(57)【要約】  本発明は、特に脂肪吸引中に得られた組織の組織サンプルからの単離細胞、特に脂肪細胞の組成物の調製を目的とした使用の機械的断片化のための装置に関し、前記調製は、装置内で歯使用を機械的に断片化する少なくとも１つのステップを含み、前記装置は電動支持体（３）及び容器（１）を備え、電動支持体（３）は結合部材に固定された回転子を有するモータを備え、容器（１）は、軸回転に設定できる回転シャフト（９）を内部に備え、及び回転シャフト（９）が回転するときに容器（１）の内部を掃くことができる半径方向アーム（１０、１２）を備え、電動支持体（３）及び容器（１）は、電動支持体（３）上で容器（１）を不動化することを可能にする相補的な固定手段（１１）を備え、結合部材及び回転シャフト（９）は、モータ回転子が回転するときに回転シャフト（９）の軸回転を可能にするような方法で構成される。本発明によれば、半径方向アーム（１０、１２）は、剛性羽根型アーム（１０）及び特にナイロン又は金属から作られた可撓性フィラメント型アーム（１２）の２つのタイプである。方法により本発明は完全になる。【選択図】1
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
特に脂肪吸引中に得られた組織サンプルからの単離細胞、特に脂肪細胞及び／又は脂肪組織に含まれる細胞の組成物の調製を目的とした組織の機械的断片化のための装置であって、前記調製は、前記装置内で前記組織を機械的に断片化する少なくとも１つのステップを含み、前記装置は電動支持体（３）及び容器（１）を備え、前記電動支持体（３）は結合部材と一体の回転子を有するモータを備え、前記容器（１）は、軸方向に回転できる回転シャフト（９）を内部に含み、及び前記回転シャフト（９）が回転するときに前記容器（１）の内部を掃くことができる半径方向アーム（１０、１２）を含み、前記電動支持体（３）及び前記容器（１）は、前記電動支持体（３）上で前記容器（１）を不動化するための相補的に着脱可能な固定手段（１１）を含み、前記結合部材及び前記回転シャフト（９）は、前記モータ回転子が回転するときに前記回転シャフト（９）の軸回転を可能にするような方法で構成される装置において、
前記半径方向アーム（１０、１２）が、羽根型アーム（１０）及びフィラメント型アーム（１２）の２つのタイプであることを特徴とする、装置。
【請求項２】
前記羽根型アーム（１０）が剛性であり、前記フィラメント型アーム（１２）が可撓性であることを特徴とする、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記回転シャフト（９）が垂直であり、前記容器（１）が円筒形又は真っ直ぐな円錐台形であり、下部底壁（８）、上壁（５）、及び円筒形又は円錐台形の立ち上がり側壁（４）を有し、前記回転シャフト（９）が中央にあり、前記側壁（４）と同軸であること、及び、前記羽根型アーム（１０）が前記回転シャフト（９）の下部に配置され、前記フィラメント型アーム（１２）が前記羽根型アーム（１０）より上に配置されることを特徴とする、請求項１又は２に記載の装置。
【請求項４】
各羽根型アーム（１０）が少なくとも１つの面取りされた縦方向縁部を有し、前記少なくとも１つの面取りされた縁部が、前記回転シャフト（９）が回転するときに前記容器の内側を最初に掃く前記アームの側面にあることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項５】
各フィラメント型アーム（１２）がナイロン又は金属ワイヤからなることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項６】
前記ナイロン又は金属ワイヤの直径が０．５ｍｍ〜３ｍｍの間に含まれることを特徴とする、請求項５に記載の装置。
【請求項７】
前記容器（１）の前記円筒形又は円錐台形の立ち上がり側壁（４）が、内側にぎざぎざを含むことを特徴とする、請求項３〜６のいずれか一項に記載の装置。
【請求項８】
前記容器（１）が液体不透過性であること、及び、前記上壁（５）が２つの開口部を含み、第１の開口部（１７）はフィルタ（１５）で閉じられ、第２の開口部（２０）は自己密閉式隔壁で閉じられ、前記自己密閉式隔壁は、穴あけチューブで穴をあけることができ、前記穴あけチューブを取り除くと完全に不透過性になるような方法で自動的に密閉することを特徴とする、請求項３〜７のいずれか一項に記載の装置。
【請求項９】
代替案として、前記自己密閉式隔壁は自己閉鎖式バルブ（１６）又はフラップであることを特徴とする、請求項８に記載の装置。
【請求項１０】
特に脂肪吸引中に取得された組織サンプルから単離細胞、特に脂肪細胞及び／又は脂肪組織に含まれる細胞の組成物を調製するための方法であって、前記調製は、装置内での前記組織の機械的断片化の少なくとも１つのステップを含み、前記装置は電動支持体（３）及び容器（１）を備え、前記電動支持体（３）は、結合部材と一体の回転子を有するモータを備え、前記容器（１）は、軸方向に回転可能な回転シャフト（９）を内側に含み、及び前記回転シャフト（９）が回転するときに前記容器の内部を掃くことができる半径方向アーム（１０、１２）を含み、前記電動支持体（３）及び前記容器（１）は、前記電動支持体（３）上で前記容器（１）を不動化するための相補的に着脱可能な固定手段（１１）を含み、前記結合部材及び前記回転シャフト（９）は、前記モータ回転子が回転するときに前記回転シャフト（９）の軸回転を可能にするような方法で構成される方法において、
請求項１〜９のいずれか一項に記載の装置が、前記組織の断片化のために使用され、抽出された組織が前記容器（１）に導入され、前記モータの電源がオンにされ、前記結合部材が前記回転シャフト（９）を回転できるように前記容器（１）は前記電動支持体（３）に前もって固定され、前記モータを停止した後、前記容器（１）の内容物の少なくとも一部が収集されることを特徴とする、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、細胞組成物を調製するための装置の分野に関する。より具体的には、単離された細胞の組成物の調製を目的とする組織の機械的断片化のための装置、及びその装置を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
さまざまな目的のために、人間又は動物の体の特定の部分への生細胞の注入を実行することが知られている。これらの細胞は、例えば痛みの再生又は対症療法により、損傷した組織又は器官に作用できる特性を有する。
【０００３】
そのような細胞を取得するプロセスが、特に脂肪細胞について開発されてきた。一般に、そのような脂肪細胞を取得するこれらの方法は、組織から細胞を放出するために、プロテアーゼのカクテル（コラゲナーゼ）による組織の細胞外マトリックスの酵素消化に基づく共通のステップを有する。
【０００４】
公知の方法の中で、脂肪組織に含まれる特定の細胞を精製するための方法及びツールの両方を記載する文献国際公開第２００７／０３４１１５  Ａ１号パンフレットに言及することができる。
【０００５】
文献国際公開第２０１５／０３５２２１  Ａ１号パンフレット、米国特許出願公開第２００５／１３９７０４  Ａ１号明細書及び国際公開第９５／０９０５１  Ａ１号パンフレットに記載される方法も知られている。
【０００６】
この酵素学的方法によるかかる細胞の放出は効果的であるが、このタイプの酵素学的方法は規制上の制約を受け、多大な費用がかかる。
【０００７】
これらの制約を回避するために、純粋に機械的な方法を使用することができ、それは酵素を使用せずに脂肪細胞を精製することを可能にする。既知の機械的な方法のほとんどは、組織のマトリックス構造から細胞を放出するために機械的作用を使用する。これらの操作を可能にする装置は、クラスＩＩ医療装置とみなされる。
【０００８】
組織サンプルからの細胞調製の分野において、２０１４年のＭｉｃｒｏＡｉｒｅからのＳｔｒｏｍａＣｅｌｌ（登録商標）システムを挙げることができ、これは脂肪吸引液１ミリリットルあたり１４０，０００個の細胞で脂肪組織から細胞を機械的に単離するための半自動化方法として記載されている。同年のＭ．Ｒａｐｉｓｉｏのチームによる発表は、６分間の瓶内での振動単離後に遠心分離を行い、脂肪吸引液１ミリリットルあたり１２５，０００個の細胞、したがって５％の前駆細胞の収率で細胞を集めることを記載している（Ａｒｏｎｏｗｉｔｚら、ＳｐｒｉｎｇｅｒＰｌｕｓ  ２０１５）。
【０００９】
その後、脂肪組織に由来する細胞の単離を主張するいくつかの装置がまとまった。２１０５年にＯｂｅｒｂａｕｅｒにより１０を超えるシステムがリストされ（Ｏｂｅｒｂａｕｅｒら、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ、２０１５）、最も知られているのがＰｕｒｅＧｒａｆｔ（Ｃｙｔｏｒｉ）、Ｆａｓｔｅｍ（Ｃｏｒｉｏｓ  Ｓｏｃ  Ｃｏｏｐ）、Ｒｅｖｏｌｖｅ／ＧＩＤ  ７００（ＬｉｆｅＣｅｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ／ＧＩＤ  Ｇｒｏｕｐ  Ｉｎｃ）、Ｌｉｐｏｇｅｍｓ（Ｌｉｐｏｇｅｍｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓ．ｐ．Ａ．）、ＳｔｒｏｍａＣｅｌｌ（ＭｉｃｒｏＡｉｒｅ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＬＬＣ）及びＭｙＳｔｅｍ（ＭｙＳｔｅｍ  ＬＬＣ）である。２０１５年、ＣｉｃｉｏｎｅのチームはＭｙＳｔｅｍ  ＥＶＯ技術による細胞単離について記載し（Ｃｉｃｉｏｎｅら、ＰＲＳ  ２０１５）、Ｄｏｍｅｎｉｓのチームは２つの酵素消化プロトコルによるＦａｓｔｅｍ技術の比較研究を実施した（Ｄｏｍｅｎｉｓら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ＆Ｔｈｅｒａｐｙ、２０１５）。
【００１０】
翌年、Ｌｉｐｏｇｅｍｓ技術が報告され、この技術は閉鎖型システムで球体を使用して脂肪組織を手動で微小断片化する。Ｔｒｅｍｏｌａｄａのチームの発表（Ｔｒｅｍｏｌａｄａら、Ｃｕｒｒ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ、２０１６）は、形成外科、一般外科、整形外科、さらには顎顔面外科への適用においても、世界中でこの方法によって治療された７０００を超える患者をすでに主張している。
【００１１】
２０１６年、Ｃｏｎｄｅ−Ｇｒｅｅｎのチームは、脂肪組織からの細胞の機械的抽出について評価を行った。研究は主にインビトロのままであり、同時に遠心分離、攪拌（手動又は電気的）、及び渦を使用して細胞を単離する（Ｃｏｎｄｅ−Ｇｒｅｅｎ  ＰＲＳ  ２０１６）。
【００１２】
最後に、シリンジ間シャッフリングによる脂肪細胞溶解に含まれる、ナノファットという名前で２０１３年にＴｏｎｎａｒｄによって説明された乳化技術（Ｔｏｎｎａｒｄら、ＰＲＳ、２０１３）は、間質画分から細胞を、特に多能性細胞を抽出する方法と同じくみなされる（Ｂａｙｎａｒｄら、ＰＲＳ、２０１６）。ナノファットプロトコルはその後、Ｔｕｌｉｐ  Ｍｅｄｉｃａｌから販売されている。
【００１３】
この分野の文献には、次のような多くの記事が含まれる：
−Ｔｏｎｎａｒｄら、ＰＲＳ、２０１３、ナノファットグラフティング：基礎研究及び臨床的利用
−Ａｒｏｎｏｗｉｔｚら、ＳｐｒｉｎｇｅｒＰｌｕｓ、２０１５、脂肪組織からの間質血管画分細胞の機械的単離と酵素的単離
−Ｏｂｅｒｂａｕｅｒら、細胞再生、２０１５、脂肪組織由来細胞の酵素的及び非酵素的単離システム：最先端技術
−Ｄｏｍｅｎｉｓら、幹細胞研究及び治療、２０１５、脂肪組織由来幹細胞：標準及び３つの市販の細胞支援リポトランスファー技術のインビトロ及びインビボ分析
−Ｃｉｃｉｏｎｅら、ＰＲＳ、２０１５、脂肪吸引液の流体部分の精製を可能にする閉鎖型装置のインビトロ実証
−Ｔｒｅｍｏｌａｄａら、Ｃｕｒｒ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ、２０１６、脂肪組織及び間葉系幹細胞：最先端技術及びＬｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）技術開発
−Ｃｏｎｄｅ−Ｇｒｅｅｎら、ＰＲＳ、２０１６、脂肪由来間質血管画分の機械的単離への移行：来たるべき技術の評価
−Ｂａｎｙａｒｄら、ＰＲＳ、２０１６、機械的せん断後の間質血管画分の表現型分析によりストレス誘発性前駆細胞集団が明らかになる
−Ｃｈａｐｐｕｔら、ＰＲＳ、２０１６、機械的に単離された間質血管画分は有効で有用なコラゲナーゼフリーの代替技術を提供する：比較研究
−Ｖａｎ  Ｄｏｎｇｅｎら、ＪＴＥＲＭ、２０１７、再生目的のための臨床グレード間質血管画分の単離のための術中手順の比較：系統的評価
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本文書を読むと明らかになる最先端技術及びその他の上記の欠点を改善するために、本発明は、抽出した組織から、特に組織のせん断によって、細胞を調製するための機械的方法の実施を可能にする特定の構造のミキサーを提案する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
より詳細には、本発明によれば、特に脂肪吸引中に得られた、組織サンプルからの、単離細胞、特に脂肪細胞及び／又は脂肪組織に含まれる細胞の組成物の調製を目的とした組織の機械的断片化のための装置が提案され、前記調製は、装置内で組織を機械的に断片化する少なくとも１つのステップを含み、前記装置は、電動支持体と容器とを備え、電動支持体は結合部材と一体の回転子を有するモータを備え、容器は、軸方向に回転できる回転シャフトを内部に含み、及び回転シャフトの回転中に容器の内部を掃くことができる半径方向アームを含み、電動支持体及び容器は、電動支持体上で容器を不動化するための相補的に着脱可能な固定手段を含み、結合部材及び回転シャフトは、モータ回転子が回転するときに回転シャフトの軸回転を可能にするような方法で構成される。
【００１６】
本発明によれば、半径方向アームは、羽根型アームとフィラメント型アームの２つのタイプである。
【００１７】
個別に又はすべての技術的に可能な組み合わせに従って取り上げられる本発明による装置の他の非限定的かつ有利な特徴は以下のものである：
−容器は金属製である、
−容器はプラスチック材料から作られる、
−プラスチック材料は高分子である、
−容器は半透明である、
−容器は透明である、
−結合部材により、回転シャフトをモータ回転子に着脱可能に及び回転式に結合することが可能になる、
−容器は液体不透過性である、
−容器は２つの開口部を含み、第１の開口部はフィルタで閉じられ、第２の開口部は、中空の針又はトロカール又はカニューレで穴をあけることができ、針又はトロカール又はカニューレを取り除くと気体、液体、粒子及び細胞に対して不透過性であるように自動的に密閉する自己密閉式隔壁で閉じられる、
−自己密閉式隔壁はシリコーンバルブである、
−第２の開口部は、取り外し可能なプラグ又はキャップによって外側に対してさらに閉じられる、
−代替として、自己密閉式隔壁は自己閉鎖式バルブ又はフラップである、
−回転シャフトの少なくとも一部は金属製である、
−回転シャフトの少なくとも一部はプラスチック材料から作られる、
−回転シャフトは金属製である、
−回転シャフトはプラスチック材料から作られる、
−回転シャフトは金属及びプラスチック材料から作られる、
−羽根型アームはプラスチック材料又は金属から作られる、
−フィラメント型アームはプラスチック材料、特にナイロン又は等価物から作られ、
−フィラメント型アームは金属製である、
−羽根型アームは実質的に真っ直ぐな半径方向の延在部を有する、
−羽根型アームは湾曲した半径方向延在部を有する、
−羽根型アームの少なくとも１つは、その半径方向延在部に実質的に垂直な平面内に延びる少なくとも１つの隆起を含む、
−羽根型アームは、円形、楕円形、正方形、長方形、多角形、紡錘形、Ｔ字形の断面の中から選択された横方向断面を有する、
−羽根型アームは、直線、曲線、らせん断面の中から選択された縦方向断面を有する、
−フィラメント型アームは、円形、楕円形、正方形、長方形、多角形の断面の中から選択された横方向断面を有する、
−羽根型アームは剛性であり、フィラメント型アームは可撓性である、
−少なくとも１つの羽根型アームセグメントは可撓性である、
−羽根型アームの少なくとも一部は回転シャフトに関節接合される、
−羽根型アームとフィラメント型アームは両方とも剛性である、
−回転シャフトは水平であり、容器は円筒形又は真っ直ぐな円錐台の形状であり、第１の垂直端壁と第２の垂直端壁は円筒状又は円錐台状の側壁で分離され、回転シャフトは側壁と同軸である、
−回転シャフトは水平に対して傾斜しているが垂直ではなく、容器は円筒形又は真っ直ぐな円錐台の形状であり、第１の垂直端壁と第２の上部垂直端壁は円筒状又は円錐台状の側壁で分離される、
−回転シャフトは垂直であり、容器は円筒形又は真っ直ぐな円錐台の形状であり、下部底壁、上壁、及び円筒形又は円錐台形の立ち上がり側壁を有し、回転シャフトは中央にあり、側壁と同軸であり、羽根型アームは回転シャフトの下部に配置され、フィラメント型アームは羽根型アームより上に配置される、
−回転シャフトは単一部品である、
−回転シャフトは一緒に組み立てられたいくつかの部品で構成される、
−支持体は、モータと結合部材を含みかつ支持体の電動部分を形成する部分を有する、
−容器が電動支持体に固定されるとき、支持体の電動部分は容器の上に配置され、回転シャフトは容器の頂部によって結合部材によって駆動され、容器の底壁は連続的であり、電動支持体は電動部分が容器を覆うように特に全体的に水平なＵ又はＺ字形を有する、
−容器が電動支持体に固定されるとき、支持体の電動部分は容器の上に配置され、回転シャフトは容器の底部によって結合部材によって駆動され、容器の底壁は回転シャフトの通路のための開口部を含み、前記通路開口部は密閉される、
−結合部材は回転シャフトと直接接触する機械的結合を提供する、
−結合部材は回転シャフトとの遠隔磁気結合を提供し、これにより、回転シャフトは容器の壁を通過しないため、回転シャフト用のシールが回避される、
−モータ回転子は回転シャフトの一部であり、結合は電動支持体内のモータの固定子と容器の回転シャフト上の回転子との間で電磁的であり、これにより、回転シャフトが容器の壁を通過しないため、回転シャフト用のシールが回避される、
−下部底壁及び立ち上がり側壁は単一部品である、
−上壁は容器の蓋を形成する、
−上壁は、立ち上がり側壁の頂部に追加される、
−上壁は、立ち上がり側壁の頂部から取り外し可能である、
−容器は円錐台形で、底壁側の直径が４３ｍｍ、上壁側の直径が５４ｍｍである、
−容器の有効容積の高さは、有効容積１００ｃｃで７０．７ｍｍである、
−容器の全高は９７．５ｍｍである、
−各羽根型アームは少なくとも１つの面取りされた縦方向縁部を有し、前記少なくとも１つの面取りされた縁部は、回転シャフトが回転するときに容器の内側を最初に掃くことができるアームの側面にある、
−面取りされた縁部は鋭い縁部である、
−面取りされた縁部はさらにくぼみを含む、
−各フィラメント型アームは、ナイロン又は金属ワイヤからなる、
−ナイロン又は金属ワイヤの直径は０．５ｍｍ〜３ｍｍの間に含まれる、
−ナイロン又は金属ワイヤは回転シャフトの高さに沿って食い違い状に配置され、２つの隣接するワイヤステージ間の距離は高さに沿って一定である、
−ナイロン又は金属ワイヤは回転シャフトの高さに沿って食い違い状に配置され、２つの隣接するワイヤステージ間の距離は高さに沿って変化する、
−ナイロン又は金属ワイヤは、回転シャフトの高さに沿って食い違い状に配置され、２つの隣接するワイヤステージ間の距離は５ｍｍ〜２０ｍｍの間に含まれる、
−ナイロン又は金属ワイヤは、回転シャフトの高さに沿って垂直方向に整列される、
−ナイロン又は金属ワイヤは回転シャフトの高さに沿って螺旋状に整列される、
−容器の円筒形又は円錐台形の立ち上がり側壁はぎざぎざを内側に含む、
−容器は液体不透過性であり、上壁は２つの開口部を含み、第１の開口部はフィルタで閉じられ、第２の開口部は自己密閉式隔壁で閉じられ、この自己密閉式隔壁は穴あけチューブで穴をあけることができ、穴あけチューブを取り除くと完全に不透過性になるような方法で自動的に密閉する、
−穴あけチューブは中空の針又はトロカール又はカニューレである、
−自己密閉式隔壁はエラストマーから作られる、
−自己密閉式隔壁はシリコーンバルブである、
−上壁の２つの開口部の少なくとも１つは、引き裂き可能な膜シールで外側が覆われる、
−上壁の２つの開口部の少なくとも１つは、取り外し可能なキャップで外側が覆われる、
−容器の上壁は取り外し可能な蓋である、
−容器とその回転シャフトは使い捨てである、
−容器とその回転シャフトは滅菌可能である、
−電動支持体はモータ回転子の回転速度を制御するシステムを含む、
−電動支持体はモータ回転子の回転速度を測定するシステムを含む、
−電動支持体は、モータ回転子の回転に対抗する抵抗トルクを測定するためのシステムを含む、
−電動支持体は、容器の存在を検出するためのシステムを含む、
−モータ回転子の回転速度制御システムは、以下の動作：一定方向の回転、交互方向の回転、一定速度回転、可変速度回転、速度進化プログラムに従ったいくつかの速度の少なくとも１つでの回転、のうちの少なくとも１つを可能にするように構成され、前記プログラムは電動支持体の測定システムによって実行された測定の結果に対して調整されたステップを含むことができる、
−電動支持体は、モータ回転子の回転持続時間を調整するためのタイマーを含む、
−電動支持体は、容器の温度を調整するための熱調整手段を含む、
−好ましくは、電動支持体は、プリセットされた回転速度調整システムと回転持続時間タイマーとを備え、ここで装置はオートマチックであり、ユーザは速度も持続時間も調整することができない。
【００１８】
本発明はまた、特に脂肪吸引中に取得された、組織サンプルから、単離細胞、特に脂肪細胞及び／又は脂肪組織に含まれる細胞の組成物を調製するための方法を提案し、前記調製は、装置内での組織の機械的断片化の少なくとも１つのステップを含み、前記装置は電動支持体及び容器を備え、電動支持体は、結合部材と一体の回転子を有するモータを備え、容器は、軸方向に回転可能な回転シャフトを内側に含み、及び回転シャフトが回転するときに容器の内部を掃くことができる半径方向アームを含み、電動支持体及び容器は、電動支持体上で容器を不動化するための相補的に着脱可能な固定手段を含み、結合部材及び回転シャフトは、モータ回転子が回転するときに回転シャフトの軸回転を可能にするような方法で構成される。
【００１９】
前記方法によれば、先行請求項のいずれか一項に記載の装置は、組織の断片化のために使用され、抽出された組織が容器に導入され、モータの電源がオンにされ、結合部材が回転シャフトを回転できるように容器は電動支持体に前もって固定されており、モータを停止した後、容器内容物の少なくとも一部が収集される。
【００２０】
前記方法の、場合によっては組み合わされる変形例において：
−回転シャフトの回転は常に同じ方向で行われる、
−回転シャフトの回転は交互の方向で行われる、
−回転シャフトの回転は少なくとも３６０°にわたって交互に行われる、
−回転シャフトの回転は３６０°超にわたって交互に行われる。
【００２１】
非限定的な例として与えられた添付の図面に関する以下の記載は、本発明が何で構成され、どのように実施できるかをよく理解できるようにするものである。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の容器の回転シャフトを通過する軸方向垂直断面を示す。
【図２】図１の容器の上面図を示す。
【図３】図１の容器の半径方向断面を示す。
【図４】本発明の装置を使用した単離細胞の組成物の調製の異なるステップを図式化する。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
装置
本発明で実施される抽出された組織の機械的処理の解決策の枠組み内で、組織からの細胞の単離は、組織がミキサー内で受ける摩擦力及びせん断力に基づく。
【００２４】
好ましくは、このミキサーは脂肪組織を粉砕するように、及び脂肪組織を構成する細胞、主にＳＶＦ（間質血管細胞群（Ｓｔｒｏｍａｌ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ））の細胞を得るように意図されているが、他の組織又は器官に含まれる細胞の精製に使用することもできる。
【００２５】
本発明のミキサーは以下の２つの構成要素を主に含む：電動支持体と呼ばれる電気モータを含む支持体、及び、電動支持体に適合可能な容器。電動支持体は、容器が電動支持体に固定されると容器の内部の回転シャフトを回転させることを可能にするモータを含み、前記回転シャフトは半径方向アームを含む。容器は電動支持体に着脱可能に固定され、回転駆動から分離可能な結合手段が電動支持体と容器の回転シャフトとの間に設置される。
【００２６】
回転シャフトの回転速度は、約４０００ｒｐｍ（１分あたりの回転数）であることが好ましく、これは細胞数と生存率の観点から最適な細胞精製収率をもたらす。変形例では、２０００〜８０００ｒｐｍの間に含まれる回転速度が提供され、ミキサーはモータ回転子の、したがって回転シャフトの回転速度を調整するための手段を含み得る。
【００２７】
容器に対し中心／同軸である、ここでは実質的に円錐台形である回転シャフトは、脂肪組織の対流のために、その基部に半径方向の羽根を備える。回転シャフトに沿ってより高い所に、ナイロン又は金属ワイヤが回転シャフトに対して垂直／半径方向に固定され、組織の効率的な切断と分断を保証する。ナイロン又は金属ワイヤの直径は０．５ｍｍ〜３ｍｍの間に含まれる。ナイロン又は金属ワイヤの数は３〜１５の間に含まれる。
【００２８】
ナイロン又は金属ワイヤによる組織の切断を最適化するために、容器の内面にぎざぎざを挿入することができる。その数は２〜１２の間に含まれ得、厚さは１ｍｍ〜６ｍｍの間に含まれ得る。ぎざぎざの存在により、組織の乱流を引き起こして、最適な混合を可能にすることができる。それにもかかわらず、これらのぎざぎざは、それらなしでも細胞を得ることができるという意味で任意のものであるが、それらの存在は細胞調製収率を大幅に増加させる。
【００２９】
容器はその上部に２つの装置を含む蓋を有し、これにより本発明を実施する間の組織の汚染を減らすことが可能になる。第１の装置は、感染又は不活性粒子のない空気の交換を可能にする０．２２μｍのフィルタを備えた蓋を貫通する通気口である。第２の装置は、カニューレの通過と同時に外気が通過することなくカニューレの通過を可能にするバルブ又は隔壁である。好ましくは、このバルブ又はこの隔壁は、３ｍｍのカニューレ、典型的には脂肪吸引カニューレの通過を可能にする。しかしながら、この使用可能なカニューレの直径は１ｍｍから５ｍｍであり得る。このバルブ又は隔壁は、脂肪吸引に由来する脂肪組織が粉砕のために容器に直接入り、ミキサー内で混合した後にホモジネートを抽出することを可能にする。
【００３０】
したがって、好ましくは、容器はシリコーンバルブである隔壁によって閉鎖されるが、直径１〜５ｍｍの中空カニューレの通過を許容し、前記カニューレが引き抜かれると自動的に閉鎖する。このシリコーンバルブは、バルブと外気との長時間の直接接触を回避するために、外側／頂部プラグによって完成されてもよい。この穴の開いていないシリコーンバルブは、特に容器から外向き方向に、液体、粒子、及び細胞に対して不透過性である。シリコーンバルブ及びプラグは、２つの方向において、気体＋液体＋粒子＋細胞に対して不透過性である。
【００３１】
図１〜３には、垂直に使用し、その回転シャフトを底部によって駆動する本発明の容器１の例が示されている。この容器は、ここでは、円錐台形のワンピースボウルから構成され、その底壁８は円錐台形の上昇する側壁４によって上向きに延長される。容器１の側壁４の内面は、ぎざぎざ１９を含む。回転シャフト９は、側壁４の中心に、及び側壁４に同軸に配置され、ここではいくつかの部品のアセンブリから形成される。回転シャフト９は、底壁８を密閉方式で貫通し、その下端部に、電気モータを含む支持体３（図４参照）であって容器を着脱可能に固定することができる支持体３の相補的結合部材（図示せず）への迅速な結合のための手段７を含む。
【００３２】
電動支持体３（図４参照）は、その動作パラメータ、特に回転のオン／オフ、持続時間及び／又は速度を調整するための手段１３、１４を含む。この着脱可能な固定を可能にするために、電動支持体の固定手段と相補的な固定手段１１が実装され、この場合、４分の１回転ねじ込みによる。底壁８を通る回転シャフト９の通路のシール性は、Ｏリングシール２の実装により得られる。
【００３３】
狭い下部ベース部と広い上部とを備えた円錐台形のボウルは、蓋を形成する頂壁５によってその上部で閉鎖される。この蓋５はこの例ではクリップされており、取り外すことは意図されていない。それは溶接することもできる。変形実施形態では、この蓋は取り外し可能である。蓋５は２つの貫通開口部を含む。第１の開口部１７は、０．２２μｍのフィルタ及びスクリーン１８によって閉鎖される。第２の開口部２０は、直径３ｍｍの自動閉鎖式バルブ１６によって閉鎖され、閉鎖されると完全な密閉を保証する。このフラップ１６は、カニューレが第２の開口部２０に導入されると道を譲る。シリコーンバルブタイプの自動密閉式隔壁の場合、カニューレの除去後にバルブは閉鎖する。第２の開口部２０は、取り外し可能なキャップによって外側が覆われる。
【００３４】
回転シャフト９は、２つのタイプの半径方向アーム１０、１２を含む。回転シャフトの底部の方に、剛性羽根型アーム１０が配置され、これらのアームの上に、ナイロン又は金属から作られた可撓性又は柔軟なフィラメント型アーム１２が配置される。羽根型アーム１０は、アーム１０の半径方向延在部に実質的に垂直な垂直面に延在する隆起６を含むことができる。半径方向アーム、特にフィラメント型アーム１２は、回転シャフト９の高さにわたって食い違い状に配置され、回転シャフト９の周囲全体に角度的に分散される。
【００３５】
方法
所望の細胞組成物を取得するためのステップを図４に概略的に示す。
【００３６】
あらかじめ、ステップＡで、吸引シリンジ２２又は自動真空吸引装置によって脂肪組織の抽出を患者２１に実行した。ステップＢで、シリンジ２２のカニューレを第２の開口部２０に通すことにより、脂肪組織を容器１に導入する。組織を容器に注入する間、容器１の内部で過圧下に置かれた空気はフィルタ１５を通過することにより第１の開口部１７を通して排出される。ステップＣで、シリンジ２２を容器１から取り除く。ステップＤで、容器１を電動支持体３に固定し、電動支持体３のモータを起動して容器１の回転シャフト９を回転させ、これが組織を破壊し、細胞を解放する。動作パラメータを電動支持体の調整手段１３、１４によって調整する。ステップＥで、分解された組織の細胞及び他の要素を、第２の開口部２０を通して導入したシリンジカニューレ２３の中に収集する。ステップＦで、シリンジ２３による吸引中、外気がフィルタ１５を通過することによって第１の開口部１７を通して入る可能性がある。ステップＧで、ステップＨで再注入するための所望の細胞を選択するために遠心分離を実行する。
【００３７】
抽出された脂肪組織に基づいて、本発明のミキサーは、コラゲナーゼを使用するプロトコルで得られるものに近いＳＶＦ（間質血管細胞群）と呼ばれる細胞組成物を得ることを可能にする。
【００３８】
通常、量的な観点から、２５ｍｌの脂肪組織に基づいて、約２００，０００の生細胞が得られる。品質の観点から、本発明のミキサーの使用は、前駆細胞（間葉幹細胞）及び周皮細胞とみなされる細胞を集める精製細胞の総数に対して、表現型ＣＤ３４＋、ＣＤ３１−、ＣＤ４５−を有する約１７％の細胞を得ることを可能にする。そのような比率は、コラゲナーゼの使用に基づいた精製プロトコルで得られる比率（１９％）に非常に近い。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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