(57)【要約】  本発明は、プロバイオティクス又はライブバイオセラピューティクスとして人々に投与するのに適した、安定で、効力が高く、動物由来の添加剤を含まない、ラクトバチルスの乾燥保存調製物を提供する。
2020526583.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物由来の添加剤を含まない、膣ラクトバチルス属菌種の水性細菌懸濁液であって、前記懸濁液が、膣ラクトバチルス属菌種の細胞ペレットと、
（ｉ）５〜２０％（ｗ／ｖ）のトレハロース、
（ｉｉ）２〜９％（ｗ／ｖ）のキシリトール、
（ｉｉｉ）０．５〜１．５％（ｗ／ｖ）のアスコルビン酸ナトリウム、及び
（ｉｖ）１０〜５０ｍＭのリン酸ナトリウム、
から実質的に成る水性保存媒体と、の組み合わせにより得られるものである、水性細菌懸濁液。
【請求項２】
前記水性保存媒体が、所望により０〜５％のグルタミン酸ナトリウムを含む、請求項１に記載の細菌懸濁液。
【請求項３】
前記膣ラクトバチルス属菌種が、有効培養条件下で０．５ｐｐｍ超の過酸化水素を生産する能力を有する、請求項１に記載の細菌懸濁液。
【請求項４】
前記膣ラクトバチルス属菌種が、ラクトバチルス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ラクトバチルス・ジェンセニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｅｎｓｅｎｉｉ）、及びラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）からなる群より選択される、請求項１に記載の細菌懸濁液。
【請求項５】
前記水性保存媒体が、
（ｉ）５〜１５％（ｗ／ｖ）のトレハロース、
（ｉｉ）２〜７％（ｗ／ｖ）のキシリトール、
（ｉｉｉ）０．５〜１．０％（ｗ／ｖ）のアスコルビン酸ナトリウム、及び
（ｉｖ）１０〜３０ｍＭのリン酸ナトリウム、
から実質的に成る、請求項１に記載の細菌懸濁液。
【請求項６】
前記水性保存媒体が、所望により０〜５％のグルタミン酸ナトリウムを含む、請求項５に記載の細菌懸濁液。
【請求項７】
凍結乾燥されて乾燥粉末を形成している、請求項１に記載の細菌懸濁液。
【請求項８】
０．２２０未満の水分活性値を有する、請求項７に記載の乾燥粉末。
【請求項９】
前記粉末が、粉末：添加剤比１：１〜１：１０ｗ／ｗで不活性添加剤と組み合わされる、請求項８に記載の乾燥粉末。
【請求項１０】
前記添加剤がマルトデキストリンである、請求項９に記載の乾燥粉末。
【請求項１１】
前記粉末：添加剤比が１：１〜１：５ｗ／ｗである、請求項９に記載の乾燥粉末。
【請求項１２】
膣内投与のために設計されたプラスチックハウジングに収容されている、請求項７に記載の乾燥粉末。
【請求項１３】
（ｉ）細胞濃度が１ｍＬ当たり１０８〜１０１３である膣ラクトバチルス属菌種の水性懸濁液を得ること、
（ｉｉ）前記溶液を遠心分離して細菌細胞ペレットを形成すること、及び
（ｉｉｉ）
（ａ）５〜２０％（ｗ／ｖ）のトレハロース、
（ｂ）２〜９％（ｗ／ｖ）のキシリトール、
（ｃ）０．５〜１．５％（ｗ／ｖ）のアスコルビン酸ナトリウム、及び
（ｄ）１０〜５０ｍＭのリン酸ナトリウム、
から実質的に成る水性保存媒体中に前記細菌細胞ペレットを再懸濁すること、
を含み、
細菌懸濁液を得るための、保存媒体（ｍＬ）に対する細胞ペレット湿重量（ｇ）の重量割合は、１：１〜１：５（細胞ペレットのグラム数：保存媒体のミリリットル数）である、動物由来の添加剤を含まない乾燥条件下でラクトバチルス属菌種を保存する方法。
【請求項１４】
前記水性保存媒体が、所望により０〜５％のグルタミン酸ナトリウムを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記膣ラクトバチルス属菌種が、有効培養条件下で０．５ｐｐｍ超の過酸化水素を生産する能力を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記膣ラクトバチルス属菌種が、ラクトバチルス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ラクトバチルス・ジェンセニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｅｎｓｅｎｉｉ）、及びラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）からなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記水性保存媒体が、
（ａ）５〜１５％（ｗ／ｖ）のトレハロース、
（ｂ）２〜７％（ｗ／ｖ）のキシリトール、
（ｃ）０．５〜１．０％（ｗ／ｖ）のアスコルビン酸ナトリウム、及び
（ｄ）１０〜３０ｍＭのリン酸ナトリウム、
から実質的に成る、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記水性保存媒体が、所望により０〜５％のグルタミン酸ナトリウムを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
乾燥粉末を得るために凍結乾燥される、請求項１３に記載の細菌懸濁液。
【請求項２０】
０．２２０未満の水分活性値を有する、請求項１３に記載の乾燥粉末。
【請求項２１】
前記乾燥粉末が、粉末：添加剤比１：１〜１：１０ｗ／ｗで不活性添加剤と組み合わされる、請求項２０に記載の乾燥粉末。
【請求項２２】
前記添加剤がマルトデキストリンである、請求項２１に記載の乾燥粉末。
【請求項２３】
前記粉末：添加剤比が１：１〜１：５ｗ／ｗである、請求項２１に記載の乾燥粉末。
【請求項２４】
（ｉ）異常膣微生物叢と診断された女性を選択する工程、
（ｉｉ）異常膣微生物叢のレベルを低下させるために有効な量の抗生物質を投与する工程、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の後、動物由来の添加剤を含まない、膣ラクトバチルス属菌種の水性細菌懸濁液に由来する乾燥粉末を投与する工程であって、前記懸濁液が、膣ラクトバチルス属菌種の細胞ペレットと、
（ａ）５〜２０％（ｗ／ｖ）のトレハロース、
（ｂ）２〜９％（ｗ／ｖ）のキシリトール、
（ｃ）０．５〜１．５％（ｗ／ｖ）のアスコルビン酸ナトリウム、及び
（ｄ）１０〜５０ｍＭのリン酸ナトリウム、
から実質的に成る水性保存媒体と、の組み合わせにより得られる、工程、
を含む、女性における異常膣微生物叢を治療する方法。
【請求項２５】
前記水性保存媒体が、所望により０〜５％のグルタミン酸ナトリウムを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
工程（ｉｉ）が、抗生物質を２〜７日間毎日投与することを含み、工程（ｉｉｉ）が、抗生物質の投与完了２日前から工程（ｉｉ）の抗生物質の投与終了後２日までの任意の時点で開始される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記膣ラクトバチルス属菌種が、有効培養条件下で０．５ｐｐｍ超の過酸化水素を生産する能力を有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記膣ラクトバチルス属菌種が、ラクトバチルス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ラクトバチルス・ジェンセニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｅｎｓｅｎｉｉ）、及びラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）からなる群より選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
０．２２０未満の水分活性値を有する、請求項２４に記載の乾燥粉末。
【請求項３０】
粉末：添加剤比１：１〜１：１０ｗ／ｗで不活性添加剤と組み合わされる、請求項２９に記載の乾燥粉末。
【請求項３１】
前記添加剤がマルトデキストリンである、請求項３０に記載の乾燥粉末。
【請求項３２】
前記粉末：添加剤比が１：１〜１：５ｗ／ｗである、請求項３０に記載の乾燥粉末。
【請求項３３】
前記細胞ペレットが、
（ａ）５〜１５％（ｗ／ｖ）のトレハロース、
（ｂ）２〜７％（ｗ／ｖ）のキシリトール、
（ｃ）０．５〜１．０％（ｗ／ｖ）のアスコルビン酸ナトリウム、及び
（ｄ）１０〜３０ｍＭのリン酸ナトリウム、
から実質的に成る水性保存媒体と組み合わされる、請求項２４に記載の方法。
【請求項３４】
前記水性保存媒体が、所望により０〜５％のグルタミン酸ナトリウムを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記抗生物質が、クリンダマイシン、メトロニダゾール、又はチニダゾールである、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年７月７日に出願された米国仮特許出願第６２／５２９，７５６号の優先権を主張するものであり、該仮特許出願は、その全体の内容が全ての目的のために全体として本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
全てのヒトの粘膜には、細菌叢が自然にコロニーを作っている。最近の研究によって、ヒトの消化管、口腔及び膣内で認められる微生物叢が、身体の細胞及び組織と密接に相互作用して、非特異的宿主防御等の自然の生物学的プロセスを調節することが示されている。例えば、Ｒｅｄｏｎｄｏ−Ｌｏｐｅｚ  ｅt  ａｌ．，  （１９９０）Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１２：８５６−８７２；Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｊ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ２０１６  Ｊｕｌ  ７，５３５（７６１０）：９４−１０３；ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ，Ａ．  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２０１４  Ｍａｙ，１４２（１）：２４−３１；Ｎｅｌｓｏｎ，Ｄ．Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｅｒｏｂｅ  ２０１６  Ｄｅｃ，４２：６７−７３を参照のこと。概して、健康な膣の微生物叢は、乳酸の生成及び膣の酸性化を介して、又は過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）等の他の抗菌生成物の生産によって、感染に抵抗する際に重要な役割を果たすグラム陽性桿菌であるラクトバチルス属菌種が優位を占めている。世界的に最も一般的に健康な女性の生殖器系から単離されるラクトバチルスの種としては、Ｌ．クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、Ｌ．ジェンセニイ（Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ）、Ｌ．ガセリ（Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ）及びＬ．イネルス（Ｌ．ｉｎｅｒｓ）が挙げられる。例えば、Ａｎｔｏｎｉｏ  ｅｔ  ａｌ，  （１９９９）  Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  １８０：  １９５０−１９５６；  Ｖａｓｑｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００２）  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ４０：２７４６−２７４９；  Ｖａｌｌｏｒ，  Ａ．  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．  ２００１  Ｄｅｃ  １，  １８４（１１）：  １４３１−６；  Ｒａｖｅｌ，  Ｌ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐ  ｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，  ＵＳＡ．  ２０１１  Ｍａｒ  １５，  １０８  Ｓｕｐｐｌ  １  ：４６８０−７を参照のこと。Ｌ．クリスパタス、Ｌ．ジェンセニイ、及びＬ．ガセリは、Ｈ２Ｏ２を生産する能力があるが、Ｌ．イネルス株は、概してＨ２Ｏ２を生産しない。これらの種は、食物中及び／又は環境中のラクトバチルス属菌種とは系統学的かつ機能的に異なる。これらの通性嫌気性菌は、グルコースを乳酸に代謝し、これは膣の非特異的宿主防御の主要部分を担う、膣の低ｐＨ（４．０〜４．５）の維持に寄与する。酸性のｐＨは日和見性の共生生物及び病原生物の増殖に対する顕著な拮抗作用を有し、乳酸はＨＩＶ及びＨＳＶ−２に対する抗ウィルス活性を有する。
【０００３】
Ｈ２Ｏ２生産株（例えば、Ｌ．クリスパタス及びＬ．ジェンセニイ）は、Ｈ２Ｏ２を生産しないもの（Ｌ．イネルス）よりも保護力が強い。充分な量の保護的ラクトバチルス属菌種がコロニーを形成した膣粘膜を有する女性は、淋病、クラミジア感染、トリコモナス症及び細菌性腟症の頻度が５０％低いことが示されている。膣内のＨ２Ｏ２を生産するラクトバチルスの存在は、細菌性腟症、症候性酵母菌性腟炎、並びにナイセリア・ゴノレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａ）、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、トリコモナス・バギナリス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）等の性感染性病原体の頻度の低下と関連している。インビトロにおける研究において、Ｈ２Ｏ２を生産するラクトバチルスは、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）等の膣病原体に対して強力な殺菌性及び殺ウィルス性を有することが示されている。したがって、膣粘膜に関連する有益なラクトバチルスは、保護的な「バイオフィルム」を提供すると考えることができる。例えば、Ｆａｌａｇａｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｄｒｕｇｓ，６６：１２５３−１２６１を参照のこと。
【０００４】
多くの膣用薬物及び全身性薬物は、膣ラクトバチルスを死滅させる可能性があり、優位を占めている膣ラクトバチルス属菌種が欠乏すると、ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）及びアトポビウム・バギナ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ  ｖａｇｉｎａｅ）等の通性嫌気性菌及び偏性嫌気性菌が生息する異常微生物叢の多様性が増大したり、膣のｐＨが上昇したり、炎症誘発性サイトカインのレベルが増大したりする。これらは、細菌性腟症（ＢＶ）等の臨床症候群の進展、日和見感染の確立、女性におけるＨＩＶ−１及び単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）のリスクの増加に関連しうる。例えば、Ｓｈａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  １９１  ：２５−３２；  Ｔａｈａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  ＡＩＤＳ  １２：  １６９９−１７０６；  Ｂｏｌｔｏｎ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｅｘ  Ｔｒａｎｓ  Ｄｉｓ  ２００８  Ｍａｒ  ３５（３）：２１４−２１５を参照のこと。ゆえに、性感染症を抗生物質で治療すると、女性が繰り返し当該疾患にかかるリスクが増大する可能性がある。これらの知見は、ラクトバチルスが概して膣の健康を促進するというよく知られた見解とともに、女性は、尿生殖路感染を予防又は治療するために、ラクトバチルスのコロニーを膣に再形成するべきであるということを臨床医に示唆してきた。
【０００５】
健康な膣の微生物叢を補充し、尿生殖路感染を予防するための、抗生物質を用いない生態学的に適切なアプローチ、例えばラクトバチルス置換治療（ＬＲＴ）の開発には、相当な関心がおかれてきた。ＬＲＴの成功は、生態学的に適切なラクトバチルス属菌株の選択、細胞保存、再度水分を与えられた後の乾燥ラクトバチルス調製物の回収、並びに膣のコロニー形成の程度及び継続時間に一部依存する。有益な細菌及びその他の物質を膣粘膜に投与するための各種方法が知られている。実際、腟内用又は経口用のラクトバチルス製品は、健康食品店で入手可能な「アシドフィルス」調製物、及び食料品店で購入されるアシドフィルスミルク又はアシドフィルスヨーグルトの形で、１００年を超えて入手可能であった（例えば、これらの製品は、通常、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）の株を含むことを謳っている）。これらの製品は、ヒト由来の凍結乾燥ラクトバチルス・アシドフィルスを含有する膣錠、カプセル及び膣坐剤、並びに各種栄養補助食品を含むものであった。
【０００６】
これらの製品では、膣に外因性ラクトバチルスのコロニーを形成させることができず、たいがい有効ではない。これらの失敗は、多くの場合、商業的に入手可能な製品の品質が低く、またプロバイオティクスに含まれるラクトバチルス属菌種が膣由来ではないため膣に適切でないことに起因する。食物又はラクトバチルス補助食品として販売されるラクトバチルス製品には、多くの場合、他の潜在的病原体が混入していることが報告されている。さらに、ヨーグルトから得られるラクトバチルスは、膣上皮細胞に固着することができない。ラクトバチルスが前記上皮細胞に固着することは、宿主生物のコロニー形成を確立するために必要な工程である。さらに、模擬的な膣液中における回収率の低さに示される、生理学的に生存能力のある細胞の割合の低さは、実際の細菌の用量に著しい影響を及ぼす。
【０００７】
ゆえに、厳しい条件下でも製造することが可能であり、かつ、インビボにおける殺菌性を有し、膣上皮細胞に付着し、生菌叢の有効な効力を有する適切なヒトラクトバチルス属菌株を用いた、膣感染症の治療のための製品が必要とされる。本発明は、これらの必要性及びその他の必要性に応えるものである。
【発明の概要】
【０００８】
一態様において、本発明は、動物由来の添加剤を含まない膣ラクトバチルス属菌種の水性細菌懸濁液を提供する。前記懸濁液は、膣ラクトバチルス属菌種の細胞ペレットと水性保存媒体との組み合わせにより得ることができる。前記水性保存媒体は、５〜２０％（ｗ／ｖ）のトレハロース、２〜９％（ｗ／ｖ）のキシリトール、０．５〜１．５％（ｗ／ｖ）のアスコルビン酸ナトリウム、１０〜５０ｍＭのリン酸ナトリウム、所望により０〜５％（ｗ／ｖ）のグルタミン酸ナトリウムを含んでいてもよい。
【０００９】
別の態様において、本発明は、動物由来の添加剤の非存在下で、乾燥条件下でラクトバチルス属菌種を保存する方法を提供する。前記方法は、細胞濃度が１ｍＬ当たり約１０８〜約１０１０である膣ラクトバチルス属菌種の水性懸濁液を得ること、前記溶液を遠心分離して細胞ペレットを形成すること、及び水性保存媒体中に前記細胞ペレットを再懸濁することを含む。前記水性保存媒体は、５〜２０％（ｗ／ｖ）のトレハロース、２〜９％（ｗ／ｖ）のキシリトール、０．５〜１．５％（ｗ／ｖ）のアスコルビン酸ナトリウム、１０〜５０ｍＭのリン酸ナトリウム、及び所望により０〜５％（ｗ／ｖ）のグルタミン酸ナトリウムを含んでいてもよい。得られた前記細菌懸濁液は、保存媒体（ｍＬ）に対する細胞ペレット湿重量（すなわち、遠心分離を行い、上清をデカントした後の細胞ペレットのグラム数）の重量割合が１：１〜１：５（ペレットのグラム数：保存媒体のミリリットル数）であってもよい。
【００１０】
本発明の別の態様は、女性における異常膣微生物叢を治療する方法を提供するものである。前記方法は、異常膣微生物叢と診断された女性を選択すること、異常膣微生物叢のレベルを低下させるために有効な量の抗生物質を投与すること、その後、動物由来の添加剤を含まない、膣ラクトバチルス属菌種の水性細菌懸濁液に由来する乾燥粉末を投与することを含む。前記水性懸濁液は、膣ラクトバチルス属菌種の細胞ペレットと、５〜２０％（ｗ／ｖ）のトレハロース、２〜９％（ｗ／ｖ）のキシリトール、０．５〜１．５％（ｗ／ｖ）のアスコルビン酸ナトリウム、１０〜５０ｍＭのリン酸ナトリウム、及び所望により０〜５％（ｗ／ｖ）のグルタミン酸ナトリウムを含むことができる水性保存媒体と、の組み合わせにより得られるものである。
【００１１】
いくつかの実施形態において、女性における異常膣微生物叢を治療する前記方法は、抗生物質を２〜７日間毎日投与することを含み、前記乾燥粉末の前記投与は、抗生物質の投与の中止２日前から抗生物質の投与２日後までの任意の時点で開始することができる。いくつかの場合において、前記抗生物質は、クリンダマイシン、メトロニダゾール、又はチニダゾールであってもよい。
【００１２】
以下の実施形態は、本発明の上記態様のいずれとも組み合わせることができる。例えば、いくつかの実施形態において、前記水性細菌懸濁液の前記膣ラクトバチルス属菌種は、有効培養条件の下で０．５ｐｐｍ超の過酸化水素を生産することができる。他の実施形態において、前記膣ラクトバチルス属菌種は、ラクトバチルス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ラクトバチルス・ジェンセニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｅｎｓｅｎｉｉ）、及びラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）からなる群より選択され得る。
【００１３】
本発明のいくつかの実施形態において、前記水性保存媒体は、５〜１５％（ｗ／ｖ）のトレハロース、２〜７％（ｗ／ｖ）のキシリトール、０．５〜１．０％（ｗ／ｖ）のアスコルビン酸ナトリウム、１０〜３０ｍＭのリン酸ナトリウム、及び所望により０〜５％（ｗ／ｖ）のグルタミン酸ナトリウムを含むことができる。
【００１４】
別の実施形態において、前記細菌懸濁液を凍結乾燥して乾燥粉末を得てもよい。前記乾燥粉末は、水分活性値が０．２２０未満のものであってもよい。いくつかの実施形態において、コロニー形成単位の濃度を調整するために、前記粉末を、粉末：添加剤比１：１〜１：１０ｗ／ｗで不活性添加剤と組み合わせてもよい。あるいは、最終生産物の効力を調整するために、前記乾燥粉末を添加剤調製物と組み合わせてもよい。便宜上、前記乾燥粉末は、膣内投与のために設計されたプラスチックハウジングに収容されていてもよい。
【００１５】
本発明のいくつかの実施形態において、前記細菌懸濁液の前記水性保存媒体は、スキムミルクを含まない。別の実施形態において、前記細菌懸濁液の前記水性保存媒体は、α−トコフェロールを含まない。本発明のいくつかの実施形態において、前記細菌懸濁液の前記水性保存媒体は、スキムミルクもα−トコフェロールも含まない。
【００１６】
本発明のいくつかの実施形態において、前記水性保存媒体は、５〜２０％（ｗ／ｖ）のトレハロース、２〜９％（ｗ／ｖ）のキシリトール、０．５〜１．５％（ｗ／ｖ）のアスコルビン酸ナトリウム、１０〜５０ｍＭのリン酸ナトリウム、及び所望により０〜５％（ｗ／ｖ）のグルタミン酸ナトリウムを含み、スキムミルクを含まないものであってもよい。本発明のいくつかの実施形態において、前記水性保存媒体は、５〜２０％（ｗ／ｖ）のトレハロース、２〜９％（ｗ／ｖ）のキシリトール、０．５〜１．５％（ｗ／ｖ）のアスコルビン酸ナトリウム、１０〜５０ｍＭのリン酸ナトリウム、及び所望により０〜５％（ｗ／ｖ）のグルタミン酸ナトリウムを含み、α−トコフェロールを含まないものであってもよい。本発明のいくつかの実施形態において、前記水性保存媒体は、５〜２０％（ｗ／ｖ）のトレハロース、２〜９％（ｗ／ｖ）のキシリトール、０．５〜１．５％（ｗ／ｖ）のアスコルビン酸ナトリウム、１０〜５０ｍＭのリン酸ナトリウム、及び所望により０〜５％（ｗ／ｖ）のグルタミン酸ナトリウムを含み、スキムミルクもα−トコフェロールも含まないものであってもよい。
【００１７】
一態様において、本発明は、異常膣微生物叢と診断された女性の治療に用いるための、動物由来の添加剤を含まない、膣ラクトバチルス属菌種の水性細菌懸濁液に由来する乾燥粉末を含む組成物であって、前記女性は、異常膣微生物叢のレベルを低下させるために有効な量の抗生物質で予め治療されており、前記水性細菌懸濁液は、膣ラクトバチルス属菌種の細胞ペレットと、（ａ）５〜２０％（ｗ／ｖ）のトレハロース、（ｂ）２〜９％（ｗ／ｖ）のキシリトール、（ｃ）０．５〜１．５％（ｗ／ｖ）のアスコルビン酸ナトリウム、及び（ｄ）１０〜５０ｍＭのリン酸ナトリウムから実質的に成る水性保存媒体と、の組み合わせにより得られる、組成物に関する。いくつかの実施形態において、前記水性保存媒体は、所望により０〜５％のグルタミン酸ナトリウムを含む。
【００１８】
本発明の別の態様は、
異常膣微生物叢のレベルを低下させるために有効な量の１又は複数の抗生物質を含む第１容器と、
動物由来の添加剤を含まない、膣ラクトバチルス属菌種の水性細菌懸濁液に由来する乾燥粉末を含むある量の組成物を含む第２容器であって、前記懸濁液が、膣ラクトバチルス属菌種の細胞ペレットと、（ａ）５〜２０％（ｗ／ｖ）のトレハロース、（ｂ）２〜９％（ｗ／ｖ）のキシリトール、（ｃ）０．５〜１．５％（ｗ／ｖ）のアスコルビン酸ナトリウム、及び（ｄ）１０〜５０ｍＭのリン酸ナトリウムから実質的に成る水性保存媒体と、の組み合わせにより得られる、第２容器と、
所望により、異常膣微生物叢と診断された女性の治療におけるキットの使用のための説明書と、
を含む、異常膣微生物叢と診断された女性の治療に用いるための複数のパーツを有するキットに関する。いくつかの実施形態において、前記水性保存媒体は、所望により０〜５％のグルタミン酸ナトリウムを含む。
【００１９】
一実施形態において、前記１又は複数の抗生物質は、例えば、前記女性に２〜７日間投与するためのものであり、前記乾燥粉末は、抗生物質の投与完了２日前から抗生物質の投与終了後２日後までの任意の時点で投与するためのものである。
【００２０】
したがって、前記複数のパーツを有するキットは、好ましくは、異常膣微生物叢と診断された女性の治療に用いるための、ｉ）前記１又は複数の抗生物質と、引き続くｉｉ）動物由来の添加剤を含まない、膣ラクトバチルス属菌種の水性細菌懸濁液に由来する乾燥粉末を含む組成物と、の連続投与を意図するものである。
【００２１】
一実施形態において、前記膣ラクトバチルス属菌種は、有効培養条件下で０．５ｐｐｍ超の過酸化水素を生産する能力を有し、前記ラクトバチルス属菌種は、例えば、ラクトバチルス・クリスパタス、ラクトバチルス・ジェンセニイ、及びラクトバチルス・ガセリからなる種の群より選択される。
【００２２】
本発明の態様のうちの１つの文脈に記載される実施形態及び特徴は、本発明の他の態様にも適用可能である点に留意する必要がある。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】スキムミルクを配合した（下側の線、丸）、又はスキムミルクを配合していない（上側の線、逆三角形）ＬＡＣＴＩＮ−Ｖの安定性。粉末試料を１年間２５℃で保存し、ＭＲＳ寒天平板上で培養してコロニーを計数することによって、活性を異なる時点で決定した。
【００２４】
【図２】グルタミン酸一ナトリウムを含むラクトバチルス粉末調製物、又はグルタミン酸一ナトリウムを含まないラクトバチルス粉末調製物。経時的に生存率を測定することによって、３７℃におけるグルタミン酸一ナトリウムを含まない（丸、三角形）、又はグルタミン酸一ナトリウムを含む（正方形、逆三角形）、４つのＬＡＣＴＩＮ−Ｖ調製物の加速安定性を決定した。粉末試料を９０日間３７℃で保存し、ＭＲＳ寒天平板上で培養し、コロニーを計数することによって、生存率を異なる時点で決定した。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
Ｉ．序論
本発明は、治療として人々に投与するために適切なラクトバチルスの高効力かつ安定な乾燥保存調製物であって、高いコロニー形成力を有し、動物由来の添加剤を含まない、乾燥保存調製物を提供する。具体的には、本明細書に開示されるように、本発明は、ディスバイオーシスを修正し、膣の健康を維持する手段として、膣粘膜に保護的ラクトバチルス微生物叢を再定着させるためのラクトバチルス置換治療（ＬＲＴ）のための方法及び組成物を提供する。以下により詳細に記載されるように、本発明は、一時的に緩衝された乾燥ラクトバチルス調製物の調製及び使用のための、方法、組成物及び試薬を示すものである。
【００２６】
ＩＩ．定義
本明細書において、「膣微生物叢（ｖａｇｉｎａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ）」又は「膣マイクロバイオーム（ｖａｇｉｎａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ）」という用語は、交換可能に用いられ、膣にコロニーを形成する微生物を指すが、「微生物叢」及び「マイクロバイオーム」が好ましい用語である。「異常膣微生物叢」又は「異常膣マイクロバイオーム」又は「膣ディスバイオーシス」という用語は、膣粘膜に保護的ラクトバチルス属菌種が不足しており、著しい数の多様な非ラクトバチルス属菌種のコロニーが形成されている状態を指す。その状態は、症候性であることも無症候性であることもある。
【００２７】
本明細書で用いられる場合、「水性保存媒体」又は「保存調製物」又は「保存媒体」という用語は、交換可能に用いられ、保存プロセス中に起こる有害な影響を最小限に抑えつつ、代謝的不活性状態で細胞培養物を保存及び維持することができる組成物を指す。概して、ラクトバチルス属菌株は、当該保存媒体への添加、凍結及び凍結乾燥の際、活性的に増殖する代謝状態から代謝的不活性状態に転化する。したがって、保存媒体は、細胞が再度水分を与えられて粘膜面に付着し、完全な代謝活性を回復することが可能となるように、細胞回復力を最適化する調合としてもよい。本明細書で用いられる前記水性保存媒体は、通常、炭水化物、ポリオール（糖アルコール）、抗酸化剤、緩衝剤、及び所望によりアミノ酸を含む水溶液である。前記水性保存媒体は、細菌の細胞ペレットを約１０８ＣＦＵ／ｍＬの濃度に再懸濁するために用いられ、この懸濁液を乾燥し、２〜８℃で少なくとも２年間保存し、最懸濁して、ＣＦＵの損失を１５％未満とすることが可能である。
【００２８】
本明細書で用いられる場合、「動物由来の添加剤」という用語は、活性成分とみなされる物質を含む組成物に含まれていることがある、動物に由来する不活性物質を指す。非限定的な例としては、ミルク、ヨーグルト、バターオイル、鶏脂、ラード、ゼラチン及び獣脂が挙げられる。
【００２９】
本明細書で用いられる場合、「添加剤」及び「不活性添加剤」という用語は、交換可能に用いられ、長期の安定化の目的のため、前記粉末調製物を増量するため（したがって、多くの場合、「増量剤」、「充填剤」又は「希釈剤」と称される）、又は薬物吸収を容易にすること、粘度を減少させること、若しくは溶解度を高めることなど、最終的投与形態における前記活性成分に対する治療上の増進を付与するために含まれる、薬物の活性成分と共に配合される不活性物質を指す。添加剤の例としては、限定されるものではないが、マルトデキストリン、デンプン、アルファ化デンプン、微結晶性セルロース、炭酸カルシウム、リン酸二カルシウム、コロイド状ＳｉＯ２、Ｐｈａｒｍａｓｐｅｒｓｅ（登録商標）、マンニトール、キシリトール、トレハロース、ラクトース、スクロース、ポリビニルピロリドン、クロスポビドン、グリシン、ステアリン酸マグネシウム、ステアリルフマル酸ナトリウム、シクロデキストリン並びにそれらの誘導体及び混合物が挙げられる。
【００３０】
本明細書で用いられる場合、「から実質的に成る」という用語は、開示された成分又は工程、及び、前記組成物又は方法の基本的かつ新しい特性に重要な影響を及ぼさない他の任意の成分又は工程を含む組成物又は方法を指す。列挙された成分から実質的に成る組成物は、それらの組成物の必須特性に影響を及ぼす追加的な成分を含まない。例えば、本発明のラクトバチルス粉末調製物は、乾燥ラクトバチルス粉末の生存率特性に影響を与えることなく、医薬的に許容し得る添加剤、例えば着色剤及び／又は充填剤、抗ウィルス剤若しくは抗菌剤、及び／又は酵素を含んでいてもよい。
【００３１】
本明細書で用いられる場合、「ラクトバチルス」という用語は、グルコース等の炭水化物原料からラクテート（乳酸）を生産する能力を特徴とする、グラム陽性通性嫌気性細菌である細菌を指す。これらの細菌は、食品内に存在していることもあり、膣粘膜又は胃腸粘膜にコロニーを形成する共生生物であることもある。
【００３２】
本明細書で用いられる場合、「ラクトバチルス・クリスパタス」又は「Ｌ．クリスパタス」という用語は、ラクトバチルス属の種を指す。前記種は、概して、リボソーム１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のポリヌクレオチド配列に基づいて他のラクトバチルスから区別される。「ラクトバチルス・ガセリ」又は「Ｌ．ガセリ」、及び「ラクトバチルス・ジェンセニイ」又は「Ｌ．ジェンセニイ」は、ラクトバチルスの他の種を指す。Ｌ．クリスパタス、Ｌ．ガセリ、Ｌ．ジェンセニイは、過酸化水素を生産することができる膣内種である。
【００３３】
本明細書で用いられる場合、「乾燥組成物」という用語は、水分が除去された組成物を指す。乾燥手法又は脱水手法としては、例えば、加熱（例えば、昇華）、低圧又は真空の印加、凍結乾燥（すなわち、フリーズドライ）及びそれらの組み合わせが挙げられる。組成物は、一般に、簡単な貯蔵及び輸送のために脱水される。
【００３４】
本明細書で用いられる場合、「有効培養条件」という用語は、ラクトバチルス細胞が、当該細胞の増殖を促進するために置かれる又はさらされる環境を指す。したがって、前記用語は、細胞の増殖に影響を及ぼし、約０．５〜２．５時間の世代時間（細胞集団の倍加速度）を可能にし得る、媒体、温度、雰囲気条件、基質、撹拌条件等を指す。
【００３５】
本明細書で用いられる場合、「効力」という用語は、薬剤単位（すなわち、医療用粉末）当たりの送達される生存微生物細胞の数を指す。本発明によれば、生存細胞は、増殖及び繁殖することが可能である。ラクトバチルス乾燥粉末がインビボで有効であるというためには、前記微生物細胞が膣上皮細胞に、薬剤単位当たり少なくとも約１０８ＣＦＵの効力でコロニーを形成し、かつ、（例えば、細菌性腟症等の感染状態がないことにより示される）生物学的効果を有することが必要である。「高効力」は、薬剤単位当たり少なくとも１０８個の生存微生物細胞（ＣＦＵ）を含む膣薬剤を指す。
【００３６】
本明細書で用いられる場合、「凍結乾燥」という用語は、物質を凍結させ、次いで昇華及び／又は蒸発によって水の濃度を生物学的反応又は化学的反応を補助しないレベルに低下させるプロセスを指す。
【００３７】
本明細書で用いられる場合、「水分活性」という用語及び「ａｗ」という表記は、平衡相対湿度（「ＥＲＨ」）を１００で割ったものと同等の値を指し、かつ当該値と定義される。ＥＲＨは、乾燥粉末が水分を吸収せず、環境中に水分を喪失することもない平衡状態である。前記ＥＲＨは、全ての成分、特に自由水又は結合水として存在し得る水分含有量が高い成分の組成によって影響を受ける。自由水の量は、乾燥粉末の貯蔵安定性及び純度に影響し、保存中の望ましくない活性の低下又は混入微生物の増殖をもたらす可能性がある。
【００３８】
本明細書で用いられる場合、「湿重量」という用語は、上清の遠心分離及びデカンテーションの後の細胞ペレットの重量（ｇ）を指す。概して、細胞回収の工程の後、遠心分離ボトルを予め秤量し、細胞を遠心沈殿させ、上清をデカントし、前記ボトルを再度秤量する。重量の差が前記ペレットの湿重量である。
【００３９】
ＩＩＩ．組成物及び方法
膣の細菌の取得
本発明の薬剤（すなわち、医療用粉末）に用いるために適切なラクトバチルス属菌株は、本明細書において記載される識別的な特徴を有するいずれのラクトバチルス属菌株であってもよい。ラクトバチルス属菌株は、本技術分野で知られている適切なスクリーニング手法を用いて、天然源から検出し、分離することができる。具体的には、本発明の薬剤に用いるためのラクトバチルスの適切な株は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）又は生体防御・新興感染症研究資源レポジトリ（Ｂｉｏｄｅｆｅｎｓｅ  ａｎｄ  Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ（ＢＥＩ）、ｂｅｉｒｅｓｏｕｒｃｅｓ．ｏｒｇ）等の公的に利用可能な資源から得てもよく、ヒトの健康な膣から分離してもよい。本発明に用いるために適切なラクトバチルス属菌株の識別的な特徴、及びこれらの特徴のためのスクリーニング方法は、以下で詳細に考察される。
【００４０】
本発明に用いるために適切なラクトバチルスの１つの識別的な特徴は、ラクトバチルス属菌株のパーセント膣上皮細胞（ＶＥＣ）結合価が少なくとも約５０％であるということである。「パーセントＶＥＣ結合価（ｐｅｒｃｅｎｔ  ＶＥＣ  ｃｏｈｅｓｉｏｎ  ｖａｌｕｅ）」は、ある特定された群のＶＥＣの総数における、少なくとも１つのラクトバチルス細胞が付着（ａｄｈｅｒｅ）するＶＥＣの割合として定義される。本発明によれば、「結合（ｃｏｈｅｓｉｏｎ）」及び「付着（ａｄｈｅｒｅｎｃｅ）」という用語は、交換可能に使用され得る。膣上皮細胞への微生物細胞の付着は、コロニー形成及び生物学的効果のために重要である。膣上皮細胞への医療用粉末のラクトバチルス細胞の付着が成功することによって、膣上皮細胞のコロニー形成が成功する。長期のインビボにおけるコロニー形成は、本発明の生産物及び方法の目標であり、「パーセントＶＥＣ結合価」は、インビトロ及びインビボにおいて、顕著な数のＶＥＣが微生物細胞を受け入れるかどうかの良好な予測因子である。許容し得るＶＥＣ結合価を決定するために用いられる方法は、本技術分野でよく知られており、米国特許第６，４６８，５２６号及び米国特許第６，０９３，３９４号に見出される。また、Ｋｗｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｕｒｏｌ．２００６，１７６：２０５０−２０５４も参照のこと。
【００４１】
本発明の薬剤に用いるために適切なラクトバチルスの別の識別的な特徴は、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を生産する能力である。Ｈ２Ｏ２陽性表現型も持続性膣コロニー形成に関連する。例えば、Ｖａｌｌｏｒ，Ａ．Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．２００１  Ｄｅｃ  １；１８４（１１）：１４３１−６を参照のこと。上述のように、過酸化水素は、ラクトバチルスによる他の微生物の死滅の原因となることが示されている。好ましくは、ラクトバチルスは、標準増殖条件下で約０．５ｐｐｍ超のＨ２Ｏ２を生産することができる。より好ましくは、ラクトバチルスは、少なくとも約１０ｐｐｍのＨ２Ｏ２を生産することが可能であり、さらに好ましくは、ラクトバチルスは、有効増殖条件下で少なくとも約２０ｐｐｍのＨ２Ｏ２を生産することが可能である。有効増殖条件とは、本明細書において、Ｈ２Ｏ２の生産を促進し得る任意の媒体及び条件と定義される。有効増殖条件としては、インビトロ増殖条件（例えば、有効な培地及び培養条件）及びインビボ増殖条件（例えば、良好な膣のコロニー形成）の両方が挙げられる。過酸化水素を生産する膣ラクトバチルスとしては、Ａｎｔｏｎｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  １９９９，１８０：１９５０−６に記載されているように、ほとんどのＬ．クリスパタス株及びＬ．ジェンセニイ株、及びＬ．ガセリ株の約半分が挙げられる。
【００４２】
本発明のラクトバチルスによるＨ２Ｏ２生産は、Ｈ２Ｏ２生産を測定するためのいずれの手段によって定量してもよい。Ｈ２Ｏ２生産を測定するために用いられる方法は、本技術分野でよく知られており、培養方法又は直接検出方法を挙げることができる。前記培養方法は、ラクトバチルスをテトラメチルベンジジン培地（ＴＭＢ）上に接種し、嫌気的条件下でインキュベートした場合に形成される青色顔料の強度を定量することによってＨ２Ｏ２生産を測定することを含み得る。例えば、３７℃の嫌気的条件下で、約４８時間、ＴＭＢ寒天平板上でラクトバチルスをインキュベートする。次いで、前記寒天平板を大気中の空気に曝露させる。前記大気中の空気への曝露によって、ラクトバチルスによって生産されたＨ２Ｏ２が寒天内の西洋わさびペルオキシダーゼと反応し、前記ＴＭＢが酸化されることによって、ラクトバチルスのコロニーは青色に変化する。例えば、Ａｎｔｏｎｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  １９９９；１８０：１９５０−６を参照のこと。前記直接検出方法を用いて、商業的に入手可能なＨ２Ｏ２検出試験紙（例えば、ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ又はＭｅｒｃｋから入手可能）を使用して０〜１００ｍｇ／Ｌの検出スケールでＨ２Ｏ２の量を測定してもよい。例えば、Ｓｔｒｕｓ，Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｖａｇｉｎａｌ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｃａｎｄｉｄａ．  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ．２００５  Ｊｕｎ；１３（２）：６９−７５を参照のこと。
【００４３】
本発明の薬剤に用いるために適切なラクトバチルスの別の識別的な特徴は、インビボ及びインビトロの両方における経時的なラクトバチルス属菌株の遺伝的同一性及び遺伝的安定性である。本発明によれば、遺伝的安定性とは、ラクトバチルス属菌株の継続的世代が母株の同一の遺伝的プロファイルを実質的に維持する能力を指す。すなわち、遺伝的に安定した株の継続的世代は、一定期間にわたって、そのゲノムＤＮＡの実質的な変異を獲得しない。インビトロでの貯蔵又はインビボでの膣上皮細胞のコロニー形成の後の経時的なラクトバチルス属菌株の遺伝的同一性及び遺伝的安定性は、反復配列ポリメラーゼ連鎖反応（Ｒｅｐ  ＰＣＲ）を用いて確認することができる。遺伝的同一性及び遺伝的安定性ラクトバチルス属菌株を確認するために用いられるＲｅｐ  ＰＣＲ方法は、本技術分野でよく知られており、米国特許第６，０９３，３９４号に見出すことができる。また、Ａｎｔｏｎｉｏ＆Ｈｉｌｌｉｅｒ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００３，４１：１８８１−１８８７も参照のこと。
【００４４】
本発明の薬剤に用いるために適切なラクトバチルスの別の識別的な特徴は、乳酸を生産する能力である。乳酸は、インビトロにおいて病原体の増殖を阻害することが示されている。好ましくは、ラクトバチルスは、有効増殖条件下で、少なくとも約０．７５ｍｇ／１００ｍＬの乳酸を生産し、より好ましくは少なくとも約４ｍｇ／１００ｍＬの乳酸、さらに好ましくは少なくとも約８．８ｍｇ／１００ｍＬの乳酸を生産する。
【００４５】
適切なラクトバチルス属菌株は、細胞の大きさが比較的大きくてもよい。Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙにおいて提供されるように、典型的なラクトバチルスは、幅が０．８〜１．６μｍ、長さが２．３〜１１μｍである。本発明に用いるための好ましいラクトバチルス属菌株は、幅約１μｍ〜約２μｍ、長さ約２μｍ〜約４μｍの細胞サイズを有する。理論に束縛されることなく、本発明者らは、本発明のラクトバチルス属菌株の細胞が大きなサイズを有すると、当該ラクトバチルス属菌株が、生物競争的排除における保護剤の役割をより良好に果たすようになる可能性があると考える。生物競争的排除とは、本発明の１又は複数の医療用粉末株が、望ましくない菌株の増殖を競争的に阻害する能力を指す。そのような排除は、有益なラクトバチルス細胞（例えば、医療用粉末株）が膣上皮細胞上の利用可能な空間を占有することによって、病原性の、又は望ましくない微生物細胞の付着が防止されることに起因する。
【００４６】
本発明の薬剤には、ラクトバチルスの公知の種及び株に加えて、天然由来の新たに同定された種及び株、並びに公知の又は新たに同定された株に由来する変異株を用いることができる。本発明の薬剤に用いるために適切なラクトバチルスの識別的な特徴を有するラクトバチルスの親株の変異体は、例えば、親株に１回以上の化学的変異生成及び／又は放射線変異生成を行って変異生成の速度を上げることにより、所望の特性が改善した微生物を得る確率を上昇させることによって得てもよい。本発明の変異微生物が、微生物を遺伝子操作して、例えばパーセントＶＥＣ結合価を増加させることによって得られ得る微生物も含むことは、当業者にとって明らかであろう。本明細書で用いられる場合、「変異微生物」は、そのような微生物のヌクレオチド組成が、自然に発生した、又は変異原への曝露による、又は遺伝子操作による、（１又は複数の）変異によって改変された、親微生物の変異体である。
【００４７】
ラクトバチルスの好ましい種としては、ラクトバチルス・クリスパタス、ラクトバチルス・ガセリ及びラクトバチルス・ジェンセニイ、又はこれらの同定された種のうちのいずれかの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列に対して９５％の配列相同性を有するラクトバチルスの種が挙げられる。ラクトバチルスの特に好ましい株は、ラクトバチルス・クリスパタスＣＴＶ−０５株、ラクトバチルス・クリスパタスＳＪ−３Ｃ株の全ての識別的な特徴を有する株である。ラクトバチルス・クリスパタスＣＴＶ−０５は好ましい株である。ラクトバチルス属菌株を区別するために用いられる方法としては、Ａｎｔｏｎｉｏ＆Ｈｉｌｌｉｅｒ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００３，４１：１８８１−１８８７に記載されているようなＲｅｐ−ＰＣＲ、元来は病原体の株を同定するために開発された多遺伝子座配列タイピング（ＭＬＳＴ）（例えば、Ｍａｉｄｅｎ，Ｍ．Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８，Ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔｙｐｉｎｇ：ａ  ｐｏｒｔａｂｌｅ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９５：３１４０−２１４５参照）、及び全ゲノム配列決定が挙げられる。
【００４８】
膣の細菌の培養
本発明に有用なラクトバチルス属菌株は、液体媒体又は固体媒体（例えば、寒天）内で増殖させることができる。本発明に有用なラクトバチルス属菌株を増殖させるための細菌培地は公知かつ商業的に入手可能であり（例えば、ＢＤ  Ｄｉｆｃｏから）、例えば、ｄｅ  Ｍａｎ，Ｒｏｇｏｓａ，ａｎｄ  Ｓｈａｒｐｅ（ＭＲＳ）培地、及びＲｏｇｏｓａ培地が挙げられる。前記ラクトバチルスは、好ましくは、嫌気的に又は微好気的に培養され、培地の温度は、ラクトバチルスの増殖に適切ないずれの温度でもあってもよい。本発明のためのラクトバチルス属菌株は嫌気的条件で培養することが可能であり、概して約３７℃で増殖させる。本発明に有用な膣ラクトバチルス属菌株の有効培養条件は、本技術分野でよく知られている。ラクトバチルス属菌株、特にＬ．クリスパタス及びＬ．ガセリを培養するための具体的な培養条件、培地、及び方法は、例えば、米国特許第８，３２９，４４７号、米国特許第６，０９３，３９４号、及びＤａｖｉｓ，Ｃ．Ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ  ｓｔｒａｉｎｓ：Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｃｕｌｔｕｒｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｄ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｔｏ  ｑｕａｎｔｉｆｙ  ｖｉａｂｌｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４；１０３：９−１７に見出すことができる。
【００４９】
前記培地には、活発に増殖しているラクトバチルス属菌株の培養物を、適当な増殖期間後に前記保存媒体へ移すために適切な細胞密度（又は効力）とするのに充分な量播種する。本明細書において用いられるラクトバチルスの適当な増殖期間の非限定的な例は、１〜２．５時間の世代時間である。約１０８ＣＦＵ／ｍＬ〜約１０１０ＣＦＵ／ｍＬの範囲内の好ましい細胞密度に前記細胞を増殖させる。培養ベースの方法を用いて細胞密度を決定する。この方法では、ラクトバチルス培養物の系列希釈物をＭＲＳ寒天平板上に平板培養し、３７℃で嫌気的に４８時間インキュベートする。前記平板上のコロニーを計数し、試料中のＣＦＵ（コロニー形成単位）数をＣＦＵ／ｍＬ又はＣＦＵ／ｇとして算出する。前記ＣＦＵを決定する方法は、以下で詳細に記載される。
【００５０】
前記細胞が好ましい細胞密度まで増殖したら、任意の適切な方法を用いて前記細胞を回収して、前記培地から前記細胞を取り除くことができる。前記培養細胞を回収するための非限定的な例示的方法としては、濾過、遠心分離、及び沈降が挙げられる。いくつかの例において、培養細胞の回収は、中空繊維濾過、及び透析濾過による洗浄を含むことができる。培養されたラクトバチルス細胞を回収する方法は、本技術分野でよく知られており、実施例のセクションで詳細に記載される。前記細胞を前記培地から分離した後、及び／又はバイオマスを洗浄した後、前記細胞を遠心分離して、保存媒体中における懸濁用の細胞ペレットを形成させる。
【００５１】
水性保存媒体の調製
上述の方法により形成される細胞ペレットを、適切な水性保存媒体に再懸濁させる。このとき、保存媒体（ｍＬ）に対する細胞ペレット湿重量（ｇ）の重量割合を１：１〜１：８（細胞ペレットのグラム数：保存媒体のミリリットル数）とすることができる。いくつかの実施形態において、前記細菌細胞ペレットを適切な水性保存媒体に再懸濁させ、このとき、保存媒体（ｍＬ）に対する細胞ペレット湿重量（ｇ）の重量割合を１：１〜１：７、１：１〜１：６、１：１〜１：５、１：１〜１：４、１：１〜１：３、１：１〜１：２、１：２〜１：６、又は１：３〜１：５（細胞ペレットのグラム数：保存媒体のミリリットル数）とすることができる。いくつかの実施形態において、前記細菌細胞ペレットを適切な水性保存媒体に再懸濁させ、このとき、保存媒体（ｍＬ）に対する細胞ペレット湿重量（ｇ）の重量割合を１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、又は１：８（細胞ペレットのグラム数：保存媒体のミリリットル数）とすることができる。いくつかの実施形態において、前記細菌細胞ペレットを適切な水性保存媒体に再懸濁させ、このとき、保存媒体（ｍＬ）に対する細胞ペレット湿重量（ｇ）の重量割合を１：１〜１：５（細胞ペレットのグラム数：保存媒体のミリリットル数）とすることができる。いくつかの実施形態において、前記細菌細胞ペレットを適切な水性保存媒体に再懸濁させ、このとき、保存媒体（ｍＬ）に対する細胞ペレット湿重量（ｇ）の重量割合を１：１〜１：３（細胞ペレットのグラム数：保存媒体のミリリットル数）とすることができる。
【００５２】
前記水性保存媒体は、保存プロセス中において起こる有害な影響を最小限に抑える成分を含む。本発明の前記保存媒体は、炭水化物、ポリオール、抗酸化剤、緩衝剤及び所望によりアミノ酸を含む。前記保存媒体中で用いられる前記炭水化物は、凍結乾燥保護剤として機能し、凍結乾燥中、及びその後の貯蔵中、前記細胞を保護し、安定化させる。本発明による使用のために適切な非限定的で例示的な炭水化物としては、トレハロース、デキストロース、ラクトース、マルトース、スクロース及び／又は他の任意の二糖若しくは多糖が挙げられる。いくつかの実施形態において、前記保存媒体は、前記保存媒体の体積当たりの重量（ｗ／ｖ）として約０．５％〜約３０％の炭水化物、又は前記保存媒体の体積当たりのｗ／ｖとして約１％〜約２５％、約５％〜約２０％、若しくは約１０％〜約１５％の炭水化物を含む。いくつかの実施形態において、前記保存媒体は、前記保存媒体の体積当たりの重量（ｗ／ｖ）として約０．５％以上の炭水化物を含むか、又は前記保存媒体の体積当たりのｗ／ｖとして約１％以上、約２％以上、約５％以上、約７％以上、約１０％以上、約１５％以上、約２０％以上、約２５％以上若しくは約３０％以上の炭水化物を含む。いくつかの実施形態において、前記保存媒体は、前記保存媒体の体積当たりのｗ／ｖとして約５％〜約２０％のトレハロースを含む。本発明のいくつかの他の実施形態において、前記保存媒体は、前記保存媒体の体積当たりのｗ／ｖとして約５％〜約１５％のトレハロースを含む。
【００５３】
前記保存媒体の前記ポリオール（すなわち、多価アルコール）は、凍結乾燥中の脱水のストレスから細胞を保護するのに役立つ凍結乾燥保護剤である。本発明による使用のために適切な非限定的で例示的なポリオールとしては、キシリトール、アドニトール、グリセロール、ズルシトール、イノシトール、マンニトール、マルチトール、イソマルト、ラクチトール、エリスリトール、ソルビトール及び／又はアラビトールが挙げられる。いくつかの実施形態において、前記保存媒体は、前記保存媒体の体積当たりの重量（ｗ／ｖ）として約０．１％〜約１２％のポリオール、又は前記保存媒体のｗ／ｖとして約１％〜約１０％、約２％〜約９％、若しくは約３％〜約７％のポリオールを含む。いくつかの実施形態において、前記保存媒体は、前記保存媒体の体積当たりの重量（ｗ／ｖ）として約０．１％以上のポリオール、又は前記保存媒体の体積当たりのｗ／ｖとして約０．５％以上、約１％以上、約２％以上、約３％以上、約５％以上、約６％以上、約７％以上、約８％以上、約９％以上、約１０％以上、約１１％以上若しくは約１２％以上のポリオールを含む。いくつかの実施形態において、前記保存媒体は、前記保存媒体の体積当たりのｗ／ｖとして約２％〜約９％のキシリトールを含む。本発明のいくつかの他の実施形態において、前記保存媒体は、前記保存媒体の体積当たりのｗ／ｖとして約２％〜約７％のキシリトールを含む。
【００５４】
前記保存媒体の前記抗酸化剤は、前記保存及び貯蔵プロセスの間、前記微生物細胞の酸化性損傷を抑制する。本発明による使用のために適切な非限定的で例示的な抗酸化剤としては、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸、パルミチルアスコルベート、没食子酸プロピル及びビタミンＥ（α−トコフェロール）が挙げられる。いくつかの実施形態において、前記保存媒体は、前記保存媒体の体積当たりの重量（ｗ／ｖ）として約０．１％〜約５％の抗酸化剤、又は前記保存媒体の体積当たりのｗ／ｖとして約０．５％〜約３．０％、若しくは約１．０％〜約２．０％の抗酸化剤を含む。いくつかの実施形態において、前記保存媒体は、前記保存媒体の体積当たりの重量（ｗ／ｖ）として約０．１％以上の抗酸化剤、又は前記保存媒体の体積当たりのｗ／ｖとして約０．３％以上、約０．５％以上、約１．０％以上、約１．５％以上、約２．０％以上、約２．５％以上、約３．０％以上、約３．５％以上、約４．０％以上、約４．５％以上若しくは約５．０％以上の抗酸化剤を含む。いくつかの実施形態において、前記保存媒体は、前記保存媒体の体積当たりのｗ／ｖとして約０．５％〜約１．５％のアスコルビン酸ナトリウムを含む。本発明のいくつかの他の実施形態において、前記保存媒体は、前記保存媒体の体積当たりのｗ／ｖとして約０．５％〜約１．５％のアスコルビン酸ナトリウムを含む。
【００５５】
前記保存媒体に用いるために適切な緩衝剤は、前記細菌細胞の安定性及び回収率を高める。前記保存媒体に用いるために適切な緩衝剤は、細菌、膣上皮細胞、又は医薬組成物を用いている女性の患者に対していかなる毒性作用も発現しない生理学的物質である。本発明による使用のために適切な非限定的で例示的な緩衝剤としては、リン酸ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸カリウム、重炭酸ナトリウム、ヒスチジン、アルギニン及びクエン酸ナトリウムが挙げられる。いくつかの実施形態において、前記緩衝剤は、ｐＫａが約４．３〜約８．０、又は約４．６〜約７．７、又は約５．０〜約７．３、又は約５．４〜約７．０、又は約６．０〜約６．７であってもよい。いくつかの他の実施形態において、前記保存媒体は、ｐＫａが少なくとも４．３以上、４．４以上、４．５以上、４．６以上、４．７以上、４．８以上、４．９以上、５．０以上、５．５以上、６．０以上、６．５以上、７．０以上、７．５以上、８．０以上の緩衝溶液を含む。いくつかの実施形態において、前記保存媒体は、生理学的範囲内のｐＫａを有する緩衝溶液を含む。他の実施形態において、前記保存媒体は、約６．７〜約７．８のｐＫａを有する緩衝溶液を含む。
【００５６】
さらなる実施形態において、前記保存媒体は、約５ｍＭ〜約７０ｍＭの緩衝剤を含み、又は約１０ｍＭ〜約６５ｍＭ、若しくは約１５ｍＭ〜約６０ｍＭ、若しくは約２０ｍＭ〜約５５ｍＭ、若しくは約２５ｍＭ〜約５０ｍＭ、若しくは約３０ｍＭ〜約４５ｍＭ、若しくは約３５ｍＭ〜約４０ｍＭの緩衝剤を含む。いくつかの実施形態において、前記保存媒体は、約５ｍＭ以上の緩衝剤を含むか、又は約１０ｍＭ以上、約１５ｍＭ以上、約２０ｍＭ以上、約２５ｍＭ以上、約３０ｍＭ以上、約３５ｍＭ以上、約４０ｍＭ以上、約４５ｍＭ以上、約５０ｍＭ以上、約５５ｍＭ以上、約６０ｍＭ以上、約６５ｍＭ以上若しくは約７０ｍＭ以上の緩衝剤を含む。いくつかの実施形態において、前記保存媒体は、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭのリン酸ナトリウムを含む。本発明のいくつかの他の実施形態において、前記保存媒体は、約１０ｍＭ〜約３０ｍＭのリン酸ナトリウムを含む。
【００５７】
いくつかの実施形態において、前記保存媒体は、凍結乾燥プロセスの間の凍結保存に著しい影響を及ぼすことなく高温においてラクトバチルス細胞の安定性を高めるのに役立つアミノ酸を所望により含むことができる。いくつかの実施形態において、所望により存在する前記アミノ酸は、適切なアミノ酸の塩の形態であってもよい。本発明による使用のために適切な非限定的で例示的なアミノ酸及び／又はそれらの塩としては、グルタミン酸ナトリウム、グルタミン、グリシン、アルギニン、ヒスチジン及びリジンが挙げられる。いくつかの実施形態において、前記保存媒体は、所望により、前記保存媒体の体積当たりの重量（ｗ／ｖ）として約０％〜約５％のアミノ酸を含むか、又は前記保存媒体の体積当たりのｗ／ｖとして約０．５％〜約３．０％、若しくは約１．０％〜約２．０％のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、前記保存媒体は、所望により、前記保存媒体の体積当たりの重量（ｗ／ｖ）として約０．１％以上のアミノ酸、又は前記保存媒体の体積当たりのｗ／ｖとして約０．３％以上、約０．５％以上、約１．０％以上、約１．５％以上、約２．０％以上、約２．５％以上、約３．０％以上、約３．５％以上、約４．０％以上、約４．５％以上若しくは約５．０％以上のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、所望により前記保存媒体に含まれる前記アミノ酸は、アミノ酸塩であるグルタミン酸ナトリウムであり、好ましくはグルタミン酸一ナトリウムである。いくつかの実施形態において、前記保存媒体は、所望により、前記保存媒体の体積当たりのｗ／ｖとして約０％〜約５％のグルタミン酸ナトリウムを含む。本発明のいくつかの他の実施形態において、前記保存媒体は、所望により、保存媒体の体積当たりのｗ／ｖとして約０％〜約５％のグルタミン酸一ナトリウムを含む。いくつかの実施形態において、前記保存媒体は、所望により、保存媒体の体積当たりのｗ／ｖとして約１％〜約４％のグルタミン酸ナトリウムを含む。本発明のいくつかの他の実施形態において、前記保存媒体は、所望により、前記保存媒体の体積当たりのｗ／ｖとして約１％〜約４％のグルタミン酸一ナトリウムを含む。
【００５８】
本発明の前記保存媒体は、前記保存媒体の約５％〜２０％  ｗ／ｖである炭水化物、前記保存媒体の約２％〜９％  ｗ／ｖであるポリオール、前記保存媒体の約０．５％〜１．５％  ｗ／ｖである抗酸化剤、及び１０ｍＭ〜５０ｍＭである緩衝剤を含む。他の実施形態において、本発明による使用のために適切な保存媒体は、前記保存媒体の約５％〜１５％  ｗ／ｖである炭水化物、前記保存媒体の約２％〜７％  ｗ／ｖであるポリオール、前記保存媒体の約０．５％〜１．０％  ｗ／ｖである抗酸化剤、及び１０ｍＭ〜３０ｍＭである緩衝剤を含むことができる。
【００５９】
いくつかの実施形態において、本発明の前記保存媒体は、前記保存媒体の約５％〜２０％  ｗ／ｖである炭水化物、前記保存媒体の約２％〜９％  ｗ／ｖであるポリオール、前記保存媒体の約０．５％〜１．５％  ｗ／ｖである抗酸化剤、１０ｍＭ〜５０ｍＭである緩衝剤、及び、所望により、前記保存媒体の約０％〜５％  ｗ／ｖであるアミノ酸を含む。他の実施形態において、本発明による使用のために適切な保存媒体は、前記保存媒体の約５％〜１５％  ｗ／ｖである炭水化物、前記保存媒体の約２％〜７％  ｗ／ｖであるポリオール、前記保存媒体の約０．５％〜１．０％  ｗ／ｖである抗酸化剤、１０ｍＭ〜３０ｍＭである緩衝剤、及び、所望により、前記保存媒体の約０％〜５％であるアミノ酸を含むことができる。
【００６０】
本発明の特に有用な保存媒体の例は、前記保存媒体の約５％〜２０％  ｗ／ｖである前記炭水化物としてのトレハロース、前記保存媒体の約２％〜９％  ｗ／ｖである前記ポリオールとしてのキシリトール、前記保存媒体の約０．５％〜１．５％  ｗ／ｖである前記抗酸化剤としてのアスコルビン酸ナトリウム、及び１０ｍＭ〜５０ｍＭである前記緩衝剤としてのリン酸ナトリウムを含む。いくつかの実施形態において、本発明の特に有用な保存媒体は、前記保存媒体の約５％〜２０％  ｗ／ｖである前記炭水化物としてのトレハロース、前記保存媒体の約２％〜９％  ｗ／ｖである前記ポリオールとしてのキシリトール、前記保存媒体の約０．５％〜１．５％  ｗ／ｖである前記抗酸化剤としてのアスコルビン酸ナトリウム、１０ｍＭ〜５０ｍＭである前記緩衝剤としてのリン酸ナトリウム、及び、所望により、前記保存媒体の約０％〜５％  ｗ／ｖである前記アミノ酸としてのグルタミン酸ナトリウムを含む。他の実施形態において、本発明による使用のために適切な保存媒体は、前記保存媒体の約５％〜１５％  ｗ／ｖであるトレハロース、前記保存媒体の約２％〜７％  ｗ／ｖであるキシリトール、前記保存媒体の約０．５％〜１．０％  ｗ／ｖであるアスコルビン酸ナトリウム、及び１０ｍＭ〜３０ｍＭであるリン酸ナトリウムを含む。いくつかの他の実施形態において、本発明による使用のために適切な保存媒体は、前記保存媒体の約５％〜１５％  ｗ／ｖであるトレハロース、前記保存媒体の約２％〜７％  ｗ／ｖであるキシリトール、前記保存媒体の約０．５％〜１．０％  ｗ／ｖであるアスコルビン酸ナトリウム、１０ｍＭ〜３０ｍＭであるリン酸ナトリウム、及び、所望により、前記保存媒体の約０％〜５％  ｗ／ｖであるグルタミン酸ナトリウムを含む。なんら限定的であることを意味するものではないが、以下の表１に代表的な保存媒体組成物を示す。
【００６１】
【表１】
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【００６２】
上述した、回収されたラクトバチルス細胞を前記媒体に加える前に、前記細胞を緩衝生理食塩液中で洗浄してもよい。回収された前記ラクトバチルス細胞を本明細書に記載される前記保存媒体に導入するとき、得られた混合物を細胞−保存媒体スラリーと称する。いくつかの実施形態において、細胞−保存媒体スラリーは、１０８ＣＦＵ／ｍＬ〜１０１１ＣＦＵ／ｍＬの活性を有することができる。より好ましい細胞−保存媒体スラリーは、少なくとも約１０１０ＣＦＵ／ｍＬの活性を有することができる。当業者は本明細書に開示される基本的な培養工程、回収工程及び懸濁工程にはバリエーションがあることを理解するため、本発明にはそのようなバリエーションが組み込まれていることは理解されるべきである。
【００６３】
細胞−保存媒体スラリーの乾燥
本技術分野で知られている任意の適切な乾燥方法を用いて、前記細胞−保存媒体スラリーを乾燥させて、バルク薬剤粉末を生産してもよい。典型的に、乾燥による効果は、細菌を休止状態にして、細菌の生存率にマイナスの影響を及ぼす環境的要素から細菌を保護することである。休止状態をもたらす標準的な方法は水の除去によるものである。通常、標準的細胞プロセス（例えば、酵素活性）が停止するか、又は少なくとも大きく低下するように、充分な水を除去する。
【００６４】
長期保存のための安定性を向上させるために、細菌調製物を乾燥させるための本技術分野で知られている数々の方法のいずれかを用いて、前記細胞−保存媒体スラリーを乾燥させることができる。乾燥方法及び保護剤は、Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００６）Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈ．６６：１８３−１９３のレビューに開示されている。適切な乾燥方法としては、空気乾燥、減圧乾燥、オーブン乾燥、噴霧乾燥、フラッシュ乾燥、流体床乾燥、制御雰囲気乾燥及び凍結乾燥（すなわち、フリーズドライ）が挙げられる。いくつかの実施形態において、前記乾燥プロセスにおける補助のために、及び／又は乾燥調製物中への水分の再吸収を防止するために、乾燥剤が用いられる。いくつかの実施形態において、前記乾燥は、凍結乾燥器（すなわち、Ｖｉｒｔｉｓ、ＳＰ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて行われる。当業者に知られている詳細な凍結乾燥方法は、米国特許第６，０９３，３９４号、米国特許第８，３２９，４４７号及び米国特許第８，６４２，０２９号に開示されている。得られる前記乾燥調製物（バルク粉末と称される）の効力について、以下に記載される方法を用いて試験する。前記乾燥バルク薬剤粉末の効力は、１０９ＣＦＵ／ｇ〜１０１２ＣＦＵ／ｇであり得る。より好ましいバルク粉末は、少なくとも約１０１０ＣＦＵ／ｇの活性を有し得る。
【００６５】
残留水分の測定
本技術分野で知られている任意の適切な方法を用いて、乾燥調製物の残留水分の存在を試験することができる。前記乾燥調製物中の残留水分は、米国特許第８，３２９，４４７号及び米国特許第８，６４２，０２９号に記載されているように重量測定的に測定することもできる。または、粉末中の水分含有量を測定するための器具（例えば、ＩＲ−１２０  Ｍｏｉｓｔｕｒｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｄｅｎｖｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、コロラド州デンバー））を使用して、乾燥中に前記調製物の水分含有量をモニターしてもよい。よく知られた電量滴定法又は容量滴定法、例えばカールフィッシャー滴定を行うことによって、残留水分を決定することもできる。
【００６６】
ラクトバチルス粉末中の水分含有量は、水分活性メータ、例えば、ＡｑｕａＬａｂ  ＣＸ−２  Ｍｏｄｅｌシリーズ（Ｄｅｃａｇｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ワシントン州プルマン）又はＲｏｔｒｏｎｉｃ  Ｍｏｄｅｌシリーズ（Ｒｏｔｒｏｎｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｒｐ．、ニューヨーク州ハンティントン）を用いて、自由水又は水分活性（ａｗ）として測定することもできる。前記水分活性メータ（ＡｑｕａＬａｂ  ＣＸ−２、Ｄｅｃａｇｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）は、鏡面冷却式露点法を用いて生成物のａｗを測定する。試料をＡｑｕａＬａｂ内に配置すると、前記チャンバの中のステンレス鋼ミラーが繰り返し加熱及び冷却され、その間結露が形成されたり除去されたりする。この機器のファンによって、前記検知チャンバ内の空気が循環され、平衡プロセスの速度が上昇する。前記ミラーが結露する度に、ＡｑｕａＬａｂは温度を測定し、前記試料のａｗを算出して、これらの値を保存して、前の値と比較する。連続的な読取値のａｗ値の差が０．００１未満になると、測定プロセスは完了する。
【００６７】
水エネルギーレベル、すなわち水分活性（ａｗ）は、得られた乾燥ラクトバチルスバルク薬剤粉末の全体的安定性を決定する。当業者は、本発明の前記薬物粉末のａｗ等、医薬の水分活性の重要性を理解するであろう。医薬生産物の水分活性を低く維持することによって、前記活性医薬成分（すなわち、前記ラクトバチルス薬物粉末）の劣化を回避することができる。さらに、水分活性が低い、本発明の前記ラクトバチルス薬物粉末等の医薬生産物は、薬物の劣化や薬物が効力を失う原因となる結晶化、ケーキング、及び凝集（ｃｌｕｍｐｉｎｇ）の影響を受けにくい。これらは時間依存的反応であり、その速度は水分活性に影響を受ける。生産調製物に対するａｗの影響に関する詳細は、米国薬局方  方法＜１１１２＞  「非滅菌医薬品の微生物学的特徴−水分活性決定の適用」に見出すことができる。
【００６８】
いくつかの実施形態において、前記乾燥ラクトバチルスバルク薬剤原料は、測定されたａｗが約０．００１〜約０．２２０、又は約０．００５〜約０．２００、又は約０．０１０〜約０．１５０、又は約０．０２５〜約０．１００、又は約０．０５０〜約０．０７５であってもよい。他の実施形態において、前記乾燥ラクトバチルスバルク薬剤原料は、測定されたａｗが、約０．００１以上、約０．００３以上、約０．００５以上、約０．００７以上、約０．０１０以上、約０．０３０以上、約０．０５０以上、約０．０７０以上、約０．１００以上、約０．１５０以上、約０．１７０以上、約０．２００以上、約０．２２０以上であってもよい。特定の実施形態において、前記乾燥ラクトバチルスバルク薬剤原料は、測定されたａｗが０．２２０未満であってもよい。
【００６９】
効力の測定
本発明の前記ラクトバチルス調製物（湿潤及び／又は乾燥）は、本技術分野で知られている任意の適切な方法を用いて、前記調製プロセス中の異なる時点の効力について試験される。ラクトバチルス調製物の効力を決定するために用いられるそのような方法としては、培養ベースの方法が挙げられるが、これに限定されるものではない。ラクトバチルスの細胞密度を決定するための光散乱法は、発酵プロセスをモニターするために用いられ、細菌の試料の６００ｎｍにおける光学密度を測定することを含む。
【００７０】
前記ラクトバチルス調製物の効力を測定するために用いられる好ましい方法は、系列希釈物を含む培養ベースの方法である。試験対象の前記ラクトバチルス調製物の試料を得て、系列希釈物を作製する。少量のアリコート（すなわち、１００μＬ）の系列希釈物をＭＲＳ寒天平板上で平板培養する。前記試料を、３７℃で４８時間、嫌気的にインキュベートする。適切な時間が経過した後、透過光中にペトリ皿を配置することによって前記平板に光を当てる。独立したコロニーを、手作業で、又は商業的に入手可能な細菌計数ソフトウェアを用いながらカメラ及びコンピュータで計数し、前記試料中のＣＦＵの数をＣＦＵ／ｍＬ又はＣＦＵ／ｇとして算出する。培養ベースの方法についてのさらなる詳細は、Ｂｒｕｇｇｅｒ，Ｓ．Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｃｏｌｏｎｙ  Ｆｏｒｍｉｎｇ  Ｕｎｉｔｓ  ｏｎ  Ａｇａｒ  Ｐｌａｔｅｓ．ＰＬＯＳ  ＯＮＥ  ２０１２；７（３）：ｅ３３６９５に開示されている。
【００７１】
純度及び同一性
前記効力及び前記水分活性の測定に加えて、上記乾燥方法により生産される前記バルク薬剤粉末は、純度及び同一性について試験してもよい。前記バルク薬剤粉末の純度は、米国薬局方  方法＜６１＞「微生物計数試験」、及び米国薬局方  方法＜６２＞「特定微生物の試験」に記載されているように、本技術分野でよく知られている方法を用いて決定される。前記バルク粉末及び最終医薬生産物中の前記ラクトバチルス属菌種の遺伝的同定は、商業的に入手可能なキット（例えば、Ｐｏｗｅｒ  Ｓｏｉｌ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，Ｍｏ  Ｂｉｏ）を用いてゲノムＤＮＡを分離し、ＰＣＲによって特異的プライマーを用いて１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を増幅し、市販のＤＮＡ配列決定サービス（ＭＣＬＡＢ）を用いて遺伝子を配列決定し、前記配列を参照標準と比較することによって行われる。前記バルク薬剤粉末中の前記ラクトバチルス属菌株の同定は、本技術分野でよく知られている方法、例えば、反復配列ポリメラーゼ連鎖反応（Ｒｅｐ  ＰＣＲ）並びに米国特許第６，０９３，３９４ｌ号、米国特許第８，３２９，４４７号及び米国特許第８，６４２，０２９号に記載されている方法を用いて決定される。
【００７２】
不活性添加剤による細菌粉末の希釈
米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認され開発された効力及び用量ガイドラインを遵守するため、医薬的に許容し得る添加剤を用いて前記ラクトバチルスバルク薬剤粉末の活性を希釈する。前記ラクトバチルス薬物粉末の効力を希釈するためには、本技術分野で知られているいずれの適切で不活性な医薬的に許容し得る添加剤（すなわち、希釈剤）も用いることができる。いくつかの実施形態において、希釈剤は、マルトデキストリン、アルファ化デンプン、ラクトース、Ｐｈａｒｍａｓｐｅｒｓｅ（登録商標）、マンニトール、キシリトール、微結晶性セルロース、糖又はそれらの組み合わせであり得る。他の実施形態において、不活性増量剤を他の希釈剤と組み合わせて用いることができる。他の実施形態において、前記ラクトバチルスバルク薬剤粉末を希釈するためにマルトデキストリン又はアルファ化デンプンを用いることができる。いくつかの実施形態において、前記ラクトバチルスバルク薬剤粉末を希釈するためにマルトデキストリンが用られる。
【００７３】
いくつかの実施形態において、前記ラクトバチルスバルク薬剤粉末は、不活性添加剤で３倍から１０倍希釈される。他の実施形態において、前記ラクトバチルスバルク薬剤粉末は、不活性添加剤と、１：１〜１：１２ｗ／ｗ（粉末：不活性添加剤）の割合で組み合わされ得る。いくつかの実施形態において、前記ラクトバチルスバルク薬剤粉末は、不活性添加剤と、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、又は１：１２ｗ／ｗ（粉末：不活性添加剤）の割合で組み合わされ得る。特定の実施形態において、前記ラクトバチルスバルク薬剤粉末は、不活性添加剤と、１：１〜１：１０ｗ／ｗ（粉末：不活性添加剤）の割合で組み合わされ得る。特定の実施形態において、前記ラクトバチルスバルク薬剤粉末は、不活性添加剤と、１：１〜１：５ｗ／ｗ（粉末：不活性添加剤）の割合で組み合わされ得る。いくつかの実施形態において、前記ラクトバチルスバルク薬剤粉末は、不活性添加剤と、１：１〜１：３ｗ／ｗ（粉末：不活性添加剤）の割合で組み合わされ得る。
【００７４】
特定の実施形態において、前記ラクトバチルスバルク薬剤粉末は、マルトデキストリンと、１：１〜１：１０ｗ／ｗ（粉末：マルトデキストリン）の割合で組み合わされ得る。特定の実施形態において、前記ラクトバチルスバルク薬剤粉末は、マルトデキストリンと、１：１〜１：５ｗ／ｗ（粉末：マルトデキストリン）の割合で組み合わされ得る。いくつかの実施形態において、前記ラクトバチルスバルク薬剤粉末は、マルトデキストリンと、１：１〜１：３ｗ／ｗ（粉末：マルトデキストリン）の割合で組み合わされ得る。希釈された前記乾燥ラクトバチルスバルク薬剤粉末（医薬生産物と称する）の効力は、１０８ＣＦＵ／ｇ〜１０１１ＣＦＵ／ｇであってもよく、１０８ＣＦＵ／ｇ〜１０１０ＣＦＵ／ｇであってもよい。より好ましい医薬生産物は、１０９ＣＦＵ／ｇを超える活性を有してもよい。
【００７５】
前記医薬生産物は、約１００ｍｇ〜６００ｍｇの用量（ｄｏｓｅ）で包装され得る。いくつかの実施形態において、前記医薬生産物の用量は、約１００ｍｇの用量で、又は約１５０ｍｇ、約２００ｍｇ、約２５０ｍｇ、約３００ｍｇ、約３５０ｍｇ、約４００ｍｇ、約４５０ｍｇ、約５００ｍｇ、約５５０ｍｇ若しくは約６００ｍｇの用量で包装され得る。他の実施形態において、前記医薬生産物は、約１５０ｍｇ〜４５０ｍｇ、又は約１５０ｍｇ〜約４００ｍｇ、又は約１５０ｍｇ〜約３５０ｍｇの用量で包装され得る。いくつかの実施形態において、前記医薬生産物は、約１５０ｍｇ〜２５０ｍｇの用量で包装され得る。特定の実施形態において、前記医薬生産物は、約２００ｍｇの用量で包装され得る。
【００７６】
前記医薬生産物は、医療用粉末アプリケータ内に配置してもよく（最終医薬生産物と称する）、輸送及び貯蔵の間において水分及び酸素に対して保護するために包装してもよい。前記包装は、マイラー（Ｍｙｌａｒ）又は金属フィルムパウチ等、上記保護のための任意の適切な材料からなるものであってよい。いくつかの実施形態において、前記最終医薬生産物は、例えば個別の投与（ｄｏｓａｇｅ）用に、個包装される。
【００７７】
前記乾燥保存ラクトバチルス最終医薬生産物の使用
本明細書に記載される任意の適切なラクトバチルス属菌種及びラクトバチルス属菌株の前記最終医薬生産物（すなわち、乾燥粉末）は、膣感染症（すなわち、異常膣微生物叢）を予防及び／又は治療するために使用することができる。そのような膣感染症としては、細菌性腟症、酵母菌性腟炎、淋病、クラミジア、トリコモナス症、ヒト免疫不全症ウィルス感染、単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）、尿路感染症及び骨盤炎症性疾患が挙げられるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態において、前記最終医薬生産物は、細菌性腟症、酵母菌性腟炎又は尿路感染症を予防及び／又は治療するために使用することができる。特定の実施形態において、前記乾燥粉末は、細菌性腟症（ＢＶ）を予防及び／又は治療するために使用することができる。
【００７８】
異常膣微生物叢は、本技術分野で知られている任意の適切な手段を用いて検出し、診断することができる。膣感染症は、症候性でも無症候性でもありうる。症状としては、一般的に、異臭及び／又は異常分泌物、並びにそう痒及び／又は疼痛による不快感が挙げられる。膣感染症によっては、異常膣微生物叢は、医療相談を行っていない女性に検出されたり、診断装置や診断キットにより検出されたりすることもある。例えば、酵母菌性腟炎を検出するためのいくつかの安価で処方箋の不要なキットが入手可能である（例えば、Ｖａｇｉｓｉｌ（商標））。
【００７９】
場合によっては、医師が前記膣感染症を検出し、診断する。臨床的基準では、上述の症状、４．５超の膣液ｐＨ、及び顕微鏡検査におけるクルー細胞（例えば、付着性球桿菌が点在する膣上皮細胞）の存在、を含む少なくとも３つの症候の存在を必要とする。例えば、細菌性腟症は、例えば、Ａｍｓｅｌ臨床基準又はグラム染色膣垢塗抹標本（Ｎｕｇｅｎｔスコアリングシステム）によって検出することができる。前記グラム染色膣垢塗抹標本は、ラクトバチルス（グラム陽性菌）、グラム陰性桿菌、グラム不定桿菌、グラム陰性球菌及びグラム不定球菌（すなわち、Ｇ．バギナリス（Ｇ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）及びペプトストレプトコッカス（ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ））の相対濃度、並びにＢＶに特徴的な湾曲したグラム陰性桿菌（ｃｕｒｖｅｄ  Ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｒｏｄｓ）（すなわち、モビルンカス（Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ））の相対的濃度を決定するために用いられる。各種膣感染症のための検出方法及び診断方法は、本技術分野でよく知られており、米国特許第８，３２９，４４７号に記載されている。また、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｓｔｄ／ｔｇ２０１５／ｂｖ．ｈｔｍも参照のこと。
【００８０】
本発明の前記乾燥粉末は単独で投与してもよく、膣感染症の予防及び／又は治療のための他の任意の治療と併用して（例えば、他の任意の治療と同時に、他の任意の治療の前に、及び／又は他の任意の治療の後で）投与してもよい。膣感染症の予防及び／又は治療のための他の任意の治療の投与は、異常膣微生物叢のレベルを減少させるために有効な量で行うことができる。膣感染症の予防及び／又は治療のための他の治療としては、本技術分野でよく知られている抗生物質又は抗ウィルス剤を挙げることができる。いくつかの実施形態において、膣感染症の予防及び／又は治療のための他の治療は抗生物質であってもよい。異常膣微生物叢の予防及び／又は治療のための適切な抗生物質は、本技術分野で公知である。そのような抗生物質としては、クリンダマイシン、メトロニダゾール及びチニダゾールが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の乾燥粉末と併用して使用するための抗生物質は、任意の適切な投与形態であってよい。例えば、抗生物質は、（ゲル剤又はクリーム剤として）局所的に送達されてもよく、経口錠、膣錠、カプセル剤又は坐剤として送達されてもよい。特定の実施形態において、前記抗生物質は、局所ゲル剤として投与される。
【００８１】
前記抗生物質治療は、１日１〜２回投与され得る。特定の実施形態において、前記抗生物質処置は、１日１回投与され得る。
【００８２】
本発明のいくつかの実施形態において、前記抗生物質は、２〜７日間投与され得る。他の実施形態において、前記抗生物質は、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間及び７日間投与され得る。いくつかの他の実施形態において、前記抗生物質は、２〜７日間、又は３〜６日間、又は４〜５日間、又は４〜７日間投与され得る。特定の実施形態において、前記抗生物質は、２〜７日間投与され得る。別の実施形態において、前記抗生物質は、７日間投与され得る。別の実施形態において、前記抗生物質は、５日間投与され得る。
【００８３】
いくつかの実施形態において、前記乾燥粉末の投与は、抗生物質の投与計画の最後の数日間で行う（すなわち、抗生物質の投与計画の完了前の２〜４日間）。他の実施形態において、前記乾燥粉末は、抗生物質の投与計画の完了後に投与される。前記乾燥粉末は、抗生物質の投与計画の完了後に１日１回又は２回投与され得る。いくつかの実施形態において、前記乾燥粉末は、抗生物質の投与計画の完了後１日２回投与され得る。特定の実施形態において、前記乾燥粉末は、抗生物質の投与計画の完了後１日１回投与され得る。
【００８４】
本発明のいくつかの実施形態において、前記乾燥粉末は、抗生物質の投与計画の完了後１〜１４日間投与され得る。他の実施形態において、前記乾燥粉末は、抗生物質の投与計画の完了後、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、１０日間、１２日間又は１４日間投与され得る。いくつかの他の実施形態において、前記乾燥粉末は、抗生物質の投与計画の完了後、２〜１２日間、又は３〜１０日間、又は４〜７日間、又は５〜６日間投与され得る。特定の実施形態において、前記乾燥粉末は、抗生物質の投与計画の完了後５〜７日間投与され得る。別の実施形態において、前記乾燥粉末は、抗生物質の投与計画の完了後５日間投与され得る。
【００８５】
抗生物質投与計画及び初期の乾燥粉末投与計画の完了後、追加の期間、本発明の前記乾燥粉末を投与することができる。例えば、前記乾燥粉末を用いた初期治療の完了後（すなわち、１日１回投与を７日間）、前記乾燥粉末を１週間につき１〜５回投与してもよい。いくつかの実施形態において、前記乾燥粉末は、初期乾燥粉末治療計画の完了後、１週間につき１回、２回、３回、４回又は５回投与され得る。他の実施形態において、前記乾燥粉末は、初期乾燥粉末治療計画の完了後、１週間につき１〜４回、又は１週間につき２〜５回、又は１週間につき１〜３回、又は１週間につき１〜２回投与され得る。特定の実施形態において、前記乾燥粉末は、初期乾燥粉末治療計画の完了後、１週間につき１回投与され得る。
【００８６】
本発明のいくつかの実施形態において、前記乾燥粉末は、初期乾燥粉末治療計画の完了後１〜２６週間投与され得る。他の実施形態において、前記乾燥粉末は、初期乾燥粉末治療計画の完了後、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、１０週間、１２週間、１４週間、１６週間、１８週間、２０週間、２２週間、２４週間又は２６週間投与され得る。いくつかの他の実施形態において、前記乾燥粉末は、初期乾燥粉末治療計画の完了後、２〜２６週間、又は３〜２４週間、又は４〜２２週間、又は５〜２０週間、又は６〜１８週間、又は７〜１６週間、又は８〜１４週間、又は１０〜１２週間投与され得る。特定の実施形態において、前記乾燥粉末は、初期乾燥粉末治療計画の完了後５〜１０週間投与され得る。別の実施形態において、前記乾燥粉末は、初期乾燥粉末治療計画の完了後１０週間投与され得る。
【００８７】
本明細書に引用される全ての公報及び特許出願は、個々の刊行物又は特許出願書が具体的かつ個別に示され参照により組み込まれているかのように、本明細書に参照により組み込まれる。
【００８８】
上述の本発明は、理解の明暸性のために説明及び例によって多少詳細に記載されたが、本発明の教示を考慮して、添付の特許請求の範囲の精神又は範囲を逸脱することなく、一定の変更及び改変が為されてもよいことは、当業者にとって直ちに明らかであろう。
【実施例】
【００８９】
ＩＶ．実施例
以下の例は、説明の目的でのみ提供されるものであって、限定のために提供されるものではない。本質的に同様の結果を生じるために変更又は改変され得る種々の非決定的パラメータを、当業者は容易に認識するであろう。
【００９０】
実施例１．  ラクトバチルスの乾燥組成物の調製
本実施例には、細菌培養、保存媒体中における懸濁、乾燥、希釈及び包装を含む、粉末形態のラクトバチルスの乾燥組成物を医薬品として調製するための概略の戦略が詳細に記載される。ラクトバチルス・クリスパタスＳＪ−３Ｃの培養及び処理のための、ここで記載される手順は、本発明による使用のために適切ないずれの微生物に対しても適用可能である。
【００９１】
最初のラクトバチルス・クリスパタスＳＪ−３Ｃ（ＳＪ−３Ｃ）細胞は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）の寄託より、ＰＴＡ−１０１３８のＡＴＣＣ番号で得ることができる。これらの細胞のマスターセルバンク及びワーキングセルバンクを作製し、引き続き乾燥ラクトバチルス組成物の調製に用いることができる。
【００９２】
最初に、前記ＳＪ−３Ｃ細胞を、改変ｄｅ  Ｍａｎ，Ｒｏｇｏｓａ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐｅ（ＭＲＳ）寒天平板上で平板培養し、３７℃で７２時間、嫌気的条件下で増殖させる。前記平板から得られた細胞を１０ｍＬの改変ＭＲＳに接種し、３７℃で２４時間、嫌気的にインキュベートする。次いで、この培養物を４９０ｍＬの増殖培地に移し、３７℃で２４時間インキュベートした後、５ＬのＢｅｌｌｃｏバイオリアクター中の４．５Ｌの培地に移す。５リットルの培養物を追加的に２４時間、３７℃で、嫌気的にインキュベートして発酵槽接種物とする。
【００９３】
窒素ガスを拡散（ｓｐａｒｇｅ）させた改変ＭＲＳ培地の存在下で、ｐＨ６．０で、発酵槽（１００Ｌの発酵槽）内で発酵を行う。前記接種物の添加によって発酵を開始し、細胞が初期定常期に達し、成長が停止する約１５時間後に完了させる。この時点で、グルコースは枯渇し、乳酸生成は停止し、６００ｎｍ（ＯＤ６００）における前記培養物の光学密度は一定のままであり、前記細胞を回収する。
【００９４】
細胞を回収し、濃縮し、接線流膜を用いた閉鎖滅菌中空糸システム内で、リン酸緩衝生理食塩水へ緩衝液を交換（透析濾過）することにより洗浄する。残留乳酸濃度が回収時における初期値の１０％に達し、透過液のｐＨが一定のままとなった場合、前記細胞を前記回収システムから無菌的に取り除き、２０分間、２〜８℃、１５００×ｇで、遠心分離によって回収する。
【００９５】
細胞ペースト１ｇにつき２．５ｍＬの保存溶液を用いて、細胞ペレットを保存媒体溶液中で再懸濁させる。前記保存媒体溶液は、１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中に１５％のトレハロース、６％のキシリトール、及び１％のアスコルビン酸ナトリウムを含有し、これを用いて、回収されたＳＪ−３Ｃスラリーのバッチを調製する。得られた前記保存媒体細胞スラリーのバッチの算出される活性を１×１０１０ＣＦＵ／ｍＬ〜５×１０１０ＣＦＵ／ｍＬとする。前記スラリーを、滅菌Ｌｙｏｇｕａｒｄ（商標）トレイに移し、Ｖｉｒｔｉｓ  Ｇｅｎｅｓｉｓ凍結乾燥機内で凍結乾燥する。凍結乾燥前に、前記細胞スラリーの生存率を平板計数によって決定する。前記細胞塊を含む前記Ｌｙｏｇｕａｒｄ（商標）トレイを、乾燥剤を有するヒートシールしたバッグ内に配置し、窒素ガスでパージし、粉砕まで２〜８℃で保持する。
【００９６】
固化防止剤として０．５％コロイド状二酸化ケイ素と合わせた前記凍結乾燥細胞塊をコーンミルにより粉砕することによって、ＳＪ−３Ｃバルク薬剤原料を生産する。前記バルク粉末を窒素（Ｎ２）ガスでパージし、ヒートシールされたバッグ内で２〜８℃で乾燥剤と共に医薬生産物の製造に用いるまで保存する。上述した方法及び当業者に公知の方法により、前記ＳＪ−３Ｃバルク薬剤原料を、純度、効力（ＣＦＵ）、同一性、及び残留水分について試験する。得られた前記乾燥ＳＪ−３Ｃバルク薬剤原料のバッチの理想的活性は、５×１０１０ＣＦＵ／ｇ〜１．０×１０１１ＣＦＵ／ｇであるべきである。前記乾燥ＳＪ−３Ｃバルク薬剤原料の理想的水分活性は、０．２２０未満であるべきである。純度について試験する場合、得られた前記ＳＪ−３Ｃバルク薬剤原料は、総好気性菌数が２００ＣＦＵ／ｇ未満であり、総酵母数及び総カビ数が２０ＣＦＵ／ｇ未満であり、好ましくない生物が存在しない。得られた前記ＳＪ−３Ｃバルク薬剤原料の同一性を１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列によって確認する。
【００９７】
マルトデキストリンで前記バルク薬剤原料を３〜１０倍希釈して、最終用量を２×１０９ＣＦＵ／用量〜５×１０９ＣＦＵ／用量とする。前記用量は２００ｍｇである。１用量の前記希釈薬物物質を医療用粉末アプリケータ内に配置し、最終医薬生産物として包装する。
【００９８】
実施例２．  動物由来の添加剤を含む、及び動物由来の添加剤を含まない保存媒体の調製物の試験
以下の実施例は、乾燥粉末ラクトバチルス・クリスパタスのための、室温での良好な安定性を示す、スキムミルクを含まない保存媒体の調製物の開発及び特定を示す。本実施例は、保存媒体から動物由来の添加剤を排除した場合に、乾燥ラクトバチルス粉末の安定性が高まることを示す。ラクトバチルス・クリスパタスＣＴＶ−０５を用いた前記保存媒体培養物の配合及び開発について説明されている以下の手法は、本発明による使用のために適切ないずれの微生物にも適用可能である。
【００９９】
保存調製物開発の試験のために、ラクトバチルス・クリスパタスＣＴＶ−０５を、撹拌バイオリアクターＢｉｏＦｌｏ  １１０  Ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ  ａｎｄ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ニュージャージー州エジソン）内で、１Ｌのスケールで、改変ＭＲＳ培地中、ｐＨ６．０で増殖させた。バッチ発酵プロセスを用い、グルコース消費及び乳酸生成が完了した初期定常期に細胞を回収した。前記発酵プロセスによって、概して、１．０×１０９〜１．５×１０９ＣＦＵ／ｍＬが得られ、細胞生存率は９０％を超えた。前記細胞を遠心分離によって回収し、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、１又は複数の保存基質と混合した。次いで、前記混合物をＶｉｒｔｉｓ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ凍結乾燥器内で凍結乾燥させた。
【０１００】
最初に、スキムミルク、トレハロース、キシリトール、アスコルビン酸、α−トコフェロール及びリン酸緩衝液を含む、ラクトバチルスを保存するための異なる濃度の添加剤を含む１６の保存基質において、ＣＴＶ−０５の凍結保存安定性及び加速安定性を評価した（表２）。
【０１０１】
【表２】
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【０１０２】
前記試料を血清バイアル内に配置して、−４０℃で５時間凍結し、次いで真空下で３０時間、−４０℃で一次乾燥に供し、２５℃で２０時間二次乾燥に供した。前記試料を乾燥剤と共にホイルパウチ内に包装し、３７℃で貯蔵した。一定の間隔をおいて粉末試料を取り除き、０日目、１０日目及び３０日目に、ＭＲＳ寒天上における平板培養及びコロニーの計数を行うことによって生存率（すなわち、活性）を測定した。表３に示されるように、３７℃において、調製物６及び調製物１６は最も優れた貯蔵安定性を示した（初期の生存率の７０％〜７５％を維持）。
【０１０３】
【表３】
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【０１０４】
上記と同じ１６種の調製物からスキムミルク成分を除去したものを用いて、同様の実験を行った（表４）。
【０１０５】
【表４】
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【０１０６】
表５において以下で示されるように、３７℃において、スキムミルクを含まない調製物６及び調製物１６は同様の初期効力を有し、最も高い貯蔵安定性を示した（初期の生存率の約２５％）。
【０１０７】
【表５】
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【０１０８】
調製物６及び調製物１６中にスキムミルクを配合することによって貯蔵安定性が向上するようであったが、アスコルビン酸ナトリウム及びキシリトールの濃度を高めることによっても貯蔵安定性が向上すると考えられた。一方、α−トコフェロールの濃度を高めてもＣＴＶ−０５の貯蔵安定性は向上しないようであった。その後の実験において、α−トコフェロール（及びその媒体であるＴｗｅｅｎ２０）を除去するとＣＴＶ−０５の安定性が向上したことが示された。
【０１０９】
上記表２の調製物６の保存基質からα−トコフェロール（及びＴｗｅｅｎ２０）を除去した後、凍結乾燥中の凍結保護又は２５℃における長期保存安定性に悪影響を及ぼすことなく、スキムミルクも除去することができることがわかった（図１）。したがって、１５％のトレハロース、６％のキシリトール、１％のアスコルビン酸ナトリウム及び１０ｍＭのリン酸ナトリウムを含むｐＨ７．４の保存溶液を用いて、凍結保護及び室温安定性の最良の組み合わせを達成することができた（図１、上の線）。この調製物は、５％のスキムミルクを含む同じ調製物（図１、下の線）よりも良好な安定性を提供した。
【０１１０】
実施例３．  安定性を向上させるためのグルタミン酸一ナトリウムの使用
実施例２の手順の後、培養されたＬ．クリスパタスＣＴＶ−０５（ＬＡＣＴＩＮ−Ｖ）細胞を、以下の４つの異なる保存媒体中に配合した。
１）１５％のトレハロース、６％のキシリトール、１％のアスコルビン酸ナトリウム及び１０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４（三角形）；
２）１）と同じ保存媒体に５％のグルタミン酸一ナトリウムを追加したもの（逆三角形）；
３）１２％のトレハロース、８％のキシリトール、１％のアスコルビン酸ナトリウム及び１０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４（丸）；及び
４）３）と同じ保存媒体に５％のグルタミン酸一ナトリウムを追加したもの（正方形）。
図２に示されるように、グルタミン酸一ナトリウムは、初期凍結保存に影響を及ぼすことなく、高温（３７℃）において両方の粉末調製物の安定性を向上させた。
【０１１１】
実施例４．  異常膣微生物叢を治療するための乾燥組成物の使用
本実施例には、本発明のラクトバチルス属菌をインビボで使用し、粉末として患者に送達させて、再発性細菌性腟症の女性の膣に再びコロニーを形成させることが可能であることを示す、インビボの試験が詳細に記載される。
【０１１２】
再発性細菌性腟症（ＢＶ）の２５歳の女性患者は、膣異臭及び異常分泌物、並びにそう痒及び疼痛からの不快感等のＢＶ感染の症状を有している。この女性患者において、ＢＶはＡｍｓｅｌ臨床基準（３つ以上の基準を満たす場合）により検出され、Ｎｕｇｅｎｔスコアリングシステムにより微生物学的に確認される（Ｎｕｇｅｎｔスコアが７〜１０の場合）。
【０１１３】
前記患者は、０．７５％の局所メトロニダゾール（ＭｅｔｒｏＧｅｌ（登録商標））による最初の標準抗生物質治療を、１日１回、５日間受ける。前記メトロニダゾール治療の完了後、前記女性患者は、本発明のラクトバチルスＳＪ−３Ｃ医薬生産物を用いた治療を開始する。包装された医療用粉末アプリケータを用いて、１用量当たり２×１０９ＣＦＵの活性を有する２００ｍｇ用量のＳＪ−３Ｃ医薬生産物を前記患者の膣内に投与する。前記患者は、５日間連続で睡眠前に１日１回、前記ＳＪ−３Ｃ医薬生産物の１用量の投与を受け、その後１週間に２回の治療を１０週間受ける。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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