’−ＧＴＧＴＧＡＧＴＴＴＴＧＴＣＧＣＴＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＡＣＣＴＧ（配列番号５６）、そのため、ＭＲ１膜貫通及び細胞内ドメインを除外する。ヒトＩｇＧ１重鎖のヒンジ領域及びＣＨ２−ＣＨ３領域へ相補的なＤＮＡは次のプライマーを使用して生成された：ｐＦＵＳＥ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ１（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）からのＮｈｅＩ−ヒンジ−ｆ  ５’−ＣＡＧＧＴＣＣＣＣＣＡＧＧＣＴＡＧＣＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣ（配列番号５７）及びＩｇＧ１ＮｏｔＩ＿ｒ  ５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡ（配列番号５８）。β２ｍＭＲ１Ａ及びＩｇＧ１  ＰＣＲプロダクトは、オーバーラップエクステンションＰＣＲを用いたツーステップスプライシングを使用して連結され、得られたコンストラクトはＢＣＭＧＳＮｅｏ発現ベクターのＸｈｏＩ／ＮｏｔＩサイトへサブクローニングされた。ＣＨＯ−Ｋ１細胞は、Ｍｅｔａｆｅ��ｔｅｎｅＰｒｏ（Ｂｉｏｎｔｅｘ）を使用し、最終コンストラクトでトランスフェクトされ、限界希釈法によってクローニングされ、そしてβ２ｍ−ＭＲ１−Ｆｃ融合蛋白質の生成をＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。ＥＸ−ＣＥＬＬ  ＡＣＦ  ＣＨＯ無血清培地（Ｓｉｇｍａ）へ導入された、選択されたクローンは、タンパク質産生に使用され、β２ｍ−ＭＲ１−Ｆｃは、製造者の取扱説明書によってＰｒｏｔｅｉｎ−Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して精製された。タンパク質の完全性及び精製は、抗ＭＲ１  ｍＡｂ  ２５．６（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用するウエスタンブロット及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認された。【００７５】流動細胞計測法と抗体。細胞表面標識化は標準プロトコルを使用して行なわれた。細胞内の標識化は製造者の取扱説明書によるＴｒｕｅ−ＮｕｃｌｅａｒＴＭ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓｅｔを使用して行なわれた。次の抗ヒトｍＡｂｓがＢｉｏｌｅｇｅｎｄから得られた：ＣＤ４−ＡＰＣ（ＯＫＴ４）、ＣＤ８α−ＰＥ（ＴｕＧｈ４）、ＣＤ１６１−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７（ＨＰ−３Ｇ１０）、ＣＤ６９−ＰＥ（ＦＮ５０）、ＣＤ３−ＰＥ／Ｃｙ７、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ−７１１、又はＡｌｅｘａ−７００（ＵＣＨＴ１）、ＣＤ１３７ビオチン（ｎ４ｂ４−１）、ＣＸＣＲ３−Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ４２１（Ｇ０２５Ｈ７）、ＣＤ８３ビオチン（ＨＢ１５ｅ）、ＭＲ１−ＰＥ（２６．５）及びＴＲＡＶ１−２−ＰＥ（１０Ｃ３）。ＣＤ８６−ＦＩＴＣ（２３３１）、ＣＣＲ４−ＰＥＣｙ７（１Ｇ１）及びＣＣＲ６−ＰＥ（１１Ａ９）のｍＡｂｓは、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎからだった。これらのｍＡｂｓはすべて５μｇ／ｍｌで使用された。ビオチン化されたｍＡｂｓは、ストレプトアビジン−ＰＥ及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８、又はＢｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ４２１（２μｇ／ｍｌ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で明らかにされた。サンプルはＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）上で得られた。細胞選別実験はＩｎｆｌｕｘ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して行なわれた。死細胞とダブレットは、前方散乱エリア及び幅の基礎、側方散乱及びＤＡＰＩ染色上で除外された。データはすべてＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を使用して分析された。【００７６】ＭＲ１Ｔ細胞クローンのＴＣＲ遺伝子分析。ＴＣＲα及びβ、又はＭＲ１Ｔ細胞クローンによる遺伝子ＴＣＲγ及びδの発現は、合計の相補的ＤＮＡ及び特異なプライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲによって、又は製造者の取扱説明書に従いＩＯＴｅｓｔ（登録商標）Ｂｅｔａ  Ｍａｒｋ  ＴＣＲ  Ｖβ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  Ｋｉｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）又はｐａｎγδのＴＣＲに特有の単クローン抗体（Ｂ１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用する流動細胞計測法によってのどちらかで評価された。ＲＴ−ＰＣＲについては、ＲＮＡはＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ＲＮＡ  ＩＩ  Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ  Ｎａｇｅｌ）を使用して準備された。また、相補的ＤＮＡはＳｕｐｅｒｓｃ��ｉｐｔ  ＩＩＩ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して合成された。ＴＣＲα、β、γ及びδ相補的ＤＮＡは、製造社（ＴＣＲ  ｔｙｐｉｎｇ  ａｍｐｌｉｍｅｒ  ｋｉｔ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）の指示どおりＶα、Ｖβ、Ｖγ、及びＶδのプライマーのセットを使用して増幅された。機能的な転写物はシーケンスにより識別され、次に、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ情報システム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）を使用して分析された。【００７７】ＴＣＲ遺伝子導入。ＭＡＩＴ細胞クローンＭＲＣ２５からのＴＣＲα及びβの機能的な相補的ＤＮＡは、ＢＣＭＧＳＮｅｏ発現ベクター（Ｋａｒａｓｕｙａｍａ  ａｎｄ  Ｍｅｌｃｈｅｒｓ  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８８  １８：９７−１０４）のＸｈｏＩ／ＮｏｔＩサイトへクローンを作られた。また、得られたコンストラクトは、標準手順によるエレクトロポレーションによってＪ．ＲＴ３−Ｔ３．５細胞を共同トランスフェクトするために使用された。ＴＲＡＶ１−２及びＣＤ３を発現するトランスフェクタントはＦＡＣＳソートされた。ＴＣＲα及びβ、又はＭＲ１ＴクローンからのＴＣＲγ及びδの機能的な相補的ＤＮＡは、プラスミド５２９６２（Ａｄｄｇｅｎｅ）発現ベクターの改変版のＸｍａＩ／ＢａｍＨＩサイトへクローンを作られた。ＳＫＷ−３細胞は上述されるように生成されたウィルス粒子を含んでいる上清で形質導入された。細胞は、ＣＤ３発現に基づいてＦＡＣＳソートされた。【００７８】細胞及び全腫瘍溶解物の分画。細胞溶解物の全量は穏やかな超音波処理を用いて水中で破砕することで２．５×１０９のＴＨＰ−１細胞の単一のペレットから生成された。その後、超音波で処理された物質は遠心分離機にかけられ（４℃、１５分間、１５，０００ｇ）、上清は集められた（Ｓ１）。次に、ペレットはメタノール中で再懸濁され、超音波で処理され、前述のように遠心分離機にかけられ、得られた上清は、Ｓ１上清でプールされた。メタノールの最終濃度は１０％だった。その後、細胞抽出液の合計はＣ１８  Ｓｅｐ−Ｐａｋカートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に充填され、結合していない物質は集められ、乾燥された（分画Ｅ−ＦＴ）。結合された物質は、７５％（分画Ｅ１）及び１００％のメタノール（分画Ｅ２）を有するバッチ中で溶出された。Ｅ−ＦＴ物質はアセトニトリル／水（９：１ｖｏｌ／ｖｏｌ）中で再懸濁され、ＮＨ２  Ｓｅｐ−Ｐａｋカートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に充填された。結合していない物質（分画Ｎ−ＦＴ）及び４つの追加の分画が増加する多量の水で溶出された。分画Ｎ１は３５％のＨ２Ｏ、分画Ｎ２は６０％のＨ２Ｏ、分画Ｎ３は１００％のＨ２Ｏ、分画Ｎ４は１００％のＨ２Ｏ及び５０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ７．０）で溶出された。分画はすべて乾燥され、そして、−７０℃で格納される前に２０％のメタノール（分画Ｅ１、Ｅ２及びＮ−ＦＴ）又は１００％のＨ２Ｏ（他のすべての分画）中で再懸濁された。【００７９】記述される（Ｚｉｐｐｅｌｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ３、２３６−２４４（２０１５））ように、マウスＥＭＴ６胸腫瘍が準備された。新鮮に��除された腫物は、食塩水中で広範囲に洗浄され、重さを計測され、４ｇの塊は加圧型組織グラインダーを使用して、７ｍｌのＨＰＬＣグレード水の中でホモジナイズされた。腫瘍ホモジェネートは２回の結氷融解サイクルを行い、４℃で１０分間で遠心分離機にかけ（３，２５０ｇ）、そして上清は集められ、−７０℃で保管された。ペレットは２回２ｍｌのＨＰＬＣグレード水で抽出され、４℃１０分間で遠心分離機にかけられ（５，１００ｇ）、上清は集められて−７０℃で格納された。ペレットは、攪拌により室温で５分間、９ｍｌのＨＰＬＣグレードメタノールでさらに抽出され、４℃で１０分間遠心分離機にかけられ（５，１００ｇ）、上清は集められた。３つの上清は貯留され、乾燥され、水：メタノール（１０：１）の中へ再懸濁された。物質は、上記のようにＣ１８及びＮＨ２Ｓｅｐ−Ｐａｋカートリッジを使用して分画された。【００８０】Ｔ細胞活性化アッセイ。ＭＲ１制限Ｔ細胞（もし他の方法で示されなければ５×１０４／ｗｅｌｌ）は、二重または三重中の２００μｌ全容積の中で示された標的細胞（５×１０４／ｗｅｌｌ）で共培養された。Ｔ細胞は、示されたＡＰＣで２４時間培養された。いくつかの実験では、抗ＭＲ１  ｍＡｂｓ（クローン２６．５）又はマウスＩｇＧ２ａアイソタイプ対照ｍＡｂｓ（両方とも３０μｇ／ｍｌ）は、Ｔ細胞の追加に先立って添加され３０分インキュベートされた。大腸菌溶解物は、ＬＢ培地の中で育てられるＨ５α株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から準備され、指数的生長中に集められた、Ｄた。細菌細胞は、ＰＢＳの中で２度洗浄され、次に、超音波処理によって溶解された。遠心分離（１５分間、１５，０００ｇ）の後、上清は集められ、乾燥され、−７０℃で保管された。ＡＰＣは、Ｔ細胞の追加の前に１０８ＣＦＵ／ｍｌ（もし、他の方法で示されなかったならば）と等価な大腸菌溶解物で４時間パルス化された。いくつかの実験では、ＡＰＣは、Ｔ細胞を備えた共培養の前に４時間、６−ＦＰ又はＡｃ−６−ＦＰ（Ｓｃｈｉｒｃｋｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）であらかじめ培養された。ＴＣＲＶγ９及びＶδ２鎖を発現するＴＣＲγδ細胞を備えた対照実験では、ＡＰＣは、最初にＴ細胞追加前にゾレドロネート（１０μｇ／ｍｌ）で６時間処理された。プレート結合組換えヒトβ２ｍ−ＭＲ１−Ｆｃの活性化実験は９６ウェルプレートの上にβ２ｍ−ＭＲ１−Ｆｃをコーティングすることにより行なわれ（４μｇ／ｍｌ）、２度洗浄しＴ細胞を添加する前に３７℃で４時間カートリッジ精製された細胞溶解物で充填する。上清は２４時間後に集められ、ＩＦＮ−γ又はＧＭ−ＣＳＦはＥＬＩＳＡによって評価された。細胞培養上澄みの中の多数のサイトカイン及びケモカインは、Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘ  ＭＡＰヒトサイトカイン／ケモカイン磁気ビーズパネルを使用して分析された。製造者の取扱説明書によって４１  ｐｌｅｘ（ＨＣＹＴＭＡＧ−６０Ｋ−ＰＸ４１；Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を前もって混合した。サンプルはＦｌｅｘｍａｐ  ３Ｄシステム（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上で得られた。また、Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘアナリスト・ソフトウェアは、中間蛍光強度及び被検体濃度を決定するために使用された。【００８１】腫瘍細胞の��滅。死滅アッセイは、抗ＭＲ１  ｍＡｂ（３０μｇ／ｍｌ、クローン２６．５）がある状態又はない状態で、２４時間、異なるＥ／Ｔ比率で単独で又はＴ細胞とともに培養された標的細胞株（２×１０４細胞／ｍｌ）を使用して行なわれた。以前に記述されたように、標的細胞はＰＥ−Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ（ＢＤ）及びプロピジウムヨウ化物（ＰＩ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で染色された。Ｔ細胞は抗ＣＤ３  ｍＡｂｓで染色されることにより同定され、解析から除外した。アポトーシスは以下のように評価された：
Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ＋ＰＩ＋＝アポトーシス進行及びＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＰＩ＋＝ネクローシス。Ｔ細胞がない状態（自発的アポトーシス；Ｔ細胞はない）でのアポトーシスの＋壊死細胞のパーセンテージも示される。【００８２】統計。データは対応なしスチューデントｔ検定（Ｐｒｉｓｍ６（ＧｒａｐｈＰａｄｓｏｆｔｗａｒｅ））を使用して分析された。【００８３】健康なドナーの中の新規な腫瘍反応性ＭＲ１制限Ｔ細胞の同定及びキャラクタリゼーション
発明者は、ヒトＭＡＩＴ細胞のレパートリーに関する初期の研究の間に微生物のリガンドに反応しなかった異型のＭＲ１制限Ｔ細胞クローンを検出した。このＴ細胞クローン（ＤＧＢ１２９）は、表面のＭＲ１（ＣＣＲＦ−ＳＢリンパ芽球性白血病細胞又はＴＨＰ−１単球性白血病細胞；図１Ａ）を本質的に表示する細胞株を認識し又は任意の外来性の追加の抗原がない状態でＭＲ１遺伝子（Ａ３７５メラノーマ細胞；Ａ３７５−ＭＲ１；図１Ａ）を用いてトランスフェクトされた（図１Ｂ）。ＭＲ１＋標的細胞の無菌の（ｓｔｅｒｉｌｅ）認識は、抗ＭＲ１単クローン抗体（ｍＡｂｓ）（図１Ｂ）でブロックすることにより完全に阻害され、したがって同時にアッセイされた大腸菌由来抗原へのＭＡＩＴ細胞応答に似ていた（図１Ｃ）。重要なことには、ＤＧＢ１２９  Ｔ細胞は、合成ＭＡＩＴ細胞アゴニスト６，７−ジメチル−８−Ｄ−リビチルルマジン（ＲＬ−６、７−ｄｉＭｅ；図１Ｄ）を認識せず、対照ＭＡＩＴ細胞クローンとは異なり、その代りに、この化合物によってＭＲ１依存的様式で刺激された（図１Ｅ）。ＤＧＢ１２９細胞は、ＭＡＩＴ細胞に典型的な古典的な半不変のＴＣＲを発現しなかった（表１）。【００８４】発明者は、ＤＧＢ１２９クローンが微生物反応的ＭＡＩＴ細胞と異なる腫瘍反応的ＭＲ１制限Ｔ細胞の新規な集団の代表かどうか調査した。したがって、これらの予測されないＭＲ１制限Ｔ細胞を単離し研究する方法を樹立した。２人の健康なドナーから精製されたＴ細胞は、増殖マーカＣｅｌｌＴｒａｃｅ  ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）で標識され、また外因性抗原がない状態で放射線を照射されたＡ３７５−ＭＲ１細胞を用いて刺激された。増殖細胞はＡ３７５−ＭＲ１細胞を用いて再誘発され、これらの活性化マーカＣＤ１３７高いレベルの発現は、限界希釈法（図２Ａ）によって分類及びクローンニングされた。その後、個々のＴ細胞クローンは、Ａ３７５−ＭＲ１細胞及びＭＲ１欠損Ａ３７５（Ａ３７５−ＷＴ）細胞を認識するそれらの能力に関して調べられた。両方のドナーにおいて、発明者は、Ｔ細胞クローン（それぞれ１２６／１９５及び３７／５７）の主要分画がＡ３７５−ＭＲ１細胞（図２Ｂ、Ｄ）の特異的認識を表示し、それは抗ＭＲ１ブロックｍＡｂｓ（図２Ｃ、Ｅ）によって阻害されたことがわかった。１２のＭＲ１反応的なＴ細胞クローンをＴＣＲＶβ特異的ｍＡｂｓで染色することは、同じＴＲＢＶ遺伝子を共有するクローンのうちのいくつかでそれらが７つの異なるＴＲＢＶ鎖（ＴＲＢＶ４−３、６−５／６−６／６−９、９、１８、２５−１、２８、２９−１）を発現することを明らかにした。さらに、古典的ＭＡＩＴ細胞についていずれも、ＴＲＡＶ１−２鎖を発現しなかった。【００８５】特異的マーカの欠損は、標準の流動細胞計測法による生体外のこれらの新規なＴ細胞の一義的な同定をできなかった。したがって、それらの頻度は、超短時間の生体外の刺激及び単一のＴ細胞クローン作成実験の後に流動細胞計測法解析を組み合わせることにより推定された。５人の健康なドナーから精製された血液Ｔ細胞は、ＭＲ１欠損又はＭＲ１十分なＡ３７５細胞で一晩共培養され、活性化マーカＣＤ６９及びＣＤ１３７（図３Ａ）の発現に関して分析された。スクリーニングされた５人のドナーのすべてでは、検出されたＣＤ６９＋ＣＤ１３７＋Ｔ細胞の割合は、Ａ３７５−ＷＴ細胞（０．０１５−０．０３２％に及ぶ）（図３Ａ、Ｂ）との共培養の後によりもＡ３７５−ＭＲ１細胞（Ｔ細胞の０．０３４−０．０７２％に及ぶ）での刺激の後に一貫してより高かった。ＭＲ１発現の異なる２つのタイプのＡＰＣのように、ＭＲ１反応性Ｔ細胞はＭＲ１ポジティブＡＰＣで刺激の後に活性化Ｔ細胞の増大数の主な原因であった。このアプローチを使用して、発明者は、１：２，５００（０．０７２−０．０３２＝０．０４％）と１：５，０００（０．０３４−０．０１５＝０．０１９％）の範囲に及ぶ頻度で分析された個体の循環するＴ細胞プールがＡ３７５−ＭＲ１反応性Ｔ細胞を含むと推測した。この予測頻度は、抗原暴露（Ｌｕｃａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７８：７２８４−７２８７；Ｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３８：３７３−３８３）の後にペプチドに特有のＣＤ４＋Ｔ細胞の度数より高い。これらの観察は、並列の実験によって支援され、それはこれらのドナー（ドナーＣ、図３Ａ、右のパネル）のうちの１人からソートされたＣＤ６９＋ＣＤ１３７＋一晩活性化Ｔ細胞がクローニングされた。確かに、９６のスクリーニングされたＴ細胞クローンのうち３１（３２％）がＡ３７５−ＭＲ１細胞（図３Ｃ）への反応性を示し、それは抗ＭＲ１  ｍＡｂｓによって阻害された（図３Ｄ）。したがって、このドナーの血液Ｔ細胞の中のＡ３７５−ＭＲ１反応するＴ細胞の計算された頻度は、１：５，０００（０．０６５ｘ０．３２＝０．０２％）、評価された範囲と一致する値だった。３人のドナーに由来した代表的なＴ細胞クローンの詳細解析は、それらが種々のＴＣＲα及びβ鎖、及びＣＤ４、ＣＤ８及びＣＤ１６１（表１）の示された差異の発現を表示することを確認した。【００８６】まとめると、これらの調査結果は、同定された腫瘍反応的ＭＲ１制限Ｔ細胞が健康なヒト個体（今後、ＭＲ１Ｔ細胞と名付ける）の血液中のリンパ球の新規でさらに共通の多クローンの集団であることを示唆した。【００８７】ＭＲ１Ｔ細胞ＴＣＲ遺伝子導入は、腫瘍細胞のＭＲ１を制限された認識を与える
発明者は、次に腫瘍細胞へのＭＲ１Ｔ細胞応答性がＴＣＲによってもたらされるかどうか調査した。ＴＣＲ欠損ＳＫＷ−３細胞の異なるＭＲ１Ｔ細胞クローンからクローニングされた対になったＴＣＲα及びβ遺伝子の発現は、腫瘍細胞のＭＲ１認識を与え、オリジナルのＭＲ１Ｔ細胞によって表示されたそれに匹敵し、それは完全に抗ＭＲ１−ｍＡｂｓによってブロックされた（図４Ａ−Ｃ）。対照実験では、代表的なＭＡＩＴ細胞クローンのＴＣＲα及びβ遺伝子の導入は、大腸菌抗原がある状態でのみＭＲ１依存的様式でＡ３７５−ＭＲ１細胞を認識する能力を与えた（図４Ｄ）。これらのデータは、腫瘍細胞のＭＲ１Ｔ細胞認識を媒介する際のＴＣＲの重大な役割を強調し、ＭＲ１Ｔ細胞ＴＣＲ遺伝子導入がＭＲ１発現腫瘍細胞への選択されたＴ細胞の反応性を有効に再指示することができることを示唆した。【００８８】ＭＲ１Ｔ細胞クローンによる腫瘍細胞の特異的認識
ＭＲ１を発現するＡ３７５メラノーマ細胞に反応するＭＲ１Ｔ細胞クローンの大きなパネルを生成したことで、発明者は次に、ＴＨＰ−１骨髄単核細胞、Ｈｕｈ７ヘパトーマ細胞、ＨＣＴ１１６結腸癌細胞及びＬＳの１７４Ｔのゴブレット状の結腸腺癌細胞を含む表面のＭＲ１を本質的に発現する他のタイプの腫瘍細胞を認識することができたかどうかを調査した。すべてのこれらの細胞型は、微生物抗原がある状態及びＭＲ１依存の方法（図５Ａ）でＭＡＩＴ細胞活性化を支援した。同じ細胞は、様々な程度まで選択したＭＲ１Ｔ細胞クローンの無菌の活性化を引き起こすことができた。ＴＨＰ−１細胞は、大多数のテストされたＭＲ１Ｔ細胞クローンによって、続いてＨｕｈ７ヘパトーマ細胞、ＬＳの１７４Ｔのゴブレット状の細胞及びＨＣＴ１１６結腸癌細胞（図５Ｂ）によって認識された。重要なことには、反応はすべて抗ＭＲ１  ｍＡｂｓによってブロックされた。【００８９】これらのデータは、ＭＲ１Ｔ細胞が非多形性の抗原提示分子ＭＲ１に制限された腫瘍反応性Ｔ細胞の新しく不均一な集団であることをさらに確認した。【００９０】ＭＲ１Ｔ細胞は腫瘍細胞の中にあるＭＲ１に結合された抗原を認識する
発明者は、次に腫瘍細胞へのＭＲ１Ｔ細胞応答性の基準を検討した。まず、ＭＡＩＴ細胞との相似で、ＭＲ１Ｔ細胞クローンが微生物抗原を認識することができた可能性を決定的に除外しようと努力した。対照ＭＡＩＴ細胞クローンは大腸菌溶解物がある状態でのみＡ３７５−ＭＲ１細胞と反応したが、異なるＭＲ１Ｔ細胞クローンの活性化は大腸菌溶解物によって増強されなかった（図６Ａ）。これらのデータと一致して、ＭＲ１ネガティブのＡ３７５−ＷＴ細胞は大腸菌溶解物が添加されたかどうかに関係なく、一方のタイプのＴ細胞を刺激しなかった（図６Ａ）。また、重要なことには、抗ＭＲ１  ｍＡｂｓは効率的にＭＲ１Ｔ及びＭＡＩＴ細胞応答の両方をブロックした（図６Ａ）。これらの発見は、大腸菌及び刺激性ＭＡＩＴ細胞の中にある微生物のリガンドがテストされるＭＲ１Ｔ細胞を刺激しないことを確認した。【００９１】その後、発明者は、既知のＭＲ１リガンド６−ＦＰ及びＡｃ−６−ＦＰに対するＭＲ１Ｔ細胞の反応をテストした。それは、ＴＲＡＶ１−２−ネガティブＴ細胞の希少なサブセットを刺激し、かつ微生物抗原によるＭＡＩＴ細胞活性化阻害することが以前に報告されていた。ＭＲ１Ｔ細胞刺激は、６−ＦＰ又はＡｃ−６−ＦＰリガンド（さらに、それらは対照ＭＡＩＴ細胞の大腸菌刺激を妨害した）がある状態で妨害されが、同じＡＰＣによって示された同種抗原への対照ＴＣＲγδ細胞応答を妨害させず、それにより、化合物毒性（図６Ｂ、図６Ｃ及び図７Ａ−Ｃ）を除外した。顕著に、標的Ａ３７５細胞が不完全なリガンド結合能力（リジン４３のアラニンへの突然変異（Ａ３７５−ＭＲ１  Ｋ３４Ａ）によるリガンドを備えたシッフ塩基形成のブロック；図６Ｂ、Ｃ及び図７Ｄ、Ｅ）を備えた突然変異体ＭＲ１分子を発現するために形質導入された場合６−ＦＰ又はＡｃ−６−ＦＰは、ＭＲ１Ｔ細胞又はＭＡＩＴ細胞の活性化を阻害できない。６−ＦＰ又はＡｃ−６−ＦＰで観察された特異的抑制は、ＭＲ１Ｔ細胞はｉ）６−ＦＰ及びＡｃ−６−ＦＰを認識しない、ｉｉ）ＭＲ１に結合された細胞性抗原に反応し、ｉｉｉ）ＭＲ１を備えたシッフ塩基の形成を要求しないリガンドによって刺激されることを示す。【００９２】認識された抗原の起源についてのさらに詳しい情報を獲得するために、発明者は、いくつかのＭＲ１リガンド（例えば６−ＦＰ）が細胞培養に使用されたＲＰＭＩ１６４０培地中のフォラシンの存在に由来してもよいので、腫瘍標的細胞の刺激能が培地要素に依存するかどうか調査した。ＴＨＰ−１及びＡ３７５−ＭＲ１細胞の両方は、もっぱら５％のヒト血清で補充されたリン酸塩緩衝食塩水溶液（ＰＢＳ）で広範囲に４日洗浄及び培養された。細胞は、ＤＧＢ１２９  ＭＲ１Ｔ細胞を刺激するために使用される前に毎日洗浄された。また、Ｔ細胞活性化アッセイはＰＢＳの中で行なわれた。ＲＰＭＩ１６４０又はＰＢＳ中で育てられたＴＨＰ−１及びＡ３７５−ＭＲ１細胞は、同じ刺激能（図８Ａ、Ｂ）を示し、それにより、培地組成がＭＲ１Ｔ細胞活性化の原因ではないことを示した。その後、刺激する抗原が標的腫瘍細胞の中にあったかどうか直接調査するために、発明者は抗原の源として２タイプの腫瘍溶解物を使用し、Ｔ細胞活性化アッセイを行なっ��。第２の溶解物が切除直後にマウス胸腫物から準備された一方、第１の溶解物は生体外で培養されたＴＨＰ−１細胞から得られた。疎水性の２つの分画及び４つの親水性の分画が、本質的に低レベルのＭＲ１を発現するＡＰＣ  ＴＨＰ−１細胞として使用して得られテストされた。ＤＧＢ１２９クローンは、分画Ｎ４とのみ反応し、それは新鮮に移植されたマウス腫瘍及び生体外の培養されたＴＨＰ−１細胞（図８Ｃ、Ｄ）の両方から単離された親水性化合物を大いに含んでいる。これらの結果は、刺激性抗原がＲＰＭＩ１６４０の成分に由来する可能性を除外し、それらの細胞起源を示した。発明者は、ＤＧＢ７０、別の代表的なＭＲ１Ｔ細胞クローンとともに、ＴＨＰ−１溶解物から生成された分画もテストした。ＤＧＢ７０細胞は、Ｎ４ではなく分画Ｎ３を認識し（図８Ｅ）、少なくとも２つの別個の化合物が差別的に２つのＭＲ１Ｔクローンを刺激したことを示唆する。同じ分画も可塑性結合のＭＲ１分子に充填され、選択肢及び特異な刺激能を示した、つまりＮ３はＤＧＢ７０細胞だけを刺激した。その一方でＮ４はＤＧＢ１２９細胞だけ（図８Ｆ）を刺激し、Ｎ３とＮ４の分画がない状態で、２つのクローンはさらに特異性抗原の要求を示し、ＭＲ１に反応しなかった。【００９３】結論として、これらのデータは、ＭＲ１Ｔ細胞が培地に由来しないリガンドで組み合わせられたＭＲ１を認識し、生体内で育成した腫瘍細胞内にも提示することを示した。【００９４】ＭＲ１Ｔ細胞は差異の抗腫瘍反応を表示する
ＭＲ１Ｔ細胞の抗腫瘍活性を評価するために、発明者は、生体外で腫瘍細胞を直接殺す能力をテストした。２つの代表的なＭＲ１Ｔ細胞クローン（ＤＧＢ１２９及びＤＧＢ７０）が、効率的に様々なエフェクタ：ターゲット比率でＭＲ１発現ＴＨＰ−１及びＡ３７５細胞の両方を殺した（図９Ａ、Ｂ）。ターゲットが大腸菌感染した場合、それは完全に殺すことができたが（図示しない）、対照ＭＡＩＴ細胞クローンはこれらの２つの細胞タイプを殺さなかった。これらの結果は、ＭＲ１Ｔ細胞がＭＲ１を発現する腫瘍細胞に対する特異的な細胞毒性活性を表示することを示した。【００９５】発明者は、ＭＲ１Ｔ細胞が骨髄単球性の腫瘍細胞系統ＴＨＰ−１を認識し殺したと分かったので、次に、それらが異なるドナーから単球を含む正常な骨髄性細胞及び単球由来の樹状細胞（ＭｏＤＣ）も認識することができるかどうかに取り組んだ。単球はテストされたＭＲ１Ｔ細胞クローンのうちのどれによっても認識されなかった（図示しない）。対照的に、いくつかのＭＲ１Ｔ細胞クローンはＭＲ１依存的様式でＭｏＤＣに反応した（図９Ｃ）。興味深いことには、代表的なＤＧＢ１２９  ＭＲ１Ｔ細胞クローンで行なわれた実験は、ＭｏＤＣの認識がＭｏＤＣ死滅（図示しない）を結果的にもたらさないがＭｏＤＣによるＣＤ８３とＣＤ８６の活性化マーカの促進された上方制御をもたらしたことを明らかにした（図９Ｄ）。著しく、ＤＧＢ１２９細胞によって引き起こされたＭｏＤＣの活性化は、抗ＭＲ１  ｍＡｂｓによって完全に阻害された（図９Ｄ）。これらのデータは、いくつかの腫瘍反応的なＭＲ１Ｔ細胞が直接の抗腫瘍活性を誘発しさらに、有効な抗腫瘍免疫反応の樹立での重要な関係と共に、生得の免疫細胞の活性化を促進することを示唆した。【００９６】いくつかのＭＲ１Ｔ細胞クローンがＨＣＴ１１６とＬＳの１７４Ｔの腸の腫瘍細胞へ反応したと発明者が観察したとともに、それらは次にさらに、腸生検から準備された正常な腸上皮細胞（ＧＥＣ）を認識し得るかどうか調査した。ＧＥＣ細胞はテストされたＨＣＴ１１６又はＬＳ１７４Ｔ反応性ＭＲ１Ｔ細胞クローンのうちのどれにも刺激性でなく（図９Ｆ、Ｇ）、したがって、正常な腸上皮細胞に反応しない一方、ＭＲ１Ｔ細胞クローンが胃腸の腫瘍細胞の特異的認識を表示し得ることを示唆した。【００９７】さらにＭＲ１Ｔ細胞によって腫瘍認識の特異性を評価するために、発明者は、好中球、ナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞及びＴ細胞を含む他のタイプの正常細胞に反応するかどうかを最後に調査した。これらの細胞のどれもテストされたＭＲ１Ｔ細胞によって認識されなかった（図示しない）。【００９８】まとめると、これらのデータは、ヒトＭＲ１制限Ｔリンパ球の新しく不均一な集団としてのＭＲ１Ｔ細胞を同定する、（１）腫瘍細胞の多種類に異なって反応する、（２）腫瘍細胞に対して細胞毒性活性を示す、（３）生体外の区別されたＭｏＤＣの例外を備えた正常細胞を認識しない、及び（４）ＭｏＤＣを殺さないが、代わりに、それらの活性化を引き起こす。これらの調査結果は、ＭＲ１Ｔ細胞が重要な抗腫瘍特性を表示しそれらの免疫療法のポテンシャルのために開発されて当然であることを示唆した。【００９９】ＭＲ１Ｔ細胞は��能的に異種混合である
発明者は、最後にＡ３７５−ＭＲ１腫瘍細胞によって刺激時の代表的なＭＲ１Ｔ細胞クローンのサイトカイン分泌プロフィールを分析した。テストされたクローンはすべてＩＦＮ−γを放出した（図１０Ａ）。しかしながら、発明者は、さらにＴｈ１（ＩＬ−α及びＴＮＦ−α及び、ＴＮＦ−β）、Ｔｈ２（ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３）及びＴｈ１７サイトカイン（ＩＬ−１７Ａ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ）の種々の発現プロフィール及び他の可溶性因子（ＭＩＰ−１β及び可溶のＣＤ４０Ｌ  ＰＤＧＦ−ＡＡ及びＶＥＧＦ；図１０Ｂ）を観察した。可変組合せ及びＭＲ１Ｔ細胞によって発現された多量のサイトカインは、この集団内の相当な機能的可塑性を示唆した。例えば、クローンＤＧＡ４は、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α及びＧＭ−ＣＳＦを大量分泌したが、プロトタイプのＴｈ２サイトカインＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０又はＩＬ−１３を分泌せず、したがって「異型の」Ｔｈ１７のような発現型を表示した。対照的に、クローンＴＣ５Ａ８７は相当な量のＶＥＧＦ及びＰＧＤＦ−ＡＡを放出したが、Ｔｈ１又はＴｈ２サイトカインをほとんど放出せず、ＩＬ−１７Ａは放出しなかった。顕著に、研究された７つのクローンのうちの４つは（ＤＧＢ１２９、ＣＨ９Ａ３、ＤＧＢ７０、ＪＭＡ）、サイトカイン放出のＴｈ２に優位に傾いたプロフィールを表示し、それは最近保護抗腫瘍免疫に関係している機能的な発現型である。【０１００】発明者は、次に別個の機能を備え、その発現が組み合わせられた選択肢はＴ細胞再循環及びホーミングサイトへの遊走を制限する可変Ｔ細胞サブセットによって発現されると知られていた３つの選択されたケモカイン受容体の発現を調査した。ＤＧＡ４以外のすべてのＭＲ１Ｔ細胞クローンは高いレベルのＣＸＣＲ３（図１１）を表示した。さらに、発明者は、ＣＣＲ４及びＣＣＲ６（図１１）の分岐する発現パターンを観察した。それは、ＭＲ１Ｔ細胞が異種混合であることをさらに示唆した。【０１０１】一連の研究の最後では、ＭＲ１Ｔ細胞が生体内で肺充実性腫瘍モデルを使用して、それらの腫瘍死滅能力を維持するかどうかが調査された。マウスは、ＤＧＢ１２９細胞を受け取るＭＲ１発現Ａ３７５メラノーマ細胞を静脈注射されるか、処置されないままであった。１４日においては、マウスが屠殺され、肺の中の腫瘍結節の数が数えられた。治療していないマウスは２００−２５０の結節を示したが、ＭＲ１Ｔ細胞で処理されたものは１−６の結節（図１２）を示した。これらの結果は、生体内で育成する腫瘍細胞がＭＲ１Ｔ細胞を刺激する抗原を生産することを確認した。重要なことには、それらは、充実性腫瘍細胞を生体内で殺すためにＭＲ１Ｔ細胞の効率能力の強い証拠を提供した。【０１０２】まとめると、これらのデータは、腫瘍、ＭＲ１Ｔ細胞が別個の再循環パターン及び組織ホーミング能力を備えた多数の部分集合及び腫瘍免疫中の有望な異なる役割を含むことを提案し、したがって、ここでテストされたＭＲ１反応性Ｔクローンは、発現型及び機能的に多様であることを示した。結論として、これらのデータはＭＲ１Ｔ細胞を、ＭＲ１を認識するヒトＴリンパ球の新規な集団であると確認する：腫瘍���連抗原は複合体を形成し、多数のエフェクタ機能を備えた抗腫瘍免疫反応に参加してもよい。【０１０３】
【表１】
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【０１０４】
【表２】
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【０１０５】以下の例は、本発明が適用される臨床のワークフローをさらに示す：【０１０６】ＭＲ１を発現する癌のスクリーニング
癌患者の新鮮な組織又は新鮮な凍結組織の生検は、ヒトＭＲ１特異的なＡｂｓ及びＭＲ１  ｍＲＮＡのＰＣＲ増幅を使用して、ＭＲ１発現について分析される。【０１０７】癌治療（実施例１）：主要なＭＲ１を発現する癌細胞の認識用の最良のＭＲＴ１  ＴＣＲ遺伝子の選択。
−  生体外で単離された初代ＭＲ１＋癌細胞は以前に特徴付けられたＭＲ１Ｔ細胞クローンのライブラリを刺激するために使用される。各クローンは異なるＴＣＲ遺伝子を発現し、異なるタイプの癌細胞を認識する。
−  患者の癌細胞に最も良く応答するＭＲ１Ｔ細胞クローンが選択され、それらのＴＣＲ遺伝子はＴＣＲ遺伝子療法に使用される。応答は、サイトカイン放出機能及び／又は表面マーカ発現としてアッセイされる。細胞は、ＣＤ３、ＣＤ６９、ＣＤ１３７、ＣＤ１５０及び／又はＩＣＯＳ（表面マーカ）及びＩＮＦ−γ及びＧＭ−ＣＳＦ（サイトカイン）に例証されるが制限されずに、分析された活性化マーカに反応的な抗体で染色される内部（サイトカイン）又は表面マーカによってアッセイされる。
−  利用可能な場合、可溶性ＭＲ１Ｔ  ＴＣＲは多量体化され、腫瘍生検から単離された腫瘍細胞を染色するのに使用されるだろう。腫瘍細胞と結合するＭＲ１Ｔ  ＴＣＲ多量体は、その患者の中の遺伝子療法にふさわしいＭＲ１Ｔ  ＴＣＲの迅速な選択ができるだろう。
−  いくつかの患者の循環Ｔ細胞個体群は、受容体Ｔ細胞（ナイーブ、セントラルメモリ、エフェクタメモリ、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、又はＣＤ４、ＣＤ８ダブルネガティブＴ細胞）として使用され得る。ナイーブＴ細胞は、ＭＲ１腫瘍抗原を認識するＴＣＲ遺伝子で形質導入される場合に、刺激されていないＴリンパ球が、腫瘍細胞がある状態で成熟することを可能にするために選択されている。ＭＲ１を発現する腫瘍細胞の認識で即時の増殖及びエフェクタ機能（腫瘍致死）を提供するので、セントラル及びエフェクタメモリ細胞が使用される。ＣＤ４細胞は動員を促進するＴヘルパー細胞の十分な数及び抗腫瘍機能を備えた他の細胞の増殖を提供するために選択される。ＣＤ８  Ｔ細胞は腫瘍細胞の死滅を促進するために選択される。ＣＤ４−ＣＤ８ダブルネガティブＴ細胞は、大量のキラー・エフェクタ分子（ＴＮＦα、グランザイム及びグラニュリシン）の即時放出のようなそれらの自然様の機能に選択される。
−  形質導入されたＴＣＲ遺伝子を発現し選択されたエフェクタ機能を有するＴ細胞は、養子関係の細胞治療（ＡＣＴ）に使用される。【０１０８】患者の末梢血からのＴ細胞は、表面マーカ（ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ５７）特異的なモノクローナル抗体で染色され、ソートされる。ソートされた集団はそれぞれ、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｔ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で活性化され、個人の患者に選択されたＭＲ１Ｔ  ＴＣＲをコードするＴＣＲ遺伝子で２４時間後にトランスフェクトされる。これは修飾済（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）のＴ細胞調合液（レシピエントＴ細胞）を産出する。ある場合には、レシピエントＴ細胞も、ＰＤ１、ＩＬＴ２及びＩＬＴ４抑制遺伝子を不活性化する遺伝子編集方法によって就職されるか、又は細胞生存、細胞膨張を促進し、癌治療エフェクタ機能を増強するためにＣＤ１３７とＣＤ１３４の遺伝子で形質導入された。【０１０９】リンパ球の枯渇（Ｌｙｍｐｈｏｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）は、非骨髄機能廃絶化学療法の前処置療法（２日間６０ｍｇ／ｋｇでシクロホスファミド及び５日間２５ｍｇ／ｍ２でフルダラビンを投与する）を使用して、レシピエント癌患者の中で作られ、患者に７２０，０００ＩＵ／ｋｇで与えられたＴ細胞及びＩＬ−２の導入が後続する。いくつかの実例では、２００又は１２００センチグレイ（ｃＧｙ；１Ｇｙ＝１００ｒａｄ）の全身照射が、前処置療法に追加される。ＭＲ１Ｔの外因性のＴＣＲ遺伝子（修正済のＴ細胞準備）を発現するＴ細胞は、レシピエントへ導入される。【０１１０】ＴＣＲ遺伝子は、安全な組換えのレンチウイルスベクター（例えばＰｒｏｖａｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １８，８０７−８１５（２０１２）を参照）中でクローニングされる。それは自殺遺伝子を含んでおり、他の介助ウィルスがない状態での成熟したウィルス粒子を生むことができない。ある場合には、ＴＣＲ遺伝子が、自殺遺伝子（例に関しては、Ｇｒｅｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ６，９５（２０１５）を参照）を含んでいるベクター中でクローニングされ、それにより、望まれない遺伝子挿入に由来した危険を減らす。ある場合には、ＴＣＲ  ＭＲ１Ｔ遺伝子をコードするＲＮＡが、受容細胞（例に関してはＺｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  １３，１５１，（２００６）を参照）中でトランスフェクトされる。【０１１１】癌治療（実施例２）：治療される患者の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）からのＭＲ１Ｔ細胞の単離。
−  自己由来のＴＩＬは、我々の以前に確立しているプロトコル（Ｄｅ  Ｌｉｂｅｒｏ、同書中に）による癌組織生検から準備されている。
−  Ｔ細胞は、ＩＬ−２、ＩＬ−７及びＩＬ−１５を補充された培地を使用して、２〜３週間生体外で増殖する。
−  増殖したＴ細胞は、自己由来のＭＲ１＋癌細胞に対する反応に関してテストされる。
−  活性化マーカ（ＣＤ１３７、ＣＤ１５０、ＣＤ６９、ＩＣＯＳ）の表面発現を増加させるＴ細胞は、癌に特有であると考えられる。また、抗ＭＲ１単クローン抗体のある状態によって阻害される場合、それらはＭＲ１依存的であると考えられる。
−  上に概説されるように、癌反応的なＴ細胞は上記の活性化マーカのうちの１つの発現によってソートされ、増殖し、ＡＣＴのために使用される。
【図１ＡＢＣＤＥ】
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【図２ＡＢＣＤＥ】
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【図３ＡＢＣＤ】
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【図４ＡＢＣＤＥ】
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【図５ＡＢ】
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【図６ＡＢＣ】
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【図７ＡＢＣＤＥ】
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【図８ＡＢＣＤＥＦ】
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【図９ＡＢＣＤＥＦ】
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【図１０ＡＢ】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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