(57)【要約】本発明で開示するのは、ヘキサデカンを溶媒として用いてワックス包埋試料を溶解し、抽出された核酸をエタノールを用いて析出および洗浄し、核酸をＮＰ４０およびＳＤＳを含む溶解緩衝液中に溶解させて、ワックス包埋試料から核酸を単離するための方法およびそのキットである。本開示に記載の試薬および技術を実施することにより、ユーザは、収率がより良好で分解が少なく、後続の配列決定および解析のための特異なｍＲＮＡ転写物をより多く含む生成物を得ることが可能である。
2020531001.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ワックス包埋生物学的試料から核酸を抽出する方法であって：
（ａ）前記生物学的試料とワックス可溶化有機溶媒とを組み合わせて、前記試料に由来する核酸の少なくとも一部が溶解している混合物を形成するステップと；
（ｂ）前記混合物にアルコールを加え、それにより前記アルコールを加える前後で、前記核酸を含む混合物から析出物を形成するステップと；次に、
（ｃ）前記有機溶媒と前記アルコールを前記析出物から分離するステップと；
（ｄ）前記析出物中にある前記試料由来の核酸の少なくとも一部を溶解するように、前記析出物を溶解緩衝液と組み合わせて溶解液を形成するステップと；
（ｅ）前記溶解液を、核酸に結合するように適合させたビーズと組み合わせるステップと；その後、
（ｆ）前記ビーズから前記生物学的試料に由来する核酸を回収するステップとを含み；
前記溶解緩衝液は、ノニル−フェノキシポリエトキシルエタノール（ＮＰ４０）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、またはＮＰ４０とＳＤＳの両方の組合せを含む、１つまたは複数の界面活性剤を含む、方法。
【請求項２】
前記１つまたは複数の界面活性剤はＮＰ４０を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記１つまたは複数の界面活性剤は、０．２５％〜１％（ｗ／ｖ）の濃度のＳＤＳを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記１つまたは複数の界面活性剤はＮＰ４０およびＳＤＳの両方を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記１つまたは複数の界面活性剤は、ＮＰ４０および／もしくはＳＤＳに加えて、またはＮＰ４０および／もしくはＳＤＳの代わりに、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１１４、Ｔｗｅｅｎ（商標）２０（ポリソルベート２０）、Ｔｗｅｅｎ（商標）４０、Ｔｗｅｅｎ（商標）６０、およびＴｗｅｅｎ（商標）８０から選択される１つまたは複数の非イオン性界面活性剤を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記生物学的試料はヒト組織試料である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記生物学的試料はパラフィンに包埋されている、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記有機溶媒は少なくとも６個の炭素原子を含む飽和炭化水素である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記有機溶媒は、１０〜２０個の炭素原子または１３〜１７個の炭素原子を含む直鎖状アルカンである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記有機溶媒はヘキサデカンである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記アルコールはエタノールである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記溶解緩衝液はプロテアーゼをさらに含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法
【請求項１３】
前記溶解緩衝液はプロテイナーゼＫを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記溶解緩衝液はＳＤＳなどのＲＮアーゼ阻害剤を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記アルコールを加える前に、工程（ａ）の混合物を５５℃の温度で１〜５分間インキュベートする、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記アルコールを加える前に、前記有機溶媒を前記析出物から除去する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記溶解緩衝液を加える前に前記析出物を乾燥させる、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記試料由来の核酸をＤＮアーゼＩなどのＤＮアーゼで処理してデオキシリボ核酸を除去することにより、前記ビーズから回収された核酸をＲＮＡ用に濃縮するステップをさらに含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記試料由来の核酸をＲＮアーゼで処理してリボ核酸を除去することにより、前記ビーズから回収された核酸をＤＮＡ用に濃縮するステップをさらに含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ビーズから回収された核酸は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ビーズから回収された核酸について核酸配列を決定するステップをさらに含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ビーズから回収された核酸からの遺伝子発現を解析するステップをさらに含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
ワックス包埋生物学的試料から核酸を単離するためのプロトコルにおいて、核酸の回収を改善するための方法であって、
前記プロトコルは、前記ワックス包埋試料を有機溶媒に溶解するステップと、前記有機溶媒から核酸を水性緩衝液中に抽出するステップと、前記核酸を前記水性緩衝液から単離するステップとを含み；
前記改善には、以下の：
（１）少なくとも１０個の炭素原子（ヘキサデカンなど）を含む飽和炭化水素を前記有機溶媒として使用する；
（２）前記有機溶媒中の核酸を析出物にし、該析出物を次に洗浄して前記有機溶媒とアルコールを除去する；
（３）前記水性緩衝液中に非イオン性界面活性剤ノニル−フェノキシポリエトキシルエタノール（ＮＰ４０）を含む；
（４）前記水性緩衝液中にＲＮアーゼ阻害剤（ドデシル硫酸ナトリウム、ＳＤＳなど）を含むという特徴のうち１つまたは複数が任意の組み合わせで含まれる、方法。
【請求項２４】
前記プロトコルが以下の：
（１）前記核酸の収率の中央値が少なくとも２５ｎｇ／μＬである；
（２）長さが２００塩基対超の断片の割合（ＤＶ２００）の中央値が少なくとも４０
％である；
（３）Ｃｑ＜２２で検出される特異なｍＲＮＡ転写物の数の中央値が少なくとも１００である、という基準のうち１つまたは複数において改善される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）生物学的試料から核酸を抽出するためのキットであって、
（ａ）パラフィンおよび前記ＦＦＰＥ生物学的試料中の核酸の少なくとも一部を溶解するのに充分な量のヘキサデカン；
（ｂ）前記生体試料からヘキサデカンを除去するのに十分な量のエタノール；
（ｃ）前記ヘキサデカンおよび前記エタノールを用いて沈殿させた前記試料由来の核酸を溶解するように配合され、ノニルーフェノキシポリエトキシレタノール（ＮＰ４０）および少なくとも１つのプロテアーゼを含む溶解緩衝液；および
（ｄ）前記溶解緩衝液中に溶解した前記試料由来の核酸に結合するように適合させたビーズを別個のコンパートメントに含み；
前記ＦＦＰＥ生物学的試料から核酸を抽出するための指示書をさらに含む、キット。
【請求項２６】
前記プロテアーゼはプロテイナーゼＫである、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
前記ビーズは磁性ビーズである、請求項２５または２６に記載のキット。
【請求項２８】
前記溶解緩衝液はＲＮアーゼ阻害剤を含む、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２９】
前記溶解緩衝液はドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む、請求項２５〜２８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３０】
ＤＮアーゼをさらに含む、請求項２５〜２９のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本願は、２０１７年８月１８日に出願された米国仮出願６２／５４７５４８号の優先権の利益を主張するものである。この優先出願は、これにより、あらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれるものとする。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、生物学的試料から核酸を抽出するための方法およびキットに関するものであり、遺伝学および医学の分野に応用される。以下に記載される方法およびキットは、限定するわけではないが、細胞および／または組織集合における、核酸配列決定および遺伝子発現解析などの後続の解析のために生物学的試料から核酸を抽出するのに有用である。
【背景技術】
【０００３】
ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料は、ある疾患の遺伝的基盤を理解するのに有益なソースであるが、ＦＦＰＥ試料からＤＮＡおよびＲＮＡを抽出することは困難である。ＦＦＰＥ試料からの核酸の抽出、濃縮、および単離は、毒性有機溶媒の使用、長時間のプロテアーゼ消化、高温への暴露、および高塩類溶液の使用をしばしば必要とする複雑な過程である
【０００４】
キシレンは有毒な化学物質であるが、ＤＮＡおよびＲＮＡ抽出のためにＦＦＰＥ試料を脱パラフィンするのに一般的に使用されている。脱パラフィン化組織は、多数回洗浄してキシレンを除去した後、通常はプロテアーゼで消化され、核酸は、例えば、フェノール−クロロホルム法を用いて単離される。多段階プロセスに加えて、ＦＦＰＥ試料中の核酸はしばしば化学的に修飾され、断片化されることから、これらの試料から抽出される核酸の収率はしばしば低くなる。ワックス包埋生物学的試料から核酸を抽出するためには、より良い方法が必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、本開示が出願された時点での技術水準よりも優れた、ワックス包埋試料から核酸を単離する技術を提供するものである。本明細書に記載される試薬および技術を実施することによって、ユーザは、配列決定および発現解析のためにかなり良好な核酸を含む生成物を得て、核酸を単離した試料について、より高品質かつより広範囲の情報を得ることが可能である。
【０００６】
本開示では、本発明の技術を、同じ目的を得るために商業的に利用可能なキットと比較した実験（実施例４〜８）のデータを提供する。データにより、本発明の技術が、限定するわけではないが、以下に挙げるユーザにとって多くの実質的な利点を有することを示す：
・ｍＲＮＡおよび他の核酸のより良好な収率が出発試料から達成され、後続の解析用により多くの材料をユーザに提供することが可能である；
・試料から単離された核酸の劣化が少なく、ユーザが試料間の比較のためにより良好な配列情報を得ることを可能にする；
・単離された核酸における特異なＲＮＡ種の数が増加し、それにより、後続の解析の感度が改善される。
これらの改善は、広範囲の異なったタイプの生物学的試料において観察されており、本発明の幅広い応用性を実証する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
核酸は、ワックスまたはパラフィンに包埋された、ヒトまたは他の生物由来の組織または細胞試料から抽出することが可能である。試料をワックス可溶有機溶媒と組み合わせて混合物を形成すると、ワックスの実質的に全て（＞９５％、好ましくは＞９８％）が液相となり、試料に由来する核酸の少なくとも一部が溶解される。次に、前記混合物にアルコールを加える。アルコールを加える前後で、試料の核酸を含む析出物または固相が形成される。
【０００８】
次いで、試料に元々添加されていた溶剤またはアルコールの少なくとも９０％、好ましくは９７％、または全てを除去するように、有機溶媒およびアルコールを析出物から分離させる。除去する方法は、遠心分離、重力沈殿、ろ過、またはカラム分離でよい。次いで、析出物を溶解緩衝液と組み合わせて溶解液を形成する。これを最終生成物としてもよいが、典型的には、核酸はさらなる解析のために溶液から単離される。例えば、該溶液に、核酸に結合するように適応させたビーズを加えることが可能である。適切なインキュベーション時間後、ビーズを溶液から分離させ、核酸をビーズから回収する。
【０００９】
溶解緩衝液は、１つもしくは複数の非イオン性界面活性剤および／または１つもしくは複数のＲＮアーゼ阻害試薬を含む。好適な非イオン性界面活性剤はノニル−フェノキシポリエトキシルエタノール（ＮＰ４０）である。一部の例で使用可能な他の非イオン性界面活性手段としては、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１１４、Ｔｗｅｅｎ（商標）２０（ポリソルベート２０）、Ｔｗｅｅｎ（商標）４０、Ｔｗｅｅｎ（商標）６０、Ｔｗｅｅｎ（商標）８０が挙げられる。好適なＲＮアーゼ阻害剤は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）であり、これは例えば０．２５％〜１％（ｗ／ｖ）の実効濃度で溶解緩衝液中に存在する。抽出用の好適な有機溶媒は、少なくとも６個の炭素原子を含む飽和炭化水素、例えば、１０〜２０個の炭素原子を含む直鎖状アルカン、またはヘキサデカンによって例示される１３〜１７個の炭素原子を含む直鎖状アルカンである。好適なアルコールは、エタノールによって例示される５個以下の炭素原子を含む飽和アルコールである。溶解緩衝液はまた、プロテイナーゼＫによって例示されるセリンプロテアーゼなどのプロテアーゼを含有してもよい。
【００１０】
これらの試薬は、任意の効果的なプロトコルに従って使用される。例えば、試料と有機溶媒の混合物は、アルコールを加える前に、５５℃の温度で１〜５分間など、溶解を促進する温度および時間でインキュベートすることが可能である。オプションとして、アルコールを加える前に有機溶媒を析出物から除去する。オプションとして、溶解緩衝液を加える前に、アルコールの３％未満または１％未満が残るように、アルコール洗浄後、析出物を乾燥させる。
【００１１】
目的がＲＮＡを回収することである場合、試料の核酸を、オプションとしてＤＮアーゼＩなどのＤＮアーゼで処理して、試料からＤＮＡを除去する。この処理は、溶解緩衝液中にＤＮアーゼを含めることによって、緩衝液をビーズと接触させる場合はビーズとのインキュベーション時または核酸をビーズから回収した後にＤＮアーゼを加えることによって、行うことが可能である。回収した核酸は、試料の核酸配列の決定、遺伝子発現の解析、またはユーザが望む任意の他の目的のために使用することが可能である。
【００１２】
本発明はまた、ワックス包埋生物学的試料から核酸を単離するためのプロトコルにおいて、核酸の回収を改善する方法を提供する。標準プロトコルは、ワックス包埋試料を有機溶媒に溶解するステップと、有機溶媒から核酸を水性緩衝液中に抽出するステップと、水性緩衝液から核酸を単離するステップとを含むことが多い。前記改善には、以下の、（１）少なくとも１０個の炭素原子を含む飽和炭化水素（ヘキサデカンなど）を有機溶媒として用いる、（２）有機溶媒中の核酸を析出物にし、これを次に洗浄して有機溶媒およびアルコールを除去する、（３）水性緩衝液中に非イオン性界面活性剤ノニル−ポリエトキシルエタノール（ＮＰ４０）を含ませる、および（４）水性緩衝液中にＲＮアーゼ阻害剤（ドデシル硫酸ナトリウム、つまりＳＤＳなど）を含ませるという特徴のうち、任意の組み合わせで１つ、２つ、３つまたは全てが含まれる。
【００１３】
条件によるが、プロトコルに従って核酸を単離することによって達成され得る結果としては、（１）試料からの核酸の収率の改善：例えば、核酸の収率の中央値が少なくとも１５、２５、３５、もしくは５０ｎｇ／μＬである、（２）単離した核酸の分解の減少：例えば、調製物における長さが２００塩基対超の核酸もしくは断片の割合（ＤＶ２００）の中央値が少なくとも３０％、４０％；５０％、もしくは６５％である、（３）単離したｍＲＮＡに由来する特異なｍＲＮＡ転写物の数の増加：例えば、Ｃｑ＜２２で単離したＲＮＡで検出される特異なｍＲＮＡ転写物数の中央値が少なくとも４０、６０、１００、もしくは１５０である；または単離したＤＮＡで検出される特異な遺伝子数の中央値が少なくとも１００００、１２０００、もしくは１５０００であることのうち、任意の１つ、２つ、または３つ以上が挙げられる。斯かる条件を満たすか否かは、以下の実施例の節で例示されるように、種々の組織試料から収集したパネルパラフィン包埋ヒトがん生検検体などの標準ＦＦＰＥ試料を用いて決定される。
【００１４】
本発明はまた、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）または他の生物学的試料から核酸を抽出するための種々の組み合せ試薬およびキットを提供する。実例として、本発明の組み合わせまたはキットは、（ａ）ＦＦＰＥ生物学的試料のパラフィンおよび核酸の少なくとも一部を溶解するのに十分な量のヘキサデカンまたは他の飽和炭化水素；（ｂ）生物学的試料からヘキサデカンを除去するのに十分な量のエタノールまたは他のアルコール；（ｃ）沈殿させた試料から核酸を溶解するように配合され、ノニル−フェニルポリエトキシルエタノール（ＮＰ４０）などの非イオン性界面活性剤、プロテイナーゼＫなどの少なくとも１つのプロテアーゼ、およびオプションとしてＳＤＳなどのＲＮアーゼ阻害剤を含む溶解緩衝液を、別個の容器に含み得る。キットは、オプションとして：（ｄ）溶解緩衝液に溶解した試料由来の核酸に結合するように適合させたビーズまたは他の核酸分離手段；および（ｅ）ＤＮアーゼを含む。
【００１５】
典型的には、このキットはまた、ＦＦＰＥ生物学的試料から核酸を抽出するための指示書も含む。組み合わせ試薬の試薬は別々に販売することができ、販売者は、本発明の単離プロトコルを実施するために、如何にそれらを組み合わせるかについての情報を消費者に提供する。
【００１６】
本発明のこれらおよび他の態様について、以下の節でより詳細に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１Ａは、ＦＦＰＥ生物学的試料からＤＮＡおよびＲＮＡの両方を抽出するワークフローを示す模式図である。図１Ｂは、ＦＦＰＥ生物学的試料からＲＮＡのみを抽出するワークフローを示す模式図である。
【図２】ＮＰ−４０またはＳＤＳを含む種々の溶解緩衝液を用いて得られたＤＮＡの量、および２つの市販キットを用いて得られたＤＮＡの量を比較した棒グラフである。
【図３】図３Ａは、異なる量のＳＤＳを含む種々の溶解緩衝液を用いて得られたＲＮＡの量を比較した棒グラフである。図３Ｂは、溶解緩衝液中で使用されるＳＤＳの割合が、ビーズを用いて抽出されるＲＮＡの量およびｑＰＣＲによる下流分析のいずれにも悪影響を及ぼさないことが見出されたことを示す表である。
【図４】本発明のキットを用いて抽出されたＲＮＡの質と、種々の市販の抽出キットを用いて抽出されたＲＮＡの質を比較したノーザンブロットである。すべてのＲＮＡを同じブロックのＦＦＰＥ肺がんカールから抽出した。
【図５】図５Ａは、異なるキットを用いて抽出されたＲＮＡの逆転写によって得られるＣＸ３ＣＬ１  ｃＤＮＡの量を比較した定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）曲線である。図５Ｂは、異なるキットを用いて抽出されたＲＮＡを用いて検出された遺伝子発現を示す表である。
【図６】種々の市販の抽出キットを用いて抽出されたＲＮＡのライブラリ収率およびサイズ分布を比較したエレクトロフェログラムである。
【図７】図７Ａは、（市販のキットと比較して）本発明のキットを用いて抽出されたＲＮＡによって、より多くの遺伝子をＲＮＡ配列決定により検出することが可能になったことを示す棒グラフである。図７Ａは、特に、本発明のキットを用いると、４つの異なるＦＦＰＥ試料のそれぞれで一貫してより多くの遺伝子が検出され、１試料あたりで検出された遺伝子数の変動が少なかったことを示す。図７Ｂは、（市販のキットと比較して）本発明のキットを用いて抽出されたＲＮＡによって、より多くの遺伝子をＲＮＡ配列決定により検出することが可能になったことを示す棒グラフである。
【図８】図８Ａは、本発明の試薬キットを用いたＦＦＰＥ参照試料からのｍＲＮＡ収率を示す図である。図８Ｂは、本発明の試薬キットを用いたＦＦＰＥ参照試料からのｍＲＮＡ収率を示す図である。図８Ｃは、長さが２００塩基対超である断片の割合（ＤＶ２００）を示す図である。図８Ｄは、長さが２００塩基対超である断片の割合（ＤＶ２００）を示す図である。図８Ｅは、検出された標的の数を示す図である。図８Ｆは、検出された標的の数を示す図である。これら３つの判断基準のすべてにおいて、検査キットの結果は現在市販されているキットの結果と比較して優れていた。
【図９】図９Ａは、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ（登録商標）試薬キットを用いて得られた収率とＱｉａｇｅｎのキットを用いて得られた収率を比較した図である。図９Ｂは、Ｆｌｕｉｄｉｇｍキットでは、長さが２００塩基対以上であるｍＲＮＡ種の検出数であるＤＶ２００が、６０％〜９５％改善したことを示す図である。図９Ｃは、Ｆｌｕｉｄｉｇｍキットによって特定された標的数がＱｉａｇｅｎキットと比較して約４５％改善したことを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本開示は、ワックス包埋生物学的試料（ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）生物学的試料など）から核酸（デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）など）を抽出、単離、および／または精製するための方法およびキットを提供する。該方法およびキットを用いて、高収率で分解が少なく、直後の解析に適した抽出核酸を得ることが可能である。提供する方法およびキットは、後続の核酸配列決定手順（シーケンシングなど）または増幅（例えばｑＰＣＲ）による検出に有用である。この技術を用いて、元の試料のＤＮＡ量および／またはＲＮＡ発現プロファイルを決定することができる。
【００１９】
Ｉ．ワックス包埋生物学的試料の脱パラフィン化
本発明に従って処理され得るワックス包埋生物学的試料としては、ワックスに埋め込まれまたは包埋され、組織化学的、化学的、または生物学的解析のために保存された、ヒトもしくは他の哺乳動物などの対象から単離された臓器、組織、もしくは細胞の画分およびスライス、または不死化細胞株が挙げられる。試料は、組織切片（例えば、組織スライドもしくはブロックなど）、または、限定するわけではないが、がん組織であると判定された生物学的試料から採取される組織切片を含む、疾患を有する生物学的試料から採取された組織切片であり得る。
【００２０】
生物学的試料を保存するために一般的に使用されるワックスは、しばしば長鎖炭化水素の混合物からなり、脂肪酸、脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、および長鎖アルコールなどの追加の成分を含み得る。ワックスは、さらにその特性を高めるために、ジメチルスルホキシドなどの保存剤を含み得る。生物学的試料を包埋するために使用されるワックスは天然起源でも合成起源でも良く、石油、石炭、オイルシェール、動物、および／または植物に由来し得る。ワックスは疎水性で水に不溶であるが、有機、非極性溶媒には可溶である。生物学的試料は、主として長鎖炭化水素からなるパラフィンワックスに埋め込まれ得る。パラフィンワックスはまた、飽和直鎖−およびイソ−アルカン、ナフテン、ならびにアルキル−およびナフテン−置換芳香族化合物の混合物を含有し得る。炭化水素鎖の分岐および／または飽和の程度は、パラフィンワックスの化学的特性に影響を及ぼし得る。
【００２１】
ワックス包埋生物学的試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）生物学的試料であり得る。ホルマリンはホルムアルデヒドの水溶液であり、しばしば４０容量%のホルムアルデヒド（例えば、約３７重量％のホルムアルデヒド）からなる。ＦＦＰＥ生物学的試料において、生物学的試料はホルムアルデヒドを用いて固定された後、パラフィンワックスに埋め込まれる。ワックス包埋生物学的試料の厚さは、１〜２０μｍ（例えば、１〜１８μｍ、１〜１６μｍ、１〜１４μｍ、１〜１２μｍ、１〜１０μｍ、１〜８μｍ、１〜６μｍ、１〜４μｍ、１〜２μｍ、２〜２０μｍ、４〜２０μｍ、６〜２０μｍ、８〜２０μｍ、１０〜２０μｍ、１２〜２０μｍ、１４〜２０μｍ、１６〜２０μｍ、１８〜２０μｍ、２〜１８μｍ、３〜１６μｍ、４〜１４μｍ、５〜１２μｍ、５〜１０μｍ、または６〜８μｍ）であり得る。本発明の方法は、脱パラフィン化ともいう、包埋された生物学的試料からワックスを除去する第一ステップを含む。
【００２２】
ＦＦＰＥ生物学的試料を、まずワックス可溶化剤（ヘキサデカンなど）と接触させて混合物を形成する。次に、混合物にアルコール（エタノールなど）を加えて、ワックス可溶化剤の除去を促進する。条件によっては、ワックス可溶化剤とアルコールを同時に試料に加えてもよい。最後に、可溶化ワックス、ヘキサデカンなどのワックス可溶化剤、およびエタノールなどのアルコールを、例えば、混合物を遠心分離して、所望の生物学的試料を含むペレットと、可溶化ワックス、ワックス可溶化剤、およびアルコールを含む上澄み液を形成することによって、混合物から除去する。その後、上澄み液は取り除いて廃棄してよい。混合物を、約５０℃〜約６０℃（例えば、約５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、または５９℃）でインキュベートして、ワックスの溶解および試料からの分離をさらに補助することもできる。ワックス可溶化剤を生物学的試料に加えワックスを溶解した後、アルコールを加える前に溶解ワックスおよびワックス可溶化剤を混合物から除去してもよい。
【００２３】
本発明で使用される方法およびキットで使用されるワックス可溶化剤は、典型的には、飽和または不飽和炭化水素などの有機溶媒である。該溶媒は、ワックスを可溶化することができる直鎖状、分枝状、および／または環状のアルカンを含有し得る。ワックス可溶化剤は、Ｃ１０−Ｃ２０直鎖状アルカン（例えば、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、またはＣ２０直鎖状アルカン；Ｃ１１−Ｃ１９、Ｃ１２−Ｃ１８、Ｃ１３−Ｃ１７、またはＣ１４−Ｃ１６直鎖状アルカン）、例えばヘキサデカンなどの直鎖状アルカンであり得る。ワックスをいったん可溶化したら、混合物を遠心分離し、可溶化ワックスおよびワックス可溶化剤を上澄み液として廃棄してもよいし、結果として生じる生物学的試料を含むペレットをアルコールを用いて洗浄して、残存するワックス可溶化剤をすべて除去してもよい。アルコール洗浄ステップの実施は、生物学的試料からワックス可溶化剤を完全に除去するのに役立ち得、これは、抽出核酸の収率および純度の向上に寄与し得る。アルコール洗浄ステップの後、生物学的試料混合物を遠心分離して上澄み液としてアルコールを除去し、ワックスから脱包埋された生物学的試料をペレットとして収集することができる。ペレットはまた、すべての残留エチルアルコールが蒸発するまで風乾してもよい。
【００２４】
ＩＩ．細胞溶解と核酸単離
いったん生物学的試料を脱パラフィンすれば、溶解緩衝液を用いて試料を溶解して、細胞成分を遊離させることができる。溶解緩衝液は、生物学的試料中の細胞を壊し開けまたは溶解して、核酸を分解、断片化、または改変することなく溶液中に遊離させることが可能な任意の水溶液とすることができる。本発明の方法およびキットに使用される溶解緩衝液は、例えば、１つもしくは複数の界面活性剤、１つもしくは複数のプロテアーゼ、１つもしくは複数の塩類、１つもしくは複数の緩衝剤、および／または１つもしくは複数のキレート剤を含み得る。溶解緩衝液は、最も効率的な溶解のため、および、所望の細胞成分に安定した環境を提供するために、所望のｐＨ範囲（典型的には６〜８のｐＨ；例えば、６、６．２、６．４、６．６、６．８、７、７．２、７．４、７．６、７．８、または８のｐＨ）に調整されるまたは該ｐＨ範囲で維持される場合がある。
【００２５】
ＤＮＡのみが所望される場合、溶解緩衝液はリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）をさらに含んでよく、ＲＮアーゼ阻害剤を含むことはできない。ＤＮＡとＲＮＡの両方またはＲＮＡのみが所望される場合は、溶解緩衝液は、ＲＮＡ分解を防止するためにＲＮアーゼ阻害剤（ＲＮＡエンハンサーともいう）をさらに含んでよい。生物学的試料の種類および抽出すべき所望の細胞成分に応じて、界面活性剤、プロテアーゼ、塩類、緩衝剤、キレート剤、ならびに溶解緩衝液中のそれぞれの量および濃度を、特定の生物学的試料に合わせて調整することができる。溶解緩衝液の成分は、混合して提供されるかまたは別々に試料に加えられて、溶解液を形成し得る。
【００２６】
脱パラフィン化生物学的試料は、溶解緩衝液と接触して溶解液を形成し得る。効率的な細胞溶解のためには、溶解液を約５０℃〜約６０℃（例えば、約５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、または５９℃）で加熱された環境において１〜２４時間（例えば、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、または２３時間）インキュベートするとよい。溶解液を約５５℃で約１〜約１６時間インキュベートするとよい。ＲＮＡを単離する場合、このインキュベーションは約１時間、または少なくとも１時間でよい。ＤＮＡ（またはＤＮＡとＲＮＡの両方）を単離する場合は、このインキュベーションは、少なくとも１６時間などより長くなる場合がある。溶解反応を（溶解緩衝液中のプロテアーゼを不活性化することなどによって）止めるには、溶解液を約８５℃〜約９５℃（例えば、約９０℃）で５〜１０分間さらにインキュベートするとよい。続いて、不所望の細胞材料をペレット化し、次のビーズ精製のために上澄み液中の核酸を単離するために、溶解液を遠心分離する場合がある。
【００２７】
溶解緩衝液中の界面活性剤により、細胞膜の破壊と、膜タンパク質および脂質の可溶化が可能になる。界面活性剤は両親媒性分子で、脂肪族または芳香族の性質をもつ非極性尾部基と極性頭部基の両方を含む。溶解緩衝液中の界面活性剤は、非イオン性、アニオン性、カチオン性、双性イオン性、またはそれらの混合であり得る。本発明の方法において使用され得る溶解緩衝液に含まれ得る界面活性剤の例としては、限定するわけではないが、ＮＰ-４０、ＴｒｉｒｏｎＸ１００、ＴｒｉｔｏｎＸ-１１４、Ｔｗｅｅｎ２０（ポリソルベート２０）、Ｔｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０、３［（３コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳ）、３［（３コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］-２-ヒドロキシ−１−プロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳＯ）、オクチルグルコシド、オクチルチオグルコシド、胆汁塩類（例えば、コール酸塩）、および４級アンモニウム界面活性剤（例えば、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＴＴＡＢ）、エチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＥＴＡＢ））が挙げられる。溶解緩衝液中の界面活性剤はＮＰ−４０である。溶解緩衝液中の界面活性剤の量は、当業者によって最適化され得る。
【００２８】
溶解緩衝液は、０．０１％〜１％（例えば、約０．０２５％、約０．０５％、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、または約０．９％）のＮＰ−４０などの非イオン性界面活性剤を含み得る。溶解緩衝液は、０．０１％〜０．５％、０．０１％〜０．２５％、または０．０１％〜０．１％のＮＰ−４０を含み得る。溶解緩衝液は、０．０５％〜１％、０．０５％〜０．５％、０．０５％〜０．２％、０．１％〜１％、または０．１％〜０．５％のＮＰ−４０を含み得る。溶解緩衝液は約０．０５％のＮＰ４０を含み得る。溶解緩衝液は試料に加えられて溶解液を形成する。後述するように、溶解緩衝液用の追加成分は、界面活性剤と混合して、または別々に含めることができる。
【００２９】
本発明の方法およびキットで使用される溶解緩衝液は、１つまたは複数のプロテアーゼを含む。プロテアーゼはタンパク質分解によってタンパク質をより小さなペプチドやアミノ酸に分解する酵素である。プロテアーゼは、その活性部位に関与する触媒基によって分類することができる。プロテアーゼの種類例としては、限定するわけではないが、セリンプロテアーゼ（プロテイナーゼＫ、キモトリプシン、トリプシン、エラスターゼ、プラスミン、トロンビン、先体プロテアーゼ、補体Ｃ１、ケラチナーゼ、コラゲナーゼ、フィブリノリシン、およびコクーナーゼなど）、システインプロテアーゼ（パパイン、ブロメライン、カテプシン、カルパイン、カスパーゼ−１、ソルターゼ、ＴＥＶプロテアーゼ、およびＣ型肝炎ウイルスペプチダーゼ２など）、トレオニンプロテアーゼ、アスパラギンプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、ならびにアスパラギンペプチドリアーゼが挙げられる。プロテアーゼは、溶解液を形成するのに、溶解緩衝液の他の成分と混合されていてもよいし、溶解緩衝液の他の成分と組み合わされてもよい。
【００３０】
溶解液は、溶液のｐＨの急速な変化を防ぐために、緩衝剤をさらに含んでよい。緩衝剤の例としては、限定するわけではないが、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）、クエン酸、酢酸、リン酸カリウム、ホウ酸、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、ビシン、トリシン、３−（Ｎ−トリス−（ヒドロキシメチル）メチルアミノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−［［１，３−ジヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−２−イル］アミノ］エタンスルホン酸（ＴＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸（ＰＩＰＥＳ）、カコジラート、および２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）が挙げられる。
【００３１】
緩衝剤は、最も効率的な溶解のため、および、所望の細胞成分に安定した環境を提供するために、溶解緩衝液のｐＨを６〜８のｐＨ（例えば、６、６．２、６．４、６．６、６．８、７、７．２、７．４、７．６、７．８、または８のｐＨ）で維持する場合がある。本発明の方法およびキットで使用される溶解緩衝液はまた、キレート剤、還元剤、安定剤、有機もしくは無機塩類、金属イオン、および／またはｐＨ指示薬などの追加の試薬を含んでもよい。溶解緩衝液にはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート剤が含まれていてもよい。緩衝剤は、溶解液を形成するために、溶解緩衝液の他の成分と混合して提供されてもよいし、溶解緩衝液の他の成分と組み合わされてもよい。
【００３２】
ＤＮＡとＲＮＡの両方またはＲＮＡのみが生物学的試料から所望される場合、溶解液は、ＲＮＡ分解を防止するためにＲＮアーゼ阻害剤（ＲＮＡエンハンサーともいう）をさらに含んでよい。ＲＮアーゼ阻害剤は、ある種類のリボヌクレアーゼに結合するタンパク質であり得る。ＲＮアーゼ阻害剤は低分子化合物であり得る。本方法およびキットの溶解緩衝液に使用されるＲＮアーゼ阻害剤は、ＳＤＳを含む水溶液であり得る。
【００３３】
溶解緩衝液は、０．１％ＳＤＳ〜１．５％ＳＤＳ（例えば、０．１％〜１．２％、０．１％〜１．０％、０．１％〜０．８％、０．１％〜０．６％、０．１％〜０．４％、０．１％〜０．２％、０．２％〜１．５％、０．４％〜１．５％、０．６％〜１．５％、０．８％〜１．５％、１.０％〜１．５％、１．２％〜１．５％、または１．４％〜１．５％ＳＤＳ）を含み得る。本発明で使用する溶解緩衝液は、０．１２５％ＳＤＳ〜１％ＳＤＳ（例えば、０．１２５％ＳＤＳ超および１％ＳＤＳ以下）を含み得る。溶解緩衝液は、０．１％〜１．５％、０．２％〜１．２％、０．２％〜１％、０．２５％〜１％、０．２％〜０．９％、０．２％〜０．８％、０．２５％〜０．７％、０．２％〜０．６％、０．２５％〜０．５％、０．３％〜０．５％、または約０．４％のＳＤＳを含み得る。溶解緩衝液の成分は、溶解液を形成するために、混合して提供されても、試料に別々に加えられてもよい。
【００３４】
溶解緩衝液の成分は、溶解液を形成するために、混合して提供されても別々に提供されてもよい。生物学的試料からＤＮＡのみが所望される場合、溶解緩衝液は、典型的には、ＲＮアーゼ阻害剤を含まない。生物学的試料からＤＮＡのみが所望される場合、溶解緩衝液は、ＲＮアーゼＡ、ＲＮアーゼＨ、ＲＮアーゼＩＩＩ、ＲＮアーゼＬ、およびＲＮアーゼＰなどのＲＮアーゼをさらに含み得る。生物学的試料からＤＮＡのみが所望される場合、溶解緩衝液はＲＮアーゼＡをさらに含み得る。さらに、ＲＮＡのみが所望される場合、本方法はＤＮアーゼ消化という追加のステップを含み得る。ＲＮアーゼ阻害剤は、溶解液を形成するために、溶解緩衝液の他の成分と混合して提供されても、溶解緩衝液の他の成分と組み合わされてもよい。本発明の方法およびキットにおいて、界面活性剤、プロテアーゼ、緩衝剤、ＲＮアーゼ阻害剤、またはそれらの任意の組合せの１つまたは複数は、溶解液を形成する際に溶解緩衝液の他の成分と混合して提供されても、組み合わされてもよい。例えば、界面活性剤、ＲＮＡ阻害剤およびプロテアーゼは全て別々に提供されてもよいし、１つまたは複数が緩衝剤に含まれてもよい。
【００３５】
ＩＩＩ．単離核酸のビーズ精製
前節に記載した上澄み液中の単離核酸は、クロマトグラフィなどの種々の固相分離法を用いてさらに精製することができる。多くの利用可能な固相分離法は、最適な塩濃度およびｐＨ下において、核酸分子とシリカ表面の間の誘因性相互作用を利用する。前節に記載した単離核酸を含む溶液は、表面をシリカでコーティングした磁性ビーズなどのビーズと混ぜることができる。いったん核酸が磁性ビーズと結合すれば、ビーズを、磁性セパレータを用いて水溶液から分離させることが可能である。単離核酸は、次に、水を用いて磁性ビーズから溶離することが可能である。磁性ビーズに対する核酸の割合は、核酸収率を向上させるように最適化することができる。
【００３６】
ビーズは、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを特異的または非特異的に捕捉する結合部分を提供する表面を有することによって、核酸と結合するように適合させる。核酸を単離するように設計された磁性ビーズは、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４１：２４４０−２４４３，２００３、Ｍｉｓｚｃｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４９：３６９４−３６９６，２０１１、およびＹａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１７１：１９５−１９９，２０１１に記載されている。
【００３７】
ＡＭＰｕｒｅ（登録商標）ビーズ、ＭａｇＪＥＴ（登録商標）ビーズ、およびＭａｇｎｅｓｉｌ  Ｂｌｕｅ（登録商標）ビーズなどの種々の磁性ビーズも商業的に利用可能である。ＡＭＰｕｒｅビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）は、非特異的および可逆的にＤＮＡに結合することが可能な、（琥珀酸の形をした）カルボキシル基でコーティングされた磁性粒子である。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および塩（通常はＮａＣｌ）の存在下でそれらをＤＮＡに加えると、むらのあるゲル抽出が、標準化され、かつ迅速な結合および溶離ステップになる。Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＭａｇＪＥＴ（商標）ｍＲＮＡ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｋｉｔは、全ＲＮＡ試料からｍＲＮＡを精製するために設計されている。オリゴ（ｄＴ）ビーズは、ポリＡ＋ＲＮＡに特異的に結合する。典型的には、シリカコーティングビーズは全ＲＮＡを抽出し、オリゴ（ｄＴ）ビーズは全ｍＲＮＡを選択的に抽出し、ＲＳＶ特異的ビーズは、ＲＳＶ  Ｎ遺伝子のｍＲＮＡを選択的に抽出する。ビーズの機能性の選択は、概して、標的検出ストラテジーに左右される。Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ａｐｐｌ  Ｍａｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ．２０１５  ７（１１）：６０６２−９および米国特許第７５２７９７９号を参照されたい。
【００３８】
単離核酸を含む溶液は、固相としてシリカを含むカラムに搭載することができる。上澄み液は、重力または遠心分離（スピンカラムの場合）のいずれかにより除去することができる。単離核酸は、次に、水を用いてカラムより溶離することができる。このビーズ精製により、ＳＤＳなどのＲＮアーゼ阻害剤から単離核酸を分離することができる。
【００３９】
ＩＶ．ＤＮアーゼ消化
上記のように、ＲＮＡが所望の物質であれば、プロトコルは核酸が単離されるとすぐにＤＮアーゼ消化という追加ステップを含み得る。ＤＮアーゼ（ＤＮアーゼＩまたはＤＮアーゼＩＩなど）は、ＤＮＡ骨格のホスホジエステ結合の加水切断を触媒してＤＮＡを分解するために使用され得る。本発明で使用される例示的なＤＮアーゼは、ＤＮアーゼＩである。例えば、ＤＮアーゼＩおよびそれと親和性のある緩衝液を、単離されたＤＮＡおよびＲＮＡを含む溶液に加えることができる。結果として生じる混合物は、ＤＮアーゼＩによる酵素ＤＮＡ消化が起こるように、３７℃で５−１０分間インキュベートするとよい。反応を止めるには、該溶液にキレート剤（ＥＤＴＡなど）を加え、該溶液を７０−８０℃で５−１０分間インキュベートするとよい。追加のビーズ精製を行って、分解されたＤＮＡ断片と比較してシリカ表面に対しより高い親和性を有するＲＮＡ分子を単離することができる。
【００４０】
本発明の実施形態
この節では、本発明のある実施形態の特徴の概略を述べるが、これらに限定されることはない。他の特徴および実施形態は、本開示の他で提供される。
【００４１】
本発明は、核酸（デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）など）をワックス包埋生物学的試料（ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）生物学的試料など）から抽出するための方法およびキットを含む。本発明の方法およびキットは、ヘキサデカンなどのアルカンを使用して、ワックス（パラフィンなど）を可溶化することができる。ヘキサデカンはパラフィンを容易に溶解し、キシレンよりも遥かに毒性が低く、１回または複数回のエタノール洗浄できれいに除去することが可能であり、これにより核酸抽出収率が改善される。
【００４２】
本発明の方法で使用される溶解緩衝液は、所望の核酸がＲＮＡのみまたはＤＮＡとＲＮＡの両方であれば、ＲＮアーゼ阻害剤を含み得る。溶解緩衝液は、界面活性剤（ＮＰ−４０など）およびプロテアーゼ（プロテイナーゼＫなど）も含み得る。本方法およびキットは、高収率かつ低分解の抽出核酸を提供し、該核酸を、限定するわけではないが、核酸配列決定および遺伝子発現解析（ＰＣＲなどによる）などの後続の解析に適したものにする。ある実施形態では、本方法およびキットを用いて抽出された核酸は、予め増幅することを必要とせず、直後の解析：例えば、ゲノム配列決定にかけるのに適している。
【００４３】
一態様において、本発明は、（ａ）生物学的試料をワックス可溶化剤と接触させて混合物を形成し；（ｂ）混合物にアルコールを加え；（ｃ）ワックス可溶化剤に可溶化されたワックスとアルコールを混合物から除去し；（ｄ）生物学的試料をＮＰ−４０を含む溶解緩衝液と接触させて溶解液を形成し；（ｅ）ビーズを用いて核酸を溶解液から単離することにより、ワックス包埋生物学的試料から核酸を抽出する方法を提供する。
【００４４】
別の態様では、本発明は、（ａ）生物学的試料をワックス可溶化剤と接触させて混合物を形成し；（ｂ）混合物にアルコールを加え；（ｃ）ワックス可溶化剤に可溶化されたワックスとアルコールを混合物から除去し；（ｄ）生物学的試料を、０．２５％〜１％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む溶解緩衝液と接触させて溶解液を形成し；（ｅ）ビーズを用いて核酸を溶解液から単離することにより、ワックス包埋生物学試料から核酸を抽出する方法を提供する。
【００４５】
別の態様では、本発明は、（ａ）生物学的試料をワックス可溶化剤と接触させて混合物を形成し；（ｂ）混合物にアルコールを加え；（ｃ）ワックス可溶化剤に可溶化されたワックスとアルコールを混合物から除去し；（ｄ）生物学的試料を、ＮＰ−４０およびドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む溶解緩衝液と接触させて溶解液を形成し；（ｅ）ビーズを用いて核酸を溶解液から単離することにより、ワックス包埋生物学試料から核酸を抽出する方法を提供する。
【００４６】
本発明の上記３つの態様の一部の実施形態では、ステップ（ａ）の混合物は、ステップ（ｂ）の前に５５℃で１〜５分間インキュベートされる。一部の実施形態では、ワックス可溶化剤は、ステップ（ａ）の後およびステップ（ｂ）の前に除去される。一部の実施形態では、ワックス可溶化剤とアルコールはワックス包埋生物学的試料に同時に加えられる。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）の後、生物学的試料をステップ（ｄ）の前に乾燥させる。
【００４７】
本発明の上記３つの態様の一部の実施形態では、核酸がリボ核酸（ＲＮＡ）である場合、本方法はさらに、ステップ（ｅ）で単離された核酸をＤＮアーゼと接触させることにより、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を除去するステップ（ｆ）を含む。特定の実施形態では、ＤＮアーゼはＤＮアーゼＩである。一部の実施形態では、本方法はさらに、磁性ビーズを用いてＲＮＡを単離するステップ（ｇ）を含む。
【００４８】
本発明の上記３つの態様の一部の実施形態では、溶解緩衝液はプロテアーゼを含む。特定の実施形態では、プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、およびアスパラギンペプチドリアーゼからなる群より選択される。特定の実施形態では、プロテアーゼはセリンプロテアーゼ（プロテイナーゼＫなど）である。
【００４９】
本発明の上記３つの態様の一部の実施形態では、溶解緩衝液は少なくとも１つの界面活性剤を含む。特定の実施形態では、界面活性剤は、ＮＰ４０、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４、Ｔｗｅｅｎ２０（ポリソルベート２０）、Ｔｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ６０、およびＴｗｅｅｎ８０からなる群より選択される。一部の実施形態では、溶解緩衝液はＲＮアーゼ阻害剤（ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）など）を含む。一部の実施形態では、溶解緩衝液はＲＮアーゼを含む。
【００５０】
別の態様では、本発明は、（ａ）生物学的試料をワックス可溶化剤と接触させて混合物を形成し；（ｂ）混合物にアルコールを加え；（ｃ）ワックス可溶化剤に可溶化されたワックスとアルコールを混合物から除去し；（ｄ）生物学的試料を、溶解緩衝液と接触させて溶解液を形成し；（ｅ）ビーズを用いて核酸を溶解液から単離することにより、ワックス包埋生物学試料からデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を抽出する方法を提供するが、ここにおいて溶解緩衝液はＳＤＳを全く含まない。
【００５１】
本発明の上記態様のいずれかの一部の実施形態では、本方法で用いられるビーズは磁性ビーズである。一部の実施形態では、ワックス可溶化剤は、Ｃ１０−Ｃ２０直鎖状アルカン（Ｃ１３−Ｃ１７直鎖状アルカンなど）などの直鎖状アルカンである。特定の実施形態では、直鎖状アルカンはヘキサデカンである。
【００５２】
本発明の上記態様のいずれかの一部の実施形態では、ワックス包埋生物学的試料は、パラフィン包埋生物学的試料（ホルマリン固定パラフィン固定（ＦＦＰＥ）生物学的試料など）である。一部の実施形態では、生物学的試料は、ヒト組織試料である。
【００５３】
別の態様では、本発明は、（ａ）ＦＦＰＥ生物学的試料をヘキサデカンと接触させて混合物を形成し、ＦＦＰＥ生物学的試料中のパラフィンをヘキサデカンで可溶化し；（ｂ）混合物を遠心分離して、ヘキサデカンおよび可溶化パラフィンを含む上澄み液と、生物学的試料を含むペレットとを形成し；（ｃ）上澄み液を取り出し、廃棄し；（ｄ）エタノールをペレットに加え；（ｅ）エタノールをペレットから除去し；（ｆ）ペレットを乾燥させ；（ｇ）ペレットを溶解緩衝液と接触させて溶解液を形成し；（ｈ）ビーズを用いて核酸を溶解液から単離することによりホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）生物学的試料から核酸を抽出する方法も取り上げるが、ここにおいて溶解緩衝液は、ＮＰ−４０、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、およびプロテイナーゼＫを含む。
【００５４】
この態様の一部の実施形態では、核酸がリボ核酸（ＲＮＡ）である場合、本方法はさらに、ステップ（ｈ）で単離した核酸をＤＮアーゼ（ＤＮアーゼＩなど）と接触させることによりデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を除去するステップ（ｉ）を含む。特定の実施形態では、本方法はさらに、ビーズ（磁性ビーズなど）を用いてＲＮＡを単離するステップ（ｊ）を含む。
【００５５】
さらに別の態様では、本発明は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）生物学的試料から核酸を抽出するキットも取り上げる。該キットは、（ａ）ＦＦＰＥ生物学的試料から核酸を抽出するための指示書；（ｂ）ヘキサデカン；（ｃ）エタノール；（ｄ）プロテイナーゼＫとＮＰ−４０を含む溶解緩衝液；および（ｅ）ビーズを含む。一部の実施形態では、キットの溶解緩衝液は、ＲＮアーゼ阻害剤（ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）など）を含む。一部の実施形態では、キットの溶解緩衝液は、さらに、（ｆ）ＤＮアーゼ（ＤＮアーゼＩなど）を含む。
【００５６】
定義
本開示の文脈において、用語「ワックス包埋生物学的試料」は、ワックスに埋め込まれまたは包埋され、後続の組織化学的、化学的、または生物学的解析のために保存された、対象（ヒトなど）から単離された臓器、組織（がん組織の切片、ブロック、もしくはスライドなど）、もしくは細胞の、１つもしくは複数の画分もしくはスライス、または不死化細胞株を指す。パラフィンは、斯かる目的のために使用することができるワックスの例である。ワックスは、その特性および生物学的試料の安定性を高めるために保存料も含み得る。生物学的試料は、ホルムアルデヒドを用いて固定してから、ワックスに埋め込めばよい。
【００５７】
用語「ワックス可溶化剤」は、ワックス包埋生物学的試料からワックス（パラフィンなど）を可溶化し、除去するために用いられる有機溶媒を指す。ワックス可溶化剤は、ワックスを可溶化することが可能な直鎖状、分岐状、および／または環状のアルカンを含む溶媒であり得る。ワックス可溶化剤は、直鎖状アルカン、例えば、ヘキサデカンなどのＣ１０−Ｃ２０直鎖状アルカン（例えば、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、またはＣ２０直鎖状アルカン；Ｃ１１−Ｃ１９、Ｃ１２−Ｃ１８、Ｃ１３−Ｃ１７、またはＣ１４−Ｃ１６直鎖状アルカン）などであり得る。
【００５８】
用語「脱パラフィンする」または「脱パラフィン化」は、例えば、ヘキサデカンなどのワックス可溶化剤中のパラフィンを可溶化することにより、ＦＦＰＥ生物学的試料からパラフィンを除去するプロセスを指す。
【００５９】
用語「溶解緩衝液」は、生物学的試料中の細胞を壊し開けまたは溶解して、核酸を分解、断片化、または修飾することなく溶液に放出するために使用される水性緩衝液を指す。溶解緩衝液は、しばしば、界面活性剤とプロテアーゼを含む。ＤＮＡとＲＮＡの両方またはＲＮＡのみが抽出核酸として所望される場合、溶解緩衝液は、ＲＮＡ分解を防止するように機能する、ＲＮアーゼ阻害剤（ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む溶液など）をさらに含み得る。
【００６０】
溶解緩衝液はまた、緩衝剤、キレート剤、または他の塩類も含み得る。本発明で使用される溶解緩衝液は、０．１％ＳＤＳ〜１．５％ＳＤＳ（例えば、０．１％〜１．２％、０．１％〜１．０％、０．１％〜０．８％、０．１％〜０．６％、０．１％〜０．４％、０．１％〜０．２％、０．２％〜１．５％、０．４％〜１．５％、０．６％〜１．５％、０．８％〜１．５％、１．０％〜１．５％、１．２％〜１．５％、または１．４％〜１．５％ＳＤＳ）を含み得る。溶解緩衝液は、０．１２５％ＳＤＳ〜１％ＳＤＳ（例えば、０．１２５％ＳＤＳ超および１％ＳＤＳ以下）を含み得る。溶解緩衝液は、０．１％〜１．５％、０．２％〜１．２％、０．２％〜１％、０．２５％〜１％、０．２％〜０．９％、０．２％〜０．８％、０．２５％〜０．７％、０．２％〜０．６％、０．２５％〜０．５％、０．３％〜０．５％、または約０．４％のＳＤＳを含み得る。溶解緩衝液の成分は、溶解液を形成するために、混合して提供されても、試料に別々に加えられてもよい。
【００６１】
用語「界面活性剤」は、細胞膜を破壊し、細胞溶解中に膜タンパク質および脂質を可溶化する、溶解緩衝液中の化学物質を指す。界面活性剤は両親媒性分子で、脂肪族または芳香族の性質をもつ非極性尾部基と極性頭部基の両方を含む。溶解緩衝液中の界面活性剤は、非イオン性、アニオン性、カチオン性、双性イオン性、またはそれらの混合であり得る。
【００６２】
用語「ＲＮアーゼ阻害剤」または「ＲＮＡエンハンサー」は、ＲＮアーゼによるＲＮＡ分解を阻害するために使用される低分子化合物を指す。ＲＮアーゼ阻害剤またはＲＮＡエンハンサーは、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方またはＲＮＡのみが所望される場合の溶解緩衝液の成分である。ＲＮアーゼ阻害剤またはＲＮＡエンハンサーは、ＳＤＳを含む溶液であってもよい。ＤＮＡおよびＲＮＡの両方またはＲＮＡのみが所望される場合、溶解緩衝液は、０．１２５％ＳＤＳ超および１％ＳＤＳ以下を含み得る。溶解緩衝液は、０．１％〜１．５％、０．２％〜１．２％、０．２５％〜１％、０．２％〜０．８％、０．２％〜０．６％、０．２５％〜０．７％、０．２５％〜０．５％、０．３％〜０．５％、または約０．４％のＳＤＳを含み得る。
【００６３】
用語「〜」は、示された範囲内の任意の量を指し、示された範囲の各末端を包含する。例えば、０．２５％〜０．５％のＳＤＳは、０．２５％から０．５％の任意の量、ならびに０．２５％ＳＤＳおよび０．５％ＳＤＳを指す。
【００６４】
用語「約」は、特定の値の±１０％の値の範囲を指す。例えば、「約５５℃」は、５５℃の±１０％、つまり４９．５℃から６０．５℃を含む。斯かる範囲が所望の機能を実行するか、または所望の結果を達成する。例えば、「約」は、記載された値の１０％未満内、５％未満内、１％未満内、０．１％未満内、および０．０１％未満内の量を指し得る。
【００６５】
単独で、または前記技術と組み合わせて使用することが可能な他の発明品、方法、および特徴については、以下の説明及び例によって証明する。
【実施例】
【００６６】
本発明を、具体例によってより詳細に記載する。以下の実施例は例示的な目的のために提供するもので、いかなる方法であれ、本発明の実施を制限することを意図したものではない。当業者は、本質的に同じ結果をもたらすように変更または修正することが可能な種々の重要ではないパラメータを容易に認識しよう。
【００６７】
実施例１Ａ：ＦＦＰＥ生物学的試料から（１）ＤＮＡおよびＲＮＡならびに（２）ＤＮＡのみを抽出するためのプロトコル（図１Ａ）
ＤＮＡ／ＲＮＡの抽出
１．１．５ｍＬチューブにＦＦＰＥ試料を加える：
・ＦＦＰＥスライドを使用する場合：ＦＦＰＥ試料をスライドガラスからメスまたはブレードを用いて１．５ｍＬチューブに慎重に移す。
・ＦＦＰＥカールを使用する場合：１〜４つのＦＦＰＥ切片を１本の１．５ｍＬチューブに移す。
２．ＦＦＰＥ試料を含む１．５ｍＬチューブそれぞれにヘキサデカンを１ｍＬ加え、最高速度で１０秒間ボルテックスする。
・チューブに未溶解のパラフィンがまだ残っている場合は、５５℃で３分間インキュベートして、パラフィンを完全に溶かす。
３．１５０００ｘｇで室温で２分間遠心分離する。
４．ピペッティングにより上澄み液を除去する。ペレットは除去しない。
５．各チューブに１００％エタノールを１ｍＬ加え、最高速度で１０秒間ボルテックスすることにより混ぜる。１５０００ｘｇで室温で２分間遠心分離する。
６．ピペッティングにより上澄み液を除去する。ペレットは除去しない。
７．ペレットを室温で１０分間風乾する。
８．ＤＮＡとＲＮＡを単離する：
【００６８】
【表１】
2020531001.tif 000003
【００６９】
９．中速で数秒間ボルテックスすることにより混ぜる。次に、チューブを短時間遠心分離する。
１０．チューブを５５℃で一晩（約１６時間）インキュベートする。
１１．チューブを９０℃で１０分間インキュベートする。
１２．１５０００ｘｇで室温で２分間遠心分離する。上澄み液１００μＬをビーズ除去用の新しいチューブに移す。ペレットを廃棄する。
【００７０】
ビーズ除去の実施
１．ビーズのボトルを最高速度で２０秒間ボルテックスすることにより磁性ビーズを再懸濁させる。
２．既存の１．５ｍＬチューブにおいて、ビーズと、２０％ＰＥＧおよび２．５ＭのＮａＣｌを含む精製緩衝液とを、以下に示す体積を用いて上記のステップ１１で生じた上澄み液に加える：
【００７１】
【表２】
2020531001.tif 000004
【００７２】
３．上下にピペッティングし、次に最高速度で１５秒間ボルテックスすることによりよく混ぜる。チューブを短時間遠心分離する。
４．室温で１０分間インキュベートする。
５．チューブを磁性セパレータに２分間置く。
６．チューブをセパレータに置いたまま、ピペッティングにより上澄み液を取り除き、廃棄する。
７．チューブをセパレータに置いたまま、８０％エタノールを４００μＬずつ各チューブに加えてビーズを洗浄し、１分間インキュベートする。エチルアルコールを取り除き、廃棄する。
８．４００μＬの８０％エタノールを用いてステップ７を２回繰り返す。
９．残ったエチルアルコールを取り除いた後、チューブをラックに置く。ビーズを３７℃で１分間乾燥（または１０分間風乾）させる。
１０．各チューブにトリス−ＥＤＴＡを１５μＬ加える。上下にピペッティングし、ボルテックスすることによりよく混ぜる。チューブを短時間遠心分離する。
１１．チューブを室温で２分間インキュベートする。
１２．チューブを磁性セパレータに２分間置く。
１３．溶出液を新しい１．５ｍＬチューブに移す。
【００７３】
実施例１Ｂ：ＦＦＰＥ生物学的試料からＲＮＡのみを抽出するためのプロトコル（図１Ｂ）
ＲＮＡの抽出
１．ＦＦＰＥ試料を１．５ｍＬチューブに加える：
・ＦＦＰＥスライドを使用する場合：ＦＦＰＥ試料をスライドガラスからメスまたはブレードを用いて１．５ｍＬチューブに慎重に移す。
・ＦＦＰＥカールを使用する場合：１〜４つのＦＦＰＥ切片を１本の１．５ｍＬチューブに移す。
２．ＦＦＰＥ試料を含む１．５ｍＬチューブそれぞれにヘキサデカンを１ｍＬ加え、最高速度で１０秒間ボルテックスする。
・チューブに未溶解のパラフィンが残っている場合は、５５℃で３分間インキュベートして、パラフィンを完全に溶かす。
３．１５０００ｘｇで室温で２分間遠心分離する。
４．ピペッティングにより上澄み液を除去する。ペレットは除去しない。
５．各チューブに１００％エタノールを１ｍＬ加え、最高速度で１０秒間ボルテックスすることにより混ぜる。１５０００ｘｇで室温で２分間遠心分離する。
６．ピペッティングにより上澄み液を除去する。ペレットは除去しない。
７．ペレットを室温で１０分間、または残留エタノールがすべて蒸発するまで風乾する。
８．核酸を単離する：
【００７４】
【表３】
2020531001.tif 000005
【００７５】
中速で数秒間ボルテックスすることにより混ぜる。チューブを短時間、低速で遠心分離する。
９．チューブを５５℃で１時間インキュベートする。
１０．チューブを９０℃で１０分間インキュベートする。
１１．１５０００ｘｇで室温で２分間遠心分離する。上澄み液１００μＬをビーズ除去の用の新しいチューブに移す。ペレットを廃棄する。
【００７６】
ビーズ除去の実施
１．ビーズのボトルを最高速度で２０秒間ボルテックスすることにより磁性ビーズを再懸濁させる。
２．既存の１．５ｍＬチューブにおいて、ビーズと、２０％ＰＥＧおよび２．５ＭのＮａＣｌを含む精製緩衝液とを、以下に示す体積を用いて上記のステップ１１で生じた上澄み液に加える：
【００７７】
【表４】
2020531001.tif 000006
【００７８】
３．上下にピペッティングし、次に最高速度で１０秒間ボルテックスすることによりよく混ぜる。チューブを短時間、低速で遠心分離する。
４．室温で１０分間インキュベートする。
５．チューブを磁性セパレータに２分間置く。
６．ビーズを乱さず、チューブを磁性セパレータに置いたまま、ピペットを用いて上澄み液を取り除き、廃棄する。
７．８０％エタノールでビーズを洗浄する：
ａ．チューブをセパレータ上で保持し、各チューブに８０％エタノールを４００μＬ加えてビーズを洗浄する。
ｂ．チューブを室温で１分間インキュベートする。
ｃ．ビーズを乱さずに、チューブを磁性セパレータに置いたまま、エタノールを取り除き、廃棄する。
ｄ．ステップａ〜ｃを２回繰り返す。
８．残留エタノールを除去する。チューブをラックに移し、ビーズを３７℃で１分間乾燥（または室温で１０分間風乾）する。
９．溶出液を調製する：
ａ．各チューブにトリス−ＥＤＴＡを１７μＬ加える。上下にピペッティングし、ボルテックスすることによりよく混ぜる。チューブを短時間、低速で遠心分離する。
ｂ．チューブを室温で２分間インキュベートする。
ｃ．チューブを磁性セパレータに２分間置く。
１０．ビーズを乱さずに、チューブを磁性セパレータに置いたまま、溶出液をＤＮアーゼＩ消化用の新しい１．５ｍＬチューブに移す。
【００７９】
ＤＮアーゼＩ消化の実施
１．溶出液に１０ＸＤＮアーゼ反応緩衝液２μＬとＤＮアーゼＩ１μＬを加える。
２．チューブを３７℃で１０分間インキュベートする。
３．各チューブに５０ｍＭのＥＤＴＡを２μＬ加える。ボルテックスし、短時間遠心分離し、７５℃で１０分間インキュベートする。
４．チューブをラックに移し、室温まで冷却する。
５．磁性ビーズ２２μＬと、２０％ＰＥＧおよび２．５ＭのＮａＣｌを含む精製緩衝液９μＬとを加える。
６．上下にピペッティングし、次に最高速度で１０秒間ボルテックスすることによりよく混ぜる。チューブを低速で短時間遠心分離する。
７．室温で１０分間インキュベートする。
８．チューブを磁性セパレータに２分間置く。
９．ビーズを乱さず、チューブを磁性セパレータに置いたまま、ピペットを用いて上澄み液を取り除き、廃棄する。
１０．８０％エタノールでビーズを洗浄する：
ａ．チューブをセパレータに置いたまま、各チューブに８０％エタノールを１００μＬ加えてビーズを洗浄する。
ｂ．チューブを室温で１分間インキュベートする。
ｃ．ビーズを乱さずに、チューブを磁性セパレータに置いたまま、エタノールを取り除き、廃棄する。
ｄ．ステップａ〜ｃを２回繰り返す。
１１．残留エタノールを除去する。チューブをラックに移し、ビーズを３７℃で１分間乾燥（または室温で１０分間風乾）する。
ａ．各チューブにトリス−ＥＤＴＡを２０μＬ加える。上下にピペッティングし、ボルテックスすることによりよく混ぜる。チューブを低速で短時間遠心分離する。
ｂ．チューブを室温で２分間インキュベートする。
ｃ．チューブを磁性セパレータに２分間置く。
１２．ビーズを乱さず、チューブを磁性セパレータに置いたまま、溶出液を新しい１．５ｍＬチューブに移す。
１３．ＲＮＡ試料は、抽出直後に定量し、適格性を確認してもよいし、長期保存用に−８０℃で保存してもよい。
【００８０】
実施例２：ＮＰ−４０およびＳＤＳ濃度がＤＮＡ収率に及ぼす影響
プロテイナーゼＫのみを含む、またはＳＤＳもしくはＮＰー４０のいずれかと組み合わせて含む溶解緩衝液を用いて、核酸をＦＦＰＥ試料から抽出した。核酸抽出の他の点は、実施例１Ａおよび１Ｂに記載されたワークフローと同様だった。全ＤＮＡ数をｑＰＣＲ（３つ組）により定量し、逆算してナノグラム単位のｓｓＤＮＡ総量を求めた（図２）。
【００８１】
市販のキットおよび方法で得られたＤＮＡ収率と比べ優れたＤＮＡ収率が得られた（２倍の増加）（市販のキット＃１および＃３は、以下の例に記載する後続の比較でも使用した）。プロテイナーゼＫ溶解緩衝液にＮＰ−４０を添加することによりＤＮＡ収率は高まり、濃度０．０５％のＮＰー４０が最大ＤＮＡ収率をもたらすことが示された。
【００８２】
実施例３：ＳＤＳ濃度がＲＮＡ収率に及ぼす影響
肺がん組織切片からのＦＦＰＥ試料を、実施例１Ａおよび１Ｂに記載したものと同様の方法を用いて調製した。ＳＤＳを異なる濃度で、プロテイナーゼＫおよび０．０５％ＮＰ−４０を含む溶解緩衝液に加えた。ＲＮＡから得られたｃＤＮＡのデジタルＰＣＲによって測定したところ、０．２５％〜１％のＳＤＳ濃度がＲＮＡ収率を最大化することが分かった（図３Ａ）。溶解緩衝液における前記量のＮＰ４０は、実施例２で示されるように、完全な溶解（核の溶解を含む）を可能にして高いＤＮＡ収率をもたらすことが予め示されていることから、ＳＤＳによるＲＮＡ収率の向上は、ＳＤＳのＲＮアーゼ阻害剤としての機能に起因する。溶解緩衝液で使用した前記割合のＳＤＳは、ビーズを用いて抽出されるＲＮＡの量にもｑＰＣＲによる下流分析にも悪影響を及ぼさないことが分かった（図３Ｂ）。従って、ＳＤＳは、悪影響なく、ビーズ洗浄ステップ時に存在し得る。
【００８３】
実施例４−７は、実施例１Ａおよび１Ｂに記載されたのと同様の方法で本発明のキットを用いて得られたＲＮＡの質を、３つの市販キットを用いて（市販キットに規定された方法に従って）得られたＲＮＡと比較して評価するものである。市販キット＃１はＱＩＡＧＥＮのＡｌｌＰｒｅｐ（商標）キットであり、市販キット＃２はＱＩＡＧＥＮのｍｉＲＮｅａｓｙ（商標）キットであり、市販キット＃３はＴｈｅｍｏ  ＦｉｓｈｅｒのＲｅｃｏｖｅｒａｌｌ（商標）キットである。
【００８４】
実施例４：異なるキットを用いたＲＮＡの質の比較
実施例１Ｂに記載したワークフローおよび３つの市販キットのワークフローを用いて、同じブロックに由来するＦＦＰＥ肺がんカールからＲＮＡを得た。ノーザンブロットを実施して、本発明のキットを用いて抽出したＲＮＡの質を、市販の３つの抽出キットと比較した（図４）。本キットを用いて抽出したＲＮＡは、商業的に利用可能な３つのキットを用いて抽出したＲＮＡよりも、平均断片長が長く、断片化が少ないことが示された。具体的には、ＤＶ２００値（２００ヌクレオチド超のＲＮＡの割合）は約４５％以上であり、これは、商業的に利用可能なキットより少なくとも１０％高かった。
【００８５】
実施例５：異なるキットを用いたｑＰＣＲによる標的検出の比較
実施例４に記載したようにＲＮＡを得て、抽出したＲＮＡ１μＬを逆転写に用いてｃＤＮＡを作製した。定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により標的を検出した。図５Ａは、本発明のキットで抽出したＲＮＡを用いた場合は、３つの市販キットと比較して、特定の標的を検出するためのＣｔがより低いことを示すｑＰＣＲ曲線である。図５Ｂは、本キットを用いてｑＰＣＲにより検出された標的数（検出された合計アッセイ）が、３つの市販キットと比較して多いことを示す表である。本キットでは、３つの市販キットと比較して、所定の定量サイクル（例えば、Ｃｑ２０超、例えば２２など）で標的をより高い割合で検出することが可能だった（２０％の相対的増加、または少なくとも１０％の絶対的増加）。
【００８６】
実施例６：異なるキットを用いて抽出したＲＮＡから生成したＲＮＡライブラリの比較
本発明のキットおよび３つの市販の抽出キット（ＱＩＡＧＥＮのｍｉＲＮｅａｓｙおよびＡｌｌＰｒｅｐキット、ならびにＴｈｅｒｍｏ  ＦｉｓｈｅｒのＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌ（商標）キット）の各々を用いて抽出した５０ｎｇのＲＮＡを用いて、ＴｒｕＳｅｑ  ＲＮＡ  Ａｃｃｅｓｓ（商標）ＫｉｔによりＲＮＡ配列決定ライブラリ（配列決定に適合させたｃＤＮＡ配列）を生成した。
【００８７】
図６に示すように、アジレント２１００Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（商標）を用いて得られたエレクトロフェログラムは、ライブラリの収率とサイズ分布を比較するものである。本キットを用いて抽出したＲＮＡは、同じＲＮＡインプットを与えた場合、より高いライブラリ収率をもたらし、本キットは、商業的に利用可能なキットを用いて抽出したＲＮＡよりも良質な（断片化の少ない）ＲＮＡ抽出を実現することが示された。このように、本キットは、商業的に利用可能なキットを用いて抽出したＲＮＡと比較して、より良質で、ＲＮＡ配列決定により適した抽出ＲＮＡを提供した。本キットは、商業的に利用可能なキットと比較して、ＲＮＡ配列決定ライブラリのより高い収率を実現した（例えば、同量のＲＮＡインプットを与えた場合、少なくとも５０％の相対的増加）。
【００８８】
実施例７：異なるキットを用いて抽出したＲＮＡから生成したＲＮＡライブラリの比較
本発明のキットおよび市販キットで抽出したＲＮＡからＲＮＡ配列決定ライブラリを得た。図７Ａに示すように、本キットを用いて抽出したＲＮＡでは（市販キットと比較して）、４つの試料にわたって、１試料あたりの検出される遺伝子の数のばらつきを抑えながらより多くの遺伝子をＲＮＡ配列決定により検出することができた。
【００８９】
図７Ｂに示すように、本キットを用いて抽出したＲＮＡでは（３つの市販キットと比較して）、より多くの遺伝子をＲＮＡ配列決定により検出することができた（少なくとも１００個多い遺伝子が検出された）。
【００９０】
本キットでは、市販キットと比較して、試料で検出される遺伝子数の標準偏差を半分以下にできた。さらに、３つの市販キットと比較して、本キットから得たＲＮＡを用いて少なくとも１００個多い遺伝子が検出された。
【００９１】
実施例８：核酸のより良好な回収のための質管理
本開示で提供する技術は、商業流通用試薬キットとして使用するために開発したものである。以下の例では、本キットとＱｉａｇｅｎ社製の商業的に利用可能なキット（Ｑｉａｇｅｎ（商標）ｍｉＲＮｅａｓｙキット）の両方を用いて、多数のパラフィン（ＦＦＰＥ）包埋試料から核酸を抽出した。種々の試料からそれぞれのキットにより抽出した核酸について、総ＲＮＡ収率とＲＮＡの質を求めた。
【００９２】
さらに、抽出核酸から特定された別個のＲＮＡ種の数を、Ａｄｖａｎｔａ（商標）ＩＯ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｐａｎｅｌ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  Ｃｏｒｐ．，カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）を用いて評価した。このパネルには、９１個のがん免疫療法遺伝子および５つの基準遺伝子のパネル用ＰＣＲアッセイが含まれ、ｑＰＣＲを用いた細胞プロファイリングおよびバイオマーカーの特定が可能である。本例で使用したパラフィン包埋試料は、以下をソースとした。
【００９３】
【表５】
2020531001.tif 000007
【００９４】
キットの質の基準は以下の通りとした：
１）標準サンプル（ＨＤ７８３基準物質、Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社、英国）の総収率について：ナノドロップ解析により総ＲＮＡ濃度を測定する。目標：≧５ｎｇ／μＬ
２）ＤＶ２００（回収されたＲＮＡ断片のうち、長さが２００ヌクレオチド以上のものの割合）について：ＲＮＡ塩基配列決定ＱＣによりＲＮＡ断片サイズを測定する。目標：できるだけ高い
３）ＲＮＡ種の数について：２２（必要）または２８（許容）未満のＣｑ値でＦｌｕｉｄｉｇｍ  Ａｄｖａｎｔａ（商標）  Ｉｍｍｕｎｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｐａｎｅｌにより検出された標的ＲＮＡを求める
【００９５】
図８Ａおよび８Ｂは、基準（１）に照らしたＦｌｕｉｄｉｇｍ（登録商標）試薬キットの結果、つまり総収率を示す。ＨＤ７８３対照試料では、収率は３０〜６０ｎｇ／μＬであった。
【００９６】
図８Ｃおよび８Ｄは、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ（登録商標）試薬キットから得られた結果（横軸）を、Ｑｉａｇｅｎのキット（縦軸）と比較したものである。結果は、基準（２）、つまり長さが２００塩基対超の断片割合（ＤＶ２００）に従ってスコア化してある。各点は、両キットで試験した別個のＦＦＰＥ試料を表す（外れ値除去に応じて２または３反復の平均、ＷＳＲ  ｐ値は平均値に依存しない）。Ｆｌｕｉｄｉｇｍキットを用いたＲＮＡ抽出では、Ｑｉａｇｅｎ（商標）  ｍｉＲＮｅａｓｙキットを用いた抽出と比較して、より大きいＲＮＡ断片の割合が高いという結果が、両解析法により示された（ｐ＜０．０５）。
【００９７】
図８Ｅおよび８Ｆは、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ（登録商標）試薬キット（横軸）とＱｉａｇｅｎのキット（縦軸）を、基準（３）、つまり検出された標的数に照らして比較したときに得られたデータを示す。各点は独立したＦＦＰＥ試料抽出比較を表す（３反復の平均、４０＋４１比較）。Ｆｌｕｉｄｉｇｍキットを用いたＲＮＡ抽出では、Ｑｉａｇｅｎ（商標）ｍｉＲＮｅａｓｙキットを用いて抽出されたものと比較して、Ａｄｖａｎｔａ（商標）ＩＯ遺伝子発現パネルからより多くの標的が検出された（ｐ＜０．０５）。
【００９８】
図９Ａは、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ（登録商標）試薬キットを用いて得られた収率（基準（１））とＱｉａｇｅｎのキットを用いて得られた収率を比較したものである。結果は、Ｑｉａｇｅｎのキットを用いた抽出では、Ｑｕｂｉｔ（商標）蛍光計（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で測定した場合、全体的なＲＮＡ収率が高くなることを示す。全体収率はより高いものの、ＱｉａｇｅｎのＲＮＡは、Ａｄｖａｎｔａ（商標）ＩＯパネルでのパフォーマンスがより低く、２００塩基対超の断片の割合もより低い。全体収率はＦＦＰＥ抽出ＲＮＡの最も重要な基準ではない。両キットとも、Ａｄｖａｎｔａ（商標）ＩＯパネルによる解析に十分な物質を生成する。
【００９９】
図９Ｂおよび９Ｃは、ＤＶ２００（基準（２））とＣｑ＜２２で検出された標的数（基準（３））に照らしてＱｉａｇｅｎ社キットと比較した際の、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  ＦＦＰＥ  ＲＮＡ抽出での性能向上を可視化するものである。各点は別個のＦＦＰＥ試料（３反復の平均）を表す。図９Ｂは、オペレータ次第で、ＦｌｕｉｄｉｇｍキットではＤＶ値が６０％〜９５％向上したことを示す。図９Ｃは、Ｆｌｕｉｄｉｇｍキットによって特定される標的の数が約４５％向上し、これはオペレータとは無関係であったことを示す。
【０１００】
このように、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ（登録商標）試験キットは、３つの基準すべてに照らして、品質管理解析に合格した。基準（２）および（３）によって評価した場合は、研究および／または臨床診断のための発現解析を実質的に向上させるほどの良い結果が得られた。
【０１０１】
前記発明について、明瞭さおよび理解を目的としてある程度詳細に記載したが、関連技術に熟練した者は、いったんこの開示に精通してしまえば、特許請求範囲における本発明の真の範囲を逸脱することなく、形式および細部の種々の変形を行うことができることを理解するであろう。従って、本発明は、上記の方法または構造の、厳密な構成要素または細部に限定されるものではない。プロセス自体に必要な範囲または固有の範囲を除き、図面を含む本開示に記載した方法またはプロセスのステップまたは段階に対し、特定の順序が意図および暗示されることはない。多くの場合、プロセスのステップの順序は、記載した方法の目的、効果、または趣旨を変更することなく変更することができる。
【０１０２】
本開示で引用される全ての刊行物および特許文献は、斯かる刊行物または文献の各々が、参照によって本明細書に組み込まれることが具体的かつ個別に示されているかのように、参照によって本明細書に組み込まれる。刊行物および特許文献（特許、公開特許出願、および未公開特許出願）を引用することは、斯かる文献のいずれについても関連先行技術であることを認めることを意図するものではなく、その内容または日付について何らかの承認をするものでもない。
【図１】
2020531001.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
2020531001.tif 000016
【図８−３】
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【図９−１】
2020531001.tif 000018
【図９−２】
2020531001.tif 000019
【国際調査報告】
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2020531001.tif 000021