(57)【要約】  本発明は、ヒト口腔粘膜幹細胞（ｈＯＭＳＣ）に由来するセクレトーム、およびｈＯＭＳＣ由来セクレトームを含む無細胞組成物を提供する。治療、美容および組織再生においてｈＯＭＳＣ由来セクレトームを入手する、操作するならびに使用する方法も提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの担体、賦形剤または希釈剤とともに、ヒト口腔粘膜幹細胞から分泌される物質（ｈＯＭＳＣ由来セクレトーム）を含む、無細胞組成物。
【請求項２】
（ｉ）間質細胞由来因子１（ＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ１）、スーパーオキシドジスムターゼ［Ｃｕ−Ｚｎ］（ＳＯＤ１）、中脳星状膠細胞由来神経栄養因子（ＭＡＮＦ）、シスタチンＣ（ＣＳＴ３）、ガレクチン１（ＬＧＡＬＳ１）、グリア由来ネキシン（ＳＥＲＰＩＮＥ２）、インスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ２）、潜在型トランスフォーミング成長因子ベータ結合タンパク質１（ＬＴＢＰ１）、潜在型トランスフォーミング成長因子ベータ結合タンパク質２（ＬＴＢＰ２）、潜在型トランスフォーミング成長因子ベータ結合タンパク質３フラグメント（ＬＴＢＰ３）、潜在型トランスフォーミング成長因子ベータ結合タンパク質４（ＬＴＢＰ４）、神経芽細胞分化関連タンパク質（ＡＨＮＡＫ）および色素上皮由来因子（ＳＥＲＰＩＮＦ１／ＰＥＤＦ）からなる群からの少なくとも１つのタンパク質、または
（ｉｉ）肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、胎盤成長因子（ＰＩＧＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（ＭＣＳＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、マクロファージ炎症性タンパク質３（ＭＩＰ−３ａ）、成長調節発癌遺伝子アルファ（ＧＲＯ−ａもしくはＣＸＣＬ１）、マクロファージ由来／ＣＣＬ２２ケモカイン（ＭＤＣもしくはＣＣＬ２２）、成長調節発癌遺伝子（ＧＲＯ）、ＩＧＦＢＰ−２、ニューロトロフィン４（ＮＴ−４）、単球化学誘引物質タンパク質２（ＭＣＰ−２／ＣＣＬ８）、インスリン成長因子１（ＩＧＦ−１）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン２（ＩＬ−２）および脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）からなる群より選択される少なくとも１つのタンパク質、または
（ｉｉｉ）１ＳＶ、３ＳＶ、ＡＣＴＧ２、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭＴＳＬ１、ＡＤＭ、ＡＮＸＡ４、ＡＰＯＤ、ＣＡＬＭ２、ＣＤ１０９、ＣＤ５９、ＣＤＨ６、ＣＦＤ、ＣＯＬ１５Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、ＣＯＬＥＣ１２、ＣＴＨＲＣ１、ＣＴＳＣ、ＣＴＳＬ、ＣＸＣＬ１２、ＤＣＤ、ＤＤＡＨ２、ＤＫＫ１、ＤＳＧ１、ＤＳＰ、ＤＳＴＮ、ＥＣＨ１、ＥＤＩＬ３、ＥＦＥＭＰ１、ＥＬＮ、ＦＬＧ、ＧＮＢ２、ＧＲＥＭ２、Ｈ３Ｆ３Ｂ、ＨＢＡ１、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＨ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＫ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ａ、ＨＭＧＮ２、ＨＮＲＮＰＡＢ、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＨＳＰＡ１Ａ、ＨＳＰＧ２、ＩＧＦＢＰ５、ＪＵＰ、ＫＨＳＲＰ、ＬＤＨＡ、ＭＮＢ２、ＬＴＢＰ４、ＭＡＮ１Ａ１、ＭＦＡＰ４、ＭＭＰ１、ＭＭＰ１４、ＭＴ２Ａ、ＮＢＬ１、ＯＭＤ、ＰＦＮ１、ＰＩ１６、ＰＳＧ５、ＰＳＭＢ６、ＰＴＧＤＳ、ＲＡＲＲＥＳ２、ＳＬＩＴ３、ＳＰＯＣＫ１、ＳＰＴＢＮ４、ＳＴＯＭ、ＴＭＳＢ１０、ＴＭＳＢ４Ｘ、ＴＮＦＡＩＰ６、ＴＮＸＢ、ＴＰＩ１、ＴＵＢＡ１Ｃ、ＵＢＣ、ＶＩＴおよびＷＮＴ５Ａからなる群より選択される少なくとも１つのタンパク質、または
（ｉｖ）ｈｓａ−ｍｉＲ−４４５４＋ｈｓａ−ｍｉＲ−７９７５、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６１２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１４４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ＋ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８ｈ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７６ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２６ａ＋ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｃ−５ｐ＋ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７５８−３ｐ＋ｈｓａ−ｍｉＲ−４１１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２０６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１４ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ａｈ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４３、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２３４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−８８８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１４ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｍ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐおよびｈｓａ−ｍｉＲ−１２９０からなる群より選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、あるいは
その組合せ
を含む、請求項１に記載の無細胞組成物。
【請求項３】
（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）または（ｉｖ）からの複数の物質を含む、請求項２に記載の無細胞組成物。
【請求項４】
少なくとも１つの（ｉ）からのタンパク質と、少なくとも１つの（ｉｉ）からのタンパク質と、少なくとも１つの（ｉｉｉ）のタンパク質と、任意選択で少なくとも１つの（ｉｖ）からのｍｉＲＮＡとを含む、請求項２に記載の無細胞組成物。
【請求項５】
間質細胞由来因子１（ＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ１）、中脳星状膠細胞由来神経栄養因子（ＭＡＮＦ）、スーパーオキシドジスムターゼ［Ｃｕ−Ｚｎ］（ＳＯＤ１）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、胎盤成長因子（ＰＩＧＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（ＭＣＳＦ）および血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）からなる群より選択される少なくとも１つの因子を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の無細胞組成物。
【請求項６】
ｈｓａ−ｍｉＲ−４４５４＋ｈｓａ−ｍｉＲ−７９７５、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６１２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１４４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ＋ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８ｈ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７６ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２６ａ＋ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｃ−５ｐ＋ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７５８−３ｐ＋ｈｓａ−ｍｉＲ−４１１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２０６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１４ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ａｈ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４３、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２３４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−８８８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１４ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｍ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐおよびｈｓａ−ｍｉＲ−１２９０からなる群より選択される少なくとも６つのマイクロＲＮＡ分子を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の無細胞組成物。
【請求項７】
前記少なくとも１つの（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）のタンパク質が、他の幹細胞源に由来するセクレトーム中より有意に高い濃度で存在する、請求項２〜５のいずれか１項に記載の無細胞組成物。
【請求項８】
他の幹細胞源に由来するセクレトーム中より有意に高い濃度で存在する前記少なくとも１つのタンパク質が、間質細胞由来因子１（ＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ１、Ｐ４８０６１）、スーパーオキシドジスムターゼ［Ｃｕ−Ｚｎ］（ＳＯＤ１、Ｐ００４４１）、中脳星状膠細胞由来神経栄養因子（ＭＡＮＦ、Ｐ５５１４５）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、胎盤成長因子（ＰＩＧＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（ＭＣＳＦ）、および血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）からなる群より選択される、請求項７に記載の無細胞組成物。
【請求項９】
他の幹細胞源に由来するセクレトーム中より有意に低い濃度で少なくとも１つのタンパク質を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の無細胞組成物。
【請求項１０】
前記少なくとも１つのタンパク質が、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、ガンマインターフェロンによって誘導されるモノカイン（ＭＩＧ／ＣＸＣＬ９）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ−３リガンド）、レプチン、上皮由来好中球活性化ペプチド７８（ＥＮＡ−７８／ＣＸＣＬ５）および単球走化性タンパク質３（ＭＣＰ−３／ＣＣＬ７）からなる群より選択される、請求項９に記載の無細胞組成物。
【請求項１１】
神経系のホメオスタシスに関与する少なくとも１つのタンパク質を含み、前記タンパク質が、シスタチンＣ、ガレクチン１、グリア由来ネキシン、インスリン様成長因子ＩＩ、（ＩＧＦ２）、潜在型トランスフォーミング成長因子ベータ結合タンパク質１（ＬＴＢＰ１）、潜在型トランスフォーミング成長因子ベータ結合タンパク質２（ＬＴＢＰ２）；潜在型トランスフォーミング成長因子ベータ結合タンパク質３（ＬＴＢＰ３）；潜在型トランスフォーミング成長因子ベータ結合タンパク質４（ＬＴＢＰ４）；中脳星状膠細胞由来神経栄養因子（ＭＡＮＦ）、神経芽細胞分化関連タンパク質（ＡＨＡＮＫ）、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）、間質細胞由来因子１（ＳＤＦ１）、およびスーパーオキシドジスムターゼ［Ｃｕ−Ｚｎ］（ＳＯＤＣ）からなる群より選択される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の無細胞組成物。
【請求項１２】
細胞外小胞（ＥＶ）を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の無細胞組成物。
【請求項１３】
微小胞を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の無細胞組成物。
【請求項１４】
エキソソームを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の無細胞組成物。
【請求項１５】
１，０００ダルトン以上の分子の大きさを有する可溶性因子を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の無細胞組成物。
【請求項１６】
前記可溶性因子が、タンパク質、ペプチド、ホルモン、ＤＮＡおよびＲＮＡ種、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド、ならびにその組合せからなる群より選択される、請求項１５に記載の無細胞組成物。
【請求項１７】
可溶性因子と微小胞とエキソソームとを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の無細胞組成物。
【請求項１８】
薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤を含む医薬組成物である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
美容用組成物である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
疾患または障害を予防するまたは治療することにおける使用のための、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記疾患または障害が、炎症性疾患；自己免疫疾患；血管疾患；心疾患；呼吸器系疾患；骨格系疾患；消化管疾患；腎疾患；尿路疾患；皮膚疾患；老化関連疾患；末梢神経疾患、骨格筋疾患；中枢神経系の疾患；眼疾患；内分泌系の疾患；および歯科口腔疾患からなる群より選択される、請求項２０に記載の使用のための組成物。
【請求項２２】
組織リモデリング、組織修復または組織再生における使用のための、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
組織リモデリング、組織修復または組織再生が、創傷治癒を促進すること、瘢痕形成を予防するまたは軽減すること；瘢痕治癒を促進すること、軟骨または骨形成を促進すること；中枢神経系または末梢神経系での損傷の修復または再生を促進すること；ならびに虚血器官の新血管新生および血管新生を促進することからなる群より選択される少なくとも１つの過程を含む、請求項２２に記載の使用のための組成物。
【請求項２４】
前記損傷が、神経系の外傷、神経変性疾患または血管疾患により引き起こされた、請求項２３に記載の使用のための組成物。
【請求項２５】
中枢神経系または末梢神経系での損傷の修復または再生を促進することにおける使用のための、薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤と合わせた請求項１１に記載の無細胞組成物。
【請求項２６】
前記セクレトームが、自家ｈＯＭＳＣに由来する、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の無細胞組成物。
【請求項２７】
前記セクレトームが、同種ｈＯＭＳＣに由来する、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の無細胞組成物。
【請求項２８】
ｈＯＭＳＣから無細胞セクレトームを作製する方法であって、
ｉ．外植または酵素消化によってｈＯＭＳＣを単離する段階と、
ｉｉ．培養培地中でｈＯＭＳＣを拡大する段階と、
ｉｉｉ．前記培地を基本培地に置き換える段階と、
ｉｖ．１時間〜１２０時間の範囲の一定時間にわたって前記基本培地中でｈＯＭＳＣを培養する段階と
ｖ．培養物から前記培地を回収する段階と、
ｖｉ．任意選択で、前記培地を１．１〜１０，０００倍に濃縮する段階
を含む、方法。
【請求項２９】
段階（ｉｖ）中にまたはその後に前記ｈＯＭＳＣが、前記セクレトームの内容に影響を及ぼす刺激または条件に供される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
それを必要とする対象に請求項１に記載の無細胞組成物を投与することを含む疾患または障害を予防するまたは治療する方法。
【請求項３１】
前記疾患または障害が、炎症性疾患；自己免疫疾患；血管疾患；心疾患；呼吸器系疾患；骨格系疾患；消化管疾患；腎疾患；尿路疾患；皮膚疾患；老化関連疾患；末梢神経および骨格筋疾患；中枢神経系の疾患；眼疾患；内分泌系の疾患；ならびに歯科口腔疾患からなる群より選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記治療する方法が、組織リモデリング、組織修復または組織再生を含む、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記治療の方法が、少なくとも１つの医原性損傷によって全体にまたは部分的に破壊された器官および組織の修復または再生を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記少なくとも１つの医原性損傷が、機械的外傷、化学的損傷、化学療法、放射線照射または熱により引き起こされる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記少なくとも１つの損傷が、中枢神経系の挫傷、脊椎損傷、脊髄切断、末梢神経の挫滅または切断、熱傷、ニューロパチー、心臓病、骨折、腱および靭帯の断裂からなる群より選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
組織リモデリング、組織修復または組織再生が、創傷治癒を促進すること、瘢痕形成を予防するまたは軽減すること、瘢痕治癒を促進するまたは軟骨もしくは骨形成を促進すること；外傷、神経変性疾患または神経系の血管疾患により引き起こされる中枢神経系または末梢神経系の修復または再生を促進すること；および虚血器官の新血管新生および血管新生を促進することからなる群より選択される少なくとも１つの過程を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
前記虚血器官が、心臓、脳、末梢神経および腎臓からなる群より選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記組成物が、医薬組成物である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３９】
前記組成物が、美容用組成物である、請求項３０に記載の方法。
【請求項４０】
前記障害が、糖尿病性創傷である、請求項３０に記載の方法。
【請求項４１】
前記障害が、美容障害である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記無細胞組成物が、自家ｈＯＭＳＣに由来するセクレトームを含む、請求項３０〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記無細胞組成物が、同種ｈＯＭＳＣに由来するセクレトームを含む、請求項３０〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記組成物が、局所、皮下、筋肉内、動脈内、腹腔内、髄腔内、静脈内からなる群より選択される経路によりそれを必要とする対象に投与されるか必要とする部位で任意の組織中に直接注射される、請求項３０〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記組成物が、損傷組織に局所的に投与される、請求項３０〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記組成物が、全身的に投与される、請求項３０〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記ｈＯＭＳＣが、ナイーブ細胞である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の無細胞組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞および再生医療の分野のものである。具体的には、本発明は、ヒト口腔粘膜幹細胞由来セクレトームの組成物を提供する。治療における幹細胞セクレトームの入手、操作および使用のための方法も提供される。
【背景技術】
【０００２】
ヒト口腔粘膜由来幹細胞（ｈＯＭＳＣ）は、口腔粘膜の固有層に由来する特有の幹細胞集団である（Ｍａｒｙｎｋａ−Ｋａｌｍａｎｉら，２０１０）。ｈＯＭＳＣは、胚性幹細胞、神経堤幹細胞および間葉系幹細胞のマーカーからなる特有の免疫表現型を発現する。網羅的遺伝子解析により、ｈＯＭＳＣのｉｎ  ｖｉｖｏからｉｎ  ｖｉｔｒｏへの移行は哺乳動物生物体の胚および胎児の発生段階で神経堤細胞系の発生に関与する遺伝子の差次的な発現をもたらすことが明らかにされている。
【０００３】
神経堤は、神経系およびグリア系ならびに軟骨芽細胞系、造骨系、脂肪細胞系および線維芽細胞系をそれぞれ含む外胚葉および間葉由来の様々な細胞系を生じる一時的な発生的構造である。ｈＯＭＳＣがｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでこれらの細胞系に分化することも示されている（Ｍａｒｙｎｋａ−Ｋａｌｍａｎｉら，２０１０、Ｔｒｅｖｅｓ−Ｍａｎｕｓｈｅｖｉｔｚら，２０１３、Ｇａｎｚら，２０１４ａ，２０１４ｂ）。
【０００４】
ドーパミン作動性様ニューロンまたは星状膠細胞様細胞に分化されｉｎ  ｖｉｖｏで移植されたｈＯＭＳＣが動物モデルで治療効果を示すことが明らかにされている（Ｇａｎｚら，２０１４ａ，２０１４ｂ）。さらにナイーブｈＯＭＳＣについても、これらの動物モデルでは一部の治療活性が無効であり、その治療効果はプラセボのものと同程度であることが示されている。
【０００５】
最近、胚性幹細胞および成体幹細胞が細胞外小胞の宝庫でもあることが示されている（Ｄｅｓｒｏｃｈｅｒｓら，２０１６、Ｋｏｎａｌａら，２０１６）。細胞外小胞（ＥＶ）は、真核細胞の細胞質から放出される、大きさが５０ｎｍから１．５〜２ミクロンの範囲である小胞である。
【０００６】
ＥＶは、それらの生合成および大きさによって大きく２つの主要な種類、すなわち、大きさの範囲が５０〜１５００ｎｍの微小胞または脱落微小胞と、大きさの範囲が３０〜１２０ｎｍのエキソソームとに分けられる。エキソソームは、多胞体の管腔膜に由来する脂質二重膜小胞であり、それらは細胞膜との融合によって恒常的に放出される。微小胞とエキソソームの生合成は異なる。微小胞は、細胞膜で膜からの出芽および分裂によって形成される。エキソソームはエンドソーム／ゴルジ系に由来し、輸送に必要とされるエンドソーム選別複合体によって少なくとも一部が細胞表面に定着され、そこでエキソサイトーシスを受ける。
【０００７】
細胞外小胞は、タンパク質、脂質、核酸からなるカーゴを含む（Ｄｅｓｒｏｃｈｅｒｓら，２０１６、Ｘｕら，２０１６）。ＥＶの内容は、細胞の起源、その生理的状態および病理学的状態ならびに細胞の放出部位によって不均一であり、動的状態にある。エキソソームの組成は、エキソソーム内へのカーゴの選別により、その起源の細胞とは異なるものであり得る。ＥＶのカーゴは、細胞間接触ならびにパラクリン作用およびオートクリン作用の可溶性因子の分泌の古典的な方法に加えて、細胞間コミュニケーションの方法としての役割を果たすことが示されている。ＥＶの生物学的作用に関する知見の大部分は、癌細胞に関して実施された研究に由来するものである。ＥＶのカーゴが、癌細胞の増殖および生存ならびに血管新生ならびに腫瘍線維芽細胞の移動、生存および成長を誘導することが示されている（Ａｎｔｏｎｙａｋら，２０１５）。エキソソームは、遺伝物質の運搬体であることが明らかにされており、癌の診断および予後のバイオマーカーと見なされ、治療効果のモニタリングに提案されている。現在、エキソソームベースの腫瘍ワクチンおよび薬物の送達が癌の治療戦略として評価されている（Ｇｕｅら，２０１７）。
【０００８】
骨髄および脂肪組織に由来する成体幹細胞から得た訓化培地は、心虚血および創傷治癒において治療可能性を有することが明らかにされている（Ｌａｉら，２０１０、Ｈｕら，２０１６）。
【０００９】
カーゴの内容は微小胞とエキソソームとで異なっており、その差は細胞の起源に左右されるという証拠が蓄積されつつある（Ｋａｎａｄａら，２０１５）。さらに、最近のデータは、カーゴの性状が、様々なタイプの癌細胞によって放出されるＥＶでも、様々なタイプの幹細胞によって放出されるＥＶでも細胞特異的であることを示唆する（Ｖｉｌｌａｒｒｏｙａ−Ｂｅｌｔｒｉら，２０１４、Ｌｏｐｅｚ−Ｖｅｒｒｉｌｌｉ  ＭＡら，２０１６）。
【００１０】
国際公開第２００８／１３２７２２号には、多能性成体幹細胞の供給源としての消化管粘膜、特に口腔粘膜の固有層が開示されている。
【００１１】
国際公開第２０１３０７６７２６号には、様々な神経細胞系への選択的分化の供給源としての口腔粘膜の固有層に由来する幹細胞（ＯＭＳＣ）ならびにニューロン新生の誘導または維持におけるそれらの使用、神経変性障害および精神障害の治療のためのならびに外傷による神経組織喪失におけるそれらの使用が開示されている。
【００１２】
米国特許出願公開第２０１６／０２５６４９６号は、歯肉線維芽細胞由来産物、例えば訓化培地、ならびに変形性関節症および関節リウマチなどの整形外科病態の予防または治療のための方法におけるその使用に関する。
【００１３】
Ｍｅｄ  Ｃｅｌｌ社の国際公開第２０１７／００１６４９号、国際公開第２０１６／０８２８８２号および国際公開第２０１６／０８３５００号には、間葉系幹細胞または樹状細胞によって分泌されるセクレトームを生産する具体的な方法が開示されている。
【００１４】
国際公開第２０１４／０５７０９７号には、成人ヒト間葉系幹細胞と成人完全分化心筋細胞を適切な培地で共培養してプレコンディショニングされた成人ヒト間葉系幹細胞を得ることによる、成人ヒト間葉系幹細胞のセクレトームを調節する方法が開示されている。
【００１５】
疾患および障害の予防および治療ならびに組織再生の促進に有用な組成物に関して満たされていない必要性が未だ存在する。このような組成物は、特有で、拡大可能であり、入手が容易な供給源に有利に由来し得る。
【発明の概要】
【００１６】
口腔粘膜の固有層に由来するヒト幹細胞（ｈＯＭＳＣ）の馴化培地またはセクレトームを治療用組成物としてここに開示する。本発明は部分的には、ナイーブｈＯＭＳＣセクレトームの組成物が特有であり、したがって、特有の治療可能性を有し、このことは、他の供給源に由来するナイーブ幹細胞のセクレトームより有利であるという発見に基づくものである。さらに、ｈＯＭＳＣ刺激はセクレトームの内容における、したがってその治療能における変化に反映される細胞応答を引き起こし得る。上記ｈＯＭＳＣ刺激によって生じるセクレトームがｈＯＭＳＣ刺激細胞に特有であり、同じ刺激を他の供給源に由来する成体幹細胞に与えると、異なるセクレトームが生じることも考えられる。
【００１７】
本明細書には、ナイーブｈＯＭＳＣのセクレトームが、サイトカイン、ケモカインおよび核酸の存在、不在または相対量において他の幹細胞のセクレトームとは異なる特有の特徴を有することが初めて開示される。
【００１８】
本明細書には、ｈＯＭＳＣおよびそれに由来するセクレトームを含む無細胞組成物が糖尿病性創傷治癒を促進でき、このことは、ｈＯＭＳＣセクレトームを新生血管、細胞増殖および結合組織形成の促進に使用できる可能性を示唆していることも開示される。予想外にも、ｈＯＭＳＣおよびそれらのセクレトームの創傷治癒における活性は他の供給源に由来する幹細胞およびセクレトームよりも優れている。
【００１９】
利用しやすく再現性のある使い捨てのナイーブｈＯＭＳＣ細胞供給源に由来する本発明によるセクレトームは、細胞分化の誘導を必要とせず容易に入手し使用できる。
【００２０】
本発明は、一態様では、ヒト口腔粘膜幹細胞から分泌される物質（ｈＯＭＳＣ由来セクレトーム）を少なくとも１つの担体、賦形剤または希釈剤とともに含む、無細胞組成物を提供する。
【００２１】
本発明によるｈＯＭＳＣ由来セクレトームを含む無細胞組成物は、それらの内容が特有であり、他の供給源の幹細胞のセクレトームとは異なる。
【００２２】
いくつかの実施形態では、ｈＯＭＳＣはナイーブｈＯＭＳＣである。
【００２３】
いくつかの実施形態では、無細胞組成物は、
（ｉ）間質細胞由来因子１（ＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ１）、スーパーオキシドジスムターゼ［Ｃｕ−Ｚｎ］（ＳＯＤ１）、中脳星状膠細胞由来神経栄養因子（ＭＡＮＦ）、シスタチンＣ（ＣＳＴ３）、ガレクチン１（ＬＧＡＬＳ１）、グリア由来ネキシン（ＳＥＲＰＩＮＥ２）、インスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ２）、潜在型トランスフォーミング成長因子ベータ結合タンパク質１（ＬＴＢＰ１）、潜在型トランスフォーミング成長因子ベータ結合タンパク質２（ＬＴＢＰ２）、潜在型トランスフォーミング成長因子ベータ結合タンパク質３フラグメント（ＬＴＢＰ３）、潜在型トランスフォーミング成長因子ベータ結合タンパク質４（ＬＴＢＰ４）、神経芽細胞分化関連タンパク質（ＡＨＮＡＫ）および色素上皮由来因子（ＳＥＲＰＩＮＦ１／ＰＥＤＦ）からなる群からの少なくとも１つのタンパク質；または
（ｉｉ）肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、胎盤成長因子（ＰＩＧＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（ＭＣＳＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、マクロファージ炎症性タンパク質３（ＭＩＰ−３ａ）、成長調節発癌遺伝子アルファ（ＧＲＯ−ａもしくはＣＸＣＬ１）、マクロファージ由来／ＣＣＬ２２ケモカイン（ＭＤＣもしくはＣＣＬ２２）、成長調節発癌遺伝子（ＧＲＯ）、ＩＧＦＢＰ−２、ニューロトロフィン４（ＮＴ−４）、単球化学誘引物質タンパク質２（ＭＣＰ−２／ＣＣＬ８）、インスリン成長因子１（ＩＧＦ−１）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン２（ＩＬ−２）および脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）からなる群より選択される少なくとも１つのタンパク質；または
（ｉｉｉ）１ＳＶ、３ＳＶ、ＡＣＴＧ２、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭＴＳＬ１、ＡＤＭ、ＡＮＸＡ４、ＡＰＯＤ、ＣＡＬＭ２、ＣＤ１０９、ＣＤ５９、ＣＤＨ６、ＣＦＤ、ＣＯＬ１５Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、ＣＯＬＥＣ１２、ＣＴＨＲＣ１、ＣＴＳＣ、ＣＴＳＬ、ＣＸＣＬ１２、ＤＣＤ、ＤＤＡＨ２、ＤＫＫ１、ＤＳＧ１、ＤＳＰ、ＤＳＴＮ、ＥＣＨ１、ＥＤＩＬ３、ＥＦＥＭＰ１、ＥＬＮ、ＦＬＧ、ＧＮＢ２、ＧＲＥＭ２、Ｈ３Ｆ３Ｂ、ＨＢＡ１、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＨ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＫ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ａ、ＨＭＧＮ２、ＨＮＲＮＰＡＢ、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＨＳＰＡ１Ａ、ＨＳＰＧ２、ＩＧＦＢＰ５、ＪＵＰ、ＫＨＳＲＰ、ＬＤＨＡ、ＭＮＢ２、ＬＴＢＰ４、ＭＡＮ１Ａ１、ＭＦＡＰ４、ＭＭＰ１、ＭＭＰ１４、ＭＴ２Ａ、ＮＢＬ１、ＯＭＤ、ＰＦＮ１、ＰＩ１６、ＰＳＧ５、ＰＳＭＢ６、ＰＴＧＤＳ、ＲＡＲＲＥＳ２、ＳＬＩＴ３、ＳＰＯＣＫ１、ＳＰＴＢＮ４、ＳＴＯＭ、ＴＭＳＢ１０、ＴＭＳＢ４Ｘ、ＴＮＦＡＩＰ６、ＴＮＸＢ、ＴＰＩ１、ＴＵＢＡ１Ｃ、ＵＢＣ、ＶＩＴおよびＷＮＴ５Ａからなる群より選択される少なくとも１つのタンパク質；または
（ｉｖ）ｈｓａ−ｍｉＲ−４４５４＋ｈｓａ−ｍｉＲ−７９７５、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６１２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１４４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ＋ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８ｈ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７６ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２６ａ＋ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｃ−５ｐ＋ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７５８−３ｐ＋ｈｓａ−ｍｉＲ−４１１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２０６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１４ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ａｈ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４３、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２３４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−８８８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１４ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｍ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐおよびｈｓａ−ｍｉＲ−１２９０からなる群より選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）；あるいは
その組合せ
を含む。
【００２４】
いくつかの実施形態では、無細胞組成物は、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）または（ｉｖ）の複数の物質を含む。
【００２５】
また別の実施形態では、無細胞組成物は、少なくとも１つの（ｉ）からのタンパク質と、少なくとも１つの（ｉｉ）からのタンパク質と、少なくとも１つの（ｉｉｉ）のタンパク質と、任意選択で少なくとも１つの（ｉｖ）からのｍｉＲＮＡとを含む。
【００２６】
いくつかの特定の実施形態では、ｈＯＭＳＣ由来セクレトームの無細胞組成物は、間質細胞由来因子１（ＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ１）、中脳星状膠細胞由来神経栄養因子（ＭＡＮＦ）、スーパーオキシドジスムターゼ［Ｃｕ−Ｚｎ］（ＳＯＤ１）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、胎盤成長因子（ＰＩＧＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（ＭＣＳＦ）および血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）からなる群より選択される少なくとも１つの因子を含む。
【００２７】
別の実施形態では、ｈＯＭＳＣ由来セクレトームの無細胞組成物は、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４５４＋ｈｓａ−ｍｉＲ−７９７５、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６１２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１４４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ＋ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８ｈ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７６ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２６ａ＋ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｃ−５ｐ＋ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７５８−３ｐ＋ｈｓａ−ｍｉＲ−４１１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２０６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１４ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ａｈ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４３、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２３４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−８８８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１４ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｍ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐおよびｈｓａ−ｍｉＲ−１２９０からなる群より選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡ分子を含む。
【００２８】
いくつかの特定の実施形態では、ｈＯＭＳＣ由来セクレトームの無細胞組成物は、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４５４＋ｈｓａ−ｍｉＲ−７９７５、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６１２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１４４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ＋ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８ｈ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７６ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２６ａ＋ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｃ−５ｐ＋ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７５８−３ｐ＋ｈｓａ−ｍｉＲ−４１１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２０６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１４ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ａｈ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４３、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２３４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−８８８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１４ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｍ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐおよびｈｓａ−ｍｉＲ−１２９０からなる群より選択される少なくとも６つのマイクロＲＮＡ分子を含む。
【００２９】
いくつかの実施形態では、無細胞組成物は、少なくとも１つのタンパク質を、他の幹細胞源に由来するセクレトーム中の上記タンパク質の濃度より有意に高い濃度で含む。いくつかの特定の実施形態では、無細胞組成物は、少なくとも１つの（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）のタンパク質を、他の幹細胞源に由来するセクレトーム中の濃度より有意に高い濃度で含む。
【００３０】
いくつかの実施形態では、ｈＯＭＳＣ由来セクレトームの無細胞組成物中に他の幹細胞源に由来するセクレトーム中より有意に高い濃度で存在する少なくとも１つのタンパク質は、間質細胞由来因子１（ＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ１、Ｐ４８０６１）、スーパーオキシドジスムターゼ［Ｃｕ−Ｚｎ］（ＳＯＤ１、Ｐ００４４１）、中脳星状膠細胞由来神経栄養因子（ＭＡＮＦ、Ｐ５５１４５）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、胎盤成長因子（ＰＩＧＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（ＭＣＳＦ）および血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）からなる群より選択される。
【００３１】
特定の実施形態では、セクレトームは、間質細胞由来因子１（ＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ１）、中脳星状膠細胞由来神経栄養因子（ＭＡＮＦ）、スーパーオキシドジスムターゼ［Ｃｕ−Ｚｎ］（ＳＯＤ１）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、胎盤成長因子（ＰＩＧＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（ＭＣＳＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、成長調節発癌遺伝子（ＧＲＯ）、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、マクロファージ炎症性タンパク質３（ＭＩＰ−３ａ）、成長調節発癌遺伝子アルファ（ＧＲＯ−ａもしくはＣＸＣＬ１）、マクロファージ由来／ＣＣＬ２２ケモカイン（ＭＤＣもしくはＣＣＬ２２）、インスリン様成長因子結合タンパク質２（ＩＧＦＢＰ−２）、ニューロトロフィン４（ＮＴ−４）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド８（ＣＣＬ８）としても知られる単球化学誘引物質タンパク質２（ＭＣＰ−２）、インスリン成長因子１（ＩＧＦ−１）、インスリン様成長因子２、シスタチンＣ（ＣＳＴ３）、ガレクチン１（ＬＧＡＬＳ１）、グリア由来ネキシン（ＳＥＲＰＩＮＥ２）、潜在型トランスフォーミング成長因子ベータ結合タンパク質１（ＬＴＢＰ１）、潜在型トランスフォーミング成長因子ベータ結合タンパク質２（ＬＴＢＰ２）、潜在型トランスフォーミング成長因子ベータ結合タンパク質３（ＬＴＢＰ３）、潜在型トランスフォーミング成長因子ベータ結合タンパク質４（ＬＴＢＰ４）、神経芽細胞分化関連タンパク質（ＡＨＮＡＫ）、色素上皮由来因子（ＳＥＲＰＩＮＦ１）および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）からなる群より選択される少なくとも１つのタンパク質を、皮膚幹細胞または骨髄幹細胞に由来するセクレトーム中の上記タンパク質の濃度より有意に高い濃度で含む。
【００３２】
特定の実施形態では、セクレトームは、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、胎盤成長因子（ＰＩＧＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（ＭＣＳＦ）および血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）からなる群より選択される少なくとも１つのタンパク質を、皮膚幹細胞または骨髄幹細胞に由来するセクレトーム中の上記タンパク質の濃度より有意に高い濃度で含む。
【００３３】
別の実施形態では、ｈＯＭＳＣ由来セクレトームは、少なくとも１つのタンパク質を、他の幹細胞源に由来するセクレトーム中の上記タンパク質の濃度より有意に低い濃度で含む。
【００３４】
いくつかの実施形態では、ｈＯＭＳＣ由来セクレトームの無細胞組成物は、少なくとも１つのタンパク質を、他の幹細胞源に由来するセクレトーム中の上記タンパク質の濃度より有意に低い濃度で含む。
【００３５】
特定の実施形態では、他の幹細胞源に由来するセクレトーム中より有意に低い濃度で存在する少なくとも１つのタンパク質は、皮膚幹細胞または骨髄幹細胞に由来するセクレトーム中の上記タンパク質の濃度より有意に低い濃度の、単球走化性タンパク質３（ＭＣＰ−３／ＣＣＬ７）、上皮好中球活性化ペプチドまたはＣ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン５（ＥＮＡ−７８またはＣＸＣＬ５）、レプチン、Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ−３リガンド）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、ガンマインターフェロンによって誘導されるモノカイン（ＭＩＧまたはＣＸＣＬ９）およびインターロイキン８（ＩＬ−８）からなる群より選択される。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。
【００３６】
いくつかの実施形態では、ｈＯＭＳＣ由来セクレトームのタンパク質および核酸の内容は、その他の幹細胞のセクレトームのタンパク質および核酸の内容とは異なる。
【００３７】
特定の実施形態では、セクレトームは、神経系のホメオスタシスに関与する少なくとも１つのタンパク質を含む。
【００３８】
いくつかの実施形態では、神経系のホメオスタシスに関与する少なくとも１つのタンパク質は、シスタチンＣ、ガレクチン１、グリア由来ネキシン、インスリン様成長因子ＩＩ、（ＩＧＦ２）、潜在型トランスフォーミング成長因子ベータ結合タンパク質１（ＬＴＢＰ１）、潜在型トランスフォーミング成長因子ベータ結合タンパク質２（ＬＴＢＰ２）、潜在型トランスフォーミング成長因子ベータ結合タンパク質３（ＬＴＢＰ３）、潜在型トランスフォーミング成長因子ベータ結合タンパク質４（ＬＴＢＰ４）、中脳星状膠細胞由来神経栄養因子（ＭＡＮＦ）、神経芽細胞分化関連タンパク質（ＡＨＡＮＫ）、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）、間質細胞由来因子１（ＳＤＦ１）およびスーパーオキシドジスムターゼ［Ｃｕ−Ｚｎ］（ＳＯＤＣ）から選択され得る。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。
【００３９】
本発明によるｈＯＭＳＣ由来セクレトームは、その中でそれらが増殖される、または維持される培地中に分泌または放出される物質を含む。このような培地を本明細書では訓化培地と呼ぶ。
【００４０】
いくつかの実施形態では、ｈＯＭＳＣ由来セクレトームおよび無細胞組成物は細胞外小胞（ＥＶ）を含む。
【００４１】
いくつかの実施形態では、ｈＯＭＳＣ由来セクレトームおよび無細胞組成物は微小胞を含む。
【００４２】
別の実施形態では、ｈＯＭＳＣ由来セクレトームおよび無細胞組成物はエキソソームを含む。
【００４３】
いくつかの実施形態では、ｈＯＭＳＣ由来セクレトームおよび無細胞組成物は、微小胞とエキソソームとを含む。
【００４４】
いくつかの実施形態では、組成物ｈＯＭＳＣ由来セクレトームおよび無細胞組成物は可溶性因子を含む。
【００４５】
いくつかの実施形態では、可溶性因子は、タンパク質、ペプチド、ホルモン、ＤＮＡおよびＲＮＡ種、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドならびにその組合せからなる群より選択される。
【００４６】
いくつかの実施形態では、可溶性因子は、分子の大きさが１，０００ダルトン（Ｄａ）以上の分子である。
【００４７】
いくつかの特定の実施形態では、可溶性因子は、分子の大きさが、例えば、１，０００〜１０，０００Ｄａ；１，０００〜３０００Ｄａ；１，０００〜５，０００Ｄａ；２，０００〜６，０００Ｄａ；５，０００〜１０，０００Ｄａ；７，０００〜１０，０００Ｄａ，１０，０００〜３０，０００Ｄａ；１０，０００〜５０，０００Ｄａなどである、またはさらに大きい分子の大きさを有する、分子である。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。
【００４８】
いくつかの実施形態では、当該技術分野で公知の方法を用いてｈＯＭＳＣの訓化培地を濃縮して、諸成分を訓化培地のものより高い濃度で含むｈＯＭＳＣセクレトームを得る。
【００４９】
いくつかの実施形態では、セクレトームは、セクレトームの内容に影響を及ぼす刺激または条件に曝したｈＯＭＳＣに由来する。
【００５０】
いくつかの実施形態では、刺激または条件としては、特に限定されないが、化学的刺激、物理的刺激、基質刺激および／または生物学的刺激が挙げられる。
【００５１】
いくつかの実施形態では、無細胞組成物は、ｈＯＭＳＣ由来セクレトームを薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤とともに含む、医薬組成物である。
【００５２】
いくつかの実施形態では、無細胞組成物は、ｈＯＭＳＣ由来セクレトームを美容用途に適した許容される担体、賦形剤または希釈剤とともに含む、美容用組成物である。
【００５３】
いくつかの実施形態では、ｈＯＭＳＣ由来セクレトームを含む無細胞組成物は、組織リモデリングまたは組織再生での使用のためである。
【００５４】
いくつかの実施形態では、創傷治癒の促進、瘢痕形成の予防もしくは軽減、瘢痕治癒の促進または軟骨もしくは骨形成の促進での使用のために、本発明による医薬組成物が提供される。
【００５５】
いくつかの実施形態では、ｈＯＭＳＣ由来セクレトームの無細胞組成物は、糖尿病性創傷治癒の促進または加速での使用のためである。
【００５６】
本発明は、別の態様では、ｈＯＭＳＣ由来の無細胞セクレトームを作製する方法を提供し、この方法は、
ｉ．外植または酵素消化によってｈＯＭＳＣを単離する段階；
ｉｉ．ｈＯＭＳＣを培養培地中で拡大する段階；
ｉｉｉ．培地を基本培地に置き換える段階；
ｉｖ．ｈＯＭＳＣを基本培地中で１時間〜１２０時間の範囲の一定時間にわたって培養する段階；
ｖ．培養物から培地を回収する段階；および
ｖｉ．任意選択で、培地を１．１〜１０，０００倍に濃縮する段階
を含む。
【００５７】
いくつかの実施形態では、単離されるｈＯＭＳＣはナイーブ細胞である。
【００５８】
いくつかの実施形態では、段階（ｉｖ）で、またはその後に、ｈＯＭＳＣをセクレトームの内容に影響を及ぼす刺激または条件に曝す。いくつかの実施形態では、上記刺激は、化学的刺激、物理的刺激、基質刺激または生物学的刺激からなる群より選択される。
【００５９】
セクレトームおよび無細胞組成物の作製のために本発明に従って使用されるナイーブｈＯＭＳＣまたは刺激ｈＯＭＳＣは、未分化状態にて組織培養で維持され拡大される。
【００６０】
ｈＯＭＳＣ由来セクレトームを含む医薬無細胞組成物および美容用無細胞組成物は、機械的外傷、化学的損傷、放射線照射および熱または任意の他のタイプの医原性損傷によって全体または一部が破壊された器官および組織の修復および再生のために、本発明に従って使用され得る。このような損傷の例としては、特に限定されないが、中枢神経系の挫傷、脊椎損傷、脊髄切断、末梢神経の挫滅または切断、熱傷、化学療法によるニューロパチーおよび心臓病、骨折、腱および靭帯の断裂が挙げられる。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。
【００６１】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、自家ｈＯＭＳＣに由来するセクレトームを含み、すなわち、治療を受ける個人がセクレトーム作製のためのｈＯＭＳＣのドナーとしての役割を果たす。
【００６２】
別の実施形態では、本発明の組成物は、同種ｈＯＭＳＣに由来するセクレトームを含み、すなわち、患者と無関係なドナーがセクレトーム作製のためのｈＯＭＳＣのドナーとしての役割を果たす。
【００６３】
また別の態様では、本発明は、それを必要とする対象にｈＯＭＳＣ由来セクレトームを含む無細胞組成物を投与することを含む疾患または障害を予防または治療する方法を提供する。
【００６４】
幹細胞での予防または治療に適したいずれの疾患または障害も、本発明による組成物で治療または予防され得る。
【００６５】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物での予防または治療に適した疾患または障害は、
ｉ．炎症性疾患（例えば、変形性関節症）；
ｉｉ．自己免疫疾患（例えば、関節リウマチ、強皮症）；
ｉｉｉ．血管疾患（例えば、動脈炎／バージャー病）；
ｉｖ．心疾患（例えば、心筋梗塞、慢性心不全）；
ｖ．呼吸器系疾患（例えば、慢性閉塞性肺疾患、特発性肺線維症）；
ｖｉ．骨格系疾患（例えば、骨再生、無血性壊死、骨髄炎、軟骨修復、腱修復、筋ジストロフィー）；
ｖｉｉ．消化管疾患（例えば、瘻孔、潰瘍、食道狭窄、肝硬変、失禁、クローン病）；
ｖｉｉｉ．腎疾患（例えば、腎障害）；
ｉｘ．尿路（例えば、失禁）；
ｘ．皮膚疾患（例えば、足潰瘍、表皮水疱症、天疱瘡、糖尿病性潰瘍、静止静脈潰瘍、慢性褥瘡）；
ｘｉ．老化関連疾患；
ｘｉｉ．末梢神経および骨格筋疾患（例えば、慢性炎症性脱髄性多発神経根ニューロパチー、ギラン・バレー症候群、筋ジストロフィー）；
ｘｉｉｉ．中枢神経系の疾患（例えば、神経変性疾患、例えば脱髄性疾患（多発性硬化症］、アルツハイマー病、パーキンソン病、球脊髄萎縮症など、脳卒中、脊髄虚血、多系統萎縮症としての自律神経系の疾患）；
ｘｉｖ．眼疾患（例えば、網膜症［加齢黄斑変性症、糖尿病性網膜症、動脈硬化性網膜症）、視神経炎）；
ｘｖ．内分泌系の疾患（例えば、糖尿病およびその合併症：［血管障害、ニューロパチー、慢性潰瘍、腎障害］）；ならびに
ｘｖｉ．歯科口腔疾患（例えば、歯髄関連疾患、歯周病、歯槽骨欠損、免疫疾患を原因とする口腔粘膜潰瘍）
からなる群より選択される。
【００６６】
それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。
【００６７】
特定の実施形態では、障害は糖尿病性創傷である。
【００６８】
いくつかの実施形態では、障害は美容障害である。
【００６９】
いくつかの実施形態では、治療の方法は、組織リモデリング、組織修復または組織再生を含み、それを必要とする対象にｈＯＭＳＣ由来セクレトームを含む無細胞組成物を投与することを含み、上記組成物は、医薬組成物または美容用組成物であり得る。
【００７０】
いくつかの実施形態では、それを必要とする対象にｈＯＭＳＣ由来セクレトームを含む無細胞組成物を投与することを含む、糖尿病性創傷治癒を促進または加速するための方法が提供される。
【００７１】
また別の態様では、本発明は、本発明によるヒト口腔粘膜幹細胞（ｈＯＭＳＣ）から分泌される物質を含む少なくとも１つの無細胞組成物を投与することを含む、組織の修復および再生のための方法を提供する。
【００７２】
いくつかの実施形態では、修復または再生の方法は、機械的外傷、化学的損傷、放射線照射および熱または任意の他のタイプの医原性損傷によって全体または一部が破壊された器官および組織に対するものである。このような損傷の例としては、特に限定されないが、中枢神経系の挫傷、脊椎損傷、脊髄切断、末梢神経の挫滅または切断、熱傷、化学療法によるニューロパチーおよび心臓病、骨折、腱および靭帯の断裂が挙げられる。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。
【００７３】
いくつかの実施形態では、組織の修復または再生は、創傷治癒、変性疾患、先天性の欠損、老化に関連する欠損および医原性の欠損からなる群より選択される病態、疾患または障害に関連する。
【００７４】
特定の実施形態では、幹細胞は、同種幹細胞または自家幹細胞である。
【００７５】
本発明の組成物は、特に限定されないが、局所、皮下、筋肉内、静脈内、動脈内、関節内、病巣内、腫瘍内または非経口を含む任意の適切な投与経路によりそれを必要とする対象に投与され得る。いくつかの実施形態では、創傷治癒に対し、局所投与を用い得る。したがって、用いる具体的な投与経路に適合するよう本発明による医薬組成物および美容用組成物を製剤化する。例えば、局所投与のために、当該技術分野で公知の方法を用いて、組成物をクリーム剤、泡状剤、ゲル剤、ローション剤および軟膏剤として製剤化し得る。
【００７６】
いくつかの実施形態では、組成物を損傷組織に局所投与する。
【００７７】
ｈＯＭＳＣ由来セクレトームを含む本発明による組成物を任意の治療レジメンに従って損傷組織に投与し得る。例えば、組成物を同じまたは異なる部位に１回または複数回投与し得る。
【００７８】
いくつかの実施形態では、ｈＯＭＳＣ由来セクレトームを含む本発明の無細胞組成物を、少なくとも１つの追加の医薬用または美容用の薬剤または治療法を含む治療レジメンの一環としてそれを必要とする対象に投与する。
【００７９】
幹細胞に関して先行技術で知られている、または考えられる実質的にあらゆる使用をｈＯＭＳＣに由来する本発明セクレトームで実施することができる。これらの使用は、予防技術および治療技術を含む。
【００８０】
のちに記載される詳細な説明から本発明のさらなる実施形態および適用性の全範囲が明らかになるであろう。ただし、詳細な説明および具体例は、本発明の好ましい実施形態を示すものであって、当業者にはこの詳細な説明から、本発明の趣旨と範囲に含まれる様々な変更および修正が明らかになるため、単に例示を目的として記載されるものであることを理解するべきである。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】ｈＯＭＳＣの幹細胞マーカープロファイルと包皮幹細胞（ｈ皮膚）の幹細胞マーカープロファイルの間の比較を示す図である。結果は、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに対する−ΔＣｔ（サイクル閾値）値として表される。負の値が大きいことは発現レベルが低いことを意味する。
【図２】多能性幹細胞マーカーおよび神経堤関連幹細胞マーカーに対する抗体を用いた免疫蛍光染色からのｈＯＭＳＣセクレトームとｈ皮膚ＳＣセクレトームの間のタンパク質発現の相対的差を示す図である。
【図３】選択したマーカーのｈＯＭＳＣとｈ皮膚ＳＣでの発現比を示す図である。
【図４】若年ヒト骨髄から得た間葉系幹（間質）細胞のセクレトームのタンパク質発現を示す図である。Ｐａｒｋら，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，２００９から引用したデータ。
【図５】左上パネルは、創傷前の糖尿病ｄｂ／ｄｂマウスの背側皮膚に縫合したドーナツ状環を示す図である。右上パネルは、創傷直後の部位を示す図である。左下パネルは、真皮内注射の部位を示す図である。右下パネルは、組織像または切除した皮膚を示す図である。
【図６Ａ】ｈＯＭＳＣもしくはｈ皮膚ＳＣまたはＰＢＳ溶媒（未処置）で処置したｄｂ／ｄｂ糖尿病マウスのグループの糖尿病性創傷治癒の速度を示す定量的写真（６Ａ）および代表的な定性的写真（６Ｂ）を示す図である。
【図６Ｂ】ｈＯＭＳＣもしくはｈ皮膚ＳＣまたはＰＢＳ溶媒（未処置）で処置したｄｂ／ｄｂ糖尿病マウスのグループの糖尿病性創傷治癒の速度を示す定量的写真（６Ａ）および代表的な定性的写真（６Ｂ）を示す図である。
【図７】ｈＯＭＳＣで処置したｄｂ／ｄｂ糖尿病マウス、ｄｂ／ｄｂ糖尿病未処置マウスまたは野生型（ＷＴ）未処置マウスのグループの糖尿病性創傷治癒の速度の定量的な図である。
【図８】ＷＴ未処置マウス、ＷＴ−ｈＯＭＳＣ処置マウス、ｄｂ／ｄｂ未処置マウス、ｄｂ／ｄｂ−ｈＯＭＳＣ処置マウスおよびｄｂ／ｄｂ  ｈＡＤＳＣ（ヒト脂肪組織由来幹細胞）処置マウスでの創傷完全閉鎖に必要とされた平均時間を示す図である。算出したｔ検定ｐ値は、ＷＴ未処置対ｄｂ−ｈＯＭＳＣ＝０．１９５３３；ｄｂ−ｈＯＭＳＣ処置対ｄｂ未処置＝５．３４Ｅ−６；ｄｂ−ｈＯＭＳＣ処置対ｄｂ−ｈＡＤＳＣ処置＝０．０００４４；ｄｂ未処置対ｄｂ−ｈＡＤＳＣ処置＝．４８９８３；ＷＴ未処置対ｄｂ−ｈＯＭＳＣ処置＝１．９９３３Ｅ−５；ＷＴ未処置対ｄｂ未処置＝２．２６２Ｅ−５である。
【図９】ｈＯＭＳＣ、ｈ皮膚ＳＣ、ｈＡＤＣＳまたはＰＢＳ溶媒（未処置）で処置したｄｂ／ｄｂ糖尿病マウスのグループでの糖尿病性創傷治癒の速度の定量的な図である。
【図１０】ｈＯＭＳＣ、ｈＯＭＳＣ由来無細胞セクレトーム、ｈ皮膚幹細胞またはＰＢＳ溶媒（未処置）で処置したｄｂ／ｄｂ糖尿病マウスのグループでの糖尿病性創傷治癒の速度の定量的な図である。
【図１１】質量分光光度法によって同定された３６９種類のｈＯＭＳＣセクレトームタンパク質およびそれらの平均相対存在量（強度）を示す図である。
【図１２】ＢＭＳＣ、ＡＳＣまたはＤＰＳＣのいずれかに由来するセクレトームで挙げられている１５３４種類のタンパク質に共通する２９４種類のｈＯＭＳＣセクレトームタンパク質を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００８２】
（発明の詳細な説明）
本発明は、疾患および障害の治療および予防のためのヒト口腔粘膜由来成体幹細胞のセクレトームを提供する。
【００８３】
ｈＯＭＳＣは、発達するコロニー中で多能性マーカーＯｃｔ４、ＮａｎｏｇおよびＳｏｘ２ならびにＮＣ−ＳＣマーカーＳｎａｉｌ、Ｓｌｕｇ、Ｓｏｘ１０、ＴｗｉｓｔおよびＮｏｔｃｈ１を共発現する神経堤（ＮＣ）由来幹細胞型の１つである（Ｍａｒｙｎｋａ−Ｋａｌｍａｎｉら，２０１０；Ｗｉｄｅｒａら，２００９）。ＮＣは、脊椎動物胚の一過性の神経外胚葉構造である。ＮＣが胚に存在する間にそれは様々な始原組織に定着する移動性の複能性幹細胞を生じ、そこでこれらの細胞は神経細胞系および／または外胚葉性間葉組織または中外胚葉と呼ばれる間葉表現型を有する細胞系に分化する。これらのＮＣ−ＳＣの一部は、成体中で比較的分化の進んでいない状態のままであり、真皮および骨髄などの間葉系起源の組織中でも神経分化の傾向を示す。
【００８４】
典型的な全成体集団は少量の幹細胞を含み、このため、幹細胞の拡大および単離には労力および時間がかかり、通常、効率的でない。口腔粘膜の固有層に由来する初代全集団および拡大された全細胞集団は主として（８０％超）ナイーブ幹細胞からなることが明らかになった。３例の異なるドナーの口腔粘膜から得た細胞集団の大部分（８０〜９０％）は間葉系幹細胞マーカーを発現することが示された。Ｍａｒｙｎｋａ−Ｋａｌｍａｎｉら，２０１０（同上）の研究は、ごくわずかな罹患率で採取される３〜４×２×１ｍｍの生検試料から数兆個のｈＯＭＳＣがコスト効率よく再現可能な方法で得られることを示した。
【００８５】
臨床利用のために固形組織から幹細胞を単離する典型的な方法は、酵素消化または外植によって細胞外マトリックスから細胞を放出すること；十分に大きな集団を得るため初代全集団を拡大すること；および全集団から幹細胞を単離することを含む。
【００８６】
口腔粘膜固有層由来の単離幹細胞集団の質および量は老化による影響をあまり受けず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでその多能性を失わずに拡大でき、したがって、それを必要とする対象に再び投与して効果的に組織再生およびその他の治療過程をもたらすのに安全で信頼できるセクレトームの供給源である。
【００８７】
定義
口腔粘膜は、口腔、すなわち、歯肉および口蓋を含む頬および歯槽堤、舌、口腔底ならびに口唇の口腔部分を覆う粘膜である。口腔粘膜は、外胚葉起源の上皮組織と、外胚葉性間葉起源の結合組織である固有層（ＬＰ）とからなる。口腔内の結合組織が外胚葉性間葉起源であるのと同じように、口腔粘膜固有層（ＯＭＬＰ）の細胞は胚外胚葉性の神経堤を起源とする。ヒト口腔粘膜の創傷は主として再生により治癒する。治癒速度は皮膚またはその他の結合組織よりも速く、年齢および性別によって受ける影響はごくわずかであると思われる（Ｓｚｐａｄｅｒｓｋａ，Ａ．Ｍ．ら，Ｊ  Ｄｅｎｔ  Ｒｅｓ，２００３，８２，６２１−６２６）。
【００８８】
「幹細胞」（ＳＣ）は、一連の成熟機能性細胞を生じさせることができる未分化細胞である。
【００８９】
「胚性幹（ＥＳ）細胞」は、胚の胚盤胞の内部細胞塊に由来し、多能性であり、したがって、任意の器官もしくは組織タイプに、または少なくとも潜在的に、完全な胚へと発達する能力を有する細胞である。
【００９０】
「成体幹細胞」は、出生後の生物体の組織、器官または血液に由来する生後の幹細胞である。
【００９１】
「多能性幹細胞」は、３種類の胚細胞層ならびにそれらの誘導体である細胞系および組織を生じることが可能な幹細胞である。
【００９２】
「複能性幹細胞」は、組織または器官全体を構成する複数の細胞系を形成することが可能な幹細胞である。
【００９３】
本発明によるセクレトームは、ヒト口腔粘膜由来幹細胞から培地中に分泌または放出される可溶性物質および不溶性物質をそれらの様々な形態で含む、組成物である。これらの物質はとりわけ、以下のものを含む：
２．
ａ．タンパク質
ｂ．ペプチド
ｃ．ホルモン
ｄ．様々なＤＮＡおよびＲＮＡ種
ｅ．核酸のオリゴマー
ｆ．分子量１，０００ダルトン超のその他の分子
などの可溶性分子
３．
ａ．タンパク質：成長因子、サイトカイン、ホルモン、細胞表面受容体、細胞質タンパク質および核タンパク質、代謝酵素、受容体リガンド、接着タンパク質、エンドソーム関連タンパク質、テトラスパニン、脂質ラフト関連タンパク質、抗原など
ｂ．ＲＮＡ種：ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡおよびｌｎｃＲＮＡならびに考え得るその他のＲＮＡ種
ｃ．ＤＮＡ：ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）
ｄ．脂質：コレステロール、スフィンゴミエリン、ヘキソシルセルミド（ｈｅｘｏｓｙｌｃｅｒｍｉｄｅ）およびその他
ｅ．レクチン、グリカン、プロテオグリカン、糖タンパク質
を含有する細胞外小胞。
【００９４】
細胞外小胞は、上記の可溶性物質および不溶性物質のカーゴを運搬する膜結合粒子である。「細胞外小胞」という用語は、様々な種の分泌小胞または脱落小胞のグループを指す。これらは以下のサブタイプに分けられる（Ｘｕら，ＪＩＣ  ２０１６）：
１．微小胞または脱落微小胞；大きさの範囲−５０〜１５００ｎｍ
２．エキソソーム；大きさの範囲−３０〜１２０ｎｍ
３．小胞；大きさの範囲＜５００ｎｍ。
【００９５】
培地または拡大培地は、その中でｈＯＭＳＣを培養し拡大する培地である。本発明のいくつかの実施形態による培養／拡大培地は、以下の成分、すなわち、低グルコースダルベッコ改変イーグル培地（ＬＧＤＭＥＭ）、ストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシン、アンホテリシンＢ、グルタミンおよび血清、例えばウシ胎児血清（ＦＣＳ）の少なくとも１つを含む。
【００９６】
いくつかの実施形態では、培養拡大培地は、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社、ベテ・ハエメク、イスラエル）、グルタミン２ｍＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）および１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ、Ｇｉｂｃｏ社）を添加した低ＬＧＤＭＥＭを含む。
【００９７】
基本培地は、血清を含まない培地である。
【００９８】
本発明による訓化培地は、その中でｈＯＭＳＣが増殖される、または維持される培地中に分泌または放出されたｈＯＭＳＣ由来物質を含むｈＯＭＳＣ培養物から収集した培地を指す。
【００９９】
ｈＯＭＳＣセクレトームを含む訓化培地を任意選択で、当該技術分野で公知の方法を用いて濃縮して、セクレトーム成分の濃度を上昇させた後、例えば凍結状態で保存し得る。あるいは、訓化培地を凍結乾燥させ、セクレトームを凍結粉末として保存し、注射用水もしくは生理食塩水またはその他の当該技術分野で公知の溶液で注射用に再構成することができる。
【０１００】
セクレトームまたは凍結乾燥セクレトームを含有する濃縮訓化培地は当該技術分野で公知の任意の添加剤または保存剤を添加された後、いくつかの実施形態による条件および温度で保管されて諸物質をそれらの本来の効果的な形態で維持し得る。
【０１０１】
本発明のセクレトームを、よく知られているように、薬学的に許容され、セクレトームの成分と適合性のある少なくとも１つの賦形剤または担体と混合し得る。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、Ｐｌａｓｍａ  Ｌｙｔｅ、デキストロース、グリセロール、エタノール、ポリエチレングリコール、ミネラル化賦形剤、例えばヒドロキシアパタイト粒子およびリン酸三カルシウムのパテまたは粒子など、ならびにその組合せである。賦形剤および担体は、細胞外マトリックス成分、例えば、タンパク質（コラーゲン、エラスチン、接着タンパク質、例えばフィブロネクチン、ビトロネクチン、アルブミンなど）；糖タンパク質（オステオポンチン、骨シアロタンパク質、トロンボンスポンジン（ｔｈｒｏｍｂｏｎｓｐｏｎｄｉｎ）、テネイシンなど）；プロテオグリカンおよびグリコセアミノグリカン（ｇｌｙｃｏｓｅａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ）（ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸など）なども含み得る。その他の適切な賦形剤および担体は当業者に周知である。
【０１０２】
さらに、組成物は必要に応じて、乳化剤、ｐＨ緩衝剤などの補助物質を少量含有し得る。
【０１０３】
本明細書で使用される「治療」という用語は、治療的処置および予防的手段の両方を指す。治療を必要とする者は、既に障害を有する者および障害が予防されるべき者を含む。
【０１０４】
対象に組成物を「投与すること」または対象への組成物の「投与」という用語は、当業者に公知の様々な方法の１つを用いて実施し得る。例えば、組成物を経腸的に、または非経口的に投与できる。経腸的には、経口、舌下または直腸内を含む消化管経由の投与を指す。非経口投与としては、静脈内投与，皮内投与，筋肉内投与，腹腔内投与，皮下投与，眼内投与，舌下投与，鼻腔内投与，吸入による投与，脊髄内投与，脳内投与および経皮投与（例えば皮膚の管からの吸収による）が挙げられる。組成物を再充電可能な、もしくは生分解性のポリマー製装置もしくはその他の装置、例えば、パッチおよびポンプ、または化合物もしくは薬剤の持続放出、徐放もしくは制御放出をもたらす製剤によって適宜導入してもよい。投与を例えば、１回、複数回および／または１つもしくは複数の長い期間にわたって実施してもよい。いくつかの実施形態では、投与は、自己投与を含む直接投与および薬物処方の行為を含む間接投与をともに含む。例えば、本明細書で使用される場合、患者に薬物を自己投与するよう指示する、あるいは別の者および／または患者に薬物の処方箋を提供する者に薬物を投与してもらうよう指示する医師が患者に薬物を投与する。
【０１０５】
以下の実施例は、本発明の化合物および方法を作製および使用する方法を説明することを意図するものであり、決して制限するものとして解釈されるべきではない。これより、本発明をその特定の実施形態とともに記載するが、当業者には多数の修正および変形が明らかになるのは明白である。したがって、添付の「特許請求の範囲」の趣旨および広い範囲に含まれるこのような修正形態および変形形態がいずれも包含されるものとする。
【０１０６】
（実施例）
以下に記載する結果は、部分的には、口腔を覆う口腔粘膜の不可欠な部分であるヒト歯肉の固有層（上皮部分は含まない）に由来する細胞集団のセクレトームから得られたものである。口蓋および歯槽粘膜から単離したｈＯＭＳＣは同じ特性を示す。
【０１０７】
ｈＯＭＳＣの単離および培養
具体的には年齢２５〜８０歳のドナーの歯肉起源の口腔粘膜生検試料から、上および国際公開第２００８／１３２７２２号に記載されている通りにｈＯＭＳＣを入手した。
【０１０８】
簡潔に述べれば、３〜４×２×１ｍｍの歯肉粘膜または歯槽粘膜の生検試料を細切し、Ｍａｒｉｎｋａ−Ｋａｌｍａｎｉら２０１０（同上）によって記載されている通りに、２５ｃｍ２の組織培養フラスコ中、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社、ベテ・ハエメク、イスラエル）、グルタミン２ｍＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）および１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｇｉｂｃｏ社）を添加した低グルコースダルベッコ改変イーグル培地（ＬＧＤＭＥＭ）で外植片を培養した。この培地を培地または拡大培地と呼ぶ。いくつかの場合には、ストレプトマイシンおよびペニシリンをゲンタマイシンに置き換え、拡大培地中にはアンホテリシンＢも含まれる。
【０１０９】
セクレトーム生成
拡大培地で拡大し、累積集団倍加数が５〜８０であるｈＯＭＳＣの培養物をｈＯＭＳＣセクレトームの生成に用いる。拡大培地を除去し、培養物をＰＢＳで十分に洗浄し、次いで、基本培地またはＬＧＤＭＥＭを加える。２４〜１２０時間後に、培地を収集し、遠心分離して死細胞をすべて除去する。上清はセクレトームを含む。
【０１１０】
当該技術分野で公知の装置および方法を用いて上清を濃縮することにより、セクレトーム成分の濃度を上昇させることができる。本明細書に示されるように、いくつかの実施形態では、１．１〜１０，０００倍の範囲の濃度比が所望の治療効果を得るのに有用かつ効果的であると考えられる。
【０１１１】
タンパク質および分子レベルでのアレイ解析は、ｈＯＭＳＣセクレトームが、皮膚由来幹細胞および骨髄由来幹細胞を含む他の供給源に由来する幹細胞セクレトームではこれまでみられなかった特有の組成的特徴を有することを示す。
【０１１２】
ｈＯＭＳＣを様々な培養条件および刺激に供することによって、セクレトームの組成を変化させ得る。このような培養刺激および条件の例としては、特に限定されないが、以下のものが挙げられる：
・化学的なもの：例えば、低酸素、高酸素、化学薬品、様々な種類の化学的刺激因子もしくは阻害剤または様々な経路、例えばＣａ＋＋などの高イオンもしくは低イオン濃度および／またはグルコース、スタチン、ビスホスホナートのような様々な化学薬品など；
・物理的なもの：例えば、超音波、機械的振動、電気刺激、連続的または断続的な歪み、光、放射線；
・基質：例えば、接着タンパク質、三次元マトリックス、懸濁細胞培養用のビーズ；
・生物学的なもの：例えば、成長因子、サイトカイン、ホルモン刺激、分化因子、ＤＮＡおよびＲＮＡ種、遺伝的操作。
【０１１３】
実施例１．ｈＯＭＳＣの幹細胞マーカーとそれらのまたはその他の供給源の比較
ｈＯＭＳＣを既に記載されている通りに入手した（Ｍａｒｙｎｋａ−Ｋａｌｍａｎｉら，２０１０および国際公開第２００８／１３２７２２号）。８日齢の乳児の包皮から酵素消化によって包皮ＳＣ（ｈ皮膚ＳＣ）を単離した。両細胞型ともＴ−７５細胞フラスコ中にて、必須アミノ酸、抗生物質およびウシ胎児血清を添加した低グルコースＤＭＥＭで増殖させた。
【０１１４】
ｈＯＭＳＣおよび包皮幹細胞（ｈ皮膚ＳＣ）の幹細胞マーカーをＲＴ−ＰＣＲおよび免疫化学によって評価した（Ｍａｒｉｎｋａ−Ｋａｌｍａｎｉら，２０１０，同上および未発表データ）。
【０１１５】
図１に示されるように、ｈＯＭＳＣは、ｈ皮膚ＳＣより多能性関連マーカーおよび神経堤関連マーカーの発現が高い。
【０１１６】
マーカーＯＣＴ４、ＳＯＸ２およびＮＡＮＯＧは特徴的な多能性関連マーカーであり、ｃ−ＭＹＣおよびＫＬＦ４はともに多能性関連マーカーおよび初期神経堤マーカーであり、ＳＮＡＩＬは特徴的な神経堤幹細胞マーカーである。
【０１１７】
多能性関連幹細胞マーカーおよび神経堤関連幹細胞マーカーに対する抗体を用いた免疫蛍光法により分子データをタンパク質レベルで確認し、ｈＯＭＳＣの方がｈ皮膚ＳＣよりマーカーＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、Ｃ−ＭＹＣ、ＫＬＦ４およびＳＮＡＩＬの存在量が多いことがわかった。また、ｈＯＭＳＣの染色が核に限定されていることも明らかになり、これらの転写因子の機能的活性が示唆された。したがって、ｈ皮膚ＳＣと比べｈＯＭＳＣで上記マーカーの発現が明らかに高いと結論付けられる。
【０１１８】
実施例２．ｈＯＭＳＣセクレトームの網羅的解析
ｈＯＭＳＣセクレトームのタンパク質および核酸の内容を明らかにすることにより、ｈＯＭＳＣセクレトームに特有の特徴を確認する。３種類の異なる方法、すなわち、タンパク質アレイ、質量分光光度法（ＭＳ）およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）による特徴付けを用いて、広範囲にわたるｈＯＭＳＣセクレトーム成分を得る。
【０１１９】
上記の通りにｈＯＭＳＣを作製し、拡大培地で拡大する。馴化培地でのタンパク質プロファイルを質量分光光度法および市販のタンパク質アレイキットによって評価した。当該技術分野で知られている方法を用い、ｈＯＭＳＣセクレトーム中に含まれるＲＮＡの配列の特定を実施して、ｈＯＭＳＣセクレトームの遺伝子カーゴを決定する。
【０１２０】
タンパク質プロファイル
ｈＯＭＳＣセクレトームのタンパク質の内容をＭＳおよびタンパク質アレイによって解析した。
【０１２１】
ＭＳ解析：それぞれが別個のドナーに由来する４つの異なるｈＯＭＳＣ培養物の４つのセクレトームを上記の通りに調製する。試料０．１ｍｌをトリプシンによって消化し、Ｑ  ｅｘａｃｔｉｖｅ  ｐｌｕｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社）でＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより解析し、ヒトおよびウシのｕｎｉｐｒｏｔデータベース（ウシ胎児血清に関するもの）に対してＤｉｓｃｏｖｅｒｅｒソフトウェアバージョン１．４により解析する。同定されたタンパク質を、標的−デコイ戦略を用いてペプチドレベルおよびタンパク質レベルで偽発見率（ＦＤＲ）＜０．０１のフィルターにかける。
【０１２２】
タンパク質をフィルターにかけて、共通の夾雑物および単一ペプチドの同定を排除する。各ペプチドのピーク面積を算出することにより半定量化を実施した。タンパク質の面積は各タンパク質からの最も強度の高い３つのペプチドの平均値である。
【０１２３】
ｈＯＭＳＣセクレトーム中に計３６９種類のタンパク質が同定され（図１１）、これは、細胞外マトリックスタンパク質、糖タンパク質、タンパク質受容体、細胞外マトリックスタンパク質に対するタンパク質分解酵素およびタンパク質分解酵素阻害因子、代謝に関与するタンパク質、熱ショックタンパク質などのストレス応答に関与するタンパク質、核タンパク質、組織の発生および修復に関与するタンパク質、インテグリンおよびエキソソームマーカーＣＤ６３を含む分化クラスター（ＣＤ）タンパク質などの細胞膜内在性タンパク質、免疫調節タンパク質ならびにその他のタンパク質クラスターを含んだ。
【０１２４】
注目すべきなのは、表１に詳細に記載する、神経系のホメオスタシス、保護および修復に関与する１３種類のタンパク質からなるクラスターである：
【表１】
2020527038.tif 000002
【０１２５】
特に興味深いのは、ｈＯＭＳＣセクレトーム中にＳＯＤ１および中脳星状膠細胞由来神経栄養因子（ＭＡＮＦ）が存在することである。これらのタンパク質は、神経変性疾患の目印であり細胞死の原因である細胞内ストレスを抑制する。さらに、ＭＡＮＦは、動物モデルでのパーキンソン病の治療に有効であることが示されている（Ｖｏｕｔｉｌａｉｎｅｎら，２０１５）。
【０１２６】
ＭＳによって決定されたｈＯＭＳＣセクレトームのタンパク質組成は特有である。ｈＯＭＳＣセクレトームを、ヒトの骨髄（ＢＭＳＣ）、脂肪組織（ＡＳＣ）または歯髄（ＤＰＳＣ）に由来する間葉系幹細胞のセクレトーム（Ｔａｃｈｉｄａら，２０１５）と比較すると、ｈＯＭＳＣセクレトームは、いずれのセクレトームにも検出されないタンパク質を７５種類含むことが見出される。
【０１２７】
同定された７５種類の特有のタンパク質を表２に挙げる：
【表２】
2020527038.tif 000003
【０１２８】
ｈＯＭＳＣセクレトームに特有であるタンパク質ＣＸＣＬ１２は、損傷器官への幹細胞動員に役立ち、神経前駆細胞の増殖および移動を促進することが知られている（Ｗｕら，２００９）。このタンパク質は、ｈＯＭＳＣセクレトーム中に多量に存在し、３６９種類のタンパク質のうち５８位にランク付けされる、すなわち、検出されたタンパク質の上位２０％に入る。
【０１２９】
疾患または損傷を原因とするストレス下にある末梢組織は、ＣＸＣＬ１２を分泌して、骨髄から内皮前駆細胞および間葉系幹（間質）細胞を動員する。損傷を受けた糖尿病組織では、この過程が大幅に抑制される（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓら，２０１５、Ｔｅｐｐｅｒら，２０１０）。ＣＸＣＬ１２を主要な栄養因子として含むｈＯＭＳＣセクレトームの損傷組織での投与は、一般的な個人および特に糖尿病の個人での創傷治癒を促進する。
【０１３０】
図１２に示されるように、計２９４種類のｈＯＭＳＣセクレトームタンパク質は、ＢＭＳＣ、ＡＳＣまたはＤＰＳＣに由来するセクレトームで挙げられる１５３４種類のタンパク質に共通する。一方、セクレトームに特有の特徴は、その成分によってだけでなく、これらの成分の相対存在量によっても求められる。例えば、成長因子のインスリンファミリーに属し組織のホメオスタシスおよび修復において多面的な機能を有するインスリン成長因子２（ＩＧＦ２）は、ｈＯＭＳＣセクレトームの主要成分の１つであるが、ＢＭＳＣではほとんど検出されず、ＡＳＣおよびＤＰＳＣでは全く検出されない。
【０１３１】
タンパク質アレイ：８０種類のタンパク質のタンパク質アレイキット（ＲａｙＢｉｏ（登録商標）Ｇ−Ｓｅｒｉｅｓ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ａｒｒａｙ、ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ社、米国）により、ｈＯＭＳＣのセクレトームのタンパク質成分をさらに解析し、ｈ皮膚ＳＣのものと比較した。タンパク質解析は、ｈ皮膚ＳＣのセクレトームと比較してｈＯＭＳＣセクレトームで過剰発現または過小発現される少なくとも２１種類のタンパク質の分泌に差があることを明らかにした（図２および３）。注目すべきなのは、ｈ皮膚ＳＣと比較して存在量の多いサイトカインであるタンパク質ＰｌＧＦ、ＭＳＣＦ、ＶＥＧＦおよびＨＧＦならびに存在量の少ないタンパク質レプチン、ＥＮＡ−７８およびＭＣＰ−３である。
【０１３２】
ｈＯＭＳＣおよびｈ皮膚ＳＣのセクレトームを、上記のｈＯＭＳＣおよびｈ皮膚ＳＣのセクレトームを明らかにするために使用された同じ抗体アレイキットを使用した若年ヒト骨髄由来のヒト間葉系幹細胞に関して公開されているもの（Ｐａｒｋら，２００９）とさらに比較した。検出下限の値が５０であることを考慮に入れると、図２および４の比較は、成長因子および神経栄養性作用物質のＰｌＧＦ、ＥＧＦ、ＳＤＦ−１、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＩＧＦ１、アンジオゲニンならびにその他の多数の物質が骨髄由来間葉系幹細胞のセクレトームでは検出されないが、ｈＯＭＳＣでは発現されることを示す。
【０１３３】
因子および作用物質のいくつか、例えばＨＧＦなどはｈＯＭＳＣで高発現される。ｈＯＭＳＣセクレトームと皮膚ＳＣのセクレトームの間の差が図３に示され、これはｈＯＭＳＣセクレトームと皮膚ＳＣセクレトーム内の様々なケモカインの量の割合を示す。図１〜４に示されるデータは、３種類の幹細胞型が被験タンパク質に関して異なる分泌プロファイルを有することをはっきり示す。
【０１３４】
マイクロＲＮＡ解析：濃縮段階を実施しないこと以外はセクレトームの調製に関して上に記載した通りに、それぞれ異なるドナーに由来する３つの異なるｈＯＭＳＣ培養物から訓化培地を収集した。訓化培地を１２０００Ｇ、４℃で４分間遠心分離し、以下の手順に従って全ｍｉＲＮＡを抽出した：
１．試料１０ｍｌにＴｒｉｚｏｌ（商標）試薬７ｍｌを加え、ボルテックスする。次いで、試料を室温で５分間静置する。
２．クロロホルム１．４ｍｌを加え、試料を１５秒間、激しく振盪する。
３．試料を１５，３００Ｇ、４℃で１５分間遠心分離する。
４．中間相を慎重に避けながら、上部の水相を新たなチューブに移す。
５．ｍｉｒＶａｎａ（商標）ＰＡＲＩＳ  ｍｉＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ（登録商標））を製造業者のプロトコル通りに用いてｍｉＲＮＡを単離する。ｍｉｒＶａｎａ（商標）キットは、連続する２つのＧＦＦを用いる。無ＲＮアーゼ水５０μｌでｍｉＲＮＡを溶離させる。
【０１３５】
ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）光分光光度計（ＮａｎｏｄｒｏｐＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ウィルミントン、デラウェア州、米国）を用いてｍｉＲＮＡの濃度および純度を評価した。表３に示すように、波長依存性の吸光係数が溶液中の全ＲＮＡの微量成分を表す：
【表３】
2020527038.tif 000004
【０１３６】
マイクロＲＮＡ発現の特徴付け
逆転写も増幅も使用せずに、ｎＣｏｕｎｔｅｒ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｐｒｏｂｅｓと呼ばれる分子バーコードを用いることにより８００種類のｍｉＲＮＡを検出する方法であるｎＣｏｕｎｔｅｒ  ｍｉＲＮＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ．ｃｏｍに記載される）を用いて、ｍｉＲＮＡ発現プロファイリングを実施した。特定のｍｉＲＮＡカウント数を全実験試料で算出したＣＶＳ統計値に基づき選択した安定に発現するｍｉＲＮＡに対して正規化するｎＳｏｌｖｅｒ（商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社からの無料ダウンロード）を用いて、またはＳｐｉｋｅ−ｉｎ対照を用いて、全データ解析および正規化を実施した。
【０１３７】
表４に示す正規化データは、それぞれ異なるドナーに由来する３つのｈＯＭＳＣセクレトームで発現する３９種類のｍｉＲＮＡを示す。このｍｉＲＮＡはそれぞれ相対発現値が、上記の方法論を用いる場合に許容される低い方のｍｉＲＮＡ検出閾値である、２０を上回る。
【０１３８】
【表４】
2020527038.tif 000005
【０１３９】
これらの３９種類のｍｉＲＮＡのプロファイルを、骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭＳＣ）および脂肪由来間葉系幹細胞（ＡＳＣ）に関して公開されているプロファイル（Ｂａｇｌｉｏら，２０１５）と比較した。その結果は、ｈＯＭＳＣセクレトームのｍｉＲＮＡプロファイルが特有であることを示す。わずか５種類および３種類のｍｉＲＮＡが、ｈＯＭＳＣセクレトームのｍｉＲＮＡとＢＭＳＣセクレトームおよびＡＳＣセクレトームで検出されたｍｉＲＮＡの間でそれぞれ共有される。ｈＯＭＳＣセクレトームとＢＭＳＣセクレトームが共有する５種類のｍｉＲＮＡのうち３種類がＡＳＣセクレトームとも共有される。したがって、３４種類のｍｉＲＮＡは、治療能が高いと考えられている成人ＢＭＳＣセクレトームおよび成人ＡＳＣセクレトームのｍｉＲＮＡ組成物の中には含まれていない。
【０１４０】
実施例３．創傷治癒におけるｈＯＭＳＣの治療能
糖尿病では、局所および全身のシグナル伝達の異常ならびに創傷治癒の合図に対する不適切な組織応答のため創傷治癒が遅れる。この創傷治癒過程の多因子性の異常は、細胞遊走の遅延、新たな血管および結合組織の形成の低下をもたらす。幹細胞はこれまで、その多因子性のセクレトームにより、最先端の糖尿病性創傷治療手段として提案されてきた。
【０１４１】
レプチン受容体が欠損したトランスジェニックマウス（ｄｂ／ｄｂマウス）は、摂餌量が増加し、その結果、肥満になって２型糖尿病を発症し、ヒトの２型糖尿病と類似した病因を有するものとして用いられた。糖尿病ｄｂ／ｄｂマウスは、既知のマウス糖尿病モデルのなかで皮膚の創傷閉鎖速度が最も遅い（Ｍｉｃｈａｅｌｓ  Ｊら，２００７）。
【０１４２】
糖尿病（血糖＞３００ｍｇ／ｄｃｌ）ｄｂ／ｄｂマウスの背部に直径６ｍｍの全層皮膚創傷を実施した。創傷収縮を防ぐため、創傷の周辺に内径８ｍｍのシリコン製のドーナツ状環を縫合し、肉眼レベルでの創傷閉鎖速度を算出するための標準参照物とした。マウスをそれぞれが５〜１０個体からなる３つのグループ、すなわち、ｉ）細胞送達の溶媒としての役割を果たすＰＢＳを注射する陰性対照群；ｉｉ）ｈＯＭＳＣ処置群；およびｉｉｉ）ｈ皮膚ＳＣ処置群に分けた。等距離にある４つの部位の皮内に５×１０５個／部位の細胞を注射した。２〜４日毎にマウスの写真を撮影して創傷閉鎖速度を決定した。これを実施するため、各個体の各時点での創傷面積を写真の画像解析によって求め、同じ写真上に見られたドーナツ状環の内周を輪郭とする面積を求めることにより創傷面積を正規化した（図５）。
【０１４３】
図６Ａ（定量的結果）および６Ｂ（代表的な定性写真）に示される結果は、ｈＯＭＳＣ処置個体の方が未処置個体（ＰＢＳ溶媒）またはｈ皮膚ＳＣ処置個体より創傷閉鎖までの創傷治癒速度が統計的有意に（ｐ＜０．０５）速いことを示す。ｈＯＭＳＣで処置した全個体の創傷閉鎖が創傷の１６日後に認められたのに対し、未処置群の全個体の創傷完全閉鎖は創傷の２６日後に認められた。さらに、未処置群とｈ皮膚ＳＣ処置群との間に統計的有意差はみられなかった。
【０１４４】
別の試験で、健常未処置野生型（ＷＴ）個体でも自然な創傷治癒速度を検討した。この目的のために、上記と同じ実験設定を用いた。マウスはそれらのｄｂ／ｄｂ対応物と週齢が一致した。
【０１４５】
図７に示されるように、ｈＯＭＳＣ処置マウスの創傷治癒速度はＷＴ未処置マウスとほぼ同じであった。ｈＯＭＳＣで処置したｄｂ／ｄｂ糖尿病マウスの創傷完全閉鎖までの平均時間は１４．３±１．４日であり、ＷＴ未処置マウスの平均時間は１５．１４±１．０６日であり、ｄｂ／ｄｂ糖尿病未処置マウスの平均時間は２２．７５±２．１６であった。以上の結果は、ｈＯＭＳＣには、創傷治癒に対する糖尿病状態の有害な作用を克服し、糖尿病性創傷治癒の速度を正常に戻す能力があることを示す。
【０１４６】
糖尿病性創傷治癒に対するｈ皮膚ＳＣの刺激作用がみられなかったのは驚くべきことであり、そこで、別のＳＣ集団、すなわち、脂肪組織由来幹細胞（ｈＡＤＳＣ）の能力を同じ実験設定で検討した。図８および９に示される結果は、ｈＡＤＳＣ処置マウスの創傷治癒速度はｈＯＭＳＣ処置マウスより統計的有意に低かったが、未処置マウスまたはｈ皮膚ＳＣ処置マウスの創傷治癒速度より高かった（ｐ＜０．０５）ことを示す。それでも、ｈＡＤＳＣで処置した全個体の完全な創傷治癒は、ｈ皮膚ＳＣで処置したマウスの場合と同じく創傷の２４日後に認められた。
【０１４７】
したがって、ナイーブｈＯＭＳＣは糖尿病性創傷治癒を促進する点で他の幹細胞より優れていると結論づけられた。
【０１４８】
実施例４．ｈＯＭＳＣセクレトームの治療能
ｈＯＭＳＣの治療効果が少なくとも部分的にはそれらの特有のセクレトームに起因するかどうかを検討するため、１×１０６個のｈＯＭＳＣを無血清培地で２４時間維持した。
【０１４９】
次いで、培地を収集し、カットオフが１，０００ダルトンの濃縮フィルター（Ａｍｉｃｏｎ社）で濃縮した。濃縮培地は、ＭＳによる解析でナイーブｈＯＭＳＣのセクレトームの成分を含む。このｈＯＭＳＣ由来濃縮訓化培地を実施例２および図５に記載される通りに糖尿病性創傷治癒モデルに注射した。各糖尿病ｄｂ／ｄｂマウスの図５の矢印で示す各部位に、２４時間にわたって２×１０５個のｈＯＭＳＣの分泌を示す訓化培地５０μｌを注射した。したがって、各個体の創傷の周辺に濃縮訓化培地を計２００μｌ注射した。訓化培地の投与は実験期間の初めのみ実施した。マウスを上記の通りに肉眼的に追跡し、閉鎖した時点で屠殺した。シリコン環を含む創傷面積を読み出して処理し、組織学的解析に供した。
【０１５０】
創傷閉鎖速度を図１０に示す。この結果は、濃縮ｈＯＭＳＣ訓化培地内に閉じ込められたｈＯＭＳＣ−セクレトームの１回の投与がｈＯＭＳＣと同等に糖尿病性創傷治癒促進に効果的であったことを示す。治癒した創傷の中央部の血管数およびコラーゲン量の組織形態計測的解析は、ｉ）ｈＯＭＳＣ処置個体でのコラーゲン性結合組織量とｈＯＭＳＣセクレトーム処置個体でのコラーゲン性結合組織量との間に統計的有意差はみられないこと；およびｉｉ）ｈＯＭＳＣセクレトーム処置個体での血管数が未処置個体またはｈ皮膚ＳＣ処置個体より増加し、ｈＯＭＳＣ処置個体より血管数が減少していることを明らかにした。
【０１５１】
いかなる理論にも作用機序にも束縛されることを望むものではないが、諸物質を分泌し続ける幹細胞を用いる治療と比較して、セクレトームを用いる継続的治療または複数回の治療が必要とされることが示唆される。それでも、細胞よりセクレトーム組成物の方が、操作し、特徴付け、維持し、投与するのにより安全かつ容易である。
【０１５２】
結果はまとめて、ｈＯＭＳＣ−セクレトームが、ｈＯＭＳＣの糖尿病性足部潰瘍の治癒を促進する効率を保持しており、したがってそれらを、特にｄｅ  ｎｏｖｏ血管新生が必要とされる場合には常に、自立した治療手段または細胞療法の補助として使用できる可能性を示唆する。
【０１５３】
特定の実施形態に関する上記の説明によって本発明の全般的性質が十全に明らかになるため、他者にも、現在の知識を適用することによって、過度の実験を実施することもなく、一般的概念を逸脱することもなく、このような特定の実施形態を容易に修正し、かつおよび／または様々な用途に適合させることが可能であり、したがって、このような適合および修正は、本開示の実施形態の均等物の意味および範囲に含まれることが理解されるべきであり、そうされることを意図するものである。本明細書で用いられる表現または用語は、説明を目的とするものであって、限定を目的とするものではないことを理解するべきである。開示される様々な機能を実施するための手段、材料および段階は、本発明から逸脱することなく様々な代替形態をとり得る。
【０１５４】
（参考文献）
・Ａｎｔｏｎｙａｋ  ＭＡ，Ｃｅｒｉｏｎｅｅ  ＲＡ（２０１５）Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｐｉｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｔｒａｉｔｓ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅｓ  ａｎｄ  ｅｘｏｓｏｍｅｓ．ＰＮＡＳ  １１２（１２），３５８９−３５９０．
・Ｂａｇｌｉｏ  ＳＲ，Ｒｏｏｉｊｅｒｓ  Ｋ，Ｋｏｐｐｅｒｓ−Ｌａｌｉｃ  Ｄ，．Ｖｅｒｗｅｉｊ  ＦＪ，ＭＰ，Ｚｉｎｉ  Ｎ，Ｎａａｉｊｋｅｎｓ  Ｂ，Ｐｅｒｕｔ  Ｆ，Ｎｉｅｓｓｅｎ  ＨＷＭ，Ｂａｌｄｉｎｉ  Ｎ  ａｎｄ  Ｐｅｇｔｅｌ  ＤＭ（２０１５）．Ｈｕｍａｎ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ−ａｎｄ  ａｄｉｐｏｓｅｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｓｅｃｒｅｔｅ  ｅｘｏｓｏｍｅｓ  ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ｉｎ  ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｖｅ  ｍｉＲＮＡ  ａｎｄ  ｔＲＮＡ  ｓｐｅｃｉｅｓ．６，１２７−１４７．
・Ｄｅｓｒｏｃｈｅｒｓ  ＬＭ，Ａｎｔｏｎｙａｋ  ＭＡ，Ｃｅｒｉｏｎｅ  ＲＡ（２０１６）Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ：Ｓａｔｅｌｌｉｔｅｓ  ｏｆ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  ３７，３０１−３０９．
・ＤｉＰｉｅｔｒｏ  ＬＡ（２００３）．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｉｎｊｕｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｏｒａｌ  ｍｕｃｏｓａｌ  ａｎｄ  ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｗｏｕｎｄｓ．Ｊ．Ｄｅｎｔ．Ｒｅｓ．８２，６２１−６２６．
・Ｇａｎｚ  Ｊ，Ａｒｉｅ  Ｉ，Ｂｅｎ−Ｚｕｒ  Ｔ，Ｄａｄｏｎ−Ｎａｃｈｕｍ  Ｍ，Ｐｏｕｒ  Ｓ，Ａｒａｉｄｙ  Ｓ，Ｐｉｔａｒｕ  Ｓ，Ｏｆｆｅｎ  Ｄ（２０１４）．Ａｓｔｒｏｃｙｔｅ−ｌｉｋｅ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｏｒａｌ  ｍｕｃｏｓａ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｐｒｏｖｉｄｅ  ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．３，３７５−８６．
・Ｇａｎｚ  Ｊ，Ａｒｉｅ  Ｉ，Ｂｕｃｈ  Ｓ，Ｚｕｒ  ＴＢ，Ｂａｒｈｕｍ  Ｙ，Ｐｏｕｒ  Ｓ，Ａｒａｉｄｙ  Ｓ，Ｐｉｔａｒｕ  Ｓ，Ｏｆｆｅｎ  Ｄ（２０１４）．Ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ−ｌｉｋｅ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｏｒａｌ  ｍｕｃｏｓａ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｃｕｅｓ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｓｙｍｐｔｏｍｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｅｍｉ−ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉａｎ  ｒａｔ  ｍｏｄｅｌ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ９（６），ｅ１００４４５．
・Ｇｕｅ  Ｗ．，Ｇａｏ  Ｙ．，Ｌｉ  Ｎ．，Ｓｈａｏ  Ｆ．，Ｗａｎｇ  Ｃ．，Ｗａｎｇ  Ｐ．，Ｙａｎｇ  Ｚ．，Ｌｉ  Ｒ．，ａｎｄ  Ｈｅ  Ｊ．（２０１７）．Ｅｘｏｓｏｍｅｓ：Ｎｅｗ  ｐｌａｙｅｒｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ（Ｒｅｖｉｅｗ）．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ３８：６６５−６７５．
・Ｈｕ  Ｌ，Ｗａｎｇ  Ｊ，Ｚｈｏｕ  Ｘ，Ｘｉｏｎｇ  Ｚ，Ｚｈａｏ  Ｊ，Ｙｕ  Ｒ，Ｈｕａｎｇ  Ｆ，Ｚｈａｎｇ  Ｈ，Ｃｈｅｎ  Ｌ（２０１６）．Ｅｘｏｓｏｍｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ  ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ｖｉａ  ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ６，３２９９３．
・Ｋａｎａｄａ  Ｍ，Ｂａｃｈｍａｎｎ  ＭＨ，Ｈａｒｄｙ  ＪＷ，Ｆｒｉｍａｎｎｓｏｎ  ＤＯ，Ｂｒｏｎｓａｒｔ  Ｌ，Ｗａｎｇ  Ａ，Ｓｙｌｖｅｓｔｅｒ  ＭＤ，Ｓｃｈｍｉｄｔ  ＴＬ，Ｋａｓｐａｒ  ＲＬ，Ｂｕｔｔｅ  ＭＪ，Ｍａｔｉｎ  ＡＣ，Ｃｏｎｔａｇ  ＣＨ（２０１５）．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｆａｔｅｓ  ｏｆ  ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ｔｏ  ｔａｒｇｅｔ  ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １１２，Ｅ１４３３−Ｅ１４４２．
・Ｋｏｎａｌａ  ＶＢ，Ｍａｍｉｄｉ  ＭＫ，Ｂｈｏｎｄｅ  Ｒ，Ｄａｓ  ＡＫ，Ｐｏｃｈａｍｐａｌｌｙ  Ｒ，Ｐａｌ  Ｒ（２０１６）．Ｔｈｅ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｌａｎｄｓｃａｐｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ  ｓｅｃｒｅｔｏｍｅ：Ａ  ｎｅｗ  ｐａｒａｄｉｇｍ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ  １８（１），１３−２４．
・Ｌａｉ，Ｒ．Ｃ．，Ａｒｓｌａｎ，Ｆ．，Ｌｅｅ，Ｍ．Ｍ．，Ｓｚｅ，Ｎ．Ｓ．Ｋ．，Ｃｈｏｏ，Ａ．，Ｃｈｅｎ，Ｔ．Ｓ．，Ｓａｌｔｏ−Ｔｅｌｌｅｚ，Ｍ．，Ｔｉｍｍｅｒｓ，Ｌ．，Ｌｅｅ，Ｃ．Ｎ．，Ｅｌ  Ｏａｋｌｅｙ，Ｒ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）．Ｅｘｏｓｏｍｅ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｂｙ  ＭＳＣ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｓｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｊｕｒｙ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．４，２１４−２２２．
・Ｌｏｐｅｚ−Ｖｅｒｒｉｌｌｉ  ＭＡ，Ｃａｖｉｅｄｅｓ  Ａ，Ｃａｂｒｅｒａ  Ａ，Ｓａｎｄｏｖａｌ  Ｓ，Ｗｙｎｅｋｅｎ  Ｕ，Ｋｈｏｕｒｙ  Ｍ（２０１６）Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｅｘｏｓｏｍｅｓ  ｆｒｏｍ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｓｏｕｒｃｅｓ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｎｅｕｒｉｔｉｃ  ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ３２０，１２９−１３９．
・Ｍａｒｙｎｋａ−Ｋａｌｍａｎｉ  Ｋ，Ｔｒｅｖｅｓ  Ｓ，Ｙａｆｅｅ  Ｍ，Ｒａｃｈｉｍａ  Ｈ，Ｇａｆｎｉ  Ｙ，Ｃｏｈｅｎ  ＭＡ，Ｐｉｔａｒｕ  Ｓ（２０１０）．Ｔｈｅ  ｌａｍｉｎａ  ｐｒｏｐｒｉａ  ｏｆ  ａｄｕｌｔ  ｈｕｍａｎ  ｏｒａｌ  ｍｕｃｏｓａ  ｈａｒｂｏｒｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２８（５），９８４−９５．
・Ｍｉｃｈａｅｌｓ  Ｊ  ５ｔｈ，Ｃｈｕｒｇｉｎ  ＳＳ，Ｂｌｅｃｈｍａｎ  ＫＭ，Ｇｒｅｉｖｅｓ  ＭＲ，Ａａｒａｂｉ  Ｓ，Ｇａｌｉａｎｏ  ＲＤ，Ｇｕｒｔｎｅｒ  ＧＣ（２００７）．ｄｂ／ｄｂ  ｍｉｃｅ  ｅｘｈｉｂｉｔ  ｓｅｖｅｒｅ  ｗｏｕｎｄ−ｈｅａｌｉｎｇ  ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔｓ  ｃｏｍｐａｒｅｄ  ｗｉｔｈ  ｏｔｈｅｒ  ｍｕｒｉｎｅ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｉｎ  ａ  ｓｉｌｉｃｏｎｅ−ｓｐｌｉｎｔｅｄ  ｅｘｃｉｓｉｏｎａｌ  ｗｏｕｎｄ  ｍｏｄｅｌ．Ｗｏｕｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｒｅｇｅｎ．１５（５），６６５−７０
・Ｐａｒｋ  ＣＷ，Ｋｉｍ  ＫＳ，Ｂａｅ  Ｓ，Ｓｏｎ  ＨＫ，Ｍｙｕｎｇ  ＰＫ，Ｈｏｎｇ  ＨＪ，Ｋｉｍ  Ｈ（２００９）．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｒｒａｙ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２（１），５９−６８．
・Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ  Ｍ，Ｗｏｎｇ  ＶＷ，Ｒｅｎｎｅｒｔ  ＣＲ，Ｄａｖｉｓ  ＣＲ，Ｌｏｎｇａｋｅｒ  ＭＴ，Ｇｕｒｔｎｅｒ  ＧＣ（２０１５）．Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｕｎｄｅｒｌｉｅ  ｓｏｍｅ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ２０１５，８５（８）．
・Ｓｋｏｇ  Ｊ，Ｗｕｒｄｉｎｇｅｒ  Ｔ，ｖａｎ  Ｒｉｊｎ  Ｓ，Ｍｅｉｊｅｒ  ＤＨ，Ｇａｉｎｃｈｅ  Ｌ，Ｓｅｎａ−Ｅｓｔｅｖｅｓ  Ｍ，Ｃｕｒｒｙ  ＷＴ  Ｊｒ，Ｃａｒｔｅｒ  ＢＳ，Ｋｒｉｃｈｅｖｓｋｙ  ＡＭ，Ｂｒｅａｋｅｆｉｅｌｄ  ＸＯ（２００８）．Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅｓ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｔｈａｔ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｔｕｍｏｕｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｐｒｏｖｉｄｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ．Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０（１２），１４７０−６．
・Ｔａｃｈｉｄａ  Ｙ，Ｓａｋｕｒａｉ  Ｈ，Ｏｋｕｔｓｕ  Ｊ，Ｓｕｄａ  Ｋ，Ｓｕｇｉｔａ  Ｒ，Ｙａｇｉｎｕｍａ  Ｙ，Ｏｇｕｒａ  Ｙ，Ｓｈｉｍａｄａ  Ｋ，Ｉｓｏｎｏ  Ｆ，Ｋｕｂｏｔａ  Ｋ  ａｎｄ  Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｈ．（２０１５）．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ，Ａｄｉｐｏｓｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｄｅｎｔａｌ  Ｐｕｌｐ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ；８（１２），２６６−２７３．
・Ｔｅｐｐｅｒ  ＯＭ，Ｃａｒ  Ｊ，’Ｒｏｂｅｒｔ  Ｊ．Ａｌｌｅｎ  Ｊｒ，Ｃｈａｎｇ  ＣＣ，”Ｌｉ  ＣＤ，Ｔａｎａｋａ  Ｒ，Ｇｕｐｔａ  ＳＭ，Ｌｅｖｉｎｅ  ＪＰ，Ｓａａ  ｄｅｈ  ＰＢ，Ｗａｒｒｅｎ  ＳＭ．（２０１０）．Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｎｕｍｂｅｒ  ａｎｄ  ｆａｉｌｅｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆａｃｔｏｒ−１・  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｉｍｐａｉｒ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｔｉｓｓｕｅ  ｒｅｐａｉｒ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５９，１９７４−１９８３．
・Ｔｒｅｖｅｓ−Ｍａｎｕｓｅｖｉｔｚ  Ｓ，Ｈｏｚ  Ｌ，Ｒａｃｈｉｍａ  Ｈ，Ｍｏｎｔｏｙａ  Ｇ，Ｔｚｕｒ  Ｅ，Ｖａｒｄｉｍｏｎ  Ａ，Ｎａｒａｙａｎａｎ  ＡＳ，Ａｍａｒ  Ｓ，Ａｒｚａｔｅ  Ｈ，Ｐｉｔａｒｕ  Ｓ（２０１３）．Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌａｍｉｎａ  ｐｒｏｐｒｉａ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｏｒａｌ  ｍｕｃｏｓａ  ａｎｄ  ｇｉｎｇｉｖａ  ｄｅｖｅｌｏｐ  ｉｎｔｏ  ｍｉｎｅｒａｌｉｚｅｄ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ．４０（１），７３−８１．
・Ｖｉｌｌａｒｒｏｙａ−Ｂｅｌｔｒｉ  Ｃ，Ｂａｉｘａｕｌｉ  Ｆ，Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ−Ｖａｚｑｕｅｚ  Ｃ，Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｍａｄｒｉｄ  Ｆ，Ｍｉｔｔｅｌｂｒｕｎｎ  Ｍ（２０１４）Ｓｏｒｔｉｎｇ  ｉｔ  ｏｕｔ：ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｏｓｏｍｅ  ｌｏａｄｉｎｇ．Ｓｅｍｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  ２８，３−３．
・Ｖｏｕｔｉｌａｉｎｅｎ  ＭＨ，Ａｒｕｍａｅ  Ｕ，Ａｉｒａｖａａｒａ  Ｍ，Ｓａａｒｍａ  Ｍ．（２０１５）．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍａｔｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｌｏｃａｔｅｄ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ＣＤＮＦ／ＭＡＮＦ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒ  ５８９，３７３９−３７４８．
・Ｗｕ  Ｙ．，Ｐｅｎｇ  Ｈ．，Ｃｕｉ  Ｍ．，Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｎ．Ｐ．，Ｈｕａｎｇ  Ｙ．，ａｎｄ  Ｚｈｅｎｇ  Ｃ．（２００９），ＣＸＣＬ２  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｈｕｍａｎ  ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ａｋｔ−１／ＦＯＸＯ３ａ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １０９，１１５７−１１６７．
・Ｘｕ  Ｒ，Ｇｒｅｅｎｉｎｇ  ＤＷ，Ｚｈｕ  ＨＪ，Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｎ，Ｓｉｍｐｓｏｎ  ＲＪ（２０１６）．Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：ｔｏｗａｒｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｊ，Ｃｌｉｎ，Ｉｎｖｅｓｔ．；１２６（４），１１５２−６２．
・Ｚａｎｄｅｒ  Ｃ，Ｈｅｉｄｂｒｅｄｅｒ  Ｍ，Ｋａｓｐｅｒｅｋ  Ｙ，Ｎｏｌｌ  Ｔ，Ｓｅｉｔｚ  Ｏ，Ｓａｌｄａｍｌｉ  Ｂ，Ｓｕｄｈｏｆｆ  Ｈ，Ｓａｄｅｒ  Ｒ，Ｋａｌｔｓｃｈｍｉｄｔ  Ｃ，Ｋａｌｔｓｃｈｍｉｄｔ  Ｂ（２００９）．Ａｄｕｌｔ  Ｐａｌａｔｕｍ  ａｓ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｓｏｕｒｃｅ  ｏｆ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｃｒｅｓｔ−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ；２７，１８９９−１９１０．
・Ｚｈａｎｇ  Ｑ，Ｎｇｕｙｅｎ  Ｐ，Ｘｕ  Ｑ，Ｐａｒｋ  Ｗ，Ｌｅｅ  Ｓ，Ｆｕｒｕｈａｓｈｉ  Ａ，Ｌｅ  ＡＤ（２０１７）．Ｎｅｕｒａｌ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ−Ｌｉｋｅ  Ｃｅｌｌｓ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｉｎｇｉｖａ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｒｅｇｕｌａｔｅ  Ｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｃｈｗａｎｎ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｒａｔ  Ｓｃｉａｔｉｃ  Ｎｅｒｖｅ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．６（２），４５８−４７０．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【国際調査報告】
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