(57)【要約】  本発明は、初期心不全を診断するための方法に関する。本発明は、ニューヨーク心臓協会（ＮＹＨＡ）分類システムに基づいた、クラスＩおよびクラスＩＩ心不全の診断に特に関する。本発明はまた、健康対照者とＮＹＨＡクラスＩＩＩ／ＩＶの心不全患者とを判別することもできる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の初期心不全を検出する方法であって、
該対象から得られた生物学的サンプルを分析し、該サンプル中の少なくとも１つのバイオマーカーの濃度を測定し、そして、該少なくとも１つのバイオマーカーの濃度がその少なくとも１つのバイオマーカーの所定の基準濃度より高いかまたは低い場合に、対象に対して心不全分類を割り当てること、を含む方法。
【請求項２】
前記少なくとも１つのバイオマーカーの所定の基準濃度が、健常者から採取された生物学的サンプルから決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
対象の初期心不全を検出する方法であって、
該対象から得られた生物学的サンプルを分析し、該サンプル中の少なくとも１つのバイオマーカーの濃度を測定し、健常者から得られた生物学的サンプル中の少なくとも１つのバイオマーカーの濃度を測定し、そして、対象からのサンプル中の少なくとも１つのバイオマーカーの濃度が健常者から得られた生物学的サンプル中の少なくとも１つのバイオマーカーの濃度より高いかまたは低い場合に、対象に対して心不全分類を割り当てること、を含む方法。
【請求項４】
対象の初期心不全をスクリーニングする方法であって、
該対象から得られた生物学的サンプルを分析し、該サンプル中の少なくとも１つのバイオマーカーの濃度を測定し、そして、該少なくとも１つのバイオマーカーの濃度が、その少なくとも１つのバイオマーカーの所定の基準濃度より高いかまたは低い場合に、対象に対して心不全分類を割り当てること、を含む方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つのバイオマーカーが、ＫＬＫ１、ＴＣＰＤ、Ｓ１０Ａ７、ＤＬＤＨ、ＩＧＨＡ２、ＣＡＭＰ、ＫＶ１１０、ＮＡＭＰＴ、ＣＯＰＢ、ＳＰＲ２ＡおよびＨＶ３１１から成るタンパク質の群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つのバイオマーカーが、ＫＬＫ１、ＴＣＰＤ、Ｓ１０Ａ７、ＤＬＤＨ、ＩＧＨＡ２およびＣＡＭＰから成るタンパク質の群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１つのバイオマーカーが、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのタンパク質を含むバイオマーカーパネルである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記バイオマーカーパネルが、３つのタンパク質を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記バイオマーカーパネルが、ＫＬＫ１、Ｓ１０Ａ７およびＣＡＭＰを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１つのバイオマーカーが、ＫＶ１１０、ＮＡＭＰＴ、ＣＯＰＢ、ＳＰＲ２ＡおよびＨＶ３１１から成るタンパク質の群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも１つのバイオマーカーが、２つ、３つ、４つまたは５つのタンパク質を含むバイオマーカーパネルである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記生物学的サンプルが、全血、血清、血漿、痰または唾液から成る群から選択される、請求項５〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記生物学的サンプルが唾液である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
初期心不全に関係する少なくとも１つのバイオマーカーの存在を検出するためのキットであって、少なくとも１つのバイオマーカーに特異的に結合する少なくとも１つの分子がその上に固定された固体支持体を含むキット。
【請求項１５】
初期心不全に関係する少なくとも１つのバイオマーカー（ここで、該少なくとも１つのバイオマーカーが、ＫＬＫ１、ＴＣＰＤ、Ｓ１０Ａ７、ＤＬＤＨ、ＩＧＨＡ２、ＣＡＭＰ、ＫＶ１１０、ＮＡＭＰＴ、ＣＯＰＢ、ＳＰＲ２ＡおよびＨＶ３１１から成る群から選択される）の存在を検出するためのキットであって、少なくとも１つのバイオマーカーに特異的に結合する少なくとも１つの分子がその上に固定された固体支持体を含むキット。
【請求項１６】
前記少なくとも１つのバイオマーカーに特異的に結合する少なくとも１つの分子が、該少なくとも１つのバイオマーカーに特異的に結合する抗体である、請求項１４または請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
前記固体支持体が、その上に固定された２つ、３つ、４つ、５つまたは６つの抗体を有する、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
前記固体支持体が、その上に固定された３つの抗体を有する、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
前記抗体が、ＫＬＫ１、Ｓ１０Ａ７およびＣＡＭＰに対する抗体である、請求項１８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、初期心不全を診断するための方法に関する。本発明は、ニューヨーク心臓協会（ＮＹＨＡ）分類システムに基づいた、クラスＩおよびクラスＩＩ心不全の診断に特に関する。本発明はまた、健康対照者とＮＹＨＡクラスＩＩＩ／ＩＶの心不全患者とを判別することもできる。
【背景技術】
【０００２】
心筋が、血液および酸素に関して身体の要求を満たすのに十分な血液をもう汲み出すことができないほど弱められたとき、心不全が起こる。言い換えれば、心臓は、その作業負荷を維持することができない。肥大、筋肉量の増大、およびより速いポンピングを含めた初期心不全の間に関与する多くの補償機構が存在する。治療および／またはライフスタイルの変化がなければ、最終的に補償機構は有効でなくなり、ヒトは、例えば、疲労感や呼吸障害などの心不全の症状を感じ始める。
【０００３】
２０世紀の初頭には、心臓機能の測定値を得る方法がなかったので、診断の整合性がなかった。ＮＹＨＡは、心不全の臨床記述に今日まで使用されている分類システム（Ｔｈｅ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，  １９９４）を開発した。ＮＹＨＡ分類システムによると、患者は、身体活動中の彼らの制限、通常の呼吸中のいずれかの制限または症状と息切れおよび／または狭心症に基づいて、４つのカテゴリの１つに入れられる。
【０００４】
分類システムを表１に示す。
【０００５】
表１．  心不全のＮＹＨＡ機能分類
【表１】
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【０００６】
心不全は、その高い世界的な有病率に主に起因して、実質的な社会的および経済的負担を社会に課している。例えば、世界中で２３００万人が毎年診断されていると概算される（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｗｅｌｆａｒｅ  （ＡＩＨＷ）  ２０１１）。オーストラリアの全死亡の約３０％が心不全に起因したので、生存率もまた低い（Ｐａｌａｚｚｕｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）。心不全の大きなリスク因子としては、年齢、運動不足、肥満につながる粗末な食習慣、喫煙および過度なアルコール摂取が挙げられる（Ｐａｌａｚｚｕｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）。多くの国で高齢化が起こっており、心不全がより一層蔓延する問題になることが予想される（Ｍａｒｉａｎ  ａｎｄ  Ｎａｍｂｉ，  ２００４）。
【０００７】
現在、心不全に関する基準は、その疾患の複雑さ故に、存在していない。特に、心不全に関する簡単な診断検査も存在しない。心臓の構造または機能における初期変化、例えば、先に言及した補償機構などは、医用画像工学を使用して検出できるが、しかしながら、すべての潜在的心不全患者において画像化を実施することは、実用的でないか、または費用対効果に優れていない。
【０００８】
例えば、冠状動脈心臓疾患、心不全、心筋障害、先天性心臓疾患、末梢血管疾患および脳卒中などの心血管疾患を発症する個体の可能性を評価するために設計された多くの非侵襲性リスク採点システムがある。例えば、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ  Ｒｉｓｋ  Ｓｃｏｒｅは、１０年間に冠状動脈心臓疾患、末梢動脈障害および心不全を発症するリスクを概算するためのアルゴリズムである（ＭｃＫｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７１）。他の例は、心不全の診断のためのＢｏｓｔｏｎ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ（Ｃａｒｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５）（最も高い感度および特異性を有することが示されている（Ｓｈａｍｓｈａｍ  ａｎｄ  Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，  ２０００））およびＤｕｋｅ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ（Ｈａｒｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７７）である。これらのタイプの基準は、診断結論に至るために患者の病歴、身体検査、所定の臨床診断法および臨床検査の組み合わせを使用するので（Ｋｒｕｍら、２００６）、進行したまたは重篤な心不全を診断するのに特に有用である。しかしながら、心不全と臨床症状の悪化の防止経過は早期診断を必要とする。そのため、初期心不全の非侵襲性診断の精度の改善が必要である。
【０００９】
従来技術公開が本明細書中で言及される場合、この言及は、その公開がオーストラリアまたはその他の国における当該技術分野の共有の一般知識の一部を形成することに承認を与えないことは明確に理解される。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、初期心不全、特に、ＮＹＨＡ分類法によるクラスＩおよびＩＩの診断方法に広く向けられる。特に、本発明は、初期心不全に対して高い相関関係を有するバイオマーカーの識別と使用に関する。
【００１１】
第一の態様において、本発明は、対象の初期心不全を検出する方法を提供するものであり、該方法は、該対象から得られた生物学的サンプルを分析し、該サンプル中の少なくとも１つのバイオマーカーの濃度を測定し、そして、該少なくとも１つのバイオマーカーの濃度がその少なくとも１つのバイオマーカーの所定の基準濃度より高いかまたは低い場合に、対象に対して心不全分類を割り当てることを含む。少なくとも１つのバイオマーカーの所定の基準濃度は、健常者から採取された生物学的サンプルから決定され得る。
【００１２】
第二の態様において、本発明は、対象の初期心不全を検出する方法を提供するものであり、該方法は、該対象から得られた生物学的サンプルを分析し、該サンプル中の少なくとも１つのバイオマーカーの濃度を測定し、健常者から得られた生物学的サンプル中の少なくとも１つのバイオマーカーの濃度を測定し、そして、対象からのサンプル中の少なくとも１つのバイオマーカーの濃度が健常者から得られた生物学的サンプル中の少なくとも１つのバイオマーカーの濃度より高いかまたは低い場合に、対象に対して心不全分類を割り当てることを含む。
【００１３】
第三の態様において、本発明は、対象の初期心不全を検出する方法を提供するものであり、該方法は、該対象から得られた生物学的サンプルを分析し、該サンプル中の少なくとも１つのバイオマーカーの濃度を測定し（ここで、該少なくとも１つのバイオマーカーは、ＫＬＫ１、ＴＣＰＤ、Ｓ１０Ａ７、ＤＬＤＨ、ＩＧＨＡ２、ＣＡＭＰ、ＫＶ１１０、ＮＡＭＰＴ、ＣＯＰＢ、ＳＰＲ２ＡおよびＨＶ３１１から成る群から選択される）、そして、該少なくとも１つのバイオマーカーの濃度がその少なくとも１つのバイオマーカーの所定の基準濃度より高いかまたは低い場合に、対象に対して心不全分類を割り当てることを含む。
【００１４】
第四の態様において、本発明は、対象の初期心不全を検出する方法を提供するものであり、該方法は、該対象から得られた生物学的サンプルを分析し、該サンプルの少なくとも１つのバイオマーカーの濃度を測定し（ここで、該少なくとも１つのバイオマーカーは、ＫＬＫ１、ＴＣＰＤ、Ｓ１０Ａ７、ＤＬＤＨ、ＩＧＨＡ２、ＣＡＭＰ、ＫＶ１１０、ＮＡＭＰＴ、ＣＯＰＢ、ＳＰＲ２ＡおよびＨＶ３１１から成る群から選択される）、健常者から得られた生物学的サンプル中の少なくとも１つのバイオマーカーの濃度を測定し、そして、対象からのサンプル中の少なくとも１つのバイオマーカーの濃度が健常者から得られた生物学的サンプル中の少なくとも１つのバイオマーカーの濃度より高いかまたは低い場合に、対象に対して心不全分類を割り当てることを含む。
【００１５】
第五の態様において、本発明は、対象の初期心不全をスクリーニングする方法を提供するものであり、該方法は、該対象から得られた生物学的サンプルを分析し、該サンプル中の少なくとも１つのバイオマーカーの濃度を測定し、そして、該少なくとも１つのバイオマーカーの濃度が少なくとも１つのバイオマーカーの所定の基準濃度より高いかまたは低い場合に、対象に対して心不全分類を割り当てることを含む。
【００１６】
第六の態様において、本発明は、初期心不全に関係する少なくとも１つのバイオマーカーの存在を検出するためのキットを提供するものであり、該キットは、少なくとも１つのバイオマーカーに特異的に結合する少なくとも１つの分子がその上に固定された固体支持体を含む。
【００１７】
第七の態様において、本発明は、初期心不全に関係する少なくとも１つのバイオマーカー（ここで、該少なくとも１つのバイオマーカーは、ＫＬＫ１、ＴＣＰＤ、Ｓ１０Ａ７、ＤＬＤＨ、ＩＧＨＡ２、ＣＡＭＰ、ＫＶ１１０、ＮＡＭＰＴ、ＣＯＰＢ、ＳＰＲ２ＡおよびＨＶ３１１から成る群から選択される）の存在を検出するためのキットを提供するものであり、該キットは、少なくとも１つのバイオマーカーに特異的に結合する少なくとも１つの分子がその上に固定された固体支持体を含む。
【００１８】
この明細書を通じて、文脈に別段の要求がない限り、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」および「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」という単語は、記述された整数または整数の群の包含を意味し、その他の整数または整数の群の除外を意味するものではないと理解される。
【００１９】
本明細書中に記載した特徴のいずれも、本発明の範囲内において本明細書中に記載する任意の１もしくは複数の他の特徴との任意の組み合わせで組み合わせられ得る。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、抽出イオンクロマトグラムのＬＣ‐ＥＳＩ‐ＭＳ／ＭＳデータから決定した場合の、ＰｒｏｔｅｉｎＰｉｌｏｔデータベース検索によって同定される各タンパク質からのペプチドの存在量を示すグラフである（表３）。
【００２１】
【図２】図２は、ＳＷＡＴＨ‐ＭＳによって測定した場合の、健康対照者とＮＹＨＡクラスＩおよびクラスＩＩＩ／ＩＶの心不全患者における様々な唾液タンパク質の相対的量を比較する一連のグラフである。図２Ａ、ＳＷＡＴＨ‐ＭＳによって妥当性確認した個々のタンパク質；図２Ｂ、ＳＰＬＣ２（ＢＮＰ：対照）；図２Ｃ、ＫＬＫ１（ＢＮＰ：対照）；図２Ｄ、ＫＬＫ１：ＳＰＬＣ２（ＢＮＰ：対照）；図２Ｅ、Ｓ１０Ａ７（ＢＮＰ：対照）；図２Ｆ、Ｓ１０Ａ７：ＳＰＬＣ２（ＢＮＰ：対照）；図２Ｇ、ＡＡＣＴ（ＢＮＰ：対照）；および図２Ｈ、ＡＡＣＴ：ＳＰＬＣ２（ＢＮＰ：対照）。
【００２２】
【図３】図３は、健康対照者と心不全患者における選択した唾液タンパク質の比を比較する一連のドットプロットである。図３Ａ、ＫＬＫ１：ＳＰＬＣ２；図３Ｂ、Ｓ１０Ａ７：ＳＰＬＣ２；および図３Ｃ、ＡＡＣＴ：ＳＰＬＣ２。
【００２３】
【図４】図４Ａ、４Ｂおよび４Ｃは、図３の唾液タンパク質比に関するＲＯＣ曲線である。図４Ａ、ＫＬＫ１：ＳＰＬＣ２；図４Ｂ、Ｓ１０Ａ７：ＳＰＣＬ２；および図４Ｃ、ＡＡＣＴ：ＳＰＬＣ２。
【００２４】
【図５】図５は、ＳＷＡＴＨ‐ＭＳによって測定した場合の、健康対照者とＮＹＨＡクラスＩおよびクラスＩＩＩ／ＩＶの心不全患者における様々な唾液タンパク質（ＫＶ１１０、ＮＡＭＰＴ、ＣＯＰＢ、ＳＰＲ２ＡおよびＨＶ３１１）の相対的量を比較する一連のグラフである。
【００２５】
【図６】図６は、様々なコホート（ＮＹＨＡクラスＩ、ＮＹＨＡクラスＩＩＩ／ＩＶおよび対照）間の、図５に示した唾液タンパク質の組み合わせの比較のためのＲＯＣ曲線の重ね合わせである。
【００２６】
【図７】図７は、ＳＷＡＴＨ‐ＭＳによって測定した場合の、健康対照者とＮＹＨＡクラスＩおよびクラスＩＩＩ／ＩＶの心不全患者における様々な唾液タンパク質（ＫＬＫ１、ＴＣＰＤ、Ｓ１０Ａ７、ＤＬＤＨ、ＩＧＨＡ２およびＣＡＭＰ）の相対的量を比較する一連のグラフである。
【００２７】
【図８】図８は、様々なコホート（ＮＹＨＡクラスＩ、ＮＹＨＡクラスＩＩＩ／ＩＶおよび対照）間の、図７に示した唾液タンパク質の組み合わせの比較のためのＲＯＣ曲線の重ね合わせである。
【００２８】
【図９】図９は、免疫学的アッセイによって測定した場合の、健康対照者、心不全を発症するリスクが高い個体および心不全患者における様々な唾液タンパク質（Ｓ１０Ａ７、ＫＬＫ１およびＣＡＭＰ）の濃度を比較する一連のグラフ；ならびに唾液タンパク質の組み合わせの比較のためのＲＯＣ曲線である。予測スコアは、これらの唾液タンパク質の濃度を組み合わせることによって作り出された。図９Ａ、Ｓ１０Ａ７；図９Ｂ、ＣＡＭＰ；図９Ｃ、ＫＬＫ１；図９Ｄ、組み合わせた唾液タンパク質の予測スコア；図９Ｅ、心不全患者と対照者の間の唾液タンパク質の組み合わせの比較のためのＲＯＣ曲線；図９Ｆ、ＳＣＲＥＥＮ‐ＨＦコホートと対照者の間の唾液タンパク質の組み合わせの比較のためのＲＯＣ曲線。
【００２９】
【図１０】図１０は、試験への組み入れ組み入れ後に心血管疾患を発症した試験対象と、心臓血管疾患に関連する入院していない試験対象の間の予測スコアを示すグラフである。
【００３０】
【図１１】（Ａ）６人の健康対照者と６人の心不全患者の唾液サンプル中のＫＬＫ１、ＴＣＰＤ、Ｓ１０Ａ７、ＤＬＤＨ、ＩＧＨＡ２およびＣＡＭＰのウエスタンブロット法。（Ｂ）健康対照者と心不全患者の唾液サンプル中のＫＬＫ１、ＴＣＰＤ、Ｓ１０Ａ７、ＤＬＤＨ、ＩＧＨＡ２およびＣＡＭＰの標準誤差を伴った平均相対バンド強度。
【００３１】
【図１２】図１２は、１２人の健康対照者と１２人の心不全患者の追加の唾液サンプル中のＳ１０Ａ７のウエスタンブロットである。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
実施形態の説明
略語
以下の略語を全体にわたって使用する：
ＡＡＣＴ＝α１抗キモトリプシン
ＢＮＰ＝脳性ナトリウム利尿ペプチド
ＣＡＭＰ＝カテリシジン抗微生物ペプチド
ＣＯＰＢ＝コートマーサブユニットβ
ＤＬＤＨ＝ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ、ミトコンドリアのもの
ＥＳＩ＝電子スプレーイオン化
ＧＥＬＳ＝ゲルゾリン
ｈ＝時間
ＨＶ３１１＝Ｉｇ重鎖Ｖ‐ＩＩＩ領域ＫＯＬ
ＩＧＨＡ２＝Ｉｇα‐２鎖Ｃ領域
ＩＧＪ＝免疫グロブリンＪ鎖
ＩＱＲ＝四分位範囲
ＫＬＫ１＝カリクレイン１
ＫＶ１１０＝Ｉｇκ鎖Ｖ‐Ｉ領域ＨＫ１０２
ＬＣ＝液体クロマトグラフィー
ＬＣ‐ＥＳＩ‐ＭＳ／ＭＳ＝液体クロマトグラフ‐電子スプレーイオン化タンデム質量分析法
ＬＰＬＣ１＝長い口蓋肺および鼻上皮癌腫関連タンパク質１
ｍｉｎ＝分
ＭＭＰ９＝マトリックスメタロプロテイナーゼ‐９
ＭＳ＝質量分析法
ＭＳ／ＭＳ＝タンデム質量分析法
ＮＡＭＰＴ＝ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ
ＮＰＶ＝陰性適中率
ＮＹＨＡ＝ニューヨーク心臓協会
ＰＢＳ＝リン酸緩衝生理食塩水
ＰＰＶ＝陽性適中率
ｒｃｆ＝相対遠心力
ＲＯＣ＝受信者動作特性
ｓ＝（単数もしくは複数の）秒
Ｓ１０Ａ７＝Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ７
ＳＰＬＣ２＝短い口蓋肺および鼻関連タンパク質２
ＳＰＲ２Ａ＝小型プロリンリッチタンパク質２Ａ  
ＳＷＡＴＨ＝すべての理論的フラグメントイオンスペクトルの連続ウィンドウ取得
ＴＣＰＤ＝Ｔ複合タンパク質１サブユニットδ
ＴＯＦ＝飛行時間
ＶＩＭＥ＝ビメンチン
【００３３】
本発明は、初期心不全に罹患している対象から採取された生物学的サンプル中のタンパク質が、健常者から採取された生物学的サンプルと比較して、示差的な存在量であるという発見を一部根拠としている。本発明者らは、高い存在量のタンパク質の喪失およびＳＷＡＴＨ‐ＭＳを使用して、初期心不全において診断有用性を有する見込みのあるバイオマーカーとして唾液タンパク質を同定する。
【００３４】
従って、第一の態様において、本発明は、対象の初期心不全を検出する方法を提供するものであり、該方法は、該対象から得られた生物学的サンプルを分析し、該サンプル中の少なくとも１つのバイオマーカーの濃度を測定し、そして、該少なくとも１つのバイオマーカーの濃度がその少なくとも１つのバイオマーカーの所定の基準濃度より高いかまたは低い場合に、対象に対して心不全分類を割り当てることを含む。少なくとも１つのバイオマーカーの所定の基準濃度は、健常者から取られた生物学的サンプルから決定され得る。
【００３５】
本願発明の目的に関して、心不全の病期を説明するための「（単数もしくは複数の）初期」という語句は、ニューヨーク心臓協会によって規定される機能的分類ＮＹＨＡクラスＩおよび／またはＮＹＨＡクラスＩＩを指す。
【００３６】
「生物学的サンプル」という用語は、対象から抽出されるサンプルを指すために本明細書中に使用される。その用語は、未処理の、処理した、希釈したまたは濃縮した生物学的サンプルを包含する。対象から得られた生物学的サンプルは、例えば、全血、血清または血漿などのあらゆる好適なサンプルであり得る。好ましくは、生物学的サンプルは対象の口腔から得られる。従って、生物学的サンプルは、痰または唾液であり得る。初期心不全を診断するための非侵襲性の、費用対効果に優れた方法を提供する本発明によると、対象から得られた生物学的サンプルは、好ましくは唾液である。
【００３７】
少なくとも１つのバイオマーカーは、初期心不全との相関関係を有すると同定された生物学的サンプル中に存在するタンパク質である。生物学的サンプルは、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つなどのバイオマーカーの濃度について分析され得る。例えば、少なくとも１つのバイオマーカーは、ＫＬＫ１、ＴＣＰＤ、Ｓ１０Ａ７、ＤＬＤＨ、ＩＧＨＡ２、ＣＡＭＰ、ＫＶ１１０、ＮＡＭＰＴ、ＣＯＰＢ、ＳＰＲ２ＡおよびＨＶ３１１から成る群から選択されるいろいろなタンパク質であり得る。一実施形態において、少なくとも１つのバイオマーカーは、ＫＬＫ１、ＴＣＰＤ、Ｓ１０Ａ７、ＤＬＤＨ、ＩＧＨＡ２およびＣＡＭＰから成るタンパク質の群から選択される。好ましくは、少なくとも１つのバイオマーカーは、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つすべてのこれらのタンパク質から成るバイオマーカーパネルである。特に好ましい実施形態において、バイオマーカーパネルには、ＫＬＫ１、Ｓ１０Ａ７およびＣＡＭＰが含まれる。代替の実施形態において、少なくとも１つのバイオマーカーは、ＫＶ１１０、ＮＡＭＰＴ、ＣＯＰＢ、ＳＰＲ２ＡおよびＨＶ３１１から成る群から選択される。特に好ましい実施形態において、少なくとも１つのバイオマーカーは、２つ、３つ、４つまたは５つすべてのこれらのタンパク質から成るバイオマーカーパネルである。
【００３８】
バイオマーカーの所定の基準濃度は、範囲外のバイオマーカーの濃度が初期心不全を暗示するような、濃度範囲の形態であり得る。あるいは、バイオマーカーの所定の基準濃度は、その値より高いまたは低いバイオマーカーの濃度が初期心不全を暗示するような、特定の値の形態であり得る。そのため、対象の初期心不全の検出に使用される各バイオマーカーに関して、健常者からの生物学的サンプルのバイオマーカーの所定の基準濃度が決定されたかまたは知られている。
【００３９】
本願発明との関連において、および健常者から採取された生物学的サンプルからの少なくとも１つのバイオマーカーの所定の基準濃度の決定に関して、「健常者」は、心不全に罹患していない対象である。すなわち、健常者は、心不全のあらゆる表だった症状に罹患しておらず、かつ、ＮＹＨＡクラスＩまたはクラスＩＩに分類されないであろう対象である。
【００４０】
本発明者らは、特定のタンパク質が、健常者の同じタンパク質の存在量と比較したときに、ＮＹＨＡクラスＩまたはクラスＩＩに分類された対象からの唾液中での存在量が増大したことを驚いたことに見出した。逆に、特定のタンパク質は、健常者の同じタンパク質の存在量と比較したときに、ＮＹＨＡクラスＩまたはクラスＩＩに分類された対象からの唾液中での存在量を減少させた。
【００４１】
心不全分類は対象からの生物学的サンプルのうちのたった１つのバイオマーカーの濃度に基づいて対象に付与され得るが、分類のより高度な確実性がより多くのバイオマーカーを使用することによって達成される場合があるので、生物学的サンプル中の２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上のバイオマーカーの濃度を分類の割り当ての根拠にすることは、有利である。
【００４２】
対象の初期心不全を検出するために、２つ以上のバイオマーカーから成るバイオマーカーパネルを使用するとき、そのパネルは健常者からの唾液中の同じバイオマーカーに関するものより、心不全対象から唾液中により高い濃度を有するバイオマーカーから成る。あるいは、そのパネルは、健常者からの唾液中の同じバイオマーカーからのものより、心不全対象からの唾液中でより低い濃度を有するバイオマーカーから成り得る。更なる代替手段において、そのパネルは、バイオマーカーの組み合わせから成り得、ここで、少なくとも１つのバイオマーカーは、健常者からの唾液中の同じバイオマーカーに関するものに比べて、心不全対象からの唾液中でより高い濃度を有する、および少なくとも１つのバイオマーカーは、健常者からの唾液の同じバイオマーカーに関するものに比べて、心不全対象からの唾液中でより低い濃度を有する。
【００４３】
第二の態様において、本発明は、対象の初期心不全を検出する方法を提供するものであり、該方法は、該対象から得られた生物学的サンプルを分析し、該サンプル中の少なくとも１つのバイオマーカーの濃度を測定し、健常者から得られた生物学的サンプル中の少なくとも１つのバイオマーカーの濃度を測定し、そして、対象からのサンプル中の少なくとも１つのバイオマーカーの濃度が健常者から得られた生物学的サンプル中の少なくとも１つのバイオマーカーの濃度より高いかまたは低い場合に、対象に対して心不全分類を割り当てることを含む。
【００４４】
潜在的な心臓不全対象または健常者からの、生物学的サンプル中の少なくとも１つのバイオマーカーの濃度は、タンパク質濃度を決定するための任意の好適な手段によって決定され得る。例えば、その濃度は、マススペクトル分析によって測定され得る。潜在的な心不全対象からのサンプルの質量スペクトルと、健常者からのサンプルの質量スペクトルによる特定のバイオマーカーのピーク強度の比較は、２つのサンプル中のバイオマーカーの存在量の相対的差異の徴候を提供し得る。より正確な比較は、以下の実施例で詳述されるとおり、ＳＷＡＴＨ‐ＭＳを使用して得られる。
【００４５】
あるいは、生物学的サンプル中の少なくとも１つのバイオマーカーの濃度の測定は、少なくとも１つのバイオマーカーに特異的に結合する１つの試薬または複数の試薬を使用しておこなわれ得る。例えば、その試薬は、バイオマーカーのエピトープに対する抗体を含む場合があり、その抗体は、抗体‐バイオマーカー複合体の存在を検出するための標識（例えば、蛍光標識）を任意選択で包含する。
【００４６】
第三の態様において、本発明は、対象の初期心不全を検出する方法を提供するものであり、該方法は、該対象から得られた生物学的サンプルを分析し、該サンプル中の少なくとも１つのバイオマーカーの濃度を測定し（ここで、該少なくとも１つのバイオマーカーは、ＫＬＫ１、ＴＣＰＤ、Ｓ１０Ａ７、ＤＬＤＨ、ＩＧＨＡ２、ＣＡＭＰ、ＫＶ１１０、ＮＡＭＰＴ、ＣＯＰＢ、ＳＰＲ２ＡおよびＨＶ３１１から成るタンパク質の群から選択される）、そして、該少なくとも１つのバイオマーカーの濃度がその少なくとも１つのバイオマーカーの所定の基準濃度より高いかまたは低い場合に、対象に対して心不全分類を割り当てることを含む。その少なくとも１つのバイオマーカーの所定の基準濃度は、健常者から採取された生物学的サンプルから決定され得る。
【００４７】
生物学的サンプルは、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個または１１個すべてのタンパク質の濃度について分析され得る。心不全分類は生物学的サンプルからのたった１つのタンパク質の濃度に基づいて対象に付与され得るが、分類のより高度な確実性がより多くのバイオマーカーを使用することによって達成される場合があるので、生物学的サンプル中の２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個または１１個のタンパク質の濃度を分類の割り当ての根拠にすることは、有利である。
【００４８】
分類の確実性は、比較データの感度および特異性を測定することによって評価できる。
【００４９】
第四の態様において、本発明は、対象の初期心不全を検出する方法を提供するものであり、該方法は、該対象から得られた生物学的サンプルを分析し、該サンプルの少なくとも１つのバイオマーカーの濃度を測定し（ここで、該少なくとも１つのバイオマーカーは、ＫＬＫ１、ＴＣＰＤ、Ｓ１０Ａ７、ＤＬＤＨ、ＩＧＨＡ２、ＣＡＭＰ、ＫＶ１１０、ＮＡＭＰＴ、ＣＯＰＢ、ＳＰＲ２ＡおよびＨＶ３１１から成るタンパク質の群から選択される）、健常者から得られた生物学的サンプル中の少なくとも１つのバイオマーカーの濃度を測定し、そして、対象からのサンプル中の少なくとも１つのバイオマーカーの濃度が健常者から得られた生物学的サンプル中の少なくとも１つのバイオマーカーの濃度より高いかまたは低い場合に、対象に対して心不全分類を割り当てることを含む。
【００５０】
第五の態様において、本発明は、初期心不全に関係する少なくとも１つのバイオマーカーの存在を検出するためのキットを提供するものであり、該キットは、少なくとも１つのバイオマーカーに特異的に結合する少なくとも１つの分子がその上に固定された固体支持体を含む。
【００５１】
少なくとも１つのバイオマーカーに特異的に結合する少なくとも１つの分子が、任意の好適な分子になり得る。好ましくは、その少なくとも１つの分子は、少なくとも１つのバイオマーカーに特異的に結合する抗体を含む。そのため、固体支持体は、その上に固定された１つ、２つ、３つ、４つなどの抗体を有し得る。
【００５２】
固体支持体は、抗体の固定に適するように修飾され得、かつ、少なくとも１つの検出する方法に適している任意の好適な材料であり得る。固体支持体に好適な材料の代表的な例としては、ガラスおよび修飾もしくは官能化ガラス、プラスチック（アクリル、ポリスチレンおよびスチレンやその他の材料のコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、テフロン（登録商標）などを含む）、多糖類、ナイロンもしくはニトロセルロース、樹脂、シリカまたはシリコンおよび修飾シリコンを含めたシリカベースの材料、炭素、金属、無機ガラスならびにプラスチックが挙げられる。その固体支持体は、ほとんど蛍光を発することなく、光学的検出を可能にし得る。
【００５３】
その固体支持体は平面であり得るが、他の形状の基板が利用され得る。例えば、その固体支持体は、内面に配置された抗体を有するチューブである場合がある。
【００５４】
第六の態様において、本発明は初期心不全に関係する少なくとも１つのバイオマーカー（ここで、該少なくとも１つのバイオマーカーは、ＫＬＫ１、ＴＣＰＤ、Ｓ１０Ａ７、ＤＬＤＨ、ＩＧＨＡ２、ＣＡＭＰ、ＫＶ１１０、ＮＡＭＰＴ、ＣＯＰＢ、ＳＰＲ２ＡおよびＨＶ３１１から成る群から選択される）の存在を検出するためのキットを提供するものであり、該キットは、少なくとも１つのバイオマーカーに特異的に結合する少なくとも１つの分子がその上に固定された固体支持体を含む。
【実施例】
【００５５】
実施例1
材料と方法
試験参加者
この試験はＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｔｈｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｂｏａｒｄ  ａｎｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃｓ  ＣｏｍｍｉｔｔｅｅおよびＲｏｙａｌ  Ｂｒｉｓｂａｎｅ  ａｎｄ  Ｗｏｍｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｏｖｅｒｎａｎｃｅによって承認された。すべての試験参加者が、＞１８歳の年齢であり、そして、サンプル採取前にインフォームドコンセントを受けた。健康対照者の除外基準は、いずれかの合併疾患および口腔疾患（例えば、歯周疾患や歯肉炎、自己免疫性疾患、感染性疾患、筋骨格疾患、または悪性疾患、および最近の手術または外傷性傷害）の存在を表明するようにボランティアに質問する簡単なアンケートに基づいた。何らか条件が存在した場合、その参加者を試験から除外した。ボランティアは、白人およびアジア系民族出身であり、発熱または悪寒の症状がなく、良好な口腔衛生を有した。
【００５６】
合計３０人の健康対照者および３３人の徴候性心不全患者を、オーストラリアのブリスベンのＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄ，  ｔｈｅ  Ｍａｔｅｒ  Ａｄｕｌｔ  ＨｏｓｐｉｔａｌまたはＲｏｙａｌ  Ｂｒｉｓｂａｎｅ  ａｎｄ  Ｗｏｍｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌから２０１２年１月から２０１４年７月まで動員した。患者を、彼らの臨床的症状に基づいてＭａｔｅｒ  Ａｄｕｌｔ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ａｎｄ  Ｒｏｙａｌ  Ｂｒｉｓｂａｎｅ  ａｎｄ  Ｗｏｍｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌにて心臓内科医によってニューヨーク心臓協会（ＮＹＨＡ）機能的分類システムを使用して分類した。試験に参加したすべての患者を、ＮＹＨＡクラスＩＩＩまたはＩＶ患者として分類した。心不全患者の平均年齢は６７．６歳であり、そして、健康対照者の平均年齢は４９．７歳であった。男性は、心不全患者コホートの６３．３％および健康対照者コホートの４３．３％を含んだ。
唾液サンプル採取
【００５７】
全口腔非刺激安静時唾液を、以前に公開された方法（Ｍａｒｔｉｎｅｔ  Ｗ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３；  Ｐｕｎｙａｄｅｅｒａ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１；  Ｆｏｏ  ＪＹ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３；  Ｃａｓｔａｇｎｏｌａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１；  Ｈｅｌｍｅｒｈｏｒｓｔ  ＥＪ  ａｎｄ  Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ  ＦＧ，  ２００７；  Ｌｏｏ  ＪＡ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０）に従って初期および後期心不全患者および健康対照者から採取した。ボランティアには、唾液採取前の少なくとも３０分間、飲食（水を除く）を控えるように依頼した。ボランティアには、食品粒子や食べかすを取り除くために水で口をすすぎ、彼らの頭を前下方に傾け、口内に唾液を貯め、そして、氷上のＦａｌｃｏｎチューブ（５０ｍＬ、Ｇｒｅｉｎｅｒ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）内に吐き出すように依頼した。サンプルを、ドライアイスで冷やして研究室まで運び、タンパク質低結合型エッペンドルフチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，  ＵＳＡ）内に等分し、そして、後の解析のために‐８０℃にて保存した。
唾液サンプルにおける総タンパク質濃度
【００５８】
一次審査のために、患者（ｎ＝１０）および対照（ｎ＝１０）からの唾液サンプル中の総タンパク質濃度を、２Ｄ  Ｑｕａｎｔキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ，  Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して計測した。吸収度を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＲ１９０プレートリーダ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，  ＬＬＣ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，  ＵＳＡ）を使用して４８０ｎｍにて計測した。Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ（商標）Ｂｒａｄｆｏｒｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ‐Ｒａｄ，  ＵＳＡ）を、ＳＷＡＴＨ‐ＭＳ妥当性確認のために、患者（ｎ＝３０）および対照（ｎ＝３０）からの唾液サンプル中の総タンパク質濃度を定量化するのに使用した（以下を参照）。
マススペクトル分析のための唾液サンプル調製
【００５９】
心不全患者および健康対照者から採取した、タンパク質含有量について正規化される唾液サンプルを別々に貯留した。各個体からの等量の総タンパク質を、対照および患者に関して、それぞれ１０ｍｇの総貯留タンパク質を得るように貯留した。貯留したサンプルを、製造業者の取扱説明書に従って、ＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ（登録商標）小容量キット（Ｂｉｏ‐Ｒａｄ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）を用いて加工した。ビーズ充填層（２０μＬ）を貯留した唾液に加え、そして、回転式振盪機により２５℃にて１６時間インキュベートした。ビーズを１，０００相対遠心力（ｒｃｆ）にて１分間の遠心分離によってペレット化し、そして、上清を捨てた。ビーズをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、そして、結合タンパク質を８Ｍの尿素、２％のＣＨＡＰＳおよび５％の酢酸（２０μＬ）中に溶出した。溶出したタンパク質を、１：１のメタノール：アセトン（８０μＬ）の添加、−２０℃にて１６時間のインキュベーション、そして、１０分間の１８，０００ｒｃｆの遠心分離によって沈殿させた。そのタンパク質ペレットを、１％のＳＤＳを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌバッファー  ｐＨ８中に再懸濁した。システインを、１０ｍＭまでのＤＴＴの添加、そして、９５℃にて１０分間のインキュベーションによって還元し、次に、２５ｍＭまでのアクリルアミドの添加、そして、２３℃にて１時間のインキュベーションによってアルキル化した。タンパク質を、上述のとおり沈殿させ、プロテオミックスグレードのトリプシン（１μｇ）（ＳｉｇｍａＡｌｒｄｉｃｈ，  ＵＳＡ）を含む５０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３（５０μＬ）中に再懸濁し、そして、３７℃にて１６時間インキュベートした。
【００６０】
個々のサンプルを使用したＳＷＡＴＨ‐ＭＳ妥当性確認のために、５０μｇの総タンパク質を含有する唾液に、等量の１００ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌバッファー  ｐＨ８、２％のＳＤＳおよび２０ｍＭのＤＴＴを補い、そして、９５℃にて１０分間インキュベートした。次に、タンパク質を、上述のとおりアルキル化し、沈殿させ、そして、消化した。
質量分析とデータ分析
【００６１】
ペプチドを、Ｃ１８  Ｚｉｐ  Ｔｉｐｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  ＵＳＡ）を使用して脱塩し、そして、原則的に先に記載したとおり、Ｎａｎｏｓｐｒａｙ  ＩＩＩインタフェース（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ）を備えたＴｒｉｐｌｅ  ＴＯＦ  ５６００質量分析計によりＰｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  ｎａｎｏ  ＬＣシステム（Ｓｈｉｍａｄｚｕ，  Ｊａｐａｎ）を使用したＬＣ‐ＥＳＩ‐ＭＳ／ＭＳによって分析した（Ｆｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３；  Ｏｖｃｈｉｎｎｉｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２）。約２μｇのペプチドを、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｃ１８トラップ（３００Åの細孔サイズ、５μｍの粒度、０．３ｍｍ  ｉ．ｄ．×５ｍｍ）により３０μＬ／分の流量にて３分間脱塩し、次に、Ｖｙｄａｃ  ＥＶＥＲＥＳＴ逆相Ｃ１８  ＨＰＬＣカラム（３００Åの細孔サイズ、５μｍの粒度、１５０μｍ  ｉ．ｄ．×１５０ｍｍ）により１μＬ／分の流量にて分離した。ペプチドを、バッファーＡ（１％のアセトニトリルと０．１％のギ酸）およびバッファーＢ（０．１％のギ酸を加えた８０％のアセトニトリル）を用いた、２分間かけた１‐１０％のバッファーＢと、それに続く４５分間かけた１０‐６０％のバッファーＢのグラジエントで分離した。気体および電圧設定を必要に応じて調整した。３５０〜１８００のｍ／ｚからのＭＳ‐ＴＯＦスキャンを、０．５秒間にわたり実施し、それに続いて、１スペクトルあたり０．０５秒間にわたる４０〜１８００のｍ／ｚからの上位２０ペプチドの自動化ＣＥ選択を用いてＭＳ／ＭＳの情報依存型取得を実施した。同一のＬＣパラメーターを、０．０５秒間にわたる３５０〜１８００のｍ／ｚからのＭＳ‐ＴＯＦスキャンを用いたＳＷＡＴＨ分析と、それに続く４００〜１２５０のｍ／ｚ範囲にわたってそれぞれ０．１秒間重複する１ｍ／ｚのウィンドウを有する２６ｍ／ｚの分離ウィンドウを用いた高感度の情報独立型取得に使用した。コリジョンエネルギーを、ｍ／ｚウィンドウ範囲に基づくＡｎａｌｙｓｔソフトウェア（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ）によって自動的に割り当てた。
【００６２】
タンパク質を、ＰｒｏｔｅｉｎＰｉｌｏｔ（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ）を使用して同定し、標準的な設定：サンプルタイプ、識別；システインアルキル化、なし；装置、Ｔｒｉｐｌｅ‐ＴＯＦ  ５６００；分析種、制限なし；ＩＤフォーカス、生物学的修飾；酵素、トリプシン；検索努力、ＩＤの最後まで、を使用してＬｕｄｗｉｇＮＲデータベース（ｈｔｔｐ：／／ａｐｃｆ．ｅｄｕ．ａｕからダウンロード、２０１２年１月２７日時点；１６，８１８，９７３配列；５，８９１，３６３，８２１残基）を検索した。ＰｒｏｔｅｉｎＰｉｌｏｔを使用した誤発見率解析を、すべての検索に対して実施した。９９％超の信頼性および１％未満の部分的な誤発見率で同定されたペプチドを、更なる分析のために含んだ。タンパク質ランク、スコア、ペプチド包含百分率およびペプチド数に基づくタンパク質量の準定量的比較を、先に記載したとおり実施した（Ｂａｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｚ，  ２０１３）。抽出イオンクロマトグラムをＰｅａｋ  Ｖｉｅｗ  １．１を使用して得た。ＰｒｏｔｅｉｎＰｉｌｏｔデータを、ＳＷＡＴＨ分析のためのイオンライブラリとして使用した。タンパク質量を、標準的な設定を用いたＰｅａｋ  Ｖｉｅｗ  １．２ソフトウェアで自動的に計測した。それぞれのタンパク質の存在量を、ＡＮＯＶＡを使用して、それぞれの個々のサンプル中で同定されたタンパク質の総存在量に対して正規化し、ログ変換し、そして、比較した。ＳＷＡＴＨ分析を用いて作成したデータを、Ｒに基づいて（Ｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｏｒｅ  Ｔｅａｍ，  ２０１１）、オープンソースの統計パッケージＭＳｓｔａｔｓ（Ｃｌｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２；  Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２）を使用して、タンパク質の有意性について分析した。群比較関数を使用して、心不全患者と対照との間のタンパク質量における有意な変化を比較した。
実施例２
ＬＣ‐ＥＳＩ‐ＭＳ／ＭＳによるタンパク質の同定
【００６３】
心不全の新規の推定唾液タンパク質バイオマーカーを、高いＢＮＰを有する患者および健康対照者からの唾液を別々に貯留し、ＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒダイナミックレンジ縮小をおこない、トリプシンでタンパク質を消化し、そして、ＬＣ‐ＥＳＩ‐ＭＳ／ＭＳとデータベース検索を使用してペプチドを同定することによって同定した。心不全患者と対照との間で変化した存在量を有するタンパク質を検出するために、各タンパク質について同定されたペプチドのランク、スコア、ペプチド包含百分率および数を比較するために、準定量的アプローチを使用した。この準定量的アプローチは、表２に提示したように、複数の推定される示差的存在量のタンパク質を同定した。
表２．  心不全患者を対照と比較する、示差的な存在量の唾液タンパク質
【表２】
2020530120.tif 000003
【００６４】
これらの推定バイオマーカーの最初の妥当性確認のために、抽出イオンクロマトグラムのＬＣ‐ＥＳＩ‐ＭＳ／ＭＳデータ（図１）から決定した、ＰｒｏｔｅｉｎＰｉｌｏｔデータベース検索によって同定された各タンパク質のペプチドの存在量（表３）を比較した。ペプチド存在量の比較は、対照サンプルと比較した心不全患者において、有意に高い存在量を有する２つのタンパク質（長い口蓋、肺および鼻上皮癌腫関連タンパク質１、ＬＰＬＣ１（Ｐ＝０．０００４）およびマトリックスメタロプロテイナーゼ‐９、ＭＭＰ９（Ｐ＝０．０２））および有意に低い存在量を有する２つのタンパク質（ゲルゾリン、ＧＥＬＳ（Ｐ＝０．０３）および短い口蓋、肺および鼻関連タンパク質２、ＳＰＬＣ２（Ｐ＝０．０００３））を同定した。数個の追加のタンパク質は、検出された確信して同定したペプチドの数が少ないため、統計的に比較できなかった存在量に大きな変更を示した（カリクレイン１、ＫＬＫ１；免疫グロブリンＪ鎖、ＩＧＪ；およびビメンチン、ＶＩＭＥ）。そのため、この最初の解析では、心不全のいくつかの推定唾液タンパク質バイオマーカーを同定した。
表３．  ＰｒｏｔｅｉｎＰｉｌｏｔを使用して同定した各タンパク質のためのペプチドの相対的量
【表３】
2020530120.tif 000004
実施例３
ＳＷＡＴＨ‐ＭＳを用いた妥当性確認
【００６５】
貯留サンプルのＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒＲ分析から同定した新規推定バイオマーカーの妥当性確認するために、ＳＷＡＴＨ‐ＭＳ検出を、心不全患者および対照から採取した個々の唾液サンプルに対して実施した。心不全患者と対照からの唾液の不偏性ＳＷＡＴＨ‐ＭＳプロテオミクス比較は、存在量の＞２倍の差および調整Ｐ＜０．０１を有する７つのタンパク質の同定をもたらした。これには、推定心不全バイオマーカーとしてＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ分析によって同定されたＳＰＬＣ２タンパク質が挙げられる。ＳＰＬＣ２の相対的量は、対照に比べて心不全患者において１．８９倍低かった。高い特異性（ほとんど完全な群分離）（図２Ａを参照、調整Ｐ＜０．０００１）を有する唾液は、心不全の唾液タンパク質バイオマーカーとしてＳＰＬＣ２の妥当性確認した。ＫＬＫ１はまた、対照からの唾液に比べて、心不全患者からの唾液中のその高い存在量のため、推定バイオマーカーとしてＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒ分析によっても推定的に同定された（図１）。ＫＬＫ１の高い存在量はまた、ＳＷＡＴＨ‐ＭＳ分析によっても妥当性確認され、そしてそれは、対照と比較して、心不全患者における１．３倍の増大を示した（図２Ｂ、調整Ｐ＝＜０．０００１）。
【００６６】
対照と比較して心不全患者においてＳＰＬＣ２存在量が減少し、かつ、ＫＬＫ１存在量が増大した場合に、心不全を同定するための個別に妥当性確認したこれらのバイオマーカーの存在量の比の有用性を調査した。比の５．３倍の差と高い特異性（図２Ｃ、Ｐ＝０．００００１）を有する、心不全患者と対照者との間の大きく、かつ、高度に有意な識別を観察した。Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ（ＲＯＣ）曲線分析をおこなって、バイオマーカーとしてのＳＰＬＣ２およびＫＬＫ１の診断能力を判定した。ＫＬＫ：ＳＰＬＣ２の分析（図３Ａ、図４Ａ）は、７０．０％の感度および６６．７％の特異性を有する０．７５の曲線下面積（ＡＵＣ）を示す。
実施例４
バイオマーカーパネルの予測能力
【００６７】
初期心不全に関する推定バイオマーカーＫＶ１１０、ＮＡＭＰＴ、ＣＯＰＢ、ＳＰＲ２ＡおよびＨＶ３１１（図５）を含むパネルの予測能力を、ＭＳｓｔａｔｓ（Ｃｌｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２；  Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２）を使用して評価したが、それは、Ｒ（Ｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｏｒｅ  Ｔｅａｍ，  ２０１１）に基づいている。様々なコホート（ＮＹＨＡクラスＩ、ｎ＝２０；ＮＹＨＡクラスＩＩＩ／ＩＶ、ｎ＝１９；健康対照者、ｎ＝２０）におけるバイオマーカーの組み合わせの感度および特異性を表４で説明する。
表４．  バイオマーカーの組み合わせの感度と特異性
【表４】
2020530120.tif 000005
【００６８】
図６のＲＯＣ曲線は、５つのバイオマーカーＫＶ１１０、ＮＡＭＰＴ、ＣＯＰＢ、ＳＰＲ２ＡおよびＨＶ３１１の組み合わせの診断可能性について有用な概要を提供する。ＲＯＣ曲線下面積が１に近ければ近くほど、診断可能性は良好である。健康対照者における５つのバイオマーカーと比較した、ＮＹＨＡクラスＩ患者における５つのバイオマーカーの組み合わせに関するＲＯＣ曲線には、０．９６のＡＵＣ、９５．０％の感度および９０．０％の特異性がある（図６）。これらの結果は、５つのバイオマーカーの組み合わせの高い診断能力を暗示する。
【００６９】
初期心不全に関する推定バイオマーカーＫＬＫ１、ＴＣＰＤ、Ｓ１０Ａ７、ＤＬＤＨ、ＩＧＨＡ２およびＣＡＭＰ（図７）を含むパネルの予測能力を、ＭＳｓｔａｔｓ（Ｃｌｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２；  Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２）を使用して評価したが、それは、Ｒ（Ｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｏｒｅ  Ｔｅａｍ，  ２０１１）に基づいている。様々なコホート（ＮＹＨＡクラスＩ、ｎ＝２０；ＮＹＨＡクラスＩＩＩ／ＩＶ、ｎ＝１９；健康対照者、ｎ＝２０）におけるバイオマーカーの組み合わせの感度および特異性を表５で説明する。
表５．  バイオマーカーの組み合わせの感度と特異性
【表５】
2020530120.tif 000006
【００７０】
図８のＲＯＣ曲線は、６つのバイオマーカーＫＬＫ１、ＴＣＰＤ、Ｓ１０Ａ７、ＤＬＤＨ、ＩＧＨＡ２およびＣＡＭＰの組み合わせの診断可能性について有用な概要を提供する。ＲＯＣ曲線下面積が１に近ければ近くほど、診断可能性は良好である。健康対照者における６つのバイオマーカーと比較した、ＮＹＨＡクラスＩ患者における５つのバイオマーカーの組み合わせに関するＲＯＣ曲線には、０．８６のＡＵＣ、８０．０％の感度および７０．０％の特異性がある（図６）。これらの結果は、６つのバイオマーカーの組み合わせの高い診断能力を暗示する。
【００７１】
初期心不全を発症するリスクが高い個体に関する推定バイオマーカーＫＬＫ１、Ｓ１０Ａ７およびＣＡＭＰ（図９）を含むパネルの予測能力を、ＭＳｓｔａｔｓ（Ｃｌｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２；  Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２）を使用して評価したが、それは、Ｒ（Ｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｏｒｅ  Ｔｅａｍ，  ２０１１）に基づいている。様々なコホート（心不全患者、ｎ＝１００；心不全を発症するリスクが高い個体（ＳＣＲＥＥＮ‐ＨＦ）、ｎ＝１２１；健康対照者、ｎ＝８８）におけるバイオマーカーの組み合わせの感度および特異性を表６で説明する。
表６．  バイオマーカーの組み合わせの感度と特異性
【表６】
2020530120.tif 000007
【００７２】
試験に組み入れ後に心血管疾患を発症した試験対象と、心臓血管疾患関連の入院をしなかったヒトとの間の予測スコアを図１０に示す。
【００７３】
ＳＣＲＥＥＮ‐ＨＦコホートの９９人の参加者のうち、そのうちの１１人を一次診断として心血管疾患の病院に入院させた。これらの１１人の個体において３マーカーパネルによって作成した予測スコアは、０．５１７の中央値を有し０．１３９〜０．９９６の範囲に及び（ＩＱＲ：０．２５６〜０．９２０）、心臓血管疾患関連の入院をしなかった個体では予測スコアは、０．２９４の中央値を有し０．０８６〜０．９９２の範囲に及んだ（ＩＱＲ：０．１７２〜０．６７９）。２つのＳＣＲＥＥＮ‐ＨＦコホート群の間には統計的な有意差がある（ｐ＝０．０３８２）。
【００７４】
診断パネルのメンバーとしてのＫＬＫ１、ＴＣＰＤ、Ｓ１０Ａ７、ＤＬＤＨ、ＩＧＨＡ２およびＣＡＭＰの妥当性確認のために、ウエスタンブロッティング分析を、６人の無作為に選出した健康対照者および６人の無作為に選出した心不全患者に対して実施した。図１１に示したとおり、Ｓ１０Ａ７およびＩＧＨＡ２を個々の唾液サンプル中で検出した。Ｓ１０Ａ７は、６つの心不全患者のサンプルのうちの５つおよび６つの健康対照者のサンプルのうちの１つだけで検出された。それぞれのサンプルのバンド強度を、健康対照者の平均バンド強度に対して正規化した。ＳＷＡＴＨ‐ＭＳからの結果と同様に、Ｓ１０Ａ７およびＩＧＨＡ２の両方が、健康対照者サンプルと比較して、心不全患者サンプルにおいてより高いタンパク質量を実証した。心不全患者のＳ１０Ａ７の平均バンド強度は、健康対照者サンプルのそれより６倍高かった。ＩＧＨＡ２は、健康対照者サンプルと比較して、心不全患者サンプルにおいてより高い存在量を有したが（１．０６：１）、有意差は観察されなかった。最初のスクリーニングにおける所見とは対照的に、健康対照者と患者のサンプル中のＫＬＫ１の発現は類似していた（１：０．９８）。ＣＡＭＰ発現もまた、対照に比べて心不全患者においてより高い発現があり異なっていた（１：１．４５２）。ＴＣＰＤおよびＤＬＤＨは、ウエスタンブロッティングでは検出されなかった。
【００７５】
この明細書を通じた「一実施形態」または「ある実施形態」に対する言及は、その実施形態に関連して説明される特定の特性、構造、または特徴が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。よって、この明細書中の様々な位置の「一実施形態において」または「ある実施形態において」という語句の出現は、同じ実施形態を必ずすべてに言及するというわけではない。さらに、特定の特性、構造、または特徴が、１もしくは複数の組み合わせにおいて任意の好適な様式で組み合わせられてもよい。
【００７６】
法令に従って、本発明は、構造的または系統的特徴に関して多少特有の言語で記載されている。本明細書中に記載した手段は、本発明を実施するのに好ましい形態を含むので、本発明が図示または記載された特定の特徴に限定されないことは理解されるべきである。そのため、本発明は、当業者によって適切に解釈される（もしあれば）添付の特許請求の範囲の適切な範囲内の任意のその形態または修飾で主張される。
【００７７】
引用文献リスト
【００７８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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