(57)【要約】  対象者における歯肉炎の存在を評価するための体外での方法が開示される。この方法は、３つのバイオマーカータンパク質の選択を決定するための洞察に基づいている。従って、対象者の唾液試料において、タンパク質である肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）及びインターロイキン１β（ＩＬ−１β）、並びに、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）及びヘモグロビン（Ｈｂ）のうち少なくとも１つの濃度が測定される。測定された濃度に基づき、上記のタンパク質に対する結合濃度を反映する値が決定される。この値は、歯肉炎又は歯周炎の欠如に関連している結合濃度を同じ様式で反映する閾値と比較される。この比較によって、試験値が上記の対象における歯肉炎の存在を示すかどうかを評価することが可能である。その結果、典型的には、閾値によって反映される結合濃度を超える結合濃度を反映する試験値は、歯肉炎の存在を示す。
2020527693.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象者における歯肉炎の存在を評価するための体外での方法であって、前記対象者由来の唾液試料において、タンパク質である肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インターロイキン１β（ＩＬ−１β）、並びに、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）及びヘモグロビン（Ｈｂ）のうち少なくとも１つの濃度を検出するステップと、前記タンパク質に対して測定された結合濃度を反映する試験値を決定するステップと、前記試験値が、前記対象者における歯肉炎の存在を示しているかどうかを評価するように、前記試験値を、歯肉炎又は歯周炎の欠如に関連している結合濃度を同じ様式で反映する閾値と比較するステップとを含む方法。
【請求項２】
前記閾値は、１つ又は複数の参照試料中の前記タンパク質に対して決定された濃度に基づいており、各試料は、歯肉炎又は歯周炎の欠如に関連している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記閾値は、歯肉炎又は歯周炎を有していない対象者由来の試料、及び、歯肉炎を有する対象者由来の試料を含む一組の試料中の前記タンパク質の濃度に基づいている、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
検出される前記タンパク質は、ＨＧＦ、ＩＬ−１β、及びＣＲＰから成る、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
検出される前記タンパク質は、ＨＧＦ、ＩＬ−１β、及びＨｂから成る、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
決定された前記濃度の値は、０から１の数字に算術的に処理される、請求項１乃至５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
対象者における歯肉炎の存在を評価するためのバイオマーカーとしての、前記対象者の唾液試料におけるタンパク質である肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インターロイキン１β（ＩＬ−１β）、並びに、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）及びヘモグロビン（Ｈｂ）のうち少なくとも１つの使用。
【請求項８】
患者の唾液の試料における歯肉炎に対する少なくとも３つのバイオマーカーを検出するためのキットであって、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インターロイキン１β（ＩＬ−１β）、並びに、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）及びヘモグロビン（Ｈｂ）のうち１つを検出するための１つ又は複数の検出試薬を含むキット。
【請求項９】
前記１つ又は複数の検出試薬は、少なくとも３つの検出試薬である、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を検出するための第１の検出試薬、インターロイキン１β（ＩＬ−１β）を検出するための第２の検出試薬、並びに、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）及びヘモグロビン（Ｈｂ）のうち１つを検出するための第３の検出試薬を含む、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
前記１つ又は複数の検出試薬は、固体支持体上に含まれる、請求項８又は請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
前記１つ又は複数の検出試薬は、ＨＧＦ、ＩＬ−１β、及びＣＲＰ、又は、ＨＧＦ、ＩＬ−１β、及びＨｂに対する検出試薬から成る、請求項８乃至１０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１２】
対象者における歯肉炎を診断するためのシステムであって、
−  患者の唾液の試料において、タンパク質であるＨＧＦ、ＩＬ−１β、並びに、ＣＲＰ及びＨｂのうち少なくとも１つを検出することができ且つ検出するように適応した検出手段と、
−  前記タンパク質の決定された濃度から、前記対象者が歯肉炎を有するかどうかの指標を決定することができ且つ決定するように適応したプロセッサと、
を含むシステム。
【請求項１３】
口腔液試料を受けるための容器をさらに含み、前記容器は前記検出手段を含む、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１４】
−  前記指標をユーザに提示するためのユーザインタフェースと、
−  前記プロセッサから前記ユーザインタフェースへ前記指標を転送するための前記プロセッサと前記ユーザインタフェースとの間のデータ接続と、
をさらに含む、請求項１２又は１３に記載のシステム。
【請求項１５】
前記プロセッサは、インターネットベースのアプリケーションによって機能することを可能にする、請求項１２乃至１４のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１６】
第１の時点ｔ１から第２の時点ｔ２までの時間間隔にわたる、対象者における歯肉炎の状態の変化を決定するための体外での方法であって、ｔ１にて前記対象者から得られた少なくとも１つの唾液試料において、及び、ｔ２にて前記対象者から得られた少なくとも１つの唾液試料において、タンパク質である肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インターロイキン１β（ＩＬ−１β）、並びに、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）及びヘモグロビン（Ｈｂ）のうち少なくとも１つの濃度を検出するステップと、前記濃度を比較し、それによって、いずれか１つ、２つ、又は３つ全ての濃度の差が状態の変化を反映しているステップとを含む方法。
【請求項１７】
患者が歯肉炎を有するかどうかを診断する方法であって、前記患者の唾液の試料において、タンパク質である肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インターロイキン１β（ＩＬ−１β）、並びに、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）及びヘモグロビン（Ｈｂ）のうち少なくとも１つを検出するステップと、前記患者における歯肉炎の存在を、前記試料における前記タンパク質の濃度に基づき評価するステップとを含む方法。
【請求項１８】
歯肉炎を患う患者において、タンパク質である肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インターロイキン１β（ＩＬ−１β）、並びに、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）及びヘモグロビン（Ｈｂ）のうち少なくとも１つを検出する方法であって、
（ａ）患者から唾液試料を得るステップと、
（ｂ）前記試料を、前記タンパク質に結合することができる１つ又は複数の検出試薬と接触させ、各タンパク質と前記１つ又は複数の検出試薬との結合を検出することによって、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インターロイキン１β（ＩＬ−１β）、並びに、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）及びヘモグロビン（Ｈｂ）のうち少なくとも１つが前記試料中に存在するかどうかを検出するステップと、
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、口腔ケアの分野におけるものであり、歯周疾患の唾液ベースの診断に関係する。特に、本発明は、歯肉炎の発生を決定するためのキット及び方法に関係する。
【背景技術】
【０００２】
歯肉の炎症又は歯肉炎は、主に歯の細菌性バイオフィルム又は歯垢が歯の表面に付着することによって引き起こされる非破壊の歯周疾患である。検出及び治療されない場合、可逆的な歯肉炎は、通常、歯周炎として定義される状態であり、不可逆的であり、組織破壊及び歯槽骨喪失を引き起こし、最終的には歯を喪失する、歯を包囲する組織（すなわち、歯周組織）の炎症につながる。歯肉疾患の進行中に、通常、歯肉の腫れ、ピンクから暗赤色への色の変化、歯肉の出血、口臭、及び歯肉がより敏感になる又は痛くて触れない等、それに関連する臨床徴候及び症状がある。
【０００３】
重度の歯周組織炎は、真性糖尿病、ＨＩＶ感染、血小板減少症、及び白血病等の状態の調査を促すはずである。例えば、糖尿病患者の場合、重度の歯周疾患は、腎症、脳卒中、一過性脳虚血発作、狭心症、心筋梗塞、及び心不全を含む、様々な糖尿病合併症の強力な予測因子であり得る。
【０００４】
従って、歯周疾患の早期且つ正確な診断が健康の観点から重要である。この目的を達成するために、特に歯肉炎の段階での診断が望ましい。
【０００５】
歯周疾患は、一般的な歯科診療において依然として十分に診断されず（非特許文献１）、治療介入率は比較的低く、未治療の症例が相当量ある。現在の診断は、歯科医療従事者による口腔組織の状態（色、腫脹、プロービング時の出血の程度、ポケットの深さのプロービング、及び口腔Ｘ線による骨喪失）の不正確で主観的な臨床検査に依存する。これらの従来の方法は時間がかかり、使用される技術の一部（ポケット深さ、Ｘ線）は、現在の疾患活動性又はさらなる疾患に対する易罹患性ではなく、過去の疾患活動性等の歴史的事象を反映する。従って、好ましくは非専門家によっても実行され得るより客観的で速く正確で使いやすい診断法が望ましい。それによって、現在の疾患活動性、及び、おそらくさらなる歯周疾患に対する対象の易罹患性を測定することが望ましい。
【０００６】
唾液又は口腔液は、長い間、口腔疾患及び一般疾患の診断用流体として提唱されてきた。また、ラブオンチップとも呼ばれる小型化されたバイオセンサの出現で、迅速なチェアサイドテストのためのポイントオブケア診断が、より大きな科学的及び臨床的関心を得てきた（非特許文献２）。
【０００７】
特に歯周疾患の検出に対して、組織の炎症及び破壊に関連している炎症性バイオマーカーは、近接しているために容易に唾液中に入る可能性があり、唾液が歯周疾患の検出に対して強い可能性を有することを示唆している。従って、実際に、この分野は相当な関心を得ており、望みを与える結果が示されてきた。しかし、明確な試験はまだ現れていない。
【０００８】
唾液のバイオマーカーに対するポイントオブケアテストの開発に対するこれまでの制限には、チェアサイドの応用に適応できる技術の欠如、及び、個々の試料における多数のバイオマーカーの分析ができないことが含まれていた。そのようなテストにおいてどの多数のバイオマーカーを含むかという選択も、文献において十分に扱われておらず、実用的試験においても実践されていない。これらの挑戦は、非特許文献３において論じられている。
【０００９】
バイオマーカーは、臨床症状の根拠を与える生物学的指標を表し、そのようなものとして、歯周疾患の臨床転帰を診断するための客観的尺度である。最終的には、証明されたバイオマーカーを利用して、将来の疾患のリスクを評価する、非常に早期の段階の疾患を同定する、初期治療に対する応答を同定する、及び予防対策の実践を可能にすることができる。
【００１０】
歯肉炎を診断するための現在の方法は、ポケットの深さ、プロービング時の出血のレベル、及び歯肉炎指数の推定を含む。これは、歯科医が全ての患者及び／又は全ての来診時に行うことはなく、消費者が行うこと（自己診断）が不可能な重労働のプロセスである。
【００１１】
よりシンプルなプロセス、特に、少量の唾液試料が対象から、及びおそらく対象自身によって採取されることのみを要求するプロセスを提供することが望ましい。そのような試料は、測定に基づいて、対象が歯肉炎を有する可能性の指標を戻すことができるように唾液試料の分類を可能にすることになる体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での診断装置に入れられることが望ましい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｍｏｒｇａｎ  ＲＧ  （２００１）．Ｂｒｉｔ  Ｄｅｎｔ  Ｊ  １９１：  ４３６−４１
【非特許文献２】Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓａｌｉｖａｒｙ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ．  Ｏｒｔｈｏｄ  Ｃｒａｎｉｏｆａｃ  Ｒｅｓ，  １２（３）（２００９），ｐｐ．２０６−２１１
【非特許文献３】Ｊｉ  ＆  Ｃｈｏｉ，  Ｆｒｏｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２０１５；５：６５
【非特許文献４】Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （１９８８）
【発明の概要】
【００１３】
上述の要望により良く取り組むために、本発明は、一態様において、対象者（ａ  ｈｕｍａｎ  ｓｕｂｊｅｃｔ）における歯肉炎の存在を評価するための体外での方法に関し、当該方法は、上記の対象者由来の唾液試料において、タンパク質である：肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インターロイキン１β（ＩＬ−１β）、並びに、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）及びヘモグロビン（Ｈｂ）のうち少なくとも１つの濃度を検出するステップ；上記のタンパク質に対して測定された結合濃度（ａ  ｊｏｉｎｔ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）を反映する試験値を決定するステップ；試験値が、上記の対象者における歯肉炎の存在を示しているかどうかを評価するように、試験値を、歯肉炎又は歯周炎の欠如に関連している結合濃度を同じ様式で反映する閾値と比較するステップ；を含む。
【００１４】
別の態様では、本発明は、前記対象者における歯肉炎の存在を評価するためのバイオマーカーとしての、対象者の唾液試料におけるタンパク質である肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インターロイキン１β（ＩＬ−１β）、並びに、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）及びヘモグロビン（Ｈｂ）のうち少なくとも１つの使用を示す。典型的には、評価は、上記の試料における上記のタンパク質の濃度に基づき行われる。
【００１５】
さらなる態様では、本発明は、対象者における歯肉炎を診断するためのシステムに属し、当該システムは：
−  患者（ａ  ｈｕｍａｎ  ｐａｔｉｅｎｔ）の唾液の試料において、タンパク質であるＨＧＦ、ＩＬ−１β、並びに、ＣＲＰ及びＨｂのうち少なくとも１つを検出することができ且つ検出するように適応した検出手段；及び、
−  上記のタンパク質の決定された濃度から、対象が歯肉炎を有するかどうかの指標を決定することができ且つ決定するように適応したプロセッサ；
を含む。
【００１６】
当該システムは、任意的に、情報を示すことができ、好ましくは情報を入れることもできるユーザインタフェース、特にグラフィカルユーザインタフェースへのデータ接続を有し、インタフェースは、システムの一部であるか、又は、リモートインタフェースである。
【００１７】
任意的に、上述のアイテムのうちの１つ又は複数、特にプロセッサは、「クラウド」で、すなわち、固定機械で機能するのではなく、インターネットベースのアプリケーションよって機能することが可能にされる。
【００１８】
別のさらなる態様では、本発明は、患者の唾液の試料における歯肉炎に対する少なくとも３つのバイオマーカーを検出するためのキットを提供し、当該キットは、ＨＧＦ、ＩＬ−１β、並びに、ＣＲＰ及びＨｂのうち１つを検出するための１つ又は複数、典型的には３つの検出試薬を含む。典型的には、３つ以上の検出試薬が使用され、そのそれぞれが、異なるバイオマーカーに結合する。一実施形態において、第１の検出試薬は肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）に結合することができ、第２の検出試薬はインターロイキン１β（ＩＬ−１β）に結合することができ、さらに、第３の検出試薬は、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）及びヘモグロビン（Ｈｂ）のうち１つに結合することができる。
【００１９】
さらに別の態様では、本発明は、第１の時点ｔ１から第２の時点ｔ２までの時間間隔にわたる、対象者における歯肉炎の状態の変化を決定するための体外での方法を提供し、当該方法は、ｔ１にて上記の対象者から得られた少なくとも１つの唾液試料において、及び、ｔ２にて上記の対象者から得られた少なくとも１つの唾液試料において、タンパク質である：肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インターロイキン１β（ＩＬ−１β）、並びに、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）及びヘモグロビン（Ｈｂ）のうち少なくとも１つの濃度を検出するステップと、濃度を比較し、それによって、いずれか１つ、２つ、又は３つ全ての濃度の差が状態の変化を反映しているステップとを含む。
【００２０】
さらなる態様では、本発明は、患者が歯肉炎を有するかどうかを診断する方法を提供し、当該方法は、患者の唾液の試料において、タンパク質である肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インターロイキン１β（ＩＬ−１β）、並びに、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）及びヘモグロビン（Ｈｂ）のうち少なくとも１つを検出するステップと、患者における歯肉炎の存在を、上記の試料における上記のタンパク質の濃度に基づき評価するステップとを含む。任意的に、この態様の方法は、患者における歯肉炎を治療するさらなるステップを含む。
【００２１】
別のさらなる態様では、本発明は、歯肉炎を患う患者において、タンパク質である肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インターロイキン１β（ＩＬ−１β）、並びに、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）及びヘモグロビン（Ｈｂ）のうち少なくとも１つを検出する方法を提供し、当該方法は：
（ａ）患者から唾液試料を得るステップ；及び、
（ｂ）唾液試料を、上記のタンパク質に結合する１つ又は複数の検出試薬と接触させ、各タンパク質と１つ又は複数の検出試薬との結合を検出することによって、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インターロイキン１β（ＩＬ−１β）、並びに、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）及びヘモグロビン（Ｈｂ）のうち少なくとも１つが試料中に存在するかどうかを検出するステップ；
を含む。典型的には、ＨＧＦに結合することができる第１の検出試薬、ＩＬ−１βに結合することができる第２の検出試薬、並びに、ＣＲＰ及びＨｂのうち１つに結合することができる第３の検出試薬がある。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本開示において記載される方法において使用するためのシステムの概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
一般的な意味では、本発明は、対象者が歯肉炎を有しているかどうかを十分正確に決定するために、上記の対象者の唾液試料におけるバイオマーカーとして役立ち得るタンパク質はわずか３つであるという賢明な洞察に基づいている。これらのタンパク質は、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インターロイキン１β（ＩＬ−１β）、並びに、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）及びヘモグロビン（Ｈｂ）のうちいずれか又は両方である。
【００２４】
ＨＧＦは、傍分泌細胞の増殖、運動刺激、及び形態形成の因子であり、間葉系細胞によって分泌され、主に上皮細胞及び内皮細胞を標的とし、該細胞に作用するが、造血前駆細胞にも作用する。ＨＧＦは、筋形成及び創傷治癒において主要な役割を持つと示されてきた。有糸分裂誘発、細胞運動性、及びマトリックス浸潤を刺激するその能力は、それに血管新生、腫瘍形成、及び組織再生における中心的な役割を与える。ＨＧＦは上皮細胞の増殖を刺激し、結合組織の付着の再生を防ぐ。ＨＧＦは、様々な疾患における疾患活動性を示す血清マーカーとして知られている。
【００２５】
ＩＬ−１βは、サイトカインのインターロイキン１ファミリーのメンバーである。このサイトカインは、プロタンパク質として活性化されたマクロファージによって産生され、カスパーゼ１（ＣＡＳＰ１／ＩＣＥ）によってその活性型までタンパク質分解により処理される。このサイトカインは、炎症反応の重要なメディエーターであり、細胞の増殖、分化、及びアポトーシスを含む種々の細胞活性に関与している。
【００２６】
Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）は、血漿中に存在する環状の五量体タンパク質であり、そのレベルは炎症に応答して上昇し、マクロファージ及びＴ細胞によるインターロイキン６の分泌に続いて増加する肝臓起源の急性期タンパク質である。その生理学的役割は、Ｃ１Ｑ複合体を介して補体系を活性化するために、死細胞又は死にかけている細胞（及び一部のタイプの細菌）の表面に発現するリゾホスファチジルコリンに結合することである。ＣＲＰは、マクロファージ及び脂肪細胞（ｆａｔ  ｃｅｌｌ／ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ）によって放出された因子に応答して肝臓によって合成され、タンパク質のペントラキシンファミリーのメンバーである。
【００２７】
ヘモグロビン（Ｈｂ）は、ほぼ全ての脊椎動物の赤血球並びに一部の無脊椎動物の組織における鉄含有酸素輸送金属タンパク質である。
【００２８】
上述の４つのタンパク質は、当技術分野において知られている。当業者は、その構造を認識し、唾液試料等の水性試料におけるそれらのタンパク質を検出する方法を認識している。以下において、上述のタンパク質バイオマーカーは、ひとまとめに「本発明のバイオマーカーパネル」と呼ばれる。本発明のバイオマーカーパネルは、一実施形態において、本発明において同定される４つのタンパク質バイオマーカー、すなわち、ＨＧＦ、ＩＬ−１β、ＣＲＰ、及びＨｂから成る。好ましくは、本発明のバイオマーカーパネルは、本発明において同定されるタンパク質バイオマーカーのうち３つ以下、すなわち、ＨＧＦ、ＩＬ−１β、及びＣＲＰ、又は、ＨＧＦ、ＩＬ−１β、及びＨｂから成る。本発明のバイオマーカーパネルに加えて、他のバイオマーカー、及び／又は、（例えば、年齢、性別等の）人口統計学的データ等のデータを、歯肉炎の決定に適用されるデータのセットに含めることができる。好ましいさらなるバイオマーカーは、インターロイキン６（ＩＬ６）及びエラスターゼである。
【００２９】
他のバイオマーカーが任意的に含まれる場合、バイオマーカーの総数（すなわち、本発明のバイオマーカーパネル＋さらなるバイオマーカー）は、典型的には４、５、又は６である。
【００３０】
しかし、本発明の望ましい利点は、４つ以下のバイオマーカーを測定する、好ましくは３つのみのバイオマーカーを測定することによって、対象における歯肉炎の発生を決定することができるということである。特に、この決定は、他のデータの使用を含むことを必要とせず、これは、有利に、シンプル且つ単刀直入の診断試験を提供する。
【００３１】
当該方法は、必要に応じて、少量の唾液試料、例えば液滴サイズが対象者から採取されるということのみを要求する。試料のサイズは、典型的には、１〜２ｍｌ等、０．１μｌから２ｍｌに及ぶことになり、それによって、例えば０．１から１００μｌ等のより少ない量を、体外での装置の処理に使用することができ、それによって、７．５から１７ｍｌ等、２０ｍｌまで等のより大きな試料を採取することも可能である。この試料は体外での診断装置に入れられ、この装置は、関与する少なくとも３つのタンパク質の濃度を測定し、且つ、診断結果を戻して、歯肉炎を有するかどうかの可能性に基づき対象者を分類する。
【００３２】
本発明の使用の容易さは、歯科患者の大半を定期的に（例えば、定期的な歯科チェックの一部として又は自宅においてさえも）検査することを可能にすることになる。これによって、歯周炎に進む前に歯肉炎の存在を検出することが可能であり、従って、口腔ケア処置をタイムリーに行って歯肉炎の影響を元に戻すことが可能になる。特に、この方法は、自己診断にも適しており、それによって、試料を採取し、それを装置に入れるステップを、対象者自身により行うことができる。
【００３３】
本発明の方法は、典型的には、１つ又は複数の検出試薬を使用することによって、本発明のバイオマーカーパネルを構成する上述の少なくとも３つのタンパク質、及び任意のさらなるバイオマーカータンパク質を検出するステップを含む。
【００３４】
本発明に従って検査される「唾液」は、唾吐き若しくはスワビングによって得ることができる無希釈の唾液、又は、流体で口をすすぐことによって得ることができる希釈した唾液であってもよい。希釈した唾液は、患者が（例えば、５ｍｌ又は１０ｍｌ等の）滅菌水又は他の適した流体で数秒間、口をすすぐか又は洗い流し、さらに、容器に吐き出すことによって得られてもよい。希釈した唾液は、オーラルリンス液と呼ばれることがあってもよい。
【００３５】
「検出するステップ」が意味するものは、バイオマーカータンパク質の濃度を測定、定量化、スコア化、又はアッセイすることである。バイオマーカータンパク質を含む生物学的化合物を評価する方法は、当技術分野において知られている。タンパク質バイオマーカーを検出する方法には、直接測定及び間接測定が含まれるということが認識されている。当業者は、特定のバイオマーカータンパク質をアッセイする適切な方法を選択することができることになる。
【００３６】
タンパク質バイオマーカーに関して「濃度」という用語には、その通常の意味、すなわち、体積中のタンパク質の存在量が与えられることになる。タンパク質濃度は、典型的には、体積当たりの質量で測定され、最も典型的にはｍｇ／ｍｌ又はμｇ／ｍｌであるが、ｐｇ／ｍｌ程に低いこともある。代替の尺度は、容積モル濃度（又はモル濃度）のｍｏｌ／Ｌ又は「Ｍ」である。濃度は、既知の決定された又は予め決定された体積の試料におけるタンパク質の量を検出することによって決定することができる。
【００３７】
濃度を決定することの代替案は、試料におけるタンパク質バイオマーカーの絶対量を決定するか、又は、例えば、試料における他の全てのタンパク質の総量と比較したバイオマーカーの量等、試料におけるバイオマーカーの質量分率を決定することである。
【００３８】
「検出試薬」は、関心のあるタンパク質バイオマーカーに特異的に（又は選択的に）結合する、それと相互作用する、又はそれを検出する薬剤又は化合物である。そのような検出試薬には、タンパク質バイオマーカーに優先的に結合する抗体、ポリクローナル抗体、又はモノクローナル抗体が含まれ得るが、それらに限定されない。
【００３９】
「特異的に（又は選択的に）結合する」又は「特異的に（又は選択的に）免疫反応する」という語句は、検出試薬を言及する場合、タンパク質及び他の生物製剤の異種集団におけるタンパク質バイオマーカーの存在を決定するような結合反応を指す。従って、指定の免疫測定条件下では、特定された検出試薬（例えば、抗体等）は、バックグラウンドの少なくとも２倍特定のタンパク質に結合し、試料において存在する他のタンパク質には有意な量で実質的に結合しない。そのような条件下での特異的結合には、特定のタンパク質に対するその特異性のために選択された抗体が要求され得る。種々の免疫測定フォーマットを使用して、特定のタンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択することができる。例えば、固相ＥＬＩＳＡ免疫測定法（酵素結合免疫吸着測定法）が、タンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択するために日常的に使用されている（例えば、特異的免疫反応性を決定するために使用することができる免疫測定フォーマット及び条件の説明に対して、非特許文献４を参照されたい）。典型的には、特異的又は選択的な反応は、バックグラウンド信号又はノイズの少なくとも２倍になり、より典型的には、バックグラウンドの１０から１００倍を超えることになる。
【００４０】
「抗体」は、エピトープ（例えば、抗原等）に特異的に結合しそれを認識する、１つ又は複数の免疫グロブリン遺伝子又はその断片によって実質的にコードされるポリペプチドリガンドを指す。認識される免疫グロブリン遺伝子には、カッパー及びラムダの軽鎖定常部遺伝子、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン、及びミューの重鎖定常部遺伝子、並びに、無数の免疫グロブリン可変部遺伝子が含まれる。抗体は、例えば、未変化の免疫グロブリンとして、又は、様々なペプチダーゼを用いた消化によって産生される多数の十分に特徴付けられた断片として存在する。これには、例えば、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ）’２フラグメントが含まれる。「抗体」という用語は、本明細書において使用される場合、抗体全体の修飾によって産生された抗体断片、又は、組換えＤＮＡ方法論を使用してｄｅ  ｎｏｖｏで合成されたものも含み、また、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、又は単鎖抗体も含む。抗体の「Ｆｃ」部分は、免疫グロブリン重鎖のうち、１つ又は複数の重鎖定常部ドメインであるＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含むが、重鎖可変部を含まない部分を指す。抗体は、例えば、第１の抗原に特異的に結合する第１の可変部及び第２の異なる抗原に特異的に結合する第２の可変部を有する抗体等、二重特異性抗体であってもよい。少なくとも１つの二重特異性抗体の使用は、必要とされる検出試薬の数を減らすことができる。
【００４１】
診断方法は、その感度及び特異性において異なる。診断アッセイの「感度」は、検査で陽性反応が出た病気の個体の割合（「真陽性」のパーセント）である。このアッセイによって検出されない病気の個体は「偽陰性」である。病気ではなく、アッセイにおいて検査で陰性反応が出た対象者は、「真陰性」と呼ばれる。診断アッセイの「特異性」は、１から偽陽性率を差し引いたものであり、ここで「偽陽性」率は、検査で陽性反応が出た病気を有していない者の割合として定義される。
【００４２】
本発明の１つ又は複数のバイオマーカータンパク質は、任意の手段によって試料において検出することができる。バイオマーカー検出のための好ましい方法は、抗体ベースのアッセイ、タンパク質アレイアッセイ、質量分析（ＭＳ）ベースのアッセイ、及び（近）赤外分光法ベースのアッセイである。例えば、免疫測定法には、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、「サンドイッチ」免疫測定法、免疫沈降法、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、及び蛍光免疫測定法等の技術を使用した競合的及び非競合的アッセイ系が含まれるが、これらに限定されない。そのようなアッセイはルーチンであり、当技術分野において良く知られている。例証的な免疫測定法は、以下に簡単に記載される（が、限定として意図されない）。
【００４３】
免疫沈降プロトコルは、一般的に、プロテインホスファターゼ及び／又はプロテアーゼ阻害剤（例えば、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチニン、バナジン酸ナトリウム等）を追加したＲＩＰＡバッファー（１％ＮＰ−４０又はＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２の０．０１Ｍ  リン酸ナトリウム、１％Ｔｒａｓｙｌｏｌ）等の溶解バッファーにおいて細胞の集団を溶解すること、細胞可溶化物に関心のある抗体を添加すること、４℃である期間（例えば１〜４時間等）インキュベートすること、細胞可溶化物にタンパク質Ａ及び／又はタンパク質Ｇのセファロースビーズを添加すること、４℃で約１時間又はそれ以上インキュベートすること、溶解バッファーにおいてビーズを洗浄すること、及び、ＳＤＳ／試料のバッファーにおいてビーズを再懸濁することを含む。特定の抗原を免疫沈降させる抗体の能力は、例えば、ウエスタンブロット分析によって評価することができる。当業者は、（例えば、セファロースビーズを用いて細胞可溶化物を前もってはっきりさせる等）抗原に対する抗体の結合を増やす、及び、バックグラウンドを減らすために修正することができるパラメータに関してよく知っているであろう。
【００４４】
ウエスタンブロット分析は、一般的に、タンパク質試料の調製、（例えば、抗原の分子量に応じて８％〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ等の）ポリアクリルアミドゲルにおけるタンパク質試料の電気泳動、ポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース、ＰＶＤＦ、又はナイロン等のメンブレンへのタンパク質試料の移し、（例えば、３％ＢＳＡ又は無脂肪ミルクを有するＰＢＳ等の）ブロッキング溶液におけるメンブレンのブロッキング、（例えば、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ２０等の）洗浄バッファーにおけるメンブレンの洗浄、ブロッキングバッファーにおいて希釈された一次抗体（関心のある抗体）を用いたメンブレンのブロッキング、洗浄バッファーにおけるメンブレンの洗浄、ブロッキングバッファーにおいて希釈された（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ等の）酵素基質又は（例えば３２Ｐ又は１２５Ｉ等の）放射性分子に結合した（例えば、抗ヒト抗体等、一次抗体を認識する）二次抗体を用いたメンブレンのブロッキング、洗浄バッファーにおけるメンブレンの洗浄、及び抗原の存在の検出を含む。当業者は、検出される信号を増やす、及び、バックグラウンドノイズを減らすために修正することができるパラメータに関してよく知っているであろう。
【００４５】
ＥＬＩＳＡは、典型的には、抗原（すなわち、関心のあるバイオマーカータンパク質又はその断片）の調製、抗原を用いた９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルの被覆、（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ等の）酵素基質等の検出可能な化合物に結合した関心のある抗体のウェルへの添加及びある期間のインキュベート、並びに、抗原の存在の検出を含む。ＥＬＩＳＡにおいては、関心のある抗体を、検出可能な化合物に結合させる必要はなく；代わりに、検出可能な化合物に結合した（関心のある抗体を認識する）第２の抗体をウェルに添加することができる。さらに、抗原を用いてウェルを被覆する代わりに、抗体がウェルに被覆されてもよい。この場合、検出可能な化合物に結合した第２の抗体を、被覆されたウェルへ関心のある抗原の添加後に添加することができる。当業者は、検出されるシグナルを増やすために修正することができるパラメータだけでなく、当技術分野において知られたＥＬＩＳＡの他のバリエーションに関してもよく知っているであろう。
【００４６】
本明細書において開示される方法では、上述の少なくとも３つのバイオマーカータンパク質の濃度が決定される。これは、歯肉炎の存在の決定において、７０％を超える、好ましくは７５％を超える特異性も感度も提供することを可能にするバイオマーカータンパク質の選択を表しているということがわかった。そのような試験は、当該分野において実現可能な試験に対する要求を満たす（特に：十分に予測可能であるが、可能な限りシンプルである）と考慮される。
【００４７】
多数のマーカーが使用されるため、バイオマーカーのうち全てが、歯肉炎の存在が決定されるために有意な差次的発現を示す必要があるというわけではない。閾値が健康な状態を反映する値である一実施形態において、バイオマーカーのうち少なくとも２つの濃度における増加等の明らかな変化（すなわち、差次的発現）は、対象者が歯肉炎を有している可能性があるということを示す。好ましくは、２つ又は３つ全てのバイオマーカーの濃度における明らかな変化は、対象者が歯肉炎を有しているということを示す。この変化は、全てのバイオマーカーに対して増加であってもよいが、例えば、バイオマーカーのうち１つの減少及び他のバイオマーカーのうち１つ又は２つの増加等であってもよい。本開示において反映される洞察は、本発明のバイオマーカーパネルの測定に基づき、十分な精度で、歯肉炎を健康な口腔状態から区別することができるということである。
【００４８】
この洞察は、対象者の唾液試料におけるバイオマーカーとしての、タンパク質である肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インターロイキン１β（ＩＬ−１β）、並びに、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）及びヘモグロビン（Ｈｂ）のうち少なくとも１つの、典型的には上記の試料における上記のタンパク質の濃度に基づき上記の対象者における歯肉炎の存在を評価するための使用である、本発明の別の態様を支持する。
【００４９】
この使用は、以前及び以降に実質的に記載される方法で実践することができる。
【００５０】
本発明の方法は、上記のタンパク質に対して測定された結合濃度を反映する試験値を決定するステップを含む。結合濃度の値は、決定された濃度の入力及びこれらの値の算術演算によって得られる任意の値であり得る。これは、例えば、濃度のシンプルな加算であり得る。また、これらの濃度の所望の重みを反映する因数を用いた各濃度の乗算、次に、結果の合計も含み得る。また、濃度の互いの乗算、又は、乗算、除算、減算、べき乗、及び加算の任意の組み合わせも含み得る。さらに、ある冪（ｓｏｍｅ  ｐｏｗｅｒ）へのそれらの濃度の上昇（ｒａｉｓｉｎｇ）も含み得る。
【００５１】
結果として生じる結合濃度の値は、歯肉炎又は歯周炎の欠如に関連している結合濃度を同じ様式で反映する閾値と比較される。この閾値は、典型的には、歯肉炎又は歯周炎に関連していない値であるため、歯肉の健康に関して健康としてみなされる。この比較によって、試験値が上記の対象者における歯肉炎の存在を示すかどうかを評価することが可能である。
【００５２】
閾値は、例えば、歯肉炎又は歯周炎の欠如に関連している参照試料における、すなわち、歯肉の健康に関して健康であるとして分類された対象者における同じタンパク質に対して決定された濃度に基づき同じ様式で得られた結合濃度の値であり得る。典型的には、その結果、閾値によって反映される結合濃度を超える結合濃度を反映する試験値は、上記の対象者における歯肉炎の存在を示す。しかし、歯肉炎を示す試験値が閾値を下回り、歯肉炎又は歯周炎を示さない試験値が閾値を超えるように（例えば、負の乗数を使用することによって）閾値を計算することも可能であるということが理解されることになる。
【００５３】
閾値は、健康な対象者、及び、既知の歯肉炎の診断が下った対象者を含む一組の試料における本バイオマーカータンパク質の濃度を測定することに基づき決定することもできる。その結果、測定された濃度の値は、機械学習法をおそらく含む統計学的分析を受けることができ、所望の感度及び特異性で、健康であるとして分類された対象者と、歯肉炎を患う患者として分類された対象者とを識別するのを可能にしている。そこから、所望の閾値を得ることができる。この閾値に基づき、検査されることになる試料は、同じ濃度測定を受けることができ、濃度の値は、次に、閾値と比較することができる結合濃度の値を決定するように、閾値が得られたのと同じ様式で処理され、従って、検査した試料が健康であるか又は歯肉炎の存在を示すとして分類されるのが可能になる。
【００５４】
興味深い実施形態では、結合濃度の値は、以下のようなスコアの形で得られる。数値（例えば、ｎｇ／ｍｌのタンパク質濃度の値）が各測定に割り当てられ、これらの値は線形又は非線形結合で使用されて、ゼロから１のスコアが計算される。上述のように閾値が一組の対象者に基づき決定される事象では、０から１のスコアは、典型的には、（さらに示されるように）結合濃度を入力とするシグモイド関数を用いて計算される。
【００５５】
スコアが特定の閾値を超えた場合、当該方法は、患者が歯肉炎を有しているということを示す。閾値は、所望の感度及び特異性に基づき選ばれてもよい。別の興味深い実施形態では、同じスコアが、ゼロと１との間で計算されるが、ここでは、（専門家が、自身の患者の全評価を考慮してこれを解釈することができるように）歯肉炎を有している可能性を反映している。或いは、スコアは、例えば歯肉炎を有する低い、中程度の、又は高いリスクを述べる認定された指標に変換される。
【００５６】
本発明に従って、対象者において「健康又は歯肉炎の分類」を行うことにおいて、これは、歯周炎等、より重度の口腔衛生炎症状態を患っていないと仮定することができる対象者に対するものであるということが理解されることになる。これは、例えば以前に行われた歯周炎の診断から既知であってもよく、又は、例えば、対象者の口腔衛生状態の記録から仮定されてもよい。
【００５７】
当技術分野において認められている、及び、本開示において適用される臨床的定義は、以下に基づいている：
歯肉炎指数（ＧＩ）
フルマウスの歯肉炎指数が、０から４のスケールで評価されるＬｏｂｅｎｅ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｇｉｎｇｉｖａｌ  Ｉｎｄｅｘ  （ＭＧＩ）に基づき記録されることになり、ここで：
−  ０＝炎症の欠如
−  １＝軽度の炎症；色のわずかな変化、任意の部分ではあるがマージン又は乳頭部歯肉ユニット全体ではない部分のテクスチャーの変化はほとんどない
−  ２＝軽度の炎症；であるが、マージン又は乳頭部ユニット全体を含む
−  ３＝中等度の炎症；グレージング、発赤、浮腫、及び／又は、マージン又は乳頭部ユニットの肥大
−  ４＝重度の炎症；顕著な発赤、浮腫、及び／又は、マージン又は乳頭部歯肉ユニットの肥大、特発性出血、うっ血、又は潰瘍
である。
【００５８】
プロービング深さ（ＰＤ）
プロービング深さは、手動のＵＮＣ−１５歯周プローブを使用して、最も近いｍｍまで記録されることになる。プロービング深さとは、（ポケットの底部にあると仮定される）プローブの先端から歯肉の遊離縁までの距離のことである。
【００５９】
歯肉退縮（ＲＥＣ）
歯肉退縮は、手動のＵＮＣ−１５歯周プローブを使用して、最も近いｍｍまで記録されることになる。歯肉退縮とは、歯肉の遊離縁からセメントエナメル境までの距離のことである。歯肉退縮は正の数として示されることになり、歯肉異常増殖は負の数として示されることになる。
【００６０】
臨床的アタッチメントロス（ＣＡＬ）
臨床的アタッチメントロスは、各部位のプロービング深さ＋退縮の和として計算されることになる。
【００６１】
プロービング時の出血（ＢＯＰ）
プロービング後、各部位は、プロービング時の出血について評価されることになり、出血がプロービングから３０秒以内に発生する場合、その部位には１というスコアが割り当てられることになり、そうでない場合は０というスコアが割り当てられることになる。
【００６２】
結果として生じる対象者群（患者群）の定義は以下の通りである：
−  健常者群（Ｈ）：全部位においてＰＤ≦３ｍｍである（が、最後の植立臼歯の遠位部では４ｍｍまでのポケットが許容される）、隣接面（ｉｎｔｅｒｐｒｏｘｉｍａｌ）アタッチメントロスを有する部位は無し、≦１０％の部位において≧２．０のＧＩ、％ＢＯＰスコア≦１０％；
−  歯肉炎群（Ｇ）：＞３０％の部位においてＧＩ≧３．０、隣接面アタッチメントロスを有する部位は無し、ＰＤ＞４ｍｍを有する部位は無し、％ＢＯＰスコア＞１０％；
−  軽度から中等度の歯周炎群（ＭＰ）：≧８の歯での５〜７ｍｍの隣接面ＰＤ（約２〜４ｍｍＣＡＬに等しい）、％ＢＯＰスコア＞３０％； 
−  進行した歯周炎群（ＡＰ）：≧１２の歯での≧７ｍｍの隣接面ＰＤ（約≧５ｍｍＣＡＬに等しい）、％ＢＯＰスコア＞３０％。
【００６３】
一実施形態では、本発明の方法は、図１において概略的に表されているシステムを使用する。システムは、様々な装置の構成要素（ユニット）をその中に一体化させた単一の装置であり得る。システムは、その様々な構成要素又はこれらの構成要素の一部を別の装置として有することもできる。図１において示されている構成要素は、測定装置（Ａ）、グラフィカルユーザインタフェース（Ｂ）、及びコンピュータ処理ユニット（Ｃ）である。
【００６４】
上述のように、本発明のシステムは、インタフェースへのデータ接続を含み、それによって、インタフェース自体は、システムの一部であり得るか、又は、リモートインタフェースであり得る。後者は、実際のインタフェースを提供するために、異なる装置、好ましくはスマートフォン又はタブレットコンピュータ等のハンドヘルド装置を使用する可能性を指す。そのような場合におけるデータ接続は、好ましくは、Ｗｉ−Ｆｉ又はＢｌｕｅｔｏｏｔｈ（登録商標）によって又は他の技術若しくは規格によって等、無線データ転送を含むことになる。
【００６５】
測定装置（Ａ）は、例えば、装置（Ａ）に挿入することができるカートリッジ（Ａ１）上に唾液を滴下することによって等、唾液試料を受けるように構成されている。この装置は、同じ唾液試料から、少なくともタンパク質であるＨＧＦ及びＩＬ−１β、並びに、タンパク質であるＣＲＰ及びＨｂのうち少なくとも１つの濃度を決定することができる既存の装置であり得る。処理ユニット（Ｃ）は、部品（Ａ）からタンパク質濃度に対する数値を受ける。ユニット（Ｃ）には、０から１のスコア（Ｓ）を計算するのを可能にするソフトウェア（典型的には、組み込みソフトウェア）が提供される。ソフトウェアは、閾値（Ｔ）の数値をさらに含む。計算された値（Ｓ）が（Ｔ）を超える場合、ユニット（Ｃ）は、グラフィカルユーザインタフェース（Ｂ）に「歯肉炎」の指標（Ｉ）を出力し、そうでない場合は「歯肉炎なし」を出力することになる。さらなる実施形態は、（Ｓ）の特定の値を使用して、指標（Ｉ）が作製される確実性を示してもよい。これは確率スコアであり得、それによって、０．５は可能な閾値であり、例えば、スコアＳ＝０．８は、歯肉炎の可能性を示しているであろう。興味深い選択肢は：
−  スコアＳに基づいて、確実性を直接示すことができ、すなわち、Ｓ＝０．８は、８０％の歯肉炎の確実性を意味する；
−  スコアＳに基づいて、２進法又は３進法表示（ａ  ｂｉｎａｒｙ  ｏｒ  ｔｅｒｔｉａｒｙ  ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ）を作製することができる；
−  Ｓ＜Ｔ→健康、Ｓ≧Ｔ→歯肉炎
−  Ｓ＜Ｒ１→健康、Ｒ１≦Ｓ＜Ｒ２→決定的ではない
−  Ｓ≧Ｒ２→歯肉炎
である。
【００６６】
加えて、そのような２進法又は３進法表示に確実性を添付することが可能である。この確実性は、選ばれた１つ又は複数の閾値（Ｔ，Ｒ１，Ｒ２）からのスコアＳの距離によって決定されることになる。
【００６７】
＊スコアの特定の計算は、例えば、以下の式：
【００６８】
【数１】
2020527693.tif 000003
を適用するシグモイド関数によって実践することができる。
【００６９】
式中、Ｎは、使用されるタンパク質／バイオマーカーの数であり、ｃ０、ｃ１等は係数（数値）であり、さらに、Ｂ１、Ｂ２等はそれぞれのタンパク質濃度である。
【００７０】
＊係数の決定は、訓練手順によって行うことができる：
−  歯肉炎を有するＮ１対象者及び歯肉炎を有していないＮ２対象者を選択する。歯肉炎を有していない対象者は、スコアＳ＝０を有すると考えられ、歯肉炎を有する対象者は、スコアＳ＝１を有すると考えられる。
−  各対象者から唾液試料を採取し、先に説明されたバイオマーカーの組み合わせのタンパク質濃度を決定する。
−  タンパク質濃度とスコアのロジスティック回帰を行う。
【００７１】
＊他の回帰又は機械学習方法（線形回帰、ニューラルネットワーク、サポートベクターマシン）を使用して、タンパク質濃度に基づき、対象者が歯肉炎を有するか又は健康な口腔状態を有するかどうかを予測する分類器を訓練することができる。
【００７２】
上述のシステムに関して、本発明は、さらなる態様において、対象者における歯肉炎を診断するためのシステムも提供し、当該システムは：
−  患者の唾液の試料において、タンパク質であるＨＧＦ、ＩＬ−１β、並びに、ＣＲＰ及びＨｂのうち少なくとも１つを検出することができ且つ検出するように適応した検出手段であって；先に説明したように、そのような手段は、既知で当業者には容易に手に入れやすく；典型的には、検出手段が提供される対象者の口腔試料をその中で受けるための容器が提供される、検出手段；
−  上記のタンパク質の決定された濃度から、対象者が歯肉炎を有するか否かの指標を決定することができ且つ決定するように適応したプロセッサ；
を含む。
【００７３】
任意的に、当該システムは、情報を提示することができるユーザインタフェース（又は、リモートインタフェースへのデータ接続）、特にグラフィカルユーザインタフェース（ＧＵＩ）を含み；ＧＵＩは、テキストベースのユーザインタフェース、タイプされたコマンドラベル、又はテキストナビゲーションの代わりに（そのようなインタフェースタイプはいずれも本発明において除外されない）、グラフィカルなアイコン及び二次表記等の可視指示を介して電子装置とユーザが相互作用することを可能にするタイプのユーザインタフェースであり；ＧＵＩは、一般的に知られており、典型的には、ＭＰ３プレーヤー、ポータブルメディアプレーヤー、ゲーム装置、スマートフォン、及び小規模な家庭用、オフィス用及び工業用の制御装置等、ハンドヘルドモバイル装置において使用されており；上記のように、インタフェースは、任意的に、例えば対象者の年齢、性別、ＢＭＩ（肥満度指数）等の情報を入れることができるように選ぶこともできる。
【００７４】
本発明は、別に又は上述のシステムの一部として、患者の唾液の試料における歯肉炎に対する少なくとも３つのバイオマーカーを検出するためのキットも提供する。本発明のキットは、ＨＧＦ、ＩＬ−１β、並びに、ＣＲＰ及びＨｂのうち１つを検出するための１つ又は複数の検出試薬を含む。典型的には、キットは、それぞれが異なるバイオマーカーに向けられた３つの検出試薬を含み、ここで、第１の検出試薬は肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）に結合することができ、第２の検出試薬はインターロイキン１β（ＩＬ−１β）に結合することができ、さらに、第３の検出試薬は、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）及びヘモグロビン（Ｈｂ）のうち１つに結合することができる。本発明の方法に関連して上述したように、キットは、特にＣＲＰ及びＨｂのうちもう一方に対して、及び／又は、ＩＬ６及び／又はエラスターゼに対して等、さらなる検出試薬を含んでもよい。好ましい実施形態では、当該キットにおいて利用可能にされる検出試薬は、上述のように、本発明の３−バイオマーカーパネルを構成する３つのタンパク質の選択のための検出試薬から成る。
【００７５】
好ましくは、当該キットは、上記の検出試薬を含む、チップ、マイクロタイタープレート、又はビーズ若しくは樹脂等、固体の支持体を含む。一部の実施形態では、当該キットは、ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（商標）等の質量分析プローブを含む。
【００７６】
キットは、非結合の検出試薬又は上記のバイオマーカーに特異的な洗浄溶液及び／又は検出試薬も提供することができる（サンドイッチタイプのアッセイ）。
【００７７】
興味深い態様において、本発明のバイオマーカーパネルの認識は、時間の経過に伴い、対象、特に対象者における歯肉炎の状態をモニターすることにおいて適用される。従って、本発明は、第１の時点ｔ１から第２の時点ｔ２までの時間間隔にわたる、対象者における歯肉炎の状態の変化を決定するための体外での方法も提供する。当該方法は、ｔ１にて上記の対象者から得られた少なくとも１つの唾液試料において、及び、ｔ２にて上記の患者から得られた少なくとも１つの唾液試料において、タンパク質である：肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インターロイキン１β（ＩＬ−１β）、並びに、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）及びヘモグロビン（Ｈｂ）のうち少なくとも１つの濃度を検出するステップを含む。得られた両方の測定において得られた濃度は比較され、それによって、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは３つ全ての濃度の差が状態の変化を反映する。この差は、濃度の差として審査することができ、従って、まず０から１の数字を生成することなく、又は、いかなる他の分類もなしに、直接比較が可能である。両時点にて受けた測定値は、上記のように歯肉炎の欠如又は発生を決定する場合に行われるのとまさに同じ方法で処理することもできるということが理解されることになる。
【００７８】
本発明は、患者が歯肉炎を有するかどうかを診断する方法も提供し、当該方法は、患者の唾液において、タンパク質である肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インターロイキン１β（ＩＬ−１β）、並びに、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）及びヘモグロビン（Ｈｂ）のうち少なくとも１つの存在を検出するステップと、上記の試料における上記のタンパク質の濃度に基づき患者における歯肉炎の存在を評価するステップとを含む。任意的に、この態様の方法は、患者における歯肉炎を治療するさらなるステップを含む。この任意の治療ステップは、既知の治療剤の投与若しくは歯科処置、又は、治療剤及び歯科処置の組み合わせを含み得る。既知の治療剤には、口腔洗浄薬、チップ、ゲル、又はミクロスフェア等の抗菌剤含有薬剤の投与が含まれる。歯肉炎の治療において使用するための典型的な抗菌剤はクロルヘキシジンである。他の治療剤には、抗生物質、典型的には経口投与される抗生物質、及びドキシサイクリン等の酵素抑制薬が含まれる。既知の非外科的な治療手技には、スケーリング、又は、スケーリング及びルートプレーニング（ＳＲＰ）が含まれる。
【００７９】
本発明は、歯肉炎を患う患者において、タンパク質である肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インターロイキン１β（ＩＬ−１β）、並びに、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）及びヘモグロビン（Ｈｂ）のうち少なくとも１つを検出する方法をさらに提供し、当該方法は：
（ａ）患者から唾液試料を得るステップと、
（ｂ）唾液試料を、上記のタンパク質に結合することができる１つ又は複数の検出試薬と接触させ、各タンパク質と１つ又は複数の検出試薬との結合を検出することによって、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インターロイキン１β（ＩＬ−１β）、並びに、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）及びヘモグロビン（Ｈｂ）のうち少なくとも１つが唾液試料中に存在するかどうかを検出するステップと、
を含む。
【００８０】
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照してさらに例示される。
【００８１】
実施例
５４の対象者を用いた臨床試験において、そのうち２５例を歯肉炎と診断し、２９例を健康な歯肉を有すると診断し、ＲＯＣ（受信者動作特性）曲線下面積（ＡＵＣ）値を得た。
【００８２】
統計では、受信者動作特性曲線又はＲＯＣ曲線は、その弁別閾値が変化するに従い二項分類器システムの性能を例示するグラフィカルプロットである。この曲線は、様々な閾値設定での偽陽性率（ＦＰＲ）に対して真陽性率（ＴＰＲ）をプロットすることによって作成される。真陽性率は、機械学習における感度、想起、又は検出の確率としても知られている。偽陽性率は、フォールアウト又はフォルスアラームの確率としても知られており、（１−特異性）として計算することができる。従って、ＲＯＣ曲線は、フォールアウトの関数としての感度である。一般に、検出及びフォルスアラームの両方の確率分布が既知である場合、ＲＯＣ曲線は、ｙ軸上の検出確率の累積分布関数（−∞から弁別閾値までの確率分布下の面積）を、ｘ軸上のフォルスアラーム確率の累積分布関数に対してプロットすることによって生成することができる。試験の精度は、検査している群を、問題の疾患を有する群と有さない群とにどれだけうまく試験が分けるかに依存する。精度は、ＲＯＣ曲線下面積によって測定される。１の面積は完璧な試験を表し；０．５の面積は価値の無い試験を表す。診断試験の精度を分類するためのガイドは、伝統的なアカデミックポイントシステム：
−  ０．９０−１＝秀（Ａ）
−  ０．８０−０．９０＝優（Ｂ）
−  ０．７０−０．８０＝良（Ｃ）
−  ０．６０−０．７０＝可（Ｄ）
−  ０．５０−０．６０＝不可（Ｆ）
である。
【００８３】
上記に基づき、上述の臨床試験の結果において、０．７５を超えるＲＯＣ  ＡＵＣ値が、本発明に係る診断試験を提供するための望ましい精度を表すと考慮される。
【００８４】
以下の表１は、決定された全てのバイオマーカー及びバイオマーカーパネルの中から、０．７０を超えるＲＯＣ  ＡＵＣ値を表すデータを要約したものである。表において提示されているバイオマーカータンパク質は、上述のＨＧＦ、ＩＬ−１β、ＣＲＰ、及びＨｂだけでなく、インターロイキン６（Ｌ６）及びエラスターゼである。表において、０．８１のＲＯＣ  ＡＵＣに関して最大の結果が、４つのマーカー：ＨＧＦ、ＩＬ−１β、ＣＲＰ、及びエラスターゼから成るバイオマーカーパネルを用いて得られているということがわかる。これに近い０．８０という結果が、５つのバイオマーカー、すなわち、ＨＧＦ、ＩＬ−１β、ＣＲＰ、Ｈｂ、及びエラスターゼ、又は、ＨＧＦ、ＩＬ−１β、ＣＲＰ、ＩＬ６、及びエラスターゼのパネルを用いて、又は、６−マーカーパネルを用いてさえも得られている。
【００８５】
しかし、本発明において有用な、シンプルであるが十分に信頼性のある試験を提供するために、可能な限り少ないバイオマーカーを適用することが望ましい。その結果、１つのマーカー及び２つのマーカーのバイオマーカーパネルは、０．７５以下の、すなわち、完璧な試験（１）よりも上述の価値の無い試験の値（０．５）に近いＲＯＣ  ＡＵＣ値を提供するということがわかる。
【００８６】
ここで、可能な限り少ないマーカーを適用する０．７５を超えるＲＯＣ  ＡＵＣを有するという最適な結果は、ＨＧＦ、ＩＬ−１β、並びに、ＣＲＰ及びＨｂのうちいずれか（３−マーカーパネル）、又は、ＣＲＰ及びＨｂの両方（４−マーカーパネル）から成るバイオマーカーパネルの選択に付随的であるということがわかった。明らかに、結果は類似しており、３マーカーパネルが、４マーカーパネルよりも好ましい。
【００８７】
【表１】
2020527693.tif 000004
本発明は、図面及び上記の説明において詳細に例示及び記述されてきたけれども、そのような例示及び記述は、例示的又は例証的であり、拘束性はないと考慮されることになる。本発明は、開示された実施形態に限定されない。
【００８８】
例えば、異なるバイオマーカーに対する検出試薬を異なる単位で提示することが可能である。又は、好都合に、本発明のキットは、全ての実施形態において使用されるタンパク質バイオマーカー、すなわち、ＨＧＦ及びＩＬ−１βに対する固定されたセットの検出試薬、並びに、さらなるバイオマーカーのいずれか、すなわち、ＣＲＰ又はＨｂに対する検出試薬を含む可変モジュールを含むことができる。
【００８９】
開示された実施形態に対する他の変化は、請求された発明を実行する際に、図面、明細書、及び付随の特許請求の範囲の調査から当業者により理解する及びもたらすことができる。特許請求の範囲において、「含む」という用語は、他の要素又はステップを除外せず、不定冠詞はその複数形を除外しない。本発明の特定の特徴が互いに異なる従属項において記載されているという単なる事実は、これらの特徴の組合せを役立つよう使用することができないと示しているわけではない。特許請求の範囲におけるいかなる参照番号も、その範囲を限定するとして解釈されるべきではない。
【００９０】
要約すると、本発明者等は、本明細書によって、対象者における歯肉炎の存在を評価するための体外での方法を開示している。この方法は、３つのバイオマーカータンパク質の選択を決定するための洞察に基づいている。従って、対象者の唾液試料において、タンパク質である肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）及びインターロイキン１β（ＩＬ−１β）、並びに、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）及びヘモグロビン（Ｈｂ）のうち少なくとも１つの濃度が測定される。測定された濃度に基づき、上記のタンパク質に対する結合濃度を反映する値が決定される。この値は、歯肉炎又は歯周炎の欠如に関連している結合濃度を同じ様式で反映する閾値と比較される。この比較によって、試験値が上記の対象における歯肉炎の存在を示すかどうかを評価することが可能である。その結果、典型的には、閾値によって反映される結合濃度を超える結合濃度を反映する試験値は、歯肉炎の存在を示す。
【図１】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年6月20日(2019.6.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象者における歯肉炎の存在を評価するための体外での方法であって、前記対象者由来の唾液試料において、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インターロイキン１β（ＩＬ−１β）、及びＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）から成るタンパク質の濃度を検出するステップと、前記タンパク質に対して測定された結合濃度を反映する試験値を決定するステップと、前記試験値が、前記対象者における歯肉炎の存在を示しているかどうかを評価するように、前記試験値を、歯肉炎又は歯周炎の欠如に関連している結合濃度を同じ様式で反映する閾値と比較するステップとを含む方法。
【請求項２】
前記閾値は、１つ又は複数の参照試料中の前記タンパク質に対して決定された濃度に基づいており、各試料は、歯肉炎又は歯周炎の欠如に関連している、又は、
前記閾値は、歯肉炎又は歯周炎を有していない対象者由来の試料、及び、歯肉炎を有する対象者由来の試料を含む一組の試料中の前記タンパク質の濃度に基づいている、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
決定された前記濃度の値は、０から１の数字に算術的に処理される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
対象者における歯肉炎の存在を評価するためのバイオマーカーとしての、前記対象者の唾液試料における肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インターロイキン１β（ＩＬ−１β）、及びＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）から成るタンパク質の使用。
【請求項５】
患者の唾液の試料における歯肉炎に対する３つのバイオマーカーを検出するためのキットであって、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インターロイキン１β（ＩＬ−１β）、及びＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）から成るタンパク質を検出するための１つ又は複数の検出試薬を含み、任意的に、
前記１つ又は複数の検出試薬は、３つの検出試薬である、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を検出するための第１の検出試薬、インターロイキン１β（ＩＬ−１β）を検出するための第２の検出試薬、及びＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）を検出するための第３の検出試薬を含む、キット。
【請求項６】
前記１つ又は複数の検出試薬は、固体支持体上に含まれる、請求項５に記載のキット。
【請求項７】
対象者における歯肉炎を診断するためのシステムであって、
−  患者の唾液の試料において、ＨＧＦ、ＩＬ−１β、及びＣＲＰから成るタンパク質を検出することができ且つ検出するように適応した検出手段と、
−  前記タンパク質の決定された濃度から、前記対象者が歯肉炎を有するかどうかの指標を決定することができ且つ決定するように適応したプロセッサと、
を含み、任意的に、
口腔液試料を受けるための容器であって、前記検出手段を含む容器
をさらに含むシステム。
【請求項８】
−  前記指標をユーザに提示するためのユーザインタフェースと、
−  前記プロセッサから前記ユーザインタフェースへ前記指標を転送するための前記プロセッサと前記ユーザインタフェースとの間のデータ接続と、
をさらに含む、請求項７に記載のシステム。
【請求項９】
前記プロセッサは、インターネットベースのアプリケーションによって機能することを可能にする、請求項７又は８に記載のシステム。
【請求項１０】
第１の時点ｔ１から第２の時点ｔ２までの時間間隔にわたる、対象者における歯肉炎の状態の変化を決定するための体外での方法であって、ｔ１にて前記対象者から得られた少なくとも１つの唾液試料において、及び、ｔ２にて前記対象者から得られた少なくとも１つの唾液試料において、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インターロイキン１β（ＩＬ−１β）、及びＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）から成るタンパク質の濃度を検出するステップと、前記濃度を比較し、それによって、いずれか１つ、２つ、又は３つ全ての濃度の差が状態の変化を反映しているステップとを含む方法。
【請求項１１】
患者が歯肉炎を有するかどうかを診断する方法であって、前記患者の唾液の試料において、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インターロイキン１β（ＩＬ−１β）、及びＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）から成るタンパク質を検出するステップと、前記患者における歯肉炎の存在を、前記試料における前記タンパク質の濃度に基づき評価するステップとを含む方法。
【請求項１２】
歯肉炎を患う患者において、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インターロイキン１β（ＩＬ−１β）、及びＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）から成るタンパク質を検出する方法であって、
（ａ）患者から唾液試料を得るステップと、
（ｂ）前記試料を、前記タンパク質に結合することができる１つ又は複数の検出試薬と接触させ、各タンパク質と前記１つ又は複数の検出試薬との結合を検出することによって、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インターロイキン１β（ＩＬ−１β）、及びＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）が前記試料中に存在するかどうかを検出するステップと、
を含む方法。
【国際調査報告】
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