(57)【要約】本発明は、操作されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントおよびその組成物を提供する。これらのバリアントは、インビトロ転写の開始においてＧＴＰを超えて対称的にキャップされたＧＴＰアナログを選択的に組み込むために考案された。本発明はまた、本明細書で提供されるバリアントを使用するための方法を提供する。本発明はさらに、本明細書で提供される組成物の使用を提供する。上記操作されたＲＮＡポリメラーゼバリアントは、少なくとも１個の置換またはポリペプチド配列における置換セットを含み得る。
2020530266.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４および／もしくは１５の参照配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはこれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的フラグメントを含む操作されたＲＮＡポリメラーゼであって、ここで該操作されたＲＮＡポリメラーゼは、少なくとも１個の置換または該ポリペプチド配列における置換セットを含み、ここで該ポリペプチド配列のアミノ酸置換は、配列番号４もしくは１５を参照して番号付けされる、操作されたＲＮＡポリメラーゼ。
【請求項２】
少なくとも１個の置換または置換セットは、３９７／５１３／６３５、３９７／５１３／６３５／６６０、５１３／６６０／６６４、５１３／６３５／６６０、５１３／６３５／６６４、５１３／６６０／６６４、および６６０／６６４、ならびに／またはこれらの任意の組み合わせから選択され、ここで該アミノ酸位置は、配列番号４を参照して番号付けされる、請求項１に記載の操作されたＲＮＡポリメラーゼ。
【請求項３】
少なくとも１個の置換または置換セットは、３９７、３９７／５１３、３９７／５１３／６３５、３９７／５１３／６３５、３９７／５１３／６３５／６５６、３９７／５１３／６３５／６５６／６６０、３９７／５１３／６３５／６５６／６６０／６６４、３９７／５１３／６３５／６５６／６６４、３９７／５１３／６３５／６６０、３９７／５１３／６３５／６６０／６６４、３９７／５１３／６３５／６６４、３９７／５１３／６５６／６６０、３９７／５１３／６６０、３９７／５１３／６６０／６６４、３９７／５１３／６６４、３９７／５１３、３９７／６３５、３９７／６３５／６５６／６６０／６６４、３９７／６３５／６５６／６６４、３９７／６３５／６６０、３９７／６３５／６６４、３９７／６３５／６６４／８５０、３９７／６６０、３９７／６６４、および／またはこれらの任意の組み合わせから選択され、ここで該アミノ酸位置は、配列番号４を参照して番号付けされる、請求項１に記載の操作されたＲＮＡポリメラーゼ。
【請求項４】
少なくとも１個の置換または置換セットは、１１３／１３７／５１３、１３６／３５７／４０４／５１４、１３６／３５７／５１４、１３６／３９４／４０４／４４６、１３６／４０１、１３６／４０１／４０４、１３６／４０４／４４６、１３６／４０４／５１４、１３６／４４６、１３６／５１４、１３７、１３７／４０１、１３７／４０１／５１３、１３７／４０１／５１３、１３７／５１３、１３７／５１３／６２１、１３７／６３５、１３７／６５６、３５７／３９４／４０１／４０４／５１４、３５７／３９４／４４６／５１４、３５７／５１４、３９４／４４６／５１４、４０１／４０４、４０１／４０４／５１４、４０１／５１３／６３５、４０１／６３５、５１３／６３５、５１３／６３５／６５６、５１３／６６０、６３５／６５６、６３５／６６０、および６６０、ならびに／またはこれらの任意の組み合わせから選択され、ここで該アミノ酸位置は、配列番号１５を参照して番号付けされる、請求項１に記載の操作されたＲＮＡポリメラーゼ。
【請求項５】
前記操作されたＲＮＡポリメラーゼは、表５．３、表５．４、表５．５、および／または表５．６に示される少なくとも１つの操作されたＲＮＡポリメラーゼバリアントの配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはこれより高く同一であるポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の操作されたＲＮＡポリメラーゼ。
【請求項６】
前記操作されたＲＮＡポリメラーゼは、表５．３、表５．４、表５．５、および／または表５．６で提供されるバリアントの操作されたポリメラーゼである、請求項１に記載の操作されたＲＮＡポリメラーゼ。
【請求項７】
前記操作されたＲＮＡポリメラーゼは、配列番号４、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、および／または３９に示される少なくとも１つの操作されたＲＮＡポリメラーゼバリアントの配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはこれより高く同一であるポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の操作されたＲＮＡポリメラーゼ。
【請求項８】
前記操作されたＲＮＡポリメラーゼは、配列番号４、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、または３９に示されるバリアントの操作されたポリメラーゼを含む、請求項１に記載の操作されたＲＮＡポリメラーゼ。
【請求項９】
前記操作されたポリメラーゼは、野生型Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼと比較して、少なくとも１つの改善された特性を示す、請求項１〜８のいずれかに記載の操作されたＲＮＡポリメラーゼ。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの改善された特性は、転写開始の間のＧＴＰに対するキャップアナログの改善された選択性、改善されたタンパク質発現、貯蔵緩衝液中の改善された安定性、および反応条件下での改善された安定性から選択される、請求項９に記載の操作されたＲＮＡポリメラーゼ。
【請求項１１】
前記ポリメラーゼは、ＲＮＡ収量、転写忠実度、熱安定性、タンパク質発現、−２０℃での安定性、または野生型Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼに等しい反応条件での安定性を維持する、請求項１〜１０のいずれかに記載の操作されたＲＮＡポリメラーゼ。
【請求項１２】
前記操作されたポリメラーゼは、精製されている、請求項１〜１１のいずれかに記載の操作されたＲＮＡポリメラーゼ。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれかに記載の少なくとも１つの操作されたＲＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチド配列。
【請求項１４】
配列番号４および／もしくは１５の参照配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはこれより高い配列同一性を含む少なくとも１つの操作されたＲＮＡポリメラーゼ、またはその機能的フラグメントをコードするポリヌクレオチド配列であって、ここで該操作されたＲＮＡポリメラーゼは、１またはこれより多くのアミノ酸位置において少なくとも１個の置換を含む、ポリヌクレオチド配列。
【請求項１５】
配列番号４、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７および／もしくは３９と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはこれより高い配列同一性を含む少なくとも１つの操作されたＲＮＡポリメラーゼ、またはその機能的フラグメントをコードするポリヌクレオチド配列。
【請求項１６】
少なくとも１つの操作されたＲＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチド配列であって、ここで該ポリヌクレオチド配列は、配列番号３、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、および／もしくは３８と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはこれより高い配列同一性を含む、ポリヌクレオチド配列。
【請求項１７】
前記ポリヌクレオチド配列は、制御配列に作動可能に連結される、請求項１３〜１６のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項１８】
前記ポリヌクレオチド配列は、コドン最適化される、請求項１３〜１６のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項１９】
請求項１３〜１８のいずれかに記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
【請求項２０】
少なくとも１つの請求項１９に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２１】
操作されたＲＮＡポリメラーゼを宿主細胞において生成するための方法であって、該方法は、請求項２０に記載の宿主細胞を適切な培養条件下で培養する工程であって、少なくとも１つの操作されたＲＮＡポリメラーゼを生成する工程を包含する方法。
【請求項２２】
前記培養物および／または宿主細胞から少なくとも１つの操作されたＲＮＡポリメラーゼを回収する工程をさらに包含する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記少なくとも１つの操作されたＲＮＡポリメラーゼを精製する工程をさらに包含する、請求項２１および／または２２に記載の方法。
【請求項２４】
少なくとも１つの請求項１〜１２のいずれかに記載の操作されたＲＮＡポリメラーゼを含む組成物。
【請求項２５】
キャップされたＲＮＡ転写物を生成するための方法であって、該方法は、ｉ）少なくとも１つの請求項１〜１２のいずれかに記載の操作されたＲＮＡポリメラーゼ、ジヌクレオチドキャップアナログ、およびｉｉ）ＤＮＡテンプレートを含む組成物を提供する工程；該ＤＮＡテンプレートを該組成物に、該操作されたＲＮＡポリメラーゼがキャップされたＲＮＡ転写物を生成するような条件下で曝す工程を包含する方法。
【請求項２６】
前記ジヌクレオチドキャップアナログは、α，γ−ビス（Ｎ７−メチルグアノシン）トリホスフェート（ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）ｍ７Ｇ）またはアンチリバースキャップアナログ３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ジヌクレオチドキャップアナログは、α，γ−ビス（Ｎ７−メチルグアノシン）トリホスフェートである、請求項２５および／または２６に記載の方法。
【請求項２８】
無機ピロホスファターゼの添加をさらに包含する、請求項２５〜２７のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2017年６月30日に出願された米国仮特許出願番号第  62/527,764号、および2017年７月5日に出願された  米国仮特許出願番号第62/528,846号に基づく優先権を主張しており、その両方はすべての目的のために全体が参考として援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、操作されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントおよびその組成物を提供する。これらのバリアントは、インビトロ転写の開始においてＧＴＰを超えてｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）ｍ７Ｇキャップアナログを選択的に組み込むために考案された。本発明はまた、本明細書で提供されるバリアントを使用するための方法を提供する。本発明はさらに、本明細書で提供される組成物の使用を提供する。
配列表、表またはコンピュータープログラムへの言及
配列表の公式の写しは、ＡＳＣＩＩフォーマットのテキストファイルとしてＥＦＳ−Ｗｅｂを介して本明細書と同時に提出される（ファイル名「ＣＸ８−１６８CＵＳＰ１＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」、作成日２０１７年７月５日、およびサイズ１８４，３２０バイト）。ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出された配列表は、明細書の一部であり、その全体において本明細書に参考として援用される。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｅ．Ｃ．  ２．７．７．６）は、５’から３’の方向においてＲＮＡの形成を触媒する、モノマーの、バクテリオファージによってコードされるＤＮＡ指向性ＲＮＡポリメラーゼである。転写開始のプロセスにおいて、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、特異的プロモーター配列（すなわち、Ｔ７プロモーター）を認識する。天然に存在するＴ７  ＲＮＡポリメラーゼは、８８３アミノ酸を含む。それは、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼに高度に相同性であり、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼに幾分相同性である。Ｔ７は、多数のドメイン（Ｎ末端ドメイン、「ｔｈｕｍｂ」、「ｐａｌｍ」および「ｆｉｎｇｅｒｓ」が挙げられる）から構成される（例えば、Ｓｏｕｓａ  ａｎｄ  Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ，  Ｐｒｏｇ．  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ７３：１−４１  ［２００３］、および米国特許第９，１９３，９５９号を参照のこと）。Ｎ末端ドメインのコンホメーションは、機能している酵素の開始相と伸長相との間で変化する。
Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子のクローニングおよび発現は、記載されている（例えば、米国特許第４，９５２，４９６号を参照のこと）。そのプロモーター特異性および高いＲＮＡポリメラーゼ活性に起因して、Ｔ７は、種々の適用に使用されている。それはまた、Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換え遺伝子の高レベル発現のために有用である（Ｓｔｕｄｉｅｒ  ａｎｄ  Ｍｏｆｆａｔ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １８：１１３−１３０  ［１９８６］を参照のこと）。Ｔ７はまた、種々の核酸増幅法（診断法において使用されるものを含む）において使用される。安定性および熱安定性はしばしば、診断法の構成要素の開発において重要な行旅事項であることから、Ｔ７の熱安定性および安定性を改善することに関する研究が報告されてきた（例えば、米国特許第９，１９３，９５９号、同第８，５５１，７５２号、および同第７，５０７，５６７号などを参照のこと）。にも関わらず、天然に存在する酵素と比較した場合、改善された特性を示すバリアントＴ７酵素が、当該分野で未だに必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第４，９５２，４９６号明細書
【特許文献２】米国特許第９，１９３，９５９号明細書
【特許文献３】米国特許第８，５５１，７５２号明細書
【特許文献４】米国特許第７，５０７，５６７号明細書
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｓｏｕｓａ  ａｎｄ  Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ，  Ｐｒｏｇ．  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ７３：１−４１  ［２００３］
【非特許文献２】Ｓｔｕｄｉｅｒ  ａｎｄ  Ｍｏｆｆａｔ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １８：１１３−１３０  ［１９８６］
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の要旨
本発明は、操作されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントおよびその組成物を提供する。これらのバリアントは、インビトロ転写の開始においてＧＴＰを超えて対称的にキャップされたＧＴＰアナログを選択的に組み込むために考案された。本発明はまた、本明細書で提供されるバリアントを使用するための方法を提供する。本発明はさらに、本明細書で提供される組成物の使用を提供する。
【０００７】
本発明は、配列番号４および／または１５の参照配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはこれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列、またはこれらの機能的フラグメントを含む操作されたＲＮＡポリメラーゼを提供し、ここで上記操作されたＲＮＡポリメラーゼは、上記ポリペプチド配列において少なくとも１個の置換または置換セットを含み、上記ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号４または１５を参照して番号付けされる。
【０００８】
いくつかの実施形態において、上記操作されたＲＮＡポリメラーゼは、３２／３５７、４９／６４２、９７／３５７、１３６、１３７、１６０／６４３、１６７／５１４、２５０、３０２／５１３、３１４／４０１、３５７、３９２、３９３、３９４、３９７、４０１、４０４、４４４、４４６、４７８、５１３、５１４、５８２、６３５、６３６、６３７、６３９、６４２、６４３、６４５、６５３、６５６、６６０、６６０／８０６、６６１、および６６４、ならびに／またはこれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ここで上記アミノ酸位置は、配列番号４を参照して番号付けされる。いくつかのさらなる実施形態において、上記操作されたＲＮＡポリメラーゼは、３２Ｖ／３５７Ｉ、４９Ｇ／６４２Ｌ、９７Ｄ／３５７Ｇ、１３６Ｅ／Ｉ、１３７Ｗ、１６０Ｌ／６４３Ｓ、１６７Ｎ／５１４Ｌ、２５０Ｄ、３０２Ｖ／５１３Ｇ、３１４Ｃ／４０１Ｖ、３５７Ｇ／Ｋ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ、３９２Ｄ、３９３Ｌ／Ｙ、３９４Ａ／Ｌ／Ｒ、３９７Ｆ／Ｍ／Ｑ／Ｗ、４０１Ａ／Ｉ／Ｌ／Ｓ／Ｖ、４０４Ｅ／Ｙ、４４４Ｆ／Ｈ／Ｉ／Ｖ、４４６Ｗ／Ｙ、４７８Ｆ／Ｍ／Ｗ、５１３Ｃ／Ｆ／Ｋ／Ｌ／Ｒ／Ｔ／Ｗ、５１４Ｆ／Ｉ／Ｌ／Ｙ、５８２Ｎ、６３５Ｗ、６３６Ｌ、６３７Ｇ／Ｐ／Ｓ、６３９Ｈ、６４２Ｌ、６４３Ａ、６４５Ｖ、６５３Ｃ、６５６Ｆ／Ｗ、６６０Ａ／Ｃ／Ｍ／Ｓ／Ｔ／Ｗ、６６０Ｎ／８０６Ｙ、６６１Ｅ／Ｙ、および６６４Ｗ、ならびに／またはこれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ここで上記アミノ酸位置は、配列番号４を参照して番号付けされる。いくつかの追加の実施形態において、上記操作されたＲＮＡポリメラーゼは、Ａ３２Ｖ／Ｅ３５７Ｉ、Ｅ４９Ｇ／Ｍ６４２Ｌ、Ｅ９７Ｄ／Ｅ３５７Ｇ、Ａ１３６Ｅ／Ｉ、Ｄ１３７Ｗ、Ｒ１６０Ｌ／Ｔ６４３Ｓ、Ｋ１６７Ｎ／Ｓ５１４Ｌ、Ｔ２５０Ｄ、Ａ３０２Ｖ／Ｄ５１３Ｇ、Ｒ３１４Ｃ／Ｒ４０１Ｖ、Ｅ３５７Ｇ／Ｋ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ、Ｙ３９２Ｄ、Ｒ３９３Ｌ／Ｙ、Ｋ３９４Ａ／Ｌ／Ｒ、Ａ３９７Ｆ／Ｍ／Ｑ／Ｗ、Ｒ４０１Ａ／Ｉ／Ｌ／Ｓ／Ｖ、Ｓ４０４Ｅ／Ｙ、Ｎ４４４Ｆ／Ｈ／Ｉ／Ｖ、Ｍ４４６Ｗ／Ｙ、Ｄ４７８Ｆ／Ｍ／Ｗ、Ｄ５１３Ｃ／Ｆ／Ｋ／Ｌ／Ｒ／Ｔ／Ｗ、Ｓ５１４Ｆ／Ｉ／Ｌ／Ｙ、Ａ５８２Ｎ、Ｓ６３５Ｗ、Ｖ６３６Ｌ、Ｔ６３７Ｇ／Ｐ／Ｓ、Ｒ６３９Ｈ、Ｍ６４２Ｌ、Ｔ６４３Ａ、Ａ６４５Ｖ、Ｆ６５３Ｃ、Ｑ６５６Ｆ／Ｗ、Ｄ６６０Ａ／Ｃ／Ｍ／Ｓ／Ｔ／Ｗ、Ｄ６６０Ｎ／Ｈ８０６Ｙ、Ｔ６６１Ｅ／Ｙ、およびＰ６６４Ｗ、ならびに／またはこれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ここで上記アミノ酸位置は、配列番号４を参照して番号付けされる。
【０００９】
いくつかの実施形態において、上記操作されたＲＮＡポリメラーゼは、３９７／５１３／６３５、３９７／５１３／６３５／６６０、５１３／６６０／６６４、５１３／６３５／６６０、５１３／６３５／６６４、５１３／６６０／６６４、および６６０／６６４、ならびに／、またはこれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ここで上記アミノ酸位置は、配列番号４を参照して番号付けされる。いくつかのさらなる実施形態において、上記操作されたＲＮＡポリメラーゼは、３９７Ｆ／５１３Ｗ／６３５Ｗ、３９７Ｆ／５１３Ｙ／６３５Ｗ、３９７Ｗ／５１３Ｙ／６３５Ｗ、３９７Ｗ／５１３Ｗ／６３５Ｗ、３９７Ｗ／５１３Ｙ／６３５Ｗ／６６０Ｆ、３９７Ｗ／５１３Ｗ／６３５Ｗ／６６０Ｗ、３９７Ｙ／５１３Ｗ／６３５Ｗ／６６０Ｆ、４７５Ｖ／５１３Ｗ／６３５Ｗ／６６０Ｙ、５１３Ｆ／６６０Ｗ／６６４Ｙ、５１３Ｗ／６３５Ｗ／６６０Ｆ、５１３Ｗ／６３５Ｗ／６６４Ｗ、５１３Ｙ／６３５Ｗ／６６０Ｆ、５１３Ｙ／６３５Ｗ／６６０Ｙ、５１３Ｙ／６６０Ｗ／６６４Ｗ、および６６０Ｙ／６６４Ｗ、ならびに／またはこれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、上記アミノ酸位置は、配列番号４を参照して番号付けされる。いくつかの追加の実施形態において、上記操作されたＲＮＡポリメラーゼは、Ａ３９７Ｆ／Ｄ５１３Ｗ／Ｓ６３５Ｗ、Ａ３９７Ｆ／Ｄ５１３Ｙ／Ｓ６３５Ｗ、Ａ３９７Ｗ／Ｄ５１３Ｙ／Ｓ６３５Ｗ、Ａ３９７Ｗ／Ｄ５１３Ｗ／Ｓ６３５Ｗ、Ａ３９７Ｗ／Ｄ５１３Ｙ／Ｓ６３５Ｗ／Ｄ６６０Ｆ、Ａ３９７Ｗ／Ｄ５１３Ｗ／Ｓ６３５Ｗ／Ｄ６６０Ｗ、Ａ３９７Ｙ／Ｄ５１３Ｗ／Ｓ６３５Ｗ／Ｄ６６０Ｆ、Ａ４７５Ｖ／Ｄ５１３Ｗ／Ｓ６３５Ｗ／Ｄ６６０Ｙ、Ｄ５１３Ｆ／Ｄ６６０Ｗ／Ｐ６６４Ｙ、Ｄ５１３Ｗ／Ｓ６３５Ｗ／Ｄ６６０Ｆ、Ｄ５１３Ｗ／Ｓ６３５Ｗ／Ｐ６６４Ｗ、Ｄ５１３Ｙ／Ｓ６３５Ｗ／Ｄ６６０Ｆ、Ｄ５１３Ｙ／Ｓ６３５Ｗ／Ｄ６６０Ｙ、Ｄ５１３Ｙ／Ｄ６６０Ｗ／Ｐ６６４Ｗ、およびＤ６６０Ｙ／Ｐ６６４Ｗ、ならびに／またはこれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、上記アミノ酸位置は、配列番号４を参照して番号付けされる。
【００１０】
いくつかの実施形態において、上記操作されたＲＮＡポリメラーゼは、３９７、３９７／５１３、３９７／５１３／６３５、３９７／５１３／６３５、３９７／５１３／６３５／６５６、３９７／５１３／６３５／６５６／６６０、３９７／５１３／６３５／６５６／６６０／６６４、３９７／５１３／６３５／６５６／６６４、３９７／５１３／６３５／６６０、３９７／５１３／６３５／６６０／６６４、３９７／５１３／６３５／６６４、３９７／５１３／６５６／６６０、３９７／５１３／６６０、３９７／５１３／６６０／６６４、３９７／５１３／６６４、３９７／５１３、３９７／６３５、３９７／６３５／６５６／６６０／６６４、３９７／６３５／６５６／６６４、３９７／６３５／６６０、３９７／６３５／６６４、３９７／６３５／６６４／８５０、３９７／６６０、３９７／６６４、３９７／６６０／６６４、３９７／８３７、３９９／６３５／６６０、４７５／５１３／６３５／６６０、５１３、５１３／６３５、５１３／６３５／６５６、５１３／６３５／６５６／６６０、５１３／６３５／６５６／６６４、５１３／６３５／６６０、５１３／６３５／６６０／６６４、５１３／６３５／６６４、５１３／６５６／６６０、５１３／６５６／６６４、５１３／６６０、５１３／６６０／６６４、５１３／６６４、６３５、６３５／６５６、６３５／６５６／６６４、６３５／６６０、６３５／６６０／６６４、６３５／６６４、６５６／６６０／６６４、６５８、６６０、６６０／６６４、および６６４、ならびに／またはこれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、上記アミノ酸位置は、配列番号４を参照して番号付けされる。いくつかのさらなる実施形態において、上記操作されたＲＮＡポリメラーゼは、３９７Ｆ、３９７Ｆ／５１３Ｆ、３９７Ｆ／５１３Ｆ／６３５Ｆ、３９７Ｆ／５１３Ｆ／６３５Ｗ、３９７Ｆ／５１３Ｆ／６３５Ｗ／６６０Ｗ、３９７Ｆ／５１３Ｗ／６３５Ｗ、３９７Ｆ／５１３Ｗ／６３５Ｗ／６５６Ｆ／６６４Ｆ、３９７Ｆ／５１３Ｗ／６６４Ｗ、３９７Ｆ／５１３Ｙ、３９７Ｆ／５１３Ｙ／６３５Ｗ、３９７Ｆ／５１３Ｙ／６３５Ｗ／６５６Ｗ、３９７Ｆ／５１３Ｙ／６３５Ｗ／６６４Ｆ、３７Ｆ／５１３Ｙ／６５６Ｈ／６６０Ｗ、３９７Ｆ／６３５Ｆ／６６０Ｗ、３９７Ｆ／６３５Ｗ、３９７Ｆ／６６０Ｗ、３９７Ｆ／６６４Ｗ、３９７Ｗ、３９７Ｗ／５１３Ｆ、３９７Ｗ／５１３Ｆ／６３５Ｆ／６５６Ｆ／６６０Ｆ／６６４Ｗ、３９７Ｗ／５１３Ｆ／６３５Ｆ／６６０Ｗ、３９７Ｗ／５１３Ｆ／６３５Ｗ、３９７Ｗ／５１３Ｆ／６６０Ｆ、３９７Ｗ／５１３Ｆ／６６０Ｗ、３９７Ｗ／５１３Ｆ／６６０Ｙ／６６４Ｆ、３９７Ｗ／５１３Ｗ、３９７Ｗ／５１３Ｗ／６３５Ｆ、３９７Ｗ／５１３Ｗ／６３５Ｆ／６５６Ｗ／６６０Ｆ、  ３９７Ｗ／５１３Ｗ／６３５Ｗ、３９７Ｗ／５１３Ｗ／６３５Ｗ／６５６Ｙ、３９７Ｗ／５１３Ｗ／６３５Ｗ／６６０Ｗ、３９７Ｗ／５１３Ｗ／６３５Ｗ／６６０Ｗ／６６４Ｙ、３９７Ｗ／５１３Ｗ／６３５Ｗ／６６０Ｙ／６６４Ｙ、３９７Ｗ／５１３Ｗ／６６０Ｗ、３９７Ｗ／５１３Ｗ／６６０Ｗ／６６４Ｙ、３９７Ｗ／５１３Ｗ／６６４Ｆ、３９７Ｗ／５１３Ｗ／６６４Ｗ、３９７Ｗ／���１３Ｙ／６３５Ｆ、３９７Ｗ／５１３Ｙ／６３５Ｗ／６５６Ｙ／６６０Ｗ／６６４Ｗ、３９７Ｗ／５１３Ｙ／６３５Ｗ、３９７Ｗ／５１３Ｙ／６３５Ｗ／６５６Ｙ／６６４Ｙ、３９７Ｗ／５１３Ｙ／６３５Ｗ／６６０Ｆ、３９７Ｗ／６３５Ｆ、３９７Ｗ／６３５Ｆ／６６４Ｆ、３９７Ｗ／６３５Ｗ、３９７Ｗ／６３５Ｗ／６５６Ｆ／６６４Ｆ、３９７Ｗ／６３５Ｗ／６５６Ｆ／６６４Ｗ、３９７Ｗ／６３５Ｗ／６５６Ｆ／６６４Ｙ、３９７Ｗ／６３５Ｗ／６６０Ｗ、３９７Ｗ／６３５Ｗ／６６０Ｙ、３９７Ｗ／６３５Ｗ／６６４Ｆ、３９７Ｗ／６３５Ｗ／６６４Ｗ／８５０Ｔ、３９７Ｗ／６６０Ｆ／６６４Ｆ、３９７Ｗ／６６０Ｆ／６６４Ｙ、３９７Ｗ／６６０Ｗ、３９７Ｗ／８３７Ｋ、３９７Ｙ、３９７Ｙ／５１３Ｆ／６３５Ｗ／６５６Ｆ／６６０Ｗ／６６４Ｆ、３９７Ｙ／５１３Ｆ／６３５Ｗ／６６４Ｗ、３９７Ｙ／５１３Ｗ／６３５Ｆ／６６４Ｙ、３９７Ｙ／５１３Ｗ／６３５Ｗ／６６０Ｆ、３９７Ｙ／５１３Ｗ／６５６Ｗ／６６０Ｗ、３９７Ｙ／５１３Ｙ、３９７Ｙ／５１３Ｙ／６３５Ｗ、３９７Ｙ／６３５Ｆ、３９７Ｙ／６３５Ｆ／６６０Ｗ、３９７Ｙ／６３５Ｗ、３９７Ｙ／６３５Ｗ／６５６Ｆ／６６０Ｙ／６６４Ｗ、３９７Ｙ／６３５Ｗ／６６０Ｆ、３９７Ｙ／６６０Ｆ／６６４Ｗ、３９７Ｙ／６６４Ｆ、３９９Ｅ／６３５Ｆ／６６０Ｗ、４７５Ｖ／５１３Ｗ／６３５Ｗ／６６０Ｙ、５１３Ｆ、５１３Ｆ／６３５Ｆ、５１３Ｆ／６３５Ｗ、５１３Ｆ／６３５Ｗ／６５６Ｗ、５１３Ｆ／６３５Ｗ／６６４Ｗ、５１３Ｆ／６６０Ｗ、５１３Ｆ／６６０Ｗ／６６４Ｆ、５１３Ｆ／６６０Ｗ／６６４Ｙ、５１３Ｗ、５１３Ｗ／６３５Ｆ、５１３Ｗ／６３５Ｗ、５１３Ｙ／６３５Ｆ／６６０Ｆ／６６４Ｙ、５１３Ｗ／６３５Ｗ／６５６Ｗ／６６０Ｆ、５１３Ｗ／６３５Ｗ／６６０Ｆ、５１３Ｗ／６３５Ｗ／６６４Ｗ、５１３Ｗ／６５６Ｗ／６６４Ｗ、５１３Ｗ／６５６Ｙ／６６０Ｗ、５１３Ｗ／６６０Ｆ、５１３Ｗ／６６０Ｗ、５１３Ｙ／６３５Ｆ、５１３Ｙ／６３５Ｆ／６６４Ｗ、５１３Ｙ／６３５Ｒ／６５６Ｆ／６６４Ｙ、５１３Ｙ／６３５Ｗ、５１３Ｙ／６３５Ｗ／６６０Ｆ、５１３Ｙ／６３５Ｗ／６６０Ｙ、５１３Ｙ／６３５Ｗ／６６０Ｙ／６６４Ｆ、５１３Ｙ／６６０Ｗ、５１３Ｙ／６６０Ｗ／６６４Ｗ、５１３Ｙ／６６０Ｙ／６６４Ｆ、５１３Ｙ／６６４Ｙ、６３５Ｆ／６５６Ｆ／６６４Ｙ、６３５Ｆ／６５６Ｙ／６６４Ｗ、６３５Ｆ／６６０Ｗ／６６４Ｆ、６３５Ｗ、６３５Ｗ／６５６Ｗ、６３５Ｗ／６６０Ｆ、  ６３５Ｗ／６６０Ｗ、６３５Ｗ／６６４Ｗ、６５６Ｗ／６６０Ｆ／６６４Ｙ、６５６Ｗ／６６０Ｗ／６６４Ｙ、６５８Ｐ、６６０Ｆ、６６０Ｆ／６６４Ｆ、６６０Ｆ／６６４Ｙ、６６０Ｗ／６６４Ｆ、６６０Ｙ／６６４Ｗ、６６４Ｆ、および６６４Ｗ、ならびに／またはこれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、上記アミノ酸位置は、配列番号４を参照して番号付けされる。いくつかの追加の実施形態において、上記操作されたＲＮＡポリメラーゼは、Ａ３９７Ｆ、Ａ３９７Ｆ／Ｄ５１３Ｆ、Ａ３９７Ｆ／Ｄ５１３Ｆ／Ｓ６３５Ｆ、Ａ３９７Ｆ／Ｄ５１３Ｆ／Ｓ６３５Ｗ、Ａ３９７Ｆ／Ｄ５１３Ｆ／Ｓ６３５Ｗ／Ｄ６６０Ｗ、Ａ３９７Ｆ／Ｄ５１３Ｗ��Ｓ６３５Ｗ、Ａ３９７Ｆ／Ｄ５１３Ｗ／Ｓ６３５Ｗ／Ｑ６５６Ｆ／Ｐ６６４Ｆ、Ａ３９７Ｆ／Ｄ５１３Ｗ／Ｐ６６４Ｗ、Ａ３９７Ｆ／Ｄ５１３Ｙ、Ａ３９７Ｆ／Ｄ５１３Ｙ／Ｓ６３５Ｗ、Ａ３９７Ｆ／Ｄ５１３Ｙ／Ｓ６３５Ｗ／Ｑ６５６Ｗ、Ａ３９７Ｆ／Ｄ５１３Ｙ／Ｓ６３５Ｗ／Ｐ６６４Ｆ、Ａ３９７Ｆ／Ｄ５１３Ｙ／Ｑ６５６Ｈ／Ｄ６６０Ｗ、Ａ３９７Ｆ／Ｓ６３５Ｆ／Ｄ６６０Ｗ、Ａ３９７Ｆ／Ｓ６３５Ｗ、Ａ３９７Ｆ／Ｄ６６０Ｗ、Ａ３９７Ｆ／Ｐ６６４Ｗ、Ａ３９７Ｗ、Ａ３９７Ｗ／Ｄ５１３Ｆ、Ａ３９７Ｗ／Ｄ５１３Ｆ／Ｓ６３５Ｆ／Ｑ６５６Ｆ／Ｄ６６０Ｆ／Ｐ６６４Ｗ、Ａ３９７Ｗ／Ｄ５１３Ｆ／Ｓ６３５Ｆ／Ｄ６６０Ｗ、Ａ３９７Ｗ／Ｄ５１３Ｆ／Ｓ６３５Ｗ、Ａ３９７Ｗ／Ｄ５１３Ｆ／Ｄ６６０Ｆ、Ａ３９７Ｗ／Ｄ５１３Ｆ／Ｄ６６０Ｗ、Ａ３９７Ｗ／Ｄ５１３Ｆ／Ｄ６６０Ｙ／Ｐ６６４Ｆ、Ａ３９７Ｗ／Ｄ５１３Ｗ、Ａ３９７Ｗ／Ｄ５１３Ｗ／Ｓ６３５Ｆ、Ａ３９７Ｗ／Ｄ５１３Ｗ／Ｓ６３５Ｆ／Ｑ６５６Ｗ／Ｄ６６０Ｆ、Ａ３９７Ｗ／Ｄ５１３Ｗ／Ｓ６３５Ｗ、Ａ３９７Ｗ／Ｄ５１３Ｗ／Ｓ６３５Ｗ／Ｑ６５６Ｙ、Ａ３９７Ｗ／Ｄ５１３Ｗ／Ｓ６３５Ｗ／Ｄ６６０Ｗ、Ａ３９７Ｗ／Ｄ５１３Ｗ／Ｓ６３５Ｗ／Ｄ６６０Ｗ／Ｐ６６４Ｙ、Ａ３９７Ｗ／Ｄ５１３Ｗ／Ｓ６３５Ｗ／Ｄ６６０Ｙ／Ｐ６６４Ｙ、  Ａ３９７Ｗ／Ｄ５１３Ｗ／Ｄ６６０Ｗ、Ａ３９７Ｗ／Ｄ５１３Ｗ／Ｐ６６４Ｆ、Ａ３９７Ｗ／Ｄ５１３Ｗ／Ｄ６６０Ｗ／Ｐ６６４Ｙ、Ａ３９７Ｗ／Ｄ５１３Ｗ／Ｐ６６４Ｗ、Ａ３９７Ｗ／Ｄ５１３Ｙ／Ｓ６３５Ｆ、Ａ３９７Ｗ／Ｄ５１３Ｙ／Ｓ６３５Ｗ／Ｑ６５６Ｙ／Ｄ６６０Ｗ／Ｐ６６４Ｗ、Ａ３９７Ｗ／Ｄ５１３Ｙ／Ｓ６３５Ｗ、Ａ３９７Ｗ／Ｄ５１３Ｙ／Ｓ６３５Ｗ／Ｑ６５６Ｙ／Ｐ６６４Ｙ、Ａ３９７Ｗ／Ｄ５１３Ｙ／Ｓ６３５Ｗ／Ｄ６６０Ｆ、Ａ３９７Ｗ／Ｓ６３５Ｆ、Ａ３９７Ｗ／Ｓ６３５Ｆ／Ｐ６６４Ｆ、Ａ３９７Ｗ／Ｓ６３５Ｗ、Ａ３９７Ｗ／Ｓ６３５Ｗ／Ｑ６５６Ｆ／Ｐ６６４Ｆ、Ａ３９７Ｗ／Ｓ６３５Ｗ／Ｑ６５６Ｆ／Ｐ６６４Ｗ、Ａ３９７Ｗ／Ｓ６３５Ｗ／Ｑ６５６Ｆ／Ｐ６６４Ｙ、Ａ３９７Ｗ／Ｓ６３５Ｗ／Ｄ６６０Ｗ、Ａ３９７Ｗ／Ｓ６３５Ｗ／Ｄ６６０Ｙ、Ａ３９７Ｗ／Ｓ６３５Ｗ／Ｐ６６４Ｆ、Ａ３９７Ｗ／Ｓ６３５Ｗ／Ｐ６６４Ｗ／Ａ８５０Ｔ、Ａ３９７Ｗ／Ｄ６６０Ｆ／Ｐ６６４Ｆ、Ａ３９７Ｗ／Ｄ６６０Ｆ／Ｐ６６４Ｙ、Ａ３９７Ｗ／Ｄ６６０Ｗ、Ａ３９７Ｗ／Ｅ８３７Ｋ、Ａ３９７Ｙ、Ａ３９７Ｙ／Ｄ５１３Ｆ／Ｓ６３５Ｗ／Ｑ６５６Ｆ／Ｄ６６０Ｗ／Ｐ６６４Ｆ、Ａ３９７Ｙ／Ｄ５１３Ｆ／Ｓ６３５Ｗ／Ｐ６６４Ｗ、Ａ３９７Ｙ／Ｄ５１３Ｗ／Ｓ６３５Ｆ／Ｐ６６４Ｙ、Ａ３９７Ｙ／Ｄ５１３Ｗ／Ｓ６３５Ｗ／Ｄ６６０Ｆ、Ａ３９７Ｙ／Ｄ５１３Ｗ／Ｑ６５６Ｗ／Ｄ６６０Ｗ、Ａ３９７Ｙ／Ｄ５１３Ｙ、Ａ３９７Ｙ／Ｄ５１３Ｙ／Ｓ６３５Ｗ、Ａ３９７Ｙ／Ｓ６３５Ｆ、Ａ３９７Ｙ／Ｓ６３５Ｆ／Ｄ６６０Ｗ、Ａ３９７Ｙ／Ｓ６３５Ｗ、Ａ３９７Ｙ／Ｓ６３５Ｗ／Ｑ６５６Ｆ／Ｄ６６０Ｙ／Ｐ６６４Ｗ、Ａ３９７Ｙ／Ｓ６３５Ｗ／Ｄ６６０Ｆ、Ａ３９７Ｙ／Ｄ６６０Ｆ／Ｐ６６４Ｗ、Ａ３９７Ｙ／Ｐ６６４Ｆ、Ｋ３９９Ｅ／Ｓ６３５Ｆ／Ｄ６６０Ｗ、Ａ４７５Ｖ／Ｄ５１３Ｗ／Ｓ６３５Ｗ／Ｄ６６０Ｙ、Ｄ５１３Ｆ、Ｄ５１３Ｆ／Ｓ６３５Ｆ、Ｄ５１３Ｆ／Ｓ６３５Ｗ、Ｄ５１３Ｆ／Ｓ６３５Ｗ／Ｑ６５６Ｗ、Ｄ５１３Ｆ／Ｓ６３５Ｗ／Ｐ６６４Ｗ、Ｄ５１３Ｆ／Ｄ６６０Ｗ、Ｄ５１３Ｆ／Ｄ６６０Ｗ／Ｐ６６４Ｆ、Ｄ５１３Ｆ／Ｄ６６０Ｗ／Ｐ６６４Ｙ、Ｄ５１３Ｗ、Ｄ５１３Ｗ／Ｓ６３５Ｆ、Ｄ５１３Ｗ／Ｓ６３５Ｗ、Ｄ５１３Ｙ／Ｓ６３５Ｆ／Ｄ６６０Ｆ／Ｐ６６４Ｙ、Ｄ５１３Ｗ／Ｓ６３５Ｗ／Ｑ６５６Ｗ／Ｄ６６０Ｆ、Ｄ５１３Ｗ／Ｓ６３５Ｗ／Ｄ６６０Ｆ、Ｄ５１３Ｗ／Ｓ６３５Ｗ／Ｐ６６４Ｗ、Ｄ５１３Ｗ／Ｑ６５６Ｗ／Ｐ６６４Ｗ、Ｄ５１３Ｗ／Ｑ６５６Ｙ／Ｄ６６０Ｗ、Ｄ５１３Ｗ／Ｄ６６０Ｆ、Ｄ５１３Ｗ／Ｄ６６０Ｗ、Ｄ５１３Ｙ／Ｓ６３５Ｆ、Ｄ５１３Ｙ／Ｓ６３５Ｆ／Ｐ６６４Ｗ、Ｄ５１３Ｙ／Ｓ６３５Ｒ／Ｑ６５６Ｆ／Ｐ６６４Ｙ、Ｄ５１３Ｙ／Ｓ６３５Ｗ、Ｄ５１３Ｙ／Ｓ６３５Ｗ／Ｄ６６０Ｆ、Ｄ５１３Ｙ／Ｓ６３５Ｗ／Ｄ６６０Ｙ、Ｄ５１３Ｙ／Ｓ６３５Ｗ／Ｄ６６０Ｙ／Ｐ６６４Ｆ、Ｄ５１３Ｙ／Ｄ６６０Ｗ、Ｄ５１３Ｙ／Ｄ６６０Ｗ／Ｐ６６４Ｗ、Ｄ５１３Ｙ／Ｄ６６０Ｙ／Ｐ６６４Ｆ、Ｄ５１３Ｙ／Ｐ６６４Ｙ、Ｓ６３５Ｆ／Ｑ６５６Ｆ／Ｐ６６４Ｙ、Ｓ６３５Ｆ／Ｑ６５６Ｙ／Ｐ６６４Ｗ、Ｓ６３５Ｆ／Ｄ６６０Ｗ／Ｐ６６４Ｆ、Ｓ６３５Ｗ、Ｓ６３５Ｗ／Ｑ６５６Ｗ、Ｓ６３５Ｗ／Ｄ６６０Ｆ、Ｓ６３５Ｗ／Ｄ６６０Ｗ、Ｓ６３５Ｗ／Ｐ６６４Ｗ、Ｑ６５６Ｗ／Ｄ６６０Ｆ／Ｐ６６４Ｙ、Ｑ６５６Ｗ／Ｄ６６０Ｗ／Ｐ６６４Ｙ、Ｌ６５８Ｐ、Ｄ６６０Ｆ、Ｄ６６０Ｆ／Ｐ６６４Ｆ、Ｄ６６０Ｆ／Ｐ６６４Ｙ、Ｄ６６０Ｗ／Ｐ６６４Ｆ、Ｄ６６０Ｙ／Ｐ６６４Ｗ、Ｐ６６４Ｆ／Ｗ、ならびに／またはこれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、上記アミノ酸位置は、配列番号４を参照して番号付けされる。
【００１１】
いくつかの実施形態において、上記操作されたＲＮＡポリメラーゼは、１１３／１３７／５１３、１３６／３５７／４０４／５１４、１３６／３５７／５１４、１３６／３９４／４０４／４４６、１３６／４０１、１３６／４０１／４０４、１３６／４０４／４４６、１３６／４０４／５１４、１３６／４４６、１３６／５１４、１３７、１３７／４０１、１３７／４０１／５１３、１３７／４０１／５１３、１３７／５１３、１３７／５１３／６２１、１３７／６３５、１３７／６５６、３５７／３９４／４０１／４０４／５１４、３５７／３９４／４４６／５１４、３５７／５１４、３９４／４４６／５１４、４０１／４０４、４０１／４０４／５１４、４０１／５１３／６３５、４０１／６３５、５１３／６３５、５１３／６３５／６５６、５１３／６６０、６３５／６５６、６３５／６６０、および６６０、ならびに／またはこれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、上記アミノ酸位置は、配列番号１５を参照して番号付けされる。いくつかのさらなる実施形態において、上記操作されたＲＮＡポリメラーゼは、１１３Ｍ／１３７Ｗ／５１３Ｒ，１３６Ｅ／３５７Ｉ／４０４Ｙ／５１４Ｉ、１３６Ｉ／３５７Ｉ／５１４Ｆ、１３６Ｉ／３５７Ｋ／５１４Ｆ、１３６Ｉ／３９４Ｒ／４０４Ｙ／４４６Ｗ、１３６Ｉ／４０１Ｖ、１３６Ｉ／４０１Ｖ／４０４Ｙ、１３６Ｅ／４０４Ｙ／４４６Ｗ、１３６Ｅ／４０４Ｙ／５１４Ｆ、１３６Ｉ／４４６Ｗ、１３６Ｅ／５１４Ｆ、１３６Ｉ／５１４Ｉ、１３７Ｗ、１３７Ｗ／４０１Ｉ、１３７Ｗ／４０１Ｓ、１３７Ｗ／４０１Ｓ／５１３Ｒ、１３７Ｗ／４０１Ｓ／５１３Ｗ、１３７Ｗ／４０１Ｖ、１３７Ｗ／５１３Ｗ、１３７Ｗ／５１３Ｒ／６２１Ｒ、１３７Ｗ／６３５Ｗ、１３７Ｗ／６５６Ｆ、３５７Ｎ／３９４Ｒ／４４６Ｗ／５１４Ｉ、３５７Ｒ／３９４Ｒ／４０１Ｖ／４０４Ｙ／５１４Ｌ、３５７Ｒ／５１４Ｆ、３９４Ｒ／４４６Ｗ／５１４Ｉ、４０１Ｓ／５１３Ｒ／６３５Ｗ、４０１Ｓ／６３５Ｗ、４０１Ｖ／４０４Ｙ、４０１Ｖ／４０４Ｙ／５１４Ｌ、５１３Ｌ／６３５Ｗ、５１３Ｌ／６６０Ｗ、５１３Ｒ／６３５Ｗ／６５６Ｆ、６３５Ｗ／６５６Ｆ、６３５Ｗ／６６０Ｔ、および６６０Ｓ／Ｔ、ならびに／またはこれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、上記アミノ酸位置は、配列番号１５を参照して番号付けされる。いくつかの追加の実施形態において、上記操作されたＲＮＡポリメラーゼは、Ｌ１１３Ｍ／Ｄ１３７Ｗ／Ｄ５１３Ｒ、Ａ１３６Ｅ／Ｅ３５７Ｉ／Ｓ４０４Ｙ／Ｓ５１４Ｉ、Ａ１３６Ｅ／Ｓ４０４Ｙ／Ｍ４４６Ｗ、Ａ１３６Ｅ／Ｓ４０４Ｙ／Ｓ５１４Ｆ、Ａ１３６Ｅ／Ｓ５１４Ｆ、Ａ１３６Ｉ／Ｅ３５７Ｉ／Ｓ５１４Ｆ、Ａ１３６Ｉ／Ｅ３５７Ｋ／Ｓ５１４Ｆ、Ａ１３６Ｉ／Ｋ３９４Ｒ／Ｓ４０４Ｙ／Ｍ４４６Ｗ、Ａ１３６Ｉ／Ｒ４０１Ｖ、Ａ１３６Ｉ／Ｒ４０１Ｖ／Ｓ４０４Ｙ、Ａ１３６Ｉ／Ｍ４４６Ｗ、Ａ１３６Ｉ／Ｓ５１４Ｉ、Ｄ１３７Ｗ、Ｄ１３７Ｗ／Ｒ４０１Ｉ、Ｄ１３７Ｗ／Ｒ４０１Ｓ、Ｄ１３７Ｗ／Ｒ４０１Ｓ／Ｄ５１３Ｒ、Ｄ１３７Ｗ／Ｒ４０１Ｓ／Ｄ５１３Ｗ、Ｄ１３７Ｗ／Ｒ４０１Ｖ、Ｄ１３７Ｗ／Ｄ５１３Ｗ、Ｄ１３７Ｗ／Ｄ５１３Ｒ／Ｋ６２１Ｒ、Ｄ１３７Ｗ／Ｓ６３５Ｗ、Ｄ１３７Ｗ／Ｑ６５６Ｆ、Ｅ３５７Ｎ／Ｋ３９４Ｒ／Ｍ４４６Ｗ／Ｓ５１４Ｉ、Ｅ３５７Ｒ／Ｋ３９４Ｒ／Ｒ４０１Ｖ／Ｓ４０４Ｙ／Ｓ５１４Ｌ、Ｅ３５７Ｒ／Ｓ５１４Ｆ、Ｋ３９４Ｒ／Ｍ４４６Ｗ／Ｓ５１４Ｉ、Ｒ４０１Ｓ／Ｄ５１３Ｒ／Ｓ６３５Ｗ、Ｒ４０１Ｓ／Ｓ６３５Ｗ、Ｒ４０１Ｖ／Ｓ４０４Ｙ、Ｒ４０１Ｖ／Ｓ４０４Ｙ／Ｓ５１４Ｌ、Ｄ５１３Ｌ／Ｓ６３５Ｗ、Ｄ５１３Ｌ／Ｄ６６０Ｗ、Ｄ５１３Ｒ／Ｓ６３５Ｗ／Ｑ６５６Ｆ、Ｓ６３５Ｗ／Ｑ６５６Ｆ、Ｓ６３５Ｗ／Ｄ６６０Ｔ、およびＤ６６０Ｓ／Ｔ、ならびに／またはこれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、上記アミノ酸位置は、配列番号１５を参照して番号付けされる。
【００１２】
いくつかの追加の実施形態において、上記操作されたＲＮＡポリメラーゼは、表５．３、表５．４、表５．５、および／または表５．６に示される少なくとも１つの操作されたＲＮＡポリメラーゼバリアントの配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはこれより高く同一であるポリペプチド配列を含む。いくつかの追加の実施形態において、上記操作されたＲＮＡポリメラーゼは、表５．３、表５．４、表５．５、および／または表５．６に提供されるバリアントの操作されたポリメラーゼである。
【００１３】
なおいくつかの追加の実施形態において、上記操作されたＲＮＡポリメラーゼは、配列番号１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７および／または３９に示される少なくとも１つの操作されたＲＮＡポリメラーゼバリアントの配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはこれより高く同一であるポリペプチド配列を含む。いくつかのさらなる実施形態において、上記操作されたＲＮＡポリメラーゼは、配列番号１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７または３９に示されるバリアントの操作されたポリメラーゼである。
【００１４】
いくつかのさらなる実施形態において、上記操作されたポリメラーゼは、野生型Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼと比較して、少なくとも１つの改善された特性を含む。いくつかのさらなる実施形態において、上記操作されたＲＮＡポリメラーゼは、転写開始の間のＧＴＰに対するキャップアナログに関して改善された選択性、改善されたタンパク質発現、貯蔵緩衝液中での改善された安定性、および反応条件下での改善された安定性から選択される少なくとも１つの改善された特性を示す。いくつかの追加の実施形態において、上記操作されたＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡ収量、転写忠実度、熱安定性、タンパク質発現、−２０℃での安定性、または野生型Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼに等価な反応条件下での安定性を維持する。なおいくつかの追加の実施形態において、上記操作されたＲＮＡポリメラーゼは精製される。なおいくつかのさらなる実施形態において、本発明は、少なくとも１つの本明細書で提供される操作されたＲＮＡポリメラーゼを含む組成物を提供する。
【００１５】
本発明はまた、少なくとも１つの本明細書で提供される操作されたＲＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を提供する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの操作されたＲＮＡポリメラーゼをコードする上記ポリヌクレオチド配列は、配列番号４および／または１５の参照配列、またはこれらの機能的フラグメントと少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはこれより高い配列同一性を含み、ここで上記操作されたＲＮＡポリメラーゼは、１またはこれより多くのアミノ酸位置において少なくとも１個の置換を含む。いくつかのさらなる実施形態において、本明細書で提供される操作されたＲＮＡポリメラーゼをコードする上記ポリヌクレオチド配列は、配列番号４、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７および／または３９、またはその機能的フラグメントと少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはこれより高い配列同一性を含む。いくつかのさらなる実施形態において、少なくとも１つの操作されたＲＮＡポリメラーゼをコードする上記ポリヌクレオチド配列は、配列番号３、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６および／または３８と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはこれより高い配列同一性を含む。なおいくつかの追加の実施形態において、上記ポリヌクレオチド配列は、制御配列に作動可能に連結される。なおいくつかのさらなる実施形態において、上記ポリヌクレオチド配列は、コドン最適化される。
【００１６】
本発明はまた、少なくとも１つの本明細書で提供されるポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを提供する。本発明は、少なくとも１つの本明細書で提供される発現ベクターを含む宿主細胞をさらに提供する。本発明はまた、宿主細胞において、操作されたＲＮＡポリメラーゼを生成するための方法を提供し、上記方法は、本明細書で提供される宿主細胞を、少なくとも１つの操作されたＲＮＡポリメラーゼが生成されるように、適切な培養条件下で培養する工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記培養物および／または宿主細胞から少なくとも１つの操作されたＲＮＡポリメラーゼを回収する工程を包含する。なおいくつかの追加の実施形態において、上記方法は、少なくとも１つの操作されたＲＮＡポリメラーゼを精製する工程をさらに包含する。
【００１７】
本発明はまた、キャップされたＲＮＡ転写物を生成するための方法を提供し、上記方法は、ｉ）少なくとも１つの本明細書で提供される操作されたＲＮＡポリメラーゼ、ジヌクレオチドキャップアナログ、およびｉｉ）ＤＮＡテンプレート、を含む組成物を提供する工程；上記ＤＮＡテンプレートを上記組成物に、上記操作されたＲＮＡポリメラーゼがキャップされたＲＮＡ転写物を生成するような条件下で曝す工程を包含する。上記方法のうちのいくつかの実施形態において、上記ジヌクレオチドキャップアナログは、α，γ−ビス（Ｎ７−メチルグアノシン）トリホスフェート（ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）ｍ７Ｇ）またはアンチリバースキャップアナログ３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇである。上記方法のうちのいくつかのさらなる実施形態において、上記ジヌクレオチドキャップアナログは、α，γ−ビス（Ｎ７−メチルグアノシン）トリホスフェートである。上記方法のうちのいくつかの追加の実施形態において、無機ピロホスファターゼは、上記反応物に添加される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、「ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）ｍ７Ｇ」（「α，γ−ビス（Ｎ７−メチルグアノシン）トリホスフェート」、「キャップされたＧＴＰ」、「対称的キャップアナログ」、または「キャップ」ともいわれる）の化学構造を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
発明の詳細な説明
本発明は、操作されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントおよびその組成物を提供する。これらのバリアントは、インビトロ転写の開始において、ＧＴＰを超えてｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）ｍ７Ｇキャップアナログを選択的に組み込むために考案された。本発明はまた、本明細書に提供されるバリアントを使用する方法を提供する。本発明は、本明細書に提供される組成物の使用をさらに提供する。
【００２０】
本発明は、キャップされたＲＮＡの効率的生成のための組成物および方法を提供する。大部分の真核生物細胞のｍＲＮＡ転写物および大部分の真核生物ウイルスのｍＲＮＡ転写物、ならびに真核生物ＲＮＳの他の形態（例えば、小さな核ＲＮＡ［ｓｎＲＮＡ］、およびプレ−マイクロＲＮＡ［ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ］）は、それらの５’末端においてブロックされるかまたは「キャップされ（ｃａｐｐｅｄ）」る（例えば、米国特許第８，８４６，３４８号（その全体において本明細書に参考として援用される）を参照のこと）。そのキャップは、グアニンヌクレオシドであり、これは、その５’−炭素を介してトリホスフェート基へと連結され、そのトリホスフェート基が、その一次ｍＲＮＡ転写物の最も５’側のヌクレオチドの５’炭素へと連結される。大部分の真核生物では、そのキャップヌクレオチドにおけるグアニンの７位にある窒素は、メチル化される。これらのＲＮＡ分子の５’キャップは、ＲＮＡ安定性およびプロセシングにおいて重要な役割を果たす。そのキャップは、ｍＲＮＡ代謝において非常に重要な役割を果たし、核においてＲＮＡ転写物のプロセシングおよび成熟、核から細胞質へのｍＲＮＡの輸送、ｍＲＮＡ安定性、ならびにｍＲＮＡからタンパク質への効率的翻訳のために必要とされる（例えば、Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ２４７：４６１−９  ［１９９７］を参照のこと）。その５’キャップ構造は、真核生物およびウイルスｍＲＮＡのタンパク質合成の開始に関与する。その５’キャップはまた、５’−エキソヌクレアーゼ活性に抵抗性を提供し、その非存在は、ｍＲＮＡの迅速な分解を生じる（例えば、米国特許第８，８３６，３４８号；およびＦｕｒｉｉｃｈｉ  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｎａｔ，  ２６６：２３５−９  ［１９９７］を参照のこと）。キャッピングによって提供される利点に起因して、キャップされたＲＮＡ転写物の効率的合成は、種々の機能（インビトロおよびインビボでのタンパク質合成が挙げられるが、これらに限定されない）のためにかなりの価値を提供する。
【００２１】
キャップされたＲＮＡのインビトロ合成は実際には、２つの酵素経路のうちの一方を通じて達成され得る。ワクシニアウイルスキャッピング酵素は、７−メチルグアノシンキャップ構造を、インビトロで転写されたＲＮＡの５’ホスフェートに付加する２つのサブユニットおよび３つの酵素活性を有する（Ｍａｏ  ａｎｄ  Ｓｈｕｍａｎ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，    ２６９：２４４７２−９  ［１９９４］を参照のこと）。
【００２２】
キャップされたＲＮＡのインビトロ合成のための代替の方法は、キャップアナログの使用とともに、インビトロ転写の間にキャップ構造を組み込むことである。これらの７−メチルグアノシン含有ジヌクレオチドは、５’−５’トリホスフェート連結を含み、転写の開始部位において組み込まれ、７−メチルグアノシンキャップされたＲＮＡ生成物を生じる。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、そのテンプレート上のシトシン残基に対向するグアノシンの組み込みに伴って、転写を自然に開始する。キャッピングの高効率を達成するために、そのグアノシンキャップアナログは、ｍＲＮＡにおける第１の位置における組み込むに関して競合するＧＴＰに対して高濃度でインビトロ転写反応物中に存在しなければならない。同時転写的なインビトロキャッピングの１つの有用な特徴は、キャップ組み込みが開始の間に達成されることから、全長ｍＲＮＡの最終的配列または二次構造がキャッピングの程度に影響を及ぼさないことである。さらに、そのプロセスは、単一工程反応においてわずか１つの酵素（ＲＮＡポリメラーゼ）の使用を要する。化学合成されたキャップアナログの使用はまた、ワクシニアキャッピング酵素によるメチル化が十分に認識されていない代替のヌクレオチドキャップ構造を使用するための融通性を増大させる。しかし、そのキャップアナログは、ヌクレオチドおよび他の反応構成要素と比較して高価であり、その反応において高濃度で存在しなければならない。本発明は、キャップアナログの低減した濃度を使用して効率的キャッピングを可能にするために、転写の開始においてＧＴＰを超えてキャップアナログを組み込むことに関して選択的であるＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントを提供し、キャップされたＲＮＡのより費用効果的および拡張性のある生成プロセスを提供する。
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態において、無機ピロホスファターゼは、ＲＮＡポリメラーゼによる転写の生成物インヒビターであるピロホスフェートをオルトホスフェートへの分解するために、そのインビトロ転写反応の間に存在する。
【００２４】
略語および定義：
別段定義されなければ、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、一般的に、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。一般に、本明細書で使用される命名法、ならびに以下で記載される細胞培養、分子遺伝学、微生物学、生化学、有機化学、分析化学および核酸化学の実験手順は、当該分野で周知かつ一般に使用されるものである。このような技術は周知であり、多くのテキストおよび当業者に周知の参照研究の中で記載される。標準的な技術、またはその改変は、化学合成および化学分析のために使用される。本明細書で言及される全ての特許、特許出願、文献および刊行物（上記および下記ともに）は、本明細書に明示的に参考として援用される。
【００２５】
本明細書で記載されるものに類似または等価な任意の適切な方法および材料は、本発明の実施における使用を見出し得るが、いくつかの方法および材料は、本明細書で記載される。本発明は、記載される特定の方法論、プロトコル、および試薬に限定されないことは、理解されるべきである。なぜならこれらは、これらが当業者によって使用される状況に依存して、変動し得るからである。よって、直ぐ下で定義される用語は、全体としてその適用に言及することによって、より十分に記載される。本明細書で言及される全ての特許、特許出願、文献および刊行物（上記および下記ともに）は、本明細書に明示的に参考として援用される。
【００２６】
また、本明細書で使用される場合、単数形「１つの、ある（ａ）」、「１つの、ある（ａｎ）」、および「上記、この、その（ｔｈｅ）」は、状況が明らかに別のことを示さなければ、複数形への言及を含む。
【００２７】
数値範囲は、その範囲を定義する数字の両端を含む。従って、本明細書で開示されるあらゆる数値範囲は、より狭い数値範囲が全て本明細書で明示的に記載されているかのように、このようなより広い数値範囲内に入るこのようなあらゆるより狭い数値範囲を包含することが意図される。本明細書で開示されるあらゆる最大の（または最小の）数値限定は、より低い（またはより高い）数値限定が、本明細書で明示的に書かれているかのように、このようなあらゆるより低い（またはより高い）数値限定を含むことも、意図される。
【００２８】
用語「約（ａｂｏｕｔ）」とは、特定の値に関する受容可能なエラーである。場合によっては、「約」は、所定の値の範囲の０．０５％、０．５％、１．０％、または２．０％以内を意味する。場合によっては、「約」は、所定の値の１標準偏差、２標準偏差、３標準偏差、または４標準偏差以内を意味する。
【００２９】
さらに、本明細書で提供される見出しは、全体としてその適用に言及することによってもたらされ得る本発明の種々の局面または実施形態の限定ではない。
【００３０】
よって、直ぐ下で定義される用語は、全体としてその適用に言及することによって、より十分に記載される。にも関わらず、本発明の理解を容易にするために、多くの用語が、以下で定義される。
【００３１】
別段示されなければ、それぞれ、核酸は、５’から３’の配向において左から右へと書かれ；アミノ酸配列は、アミノからカルボキシの配向において左から右へと書かれる。
【００３２】
本明細書で使用される場合、用語「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」およびその同種の語は、それらの包括的な意味（すなわち、用語「含む、包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）およびその相当する同種の語に対して等価なもの）において使用される。
【００３３】
「ＥＣ」番号は、Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＮＣ−ＩＵＢＭＢ）のＥｎｚｙｍｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅに言及する。ＩＵＢＭＢ生化学分類は、酵素が触媒する化学反応に基づいて、その酵素の数字分類システムである。
【００３４】
「ＡＴＣＣ」とは、アメリカンタイプカルチャーコレクションをいい、その生物貯蔵コレクションは、遺伝子および株を含む。
【００３５】
「ＮＣＢＩ」は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎおよびそこで提供される配列データベースをいう。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）」とは、５’から３’の方向においてＲＮＡの形成を触媒するモノマーのＴ７  バクテリオファージによってコードされるＤＮＡ指向性ＲＮＡポリメラーゼをいう。
【００３７】
本明細書で使用される場合、用語「キャップ（ｃａｐ）」とは、グアニンヌクレオシドであって、これは、その５’炭素を介してトリホスフェート基へと繋がれ、そのトリホスフェート基は、ｍＲＮＡ転写物の最も５’側のヌクレオチドの５’炭素へと繋がれる。いくつかの実施形態において、そのキャップにおけるグアニンの７位にある窒素は、メチル化される。
【００３８】
本明細書で使用される場合、用語「キャップされたＲＮＡ（ｃａｐｐｅｄ  ＲＮＡ）」、「５’キャップされたＲＮＡ（５’  ｃａｐｐｅｄ  ＲＮＡ）」、および「キャップされたｍＲＮＡ（ｃａｐｐｅｄ  ｍＲＮＡ）」は、それぞれそのキャップを含む、ＲＮＡおよびｍＲＮＡをいう。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」および「核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）」とは、一緒に共有結合的に連結される２またはこれより多くのヌクレオシドをいう。そのポリヌクレオチドは、リボヌクレオチド（すなわち、ＲＮＡ）から全体的に構成されてもよいし、２’デオキシリボヌクレオチド（すなわち、ＤＮＡ）から全体的に構成されてもよいし、リボヌクレオチドおよび２’デオキシリボヌクレオチドの混合物からされてもよい。そのヌクレオシドは代表的には、標準的なホスホジエステル連結を介して一緒に連結される一方で、そのポリヌクレオチドは、１またはこれより多くの非標準的な連結を含み得る。そのポリヌクレオチドは、１本鎖または２本鎖であってもよいし、１本鎖領域および２本鎖領域の両方を含んでいてもよい。さらに、ポリヌクレオチドが代表的には、天然に存在するコードする核塩基（すなわち、アデニン、グアニン、ウラシル、チミンおよびシトシン）から構成される一方で、それは、１またはこれより多くの改変されたおよび／または合成の核塩基（例えば、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチンなどのような）を含み得る。いくつかの実施形態において、このような改変されたまたは合成の核塩基は、アミノ酸配列をコードする核塩基である。
【００４０】
「タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ）」「ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」、および「ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）」は、長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）に関わらず、アミド結合によって共有結合的に連結された少なくとも２つのアミノ酸のポリマーを示すために、本明細書で交換可能に使用される。
【００４１】
「アミノ酸（ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ）」とは、それらの一般に公知の３文字記号によって、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨される一文字記号のいずれかによって、本明細書で言及される。ヌクレオチドは、同様に、それらの一般に受容される一文字表記によって言及され得る。
【００４２】
その遺伝的にコードされるアミノ酸に関して使用される略語は、従来どおりであり、以下のとおりである：アラニン（ＡｌａまたはＡ）、アルギン（ＡｒｅまたはＲ）、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、リジン（ＬｙｓまたはＫ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、スレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、およびバリン（ＶａｌまたはＶ）。
【００４３】
その三文字略語が使用される場合、「Ｌ」もしくは「Ｄ」が具体的に先行しなければ、またはその略語が使用される状況から明らかでなければ、そのアミノ酸は、α炭素（Ｃα）についてＬ配置またはＤ配置のいずれかにあり得る。例えば、「Ａｌａ」は、そのα炭素についての配置を特定することなくアラニンを指すのに対して、「Ｄ−Ａｌａ」および「Ｌ−Ａｌａ」は、それぞれ、Ｄ−アラニンおよびＬ−アラニンを指す。その一文字略語が使用される場合、大文字は、そのα炭素についてＬ配置にあるアミノ酸を指し、小文字は、そのα炭素についてＤ配置にあるアミノ酸を指す。例えば、「Ａ」は、Ｌ−アラニンを指し、「ａ」は、Ｄ−アラニンを指す。ポリペプチド配列が、一文字または三文字の略語（またはこれらの混合）の繋がりとして表される場合、その配列は、一般的慣例に従うアミノ（Ｎ）からカルボキシ（Ｃ）の方向において表される。
【００４４】
遺伝的にコードしているヌクレオシドのために使用される略語は従来どおりであり、以下のとおりである：アデノシン（Ａ）；グアノシン（Ｇ）；シチジン（Ｃ）；チミジン（Ｔ）；およびウリジン（Ｕ）。具体的に書かれなければ、その省略されたヌクレオシドは、リボヌクレオシドまたは２’−デオキシリボヌクレオシドのいずれかであり得る。そのヌクレオシドは、個別ベースでまたは集合物ベースでリボヌクレオシドまたは２’−デオキシリボヌクレオシドのいずれかであると特定され得る。核酸配列が一文字略語の繋がりとして表される場合、その配列は、一般的慣例に従う５’から３’方向において表され、そのホスフェートは示されない。
【００４５】
用語「操作された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）」、「組換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）」、「天然に存在しない（ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）」、および「バリアント（ｖａｒｉａｎｔ）」とは、細胞に言及して使用される場合、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、物質、あるいは他の状態で天然に存在しないか、またはそれと同じであるが、合成の材料から生成もしくは得られる様式で、および／または組み換え技術を使用する操作によって改変されている物質の天然のまたはネイティブの形態に相当する物質をいう。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）」および「天然に存在する（ｎａｔｕｒａｌｌｙ−ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）」とは、天然において見出される形態をいう。例えば、野生型ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然において供給源から単離され得、人の手による操作によって意図的に改変されていない生物に存在する配列である。
【００４７】
「コード配列（ｃｏｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）とは、タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸（例えば、遺伝子）のその一部をいう。
【００４８】
用語「パーセント（％）配列同一性（ｐｅｒｃｅｎｔ  （％）  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの中での比較をいうために本明細書で使用され、比較ウインドウに対して２つの最適に整列された配列を比較することによって決定され、ここでその比較ウインドウにおけるポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の一部は、その２つの配列の最適なアラインメントのために参照配列と比較した場合に、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。そのパーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列において起こる位置の数を決定して、マッチした位置の数をもたらし、そのマッチした位置の数をその比較ウインドウにおける位置の総数で除算し、その結果に１００をかけて、配列同一性のパーセンテージをもたらすことによって計算され得る。あるいは、そのパーセンテージは、その同一の核酸塩基もしくはアミノ酸残基が両方の配列において起こるか、または核酸塩基またはアミノ酸残基がギャップと整列されるかのいずれかの位置の数を決定して、マッチした位置の数をもたらし、そのマッチした位置の数をその比較ウインドウにおける位置の総数で除算し、その結果に１００をかけて、配列同一性のパーセンテージをもたらすことによって計算され得る。当業者は、２つの配列を整列するために利用可能な多くの確立されたアルゴリズムが存在することを認識する。比較のための配列の最適なアラインメントは、当該分野で公知のように、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎの局所的相同性アルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，    Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．，  ２：４８２  ［１９８１］）によって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈの相同性アラインメントアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ４８：４４３  ［１９７０）によって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎの類似性検索法（Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：２４４４  ［１９８８］）によって、これらのアルゴリズムのコンピューター化された実行（例えば、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＰａｃｋａｇｅのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または目視検査によって実行され得る。パーセント配列同一性および配列類似性を決定するために適したアルゴリズムの例としては、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズム（これは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．によって記載される）が挙げられるが、これらに限定されない（それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２１５：  ４０３−４１０  ［１９９０］；およびＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２５：３３８９−３４０２  ［１９７７］を参照のこと）。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎウェブサイトを通じて公に入手可能である。このアルゴリズムは、問い合わせ配列における長さＷの短い���ード（これは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列させた場合に、いくつかの正の値の閾値スコアＴにマッチするかまたは満たすかのいずれかである）を同定することによって、高スコアの配列ペア（ＨＳＰｓ）を先ず同定することを包含する。Ｔは、隣接ワードスコア閾値といわれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，前出を参照のこと）。これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰｓを見出すために検索を開始するためのシードとして作用する。そのワードヒットは、次いで、累積アラインメントスコアが増大され得る限りにおいて、各配列に沿って両方向に延ばされる。累積スコアは、ヌクレオチド配列のために、パラメーターＭ（マッチする残基の対の報酬スコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基に関するペナルティースコア；常に＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列に関しては、スコアリングマトリクスは、累積スコアを計算するために使用される。各方向におけるワードヒットの伸長は、以下の場合に停止される：累積アラインメントスコアが、その最大達成値から量Ｘが減少する；１またはこれより多くの負のスコアの残基アラインメントの蓄積に起因して、累積スコアが０またはこれより小さくなる；またはいずれかの配列の末端に到達する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターであるＷ、Ｔ、およびＸは、そのアラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列に関して）は、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列に関しては、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：１０９１５  ［１９８９］を参照のこと）を使用する。配列アラインメントおよび％配列同一性の例示的な決定は、提供されるデフォルトパラメーターを使用して、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｐａｃｋａｇｅ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，  Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）の中のＢＥＳＴＦＩＴまたはＧＡＰプログラムを使用し得る。
【００４９】
「参照配列（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」とは、配列比較のための基準として使用される規定された配列をいう。参照配列は、より大きな配列の部分セット、例えば、全長の遺伝子またはポリペプチド配列のセグメントであり得る。一般に、参照配列は、その核酸またはポリペプチドの全長において少なくとも２０のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の長さ、少なくとも２５残基の長さ、少なくとも５０残基の長さ、少なくとも１００残基の長さまたは全長である。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、各々、（１）その２つの配列の間で類似である配列（すなわち、完全な配列の一部）を含み得る、および（２）その２つの配列の間で異なる配列をさらに含み得ることから、２つの（またはこれより多くの）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの間の配列比較は、代表的には、配列類似性の局所的領域を同定および比較するために、その２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列を、「比較ウインドウ（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｎｄｏｗ）」に対して比較することによって行われる。いくつかの実施形態において、「参照配列」は、一次アミノ酸配列に基づき得、ここでその参照配列は、その一次配列における１またはこれより多くの変化を有し得る配列である。
【００５０】
「比較ウインドウ」とは、少なくとも約２０の連続するヌクレオチド位置またはアミノ酸残基の概念上のセグメントであって、ここで配列が少なくとも２０の連続するヌクレオチドまたはアミノ酸の参照配列と比較され得、その比較ウインドウの中の配列の一部が、その２つの配列の最適なアラインメントのために、その参照配列（これは、付加も欠失も含まない）と比較した場合、２０％またはこれより低い付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得るものをいう。その比較ウインドウは、２０より長い連続する残基であり得、必要に応じて、３０、４０、５０、１００、またはより長いウインドウを含む。
【００５１】
「に相当する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ  ｔｏ）」、「への言及（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｔｏ）」または「に対して、と比較して（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｔｏ）」は、所定のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列の番号付けの状況において使用される場合、その所定のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列が特定された参照配列と比較される場合に、その参照配列の残基の番号付けに言及する。言い換えると、所定のポリマーの残基数または残基位置は、その所定のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列内の残基の実際の多くの位置によるよりむしろ、その参照配列に関して指定される。例えば、所定のアミノ酸配列（例えば、操作されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼのもの）は、ギャップを導入して、その２つの配列の間の残基マッチを最適化することによって、参照配列に対して整列され得る。これらの場合に、そのギャップは存在するが、その所定のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列中の残基の番号付けは、これが整列されているその参照配列に関して行われる。
【００５２】
「アミノ酸差異（ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）」または「残基差異（ｒｅｓｉｄｕｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）」は、参照配列における相当する位置でアミノ酸残基に対して、ポリペプチド配列の位置におけるアミノ酸残基の差異をいう。アミノ酸差異の位置は一般に、「Ｘｎ」として本明細書で言及され、ここでｎは、その残基差異が基づく参照配列における相当する位置に言及する。例えば、「配列番号２と比較した場合に位置Ｘ９３での残基差異（ｒｅｓｉｄｕｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ａｔ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｓ  ｃｏｍｐａｒｅｄ  ｔｏ  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）」とは、配列番号２の９３位に相当するポリペプチド位置のアミノ酸残基の差異をいう。従って、配列番号２の参照ポリペプチドが９３位においてセリンを有する場合、「配列番号２と比較した場合に位置Ｘ９３における残基差異」は、配列番号２の９３位に相当するポリペプチドの位置でセリン以外の任意の残基のアミノ酸置換を有する。本明細書において大部分の場合、ある位置での具体的なアミノ酸残基差異は、「ＸｎＹ」と示され、ここで「Ｘｎ」は、上記で記載されるとおりの相当する位置を特定し、「Ｙ」は、その操作されたポリペプチドにおいて見出されるアミノ酸の一文字識別子（すなわち、その参照ポリペプチド中のものとは異なる残基）である。場合によっては（例えば、本明細書中の実施例において提供される表では）、本開示はまた、従来の註釈「ＡｎＢ」（ここでＡは、参照配列中の残基の一文字識別子であり、「ｎ」は、その参照配列中の残基位置の番号であり、Ｂは、その操作されたポリペプチドの配列中の残基置換の一文字識別子である）によって示される具体的なアミノ酸差異を提供する。場合によっては、本開示のポリペプチドは、残基差異が参照配列と比較して存在するその特定された位置のリストによって示される、参照配列に対して１またはこれより多くのアミノ酸残基差異を含み得る。いくつかの実施形態において、１より多くのアミノ酸がポリペプチドの具体的な残基位置において使用され得る場合、使用され得る種々のアミノ酸残基は、「／」によって分けられ得る（例えば、Ｘ１０Ｈ／Ｘ１０ＰまたはＸ１０Ｈ／Ｐ）。いくつかの実施形態において、その酵素バリアントは、１より多くの置換を含む。これらの置換は、読みやすさのためにスラッシュによって分けられる（例えば、Ｃ１４Ａ／Ｋ１２２Ａ）。本出願は、保存的および非保存的なアミノ酸置換のいずれか／または両方を含む１またはこれより多くのアミノ酸差異を含む操作されたポリペプチド配列を包含する。
【００５３】
「保存的アミノ酸置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」とは、ある残基を、類似の側鎖を有する異なる残基で置換することをいい、従って代表的には、そのポリペプチド中のアミノ酸を、同じクラスまたは類似の規定されたアミノ酸クラス内のアミノ酸で置換することを含む。例示であって限定ではなく、脂肪族側鎖を有するアミノ酸は、別の脂肪族アミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン）で置換され得る；ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸は、ヒドロキシル側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、セリンおよびスレオニン）で置換される；芳香族側鎖を有するアミノ酸は、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、およびヒスチジン）で置換される；塩基性側鎖を有するアミノ酸は、塩基性側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、リジンおよびアルギニン）で置換される；酸性側鎖を有するアミノ酸は、酸性側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）で置換される；そして／または疎水性もしくは親水性のアミノ酸は、それぞれ、別の疎水性もしくは親水性のアミノ酸で置換される。
【００５４】
「非保存的置換（ｎｏｎ−ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」とは、ポリペプチド中のアミノ酸を、顕著に異なる側鎖特性を有するアミノ酸で置換することをいう。非保存的置換は、その規定されたグループ内ではなく、そのグループの間でアミノ酸を使用し得、そして（ａ）置換の領域におけるペプチド骨格の構造（例えば、グリシンの代わりにプロリン）、（ｂ）電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のかさ高さ、に影響を及ぼす。例示であって限定ではなく、例示的な非保存的置換は、塩基性または脂肪族アミノ酸で置換された酸性アミノ酸；小さなアミノ酸で置換された芳香族アミノ酸；および疎水性アミノ酸で置換された親水性アミノ酸であり得る。
【００５５】
「欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）」とは、１またはこれより多くのアミノ酸を参照ポリペプチドから除去することによる、そのポリペプチドに対する改変をいう。欠失は、１もしくはこれより多くのアミノ酸、２もしくはこれより多くのアミノ酸、５もしくはこれより多くのアミノ酸、１０もしくはこれより多くのアミノ酸、１５もしくはこれより多くのアミノ酸、または２０もしくはこれより多くのアミノ酸、酵素活性を保持するおよび／または操作された酵素の改善された特性を保持すると同時に、参照酵素を構成するアミノ酸の総数のうちの１０％まで、もしくはアミノ酸の総数のうちの２０％までの除去を含み得る。欠失は、そのポリペプチドの内部部分および／または末端部分に指向され得る。種々の実施形態において、その欠失は、連続するセグメントを含み得るか、または不連続であり得る。
【００５６】
「挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）」とは、１またはこれより多くのアミノ酸をその参照ポリペプチドから付加することによる、そのポリペプチドに対する改変をいう。挿入は、そのポリペプチドの内部部分に、またはカルボキシ末端もしくはアミノ末端にあり得る。挿入は、本明細書で使用される場合、当該分野で公知であるとおりの融合タンパク質を含む。その挿入は、アミノ酸の連続するセグメントであり得るか、または天然に存在するポリペプチド中のアミノ酸のうちの１またはこれより多くによって分離され得る。
【００５７】
「単離されたポリペプチド（ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」とは、ポリペプチドに天然に付随する他の夾雑物（例えば、タンパク質、脂質、およびポリヌクレオチド）から実質的に分離されているそのポリペプチドをいう。その用語は、それらの天然に存在する環境または発現系（例えば、宿主細胞またはインビトロ合成）から除去または精製されているポリペプチドを包含する。その組換えＴ７  ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドは、細胞内に存在してもよいし、細胞培地中に存在してもよいし、種々の形態（例えば、溶解物または単離された調製物）で調製されてもよい。このようにして、いくつかの実施形態において、その組換えＴ７  ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドは、単離されたポリペプチドであり得る。
【００５８】
「実質的に純粋なポリペプチド（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｐｕｒｅ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」とは、そのポリペプチド種が、存在する優勢な種であり（すなわち、モルベースでまたは重量ベースで、組成物において任意の他の個々の高分子種より量が豊富な）、概して、他の種が、モルまたは％重量で存在する高分子種のうちの少なくとも約５０％を構成する場合、実質的に精製された組成物である組成物に言及する。一般に、実質的に純粋なＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ組成物は、その組成物中に存在するモルまたは％重量で全高分子種のうちの約６０％もしくはこれより高く、約７０％もしくはこれより高く、約８０％もしくはこれより高く、約９０％もしくはこれより高く、約９５％もしくはこれより高く、および約９８％もしくはこれより高くを含む。いくつかの実施形態において、目的の種は、本質的に均質になるまで精製される（すなわち、夾雑種は、従来の検出法によってその組成物中で検出できない）。ここでその組成物は、単一の高分子種から本質的になる。溶媒種、低分子（＜５００ダルトン）、および元素イオン種は、高分子種とみなされない。いくつかの実施形態において、その単離された組換えＴ７  ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチド組成物である。
【００５９】
Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの「単離された酵素特性（ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｅｎｚｙｍｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｙ）とは、参照Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドおよび／または野生型Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドおよび／または別の操作されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドと比較した場合に、任意の酵素特性において改善を示す操作されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドをいう。改善された特性としては、以下のような特性が挙げられるが、これらに限定されない：ＧＴＰを超えるキャップアナログに関する増大した選択性、複製の増大した忠実度、増大したＲＮＡ収量、増大したタンパク質発現、増大した熱活性（ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｖｉｔｙ）、増大した熱安定性、増大したｐＨ活性、増大した安定性、増大した酵素活性、増大した基質特異性もしくは親和性、増大した比活性、基質もしくは最終生成物阻害（ピロホスフェートを含む）に対する増大した抵抗性、増大した化学的安定性、改善された溶媒安定性、酸性もしくは塩基性のｐＨに対する増大された寛容性、タンパク質分解活性に対する増大した寛容性（すなわち、タンパク質分解に対して低減した感受性）、低減した凝集、増大した溶解性、および質変化した温度プロフィール。
【００６０】
「改善された酵素活性（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）」または「増強された触媒活性（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）」とは、比活性（例えば、生成される生成物／時間／重量  タンパク質）の増大または基質から生成物へのパーセント変換（例えば、参照Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼと比較した場合に、バリアント  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの特定された量を使用して、特定された期間において基質の出発量から生成物へのパーセント変換）の増大によって表され得る、操作されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼの改善された特性をいう。酵素活性を決定する例示的な方法は、実施例において提供される。酵素活性に関する任意の特性は、影響を及ぼされ得る。
【００６１】
「ハイブリダイゼーションストリンジェンシー（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）」とは、核酸のハイブリダイゼーショにおけるハイブリダイゼーション条件（例えば、洗浄条件）をいう。一般に、ハイブリダイゼーション反応は、より低いストリンジェンシーの条件下で行われ、続いて、種々であるが、より高いストリンジェンシーの洗浄が行われる。用語「温和なストリンジェントなハイブリダイゼーション（ｍｏｄｅｒａｔｅｌｙ  ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）」とは、標的ＤＮＡと約６０％  同一性、好ましくは約７５％  同一性、約８５％  同一性を有する、標的−ポリヌクレオチドと約９０％より高い同一性で、標的−ＤＮＡが相補的な核酸に結合することを可能にする条件をいう。例示的な温和なストリンジェントな条件は、４２℃で５０％  ホルムアミド、５×  デンハルト溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％  ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、続いて、４２℃で０．２×ＳＳＰＥ、０．２％  ＳＤＳ中での洗浄に等価な条件である。「高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション（ｈｉｇｈ  ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）」とは概して、規定されたポリヌクレオチド配列の溶液条件下で決定されるとおりの熱溶融温度Ｔｍから約１０℃もしくはこれより低い条件に言及する。いくつかの実施形態において、高ストリンジェンシー条件は、６５℃の０．０１８Ｍ  ＮａＣｌ中で安定なハイブリッドを形成するそれら核酸配列のみのハイブリダイゼーションを可能にする条件をいう（すなわち、ハイブリッドは、６５℃の０．０１８Ｍ  ＮａＣｌ中で安定でない場合、それは、本明細書で企図されるように、高ストリンジェンシー条件下で安定でない）。高ストリンジェンシー条件は、例えば、４２℃の５０％  ホルムアミド、５×デンハルト溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％  ＳＤＳに等価な条件でのハイブリダイゼーション、続いて、６５℃での０．１×ＳＳＰＥ、および０．１％  ＳＤＳ中での洗浄に提供され得る。別の高ストリンジェンシー条件は、０．１％（ｗ：ｖ）  ＳＤＳを含む５×ＳＳＣ中で６５℃においてハイブリダイズすることに等価な条件でハイブリダイズし、０．１％  ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中で６５℃において洗浄することである。他の高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、および温和なストリンジェント条件は、上記で引用される参考文献中に記載される。
【００６２】
「コドン最適化される（ｃｏｄｏｎ  ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ）」とは、タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコドンを、そのコードされるタンパク質が特定の生物においてより効率的に発現されるように、その目的の生物において優先的に使用されるコドンに変更することに言及する。その遺伝コードは、大部分のアミノ酸がいくつかのコドンによって表される（「同義語（ｓｙｎｏｎｙｍ）」または「同義の（ｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓ）コドン」といわれる）という点で縮重しているが、特定の生物によるコドン使用法は、無作為ではなく、特定のコドン三つ組に偏っていることは周知である。このコドン使用法の偏りは、所定の遺伝子、共通機能もしくは祖先の遺伝子、高発現タンパク質  対  低コピー数タンパク質、および生物のゲノムの集合性のタンパク質コード領域に言及して、より高いこともある。いくつかの実施形態において、そのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドは、発現のために選択される宿主生物から最適な生成のために最適化されたコドンであり得る。
【００６３】
「制御配列（ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」とは、本明細書では、本出願のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現に必要なまたは有利な、全ての構成要素を含むことに言及する。各制御配列は、そのポリペプチドをコードする核酸配列に対して天然であってもよいし、外来であってもよい。このような制御配列としては、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター配列、シグナルペプチド配列、開始配列および転写ターミネーターが挙げられるが、これらに限定されない。少なくとも、その制御配列は、プロモーター、ならびに転写および翻訳停止シグナルを含む。その制御配列は、その制御配列とポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域とのライゲーションを促進する特定の制限部位を導入する目的で、リンカーとともに提供され得る。
【００６４】
「作動可能に連結される（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」とは、制御配列が、目的のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現を指示または調節するように、目的のポリヌクレオチドに相対的な位置においてその制御配列が適切に（すなわち、機能的な関係性に）配置される構成として本明細書で定義される。
【００６５】
「プロモーター配列（ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」とは、目的のポリヌクレオチド（例えば、コード配列）の発現のために宿主細胞によって認識される核酸配列をいう。そのプロモーター配列は、転写制御配列を含み、これは、目的のポリヌクレオチドの発現を媒介する。そのプロモーターは、変異、短縮化、およびハイブリッドプロモーターを含め、選択された宿主細胞において転写活性を示す任意の核酸配列であり得、宿主細胞に対して相同または異種いずれかの細胞外または細胞内のポリペプチドをコードする遺伝子から得られ得る。
【００６６】
「適切な反応条件（ｓｕｉｔａｂｌｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）」とは、本出願のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドが、基質を所望の生成物化合物に変換し得る、酵素変換反応溶液におけるそれらの条件（例えば、装填する酵素の範囲、装填する基質、温度、ｐＨ、緩衝液、共溶媒など）をいう。
【００６７】
酵素変換反応プロセスの状況における「基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）」は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドが作用する化合物または分子をいう。
【００６８】
酵素変換反応プロセスの状況における「生成物（ｐｒｏｄｕｃｔ）」とは、基質に対するそのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドの作用から生じる化合物または分子をいう。
【００６９】
本明細書で使用される場合、用語「培養する（ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ）」とは、任意の適切な条件下で微生物細胞の集団を増殖させることに言及する（例えば、液体、ゲル、または固体培地を使用する）。      
【００７０】
組換えポリペプチドは、当該分野で公知の任意の適切な方法を使用して生成され得る。その目的の野生型ポリペプチドをコードする遺伝子は、ベクター（例えば、プラスミド）においてクローニングされ得、望ましい宿主（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなど）において発現される。組換えポリペプチドのバリアントは、当該分野で公知の種々の方法によって生成され得る。実際に、当業者に周知の広く種々の異なる変異誘発技術が存在する。さらに、変異誘発キットはまた、多くの市販の分子生物学供給業者から入手可能である。規定のアミノ酸における特定の置換（部位指向性）、遺伝子の局所的領域における特定のもしくは無作為の変異（領域特異的）、または遺伝子全体にわたる無作為の変異誘発（例えば、飽和変異誘発）を作製する方法が利用可能である。多くの適切な方法は、酵素バリアントを生成するために当業者に公知である（ＰＣＲを使用する１本鎖ＤＮＡまたは２本鎖ＤＮＡの部位指向性変異誘発、カセット変異誘発、遺伝子合成、エラープローンＰＣＲ、シャフリング、および化学飽和変異誘発、または当該分野で公知の任意の他の適切な方法が挙げられるが、これらに限定されない）。ＤＮＡおよびタンパク質操作のために使用される方法の非限定的な例は、以下の特許において提供される：米国特許第６，１１７，６７９号；米国特許第６，４２０，１７５号；米国特許第６，３７６，２４６号；米国特許第６，５８６，１８２号；米国特許第７，７４７，３９１号；米国特許第７，７４７，３９３号；米国特許第７，７８３，４２８号；および米国特許第８，３８３，３４６号。そのバリアントが生成された後、それらは、任意の所望の特性（例えば、高いもしくは増大した活性、または低いもしくは低減した活性、増大した熱活性、増大した熱安定性、および／または酸性ｐＨ安定性など）についてスクリーニングされ得る。
【００７１】
いくつかの実施形態において、「組換えＴ７  ＲＮＡポリメラーゼポリペプチド（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｔ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」（「操作されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼポリペプチド（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｔ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」、「バリアントＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ酵素（ｖａｒｉａｎｔ  Ｔ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｅｎｚｙｍｅ）」、および「Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント（Ｔ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｖａｒｉａｎｔｓ）ともいわれる」は、使用が見出される。
【００７２】
本明細書で使用される場合、「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」は、ＤＮＡ配列を細胞に導入するためのＤＮＡ構築物である。いくつかの実施形態において、そのベクターは、そのＤＮＡ配列の中でコードされるポリペプチドの適切な宿主において発現をもたらし得る適切な制御配列に作動可能に連結される発現ベクターである。いくつかの実施形態において、「発現ベクター（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ）」は、宿主細胞において発現を駆動するためにＤＮＡ配列（例えば、導入遺伝子）に作動可能に連結されるプロモーター配列を有し、いくつかの実施形態において、転写ターミネーター配列をも含む。
【００７３】
本明細書で使用される場合、用語「発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」は、そのポリペプチドの生成に関与する任意の工程を含む（転写、転写後修飾、翻訳、および翻訳後修飾が挙げられるが、これらに限定されない）。いくつかの実施形態において、その用語はまた、そのポリペプチドの細胞からの分泌を含む。
【００７４】
本明細書で使用される場合、用語「生成する（ｐｒｏｄｕｃｅ）」とは、細胞によるタンパク質および／または他の化合物の生成をいう。その用語が、ポリペプチドの生成に関与する任意の工程（転写、転写後修飾、翻訳および翻訳後修飾が挙げられるが、これらに限定されない）を包含することが意図される。いくつかの実施形態において、その用語はまた、細胞からのそのポリペプチドの分泌を包含する。
【００７５】
本明細書で使用される場合、アミノ酸またはヌクレオチド配列（例えば、プロモーター配列、シグナルペプチド、ターミネーター配列など）は、その２つの配列が天然において関連しない場合に、作動可能に連結される別の配列に対して「異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）」である。
【００７６】
本明細書で使用される場合、用語「宿主細胞（ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ）」および「宿主系統（ｈｏｓｔ  ｓｔｒａｉｎ）」とは、本明細書で提供されるＤＮＡ（例えば、そのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントをコードするポリヌクレオチド）を含む発現ベクターに適した宿主をいう。いくつかの実施形態において、その宿主細胞は、当該分野で公知のとおりの組換えＤＮＡ技術を使用して構築されるベクターで形質転換またはトランスフェクトされている原核生物または真核生物の細胞である。
【００７７】
用語「アナログ（ａｎａｌｏｇｕｅ）」とは、ポリペプチドに言及して使用される場合、参照ポリペプチドと７０％を超える配列同一性であるが１００％未満の配列同一性（例えば、７５％を超える、７８％、８０％、８３％、８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性）を有するポリペプチドを意味する。いくつかの実施形態において、アナログは、１またはこれより多くの天然に存在しないアミノ酸残基（ホモアルギニン、オルニチンおよびノルバリンが挙げられるが、これらに限定されない）、ならびに天然に存在するアミノ酸を含むポリペプチドを意味する。いくつかの実施形態において、アナログはまた、１またはこれより多くのＤ−アミノ酸残基および２またはこれより多くのアミノ酸残基の間の非ペプチド連結を含む。
【００７８】
用語「有効量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」とは、所望の結果を生じるために十分な量を意味する。当業者は、慣用的な実験を使用することによって何が有効量であるかを決定し得る。
【００７９】
用語「単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」および「精製された（ｐｕｒｉｆｉｅｄ）」とは、分子（例えば、単離された核酸、ポリペプチドなど）または天然に関連する少なくとも１つの他の構成要素から除去される他の構成要素をいうために使用される。用語「精製された」は、絶対的な純度を要求せず、むしろ、相対的な定義として意図される。
【００８０】
本明細書で使用される場合、「組成物（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」および「製剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）」とは、任意の適切な使用（例えば、研究、診断など）に関して意図された、少なくとも１つの本発明の操作されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを含む生成物を包含する。
【００８１】
用語「転写（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）」とは、ＤＮＡテンプレートの一部が、ＲＮＡポリメラーゼ酵素の作用によってＲＮＡへのコピーされるプロセスをいうために使用される。
【００８２】
用語「ＤＮＡテンプレート（ＤＮＡ  ｔｅｍｐｌａｔｅ）」とは、プロモーター配列および転写のＲＮＡ生成物をコードする配列を含む１本鎖または２本鎖のＤＮＡ分子をいうために使用される。
【００８３】
用語「プロモーター」とは、転写の開始部位としてＲＮＡポリメラーゼによって認識されるＤＮＡ配列をいうために使用される。そのプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼを動員し、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの場合には、転写の開始部位を決定する。
【００８４】
用語「ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）」とは、ＤＮＡテンプレートをＲＮＡポリヌクレオチドへと、ヌクレオチドトリホスフェートを成長しつつあるＲＮＡポリマーへと段階的に組み込むことによってコピーする、ＤＮＡ指向性ＲＮＡポリメラーゼをいうために使用される。
【００８５】
用語「メッセンジャーＲＮＡ（ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ）および「ｍＲＮＡ」とは、タンパク質をコードするＲＮＡ分子をいうために使用される。このタンパク質は、翻訳の作用を通じて解読される。
【００８６】
用語「７−メチルグアノシンキャップ（７−ｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｏｓｉｎｅ  ｃａｐ）」、「７ｍｅＧ」、「５プライムキャップ（ｆｉｖｅ−ｐｒｉｍｅ  ｃａｐ）」、および「５’キャップ（５’ｃａｐ）」は、真核生物ｍＲＮＡの５’末端に存在する特定の改変されたヌクレオチド構造に言及して使用される。その７−メチルグアノシンキャップ構造は、５’−５’トリホスフェート連結を通じてそのｍＲＮＡにおける第１のヌクレオチドへと結合される。インビボでは、このキャップ構造は、多数の酵素の連続的な作用を通じて、発生しようとしているｍＲＮＡの５’末端に付加される。インビトロでは、そのキャップは、キャップアナログの使用によって、ＲＮＡポリメラーゼによる転写の開始において直接組み込まれ得る。
【００８７】
用語「キャップアナログ（ｃａｐ  ａｎａｌｏｇ）」とは、５’−５’ジ−、トリ−、またはテトラ−ホスフェート連結を含むジヌクレオチドをいう。そのジヌクレオチドの一方の末端は、グアノシンまたは置換されたグアノシン残基のいずれかにおいて終結する；ＲＮＡポリメラーゼが、３’ヒドロキシルから伸長することによって転写を開始する末端が、この末端である。そのジヌクレオチドの他方の末端は、真核生物のキャップ構造を模倣するグアノシンであり、代表的には、７−メチル−、７−ベンジル−、もしくは７−エチル-置換および／または７−アミノメチルもしくは７−アミノエチル置換を有する。いくつかの場合に、このヌクレオチドはまた、その分子のキャップ末端からの転写の開始を妨げるために３’ヒドロキシル基で置換されたメトキシである。
【００８８】
用語「ＡＲＣＡ」および「アンチリバースキャップアナログ（ａｎｔｉ−ｒｅｖｅｒｓｅ  ｃａｐ  ａｎａｌｏｇ）」とは、そのキャップアナログが、正確な配向において転写物へと適切に組み込まれることを担保することによって、インビトロ翻訳の効率を最大化するために指定された、キャップアナログの化学的に改変された形態をいう。これらのアナログは、翻訳を増強するにあたって使用が見出される。いくつかの実施形態において、当該分野で公知のＡＲＣＡは、使用が見出される（例えば、Ｐｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｒｇ．  Ｌｅｔｔ．，  ４：１６１−１６４  ［２００２］）。
【００８９】
用語「リボスイッチ（ｒｉｂｏｓｗｉｔｃｈ）」とは、リガンドの存在下で、そのＲＮＡ酵素自体または別のＲＮＡを切断する自己触媒性ＲＮＡ酵素をいうために使用される。
【００９０】
用語「忠実度（ｆｉｄｅｌｉｔｙ）」とは、ＤＮＡテンプレートをＲＮＡポリヌクレオチドへと転写またはコピーするにあたって、ＲＮＡポリメラーゼの精度をいうために使用される。不正確な転写は、一ヌクレオチド多型（ＳＮＰｓ）またはインデルを生じ得る。
【００９１】
用語「一ヌクレオチド多型（ｓｉｎｇｌｅ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）」または「ＳＮＰ」とは、ポリヌクレオチドにおける１つの位置に存在するヌクレオチドの変化をいう。転写の状況において、ＳＮＰｓは、ＤＮＡテンプレート上の１つの位置において、ＲＮＡポリメラーゼによって、非相補的リボヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵ）の誤った組み込みから生じ得る。
【００９２】
用語「インデル（ｉｎｄｅｌ）」とは、１またはこれより多くのポリヌクレオチドの挿入または欠失をいうために使用される。ＲＮＡポリメラーゼによる転写の状況において、インデルエラーは、１またはこれより多くの余分なリボヌクレオチドの付加またはＤＮＡテンプレート上の１つの位置における１またはこれより多くのヌクレオチドを組む混むことができないことから生じる。
【００９３】
用語「選択性（ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ）」とは、一方の基質に対して、触媒された反応の間の別の基質と比較した場合により高い活性を有する酵素の形質をいうために使用される。同時転写キャッピングの状況において、そのＲＮＡポリメラーゼは、ＧＴＰを超えるキャップアナログの高いまたは低い選択性を有し得る。
【００９４】
用語「無機ピロホスファターゼ（ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）」とは、無機ピロホスフェートをオルトホスフェートへと分解する酵素をいうために使用される。
【００９５】
操作されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ活性：  
いくつかの実施形態において、改善された特性を示す、操作されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号４および／または１５と少なくとも約８５％、少なくとも約８８％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％  アミノ酸配列同一性、配列番号４および／もしくは１５と比較した場合に、１またはこれより多くのアミノ酸位置（例えば、配列番号４および／もしくは１５と比較して、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１４個、１５個、２０個もしくはこれより多くのアミノ酸位置）においてアミノ酸残基差異、または配列番号４および／もしくは１５と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくはこれより大きなアミノ酸配列同一性を有する配列を有する。いくつかの実施形態において、配列番号４と比較した場合に、１またはこれより多くの位置におけるその残基差異は、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはこれより多くの保存的アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、その操作されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドは、表５．３、表５．５、および／または表５．６に列挙されるポリペプチドである。いくつかの実施形態において、その操作されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドは、配列番号４、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３２、３３、３５、３７、および／または３９から選択される。いくつかの実施形態において、配列番号１５と比較した場合に、１またはこれより多くの位置における残基差異は、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはこれより多くの保存的アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、その操作されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドは、表５．４に列挙されたポリペプチドである。いくつかの実施形態において、その操作されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドは、配列番号４、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３２、３３、３５、３７、および／または３９から選択される。
【００９６】
いくつかの実施形態において、その操作されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドは、本発明によって包含される操作されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドの機能的フラグメントを含む。機能的フラグメントは、得られた操作されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼポリペプチド（すなわち、親の操作されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ）の活性の少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を有する。機能的フラグメントは、その操作されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼの親配列の少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％およびさらに９９％を含む。いくつかの実施形態において、その機能的フラグメントは、５個未満、１０個未満、１５個未満、１０個未満、２５個未満、３０個未満、３５個未満、４０個未満、４５個未満、および５０個未満のアミノ酸が短縮される。
【００９７】
操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、発現ベクターおよび宿主細胞：  
本発明は、本明細書で記載される操作されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、そのポリヌクレオチドは、そのポリペプチドを発現し得る組換えポリヌクレオチドを作製するために遺伝子発現を制御する１またはこれより多くの異種調節配列に作動可能に連結される。その操作されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む発現構築物は、その相当するＴ７  ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドを発現するために適切な宿主細胞へと導入され得る。
【００９８】
当業者に明らかであるように、タンパク質配列の利用可能性およびその種々のアミノ酸に相当するコドンの知識は、本発明のポリペプチドをコードし得るポリヌクレオチド全ての記載を提供する。その遺伝コードの縮重は、その同じアミノ酸が代替のまたは同義のコドンによってコードされる場合、極めて多数の核酸が作製されることを可能にし、そのうちの全てが、その操作されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードする。従って、特定のアミノ酸配列の知識があれば、当業者は、そのタンパク質のアミノ酸配列を変化させない方法で、１またはこれより多くのコドンの配列を単に改変することによって、任意の数の種々の核酸を作製し得る。この点において、本発明は、その可能なコドン選択に基づく組み合わせを選択することによって、本明細書で記載されるポリペプチドをコードする、作製され得るポリヌクレオチドの各々のおよびあらゆる可能なバリエーションを具体的に企図し、そして全てのこのようなバリエーションは、本明細書で記載される任意のポリペプチド（表５．３、表５．４、表５．５、および／または表５．６に提供されるバリアントを含む）に関して具体的に開示されると見做されるべきである。
【００９９】
種々の実施形態において、そのコドンは好ましくは、そのタンパク質が生成されている宿主細胞に適合するように選択される。例えば、細菌において使用される好ましいコドンは、細菌における発現のために使用される。結論として、その操作されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードするコドン最適化ポリヌクレオチドは、全長コード領域のコドン位置のうちの約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％超において好ましいコドンを含む。
【０１００】
いくつかの実施形態において、上記のように、そのポリヌクレオチドは、本明細書で開示される特性を有するＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドをコードし、そのポリペプチドは、配列番号４および１５から選択される参照配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはこれより高い同一性を有するアミノ酸配列、または表５．３、表５．４、表５．５、および／もしくは表５．６で開示されるとおりの任意のバリアントのアミノ酸配列、ならびに配列番号１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３２、３３、３５、３７、および／もしくは３９の参照ポリペプチドと比較した場合に１もしくはこれより多くの残基差異、または表５．３、表５．４、表５．５、および／もしくは表５．６で開示されるとおりの任意のバリアントのアミノ酸配列（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０もしくはこれより多くのアミノ酸残基位置）を含む。いくつかの実施形態において、その参照配列は、配列番号４および／または１５から選択される。いくつかの実施形態において、そのポリヌクレオチドは、本明細書で開示される特性を有するＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドをコードし、ここでそのポリペプチドは、参照配列の配列番号４および／または１５と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはこれより高い配列同一性、ならびに配列番号４および／または１５のポリペプチドと最適に整列された場合に、表５．３、表５．４、表５．５、および／または表５．６で提供されるものから選択される残基位置において、配列番号４および／または１５と比較した場合に１またはこれより多くの残基差異を有するアミノ酸配列を含む。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、その操作されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号４、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３２、３３、３５、３７、および３９をコードするポリヌクレオチド配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、操作されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号３、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、および３８と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のヌクレオチド残基同一性を有する。いくつかの実施形態において、その操作されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号３、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、および３８から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、そのポリヌクレオチドは、高度にストリンジェントな条件下で、配列番号３および／もしくは１４から選択される参照ポリヌクレオチド配列、またはその相補体、または本明細書で提供されるバリアントＴ７  ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドのうちのいずれかをコードするポリヌクレオチド配列にハイブリダイズし得る。いくつかの実施形態において、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るそのポリヌクレオチドは、配列番号４および／または１５と比較した場合に、表５．３、表５．４、表５．５、および／または表５．６に示される任意の位置から選択される残基位置において１またはこれより多くの残基差異を有するアミノ酸配列を含むＴ７  ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードする。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される操作されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドのうちのいずれかをコードする単離されたポリヌクレオチドは、そのポリペプチドの発現を提供する種々の方法で操作され得る。いくつかの実施形態において、そのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、１またはこれより多くの制御配列が、そのポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現を調節するために存在する発現ベクターとして提供される。ベクターへと挿入する前のその単離されたポリヌクレオチドの操作は、その発現ベクターに依存して、望ましいかまたは必要であり得る。組換えＤＮＡ法を利用してポリヌクレオチドおよび核酸配列を改変するための技術は、当該分野で周知である。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、その制御配列は、配列の中でも、プロモーター、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、シグナルペプチド配列、および転写ターミネーターが挙げられる。当該分野で公知であるように、適切なプロモーターは、使用される宿主細胞に基づいて選択され得る。糸状菌宿主細胞の例示的なプロモーターとしては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ中性αアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ酸安定性αアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒもしくはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉリパーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅアルカリ性プロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅトリオースホスフェートイソメラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓアセトアミダーゼ、およびＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼ（例えば、ＷＯ  ９６／００７８７を参照のこと）の遺伝子から得られるプロモーター、ならびにＮＡ２−ｔｐｉプロモーター（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ中性αアミラーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅトリオースホスフェートイソメラーゼの遺伝子に由来するプロモーターのハイブリッド）、ならびにこれらの変異した、短縮された、およびハイブリッドのプロモーターが挙げられる。例示的な酵母細胞プロモーターは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、ならびにＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ３−ホスホグリセレートキナーゼの遺伝子に由来し得る。酵母宿主細胞の他の有用なプロモーターは、当該分野で公知である（例えば、Ｒｏｍａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｙｅａｓｔ  ８：４２３−４８８  ［１９９２］を参照のこと）。哺乳動物細胞における使用のための例示的なプロモーターとしては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、サル液胞形成ウイルス４０（Ｓｉｍｉａｎ  ｖａｃｕｏｌａｔｉｎｇ  ｖｉｒｕｓ  ４０）（ＳＶ４０）に由来するもの、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓホスホグリセレートキナーゼ、βアクチン、伸長因子−１ａもしくはグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼに由来するもの、またはｆｒｏｍ  Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ  βアクチンに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、その制御配列は、転写を終結するために、適切な転写ターミネーター配列（宿主細胞によって認識される配列）である。そのターミネーター配列は、そのペプチドをコードする核酸配列の３’末端に作動可能に連結される。選択された宿主細胞において機能的な任意のターミネーターは、本発明において使用が見出される。例えば、糸状菌宿主細胞のための例示的な転写ターミネーターは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニレートシンターゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  αグルコシダーゼ、およびＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得られ得る。酵母宿主細胞のための例示的なターミネーターは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅシトクロムＣ（ＣＹＣ１）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼの遺伝子から得られ得る。酵母宿主細胞のための他の有用なターミネーターは、当該分野で公知である（例えば、Ｒｏｍａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，前出を参照のこと）。哺乳動物細胞のための例示的なターミネーターとしては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、サル液胞形成ウイルス４０（ＳＶ４０）、またはＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ成長ホルモンに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、その制御配列は、適切なリーダー配列、宿主細胞による翻訳にとって重要であるｍＲＮＡの非翻訳領域である。そのリーダー配列は、そのポリペプチドをコードする核酸配列の５’末端に作動可能に連結される。選択された宿主細胞において機能的である任意のリーダー配列が、使用され得る。糸状菌宿主細胞のための例示的なリーダーは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓトリオースホスフェートイソメラーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための適切なリーダーは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ３−ホスホグリセレートキナーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  α因子、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）の遺伝子から得られるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０７】
その制御配列はまた、ポリアデニル化配列（その核酸配列の３’末端に作動可能に連結され、転写される場合に、その宿主細胞によってポリアデノシン残基を転写されたｍＲＮＡに付加するシグナルとして認識される配列）であり得る。選択された宿主細胞において機能的である任意のポリアデニル化配列は、本発明において使用され得る。糸状菌宿主細胞のための例示的なポリアデニル化配列としては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニレートシンターゼ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  αグルコシダーゼの遺伝子に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。酵母宿主細胞のための有用なポリアデニル化配列はまた、当該分野で公知である（例えば、Ｇｕｏ  ａｎｄ  Ｓｈｅｒｍａｎ，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏ．，  １５：５９８３−５９９０  ［１９９５］を参照のこと）。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、その制御配列は、ポリペプチドのアミノ末端に連結されたアミノ酸配列をコードしかつそのコードされたポリペプチドを細胞分泌経路へと方向付けるシグナルペプチドコード領域である。その核酸配列のコード領域の５’末端は、その分泌されたポリペプチドをコードするコード領域のセグメントと翻訳リーディングフレームにおいて天然に連結されたシグナルペプチドコード領域を本質的に含み得る。あるいは、そのコード配列の５’末端は、そのコード配列に対して外来であるシグナルペプチドコード領域を含み得る。その発現されたポリペプチドを選択された宿主細胞の分泌経路へと方向付ける任意のシグナルペプチドコード領域は、本明細書で提供される操作されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドの発現のために使用が見出される。糸状菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード領域としては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ中性アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓセルラーゼ、およびＨｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａリパーゼの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域が挙げられるが、これらに限定されない。酵母宿主細胞のための有用なシグナルペプチドとしては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  α因子およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼの遺伝子に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。哺乳動物宿主細胞のための有用なシグナルペプチドとしては、免疫グロブリンγ（ＩｇＧ）の遺伝子に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、その制御配列は、ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコードするプロペプチドコード領域である。その得られたポリペプチドは、「プロエンザイム（ｐｒｏｅｎｚｙｍｅ）」、「プロポリペプチド（ｐｒｏｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」、または「チモーゲン（ｚｙｍｏｇｅｎ）（いくつかの場合には）といわれ得る。プロポリペプチドは、そのプロペプチドをプロポリペプチドから触媒的にまたは自己触媒的に切断することによって、成熟活性ポリペプチドに変換され得る。
【０１１０】
別の局面において、本発明はまた、操作されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびこれらが導入されるべき宿主のタイプに依存して、１またはこれより多くの発現調節領域（例えば、プロモーターおよびターミネーター、複製起点など）を含む組換え発現ベクターを提供する。いくつかの実施形態において、上記で記載される種々の核酸および制御配列は、１またはこれより多くの従来の制限部位を含めて。このような部位でバリアント  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードする核酸配列の挿入または置換を可能にする組換え発現ベクターを生成するために一緒に結合される。あるいは、本発明のポリヌクレオチド配列は、そのポリヌクレオチド配列またはそのポリヌクレオチド配列を含む核酸構築物を、発現のための適切なベクターへと挿入することによって発現される。その発現ベクターを作製するにあたって、そのコード配列は、そのコード配列が発現のための適切な制御配列と作動可能に連結されるように、そのベクターの中に位置する。
【０１１１】
その組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ手順に従来どおり供され得、そのバリアント  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ  ポリヌクレオチド配列の発現を生じ得る任意のベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であり得る。そのベクターの選択は、代表的には、そのベクターとそのベクターが導入されるべき宿主細胞との適合性に依存する。そのベクターは、直線状または閉じた環状のプラスミドであり得る。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、その発現ベクターは、自律的に複製するベクター（すなわち、染色体外実体として存在するベクター）であり、その複製は、染色体複製（例えば、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、または人工染色体）とは無関係である。そのベクターは、自己複製を保証するための任意の手段を含み得る。いくつかの代替の実施形態において、そのベクターは、その宿主細胞へと導入される場合に、ゲノムへと組み込まれかつ染色体と一緒に複製され、その染色体の中に組み込まれるものであり得る。さらに、宿主細胞のゲノムへと挿入されるべき全ＤＮＡを一緒に含む、単一のベクターもしくはプラスミド、または２もしくはこれより多くのベクターもしくはプラスミド、あるいはトランスポゾンが、使用され得る。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、その発現ベクターは好ましくは、１またはこれより多くの選択マーカーを含み、これらマーカーは、形質転換された細胞の容易な選択を可能にする。「選択マーカー（ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ  ｍａｒｋｅｒ）」とは、殺生物剤またはウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求株に対する原栄養などを提供する生成物の遺伝子である。酵母宿主細胞に適したマーカーとしては、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１、およびＵＲＡ３が挙げられるが、これらに限定されない。糸状菌宿主細胞における使用のための選択マーカーは、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｐｈ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（ニトレートレダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−ホスフェートデカルボキシラーゼ）、ｓＣ（スルフェートアデニルトランスフェラーゼ）、およびｔｒｐＣ（アントラニレートシンターゼ）、ならびにこれらの等価物が挙げられるが、これらに限定されない。別の局面において、本発明は、本出願の少なくとも１つの操作されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供し、そのポリヌクレオチドは、その宿主細胞における操作されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ酵素の発現のための１またはこれより多くの制御配列に作動可能に連結される。本発明の発現ベクターによってコードされるポリペプチドを発現することにおける使用のための宿主細胞は当該分野で周知であり、真菌細胞、例えば、酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ［例えば、ＡＴＣＣアクセッション番号２０１１７８］）；昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｓｆ９細胞）、植物細胞、動物細胞（例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、およびＢＨＫ）、およびヒト細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ、ヒト線維芽細胞、ＴＨＰ−１、ＪｕｒｋａｔおよびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞株）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１４】
よって、別の局面において、本発明は、操作されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドを生成するための方法を提供し、ここでその方法は、その操作されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現し得る宿主細胞を、そのポリペプチドの発現に適した条件下で培養する工程を包含する。いくつかの実施形態において、その方法はさらに、本明細書で記載されるように、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドを単離および／または精製する工程を包含する。
【０１１５】
上記の宿主細胞のための適切な培養培地および増殖条件は、当該分野で周知である。そのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドの発現のためのポリヌクレオチドは、当該分野で公知の種々の方法によって細胞へと導入され得る。技術としては、とりわけ、エレクトロポレーション、バイオリスティックパーティクルボンバードメント、リポソーム媒介性トランスフェクション、塩化カルシウムトランスフェクション、およびプロトプラスト融合が挙げられる。
【０１１６】
本明細書で開示される特性を有する操作されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼは、天然に存在するまたは操作されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、当該分野で公知のおよび本明細書で記載されるとおりの、変異誘発および／または指向性進化法に供する工程によって得られ得る。例示的な指向性進化技術は、変異誘発および／またはＤＮＡシャフリングである（例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１：１０７４７−１０７５１  ［１９９４］；  ＷＯ  ９５／２２６２５；  ＷＯ  ９７／００７８；  ＷＯ  ９７／３５９６６；  ＷＯ  ９８／２７２３０；  ＷＯ  ００／４２６５１；  ＷＯ  ０１／７５７６７および米国特許第６，５３７，７４６号を参照のこと）。使用され得る他の指向性進化手順としては、とりわけ、千鳥状伸長プロセス（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ）（ＳｔＥＰ）、インビトロ組換え（例えば、Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  １６：２５８−２６１  ［１９９８］を参照のこと）、変異誘発ＰＣＲ（例えば、Ｃａｌｄｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．，  ３：Ｓ１３６−Ｓ１４０  ［１９９４］を参照のこと）、およびカセット変異誘発（例えば、Ｂｌａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９３：３５２５−３５２９  ［１９９６］を参照のこと）が挙げられる。
【０１１７】
例えば、変異誘発および指向性進化法は、発現、スクリーニングおよびアッセイされ得るバリアントライブラリーを生成するためにポリヌクレオチドに容易に適用され得る。変異誘発および指向性進化法は、当該分野で周知である（例えば、ＵＳ特許第５，６０５，７９３、５，８１１，２３８、５，８３０，７２１、５，８３４，２５２、５，８３７，４５８、５，９２８，９０５、６，０９６，５４８、６，１１７，６７９、６，１３２，９７０、６，１６５，７９３、６，１８０，４０６、６，２５１，６７４、６，２７７，６３８、６，２８７，８６１、６，２８７，８６２、６，２９１，２４２、６，２９７，０５３、６，３０３，３４４、６，３０９，８８３、６，３１９，７１３、６，３１９，７１４、６，３２３，０３０、６，３２６，２０４、６，３３５，１６０、６，３３５，１９８、６，３４４，３５６、６，３５２，８５９、６，３５５，４８４、６，３５８，７４０、６，３５８，７４２、６，３６５，３７７、６，３６５，４０８、６，３６８，８６１、６，３７２，４９７、６，３７６，２４６、６，３７９，９６４、６，３８７，７０２、６，３９１，５５２、６，３９１，６４０、６，３９５，５４７、６，４０６，８５５、６，４０６，９１０、６，４１３，７４５、６，４１３，７７４、６，４２０，１７５、６，４２３，５４２、６，４２６，２２４、６，４３６，６７５、６，４４４，４６８、６，４５５，２５３、６，４７９，６５２、６，４８２，６４７、６，４８９，１４６、６，５０６，６０２、６，５０６，６０３、６，５１９，０６５、６，５２１，４５３、６，５２８，３１１、６，５３７，７４６、６，５７３，０９８、６，５７６，４６７、６，５７９，６７８、６，５８６，１８２、６，６０２，９８６、６，６１３，５１４、６，６５３，０７２、６，７１６，６３１、６，７７７，２１８、６，９１７，８８２、６，９４６，２９６、６，９６１，６６４、６，９９５，０１７、７，０２４，３１２、７，０５８，５１５、７，１０５，２９７、  ７，１４８，０５４、７，２８８，３７５、７，４２１，３４７、７，４３０，４７７、７，５３４，５６４、７，６２０，５００、７，６２０，５０２、７，６２９，１７０、７，７０２，４６４、７，７４７，３９１、７，７４７，３９３、７，７５１，９８６、７，７７６，５９８、７，７８３，４２８、７，７９５，０３０、７，８５３，４１０、７，８６８，１３８、７，８７３，４７７、７，８７３，４９９、７，９０４，２４９、  ７，９５７，９１２、８，０１４，９６１、８，０２９，９８８、８，０５８，００１、８，０７６，１３８、８，０１８，１５０、８，１７０，８０６、８，３７７，６８１、８，３８３，３４６、８，４５７，９０３、８，５０４，４９８、８，５８９，０８５、８，７６２，０６６、８，８４９，５７５、８，８７６，０６６、８，７６８，８７１、９，５９３，３２６、９，６６５，６９４および全ての関連USおよび非US対応物；  Ｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ２５４（２）：１５７−７８  ［１９９７］；  Ｄａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ５７：３６９−７４  ［１９９６］；  Ｓｍｉｔｈ，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｇｅｎｅｔ．，  １９：４２３−４６２  ［１９８５］；  Ｂｏｔｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２２９：１１９３−１２０１  ［１９８５］；  Ｃａｒｔｅｒ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．，  ２３７：１−７  ［１９８６］；  Ｋｒａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ，  ３８：８７９−８８７  ［１９８４］；  Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ，  ３４：３１５−３２３  ［１９８５］；  Ｍｉｎｓｈｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．    Ｏｐ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．，  ３：２８４−２９０  ［１９９９］；  Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  １７：２５９−２６４  ［１９９９］；  Ｃｒａｍｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３９１：２８８−２９１  ［１９９８］；  Ｃｒａｍｅｒｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  １５：４３６−４３８  ［１９９７］；  Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．    Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ９４：４５０４−４５０９  ［１９９７］；  Ｃｒａｍｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  １４：３１５−３１９  ［１９９６］；  Ｓｔｅｍｍｅｒ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３７０：３８９−３９１  ［１９９４］；  Ｓｔｅｍｍｅｒ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９１：１０７４７−１０７５１  ［１９９４］；  ＵＳ特許出願公開２００８／０２２０９９０、ＵＳ  ２００９／０３１２１９６、ＵＳ２０１４／０００５０５７、ＵＳ２０１４／０２１４３９１、ＵＳ２０１４／０２２１２１６；  ＵＳ２０１５／００５０６５８、ＵＳ２０１５／０１３３３０７、ＵＳ２０１５／０１３４３１５および関連ＵＳおよび非ＵＳ対応物；ＷＯ  ９５／２２６２５、ＷＯ  ９７／００７８、ＷＯ  ９７／３５９６６、ＷＯ  ９８／２７２３０、ＷＯ  ００／４２６５１、ＷＯ  ０１／７５７６７、およびＷＯ  ２００９／１５２３３６（これらは全て本明細書に参考として援用される）を参照のこと）。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、変異誘発処理後に得られる酵素バリアントは、その酵素バリアントを規定された温度（または他のアッセイ条件）に供し、熱処理または他のアッセイ条件後に残存している酵素活性の量を測定する工程によってスクリーニングされる。そのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡは、次いで、その宿主細胞から単離され、そのヌクレオチド配列変化（あるとすれば）を同定するために配列決定され、異なるまたは同じ宿主細胞においてその酵素を発現するために使用される。その発現ライブラリーから酵素活性を測定することは、当該分野で公知の任意の適切な方法を使用して行われ得る（例えば、標準的な生化学的技術（例えば、ＨＰＬＣ分析））。
【０１１９】
公知の配列の操作されたポリペプチドのために、その酵素をコードするポリヌクレオチドは、公知の合成法に従って、標準的な固相法によって調製され得る。いくつかの実施形態において、約１００塩基までのフラグメントは、個々に合成され得、次いで、繋げられて（例えば、酵素的または化学的ライゲーション法（ｌｉｔｉｇａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）、またはポリメラーゼ媒介性方法によって）、任意の所望の連続する配列を形成し得る。例えば、本明細書で開示されるポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、自動化合成法において代表的に実施されるように、古典的なホスホロアミダイト法を使用する化学合成法によって調製され得る（例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｅｔｒａ．  Ｌｅｔｔ．，  ２２：１８５９−６９  ［１９８１］；およびＭａｔｔｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  ３：８０１−０５  ［１９８４］を参照のこと）。ホスホロアミダイト法に従って、オリゴヌクレオチドは、合成され（例えば、自動ＤＮＡ合成機において）、精製され、アニールされ、ライゲーションされ、適切なベクターの中にクローニングされる。
【０１２０】
よって、いくつかの実施形態において、その操作されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドを調製するための方法は、以下の工程を包含し得る：（ａ）表５．３、表５．４、表５．５、および／または表５．６、ならびに配列番号１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、および３９で提供される任意のバリアントのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成する工程、ならびに（ｂ）そのポリヌクレオチドによってコードされるＴ７  ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドを発現させる工程。その方法のうちのいくつかの実施形態において、そのポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列は、必要に応じて、１またはいくつかの（例えば、３個、４個、５個まで、または１０個までの）アミノ酸残基欠失、挿入および／または置換を有し得る。いくつかの実施形態において、そのアミノ酸配列は、必要に応じて、１〜２個、１〜３個、１〜４個、１〜５個、１〜６個、１〜７個、１〜８個、１〜９個、１〜１０個、１〜１５個、１〜２０個、１〜２１個、１〜２２個、１〜２３個、１〜２４個、１〜２５個、１〜３０個、１〜３５個、１〜４０個、１〜４５個、または１〜５０個のアミノ酸残基欠失、挿入および／または置換を有する。いくつかの実施形態において、そのアミノ酸配列は、必要に応じて、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、３０個、３０個、３５個、４０個、４５個、または５０個のアミノ酸残基欠失、挿入および／、または置換を有する。いくつかの実施形態において、そのアミノ酸配列は、必要に応じて、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１８個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、または２５個のアミノ酸残基欠失、挿入および／または置換を有する。いくつかの実施形態において、その置換は、保存的または非保存的な置換であり得る。
【０１２１】
その発現された。操作されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドは、任意の望ましい改善された特性（例えば、活性、選択性、安定性、耐酸性、プロテアーゼ感度など）について、当該分野で公知の任意の適切なアッセイ（本明細書で記載されるアッセイおよび条件が挙げられるが、これらに限定されない）を使用して評価され得る。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、宿主細胞において発現される、その操作されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドのうちのいずれかは、タンパク質精製の周知の技術のうちのいずれか１またはこれより多く（とりわけ、リゾチーム処理、超音波処理、濾過、塩析、超遠心分離、およびクロマトグラフィーが挙げられる）を使用して、細胞および／または培養培地から回収される。
【０１２３】
そのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドの単離のためのクロマトグラフィー技術としては、とりわけ、逆相クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、およびアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。特定の酵素を精製するための条件は、部分的に、正味の電荷、疎水性、親水性、分子量、分子形状などのような因子に依存し、当業者に明らかである。いくつかの実施形態において、アフィニティー技術は、その改善されたバリアントＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ酵素を単離するために使用され得る。アフィニティークロマトグラフィー精製を利用するいくつかの実施形態において、そのバリアントＴ７  ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドを特異的に結合する任意の抗体は、使用が見出される。アフィニティークロマトグラフィー精製を利用するいくつかの実施形態において、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼに共有結合されるグリカンに結合するタンパク質は、使用が見出される。アフィニティークロマトグラフィー精製を利用するなお他の実施形態において、そのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ活性部位に結合する任意の低分子は、使用が見出される。抗体の生成に関しては、種々の宿主動物（ウサギ、マウス、ラットなどが挙げられるが、これらに限定されない）は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼポリペプチド（例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント）、またはこれらのフラグメントを注射することによって免疫される。いくつかの実施形態において、そのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドまたはフラグメントは、側鎖官能基または側鎖官能基に結合されるリンカーによって、適切なキャリア（例えば、ＢＳＡ）に結合される。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、その操作されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドは、本明細書で記載されるとおりの操作されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｄａｕｃｕｓ  ｃａｒｏｔａ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ）、またはＣｒｉｃｅｔｕｌｕｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ（例えば、ＣＨＯ））を、その操作されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドの生成をもたらす条件下で培養する工程ならびにその操作されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドを、その細胞および／または培養培地から回収する工程を包含する方法によって、宿主細胞において生成される。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、本発明は、操作されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドを生成するための方法を包含し、上記方法は、配列番号４および／または１５の参照配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性、ならびに配列番号４および／または１５のアミノ酸配列で最適に整列された場合、表５．３、表５．４、表５．５、および／または表５．６で提供されるものから選択される、配列番号４および／または１５と比較した場合に１またはこれより多くのアミノ酸残基差異、ならびに／またはこれらの組み合わせを有する操作されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む組換え真核生物細胞を、その操作されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドの生成を可能にする適切な培養条件下で培養する工程、ならびに必要に応じて、その操作されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドを、培養物および／または培養された細菌細胞から回収する工程を包含する。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、一旦その操作されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドが組換え宿主細胞または細胞培養培地から回収された後、それらは、当該分野で公知の任意の適切な方法によってさらに精製される。いくつかの追加の実施形態において、その精製されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドは、種々の適用および使用に適切な場合に、その操作されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドを含む組成物および製剤（例えば、薬学的組成物）を提供するために、他の成分および化合物と合わされる。いくつかの追加の実施形態において、その精製されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼポリペプチド、または製剤化されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドは、凍結乾燥される。
【０１２７】
組成物：
本発明は、種々の組成物および形式（以下で記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない）を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、診断目的で組成物における使用に適した操作されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドを提供する。
【０１２８】
実験
以下の実施例は、達成された実験および結果を含め、例証目的で提供されるに過ぎず、本発明を限定すると解釈されるべきではない。
【０１２９】
以下で開示される実験では、以下の略語が適用される：    ｐｐｍ（パートパーミリオン）；  Ｍ（モル濃度）；  ｍＭ（ミリモル濃度）、ｕＭおよびμＭ（マイクロモル濃度）；  ｎＭ（ナノモル濃度）；  ｍｏｌ（モル）；  ｇｍおよびｇ（グラム）；  ｍｇ（ミリグラム）；  ｕｇおよびμｇ（マイクログラム）；  Ｌおよびｌ（リットル）；  ｍｌおよびｍＬ（ミリリットル）；  ｃｍ（センチメートル）；  ｍｍ（ミリメートル）；  ｕｍおよびμｍ（マイクロメートル）；  ｓｅｃ．（秒）；  ｍｉｎ（ｓ）（分）；  ｈ（ｓ）およびｈｒ（ｓ）（時間）；  Ｕ（ユニット）；  ＭＷ（分子量）；  ｒｐｍ（回転／分）；  ｒｃｆ（相対遠心力）；  ℃（摂氏温度）；  ＣＤＳ（コード配列）；  ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）；  ＲＮＡ（リボ核酸）；  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０（一般に使用される実験用Ｅ．ｃｏｌｉ株であり、Ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ［ＣＧＳＣ］、Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，  ＣＴから入手可能）；ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）；  ＭＷＣＯ（分子量カットオフ）；  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド・ゲル電気泳動）；  Ｔ７ＲＮＡＰ（Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ）；  ＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）；  ＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル）；  ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）；  ＰＭＢＳ（ポリミキシンＢ硫酸）；  ＮＡＤＰＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート）；  ＧＩＤＨ（グルタメートデヒドロゲナーゼ）；  ＦＩＯＰＣ（陽性コントロールに対する倍数改善）；  ＬＢ（ルリアブロス）；  ＭｅＯＨ（メタノール）；  Ａｔｈｅｎｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ａｔｈｅｎｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ａｔｈｅｎｓ，  ＧＡ）；  ＮＥＢ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｉｐｓｗｉｃｈ，  ＭＡ）；  Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ（Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ，  Ｇｉｌｆｏｒｄ，  ＮＨ）；  ＰｒｏＳｐｅｃ（ＰｒｏＳｐｅｃ  Ｔａｎｙ  Ｔｅｃｈｎｏｇｅｎｅ，  Ｅａｓｔ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，  ＮＪ）；  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）；  Ｒａｍ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒａｍ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｉｎｃ．，  Ｙｏｎｋｅｒｓ，  ＮＹ）；  Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ．（Ｐａｌｌ，  Ｃｏｒｐ．，  Ｐｔ．  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  ＮＹ）；  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  Ｃｏｒｐ．，  Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ  ＭＡ）；  Ｄｉｆｃｏ（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  ＢＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｄｅｔｒｏｉｔ，  ＭＩ）；  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，  ＬＬＣ，  Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，  ＣＡ）；  Ｋｕｈｎｅｒ（Ａｄｏｌｆ  Ｋｕｈｎｅｒ，  ＡＧ，  Ｂａｓｅｌ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）；  Ａｘｙｇｅｎ（Ａｘｙｇｅｎ，  Ｉｎｃ．，  Ｕｎｉｏｎ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）；  Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．，  Ｔｏｒｏｎｔｏ，  Ｏｎｔａｒｉｏ，  Ｃａｎａｄａ）；  Ｃａｍｂｒｉｄｇ���  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，    Ｉｎｃ．，  Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ，  ＭＡ）；  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  ｐａｒｔ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｃｏｒｐ．，  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，  ＮＹ）、Ａｇｉｌｅｎｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，  ＣＡ）；  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ｐａｒｔ  ｏｆ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｗａｌｔｈａｍ，  ＭＡ）；  Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  ＮＧＳ（Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  Ｎｅｘｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）；  Ｌｉ−ＣＯＲ（Ｌｉ−ＣＯＲ，  Ｌｉｎｃｏｌｎ，  ＮＥ）；  ＵＶＰ（ＵＶＰ，  Ｕｐｌａｎｄ，  ＣＡ）；  Ｂｉｏｔｉｕｍ（Ｂｉｏｔｉｕｍ，  Ｉｎｃ．，  Ｆｒｅｍｏｎｔ，  ＣＡ）；  Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，  Ｉｎｃ．，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ）；  Ｍｅｇａｚｙｍｅ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｗｉｃｋｌｏｗ，  Ｉｒｅｌａｎｄ）；  Ｅｎｚｏ（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，  ＮＹ）；  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）；  Ｐｉｅｒｃｅ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（現在はＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの一部），  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  ＩＬ）；  ＬＩ−ＣＯＲ（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｌｉｎｃｏｌｎ，  ＮＥ）；  Ａｍｉｃｕｓ（Ａｍｉｃｕｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  Ｃｒａｎｂｕｒｙ，  ＮＪ）；  Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，  Ｉｎｃ．，  Ｔｏｒｒａｎｃｅ，  ＣＡ）；  Ｏｐｔｉｍａｌ（Ｏｐｔｉｍａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｂｅｌｍｏｎｔ，  ＣＡ）；ならびにＢｉｏ−Ｒａｄ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）。
【０１３０】
以下のポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、本発明における使用が見出される。いくつかの場合（以下で示されるとおり）、そのポリヌクレオチド配列の後に、そのコードされるポリペプチドが続く。
【実施例】
【０１３１】
実施例１
Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子獲得および発現ベクターの構築
野生型（ＷＴ）Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ酵素（配列番号２）は、バクテリオファージ  Ｔ７のゲノム（配列番号１）によってコードされる。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの６−ヒスチジンタグ化バージョン（配列番号４）をコードする合成遺伝子（配列番号３）を構築し、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ発現ベクターｐＣＫ１００９００ｉへとサブクローニングした（例えば、米国特許第７，６２９，１５７号および米国特許出願公開２０１６／０２４４７８７（ともに参考として援用される）を参照のこと）。これらのプラスミド構築物を、Ｗ３１１０に由来するＥ．ｃｏｌｉ株へと形質転換した。当業者によって一般に公知の指向性進化技術を、これらのプラスミドから遺伝子バリアントのライブラリーを生成するために使用した（例えば、米国特許第８，３８３，３４６号およびＷＯ  ２０１０／１４４１０３（これらはともに、参考として援用される）を参照のこと）。本明細書で記載される酵素バリアントにおける置換は、示されるように、６Ｈｉｓ標的化ＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ酵素（すなわち、配列番号４）またはそのバリアントを参照して示される。
【０１３２】
実施例２
ハイスループット（ＨＴＰ）でのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ発現および精製
この実施例では、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ発現および精製で行われる実験が記載される。
【０１３３】
Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼおよびバリアントのハイスループット（ＨＴＰ）増殖
形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ細胞を、１％  グルコースおよび３０μｇ／ｍｌ  クロラムフェニコールを含むＬＢアガープレート上にプレートすることによって選択した。３７℃で一晩インキュベートした後、コロニーを、１８０μｌ／ウェル  ＬＢ培地（１％  グルコースおよび３０μｇ／ｍｌ  クロラムフェニコールを補充）を満たした９６ウェル浅平底ＮＵＮＣＴＭ（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）プレートのウェルへと入れた。その培養物を、１８〜２０時間にわたって振盪機（２００ｒｐｍ、３０℃、および８５％  相対湿度；  Ｋｕｈｎｅｒ）において一晩増殖させた。一晩増殖サンプル（２０μＬ）を、３８０μＬのＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（３０μｇ／ｍｌ  クロラムフェニコールを補充）を満たしたＣｏｓｔａｒ  ９６ウェルディーププレートに移した。そのプレートを、１２０分間、振盪機（２５０ｒｐｍ、３０℃、および８５％  相対湿度；  Ｋｕｈｎｅｒ）において、ＯＤ６００が０．４〜０．８の間に達するまでインキュベートした。次いで、その細胞を、４０μＬの、滅菌水中１０ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導し、１８〜２０時間にわたって一晩、振盪機（２５０ｒｐｍ、３０℃、および８５％  相対湿度；  Ｋｕｈｎｅｒ）においてインキュベートした。その細胞をペレットにし（４０００ｒｐｍ×２０分間）、その上清を廃棄し、その細胞を、分析する前に−８０℃において凍結した。
【０１３４】
ＨＴＰペレットの溶解
細胞ペレットを、４００μＬの溶解緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１ｍｇ／ｍｌ  リゾチーム、および０．５ｍｇ／ｍｌ  ポリミキシンＢ硫酸）中に再懸濁し、その混合物を、１．５時間室温において撹拌した。次いで、溶解物をペレットにし（４０００ｒｐｍ×５分間）、その清澄にした上清を精製のためにとっておいた。
【０１３５】
粗製溶解物からのＴ７ＲＮＡＰのＨＴＰ精製
Ｔ７ＲＮＡＰを、清澄にしたＥ．ｃｏｌｉ溶解物から、Ｈｉｓ−−Ｓｅｌｅｃｔ（（登録商標）高キャパシティ（ＨＣ）ニッケルコーティングされたプレート（Ｓｉｇｍａ）を使用する金属−アフィニティークロマトグラフィーによって、製造業者の説明書に従って精製した。Ｈｉｓ−Ｓｅｌｅｃｔ（登録商標）プレートを、１ウェルあたり合計８００μｌの洗浄緩衝液（５０ｍＭ  リン酸ナトリウム  ｐＨ７．５、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  イミダゾール、０．１％  ｖ／ｖ  ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）試薬[Ｓｉｇｍａ]）で平衡化した。次いで、Ｔ７ＲＮＡＰを含む２００μｌのＨＴＰ溶解物と２００μｌの洗浄緩衝液を混合し、プレートに装填し、１分間、２０００相対遠心力（ｒｃｆ）および４℃において遠心分離した。そのプレートを、６００μｌの洗浄緩衝液／ウェルで２回洗浄した（各洗浄に関して、３０００ｒｃｆおよび４℃において３分間の遠心分離）。酵素サンプルを、４℃において、３０００ｒｃｆで１分間の遠心分離によって、２００μｌ  溶離緩衝液（５０ｍＭ  リン酸ナトリウム  ｐＨ７．５、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２５０ｍＭ  イミダゾール、０．１％  ｖ／ｖ  ＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０試薬）を添加して溶離した。
【０１３６】
溶離液を、ＺｅｂａＴＭ  Ｓｐｉｎ脱塩プレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して緩衝液交換した。簡潔には、プレートを、１ウェルあたり３７５μｌの２×Ｔ７ＲＮＡＰ貯蔵緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ  ｐＨ７．９、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２％  ｗ／ｖ  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）で２回平衡化し、２分間、１１００×ｇにおいて４℃で遠心分離した。脱塩プレートに、１００μｌのＨｉｓ−Ｓｅｌｅｃｔ（登録商標）プレートサンプル溶離液を装填し、２分間、１１００×ｇにおいて４℃で遠心分離した。その脱塩プレートからの溶離液を保持し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  ｖ／ｖ  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および５０％  グリセロール（ｖ／ｖ）の最終貯蔵緩衝液濃度のために等容積のグリセロールと混合した。
【０１３７】
精製した調製物中のＲＮａｓｅ夾雑の非存在を、ＲＮａｓｅ  Ａｌｅｒｔアッセイ（ＩＤＴ，  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して確認した。Ｔ７ＲＮＡＰサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、大部分のサンプルに関して検出可能な夾雑バンドを示さなかった。
【０１３８】
ＨＴＰ精製Ｔ７ＲＮＡＰを使用するインビトロ転写反応のために、精製ポリメラーゼを、全反応容積のうちの１０％（振盪フラスコ培養物からの酵素に関しては５％）の最終濃度に添加した。
【０１３９】
実施例３
Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの振盪フラスコ発現および精製
この実施例では、Ｔ７ＲＮＡＰの振盪フラスコ発現および精製を含む実験を記載する。
【０１４０】
振盪フラスコ発現
実施例２に記載されるように増殖させた、選択されたＨＴＰ培養物を、１％  グルコースおよび３０μｇ／ｍｌ  クロラムフェニコールを有するＬＢアガープレート上にプレートし、３７℃で一晩増殖させた。各培養物からの単一コロニーを、１％  グルコースおよび３０μｇ／ｍｌ  クロラムフェニコールを有する６ｍｌのＬＢブロスに移した。その培養物を、１８時間、３０℃、２５０ｒｐｍにおいて増殖させ、３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを有する２５０ｍｌのＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈへとおよそ１：１０の希釈で０．２の最終ＯＤ６００へと継代した。その培養物をおよそ３時間、３０℃、２５０ｒｐｍにおいて、０．６〜０．８のＯＤ６００へとインキュベートし、次いで、１ｍＭの最終濃度においてＩＰＴＧを添加して誘導した。その誘導した培養物を、２０時間、３０℃、２５０ｒｐｍにおいてインキュベートした。そのインキュベーション期間の後、その培養物を４０００ｒｐｍ×１０分間で遠心分離した。その培養上清を廃棄し、そのペレットを、３５ｍｌ  溶解緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．５、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０、１０ｍＭ  イミダゾール）中に再懸濁した。この細胞懸濁物を、アイスバスの中で冷却し、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ細胞破砕機（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｍ‐１１０Ｌ）を使用して溶解した。その粗製溶解物を、遠心分離（１６，０００ｒｐｍで６０分間、４℃）によってペレットにし、次いで、その上清を、０．２μｍ  ＰＥＳ膜を通じて濾過して、その溶解物をさらに清澄にした。
【０１４１】
振盪フラスコ溶解物からのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼの精製
Ｔ７ＲＮＡＰ溶解物を、ＡＫＴＡ  Ｓｔａｒｔ精製システムおよびＡＣ  Ｓｔｅｐ  ＨｉＦ設定（実行パラメーターは、以下に提供される）を使用する５ｍｌ  ＨｉｓＴｒａｐ  ＦＦカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して精製した。そのＳＦ洗浄緩衝液を、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム  ｐＨ７．５、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  ｖ／ｖ  ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）試薬（Ｓｉｇｍａ）、および２５ｍＭ  イミダゾールから構成した。そのＳＦ溶離緩衝液を、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム  ｐＨ７．５、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  ｖ／ｖ  ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）試薬（Ｓｉｇｍａ）、および３００ｍＭ  イミダゾールから構成した。
【表２．１】
2020530266.tif 000003
【０１４２】
単一の５つの最も濃縮された３ｍｌ  画分を、ＵＶ吸収（Ａ２８０）によって同定し、２×  Ｔ７ＲＮＡＰ貯蔵緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ８．０、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２％  ｖ／ｖ  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）中で一晩、１０Ｋ  Ｓｌｉｄｅ−Ａ−ＬｙｚｅｒＴＭ透析カセット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）中で一晩、緩衝液交換のために、１６時間、続いて、第２の緩衝液交換のために２４時間、透析した。等容積のグリセロールを、その透析した物質に添加した。その調製物中の酵素濃度は、ゲルデンシトメトリーおよび２８０ｎｍでの吸収によって測定した。
【０１４３】
実施例４
転写反応
転写反応を、キャップアナログ  α，γ−ビス  （Ｎ７−メチルグアノシン）トリホスフェート（「ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）ｍ７Ｇ」、「キャップされたＧＴＰ」、または「キャップ」ともいわれる）で組み立てた（Ｇｒｕｄｚｉｅｎ  ｅｔ．  ａｌ．，  ＲＮＡ，  １０：１４７９−８７  ［２００４］を参照のこと）。操作された転写ＤＮＡテンプレートＧｌｍＳ−１６Ａ（配列番号５）は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ  ＧｌｍＳリボスイッチのコード配列（配列番号６）に連結されたＴ７ＲＮＡＰプロモーター配列を含む。そのリガンド、グルコサミン−６−ホスフェートで誘導すると、ＧｌｍＳリボスイッチは自己切断し、１６マーＲＮＡヌクレオチド（配列番号７）をその転写物の５’末端から放出し、これは、キャップ構造またはキャップされていない５’ホスフェートを含む。この小さな１６マーＲＮＡオリゴヌクレオチド切断産物は、キャップされた種およびキャップされていない種を区別するために使用した、イオン化およびＬＣ−ＭＳによる分析を施すことができた。
【０１４４】
反応物（３０ｕｌ）を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ７．９、３０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＤＴＴ、６ｍＭ  ＡＴＰ、６ｍＭ  ＣＴＰ、６ｍＭ  ＵＴＰ、４．８ｍＭ  ＧＴＰ、１．２ｍＭ  ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）ｍ７Ｇ、５０ｎｇ／μｌ  ＧｌｍＳ−１６Ａ転写テンプレート、１Ｕ／μｌ  ＲＮａｓｉｎインヒビター、および６．４ｍＭ  グルコサミン−６−ホスフェートの最終濃度で組み立てた。ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）ｍ７ＧおよびＧＴＰの合計を、６ｍＭで保持した。グルコサミン−６−ホスフェートを反応の開始時に含め、リボスイッチの切断を４時間のインビトロ転写の間に進めさせた。ＨＴＰスクリーニングのために、反応物を等しい（３０μｌ）容積の４０ｍＭ  ＥＤＴＡでクエンチした。ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）ｍ７ＧおよびGTPの合計を６ｍＭで維持した。
【０１４５】
実施例５
ＬＣ−ＭＳ活性アッセイ
この実施例はより短いキャップされた５’−およびキャップされていない５’  よりホスフェート切断生成物の分析のために、、Ｔｈｅｒｍｏ  ＬＴＱ  ＭＳシステムを使用してより小さなＲＮＡフラグメントの分離のために開発されたＬＣ−ＭＳ法を記載する。
【０１４６】
その７ｍｅＧ−キャップされたおよび５’トリホスフェート非キャップ１６マー切断生成物（配列番号７）を、質量分析法に関してオリゴヌクレオチドの分離のために一般に使用されるＣ１８カラムおよびＨＦＩＰ移動相を使用して、逆相イオン対ＨＰＬＣ法で反応物およびより高いＭＷ  ＲＮＡからクロマトグラフィーで分離した（図１を参照のこと）（表５．１を参照のこと）。
【表５．１】
2020530266.tif 000004
【０１４７】
キャップされたおよびキャップされていない１６マー切断生成物に関するベースピーク抽出を、多数の負に荷電したイオンおよび金属付加物を含め、各種に関して７つのイオンを使用して行った。これらの７つのイオンのピーク強度を使用して、そのキャップされたおよびキャップされていない１６マー切断生成物の各々のシグナルを導出した。これらのイオンは、多数の荷電した状態ならびにナトリウム付加物およびカリウム付加物を含んだ（表５．２を参照のこと）。全てのイオンを、その予測された値の１質量単位内で観察した。
【表５．２】
2020530266.tif 000005
【０１４８】
ＷＴ  Ｔ７ＲＮＡＰに対するキャッピング性能（すなわち、「親に対する倍数改善」、または「ＦＩＯＰ」）を、各サンプルに関するキャップされた／キャップされていないピーク強度比を、各プレート上に存在するＷＴ親コントロールに関して計算された比で除算することによって計算した（ｎ＝６〜１０）。そのＦＩＯＰ値を使用して、ＷＴ  Ｔ７ＲＮＡＰまたはライブラリー親（これをあらゆるプレート上にコントロールとして含めた）に対するバリアント性能をランク付けした。この相対的定量法を使用することによって、そのキャップされた種とキャップされていない種との間で本質的であったイオン化における差異、ならびにＨＦＩＰ移動相のバッチおよびＥＤＴＡ濃度によって引き起こされるシグナルのバリエーションを相殺することは可能であった。インビトロ転写反応を、以下の表に示されるとおりの反応時間およびｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）ｍ７Ｇ濃度で、実施例４で記載されるように行った。表５．３、表５．４、および表５．５は、３〜６つの複製の平均活性改善を報告する。表５．６は、複製された情報が利用可能なバリアントに関する平均活性改善を報告する。
【表５．３−１】
2020530266.tif 000006
【表５．３−２】
2020530266.tif 000007
【表５．４−１】
2020530266.tif 000008
【表５．４−２】
2020530266.tif 000009
【０１４９】
バリアント８５は、ＬＣ−ＭＳアッセイにおいてキャップされていないｍＲＮＡの検出不能レベルを有することが注記された。
【表５．５】
2020530266.tif 000010
【表５．６−１】
2020530266.tif 000011
【表５．６−２】
2020530266.tif 000012
【表５．６−３】
2020530266.tif 000013
【表５．６−４】
2020530266.tif 000014
【０１５０】
実施例６
ＲＮＡ収量の決定
インビトロ転写反応を、ルシフェラーゼテンプレート（配列番号１０）を使用することを除いて、実施例４に記載されるとおりに行った。インビトロ転写反応からのｍＲＮＡ収量を、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ  ＲＮＡ  Ａｓｓａｙキット（広範囲、Ｑ−３３１４０，  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）に関する製造業者のプロトコルに従って行った。ｍＲＮＡ存在量を、アッセイキットに伴って提供されるｍＲＮＡ標準に関して導出される標準曲線を使用して計算した。
【表６．１】
2020530266.tif 000015
【０１５１】
実施例７
Ｔ７ＲＮＡＰバリアント転写忠実度の決定
ポリメラーゼ忠実度を、バリアントポリメラーゼから転写されたｍＲＮＡに由来する多数のＲＴ−ＰＣＲクローンを直接配列決定することに基づいて測定した。インビトロ転写反応を、０．５ｍＭ  ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）ｍ７Ｇ、５．５ｍＭ  ＧＴＰを使用し、グルコサミン−６−ホスフェートを省略して、実施例４に記載されるとおりに行った。ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）ｍ７Ｇを含めることは、プロセス関連条件下で、ＷＴおよびバリアントポリメラーゼのエラー率へのこのキャップアナログ（あるとすれば）の寄与の測定を可能にした。１．７ｋｂ  ルシフェラーゼテンプレートＤＮＡ（配列番号８）は、全長ｍＲＮＡ転写物を生成するために、野生型およびバリアントＴ７  ＲＮＡＰを使用する転写のためのＤＮＡテンプレートとして働いた。ＲＮＡを、Ｚｙｍｏ  ＲＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ａｎｄ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ−２５キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して単離し、残留ＤＮＡを、ＤＮＡ非含有ＤＮＡａｓｅ  Ｉキット（Ａｍｂｉｏｎ／  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）での２連続処理によって、ＲＮＡサンプルから除去した。サンプルを、オリゴ−（ｄＴ）２５プライマー（配列番号４０）を使用してＡｃｃｕｐｒｉｍｅ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ）で逆転写し、そのルシフェラーゼテンプレート上のポリ（Ａ）テールにアニールした。次いで、そのＲＴ反応を、ＨＦ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、ＰＣＲを介してＰＨＵＳＩＯＮ（登録商標）高忠実度ＤＮＡポリメラーゼを使用して増幅して、１６７５−ｂｐアンプリコンを、ルシフェラーゼコード配列にアニールする遺伝子特異的プライマー（配列番号１２、配列番号１３）を使用して生成した。増幅したフラグメントを、ＢｇｌＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化し、クローニングベクターへとライゲーションし、形質転換して、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて単一クローンを生成した。
【０１５２】
個々のクローンを拾い上げ、多重バーコード化ストラテジーを使用して、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  ＰＧＭプラットフォーム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）で配列決定した。バーコード読み取りをデコンボリューションし、次いで、個々のクローンの配列を、配列番号１２と配列番号１３との間の１６３２−ｂｐ領域のその予測されたテンプレート配列に対して組み立てた。小さな挿入、欠失（すなわち、インデル）、および一ヌクレオチド多型を含む変異を一致させた。大部分の観察された変異は置換であったが、挿入および欠失も観察された。配列決定されたｍＲＮＡ由来クローンの塩基ごとの変異の総数を計算し、表７．１および表７．２に報告する。文献に基づいて塩基ごとの変異のその予測された全体的割合は、Ｔ７ＲＮＡＰ（１×１０−４）（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ３９：１１５７１−１１５８０  ［２０００］）、Ａｃｃｕｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素（６×１０−５）（Ａｇｉｌｅｎｔ；製品文献を参照のこと）、およびＰｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（１．２×１０−５）（２０サイクル；ＮＥＢ製品文献を参照のこと）に起因するエラーの合計、または全体で１．７２×１０−４である。大部分のバリアントポリメラーゼは、０．５ｍＭ  ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）ｍ７Ｇの存在下であっても、Ｔ７ＲＮＡＰの報告された文献値に近い全体的なエラー率を示した。
【０１５３】
片側（右側）二項検定を使用して、実験における実際のエラー率が、表７．１および表７．２において示される別個の実験において、Ｔ７ＲＮＡＰ−ＷＴの観察された全体的なエラー率に等しい場合、配列決定された塩基数を与えたその観察されたエラー数（またはこれより多い）をサンプリングする確率を計算した。所定のバリアントの忠実度は、０．０５より大きいｐ値に関してこのアッセイにおいてＷＴ  Ｔ７ＲＮＡＰから区別不能と見做された。表７．１では、観察されたエラー率結果列において、「＋」は１．７＊１０−４未満であり、「−」は１．７＊１０−４超である一方で、二項検定結果カラムでは、「＋」はｐ＞０．０５であり、「−」は０＜０．０５である。表７．２では、観察されたエラー率結果列において、「＋」は１．５×１０−４未満であり、「−」は１．５×１０−４超である一方で、二項検定結果列において、「＋」はｐ＞０．０５であり「−」はｐ＜０．０５である。
【表７．１】
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【表７．２】
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【０１５４】
本発明は、その具体的実施形態を参照して記載されてきた一方で、種々の変更がなされ得、均等物は、特定の状況、材料、組成物、プロセス、プロセスの工程に適合させるために置換され得、それによって、本発明の利益は、特許請求されるものの範囲から逸脱することなく達成され得る。
【０１５５】
米国での全ての目的のために、本出願において引用された各々のおよびあらゆる刊行物および特許文献は、各々のこのような刊行物または文献が具体的にかつ個々に本明細書に参考として援用されることが示されたかのように、本明細書に参考として援用される。刊行物および特許文献の引用は、任意のこのような文書が、関連する先行技術であるという指摘として意図されず、その内容または日付に関しての承認を構成しない。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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