(57)【要約】  本開示は、ＴＤＰ−４３中の立体配座エピトープ、それらに対する抗体、ならびに免疫原およびそれらに特異的な抗体を作製および使用する方法に関する。【選択図】図１Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１）ＴＴＥ、２）ＴＴＥＱ（配列番号１）、３）ＴＥＱ、またはそれらの一部、および最大６つのＴＤＰ−４３の連続する残基を含むＴＤＰ−４３ペプチドと、リンカーとを含む、環状化合物であって、前記リンカーが、前記ＴＤＰ−４３ペプチドのＮ末端残基および前記ペプチドのＣ末端残基に共有結合され、前記ＴＤＰ−４３ペプチド中の少なくとも１つのアミノ酸が、対応する直鎖状および／または天然型ＴＤＰ−４３中のＴ、Ｅ、および／またはＱよりも交互立体配座である、環状化合物。
【請求項２】
前記ＴＤＰ−４３ペプチドが、ＴＴＥＱ（配列番号１）、ＴＴＥ、ＴＥＱ、ＫＴＴＥ（配列番号１０）、ＫＴＴＥＱ（配列番号１２）、ＴＥＱＤ（配列番号８）、またはＴＴＥＱＤ（配列番号９）から選択され、任意選択的に、前記環状化合物が、配列番号２、３、１３、２２〜３９、および４２〜４４のうちのいずれか１つから選択される化合物である、請求項１または本明細書におけるいずれの他の請求項に記載の環状化合物。
【請求項３】
前記ＴＤＰ−４３ペプチドが、ＴＴＥＱ（配列番号１）、ＴＥＱ、またはＴＴＥである、請求項１もしくは２または本明細書におけるいずれかの他の請求項に記載の環状化合物。
【請求項４】
前記リンカーが、１〜８つのアミノ酸および／または１つ以上の官能性部分を含むか、またはこれらからなる、請求項１〜３のいずれか一項または本明細書におけるいずれかの他の請求項に記載の環状化合物。
【請求項５】
前記リンカーのアミノ酸が、ＡおよびＧから選択され、かつ／または前記官能性部分がＣである、請求項４または本明細書におけるいずれかの他の請求項に記載の環状化合物。
【請求項６】
前記リンカーが、ＧＧＣＧＧ（配列番号４０）、ＧＣＧＧ（配列番号４１）、またはＧＣＧを含むか、またはこれらからなる、請求項１〜５のいずれか一項または本明細書におけるいずれかの他の請求項に記載の環状化合物。
【請求項７】
前記リンカーが、１つ以上のＰＥＧ分子を含む、請求項１〜６のいずれか一項または本明細書におけるいずれかの他の請求項に記載の環状化合物。
【請求項８】
前記環状化合物が、本明細書に記載の環状構造から選択され、好ましくは、前記環状化合物が、配列番号２、３、１３、２２〜３９、および４２〜４４、より好ましくは、配列番号２、３、２２、２３、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、および４２のうちのいずれか１つから選択される配列、任意選択的に、配列番号２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、および４２のうちのいずれか１つから選択される配列、または配列番号２、３、２２、２３、および４２から選択される配列を有する、請求項１または本明細書におけるいずれの他の請求項に記載の環状化合物。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項または本明細書におけるいずれかの他の請求項に記載の環状化合物を含む、免疫原。
【請求項１０】
前記環状化合物が、担体タンパク質もしくは免疫原性向上成分に結合され、かつ／またはアジュバントと共に製剤化される、請求項９または本明細書におけるいずれかの他の請求項に記載の免疫原。
【請求項１１】
前記担体タンパク質が、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）であるか、または前記免疫原性向上成分が、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）である、請求項１０または本明細書におけるいずれかの他の請求項に記載の免疫原。
【請求項１２】
前記アジュバントが、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウムミョウバン、モノホスホリルリピドＡおよびＱＳ２１から選択される、請求項９〜１１のいずれか一項または本明細書におけるいずれかの他の請求項に記載の免疫原。
【請求項１３】
対応する直鎖状化合物および／または天然型ＴＤＰ−４３ポリペプチドと比較して、請求項１〜８のいずれか一項または本明細書におけるいずれかの他の請求項に記載の環状化合物中の前記ＴＤＰ−４３ペプチド中のエピトープに選択的に結合する抗体。
【請求項１４】
前記エピトープが、主に前記抗体との結合に関わる、１）ＴＴＥ、２）ＴＥＱ、３）ＴＴＥＱ（配列番号１）、４）ＫＴＴＥ（配列番号１０）、５）ＫＴＴＥＱ（配列番号１２）、６）ＴＥＱＤ（配列番号８）、または７）ＴＴＥＱＤ（配列番号９）の少なくとも２つの連続するアミノ酸残基を含むか、またはこれらからなり、前記少なくとも２つの連続するアミノ酸が、任意選択的に、ＴＴＥ、任意選択的にＴＴＥＱ（配列番号１）内に埋め込まれたＴＴである、請求項１３または本明細書におけるいずれかの他の請求項に記載の抗体。
【請求項１５】
前記ＴＤＰ−４３ペプチドおよび／またはエピトープが、ＴＴＥＱ（配列番号１）、ＫＴＴＥＱＤ（配列番号７）、ＫＴＴＥ（配列番号１０）、またはＴＥＱＤ（配列番号８）を含むか、またはこれからなる、請求項１３もしくは１４または本明細書におけるいずれかの他の請求項に記載の抗体。
【請求項１６】
前記抗体が、対応する直鎖状化合物および／または天然型ＴＤＰ−４３ポリペプチドと比較して、１）ＴＴＥ、２）ＴＥＱ、３）ＴＴＥＱ（配列番号１）、４）ＫＴＴＥ（配列番号１０）、５）ＫＴＴＥＱ（配列番号１２）、６）ＴＥＱＤ（配列番号８）、または７）ＴＴＥＱＤ（配列番号９）を含む環状化合物に選択的に結合する、請求項１３もしくは１４または本明細書におけるいずれかの他の請求項に記載の抗体。
【請求項１７】
前記抗体が、対応する直鎖状化合物および／または天然型ＴＤＰ−４３ポリペプチドと比較して、前記環状化合物について少なくとも２倍、３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、または少なくとも２０倍、より選択的である、請求項１３〜１６のいずれか一項または本明細書におけるいずれかの他の請求項に記載の抗体。
【請求項１８】
前記抗体が、天然型ＴＤＰ−４３ポリペプチドと比較して、ミスフォールドＴＤＰ−４３ポリペプチドに選択的に結合する、請求項１３〜１７のいずれか一項または本明細書におけるいずれかの他の請求項に記載の抗体。
【請求項１９】
前記抗体が、天然型ＴＤＰ−４３ポリペプチドと比較して、ミスフォールドＴＤＰ−４３ポリペプチドについて少なくとも２倍、３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、または少なくとも２０倍、より選択的である、請求項１８または本明細書におけるいずれかの他の請求項に記載の抗体。
【請求項２０】
請求項１３〜１９いずれか一項または本明細書におけるいずれかの他の請求項に記載の抗体と同じかまたは重複するＴＤＰ−４３ペプチドを含む、ミスフォールドＴＤＰ−４３または環状ペプチドとの結合について競合する抗体であって、好ましくは、表１０に提供される重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域と少なくとも８０％以上の配列同一性を共有する、抗体。
【請求項２１】
前記抗体が、請求項１〜８のいずれか一項に記載の環状化合物、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の免疫原を使用して産生またはスクリーニングされる、請求項１３〜２０のいずれか一項または本明細書におけるいずれかの他の請求項に記載の抗体。
【請求項２２】
前記抗体が、任意選択的に融合された、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域が、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、前記軽鎖可変領域が、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含み、前記ＣＤＲの前記アミノ酸配列が、配列：
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または
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または
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または
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または
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または
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【請求項２３】
前記抗体が、ｉ）配列番号４６に記載のアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号４６と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、前記ＣＤＲ配列が、配列番号６７、６８、および６９に記載の通りである、アミノ酸配列、またはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、かつ／あるいは前記抗体が、ｉ）配列番号４８に記載のアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号４８と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、前記ＣＤＲ配列が、配列番号７０、７１、および７２に記載される通りである、アミノ酸配列、またはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、任意選択的に、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号４５に記載のヌクレオチド配列またはそのコドン縮退もしくは最適化バージョンによってコードされ、かつ／あるいは前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号４７に記載のヌクレオチド配列またはそのコドン縮退もしくは最適化バージョンによってコードされる、請求項１３〜２２のいずれか一項または本明細書におけるいずれかの他の請求項に記載の抗体。
【請求項２４】
前記重鎖可変領域が、配列番号４６に記載のアミノ酸配列を含み、かつ／または前記軽鎖可変領域が、配列番号４８に記載のアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載の抗体。
【請求項２５】
前記抗体が、ｉ）配列番号５０に記載のアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号５０と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、前記ＣＤＲ配列が、配列番号７３、７４、および７５に記載の通りである、アミノ酸配列、またはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、かつ／あるいは前記抗体が、ｉ）配列番号５２に記載のアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号５２と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、前記ＣＤＲ配列が、配列番号７６、７７、および７８に記載される通りである、アミノ酸配列、またはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、任意選択的に、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号４９に記載のヌクレオチド配列またはそのコドン縮退もしくは最適化バージョンによってコードされ、かつ／あるいは前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号５１に記載のヌクレオチド配列またはそのコドン縮退もしくは最適化バージョンによってコードされる、請求項１３〜２２のいずれか一項または本明細書におけるいずれかの他の請求項に記載の抗体。
【請求項２６】
前記重鎖可変領域が、配列番号５０に記載のアミノ酸配列を含み、かつ／または前記軽鎖可変領域が、配列番号５２に記載のアミノ酸配列を含む、請求項２５に記載の抗体。
【請求項２７】
前記抗体が、ｉ）配列番号５４に記載のアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号５４と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、前記ＣＤＲ配列が、配列番号７３、７９、および８０に記載の通りである、アミノ酸配列、またはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、かつ／あるいは前記抗体が、ｉ）配列番号５６に記載のアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号５６と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、前記ＣＤＲ配列が、配列番号７６、７７、および８１に記載される通りである、アミノ酸配列、またはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、任意選択的に、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号５３に記載のヌクレオチド配列またはそのコドン縮退もしくは最適化バージョンによってコードされ、かつ／あるいは前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号５５に記載のヌクレオチド配列またはそのコドン縮退もしくは最適化バージョンによってコードされる、請求項１３〜２２のいずれか一項または本明細書におけるいずれかの他の請求項に記載の抗体。
【請求項２８】
前記重鎖可変領域が、配列番号５４に記載のアミノ酸配列を含み、かつ／または前記軽鎖可変領域が、配列番号５６に記載のアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載の抗体。
【請求項２９】
前記抗体が、ｉ）配列番号５８に記載のアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号５８と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、前記ＣＤＲ配列が、配列番号６７、６８、および８２に記載の通りである、アミノ酸配列、またはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、かつ／あるいは前記抗体が、ｉ）配列番号６０に記載のアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号６０と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、前記ＣＤＲ配列が、配列番号８３、８４、および８５に記載される通りである、アミノ酸配列、またはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、任意選択的に、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号５７に記載のヌクレオチド配列またはそのコドン縮退もしくは最適化バージョンによってコードされ、かつ／もしくは前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号５９に記載のヌクレオチド配列またはそのコドン縮退もしくは最適化バージョンによってコードされる、請求項１３〜２２のいずれか一項または本明細書におけるいずれかの他の請求項に記載の抗体。
【請求項３０】
前記重鎖可変領域が、配列番号５８に記載のアミノ酸配列を含み、かつ／または前記軽鎖可変領域が、配列番号６０に記載のアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載の抗体。
【請求項３１】
前記抗体が、ｉ）配列番号６２に記載のアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号６２と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、前記ＣＤＲ配列が、配列番号８６、８７、および８８に記載の通りである、アミノ酸配列、またはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、かつ／あるいは前記抗体が、ｉ）配列番号６４に記載のアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号６４と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、前記ＣＤＲ配列が、配列番号７６、７７、および９２に記載される通りである、アミノ酸配列、またはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、任意選択的に、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号６１に記載のヌクレオチド配列またはそのコドン縮退もしくは最適化バージョンによってコードされ、かつ／または前記抗体が、配列番号６３に記載のヌクレオチド配列またはそのコドン縮退もしくは最適化バージョンによってコードされた軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む、請求項１３〜２２のいずれか一項または本明細書におけるいずれかの他の請求項に記載の抗体。
【請求項３２】
前記重鎖可変領域が、配列番号６２に記載のアミノ酸配列を含み、かつ／または前記軽鎖可変領域が、配列番号６４に記載のアミノ酸配列を含む、請求項３１または本明細書におけるいずれかの他の請求項に記載の抗体。
【請求項３３】
前記抗体が、ｉ）配列番号６６に記載のアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号６６と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、前記ＣＤＲ配列が、配列番号８９、９０、および９１に記載の通りである、アミノ酸配列、またはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、かつ／あるいは前記抗体が、ｉ）配列番号６４に記載のアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号６４と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、前記ＣＤＲ配列が、配列番号７６、７７、および９２に記載される通りである、アミノ酸配列、またはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、任意選択的に、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号６５に記載のヌクレオチド配列またはそのコドン縮退もしくは最適化バージョンによってコードされ、かつ／あるいは前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号６３に記載のヌクレオチド配列またはそのコドン縮退もしくは最適化バージョンによってコードされる、請求項１３〜２２のいずれか一項または本明細書におけるいずれかの他の請求項に記載の抗体。
【請求項３４】
前記重鎖可変領域が、配列番号６６に記載のアミノ酸配列を含み、かつ／または前記軽鎖可変領域が、配列番号６４に記載のアミノ酸配列を含む、請求項３３または本明細書におけるいずれかの他の請求項に記載の抗体。
【請求項３５】
前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１３〜３４のいずれか一項または本明細書におけるいずれかの他の請求項に記載の抗体。
【請求項３６】
前記抗体が、ヒト化抗体である、請求項１３〜３５のいずれか一項または本明細書におけるいずれかの他の請求項に記載の抗体。
【請求項３７】
前記抗体が、単鎖抗体である、請求項１３〜３６のいずれか一項または本明細書におけるいずれかの他の請求項に記載の抗体。
【請求項３８】
前記抗体が、Ｆａｂ、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ´）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、二量体、ナノボディ、低分子化抗体、二特異性抗体、およびそれらの多量体から選択される結合断片である、請求項１３〜３９のいずれか一項または本明細書におけるいずれかの他の請求項に記載の抗体。
【請求項３９】
請求項１３〜３８のいずれか一項または本明細書におけるいずれかの他の請求項に記載の抗体と、検出可能な標識または輸送部分、任意選択的に、血液脳関門にわたる、かつ／または細胞内への輸送を容易にする分子と、を含む、免疫複合体。
【請求項４０】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の化合物もしくは免疫原のアミノ酸残基、請求項１３〜３８のいずれか一項に記載の抗体、または請求項３９もしくは本明細書におけるいずれかの他の請求項に記載のタンパク質性免疫複合体、またはその任意の一部をコードする、核酸。
【請求項４１】
請求項１３〜３８のいずれか一項または本明細書におけるいずれかの他の請求項に記載の抗体を発現する細胞であって、任意選択的に、前記細胞がハイブリドーマである、細胞。
【請求項４２】
任意選択的に希釈剤と共に、請求項１〜８のいずれか一項または本明細書におけるいずれかの他の請求項に記載の環状化合物、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の免疫原、請求項１３〜３８のいずれか一項に記載の抗体、請求項３９に記載の免疫複合体、請求項４０に記載の核酸、または請求項４１もしくは本明細書におけるいずれかの他の請求項に記載の細胞を含む、組成物。
【請求項４３】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の環状化合物または請求項９〜１２のいずれか一項または本明細書におけるいずれかの他の請求項に記載の免疫原を含む、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
アジュバントを含む、請求項４３または本明細書におけるいずれかの他の請求項に記載の組成物。
【請求項４５】
前記アジュバントが、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム水酸化アルミニウムミョウバン、モノホスホリルリピドＡ、および／またはＱＳ２１である、請求項４４または本明細書におけるいずれかの他の請求項に記載の組成物。
【請求項４６】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の免疫原、請求項１３〜３８のいずれか一項に記載の抗体、請求項３９に記載の免疫複合体、請求項４０に記載の核酸、請求項４１に記載の細胞、または請求項４２〜４５のいずれか一項もしくは本明細書におけるいずれかの他の請求項に記載の組成物を含む、キット。
【請求項４７】
請求項１３〜３８のいずれか一項に記載の抗体を作製する方法であって、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の化合物もしくは免疫原、または前記化合物もしくは免疫原を含む組成物を対象に投与することと、投与された前記化合物もしくは免疫原について選択的な抗体および／または抗体を発現する細胞を単離することと、を含む、方法。
【請求項４８】
ミスフォールドＴＤＰ−４３ポリペプチドを含む疑いがある試料が、ミスフォールドＴＤＰ−４３ポリペプチドを含有するかどうかを判定する方法であって、
ａ．抗体：ミスフォールドＴＤＰ−４３ポリペプチド複合体を形成するための許容可能な条件下で、前記試料を請求項１３〜３８のいずれか一項に記載の抗体と接触させることと、
ｂ．任意の複合体の存在を検出することと、を含み、
検出可能な複合体の存在は、前記試料がミスフォールドＴＤＰ−４３ポリペプチドを含有し得ることを示す、方法。
【請求項４９】
前記試料が、脳組織抽出物、脊髄組織、および／またはＣＳＦを含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記試料が、ヒト試料であり、任意選択的に、ＡＬＳもしくはＦＴＤを有するか、または有する疑いがある対象に由来する、請求項４８または４９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
これは、２０１７年５月３０日に出願された、米国仮特許出願第６２／５１２，６４７号、２０１７年１０月１０日に出願された、同第６２／５７０，５８２号、および２０１７年１２月７日に出願された、同第６２／５９５，８６６号の優先権に基づく米国特許法第１１９条の利益を主張する特許協力条約出願であり、これらの出願の各々は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表の組み込み
ＥＦＳ−ＷＥＢを介して提出され、２０１８年５月３０日に作出された、配列表「Ｐ５１８６６ＰＣ００＿ＳＴ２５」（２９，２１１バイト）のコンピュータ可読媒体が、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本開示は、ＴＤＰ−４３エピトープおよびそれらに対する抗体に関し、より具体的には、ミスフォールドＴＤＰ−４３中で選択的にアクセス可能であることが予測される立体配座ＴＤＰ−４３エピトープおよび関連する抗体組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
４３ｋＤａ（ＴＤＰ−４３）の相互作用応答（ＴＡＲ）要素のＤＮＡ結合タンパク質は、４１４アミノ酸タンパク質であり、Ｎ末端ユビキチン様ドメイン（ＮＴＤ、残基１〜１０２）、残基１０６〜１７７（ＲＲＭ１）および残基１９２〜２５９（ＲＲＭ２）からなる２つのＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ）、ならびにＣ末端ドメイン（ＣＴＤ、残基２７４〜４１４）から構成される。ＮＴＤは、核局在化シグナル（ＮＬＳ、残基８２〜９８）を含有する。ＲＲＭ２は、残基２３９〜２５０からの核外搬出シグナル（ＮＥＳ）を含む。
【０００５】
ＴＤＰ−４３は、主に、ＲＮＡ代謝において中心的な役割を果たす核タンパク質である。ＴＤＰ−４３は、罹患した神経細胞内の病原性内包物が翻訳後修飾されたＴＤＰ−４３を含有し得るため、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）および前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）疾患スペクトラムにおける研究の焦点になっている。ＴＤＰ−４３のＣＴＤは、ほぼすべての家族性ＡＬＳ／ＦＴＤ関連突然変異がＴＤＰ−４３に見られる場所であるため、疾患に特に関連している。
【０００６】
他の突然変異には、ベータストランド４と５との間でＲＲＭ１に位置するＤ１６９Ｇ、ＮＬＳ領域における突然変異であるＡ９０Ｖ、ならびにＲＲＭ２とＣ末端ドメインとの間のリンカー中にある突然変異Ｋ２６３ＥおよびＮ２６７Ｓが含まれる。
【０００７】
ＲＲＭ１およびＲＲＭ２は、ＮＭＲによって構造的に判定されている。例えば、ＲＲＭ１は、原子分解三次元構造データのデータベースであるタンパク質構造データバンク（ＰＤＢ）においてＰＤＢエントリ４ＩＵＦとして入手可能であり、ＲＲＭ２は、ＰＤＢエントリ１ＷＦ０として入手可能であり、ＮＴＤは、ＰＤＢエントリ２Ｎ４Ｐとして入手可能である。
【０００８】
４ＩＵＦの構造は、Ｋｕｏ  ｅｔ  ａｌ．に報告されている［１］。１ＷＦ０の構造は、Ｈｅ  ｅｔ  ａｌに報告されている［２］。２Ｎ４Ｐの構造は、Ｍｏｍｐｅａｎ  ｅｔ  ａｌ．に報告されている［３］。
【０００９】
ＴＤＰ−４３は、突発性および家族性の両方の形態のＡＬＳおよびＦＴＤを有する患者の神経細胞内包物中で高リン酸化、ユビキチン化、および断片化されることが見出された［４］。
【００１０】
ＴＤＰ−４３の凝集は、ここでは、ＡＬＳのほぼすべて（およそ９７％）の場合およびＦＴＤの場合のざっと半分（およそ４５％）で見られている。ＴＤＰ−４３は、ＡＬＳ患者の運動神経細胞中に見られる細胞質内包物の主な成分のうちの１つである。
【００１１】
ＴＤＰ−４３内包物の病理学的前駆体は、機能性ＴＤＰ−４３の濃度をはるかに下回る濃度を有し得る。低濃度のミスフォールドＴＤＰ−４３は、この標的を見つけにくいものにする。正常なＴＤＰ−４３を標的とする抗体または薬物は、細胞にとって致命的である可能性がある。ＴＤＰ−４３は、胚発生に必須のＲＮＡ調節タンパク質である［５］。
【００１２】
ＴＤＰ−４３に結合する抗体が記載されている。
【００１３】
ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＰＲＯＧＮＯＳＴＩＣ  ＡＮＤ／ＯＲ  ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣ  ＯＦ  ＮＥＵＲＯＤＥＧＥＮＥＲＡＴＩＶＥ  ＤＩＳＥＡＳＥ，ＭＥＴＨＯＤＳ  ＴＯ  ＩＤＥＮＴＩＦＹ  ＣＡＮＤＩＤＡＴＥ  ＣＯＭＰＯＵＮＤＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＵＮＤＳ  ＦＯＲ  ＴＲＥＡＴＩＮＧ  ＮＥＵＲＯＤＥＧＥＮＥＲＡＴＩＶＥ  ＤＩＳＥＡＳＥと題された、ＷＯ２０１２／１７４６６６は、抗ＴＤＰ−４３抗体を使用してＴＤＰ−４３とＮＦ−κβ  ｐ６５との間の相互作用を評価することを通して、ＡＬＳおよびＦＴＤなどの神経変性疾患を診断するための方法を開示している。
【００１４】
ＴＤＰ−４３−ＢＩＮＤＩＮＧ  ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ  ＵＳＥＦＵＬ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＴＲＥＡＴＭＥＮＴ  ＯＦ  ＮＥＵＲＯＤＥＧＥＮＥＲＡＴＩＶＥ  ＤＩＳＥＡＳＥＳと題された、ＷＯ２０１６／０８６３２０は、ＴＤＰ−４３のＲＲＭ１ドメインに結合して、ＡＬＳおよびＦＴＤの治療のためのＮＦ−κβとのその相互作用を阻害する抗体を開示している。
【００１５】
天然に折り畳まれたＴＤＰ−４３上でミスフォールドＴＤＰ−４３に優先的または選択的に結合する抗体が望ましい。
【発明の概要】
【００１６】
残基ＴＴＥＱ（配列番号１）またはそれらの一部を含み、かつ／またはそれらからなるＴＤＰ−４３中の立体配座エピトープ、またはそれに対する抗体を本明細書に記載する。エピトープは、天然型タンパク質中の立体配座から区別する立体配座で、ＴＤＰ−４３のミスフォールド種中に選択的に露出され得るエピトープとして同定される。
【００１７】
ある態様は、１）ＴＴＥ、２）ＴＴＥＱ（配列番号１）、３）ＴＥＱ、またはそれらの一部、および最大６つのＴＤＰ−４３の連続する残基を含むＴＤＰ−４３ペプチドと、リンカーとを含む、化合物、任意選択的に、環状化合物であって、リンカーが、ＴＤＰ−４３ペプチドのＮ末端残基および／またはペプチドのＣ末端残基に共有結合され、ＴＤＰ−４３ペプチド中の少なくとも１つのアミノ酸が、対応する直鎖状および／または天然型ＴＤＰ−４３中のＴ、Ｅ、および／またはＱよりも交互立体配座である、化合物を含む。
【００１８】
実施形態では、ＴＤＰ−４３ペプチドは、ＴＴＥＱ（配列番号１）、ＴＴＥ、ＴＥＱ、ＫＴＴＥ（配列番号１０）、ＫＴＴＥＱ（配列番号１２）、ＴＥＱＤ（配列番号８）、またはＴＴＥＱＤ（配列番号９）から選択され、任意選択的に、環状化合物は、配列番号２、３、１３、２２−３９、および４２−４４のうちのいずれか１つから選択される化合物である。
【００１９】
実施形態では、環状化合物は、本明細書に記載の環状構造から選択され、好ましくは、環状化合物は、配列番号２、３、１３、２２〜３９、および４２〜４４、より好ましくは、配列番号２、３、２２、２３、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、および４２のうちのいずれか１つから選択される配列、任意選択的に、配列番号２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、および４２のうちのいずれか１つから選択される配列、または配列番号２、３、２２、２３、および４２から選択される配列を有する。
【００２０】
別の態様では、本明細書に記載の環状化合物を含む免疫原も提供する。
【００２１】
実施形態では、環状化合物は、担体タンパク質もしくは免疫原性向上成分に結合され、かつ／またはアジュバントと共に製剤化される。
【００２２】
実施形態では、担体タンパク質は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）であるか、または免疫原性向上成分は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）であり、かつ／またはアジュバントは、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウムミョウバン、モノホスホリルリピドＡ、およびＱＳ２１から選択される。
【００２３】
別の態様は、対応する直鎖状化合物および／または天然型ＴＤＰ−４３ポリペプチドと比較して、本明細書に記載の環状化合物中の前記ＴＤＰ−４３ペプチド中のエピトープに選択的に結合する抗体を提供する。
【００２４】
実施形態では、抗体は、対応する直鎖状化合物および／または天然型ＴＤＰ−４３ポリペプチドと比較して、１）ＴＴＥ、２）ＴＥＱ、３）ＴＴＥＱ（配列番号１）、４）ＫＴＴＥ（配列番号１０）、５）ＫＴＴＥＱ（配列番号１２）、６）ＴＥＱＤ（配列番号８）、および／または７）ＴＴＥＱＤ（配列番号９）を含む環状化合物に選択的に結合する。
【００２５】
別の実施形態では、抗体は、対応する直鎖状化合物および／または天然型ＴＤＰ−４３ポリペプチドと比較して、環状化合物について少なくとも２倍、３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、または少なくとも２０倍、より選択的である。
【００２６】
実施形態では、本明細書に記載の抗体と同じかまたは重複するＴＤＰ−４３ペプチドを含むミスフォールドＴＤＰ−４３または環状ペプチドとの結合について競合する抗体であって、好ましくは、表１０に提供される重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域と少なくとも８０％以上の配列同一性を共有する、抗体も提供する。
【００２７】
実施形態では、抗体は、本明細書に記載の環状化合物または免疫原を使用して産生またはスクリーニングされる。
【００２８】
実施形態では、抗体は、例えば表１０に記載のＣＤＲのセットを含む。
【００２９】
別の実施形態では、抗体は、ｉ）表１０に記載のアミノ酸配列、ｉｉ）当該重鎖可変領域の配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、ＣＤＲ配列が、当該重鎖可変領域の配列に記載の通りである、アミノ酸配列、またはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、かつ／あるいは抗体が、ｉ）表１０に記載のアミノ酸配列、ｉｉ）当該軽鎖可変領域の配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、ＣＤＲ配列が、当該軽鎖可変領域の配列に記載される通りである、アミノ酸配列、またはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、任意選択的に、重鎖可変領域のアミノ酸配列が、表１０に記載のヌクレオチド配列またはそのコドン縮退もしくは最適化バージョンによってコードされ、かつ／あるいは軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、表１０に記載のヌクレオチド配列またはそのコドン縮退もしくは最適化バージョンによってコードされる。
【００３０】
別の実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、および／または単鎖抗体、または前述のいずれかの結合断片である。
【００３１】
別の態様は、本明細書に記載の抗体および検出可能な標識または輸送部分、任意選択的に、血液脳関門にわたる、かつ／または細胞内への輸送を容易にする分子を含む、免疫複合体を含む。
【００３２】
さらなる態様は、本明細書に記載の化合物、免疫原のアミノ酸残基、抗体、またはタンパク質性免疫複合体、またはその任意の一部をコードする、核酸を提供する。
【００３３】
別の態様は、本明細書に記載の抗体を発現する細胞であって、任意選択的に、細胞がハイブリドーマである、細胞を提供する。
【００３４】
別の態様は、任意選択的に希釈剤と共に、本明細書に記載の環状化合物、免疫原、抗体、免疫複合体、核酸、または細胞を含む、組成物である。
【００３５】
実施形態では、組成物は、本明細書に記載の環状化合物または免疫原およびアジュバントを含む。
【００３６】
実施形態では、アジュバントは、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム水酸化アルミニウムミョウバン、モノホスホリルリピドＡ、および／またはＱＳ２１である。
【００３７】
本明細書に記載の１つ以上の成分、例えば、本明細書に記載の化合物、免疫原、抗体、免疫複合体、核酸、細胞、または組成物を含む、キットも提供する。
【００３８】
別の態様では、本明細書に記載の抗体を作製する方法であって、本明細書に記載の免疫原、または免疫原を含む組成物を対象に投与することと、投与された免疫原のＴＤＰ４３ペプチドについて選択的または特異的な抗体および／または抗体を発現する細胞を単離することと、を含む、方法も提供する。
【００３９】
さらなる態様は、ミスフォールドＴＤＰ−４３ポリペプチドを含む疑いがある試料が、ミスフォールドＴＤＰ−４３ポリペプチドを含有するかどうかを判定する方法であって、
抗体：ミスフォールドＴＤＰ−４３ポリペプチド複合体を形成するための許容可能な条件下で、試料を本明細書に記載の抗体と接触させることと、
任意の複合体の存在を検出することと、を含み、
検出可能な複合体の存在は、試料がミスフォールドＴＤＰ−４３ポリペプチドを含有し得ることを示す、方法を含む。
【００４０】
実施形態では、試料は、脳組織抽出物、脊髄組織、および／またはＣＳＦを含む。別の実施形態では、試料は、ヒト試料であり、任意選択的に、ＡＬＳもしくはＦＴＤを有するか、または有する疑いがある対象に由来する。
【００４１】
本開示の他の特徴および利点は、以下の詳細な記載から明らかになるであろう。しかしながら、本開示の好ましい実施形態を示す、詳細な記載および特定の実施例は、本開示の趣旨および範囲内の様々な変更および修正がこの詳細な記載から当業者に明らかになるため、単なる例示として与えられることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
本開示の実施形態は、これより、以下の図面に関して記載される。
【００４３】
【図１Ａ−Ｃ】ミスフォールドＴＤＰ−４３中のエピトープの露出を予測するために使用される異なる測定基準を描画するグラフである。図１Ａは、エピトープを選択する基準としてＳＡＳＡ（ΔＳＡＳＡ）の増加を使用した、天然型構造ＰＤＢ  ４ＩＵＦから生じるエピトープの予測を表すグラフである。ＴＴＥエピトープは、ＰＤＢ構造４ＩＵＦについての予測として現れる。図１Ｂは、エピトープ選択についての基準として天然型接触の喪失を使用した、構造ＰＤＢ  ４ＩＵＦから生じるエピトープ予測を示すグラフである。ＴＴＥＱエピトープ（配列番号１）は、この測定基準を使用した予測として現れる。図１Ｃは、ＳＡＳＡ（ΔＳＡＳＡ）の増加、エピトープの動力学の増加を表す、原子配置の平均二乗変動（ＲＭＳＦ）の増加、および天然型接触の数であるΔ接触の減少を含む、いくつかの測定基準を示す。これら３つの異なる測定基準は、それぞれ、エピトープＴＴＥ、ＴＴＥ、およびＴＴＥＱ（配列番号１）を予測する。
【図２Ａ−Ｊ】天然に折り畳まれたＴＴＥＱ（配列番号１）からミスフォールドＴＴＥＱ（配列番号１）を立体配座的に区別し得るいくつかの二面角についての二面角分布を示すグラフである。天然型集合体（破線）、偏倚集合体（実線）（ＴＤＰ−４３のミスフォールドＲＲＭ１の表示）、および環状ＣＧＧＴＴＥＱＧＧ（配列番号２）（陰影ヒストグラム）足場（免疫原との接合において使用するための）の分布を、残基トレオニン１１５（Ｔ１１５）の側鎖および骨格原子を伴う、４つの原子によって定義された以下の二面角：Ｃ−Ｃα−Ｃβ−Ｏγ１（図２Ａ）、Ｃ−Ｃα−Ｎ−ＨＮ（図２Ｂ）、Ｏ−Ｃ−Ｃα−Ｎ（図２Ｃ）について示す。残基Ｔ１１６についての二面角分布を、残基Ｔ１１６の側鎖および骨格原子を伴う、角度Ｃβ−Ｃα−Ｎ−ＨＮ（図２Ｄ）、Ｎ−Ｃα−Ｃβ−Ｏγ１（図２Ｅ）、およびＯ−Ｃ−Ｃα−Ｎ（図２Ｆ）について示す。残基Ｅ１１７についての二面角分布を、角度Ｃα−Ｃβ−Ｃγ−Ｃδ（図２Ｇ）、Ｏε１−Ｃδ−Ｃγ−Ｃβ（図２Ｈ）について示す。残基Ｑ１１８についての二面角分布を、角度Ｏ−Ｃ−Ｃα−Ｃβ（図２Ｉ）、および角度Ｃα−Ｃβ−Ｃγ−Ｃδ（図２Ｊ）について示す。この後者の二面角分布は、天然型、偏倚、および環状間を区別しない角度の例示として示されている。重複割合値を表１Ａに提供する。分布についての二面角のピーク値を表２Ａに与える。
【図３Ａ−Ｈ】天然型集合体（破線）、偏倚集合体（実線）、および環状ＣＧＧＴＴＥＱＧＧ（配列番号２）（陰影ヒストグラム）における残基１１５Ｔ、１１６Ｔ、および１１７Ｅ、ならびに１１８Ｑについての平衡骨格ラマチャンドラン角度（ファイまたはφ、およびプサイまたはψ）。残基Ｔ１１５についてのラマチャンドラン角度分布を、骨格角度Ｃ´−Ｎ−Ｃα−Ｃ´（以後、ファイ）（図３Ａ）、Ｎ−Ｃα−Ｃ´−Ｎ（以後、プサイ）（図３Ｂ）について示す。ファイおよびプサイも、Ｔ１１６（図３Ｃ、およびＤ）、Ｅ１１７（図３ＥおよびＦ）、およびＱ１１８（図３ＧおよびＨ）について示す。これらのラマチャンドラン角度の重複確率を表３Ａに示す。対応する分布のピーク角度を表４Ａに示す。
【図４Ａ】垂直破線によって描写されるＴＴＥＱ（配列番号１）を含む、ＴＤＰ−４３のＲＲＭ１中のすべてのアミノ酸について、残基指標の関数として溶解度を示すグラフである。エピトープは、主な配列に沿った平均溶解度よりも高い領域内にある。
【図４Ｂ】残基ＴＴＥＱ（配列番号１）についてのＳＡＳＡを示し、環状ペプチドシクロ（ＣＧＧＴＴＥＱＧＧ）（配列番号２）中のＴＴＥＱ（配列番号１）は、円図柄を含む実線として表され、偏倚した部分的に折り畳まれていないペプチド中のＴＴＥＱ（配列番号１）は、正方形図柄を含む破線に表され、天然型構造４ＩＵＦの文脈でのＴＴＥＱ（配列番号１）は、三角形図柄を含む薄い灰色の線に表される。
【図４Ｃ】残基ＴＴＥＱ（配列番号１）についてのＳＡＳＡを示し、環状ペプチドシクロ（ＣＧＴＴＥＱＧ）（配列番号３）中のＴＴＥＱ（配列番号１）は、円図柄を含む実線として表され、偏倚した部分的に折り畳まれていないペプチド中のＴＴＥＱ（配列番号１）は、正方形図柄を含む破線に表され、天然型構造４ＩＵＦの文脈でのＴＴＥＱ（配列番号１）は、三角形図柄を含む薄い灰色の線に表される。
【図５Ａ．Ｂ】ＴＴＥＱ（配列番号１）エピトープの環状および天然型集合体の集合体の重心構造である。黒く着色された立体配座は、環状ペプチドの最大クラスターの重心であり、そのため、環状ペプチドの典型的な立体配座を最良に表す。白く着色された立体配座は、天然型集合体（「天然型ペプチド」とも称される）中のＴＴＥＱ（配列番号１）の最大クラスターの重心であり、そのため、天然型集合体中のＴＴＥＱ（配列番号１）の典型的な立体配座を最良に表すべきである。図５Ａは、環状ＣＧＧＴＴＥＱＧＧ（配列番号２）中の残基Ｔ１１５、Ｔ１１６、Ｅ１１７、およびＱ１１８（ＴＴＥＱ配列番号１）の整列された重心構造を示し、天然型ペプチドは、図において重複されている。図５Ｂは、両方ともリコリス表現でレンダリングされた、環状ペプチド構造ＣＧＴＴＥＱＧ（配列番号３）および天然型ペプチド構造ＴＴＥＱ（配列番号１）について、図５Ａと同じであり、そのため、側鎖の配向を見ることができる。
【図６Ａ−Ｅ】天然型および偏倚表現でのＴＴＥ／ＴＴＥＱエピトープの概略的表現である。エピトープＴＴＥＱ（配列番号１）のＳＡＳＡは、配列ＣＧＧＴＴＥＱＧＧ（配列番号２）およびＣＧＴＴＥＱＧ（配列番号３）の天然型、偏倚、および環状ペプチドの文脈で示される。Ｔ１１５およびＥ１１７を標識化する。図６Ａは、天然型集合体中のエピトープＴＴＥＱ（配列番号１）のＳＡＳＡを示す。図６Ｂは、偏倚集合体中のエピトープＴＴＥＱ（配列番号１）のＳＡＳＡを示す。図６Ｃは、環状ペプチドシクロ（ＣＧＧＴＴＥＱＧＧ）（配列番号２）集合体中のエピトープＴＴＥＱ（配列番号１）のＳＡＳＡを示す。図６Ｄは、環状ペプチドシクロ（ＣＧＴＴＥＱＧ）（配列番号３）集合体中のエピトープＴＴＥＱ（配列番号１）のＳＡＳＡを示す。これらのパネルは、環状ペプチドによって提示される抗原性表面が偏倚重心構造の抗原性表面とより類似しており、天然型構造における表面とは区別されることを定性的に示す。これは、天然型集合体中に存在するが、偏倚集合体中では壊れている相互作用を分析することによって裏付けられる。特に、図６Ｅは、残基Ｅ１１７およびＫ１３７の側鎖間の塩橋を示す。この塩橋は、天然型集合体中には存在する（図６Ｅの左パネル）が、偏倚集合体（図６Ｅの右パネル）中では壊れている。この塩橋の破壊により、Ｅ１１７の側鎖への露出が容易になり、抗体結合のために利用可能にする。
【図７Ａ−Ｊ】直鎖状、環状、偏倚、および／または天然型立体配座を比較する一連の描画である。図７Ａ、Ｂは、ＲＭＳＤによるクラスタリング描画であり、軸は、環状ペプチド集合体の重心構造におけるＴＴＥＱ（配列番号１）に対するＴＴＥＱ（配列番号１）のＲＭＳＤに対応し、天然型集合体の集合体の重心構造におけるＴＴＥＱ（配列番号１）に対するＴＴＥＱ（配列番号１）のＲＭＳＤに対応し、ＰＤＢ  ＩＤ  ４ＩＵＦの天然型構造的集合体の重心構造におけるＴＴＥＱ（配列番号１）に対するＴＴＥＱ（配列番号１）のＲＭＳＤに対応する。図７Ａは、描画である。各点は、環状ペプチドシクロ（ＣＧＧＴＴＥＱＧＧ）（配列番号２）平衡集合体（説明文において述べられている円）、直鎖状ペプチド平衡集合体（説明文で述べられている＋図柄）、ＰＤＢ  ＩＤ  ４ＩＵＦから始まる天然型構造平衡集合体（説明文において述べられている逆三角形）、または偏倚構造的集合体（説明文に述べられている星印）のいずれかから取られた所与の立体配座に対応する。図７Ｂは、図７Ａと類似しているが、直鎖状集合体は示されておらず、偏倚集合体は、これより、＋図柄によって表される。図７Ｃは、収束を示すために、試料採取された立体配置の数の関数として異なる集合体間の重複割合を示す描画である。数的重複割合を表６Ａに与える。図７ＤおよびＥは、図７ＡおよびＢと同じであるが、環状ペプチドシクロ（ＣＧＴＴＥＱＧ）（配列番号３）についての情報を示す。図７Ｆは、図７Ｃと同じであるが、環状ペプチドシクロ（ＣＧＴＴＥＱＧ）（配列番号３）についての情報を示す。図７Ｇは、分布の部分がカットオフ値よりも大きい密度を有する第１の調査結果によって定義される、環状分布と天然型分布との間の相関関係を示し、そのため、所与の割合の合計分布の両方、例えば、合計分布の６０％を与える環状分布および天然型分布についての密度カットオフが包含される。次に、これらの部分分布について、相関係数は、
【数１】
2020522475.tif 000003
のように定義される。天然型分布とＣＧＧＴＴＥＱＧＧ（配列番号２）環状分布との間のそのように定義された相関係数は、それぞれの分布の１００％が含まれる場合に約４．５％まで収束する。図７Ｈは、それぞれの分布の１００％が含まれる場合に約８％まで収束する、環状ペプチドシクロ（ＣＧＴＴＥＱＧ）（配列番号３）集合体および天然型集合体についての同じ相関関係を描画する。図７Ｉは、シクロＣＧＧＴＴＥＱＧＧ（配列番号２）集合体と天然型集合体との間の構造的重複に対する単一の残基欠失の効果を試験する。上記に定義されるように、天然型で環状であり、環状で天然型である、重複の平均を使用する。Ｘ軸は、試料採取された立体配座の数に対応し、結果の収束の評価基準として使用され、横座標の最大値での縦座標値が最も信頼性の高い値である。図７Ｊは、環状ペプチドシクロ（ＣＧＴＴＥＱＧ）（配列番号３）に対応する。結論は、このエピトープ足場について同じである。Ｔ１１５は、有意な立体配座選択性を与える。
【図８Ａ．Ｂ】シクロ（ＣＧＴＴＥＧ）（配列番号２８）（図８Ａ）およびシクロ（ＣＧＴＴＥＧＧ）（配列番号２９）（図８Ｂ）についてのＲＭＳＤクラスタリング描画を示す。
【図９Ａ．Ｂ】シクロ（ＣＧＴＴＥＧ）（配列番号２８）（図９Ａ）およびシクロ（ＣＧＴＴＥＧＧ）（配列番号２９）（図９Ｂ）についての異なる集合体間の重複割合を描画した描画である。
【図１０】シクロ（ＣＧＧＴＴＥＱＧＧ）に対して産生された抗体を使用した、ミスフォールドＴＤＰ−４３の染色を示す一連の免疫蛍光画像である。
【図１１Ａ】脊髄ホモジネートとの陰性対照ＩｇＧ１抗体の背景結合を示す免疫ドットプロットである。
【図１１Ｂ】脊髄ホモジネートとの陽性対照抗のＴＤＰ４３ポリクローナル抗体の結合を示す免疫ドットブロットである。
【図１１Ｃ】脊髄ホモジネートとの環状ペプチドシクロ（ＣＧＧＴＴＥＱＧＧ）（配列番号２）およびシクロ（ＣＧＴＴＥＱＧ）（配列番号３）に対して産生された抗体の結合を示す免疫ドットブロットである。
【図１２Ａ】ＤＡＰＩで染色されたＴＤＰ−４３ΔＮＬＳを発現するＨＥＫ２９３ＦＴ細胞の画像である。
【図１２Ｂ】抗ＨＡで染色されたＴＤＰ−４３ΔＮＬＳを発現するＨＥＫ２９３ＦＴ細胞の画像である。
【図１２Ｃ】シクロ（ＣＧＧＴＴＥＱＧＧ）（配列番号２）を含む免疫原に対して産生された抗体で染色されたＴＤＰ−４３ΔＮＬＳを発現するＨＥＫ２９３ＦＴ細胞の画像である。
【図１２Ｄ】シクロ（ＣＧＧＴＴＥＱＧＧ）（配列番号２を含む免疫原に対して産生された抗ＨＡ抗体と抗体との間の染色の共局在化を示す画像である。
【図１３Ａ】配列決定された抗体の重鎖のタンパク質配列についての可変領域の整列である。ＣＤＲ領域をボックス化する。
【図１３Ｂ】配列決定された抗体の軽鎖のタンパク質配列についての可変領域の整列である。ＣＤＲ領域をボックス化する。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
ミスフォールディング特異的抗体の生成は、天然型構造において、存在しないか、またはより少ない程度に存在する、ミスフォールドＴＤＰ−４３ペプチドに対する標的の同定を通して達成され得る。ミスフォールディング特異的エピトープは、主な配列において、天然型構造における対応するセグメントと異なる必要はなく、しかしながら、ミスフォールド集合体の文脈において立体配座的に区別されるべきである。すなわち、エピトープは、天然型構造において存在しない（または好ましくない）ミスフォールド集合体中の骨格および／または側鎖立体配座の観点で区別される立体配座を提示するだろう。
【００４５】
天然型タンパク質領域に対して産生された抗体は、ミスフォールドタンパク質について選択的でない傾向があり、したがって、天然型機能性タンパク質に同様に結合する。
【００４６】
本明細書に記載のように、ＴＤＰ−４３のミスフォールド形態について選択的であり得る抗体を発生させるために、本発明者らは、天然型折り畳みの文脈で阻害が生じやすく、ミスフォールドタンパク質の表面上に同様に露出され得る、ＴＤＰ−４３配列の領域を同定することを求めた。
【００４７】
実施例に記載のように、標準化された力場による分子動力学を使用したコンピュータシミュレーションを用いた。折り畳み構造の実験的に有効性が確認された構造モデルは、異常な細胞環境における外部チャレンジの際に障害が生じやすい隣接する主な配列の１つ以上の領域を生じるように、分子動力学を使用して部分的に展開されるその「天然型」立体配座から全体的に偏倚している。
【００４８】
これらの弱い安定領域は、発生期のミスフォールドタンパク質、またはミスフォールド病原性種中に露出される可能性があり、この文脈において、天然型集合体中に存在するよりも交互立体配座中に存在すると仮説を立てた。したがって、それらはミスフォールドタンパク質特異的エピトープ予測を構成し得る。
【００４９】
理論に縛られることは望まないが、ミスフォールドタンパク質中のこれらの配列領域は、天然型折り畳み（例えば、表面上にある）の立体配座とは区別される立体配座において露出される可能性があり、同様に、対応する数量が天然型ＴＤＰ−４３において示すよりも、より大きく露出された表面領域を有する領域、または異なる二面角分布によって見られる交互側鎖立体配座、および／または構造的整列によって測定される異なる全体的な立体配座中に露出され得る。
【００５０】
実施例に記載されるように、本発明者らは、天然型構造の文脈において阻害が生じやすく、そのため、部分的に形成された天然型構造中に露出される可能性が高いと予測される領域における最小エピトープを同定した。本発明者らは、より大きく露出された表面領域などの交互立体配座の基準を満たし、かつ／または平均二乗偏差（ＲＭＳＤ）によって天然型集合体に対して容易に整列しないが、より好ましくは、偏倚した、部分的に障害が生じた集合体に対して整列する、同定されたエピトープを含む環状化合物を設計した。
【００５１】
これらのエピトープに対して産生された抗体を、細胞培養中のミスフォールドＴＤＰ−４３を認識する免疫蛍光法によって、かつＡＬＳ患者対対照由来の脊髄ホモジネート中の病原性ＴＤＰ４３に結合する免疫ドットブロッティングによって示す。
【００５２】
Ｉ．定義
本明細書で使用される場合、「ＴＤＰ−４３」という用語は、代替的に、「ＴＤＰ４３」とも称されるか、または本明細書で使用される場合、「ＴＤＰ」は、野生型ＴＤＰ−４３、天然型ＴＤＰ−４３を含むＴＤＰ−４３のすべての形態、ならびにすべての種、特にヒトＴＤＰ−４３（すなわち、ｈＴＤＰ−４３）由来の突然変異型およびそれらの類似体を含むミスフォールド形態を意味する。ヒトＴＤＰ−４３は、典型的には４１４アミノ酸残基のタンパク質であり、アミノ酸配列（例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ１３１４８）およびヌクレオチド配列（例えば受託番号ＨＧＮＣ：１１５７１）は、以前に特徴付けられている。ＴＤＰ−４３は、ＲＲＭ１およびＲＲＭ２ドメインを含む。ＴＤＰ−４３のＲＲＭ１は、アミノ酸１０６〜１７７からなるタンパク質の第１のＲＮＡ認識モチーフを指す。ＴＤＰ−４３のＲＲＭ１ドメインの構造は決定されており、ＰＤＢエントリ４ＩＵＦとしてタンパク質データバンク上に列挙されている。ＰＤＢ  ４ＩＵＦ構造をコンピュータ上で平衡させて、本明細書で不定的に「ＲＲＭ１の天然型構造」、「ＴＤＰ−４３の平衡天然型集合体」、「ＴＤＰ−４３のＲＲＭ１の平衡天然型集合体」、または「ＴＤＰ−４３天然型構造的集合体」と称される、ＴＤＰ−４３の天然型構造におけるエピトープの天然型立体配座のすべての測定値に対して使用された、平衡集合体を得ることができる。
【００５３】
本明細書で使用される場合、「野生型」とは、非突然変異または天然に生じるタンパク質の主なアミノ酸配列を指す。
【００５４】
本明細書で使用される場合、「天然型」とは、特異的タンパク質またはその一部の正常な三次元構造を指す（例えば、天然型ＴＤＰ−４３  ＲＲＭ１ドメインの結晶構造の原子レベルの座標が、タンパク質構造データバンク受託番号４ＩＵＦで入手可能である）。天然型ＴＤＰ−４３は、任意選択的に、「天然に折り畳まれた」ＴＤＰ−４３、「正常に折り畳まれた」ＴＰＤ−４３、および／または「健常な」ＴＤＰ−４３と称される。同様に、ＴＤＰ−４３の天然型ＲＲＭ１ドメインは、任意選択的に、ＴＤＰ−４３の「天然に折り畳まれた」ＲＲＭ１ドメインまたはＴＰＤ−４３の「正常に折り畳まれた」ＲＲＭ１ドメインと称される。したがって、「天然型ＴＤＰ−４３」、または「天然に折り畳まれたＴＤＰ−４３」という用語は、本明細書では、Ｘ線結晶構造解析下での、または核磁気共鳴測定から再構成されるような、天然型構造を示す、非共有結合した個々のＴＤＰ−４３ペプチドを含む分子構造を含む、発生期の翻訳後に天然に折り畳まれたＴＤＰ−４３、および／または非疾患状態（例えば、正常な細胞）で折り畳まれた二量体ＴＤＰ−４３を指す。ＲＲＭ１の天然型構造は、アルファらせんおよびベータシートの両方からなるアルファ／ベータ構造を有する。
【００５５】
本明細書で使用される場合、「ミスフォールド」とは、ポリペプチドまたはその一部の二次構造および三次構造を指し、ポリペプチドが、適切な機能状態でのそのポリペプチドについて正常でない立体配座を採用したことを示す。ミスフォールディングは、アミノ酸欠失、置換、または付加などのタンパク質中の突然変異によって引き起こされ得るが、野生型配列タンパク質も、疾患においてミスフォールドされ、微小環境条件および／またはニトロ化、酸化、カルボニル化、もしくは他の修飾などのアミノ酸修飾の結果として、例えば疾患特異的エピトープを露出する可能性がある。他の翻訳後修飾には、異常なユビキチン化、リン酸化、アセチル化、ＳＵＭＯ化、およびＣ末端断片のユビキチン化への開裂が含まれる。したがって、本明細書でポリペプチドを指す場合、「ミスフォールドＴＤＰ−４３ポリペプチド」または「ミスフォールドＴＤＰ−４３」は、立体配座が、天然型構造の一部を含有して、部分的に順序付けられ、天然型ＴＤＰ−４３よりも交互立体配座を有するアミノ酸のポリマーセグメントを含有して、部分的に障害が生じ、ＳＡＳＡの増加を示すことが多く、天然型平衡集合体中で探索されたものよりも多様な立体配座集合体を試料採取する、ＴＤＰ−４３の複数の立体配座を示すＴＤＰ−４３ポリペプチドを指す。
【００５６】
ミスフォールドＴＤＰ−４３は、タンパク質機能の喪失、毒性、および病原性凝集体の繁殖をもたらす凝集体の形成が生じやすい。
【００５７】
「突然変異ＴＤＰ−４３」という用語は、例えば［６］に記載の生物情報学ツールに記載される突然変異を含む、例えばＦＴＤまたは家族性ＡＬＳに特徴的な置換など、例えばアミノ酸置換をもたらす遺伝子突然変異の結果として生じるＴＤＰ−４３の形態、とくにＴＤＰ−４３の内生的形態を指す。
【００５８】
「ＴＴＥＱ（配列番号１）」という用語は、配列番号１に示すような、アミノ酸配列：トレオニン、トレオニン、グルタミン酸、グルタミンを意味する。同様に、ＴＴＥ、ＴＥＱ、ＫＴＴＥ（配列番号１０）、ＫＴＴＥＱＤ（配列番号７）、ＴＴＥＱＤ（配列番号９）、ＴＴＥＱＤＬ（配列番号１１）、ＴＥＱＤ（配列番号８）は、１文字アミノ酸コードによって同定されたアミノ酸配列を指す。文脈に応じて、アミノ酸配列の参照は、環状化合物のアミノ酸配列など、ＴＤＰ−４３または単離ペプチドにおける配列を指す可能性がある。配列ＴＴＥＱ（配列番号１）は、アミノ酸の主な配列における残基１１５〜１１８からなる。
【００５９】
本明細書で使用される場合、「ＴＴＥＱ（配列番号１）または関連するエピトープおよび／または前述の任意の一部」という用語は、アミノ酸Ｔ１１５および／またはＴ１１６および／またはＥ１１７を最小限含み、例えば、ＴＴＥ、ＫＴＴ、またはＴＥＱを含む。ＴＴＥＱ（配列番号１）または関連するエピトープおよび／または前述の任意の一部の参照は、例えば、ＴＤＰ−４３ペプチド配列を含む環状化合物によって産生された抗体によって結合されるＴＤＰ−４３上の領域を指す可能性がある。例えば、抗体は、Ｔ１１５、Ｔ１１６、もしくはＥ１１７、Ｔ１１５および／またはＴ１１６および／またはＥ１１７の特定の一部、または前述の任意の組み合わせに選択的または特異的に結合し得る。代替的に、抗体を作製するための環状化合物中に含まれるＴＤＰ−４３ペプチド配列を指す可能性がある。
【００６０】
本明細書で使用される場合、「天然型における１１５Ｔ、１１６Ｔ、１１７Ｅ、および／または１１８Ｑによって占められるよりも交互立体配座」という用語は、例えば、ＰＤＢ  ４ＩＵＦ、および図、および／または表に示すように、ＴＤＰ−４３天然型構造的集合体における１１５Ｔ、１１６Ｔ、１１７Ｅ、および／または１１８Ｑについての当該特性と比較して、溶媒露出度（例えば実施例に記載の環状ペプチドにおいて測定されるＴＴＥＱ（配列番号１）を含むペプチドの文脈において、ＲＭＳＤ構造的整列、および１つ以上の骨格の二面角もしくは側鎖二面角から選択される１つ以上の異なる立体配座特性を有することを意味する。同様に、本明細書で使用される場合、天然型構造におけるＴ、Ｅ、および／またはＱのうちの１つ以上によって占められるよりも「交互立体配座」という用語は、ＰＤＢ  ４ＩＵＦ、および図１〜９、および／または表において示すように、天然型ＴＤＰ−４３における、Ｔ、Ｅ、および／またはＱのうちの１つ以上、例えば、Ｔ、Ｅ、および／またはＱについて当該特性と比較して、溶媒露出度（例えば、ＴＴＥＱ（配列番号１）またはＴＴＥを含む対応する直鎖状ペプチドの文脈において、１つ以上の骨格の二面角もしくは側鎖二面角から選択される１つ以上の異なる立体配座特性を有することを意味する。例えば、図２によると、残基１１５Ｔについて、二面Ｃ−ＣＡ−ＣＢ−ＯＧ１およびＣ−ＣＡ−Ｎ−ＨＮは、環状ペプチドシクロ（ＣＧＧＴＴＥＱＧＧ）（配列番号２）および偏倚集合体の両方を天然型における対応する二面角と区別する。特に、例えば、二面Ｃ−ＣＡ−ＣＢ−ＯＧ１は、天然型集合体中に存在しない環状集合体および偏倚集合体について１８０度でピークを示す。
【００６１】
本明細書で使用される場合、「エピトープ」とは、Ｂ細胞もしくはＴ細胞受容体、またはその抗体もしくは結合断片によって認識されるタンパク質の領域を意味する。エピトープは、任意選択的に、直鎖状アミノ酸配列または抗体によって認識されるタンパク質の領域によって表される。エピトープは、１つ以上の抗原決定基を含み得る。例えば、ミスフォールドエピトープに対応する単離ペプチドに対して生成された抗体は、当該エピトープ配列の一部または全部を認識する。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「ミスフォールドエピトープ」または「立体配座エピトープ」という用語は、対応する天然型構造中に存在しない三次元構造の少なくともある態様が同族抗体によって認識される、特定の三次元構造を有するアミノ酸の配列またはその抗原決定基を指す。「ミスフォールドエピトープまたは立体配座エピトープ」は、ミスフォールドタンパク質（例えば、ＡＬＳおよびＦＴＤ中に存在するような）中に露出されるか、またはアクセス可能である。ミスフォールドエピトープに選択的に結合する抗体は、その立体配座特異的エピトープのアミノ線のうちの１つ以上の空間配列を認識する。例えば、ＴＴＥＱ（配列番号１）立体配座エピトープは、天然型ＴＤＰ−４３または例えばＴＴＥＱ（配列番号１）を含む直鎖状ペプチドを使用して産生された抗体上のエピトープと比較して、抗体の選択性、例えば、少なくとも２倍、３倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、２５０倍、５００倍、または１０００倍以上の選択性によって認識される、ＴＴＥＱ（配列番号１）のエピトープを指す。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「類似体」という用語は、実質的に同じ方法で本明細書に記載されるペプチド、タンパク質、または核酸分子と実質的に同じ機構を行う、本発明のアミノ酸およびヌクレオチド配列の一部、伸長、置換、変異、修飾、またはそれらの化学的同等物および誘導体を含む。環状ペプチドなどの環状化合物の類似体はまた、ＴＤＰ−４３ペプチドに対する付加および欠失を含む。核酸の類似体は、本発明の単離ペプチドをコードする縮退ヌクレオチド置換を含む。加えて、類似ペプチドおよび類似ヌクレオチド配列は、それらの誘導体を含む。
【００６４】
「アミノ酸」という用語は、天然に生じるアミノ酸ならびに修飾Ｌアミノ酸のうちのすべてを含む。アミノ酸の原子は、例えば、異なる同位体を含み得る。例えば、アミノ酸は、水素と置換された重水素、窒素−１４と置換された窒素−１５、および炭素−１２と置換された炭素−１３、ならびに他の同様の変化を含み得る。
【００６５】
本明細書で使用される場合、「保存的アミノ酸置換」は、１つのアミノ酸残基が、タンパク質の所望の特性を無効にすることなく、別のアミノ酸残基と置き換えられる置換である。好適な保存的アミノ酸置換は、互いに対して同様の疎水性、極性、およびＲ基サイズを有するアミノ酸を置換することによって行われ得る。保存的アミノ酸置換の例には、以下が含まれる。
【表１】
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【００６６】
本明細書で使用される場合、「配列同一性」という用語は、２つのポリペプチド配列または２つの核酸配列間の配列同一性の割合を指す。２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一性パーセントを決定するために、配列は、最適な比較の目的のために整列される（例えば、第２のアミノ酸または核酸配列との最適な整列のために第１のアミノ酸または核酸配列の配列で間隙を導入することができる）。次に、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置でのアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列の位置が第２の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められている場合、分子は、その位置で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、配列によって共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝同一の重複位置の数／位置の合計数×１００％）一実施形態では、２つの配列は、同じ長さである。数値計算用アルゴリズムを使用して、２つの配列間の同一性パーセントの決定も達成することができる。２つの配列の比較のために利用される数値計算用アルゴリズムの好ましい非制限的例は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：２２６４−２２６８，ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ａｓ  ｉｎ  Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：５８７３−５８７７のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれる。例えば、スコア＝１００、語長＝１２に対するＮＢＬＡＳＴヌクレオチドプログラムパラメータセットによりＢＬＡＳＴヌクレオチド調査を行って、本願の核酸分子と同種のヌクレオチド配列を得ることができる。例えば、スコア−５０、語長＝３に対するＸＢＬＡＳＴプログラムパラメータセットによりＢＬＡＳＴタンパク質調査を行って、本明細書に記載のタンパク質分子と同種のアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のために間隙のある整列を得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２に記載されるように、間隙のあるＢＬＡＳＴを利用することができる。代替的に、プサイ−ＢＬＡＳＴを使用して、分子間の距離関係を検出する反復調査（同文献）を行うことができる。ＢＬＡＳＴ、間隙のあるＢＬＡＳＴ、およびプサイ−Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムの（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴの）デフォルトパラメータを使用することができる（例えば、ＮＣＢＩウェブサイトを参照されたい）。配列の比較のために利用される数値計算用アルゴリズムの別の好ましい非制限的例は、Ｍｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，１９８８，ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１−１７のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列整列ソフトウエアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれる。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重��残基表、１２の間隙長さペナルティ、および４の間隙ペナルティを使用することができる。間隙を可能にするか、または可能にすることなく、上記に記載のものと同様の技術を使用して、２つの配列間の同一性パーセントを決定することができる。同一性パーセントの計算では、典型的には、完全な一致のみが計数される。
【００６７】
抗体について、ＩＭＧＴまたはその他（例えばＫａｂａｔ番号付け慣習）によって抗体配列が最大限に整列された場合に、配列相同性の割合を判定することができる。整列後、対象の抗体領域（例えば、重鎖または軽鎖の全成熟可変領域）が参照抗体の同じ領域と比較されている場合、対象と参照抗体領域との間の配列同一性の割合は、対象および参照抗体領域の両方において同じアミノ酸によって占められる位置の数を、間隙を計数しない、２つの領域の整列位置の合計数によって除算し、１００で乗算して割合に変換したものである。
【００６８】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単鎖、ヒト化および他のキメラ抗体ならびにそれらの結合断片を含むことが意図される。抗体は、組み換え源に由来し得、かつ／または遺伝子導入動物中に生産され得る。生化学的技術の使用を通して生産され得るか、またはライブラリーから単離され得る、ヒト抗体も含まれる。ヒト化抗体またはキメラ抗体は、１つもしくは複数のアイソタイプまたはクラスからの配列を含み得る。
【００６９】
「単離抗体」という語句は、抗体を生産した供給源、例えば、動物、ハイブリドーマ、または他の細胞株（抗体を生産する組み換え細胞など）から除去されたインビボまたはインビトロで生産された抗体を指す。単離抗体は、任意選択的に、「精製され」ており、これは、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の純度を意味する。
【００７０】
本明細書で使用される場合、無傷もしくは完全な抗体または抗体鎖よりも少ないアミノ酸残基を含む抗体または抗体鎖の一部もしくは一部分に対する、抗原に結合するか、または無傷抗体と競合する、「結合断片」という用語。例示的な結合断片は、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ´）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、二量体、ナノボディ、低分子化抗体、二特異性抗体、およびそれらの多量体を含む。断片は、無傷もしくは完全な抗体または抗体鎖の化学的もしくは酵素処理を介して得ることができる。組み換え手段によっても、断片を得ることができる。例えば、Ｆ（ａｂ´）２断片は、ペプシンにより抗体を処理することによって生成することができる。結果として生じたＦ（ａｂ´）２断片を処理して、ジスルフィド架橋を減少させ、Ｆａｂ´断片を生産することができる。パパイン消化は、Ｆａｂ断片の形成をもたらし得る。Ｆａｂ、Ｆａｂ´、およびＦ（ａｂ´）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、二量体、低分子化抗体、二特異性抗体、二重特異的抗体断片、ならびに他の断片も、組み換え発現技術によって構成され得る。
【００７１】
当該技術分野で認識されている「ＩＭＧＴ番号付け」または「免疫遺伝学データベース番号付け」という用語は、抗体の重鎖および軽鎖可変領域、またはその抗原結合部分における他のアミノ酸残基よりも可変（すなわち、超可変）であるアミノ酸残基を番号付けするシステムを指す。
【００７２】
本明細書で参照されるＣＤＲ配列は、ＩＭＧＴまたはＮＣＢＩ生殖細胞系Ｖ遺伝子データベースに対するＢＬＡＳＴとの整列を調査するＩＧＢｌａｓｔ同定に基づいている。配列がＩＭＧＴ番号付けに対応することも確認された。可変領域についての全配列が提供されているので、Ｋａｂａｔなどの他の慣習に基づいて、ＣＤＲを同様に同定することが可能である。
【００７３】
抗体がＴＴＥＱ（配列番号１）などの特定された残基内のエピトープに結合すると述べられる場合、抗体が特定された残基またはそれらの一部、例えば、立体配座選択的方法における少なくとも１残基または少なくとも２残基を含有するポリペプチドに選択的または特異的に結合することを意味する。このような抗体は、ＴＴＥＱ（配列番号１）のすべての残基に接触する必要はなく、当該エピトープ内のすべての単一のアミノ酸置換または欠失が、結合親和性に必ずしも有意に、または等しく影響を与える必要はない。
【００７４】
本明細書で使用される場合、「検出可能な標識」という用語は、本明細書に記載のペプチドまたは化合物に負荷または導入することができ、直接または間接的のいずれかで検出可能なシグナルを生産することができる、ペプチド配列、蛍光タンパク質などの部分を指す。例えば、標識は、３Ｈ、１３Ｎ、１４Ｃ、１８Ｆ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉなどの放射線不透過性陽電子放出放射性核種（例えば、ＰＥＴ撮像において使用するための）もしくは放射性同位体；フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、もしくはルシフェリンなどの蛍光（蛍光色素分子）もしくは化学発光（発色団）化合物；アルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、もしくは西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素；撮像剤；または金属イオンであり得る。検出可能な標識はまた、例えば二次抗体を使用して、間接的に検出可能であり得る。
【００７５】
本明細書で使用される場合、「ミスフォールドＴＤＰ−４３中に選択的に提示されるか、またはアクセス可能なエピトープ」という用語は、単量体、二量体、または凝集形態であるかどうかにかかわらずＡＬＳまたはＦＴＤ（例えば、疾患関連のミスフォールドＴＤＰ−４３）中に存在するミスフォールドＴＤＰ−４３上で選択的に提示されるか、またはアクセス可能であるが、ＴＤＰ−４３の天然型の正しく折り畳まれたホモ二量体の分子表面上ではない、エピトープを指す。
【００７６】
本明細書で使用される場合、「ＴＴＥＱからなるエピトープ」という語句は、残基のうちの任意の１つ以上が例えばアラニンに対して突然変異した突然変異ＴＴＥＱ（配列番号１）ペプチドと比較して、ＴＴＥＱ（配列番号１）ペプチドに優先的に結合する抗体によって特異的かつ優先的に結合される、エピトープ、任意選択的に、立体配座エピトープを示す。同様に、本明細書で使用される場合、「立体配座エピトープがＴＴＥＱからなる」という語句は、別の立体配座（例えば天然型）上の特定の立体配座（例えば、ミスフォールドタンパク質、環状化合物、またはいくつかの他の制限された立体配座）において、任意選択的に、残基のうちの少なくとも１つ以上が、例えばアラニンに対して突然変異した場合（例えば、ＴＴＥＱ（配列番号１）を含むペプチドの環状立体配座、対、残基のうちの１つ以上が突然変異したペプチドの環状立体配座）に、ＴＴＥＱ（配列番号１）に優先的に結合する抗体によって特異的に結合されるエピトープを示す。
【００７７】
「ＴＴＥＱまたはその一部からなるエピトープ」という語句は、残基のうちの少なくとも１つ以上、任意選択的に、１１５Ｔ、１１６Ｔ、１１７Ｅ、および／または１１８Ｑが、アラニンに対して突然変異したか、または不存在である場合のペプチドと比較して、ＴＴＥＱ（配列番号１）ペプチドに特異的または優先的に結合する抗体によって特異的に結合されるエピトープを示す。同様に、本明細書で使用される場合、「立体配座エピトープがＴＴＥＱまたはその一部からなる」という語句は、別の立体配座（例えば、天然型立体配座）上で特定の立体配座（例えばミスフォールドタンパク質、環状、またはいくつかの他の制限された立体配座）にある場合に、任意選択的に、残基のうちの少なくとも１つ以上、任意選択的に１１５Ｔ、１１６Ｔ、１１７Ｅ、および／または１１８Ｑがアラニンに対して突然変異したか、または不存在である場合（例えば、ＴＴＥＱ（配列番号１）を含むペプチドの環状立体配座、対、残基のうちの１つ以上が突然変異したか、または不存在であるペプチドの環状立体配座）に、ＴＴＥＱ（配列番号１）またはその一部に優先的に結合する抗体によって特異的に結合されるエピトープを示す。
【００７８】
本明細書で使用される場合、「より大きい親和性」という用語は、抗体Ｘが標的Ｚよりも強く（Ｋｏｎ）、かつ／またはより小さい解離定数（Ｋｏｆｆ）で標的Ｙに結合する抗体結合の程度を指し、この文脈において、抗体Ｘは、Ｚに対するよりも標的Ｙに対してより大きい親和性を有する。同様に、本明細書で「より小さい親和性」という用語は、抗体Ｘが標的Ｚよりも弱く、かつ／またはより大きい解離定数で標的Ｙに結合する抗体結合の程度を指し、この文脈において、抗体Ｘは、Ｚに対するよりも標的Ｙに対してより小さい親和性を有する。抗体とその標的抗原との間の結合親和性は、ＫＤがｋｏｎ／ｋｏｆｆに等しい、１／ＫＤに等しいＫＡとして表され得る。ｋｏｎおよびｋｏｆｆ値は、（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅシステムを使用して測定可能な）表面プラズモン共鳴を使用して測定することができる。
【００７９】
また、本明細書で使用される場合、「免疫原性」という用語は、抗体の生産を引き出し、Ｔ細胞、および免疫原の抗原性部分に対して方向付けされた他の反応性免疫細胞を活性化する物質を指す。
【００８０】
本明細書で使用される場合、「免疫原」は、免疫応答を引き起こし、かつ／または抗体の生産をもたらす物質を意味する。例えばＫＬＨに接合された単離化合物を含む、本明細書に記載の免疫原性化合、接合、および融合に加えて、同定されたエピトープ、例えばＴＴＥＱおよび／またはＴＴＥなどの関連するエピトープに対して交差反応性抗体を引き出すペプチド模倣体を用いることができる。有用な免疫原として機能するために、ＴＤＰ−４３ペプチドは、望ましくは、最小限Ｔ１１５および／またはＴ１１６および／またはＥ１１７を含む、最小約３、４、５、６、または７つのＴＤＰ−４３残基を組み込み、任意選択的に、ＫＬＨなどの免疫原性増強剤を組み込む。環状ペプチド中の残基の数が増加するにつれて、構成は、直鎖状ペプチドに対して立体配座的により類似する。天然型構造と比較して、ミスフォールド状態の類似性の最適な程度は、約７〜９つの残基で生じる（表６Ｃおよび表８Ａを参照されたい）。
【００８１】
環状化合物に関して「対応する直鎖状化合物」という用語は、環状化合物と同じ配列または化学的部分を含むか、またはこれらからなるが、直鎖状（非環化）形態にある、化合物、任意選択的にペプチドを指す。
【００８２】
本明細書で使用される場合、「核酸配列」という用語は、天然に生じる塩基、糖、および糖間（骨格）連結からなるヌクレオシドまたはヌクレオチド単量体の配列を指す。この用語はまた、天然に生じない単量体またはそれらの一部分を含む、修飾または置換された配列を含む。本願の核酸配列は、デオキシリボ核酸配列（ＤＮＡ）またはリボ核酸配列（ＲＮＡ）である場合があり、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、およびウラシルを含む、天然に生じる塩基を含み得る。配列はまた、修飾塩基を含有し得る。このような修飾塩基の例には、アザおよびデアザアデニン、グアニン、シトシン、チミジン、およびウラシル、ならびにキサンチンおよびヒポキサンチンが含まれる。核酸は、二本鎖または一本鎖のいずれかである可能性があり、センス鎖またはアンチセンス鎖を表す。さらに、「核酸」という用語は、相補的核酸配列ならびにコドン最適化または同義コドン同等物を含む。本明細書で使用される場合、「単離核酸配列」という用語は、組み換えＤＮＡ技術、または化学的前駆体によって生産された場合の細胞物質もしくは培地、または化学的に合成された場合の他の化学物質を実質的に含まない核酸を指す。単離核酸はまた、核酸が由来する核酸（すなわち、核酸の５´および３´末端に位置する配列）を天然に側面に配置する配列を実質的に含まない。
【００８３】
作動的に連結される」とは、核酸の発現を可能にする方法で核酸が調節配列に連結されることを意味することを意図している。好適な調節配列は、細菌、真菌、ウイルス、哺乳動物、または昆虫の遺伝子を含む、様々な供給源に由来し得る。適切な調節配列の選択は、選択される宿主細胞に応じ、当業者によって容易に達成することができる。このような調節配列の例には、翻訳開始シグナルを含む、転写プロモーターおよびエンハンサー、またはＲＮＡポリメラーゼ結合配列、リボソーム結合配列が含まれる。さらに、選択される宿主細胞および用いられるベクターに応じて、複製起点、追加のＤＮＡ制限部位、エンハンサー、転写の誘導性をもたらす配列などの他の配列が、発現ベクターに組み込まれ得る。
【００８４】
本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、当該核酸分子を、例えば、原核細胞および／もしくは真核細胞に導入することを可能にし、かつ／またはゲノムに導入することを可能にする、核酸分子のための任意の中間ビヒクルを含み、プラズミド、ファージミド、バクテリオファージまたはレトロウイルス系ベクターなどのウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどを含む。本明細書で使用される場合、「プラズミド」という用語は、遺伝子的に、染色体ＤＮＡから独立して複製することができる、染色体外遺伝子物質の構成、通常、環状ＤＮＡ二本鎖を指す。
【００８５】
「少なくとも中程度に厳しいハイブリダイゼーション条件」とは、溶液中の２つの相補的核酸分子間の選択的なハイブリダイゼーションを促進する条件を選択することを意味する。ハイブリダイゼーションは、核酸配列分子のすべてまたは一部分に生じ得る。ハイブリダイズ部分は、典型的には、長さが少なくとも１５（例えば、２０、２５、３０、４０、または５０）ヌクレオチドである。当業者であれば、核酸二本鎖、またはハイブリッドの安定性は、緩衝液を含有するナトリウム中で、ナトリウムイオン濃度および温度の関数（Ｔｍ＝８１．５°Ｃ−１６．６（ログ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％（Ｇ＋Ｃ）−６００／Ｉ）、または同様の方程式）である、Ｔｍによって判定されることを理解するであろう。したがって、ハイブリッドの安定性を判定する洗浄条件におけるパラメータは、ナトリウムイオン濃度および温度である。既知の核酸分子と類似しているが同一でない分子を同定するために、１％の不一致は、Ｔｍにおける約１℃の減少をもたらすことが想定され得、例えば、核酸分子が＞９５％同一性を有することが求められる場合、最終洗浄温度は、約５℃減少されるであろう。これらの検討に基づいて、当業者であれば、適切なハイブリダイゼーション条件を容易に選択することができるであろう。好ましい実施形態では、厳しいハイブリダイゼーション条件が選択される。例として、以下の条件を用いて、厳しいハイブリダイゼーション：上記の方程式に基づくＴｍ−５℃の５×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）／５×デンハルト溶液／１．０％のＳＤＳでのハイブリダイゼーション、その後の６０℃での０．２×ＳＳＣ／０．１％のＳＤＳの洗浄を達成することができる。中程度に厳しいハイブリダイゼーション条件は、４２℃での３×ＳＳＣにおける洗浄ステップを含む。しかしながら、代替的緩衝液、塩、および温度を使用して、同等の厳密性を達成することができることが理解される。ハイブリダイゼーション条件に関する追加の手引きを以下に見出すことできる。Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．，２００２，ａｎｄ  ｉｎ：Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１。
【００８６】
本明細書で使用される場合、抗体を参照して「特異的に結合する」とは、抗体がその標的抗原を認識し、構造的に異なる抗原および／または修飾または突然変異した配列を含む抗原に対するよりも大きい親和性によりその標的に結合することを意味する。例えば、多価抗体は、少なくとも１ｅ−６、少なくとも１ｅ−７、少なくとも１ｅ−８、少なくとも１ｅ−９、または少なくとも１ｅ−１０のＫＤでその標的に結合する。少なくとも１ｅ−８よりも大きい親和性が好ましい。可変ドメインを含むＦａｂ断片などの抗原結合断片は、非断片化抗体との多価相互作用よりも１０倍または１００倍小さい親和性でその標的を発見し得る。
【００８７】
本明細書で使用される場合、ＴＤＰ−４３（例えば天然型、またはミスフォールドタンパク質）の形態と優先的に結合する抗体に関して「選択的」という用語は、結合タンパク質が、少なくとも３倍、または少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２５０倍、少なくとも５００倍、または少なくとも１０００倍以上大きい親和性により形態に結合することを意味する。したがって、特定の立体配座（例えば、ミスフォールドタンパク質、環状ペプチド）に対してより選択的な抗体は、別の形態と比較して、少なくとも３倍などより大きい親和性によりＴＤＰ−４３と優先的に結合する
【００８８】
本明細書で使用される場合、「リンカー」という用語は、ＴＴＥＱ（配列番号１）エピトープペプチドを含むペプチドに共有結合され、任意選択的に、ＴＴＥＱ（配列番号１）ペプチドのＮ末端およびＣ末端に連結されて、環状化合物を生産し得る、化学的部分を意味する。リンカーは、システイン残基などのスペーサーおよび／または１つ以上の官能性部分を含み得る。リンカーは、官能性部分を介して、担体タンパク質、またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などの免疫原向上成分に連結され得る。リンカーは、例えば、１〜９個のアミノ酸であり得る。
【００８９】
本明細書で使用される場合、「スペーサー」という用語は、ペプチドのＮ末端およびＣ末端に直接または間接的に共有結合されて、ペプチド自体よりも長い長さの環状化合物を生産することができる、任意の非免疫原性または低免疫原性化学的部分を意味し、例えば、スペーサーは、ＴＴＥＱ（配列番号１）からなるペプチドのＮ末端およびＣ末端に連結されて、ＴＴＥＱ（配列番号１）配列自体よりも長い骨格長さの環状化合物を生産することができる。すなわち、環化された場合、スペーサー（例えば、３つのアミノ酸残基のうちの）を含むペプチドは、スペーサーを含まないペプチドよりもより大きい閉鎖円を成す。スペーサーは、限定されないが、例えば、ＧＴＴＥＱＧ（配列番号４）ＴＴＥＱＧ（配列番号５）、ＧＴＴＥＱ（配列番号６）などであるペプチドと組み合わせた場合の、Ｇ、Ａ、またはＰＥＧの繰り返しなどの非免疫原性部分を含み得る。スペーサーは、スペーサー内に散在され得るか、またはスペーサーの一方の末端または両方の末端に共有結合され得る、１つ以上のシステイン（Ｃ）残基などの１つ以上の官能化部分を含むか、またはこれらに結合され得る。ＣまたはＤ残基などの官能性部分がスペーサーの１つ以上の末端に共有結合した場合、スペーサーは、間接的に、ペプチドに共有結合する。スペーサーはまた、ビオチン分子がアミノ酸残基に導入された場合のように、スペーサー残基中に官能性部分を含み得る。
【００９０】
本明細書で使用される場合、「官能性部分」という用語は、本明細書で使用される場合、原子または単一原子の別の群と反応して、２つの群と原子との間の化学的相互作用を形成する原子または単一原子の群（いわゆる「相補的官能基」）を指す、「官能基」を含む化学成分を指す。システインの場合、官能基は、反応されてジスルフィド結合を形成することができる−ＳＨであり得る。したがって、リンカーは、例えば、ＣＣＣであり得る。原子の別の群との反応は、例えば、Ｋｄ〜１ｅ−１４を有し得る、ビオチン−ストレプトアビジン結合の場合のように、共有結合または強い非共有結合であり得る。本明細書で使用される場合、強い非共有結合とは、少なくとも１ｅ−９、少なくとも１ｅ−１０、少なくとも１ｅ−１１、少なくとも１ｅ−１２、少なくとも１ｅ−１３、または少なくとも１ｅ−１４のＫｄとの相互作用を意味する。
【００９１】
タンパク質および／または他の薬剤は、環状化合物に対して官能化（例えば、結合）されて、免疫原性を助けるか、またはインビトロ研究においてプローブとして作用するかのいずれかであり得る。この目的のために、反応すること（例えば、共有結合するか、または非共有結合であるが、強く結合する）ができる任意の官能性部分を使用し得る。特定の一実施形態では、官能性部分は、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などの免疫原性向上成分、またはインビトロ免疫ブロットまたは免疫組織化学的アッセイのために使用されるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの担体タンパク質であり得る、対象となるタンパク質上の不対のシステインとのジスルフィド結合を形成するように反応されるシステイン残基である。
【００９２】
本明細書で使用される場合、「〜と反応する」という用語は、遺伝子的に、化学的相互作用の形成をもたらす電子流または静電荷の転写があることを意味する。
【００９３】
本明細書で使用される場合、「動物」または「対象」という用語は、任意選択的に、ヒトを含むか、または除外する、哺乳動物を含む動物界のすべてのメンバーを含む。
【００９４】
本開示の範囲の理解において、「〜からなる」という用語およびその派生物は、本明細書で使用される場合、述べられた特徴、要素、成分、群、整数、および／またはステップの存在を特定する、閉鎖形式の用語であり、また、他の述べられていない特徴、要素、成分、群、整数、および／またはステップの存在を除外することを意図している。
【００９５】
本明細書での終点による数的範囲の列挙には、その範囲内に包含されるすべての数および分数を含む（例えば、１〜５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．９０、４、および５を含む）。すべての数およびそれらの分数は、「約」という用語によって修正されることが推定されることも理解されるべきである。さらに、「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」とは、別段内容が明確に指定しない限り、複数の指示対象を含むことが理解されるべきである。「約」という用語は、参照される数のプラスまたはマイナス０．１〜５０％、５〜５０％、または１０〜４０％、好ましくは１０〜２０％、より好ましくは１０％または１５％を意味する。
【００９６】
さらに、特定のセクションに記載されている定義および実施形態は、当業者によって理解されるように好適であると記載されている本明細書の他の実施形態に適用可能であることが意図されている。例えば、以下の節では、本発明の異なる態様がより詳細に定義されている。このように定義された各態様は、明確に反対と示されない限り、いずれかの他の態様（複数可）と組み合わされ得る。具体的には、好ましいか、または利益があると示されるいずれかの特徴は、好ましいか、または利益があると示されるいずれかの他の特徴（複数可）と組み合わされ得る。
【００９７】
ＩＩ．エピトープおよび結合タンパク質
本発明者らは、ＴＤＰ−４３タンパク質上のアミノ酸１１５〜１１８でのＴＴＥＱ（配列番号１）、およびＴＤＰ−４３タンパク質上のアミノ酸１１５〜１１７でのＴＴＥを含む、ＴＤＰ−４３中のエピトープを同定した、本発明者らは、さらに、これらのエピトープまたはそれらの一部が立体配座エピトープであること、およびＴＴＥ、ＴＥＱ、またはＴＴＥＱ（配列番号１）、またはそれらの一部が、ＴＤＰ−４３のミスフォールドタンパク質種における抗体結合に選択的にアクセス可能であり得ることを同定した。
【００９８】
天然型で同定されたエピトープと偏倚ＴＤＰ−４３集合体との間で同定された１つ以上の立体配座の差に基づいて、本発明者らは、ミスフォールドＴＤＰ−４３に選択的または特異的に結合する抗体を生産するための立体配座的に制限された化合物および免疫原を設計した。
【００９９】
当該免疫原を使用して産生される抗体は、ミスフォールドＴＤＰ−４３を検出するのに有用であり得る。
【０１００】
実施例に記載のように、環状ペプチドシクロ（ＣＧＧＴＴＥＱＧＧ）（配列番号２）、シクロ（ＣＧＴＴＥＱＧ）（配列番号３）、シクロ（ＣＧＴＴＥＧ）（配列番号２８）、およびシクロ（ＣＧＴＴＥＧＧ）（配列番号２９）などの環状化合物は、天然型種に関するミスフォールドＴＤＰ−４３中のエピトープの立体配座を捕捉し得る。例えば、環状９量体シクロ（ＣＧＧＴＴＥＱＧＧ）（配列番号２）中のアミノ酸についての溶媒アクセス可能な表面領域、ＲＭＳＤ構造的整列、および二面角分布は、天然型集合体中の対応する数量とは有意に異なることが見出された。これは、環状化合物が、天然型集合体中に提示される配列とは立体配座的に区別される立体配座エピトープを提供し得ることを示唆している。
【０１０１】
ＩＩＩ．ＴＴＥＱ（配列番号１）およびＴＴＥ「エピトープ」化合物
したがって、本開示は、アミノ酸ＴＴＥＱ（配列番号１）またはＴＤＰ−４３上のアミノ酸残基１１５〜１１７に対応するＴＴＥ、およびアミノ酸１１６〜１１８に対応するＴＥＱからなるＴＤＰ−４３中の立体配座エピトープを同定する。実施例で実証されているように、ＴＴＥＱ（配列番号１）およびＴＴＥは、ＴＤＰ−４３中に障害が生じやすい領域として同定された。残基ＴＴＥおよびＴＴＥＱ（配列番号１）は、コンピュータ予測において現れた。
【０１０２】
ミスフォールドＴＤＰ−４３中に露出され得る領域を同定するために、天然型ＲＲＭ１および偏倚したＲＲＭ１によって示される立体配座における差が存在する。例えば、表５は、Ｅ１１７は、天然型タンパク質中におけるよりも偏倚タンパク質中により多く露出され、環状ペプチドシクロ（ＣＧＧＴＴＥＱＧＧ）においてまたより多く露出されることを示す。天然型タンパク質中では、この残基は、偏倚立体配置において阻害される、Ｌｙｓ  １３７を含む塩橋に関与する。
【０１０３】
ある態様は、ＴＴＥＱ（配列番号１）、ＴＴＥなどの関連するエピトープおよび／または前述の任意の一部を含むか、またはこれらからなるＴＤＰ−４３ペプチドを含む化合物を含み、ペプチドがＴＴＥＱ（配列番号１）である場合、ペプチドは、天然型ＴＤＰ−４３中のＴＴＥおよび／またはＴＴＥＱ（配列番号１）から少なくとも１つの特徴において区別される立体配座にある。実施形態では、ＴＤＰ−４３ペプチドは、ＴＴＥ、ＴＴＥＱ（配列番号１）、ＫＴＴＥ（配列番号１０）、ＫＴＴＥＱ（配列番号１２）、ＴＥＱ、ＴＥＱＤ（配列番号８）、またはＴＴＥＱＤ（配列番号９）から選択される。ＴＤＰ−４３ペプチドＴＴＥＱＤ（配列番号９）、ＴＥＱＤ（配列番号８）、ＫＴＴＥＱ（配列番号１２）、ＴＴＥ、およびＴＥＱを使用して、本明細書で集合的にＴＴＥＱ（配列番号１）および関連するエピトープと称されるエピトープに含まれる抗体を産生することができる。実施形態では、関連するエピトープは、ＴＴＥ、ＴＥＱＤ（配列番号８）、ＫＴＴＥ（配列番号１０）、およびエピトープＴＴＥに対するＴＤＰ−４３のＮ末端またはＣ末端のいずれかに１、２、または３つのアミノ酸を含むエピトープを含むか、またはこれらからなる。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、ＴＴＥ、ＴＥＱ、またはＴＴＥＱ（配列番号１）を含む、ペプチド、立体配座ペプチドは、ＴＴＥＱ（配列番号１）、例えば、ＴＴＥＱＤ（配列番号９）またはＫＴＴＥＱＤ（配列番号７）のＴＤＰ−４３のＮ末端および／またはＣ末端に１つまたは２つの追加の残基を含み得る。例えば、ＴＤＰ−４３におけるＴＴＥＱ（配列番号１）に対する３つのアミノ酸のＮ末端は、ＰＷＫであり、ＴＴＥＱ（配列番号１）に対する３つのアミノ酸のＣ末端は、ＤＬＫである。実施形態では、ＴＤＰ−４３ペプチドは、６つのＴＤＰ−４３残基の最大値である。実施形態では、ＴＤＰ−４３ペプチドは、５つのＴＤＰ−４３残基の最大値である。また別の実施形態では、ＴＤＰ−４３ペプチド（例えば、環状化合物などの化合物中の）は、４つのＴＤＰ−４３残基、任意選択的に、ＴＴＥＱ（配列番号１）である。
【０１０５】
実施形態では、化合物は、リンカーをさらに含む。リンカーは、スペーサーおよび／または１つ以上の官能性部分を含む。リンカーは、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、または９つのアミノ酸、および／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分などの同等に機能する分子、および／またはそれらの組み合わせを含み得る。実施形態では、スペーサーアミノ酸は、ＧおよびＡなどの非免疫原性または低免疫原性アミノ酸残基から選択され、例えば、スペーサーは、ＧＧＧ、ＧＡＧ、Ｇ（ＰＥＧ）Ｇ、ＰＥＧ−ＰＥＧ（ＰＥＧ２とも称される）−ＧＧなどであり得る。１つ以上の官能性部分、例えば官能基を含むアミノ酸は、薬剤または検出可能なタグまたはＢＳＡなどの担体またはＫＬＨなどの免疫原性向上成分に化合物を結合させるために含まれ得る。
【０１０６】
実施形態では、リンカーは、ＧＣ−ＰＥＧ、ＰＥＧ−ＧＣ、ＧＣＧ、またはＰＥＧ２−ＣＧを含む。
【０１０７】
実施形態では、リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、または９つのアミノ酸を含む。
【０１０８】
ＴＴＥまたはＴＴＥＱ（配列番号１）を含むペプチドが、ＴＴＥＱ（配列番号１）に対するＮ末端および／またはＣ末端であるＴＤＰ−４３中に見られる１、２、または３つの追加の残基を含む実施形態では、環化化合物中のリンカーは、ＴＤＰ−４３残基のＮ末端および／またはＣ末端に共有結合される（例えば、ペプチドがＫＴＴＥＱ（配列番号１２）である場合、リンカーは、ＫおよびＱ残基に共有結合される）。同様に、ＴＤＰ−４３ペプチドがＴＴＥＱ（配列番号１）である場合、リンカーは、残基ＴおよびＱに共有結合され、ＴＤＰ−４３ペプチドがＴＴＥＱＤ（配列番号９）である場合、リンカーは、残基ＴおよびＤに共有結合される。
【０１０９】
化合物のタンパク質性部分（またはリンカーがタンパク質性でもある化合物）は、同質の溶液中に固相合成または合成などのタンパク質の化学においてよく知られている技術を使用して、化学的合成によって調製することができる。
【０１１０】
実施形態では、化合物は、環状化合物であり、例えば、ＴＴＥまたはＴＴＥＱ（配列番号１）を含むＴＤＰ−４３ペプチドが環状化合物に含まれる。本明細書での「環状ペプチド」の参照は、完全にタンパク質性の化合物（例えば、リンカーが２、３、４、５、６、７、８、または９つのアミノ酸である）を指す可能性がある。実施例で判定された環状ペプチドについて記載される特性は、非アミノ酸リンカー分子を含む他の化合物（例えば、環状化合物）に組み込まれ得ることが理解される。
【０１１１】
したがって、ある態様は、ペプチドＴＴＥＱ（配列番号１）（または、ＴＴＥなどのその一部）と、リンカーとを含む環状化合物であって、リンカーが、ＴＴＥまたはＴＴＥＱ（配列番号１）を含むペプチドに直接または間接的に共有結合され、任意選択的に、Ｔ１１５、Ｔ１１６、Ｅ１１７、および／またはＱ１１８残基のうちの少なくとも１つが、天然型ＴＤＰ−４３中に現れ得るように、ＴＴＥＱ（配列番号１）を含む天然型集合体中のＴ、Ｔ、Ｅ、およびＱ残基よりも交互立体配座にあり、任意選択的に、少なくともＴ、Ｔ、Ｅ、および／またはＱが、例えば、ＴＤＰ−４３二量体中に現れ得るように、ＴＴＥＱ（配列番号１）を含む天然型集合体中に占められる立体配座よりも、より多く溶媒露出された立体配座または代替的立体配座のいずれかである、環状化合物を提供する。
【０１１２】
実施形態では、環状化合物は、ＴＴＥまたはＴＴＥＱ（配列番号１）および最大６つのＴＤＰ−４３残基（例えば、ＴＴＥまたはＴＴＥＱ（配列番号１）に対して１または２（またはＴＴＥの場合、３つの）アミノ酸のＮ末端および／またはＣ末端）を含むＴＤＰ−４３ペプチドと、リンカーとを含み、リンカーは、ＴＤＰ−４３ペプチドのペプチドＮ末端残基およびＣ末端残基に直接または間接的に共有結合され、任意選択的に、少なくともＴ１１５、Ｔ１１６、Ｅ、またはＱは、ＴＴＥＱ（配列番号１）を含む天然型集合体中のＴ１１５、Ｔ１１６、Ｅ、またはＱよりも交互立体配座にあり、かつ／または天然型でのＴＴＥＱ（配列番号１）中のＴ１１５、Ｔ１１６、Ｅ、またはＱの立体配座であり、任意選択的に、少なくともＴ１１５、Ｔ１１６、Ｅ、またはＱは、ＴＴＥＱ（配列番号１）を含む天然型集合体中に占められる立体配座よりも多い表面露出を有する。
【０１１３】
環状化合物は、環化の前に、ＴＤＰ−４３ペプチド、任意選択的に、ＴＴＥＱ（配列番号１）または関連するエピトープを含むペプチドのＮ末端またはＣ末端に共有結合されるリンカーを含む直鎖状分子として合成することができる。代替的に、リンカーの一部は、環化の前に、Ｎ末端に共有結合され、一部は、Ｃ末端に共有結合される。いずれかの場合でも、直鎖状化合物は、例えば、ヘッドトゥーテール環化（例えばアミド結合環化）において環化される。
【０１１４】
実施形態では、環状化合物は、ＴＴＥＱ（配列番号１）を含むか、またはこれからなるペプチドと、リンカーとを含み、リンカーは、ペプチドのＮ末端およびＣ末端（例えば、ペプチドがＴＴＥＱ（配列番号１）からなる場合のＴおよびＱ残基に結合される。実施形態では、Ｔ、Ｅ、および／またはＱ残基のうちの少なくとも１つは、ＴＴＥＱ（配列番号１）を含む天然型集合体中のＴ、Ｅ、および／またはＱ残基のうちの少なくとも１つによって占められるよりも環状化合物において交互立体配座にある。
【０１１５】
実施形態では、Ｔ、Ｅ、および／またはＱ残基のうちの少なくとも１つは、残基によって、任意選択的に、天然型集合体中のＴ、Ｅ、および／またはＱによって占められるよりも環状化合物において交互立体配座にある。
【０１１６】
実施形態では、Ｔ、Ｅ、および／またはＱ残基のうちの少なくとも１つは、天然型における残基によって占められるよりも環状化合物において交互立体配座にある。
【０１１７】
実施形態では、交互立体配座は、より多く溶媒露出された立体配座である。
【０１１８】
実施形態では、少なくともＴ１１５は、任意選択的に単独またはＴ１１６と組み合わせて、ＴＴＥＱ（配列番号１）を含む天然型集合体中に占められる立体配座よりも交互立体配座にある。
【０１１９】
例えば、交互立体配座は、天然型集合体中の二面角とは異なる、残基Ｔ１１５中の１つ以上の異なる二面角を含み得る。
【０１２０】
例えば、交互立体配座は、天然型集合体中の二面角とは異なる、１つ以上の異なる骨格二面角（ラマチャンドラン角度）を含み得る。
【０１２１】
実施形態では、環状化合物は、環状化合物と天然型集合体との間の最小平均側鎖／骨格二面角の差を含む。
【０１２２】
実施形態では、環状化合物は、Ｔ、Ｅ、およびＱから選択される残基を含み、１つ以上の側鎖または骨格二面角は、天然型集合体の文脈で対応する二面角よりも、環状化合物において、少なくとも３０度、少なくとも４０度、少なくとも５０度、少なくとも６０度、少なくとも７０度、少なくとも８０度、少なくとも９０度、少なくとも１００度、少なくとも１１０度、少なくとも１２０度、少なくとも１３０度、少なくとも１４０度、少なくとも１５０度、少なくとも１６０度、または少なくとも１７０度異なる。
【０１２３】
図２および３に示すように、Ｔ１１５およびＴ１１６のいくつかの骨格および側鎖二面角分布は、天然型集合体と比較して、環状ペプチド集合体において実質的に異なる。例えば、表２Ａは、シミュレーションされた天然型集合体および環状ペプチドについて、Ｔ１１５の二面角Ｃ−ＣＡ−ＣＢ−ＯＧ１における差が、環状と天然型との間で約−１６０度である可能性が最も高いことを示している。実施形態では、環状化合物は、天然型集合体の文脈で対応する二面角よりも、少なくとも３０度、少なくとも４０度、少なくとも５０度、少なくとも６０度、少なくとも７０度、少なくとも８０度、少なくとも９０度、少なくとも１００度、少なくとも１１０度、少なくとも１２０度、少なくとも１３０度、少なくとも１４０度、少なくとも１５０度、または少なくとも１６０度である、Ｃ−ＣＡ−ＣＢ−ＯＧ１二面角を含むＴ残基を含む。同様に、Ｔ１１６二面Ｎ−ＣＡ−ＣＢ−ＯＧ１について環状集合体と天然型集合体との間の二面角における差は、約１５０度である可能性が最も高い。したがって、実施形態では、環状化合物は、直鎖状化合物の文脈で対応する二面角よりも、少なくとも３０度異なる、少なくとも４０度異なる、少なくとも５０度異なる、少なくとも６０度異なる、少なくとも７０度異なる、少なくとも８０度異なる、少なくとも９０度異なる、少なくとも１００度異なるなど、最大少なくとも１５０度異なる、二面角Ｎ−ＣＡ−ＣＢ−ＯＧ１を含むＴを含む。Ｔ１１５二面Ｃ−ＣＡ−Ｎ−ＨＮについて環状ペプチドと天然型集合体との間の最も可能性の高い二面角における対応する差は、５０度である。したがって、実施形態では、環状化合物は、天然型集合体の文脈で対応する二面角よりも、少なくとも３０度異なる、少なくとも４０度異なる、または少なくとも５０度異なる、Ｃ−ＣＡ−Ｎ−ＨＮに対する二面角を含むＴを含む。Ｔ１１６二面ＣＢ−ＣＡ−Ｎ−ＨＮについて環状ペプチドと天然型集合体との間の最も可能性の高い二面角における対応する差は、−７０度である。したがって、実施形態では、環状化合物は、天然型集合体または天然型のいずれかの文脈で対応する二面角よりも、少なくとも３０度異なる、少なくとも４０度異なる、少なくとも５０度異なる、少なくとも６０度異なる、または少なくとも７０度異なる、ＣＢ−ＣＡ−Ｎ−ＨＮに対する二面角を含むＴを含む。上記の角度差は、例えば、正または負、（＋）または（−）であり得る。
【０１２４】
表４Ａに与えられるラマチャンドラン角度のピーク値によると、最も可能性の高いラマチャンドランφおよびψ値は、表４Ｂにも提示されるように、残基Ｔ１１５、Ｔ１１６、Ｅ１１７、およびＱ１１８について環状集合体と天然型集合体との間で異なる。環状および天然型ピークφ値間のそれぞれの差Δφは、５０、−６５、−４０、および−３５度であり、環状および天然型ピークのψ値間のそれぞれの差Δψは、−４５、３０、４０、および５０度である。全体的なφ、ψ値は、環状ペプチドと天然型ペプチドとの間で有意に異なる。表３Ａは、環状集合体および天然型集合体におけるφ、ψ値の分布の重複を与えている。Ｔ１１５、Ｔ１１６、Ｅ１１７、およびＱ１１８についてのφおよびψ分布の平均重複は、それぞれ、２８％、６３％、５５％、および２３％である。これらの数は、合わせて、環状集合体および天然型集合体についての二面角の異なる分布を示している。
【０１２５】
実施形態では、環状化合物は、天然型化合物の文脈で対応するラマチャンドラン角度よりも、少なくとも３０度、少なくとも４０度異なる、少なくとも５０度、または少なくとも６０度異なる、ラマチャンドラン骨格角度を含むＱを含む。
【０１２６】
角度差は、正または負、（＋）または（−）であり得る。
【０１２７】
交互立体配座は、交互骨格配向を含み得る。例えば、天然型形態と比較して、環状エピトープが抗体に対して露出する骨格配向が異なる。
【０１２８】
実施形態では、Ｔ、Ｔ、Ｅ、Ｑ、ＴＴ、ＴＥ、ＥＱ、ＴＴＥ、ＴＥＱ、および／またはＴＴＥＱ（配列番号１）は、例えば、天然型集合体などの非ミスフォールドタンパク質立体配座におけるこれらの残基によって占められるものと比較して、交互立体配座にある。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、ＴＴＥＱ（配列番号１）、ＴＴＥ、またはＫＴＴＥ（配列番号１０）を含むペプチドを含む環状化合物は、例えば、ＴＴＥＱ（配列番号１）の、前述の１つのＴＤＰ−４３の上流および／または下流に１つ、または２つ以上の残基を含み得る。このような場合、スペーサーは、ＴＤＰ−４３配列の対応する残基の末端のＮ末端およびＣ末端に共有結合される。
【０１３０】
実施形態では、環状化合物は、配列番号２、３、２２、２３、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、および４２、またはそれらの任意のサブセットのうちのいずれか１つから選択される配列を有する。実施形態では、環状化合物は、配列番号２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、および３５のうちのいずれか１つから選択される配列を含む。別の実施形態では、環状化合物は、配列番号２、３、２２、２３、および４２から選択される配列を含む。また他の実施形態では、環状化合物は、配列番号２９、３２、および３４のうちのいずれか１つから選択される配列を含む。また他の実施形態では、環状化合物は、配列番号２、３、２２、および２３のうちのいずれか１つから選択される配列を含む。
【０１３１】
環化ペプチドを作製するための方法は、当該技術分野において知られており、ＳＳ環化またはアミド環化（ヘッドトゥーテール、または骨格環化）を含む。方法は、実施例のセクションにさらに記載されている。例えば、そのＮ末端およびＣ末端に「Ｃ」残基、例えば、ＣＧＴＴＥＱＧＣ（配列番号１３）を含むペプチドは、ＳＳ環化によって反応されて、環状ペプチドを生産することができる。実施例に記載のように、同定された立体配座エピトープに対するそれらの関連性について、環状化合物を評価した。例えば、ＴＴＥＱ（配列番号１）またはＴＴＥ  ＴＤＰ−４３ペプチドを含む環状化合物を使用して、ミスフォールドＴＤＰ−４３について選択的な抗体を産生し得る。
【０１３２】
本明細書に記載のように、エピトープＴＴＥＱ（配列番号１）および／またはその一部は、ＴＤＰ−４３のミスフォールドで繁殖する菌株における潜在的な標的であり得、立体配座エピトープを認識する抗体は、例えば、このような繁殖する菌株を検出するのに有用であり得る。
【０１３３】
別の態様は、ＴＴＥ、ＴＴＥＱ（配列番号１）、または関連するエピトープを含む化合物、任意選択的に、本明細書に記載の環状化合物を含む、免疫原を含む。実施形態では、免疫原は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などの免疫原性向上成分を含み、かつ／またはアジュバント（例えば、ミョウバン、モノホスホリルリピドＡ、またはＱＳ２１）と同時注入するために製剤化される。他の同様の成分が当該技術分野で知られており、追加のアジュバントが以下に記載される。以下にさらに記載されるように、アジュバントは、典型的には、化合物を含む組成物中に製剤化される。免疫原性向上成分は、アミド結合、ジスルフィド結合などを通して直接か、または化学的リンカーを通して間接的にかのいずれかで化合物に結合され得る。別の実施形態では、免疫原は、多重抗原性ペプチド（ＭＡＰ）である。例えば、ＭＡＰは、環化される直鎖状化合物を調製し、任意選択的に、ヘッドトゥーテール環化を使用してペプチドを環化し、リンカー中のアミノ酸を通して、任意選択的にリンカー中のＣまたはＤ残基を通して、環化ペプチドをＭＡＰ樹脂に接合することによって、合成され得る。ＭＡＰは、環状構造に対して構成されており（例えば、Ｍｉｓｕｍｉ  ｅｔ  ａｌＪ．Ｖｉｒｏｌ．Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２００１  ｖｏｌ．７５  ｎｏ．２３  １１６１４−１１６２０を参照されたい）、本明細書に記載のものと同様の方法を使用し得る。
【０１３４】
免疫原性向上成分を含む免疫原は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｌａｔｅｅｆ  ｅｔ  ａｌ  ２００７に記載の方法を使用して、システインなどの官能性部分を含む制限されたエピトープペプチドおよびリンカーを含有する環状化合物を、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などの免疫原性向上成分またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの担体に接合することによって生産され得る。実施形態では、実施例３に記載の方法を使用する。
【０１３５】
さらなる態様は、本明細書に記載の化合物もしくは免疫原のタンパク質性部分をコードする単離核酸である。
【０１３６】
ＩＶ．抗体、細胞、および核酸
したがって、抗体を産生するために、上記に記載のエピトープＴＴＥＱ（配列番号１）または関連するエピトープを含む、化合物、特に環状化合物を使用することができる。ＴＴＥＱ（配列番号１）または関連するエピトープ、例えば、ＫＴＴＥ（配列番号１０）、ＴＴＥ、ＴＥＱ、ＴＴＥＱＤ（配列番号９）、ＫＴＴＥＱＤ（配列番号７）、ＫＴＴＥＱＤＬ（配列番号１４）、および／または本明細書に記載の他の関連するエピトープ配列を含む環状化合物を使用して、ミスフォールドＴＤＰ−４３に選択的に結合する抗体を産生することができる。
【０１３７】
したがって、例えば、表１１に列挙されるエピトープまたは環状化合物配列を含むものを含む、本明細書に記載の化合物、特に環状化合物を使用して、それらが含み、かつ／または本明細書に記載の１つ以上の異なる特徴を含む、ミスフォールドＴＤＰ−４３中のこれらの残基の特異的立体配座を認識する、ＴＤＰ−４３中のエピトープに特異的または選択的に結合する抗体を産生することができる。
【０１３８】
したがって、ある態様は、ＴＤＰ−４３上でエピトープに特異的または選択的に結合する抗体を含み、エピトープは、ＴＴＥＱ（配列番号１）、それらの関連するエピトープ、またはその一部、または前述のいずれかの立体配座エピトープを含むか、またはこれらからなる。実施形態では、エピトープがＴＴＥＱ（配列番号１）からなる場合、それは、立体配座エピトープである。
【０１３９】
実施形態では、抗体は、単離されている。
【０１４０】
実施形態では、抗体は、特異的に結合せず、かつ／または天然型ＴＤＰ−４３について選択的でなく、例えば、ＴＴＥＱ（配列番号１）またはＴＴＥなどの関連するエピトープの立体配座は、天然型ＴＤＰ−４３中に存在する通りである。選択的結合は、本明細書に記載のように、ＥＬＩＳＡまたは表面プラズモン共鳴測定を使用して測定することができる。
【０１４１】
したがって、さらなる態様は、ＴＤＰ−４３上に存在するエピトープに特異的または選択的に結合する抗体であり、エピトープは、主に抗体の結合に関わる少なくとも１つのアミノ酸残基を含むか、またはこれからなり、少なくとも１つのアミノ酸は、配列ＴＴＥＱ（配列番号１）、ＴＥＱ、またはＫＴＴＥ（配列番号１０）内に埋め込まれたＴ１１５、Ｔ１１６、Ｅ、またはＱであり、任意選択的に、エピトープは、ＴＴＥＱ（配列番号１）からなる場合、立体配座エピトープである（例えば、対応する天然型集合体に関して交互の任意選択的に溶媒露出される立体配座においてペプチドに選択的に結合し、例えば、エピトープの少なくとも１つのアミノ酸は、より多く溶媒露出される）。実施形態では、エピトープは、主に抗体への結合に関わる少なくとも２つの連続するアミノ酸残基を含むか、またはこれらからなり、少なくとも２つの連続するアミノ酸は、ＴＴＥＱ（配列番号１）、ＴＴＥ、またはＴＥＱ内に埋め込まれたＴＥ、またはＥＱである。
【０１４２】
別の実施形態では、エピトープは、立体配座エピトープであり、ＴＴＥＱ（配列番号１）、ＴＴＥ、またはＴＥＱからなる。実施形態では、抗体は、ＴＴＥＱ（配列番号１）、ＴＴＥ、またはＴＥＱ、または環状化合物中の他の関連するエピトープ、任意選択的に環状ペプチド、任意選択的にシクロ（ＣＧＴＴＥＱＧ）（配列番号３）、または対応する直鎖状ペプチドおよび／または天然型集合体に関して、配列番号２、３、２２、２３、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、および４２、またはそれらの任意のサブセットのうちのいずれか１つの配列を有する環状ペプチドに選択的に結合する。
【０１４３】
実施形態では、抗体は、本明細書に記載の少なくとも１つの交互立体配座特徴を含む、本明細書に記載のエピトープペプチド（例えば、天然型構造的集合体と比較して、環状化合物中のエピトープの）を含む環状化合物に特異的に結合する。例えば、特定のエピトープ立体配座に結合する抗体は、立体配座特異的抗体とも称され得る。立体配座特異的抗体は、特定のミスフォールドＴＤＰ−４３種を示差的に認識することができ、天然型種と比較して、１つの種または種の群についてより高い親和性を有し得る。
【０１４４】
例えば、実施形態では、抗体は、Ｔ、Ｅ、およびＱから選択される残基を含む環状化合物に特異的に結合し、少なくとも１つの二面角は、天然型構造の文脈で対応する二面角よりも、環状化合物において、少なくとも３０度、少なくとも４０度、少なくとも５０度、少なくとも６０度、少なくとも７０度、少なくとも８０度、少なくとも９０度、少なくとも１００度、少なくとも１１０度、少なくとも１２０度、少なくとも１３０度、少なくとも１４０度、または少なくとも１５０度異なる。
【０１４５】
実施形態では、抗体は、任意選択的に、ＴＴＥＱ（配列番号１）を含む天然型集合体に関してシクロ（ＣＧＧＴＴＥＱＧＧ）（配列番号２）の文脈で、任意選択的に、ＴＴＥＱ（配列番号１）を含む天然型集合体に関して直鎖状シクロ（ＣＧＴＴＥＱＧ）（配列番号３）の文脈で、ＴＴＥＱ（配列番号１）またはその一部を含む環状化合物に選択的に結合する。例えば、実施形態では、抗体は、環状立体配座におけるＴＴＥＱ（配列番号１）またはＴＴＥに選択的に結合し、任意選択的に、本明細書に記載の方法を使用して、例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学、または表面プラズモン共鳴によって測定されるように、天然型集合体におけるＴＴＥＱ（配列番号１）またはＴＴＥと比較して、環状立体配座におけるＴＴＥＱ（配列番号１）またはＴＴＥについて、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍または少なくとも１０００倍より選択的なより大きい選択性（例えば、結合親和性）を有する。
【０１４６】
実施形態では、抗体を生産するために選択的に結合され、かつ／または使用される環状化合物は、表１１の化合物である。別の実施形態では、当該環状化合物は、配列番号２、３、２２、２３、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、および４２、またはそれらの任意のサブセットから選択される環状化合物である。実施形態では、環状化合物は、配列番号２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、および３５のうちのいずれか１つから選択される配列を含む。別の実施形態では、環状化合物は、配列番号２、３、２２、２３、および４２から選択される配列を含む。また他の実施形態では、環状化合物は、配列番号２９、３２、および３４のうちのいずれか１つから選択される配列を含む。また他の実施形態では、環状化合物は、配列番号２、３、２２、および２３のうちのいずれか１つから選択される配列を含む。
【０１４７】
実施形態では、選択的に結合された環状化合物は、表１１の化合物である。実施形態では、選択性は、天然型ＴＤＰ−４３から選択されるＴＤＰ−４３の種にわたる環状化合物および／またはミスフォールドＴＤＰ−４３ポリペプチドについて、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、または少なくとも１０００倍より選択的である。
【０１４８】
また別の態様では、本開示は、配列番号２、３、２２、２３、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、および４２のうちのいずれか１つから選択される配列を有する環状ペプチドへの選択的な結合を競合する抗体を提供する。
【０１４９】
モノクローナル抗体を生産するために、抗体生産細胞（リンパ球）は、本明細書に記載の免疫原により免疫付与され、標準的な体細胞の融合手順の骨髄腫細胞により融合され、よってこれらの細胞を不死化し、ハイブリドーマ細胞を生じる、対照から採取され得る。このような技術は、当該技術分野でよく知られている（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎによって元々開発されたハイブリドーマ技術（Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７（１９７５））、ならびにヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ４：７２（１９８３））、ヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，１２１：１４０−６７（１９８６））、および組み合せ抗体ライブラリーのスクリーニング（Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５（１９８９））などの他の技術）。ハイブリドーマ細胞は、所望のエピトープに特異的に反応的な抗体の生産について免疫化学的にスクリーニングすることができ、モノクローナル抗体を単離することができる。
【０１５０】
特定の抗原または分子に対して反応的な特異的抗体または抗体断片はまた、細胞表面成分を含む細菌中に発現される、免疫グロブリン遺伝子またはそれらの一部分をコードする発現ライブラリーをスクリーニングすることによって生成され得る。例えば、完全なＦａｂ断片、ＶＨ領域、およびＦＶ領域は、ファージ発現ライブラリーを使用して細菌中に発現され得る（例えば、Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４１：５４４−５４６（１９８９）、Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１（１９８９）、およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４（１９９０）を参照されたい）。
【０１５１】
非ヒト種由来の抗体のヒト化は、文献によく記載されている。例えば、ＥＰ−Ｂ１  ０  ２３９４００  ａｎｄ  Ｃａｒｔｅｒ＆Ｍｅｒｃｈａｎｔ  １９９７（それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ８，４４９−４５４，１９９７）を参照されたい。ヒト化抗体はまた、商業的に容易に入手可能である（例えば、Ｓｃｏｔｇｅｎ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，２  Ｈｏｌｌｙ  Ｒｏａｄ，Ｔｗｉｃｋｅｎｈａｍ，Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ，Ｇｒｅａｔ  Ｂｒｉｔａｉｎ．）。
【０１５２】
げっ歯類抗体のヒト化形態は、ＣＤＲ移植によって容易に生成される（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７，１９８８）。この手法では、げっ歯類モノクローナル抗体の抗原結合部位を含む６つのＣＤＲループは、対応するヒトフレームワーク領域に連結される。ＣＤＲ移植は、フレームワーク領域のアミノ酸が抗原認識に影響を与え得るため、親和性が低減した抗体を生じることが多い（Ｆｏｏｔｅ＆Ｗｉｎｔｅｒ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２２４：４８７−４９９，１９９２）。抗体の親和性を維持するために、部位方向付けされた変異原性または他の組み換え技術によって特定のフレームワーク残基を置き換えることが必要であることが多く、抗原結合部位のコンピュータモデリングによって補助され得る（Ｃｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５２：２９６８−２９７６，１９９４）。
【０１５３】
抗体のヒト化形態は、任意選択的に、表面再建によって得られる（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２３５：９５９−９７３，１９９４）。この手法では、げっ歯類抗体の表面残基のみがヒト化される。
【０１５４】
特定の抗原に特異的なヒト抗体は、ファージ表示戦略によって同定され得る（Ｊｅｓｐｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２：８９９−９０３，１９９４）。１つの手法では、特定の抗原に対して方向付けられたげっ歯類抗体の重鎖は、繊維状ファージ上のＦａｂ断片として表示するために、ヒト軽鎖のレパートリーからクローン化され、これと対になる。ファージは、抗原に結合することによって選択される。選択されるヒト軽鎖は、その後、ファージ上で表示するためにヒト重鎖のレパートリーと対になり、ファージは、抗原に結合することによって再び選択される。結果は、特定の抗原に特異的なヒト抗体Ｆａｂ断片である。別の手法では、ファージのライブラリーは、メンバーがそれらの外部表面上に異なるヒト抗体断片（ＦａｂまたはＦｖ）を表示する場合に生産される（Ｄｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ９１／１７２７１およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ９２／０１０４７）。所望の特異性を有する抗体を表示するファージは、特異的抗原に対する親和性の強化によって選択される。いずれかの手法から同定されるヒトＦａｂまたはＦｖ断片は、哺乳動物細胞中のヒト抗体として発現するために再クローン化され得る。
【０１５５】
ヒト抗体は、任意選択的に、遺伝子導入動物から得られる（米国特許第第６，１５０，５８４号、同第６，１１４，５９８号、および同第５，７７０，４２９号）。この手法では、キメラまたは生殖系列突然変異マウスにおける重鎖接合領域（ＪＨ）遺伝子を削除する。ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイは、その後、このような突然変異マウスに転写される。結果として生じた遺伝子導入マウスは、次に、抗原チャレンジに対するヒト抗体の完全なレパートリーを生成することができる。
【０１５６】
ヒト化またはヒト抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、またはＩｇＥを含む任意のクラスの免疫グロブリン、ならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む任意のアイソタイプから選択される。ヒト化抗体またはヒト抗体は、１つもしくは複数のアイソタイプまたはクラスからの配列を含み得る。さらに、これらの抗体は、典型的には、Ｆａｂ、Ｆａｂ´Ｆ（ａｂ´）２、Ｆｄ、Ｆｖ、および単一ドメイン抗体断片などの抗原結合断片として、または重鎖および軽鎖がスペーサーによって連結される単鎖抗体として生産される。また、ヒト抗体またはヒト化抗体は、単量体またはポリマー形態で存在し得る。ヒト化抗体は、任意選択的に、１つの非ヒト鎖および１つのヒト化鎖（すなわち、１つのヒト化重鎖または軽鎖）を含む。
【０１５７】
さらに、本明細書に記載のエピトープについて特異的な抗体は、抗体ファージ表示ライブラリーをスクリーニングすることによって容易に単離される。例えば、抗体ファージライブラリは、任意選択的に、疾患特異的エピトープに対して特異的な抗体断片を同定するために、本発明の疾患特異的エピトープを使用することによってスクリーニングされる。同定された抗体断片は、任意選択的に、本発明の異なる実施形態と共に有用である組み換え抗体の変種を生産するために使用される。抗体ファージ表示ライブラリーは、当該技術分野でよく知られている、抗体ファージライブラリをスクリーニングするためのＸｏｍａ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）方法を通して、商業的に入手可能である。
【０１５８】
以下に示すように、トランスフェクト細胞またはＡＬＳ脊髄ホモジネート中のミスフォールド疾患関連ＴＤＰ−４３を検出するための陽性であるいくつかの抗体を配列決定した。
【０１５９】
したがって、別の実施形態では、本明細書に記載の抗体は、任意選択的に融合される、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、軽鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含み、当該ＣＤＲの前記アミノ酸配列は、以下の配列を含む。
2020522475.tif 000005
【０１６０】
別の実施形態では、本明細書に記載の抗体は、任意選択的に融合される、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、軽鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含み、当該ＣＤＲの前記アミノ酸配列は、以下の配列を含む。
2020522475.tif 000006
【０１６１】
別の実施形態では、本明細書に記載の抗体は、任意選択的に融合される、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、軽鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含み、当該ＣＤＲの前記アミノ酸配列は、以下の配列を含む。
2020522475.tif 000007
【０１６２】
別の実施形態では、本明細書に記載の抗体は、任意選択的に融合される、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、軽鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含み、当該ＣＤＲの前記アミノ酸配列は、以下の配列を含む。
2020522475.tif 000008
【０１６３】
また別の実施形態では、本明細書に記載の抗体は、任意選択的に融合される、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、軽鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含み、当該ＣＤＲの前記アミノ酸配列は、以下の配列を含む。
2020522475.tif 000009
【０１６４】
また別の実施形態では、本明細書に記載の抗体は、任意選択的に融合される、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、軽鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含み、当該ＣＤＲの前記アミノ酸配列は、以下の配列を含む。
2020522475.tif 000010
【０１６５】
図１３ＡおよびＢに示すように、ＣＤＲＳは、構造的類似性を共有する。具体的には、いくつかのクローンの軽鎖配列が類似している。
【０１６６】
実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。実施形態では、抗体は、表１０に列挙されるＣＤＲ配列を含むヒト化抗体などのキメラ抗体である。
【０１６７】
別の実施形態では、任意選択的に、単鎖抗体の文脈で、表１０のＣＤＲならびに軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む抗体も提供する。
【０１６８】
また別の態様では、抗体は、ｉ）配列番号４６に記載のアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号４６と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、ＣＤＲ配列が、配列番号６７、６８、および６９に記載される通りである、アミノ酸配列、またはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列を含む、重鎖可変領域を含む。別の態様では抗体は、ｉ）配列番号４８に記載のアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号４８と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、ＣＤＲ配列が、配列番号７０、７１、および７２に記載される通りである、アミノ酸配列、またはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域を含む。別の実施形態では、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号４５に記載のヌクレオチド配列またはそのコドン縮退もしくは最適化バージョンによってコードされる。別の実施形態では、抗体は、配列番号４７に記載のヌクレオチド配列またはそのコドン縮退もしくは最適化バージョンによってコードされた軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む。実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号４６に記載のアミノ酸配列を含む。実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号４８に記載のアミノ酸配列を含む。
【０１６９】
また別の態様では、抗体は、ｉ）配列番号５０に記載のアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号５０と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、ＣＤＲ配列が、配列番号７３、７４、および７５に記載される通りである、アミノ酸配列、またはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列を含む、重鎖可変領域を含む。別の態様では抗体は、ｉ）配列番号５２に記載のアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号５２と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、ＣＤＲ配列が、配列番号７６、７７、および７８に記載される通りである、アミノ酸配列、またはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域を含む。別の実施形態では、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号４９に記載のヌクレオチド配列またはそのコドン縮退もしくは最適化バージョンによってコードされる。別の実施形態では、抗体は、配列番号５１に記載のヌクレオチド配列またはそのコドン縮退もしくは最適化バージョンによってコードされた軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む。実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号５０に記載のアミノ酸配列を含む。実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号５２に記載のアミノ酸配列を含む。
【０１７０】
また別の態様では、抗体は、ｉ）配列番号５４に記載のアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号５４と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、ＣＤＲ配列が、配列番号７３、７９、および８０に記載される通りである、アミノ酸配列、またはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列を含む、重鎖可変領域を含む。別の態様では、抗体は、ｉ）配列番号５６に記載のアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号５６と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、ＣＤＲ配列が、配列番号７６、７７、および８１に記載される通りである、アミノ酸配列、またはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域を含む。別の実施形態では、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号５３に記載のヌクレオチド配列またはそのコドン縮退もしくは最適化バージョンによってコードされる。別の実施形態では、抗体は、配列番号５５に記載のヌクレオチド配列またはそのコドン縮退もしくは最適化バージョンによってコードされた軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む。実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号５４に記載のアミノ酸配列を含む。実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号５６に記載のアミノ酸配列を含む。
【０１７１】
また別の態様では、抗体は、ｉ）配列番号５８に記載のアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号５８と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、ＣＤＲ配列が、配列番号６７、６８、および８２に記載される通りである、アミノ酸配列、またはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列を含む、重鎖可変領域を含む。別の態様では、抗体は、ｉ）配列番号６０に記載のアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号６０と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、ＣＤＲ配列が、配列番号８３、８４、および８５に記載される通りである、アミノ酸配列、またはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域を含む。別の実施形態では、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号５７に記載のヌクレオチド配列またはそのコドン縮退もしくは最適化バージョンによってコードされる。別の実施形態では、抗体は、配列番号５９に記載のヌクレオチド配列またはそのコドン縮退もしくは最適化バージョンによってコードされた軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む。実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号５８に記載のアミノ酸配列を含む。実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号６０に記載のアミノ酸配列を含む。
【０１７２】
また別の態様では、抗体は、ｉ）配列番号６２に記載のアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号６２と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、ＣＤＲ配列が、配列番号８６、８７、および８８に記載される通りである、アミノ酸配列、またはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列を含む、重鎖可変領域を含む。別の態様では、抗体は、ｉ）配列番号６４に記載のアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号６４と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、ＣＤＲ配列が、配列番号７６、７７、および９２に記載される通りである、アミノ酸配列、またはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域を含む。別の実施形態では、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号６１に記載のヌクレオチド配列またはそのコドン縮退もしくは最適化バージョンによってコードされる。別の実施形態では、抗体は、配列番号６３に記載のヌクレオチド配列またはそのコドン縮退もしくは最適化バージョンによってコードされた軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む。実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号６２に記載のアミノ酸配列を含む。実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号６４に記載のアミノ酸配列を含む。
【０１７３】
また別の態様では、抗体は、ｉ）配列番号６６に記載のアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号６６と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、ＣＤＲ配列が、配列番号８９、９０、および９１に記載される通りである、アミノ酸配列、またはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列を含む、重鎖可変領域を含む。別の態様では、抗体は、ｉ）配列番号６４に記載のアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号６４と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、ＣＤＲ配列が、配列番号７６、７７、および９２に記載される通りである、アミノ酸配列、またはｉｉｉ）ｉ）の保存的置換アミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域を含む。別の実施形態では、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号６５に記載のヌクレオチド配列またはそのコドン縮退もしくは最適化バージョンによってコードされる。別の実施形態では、抗体は、配列番号６３に記載のヌクレオチド配列またはそのコドン縮退もしくは最適化バージョンによってコードされた軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む。実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号６６に記載のアミノ酸配列を含む。実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号６４に記載のアミノ酸配列を含む。
【０１７４】
別の態様は、表１０に列挙されるＣＤＲ配列を有する抗体と同じエピトープに特異的に結合する抗体である。
【０１７５】
別の態様は、本明細書に記載の環状化合物、および／または表１０に列挙されるＣＤＲ配列を含む抗体などの本明細書に記載の抗体を含むヒトミスフォールドＴＤＰ４３との結合について競合する抗体を含む。
【０１７６】
抗体間の競合は、例えば、共通抗原との参照抗体の特異的結合を阻害する能力について試験下の抗体を評価するアッセイを使用して判定することができる。試験抗体は、過剰の試験抗体（例えば、少なくとも２倍、５倍、１０倍、または２０倍）が、参照抗体の結合を、競合的結合アッセイで測定されるように、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％阻害する場合に、参照抗体と競合する。
【０１７７】
さらなる態様は、検出可能な標識に接合された抗体である。実施形態では、検出可能な標識は、陽電子放出放射性核種である。陽電子放出放射性核種は、例えば、ＰＥＴ撮像において使用することができる。実施形態では、抗体は、血液脳関門にわたる、かつ／または細胞への輸送を許容する輸送部分に接合される。例えば、抗体は、鉄輸送タンパク質メラノトランスフェリン（ｐ９７）に共有結合され得るか、またはトランスフェリン受容体、インスリン受容体、リポタンパク質受容体、Ｂａｓｉｇｉｎ、Ｇｌｕｔ１、またはＣＤ９８ｈｃなどのＢＢＢ受容体に対して特異的な抗体断片に融合され得る。別の例は、他のＢＢＢ表面受容体に対して方向付けされたＢＢＢ浸透性単一ドメイン抗体ＦＣ５または単一ドメイン抗体に融合される。実施形態では、抗体は、細胞内凝集ＴＤＰ４３の診断的検出のための細胞内へのエントリを容易にする輸送部分に接合される。例えば、抗体は、トランス活性化転写活性化因子（ＴＡＴ）およびＴＡＴ誘導体、ペネトラチン、またはトランスポータンなどの細胞貫通ペプチドに化学的に連結され得るか、または組み換え融合される。
【０１７８】
さらなる態様は、本明細書に記載の抗体および／またはそれらの結合断片およびミスフォールドＴＤＰ−４３を含む抗体複合体に関する。さらなる態様は、本明細書に記載の抗体またはその一部をコードする単離核酸である。
【０１７９】
重鎖または軽鎖をコードする核酸、例えば、本明細書に記載のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、および／またはＣＤＲ−Ｈ３領域を含む重鎖をコードするか、または本明細書に記載のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、および／またはＣＤＲ−Ｌ３領域を含む軽鎖をコードする核酸も提供する。
【０１８０】
本開示は、本明細書に開示の抗体および／またはその結合断片をコードする核酸配列の変異も提供する。例えば、変異は、少なくとも中程度に厳しいハイブリダイゼーション条件またはコドン縮退または最適化された配列の下で、本明細書に開示の抗体および／またはその結合断片をコードする核酸配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、変異核酸配列は、配列番号４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、および６５のうちのいずれか１つをコードする核酸配列に対して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、最も好ましくは少なくとも８０％、よりいっそう好ましくは少なくとも９０％、さらに最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する。
【０１８１】
別の態様は、本明細書に開示の核酸を含む発現カセットまたはベクターである。実施形態では、ベクターは、単離ベクターである。
【０１８２】
ベクターは、抗体および／もしくはその結合断片を生産するか、または本明細書に記載のペプチド配列を発現するのに好適なベクターを含む、任意のベクターであり得る。
【０１８３】
核酸分子は、既知の方法で、タンパク質の発現を確保する適切な発現ベクターに組み込まれ得る。可能な発現ベクターは、限定されないが、コスミド、プラズミド、または修飾ウイルス（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）を含む。ベクターは、使用される宿主細胞と互換性があるべきである。発現ベクターは、「宿主細胞の形質変換に好適」であり、発現ベクターが、本明細書に記載のエピトープまたは抗体に対応するペプチドをコードする核酸分子を含有することを意味する。
【０１８４】
実施形態では、ベクターは、例えば、遺伝子治療による単鎖抗体を発現するのに好適である。ベクターは、例えば、神経特異的プロモーターなどを使用して、神経組織における特異的発現のために適合され得る。実施形態では、ベクターは、ＩＲＥＳを含み、軽鎖可変領域および重鎖可変領域の発現を可能にする。このようなベクターを使用して、インビボで抗体を送達することができる。
【０１８５】
好適な調節配列は、細菌、真菌、ウイルス、哺乳動物、または昆虫遺伝子を含む、様々な供給源に由来し得る。
【０１８６】
このような調節配列の実施例には、翻訳開始シグナルを含む、転写プロモーターおよびエンハンサーまたはＲＮＡポリメラーゼ結合配列、リボソーム結合配列が含まれる。さらに、選択される宿主細胞および用いられるベクターに応じて、複製起点、追加のＤＮＡ制限部位、エンハンサー、および転写の誘導性をもたらす配列などの他の配列が、発現ベクターに組み込まれ得る。
【０１８７】
実施形態では、調節配列は、神経組織および／または細胞における発現を方向付けるか、または増加させる。
【０１８８】
実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。
【０１８９】
組み換え発現ベクターはまた、本明細書に記載の抗体またはエピトープペプチドを発現するためのベクターで形質転換されるか、影響を受けるか、またはトランスフェクトされる宿主細胞の選択を容易にするマーカー遺伝子を含有し得る。
【０１９０】
組み換え発現ベクターはまた、組み換えペプチドの発現または安定性の増加、組み換えペプチドの溶解度の増加、および例えば、本明細書に記載のタグおよび標識を含む、親和性精製におけるリガンドとして作用することによる、標的組み換えペプチドの精製の補助を提供する、融合部分（すなわち、「融合タンパク質」）をコードする発現カセットを含有し得る。さらに、タンパク質分解性開裂部位は、標的組み換えタンパク質に追加されて、融合タンパク質の精製後の融合部分からの組み換えタンパク質の分離を可能にすることができる。典型的な融合発現ベクターは、それぞれ、グルタチオンＳ転移酵素（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはタンパク質Ａを組み換えタンパク質に融合させる、ｐＧＥＸ（Ａｍｒａｄ  Ｃｏｒｐ．，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を含む。
【０１９１】
遺伝子を、例えば神経細胞および神経組織に、インビトロおよびインビボの両方で転写するためのシステムは、ウイルス、最も注目すべきは、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、およびレンチウイルスを含むレトロウイルスに基づくベクターを含む。遺伝子送達のための代替的手法は、裸のプラズミドＤＮＡならびにリポソーム−ＤＮＡ複合体の使用を含む。別の手法は、ＤＮＡがポリカチオン縮合されたＡＡＶプラズミド、および脳内遺伝子送達により脳に捕捉および導入される脂質の使用である（Ｌｅｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．ＵＳ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．２００２０７６３９４）。
【０１９２】
したがって、別の態様では、本明細書に記載の化合物、免疫原、核酸、ベクター、および抗体は、例えば、本明細書に記載の抗体、化合物、免疫原、および核酸の送達のために、リポソーム、ナノ粒子、およびウイルスタンパク質粒子などのベシクル中に製剤化され得る。具体的には、ポリマーソームを含む合成ポリマーベシクルを使用して、抗体を投与することができる。
【０１９３】
別の態様では、本明細書に記載の抗体またはその一部を発現する細胞も提供する。実施形態では、細胞は、本明細書に記載の抗体を発現するか、または本明細書に開示のベクターを含む、単離および／または組み換え細胞である。実施形態では、細胞は、ハイブリドーマなどの融合細胞である。
【０１９４】
組み換え細胞は、ポリペプチドを生産するのに好適な、例えば、抗体および／またはその結合断片を生産するのに好適な任意の細胞を使用して生成され得る。例えば、核酸（例えばベクター）を細胞に導入するために、細胞は、用いられるベクターに応じて、トランスフェクト、形質転換、または感染され得る。
【０１９５】
好適な宿主細胞は、幅広い様々な原核および真核宿主細胞を含む。例えば、本明細書に記載のタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルスを使用して）、酵母細胞、または哺乳動物の細胞中に発現され得る。
【０１９６】
実施形態では、細胞は、酵母、植物、蠕虫、昆虫、鳥類、魚類、爬虫類、および哺乳動物細胞から選択される真核細胞である。
【０１９７】
別の実施形態では、哺乳動物細胞は、骨髄腫細胞、脾臓細胞、またはハイブリドーマ細胞である。
【０１９８】
実施形態では、細胞は、神経細胞である。
【０１９９】
抗体またはペプチドを発現するのに好適な酵母および真菌宿主細胞は、限定されないが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、ｇｅｎｅｒａ  Ｐｉｃｈｉａ、またはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、および様々な種のｇｅｎｕｓ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓを含む。酵母Ｓ．ｃｅｒｉｖｉｓｉａｅを発現するためのベクターの例には、ｐＹｅｐＳｅｃ１、ｐＭＦａ、ｐＪＲＹ８８、およびｐＹＥＳ２が含まれる（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）。酵母および真菌の形質転換のためのプロトコルは、当業者によく知られている。
【０２００】
好適であり得る哺乳動物細胞は、他の中でも特に、ＣＯＳ（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ  １６５０または１６５１）、ＢＨＫ（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ  ６２８１）、ＣＨＯ（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ  ６１）、ＨｅＬａ（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ  ２）、２９３（ＡＴＣＣ番号１５７３）、およびＮＳ−１細胞を含む。哺乳動物細胞における発現を方向付けるための好適な発現ベクターは、遺伝子的に、プロモーター（例えば、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、およびシミアンウイルス４０などのウイルス物質に由来する）、ならびに他の転写および翻訳制御配列を含む。哺乳動物発現ベクターの例には、ｐＣＤＭ８およびｐＭＴ２ＰＣが含まれる。
【０２０１】
実施形態では、細胞は、例えば、ＴＤＰ４３天然型構造上でＴＤＰ−４３病理学的オリゴマーに選択的に結合するか、直鎖状化合物に関して環状化合物中に提示されたエピトープ配列に選択的に結合するか、またはプラーク結合を欠いているか、もしくはごく少量のプラーク結合を有することを含む、ハイブリドーマ細胞であって、本明細書に記載のエピトープまたはエピトープ配列について特異的および／または選択的な抗体を生成する、ハイブリドーマ細胞などの融合細胞である。
【０２０２】
さらなる態様は、本明細書に記載のエピトープに対して特異的な抗体を生産するハイブリドーマ細胞株である。
【０２０３】
Ｖ．組成物
さらなる態様は、本明細書に記載の化合物、免疫原、核酸、ベクター、または抗体を含む組成物である。
【０２０４】
実施形態では、組成物は、希釈剤を含む。
【０２０５】
核酸に対して好適な希釈剤は、水、生理食塩水、およびエタノールを含むがこれらに限定されない。
【０２０６】
抗体またはそれらの断片および／または細胞を含む、ポリペプチドに好適な希釈剤には、限定されないが、生理食塩水、ｐＨ緩衝液、ならびにグリセロール溶液、またはポリペプチドおよび／もしくは細胞を凍結させるのに好適な他の溶液が含まれる。
【０２０７】
本明細書に記載の化合物または免疫原を含む実施形態では、組成物は、アジュバントを含む。
【０２０８】
実施形態では、アジュバントは、ミョウバン、モノホスホリルリピドＡ、およびＱＳ２１から選択される。
【０２０９】
例えば、内的アジュバント（リポ多糖類など）を含む、使用され得るアジュバントは、通常、ワクチンとして使用される死菌または弱毒化した細菌の成分である。外的アジュバントは、典型的には、抗原に非共有結合され、宿主免疫応答を向上させるように製剤化された免疫調製物質である。水酸化アルミニウム、硫酸バンド、およびリン酸アルミニウム（集合的にミョウバンと称される）は、日常的に、アジュバントとして使用される。広範囲の外的アジュバントが、免疫原に対する強力な免疫応答を引き起こす可能性がある。これらは、Ｓｔｉｍｕｌｏｎｓ（ＱＳ２１、Ａｑｕｉｌａ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、Ｍａｓｓ．）などのサポニン、または膜タンパク質抗原（免疫刺激複合体）に複合体化された、ＩＳＣＯＭおよび（免疫賦活性複合体）およびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸなどのそこから生成された粒子、鉱油を含むプルロニックポリマー、死滅マイコバクテリアおよび鉱油、完全フロイントアジュバント、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）およびリポ多糖類（ＬＰＳ）などの細菌生成物、ならびに脂質Ａ、およびリポソームを含む。
【０２１０】
実施形態では、アジュバントは、水酸化アルミニウムである。別の実施形態では、アジュバントは、リン酸アルミニウムである。水中油型乳剤は、スクアレン、落花生油、ＭＦ５９（ＷＯ９０／１４３８７）、ＳＡＦ（Ｓｙｎｔｅｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）、およびＲｉｂｉ（商標）（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｍｏｎｔ．）を含む。水中油型乳剤は、ムラミルペプチド（例えば、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミル−Ｌ−アラニン−２−（１´−２´ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−ＡＩ−Ｄ−イソグル−Ｌ−アラ−ジパルミトキシプロピルアミド（ＤＴＰ−ＤＰＰ）セルアミド（ＴＭ））、または他の細菌細胞壁成分などの免疫賦活性剤と共に使用され得る。
【０２１１】
アジュバントは、単一組成物として免疫原と共に投与され得る。代替的に、アジュバントは、免疫原の投与の前、同時、および／または後に投与され得る。
【０２１２】
実施形態では、組成物は、本明細書に記載の抗体またはその一部を含む。別の実施形態では、組成物は、本明細書に記載の抗体またはその一部、および希釈剤を含む。実施形態では、組成物は、滅菌組成物である。
【０２１３】
実施形態では、組成物は、ミスフォールドＴＤＰ−４３の検出など、本明細書に記載の方法のためのものである。
【０２１４】
ＶＩ．キット
さらなる態様は、滅菌バイアルなどのバイアルまたは他のハウジングに含まれる、本明細書に記載のｉ）抗体および／またはその結合断片、ｉｉ）核酸、ｉｉｉ）ペプチドもしくは免疫原、ｉｖ）組成物、またはｖ）組み換え細胞、ならびに任意選択的に、基準剤および／またはそれらの使用のための命令を含む、キットに関する。
【０２１５】
実施形態では、キットは、ＥＬＩＳＡである。
【０２１６】
実施形態では、キットは、滅菌バイアルなどの容器に含有される、本明細書に記載の抗体または結合断片を含む。
【０２１７】
ＶＩＩ．方法
本明細書に記載の化合物、免疫原、および抗体を作製するための方法を含む。
【０２１８】
具体的には、ＴＴＥＱ（配列番号１）の立体配座エピトープまたは関連するエピトープについて選択的な抗体を作製する方法を提供する。実施形態では、方法は、本明細書に記載の免疫原を対象に投与することと、免疫原のＴＤＰ−４３ペプチドおよび／またはミスフォールドＴＤＰ−４３に選択的に結合する抗体を単離することと、を含む。
【０２１９】
さらなる態様は、ミスフォールドＴＤＰ−４３、例えば、ＴＴＥ、ＴＴＥＱ（配列番号１）、または関連する立体配座エピトープを含むミスフォールドＴＤＰ−４３を含むかどうかを検出する方法を提供し、かつ／または残基Ｔ１１５、Ｔ１１６、Ｅ、またはＱのうちの少なくとも１つは、非ミスフォールドタンパク質立体配座中のＴ、Ｅ、および／またはＱによって占められるよりも交互立体配座にある。
【０２２０】
実施形態では、本方法は、
ａ．抗体：ミスフォールドＴＤＰ−４３ポリペプチド複合体を生産するための許容可能な条件下で、本明細書に記載の抗体と試料を接触させることと、
ｂ．任意の複合体の存在を検出することと、を含み、
検出可能な複合体の存在は、試料がミスフォールドＴＤＰ−４３ポリペプチドを含有し得ることを示している。
【０２２１】
別の実施形態では、本方法は、
（ａ）抗体−抗原複合体を生産するための許容可能な条件下で、本明細書に記載の抗体と当該対象の試験試料を接触させることと、
（ｂ）試験試料中の抗体−抗原複合体の量を測定することと、
（ｃ）試験試料中の抗体−抗原複合体の量を対照と比較することと、を含み、対照と比較して、試験試料中の抗体−抗原複合体の検出は、試料がＴＴＥＱ（配列番号１）またはＴＴＥ（例えば、ミスフォールドＴＤＰ−４３）などの関連するエピトープを含む、ＴＤＰ−４３を含むことを示している。
【０２２２】
実施形態では、試料は、生体試料である。実施形態では、試料は、脳組織、脊髄組織、またはそれらの抽出物、および／またはＣＳＦを含む。実施形態では、試料は、ヒト対象から得られる。
【０２２３】
実施形態では、試料は、ＡＬＳを有する対象に由来する。別の実施形態では、試料は、ＦＴＤを有する対象に由来する。
【０２２４】
フローサイトメトリー、ドットまたはスロットブロット、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、および免疫沈降、その後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ免疫細胞化学などの免疫測定を含む、いくつかの方法を使用して、ミスフォールドＴＤＰ−４３ポリペプチドが本明細書に記載の抗体を使用した試料中に存在するかどうかを判定することができる。実施形態では、使用される方法は、実施例７、８、または１０に記載のステップのうちの１つ以上を含む。
【０２２５】
表面プラズモン共鳴を使用して、立体配座の特異的結合を評価することができる。
【０２２６】
本明細書に記載の標識された抗体を、ミスフォールドＴＤＰ−４３の位置を検出するために対象に投与することもできる。
【０２２７】
さらなる態様は、本明細書に記載の化合物を含む、化合物、免疫原、および／または組成物を対象に投与することと、任意選択的に、投与された化合物もしくは免疫原に特異的に結合する細胞および／または抗体を単離することと、を含む、対象における免疫応答を誘導する方法を含む。上記の開示は、本願を遺伝子的に記載している。以下の特定の例を参照することにより、より完全な理解を得ることができる。これらの例は、例示の目的のためだけに記載されており、本願の範囲を限定することを意図していない。同等物の形態の変化および置換は、状況が適切であると示唆し得るか、または適切である可能性があるため、考慮される。特定の用語が本明細書で用いられているが、このような用語は、記載の観点で意図されており、限定の目的のためではない。
【０２２８】
以下の非制限的例は、本開示の例示である。
【実施例】
【０２２９】
実施例１
ＴＤＰ−４３エピトープの予測
ほとんどのＡＬＳ／ＦＴＤ突然変異はＣ末端にあるが、突然変異の効果が、ＴＤＰ−４３の病理学的凝集体をもたらす可能性があり、これらの多量体凝集体は、構造化ドメインの障害を誘導する可能性がある。したがって、ＲＲＭ１ドメインは、ミスフォールドＴＤＰ−４３中に存在する立体配座特異的エピトープの存在について評価された。
【０２３０】
ＴＤＰ−４３中の推定上のミスフォールドエピトープは、２０１６年１１月９日に出願された、ＷＯ／２０１７／０７９８３６、ＳＹＳＴＥＭＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＰＲＥＤＩＣＴＩＮＧ  ＭＩＳＦＯＬＤＥＤ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＥＰＩＴＯＰＥＳ  ＢＹ  ＣＯＬＬＥＣＴＩＶＥ  ＣＯＯＲＤＩＮＡＴＥ  ＢＩＡＳＩＮＧに記載される「集合的座標の偏倚」と称される方法の助けを得て予測された。本明細書に記載のように、本方法は、タンパク質（またはペプチド凝集体）にグローバル座標の偏倚を課して、タンパク質（またはペプチド凝集体）をミスフォールドさせ、次に、部分的に非構造化されたタンパク質（またはペプチド凝集体）の最も可能性の高い展開領域を予測する、分子動力学に基づくシミュレーションを使用する。偏倚シミュレーションを行い、各残基指標に対応する（検討中のタンパク質の初期構造のものと比較して）溶媒アクセス可能な表面領域（ＳＡＳＡ）。ＳＡＳＡは、Ｈ２Ｏにアクセス可能な表面領域を表す。ＳＡＳＡにおける正の変化（検討中のタンパク質の初期構造のものと比較して）は、関連する残基指標の領域における展開を示すものと考えられ得る。候補エピトープを同定するために、ＳＡＳＡに加えて、２つの他の方法を使用した。これらは、カットオフ長さ内の非水素原子によって定義される天然型接触の喪失と、構造的集合体における平均についての偏差の範囲を測定する平均二乗変動（ＲＭＳＦ）とであり、ここで、いくつかのアミノ酸についてのＲＭＳＦの増加は、こうしたアミノ酸の動力学の増加を示す。
【０２３１】
ＴＤＰ−４３（ＰＤＢエントリ４ＩＵＦ）の天然に折り畳まれたＲＲＭ１ドメインに本方法を適用した。
【０２３２】
ＷＯ／２０１７／０７９８３６に記載の方法および以下に記載のＣＨＡＲＭＭ力場パラメータを使用して、各初期構造についてシミュレーションを行った。Ｋ．Ｖａｎｏｍｍｅｓｌａｅｇｈｅ，Ｅ．Ｈａｔｃｈｅｒ，Ｃ．Ａｃｈａｒｙａ，Ｓ．Ｋｕｎｄｕ，Ｓ．Ｚｈｏｎｇ，Ｊ．Ｓｈｉｍ，Ｅ．Ｄａｒｉａｎ，Ｏ．Ｇｕｖｅｎｃｈ，Ｐ．Ｌｏｐｅｓ，Ｉ．Ｖｏｒｏｂｙｏｖ，ａｎｄ  Ａ．Ｄ．  Ｍａｃｋｅｒｅｌｌ．Ｃｈａｒｍｍ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｆｏｒｃｅ  ｆｉｅｌｄ：Ａ  ｆｏｒｃｅ  ｆｉｅｌｄ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ−ｌｉｋｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｃｈａｒｍｍ  ａｌｌ−ａｔｏｍ  ａｄｄｉｔｉｖｅ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｏｒｃｅ  ｆｉｅｌｄｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１（４）：６７１−６９０，２０１０；ａｎｄ  Ｐ．Ｂｊｅｌｋｍａｒ，Ｐ．Ｌａｒｓｓｏｎ，Ｍ．Ａ．Ｃｕｅｎｄｅｔ，Ｂ．Ｈｅｓｓ，ａｎｄ  Ｅ．Ｌｉｎｄａｈｌ．Ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＨＡＲＭＭ  ｆｏｒｃｅ  ｆｉｅｌｄ  ｉｎ  ＧＲＯＭＡＣＳ：ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｆｒｏｍ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｍａｐｓ，ｖｉｒｔｕａｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｓｉｔｅｓ，ａｎｄ  ｗａｔｅｒ  ｍｏｄｅｌｓ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｔｈｅｏ．Ｃｏｍｐ．，６：４５９−４６６，２０１０，ｂｏｔｈ  ｏｆ  ｗｈｉｃｈ  ａｒｅ  ｈｅｒｅｂｙ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  ｈｅｒｅｉｎ  ｂｙ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ｗｉｔｈ  ＴＩＰ３Ｐ  ｗａｔｅｒ  ａｓ  ｓｏｌｖｅｎｔ。
【０２３３】
Ｉ．立体配座の特異的エピトープ
本開示は、ミスフォールドＴＤＰ−４３について選択的であり得る抗体に関する。
【０２３４】
ミスフォールディング特異的抗体の生成の必須条件は、天然型構造の文脈で存在しない（例えば、結合にアクセス可能でない）ＴＤＰ−４３ペプチドに対する標的の同定である。これらのミスフォールディング特異的エピトープは、主な配列において天然型ＴＤＰ−４３中の対応するセグメントと異なっていないが、ミスフォールドタンパク質の文脈で立体配座的に区別されるであろう。すなわち、これらは、天然に折り畳まれたタンパク質中に存在しないミスフォールドタンパク質中の区別される立体配座を提示するであろう。
【０２３５】
天然型集合体領域に対していずれかに方向付けされる抗体は、ミスフォールドタンパク質について選択的でない傾向があり、したがって、健常なタンパク質に同様に結合する。正常なタンパク質の濃度は、ミスフォールドタンパク質の濃度よりも実質的に高い可能性があるので、このような抗体は、「標的の混乱」を生じる可能性があり、主に健常なタンパク質に結合し、機能性ＴＤＰ−４３、ミスフォールドタンパク質種を選択的に標的としてこれらを除去するのではなく、機能性ＴＤＰ−４３の除去を促進するであろう。これは、重要なＲＮＡ結合および細胞の生存に必須のストレス応答機能を阻害する可能性がある。
【０２３６】
ＴＤＰ−４３のミスフォールドタンパク質形態について選択的な抗体を開発するために、外部摂動力の適用時に阻害される可能性が高い天然型タンパク質中の領域を、集合的座標アルゴリズムを使用して同定した。理論に縛られることを望まないが、天然型の文脈での阻害がミスフォールドタンパク質の表面上に同様に露出され得ると仮説を立てた。しかしながら、ミスフォールドタンパク質上で、これらの配列領域は、天然型ＴＤＰ−４３とは区別される立体配座中に露出され得る。例えば、表面上にあって、それらは、次に、構造的整列によって判定されるように、対応する数量がいずれかの天然型集合体中において示すよりも、より大きく露出された表面領域、異なる二面角分布、および／または全体的な異なる立体配座幾何学を有する領域に露出され得る。
【０２３７】
ＴＴＥＱ（配列番号１）およびＴＴＥを含む環状化合物を本明細書に記載する。環状化合物は、上記の基準のうちの１つ以上を満たすように設計されている。
【０２３８】
ＩＩ．エピトープ予測
エピトープＴＴＥＱ（配列番号１）およびＴＴＥは、予測されたエピトープとして現れる。
【０２３９】
ＴＴＥＱ（配列番号１）エピトープは、天然型接触の喪失を検討する場合に、ＰＤＢ構造４ＩＵＦについての予測として現れる。（図１のパネルＢ）。ＴＴＥは、ＳＡＳＡの増加を検証する場合に、構造４ＩＵＦについてのエピトープとして現れる。ＴＴＥは、ＲＭＳＦの増加を検証する場合に、構造４ＩＵＦについてのエピトープとして現れる。
【０２４０】
本明細書に考察される図１〜９の描画について、データは、Ｃｈａｒｍｍ３６力場を使用した陽溶媒（ＴＩＰ３Ｐ）中の平衡シミュレーションから得られる。各集合体についての立体配座位のシミュレーション時間および数は、以下の通りである。環状ペプチド集合体：合計で５０００フレームを含む、シミュレーション時間１００ｎｓ；偏倚集合体：各展開軌道についてのシミュレーション時間９０ｎｓ；合計で４００００フレームを含む、軌道の実験を１０回繰り返した（同等に、９０＊１０＝９００ｎｓ）。単純化のために、８０００フレームを４００００フレームから均等に試料採取した。天然型４ＩＵＦ集合体：７０００フレームを含む、１４０ｎｓ。
【０２４１】
ＩＩＩ．二面角分布
ミスフォールドタンパク質選択的エピトープの同定のためのさらなるコンピュータ支援は、側鎖二面角分布、およびミスフォールドタンパク質中に露出されたエピトープについてのプロキシである、環状ペプチド中の骨格二面角についてのラマチャンドランφおよびψ分布の両方によって提供される。いくつかの角度は、天然型ＴＤＰ−４３中の対応する分布とは実質的に異なる分布を有する。
【０２４２】
４つの残基Ｔ１１５、Ｔ１１６、Ｅ１１７、およびＱ１１８について、側鎖および骨格二面分布を試験した。分布のパーセント重複、例えば、分布「環状」での「天然型」は、角度を５°の要素に分割し、次に、環状分布の９０％がカットオフを上回り、１０％が下回るままになるまで、無限遠から確率振幅におけるカットオフを減少させることによって得られる。これは、許容可能な角度における１つ以上の領域を定義する。次に、この領域内の天然型分布のパーセントを見出した。このレシピは、非相互的であり、遺伝子的に、分布の対間に異なる数を生じる。重複の平均、例えば、環状での天然型および天然型での環状の両方の平均が、遺伝子的に検討される。
【０２４３】
図２に示すように、残基Ｔ１１５について、二面Ｃ−ＣＡ−ＣＢ−ＯＧ１、Ｃ−ＣＡ−Ｎ−ＨＮ、Ｏ−Ｃ−ＣＡ−Ｎは、天然型集合体中の対応する二面角からＴＴＥＱ（配列番号１）の環状ペプチドを明確に区別する。残基Ｔ１１６について、二面角Ｏ−Ｃ−ＣＡ−Ｎは、天然型集合体中の対応する分布から環状二面角分布を区別する。表１Ｂに示すように、環状集合体と偏倚集合体との間の二面重複は、残基Ｔ１１５およびＴ１１６について環状集合体と偏倚集合体との間の重複を越えて有意に増加される。
【０２４４】
図３によると、Ｔ１１５およびＴ１１６の骨格ラマチャンドラン角度φおよびψは、天然型集合体から環状ペプチドを区別する。Ｅ１１７およびＱ１１８について、環状ペプチド分布は区別されるが、互いに顕著に区別されない天然型および偏倚分布を有する重複を有する。
【０２４５】
図２に示す二面分布から、天然型集合体が環状ペプチド二面角のほぼすべて（９０％）の範囲内の二面を占める確率を見出すことができる。同様に、環状集合体が天然型ペプチド二面角のほぼすべて（９０％）の範囲内の二面を占める確率を見出すことができる。図２におけるこれらの選択的二面角の平均は、残基ＴＴＥＱ（配列番号１）についてのものである。Ｔ１１５：Ｏ−Ｃ−ＣＡ−Ｎ  ２８％、Ｔ１１５：Ｃ−ＣＡ−ＣＢ−ＯＧ１、５３％。すべての重複確率が、表１Ａに与えられる。残基Ｔ１１５およびＴ１１６について、環状集合体と偏倚集合体との間の重複は、遺伝子的に、環状集合体と天然型集合体との間の重複よりも大きい。
【０２４６】
以下にさらに記載されるように、個々の二面角における比較的小さい差の蓄積が、ペプチドのグローバル立体配座における大きく有意な差をもたらす可能性があり、したがって、構造的整列における有意な偏差をもたらし得る。
【０２４７】
図２に基づいて、表１Ａは、互いに対する、直鎖状、環状ペプチドシクロ（ＣＧＧＴＴＥＱＧＧ）（配列番号２）および天然型（４ＩＵＦ）形態における残基Ｔ１１５、Ｔ１１６、Ｅ１１７、およびＱ１１８の骨格および側鎖角度についての二面角分布のパーセント重複を示す。縦列１は、検討される特異的二面角である。縦列２〜７は、別の集合体中の１つの集合体の検討される二面角の重複割合を表す。例えば、縦列２は、天然型集合体中の所与の二面角と環状ペプチドシクロ（ＣＧＧＴＴＥＱＧＧ）（配列番号２）中の同じ角度との間の重複割合を示す。
【０２４８】
表１Ｂは、表１Ａの数に由来している。表１Ｂの数は、環状形態と天然型形態との間の二面角分布の平均重複が、特に残基Ｔ１１５およびＴ１１６についての環状形態と偏倚形態との間の二面角分布の平均重複未満であることを示す。これは、残基Ｔ１１５およびＴ１１６が、天然型形態に対して最大立体配座選択性をもたらす残基であり得ることを示唆している。
【０２４９】
【表２】
2020522475.tif 000011
【表３】
2020522475.tif 000012
【０２５０】
図２に示すデータに基づいて、表２Ａは、分布が環状ペプチドシクロ（ＣＧＧＴＴＥＱＧＧ）（配列番号２）と天然型集合体との間の差を示す、これらの二面角についての二面角分布のピーク値を列挙する。縦列１は、考慮される特定の二面であり、縦列２は、環状ペプチドシクロ（ＣＧＧＴＴＥＱＧＧ）（配列番号２）の文脈でのその角度に対する二面分布のピーク値であり、縦列３は、天然型構造的集合体の文脈でのペプチドＴＴＥＱ（配列番号１）に対する二面分布のピーク値であり、縦列４は、偏倚構造的集合体の文脈でのペプチドＴＴＥＱ（配列番号１）に対する二面分布のピーク値であり、縦列５は、環状および天然型集合体に対する二面分布のピーク値の差である。表２Ｂに示すように、差は、環状形態と天然型形態との間で遺伝子的により大きく、次に、環状形態と偏倚形態との間である。さらに、所与の残基について様々な二面角にわたって平均して、差（環状対天然型）マイナス（環状対偏倚）の大きさは、Ｔ１１５について最大であり、Ｔ１１５〜Ｑ１１８まで単調に減少する。
【表４】
2020522475.tif 000013
【表５】
2020522475.tif 000014
【０２５１】
ＩＶ．ラマチャンドラン角度
エピトープが抗体に対して露出する骨格配向は、ペプチドが、環状、偏倚、または天然型形態にあるかどうかに応じて異なる。この食い違いは、上記の３つの集合体中の各残基Ｔ１１５、Ｔ１１６、Ｅ１１７、およびＱ１１８について、骨格に沿ってラマチャンドラン角度ファイおよびプサイ（またはφおよびψ）を描画することによって定量化することができる。図３は、残基Ｔ１１５、Ｔ１１６、Ｅ１１７、およびＱ１１８について、平衡シミュレーションで試料採取されたファイおよびプサイ角度を描画する。図３のパネルＡおよびＢから、環状ペプチド中のＴ１１５およびＴ１１６についての骨格二面角の分布が、いずれかの天然型集合体について試料採取された二面角の分布とは異なり、偏倚集合体により類似していることが見られ得る。これは、表３Ａにさらに定量化されている。
【０２５２】
上記に定義されるように、ラマチャンドラン角度分布の重複は、表３Ａに与えられる。表３Ａは、図３に提示された残基Ｔ１１５、Ｔ１１６、Ｅ１１７、およびＱ１１８のラマチャンドラン角度の重複確率を示す。特に、天然型集合体と一致する立体配座を採用する環状ペプチドシクロ（ＣＧＧＴＴＥＱＧＧ）（配列番号２）集合体の画分および環状集合体に一致する立体配座を採用する天然型集合体の画分の平均は、それぞれ、Ｔ１１５、Ｔ１１６、Ｅ１１７、およびＱ１１８について２８％、６３％、５５％、２３％である。これは、プサイおよびファイ重複数の両方を平均化することによって得られる。これは、例えば、環状ペプチド集合体中のＴ１１５およびＱ１１８の周りの配向は、天然型集合体中のこうした残基の立体配座とは立体配座的に区別されることを示している。
【０２５３】
表３Ｂは、ラマチャンドラン角度の両方にわたって平均化された、例えば、天然型での環状、および環状での天然型について縦列２で平均化された、重複確率を示し、同様に縦列３は、所与の残基について正味の重複割合を達成するために、表３Ａの偏倚での環状および環状での偏倚をファイ、プサイにわたって平均化している。表３Ｂは、Ｔ１１５およびＴ１１６のマチャンドラン角度が、天然型形態に対する、偏倚ミスフォールド形態に向かう、最大立体配座選択性をもたらすことを示す。
【表６】
2020522475.tif 000015
【表７】
2020522475.tif 000016
【０２５４】
表４Ａは、残基Ｔ１１５、Ｔ１１６、Ｅ１１７、およびＱ１１８について図３で描画されたラマチャンドランφ、ψ角度のピーク（最も可能性の高い）値を与えている。２番目、３番目、および４番目の縦列は、それぞれ、環状ペプチドシクロ（ＣＧＧＴＴＥＱＧＧ）（配列番号２）、天然型集合体、および非天然型偏倚集合体の文脈で各残基についてのラマチャンドランファイ／プサイ角度のピーク値を示している。最も可能性の高いラマチャンドランファイおよびプサイ値は、残基Ｔ１１５、Ｔ１１６、Ｅ１１７、およびＱ１１８について環状集合体と天然型集合体との間で異なる。表４Ｂに示すように、差は、環状形態と天然型形態との間でわずかにより大きく、よって、環状形態と偏倚形態との間にある。ファイおよびプサイ角度にわたって平均化された場合、Ｔ１１５は、上記の差の間で最大の区別を示し、そのため、環状は、特に残基Ｔ１１５について、天然型よりも偏倚形態とより強い重複を有する。
【表８】
2020522475.tif 000017
【表９】
2020522475.tif 000018
【０２５５】
Ｖ．エピトープ溶解度および溶媒露出
図４のパネルＡは、ＴＤＰ−４３  ＲＲＭ１中の各アミノ酸の内的溶解度を描画している。エピトープ配列ＴＴＥＱ（配列番号１）は、タンパク質配列におけるより可溶性の領域のうちの１つであることを見ることができ、これは、タンパク質構造への外部チャレンジを実行する偏倚力に対して、その特定の領域がその溶媒露出度に反しないことを示している。
【０２５６】
図４のパネルＢおよび表５は、環状ペプチドの平衡集合体、偏倚した部分的に展開されたタンパク質集合体、および天然型集合体の各残基の中間溶媒アクセス可能表面領域（ＳＡＳＡ）を与えている。これは、偏倚集合体中の残基ＴＴＥＱ（配列番号１）のＳＡＳＡが天然型にわたって増加され、同様に、環状ペプチドのＳＡＳＡが偏倚集合体中のものにわたって増加されたことを示し、これは、より多くの表面が露出され、よって、抗体結合にアクセス可能であることを示している。露出の増加は、残基Ｔ１１５およびＥ１１７について最も顕著であり、これは、天然型集合体にわたるＳＡＳＡの最大増加を示す。Ｔ１１５について、この差は、１０１Å２であり、Ｅ１１７について、この差は、６７Å２である。
【０２５７】
図４Ｃは、図４Ｂの各残基の中間ＳＡＳＡを与えているが、これより、配列シクロ（ＣＧＴＴＥＱＧ）（配列番号３）の環状ペプチドについてのものである。結果は、環状ペプチドシクロ（ＣＧＧＴＴＥＱＧＧ）（配列番号２）についてのものを概括している。
【０２５８】
表５は、環状シクロ（ＣＧＧＴＴＥＱＧＧ）（配列番号２）集合体、偏倚集合体、および天然型集合体の文脈で残基Ｔ１１５、Ｔ１１６、Ｅ１１７、およびＱ１１８のＳＡＳＡを示す。
【表１０】
2020522475.tif 000019
【０２５９】
ＶＩ．直鎖状立体配座または線維状立体配座のいずれかの集合体とは異なる環状ペプチド立体配座クラスターの集合体
配列ＴＴＥＱ（配列番号：１）が環状ペプチドの文脈で天然型集合体におけるものとは異なる立体配座を示す明確な証拠は、立体配座間の標準的な構造的整列測定基準を使用し、次に、クラスタリング分析を実行することによって見ることができる。立体配座の平衡集合体は、天然型ＲＲＭ１（ＰＤＢ  ４ＩＵＦ）、偏倚ＲＲＭ１、および環状ペプチドシクロ（ＣＧＧＴＴＥＱＧＧ）（配列番号：２）について得られる。残基ＴＴＥＱ（配列番号１）についてのこれらの集合体からの立体配座のスナップを収集し、次に、環状ペプチド集合体の最大クラスター、天然型集合体の最大クラスター、および偏倚集合体中のＴＴＥＱ（配列番号１）の最大クラスターの重心に構造的に整列させ、次に、平均二乗偏差（ＲＭＳＤ）の３つの値を記録および描画する。クラスタリングは、本明細書では、最大クラスターアルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｂｇ．ｂｉｏ．ｉｃ．ａｃ．ｕｋ／ｍａｘｃｌｕｓｔｅｒ）によって行われる。環状、偏倚、および天然型集合体についての３つの対応するＲＭＳＤ値は、図７の三次元散布図として描画される。図７のパネルＡはまた、直鎖状ペプチドＣＧＧＴＴＥＱＧＧ（配列番号２）の平衡集合体についての結果を含む。図７Ｃは、いくつかの集合体間の重複割合を描画する。２つの重複数が特に重要である。１つは、非天然型偏倚集合体を含む環状集合体または天然型集合体の集合体との重複である。非天然型偏倚集合体は、天然型集合体と重複する立体配座を含まない偏倚集合体の一部である。すなわち、天然型集合体の一部と重複するいかなる偏倚立体配座も除去されるため、これは、天然型立体配座とは異なるこうした偏倚立体配座である。この数が高くなるほど、局所的に展開された状態を選択的に標的とするエピトープ足場が良好である。環状ペプチド集合体と非天然型偏倚集合体との間の重複は、直鎖状ペプチド集合体と非天然型偏倚集合体との間の重複よりも大きい。これは、非天然型ミスフォールド状態に対するプロキシとして環状足場を使用する利用を正当化する。環状ペプチドは、天然型集合体との重複よりも非天然型偏倚集合体と実質的により大きい重複を有する。
【０２６０】
重要な他の数は、天然型構造的集合体との環状または直鎖状のいずれかの構造的集合体間の重複である。この数は低いべきである。この数が低いほど、エピトープ足場に産生される抗体が天然型構造を標的とすることが少なくなる。数的重複割合を、表６Ａに与える。３つの集合体が互いに異なってクラスタリングすることは、以下の図７および表６Ａから明らかである。具体的には、環状ペプチド構造的集合体は、天然型集合体とは区別され、これは、環状ペプチドエピトープに特異的な抗体が直鎖状または天然型集合体中に提示された立体配座位に対して低い親和性を有し得ることを示唆している。環状ペプチドに産生された抗体は、立体配座的に選択的であり得、ＴＤＰ−４３の天然型立体配座にわたってミスフォールドタンパク質形態に優先的に結合し得るであろう。集合体間の区別は、いくつかの側鎖と骨格二面角分布との間の重複にもかかわらず生じており、上記に記載の多数の多くは小さな示差的特徴が、全体的に異なる立体配座分布をもたらす。
【０２６１】
図７のパネルＤ、Ｅ、Ｆは、対応する数量を図７Ａ、Ｂ、Ｃとして描画しているが、これより、環状ペプチドシクロ（ＣＧＴＴＥＱＧ）（配列番号３）についてのものである。結果は、上記と類似している。環状ペプチドは、天然型集合体との重複よりも非天然型偏倚集合体と実質的により大きい重複を有し、環状ペプチドは、直鎖状ペプチドよりも非天然型偏倚状態についてより良好なエピトープ足場である。
【０２６２】
表６Ａは、図７に提示されるように、環状、偏倚、および天然型（４ＩＵＦ）ペプチド立体配座のＲＭＳＤクラスタリング散布図における重複割合を与えている。縦列１は、環状形態から天然型形態までの重複割合が非常に小さく、ＣＧＧＴＴＥＱＧＧ（配列番号２）についてわずか５％であり、ＣＧＴＴＥＱＧ（配列番号３）について４％であることを示す。一方、環状集合体から偏倚集合体までのパーセント重複は、ＣＧＧＴＴＥＱＧＧ（配列番号２）についてほぼ３倍大きく、約１４％であり、ＣＧＴＴＥＱＧ（配列番号３）については約１０倍大きく、４２％である。環状集合体は、非天然型様立体配座を約９５％の確率で試料採取している。
【０２６３】
非天然型偏倚集合体中の環状ペプチドの重複は、ミスフォールド非天然型状態を正確に表す平均集合体中に足場の画分を与える。同様に、天然型偏倚集合体中の環状ペプチドの重複は、天然型状態を正確に表す平衡集合体中に足場の画分を与える。環状ペプチド集合体中の非天然型偏倚集合体の重複は、環状集合体に対する非天然型ミスフォールド状態の類似性を与え、同様に、環状ペプチド集合体中の天然型偏倚集合体の重複は、環状集合体に対する天然型ミスフォールド状態の類似性を与える。この後者の数量は、特定の関心があるものではないが、偏倚集合体と環状集合体との間の相互的重複は、両方とも、環状足場を使用する妥当性を定量化する評価基準である。表６Ｂでは、非天然型ミスフォールド立体配座対天然型立体配座を標的とする際の環状ペプチドについての良好性比率を提供するために、これらの２つの評価基準の平均をとり、これを非天然型ミスフォールド状態対天然型を標的とするための所与の環状足場を使用する際の良好性の評価基準として天然型での環状集合体の重複で除算する。縦列１は、配列を与え、縦列２は、非天然型偏倚集合体中の環状ペプチドの重複および環状ペプチド集合体中の非天然型偏倚集合体の重複の平均を与え、縦列３は、天然型集合体中の環状ペプチドの重複を与え、縦列４は、縦列２と縦列３との差を与え、縦列５は、縦列２を縦列３で除算した比率を与え、これは、環状ペプチド構成についての良好性比率として定義される。
【表１１】
2020522475.tif 000020
【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
2020522475.tif 000024
【０２６４】
表６Ｃは、良好比率の減照準で分類された、いくつかの異なる環状半径の関数として、いくつかの候補環状足場について、表６Ｂに定義される良好性比率（非天然型ミスフォールド立体配座対天然型立体配座を標的とする環状ペプチドの能力）を列挙する。分析された２つの環状足場の構成ＣＧＴＴＥＱＧ（配列番号３）およびＣＧＧＴＴＥＱＧＧ（配列番号２）は、最大良好性比率を有し、よって、これらの評価基準を使用する非天然型ミスフォールド構造についての最良のプロキシであると予測されるであろう。
【０２６５】
表６Ｄは、環状立体配座集合体と直鎖状立体配座集合体との間の重複割合を列挙する。集合体は、小〜中程度の重複割合によって見られるものと異なっており、これは、環状ペプチド集合体が直鎖状ペプチド集合体から立体配座的に区別され、また、発生期の展開されたペプチド鎖から立体配座的に区別される可能性が高いことを示している。
【０２６６】
集合体間の重複を、以下の通りに計算した。第１に、この三次元ＲＭＳＤスペースの体積を長さ０．１オングストロームの立方体要素に分割することによって、環状集合体と重複する偏倚集合体の画分（パーセント）を得る。次に、カットオフ密度以上の環状分布密度を有する立方体が環状分布の９０％を含むような、環状分布における点の「カットオフ密度」を見つける。これは、環状分布を含む特徴的な体積を与える体積（不連続であり得る）を定義し、はずれ値に起因するいかなるアーチファクトを除去する。次に、この領域内にある偏倚分布からの点の画分を見つける。この方法では、天然型での環状、偏倚での環状などについての重複割合を見つけることが可能である。
【０２６７】
図７のパネルＣおよびＦは、集合体が収束しているのに十分に大きいことを例示している。
【０２６８】
図７のパネルＧは、以下の通りにコンピュータ演算された、環状−ＣＧＧＴＴＥＱＧＧ（配列番号２）集合体と天然型集合体との間、および環状−ＣＧＧＴＴＥＱＧＧ（配列番号２）集合体と非天然型偏倚集合体との間の両方の相関係数を示す。２つの集合体間の相関係数は、カットオフ値よりも大きい密度を有する分布の一部を見つけることによって定義されており、そのため、合計分布の所与の割合、例えば、合計分布の６０％を与える環状分布および直鎖状分布についての密度カットオフが包含される。次に、これらの部分分布について、相関係数を
【数２】
2020522475.tif 000025
として定義し、ここで、ｆ（τ）およびｇ（τ）は、各ボクセルτにおける密度であり、結果は、すべてのボクセルにわたって統合（合計）される。このように定義された、天然型分布と環状分布との間の相関係数は、それぞれの分布の１００％が含まれる場合、約４．５％まで収束し、非天然型偏倚分布と環状分布との間の相関係数は、それぞれの分布の１００％が含まれる場合、約１０．５％まで収束するか、または約２倍の重複である。
【０２６９】
図７のパネルＨは、図７Ｇと同様に、環状（ＣＧＴＴＥＱＧ）（配列番号３）集合体と天然型集合体との間の相関係数、および環状（ＣＧＴＴＥＱＧ）（配列番号３）集合体と非天然型偏倚集合体との間の相関係数の両方を示す。天然型分布と環状分布との間の相関係数は、それぞれの分布の１００％が含まれる場合、約７％まで収束し、非天然型偏倚分布と環状分布との間の相関係数は、それぞれの分布の１００％が含まれる場合、約２５％まで収束するか、または約３．６倍の重複である。
【０２７０】
図７のパネルＩは、９０％の環状（ＣＧＧＴＴＥＱＧＧ）（配列番号２）集合体を有する天然型集合体、および９０％の天然型集合体を有する環状集合体の重複を平均化することによって定義される、構造的重複に対する単一残基欠失の効果を試験している。単一アミノ酸が天然型立体配座に対して立体配座選択性をもたらす場合、構造的整列からそれを除去することにより、分布間の有意に高い重複がもたらされるであろう。この試験では、Ｔ１１５が、環状ペプチドに対して最も高い立体配座選択性をもたらすものとして突出している。
【０２７１】
図７のパネルＪは、図７１と同様に、環状ペプチドシクロ（ＣＧＴＴＥＱＧ）（配列番号３）についての単一残基欠失の効果を描画している。ここでも、残基Ｔ１１５は、環状ペプチドに対して立体配座選択性をもたらすものとして突出している。
【０２７２】
構造の環状ペプチド集合体から最大クラスターの重心を構成する、ＣＧＧＴＴＥＱＧＧ（配列番号２）の環状ペプチド集合体からＴＴＥＱ（配列番号１）の最も代表的な立体配座の原子構造の概略を、図５のパネルＡに黒で示す。同様に、ＲＭＳＤを使用してそれらを整列することによって黒で示す環状ペプチドに最適に重ね合わせてそれらの異なる配向を明確にした、最大クラスターの重心を構成する、天然型構造的集合体の最も代表的な立体配座を、図５に薄い灰色で示す。具体的には、Ｔ１１５は、２つの重心立体配座間の顕著に異なる配向を有する。図５のパネルＢは、ＲＭＳＤに関して整列することによって再び最適に重ね合わせた、環状配列ＣＧＴＴＥＱＧ（配列番号３）についての環状ペプチドおよび天然型集合体に対する対応する重心立体配座を示す。両方の環状構成は、Ｔ１１５が交互立体配座にあり、より小さい範囲で、Ｑ１１８が交互立体配座に現れることを示す。
【０２７３】
表７は、環状ＣＧＧＴＴＥＱＧＧ（配列番号２）ペプチド集合体の重心構造、天然型集合体集合体の重心構造、および非天然型偏倚集合体の重心構造において残基Ｔ１１５、Ｔ１１６、Ｅ１１７、およびＱ１１８によって占められるラマチャンドラン骨格および側鎖二面角の値を列挙し、環状および天然型重心立体配座を図５に描画する。重心構造は、環状立体配座と天然型立体配座との間の実質的に異なるいくつかの二面角を表す。表７の縦列１は、対象となる残基および二面角を与え、縦列２は、環状集合体の重心構造における二面角の値を与え、縦列３は、天然型集合体の重心における二面の値を与え、縦列４は、非天然型偏倚集合体の重心における二面の値を与え、縦列５は、環状および天然型二面における差の大きさであり、縦列６は、環状および非天然型偏倚二面における差の大きさであり、縦列７は、各アミノ酸中の二面にわたって平均化された縦列５の値を与え、縦列８は、各アミノ酸における二面にわたって平均化された縦列６の値を与えている。環状二面角のうちの多くが、二面分布のピーク値について上記に記載のように、直鎖状または天然型重心における対応する二面角とは有意に異なることは明らかである。しかしながら、重心構造の二面角は、二面分布のピーク値と同じである必要はないことに留意されたい。本明細書の差の例について、残基１１５Ｔにおける二面ＯＧ１−ＣＢ−ＣＧ２−２ＨＧ２は、環状と天然型との間で１００度の差を示すが、環状と非天然型偏倚との間でわずか１５度である。１１５Ｔについて環状と天然型との間の平均差は、８７．６度であり、１１５Ｔについて環状と非天然型偏倚との間の平均差は、５１．９度である。ここでも、これらの差は、それぞれの集合体の各々における１つの立体配座（重心立体配座）についてのみのものであることに留意されたい。
【表１６−１】
2020522475.tif 000026
【表１６−２】
2020522475.tif 000027
【表１６−３】
2020522475.tif 000028
【０２７４】
再び、図６は、これより、残基ＴＴＥＱ（配列番号１）についての表面領域表現を使用して、ＣＧＧＴＴＥＱＧＧ（配列番号２）およびＣＧＴＴＥＱＧ（配列番号３）についての天然型重心、偏倚重心、および環状ペプチド重心におけるＴＴＥＱ（配列番号１）を示す。抗体に対して提示される表面領域プロファイルは、重心立体配座間で異なる。立体配座は、別々に示されているが、すべて整列されている。天然型、偏倚、および環状集合体の重心立体配座位を比較すると、Ｅ１１７および同様にＴ１１５の露出された表面領域は、図４Ｂおよび４Ｃに描画されるＳＡＳＡと単調に一致して単調に増加する。したがって、ＴＤＰ−４３の環状集合体においてこの領域に産生された抗体は、天然型ＴＤＰ−４３中のＴＴＥＱ（配列番号１）に（例えば、等しく、または同様の選択性を有して）結合する可能性は低いであろう。
【０２７５】
図６Ｅは、Ｅ１１７の側鎖の表面領域を埋めるが、部分的に展開されるタンパク質の偏倚に対して阻害される、ＴＤＰ−４３のＲＲＭ１の天然型集合体中に存在する相互作用の例を示す。天然型集合体において、Ｅ１１７は、各残基の側鎖を制限し、天然型集合体中のＥ１１７の表面領域の露出を減少させる、リジン１３７（Ｋ１３７）との塩橋を形成する。しかしながら、偏倚集合体においては（図６Ｅ、右パネル）、塩橋は壊れており、Ｅ１１７の側鎖を露出させている。図４ＢおよびＣに描画されるように、タンパク質内の他の相互作用も、Ｔ１１５の露出も増加するのに十分弱体化されている。
【０２７６】
実施例２
環状化合物ＣＧＴＴＥＧおよびＣＧＴＴＥＧＧ中のＴＴＥについてのＲＭＳＤによるクラスタリング
環状化合物ＣＧＴＴＥＧ（配列番号２８）およびＣＧＴＴＥＧＧ（配列番号２９）におけるＴＴＥについて、同様の実験のセットを行った。
【０２７７】
ＴＴＥ環状化合物について実施例１のようにＲＭＳＤを分析した。平均二乗偏差（ＲＭＳＤ）によるクラスタリングプロットを、図８に示す。軸は、環状ペプチド集合体シクロ（ＣＧＴＴＥＧ）（配列番号２８）（パネルＡ）またはシクロ（ＣＧＴＴＥＧＧ）（配列番号２９）（パネルＢ）の重心構造におけるＴＴＥに対するＴＴＥのＲＭＳＤに対応し、天然型構造的集合体（ＰＤＢ  ＩＤ  ４ＩＵＦから始まる平衡）の重心構造におけるＴＴＥに対するＴＴＥのＲＭＳＤに対応し、非天然型偏倚集合体（天然型集合体が除去された重複する点を有する偏倚集合体）の重心構造におけるＴＴＥに対するＴＴＥのＲＭＳＤに対応する。各点は、環状ペプチド平衡集合体（説明文に述べられている円）、非天然型偏倚平衡集合体（説明文に述べられている＋図柄）、またはＰＤＢ  ＩＤ  ４ＩＵＦから始まる天然型構造平衡集合体（説明文において述べられている逆三角形）のいずれかから取られた所与の立体配座に対応する。
【０２７８】
図９は、収束を示すために、試料採取された立体配置の数の関数として異なる集合体間の重複割合を示す。環状集合体は、配列シクロ（ＣＧＴＴＥＧ）（配列番号２８）（パネルＡ）またはシクロ（ＣＧＴＴＥＧＧ）（配列番号２９）（パネルＢ）に対応する。図７と同様に、集合体の各対についてのパーセント重複は、実施例２の文章に記載されるように、比較構造集合体の９０％を有する特定の集合体のパーセント重複を示す。数的重複割合を、以下の表８Ａに与える。天然型集合体との環状集合体の重複は、シミュレーションの数的正確性内でゼロであり、天然型構造に対する低い類似性は、ここでも、環状ペプチド足場についての所望の特徴である。
【表１７】
2020522475.tif 000029
【０２７９】
表８Ａは、足場シクロ（ＣＧＴＴＥＧ）（配列番号２８）およびシクロ（ＣＧＴＴＥＧＧ）（配列番号２９）について図９のパネルに提示されるようなシクロペプチドの環状形態における天然型での環状、非天然型偏倚での環状、および環状での非天然型間のＲＭＳＤクラスタリングの重複割合を示す。最後の縦列は、縦列２および３の平均を縦列４の縦列４（一番右の縦列に提供される）で除算したすることによって定義される比率を与えている。２つの足場シクロ（ＣＧＴＴＥＧ）（配列番号２８）およびシクロ（ＣＧＴＴＥＧＧ）（配列番号２９）は、無限遠に等しい重複の比率を有する（環状集合体が天然型集合体との重複を有しない）、非天然型偏倚集合体と天然型集合体との間の最大区別を示す。
【０２８０】
追加のコンピュータシミュレーションを行って、環状−天然型、環状−偏倚、および環状−（展開された単量体）集合体対間のイェンセン−シャノン距離［Ｌｉｎｄｏｒｆｆ−Ｌａｒｓｅｎ  Ｋ，Ｆｅｒｋｉｎｇｈｏｆｆ−Ｂｏｒｇ  Ｊ（２００９）Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  Ｍｅａｓｕｒｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｓｅｍｂｌｅｓ．ＰＬＯＳ  ＯＮＥ  ４（１）：ｅ４２０３］を測定することによって、様々な集合体間の類似性を測定した。重量の不確実性と共にこれらの測定基準に重量を適用することによって、天然型ＴＤＰ−４３ならびに予め折り畳まれたＴＤＰ−４３単量体（すなわち、一時的に展開されたＴＤＰ−４３単量体）からミスフォールド／偏倚ＴＤＰ−４３を差別化する実行可能な候補を選択するための複数の基準決定分析［Ｈｗａｎｇ  ＣＬ，Ｙｏｏｎ  Ｋ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ａｔｔｒｉｂｕｔｅ  ｄｅｃｉｓｉｏｎ  ｍａｋｉｎｇ：ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａ  ｓｔａｔｅ−ｏｆ−ｔｈｅ−ａｒｔ  ｓｕｒｖｅｙ．ｖｏｌ．１８６．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｍｅｄｉａ；（２０１２）］の使用が可能になる。ＲＲＭ１中の長さ７７残基の配列を使用して、アミノ酸１０３から始まり、アミノ酸１７９で終わる、ＲＲＭ１ドメインの展開された単量体をモデル化した。分析を行い、分析を使用して、偏倚ＴＤＰ−４３  ＲＲＭ１ドメインの文脈でのＴＴＥおよびＴＴＥＱ（配列番号１）エピトープと、グリシンスペーサーの可変数からなる異なる足場の文脈での当該ペプチドを含む様々な環状ペプチドとの類似性を評価した。２つの分離されたガウス分布間の標準的な偏差の数の観点で、同じシミュレーションデータについて集合体の重複を測定した。集合体の重複データのすべてを表８Ｂに示す。
【表１８】
2020522475.tif 000030
【０２８１】
表８ＢのＪＳＤデータによって測定される偏倚ＴＤＰ−４３  ＲＲＭ１ドメインの文脈でＴＴＥおよびＴＴＥＱ（配列番号１）エピトープと有意に重複したが、天然に折り畳まれたＴＤＰ−４３または一時的に展開されたＴＤＰ−４３のいずれかとの重複が小さい、環状ペプチドは、最大９つのアミノ酸（配列番号３５）を有する足場（リンカー）を含み、これは表８Ｃに与えられている。
【表１９】
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【０２８２】
実施例３
立体配座的に制限されたエピトープを含む環状化合物構成
ＴＴＥＱ（配列番号１）またはシクロ（ＣＧＴＴＥＱＧ）（配列番号３）もしくはシクロ（ＣＧＴＴＥＧ）（配列番号２８）などのＴＴＥを含むペプチドは、ヘッドトゥーテールで環化することができる。
【０２８３】
好ましくは２、３、または４つのアミノ酸および／またはＰＥＧユニットを含む、ＴＴＥＱ（配列番号１）またはＴＴＥおよびリンカーを含む天然型集合体は、Ｆｍｏｃに基づく固相ペプチド合成などの既知の方法を単独でまたは他の方法と組み合わせて使用して合成することができる。ＰＥＧ分子は、例えば、各々が参照により本明細書に組み込まれる、Ｈａｍｌｅｙ  ２０１４［７］およびＲｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．２０１２［８］に記載される連結化学を使用して、Ｎ末端でアミノ基に結合され得る。天然型集合体化合物は、１）ペプチド結合を形成する（例えば、骨格を環化する）ペプチド＋リンカーのアミノ末端およびカルボキシ末端、２）ペプチド＋リンカー中に側鎖を有するアミノ末端もしくはカルボキシ末端、または３）ペプチド＋リンカー中の２つの側鎖に共有結合することによって、環化され得る。
【０２８４】
環状化合物における結合は、すべての規則的なペプチド結合（ホモデチック環状ペプチド）であり得るか、またはエステル、エーテル、アミド、またはジスルフィド連結（ヘテロデチック環状ペプチド）などの他の種類の結合を含み得る。
【０２８５】
ペプチドは、Ｎ末端またはＣ末端での、または例えば、システインおよびホモシステインを含む、ペプチドに対して内的な、チオールまたはメルカプタン含有残基の酸化によって環化され得る。例えば、ペプチドを側面に配置する２つのシステイン残基を酸化させて、ジスルフィド結合を形成することができる。用いられ得る酸化剤には、当業者に知られ得るような、当業者に知られているような方法と共に使用される、例えば、酸素（空気）、ジメチルスルホキシド、酸化グルタチオン、シスチン、酸化銅（ＩＩ）、フェリシアン化カリウム、タリウム（ＩＩＩ）トリフルオロ酢酸、または他の酸化剤が含まれる。
【０２８６】
環状ペプチド合成に関連する方法および組成物は、米国特許公開第２００９／０２１５１７２号に記載されている。米国特許公開第２０１０／０２４０８６５号、米国特許公開第２０１０／０１３７５５９号、および米国特許第７，５６９，５４１号は、環化についての様々な方法を記載している。他の例は、国際特許公開第ＷＯ０１／９２４６６号、およびＡｎｄｒｅｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３５：９１−１６９に記載されている。
【０２８７】
より具体的には、ＴＴＥＱ（配列番号１）エピトープ、ＴＥＱエピトープ、またはＴＴＥエピトープを含む環状ペプチドは、スペーサーを含むリンカーを、スペーサーを側面に配置し、かつ／またはスペーサー内に挿入されるシステイン残基に追加することによって、構成され得る。ペプチドは、ペプチドのＮ末端およびＣ末端に追加される非天然型システイン残基間のジスルフィド連結を作出することによって、環状立体配座に構成され得る。ペプチドはまた、Ｎ末端とＣ末端アミノ酸との間のペプチド結合（例えば、ヘッドトゥーテール環化）を形成することによって、環状化合物に合成され得る。
【０２８８】
ペプチド合成は、標準的な製造手順に従って、ＣＰＣ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ  ＣＡ，ＵＳＡ）によって行われる。環状ペプチドの構造は、ミスフォールドＴＤＰ−４３ポリペプチド中のＴＴＥＱ（配列番号１）のアミノ酸骨格および側鎖の立体配座および配向を模倣するように設計された。
【０２８９】
シクロ（ＣＧＴＴＥＱＧ）（配列番号３）
シクロ（ＣＧＴＴＥＱＧ）（配列番号３）およびシクロ（ＣＧＧＴＴＥＱＧＧ）（配列番号２）は、以下の方法（ＣＰＣ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ  ＣＡ）を使用して合成され得る。２−クロルトリチル塩化物樹脂上での標準的な従来のＦｍｏｃに基づく固相ペプチド合成、続いて、３０％のＨＦＩＰ／ＤＣＭを含む樹脂による開裂によって、保護された天然型集合体を合成した。ＥＤＣを使用することによって、保護された天然型集合体を対応する保護された環状ペプチドに環化した。低濃度でのＤＭＦ中のＨＣｌ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡ。保護された環状ペプチドをＴＦＡによって脱保護して粗製環状ペプチドを与え、粗製ペプチドをＲＰ  ＨＰＬＣによって精製して凍結乾燥後に純粋な環状ペプチドを与えた。
【０２９０】
シクロ（ＣＧＴＴＥＱＧ）（配列番号３）およびシクロ（ＣＧＧＴＴＥＱＧＧ）（配列番号２）は、それぞれ、直鎖状ペプチドＣＧＴＴＥＱＧ（配列番号３）またはＣＧＧＴＴＥＱＧＧ（配列番号２）のアミド縮合によって調製することができる。
【０２９１】
シクロ（Ｃ−ＰＥＧ２−ＴＴＥＱＧ）（配列番号２４）およびシクロ（Ｃ−ＰＥＧ２−ＴＴＥＱＧＧ）（配列番号２５）は、それぞれ、直鎖状化合物Ｃ−ＰＥＧ２−ＴＴＥＱＧ（配列番号２４）またはＣ−ＰＥＧ２−ＴＴＥＱＧＧ（配列番号２５）のアミド縮合によって調製することができる。
【０２９２】
シクロ（ＣＧＴＴＥＱ−ＰＥＧ２）（配列番号２６）およびシクロ（ＣＧＧＴＴＥＱ−ＰＥＧ２）（配列番号２７）は、それぞれ、直鎖状化合物ＣＧＴＴＥＱ−ＰＥＧ２（配列番号２６）またはＣＧＧＴＴＥＱ−ＰＥＧ２（配列番号２７）のアミド縮合によって調製することができる。
【０２９３】
直鎖状（ＣＧＴＴＥＱＧ）（配列番号３）または直鎖状（ＣＧＧＴＴＥＱＧＧ）（配列番号２）を調製することができる（ＣＰＣ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ  ＣＡ）。Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｗａｎｇ樹脂上の標準的な従来のＦｍｏｃに基づく固相ペプチド合成によって、保護された天然型集合体を合成し、次に、保護されたペプチドをＴＦＡによって開裂させて粗製ペプチドを与え、粗製ペプチドをＲＰ  ＨＰＬＣによって精製して凍結乾燥語に純粋なペプチドを与え、これを使用してＢＳＡに接合させた。
【０２９４】
同様に、それぞれ、直鎖状ペプチドＣＧＴＴＥＧ（配列番号２８）またはＣＧＴＴＥＧＧ（配列番号２９）のアミド縮合によって、シクロ（ＣＧＴＴＥＧ）（配列番号２８）およびシクロ（ＣＧＴＴＥＧＧ）（配列番号２９）を調製することができる。
【０２９５】
それぞれ、直鎖状化合物Ｃ−ＰＥＧ２−ＴＴＥＧ（配列番号３６）またはＣ−ＰＥＧ２−ＴＴＥＧＧ（配列番号３７）のアミド縮合によって、シクロ（Ｃ−ＰＥＧ２−ＴＴＥＧ）（配列番号３６）およびシクロ（Ｃ−ＰＥＧ２−ＴＴＥＧＧ）（配列番号３７）を調製することができる。
【０２９６】
それぞれ、直鎖状化合物ＣＧＴＴＥ−ＰＥＧ２（配列番号３８）またはＣＧＧＴＴＥ−ＰＥＧ２（配列番号３９）のアミド縮合によって、シクロ（ＣＧＴＴＥ−ＰＥＧ２）（配列番号３８）およびシクロ（ＣＧＧＴＴＥ−ＰＥＧ２）（配列番号３９）を調製することができる。
【０２９７】
環状および直鎖状（ＣＧＴＴＥＧ）（配列番号２８）または直鎖状（ＣＧＧＴＴＥＧＧ）（配列番号３０）ペプチドを調製することができる（ＣＰＣ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ  ＣＡ）。Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｗａｎｇ樹脂上の標準的な従来のＦｍｏｃに基づく固相ペプチド合成によって、保護されたものを合成し、次に、保護されたペプチドをＴＦＡによって開裂させて粗製ペプチドを与え、粗製ペプチドをＲＰ  ＨＰＬＣによって精製して凍結乾燥語に純粋なペプチドを与え、これを使用してＢＳＡに接合させた。
【０２９８】
免疫原の構成
環状化合物シクロ（ＣＧＴＴＥＱＧ）（配列番号３）、シクロ（ＣＧＧＴＴＥＱＧＧ）（配列番号２）、シクロ（ＣＧＴＴＥＧ）（配列番号２８）、およびシクロ（ＣＧＴＴＥＧＧ）（配列番号２９）を、上記に記載のように合成し、次に、ＫＬＨ（免疫付与するために）またはＢＳＡ（スクリーニングのために）（ＣＰＣ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ  ＣＡ）に接合させた。ＢＳＡまたはＫＬＨを、ＰＢＳ緩衝液中でＳＭＣＣによって再活性化させ、次に、ＰＢＳ緩衝液中の純粋なペプチドの溶液を接合混合物に加え、接合混合物を室温で２時間攪拌する。次に、接合混合物を、透析後に凍結乾燥して、接合生成物を与える。
【０２９９】
ペプチドはまた、トリフルオロ酢酸対イオンプロトコルを使用して、ＫＬＨ（免疫付与のために）およびＢＳＡ（スクリーニングのために）に接合され得る。ペプチドは、少なくとも９５％の純度を確認するために、ＭＳおよびＨＰＬＣによって脱塩および検査される。
【０３００】
実施例４
抗体の生成および選択
立体配座的に制限された化合物、任意選択的に、ＴＴＥＱ（配列番号１）またはシクロ（ＣＧＴＴＥＱＧ）（配列番号３）、シクロ（ＣＧＧＴＴＥＱＧＧ）（配列番号２）、シクロ（ＣＧＴＴＥＧ）（配列番号２８）、もしくはシクロ（ＣＧＴＴＥＧＧ）（配列番号２９）などのＴＴＥを含む環状ペプチドなどの環状化合物は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に連結される。連結されたペプチドまたはペプチドは、Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅによって認証されたプロトコルに従って、マウスのモノクローナル抗体の生産のために、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ＬＴＤ（Ｖｉｃｔｏｒｉａ  ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）に送られる。
【０３０１】
免疫付与
簡単に言うと、雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｑｕｅｂｅｃ）に免疫付与する。抗原を含有するか、アジュバントは含有しない、一連の皮下水溶液注入を、１９日間にわたって与える。環状ペプチド−ＫＬＨの滅菌食塩水中に、マウスごとに０．５ｍｇ／ｍＬの溶液の注入当たり１００μｇで、マウスに免疫付与する。すべてのマウスを１９日目に安楽死させ、ハイブリドーマ細胞株の生成のために、リンパ球を採取する。
【０３０２】
融合／ハイブリドーマ生成
リンパ球を単離し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ  １５００）の存在下で、マウスＳＰ２／０骨髄腫細胞と融合させる。融合された細胞を、ＨＡＴ選択を使用して培養する。この方法は、半固体メチルセルロース系ＨＡＴ選択培地を使用して、ハイブリドーマ選択およびクローニングを１つのステップに組み合わせる。単一細胞由来のハイブリドーマは成長して、半固体培地上でモノクロ−ナルコロニーを形成する。融合イベント後およそ１０日間、結果として生じたハイブリドーマクローンを、９６ウェルの組織培養プレートに移し、中間ログ成長に到達する（およそ５日間）まで培地を含有するＨＴ中に成長させる。
【０３０３】
ハイブリドーマ分析（スクリーニング）
ハイブリドーマからの組織培養上清は、スクリーニング抗原（環状または直鎖状ペプチド−ＢＳＡ）上で間接的ＥＬＩＳＡによって試験することができ、二次的な、ＴＭＢ基質で成長させたヤギ抗ＩｇＧ／ＩｇＭ（Ｈ＆Ｌ）−ＨＲＰを使用して、ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体の両方についてプローブすることができる。
【０３０４】
このアッセイにおいて、クローン＞０．２ＯＤは、次の試験ラウンドに取られる。陽性培養をスクリーニング抗原上で再試験して、分泌および無関係な抗原（ヒトトランスフェリン）について確認する。対象となるクローンは、ＩｇＧまたはＩｇＭアイソタイプであるかどうかを判定するために、ＥＬＩＳＡを捕捉する抗体によってアイソタイプされ、他の環状ペプチド−ＢＳＡ接合ならびに天然型−ＢＳＡ接合に対する間接的ＥＬＩＳＡによって試験して、交差反応性を評価することができる。
【０３０５】
陽性ＩｇＧ−分泌クローンは、大規模生産を対象とする。
【０３０６】
直接結合アッセイ
直鎖状および環状ペプチド（ＢＳＡに接合された）でのクローンの結合は、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）３０００  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、表面プラズモン共鳴によって試験することができる。
【０３０７】
フロー細胞上で固定化された高密度（少なくとも１０００応答ユニット（ＲＵ））の抗原を使用して、結合分析を実行する。結合を評価するために、選択されるクローンの希釈物を表面にわたって順次注入する。
【０３０８】
親和性動力学および特異性分析について、ＴＴＥＱ（配列番号１）またはＴＴＥおよびＢＳＡを含む立体配座ペプチド、例えば、アミン接合を介してＢＳＡに接合された、配列番号２、３、２８、または２９の配列を有する環状ペプチドを、隣接するフロー細胞上に低密度（５０〜１００ＲＵ）で固定化する。次に、選択されるクローンの連続２倍希釈物（４．７ｎＭ〜７５ｎＭ）を、３分間６０μｌ／分で表面にわたって順次注入し、その後、相分離させる。二重参照減算後、センサグラムを、Ｌａｎｇｍｕｉｒ１：１結合モデルに適合させる。最大３つの別々の分析を、同じセンサチップおよび同じ条件を使用して、３日間連続して行う。
【０３０９】
また、分子親和性スクリーニングシステム（ＭＡＳＳ−１）（Ｓｉｅｒｒａ  Ｓｅｎｓｏｒｓ  ＧｍｂＨ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、結合分析を行うことができる。ＭＡＳＳ−１は、実時間での結合相互作用を観察するために、高強度レーザ光および高速光学スキャニングを用いる表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）撮像分析バイオセンサである。ペプチド−ＢＳＡ接合は、標準的なアミン結合化学を使用して、高アミン容量（ＨＡＣ）センサチップの別々のフロー細胞に対して共有的に固定化され、非反応部位をブロックする。同様に、隣接するフロー細胞を、参照制御表面としてＢＳＡにより固定化する。
【０３１０】
同族環状ペプチドに対する抗体結合の存在について、組織培養上清をスクリーニングする。各試料を希釈し、固定化されたペプチドおよびＢＳＡ参照表面にわたって２分間複製物中に注入し、その後、５分の相分離のためにのみ、実験緩衝液を注入する。すべての分析サイクル後、センサチップ表面を再生する。ＢＳＡ参照表面および空の実験緩衝液注入から結合を減算し、データの２０秒窓における注入の終了の２０秒前に測定された反応レポート点を結合することによって、センサグラムを二重参照する。
【０３１１】
アイソタイピング
抗体捕捉実験を使用して、ハイブリドーマ抗体をアイソタイプする。捕捉プレートを、４Ｃで一晩、ｐＨ９．６の緩衝液をコーティングした１００ｕＬ／ウェルの炭酸塩での１：１０，０００のヤギ抗マウスＩｇＧ／ＩｇＭ（Ｈ＆Ｌ）抗体でコーティングする。１００μｇ／ｍＬで、主な抗体（ハイブリドーマ上清）を加える。二次抗体を、１：５，０００に加える。３７Ｃで１時間振とうしたＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中に１００ｕＬ／ウェルで、ヤギ抗マウスＩｇＧｙ−ＨＲＰまたは１：１０，０００ヤギ抗マウスＩｇＭμ−ＨＲＰを加える。すべての洗浄ステップを、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３０分間行う。暗所で成長させ、等しい体積１ＭのＨＣｌで止めた、基質ＴＭＢを、５０ｕＬ／ウェルで加える。
【０３１２】
実施例５
実施例４の方法を使用して、モノクローナル抗体を作製した。特に、システイン残基を介して、ＫＬＨに接合させたシクロ（ＣＧＧＴＴＥＱＧＧ）（配列番号２）またはＫＬＨに接合させたシクロ（ＣＧＴＴＥＱＧ）（配列番号３）を、マウスに注入し、モノクローナル抗体を生成した。
【０３１３】
抗体含有ハイブリドーマ組織培養上清を、免疫グロブリンタイプについてタイプ分けし、陰性対照ペプチドおよびＢＳＡに対してスクリーニングした。以下に記載のように、免疫付与環状ペプチドへの結合、対応する直鎖状ペプチドおよび関連する環状ペプチドシクロ（ＣＧＧＴＴＥＧＧＧ）（配列番号３２）、シクロ（ＣＧＴＴＥＧＧ）（配列番号２９）への結合について、陰性対照ペプチドまたはＢＳＡに結合しなかったＩｇＧ生産クローンをＥＬＩＳＡによって試験した。
【０３１４】
ＥＬＩＳＡ条件
炭酸塩コーティング緩衝液（ｐＨ９．６）中に１００ｕＬ／ウェルで、４Ｃで一晩、ペプチドシクロ（ＣＧＧＴＴＥＱＧＧ）（配列番号２）またはシクロ（ＣＧＴＴＥＱＧ）（配列番号３）またはそれらの直鎖状バージョンを含む０．１μｇ／ウェルで、ＥＬＩＳＡプレートをコーティングした。他のアッセイでは、シクロ（ＣＧＧＴＴＥＧＧＧ）（配列番号３２）またはシクロ（ＣＧＴＴＥＧＧ）（配列番号２９）も使用して、ＥＬＩＳＡプレートをコーティングした。
【０３１５】
ＰＢＳ中の３％の脱脂肪乳で、室温で１時間、プレートをブロックした。正味１００ｕＬ／ウェルの主な抗体のハイブリドーマ組織培養上清を、３７Ｃで１時間振とうしてインキュベートした。１：１０，０００希釈での二次抗体のヤギ抗マウスＩｇＧｙ−ＨＲＰを、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中に１００ｕＬ／ウェルで加え、３７Ｃで１時間振とうしてインキュベートした。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３０分間、すべてのステップを行った。ＴＭＢ基質を、５０ｕＬ／ウェルで加え、暗所で成長させ、等しい体積１ＭのＨＣｌで止めた。成長時間は、１〜２分であり、プレートは、４５０ｎｍで読み取った。
【０３１６】
ＥＬＩＳＡの結果を、表９ＡおよびＢに提示し、これらは、免疫付与ペプチド、対、対応する直鎖状ペプチドに対して精製されたモノクロ−ナル抗体の結合親和性を示す。これらに示すように、直鎖状ペプチドと比較して、免疫付与環状ペプチドに対する優先的な結合を示す、ＩｇＧ抗体を生産した。
【表２０】
2020522475.tif 000032
【表２１】
2020522475.tif 000033
【０３１７】
加えて、ＴＴＥエピトープを含む、関連する環状ペプチドシクロ（ＣＧＧＴＴＥＧＧＧ）（配列番号３２）およびシクロ（ＣＧＴＴＥＧＧ）（配列番号２９）に結合するための抗体を試験した。１７個の抗体のうちの１５個が、免疫原に対応する直鎖状ペプチドと比較して、関連する環状ペプチドについて、より大きい親和性を有し、試験された１７個の抗体のうちの１４個が、免疫原に対応する直鎖状ペプチドと比較して、関連する環状ペプチドについて約２倍以上大きい選択性を有した。
【０３１８】
実施例６
ミスフォールドＴＤＰ−４３の特徴付け
表面プラズモン共鳴および免疫組織化学を使用して、天然型ＴＤＰ−４３ポリペプチドならびにミスフォールドＴＤＰ−４３ポリペプチドに結合する能力について、抗体を試験する。
【０３１９】
生体試料の表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）
均質化ヒトおよびマウスの神経学的組織試料を計量し、その後、組織の最終濃度が２０％（ｗ／ｖ）になるように、ある体積の新鮮な氷水ＴＢＳ（５ｍＭのＥＧＴＡ、５ｍＭのＥＤＴＡ（両方とも、Ｓｉｇｍａ製の）およびＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｌａｖａｌ  ＱＣ，Ｃａｎａｄａ製のＥＤＴＡを含まないプロテアーゼ阻害剤カクテルを補充された）中に沈水させた。機械的プローブホモジナイザーを使用して、この緩衝液中で組織を均質化する（３×３０秒のパルス、その間に３０秒の停止、すべて氷上で行われる）。次に、ＴＢＳ均質化試料を、超遠心分離法（９０分間で７０，０００ｘｇ）に供する。上清を収集し、アリコートし、−８０℃で保存した。ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ  ＩＬ，ＵＳＡ）を使用して、ＴＢＳホモジネートのタンパク質濃度を判定する。
【０３２０】
表面プラズモン共鳴分析ＡＬＳ患者および／またはＦＴＤ患者および年齢が一致した対照由来のＣＳＦ試料および神経学的組織試料を分析する。試験抗体およびＩｇＧ１アイソタイプ対照を、センサチップの２つの別々のフロー細胞上で、高密度（約１０，０００）で直接固定化する。Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００を使用して、ＴＢＳ中に均質化された希釈された神経学的組織試料を、３００秒間表面にわたって順次注入し、その後、１５０秒の緩衝液中の解離および表面再生を行う。結合応答を、ＩｇＧ１参照表面結合の減算によって二重参照し、アッセイ緩衝液で正規化し、および異なる群の試料を比較する。
【０３２１】
実施例７
ヒト胚腎臓細胞（ＨＥＫ２９３ＦＴ）を、ＨＡ−タグを有し、核局在化シグナル（ＴＤＰ−４３ΔＮＬＳ）を欠く、ＴＤＰ−４３の修飾形態で、一時的にトランスフェクトした。この形態のタンパク質は、細胞質中に蓄積し、ミスフォールド凝集体を形成する。空のベクターを、陰性対照として使用した。
【０３２２】
細胞を、４℃で一晩、ＨＡタグに対して（ミスフォールド細胞質ＴＤＰ−４３を検出するために）１μｇ／ｍｌのポリクローナルウサギ抗体で、または１０μｇ／ｍｌの試験抗体で染色した。次に、室温で１時間、蛍光標識化抗ウサギ（赤色Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７）または抗マウス（緑色Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８）二次抗体で染色することによって、結合された抗体を検出した。核ＤＮＡを、Ｈｏｅｓｃｈｓｔ  ３３３４２染料（青色）で染色した。０．３μｍのステップを含むＺ積層様式で共焦点Ｌｅｉｃａ  ＳＰ８顕微鏡上にマイクログラフを得た。含まれる画像は、細胞厚さ全体のＺ平面投影を表す。単一蛍光チャネルおよび併合シグナルのＺ積層型画像（２０〜３０個のステップ）を捕捉した。
【０３２３】
結果を図１０に提示する。パネルＡは、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２染料染色細胞を示し、細胞核を明らかにする。図１０Ｂは、ＨＡタグ付き組み換えＴＤＰ−４３ΔＮＬＳについて染色された細胞を示す。組み換えタンパク質のみを検出する。予想されるように、ＮＬＳを欠く、外因的に発現されたＴＤＰ−４３が、細胞質中に見出され、ミスフォールド凝集体中に存在している。図１０Ｃは、シクロ（ＣＧＧＴＴＥＱＧＧ）を使用して生産されたモノクロ−ナル抗体の結果を示す。主に細胞質染色が存在しており、これは、試験抗体が野生型核ＴＤＰ−４３に結合しないことを示唆している。図１０Ｄは、ＨＡタグ付き組み換えＴＤＰ−４３ΔＮＬＳ細胞質凝集体の検出とＴＤＰ−４３の試験抗体染色との間に実質的な重複（共局在化）がある併合画像を示す。
【０３２４】
実施例８
対照および突発性ＡＬＳ患者から、ヒト脊髄ホモジネートを調製し、選択される抗体によるドットプロットによって分析した。
【０３２５】
ＡＬＳを有しないヒト由来の組織を対照として使用し、２つの異なる突発性ＡＬＳ組織試料を評価した。１つは、Ｃ９０ｒｆ７２突然変異を保有する患者から得られた組織試料であり、もう１つは、未知の突然変異状態を有する患者から得られた組織試料であった。
【０３２６】
複製物中で１０マイクログラムのホモジネートによりＰＶＤＦ膜にドット付けし、試験抗体および対照抗体（ｍＩｇＧ１）を、２マイクログラム／マイクロリットル貯蔵液の５００倍の希釈で使用した。ウサギポリクローナルＴＤＰ−４３抗体（ＰｒｏｔｅｉｎＴｅｃｈ，Ｒｏｓｅｍｏｎｔ  ＩＬ）を、陽性対照として使用した。
【０３２７】
図１１Ａに示すように、ＩｇＧ１陰性対照は、すべての試料について、図１１Ｂに示すように、低い背景染色を生産し、陽性対照抗体は、すべての試験された試料について頑健な陽性シグナルを生産した。
【０３２８】
試験抗体を使用して、ｓＡＬＳ試料の選択的染色を観察した。抗体１は、クローンＩＧ１０であり、抗体２は、クローン２Ｈ１０であり、抗体３は、クローン１１Ｆ３であり、抗体４は、クローン３Ｈ５であり、抗体５は、４Ｇ５であり、抗体６は、クローン９Ｃ５である。抗体６Ｃ５はまた、ｓＡＬＳ試料の選択的染色を示した。
【０３２９】
実施例９
結合凝集ＴＤＰ−４３について陽性の抗体のうちのいくつかを配列決定した。
ハイブリドーマによって発現された免疫グロブリン遺伝子の転写を、標準的なＲＴ−ＰＣＲプロトコルを使用してハイブリドーマ細胞から生成され、標準的な染料ターミネーター毛管配列決定方法（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｓｅ，Ｖｉｃｔｏｒｉａ  ＢＣ  Ｃａｎａｄａ）を使用して配列決定された、ｃＤＮＡからの特許プライマーのセットで増幅させた。
【０３３０】
相補性判定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を、ハイライトし、太字にし、下線を引き、ＩｇＢＬＡＳＴに従って同定した（国立バイオテクノロジー情報センターツールを使用して入手可能（Ｙｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｅｌｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０１３，Ｖｏｌ．４１，Ｗｅｂ  Ｓｅｒｖｅｒ  Ｉｓｓｕｅ  ｄｏｉ：１０：１０９３｜ｎａｒ｜ｇｋｔ３８２）。このツールを使用して、ＩＭＧＴまたはＮＣＢＩ生殖系列Ｖ遺伝子データベース（このようなデータベースにおける配列は、ＦＲ／ＣＤＲ境界について予め注釈がついている）に対するＢＬＡＳＴについてクエリを調査する。一番上のデータベース配列のヒットを使用して、予め注釈が付いているＦＲ／ＣＤＲ境界情報をクエリ配列にマッピングする。ＢＬＡＳＴ調査パラメータは、Ｅｘｐｅｃｔカットオフ、２０；ワードサイズ  ９；不一致ペナルティ、−１；塵埃フィルタリング、オフである。
【表２２−１】
2020522475.tif 000034
【表２２−２】
2020522475.tif 000035
【表２２−３】
2020522475.tif 000036
【０３３１】
標識されたＶＨ１およびＶＨ２である抗体２Ｈ１０について、２つの重鎖を同定した。
【０３３２】
１つまたは両方の重鎖がそれらの環状ペプチド免疫原について選択的な抗体を生産するかどうかは、各重鎖（または、可変領域）を軽鎖（または、可変領域）で発現させ、標的結合を評価することによって確認することができる。
【０３３３】
抗体２Ｈ１０−ＶＨ１の重鎖整列は、２Ｈ１０−Ｖ２と比較して、６Ｃ５および９Ｃ５について重鎖と最も緊密に関連している。
【０３３４】
実施例１０
抗体９Ｃ５を使用したＴＤＰ−４３の免疫蛍光染色
背景を減少させる以下の修正を含む、実施例７に記載の構成およびプロトコルを使用して、ミスフォールドＴＤＰ−４３を組み換え発現させた。主な抗体および二次抗体を、使用前に１００００ＲＰＭで１０分間回転させ、主な追加の前に、室温で１時間１０％のＮＧＳでセクションをブロックした。ＤＡＰＩ染色を使用して、細胞核を同定する。
【０３３５】
図１２Ｃに示すように、９Ｃ５抗体は、ミスフォールドＴＤＰ−４３のＴＤＰ−４３細胞質内包物を検出した。図１２Ａは、ＤＡＰＩ染色細胞を示し、検出されたＴＤＰ４３が細胞質であることを確認している。組み換え発現されたＴＤＰ−４３が、主に９Ｃ５染色と共局在化したタグ付きＨＡであるため（図１２Ｄ）、ＨＡ（図１２Ｂ）についても染色を行った。
表１１  エピトープおよび環状化合物の配列
１．ＴＴＥＱ（配列番号１）
２．ＣＧＧＴＴＥＱＧＧ、シクロ（ＣＧＧＴＴＥＱＧＧ）（配列番号２）
３．ＣＧＴＴＥＱＧ、シクロ（ＣＧＴＴＥＱＧ）（配列番号３）
４．ＧＴＴＥＱＧ（配列番号４）
５．ＴＴＥＱＧ（配列番号５）
６．ＧＴＴＥＱ（配列番号６）
７．ＫＴＴＥＱＤ（配列番号７）
８．ＴＥＱＤ（配列番号８）
９．ＴＴＥＱＤ（配列番号９）
１０．ＫＴＴＥ（配列番号１０）
１１．ＴＴＥＱＤＬ（配列番号１１）
１２．ＫＴＴＥＱ（配列番号１２）
１３．ＣＧＴＴＥＱＧＣ、環状（ＣＧＴＴＥＱＧＣ）（配列番号１３）
１４．ＫＴＴＥＱＤＬ（配列番号１４）
１５．ＴＥＱＤＬＫ（配列番号１５）
１６．ＴＥＱＤＬＫＥ（配列番号１６）
１７．ＴＥＱＤＬＫＥＹ（配列番号１７）
１８．ＴＥＱＤＬＫＥＹＦ（配列番号１８）
１９．ＥＱＤＬ（配列番号１９）
２０．ＷＫＴＴＥＱ（配列番号２０）
２１．ＴＴＥＱＤＬＫＥＹＦＳＴＦＧＥＶ（配列番号２１）
２２．ＣＧＧＴＴＥＱＧＧＧ、シクロ（ＣＧＧＴＴＥＱＧＧＧ）（配列番号２２）
２３．ＣＧＴＴＥＱＧＧ、シクロ（ＣＧＴＴＥＱＧＧ）（配列番号２３）
２４．Ｃ−ＰＥＧ２−ＴＴＥＱＧ、シクロ（Ｃ−ＰＥＧ２−ＴＴＥＱＧ）、ＣＴＴＥＱＧ（配列番号２４）
２５．Ｃ−ＰＥＧ２−ＴＴＥＱＧＧ、シクロ（Ｃ−ＰＥＧ２−ＴＴＥＱＧＧ）、ＣＴＴＥＱＧＧ（配列番号２５）
２６．ＣＧＴＴＥＱ−ＰＥＧ２、シクロ（ＣＧＴＴＥＱ−ＰＥＧ２）、ＣＧＴＴＥＱ（配列番号２６）
２７．ＣＧＧＴＴＥＱ−ＰＥＧ２、シクロール（ＣＧＴＴＥＱ−ＰＥＧ２）、ＣＧＴＴＥＱ（配列番号２７）
２８．ＣＧＴＴＥＧ、シクロ（ＣＧＴＴＥＧ）（配列番号２８）
２９．ＣＧＴＴＥＧＧ、シクロ（ＣＧＴＴＥＧＧ）、（配列番号２９）
３０．ＣＧＧＴＴＥＧＧ、シクロ（ＣＧＧＴＴＥＧＧ）、（配列番号３０）
３１．ＣＧＧＧＴＴＥＧＧ、シクロ（ＣＧＧＧＴＴＥＧＧ）、（配列番号３１）
３２．ＣＧＧＴＴＥＧＧＧ、シクロ（ＣＧＧＴＴＥＧＧＧ）、（配列番号３２）
３３．ＣＧＧＧＴＴＥＧＧＧ、シクロ（ＣＧＧＧＴＴＥＧＧＧ）、（配列番号３３）
３４．ＣＧＧＧＧＴＴＥＧＧＧ、シクロ（ＣＧＧＧＧＴＴＥＧＧＧ）、（配列番号３４）
３５．ＣＧＧＧＧＴＴＥＧＧＧＧ、シクロ（ＣＧＧＧＧＴＴＥＧＧＧＧ）、（配列番号３５）
３６．Ｃ−ＰＥＧ２−ＴＴＥＧ、シクロ（Ｃ−ＰＥＧ２−ＴＴＥＧ）、ＣＴＴＥＧ（配列番号３６）
３７．Ｃ−ＰＥＧ２−ＴＴＥＧＧ、シクロ（Ｃ−ＰＥＧ２−ＴＴＥＧＧ）、ＣＴＴＥＧＧ（配列番号３７）
３８．ＣＧＴＴＥ−ＰＥＧ２、シクロ（ＣＧＴＴＥ−ＰＥＧ２）、ＣＧＴＴＥ（配列番号３８）
３９．ＣＧＧＴＴＥ−ＰＥＧ２、シクロール（ＣＧＧＴＴＥ−ＰＥＧ２）、ＣＧＧＴＴＥ（配列番号３９）
４０．ＧＧＣＧＧ（配列番号４０）
４１．ＧＣＧＧ（配列番号４１）
４２．ＣＧＧＧＴＴＥＱＧＧ、シクロ（ＣＧＧＧＴＴＥＱＧＧ）、（配列番号４２）
４３．ＣＧＧＧＧＴＴＥＱＧＧＧ、シクロ（ＣＧＧＧＧＴＴＥＱＧＧＧ）、（配列番号４３）
４４．ＣＧＧＧＧＴＴＥＱＧＧＧＧ、シクロ（ＣＧＧＧＧＴＴＥＱＧＧＧＧ）、（配列番号４４）
【０３３６】
本願は、好ましい例であると現在考えられているものを参照して記載されているが、本願は、開示される例に限定されないことが理解されるべきである。対照的に、本願は、添付の特許請求の範囲の趣旨および範囲内に含まれる様々な修正および同等の配列を包含することを意図している。
【０３３７】
すべての刊行物、特許、および特許出願は、各個々の刊行物、特許、または特許出願が、それらの全体が参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。特に、例えば、表またはどこかに提供される受託番号および／またはバイオマーカー配列（例えば、タンパク質および／または核酸）を含む、本明細書に提供される各受託番号と関連付けられる配列は、それらの全体が参照により組み込まれる。
【０３３８】
特許請求の範囲の範囲は、好ましい実施形態および実施例によって限定されるべきではなく、全体として記載と一致する最も広い範囲の解釈が与えられるべきである。
本明細書で言及される参考文献の引用
［１］Ｋｕｏ  ＰＨ，Ｃｈｉａｎｇ  ＣＨ，Ｗｎａｇ  ＹＴ，Ｄｏｕｄｅｖａ  ＬＧ，Ｙｕａｎ  ＨＳ，Ｔｈｅ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ＴＤＰ−４３  ＲＲＭ１−ＤＮＡ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｒｅｖｅａｌｓ  ｔｈｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ＵＧ−  ａｎｄ  ＴＧ−Ｒｉｃｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０１４，ｖｏｌ  ４２，４７１２。
［２］ＤＯＩ：１０．２２１０／ｐｄｂ１ｗｆ０／ｐｄｂ（Ｎｏ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ）。
［３］Ｍｏｍｐｅａｎ，Ｍ．，Ｒｏｍａｎｏ，Ｖ．，Ｐａｎｔｏｊａ−Ｕｃｅｄａ，Ｄ．，Ｓｔｕａｎｉ，Ｃ．，Ｂａｒａｌｌｅ，Ｆ．Ｅ．，Ｂｕｒａｔｔｉ，Ｅ．，ａｎｄ  Ｌａｕｒｅｎｔｓ，Ｄ．Ｖ．Ｔｈｅ  ＴＤＰ−４３  Ｎ−  Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｔ  Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ．ＦＥＢＳ  Ｊ．，２０１６，２８３，１２４２。
［４］Ａｒａｉ，Ｔ．，Ｈａｓｅｇａｗａ，Ｍ．，Ａｋｉｙａｍａ，Ｈ．，Ｉｋｅｄａ，Ｋ．，Ｎｏｎａｋａ，Ｔ．，Ｍｏｒｉ，Ｈ．，Ｍａｎｎ，Ｄ．，Ｔｓｕｃｈｉｙａ，Ｋ．，Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｍ．，Ｈａｓｈｉｚｕｍｅ，Ｙ．，ａｎｄ  Ｏｄａ，Ｔ．ＴＤＰ−４３  ｉｓ  ａ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｏｆ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｔａｕ−  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｉｎｃｌｕｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ  ｌｏｂａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２００６，３５１，６０２−６１１。
［５］Ｃｈａｎｔｅｌｌｅ  Ｆ．Ｓｅｐｈｔｏｎ，Ｓｈａｎｎｏｎ  Ｋ．Ｇｏｏｄ，Ｓｔａｎ  Ａｔｋｉｎ，Ｃｏｌｌｅｅｎ  Ｍ．Ｄｅｗｅｙ，Ｐａｕｌ  Ｍａｙｅｒ  ＩＩＩ，Ｊｏａｃｈｉｍ  Ｈｅｒｚ，ａｎｄ  Ｇａｎｇ  ＹｕＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１０，ｖｏｌ．２８５，Ｎｏ．９，６８２６−６８３４。
［６］Ａｂｅｌ，Ｏ．，Ｐｏｗｅｌｌ，Ｊ．Ｆ．，Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ｐ．Ｍ．，ａｎｄ  Ａｌ−Ｃｈａｌａｂｉ，Ａ．Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ，２０１２，３３：１３４５−５１。
［７］Ｈａｍｌｅｙ，Ｉ．Ｗ．ＰＥＧ−Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ２０１４；１５，１５４３−１５５９；ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ｂｍ５００２４６ｗ
［８］Ｒｏｂｅｒｔｓ，ＭＪ  ｅｔ  ａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｆｏｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ  ６４：１１６−１２７。
【図１Ａ】
2020522475.tif 000043
【図１Ｂ】
2020522475.tif 000044
【図１Ｃ】
2020522475.tif 000045
【図２Ａ】
2020522475.tif 000046
【図２Ｂ】
2020522475.tif 000047
【図２Ｃ】
2020522475.tif 000048
【図２Ｄ】
2020522475.tif 000049
【図２Ｅ】
2020522475.tif 000050
【図２Ｆ】
2020522475.tif 000051
【図２Ｇ】
2020522475.tif 000052
【図２Ｈ】
2020522475.tif 000053
【図２Ｉ】
2020522475.tif 000054
【図２Ｊ】
2020522475.tif 000055
【図３Ａ】
2020522475.tif 000056
【図３Ｂ】
2020522475.tif 000057
【図３Ｃ】
2020522475.tif 000058
【図３Ｄ】
2020522475.tif 000059
【図３Ｅ】
2020522475.tif 000060
【図３Ｆ】
2020522475.tif 000061
【図３Ｇ】
2020522475.tif 000062
【図３Ｈ】
2020522475.tif 000063
【図４Ａ】
2020522475.tif 000064
【図４Ｂ】
2020522475.tif 000065
【図４Ｃ】
2020522475.tif 000066
【図５Ａ】
2020522475.tif 000067
【図５Ｂ】
2020522475.tif 000068
【図６Ａ】
2020522475.tif 000069
【図６Ｂ】
2020522475.tif 000070
【図６Ｃ】
2020522475.tif 000071
【図６Ｄ】
2020522475.tif 000072
【図６Ｅ】
2020522475.tif 000073
【図７Ａ】
2020522475.tif 000074
【図７Ｂ】
2020522475.tif 000075
【図７Ｃ】
2020522475.tif 000076
【図７Ｄ】
2020522475.tif 000077
【図７Ｅ】
2020522475.tif 000078
【図７Ｆ】
2020522475.tif 000079
【図７Ｇ】
2020522475.tif 000080
【図７Ｈ】
2020522475.tif 000081
【図７Ｉ】
2020522475.tif 000082
【図７Ｊ】
2020522475.tif 000083
【図８Ａ】
2020522475.tif 000084
【図８Ｂ】
2020522475.tif 000085
【図９Ａ】
2020522475.tif 000086
【図９Ｂ】
2020522475.tif 000087
【図１０Ａ】
2020522475.tif 000088
【図１０Ｂ】
2020522475.tif 000089
【図１０Ｃ】
2020522475.tif 000090
【図１０Ｄ】
2020522475.tif 000091
【図１１Ａ】
2020522475.tif 000092
【図１１Ｂ】
2020522475.tif 000093
【図１１Ｃ】
2020522475.tif 000094
【図１２Ａ】
2020522475.tif 000095
【図１２Ｂ】
2020522475.tif 000096
【図１２Ｃ】
2020522475.tif 000097
【図１２Ｄ】
2020522475.tif 000098
【図１３Ａ】
2020522475.tif 000099
【図１３Ｂ】
2020522475.tif 000100
【配列表】
2020522475000001.app
【国際調査報告】
2020522475.tif 000101
2020522475.tif 000102