(57)【要約】  抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を調製するための方法。特に、当該方法は、ＡＤＣ薬の固相調製を実現するために、主に、静電相互作用による抗体生体分子とイオン交換担体との組み合わせを利用する。薬物−抗体カップリング比（ＤＡＲ）を制御してポリマーカップリング薬物を分離し、カップリング反応において使用される薬物の量を減らし、ＡＤＣ薬の標的の治療効果を高めるために、溶出条件を最適化する。当該調製するための方法は、より少ないステップ、シンプルな操作、およびプログラマブル制御を特徴とし、工業的生産規模拡大を容易にし、さらに、調製プロセスにおける還元剤および有機溶媒のゼロ保持を実現し、薬物安全性を著しく向上させ、ならびに製造コストを削減する。
2020518655.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原結合性タンパク質−薬物コンジュゲートを調製する方法であって、以下のステップ、
１）抗原結合性タンパク質をイオン交換担体上に固定することにより、固定された抗原結合性タンパク質を形成するステップと、
２）前記固定された抗原結合性タンパク質を薬物と接触させることにより、抗原結合性タンパク質−薬物コンジュゲートを形成するステップと、
３）前記抗原結合性タンパク質−薬物コンジュゲートを前記イオン交換担体から溶出させるステップと、を含む方法。
【請求項２】
前記イオン交換担体が、イオン交換樹脂、イオン交換膜、イオン交換繊維、好ましくは前記イオン交換樹脂、からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記イオン交換担体がカチオン交換担体であり、前記カチオン交換担体は、好ましくは、強酸性反応配位子を含み、前記強酸性反応配位子は、好ましくは、スルホネートである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ２）における前記固定された抗原結合性タンパク質が、薬物にカップリングされ、カップリング反応が、前記抗原結合性タンパク質および前記薬物が求核基と求電子基との間の相互作用によって結合される反応であり、
この場合、前記求核基は、場合により、前記抗原結合性タンパク質または前記薬物、好ましくは、前記抗原結合性タンパク質に由来し、
前記求電子基は、場合により、前記抗原結合性タンパク質または前記薬物、好ましくは、前記薬物に由来する、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
求核基が、メルカプト、ヒドロキシル基、アミノ基、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、およびアリールヒドラジド基からなる群より選択され、ただし、
前記求核基が前記薬物に由来する場合、前記求核基は、好ましくは、メルカプト基であり、
前記求核基が前記抗原結合性タンパク質に由来する場合、前記求核基は、好ましくは、前記アミノ基、前記メルカプト基、または前記ヒドロキシル基であり、ならびに、前記アミノ基は、より好ましくは、Ｎ末端アミノ基、側鎖アミノ基、またはグリコシル化された抗原結合性タンパク質における糖のアミノ基であり、前記ヒドロキシル基は、より好ましくは、前記グリコシル化された抗原結合性タンパク質における糖の前記ヒドロキシル基であり、前記メルカプト基は、より好ましくは、チオール側鎖、最も好ましくは、システインの前記チオール側鎖である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記抗原結合性タンパク質−薬物コンジュゲートが、切断可能リンカーまたは切断不可能リンカーから選択されるリンカーによってカップリングされる、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
求電子基が、活性エステル、ハロゲン化ヒドロカルビル、ハロゲン化ベンジル、アルデヒド、ケトン、カルボキシル基、およびマレイミド基からなる群より選択され、ただし、
前記求電子基が前記抗原結合性タンパク質に由来する場合、前記求電子基は、好ましくは、前記アルデヒド、前記ケトン、前記カルボキシル基、および前記マレイミド基、より好ましくは、前記マレイミド基に由来し、
前記求電子基が前記薬物に由来する場合、前記求電子基は、好ましくは、前記活性エステル、前記ハロゲン化ヒドロカルビル、前記マレイミド基、より好ましくは、前記マレイミド基であり、ならびに、前記活性エステルは、好ましくは、ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメート、酸ハロゲン化物であり、前記ハロゲン化ヒドロカルビルは、好ましくは、ハロアセトアミドである、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記求電子基が、前記薬物自体に由来するか、または、前記薬物の改変に由来する、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記固定された抗原結合性タンパク質が、リシンカップリング、軽鎖と重鎖の鎖間還元的ジスルフィド架橋カップリング、部位特異的カップリング、好ましくは、前記リシンカップリング、前記軽鎖と重鎖の鎖間還元的ジスルフィド架橋カップリング、からなる群より選択される薬物にカップリングされる、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ１）における前記抗原結合性タンパク質が、場合により、改変された抗原結合性タンパク質または改変されていない抗原結合性タンパク質、好ましくは、前記改変された抗原結合性タンパク質、から選択され、前記改変された抗原結合性タンパク質は、場合により、化学試薬または架橋剤に結合する抗原結合性タンパク質、好ましくは、前記架橋剤に結合する改変された抗原結合性タンパク質であり、
この場合、ステップ２）における前記薬物は、場合により、改変されてもまたは改変されなくてもよく、好ましくは、改変される、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記架橋剤が、好ましくは、下記の式（Ｌ２）：
【化１】
2020518655.tif 000037
の化合物を有し、
Ｔは、Ｈ、ｔｅｒｔ−ブチル、アセチル、ｎ−プロピオニル、イソプロピオニル、トリフェニルメチル、メトキシメチル、２−（トリメチルシリル）エトキシメチル、好ましくは、Ｈまたはアセチル、から選択され、
Ｒ１５は、水素原子、ハロゲン、ヒドロキシル基、シアノ基、アルキル基、アルコキシ基、およびシクロアルキル基からなる群より選択され、
Ｒ１６は、アルキル、シクロアルキル、および複素環からなる群より選択され、
ｍは、０〜５、好ましくは、１〜３である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記式（Ｌ２）によって表される前記架橋剤が、式（Ｌ３）：
【化２】
2020518655.tif 000038
の化合物である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記架橋剤が、マレイミド基またはハロアセチル部分を有し、
この場合、前記マレイミド基を有する前記架橋剤は、好ましくは、ＳＭＣＣ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＫＭＵＡ、ＧＭＢＳ、ＥＭＣＳ、ＭＢＳ、ＡＭＡＳ、ＳＭＰＨ、ＳＭＰＢ、およびＰＭＰＩ、より好ましくは、前記ＳＭＣＣ、からなる群より選択され、
前記ハロアセチル部分を有する前記架橋剤は、好ましくは、ＳＩＡＢ、ＳＩＡ、ＳＢＡ、およびＳＢＡＰ、より好ましくは、前記ＳＩＡＢ、からなる群より選択される、
請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記薬物が、毒素、化学療法薬、成長阻害剤、チューブリン阻害剤、抗生物質、放射性同位元素、および細胞毒性剤からなる群より選択される、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記薬物が、マイタンシノイド誘導体、アウリスタチン（auristatin）誘導体、カンプトテシンアルカロイドからなる群より選択され、この場合、前記マイタンシノイド誘導体は、好ましくは、ＤＭ１、ＤＭ３、ＤＭ４から選択され、前記アウリスタチン誘導体は、好ましくは、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦから選択され、前記カンプトテシンアルカロイドは、好ましくは、ＣＰＴ、１０−ヒドロキシ−ＣＰＴ、ＣＰＴ−１１、ＳＮ−３８、およびトポテカン、より好ましくは、ＳＮ−３８、から選択される、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記薬物が、以下の式（Ｄｒ）：
【化３】
2020518655.tif 000039
で表される化合物、
あるいは、互変異性体、メソマー、ラセミ体、エナチオマー、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩、からなる群より選択され、式中、
Ｒ、Ｒ１〜Ｒ７は、水素原子、ハロゲン、ヒドロキシル基、シアノ基、アルキル基、アルコキシ基、およびシクロアルキル基からなる群より選択され、
Ｒ８〜Ｒ１１の少なくとも一つは、ハロゲン、アルケニル、アルキル、およびシクロアルキルからなる群より選択され、残りは水素原子であり、
あるいは、Ｒ８〜Ｒ１１のうちの任意の二つはシクロアルキル基を形成し、残りの二つの基は、水素原子、アルキル基、およびシクロアルキル基から選択され、
Ｒ１４は、アリールまたはヘテロアリールから選択され、ならびに前記アリールまたは前記ヘテロアリールは、場合により、水素原子、ハロゲン、ヒドロキシル基、アルキル基、アルコキシ基、およびシクロアルキル基からなる群より選択される置換基でさらに置換されていてもよく、
Ｒ１２〜Ｒ１３は、水素原子、アルキル基、またはハロゲンから選択され、
好ましくは、前記式（Ｄｒ）は、以下の式（Ｉ）：
【化４】
2020518655.tif 000040
の化合物である、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記薬物が、改変された化合物、好ましくは、以下の式（Ｌ１−Ｄｒ）：
【化５】
2020518655.tif 000041
の化合物であり、
式中、
Ｌ１構造は、以下のとおりであり：
【化６】
2020518655.tif 000042
好ましくは、ＭＣであり、
ｎは、２〜６，好ましくは、２〜５であり、
Ｒ、Ｒ２〜Ｒ７は、水素原子、ハロゲン、ヒドロキシル基、シアノ基、アルキル基、アルコキシ基、およびシクロアルキル基からなる群より選択され、
Ｒ８〜Ｒ１１の少なくとも一つは、ハロゲン、アルケニル、アルキル、およびシクロアルキルからなる群より選択され、残りは水素原子であり、
あるいは、Ｒ８〜Ｒ１１のうちの任意の二つはシクロアルキル基を形成し、残りの二つの基は、水素原子、アルキル基、およびシクロアルキル基から選択され、
Ｒ１２〜Ｒ１３は、水素原子、アルキル基、またはハロゲンから選択され、
Ｒ１４は、アリールまたはヘテロアリールから選択され、ならびに、前記アリールまたは前記ヘテロアリールは、場合により、水素原子、ハロゲン、ヒドロキシル基、アルキル基、アルコキシ基、およびシクロアルキル基からなる群より選択される置換基でさらに置換されていてもよく、
より好ましくは、式（Ｌ１−Ｄｒ）は、以下の（ＩＩ）：
【化７】
2020518655.tif 000043
によって表される化合物である、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗原結合性タンパク質が、ヒト化抗体、マウス抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、二重特異抗体、好ましくは、前記ヒト化抗体、からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗原結合性タンパク質が、モノクローナル抗体または、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ｓｃＦｖフラグメントからなる群より選択される抗原結合性フラグメントである、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗原結合性タンパク質が、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＣＤ３３、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ−２、ＣＤ１５２、ＣＤ４０、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−５、ＩＬ−１７、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１、ＩＬ−２Ｒ、ＢＬＹＳ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＴＬＡ４、ＰＣＳＫ９、ＥＧＦＲ、ｃ−Ｍｅｔ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＣＤ６０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−２３、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＲＳＶＦ、ＩｇＥ、ＲＡＮＫ、ＢＬｙＳ、α４β７、ＰＤ−１、ＣＣＲ４、ＳＬＡＭＦ７、ＧＤ２、ＣＤ２１、ＣＤ７９ｂ、ＩＬ２０Ｒα、ｓｈｏｒｔｅｎｉｎ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７２、ＩＧＦ−１Ｒ、およびＲＡＮＫＬ、あるいはそれらの抗原結合性フラグメント、好ましくは、ＥＧＦＲ、ｃ−Ｍｅｔ、またはそれらの抗原結合性フラグメント、からなる群より選択される一つまたは複数のポリペプチドに結合する、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗原結合性タンパク質が、以下、ヒュミラ（アダリムマブ）、アバスチン（ベバシズマブ）、アービタックス（セツキシマブ）、ハーセプチン（トラスツズマブ）、パージェタ（ペルツズマブ）、ベクティビックス（Panibizumab）、セラロック（Netuzumab）、ヤーボイ（イピリムマブ）、オプジーボ（Navolumab）、ルセンティス（ラニビズマブ）、エンブレル（Enacept）、ミオシント（イミシロマブペンテタート）、プロスタシント（カプロマブペンデチド）、レミケード（インフリキシマブ）、レオプロ（アブシキシマブ）、リツキサン（リツキシマブ）、シムレクト（バシリキシマブ）、シナジズ（パリビズマブ）、ベルルマ（Verluma）（ノフェツモマブ）、ゾレア（オマリズマブ）、ゼナパックス（ダクリズマブ）、シムジア（セルトリズマブ）、ゼヴァリン（イブリツモマブ）、オルソクローン（Orthoclone）（ムロモナブ）、パノレックス（エドレコロマブ）、マイロターグ（ゲムツズマブ）、ソリリス（エクリズマブ）、ＣＮＴＯ１２７５（ウステキヌマブ）、アメビブ（アレファセプト）、ラプティバ（エファリズマブ）、タイサブリ（ナタリズマブ）、アクテムラ（トシリズマブ）、オレンシア（アバタセプト）、アルカリスト（リロナセプト）、ステラーラ（ウステキヌマブ）、レモバブ（カツマクソマブ）、シンポニー（ゴリムマブ）、イラリス（カナキヌマブ）、アーゼラ（オファツムマブ）、プロリア（Prolia）（デノスマブ）、ベンリスタ（ベリムマブ）、ニューロジクス（Nulojix）（ベラタセプト）、アイリーア（アフリベルセプト）、キャンパス（アレムツズマブ）、ＣＥＡスキャンアルシツモマブ（ｆａｂフラグメント）、ポテリジオ（モガムリズマブ）、アブスラックス（ラキシバクマブ）、ガザイバ（オビヌツズマブ）、Ｌａｎｇ  Ｍｕ（コンバセプト）、サイラムザ（ラムシルマブ）、シルヴァント（シルツキシマブ）、エンタイビオ（ベドリズマブ）、キイトルーダ（ペンブロリズマブ）、ブリンサイト（ブリナツモマブ）、コセンティクス（セクキヌマブ）、ユニツキシン（ジヌツキシマブ）、ダラザレックス（ダラツムマブ）、プラルエント（アリロクマブ）、レパーサ（エボロクマブ）、ポルトラザ（ネシツムマブ）、エムプリシティ（エロツズマブ）、ヌーカラ（メポリズマブ）、プラックスバインド（Praxbind）（イダルシズマブ）、ベキサール（トシツモマブおよびＩ１３１トシツモマブ）またはそれらの抗原結合性フラグメントからなる群より選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗原結合性タンパク質が、抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合性フラグメントあるいは抗ｃ−Ｍｅｔ抗体またはその抗原結合性フラグメントからなる群より選択され、
この場合、前記抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合性フラグメントは、配列番号５、配列番号６、配列番号７のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３領域、およびその変異体と、配列番号８、配列番号９、配列番号１０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３領域およびその変異体とを含み、好ましくは、配列番号１の軽鎖および配列番号２の重鎖の配列を含み、
あるいは、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体またはその抗原結合性フラグメントは、配列番号１１または配列番号１７、配列番号１２、配列番号１３のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３領域（好ましくは、ＬＣＤＲ１は配列番号１７である）、およびその変異体と、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３領域、およびその変異体とを含み、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体またはその抗原結合性フラグメントは、好ましくは、配列番号３の軽鎖および配列番号４の重鎖を含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ステップ１）の前記抗原結合性タンパク質の導電率が、前記イオン交換担体と接触する前に５ｍＳ／ｃｍ未満に調節される、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ステップ１）において記載される前記抗原結合性タンパク質が、５．５から７．０、好ましくは、６．３のｐＨを有する緩衝液中においてイオン交換担体上に固定される、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記緩衝液が、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、好ましくは、前記リン酸緩衝液、からなる群より選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ステップ２）の前記固定された抗原結合性タンパク質が、薬物にカップリングされ、前記薬物と前記抗原結合性タンパク質のモル比を６：１未満の量に制御するために、０．２〜２ｍｌ／分の流速において、前記イオン交換担体中を通して前記薬物をゆっくりと流すことによって、カップリング反応が実施される、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ステップ２）の溶出ステップが、異なる塩濃度の前記緩衝液を使用した階段的溶出を含み、前記緩衝液のｐＨが、５．０〜６．５、好ましくは、５．５である、請求項１から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記緩衝液が、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、好ましくは、前記クエン酸緩衝液、からなる群より選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記段階的溶出が、第一段階の溶出および第二段階の溶出を含み、前記第一溶出の塩濃度は、１００〜１４０ｍＭ、好ましくは、１１０ｍＭであり、前記第二溶出の塩濃度は、１５０〜２００ｍＭ、好ましくは、１８０ｍＭである、請求項１から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記ステップ１）が、
ａ）前記抗原結合性タンパク質を前記架橋剤に結合させることにより、改変された抗原結合性タンパク質を得るステップと、
ｂ）前記改変された抗原結合性タンパク質をイオン交換担体上に固定することにより、固定された抗原結合性タンパク質を形成するステップと、
ｃ）脱保護剤を加えるステップであって、前記脱保護剤が、好ましくは、ＮＨ２ＯＨ・ＨＣＬである、ステップと、を含む、請求項１から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記抗原結合性タンパク質が、２０℃から４０℃の温度において前記架橋剤に結合する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記架橋剤への前記抗原結合性タンパク質の前記結合が、４．０から５．５、好ましくは、４．３のｐＨを有する緩衝液中において実施され、前記緩衝液が、好ましくは酢酸緩衝液、より好ましくは、アセトニトリルを含む前記酢酸緩衝液である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記ステップ１）が、
Ａ）前記抗原結合性タンパク質をイオン交換担体上に固定することにより、固定された抗原結合性タンパク質を形成するステップと、
Ｂ）還元剤を加えることにより、前記固定された抗原結合性タンパク質のジスルフィド架橋を還元するステップと、を含み、
ここで、前記還元剤は、好ましくは、ＴＣＥＰ、ＤＴＴ、メルカプトエチルアミン、Ａｃ−Ｃｙｓ、より好ましくは、前記ＴＣＥＰ、からなる群より選択される、請求項１から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記ステップＢの還元反応が、２５℃から４５℃、好ましくは、４０℃の温度において実施される、請求項３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、2017年3月30日に出願された中国特許出願第201710202043.1号、2017年4月11日に出願された中国特許出願第201710233373.7号、および、2017年5月16日に出願された中国特許出願第201710342257.9号からの優先権を主張するものである。当該中国特許の内容全体は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、抗体−薬物コンジュゲートを調製する方法に関し、詳細には、担体としてイオン交換カラムを使用して抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を調製する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＡＤＣ薬を調製するための従来のカップリング方法は、リシンカップリング、軽鎖および重鎖の鎖間還元的ジスルフィド架橋カップリング、ならびに部位特異的カップリングを含む（非特許文献１：Beck A, Reichert JM., Antibody-drug conjugates: Present and future; MAbs, 2014, 6: 15-17；非特許文献２：McCombs J R, Owen S C., Antibody-drug conjugates: design and selection of linker, payload and conjugation chemistry. The AAPS journal, 2015, 17: 339-351）。リシンカップリングプラットフォーム技術は、二官能基架橋剤を利用して、抗体のリシン残基をランダムに改変し、次いで、毒性小分子、例えば、マイタンシン誘導体ＤＭ１、ＤＭ４など、のメルカプト基と反応させて、カップリングを達成する。既に市販されているＴ−ＤＭ１（Kadcyla）は、この技術を採用している。軽鎖および重鎖の鎖間還元的ジスルフィド架橋カップリングは、システイン残基を生成するために、抗体の軽鎖と重鎖との間のジスルフィド架橋を還元し、次いで、ポリペプチド架橋剤、例えば、アプリシアトキシン誘導体のメチルアウリスタチンＥ（Methylauristatin E：ＭＭＡＥ）またはカップリングのための他のアナログなど、を含む毒素と反応させることによって達成される。既に市販されているＡＤＣ薬アドセトリスは、この技術を採用している。部位特異的カップリングは、新しいアミノ酸、例えば、システインなど、を導入することによって、主にアミノ酸配列を改変し、それにより、毒性小分子が、抗体に対して指向的に結合される。当該技術は、現在、開発の初期段階にある（非特許文献３：Panowski S.他, Site-directed antibody-drug conjugates for cancer therapy. MAbs. Taylor & Francis, 2014, 6: 34-45）。現在、市販されているＡＤＣ薬は、主に、リシンカップリングと、軽鎖および重鎖の鎖間還元的ジスルフィド架橋ランダムカップリングとをベースとする。これらの二つの方法によって得られるＡＤＣ薬は、モノクローナル抗体にカップリングされる薬物の数において大きな違いがあり、結果として薬物の不均一性を生じ、これは、ＡＤＣバッチ生産の一貫性に対する大きな課題である（非特許文献４：Wang L.他, Structural characterization of the maytansinoid-monoclonal antibody immunoconjugate, huN901-DM1, by mass spectrometry. Protein science, 2005, 14: 2436-2446）。薬物毒素−抗体カップリング比（ＤＡＲ）は、各抗体にカップリングされる毒性薬物小分子の平均数を表している。研究は、抗体にカップリングされる毒性分子の数が、ＡＤＣの重合、結合性抗原の活性、血液循環におけるクリアランス、ならびにＡＤＣの活性および許容性に影響を及ぼすことを示している。低すぎるＤＡＲ値は、その活性を低下させるであろうが、その一方で、高すぎるＤＡＲ値は、血液循環におけるＡＤＣ薬の半減期および許容性を低下させるであろうし、それは、抗原に対するＡＤＣ薬の効果的な結合を損なうであろう。それと同時に、薬物の有効性も、ＤＡＲ値の増加と共に低下し得る（非特許文献５：Hamblett KJ.他, Effects of drug loading on the antitumor activity of a monoclonal antibody-drug conjugate. Clin Cancer Res, 2004, 10: 7063-7070）。現在市販で入手可能なＡＤＣ薬の場合、理想的なＤＡＲ値は、２から４の間に制御されるべきである。
【０００４】
新規のＡＤＣ薬の開発は、空前の成功を遂げたが、当該技術は、依然として、さらなる改良を必要とする。なかでも、従来のプロセスは、あまりに多くのカップリングステップおよび複雑な操作を含んでおり、また、環境汚染にもつながり得る。さらに、それらは、有機溶媒の添加および撹拌も伴い、これは、必然的に、抗体タンパク質と架橋性化合物およびポリマーの製造との間の不一致につながる。その上、様々な有機溶媒を完全に除去することは困難であり、これは、免疫原性およびＡＤＣ薬の他の副作用の原因となり得、その結果、その急速な開発を抑制している。さらに、ＤＡＲ値も、ＡＤＣ薬の調製における重要な品質制御パラメータであり、それは、カップリングプロセスおよび精製プロセスに関する探究も必要としている。当該ＤＡＲ値は、バッチ生産の一貫性および安定性を確保するために、標的の範囲内に制御され、副産物凝集物の含有量は、制御され、可能な限り除去されるべきである。
【０００５】
特許（特許文献１：中国特許出願公開第104208719号）は、カチオン交換クロマトグラフィ精製によってＤＡＲ値およびポリマーの制御を得たが、当該特許は、精製および分離の手段のみを提供しており、ＡＤＣ製造プロセスの複雑さは変わらず、様々な有機試薬を完全に除去できていなかった。
【０００６】
プロセスの改変に関して、ＵＫのEvansは、ＡＤＣの固相調製法を発明した（特許文献２：中国特許出願公開第105579066号）。彼は、固定剤として親和性充填剤であるプロテインＡ樹脂を使用し、当該樹脂に対するその親和性によってモノクローナル抗体をプロテインＡに結合させ、次いで、モノクローナル抗体を、それぞれ、架橋剤または毒素と反応させた。この研究は、製造ステップを減らしたが、プロテインＡ親和性充填剤の高いコストおよび乏しいアルカリ耐性により、製造におけるこれらの技術の展開および適用が厳しく制限された。
【０００７】
特許文献３：中国特許出願公開第101087611号では、マレイミド基、メルカプト基、およびハロアセチル基を有する架橋剤によって抗体をＤＭ１、ＤＭ３、ＤＭ４にカップリングさせる方法について開示されており、この場合、当該マレイミド基は、ＳＭＣＣ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＫＭＵＡ、ＧＭＢＳ、ＥＭＣＳ、ＭＢＳ、ＡＭＡＳ、ＳＭＰＨ、ＳＭＰＢ、およびＰＭＰＩから選択され、なお、当該特許の内容全体は、参照により本明細書に組み入れられる。当該ハロアセチル基は、ＳＩＡＢ、ＳＩＡ、ＳＢＡ、およびＳＢＡＰから選択される。
【０００８】
特許文献４：中国特許出願公開第106029083号では、チオエーテル結合によって抗体にＭＭＡＥ、ＭＭＡＦを直接カップリングさせる、加水分解されたスクシンイミド環（またはコハク酸）について開示されており、なお、当該特許の内容全体は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０００９】
特許文献５：中国特許出願公開第106467575号では、部位特異的カップリングによる毒素、例えば、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ、ＰＢＤ、ＳＮ−３８、およびＤｏｘへの抗体のカップリングについて開示されており、なお、当該特許の内容全体は、参照により本明細書に組み入れられる。
【００１０】
出願人の先の出願である特許文献６：国際公開第2016127790（A1）号および特許文献７：国際公開第2015/113476号は、新規の毒素分子およびコンジュゲートを伴い、なお、これらの出願の内容全体は、参照により本明細書に組み入れられる。出願人の先の出願である特許文献８：中国特許出願公開第106188293号では、ｃ−Ｍｅｔ抗体コンジュゲートおよびそれらの調製方法について開示されている。出願人の先の出願（特許文献９：中国特許出願第201610526367.6号）は、ＥＧＦＲ抗体−薬物コンジュゲートおよびそれらの調製方法を提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】中国特許出願公開第104208719号
【特許文献２】中国特許出願公開第105579066号
【特許文献３】中国特許出願公開第101087611号
【特許文献４】中国特許出願公開第106029083号
【特許文献５】中国特許出願公開第106467575号
【特許文献６】国際公開第2016127790（A1）号
【特許文献７】国際公開第2015/113476号
【特許文献８】中国特許出願公開第106188293号
【特許文献９】中国特許出願第201610526367.6号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Beck A, Reichert JM., Antibody-drug conjugates: Present and future; MAbs, 2014, 6: 15-17
【非特許文献２】McCombs J R, Owen S C., Antibody-drug conjugates: design and selection of linker, payload and conjugation chemistry. The AAPS journal, 2015, 17: 339-351
【非特許文献３】Panowski S.他, Site-directed antibody-drug conjugates for cancer therapy. MAbs. Taylor & Francis, 2014, 6: 34-45
【非特許文献４】Wang L.他, Structural characterization of the maytansinoid-monoclonal antibody immunoconjugate, huN901-DM1, by mass spectrometry. Protein science, 2005, 14: 2436-2446
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、新規のプロセスは、製造ステップを減らし、コストを削減できるだけでなく、有機試薬の除去を容易にし、ＤＡＲ値の制御性を向上させるものであり、ＡＤＣ薬合成にとって非常に重要な実用性を有するであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の詳細な説明
本発明は、抗原結合性タンパク質−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を調製する方法を提供し、方法は、静電相互作用により抗体生体分子とイオン交換担体との組み合わせを利用することによって、ＡＤＣ薬の固相調製を実現する。薬物−抗体カップリング比（ＤＡＲ）を制御し、ポリマー結合薬物を分離し、カップリング反応において使用される薬物の量を減らし、ＡＤＣ薬の標的の治療効果を高めるために、溶出条件を最適化する。当該調製方法は、より少ないステップ、シンプルな操作、およびプログラ化された制御を特徴とし、工業的生産規模拡大を容易にし、さらに、調製プロセスにおける還元剤および有機溶媒のゼロ保持を可能にし、薬物安全性を著しく向上させ、ならびに製造コストを削減する。当該調製方法は、抗原結合性タンパク質をイオン交換担体上に固定するステップと、カップリングによって固定された当該抗原結合性タンパク質に薬物を結合させるステップとを含み、カップリング生成物は、イオン交換担体から溶出され、溶出液が収集される。抗原結合性タンパク質−薬物コンジュゲートは、詳細には、抗体−薬物コンジュゲートであり得る。
【００１５】
上記の目的を達成するために、本発明の技術的解決策は、抗原結合性タンパク質−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を調製する方法であって、以下のステップ、
１）抗原結合性タンパク質をイオン交換担体上に固定することにより、固定された抗原結合性タンパク質を形成するステップと、
２）当該固定された抗原結合性タンパク質を薬物と接触させることにより、抗原結合性タンパク質−薬物コンジュゲートを形成するステップと、
３）当該抗原結合性タンパク質−薬物コンジュゲートをイオン交換担体から溶出させるステップと、を含む方法である。
【００１６】
好ましくは、当該方法は、以下のステップ、
１）抗原結合性タンパク質をイオン交換担体上に固定することにより、固定された抗原結合性タンパク質を形成するステップと、
２）カップリング反応のために当該固定された抗原結合性タンパク質を薬物と接触させることにより、抗原結合性タンパク質−薬物コンジュゲートを形成するステップであって、当該カップリング反応が、当該固定された抗原結合性タンパク質を当該薬物にカップリングさせるために実施される、ステップと、
３）当該抗原結合性タンパク質−薬物コンジュゲートをイオン交換担体から溶出させるステップと、を含む。
【００１７】
本発明の好ましい実施形態において、当該抗原結合性タンパク質は、ヒト化抗体、マウス抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、および二重特異抗体からなる群より選択される。当該抗原結合性タンパク質は、これらに限定されるわけではないが、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびｓｃＦｖフラグメントから選択される抗原結合性フラグメントでもあってもよい。
【００１８】
本発明の好ましい実施形態において、当該抗原結合性タンパク質は、好ましくは、抗体、より好ましくはモノクローナル抗体から選択される。
【００１９】
本発明の好ましい実施形態において、当該イオン交換担体は、これらに限定されるわけではないが、イオン交換樹脂、イオン交換膜、イオン交換繊維、好ましくはイオン交換樹脂、からなる群より選択される。当該イオン交換担体は、カチオン交換担体またはアニオン交換担体、好ましくは、カチオン性交換担体、より好ましくは強カチオン交換担体から選択され、ならびにイオン性交換担体交換体または反応配位子は、高い酸性の反応配位子、好ましくはスルホネート基（−ＳＯ３Ｈ）から選択される。当該イオン交換担体において使用されるマトリックスは、これらに限定されるわけではないが、疎水性高分子ポリマー、例えば、ポリスチレンおよびポリメタクリルなど、好ましくはポリメタクリレート、から選択される疎水性マトリックスと、これらに限定されるわけではないが、親水性ポリマー、例えば、アガロースまたはデキストランなど、好ましくはアガロース、から選択される親水性マトリックスと、を含み、当該イオン交換担体において使用されるマトリックスは、中性マトリックスのポリマーも含み得る。いくつかの実施形態において、「イオン交換担体」および「担体」は、相互互換的に使用され得、同じ意味を有し得る。
【００２０】
本発明の好ましい実施形態において、ステップ２）における当該カップリング反応は、当該抗原結合性タンパク質および当該薬物が、求核基と求電子基との間の相互作用によって結合されるような反応であり、
この場合、求核基は、場合により、当該抗原結合性タンパク質または当該薬物、好ましくは当該抗原結合性タンパク質に由来し、
当該求電子基は、場合により、当該抗原結合性タンパク質または当該薬物、好ましくは当該薬物に由来する。
【００２１】
本発明の好ましい実施形態において、当該求核基は、メルカプト、ヒドロキシル基、アミノ基、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、およびアリールヒドラジド基からなる群より選択され、ただし、
当該求核基が当該薬物に由来する場合、当該求核基は、好ましくはメルカプトであり、
当該求核基が当該抗原結合性タンパク質に由来する場合、当該求核基は、好ましくはアミノ基（例えば、本発明の実施形態２）、メルカプト（例えば、本発明の実施形態９）、ヒドロキシル基であり、ならびに、当該アミノ基は、より好ましくは、Ｎ末端アミノ基、側鎖アミノ基、グリコシル化抗原結合性タンパク質における糖のアミノ基であり、当該ヒドロキシル基は、より好ましくは、グリコシル化抗原結合性タンパク質における糖のヒドロキシル基であり、当該メルカプト基は、より好ましくはチオール側鎖であり、最も好ましくは、システインのチオール側鎖である。
【００２２】
本発明の好ましい実施形態において、当該メルカプトは、抗体の切断還元によって生成されたリンカーに由来し、ならびに、当該アミノ基は、切断還元を受けていない抗体のそれ自体のリンカーに由来する。
【００２３】
本発明の好ましい実施形態において、当該求電子基は、活性エステル、ハロゲン化ヒドロカルビル、ハロゲン化ベンジル、アルデヒド、ケトン、カルボキシル基、およびマレイミド基からなる群より選択され、ただし、
当該求電子基が当該抗原結合性タンパク質に由来する場合、当該求電子基は、好ましくは、アルデヒド、ケトン、カルボキシル基、およびマレイミド基、より好ましくはマレイミド基、に由来し、
当該求電子基が当該薬物に由来する場合、当該求電子基は、好ましくは、活性エステル、ハロゲン化ヒドロカルビル、マレイミド基、より好ましくはマレイミド基、であり、活性エステルは、好ましくは、ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメート、酸ハロゲン化物であり、ハロゲン化ヒドロカルビルは、好ましくはハロアセトアミドである。
【００２４】
本発明の好ましい実施形態において、当該求電子基は、当該薬物自体に由来するか、または、当該薬物の改変体に由来する。
【００２５】
本発明の好ましい実施形態において、当該カップリング反応は、リシンカップリング、軽鎖と重鎖の鎖間還元的ジスルフィド架橋カップリング、または、部位特異的カップリング、好ましくはリシンカップリング、軽鎖と重鎖の鎖間還元的ジスルフィド架橋カップリング、からなる群より選択される。本発明において説明される当該軽鎖と重鎖の鎖間還元的ジスルフィド架橋カップリングは、軽鎖と重鎖との間の還元的ジスルフィド架橋カップリングを含み、ならびに、重鎖の間の還元的ジスルフィド架橋カップリングも含む。
【００２６】
本発明の好ましい実施形態において、ステップ１）の当該抗原結合性タンパク質の導電率は、当該イオン交換担体と接触する前に、５ｍＳ／ｃｍ未満に調節される。
【００２７】
本発明の好ましい実施形態において、ステップ１）の当該抗原結合性タンパク質は、５．５から７．０、好ましくは６．３のｐＨを有する緩衝液中においてイオン交換担体上に固定され、この場合、当該緩衝液は、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、好ましくはリン酸緩衝液、からなる群より選択される。
【００２８】
本発明の好ましい実施形態において、ステップ２）で説明されるカップリング反応において、当該薬物と当該抗原結合性タンパク質とのモル比は、０．２〜２ｍｌ／分の流速において当該イオン交換担体を通して当該薬物をゆっくりと流すことによって６：１未満に制御される。反応温度は室温であり、これは、１０〜３７℃であり、温度の値は、整数または小数であり、非限定的実施形態において、好ましくは２０〜２５℃であり、工業的生産のための従来の温度は２５℃である。より高い温度は、ポリマーの形成を増加させるであろう。
【００２９】
本発明の好ましい実施形態において、ステップ３）の溶出ステップは、異なる塩濃度の緩衝液を使用した階段的溶出を含み、当該緩衝液は、５．０から６．５、好ましくは５．５のｐＨを有する。当該緩衝液は、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、好ましくはクエン酸緩衝液、からなる群より選択される。
【００３０】
本発明の好ましい実施形態において、当該段階的溶出は、溶出の第一段階および溶出の第二段階を含み、当該第一段階の溶出の塩濃度は、１００〜１４０ｍＭ、好ましくは１１０ｍＭであり、当該第二段階の溶出の塩濃度は、１５０〜２００ｍＭ、好ましくは１８０ｍＭである。
【００３１】
本発明は、抗原結合性タンパク質−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を調製のための最適化された方法にも関し、当該方法は、求核基を生成するために抗原結合性タンパク質を架橋剤に結合させるステップを伴う。本発明の例示的実施形態は、実施形態２、３、４、５、および６であり、
１）抗原結合性タンパク質をイオン交換担体上に固定することにより、固定された抗原結合性タンパク質を形成するステップと、
２）カップリング反応のために当該固定された抗原結合性タンパク質を薬物と接触させることにより、抗原結合性タンパク質−薬物コンジュゲートを形成するステップと、
３）当該抗原結合性タンパク質−薬物コンジュゲートをイオン交換担体から溶出させるステップと
を含み、
ここで説明されるステップ１）は、
ａ）当該抗原結合性タンパク質を架橋剤に結合させることにより、改変された抗原結合性タンパク質を得るステップと、
ｂ）当該改変された抗原結合性タンパク質をイオン交換担体上に固定することにより、固定された抗原結合性タンパク質を形成するステップと
を含む。
【００３２】
本発明の好ましい実施形態において、当該抗原結合性タンパク質を当該架橋剤に結合させるための温度は、２０℃から４０℃である。
【００３３】
本発明の好ましい実施形態において、当該架橋剤への当該抗原結合性タンパク質の結合は、４．０から５．５、好ましくは４．３のｐＨを有する緩衝液中において実施され、当該緩衝液は、好ましくは酢酸緩衝液、より好ましくは、アセトニトリルを含む酢酸緩衝液である。
【００３４】
本発明の好ましい実施形態において、ステップ１）はさらに、ステップｃ：
ｃ．脱保護剤を加えるステップであって、当該脱保護剤が、好ましくはＮＨ２ＯＨ・ＨＣＬである、ステップ
を含む。
【００３５】
本発明は、抗原結合性タンパク質−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を調製のための別の最適化された方法にも関し、当該方法は、抗原結合性タンパク質を還元することにより、求核基を生成するステップを伴い、本発明におけるその例示的実施形態は、実施形態９である。当該方法は、
１）抗原結合性タンパク質をイオン交換担体上に固定することにより、固定された抗原結合性タンパク質を形成するステップと、
２）カップリング反応のために当該固定された抗原結合性タンパク質を薬物と接触させることにより、抗原結合性タンパク質−薬物コンジュゲートを形成するステップと、
３）当該抗原結合性タンパク質−薬物コンジュゲートをイオン交換担体から溶出させるステップと、を含み、
ここで説明されるステップ１）は、
Ａ．抗原結合性タンパク質をイオン交換担体上に固定することにより、固定された抗原結合性タンパク質を形成するステップと、
Ｂ．還元剤を加えることにより、当該固定された抗原結合性タンパク質のジスルフィド架橋を還元し、それにより、メルカプト（薬物とのカップリングのための求核基チオール）を生成させるステップと、を含み、
その場合、当該還元剤は、好ましくは、ＴＣＥＰ、ＤＴＴ、メルカプトエチルアミン、Ａｃ−Ｃｙｓ、より好ましくはＴＣＥＰ、からなる群より選択される。当該還元剤は、当該抗体のモル濃度の４〜８倍、好ましくは当該抗体のモル濃度の６倍の量において使用される。
【００３６】
本発明の好ましい実施形態において、ステップＢにおける還元反応の温度は、２５℃から４５℃、好ましくは４０℃である。
【００３７】
本発明において、当該薬物は、毒素（例えば、細菌、菌、植物、または動物に由来する酵素的に活性な毒素またはそれらのフラグメント）、化学療法薬、成長阻害剤、チューブリン阻害剤、抗生物質、放射性同位元素、核酸分解酵素、および他の細胞毒性剤を含み、当該薬物は、腫瘍細胞の微小管を阻害することによってまたはＤＮＡを切断することによって、腫瘍を除去することができる必要があり、毒素としては、これらに限定されるわけではないが、小分子薬、例えば、カンプトテシン誘導体、カリケアマイシン、マイタンシノイド、ドラスタチン、アウリスタチン（auristatin）、トリコテセン、およびこれらの薬物の細胞傷害的に活性化されたフラグメントが挙げられ、当該薬物は、マイタンシノイドの誘導体、好ましくはＤＭ１、ＤＭ３、ＤＭ４、からなる群より選択され、さらに、アウリスタチン誘導体、好ましくはＭＭＡＥ、ＭＭＡＦからも選択され得、あるいは、カンプトテシンアルカロイド、好ましくはＣＰＴ、１０−ヒドロキシ−ＣＰＴ、ＣＰＴ−１１（イリノテカン）、ＳＮ−３８、およびトポテカン、より好ましくはＳＮ−３８から選択され得る。
【００３８】
本発明の方法において、当該抗原結合性タンパク質は、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＣＤ３３、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ−２、ＣＤ１５２、ＣＤ４０、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−５、ＩＬ−１７、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１、ＩＬ−２Ｒ、ＢＬＹＳ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＴＬＡ４、ＰＣＳＫ９、ＥＧＦＲ、ｃ−Ｍｅｔ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＣＤ６０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−２３、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＲＳＶＦ、ＩｇＥ、ＲＡＮＫ、ＢＬｙＳ、α４β７、ＰＤ−１、ＣＣＲ４、ＳＬＡＭＦ７、ＧＤ２、ＣＤ２１、ＣＤ７９ｂ、ＩＬ２０Ｒα、ブレビカン、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７２、ＩＧＦ−１Ｒ、およびＲＡＮＫＬからなる群より選択される一つまたは複数のポリペプチドに結合する。
【００３９】
本発明の方法において、当該抗原結合性タンパク質はさらに、ヒュミラ（アダリムマブ）、アバスチン（ベバシズマブ）、アービタックス（セツキシマブ）、ハーセプチン（トラスツズマブ）、パージェタ（ペルツズマブ）、ベクティビックス（Panibizumab）、セラロック（Netuzumab）、ヤーボイ（イピリムマブ）、オプジーボ（Navolumab）、ルセンティス（ラニビズマブ）、エンブレル（Enacept）、ミオシント（イミシロマブペンテタート）、プロスタシント（カプロマブペンデチド）、レミケード（インフリキシマブ）、レオプロ（アブシキシマブ）、リツキサン（リツキシマブ）、シムレクト（バシリキシマブ）、シナジズ（パリビズマブ）、ベルルマ（Verluma）（ノフェツモマブ）、ゾレア（オマリズマブ）、ゼナパックス（ダクリズマブ）、シムジア（セルトリズマブ）、ゼヴァリン（イブリツモマブ）、オルソクローン（Orthoclone）（ムロモナブ）、パノレックス（エドレコロマブ）、マイロターグ（ゲムツズマブ）、ソリリス（エクリズマブ）、ＣＮＴＯ１２７５（ウステキヌマブ）、アメビブ（アレファセプト）、ラプティバ（エファリズマブ）、タイサブリ（ナタリズマブ）、アクテムラ（トシリズマブ）、オレンシア（アバタセプト）、アルカリスト（リロナセプト）、ステラーラ（ウステキヌマブ）、レモバブ（カツマクソマブ）、シンポニー（ゴリムマブ）、イラリス（カナキヌマブ）、アーゼラ（オファツムマブ）、プロリア（Prolia）（デノスマブ）、ベンリスタ（ベリムマブ）、ニューロジクス（Nulojix）（ベラタセプト）、アイリーア（アフリベルセプト）、キャンパス（アレムツズマブ）、ＣＥＡスキャンアルシツモマブ（ｆａｂフラグメント）、ポテリジオ（モガムリズマブ）、アブスラックス（ラキシバクマブ）、ガザイバ（オビヌツズマブ）、Ｌａｎｇ  Ｍｕ（コンバセプト）、サイラムザ（ラムシルマブ）、シルヴァント（シルツキシマブ）、エンタイビオ（ベドリズマブ）、キイトルーダ（ペンブロリズマブ）、ブリンサイト（ブリナツモマブ）、コセンティクス（セクキヌマブ）、ユニツキシン（ジヌツキシマブ）、ダラザレックス（ダラツムマブ）、プラルエント（アリロクマブ）、レパーサ（エボロクマブ）、ポルトラザ（ネシツムマブ）、エムプリシティ（エロツズマブ）、ヌーカラ（メポリズマブ）、プラックスバインド（Praxbind）（イダルシズマブ）、ベキサール（トシツモマブおよびＩ１３１トシツモマブ）からなる群より選択され得る。
【００４０】
いくつかの実施形態において、当該抗原結合性タンパク質は、抗ＥＧＦＲ抗体またはそれらの抗原結合性フラグメントから選択され、抗ＥＧＦＲ抗体またはそれらの抗原結合性フラグメントは、好ましくは、配列番号５、配列番号６、配列番号７の配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３領域およびそのバリアントと、配列番号８、配列番号９、配列番号１０の配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３領域およびそのバリアントとを含み、より好ましくは、配列番号１の軽鎖と配列番号２の重鎖とを含む。
【００４１】
mAb001-LCDR1: RSSQNIVHSNGNTYLD          配列番号５
mAb001-LCDR2: KVSNRFS                   配列番号６
mAb001-LCDR3: FQYSHVPWT                 配列番号７
mAb001-HCDR1: NYYIY                     配列番号８
mAb001-HCDR2: GINPTSGGSNFNEKFKT         配列番号９
mAb001-HCDR3: QGLWFDSDGRGFDF            配列番号１０
【００４２】
ｍＡｂ００１軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号１において説明される。
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQNIVHSNGNTYLDWYQQTPGKAPKLLIYKVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCFQYSHVPWTFGQGTKLQITRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【００４３】
ｍＡｂ００１重鎖のアミノ酸配列は、配列番号２において説明される。
QVQLQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTNYYIYWVRQAPGQGLEWIGGINPTSGGSNFNEKFKTRVTITADESSTTAYMELSSLRSEDTAFYFCTRQGLWFDSDGRGFDFWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
【００４４】
他の実施形態において、当該抗原結合性タンパク質は、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体またはその抗原結合性フラグメント、好ましくは、それぞれ、配列番号１１または配列番号１７、配列番号１２、配列番号１３の配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３領域およびそれらのバリアント、好ましくは配列番号１７のＬＣＤＲ１と、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６の配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３領域およびそれらのバリアントとを含む、より好ましくは配列番号３の軽鎖と配列番号４の重鎖とを含む、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体またはその抗原結合性フラグメント、から選択してもよい。
【００４５】
mAb002-LCDR1: RANKSVSTSTYNYLH                  配列番号１１
mAb002-LCDR2: LASNLAS                          配列番号１２
mAb002-LCDR3: QHSRDLPPT                        配列番号１３
mAb002-HCDR1: NYGVH                            配列番号１４
mAb002-HCDR2: VIWSGGSTNYAAAFVS                 配列番号１５
mAb002-HCDR3: NHDNPYNYAMDY                     配列番号１６
最適化されたmAb002-LCDR1: RADKSVSTSTYNYLH      配列番号１７
【００４６】
ｍＡｂ００２軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号３において説明される。
DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCRADKSVSTSTYNYLHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHSRDLPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【００４７】
ｍＡｂ００２軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号４において説明される。
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSLSNYGVHWVRQAPGKGLEWLAVIWSGGSTNYAAAFVSRLTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARNHDNPYNYAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
【００４８】
本発明の方法において、当該薬物は、改変薬物または非改変薬物、好ましくは改変薬物であり、当該抗原結合性タンパク質は、改変された抗原結合性タンパク質または改変されていない抗原結合性タンパク質、好ましくは改変された抗原結合性タンパク質である。当該薬物と当該抗原結合性タンパク質との間のカップリングは、当該求電子基と当該求核基との相互作用、または、当該求核基と当該求電子基との間の相互作用によって形成される。当該薬物および当該抗原結合性タンパク質を改変するための化学薬剤は、ＡＤＣ薬を生成するために、当該抗原結合性タンパク質と当該薬物との間において効果的なリンカーを形成することができる、上記において説明される２種類の基を形成することができる任意の物質、であり得、例えば、架橋剤などが含まれる。
【００４９】
本発明の方法において、当該リンカーは、当該抗原結合性タンパク質と当該薬物とを効果的に接続することができ、合成されたＡＤＣ薬は、人体において、毒性または副作用なしに自己崩壊することができ、腫瘍細胞に対して薬物の効果的な細胞傷害効果を発揮することができる。
【００５０】
ＡＤＣ薬を使用する治療において、当該リンカーは重要な役割を果たし、血流中において当該薬物の安定性を確保するだけでなく、当該腫瘍細胞中での迅速で効率的な当該薬物の遊離も確保する。現在、主要な二つのタイプのリンカーである、切断可能なリンカーおよび切断不可能なリンカーを、ＡＤＣ薬において使用した。当該切断可能なリンカーを使用する場合、ＡＤＣは、細胞エンドソームまたはリソソームにおける酸加水分解または特異的プロテアーゼ切断によって毒素薬物を遊離し、当該切断不可能なリンカーを使用する場合、細胞内に取り込まれたＡＤＣは、小分子薬物を遊離するために、消化および分解される必要がある。当該切断可能なリンカーとしては、酸性条件下において切断されるヒドラゾンリンカー、グルタチオンなどの還元物質の作用下において加水分解するジスルフィドブリッジリンカー、プロテアーゼ−加水分解されたポリペプチドリンカー（Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ）、およびβ−グルコシドリンカーなどが挙げられ、当該切断不可能リンカーとしては、主に、チオエーテル結合を形成することができるリンカーなどが挙げられる。上記において説明される当該切断可能リンカーおよび当該切断不可能リンカーの両方、好ましくは、当該切断不可能リンカーは、本発明の方法における使用にとって好適である。
【００５１】
本発明の方法において、当該リンカーを形成するために使用される当該架橋剤は、両端に二つの同一の活性化反応基を有するホモ二官能性架橋剤、好ましくはアミノ−アミノ架橋剤、主に、タンパク質の表面の塩基性アミノ酸の遊離第一級アミンと反応することができる、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルおよびイミドエステル、例えば、スクシンイミドのグルタン酸ジスクシンイミジル（ＤＳＧ）、または、イミデート、例えば、ジスクシンイミジル３，３’−ジチオジプロピオネート（ＤＳＰ）、ジメチル３，３’−ジチオビスプロピオンイミデート（ＤＴＢＰ）など、であり得る。
【００５２】
【化１】
2020518655.tif 000003
【００５３】
【化２】
2020518655.tif 000004
【００５４】
【化３】
2020518655.tif 000005
【００５５】
当該架橋剤は、異なるタイプの他の基と反応することができる、両端に二つの異なる活性化反応基を有するヘテロ二官能性架橋剤であってもよく、主に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド−マレイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミド−ジメルカプトピリジン、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド−マレイミドのＳＭＣＣ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＫＭＵＡ、ＧＭＢＳ、ＥＭＣＳ、ＭＢＳ、ＡＭＡＳ、ＳＭＰＨ、ＳＭＰＢ、およびＰＭＰＩ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド−ジメルカプトピリジンのＮ−スクシンイミド３−（２−ピリジンジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、４−スクシンイミジルオキシカルボニル−アルファ−メチル−アルファ（２−ピリジルジチオ）トルエン（ＳＭＰＴ）など、が挙げられる。
【００５６】
【化４】
2020518655.tif 000006
【００５７】
【化５】
2020518655.tif 000007
【００５８】
当該架橋剤はさらに、別のヘテロ二官能性架橋剤、すなわち、カルボキシ−アミノ架橋剤であってもよく、これは、主に、Ｃ末端の酸性アミノ酸のカルボキシル基およびＮ末端の塩基性アミノ酸の第一級アンモニアとカップリングするためのカルボジイミドである。当該架橋剤は、カルボキシル基およびカルボジイミドを有する付加生成物中間体を形成することができ、次いで、アミノ基と反応してアミド結合を形成することができる。当該架橋剤は、主に、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）を含む。
【００５９】
【化６】
2020518655.tif 000008
【００６０】
【化７】
2020518655.tif 000009
【００６１】
当該架橋剤はさらに、ハロアセチル基を有する別のヘテロ二官能性架橋剤であってもよく、主に、ＳＩＡＢ、ＳＩＡ、ＳＢＡ、およびＳＢＡＰが挙げられる。
【００６２】
本発明において、イオン交換担体によって抗体−薬物コンジュゲートを調製するためのある特定の方法は、抗体および薬物の組み合わせのために当業者に既知の、有機化学反応、条件、および試薬を使用するいくつかの経路、（１）共有結合を介した抗体と架橋剤との反応を実施することにより、求核基または求電子基を有する抗体−架橋剤結合生成物を形成し、その後、薬物の求核基または求電子基と反応させるステップ、（２）共有結合を介した薬物と架橋剤との反応を実施することにより、求核基または求電子基を有する薬物−架橋剤結合生成物を形成し、その後、抗体の求核基または求電子基と反応させるステップ、ならびに（３）抗体を改変することにより求核基を形成し、その後、求電子基を有する薬物に結合させるステップ、などによって達成することができる。上記の抗体および薬物の求核基または求電子基は、場合により、制限なしに、化学薬品または架橋剤の改変によって生成され得る。
【００６３】
本発明の抗原結合性タンパク質の求核基としては、これらに限定されるわけではないが、メルカプト、ヒドロキシ基、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、およびアリールヒドラジド基、好ましくはメルカプト、が含まれ、当該抗原結合性タンパク質の当該求核基は、架橋剤または薬物の求電子基と反応して共有結合を形成することができ、当該架橋剤または当該薬物の当該求電子基は、活性エステル、ハロゲン化ヒドロカルビル、ハロゲン化ベンジル、アルデヒド、ケトン、カルボキシル基、およびマレイミド基、好ましくはハロゲン化ヒドロカルビルまたはマレイミド基、より好ましくはマレイミド基、からなる群より選択され、当該活性エステルは、好ましくは、ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロゲン化ホルメート、酸ハロゲン化物であり、当該ハロゲン化ヒドロカルビルは、好ましくはハロアセトアミドである。あるいは、当該抗原結合性タンパク質は、アルデヒド、ケトン、カルボキシル基、およびマレイミド基、好ましくはマレイミド基、からなる群より選択される求電子基を有し、その場合、当該薬物は、メルカプト、ヒドロキシ基、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、およびアリールヒドラジド基からなる群より選択される求核基を有し、ＡＤＣを形成するために、上記において説明される当該抗原結合性タンパク質および当該薬物を組み合わせた。
【００６４】
本発明の抗原結合性タンパク質の当該求核基は、Ｎ末端アミノ基、側鎖アミノ基、メルカプト側鎖基、グリコシル化された抗原−結合タンパク質における糖のヒドロキシル基、またはアミノ基、好ましくはメルカプト側鎖基、より好ましくはシステインのメルカプト、からなる群からも選択され得る。その場合、当該薬物は、活性エステル、ハロゲン化ヒドロカルビル、ハロゲン化ベンジル、アルデヒド、ケトン、カルボキシル基、およびマレイミド基、好ましくはハロゲン化ヒドロカルビル、マレイミド基、より好ましくはマレイミド基、からなる群より選択される求電子基を有し、当該活性エステルは、好ましくは、ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメート、酸ハロゲン化物であり、ハロゲン化ヒドロカルビルは、好ましくはハロアセトアミドである。
【００６５】
本発明における、当該抗体を当該薬物とカップリングさせる方法は、リシンカップリング法または軽鎖および重鎖の鎖間還元的ジスルフィド架橋ランダムカップリング法、または部位特異的カップリング法を採用し得、異なるカップリング法は、当該抗体自体に対して選択的ではない。
【００６６】
いくつかの実施形態において、当該薬物は、一般式（Ｄｒ）：
【化８】
2020518655.tif 000010
の化合物、
あるいは、互変異性体、メソマー、ラセミ体、エナチオマー、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、あるいはそれらの薬学的に許容される塩
から選択され、式中、
Ｒ、Ｒ１〜Ｒ７は、水素原子、ハロゲン、ヒドロキシル基、シアノ基、アルキル基、アルコキシ基、およびシクロアルキル基からなる群より選択され、
Ｒ８〜Ｒ１１の少なくとも一つは、ハロゲン、アルケニル、アルキル、およびシクロアルキルからなる群より選択され、残りは水素原子であり、
あるいは、Ｒ８〜Ｒ１１のうちの任意の二つはシクロアルキル基を形成し、残りの二つの基は、場合により、水素原子、アルキル基、およびシクロアルキル基から選択してもよく、
Ｒ１４は、アリールまたはヘテロアリールから選択され、ならびに、当該アリールまたは当該ヘテロアリールは、場合により、水素原子、ハロゲン、ヒドロキシル基、アルキル基、アルコキシ基、およびシクロアルキル基からなる群でさらに置換されていてもよく、
Ｒ１２〜Ｒ１３は、水素原子、アルキル基、またはハロゲンから選択される。
【００６７】
いくつかの実施形態において、（Ｄｒ）化合物は、当該抗原結合性タンパク質への結合の前に改変され、好ましくは、改変後に求電子基を有し、その後、ＡＤＣを形成するために、求核基を有する抗原結合性タンパク質と反応し、この場合、当該求電子基は、好ましくはマレイミド基またはハロアセチル基、より好ましくはマレイミド基であり、ならびに当該求核基は、好ましくはメルカプト基である。
【００６８】
いくつかの実施形態において、（Ｄｒ）化合物は、当該抗原結合性タンパク質への結合の前に改変され、好ましくは、改変後に求核基を有し、その後、ＡＤＣを形成するために、求電子基を有する抗原結合性タンパク質と反応し、この場合、当該求核基は、メルカプトであり、ならびに、当該抗原結合性タンパク質の当該求電子基は、好ましくはマレイミド基、またはハロゲン化アセチル基である。
【００６９】
好ましい実施形態において、当該薬物は、式（Ｉ）：
【化９】
2020518655.tif 000011
の化合物から選択される。
【００７０】
いくつかの好ましい実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、当該抗原結合性タンパク質への結合の前に改変され、好ましくは、改変後に求電子基を有し、その後、ＡＤＣを形成するために、求核基を有する抗原結合性タンパク質と反応し、この場合、当該求電子基は、好ましくはマレイミド基またはハロアセチル基、より好ましくはマレイミド基であり、好ましくはメルカプト基である。
【００７１】
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、当該抗原結合性タンパク質への結合の前に改変され、好ましくは、改変後に求核基を有し、その後、ＡＤＣを形成するために、求電子基を有する抗原結合性タンパク質と反応し、この場合、当該求核基は、メルカプト基であり、ならびに、当該抗原結合性タンパク質の当該求電子基は、好ましくはマレイミド基またはハロゲン化アセチル基である。
【００７２】
他の実施形態において、改変薬物薬は、式（Ｌ１−Ｄｒ）：
【化１０】
2020518655.tif 000012
の化合物から選択され、
なかでも
Ｌ１構造は、以下のとおりであり、
【化１１】
2020518655.tif 000013
好ましくは、ＭＣ、
【化１２】
2020518655.tif 000014
であり、
詳細には、
【化１３】
2020518655.tif 000015
であり、
式中、
ｎは、２〜６、好ましくは２〜５であり、
Ｒ、Ｒ２〜Ｒ７は、水素原子、ハロゲン、ヒドロキシル基、シアノ基、アルキル基、アルコキシ基、およびシクロアルキル基からなる群より選択され、
Ｒ８〜Ｒ１１の少なくとも一つは、ハロゲン、アルケニル、アルキル、およびシクロアルキルからなる群より選択され、残りは水素原子であり、
あるいは、Ｒ８〜Ｒ１１のうちの任意の二つはシクロアルキル基を形成し、残りの二つの基は、場合により、水素原子、アルキル基、およびシクロアルキル基から選択してもよく、
Ｒ１４は、アリールまたはヘテロアリールから選択され、ならびに、当該アリールまたは当該ヘテロアリールは、場合により、水素原子、ハロゲン、ヒドロキシル基、アルキル基、アルコキシ基、およびシクロアルキル基からなる群でさらに置換されていてもよい。
【００７３】
他の好ましい実施形態において、薬物は、式（ＩＩ）：
【化１４】
2020518655.tif 000016
の化合物から選択される。
【００７４】
本発明の方法において、ＡＤＣ薬の固相調製は、好ましくは、リシンカップリング法を使用することによって、イオン交換担体によって当該抗原結合性タンパク質を固定することにより実現され、この場合、当該抗体は、当該架橋剤を使用することによって改変され、次いで、ＡＤＣを形成するために、当該薬物と組み合わされる。当該改変は、場合により、当該抗原結合性タンパク質が当該イオン交換担体上に固定される前または後の改変、好ましくは当該抗原結合性タンパク質が当該イオン交換担体上に固定される前の改変を含んでもよい。
【００７５】
本発明の好ましい実施形態において、ステップ１）における当該抗原結合性タンパク質は、場合により、改変された抗原結合性タンパク質または改変されていない抗原結合性タンパク質、好ましくは改変された抗原結合性タンパク質、であってもよく、当該改変された抗原結合性タンパク質は、場合により、当該抗原結合性タンパク質を化学試薬または架橋剤に、好ましくは、当該改変された抗原結合性タンパク質を当該架橋剤に結合させてもよく、
この場合、ステップ２）における薬物は、場合により、改変されてもまたは改変されていなくもよく、好ましくは改変される。
【００７６】
いくつかの実施形態において、当該抗原結合性タンパク質は、当該イオン交換担体への当該抗原結合性タンパク質の結合の前に当該架橋剤によって改変され、その後、当該改変された抗原結合性タンパク質が当該イオン交換担体に固定され、その後、ＡＤＣを形成するために当該薬物に結合される。
【００７７】
一実施形態において、当該架橋剤は、式（Ｌ２）：
【化１５】
2020518655.tif 000017
の化合物を有し、
Ｔは、Ｈ、ｔｅｒｔ−ブチル、アセチル、ｎ−プロピオニル、イソプロピオニル、トリフェニルメチル、メトキシメチル、または２−（トリメチルシリル）エトキシメチル、好ましくはＨまたはアセチル、から選択され、
Ｒ１５は、水素原子、ハロゲン、ヒドロキシル基、シアノ基、アルキル基、アルコキシ基、およびシクロアルキル基からなる群より選択され、
Ｒ１６は、アルキル、シクロアルキル、および複素環からなる群より選択され、
ｍは、０〜５、好ましくは１〜３であり、
その場合、当該薬物は、活性エステル、ハロゲン化ヒドロカルビル、ハロゲン化ベンジル、アルデヒド、ケトン、カルボキシル基、およびマレイミド基、好ましくはハロゲン化ヒドロカルビル、マレイミド基、より好ましくはマレイミド基、からなる群より選択される求電子基を有し、当該活性エステルは、好ましくは、ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメート、酸ハロゲン化物であり、ハロゲン化ヒドロカルビルは、好ましくはハロアセトアミドである。
【００７８】
好ましい実施形態において、改変薬物は、式（Ｌ１−Ｄｒ）の化合物から選択される。
【００７９】
好ましい実施形態において、当該薬物は、式（ＩＩ）の化合物から選択される。
【００８０】
別の実施形態において、当該架橋剤は、マレイミド基、またはハロアセチル基の部分であり、その場合、マレイミド基を有する当該架橋剤は、好ましくは、ＳＭＣＣ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＫＭＵＡ、ＧＭＢＳ、ＥＭＣＳ、ＭＢＳ、ＡＭＡＳ、ＳＭＰＨ、ＳＭＰＢ、およびＰＭＰＩ、より好ましくはＳＭＣＣ、から選択され、ハロアセチル基の部分を有する当該架橋剤は、好ましくは、ＳＩＡＢ、ＳＩＡ、ＳＢＡ、およびＳＢＡＰ、より好ましくはＳＩＡＢ、から選択され、求核基を有する当該薬物は、好ましくは、メルカプト基、ヒドロキシ基、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、およびアリールヒドラジド基、より好ましくはメルカプト基、から選択される。
【００８１】
本発明の方法において、メルカプト基は、抗体の鎖間ジスルフィド架橋、すなわち、システイン架橋を還元することによっても形成することができ、次いで、ＡＤＣを形成するために、求電子基を有する薬物と反応し、当該薬物は、自身の求電子基、または化学薬剤で改変された求電子基を有し得るか、または架橋剤によって改変された求電子基を有し得る。
【００８２】
いくつかの実施形態において、イオン交換担体上に固定された抗原結合性タンパク質を還元するために、還元剤が加えられ、その場合、当該還元剤は、好ましくは、これらに限定されるわけではないが、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、メルカプトエチルアミン、アセチルシステイン（Ａｃ−Ｃｙｓ）、より好ましくはトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）であり、当該薬物は、好ましくは、活性エステル、ハロゲン化ヒドロカルビル、ハロゲン化ベンジル、アルデヒド、ケトン、カルボキシル基、およびマレイミド基、好ましくはハロゲン化ヒドロカルビルまたはマレイミド基、より好ましくはマレイミド基、から選択される求電子基を有する。当該活性エステルは、好ましくは、ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメート、酸ハロゲン化物であり、当該ハロゲン化ヒドロカルビルは、好ましくはハロアセトアミドであり、当該薬物は、自身の求電子基、または架橋剤で改変された求電子基を有し、改変は、化学試薬または架橋剤による改変を含む。
【００８３】
一実施形態において、当該還元剤は、トリ（２−カルボニルエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）から選択され、当該薬物は、架橋剤で改変された求電子基を有し、その場合、架橋剤は、マレイミド基を有し、ならびにマレイミド基を有する当該架橋剤は、好ましくは、ＳＭＣＣ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＫＭＵＡ、ＧＭＢＳ、ＥＭＣＳ、ＭＢＳ、ＡＭＡＳ、ＳＭＰＨ、ＳＭＰＢ、およびＰＭＰＩ、より好ましくはＳＭＣＣ、から選択される。
【００８４】
好ましい実施形態において、当該還元剤は、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）から選択され、当該架橋剤は、ハロアセチル基の部分を有しており、その場合、ハロアセチル基の部分を有する当該架橋剤は、好ましくは、ＳＩＡＢ、ＳＩＡ、ＳＢＡ、およびＳＢＡＰから、より好ましくはＳＩＡＢから選択される。
【００８５】
別の実施形態において、当該還元剤は、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）から選択され、ならびに当該薬物は、化学薬剤によって改変された求電子基を有し、式（Ｄｒ）の化合物から選択される。
【００８６】
別の好ましい実施形態において、当該薬物は、式（Ｉ）の化合物から選択される。
【００８７】
別の実施形態において、当該還元剤は、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）から選択され、ならびに自身の求電子基を有する当該薬物は、式（Ｌ１−Ｄｒ）の化合物から選択される。
【００８８】
別の好ましい実施形態において、当該薬物は、式（ＩＩ）の化合物から選択される。
【００８９】
本発明において当該抗原結合性タンパク質が当該薬物と相互作用するための基は、主に、メルカプト基およびマレイミド（またはハロゲン化アセチル基）であり、これらは、切断不可能リンカーに属するチオエーテル結合の構造を形成する。標的のリンカーを形成するために、架橋剤を使用することにより、当該抗原結合性タンパク質または当該薬物を改変することができ、その後、抗体−薬物コンジュゲートを形成するために反応基と反応させる。抗原結合性タンパク質を薬物に安定して結合することができる任意の架橋剤は、本発明における使用にとって好適である。当該薬物が取り付けられる当該抗原結合性タンパク質の位置は、交換可能であり、ならびにチオエーテル結合の形成は、ハロゲン化アセチル基を遊離メルカプト基と反応させることによっても得ることができる。
【００９０】
本発明の方法において、イオン交換担体を使用してＡＤＣを調製する方法は、以下のステップ、架橋剤によって当該抗原結合性タンパク質（例えば、抗体）を改変し、当該抗原結合性タンパク質をイオン交換担体上に固定することにより、固定された抗原結合性タンパク質を形成するステップと、当該固定された抗原結合性タンパク質を薬物と接触させることにより、抗原結合性タンパク質−薬物コンジュゲートを形成するステップと、当該抗原結合性タンパク質−薬物コンジュゲートを当該イオン交換担体から溶出させるステップとを含む。
【００９１】
一実施形態において、当該架橋剤は、式（Ｌ３）の化合物から選択され、当該抗原結合性タンパク質は、配列番号５、配列番号６、配列番号７のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３領域、および、それらのバリアントと、配列番号８、配列番号９、配列番号１０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３領域、および、それらのバリアントとを含み、当該薬物は、式（ＩＩ）の化合物から選択される。
【００９２】
【化１６】
2020518655.tif 000018
【００９３】
好ましい実施形態において、当該架橋剤は、式（Ｌ３）の化合物から選択され、当該抗原結合性タンパク質は、配列番号１の軽鎖と、配列番号２の重鎖とを含み、当該薬物は、式（ＩＩ）の化合物から選択される。
【００９４】
別の実施形態において、当該架橋剤は、式（Ｌ３）の化合物から選択され、当該抗原結合性タンパク質は、配列番号１１または配列番号１７、配列番号１２、配列番号１３のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３領域およびそれらのバリアント、好ましくは、配列番号１７のＬＣＤＲ１と、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３領域およびそれらのバリアントとを含み、当該薬物は、式（ＩＩ）の化合物から選択される。
【００９５】
別の好ましい実施形態において、当該架橋剤は、式（Ｌ３）の化合物から選択され、当該抗原結合性タンパク質は、配列番号３の軽鎖と、配列番号４の重鎖とを含み、当該薬物は、式（ＩＩ）の化合物から選択される。
【００９６】
好ましい実施形態は、以下のステップ、
（ｉ）リシンカップリングのメカニズムおよび還元剤の機能を利用するステップであって、抗体−架橋剤コンジュゲートを形成するために、当該架橋剤の末端のアルデヒド基による当該抗体のリシン側鎖のアミノ基の還元的アミノ化を行うことにより、当該リシンを当該架橋剤で改変し、ならびに、遊離の当該架橋剤を除去する、ステップと、（ｉｉ）カチオン交換カラムを平衡化し、当該カラムを当該架橋剤でリンス処理（ｒｉｎｓｉｎｇ）し、再平衡化し、その後、イオン交換カラムの上に当該抗体−架橋剤コンジュゲートをロードし、３回リンス処理するステップと、（ｉｉｉ）当該架橋剤の末端を脱保護するステップと、（ｉｖ）平衡化し、当該イオン交換カラムの上に毒素をロードし、その後、二次リンス処理を行い、二次溶出を行って、再生するステップと、を含む。
【００９７】
本発明のＡＤＣを調製するさらなる方法において、抗原結合性タンパク質は、鎖間ジスルフィド架橋を還元する方法によって薬物にカップリングされる。当該抗原結合性タンパク質が当該イオン交換担体上に固定された後、当該抗原結合性タンパク質の当該ジスルフィド架橋を遊離メルカプト基へと還元するために、還元剤を加えるステップが実施され、遊離メルカプト基は、マレイミド基またはハロゲン化アセチル基を有する薬物と反応して、チオエーテル結合ＡＤＣ薬を形成する。
【００９８】
別の実施形態において、当該架橋剤は、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）から選択され、当該抗原結合性タンパク質は、配列番号５または配列番号６、配列番号７のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３領域およびそれらのバリアントと、配列番号８、配列番号９、配列番号１０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３領域およびそれらのバリアントとを含み、薬物は、式（ＩＩ）の化合物から選択される。
【００９９】
好ましい実施形態において、当該架橋剤は、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）から選択され、当該抗原結合性タンパク質は、配列番号１の軽鎖と、配列番号２の重鎖とを含み、当該薬物は、式（ＩＩ）の化合物から選択される。
【０１００】
別の実施形態において、当該架橋剤は、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）から選択され、当該抗原結合性タンパク質は、配列番号１１または配列番号１７、配列番号１２、配列番号１３のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３領域およびそれらのバリアント、好ましくは配列番号１７のＬＣＤＲ１と、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３領域およびそれらのバリアントとを含み、当該薬物は、式（ＩＩ）の化合物から選択される。
【０１０１】
別の好ましい実施形態において、当該架橋剤は、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）から選択され、当該抗原結合性タンパク質は、配列番号３の軽鎖と、配列番号４の重鎖とを含み、当該薬物は、式（ＩＩ）の化合物から選択される。
【０１０２】
好ましい実施形態は、以下のステップ、
（ｉ）鎖間ジスルフィド架橋カップリングステラテジーおよび固定化担体としてカチオン交換樹脂を利用し、カラムを平衡化し、抗体試料をロードし、その後、リンス処理し、還元剤を加えることによって抗体の鎖間ジスルフィド架橋を還元するステップと、（ｉｉ）イオン交換カラムの上に毒素をロードし、その後、二次リンス処理を行い、二次溶出を行い、ならびに再生するステップと、を含む。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、還元剤によって当該抗体の鎖間ジスルフィド架橋を還元するための反応温度は、２５〜４５℃、好ましくは４０℃である。
【０１０４】
本発明の全ての実施形態において、当該担体への当該抗原結合性タンパク質の結合は、その後に、１０℃から３７℃、好ましくは２５℃の温度においてインキュベートを行い、当該温度の値は整数または分数であり、非限定的な実施形態において、当該温度は、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、または３７℃であり得る。
【０１０５】
さらに、当該担体への当該抗原結合性タンパク質の結合は、５．５〜７．０、好ましくは６．３のｐＨを有する緩衝液中において実施され、緩衝液としては、これらに限定されるわけではないが、リン酸緩衝液、酢酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、好ましくはリン酸緩衝液、が含まれる。
【０１０６】
さらに、当該担体の上に当該抗原結合性タンパク質をロードする場合、最適化されたローディング流速は、０．１〜０．５ｍｌ／分に制御され、これは、ある特定の実験において使用される当該イオン交換担体の量に応じて調節される。
【０１０７】
さらに、当該イオン交換担体の上に当該抗原結合性タンパク質をロードする前に、当該抗原結合性タンパク質溶液の導電率を５ｍＳ／ｃｍの範囲内に調節する必要がある。
【０１０８】
さらに、当該薬物への当該イオン交換担体上に固定された当該抗原結合性タンパク質のカップリングは、イオン交換カラムにおいて実施される。反応において使用される当該薬物の量を減じるために、当該薬物は、ゆっくりとした流速で当該イオン交換担体の上にロードされ、当該抗原結合性タンパク質に対する当該薬物のモル比は、６、５、４、３、２、１、好ましくは６であり、好ましい流速は、０．２ｍｌ／分である。
【０１０９】
さらに、当該抗原結合性タンパク質および当該薬物のコンジュゲートは、結合後にイオン交換担体から溶出する必要があり、緩衝液のｐＨは、５．０〜６．５、好ましくは５．５であり、当該緩衝液としては、これらに限定されるわけではないが、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、好ましくはクエン酸緩衝液、が挙げられ、当該緩衝液の濃度は、１０〜５０ｍＭ、好ましくは２０ｍＭである。
【０１１０】
さらに、単離した合成ＡＤＣ薬に高分子抗体を含ませるために、段階的溶出方法を採用した。溶出プロセスにおいて使用されるクエン酸緩衝液は、ＮａＣｌを含み、第一溶出ステップのために調製した溶出緩衝液中のＮａＣｌの濃度は、１００〜１４０ｍＭ、好ましくは１１０ｍＭである。
【０１１１】
さらに、第二溶出ステップのために調製した溶出緩衝液において、当該緩衝液は、１５０〜２００ｍＭのＮａＣｌ、好ましくは１８０ｍＭのＮａＣｌを含む。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、当該架橋剤への当該抗原結合性タンパク質の結合は、２０℃から４０℃の温度において実施され、その値は整数または分数、非限定的な実施形態において、当該温度は、好ましくは２０℃、２２℃、２４℃、２８℃、３２℃、３６℃、より好ましくは２８℃であり、ならびに、ある特定の実施形態では、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃であり得る。
【０１１３】
さらに、当該架橋剤への当該抗原結合性タンパク質の結合は、４．０から５．５、好ましくは４．３のｐＨを有する緩衝液中において実施され、当該緩衝液は、好ましくは酢酸緩衝液、好ましくは、アセトニトリルを含む酢酸緩衝液である。
【０１１４】
さらに、保護基を有する当該架橋剤の場合、抗原タンパク質への結合の後、当該架橋剤の当該保護基を除去する必要があり、その結果、当該架橋剤が当該薬物に結合することを可能にし、当該脱保護剤は、これらに限定されるわけではないが、ＮＨ２ＯＨ・ＨＣＬを含み得、当該脱保護基の濃度は、１０ｍＭから５０ｍＭの範囲、好ましくは２０ｍＭである。
【０１１５】
本発明の方法において、当該担体への当該抗原結合性タンパク質の結合、当該薬物への当該抗原結合性タンパク質の結合、および当該抗原結合性タンパク質および当該薬物のカップリング生成物の溶出は、イオン交換カラムにおいて実施される。
【０１１６】
本発明の方法において、場合により、リンス処理ステップが含まれていてもよく、当該イオン交換カラムは、ＡＤＣ薬の溶出を困難にする、マトリックスへの疎水性薬物の結合を防ぐため、イオン交換充填剤マトリックスの疎水性を遮断するために架橋剤を含む緩衝液によってリンス処理され、親水性イオン交換充填剤マトリックス、例えば、アガロースなど、が使用されるような場合、当該マトリックスは、抗体の表面上のリシン残基と反応するであろうし、その結果、当該薬物と当該抗体とのカップリングを妨げるであろう。したがって、リシンカップリングのステラテジー下では、疎水性マトリックスのイオン交換充填剤が好ましい。
【０１１７】
発明の詳細な説明
本発明をより良く理解するために、ある特定の技術用語および科学用語は、以下において詳細に定義される。本発明の他の部分において特に明記されない限り、本明細書において使用される全ての他の技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。
【０１１８】
用語「ヒト化抗体」は、本明細書において、ＣＤＲグラフト抗体のヒト化とも呼ばれ、これは、ヒト抗体可変領域フレームワーク中へのマウスＣＤＲ配列のグラフトを意味し、すなわち、異なるタイプのヒト生殖系列抗体フレームワーク配列によって産生された抗体である。
【０１１９】
用語「マウス抗体」は、当技術分野における知識および技術により、マウスを使用して調製された抗ヒトモノクローナル抗体である。調製の際、試験対象は抗原を注入され、次いで、所望の配列または機能特性を有する抗体を発現するハイブリドーマが単離される。当該マウス抗体またはその抗原結合性フラグメントはさらに、マウスκ鎖、λ鎖、またはそのバリアントの軽鎖定常領域を含み得るか、または、さらに、マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４、またはそのバリアントの重鎖定常領域を含む。
【０１２０】
用語「ヒト抗体」は、ヒトまたはヒト細胞によって産生されたアミノ酸配列または、ヒト抗体ライブラリまたは他のヒト抗体コード配列を利用した非ヒト由来抗体に由来するアミノ酸配列、に対応するアミノ酸配列を有する抗体を意味する。「ヒト抗体」のこの定義は、非ヒト抗原−結合性残基を含むヒト化抗体を明確に除外する。
【０１２１】
用語「キメラ抗体」は、マウス抗体の可変領域をヒト抗体の定常領域と融合させることによって得られる抗体であり、当該マウス抗体によって誘発される免疫反応を軽減することができる。キメラ抗体を構築するために、マウス特異的モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマが最初に構築され、次いで、マウスハイブリドーマ細胞から可変領域遺伝子が得られ、次いで、遺伝子組換え発現のために、ヒト抗体の定常領域遺伝子中にクローニングされる。
【０１２２】
用語「一本鎖抗体」は、１５から２０のアミノ酸による短いペプチドによって重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを接続することによって形成された抗体を称する。当該一本鎖抗体は、遺伝子工学技術を使用して大腸菌（E.coli）において発現される人工の合成抗体であり、完全抗体の一つの鎖のみを含む。
【０１２３】
本発明の「抗体」は、所望の生物活性を示す抗体の任意の形態を称する。したがって、それは、最も広い意味において使用され、具体的には、これらに限定されるわけではないが、完全長抗体、抗体結合性フラグメントまたは誘導体を包む。抗体の源としては、これらに限定されるわけではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、遺伝子操作された抗体（例えば、二重特異性抗体）が含まれる。
【０１２４】
用語「Ｆａｂフラグメント」は、完全軽鎖と重鎖のＶＨおよびＣＨ１機能性領域とからなるフラグメントを称する。Ｆａｂ分子の当該重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド架橋を形成することができない。
【０１２５】
用語「Ｆａｂ’フラグメント」は、軽鎖と重鎖のＶＨおよびＣＨ１機能領域とを含み、さらに、Ｆ（ａｂ’）２分子を形成するために二つのＦａｂ’フラグメントの二つの重鎖の間において鎖間ジスルフィド架橋を形成することができる、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間の領域も含む。
【０１２６】
用語「Ｆ（ａｂ’）２フラグメント」は、二つの軽鎖と、鎖間ジスルフィド架橋を二つの重鎖の間に形成する、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間の部分的定常領域を含む二つの重鎖とを含む。したがって、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、二つの重鎖の間のジスルフィド架橋によって一緒に結合された二つのＦａｂ’フラグメントからなる。
【０１２７】
用語「ｓｃＦｖフラグメント」は、遺伝子工学的手法によって製造された一本鎖可変領域（ＳｃＦｖ）を称し、これは、柔軟なポリペプチドによって一緒に結合されたＶＨ領域およびＶＬ領域を含むＦｖタイプのフラグメントである。
【０１２８】
用語「抗原結合性タンパク質」は、標的細胞に関連する抗原または受容体を認識してそれに結合することができる巨大化合物である。当該抗原結合性タンパク質の機能は、当該抗原結合性タンパク質に結合する標的細胞集団に当該薬物を提供することであり、そのようなものとして、これらに限定されるわけではないが、タンパク質ホルモン、レクチン、成長因子、抗体、または細胞に結合することができる他の分子、好ましくは抗体が挙げられる。
【０１２９】
本発明の抗体は、モノクローナル抗体またはｍＡｂを意味し、これらは、単一のクローン細胞株から得られる抗体を意味し、当該細胞株は、真核細胞株、原核細胞株、またはファージクローン細胞株に限定されない。当該モノクローナル抗体または当該抗原結合性フラグメントは、例えば、ハイブリドーマ技術、遺伝子組換え技術、ファージディスプレー技術、合成技術（例えば、ＣＤＲグラフト）、または他の従来技術などを使用する遺伝子組換えによって得ることができる。
【０１３０】
本発明の抗体は、免疫グロブリンを意味し、これは、二つの同一の重鎖と二つの同一の軽鎖が鎖間ジスルフィド架橋によって結合されているテトラペプチド鎖構造である。当該免疫グロブリンの重鎖定常領域は、異なるアミノ酸組成および配置順序を有し、そのため、その抗原性も異なっている。したがって、当該免疫グロブリンは、５つのクラスまたはアイソタイプ、すなわち、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥ、に分類することができ、対応する当該重鎖は、それぞれ、μ鎖、δ鎖、γ鎖、α鎖、およびε鎖である。Ｉｇの同じクラスは、ヒンジ領域のアミノ酸組成ならびに重鎖ジスルフィド架橋の数および位置における違いに応じて、異なるサブクラスに分けることができる。例えば、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ｌｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４に分類することができる。当該軽鎖は、定常領域の間の違いに応じて、κ鎖またはλ鎖に分類される。Ｉｇの５つのクラスにおいて、Ｉｇの各クラスは、κ鎖またはλ鎖を有し得る。
【０１３１】
抗体の重鎖および軽鎖のＮ末端付近の約１１０のアミノ酸の配列は、大いに異なっており、可変領域（Ｖ領域）と命名され、Ｃ末端付近の残りのアミノ酸配列は、比較的安定であり、定常領域（Ｃ領域）と命名されている。当該可変領域は、三つの高度可変領域（ＨＶＲ）と４つの比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）とを含む。当該三つの高度可変領域は、当該抗体の特異性を決定し、相補性決定領域（ＣＤＲ）としても知られる。軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）のそれぞれは、三つのＣＤＲ領域および４つのＦＲ領域からなり、これらは、アミノ酸末端からカルボキシ末端まで連続して配置される、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４。当該軽鎖の当該三つのＣＤＲ領域は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３と称し、当該重鎖の当該三つのＣＤＲ領域は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を称する。本発明において説明される当該抗体または当該抗原結合性フラグメントの当該ＬＣＶＲ領域および当該ＨＣＶＲ領域のＣＤＲアミノ酸残基の数および位置は、既知のＫａｂａｔ付番規則に従うか（ＬＣＤＲ１〜３、ＨＣＤＥ２〜３）、またはＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ付番規則（ＨＣＤＲ１）に従う。
【０１３２】
「場合による（ｏｐｔｉｏｎａｌ）」または「場合により（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）」は、その後に説明される事象または情況が、生じ得るが、必ずしも生じなくてもよいことを意味し、説明は、事象または情況が生じる場合または生じない場合を包む。例えば、「場合により、１〜３の抗体重鎖可変領域を含む」は、抗体の重鎖可変領域の特定の配列が、存在し得るが、必ずしも存在しなくてもよいことを意味する。
【０１３３】
用語「架橋剤」は、小分子化合物のクラスを称し、分子は、両端または分子構造内に、特定の基（アミノ、カルボキシル、チオール、など）に対する二つ以上の反応性末端を有し、それが、二つまたは複数の他の分子とカップリングし得る。反応に関与する様々な分子は、架橋剤と共有結合して、新しい分子を形成する。
【０１３４】
用語「リンカー」は、抗原結合性タンパク質を薬物に共有結合的に接続する共有結合または原子鎖を有する化学モジュールを称する。当該化学モジュールは、改変された抗原結合性タンパク質を、薬物の改変された部分に結合させることによって形成される。
【０１３５】
用語「導電率」は、二つの電極間において電流を伝導する水溶液の能力を称する。一般的に、導電率または比導電率は、物質の伝導電流の指標である。溶液中において、電流は、イオン輸送によって流れる。したがって、水溶液中に存在するイオンの数が増えるに従って、溶液は、より高い導電率を有するであろう。導電率は、ｍｍｈｏｓ（ｍＳ／ｃｍ）において測定され、溶液の導電率は、その中のイオン濃度を変えることによって変えることができる。例えば、溶液中のイオン性賦形剤の濃度は、所望の導電率を達成するために変えることができる。
【０１３６】
用語「薬物」は、毒素（例えば、細菌、菌類、植物、または動物に由来する酵素的に活性な毒素またはそれらのフラグメント）、化学療法薬、成長阻害剤、チューブリン阻害剤、抗生物質、放射性同位元素、核酸分解酵素、および他の細胞毒性剤を称する。
【０１３７】
用語「毒素」は、細胞の成長または増殖に対して有害効果を生じることができる任意の物質を称する。
【０１３８】
用語「チューブリン阻害剤」は、チューブリンの重合を阻害することによって、またはチューブリンの重合を促進することによって、細胞の有糸分裂プロセスを干渉し、その結果、抗腫瘍効果を発揮する化合物のクラスを称する。それらの非限定的な実施形態としては、マイタンシノイド、カリチアマイシン、タキサン、ビンクリスチン、コルヒチン、ドラスタチン／アウリスタチン、好ましくはメイタンシノイドまたはドラスタチン／アウリスタチンが含まれる。
【０１３９】
マイタンシノイドは、当技術分野において周知であり、既知の方法に従って天然源から単離することも、または遺伝子工学技術を使用して製造することもできる（Yuら, The biosynthetic gene cluster of the maytansinoid antitumor agent ansamitocin from Actinosynnema pretiosum, PNAS, 2002, 99: 7968-7973）。マイタンシノールおよびマイタンシノールのアナログは、既知の方法によって、合成により調製することができる。マイタンシノイドアルカロイド薬物モジュールの非限定的な実施形態としては、国際公開第2016127790（A1）号において開示されるように、ＤＭ１、ＤＭ３、およびＤＭ４が含まれる。
【０１４０】
アウリスタチンは、化学構造式を有する完全に合成薬であり、その物理特性および薬物特性を最適化するために改変することが比較的容易である。当該抗体とのカップリングのために使用される当該アウリスタチンの誘導体としては、主に、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）およびモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）が含まれ、前者は、Ｃ末端に２−アミノ−１−フェニルプロピル−１−オールを付加させることによって合成された合成ペンタペプチドであり、天然のチューブリンポリメラーゼ阻害剤ドラスタチン−１０に由来する。様々なヒト腫瘍細胞系に対するＭＭＡＥの阻害活性は、１ナノモル未満である。ＭＭＡＥの細胞毒性活性を減じるために、ドラスタチン−１０のＣ末端にフェニルアラニンを付加させることによって、ＭＭＡＦが開発された。カルボキシル基の構造的導入により、ＭＭＡＦは、乏しい細胞膜透過性を有し、したがって、細胞に対するその生物活性は、著しく減少される。しかしながら、抗体とのカップリング後における細胞に対する阻害活性は、大いに増加した（米国特許第７７５０１１６号）。
【０１４１】
ＣＰＴは、カンプトテシンの略語であり、本出願において、ＣＰＴは、カンプトテシン自身あるいはカンプトテシンのアナログまたは誘導体を意味するために使用される。示された番号および文字Ａ〜Ｅでラベルされた環を有するカンプトテシンならびにそのアナログの構造は、以下の式によって提供される。
【０１４２】
【化１７】
2020518655.tif 000019
ＣＰＴ：Ｒ１＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ
１０−ヒドロキシ−ＣＰＴ：Ｒ１＝ＯＨ；Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ
イリノテカン（ＣＰＴ−１１）：Ｒ１＝
【化１８】
2020518655.tif 000020
；Ｒ２＝エチル；Ｒ３＝Ｈ
ＳＮ−３８：Ｒ１＝ＯＨ；Ｒ２＝エチル；Ｒ３＝Ｈ
トポテカン：Ｒ１＝ＯＨ；Ｒ２＝Ｈ；Ｒ３＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ３）２
【０１４３】
本明細書において使用される場合、「抗体−薬物コンジュゲート」は、相互互換的に「ＡＤＣ」とも呼ばれる。
【０１４４】
本発明における用語「遊離メルカプト基」は、硫黄原子を含む構造基を意味し、主に、薬物または毒素におけるメルカプト基、抗原結合性タンパク質のジスルフィド架橋の還元後に現れるメルカプト基、または抗原結合性タンパク質リシンまたはシステインのリシンまたはシステイン上のメルカプト基を意味する。
【０１４５】
用語「チオエーテル結合」は、式−Ｓ−を有する構造的結合のクラスを称する。
【０１４６】
用語「還元剤」は、酸化還元（レドックス）反応において電子を失うかまたは電子の偏りを有する物質である。当該還元剤自体は、広い意味において酸化防止剤でもあり、還元性を有し、酸化されるであろうし、その生成物は、酸化生成物と呼ばれる。本発明の実施形態において、当該還元剤はＲＡで表され、当該還元剤の非限定的な実施形態としては、Ｈ２、炭素（Ｃ）、一酸化炭素（ＣＯ）、還元された鉄粉末（Ｆｅ）、亜鉛粉末（Ｚｎ）、アルカリ金属（通常、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ）、他の活性金属（例えば、Ｍｇ、Ａｌ、Ｃａ、Ｌａなど）、塩化第一スズ（ＳｎＣｌ２）、シュウ酸、水素化ホウ素カリウム（ＫＢＨ４）、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３）、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（（ＣＨ３ＣＯＯ）３ＢＨＮａ）、水素化アルミニウムリチウム（ＬｉＡｌＨ４）、次亜リン酸、次亜リン酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ３）、トリス（２−カルボキシルエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、メルカプトエチルアミン、アセチルシステイン（Ａｃ−Ｃｙｓ）を含む。
【０１４７】
本発明における「カチオン交換担体」は、強酸タイプのカチオン交換担体および弱酸タイプのカチオン交換担体を含む、酸性交換基を有する担体を意味する。当該カチオン交換担体は、担体の形態の、カチオン交換樹脂、カチオン交換膜、カチオン交換繊維、好ましくはカチオン交換樹脂を含む。強酸タイプの当該カチオン交換担体は、主に、強酸性反応基、例えば、スルホネート基（−ＳＯ３Ｈ）など、を含み、このイオン交換担体は、全てのカチオンを交換することができる。弱酸タイプの当該カチオン交換担体は、弱い反応基、例えば、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ基）、リン酸基など、を含み、このイオン交換担体は、弱塩基におけるＣａ２＋およびＭｇ２＋などのカチオンのみを交換することができ、その一方で、強塩基におけるＮａ＋、Ｋ＋などのイオンは交換することができない。強酸カチオン交換樹脂の非限定的な実施形態は、Millpore Fractogel SO3、Millpore Eshmuno S、Millpore Eshmuno CPX、GE CaptoS Impact、GE SP Sepharose Fast Flow、HiTrapTM Capto S ImpActである。弱酸カチオン交換樹脂の非限定的な実施形態は、Millpore EMD COO-、GE CM Sepharose Fast Flowである。
【０１４８】
用語「アルキル」は、一個から二十個の炭素原子、好ましくは一個から十二個の炭素原子、より好ましくは一個から十個の炭素原子、最も好ましくは一個から六個の炭素原子の直鎖基および分岐鎖基を含む飽和脂肪族炭化水素基を称する。非限定的な実施形態としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｎ−ペンチル、１，１−ジメチルプロピル、１，２−ジメチルプロピル、２，２−ジメチルプロピル、１−エチルプロピル、２−メチルブチル、３−メチルブチル、ｎ−ヘキシル、１−エチル−２−メチルプロピル、１，１，２−トリメチルプロピル、１，１−ジメチルブチル、１，２−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、１，３−ジメチルブチル、２−エチルブチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、４−メチルペンチル、２，３−ジメチルブチル、ｎ−ヘプチル、２−メチルヘキシル、３−メチルヘキシル、４−メチルヘキシル、５−メチルヘキシル、２，３−ジメチルペンチル、２，４−ジメチルペンチル、２，２−ジメチルペンチル、３，３−ジメチルペンチル、２−エチルペンチル、３−エチルペンチル、ｎ−オクチル、２，３−ジメチルヘキシル、２，４−ジメチルヘキシル、２，５−ジメチルヘキシル、２，２−ジメチルヘキシル、３，３−ジメチルヘキシル、４，４−ジメチルヘキシル、２−エチルヘキシル、３−エチルヘキシル、４−エチルヘキシル、２−メチル−２−エチルペンチル、２−メチル−３−エチルペンチル、ｎ−デシル、２−メチル−２−エチルヘキシル、２−メチル−３−エチルヘキシル、２，２−ジエチルペンチル、ｎ−デシル、３，３−ジエチルヘキシル、２，２−ジエチルヘキシル、およびそれらの様々な分岐鎖状異性体が含まれる。より好ましいのは、一個から六個の炭素原子を有するより低級アルキル基であり、非限定的な実施形態としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル塩基、ｎ−ペンチル、１，１−ジメチルプロピル、１，２−ジメチルプロピル、２，２−ジメチルプロピル、１−エチルプロピル、２−メチルブチル、３−メチルブチル、ｎ−ヘキシル、１−エチル−２−メチルプロピル、１，１，２−トリメチルプロピル、１，１−ジメチルブチル、１，２−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、１，３−ジメチルブチル、２−エチルブチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、４−メチルペンチル、２，３−ジメチルブチルなどが挙げられる。アルキル基は、置換されていてもまたは置換されていなくてもよく、置換されている場合、置換基は、結合のために利用可能な任意の部位において置換され得、以下の基の一つまたは複数は、好ましくは、独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルアミノ、ハロゲン、フルオレニル、ヒドロキシ、ニトロ、シアノ、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、環アルコキシ、ヘテロシクロアルコキシ、シクロアルキルチオ、ヘテロシクロアルキルチオ、およびオキソからなる群より選択される。
【０１４９】
用語「シクロアルキル」は、三個から二十個の炭素原子、好ましくは三個から十二個の炭素原子、より好ましくは三個から十個の炭素原子、最も好ましくは三個から八個の炭素原子を含む飽和または部分的不飽和の単環式または多環式環状炭化水素置換基を称する。単環式の当該シクロアルキル基の非限定的な実施形態としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘキサジエニル、シクロヘプチル、シクロヘプタトリエニル、シクロオクチルなどが挙げられる。多環式の当該シクロアルキル基としては、スピロ環、縮合環、および架橋された環のシクロアルキル基が含まれる。
【０１５０】
用語「ヘテロシクリル」は、一つまたは複数の環原子が、−ＯＯ−、−ＯＳ−、または−ＳＳ−の環部分を除く、窒素、酸素、またはＳ（Ｏ）ｍ（この場合、ｍは、０から２の整数である）から選択されるヘテロ原子であり、残りの環原子が炭素であるような、三個から二十個の環原子を含む飽和または部分的不飽和の単環式または多環式環状炭化水素置換基を意味する。当該ヘテロシクリルは、好ましくは、三個から十二個の環原子を含み、そのうちの一個から四個は、ヘテロ原子であり、より好ましくは、シクロアルキル基環は、三個から十個の環原子を含む。単環式の当該ヘテロシクリル基の非限定的な実施形態としては、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ホモピペラジニルなどが含まれる。多環式の当該ヘテロシクリル基としては、スピロ環、縮合環、および架橋された環のヘテロシクリル基が含まれる。
【０１５１】
当該ヘテロシクリル環は、アリール環、ヘテロアリール環、またはシクロアルキル環に縮合していてもよく、その場合、親構造に結合する環は、複素環基である。その非限定的な実施形態としては、
【化１９】
2020518655.tif 000021
などが含まれる。
【０１５２】
当該ヘテロシクリル基は、場合により、置換されていてもまたは置換されていなくてもよく、置換されている場合、置換基は、好ましくは、独立して、以下の基、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルスルファニル、アルキルアミノ、ハロゲン、フルオレニル、ヒドロキシ、ニトロ、シアノ、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルコキシ、ヘテロシクロアルコキシ、シクロアルキルチオ、ヘテロシクロアルキルチオ、およびオキソのうちの一つまたは複数から選択される。
【０１５３】
用語「アリール」は、共役したπ電子系を有する六個から十四個の炭素原子、好ましくは六個から十個の原子による全て炭素の単環式の環基または縮合多環式の環（すなわち、隣接する炭素原子対を共有する環）基、例えば、フェニルおよびナフチル、好ましくはフェニル、を称する。当該アリール環は、ヘテロアリール環、ヘテロシクリル環、またはシクロアルキル環に縮合していてもよく、その場合、親構造が結合している環は、アリール環であり、その非限定的な実施形態としては、
【化２０】
2020518655.tif 000022
が含まれる。
【０１５４】
当該アリール基は、置換されていてもまたは置換されていなくてもよく、置換されている場合、置換基は、好ましくは、独立して、以下、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルアミノ、ハロゲン、フルオレニル、ヒドロキシ、ニトロ、シアノ、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルコキシ、ヘテロシクロアルコキシ、シクロアルキルチオ、およびヘテロシクロアルキルチオ（heterocyclealkylthio）から選択される基のうちの一つまたは複数である。
【０１５５】
用語「ヘテロアリール」は、一個から四個のヘテロ原子と五個から十四個の環原子とを含むヘテロ芳香族系を意味し、その場合、ヘテロ原子は、酸素、硫黄、および窒素からなる群より選択される。当該ヘテロアリール基は、好ましくは５員環から１０員環、より好ましくは５員環または６員環、例えば、フリル、チエニル、ピリジル、ピロリル、Ｎ−アルキルピロリル、ピリミジニル、ピラジニル、イミダゾリル、テトラゾリルなど、である。当該ヘテロアリール環は、アリール環、複素環、またはシクロアルキル環に縮合していてもよく、その場合、親構造の結合している環は、ヘテロアリール環であり、その非限定的な実施形態としては、
【化２１】
2020518655.tif 000023
が含まれる。
【０１５６】
当該ヘテロアリール基は、場合により、置換されていてもまたは置換されていなくてもよく、置換されている場合、置換基は、好ましくは、独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルアミノ、ハロゲン、フルオレニル、ヒドロキシ、ニトロ、シアノ、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルコキシ、ヘテロシクロアルコキシ、シクロアルキルチオ、およびヘテロシクロアルキルチオから選択される基の一つまたは複数である。
【０１５７】
用語「アルコキシ」は、−Ｏ−（アルキル）および−Ｏ−（非置換シクロアルキル）を称し、その場合、当該アルキルまたは当該シクロアルキルは、上記において定義されるとおりである。当該アルコキシ基の非限定的な実施形態としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、シクロプロポキシ、シクロブトキシ、シクロペンチルオキシ、またはシクロヘキシルオキシが含まれる。当該アルコキシ基は、置換されていてもまたは置換されていなくてもよく、置換されている場合、置換基は、好ましくは、独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルアミノ、ハロゲン、フルオレニル、ヒドロキシ、ニトロ、シアノ、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルコキシ、ヘテロシクロアルコキシ、シクロアルキルチオ、およびヘテロシクロアルキルチオから選択される基のうちの一つまたは複数である。
【０１５８】
用語「アルキルアミノ」は、−Ｎ−（アルキル）および−Ｎ−（非置換シクロアルキル）を称し、その場合、当該アルキルまたは当該シクロアルキルは、上記において定義されるとおりである。アルキルアミノ基の非限定的な実施形態としては、メチルアミノ、エチルアミノ、プロピルアミノ、ブチルアミノ、シクロプロピルアミノ、シクロブチルアミノ、シクロペンチルアミノ、またはシクロヘキシルアミノが含まれる。アルキルアミノ基は、置換されていてもまたは置換されていなくてもよく、置換されている場合、置換基は、好ましくは、独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルカンチオ、アルキルアミノ、ハロゲン、フルオレニル、ヒドロキシ、ニトロ、シアノ、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルコキシ、ヘテロシクロアルコキシ、シクロアルキルチオ、およびヘテロシクロアルキルチオから選択される基のうちの一つまたは複数である。
【０１５９】
用語「結合（ｂｏｎｄ）」は、「−」によって表される共有結合を称する。
【０１６０】
用語「ヒドロキシ」は、−ＯＨ基を称する。
【０１６１】
用語「ハロゲン」は、フルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨードを意味する。
【０１６２】
用語「カルボキシレート基」は、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（アルキル）または（シクロアルキル）を意味し、その場合、アルキルまたはシクロアルキルは、上記において定義されるとおりである。「場合による」または「場合により」は、その後に説明される事象または情況が生じ得るが、必ずしも生じ得ないことを意味し、説明は、事象または情況が生じる場合または生じない場合を包含する。例えば、「場合によりアルキル基で置換されていてもよい複素環基」は、アルキル基が存在し得るが、必ずしも存在しなくてもよいことを意味し、説明は、複素環基がアルキル基で置換されている場合および複素環基がアルキル基で置換されていない場合を包含する。
【０１６３】
「置換された」は、お互いに独立して、対応する数の置換基で置換された、基における一つまたは複数の水素原子、好ましくは五個まで、より好ましくは一個から三個の水素原子を称する。言うまでもなく、当該置換基は、それらの可能な化学的位置のみに存在し、当業者は、過度の努力なしに、可能であり得るまたは可能であり得ない置換基を、（実験または理論により）特定できるであろう。例えば、遊離水素を有するアミノ基またはヒドロキシル基は、不飽和（例えば、オレフィン性）結合を有する炭素原子と組み合わされた場合、不安定であり得る。
【０１６４】
略語
ＭＭＡＥ＝モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＷ７１８）
ＭＭＡＦ＝当該薬物のＣ末端にフェニルアラニンを有するアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）の変異体（ＭＷ７３１．５）
ＤＭ１＝Ｎ（２’）−デアセチル−Ｎ（２’）−（３−メルカプト−１−オキシプロピル）−メイタンシン
ＤＭ３＝Ｎ（２’）−デアセチル−Ｎ２−（４−メルカプト−１−オキソペンチル）−メイタンシン
ＤＭ４＝Ｎ（２’）−デアセチル−Ｎ２−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペンチル）−メイタンシン
ＳＭＣＣ＝スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート
ＬＣ−ＳＭＣＣ＝スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシ−（６−アミドカプロエート）
ＫＭＵＡ＝κ−マレイミドウンデカン酸Ｎ−スクシンイミジルエステル
ＧＭＢＳ＝γ−マレイミド酪酸Ｎ−スクシンイミジルエステル
ＥＭＣＳ＝ε−マレイミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
ＭＢＳ＝ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
ＡＭＡＳ＝Ｎ−（α−マレイミドアセテート）−スクシンイミジルエステル
ＳＭＰＨ＝スクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート
ＳＭＰＢ＝Ｎ−スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチレート
ＰＭＰＩ＝Ｎ−（ｐ−マレイミドフェニル）イソシアネート
ＳＩＡＢ＝Ｎ−スクシンイミジル−４−（ヨードアセチル）−アミノベンゾエート
ＳＩＡ＝Ｎ−スクシンイミジルヨードアセテート
ＳＢＡ＝Ｎ−スクシンイミジルブロモアセテート
ＳＢＡＰ＝Ｎ−スクシンイミジル３−（ブロモアセチルアミノ）プロピオネート
【０１６５】
本発明の化合物の合成方法
本発明の目的を達成するために、本発明は、以下の技術的解決策を採用する。
【０１６６】
解決策１
本発明は、一般式ＡＤＣ−１の調製方法も提供し、その場合、ステップは、上記のステップ１）における、ａステップ（実施形態２のように）、ｂステップ（実施形態４のように）、ｃステップ（実施形態５のように）、ならびにステップ２）およびステップ３）（実施形態６のように）を含み、詳細は以下のとおりである。
【０１６７】
【化２２】
2020518655.tif 000024
翻訳あり
【０１６８】
本明細書において説明されるｍＡｂは、本発明の抗原結合性タンパク質であり、Ｌ１−ＤｒおよびＬ２の定義は、一般式（Ｌ２）および式（Ｌ１−Ｄｒ）において定義されるとおりである。
【０１６９】
本発明によって調製される一般式ＡＤＣ−１の非限定的な実施形態は、以下のとおりである。
【０１７０】
【化２３】
2020518655.tif 000025
【０１７１】
本明細書において説明されるｍＡｂは、実施形態２において説明されるＥＧＦＲ抗体および実施形態１１において説明されるｃ−Ｍｅｔ抗体である。
【０１７２】
解決策２
本発明は、一般式ＡＤＣ−２（実施形態９などの例示的実施形態を参照されたい）の調製方法も提供し、当該ステップは、上記のステップ１）におけるＡステップ、Ｂステップ、ならびにステップ２）およびステップ３）を含み、詳細は、以下のとおりである。
【０１７３】
【化２４】
2020518655.tif 000026
【０１７４】
ｍＡｂは、本発明の抗原結合性タンパク質であり、当該抗原結合性タンパク質は、ステップ１）におけるステップＡによってイオン担体上に固定され、さらに、薬物と反応するために、還元反応が行われ、Ｌ１−Ｄｒの定義は、一般式（Ｌ１−Ｄｒ）において説明されるとおりである。
【０１７５】
本発明によって調製される一般式ＡＤＣ−２の非限定的な実施形態は、以下のとおりである。
【０１７６】
【化２５】
2020518655.tif 000027
【０１７７】
本明細書において説明されるｍＡｂは、実施形態９において説明されるＥＧＦＲ抗体および実施形態１１において説明されるｃ−Ｍｅｔ抗体である。
【０１７８】
本発明の有益効果は以下のとおりである。
１．本発明において、生体分子の固定は、抗体生体分子とイオン交換樹脂との間の静電相互作用によって実現され、それにより、カップリングプロセスの際の相互衝突によって生じる生体分子の凝集が避けられる。
２．本発明のプロセス工程は、シンプルであり、操作するのに好都合である。それは、プログラムによる制御を実現し、人為ミスを避け、生産効率を向上させる。
３．抗体などの生体分子を固定することにより、有機溶媒のゼロ保持が達成され、薬物の副作用が低減される。
４．溶出条件を最適化することにより、ＤＡＲ値（薬物−抗体結合比）を、必要な範囲内に効果的に制御することができ、それと同時に、ポリマーを含む、抗体にコンジュゲート化された薬物を、分離し、除去することができる。
５．製造プロセス条件は穏やかであり、抗体などの生体分子への機械的損傷を避け、当該抗体の完全性を確保する。
６．毒性小分子の濃度および使用法ならびに操作の際の人体への毒性および環境汚染を、本発明のプロセスによって低減することができる。
７．抗体精製プロセスにおけるカチオン精製ステップを排除することができ、精製効率を向上させることができる。
８．イオン交換担体によるＡＤＣ薬の合成は、大量の試料を扱いつつ、製造コストを低減する。充填剤１リットルあたり５０ｇ以上の、抗体などの生体分子を取り扱うことができ、バッチ式生産規模拡大にとって有用であることが予想される。
【図面の簡単な説明】
【０１７９】
【図１】抗体および架橋剤の反応方程式。
【図２】ＬＡＲ値に対する、抗体に対する架橋剤のモル比の効果。
【図３】架橋剤末端保護基の除去反応方程式。
【図４】毒素の連結反応および抗体−薬物コンジュゲートの溶出のフローダイアグラム。
【図５】ＥＧＦＲ抗体−薬物コンジュゲートの段階的溶出クロマトグラム。
【図６】ＥＧＦＲ抗体鎖間ジスルフィド架橋カップリングによって得られるＡＤＣの段階的溶出クロマトグラム。
【図７】リシンカップリングを使用した抗体−薬物コンジュゲートの溶出のＳＥＣ分析結果、（Ａ）抗体−架橋剤の分析チャート、（Ｂ）溶出ピークＡの分析チャート、（Ｃ）溶出ピークＢの分析チャート、（Ｄ）溶出ピークＣの分析チャート。
【図８】架橋剤に結合した抗体の質量スペクトル分析。
【図９】ＥＧＦＲ抗体−薬物コンジュゲートの質量スペクトル分析。
【図１０】ＥＧＦＲ抗体の鎖間ジスルフィド架橋カップリングのＨＩＣ分析。
【図１１】ｃ−Ｍｅｔ抗体のＡＤＣ薬カップリング結果の分析、（Ａ）リシンカップリング結果の質量スペクトル分析、（Ｂ）鎖間ジスルフィド架橋還元的カップリングのＨＩＣダイアグラム。
【発明を実施するための形態】
【０１８０】
好ましい実施形態の詳細な説明
本開示は、説明される特定の実施形態によってある範囲に限定されず、それらの実施形態は、本開示の個々の態様の例示として意図され、本発明の趣旨および範囲は、それらに限定されない。特に明記されない限り、本発明の実施形態における実験方法は、概して、製造とって好ましい従来の条件に従って、または原材料または商品の製造元によって推奨される条件に従って、選択される。特に明記されない限り、本明細書において使用される試薬は、市販されている。
【０１８１】
実施形態１．ＥＧＦＲ抗体の構築および発現
ＥＧＦＲ抗体ｍＡｂ００１は、ニモツズマブの点変異によって得られるＩｇＧ１−ＹＴＥ改変ニモツズマブ変異体である。
【０１８２】
抗体ＶＨ／ＶＫ遺伝子フラグメントを構築するＰＣＲに対してプライマーを設計し、次いで、完全長抗体発現担体ＶＨ−ＣＨ１−ＦＣ−ｐＨｒ／ＶＫ−ＣＬ−ｐＨｒを構築するために、（シングルペプチドおよび定常領域遺伝子（ＣＨ１−ＦＣ／ＣＬ）フラグメントを有する）発現担体ｐＨｒと相同的に再結合させた。プラスミドの元の形態は、ＩｇＧ１を発現することができ、三重部位変異を含むＩｇＧ１−ＹＴＥ抗体、すなわち、Ｍ２５８Ｙ／Ｓ２６０Ｔ／Ｔ２６２Ｅ（ＹＴＥ）を、点変異によって得た。最終的なＥＧＦＲ抗体ｍＡｂ００１配列は、配列番号１および配列番号２において説明される。プラスミドを、配列決定によって確認し、当技術分野において周知の方法によって単離した後、２９３細胞一過性発現を実施し、それにより、単離および精製のために所与の抗体タンパク質を含む培養上清を得た。
【０１８３】
ｍＡｂ００１の抗体配列は、以下のとおりである。
【０１８４】
ｍＡｂ００１軽鎖のアミノ酸配列：配列番号１
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQNIVHSNGNTYLDWYQQTPGKAPKLLIYKVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCFQYSHVPWTFGQGTKLQITRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【０１８５】
ｍＡｂ００１重鎖のアミノ酸配列：配列番号２
QVQLQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTNYYIYWVRQAPGQGLEWIGGINPTSGGSNFNEKFKTRVTITADESSTTAYMELSSLRSEDTAFYFCTRQGLWFDSDGRGFDFWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
注記：二重下線は、ＹＴＥ変異部位を表す。
【０１８６】
ｍＡｂ００１抗体の精製および分析：
不純物を除去するために、上記の細胞培養上清を高速において遠心分離し、次いで、プロテインＡカラム親和クロマトグラフィにかけた。Ａ２８０読み取り値がベースラインまで下がるまで、ＰＢＳでカラムをリンス処理した。ｐＨ３．０の１００ｍＭの酢酸ナトリウムで所与のタンパク質を溶出させ、１Ｍのトリス−ＨＣｌで中和した。溶出した試料を、適切に濃縮し、さらに、ＰＢＳによって平衡化させたゲルクロマトグラフィカラムＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（ＧＥ）を使用して分子篩によって精製し、抗体モノマーを有する吸収ピークの試料を収集し、プールした。試料は濃縮してもよく、または試料緩衝液を、好適な濃度の最終試料を得るために、当技術分野において周知の限外ろ過法によって置換することもできる。
【０１８７】
実施形態２．モノクローナル抗体であるＥＧＦＲ抗体および架橋剤の還元的アミノ化反応
リシンカップリングのメカニズムに基づいて、２０ｍｇ／ｍｌのモノクローナル抗体ｍＡｂ００１のストック溶液を改変緩衝液（１００ｍＭの酢酸＋１０％のアセトニトリル、ｐＨ４．３）で置換し、０．６５〜１．７ｍＭの二官能性架橋剤３−アセチルメルカプト（ＡＴＰＰＡ）および２５ｍＭの還元剤シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ３ＣＮ）を加え、その結果、１００ｒｐｍで２時間撹拌しながら２４〜３６℃の温度においてリシンを改変した。モノクローナル抗体上のアミノ基（−ＮＨ２）を、架橋剤の末端のアルデヒド基によって還元的にアミノ化することにより、中間体Ｉを形成し、反応方程式を図１に示した。ＬＡＲ値は、表１に示されるように、異なる温度の反応条件下において生成されるｍＡｂ−架橋剤の量とは異なっており、この場合、抗体に対する架橋剤のモル比は６である。遊離架橋剤を限外ろ過（ＵＦ）システムによって除去し、中間体Ｉの緩衝液を、新しい緩衝液（２０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ６．３）で置換し、使用まで貯蔵した。図２は、モノクローナル抗体に対する架橋剤のモル比の最適化を示している。架橋剤とモノクローナル抗体の比が、２８℃の温度において２時間、８：１に制御される場合、生成物における架橋剤−モノクローナル抗体比（ＬＡＲ）のカップリング比は、約３．５において制御することができる。
【０１８８】
【化２６】
2020518655.tif 000028
３−アセチルメルカプト（ＡＴＰＰＡ）
【０１８９】
【表１】
2020518655.tif 000029
【０１９０】
実施形態３．イオン交換カラムの架橋剤によるリンス処理
リシンカップリングステラテジーによってＡＤＣを合成するプロセスにおいて、ＡＤＣを合成するために、１ｍｌのカチオン交換樹脂、MercK Millipore製のFractogel（登録商標）SO3（Ｍ）を担体として使用した。以下のステップに従って、当該架橋剤によって強疎水性マトリックスを遮断した。
【０１９１】
１）平衡化：５カラム容積（ＣＶ）の１００ｍＭの酢酸緩衝液（５％のアセトニトリル、ｐＨ４．３）を、０．２ｍｌ／分の流速において、１ｍｌのカチオン交換カラムMillipore  SO3（Ｍ）を通して流した。
２）リンス処理：平衡のために上記に説明される酢酸緩衝液によって６５０ｍＭの３−アセチルメルカプト（ＡＴＰＰＡ）溶液を調製し、０．２ｍｌ／分で２０ＣＶの流速において、カラムをリンス処理して平衡化した。
【０１９２】
実施形態４．架橋剤に結合した抗体とイオン交換カラムとの結合
１）平衡化：媒体として強カチオン（-SO3）交換可能樹脂を使用することにより、５ＣＶの平衡緩衝液を使用して、０．２ｍｌ／分の流速において樹脂をリンス処理する。
２）ローディング：中間体Ｉ溶液の導電率を５ｍＳ／ｃｍ以内に制御し、１Ｍのクエン酸および１ＭのＴｒｉｓによりｐＨを６．３に調節し、０．２ｍｌ／分の流速において、当該イオン交換カラムを通して当該中間体Ｉ溶液を流し、そのキャパシティを１０〜５０ｍｇ／ｍｌに制御する。
３）リンス処理：３ＣＶの平衡緩衝液でカラムをリンス処理する。
４）第二リンス処理：０．２ｍｌ／分の流速において、３ＣＶの反応緩衝液（１００ｍＭの酢酸緩衝液＋５％のアセトニトリル、ｐＨ４．３）により、当該イオン交換カラムに蓄積されたイオンを徹底的に除去する。
５）第三リンス処理：０．２ｍｌ／分の流速において、５ＣＶの平衡緩衝液によってアセトニトリルを除去する。
【０１９３】
実施形態５．架橋剤の末端の脱保護
当該イオン交換カラムに結合された中間体Ｉは、末端保護基を有する架橋剤を含み、当該末端保護基は、その後の毒素への中間体Ｉの結合を促進するために、脱保護剤であるヒドロキシルアミンヒドロクロリド（ＮＨ２ＯＨ・ＨＣＬ）によって遊離メルカプト基へと変換する必要がある。２０ｍＭのヒドロキシルアミンヒドロクロリド溶液を平衡緩衝液によって調製し、中間体ＩＩを形成するため、当該架橋剤の末端におけるスルフヒドリル基を完全に還元するために、カラムを、０．２ｍｌ／分の流速において、１２ＣＶのヒドロキシルアミンヒドロクロリド溶液によってリンス処理した。反応式を図３に示す。当該反応が停止した後、カラムを、０．２ｍｌ／分の流速において、５ＣＶの平衡緩衝液によって直接リンス処理した。
【０１９４】
実施形態６．抗体および毒素のカップリング
この実験において使用される毒素の構造は、以下のとおりである。
【０１９５】
【化２７】
2020518655.tif 000030
【０１９６】
毒素は、国際公開第2016127790（A1）号の方法に従って調製することができる。毒素をカップリングするプロセスにおいて、新しい反応緩衝液（２０ｍＭのリン酸緩衝液＋５％のアセトニトリル、ｐＨ６．３）を使用して、４０ＣＶの１０ｍＭの毒素溶液を調製する。プロセス全体については図４を参照されたい。
【０１９７】
１）平衡化：イオン交換カラムに結合させた当該中間体ＩＩを、０．２ｍｌ／分の流速で５ＣＶの流速において、合計５ＣＶの新しい緩衝液（２０ｍＭのリン酸緩衝液＋５％のアセトニトリル、ｐＨ６．３）によって平衡化した。
２）ローディング：３０〜５０ＣＶの１０ｍＭの毒素を、０．２ｍｌ／分の流速において当該イオン交換カラムを通して流し、室温で反応させた。
３）リンス処理：０．２ｍｌ／分の流速において、反応における未結合の毒素を、５ＣＶの緩衝液（２０ｍＭのリン酸緩衝液＋５％のアセトニトリル、ｐＨ６．３）によってリンス処理した。
４）第二リンス処理：０．２ｍｌ／分の流速において、５ＣＶの平衡緩衝液（１００ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ６．３）によって残留アセトニトリルをリンス処理した。
５）溶出：０．２ｍｌ／分の流速において、１５ＣＶの溶出緩衝液（２０ｍＭのクエン酸＋１１０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．５）によって溶出を実施した。
６）第二溶出：さらなる１５ＣＶの溶出緩衝液（２０ｍＭのクエン酸＋１８０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．５）を使用して、０．２ｍｌ／分の制御された流速において、生成され得るポリマーを溶出させた。溶出クロマトグラフィ全体は図５に示されており、関連データ分析は表２に示される。
７）再生：イオン交換カラムを、０．２ｍｌ／分の流速において、５ＣＶの１ＭのＮａＯＨによって再生した。
【０１９８】
結果として、本発明によって得られる例示のＡＤＣ構造は、以下のとおりである。
【０１９９】
【化２８】
2020518655.tif 000031
【０２００】
【表２】
2020518655.tif 000032
【０２０１】
実施形態７．サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）分析方法
ＡＤＣ薬の調製において、モノクローナル抗体と毒素とのコンジュゲートのみが、真に治療に有効である。 ＡＤＣ薬中の有効成分の含有量を分析するために、Waters X Bridge（登録商標）ＢＥＨ ＳＥＣカラム（ＰＮ：１８６００７６４０；ＳＮ：０１１４３６１３３１６１２１；サイズ：７．８×３００ｍｍ、２００Å、３．５μｍ）、プレパックされたカラム（ＰＮ：１８６００７６３８；ＳＮ：０１０９３６１６２１６１０１；サイズ：７．８×３０ｍｍ、２００Å、３．５μｍ）を、１００ｍＭの流動性、２０ｍＭの硫酸ナトリウムを含有するｐＨ６．７のリン酸緩衝液、および３％（ｖ／ｖ）のイソプロパノールを用いて使用した。クロマトグラフ結果における異なる溶出ピークに対して、ＳＥＣ分析を実施した。１００μｇのタンパク質をインジェクション、０．５ｍｌ／分の流速において、２８０ｎｍにおける吸収ピークを測定した。結果を図７に示す。
【０２０２】
実施形態８．抗体に対する小分子薬物毒物の薬物毒物−抗体カップリング比（ＤＡＲ）の質量スペクトル分析
上記のカチオン交換カラムから溶出したＡＤＣ薬（ピークＡ）を、Waters XevoＧ２−ＸＳ Ｑ−ＴＯＦ（Waters Corporation、ミルフォード、マサチューセッツ）によって、陽イオンＥＳＩモードにおいて、５００〜５０００ｍ／ｚの範囲で処理し、脱グリコシル化されたＡＤＣ分子の質量スペクトル分析データを得た。それぞれ、脱溶媒ガス温度は４５０℃であり、ガス流量は８００Ｌ／時であり、イオン源温度は１２０℃であり、キャピラリー電圧は３０００Ｖであった。ＵＮＩＦＩソフトウェアバージョン１．８の最大エントロピーデコンボリューションアルゴリズムを使用して、生データをゼロチャージ質量スペクトルに変換した。ｍＡｂ００１抗体、当該架橋剤、および、当該毒素の分子量は、それぞれ、１４７，４５８Ｄａ、１３２Ｄａ、および９５５Ｄａである。脱グリコシル化ＡＤＣ分子のローディング量は、１μｇであり、薬物毒物−抗体カップリング比（ＤＡＲ）は以下のように計算される。
【０２０３】
【数１】
2020518655.tif 000033
【０２０４】
薬物毒物−抗体カップリング比（ＤＡＲ）の比は、ＡＤＣ薬の有効性にとって重要であり、架橋剤−モノクローナル抗体比（ＬＡＲ）は、その後のＤＡＲに直接影響を及ぼす。図８は、３．５８のＬＡＲ値において架橋剤とカップリングしたＥＧＦＲ抗体の質量スペクトログラムである。図９は、２．５９のＤＡＲ値におけるＥＧＦＲ抗体のＡＤＣ薬の質量スペクトル分析である。
【０２０５】
実施形態９．モノクローナルＥＧＦＲ抗体の鎖間ジスルフィド架橋の還元反応
鎖間ジスルフィド架橋のためのカップリングステラテジーは、リシンカップリングメカニズムとは異なっていた。ＥＧＦＲ抗体が担体に結合する前に、ジスルフィド架橋は切断され、親水性担体マトリックスは、当該ジスルフィド架橋と相互作用しないだろう。したがって、１ｍｌのＧＥ製陽イオン交換樹脂ＨｉＴｒａｐＴＭ  Ｃａｐｔｏ  Ｓ  ＩｍｐＡｃｔを、固定化担体として使用し、当該マトリックスは、親水性アガロースである。
【０２０６】
カラムを、０．２ｍｌ／分の流速において、２ｍＭのＥＤＴＡを含む２０ｍＭのｐＨ６．３のリン酸緩衝液で平衡化した。次いで、６０ＣＶのＥＧＦＲモノクローナル抗体試料を同じ流速においてロードし、ローディングを２０ｍｇで制御した。平衡緩衝液を使用して、リンス処理を続け、未結合のモノクローナル抗体または不純物を除去した。その後、当該イオン交換カラムを、４０℃の絶縁中間層に移した（還元剤ＴＣＥＰおよびＥＧＦＲ抗体が４０℃で反応するのを確保するため）。抗体の６倍モル濃度を有する２４ＣＶの還元剤ＴＣＥＰを平衡緩衝液に溶解させ、０．２ｍｌ／分の流速において、カラムを通してゆっくりと流した。還元反応の直後に、当該イオン交換カラムを当該絶縁中間層から取りだし、室温（２０〜２５℃、２５℃による工業的に通常の生産）に静置し、薬物を加え、固定された抗原結合性タンパク質に接触させて、還元されたメルカプト基との当該薬物の反応が室温で実施されることを確保した。残りの還元剤は、リンス処理する必要はなく、当該薬物とカップリングさせる次のステップにおいて直接リンス処理されて、除去される。
【０２０７】
この方法によって得られるＡＤＣの構造は以下のとおりである。毒素への結合および生成物の溶出は、実施形態６と同様である。溶出クロマトグラフィは図６に示されており、関連データ分析は表２に示されている。
【０２０８】
【化２９】
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【０２０９】
実施形態１０．疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）
ジスルフィド架橋のカップリングステラテジーは、最初に、ＥＧＦＲ抗体の重鎖の間または重鎖と軽鎖との間のジスルフィド架橋の切断を必要とするため、質量スペクトル分析によって薬物のカップリング値を分析する場合、重鎖および軽鎖の一連の質量スペクトルピークが得られるであろうし、それは、ＤＡＲ値の分析を困難にする。したがって、本明細書において、ＤＡＲ値は、抗体結合性薬物の強疎水性にしたがって、ＨＩＣ分析によって特定した。
【０２１０】
０〜１００％の緩衝液ＡおよびＢによるリニアグラジエントを伴うＴＯＳＯＨ  ＴＳＫ−ｂｕｔｙｌ  ＮＰＲカラムを使用して、０．５ｍｌ／分の流速において、疎水性クロマトグラフィを実施した。この場合、緩衝液Ａは、１．５Ｍの酢酸アンモニウムと２５ｍＭのリン酸ナトリウムとを含み、ｐＨ６．９５であり、緩衝液Ｂは、２５ｍＭのリン酸ナトリウムと、２５％のＩＰＡとを含み、ｐＨ６．９５である。コンジュゲートの薬物−抗体カップリング比は、溶出ピークエリアの２８０ｎｍでの吸収を積算することによって特定した。図１０は、ＥＧＦＲ抗体のジスルフィド架橋のランダムカップリングの結果を示している（ＤＡＲ＝３．３４）。本明細書において使用される方法は、ある特定の汎用性を有しており、抗体のタイプに限定されない。
【０２１１】
実施形態１１．ｃ−Ｍｅｔ抗体薬物コンジュゲートの調製
モノクローナル抗体応用の分野における本発明の汎用性を確認するために、ＡＤＣ薬の調製に、別の抗体：ｃ−Ｍｅｔ抗体を選択した。二つのカップリング方法、リシンカップリングステラテジーおよび鎖間ジスルフィド架橋カップリングステラテジーを採用し、本明細書において使用した特定の実験方法および毒素は、上記の実施形態において調製されるＥＧＦＲ抗体薬物コンジュゲートと同様である。
【０２１２】
ｃ−Ｍｅｔ抗体ｍＡｂ００２は、中国特許出願公開第106188293号の方法に従って調製したヒト化モノクローナル抗体である。
【０２１３】
ｍＡｂ００２の抗体配列は、以下のとおりである。
【０２１４】
ｍＡｂ００２軽鎖アミノ酸配列：配列番号３
DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCRADKSVSTSTYNYLHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHSRDLPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【０２１５】
ｍＡｂ００２重鎖アミノ酸配列：配列番号４
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSLSNYGVHWVRQAPGKGLEWLAVIWSGGSTNYAAAFVSRLTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARNHDNPYNYAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
【０２１６】
図１１Ａに示されるように、ＭＳを使用して、ｃ−Ｍｅｔ抗体薬物コンジュゲートのリシンカップリングの結果を分析した。リシンカップリング法によって得られるｃ−Ｍｅｔ抗体ＡＤＣの構造は、以下のとおりである。
【０２１７】
【化３０】
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【０２１８】
鎖間ジスルフィド架橋のカップリングの際、還元剤を元のＴＣＥＰからＤＴＴで置き換え、ＤＴＴの濃度は、ｃ−Ｍｅｔ抗体のモル濃度の８倍であった。カップリングステップおよび他のパラメータは、ＥＧＦＲ抗体の場合と同様である。カップリング生成物のＨＩＣ分析を図１１Ｂに示す。ｃ−Ｍｅｔ抗体鎖の間のジスルフィド架橋は、ほぼ完全に切断され、当該ＡＤＣ薬のＤＡＲは４．５８である。鎖間ジスルフィド架橋還元的カップリングｃ−Ｍｅｔ抗体のＡＤＣ薬の構造は、以下のとおりである。
【０２１９】
【化３１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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