(57)【要約】  本発明は、胚性幹細胞及び誘導多能性幹細胞を含めた多能性幹細胞を培養するための化学的に規定された培地(Chemically defined medium)又は最小細胞培地に関する。前記培地は、以下の成分:基礎培地、IGF1、TGFβファミリーメンバー及びグルタミン補充剤からなってもよい。本発明は、細胞培地を含む方法及び使用にも関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞を培養するための細胞培地であって、インシュリン様成長因子1(IGF1)を含み、線維芽細胞成長因子(FGF)及びいかなるFGF受容体活性化剤も含まない若しくは実質的に含まない、かつErbB3リガンドを含まない、化学的に規定された培地(Chemically defined medium)又は最小培地である細胞培地。
【請求項２】
胚性幹細胞又は誘導多能性細胞を培養するための、請求項1に記載の細胞培地。
【請求項３】
哺乳動物細胞を培養するための、請求項1又は2のいずれか一項に記載の細胞培地。
【請求項４】
ヒト細胞を培養するための、請求項3に記載の細胞培地。
【請求項５】
前記IGF1が、配列番号1又は配列番号2の配列を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の培地。
【請求項６】
TGFβファミリーメンバーをさらに含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の培地。
【請求項７】
前記TGFβファミリーメンバーが、アクチビンである、請求項6に記載の培地。
【請求項８】
ヒト多能性幹細胞を培養するための細胞培地であって、化学的に規定された培地(Chemically defined medium)又は最小培地であり、基礎培地、IGF1、TGFβファミリーメンバー及びグルタミン補充剤からなる細胞培地。
【請求項９】
前記TGFβファミリーメンバーが、アクチビンである、請求項8に記載の培地。
【請求項１０】
前記基礎培地が、Advanced DMEM/F12である、請求項8又は9に記載の培地。
【請求項１１】
in vitroで多能性幹細胞を培養する方法であって、請求項1〜10のいずれか一項に記載の培地中で前記細胞を培養する工程を含む方法。
【請求項１２】
多能性幹細胞の培養における、請求項1〜10のいずれか一項に記載の培地の使用。
【請求項１３】
前記細胞が、胚性幹細胞又は誘導多能性細胞である、請求項11に記載の方法又は請求項12に記載の使用。
【請求項１４】
前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項13に記載の方法又は使用。
【請求項１５】
前記細胞が、ヒト細胞である、請求項14に記載の方法又は使用。
【請求項１６】
請求項11〜15のいずれか一項に記載の方法によって得られる又は得られた細胞。
【請求項１７】
胚を培養するための培地であって、前記培地が、請求項1〜10のいずれか一項に記載されたものである、培地。
【請求項１８】
胚を培養するためのin vitro方法であって、請求項17に記載の培地中で前記胚を培養する工程を含む方法。
【請求項１９】
前記胚が、ヒト胚である、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
胚の培養における、請求項17に記載の培地の使用。
【請求項２１】
前記培養が、基底膜と組み合わせて実施される、請求項11〜15又は17〜20のいずれか一項に記載の方法又は使用。
【請求項２２】
前記基底膜が、ラミニンを含む、請求項21に記載の方法又は使用。
【請求項２３】
ヒト胚の培養に必須の因子についてスクリーニングする方法であって、
(i) 分析しようとする因子を添加することによって培地を調製する工程と;
(ii) 前記培地中でヒト胚を培養する工程と;
(iii) 前記胚を、前記因子を含まない培地中で又は前記因子の活性化剤若しくは阻害剤の存在下で培養した胚と比較する工程と
(iv) 前記因子が前記胚の培養に必須かどうかを決定する工程と
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胚性幹細胞及び誘導多能性幹細胞を含めた多能性幹細胞を培養するための化学的に規定された(Chemically defined)細胞培地に関する。本方法は、細胞培地を含む方法及び使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト着床前胚の胚盤葉上層細胞から誘導したヒト胚性幹細胞(hES細胞)は、由来するその細胞型のいくつかの性状を再現し、培養で無限に維持することもできる。胚盤葉上層は、胚体(embryo proper)を形成する特有の潜在能力を有する。したがって、hES細胞は、胚盤葉上層が、ヒト発達の初期段階の過渡期にどのように樹立され、維持されるかについて理解するための有用なツールとなっている。さらに、hES細胞は、それぞれの適当な条件下で培養した場合に複数の異なる細胞型を生じる潜在能力のため、臨床応用のためのツールにもなり得る。
【０００３】
加えて、誘導多能性幹細胞(iPS細胞)は、皮膚細胞(線維芽細胞)などの非多能性細胞を再プログラミングして、hES細胞の樹立又は維持に重要であると同定されている鍵遺伝子の発現を上方調節し、すでに分化した細胞型と関連付けられた遺伝子を下方調節することによって生成され得る。誘導過程は、ヒトES細胞培養培地中で通常のとおり実施されて、成功裏に再プログラミングされた細胞が選択される。
【０００４】
この再プログラミング過程は、胚から誘導したhES細胞と同様に、胎児を構成する全ての組織に寄与する潜在能力を有する多能性様細胞へと線維芽細胞を復帰させる。これは、例えば、個体から多能性細胞を生成することにより個別治療を潜在的に可能にすることになる。したがって、iPS細胞再プログラミングは、ヒトES細胞と可能な限り近く、理想的には同一である細胞を生成することを目標とする。
【０００５】
ヒトES及びiPS細胞は、in vitroで長期間増殖する能力があり、一方で身体の全ての細胞型に分化する潜在能力を保持している。したがって、これらの細胞は、創薬及び治療的使用の両方に対して患者特異的な機能細胞の無制限な供給を潜在的に提供する可能性がある。加えて、無制限の増殖能力を持つhES及びiPS細胞は、臨床的に関連する細胞型への分化の出発細胞集団として体細胞に勝る特有の利点を有する。
【０００６】
hES及びiPS細胞の両方は、類似の培養条件で維持され得、その条件は通常、ヒト胚からhES細胞を誘導するのに適しているとこれまでに決定されている条件である(目標は、iPS細胞がhES細胞と同等となるようにするためなので)。古典的培地配合物は、動物由来血清、さもなければ未規定の又は様々な成分を利用する傾向がある。これは、臨床品質の培養系に対する問題を含んでおり、培養系は、理想的にはゼノフリーであり、一貫性のため及びバッチ間変動を最小にするために規定された成分を有するべきである。大多数のhES細胞培地は、現在のところ外因性の線維芽細胞成長因子(FGF)、しばしばbFGF若しくはFGF2、を含有し、それら因子は培地に添加されるか、又は細胞がその上で培養され得る有糸分裂不活性化フィーダー(MEF)細胞によって分泌されるかのいずれかである。
【０００７】
しかしながら、既存のhES細胞(拡大解釈すれば、これら細胞と同等であるように誘導したiPS細胞)は、hES細胞の誘導元のヒト胚内の胚盤葉上層と完全には同一でないことが次第に明らかになっている。したがって、hES細胞が技術的に多能性であるとはいえ、それらは、分化潜在能力の点で多少の偏向を呈し、固有の転写及び後成的状況を有する可能性があり、ヒト胚盤葉上層がどのように樹立又は維持されるかという正確なモデルを提供しない可能性がある。これは、この発達段階の基礎生物学を調査するモデルとしての及びヒト疾患をモデル化し処置するための細胞の臨床供給源としてのhES細胞の使用にとっての課題となる。
【０００８】
したがって、ヒト胚におけるシグナル伝達環境に基づき、したがってそれを再現し、あらゆる不要な及びおそらく有害な因子を排除するhES並びにiPS細胞培養のための代替培地に対する当技術分野での必要性が存在する。そのうえ、医薬品製造品質管理基準(GMP)に準拠し、したがって化学的に規定されて(Chemically defined)おり、ゼノフリーである培養条件を同定する必要性がある。
【０００９】
本発明者らは、発達中のヒト着床前胚における多能性胚盤葉上層の樹立及び維持のためのシグナル伝達要件をさらに調査した。本発明者らは、ヒト胚盤葉上層細胞の情報に基づいた分子理解を使用して、規定されたhES及びiPS細胞培養培地を開発した。
【発明の概要】
【００１０】
本発明者らは、インシュリン様成長因子1(IGF1)を含み、線維芽細胞成長因子(FGF)を含まない培地が、多能性幹細胞の培養に使用され得ることを驚くべきことに見出した。本願実施例において実証される通り、培養におけるヒト胚へのFGFの添加は、NANOG発現の減少をもたらす。NANOGは、胚性幹細胞における多能性関連転写因子であり、NANOG発現の減少は、したがって全般的な多能性遺伝子発現に対する有害作用を示す。FGFはhES及びiPS細胞培養培地の標準成分であるので、これは驚くべき結果であった。反対に、胚培養培地へのIGF1の添加は、内部細胞塊(ICM)内のNANOGを発現する細胞の割合の増大をもたらす。
【００１１】
したがって、本発明は、IGF1、例えば外因性IGF1を含み、外因性FGFなどのFGFを含まない又は実質的に含まない細胞培地を提供する。
【００１２】
本発明の一態様において、細胞培地は、基本培地、IGF1、TGFβファミリーメンバー及びグルタミン補充剤だけからなる。すなわち、その培地はこれらの成分だけを含む。他のいかなる成分も存在しない。
【００１３】
本願実施例は、ヒト胚性幹細胞及び誘導多能性細胞の両方がそのような培地において維持され、誘導され得ることを示す。本発明による培地中で成長した細胞は、多能性幹細胞の培養のために市販されている培地(mTeSR(商標)1)中で成長した細胞又は基本培地、L-グルタミン、b-メルカプトエタノール、KnockOut Serum Replacement +外因性FGFの添加を含み、任意選択で外因性アクチビンを含有する従来培地の存在下で有糸分裂不活性化線維芽細胞(MEF)の層上で成長した細胞と同じ形態学的及び分子的特徴を示した。本発明は、化学的に規定された培地(Chemically defined medium)、すなわち全ての化学成分が分かっている培地を提供し、その培地は、本明細書に記載のヒト胚性幹細胞及びiPS細胞などの多能性幹細胞を培養するのに非常に有利である。化学的に規定された培地(Chemically defined medium)は、例えば、臨床安全性及び有効性に関する規制順守の理由で有利である。
【００１４】
本明細書に記載の本発明の細胞培地は、胚性幹細胞及び誘導多能性細胞などの多能性幹細胞の培養に使用され得る。本明細書では用語「培養」は、例えば細胞の誘導、樹立、維持及び増幅を含めたin vitro培養の全ての態様を包含するものとする。
【００１５】
本明細書では用語多能性幹細胞は、多能性である細胞を意味することを意図する。多能性幹細胞は、多くの異なる細胞型、例えば3つの胚葉:内胚葉、中胚葉及び外胚葉のどれにでも分化する潜在能力を有する。
【００１６】
一態様において、多能性幹細胞は、マウス、ウサギ、ウシ、ブタ又は非ヒト霊長類由来であってもよい。好ましい態様において、多能性幹細胞は、ヒト多能性幹細胞である。
【００１７】
好ましい実施形態において、多能性幹細胞は、胚性幹細胞、最も好ましくはヒト胚性幹細胞である。
【００１８】
当技術分野で公知のように、胚性幹細胞は、初期胚から誘導された多能性幹細胞である。胚性幹細胞株(ES細胞株)は、胚盤胞又はより初期の桑実期胚の内部細胞塊(ICM)の胚盤葉上層細胞から誘導された細胞の培養物である。胚盤胞は、ヒトにおいておよそ5〜7日齢であり、100〜300個の細胞で構成される初期段階の胚である。ES細胞は、多能性であり、発達の間に3つの一次胚葉:外胚葉、内胚葉及び中胚葉の全ての誘導物を生じる。言い換えれば、ES細胞は、成人の身体の細胞型のそれぞれに発達することができる。
【００１９】
代替実施形態において、多能性幹細胞は、誘導多能性幹細胞、最も好ましくはヒト誘導多能性幹細胞である。
【００２０】
誘導多能性幹細胞は、再プログラミング因子と称される特定の遺伝子又は非組込みmRNA若しくは化学物質を挿入することにより、非多能性細胞、通常は成人体細胞、若しくは最終分化した細胞、例えば線維芽細胞、造血細胞、筋細胞、ニューロン、上皮細胞等から人工的に調製される多能性幹細胞の一種である。
【００２１】
細胞は、転写因子SOX2(SRY関連HMGボックス2)、OCT4(八量体結合転写因子4)、KLF4(クルッペル様因子4)、及びc-MYC(V-mycトリ骨髄球腫症ウイルス発がん遺伝子ホモログ)、L-MYC、N-MYC、NANOG、LIN28、SALL4、UTF1、TBX3、p53及び/若しくはp21の阻害剤、並びに/又は5'-アザシチジン及びRG108など後成的修飾薬物の存在のうちのいずれか1つ若しくは組合せで形質導入、トランスフェクト、電気穿孔若しくはヌクレオフェクトされ得る。当業者は、このリストが網羅的なものではなく、hES細胞に似ている誘導多能性幹(iPS)細胞を生成するために使用されている因子のいくつか又は因子の組合せの単なる例であることを認識している。これらの因子は、iPS細胞への非多能性細胞の変換に影響を及ぼす。成体マウスをiPS細胞から誘導することができることは、当技術分野で公知である。これらの再プログラミングされた細胞は、ES細胞様の特性を獲得し、したがって任意の組織を生成する潜在能力を有する(Boland、ら  (2009年) Nature 461:91〜94頁; Quinlanら  (2011年) Cell Stem Cell 9:366〜373頁)。
【００２２】
当業者は、胚性幹細胞を培養、単離又は作製する方法を承知している。
【００２３】
例えば、hES細胞は、例えばThomsonら  (1995年) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7844〜7848頁; Thomsonら  (1998年) Science 282:1145頁; Thomson及びMarshall (1998年) Curr. Top. Dev. Biol. 38:133〜165頁; Reubinoffら  (2000年) Nat. Biotechnol. 18:399〜404頁; Chen及びEgliら、Cell Stem Cell、2009年2月6日、4頁に述べられる方法を使用して胚盤胞から得ることができる。
【００２４】
樹立ES細胞株も利用可能である。様々なhES細胞株が公知であり、それらの成長及び増殖の条件は規定されており、例えば、hES細胞株Shef6、H1、H7、H9、H13及びH14である。任意のES細胞又はES細胞株が、本発明による使用に適している。
【００２５】
ES細胞は、胚盤胞の内部細胞塊を培養することによって胚盤胞から誘導させてもよく、又は樹立細胞株の培養物から得られてもよい。したがって、本明細書では、用語「ES細胞」とは、胚盤胞の内部細胞塊細胞、内部細胞塊由来細胞の培養物から得たES細胞、及びES細胞株の培養物から得たES細胞を指し得る。
【００２６】
iPS細胞は、様々な方法によって得られ得る。例えば、Takahashiら  (2007年) Cell 126(4):663〜76頁の方法を参照のこと。iPS細胞は、hES細胞と形態学的に類似しており、様々なhES細胞マーカーを発現する。
【００２７】
ヒト胚性幹細胞は、いくつかの転写因子及び細胞表面タンパク質の存在によって規定され得る。適切な転写因子マーカーには、OCT4、NANOG及びSOX2があり、適切な抗原マーカーには、糖脂質SSEA3及びSSEA4並びに硫酸ケラタン抗原TRA-1-60及びTRA-1-81がある。
【００２８】
iPS細胞は、SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60及びTRA-1-81に対する抗体を使用して免疫組織化学若しくはフローサイトメトリーによって同定又は確認され得る特徴的な抗原も有する。そのような方法は、当業者にとって日常的なものである。
【００２９】
胚性幹細胞の多能性は、in vitroにおける自発的若しくは指向的分化によって又は8〜12週齢雄SCIDマウスの後肢筋肉におよそ0.5〜10×106個細胞を注射して、3つの胚葉それぞれのうち少なくとも1つの細胞型を実証する奇形腫を生成することによって確認され得る。
【００３０】
本発明は、本方法のいずれかによって得られた若しくは得られる任意の細胞若しくは細胞集団又は本明細書に記載の本発明の使用に及ぶ。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１−１】ヒト胚のFGF処理を示す図である。(A)FGF処理条件の概略を示す図である。(B)標準培地中で培養した胚(a)又はE2.5から1μg/ml FGF2及び1μg/mlヘパリンを補充した培地中で培養した胚(b、b')におけるE6-E7でのNANOG(多能性胚盤葉上層マーカー)及びGATA6(原始内胚葉マーカー)の免疫蛍光分析をDAPIマージと共に示す図である。(C)標準培地(a')又はE2.5から100ng/ml FGF2を補充した培地(c)中のE6-E7でのNANOG及びGATA6の免疫蛍光分析をDAPIマージと共に示す図である。(D)E5から100ng/ml FGF2を補充した培地中で培養した胚(d)におけるE6-E7でのNANOG及びSOX17(原始内胚葉マーカー)の免疫蛍光分析をDAPIマージと共に示す図である。(E)対照又はE5からE6-E7の間100ng/ml FGF2で処理した胚におけるNANOG及びSOX17を発現する細胞の定量化を示す図である。スケールバー=100μm。
【図１−２】図１−１の続きである。
【図１−３】図１−２の続きである。
【図１−４】図１−３の続きである。
【図２−１】ヒト胚のIGF処理を示す図である。(A)単一細胞RNA配列決定分析で決定されたヒト胚盤胞におけるインスリン及びIGFリガンド並びに受容体のマップされたリード100万個のキロベース当たりのリード(RPKM)値のボックスプロットを示す図である(Blakeleyら、2015年、Development、142:3151〜3165頁)。発現の範囲が、ヒト胚盤葉上層(EPI)、原始内胚葉(PE)又は栄養外胚葉(TE)系統について示される。ボックスは、第1及び第3四分位数、水平線は中央値、ひげは四分位範囲の1.5倍の長さに対応し、点は外れ値であった。(B)IGF1処理条件の概略を示す図である。(C)E2.5から17nM IGF1を補充した培地中で培養した胚におけるE6-E7でのNANOGの免疫蛍光分析をDAPIマージと共に示す図である。(D)対照又はIGF処理胚におけるNANOGを発現する細胞の定量化を示す図である。片側t検定。*P <0.05; ns.：有意でない。スケールバー=100μm。
【図２−２】図２−１の続きである。
【図２−３】図２−２の続きである。
【図３−１】ヒト胚盤胞における選択したラミニン及びインテグリンサブユニットの転写産物の発現を示す図である。(A)単一細胞RNA配列決定分析で決定したヒト胚盤胞に示されるラミニン511(LAMA5、LAMB1、LAMC1)及びインテグリンα6β1サブユニット(ITGA6、ITGB1)のマップされたリード100万個のキロベース当たりのリード(RPKM)値のボックスプロットを示す図である(Blakeleyら、2015年、Development、142:3151〜3165頁)。発現の範囲が、ヒト胚盤葉上層(EPI)、原始内胚葉(PE)又は栄養外胚葉(TE)系統について示される。ボックスは、第1及び第3四分位数、水平線は中央値、ひげは四分位範囲の1.5倍の長さに対応し、点は外れ値であった。(B)マトリゲル又はラミニンLN-511(BioLamina)及びiMatrix-511(Takara)上でmTeSR(商標)1培地中で成長したH9 hES細胞の代表的な位相差画像である。スケールバー=150μm。
【図３−２】図３−１の続きである。
【図４−１】アクチビン及びIGF1(AI培地)の存在下で樹立hES細胞を培養する方法の確立に関する図である。(A)ラミニン511(iMatrix-511)上で対照mTeSR(商標)1培地、又はA-DMEM、FGF2及びアクチビン、IGF1単独若しくはアクチビン及びIGF1(AI培地)中で2継代増殖させたH1 hES細胞の代表的な位相差画像である。生物学的複製n=2及び技術的複製n=2。スケールバー=300μm。(B)手作業、又は様々な解離試薬-無塩PBS、Gentle Cell Dissociation Reagent、ReLeSR若しくは0.5mM EDTAのいずれかによる継代の2日後に17nM IGF1及び50ngアクチビンに適合されたH9 hES細胞の代表的な画像である。技術的複製n=2又は3。スケールバー=150μm。(C)Rho関連キナーゼ(ROCK)阻害剤を使用して単一細胞レベルに最初に解離させたShef6細胞及びその後の成長の代表的な画像である。生物学的複製n=2及び技術的複製n=3。スケールバー=1000μm。
【図４−２】図４−１の続きである。
【図４−３】図４−２の続きである。
【図５−１】FGF受容体又は下流のMEK/ERKシグナル伝達の阻害剤を含むAI培地中で培養した細胞を示す図である。(A)100nM PD173074(PD17、FGF受容体阻害剤)、1μM PD0325901(PD13、MEK阻害剤)又は10μM SB-431542(SB、アクチビン/ノーダル受容体阻害剤)で処理したAI培地中のhES細胞培養の代表的な位相差画像である。細胞を、阻害剤に72時間曝露した。技術的複製n=4。スケールバー=100μm。(B)対照であるDMSO又はFGF受容体阻害剤、MEK阻害剤若しくはアクチビン/ノーダル受容体阻害剤を補充したAI培地中で培養したhES細胞の代表的な免疫蛍光分析を示す図である。多能性タンパク質OCT4及びNANOGの発現が、DAPI核染色と一緒に示される。スケールバー=100μm。
【図５−２】図５−１の続きである。
【図６−１】AI培地中で培養したhES及びiPS細胞の特徴付けを示す図である。(A)MEF上のKSR+FGF、ラミニン511上のmTeSR(商標)1又はラミニン511上のAI培地中で培養したhES細胞の代表的な位相差画像である。生物学的複製n=2又は3、技術的複製n=3。スケールバー=画像の上列の場合300μm、下列の場合100μm。(B)AI培地中のhES細胞(Shef6細胞株)又はiPS細胞(CiB10)の培養を独立に検証する代表的な位相差画像である。スケールバー=400μm。(C) hES又はiPS細胞の累積細胞集団倍加数を示す図である。(D)AI培地中で培養したhES又はiPS細胞に対する生存率アッセイを示す図である。(E)AI培地中での4日間にわたる培養の1cm2当たりの生存可能なhES又はiPS細胞の数を示す図である。(F)AI培地中で培養したhES細胞(Shef6)の代表的な免疫蛍光分析を示す図である。OCT4又はNANOG、TRA-1-81又はSSEA4及びDAPI核染色。画像は、分析したiPS細胞の代表例でもある。hES細胞の生物学的複製n=3、及びiPS細胞の生物学的複製n=2。スケールバー=50μm。
【図６−２】図６−１の続きである。
【図６−３】図６−２の続きである。
【図７−１】AI培地中で培養した細胞が、多能性タンパク質を強く発現することを示す図である。(A)AI培地中で培養したhES及びiPS細胞の代表的なフローサイトメトリー分析を示す図である。多能性タンパク質TRA-1-60、SSEA4、CD30、SSEA3、NANOG、OCT4及びSOX2の発現が定量化された。技術的複製n=3。(B)ROCK阻害剤を使用した単一細胞継代(左のグラフ)又は(C)凝集塊継代(右のグラフ)後のiPS及びhES細胞における多能性タンパク質発現のパーセンテージを示す図である。(D)46、XXであり、核型が正常であったhES及びiPS細胞の代表的なGバンドパターンを示す図である。
【図７−２】図７−１の続きである。
【図７−３】図７−２の続きである。
【図８】AI培地におけるヒト着床前胚からのhES細胞のde novo誘導を示す図である。(A)6日目のヒト着床前胚の内部細胞塊(ICM)が解剖され、MEFコーティングしたプレートの存在下にAI培地中にプレーティングされた図である。初期のICM生育後、細胞は、ラミニン511コーティングしたプレート上へ継代された。スケールバー=150μm。(B)多能性タンパク質OCT4、NANOG、SOX2及びTRA-1-81の発現並びにDAPI核染色に対するAI培地中で培養した新たに樹立されたhES細胞の代表的な免疫蛍光分析を示す図である。生物学的複製n=3。スケールバー=100μm。
【図９】AI培地におけるiPS細胞株のde novo誘導を示す図である。(A)iPS細胞様コロニーが、OCT4、SOX2、cMYC及びKLF4(丸)の外因性発現を駆動するセンダイウイルスによる一過性形質導入後12又は18日以内に検出され得たことを示す図である。iPS細胞誘導は、KSR+FGF、TeSR(商標)-E8又はAI培地中で実行された。スケールバー=300μm上列、100μm下列。(B)示した培地における培養18日後に現れたコロニーのTRA-1-60染色を示す図である。スケールバー=100μm。(C)AI培地を使用して誘導させた樹立iPS細胞株を示す図である。技術的複製n=2。スケールバー=100μm。
【図１０−１】AI培地中で培養した細胞の分化潜在能力を示す図である。(A)AI培地における3つ全ての胚葉への新たに樹立されたhES細胞の自発的分化を確認する免疫蛍光画像である:SOX17(内胚葉)、TUJ1(外胚葉)及びデスミン(中胚葉)を緑色、DAPI核染色を青色で重層した。n=2技術的複製及びn=3生物学的複製の代表例。スケールバー=100μm。(B)機能的に成熟した肝細胞へのAI培地(P20)に適合させたH9 hES細胞の指向的分化を示す図である。代表的な位相差画像が時間的経過全体にわたって示される。スケールバー=150μm上列及び100μm下列。(C)肝細胞分化過程全体にわたるAI培地に適合させたH9細胞の経時的免疫蛍光分析を示す図である。細胞は、内胚葉マーカーCXCR4及びSOX17を初めに発現し、次いで前腸内胚葉細胞に分化するにつれてFOXA2を上方調節し、最終的に成熟肝細胞としてアルファ-フェトプロテイン(AFP)及びサイトケラチン18(CK18)を発現する。スケールバー=100μm。
【図１０−２】図１０−１の続きである。
【００３２】
本明細書に述べる通り、本発明による細胞培地は、インシュリン様成長因子1(IGF1)、例えば細胞培地に添加した外因性IGF1を含む。一実施形態において、IGF1はヒトIGF1である。
【００３３】
本明細書では用語「外因性」は、細胞培地から導入又は細胞培地の外で産生され、すなわち例えば培地中の細胞によって細胞培地中で合成又は産生される(天然遺伝子産物など内在性又は天然に産生される)ものではないことを意味するものとする。
【００３４】
IGF1転写産物のスプライスバリアントがいくつか存在する(さらなる情報については例えばPhilippouら、Mol med 2014年; 20(1):202〜214頁を参照のこと)。ヒトIGF1-Bのアミノ酸配列(標準的な配列)は、下記配列番号1の通りである:
2020503878.tif 000002
【００３５】
IGF1-A形の配列は、下記配列番号2の通りである:
2020503878.tif 000003
【００３６】
IGF1のスプライスバリアントは、同じ成熟IGF1タンパク質を基本的に生じる。組換えIGF1成熟タンパク質は、例えばR&D Systems(Minneapolis、米国)、カタログ番号291-G1(7.6kDa成熟タンパク質)から市販されている。そのようなIGF1の市販されている供給源が、本発明によって使用されてもよい。
【００３７】
本発明の培地に使用されるタンパク質性因子(例えば、本明細書に記載のIGF1又はアクチビン)のいずれも、組換え的に発現又は生化学的に合成され得ることが認識されるであろう。加えて、天然に存在するタンパク質性因子は、当技術分野で周知の方法を使用して生体サンプル(例えば、ヒト血清、細胞培養物から)から精製され得る。本明細書に述べた通り、因子は、市販されていてもよい。
【００３８】
本発明のタンパク質性因子の生化学合成は、標準的な固相法を使用して実行され得る。これらの方法には、完全固相合成、部分的固相合成方法、断片縮合及び古典的溶液合成がある。
【００３９】
本発明のタンパク質性因子の組換え発現は、当技術分野で公知の組換え技術を使用して生成され得る。
【００４０】
IGF1への言及は、IGF1と同じ機能を有するIGF1の断片、バリアント、誘導体及びホモログを包含するものとする。
【００４１】
一実施形態において、IGF1断片、バリアント、誘導体又はホモログ(相同配列を持つ)は、配列番号1若しくは配列番号2に対して少なくとも約60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99若しくは100%の配列同一性及び例えば好ましくは細胞培養における機能に関してIGF1と同じ機能を有し得る。一実施形態において、断片、バリアント、誘導体又はホモログは、配列番号1若しくは配列番号2に対して少なくとも約98%の配列同一性及び例えば細胞培養における機能に関してIGF1と同じ機能を有し得る。
【００４２】
配列同一性は、任意の簡便な方法によって評価され得る。しかしながら、配列間の配列同一性の程度を決定する場合、配列のマルチプルアラインメントを行うコンピュータプログラム、例えばClustal W (Thompsonら、(1994年) Nucleic Acids Res.、22: 4673〜4680頁)が有用である。ALIGN(Myersら、(1988年) CABIOS、4: 1〜17頁)、FASTA(Pearsonら、(1988年) PNAS、85:2444〜2448頁; Pearson (1990年)、Methods Enzymol.、183: 63〜98頁)及びギャップBLAST(Altschulら、(1997年) Nucleic Acids Res.、25: 3389〜3402頁)のような配列対を比較及びアラインメントさせるプログラムも、この目的に有用である。
【００４３】
さらに、欧州バイオインフォマティクス研究所のDaliサーバは、タンパク質配列の構造に基づくアラインメントを提供している(Holm (1993年) J. Mol. Biol.、233: 123〜38頁; Holm (1995年) Trends Biochem. Sci.、20: 478〜480頁; Holm (1998年) Nucleic Acid Res.、26: 316〜9頁)。
【００４４】
複数配列のアラインメント及びパーセント同一性の算出は、標準的なBLASTパラメーター(利用可能な全生物の配列、マトリックスBlosum 62、ギャップコスト:存在11、伸長1)を使用して決定されてもよい。
【００４５】
別法として、以下のプログラム及びパラメーターが、使用されてもよい:プログラム: Align Plus 4、バージョン4.10(Sci Ed Central Clone Manager Professional Suite)。DNA比較:全体的な比較、標準的線形スコアリングマトリックス、ミスマッチペナルティ=2、ギャップ開始ペナルティ=4、ギャップ伸長ペナルティ=1。アミノ酸比較:全体的な比較、BLOSUM 62スコアリングマトリックス。
【００４６】
用語「相同」は、2つのアミノ酸配列、すなわちペプチド又はポリペプチド配列の配列間の配列同一性の程度(上記参照)を指すものとする。「相同性」は、比較しようとする配列に対して最適条件下でアラインメントされた2つの配列を比較することによって決定されてもよい。そのような配列相同性は、例えば、ClustalWアルゴリズムを使用してアラインメントを作成することによって算出され得る。一般に利用可能な配列分析ソフトウェア、より具体的にはVector NTI、GENETYX又は他のツールが公開データベースによって提供されている。したがって、記載されている又は所与の配列のバリアントは、例えば細胞培養においてバリアントが親の機能的活性を保持する、すなわちバリアントが機能的に同等である、言い換えれば親の活性を有する又は呈する限り本発明の範囲に含まれる。そのようなバリアントは、親配列と比較して1つ以上のアミノ酸のアミノ酸置換、付加又は欠失を含んでもよい。
【００４７】
所与のアミノ酸配列の「バリアント」によって、例えば、アミノ酸残基のうちの1つ又は2つの側鎖が、ペプチドが誘導元の親ペプチドの機能的活性を保持するように改変され得る(例えば別の天然に存在するアミノ酸残基の側鎖又は他の何らかの側鎖とそれらを置換することによる)ことを意味するものとする。
【００４８】
バリアントは、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンの残基から選択されるアミノ酸残基のうちの1つ以上によるアミノ酸残基の置換を含んでもよい。
【００４９】
そのようなバリアントは、相同的置換、すなわち塩基性に対して塩基性、酸性に対して酸性、極性に対して極性、等など同種/保存的置換から生じ得る。非相同的置換、すなわちあるクラスの残基から別のクラスへの置換も起こり得、又は別法としてオルニチン、ジアミノ酪酸、ノルロイシン、ピリジルアラニン、チエニルアラニン、ナフチルアラニン及びフェニルグリシンなど非天然のアミノ酸の内包も含み得る。
【００５０】
置換は、保存的置換でもよい。本明細書では「保存的置換」とは、所与の位置でアミノ酸同一性を変化させておよそ同等のサイズ、電荷及び/又は極性のアミノ酸で置換することを指す。アミノ酸の天然の保存的置換の例には、以下の8つの置換群がある(従来通りの1文字コードによって示される): (1) M、I、L、V; (2) F、Y、W; (3) K、R、(4) A、G; (5) S、T; (6) Q、N; (7) E、D;及び(8) C、S。1つ以上のアミノ酸が化学的に誘導体化され、例えば化学基で置換されている機能的に同等の誘導体も含まれる。機能的に同等の誘導体は、ペプチドの合成の前後のいずれかに特定のアミノ酸を反応させることによって化学的に修飾されてもよい。例は当技術分野で公知であり、例えば、R. Lundblad、Chemical Reagents for Protein Modification、第3版、CRC Press、2004年(Lundblad、2004年)に記載されている。アミノ酸の化学修飾には、アシル化による修飾、アミジン化、リジンのピリドキシル化、還元的アルキル化、2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)によるアミノ基のトリニトロベンジル化、カルボキシル基のアミド修飾及びシステインのシステイン酸への過ギ酸酸化によるスルフヒドリル修飾、水銀誘導体の形成、他のチオール化合物との混合ジスルフィドの形成、マレイミドとの反応、ヨード酢酸又はヨードアセトアミドによるカルボキシメチル化並びにそれだけには限らないがアルカリ性pHにおけるシアン酸塩によるカルバモイル化があるが、これに限定されない。
【００５１】
本発明による細胞培地は、IGF1、例えばIGF1を含み、すなわちIGF1は、培地に添加され、培地中で細胞によって天然に産生されていない。
【００５２】
IGF1は、約0.1nM〜50nMの濃度で本発明の細胞培地中に存在してもよい。例えば、IGF1は、約1.0〜20nM、例えば1.2〜18nM、1.7〜17nM又は1.5〜15nMの濃度で細胞培地中に存在してもよい。例えば、IGF1の濃度は、約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0、14.0、15.0、16.0、17.0、18.0、19.0、20.0、21.0、22.0、23.0、24.0、25.0、26.0、27.0、28.0、29.0、30.0、31.0、32.0、33.0、34.0、35.0、36.0、37.0、38.0、39.0、40.0、41.0、42.0、43.0、44.0、45.0、46.0、47.0、48.0、49.0又は50.0nMでもよい。一実施形態において、細胞培地中のIGF1は、約1.7又は17nMの濃度である。一実施形態において、濃度は1.7nMである。一実施形態において、濃度は17nMである。一実施形態において、本明細書に記載の本発明の細胞培地は、外因性IGF2を含まない。すなわち、本発明による細胞培地は、外因性IGF2を含めて、IGF2を含まない又は実質的に含まない。一実施形態において、外因性IGF2は、細胞培地に添加されていない。本明細書では用語「IGF2」はまた、IGF2の、本明細書において定義した任意のホモログ、バリアント又は誘導体を包含するものとする。
【００５３】
本発明による細胞培地は、線維芽細胞成長因子(FGF)を含まない又は実質的に含まない。培地は、外因性FGFを含まなくてもよい。すなわち、外因性FGFは、本発明の細胞培地に添加されておらず、培地は外因性FGFを含まない。
【００５４】
「実質的に」は、本明細書において明白な通常の定義により使用されて、大きな範囲又は程度を意味する。例えば、FGFを実質的に含まない、とは、大きな範囲でFGFを含まない、大きな程度でFGFを含まないことを意味する。数値的な精度が必要であるべき場合、文脈に応じて、本明細書では「実質的に」は、少なくとも、70%、75%、80%、85%、若しくは90%以上、例えば91、92、93、94、95、96、97、98、99若しくは100%を意味する。
【００５５】
FGFは、血管形成、創傷治癒、胚発達及び様々な内分泌シグナル伝達経路に関係するメンバーを含む成長因子のファミリーである。本明細書では用語「FGF」は、FGFファミリーの任意のメンバー、例えばFGF1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22又は23を包含するものとする。本発明による培地は、FGF1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22及び23から選択されるFGFの1つ以上を含まない又は実質的に含まなくてもよい。一実施形態において、本発明の細胞培地は、全てのFGF1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22及び23を含まない又は実質的に含まず、すなわち、本明細書に記載のいかなる外因性FGFも、本発明の細胞培地に無添加であり得る。
【００５６】
本明細書では用語「FGF」は、任意のFGFの、本明細書において定義した任意のホモログ、バリアント又は誘導体を包含するものとする。
【００５７】
一態様において、培地は、FGF2、例えば外因性FGF2若しくは本明細書に定義されるその任意のホモログ、バリアント、誘導体を含まない又は実質的に含まない。したがって、この態様において、いかなる外因性FGF2も、本発明による細胞培地に添加されない。
【００５８】
本発明による培地は、いかなるFGF受容体(FGFR)の活性化剤も含まない又は実質的に含まなくてもよい。線維芽細胞成長因子受容体は、3つの免疫グロブリン様ドメインで構成される細胞外リガンドドメイン、1つの膜貫通らせんドメイン及びチロシンキナーゼ活性を持つ細胞内ドメインからなる。これらの受容体は、線維芽細胞成長因子を結合する。4つの線維芽細胞成長因子受容体遺伝子の選択的スプライシングは、およそ48種の異なるアイソフォームのFGFRの産生を促進する。これらのアイソフォームは、そのリガンド結合特性及びキナーゼドメインにおいて変動するが、しかしながら全てが、3つの免疫グロブリン(Ig)様ドメイン(D1〜D3)で構成される共通の細胞外領域を共有しており、したがって免疫グロブリンスーパーファミリーに属する。
【００５９】
3つの免疫グロブリン(Ig)様ドメインである、D1、D2及びD3は、D1とD2との間に、FGFRに対するFGF結合の調節に関与し得る酸性アミノ酸の領域(「酸性ボックス」)を示す。免疫グロブリン様ドメインD2及びD3は、FGF結合に十分である。
【００６０】
本発明の細胞培地は、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FGFRL1(FGF受容体様1)及び/若しくはFGFR6の活性化剤を含まない又は実質的に含まなくてもよい。
【００６１】
「活性化剤」への言及は、FGF受容体の活性化をもたらし、したがってFGFシグナル伝達をもたらす物質又は分子を意味するものとする。例えば、完全長FGFリガンドの部分の断片は、FGF受容体を活性化し得る。
【００６２】
一実施形態において、本明細書に記載の本発明の細胞培地は、FGF受容体FGFR1又はFGFR2の活性化剤を含まない若しくは実質的に含まない。
【００６３】
一実施形態において、本発明の細胞培地は、FGF受容体の阻害剤を含む。適切な阻害剤は当業者に公知であり、市販されている。
【００６４】
FGF受容体阻害剤は、PD173074、ポナチニブ、BGJ398、ニンテダニブ、ドビチニブ、PRN1371、PD-166866、BLU-554、SUN11602、S49076、NSC12、エルダフィチニブ、AZD4547、ダヌセルチブ、ブリバニブ、ドビチニブ、MK-2461、ブリバニブアラニナート(BMS-582664)、SSR128129E、LY2874455、SU5402、ドビチニブ乳酸、FIIN-2、CH5183284及びBLU9931から選択されてもよい。一態様において、阻害剤はPD173074でもよい。
【００６５】
一実施形態において、本発明の細胞培地は、MEK阻害剤を追加的に又は代わりに含んでもよい。適切な阻害剤は当業者に公知であり、市販されている。
【００６６】
MEK阻害剤は、PD0325901、アルクチゲニン、BIX 02189、10Z-ハイメニアルディシン、PD184352、PD198306、PD334581、PD98059、SL327、U0124及びU0126から選択されてもよい。一態様において、阻害剤はPD0325901でもよい。
【００６７】
一実施形態において、本発明の細胞培地は、ERK阻害剤を追加的に又は代わりに含んでもよい。適切な阻害剤は当業者に公知であり、市販されている。
【００６８】
ERK阻害剤は、SCH772984、DEL-22379、VX-11e、LY3214996、ERK5-IN-1、XMD8-92、SC1、ウリキセルチニブ、FR180204及びGDC-0994から選択されてもよい。
【００６９】
一態様において、培地は、TGFβ阻害剤、例えばSB-431542を含んでもよい。本明細書に記載の本発明による細胞培地は、TGFβファミリーメンバータンパク質を含んでもよい。
【００７０】
TGFβシグナル伝達経路は、細胞成長、細胞分化、アポトーシス、細胞ホメオスタシス並びに他の細胞機能を含め、成体生物及び発達中の胚両方における多くの細胞過程に関係する。
【００７１】
TGFβファミリーメンバーには、骨形成タンパク質(BMP)、成長及び分化因子(GDF)、抗ミューラー管ホルモン(AMH)、アクチビン、ノーダル並びにTGFβのものがある。一態様において、TGFβファミリーメンバーは、アクチビン又はノーダルでもよい。
【００７２】
本発明の好ましい実施形態において、細胞培地は、アクチビンを含む。例えば、アクチビンA、アクチビンAB及び/又はアクチビンBなどの外因性アクチビンが、細胞培地中に存在してもよい。本発明による使用のためのアクチビンの適切な供給源は、例えばR&D Systems(カタログ番号338-AC/CF)又はPeprotech(カタログ番号120-14)から市販されている。
【００７３】
一態様において、培地は、複数のTGFβファミリーメンバータンパク質、例えば本明細書に述べる異なるTGFβファミリーメンバータンパク質の組合せを含んでもよい。
【００７４】
本発明の一態様において、細胞培地は、いかなるBMP、例えばいかなる外因性BMPも含まない又は実質的に含まない。
【００７５】
TGFβファミリーメンバーは、1ng/ml〜1mg/mlの濃度として本発明の細胞培地中に存在してもよい。例えば、アクチビンは、約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9又は1mg/mlの濃度で細胞培地中に存在してもよい。アクチビンの濃度は、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95又は100ng/mlでもよい。アクチビンの濃度は、約10〜約50ng/mlであってもよい。一実施形態において、アクチビンの濃度は、約10ng/mlである。一実施形態において、アクチビンの濃度は、約50ng/mlである。
【００７６】
グルタミン補充剤は、Glutamax(商標)など任意の適切なグルタミン補充剤又はL-グルタミンなどのグルタミンでもよい。
【００７７】
一態様において、グルタミン補充剤は、Glutamax(商標)である。Glutamax(商標)は、例えばGibcoから市販されている(カタログ番号35050-038)。本発明の一態様において、グルタミン補充剤は、Gibco製Glutamax(商標)である。
【００７８】
グルタミン補充剤は、約0.5〜10mM、例えば0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5又は10.0mMの濃度で細胞培地中に存在してもよい。一態様において、グルタミン補充剤は、約1mM〜3mMの濃度で細胞培地中に存在してもよい。一態様において、グルタミン補充剤は、約2mMの濃度で細胞培地中に存在してもよい。
【００７９】
本発明の一実施形態において、細胞培地は、BMP阻害剤を含む。
【００８０】
BMPは、骨及び軟骨の形成を誘導するその能力によって当初発見され、全身の組織構造を組織化するのに重要であると現在考えられている。7つのBMPが、当初発見された。これらのうち6つ(BMP2〜BMP7)は、タンパク質のトランスフォーミング成長因子ベータスーパーファミリーに属している。BMP1は、メタロプロテアーゼである。さらなる13個のBMPがその後発見され、合計20個になった。BMPのいずれか又は1つ以上のBMPの組合せが、本発明による細胞培地中で阻害されてもよい。
【００８１】
任意の適切なBMP阻害剤又はBMP阻害剤の組合せが、本明細書に記載の本発明の細胞培地に添加されてもよい。BMP阻害剤は当技術分野で公知である。そのような阻害剤は、BMPさらにはBMP受容体の阻害剤を含んでもよい。
【００８２】
例えば、BMP阻害剤には、それだけには限らないが、DMH1(4-[6-(4-イソプロポキシフェニル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-3-イル]キノロン、例えばSigma-Aldrich、カタログ番号D8946から利用可能である)、ドルソモルフィン(6-[4-(2-ピペリジン-1-イルエトキシ)フェニル]-3-ピリジン-4-イルピラゾロ[1,5-a]ピリミジン、例えばSigma-Aldrichカタログ番号P5499から利用可能である)、K02288(3-[(6-アミノ-5-(3,4,5-トリメトキシフェニル)-3-ピリジニル]フェノール、3-[6-アミノ-5-(3,4,5-トリメトキシフェニル)-3-ピリジニル]-フェノール)、例えばSigma-Aldrich、カタログ番号SML1307 - K02288から利用可能である)、及びLDN-193189(4-[6-[4-(1-ピペラジニル)フェニル]ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-3-イル]-キノリン塩酸、例えばSigma-Aldrich、カタログ番号SML0559から利用可能である)がある。一実施形態において、BMP阻害剤は、DMH1である。
【００８３】
本明細書に記載の本発明の細胞培地のための基礎培地は、多能性幹細胞を培養するための任意の適切な培地であることができる。多能性幹細胞に適切な培地は、市販されており、当技術分野で公知であり、又は本技術の分野で当業者に公知の方法によって調製されてもよい。本明細書に記載の本発明によって使用されてもよい基礎培地には、ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)、ハムF10培地、ハムF12培地、Advanced DMEM、Advanced DMEM/F12、最小必須培地、DMEM/F-12、DMEM/F-15、リーボビッツL-15、RPMI1640、イスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM)、OPTI-MEM SFM(Invitrogen Inc.)、N2B27、MEF-CM及び規定された基礎ESC培地、ExVivo 10、ESGrow又はその組合せがあるが、これに限定されない。一実施形態において、培地はAdvanced DMEM/F-12である。
【００８４】
Advanced DMEM/F12は、例えばThermoFisher Scientificから市販されている。培地は、一態様において、以下の組成を有してもよい。
【表１】
2020503878.tif 000004
2020503878.tif 000005
【００８５】
一実施形態において、基礎培地は、LifeGlobal(登録商標)製Global(登録商標)培地である。この培地は、グルコース、乳酸塩、ピルビン酸塩及び20種全てのアミノ酸を含む重炭酸塩緩衝培地である。一態様において、基礎培地は、塩化ナトリウム、ピルビン酸ナトリウム、L-アルギニン、L-トレオニン、塩化カリウム、L-アラニン、L-システイン、L-トリプトファン、塩化カルシウム、L-アスパラギン、L-ヒスチジン、L-チロシン、リン酸カリウム、L-アスパラギン酸、L-イソロイシン、L-バリン、硫酸マグネシウム、L-グルタミン酸、L-ロイシン、グリシル-L-グルタミン、重炭酸ナトリウム、グリシン、L-リジン、EDTA、グルコース、L-プロリン、L-メチオニン、フェノールレッド、乳酸ナトリウム、L-セリン、L-フェニルアラニン及び硫酸ゲンタマイシン*(10μg/ml)を含む。
【００８６】
一実施形態において、培地は、フィーダー細胞、例えばマウス胚線維芽細胞(MEF)若しくは他のフィーダー若しくは支持細胞で馴化又は前処理されていない。
【００８７】
さらなる実施形態において、培地は血清を含まず、すなわち無血清である。したがって、一態様において、いかなる血清も、本発明の細胞培地に添加されていない。
【００８８】
本発明の一態様において、培地は、ErbB3リガンドを含まない。本明細書では、「ErbB3リガンド」とは、ErbB3に結合するリガンドを指し、ErbB3は、ErbB2と二量体化し、それによりErbB2/ErbB3ヘテロ二量体受容体のErbB2部分のチロシンキナーゼ活性を活性化する。
【００８９】
ErbB3リガンドの非限定的な例として:
ニューレグリン1; HRG-β、HRG-α、Neu分化因子(NDF)、アセチルコリン受容体誘導活性(ARIA)、グリア成長因子2(GGF2)、並びに感覚及び運動ニューロン由来因子(SMDF)を含むがこれに限定されないニューレグリン1のスプライスバリアント及びアイソフォーム;
ニューレグリン2; NRG2-β;エピレグリン;及びビレグリンを含むがこれに限定されないニューレグリン2のスプライスバリアント及びアイソフォームが挙げられる。
【００９０】
ErbB3リガンドは、ニューレグリン1、ヘレグリンβ(HRG-β)、ヘレグリンα(HRG-α)、Neu分化因子(NDF)、アセチルコリン受容体誘導活性(アリア)、グリア成長因子2(GGF2)、運動ニューロン由来因子(SMDF)、ニューレグリン2、ニューレグリン2β(NRG2-β)、エピレグリン、ビレグリン並びにそのバリアント及び機能的断片からなる群から選択されてもよい。一態様において、本発明による培地は、ヘレグリンβ(HRG-β)を含まない。
【００９１】
基礎培地は、必要とされる他の栄養素又は成分を含んでもよい。例えば、培地は、アミノ酸、ミネラル、塩類、アスコルビン酸、グルコース、グルタミン、フェノールレッド、抗生物質、βメルカプトエタノール、血清、血清補助タンパク質及び/又は脂質を含んでもよい。
【００９２】
本発明の一実施形態において、培地は、化学的に規定された培地(Chemically defined medium)、すなわち化学成分の全てが公知の培地である。規定された培地は全ての成分を公知の量で有するべきであり、いかなる酵母、動物又は植物の組織も存在するべきでない。したがって、化学的に規定された培地(Chemically defined medium; CDM)は、指定された成分、好ましくは公知の化学構造の成分だけを含有する細胞を培養するための栄養分のある溶液である。CDMは、規定されていない成分、又はフィーダー細胞、間質細胞、血清などの、規定されていない成分を含む要素及びマトリゲル(商標)など複雑な細胞外マトリックスを欠いている。化学的に規定された培地はヒト化されてもよい。ヒト化され化学的に規定された培地は、ウシ胎仔血清(FBS)及びマウスフィーダー細胞など、非ヒト動物から誘導された又は単離された成分若しくは補助剤を欠いている。馴化培地は、培養細胞由来の規定されていない成分を含み、化学的に規定されていない。
【００９３】
CDMは、無血清培地補充剤及び/又は1つ以上の追加の成分、例えばトランスフェリン、1-チオグリセロール、規定された脂質、L-グルタミン若しくはGlutaMAX-1(商標)などの代用物、ニコチンアミド、デキサメタゾン、セレニウム、ピルビン酸、HEPESなどの緩衝液、重炭酸ナトリウム、グルコース並びにペニシリン及びストレプトマイシンなどの抗生物質、任意選択でポリビニルアルコール;インスリン;ポリビニルアルコール及びインスリン;血清アルブミン;若しくは血清アルブミン及びインスリンを補充された化学的に規定された基本培地を含んでもよい。
【００９４】
培地は、細胞培養に必須である要素だけを含有する最小培地でもよい。
【００９５】
細胞培養に適切な条件は、当技術分野で公知である。例えば、細胞培養物は、培養液のpHを維持するためにCO2雰囲気、例えば、0%〜12%、O2 0%〜20%中で維持され、湿潤雰囲気において37℃でインキュベートされ、コンフルエンスを例えば85%未満に維持するために継代されてもよい。
【００９６】
本発明による細胞培地は、基底膜と組み合わせて使用されてもよい。基底膜が、発達中の胚によって産生される最初の細胞外マトリックスであるという前提で、それは幹細胞挙動を調整する因子として同定されており、基底膜分子は、in vitroで基層として利用され得る。
【００９７】
本発明により使用され得る基底膜分子の例には、ビトロネクチン、フィブロネクチン、様々な型のコラーゲン、ラミニン、ケラチン、フィブリン、フィブリノゲン、ヒアルロン酸、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、アガロース又はゼラチンがある。
【００９８】
最適な細胞培地/基底膜の組合せを提供する目的で、胚環境を反映する適切な基底膜が、使用されてもよい。
【００９９】
好ましい実施形態において、基底膜は、ラミニンを含み、より好ましくはラミニン以外の分子を含まず、したがって基底膜はラミニンだけを含有し得、すなわちラミニンからなる。
【０１００】
本実施例は、ラミニンと組み合わせて本明細書に記載の本発明による培地中で成長させるヒト胚性幹細胞及びiPS細胞株のde novo誘導を示す。細胞は、市販されている培地中で、他の基質上で成長させた細胞と形態学的に類似しているように見えるが、本発明は、培地が化学的に規定された最小培地であるという利点を有する。ラミニンは、より化学的に規定されており、バッチ変動の影響をより受けにくいので、他の市販されている基質、例えばマトリゲルに比べても有利である。
【０１０１】
ラミニンは、細胞外マトリックスのタンパク質である。ラミニンは、基底層(基底膜の層のうちの1つ)の主要な成分を形成する。ラミニンは、組織の構造的足場の部分を形成し、細胞によって分泌され、細胞外マトリックスに組み込まれる。ラミニンは、α鎖、β鎖及びγ鎖を含有するヘテロ三量体タンパク質である。ラミニン分子は、その鎖組成によって命名される。したがって、ラミニン511は、α5、β1及びγ1鎖を含有する。
【０１０２】
本明細書に記載される本発明の一実施形態において、ラミニン511又は521が使用されてもよい。一実施形態において、ラミニン511が使用される。ラミニンは、例えば、BioLamina(組換えラミニン511、及びTakara/Clontech iMatrix-511、組換えラミニン511 E8断片、ラミニン521)から市販されている。
【０１０３】
当業者は、例えば上述したラミニンについて製造業者の推奨する方法で使用されるように、適切な基底膜を処方することができよう(Miyazakiら、Biochem Biophys Res Commun. 2008年; 375(1):27〜32頁; Rodinら、Nat Biotechnol. 2010年; 28(6):611〜5頁;及びMiyazakiら、Nat Commun. 2012年;3:1236頁も参照のこと)。
【０１０４】
本発明の一態様において、ラミニンは、例えば本明細書に記載の胚の培養のために本発明による培地に添加されてもよい。すなわち、本明細書に記載の培地は、ラミニンをさらに含んでもよい。
【０１０５】
本発明の細胞培地は、本明細書に記載の多能性幹細胞を培養する方法に使用され得る。
【０１０６】
したがって、本発明は、本明細書に記載の本発明の細胞培地で多能性幹細胞を培養する工程を含む、前記細胞を培養する方法を提供する。
【０１０７】
換言すると、本発明は、多能性幹細胞の培養における本明細書に記載の本発明による細胞培地の使用を提供する。
【０１０８】
本明細書に記載の細胞培地の全ての態様及び好ましい実施形態が、本発明の方法及び使用に使用されてもよい。
【０１０９】
本発明のさらなる態様において、本明細書に記載の細胞培地は、胚の培養に使用されてもよい。好ましい実施形態において、胚はヒト胚である。
【０１１０】
したがって、本発明は、胚の培養のための培地も提供する。
【０１１１】
本発明は、本明細書に記載の培地で胚を培養する工程を含む、前記胚を培養する方法も提供する。本発明は、そのような方法によって作製される胚を包含しない。
【０１１２】
培地は、より良好な胚培養をもたらし得る、例えば研究又はIVF処理のために成功裏に発達する胚の割合を増大させる胚の培養条件の改善を提供し得る。
【０１１３】
当業者は、標準的な実践を使用して胚を培養する方法を承知しているはずである。適切な方法は、例えば、Wiemerら、2002年、Reprod Biomed Online、5:323〜327頁及びAndersonら、2002年、Reprod Biomed Online、5:142〜147頁に見ることができる。
【０１１４】
なおさらなる態様において、本発明は、胚の培養に必須の因子のスクリーニング方法を提供する。
【０１１５】
そのような方法は、基礎細胞培養培地に因子を添加する工程と、前記培地中で胚を培養する工程と、次いでその因子のタンパク質又は遺伝子発現に対する効果を分析する工程とを含んでもよい。因子を添加することによる胚に対する効果は、外因性因子を含まない培地中で培養した胚と比較して、その因子が胚に必須か及び/又は有利かを決定することによって評価されてもよい。
【０１１６】
したがって、本発明は、ヒト胚の培養に必須の因子についてスクリーニングする方法を提供し、前記方法は、
1. 分析しようとする因子を添加することによって培地を調製する工程と;
2. 前記培地中でヒト胚を培養する工程と;
3. 前記胚を、前記因子を含まない培地中で又は前記因子の阻害剤若しくは活性化剤を含有する培地中で培養した胚と比較する工程と;
4. 前記因子が前記胚の培養に必須かどうかを決定する工程と
を含む。
【０１１７】
標準的な方法及び技術を使用して、上記方法を実施してもよい。一態様において、前記胚を比較し、前記因子が培養に必須かどうかを決定する工程は、前記因子が胚盤葉上層細胞の割合を改変するかどうかを決定することによって実行されてもよい。例えば、免疫蛍光染色を、多能性胚盤葉上層と関連付けられたマーカー、並びに細胞核に印をつけるDNA対比染色剤を使用して対照及び処理胚に対して実施することができる。自動化されたソフトウェアツールを使用して核を検出し、分割し、それにより各胚の中の細胞数を決定することができる(MINS 1.3、http://katlab-tools.org/)、(Louら、2014年、Stem Cell Reports 2:382〜397頁)。胚盤葉上層細胞の数は、処理した胚と胚内の全細胞の割合として算出され、次いで対照と比較して、割合における統計的に有意なあらゆる変化が決定され得る。
【０１１８】
本発明は、実施例により次にさらに説明されることになり、その実施例は、本発明の実施において当業者を助けるのに役立つことを意図するものであり、本発明の範囲を制限するものでは決してない。
【実施例】
【０１１９】
[実施例1]
材料及び方法
ヒト胚盤胞トランスクリプトームデータセットの生成
推定上の別個の成長因子又はシグナル伝達経路を同定するために、ヒト胚から単離した単一細胞の分析から最近生成されたRNA配列決定(RNA-seq)データセットを使用した(Blakeleyら、2015年、Development、142:3151〜3165頁)。簡潔には、胚盤胞段階のヒト胚(E6-E7)をレーザー顕微解剖して、大部分の壁栄養外胚葉を内部細胞塊(ICM)及び極栄養外胚葉(極TE)から分離した。ICM及び極TEを、0.05%トリプシン/EDTA(Invitrogen)中で5〜10分間インキュベートし、30μm内径割球生検ピペット(Research Instruments)を使用して単一細胞を単離した。RNAを単一細胞から抽出し、Illumina Sequencing-HV(Clontech Laboratories)用のSMARTer Ultra Low RNA Kitを使用してDNA合成処理を行った。Covaris S2を、10%デューティ、強度5、連射サイクル200に設定を修正して使用して、cDNAを2分間剪断した。
【０１２０】
ライブラリを、製造業者の指示にしたがってClontech Low Input Library Prep Kitを使用して調製した。ライブラリ品質をAgilent 2100 BioAnalyserで評価し、濃度をQubit 2.0 Fluorometer (Life Technologies)で測定した。ライブラリを、Illumina HiSeq 2500で標準的なIlluminaアダプタを使用して50bpペアエンド配列決定に供した。
【０１２１】
RNA-seqデータの品質は、FastQCツールを使用して評価した。リードを、Tophat2(Kimら、2013年、Genome Biol、14、R36)を使用してヒトゲノム配列hg19に対してアラインメントし、低いパーセンテージ(<50%)でマップされたサンプルは以降の分析から除外した。各遺伝子に特異的にマップされたリードの数を、プログラムhtseq-count(Andersら、2015年、Bioinformatics、31、166〜169頁)を使用して計数した。各サンプルについて個々のカウントファイルを、edgeRパッケージ中のRPKM(マップされたリード100万個のキロベース当たりのリード)機能両方を使用して標準化した(Robinsonら、2010年、Bioinformatics、26、139〜140頁)。追加のヒト単一細胞RNA-seqデータ(Yanら、2013年、Nature Structural and Molecular Biology 20:1131〜1139頁)を、RPKM方法を使用して標準化し、本発明者ら自身の胚盤胞配列決定データと一体化した。
【０１２２】
全般的遺伝子発現における差異を調査するために、最も発現が変動した上位8000個の遺伝子のPCAを、Rパッケージprcompを使用してヒト胚盤胞サンプルに対して実行した。細胞を、3つの系統:胚盤葉上層(EPI)、原始内胚葉(PE)又は栄養外胚葉(TE)に分類し、RPKM値のボックスプロットを生成して、遺伝子発現の範囲を示した。
【０１２３】
拡張した方法が、Blakeleyら、2015年、Development、142:3151〜3165頁に提供されている(Supplementary Materials and Methodsを参照のこと)。
【０１２４】
ヒト胚培養
ヒト胚は、UK Human Fertilisation and Authority登録番号R0162の元でインフォームドコンセントにより研究計画に贈与された。ストロー中に凍結されているガラス固化胚を、ストローの内容物を液体窒素から直接、解凍溶液(Irvine Scientific Vitrification Thaw Kit)に速やかに移すことによって解凍し、また製造業者の指示通り解凍した。cryopets中に凍結されている胚を、解凍溶液(Irvine Scientific Vitrification Thaw Kit)に移す前に37℃水浴中で3秒間まず解凍した。ガラスアンプル中に凍結されている胚を、液体窒素下でバイアルの上部を除去した後に37℃水浴中で完全に解凍した。内容物をペトリ皿に注ぎ、製造業者の指示通りショ糖溶液(Quinn's Advantage Thaw Kit、Origio)の勾配を通じて胚を移した。
【０１２５】
胚を、インキュベーター内で37℃及び5% CO2に予備平衡化した5mg/mL LifeGlobal Protein Supplementを補充したGlobal Media (LifeGlobal)中で通常通り培養した。成長因子又は阻害剤処理のために、これら条件を指示の通りFGF2(3718-FB-01M、R&D)又はIGF1(291-G1-10、R&D)をさらに補充した。
【０１２６】
免疫蛍光
胚を、4%(w/v)パラホルムアルデヒド(PFA)(ThermoFisher Scientific)を用いて回転振とう器上で、4℃で1時間固定し、以前に記載されているようにして分析した(Niakan及びEggan、Developmental Biology、2013年: doi: 10.1016/j.ydbio.2012.12.008)。簡潔には、次いで胚を、カルシウム及びマグネシウムを含まないダルベッコリン酸緩衝食塩水(PBS)(Thermo Fisher Scientific)に希釈した0.1%(v/v)Tween-20(Sigma Aldrich)の数回の洗浄を通じて移して、残留するパラホルムアルデヒドを除去した。胚を、透過化処理のために0.5%(v/v)Tween-20中に20分間置いた。胚を、ブロッキング溶液(0.1%(v/v)Tween-20に希釈した10%ロバ血清)中で、室温で1時間ブロッキングした。胚を、ブロッキング溶液に1:500の濃度の一次抗体中に回転振とう器上で、4℃で終夜置いた。以下の一次抗体を、(全て1:500希釈で)使用した:抗NANOG(AF1997 R&D Systems、REC-RCAB0001P 2B Scientific又はab21624、Abcam)、抗GATA6(SC-9055、Santa Cruz)及び抗SOX17(AF1924、R&D Systems)。次の日、胚を、0.1%(v/v)Tween-20の4回洗浄を通じて移し、次いで、最後の洗浄に30分間置いた。二次抗体(Cy3、FITC又はCy5ロバ抗ウサギ、マウス、又は、ヤギ、Molecular Probes)を1:300の濃度でブロッキング溶液に希釈した。胚を、二次抗体中に回転振とう器上で、室温で1時間置き、0.1%(v/v)Tween-20の4回洗浄を通じて移し、最後の洗浄に30分間置いた。胚を、共焦点画像化のためにボトムディッシュカバーガラス(MatTek)上でDAPI含有Vectashield(Vector Labs):0.1%(v/v)Tween-20の1:3希釈50μL中に置いた。
【０１２７】
免疫蛍光の共焦点画像化及び定量化
胚を、ヒト又はマウス胚に対してそれぞれ3μm又は2μmのz-断面厚でLeica SP5倒立共焦点顕微鏡(Leica Microsystems GmbH)で撮像した。MINS 1.3ソフトウェアを使用して核を検出し、区分し、それにより各胚中の細胞数を決定した(http://katlab-tools.org/)、(Louら、Stem Cell Reports 2014年、doi: 10.1016/j.stemcr.2014.01.010)。tif形式の共焦点スタックを、自動化核区分のためにMINSパイプラインにロードした。MINS区分出力を適切な区分について手作業で確認し、有糸分裂核を分析から除去した。データを、GraphPad Prismバージョン6(GraphPad Software、La Jolla、CA)を使用してその後プロットした。
【０１２８】
結果
胚培養に対するFGFの効果の調査
ヒト胚を、100ng/ml又は1μg/mlの濃度で、FGF2を補充したヒト胚培養培地中でE2.5又はE5から培養した(図1A)。免疫蛍光分析は、100ng/ml又は1μg/mlのいずれかでE2.5から処理した場合に、無処理の対照と比較してNANOG発現が消失したことを示した(図1)。
【０１２９】
これは、FGF添加が、ヒト胚における多能性遺伝子発現に対して有害作用を有することを示した(図1A〜図1C)。
【０１３０】
それに対し、胚体外マーカーGATA6は、両方の例において依然として発現され、このことは、FGFの効果が多能性区画に特異的であることを示した。しかしながら、E5から100ng/mlで処理した場合、NANOGは(胚体外マーカーSOX17がそうであったように)発現され続け(図1D及び図1E)、このことは、低濃度でのより短い処理は多能性に対して有害ではない可能性があり、同時に胚体外系統に影響を及ぼさないことを示した。
【０１３１】
ヒト胚培養に対するIGF1の効果の調査
トランスクリプトームデータセット(材料及び方法において上記の通り、作製された)に問い合わせを送信し、多能性胚盤葉上層細胞において発現される受容体をコードしている、又はヒト胚において任意の細胞型によって発現されるリガンドをコードしている転写産物を同定した。本発明者らは初期のヒト発達においてインスリン(INSR)及びIGF1(IGF1R)受容体、加えてIGF1リガンド(IGF1)の転写産物の発現を同定した(図2A)。特に、インスリン及びIGF2の発現は、ヒト胚盤胞において検出不能であった。ヒト胚盤胞におけるIGF1及びその同族受容体の転写産物の存在は、これが、調節する興味深い候補になる可能性があることを示した。
【０１３２】
ヒト胚を、17nM IGF1を補充したヒト胚培養培地中でE2.5から培養した(図2B)。E6-7で、胚を、免疫蛍光によってNANOGの発現について分析した(図2C)。自動化された定量化分析は、IGF1処理により、対照胚と比較してNANOGを発現する細胞の割合が2倍に増大(p値<0.05)することを示した(図2D)。さらに、ヒト胚盤葉上層細胞中で富化されるマーカーである転写因子KLF17も、IGF1で処理したヒト胚においてより高い割合の細胞で発現された(図2E)。すべて合わせると、これは、外因性IGF1に曝露されたヒト胚における多能性遺伝子発現に対する陽性効果を示し、IGF1をhES及びiPS細胞誘導の間に使用できることを示した。
【０１３３】
hES細胞誘導に適当な基底膜基質を同定する
ヒトES細胞誘導及び培養系は、細胞増殖のためにMEF支持層をしばしば利用するが、MEFはFGFを分泌するので、本発明者らの要件と適合しなかった。マトリゲル、ラミニン及びビトロネクチンなどの支持マトリックス基質層が、フィーダーフリー培養系においてMEFの代わりに一般的に使用される。しかしながら、マトリゲルは、エンジェルブレスホームスワーン(EHS)肉腫細胞から抽出され、したがって依然としてバッチ間変動性の影響を受け、成長因子低減形態においてもFGFを含めた様々な成長因子の顕著な濃度を保持している。追加の基底膜基質が、ヒト胚に存在するそれらを反映することになるかどうかも不明であった。
【０１３４】
したがって、本発明者らはトランスクリプトームデータセットに問い合わせを送信し、hES及びiPS細胞の誘導のために、化学的に規定され、生理的に関連する基質を同定した。本発明者らはまた、図3Aに示すように、トランスクリプトームデータセットを調べ、ヒト胚盤胞におけるラミニン結合インテグリンα6及びインテグリンβ1(ITGA6、ITGB1)の転写産物の発現を同定した。本発明者らは、インテグリンα6及びインテグリンβ1が高親和性で結合することがこれまでに示されている(Nishiuchiら、2006年、Matrix Biology、25、189〜197頁)ラミニン511のサブユニット転写産物(LAMA5、LAMB1、LAMC1)を同定した。結果的に、組換えヒトラミニン511(Biolamina)又は組換えラミニン511 E8断片(iMatrix-511、Takara)を基底膜基質として選択して、hES細胞を培養し、それにより胚盤胞内のニッチを再現した。ラミニンバリアントを試験するために、mTeSR(商標)1培地中のH9細胞を、iMatrix-511(Takara)又はLN-511(Biolamina)のいずれかの0.5μg/cm2でコーティングしたプレート及び対照マトリゲルプレート上で継代し、3日間培養した。本発明者らは、H9細胞が、マトリゲルコーティングと同等にiMatrix-511又はラミニン511上で多能性形態を保持できると決定した(図3B)。
【０１３５】
[実施例2]
材料及び方法
hES及びiPS細胞の培養条件
FGF2を補充したKnockOut Serum Replacement(KOSR)培地(KSR+FGF)における培養のために、細胞を、MEFコーティングした予めゼラチン化した組織培養プレート(Corning)上で20% KOSR及び5ng/ml FGF中で維持した。細胞を、手作業のピッキングによって継代した。
【０１３６】
mTeSR(商標)1培地(StemCell Technologies)中での培養のために、細胞を、マトリゲルコーティングした(BD Biosciences)組織培養プレート上で通常維持した。マトリゲルコーティングを、製造業者の指示に従って室温(RT)で1時間実行した。細胞を、ReLeSR(Stemcell Technologies)を使用して凝集塊として継代した。ReLeSRをRTで30秒間ウェルに添加し、次いで吸引除去し、次いでプレートを37℃で5分間インキュベートし、mTeSR(商標)1で反応を停止させ、軽くタッピングして所望のサイズの凝集塊を取り除いた。H1及びH9細胞も、0.5μg/cm2ラミニン511(Biolamina、Takara)でコーティングしたプレートに適合させた。ラミニンコーティングを、製造業者の指示に従って4℃で終夜又は37℃で1時間のいずれかで実行した。ラミニン511上の細胞も、ReLeSRで継代したが、37℃で7分間インキュベーションした。
【０１３７】
TeSR(商標) E8培地(StemCell Technologies)における培養のために、細胞をビトロネクチンコーティングした組織培養プレート(StemCell Technologies)上で維持した。ビトロネクチンコーティングを、製造業者の指示に従ってRTで2時間実行した。細胞を、0.5mM EDTAを使用して凝集塊として継代した。EDTAをRTで5分間ウェルに添加し、次いで吸引除去し、次いでTeSR(商標) E8をウェルに添加し、細胞を、5mlストリペットで分散させた。
【０１３８】
AI培地における培養のために、ラミニン上のmTeSR(商標)1中の細胞と同様に、細胞を、0.5μg/cm2ラミニン511(Biolamina、Takara)でコーティングしたプレート上で維持し、通常、ReLeSRで継代した。AI培地における継代初期に新たに誘導したhES細胞を、手作業のピッキングによって継代した。実施例に示した通り、AI培地中の細胞も、様々な解離試薬を使用して分割した。Accutase又はAccuMax(StemCell Technologies)については、解離試薬をウェルに添加して5〜10分間置き、ウェル内容物を回収し、ペレット化し、解離試薬を除去した。細胞を、プレーティングのために10mM ROCK阻害剤有り又は無しのAI培地に次いで再懸濁した。温和細胞解離試薬Gentle Cell Dissociation Reagent(StemCell Technologies)については、試薬をウェルに添加して6分間置き、次いで吸引除去し、AI培地を添加した。ウェル内容物を回収し、5mlストリペットで脱凝集させた。0.5mM EDTA(Sigma)については、試薬を添加して5分間置き、次いで吸引し、AI培地を添加し、細胞を分散させた。無塩PBS(Gibco、Life Technologies)については、試薬を添加して6分間置き、吸引除去し、次いでAI培地を添加し、細胞を分散させた。
【０１３９】
阻害剤処理実験の場合、実施例に示した通り、細胞培養培地を、100nM PD173074(FGF受容体阻害剤)、1μM PD0325901(MEK阻害剤)又は10μM SB-431542(アクチビン/ノーダル受容体阻害剤)を補充した。細胞を、阻害剤に72時間曝露した。
【０１４０】
免疫蛍光
固定化の日に、培地を、多能性細胞株又は分化細胞から除去し、細胞を、カルシウム及びマグネシウムを含まないダルベッコリン酸緩衝食塩水(PBS)(Thermo Fisher Scientific)で洗浄した。細胞を、4%(w/v)パラホルムアルデヒド(PFA)(ThermoFisher Scientific)で1時間固定し、0.5%(w/v)Triton X-100又は0.5%(v/v)Tween-20(Sigma Aldrich)で透過化処理した。PBS(0.05%(v/v)Tween-20又は0.01% Tween-20を含有する)中の2〜10%(v/v)ロバ血清(AbCam)を使用して、非特異的結合を最小化した。以下の一次抗体を、(特に明記しない限り全て1:500希釈で)使用した:抗NANOG(AF1997 R&D Systems; REC-RCAB0001P、2B Scientific; 4903P、Cell Signaling Technologies又はab21624、Abcam)、抗SOX17(AF1924、R&D Systems)、抗TRA-1-81(MAB4381、Millipore;又は560072、BD Biosciences)、抗TUJ1(T2200、Sigma)、抗FOXA2(3143、Cell Signaling)、抗OCT4(sc-5279、Santa Cruz又は2750S、Cell Signaling Technologies)、抗SSEA4(MA1-021、Life Technologies又はMC-813-70、DSHB、1:100)、抗TRA-1-60(MAB4360、Millipore、1:100)、抗CXCR4(MAB173、R&D)、抗デスミン(RB-9014-R7、Neomarkers、1:50)、抗AFP(A0008、Dako)、抗サイトケラチン18(ab668、Abcam)。一次抗体を、PBS(0.05%又は0.01%v/vTween-20を含有する)で洗浄することにより除去した。二次抗体(Alexa Fluor(登録商標)488、Alexa Fluor(登録商標)594、Alexa Fluor(登録商標)555ロバ抗ウサギ、マウス又はヤギ、Molecular Probes)を、1:300の濃度でブロッキング溶液に希釈し、対応するウェルに室温で添加して1時間置いた。次いで、細胞を、0.1%(v/v)Tween-20中で数回洗浄し、最後の洗浄に30分間置いた。DAPIを含有するVectashield(Vector Labs)少量を、画像化前に各ウェルに添加した。
【０１４１】
画像化
画像は、Leica TCS SP8共焦点顕微鏡又はCell∧Fソフトウェア(Olympus Corporation)と共にオリンパスIX73顕微鏡を使用して取得した。位相差画像は、Leica MC170 H9カメラ(Leica Microsystems GmbH)を用いてLeica DM IL LED顕微鏡で撮像した。
【０１４２】
着床前胚からのヒトES細胞誘導
幹細胞誘導前にインキュベーター内で37℃及び5% CO2に予備平衡化した5mg/mL LifeGlobal Protein Supplementを補充したGlobal Media (LifeGlobal)中でE5又はE6ヒト胚盤胞を、まず初めに培養した。Chenら、2009年、Cell Stem Cell: doi: 10.1016/j.stem.2008.12.001に記載のようにして、オリンパスIX73顕微鏡及びSaturn5レーザー(Research Instruments)を使用してE6胚盤胞段階のヒト胚を分散させて、内部細胞塊を単離した。胚を、鉱油を重層したペトリ皿上でHEPESを含む少量のGlobal(登録商標) Total(登録商標)(LGTH、LifeGlobal)中に置いて、顕微操作した。内部細胞塊(ICM)及び極栄養外胚葉を、AI培地中でMEFコーティングした皿にプレーティングした。hES細胞様形態を持つICM生育物を、さらなる増殖のためにMEFコーティングした又はラミニン511のいずれかの皿に手作業で採取した。
【０１４３】
ヒトiPS細胞誘導
ヒトBJ線維芽細胞を、30〜60%コンフルエントになるようにプレーティングして、2日後に形質導入した(6ウェルの、ウェル当たり1×105個細胞)。細胞を、製造業者の指示に従ってCytotune(商標)2.0 Sendai再プログラミングキット(Invitrogen)を使用し、次いで形質導入し、形質導入の6日後、MEFコーティングした皿(KSR+FGF培地)、ビトロネクチンコーティングした皿(TeSR(商標)E8培地)又はラミニン511コーティングした(AI培地)皿に移した。細胞を、この時点で低酸素条件(5% O2、5% CO2、37℃)に移し、誘導の残り期間を低酸素下で培養した。形質導入の18日後、TRA-1-60発現を、製造業者の指示に従って(1:100希釈)Stemgent(登録商標) StainAlive(商標) TRA-1-60抗体(DyLight（商標）488)キットを使用して分析した。多能性ES細胞形態を有するコロニーを、形質導入の22日後に採取して増殖させ、安定なiPS細胞株を樹立した。
【０１４４】
細胞増殖及び生存率
稼働細胞バンクのランダムな3本のバイアルの細胞を、ThawStar(登録商標)装置で解凍し、2次元培養系LN511中で、AI培地で別々に培養した。細胞計数及び生存率を、Nucleocounter NC-200(Chemometech)によって測定し、集団倍加数を式1に従って算出した。
【０１４５】
【数１】
2020503878.tif 000006
【０１４６】
フローサイトメトリー
表面及び細胞内の多能性関連タンパク質の発現を、MACSQuant(登録商標) Analyzer10血球計算器(Myltenyi Biotec)を使用してフローサイトメトリーによって分析した。単一細胞懸濁液を洗浄し、以下のコンジュゲート抗体: SSEA4(130-098-341、Myltenyi); SSEA3(330306、Biolegend); CD30(550041、BD Biosciences); TRA-1-60(560495、Biolegend); NANOG(560791、BD Biosciences); OCT4(561556、BD Biosciences); SOX2(656108、BD Biosciences)によりBD Pharmigen(商標)Stain Buffer(BD Biosciences)中で染色した。細胞内タンパク質(NANOG、OCT4、SOX2)に対して染色する場合、細胞を、BD Cytofix(商標)固定化緩衝液(BD Biosciences)を使用して固定し、室温で15分間インキュベートした。この後、細胞を、染色に進む前にBD Pharmigen(商標)Stain Buffer中の0.1%(v/v)Triton X-100(Sigma)により室温で15分間透過化処理した。アイソタイプ対照を、各抗体について実行した(SSEA4アイソタイプ、130-104-608、Myltenyi; SSEA3アイソタイプ、400811、Biolegend; CD30アイソタイプ、555749、BD Biosciences; TRA-1-60アイソタイプ、401618、Biolegend; NANOGアイソタイプ、557702、BD Biosciences; OCT3/4アイソタイプ、554680、BD Biosciences; SOX2アイソタイプ、400136、BD Biosciences)。細胞を、Live/Dead(登録商標)判別色素(L23105、ThermoFischer Scientific)で染色し、生存単一細胞集団画分の表現型分析を、フローサイトメトリーによって実行した。アイソタイプ染色を、各分析及び条件に対する陰性対照とした。
【０１４７】
核型(Gバンド)
Gバンド核形分析に使用するヒトES及びiPS細胞を、懸濁状態で固定した。複数の分裂中期スプレッドをサンプル毎に分析し、染色体数及びGバンドパターンを決定した。
【０１４８】
分化アッセイ
自発的分化のために、AI培地中で培養した細胞をMEF培養培地(10% FBS)に6又は12日間切り替えた。細胞を、3つの胚葉系統について免疫蛍光分析のために次いで固定した。
【０１４９】
指向性分化のために、AI培地に適合させた細胞を、Hannanら、2013年、Nat Protoc: doi:10.1038/nprot.2012.153に詳述される肝細胞分化プロトコルによって得た。適合させたH9細胞を、Accutaseを使用して単一細胞に解離し、ROCK阻害剤(Y27632、Tocris)を10μMで含有するAI培地に次いで再懸濁した。細胞を、MEF培地でプレコーティングしたゼラチン化組織培養プレートに1×105個/cm2で播種した。AI培地を、24時間後に補給した。肝細胞分化プロトコルを、播種48時間後に開始し、その時点で細胞を低酸素条件(5% O2、5% CO2、37℃)に移し、これらの条件を分化の全体を通じて維持した。細胞を、分化誘導の3日後(内胚葉)、8日後(前腸内胚葉)及び25日後(成熟肝細胞)に免疫蛍光のために固定した。
【０１５０】
結果
アクチビン及びIGF1を含む化学的に規定された(Chemically defined)最小培地(AI)は、ヒト多能性を支持するのに十分である
本発明者らは、まず樹立hES細胞を使用して、多能性培養培地においてIGF1がFGF2を置換し得るかどうかを決定した。ラミニン511の生理的関連を考慮して、本発明者らは、特に明記しない限り化学的に規定された(Chemically defined)条件における多能性細胞培養にこの精製された基底膜成分で続けた。生存可能な培養系を樹立する条件を試験するために、H1 hES細胞を、対照mTeSR(商標)1培地、グルタミン補充剤(2mM)を含む基本培地(Advanced-DMEM/F12)、又はグルタミン、12ng/ml FGF2及び10ng/mlアクチビン(Vallierら、2005年、J Cell Sci、118、4495〜4509頁による成長因子濃度)、グルタミン及び17nM IGF1、若しくはグルタミン、10ng/mlアクチビン及び17nM IGF1を補充した基本培地、のいずれかの中で増殖させた(図4A)。アクチビン及びIGF1(今後AI)培地中で培養したhES細胞は、高い核対細胞質比、密集したコロニー及び明瞭なコロニー境界線により対照mTeSR(商標)1処理細胞と似ていた。
【０１５１】
本発明者らは、次にAI培地中で細胞を継代する方法を試験し、手作業のピッキング、無塩PBS、温和細胞解離緩衝液(Gentle Cell Dissociation Buffer)又はReLeSRのいずれも細胞を増殖させるために使用し得るが、EDTA単独では使用し得ないことを見出した(図4B)。本発明者らは、AI培地中の細胞を、単一細胞レベルに分散させ得るかどうかも決定した。これは、クローン細胞株の樹立、又はトランスジェニック若しくは遺伝的改変hES細胞の誘導の際に重要である。本発明者らは、単一細胞を、Rho関連キナーゼ(ROCK)阻害剤の存在下でAccutaseにより分散させることができ、凝集塊として継代されるものと類似してさらに増殖させることができることを確認した(図4C)。
【０１５２】
本発明者らは、AI培地中で培養したhES細胞が、FGFシグナル伝達と無関係に維持されるかどうかを次に調べようとした。本発明者らは、FGF受容体又は下流のMEK/ERKシグナル伝達の阻害剤により、AI培地中で培養した細胞を処理した(図5A)。FGF受容体及びMEK/ERK阻害剤を補充したAI培地中の細胞は、DMSO処理した対照hES細胞と同様に、細胞内に高い核対細胞質比を有する密集した明瞭なコロニーを含めむ多能性細胞の形態を保持した。それに対し、TGFβシグナル伝達経路の阻害剤で細胞を処理した場合に予想される通りhES細胞がアポトーシスを起こしたことは、hES細胞維持に対するこのシグナル伝達経路の重要性を示唆した(図5A)。本発明者らは、FGF受容体又はMEK/ERK阻害剤を補充したAI培地中で培養した細胞が、多能性タンパク質OCT4及びNANOGの発現を保持することを免疫蛍光分析によって確認した(図5B)。それに対し、TGFβ阻害剤処理の3日後に観察できた少数のコロニーにおいて、NANOG発現は、大多数の細胞において検出できなかった(図5B)。すべて合わせると、これは、AI培地中のhES細胞は、その維持についてTGFβシグナル伝達に依存するが、hES細胞は、FGFシグナル伝達とは無関係に培養できることを示している。
【０１５３】
独立したhES細胞(H1及びH9)を、ラミニン511上のAI培地中で6カ月間にわたって25継代を超えて増殖させた。細胞は、ReLeSRを使用しておよそ4〜5日間サイクルで継代され、mTeSR(商標)1又はKSR+FGF中の細胞と同等に多能性形態を保持した(図6A)。またhES細胞(Shef6)及びiPS細胞(CiB10)細胞の両方を、ラミニン511上のAI培地中でそれぞれ独立に増殖させた(図6B)。
【０１５４】
AI培地中で培養したhES及びiPS細胞は、それらの集団を毎日2倍にし、高い生存率を保持することができた(図6C、図6D及び図6E)。免疫蛍光分析で決定した通り、AI培地中で培養したヒトES及びiPS細胞は、多能性因子OCT4、NANOG、TRA-1-81及びSSEA4を強く発現した(図6F)。フローサイトメトリー分析により、高い割合のhES及びiPS細胞が、多能性関連細胞表面抗原TRA-1-60、SSEA4、CD30及びSSEA3並びに核タンパク質NANOG、OCT4及びSOX2を発現することが確認された(図7A)。細胞を、単一細胞継代方法を使用して又は細胞の凝集塊として数世代にわたって増殖させた場合、それは維持された(図7B及び図7C)。さらに、Gバンド核形分析により、hES及びiPS細胞の両方が、46個の染色体の正常な補完物を保持することが確認された(図7D)。
【０１５５】
AI培地は、ヒト胚からのhES細胞の誘導及び線維芽細胞からのiPS細胞の再プログラミングを支持する
これら培養条件のストリンジェントな試験として、本発明者らは、AI培地を使用してヒト胚からhES細胞を直接誘導させ得るかどうかを次に追及した。5日目の胚盤胞を、ヒト胚培養培地中で6日目まで終夜培養した。内部細胞塊(ICM)及び重層している極栄養外胚葉を、壁栄養外胚葉から顕微解剖し、ICM凝集塊をAI培地中にプレーティングした(図8A)。ヒトES細胞様コロニーが、AI培地中へのプレーティング後1週間以内に現れ、ラミニン511上で安定なhES細胞株として維持できた(図8A)。免疫蛍光分析により、hES細胞が、多能性タンパク質NANOG、OCT4、SOX2及びTRA-1-81を発現することが確認された(図8B)。
【０１５６】
本発明者らは、AI培地を使用し、標準的な再プログラミング方法を使用して分化した線維芽細胞からのiPS細胞の誘導を裏付けできるかどうかも決定しようとした。本発明者らは、再プログラミング因子OCT4、SOX2、KLF4及びc-MYCを保有しているセンダイウイルスベクターでBJ線維芽細胞をウイルスによって形質導入した。ウイルス形質導入後、線維芽細胞を、AI培地、KSR+FGF又はTeSR(商標) E8培地中に置いた。多能性幹細胞に類似するコロニーが、感染後12日以内に現れた(図9A、丸)。現れたコロニーはTRA-1-60について染色された生細胞であり、そのことがそれらのiPS細胞様の同一性を確認した(図9B)。AI培地中で樹立したコロニーは、経時的に拡大し続け、Accutaseで継代されて、安定なiPS細胞株が樹立された(図9C)。すべて合わせると、これは、AI培地が、自己複製するiPS細胞コロニーの樹立を可能にするのに十分であることを実証した。
【０１５７】
AI培地中で培養されるhES細胞の自発的及び指向的分化
本発明者らは、AI培地において専ら誘導されたhES細胞が多能性であり、胚葉分化の能力を保持することを確認した。自発的に分化するhES細胞の免疫蛍光分析により、SOX17発現性内胚葉細胞、TUJ1発現性の外胚葉誘導ニューロン、及びデスミン発現性中胚葉細胞に分化するhES細胞の能力を実証した(図10A)。
【０１５８】
本発明者らは、標準的なプロトコル(Hannanら、2013年、Nat Protoc. 8、430〜437頁)を使用して、AI培地に適合させたhES細胞の、機能的肝細胞に分化する能力を次に試験した。肝細胞分化は、肝臓関連疾患の病因を理解するためだけでなく、臨床試験前に薬物毒性について大規模スクリーニングを実行する及び細胞置換療法用の細胞を生成する可能性のためにも臨床的に意義のあるものである。
【０１５９】
本発明者らは、肝細胞分化過程の間に細胞形態の明らかな変化を観察し(図10B)、それはこれまで報告されているものと一致した。免疫蛍光分析により、SOX17及びCXCR4を発現する最初の汎内胚葉細胞、続いてFOXA2を発現する前腸内胚葉細胞並びにAFP及びサイトケラチン18を発現する最終的な成熟肝細胞の同一性を確認した(図10C)。
【０１６０】
本明細書に言及される全ての文書は、それが言及する主題に特段の留意を払いながら、その全体を参照により本明細書に組み込む。本発明の範囲及び精神を逸脱しない本発明に記載される方法及び系の様々な修正並びに変更は、当業技術者にとって明らかであろう。
【０１６１】
本発明は、特定の好ましい実施形態と関連して記載されているが、請求される本発明が、そのような特定の実施形態に不必要に限定されるべきでないことを理解すべきである。実際、分子生物学、細胞免疫又は関連分野の当業者に明らかな本発明を実施するために記載されている様式の様々な修正は、以下の特許請求の範囲内にあるものとする。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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