(57)【要約】本出願は、がん、例えば、ＢＲＡＦ及び／またはＲＡＳ変異を有する及び有しないがんを治療するのに使用することができる化合物、組成物及びそれらの組み合わせを記載する。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において腫瘍を治療する方法であって、ＤＮＡ損傷剤、ならびにＢＲＡＦ阻害剤のＤＦＧ−ｏｕｔ（不活性）コンフォメーションに対して特異的なＢＲＡＦ阻害剤、ＣＲＡＦ阻害剤及び汎ＲＡＦ阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩からなる群から選択される阻害剤を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項２】
前記阻害剤が、ＲＡＦ２６５、ＡＤ８０、ＧＤＣ０８７９、ＡＺ６２８、ＺＭ３３６３７２、ＮＶＰＢＨＧ７１２、ＬＹ３００９１２０、ＴＡＫ６３２、ＭＬＮ２４８０もしくはＸＰ１０２またはその医薬的に許容可能な塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＤＮＡ損傷剤が、二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こす薬剤、一本鎖切断を引き起こす薬剤、代謝拮抗剤、ＤＮＡ架橋剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ポリメラーゼ阻害剤、ヌクレオシド類似体またはアルキル化剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＤＮＡ損傷剤が、ゲムシタビン、５−ＦＵ、シタラビン、メトトレキサート、ピリメタミン、ブレオマイシン、オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、エトポシド、ドキソルビシン、ビノレルビン、ミトキサントロン、ポドフィロトキシン、アフィディコリン、フォテムスチン、カルムスチン、Ｓ−２３９０６、Ｓ３９、ＳＮ−３８、トポテカン、カンプトテシン、レベッカマイシンまたはそれらのいずれかの医薬的に許容可能な塩である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＤＮＡ損傷剤が、ゲムシタビン、メトトレキサート、カンプトテシン及び／またはピリメタミンあるいはその医薬的に許容可能な塩である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩及び前記ＤＮＡ損傷剤が、順次、同時に、または重複して投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記阻害剤が前記対象に投与されるより前に、前記ＤＮＡ損傷剤が前記対象に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＤＮＡ損傷剤が前記対象に投与されてから少なくとも１〜２４時間後に、前記阻害剤が前記対象に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記阻害剤が前記対象に投与される前に、前記対象が前記ＤＮＡ損傷剤で前治療される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩及び前記ＤＮＡ損傷剤が経口的に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩及び前記ＤＮＡ損傷剤が静脈内に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩が経口的に投与され、前記ＤＮＡ損傷剤が静脈内に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩が静脈内に投与され、前記ＤＮＡ損傷剤が経口的に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記阻害剤が、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、エンコラフェニブ、ソラフェニブ、ＲＡＦ２６５、ＡＤ８０、ＧＤＣ０８７９、ＡＺ６２８、ＺＭ３３６３７２、ＮＶＰＢＨＧ７１２、ＬＹ３００９１２０、ＴＡＫ６３２、ＭＬＮ２４８０もしくはＸＰ１０２またはその医薬的に許容可能な塩である、請求項３〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記腫瘍が、膵臓腫瘍、黒色腫腫瘍、肺腫瘍、結腸癌腫瘍、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍または乳房腫瘍である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記腫瘍が膵臓腫瘍である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記腫瘍が黒色腫腫瘍である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記腫瘍が転移性腫瘍である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記腫瘍が野生型ＢＲＡＦとして特徴づけられる、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記腫瘍が野生型ＲＡＳとして特徴づけられる、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記腫瘍が変異ＢＲＡＦとして特徴づけられる、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記腫瘍が変異ＢＲＡＦ  Ｖ６００ＥまたはＶ６００Ｋとして特徴づけられる、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記腫瘍が変異ＲＡＳとして特徴づけられる、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記腫瘍が野生型ＢＲＡＦ及び変異ＲＡＳとして特徴づけられる、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記腫瘍が変異ＢＲＡＦ及び野生型ＲＡＳとして特徴づけられる、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記対象が、約９６０ｍｇ、７２０ｍｇ、４８０ｍｇ、２４０ｍｇ、１５０ｍｇ、１００ｍｇ、５０ｍｇもしくは２５ｍｇ（１日２回）、または９６０ｍｇ、７２０ｍｇ、４８０ｍｇ、２４０ｍｇ、１５０ｍｇ、１００ｍｇ、５０ｍｇもしくは２５ｍｇ未満（１日２回）である、前記阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩の用量を投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＤＮＡ損傷剤が、約１２５０ｍｇ／ｍ２、１０００ｍｇ／ｍ２、８００ｍｇ／ｍ２、６００ｍｇ／ｍ２、４００ｍｇ／ｍ２、２００ｍｇ／ｍ２、１００ｍｇ／ｍ２もしくは５０ｍｇ／ｍ２、２５ｍｇ／ｍ２、１０ｍｇ／ｍ２もしくは５ｍｇ／ｍ２の用量、または１２５０ｍｇ／ｍ２、１０００ｍｇ／ｍ２、８００ｍｇ／ｍ２、６００ｍｇ／ｍ２、４００ｍｇ／ｍ２、２００ｍｇ／ｍ２、１００ｍｇ／ｍ２もしくは５０ｍｇ／ｍ２、２５ｍｇ／ｍ２、１０ｍｇ／ｍ２もしくは５ｍｇ／ｍ２未満の用量で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＤＮＡ損傷剤が、毎日、週２回、週３回、週４回、週５回、毎週、２週毎、３週毎または毎月投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＤＮＡ損傷剤が二本鎖切断ＤＮＡ損傷剤またはその医薬的に許容可能な塩である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＤＮＡ損傷剤が、ゲムシタビン、メトトレキサート、カンプトテシンもしくはピリメタミンまたはそれらの医薬的に許容可能な塩である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ＭＥＫ阻害剤またはタキサンを投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＤＮＡ損傷剤が前記対象に投与された後に、前記ＭＥＫ阻害剤または前記タキサンが前記対象に投与される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ＭＥＫ阻害剤またはタキサンを投与することをさらに含む、請求項２〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＭＥＫ阻害剤がトラメチニブであるか、前記タキサンがパクリタキセルまたはタンパク質結合パクリタキセルまたは本明細書に記載の他のタキサンである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
ＥＧＦＲ阻害剤を投与することをさらに含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＥＧＦＲ阻害剤が、セツキシマブ、パニツムマブ、ザルツムマブ、ニモツズマブ、マツズマブ、ゲフィチニブまたはエルロチニブである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
前記対象において腫瘍サイズが低減される、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
前記腫瘍サイズが約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００％低減される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記腫瘍が治療後にサイズを増大しない、請求項１に記載の方法。
【請求項４０】
ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異もＶ６００Ｋ変異も有しない腫瘍を有する対象を治療する方法であって、ＢＲＡＦ阻害剤のＤＦＧ−ｏｕｔ（不活性）コンフォメーションに対して特異的なＢＲＡＦ阻害剤、ＣＲＡＦ阻害剤及び汎ＲＡＦ阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩からなる群から選択される阻害剤ならびにＤＮＡ損傷剤を前記ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異もＶ６００Ｋ変異も有しない前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項４１】
対象において転移性腫瘍を治療する方法であって、ＢＲＡＦ阻害剤のＤＦＧ−ｏｕｔ（不活性）コンフォメーションに対して特異的なＢＲＡＦ阻害剤、ＣＲＡＦ阻害剤及び汎ＲＡＦ阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩からなる群から選択される阻害剤ならびにＤＮＡ損傷剤を投与することを含む、前記方法。
【請求項４２】
薬物耐性腫瘍を治療する方法であって、ＢＲＡＦ阻害剤のＤＦＧ−ｏｕｔ（不活性）コンフォメーションに対して特異的なＢＲＡＦ阻害剤、ＣＲＡＦ阻害剤及び汎ＲＡＦ阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩からなる群から選択される阻害剤ならびにＤＮＡ損傷剤を投与することを含む、前記方法。
【請求項４３】
ＢＲＡＦ阻害剤のＤＦＧ−ｏｕｔ（不活性）コンフォメーションに対して特異的なＢＲＡＦ阻害剤、ＣＲＡＦ阻害剤及び汎ＲＡＦ阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩からなる群から選択される阻害剤ならびにＤＮＡ損傷剤を含む、医薬組成物。
【請求項４４】
ＢＲＡＦ阻害剤のＤＦＧ−ｏｕｔ（不活性）コンフォメーションに対して特異的なＢＲＡＦ阻害剤、ＣＲＡＦ阻害剤及び汎ＲＡＦ阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩からなる群から選択される阻害剤ならびにＤＮＡ損傷剤を含む、固定単位剤形。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年８月７日に出願された米国特許仮出願第６２／５４１，９１１号及び２０１７年１２月２０日に出願された米国特許仮出願第６２／６０８，２６５号に対して優先権を主張し、これらのそれぞれは、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。本出願は、２０１６年２月５日に出願された米国特許仮出願第６２／２９１，９３１号、２０１６年６月２日に出願された米国特許仮出願第６２／３４４，６１２号及び２０１６年１１月２１日に出願された米国特許仮出願第６２／４２４，７９２号ならびに、２０１７年２月３日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１６５３号と関連しており、これらのそれぞれは、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、一般に、がん、例えば、野生型または変異型ＲａｆまたはＲａｓをともなうがんを治療するための化合物の組み合わせに関する。
【背景技術】
【０００３】
ＢＲＡＦ阻害剤は、末期黒色腫、例えば、転移性黒色腫または切除不能な黒色腫を治療するために承認されている。しかし、これらは、ＢＲＡＦ変異、例えば、Ｖ６００ＥまたはＶ６００Ｋを有する黒色腫で承認されているだけである。さらに、これらの化合物が野生型ＢＲＡＦを有する患者の腫瘍を実際は悪化させ得ることが、広く認められている。さらに、これらの化合物の効力は永続的ではなく、変異ＢＲＡＦを有する腫瘍は、そのような治療に耐性になることが多い。変異ＲＡＳ（ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ及び／またはＨＲＡＳ）を有する腫瘍は、これらの化合物で治療した場合にさらに速く進行することも分かった。したがって、野生型及び変異ＢＲＡＦを有する腫瘍において、さらには黒色腫の範囲を超えて、これらの化合物の効力を増大させる必要性がある。本明細書に記載の実施形態は、これらの必要性及び他のものを満たす。
【発明の概要】
【０００４】
本明細書で提供される実施形態は、対象において腫瘍を治療する方法であって、ＢＲＡＦ阻害剤、ＢＲＡＦ阻害剤のＤＦＧ−ｏｕｔ（不活性）コンフォメーションに対して特異的なＢＲＡＦ阻害剤、ＣＲＡＦ阻害剤及び汎ＲＡＦ阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩からなる群から選択される阻害剤ならびにＤＮＡ損傷剤を対象に投与することを含む方法を提供する。
【０００５】
本明細書で提供される実施形態は、対象において腫瘍の状態を維持する方法であって、ＢＲＡＦ阻害剤、ＢＲＡＦ阻害剤のＤＦＧ−ｏｕｔ（不活性）コンフォメーションに対して特異的なＢＲＡＦ阻害剤、ＣＲＡＦ阻害剤及び汎ＲＡＦ阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩からなる群から選択される阻害剤ならびにＤＮＡ損傷剤を対象に投与することを含む方法を提供する。
【０００６】
本明細書で提供される実施形態は、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異もＶ６００Ｋ変異も有しない腫瘍を有する対象を治療する方法であって、ＢＲＡＦ阻害剤、ＢＲＡＦ阻害剤のＤＦＧ−ｏｕｔ（不活性な）コンフォメーションに対して特異的なＢＲＡＦ阻害剤、ＣＲＡＦ阻害剤及び汎ＲＡＦ阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩からなる群から選択される阻害剤ならびにＤＮＡ損傷剤をＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異もＶ６００Ｋ変異も有しない対象に投与することを含む方法を提供する。
【０００７】
本明細書で提供される実施形態は、対象において転移性腫瘍を治療する方法であって、ＢＲＡＦ阻害剤、ＢＲＡＦ阻害剤のＤＦＧ−ｏｕｔ（不活性な）コンフォメーションに対して特異的なＢＲＡＦ阻害剤、ＣＲＡＦ阻害剤及び汎ＲＡＦ阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩からなる群から選択される阻害剤ならびにＤＮＡ損傷剤を投与することを含む方法を提供する。
【０００８】
本明細書で提供される実施形態は、薬物耐性腫瘍を治療する方法であって、ＢＲＡＦ阻害剤、ＢＲＡＦ阻害剤のＤＦＧ−ｏｕｔ（不活性な）コンフォメーションに対して特異的なＢＲＡＦ阻害剤、ＣＲＡＦ阻害剤及び汎ＲＡＦ阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩からなる群から選択される阻害剤ならびにＤＮＡ損傷剤を投与することを含む方法を提供する。
【０００９】
本明細書で提供される実施形態は、ＢＲＡＦ阻害剤、ＢＲＡＦ阻害剤のＤＦＧ−ｏｕｔ（不活性な）コンフォメーションに対して特異的なＢＲＡＦ阻害剤、ＣＲＡＦ阻害剤及び汎ＲＡＦ阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩からなる群から選択される阻害剤ならびにＤＮＡ損傷剤を含む医薬組成物を提供する。
【００１０】
本明細書で提供される実施形態は、ＢＲＡＦ阻害剤、ＢＲＡＦ阻害剤のＤＦＧ−ｏｕｔ（不活性）コンフォメーションに対して特異的なＢＲＡＦ阻害剤、ＣＲＡＦ阻害剤及び汎ＲＡＦ阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩またはそれらの医薬的に許容可能な塩からなる群から選択される阻害剤ならびにＤＮＡ損傷剤を含む固定単位剤形を提供する。
【００１１】
本明細書で提供される実施形態は、ＢＲＡＦ阻害剤、ＢＲＡＦ阻害剤のＤＦＧ−ｏｕｔ（不活性な）コンフォメーションに対して特異的なＢＲＡＦ阻害剤、ＣＲＡＦ阻害剤及び汎ＲＡＦ阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩からなる群から選択される阻害剤ならびにＤＮＡ損傷剤を含む注射可能な医薬組成物を提供する。
【００１２】
本明細書で提供される実施形態は、ＢＲＡＦ阻害剤、ＢＲＡＦ阻害剤のＤＦＧ−ｏｕｔ（不活性な）コンフォメーションに対して特異的なＢＲＡＦ阻害剤、ＣＲＡＦ阻害剤及び汎ＲＡＦ阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩からなる群から選択される阻害剤ならびにＤＮＡ損傷剤を含む注射可能な医薬組成物を調製する方法であって、阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩とＤＮＡ損傷剤を混合して、注射可能な医薬組成物を形成することを含む方法を提供する。
【００１３】
本明細書で提供される実施形態は、ＢＲＡＦ阻害剤、ＢＲＡＦ阻害剤のＤＦＧ−ｏｕｔ（不活性な）コンフォメーションに対して特異的なＢＲＡＦ阻害剤、ＣＲＡＦ阻害剤及び汎ＲＡＦ阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩からなる群から選択される阻害剤ならびにＤＮＡ損傷剤を含むキットを提供する。
【００１４】
本明細書で提供される実施形態は、ＢＲＡＦ阻害剤、ＢＲＡＦ阻害剤のＤＦＧ−ｏｕｔ（不活性）コンフォメーションに対して特異的なＢＲＡＦ阻害剤、ＣＲＡＦ阻害剤及び汎ＲＡＦ阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩からなる群から選択される阻害剤を含む医薬調製物ならびに処方情報を含む容器であって、処方情報が、野生型ＲＡＦと特徴づけられる腫瘍を有する対象にＤＮＡ損傷剤とともに阻害剤を投与するための指示を含む、容器を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】図１Ａ及び図１Ｂは、示される様々ながん細胞株における４８時間死滅曲線を図示する図である。薬物Ａはベムラフェニブであり、薬物Ｂはゲムシタビンである。ＲＡＳ及びＢＲＡＦの変異状況を図に示す。
【図１Ｂ】図１Ａ及び図１Ｂは、示される様々ながん細胞株における４８時間死滅曲線を図示する図である。薬物Ａはベムラフェニブであり、薬物Ｂはゲムシタビンである。ＲＡＳ及びＢＲＡＦの変異状況を図に示す。
【図２Ａ】図２Ａ及び図２Ｂは、４８時間死滅曲線（非線形回帰）を図示する図である。これは、ＷＴ−ＢＲＡＦ及びＫＲＡＳ−Ｇ１２Ｃ変異を有する間葉系膵臓癌細胞株における、ベムラフェニブとゲムシタビンの組み合わせ処理による感受性の１００倍の増大を示す。薬物Ａはベムラフェニブであり、薬物Ｂはゲムシタビンである。ＲＡＳ及びＢＲＡＦの変異状況を図に示す。
【図２Ｂ】図２Ａ及び図２Ｂは、４８時間死滅曲線（非線形回帰）を図示する図である。これは、ＷＴ−ＢＲＡＦ及びＫＲＡＳ−Ｇ１２Ｃ変異を有する間葉系膵臓癌細胞株における、ベムラフェニブとゲムシタビンの組み合わせ処理による感受性の１００倍の増大を示す。薬物Ａはベムラフェニブであり、薬物Ｂはゲムシタビンである。ＲＡＳ及びＢＲＡＦの変異状況を図に示す。
【図３Ａ】図３Ａ及び図３Ｂは、本明細書に記載のベムラフェニブ及びゲムシタビン処理のコロニー阻害％を図示する。
【図３Ｂ】図３Ａ及び図３Ｂは、本明細書に記載のベムラフェニブ及びゲムシタビン処理のコロニー阻害％を図示する。
【図４】ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞の特徴づけを図示する図である。図４Ａ：ＳＫ−ＭＥＬ−２８とＳＫＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞の増殖速度の比較（ｎ＝３）。時点０で、１０００００個の細胞をプレーティングした。図４Ｂ：異なる用量のベムラフェニブによる処理後のＳＫ−ＭＥＬ−２８及びＳＫＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞のコロニー形成アッセイ（ｎ＝５）（ｐ＜０．０００１）。
【図５】ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞の特徴づけを図示する図である。図５Ａ：バイアスのないマススペクトロメトリー：ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞及びＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞の異なる処理後のＦＡＭ１２９Ｂタンパク質の存在量（ｎ＝３）。図５Ｂ：ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞の特徴づけを図示する。差次的に処理されたＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞及びＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞のＰＨＧＤＨタンパク質発現のウエスタンブロット。アルファチューブリンをローディングコントロールとして使用した。５０μｇのタンパク質を各レーンにロードした。
【図６−１】図６Ａは、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞におけるベムラフェニブ耐性に対するセリン生合成経路の重要性を図示する図である。異なる用量のベムラフェニブを用いた対照またはＰＨＧＤＨ  ｓｉＲＮＡ処理後のＳＫＭＥＬ−２８細胞のコロニー形成アッセイ（ｎ＝３）（ｐ＝０．３０５２）を示す。図６Ｂは、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞におけるベムラフェニブ耐性に対するセリン生合成経路の重要性を図示する図である。異なる用量のベムラフェニブを用いた対照またはＰＨＧＤＨ  ｓｉＲＮＡ処理後のＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞のコロニー形成アッセイ（ｎ＝３）（ｐ＜０．０００１）を示す。
【図６−２】図６Ｃは、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞におけるベムラフェニブ耐性に対するセリン生合成経路の重要性を図示する図である。異なる用量のベムラフェニブ＋／−メトトレキサート（７５ｎＭ）による処理後のＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞のコロニー形成アッセイ（ｎ＝３）（ｐ＝０．９２０３）を示す。図６Ｄは、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞におけるベムラフェニブ耐性に対するセリン生合成経路の重要性を図示する図である。異なる用量のベムラフェニブ＋／−メトトレキサート（７５ｎＭ）による処理後のＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞のコロニー形成アッセイ（ｎ＝３）（ｐ＜０．０００１）を示す。
【図６−３】図６Ｅは、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞におけるベムラフェニブ耐性に対するセリン生合成経路の重要性を図示する図である。異なる用量のベムラフェニブ＋／−セリン（培地中）による処理後のＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞のコロニー形成アッセイ（ｎ＝３）（ｐ＜０．０００１）を示す。
【図７−１】図７Ａは、ゲムシタビンがＳＫＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞をベムラフェニブに対して感受性にすることを図示する図である。異なる用量のベムラフェニブ＋／−ゲムシタビン（５０ｎＭ）による処理後のＳＫＭＥＬ−２８細胞のコロニー形成アッセイ（ｎ＝３）（ｐ＜０．０００１）を示す。
【図７−２】図７Ｂは、ゲムシタビンがＳＫＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞をベムラフェニブに対して感受性にすることを図示する図である。異なる用量のベムラフェニブ＋／−ゲムシタビン（５０ｎＭ）による処理後のＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞のコロニー形成アッセイ（ｎ＝３）（ｐ＜０．０００１）を示す。図７Ｃは、ゲムシタビンがＳＫＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞をベムラフェニブに対して感受性にすることを図示する図である。異なる用量のベムラフェニブ＋／−ゲムシタビン（５０ｎＭ）を用いた対照またはＰＨＧＤＨ  ｓｉＲＮＡ処理後のＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞のコロニー形成アッセイ（ｎ＝３）（ｐ＝０．９８１６）を示す。
【図７−３】図７Ｄは、ゲムシタビンがＳＫＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞をベムラフェニブに対して感受性にすることを図示する図である。異なる用量のベムラフェニブ＋／−ゲムシタビン（５０ｎＭ）を用いた対照またはＰＨＧＤＨ  ｓｉＲＮＡ処理後のＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞のコロニー形成アッセイ（ｎ＝３）（ｐ＝０．０１８９）を示す。図７Ｅは、ゲムシタビンがＳＫＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞をベムラフェニブに対して感受性にすることを図示する図である。異なる用量のベムラフェニブ＋ゲムシタビン（５０ｎＭ）＋／−メトトレキサート（７５ｎＭ）による処理後のＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞のコロニー形成アッセイ（ｎ＝３）（ｐ＝０．６５８５）を示す。
【図７−４】図７Ｆは、ゲムシタビンがＳＫＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞をベムラフェニブに対して感受性にすることを図示する図である。異なる用量のベムラフェニブ＋ゲムシタビン（５０ｎＭ）＋／−メトトレキサート（７５ｎＭ）による処理後のＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞のコロニー形成アッセイ（ｎ＝３）（ｐ＜０．０００１）を示す。図７Ｇは、ゲムシタビンがＳＫＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞をベムラフェニブに対して感受性にすることを図示する図である。ゲムシタビンとベムラフェニブの間の相乗効果を表すＦａ−ＣＩプロットである。線より下に入るデータポイントは薬物間の相乗効果を示す。データポイントは、特定の用量でのＣＩ計算値を表す。本明細書の表３はＣＩ値を含む。
【図８−１】図８Ａは、ゲムシタビンが、膵臓癌細胞株をベムラフェニブに対して感受性にすることを図示する図である。異なる用量のゲムシタビン＋／−ベムラフェニブ（１μＭ）による処理後のＢｘＰＣ３Ｍ１細胞のコロニー形成アッセイ（ｎ＝３）（ｐ＜０．０００１）を示す。図８Ｂは、ゲムシタビンが、膵臓癌細胞株をベムラフェニブに対して感受性にすることを図示する図である。ゲムシタビンとベムラフェニブの間の相乗効果を表すＦａ−ＣＩプロット。線より下に入るデータポイントは薬物間の相乗効果を示す。データポイントは、特定の用量でのＣＩ計算値を表す。ＣＩ値について表３を参照されたい。
【図８−２】図８Ｃは、ゲムシタビンが、ＮＳＣＬＣ細胞株をベムラフェニブに対して感受性にすることを図示する図である。異なる用量のゲムシタビン＋／−ベムラフェニブ（１μＭ）による処理後のＮＣＩ−Ｈ２１２２細胞のコロニー形成アッセイ（ｎ＝３）（ｐ＜０．０００１）を示す。
【図９−１】図９Ａは、膵臓癌細胞株におけるベムラフェニブ誘導性の細胞増殖及びセリン合成を図示する図である。ベムラフェニブ（１０μＭ）で処理したＢｘＰＣ３細胞の細胞増殖アッセイを示す。０日目に、１０００００個の細胞をプレーティングした。
【図９−２】図９Ｂは、膵臓癌細胞株におけるベムラフェニブ誘導性の細胞増殖及びセリン合成を図示する図である。ベムラフェニブ（１０μＭ）で処理したＢｘＰＣ３Ｍ１細胞の細胞増殖アッセイを示す。０日目に、１０００００個の細胞をプレーティングした。図９Ｃは、膵臓癌細胞株におけるベムラフェニブ誘導性の細胞増殖及びセリン合成を図示する図である。ベムラフェニブ（１０μＭ）で処理したＰａｎｃ１細胞の細胞増殖アッセイを示す。０日目に、１０００００個の細胞をプレーティングした。
【図９−３】図９Ｄは、膵臓癌細胞株におけるベムラフェニブ誘導性の細胞増殖及びセリン合成を図示する図である。ベムラフェニブ（１０μＭ）で処理したＭｉａＰａｃａ２細胞の細胞増殖アッセイを示す。０日目に、１０００００個の細胞をプレーティングした。図９Ｅは、膵臓癌細胞株におけるベムラフェニブ誘導性の細胞増殖及びセリン合成を図示する図である。マススペクトロメトリーであり、ＤＭＳＯまたはベムラフェニブ（１０μＭ）で処理した膵臓癌細胞におけるＰＨＧＤＨタンパク質の発現（ｎ＝３）を示す。
【図９−４】図９Ｆは、膵臓癌細胞株におけるベムラフェニブ誘導性の細胞増殖及びセリン合成を図示する図である。マススペクトロメトリーであり、ＤＭＳＯまたはベムラフェニブ（１０μＭ）で処理した膵臓癌細胞におけるＰＳＡＴ１タンパク質の発現（ｎ＝３）を示す。図９Ｇは、膵臓癌細胞株におけるベムラフェニブ誘導性の細胞増殖及びセリン合成を図示する図である。マススペクトロメトリーであり、ＤＭＳＯまたはベムラフェニブ（１０μＭ）で処理した膵臓癌細胞におけるＰＳＰＨタンパク質の発現（ｎ＝３）を示す。
【図９−５】図９Ｈは、膵臓癌細胞株におけるベムラフェニブ誘導性の細胞増殖及びセリン合成を図示する図である。マススペクトロメトリーであり、ＤＭＳＯまたはベムラフェニブ（１０μＭ）で処理した膵臓癌細胞におけるＳＡＲＳタンパク質の発現（ｎ＝３）を示す。
【図１０−１】図１０Ａは、ＢｘＰＣ３Ｍ１細胞のベムラフェニブ誘導性感受性化の増強を図示する図である。異なる用量のゲムシタビン＋／−ベムラフェニブ（１μＭ）＋／−メトトレキサート（７５ｎＭ）による処理後のＢｘＰＣ３Ｍ１細胞のコロニー形成アッセイ（ｎ＝３）（ｐ＝０．０２５８）を示す。
【図１０−２】図１０Ｂは、ＮＣＩ−Ｈ２１２２細胞のベムラフェニブ誘導性感受性化の増強を図示する図である。異なる用量のゲムシタビン＋／−ベムラフェニブ（１μＭ）＋／−メトトレキサート（７５ｎＭ）による処理後のＮＣＩ−Ｈ２１２２細胞のコロニー形成アッセイ（ｎ＝３）（ｐ＝００２０）を示す。図１０Ｃは、ＢｘＰＣ３Ｍ１細胞のベムラフェニブ誘導性感受性化の増強を図示する図である。異なる用量のベムラフェニブ＋／−セリンによる処理後のＢｘＰＣ３Ｍ１細胞のコロニー形成アッセイ（ｎ＝３）（ｐ＜０．０００１）を示す。
【図１１−１】図１１Ａは、ＢｘＰＣ３Ｍ１細胞のゲムシタビンに対するダブラフェニブ誘導性感受性化を図示する図である。異なる用量のゲムシタビン＋／−ダブラフェニブ（１μＭ）による処理後のＢｘＰＣ３Ｍ１細胞のコロニー形成アッセイ（ｎ＝３）（ｐ＜０．０００１）を示す。図１１Ｂは、ＮＣＩ−Ｈ２１２２細胞のゲムシタビンに対するダブラフェニブ誘導性感受性化を図示する図である。異なる用量のゲムシタビン＋／−ダブラフェニブ（１μＭ）による処理後のＮＣＩ−Ｈ２１２２細胞のコロニー形成アッセイ（ｎ＝３）（ｐ＜０．０００１）を示す。
【図１１−２】図１１Ｃは、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞のゲムシタビンに対するダブラフェニブ誘導性感受性化を図示する図である。異なる用量のダブラフェニブ＋／−ゲムシタビン（５０ｎＭ）による処理後のＢｘＰＣ３Ｍ１細胞のコロニー形成アッセイ（ｎ＝３）（ｐ＜０．０００１）を示す。
【図１２Ａ】図１２Ａ及び図１２Ｂは、ゲムシタビン及びＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ阻害剤での順次の組み合わせ処理を介するがん細胞感受性化の概略図を図示する。図１２Ａのカスケードは、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異内の、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ阻害剤（ＢＲＡＦｉ）に対するＳＫ−ＭＥＬ−２８の細胞応答を表す。図１２Ｂのカスケードの左側は、変異プロファイル内の、ＢＲＡＦｉに対する獲得性ＢＲＡＦｉ耐性のＳＫＭＥＬ−２８ＶＲ１の細胞応答を表す。獲得耐性は、ゲムシタビンの前処理なしで、ＭＡＰＫカスケードの逆説的な誘導を引き起こす。ゲムシタビンの前処理とそれに続くＢＲＡＦｉは、細胞が停止している間に、ＭＡＰＫカスケードの逆説的な誘導及びセリン合成の誘導をもたらす。セリン合成の誘導は、ヌクレオチド合成のための葉酸サイクルの誘導をもたらす。これら一連の事象は、相反する、ゲムシタビン誘導性ＤＮＡ損傷からの細胞周期停止シグナルを引き起こす細胞シグナリング経路の活性化とＢＲＡＦ阻害剤によるＭＡＰＫシグナリング経路の活性化により、細胞死をもたらす。図１２Ｂのカスケードの右側は、ゲムシタビンの前処理による、ＢＲＡＦ  ＷＴ膵臓癌ＢｘＰＣ３Ｍ１及び非小細胞肺癌ＮＣＩ−Ｈ２１２２細胞のＢＲＡＦ阻害剤に対する感受性化を示す。これらのＢＲＡＦ  ＷＴ細胞株では、ゲムシタビンは細胞周期停止を誘導する。停止した細胞へのＢＲＡＦ阻害剤の添加は、ＭＡＰＫカスケードを誘導し、セリン合成及び葉酸合成の増大につながる。これら一連の事象は、相反する、ゲムシタビン誘導性ＤＮＡ損傷からの細胞周期停止を引き起こす細胞シグナリング経路の活性化とＢＲＡＦ阻害剤によるＭＡＰＫシグナリング経路の活性化により、細胞死をもたらす。細胞死の実際のメカニズムは依然として不明である。
【図１２Ｂ】図１２Ａ及び図１２Ｂは、ゲムシタビン及びＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ阻害剤での順次の組み合わせ処理を介するがん細胞感受性化の概略図を図示する。図１２Ａのカスケードは、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異内の、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ阻害剤（ＢＲＡＦｉ）に対するＳＫ−ＭＥＬ−２８の細胞応答を表す。図１２Ｂのカスケードの左側は、変異プロファイル内の、ＢＲＡＦｉに対する獲得性ＢＲＡＦｉ耐性のＳＫＭＥＬ−２８ＶＲ１の細胞応答を表す。獲得耐性は、ゲムシタビンの前処理なしで、ＭＡＰＫカスケードの逆説的な誘導を引き起こす。ゲムシタビンの前処理とそれに続くＢＲＡＦｉは、細胞が停止している間に、ＭＡＰＫカスケードの逆説的な誘導及びセリン合成の誘導をもたらす。セリン合成の誘導は、ヌクレオチド合成のための葉酸サイクルの誘導をもたらす。これら一連の事象は、相反する、ゲムシタビン誘導性ＤＮＡ損傷からの細胞周期停止シグナルを引き起こす細胞シグナリング経路の活性化とＢＲＡＦ阻害剤によるＭＡＰＫシグナリング経路の活性化により、細胞死をもたらす。図１２Ｂのカスケードの右側は、ゲムシタビンの前処理による、ＢＲＡＦ  ＷＴ膵臓癌ＢｘＰＣ３Ｍ１及び非小細胞肺癌ＮＣＩ−Ｈ２１２２細胞のＢＲＡＦ阻害剤に対する感受性化を示す。これらのＢＲＡＦ  ＷＴ細胞株では、ゲムシタビンは細胞周期停止を誘導する。停止した細胞へのＢＲＡＦ阻害剤の添加は、ＭＡＰＫカスケードを誘導し、セリン合成及び葉酸合成の増大につながる。これら一連の事象は、相反する、ゲムシタビン誘導性ＤＮＡ損傷からの細胞周期停止を引き起こす細胞シグナリング経路の活性化とＢＲＡＦ阻害剤によるＭＡＰＫシグナリング経路の活性化により、細胞死をもたらす。細胞死の実際のメカニズムは依然として不明である。
【図１３】ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞のＰＨＧＤＨ遺伝子のアブレーションを図示する図である。レーン１：ＰＨＧＤＨ  ｓｉＲＮＡ＋ベムラフェニブ。レーン２：ＰＨＧＤＨ  ｓｉＲＮＡ＋ＤＭＳＯ。レーン３：対照ｓｉＲＮＡ＋ベムラフェニブ。レーン４：対照ｓｉＲＮＡ＋ＤＭＳＯ。アルファチューブリンをローディングコントロールとして使用した。５０μｇのタンパク質を各レーンにロードした。
【図１４Ａ】ゲムシタビンがＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞をベムラフェニブに対して感受性にしたことを図示する図である。ＳＫ−ＭＥＬ２８ＶＲ１細胞における、ゲムシタビンとベムラフェニブの相乗効果を示す正規化したアイソボログラムを示す。線の左に入るデータポイントは相乗効果を示す。データポイントは、特定の用量でのＣＩ計算値を表す（ＣＩ値について表３を参照されたい）。
【図１４Ｂ】ゲムシタビンがＢｘＰＣ３Ｍ１細胞をベムラフェニブに対して感受性にしたことを図示する図である。ＢｘＰＣ３Ｍ１細胞において、ゲムシタビンとベムラフェニブの相乗効果を示す正規化したアイソボログラムを示す。線の左に入るデータポイントは相乗効果を示す。データポイントは、特定の用量でのＣＩ計算値を表す（ＣＩ値について表４を参照されたい）。
【図１５】ゲムシタビンが、３Ｄ−スフェロイド増殖アッセイにおいて、膵臓癌患者由来の細胞株及びＡＴＣＣ樹立細胞株をベムラフェニブまたはダブラフェニブに対して感受性にしたことを図示する図である。０日目に、２０，０００個の細胞をプレーティングし（Ｃｏｒｎｉｎｇ４５１５スフェロイドプレート）、２日目（すべてのスフェロイドが少なくとも５００μｍの直径である）にゲムシタビンを加え、３日目にゲムシタビンを洗い落とし、ＢＲＡＦ阻害剤を加え、５日目にＣＴＧ３Ｄ細胞生存率アッセイを行った（ｎ＝２）。
【図１６−１】Ａは、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１転移性黒色腫細胞におけるカンプトテシン及びベムラフェニブの組み合わせからの相乗的結果を図示する図である。Ｂは、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１転移性黒色腫細胞におけるカンプトテシン及びベムラフェニブの組み合わせからの相乗的結果を図示する図である。
【図１６−２】Ｃは、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１転移性黒色腫細胞におけるカンプトテシン及びダブラフェニブの組み合わせからの相乗的結果を図示する図である。Ｄは、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１転移性黒色腫細胞におけるカンプトテシン及びダブラフェニブの組み合わせからの相乗的結果を図示する図である。
【図１７】図１７Ａは、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１転移性黒色腫細胞におけるメトトレキサートとエンコラフェニブの組み合わせからの相乗的結果を図示する図である。図１７Ｂは、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１転移性黒色腫細胞におけるメトトレキサートとエンコラフェニブの組み合わせからの相乗的結果を図示する図である。
【図１８Ａ】ゲムシタビンとパクリタキセルとＢＲＡＦ阻害剤のエンコラフェニブの組み合わせからの相乗的結果を図示する図である。
【図１８Ｂ】ゲムシタビンとパクリタキセルとＢＲＡＦ阻害剤のダブラフェニブの組み合わせからの相乗的結果を図示する図である。
【図１８Ｃ】ゲムシタビンとパクリタキセルとＢＲＡＦ阻害剤のダブラフェニブの組み合わせからの相乗的結果を図示する図である。
【図１９】図１９Ａは、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１転移性黒色腫細胞におけるゲムシタビンとＢＲＡＦ阻害剤ＧＤＣ０８７９の組み合わせからの相乗的結果を図示する図である。図１９Ｂは、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１転移性黒色腫細胞におけるゲムシタビンとＢＲＡＦ阻害剤ＡＤ８０の組み合わせからの相乗的結果を図示する図である。
【図２０】図２０Ａは、５０１ｍｅｌ転移性黒色腫細胞におけるゲムシタビンとＢＲＡＦ阻害剤ＧＤＣ０８７９の組み合わせからの相乗的結果を図示する図である。図２０Ｂは、５０１ｍｅｌ転移性黒色腫細胞におけるゲムシタビンとＢＲＡＦ阻害剤ＡＤ８０の組み合わせからの相乗的結果を図示する図である。
【図２１】図２１Ａは、Ｐａｎｃ１膵臓癌細胞におけるゲムシタビンとＢＲＡＦ阻害剤ＧＤＣ０８７９の組み合わせからの相乗的結果を図示する図である。図２１Ｂは、Ｐａｎｃ１膵臓癌細胞におけるゲムシタビンとＢＲＡＦ阻害剤ＡＤ８０の組み合わせからの相乗的結果を図示する図である。
【図２２】図２２Ａは、ＢｘＰＣ３Ｍ１膵臓癌細胞におけるゲムシタビンとＢＲＡＦ阻害剤ＧＤＣ０８７９の組み合わせからの相乗的結果を図示する図である。図２２Ｂは、ＢｘＰＣ３Ｍ１膵臓癌細胞におけるゲムシタビンとＢＲＡＦ阻害剤ＡＤ８０の組み合わせからの相乗的結果を図示する図である。
【図２３】図２３Ａは、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１転移性黒色腫細胞におけるゲムシタビンとＣＲＡＦ阻害剤ＺＭ３３６３７２の組み合わせからの相乗的結果を図示する図である。図２３Ｂは、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１転移性黒色腫細胞におけるゲムシタビンとＣＲＡＦ阻害剤ＮＶＰＢＨＧ７１２の組み合わせからの相乗的結果を図示する図である。
【図２４】図２４Ａは、５０１ｍｅｌ転移性黒色腫細胞におけるゲムシタビンとＣＲＡＦ阻害剤ＺＭ３３６３７２の組み合わせからの相乗的結果を図示する図である。図２４Ｂは、５０１ｍｅｌ転移性黒色腫細胞におけるゲムシタビンとＣＲＡＦ阻害剤ＮＶＰＢＨＧ７１２の組み合わせからの相乗的結果を図示する図である。
【図２５】図２５Ａは、Ｐａｎｃ１膵臓癌細胞におけるゲムシタビンとＣＲＡＦ阻害剤ＺＭ３３６３７２の組み合わせからの相乗的結果を図示する図である。図２５Ｂは、Ｐａｎｃ１膵臓癌細胞におけるゲムシタビンとＣＲＡＦ阻害剤ＮＶＰＢＨＧ７１２の組み合わせからの相乗的結果を図示する図である。
【図２６】図２６Ａは、ＢｘＰＣ３Ｍ１膵臓癌細胞におけるゲムシタビンとＣＲＡＦ阻害剤ＺＭ３３６３７２の組み合わせからの相乗的結果を図示する図である。図２６Ｂは、ＢｘＰＣ３Ｍ１膵臓癌細胞におけるゲムシタビンとＣＲＡＦ阻害剤ＮＶＰＢＨＧ７１２の組み合わせからの相乗的結果を図示する図である。
【図２７】図２７Ａは、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１転移性黒色腫細胞におけるゲムシタビンと汎ＲＡＦ阻害剤ＲＡＦ２６５の組み合わせからの相乗的結果を図示する図である。図２７Ｂは、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１転移性黒色腫細胞におけるゲムシタビンと汎ＲＡＦ阻害剤ＴＡＫ６３２の組み合わせからの相乗的結果を図示する図である。
【図２８】図２８Ａは、５０１ｍｅｌ転移性黒色腫細胞におけるゲムシタビンと汎ＲＡＦ阻害剤ＲＡＦ２６５の組み合わせからの相乗的結果を図示する図である。図２８Ｂは、５０１ｍｅｌ転移性黒色腫細胞におけるゲムシタビンと汎ＲＡＦ阻害剤ＴＡＫ６３２の組み合わせからの相乗的結果を図示する図である。
【図２９】図２９Ａは、Ｐａｎｃ１膵臓癌細胞におけるゲムシタビンと汎ＲＡＦ阻害剤ＲＡＦ２６５の組み合わせからの相乗的結果を図示する図である。図２９Ｂは、Ｐａｎｃ１膵臓癌細胞におけるゲムシタビンと汎ＲＡＦ阻害剤ＴＡＫ６３２の組み合わせからの相乗的結果を図示する図である。
【図３０】図３０Ａは、ＢｘＰＣ３Ｍ１膵臓癌細胞におけるゲムシタビンと汎ＲＡＦ阻害剤ＲＡＦ２６５の組み合わせからの相乗的結果を図示する図である。図３０Ｂは、ＢｘＰＣ３Ｍ１膵臓癌細胞におけるゲムシタビンと汎ＲＡＦ阻害剤ＴＡＫ６３２の組み合わせからの相乗的結果を図示する図である。
【図３１】図３１Ａは、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１転移性黒色腫細胞におけるゲムシタビンとＢＲＡＦ第２世代阻害剤ＸＰ１０２の組み合わせからの相乗的結果を図示する図である。図３１Ｂは、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１転移性黒色腫細胞におけるメトトレキサートとＢＲＡＦ第２世代阻害剤ＸＰ１０２の組み合わせからの相乗的結果を図示する図である。
【図３２】図３２Ａは、Ｐａｎｃ１膵臓癌細胞におけるゲムシタビンとＢＲＡＦ第２世代阻害剤ＸＰ１０２の組み合わせからの相乗的結果を図示する図である。図３３Ｂは、Ｐａｎｃ１膵臓癌細胞におけるメトトレキサートとＢＲＡＦ第２世代阻害剤ＸＰ１０２の組み合わせからの相乗的結果を図示する図である。
【図３３】図３３Ａは、ＢｘＰＣ３Ｍ１膵臓癌細胞におけるゲムシタビンとＢＲＡＦ第２世代阻害剤ＸＰ１０２の組み合わせからの相乗的結果を図示する図である。図３３Ｂは、ＢｘＰＣ３Ｍ１膵臓癌細胞におけるメトトレキサートとＢＲＡＦ第２世代阻害剤ＸＰ１０２の組み合わせからの相乗的結果を図示する図である。
【図３４】図３４Ａは、ＳＷ６２０結腸癌細胞におけるゲムシタビンとＢＲＡＦ第２世代阻害剤ＸＰ１０２の組み合わせからの相乗的結果を図示する図である。図３４Ｂは、ＳＷ６２０結腸癌細胞におけるメトトレキサートとＢＲＡＦ第２世代阻害剤ＸＰ１０２の組み合わせからの相乗的結果を図示する図である。
【図３５】図３５Ａは、Ａ５４９肺癌細胞におけるゲムシタビンとＢＲＡＦ第２世代阻害剤ＸＰ１０２の組み合わせからの相乗的結果を図示する図である。図３５Ｂは、Ａ５４９肺癌細胞におけるメトトレキサートとＢＲＡＦ第２世代阻害剤ＸＰ１０２の組み合わせからの相乗的結果を図示する図である。
【図３６】ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１転移性黒色腫細胞におけるゲムシタビンとＭＥＫ阻害剤Ｅ６２０１の組み合わせからの相乗的結果を図示する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本出願は、化合物の組み合わせ及びその使用方法を記載する。化合物及び組み合わせは、単位剤形で、または異なる剤形で投与することができる医薬組成物として調製することもできる。
【００１７】
ベムラフェニブは、式Ｉの化合物またはその医薬的に許容可能な塩を指す：
【化１】
2020530014.tif 000003
【００１８】
ダブラフェニブは、式ＩＩの化合物またはその医薬的に許容可能な塩を指す：
【化２】
2020530014.tif 000004
【００１９】
エンコラフェニブは、式ＩＩＩの化合物またはその医薬的に許容可能な塩を指す：
【化３】
2020530014.tif 000005
【００２０】
ソラフェニブは、式ＩＶの化合物またはその医薬的に許容可能な塩を指す：
【化４】
2020530014.tif 000006
【００２１】
本明細書全体を通してＢＲＡＦ阻害剤が言及される。例としては、限定されないが、ベムラフェニブ、ダブラフェニブまたはエンコラフェニブ及びそれらの医薬的に許容可能な塩が挙げられる。ソラフェニブ、ＲＡＦ２６５、ＡＤ８０、ＧＤＣ０８７９、ＡＺ６２８、ＺＭ３３６３７２、ＮＶＰＢＨＧ７１２、ＬＹ３００９１２０、ＴＡＫ６３２、ＭＬＮ２４８０またはＸＰ１０２などの他のＢＲＡＦ、ＣＲＡＦまたは汎ＲＡＦ阻害剤を代わりに用いることもできる。したがって、誤解を避けるために、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、ソラフェニブ、エンコラフェニブ、ＲＡＦ２６５、ＡＤ８０、ＧＤＣ０８７９、ＡＺ６２８、ＺＭ３３６３７２、ＮＶＰＢＨＧ７１２、ＬＹ３００９１２０、ＴＡＫ６３２、ＭＬＮ２４８０またはＸＰ１０２が言及される場合は、ＢＲＡＦ阻害剤を広く使用することができること、または他の特定のタイプのＢＲＡＦ阻害剤も使用することができることが開示される。この言及はまた、本明細書に記載の化合物の医薬的に許容可能な塩を含むと解釈されるべきである。ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、エンコラフェニブ、ソラフェニブ、ＲＡＦ２６５、ＡＤ８０、ＧＤＣ０８７９、ＡＺ６２８、ＺＭ３３６３７２、ＮＶＰＢＨＧ７１２、ＬＹ３００９１２０、ＴＡＫ６３２、ＭＬＮ２４８０もしくはＸＰ１０２またはそれらの医薬的に許容可能な塩は、がんを治療する様々な治療剤、例えば、限定されないが、ＤＮＡ損傷剤と（同時に、または順次）組み合わせることができる。そのようなＤＮＡ損傷剤の例としては、限定されないが、二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こす薬剤、一本鎖切断を引き起こす薬剤、代謝拮抗剤、ＤＮＡ架橋剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ポリメラーゼ阻害剤またはアルキル化剤が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ損傷剤はヌクレオシド類似体である。いくつかの実施形態では、ヌクレオシド類似体は、シトシンアラビノシド、フルダラビン、クラドリビンまたはゲムシタビンである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ損傷剤は、ゲムシタビン、シトシンアラビノシド、フルダラビン、クラドリビン、５−ＦＵ、シタラビン、メトトレキサート、ピリメタミン、ブレオマイシン、オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、エトポシド、ドキソルビシン、ビノレルビン、ミトキサントロン、ポドフィロトキシン、アフィディコリン、フォテムスチン、カルムスチン、Ｓ−２３９０６、Ｓ３９、ＳＮ−３８、トポテカン、カンプトテシン、レベッカマイシンなどである。これらの薬剤は、個々に、または組み合わせて、ＢＲＡＦ阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩と組み合わせることができる。いくつかの実施形態では、ＢＲＡＦ阻害剤は、ヌクレオシド類似体とともに投与される。いくつかの実施形態では、ＢＲＡＦ阻害剤は、キノリンアルカロイド、例えば、限定されないが、カンプトテシンとともに投与される。投与は本明細書に記載の方法に従って行うことができ、薬剤は、ＢＲＡＦ阻害剤の前に、またはそうでなければ本明細書に記載のように、投与することができる。これらは、ＭＥＫ阻害剤、例えば、限定されないが、トラメチニブなどと組み合わせることもできる。いくつかの実施形態では、ＭＥＫ阻害剤はまた、本明細書に記載のように、ＢＲＡＦ阻害剤（例えば、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、ソラフェニブ、エンコラフェニブ、ＲＡＦ２６５、ＡＤ８０、ＧＤＣ０８７９、ＡＺ６２８、ＺＭ３３６３７２、ＮＶＰＢＨＧ７１２、ＬＹ３００９１２０、ＴＡＫ６３２、ＭＬＮ２４８０またはＸＰ１０２）及びＤＮＡ損傷剤と組み合わせることができ、またはこれらとともに投与することができる。いくつかの実施形態では、ＢＲＡＦ阻害剤はＭＥＫ阻害剤と（同時に、または順次）組み合わせて投与されない。
【００２２】
いくつかの実施形態では、組成物または方法は、さらなる治療剤と組み合わされる。いくつかの実施形態では、さらなる治療剤は微小管安定化剤である。微小管安定化剤の非限定例はタキサンである。いくつかの実施形態では、タキサンは、限定されないが、パクリタキセル、ドセタキセル、カバジタキセルなどである。いくつかの実施形態では、タキサンはタンパク質結合タキサンである。例えば、パクリタキセルはタンパク質結合パクリタキセルであり得、これは、ナノ粒子アルブミン結合パクリタキセルまたはｎａｂ−パクリタキセルとも称され得る。タンパク質結合パクリタキセルの非限定的一例はアブラキサン（登録商標）である。ある実施形態では、他のタキサンがタンパク質に結合している。
【００２３】
化合物、組成物及びそれらの組み合わせは、限定されないが、対象において、がんまたは腫瘍、例えば、黒色腫、膵臓癌、肺癌（例えば、ＮＳＣＬＣもしくはＳＣＬＣ）、結腸癌、卵巣癌、前立腺癌または乳癌を治療することを含めた、本明細書に記載の方法のいずれかで、使用することができる。
【００２４】
いくつかの実施形態では、組成物、例えば、ＢＲＡＦ阻害剤（例えば、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、ソラフェニブ、エンコラフェニブ、ＲＡＦ２６５、ＡＤ８０、ＧＤＣ０８７９、ＡＺ６２８、ＺＭ３３６３７２、ＮＶＰＢＨＧ７１２、ＬＹ３００９１２０、ＴＡＫ６３２、ＭＬＮ２４８０もしくはＸＰ１０２）またはその医薬的に許容可能な塩とＤＮＡ損傷剤との医薬組成物または固定剤形が提供される。組成物は、本明細書に記載のように、ＭＥＫ阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤またはさらなる治療剤（例えば、タキサン）を含むこともできる。いくつかの実施形態では、組成物は、ＭＥＫ阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤またはさらなる治療剤を含まなくてもよい。本明細書で提供される、ＢＲＡＦ阻害剤またはその医薬的に許容可能な塩とＤＮＡ損傷剤の組み合わせ及びその組み合わせの使用は、本明細書に記載のように、驚くべき予想外のがん治療能力及び他の予想外の結果を示す。いくつかの実施形態では、組み合わせは腫瘍の進行を遅らせる。いくつかの実施形態では、組み合わせは、腫瘍サイズを低減させる。いくつかの実施形態では、組み合わせは、ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦまたは汎ＲＡＦ阻害剤に耐性になった腫瘍を再び感受性にする。いくつかの実施形態では、組み合わせは、ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦまたは汎ＲＡＦ阻害剤に耐性がある腫瘍を感受性にする。再び感受性になった腫瘍とは、一次治療、例えば、ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦまたは汎ＲＡＦ阻害剤（例えば、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、ソラフェニブ、エンコラフェニブ、ＲＡＦ２６５、ＡＤ８０、ＧＤＣ０８７９、ＡＺ６２８、ＺＭ３３６３７２、ＮＶＰＢＨＧ７１２、ＬＹ３００９１２０、ＴＡＫ６３２、ＭＬＮ２４８０またはＸＰ１０２）に耐性になっている、または耐性になることが予期される腫瘍を指す。感受性にされた腫瘍とは、ある治療に耐性があった腫瘍であり、且つ現在その治療で治療することができる腫瘍を指す。例えば、ＢＲＡＦ阻害剤に応答しない腫瘍は、ＢＲＡＦ阻害剤とＤＮＡ損傷剤の組み合わせで腫瘍が治療される場合に、ＢＲＡＦ阻害剤に感受性にされる。いくつかの実施形態では、感受性化は、ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦまたは汎ＲＡＦ阻害剤とともにＤＮＡ損傷剤で腫瘍を前治療することによってもたらされる。いかなる特定の理論にも拘束されるものではないが、ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦまたは汎ＲＡＦ阻害剤とＤＮＡ損傷剤（前治療であるかないかを問わない）との組み合わせは、いずれかの成分単独と比較して相乗的に作用する。いくつかの実施形態では、ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦまたは汎ＲＡＦ阻害剤は、ＤＮＡ損傷剤との組み合わせが理由で、以前に使用されていたものよりも低い用量で使用することもできる。そのような用量の非限定例は本明細書に記載されている。ＤＮＡ損傷剤は、これが、ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦまたは汎ＲＡＦ阻害剤と組み合わされるので、典型的なものよりも低い用量で使用することもできる。そのような用量の非限定例は本明細書に記載されている。これらの組み合わせは、ＭＥＫ阻害剤とともに、またはＭＥＫ阻害剤なしで使用することもできる。ＭＥＫ阻害剤の例は本明細書に記載されているが、他のものを使用することもできる。組み合わせは、ＥＧＦＲ阻害剤とともに投与することもできる。組み合わせは、ＥＧＦＲ阻害剤なしで投与することもできる。ＥＧＦＲ阻害剤の例としては、限定されないが、セツキシマブ、パニツムマブ、ザルツムマブ、ニモツズマブ、マツズマブ、ゲフィチニブ及びエルロチニブが挙げられる。組み合わせは、タキサンとともに、またはタキサンなしで投与することもできる。タキサンの非限定例は本明細書に記載されている。本明細書に記載の組み合わせは、同じ製剤または単位剤形中で組み合わせることができ、または別々に投与することができるが、依然として組み合わされていると考えることができ、なぜなら、これらが、各治療剤でがんを治療する目的で患者に投与されているからである。
【００２５】
いくつかの実施形態では、ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦまたは汎ＲＡＦ阻害剤とＤＮＡ損傷剤との組み合わせは、維持療法及び／または二次療法で使用される。維持療法または二次療法は、がんを有する患者、及び一次治療で既に治療されており、腫瘍が一次治療に応答した患者を二次療法で治療することを指す。維持療法は、完全に除去されない場合には腫瘍の増殖能力を遅延させるために、または腫瘍が完全に除去される場合には腫瘍が再発しないようにするために、使用することができる。維持療法は、腫瘍が安定である場合、または患者が完全奏効（例えば、寛解状態であると考えられる）を有していた場合に、使用されることが多い。しかし、維持療法は、対象が、一次療法に対して部分奏効または単なる奏効を有していた場合に使用することもできる。組み合わせは、本明細書に記載のように、ＭＥＫ阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤またはタキサンを含むこともできる。
【００２６】
いくつかの実施形態では、がん転移を治療するための方法であって、ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦまたは汎ＲＡＦ阻害剤（例えば、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、エンコラフェニブ、ソラフェニブ、ＲＡＦ２６５、ＡＤ８０、ＧＤＣ０８７９、ＡＺ６２８、ＺＭ３３６３７２、ＮＶＰＢＨＧ７１２、ＬＹ３００９１２０、ＴＡＫ６３２、ＭＬＮ２４８０及び／またはＸＰ１０２）及びＤＮＡ損傷剤を対象に投与することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、ＭＥＫ阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤またはタキサンを投与することを含み、その非限定例は本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、転移性がんは、転移性黒色腫、膵臓癌、肺癌、結腸癌、卵巣癌、前立腺癌または乳癌である。いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に記載の他の実施形態と同様のまたは同じＢＲＡＦ阻害剤の前に、ＤＮＡ損傷剤を投与することを含む。
【００２７】
がん（腫瘍）は、治療自体に由来する選択圧のために、治療に耐性になることが多い。したがって、ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦまたは汎ＲＡＦ阻害剤などの治療は、初期に作用するが、次いで、耐性が発生するために、一定期間後に作用を停止する可能性がある。本明細書に記載のＢＲＡＦ、ＣＲＡＦまたは汎ＲＡＦ阻害剤をＤＮＡ損傷剤とともに投与することによって、この耐性を克服するまたは減らすことができる。したがって、いくつかの実施形態では、耐性がんを治療する方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦまたは汎ＲＡＦ阻害剤及びＤＮＡ損傷剤を、治療耐性がんを有する対象に投与することを含む。その例は本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、がんは、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、ソラフェニブ、エンコラフェニブ、ＲＡＦ２６５、ＡＤ８０、ＧＤＣ０８７９、ＡＺ６２８、ＺＭ３３６３７２、ＮＶＰＢＨＧ７１２、ＬＹ３００９１２０、ＴＡＫ６３２、ＭＬＮ２４８０及び／またはＸＰ１０２に耐性である。いくつかの実施形態では、方法は、ＭＥＫ阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤及び／またはタキサンあるいはそれらの任意の組み合わせとともに治療剤を投与することを含み、その非限定例は本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に記載の他の実施形態と同様のまたは同じＢＲＡＦ、ＣＲＡＦまたは汎ＲＡＦ阻害剤の前に、ＤＮＡ損傷剤を投与することを含む。
【００２８】
医薬組成物／製剤
医薬組成物は、１種または複数の生理学的に許容可能な担体または賦形剤を使用して、標準的な技法によって製剤化することができる。製剤は、緩衝剤及び／または防腐剤を含むことができる。化合物及びその生理学的に許容可能な塩及び溶媒和化合物は、吸入を介するもの、局所的、経鼻的、経口的、非経口的（例えば、静脈内、腹腔内、膀胱内もしくは髄腔内）または直腸的なものを含めた任意の適切な経路による投与のために、１種または複数の医薬的に許容可能な担体を含むビヒクル中に製剤化することができ、それらの比率は、化合物の溶解度及び化学的性質、選択される投与経路ならびに標準的な生物学的実施によって決定される。
【００２９】
医薬組成物は、本明細書に記載の有効量の１種または複数の化合物（複数可）を、例えば、医薬的に許容可能な希釈剤、防腐剤、可溶化剤、乳化剤、佐剤及び／または他の担体とともに含むことができる。そのような組成物は、様々な緩衝内容物（例えば、ＴＲＩＳまたは他のアミン、カルボネート、リン酸、アミノ酸、例えば、グリシンアミド塩酸塩（特に生理的ｐＨ範囲内のもの）、Ｎ−グリシルグリシン、リン酸ナトリウムもしくはリン酸カリウム（二塩基性、三塩基性）など、またはＴＲＩＳ−ＨＣｌもしくは酢酸）、ｐＨ及びイオン強度の希釈剤；添加剤、例えば、界面活性剤及び可溶化剤（例えば、表面活性剤、例えば、プルロニック、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０（ポリソルベート８０）、クレモフォール、ポリオール、例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなど）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、防腐剤（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール、パラベンなど）、ならびに増量物質（例えば、糖、例えば、スクロース、ラクトース、マンニトール、ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドンまたはデキストランなど）；及び／またはポリ乳酸、ポリグリコール酸などのポリマー化合物の粒子性調製物中への、またはリポソーム中への材料の組み込みを含むことができる。ヒアルロン酸を使用することもできる。そのような組成物は、物理的状態、安定性、インビボ放出の速度及びインビボクリアランスの速度に影響を与えるために用いることができる。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．（１９９０，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．１８０４２）ｐａｇｅｓ  １４３５−１７１２を参照されたい。組成物は、例えば、液体形態で調製してもよく、または凍結乾燥形態などの乾燥粉末の状態でもよい。そのような組成物を投与する特定の方法は以下に記載される。
【００３０】
緩衝剤が本明細書に記載の製剤に含まれることになる場合、緩衝剤は、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リジン、アルギニン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム及びトリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタンまたはそれらの混合物から選択することができる。緩衝剤はまた、グリシルグリシン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム及びリン酸ナトリウムまたはそれらの混合物でもよい。
【００３１】
本明細書に記載の化合物のうちの１つの製剤に医薬的に許容可能な防腐剤が含まれることになる場合、防腐剤は、フェノール、ｍ−クレゾール、メチルｐ−ヒドロキシベンゾエート、プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエート、２−フェノキシエタノール、ブチルｐ−ヒドロキシベンゾエート、２−フェニルエタノール、ベンジルアルコール、クロロブタノール及びチオメルサールまたはそれらの混合物から選択することができる。
【００３２】
防腐剤は、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌの濃度で、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌの濃度で、または約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。
【００３３】
医薬組成物における防腐剤の使用は当業者に周知である。便宜上、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，１９ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５を参照する。
【００３４】
製剤はキレート剤をさらに含むことができ、キレート剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸及びアスパラギン酸の塩ならびにそれらの混合物から選択することができる。
【００３５】
キレート剤は、０．１ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ〜２ｍｇ／ｍｌまたは２ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在し得る。
【００３６】
医薬組成物におけるキレート剤の使用は当業者に周知である。便宜上、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，１９ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５を参照する。
【００３７】
本明細書に記載の化合物の製剤は、高分子量ポリマー及び低分子化合物から選択される安定化剤をさらに含むことができ、そのような安定化剤としては、限定されないが、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ３３５０）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、様々な塩（例えば、塩化ナトリウム）、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、イミダゾール、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン及びスレオニンまたはそれらの任意の混合物が挙げられる。安定化剤は、Ｌ−ヒスチジン、イミダゾールまたはアルギニンでもよい。
【００３８】
高分子量ポリマーは、０．１ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ〜３０ｍｇ／ｍｌまたは３０ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在し得る。
【００３９】
低分子量化合物は、０．１ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ〜３０ｍｇ／ｍｌまたは３０ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在し得る。
【００４０】
医薬組成物における安定化剤の使用は当業者に周知である。便宜上、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，１９ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５を参照する。
【００４１】
本明細書に記載の化合物の製剤は、表面活性剤をさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、表面活性剤は、界面活性剤、エトキシル化ヒマシ油、ポリグリコールグリセリド、アセチル化モノグリセリド、ソルビタン脂肪酸エステル、ポロキサマー、例えば、１８８及び４０７、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン誘導体、例えば、アルキル化及びアルコキシル化誘導体（Ｔｗｅｅｎ、例えば、Ｔｗｅｅｎ−２０またはＴｗｅｅｎ−８０）、モノグリセリドまたはそのエトキシル化誘導体、ジグリセリドまたはそのポリオキシエチレン誘導体、グリセロール、コール酸またはその誘導体、レシチン、アルコール及びリン脂質、グリセロリン脂質（レシチン、ケファリン、ホスファチジルセリン）、グリセロ糖脂質（ガラクトピラノシド）、スフィンゴリン脂質（スフィンゴミエリン）及びスフィンゴ糖脂質（セラミド、ガングリオシド）、ＤＳＳ（ドクサートナトリウム、ドクサートカルシウム、ドクサートカリウム、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウムまたはラウリル硫酸ナトリウム）、ジパルミトイルホスファチジン酸、カプリル酸ナトリウム、胆汁酸及びその塩ならびにグリシンまたはタウリンコンジュゲート、ウルソデオキシコール酸、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム、Ｎ−ヘキサデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、陰イオン性（アルキル−アリール−スルホネート）一価表面活性剤、パルミトイルリゾホスファチジル−Ｌ−セリン、リゾリン脂質（例えば、エタノールアミン、コリン、セリンまたはスレオニンの１−アシル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸エステル）、リゾホスファチジル及びホスファチジルコリンのアルキル、アルコキシル（アルキルエステル）、アルコキシ（アルキルエーテル）誘導体、例えば、リゾホスファチジルコリンのラウロイル及びミリストイル誘導体、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ならびに極性頭部基、すなわち、コリン、エタノールアミン、ホスファチジン酸、セリン、スレオニン、グリセロール、イノシトールの修飾体、ならびに正電荷を帯びたＤＯＤＡＣ、ＤＯＴＭＡ、ＤＣＰ、ＢＩＳＨＯＰ、リゾホスファチジルセリン及びリゾホスファチジルスレオニン、双性イオン性表面活性剤（例えば、Ｎ−アルキル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニオ−１−プロパンスルホネート、３−コールアミド−１−プロピルジメチルアンモニオ−１−プロパンスルホネート、ドデシルホスホコリン、ミリストイルリゾホスファチジルコリン、ニワトリ卵リゾレシチン）、陽イオン性表面活性剤（第四級アンモニウム塩基）（例えば、セチル−トリメチルアンモニウムブロミド、塩化セチルピリジニウム）、非イオン性界面活性剤、ポリエチレンオキシド／ポリプロピレン酸化物ブロックコポリマー（プルロニック／テトロニクス、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ドデシルβ−Ｄ−グルコピラノシド）またはポリマー性表面活性剤（Ｔｗｅｅｎ−４０、Ｔｗｅｅｎ−８０、Ｂｒｉｊ−３５）、フシジン酸誘導体（例えば、タウロ−ジヒドロフシド酸ナトリウムなど）、長鎖脂肪酸及びその塩（Ｃ６〜Ｃ１２）（例えば、オレイン酸及びカプリル���）、アシルカルニチン及び誘導体、リジン、アルギニンもしくはヒスチジンのＮα−アシル化誘導体またはリジンもしくはアルギニンの側鎖アシル化誘導体、リジン、アルギニンまたはヒスチジンと中性または酸性アミノ酸との任意の組み合わせを含むジペプチドのＮα−アシル化誘導体、中性アミノ酸と２つの荷電アミノ酸との任意の組み合わせを含むトリペプチドのＮα−アシル化誘導体から選択することができ、あるいは表面活性剤はイミダゾリン誘導体またはそれらの混合物の群から選択することができる。
【００４２】
医薬組成物における表面活性剤の使用は当業者に周知である。便宜上、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，１９ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５を参照する。
【００４３】
医薬的に許容可能な甘味剤は、本明細書に記載の化合物の製剤の一部であり得る。医薬的に許容可能な甘味剤としては、少なくとも１つの強い甘味剤、例えば、サッカリン、サッカリンナトリウムまたはサッカリンカルシウム、アスパルテーム、アセスルファムカリウム、シクラミン酸ナトリウム、アリターム、ジヒドロカルコン甘味剤、モネリン、ステビオシドまたはスクラロース（４，１’，６’−トリクロロ−４，１’，６’−トリデオキシガラクトスクロース）、サッカリン、サッカリンナトリウムまたはサッカリンカルシウム、ならびに場合により、バルク甘味剤、例えば、ソルビトール、マンニトール、フルクトース、スクロース、マルトース、イソマルト、グルコース、水素化グルコースシロップ、キシリトール、カラメル及びハチミツが挙げられる。
【００４４】
強い甘味剤は、低濃度で都合よく用いられる。例えば、サッカリンナトリウムの場合には、濃度は、最終的な製剤の全体積に基づいて０．０４％〜０．１％（ｗ／ｖ）の範囲にわたり得るか、または低投与量製剤で約０．０６％であり、高投薬量製剤で約０．０８％である。バルク甘味剤は、約１０％〜約３５％または約１０％〜１５％（ｗ／ｖ）の範囲にわたる、より多くの量で効果的に使用され得る。
【００４５】
本明細書に記載の化合物の製剤は、従来の技法によって、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９８５、またはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，１９ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５に記載されているように調製することができ、医薬品産業のそのような従来の技法は、所望の最終産物を得るために、適宜、成分を溶解し、混合することを含む。
【００４６】
フレーズ「医薬的に許容可能な」または「治療的に許容可能な」は、ヒトに投与される場合に、生理的に忍容性があり、好ましくは、アレルギー反応または同様の有害な反応、例えば、急性胃蠕動、眩暈などを典型的にはもたらさない、分子実体及び組成物を指す。本明細書で使用する場合、用語「医薬的に許容可能な」は、動物における、より詳細にはヒトにおける使用について、連邦または州政府の規制当局により承認されている、または米国薬局方もしくは他の一般に認められている薬局方（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ  ｅｄｉｔ．１９８５）に列挙されていることを意味する。
【００４７】
本明細書に記載の化合物の投与は、当技術分野で既知の任意の方法を使用して行うことができる。例えば、投与は、経皮投与、非経口投与、静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、頭蓋内投与、眼窩内投与、眼部投与、心室内投与、関節内投与、髄腔内投与、大槽内投与、腹腔内投与、脳室内投与、髄腔内投与、鼻腔内投与、エアロゾル投与、坐剤による投与、または経口投与でもよい。本明細書に記載の化合物の医薬組成物は、注射投与用、または経口投与、肺投与、経鼻投与、経皮投与、眼投与用であってもよい。
【００４８】
経口投与については、本明細書に記載の化合物の医薬組成物は、単位剤形、例えば、カプセル剤または錠剤に製剤化することができる。錠剤またはカプセル剤は、結合剤、例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンもしくはヒドロキシプロピルメチルセルロース；フィラー、例えば、ラクトース、微結晶セルロースもしくはリン酸水素カルシウム；潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクもしくはシリカ；崩壊剤、例えば、ジャガイモデンプンもしくはデンプングリコール酸ナトリウム；または湿潤剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウムを含めた医薬的に許容可能な賦形剤を用いて、従来の手段によって調製することができる。錠剤は、当技術分野で周知の方法によってコーティングすることができる。経口投与用の液体調製物は、例えば、溶液剤、シロップ剤もしくは懸濁剤の形態をとることができ、またはこれは、使用前に水もしくは他の適切なビヒクルで構成するための乾燥生成物として提供することができる。そのような液体調製物は、医薬的に許容可能な添加剤、例えば、懸濁化剤、例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用脂；乳化剤、例えば、レシチンまたはアラビアゴム；非水性ビヒクル、例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコールまたは分画植物油；及び防腐剤、例えば、メチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸を用いて、従来の手段によって調製することができる。調製物は、適宜、緩衝塩、着香料、着色剤及び／または甘味剤を含むこともできる。所望ならば、経口投与用調製物は、活性化合物の制御放出を与えるように、適切に製剤化することができる。いくつかの実施形態では、単位剤形は、ＢＲＡＦ阻害剤と１種または複数のＤＮＡ損傷剤の両方を含む組み合わせ生成物として製剤化することができる。いくつかの実施形態では、単位剤形は、ＢＲＡＦ阻害剤を含む１つの組成物及びＤＮＡ損傷剤の１つまたは複数を含む第２の組成物を指す。複数のＤＮＡ損傷剤が使用される場合は、同数の単位剤形を調製し、使用することができる。
【００４９】
非経口投与については、本明細書に記載の化合物は、医薬的に許容可能なビヒクルまたは担体を有する組成物に入れられて、静脈内、皮下または筋肉内注射のいずれかによって投与される。化合物は、注射による、例えば、ボーラス注射または持続注入による非経口投与用に製剤化することができる。注射用製剤は、単位剤形で、例えば、アンプルで、または多回用量容器で、防腐剤を添加して、提供することができる。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁剤、液剤または乳剤などの形態をとることができ、製剤用薬剤、例えば、懸濁化剤、安定化剤及び／または分散剤を含むことができる。あるいは、活性成分は、使用前に、適切なビヒクル、例えば、滅菌した発熱物質を含まない水で構成するための粉末形態でもよい。
【００５０】
注射による投与については、化合物（複数可）は、滅菌水性ビヒクルの溶液で使用することができ、これは、他の溶質、例えば、緩衝剤または防腐剤及び溶液を等張にするのに十分な量の医薬的に許容可能な塩またはグルコースを含むこともできる。本明細書に記載の化合物の医薬組成物は、注射可能な投与用の滅菌溶液剤または懸濁剤を提供するために、医薬的に許容可能な担体を用いて製剤化することができる。注射液は、液体溶液剤もしくは懸濁剤、注射前の液体の溶液剤もしくは懸濁剤に適した固体形態として、または乳剤としてのいずれかとして、従来の形態で調製することができる。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、マンニトール、ラクトース、レシチン、アルブミン、グルタミン酸ナトリウム、システイン塩酸塩などである。さらに、所望ならば、注射可能な医薬組成物は、少量の無毒の補助物質、例えば、湿潤剤、ｐＨ緩衝剤などを含むことができる。所望ならば、吸収増強調製物（例えば、リポソーム）を利用することができる。適切な医薬担体は、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”ｂｙ  Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎに記載されている。注射製剤は、ＢＲＡＦ阻害剤と１種または複数のＤＮＡ損傷剤との組み合わせを含むことができる。注射製剤は、別々の製剤を１つにまとめることによって調製することもできる。製剤は、順次または同時にまたはほぼ同時に投与することもできる。
【００５１】
化合物は、例えば、従来の坐剤基材、例えば、ココアバターまたは他のグリセリドを含む、直腸用組成物、例えば、坐剤または停留浣腸に製剤化することもできる。
【００５２】
さらに、化合物はデポー調製物として製剤化することができる。そのような長時間作用型製剤は、埋植（例えば、皮下もしくは筋肉内）によって、または筋肉内注射によって、投与することができる。したがって、例えば、化合物は、適切なポリマー性もしくは疎水性材料（例えば、許容可能な油の乳剤として）またはイオン交換樹脂を用いて、あるいは難溶性誘導体として、例えば、難溶性塩として、製剤化することができる。
【００５３】
組成物は、所望ならば、活性成分を含む１つまたは複数の単位剤形を含むことができるパックまたはディスペンサー装置に入れて、提供することができる。パックは、例えば、金属箔またはプラスチック箔を含むことができ、例えば、ブリスターパックである。パックまたはディスペンサー装置に、投与のための指示を添付することができる。
【００５４】
本明細書に記載の化合物は、プロドラッグと称される誘導体も含み、これは、慣例的な操作またはインビボのいずれかで修飾が切断されて親化合物になるような方法で、化合物中に存在する官能基を修飾することによって、調製することができる。
【００５５】
投薬量
本明細書に記載の化合物は、本明細書に記載の１種または複数の疾患、例えば、限定されないが、本明細書に記載のがんを予防する、治療する、または管理するために、治療有効用量で患者に投与することができる。本明細書に記載の化合物の１種または複数を含む医薬組成物は、患者において有効な治療応答を誘発するのに十分な量で患者に投与することができる。これを達成するのに適切な量は、「治療有効用量」と定義される。用量は、用いられる特定の化合物の有効性及び対象の状態、ならびに体重または治療される領域の表面積によって、決定することができる。用量サイズはまた、特定の対象における、特定の化合物またはベクターの投与に付随する任意の有害作用の存在、性質及び程度によって、決定することができる。
【００５６】
そのような化合物の毒性及び治療有効性は、細胞培養または実験動物における標準の薬学的手順によって、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％を死に至らせる用量）及びＥＤ５０（集団の５０％で治療的有効な用量）を決定することによって、決定することができる。ＬＤ５０及びＥＤ５０は、成分単独または組み合わせについて決定することができる。毒性及び治療効果の間の用量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比で表すことができる。いくつかの実施形態では、より大きな治療指数を示す組み合わせが使用される。毒性副作用を示す化合物を使用することができるが、正常細胞への潜在的な損傷を最小にし、それによって副作用を低減させるようにそのような化合物を罹患組織部位に向ける送達システムを設計するように、注意を払う必要がある。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される、ＢＲＡＦ阻害剤と１種または複数のＤＮＡ損傷剤との組み合わせを使用することによって、副作用を回避することができる。より低い用量の１種または複数の治療剤を使用することによって、副作用を回避するまたは低減させることができる。
【００５７】
細胞培養アッセイ及び動物研究から得られたデータは、ヒトで使用するための投薬量範囲を定式化するのに使用することができる。いくつかの実施形態では、そのような化合物の投薬量は、毒性がほとんどまたは全くないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投薬量は、用いられる剤形及び投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。本明細書に記載される任意の化合物については、治療有効用量は、最初に、細胞培養アッセイから推定することができる。用量は、細胞培養で決定された通りのＩＣ５０（症状の最大半量阻害を達成する試験化合物濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように、動物モデルにおいて定式化することができる。そのような情報は、ヒトでの有用な用量をより正確に決定するのに使用することができる。血漿中レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって測定することができる。一般に、モジュレーターの用量当量は、典型的な対象に対して約１ｎｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇである。
【００５８】
本明細書に記載の化合物及び／またはそれらの医薬的に許容可能な塩の量及び投与頻度は、患者の年齢、状態及びサイズならびに治療される症状の重症度などの因子を考慮して、担当臨床医の判断に従って調節される。通常の技術を有する医師または獣医師は、状態の進行を予防する、状態の進行に対抗する、または状態の進行を抑止するのに必要とされる、薬物の有効量を容易に決定し、処方することができる。一般に、有効量は、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、特に、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ体重であろうことが意図される。必要とされる用量を、２つ、３つ、４つまたはそれ以上のサブ用量として１日を通して適切な間隔で投与することが適切である場合がある。該サブ用量は、例えば、単位剤形あたり０．０１〜５００ｍｇ、特に０．１ｍｇ〜２００ｍｇの活性成分を含む単位剤形として製剤化することができる。
【００５９】
いくつかの実施形態では、医薬調製物は単位剤形である。そのような形態では、調製物は、活性成分の適切な量、例えば、所望の目的を達成するのに有効な量を含む、適切にサイズ調整された単位用量に細分される。調製物の単位用量中の活性化合物の量は、特定の用途に従って、約０．０１ｍｇ〜約１０００ｍｇ、約０．０１ｍｇ〜約７５０ｍｇ、約０．０１ｍｇ〜約５００ｍｇまたは約０．０１ｍｇ〜約２５０ｍｇに変動させるまたは調整することができる。いくつかの実施形態では、対象に投与されるＢＲＡＦ、ＣＲＡＦもしくは汎ＲＡＦ阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩の量は、９６０ｍｇ、７２０ｍｇ、４８０ｍｇ、２４０ｍｇ、１５０ｍｇ、１００ｍｇ、５０ｍｇもしくは２５ｍｇ（１日２回）未満、約９６０ｍｇ、７２０ｍｇ、４８０ｍｇ、２４０ｍｇ、１５０ｍｇ、１００ｍｇ、５０ｍｇもしくは２５ｍｇ（１日２回）、または９６０ｍｇ、７２０ｍｇ、４８０ｍｇ、２４０ｍｇ、１５０ｍｇ、１００ｍｇ、５０ｍｇもしくは２５ｍｇ（１日２回）である。用いられる実際の投薬量は、患者の要求及び治療される状態の重症度によって変動し得る。特定の状況に対して適切な投薬レジメンの決定は当技術分野の範囲内である。便宜上、必要に応じて、全投薬量は、一日の間で複数に分割し、投与することができる。
【００６０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１種または複数の化合物は、別の化合物とともに投与される。投与は、順次でもよいし、同時でもよい。組み合わせは、同じ剤形中であってもよく、または別々の用量として投与されてもよい。いくつかの実施形態では、第１の化合物はＢＲＡＦ、ＣＲＡＦまたは汎ＲＡＦ阻害剤であり、他の化合物は１種または複数のＤＮＡ損傷剤である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ損傷剤は、ゲムシタビン、５−ＦＵ、シタラビン、メトトレキサート、ピリメタミン、ブレオマイシン、オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、エトポシド、ドキソルビシン、ビノレルビン、ミトキサントロン、ポドフィロトキシン、アフィディコリン、フォテムスチン、カルムスチン、Ｓ−２３９０６、Ｓ３９、ＳＮ−３８、トポテカン、カンプトテシン、レベッカマイシンなどである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ損傷剤は、ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦまたは汎ＲＡＦ阻害剤の前に投与される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ損傷剤は、ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦまたは汎ＲＡＦ阻害剤の少なくともまたは約１０、２０、３０、４０、５０、６０、１２０、１８０、２４０、３００または３６０分前に投与される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ損傷剤は、ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦまたは汎ＲＡＦ阻害剤の少なくともまたは約、１、２、３、４または５日前に投与される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ損傷剤は、ＭＥＫ阻害剤またはタキサンが対象に投与されるより前に対象に投与される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ損傷剤は、ＭＥＫ阻害剤またはタキサンの少なくともまたは約１０、２０、３０、４０、５０、６０、１２０、１８０、２４０、３００または３６０分前に投与される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ損傷剤は、ＭＥＫ阻害剤またはタキサンの少なくともまたは約、１、２、３、４または５日前に投与される。
【００６１】
いくつかの実施形態では、ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦまたは汎ＲＡＦ阻害剤の量は、約１ｍｇ〜約１００ｍｇ、約５ｍｇ〜約１００ｍｇ、約１０ｍｇ〜約１００ｍｇ、約２５ｍｇ〜約１００ｍｇ、約５０ｍｇ〜約１００ｍｇまたは約７５ｍｇ〜約１００ｍｇであり得る。いくつかの実施形態では、ＢＲＡＦ阻害剤の量は、約１ｍｇ〜約８０ｍｇ、約１ｍｇ〜約６０ｍｇ、約１ｍｇ〜約４０ｍｇ、約１ｍｇ〜約２０ｍｇまたは約１ｍｇ〜約１０ｍｇであり得る。いくつかの実施形態では、ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦまたは汎ＲＡＦ阻害剤の量は、約５ｍｇ〜約８０ｍｇであり得る。いくつかの実施形態では、ＢＲＡＦ阻害剤の量は約５ｍｇ〜約２４０ｍｇである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ損傷剤は、約１２５０ｍｇ／ｍ２、１０００ｍｇ／ｍ２、８００ｍｇ／ｍ２、６００ｍｇ／ｍ２、４００ｍｇ／ｍ２、２００ｍｇ／ｍ２、１００ｍｇ／ｍ２もしくは５０ｍｇ／ｍ２、２５ｍｇ／ｍ２、１０ｍｇ／ｍ２もしくは５ｍｇ／ｍ２の用量で、または１２５０ｍｇ／ｍ２、１０００ｍｇ／ｍ２、８００ｍｇ／ｍ２、６００ｍｇ／ｍ２、４００ｍｇ／ｍ２、２００ｍｇ／ｍ２、１００ｍｇ／ｍ２もしくは５０ｍｇ／ｍ２、２５ｍｇ／ｍ２、１０ｍｇ／ｍ２もしくは５ｍｇ／ｍ２未満の用量で、あるいはこれらの間の任意の範囲の用量で投与される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ損傷剤の用量は、患者または対象に対して亜致死量と考えられる。
【００６２】
本明細書に記載の化合物は、制吐剤とも称され得る抗悪心剤とともに投与することもできる。そのような薬剤の例としては、限定されないが、ドラセトロン、グラニセトロン、オンダンセトロン、トロピセトロン、パロノセトロン、ミルタザピン、アプレピタント、カソピタントなどが挙げられる。
【００６３】
医学的使用
本明細書に記載の組成物は、がんを治療するのに有用であり得る。そのようながんの例としては、限定されないが、黒色腫、膵臓癌、肺癌、結腸癌、卵巣癌、前立腺癌及び乳癌が挙げられる。いくつかの実施形態では、腫瘍は、ＢＲＡＦ変異に対して陰性である。いくつかの実施形態では、腫瘍は野生型ＢＲＡＦである。いくつかの実施形態では、腫瘍はＢＲＡＦに変異を有する。いくつかの実施形態では、腫瘍はＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異を有する。いくつかの実施形態では、腫瘍はＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異がない。いくつかの実施形態では、腫瘍はＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｋ変異を有する。いくつかの実施形態では、腫瘍はＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｋ変異がない。いくつかの実施形態では、腫瘍はＲＡＳ（例えば、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ及び／またはＨＲＡＳ）変異を有する。いくつかの実施形態では、ＲＡＳ変異はＧ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２ＶまたはＧ１３Ｄである。いくつかの実施形態では、腫瘍はＲＡＳ変異がない。いくつかの実施形態では、腫瘍は野生型ＲＡＳである。誤解を避けるために、用語「ＲＡＳ」は、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ及び／またはＨＲＡＳを指すことができる。いくつかの実施形態では、ＲＡＳはＫＲＡＳである。いくつかの実施形態では、ＲＡＳはＮＲＡＳである。いくつかの実施形態では、ＲＡＳはＨＲＡＳである。
【００６４】
いくつかの実施形態では、腫瘍は、ＢＲＡＦ阻害剤と１種または複数のＤＮＡ損傷剤との組み合わせを投与するより前に、変異について解析される。いくつかの実施形態では、腫瘍はＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異について解析される。いくつかの実施形態では、腫瘍はＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｋ変異について解析される。いくつかの実施形態では、腫瘍はＲＡＳ  Ｇ１２Ｃ変異について解析される。いくつかの実施形態では、腫瘍はＲＡＳ  Ｇ１２Ｄ変異について解析される。いくつかの実施形態では、腫瘍はＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ変異について解析される。いくつかの実施形態では、腫瘍はＲＡＳ  Ｇ１３Ｄ変異について解析される。いくつかの実施形態では、患者は、ＢＲＡＦ中の変異が見出されない場合、ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦまたは汎ＲＡＦ阻害剤とＤＮＡ損傷剤との組み合わせでのみ治療される。いくつかの実施形態では、患者は、ＢＲＡＦ中の変異が見出される場合、ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦまたは汎ＲＡＦ阻害剤とＤＮＡ損傷剤との組み合わせでのみ治療される。いくつかの実施形態では、患者は、ＲＡＳ中の変異が見出されない場合、ＢＲＡＦ阻害剤とＤＮＡ損傷剤の組み合わせでのみ治療される。いくつかの実施形態では、患者は、ＲＡＳ中の変異が見出される場合、ＢＲＡＦ阻害剤とＤＮＡ損傷剤の組み合わせでのみ治療される。
【００６５】
いくつかの実施形態では、がんを治療する方法が提供される。いくつかの実施形態では、がんは黒色腫、膵臓癌、肺癌（例えば、ＮＳＣＬＣもしくはＳＣＬＣ）、結腸癌、卵巣癌、前立腺癌または乳癌である。いくつかの実施形態では、がんは、本明細書に記載のがんのうちの１つとして発生した転移性がんである。したがって、本明細書に記載のように、転移性がんを治療する方法が提供される。
【００６６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、本明細書に記載のように、ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦまたは汎ＲＡＦ阻害剤と１種または複数のＤＮＡ損傷剤との組み合わせを投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦまたは汎ＲＡＦ阻害剤は、１種もしくは複数のＤＮＡ損傷剤と同時に、または１種もしくは複数のＤＮＡ損傷剤の（前もしくは後に）順次対象に投与される。いくつかの実施形態では、方法は、ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦもしくは汎ＲＡＦ阻害剤を最初に投与し、次いで、阻害剤が完全に投与される前に、１種もしくは複数のＤＮＡ損傷剤を投与すること、またはその逆を含む。そのような投与は、治療剤の重複と称され得る。いくつかの実施形態では、組み合わせはまた、本明細書に記載のように、ＭＥＫ阻害剤またはＥＧＦＲ阻害剤とともに投与される。化合物は、任意の順序で投与することができ、これらは単なる例に過ぎず、制限を意図したものではない。いくつかの実施形態では、対象は、ＢＲＡＦ、ＭＥＫ阻害剤及び／またはタキサンで治療されるより前に、本明細書に記載のＤＮＡ損傷剤が投与される。いくつかの実施形態では、対象は、第１ステップで、ゲムシタビン、メトトレキサートもしくはピリメタミン（または本明細書に記載の他のＤＮＡ損傷剤）が投与され、次いで、その後に、対象は、ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦもしくは汎ＲＡＦ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤及び／またはタキサンが投与される。これは前治療とも称され得る。したがって、いくつかの実施形態では、対象は、ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦまたは汎ＲＡＦ阻害剤が対象に投与される前に、ＤＮＡ損傷剤で前治療される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ損傷剤の投与とＢＲＡＦ阻害剤及び／またはＭＥＫ阻害剤及び／またはタキサンの投与の間の時間は、約または少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１６、１８、２０または２４時間である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ損傷剤の投与とＢＲＡＦ、ＣＲＡＦもしくは汎ＲＡＦ及び／またはＭＥＫ阻害剤及び／またはタキサンの投与の間の時間は、約または少なくとも１〜２４、１〜１８、１〜１２、１〜８、１〜６、１〜４、４〜１２、４〜１６、４〜２０、４〜２４、８〜１２、８〜１６、８〜２０、８〜２４、１２〜１６、１２〜１８、１２〜２４、１６〜２０、１６〜２４または２０〜２４時間である。いくつかの実施形態では、ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦもしくは汎ＲＡＦ及び／またはＭＥＫ阻害剤及び／またはタキサンは、ＤＮＡ損傷剤が投与されてから１〜１０日後に投与される。いくつかの実施形態では、ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦもしくは汎ＲＡＦ及び／またはＭＥＫ阻害剤及び／またはタキサンは、ＤＮＡ損傷剤が投与されてから約または少なくとも１〜１０日後に投与される。いくつかの実施形態では、ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦもしくは汎ＲＡＦ及び／またはＭＥＫ及び／またはタキサン阻害剤は、約もしくは少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、またはＤＮＡ損傷剤が投与された後に投与される。このプロトコールは、必要に応じて、例えば、単に例として、１、２、３、４、５、６、７または８回繰り返すことができる。いくつかの実施形態では、対象は、ＭＥＫ阻害剤が投与されない。いくつかの実施形態では、ＢＲＡＦ阻害剤は、ＭＥＫ阻害剤及び／またはタキサンなしで投与される。いくつかの実施形態では、ＢＲＡＦ阻害剤は、ＭＥＫ阻害剤及び／またはタキサンを含まずに投与される。いくつかの実施形態では、ＢＲＡＦ阻害剤は、ＭＥＫ阻害剤及び／またはタキサンの非存在下で投与される。いくつかの実施形態では、ＢＲＡＦ阻害剤を含む医薬組成物は、ＭＥＫ阻害剤及び／またはタキサンがない。
【００６７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、対象の腫瘍においてＢＲＡＦ及び／またはＲＡＳ変異を検出すること、ならびにＢＲＡＦ及び／またはＲＡＳ変異を有しない対象において、ＢＲＡＦ阻害剤と１種または複数のＤＮＡ損傷剤との組み合わせで対象を治療することを含む。治療方法及び異なる活性成分の投与順序は、本明細書に記載される任意の方法に従って行うことができる。これは、例えば、患者が治療から恩恵を受けることを確実にするために、行うことができる。しかし、患者が、そのような変異について特に試験される必要はない。いくつかの実施形態では、検出されない変異はＢＲＡＦ  Ｖ６００ＥまたはＶ６００Ｋである。いくつかの実施形態では、ＢＲＡＦ及び／またはＲＡＳ変異を有する対象は、本明細書に記載の組み合わせで治療される。いくつかの実施形態では、治療される対象は、野生型ＢＲＡＦ及び変異型ＲＡＳである腫瘍を有する。いくつかの実施形態では、変異ＲＡＳは本明細書に記載の変異を含む。いくつかの実施形態では、治療される対象は、変異型ＢＲＡＦ及び変異型ＲＡＳを有する腫瘍を有する。いくつかの実施形態では、それぞれの変異は本明細書に記載されるものである。いくつかの実施形態では、治療される対象は、変異型ＢＲＡＦ及び野生型ＲＡＳを有する腫瘍を有する。変異は任意の変異、例えば本明細書に記載のものであり得る。腫瘍中に存在する変異は、任意の方法、例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ゲノムシークエンシング、ＲＮＡシークエンシング、ノーザンブロット、サザンブロット、ウエスタンブロットあるいはＢＲＡＦ及び／またはＲＡＳ中の変異を検出するのに使用することができる任意の他の分子技法によって、検出することができる。ＢＲＡＦ及び／またはＲＡＳ中の変異を検出する特定の方法は、重要ではない。変異は、任意の腫瘍試料において検出することができる。腫瘍試料は、例えば生検を介して、得ることができる。腫瘍の変異状況を特定するために、血液試料を使用することもできる。変異の有無を検出するための試料及び技法は、本明細書に記載の方法にとって重要ではない。
【００６８】
いくつかの実施形態では、薬物耐性腫瘍を治療する方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦもしくは汎ＲＡＦ阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩及びＤＮＡ損傷剤を投与することを含む。いくつかの実施形態では、薬物耐性腫瘍は、ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦまたは汎ＲＡＦ阻害剤からなる治療に耐性である。いくつかの実施形態では、薬物耐性腫瘍は転移性腫瘍である。いくつかの実施形態では、転移性腫瘍は、転移性黒色腫、転移性膵臓腫瘍、転移性肺腫瘍、転移性結腸腫瘍、転移性卵巣腫瘍、転移性前立腺腫瘍、転移性肺腫瘍または転移性乳房腫瘍である。いくつかの実施形態では、薬物耐性腫瘍は、黒色腫、膵臓腫瘍、肺腫瘍、結腸腫瘍、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍、肺腫瘍または乳房腫瘍である。
【００６９】
いくつかの実施形態では、薬物耐性腫瘍は野生型ＢＲＡＦとして特徴づけられる。いくつかの実施形態では、薬物耐性腫瘍は変異ＢＲＡＦとして特徴づけられる。いくつかの実施形態では、変異ＢＲＡＦはＢＲＡＦ  Ｖ６００ＥまたはＶ６００Ｋである。
【００７０】
いくつかの実施形態では、薬物耐性腫瘍は野生型ＲＡＳとして特徴づけられる。いくつかの実施形態では、薬物耐性腫瘍は変異ＲＡＳとして特徴づけられる。いくつかの実施形態では、薬物耐性腫瘍を治療する方法は、投与ステップより前に、対象に由来する腫瘍試料においてＢＲＡＦ  Ｖ６００ＥまたはＶ６００Ｋ変異の有無を検出することをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、投与ステップより前に、対象に由来する腫瘍試料においてＲＡＳ変異の有無を検出することを含む。ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦまたは汎ＲＡＦ阻害剤は、本明細書に記載される任意のそのような阻害剤であり得る。
【００７１】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ損傷剤は、本明細書に記載される任意のものである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ損傷剤は、ゲムシタビン、５−ＦＵ、シタラビン、メトトレキサート、ピリメタミン、ブレオマイシン、オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、エトポシド、ドキソルビシン、ビノレルビン、ミトキサントロン、ポドフィロトキシン、アフィディコリン、フォテムスチン、カルムスチン、Ｓ−２３９０６、Ｓ３９、ＳＮ−３８、トポテカン、カンプトテシン、レベッカマイシンまたはそれらの任意の医薬的に許容可能な塩である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ損傷剤は、ゲムシタビン、メトトレキサート及び／またはピリメタミンである。
【００７２】
本明細書に記載のように、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組み合わせは、１種または複数の医薬的に許容可能な担体を含むビヒクル中で、限定されないが、吸入を介するもの、局所的、経鼻的、経口的、非経口的（例えば、静脈内、腹腔内、膀胱内もしくは髄腔内）または直腸的なものを含めた任意の適切な経路によって投与することができ、それらの比率は、化合物の溶解度及び化学的性質、選択される投与経路ならびに標準的な実施によって決定される。
【００７３】
本明細書で提供される実施形態は、キットも提供した。いくつかの実施形態では、キットは、ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦもしくは汎ＲＡＦ阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩を含む医薬組成物及びＤＮＡ損傷剤を含む医薬組成物を含む。いくつかの実施形態では、１つの医薬組成物が両方を含む。いくつかの実施形態では、これらは別々の医薬組成物である。いくつかの実施形態では、キットは、ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦまたは汎ＲＡＦ阻害剤を含む第１の医薬的に許容可能な容器及びＤＮＡ損傷剤を含む第２の医薬的に許容可能な容器を含む。いくつかの実施形態では、容器は滅菌されており、発熱物質を含まない。いくつかの実施形態では、キットは処方情報を含む。いくつかの実施形態では、処方情報は、ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦまたは汎ＲＡＦ阻害剤及びＤＮＡ損傷剤を野生型ＢＲＡＦ及び／または変異ＢＲＡＦとして特徴づけられる腫瘍を有する対象に投与するための指示を含む。いくつかの実施形態では、処方情報は、ＢＲＡＦ阻害剤及びＤＮＡ損傷剤を野生型ＲＡＳまたは変異ＲＡＳとして特徴づけられる腫瘍を有する対象に投与するための指示を含む。
【００７４】
本明細書で提供される実施形態は、ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦまたは汎ＲＡＦ阻害剤を含む医薬組成物及び処方情報を含む容器も提供し、処方情報は、ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦまたは汎ＲＡＦ阻害剤をＤＮＡ損傷剤とともに野生型ＲＡＦと特徴づけられる腫瘍を有する対象に投与するための指示を含む。いくつかの実施形態では、腫瘍は黒色腫腫瘍である。いくつかの実施形態では、容器は、ＢＲＡＦ阻害剤を含む、カプセル剤、錠剤または他の経口投与剤形を含む。いくつかの実施形態では、ＢＲＡＦ阻害剤は、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、エンコラフェニブもしくはソラフェニブまたはそれらの医薬的に許容可能な塩である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ損傷剤は、二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こす薬剤、一本鎖切断を引き起こす薬剤、代謝拮抗剤、ＤＮＡ架橋剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ポリメラーゼ阻害剤またはアルキル化剤である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ損傷剤は、ゲムシタビン、５−ＦＵ、シタラビン、メトトレキサート、ピリメタミン、ブレオマイシン、オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、エトポシド、ドキソルビシン、ビノレルビン、ミトキサントロン、ポドフィロトキシン、アフィディコリン、フォテムスチン、カルムスチン、Ｓ−２３９０６、Ｓ３９、ＳＮ−３８、トポテカン、カンプトテシン、レベッカマイシンまたはそれらの任意の医薬的に許容可能な塩である。いくつかの実施形態では、指示は、ＥＧＦＲ阻害剤またはＭＥＫ阻害剤またはタキサン、例えば、限定されないが、本明細書に記載のものを対象に投与することをさらに提供する。
【００７５】
定義
別段定義しない限り、本明細書で使用するすべての技術用語及び科学用語は、当業者が通常理解するものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様または均等の方法及び材料を本明細書に記載の組成物及び化合物の実施または試験において使用することができるが、適切な方法及び材料を以下に記載する。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。矛盾がある場合には、定義を含めて本明細書が優先する。さらに、材料、方法及び実施例は例示に過ぎず、制限を意図したものではない。本明細書に記載の組成物及び化合物の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかである。
【００７６】
本明細書で使用する場合、フレーズ「医薬的に許容可能な」は、適切な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応または他の問題もしくは合併症をともなわないで、ヒト及び動物の組織と接触させて使用するのに適しており、合理的な利益／危険比に見合う、化合物、材料、組成物及び／または剤形を指す。
【００７７】
「医薬製剤」は、担体、溶媒、賦形剤及び塩が、製剤の活性成分（例えば、本明細書に記載の化合物）に適合しなければならないことをさらに意味する。用語「医薬製剤」と「医薬組成物」は一般に互換的であり、これらは、本出願において、そのように使用されることが当業者に理解される。
【００７８】
本明細書で使用する場合、「医薬的に許容可能な塩」は、開示される化合物の誘導体であって、親化合物が、それらの酸性塩または塩基塩を作製することにより修飾される誘導体を指す。医薬的に許容可能な塩の例としては、限定されないが、アミンなどの塩基性残基の無機または有機酸塩；カルボン酸などの酸性残基のアルカリまたは有機塩などが挙げられる。医薬的に許容可能な塩は、例えば、無毒の無機酸または有機酸から形成される、親化合物の従来の無毒の塩または第四級アンモニウム塩を含む。例えば、そのような従来の無毒の塩としては、限定されないが２−アセトキシ安息香酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、酢酸、アスコルビン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、重炭酸、炭酸、クエン酸、エデト酸、エタンジスルホン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルタミン酸、グリコール酸、グリコリルアルサニル酸、ヘキシルレゾルシン酸、ヒドラバム酸、臭化水素酸、塩酸、ヨウ化水素酸、ヒドロキシマレイン酸、ヒドロキシナフトエ酸、イセチオン酸、乳酸、ラクトビオン酸、ラウリルスルホン酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ナプシル酸、硝酸、シュウ酸、パモ酸、パントテン酸、フェニル酢酸、リン酸、ポリガラクツロ酸、プロピオン酸、サリチル酸、ステアリン酸、亜酢酸（ｓｕｂａｃｅｔｉｃ）、コハク酸、スルファミン酸、スルファニル酸、硫酸、タンニン酸、酒石酸及びトルエンスルホン酸から選択される無機酸及び有機酸に由来するものが挙げられる。本開示は、本明細書に記載される任意の化合物（複数可）の医薬的に許容可能な塩を含む。
【００７９】
医薬的に許容可能な塩は、従来の化学的方法によって、塩基性または酸性部分を含む親化合物から合成することができる。一般に、そのような塩は、水中、もしくは有機溶媒中、または２つの混合物（一般に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノールまたはアセトニトリルなどのような非水性媒体）中で、これらの化合物の遊離酸または塩基形態を化学量論的量の適切な塩基または酸と反応させることによって調製することができる。適切な塩のリストは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １８ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，ＵＳＡ，ｐ．１４４５（１９９０）に見られる。
【００８０】
プロドラッグは、医薬品の多数の望ましい品質（例えば、溶解度、バイオアベイラビリティ、製造など）を増強することが既知であるので、本明細書に記載の化合物は、疾患の治療のために、プロドラッグ形態で送達することができ、この形態で投与することができる。「プロドラッグ」は、そのようなプロドラッグが哺乳類対象に投与される場合に、本明細書に記載の活性な親薬物をインビボで放出する任意の共有結合した担体を含むことが意図される。プロドラッグは、慣例的な操作またはインビボのいずれかで修飾が切断されて親化合物になるような方法で、化合物中に存在する官能基を修飾することによって、調製される。プロドラッグは、ヒドロキシ基、アミノ基またはスルフヒドリル基が、プロドラッグが哺乳類対象に投与された場合に、それが開裂して、それぞれ遊離ヒドロキシル基、遊離アミノ基または遊離スルフヒドリル基を形成する任意の基に結合している、本明細書に記載の化合物を含む。プロドラッグの例としては、限定されないが、本明細書に記載の化合物のアルコール及びアミン官能基の酢酸、ギ酸及び安息香酸誘導体が挙げられる。
【００８１】
本明細書で使用する場合、「治療する」または「治療」は、状態、疾患、障害などの改善をもたらす、任意の効果、例えば、減らすこと、低減させること、調節すること、または除去することを含む。病態を「治療すること」または病態の「治療」は、哺乳動物、特にヒトにおける疾患状態の治療を意味し、以下を含む：（ａ）現行の疾患状態を阻害すること、すなわち、その発達もしくはその臨床症状を抑止すること；及び／または（ｃ）疾患状態を軽減すること、すなわち、病態の退行を引き起こすこと。
【００８２】
本明細書で使用する場合、「哺乳動物」または「対象」は、ヒト及び非ヒト患者を指す。いくつかの実施形態では、対象は、それらを必要とする対象である。用語「対象」及び「患者」は、互換的に使用され得る。本明細書で使用する場合、「それらを必要とする」患者は、治療を必要とするとして特定されている、または治療を必要とする疑いがある対象である。例えば、がんと診断されている対象はそれらを必要とする対象とみなすことができる。伝統的に、ＢＲＡＦ変異がない対象は、ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦまたは汎ＲＡＦ阻害剤について、それらを必要とする対象とみなされないと思われ、この理由は、これが、そのような治療に対して禁忌であるからである。しかし、ＢＲＡＦ阻害剤及び１種または複数のＤＮＡ損傷剤の本明細書に記載の組み合わせは、組み合わせがそのようなＢＲＡＦ野生型腫瘍をＢＲＡＦ、ＣＲＡＦまたは汎ＲＡＦ阻害剤の治療に感受性にする能力により、その同じ対象をそれらを必要とする対象に変えることができる。
【００８３】
本明細書で使用する場合、用語「治療有効量」は、生物活性、例えば、疼痛軽減を誘発するのに十分な量で受容者中または受容者上に存在する、本明細書に記載の化合物または化合物の組み合わせを指す。いくつかの実施形態では、化合物の組み合わせは相乗的な組み合わせである。相乗効果は、例えば、Ｃｈｏｕ  ａｎｄ  Ｔａｌａｌａｙ，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇｕｌ．ｖｏｌ．２２，ｐｐ．２７−５５（１９８４）によって記載されるように、組み合わせて投与される場合の化合物の効果が、単一薬剤として単独で投与される場合の化合物の相加効果より大きい場合に生じる。一般に、相乗効果は、化合物の最適以下の濃度で最も明らかに示される。相乗効果は、個々の成分と比較した、組み合わせの低い細胞毒性、疼痛低下の増大、またはいくつかの他の有益効果に関するものであり得る。
【００８４】
本明細書で使用されるすべてのパーセンテージ及び比は、別段指示がない限り、重量基準である。
【００８５】
説明全体を通して、組成物が、特定の成分を有する、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）もしくは含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）として記載されている場合、またはプロセスが、特定のプロセスステップを有する、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）もしくは含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）として記載されている場合は、本明細書に記載の組成物はまた、記載される成分から本質的になる、または記載される成分からなること、及び本明細書に記載のプロセスはまた、記載されるプロセシングステップから本質的になる、または記載されるプロセシングステップからなることが意図される。さらに、ステップの順序またはある特定の行為を行うための順序は、プロセスが実施可能なままである限り、重要でないことを理解されたい。さらに、２つ以上のステップまたは行為を同時に行うことができる。
【００８６】
本開示全体を通して使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈において別段明記しない限り、複数の意味を含む。したがって、例えば、「１つの組成物」への言及は、単一の組成物だけでなく複数のそのような組成物も含み、「１つの治療剤」への言及は、１つまたは複数の治療剤及び／または医薬品ならびに当業者に既知であるそれらの均等物などへの言及である。したがって、例えば、「１つの宿主細胞」への言及は、複数のそのような宿主細胞を含み、「１つの抗体」への言及は、１つまたは複数の抗体及び当業者に既知であるそれらの均等物などへの言及である。
【００８７】
本明細書に記載の化合物は、既知の方法に従って調製することができる。
【００８８】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される実施形態は、以下を含むが、それらに限定されない。
【００８９】
１．対象において腫瘍を治療する方法であって、ＤＮＡ損傷剤、ならびにＢＲＡＦ阻害剤のＤＦＧ−ｏｕｔ（不活性）コンフォメーションに対して特異的なＢＲＡＦ阻害剤、ＣＲＡＦ阻害剤及び汎ＲＡＦ阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩からなる群から選択される阻害剤を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【００９０】
２．前記阻害剤が、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、エンコラフェニブ、ソラフェニブ、ＲＡＦ２６５、ＡＤ８０、ＧＤＣ０８７９、ＡＺ６２８、ＺＭ３３６３７２、ＮＶＰＢＨＧ７１２、ＬＹ３００９１２０、ＴＡＫ６３２、ＭＬＮ２４８０もしくはＸＰ１０２またはその医薬的に許容可能な塩である、実施形態１に記載の方法。
【００９１】
３．前記ＤＮＡ損傷剤が、二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こす薬剤、一本鎖切断を引き起こす薬剤、代謝拮抗剤、ＤＮＡ架橋剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ポリメラーゼ阻害剤、ヌクレオシド類似体またはアルキル化剤である、実施形態１または２に記載の方法。
【００９２】
４．前記ＤＮＡ損傷剤が、ゲムシタビン、５−ＦＵ、シタラビン、メトトレキサート、ピリメタミン、ブレオマイシン、オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、エトポシド、ドキソルビシン、ビノレルビン、ミトキサントロン、ポドフィロトキシン、アフィディコリン、フォテムスチン、カルムスチン、Ｓ−２３９０６、Ｓ３９、ＳＮ−３８、トポテカン、カンプトテシン、レベッカマイシンまたはそれらの任意の医薬的に許容可能な塩である、実施形態３に記載の方法。
【００９３】
５．前記ＤＮＡ損傷剤が、ゲムシタビン、メトトレキサート、カンプトテシン及び／またはピリメタミンあるいはその医薬的に許容可能な塩である、実施形態３に記載の方法。
【００９４】
６．前記阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩及び前記ＤＮＡ損傷剤が、順次、同時に、または重複して投与される、実施形態１に記載の方法。
【００９５】
７．前記阻害剤が前記対象に投与されるより前に、前記ＤＮＡ損傷剤が前記対象に投与される、実施形態１に記載の方法。
【００９６】
８．前記ＤＮＡ損傷剤が前記対象に投与されてから少なくとも１〜２４時間後に、前記阻害剤が前記対象に投与される、実施形態１に記載の方法。
【００９７】
９．前記阻害剤が前記対象に投与される前に、前記対象が前記ＤＮＡ損傷剤で前治療される、実施形態１に記載の方法。
【００９８】
１０．前記阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩及び前記ＤＮＡ損傷剤が経口的に投与される、実施形態１に記載の方法。
【００９９】
１１．前記阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩及び前記ＤＮＡ損傷剤が静脈内に投与される、実施形態１に記載の方法。
【０１００】
１２．前記阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩が経口的に投与され、前記ＤＮＡ損傷剤が静脈内に投与される、実施形態１に記載の方法。
【０１０１】
１３．前記阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩が静脈内に投与され、前記ＤＮＡ損傷剤が経口的に投与される、実施形態１に記載の方法。
【０１０２】
１４．前記阻害剤が、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、エンコラフェニブ、ソラフェニブ、ＲＡＦ２６５、ＡＤ８０、ＧＤＣ０８７９、ＡＺ６２８、ＺＭ３３６３７２、ＮＶＰＢＨＧ７１２、ＬＹ３００９１２０、ＴＡＫ６３２、ＭＬＮ２４８０もしくはＸＰ１０２またはその医薬的に許容可能な塩である、実施形態３〜１３のいずれか１つに記載の方法。
【０１０３】
１５．前記腫瘍が、膵臓腫瘍、黒色腫腫瘍、肺腫瘍、結腸癌腫瘍、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍または乳房腫瘍である、実施形態１に記載の方法。
【０１０４】
１６．前記腫瘍が膵臓腫瘍である、実施形態１に記載の方法。
【０１０５】
１７．前記腫瘍が黒色腫腫瘍である、実施形態１に記載の方法。
【０１０６】
１８．前記腫瘍が転移性腫瘍である、実施形態１に記載の方法。
【０１０７】
１９．前記腫瘍が野生型ＢＲＡＦとして特徴づけられる、実施形態１に記載の方法。
【０１０８】
２０．前記腫瘍が野生型ＲＡＳとして特徴づけられる、実施形態１に記載の方法。
【０１０９】
２１．前記腫瘍が変異ＢＲＡＦとして特徴づけられる、実施形態１に記載の方法。
【０１１０】
２２．前記腫瘍が変異ＢＲＡＦ  Ｖ６００ＥまたはＶ６００Ｋとして特徴づけられる、実施形態１に記載の方法。
【０１１１】
２３．前記腫瘍が変異ＲＡＳとして特徴づけられる、実施形態１に記載の方法。
【０１１２】
２４．前記腫瘍が野生型ＢＲＡＦ及び変異ＲＡＳとして特徴づけられる、実施形態１に記載の方法。
【０１１３】
２５．前記腫瘍が変異ＢＲＡＦ及び野生型ＲＡＳとして特徴づけられる、実施形態１に記載の方法。
【０１１４】
２６．前記対象が、約９６０ｍｇ、７２０ｍｇ、４８０ｍｇ、２４０ｍｇ、１５０ｍｇ、１００ｍｇ、５０ｍｇもしくは２５ｍｇ（１日２回）、または９６０ｍｇ、７２０ｍｇ、４８０ｍｇ、２４０ｍｇ、１５０ｍｇ、１００ｍｇ、５０ｍｇもしくは２５ｍｇ未満（１日２回）である、前記阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩の用量を投与される、実施形態１に記載の方法。
【０１１５】
２７．前記ＤＮＡ損傷剤が、約１２５０ｍｇ／ｍ２、１０００ｍｇ／ｍ２、８００ｍｇ／ｍ２、６００ｍｇ／ｍ２、４００ｍｇ／ｍ２、２００ｍｇ／ｍ２、１００ｍｇ／ｍ２もしくは５０ｍｇ／ｍ２、２５ｍｇ／ｍ２、１０ｍｇ／ｍ２もしくは５ｍｇ／ｍ２の用量、または１２５０ｍｇ／ｍ２、１０００ｍｇ／ｍ２、８００ｍｇ／ｍ２、６００ｍｇ／ｍ２、４００ｍｇ／ｍ２、２００ｍｇ／ｍ２、１００ｍｇ／ｍ２もしくは５０ｍｇ／ｍ２、２５ｍｇ／ｍ２、１０ｍｇ／ｍ２もしくは５ｍｇ／ｍ２未満の用量で投与される、実施形態１に記載の方法。
【０１１６】
２８．前記ＤＮＡ損傷剤が、毎日、週２回、週３回、週４回、週５回、毎週、２週毎、３週毎または毎月投与される、実施形態１に記載の方法。
【０１１７】
２９．前記ＤＮＡ損傷剤が二本鎖切断ＤＮＡ損傷剤またはその医薬的に許容可能な塩である、実施形態２７または２８に記載の方法。
【０１１８】
３０．前記ＤＮＡ損傷剤が、ゲムシタビン、メトトレキサート、カンプトテシンもしくはピリメタミンまたはそれらの医薬的に許容可能な塩である、実施形態２９に記載の方法。
【０１１９】
３１．ＭＥＫ阻害剤またはタキサンを投与することをさらに含む、実施形態１に記載の方法。
【０１２０】
３２．前記ＤＮＡ損傷剤が前記対象に投与された後に、前記ＭＥＫ阻害剤または前記タキサンが前記対象に投与される、実施形態３１に記載の方法。
【０１２１】
３３．ＭＥＫ阻害剤またはタキサンを投与することをさらに含む、実施形態２〜３０のいずれか１つに記載の方法。
【０１２２】
３４．前記ＭＥＫ阻害剤がトラメチニブであるか、前記タキサンがパクリタキセルまたはタンパク質結合パクリタキセルまたは本明細書に記載の他のタキサンである、実施形態３１に記載の方法。
【０１２３】
３５．ＥＧＦＲ阻害剤を投与することをさらに含む、実施形態１〜２７のいずれか１つに記載の方法。
【０１２４】
３６．前記ＥＧＦＲ阻害剤が、セツキシマブ、パニツムマブ、ザルツムマブ、ニモツズマブ、マツズマブ、ゲフィチニブまたはエルロチニブである、実施形態２８に記載の方法。
【０１２５】
３７．前記対象において腫瘍サイズが低減される、実施形態１に記載の方法。
【０１２６】
３８．前記腫瘍サイズが約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００％低減される、実施形態３７に記載の方法。
【０１２７】
３９．前記腫瘍が治療後にサイズを増大しない、実施形態１に記載の方法。
【０１２８】
４０．対象において腫瘍の状態を維持する方法であって、ＢＲＡＦ阻害剤、ＢＲＡＦ阻害剤のＤＦＧ−ｏｕｔ（不活性）コンフォメーションに対して特異的なＢＲＡＦ阻害剤、ＣＲＡＦ阻害剤及び汎ＲＡＦ阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩からなる群から選択される阻害剤ならびにＤＮＡ損傷剤を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【０１２９】
４１．前記阻害剤が前記対象に投与されるより前に、前記ＤＮＡ損傷剤が前記対象に投与される、実施形態４０に記載の方法。
【０１３０】
４２．前記ＤＮＡ損傷剤が前記対象に投与されてから少なくとも１〜２４時間後に、前記阻害剤が前記対象に投与される、実施形態４０に記載の方法。
【０１３１】
４３．前記阻害剤が前記対象に投与される前に、前記対象が前記ＤＮＡ損傷剤で前治療される、実施形態４０に記載の方法。
【０１３２】
４４．前記対象において前記腫瘍が再発しない、実施形態４０に記載の方法。
【０１３３】
４５．前記対象において前記腫瘍がサイズを増大しない、実施形態４０に記載の方法。
【０１３４】
４６．前記対象が、前記阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩及び前記ＤＮＡ損傷剤が投与されるより前に、黒色腫腫瘍、膵臓腫瘍、肺腫瘍、結腸腫瘍、卵巣腫瘍または前立腺腫瘍について治療されている、実施形態４０に記載の方法。
【０１３５】
４７．前記腫瘍を有する前記対象が、ＤＮＡ損傷剤とともに、またはＤＮＡ損傷剤なしで、前記阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩で以前に治療されている、実施形態４０に記載の方法。
【０１３６】
４８．前記腫瘍が野生型ＢＲＡＦとして特徴づけられる、実施形態４０に記載の方法。
【０１３７】
４９．前記腫瘍が変異ＢＲＡＦとして特徴づけられる、実施形態４０に記載の方法。
【０１３８】
５０．前記腫瘍が、変異ＢＲＡＦがＶ６００ＥまたはＶ６００Ｋであるとして特徴づけられる、実施形態４０に記載の方法。
【０１３９】
５１．前記腫瘍が野生型ＲＡＳとして特徴づけられる、実施形態４０に記載の方法。
【０１４０】
５２．前記腫瘍が変異ＲＡＳとして特徴づけられる、実施形態４０に記載の方法。
【０１４１】
５３．前記阻害剤が、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、エンコラフェニブ、ソラフェニブ、ＲＡＦ２６５、ＡＤ８０、ＧＤＣ０８７９、ＡＺ６２８、ＺＭ３３６３７２、ＮＶＰＢＨＧ７１２、ＬＹ３００９１２０、ＴＡＫ６３２、ＭＬＮ２４８０もしくはＸＰ１０２またはその医薬的に許容可能な塩である、実施形態４０〜５２のいずれか１つに記載の方法。
【０１４２】
５４．前記ＤＮＡ損傷剤が、二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こす薬剤、一本鎖切断を引き起こす薬剤、代謝拮抗剤、ＤＮＡ架橋剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ポリメラーゼ阻害剤またはアルキル化剤である、実施形態４０〜５３のいずれか１つに記載の方法。
【０１４３】
５５．前記ＤＮＡ損傷剤が、ゲムシタビン、５−ＦＵ、シタラビン、メトトレキサート、ピリメタミン、ブレオマイシン、オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、エトポシド、ドキソルビシン、ビノレルビン、ミトキサントロン、ポドフィロトキシン、アフィディコリン、フォテムスチン、カルムスチン、Ｓ−２３９０６、Ｓ３９、ＳＮ−３８、トポテカン、カンプトテシン、レベッカマイシンまたはそれらの任意の医薬的に許容可能な塩である、実施形態５４に記載の方法。
【０１４４】
５６．ＭＥＫ阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、タキサンまたはそれらの任意の組み合わせを投与することをさらに含む、実施形態４０〜５５のいずれか１つに記載の方法。
【０１４５】
５７．ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異もＶ６００Ｋ変異も有しない腫瘍を有する対象を治療する方法であって、ＢＲＡＦ阻害剤、ＢＲＡＦ阻害剤のＤＦＧ−ｏｕｔ（不活性）コンフォメーションに対して特異的なＢＲＡＦ阻害剤、ＣＲＡＦ阻害剤及び汎ＲＡＦ阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩からなる群から選択される阻害剤ならびにＤＮＡ損傷剤を前記ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異もＶ６００Ｋ変異も有しない前記対象に投与することを含む、前記方法。
【０１４６】
５８．前記阻害剤が、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、エンコラフェニブ、ソラフェニブ、ＲＡＦ２６５、ＡＤ８０、ＧＤＣ０８７９、ＡＺ６２８、ＺＭ３３６３７２、ＮＶＰＢＨＧ７１２、ＬＹ３００９１２０、ＴＡＫ６３２、ＭＬＮ２４８０もしくはＸＰ１０２またはその医薬的に許容可能な塩である、実施形態５７に記載の方法。
【０１４７】
５９．前記ＤＮＡ損傷剤が、二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こす薬剤、一本鎖切断を引き起こす薬剤、代謝拮抗剤、ＤＮＡ架橋剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ポリメラーゼ阻害剤、ヌクレオシド類似体またはアルキル化剤である、実施形態５７に記載の方法。
【０１４８】
６０．前記ＤＮＡ損傷剤が、ゲムシタビン、５−ＦＵ、シタラビン、メトトレキサート、ピリメタミン、ブレオマイシン、オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、エトポシド、ドキソルビシン、ビノレルビン、ミトキサントロン、ポドフィロトキシン、アフィディコリン、フォテムスチン、カルムスチン、Ｓ−２３９０６、Ｓ３９、ＳＮ−３８、トポテカン、カンプトテシン、レベッカマイシンまたはそれらの任意の医薬的に許容可能な塩である、実施形態５９に記載の方法。
【０１４９】
６１．ＭＥＫ阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤もしくはタキサンまたはそれらの任意の組み合わせを投与することをさらに含む、実施形態５７〜６０のいずれか１つに記載の方法。
【０１５０】
６２．前記投与ステップより前に、前記対象に由来する腫瘍試料においてＢＲＡＦ  Ｖ６００ＥまたはＶ６００Ｋ変異の有無を検出することをさらに含む、実施形態５７〜６１のいずれか１つに記載の方法。
【０１５１】
６３．前記ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異もＶ６００Ｋ変異も有しない前記腫瘍がＲＡＳ変異を有しない、または前記ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異もＶ６００Ｋ変異も有しない前記腫瘍がＲＡＳ変異を含む、実施形態５７〜６２のいずれか１つに記載の方法。
【０１５２】
６４．前記ＲＡＳ変異または前記ＢＲＡＦ変異の有無を検出することをさらに含む、実施形態５７〜６３のいずれか１つに記載の方法。
【０１５３】
６５．前記阻害剤が前記対象に投与されるより前に、前記ＤＮＡ損傷剤が前記対象に投与される、実施形態５７に記載の方法。
【０１５４】
６６．前記ＤＮＡ損傷剤が前記対象に投与されてから少なくとも１〜２４時間後に、前記阻害剤が前記対象に投与される、実施形態５７に記載の方法。
【０１５５】
６７．前記阻害剤が前記対象に投与される前に、前記対象が前記ＤＮＡ損傷剤で前治療される、実施形態５７に記載の方法。
【０１５６】
６８．前記腫瘍が膵臓腫瘍または黒色腫腫瘍である、実施形態５７に記載の方法。
【０１５７】
６９．対象において転移性腫瘍を治療する方法であって、ＢＲＡＦ阻害剤、ＢＲＡＦ阻害剤のＤＦＧ−ｏｕｔ（不活性）コンフォメーションに対して特異的なＢＲＡＦ阻害剤、ＣＲＡＦ阻害剤及び汎ＲＡＦ阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩からなる群から選択される阻害剤ならびにＤＮＡ損傷剤を投与することを含む、前記方法。
【０１５８】
７０．前記転移性腫瘍が、転移性黒色腫、転移性膵臓腫瘍、転移性肺腫瘍、転移性結腸腫瘍、転移性卵巣腫瘍、転移性前立腺腫瘍または転移性乳房腫瘍である、実施形態６９に記載の方法。
【０１５９】
７１．前記腫瘍が野生型ＢＲＡＦとして特徴づけられる、実施形態６９に記載の方法。
【０１６０】
７２．前記腫瘍が変異ＢＲＡＦとして特徴づけられる、実施形態６９に記載の方法。
【０１６１】
７３．前記変異ＢＲＡＦがＢＲＡＦ  Ｖ６００ＥまたはＶ６００Ｋである、実施形態７２に記載の方法。
【０１６２】
７４．前記腫瘍が野生型ＲＡＳとして特徴づけられる、実施形態６９に記載の方法。
【０１６３】
７５．前記腫瘍が変異ＲＡＳとして特徴づけられる、実施形態６９に記載の方法。
【０１６４】
７６．前記投与ステップより前に、前記対象に由来する腫瘍試料においてＢＲＡＦ  Ｖ６００ＥまたはＶ６００Ｋ変異の有無を検出することをさらに含む、実施形態６９〜７５のいずれか１つに記載の方法。
【０１６５】
７７．前記投与ステップより前に、前記対象に由来する腫瘍試料においてＲＡＳ変異の有無を検出することをさらに含む、実施形態６９〜７６のいずれか１つに記載の方法。
【０１６６】
７８．前記阻害剤が、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、エンコラフェニブ、ソラフェニブ、ＲＡＦ２６５、ＡＤ８０、ＧＤＣ０８７９、ＡＺ６２８、ＺＭ３３６３７２、ＮＶＰＢＨＧ７１２、ＬＹ３００９１２０、ＴＡＫ６３２、ＭＬＮ２４８０もしくはＸＰ１０２またはその医薬的に許容可能な塩である、実施形態６９〜７７のいずれか１つに記載の方法。
【０１６７】
７９．前記ＤＮＡ損傷剤が、二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こす薬剤、一本鎖切断を引き起こす薬剤、代謝拮抗剤、ＤＮＡ架橋剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ポリメラーゼ阻害剤またはアルキル化剤である、実施形態６９〜７８のいずれか１つに記載の方法。
【０１６８】
８０．前記ＤＮＡ損傷剤が、ゲムシタビン、５−ＦＵ、シタラビン、メトトレキサート、ピリメタミン、ブレオマイシン、オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、エトポシド、ドキソルビシン、ビノレルビン、ミトキサントロン、ポドフィロトキシン、アフィディコリン、フォテムスチン、カルムスチン、Ｓ−２３９０６、Ｓ３９、ＳＮ−３８、トポテカン、カンプトテシン、レベッカマイシンまたはそれらの任意の医薬的に許容可能な塩である、実施形態７９に記載の方法。
【０１６９】
８１．ＥＧＦＲ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤もしくはタキサンまたはそれらの任意の組み合わせを前記対象に投与することをさらに含む、実施形態６９〜８０のいずれか１つに記載の方法。
【０１７０】
８２．前記阻害剤が前記対象に投与されるより前に、前記ＤＮＡ損傷剤が前記対象に投与される、実施形態６９に記載の方法。
【０１７１】
８３．前記ＤＮＡ損傷剤が前記対象に投与されてから少なくとも１〜２４時間後に、前記阻害剤が前記対象に投与される、実施形態６９に記載の方法。
【０１７２】
８４．前記ＢＲＡＦ阻害剤が前記対象に投与される前に、前記対象が前記ＤＮＡ損傷剤で前治療される、実施形態６９に記載の方法。
【０１７３】
８５．薬物耐性腫瘍を治療する方法であって、ＢＲＡＦ阻害剤、ＢＲＡＦ阻害剤のＤＦＧ−ｏｕｔ（不活性）コンフォメーションに対して特異的なＢＲＡＦ阻害剤、ＣＲＡＦ阻害剤及び汎ＲＡＦ阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩からなる群から選択される阻害剤ならびにＤＮＡ損傷剤を投与することを含む、前記方法。
【０１７４】
８６．前記薬物耐性腫瘍が前記阻害剤からなる治療に耐性である、実施形態８５に記載の方法。
【０１７５】
８７．前記薬物耐性腫瘍が転移性腫瘍である、実施形態８６に記載の方法。
【０１７６】
８８．前記転移性腫瘍が、転移性黒色腫、転移性膵臓腫瘍、転移性肺腫瘍、転移性結腸腫瘍、転移性卵巣腫瘍、転移性前立腺腫瘍、転移性肺腫瘍または転移性乳房腫瘍である、実施形態８７に記載の方法。
【０１７７】
８９．前記薬物耐性腫瘍が、黒色腫、膵臓腫瘍、肺腫瘍、結腸腫瘍、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍、肺腫瘍または乳房腫瘍である、実施形態８５に記載の方法。
【０１７８】
９０．前記腫瘍が野生型ＢＲＡＦとして特徴づけられる、実施形態８５に記載の方法。
【０１７９】
９１．前記腫瘍が変異ＢＲＡＦとして特徴づけられる、実施形態８５に記載の方法。
【０１８０】
９２．前記変異ＢＲＡＦがＢＲＡＦ  Ｖ６００ＥまたはＶ６００Ｋである、実施形態９１に記載の方法。
【０１８１】
９３．前記腫瘍が野生型ＲＡＳとして特徴づけられる、実施形態８５に記載の方法。
【０１８２】
９４．前記腫瘍が変異ＲＡＳとして特徴づけられる、実施形態８５に記載の方法。
【０１８３】
９５．前記投与ステップより前に、前記対象に由来する腫瘍試料においてＢＲＡＦ  Ｖ６００ＥまたはＶ６００Ｋ変異の有無を検出することをさらに含む、実施形態８５に記載の方法。
【０１８４】
９６．前記投与ステップより前に、前記対象に由来する腫瘍試料においてＲＡＳ変異の有無を検出することをさらに含む、実施形態８５に記載の方法。
【０１８５】
９７．前記阻害剤が、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、エンコラフェニブ、ソラフェニブ、ＲＡＦ２６５、ＡＤ８０、ＧＤＣ０８７９、ＡＺ６２８、ＺＭ３３６３７２、ＮＶＰＢＨＧ７１２、ＬＹ３００９１２０、ＴＡＫ６３２、ＭＬＮ２４８０もしくはＸＰ１０２またはその医薬的に許容可能な塩である、実施形態８５に記載の方法。
【０１８６】
９８．前記ＤＮＡ損傷剤が、二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こす薬剤、一本鎖切断を引き起こす薬剤、代謝拮抗剤、ＤＮＡ架橋剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ポリメラーゼ阻害剤、ヌクレオシド類似体またはアルキル化剤である、実施形態８５に記載の方法。
【０１８７】
９９．前記ＤＮＡ損傷剤が、ゲムシタビン、５−ＦＵ、シタラビン、メトトレキサート、ピリメタミン、ブレオマイシン、オキサリプラチン、シスプラチン、エトポシド、ドキソルビシン、ビノレルビン、ミトキサントロン、ポドフィロトキシン、アフィディコリン、フォテムスチン、カルムスチン、Ｓ−２３９０６、Ｓ３９、ＳＮ−３８、トポテカン、カンプトテシン、レベッカマイシンまたはそれらの任意の医薬的に許容可能な塩である、実施形態９８に記載の方法。
【０１８８】
１００．阻害剤が前記対象に投与されるより前に、前記ＤＮＡ損傷剤が前記対象に投与される、実施形態８５に記載の方法。
【０１８９】
１０１．前記ＤＮＡ損傷剤が前記対象に投与されてから少なくとも１〜２４時間後に、前記阻害剤が前記対象に投与される、実施形態８５に記載の方法。
【０１９０】
１０２．前記阻害剤が前記対象に投与される前に、前記対象が前記ＤＮＡ損傷剤で前治療される、実施形態８５に記載の方法。
【０１９１】
１０３．ＢＲＡＦ阻害剤、ＢＲＡＦ阻害剤のＤＦＧ−ｏｕｔ（不活性）コンフォメーションに対して特異的なＢＲＡＦ阻害剤、ＣＲＡＦ阻害剤及び汎ＲＡＦ阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩からなる群から選択される阻害剤ならびにＤＮＡ損傷剤を含む、医薬組成物。
【０１９２】
１０４．前記ＤＮＡ損傷剤が二本鎖切断剤である、実施形態１０３に記載の医薬組成物。
【０１９３】
１０５．前記ＤＮＡ損傷剤が、ゲムシタビン、メトトレキサートもしくはピリメタミンまたはそれらの医薬的に許容可能な塩である、実施形態１０３に記載の医薬組成物。
【０１９４】
１０６．前記医薬組成物が経口送達に適している、実施形態１０３に記載の医薬組成物。
【０１９５】
１０７．前記医薬組成物が注射に適している、実施形態１０３に記載の医薬組成物。
【０１９６】
１０８．ＭＥＫ阻害剤及び／またはＥＧＦＲ阻害剤及び／またはタキサンあるいはそれらの任意の組み合わせをさらに含む、実施形態１０３に記載の医薬組成物。
【０１９７】
１０９．ＢＲＡＦ阻害剤、ＢＲＡＦ阻害剤のＤＦＧ−ｏｕｔ（不活性）コンフォメーションに対して特異的なＢＲＡＦ阻害剤、ＣＲＡＦ阻害剤及び汎ＲＡＦ阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩からなる群から選択される阻害剤ならびにＤＮＡ損傷剤を含む、固定単位剤形。
【０１９８】
１１０．１５０ｍｇ、２４０ｍｇ、または１５０ｍｇもしくは２４０ｍｇ未満、または約１５０ｍもしくは２４０ｍｇの前記阻害剤を含む、実施形態１０９に記載の固定単位剤形。
【０１９９】
１１１．約５〜約２００ｍｇの前記阻害剤を含む、実施形態１０９に記載の固定単位剤形。
【０２００】
１１２．阻害剤が、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、エンコラフェニブ、ソラフェニブ、ＲＡＦ２６５、ＡＤ８０、ＧＤＣ０８７９、ＡＺ６２８、ＺＭ３３６３７２、ＮＶＰＢＨＧ７１２、ＬＹ３００９１２０、ＴＡＫ６３２、ＭＬＮ２４８０もしくはＸＰ１０２またはその医薬的に許容可能な塩である、実施形態１０９に記載の固定単位剤形。
【０２０１】
１１３．前記ＤＮＡ損傷剤が、二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こす薬剤、一本鎖切断を引き起こす薬剤、代謝拮抗剤、ＤＮＡ架橋剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ポリメラーゼ阻害剤、ヌクレオシド類似体またはアルキル化剤である、実施形態１０９に記載の固定単位剤形。
【０２０２】
１１４．前記ＤＮＡ損傷剤が、ゲムシタビン、５−ＦＵ、シタラビン、メトトレキサート、ピリメタミン、ブレオマイシン、オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、エトポシド、ドキソルビシン、ビノレルビン、ミトキサントロン、ポドフィロトキシン、アフィディコリン、フォテムスチン、カルムスチン、Ｓ−２３９０６、Ｓ３９、ＳＮ−３８、トポテカン、カンプトテシン、レベッカマイシンまたはそれらの任意の医薬的に許容可能な塩である、実施形態１１３に記載の固定単位剤形。
【０２０３】
１１５．前記ＤＮＡ損傷剤が、約１２５０ｍｇ／ｍ２、１０００ｍｇ／ｍ２、８００ｍｇ／ｍ２、６００ｍｇ／ｍ２、４００ｍｇ／ｍ２、２００ｍｇ／ｍ２、１００ｍｇ／ｍ２もしくは５０ｍｇ／ｍ２、２５ｍｇ／ｍ２、１０ｍｇ／ｍ２もしくは５ｍｇ／ｍ２の量、または１２５０ｍｇ／ｍ２、１０００ｍｇ／ｍ２、８００ｍｇ／ｍ２、６００ｍｇ／ｍ２、４００ｍｇ／ｍ２、２００ｍｇ／ｍ２、１００ｍｇ／ｍ２もしくは５０ｍｇ／ｍ２、２５ｍｇ／ｍ２、１０ｍｇ／ｍ２もしくは５ｍｇ／ｍ２未満の量で存在する、実施形態１１３に記載の固定単位剤形。
【０２０４】
１１６．ＥＧＦＲ阻害剤またはＭＥＫ阻害剤またはタキサンを含むか、ＥＧＦＲ阻害剤またはＭＥＫ阻害剤またはタキサンを含まない、実施形態１０９に記載の固定単位剤形。
【０２０５】
１１７．ＢＲＡＦ阻害剤、ＢＲＡＦ阻害剤のＤＦＧ−ｏｕｔ（不活性）コンフォメーションに対して特異的なＢＲＡＦ阻害剤、ＣＲＡＦ阻害剤及び汎ＲＡＦ阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩からなる群から選択される阻害剤ならびにＤＮＡ損傷剤を含む、注射可能な医薬組成物。
【０２０６】
１１８．１５０ｍｇ、２４０ｍｇ、または１５０ｍｇもしくは２４０ｍｇ未満、または約１５０ｍもしくは２４０ｍｇの前記阻害剤を含む、実施形態１１７に記載の注射可能な医薬組成物。
【０２０７】
１１９．前記組成物が約５〜約２００ｍｇの前記阻害剤を含む、実施形態１１７に記載の注射可能な医薬組成物。
【０２０８】
１２０．前記阻害剤が、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、エンコラフェニブ、ソラフェニブ、ＲＡＦ２６５、ＡＤ８０、ＧＤＣ０８７９、ＡＺ６２８、ＺＭ３３６３７２、ＮＶＰＢＨＧ７１２、ＬＹ３００９１２０、ＴＡＫ６３２、ＭＬＮ２４８０及び／またはＸＰ１０２あるいはその医薬的に許容可能な塩である、実施形態１１７に記載の注射可能な医薬組成物。
【０２０９】
１２１．前記ＤＮＡ損傷剤が、二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こす薬剤、一本鎖切断を引き起こす薬剤、代謝拮抗剤、ＤＮＡ架橋剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ポリメラーゼ阻害剤またはアルキル化剤である、実施形態１１７に記載の注射可能な医薬組成物。
【０２１０】
１２２．前記ＤＮＡ損傷剤が、ゲムシタビン、５−ＦＵ、シタラビン、メトトレキサート、ピリメタミン、ブレオマイシン、オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、エトポシド、ドキソルビシン、ビノレルビン、ミトキサントロン、ポドフィロトキシン、アフィディコリン、フォテムスチン、カルムスチン、Ｓ−２３９０６、Ｓ３９、ＳＮ−３８、トポテカン、カンプトテシン、レベッカマイシンまたはそれらの任意の医薬的に許容可能な塩である、実施形態１１７に記載の注射可能な医薬組成物。
【０２１１】
１２３．前記ＤＮＡ損傷剤が、約１２５０ｍｇ／ｍ２、１０００ｍｇ／ｍ２、８００ｍｇ／ｍ２、６００ｍｇ／ｍ２、４００ｍｇ／ｍ２、２００ｍｇ／ｍ２、１００ｍｇ／ｍ２もしくは５０ｍｇ／ｍ２、２５ｍｇ／ｍ２、１０ｍｇ／ｍ２もしくは５ｍｇ／ｍ２の量、または１２５０ｍｇ／ｍ２、１０００ｍｇ／ｍ２、８００ｍｇ／ｍ２、６００ｍｇ／ｍ２、４００ｍｇ／ｍ２、２００ｍｇ／ｍ２、１００ｍｇ／ｍ２もしくは５０ｍｇ／ｍ２、２５ｍｇ／ｍ２、１０ｍｇ／ｍ２もしくは５ｍｇ／ｍ２未満の量で存在する、実施形態１１７に記載の注射可能な医薬組成物。
【０２１２】
１２４．ＥＧＦＲ阻害剤またはＭＥＫ阻害剤またはタキサンを含むか、ＥＧＦＲ阻害剤またはＭＥＫ阻害剤またはタキサンを含まない、実施形態１１７に記載の注射可能な医薬組成物。
【０２１３】
１２５．前記ＤＮＡ損傷剤が、ゲムシタビン、メトトレキサートまたはピリメタミンである、実施形態１１７に記載の注射可能な医薬組成物。
【０２１４】
１２６．ＢＲＡＦ阻害剤、ＢＲＡＦ阻害剤のＤＦＧ−ｏｕｔ（不活性）コンフォメーションに対して特異的なＢＲＡＦ阻害剤、ＣＲＡＦ阻害剤及び汎ＲＡＦ阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩からなる群から選択される阻害剤ならびにＤＮＡ損傷剤を含む注射可能な医薬組成物調製する方法であって、前記阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩とＤＮＡ損傷剤を混合して、注射可能な医薬組成物を形成することを含む、前記方法。
【０２１５】
１２７．前記ＢＲＡＦ阻害剤が、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、エンコラフェニブ、ソラフェニブ、ＲＡＦ２６５、ＡＤ８０、ＧＤＣ０８７９、ＡＺ６２８、ＺＭ３３６３７２、ＮＶＰＢＨＧ７１２、ＬＹ３００９１２０、ＴＡＫ６３２、ＭＬＮ２４８０もしくはＸＰ１０２またはその医薬的に許容可能な塩である、実施形態１２６に記載の方法。
【０２１６】
１２８．前記ＤＮＡ損傷剤が、二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こす薬剤、一本鎖切断を引き起こす薬剤、代謝拮抗剤、ＤＮＡ架橋剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ポリメラーゼ阻害剤、ヌクレオシド類似体またはアルキル化剤である、実施形態１２６に記載の方法。
【０２１７】
１２９．前記ＤＮＡ損傷剤が、ゲムシタビン、５−ＦＵ、シタラビン、メトトレキサート、ピリメタミン、ブレオマイシン、オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、エトポシド、ドキソルビシン、ビノレルビン、ミトキサントロン、ポドフィロトキシン、アフィディコリン、フォテムスチン、カルムスチン、Ｓ−２３９０６、Ｓ３９、ＳＮ−３８、トポテカン、カンプトテシン、レベッカマイシンまたはそれらの任意の医薬的に許容可能な塩である、実施形態１２６に記載の方法。
【０２１８】
１３０．ＢＲＡＦ阻害剤、ＢＲＡＦ阻害剤のＤＦＧ−ｏｕｔ（不活性）コンフォメーションに対して特異的なＢＲＡＦ阻害剤、ＣＲＡＦ阻害剤及び汎ＲＡＦ阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩からなる群から選択される阻害剤ならびにＤＮＡ損傷剤を含む、キット。
【０２１９】
１３１．前記阻害剤を含む第１の医薬的に許容可能な容器及び前記ＤＮＡ損傷剤を含む第２の医薬的に許容可能な容器を含む、実施形態１３０に記載のキット。
【０２２０】
１３２．前記容器が滅菌されており、発熱物質を含まない、実施形態１３０に記載のキット。
【０２２１】
１３３．さらに処方情報を含む、実施形態１３０に記載のキット。
【０２２２】
１３４．前記処方情報が、前記阻害剤及び前記ＤＮＡ損傷剤を対象に投与するための指示を含む、実施形態１３３に記載のキット。
【０２２３】
１３５．前記処方情報が、前記阻害剤及び前記ＤＮＡ損傷剤を野生型ＲＡＦと特徴づけられる腫瘍を有する対象に投与するための指示を含む、実施形態１３３に記載のキット。
【０２２４】
１３６．前記処方情報が、前記阻害剤を投与する前に前記ＤＮＡ損傷剤を前記対象に投与するための指示を含む、実施形態１３３に記載のキット。
【０２２５】
１３７．ＢＲＡＦ阻害剤、ＢＲＡＦ阻害剤のＤＦＧ−ｏｕｔ（不活性）コンフォメーションに対して特異的なＢＲＡＦ阻害剤、ＣＲＡＦ阻害剤及び汎ＲＡＦ阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩からなる群から選択される阻害剤を含む医薬調製物ならびに処方情報を含む容器であって、前記処方情報が、野生型ＲＡＦと特徴づけられる腫瘍を有する対象にＤＮＡ損傷剤とともに前記阻害剤を投与するための指示を含む、前記容器。
【０２２６】
１３８．腫瘍が黒色腫腫瘍である、実施形態１３７に記載の容器。
【０２２７】
１３９．前記阻害剤を含む、カプセル剤、錠剤または他の経口投与剤形を含む、実施形態１３７に記載の容器。
【０２２８】
１４０．前記阻害剤が、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、エンコラフェニブ、ソラフェニブ、ＲＡＦ２６５、ＡＤ８０、ＧＤＣ０８７９、ＡＺ６２８、ＺＭ３３６３７２、ＮＶＰＢＨＧ７１２、ＬＹ３００９１２０、ＴＡＫ６３２、ＭＬＮ２４８０もしくはＸＰ１０２またはその医薬的に許容可能な塩である、実施形態１３７〜１３９のいずれか１つに記載の容器。
【０２２９】
１４１．前記ＤＮＡ損傷剤が、二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こす薬剤、一本鎖切断を引き起こす薬剤、代謝拮抗剤、ＤＮＡ架橋剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ポリメラーゼ阻害剤、ヌクレオシド類似体またはアルキル化剤である、実施形態１３７〜１３９のいずれか１つに記載の容器。
【０２３０】
１４２．前記ＤＮＡ損傷剤が、ゲムシタビン、５−ＦＵ、シタラビン、メトトレキサート、ピリメタミン、ブレオマイシン、オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、エトポシド、ドキソルビシン、ビノレルビン、ミトキサントロン、ポドフィロトキシン、アフィディコリン、フォテムスチン、カルムスチン、Ｓ−２３９０６、Ｓ３９、ＳＮ−３８、トポテカン、カンプトテシン、レベッカマイシンまたはそれらの任意の医薬的に許容可能な塩である、実施形態１４１に記載の容器。
【０２３１】
１４３．ＥＧＦＲ阻害剤またはＭＥＫ阻害剤またはタキサンをさらに含むか、ＥＧＦＲ阻害剤またはＭＥＫ阻害剤またはタキサンを含まない、実施形態１３７に記載の容器。
【実施例】
【０２３２】
以下の実施例は本明細書に記載の方法及び組成物の例示であるが、これらを限定するものではない。通常は療法で遭遇し、当業者に明白な、様々な条件及びパラメーターの他の適切な修正及び適合は、本明細書に記載の化合物及び方法の趣旨及び範囲の中である。
【０２３３】
実施例１：ゲムシタビンはベムラフェニブの治療効果を増強する
ウェルあたりおよそ２５０，０００個の細胞で細胞をプレーティングした。およそ２４時間後、図１Ａ及び１Ｂに示すように、化合物を、単独でまたは組み合わせて与えた。およそ４８時間後、細胞を回収し、計数した。図１Ａ及び１Ｂは、ベムラフェニブ（薬物Ａ）とゲムシタビン（薬物Ｂ）の相乗効果を図示する。驚くべき結果は、化合物の組み合わせが野生型ＢＲＡＦである細胞型においてでさえ有効であることであった。
【０２３４】
図２Ａ及び２Ｂは、ベムラフェニブに対する細胞の感受性をおよそ１００倍増大させるベムラフェニブとゲムシタビンの組み合わせを図示する。細胞は野生型ＢＲＡＦを有する腺癌に由来する。したがって、ベムラフェニブが細胞を死滅させるのに有効であろうことが予想外であったと思われた。しかし、ベムラフェニブ（薬物Ａ）をゲムシタビン（薬物Ｂ）と組み合わせると、細胞がベムラフェニブ療法に感受性になり、これに応答することが見出された。図１Ａ、１Ｂ、２Ａ及び２Ｂで分かるように、この結果は、各薬剤を単独で使用した場合ではなく、組み合わせて使用した場合のみ観察された。この組み合わせはまた、各化合物の１つまたは複数のより低い量を使用して、有意な細胞死滅を達成することができた。この組み合わせはまた、いずれかの化合物単独よりも良く、且つ相乗的な量で、コロニー形成を阻害した（データ非表示）。
【０２３５】
野生型ＢＲＡＦ及び変異ＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｃ）を有する転移性がん細胞株（ＨＤ。ＢｘＰＣ３Ｍ１としても知られる）ならびに野生型ＢＲＡＦ及び野生型ＲＡＳを有するがん細胞株（ＢｘＰＣ３）を、様々な条件下で、ゲムシタビン及びベムラフェニブで処理した。細胞は、両方の薬剤で、同時に、または順次（すなわち、最初にゲムシタビン、続いてベムラフェニブ、もしくは最初にベムラフェニブ、続いてゲムシタビンのいずれか）のいずれかで処理した。薬剤を細胞から洗い流してから、細胞をコロニー形成させた。細胞を固定し（高濃度メタノール）及び２０％エタノール中の０．４％クリスタルバイオレットで染色し、５９５ｎｍの吸光度を読み取ることによって、コロニーを定量化した。以下の表に例示する結果は、ゲムシタビン、それに続くベムラフェニブの順次添加は、同時処理、またはゲムシタビン（薬物Ｂ）より前にベムラフェニブ（薬物Ａ）を加えた場合と比較して、コロニー形成を低減させたことを示す。
【表１】
2020530014.tif 000007
これらの結果は、図３Ａ及び３Ｂにも図示する。
【０２３６】
いかなる特定の理論にも拘束されるものではないが、この結果は、細胞をＳ期で停止させる亜致死量のＤＮＡ損傷剤（ゲムシタビン）でＷＴ  ＢＲＡＦ／変異ＫＲＡＳ細胞をプライムしたためであると考えられ、またはＧ２期（ドキソルビシン、エトポシド）もしくはＧ１期（メトトレキサート）で他のＤＮＡ損傷剤が使用され、次いで、ベムラフェニブまたは他のＢＲＡＦ阻害剤、例えば、本明細書に開示されるものが添加される場合は、続いて、細胞周期停止がＭＡＰＫ経路を活性化し、停止した細胞が損傷した複製しないＤＮＡで増殖しようとする。次いで、細胞は生存することができずに死ぬ。ＤＮＡ損傷剤を使用した細胞のプライミングがない場合は、ＢＲＡＦ阻害剤は、通常は、ＭＡＰＫ経路を活性化し、野生型ＢＲＡＦを有する腫瘍細胞の増殖を増強し、これは、ＢＲＡＦ阻害剤のラベル上に禁忌として示される。
【０２３７】
これらの結果は、野生型ＢＲＡＦ腫瘍でそのような阻害剤を使用することが有し得る有害効果が理由で、ベムラフェニブの治療より前に腫瘍検体においてＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異のエビデンスを確認することを臨床医に指示する、ベムラフェニブ及び他のＢＲＡＦ阻害剤に対するラベルを考慮すると、驚くべきことである。したがって、処理された細胞型でベムラフェニブが有効であろうこと、及びベムラフェニブの効果は、これをＤＮＡ損傷剤、例えば、二本鎖切断を引き起こすヌクレオシド類似体であるゲムシタビンと組み合わせることによって、相乗的に増強されないであろうことは、予想外であったと思われる。細胞を死滅させる能力はＫＲＡＳ変異と関係がなく、これも、ベムラフェニブがＫＲＡＳ変異型腫瘍で有効でなかったことを示す以前のエビデンスのために、驚くべきことであり、予想外であった。
【０２３８】
実施例２：ベムラフェニブ耐性ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞の特定及び特徴づけ。薬物選抜によって、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ベムラフェニブ耐性細胞株をＳＫ−ＭＥＬ−２８親細胞から単離した。ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１の増殖速度も親細胞株よりも速かった（図４Ａ）。ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞は１６時間の倍加時間を有していたが、親細胞は２３．１時間の倍加時間を有していた。コロニー形成アッセイによって、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞は、その親細胞株と比較してベムラフェニブに耐性があることが明らかになった（図４Ｂ）。ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞は、ベムラフェニブについて約３０μＭのＩＣ５０を有していた（データ非表示）が、親細胞株は約１μＭのＩＣ５０を有していた（図４Ｂ）。マススペクトロメトリー（ＭＳ）分析によって、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１は、ベムラフェニブ処理に応答して、親細胞株と比較して異なるプロテオミックプロファイルを有することが明らかになった。ＦＡＭ１２９Ｂは、ベムラフェニブで処理されたＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞とビヒクルで処理されたＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞の間で、３番目に高い差次的発現を有するとして特定された（表２）。
【表２】
2020530014.tif 000008
【表３】
2020530014.tif 000009
【０２３９】
表２は、バイアスのないマススペクトロメトリーを記載する。ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞とＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞の間で、ベムラフェニブ処理の後に最大の差次的発現を有するタンパク質。特定されたタンパク質は、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞において薬物治療で存在量が増大しおり、ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞において薬物治療で存在量が低下している。倍数差異は、親ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞と比較した、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞のベムラフェニブ処理による特定のタンパク質の存在量の増大の定量的尺度である。
【０２４０】
細胞質内のＦＡＭ１２９Ｂの存在量は、ビヒクル処理と比較して、ベムラフェニブ処理で約６倍増大した（図５Ａ）。興味深いことに、親ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞において、ベムラフェニブ処理に応答してＦＡＭ１２９Ｂの存在量は低下した。これらの傾向は、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞において活性なＭＡＰＫ経路を示したが、ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞においては示さなかった。さらに、ＦＡＭ１２９Ｂタンパク質の傾向は、観察された細胞増殖の誘導を支持し、ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞と比較して、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞の浸潤能の増大を示唆した。
【０２４１】
重要なことに、セリン生合成経路のタンパク質は、耐性細胞とベムラフェニブに応答する感受性細胞の間で、規定された経路内の最も高い差次的発現タンパク質であった。この経路の全３酵素（ＰＨＧＤＨ、ＰＳＡＴ１、ＰＳＰＨ）ならびにセリン−ｔＲＮＡリガーゼのＳＡＲＳ（細胞質）及びＳＡＲＳ２（ミトコンドリア）は、ベムラフェニブに暴露されたＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞において、ビヒクル以上の存在量で発現していたが、反対の傾向が親細胞で観察された（データ非表示）。ＰＨＧＤＨ抗体を使用するウエスタンブロッティングによって、ＭＳ分析を介して観察された傾向が確認された（図５Ｂ）。ＭＳデータと一致して、ウエスタンブロットによって、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞が、親細胞と比較して、ベースラインＰＨＧＤＨ発現が増大したことが明らかになった（図５Ｂ）。さらに、ウエスタンによって、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞において、ベムラフェニブ処理の後に、ＰＨＧＤＨレベルが増大することが明らかになり（図５Ｂ）、これは、ＭＳデータと一致する（非表示）。
【０２４２】
ＰＨＧＤＨは、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞のベムラフェニブ耐性に必須である。ＰＨＧＤＨは、セリン合成経路の第１ステップを構成する、３−ホスホヒドロキシピルビン酸への３−ホスホグリセリン酸の変換を触媒する酵素である。セリン合成がベムラフェニブ耐性に重要であったかどうかを直接試験するために、ｓｉＲＮＡを使用して、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１株及びＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞株においてＰＨＧＤＨを枯渇させた（図１３）。ＰＨＧＤＨ  ｓｉＲＮＡは、ベムラフェニブ処理後のＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞死を有意に増強したが、ベムラフェニブによる親ＳＫ−ＭＥＬ−２８の細胞死に対していかなる相加効果も有していなかった（図６Ａ及び６Ｂ）。対照ｓｉＲＮＡの処理によって、各細胞株について、ベムラフェニブ処理後の細胞生存率のベースラインを確立した。ＰＨＧＤＨ  ｓｉＲＮＡ＋ベムラフェニブ処理は、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞において、ベースラインを下回る細胞生存率の低下を示した（図６Ｂ）が、親細胞はそうではなかった（図６Ａ）。
【０２４３】
メトトレキサートは、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞をベムラフェニブに対して選択的に感受性にする。セリン生合成タンパク質が、親ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞ではなく、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞において選択的に誘導されたので、セリンが葉酸サイクルの直接インプットであるからことから、セリン合成が葉酸サイクルに寄与しているがどうかを調べた。葉酸サイクルは、がん細胞におけるＤＮＡの合成及び修復に重要なチミジル酸の生成につながるテトラヒドロ葉酸（ＴＨＦ）の生成に必要である。さらに、同じ研究が、グリシンへのセリンの変換と葉酸サイクルの両方が、腫瘍由来細胞株のサイトゾルにおけるＡＴＰ生成の一炭素代謝サイクルへ前駆物質を与えることを示した。葉酸代謝拮抗薬であるメトトレキサートは、ジヒドロ葉酸還元酵素及びチミジル酸合成酵素を阻害し、したがって、ヌクレオチド合成を阻害する。メトトレキサートは、腫瘍由来細胞株においてＡＴＰレベルを低減することも示された。葉酸サイクルに対するセリンの重要性と一致して、メトトレキサート（７５ｎＭ）は、ベムラフェニブ処理後のＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１の細胞死滅を有意に増強した（図６Ｄ）。対照的に、親ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞において、メトトレキサート／ベムラフェニブ処理による有意な死滅は、観察されなかった（図６Ｃ）。
【０２４４】
セリン枯渇はＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞をベムラフェニブに対して感受性にする。セリン合成の下流の葉酸サイクルをメトトレキサートで妨害することが、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞をベムラフェニブに対して感受性にするので、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１のベムラフェニブ耐性に対する細胞外セリン枯渇の効果を調査した。コロニー形成アッセイにおいて、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞の細胞プレーティング及び薬物処理の間、セリン、グルコース及びグリシンが枯渇した培地を使用した。薬物処理後、細胞に完全培地を再供給し、細胞をコロニーに増殖させた。コロニー形成アッセイの定量化によって、セリン枯渇条件下のベムラフェニブ処理後に、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１の細胞死の増加が明らかになった（図６Ｅ）。２．５μＭ及び５μＭのベムラフェニブ用量で、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞は、セリン枯渇で＞５０％の細胞死を示したが、完全培地では示さなかった。ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞のベムラフェニブ耐性に対する高細胞外セリンレベルの効果も調査した。大量の細胞外セリンは、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞のベムラフェニブ耐性に影響を及ぼさなかった（データ非表示）。まとめると、このデータは、ベースラインの細胞外セリンレベルが、ベムラフェニブストレス条件下におけるＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞の生存に重要であることを示す。
【０２４５】
ベムラフェニブに対するＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞の増感剤としてのゲムシタビンの特定。葉酸サイクルは、ＤＮＡ修復の間のヌクレオチド生成に重要であり、ＰＨＧＤＨ、ＰＳＡＴ１及びＰＳＰＨタンパク質のレベルは、ゲノム不安定性の条件下で増大することが示されている。したがって、ベムラフェニブに対するＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞の潜在的な増感剤として、ＤＮＡ架橋剤、トポイソメラーゼ阻害剤及びヌクレオシド類似体を含めて、いくつかのクラスのＤＮＡ損傷剤を試験した。ヌクレオシド類似体のゲムシタビンは、組み合わせて使用した場合に、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞をベムラフェニブに対して有意に感受性にしたが、この組み合わせ処理は、単一のベムラフェニブ処理と比べて、ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞を感受性にしなかった（図７Ａ及び７Ｂ）。コロニー形成アッセイにおいて、５０ｎＭ用量のゲムシタビンを可変用量のベムラフェニブに加えた。重要なことに、ＰＨＧＤＨ  ｓｉＲＮＡ処理は、ゲムシタビン／ベムラフェニブの組み合わせ処理で観察される細胞死を越えて、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１の細胞死を増強したが、ゲムシタビン／ベムラフェニブの組み合わせで処理したＳＫ−ＭＥＬ−２８親細胞の細胞死を増強しなかった（図７Ｃ及び７Ｄ）。さらに、メトトレキサートは、ゲムシタビン／ベムラフェニブの組み合わせと一緒に処理した場合に、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞の細胞死を有意に増強したが、ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞はそうではなかった（図７Ｅ及び７Ｆ）。重要なことに、組み合わせ指数（ＣＩ）の計算によって、試験したすべての用量で、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞においてゲムシタビンとベムラフェニブの間で相乗効果が示された（図７Ｇ、表３（以下）、図１４Ａ）。
【表４】
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【０２４６】
ベムラフェニブは、膵臓癌細胞及び非小細胞肺癌細胞をゲムシタビンに対して感受性にする。ゲムシタビンは膵臓癌における第一選択療法である。したがって、４種の膵細胞株（ＢｘＰＣ３、Ｐａｎｃ１、ＭｉａＰａｃａ２及びＢｘＰＣ３Ｍ１）を、ベムラフェニブ処理によるゲムシタビン感受性化について試験した。可変ゲムシタビン用量及び１μＭの一定ベムラフェニブ用量を使用して、コロニー形成アッセイによって、ベムラフェニブによってＢｘＰＣ３Ｍ１細胞がゲムシタビンに対して有意に感受性になることが明らかになった（図８Ａ）。重要なことに、組み合わせ指数（ＣＩ）の計算によって、ＢｘＰＣ３Ｍ１細胞において、特定の用量で、ゲムシタビンとベムラフェニブの間で相乗効果が示された（図８Ｂ、表４、図１４Ｂ）。最高（５０００ｎＭ）及び最低（５ｎＭ及び１０ｎＭ）ゲムシタビン用量は、ゲムシタビンとベムラフェニブの間で競合性を示した。しかし、２５ｎＭ〜１０００ｎＭのゲムシタビン用量は、２種の薬物の間で相乗効果を示した。さらに、ゲムシタビンはまた、特に高齢患者または不健康な患者の進行した非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の治療で有効であった。本発明者らは、ステージ４腺癌ＮＳＣＬＣ細胞株ＮＣＩ−Ｈ２１２２を試験した。１μＭのベムラフェニブがＮＣＩ−Ｈ２１２２細胞をゲムシタビンに対して感受性にすることが観察された（図８Ｃ）。
【表５】
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【０２４７】
ベムラフェニブは、膵臓癌細胞においてセリン合成タンパク質を誘導する。次に、膵臓癌細胞の増殖に対するベムラフェニブ処理の効果を試験した。試験した細胞株の４種すべて（ＢｘＰＣ３Ｍ１、ＢｘＰＣ３、Ｐａｎｃ１及びＭｉａＰａｃａ２）は、ＷＴ  ＢＲＡＦを発現する。２０１０年のＮａｔｕｒｅの研究に基づいて、期待通りに、ベムラフェニブ処理（１０μＭ）は４種の細胞株すべての増殖を増大させた（図９Ａ、９Ｂ、９Ｃ及び９Ｄ）。セリン合成が腫瘍細胞の増殖の増大と相関することが示されているので、ＭＳによって膵細胞株のプロテオミックプロファイルを比較した。予想通り、ＰＨＧＤＨ、ＰＳＡＴ１、ＰＳＰＨ及びＳＡＲＳタンパク質の存在量は、試験した４種の細胞株すべてで増大した（図９Ｅ、９Ｆ、９Ｇ及び９Ｈ）。重要なことに、ＢｘＰＣ３Ｍ１細胞は、試験した他の３種の細胞株と比較して、４種のタンパク質すべてについてタンパク質存在量の最大の増大を表した。さらに、ゲムシタビン＋ベムラフェニブと組み合わせたメトトレキサート処理は、メトトレキサートをともなわないゲムシタビン＋ベムラフェニブ処理と比較して、ＢｘＰＣ３Ｍ１細胞及びＮＣＩ−Ｈ２１２２細胞の細胞死を増加させた（図１０Ａ及び１０Ｂ）。次に、ＢｘＰＣ３Ｍ１のベムラフェニブ耐性に対する細胞外セリン枯渇の効果を調査した。コロニー形成アッセイにおいて、ＢｘＰＣ３Ｍ１細胞の細胞プレーティング及び薬物処理の間、セリン、グルコース及びグリシンが枯渇した培地を使用した。薬物処理後、細胞に完全培地を再供給し、細胞をコロニーに増殖させた。コロニー形成アッセイの定量化によって、セリン枯渇条件下のベムラフェニブ処理後に、ＢｘＰＣ３Ｍ１の細胞死の有意な増加が明らかになった（図１０Ｃ）。５μＭのベムラフェニブ用量で、ＢｘＰＣ３Ｍ１細胞は、セリン枯渇培地で＞５０％の細胞死を示したが、完全培地では示さなかった。
【０２４８】
別のＢＲＡＦ阻害剤であるダブラフェニブは、がん細胞をゲムシタビンに対して感受性にする。ベムラフェニブと同様に、ダブラフェニブは、転移性黒色腫に対して有効性を有するＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ阻害剤である。本発明者らは、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１、ＢｘＰＣ３Ｍ１細胞及びＮＣＩ−Ｈ２１２２細胞を感受性にするダブラフェニブの効力を試験した。各病態の第一選択薬物を可変用量で与えた。ダブラフェニブは、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異を有する転移性黒色腫の第一選択療法と考えられ、一方で、ゲムシタビンは膵臓癌及びＮＳＣＬＣの第一選択療法である。ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞に対して、ゲムシタビン用量を５０ｎｍで一定に保ち、ダブラフェニブを可変用量とした。これに対して、膵臓癌細胞株及びＮＳＣＬＣ細胞株において、ダブラフェニブ用量を１μＭで一定に保ち、ゲムシタビンを可変用量とした。興味深いことに、ダブラフェニブ処理は、ＢｘＰＣ３Ｍ１細胞及びＮＣＩ−Ｈ２１２２細胞をゲムシタビンに対して感受性にし（図１１Ａ及び１１Ｂ）、ゲムシタビンはＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞をダブラフェニブに対して感受性にした（図１１Ｃ）。
【０２４９】
考察：本発明者らは、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ阻害剤耐性のメカニズムを研究するために、ベムラフェニブ耐性ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞（ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１）を単離した。本発明者らのプロテオミクスデータは、ベムラフェニブに応答して、親ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞由来のＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞のタンパク質シグネチャを区別した。セリン生合成経路の酵素のレベル（ＰＨＧＤＨ、ＰＳＡＴ１及びＰＳＰＨならびにセリンｔＲＮＡ−リガーゼＳＡＲＳ１／２）は、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞のベムラフェニブ処理に応答して上昇することが観察された。対照的に、言及されるタンパク質の５種すべてが、ＳＫ−ＭＥＬ−２８親細胞のベムラフェニブ処理に応答して減少した。引き続くウエスタンブロッティングによって、ＭＳアッセイで観察されたタンパク質傾向が確証された。これらの結果から、本発明者らは、セリン合成はＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞のベムラフェニブ耐性に重要であると仮定する。セリン合成は、がん細胞の増殖に重要であることが示されている。これは、がん細胞の増殖の間のヌクレオチド及びアミノ酸の合成にグリシンではなくセリンが重要であったことを示す。実際に、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞は、ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞（２３．１時間の倍加時間）と比較してより高い増殖速度（１６時間の倍加時間）を有していた。ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞におけるベムラフェニブに応じたセリン生合成誘導についての本発明者らのプロテオミクスの知見は、セリン合成をがん細胞の生存の増大と正に相関させる発表された報告（Ｍａｔｔａｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６；Ｐｏｓｓｅｍａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）を支持する。
【０２５０】
ｓｉＲＮＡによるＰＨＧＤＨアブレーション後のコロニー形成アッセイによって、ベムラフェニブに対するＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１の耐性にとってのＰＨＧＤＨ遺伝子産物の重要性が確証された。メトトレキサート処理後のコロニー形成アッセイとともにこのデータによって、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞の耐性シグネチャの重要な要素としてセリン合成が確証された。ＰＨＧＤＨは、セリン生合成経路の第１ステップを触媒し、３−ホスホグリセリン酸を３−ホスホヒドロキシピルビン酸へ変換する。さらに、ＰＨＧＤＨ遺伝子の増幅が乳癌及び黒色腫で報告されている。実際に、ある特定の乳癌細胞型は、より高いＰＨＧＤＨ遺伝子発現によるセリン合成フラックスの増大に依存していることが示されている。さらに、ＮＳＣＬＣでは、ＰＨＧＤＨ遺伝子の増幅及び過剰発現は侵攻性疾患と正に相関する。重要なことに、ＰＨＧＤＨ遺伝子は転移性黒色腫で増幅されることが多く、そのノックダウンは細胞生存率に負に影響を及ぼす。ベムラフェニブ感受性化により誘導されるＰＨＧＤＨアブレーションは、乳癌におけるＢＲＣＡ１アブレーション及び白金ベースの化学療法の話を暗示する。
【０２５１】
セリン生合成は上流にあり、ヌクレオチド及びアミノ酸の代謝に関与する複数の経路に流れ込む。特に、葉酸サイクルはヌクレオチド代謝に寄与する。本発明者らは、ＳＫ−ＭＥＬ−２８及びＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１の細胞生存率に関して、葉酸代謝拮抗薬のメトトレキサートをベムラフェニブと組み合わせて試験した。メトトレキサートは、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞をベムラフェニブに対して選択的に感受性にする。メトトレキサートは、増殖中のがん細胞で活性化されるＳＯＧ（セリン−一炭素サイクル−グリシン切断）として知られる代替代謝経路におけるセリン生合成の下流に位置する葉酸サイクルを阻害することが既知である。さらに、セリン枯渇実験によって、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１のベムラフェニブ耐性にとってベースラインレベルの細胞外セリンが必要であることが示された。最近の研究によって、ＢＲＡＦ阻害剤耐性黒色腫細胞が細胞増殖の誘導中に酸化的代謝に切り替わることが必要であることが特定された。実際に、耐性細胞は、増殖のために、グルコースではなくグルタミンに過度に依存していることが報告されている。興味深いことに、グルタミンから触媒されるグルタミン酸は、セリン生合成経路の第２ステップの前駆物質である。ＰＳＰＨ酵素は、３−ホスホヒドロキシピルビン酸からホスホセリンへの変換の間に、グルタミン酸からα−ケトグルタル酸への変換を触媒する。本発明者らは、セリン合成は、潜在的に、増殖の間の酸化的代謝への記載の切り替わりの結果として、本発明者らのＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞で活性であると仮定する。ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞のグルタミンへの依存を調べるために、さらなる研究が必要とされる。
【０２５２】
高信頼度ヒットの中でも特に、ＦＡＭ１２９Ｂは、ベムラフェニブ処理に関して、２種の細胞株の間で最も差次的に発現しているタンパク質のうちの１つとして特定された。ＦＡＭ１２９は、Ｎｉｂａｎ様タンパク質１としても知られる接着結合関連タンパク質である。ＦＡＭ１２９Ｂは、ＢＲＡＦ／ＭＡＰＫＫ／ＥＲＫシグナリングカスケードによって４つセリン残基でリン酸化され、ＦＡＭ１２９Ｂは、ＭＡＰＫ経路が活性な条件下でのみ、黒色腫細胞の細胞質全体にわたって分散していることが既知である。化学的阻害剤ＵＯ１２６によるＭＡＰＫカスケードの阻害は、ＦＡＭ１２９Ｂを細胞膜に局在化させた。Ｓｍａｌｌｅｙらは、ＦＡＭ１２９Ｂの過剰発現が黒色腫細胞の浸潤能を高めることを示した。ＦＡＭ１２９Ｂは、黒色腫において、ＭＡＰＫカスケードの下流の複数のシグナリング経路に影響を及ぼす。本発明者らのアッセイでは、細胞質内のＦＡＭ１２９Ｂタンパク質の存在量は、ベムラフェニブ処理後のＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞で増大したが、ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞では低下した。したがって、本発明者らのＭＳアッセイにおけるＦＡＭ１２９Ｂタンパク質の傾向によって、ベムラフェニブがＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞においてＭＡＰＫ経路の活性化を誘導するが、ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞では誘導しないことが示唆された。さらに、ＭＡＰＫの活性化により、ベムラフェニブが、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞において細胞増殖を誘導することができることが示唆され、これは、セリン合成誘導の知見を支持するものである。本発明者らは、現在、転移性黒色腫細胞におけるベムラフェニブ耐性に対する潜在的なバイオマーカーとしてＦＡＭ１２９Ｂを調べている。
【０２５３】
興味深いことに、葉酸サイクルは細胞増殖の間のヌクレオチドプールの補充に寄与することが既知であり、ＤＮＡ損傷はヌクレオチドの生成を誘導する。さらに、３種のセリン合成酵素のレベルは、すべて、ＤＮＡ損傷及びゲノム不安定性の条件下で増大することが示された。本発明者らは、ベムラフェニブに対するＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞の増感剤として、いくつかのＤＮＡ損傷剤を試験した。ゲムシタビンは、ベムラフェニブの添加前にＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞がこの薬物で前処理される場合に、増感剤として特定された。組み合わせ指数の計算によって、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞において、ゲムシタビンとベムラフェニブの間の相乗効果が明らかになった。ゲムシタビンはデオキシシチジン類似体であり、これは、膵臓癌及び肺癌を含めた複数の腫瘍タイプに対する一次化学療法であった。ゲムシタビンは、ｐ５３変異型細胞の細胞周期のＳ期における複製フォークの崩壊の結果としてＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こし、またはｐ５３ＷＴ細胞のＧ１におけるＰＵＭＡ及びＢａｘ媒介性細胞死プログラムを介してアポトーシスを誘導する。しかし、膵臓及び肺癌の腫瘍細胞のｐ５３及び他の遺伝子において一般に生じる変異は、ゲムシタビンに対して獲得耐性を推進し、その結果、無病生存率を低くする。ｐ５３変異型がん細胞は、ｎＭ用量のゲムシタビンによる処理後にＳ期で停止するようになるが、死にはしない。一方で、ｐ５３ＷＴ細胞は、同一用量で、Ｇ１停止後に死ぬ。ｐ５３、ＢＲＡＦ及びＫＲＡＳのようなゲートキーパー遺伝子中の変異は、天然のがん細胞進行において一般的な事象であり、したがって、がん細胞が転移に向かって進行する場合の、がん細胞が薬物のＤＮＡ損傷作用に抵抗する生得的能力は、特に問題となる。それにもかかわらず、ゲムシタビンは、進行した膵臓癌（ＰＣａ）に対して第一選択療法のままである。
【０２５４】
薬物添加の順序は、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞における本発明者らのゲムシタビン／ベムラフェニブの組み合わせの成功にとって重要であった。同時薬物処理またはベムラフェニブもしくはダブラフェニブの前処理に続くゲムシタビン処理を用いる実験は、有意な感受性化を示さなかった（データ非表示）。本発明者らは、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞は、ゲムシタビンによって引き起こされるＤＮＡ二本鎖切断により、Ｓ期で停止すると仮定する。結果として、停止した細胞をベムラフェニブで処理する場合に、ＭＡＰＫカスケードが活性化され、セリン生合成及び葉酸サイクルが誘導される。本発明者らは、これら一連の事象は、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞において最終的に細胞死につながると考える。ゲムシタビン／ベムラフェニブの組み合わせによるＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１の細胞死を十分に特徴づけるために、さらなる実験が是認される。本発明者らは、ＤＮＡ損傷は、ＤＮＡ修復のためにＳＫ−ＭＥＬ２８ＶＲ１細胞において細胞周期停止を誘導して、葉酸サイクル及びヌクレオチド合成の活性化を開始すると仮定する。細胞が停止している間、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ阻害剤処理は、ＭＡＰＫ経路を活性化し、セリン合成及びヌクレオチド合成を誘導する。細胞のヌクレオチドプールを枯渇させる２つの相反する経路が、細胞死を引き起こす。
【０２５５】
次に、本発明者らのベムラフェニブ研究を、この薬物に本来応答性でないＢＲＡＦ  ＷＴがん細胞株で反復した。ベムラフェニブは、ＢＲＡＦ  ＷＴバックグラウンドを有する細胞の増殖を増大させることが既知であるので、本発明者らは、セリン生合成が、ベムラフェニブ処理条件下での細胞の生存及び増殖にとって重要であり得ると仮定する。本発明者らは、ＢＲＡＦ  ＷＴであり、ベムラフェニブに本質的に耐性である、複数のがん細胞株を調査した。膵臓癌細胞、ＮＳＣＬ癌細胞、乳癌細胞及び結腸癌細胞を試験した。実際に、ＭＳ研究によって、ベムラフェニブ処理に応答してＢＲＡＦ  ＷＴ膵臓癌細胞において大きく誘導されたとして、セリン生合成経路が特定された。ＢｘＰＣ３Ｍ１細胞は、薬物処理された膵臓癌細胞株のセリン合成酵素の増大が最も高かった。次いで、可変用量のゲムシタビンを試験し、ベムラフェニブ用量を一定に保った。１種の膵臓癌細胞株（ＢｘＰＣ３Ｍ１）及び１種のＮＳＣＬ（ＮＣＩ−Ｈ２１２２）癌細胞株がゲムシタビン／ベムラフェニブの組み合わせ処理に対して感受性になった。薬物添加の順序は、感受性化にとって重要な役割を果たした。ゲムシタビンの前処理は、ＢＲＡＦ阻害剤と組み合わせた場合に、感受性化に対して相乗効果を示した。組み合わせ指数の計算によって、２５ｎＭ〜１０００ｎＭのゲムシタビン用量で、ゲムシタビンとベムラフェニブの間の相乗効果が明らかになった。２種の薬物は、５ｎＭ、１０ｎＭ及び５０００ｎＭのゲムシタビン用量で、競合的な関係を有していた。このデータは、５０００ｎＭ用量のゲムシタビン単独が細胞死を引き起こし、１μＭベムラフェニブの追加によって、ゲムシタビンの毒性が低減することを示した。しかし、より低用量のゲムシタビン（２５ｎＭ〜１０００ｎＭ）は、ベムラフェニブと相乗効果を示した。最低用量のゲムシタビン（５ｎＭ及び１０ｎＭ）で、２種の薬物は競合的な関係を有する。これらの用量のゲムシタビンは、低すぎて、本発明者らのＣＩプロットにいかなる影響も与えることができないように思われる。本発明者らは、細胞周期停止は、ＢｘＰＣ３Ｍ１細胞において、ベムラフェニブ誘導性細胞死に必要であると考える。さらに、ＢｘＰＣ３Ｍ１細胞の増殖はベムラフェニブ処理によって誘導された。セリン枯渇実験によって、ＢｘＰＣ３Ｍ１のベムラフェニブ耐性にとって、ベースラインレベルの細胞外セリンが必要であることが示された。重要なことに、ゲムシタビンは、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞、ＢｘＰＣ３Ｍ１細胞及びＮＣＩ−Ｈ２１２２細胞を、第２のＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ阻害剤ダブラフェニブに対して感受性にした。まとめると、本発明者らのデータは、ベムラフェニブまたはダブラフェニブに対する、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞の獲得耐性ならびにＢｘＰＣ３Ｍ１細胞及びＮＣＩ−Ｈ２１２２細胞の内因性耐性が、ゲムシタビンの添加によって、反転し得ることを示した。ゲムシタビン及びベムラフェニブは、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞及びＢｘＰＣ３Ｍ１細胞で相乗効果を示した。
【０２５６】
本発明者らは、試験したすべての膵臓癌及びＮＳＣＬＣ細胞株全体にわたってゲムシタビン／ベムラフェニブの組み合わせによる感受性化を観察したわけではないので、レスポンダー、すなわち、ＳＫ−ＭＥＬ２８ＶＲ１細胞とＢｘＰＣ３Ｍ１細胞とＮＣＩ−Ｈ２１２２細胞の間で、統一的な特性を調べ始めた。以前のＲＮＡシークエンシングデータ（データ非表示）から、ＢｘＰＣ３Ｍ１細胞がＮＣＩ−Ｈ２１２２細胞株と同一のホモ接合型ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｃ変異を有することが分かっている。さらに、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ変異はＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞において生じた。さらに、ＮＣＩ−Ｈ２１２２細胞及びＢｘＰＣ３Ｍ１細胞はＢＲＡＦについてＷＴである。しかし、本発明者らがさらに探索している興味深い知見は、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞、ＢｘＰＣ３Ｍ１細胞及びＮＣＩ−Ｈ２１２２細胞に共通している定性的特徴である。３種すべての細胞株は、遊離した表現型を有する（データ非表示）。この表現型は、間葉系癌細胞の遊離した表現型と一致する。上皮間葉転換（ＥＭＴ）がベムラフェニブ耐性への経路であることが優先される。本発明者らは、現在、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞、ＢｘＰＣ３Ｍ１細胞及びＮＣＩ−Ｈ２１２２細胞をＥＭＴスケールで十分に特徴づけることに関して研究しており、ならびに３Ｄゲル浸潤研究及びゲノムシークエンシングによって、それらの転移能を調べている。本発明者らは、転移能及び変異プロファイルが、ゲムシタビン／ベムラフェニブの組み合わせに対する細胞感受性の重要な決定因子であり、個別化療法の可能性を明らかにすると仮定する。さらに、本発明者らは、メトトレキサート＋ベムラフェニブまたはダブラフェニブ処理に対する、さらなる耐性黒色腫細胞株の応答をさらに調べている。
【０２５７】
本研究は、がん細胞におけるＢＲＡＦ阻害剤耐性の新規で重要な決定因子として、セリン生合成を特定した。さらに、本発明者らは、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ阻害剤に対する黒色腫細胞の増感剤として、メトトレキサートを示した。さらなる実験によって、ＳＯＧ経路のさらなる阻害剤が、ＢＲＡＦ阻害剤に対する細胞の増感剤としてのそれらの有効性について調べられるであろう。重要なことに、本発明者らは、ＢＲＡＦ阻害剤であるベムラフェニブまたはダブラフェニブに対するがん細胞の増感法としてのゲムシタビン前処理を示した。最後に、本発明者らの研究は、ＢＲＡＦ阻害剤、すなわちベムラフェニブまたはダブラフェニブに対するＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ及びＢＲＡＦ  ＷＴがん細胞の耐性を反転させるために破壊することができる新規なタンパク質及び経路標的を特定するための定量的なプロテオミクスプロファイリングの好結果の使用を示す。いかなる特定の理論にも拘束されるものではないが、図１２Ａ及び１２Ｂは、本明細書に記載のデータ及び経路を図示する。これらの組み合わせは、例えば、膵臓癌及び黒色腫ならびに本明細書に記載の他のタイプのがんを治療するのに使用することができる。
【０２５８】
材料及び方法
細胞培養及び化学物質：Ｐａｎｃ１、ＢｘＰＣ３、ＭｉａＰａｃａ２及びＮＣＩ−Ｈ２１２２細胞は、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から購入した。ＳＫ−ＭＥＬ−２８及び５０１ＭＥＬ細胞は、Ｆｏｘ  Ｃｈａｓｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＦＣＣＣ）のＤｒ．Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｂｅｌｌａｃｏｓａの御厚意により頂いた。細胞株ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１は、段階的なベムラフェニブ選抜によって特定した。手短に言えば、１００，０００個のＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞を１０μＭベムラフェニブに４８時間、次いで２０μＭのベムラフェニブに４８時間、次いで３０μＭのベムラフェニブに４８時間暴露した。生存細胞をプールし、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１細胞株として特定した。細胞株ＢｘＰＣ３Ｍ１は、ＢｘＰＣ３細胞の受動的選抜によって特定した。単一のＢｘＰＣ３細胞をプレーティングし、サブクローンに増殖させた。非常に接着性のＢｘＰＣ３親細胞と質的に異なる遊離した表現型を有するサブクローンを特定し、ＢｘＰＣ３Ｍ細胞株として単離した。１つのそのような細胞株はＢｘＰＣ３Ｍ１である。すべての細胞株は、ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ（ＧｅｎＤｅｐｏｔ）または２ｍＭグルタミン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；２５０３００８１）を補充したＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＢＳ（ＧｅｎＤｅｐｏｔ）中で培養し、５％ＣＯ２中で３７℃で維持した。グルコースもグリシンもセリンもないＲＰＭＩ１６４０（Ｔｅｋｎｏｖａ）／１０％透析ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；２６４０００３６）をセリン枯渇研究に使用した。ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、エンコラフェニブ、メトトレキサート、カンプトテシン及びゲムシタビンはＳｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍから入手した。ＰＨＧＤＨ  ｓｉＲＮＡはＡｍｂｉｏｎ（ＡＭ１６７０８）から入手し、リポフェクタミンＲＮＡｉＭａｘはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（１０００１４４７２）から入手した。
【０２５９】
細胞生存率アッセイ：コロニー形成アッセイのために、０日目に、ウェルあたり４００個の細胞を２４ウェルプレート中に播種した。１日目に、細胞をＤＭＳＯまたは様々な用量のゲムシタビンで２４時間処理した。２日目に、ゲムシタビンを洗い落とし、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ及びメトトレキサートを加えた。４日目に、２日目に加えた薬物を洗い落とした。その後７日間細胞を増殖させてから、先に記載されたように定量化するために、これを固定し（１０％メタノール＋１０％酢酸）、クリスタルバイオレット（２０％エタノール中に０．４％）で染色した。
【０２６０】
マススペクトロメトリー：Ｕ３０００  ＲＳＬＣｎａｎｏ  ＨＰＬＣ装置（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と一体となったＱ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ  ＨＦ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で行われる液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）分析のために、試料を乾燥させ、２．５％ＡＣＮ／０．１％ギ酸に再溶解した。５μＬの試料をＣ１８トラップカラム（ＰｅｐＭａｐ１００；３００μｍ  ｉ．ｄ．×５ｍｍ、５μｍ粒径、１００Å；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に１分あたり１０μＬの流速でロードした。ペプチド分離は、Ｃ１８カラム（ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  Ｍ−Ｃｌａｓｓ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ＣＳＨ  Ｃ１８；１３０Å  １．７μｍ  ７５μｍ×２５０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ）で、１分あたり０．２６μＬの流速及び以下の勾配で行った：０〜３分、２％Ｂ定組成；３〜７６分、２％〜３０％Ｂ；７６〜９０分、３０％〜４５％Ｂ；９０〜９８分、４５％〜９８％Ｂ。移動相Ａは０．１％ギ酸であり、移動相Ｂは８０：２０アセトニトリル：水中の０．１％ギ酸であった。この実施は、Ｐｒｏｇｅｎｅｓｉｓ−ＱＩ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ（Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  ｄｙｎａｍｉｃｓ）を使用して分析した。Ｍａｓｃｏｔ（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ；バージョン２．５．１）を使用して、クロマトグラムを整列させ、ペプチドの特定のためにＭＳ／ＭＳデータを抽出した。Ｍａｓｃｏｔは、消化酵素トリプシンを仮定して、ＱＭＣペプチド配列及びＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベース（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓについて選択）を含むカスタムデータベースであるｃＲＡＰデータベースを検索するように設定した。Ｍａｓｃｏｔは、０．０６Ｄａのフラグメントイオン質量許容度及び１５ＰＰＭの親イオン許容度を用いて検索した。アスパラギン及びグルタミンの脱アミド化、メチオニンの酸化、リジンのアセチル、リジンのプロピオニル及びシステインのカルバミドメチル化を可変性修飾としてＭａｓｃｏｔで指定した。ＦＤＲ＜１％を使用して特定されたペプチドを抽出し、ピークの割り当てのためにＰｒｏｇｅｎｅｓｉｓにインポートし直した。少なくとも２つのユニークなペプチド及び２０のＭａｓｃｏｔスコアを有するタンパク質のみをさらなる分析に使用した。ペプチド及びタンパク質の定量化は、試料全体にわたって、正規化のために合成対照ペプチドを使用した。すべてのＭＳの実施は、Ｄｏｎａｌｄ  Ｄａｎｆｏｒｔｈ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ及びＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｅｂｒａｓｋａ，ＬｉｎｃｏｌｎのＰｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ  ｆａｃｉｌｉｔｙで行った。
【０２６１】
データプロット及び統計：すべてのプロテオミクス傾向プロットは、Ｅｖｏｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅスイート（ＥＳ）を使用して構築した。ボルケーノプロットは、発現比と統計的有意性の両方によって、データポイントを２軸で視覚的に分離する働きをする。これによって、所与の比較内で最も重要な差次的発現タンパク質を決定する単純な方法が可能になる。各タンパク質について、比較される各実験から反復値を集めて、値の２つの分布を作成する。値の２つの独立した試料間で、同一平均のスチューデントのｔ検定を使用して、分布を比較し、統計的有意性のＰ値を生成する。次いで、Ｐ値の−ｌｏｇ１０を用いて、グラフ表示にＹ座標を提供する。Ｘ座標、すなわち比は、所与の実験について、反復比の値の平均のｌｏｇ１０によって与えられる。組み合わせ指数の計算、Ｆａ−ＣＩプロット及びアイソボログラムは、Ｃｈｏｕ−Ｔｕｌａｌａｙ方法を使用して、Ｃｏｍｐｕｓｙｎソフトウェアプログラムを使用して構築した。コロニー形成アッセイを表すすべてのプロットは、Ｐｒｉｓｍ７ソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍ）を使用して構築した。二元配置ＡＮＯＶＡ検定を使用して、ｐ値を計算した。
【０２６２】
ウエスタンブロッティング：細胞を回収し、ＰＢＳ中で洗浄し、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤を含むＮＰ４０溶解バッファー（１％ＮＰ４０／ＰＢＳ／１０％グリセロール）中で溶解した。Ｔｏｔａｌ−Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａｓｓａｙ−ｋｉｔ（ＩＴＳＩ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｋ−００１４−２０）を用いてタンパク質濃度を決定し、次いで、ＳＤＳサンプルバッファーを可溶化液に加えた。５０ｕｇの煮沸した可溶化液をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、次いで、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｐ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；ＩＰＶＨ０００１０）にトランスファーした。免疫ブロットに使用するＰＨＧＤＨ抗体はＡｂｃａｍ（ａｂ２１１３６５）から入手した。免疫ブロットに使用するα−チューブリン抗体はＡｂｃａｍ（ａｂ７２９１）から入手した。α−チューブリンは、いかなる細胞株または薬物処理においてもその発現が変動しなかったので、ローディングコントロールとして使用した。
【０２６３】
実施例３：ゲムシタビンは、膵臓癌患者由来の細胞及びＡＴＣＣ樹立細胞株をベムラフェニブまたはダブラフェニブに対して感受性にする。２０，０００個の細胞をプレーティングして、３Ｄ−スフェロイド増殖アッセイ（Ｃｏｒｎｉｎｇ４５１５スフェロイドプレート）中で増殖させた。すべてのスフェロイドが少なくとも５００μｍの直径がであった２日後に、ゲムシタビンを加えた。翌日ゲムシタビンを洗い落とし、３日目（プレーティング後３日目）にＢＲＡＦ阻害剤を加えた。ＣＴＧ３Ｄ細胞生存率アッセイをプレーティング後５日目（すなわち、５日目、ｎ＝２）に行った。図１５のデータが図示するように、ＤＮＡ損傷剤、例えばゲムシタビンによる細胞の前処理は、膵臓癌細胞をＢＲＡＦ阻害剤に対して感受性にし、その増殖を阻害するだけでなく、細胞死も導く。これは、これらの細胞をこの組み合わせで死滅させることができるという、驚くべき、予想外の効果であった。
【０２６４】
実施例４：カンプトテシンはＢＲＡＦ阻害剤と相乗効果を示す。一定比組み合わせ指数（ＣＩ）の計算によって、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１転移性黒色腫細胞において、カンプトテシンとダブラフェニブまたはベムラフェニブの間で有意な相乗効果が示された（図１６）。カンプトテシンはトポイソメラーゼ１阻害剤であり、ＤＮＡ損傷剤である。コロニー形成アッセイは、Ｃｈｏｕ  Ｔａｌａｌａｙの一定比ＣＩ計算に対応するように設定した。単一カンプトテシン処理の開始用量は１５０ｎＭであり、ベムラフェニブは１００μＭであり、ダブラフェニブは１００μＭであった。用量は、３連で、連続したウェル中で、一定比で１／２、１／４、１／８、１／１６及び１／３２に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、カンプトテシン対いずれかのＢＲＡＦ阻害剤の比は１対６６．７であり、カンプトテシンの開始用量として１５０ｎＭ及びＢＲＡＦ阻害剤の開始用量として１０μＭを用いた。０日目に、２４ウェルプレートのウェルあたり４００個の細胞をプレーティングした。１日目にカンプトテシンを加え、２日目に洗い落とした。２日目のカンプトテシン洗浄後に、いずれかのＢＲＡＦ阻害剤、ベムラフェニブ（図１６Ａ及び１６Ｂ）またはダブラフェニブ（図１６Ｃ及び１６Ｄ）を加えた。４日目にＢＲＡＦ阻害剤を洗い落とし、コロニーを７日間させてから、以前に記載された定量化のために、これを固定し（１０％メタノール＋１０％酢酸）、クリスタルバイオレット（２０％エタノール中に０．４％）で染色した。図１６Ａは、カンプトテシンとベムラフェニブの間で相乗効果を示す、一定比のＦａＣＩプロットである。図１６Ｂは、カンプトテシンとベムラフェニブの間で相乗効果を示す、一定比のアイソボログラムである。図１６Ｃは、カンプトテシンとダブラフェニブの間で相乗効果を示す、一定比のＦａＣＩプロットである。図１６Ｄは、カンプトテシンとダブラフェニブの間で相乗効果を示す、一定比のアイソボログラムである。全体として、これらの結果は、カンプトテシン＋ベムラフェニブとカンプトテシン＋ダブラフェニブの両方の組み合わせ処理の転移性黒色腫に対する治療的可能性を明らかに示す。キノリンアルカロイド、例えばカンプトテシンとＢＲＡＦ阻害剤、例えば本明細書に記載のものとの組み合わせの相乗効果は、驚くべきことであり、予想外であった。
【０２６５】
実施例５：メトトレキサートはとエンコラフェニブ相乗効果を示す
３Ｄスフェロイド増殖アッセイから得られた一定比組み合わせ指数（ＣＩ）の計算は、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１転移性黒色腫細胞において、メトトレキサート及びエンコラフェニブの間で有意な相乗効果を示した（図１７）。メトトレキサートは葉酸代謝拮抗薬であり、ＤＮＡ損傷剤である。エンコラフェニブは、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異黒色腫細胞においてセネッセンス及びオートファジーを誘導することが既知であるＢＲＡＦ阻害剤である。他のＢＲＡＦ阻害剤と同様に、エンコラフェニブは、ＢＲＡＦ  ＷＴバックグラウンドにおいてＭＡＰＫ経路を逆説的に活性化する。スフェロイド増殖アッセイは、Ｃｈｏｕ  Ｔａｌａｌａｙの一定比ＣＩ計算に対応するように設定した。単一メトトレキサート処理の開始用量は２００ｎＭであり、エンコラフェニブは１００μＭであった。用量は、３連で、連続したウェル中で、一定比で１／２、１／４、１／８、１／１６及び１／３２に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、メトトレキサート対エンコラフェニブの比は１対２５であり、メトトレキサートの開始用量として２００ｎＭを用い、エンコラフェニブの開始用量として５μＭを用いた。９６ウェルスフェロイドプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ４５１５）のウェルあたり５，０００個の細胞をプレーティングした。スフェロイド増殖が少なくとも５００μｍの直径に一旦達したら、メトトレキサート及びエンコラフェニブを加えた。細胞を９６時間インキュベートした。続いて、ＣＴＧ３Ｄアッセイを行って、スフェロイド増殖を評価した。図１７Ａは、メトトレキサート及びエンコラフェニブの間で相乗効果を示す、一定比のＦａＣＩプロットである。図１７Ｂは、メトトレキサート及びエンコラフェニブの間で相乗効果を示す、一定比のアイソボログラムである。全体として、図１７は、メトトレキサート＋エンコラフェニブの組み合わせ処理の転移性黒色腫に対する治療的可能性を明らかに示す。メトトレキサートとＢＲＡＦ阻害剤、例えば本明細書に記載のものとの組み合わせの相乗効果は、驚くべきことであり、予想外であった。
【０２６６】
実施例６：ＢＲＡＦ阻害剤とＤＮＡ損傷剤とタキサンの組み合わせは、以前に治療に非応答性であったがんを治療するのに使用することができる
一定比組み合わせ指数（ＣＩ）の計算によって、ヒト膵臓癌細胞株（ＢｘＰＣＭ１；図１８Ａ）、マウスＫＰＣ膵臓癌モデル細胞株（ＫＰＣ  ＦＣ１２４２；図１８Ｂ）または患者由来の膵臓癌細胞株（ＰＮＸ００１；図１８Ｃ）において、ゲムシタビンとパクリタキセル／アブラキサンとＢＲＡＦ阻害剤（ダブラフェニブまたはエンコラフェニブ）の間で有意な相乗効果が示された。タキソールとして販売されているパクリタキセルは、膵臓癌、皮膚癌、肺癌、乳癌、子宮頸癌及び卵巣癌を含めた多発癌治療するのに使用される化学療法剤である。アブラキサンは、アルブミン粒子に結合しているパクリタキセル（ｎａｂ−パクリタキセル）の商品名である。ゲムシタビン＋アブラキサンの組み合わせは、現在、米国において＞６０％の切除不能な膵臓癌患者に与えられる第一選択治療剤である。コロニー形成アッセイは、Ｃｈｏｕ  Ｔａｌａｌａｙの一定比ＣＩ計算に対応するように設定した。
【０２６７】
ＢｘＰＣ３Ｍ１（図１８Ａ）については、単一ゲムシタビン処理の開始用量は１５０ｎＭであり、パクリタキセルは４０ｎＭであり、エンコラフェニブは１００μＭであった。用量は、３連で、連続したウェル中で、一定比で１／２、１／４、１／８、１／１６及び１／３２に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、ゲムシタビン対エンコラフェニブの比は１対２００であり、ゲムシタビンの開始用量として２５ｎＭを用い、エンコラフェニブの開始用量として５μＭを用いた。パクリタキセル対エンコラフェニブの比は１対２５０であり、パクリタキセルの開始用量として２０ｎＭを用い、エンコラフェニブの開始用量として５μＭを用いた。
【０２６８】
ＫＰＣ  ＦＣ１２４２（図１８Ｂ）については、単一ゲムシタビン処理の開始用量は５０ｎＭであり、パクリタキセルは１００ｎＭであり、ダブラフェニブは１００μＭであった。用量は、３連で、連続したウェル中で、一定比で１／２、１／４、１／８、１／１６及び１／３２に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、ゲムシタビン対ダブラフェニブの比は１対４００であり、ゲムシタビンの開始用量として２５ｎＭを用い、ダブラフェニブの開始用量として１０μＭを用いた。パクリタキセル対ダブラフェニブの比は１対５００であり、パクリタキセルの開始用量として２０ｎＭを用い、ダブラフェニブの開始用量として１０μＭを用いた。
【０２６９】
ＰＮＸ００１（図１８Ｃ）については、単一ゲムシタビン処理の開始用量は１０ｎＭであり、アブラキサンは２０ｎＭであり、ダブラフェニブは１００μＭであった。用量は、３連で、連続したウェル中で、一定比で１／２、１／４、１／８、１／１６及び１／３２に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、ゲムシタビン対ダブラフェニブの比は１対１０００であり、ゲムシタビンの開始用量として１０ｎＭを用い、ダブラフェニブの開始用量として１０μＭを用いた。アブラキサン対ダブラフェニブの比は１対４０００であり、アブラキサンの開始用量として２．５ｎＭを用い、ダブラフェニブの開始用量として１０μＭを用いた。ゲムシタビン及びアブラキサンの投与を繰り返して、二重処理曲線を得た（図１８Ｃ）。０日目に、２４ウェルプレートのウェルあたり４００個の細胞をプレーティングした。ゲムシタビン及びパクリタキセル／アブラキサンを１日目に加え、これを２日目に洗い落とした。
【０２７０】
２日目にゲムシタビン及びパクリタキセル／アブラキサンを洗い落とした後に、ＢＲＡＦ阻害剤のエンコラフェニブ（図１８Ａ）またはダブラフェニブ（図１８Ｂ及び１８Ｃ）のいずれかを加えた。４日目にＢＲＡＦ阻害剤を洗い落とし、コロニーを７日間させてから、以前に記載された定量化のために、これを固定し（１０％メタノール＋１０％酢酸）、クリスタルバイオレット（２０％エタノール中に０．４％）で染色した。図１８Ａは、ヒト膵臓癌細胞株（ＢｘＰＣ３Ｍ１）においてゲムシタビンとパクリタキセルとエンコラフェニブの間で相乗効果を示す、一定比のＦａＣＩプロットである。図１８Ｂは、マウスＫＰＣ膵臓癌細胞株（ＫＰＣ  ＦＣ１２４２）においてゲムシタビンとパクリタキセルとダブラフェニブの間で相乗効果を示す、一定比のＦａＣＩプロットである。図１８Ｃは、ヒト患者由来の膵臓癌細胞株（ＰＮＸ００１）においてゲムシタビンとアブラキサンとダブラフェニブの間で相乗効果を示す、一定比のＦａＣＩプロットである。重要なことに、図１８Ｃは、ゲムシタビン＋アブラキサン処理に応答しないが、ゲムシタビン＋アブラキサン＋ダブラフェニブの組み合わせ処理には応答する患者由来の細胞株を示す。全体として、これらの結果は、ゲムシタビン＋パクリタキセル／アブラキサン＋ＢＲＡＦ阻害剤の組み合わせ処理の膵臓癌に対する治療的可能性を明らかに示す。ヌクレオシド類似体及びＤＮＡ損傷剤、例えばゲムシタビンとタキサン、例えばパクリタキセル／アブラキサンとＢＲＡＦ阻害剤、例えば本明細書に記載のものとの組み合わせの相乗効果は、驚くべきことであり、予想外であった。
【０２７１】
実施例７：ＢＲＡＦ阻害剤とＤＮＡ損傷剤の組み合わせは、以前に治療に非応答性であったがんを治療するのに使用することができる。一定比組み合わせ指数（ＣＩ）の計算によって、転移性黒色腫細胞株（ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１；図１９Ａ及び１９Ｂ、５０１ｍｅｌ；図２０Ａ及び２０Ｂ）ならびに膵臓癌細胞株（Ｐａｎｃ１；図２１Ａ及び２１Ｂ、ＢｘＰＣ３Ｍ１；図２２Ａ及び２２Ｂ）において、ゲムシタビンとＢＲＡＦ阻害剤ＧＤＣ０８７９またはＡＤ８０の間で有意な相乗効果が示された。
【０２７２】
ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１（図１９Ａ）については、単一ゲムシタビン処理の開始用量は１５０ｎＭであり、ＧＤＣ０８７９は１００μＭであった。用量は、３連で、連続したウェル中で、一定比で１／２、１／４、１／８、１／１６及び１／３２に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、ゲムシタビン対ＧＤＣ０８７９の比は１対２００であり、ゲムシタビンの開始用量として２５ｎＭを用い、ＧＤＣ０８７９の開始用量として５μＭを用いた。
【０２７３】
ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１（図１９Ｂ）については、単一ゲムシタビン処理の開始用量は１５０ｎＭであり、ＡＤ８０は１００μＭであった。用量は、３連で、連続したウェル中で、一定比で１／２、１／４、１／８、１／１６及び１／３２に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、ゲムシタビン対ＡＤ８０の比は１対２００であり、ゲムシタビンの開始用量として２５ｎＭを用い、ＡＤ８０の開始用量として５μＭを用いた。
【０２７４】
５０１ｍｅｌ（図２０Ａ）については、単一ゲムシタビン処理の開始用量は１５０ｎＭであり、ＧＤＣ０８７９は１００μＭであった。用量は、３連で、連続したウェル中で、一定比で１／２、１／４、１／８、１／１６及び１／３２に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、ゲムシタビン対ＧＤＣ０８７９の比は１対２００であり、ゲムシタビンの開始用量として２５ｎＭを用い、ＧＤＣ０８７９の開始用量として５μＭを用いた。
【０２７５】
５０１ｍｅｌ（図２０Ｂ）については、単一ゲムシタビン処理の開始用量は１５０ｎＭであり、ＡＤ８０は１００μＭであった。用量は、３連で、連続したウェル中で、一定比で１／２、１／４、１／８、１／１６及び１／３２に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、ゲムシタビン対ＡＤ８０の比は１対２００であり、ゲムシタビンの開始用量として２５ｎＭを用い、ＡＤ８０の開始用量として５μＭを用いた。
【０２７６】
Ｐａｎｃ１（図２１Ａ）については、単一ゲムシタビン処理の開始用量は１５０ｎＭであり、ＧＤＣ０８７９は１００μＭであった。用量は、３連で、連続したウェル中で、一定比で１／２、１／４、１／８、１／１６及び１／３２に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、ゲムシタビン対ＧＤＣ０８７９の比は１対２００であり、ゲムシタビンの開始用量として２５ｎＭを用い、ＧＤＣ０８７９の開始用量として５μＭを用いた。
【０２７７】
Ｐａｎｃ１（図２１Ｂ）については、単一ゲムシタビン処理の開始用量は１５０ｎＭであり、ＡＤ８０は１００μＭであった。用量は、３連で、連続したウェル中で、一定比で１／２、１／４、１／８、１／１６及び１／３２に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、ゲムシタビン対ＡＤ８０の比は１対２００であり、ゲムシタビンの開始用量として２５ｎＭを用い、ＡＤ８０の開始用量として５μＭを用いた。
【０２７８】
ＢｘＰＣ３Ｍ１（図２１Ａ）については、単一ゲムシタビン処理の開始用量は１５０ｎＭであり、ＧＤＣ０８７９は１００μＭであった。用量は、３連で、連続したウェル中で、一定比で１／２、１／４、１／８、１／１６及び１／３２に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、ゲムシタビン対ＧＤＣ０８７９の比は１対２００であり、ゲムシタビンの開始用量として２５ｎＭを用い、ＧＤＣ０８７９の開始用量として５μＭを用いた。
【０２７９】
ＢｘＰＣ３Ｍ１（図２１Ｂ）については、単一ゲムシタビン処理の開始用量は１５０ｎＭであり、ＡＤ８０は１００μＭであった。用量は、３連で、連続したウェル中で、一定比で１／２、１／４、１／８、１／１６及び１／３２に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、ゲムシタビン対ＡＤ８０の比は１対２００であり、ゲムシタビンの開始用量として２５ｎＭを用い、ＡＤ８０の開始用量として５μＭを用いた。
【０２８０】
２日目にゲムシタビンを洗い落とした後に、ＢＲＡＦ阻害剤ＧＤＣ０８７９（図１９Ａ、２０Ａ、２１Ａ及び２２Ａ）またはＡＤ８０（図１９Ｂ、２０Ｂ、２１Ｂ及び２２Ｂ）のいずれかを加えた。４日目にＢＲＡＦ阻害剤を洗い落とし、コロニーを７日間させてから、以前に記載された定量化のために、これを固定し（１０％メタノール＋１０％酢酸）、クリスタルバイオレット（２０％エタノール中に０．４％）で染色した。図１９Ａは、ヒト転移性黒色腫細胞株（ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１）においてゲムシタビンとＧＤＣ０８７９の間で相乗効果を示す、一定比のＦａＣＩプロットである。図１９Ｂは、ヒト転移性黒色腫細胞株（ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１）においてゲムシタビンとＡＤ８０の間で相乗効果を示す、一定比のＦａＣＩプロットである。図２０Ａは、ヒト転移性黒色腫細胞株（５０１ｍｅｌ）においてゲムシタビンとＧＤＣ０８７９の間で相乗効果を示す、一定比のＦａＣＩプロットである。図２０Ｂは、ヒト転移性黒色腫細胞株（５０１ｍｅｌ）においてゲムシタビンとＡＤ８０の間で相乗効果を示す、一定比のＦａＣＩプロットである。図２１Ａは、ヒト膵臓癌細胞株（Ｐａｎｃ１）においてゲムシタビンとＧＤＣ０８７９の間で相乗効果を示す、一定比のＦａＣＩプロットである。図２１Ｂは、ヒト膵臓癌細胞株（Ｐａｎｃ１）においてゲムシタビンとＡＤ８０の間で相乗効果を示す、一定比のＦａＣＩプロットである。図２２Ａは、ヒト膵臓癌細胞株（ＢｘＰＣ３Ｍ１）においてゲムシタビンとＧＤＣ０８７９の間で相乗効果を示す、一定比のＦａＣＩプロットである。図２２Ｂは、ヒト膵臓癌細胞株（ＢｘＰＣ３Ｍ１）においてゲムシタビンとＡＤ８０の間で相乗効果を示す、一定比のＦａＣＩプロットである。全体として、これらの結果は、ゲムシタビン＋ＢＲＡＦ阻害剤の組み合わせ処理の転移性黒色腫及び膵臓癌に対する治療的可能性を明らかに示す。ヌクレオシド類似体及びＤＮＡ損傷剤、例えばゲムシタビンとＢＲＡＦ阻害剤、例えば本明細書に記載のものとの組み合わせの、増殖性非応答性腫瘍細胞株を阻害できる相乗効果は、驚くべきことであり、予想外であった。
【０２８１】
実施例８：ＣＲＡＦ阻害剤とＤＮＡ損傷剤の組み合わせは、以前に治療に非応答性であったがんを治療するのに使用することができる。以下の実施例は、ＣＲＡＦ阻害剤も以前に治療に非応答性であったがんを治療するのに使用することができることを示す。一定比組み合わせ指数（ＣＩ）の計算によって、転移性黒色腫細胞株（ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１；図２３Ａ及び２３Ｂならびに５０１ｍｅｌ；図２４Ａ及び２４Ｂ）ならびに膵臓癌細胞株（Ｐａｎｃ１；図２５Ａ及び２５Ｂ、ＢｘＰＣ３Ｍ１；図２６Ａ及び２６Ｂ）において、ゲムシタビンとＣＲＡＦ阻害剤ＺＭ３３６３７２及びＮＶＰＢＨＧ７１２の間で有意な相乗効果が示された。
【０２８２】
ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１（図２３Ａ）については、単一ゲムシタビン処理の開始用量は１５０ｎＭであり、ＺＭ３３６３７２は１００μＭであった。用量は、３連で、連続したウェル中で、一定比で１／２、１／４、１／８、１／１６及び１／３２に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、ゲムシタビン対ＺＭ３３６３７２の比は１対２００であり、ゲムシタビンの開始用量として２５ｎＭを用い、ＺＭ３３６３７２の開始用量として５μＭを用いた。
【０２８３】
ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１（図２３Ｂ）については、単一ゲムシタビン処理の開始用量は１５０ｎＭであり、ＮＶＰＢＨＧ７１２は１００μＭであった。用量は、３連で、連続したウェル中で、一定比で１／２、１／４、１／８、１／１６及び１／３２に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、ゲムシタビン対ＮＶＰＢＨＧ７１２の比は１対２００であり、ゲムシタビンの開始用量として２５ｎＭを用い、ＮＶＰＢＨＧ７１２の開始用量として５μＭを用いた。
【０２８４】
５０１ｍｅｌ（図２４Ａ）については、単一ゲムシタビン処理の開始用量は１５０ｎＭであり、ＺＭ３３６３７２は１００μＭであった。用量は、３連で、連続したウェル中で、一定比で１／２、１／４、１／８、１／１６及び１／３２に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、ゲムシタビン対ＺＭ３３６３７２の比は１対２００であり、ゲムシタビンの開始用量として２５ｎＭを用い、ＺＭ３３６３７２の開始用量として５μＭを用いた。
【０２８５】
５０１ｍｅｌ（図２４Ｂ）については、単一ゲムシタビン処理の開始用量は１５０ｎＭであり、ＮＶＰＢＨＧ７１２は１００μＭであった。用量は、３連で、連続したウェル中で、一定比で１／２、１／４、１／８、１／１６及び１／３２に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、ゲムシタビン対ＮＶＰＢＨＧ７１２の比は１対２００であり、ゲムシタビンの開始用量として２５ｎＭを用い、ＮＶＰＢＨＧ７１２の開始用量として５μＭを用いた。
【０２８６】
Ｐａｎｃ１（図２５Ａ）については、単一ゲムシタビン処理の開始用量は１５０ｎＭであり、ＺＭ３３６３７２は１００μＭであった。用量は、３連で、連続したウェル中で、一定比で１／２、１／４、１／８、１／１６及び１／３２に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、ゲムシタビン対ＺＭ３３６３７２の比は１対２００であり、ゲムシタビンの開始用量として２５ｎＭを用い、ＺＭ３３６３７２の開始用量として５μＭを用いた。
【０２８７】
Ｐａｎｃ１（図２５Ｂ）については、単一ゲムシタビン処理の開始用量は１５０ｎＭであり、ＮＶＰＢＨＧ７１２は１００μＭであった。用量は、３連で、連続したウェル中で、一定比で１／２、１／４、１／８、１／１６及び１／３２に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、ゲムシタビン対ＮＶＰＢＨＧ７１２の比は１対２００であり、ゲムシタビンの開始用量として２５ｎＭを用い、ＮＶＰＢＨＧ７１２の開始用量として５μＭを用いた。
【０２８８】
ＢｘＰＣ３Ｍ１（図２６Ａ）については、単一ゲムシタビン処理の開始用量は１５０ｎＭであり、ＺＭ３３６３７２は１００μＭであった。用量は、３連で、連続したウェル中で、一定比で１／２、１／４、１／８、１／１６及び１／３２に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、ゲムシタビン対ＺＭ３３６３７２の比は１対２００であり、ゲムシタビンの開始用量として２５ｎＭを用い、ＺＭ３３６３７２の開始用量として５μＭを用いた。
【０２８９】
ＢｘＰＣ３Ｍ１（図２６Ｂ）については、単一ゲムシタビン処理の開始用量は１５０ｎＭであり、ＮＶＰＢＨＧ７１２は１００μＭであった。用量は、３連で、連続したウェル中で、一定比で１／２、１／４、１／８、１／１６及び１／３２に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、ゲムシタビン対ＮＶＰＢＨＧ７１２の比は１対２００であり、ゲムシタビンの開始用量として２５ｎＭを用い、ＮＶＰＢＨＧ７１２の開始用量として５μＭを用いた。
【０２９０】
２日目にゲムシタビンを洗い落とした後に、ＣＲＡＦ阻害剤ＺＭ３３６３７２（図２３Ａ、２４Ａ、２５Ａ及び２６Ａ）またはＮＶＰＢＨＧ７１２（図２３、２４Ｂ、２５Ｂ及び２６Ｂ）のいずれかを加えた。４日目にＣＲＡＦ阻害剤を洗い落とし、コロニーを７日間させてから、以前に記載された定量化のために、これを固定し（１０％メタノール＋１０％酢酸）、クリスタルバイオレット（２０％エタノール中に０．４％）で染色した。図２３Ａは、ヒト転移性黒色腫細胞株（ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１）においてゲムシタビンとＺＭ３３６３７２の間で相乗効果を示す、一定比のＦａＣＩプロットである。図２３Ｂは、ヒト転移性黒色腫細胞株（ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１）においてゲムシタビンとＺＭ３３６３７２の間で相乗効果を示す、一定比のＦａＣＩプロットである。図２４Ａは、ヒト転移性黒色腫細胞株（５０１ｍｅｌ）においてゲムシタビンとＺＭ３３６３７２の間で相乗効果を示す、一定比のＦａＣＩプロットである。図２４Ｂは、ヒト転移性黒色腫細胞株（５０１ｍｅｌ）においてゲムシタビンとＺＭ３３６３７２の間で相乗効果を示す、一定比のＦａＣＩプロットである。図２５Ａは、ヒト膵臓癌細胞株（Ｐａｎｃ１）においてゲムシタビンとＺＭ３３６３７２の間で相乗効果を示す、一定比のＦａＣＩプロットである。図２５Ｂは、ヒト膵臓癌細胞株（Ｐａｎｃ１）においてゲムシタビンとＮＶＰＢＨＧ７１２の間で相乗効果を示す、一定比のＦａＣＩプロットである。図２６Ａは、ヒト膵臓癌細胞株（ＢｘＰＣ３Ｍ１）においてゲムシタビンとＺＭ３３６３７２の間で相乗効果を示す、一定比のＦａＣＩプロットである。図２６Ｂは、ヒト膵臓癌細胞株（ＢｘＰＣ３Ｍ１）においてゲムシタビンとＺＭ３３６３７２の間で相乗効果を示す、一定比のＦａＣＩプロットである。全体として、これらの結果は、ゲムシタビン＋ＣＲＡＦ阻害剤組み合わせ処理の転移性黒色腫及び膵臓癌に対する治療的可能性を明らかに示す。ヌクレオシド類似体及びＤＮＡ損傷剤、例えばゲムシタビンとＣＲＡＦ阻害剤、例えば本明細書に記載のものとの組み合わせの相乗効果は、驚くべきことであり、予想外であった。
【０２９１】
実施例９：汎ＲＡＦ阻害剤とＤＮＡ損傷剤の組み合わせは、以前に治療に非応答性であったがんを治療するのに使用することができる。以下の実施例は、汎ＲＡＦ阻害剤も以前に治療に非応答性であったがんを治療するのに使用することができることを示す。一定比組み合わせ指数（ＣＩ）の計算によって、転移性黒色腫細胞株（ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１；図２７Ａ及び２７Ｂならびに５０１ｍｅｌ；図２８Ａ及び２８Ｂ）ならびに膵臓癌細胞株（Ｐａｎｃ１；図２９Ａ及び２９Ｂ、ＢｘＰＣ３Ｍ１；図３０Ａ及び３０Ｂ）においてゲムシタビンと汎ＲＡＦ阻害剤ＲＡＦ２６５及びＴＡＫ６３２の間で有意な相乗効果が示された。
【０２９２】
ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１（図２７Ａ）については、単一ゲムシタビン処理の開始用量は１５０ｎＭであり、ＲＡＦ２６５は１００μＭであった。用量は、３連で、連続したウェル中で、一定比で１／２、１／４、１／８、１／１６及び１／３２に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、ゲムシタビン対ＲＡＦ２６５の比は１対２００であり、ゲムシタビンの開始用量として２５ｎＭを用い、ＲＡＦ２６５の開始用量として５μＭを用いた。
【０２９３】
ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１（図２７Ｂ）については、単一ゲムシタビン処理の開始用量は１５０ｎＭであり、ＴＡＫ６３２は１００μＭであった。用量は、３連で、連続したウェル中で、一定比で１／２、１／４、１／８、１／１６及び１／３２に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、ゲムシタビン対ＴＡＫ６３２の比は１対２００であり、ゲムシタビンの開始用量として２５ｎＭを用い、ＴＡＫ６３２の開始用量として５μＭを用いた。
【０２９４】
５０１ｍｅｌ（図２８Ａ）については、単一ゲムシタビン処理の開始用量は１５０ｎＭであり、ＲＡＦ２６５は１００μＭであった。用量は、３連で、連続したウェル中で、一定比で１／２、１／４、１／８、１／１６及び１／３２に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、ゲムシタビン対ＲＡＦ２６５の比は１対２００であり、ゲムシタビンの開始用量として２５ｎＭを用い、ＲＡＦ２６５の開始用量として５μＭを用いた。
【０２９５】
５０１ｍｅｌ（図２８Ｂ）については、単一ゲムシタビン処理の開始用量は１５０ｎＭであり、ＴＡＫ６３２は１００μＭであった。用量は、３連で、連続したウェル中で、一定比で１／２、１／４、１／８、１／１６及び１／３２に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、ゲムシタビン対ＴＡＫ６３２の比は１対２００であり、ゲムシタビンの開始用量として２５ｎＭを用い、ＴＡＫ６３２の開始用量として５μＭを用いた。
【０２９６】
Ｐａｎｃ１（図２９Ａ）については、単一ゲムシタビン処理の開始用量は１５０ｎＭであり、ＲＡＦ２６５は１００μＭであった。用量は、３連で、連続したウェル中で、一定比で１／２、１／４、１／８、１／１６及び１／３２に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、ゲムシタビン対ＲＡＦ２６５の比は１対２００であり、ゲムシタビンの開始用量として２５ｎＭを用い、ＲＡＦ２６５の開始用量として５μＭを用いた。
【０２９７】
Ｐａｎｃ１（図２９Ｂ）については、単一ゲムシタビン処理の開始用量は１５０ｎＭであり、ＴＡＫ６３２は１００μＭであった。用量は、３連で、連続したウェル中で、一定比で１／２、１／４、１／８、１／１６及び１／３２に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、ゲムシタビン対ＴＡＫ６３２の比は１対２００であり、ゲムシタビンの開始用量として２５ｎＭを用い、ＴＡＫ６３２の開始用量として５μＭを用いた。
【０２９８】
ＢｘＰＣ３Ｍ１（図３０Ａ）については、単一ゲムシタビン処理の開始用量は１５０ｎＭであり、ＲＡＦ２６５は１００μＭであった。用量は、３連で、連続したウェル中で、一定比で１／２、１／４、１／８、１／１６及び１／３２に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、ゲムシタビン対ＲＡＦ２６５の比は１対２００であり、ゲムシタビンの開始用量として２５ｎＭを用い、ＲＡＦ２６５の開始用量として５μＭを用いた。
【０２９９】
ＢｘＰＣ３Ｍ１（図３０Ｂ）については、単一ゲムシタビン処理の開始用量は１５０ｎＭであり、ＴＡＫ６３２は１００μＭであった。用量は、３連で、連続したウェル中で、一定比で１／２、１／４、１／８、１／１６及び１／３２に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、ゲムシタビン対ＴＡＫ６３２の比は１対２００であり、ゲムシタビンの開始用量として２５ｎＭを用い、ＴＡＫ６３２の開始用量として５μＭを用いた。
【０３００】
２日目にゲムシタビンを洗い落とした後に、汎ＲＡＦ阻害剤ＲＡＦ２６５（図２７Ａ、２８Ａ、２９Ａ及び３０Ａ）またはＴＡＫ６３２（図２７Ｂ、２８Ｂ、２９Ｂ及び３０Ｂ）のいずれを加えた。４日目に汎ＲＡＦ阻害剤を洗い落とし、コロニーを７日間させてから、以前に記載された定量化のために、これを固定し（１０％メタノール＋１０％酢酸）、クリスタルバイオレット（２０％エタノール中に０．４％）で染色した。図２７Ａは、ヒト転移性黒色腫細胞株（ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１）においてゲムシタビンとＲＡＦ２６５の間で相乗効果を示す、一定比のＦａＣＩプロットである。図２７Ｂは、ヒト転移性黒色腫細胞株（ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１）においてゲムシタビンとＴＡＫ６３２の間で相乗効果を示す、一定比のＦａＣＩプロットである。図２８Ａは、ヒト転移性黒色腫細胞株（５０１ｍｅｌ）においてゲムシタビンとＲＡＦ２６５の間で相乗効果を示す、一定比のＦａＣＩプロットである。図２８Ｂは、ヒト転移性黒色腫細胞株（５０１ｍｅｌ）においてゲムシタビンとＴＡＫ６３２の間で相乗効果を示す、一定比のＦａＣＩプロットである。図２９Ａは、ヒト膵臓癌細胞株（Ｐａｎｃ１）においてゲムシタビンとＲＡＦ２６５の間で相乗効果を示す、一定比のＦａＣＩプロットである。図２９Ｂは、ヒト膵臓癌細胞株（Ｐａｎｃ１）においてゲムシタビンとＴＡＫ６３２の間で相乗効果を示す、一定比のＦａＣＩプロットである。図３０Ａは、ヒト膵臓癌細胞株（ＢｘＰＣ３Ｍ１）においてゲムシタビンとＲＡＦ２６５の間で相乗効果を示す、一定比のＦａＣＩプロットである。図３０Ｂは、ヒト膵臓癌細胞株（ＢｘＰＣ３Ｍ１）においてゲムシタビンとＴＡＫ６３２の間で相乗効果を示す、一定比のＦａＣＩプロットである。全体として、これらの結果は、ゲムシタビン＋汎ＲＡＦ阻害剤の組み合わせ処理の転移性黒色腫及び膵臓癌に対する治療的可能性を明らかに示す。ヌクレオシド類似体及びＤＮＡ損傷剤、例えばゲムシタビンと汎ＲＡＦ阻害剤、例えば本明細書に記載のものとの組み合わせの相乗効果は、驚くべきことであり、予想外であった。
【０３０１】
実施例１０：ＢＲＡＦキナーゼのＤＦＧ−ｏｕｔ（不活性）コンフォメーションに結合する選択的ＢＲＡＦ阻害剤（第２世代ＢＲＡＦ阻害剤）とＤＮＡ損傷剤の組み合わせは、以前に治療に非応答性であったがんを治療するのに使用することができる。一定比組み合わせ指数（ＣＩ）の計算によって、転移性黒色腫細胞株（ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１；図３１Ａ及び３１Ｂ）、膵臓癌細胞株（Ｐａｎｃ１；図３２Ａ及び３２Ｂ、ＢｘＰＣ３Ｍ１；図３３Ａ及び３３Ｂ）、結腸癌細胞株（ＳＷ６２０；図３４Ａ及び３４Ｂ）ならびに肺癌細胞株（Ａ５４９；図３５Ａ及び３５Ｂ）において、ゲムシタビンまたはメトトレキサートとＢＲＡＦ阻害剤ＸＰ１０２（ＢＩ８８２３７０として以前に知られている）の間で有意な相乗効果が示された。
【０３０２】
ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１（図３１Ａ）については、単一ゲムシタビン処理の開始用量は１５０ｎＭであり、ＸＰ１０２は１００μＭであった。用量は、３連で、連続したウェル中で、一定比で１／２、１／４、１／８、１／１６及び１／３２に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、ゲムシタビン対ＸＰ１０２の比は１対２００であり、ゲムシタビンの開始用量として２５ｎＭを用い、ＸＰ１０２の開始用量として５μＭを用いた。
【０３０３】
ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１（図３１Ｂ）については、単一メトトレキサート処理の開始用量は１５０ｎＭであり、ＸＰ１０２は１００μＭであった。用量は、３連で、連続したウェル中で、一定比で１／２、１／４、１／８、１／１６及び１／３２に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、メトトレキサート対ＸＰ１０２の比は１対２００であり、メトトレキサートの開始用量として２５ｎＭを用い、ＸＰ１０２の開始用量として５μＭを用いた。
【０３０４】
Ｐａｎｃ１（図３２Ａ）については、単一ゲムシタビン処理の開始用量は１５０ｎＭであり、ＸＰ１０２は１００μＭであった。用量は、３連で、連続したウェル中で、一定比で１／２、１／４、１／８、１／１６及び１／３２に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、ゲムシタビン対ＸＰ１０２の比は１対２００であり、ゲムシタビンの開始用量として２５ｎＭを用い、ＸＰ１０２の開始用量として５μＭを用いた。
【０３０５】
Ｐａｎｃ１（図３２Ｂ）については、単一メトトレキサート処理の開始用量は１５０ｎＭであり、ＸＰ１０２は１００μＭであった。用量は、３連で、連続したウェル中で、一定比で１／２、１／４、１／８、１／１６及び１／３２に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、メトトレキサート対ＸＰ１０２の比は１対２００であり、メトトレキサートの開始用量として２５ｎＭを用い、ＸＰ１０２の開始用量として５μＭを用いた。
【０３０６】
ＢｘＰＣ３Ｍ１（図３３Ａ）については、単一ゲムシタビン処理の開始用量は１５０ｎＭであり、ＸＰ１０２は１００μＭであった。用量は、３連で、連続したウェル中で、一定比で１／２、１／４、１／８、１／１６及び１／３２に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、ゲムシタビン対ＸＰ１０２の比は１対２００であり、ゲムシタビンの開始用量として２５ｎＭを用い、ＸＰ１０２の開始用量として５μＭを用いた。
【０３０７】
ＢｘＰＣ３Ｍ１（図３３Ｂ）については、単一メトトレキサート処理の開始用量は１５０ｎＭであり、ＸＰ１０２は１００μＭであった。用量は、３連で、連続したウェル中で、一定比で１／２、１／４、１／８、１／１６及び１／３２に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、メトトレキサート対ＸＰ１０２の比は１対２００であり、メトトレキサートの開始用量として２５ｎＭを用い、ＸＰ１０２の開始用量として５μＭを用いた。
【０３０８】
ＳＷ６２０（図３４Ａ）については、単一ゲムシタビン処理の開始用量は１５０ｎＭであり、ＸＰ１０２は１００μＭであった。用量は、３連で、連続したウェル中で、一定比で１／２、１／４、１／８、１／１６及び１／３２に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、ゲムシタビン対ＸＰ１０２の比は１対２００であり、ゲムシタビンの開始用量として２５ｎＭを用い、ＸＰ１０２の開始用量として５μＭを用いた。
【０３０９】
ＳＷ６２０（図３４Ｂ）については、単一メトトレキサート処理の開始用量は１５０ｎＭであり、ＸＰ１０２は１００μＭであった。用量は、３連で、連続したウェル中で、一定比で１／２、１／４、１／８、１／１６及び１／３２に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、メトトレキサート対ＸＰ１０２の比は１対２００であり、メトトレキサートの開始用量として２５ｎＭを用い、ＸＰ１０２の開始用量として５μＭを用いた。
【０３１０】
Ａ５４９（図３５Ａ）については、単一ゲムシタビン処理の開始用量は１５０ｎＭであり、ＸＰ１０２は１００μＭであった。用量は、３連で、連続したウェル中で、一定比で１／２、１／４、１／８、１／１６及び１／３２に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、ゲムシタビン対ＸＰ１０２の比は１対２００であり、ゲムシタビンの開始用量として２５ｎＭを用い、ＸＰ１０２の開始用量として５μＭを用いた。
【０３１１】
Ａ５４９（図３５Ｂ）については、単一メトトレキサート処理の開始用量は１５０ｎＭであり、ＸＰ１０２は１００μＭであった。用量は、３連で、連続したウェル中で、一定比で１／２、１／４、１／８、１／１６及び１／３２に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、メトトレキサート対ＸＰ１０２の比は１対２００であり、メトトレキサートの開始用量として２５ｎＭを用い、ＸＰ１０２の開始用量として５μＭを用いた。
【０３１２】
２日目にゲムシタビン（図３１Ａ、３２Ａ、３３Ａ、３４Ａ及び３５Ａ）またはメトトレキサート（図３１Ｂ、３２Ｂ、３３Ｂ、３４Ｂ及び３５Ｂ）を洗い落とした後に、ＸＰ１０２を加えた。４日目にＸＰ１０２を洗い落とし、コロニーを７日間させてから、以前に記載された定量化のために、これを固定し（１０％メタノール＋１０％酢酸）、クリスタルバイオレット（２０％エタノール中に０．４％）で染色した。図３１Ａは、ヒト転移性黒色腫細胞株（ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１）においてゲムシタビンとＸＰ１０２の間で相乗効果を示す、一定比のＦａＣＩプロットである。図３１Ｂは、ヒト転移性黒色腫細胞株（ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１）において、メトトレキサートとＸＰ１０２の間で相乗効果を示す、一定比のＦａＣＩプロットである。図３２Ａは、ヒト膵臓癌細胞株（Ｐａｎｃ１）においてゲムシタビン及びＸＰ１０２の間で相乗効果を示す、一定比のＦａＣＩプロットである。図３２Ｂは、ヒト膵臓癌細胞株（Ｐａｎｃ１）においてメトトレキサートとＸＰ１０２の間で相乗効果を示す、一定比のＦａＣＩプロットである。図３３Ａは、ヒト膵臓癌細胞株（ＢｘＰＣ３Ｍ１）においてゲムシタビンとＸＰ１０２の間で相乗効果を示す、一定比のＦａＣＩプロットである。図３３Ｂは、ヒト膵臓癌細胞株（ＢｘＰＣ３Ｍ１）においてメトトレキサートとＸＰ１０２の間で相乗効果を示す、一定比のＦａＣＩプロットである。図３４Ａは、ヒト結腸癌細胞株（ＳＷ６２０）においてゲムシタビンとＸＰ１０２の間で相乗効果を示す、一定比のＦａＣＩプロットである。図３４Ｂは、ヒト結腸癌細胞株（ＳＷ６２０）においてメトトレキサートとＸＰ１０２の間で相乗効果を示す、一定比のＦａＣＩプロットである。図３５Ａは、ヒト肺癌細胞株（Ａ５４９）においてゲムシタビンとＸＰ１０２の間で相乗効果を示す、一定比のＦａＣＩプロットである。図３５Ｂは、ヒト肺癌細胞株（Ａ５４９）においてメトトレキサートとＸＰ１０２の間で相乗効果を示す、一定比のＦａＣＩプロットである。全体として、これらの結果は、ゲムシタビンまたはメトトレキサート＋ＸＰ１０２の組み合わせ処理の転移性黒色腫、膵臓癌、結腸癌及び肺癌に対する治療的可能性を明らかに示す。がん、例えば非応答性腫瘍に由来する細胞株の治療における、ＤＮＡ損傷剤、例えばゲムシタビンまたはメトトレキサートと選択的第２世代ＢＲＡＦ阻害剤、例えば本明細書に記載のものとの組み合わせの相乗効果は、驚くべきことであり、予想外であった。
【０３１３】
実施例１１：ＭＥＫ阻害剤とＤＮＡ損傷剤の組み合わせは、以前に治療に非応答性であったがんを治療するのに使用することができる。一定比組み合わせ指数（ＣＩ）の計算によって、転移性黒色腫細胞株（ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１；図３６）において、ゲムシタビンとＭＥＫ阻害剤Ｅ６２０１の間で有意な相乗効果が示された。
【０３１４】
ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１（図３６）については、単一ゲムシタビン処理の開始用量は１５０ｎＭであり、Ｅ６２０１は１００μＭであった。用量は、３連で、連続したウェル中で、一定比で１／２、１／４、１／８、１／１６及び１／３２に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、ゲムシタビン対Ｅ６２０１の比は１対２００であり、ゲムシタビンの開始用量として２５ｎＭを用い、Ｅ６２０１の開始用量として５μＭを用いた。
【０３１５】
２日目にゲムシタビン（図３６）を洗い落とした後に、Ｅ６２０１を加えた。４日目にＥ６２０１を洗い落とし、コロニーを７日間させてから、以前に記載された定量化のために、これを固定し（１０％メタノール＋１０％酢酸）、クリスタルバイオレット（２０％エタノール中に０．４％）で染色した。図３６は、ヒト転移性黒色腫細胞株（ＳＫ−ＭＥＬ−２８ＶＲ１）においてゲムシタビンとＥ６２０１の間で相乗効果を示す、一定比のＦａＣＩプロットである。この結果は、ゲムシタビン＋Ｅ６２０１の組み合わせ処理の転移性黒色腫に対する治療的可能性を明らかに示す。ＤＮＡ損傷剤、例えばゲムシタビンとＭＥＫ阻害剤、例えばＥ６２０１の組み合わせの相乗効果は、驚くべきことであり、予想外であった。
【０３１６】
結論として、本明細書で提供される阻害剤の組み合わせ、例えば、ＤＮＡ損傷剤、例えば、限定されないが、ゲムシタビン、メトトレキサートまたはカンプトテシンなどと組み合わせた、異なるタイプのＢＲＡＦ、ＣＲＡＦ、汎ＲＡＦ、ＭＥＫ阻害剤及びＢＲＡＦキナーゼのＤＦＧ−ｏｕｔ（不活性）コンフォメーションに対して特異的なＢＲＡＦ阻害剤、例えば、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、ソラフェニブ、エンコラフェニブ、ＲＡＦ２６５、ＡＤ８０、ＧＤＣ０８７９、ＡＺ６２８、ＺＭ３３６３７２、ＮＶＰＢＨＧ７１２、ＬＹ３００９１２０、ＴＡＫ６３２、ＭＬＮ２４８０またはＸＰ１０２は、これらのクラスの化合物に非感受性であると以前に思われていた耐性がん細胞株をこれらの阻害剤に対して感受性にすることが分かった。これらの組み合わせを、他のタイプの阻害剤、例えば、タキサン、ＭＥＫ阻害剤またはＥＧＦＲ阻害剤を加えて増強させることもできる。結果は、これらの組み合わせが、ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦまたは汎ＲＡＦ阻害剤のいずれにも特異的でなく、本明細書で記載され、例示されるような様々なＢＲＡＦ、ＣＲＡＦまたは汎ＲＡＦ阻害剤の全体にわたって使用することができるも示す。これらの結果は、驚くべきことであり、予想外であり、治療の選択肢がほとんどなかったがんに対して新しい治療を可能にする。
【０３１７】
本明細書に記載の実施形態を実施例を参照して説明してきたが、それらの趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な修正を行うことができることを当業者は認識する。
【０３１８】
本明細書で参照される及び／または出願データシート中に列挙される、上記の米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願及び非特許文献のすべては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【図１Ａ】
2020530014.tif 000012
【図１Ｂ】
2020530014.tif 000013
【図２Ａ】
2020530014.tif 000014
【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図９−５】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
2020530014.tif 000048
【図１８Ｃ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【国際調査報告】
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