(57)【要約】  間葉系幹細胞を有効成分として含む甲状腺眼症を予防、改善または治療するための組成物を提供し、間葉系幹細胞を有効成分として含む甲状腺眼症を治療するための薬学的組成物は、甲状腺眼症患者の眼窩線維芽細胞の非正常的なヒアルロン酸生成増加、脂肪細胞分化増大、及び脂質蓄積増大を回復させるので、甲状腺眼症治療にも有用に利用される。【選択図】  図６
2020530304.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＯＸＰ３（フォークヘッドボックスＰ３）、ＨＬＡ−Ｇ（ヒト白血病抗原Ｇ）及びＴＬＲ４（toll様受容体４）からなる群のうちから選択される１以上を発現する間葉系幹細胞。
【請求項２】
下記の特性ａ）またはｂ）を有することを特徴とする請求項１に記載の間葉系幹細胞：
ａ）ＣＸＣＬ−１（ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１）、ＭＣＰ−１（単球走化性タンパク質１）及びＴＩＭＰ−１（メタロプロテイナーゼの組織阻害剤）からなる群のうちから選択される１以上を発現する特性、
ｂ）ＣＤ９０、ＣＤ１４６、ＣＤ１０５及びＣＤ７２からなる群のうちから選択される１以上の表面抗原特性。
【請求項３】
間葉系幹細胞を有効成分として含む甲状腺眼症を治療するための薬学的組成物。
【請求項４】
前記間葉系幹細胞は、その培養物、溶解物または抽出物を含むことを特徴とする請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
前記間葉系幹細胞は、臍帯由来、臍帯血由来、骨髄由来、胎盤由来または脂肪由来の間葉系幹細胞であることを特徴とする請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
前記間葉系幹細胞は、胎盤絨毛膜由来の間葉系幹細胞であることを特徴とする請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
前記間葉系幹細胞は、ＣＸＣＬ−１、ＭＣＰ−１またはＴＩＭＰ−１のうち１以上を分泌または発現することを特徴とする請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
前記間葉系幹細胞は、ＦＯＸＰ３、ＨＬＡ−ＧまたはＴＬＲ４のうち１以上を分泌または発現することを特徴とする請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
前記間葉系幹細胞は、ＣＤ９０、ＣＤ１４６、ＣＤ１０５またはＣＤ７２のうち１以上を発現することを特徴とする請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
前記間葉系幹細胞は、眼窩線維芽細胞の脂肪細胞への分化、またはヒアルロン酸生成を阻害することを特徴とする請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
前記甲状腺眼症は、甲状腺機能亢進症によるものであることを特徴とする請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
前記間葉系幹細胞は、眼球に投与するためのものであることを特徴とする請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
間葉系幹細胞を有効成分として含む甲状腺眼症を予防または改善するための健康機能食品用組成物。
【請求項１４】
前記間葉系幹細胞は、その培養物、溶解物または抽出物を含むことを特徴とする請求項１３に記載の健康機能食品用組成物。
【請求項１５】
甲状腺眼症の治療または予防に使用するための医薬の製造における、請求項１の間葉系幹細胞、その細胞集団、その培養物、溶解物または抽出物の使用。
【請求項１６】
有効成分の請求項１の間葉系幹細胞、その細胞集団、その培養物、溶解物または抽出物を、それを必要とする個体に投与する段階を含む甲状腺眼症を治療または予防する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、甲状腺眼症を予防、改善または治療するための組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
甲状腺眼症（ＴＡＯ：thyroid-associated ophthalmopathy）は、甲状腺異常と伴って示される慢性的眼窩炎症疾患であり、甲状腺機能異常患者の約６０％において観察される。甲状腺眼症患者には、一般的に、眼窩線維芽細胞の脂肪細胞への分化増加、及びヒアルロン酸の増加が観察され、それにより、眼球周辺脂肪細胞の肥大または炎症が発生する。治療時期を逃す場合、瞼後退、眼球突出、制限性斜眼、視力低下、複視または視野減少のような深刻な後遺症を誘発することになるために、必ず適切な治療を受けなければならない。現在まで、甲状腺眼症の治療のために、高濃度ステロイド、放射線治療、眼窩減圧術など利用しているが、その効果が制限的であり、治療による副作用や危険性がある。
従って、難治性眼窩炎症疾患である甲状腺眼症において、新たな治療剤開発が切実となっている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明が解決しようとする課題は、間葉系幹細胞を有効成分として含む甲状腺眼症を予防、改善または治療するための組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
一様相は、ＦＯＸＰ３（フォークヘッドボックスＰ３）、ＨＬＡ−Ｇ（ヒト白血病抗原Ｇ）及びＴＬＲ４（toll様受容体４）からなる群のうちから選択される１以上を発現する間葉系幹細胞を提供する。
【０００５】
前記間葉系幹細胞は、下記のａ）またはｂ）の特性を有することができる：
ａ）ＣＸＣＬ−１（ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１）、ＭＣＰ−１（単球走化性タンパク質１）及びＴＩＭＰ−１（メタロプロテイナーゼの組織阻害剤）からなる群のうちから選択される１以上を発現する特性、
ｂ）ＣＤ９０、ＣＤ１４６、ＣＤ１０５及びＣＤ７２からなる群のうちから選択される１以上の表面抗原特性。
【発明の効果】
【０００６】
間葉系幹細胞を有効成分として含む甲状腺眼症を治療するための薬学的組成物は、眼窩線維芽細胞の非正常的な活性を回復させるので、甲状腺眼症治療に有用に利用される。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１Ａ】細胞培養培地から測定したｈＰＭＳＣの神経保護サイトカインのレベルを示すグラフである。
【図１Ｂ】ＭＳＣであることを確認することができるマーカーをｈＰＭＳＣの表面で確認したことを示す図面である。
【図２】正常人とＴＡＯ患者との涙に含まれたＨＡＳ、ＨＡ及びＨＡｄａｓｅを免疫分析法を介して確認した結果の図面である。
【図３Ａ】眼窩線維芽細胞とｈＰＭＳＣとを共培養し、このとき、ＨＡＳ２発現の変化をウェスタンブロットで測定したところを示す図面である。
【図３Ｂ】眼窩線維芽細胞とｈＰＭＳＣとを共培養し、このとき、ＨＡＳ２発現の変化を数値化させたところを示す図面である。
【図４Ａ】正常人と患者との眼窩線維芽細胞をｈＰＭＳＣと共培養した後、共培養された線維芽細胞の表面マーカーの変化を観察した結果の図面である。
【図４Ｂ】正常人と患者との眼窩線維芽細胞をｈＰＭＳＣと共培養した後、共培養された線維芽細胞の表面マーカーの変化を観察した結果の図面である。
【図５】正常人と患者との眼窩線維芽細胞をｈＰＭＳＣと共培養した後、ＰＰＡＲγ、ＡＤＩＰＯＮＥＣＴＩＮ及びＣ／ＥＢＰαのｍＲＮＡ発現をリアルタイムＰＣＲで分析した結果の図面である。
【図６】正常人と患者との眼窩線維芽細胞をｈＰＭＳＣと共培養した後、線維芽細胞の脂質蓄積の変化を観察した結果の図面である。
【図７】一具体例による間葉系幹細胞が炎症誘導された細胞の免疫反応調節因子に及ぼす影響を示したグラフであり、ＡＤ：脂肪由来の間葉系幹細胞、ＢＭ：骨髄由来の間葉系幹細胞、ＰＤ：胎盤由来の間葉系幹細胞、ＷＩ−３８：線維芽細胞であり、Ａ：ＦＯＸＰ３、Ｂ：ＨＬＡ−Ｇ、Ｃ：ｈＴＲＬ４であり、＊：対照群対それ以外が減少、＃：対照群対それ以外が増加、＊＊：１ｎｇ対１０ｎｇが減少、＃＃：１ｎｇ対１０ｎｇが増加である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
一様相は、ＦＯＸＰ３（フォークヘッドボックスＰ３）、ＨＬＡ−Ｇ（ヒト白血病抗原Ｇ）及びＴＬＲ４（toll様受容体４）からなる群のうちから選択される１以上を発現する間葉系幹細胞を提供する。
【０００９】
前記間葉系幹細胞は、下記のａ）またはｂ）の特性を有することができる：
ａ）ＣＸＣＬ−１（ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１）、ＭＣＰ−１（単球走化性タンパク質１）及びＴＩＭＰ−１（メタロプロテイナーゼの組織阻害剤）からなる群のうちから選択される１以上を発現する特性、
ｂ）ＣＤ９０、ＣＤ１４６、ＣＤ１０５及びＣＤ７２からなる群のうちから選択される１以上の表面抗原特性。
【００１０】
本明細書において、用語「間葉系幹細胞（ＭＳＣ：mesenchymal stem cell）」は、自己再生能（self-renewal）と幹細胞能（stemness maintenance）とを維持し、多様な間葉系組織に分化することができる細胞を意味し、哺乳類、例えば、ヒトを含んだ動物の間葉系幹細胞を含んでもよい。また、前記間葉系幹細胞は、臍帯由来、臍帯血由来、骨髄由来、胎盤（placenta）由来または脂肪由来の間葉系幹細胞でもある。前記胎盤由来の間葉系幹細胞は、胎盤を構成する多様な組織、例えば、羊膜上皮細胞、羊膜、栄養膜、絨毛膜のような組織にも由来する。望ましくは、前記胎盤由来の間葉系幹細胞は、胎盤の絨毛膜板（chorionic plate）に由来する間葉系幹細胞でもあり、さらに望ましくは、絨毛膜板膜（chorionic plate membrane）に由来する間葉系幹細胞でもある。間葉系幹細胞の分離は、通常の当業者に自明な方法によっても行われ、例えば、Pittengerら（Science 284: 143, 1997）とvanら（J. Clin. Invest., 58: 699, 1976）の文献に開示されている。
【００１１】
前記間葉系幹細胞は、免疫サイトカインを発現または分泌するものでもある。前記間葉系幹細胞は、対照群対比、線維芽細胞対比、または他の細胞対比で、免疫サイトカインをさらに多く発現または分泌するものでもある。前記免疫サイトカインの例は、ＣＸＣＬ−１、ＭＣＰ−１またはＴＩＭＰ−１を含んでもよい。
【００１２】
また、前記間葉系幹細胞は、ＦＯＸＰ３、ＨＬＡ−ＧまたはＴＬＲ４を発現または分泌するものでもある。前記間葉系幹細胞は、対照群対比、線維芽細胞対比、または他の細胞対比で、ＦＯＸＰ３、ＨＬＡ−ＧまたはＴＬＲ４をさらに多く発現または分泌するものでもある。前記間葉系幹細胞は、骨髄由来または脂肪由来の間葉系幹細胞対比で、ＦＯＸＰ３、ＨＬＡ−ＧまたはＴＬＲ４をさらに多く発現または分泌するものでもある。前述の発現レベルの差は、例えば、ｍＲＮＡレベルまたは蛋白質レベルでの遺伝子及び蛋白質の発現量を比較したものでもある。また、前記発現レベル差は、例えば、マイクロアレイ分析及びプロテオミクス分析によるものでもある。
【００１３】
また、前記間葉系幹細胞は、前記因子のうちいずれか１以上の発現が増大するように遺伝的に操作されたものでもある。本明細書において、用語「遺伝子操作（genetic engineering）」、または「遺伝的に操作（genetically engineered）」は、細胞に対して、１以上の遺伝的変形（genetic modification）を導入する行為、またはそれによって作られた細胞を示す。例えば、前記間葉系幹細胞または宿主細胞は、ＣＸＣＬ−１、ＭＣＰ−１またはＴＩＭＰ−１、あるいはその活性断片の発現または活性が増大するように、遺伝的に操作されたもの、例えば、ＣＸＣＬ−１、ＭＣＰ−１またはＴＩＭＰ−１、あるいはその活性断片をコーディングする外因性遺伝子を含むものでもある。前記活性増大は、与えられた遺伝的に操作されていない母細胞（例：野生型）が有したり有さなかったりする内在的蛋白質または酵素の活性に比べ、同一タイプの蛋白質または酵素の活性がさらに高い活性を有することを意味する。前記外因性遺伝子は、前記間葉系幹細胞または宿主細胞において、その母細胞に比べ、言及された蛋白質の活性が増大するのに十分な量で発現されたものでもある。前記外因性遺伝子は、発現ベクターを介して、母細胞内に導入されたものでもある。また、前記外因性遺伝子は、線形ポリヌクレオチド形態で母細胞内に導入されたものでもある。また、前記外因性遺伝子は、細胞内において、発現ベクター（例：プラスミド）から発現されるものでもある。また、前記外因性遺伝子は、安定した発現のために、細胞内の遺伝物質（例：染色体）に挿入されて発現されるものでもある。
【００１４】
また、前記間葉系幹細胞は、ＣＤ９０、ＣＤ１４６、ＣＤ１０５またはＣＤ７２を発現するものでもある。詳細には、本明細書で提供される間葉系幹細胞は、細胞表面に発現される細胞標識子に対して、ＣＤ９０、ＣＤ１４６、ＣＤ１０５またはＣＤ７２の陽性表面マーカーを、少なくとも約２０％，２５％，３０％，３５％，４０％，４５％，５０％，５５％，６０％，６５％，７０％，７５％，８０％，８５％，９０％，９５％、９８％または約９９％発現するものでもある。また、本明細書で提供される間葉系幹細胞は、細胞表面に発現される細胞標識子に対して、ＣＤ４５，ＣＤ３１，ＣＤ３４またはＨＬＡ−ＤＲ陰性マーカーを、およそ少なくとも７０％以下、少なくとも６０％以下、少なくとも５０％以下、少なくとも４０％以下、少なくとも３０％以下、少なくとも２０％以下、少なくとも１０％以下、少なくとも５％以下、または少なくとも１％以下に発現するものでもある。本発明において用語「陽性」は、幹細胞標識と係わり、その標識が基準になる他の非幹細胞と比較したとき、さらに多くの量、またはさらに高い濃度で存在することを意味する。すなわち、細胞は、ある標識が、細胞の内部または表面に存在するために、その標識を利用し、その細胞を、１以上の他の細胞類型と区別することができれば、その標識に対して陽性になる。また、細胞が背景値よりさらに大きい値で、信号、例えば、細胞測定装置の信号を出すことができるほどの量でその標識を有しているということを意味する。例えば、細胞を、ＣＤ９０に特異的な抗体で検出することができるように標識することが可能であり、該抗体からの信号が、対照群（例えば、背景値）よりも検出可能にさらに大きければ、その細胞は、「ＣＤ９０＋」である。本明細書において、用語、「陰性」は、特定細胞表面標識に特異的な抗体を使用しても、背景値に比べ、その標識を検出することができないということを意味する。例えば、ＣＤ４５に特異的な抗体で、細胞を検出することができるように標識することができなければ、その細胞は、「ＣＤ４５−」である。
【００１５】
他の様相は、間葉系幹細胞を有効成分として含む甲状腺眼症を治療するための薬学的組成物を提供する。
さらに他の様相は、細胞治療剤、薬学的組成物または製剤の製造に使用するための前記間葉系幹細胞の用途を提供する。
【００１６】
さらに他の様相は、疾病、例えば、甲状腺眼症の治療または予防に使用するための医薬の製造に使用するための前記間葉系幹細胞、その細胞集団またはその培養物、溶解物、あるいは抽出物の用途を提供する。
【００１７】
さらに他の様相は、有効成分の前記間葉系幹細胞、その細胞集団またはその培養物、溶解物、あるいは抽出物を、それを必要とする個体に投与する段階を含む疾病、例えば、甲状腺眼症を治療または予防する方法を提供する。
【００１８】
用語「治療」は、疾患、障害または病態、またはその１以上の症状の軽減、進行抑制または予防を指称したり、それを含んだりし、「有効成分」または「薬剤学的有効量」は、疾患、障害または病態、あるいはその１以上の症状の軽減、進行抑制または予防に十分な、本願で提供される発明を実施する過程で利用される組成物の任意の量を意味する。
【００１９】
用語「甲状腺眼症（ＴＡＯ：thyroid-associated ophthalmopathy）」は、甲状腺ホルモンの過多分泌による甲状腺機能亢進症によって発生する眼窩炎症疾患を意味する。瞼後退、眼球突出、制限性斜視、視力低下、複視、視野減少のような病症を示すことができる。
【００２０】
前記間葉系幹細胞は、代案として、その培養物、その溶解物またはその抽出物が利用されもする。前述の培養物、溶解物または抽出物は、細胞そのままを利用し難い場合、有用な代案にもなり、蛋白質などを含んだ細胞の構成成分を含んでいるので、本来の細胞と類似していたり同等であったりする生物学的活性を示すことができる。前述の溶解物または抽出物は、商業的に利用可能な細胞溶解キットまたは抽出キットなどを利用して得ることができる。
【００２１】
前記薬学的組成物は、眼球に投与するためのものでもある。用語である「投与する」、「導入する」及び「移植する」は、相互交換的に使用され、一具体例による組成物の所望部位への少なくとも部分的局所化をもたらす方法または経路による個体内への一具体例による組成物の配置を意味する。一具体例による組成物の細胞または細胞成分の少なくとも一部を、生存する個体内において、所望位置に伝達する任意の適切な経路によっても投与される。個体投与後、細胞の生存期間は、短ければ、数時間、例えば、２４時間ないし数日、長ければ、数年以上でもある。
【００２２】
一具体例による前記組成物は、組成物総重量に対し、約０．００１重量％ないし約８０重量％の間葉系幹細胞を含んでもよい。また、前記組成物の投与用量は、０．０１ｍｇないし１０，０００ｍｇ、０．１ｍｇないし１，０００ｍｇ、１ｍｇないし１００ｍｇ、０．０１ｍｇないし１，０００ｍｇ、０．０１ｍｇないし１００ｍｇ、０．０１ｍｇないし１０ｍｇ、または０．０１ｍｇないし１ｍｇでもある。また、間葉系幹細胞の投与用量は、１．０Ｘ１０５ないし１．０Ｘ１０８細胞／ｋｇ（体重）でもある。ただし、投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢・体重・性別・病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因により、多様にも処方されし、当業者であるならば、そのような要因を考慮し、投与量を適切に調節することができるであろう。投与回数は、１回、または臨床的に容認可能な副作用の範囲内で、２回以上が可能であり、投与部位についても、１ヵ所または２ヵ所以上に投与することができる。ヒト以外の動物についても、ｋｇ当たりヒトと同一投与量にするか、あるいは、例えば、目的の動物とヒトとの器官（心臓など）の容積比（例えば、平均値）などで、前述の投与量を換算した量を投与することができる。可能な投与経路には、経口、舌下、非経口（例えば、皮下、筋肉内、動脈内、腹腔内、硬膜内、または静脈内）、直腸、局所（経皮含む）、吸入、注射、点眼、あるいは移植性装置または物質の挿入を含んでもよい。一具体例による治療の対象動物としては、ヒト、及びそれ以外の目的とする哺乳動物を例として挙げることができ、具体的には、ヒト、猿、マウス、ラット、兎、羊、牛、犬、馬、豚などが含まれる。
【００２３】
一具体例による薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体及び／または添加物を含んでもよい。例えば、滅菌水、生理食塩水、慣用の緩衝剤（リン酸、クエン酸、それ以外の有機酸など）、安定剤、塩、酸化防止剤（アスコルビン酸など）、界面活性剤、懸濁液剤、等張化剤または保存剤などを含んでもよい。局所投与のために、生体高分子（biopolymer）などの有機物、ヒドロキシアパタイトなどの無機物、具体的には、コラーゲンマトリックス、ポリラクト酸の重合体または共重合体、ポリエチレングリコールの重合体または共重合体、及びその化学的誘導体などと組み合わせるものも含んでもよい。一具体例による薬学的組成物が注射に適切な剤形に調剤される場合には、間葉系幹細胞が薬学的に許容可能な担体内に溶解されているか、あるいは溶解されている溶液状態に凍結されたものでもある。
【００２４】
一具体例による薬学的組成物は、その投与方法や剤形により、必要な場合、懸濁液剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤、保存剤、吸着防止剤、界面活性化剤、希釈剤、賦形剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤、緩衝剤、還元剤、酸化防止剤などを適切に含んでもよい。前述のところに例示されたものなどを始めとし、本発明に適する薬学的に許容される担体及び製剤は、文献［Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., 1995］などに詳細に記載されている。一具体例による薬学的組成物は、当該発明が属する技術分野において当業者が容易に実施することができる方法によって、薬学的に許容される担体及び／または賦形制を利用して製剤化することにより、単位用量形態に製造されるか、あるいは多用量容器内に内入させても製造される。このとき、該剤形は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液または乳化液の形態であるか、あるいは粉末、顆粒、錠剤またはカプセル型でもある。
さらに他の様相は、間葉系幹細胞、またはその培養物、溶解物または抽出物を含む甲状腺眼症を予防または改善するための健康機能食品用組成物を提供する。
【００２５】
前記健康食品組成物は、前記間葉系幹細胞以外に、他の食品または食品成分と共に使用され、一般的な方法によっても適切に使用される。有効成分の混合量は、使用目的（予防、健康または治療的処置）によって適切に決定される。一般的に、健康機能食品の製造時、本明細書の組成物は、原料に対して１５重量部以下の量でも添加される。前記健康食品の種類には、特別な制限はない。
【００２６】
本発明者らは、間葉系幹細胞が甲状腺眼症患者の線維芽細胞の非正常的な活性（過度なヒアルロン酸生成、脂肪細胞分化、及び脂質蓄積）を回復させることを確認したので、それを含む組成物は、甲状腺眼症の治療、予防または改善のための組成物にも有用に使用されるのである。
【実施例】
【００２７】
以下、本発明について、実施例を介して、さらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は、本発明について例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲は、それら実施例に限定されるものではない。
【００２８】
参考例
参考例１．胎盤由来間葉系幹細胞の分離
正常に分娩した健康な産婦から、前もって十分な説明に基づいた同意（informed consent）を受け、正常胎盤分娩時に収集された胎盤組織から臍帯を分離した。分離した組織（chorioamniotic membranes）を５０ｍｌ チューブに入れ、ＤＰＢＳを添加し、余分の血液を除去した後、２０ｍｌ酵素溶液Ｉ（１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼtype Ｉ、２ｍｇ／ｍｌトリプシン、２０ｍｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅＩ、１．２Ｕ／ｍｌディスパーゼ、ｘ１ ＰＳ in ＨＢＳＳ）で滅菌されたスライドガラスで、絨毛羊膜（chorioamniotic membranes）の上側部分を掻いて回収される浮遊物を一方に集めた。酵素溶液Ｉ１０ｍｌを入れ、押しなべて混ぜた後、３７℃酵素反応を１５分ずつ２回反復しながら、組織から幹細胞を分離させた。分離された細胞懸濁液を遠心分離し、分離された細胞は、１０％の牛胎児血清、１％のペニシリン・ストレプトマイシン、１μｇ／ｍｌのヘパリン、及び２５ｎｇ／ｍｌの線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ−４：fibroblast growth factor−４）が添加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２を利用して培養し、その後、４日ないし５日の間隔で培養培地を交換し、初継代でInvitrogen社のＴｒｙｐＬＥを、３７℃インキュベータで短期間（３分）処理して継代培養した。
【００２９】
参考例２．眼窩線維芽細胞（orbital fibroblast）の培養及び処理
ヒトから眼窩線維芽細胞（正常４人、患者４人）を採取し、ＤＭＥＭＦ１２（Gibco）（１０％ ＦＢＳ及び１％ペニシリン・ストレプトマイシン）に培養した。線維芽細胞が培地に分布されて育ち、２日後、ＤＭＥＭ（１０％ ＦＢＳ）に、５μｇ／ｍｌインシュリン、１ｍＭデキタメタゾン及び０．５ｍＭ ＩＢＭＸを添加し、脂肪細胞への分化が始まるようにした（day ０）。７２時間後（day ３）、培地を、１０％ ＦＢＳ及び５μｇ／ｍｌインシュリンが補充されたＤＭＥＭ培地に交換し、その後、隔日ごとに、１０％ ＦＢＳが補充されたＤＭＥＭ培地を供給した。
【００３０】
参考例３．眼窩線維芽細胞（orbital fibroblast）脂質蓄積分析
正常人と患者との眼窩線維芽細胞に、脂肪生成誘導分化培地を入れた後、ｈＰＭＳＣ（placenta derived mesenchymal stem cell）との共培養有無を分け、１０日間培養した（初期４日間：ＤＭＥＭ supplemented with １０％ ＦＢＳ、３３μＭビオチン、１７μＭパントテン酸、０．２ｎＭ Ｔ３、１０μｇ／ｍＬトランスフェリン、０．２μＭプロスタグランジンＩ２、０．１ｍＭイソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、１μＭデキサメタゾン、５μｇ／ｍｌインスリン／５−１０日間：ｗ／ｏ ＩＢＭＸ、デキサメタゾン、インスリン）。１０日後、Oil−Red−Ｏ染色を介して、線維芽細胞の脂質蓄積変化を観察した。
【００３１】
参考例４．涙試料採取
正常人（ｎ＝１３）、及び甲状腺眼症（ＴＡＯ）患者（ｎ＝１３）から、シルマーストリップ（Schirmer strip）を利用して涙を採取した。その後、シルマーストリップを、底にカニュラ（cannula）がある０．５ｍｌチューブに移し、３０μ ＬＰＢＳを添加した。前記チューブの内容物をさらに大きいチューブ（１．５ｍｌ）に移し、５分間遠心分離を行った（１３，０００ｒｐｍ）。そのように採取された涙は、−２０℃で保管した。
【００３２】
参考例５．リアルタイムＰＣＲ
培養８日目（day ８）に、ｈＰＭＳＣ（２ｘ１０５）を、眼窩線維芽細胞と共に、４８時間共培養した。細胞溶解物は、ＴＲＩｚｏｌ（Invitrogen、Ｃａｒｌｂａｄ、ＣＡ、米国）で均質化させ、ＲＮＡを抽出した。それぞれの試料からの１μｇの総ＲＮＡを逆転写し、ｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡ合成条件は、次の通りである：ＲＮＡ融解（６５℃、１分）、プーリング（２５℃、５分）、増幅（４２℃、６０分）及び酵素不活性（８５℃、１分）。
【００３３】
以下のＰＣＲ条件により、各遺伝子のｍＲＮＡ発現を増幅し、標準化（normalization）させた：初期融解（９５℃、２分）、増幅（９５℃、１０秒；５５℃、２０秒；及び７２℃、２０秒）４０サイクル。ＰＰＡＲγ、ＡＤＩＰＯＮＥＣＴＩＮ及びＣ／ＥＢＰα、プライマーセットは、以下の通りである：
【００３４】
ＰＰＡＲγ ＦＰ：５’−ＴＴＧＡＣＣＣＡＧＡＡＡＧＣＧＡＴＴＣＣ（配列番号１）−３’、ＲＰ：５’−ＡＡＡＧＴＴＧＧＴＧＧＧＣＣＡＧＡＡＴＧ（配列番号２）−３’；ＡＤＩＰＯＮＥＣＴＩＮＦＰ：５’−ＧＧＣＣＧＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣＡＧＡＧＡＴ（配列番号３）−３’、ＲＰ：５’−ＴＴＴＣＡＣＣＧＡＴＧＴＣＴＣＣＣＴＴＡＧＧ（配列番号４）−３’Ｃ／ＥＢＰαＦＰ：５’−ＴＧＴＡＴＡＣＣＣＣＴＧＧＴＧＧＧＡＧＡ（配列番号５）−３’、ＲＰ：５’−ＴＣＡＴＡＡＣＴＣＣＧＧＴＣＣＣＴＣＴＧ（配列番号６）−３’。各遺伝子のｍＲＮＡ発現は、１８ｓ ｒＲＮＡで標準化させた。データは、正常集団と比べ、脂肪分化関連因子の倍数（fold）（平均±ＳＥＭ）で表現した。
【００３５】
参考例６．ウェスタンブロット
ＲＩＰＡ緩衝液を利用し、溶解物を準備した。同量の総蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離して膜に移した。前記膜は、抗ＨＡＳ１及び抗ＨＡＳ２（SantaCruz Biotechnology、ＳＡ、米国）で１：１，０００希釈し、免疫ブロッティングし、該膜をＧＡＰＤＨ（SantaCruz）と共に培養した。洗浄後、ホースラディッシュ過酸化酵素接合抗塩素ＩｇＧ（horseradish peroxidase-conjugated anti-goat ＩｇＧ）二次抗体と共に、１：１０，０００希釈で、常温で３時間培養した。免疫反応バンドは、向上した化学発光ソリューション（enhanced chemiluminescence solution）（AnimalGenetics、Suwon、韓国）でイメージ化させ、ＣｈｅｍｉＤｏｃＴＭ ＸＲＳ＋ System Imager（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Laboratories、Hercules、ＣＡ、米国）で検出した。蛋白質発現量は、ＧＡＰＤＨで標準化させた。データは、正常集団と比べ、ＨＡＳ２の倍数（fold）（平均±ＳＥＭ）で表現した。
【００３６】
参考例７．酵素結合免疫吸着検査（ＥＬＩＳＡ）
正常人及びＴＡＯ患者から採取した涙を準備し、そのヒアルロン酸（Ｈａ：hyaluronic acid）及びヒアルロニダーゼ（Ｈｙａｌ：hyaluronidase）のレベルをＥＬＩＳＡで決定した。本分析の遂行は、製造社のマニュアルによって行った。
【００３７】
参考例８．ＦＡＣＳ分析
ヒト線維芽細胞（３ｘ１０５）を細胞解離バッファ（Life Technologies）で解離させ、ＰＢＳ（２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ）で洗浄した。それを、アイソタイプ対照群ＩｇＧ（isotype control ＩｇＧ）または抗原特異的抗体（ＢＤ Biosciences、ＣＡ、米国）と共に、２０分間培養し、細胞を確認するのに利用した。ＦＡＣＳ分類（sorting）は、ＦＡＣＳ vantage Flow Cytometer（ＢＤ Biosciences、ＣＡ、米国）を利用して行った。
【００３８】
実施例１．胎盤由来幹細胞の特性分析
前記参考例１で分離した胎盤由来間葉系幹細胞の特性を分析するために、サイトカイン分泌特性及び表面抗原特性を分析した。具体的には、ＥＬＩＳＡ分析を介し、胎盤由来間葉系幹細胞の培養培地で、神経保護サイトカインの濃度を測定し、ＦＡＣＳ分析を介し、胎盤由来間葉系幹細胞の表面抗原（ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ９０、ＣＤ３１、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１４６、ＣＤ１０６及びＣＤ７３）特性を分析し、その結果を図１に示した。
【００３９】
図１Ａは、細胞培養培地から測定したｈＰＭＳＣの神経保護サイトカインのレベルを示す。図１Ａに示されているように、ＥＬＩＳＡ分析結果、ｈＰＭＳＣを培養した培養液において、炎症反応及び傷治癒に係わるサイトカイン（ＣＸＣＬ−１、ＭＣＰ−１、ＴＩＭＰ−１）の分泌が増加するということを確認した。
【００４０】
図１Ｂは、ｈＰＭＳＣの表面パターンを示す。図１Ｂに示されているように、ＦＡＣＳで分析した結果、間葉系細胞マーカーであるＣＤ９０、ＣＤ１４６、ＣＤ１０５及びＣＤ７２が陽性と確認された。
【００４１】
実施例２．ＴＡＯ患者でのヒアルロン酸合成増加の確認
正常人及びＴＡＯ患者から採取した涙（総２６個試料）を利用し、ウェスタンブロットを実施し、ヒアルロン酸合成酵素（ＨＡＳ：hyaluronic acid synthase：ＨＡＳ）の量を測定した。総１０μｇ蛋白質をローディングした。抗ＨＡＳ１及び抗ＨＡＳ２を、４℃一晩培養した。ＴＡＯ患者から採取した涙に対するＥＬＩＳＡ分析も実施した。
【００４２】
その結果、図２Ａのように、患者の涙において、正常人に比べ、ヒアルロン酸合成酵素であるＨＡＳ１とＨＡＳ２との蛋白質発現が増大するということを確認した。図２Ｂでのように、Ｈａのレベルも上昇したということが観察されたが、図２Ｃのように、ＨＡｄａｓｅのレベルは、有意すべき変化がないということを確認した。
【００４３】
前述の通り、ＥＬＩＳＡ分析結果、ＴＡＯ患者の涙内ヒアルロン酸のレベルは、上昇したが、ヒアルロン酸分解酵素のレベルは、正常人と患者との差を見い出すことができなかった。従って、ＴＡＯ患者においては、ヒアルロン酸合成酵素が増加し、ヒアルロン酸生成が増大するということを確認した。
【００４４】
実施例３．ｈＰＭＳＣのヒアルロン酸生成低減効果の確認
線維芽細胞の培養１５日目（day １５）、眼窩線維芽細胞を、脂肪生成誘導過程中の刺激剤として、ＩＬ−１β（２０ｎｇ／ｍＬ）と共に培養した。ｈＰＭＳＣとの共培養後、ＨＡＳ２の蛋白質発現を決定した。
【００４５】
図３Ａのように、誘導過程の間、ＴＡＯ患者の線維芽細胞において、ヒアルロン酸合成酵素であるＨＡＳ２の発現が増大するということを確認し、ＰＭＳＣとの共培養を介し、増大された合成酵素の蛋白質発現が低減するということを検証した。
【００４６】
また、図３Ｂのように、ヒアルロン酸合成酵素ＨＡＳ２の蛋白質発現量を数値化させた結果、脂肪生成誘導分化メディアで培養されたＴＡＯ患者の線維芽細胞が、ＩＬ−１β刺激により、ＨＡＳ２の蛋白質発現が約２．３倍ほど増大すると見られ、それは、ＰＭＳＣとの共培養を介して低減少されることを確認した。
【００４７】
実施例４．ｈＰＭＳＣの眼窩線維芽細胞表面抗原マーカーに及ぼす効果確認
正常人及びＴＡＯ患者から採取した眼窩線維芽細胞を、ｈＰＭＳＣと共培養して起きる変化を観察した。線維芽細胞は、ＦＡＣＳで分析した。
【００４８】
線維芽細胞の培養１５日目（day １５）、線維芽細胞にＩＬ−１β（２０ｎｇ／ｍＬ）を処理した。培養２４時間後、ｈＰＭＳＣを共培養した。共培養された線維芽細胞に対し、ＣＤ９０またはＣＤ１０５をマーカーで分類した。また、線維芽細胞を顕微鏡で観察した。
【００４９】
図４Ａ及び図４Ｂのように、正常人と患者との線維芽細胞マーカーであるＣＤ１０５とＣＤ９０との変化を分析した結果、ｈＰＭＳＣとの共培養により、ＴＡＯ患者の線維芽細胞内ＣＤ９０が変化するということを確認した。
【００５０】
実施例５．ｈＰＭＳＣの脂肪細胞分化（adipogenesis）に対する効果確認
正常人及びＴＡＯ患者から採取した眼窩線維芽細胞を、４日間、脂肪分化誘導メディア１（３３μＭビオチン、１７μＭパントテン酸、０．２ｎＭ Ｔ３、１０μｇ／ｍＬトランスフェリン、０．２μＭプロスタグランジンＩ２、０．１ｍＭイソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、１μＭデキサメタゾン、５μｇ／ｍｌインスリン）と共に培養した後、５日目から１０日目まで脂肪分化誘導メディア２（３３μＭビオチン、１７μＭパントテン酸、０．２ｎＭＴ３、１０μｇ／ｍＬトランスフェリン、０．２μＭプロスタグランジンＩ２、０．１ｍＭ）と共に培養した。培養８日目、ｈＰＭＳＣ（２ｘ１０５）と、脂肪分化メディアで培養中の眼窩線維芽細胞とを４８時間共培養した。その後、代表的な脂肪細胞分化関連因子であるＰＰＡＲγ、ＡＤＩＰＯＮＥＣＴＩＮ及びＣ／ＥＢＰαのｍＲＮＡ発現を、前記参考例５に記載されたように確認し、その結果を図５に示した。
【００５１】
その結果、図５に示されているように、脂肪分化誘導培地で培養した患者の線維芽細胞内のＰＰＡＲγ、ＡＤＩＰＯＮＥＣＴＩＮ及びＣ／ＥＢＰαのｍＲＮＡ発現が、それぞれ２１．５倍、約８０倍及び３３倍増大するということを確認した。それに反し、ＰＭＳＣとの共培養を介して増大されたｍＲＮＡのＰＰＡＲγ発現が、約８倍、ＡＤＩＰＯＮＥＣＴＩＮのｍＲＮＡ発現が、約３３倍、Ｃ／ＥＢＰαのｍＲＮＡ発現が、約１２．４倍に低減されることを確認した。以上の結果により、間葉系幹細胞が、眼窩線維芽細胞のＰＰＡＲγ、ＡＤＩＰＯＮＥＣＴＩＮ及びＣ／ＥＢＰαの発現を抑制するということが分かり、それは、間葉系幹細胞が、眼窩線維芽細胞の脂肪細胞分化性を抑制するということを意味する。
【００５２】
実施例６．眼窩線維芽細胞の脂質蓄積確認
ヒト胎盤由来の間葉系幹細胞が、眼窩線維芽細胞の脂質蓄積に及ぼす影響を確認した。具体的には、正常人及びＴＡＯ患者から採取した眼窩線維芽細胞を、脂肪生成誘導培地培養と共に、ＰＭＳＣとの共培養を進めた。１０日後、Oil−RedＯ染色を利用し、眼窩線維芽細胞内脂質蓄積を、前記参考例３のように確認し、その結果を図６に示した。
その結果、図６のように、分化培地に誘導されたＴＡＯ患者の線維芽細胞の脂質蓄積が、ＰＭＳＣとの共培養を介して低減されるということを確認した。
以上の結果から、ヒト胎盤由来幹細胞（ｈＰＭＳＣ）がＴＡＯ患者の線維芽細胞の非正常的な活性を回復させるということを確認した。
【００５３】
実施例７．間葉系幹細胞の免疫調節能確認
前記参考例１で分離した胎盤由来の間葉系幹細胞、脂肪由来の間葉系幹細胞、及び骨髄由来の間葉系幹細胞の眼窩線維芽細胞に係わる免疫調節能を確認するために、naive状態の間葉系幹細胞に炎症誘導因子を処理することにより、各間葉系幹細胞で発現される各因子の発現と、炎症反応による発現とを比較分析した。前述の脂肪由来の間葉系幹細胞と、骨髄由来の間葉系幹細胞は、ＡＴＣＣ（American Type Culture Collection）から提供されて使用した。
【００５４】
具体的には、前記間葉系幹細胞に、炎症誘導因子であるＬＰＳ及びＩＬ−１βをそれぞれ１または１０ｎｇで処理した。その後、免疫調節因子であるｈＦＯＸＰ３、ｈＨＬＡ−Ｇ及びｈＴＲＬ４の発現量をｑＲＴ−ＰＣＲで確認した。具体的には、ｑＲＴ−ＰＣＲは、炎症誘導因子を処理した細胞を回収し、TRIZOLを利用した細胞溶解（lysis）段階、逆転写酵素（reverse transcriptase）を利用したｃＤＮＡ合成段階、遺伝子特異的塩基配列とＴａｇ．ＤＮＡポリメラーゼとを利用したＰＣＲ増幅段階、及び増幅されたＰＣＲ産物をアガロースゲル上で電気泳動して増幅された遺伝子の有無を確認する段階で遂行した。前記ｑＲＴ−ＰＣＲ分析の結果は、図７に示した。
【００５５】
図７は、一具体例による間葉系幹細胞が炎症誘導された細胞の免疫反応調節因子に及ぼす影響を示したグラフであり、ＡＤ：脂肪由来の間葉系幹細胞、ＢＭ：骨髄由来の間葉系幹細胞、ＰＤ：胎盤由来の間葉系幹細胞、ＷＩ−３８：線維芽細胞；Ａ：ＦＯＸＰ３、Ｂ：ＨＬＡ−Ｇ、Ｃ：ｈＴＲＬ４；＊：対照群対それ以外は、減少、＃：対照群対それ以外は、増加、＊＊：１ｎｇ対１０ｎｇは、減少、＃＃：１ｎｇ対１０ｎｇは、増加である。
【００５６】
図７に示されているように、一具体例による間葉系幹細胞は、ＨＬＡ−Ｇ、ＦＯＸＰ３、及びＴＬＲ４を、線維芽細胞対比でさらに多く発現するということが分かった。特に、胎盤由来間葉系幹細胞の場合には、免疫反応調節に関与し、Ｔ細胞攻撃から細胞を保護する効果が知られたＨＬＡ−Ｇだけではなく、ＦＯＸＰ３及びＴＬＲ４を、他の細胞に比べ、さらに多く発現するだけではなく、炎症誘導因子が処理された後にも、高い発現量を示した。naive状態において、免疫と係わる因子の発現パターンを、炎症誘導因子処理によって発現変化を分析することにより、ＨＬＡ−Ｇのような免疫調節能因子の過発現を示す間葉系幹細胞（特に、胎盤由来の間葉系幹細胞）が甲状腺眼症治療剤として有用に使用されうるということが分かった。
【図１Ａ】
2020530304.tif 000003
【図１Ｂ】
2020530304.tif 000004
【図２】
2020530304.tif 000005
【図３Ａ】
2020530304.tif 000006
【図３Ｂ】
2020530304.tif 000007
【図４Ａ】
2020530304.tif 000008
【図４Ｂ】
2020530304.tif 000009
【図５】
2020530304.tif 000010
【図６】
2020530304.tif 000011
【図７】
2020530304.tif 000012
【配列表】
2020530304000001.app
【国際調査報告】
2020530304.tif 000013
2020530304.tif 000014
2020530304.tif 000015
2020530304.tif 000016
2020530304.tif 000017
2020530304.tif 000018
2020530304.tif 000019
2020530304.tif 000020