(57)【要約】  エンベロープタンパク質の三量体形態を安定化する特定の変異を有するヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）エンベロープタンパク質が提供される。本明細書に記載されるＨＩＶエンベロープタンパク質は、向上した三量体形成の割合、及び／又は向上した三量体の収量を有する。ＨＩＶエンベロープタンパク質、核酸分子、及びＨＩＶエンベロープタンパク質をコードするベクターをディスプレイする粒子、並びにＨＩＶエンベロープタンパク質、粒子、核酸、又はベクターを含有する組成物もまた提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
６５８位におけるアミノ酸は、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、及びＬｅｕからなる群から選択され、位置のナンバリングは、ＨＩＶ−１単離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０におけるナンバリングに従う、組換え体ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）エンベロープ（Ｅｎｖ）タンパク質。
【請求項２】
前記６５８位におけるアミノ酸はＶａｌである、請求項１に記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質。
【請求項３】
前記６５８位におけるアミノ酸はＩｌｅである、請求項１に記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質。
【請求項４】
（ｉ）６５１位におけるＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、若しくはＴｒｐ、好ましくはＰｈｅ；
（ｉｉ）６５５位におけるＰｈｅ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、若しくはＴｒｐ、好ましくはＩｌｅ；
（ｉｉｉ）５３５位におけるＡｓｎ若しくはＧｌｎ、好ましくはＡｓｎ；
（ｉｖ）５８９位におけるＶａｌ、Ｉｌｅ、若しくはＡｌａ；
（ｖ）５７３位におけるＰｈｅ若しくはＴｒｐ、好ましくはＰｈｅ；
（ｖｉ）２０４位におけるＩｌｅ；及び／又は
（ｖｉｉ）６４７位におけるＰｈｅ、Ｍｅｔ、若しくはＩｌｅ、好ましくはＰｈｅのアミノ酸残基のうちの１つ以上を更に含み、
前記位置のナンバリングは、ＨＩＶ−１単離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０における前記ナンバリングに従う、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質。
【請求項５】
６５８位にＶａｌを含み、６５５位にＩｌｅを含む、請求項４に記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質。
【請求項６】
６５８位にＶａｌを含み、６５１位にＰｈｅを含む、請求項４又は５に記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質。
【請求項７】
前記（ｉ）〜（ｖｉｉ）のアミノ酸残基のうち少なくとも２つを含む、請求項４〜６のいずれか一項に記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質。
【請求項８】
前記ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質は、クレードＡ、Ｂ、又はＣのＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質、好ましくはクレードＣのＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質。
【請求項９】
前記指定アミノ酸は親ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質内に存在し、前記親ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質は、
（ａ）ＨＩＶ  Ｅｎｖコンセンサス配列を含むＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質；
（ｂ）合成ＨＩＶ  Ｅｎｖ配列；及び
（ｃ）少なくとも１０００、好ましくは少なくとも１００００の野生型ＨＩＶ  Ｅｎｖ配列のコレクション中のＨＩＶ  Ｅｎｖ配列のうち７．５％未満、好ましくは２％未満の頻度で対応する位置に存在するアミノ酸残基における少なくとも１つの矯正変異、好ましくは少なくとも３つの矯正変異を含む、好ましくはクレードＣの野生型ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質であって、前記矯正変異は、前記コレクション中のＨＩＶ  Ｅｎｖ配列のうち少なくとも１０％の頻度で対応する位置に存在するアミノ酸残基による置換であり、好ましくは、前記矯正変異は、前記コレクション中の対応する位置で最も高頻度に存在するアミノ酸残基による置換である、野生型ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質。
【請求項１０】
５０１位及び６０５位においてＣｙｓ、又は５５９位においてＰｒｏ、好ましくは、５０１位及び６０５位においてＣｙｓ、並びに５５９位においてＰｒｏを更に含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質。
【請求項１１】
（ｖｉｉｉ）５８８位におけるＧｌｎ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、若しくはＰｈｅ、好ましくはＧｌｎ若しくはＧｌｕ；
（ｉｘ）６４位におけるＬｙｓ、若しくは６６位におけるＡｒｇ、若しくは６４位におけるＬｙｓ及び６６位におけるＡｒｇ；
（ｘ）３１６位におけるＴｒｐ；
（ｘｉ）２０１位及び４３３位の両方におけるＣｙｓ；
（ｘｉｉ）５５６位若しくは５５８位におけるＰｒｏ、若しくは５５６位及び５５８位の両方におけるＰｒｏ；
（ｘｉｉｉ）５４８〜５６８アミノ酸位におけるループ（ＨＲ１ループ）の、７〜１０アミノ酸を有するループ、好ましくは８アミノ酸のループ、例えば、（配列番号１２〜１７）のいずれか１つから選択される配列を有するループによる置換；
（ｘｉｖ）５６８位におけるＧｌｙ、若しくは５６９位におけるＧｌｙ、若しくは６３６位におけるＧｌｙ、若しくは５６８位及び６３６位の両方におけるＧｌｙ、若しくは５６９位及び６３６位の両方におけるＧｌｙ；並びに／又は
（ｘｖ）３０２位におけるＴｙｒ、若しくは５１９位におけるＡｒｇ、若しくは５２０位におけるＡｒｇ、若しくは３０２位におけるＴｙｒ並びに５１９位におけるＡｒｇ、若しくは３０２位におけるＴｙｒ並びに５２０位におけるＡｒｇ、若しくは３０２位におけるＴｙｒ並びに５１９位及び５２０位の両方におけるＡｒｇ；
の１つ以上を更に含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質。
【請求項１２】
前記ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質のフューリン切断配列における変異、好ましくは、５０８〜５１１位でのＲＲＲＲＲＲ（配列番号１０）による置換を更に含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質。
【請求項１３】
ｇｐ１４０又はｇｐ１６０タンパク質である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の３つの同一の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質の非共有結合性オリゴマーを含む三量体複合体。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質又は請求項１４に記載の三量体複合体をその表面にディスプレイする、粒子、好ましくはリポソーム又はナノ粒子。
【請求項１６】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質をコードする単離核酸分子。
【請求項１７】
プロモーターに作動可能に連結された請求項１６に記載の単離核酸分子を含むベクター。
【請求項１８】
アデノウイルスベクターである、請求項１７に記載のベクター。
【請求項１９】
請求項１６に記載の単離核酸分子又は請求項１７若しくは１８に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２０】
組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質を産生する方法であって、前記組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質の産生に好適な条件下で請求項１９に記載の宿主細胞を増殖させることを含む、方法。
【請求項２１】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質、請求項１４に記載の三量体複合体、請求項１５に記載の粒子、請求項１６に記載の単離核酸分子、又は請求項１７若しくは１８に記載のベクター、及び薬学的に許容される担体を含む組成物。
【請求項２２】
ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質の三量体形成を向上させる方法であって、前記方法は、６５８位におけるＬｙｓ又はＧｌｎのＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、又はＬｅｕ、好ましくはＶａｌ又はＩｌｅ、最も好ましくはＶａｌによる置換を親ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質に導入することを含み、前記位置のナンバリングは、ＨＩＶ−１単離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０における前記ナンバリングに従う、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
世界中で数百万人もの人々がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に襲われており、抗レトロウイルス治療が広く行き渡った時代でさえも、有効なワクチンによるＨＩＶの予防は非常に高い優先度であり続けている。ＨＩＶウイルスの様々な株及びクレード間の抗原多様性が広範な有効性を有するワクチンの開発を困難にしている。ＨＩＶ−１は当該ウイルスの中で最も一般的であり、且つ最も病原性のある株であり、ＨＩＶ／ＡＩＤＳの９０％を超える症例はＨＩＶ−１のグループＭの感染に由来している。グループＭは更に、クレード又はサブタイプに細分され、クレードＣが最も広範である。有効なワクチンは、理論上、強力な細胞応答、及び様々なクレード由来のＨＩＶ−１株を中和できる広域中和抗体の両方を誘発できるであろう。
【０００２】
ＨＩＶ表面のエンベロープタンパク質スパイク（Ｅｎｖ）は、糖タンパク質ｇｐ１２０及びｇｐ４１のヘテロ二量体の三量体で構成される（図１Ａ）。前駆体タンパク質ｇｐ１６０がフューリンにより切断されてｇｐ１２０及びｇｐ４１になり、ｇｐ１２０はスパイクの頭部であり、且つＣＤ４受容体結合部位及び大きな超可変ループ（Ｖ１〜Ｖ５）を含有し、ｇｐ４１はエンベロープタンパク質スパイクの膜アンカー型ステムである。他のクラスＩ膜融合タンパク質と同様に、ｇｐ４１は、Ｎ末端融合ペプチド（ＦＰ）、Ｃ末端膜貫通（ＴＭ）ドメイン、及び細胞質ドメインを含有する。ＨＩＶと標的細胞膜との間の膜融合には、エンベロープタンパク質の一連の高次構造的な変化が必要になる。ＨＩＶワクチンは、エンベロープタンパク質に基づいて開発することができる。
【０００３】
しかし、ＨＩＶ−１の高い遺伝的変異性、エンベロープタンパク質の高密度の炭水化物コート、及びエンベロープタンパク質スパイク構造の比較的動的且つ不安定な性質を含む様々な要因が、エンベロープタンパク質に基づくＨＩＶワクチンの開発を困難なものにしている。野生型のエンベロープタンパク質は、その機能のために不安定である。したがって、ワクチン候補を生成するために安定化する修飾をエンベロープ構造に導入する場合もある。エンベロープタンパク質は中和抗体の標的であり、高度にグリコシル化されており、タンパク質エピトープを遮蔽することによって免疫原性を弱めている。全ての既知の広域中和抗体（ｂＮＡｂ）は、これらのグリカンに適応する。
【０００４】
ワクチン開発のためには、ｂＮＡｂを誘導することができるエンベロープタンパク質を使用することが好ましい。しかし、大部分のｂＮＡｂは単に、それが任意の高次構造変化を起こす前の天然のエンベロープタンパク質の高次構造を認識するにすぎない。したがって、天然様のコンパクトであり且つ閉じた高次構造でありながら、非天然であり、且つしたがって非中和性のエピトープの提示を最小化する安定したエンベロープタンパク質の開発が、このようなｂＮＡｂを生成する効率を向上させる可能性がある。ＨＩＶワクチンを作製するための先の取り組みは、三量体ＨＩＶエンベロープタンパク質ｇｐ１４０の融合前外部ドメインを含有するワクチンの開発に集中していた。ｇｐ１４０は膜貫通（ＴＭ）及び細胞質ドメインを有しないが、ｇｐ１２０とは異なり三量体構造を形成することができる。更に、これらの先の取り組みは主に、クレードＡに集中していた。しかし、誘導された中和抗体応答の幅は依然として限定的なものである。したがって、複数のＨＩＶクレードに対する安定化された天然のエンベロープ三量体が利用可能であれば、これも有益となろう。
【０００５】
２０年を超える期間、安定なエンベロープタンパク質をその融合前の三量体高次構造において開発する試みは、広域中和抗体の応答を誘導することができるエンベロープタンパク質の可溶性で安定な三量体の生成においては、限定的な達成のみを伴ってなされてきた。例えば、可溶性ｇｐ１４０三量体画分の形成を改善させるために、いわゆるＳＯＳＩＰ変異（５０１Ｃ、６０５Ｃ、及び５５９Ｐ）がエンベロープタンパク質配列に導入されている（Ｓａｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６（１７）：８８７５−８９）。いわゆるＳＯＳＩＰ変異としては、ＨＩＶ−１単離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０において、当該技術分野で使用される従来のナンバリングスキームであるナンバリングに従う５０１位及び６０５位のシステイン残基、並びに５５９位のプロリン残基が挙げられる。三次元タンパク質構造において互いに近接する５０１位及び６０５位での２個のシステイン残基の導入は、ジスルフィド架橋をもたらす。ＢＧ５０５＿ＳＯＳＩＰ及びＢ４１＿ＳＯＳＩＰ（ＳＯＳＩＰ変異を有するＨＩＶ株ＢＧ５０５及びＢ４１（すなわち、９０３２−０８．Ａ１．４６８５）株由来のエンベロープタンパク質）などのＳＯＳＩＰ変異体エンベロープタンパク質がワクチン研究に使用されてきており、Ｔｉｅｒ２の自己中和Ａｂｓを誘導することが示されている（Ｓａｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１５），３４９（６２２４）：１３９−１４０）。
【０００６】
しかしながら、いわゆるＳＯＳＩＰ変異はエンベロープタンパク質の三量体形態を安定化することができるものの、このようなＳＯＳＩＰ変異体の三量体画分は通常１０％未満であり、大量の単量体及び凝集体が依然として生成される。三量体形態を安定化する能力の点で今日まで知られる最も有望なＳＯＳＩＰ変異体エンベロープタンパク質の１つであるＳＯＳＩＰ変異体ＢＧ５０５＿ＳＯＳＩＰでさえ、通常最大で２５％の三量体形態をもたらすにすぎない（Ｊｕｌｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（２０１５），１１２（３８），１１９４７−５２）。更に、この三量体画分では、三量体はそれらが尖部で開閉するため完全に安定ではない。したがって、ＳＯＳＩＰ変異に加えて、Ｅ６４Ｋ、Ａ３１６Ｗ、及び２０１Ｃ−４３３Ｃなどのいくつかの追加の置換が、尖部を安定化し、且つ開閉を妨げるように設計されている（ｄｅ  Ｔａｅｙｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（２０１５），１６３（７），１７０２−１５；Ｋｗｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１５）Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２（７）５２２−３１）。
【発明の概要】
【０００７】
したがって、三量体形成の割合が向上し、三量体の収量が向上し、且つ／又は三量体の安定性が向上した、ＨＩＶエンベロープタンパク質の安定化された三量体が必要とされている。好ましくは、ＨＩＶエンベロープタンパク質のこのような安定化された三量体はまた、広域中和抗体（ｂＮＡｂ）との良好な結合、及び非広域中和Ａｂ（非ｂＮＡｂ）との相対的に限定的な結合を示すであろう。本発明の目的は、三量体の割合が向上し、且つ好ましくは三量体の収量も向上したＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質を提供することである。
【０００８】
本発明は、過去に説明されたＨＩＶエンベロープ三量体と比較して、三量体形成の割合が向上し、且つ／又は三量体の収量が向上した様々なクレード由来の組換え体ＨＩＶエンベロープタンパク質に関する。Ｅｎｖのフォールディングは最適化され、株特異的な特性は矯正され、且つ融合プロセスのために重要な融合前の閉じた高次構造の領域は本明細書に記載の変異によって安定化される。これは、融合前の閉じたＨＩＶ−１エンベロープ三量体のフォールディング及び安定性を最適化する普遍的なアプローチを提供する。結果として得られる安定且つ良好にフォールディングされたＨＩＶ  Ｅｎｖ三量体は、例えば、組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖ三量体の投与に際して、広域中和抗体を誘導し、且つ非中和抗体及び弱い中和抗体の誘導を低減する確率を向上させるため、免疫化の目的にとって有用である。本発明はまた、組換え体ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする単離核酸分子及びベクター、これらを含む細胞、並びに組換え体ＨＩＶエンベロープタンパク質、核酸分子、ベクター及び／又は細胞の組成物に関する。
【０００９】
１つの一般的態様では、本発明は、三量体の形成を安定化する、エンベロープタンパク質配列において同定された位置における特定のアミノ酸残基を有する、組換え体ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）エンベロープタンパク質に関する。
【００１０】
特定の実施形態では、本発明の組換え体ＨＩＶエンベロープ（Ｅｎｖ）タンパク質は、６５８位においてＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、及びＬｅｕからなる群から選択されるアミノ酸を含み、位置のナンバリングは、ＨＩＶ−１単離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０におけるナンバリングに従う。特定の好ましい実施形態では、６５８位のアミノ酸はＶａｌ又はＩｌｅである。特に好ましい実施形態では、６５８位のアミノ酸はＶａｌである。
【００１１】
特定の実施形態では、本発明の組換え体ＨＩＶエンベロープ（Ｅｎｖ）タンパク質は、
（ｉ）６５１位におけるＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、若しくはＴｒｐ；
（ｉｉ）６５５位におけるＰｈｅ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、若しくはＴｒｐ；
（ｉｉｉ）５３５位におけるＡｓｎ若しくはＧｌｎ；
（ｉｖ）５８９位におけるＶａｌ、Ｉｌｅ、若しくはＡｌａ；
（ｖ）５７３位におけるＰｈｅ若しくはＴｒｐ；
（ｖｉ）２０４位におけるＩｌｅ；及び／又は
（ｖｉｉ）６４７位におけるＰｈｅ、Ｍｅｔ、若しくはＩｌｅのアミノ酸残基のうちの１つ以上を更に含み、
位置のナンバリングは、ＨＩＶ−１単離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０におけるナンバリングに従う。特定の好ましい実施形態では、６５１位の指定アミノ酸残基がＰｈｅであり；６５５位の指定アミノ酸残基がＩｌｅであり；５３５位の指定アミノ酸残基がＡｓｎであり；且つ／又は５７３位の指定アミノ酸残基がＰｈｅである。
【００１２】
特定の実施形態では、本発明のＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質は、上記の（ｉ）〜（ｖｉｉ）からなる群から選択される指定位置のうち少なくとも２つにおいて指定アミノ酸残基を含む。
【００１３】
特定の好ましい実施形態では、本発明の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質は、６５８位にＶａｌ又はＩｌｅを含み、６５５位にＩｌｅを含む。他の好ましい実施形態では、本発明の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質は、６５８位にＶａｌ又はＩｌｅを含み、６５１位にＰｈｅを含む。好ましい実施形態では、本発明の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質は、６５８位にＩｌｅを含み、６５５位にＩｌｅを含む。他の好ましい実施形態では、本発明の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質は、６５８位にＩｌｅを含み、６５１位にＰｈｅを含む。他の好ましい実施形態では、本発明の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質は、６５８位にＩｌｅを含み、６５１位にＰｈｅを含み、６５５位にＩｌｅを含む。特に好ましい実施形態では、本発明の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質は、６５８位にＶａｌを含み、６５５位にＩｌｅを含む。他の好ましい実施形態では、本発明の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質は、６５８位にＶａｌを含み、６５１位にＰｈｅを含む。特定の好ましい実施形態では、本発明の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質は、６５８位にＶａｌを含み、６５１位にＰｈｅを含み、６５５位にＩｌｅを含む。
【００１４】
特定の実施形態では、本発明の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質は、ＨＩＶ  Ｅｎｖコンセンサスアミノ酸配列のバックボーンに、例えばクレードＣ（例えば配列番号２又は３のアミノ酸配列を含む）由来の、又はクレードＢ（例えば配列番号４又は５のアミノ酸配列を含む）由来の、上記の変異のうちの１つ以上を含む。
【００１５】
特定の実施形態では、本発明の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質は、例えば、（ａ）：配列番号６のアミノ酸配列、又は（ｂ）：１６６位でＧｌｕからＡｒｇへの変異を有する配列番号６、又は（ｃ）：５０１位及び６０５位でＣｙｓ残基へのアミノ酸の変異を有し、且つ５５９位でＰｒｏ残基へのアミノ酸の変異を有する（ａ）若しくは（ｂ）、又は（ｄ）：更なるフューリン切断部位変異、例えば、５０８〜５１１位でのＲＲＲＲＲＲ（配列番号１０）によるアミノ酸の置換を有する（ａ）、（ｂ）、若しくは（ｃ）、又は（ｅ）配列番号７、又は（ｆ）配列番号８若しくは９のアミノ酸配列を含むＥｎｖなどのモザイクＥｎｖ配列を含む合成ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質である親ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質中に上記の変異のうちの１つ以上を含む。
【００１６】
特定の実施形態では、本発明の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質は、好ましくはクレードＣの、好ましくは野生型ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質である親ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質中に上記の変異のうちの１つ以上を含み、これは、少なくとも１００、好ましくは少なくとも１０００、好ましくは少なくとも１００００の野生型ＨＩＶ  Ｅｎｖ配列のコレクション中のＨＩＶ  Ｅｎｖ配列のうち７．５％未満、好ましくは２％未満の頻度で対応する位置に見出されるアミノ酸残基における少なくとも１つの矯正変異を含み、矯正変異は、前記コレクション中のＨＩＶ  Ｅｎｖ配列のうち少なくとも１０％の頻度で対応する位置に見出されるアミノ酸残基による置換であり、好ましくは、矯正変異は、前記コレクション中の対応する位置で最も高頻度に見出されるアミノ酸残基による置換である。
【００１７】
特定の好ましい実施形態では、ＨＩＶ  Ｅｎｖは、６５８位にＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、又はＬｅｕ、好ましくはＶａｌを含み、６５１位のアミノ酸残基はＰｈｅであり、６５５位のアミノ酸残基はＩｌｅであり、５３５位のアミノ酸残基はＡｓｎであり、且つ／又は５７３位のアミノ酸残基はＰｈｅである。
【００１８】
特定の実施形態では、本発明の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質はクレードＣのＨＩＶ由来である。
【００１９】
特定の実施形態では、本発明の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質はＨＩＶ  Ｅｎｖコンセンサス配列を含む。その特定の実施形態では、コンセンサス配列は、クレードＣのＨＩＶ  Ｅｎｖコンセンサス配列である。他の実施形態では、コンセンサスはクレードＢのＨＩＶ  Ｅｎｖコンセンサス配列である。他の実施形態では、コンセンサスはクレードＡのＨＩＶ  Ｅｎｖコンセンサス配列である。
【００２０】
特定の好ましい実施形態では、本発明の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質は、上記の変異のうちの１つ以上を含み、また、５０１及び６０５位にＣｙｓ、若しくは５５９位にＰｒｏを、又は好ましくは５０１及び６０５位にＣｙｓ、及び５５９位にＰｒｏを更に含み（いわゆる「ＳＯＳＩＰ」バリアントＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質）、位置のナンバリングは、ＨＩＶ−１単離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０におけるナンバリングに従う。
【００２１】
特定の好ましい実施形態では、６５８位のアミノ酸残基はＶａｌであり、６５１位のアミノ酸残基はＰｈｅであり、６５５位のアミノ酸残基はＩｌｅであり、５３５位のアミノ酸残基はＡｓｎであり、且つ５７３位のアミノ酸残基はＰｈｅである。
【００２２】
特定の実施形態では、本発明の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質は、
（ｖｉｉｉ）５８８位におけるＧｌｎ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ若しくはＰｈｅ、好ましくはＧｌｎ若しくはＧｌｕ；
（ｉｘ）６４位におけるＬｙｓ、若しくは６６位におけるＡｒｇ、若しくは６４位におけるＬｙｓ並びに及び６６位におけるＡｒｇ；
（ｘ）３１６位におけるＴｒｐ；
（ｘｉ）２０１位及び４３３位の両方におけるＣｙｓ；
（ｘｉｉ）５５６位におけるＰｒｏ、若しくは５５８位におけるＰｒｏ、若しくは５５６位及び５５８位におけるＰｒｏ；
（ｘｉｉｉ）５４８〜５６８アミノ酸位におけるループ（ＨＲ１ループ）の、７〜１０アミノ酸を有するループ、好ましくは８アミノ酸のループ、例えば、（配列番号１２〜１７）のいずれか１つから選択される配列を有するループによる置換；
（ｘｉｖ）５６８位におけるＧｌｙ、若しくは５６９位におけるＧｌｙ、若しくは６３６位におけるＧｌｙ、若しくは５６８位及び６３６位の両方におけるＧｌｙ、若しくは５６９位及び６３６位の両方におけるＧｌｙ；並びに／又は
（ｘｖ）３０２位におけるＴｙｒ、若しくは５１９位におけるＡｒｇ、若しくは５２０位におけるＡｒｇ、若しくは３０２位におけるＴｙｒ並びに５１９位におけるＡｒｇ、若しくは３０２位におけるＴｙｒ並びに５２０位におけるＡｒｇ、若しくは３０２位におけるＴｙｒ並びに５１９位及び５２０位の両方におけるＡｒｇ；
のアミノ酸残基のうちの１つ以上を更に含む。
【００２３】
特定の実施形態では、本発明の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質は、更に、５０８〜５１１位のＲＲＲＲＲＲ（配列番号１０）による置換などの、ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質のフューリン切断配列における変異を含む。
【００２４】
一実施形態では、組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質は、ｇｐ１４０タンパク質である。
【００２５】
別の実施形態では、組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質は、ｇｐ１６０タンパク質である。
【００２６】
特定の実施形態では、組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質は、細胞質領域、例えば、細胞質領域の７アミノ酸後においてトランケートされる。
【００２７】
親ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質のフォールディング及び安定性（三量体の割合及び／又は三量体の収量の増加として測定される）を向上させる方法であって、方法は、親ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質において少なくとも１つの矯正変異、好ましくは少なくとも３つの矯正変異を導入することによって、親ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質のアミノ酸配列を矯正することを含み、矯正変異が、少なくとも１００、好ましくは少なくとも５００、好ましくは少なくとも１０００、好ましくは少なくとも１００００の野生型ＨＩＶ  Ｅｎｖ配列のコレクション中のＨＩＶ  Ｅｎｖ配列のうち７．５％未満、好ましくは２％未満の頻度で対応する位置に存在するアミノ酸残基でのアミノ酸置換であり、置換が、前記コレクション中のＨＩＶ  Ｅｎｖ配列のうち少なくとも１０％の頻度で対応する位置に存在するアミノ酸残基によるものであり、好ましくは、置換が、前記コレクション中において対応する位置で最も高頻度に存在するアミノ酸残基によるものである、方法も更に開示される。ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質のフォールディング及び安定性（三量体の割合及び／又は三量体の収量として測定される）を向上させるための前記方法によって得ることができる矯正ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質も開示される。前記矯正ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質を含む医薬組成物も開示される。本明細書に記載のＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質を矯正し、矯正された安定化ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質をコードする核酸を組換え体宿主細胞において発現させるための方法を含む、ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質を生成するための方法も開示される。
【００２８】
配列番号２と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、６５８位、好ましくは２０４、５３５、５７３、５８９、６４７、６５１、及び６５５位、並びに好ましくは更に６４、６６、２０１、３１６、４３３、５０１、５０８〜５１１、５５６、５５８、５５９、５８８、５４８−５６８、及び６０５位は％同一性の決定のために考慮されず、６５８位のアミノ酸はＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、又はＬｅｕ、好ましくはＶａｌであり、ナンバリングは、ＨＩＶ−１単離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０におけるナンバリングに従う、組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質も開示される。その特定の実施形態では、組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質は、配列番号３と少なくとも９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、６５８位、好ましくは２０４、５３５、５７３、５８９、６４７、６５１、及び６５５位、並びに好ましくは更に６４、６６、２０１、３１６、４３３、５０８〜５１１、５５６、５５８、５８８、及び５４８〜５６８位は％同一性の決定のために考慮されず、６５８位のアミノ酸はＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、又はＬｅｕ、好ましくはＶａｌであり、ナンバリングは、ＨＩＶ−１単離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０におけるナンバリングに従う。
【００２９】
別の一般的態様では、本発明は、配列番号４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質に関し、６５８位、好ましくは２０４、５３５、５７３、５８９、６４７、６５１、及び６５５位、並びに好ましくは更に６４、６６、２０１、３１６、４３３、５０１、５０８〜５１１、５５６、５５８、５５９、５８８、５４８〜５６８、及び６０５位は％同一性の決定のために考慮されず、６５８位のアミノ酸はＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、又はＬｅｕ、好ましくはＶａｌであり、ナンバリングは、ＨＩＶ−１単離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０におけるナンバリングに従う。その特定の実施形態では、組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質は、配列番号５と少なくとも９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、６５８位、好ましくは２０４、５３５、５７３、５８９、６４７、６５１、及び６５５位、並びに好ましくは更に６４、６６、２０１、３１６、４３３、５０８〜５１１、５５６、５５８、５８８、及び５４８〜５６８位は％同一性の決定のために考慮されず、６５８位のアミノ酸はＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、又はＬｅｕ、好ましくはＶａｌであり、ナンバリングは、ＨＩＶ−１単離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０におけるナンバリングに従う。
【００３０】
これらの態様及び実施形態では、％同一性の決定のために考慮されない指定位置のアミノ酸の１つ以上は、例えば、２０４位のＩｌｅ；６５１位のＰｈｅ、Ａｌａ、Ｌｅｕ又はＴｒｐなどの（下の表１及び２を参照のこと）、本明細書で好ましいものとして指定されるアミノ酸から選択されることが好ましい。
【００３１】
配列番号２、３、４、５、２０、２２、２４、２６、２７、２８、２９、３０、３１、又は３２のいずれか１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含み、配列番号２０、２２、２４、２６、２７、２８、２９、３０、３１、又は３２が特に好ましく、６５８位のアミノ酸はＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、又はＬｅｕ、好ましくはＶａｌである、組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質も開示される。この態様では、％同一性を決定する際に、好ましくは、２０４位、５３５位、５７３位、５８９位、６４７位、６５１位、６５５位及び６５８位、並びに、好ましくは更に、６４位、６６位、２０１位、３１６位、４３３位、５０８〜５１１位、５５６位、５５８位、５８８位及び５４８〜５６８位が考慮されず、また、ナンバリングは、ＨＩＶ−１単離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０におけるナンバリングに従う。この態様でもまた、％同一性を決定するために考慮されない指定位置のアミノ酸の１つ以上は、本明細書の表１の（ｉ）〜（ｖｉｉ）、表２の（ｖｉｉｉ）〜（ｘｖ）、及び／又は表１の（ｘｖｉ）において好ましいものとして指定されるアミノ酸、例えば、２０４位のＩｌｅ；６５１位のＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、又はＴｒｐなどから選択されることが好ましい。
【００３２】
別の一般的態様では、本発明は、本明細書に記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質のいずれかのうち３つの非共有結合性オリゴマーを含む三量体複合体に関する。
【００３３】
別の一般的態様では、本発明は、その表面に本発明の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質をディスプレイする粒子、例えばリポソーム又はナノ粒子、例えば、自己組織化ナノ粒子に関する。
【００３４】
別の一般的態様では、本発明は、本発明の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質をコードする単離核酸分子、及びプロモーターに作動可能に連結された単離核酸分子を含むベクターに関する。一実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。別の実施形態では、ベクターは発現ベクターである。好ましい一実施形態では、ウイルスベクターはアデノウイルスベクターである。
【００３５】
別の一般的態様は、本発明の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質をコードする単離核酸分子又はベクターを含む宿主細胞に関する。このような宿主細胞は、組換え体タンパク質の生成、組換え体タンパク質の発現、又はウイルス粒子の生成のために使用することができる。
【００３６】
別の一般的態様は、本発明の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質をコードする単離核酸分子又はベクターを含む宿主細胞を、組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質の生成に好適な条件下で増殖させることを含む、組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質を生成する方法に関する。
【００３７】
更に別の一般的態様は、本明細書に記載のような組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質、三量体複合体、単離核酸分子、又はベクター、及び薬学的に許容される担体を含む組成物に関する。
【００３８】
別の一般的態様では、本発明は、ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質の三量体形成を向上させる方法に関し、方法は、６５８位におけるアミノ酸（例えばＬｙｓ）のＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、又はＬｅｕ、好ましくはＶａｌによる置換を親ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質に導入することを含み、位置のナンバリングは、ＨＩＶ−１単離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０におけるナンバリングに従う。
【００３９】
上述の概要及び下記の本発明の詳細な説明は、添付した図面と共に読む場合により良く理解されるであろう。本発明は、図面に示す明確な実施形態に限定されないことを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１Ａ〜Ｂは、ＨＩＶエンベロープ（Ｅｎｖ）タンパク質の構造の模式図を示す。図１Ａは、全長ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質を示し、図１Ｂは、いわゆるＳＯＳＩＰ変異、及びＨＩＶ−１単離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０におけるナンバリングに従う残基６６４で始まるＣ末端トランケーション（ＳＯＳＩＰ．６４４配列）を含有する可溶性ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質を示す。
【図２−１】図２：図２Ａは、実施例３で説明されるＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイによって測定される特定の変異による、組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質のための三量体形成の割合（図２Ａ）を示し、図２Ｂは、実施例３で説明されるＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイによって測定される特定の変異による、組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質のための三量体の収量（図２Ｂ）を示し、試験された組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質は、バックボーンＨＩＶ  ＥｎｖコンセンサスクレードＣ配列ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ（配列番号３）に導入された単一、二重、又は三重のアミノ酸置換を含んでおり、三量体の割合及び三量体の収量は、三量体特異性モノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＰＧＴ１４５を組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質のそれぞれと結合させることに基づいて決定され、本発明の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質のそれぞれに対する三量体の収量及び三量体形成の割合は、本明細書で説明する追加の三量体安定化変異を一切含まないバックボーンＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ配列を有するエンベロープタンパク質のそれと比較される。
【図２−２】（上記の通り。）
【図３−１】図３：特定の変異を有する組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質のサイズ排除クロマトグラフィー／多角度光散乱（ＳＥＣ−ＭＡＬＳ）分析からのクロマトグラムを示し、試験された組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質は、バックボーンＨＩＶ  ＥｎｖコンセンサスクレードＣ配列ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ（配列番号３）に導入された単一アミノ酸置換を含んでおり、また実施例２に記載されるレクチン親和性クロマトグラフィーによって精製されており、ＳＥＣ−ＭＡＬＳ分析は実施例３に記載されるとおりに実施され、三量体形態に対応するピークはクロマトグラムのそれぞれに示されている。
【図３−２】（上記の通り。）
【図３−３】（上記の通り。）
【図４】図４Ａは、実施例４に記載される追加の三量体安定化変異を一切含まないバックボーンＣｏｎＢ＿ＳＯＳＩＰ配列を有するエンベロープタンパク質のそれと比較して、特定の変異を有するバックボーンＨＩＶ  ＥｎｖコンセンサスクレードＢ配列ＣｏｎＢ＿ＳＯＳＩＰ（配列番号５）に単一アミノ酸置換が導入された組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質の三量体形成の割合（図４Ａ）を示し、図４Ｂは、実施例４に記載される追加の三量体安定化変異を一切含まないバックボーンＣｏｎＢ＿ＳＯＳＩＰ配列を有するエンベロープタンパク質のそれと比較して、特定の変異を有するバックボーンＨＩＶ  ＥｎｖコンセンサスクレードＢ配列ＣｏｎＢ＿ＳＯＳＩＰ（配列番号５）に単一アミノ酸置換が導入された組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質の三量体の収量（図４Ｂ）を示し、三量体の収量及び三量体形成の割合は、ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイによって測定された。
【図５−１】図５：図５Ａ〜５Ｂは、実施例５に記載のバックボーン合成ＨＩＶエンベロープタンパク質配列ＤＳ＿ｓＣ４＿ＳＯＳＩＰ＿Ｅ１６６Ｒに導入されたアミノ酸置換を有する組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質に関する三量体形成の割合及び三量体の収量を示し；三量体形成の割合及び三量体の収量はＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイによって測定された。
【図５−２】（上記の通り。）
【図６】特定の変異を有する組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質のサイズ排除クロマトグラフィー／多角度光散乱（ＳＥＣ−ＭＡＬＳ）分析からのクロマトグラムを示し、試験された組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質は単一のＫ６５５Ｉ変異を含んでおり、各々の次のバリアント中で追加の変異は、バックボーンＨＩＶ  ＥｎｖコンセンサスクレードＣ配列ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ（配列番号３）に導入され、また実施例２に記載のレクチン親和性クロマトグラフィーによって精製されており、ＳＥＣ−ＭＡＬＳ分析は実施例３に記載されるとおりに実施され、ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ中のｇｐ１４０単量体を示すピークは、三量体ピークの右側の影付き四角によって示されている。下段のパネルは、各追加の変異がｇｐ１４０の単量体ピークの高さにおいて更なる下降をもたらすことを認めることができるように、グラフの下方部分を拡大して示す。
【図７−１】図７：図７Ａは、ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイによって測定された、実施例８に記載される指示変異を有する組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質に関する三量体形成の割合（異なる実験に対して図７Ａ）を示す。図７Ｂは、ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイによって測定された、実施例８に記載される指示変異を有する組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質に関する三量体形成の割合（異なる実験に対して図７Ｂ）を示し、図７Ｃは、ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイによって測定された、実施例８に記載される指示変異を有する組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質に関する三量体の収量（異なる実験に対して図７Ｃ）を示し、図７Ｄは、ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイによって測定された、実施例８に記載される指示変異を有する組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質に関する三量体の収量（異なる実験に対して図７Ｄ）を示す。
【図７−２】（上記の通り。）
【図７−３】（上記の通り。）
【図７−４】（上記の通り。）
【図８】実施例８に記載のとおりの指定変異を有する組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質のＳＥＣ−ＭＡＬＳクロマトグラムを示す。
【図９−１】図９：図９Ａは、実施例９に記載される追加の三量体安定化変異を一切含まないバックボーンＢＧ５０５＿ＳＯＳＩＰ配列を有するエンベロープタンパク質のそれと比較した、単一アミノ酸置換及び置換の組み合わせを有するＢＧ５０５＿ＳＯＳＩＰ（野生型クレードＡ株に由来する）の三量体形成の割合（図９Ａ）を示し、図９Ｂは、実施例９に記載される追加の三量体安定化変異を一切含まないバックボーンＢＧ５０５＿ＳＯＳＩＰ配列を有するエンベロープタンパク質のそれと比較した、単一アミノ酸置換及び置換の組み合わせを有するＢＧ５０５＿ＳＯＳＩＰ（野生型クレードＡ株に由来する）の三量体の収量（図９Ｂ）を示す。三量体の収量及び三量体形成の割合は、ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイによって測定された。
【図９−２】（上記の通り。）
【図１０】組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質のサイズ排除クロマトグラフィー／多角度光散乱（ＳＥＣ−ＭＡＬＳ）分析のクロマトグラムを示し；ＳＥＣ−ＭＡＬＳ分析は、Ｅｎｖトランスフェクト細胞の培養上清上で実施された。三量体形態に対応するピークは、７〜７．５分の間に溶出する。暗灰色の線はＢＧ５０５＿ＳＯＳＩＰ（野生型クレードＡ株に由来する）であり、明灰色の線は、Ｌ５５６Ｐ、Ｋ６５５Ｉ、Ｍ５３５Ｎ、Ｎ６５１Ｆ、Ｄ５８９Ｖ、Ｋ５８８Ｅ置換を有するＢＧ５０５＿ＳＯＳＩＰである。
【図１１−１】図１１：実施例１０に記載されるＣ９７ＺＡ＿ＳＯＳＩＰバリアントに関する三量体の収量を示す。３つの安定化置換（Ｌ５５６Ｐ、Ｔ６５１Ｆ及びＭ５３５Ｎ）を有するＣ９７ＺＡの三量体の収量（図１０Ａ及びＢ）。図１１Ｂでは、Ｅｎｖ配列は、図１３で記載される概念的フレームワークに従ってＣ９７ＺＡ  Ｅｎｖ配列を矯正するために追加された追加の変異（２１個の追加の変異）、及び追加の安定化置換（Ｋ６５５Ｉ、Ｄ５８９Ｖ、Ａ２０４Ｉ及びＫ５８８Ｅ）の導入によって更に最適化された。三量体の収量及び三量体形成の割合は、ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイによって測定された。シグナルは、１に設定されたＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰシグナルに正規化された。ＰＮＧＳは、潜在的Ｎ−グリコシル化部位である。
【図１１−２】（上記の通り。）
【図１２】４つの安定化置換を有するＨＩＶ−１  Ｅｎｖ株ＤＵ４２２の三量体の収量（詳細は実施例１１を参照されたい）。全ての数値は、１に設定されたＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ（図示せず）に正規化された。
【図１３】株Ｃ９７ＺＡについて示されるＨＩＶ−１  Ｅｎｖ配列を矯正するための全般的な概念。全ＨＩＶ−１データベースで出現頻度が最も高い残基（本明細書では「コンセンサス残基」と称する）（上部の棒）及びＣ９７ＺＡ残基位置の出現割合の低い方から高い方にソートされた株Ｃ９７ＺＡ残基（下部の棒）。コンセンサス残基に置換されるＣ９７ＺＡ配列位置は、次の条件に基づいて選択される：Ｅｎｖデータベース配列において２％未満で出現するＣ９７ＺＡ残基を有する位置（黒色の棒）。Ｅｎｖデータベース配列において２％〜７．５％の間で出現し、埋まっているか又は部分的に埋まっているＣ９７ＺＡ残基を有する位置（暗灰色の棒）。Ｃ９７ＺＡ及び親水性コンセンサス残基において露出し、且つ疎水性である位置（２つの最も明るい灰色の棒）、並びに潜在的Ｎ−グリコシル化部位（ＰＮＧＳ）コンセンサス残基（Ｓ２３４Ｎ）である位置。
【図１４】配列矯正及び変異性の安定化を介した融合前の閉じたＨＩＶ  ＥＮＶ＿ＳＯＳＩＰ三量体。広域中和抗体用のＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰに正規化された、全てのＳＯＳＩＰバリアントについての細胞培養上清におけるＡｌｐｈａＬＩＳＡシグナル。個別のＨＩＶ  Ｅｎｖバリアントに関して、「安定化」は「ＳＴＡＢ」によって示され、「矯正」は「ＲＥＰ」によって示される。
【図１５】対照Ｅｎｖ＿ＳＯＳＩＰバリアント（バックボーンＳＯＳＩＰ）の分析的ＳＥＣプロファイル、実施例１２及び図１３に記載される概念に基づく矯正されたＥｎｖバリアント、並びにトランスフェクション後に細胞培養上清を用いた、表３に基づく追加の安定化置換を有するＥｎｖバリアント。細胞培養上清の偽シグナルが全てのプロファイルから差し引かれた。三量体ピークは＊で示される。
【図１６】安定化ＳＯＳＩＰ改変を有しないＨＩＶ−１  Ｅｎｖ  ＣｏｎＣバリアントの三量体の収量。
【図１７−１】図１７：５８９位、６４７位、６５１位、及び６５５位でメチオニンへの変異を有するＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰの三量体の収量（Ａ）及び三量体の割合（Ｂ）。全ての数値は、１に設定されたＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ（図示せず）に正規化された。エラーバーは、棒の右端で示される。
【図１７−２】（上記の通り。）
【図１８】トランスフェクション後に細胞培養上清を用いた、ＣｏｎＢ＿ＳＯＳＩＰ及びＣｏｎＢ＿ＳＯＳＩＰ＿Ｑ６５８Ｖの分析的ＳＥＣプロファイル。細胞培養上清の偽シグナルが全てのプロファイルから差し引かれた。三量体ピークは線で示され、且つ「三量体」とラベリングされ、単量体ピークは「単量体」とラベリングされている。
【図１９】ウサギ（ヒートマップ１列につき１動物）における血清ＩＤ５０力価。実施例１５で説明される、ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ  Ｎｉ−ＮＴＡリポソーム（安定化ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ．ｖ３、配列番号２８）でプライミングし、リポソームに共有結合したＥｎｖタンパク質（矯正及び安定化（ＲＡＳ）ｓＣ４＿ＳＯＳＩＰ．ｖ４、配列番号３２；ＲＡＳ  Ｃ９７ＺＡ＿ＳＯＳＩＰ．ｖ２、配列番号３０；ＲＡＳ  Ｄｕ４２２＿ＳＯＳＩＰ．ｖ１、配列番号３１）（Ｅｎｖ−リポソーム）により３回ブースト免疫化した後のウサギにおける血清ＩＤ５０力価。対照動物（ｎ＝２）はトリス緩衝液を注射した。７−ウイルスクレードＣ  Ｔｉｅｒ２パネルを用いる（クレードＣ  Ｅｎｖを含むヒートマップ内のカラムは下部に単離コードを有する）。
【図２０】膜結合性コンセンサスＣ  ＳＯＳＩＰ  Ｅｎｖにおける安定化変異の影響。膜結合性ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ＿ＦＬの統合ＭＦＩを安定化ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ＿ＦＬと比較するＦＡＣＳ実験。データは、ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ＿ＦＬバックボーン±ＳＤに対する平均倍率変化としてプロットされている（二重染色）。詳細は実施例１８を参照されたい。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
背景技術の項で、また本明細書全体を通して、様々な刊行物、論文及び特許が引用又は記載されており、これらの参考文献はそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれる文献、行為、材料、装置、物品などの議論は、本発明の文脈を提供することを目的とする。そのような議論は、これらの内容のいずれか又は全てが、開示されている、又は特許請求されているあらゆる発明に関する先行技術の一部を形成することを認めるものではない。
【００４２】
別途定義されていない限り、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、本発明が関係する分野の当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有する。さもなければ、本明細書で使用される特定の用語は、本明細書で規定されている意味を有する。本明細書に引用されている全ての特許、公開される特許出願及び公報は、参照により完全に記載されているかのように本明細書に組み込まれる。本明細書で使用する場合、及び添付した特許請求の範囲においては、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、別途文脈が明白に規定していない限り、複数の言及を含むことに留意しなければならない。
【００４３】
特に明記しない限り、本明細書に記載される濃度又は濃度範囲などの任意の数値は、全ての場合において、用語「約」によって修飾されていると理解されるべきである。したがって、数値は、通常、列挙された値の±１０％を含む。本明細書で使用する場合、数値範囲の使用は、全ての可能な部分的範囲、その範囲内の全ての個々の数値を明示的に含み、文脈に明らかに別段の指示がない限り、そのような範囲内の整数及び値の分数を含む。
【００４４】
アミノ酸は本開示の全体にわたって参照される。２０個の天然に存在するアミノ酸、及び多くの天然に存在しないアミノ酸がある。天然及び非天然アミノ酸の両方を含む既知のアミノ酸の各々は、フルネーム、１文字の省略コード、及び３文字の省略コードを有し、その全てが当業者によく知られている。例えば、２０個の天然に存在するアミノ酸に用いられる３文字及び１文字の省略コードを次に示す：アラニン（Ａｌａ；Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）、アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）、システイン（Ｃｙｓ；Ｃ）、グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）、グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ；Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）、及びバリン（Ｖａｌ；Ｖ）。アミノ酸は、それらのフルネーム、１文字の省略コード、又は３文字の省略コードによって参照され得る。
【００４５】
別途文脈が明白に規定していない限り、本明細書で用いられるＨＩＶエンベロープタンパク質のアミノ酸配列における位置のナンバリングは、例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれるＫｏｒｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ＡＩＤＳ  １９９８：Ａ  Ｃｏｍｐｉｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｋｏｒｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  Ｇｒｏｕｐ，Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ，Ｎ．Ｍｅｘ．）に記述されているように、ＨＩＶ−１単離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０におけるナンバリングに従う。ＨＸＢ２に従うナンバリングは、ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質の分野において慣例的なものである。ＨＩＶ−１単離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する。この配列を有する目的のＨＩＶ  Ｅｎｖ配列のアラインメントを使用して、目的の配列における対応するアミノ酸のナンバリングを見出すことができる。
【００４６】
用語「配列同一性のパーセント（％）」又は「％同一性」は、アミノ酸配列の全長を構成するアミノ酸残基の数と比較して、２つ以上の整列させたアミノ酸配列の同一のアミノ酸の一致する（「ヒットする」）数を指す。言い換えると、配列が当該技術分野において既知である配列比較アルゴリズムを使用して測定される際に最大限の一致に対して比較され整列させる場合、又は手動で整列させ視覚的に検証される場合、アラインメントを使用して、２つ以上の配列について、同一のものである（例えば、９５％、９７％又は９８％の同一性）アミノ酸残基の百分率が決定されてもよい。したがって、配列同一性を決定するために比較される配列は、アミノ酸の置換、付加又は欠失によって異なってもよい。タンパク質配列を整列させるための好適なプログラムは、当業者に知られている。タンパク質配列の百分率配列同一性は、例えばＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用する、例えばＣＬＵＳＴＡＬＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａ、ＦＡＳＴＡ、又はＢＬＡＳＴなどのプログラムにより決定することができる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦ，ｅｔ  ａｌ（１９９７），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）。
【００４７】
本明細書で使用する場合、「ＨＩＶ  Ｅｎｖ配列のコレクション」は、同じクレード（例えば、クレードＣ）又は異なるクレード（例えば、クレードＡ、Ｂ、Ｃなど）に由来し得る、野生型ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質のランダム配列の典型的な数（例えば、少なくとも１００、又は５００、又は１０００、又はそれ以上）のコレクションである。このような配列の好適なコレクションは、データベース内で入手可能であり、或いは、下位のコレクションがそれから、例えば、ＨＩＶ配列データベース（Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）から抽出されてもよい。このようなコレクションは、好ましくは、少なくとも１００個のＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質配列、１０００個のＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質配列、少なくとも１００００個のＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質配列、少なくとも５００００個のＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質配列を含み、また、９００００個を超えるＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質配列を含有してもよい。
【００４８】
ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質における「対応する位置」は、少なくとも２つのＨＩＶ  Ｅｎｖ配列が整列しているときのアミノ酸残基の位置を指す。別段の指定がない限り、これらの目的のためにナンバリングするアミノ酸位置は、当該技術分野で慣例のように、ＨＩＶ−１単離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０におけるナンバリングに従う。
【００４９】
本明細書で使用する場合、「安定化変異」は、表１の項目（ｉ）〜（ｖｉｉ）若しくは（ｘｖｉ）、又は表２の（ｖｉｉｉ）〜（ｘｖ）のいずれかにおいて本明細書で記載のとおりの変異であり、これは、親分子と比較して、その変異が前記親分子における対応するアミノ酸の置換によって導入されるときに、ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質の三量体の割合及び／又は三量体の収量（これは、例えば、本明細書に記載のＡｌｐｈａＬＩＳＡ若しくはＳＥＣ−ＭＡＬＳアッセイによって測定することができる）を増加させる。このような安定化変異に起因するアミノ酸は通常、野生型ＨＩＶ単離株のＥｎｖタンパク質において、たとえあったとしてもまれにしか見出されない。
【００５０】
本明細書で使用する場合、「矯正変異」は、親ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質におけるアミノ酸残基の置換であり、このアミノ酸残基は、ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質配列のコレクションにおける対応する位置で、７．５％未満、好ましくは２％未満存在し、置換は、前記コレクションにおける対応する位置でより高頻度に、例えば、前記コレクションにおけるＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質の少なくとも１０％において存在するアミノ酸によるものであり、好ましくは、ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質の少なくとも２０％において前記コレクションにおける対応する位置で存在するアミノ酸によるものであるか、又は前記コレクションにおける対応する位置で最も高頻度に存在するアミノ酸によるものである。したがって、このような矯正変異に起因するアミノ酸は通常、比較的高い割合の野生型ＨＩＶ単離株のＥｎｖタンパク質において見出され、また、いくつかの場合では、コンセンサスＨＩＶ  Ｅｎｖ配列における対応する位置のものと同じであり得る。
【００５１】
本明細書で使用する場合、「矯正及び安定化された」ＨＩＶ  Ｅｎｖ配列は通常、少なくとも１つの矯正変異及び少なくとも１つの安定化変異を含有し、好ましくは、親ＨＩＶ  Ｅｎｖ配列と比較して、複数の矯正変異及び複数の安定化変異を含有する。
【００５２】
ＨＩＶ株（又はそれに由来するＥｎｖタンパク質）を意味する場合、用語「天然」又は「野生型」は、本明細書では同じ意味で用いられ、天然において、例えば、ＨＩＶ感染患者において存在するようなＨＩＶ株（又はそれに由来するＥｎｖタンパク質）を指す。
【００５３】
本発明は一般に、エンベロープタンパク質の三量体形態を安定化するエンベロープタンパク質配列における指定位置で、ある種のアミノ酸置換を含む組換え体ＨＩＶエンベロープ（Ｅｎｖ）タンパク質に関する。同定された本発明のアミノ酸置換の１つ以上をＨＩＶエンベロープタンパク質の配列に導入することにより、三量体形成の割合の増加及び／又は三量体の収量の増加をもたらすことができる。これは、例えば、三量体特異性抗体、融解温度、サイズ排除クロマトグラフィー、及び適切にフォールディングされた（安定三量体）或いは不適切にフォールディングされた（不安定又は非三量体）Ｅｎｖタンパク質に結合する抗体への結合を用いて測定することができ、三量体の割合及び／又は三量体の収量の増加は、安定な、天然の、適切にフォールディングされたＥｎｖタンパク質を示すと考えられる。
【００５４】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）のファミリーの一部であるレンチウイルス（Ｌｅｎｔｉｖｉｒｉｎａｅ）属のメンバーである。２種のＨＩＶがヒトに感染し、それは、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２である。ＨＩＶ−１は、ＨＩＶウイルスの最も一般的な株であり、ＨＩＶ−２と比べて病原性が高いことが知られている。本明細書で使用する場合、用語「ヒト免疫不全ウイルス」及び「ＨＩＶ」は、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２を指すが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、ＨＩＶはＨＩＶ−１を指す。
【００５５】
ＨＩＶは、高度な遺伝的分岐を有する複数のクレードに分類される。本明細書で使用する場合、用語「ＨＩＶクレード」又は「ＨＩＶサブタイプ」は、それらの遺伝的類似性の度合いに従って分類された関連するヒト免疫不全ウイルスを指す。ＨＩＶ−１単離株の最も大きな群は、グループＭ（主系統）と呼ばれており、少なくとも１０種のクレードＡ〜Ｊからなる。
【００５６】
１つの一般的態様では、本発明は、組換え体ＨＩＶエンベロープ（Ｅｎｖ）タンパク質に関する。用語「組換え体」は、タンパク質に関して使用される場合、組換え体技術又はインビトロでの化学合成によって生成されるタンパク質を指す。本発明の実施形態によれば、「組換え体」タンパク質は、それが、対応する天然に存在する配列に見出されない少なくとも１つの配列要素（例えば、アミノ酸置換、欠失、付加、配列の置換など）を含有するという点において人工的なアミノ酸配列を有する。好ましくは、「組換え体」タンパク質は、１つ以上の天然に存在するＨＩＶ株に対して免疫応答を誘導するか、又は免疫を生じさせるように最適化された天然に存在しないＨＩＶエンベロープタンパク質である。
【００５７】
用語「ＨＩＶエンベロープタンパク質」、「ＨＩＶ  Ｅｎｖ」及び「ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質」は、ＨＩＶビリオンのエンベロープ上で自然に発現され、且つＨＩＶがＨＩＶ感染細胞の原形質膜を標的化してそれに付着することを可能にする、タンパク質又はその断片若しくは派生体を指す。用語「エンベロープ」及び「Ｅｎｖ」は、本開示を通して同じ意味で用いられる。ＨＩＶ  ｅｎｖ遺伝子は、タンパク質分解により切断されて２つの成熟エンベロープ糖タンパク質であるｇｐ１２０及びｇｐ４１になる、前駆体タンパク質ｇｐ１６０をコードする。切断反応は、レトロウイルス性のエンベロープ糖タンパク質前駆体中で高度に保存された配列モチーフにおいて、宿主細胞のプロテアーゼであるフューリンによって（又はフューリン様プロテアーゼによって）媒介される。より具体的には、ｇｐ１６０は（ｇｐ１６０）３へと三量体形成し、更に切断を経て、２つの非共有結合した成熟糖タンパク質ｇｐ１２０及びｇｐ４１になる。続いて、ウイルス侵入が、ｇｐ１２０／ｇｐ４１ヘテロ二量体の三量体によって媒介される。ｇｐ１２０は受容体結合断片であり、このような受容体を有する標的細胞（例えばヘルパーＴ細胞など）上のＣＤ４受容体（及び共受容体）に結合する。ｇｐ４１は、ｇｐ１２０に非共有結合しており、融合断片であり、ＨＩＶが細胞に侵入する第２のステップをもたらす。ｇｐ４１は、最初はウイルスエンベロープ内に埋め込まれているが、ｇｐ１２０がＣＤ４受容体及び共受容体に結合すると、ｇｐ１２０はその高次構造を変化させてｇｐ４１を露出状態にし、このとき、宿主細胞との融合を促進し得る。ｇｐ１４０はｇｐ１６０の外部ドメインである。
【００５８】
本発明の実施形態によれば、「ＨＩＶエンベロープ（Ｅｎｖ）タンパク質」は、ｇｐ１６０若しくはｇｐ１４０タンパク質、又はその組み合わせ、融合物、トランケーション若しくは派生体であり得る。例えば、「ＨＩＶエンベロープタンパク質」は、ｇｐ４１タンパク質と非共有結合したｇｐ１２０タンパク質を含み得る。「ＨＩＶエンベロープタンパク質」はまた、外部ドメイン（すなわち、細胞外空間に延在するドメイン）におけるＣ末端トランケーション、ｇｐ４１の外部ドメインにおけるトランケーション、ｇｐ４１の膜貫通ドメインにおけるトランケーション、又はｇｐ４１の細胞質ドメインにおけるトランケーションなどの、ｇｐ４１におけるトランケーションを含むエンベロープタンパク質を含むが、これらに限定されないトランケートされたＨＩＶエンベロープタンパク質であり得る。ＨＩＶエンベロープタンパク質はまた、ｇｐ１６０外部ドメイン、又は伸長若しくはトランケートされた種類のｇｐ１４０に対応するｇｐ１４０であり得る。ｇｐ１４０タンパク質の発現については、いくつかの論文（例えば、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｓａｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｈａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）に記載されており、このタンパク質は、例えば様々なＨＩＶ株に基づく様々なバリアントで、サービス提供者から注文することもできる。本発明によるｇｐ１４０タンパク質は、ｇｐ１２０ドメインとｇｐ４１外部ドメインが切断されず、且つ共有結合されるように切断部位の変異を有することもでき、或いは、ｇｐ１２０ドメインとｇｐ４１外部ドメインが切断され、且つ、例えば、ジスルフィド架橋によって共有結合することもできる（例えば、ＳＯＳＩＰバリアントなど）。「ＨＩＶエンベロープタンパク質」は更に、例えば、フューリン切断部位における配列変異、及び／又はいわゆるＳＯＳＩＰ変異を有する天然に存在するＨＩＶエンベロープタンパク質の派生体であり得る。本発明によるＨＩＶエンベロープタンパク質はまた、切断部位を有することができ、その結果、ｇｐ１２０及びｇｐ４１外部ドメインが非共有結合され得る。
【００５９】
本発明の好ましい実施形態では、ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質は、ｇｐ１４０タンパク質又はｇｐ１６０タンパク質であり、より好ましくはｇｐ１４０タンパク質である。他の好ましい実施形態では、Ｅｎｖタンパク質は、例えば、天然のＥｎｖタンパク質と比較して、細胞質領域の７番目の残基の後の残基の欠失によってトランケートされる。
【００６０】
本発明の実施形態によれば、「ＨＩＶエンベロープタンパク質」は、三量体又は単量体であり得、好ましくは三量体である。三量体は、ホモ三量体（例えば、３つの同一のポリペプチド単位を含む三量体）、又はヘテロ三量体（例えば、全てが同一とは限らない３つのポリペプチド単位を含む三量体）であり得る。好ましくは、三量体は、ホモ三量体である。切断されたｇｐ１４０又はｇｐ１６０の場合、それは、ｇｐ１２０−ｇｐ４１二量体であるポリペプチド単位の三量体であり、これら３つの二量体が全て同一である場合、これはホモ三量体であるとみなされる。
【００６１】
「ＨＩＶエンベロープタンパク質」は、可溶性タンパク質又は膜結合性タンパク質であり得る。膜結合性エンベロープタンパク質は通常、例えば、図１Ａに示されるような膜貫通ドメイン（ＴＭ）を含む全長ＨＩＶエンベロープタンパク質におけるなどの、膜貫通ドメインを含む。膜結合性タンパク質は、細胞質ドメインを有し得るが、膜結合性になるために細胞質ドメインを必要としない。可溶性エンベロープタンパク質は、少なくとも部分的な又は完全な膜貫通ドメインの欠失を含む。例えば、全長ＨＩＶエンベロープタンパク質のＣ末端をトランケートして膜貫通ドメインを欠失させ、それによって、図１Ｂに示されるような可溶性タンパク質を生成することができる。しかしながら、ＨＩＶエンベロープタンパク質は、図１Ｂに示されるものに対して、より短いトランケーション及び代替のトランケーション位置を有してもなお可溶性であり得る。トランケーションは様々な位置で行うことができ、非限定的な例は、アミノ酸６６４、６５５、６８３などの後であり、これらは全て可溶性タンパク質をもたらす。本発明による膜結合性Ｅｎｖタンパク質は、天然のＥｎｖタンパク質と比較して、完全な又は部分的なＣ末端ドメイン（例えば、Ｃ末端細胞質ドメインの部分的な欠失、例えば、特定の実施形態では、細胞質領域の７番目の残基の後）を含み得る。
【００６２】
シグナルペプチドは通常、発現される際にＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質のＮ末端に存在するが、シグナルペプチダーゼによって切断され、そのため、成熟タンパク質においては存在しない。シグナルペプチドは他のシグナル配列と交換することができ、シグナルペプチドの２つの非限定的な例が、配列番号１１、１８、３３及び３４において本明細書で提供される。
【００６３】
本発明の実施形態によれば、ＨＩＶエンベロープタンパク質、例えば、ｇｐ１６０又はｇｐ１４０は、任意のＨＩＶクレード（又は「サブタイプ」）、例えば、クレードＡ、クレードＢ、クレードＣ、クレードＤ、クレードＥ、クレードＦ、クレードＧ、クレードＨなど、又はその組み合わせ（例えば、ＢＣ、ＡＥ、ＡＧ、ＢＥ、ＢＦ、ＡＤＧなどの異なるサブタイプのウイルス間での組換えに由来する「組換型流行株」すなわちＣＲＦにおいてなど）からのＨＩＶエンベロープタンパク質配列に由来し得る。ＨＩＶエンベロープタンパク質配列は、天然に存在する配列、モザイク配列、コンセンサス配列、合成配列、又はその任意の派生体若しくは断片であり得る。「モザイク配列」は、１つ以上のＨＩＶクレードの少なくとも３つのＨＩＶエンベロープ配列に由来する複数のエピトープを含有し、Ｔ細胞エピトープの適用範囲を最適化するアルゴリズムによって設計され得る。モザイクＨＩＶエンベロープタンパク質の配列の例としては、例えば、Ｂａｒｏｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２０１０，１６：３１９−３２３；及び国際公開第２０１０／０５９７３２号パンフレットに記載のもの、例えば、配列番号８及び９に示されるものなどが挙げられる。本明細書で使用する場合、「コンセンサス配列」は、例えば、相同タンパク質のアミノ酸配列のアラインメント（例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａを使用する）によって決定されるような、相同タンパク質のアミノ酸配列のアラインメントに基づくアミノ酸の人工的な配列を意味する。それは、少なくとも１０００個の天然のＨＩＶ単離株由来のＥｎｖの配列に基づいて、配列アラインメントにおける各位置で見出される最も高頻度なアミノ酸残基の計算された順序である。「合成配列」は、２つ以上の天然に存在するＨＩＶ株に対して免疫応答を誘導するか、又は免疫を生じさせるように最適化された天然に存在しないＨＩＶエンベロープタンパク質である。モザイクＨＩＶエンベロープタンパク質は、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質の非限定的な例である。本発明の好ましい実施形態では、親ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質はコンセンサスＥｎｖタンパク質、又は合成Ｅｎｖタンパク質である。親Ｅｎｖタンパク質においては、変異が導入されると、６５８位にアミノ酸のＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、又はＬｅｕ、好ましくはＶａｌ又はＩｌｅをもたらす。任意選択的に、こうしたＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質は、更に、本明細書の表１に記載される指定位置（ｉ）〜（ｖｉｉ）に指定アミノ酸のうちの少なくとも１つを有し得る。指定位置（ｉ）〜（ｖｉｉ）の指定アミノ酸残基のうち少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つを有し、好ましくは更に、下記で説明するＳＯＳＩＰ及び／又はフューリン切断部位変異を有する、コンセンサスＥｎｖタンパク質が特に好ましい。
【００６４】
本発明の特定の実施形態では、ＨＩＶエンベロープタンパク質は、天然に存在する配列、モザイク配列、コンセンサス配列、合成配列などであるかに関わらず、例えば、フューリン切断部位及び／又はいわゆるＳＯＳＩＰ変異において、追加の配列変異を含む。
【００６５】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明のＨＩＶエンベロープタンパク質は更なる変異を有し、これは「ＳＯＳＩＰ変異体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質」である。いわゆるＳＯＳＩＰ変異は、「ＳＯＳ変異」（新たに作られたシステイン残基間で適切なジスルフィド架橋の導入をもたらす、５０１位及び６０５位におけるＣｙｓ残基）並びに「ＩＰ変異」（５５９位におけるＰｒｏ残基）を含む、三量体安定化変異である。本発明の実施形態によれば、ＳＯＳＩＰ変異体Ｅｎｖタンパク質は、５０１位及び６０５位におけるＣｙｓ；５５９位におけるＰｒｏ；並びに好ましくは、５０１位及び６０５位におけるＣｙｓ並びに５５９位におけるＰｒｏからなる群から選択される少なくとも１つの変異を含む。ＳＯＳＩＰ変異体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質は更に、例えば、フューリン切断部位において、他の配列変異を含み得る。加えて、特定の実施形態では、Ｅｎｖタンパク質が、ＳＯＳＩＰバリアントにおける５５９位のＰｒｏの代わりとしてだけでなく、すでに５５９位にＰｒｏを有するＳＯＳＩＰバリアントの三量体形成を更に向上させ得る追加の変異としても作用することができると見出された、５５６位若しくは５５８位、又は５５６位及び５５８位においてＰｒｏを含むように、更に変異を追加することが可能である。
【００６６】
本発明の特定の好ましい実施形態では、ＳＯＳＩＰ変異体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質は、５０１位及び６０５位においてＣｙｓ、並びに５５９位においてＰｒｏを含む。
【００６７】
特定の実施形態では、本発明のＨＩＶエンベロープタンパク質は更に、フューリン切断部位における変異を含む。フューリン切断配列における変異は、アミノ酸の置換、欠失、挿入、又は１つの配列の別の配列での置換、又はリンカーアミノ酸配列による置換であり得る。本発明において好ましくは、フューリン切断部位を変異させることを使用して、切断部位を最適化することができ、その結果、例えば、残基５０８〜５１１の配列のＲＲＲＲＲＲ（配列番号１０）による置換によって［すなわち、４個のアルギニン残基による５０９〜５１０位での典型的なアミノ酸配列（例えば、ＥＫ）の置換（すなわち、２個の置換及び２個の付加）、一方で５０８位及び５１１位では、大部分のＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質に存在するアルギニン残基がすでにあり、そのためこれらは通常、置換を必要としないが、文献における最終結果がアミノ酸配列ＲＲＲＲＲＲとして参照されることが多いため、本発明者らは本明細書におけるこの命名法を使用し続けた］、フューリン切断が野生型と比較して向上する。フューリン切断を向上させる他の変異が知られており、且つ使用することもできる。或いは、フューリン切断部位をリンカーで置換することが可能であり、その結果、フューリン切断はもはや必要なくなるが、タンパク質は、天然様の高次構造をとることになる（例えば、（Ｓｈａｒｍａ  ｅｔ  ａｌ，２０１５）及び（Ｇｅｏｒｇｉｅｖ  ｅｔ  ａｌ，２０１５）に記載される）。
【００６８】
本発明の特定の実施形態では、本発明のＨＩＶエンベロープタンパク質は更に、いわゆるＳＯＳＩＰ変異（好ましくは、５０１位及び６０５位におけるＣｙｓ、並びに５５９位におけるＰｒｏ）、並びにフューリン切断部位における配列変異、好ましくは、残基５０８〜５１１の配列のＲＲＲＲＲＲ（配列番号１０）による置換の両方を含む。特定の好ましい実施形態では、ＨＩＶ  Ｅｎｖは、指定のＳＯＳＩＰ及びフューリン切断部位変異の両方を含み、更に加えて、５５６位又は５５８位、最も好ましくは、５５６位及び５５８位の両方においてＰｒｏ残基を含む。
【００６９】
本発明の好ましい実施形態では、ＨＩＶエンベロープタンパク質のアミノ酸配列は、ＨＩＶエンベロープクレードＣコンセンサス又はＨＩＶエンベロープクレードＢコンセンサスなどの、コンセンサス配列である。特に好ましい実施形態では、ＨＩＶエンベロープタンパク質のアミノ酸配列は、ＨＩＶエンベロープクレードＣコンセンサスである。
【００７０】
本発明で使用することができる例示的なＨＩＶエンベロープタンパク質としては、ＨＩＶエンベロープクレードＣコンセンサス（配列番号２）及びＨＩＶエンベロープクレードＢコンセンサス（配列番号４）が挙げられる。これらのＨＩＶエンベロープクレードＣ及びクレードＢコンセンサス配列は、例えば、配列番号３に示されるＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ配列及び配列番号５に示されるＣｏｎＢ＿ＳＯＳＩＰ配列などの、上記のいわゆるＳＯＳＩＰ変異及び／又はフューリン切断部位における配列変異などの、例えば、安定性及び／又は三量体形成を亢進する追加の変異を含むことができる。
【００７１】
本発明で用いることのできる好ましいＨＩＶエンベロープタンパク質配列（「バックグラウンド」又は「親」分子として；ここで続いて６５８位はＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、又はＬｅｕに変異する）のその他の非限定的な例としては、例えば配列番号６、又は１６６位でＧｌｕからＡｒｇへの変異を有する配列番号６のアミノ酸配列を含む合成ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質が挙げられ、これらのいずれかは、任意選択的に上記で説明したＳＯＳＩＰ及び／又はフューリン切断部位変異を更に有する。別の非限定的な例は、配列番号７である。更なる非限定的な例は、配列番号８又は９のアミノ酸配列を有するものなどのモザイクＨＩＶエンベロープタンパク質である。
【００７２】
特定の実施形態では、親分子は、野生型ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質であって、１個又は好ましくは複数のアミノ酸が本明細書に記載の方法に従って矯正されている。このような親分子は、少なくとも１００、好ましくは少なくとも５００、好ましくは少なくとも１０００、好ましくは少なくとも１００００、好ましくは少なくとも２００００の野生型ＨＩＶ  Ｅｎｖ配列のコレクション中のＨＩＶ  Ｅｎｖ配列のうち７．５％未満、好ましくは２％未満の頻度で対応する位置において存在するアミノ酸残基で少なくとも１つの矯正変異を含み、矯正変異は、前記コレクション中のＨＩＶ  Ｅｎｖ配列のうち少なくとも１０％の頻度で対応する位置に存在するアミノ酸残基による置換である。好ましくは、前記置換は、前記コレクション中のＨＩＶ  Ｅｎｖ配列のうち少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％の頻度で対応する位置において存在するアミノ酸残基によるものである。好ましくは、前記置換は、前記コレクション中の最も高頻度に対応する位置で存在するアミノ酸残基によるものである。特定の好ましい実施形態では、前記親分子は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は少なくとも２０個のこのような矯正変異を含む。好ましくは、野生型Ｅｎｖタンパク質と比較して、前記コレクション中のＨＩＶ  Ｅｎｖ配列のうち２％未満の頻度で対応する位置に存在する、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は全てのアミノ酸残基が、親分子において矯正され、特定の実施形態では、野生型Ｅｎｖタンパク質と比較して、前記コレクション中のＨＩＶ  Ｅｎｖ配列のうち７．５％未満の頻度で対応する位置に存在する、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は全てのアミノ酸残基が、親分子において矯正される。特定の実施形態では、野生型ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質は、クレードＡ株、Ｂ株、又はＣ株に由来し、好ましくは、クレードＣ株に由来する。この矯正変異の結果として、親分子は、起源となる野生型株よりもＨＩＶ  Ｅｎｖコンセンサス配列に対してより高い類似を示すことになり、したがって、矯正されたアミノ酸残基は、本明細書では「コンセンサスアミノ酸」又は「コンセンサス残基」と称される場合がある。この矯正作用の結果、フォールディング、三量体形成、発現、及び／又は安定性に関して、結果として生じる親分子の特性が大幅に高められ、結果として生じる分子は本明細書において「矯正されたＥｎｖタンパク質」と称される。このような親分子への安定化変異の追加（例えば、（ｘｖｉ）（表１）及び／若しくは（ｉ）〜（ｖｉｉ）（表１）の１つ以上、並びに／又は任意選択により（ｖｉｉｉ）〜（ｘｖ）（表２））により、三量体の割合、三量体の収量、安定性、広域中和抗体の結合、フォールディングの１つ以上においてより一層の向上がもたらされ、野生型ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質に由来する結果として生じる分子は、本明細書において「矯正及び安定化されたＥｎｖタンパク質」と称される。安定化変異の導入が実際に、結果として生じる配列をコンセンサス配列からわずかに���換し、そのため、矯正及び安定化されたＨＩＶ  Ｅｎｖ分子の非常に高められた特性の実質的な結果は、２つの完全に異なる概念に基づくことが当業者には明らかであろう。
【００７３】
本発明の変異はＳＯＳＩＰ変異とは独立しており、加えて、本明細書で説明する変異は、いくつかの異なるＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質バックボーンにおいて機能することが示されているため、６５８位におけるアミノ酸を、アミノ酸Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、又はＬｅｕ、任意選択的に更に表１で説明する位置（ｉ）〜（ｖｉｉ）における指定アミノ酸と置換させる変異は、ＳＯＳＩＰ変異の存在しないＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質中でも用いることができ（例えば、Ｅｎｖコンセンサス配列、又は野生型ＨＩＶ単離株由来のＥｎｖタンパク質において）、また、その三量体形成を向上させる可能性もある。実際に、変異（ｉ）〜（ｖｉｉ）が、ＳＯＳ変異の不在下及びＩＰ変異の不在下で機能して、ＨＩＶ  Ｅｎｖの三量体形成特性を向上させることができることが示されている。
【００７４】
本発明の実施形態による組換え体ＨＩＶエンベロープタンパク質は、ＨＩＶエンベロープタンパク質のアミノ酸配列における特定された位置である種のアミノ酸残基を有するＨＩＶエンベロープタンパク質を含む。具体的には、Ｅｎｖタンパク質中の６５８位を変異させて、Ｅｎｖタンパク質の三量体形成を向上させることができ、位置のナンバリングは、ＨＩＶ−１単離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０におけるナンバリングに従うことが示されている。更に、任意選択的な実施形態では、エンベロープタンパク質において７つの位置が同定され、更にその同定された位置の各々では特定のアミノ酸残基が望ましい。エンベロープタンパク質配列におけるこれらの同定された位置としては、（ｉ）６５１位、（ｉｉ）６５５位、（ｉｉｉ）５３５位、（ｉｖ）５８９位、（ｖ）５７３位、（ｖｉ）２０４位、及び（ｖｉｉ）６４７位が挙げられ、位置のナンバリングは、ＨＩＶ−１単離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０におけるナンバリングに従う。本発明のＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質は、６５８位にＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、又はＬｅｕ、好ましくはＶａｌ又はＩｌｅ、より好ましくはＶａｌを有し、また任意選択的に指定位置（ｉ）〜（ｖｉｉ）のうちの少なくとも１つに、好ましくは指定位置（ｉ）〜（ｖｉｉ）のうちの少なくとも２つに、より好ましくは指定位置（ｉ）〜（ｖｉｉ）のうちの少なくとも３つに特定のアミノ酸残基を有する。同定された位置（ｉ）〜（ｖｉｉ）の各々において望ましい特定のアミノ酸残基を表１に示す。これらの選択肢の中で好ましい位置は、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖｉ）及び／又は（ｖｉｉ）である。これらの選択肢の中で特に好ましい位置は、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、及び／又は（ｖｉｉ）である。
【００７５】
【表１】
2020527046.tif 000002
【００７６】
６５８位においてＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、又はＬｅｕが、且つ任意選択的に、１つ以上のその他の指定位置において１つ以上の望ましいアミノ酸（又は指定アミノ酸）置換が導入されるＨＩＶエンベロープタンパク質のアミノ酸配列は、「バックボーンＨＩＶエンベロープ配列」又は「親ＨＩＶエンベロープ配列」と称される。例えば、配列番号３のＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ配列中の６５８位がＶａｌに変異される場合、ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ配列は「バックボーン」又は「親」配列であると考えられる。本発明の実施形態による新規の安定化変異を、単独で、又はいわゆるＳＯＳＩＰ変異及び／若しくはフューリン切断部位における変異などの他の変異と組み合わせて導入することができる「バックボーン」又は「親」配列として、任意のＨＩＶエンベロープタンパク質を使用することができる。バックボーンとして使用され得るＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質の非限定的な例としては、天然ＨＩＶ単離株由来のＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質、合成ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質、又はコンセンサスＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質が挙げられ、特定の非限定的な例においては、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、又は配列番号９を含むものが挙げられる（最後の４つの配列に関しては、天然Ｅｎｖタンパク質由来の追加的アミノ酸がＣ末端で追加されてもよく、続いて６５８位がＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、又はＬｅｕに変異するが、これは、ＨＩＶ−１単離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０におけるナンバリングに従う６５８位の前に終端する任意のＥｎｖ配列に対して行うことができる）。
【００７７】
本発明の特定の実施形態によれば、ＨＩＶエンベロープタンパク質は、６５８位でＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、又はＬｅｕを有することに加えて、任意選択的に、６５１位、６５５位、５３５位、５８９位、５７３位、２０４位、及び６４７位からなる群から選択される指定位置のうち少なくとも１つで、表１の１、２、３、４、５、６、又は７つの位置での指定アミノ酸残基などの指定アミノ酸残基を有することができる。好ましくは、ＨＩＶエンベロープタンパク質は、１、２、又は３つの指定位置で置換され、より好ましくは、ＨＩＶエンベロープタンパク質は、少なくとも２つの指定位置で置換される。よりいっそう好ましくは、ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質は、３つの指定位置、４つの指定位置、５つの指定位置、６つの指定位置、又は７つ全ての指定位置で置換される。好ましくは、ＨＩＶエンベロープタンパク質は、少なくとも２つの指定位置で指定アミノ酸残基を含有する。より好ましくは、ＨＩＶエンベロープタンパク質は、３つの指定位置で指定アミノ酸残基を含有する。他の好ましい実施形態では、ＨＩＶエンベロープタンパク質は、４、５、６、又は７つ全ての指定位置で指定アミノ酸残基を含有する。
【００７８】
複数の位置で指定アミノ酸を有するＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質の実施形態（ＨＩＶ−１単離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０におけるナンバリングに従ってナンバリングされた位置、続いてその位置に存在する残基の１文字のアミノ酸コード、１つのＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質実施形態内の位置は読点によって隔てられ［例えば、６５５位にＩｌｅ、６５８位にＶａｌを有するＥｎｖタンパク質の実施形態は、６５５Ｉ、６５８Ｖと記載される］、一方で異なる実施形態（すなわち、異なるＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質）はセミコロンで区切られている）としては以下のものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７９】
２つの位置で指定アミノ酸を有するＥｎｖタンパク質の場合：６５１Ｆ、６５８Ｖ；６５１Ｆ、６５８Ｉ；６５１Ｆ、６５８Ｆ；６５１Ｆ、６５８Ｍ；６５１Ｆ、６５８Ａ；６５１Ｆ、６５８Ｌ；６５５Ｉ、６５８Ｖ；６５５Ｉ、６５８Ｉ；６５５Ｉ、６５８Ｆ；６５５Ｉ、６５８Ｍ；６５５Ｉ、６５８Ａ；６５５Ｉ、６５８Ｌ；６５５Ｆ、６５８Ｖ；６５５Ｆ、６５８Ｉ；６５５Ｆ、６５８Ｆ；６５５Ｆ、６５８Ｍ；６５５Ｆ、６５８Ａ；６５５Ｆ、６５８Ｌ；５３５Ｎ、６５８Ｖ；５３５Ｎ、６５８Ｉ；５３５Ｎ、６５８Ｆ；５３５Ｎ、６５８Ｍ；５３５Ｎ、６５８Ａ；５３５Ｎ、６５８Ｌ；５８９Ｖ、６５８Ｖ；５８９Ｖ、６５８Ｉ；５８９Ｖ、６５８Ｆ；５８９Ｖ、６５８Ｍ；５８９Ｖ、６５８Ａ；５８９Ｖ、６５８Ｌ；５８９Ｉ、６５８Ｖ；５８９Ｉ、６５８Ｉ；５８９Ｉ、６５８Ｆ；５８９Ｉ、６５８Ｍ；５８９Ｉ、６５８Ａ；５８９Ｉ、６５８Ｌ；５７３Ｆ、６５８Ｖ；５７３Ｆ、６５８Ｉ；５７３Ｆ、６５８Ｆ；５７３Ｆ、６５８Ｍ；５７３Ｆ、６５８Ａ；５７３Ｆ、６５８Ｌ；２０４Ｉ、６５８Ｖ；２０４Ｉ、６５８Ｉ；２０４Ｉ、６５８Ｆ；２０４Ｉ、６５８Ｍ；２０４Ｉ、６５８Ａ；２０４Ｉ、６５８Ｌ；６４７Ｆ、６５８Ｖ；６４７Ｆ、６５８Ｉ；６４７Ｆ、６５８Ｆ；６４７Ｆ、６５８Ｍ；６４７Ｆ、６５８Ａ；６４７Ｆ、６５８Ｌ。これらの実施形態はそれぞれ、野生型単離株、又はＳＯＳＩＰ変異体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質、又はコンセンサスＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質、又は合成ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質などの任意のＨＩＶ  Ｅｎｖ配列中に存在することができる。これらの実施形態はそれぞれ、本発明に従って、その他の指定位置（ｉ）〜（ｖｉｉ）のうちの１つの第２の位置で好ましいアミノ酸のうちの１つと組み合わせることができる。指定位置（ｉ）〜（ｖｉｉ）の２つの位置で好ましいアミノ酸残基を有するこうした実施形態は、他の指定位置（ｉ）〜（ｖｉｉ）のうちの１つの第３の位置で好ましいアミノ酸の１つと組み合わせることができる。指定位置（ｉ）〜（ｖｉｉ）の３つの位置で好ましいアミノ酸残基を有するこうした実施形態は、他の指定位置（ｉ）〜（ｖｉｉ）のうちの１つの第４の位置で好ましいアミノ酸の１つと組み合わせることができる。指定位置（ｉ）〜（ｖｉｉ）の４つの位置で好ましいアミノ酸残基を有するこうした実施形態は、他の指定位置（ｉ）〜（ｖｉｉ）のうちの１つの第５の位置で好ましいアミノ酸の１つと組み合わせることができる。指定位置（ｉ）〜（ｖｉｉ）の５つの位置で好ましいアミノ酸残基を有するこうした実施形態は、他の指定位置（ｉ）〜（ｖｉｉ）のうちの１つの第６の位置で好ましいアミノ酸の１つと組み合わせることができる。指定位置（ｉ）〜（ｖｉｉ）の６つの位置で好ましいアミノ酸残基を有するこうした実施形態は、他の指定位置（ｉ）〜（ｖｉｉ）のうちの１つの第７の位置で好ましいアミノ酸の１つと組み合わせることができ、その結果、Ｅｎｖタンパク質は、７つ全ての位置（ｉ）〜（ｖｉｉ）で好ましいアミノ酸を有する。位置（ｖ）〜（ｖｉｉ）の２、３、４、５、６、又は７つで好ましいアミノ酸を有するこれらの更なる実施形態のいずれかは、野生型単離株、ＳＯＳＩＰバリアント、コンセンサ���ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質、合成ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質などに由来するものなどの任意のＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質中に存在することができる。
【００８０】
位置（ｉ）〜（ｖｉｉ）のうち２つで指定アミノ酸を含むＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質の一部の非限定的な例は、６５８Ｖ、６５１Ｆ、６５５Ｉ；６５８Ｉ、６５１Ｆ、６５５Ｉ；６５８Ｖ、６５１Ｆ、５３５Ｎ；６５８Ｉ、６５１Ｆ、５３５Ｎ；６５８Ｖ、６５１Ｆ、５８９Ｖ；６５８Ｉ、６５１Ｆ、５８９Ｖ；６５８Ｖ、６５１Ｆ、２０４Ｉ；６５８Ｉ、６５１Ｆ、２０４Ｉ；６５８Ｖ、６５１Ｆ、６４７Ｆ；６５８Ｉ、６５１Ｆ、６４７Ｆ；６５８Ｖ、６５５Ｉ、５３５Ｎ；６５８Ｉ、６５５Ｉ、５３５Ｎ；６５８Ｖ、６５５Ｉ、５８９Ｖ；６５８Ｉ、６５５Ｉ、５８９Ｖ；６５８Ｖ、６５５Ｉ、２０４Ｉ；６５８Ｉ、６５５Ｉ、２０４Ｉ；６５８Ｖ、６５５Ｉ、６４７Ｆ；６５８Ｖ、６５５Ｉ、６４７Ｆ；６５８Ｖ、５３５Ｎ、５８９Ｖ；６５８Ｉ、５３５Ｎ、５８９Ｖ；６５８Ｖ、５３５Ｎ、２０４Ｉ；６５８Ｉ、５３５Ｎ、２０４Ｉ；６５８Ｖ、５３５Ｎ、６４７Ｆ；６５８Ｉ、５３５Ｎ、６４７Ｆ；６５８Ｖ、５８９Ｖ、２０４Ｉ；６５８Ｉ、５８９Ｖ、２０４Ｉ；６５８Ｖ、５８９Ｖ、６４７Ｆ；６５８Ｉ、５８９Ｖ、６４７Ｆ；６５８Ｖ、２０４Ｉ、６４７Ｆ；６５８Ｉ、２０４Ｉ、６４７Ｆである。
【００８１】
位置（ｉ）〜（ｖｉｉ）のうち少なくとも２つで好ましいアミノ酸を有する特に好ましいＥｎｖタンパク質のいくつかの例としては、６５８Ｖ、６５１Ｆ、６５５Ｉ；６５８Ｉ、６５１Ｆ、６５５Ｉ；６５８Ｖ、６５１Ｆ、５３５Ｎ；６５８Ｉ、６５１Ｆ、５３５Ｎ；６５８Ｖ、６５１Ｆ、５８９Ｖ；６５８Ｉ、６５１Ｆ、５８９Ｖ；６５８Ｖ、６５５Ｉ、５３５Ｎ；６５８Ｉ、６５５Ｉ、５３５Ｎ；６５８Ｖ、６５５Ｉ、５８９Ｖ；６５８Ｉ、６５５Ｉ、５８９Ｖが挙げられる。
【００８２】
位置（ｉ）〜（ｖｉｉ）のうち少なくとも３つで好ましいアミノ酸を有する好ましいＥｎｖタンパク質のいくつかの例としては、６５８Ｖ、６５１Ｆ、６５５Ｉ、５３５Ｎ；６５８Ｖ、６５５Ｉ、５８９Ｖ、５３５Ｎ；６５８Ｖ、６５５Ｉ、５７３Ｆ、５８９Ｖ；６５８Ｖ、６５５Ｉ、２０４Ｉ、５８９Ｖ；６５８Ｖ、６５１Ｆ、６５５Ｉ、６４７Ｆが挙げられる。
【００８３】
位置（ｉ）〜（ｖｉｉ）のうち少なくとも４つで好ましいアミノ酸残基を有する好ましいＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質のいくつかの例としては：６５１Ｆ、６５５Ｉ、６４７Ｆ、Ｉ５３５Ｎ；６５１Ｆ、６５５Ｉ、５７３Ｆ、５８９Ｖが挙げられる。位置（ｉ）〜（ｖｉｉ）のうち少なくとも４つで指定アミノ酸残基を含むＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質の好ましい例としては、５３５Ｎ、５８９Ｖ、６５１Ｆ、６５５Ｉが挙げられる。このようなＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質の非限定的な例は、配列番号２０、２２、２４、２６、２７、２８、２９、３０、３１、及び３２において提供される。好ましいこのようなＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質は、クレードＣのＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質又はクレードＡのＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質であり、最も好ましくは、クレードＣのＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質である。特定の実施形態では、前記ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質は更に５８８Ｅを含み、すなわち、これは少なくとも５３５Ｎ、５８８Ｅ、５８９Ｖ、６５１Ｆ、６５５Ｉを含む。こうしたＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質の非限定的な例は、配列番号２０、２４、２６、２７、２８、２９、３０、３１、及び３２において提供される。特定の実施形態では、前記ＨＩＶ  Ｅｎｖは更に５５６Ｐを含み、すなわち、これは少なくとも５３５Ｎ、５５６Ｐ、５８９Ｖ、６５１Ｆ、６５５Ｉ、又は少なくとも５３５Ｎ、５５６Ｐ、５８８Ｅ、５８９Ｖ、６５１Ｆ、６５５Ｉを含む。こうしたＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質の非限定的な例は、配列番号２２、２４、２６、２７、２９、３０、３１、及び３２において提供される。これらの例示的な実施形態の分子の各々は、６５８位においてアミノ酸をＶ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ａ、又はＬ、好ましくはＶに変異させることによって更に修飾されて、本発明の実施形態をもたらすことができる（６５８位においてアミノ酸が既にＶである配列番号２９、３０、及び３１は除く）。
【００８４】
一実施形態では、本発明の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質は、６５８位にＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、又はＬｅｕ、好ましくはＶａｌ又はＩｌｅ、好ましくはＶａｌを有するＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質のアミノ酸配列、並びに：
（ｉ）６５１位におけるＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、又はＴｒｐ、好ましくはＰｈｅ；
（ｉｉ）６５５位におけるＰｈｅ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、又はＴｒｐ、好ましくはＩｌｅ；
（ｉｉｉ）５３５位におけるＡｓｎ又はＧｌｎ、好ましくはＡｓｎ；
（ｉｖ）５８９位におけるＶａｌ、Ｉｌｅ、又はＡｌａ、好ましくはＶａｌ；
（ｖ）５７３位におけるＰｈｅ又はＴｒｐ、好ましくはＰｈｅ；
（ｖｉ）２０４位におけるＩｌｅ；及び
（ｖｉｉ）６４７位におけるＰｈｅ、Ｍｅｔ、又はＩｌｅ、好ましくはＰｈｅ；
からなる群から選択される指定位置のうち少なくとも１つに指定アミノ酸残基を含む。
【００８５】
例えば、組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質は、６５８位でＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、又はＬｅｕ、及び６５１位でＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、又はＴｒｐのうちの１つ、並びに任意選択的に、追加の指定位置で追加の指定アミノ酸残基を有することができる。好ましくは、６５８位におけるＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、若しくはＬｅｕ、又は（ｉ）〜（ｖｉｉ）のアミノ酸のうち少なくとも１つがアミノ酸置換によって組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質に導入される。例えば、組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質を、６５８位においてＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、若しくはＬｅｕを含まないＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質、又は上記の（ｉ）〜（ｖｉｉ）のアミノ酸残基を全く含有しないか、若しくは１つだけ含有するＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質から生成することができ、その結果、指定アミノ酸残基の全て又は１つ以上が、アミノ酸置換によって組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質に導入される。
【００８６】
特定の実施形態では、本発明の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質は更に、（ｖｉｉｉ）５８８位においてＧｌｎ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、又はＰｈｅを含み、Ｇｌｎ又はＧｌｕが好ましい。
【００８７】
上記の置換が導入されるＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質のアミノ酸配列は、例えば、ＨＩＶクレードＡ、クレードＢ、クレードＣなどに由来する天然に存在する配列；モザイク配列；コンセンサス配列、例えば、クレードＢ又はクレードＣコンセンサス配列；合成配列；又はその任意の派生体若しくは断片などの、本開示の観点から当業者に既知の任意のＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質であり得る。本発明の特定の実施形態では、ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質のアミノ酸配列は、例えば、いわゆるＳＯＳＩＰ変異、及び／又はフューリン切断部位における変異などの追加の変異を含む。
【００８８】
特定の一実施形態では、ＨＩＶ  Ｅｎｖバックボーンタンパク質は、５０１位及び６０５位のＣｙｓ；５５９位のＰｒｏからなる群から選択される少なくとも１つの変異を含むＳＯＳＩＰ変異体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質である。好ましい実施形態では、ＳＯＳＩＰ変異体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質は、５０１位及び６０５位においてＣｙｓ、及び５５９位においてＰｒｏを含む。この実施形態によれば、組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質は、ＳＯＳＩＰ変異体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質のアミノ酸配列と、６５８位においてこの位置にＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、又はＬｅｕ、好ましくはＶａｌ又はＩｌｅ、最も好ましくはＶａｌをもたらすアミノ酸置換と、任意選択的に、指定位置のうち少なくとも１つに、
（ｉ）６５１位におけるＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、若しくはＴｒｐ、好ましくはＰｈｅ；
（ｉｉ）６５５位におけるＰｈｅ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、若しくはＴｒｐ、好ましくはＩｌｅ；
（ｉｉｉ）５３５位におけるＡｓｎ若しくはＧｌｎ、好ましくはＡｓｎ；
（ｉｖ）５８９位におけるＶａｌ、Ｉｌｅ、若しくはＡｌａ、好ましくはＶａｌ；
（ｖ）５７３位におけるＰｈｅ若しくはＴｒｐ、好ましくはＰｈｅ；
（ｖｉ）２０４位におけるＩｌｅ；及び
（ｖｉｉ）６４７位におけるＰｈｅ、Ｍｅｔ、若しくはＩｌｅ、好ましくはＰｈｅからなる群から選択される指定アミノ酸残基による１つ以上の更なるアミノ酸置換と、を含む。
【００８９】
ＳＯＳＩＰ変異体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質は更に、配列番号１０による６０８〜５１１位での置換などの、フューリン切断部位における変異を含むことができる。
【００９０】
特定の実施形態では、本発明の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質は、ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質のアミノ酸配列と、６５８位においてこの位置にＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、又はＬｅｕ、好ましくはＶａｌ又はＩｌｅ、最も好ましくはＶａｌをもたらすアミノ酸置換と、任意選択的に、指定位置のうち少なくとも１つに、
（ｉ）６５１位におけるＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、若しくはＴｒｐ、好ましくはＰｈｅ；
（ｉｉ）６５５位におけるＰｈｅ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、若しくはＴｒｐ、好ましくはＩｌｅ；
（ｉｉｉ）５３５位におけるＡｓｎ若しくはＧｌｎ、好ましくはＡｓｎ；
（ｉｖ）５８９位におけるＶａｌ、Ｉｌｅ、若しくはＡｌａ、好ましくはＶａｌ；
（ｖ）５７３位におけるＰｈｅ若しくはＴｒｐ、好ましくはＰｈｅ；
（ｖｉ）２０４位におけるＩｌｅ；及び
（ｖｉｉ）６４７位におけるＰｈｅ、Ｍｅｔ、若しくはＩｌｅ、好ましくはＰｈｅからなる群から選択される指定アミノ酸残基による１つ以上の更なるアミノ酸置換と、を含み、
ここでＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質は、
（１）例えば、配列番号２、３、４、又は５のアミノ酸配列を含む、クレードＣ又はクレードＢコンセンサス配列などの、ＨＩＶ  Ｅｎｖコンセンサス配列；
（２）合成ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質からなる群から選択される。
【００９１】
好ましくは、組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質は、ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質のアミノ酸配列、及び２つの位置又は３つの位置などの、上の（ｉ）〜（ｖｉｉ）からなる群から選択される指定位置の少なくとも２つでの指定アミノ酸残基によるアミノ酸置換を含む。しかしながら、組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質は、１、２、３、４、５、６又は７つの指定位置などの、指定位置（ｉ）〜（ｖｉｉ）の１つ以上での指定アミノ酸残基によるアミノ酸置換を含むことができる。
【００９２】
特定の一実施形態では、ＨＩＶ  Ｅｎｖバックボーンタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なアミノ酸配列を含むＨＩＶ  ＥｎｖコンセンサスクレードＣである。好ましくは、配列番号２のＨＩＶコンセンサスクレードＣ配列は、更に、いわゆるＳＯＳＩＰ変異、すなわち、５０１位及び６０５位のＣｙｓ、並びに５５９位のＰｒｏを含み、より好ましくは、更に、いわゆるＳＯＳＩＰ変異、及び例えば、５０８〜５１１位での配列番号１０による置換などのフューリン切断部位における変異を含む。特に好ましい実施形態では、ＨＩＶ  Ｅｎｖバックボーンタンパク質は、配列番号３に示す配列、又はこれと少なくとも９５％同一の配列を含み、好ましくは５０１、５５９、６０５、及び５０８〜５１１位のアミノ酸は配列番号１０によって置換され、配列番号３と比べると変異されない。
【００９３】
別の特定の実施形態では、ＨＩＶ  Ｅｎｖバックボーンタンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なアミノ酸配列を含むＨＩＶ  ＥｎｖコンセンサスクレードＢである。好ましくは、配列番号４のＨＩＶコンセンサスクレードＢ配列は更に、いわゆるＳＯＳＩＰ変異、すなわち、５０１位及び６０５位のＣｙｓ、並びに５５９位のＰｒｏを含み、より好ましくは更に、いわゆるＳＯＳＩＰ変異、及び例えば、５０８〜５１１位での配列番号１０による置換などのフューリン切断部位における変異を含む。特に好ましい実施形態では、ＨＩＶ  Ｅｎｖバックボーンタンパク質は、配列番号５に示す配列、又はこれと少なくとも９５％同一の配列を含み、好ましくは５０１、５５９、６０５、及び５０８〜５１１位のアミノ酸は配列番号１０によって置換され、配列番号５と比べると変異されない。
【００９４】
更に別の特定の実施形態では、ＨＩＶ  Ｅｎｖバックボーンタンパク質は、例えば、（ａ）：配列番号６のアミノ酸配列、（ｂ）：１６６位でＧｌｕからＡｒｇへの変異を有する配列番号６、（ｃ）配列番号７、又は（ｄ）配列番号８若しくは９を含む合成ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質であり、（ａ）、（ｂ）、又は（ｄ）は、任意選択的に、上記に記載した更なるＳＯＳＩＰ（５０１Ｃ、６０５Ｃ、５５９Ｐ）及び／又はフューリン切断部位変異（５０８〜５１１ＲＲＲＲＲＲ）を有する。
【００９５】
更に他の特定の実施形態では、ＨＩＶ  Ｅｎｖバックボーンタンパク質は、任意選択的に本明細書に記載の方法に従って配列を矯正する変異を含む、野生型クレードＡ又はクレードＣのＨＩＶウイルス由来のＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質である。
【００９６】
同時に置換することができるＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質における（ｉ）〜（ｖｉｉ）の２つの位置の例示的な組み合わせとしては、例えば、二重変異体Ｉ５３５Ｎ、Ｄ５８９Ｖ；Ｉ５３５Ｎ、Ｅ６４７Ｆ；及びＤ５８９Ｖ、Ｋ６５５Ｉなどにおける、残基５３５、５８９；５３５、６４７；及び５８９、６５５が挙げられる。他の二重変異体としては、Ｋ６５５Ｉ、Ｉ５３５Ｎ；Ｎ６５１Ｆ、Ｋ６５５Ｉ；及びＫ６５５Ｉ、Ｉ５７３Ｆが挙げられる。同時に置換することができるＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質における３つの位置の例示的な組み合わせとしては、例えば、三重変異体Ｉ５３５Ｎ、Ｄ５８９Ｖ、Ｋ６５５Ｉなどにおける、５３５、５８９、６５５が挙げられる。他の三重変異体としては、Ｋ６５５Ｉ、Ｄ５８９Ｖ、Ｉ５７３Ｆ；及びＫ６５５Ｉ、Ｎ６５１Ｆ、Ｉ５３５Ｎが挙げられる。
【００９７】
本発明の特定の実施形態では、本発明の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質（すなわち、６５８位にＶ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ａ、又はＬ、及び任意選択的に上記の位置（ｉ）〜（ｖｉｉ）に１つ以上の指定アミノ酸を有する）は更に、下の表２に示される（ｖｉｉｉ）５８８位、（ｉｘ）６４位若しくは６６位、（ｘ）３１６位、（ｘｉ）２０１位／４３３位、（ｘｉｉ）５５６位若しくは５５８位、若しくは５５６位及び５５８位、（ｘｉｉｉ）５４８〜５６８位、（ｘｉｖ）５６８位、５６９位及び６３６位、又は（ｘｖ）３０２位、５１９位若しくは５２０位からなる群から選択される１つ以上の追加の指定位置で、指定アミノ酸残基を（例えば、置換を介して）含むことができる。これらのアミノ酸置換のうち特定のもの（例えば、（ｖｉｉｉ））は、上記の変異（ｉ）〜（ｖｉｉ）（の組み合わせ）と非常に良好に組み合わせられることが、本発明者らによって見出された。これらのアミノ酸置換のうち他のものは、文献において以前に報告されていた。例えば、Ｄｅ  Ｔａｅｙｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｅｌｌ（２０１５）１６３（７），１７０２−１５）は、Ｅ６４Ｋ及びＴ３１６Ｗの二重変異を有するＨＩＶエンベロープタンパク質、並びに６６Ｒ変異を有するＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質を報告し；Ｋｗｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０１５）２２（７）５２２−３１）は、Ｉ２０４Ｃ、Ａ４３３Ｃのジスルフィド置換を有するＨＩＶエンベロープタンパク質を報告し；Ｇｕｅｎａｇａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２０１７）４６，７９２−８０３）は、Ｌ５６８Ｇ、Ｔ５６９Ｇ又はＮ６３６Ｇ、及びＮ３０２Ｙ、Ｆ５１９Ｒ、Ｌ５２０Ｒの三重置換を有するＨＩＶエンベロープタンパク質を報告した。しかしながら、本発明者らの知る限りでは、これらの過去に説明された変異は、本明細書で説明される新規な置換すなわち、６５８位におけるＶ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ａ、若しくはＬ、又は例えば表１の項（ｉ）〜（ｖｉｉ）に列記される置換のいずれとも組み合わせて説明されていない。本発明のアミノ酸置換と組み合わせられたこれらのアミノ酸変異は更に、三量体の収量及び／又は三量体形成の割合を増加させることができる。これらのアミノ酸置換は、６５８位における指定アミノ酸残基による置換に加えて、本明細書で説明する組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質のいずれにも導入することができ、且つ任意選択的に、表１で説明する指定位置の１つ以上における指定アミノ酸残基による更なる置換を有する。
【００９８】
【表２】
2020527046.tif 000003
【００９９】
本発明の指定位置で同定される置換［６５８位におけるＶ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ａ、又はＬ、及び任意選択的に（ｉ）〜（ｖｉｉ）のいずれか、例えば、表１を参照］は、天然の配列に存在しないか、又はまれにしか存在せず、過去に報告されたＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質配列における組み合わせにおいては見出されず、且つ過去にＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質の三量体形成の向上、三量体の収量の向上、及び／又は三量体の安定性の向上をもたらすと示唆されなかった。表２における変異（ｉｘ）〜（ｘｉ）（他者により過去報告された）は全て、三量体特異性抗体ＰＧＴ１４５が結合するｇｐ１２０領域にある。これらの変異は、尖部（分子の先端にある）で閉じた三量体を保持する。置換（ｘｉｉ）及び（ｘｉｉｉ）は全てｇｐ４１のＨＲ１にある。２０４位を除いて、表１における本発明の変異は全て、ＨＲ１の外部ではあるが、ｇｐ４１領域（分子の下端）にある。明らかに、過去に記載された変異は、ＰＧＴ１４５の結合によって測定される、閉じた尖部を有する三量体形成に対するその驚くべき効果はもとより、本発明の変異の導入に関するいずれの示唆も提供しなかった。表２の点変異（ｖｉｉｉ）〜（ｘｉｉ）を除いて、Ｅｎｖタンパク質のＨＲ１ループ（ＨＸＢ２単離株のｇｐ１６０に従うナンバリングによる野生型配列におけるアミノ酸残基５４８〜５６８）を、７〜１０のアミノ酸を有するより短く且つ可動性の低いループ、好ましくは、例えば（配列番号１２〜１７）のいずれか１つから選択される配列を有する８のアミノ酸のループによって置換することも可能であり、例えば、ＨＲ１ループを置換するこうしたより短いループなどを説明したＫｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ（Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．２０１６  Ｊｕｎ  ２８；７：１２０４０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１２０４０）を参照されたい。６５８位に（Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ａ、又はＬ）、及び任意選択的に指定位置（ｉ）〜（ｖｉｉ）のうちの少なくとも１つに指定アミノ酸残基を更に有するこうしたＥｎｖバリアントも本発明の実施形態である。本発明の特定の実施形態では、（ｖｉｉｉ）〜（ｘｉｉｉ）に列記される変異を、本発明のＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質、すなわち６５８位でＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、又はＬｅｕを有するＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質に追加することができる。更なる実施形態では、これらは、位置（ｉ）〜（ｖｉｉ）における指定アミノ酸の１つ以上への変異と組み合わせてもよい。また、群（ｖｉｉｉ）〜（ｘｉｉｉ）内での組み合わせを行うことができ、非限定的な例は、（６５８位でＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、又はＬｅｕ、及び任意で更に（ｉ）〜（ｖｉｉ）のうちの少なくとも１つの変異を有することに加えて）（ｖｉｉｉ）及び（ｘｉｉ）における変異（例えば６５８Ｖ、Ａ５５６Ｐ、Ｋ５８８Ｅ）の組み合わせである。位置（ｖｉｉｉ）〜（ｘｉｉ）のうちの１つにおける指定アミノ酸を有するＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質のいくつかの非限定的な例は、６５８Ｖ、５８８Ｅ；６５８Ｖ、５８８Ｑ；６５８Ｖ、５５６Ｐ；６５８Ｖ、５５８Ｐ；６５８Ｖ、２０１Ｃ−４３３Ｃ；６５８Ｖ；６３６Ｇ；６５８Ｖ、５６８Ｇ；６５８Ｖ、５６９Ｇ；６５８Ｖ、５１９Ｒ；６５８Ｖ，���２０Ｒである。
【０１００】
ここでも、これらの実施形態のうちのいずれも、任意のＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質、例えば野生型単離株、コンセンサスＥｎｖ、合成Ｅｎｖタンパク質、ＳＯＳＩＰ変異体Ｅｎｖタンパク質などの中にあってよい。
【０１０１】
指定位置におけるアミノ酸のいくつかの好ましい組み合わせとしては、６５５Ｉ、５８９Ｖ、５７３Ｆ、６５１Ｆ、５８８Ｅ、５３５Ｎ、２０４Ｉ；５５６Ｐ、６５５Ｉ、５３５Ｎ、５７３Ｆ、５８９Ｖ、２０４Ｉ、５８８Ｑ；２０４Ｉ、５３５Ｎ、５５６Ｐ、５８８Ｅ、５８９Ｖ、６５１Ｆ、６５５Ｉ；５３５Ｎ、５５６Ｐ、５８９Ｖ、６５１Ｆ、６５５Ｉ；及び５３５Ｎ、５５６Ｐ、５８８Ｅ、５８９Ｖ、６５１Ｆ、６５５Ｉが挙げられ、これらのそれぞれが、６５８位においてＶ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ａ、又はＬから選択されるアミノ酸残基と組み合わせられてよい。
【０１０２】
特定の好ましい実施形態では、ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質は、配列番号２０、２２、２４、２６、２７、２８、２９、３０、３１及び３２のいずれか１つと少なくとも９５％同一、好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％同一、好ましくは１００％同一である配列を含む。％同一性の決定については、好ましくは、表１及び２の位置（ｉ）〜（ｘｖ）、並びに好ましくは、５０１位、５５９位及び６０５位もまた考慮されない。好ましくは、これらの位置のアミノ酸残基は、それぞれ配列番号２０、２２、２４、２６、２７、２８、２９、３０、３１又は３２の配列におけるものであり、ただし、配列番号２０、２２、２４、２６、２７、２８、及び３２の場合、６５８位のアミノ酸は、この位置で得られるアミノ酸が、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、又はＬｅｕ、好ましくはＶａｌ又はＩｌｅ、最も好ましくはＶａｌであるように変異（又は追加）される。本明細書に記載の表１の（ｉ）〜（ｖｉｉ）及び／又は表２の（ｖｉｉｉ）〜（ｘｖ）から選択される単独の変異又は変異の組み合わせのいずれかにおいて、Ｅｎｖタンパク質の三量体の割合及び三量体の収量が強く増大することが見出された。
【０１０３】
本発明の実施形態によれば、組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質は、６５８位におけるＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、又はＬｅｕを有しないが、更に同一である、ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質と比較して、（ａ）三量体形成の割合の向上、及び（ｂ）三量体の収量の向上のうちの少なくとも１つを有する。
【０１０４】
本明細書で使用するとき、「三量体形成の割合の向上」とは、ＨＩＶエンベロープタンパク質のバックボーン配列が６５８位にＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、又はＬｅｕを含有する場合に、ＨＩＶエンベロープ配列のバックボーン配列が６５８位にＬｙｓ残基を含有する場合に形成される三量体の割合と比較してより高い割合の三量体が形成されることを意味する（この位置におけるＨＩＶ−１Ｅｎｖの天然のクレードＣバリアントの大部分に存在するアミノ酸；全ての株が検討される場合はＧｌｎがこの位置における最も高頻度に存在するアミノ酸であり、好ましくは、ＨＩＶエンベロープタンパク質のバックボーン配列が６５８位にＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、又はＬｅｕを含有する場合に、ＨＩＶエンベロープ配列のバックボーン配列が６５８位にＧｌｎ残基を含有する場合に形成される三量体の割合と比較してより高い三量体形成の割合もまた形成される）。より一般的には、「三量体形成の割合の向上」は、ＨＩＶエンベロープタンパク質のバックボーン配列が表１及び／又は表２に記載されるアミノ酸置換の１つ以上を含有する場合に、ＨＩＶエンベロープ配列のバックボーン配列がこのようなアミノ酸置換を含有しない場合に形成される三量体の割合と比較して、より高い割合の三量体が形成されることを意味する。本明細書で使用するとき、「三量体の収量の向上」とは、ＨＩＶエンベロープタンパク質のバックボーン配列が６５８位にＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、又はＬｅｕを含有する時に、ＨＩＶエンベロープ配列のバックボーン配列が６５８位にＬｙｓ残基を含有する時に得られる合計量の三量体形態のエンベロープタンパク質と比較して、より高い合計量の三量体形態のエンベロープタンパク質が得られることを意味する。より一般的には、「三量体の収量の向上」とは、ＨＩＶエンベロープタンパク質のバックボーン配列が表１及び／又は表２に記載されるアミノ酸置換の１つ以上を含有する場合に、ＨＩＶエンベロープ配列のバックボーン配列がこのようなアミノ酸置換を含有しない場合に得られる合計量の三量体形態のエンベロープタンパク質と比較して、より高い合計量の三量体形態のエンベロープタンパク質が得られることを意味する。
【０１０５】
三量体形成は、三量体形態のＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質に特異的に結合する抗体を用いる抗体結合アッセイによって測定することができる。三量体形態を検出するのに使用することができる三量体特異性抗体の例としては、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＰＧＴ１４５、ＰＧＤＭ１４００、ＰＧ１６、及びＰＧＴ１５１が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、三量体特異性抗体は、ｍＡｂ  ＰＧＴ１４５である。本開示の観点において当該技術分野で知られる任意の抗体結合アッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＡｌｐｈａＬＩＳＡなどを使用して、本発明の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質の三量体形成の割合を測定することができる。
【０１０６】
特定の実施形態では、三量体形成はＡｌｐｈａＬＩＳＡによって測定される。ＡｌｐｈａＬＩＳＡはビーズをベースにした近接アッセイであり、ドナービーズの高エネルギー放射によって生成した一重項酸素分子が、ドナービーズに対しておよそ２００ｎｍ以内の距離にあるアクセプタービーズに移動される。一重項酸素分子のアクセプタービーズへの移動により、その後検出され得る化学発光シグナルをもたらす次々と起こる一連の化学反応を開始させる（Ｅｇｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｃｈｅｍ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２００８，２５（１）：２−１０）。例えば、Ｆｌａｇ−Ｈｉｓタグで標識された組換え体ＨＩＶエンベロープタンパク質は、三量体特異性ｍＡｂ、三量体特異性ｍＡｂに結合する抗体にコンジュゲートされたドナービーズ、ニッケルにコンジュゲートされたドナービーズ、抗Ｈｉｓ抗体にコンジュゲートされたアクセプタービーズ、及び抗Ｆｌａｇ抗体にコンジュゲートされたアクセプタービーズとともにインキュベートされ得る。形成された三量体の量は、三量体特異性ｍＡｂに結合する抗体にコンジュゲートされたドナービーズと抗Ｈｉｓ抗体にコンジュゲートされたアクセプタービーズの対から生成される化学発光シグナルを測定することによって決定され得る。発現されたＨＩＶエンベロープタンパク質の総量は、ニッケルにコンジュゲートされたドナービーズと抗Ｆｌａｇにコンジュゲートされたアクセプタービーズの対から生成される化学発光シグナルを測定することによって決定され得る。例えば、三量体及び発現された総エンベロープタンパク質の量は、実施例３に詳述されるようなＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイによって測定され得る。三量体形成の割合は、形成された三量体の量を発現されたエンベロープタンパク質の総量で割ることによって計算され得る。
【０１０７】
形成された三量体の量及び発現されたエンベロープタンパク質の総量はまた、三量体形態をＨＩＶエンベロープタンパク質の他の形態、例えば、単量体形態から分離することができるクロマトグラフィーの手法を用いて決定され得る。使用することができるこのような手法の例としては、サイズ排除クロマトグラフィー多角度光散乱（ＳＥＣ−ＭＡＬＳ）が挙げられるが、これに限定されない。特定の実施形態によれば、三量体形成の割合は、ＳＥＣ−ＭＡＬＳを用いて決定される。特定の実施形態によれば、三量体の収量は、ＳＥＣ−ＭＡＬＳを用いて決定される。
【０１０８】
本発明は、特定の実施形態では、ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質の三量体形成を向上させるための方法も提供し、方法は、親ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質の６５８位における残基（典型的にはＬｙｓ）を、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、又はＬｅｕ、好ましくはＶａｌ又はＩｌｅ、最も好ましくはＶａｌで置換することを含む。これは、例えば、標準的な分子生物学技術を用いて行ってもよい。
【０１０９】
核酸、ベクター、及び細胞
別の一般的態様では、本発明は、本発明の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質をコードする核酸分子、及びその核酸分子を含むベクターを提供する。本発明の核酸分子は、クローニングにより得られるか、又は合成的に生成されるＲＮＡの形態又はＤＮＡの形態であり得る。ＤＮＡは、二本鎖又は一本鎖であり得る。ＤＮＡは、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又はその組み合わせを含むことができる。核酸分子及びベクターは、組換え体タンパク質の生成、宿主細胞におけるタンパク質の発現、又はウイルス粒子の生成のために使用され得る。
【０１１０】
本発明の実施形態によれば、組換え体ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする核酸は、プロモーターに作動可能に連結され、これは、核酸がプロモーターの制御下にあることを意味する。プロモーターは、相同プロモーター（すなわち、ベクターと同一の遺伝子源に由来する）、又は異種プロモーター（すなわち、異なるベクター若しくは遺伝子源に由来する）であり得る。好適なプロモーターの例としては、ヒトサイトメガロウイルス最初期（ｈＣＭＶ  ＩＥ、又は簡潔に「ＣＭＶ」）プロモーター、及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターが挙げられる。好ましくは、プロモーターは、発現カセット内部の核酸の上流に位置する。
【０１１１】
本発明の実施形態によれば、ベクターは、発現ベクターであり得る。発現ベクターとしては、組換え体タンパク質発現用ベクター、及びウイルスベクターなどの、対象の組織における発現のために対象に核酸を送達するためのベクターが挙げられるが、これらに限定されない。本発明とともに使用するのに好適なウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ベクター、腸内ウイルスベクター、ベネズエラウマ脳炎ウイルスベクター、セムリキ森林ウイルスベクター、タバコモザイクウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。ベクターはまた、非ウイルスベクターであり得る。非ウイルスベクターの例としては、プラスミド、細菌性人工染色体、酵母人工染色体、バクテリオファージなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１２】
本発明の特定の実施形態では、ベクターは、アデノウイルスベクター、例えば、組換え体アデノウイルスベクターである。組換え体アデノウイルスベクターは、例えば、ヒトアデノウイルス（ＨＡｄＶ、若しくはＡｄＨｕ）、又はチンパンジー若しくはゴリラアデノウイルス（ＣｈＡｄ、ＡｄＣｈ、若しくはＳＡｄＶ）若しくはアカゲザルアデノウイルス（ｒｈＡｄ）などのサルアデノウイルスに由来し得る。好ましくは、アデノウイルスベクターは、組換え体ヒトアデノウイルスベクター、例えば、組換え体ヒトアデノウイルス血清型２６、又は組換え体ヒトアデノウイルス血清型５、４、３５、７、４８などのいずれか１つである。他の実施形態では、アデノウイルスベクターは、ｒｈＡｄベクター、例えば、ｒｈＡｄ５１、ｒｈＡｄ５２、又はｒｈＡｄ５３である。
【０１１３】
組換え体アデノウイルスベクターの調製法は、当該技術分野で知られている。例えば、組換え体アデノウイルス２６ベクターの調製法は、例えば、国際公開第２００７／１０４７９２号パンフレット及びＡｂｂｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｖｉｒｏｌ８１（９）：４６５４−６３に記載されている。例示的なアデノウイルス２６のゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＥＦ１５３４７４及び国際公開第２００７／１０４７９２号パンフレットの配列番号１の中に見出される。ｒｈＡｄ５１、ｒｈＡｄ５２及びｒｈＡｄ５３に関する例示的なゲノム配列は、米国特許出願公開第２０１５／０２９１９３５号明細書において提供される。
【０１１４】
本発明の実施形態によれば、本明細書に記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質は、本明細書に記載のベクターのいずれかによって発現され、且つ／又はコードされ得る。遺伝暗号の縮重の観点から、当該技術分野において完全に常用される方法にしたがって、同じタンパク質をコードするいくつかの核酸配列が設計され得ることを当業者は十分に認識している。本発明の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質をコードする核酸は、任意選択によりコドン最適化されて、宿主細胞（例えば、細菌細胞又は哺乳動物細胞）における適切な発現を確実にすることができる。コドン最適化は、当該技術分野において広く適用されている技術である。
【０１１５】
本発明はまた、本明細書に記載の核酸分子及びベクターのいずれかを含む細胞、好ましくは、単離細胞を提供する。細胞は、例えば、組換え体タンパク質の生成、又はウイルス粒子の生成のために使用され得る。
【０１１６】
したがって、本発明の実施形態は、組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質を作製する方法にも関する。この方法は、プロモーターに作動可能に連結された本発明の実施形態による組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターにより宿主細胞をトランスフェクトすることと、組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質の発現に好適な条件下でトランスフェクト細胞を増殖させることと、任意選択的に、細胞中で発現された組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質を精製又は単離することとを含む。組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質は、親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなどを含む当該技術分野で知られる任意の方法によって、細胞から単離又は収集され得る。組換え体タンパク質発現のために用いられる手法は、本開示の観点において当業者によく知られているであろう。発現された組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質はまた、例えば、組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質をコードする発現ベクターによりトランスフェクトされ、且つＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質の発現に好適な条件下で増殖された細胞の上清を分析することによって、発現されたタンパク質を精製又は単離することなく調査され得る。
【０１１７】
好ましい実施形態では、発現された組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質は、安定化された三量体複合体を形成するようにタンパク質の会合を可能にする条件下で精製される。例えば、プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター）に作動可能に連結された組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質をコードする発現ベクターによりトランスフェクトされた哺乳動物細胞は、３３〜３９℃、例えば、３７℃及び２〜１２％ＣＯ２、例えば、８％ＣＯ２で培養され得る。発現はまた、昆虫細胞又は酵母細胞などの、当該技術分野では全て従来法である代替的な発現系において実施され得る。続いて、発現されたＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質は、例えば、糖タンパク質に結合するレクチン親和性クロマトグラフィーによって、細胞培養液から単離され得る。カラムに結合されたＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質は、マンノピラノシドを用いて溶出され得る。カラムから溶出されたＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質は、必要に応じてサイズ排除クロマトグラフィーなどの更なる精製ステップにかけられて、任意の残留している夾雑物、例えば、細胞夾雑物、またＥｎｖ凝集体、ｇｐ１４０単量体及びｇｐ１２０単量体も除去され得る。抗体親和性クロマトグラフィー、非ｂＮＡｂによるネガティブ選択、抗タグ精製、又はイオン交換クロマトグラフィーなどの他のクロマトグラフィー法、及び当該技術分野で知られる他の方法を含む代替の精製方法の非限定的な例も使用して、発現されたＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質を単離することができる。
【０１１８】
本発明の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質をコードする核酸分子及び発現ベクターは、本開示の観点における当該技術分野で既知の任意の方法によって作製され得る。例えば、組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質をコードする核酸は、例えば、部位特異的変異誘発、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの当業者によく知られている遺伝子操作技術及び分子生物学的手法を用いて、指定位置でバックボーンＨＩＶエンベロープ配列にアミノ酸置換の少なくとも１つを導入することによって作製することができる。続いて、核酸分子は、標準的な分子生物学的手法をまた使用して発現ベクターに導入又は「クローン化」され得る。続いて、組換え体ＨＩＶエンベロープタンパク質は、宿主細胞中の発現ベクターから発現され得、発現されたタンパク質は、本開示の観点における当該技術分野で既知の任意の方法によって、細胞培養液から精製され得る。
【０１１９】
三量体複合体
別の一般的態様では、本発明は、本発明による組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質のうち３つの非共有結合性オリゴマーを含む三量体複合体に関する。三量体複合体は、本明細書に記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質のいずれかを含むことができる。好ましくは、三量体複合体は、本発明による組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質の３つの同一の単量体（又はｇｐ１４０が切断される場合は同一のヘテロ二量体）を含む。三量体複合体は、単量体形態などのＨＩＶエンベロープタンパク質の他の形態から分離され得るか、又は三量体複合体は、単量体形態などのＨＩＶエンベロープタンパク質の他の形態とともに存在し得る。
【０１２０】
組成物及び方法
別の一般的態様では、本発明は、組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質、三量体複合体、単離核酸、ベクター、又は宿主細胞、及び薬学的に許容される担体を含む組成物に関する。組成物は、本明細書に記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質、三量体複合体、単離核酸分子、ベクター、又は宿主細胞のいずれかを含むことができる。
【０１２１】
担体としては、結合剤、崩壊剤、膨張剤、懸濁化剤、乳化剤、湿潤剤、潤滑剤、香味剤、甘味料、防腐剤、染料、可溶化剤、及びコーティングなどの１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を挙げることができる。担体又は他の材料の厳密な性質は、投与経路、例えば、筋肉内、皮内、皮下、経口、静脈内、皮膚、粘膜内（例えば、腸）、鼻腔内、又は腹腔内経路に依存し得る。液体の注射用製剤の場合、例えば、懸濁液及び溶液の場合、好適な担体及び添加剤としては、水、グリコール、油、アルコール、防腐剤、着色剤などが挙げられる。固体の経口製剤、例えば、粉末、カプセル、カプレット、ジェルキャップ及び錠剤の場合、好適な担体及び添加剤としては、デンプン、糖、希釈剤、造粒剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤などが挙げられる。鼻腔用スプレー／吸入用混合物の場合、水溶液／水性懸濁液は、好適な担体及び添加剤として、水、グリコール、油、皮膚軟化薬、安定剤、湿潤剤、防腐剤、芳香剤、香味料などを含むことができる。
【０１２２】
本発明の組成物を対象への投与に好適な任意の成分で製剤化して、投与を容易にすることができ、且つ効能を高めることができ、この投与としては、経口（腸内）投与及び非経口注射が挙げられるがこれらに限定されない。非経口注射としては、静脈内注射又は点滴、皮下注射、皮内注射、及び筋肉内注射が挙げられる。本発明の組成物をその他の投与経路用に製剤化することもでき、その他の投与経路として、経粘膜、眼内、直腸、持続性皮下注入、舌下投与、舌下、門脈循環をバイパスする口腔粘膜から、吸入又は鼻腔内が挙げられる。
【０１２３】
本発明の実施形態はまた、組成物を作製する方法に関する。本発明の実施形態によれば、組成物を作製する方法は、本発明の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質、三量体複合体、単離核酸、ベクター、又は宿主細胞を１つ以上の薬学的に許容される担体と混合することを含む。当業者は、このような組成物を調製するのに使用される従来技術に精通しているであろう。
【０１２４】
ＨＩＶ抗原（例えば、ＨＩＶのｇａｇ、ｐｏｌ及び／又はｅｎｖ遺伝子産物に由来するタンパク質又はその断片）並びにウイルスベクターなどのＨＩＶ抗原を発現するベクターは、ＨＩＶ感染症に対して対象にワクチン接種するための、又は対象においてＨＩＶ感染症に対する免疫応答を引き起こすための免疫原性組成物及びワクチンにおいて以前から使用されてきた。本明細書で使用する場合、「対象」は、本発明の実施形態による免疫原性組成物が投与されることになるか、又は投与されたあらゆる動物を意味しており、好ましくは哺乳動物を意味しており、最も好ましくはヒトを意味する。用語「哺乳動物」は本明細書で使用する場合、あらゆる哺乳動物を包含する。哺乳動物の例としては、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル、ヒトなど、好ましくはヒトが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質はまた、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する免疫応答を、それを必要とする対象において誘導するための抗原として使用することができる。免疫応答は、クレードＡ、クレードＢ、クレードＣなどの１種以上のＨＩＶクレードに対するものであり得る。組成物は、組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質が発現されるベクターを含むことができるか、又は組成物は、本発明の実施形態による単離された組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質を含むことができる。
【０１２５】
例えば、組換え体ＨＩＶタンパク質又はその三量体複合体を含む組成物は、それを必要とする対象に投与されて、対象においてＨＩＶ感染症に対する免疫応答を誘導することができる。アデノウイルスベクターなどの、本発明の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質をコードするベクターを含む組成物であって、組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質がベクターによって発現される組成物はまた、それを必要とする対象に投与されて、対象においてＨＩＶ感染症に対する免疫応答を誘導することができる。本明細書に記載の方法はまた、本発明の組成物を、好ましくは１種以上のベクター、例えば、アデノウイルスベクター又はＭＶＡベクターから発現される１種以上の追加のＨＩＶ抗原（例えば、ＨＩＶのｇａｇ、ｐｏｌ及び／又はｅｎｖ遺伝子産物に由来するタンパク質又はその断片）と組み合わせて投与することを含み、これは免疫応答をプライムし、且つブーストする方法を含む。
【０１２６】
特定の実施形態では、ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質は、任意選択的に内因性及び／又は外因性のアジュバントと組み合わせられた、リポソーム、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、ナノ粒子、ビロソーム、又はエクソソームなどの粒子上にディスプレイされ得る。可溶性又は単量体Ｅｎｖタンパク質それ自体と比較されるとき、このような粒子は通常、インビボにおいて抗原提示の有効性の亢進を示す。
【０１２７】
ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質をディスプレイするＶＬＰの例は、例えば、ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質を、ＨＩＶのＧａｇコアタンパク質又は他のレトロウイルス性のＧａｇタンパク質などの自己組織化ウイルスタンパク質と共発現させることによって作製され得る。ＶＬＰはウイルスに類似しているが、それらはウイルス性の遺伝物質を含有していないため、非感染性である。エンベロープ又はキャプシドなどのウイルス構造タンパク質の発現は、ＶＬＰの自己組織化をもたらすことができる。ＶＬＰは当業者によく知られており、ワクチンにおけるそれらの使用は、例えば（Ｋｕｓｈｎｉｒ  ｅｔ  ａｌ，２０１２）に記載される。
【０１２８】
特定の好ましい実施形態では、粒子はリポソームである。リポソームは、少なくとも１つの脂質二重層を有する球状小胞である。例えば、ＨＩＶ  Ｅｎｖ三量体タンパク質は、静電相互作用によって、例えば、ＨｉｓタグをＨＩＶ  Ｅｎｖ三量体のＣ末端及びリポソームにおける誘導体化された脂質の先端基に組み込まれるＮｉ２＋又はＣｏ２＋などの二価のキレート化原子に付加することによって、このようなリポソームに非共有結合され得る。特定の非限定的且つ例示的な実施形態では、リポソームは、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、及び１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［（Ｎ−（５−アミノ−１−カルボキシペンチル）イミノ二酢酸）スクシニル］のニッケル塩又はコバルト塩（ＤＧＳ−ＮＴＡ（Ｎｉ２＋）又はＤＧＳ−ＮＴＡ（Ｃｏ２＋））を６０：３６：４のモル比で含む。好ましい実施形態では、ＨＩＶ  Ｅｎｖ三量体タンパク質は、リポソーム表面に、例えば、リポソーム表面に組み込まれたマレイミド官能基を介して、共有結合的に結合される。そのある種の非限定的且つ例示的な実施形態では、リポソームは、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［４−（ｐ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−カルボキサミド］脂質を５４：３０：１６のモル比で含む。ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質は、例えば、ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質において付加されたＣ末端システインを介して、それに結合され得る。共有結合的に結合されたバリアントは、より安定であり、高い抗原特異的ＩｇＧ力価を誘発し、Ｅｎｖ三量体の抗原性に関連の低い「下端」のエピトープが隠されている。リポソームに結合されたＨＩＶ  Ｅｎｖ三量体を作製するための方法及びそれらの特性決定のための方法は知られており、例えば、本明細書に参照として組み込まれる（Ｂａｌｅ  ｅｔ  ａｌ，２０１７）に記載されている。本発明はまた、リポソームと融合され、且つ／又はリポソーム上にディスプレイされる本発明のＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質を提供する。
【０１２９】
特定の実施形態では、本発明のＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質は、自己組織化粒子に融合されるか、又はナノ粒子上にディスプレイされる。抗原ナノ粒子は、抗原、例えば、本発明のＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質の複数のコピーが存在するポリペプチドの集合体であり、複数の結合部位（アビディティー）をもたらし、抗原の安定性及び免疫原性の向上をもたらすことができる。ワクチンにおける使用のための自己組織化タンパク質ナノ粒子の調製法及び使用は、当業者によく知られており、例えば、（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ，２０１４）、（Ｌｏｐｅｚ−Ｓａｇａｓｅｔａ  ｅｔ  ａｌ，２０１６）を参照されたい。非限定的な例として、自己組織化ナノ粒子は、フェリチン、バクテリオフェリチン、又はＤＰＳに基づき得る。表面上にタンパク質をディスプレイするＤＰＳナノ粒子は、例えば、国際公開第２０１１／０８２０８７号パンフレットに記載される。このような粒子上の三量体ＨＩＶ−１抗原の説明は、例えば、（Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ，２０１６）に記載されている。他の自己組織化タンパク質ナノ粒子及びその調製法は、例えば、本明細書に参照として組み込まれる国際公開第２０１４／１２４３０１号パンフレット、及び米国特許出願公開第２０１６／０１２２３９２号明細書に開示される。本発明はまた、自己組織化ナノ粒子と融合され、且つ／又は自己組織化ナノ粒子上にディスプレイされる本発明のＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質を提供する。本発明はまた、本発明によるＶＬＰ、リポソーム、又は自己組織化ナノ粒子を含む組成物を提供する。
【０１３０】
特定の実施形態では、アジュバントは、本発明の組成物中に含まれるか、又は本発明の組成物と同時投与される。アジュバントの使用は任意選択であり、アジュバントの使用により、組成物がワクチン接種の目的のために使用されるときに免疫応答が更に亢進され得る。同時投与又は本発明による組成物中に含まれるのに好適なアジュバントは、好ましくは、潜在的に安全であり、十分に許容され、且つ投与対象において効果的なものであるべきである。このようなアジュバントは当業者によく知られており、非限定的な例としては、ＱＳ−２１、Ｄｅｔｏｘ−ＰＣ、ＭＰＬ−ＳＥ、ＭｏＧＭ−ＣＳＦ、ＴｉｔｅｒＭａｘ−Ｇ、ＣＲＬ−１００５、ＧＥＲＢＵ、ＴＥＲａｍｉｄｅ、ＰＳＣ９７Ｂ、Ａｄｊｕｍｅｒ、ＰＧ−０２６、ＧＳＫ−Ｉ、ＧｃＭＡＦ、Ｂ−ａｌｅｔｈｉｎｅ、ＭＰＣ−０２６、Ａｄｊｕｖａｘ、ＣｐＧ  ＯＤＮ、Ｂｅｔａｆｅｃｔｉｎ、リン酸アルミニウム（例えば、ＡｄｊｕＰｈｏｓ）又は水酸化アルミニウムなどのアルミニウム塩、及びＭＦ５９が挙げられる。
【０１３１】
それぞれＨＩＶエンベロープコンセンサスクレードＣ及びコンセンサスクレードＢを表す、配列番号２又は配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む組換え体ＨＩＶエンベロープタンパク質も本明細書で開示される。これらのコンセンサス配列は、天然に存在するいずれの配列にも見出されておらず、そのため、新規のＨＩＶエンベロープタンパク質であると考えられる。配列番号２又は配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む組換え体ＨＩＶエンベロープタンパク質は、任意選択的に、例えば、配列番号３、又は５５８位及び／又は５５６位にＰｒｏを更に含む配列番号３、並びに配列番号５、又は５５８位及び／又は５５６位にＰｒｏを更に含む配列番号５に示す配列におけるものなどの、いわゆるＳＯＳＩＰ変異及び／又はフューリン切断部位における変異を含むことができる。これらの配列に関する％同一性を決定する際には、変異したフューリン切断部位並びに５０１位、６０５位、５５９位、５５６位及び５５８位のアミノ酸は、考慮されないことが好ましい。驚くべきことに、このようなタンパク質は、高いレベルで発現され、且つ高いレベルの安定性及び三量体形成を有することが見出された。特定の実施形態では、こうしたＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質はバックボーンタンパク質として用いることができ、ここでＫ６５８をＶ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ａ、又はＬに変異させて、本発明の分子を得ることができる。これらの配列をコードする単離核酸分子、プロモーターに作動可能に連結されたこれらの配列を含むベクター、及び当該タンパク質、単離核酸分子又はベクターを含む組成物もまた開示される。
【０１３２】
実施形態
実施形態１は、６５８位にＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、及びＬｅｕからなる群から選択されるアミノ酸を含み、
位置のナンバリングは、ＨＩＶ−１単離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０におけるナンバリングに従う。
【０１３３】
実施形態２は、６５８位におけるアミノ酸がＶａｌである、実施形態１に記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質である。
【０１３４】
実施形態３は、６５８位におけるアミノ酸がＩｌｅである、実施形態１に記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質である。
【０１３５】
実施形態４は、６５８位におけるアミノ酸がＭｅｔである、実施形態１に記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質である。
【０１３６】
実施形態５は、６５８位におけるアミノ酸がＰｈｅである、実施形態１に記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質である。
【０１３７】
実施形態６は、６５８位におけるアミノ酸がＡｌａである、実施形態１に記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質である。
【０１３８】
実施形態７は、６５８位におけるアミノ酸がＬｅｕである、実施形態１に記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質である。
【０１３９】
実施形態８は、
（ｉ）６５１位におけるＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、又はＴｒｐ、好ましくはＰｈｅ；
（ｉｉ）６５５位におけるＰｈｅ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、又はＴｒｐ、好ましくはＩｌｅ；
（ｉｉｉ）５３５位におけるＡｓｎ又はＧｌｎ、好ましくはＡｓｎ；
（ｉｖ）５８９位におけるＶａｌ、Ｉｌｅ、又はＡｌａ、好ましくはＶａｌ又はＩｌｅ；
（ｖ）５７３位におけるＰｈｅ又はＴｒｐ、好ましくはＰｈｅ；
（ｖｉ）２０４位におけるＩｌｅ；及び
（ｖｉｉ）６４７位におけるＰｈｅ、Ｍｅｔ、又はＩｌｅ、好ましくはＰｈｅ；
のアミノ酸残基のうちの１つ以上を更に含み、
位置のナンバリングは、ＨＩＶ−１単離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０におけるナンバリングに従う、実施形態１〜７のいずれか１つに記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質である。
【０１４０】
実施形態９は、
（ｉ）６５１位におけるＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、又はＴｒｐ、好ましくはＰｈｅ；
（ｉｉ）６５５位におけるＰｈｅ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、又はＴｒｐ、好ましくはＩｌｅ；
（ｉｉｉ）５３５位におけるＡｓｎ又はＧｌｎ、好ましくはＡｓｎ；
（ｉｖ）５８９位におけるＶａｌ、Ｉｌｅ、又はＡｌａ、好ましくはＶａｌ又はＩｌｅ；
（ｖｉ）２０４位におけるＩｌｅ；及び
（ｖｉｉ）６４７位におけるＰｈｅ、Ｍｅｔ、又はＩｌｅ、好ましくはＰｈｅ；
のアミノ酸残基のうちの１つ以上を更に含む、実施形態８に記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質である。
【０１４１】
実施形態１０は、６５１位にＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、又はＴｒｐを含む、実施形態９に記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質である。
【０１４２】
実施形態１１は、６５１位にＰｈｅを含む、実施形態１０に記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質である。
【０１４３】
実施形態１２は、６５５位にＰｈｅ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、又はＴｒｐを含む、実施形態９に記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質である。
【０１４４】
実施形態１３は、６５５位にＩｌｅを含む、実施形態１２に記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質である。
【０１４５】
実施形態１４は、５３５位にＡｓｎ又はＧｌｎを含む、実施形態９に記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質である。
【０１４６】
実施形態１５は、５３５位にＡｓｎを含む、実施形態１４に記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質である。
【０１４７】
実施形態１６は、５８９位にＶａｌ、Ｉｌｅ、又はＡｌａを含む、実施形態９に記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質である。
【０１４８】
実施形態１７は、５８９位にＶａｌを含む、実施形態１６に記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質である。
【０１４９】
実施形態１８は、５８９位にＩｌｅを含む、実施形態１６に記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質である。
【０１５０】
実施形態１９は、２０４位にＩｌｅを含む、実施形態９に記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質である。
【０１５１】
実施形態２０は、６４７位にＰｈｅ、Ｍｅｔ、又はＩｌｅを含む、実施形態９に記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質である。
【０１５２】
実施形態２１は、６４７位にＰｈｅを含む、実施形態２０に記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質である。
【０１５３】
実施形態２２は、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖｉ）、及び（ｖｉｉ）のアミノ酸残基のうち少なくとも２つを含む、実施形態９に記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質である。
【０１５４】
実施形態２３は、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖｉ）、及び（ｖｉｉ）のアミノ酸残基のうち少なくとも３つを含む、実施形態２２に記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質である。
【０１５５】
実施形態２４は、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖｉ）、及び（ｖｉｉ）のアミノ酸残基のうち少なくとも４つを含む、実施形態２３に記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質である。
【０１５６】
実施形態２５は、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖｉ）、及び（ｖｉｉ）のアミノ酸残基のうち少なくとも５つを含む、実施形態２４に記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質である。
【０１５７】
実施形態２６は、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖｉ）、及び（ｖｉｉ）の指定アミノ酸残基のうち６つ全てを含む、実施形態２５に記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質である。
【０１５８】
実施形態２７は、６５８位にＶａｌを含み、６５５位にＩｌｅを含む、実施形態９に記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質。
【０１５９】
実施形態２８は、６５８位にＶａｌを含み、６５１位にＰｈｅを含む、実施形態９に記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質。
【０１６０】
実施形態２９は、６５８位にＩｌｅを含み、６５５位にＩｌｅを含む、実施形態９に記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質。
【０１６１】
実施形態３０は、６５８位にＩｌｅを含み、６５１位にＰｈｅを含む、実施形態９に記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質。
【０１６２】
実施形態３１は、６５８位にＶａｌを含み、６５５位にＰｈｅを含む、実施形態９に記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質。
【０１６３】
実施形態３２は、６５１位にＰｈｅを更に含む、実施形態２７、２９、又は３１のいずれか１つに記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質である。
【０１６４】
実施形態３３は、ＨＩＶ  ＥｎｖがクレードＣのＨＩＶ由来である、実施形態１〜３２のいずれか１つに記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質である。
【０１６５】
実施形態３４は、指定位置のうち１つ以上で変異されて、上記の１つ以上の位置で指定アミノ酸残基を得るＨＩＶ  Ｅｎｖ親分子を含み、親分子はコンセンサスＨＩＶ  Ｅｎｖ配列を有する、実施形態１〜３３のいずれか１つに記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質である。
【０１６６】
実施形態３５は、指定位置のうち１つ以上で変異されて、前記１つ以上の位置で指定アミノ酸残基を得るＨＩＶ  Ｅｎｖ親分子を含み、親分子は合成Ｅｎｖタンパク質である、実施形態１〜３３のいずれか１つに記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質である。
【０１６７】
実施形態３６は、指定位置のうち１つ以上で変異されて、前記１つ以上の位置で指定アミノ酸残基を得るＨＩＶ  Ｅｎｖ親分子を含み、親分子は、少なくとも１００、好ましくは少なくとも１０００、好ましくは少なくとも１００００の野生型ＨＩＶ  Ｅｎｖ配列のコレクション中のＨＩＶ  Ｅｎｖ配列のうち７．５％未満、好ましくは２％未満の頻度で対応する位置に存在するアミノ酸残基における少なくとも１つの矯正変異を含む、好ましくはクレードＣの野生型ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質であり、矯正変異は、前記コレクション中のＨＩＶ  Ｅｎｖ配列のうち少なくとも１０％の頻度で対応する位置に存在するアミノ酸残基による置換であり、好ましくは、矯正変異は、前記コレクション中の対応する位置で最も高頻度に存在するアミノ酸残基による置換である、実施形態１〜３３のいずれか１つに記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質である。
【０１６８】
実施形態３７は、５０１位及び６０５位においてＣｙｓ、又は５５９位においてＰｒｏを更に含み、好ましくは５０１位及び６０５位においてＣｙｓ、並びに５５９位においてＰｒｏを更に含む、実施形態１〜３６のいずれか１つに記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質である。
【０１６９】
実施形態３８は、５０１位及び６０５位においてＣｙｓ、並びに５５９位においてＰｒｏを含む、実施形態３６に記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質である。
【０１７０】
実施形態３９は、
（ｖｉｉｉ）５８８位におけるＧｌｎ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ若しくはＰｈｅ、好ましくはＧｌｎ若しくはＧｌｕ；
（ｉｘ）６４位におけるＬｙｓ、若しくは６６位におけるＡｒｇ、若しくは６４位におけるＬｙｓ及び６６位におけるＡｒｇの両方；
（ｘ）３１６位におけるＴｒｐ；
（ｘｉ）２０１位及び４３３位の両方におけるＣｙｓ；
（ｘｉｉ）５５６位若しくは５５８位におけるＰｒｏ、若しくは５５６位及び５５８位の両方におけるＰｒｏ；
（ｘｉｉｉ）５４８〜５６８アミノ酸位におけるループ（ＨＲ１ループ）の、７〜１０アミノ酸を有するループ、好ましくは８アミノ酸のループ、例えば、（配列番号１２〜１７）のいずれか１つから選択される配列を有するループによる置換；
（ｘｉｖ）５６８位におけるＧｌｙ、若しくは５６９位におけるＧｌｙ、若しくは６３６位におけるＧｌｙ、若しくは５６８位及び６３６位の両方におけるＧｌｙ、若しくは５６９位及び６３６位の両方におけるＧｌｙ；並びに／又は
（ｘｖ）３０２位におけるＴｙｒ、若しくは５１９位におけるＡｒｇ、若しくは５２０位におけるＡｒｇ、若しくは３０２位におけるＴｙｒ並びに５１９位におけるＡｒｇ、若しくは３０２位におけるＴｙｒ並びに５２０位におけるＡｒｇ、若しくは３０２位におけるＴｙｒ並びに５１９位及び５２０位の両方におけるＡｒｇ；
のアミノ酸残基のうちの１つ以上を更に含む、実施形態１〜３８のいずれか１つに記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質である。
【０１７１】
実施形態４０は、５５６位にＰｒｏを含む、実施形態３９に記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質である。
【０１７２】
実施形態４１は、５５８位にＰｒｏを含む、実施形態３９に記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質である。
【０１７３】
実施形態４２は、５５６及び５５８位にＰｒｏを含む、実施形態３９に記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質である。
【０１７４】
実施形態４３は、ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質のフューリン切断部位における変異を更に含む、実施形態１〜４２のいずれか１つに記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質である。
【０１７５】
実施形態４４は、フューリン切断部位における変異が、ＲＲＲＲＲＲ（配列番号１０）による５０８〜５１１位での置換を含む、実施形態４３に記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質である。
【０１７６】
実施形態４５は、ｇｐ１４０又はｇｐ１６０タンパク質である、実施形態１〜４４のいずれかに記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質である。
【０１７７】
実施形態４６は、ｇｐ１４０タンパク質である、実施形態４５に記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質である。
【０１７８】
実施形態４７は、組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質が、６５８位にＬｙｓを含むことを除いては更に同一のＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質と比較して、（ａ）三量体形成の割合の向上、及び（ｂ）三量体の収量の向上のうちの少なくとも１つを有する、実施形態１〜４６のいずれかに記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質である。
【０１７９】
実施形態４８は、三量体形成がサイズ排除クロマトグラフィー／多角度光散乱（ＳＥＣ−ＭＡＬＳ）によって測定される、実施形態４７に記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質である。
【０１８０】
実施形態４９は、６５８位におけるＶ、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ａ、又はＬに加えて、
（ａ）６５５Ｉ、５８９Ｖ、５７３Ｆ、６５１Ｆ、５８８Ｅ、５３５Ｎ、２０４Ｉ；
（ｂ）５５６Ｐ、６５５Ｉ、５３５Ｎ、５７３Ｆ、５８９Ｖ、２０４Ｉ、５８８Ｑ；
（ｃ）２０４Ｉ、５３５Ｎ、５５６Ｐ、５８８Ｅ、５８９Ｖ、６５１Ｆ、６５５Ｉ；
（ｄ）５３５Ｎ、５５６Ｐ、５８９Ｖ、６５１Ｆ、６５５Ｉ；及び
（ｅ）５３５Ｎ、５５６Ｐ、５８８Ｅ、５８９Ｖ、６５１Ｆ、６５５Ｉ；
からなる群から選択されるアミノ酸の組み合わせを含む、実施形態１〜４８のいずれかに記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質である。
【０１８１】
実施形態５０は、配列番号３、５、２０、２２、２４、２６、２７、２８、２９、３０、３１、若しくは３２のうちいずれか１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一の、好ましくは配列番号２０、２２、２４、２６、２７、２８、２９、３０、３１、若しくは３２のうちいずれか１つと少なくとも９８％同一の、又は配列番号２９、３０、若しくは３１のうちいずれか１つと１００％同一のアミノ酸配列を含む、実施形態１〜４９のいずれかに記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質である。
【０１８２】
実施形態５１は、実施形態１〜５０のいずれかに記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質のうち３つの非共有結合性オリゴマーを含む三量体複合体である。
【０１８３】
実施形態５２は、実施形態１〜５０のいずれか１つに記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質、又は実施形態５１の三量体複合体をディスプレイする粒子、例えばリポソーム又はナノ粒子、例えば自己組織化ナノ粒子である。
【０１８４】
実施形態５３は、実施形態１〜５０のいずれかに記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質をコードする単離核酸分子である。
【０１８５】
実施形態５４は、プロモーターに作動可能に連結された実施形態５３の単離核酸分子を含むベクターである。
【０１８６】
実施形態５５は、アデノウイルスベクターである実施形態５４に記載のベクターである。
【０１８７】
実施形態５６は、実施形態５３の単離核酸分子、又は実施形態５４若しくは５５のベクターを含む宿主細胞である。
【０１８８】
実施形態５７は、組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質の産生に好適な条件下で実施形態５６の宿主細胞を増殖させることを含む、組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質を産生する方法である。
【０１８９】
実施形態５８は、プロモーターに作動可能に連結された実施形態５３の単離核酸を含む発現ベクターを得ることと；発現ベクターにより細胞をトランスフェクトすることと；組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質の発現に好適な条件下でトランスフェクト細胞を増殖させることと；安定化された三量体複合体の形成を可能にする条件下で組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質を精製することと、を含む、組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質を産生する方法である。
【０１９０】
実施形態５９は、バックボーンＨＩＶエンベロープタンパク質配列の６５８位に、その位置で得られるアミノ酸がＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、又はＬｅｕ、好ましくはＶａｌ又はＩｌｅ、最も好ましくはＶａｌであるようにアミノ酸置換を導入することを含む、実施形態１〜５０のいずれか１つに記載の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質を産生する方法である。
【０１９１】
実施形態６０は、アミノ酸置換をコードするヌクレオチド配列がバックボーンＨＩＶエンベロープタンパク質配列をコードする核酸に導入される、実施形態５９による方法である。
【０１９２】
実施形態６１は、バックボーンＨＩＶエンベロープタンパク質配列が、
配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、並びに
（ａ）５０１位及び５０６位におけるＣｙｓ並びに５５９位におけるＰｒｏ、
（ｂ）アミノ酸５０８〜５１１を置換する配列番号１０を有する（ｂ）、並びに／又は
（ｃ）少なくとも１００、好ましくは少なくとも１０００、好ましくは少なくとも１００００の野生型ＨＩＶ  Ｅｎｖ配列のコレクション中のＨＩＶ  Ｅｎｖ配列のうち７．５％未満、好ましくは２％未満の頻度で対応する位置において存在するアミノ酸残基における少なくとも１つの矯正変異であって、矯正変異が、前記コレクション中のＨＩＶ  Ｅｎｖ配列のうち少なくとも１０％の頻度で対応する位置に存在するアミノ酸残基による置換であり、好ましくは、矯正変異が、前記コレクション中の対応する位置で最も高頻度に存在するアミノ酸残基による置換である、矯正変異の少なくとも（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）、好ましくは（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）のうちの少なくとも２つ、最も好ましくは、（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）をもたらす変異を有する野生型ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質
からなる群から選択される、実施形態５９又は６０の方法である。
【０１９３】
実施形態６２は、実施形態１〜５０のいずれかの組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質、実施形態５１の三量体複合体、実施形態５２の粒子、実施形態５３の単離核酸分子、又は実施形態５４若しくは５５のベクター、及び薬学的に許容される担体を含む組成物である。
【０１９４】
実施形態６３は、アジュバントを更に含む、実施形態６２の組成物である。
【０１９５】
実施形態６４は、組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質、三量体複合体、粒子、単離核酸、又はベクターを１つ以上の薬学的に許容される担体と混合することを含む、実施形態６２の組成物を産生する方法である。
【０１９６】
実施形態６５は、実施形態１〜５０のいずれか１つの組換え体ＨＩＶエンベロープタンパク質、実施形態５１の三量体複合体、実施形態５２の粒子、実施形態５３の単離核酸、又は実施形態５４若しくは５５のベクターを含む組成物を対象に投与することを含む、ＨＩＶ感染症に対するワクチンを対象に接種する方法である。
【０１９７】
実施形態６６は、実施形態１〜５０のいずれか１つの組換え体ＨＩＶエンベロープタンパク質、実施形態５１の三量体複合体、実施形態５２の粒子、実施形態５３の単離核酸、又は実施形態５４若しくは５５のベクターを含む組成物を対象に投与することを含む、ＨＩＶ感染症に対する免疫応答を、それを必要とする対象内で引き起こす方法である。
【０１９８】
実施形態６７は、粒子がリポソームである、実施形態５２の粒子である。
【０１９９】
実施形態６８は、粒子が自己組織化ナノ粒子である、実施形態５２の粒子である。
【実施例】
【０２００】
実施例１：ＨＩＶエンベロープクレードＣ及びクレードＢコンセンサス配列の生成
ＨＩＶエンベロープクレードＣコンセンサス配列
ＨＩＶクレードＣエンベロープ（Ｅｎｖ）タンパク質コンセンサス配列は、ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質の三量体形成に対する様々な変異の影響を調査するためのバックボーン配列として開発された。既知のＨＩＶウイルス単離株由来の３，４３４個のエンベロープタンパク質配列の配列アラインメントを、Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｉｖ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｉｎｄｅｘ）からダウンロードした。３，４３４個の配列から、クレードＣのみの１，２５２個の配列を選択して、ＨＩＶクレードＣ  Ｅｎｖタンパク質コンセンサス配列を生成した。アラインメントに基づいてコンセンサス残基を明確に同定することができなかった位置で、コンセンサス配列を使用して、ＢＬＡＳＴ検索によって最も近い野生型配列を同定した。続いて、これらの位置のコンセンサス残基を、ＢＬＡＳＴ検索から同定された最も近い野生型配列におけるアミノ酸として選択した。ＨＩＶ  ＥｎｖクレードＣコンセンサス配列を配列番号２に示す。
【０２０１】
ＨＩＶ  ＥｎｖクレードＣコンセンサス配列は、５０１位及び６０５位でシステイン残基、並びに５５９位でプロリン残基を含むいわゆるＳＯＳＩＰ変異を導入することと、６個のアルギニン残基により残基５０８〜５１１のフューリン部位を置換することによってフューリン切断部位を最適化することと、によって更に改変された。更に、２９５位のＶａｌをＡｓｎに変異させて（Ｖ２９５Ｎ）、ＨＩＶ株の大部分に存在し、且ついくつかの実験に使用される特定の抗体への結合を向上させることができるＮ−結合グリコシル化部位を生成した。加えて、Ｃ末端を残基６６４でトランケートして、可溶性ＨＩＶ  ｇｐ１４０タンパク質をコードする配列を得た。上記の置換／改変の全ての位置は、ＨＩＶ−１単離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０におけるナンバリングに関する。結果として生じる「ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ」と称されるＨＩＶ  ｇｐ１４０配列を（配列番号３）に示す。ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ配列を、追加の変異、例えば、単一及び二重のアミノ酸置換が導入されるバックボーン又は親ＨＩＶエンベロープ配列として使用して、本明細書で説明する組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質を生成した。
【０２０２】
ＨＩＶエンベロープクレードＢコンセンサス配列
ＨＩＶ  ＥｎｖクレードＢコンセンサス配列は、ＨＩＶ  ＥｎｖクレードＣコンセンサス配列を生成するための上記の手順と同様の手順を用いて生成された。クレードＢコンセンサス配列は、既知のクレードＢウイルス単離株由来の１，７０８個のクレードＢエンベロープタンパク質配列を用いて生成された。ＨＩＶ  ＥｎｖクレードＢコンセンサス配列を配列番号４に示す。
【０２０３】
ＨＩＶ  ＥｎｖクレードＢコンセンサス配列は更に、上記のようにいわゆるＳＯＳＩＰ変異を導入すること、６個のアルギニン残基によりフューリン部位を置換することによってフューリン切断部位を最適化すること、及び残基６６４でＣ末端をトランケートすることによって改変されて、可溶性ＨＩＶ  ｇｐ１４０クレードＢコンセンサス配列をコードする配列を得た。結果として生じる「ＣｏｎＢ＿ＳＯＳＩＰ」と称されるＨＩＶ  ｇｐ１４０  Ｅｎｖタンパク質配列を（配列番号５）に示す。
【０２０４】
コンセンサスに基づく分子は、天然の単離株に基づく分子と比較して発現レベルの向上を有し、更に既に三量体形成レベルの向上を有していたことが見出された。
【０２０５】
実施例２：組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質の発現及び精製
組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質は可溶性ｇｐ１４０タンパク質として発現され、且つ精製された。単一変異（アミノ酸置換）及びその組み合わせ（例えば、二重及び三重変異）をＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰバックボーンコンセンサス配列に導入して、一連の組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質バリアントを生成した。
【０２０６】
ＨＩＶ  ｇｐ１４０  Ｅｎｖコンストラクト及びバリアントの生成及び発現
配列番号３に示すＨＩＶクレードＣ  Ｅｎｖコンセンサス配列ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰをコードするＤＮＡを、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ  ０８８５４）又はＧｅｎｅ  Ａｒｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で合成し、コドン最適化した。続いて、コドン最適化された配列をベクターｐｃＤＮＡ２００４にクローン化して、ＨＩＶクレードＣ  ｇｐ１４０  Ｅｎｖコンストラクトを生成し、これは更なる変異を導入するためのバックボーンＨＩＶエンベロープ配列として使用された。ｐｃＤＮＡ２００４  ＨＩＶクレードＣ  ｇｐ１４０  Ｅｎｖコンストラクト上で実施される部位特異的変異誘発及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰバックボーン配列に変異を導入した。ＨＥＫ−Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞又はＨＥＫ２９３Ｆ細胞を、ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ配列又はそのバリアントをコードする９０％のｐｃＤＮＡ２００４ベクター、及びフューリンプロテアーゼをコードする１０％のｐｃＤＮＡ２００４ベクター（フューリン−ｐＣＤＮＡ２００４）により、製造業者の指示書に従って一過的にトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を３７℃及び１０％ＣＯ２で５日間培養した。培養上清を１２５０×ｇで１０分間遠心させた。その後、０．２２μｍの真空フィルターを使用して、遠心上清を滅菌濾過し、更なる使用まで４℃で保存した。
【０２０７】
９６ウェル形式における発現のために、細胞を３７℃及び１０％ＣＯ２で３日間培養した。４ｕＬのＯｐｔｉｍｅｍ（培養培地）を、添加された４ｕＬの１００ｎｇ／ｕＬ  ＤＮＡ及び８ｕＬのＥｘｐｉ２９３Ｆミックス（５４ｕＬ／ｍＬ  Ｏｐｔｉｍｅｍ）と混合し、２０分間インキュベートした。その後、２００ｕＬ／ウェルのＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞を２．５×１０Ｅ６細胞／ｍＬで添加した。培養上清を採取し、３００ｇで５分間遠心して、細胞及び細胞片を除去した。その後、０．２２μｍの真空フィルターを使用して、遠心上清を滅菌濾過し、更なる使用まで４℃で保存した。
【０２０８】
ＨＩＶ  ｇｐ１４０  Ｅｎｖタンパク質の精製
ｐｃＤＮＡ２００４ベクターから発現されるＨＩＶ  ｇｐ１４０  Ｅｎｖタンパク質を、初回の精製ではガランタス・ニバリス（Ｇａｌａｎｔｕｓ  ｎｉｖａｌｉｓ）−レクチンカラム（Ｖｅｃｔｏｒｌａｂｓ、ＡＬ−１２４３）、続く工程ではＳｕｐｅｒｄｅｘ２００  Ｉｎｃｒｅａｓｅカラム（ＧＥ）を使用する、２段階の精製プロトコルに従って精製して、残留している不純物を除去した。ガランタス・ニバリス（Ｇａｌａｎｔｕｓ  ｎｉｖａｌｉｓ）−レクチンカラムを使用する初回の工程のために、培養上清を緩衝液（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．５）で希釈し、４ｍＬ  ＣＶのＴｒｉｃｏｒｎ  １０−５０レクチンアガロースカラムに毎分４ｍＬの速度で通過させた。その後、カラムを４カラム容量の緩衝液（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．５）で洗浄し、４カラム容量の４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ及び１Ｍマンノピラノシド  ｐＨ７．５を用いて１．６ｍＬ／分の上向流により溶出したが、これは、流れの方向を下向きから上向きに変えて、エンベロープタンパク質の溶出の速度を増大させ、且つ溶出容量を減少させたことを意味している。溶出液をスピンコンセントレータ（５０Ｋ、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濃縮した。
【０２０９】
ＨＩＶ  ｇｐ１４０  Ｅｎｖタンパク質を更に、５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ  ｐＨ７．４をランニング緩衝液として使用してＳｐｅｒｄｅｘ２００カラム上で精製した。カラムから溶出した第２のピークがＨＩＶ  ｇｐ１４０  Ｅｎｖタンパク質を含有した。このピークを含有する画分をプールし、そのピークの正体は、ウェスタンブロット及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ、並びに／又はＳＥＣ−ＭＡＬＳ分析を使用してＨＩＶ  ｇｐ１４０  Ｅｎｖタンパク質だと確認された。精製されたＨＩＶ  ｇｐ１４０  Ｅｎｖタンパク質の濃度を、２８０ｎｍでの光学密度を測定することによって決定し、精製されたＨＩＶ  ｇｐ１４０  Ｅｎｖタンパク質を更なる使用まで４℃で保存した。
【０２１０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット分析
発現されたＨＩＶ  ｇｐ１４０  Ｅｎｖタンパク質を含有する細胞培養上清及び精製したＨＩＶ  ｇｐ１４０  Ｅｎｖタンパク質試料を、４〜１２％（ｗ／ｖ）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＮｕＰＡＧＥゲル、１×ＭＯＰＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で、還元条件下又は非還元条件下にて分析し、ｉＢｌｏｔ技術（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してブロットした。すべての手順を、製造業者の指示に従って実施した。純度分析のために、ゲルをＫｒｙｐｔｏｎ  Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）又はＳＹＰＲＯ  Ｒｕｂｉタンパク質染料（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で染色した。ウェスタンブロット分析のために、膜を抗６×ヒスチジンタグ抗体（抗Ｈｉｓ−ＨＲＰ）で探索した。ゲル及びブロット膜をＯｄｙｓｓｅｙ装置（Ｌｉ−Ｃｏｒ）でスキャンし、画像をＯｄｙｓｓｅｙ  ３．０ソフトウェア（Ｌｉ−Ｃｏｒ）を使用して分析した。
【０２１１】
実施例３：三量体の収量及び三量体形成の割合に関する組換え体ＨＩＶ  ｇｐ１４０  Ｅｎｖバリアントのスクリーニング
実施例２で生成された組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質バリアントを三量体形成に関してスクリーニングして、ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰバックボーン配列と比較して、形成される三量体の割合を向上させ、且つ／又は三量体の収量を向上させたそれらの変異を同定した。三量体の割合及び三量体の収量のハイスループットなスクリーニングを、ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイを使用して行い、組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質に対する一群の広域中和ＨＩＶ抗体（ｂＮＡｂ）及び非ｂＮＡｂの結合を評価した。ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイの結果を、サイズ排除クロマトグラフィー及び多角度光散乱（ＳＥＣ−ＭＡＬＳ）によって確認した。
【０２１２】
ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）アッセイ分析
ＨＩＶ  ｇｐ１４０  Ｅｎｖタンパク質の総発現量及び実施例２に記載されるように生成されたＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ配列に導入された単一アミノ酸置換を有する２００を超えるＨＩＶ  ｇｐ１４０バリアントの適切にフォールディングされた天然の三量体の総量を、細胞培養上清中でＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイによって測定した。二重変異及び三重変異を含有するＨＩＶ  ｇｐ１４０バリアントもまた試験された。いずれの追加の変異も有しないＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ配列を有するＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質を、比較のために試験した。
【０２１３】
特に、次のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を分析のために使用した：ｍＡｂ  ＰＧＴ１４５、ｍＡｂ  ＰＧＤＭ１４００、ｍＡｂ  ＰＧ１６、ｍＡｂ  ＰＧＴ１５１、ｍＡｂ  ３５Ｏ２２、ｍＡｂ  ＰＧＴ１２８、ｍＡｂ  ＰＧ９、ｍＡｂ  Ｆ１０５、ｍＡｂ  Ｂ６、ｍＡｂ  ４４７−５２ｄ、ｍＡｂ  １４ｅ、及びｍＡｂ  １７ｂ。ＭＡｂ  ４４７−５２Ｄ（ＡＢ０１４）、ＰＧ９（ＡＢ０１５）、及びＰＧ１６（ＡＢ０１６）をＰｏｌｙｍｕｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｍｍｕｎｂｉｏｌｏｇｉｓｃｈｅ  Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ  ＧｍｂＨ（Ｋｌｏｓｔｅｒｎｅｕｂｕｒｇ，Ａｕｓｔｒｉａ）から購入した。非中和抗体ｂ６をＤｅｎｎｉｓ  Ｒ．Ｂｕｒｔｏｎ（Ｔｈｅ  Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）から入手し、非中和抗体１４ｅをＪａｍｅｓ  Ｅ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ（Ｔｕｌａｎｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎｅｗ  Ｏｒｌｅａｎｓ，ＬＡ）から入手した。ｍＡｂ  ＰＧＴ１４５（ＰＤＢ：３Ｕ１Ｓ）、ＰＧＤＭ１４００（ＰＤＢ：４ＲＱＱ）、ＰＧＴ１５１（ＰＤＢ：４ＮＵＧ）、３５Ｏ２２（ＰＤＢ：４ＴＶＰ）、Ｆ１０５（ＰＤＢ：１Ｕ６Ａ）、ＰＧＴ１２８（ＰＤＢ：３ＴＹＧ）、及び１７ｂ（ＰＤＢ：４ＲＱＳ）に関しては、ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質の評価のために、公開されている配列をコードする核酸を発現ベクターにクローン化して生成した。ｍＡｂ  Ｆ１０５、Ｂ６、４４７〜５２ｄ、１４ｅ、及び１７ｂを除いて、分析のために使用される抗体は広域中和抗体（ｂＮＡｂ）である。ｂＮＡｂは、複数のＨＩＶウイルス株を中和することができる。ｂＮＡｂのうちＰＧＴ１４５、ＰＧＤＭ１４００、及びＰＧ１６は、尖部に結合するものであり、また三量体特異性である。ＰＧＴ１５１もまた三量体特異性であるが、ｇｐ１２０及びｇｐ４１の２つのプロトマーの界面で結合し、切断に依存する。非ｂＮＡｂの結合は、不適切なフォールディング又は開いた三量体高次構造を示している。
【０２１４】
タンパク質のフォールディングを、ＣＤ４の結合後にのみ露出されるＨＩＶエンベロープタンパク質の共受容体結合部位に結合することが知られる抗体（ｍＡｂ  １７ｂ）への可溶性ＨＩＶ  ｇｐ１４０  Ｅｎｖタンパク質バリアントの結合を測定することによっても試験した（データは示さず）。具体的には、可溶性受容体ＣＤ４（ｓＣＤ４）を、ｍＡｂ  １７と組み合わせて使用して、ＣＤ４に誘導される高次構造変化を評価した。事前にＣＤ４のエンベロープタンパク質への結合のない状態でのｍＡｂ  １７ｂのＨＩＶ  ｇｐ１４０  Ｅｎｖタンパク質バリアントへの結合は、部分的にフォールディングされていないか、又は事前に作動したエンベロープタンパク質（すなわち、ＣＤ４結合がない状態で「開いた」高次構造を採用する不安定なＥｎｖ）の指標となる。
【０２１５】
ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイのために、リンカー、続いてソルターゼＡタグ、続いてＦｌａｇタグ、続いて可動性の（Ｇ４Ｓ）７リンカー、最後にＨｉｓタグを含有するｐｃＤＮＡ２００４ベクター中のＨＩＶ  ｇｐ１４０  Ｅｎｖコンストラクトを調製した（ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質のＣ末端に置かれたタグの配列は、配列番号１９中で提供される）。ＨＩＶ  ｇｐ１４０  ＥｎｖコンストラクトをＨＥＫ−Ｅｘｐｉ２９３細胞中で発現させ、これを９６ウェルプレート（２００μＬ／ウェル）中で３日間培養した。未精製の上清を、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０＋０．５ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ）で１２０倍に希釈した。ｍＡｂ  １７ｂに基づくアッセイのために、上清を１２倍に希釈した。続いて、１０μＬの各希釈物を９６ウェルプレートに移し、４０μＬのアクセプタービーズ、ドナービーズ、及び上に列記されたｍＡｂのうちの１つと混合した。ドナービーズを、ｍＡｂに結合するＰｒｏｔＡ（カタログ番号：ＡＳ１０２Ｍ、ロット番号１８３１８２９、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）にコンジュゲートした。アクセプタービーズを、コンストラクトのＨｉｓタグに結合する抗Ｈｉｓ抗体（カタログ番号：ＡＬ１２８Ｍ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）にコンジュゲートした。エンベロープタンパク質の全ての形態を含む総タンパク質の収量の定量化のために、Ｈｉｓタグ検出用のニッケルコンジュゲートドナービーズ（カタログ番号：ＡＳ１０１Ｍ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）とＦｌａｇタグ検出用の抗Ｆｌａｇ抗体コンジュゲートアクセプタービーズ（カタログ番号：ＡＬ１１２Ｒ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）とを合わせた組み合わせを使用した。ｓＣＤ４−Ｈｉｓと組み合わせたｍＡｂ  １７ｂを使用する試験のために、ＰｒｏｔＡドナービーズ及び抗Ｆｌａｇアクセプタービーズの組み合わせを使用した（データは示さず）。三量体形成を検出するために１つの試料をドナービーズ及びアクセプタービーズと混合し、発現されたタンパク質の総量（すなわち、総タンパク質収量）を測定するために、同じＥｎｖバリアントの第２の試料をニッケルコンジュゲートドナービーズ及び抗Ｆｌａｇコンジュゲートアクセプタービーズと混合した。
【０２１６】
発現されたＨＩＶ  ｇｐ１４０  Ｅｎｖタンパク質を含有する上清、ｍＡｂ、ドナービーズ、及びアクセプタービーズの混合物を、室温で振盪することなく２時間インキュベートした。その後、化学発光シグナルをＳｙｎｅｒｇｙ  ＮＥＯプレートリーダー装置（ＢｉｏＴｅｋ）により測定した。偽トランスフェクト細胞に起因する平均バックグラウンドシグナルを、各ＨＩＶ  ｇｐ１４０  Ｅｎｖバリアントに対して測定されたＡｌｐｈａＬＩＳＡのカウントから差し引いた。続いて、全データセットを、ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰバックボーン配列シグナルを有するＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質に対して測定されたシグナルで割って、試験されたＨＩＶ  ｇｐ１４０  Ｅｎｖバリアントの各々についてのシグナルをバックボーンに対して正規化した。ＨＩＶ  ｇｐ１４０  Ｅｎｖバリアントの各々の三量体特異性ｍＡｂ  ＰＧＴ１４５への結合データを使用して、バリアントの各々についての三量体形成の割合及び三量体の収量を決定した。他のｍＡｂへの結合を使用して、ｂＮＡｂ及び非ｂＮＡｂに対するＨＩＶ  Ｅｎｖバリアントの一般的な結合パターンを評価した（図示せず）。
【０２１７】
ＨＩＶ  Ｅｎｖバリアントの各々に関する三量体形成の割合を、ＨＩＶ  Ｅｎｖバリアント、ｍＡｂ  ＰＧＴ１４５、ＰｒｏｔＡコンジュゲートドナービーズ、及び抗Ｈｉｓコンジュゲートアクセプタービーズの試料混合物から得られる正規化化学発光シグナルを、ＨＩＶ  Ｅｎｖバリアント、抗Ｈｉｓコンジュゲートドナービーズ、及び抗Ｆｌａｇコンジュゲートアクセプタービーズの試料混合物から得られた正規化化学発光シグナルで割ることにより計算した。
【０２１８】
ＨＩＶ  Ｅｎｖバリアントの各々に関する三量体の収量は、いずれの追加の変異も有しないＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰバックボーン配列を有するＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質に関する三量体の収量に対して決定された。ｍＡｂ  ＰＧＴ１４５のＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰエンベロープタンパク質への結合から得られる正規化化学発光シグナルを１に設定し、ｍＡｂ  ＰＧＴ１４５のＨＩＶ  ｇｐ１４０タンパク質の各々への結合から得られる正規化化学発光シグナルをこの値に対して正規化した。
【０２１９】
ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイ分析の結果−三量体の割合及び三量体の収量
ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰバックボーン配列中の上記の表１の（ｉ）〜（ｖｉｉ）のリストからのいくつかの単一、二重、及び三重アミノ酸置換に関するＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイによって決定された三量体形成の割合を図２Ａに示す。試験された単一アミノ酸置換を含有する約２００個のＨＩＶ  ｇｐ１４０  Ｅｎｖバリアントの中で、任意の追加のアミノ酸置換を有しないＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰバックボーン配列に対して形成された三量体の割合と比較して、形成された三量体の割合を少なくとも２５％増加させた７つの置換位置が同定された。
【０２２０】
図２Ａに示される結果は、三量体形成の割合において有意な増加が観察された７つの好ましい置換位置として、ＨＩＶ−１単離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０におけるナンバリングに従ってＮ６５１、Ｋ６５５、Ｉ５３５、Ｄ５８９、Ｉ５７３、Ａ２０４、及びＥ６４７が挙げられることを実証する。具体的には、三量体形成の割合を最も向上させた単一アミノ酸置換としては、Ｎ６５１Ｆ、Ｋ６５５Ｉ（／Ｆ／Ｗ）（しかし、Ｋ６５５Ｆが向上をもたらさないように見えた実験も１つ存在した）、Ｉ５３５Ｎ、Ｄ５８９Ｖ（／Ａ）、Ｉ５７３Ｆ、Ａ２０４Ｉ、Ｅ６４７Ｆが挙げられた。これらの変異のいくつかと組み合わせて試験されたいくつかの変異としては、Ｋ５８８Ｑ／Ｅ、Ｉ５５６Ｐ及びＡ５５８Ｐが挙げられ、これらは更に、本実験において、表１の位置（ｉ）〜（ｖｉｉ）で好ましいアミノ酸を有する変異体の三量体の割合を向上させた。
【０２２１】
本実験で試験された全ての二重置換は、対応する単一置換よりも高い三量体形成の割合を有し、試験された全ての三重置換は、対応する単一変異及び二重変異よりも高い、高い三量体形成の割合を有した（図２Ａ）。予想外且つ驚くべきこれらの結果は、これらの変異が、エンベロープタンパク質の三量体形成に関するこれらの実験において相乗効果の形を示すことができたことを示す。
【０２２２】
三量体形成の割合の向上に加えて、三量体の収量の増加もまた望ましい。そこで、ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰバックボーン配列において単一変異、二重変異、及び三重変異を含有するＨＩＶ  ｇｐ１４０バリアントの三量体の収量も、ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイによって決定された。結果を図２Ｂに示す。単一変異（例外はＩ５３５Ｎ、Ｄ５８９Ａ、及びＤ５８９Ｉであった）を含有する大部分のＨＩＶ  ｇｐ１４０バリアントは、ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰエンベロープタンパク質よりも高い三量体の収量を有した。しかしながら、後述するＩ５３５Ｎ変異体のより正確なＳＥＣ−ＭＡＬＳ分析は、三量体の収量の増加を示した。更に、Ｉ５３５Ｎと組み合わせたＤ５８９Ｖなどの追加の変異は、Ｉ５３５Ｎ変異の存在しない場合にその特定の追加の置換を有するエンベロープタンパク質に関して観察された三量体の収量と同じであった。二重変異を有するバリアントの三量体の収量も増加し、この場合、単一変異バリアントの各々は、ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰエンベロープタンパク質よりも高い三量体の収量を有した（図２Ｂ）。
【０２２３】
（Ｄｅ  Ｔａｅｙｅ  ｅｔ  ａｌ．（上記））によって記載されたＥ６４Ｋ、Ｔ３１６Ｗ二重置換、及び（Ｋｗｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（上記））によって記載されたジスルフィド二重置換Ｉ２０４Ｃ、Ａ４３３Ｃを含む、過去の文献に記載されたＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰバックボーン中に二重変異を有するＨＩＶ  ｇｐ１４０バリアントに関する三量体形成の割合も試験された。Ｅ６４Ｋ、Ｔ３１６Ｗ二重置換は、ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰエンベロープタンパク質よりも低い、すなわち１５％の三量体形成の割合をもたらした（データは示さず）。ジスルフィド二重置換Ｉ２０４Ｃ、Ａ４３３Ｃは三量体の割合を４３％に増加させたが（データは示さず）、Ｉ５３５Ｎ／Ｋ５８８Ｅ、Ｋ５８８Ｑ／Ｄ５８９Ｖ、Ｋ６５５Ｉ／Ｋ５８８Ｅ、Ｉ５３５Ｎ／Ｄ５８９Ｖ、Ｉ５３５Ｎ／Ｅ６４７Ｆ、Ｄ５８９Ｖ／Ｋ６５５Ｉ、及びＩ５３５Ｎ／Ｋ６５５Ｉ（図２Ａ）などの本明細書に記載の二重置換は、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ実験で更に高い三量体形成の割合をもたらした。
【０２２４】
追加の変異（残基５５８及び／又は５５６におけるプロリン）もまたＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰバックボーンに導入され、三量体形成の割合及び三量体の収量がこれらのＨＩＶ  ｇｐ１４０  Ｅｎｖタンパク質に関して測定された。ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰバックボーン中にすでに含有されているＳＯＳＩＰ変異（すなわち、５０１位及び６０５位におけるＣｙｓ、並びに５５９位におけるＰｒｏ）に加えて、５５８位又は５５６位におけるＰｒｏの単一置換と、５５６位及び５５８位の両方におけるプロリンの二重置換の両方が、三量体形成の割合及び三量体の収量を増加させた（データは示さず）。実際に、５５８位及び／又は５５６位にＰｒｏ残基を更に含むＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰバックボーンにおける本発明の新規のアミノ酸安定化置換の１つ以上の導入は、三量体形成の割合及び／又は三量体の収量を更に向上させた（例えば、図２Ａ、例えば、Ａ５５８Ｐ／Ｉ５３５Ｎ、Ｋ６５５Ｉ／Ｌ５５６Ｐ、及びＡ５５８Ｐ変異を含むいくつかの三重変異体）。
【０２２５】
その他のｂＮＡｂ及び非ｂＮＡｂに対するＨＩＶ  ｇｐ１４０  Ｅｎｖバリアントの結合データは、図２Ａ及び２Ｂに列挙されるものなどの、三量体の収量及び三量体形成の割合を増加させた、試験された単一、二重、及び三重変異の大半は、ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰバックボーン配列を有するＨＩＶエンベロープタンパク質に関してｂＮＡｂ及び非ｂＮＡｂに対する観察された結合の量と比較して、ｂＮＡｂに対する結合の増加、及び、非ｂＮＡｂに対する同量の結合又は結合の減少を更に有したことを実証した（データは示さず）。ワクチン開発のためには、ｂＮＡｂへの結合が増加し、且つ非ｂＮＡｂへの結合が減少することが好ましい。したがって、このデータは、上記の表１に示される位置（ｉ）〜（ｖｉｉ）でアミノ酸置換を含むＨＩＶエンベロープタンパク質が、広域中和抗体及び非広域中和抗体に対する結合パターンに関する望ましい特性を有することを実証している。
【０２２６】
ＳＥＣ−ＭＡＬＳ分析
更に、ＳＥＣ−ＭＡＬＳ分析を使用して、ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイを使用してスクリーニングされたＨＩＶ  ｇｐ１４０バリアントに関する三量体の収量及び三量体形成の割合を検証した。ＨＩＶ  ｇｐ１４０バリアントを３０ｍＬスケールの培養液中で発現させ、Ｐｏｌｙｐｒｅｐ自然落下カラム（Ｂｉｏｒａｄ  カタログ番号７３１−１５５０）中の２００μｌのガランサス・ニバリス（Ｇａｌａｎｔｈｕｓ  ｎｉｖａｌｉｓ）レクチンビーズ（Ｖｅｃｔｏｒｌａｂ  カタログ番号ＡＬ−１２４３）上に無細胞上清を適用することによって精製した。ビーズを２ｍｌの結合緩衝液（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で洗浄した。２５０〜５００μｌの４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１Ｍマンノピラノシド  ｐＨ７．４を使用して、タンパク質を溶出した。ＳＥＣ−ＭＡＬＳ実験を実施するために、高速液体クロマトグラフィーシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びＯｐｔｉｌａｂ  Ｔ−ｒＥＸ屈折率検出器（Ｗｙａｔｔ）と連結したＭｉｎｉＤＡＷＮ  ＴＲＥＯＳ装置（Ｗｙａｔｔ）を使用した。全体で１００μｌのレクチン溶出又は約３０μｇのタンパク質のいずれかを、ランニング緩衝液（１５０ｍＭリン酸ナトリウム、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）中で１ｍＬ／分にて平衡化したＴＳＫ−Ｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷｘｌカラム（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に適用した。データをＡｓｔｒａ  ６ソフトウェアパッケージを使用して分析し、分子量計算値を屈折率シグナルから導出した。
【０２２７】
ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰエンベロープタンパク質及び単一変異を含有するＨＩＶ  ｇｐ１４０バリアントのＳＥＣ−ＭＡＬＳクロマトグラムを図３に示す。概して、ＳＥＣ−ＭＡＬＳ分析から得られた結果は、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ分析から得られた結果と同等であり、且つ一致した。ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰエンベロープタンパク質のクロマトグラムは、４つの主要なピークを有し、約７．３分で溶出された第２のピークが三量体ピークである。ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰエンベロープタンパク質は、約２７％が三量体であると決定された。凝集体及び単量体の形成は、ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰコンセンサス配列を有するＨＩＶ  ｇｐ１４０  Ｅｎｖタンパク質に関連する多少のミスフォールディング及び不安定性があることを示している。図３に示されるクロマトグラムによって実証されるように、全ての単一置換において、ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰエンベロープタンパク質の三量体ピークと比較して、相対的に高い三量体ピークが得られ、これは、三量体の収量がＨＩＶ  ｇｐ１４０バリアントの各々で増加したことを示している。
【０２２８】
まとめると、これらの結果は、本明細書の表１の（ｉ）〜（ｖｉｉ）において同定されるアミノ酸置換が、三量体形成の割合の向上及び／又は三量体の収量の向上を有する組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質をもたらすことを実証している。具体的には、同定された変異の２つ以上の組み合わせなど、表１の（ｉ）〜（ｖｉｉ）の同定された位置で複数の置換を有するＨＩＶ  Ｅｎｖバリアントは、典型的には、単一変異のみを有するＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質と比較して、三量体の収量及び／又は三量体形成の割合でより一層の向上を示したが、これは、表１の（ｉ）〜（ｖｉｉ）の組み合わせ変異の実現可能な相乗効果を示している。三量体形成の割合が増加したＨＩＶエンベロープタンパク質は、不所望の非天然の高次構造の調製物に存在するエンベロープタンパク質に要求される精製及び除去の割合が低くなるため、ワクチン用などの製造の観点からも有利である。また、三量体の全体の発現収量の増加は、ワクチン製品の製造に有利である。
【０２２９】
実施例４：クレードＢエンベロープタンパク質コンセンサス配列に基づく組換え体ＨＩＶエンベロープタンパク質バリアント
クレードＢコンセンサス配列ＣｏｎＢ＿ＳＯＳＩＰ（配列番号５）に導入される単一アミノ酸置換（Ｉ５３５Ｎ、Ｄ５８９Ｖ、Ｎ６５１Ｆ又はＫ６５５Ｉ）を含む組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質が、実施例２に記載されるように生成され且つ精製された。三量体の収量及び三量体形成の割合を、実施例３に記載のようにＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイによって測定した。
【０２３０】
結果を、図４Ａ（三量体形成の割合）、及び図４Ｂ（三量体の収量）に示す。報告された値は、三量体形成の割合及び三量体の収量の両方に関して１に設定したＣｏｎＢ＿ＳＯＳＩＰエンベロープタンパク質について測定された値に対するものである。これらの結果は、試験された変異の全てが、三量体形成の割合を増加させたことを示す。三量体の収量は、試験された変異の全てについて、ＣｏｎＢ＿ＳＯＳＩＰエンベロープタンパク質と比較してほとんど同じであるか、又は向上した。
【０２３１】
これらの結果は、これらの変異もまた、異なるバックボーンＨＩＶエンベロープタンパク質配列、この場合はクレードＢ由来のコンセンサス配列に導入された際に、エンベロープタンパク質に対する安定化効果、例えば、三量体の収量の向上、三量体形成の割合の向上などを有したことを実証している。
【０２３２】
実施例５：合成エンベロープタンパク質配列に基づく組換え体ＨＩＶエンベロープタンパク質バリアント
配列番号７に示される配列を有する合成ＨＩＶエンベロープタンパク質（「ＤＳ＿ｓＣ４＿ＳＯＳＩＰ＿Ｅ１６６Ｒ」と命名される）に導入されるアミノ酸置換を含む組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質が、実施例２に記載されるように調製され且つ精製された。合成ＨＩＶエンベロープタンパク質ＤＳ＿ｓＣ４＿ＳＯＳＩＰ＿Ｅ１６６Ｒは、いわゆるＳＯＳＩＰ変異（残基５０１及び６０５におけるＣｙｓ、並びに残基５５９におけるＰｒｏ）、ジスルフィド（ＤＳ）結合の導入をもたらす残基２０１及び４３３におけるＣｙｓ、並びに尖部を安定化する１６６位におけるＡｒｇを有する。加えて、このタンパク質は６５５位でトランケートされる。三量体形成の割合及び三量体の収量を、実施例３に記載のようにＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイによって測定した。
【０２３３】
結果を図５に示すが、これは、試験されたバリアントの各々についての三量体形成の割合を、ＤＳ＿ｓＣ４＿ＳＯＳＩＰ＿Ｅ１６６Ｒバックボーンについての三量体形成の割合（図５Ａ）及び三量体の収量（図５Ｂ）と比較している。バックボーン配列と比較して、試験されたバリアントの各々で、三量体形成の割合がより大きいことが観察された。
【０２３４】
Ｅ１６６Ｒの他に、いくつかの他の稀に発生するアミノ酸を、野生型ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質のコレクションにおける対応する位置でより優勢なものに変化させて（Ａ１１４Ｑ、Ｅ１１７Ｋ、Ｔ３７５Ｓ、及びＩ４３４Ｍ）、後述の実施例１２及び図１３でより詳細に説明されるフレームワークに従ってタンパク質を「矯正」した。この「矯正された」タンパク質においては、安定化変異であるＡ２０４Ｉ及びＫ６５５Ｉが、ｓＣ４＿ＳＯＳＩＰをより更に向上させる（図１４）。
【０２３５】
本実施例の結果は、本明細書に記載の変異はまた、異なるバックボーンＨＩＶエンベロープタンパク質配列、この場合は非コンセンサスの、合成のＥｎｖ配列に導入される際に、エンベロープタンパク質に対する安定化効果、例えば、三量体形成の割合の向上及び／又は三量体の収量の向上を有することを実証している点で実施例４の結果と一致する。
【０２３６】
実施例６：ＨＩＶ  Ｅｎｖ変異の更なる組み合わせ
ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ（配列番号３に示される配列を有する）に導入されるアミノ酸置換を含む組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質が、実施例２に記載されるように調製され且つ精製された。三量体形成の割合を、実施例３に記載されるようにＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイによって測定した。その後、組み合わせのうちより少数の選択物（下記で斜字体で表されるもの、及び加えてＫ６５５Ｉ；Ｉ５３５Ｎ、Ｄ５８９Ｖ；Ｉ５３５Ｎ、Ｋ６５５Ｉ；Ｄ５８９Ｖ、Ｋ６５５Ｉ）を、実施例３に記載されるようにガランサス・ニバリス（Ｇａｌａｎｔｈｕｓ  ｎｉｖａｌｉｓ）レクチンを使用して精製し、三量体含量をＳＥＣ−ＭＡＬＳを使用して分析した。
【０２３７】
ＳＯＳ変異が除去されている以下の変異体を本実験のために作製した：
Ｋ６５５Ｉ、Ｎ６５１Ｆ；
Ｋ６５５Ｉ、Ｎ６５１Ｆ、Ｅ６４７Ｆ；
Ｋ６５５Ｉ、Ｎ６５１Ｆ、Ｅ６４７Ｆ、Ｉ５３５Ｎ；
Ｋ６５５Ｉ、Ｎ６５１Ｆ、Ｉ５３５Ｎ；
Ｋ６５５Ｉ、Ｉ５７３Ｆ；
Ｋ６５５Ｉ、Ｄ５８９Ｖ、Ｉ５７３Ｆ；
Ｋ６５５Ｉ、Ｄ５８９Ｖ、Ｉ５７３Ｆ、Ｎ６５１Ｆ；
Ｋ６５５Ｉ、Ｄ５８９Ｖ、Ｉ５７３Ｆ、Ｋ５８８Ｅ；
Ｋ６５５Ｉ、Ｄ５８９Ｖ、Ｉ５７３Ｆ、Ｎ６５１Ｆ、Ｋ５８８Ｅ；
Ｋ６５５Ｉ、Ｄ５８９Ｖ、Ｉ５７３Ｆ、Ｎ６５１Ｆ、Ｋ５８８Ｅ、Ｉ５３５Ｎ；
Ｋ６５５Ｉ、Ｄ５８９Ｖ、Ｉ５７３Ｆ、Ｎ６５１Ｆ、Ｋ５８８Ｅ、Ｉ５３５Ｎ、Ａ２０４Ｉ；
Ｋ６５５Ｉ、Ｄ５８９Ｖ、Ｉ５３５Ｎ、Ｌ５５６Ｐ；
Ｋ６５５Ｉ、Ｄ５８９Ｖ、Ｉ５７３Ｆ、Ｎ６５１Ｆ、Ｋ５８８Ｅ、Ｌ５５６Ｐ；
Ｋ６５５Ｉ、Ｄ５８９Ｖ、Ａ２０４Ｉ；
Ｌ５５６Ｐ、Ｎ６５１Ｆ；
Ｌ５５６Ｐ、Ｎ６５１Ｆ、Ｋ６５５Ｉ；
Ｌ５５６Ｐ、Ｎ６５１Ｆ、Ｋ６５５Ｉ、Ｉ５３５Ｎ；
Ｌ５５６Ｐ、Ｎ６５１Ｆ、Ｋ６５５Ｉ、Ｉ５３５Ｎ、Ｉ５７３Ｆ；
Ｌ５５６Ｐ、Ｎ６５１Ｆ、Ｋ６５５Ｉ、Ｉ５３５Ｎ、Ｉ５７３Ｆ、Ｄ５８９Ｖ；
Ｌ５５６Ｐ、Ｎ６５１Ｆ、Ｋ６５５Ｉ、Ｉ５３５Ｎ、Ｉ５７３Ｆ、Ｄ５８９Ｖ、Ａ２０４Ｉ；
Ｌ５５６Ｐ、Ｎ６５１Ｆ、Ｋ６５５Ｉ、Ｉ５３５Ｎ、Ｉ５７３Ｆ、Ｄ５８９Ｖ、Ａ２０４Ｉ、Ｋ５８８Ｑ；
Ｌ５５６Ｐ、Ｎ６５１Ｆ、Ｋ６５５Ｉ、Ｉ５３５Ｎ、Ｉ５７３Ｆ、Ｄ５８９Ｖ、Ａ２０４Ｉ、Ｋ５８８Ｑ、Ｅ６４７Ｆ；
Ｌ５５６Ｐ、Ｎ６５１Ｆ、Ｉ５３５Ｎ；
Ｌ５５６Ｐ、Ｎ６５１Ｆ、Ｉ５３５Ｎ、Ｉ５７３Ｆ；
Ｌ５５６Ｐ、Ｎ６５１Ｆ、Ｉ５３５Ｎ、Ｉ５７３Ｆ、Ｄ５８９Ｖ；
Ｌ５５６Ｐ、Ｎ６５１Ｆ、Ｉ５３５Ｎ、Ｉ５７３Ｆ、Ｄ５８９Ｖ、Ａ２０４Ｉ；
Ｌ５５６Ｐ、Ｎ６５１Ｆ、Ｉ５３５Ｎ、Ｉ５７３Ｆ、Ｄ５８９Ｖ、Ａ２０４Ｉ、Ｋ５８８Ｑ；
Ｌ５５６Ｐ、Ｎ６５１Ｆ、Ｉ５３５Ｎ、Ｉ５７３Ｆ、Ｄ５８９Ｖ、Ａ２０４Ｉ、Ｋ５８８Ｑ、Ｅ６４７Ｆ；
Ｌ５５６Ｐ、Ｋ６５５Ｉ、Ｉ５３５Ｎ；
Ｌ５５６Ｐ、Ｋ６５５Ｉ、Ｉ５３５Ｎ、Ｉ５７３Ｆ；
Ｌ５５６Ｐ、Ｋ６５５Ｉ、Ｉ５３５Ｎ、Ｉ５７３Ｆ、Ｄ５８９Ｖ；
Ｌ５５６Ｐ、Ｋ６５５Ｉ、Ｉ５３５Ｎ、Ｉ５７３Ｆ、Ｄ５８９Ｖ、Ａ２０４Ｉ；
Ｌ５５６Ｐ、Ｋ６５５Ｉ、Ｉ５３５Ｎ、Ｉ５７３Ｆ、Ｄ５８９Ｖ、Ａ２０４Ｉ、Ｋ５８８Ｑ；
Ｌ５５６Ｐ、Ｋ６５５Ｉ、Ｉ５３５Ｎ、Ｉ５７３Ｆ、Ｄ５８９Ｖ、Ａ２０４Ｉ、Ｋ５８８Ｑ、Ｅ６４７Ｆ；
Ｌ５５６Ｐ、Ｎ６５１Ｆ、Ｉ５３５Ｎ、Ｉ５７３Ｆ、Ｄ５８９Ｖ、Ａ２０４Ｉ、Ｋ５８８Ｑ。
【０２３８】
ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰバックボーンにおける置換の試験された全ての組み合わせが、ＡｌｐｈａＬＩＳＡにおいて、バックボーンと比較してより高い三量体の割合、及びより高い三量体の収量を示した（データは示さず）。ＳＥＣ＿ＭＡＬＳは、バックボーンにおける試験された全ての変異に関する三量体の割合の向上を確証した（データは示さず）。
【０２３９】
１つずつの追加の変異を最大９つの変異まで含むセットの場合、ＳＥＣ−ＭＡＬＳは、ＳＥＣグラフ（図６）において単量体ピークの高さは低下したが、三量体ピークの高さは同一のまま推移したため、各々の次の変異を導入するごとに三量体／単量体の比率が増加したことを示した。ＳＥＣ−ＭＡＬＳにおいて試験された全てのバリアントのうち、Ｌ５５６Ｐ、Ｎ６５１Ｆ、Ｋ６５５Ｉ、Ｉ５３５Ｎ、Ｉ５７３Ｆ、Ｄ５８９Ｖ、Ａ２０４Ｉ、Ｋ５８８Ｑ、Ｅ６４７Ｆ置換を有するバリアントは、最も高い三量体の割合（最少のｇｐ１４０単量体及び最少のｇｐ１２０単量体）と、最も高い総タンパク質収量と、より高い温度安定性のうちの１つと、を示した。これは、これらの変異がバックボーンと比較して三量体を消失することなく組み合わせられ得ることを意味している。加えて、これは、概して、任意選択により表２に記載の変異と組み合わせられる表１の（ｉ）〜（ｖｉｉ）に記載の変異の追加が、三量体形成の更なる向上をもたらすことを示唆している。
【０２４０】
「ＳＯＳ変異」が除去された（すなわち、５０１位及び６０５位における２つのシステイン残基が、コンセンサスクレードＣ配列において本来存在したアミノ酸残基に復帰した）Ｌ５５６Ｐ、Ｎ６５１Ｆ、Ｉ５３５Ｎ、Ｉ５７３Ｆ、Ｄ５８９Ｖ、Ａ２０４Ｉ、Ｋ５８８Ｑ変異を有するコンストラクトも試験された。この変異体は、ＳＯＳ変異を含まなかったこれに対応する変異体に匹敵する三量体の割合及び収量を有した。ＳＯＳ変異が除去された変異体は更に、その対応するＳＯＳ含有対応物（Ｌ５５６Ｐ、Ｎ６５１Ｆ、Ｉ５３５Ｎ、Ｉ５７３Ｆ、Ｄ５８９Ｖ、Ａ２０４Ｉ、Ｋ５８８Ｑ変異を有する）よりも少ない非ｂＮＡｂに結合したという点での利点を有した。これは、高い三量体形成の割合などの有利な特性を、ＳＯＳＩＰ変異を全ては有しないＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質においても得ることができることを実証している。
【０２４１】
発現レベル、三量体形成及び広域中和抗体ＰＧＴ１５１への結合における好ましい特性の組み合わせに基づいて、１つの変異体（ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰバックボーンにおいて試験される）は次の変異を有する：Ｌ５５６Ｐ、Ｎ６５１Ｆ、Ｉ５３５Ｎ、Ｉ５７３Ｆ、Ｄ５８９Ｖ、Ａ２０４Ｉ、Ｋ５８８Ｑ。
【０２４２】
ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰバックグラウンドにおいて、９つの最も好結果の置換は、ｇｐ４１におけるＬ５５６Ｐ、Ｅ６４７Ｆ、Ｎ６５１Ｆ、Ｋ６５５Ｉ、Ｉ５３５Ｎ、Ｄ５８９Ｖ、Ｉ５７３Ｆ、及びＫ５８８Ｅ、並びにｇｐ１２０におけるＡ２０４Ｉであった。これらの９つの全ての置換の組み合わせが、安定性、三量体の含量、及び三量体の収量の増大をもたらした。９つの置換を有するこのバリアントにおいてＬ５５６Ｐの追加が三量体の割合の向上に比較的限定的な効果を有し、且つこの状況におけるＥ６４７Ｆ置換がＰＧＴ１５１結合を妨害しているように見えたため、これらの２つの変異は、更なるバリアントにおいていつも使用されるとは限らず、且つ７つの置換を有するバリアント（ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ＿７ｍｕｔと命名される、本明細書では「安定化ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ」又は「ＣｏｎＣ＿ｂａｓｅ」と称される場合もあり；Ｎ６５１Ｆ、Ｋ６５５Ｉ、Ｉ５３５Ｎ、Ｄ５８９Ｖ、Ｉ５７３Ｆ、Ｋ５８８Ｅ、及びＡ２０４Ｉを含む）は、上記で示される９つの置換を有するバリアントよりもわずかにより安定であった（融解温度がより高い）ことが見出された。このバリアントの完全な配列（安定化されたＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ  Ｅｎｖ、ＨＩＶ１６０５４４）は配列番号２０において提供される。
【０２４３】
この時点で、特に好ましい変異体［以下の追加の変異を有するＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰバックボーンにおいて試験される：（ａ）Ｄ２７９Ｎ、Ａ２８１Ｖ、Ａ３６２Ｑ（他の人たちによって記載されるように、感染初期ウイルスとの類似性を増大させる）；（ｂ）Ｄｅｌ１３９−１５２（抗体をこのループに誘導する確率を減少させるための可変ループの欠失）；及び（ｃ）Ｖ２９５Ｎ（ＨＩＶ株の大部分に存在するグリカン部位の導入）］は、発現レベル、三量体形成、及び広域中和抗体への結合における好ましい特性の組み合わせに基づいてＮ６５１Ｆ、Ｋ６５５Ｉ、Ｉ５３５Ｎ、Ｉ５７３Ｆ、Ｄ５８９Ｖ、Ａ２０４Ｉ、Ｋ５８８Ｅの本発明の安定化変異を有する。このバリアントの完全な配列（安定化されたＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ．ｖ３  Ｅｎｖ（ＨＩＶ１７０６５４、ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ．ｖ３））は配列番号２８において提供される。
【０２４４】
更なるバリアントでは、Ｋ６５８Ｖ変異をこのコンストラクトに追加して（下記の実施例８も参照されたい）、結果を更に向上させた。  
【０２４５】
実施例７：安定化ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質をディスプレイする自己組織化粒子
（Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ，２０１６）の記載と同様の方法で安定化されたＥｎｖタンパク質をディスプレイするフェリチン及びＤＰＳ自己組織化粒子を調製した。これを行うために、ｇｐ１４０タンパク質は、短いアミノ酸リンカー（例えば、ＧＳＧ又はＡＡＡＧＳであるが、他のリンカーも使用することができ、例えば、Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ，２０１６を参照のこと）を介してＤＮＡレベルで粒子のＮ末端に融合され、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞において融合タンパク質を発現した。この方法で調製された粒子の一例は、ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ（配列番号３）ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質に融合したフェリチンに基づき、Ｉ５３５Ｎ、Ａ５５８Ｐ、Ｄ５８９Ｖ、Ｋ６５５Ｉの変異を有した。三量体形成を向上させると報告された（Ｋｅｓａｖａｒｄｈａｎａ  ｅｔ  ａｌ，２０１４）追加のＶ５７０Ｄ変異を有するこのＥｎｖタンパク質を有するフェリチン粒子も調製したが、この変異は、望ましくない非中和抗体（１７ｂ）の結合の著しい増加をもたらすことが観察された。これらの５つの変異を有するＥｎｖはまた、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）及びマイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）に由来する２種類のＤＰＳ粒子に融合された（ＤＰＳ粒子の調製については、例えば、国際公開第２０１１／０８２０８７号パンフレットを参照のこと）。これらの５つの変異及び加えてジスルフィド架橋を導入する二重変異Ｉ２０１Ｃ−Ａ４３３Ｃを有するＥｎｖもフェリチンに融合された。
【０２４６】
粒子をＰＧＤＭ１４００親和性ビーズにより無細胞上清から精製し、その粒子をＴＳＫｇｅｌ  Ｇ６０００ＰＷＣＬカラムを用いるＳＥＣ−ＭＡＬＳを使用して分析した。ＳＥＣ−ＭＡＬＳ及び天然ＰＡＧＥ（３〜１２％）により、ほぼ予想された寸法を有する粒子が形成されたことを確認した。
【０２４７】
同様の方法で、（Ｌ５５６Ｐ、Ｎ６５１Ｆ、Ｉ５３５Ｎ、Ｉ５７３Ｆ、Ｄ５８９Ｖ、Ａ２０４Ｉ、Ｋ５８８Ｑ）の変異の組み合わせを有するＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ配列を有するＨＩＶ  Ｅｎｖをディスプレイするフェリチン及びＤＰＳ自己組織化ナノ粒子も調製される。
【０２４８】
更に、本明細書に記載の他のＨＩＶ  Ｅｎｖバリアント、例えば、配列番号２０、２２、２４、２６、２７、２８、２９、３０、３１又は３２を有するＨＩＶ  Ｅｎｖをディスプレイするリポソーム及び／又は自己組織化ナノ粒子も調製する。
【０２４９】
Ｎｉ−ＮＴＡリポソーム、及びこうしたバリアントのうちのいくつかを有する共有結合性のクリックケミストリー・リポソームも調製された（Ｉｎｇａｌｅ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．２０１６，１５（９）：１９８６−９９；Ｂａｋ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．２０１６，２７（７）：１６７３−８０）。リポソームをｎｓ−ＴＥＭを用いて分析し、これは、リポソーム表面上で、均等に離間し、直交的にディスプレイされ、高密度で被覆されたＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質を示した。
【０２５０】
実施例８．６５８位で三量体安定化変異を有するＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質
６５８位（ＨＩＶ−１単離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０に従うナンバリング）で置換変異を有する組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質をＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ（配列番号３）バックボーン中で調製した。Ｋ６５８を、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、及びＬｅｕに変異させた。加えて、いくつかの二重変異体が作られ、これらの変異は、上記の安定化変異の１つであるＫ６５５Ｉと組み合わせられた。三量体形成の割合を、実施例３に記載されるようにＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイによって決定した。
【０２５１】
結果を図７Ａ及び７Ｂ（三量体の割合、異なる実験において測定されたため２つのパネルがある）、並びに図７Ｃ及び７Ｄ（三量体の収量、異なる実験において測定されたため２つのパネルがある）に示す。これらの結果は、６５８位でのＩｌｅ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、又はＶａｌによる置換が、三量体形成の割合の向上及び三量体の収量の向上をもたらしたことを実証している。６５８位でのＩｌｅによる置換は、上記の表１における変異由来の最も機能的な単一変異体であったＫ６５５Ｉ変異（例えば、図２Ａを参照のこと）とほぼ同じ範囲の増加をもたらした（図７Ａ、Ｃ）。６５８位でのＶａｌによる置換は、更に高い向上をもたらした（図７Ａ、Ｃ）。
【０２５２】
結果はまた、６５８位でのＩｌｅ又はＶａｌによる置換を上記の変異Ｋ６５５Ｉと組み合わせることができ、これが、対応する単一変異体の各々と比較して更なる向上をもたらしたことを実証した（図７Ａ、Ｃ）。
【０２５３】
Ｋ６５８Ｖ変異体も、ＳＥＣ−ＭＡＬＳを使用して試験された。９６ウェル培養液を、ＡｌｐｈａＬＩＳＡで行われたのと同様に３日間増殖させた。上清をＳＥＣ−ＭＡＬＳカラムに直接ロードした。偽上清（フューリン発現を有する）に関して得られたクロマトグラムを、Ｅｎｖタンパク質を有する上清のクロマトグラムから差し引いた。三量体タンパク質は、７分〜８分の間でカラムから溶出した。結果を図８に示し、また、結果はＫ６５８Ｖ変異体が、バックグラウンドＥｎｖタンパク質及びＫ６５５Ｉ変異体Ｅｎｖタンパク質と比較して三量体形成の向上を示したことを確証した。
【０２５４】
本実施例は、ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質中の６５８位におけるＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、又はＡｌａによるアミノ酸の置換が、三量体の割合及び三量体の収量の向上をもたらしたことを実証している。
【０２５５】
ＡｌｐｈａＬＩＳＡ及び／又はＳＥＣ−ＭＡＬＳを使用してバリアントの三量体形成を測定する更なる実験をＨＩＶ  Ｅｎｖバリアント中で実施し、ここで、Ｋ６５８Ｖ変異は、本明細書に記載の表１及び／又は２由来の他の変異と組み合わせられ、並びにクレードＡ及びＢ由来のＨＩＶ株において存在する。例えば、６５８Ｖ変異はすでに、上記のようなＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ，７ｍｕｔバリアント（実施例７）、並びにＬ５５６Ｐ、Ｋ６５５Ｉ、Ｍ５３５Ｎ、Ｎ６５１Ｆ、Ｄ５８９Ｖ、Ｋ５８８Ｅを有するＢＧ５０５＿ＳＯＳＩＰ（下記の実施例９で説明される）、並びに矯正及び安定化されたＣ９７ＺＡ＿ＳＯＳＩＰ（下記の実施例１０で説明される）を向上させることが示されている。
【０２５６】
上記の結果に基づいて、６５８位でのバリン残基、イソロイシン残基、フェニルアラニン残基、ロイシン残基、メチオニン残基、又はアラニン残基、好ましくはバリン残基へのアミノ酸の変異は、様々なバックグラウンドＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質中で三量体形成及び／又は三量体の収量を向上させることが見込まれる。
【０２５７】
実施例９：クレードＡエンベロープタンパク質配列に基づく組換え体ＨＩＶエンベロープタンパク質バリアント
単一アミノ酸置換（Ｉ５３５Ｎ、Ｄ５８９Ｖ、Ｎ６５１Ｆ、Ｋ６５５Ｉ、Ｉ５７３Ｆ、Ａ２０４Ｉ、又はＥ６４７Ｆ）を、実施例２に記載されるようにＳＯＳＩＰ改変（「ＢＧ５０５＿ＳＯＳＩＰ」と命名される）を含む野生型クレードＡのＨＩＶエンベロープタンパク質に導入した。ＨＩＶエンベロープタンパク質ＢＧ５０５＿ＳＯＳＩＰは、いわゆるＳＯＳＩＰ変異（残基５０１及び６０５におけるＣｙｓ、並びに残基５５９におけるＰｒｏ）、並びにジスルフィド（ＤＳ）結合の導入をもたらす残基２０１及び４３３における更なるＣｙｓ、並びに３３２位における潜在的Ｎ−グリコシル化部位（Ｔ３３２Ｎ変異）を有する。このタンパク質は６６４位でトランケートされる。ＢＧ５０５＿ＳＯＳＩＰの配列を配列番号２１に示す。
【０２５８】
三量体形成の割合及び三量体の収量を、実施例３に記載のようにＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイによって測定した。試験されたバリアントの各々ついての三量体形成の割合及び三量体の収量をＢＧ５０５＿ＳＯＳＩＰと比較した。バックボーン配列と比較して、より高い三量体形成の割合が、Ｍ５３５Ｎ、Ｄ５８９Ｖ、Ｎ６５１Ｆ、又はＫ６５５Ｉ置換に関して観察された（例えば、図９Ａ）。例えば、Ｌ５５６Ｐ、Ｋ６５５Ｉ、及びＭ５３５Ｎの組み合わせは、三量体の収量及び割合のよりいっそうの増加を示した（例えば、図９Ａ及び９Ｂ）。Ｎ６５１Ｆ及びＤ５８９Ｖの組み合わせは、三量体の収量及び割合をよりいっそう向上させた（データは示さず）。クレードＡウイルスに関する本実施例の結果は、下の実施例１０及び１１（クレードＣ）並びに実施例５（クレードＢ）のものと一致し、その中で、変異Ｉ５３５Ｎ、Ｄ５８９Ｖ、Ｎ６５１Ｆ、及びＫ６５５Ｉもまた、野生型株に由来するエンベロープタンパク質に対する安定化効果、例えば、三量体形成の割合の向上及び／又は三量体の収量の向上を示した。明らかに、これらの変異はまた、野生型クレードＡ株に由来するＨＩＶ  Ｅｎｖの三量体形成を向上させる。
【０２５９】
この時点で、発現レベル、三量体形成、及び広域中和抗体への結合における好ましい特性の組み合わせに基づく、特定の好ましい変異体（ＢＧ５０５＿ＳＯＳＩＰバックボーンにおいて試験される）は次の変異を有するものである：Ｌ５５６Ｐ、Ｋ６５５Ｉ、Ｍ５３５Ｎ、Ｎ６５１Ｆ、Ｄ５８９Ｖ（例えば、ＳＥＣ−ＭＡＬＳ分析においてこのような変異体の三量体形成の著しい向上を示す図１０、及びこのような変異体の広域中和抗体の結合の明らかな向上を示す図１４を参照のこと）。この安定化されたＢＧ５０５＿ＳＯＳＩＰ  Ｅｎｖ（ＨＩＶ１７０８６３）の配列を配列番号２２に示す。
【０２６０】
変異Ｑ６５８Ｖの追加は、更にわずかな向上をもたらした。
【０２６１】
更に好ましいコンストラクトは、Ｌ５５６Ｐ、Ｋ６５５Ｉ、Ｍ５３５Ｎ、Ｎ６５１Ｆ、Ｄ５８９Ｖ変異、並びに「ＤＳ」変異（ジスルフィド結合の導入をもたらす２０１位及び４３３位におけるＣｙｓ）、Ｒ５８８Ｅ、並びにＱ６５８Ｖを含有する。当該バリアント（ＢＧ５０５＿ＳＯＳＩＰ．ｖ２  Ｅｎｖ，ＨＩＶ１７１８１４）の配列を配列番号２９に提供する。
【０２６２】
示差走査熱量測定法を用いて、ＨＩＶ  Ｅｎｖ三量体の安定性の指標である融解温度を求めた。ＨＩＶ  Ｅｎｖの融解温度を、ＭｉｃｒｏＣａｌキャピラリーＤＳＣシステムを用いて求めた。各測定で４００μＬの０．５ｍｇ／ｍＬタンパク質試料を用いた。測定を、開始温度２０℃及び最終温度１１０℃で実施した。走査速度１００℃／時間、及びフィードバックモード；低（＝シグナル増幅）。データをＯｒｉｇｉｎ  Ｊ．ソフトウェア（ＭｉｃｒｏＣａｌ  ＶＰ分析ツール）を使用して分析した。
【０２６３】
ＢＧ５０５＿ＳＯＳＩＰ．ｖ２  Ｅｎｖ（ＨＩＶ１７１８１４）Ｅｎｖバリアント（配列番号２９）の融解温度は、ＤＳＣで測定して８２．２℃であり、一方でＢＧ５０５＿ＳＯＳＩＰバックボーン（融解温度２１）は６７．８℃の融解温度を有する。
【０２６４】
実施例１０：クレードＣ野生型エンベロープタンパク質配列に基づく組換え体ＨＩＶエンベロープタンパク質バリアント
単一アミノ酸置換Ｔ６５１Ｆ、追加の置換Ｌ５５６Ｐ（Ｃ９７ＺＡ＿ＳＯＳＩＰ＿Ｌ５５６Ｐ）を伴うＷＴ  Ｃ９７ＺＡ＿ＳＯＳＩＰ  Ｅｎｖ配列（配列番号２３）に導入される二重アミノ酸置換Ｔ６５１Ｆ、Ｍ５３５Ｎを含む本発明の実施形態による組換え体ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質が、実施例２に記載のように生成され、発現された。三量体の収量及び三量体形成の割合を、実施例３に記載のようにＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイによって測定した。
【０２６５】
結果を図１１Ａ及びＢに示す。Ｃ９７ＺＡ＿ＳＯＳＩＰ＿Ｌ５５６Ｐ＿Ｔ６５１Ｆ＿Ｍ５３５Ｎの三量体の収量は、Ｃ９７ＺＡ＿ＳＯＳＩＰバックボーンのものより５倍高い。
【０２６６】
Ｌ５５６Ｐ、Ｔ６５１Ｆ及びＭ５３５Ｎ置換は、このように、Ｃ９７ＺＡ＿ＳＯＳＩＰの大幅な向上をもたらしたが、このクレードＣ野生型由来のバリアントに関するｂＮＡｂへの結合及び三量体の割合は、ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰバックボーンよりも依然として非常に低かった。ｗｔ  Ｅｎｖはその宿主に適応し得るが、場合によりその全般的な適応度が低下し、それによりフォールディングが損なわれることがあるため、Ｅｎｖ配列を、下記の実施例１２及び図１３に記載の概念的フレームワークに従って「矯正」した。合計２１個の残基を変化させて配列を矯正し、３つの潜在的Ｎ−グリコシル化部位（ＰＮＧＳ）を追加して、いわゆる「グリカンホール」（野生型ＨＩＶ株Ｅｎｖタンパク質の少なくとも５０％において潜在的Ｎ−グリコシル化部位が存在する位置）をふさいだ。Ｃ９７ＺＡ＿ＳＯＳＩＰに関する後のこのフレームワークによって導入される変異を、表３の縦列「変異の矯正」に示す。本明細書に開示される安定化変異Ｋ６５５Ｉの追加により、Ｄ５８９Ｖ、Ａ２０４Ｉ、及びＫ５８８Ｅと同様に、三量体の割合及び収量がよりいっそう増加した。
【０２６７】
これらの結果は、本明細書に記載のＴ６５１Ｆ、Ｍ５３５Ｎ、及びＫ６５５Ｉ、Ｄ５８９Ｖ、Ａ２０４Ｉ、及びＫ５８８Ｅ変異もまた、Ｃ９７ＺＡ＿ＳＯＳＩＰ（クレードＣ野生型株Ｅｎｖタンパク質に由来する）及びそのバリアントに導入される際に、エンベロープタンパク質に対する安定化効果、例えば、三量体の収量の向上、三量体形成の割合の向上を有したことを実証している。
【０２６８】
この時点で、発現レベル、三量体形成及び広域中和抗体への結合における好ましい特性の組み合わせに基づく、特定の好ましいバリアント（Ｃ９７ＺＡ＿ＳＯＳＩＰバックボーンにおいて試験される）は次の変異を有するものである：Ｑ５６７Ｋ（以前に他の人たちによって記載された）；Ａ１９８Ｔ、Ｓ２４３Ｎ、Ｋ２３６Ｔ、Ｖ２９５Ｎ（グリカンホールをふさぐため）；Ｍ３４Ｌ、Ｔ４６Ｋ、Ｔ５８Ａ、Ｑ１７１Ｋ、Ｇ１７２Ｖ、Ｐ１７９Ｌ、Ｌ１８３Ｑ、Ｉ１９２Ｒ、Ｎ２０９Ｔ、Ｍ３０７Ｉ、Ｑ３５０Ｒ、Ｎ３５２Ｈ、Ｙ３５３Ｆ、Ｄ４１２Ｎ、Ｇ４２９Ｅ、Ｖ４５５Ｔ、Ｉ４８９Ｖ、Ｌ４９１Ｉ、Ｇ５００Ｋ、Ｓ５４７Ｇ、Ｔ５７８Ａ、Ｔ６５１Ｎ（配列を矯正するため）；Ｖ５０５Ｎ、Ｅ５０７Ｔ、Ｔ６６３Ｎ（分子の基部に潜在的Ｎ−グリコシル化部位を追加される）；及びＡ２０４Ｉ、Ｍ５３５Ｎ、Ｌ５５６Ｐ、Ｋ５８８Ｅ、Ｄ５８９Ｖ、Ｔ６５１Ｆ、Ｋ６５５Ｉ（本発明の安定化変異）。このバリアントについてのデータは、例えば、図１４（特に、その中の「安定化及び矯正されたＣ９７ＺＡ」を参照されたい）に示され、元のｗｔ  Ｃ９７ＺＡ  Ｅｎｖ分子と比較して、広域中和抗体結合において非常に大きな増加を示す。このバリアント（安定化及び矯正されたＣ９７ＺＡ＿ＳＯＳＩＰ  Ｅｎｖ（ＨＩＶ１７０６９０））の配列を、配列番号２４に提供する。
【０２６９】
変異Ｋ６５８Ｖの追加がこのタンパク質をよりいっそう安定化した。
【０２７０】
更に好ましいバリアントは「ＤＳ」変異及びＫ６５８Ｖを含み、このバリアント（安定化及び矯正されたＣ９７ＺＡ＿ＳＯＳＩＰ．ｖ２  Ｅｎｖ，ＨＩＶ１７１８１０）の配列は、配列番号３０に提供される。このタンパク質の融解温度は、ＤＳＣによって測定して８０．２℃である。
【０２７１】
実施例１１：別のクレードＣ野生型エンベロープタンパク質配列に基づく組換え体ＨＩＶエンベロープタンパク質バリアント
クレードＣ株Ｄｕ４２２由来のＥｎｖタンパク質中にＳＯＳＩＰ変異を導入し、２つのグリカンホールを２９５位及び３８６位においてＫ２９５Ｎ及びＤ３８６Ｎ変異によってふさいだ。加えて、いくつかの残基を実施例１２及び図１３に記載の概念的フレームワークに従って矯正し（Ｖ２７２Ｉ、Ｗ４５６Ｒ、Ｇ４６６Ｅ、及びＦ６４３Ｙ）、安定化置換Ｌ５５６Ｐ、Ｉ５３５Ｎ、Ｎ６５１Ｆ及びＤ５８９Ｖを導入した。全ての追加の置換により、より高い三量体の収量及び三量体の割合を得た（例えば、図１２）。
【０２７２】
これらの４つの安定化変異を有する特定の試験されたバリアント（配列番号２５）において、追加のＫ６５５Ｉ置換が更に、三量体の収量及び三量体の割合をそれぞれ１．３倍及び１．４倍増加させた（データは示さず）。
【０２７３】
この時点で、発現レベル、三量体形成及び広域中和抗体への結合における好ましい特性の組み合わせに基づく、特定の好ましいＤｕ４２２＿ＳＯＳＩＰ  Ｅｎｖバリアントは次の変異を有するものである：Ｌ５５６Ｐ、Ｋ６５５Ｉ、Ｍ５３５Ｎ、Ｎ６５１Ｆ、Ｄ５８９Ｖ、Ｋ５８８Ｅ、Ｉ２０１Ｃ、Ａ４３３Ｃ、Ｖ２７２Ｉ、Ｗ４５６Ｒ、Ｇ４６６Ｅ、Ｆ６４３Ｙ、Ｄ３８６Ｎ、及びＫ２９５Ｎ。このバリアント（安定化及び矯正されたＤｕ４２２＿ＳＯＳＩＰ  Ｅｎｖ（ＨＩＶ１７０８５９）の配列は、配列番号２６に提供される。このバリアントについてのデータは、例えば、図１４に示され（その中の安定化及び矯正されたＤｕ４２２を参照されたい）、これは元のｗｔ  Ｄｕ４２２  Ｅｎｖ分子と比較して、広域中和抗体結合における非常に大きな増加を示す。
【０２７４】
更に好ましいバリアントは「ＤＳ」変異及びＫ６５８Ｖを更に含み、このバリアント（矯正及び安定化されたＤｕ４２２＿ＳＯＳＩＰ．ｖ１  Ｅｎｖ、ＨＩＶ１７１８１２）の配列は、配列番号３１に提供される。このタンパク質の融解温度は、ＤＳＣによって測定して７８．９℃である。
【０２７５】
実施例１２：矯正及び安定化する各種ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ配列
感染した患者から単離されたウイルス由来のｗｔ配列は、適切なフォールディングを阻害する不安定化変異を獲得した可能性があるため、クレードＣ  Ｃ９７ＺＡ、ＤＵ４２２、及びモザイクｓＣ４のｗｔ  Ｅｎｖ配列を最初に矯正した。
【０２７６】
野生型配列において最適でない変異を検索するために、ＵｎｉＰｒｏｔデータベース及びＬｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  ＨＩＶデータベース（約９０．０００配列）における全てのＨＩＶ−１  Ｅｎｖ配列のアラインメントを行い、各アミノ酸のアミノ酸分布を計算した。概して、図１３に記載の概念的フレームワークに従って、ｗｔ  Ｅｎｖ配列中のいくつかの比較的まれに存在するアミノ酸をより一般的なアミノ酸に置換した（データベース中の対応する位置における頻度に基づいて）。
【０２７７】
更に、Ｃ９７ＺＡ＿ＳＯＳＩＰの尖部に２つの追加の置換Ｙ３５３Ｆ及びＱ１７１Ｋが導入されて、場合によっては抗体を標的化する尖部の結合を向上させ、また、追加のグリカン部位は、これらの潜在的Ｎ−グリコシル化部位（ＰＮＧＳ）が５０％を超えて保存されていたため、Ｄ４１１Ｎ、Ｋ２３６Ｔ及びＶ２９５Ｎの置換により導入された。次に、前の実施例に記載の安定化置換を矯正された配列に移入させた。
【０２７８】
安定化されたＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰは、置換Ａ２０４Ｉ、Ｉ５３５Ｎ、Ｉ５７３Ｆ、Ｋ５８８Ｅ、Ｄ５８９Ｖ、Ｎ６５１Ｆ、及びＫ６５５Ｉを含有する（安定化されたＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ）。安定化されたＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰの完全な配列は配列番号２０において提供される。
【０２７９】
バリアントＥｎｖタンパク質及びそれらの変異のいくつかの概要が表３に提供される。
【０２８０】
【表３】
2020527046.tif 000004
【０２８１】
【表４】
2020527046.tif 000005
【０２８２】
【表５】
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【０２８３】
表３．本明細書に記載のいくつかのＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質バリアント。縦列「文献由来の変異」には、これらのコンストラクトにおいて使用され、且つ他の人たちによって過去に記載された変異を記載する。縦列「追加されたＰＮＧＳ」には、潜在的Ｎ−グリコシル化部位（多くの野生型Ｅｎｖタンパク質がこのような部位を含む位置での）を追加する変異を記載する。縦列「リーダー配列」には、リーダー配列が元の（天然の）リーダー配列でなかった場合に、どのリーダー配列が発現のために使用されたかを記載する。縦列「矯正変異」には、実施例１２及び図１３に記載のように、野生型Ｅｎｖタンパク質のいくつかのうちのフォールディング及び安定性（ｂＮＡｂへの結合に基づいて、三量体の収量及び割合として測定される）を向上させる変異を記載する。縦列「安定化変異」には、本明細書に開示されるようにタンパク質を安定化し、三量体形成を向上させる、表１及び２からの変異を記載する。縦列「更なる変異」には、いくつかのコンストラクトのためになされた追加の変異を記載する。縦列「終端」には、最後のアミノ酸の位置を記載する（表全体にわたるナンバリングは、ＨＸＢ２  Ｅｎｖ配列に関する）。
【０２８４】
野生型（ｗｔ）の矯正及び安定化されたＥｎｖバリアントにより一過的にトランスフェクトされた細胞の上清を、尖部を対象とする三量体特異性のいくつかの広域中和抗体への結合について試験した。矯正置換、及び特に安定化置換は、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（図１４）及びＳＥＣ−ＭＡＬＳ（図１５）で測定して、三量体の含有量に劇的な影響を有していた（図１４及び１５）。
【０２８５】
矯正及び安定化されたＤＳ＿ｓＣ４  Ｅｎｖタンパク質（矯正及び安定化されたＤＳ＿ｓＣ４＿ＳＯＳＩＰ  Ｅｎｖ（ＨＩＶ１７０６８６））の好ましいバリアントの配列は、配列番号２７において提供される。
【０２８６】
別の好ましいそのバリアントは、配列番号３２において提供される（矯正及び安定化されたｓＣ４＿ＳＯＳＩＰ．ｖ４  Ｅｎｖ）。このタンパク質の融解温度は、ＤＳＣによって測定して８２．８℃である。
【０２８７】
実施例１３：本発明の安定化変異は、ＳＯＳＩＰ変異の不存在下で機能する
前の実施例で示すように、７つの変異（Ａ２０４Ｉ、Ｉ５３５Ｎ、Ｉ５７３Ｆ、Ｋ５８８Ｅ、Ｄ５８９Ｖ、Ｎ６５１Ｆ、及びＫ６５５Ｉ）は、ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰにおける三量体の収量及び割合を向上させた（「ＣｏｎＣ＿ｂａｓｅ」又は「安定化されたＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ」又は「ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ  ７ｍｕｔ」をもたらす）（例えば、図１４及び１６）。
【０２８８】
本実施例は、各種ＳＯＳＩＰ変異（すなわち、「ＳＯＳ」変異：５０１位及び６０５位でのＣｙｓ残基による２つの置換；並びに「ＩＰ変異」：５５９位でのＰｒｏ残基による置換）は、更なる安定化に寄与するが、本発明の変異から利益を得るために必要ではないことを実証する。
【０２８９】
７つの変異は、図１６（ＣｏｎＣ＿ＳＯＳとＣｏｎＣ＿ＳＯＳ，７ｍｕｔとを比較する）に示されるように、安定化Ｉ５５９Ｐ変異（「ＩＰ」変異）を含有しない、いわゆるＣｏｎＣ＿ＳＯＳにおいて三量体の収量を向上させることも示された。したがって、「ＩＰ」変異は、本明細書に記載の変異からの利益を得るために必須ではない。Ｉ５５９Ｐ変異の追加が大幅な向上をもたらしたが、これは、「ＩＰ」変異が本発明の７つの変異に加えてこのコンストラクトにおいて有益であることを示す。安定化ＩＰ変異（Ｉ５５９Ｐ）はまた、Ａ５５８Ｐ又はＬ５５６Ｐによって置き換えられ得るが、これらの両方はまた、Ｉ５５９Ｐ変異を欠くバリアントと比較して大幅な向上をもたらす。
【０２９０】
また、上記の本発明の７つの変異を含有するが、「ＳＯＳ」変異を欠くＣｏｎＣ＿ＩＰ，７ｍｕｔはなお、非常に高い三量体の収量を示したが、これは、実施例７における観察と一致して、「ＳＯＳ」変異もまた、本明細書に記載の変異から利益を得るために必須ではないことを実証している（例えば、ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰとＣｏｎＣ＿ＩＰ，７ｍｕｔとを比較する）。「ＳＯＳ」変異の追加は更に三量体の収量を向上させる。
【０２９１】
したがって、本明細書に記載の安定化変異を含有するＥｎｖ三量体は、ＳＯＳＩＰ変異による更なる安定化から利益を得るが、３つのＳＯＳＩＰ変異は、本明細書に記載の安定化変異の利益（例えば、三量体の収量の向上）を得るために必要ではない。
【０２９２】
実施例１４：６４７位、６５１位又は６５５位でのメチオニン置換が三量体の品質を向上させる
実施例２に記載の変異に更に加えて、ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ（配列番号３）バックボーンにおいて、５８９位、６４７位、６５１位及び６５５位をＭｅｔ残基によって個別に置換し、三量体形成の割合及び収量について上記の方法を使用して試験した。実施例２に記載の変異のように、６４７位、６５１位又は６５５位におけるＭｅｔは、図１７で見ることができるように、三量体の品質を向上させた（より高い三量体の割合及び収量、ｂＮＡｂ結合の向上）ことが示された。
【０２９３】
したがって、６５１位でのＰｈｅ、Ａｌａ、又はＴｒｐによる置換に加えて、６５１位でのＭｅｔによる置換もまた三量体形成を向上させ；６５５位でのＰｈｅ、Ｉｌｅ、又はＴｒｐによる置換に加えて、６５５位でのＭｅｔによる置換もまた三量体形成を向上させ；且つ６４７位でのＰｈｅ又はＩｌｅによる置換に加えて、６４７位でのＭｅｔによる置換もまた三量体形成を向上させる。
【０２９４】
実施例１５．安定化されたＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質による免疫化
ウサギ免疫化の研究を、実施例７に記載されるようにリポソームに結合したＥｎｖタンパク質を用いて実施した。初回免疫（ｐｒｉｍｅ）を、Ｎｉ−ＮＴＡリポソーム上にディスプレイされた安定化したＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ．ｖ３（配列番号２８）を用いて予備形成し、続いて４つの追加免疫（ｂｏｏｓｔｓ）を、共有結合クリックリポソームを用いて予備形成し、それぞれが別のタンパク質、すなわち１）矯正及び安定化されたｓＣ４＿ＳＯＳＩＰ．ｖ４（配列番号３２）；２）矯正及び安定化されたＣ９７ＺＡ＿ＳＯＳＩＰ．ｖ２（配列番号３０）；３）矯正及び安定化されたＤｕ４２２＿ＳＯＳＩＰ．ｖ１（配列番号３１）；及び４）安定化されたＢＧ５０５＿ＳＯＳＩＰ．ｖ２（配列番号２９）を有した。
【０２９５】
連続的な免疫化後に血清を単離し、Ｅｎｖの安定し、閉じた、融合前の高次構造に特に結合する誘導された抗体について（ＥＬＩＳＡを使用して）、及びｂＮＡｂの誘導について（ウイルス中和アッセイを使用して）分析する。
【０２９６】
これまでのところ、血清は、初回免疫並びに追加免疫１、２、及び３後に単離され、ウイルス中和アッセイを使用して異種Ｔｉｅｒ２中和Ａｂの誘導について分析された。データを図１９に示す。７体中７体の動物の血清において、少なくとも２つの異なる異種Ｔｉｅｒ２  クレードＣ偽ウイルスに対する中和活性が観察され、これは、Ｅｎｖ免疫化された動物中ではシャム注射を受けた対照の動物と比較して異種Ｔｉｅｒ２  ＮＡｂの誘導が制限されることを示す。現在までに、ウサギ免疫原性モデルにおける同程度の異種Ｔｉｅｒ２中和を報告した研究グループはほとんど存在しない。
【０２９７】
実施例１６．非常に低レベルの三量体を形成することが知られているいくつかのｗｔクレードＣ  ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質の矯正及び安定化
クレードＣ株ＺＭ２３３Ｍ由来のＥｎｖタンパク質中に、文献（Ｊｕｌｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１５（上記））から知られる最もフォールディングの劣るＥｎｖであるＳＯＳＩＰ変異が導入された。更に、実施例１２及び図１３で説明される概念的フレームワークに基づいて多くの残基（Ｓ６７Ｎ、Ｉ１５６Ｎ、Ｖ１７４Ａ、Ｖ４１４Ｉ、Ｍ３３Ｎ、Ｔ３４７Ｋ、Ｈ６３８Ｙ、Ａ３９４Ｔ、Ｆ２７４Ｓ、Ｔ４７１Ｇ、Ｓ３１６Ｔ、Ｖ３２３Ｉ、Ｌ４１０Ｓ、Ｙ１３４Ｖ、Ａ３３５Ｅ、Ｉ３９５Ｙ、Ａ６５Ｖ、Ｄ１３０Ｎ、Ａ６１２Ｓ、Ｉ１１１Ｌ、Ｓ１９５Ｎ、Ｎ４７７Ｄ、Ｋ１５２Ｅ、Ｌ１８１Ｉ、Ｓ４６３Ｎ）が矯正され、また安定化置換Ｍ５３５Ｎ、Ｌ５５６Ｐ、Ｋ５８８Ｅ、Ｄ５８９Ｖ、Ｎ６５１Ｆ、Ｋ６５５Ｉ、Ｋ６５８Ｖが導入された。このバリアント（安定化及び矯正されたＺＭ２３３Ｍ  Ｅｎｖ（ＨＩＶ１７２５２０））の配列は、配列番号３５において提供される。このバリアントについてのデータは、例えば、図１４に示され（その中の安定化及び矯正されたＺＭ２３３Ｍを参照されたい）、これは元のｗｔ  ＺＭ２３３Ｍ  ＳＯＳＩＰ  Ｅｎｖ分子と比較して、広域中和抗体結合における非常に高い増加を示す。
【０２９８】
クレードＣ株ＣＮ９７００１由来のＥｎｖタンパク質中には、ＳＯＳＩＰ変異が導入された。更に、実施例１２及び図１３で説明される概念的フレームワークに基づいていくつかの残基が矯正され（Ｙ１８７ｂＮ、Ａ７７Ｔ、Ｉ２３２Ｔ、Ｖ３３Ｎ、Ｑ３５４Ｐ、Ｅ９９Ｄ、Ｐ４６２Ｎ、Ｔ１８５Ｎ、Ｔ４９Ｋ、Ｑ１０５Ｈ、Ｎ１０２Ｄ、Ｖ５２５Ａ、Ｒ１３２Ｔ、Ｅ１３０Ｎ、Ｖ１６４Ｅ、Ｎ４７７Ｄ、Ｔ２１９Ａ；注記：１８７ｂ位はＨＸＢ２中に存在しない位置である：こうした残基の場合、典型的には、全ての挿入されたアミノ酸残基のＨＸＢ２残基に対し、対応する最後のアミノ酸の後ろに文字が追加される（例えば１８７ａ、１８７ｂなど））、安定化置換Ｍ５３５Ｎ、Ｌ５５６Ｐ、Ｋ５８８Ｅ、Ｄ５８９Ｖ、Ｎ６５１Ｆ、Ｋ６５５Ｉ、Ｋ６５８Ｖが導入された。このバリアント（安定化及び矯正されたＥｎｖ  ＣＮ９７００１（ＨＩＶ１７２５２３））の配列は、配列番号３６において提供される。このバリアントについてのデータは、例えば、図１４に示され（その中の安定化及び矯正されたＣＮ９７００１を参照されたい）、これは元のｗｔ  ＣＮ９７００１  ＳＯＳＩＰ  Ｅｎｖ分子と比較して、広域中和抗体結合における非常に高い増加を示す。
【０２９９】
クレードＣ株ＺＭ２４６Ｆ由来のＥｎｖタンパク質中には、ＳＯＳＩＰ変異が導入された。更に、実施例１２及び図１３で説明される概念的フレームワークに基づいていくつかの残基が矯正され（Ｓ１１３Ｄ、Ｒ３３９Ｎ、Ｐ６３Ｋ、Ｋ４１５Ｔ、Ｋ１７２Ｅ、Ｔ１５３Ｅ、Ｓ３３５Ｅ、Ｓ１６０Ｎ、Ｉ３０３Ｔ、Ｋ４４８Ｎ、Ｉ４４４Ｔ、Ｇ３４７Ｋ、Ｑ１０６Ｅ、Ｇ２９３Ｅ、Ｉ１３５Ｎ）、安定化置換Ｍ５３５Ｎ、Ｌ５５６Ｐ、Ｋ５８８Ｅ、Ｄ５８９Ｖ、Ｎ６５１Ｆ、Ｋ６５５Ｉ、Ｋ６５８Ｖが導入された。このバリアント（安定化及び矯正されたＥｎｖ  ＺＭ２４６Ｆ（ＨＩＶ１７２５２６））の配列は、配列番号３７において提供される。このバリアントについてのデータは、例えば、図１４に示され（その中の安定化及び矯正されたＺＭ２４６Ｆを参照されたい）、これは元のｗｔ  ＺＭ２４６Ｆ  ＳＯＳＩＰ  Ｅｎｖ分子と比較して、広域中和抗体結合における非常に高い増加を示す。
【０３００】
Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＤＭ３０３３７．１のクレードＣ株由来のＥｎｖタンパク質中に、ＳＯＳＩＰ変異が導入された。更に、実施例１２及び図１３で説明される概念的フレームワークに基づいていくつかの残基が矯正され（Ｓ７２Ｈ、Ｄ２３４Ｎ、Ｒ６５１Ｎ、Ｆ６０２Ｌ、Ｙ６２１Ｄ、Ｖ４１３Ｔ、Ｖ３１６Ｔ、Ｖ５４４Ｌ）、安定化置換Ｍ５３５Ｎ、Ｌ５５６Ｐ、Ｋ５８８Ｅ、Ｄ５８９Ｖ、Ｎ６５１Ｆ、Ｋ６５５Ｉ、Ｋ６５８Ｖが導入された。このバリアント（安定化及び矯正されたＥｎｖ  ＡＤＭ３０３３７．１（ＨＩＶ１７２５１７））の配列は、配列番号３８において提供される。このバリアントについてのデータは、例えば、図１４に示され（その中の安定化及び矯正されたＡＤＭ３０３３７．１を参照されたい）、これは元のｗｔ  ＡＤＭ３０３３７．１  ＳＯＳＩＰ  Ｅｎｖ分子と比較して、広域中和抗体結合における非常に高い増加を示す。
【０３０１】
この実施例は、本明細書に記載される方法は、非常に低い（すなわち、報告される最も低いものの内である）三量体形成レベルを有すると知られるタンパク質を含む多種多様なＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質に対して使用することができ、また、こうしたタンパク質の三量体形成レベルは更に劇的に向上させることができ、これは、本明細書で開示される方法及び置換に、ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質の三量体形成を向上させるための汎用性があることを示すことを実証する。
【０３０２】
実施例１７．６５８位での変異によるクレードＢ株の安定化
ＣｏｎＢ＿ＳＯＳＩＰ（配列番号５）中で、上記の実施例で説明されたクレードＣ  Ｅｎｖ及びクレードＡ  Ｅｎｖ中で観察された三量体の収量の向上の他に、Ｑ６５８Ｖの置換によって、トランスフェクション後に細胞培養上清を用いる分析的ＳＥＣにおいて三量体の収量が向上し（図１８）、これは６５８ＶがクレードＢの三量体の収量を向上させることを示す。
【０３０３】
実施例１８．膜結合性コンセンサスＣ  ＳＯＳＩＰ中での安定化変異
ＨＥＫ２９３Ｆ細胞を、安定化アミノ酸置換Ａ２０４Ｉ、Ｉ５３５Ｎ、Ｉ５７３Ｆ、Ｋ５８８Ｅ、Ｄ５８９Ｖ、Ｎ６５１Ｆ、及びＫ６５５Ｉを含むか又は含まないかのいずれかの、膜結合性全長（ＦＬ）コンセンサスＣ（ＣｏｎＣ）ＳＯＳＩＰ（配列番号４４）を発現させるＤＮＡコンストラクトでトランスフェクトした。トランスフェクション後の２日間、細胞は、広域中和抗体及び非広域中和抗体（ｂＮＡｂ及び非ｂＮＡｂ）のパネルでインキュベートされ、蛍光活性化セルソータ（ＦＡＣＳ）を用いて、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７（ＡＦ６４７）とラベリングされた抗ヒト二次抗体によって検出された。統合平均蛍光強度（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｍｅｄｉａｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）（ｉＭＦＩ）を、ＡＦ６４７陽性細胞の頻度をＭＦＩで乗算することによって計算して、応答の大きさ及び品質の両方を組み込む測定基準を提供した（例えば、Ｄａｒｒａｈ  ＰＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２００７，１３（７）：８４３−５０）。データは、図２０の安定化変異（ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ＿ＦＬ）を有さないバックボーンコンストラクトに対する倍率変化として示される。全体的に、膜結合性の文脈におけるｂＮＡｂ  ｉＭＦＩに対する安定化変異の効果は限定的であるように見え、バックボーンと比較して、１０個のｂＮＡｂのうち１個はより高いシグナルを示し、１０個のｂＮＡｂのうち２個はより低いシグナルを示す。しかしながら、８個の非ｂＮＡｂの全ては、安定化変異の存在下でｉＭＦＩの低下を示し、これは、膜結合性の文脈においてこれらの置換の有益な効果を実証する。
【０３０４】
膜結合性の安定したＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ  Ｅｎｖバリアントをコードする核酸配列が、アデノウイルス（血清型２６）ベクターにクローニングされた。本発明の膜結合性の安定したＥｎｖバリアントをコードするアデノウイルスベクターも、ワクチン接種に用いることができる。
【０３０５】
上記の実施例は、本発明が、融合前の閉じたＨＩＶエンベロープ三量体タンパク質のフォールディング及び安定性を最適化するための普遍的なアプローチを提供することを実証している。
【０３０６】
本明細書に記載の実施例及び実施形態は例示の目的のためのものにすぎず、その広範な発明概念から逸脱することなく上記の実施形態に対する変更が可能であることは理解されよう。したがって、本発明は、開示されている特定の実施形態に限定されるのではなく、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の趣旨及び範囲に含まれる変形例を包含すると意図されていることが理解されよう。  
【０３０７】
配列のリスト
配列番号１  ＨＩＶ−１単離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０（シグナル配列は斜体であり；表１の位置（ｉ）〜（ｖｉｉ）におけるアミノ酸は灰色の網掛けで示され；６５８位におけるアミノ酸は下線付き且つ太字である）
【化１】
2020527046.tif 000007
【０３０８】
配列番号２  ＨＩＶ  ＥｎｖコンセンサスクレードＣ（コンセンサス配列のみ、いずれのシグナル配列も含まない、膜貫通ドメイン（６６４が最後のアミノ酸）、ＳＯＳＩＰ変異、及び／又はフューリン切断部位変異；表１の位置（ｉ）〜（ｖｉｉ）におけるアミノ酸は灰色の網掛けで示され；６５８位におけるアミノ酸は下線付き且つ太字である）
【化２】
2020527046.tif 000008
【０３０９】
配列番号３  ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ（ＳＯＳＩＰ変異及びフューリン切断部位（斜体）並びにＣ末端トランケーションを有する成熟クレードＣコンセンサス配列；表１の位置（ｉ）〜（ｖｉｉ）におけるアミノ酸は灰色の網掛けで示され；６５８位におけるアミノ酸は下線付き且つ太字である）
【化３】
2020527046.tif 000009
【０３１０】
配列番号４  ＨＩＶ  ＥｎｖコンセンサスクレードＢ（コンセンサス配列のみ、いずれのシグナル配列も含まない、膜貫通ドメイン（６６４が最後のアミノ酸）、ＳＯＳＩＰ変異、及び／又はフューリン切断部位変異；表１の位置（ｉ）〜（ｖｉｉ）におけるアミノ酸は灰色の網掛けで示され；６５８位におけるアミノ酸は下線付き且つ太字である）
【化４】
2020527046.tif 000010
【０３１１】
配列番号５  ＣｏｎＢ＿ＳＯＳＩＰ（ＳＯＳＩＰ変異及びフューリン切断部位（斜体）並びにＣ末端トランケーションを有する成熟クレードＢコンセンサス配列；表１の位置（ｉ）〜（ｖｉｉ）におけるアミノ酸は灰色の網掛けで示され；６５８位におけるアミノ酸は下線付き且つ太字である）
【化５】
2020527046.tif 000011
【０３１２】
配列番号６  合成ＨＩＶエンベロープタンパク質Ｍｏｓ２Ｓ  Ｅｎｖ  Ｃ４断片；表１の位置（ｉ）〜（ｖｉｉ）におけるアミノ酸は灰色の網掛けで示される）
【化６】
2020527046.tif 000012
【０３１３】
配列番号７（ＤＳ＿ｓＣ４＿ＳＯＳＩＰ＿Ｅ１６６Ｒ配列；表１の位置（ｉ）〜（ｖｉｉ）におけるアミノ酸は灰色の網掛けで示される）
【化７】
2020527046.tif 000013
【０３１４】
配列番号８（Ｍｏｓ１．Ｅｎｖ、モザイクＨＩＶエンベロープタンパク質配列；表１の位置（ｉ）〜（ｖｉｉ）におけるアミノ酸は灰色の網掛けで示される）
【化８】
2020527046.tif 000014
【０３１５】
配列番号９（Ｍｏｓ２．Ｅｎｖ、モザイクＨＩＶエンベロープタンパク質配列；表１の位置（ｉ）〜（ｖｉｉ）におけるアミノ酸は灰色の網掛けで示される）
【化９】
2020527046.tif 000015
【０３１６】
配列番号１０（フューリン切断部位変異体配列）
ＲＲＲＲＲＲ
【０３１７】
配列番号１１（シグナル配列の例（例えば、ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ、及びいくつかの野生型由来バリアントのために使用される））
ＭＲＶＲＧＩＬＲＮＷＱＱＷＷＩＷＧＩＬＧＦＷＭＬＭＩＣＮＶＶＧ（注記：最後のＶＧは、成熟タンパク質の開始、又はシグナル配列の終端になり得る）
【０３１８】
配列番号１２（ＨＲ１ループを置換できる８アミノ酸配列の例）
ＮＰＤＷＬＰＤＭ
【０３１９】
配列番号１３（ＨＲ１ループを置換できる８アミノ酸配列の例）
ＧＳＧＳＧＳＧＳ
【０３２０】
配列番号１４（ＨＲ１ループを置換できる８アミノ酸配列の例）
ＤＤＶＨＰＤＷＤ
【０３２１】
配列番号１５（ＨＲ１ループを置換できる８アミノ酸配列の例）
ＲＤＴＦＡＬＭＭ
【０３２２】
配列番号１６（ＨＲ１ループを置換できる８アミノ酸配列の例）
ＤＥＥＫＶＭＤＦ
【０３２３】
配列番号１７（ＨＲ１ループを置換できる８アミノ酸配列の例）
ＤＥＤＰＨＷＤＰ
【０３２４】
配列番号１８（シグナル配列の例（例えば、ＣｏｎＢ＿ＳＯＳＩＰのために使用される）
ＭＲＶＫＧＩＲＫＮＹＱＨＬＷＲＷＧＴＭＬＬＧＭＬＭＩＣＳＡ
【０３２５】
配列番号１９（ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイにおけるＨＩＶ  ｇｐ１４０コンストラクトのために使用されるタグ）
ＡＡＡＬＰＥＴＧＧＧＳＤＹＫＤＤＤＤＫＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＨＨＨＨＨＨ
【０３２６】
配列番号２０（安定化されたＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ、「ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ＿７ｍｕｔ」（ＨＩＶ１６０５４４））
【化１０】
2020527046.tif 000016
【０３２７】
配列番号２１（ＢＧ５０５＿ＳＯＳＩＰ  Ｅｎｖタンパク質（ＨＩＶ１５０６７３））
【化１１】
2020527046.tif 000017
【０３２８】
配列番号２２（安定化されたＢＧ５０５＿ＳＯＳＩＰ  Ｅｎｖタンパク質（ＨＩＶ１７０８６３））
【化１２】
2020527046.tif 000018
【０３２９】
配列番号２３（Ｌ５３５Ｍ及びＱ５６７Ｋを有するｗｔ  Ｃ９７ＺＡ＿ＳＯＳＩＰ  Ｅｎｖタンパク質（ＨＩＶ１５０６７３））
【化１３】
2020527046.tif 000019
【０３３０】
配列番号２４（矯正及び安定化されたＣ９７ＺＡ＿ＳＯＳＩＰ  Ｅｎｖタンパク質（ＨＩＶ１７０６９０））
【化１４】
2020527046.tif 000020
【０３３１】
配列番号２５（矯正及び安定化されたＤｕ４２２コンストラクトのバリアント（ＨＩＶ１６１８１８））
【化１５】
2020527046.tif 000021
【０３３２】
配列番号２６（矯正及び安定化されたＤｕ４２２＿ＳＯＳＩＰ（ＨＩＶ１７０８５９））
【化１６】
2020527046.tif 000022
【０３３３】
配列番号２７（矯正及び安定化されたＤＳ＿ｓＣ４＿ＳＯＳＩＰ（ＨＩＶ１７０６８６））
【化１７】
2020527046.tif 000023
【０３３４】
配列番号２８（安定化されたＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ．ｖ３（ＨＩＶ１７０６５４））
【化１８】
2020527046.tif 000024
【０３３５】
配列番号２９（安定化されたＢＧ５０５＿ＳＯＳＩＰ．ｖ２（ＨＩＶ１７１８１４））
【化１９】
2020527046.tif 000025
【０３３６】
配列番号３０（矯正及び安定化されたＣ９７ＺＡ＿ＳＯＳＩＰ．ｖ２（ＨＩＶ１７１８１０））
【化２０】
2020527046.tif 000026
【０３３７】
配列番号３１（矯正及び安定化されたＤｕ４２２＿ＳＯＳＩＰ．ｖ１（ＨＩＶ１７１８１２））
【化２１】
2020527046.tif 000027
【０３３８】
配列番号３２（安定化及び矯正されたｓＣ４＿ＳＯＳＩＰ．ｖ４）
【化２２】
2020527046.tif 000028
【０３３９】
配列番号３３（シグナル配列の例（例えば、ＤＳ＿ｓＣ４＿ＳＯＳＩＰバリアントのために使用される））
ＭＲＶＲＧＭＬＲＮＷＱＱＷＷＩＷＳＳＬＧＦＷＭＬＭＩＹＳＶ
【０３４０】
配列番号３４  シグナル配列の例（例えば、ＢＧ５０５＿ＳＯＳＩＰバリアントのために使用される））
ＭＲＶＭＧＩＱＲＮＣＱＨＬＦＲＷＧＴＭＩＬＧＭＩＩＩＣＳＡ
【０３４１】
配列番号３５（安定化及び矯正されたＺＭ２３３Ｍ＿ＳＯＳＩＰ  （ＨＩＶ１７２５２０））
【化２３】
2020527046.tif 000029
【０３４２】
配列番号３６（安定化及び矯正されたＣＮ９７００１＿ＳＯＳＩＰ（ＨＩＶ１７２５２３））
【化２４】
2020527046.tif 000030
【０３４３】
配列番号３７（安定化及び矯正されたＺＭ２４６Ｆ＿ＳＯＳＩＰ（ＨＩＶ１７２５２６））
【化２５】
2020527046.tif 000031
【０３４４】
配列番号３８（安定化及び矯正されたＡＤＭ３０３３７．１＿ＳＯＳＩＰ（ＨＩＶ１７２５１７））
【化２６】
2020527046.tif 000032
【０３４５】
配列番号３９（シグナル配列の例（例えば、ＺＭ２３３Ｍのために使用される））
ＭＲＶＲＧＩＭＲＮＷＱＱＷＷＩＷＧＳＬＧＦＷＭＬＩＩＣＮＶｎＧ
【０３４６】
配列番号４０（シグナル配列の例（例えば、ＣＮ９７００１のために使用される））
ＭＲＶＴＧＩＲＫＮＹＲＨＬＷＲＷＧＴＭＬＬＧＭＬＭＩＳＳＡ
【０３４７】
配列番号４１（シグナル配列の例（例えば、ＺＭ２４６Ｆのために使用される））
ＭＲＶＭＧＩＬＲＮＣＱＱＷＷＩＷＳＩＬＧＦＬＭＩＹＳＶＩＧ
【０３４８】
配列番号４２（シグナル配列の例（例えば、ＡＤＭ３０３３７．１のために使用される））
ＭＲＶＲＧＩＬＲＮＹＰＱＷＷＩＷＧＩＬＧＦＷＭＬＭＮＣＮＧ
【０３４９】
配列番号４３（シグナル配列の例（例えば、Ｃ９７ＺＡのために使用される））
ＭＲＶＲＧＩＰＲＮＷＰＱＷＷＭＷＧＩＬＧＦＷＭＩＩＩＣＲＶＶＧ
【０３５０】
配列番号４４（全長ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ（斜体のシグナル配列を含む））
【化２７】
2020527046.tif 000033
【０３５１】
参考文献
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１６．Ｈｅ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ（２０１６）Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．２０１６  Ｊｕｎ  ２８；７：１２０４１．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１２０４１
１７．国際公開第２０１１０８２０８７号パンフレット
１８．Ｋｅｓａｖａｒｄｈａｎａ  Ａ  ａｎｄ  Ｖａｒａｄａｒａｊａｎ  Ｒ（２０１４）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８８：９５９０−９６０４
１９．Ｇｕｅｎａｇａ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ（２０１７）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４６：７９２−８０３
２０．Ｂａｌｅ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ（２０１７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．００４４３−１７
２１．Ａｂｂｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ  （２００７）  Ｖｉｒｏｌ．８１（９）：４６５４−６４
２２．Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦ  ｅｔ  ａｌ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２
２３．Ｈａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ（２０１１）ＰＮＡＳ１０８（２８）：１１４４０−１１４４５
２４．Ｋｕｓｈｎｉｒ  ｅｔ  ａｌ（２０１２）Ｖａｃｃｉｎｅ（３１）：５８−８３
２５．国際公開第２００７／１０４７９２号パンフレット
２６．国際公開第２０１４／１２４３０１号パンフレット
２７．米国特許出願公開第２０１６／０１２２３９２号明細書
２８．Ｉｎｇａｌｅ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．（２０１６）１５：１９８６−９９．
２９．Ｂａｋ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．（２０１６）２７：１６７３−８０．
３０．Ｄａｒｒａｈ  ＰＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ．（２００７）１３：８４３−５０．
【図１】
2020527046.tif 000034
【図２−１】
2020527046.tif 000035
【図２−２】
2020527046.tif 000036
【図３−１】
2020527046.tif 000037
【図３−２】
2020527046.tif 000038
【図３−３】
2020527046.tif 000039
【図４】
2020527046.tif 000040
【図５−１】
2020527046.tif 000041
【図５−２】
2020527046.tif 000042
【図６】
2020527046.tif 000043
【図７−１】
2020527046.tif 000044
【図７−２】
2020527046.tif 000045
【図７−３】
2020527046.tif 000046
【図７−４】
2020527046.tif 000047
【図８】
2020527046.tif 000048
【図９−１】
2020527046.tif 000049
【図９−２】
2020527046.tif 000050
【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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