(57)【要約】ヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される三次元微粒子構造の製造方法であって、ａ．微粒子サブ構造が中に包埋されたヒドロゲルマトリックスの層を、i．１以上の振動発生器に振動的に連結される１以上の内面部分を有する容器内に、ヒドロゲルマトリックス前駆体の層中の微粒子の懸濁液を提供し、ii．ヒドロゲルマトリックス前駆体の層中の微粒子の懸濁液を、ヒドロゲルマトリクス前駆体内に定在音波を引き起こすように振動発生器に振動的に連結された容器の少なくとも内面から発する振動にさらして、それにより、ヒドロゲル前駆体の層内で微粒子を空間的に分配して微粒子サブ構造とし、iii．ヒドロゲル前駆体を、微粒子サブ構造体が中に包埋されたヒドロゲルマトリックスの層を形成するように固化させることによって形成する工程；ｂ．別個の容器内で工程ａ．を実施することによって微粒子サブ構造が中に包埋されたヒドロゲルマトリックスのさらなる層を形成し、このさらなる層を、微粒子サブ構造が中に包埋された、先に形成されたヒドロゲルマトリックスの層の上に堆積させる工程；及びｃ．三次元微粒子構造を形成するように、工程ｂ．を少なくとも２回以上繰り返す工程を含む方法。【選択図】図２ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程ａ．を含む、ヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される三次元微粒子構造の製造方法。
ａ．  次のｉ〜iiiによって、微粒子サブ構造もしくは微粒子構造が中に包埋されたヒドロゲルマトリックスの層を形成する工程：
i．  １以上の振動発生器に振動的に連結された１以上の内面部分を有する容器内に、ヒドロゲルマトリックス前駆体の層中の微粒子の懸濁液を提供し；
ii．  前記ヒドロゲルマトリックス前駆体の層中の前記微粒子の懸濁液を、前記ヒドロゲルマトリクス前駆体内に定在音波を引き起こすように前記振動発生器に振動的に連結された前記容器の１以上の内面部分から発する振動にさらして、それにより、ヒドロゲル前駆体の前記層内で前記微粒子を空間的に分配して微粒子サブ構造もしくは微粒子構造とし；
iii．  前記ヒドロゲル前駆体を、微粒子サブ構造もしくは微粒子構造が中に包埋されたヒドロゲルマトリックスの層を形成するように固化させる。
【請求項２】
以下の工程ｂ．及びｃ．をさらに含む、請求項１に記載のヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される三次元微粒子構造の製造方法：
ｂ．  工程ａ．を実施することによって微粒子サブ構造が中に包埋されたヒドロゲルマトリックスのさらなる層を形成し、前記さらなる層を、特に、ヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される三次元微粒子構造を形成するように、微粒子サブ構造が中に包埋された、先に形成されたヒドロゲルマトリックスの層の上に堆積させる工程、及び；
ｃ．  最終的に、ヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される三次元微粒子構造を形成するように、工程ｂ．を少なくとも１回、２回、３回又はそれより多い回数繰り返す工程。
【請求項３】
工程ａ．のiii．において、前記ヒドロゲルマトリックス前駆体は、該ヒドロゲルマトリックス前駆体を部分的に架橋することによって固化される、請求項１又は２に記載のヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される三次元微粒子構造の製造方法。
【請求項４】
工程ａ．のiii．において、前記ヒドロゲルマトリックス前駆体は、架橋剤、好ましくは、放射線又は温度等の物理的刺激によって、あるいは、酵素、ｐＨ変化又はイオン濃度変化等の化学的刺激によって、直接的又は間接的に活性化され得る架橋剤を用いて、前記ヒドロゲルマトリックス前駆体を部分的に架橋することによって固化される、請求項１〜３のいずれかに記載のヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される三次元微粒子構造の製造方法。
【請求項５】
前記ヒドロゲルマトリックスは、ゼラチンメタクリレート又はヒアルロン酸メタクリレート、コラーゲン、フィブリン／トロンビン、マトリゲル、アガロース、ヒアルロン酸チラミン、ゼラチンチラミン、アルギン酸を含む、請求項１〜４のいずれかに記載のヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される三次元微粒子構造の製造方法。
【請求項６】
前記微粒子は無機微粒子であり、及び／又は、前記微粒子は有機微粒子であり、及び／又は、前記微粒子は細胞、細胞の凝集体、又は、細胞スフェロイド、特に、該細胞は、骨芽細胞、線維芽細胞、角化細胞、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）、軟骨細胞、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ｈＵＶＥＣ）等の動物細胞又はヒト細胞であり、及び／又は、前記微粒子は２以上の異なる種類の有機微粒子である、請求項１〜５のいずれかに記載のヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される三次元微粒子構造の製造方法。
【請求項７】
前記無機微粒子は、インプラントでのバイオミネラリゼーションをサポートすることができ、例えば、ハイドロキシアパタイト微粒子やリン酸カルシウム微粒子等であり、及び／又は、前記有機微粒子は、医療用インプラントでの足場を形成することができ、例えばポリ乳酸やポリヒドロキシ酪酸等である、請求項６に記載のヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される三次元微粒子構造の製造方法。
【請求項８】
１つの層の前記微粒子サブ構造もしくは微粒子構造は、別の層の微粒子サブ構造もしくは微粒子構造と、同一の粒子分布、類似の粒子分布、又は、好ましくはこれとは異なる粒子分布を有するように形成される、請求項１〜７のいずれかに記載のヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される三次元微粒子構造の製造方法。
【請求項９】
前記微粒子の懸濁液は２以上の異なる種類の微粒子の懸濁液であり、前記層の微粒子サブ構造もしくは微粒子構造が、前記２以上の異なる種類の微粒子で形成され、前記２以上の異なる種類の微粒子は前記層内に同一の、類似の、又は好ましくは異なる粒子分布を有する、請求項１〜８のいずれかに記載のヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される三次元微粒子構造の製造方法。
【請求項１０】
前記層の微粒子サブ構造もしくは微粒子構造は、前記ヒドロゲルマトリックス前駆体の層中の微粒子の懸濁液を単一振動パルスにさらすことによって形成される、請求項１〜９のいずれかに記載のヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される三次元微粒子構造の製造方法。
【請求項１１】
前記ヒドロゲルマトリックス前駆体の層内で前記微粒子を空間的に分配して微粒子サブ構造とするために、前記ヒドロゲルマトリックス前駆体内に引き起こされる定在音波を、微粒子サブ構造が中に包埋されたヒドロゲルマトリックスの層を形成する工程の間で変更する、請求項１〜１０のいずれかに記載のヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される三次元微粒子構造の製造方法。
【請求項１２】
微粒子サブ構造が中に包埋されたヒドロゲルマトリックスの層を形成する前記工程のうち少なくとも１つで、前記微粒子の濃度を、微粒子サブ構造が中に包埋されたヒドロゲルマトリックスの層を形成する工程間で変更する、即ち、増減する、請求項１〜１１のいずれかに記載のヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される三次元微粒子構造の製造方法。
【請求項１３】
微粒子サブ構造が中に包埋されたヒドロゲルマトリックスの層を形成する前記工程のうち少なくとも１つで、前記微粒子の濃度の種類を、微粒子サブ構造が中に包埋されたヒドロゲルマトリックスの層を形成する工程間で変更する、即ち、増減する、請求項１〜１２のいずれかに記載のヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される三次元微粒子構造の製造方法。
【請求項１４】
微粒子サブ構造が中に包埋されたヒドロゲルマトリックスの層を形成する前記工程のうち少なくとも１つで、前記ヒドロゲルマトリックスの種類を、微粒子サブ構造が中に包埋されたヒドロゲルマトリックスの層を形成する工程間で変更する、即ち、増減する、請求項１〜１３のいずれかに記載のヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される三次元微粒子構造の製造方法。
【請求項１５】
以下の工程ｄ．をさらに含む、請求項１〜１４のいずれかに記載のヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される三次元微粒子構造の製造方法：
ｄ．  微粒子サブ構造が中に包埋されたヒドロゲルマトリックスの堆積させた層を、ヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される三次元微粒子構造を形成するように架橋させる工程。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれかに記載の方法によって得られる、ヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される三次元微粒子構造。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される三次元微粒子構造を得るための付加製造法（additive manufacturing）に関連する。
【背景技術】
【０００２】
生細胞を含む三次元構築物のための最先端の製造技術は、非常に特殊なバイオインクの開発を必要とするか、又は、足場上での単一細胞の操作/堆積に基づいているが、これは、大きな構築物又は多数の構築物の製造が必要な場合、非常に長いプロセスとなる。
【０００３】
音波は、架橋され得る液体培地内での細胞の位置決めに有用であることが知られており、これにより生細胞及び／又は生物活性粒子を含む概ね二次元の構築物を非常に速く得ることができる。音波にさらされた液体培地内での細胞の位置決めはほぼ瞬時であるため、架橋可能な培地内で生細胞及び／又は生物活性粒子を固定するために必要な時間は、主に架橋可能な培地が固化するのに必要な時間によって決まる。しかしながら、定在音波を用いる場合、細胞の分配は液体層の表面上の節と腹の位置によって左右されるため、細胞を凡そ二次元的に方向づけることしかできない。一例として、例えば球体又は円錐体など、ｚ方向、すなわち液体培地の表面に垂直な方向に沿って変化する構造を形成することは不可能である。そのような構造は、例えば３Ｄプリンティング技術によって形成することもできるが、これらの技術には、比較的時間がかかり、特別なバイオインクと３Ｄプリンティング装置を必要とするという欠点がある。さらに、プリンティング装置のノズルを通してバイオインクを押し出す際に細胞が受けるせん断力は、細胞の生存率を低下させる。
【０００４】
特許文献１は、多層パターン化セルアセンブリを作成する方法に関し、細胞を含む細胞懸濁液溶液が液体キャリアチャンバに装填される。細胞懸濁液溶液中の細胞が重力でチャンバの底に沈むと、いわゆるファラデー波の形の流体力学的抗力が振動発生器によって加えられ、その結果、沈下した細胞が特定の方向へと方向づけられる。
【０００５】
特許文献２は、足場を用いずに組織再生を提供するシステム及び方法を提供する。このシステムは、組織再生プロセスを増進させるのに適した流体を入れた容器と、容器の一端の音響トランスデューサと、容器の反対端のリフレクタとを含む。このトランスデューサは、容器内に定在音響場を作り出して流体内の細胞を複数の構造物に閉じ込める音響信号を提供する。
【０００６】
特許文献３は、液体を含むチャネル内に、細胞等の対象物の多層凝集体を形成する方法に関し、この凝集体は、各領域内において前記対象物に定在波等の音響波を印加することによって形成される。
【０００７】
特許文献４は、対象物のロボット操作のためのシステム及び方法を提供し、ここでは、例えば振動などによりエネルギーを伝えて攪拌した液体中に定在波を形成して、定在波の節に沿って対象物を整列させる。定在波の位置は、容器の大きさや形状を変えてエネルギー入力を制御することにより決定できる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＷＯ  ２０１６／０６９４９３  Ａ２
【特許文献２】ＷＯ  ２０１５／１１２３４３  Ａ１
【特許文献３】ＷＯ  ２０１３／１１８０５３  Ａ１
【特許文献４】ＵＳ  ２００４／０１３７１６３  Ａ１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、体積の大きい構築物を時間効率良く且つ十分な複雑さで得ることができ、細胞生存率が維持される付加製造法が必要となる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記の課題は、本発明において、それほど複雑でない装置を用いて複雑な三次元構造を作製することができ、同時にそのような複雑な三次元構造を提供するのに必要な時間を短縮することのできる方法を提供することにより解決された。
【００１１】
本発明の目的は、以下の工程ａ．を含む、ヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される三次元微粒子構造の製造方法を提供することである：
ａ．次のi）〜iii）によって、微粒子サブ構造が中に包埋されたヒドロゲルマトリックスの層を形成する工程：
ｉ）１以上の振動発生器に振動的に連結された１以上の内面部分を有する容器内に、ヒドロゲルマトリックス前駆体の層中の微粒子の懸濁液を提供し；
ii）前記ヒドロゲルマトリックス前駆体の層中の前記微粒子の懸濁液を、前記ヒドロゲルマトリックス前駆体内に定在音波を引き起こすように前記振動発生器に振動的に連結された容器の少なくとも内面部分から発する振動にさらし、それにより、前記ヒドロゲルマトリックス前駆体の層内で微粒子を空間的に分配して微粒子サブ構造もしくは微粒子構造とし；
iii）前記ヒドロゲルマトリックス前駆体を、微粒子サブ構造もしくは微粒子構造が中に包埋されたヒドロゲルマトリックスの層を形成するように固化させる。
このようにして、本発明は、定在音波を用いて、ヒドロゲルマトリックスの単一層内に、２つ以上の異なる種類の微粒子を異なるように分配させ得る方法を提供する。
【００１２】
好ましい実施形態において、本発明による方法は、以下の工程ｂ、及び／又は最後に工程ｃ．をさらに含む：
ｂ．工程ａ．を別個の容器内で実施することにより、微粒子サブ構造が中に包埋されたヒドロゲルマトリックスのさらなる層を形成し、該さらなる層を、特に、ヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される三次元微粒子構造を形成するように、微粒子サブ構造が中に包埋された、先に形成されたヒドロゲルマトリックスの層の上に堆積させる工程。
ｃ．工程ｂ．を、ヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される三次元微粒子構造を形成するように、少なくとも１回、２回、３回又はそれより多い回数繰り返す工程。
【００１３】
本発明の別の目的は、以下の工程a．、ｂ．及びｃ．を含む、ヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される三次元微粒子構造の製造方法を提供することである：
ａ．次のi）〜iii）によって、微粒子サブ構造が中に包埋されたヒドロゲルマトリックスの層を形成する工程：
ｉ）１以上の振動発生器に振動的に連結された１以上の内面部分を有する容器内に、ヒドロゲルマトリックス前駆体の層中の微粒子の懸濁液を提供し；
ii）ヒドロゲルマトリックス前駆体の層中の前記微粒子の懸濁液を、前記ヒドロゲルマトリックス前駆体内に定在音波を引き起こすように振動発生器に振動的に連結される容器の少なくとも内面部分から発する振動にさらし、それにより、前記ヒドロゲルマトリックス前駆体の層内で微粒子を空間的に分配して微粒子サブ構造とすること。
iii）前記ヒドロゲルマトリックス前駆体を、微粒子サブ構造が中に包埋されたヒドロゲルマトリックスの層を形成するように固化させる。
ｂ．工程ａ．を別個の容器内で実施することにより、微粒子サブ構造が中に包埋されたヒドロゲルマトリックスのさらなる層を形成し、該さらなる層を、微粒子サブ構造が中に包埋された、先に形成されたヒドロゲルマトリックスの層の上に堆積させる工程。
ｃ．工程ｂ．を、ヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される三次元微粒子構造を形成するように、少なくとも１回、２回、３回又はそれより多い回数繰り返す工程。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
本発明の好ましい実施形態を、図面を参照して以下に説明するが、これらは本発明の好ましい実施形態を説明するためのものであり、本発明を限定するためのものではない。
【００１５】
【図１】図１は、ヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される微粒子構造の写真（a、b、c）を示し、これは微粒子の分配のシミュレーション予測を裏付ける。対応するシミュレーション予測の斜視図（d、e、f）と上からの図（g、h、i）を示す。
【図２】図２は、定在音波を生成する装置とその各種部分（ａ、ｂ、ｃ）を示す。図２ｄ〜２ｉに、周波数１５８Ｈｚ、振幅約６Ｖを用いて得られたパターン形成ｈＭＳＣの蛍光顕微鏡画像を示す。図２ｄから分かるように、得られたパターンは同心円を形成する。図２ｅ〜２ｉは、より高倍率の蛍光顕微鏡画像を示し、これらの図では、核がＤＡＰＩで染色され、アクチン細胞骨格がファロイジンで染色されている。
【図３】図３は、ＧｅｌＭＡにＴＣＰ微粒子が丸みを帯びた碁盤目状に包埋されたＧｅｌＭＡ／ＴＣＰ微粒子懸濁液（ａ、ｂ）、ＧｅｌＭＡに酸化鉄ナノ粒子が包埋された連続で均質な層を示すＧｅｌＭＡ／酸化鉄ナノ粒子懸濁液（ｃ）、ＧｅｌＭＡに同心円状にＴＣＰ微粒子が包埋されたＧｅｌＭＡ／ＴＣＰ微粒子懸濁液（ｆ，ｈ）、並びに、各層の重ね合わせ（ｄ、ｉ）を示す。
【図４】図４は、三層のＧｅｌＭＡヒドロゲルの重ね合わせを説明する概略図を示す。
【図５】図５は、得られた３つの試料の画像を示し、直径が３２〜７５μｍのＴＣＰ粒子（白色粒子）と直径が３７〜７４μｍの樹脂粒子（灰色）が異なるように分配されている。円形のカラの空間が黒く現れている。
【図６】図６は、得られた試料の蛍光画像を示し、直径が２５０〜５００μｍのＴＣＰ粒子（黒色粒子）は疑似円形を形成し、疑似円形のｈＭＳＣｓスフェロイドは凝集している（灰色粒子）。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の目的は、以下の工程ａ．を含む、ヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される三次元微粒子構造の製造方法を提供することである：
ａ．次のi）〜iii）によって、微粒子サブ構造が中に包埋されたヒドロゲルマトリックスの層を形成する工程：
ｉ）１以上の振動発生器に振動的に連結された１以上の内面部分を有する容器内に、ヒドロゲルマトリックス前駆体の層中の微粒子の懸濁液、好ましくは、２以上の異なる種類の微粒子の懸濁液を、提供し；
ii）前記ヒドロゲルマトリックス前駆体の層中の微粒子の懸濁液、好ましくは２以上の異なる種類の微粒子の懸濁液を、前記ヒドロゲルマトリックス前駆体内に定在音波を引き起こすように前記振動発生器に振動的に連結された容器の少なくとも内面部分から発する振動にさらして、それにより、前記ヒドロゲルマトリックス前駆体の層内で、微粒子を空間的に分配して微粒子サブ構造もしくは微粒子構造とする、好ましくは、２以上の異なる種類の微粒子を空間的に異なるように分配して微粒子サブ構造もしくは微粒子構造とし；
iii）前記ヒドロゲルマトリックス前駆体を、微粒子サブ構造もしくは微粒子構造が中に包埋されたヒドロゲルマトリックスの層を形成するように固化させる。
【００１７】
好ましい実施形態では、本発明による方法は、以下の工程ｂ、及び／又は最後に工程ｃをさらに含む：
ｂ．工程ａ．を別個の容器内で実施することにより、微粒子サブ構造が中に包埋されたヒドロゲルマトリックスのさらなる層を形成し、該さらなる層を、特に、ヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される三次元微粒子構造を形成するように、微粒子サブ構造が中に包埋された、先に形成されたヒドロゲルマトリックスの層の上に堆積させる工程。
ｃ．工程ｂ．を、ヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される三次元微粒子構造を形成するように、少なくとも１回、２回、３回又はそれより多い回数繰り返す工程。
【００１８】
本発明の別の目的は、以下の工程a．、ｂ．及びｃ．を含む、ヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される三次元微粒子構造の製造のための交互積層法（layer-by-layer process）を提供することである：
ａ．次のi）〜iii）によって、微粒子サブ構造が中に包埋されたヒドロゲルマトリックスの層を形成する工程：
ｉ）１以上の振動発生器に振動的に連結された１以上の内面部分を有する容器内に、ヒドロゲルマトリックス前駆体の層中の微粒子の懸濁液を提供し；
ii）前記ヒドロゲルマトリックス前駆体の層中の前記微粒子の懸濁液を、ヒドロゲルマトリックス前駆体内に定在音波を引き起こすように前記振動発生器に振動的に連結された前記容器の少なくとも内面部分から発する振動にさらして、それにより、ヒドロゲルマトリックス前駆体の層内で微粒子を空間的に分配して微粒子サブ構造とし；
iii）前記ヒドロゲルマトリックス前駆体を、微粒子サブ構造が中に包埋されたヒドロゲルマトリックスの層を形成するように固化させる。
ｂ．工程ａ．を別個の容器内で実施することにより、微粒子サブ構造が中に包埋されたヒドロゲルマトリックスのさらなる層を形成し、該さらなる層を、微粒子サブ構造が中に包埋された、先に形成されたヒドロゲルマトリックスの層の上に堆積させる工程。
ｃ．工程ｂ．を、ヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される三次元微粒子構造を形成するように、少なくとも１回、２回、３回又はそれより多い回数繰り返す工程。
【００１９】
本発明による、ヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される三次元微粒子構造の製造方法において、前記三次元微粒子構造は、該方法がｚ方向、即ち、ヒドロゲル前駆体の表面に垂直な方向における該構造の分解能を除いて（これは、もちろん、ヒドロゲルマトリックス前駆体の個々の層の厚さに依存する）、三次元微粒子構造に関して制限がないので、任意の形状を有することができる。層の厚さは通常マイクロメートル範囲、例えば５０〜５００マイクロメートルであるが、本発明によるヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される三次元微粒子構造の製造方法においては、最大で１０又は１５ｍｍでさえあり得、これにより、体積の大きいヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される複雑な三次元微粒子構造の高速生産が可能となる。ヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される三次元微粒子構造の例としては、球体、閉じた円筒、円錐などを挙げることができる。本発明によるヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される三次元微粒子構造の製造方法に適する容器は、容器内のヒドロゲルマトリックス前駆体に振動発生器からの振動を効果的に伝達できる限り、いかなる形状であってもよいし、いかなる材料からなっていてもよい。容器の例としては、例えば、ポリマー又はガラスのペトリ皿が挙げられる。
【００２０】
本発明によるヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される三次元微粒子構造の製造方法において、該微粒子構造は、ヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される。微粒子構造は、その全体が１種類の微粒子から形成されてもよいし、又は異なる種類の微粒子から形成されてもよいと理解される。さらに、ヒドロゲルマトリックスの各層における微粒子の濃度や微粒子の種類をそれぞれ選択して、ヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される所望の全体的な三次元微粒子構造に至ることは、当業者が想到する範囲内であるだろうと理解される。さらに、これらの考慮事項は、各層のヒドロゲルマトリックスの種類にも同様に適用され、本方法の各層形成の繰り返しにおいて変えることができると理解される。
【００２１】
本発明によるヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される三次元微粒子構造の製造方法において、該三次元微粒子構造は、微粒子サブ構造が中に包埋されたヒドロゲルマトリックスを複数層形成し、これらを、ヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される三次元微粒子構造を形成するように重ね合わせることによって得られる。
【００２２】
ヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される三次元微粒子構造を形成する層は、以下によって形成される：
１以上の振動発生器に振動的に連結された１以上の内面部分を有する容器内に、ヒドロゲルマトリックス前駆体の層中の微粒子の懸濁液を提供すること；
前記ヒドロゲルマトリックス前駆体の層中の微粒子の懸濁液を、ヒドロゲルマトリックス前駆体内に定在音波を引き起こすように振動発生器に振動的に連結された容器の少なくとも内面部分から発される振動にさらして、それにより、前記ヒドロゲルマトリックス前駆体の層内で微粒子を空間的に分配して微粒子サブ構造もしくは微粒子構造とすること；及び
前記ヒドロゲルマトリックス前駆体を、微粒子サブ構造もしくは微粒子構造が中に包埋されたヒドロゲルマトリックスの層を形成するように固化させること。
【００２３】
容器内のヒドロゲルマトリックス前駆体の層中の微粒子の懸濁液は、予め、ヒドロゲルマトリックス前駆体中の微粒子の懸濁液を調製して、そのうちの所定量を容器に投与することによって提供することができる。ヒドロゲルマトリックス前駆体中の微粒子の懸濁液は、微粒子とヒドロゲルマトリックス前駆体の混合物を、好ましくはヒドロゲルマトリックス前駆体内に微粒子の等方性の空間分布が得られるように、攪拌することによって調製してもよい。微粒子が細胞の場合、加えて、細胞を分配するのに定在音波を用いることによって生じる生存能力の保存性を存分に生かすように、細胞の生存能力が減少しない方法で、混合物を攪拌することが好ましい。定在音波を生み出すために、ヒドロゲルマトリックス前駆体中の微粒子の懸濁液を入れる容器は、１以上の振動発生器に振動的に連結された１以上の内面部分を有する。これにより、定在音波の発生をもたらす振動を、ヒドロゲルマトリックス前駆体中の微粒子の懸濁液に伝えることができ、ヒドロゲルマトリックス前駆体内で微粒子を分配することができる。一旦定在音波が形成されると、微粒子は、定在音波の節領域下に集まり、腹領域に微粒子がないように空間的に分離する。一旦微粒子が空間的に分離してしまうと、ヒドロゲルマトリックス前駆体は、微粒子サブ構造もしくは微粒子構造が中に包埋されたヒドロゲルマトリックスの層を形成するように固化される。ヒドロゲルマトリックス前駆体の層を固化することによって、微粒子は空間的に固定されて、ヒドロゲルマトリックスの連続相に包埋される。そして、微粒子サブ構造が中に包埋されたヒドロゲルマトリックスの次の層を形成するプロセスを、ヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される最終的な三次元微粒子構造が得られるまで、複数回繰り返すことができる。従って、ヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される最終的な三次元微粒子構造は、基本的には、予め形成されたヒドロゲルマトリックスの層に包埋された微粒子サブ構造の層を積み重ねることによって形成される。
【００２４】
本発明によるヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される三次元微粒子構造の製造方法の好ましい実施形態では、ヒドロゲル前駆体を部分的に架橋することにより、ヒドロゲル前駆体を固化させる。「ヒドロゲル前駆体を部分的に架橋する」とは、実質的には、各層中のヒドロゲル前駆体を、微粒子を包埋する固化したヒドロゲル前駆体の連続した一層をもたらすように、層の大部分にわたって、部分的且つ均一に架橋させることと理解される。ヒドロゲルマトリックス前駆体を部分的にのみ架橋することにより、微粒子サブ構造が中に包埋されたヒドロゲルマトリックスの固化層は、その架橋能力の一部を保持する。従って、微粒子サブ構造が中に包埋されたヒドロゲルマトリックスの後の層が、部分的に架橋された先の層の上に堆積されると、先の層と後の層はそれらの間で架橋することができる。このようにして、ヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される三次元微粒子構造が形成され、これは、物体を構成する層が互いに結合され、互いに対して横方向に滑ることができないため、機械的特性が向上する。本発明によるヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される三次元微粒子構造の製造方法の好ましい実施形態において、このように、ヒドロゲル前駆体は、架橋剤を放射線によって活性化できる場合には、ヒドロゲル前駆体を完全に架橋するのに必要な放射線量の６０％、７０％、又は８０％、あるいは６０％〜８０％にさらすことにより、ヒドロゲル前駆体を部分的に架橋することによって固化させる。本発明によるヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される三次元微粒子構造の製造方法のより好ましい実施形態では、ヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される三次元微粒子構造を形成する、微粒子サブ構造が中に包埋されたヒドロゲルマトリックスの部分的に架橋された層は、追加の工程において完全に架橋され、より良好な機械的特性を有し、微粒子サブ構造が中に包埋されたヒドロゲルマトリックスの個々の層が互いと接着している、ヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される三次元微粒子構造を産出する。本発明の文脈において、「固化する」とは、物質が自らを支えられることを意味する。
【００２５】
本発明によるヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される三次元微粒子構造の製造方法の好ましい実施形態において、ヒドロゲル前駆体は、ヒドロゲル前駆体を部分的に架橋することによって固化させられ、前記部分的な架橋は、活性化されると即座に架橋しない架橋剤を用いることによって達成される。微粒子サブ構造が中に包埋されたヒドロゲルマトリックスの先の層の架橋が完了する前に、この先の層の上に、微粒子サブ構造が中に包埋されたヒドロゲルマトリックスのさらなる層が堆積されると、層の結合が高まり、機械的耐性のある、ヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される三次元微粒子構造をもたらす。
【００２６】
本発明によるヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される三次元微粒子構造の製造方法の好ましい実施形態において、ヒドロゲル前駆体は、架橋剤、好ましくは、放射線又は温度変化等の物理的刺激や、酵素、ｐＨ変化又はイオン濃度変化等の化学的刺激によって活性化することのできる架橋剤を用いて、ヒドロゲル前駆体を部分的に架橋することにより固化される。放射線又は温度変化等の物理的刺激によって活性化することのできる架橋剤を用いる場合は、ヒドロゲル層の温度を制御する加熱／冷却システムや、ヒドロゲル層を照射できるＨｇ真空ランプ又はＬＥＤランプを用いることができる。化学的刺激によって活性化することのできる架橋剤を用いる場合は、この化学的刺激を、ヒドロゲル層にスプレーガンで与えることができる。
【００２７】
本発明によるヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される三次元微粒子構造の製造方法の好ましい実施形態において、ヒドロゲルマトリックスは、ゼラチンメタクリレート又はヒアルロン酸メタクリレートを含む。あるいは、ヒドロゲルマトリックスは、ゼラチン、コラーゲン、フィブリン／トロンビン、マトリゲル、アガロース、ヒアルロン酸チラミン（hyaluronan tyramine）、ゼラチンチラミン、アルギン酸、又は生物医学的応用に使用するのに好適である当技術分野で公知の他のヒドロゲルをさらに含んでもよい。
【００２８】
本発明によるヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される三次元微粒子構造の製造方法の好ましい実施形態において、微粒子は無機微粒子であり、詳細には、インプラントでのバイオミネラリゼーションをサポートすることのできる無機微粒子であって、例えば、ハイドロキシアパタイト微粒子やリン酸カルシウムである。
【００２９】
本発明によるヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される三次元微粒子構造の製造方法の好ましい実施形態において、微粒子は有機微粒子、詳細には、医療用インプラントでの足場を形成することのできる有機微粒子、例えばポリ乳酸やポリヒドロキシ酪酸である。
【００３０】
本発明によるヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される三次元微粒子構造の製造方法の好ましい実施形態において、微粒子は細胞、又は細胞の凝集体、又は細胞スフェロイドである。詳細には、該細胞は、骨芽細胞、線維芽細胞、角化細胞、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）、軟骨細胞、又はヒト臍帯静脈内皮細胞（ｈＵＶＥＣ）等の動物細胞であってよい。
【００３１】
本発明によるヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される三次元微粒子構造の製造方法の好ましい実施形態において、微粒子は２つ以上の異なる種類の有機微粒子である。本発明の文脈において、異なる種類の微粒子とは、概して、同じ定在音波にさらされたときに空間的に異なるように分配される微粒子の種類であると理解される。微粒子の種類の違いとしては、例えば、密度、形状（geometries）、化学組成、粒子径、細胞種、及びこれらを組み合わせたものに関する違いであってもよい。
【００３２】
本発明によるヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される三次元微粒子構造の製造方法の好ましい実施形態において、無機微粒子は、インプラントでのバイオミネラリゼーションをサポートすることができ、例えば、ハイドロキシアパタイト微粒子やリン酸カルシウム微粒子等であり、及び／又は、有機微粒子は、医療用インプラントでの足場を形成することができ、例えばポリ乳酸やポリヒドロキシ酪酸等である。
【００３３】
本発明によるヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される三次元微粒子構造の製造方法の好ましい実施形態において、１つの層の微粒子サブ構造もしくは微粒子構造は、別の層の微粒子サブ構造もしくは微粒子構造と同一の粒子分布、類似の粒子分布、又は、好ましくはこれとは異なる粒子分布を有するように形成される。
【００３４】
本発明によるヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される三次元微粒子構造の製造方法の好ましい実施形態において、微粒子の懸濁液は、２以上の異なる種類の微粒子の懸濁液であり、層の微粒子サブ構造もしくは微粒子構造は、これら２以上の異なる種類の微粒子によって形成され、これら２以上の異なる種類の微粒子は、その層内に同一の、類似の、又は好ましくは異なる粒子分布を有する。
【００３５】
本発明によるヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される三次元微粒子構造の製造方法の好ましい実施形態において、１つの層の微粒子サブ構造もしくは微粒子構造は、ヒドロゲルマトリックス前駆体の層中の微粒子の懸濁液を単一振動パルスにさらすことにより形成される。一般に、本発明の文脈においては、パルスの持続時間は、５〜６０秒、より好ましくは５〜３０秒の範囲であってよい。本発明の文脈において有益な好適な周波数範囲は、約１０Ｈｚ〜８００Ｈｚの周波数である。
【００３６】
本発明によるヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される三次元微粒子構造の製造方法の好ましい実施形態では、微粒子サブ構造が中に包埋されたヒドロゲルマトリックスの層を形成する工程のうち少なくとも１つにおいて、先の工程のいずれか１つに関して微粒子の濃度を増減させる。
【００３７】
本発明によるヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される三次元微粒子構造の製造方法の好ましい実施形態では、微粒子サブ構造が中に包埋されたヒドロゲルマトリックスの層を形成する工程のうち少なくとも１つにおいて、先の工程のいずれか１つに関して微粒子の種類を増減させる。
【００３８】
本発明によるヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される三次元微粒子構造の製造方法の好ましい実施形態では、微粒子サブ構造が中に包埋されたヒドロゲルマトリックスの層を形成する工程のうち少なくとも１つにおいて、先の工程のいずれか１つに関して細胞の種類を変える。例えば、皮膚インプラントを製造しようとする場合には、皮膚インプラントの下部層では、真皮に対応する細胞が使用でき、角化細胞が利用でき、皮膚インプラントの下部層では、表皮に対応する細胞が使用でき、線維芽細胞が利用できる。例えば、骨軟骨インプラントを製造しようとする場合には、骨軟骨インプラントの下部層では、骨領域に対応する細胞が使用でき、骨芽細胞が利用でき、骨軟骨インプラントの上部層では、軟骨領域に対応する細胞が使用でき、軟骨細胞が利用できる。
【００３９】
本発明によるヒドロゲルマトリックスで形成された物体に包埋される三次元微粒子構造の製造方法の好ましい実施形態において、微粒子サブ構造が中に包埋されたヒドロゲルマトリックスの層を形成する工程のうち少なくとも１つにおいて、先の工程のいずれか１つに関してヒドロゲルマトリックスの種類を変える。例えば、皮膚インプラントを製造しようとする場合には、皮膚インプラントの下部層では、真皮に対応するヒドロゲルマトリックスが使用でき、コラーゲンを含むヒドロゲルマトリックスが利用でき、皮膚インプラントの下部層では、表皮に対応するヒドロゲルマトリックスが使用でき、コラーゲン及びケラチンを含むヒドロゲルマトリックスが利用できる。例えば、骨軟骨インプラントを製造しようとする場合には、骨軟骨インプラントの下部層では骨領域に対応するヒドロゲルマトリックスが使用でき、ゼラチンメタクリレート、ゼラチンチラミンで構成されるヒドロゲルマトリックスが利用でき、骨軟骨インプラントの上部層では、軟骨領域に対応するヒドロゲルマトリックスが使用でき、ヒアルロン酸チラミンヒドロゲルが利用できる。
【００４０】
本発明は、医療用インプラントを得るための、並びに、疾病及び／又は薬物反応のインビトロ研究に用いることのできる構築物、特に比較的体積の大きいこういった構築物を得るための迅速で便利な方法を提供することができる。
【実施例】
【００４１】
実施例１
ブタ皮膚由来のＡ型ゼラチン（シグマアルドリッチ社）１０ｇを、６０℃でダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）に溶かして１０ｗｔ％均一溶液を作製した。この溶液に、無水メタクリル酸（ＭＡ）１．４ｍｌを攪拌しながら滴下した。こうして得た混合物を５０℃で３時間反応させた。結果として生じた混合物を、追加の温めたＤＰＢＳで５倍に希釈し、１２−１４ｋＤａカットオフ透析チューブ（ＶＷＲ  サイエンティフィック社）を用いて５０℃にて６日間脱イオン化水に対して透析し、未反応の無水メタクリル酸と付加的な副産物を取り除いた。透析後、ＧｅｌＭＡ溶液をろ過し、−８０℃で凍結させ、これに続けて凍結乾燥させて、更なる使用まで−２０℃で保存した。ゼラチンのメタクリル化パーセントをＮＭＲで評価し、約５０％であることが分かった。
【００４２】
ＧｅｌＭＡ溶液中の細胞及び／又は無機微粒子の懸濁液を得るために、１０％ｗ／ｖ溶液となるようにＧｅｌＭＡをＤＭＥＭ（又はＰＢＳ）に溶かし、これにＩＲＧＡＣＵＲＥ００．３％ｗ／ｖを添加した。懸濁液の所望の組成に応じて、細胞及び／又は無機微粒子をゆっくりと添加し静かに混合して、細胞及び／又は無機微粒子の懸濁液を生成した。
【００４３】
例示の実施例として、三層構築物を、微粒子パターン及び／又は中に懸濁させる微粒子が異なる以下の三つの層を用いて製造した：
層１（図３ａ，ｂ）
周波数５４Ｈｚ、振幅４Ｖの振動運動を、角型ペトリ皿（寸法：３０ｍｍ×３０ｍｍ×５ｍｍ）に入れたＧｅｌＭＡ／ＴＣＰ微粒子懸濁液２ｍｌに約１０〜１５秒間与えることによって、ＧｅｌＭＡに包埋された丸形の格子状ＴＣＰ微粒子（図３ａ，ｂ）を得た。ＧｅｌＭＡ／ＴＣＰ微粒子懸濁液は、ＴＣＰ微粒子３５０ｍｇを３６℃でＧｅｌＭＡ２ｍｌと静かに混ぜることによって得た。ＧｅｌＭＡの約８０％を部分的に架橋するために、この層をＵＶ光源で照射した（５ｍＷ／ｃｍ２  ４０秒間）。
層２（図３ｃ）
角型ペトリ皿（寸法：３０ｍｍ×３０ｍｍ×５ｍｍ）に入れたＧｅｌＭＡ／鉄酸化物ナノ粒子懸濁液２ｍｌに振動運動を与えずに、ＧｅｌＭＡに包埋された鉄酸化物ナノ粒子の連続且つ均質な層（図３ｃ）を得た。ＧｅｌＭＡ／鉄酸化物ナノ粒子懸濁液は、鉄酸化物ナノ粒子５ｍｌを３６℃でＧｅｌＭＡ２ｍｌと静かに混ぜることによって得た。ＧｅｌＭＡの約８０％を部分的に架橋するために、この層をＵＶ光源で照射した（５ｍＷ／ｃｍ２  ４０秒間）。
層３（図３ｆ，ｈ）
周波数７７Ｈｚ、振幅６Ｖの振動運動を、円型ペトリ皿（径：４０ｍｍ、厚み：５ｍｍ）に入れたＧｅｌＭＡ／ＴＣＰ微粒子懸濁液２ｍｌに約１０〜１５秒間与えることによって、ＧｅｌＭＡに包埋された同心環状のＴＣＰ微粒子（図３ｆ，ｈ）を得た。ＧｅｌＭＡ／ＴＣＰ微粒子懸濁液は、ＴＣＰ微粒子３５０ｍｇを３６℃でＧｅｌＭＡ２ｍｌと静かに混ぜることによって得た。ＧｅｌＭＡの約８０％を部分的に架橋するために、この層をＵＶ光源で照射した（５ｍＷ／ｃｍ２  ４０秒間）。
【００４４】
これら三層のそれぞれを部分的に架橋した後、これらの層を互いの上に積層させ（下部：層１；中間部：層２；上部：層３）、これらの層を完全に架橋させて互いに接着させるために、ＵＶ光源を用いて、積層した層を照射するＵＶ光源から発するさらなる架橋放射に曝した（５ｍＷ／ｃｍ２  ２０秒間）。堆積物の概略を図３に示す。
【００４５】
実施例２
ＧｅｌＭＡ５％中のＴＣＰ及び樹脂
２つの異なる種類の粒子を異なるサブ構造に分配した。径が３２〜７５μｍの範囲であるＴＣＰ粒子２０ｍｇと、径が３７〜７４μｍの範囲である樹脂粒子２０ｇ（Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗ  Ｘ８、シグマアルドリッチ社）をＧｅｌＭＡ５％溶液１ｍｌに懸濁させ、角型皿に装填し、その後６０Ｈｚの振動にさらして固化させた。この実験を三度行った。図５に結果として生じた試料を示す。
【００４６】
実施例３
２つの異なる種類の粒子を異なるサブ構造に分配した。フィブリンゲル２ｍｌに懸濁させたｈＭＳＣスフェロイドを調製して、径が２５０〜５００μｍの範囲のＴＣＰ粒子７０ｍｇを装填した角型皿に添加した。スフェロイドとＴＣＰ粒子を一緒に約１０〜１５秒間パターン形成し、フィブリンゲルを架橋させた。生じた物体を培養した。図６に、ｈＭＳＣスフェロイドとＴＰＣ粒子の二元的な分布を見ることができる。
【図１ａ】
2020531025.tif 000003
【図１ｂ】
2020531025.tif 000004
【図１ｃ】
2020531025.tif 000005
【図１ｄ】
2020531025.tif 000006
【図１ｅ】
2020531025.tif 000007
【図１ｆ】
2020531025.tif 000008
【図１ｇ】
2020531025.tif 000009
【図１ｈ】
2020531025.tif 000010
【図１ｉ】
2020531025.tif 000011
【図２ａ】
2020531025.tif 000012
【図２ｂ】
2020531025.tif 000013
【図２ｃ】
2020531025.tif 000014
【図２ｄ】
2020531025.tif 000015
【図２ｅ】
2020531025.tif 000016
【図２ｆ】
2020531025.tif 000017
【図２ｇ】
2020531025.tif 000018
【図２ｈ】
2020531025.tif 000019
【図２ｉ】
2020531025.tif 000020
【図３】
2020531025.tif 000021
【図４】
2020531025.tif 000022
【図５】
2020531025.tif 000023
【図６】
2020531025.tif 000024
【国際調査報告】
2020531025.tif 000025
2020531025.tif 000026
2020531025.tif 000027