(57)【要約】本明細書では、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ阻害活性を示す殺虫性タンパク質をコードするヌクレオチド配列、クロヨトウムシ（ＢＣＷ）毒性タンパク質を含有するキメラ及びＢＣＷ毒素殺虫剤、そのキメラまたは殺虫剤を発現する形質転換植物に加え、本明細書においてＢＣＷ  ００１、ＢＣＷ  ００２、ＢＣＷ  ００３と呼ぶ新規殺虫性タンパク質、ならびに、生物試料内におけるヌクレオチド配列または殺虫剤の存在を検出するための方法を開示する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０及び配列番号：１２からなる群から選択される配列のアミノ酸１〜６０７を含むアミノ酸配列を有する殺虫性タンパク質またはその殺虫性フラグメント、
（ｂ）（ａ）の前記アミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を示すポリペプチドフラグメント、
（ｃ）（ａ）の前記アミノ酸配列に対して少なくとも８４％の同一性を示すポリペプチドフラグメント、
（ｄ）（ａ）の前記アミノ酸配列に対して少なくとも６４％の同一性を示すポリペプチドフラグメント、または、
（ｅ）配列番号：２、４、６、８、１０または１２のいずれか１つに記載の７位から６０７位までの前記アミノ酸配列を有する殺虫性タンパク質、
をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド構築物であって、
前記ヌクレオチド配列は異種プロモーター配列に機能的に連結する、
前記ポリヌクレオチド構築物。
【請求項２】
（ａ）配列番号：２の２５６位から６０６位までに記載のアミノ酸配列と、
（ｂ）配列番号：４の２５７位から６０７位までに記載のアミノ酸配列と、
（ｃ）配列番号：６の２５７位から６０７位までに記載のアミノ酸配列と、
を含む、
クロヨトウムシＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ種に対する毒性を有するタンパク質。
【請求項３】
前記殺虫性タンパク質は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｅｘｉｇｕａ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｌｉｔｕｒａ、Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔａ、Ｓｔｒｉａｃｏｓｔａ  ａｌｂｉｃｏｓｔａ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ、Ｐｓｅｕｄｏｐｌｕｓｉａ  ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ、Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ  ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ、Ｈｙｐｅｎａ  ｓｃａｂｒａ、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ、Ａｇｒｏｔｉｓ  ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａ、Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ  ｕｎｉｐｕｎｃｔａ、Ａｇｒｏｔｉｓ  ｉｐｓｉｌｏｎ、Ａｇｒｏｔｉｓ  ｏｒｔｈｏｇｏｎｉａ、Ｏｓｔｒｉｎｉａ  ｎｕｂｉｌａｌｉｓ、Ａｍｙｅｌｏｉｓ  ｔｒａｎｓｉｔｅｌｌａ、Ｃｒａｍｂｕｓ  ｃａｌｉｇｉｎｏｓｅｌｌｕｓ、Ｈｅｒｐｅｔｏｇｒａｍｍａ  ｌｉｃａｒｓｉｓａｌｉｓ、Ｈｏｍｏｅｏｓｏｍａ  ｅｌｅｃｔｅｌｌｕｍ、Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ  ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ、Ｃｙｄｉａ  ｐｏｍｏｎｅｌｌａ、Ｅｎｄｏｐｉｚａ  ｖｉｔｅａｎａ、Ｇｒａｐｈｏｌｉｔａ  ｍｏｌｅｓｔａ、Ｓｕｌｅｉｍａ  ｈｅｌｉａｎｔｈａｎａ、Ｐｌｕｔｅｌｌａ  ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ、Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ  ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ、Ｌｙｍａｎｔｒｉａ  ｄｉｓｐａｒ、Ａｌａｂａｍａ  ａｒｇｉｌｌａｃｅａ、Ａｒｃｈｉｐｓ  ａｒｇｙｒｏｓｐｉｌａ、Ａｒｃｈｉｐｓ  ｒｏｓａｎａ、Ｃｈｉｌｏ  ｓｕｐｐｒｅｓｓａｌｉｓ、Ｃｎａｐｈａｌｏｃｒｏｃｉｓ  ｍｅｄｉｎａｌｉｓ、Ｃｒａｍｂｕｓ  ｃａｌｉｇｉｎｏｓｅｌｌｕｓ、Ｃｒａｍｂｕｓ  ｔｅｔｅｒｒｅｌｌｕｓ、Ｄｉａｔｒａｅａ  ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ、Ｄｉａｔｒａｅａ  ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ、Ｅａｒｉａｓ  ｉｎｓｕｌａｎａ、Ｅｇｒｉａｓ  ｖｉｔｔｅｌｌａ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ａｒｍｉｇｅｒａ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ、Ｈｅｒｐｅｔｏｇｒａｍｍａ  ｌｉｃａｒｓｉｓａｌｉｓ、Ｌｏｂｅｓｉａ  ｂｏｔｒａｎａ、Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ  ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ、Ｐｈｙｌｌｏｃｎｉｓｔｉｓ  ｃｉｔｒｅｌｌａ、Ｐｉｅｒｉｓ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ、Ｐｉｅｒｉｓ  ｒａｐａｅ、Ｐｌｕｔｅｌｌａ  ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ、及びＴｕｔａ  ａｂｓｏｌｕｔａからなる群から選択されるＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ種に対する活性を示す、請求項１に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項４】
Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｅｘｉｇｕａ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｌｉｔｕｒａ、Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔａ、Ｓｔｒｉａｃｏｓｔａ  ａｌｂｉｃｏｓｔａ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ、Ｐｓｅｕｄｏｐｌｕｓｉａ  ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ、Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ  ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ、Ｈｙｐｅｎａ  ｓｃａｂｒａ、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ、Ａｇｒｏｔｉｓ  ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａ、Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ  ｕｎｉｐｕｎｃｔａ、Ａｇｒｏｔｉｓ  ｉｐｓｉｌｏｎ、Ａｇｒｏｔｉｓ  ｏｒｔｈｏｇｏｎｉａ、Ｏｓｔｒｉｎｉａ  ｎｕｂｉｌａｌｉｓ、Ａｍｙｅｌｏｉｓ  ｔｒａｎｓｉｔｅｌｌａ、Ｃｒａｍｂｕｓ  ｃａｌｉｇｉｎｏｓｅｌｌｕｓ、Ｈｅｒｐｅｔｏｇｒａｍｍａ  ｌｉｃａｒｓｉｓａｌｉｓ、Ｈｏｍｏｅｏｓｏｍａ  ｅｌｅｃｔｅｌｌｕｍ、Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ  ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ、Ｃｙｄｉａ  ｐｏｍｏｎｅｌｌａ、Ｅｎｄｏｐｉｚａ  ｖｉｔｅａｎａ、Ｇｒａｐｈｏｌｉｔａ  ｍｏｌｅｓｔａ、Ｓｕｌｅｉｍａ  ｈｅｌｉａｎｔｈａｎａ、Ｐｌｕｔｅｌｌａ  ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ、Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ  ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ、Ｌｙｍａｎｔｒｉａ  ｄｉｓｐａｒ、Ａｌａｂａｍａ  ａｒｇｉｌｌａｃｅａ、Ａｒｃｈｉｐｓ  ａｒｇｙｒｏｓｐｉｌａ、Ａｒｃｈｉｐｓ  ｒｏｓａｎａ、Ｃｈｉｌｏ  ｓｕｐｐｒｅｓｓａｌｉｓ、Ｃｎａｐｈａｌｏｃｒｏｃｉｓ  ｍｅｄｉｎａｌｉｓ、Ｃｒａｍｂｕｓ  ｃａｌｉｇｉｎｏｓｅｌｌｕｓ、Ｃｒａｍｂｕｓ  ｔｅｔｅｒｒｅｌｌｕｓ、Ｄｉａｔｒａｅａ  ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ、Ｄｉａｔｒａｅａ  ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ、Ｅａｒｉａｓ  ｉｎｓｕｌａｎａ、Ｅｇｒｉａｓ  ｖｉｔｔｅｌｌａ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ａｒｍｉｇｅｒａ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ、Ｈｅｒｐｅｔｏｇｒａｍｍａ  ｌｉｃａｒｓｉｓａｌｉｓ、Ｌｏｂｅｓｉａ  ｂｏｔｒａｎａ、Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ  ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ、Ｐｈｙｌｌｏｃｎｉｓｔｉｓ  ｃｉｔｒｅｌｌａ、Ｐｉｅｒｉｓ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ、Ｐｉｅｒｉｓ  ｒａｐａｅ、Ｐｌｕｔｅｌｌａ  ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ、及びＴｕｔａ  ａｂｓｏｌｕｔａからなる群から選択されるＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ種に対する生物活性を更に含む、請求項２に記載のタンパク質。
【請求項５】
請求項１に記載のポリヌクレオチド構築物を含むベクター。
【請求項６】
請求項１に記載のポリヌクレオチド構築物を含む宿主細胞であって、前記宿主細胞は、細菌細胞、イースト細胞及び植物細胞からなる群から選択される、前記宿主細胞。
【請求項７】
前記植物細胞は、アルファルファ、バナナ、大麦、インゲン、ブロッコリー、キャベツ、アブラナ属、人参、キャッサバ、トウゴマ、カリフラワー、セロリ、ヒヨコマメ、ハクサイ、柑橘類、ココナッツ、コーヒー、トウモロコシ、クローバー、綿、ウリ科、キュウリ、ダグラスモミ、ナス、ユーカリ、亜麻、ニンニク、ブドウ、ホップ、リーキ、レタス、テーダマツ、キビ、メロン、ナッツ、オート麦、オリーブ、タマネギ、観賞植物、ヤシ、牧草、エンドウ、ピーナッツ、コショウ、キマメ、マツ、ジャガイモ、ポプラ、カボチャ、ラジアータマツ、ダイコン、菜種、イネ、根茎、ライ麦、ベニバナ、低木、モロコシ、ダイオウマツ、ダイズ、ホウレンソウ、トウナス、イチゴ、サトウダイコン、サトウキビ、ヒマワリ、スイートコーン、モミジバフウ、サツマイモ、スイッチグラス、茶、タバコ、トマト、ライ小麦、芝草、スイカ及び小麦の植物細胞からなる群から選択される、請求項６に記載の宿主細胞。
【請求項８】
請求項１に記載のポリヌクレオチド構築物を含む植物。
【請求項９】
請求項８に記載の植物が生成する種子であって、前記種子は検出可能量の前記ポリヌクレオチド構築物を含む、前記種子。
【請求項１０】
前記植物が生成する種子、花粉、子孫、植物細胞、植物組織及び日用品は、検出可能量の前記ポリヌクレオチド構築物を含む、請求項８に記載の植物。
【請求項１１】
検出可能量の請求項１に記載のポリヌクレオチド構築物を含む生物試料。
【請求項１２】
Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ害虫種を防除するための殺虫剤として有効な量の請求項２に記載のタンパク質と、
（ａ）前記タンパク質とは異なり前記同一のＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ種に対する毒性を同様に有する薬剤であって、前記薬剤は、前記タンパク質とは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチド、ＲＮＡ分子及び化合物からなる群から選択される、前記薬剤、または、
（ｂ）Ｃｒｙ１Ａ、Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ａｃ、Ｃｒｙ１Ａ．１０５、Ｃｒｙ１Ａｅ、Ｃｒｙ１Ｂ、Ｃｒｙ１Ｃ、Ｃｒｙ１Ｄ、Ｃｒｙ１Ｅ、Ｃｒｙ１Ｆ、Ｃｒｙ１Ｇ、Ｃｒｙ１Ｈ、Ｃｒｙ１Ｉ、Ｃｒｙ１Ｊ、Ｃｒｙ１Ｋ、Ｃｒｙ１Ｌ、Ｃｒｙ２Ａ、Ｃｒｙ２Ａｂ、Ｃｒｙ２Ａｅ、Ｃｒｙ４Ｂ、Ｃｒｙ６、Ｃｒｙ７、Ｃｒｙ８、Ｃｒｙ９、Ｃｒｙ１５、Ｃｒｙ４３Ａ、Ｃｒｙ４３Ｂ、ＥＴ３５、ＥＴ６６、ＴＩＣ４００、ＴＩＣ８００、ＴＩＣ８０７、ＴＩＣ８３４、ＴＩＣ８５３、ＴＩＣ１４１５、ＶＩＰ３Ａ、ＶＩＰ３Ａｂ、ＡＸＭＩ殺虫性タンパク質、ＤＩＧ殺虫性タンパク質、ｅＨＩＰ、及びＶＩＰタンパク質からなる群から選択される薬剤、
を提供する組成物。
【請求項１３】
別の殺虫剤を更に含む請求項１２に記載の組成物であって、前記別の薬剤は、Ｃｒｙ１Ｃ、Ｃｒｙ３Ａ、Ｃｒｙ３Ｂ、Ｃｒｙ３４、Ｃｒｙ３５、Ｃｒｙ５１Ａａ１、ＥＴ２９、ＥＴ３３、ＥＴ３４、ＥＴ７０、ＴＩＣ４０７、ＴＩＣ４１７、ＴＩＣ４３１、ＴＩＣ９０１、ＴＩＣ１２０１、ＴＩＣ３１３１、５３０７、ＤＩＧ−１０、Ａｘｍｉ１８４、Ａｘｍｉ２０５及びＡｘｍｉＲ１からなる群から選択される、前記組成物。
【請求項１４】
請求項１に記載のポリヌクレオチド配列を含む種子を生成するための方法であって、前記方法は、
（ａ）前記ポリヌクレオチドを含む１つまたは複数の種子を植えることと、
（ｂ）前記種子から植物を栽培することと、
（ｃ）前記植物から多数の種子を収穫することであって、前記種子は前記ポリヌクレオチド構築物を含む、前記収穫することと、
を含む、
前記方法。
【請求項１５】
（ａ）ＤＫＢ８９６１４−９、ＭＯＮ８０１、ＭＯＮ８０２、ＭＯＮ８０９、ＭＯＮ８１０、ＭＯＮ８６３、ＭＯＮ８８０１７、ＭＯＮ８９０３４、イベント４１１４−３、イベント５３０７、ＤＡＳ５９１２２−７、Ｂｔ１０、Ｂｔ１１、Ｂｔ１７６、ＣＢＨ−３５１、ＤＫＢ−８３６１４−９、ＭＩＲ１６２、ＭＩＲ６０４、ＴＣ１５０７、ＴＣ６２７５、イベント６７６、イベント６７８、イベント６８０、イベント９８１４０、ＤＡＳ４０２７８−９、ＤＫＢ８９７９０−５、ＭＯＮ２１−９、ＨＣＥＭ４８５、ＭＯＮ８３２、ＭＯＮ８７４２７、ＮＫ６０３、Ｔ１４、Ｔ２５及びＶＣＯ０１９８１−５からなる群から選択されるトウモロコシ植物形質転換イベントと、
（ｂ）ＭＯＮ８７７５１、ＤＡＳ８１４１９−２、ＭＯＮ８７７０１、Ａ２７０４−１２、Ａ２７０４−２１、Ａ５５４７−１２７、Ａ５５４７−３５、ＣＶ１２７、ＤＡＳ４４４０６−６、ＤＡＳ６８４１６−４、ＤＰ３５６０４３、ＦＧ７２、ＭＯＮ４０３２、ＡＣＳ−ＧＭ００３−１、ＭＯＮ８７７０５、ＭＯＮ８７７０８、ＭＯＮ８９７８８、Ｗ６２、Ｗ９８、及びＧＦＭ  Ｃｒｙ１Ａからなる群から選択されるダイズ植物形質転換イベントと、
（ｃ）ＤＡＳ２４２３６−５、ＤＡＳ２１０２３−５、イベント３１７０７、イベント３１８０３、イベント３１８０７、イベント３１８０８、イベント４２３１７、ＢＮＬＡ−６０１、ＣＯＴ１０２、ＣＯＴ６７Ｂ、イベント１、ＧＨＢ１１９、ＧＫ１２、ＭＯＮ１５９８５、ＭＬＳ９１２４、ＭＯＮ１０７６、ＭＯＮ５３１、ＭＯＮ７５７、Ｔ３０３−３、Ｔ３０４−４０、ＳＧＫ３２１、イベント１９−５１ａ、ＧＨＢ６１４、ＬＬＣｏｔｔｏｎ２５、ＭＯＮ８８７０１、ＭＯＮ８８７０２、ＭＯＮ１４４５、ＭＯＮ１６９８及びＭＯＮ８８９１３からなる群から選択される綿植物形質転換イベントと、
（ｄ）サトウキビ植物形質転換イベントＮＸＩ−１Ｔと、
（ｅ）ＬＬＲＩＣＥ０６、ＬＬＲＩＣＥ６０１、ＬＬＲＩＣＥ６２、ＧＭ−Ａ１７０５４及びＧＭ−Ａ１７０５４からなる群から選択されるイネ植物形質転換イベントと、
を更に含む、
請求項８に記載の植物。
【請求項１６】
機能的に連結する、
（ａ）Ｃｒｙ１ＡドメインＩアミノ酸配列を含む第１のペプチドセグメントと、
（ｂ）ＢＣＷ  ００１ドメインＩＩ−ドメインＩＩＩアミノ酸配列を含む第２のペプチドセグメントと、
を含むＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ毒性タンパク質であって、
前記Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ毒性タンパク質は、クロヨトウムシ（Ａ．ｉｐｓｉｌｏｎ）、オオタバコガ（Ｈ．ｚｅａ）、西部インゲンヨトウムシ（Ｓ．ａｌｂｉｃｏｓｔａ）、ヨーロッパアワノメイガ（Ｏ．ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）、南西部アワノメイガ（Ｄ．ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ）、イラクサギンウワバ（Ｔ．ｎｉ）、ダイズシャクトリムシ（Ｐ．ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ）、ツマジロクサヨトウ（Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）及びサトウキビメイガ（Ｄ．ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ）からなる群から選択されるＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ害虫に対して試験を行う際に、毒性の生物活性を示す、
前記Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ毒性タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願の参照
本出願は、２０１７年１月１２日出願の米国仮出願番号６２／４４５，３１３の利益を主張するものであり、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表の組み込み
本明細書では、２０１８年１月１１日に作成された「ＭＯＮＳ４３４ＷＯ―ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」という名称のファイルを含有するコンピュータ可読形式の配列表を提供する。このファイルはＭＳ−Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）による測定において１６６，１３４バイトであり、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。この配列表は配列番号：１〜配列番号：１２から構成される。
【０００３】
本発明は一般に、昆虫阻害性タンパク質、特に、植物及び種子の農業関連Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ害虫、特に、クロヨトウムシ（「ＢＣＷ」、Ａｇｒｏｔｉｓ  ｉｐｓｉｌｏｎ）などのＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ害虫に対する昆虫阻害活性を示すタンパク質の分野に関する。
【０００４】
背景技術
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（Ｂｔ）細菌種が産生する昆虫阻害性タンパク質は当技術分野において周知である。特定のＢｔタンパク質を使用し、１種または複数種のこのようなタンパク質を含有する農業的に許容される製剤を植物に散布して、殺虫剤として有効な量のこのようなタンパク質を含有するように配合した組成物で種子をコーティングすることにより、または、結果的に有効となる１種または複数種のタンパク質を植物／種子内で発現させることにより、作物植物の農業害虫を防除することができる。
【０００５】
農業従事者が昆虫害虫を防除するために商用使用する形質転換形質として使用するＢｔタンパク質がほんの数種類だけ開発されている。農業従事者は所定スペクトルの害虫防除をもたらすのにこれらのタンパク質に依存しており、害虫を防除するのに葉面散布及び土壌散布による広範なスペクトルの化学反応に依存し続けるであろう。特定のＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ昆虫、例えば、Ａｇｒｏｔｉｓ種及びＳｔｒｉａｃｏｓｔａ種などは、Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ａｃ、Ｃｒｙ１Ｆａ、Ｃｒｙ２Ａｂ、Ｃｒｙ２Ａｅ、ＶＩＰ３Ａａを含む現在用いられている形質転換殺虫性形質、及びより少ない頻度で用いられている様々なその他のＢｔ毒素を使用して防除することが特に難しいということが証明されている。それゆえ、より広範なスペクトルの昆虫害虫種に対する活性を示す昆虫阻害性タンパク質が求められており、また、既存の殺虫剤に対する害虫の耐性発現を克服するのに用いられる毒素（害虫管理システムに現在用いられている毒素を含む）の使用が求められている。
【０００６】
本出願は、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａに対して、特に、Ａｇｒｏｔｉｓ種の害虫、例えば、クロヨトウムシなどに対して驚くほど効果的な殺虫活性をそれぞれが示す、新規のタンパク質ファミリー、変異体及びキメラ毒性タンパク質構築物について記載する。
【発明の概要】
【０００７】
新規グループの昆虫阻害性ポリペプチド（毒性タンパク質ＢＣＷ  ００１、ＢＣＷ  ００２及びＢＣＷ  ００３ならびにその殺虫性フラグメント）が、作物植物の数種類のＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ害虫に対する、特に、クロヨトウムシ種（Ａｇｒｏｔｉｓ種）に対する阻害活性を示すことが証明されている。それらタンパク質のそれぞれを単独で、または、製剤中及びｉｎ  ｐｌａｎｔａで互いに組み合わせて、またその他のＢｔタンパク質及び昆虫阻害剤と組み合わせて使用することにより、農業システムに一般的に用いられているＢｔタンパク質及び殺虫性化学反応に代わる選択肢を提供することができる。
【０００８】
本発明は、Ｃｒｙ１Ａ特性を有しＣｒｙ１Ａクラス毒性タンパク質と比較して全長未満の殺虫性タンパク質をコードするヌクレオチド配列に連結した、機能的に連結する異種プロモーターセグメントを含有するポリヌクレオチド構築物、及び、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０及び配列番号：１２に記載の約１位から６０７位までのアミノ酸配列を有するポリヌクレオチド構築物、または殺虫剤として活性なそのフラグメントを提供する。このような殺虫活性を示す全長未満のポリペプチドは、配列番号：２に記載の約１位から約６０６位までまたは約５位から約６００位までのＢＣＷ  ００１アミノ酸配列に対して少なくとも約１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９４％、９２％、９１％または９０％の同一性を示すはずである。全長あるいは考慮され得るより大きな毒性フラグメントを使用する場合、パーセント同一性はより厳密ではなく、配列番号：２、４及び６に記載の全長毒性タンパク質配列に対して約１００から、約９５、約９０、約８５、または更に８０％の同一性のパーセント同一性に広がるはずであり、食餌バイオアッセイでクロヨトウムシの幼虫に対して試験を行う際、またこのようなタンパク質を発現するトウモロコシ、綿及びダイズ形質転換イベントを用いてｉｎ  ｐｌａｎｔａで試験を行う際には、これらの毒性タンパク質は商業的に有用なレベルの生物活性を示す。
【０００９】
本発明はまた、クロヨトウムシＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ種に対して毒性を有するタンパク質を提供するが、それらタンパク質としては、配列番号：２の２５６位から６０６位までに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質（ＢＣＷ  ００１タンパク質）、及び、配列番号：４及び配列番号：６のいずれかのアミノ酸位置２５７から６０７に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質（本明細書ではそれぞれ、ＢＣＷ  ００２毒性タンパク質及びＢＣＷ  ００３毒性タンパク質と呼ぶ）が挙げられる。
【００１０】
このような殺虫性タンパク質はまた、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｅｘｉｇｕａ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｌｉｔｕｒａ、Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔａ、Ｓｔｒｉａｃｏｓｔａ  ａｌｂｉｃｏｓｔａ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ、Ｐｓｅｕｄｏｐｌｕｓｉａ  ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ、Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ  ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ、Ｈｙｐｅｎａ  ｓｃａｂｒａ、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ、Ａｇｒｏｔｉｓ  ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａ、Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ  ｕｎｉｐｕｎｃｔａ、Ａｇｒｏｔｉｓ  ｉｐｓｉｌｏｎ、Ａｇｒｏｔｉｓ  ｏｒｔｈｏｇｏｎｉａ、Ｏｓｔｒｉｎｉａ  ｎｕｂｉｌａｌｉｓ、Ａｍｙｅｌｏｉｓ  ｔｒａｎｓｉｔｅｌｌａ、Ｃｒａｍｂｕｓ  ｃａｌｉｇｉｎｏｓｅｌｌｕｓ、Ｈｅｒｐｅｔｏｇｒａｍｍａ  ｌｉｃａｒｓｉｓａｌｉｓ、Ｈｏｍｏｅｏｓｏｍａ  ｅｌｅｃｔｅｌｌｕｍ、Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ  ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ、Ｃｙｄｉａ  ｐｏｍｏｎｅｌｌａ、Ｅｎｄｏｐｉｚａ  ｖｉｔｅａｎａ、Ｇｒａｐｈｏｌｉｔａ  ｍｏｌｅｓｔａ、Ｓｕｌｅｉｍａ  ｈｅｌｉａｎｔｈａｎａ、Ｐｌｕｔｅｌｌａ  ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ、Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ  ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ、Ｌｙｍａｎｔｒｉａ  ｄｉｓｐａｒ、Ａｌａｂａｍａ  ａｒｇｉｌｌａｃｅａ、Ａｒｃｈｉｐｓ  ａｒｇｙｒｏｓｐｉｌａ、Ａｒｃｈｉｐｓ  ｒｏｓａｎａ、Ｃｈｉｌｏ  ｓｕｐｐｒｅｓｓａｌｉｓ、Ｃｎａｐｈａｌｏｃｒｏｃｉｓ  ｍｅｄｉｎａｌｉｓ、Ｃｒａｍｂｕｓ  ｃａｌｉｇｉｎｏｓｅｌｌｕｓ、Ｃｒａｍｂｕｓ  ｔｅｔｅｒｒｅｌｌｕｓ、Ｄｉａｔｒａｅａ  ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ、Ｄｉａｔｒａｅａ  ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ、Ｅａｒｉａｓ  ｉｎｓｕｌａｎａ、Ｅｇｒｉａｓ  ｖｉｔｔｅｌｌａ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ａｒｍｉｇｅｒａ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ、Ｈｅｒｐｅｔｏｇｒａｍｍａ  ｌｉｃａｒｓｉｓａｌｉｓ、Ｌｏｂｅｓｉａ  ｂｏｔｒａｎａ、Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ  ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ、Ｐｈｙｌｌｏｃｎｉｓｔｉｓ  ｃｉｔｒｅｌｌａ、Ｐｉｅｒｉｓ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ、Ｐｉｅｒｉｓ  ｒａｐａｅ、Ｐｌｕｔｅｌｌａ  ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ、及びＴｕｔａ  ａｂｓｏｌｕｔａからなる群から選択されるＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ種に対する活性を示すことが認められている。
【００１１】
本発明のタンパク質はまた、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｅｘｉｇｕａ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｌｉｔｕｒａ、Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔａ、Ｓｔｒｉａｃｏｓｔａ  ａｌｂｉｃｏｓｔａ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ、Ｐｓｅｕｄｏｐｌｕｓｉａ  ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ、Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ  ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ、Ｈｙｐｅｎａ  ｓｃａｂｒａ、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ、Ａｇｒｏｔｉｓ  ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａ、Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ  ｕｎｉｐｕｎｃｔａ、Ａｇｒｏｔｉｓ  ｉｐｓｉｌｏｎ、Ａｇｒｏｔｉｓ  ｏｒｔｈｏｇｏｎｉａ、Ｏｓｔｒｉｎｉａ  ｎｕｂｉｌａｌｉｓ、Ａｍｙｅｌｏｉｓ  ｔｒａｎｓｉｔｅｌｌａ、Ｃｒａｍｂｕｓ  ｃａｌｉｇｉｎｏｓｅｌｌｕｓ、Ｈｅｒｐｅｔｏｇｒａｍｍａ  ｌｉｃａｒｓｉｓａｌｉｓ、Ｈｏｍｏｅｏｓｏｍａ  ｅｌｅｃｔｅｌｌｕｍ、Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ  ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ、Ｃｙｄｉａ  ｐｏｍｏｎｅｌｌａ、Ｅｎｄｏｐｉｚａ  ｖｉｔｅａｎａ、Ｇｒａｐｈｏｌｉｔａ  ｍｏｌｅｓｔａ、Ｓｕｌｅｉｍａ  ｈｅｌｉａｎｔｈａｎａ、Ｐｌｕｔｅｌｌａ  ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ、Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ  ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ、Ｌｙｍａｎｔｒｉａ  ｄｉｓｐａｒ、Ａｌａｂａｍａ  ａｒｇｉｌｌａｃｅａ、Ａｒｃｈｉｐｓ  ａｒｇｙｒｏｓｐｉｌａ、Ａｒｃｈｉｐｓ  ｒｏｓａｎａ、Ｃｈｉｌｏ  ｓｕｐｐｒｅｓｓａｌｉｓ、Ｃｎａｐｈａｌｏｃｒｏｃｉｓ  ｍｅｄｉｎａｌｉｓ、Ｃｒａｍｂｕｓ  ｃａｌｉｇｉｎｏｓｅｌｌｕｓ、Ｃｒａｍｂｕｓ  ｔｅｔｅｒｒｅｌｌｕｓ、Ｄｉａｔｒａｅａ  ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ、Ｄｉａｔｒａｅａ  ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ、Ｅａｒｉａｓ  ｉｎｓｕｌａｎａ、Ｅｇｒｉａｓ  ｖｉｔｔｅｌｌａ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ａｒｍｉｇｅｒａ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ、Ｈｅｒｐｅｔｏｇｒａｍｍａ  ｌｉｃａｒｓｉｓａｌｉｓ、Ｌｏｂｅｓｉａ  ｂｏｔｒａｎａ、Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ  ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ、Ｐｈｙｌｌｏｃｎｉｓｔｉｓ  ｃｉｔｒｅｌｌａ、Ｐｉｅｒｉｓ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ、Ｐｉｅｒｉｓ  ｒａｐａｅ、Ｐｌｕｔｅｌｌａ  ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ、及びＴｕｔａ  ａｂｓｏｌｕｔａからなる群から選択されるＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ種に対する生物活性を示していてもよい。
【００１２】
本発明のタンパク質及び本明細書で意図する構築物は、プラスミド、コスミド、バクミド、ファージ媒介ベクターなどを含む任意のベクター内に含まれていてもよい。
【００１３】
このようなベクターを使用して、細菌細胞、イースト細胞及び植物細胞を含む多くの宿主細胞に本発明の構築物を導入してもよい。
【００１４】
イースト細胞である宿主細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｅａｅまたはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅなどであってもよい。細菌宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ及びその他の関連ｂａｃｉｌｌｉを含むがこれらに限定されない任意の数の周知のこのような宿主細胞であってもよい。植物宿主細胞は、アルファルファ、バナナ、大麦、インゲン、ブロッコリー、キャベツ、アブラナ属、人参、キャッサバ、トウゴマ、カリフラワー、セロリ、ヒヨコマメ、ハクサイ、柑橘類、ココナッツ、コーヒー、トウモロコシ、クローバー、綿、ウリ科、キュウリ、ダグラスモミ、ナス、ユーカリ、亜麻、ニンニク、ブドウ、ホップ、リーキ、レタス、テーダマツ、キビ、メロン、ナッツ、オート麦、オリーブ、タマネギ、観賞植物、ヤシ、牧草、エンドウ、ピーナッツ、コショウ、キマメ、マツ、ジャガイモ、ポプラ、カボチャ、ラジアータマツ、ダイコン、菜種、イネ、根茎、ライ麦、ベニバナ、低木、モロコシ、ダイオウマツ、ダイズ、ホウレンソウ、トウナス、イチゴ、サトウダイコン、サトウキビ、ヒマワリ、スイートコーン、モミジバフウ、サツマイモ、スイッチグラス、茶、タバコ、トマト、ライ小麦、芝草、スイカ及び小麦植物由来の植物細胞を含むがこれらに限定されない多くの植物種から得てもよい。
【００１５】
特に、トウモロコシ、綿及びダイズ形質転換植物変種において、例えば、このような植物細胞のゲノムに、例えば、配列番号：７、配列番号：９及び配列番号：１１に記載の適宜修飾したポリヌクレオチド配列を含有する本発明の構築物を導入して、本発明のタンパク質毒素、すなわち、ＢＣＷ  ００１、ＢＣＷ  ００２またはＢＣＷ  ００３タンパク質毒素のうちの少なくとも１つを発現する遺伝構築物をそれら植物のゲノム内に含む繁殖能力のある形質転換トウモロコシ、ダイズまたは綿植物を再生することにより、形質転換植物イベントを生じさせてもよい。このような形質転換植物はそれらの植物ゲノム内に、配列番号：８、配列番号：１０及び配列番号：１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＢＣＷ  ００１、ＢＣＷ  ００２またはＢＣＷ  ００３殺虫性タンパク質またはその殺虫性タンパク質フラグメントをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結する少なくとも１つの異種プロモーターセグメントを含むポリヌクレオチド構築物を導入されている。
【００１６】
このような形質転換植物から種子が生成され、このような種子が、植物ゲノムに導入された検出可能量のポリヌクレオチド構築物を含有する場合、種子も本発明の特徴であることを意図する。それぞれのこのような形質転換植物が生成する花粉、種子、子孫、植物細胞、植物組織及び日用品は、検出可能量のポリヌクレオチド構築物を含有する。
【００１７】
このようなＢＣＷ  ００１、ＢＣＷ  ００２またはＢＣＷ  ００３タンパク質をコードする少なくとも検出可能量のポリヌクレオチド構築物を含有するあらゆる生物試料は、本発明の範囲内である。
【００１８】
殺虫剤として有効な量の本発明のＢＣＷ  ００１、００２または００３タンパク質を提供する組成物が考えられ、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ害虫種を防除するために提供される。このような組成物はまた、ＢＣＷ毒性タンパク質とは異なる補助薬剤を含有していてもよい。このような薬剤はまた、ＢＣＷ毒性タンパク質と同一のＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ種に対する毒性を有している。補助薬剤は、ＢＣＷタンパク質とは異なるアミノ酸配列を有するタンパク質またはポリペプチドからなる薬剤の群から選択され、標的昆虫害虫に毒性作用を付与するＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡなど）である薬剤であってもよく、例えば、ピレトリン、有機リン系殺虫剤などの殺虫性化合物であってもよい。代替的に、補助薬剤は、クロヨトウムシ種の幼虫または適用可能なその他のＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ標的害虫種に毒性特性を付与する、任意の親和性Ｃｒｙまたは関連毒性タンパク質、例えば、別のＣｒｙ１Ａ、Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ａｃ、Ｃｒｙ１Ａ．１０５、Ｃｒｙ１Ａｅ（しかし、これらは、これらが適切な耐性管理特性を付与することができないために好ましくない）、もしくはＣｒｙ１Ｂ、Ｃｒｙ１Ｃ、Ｃｒｙ１Ｄ、Ｃｒｙ１Ｅ、Ｃｒｙ１Ｆ、Ｃｒｙ１Ｇ、Ｃｒｙ１Ｈ、Ｃｒｙ１Ｉ、Ｃｒｙ１Ｊ、Ｃｒｙ１Ｋ、Ｃｒｙ１Ｌ、Ｃｒｙ２Ａ、Ｃｒｙ２Ａｂ、Ｃｒｙ２Ａｅ、Ｃｒｙ４Ｂ、Ｃｒｙ６、Ｃｒｙ７、Ｃｒｙ８、Ｃｒｙ９、Ｃｒｙ１５、Ｃｒｙ４３Ａ、Ｃｒｙ４３Ｂ、ＥＴ３５、ＥＴ６６、ＴＩＣ４００、ＴＩＣ８００、ＴＩＣ８０７、ＴＩＣ８３４、ＴＩＣ８５３、ＴＩＣ１４１５、ＶＩＰ３Ａ、ＶＩＰ３Ａｂ、ＡＸＭＩ殺虫性タンパク質、ＤＩＧ殺虫性タンパク質、ｅＨＩＰ、及びＶＩＰタンパク質など、ならびに、任意の当該技術分野において周知の毒性タンパク質であってもよい。
【００１９】
このような組成物はまた、同一の標的害虫に対して必ずしも毒性を有さない別の殺虫剤、例えば、Ｃｒｙ１Ｃ、Ｃｒｙ３Ａ、Ｃｒｙ３Ｂ、Ｃｒｙ３４、Ｃｒｙ３５、Ｃｒｙ５１Ａａ１、ＥＴ２９、ＥＴ３３、ＥＴ３４、ＥＴ７０、ＴＩＣ４０７、ＴＩＣ４１７、ＴＩＣ４３１、ＴＩＣ９０１、ＴＩＣ１２０１、ＴＩＣ３１３１、５３０７、ＤＩＧ−１０、Ａｘｍｉ１８４、Ａｘｍｉ２０５及びＡｘｍｉＲ１からなる群から選択される別の薬剤などを含んでいてもよい。
【００２０】
本発明のタンパク質の殺虫特性を利用した、種子を生成するための方法も考えられる。このような方法は、ＢＣＷ  ００１、ＢＣＷ  ００２もしくはＢＣＷ  ００３タンパク質、または上記タンパク質に対して少なくとも約９０％の同一性を示すタンパク質を発現するように設計されたポリヌクレオチド構築物を含み、上記方法は、本発明のＢＣＷタンパク質毒素のうちの１種または複数種を発現するポリヌクレオチドを含有する１つまたは複数の種子を植えること、このような種子から植物を栽培すること、その後、植物から多数のこのような種子を収穫することを含む。収穫した種子はポリヌクレオチド構築物を含有し、クロヨトウムシ害虫の蔓延に対する抵抗性も有する植物を生じさせる。
【００２１】
このような植物は、本発明のタンパク質により防除されることが実証されたＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ害虫種の影響を受けやすいトウモロコシ、綿、ダイズまたは任意のその他の植物であってもよい。このような植物は、本発明のタンパク質の毒性特性の作用から利益を得るこれまでに作製された形質転換植物であると考えられる。このカテゴリーに分類されるトウモロコシ植物は、ＤＫＢ８９６１４−９、ＭＯＮ８０１、ＭＯＮ８０２、ＭＯＮ８０９、ＭＯＮ８１０、ＭＯＮ８６３、ＭＯＮ８８０１７、ＭＯＮ８９０３４、イベント４１１４−３、イベント５３０７、ＤＡＳ５９１２２−７、Ｂｔ１０、Ｂｔ１１、Ｂｔ１７６、ＣＢＨ−３５１、ＤＫＢ−８３６１４−９、ＭＩＲ１６２、ＭＩＲ６０４、ＴＣ１５０７、ＴＣ６２７５、イベント６７６、イベント６７８、イベント６８０、イベント９８１４０、ＤＡＳ４０２７８−９、ＤＫＢ８９７９０−５、ＭＯＮ２１−９、ＨＣＥＭ４８５、ＭＯＮ８３２、ＭＯＮ８７４２７、ＮＫ６０３、Ｔ１４、Ｔ２５及びＶＣＯ０１９８１−５からなる群から選択される形質転換イベントを含むがこれらに限定されない。このカテゴリーの形質転換植物に分類されるダイズ植物は、ＭＯＮ８７７５１、ＤＡＳ８１４１９−２、ＭＯＮ８７７０１、Ａ２７０４−１２、Ａ２７０４−２１、Ａ５５４７−１２７、Ａ５５４７−３５、ＣＶ１２７、ＤＡＳ４４４０６−６、ＤＡＳ６８４１６−４、ＤＰ３５６０４３、ＦＧ７２、ＭＯＮ４０３２、ＡＣＳ−ＧＭ００３−１、ＭＯＮ８７７０５、ＭＯＮ８７７０８、ＭＯＮ８９７８８、Ｗ６２、Ｗ９８、及びＧＦＭ  Ｃｒｙ１Ａからなる群から選択される。このカテゴリーに分類される綿形質転換植物は、ＤＡＳ２４２３６−５、ＤＡＳ２１０２３−５、イベント３１７０７、イベント３１８０３、イベント３１８０７、イベント３１８０８、イベント４２３１７、ＢＮＬＡ−６０１、ＣＯＴ１０２、ＣＯＴ６７Ｂ、イベント１、ＧＨＢ１１９、ＧＫ１２、ＭＯＮ１５９８５、ＭＬＳ９１２４、ＭＯＮ１０７６、ＭＯＮ５３１、ＭＯＮ７５７、Ｔ３０３−３、Ｔ３０４−４０、ＳＧＫ３２１、イベント１９−５１ａ、ＧＨＢ６１４、ＬＬＣｏｔｔｏｎ２５、ＭＯＮ８８７０１、ＭＯＮ８８７０２、ＭＯＮ１４４５、ＭＯＮ１６９８及びＭＯＮ８８９１３からなる群から選択される。このカテゴリーに分類されるサトウキビ形質転換植物は、サトウキビ植物形質転換イベントＮＸＩ−１Ｔを含む。このようなＢＣＷタンパク質毒素をコードする構築物を有する利益を得る当技術分野において周知のイネ植物は、ＬＬＲＩＣＥ０６、ＬＬＲＩＣＥ６０１、ＬＬＲＩＣＥ６２、ＧＭ−Ａ１７０５４及びＧＭ−Ａ１７０５４からなる群から選択されるイネ植物形質転換イベントを含む。
【００２２】
更に、加工植物製品は検出可能量の開示組換えポリヌクレオチドを含むように提供される。このような加工製品としては、植物バイオマス、油、荒粉、動物飼料、穀粉、フレーク、糠、綿花、もみ殻及び加工種子が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２３】
形質転換植物を作製するための方法も提供する。このような方法は、組換えポリヌクレオチドを植物細胞に導入すること、及び、組換えポリヌクレオチドがコードする昆虫阻害量の組換えポリペプチドを発現する形質転換植物を選抜すること、を含む。
【００２４】
本発明のその他の実施形態、特徴及び利点は、以下の発明を実施するための形態、実施例及び特許請求の範囲により明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ＢＣＷ  ００１、ＢＣＷ  ００２及びＢＣＷ  ００３毒性タンパク質を用いてバイオアッセイで試験を行ったＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ昆虫害虫種の一覧を示す図である。「＋」は緩衝液対照と比較した死亡率を示し、「−」は緩衝液対照のレベルを超える顕著な死亡率が認められなかったということを示し、「ＮＤ」は適用可能な毒性タンパク質を使用して試験を行わなかったということを示す。ＢＣＷ  ００１は、Ａｇｒｏｔｉｓ  ｉｐｓｉｌｏｎ（クロヨトウムシ）、Ｓｔｒｉａｃｏｓｔａ  ａｌｂｉｃｏｓｔｓａ（西部インゲンヨトウムシ）、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ（オオタバコガ）、Ｏｓｔｒｉｎｉａ  ｎｕｂｉｌａｌｉｓ（ヨーロッパアワノメイガ）、Ｄｉａｔｒａｅａ  ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ（南西部アワノメイガ）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ（イラクサギンウワバ）、Ｐｓｅｕｄｏｐｌｕｓｉａ  ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ（ダイズシャクトリムシ）に対する死亡率を示し、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（ツマジロクサヨトウ）に対して試験を行った際には死亡率または成長阻害を示さなかった。Ｄｉａｔｒａｅａ  ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ（サトウキビメイガ）についてはＢＣＷ  ００１を用いての試験は行わなかった。ＢＣＷ  ００２は、Ａｇｒｏｔｉｓ  ｉｐｓｉｌｏｎ（クロヨトウムシ）、Ｓｔｒｉａｃｏｓｔａ  ａｌｂｉｃｏｓｔｓａ（西部インゲンヨトウムシ）、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ（オオタバコガ）及びＯｓｔｒｉｎｉａ  ｎｕｂｉｌａｌｉｓ（ヨーロッパアワノメイガ）に対する死亡率を示し、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（ツマジロクサヨトウ）に対して試験を行った際には死亡率または成長阻害を示さなかった。Ｄｉａｔｒａｅａ  ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ（サトウキビメイガ）、Ｄｉａｔｒａｅａ  ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ（南西部アワノメイガ）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ（イラクサギンウワバ）及びＰｓｅｕｄｏｐｌｕｓｉａ  ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ（ダイズシャクトリムシ）についてはＢＣＷ  ００２を用いての試験は行わなかった。ＢＣＷ  ００３は、Ａｇｒｏｔｉｓ  ｉｐｓｉｌｏｎ（クロヨトウムシ）、Ｓｔｒｉａｃｏｓｔａ  ａｌｂｉｃｏｓｔｓａ（西部インゲンヨトウムシ）、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ（オオタバコガ）、Ｏｓｔｒｉｎｉａ  ｎｕｂｉｌａｌｉｓ（ヨーロッパアワノメイガ）、Ｄｉａｔｒａｅａ  ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ（サトウキビメイガ）、Ｄｉａｔｒａｅａ  ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ（南西部アワノメイガ）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ（イラクサギンウワバ）及びＰｓｅｕｄｏｐｌｕｓｉａ  ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ（ダイズシャクトリムシ）に対する死亡率を示し、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（ツマジロクサヨトウ）に対して試験を行った際には死亡率または成長阻害を示さなかった。
【図２】ＢＣＷ  ００１（配列番号：２、上段の行）対ＢＣＷ  ００２（配列番号：４、中段の行）対ＢＣＷ  ００３（配列番号：６、下段の行）のアミノ酸配列アラインメントを示す図である。それぞれの三重行の下部のアスタリスクは、３つの異なる配列のうちの少なくとも１つにおける適用可能なアミノ酸位置の差異を示している。
【００２６】
配列の簡単な説明
配列番号：１は、ＢＣＷ  ００１  Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ毒性タンパク質をコードする天然Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ株ＥＧ４３８４のヌクレオチド配列である。
【００２７】
配列番号：２は、配列番号：１に記載のオープンリーディングフレームから演繹されたＢＣＷ  ００１のアミノ酸配列である。
【００２８】
配列番号：３は、キメラＢＣＷ  ００２  Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ毒性タンパク質をコードする合成配列である。
【００２９】
配列番号：４は、配列番号：３に記載のオープンリーディングフレームから演繹されたＢＣＷ  ００２のアミノ酸配列であり、このようなＢＣＷ  ００２タンパク質は、ＢＣＷ  ００１のドメインＩＩ及びＩＩＩ（配列番号：２に記載のアミノ酸位置２５８からアミノ酸位置６０６）に機能的に連結し、配列番号：４及び配列番号：６に記載のアミノ酸位置６０８から１１７７までのＣｒｙ１Ａｃプロトキシンドメインに機能的に連結する、Ｃｒｙ１ＡｃのドメインＩから構成される。配列番号：４（ＢＣＷ  ００２）は２５９位においてのみ配列番号：６（ＢＣＷ  ００３）とは異なっており、ＢＣＷ  ００２はこの位置にイソロイシンを含み、ＢＣＷ  ００３はＢＣＷ  ００１と同様にスレオニンを含む。
【００３０】
配列番号：５は、キメラＢＣＷ  ００３  Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ毒性タンパク質をコードする合成配列である。
【００３１】
配列番号：６は、配列番号：３に記載のオープンリーディングフレームから演繹されたＢＣＷ  ００３のアミノ酸配列であり、このようなＢＣＷ  ００３タンパク質は、ＢＣＷ  ００１のドメインＩＩ及びＩＩＩ（配列番号：２に記載のアミノ酸位置２５８からアミノ酸位置６０６）に機能的に連結し、配列番号：４及び配列番号：６に記載のアミノ酸位置６０８から１１７７までのＣｒｙ１Ａｃプロトキシンドメインに機能的に連結する、Ｃｒｙ１ＡｃのドメインＩから構成される。配列番号：６（ＢＣＷ  ００３）は２５９位においてのみ配列番号：４（ＢＣＷ  ００２）とは異なっており、ＢＣＷ  ００２はこの位置にイソロイシンを含み、ＢＣＷ  ００３はＢＣＷ  ００１と同様にスレオニンを含む。
【００３２】
配列番号：７は、植物内で発現させるためのＢＣＷ  ００１タンパク質をコードする合成配列である。
【００３３】
配列番号：８は、配列番号：７から誘導したＢＣＷ  ００１の演繹アミノ酸配列である。
【００３４】
配列番号：９は、植物内で発現させるためのＢＣＷ  ００２タンパク質をコードする合成配列である。
【００３５】
配列番号：１０は、配列番号：９から誘導したＢＣＷ  ００２の演繹アミノ酸配列である。
【００３６】
配列番号：１１は、植物内で発現させるためのＢＣＷ  ００３タンパク質をコードする合成配列である。
【００３７】
配列番号：１２は、配列番号：１１から誘導したＢＣＷ  ００３の演繹アミノ酸配列である。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
殺虫性タンパク質を含有する製剤を植物／種子に散布することにより作物植物の農業害虫を防除することに代わる選択肢は、これらのタンパク質をコードするポリヌクレオチドを植物または植物部位内で発現させるための植物ゲノムに挿入することである。これらのポリヌクレオチドで形質転換された植物は、これらの発現タンパク質が形質転換形質として提供する昆虫抵抗性を保有する。
【００３９】
Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ防除において、現在用いられているタンパク質に対する昆虫の耐性が発現することを回避するために、または、現在用いられているタンパク質に対する昆虫の耐性を回避するために、異なる作用機序（ＭＯＡ）を有することに加え、スペクトルと効果が広い新規タンパク質が求められている。このニーズに応える１つの方法は、新規殺虫性タンパク質の発見を期待してＢｔゲノムを配列決定することである。別の手法は、様々なＢｔタンパク質由来のセグメントを交換して、昆虫阻害特性を有する新規キメラＢｔタンパク質を作製することである。当該技術分野において周知である多数の天然殺虫性結晶タンパク質のドメイン構造を再び組み合わせて特性が向上したキメラタンパク質を恣意的に作製する見込みは薄い（例えば、Ａ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  Ｎｕｍｅｒｏｕｓ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｏｍａｉｎｓ；Ｊ．Ｅｃｏｎｏｍｉｃ  Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｙ，９７（６）：１８０５−１８１３．２００４を参照のこと）。
【００４０】
本明細書では殺虫性タンパク質（本明細書中ではＢＣＷタンパク質と同定した）をコードするヌクレオチド配列を開示し、ＢＣＷタンパク質は、代替ＭＯＡに対するニーズに応え、より広範なスペクトルの昆虫害虫に対する活性を提供し、また耐性の発現を遅延または回避するように作用し、特に、クロヨトウムシ（ＢＣＷ）害虫を防除するために使用される。
【００４１】
ＢＣＷ  ００１は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ株ＥＧ４３８４のゲノムのシークエンシング後に、Ｃｒｙ１Ａ型タンパク質の特徴を有するアミノ酸配列を予測するオープンリーディングフレームとして発見された。ＢＣＷ  ００１オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は１１８０アミノ酸のタンパク質をコードし、このタンパク質は、識別可能なドメインＩ、ＩＩ及びＩＩＩ構造、ならびに、カルボキシ末端に予測タンパク質の半分である特徴的なＣｒｙ１Ａ型プロトキシンドメインを含む、Ｃｒｙ１タンパク質毒素の特徴の多くを有すると予測された。予測ドメインＩアミノ酸配列（配列番号：２の１残基から約２５８残基まで）は、Ｃｒｙ１Ａｃタンパク質毒素ドメインＩに対して約６７％の同一性を示す。予測ドメインＩＩアミノ酸配列（配列番号：２に記載の約２５９残基から約４５９残基まで）は、Ｃｒｙ１Ａｉ２ドメインＩＩに対して完全（１００％）な同一性を示す。予測ドメインＩＩＩアミノ酸配列（配列番号：２に記載の約２６０残基から約６０６残基まで）は、Ｃｒｙ１Ａｈ２内における対応するドメインＩＩＩ残基に対して約６３％の同一性を示す。ＢＣＷ  ００１予測タンパク質のプロトキシンドメイン構造（配列番号：２に記載の約６０７残基から１１８０残基まで）は、Ｃｒｙ１Ａａ９内における対応する残基に対して約９６％の同一性を示す。総合的に言えば、この予測全長タンパク質は、Ｃｒｙ１Ａｉに対して約８３％のアミノ酸配列同一性を示し、配列番号：２に記載のアミノ酸位置１から約６０７残基までの予測トキシン領域は、Ｃｒｙ１Ａｉ１に対して７６％の同一性を示す。この新しい毒性タンパク質を特定のＣｒｙ１Ａクラスに割り当てることが困難であるため、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ命名委員会にこの配列を提供し、このタンパク質がその独自個別の新規クラスに値するかどうかを確認する。
【００４２】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの結晶非産生株を用いてプラスミドベクターからＢＣＷ  ００１タンパク質を作製し、様々なＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ害虫に対して芽胞結晶体製剤を試験した。データについては図１の列２を参照されたい。エビデンスは、このタンパク質が、その供給源、すなわち、当該技術分野において周知のＣｒｙ１Ａａ、Ｃｒｙ１ＡｈまたはＣｒｙ１Ａｉ毒性タンパク質から誘導されるいずれのタンパク質の特徴も有していないことを示した。クロヨトウムシに対して試験を行った際、いずれの先行技術のタンパク質も何ら顕著な活性を示さなかったが、この新規タンパク質ＢＣＷ  ００１は、クロヨトウムシに対して試験を行った際、バイオアッセイにおいて毒性を示し、驚くべきことに、図１に記載分に加えその他一式のＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ害虫に対して試験を行った際に毒性特性を示した。
【００４３】
特に、未処理昆虫食餌対照と比較したバイオアッセイでは、ＢＣＷ  ００１タンパク質は、西部インゲンヨトウムシ（「ＷＢＣ」、Ｓｔｒｉａｃｏｓｔａ  ａｌｂｉｃｏｓｔａ）、オオタバコガ（「ＣＥＷ」、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ）、ヨーロッパアワノメイガ（「ＥＣＢ」、Ｏｓｔｒｉｎｉａ  ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）、南西部アワノメイガ（「ＳＷＣ」、Ｄｉａｔｒａｅａ  ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ）、ダイズシャクトリムシ（「ＳＬ」、Ｐｓｅｕｄｏｐｌｕｓｉａ  ｉｎｃｌｕｄｅｓ）、イラクサギンウワバ（「ＣＬＷ」、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）、ならびに、１齢及び３齢のクロヨトウムシ（「ＢＣＷ」、Ａｇｒｏｔｉｓ  ｉｐｓｉｌｏｎ）に対して活性を示した。
【００４４】
以下で更に記載するが、Ｃｒｙ１ＡｃのドメインＩならびにＢＣＷ  ００１のドメインＩＩ及びＩＩＩ（すなわち、それぞれ配列番号：４と配列番号：６に記載のＢＣＷ  ００２とＢＣＷ  ００３）を使用してキメラ毒性タンパク質を生成し、これらのキメラ毒性タンパク質をトウモロコシ植物及びサトウキビ植物に導入した。両方のキメラタンパク質はトウモロコシにおいて、ＢＣＷ、ＷＢＣ、ＣＥＷ及びＳＷＣに対して活性を示した。ＢＣＷ  ００３はサトウキビにおいて、ＳＣＢに対して活性を示した。
【００４５】
本明細書で使用する場合、語句「ＢＣＷタンパク質」とは、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ、限定するわけではないが特に、ＢＣＷ、ＷＢＣ及び／またはＳＣＢに対する活性を付与するＢＣＷ  ００１（配列番号：２）、ＢＣＷ  ００２（配列番号：４）及びＢＣＷ  ００３（配列番号：６）ならびにそれらの昆虫阻害性セグメントまたはこれらの組み合わせの任意の昆虫阻害性ポリペプチド配列を含む、それからなる、実質的にそれに相同である、または、それから誘導された、任意の新規昆虫阻害性タンパク質のことを意味する。ＢＣＷ  ００１をコードするポリヌクレオチドを株ＥＧ４３８４から誘導した。ＢＣＷ  ００１のコア毒性アミノ酸配列は、配列番号：２に記載の約２８位から約６０６位、６１８位までのアミノ酸に対応しており、ＢＣＷ  ００２と００３のコア毒性アミノ酸配列はそれぞれ、配列番号：４と配列番号：６に記載の約２９位から約６０７位、約６１９位までのアミノ酸に対応している。
【００４６】
一実施形態では、本明細書で開示するタンパク質は、一次δ−エンドトキシン構造、長さ（約１１７６〜１１８０アミノ酸）、プロトキシンを含まないタンパク質の長さ（約６００〜約６１９アミノ酸）、毒性コアの長さ（約５９１アミノ酸）、または、少なくとも１つのＢＣＷ特異的セグメントの存在に関連している。
【００４７】
これらのデフォルトパラメータ、重み行列：ｂｌｏｓｕｍ、ギャップオープニングペナルティ：１０．０、ギャップ伸長ペナルティ：０．０５、親水性ギャップ：Ｏｎ、親水性残基：ＧＰＳＮＤＱＥＲＫ、残基特異的ギャップペナルティ：Ｏｎを用いて、それぞれのペアにおけるアミノ酸同一のペアワイズ数及びアミノ酸同一のペアワイズ率をもたらすＣｌｕｓｔａｌ  Ｗアルゴリズムを使用して、代表的なタンパク質を互いにアラインさせた。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアルゴリズムについては、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ａｎｄ  Ｇｉｂｓｏｎ，Ｔ．Ｊ．（１９９４）「ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ：ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ，ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｗｅｉｇｈｔ  ｍａｔｒｉｘ  ｃｈｏｉｃｅ．」Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：４６７３−４６８０に記載されている。
【００４８】
その他のアライメントアルゴリズムも当該技術分野において利用可能であり、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアライメントを使用して得られた結果と類似した結果がもたらされる。
【００４９】
用語「約」は、これらのセグメントの境界が、親タンパク質の配列及びそれら互いのアライメントに応じて１、２、３、４、５、１０、２０、２５、３０または３５残基分変化し得るということを説明するために本明細書で使用される。様々なセグメントの多様性及び構造について更に説明するために、表２及び３において、ＢＣＷ  ００２と００３とその他のクロヨトウムシ活性キメラのセグメント境界を表にした。
【００５０】
用語「フラグメント」は、ＢＣＷ毒性タンパク質を表す完全アミノ酸配列または核酸配列よりも短い連続したアミノ酸配列または核酸配列について記載するために本明細書で使用される。
【００５１】
語句「昆虫阻害性」及び「殺虫性」は、本明細書において同じ意味で用いられ、昆虫の生存能、増殖、昆虫の発生、昆虫の生殖、昆虫の摂食行動、昆虫の交配行動に対する任意の測定可能な阻害をもたらすタンパク質、タンパク質フラグメント、タンパク質セグメントまたはポリヌクレオチド、及び／または、このタンパク質、タンパク質フラグメント、タンパク質セグメントまたはポリヌクレオチドを昆虫が摂食することにより引き起こされる副作用の任意の測定可能な減少をもたらすタンパク質、タンパク質フラグメント、タンパク質セグメントまたはポリヌクレオチドのことを意味する。
【００５２】
用語「生物活性」、「活性な」、「活性」、「有効な」、「効果的な」またはその変化形態は、標的昆虫害虫に対する本発明のタンパク質の作用を説明するために本明細書において同じ意味で用いられる。
【００５３】
作物は、その生育段階のある時点で産物を収穫される自生植物または栽培植物である。このような産物の非限定例は、種子、さや、葉、花、茎、根またはその任意の部位である。
【００５４】
植物の任意の組織、細菌、ウイルスまたはベクターから得た生物試料は、ポリヌクレオチドを含むか、または、本明細書で例示するタンパク質（限定するわけではないが例えば、種子、さや、葉、花、茎、根またはその任意の部位など）を発現し、検出可能量のポリヌクレオチド、タンパク質またはその両方を含有する。
【００５５】
語句「検出可能量」は、限定するわけではないが例えば、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）及び酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）などの標準的な解析法を用いることで検出可能な本明細書で開示する最小量のタンパク質またはポリヌクレオチドを説明するために本明細書で使用される。
【００５６】
一実施形態では、本明細書に記載の毒性タンパク質は共通の機能に関連し、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ昆虫種に対する殺虫活性を示す。
【００５７】
ＢＣＷ  ００１セグメントは、このようなセグメントを含有するＣｒｙ１キメラにクロヨトウムシ活性を付与する。クロヨトウムシ活性を付与するＢＣＷ  ００１セグメントの例は、配列番号：２のアミノ酸位置約２５０から約６０６まで、より詳細には、アミノ酸位置約２５５から約６０６までに記載されている。ＢＣＷ  ００１毒性タンパク質のドメインＩＩ及びＩＩＩに相当するアミノ酸のこのセグメントを含有するＣｒｙ１キメラはまた、多くの場合、クロヨトウムシの防除に関連する毒性特性をキメラタンパク質に付与する。このことは、適用可能な毒素構築物がそのドメインＩＩ及びＩＩＩ構成要素をＢＣＷ  ００１由来のこの範囲のアミノ酸で置換されているＣｒｙ１Ａ、Ｃｒｙ１Ｂ、Ｃｒｙ１Ｃ、Ｃｒｙ１Ｄ、Ｃｒｙ１Ｅ及びＣｒｙ１Ｆスキャフォールド内で試験されている。多くのケースでは、クロヨトウムシ活性はキメラ構築物において驚くほど維持されている（データは省略）。
【００５８】
本発明の一態様では、適用可能なＢＣＷ毒性タンパク質を用いて防除する害虫はとりわけ、成虫、蛹、幼虫及び新生虫を含むＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目の昆虫害虫である。
【００５９】
Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目の昆虫としては、Ｎｏｃｔｕｉｄａｅ科のアワヨトウの幼虫、ヨトウムシ、シャクトリムシ及びタバコガ、例えば、ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、シロイチモジヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｅｘｉｇｕａ）、ベルタアワヨトウ（Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔａ）、クロヨトウムシ（Ａｇｒｏｔｉｓ  ｉｐｓｉｌｏｎ）、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）、ダイズシャクトリムシ（Ｐｓｅｕｄｏｐｌｕｓｉａ  ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ）、ビロードマメケムシ（Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ  ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ）、グリーンクローバーアオムシ（Ｈｙｐｅｎａ  ｓｃａｂｒａ）、ニセアメリカタバコガ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）、グラニュレートカットワーム（Ａｇｒｏｔｉｓ  ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａ）、西部ヨトウムシ（Ａｇｒｏｔｉｓ  ｏｒｔｈｏｇｏｎｉａ）、アワヨトウの幼虫（Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ  ｕｎｉｐｕｎｃｔａ）、Ｐｙｒａｌｉｄａｅ科の穿孔虫、ツツミノガ、ウェブワーム、コーンワーム、キャベツワーム及び葉肉食者、例えば、ヨーロッパアワノメイガ（Ｏｓｔｒｉｎｉａ  ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）、クルミマダラメイガ（Ａｍｙｅｌｏｉｓ  ｔｒａｎｓｉｔｅｌｌａ）、ウスギンツトガ（Ｃｒａｍｂｕｓ  ｃａｌｉｇｉｎｏｓｅｌｌｕｓ）、クロオビクロノメイガ（Ｈｅｒｐｅｔｏｇｒａｍｍａ  ｌｉｃａｒｓｉｓａｌｉｓ）、ヒマワリガ（Ｈｏｍｏｅｏｓｏｍａ  ｅｌｅｃｔｅｌｌｕｍ）、モロコシマダラメイガ（Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ  ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ）、Ｔｏｒｔｒｉｃｉｄａｅ科のハマキガ、青虫、シードワーム及びフルーツワーム、例えば、コドリンガ（Ｃｙｄｉａ  ｐｏｍｏｎｅｌｌａ）、グレープベリーガ（Ｅｎｄｏｐｉｚａ  ｖｉｔｅａｎａ）、ナシヒメシンクイ（Ｇｒａｐｈｏｌｉｔａ  ｍｏｌｅｓｔａ）、ヒマワリ青虫ガ（Ｓｕｌｅｉｍａ  ｈｅｌｉａｎｔｈａｎａ）、ならびに、多くのその他の経済的に重要なＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ、例えば、コナガ（Ｐｌｕｔｅｌｌａ  ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）、ワタアカミムシ（Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ  ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ）、マイマイガ（Ｌｙｍａｎｔｒｉａ  ｄｉｓｐａｒ）が挙げられるがこれらに限定されない。Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目のその他の害虫としては、例えば、Ａｌａｂａｍａ  ａｒｇｉｌｌａｃｅａ（綿葉虫）、Ａｒｃｈｉｐｓ  ａｒｇｙｒｏｓｐｉｌａ（果樹ハマキガ）、Ａ．ｒｏｓａｎａ（ヨーロッパハマキガ）、ならびに、その他のＡｒｃｈｉｐｓ種、Ｃｈｉｌｏ  ｓｕｐｐｒｅｓｓａｌｉｓ（ニカメイガ（Ａｓｉａｔｉｃ  ｒｉｃｅ  ｂｏｒｅｒ）またはニカメイガ（ｒｉｃｅ  ｓｔｅｍ  ｂｏｒｅｒ））、Ｃｎａｐｈａｌｏｃｒｏｃｉｓ  ｍｅｄｉｎａｌｉｓ（イネハマキガ）、Ｃｒａｍｂｕｓ  ｃａｌｉｇｉｎｏｓｅｌｌｕｓ（ウスギンツトガ）、Ｃ．ｔｅｔｅｒｒｅｌｌｕｓ（シバツトガ）、Ｄｉａｔｒａｅａ  ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ（南西部アワノメイガ）、Ｄ．ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ（サトウキビメイガ）、Ｅａｒｉａｓ  ｉｎｓｕｌａｎａ（スピニーボールワーム）、Ｅ．ｖｉｔｔｅｌｌａ（スポッテッドボールワーム）、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ａｒｍｉｇｅｒａ（���メリカンボールワーム）、Ｈ．ｚｅａ（オオタバコガ（ｃｏｒｎ  ｅａｒｗｏｒｍ）またはオオタバコガ（ｃｏｔｔｏｎ  ｂｏｌｌｗｏｒｍ））、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ（ニセアメリカタバコガ）、Ｈｅｒｐｅｔｏｇｒａｍｍａ  ｌｉｃａｒｓｉｓａｌｉｓ（クロオビクロノメイガ）、Ｌｏｂｅｓｉａ  ｂｏｔｒａｎａ（ヨーロッパグレープバインガ）、Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ  ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ（ワタアカミムシ）、Ｐｈｙｌｌｏｃｎｉｓｔｉｓ  ｃｉｔｒｅｌｌａ（ミカンハモグリガ）、Ｐｉｅｒｉｓ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ（オオモンシロチョウ）、Ｐ．ｒａｐａｅ（モンシロチョウの幼虫またはモンシロチョウ）、Ｐｌｕｔｅｌｌａ  ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ（コナガ）、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｅｘｉｇｕａ（シロイチモジヨトウ）、Ｓ．ｌｉｔｕｒａ（ハスモンヨトウ（ｔｏｂａｃｃｏ  ｃｕｔｗｏｒｍ）、ハスモンヨトウ（ｃｌｕｓｔｅｒ  ｃａｔｅｒｐｉｌｌａｒ））、Ｓ．  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（ツマジロクサヨトウ）、及び、Ｔｕｔａ  ａｂｓｏｌｕｔａ（トマトキバガ）が挙げられる。
【００６０】
また本明細書で開示するタンパク質を使用して、ＢＣＷ特異的毒性タンパク質に特異的に結合する抗体を作製してもよく、ＢＣＷ毒性種のその他の要素をスクリーニング及び検出するのに使用してもよい。
【００６１】
一実施形態では、昆虫阻害性ＢＣＷ  ００１関連タンパク質をコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号：１、３、５、７、９及び１１に記載されている。これらのタンパク質をコードするヌクレオチド配列をスクリーニング用のプローブ及びプライマーとして用い、熱または等温増幅法及び／またはハイブリダイゼーション法、ならびに当業者に周知のその他の同定法を使用して、その種のその他の要素を同定してもよい。
【００６２】
本発明の一態様は関連タンパク質を発見するための方法を提供し、このような方法としては、Ｂｔゲノムのシークエンシング、シークエンスデータのアセンブリ、このような殺虫性タンパク質をコードするＢｔ遺伝子の同定及びクローニング、ならびに、殺虫活性をアッセイするための新規Ｂｔタンパク質の発現及び試験が挙げられる。本発明の別の態様では、分子的方法を用いて、殺虫性タンパク質の種類に由来するタンパク質のキメラを含む商業的に利用可能なタンパク質を遺伝子操作及びクローニングするが、例えば、それらキメラをＢＣＷ毒性タンパク質のセグメントからアセンブリして別の実施形態を派生させてもよい。開示するタンパク質を互いにに対して、またその他のＢｔ殺虫性タンパク質に対してアライメントしてもよく、キメラタンパク質の構築をもたらすアラインメントタンパク質間の置換に有用なそれぞれのこのようなタンパク質のセグメントを同定してもよい。このようなキメラタンパク質を害虫バイオアッセイ解析に供し、キメラにおけるそれぞれのこのようなセグメントが由来する親タンパク質と比較して上昇した生物活性及び／または広がった標的害虫スペクトルの存在の特徴を明らかにしてもよい。特定の害虫またはより広範なスペクトルの害虫に対する活性のために、その他のタンパク質とドメインまたはセグメントを交換することによりポリペプチドの殺虫活性を更に操作してもよい。
【００６３】
一実施形態では、本明細書で開示するタンパク質は、本明細書で開示するタンパク質の機能的に同等なフラグメント（Ｎ末端またはＣ末端の欠失）を含む。
【００６４】
本明細書ではＢＣＷ毒性タンパク質を提供する。特定の実施形態では、ＢＣＷ  ００１関連毒性タンパク質を単離してもよく、組成物中、形質転換微生物中、または形質転換植物中に提供してもよい。本実施形態では、ＢＣＷ  ００２タンパク質及び特にＢＣＷ  ００３タンパク質は、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ阻害活性、特に、クロヨトウムシ及び／またはサトウキビメイガに対する阻害活性を付与する。本出願における「単離されたタンパク質」または同等の用語または語句への言及は、そのタンパク質が、単独でまたはその他の組成物と混合された状態で存在しているが、その天然環境中にはないタンパク質を意味することを意図する。例えば、生物内に自然に存在する本発明の毒性タンパク質などは、これら毒性タンパク質が、これらが自然に存在する生物内に存在している限りにおいて「単離された」とは考えられない。しかしながら、これらのそれぞれは、タンパク質が、それが自然に存在する生物内に存在していない限りにおいて本開示の範囲内において「単離された」ことになる。
【００６５】
本明細書で使用する場合、「機能的に連結する」とは、一方の配列が、連結した配列に必要な機能または協調的もしくは有用な特徴をもたらすような、核酸配列またはアミノ酸配列の連結のことを意味する。
【００６６】
ＢＣＷ  ００１、ＢＣＷ  ００２及びＢＣＷ  ００３と生物学的に機能的に同等なペプチド、ポリペプチド及びタンパク質としては、これらのＢＣＷ毒性タンパク質配列内に保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列が挙げられるがこれらに限定されない。このようなアミノ酸配列では、配列内の１つまたは複数のアミノ酸が別のアミノ酸（複数可）で置換され、サイレントまたは保存的アミノ酸配列の変化がもたらされている。
【００６７】
開示する昆虫阻害性ポリペプチドはＢＣＷ  ００１、ＢＣＷ  ００２またはＢＣＷ  ００３タンパク質配列を含むことが好ましいが、この昆虫阻害性タンパク質の昆虫阻害活性と同一または同様の昆虫阻害活性を有するこの配列のフラグメント及び変異体もまた本明細書で開示されている。例えば、昆虫阻害活性を有するＢＣＷ関連毒性タンパク質内における少なくとも３０、３５、３８、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、１００、１５０、２００、５００、５５０またはそれ以上のアミノ酸の連続配列である。別の実施形態では、昆虫阻害活性を有するＢＣＷ関連毒性タンパク質のフラグメントは、ＢＣＷ毒性タンパク質配列内にアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加を含んでいてもよい。
【００６８】
一実施形態では、昆虫阻害性ポリペプチドは、配列番号：２に記載のＢＣＷ  ００１タンパク質配列の約２８残基から約６１８残基までの昆虫阻害性セグメントを含む。非限定的例としては、配列番号：２、４もしくは６、または、単独でまたはキメラタンパク質と機能的に連結して、この特定のＢＣＷ  ００１タンパク質の昆虫阻害活性と同一または同様の昆虫阻害活性を有するより短いフラグメントもしくは変異体のいずれか１つが挙げられる。別の実施形態では、昆虫阻害活性を有する配列番号：２、４または６のいずれか１つにおける少なくとも約３８またはそれ以上のアミノ酸の連続アミノ酸配列を有するセグメントもまた、機能的な殺虫性タンパク質を提供する。昆虫阻害性のＢＣＷ  ００１毒性フラグメントはまた、配列番号：２、４または６のいずれか１つの配列の約２８残基から約６１８残基に相当する５９１アミノ酸領域のうちの少なくとも３０、３５、３８、４０、４５、５０、１００、１５０、２００、５００、５５０、５５５、５６０、５６５、５７０、５７２、５７４、５８０または５８５のアミノ酸残基を有するセグメントを含んでいてもよい。
【００６９】
一部の実施形態では、成熟ＢＣＷ  ００１タンパク質（成熟とは、昆虫害虫の消化管内におけるタンパク質加水分解により１１８０のアミノ酸が開裂して、Ｎ末端までわずか６０７残基から約６１８残基にあるコア毒素を遊離し、配列番号：２に記載の大体１残基から６０６残基まで、または約５から約６１８までの任意の数の残基を含む活性毒素セグメントを遊離する（遊離したセグメントがクロヨトウムシの幼虫に対して毒性特性を示す限りにおいて）、タンパク質のプロトキシン形態のことを意味する）のフラグメントは、昆虫阻害活性を有するタンパク質のＮ末端、Ｃ末端、中央部またはこれらの組み合わせから１つまたは複数のアミノ酸が欠失したトランケート形態であってもよい。これらのフラグメントは、ＢＣＷ  ００１の天然または合成の変異体であってもよく、ＢＣＷ毒性タンパク質の昆虫阻害活性を保持していてもよい。特定の実施形態では、成熟ＢＣＷ  ００１、ＢＣＷ  ００２またはＢＣＷ  ００３タンパク質のフラグメントは、そのフラグメントをそれらから誘導する出発タンパク質分子が有する殺虫活性を示す。本明細書に記載のフラグメントまたは変異体は、タンパク質の殺虫活性に影響を及ぼす本明細書中で同定したドメインを更に含んでいてもよい。昆虫阻害活性を有するトランケート誘導体は、配列番号：２に記載のＢＣＷ  ００１毒性タンパク質配列の約２８残基から約６０６残基または６１８残基まで、または、配列番号：４または配列番号：６に記載のＢＣＷ毒性タンパク質の約２９残基から約６０７残基及び６１９残基までに相当するＢＣＷ毒性タンパク質である。
【００７０】
更に別の実施形態では、トランケートＮ末端欠失変異体としては、ＢＣＷ毒性タンパク質の毒性部分（プロトキシンを含まない）または毒性コアのＮ末端及び／またはＣ末端のいずれかに由来するアミノ酸残基を欠くＢＣＷ  ００１毒性タンパク質が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、配列番号：２の残基２８から残基６１８、または、配列番号：４または６の残基２９から残基６１９に相当するＢＣＷ  ００１タンパク質の毒性コアにおける１〜６Ｎ末端アミノ酸残基を欠失させてもよい。配列番号：２の残基２８から残基６１８、または、配列番号：４または６の残基２９から残基６１９に相当するＢＣＷ毒性タンパク質のトランケートＣ末端欠失変異体としては、１〜６Ｃ末端アミノ酸残基を欠くＢＣＷ毒性タンパク質が挙げられるがこれらに限定されない。その他の実施形態では、配列番号：２の対応する残基２８から残基６１８、または、配列番号：４または６の対応する残基２９から残基６１９を有するＢＣＷ毒性タンパク質は、１〜６アミノ末端残基のＮ末端トランケート体と１〜６カルボキシ末端残基のＣ末端トランケート体の両方を有していてもよい。
【００７１】
一部の実施形態では、ＣＰＲ２４７１９−１とは異なるタンパク質にクロヨトウムシ活性を付与する、ＣＰＲ２４７１９タンパク質の個々のセグメント１〜６、またはセグメント１〜６の組み合わせはまた、同一または同様の機能を示してもよい。
【００７２】
本明細書で開示するＢＣＷ毒性タンパク質のフラグメント及び変異体は、配列番号：２の残基２８から残基６１８または配列番号：４または６の残基２９から残基６１９に示す対応するアミノ酸配列を有する成熟ＢＣＷ毒性タンパク質の対応するセグメントに対して、約６２％以上の配列同一性、約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、またはそれ以上の配列同一性、約９９％、９９．５％、１００％のアミノ酸配列同一性を有していてもよい。
【００７３】
本発明の一実施形態は、ＢＣＷ毒性タンパク質をコードする組換えポリヌクレオチド組成物を含む。例えば、ＢＣＷ毒性タンパク質は、タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有する単離されたポリヌクレオチド分子が、組換えＤＮＡ構築物を対象とするシステム内において機能的に発現するためにプロモーター及び任意のその他の調節エレメントなどのエレメントに機能的に連結する、組換えＤＮＡ構築物と共に発現し得る。本出願における「単離されたＤＮＡ分子」または同等の用語または語句への言及は、そのＤＮＡ分子が、単独でまたはその他の組成物と混合された状態で存在しているが、その天然環境中にはないＤＮＡ分子を意味することを意図する。例えば、生物のゲノムのＤＮＡ内に自然に存在する核酸エレメント、例えば、コード配列、イントロン配列、非翻訳リーダー配列、プロモーター配列、転写停止配列などは、そのエレメントが生物のゲノム内に存在している限りにおいて、またそのエレメントが自然に存在するゲノム内の位置に存在している限りにおいて「単離された」とは考えられない。しかしながら、これらエレメントのそれぞれ及びこれらエレメントのサブ部分は、そのエレメントが、生物のゲノム内に存在していない限りにおいて、またそのエレメントが自然に存在するゲノム内の位置に存在していない限りにおいて本開示の範囲内において「単離された」ことになる。同様に、殺虫性タンパク質またはそのタンパク質の任意の天然殺虫性変異体をコードするヌクレオチド配列は、そのヌクレオチド配列が、そのタンパク質をコードする配列が自然に存在する細菌のＤＮＡ内に存在していない限りにおいて単離されたヌクレオチド配列となる。天然殺虫性タンパク質のアミノ酸配列をコードする合成ヌクレオチド配列は、本開示の目的のために単離されたと考えられる。本開示の目的のために、任意の形質転換ヌクレオチド配列、すなわち、植物または細菌の細胞のゲノムに挿入されたＤＮＡのヌクレオチド配列、または、染色体外ベクター内に存在するＤＮＡのヌクレオチド配列は、その形質転換ヌクレオチド配列が、細胞を形質転換するのに用いるプラスミドまたは同様の構築物内に存在するかにかかわらず、植物または細菌のゲノム内に存在するかにかかわらず、または、その植物または細菌に由来する組織、子孫、生物試料または日用品内に検出可能量で存在するかにかかわらず、単離されたヌクレオチド配列であると考えられる。非限定的例としては、植物内においてＢＣＷ毒性タンパク質を発現するためにＢＣＷ毒性タンパク質コード配列に機能的に連結する植物機能的プロモーター、または、Ｂｔ内においてＢＣＷ毒性タンパク質を発現するためにＢＣＷ毒性タンパク質コード配列に機能的に連結するＢｔ機能的プロモーターが挙げられる。ＢＣＷ毒性タンパク質コード配列に機能的に連結可能なその他のエレメントとしては、エンハンサー、イントロン、リーダー、コードタンパク質固定化タグ（Ｈｉｓタグ）、コード細胞内移行ペプチド（例えば、プラスチド移行ペプチド、シグナルペプチド）、翻訳後修飾酵素用のコードポリペプチド部位、リボソーム結合部位、及びＲＮＡｉ標的部位が挙げられるがこれらに限定されない。
【００７４】
本明細書で使用する場合、「組換えＤＮＡ分子」は、人間の介入なしには天然に共に存在しないＤＮＡ分子の組み合わせを含むＤＮＡ分子である。例えば、組換えＤＮＡ分子は、互いに対して非相同である少なくとも２種のＤＮＡ分子からなるＤＮＡ分子、天然に存在するＤＮＡ配列に由来するＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子、または、遺伝的形質転換または遺伝子編集により宿主細胞のＤＮＡに組み込まれたＤＮＡ分子であってもよい。同様に、「組換えタンパク質分子」は、人間の介入なしには天然に共に存在しないアミノ酸の組み合わせを含むタンパク質分子である。例えば、組換えタンパク質分子は、互いに対して非相同である少なくとも２種のアミノ酸分子からなるタンパク質分子、天然に存在するアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を含むタンパク質分子、または、宿主細胞の遺伝的形質転換の結果としてまたは宿主細胞ゲノムの遺伝子編集により宿主細胞内で発現するタンパク質分子であってもよい。
【００７５】
本明細書で提供する例示的な組換えポリヌクレオチド分子としては、配列番号：７、配列番号：９及び配列番号：１１に加え、配列番号：３及び配列番号：５に記載のヌクレオチドセグメント、配列番号：２（ＢＣＷ  ００１）、配列番号：４（ＢＣＷ  ００２）、配列番号：６（ＢＣＷ  ００３）に記載のアミノ酸配列を有する対応するポリペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチドセグメントのそれぞれ、ならびに、配列番号：８、配列番号：１０及び配列番号：１２が挙げられるがこれらに限定されない。本明細書で開示するタンパク質をコードする組換えポリヌクレオチド分子のコドンを同義コドンで置換してもよい（サイレント置換とも呼ばれる）。本明細書で開示するＢＣＷ毒性変異タンパク質のいずれかをコードする組換えポリヌクレオチドも提供する。
【００７６】
ＢＣＷ毒性タンパク質コード配列を含む組換えＤＮＡ構築物はまた、ＢＣＷ毒性タンパク質をコードするＤＮＡ配列、ＢＣＷ毒性タンパク質とは異なるタンパク質、昆虫阻害性ｄｓＲＮＡ分子または殺虫性化合物を同時に発現するように、または、それらと共発現するように構成され得る、１種または複数種の昆虫阻害剤をコードするＤＮＡの領域を更に含んでいてもよい。殺虫性化合物の非限定的例は、有機塩素化合物、有機リン化合物及びカルバメート、ピレスロイド、ネオニコチノイド、ならびに、リアノイドである。
【００７７】
全てのタンパク質またはｄｓＲＮＡ分子が１つのプロモーターから発現するように、それぞれのタンパク質またはｄｓＲＮＡ分子が別々のプロモーターの制御下となるように、または、これらのいくつかの組み合わせとなるように、組換えＤＮＡ構築物をアセンブリしてもよい。本明細書で開示するタンパク質は、本明細書で開示する１種または複数種のタンパク質が共通のヌクレオチドセグメント（選択された発現系のタイプに応じてその他のオープンリーディングフレーム及び／またはプロモーターにも含まれる）から発現する多重遺伝子発現系から発現してもよい。例えば、細菌の多重遺伝子発現系は、単一のオペロン内から多重連結／タンデムオープンリーディングフレームの発現を駆動するのに単一のプロモーターを利用していてもよい。別の例では、植物の多重遺伝子発現系は、それぞれが異なるタンパク質またはその他の物質（例えば、１種または複数種のｄｓＲＮＡ分子など）を発現する多重連結発現カセットを利用していてもよい。更に別の例では、植物の多重遺伝子発現系は、それぞれが異なるタンパク質またはその他の物質（例えば、１種または複数種のｄｓＲＮＡ分子など）を発現する多重非連結発現カセットを利用していてもよい。本明細書に記載の組換え核酸に使用するプロモーターは、プロモーター活性または遺伝子調節活性を有する完全なプロモーター配列または任意のその変異体もしくはフラグメントを含んでいてもよい。
【００７８】
ベクター、例えば、プラスミド、バキュロウイルス、人工染色体、ビリオン、コスミド、ファージミド、ファージまたはウイルスベクターなどを使用して、ＢＣＷ毒性タンパク質コード配列を含む組換えポリヌクレオチドまたは組換えＤＮＡ構築物を宿主細胞に導入してもよい。このようなベクターを使用して、宿主細胞内におけるＢＣＷ毒性タンパク質コード配列の安定発現もしくは一過性発現、またはそれに続くポリペプチドの発現を達成してもよい。ＢＣＷ毒性タンパク質コード配列を含み宿主細胞に導入された外来の組換えポリヌクレオチドまたは組換えＤＮＡ構築物のことを本明細書では「導入遺伝子」と呼ぶ。
【００７９】
本明細書ではまた、本明細書で提供するＢＣＷ毒性タンパク質コード配列のうちのいずれか１種または複数種を発現する任意の組換えポリヌクレオチドを含有する形質転換細菌、形質転換植物細胞、形質転換植物、真菌及びイースト菌、ならびに、形質転換植物部位を提供する。用語「細菌細胞」または「細菌」としては、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓまたはＲｈｉｚｏｂｉｕｍ細胞を挙げることができるがこれらに限定されない。用語「植物細胞」または「植物」としては、アルファルファ、バナナ、大麦、インゲン、ブロッコリー、キャベツ、アブラナ属、人参、キャッサバ、トウゴマ、カリフラワー、セロリ、ヒヨコマメ、ハクサイ、柑橘類、ココナッツ、コーヒー、トウモロコシ、クローバー、綿、ウリ科、キュウリ、ダグラスモミ、ナス、ユーカリ、亜麻、ニンニク、ブドウ、ホップ、リーキ、レタス、テーダマツ、キビ、メロン、ナッツ、オート麦、オリーブ、タマネギ、観賞植物、ヤシ、牧草、エンドウ、ピーナッツ、コショウ、キマメ、マツ、ジャガイモ、ポプラ、カボチャ、ラジアータマツ、ダイコン、菜種、イネ、根茎、ライ麦、ベニバナ、低木、モロコシ、ダイオウマツ、ダイズ、ホウレンソウ、トウナス、イチゴ、サトウダイコン、サトウキビ、ヒマワリ、スイートコーン、モミジバフウ、サツマイモ、スイッチグラス、茶、タバコ、トマト、ライ小麦、芝草、スイカ及び小麦の植物細胞または植物を挙げることができるがこれらに限定されない。特定の実施形態では、形質転換植物細胞から再生した形質転換植物及び形質転換植物部位を提供する。特定の実施形態では、植物からその一部を、増殖、切断、破断、粉砕または別の方法で分離させることにより、形質転換種子から形質転換植物を得ることができる。特定の実施形態では、植物部位は、種子、さや、葉、花、茎、根もしくはその任意の部位、または、形質転換植物部位の再生不可能部位であってもよい。この文脈で使用される場合、形質転換植物部位の「再生不可能」部位は、誘導して完全な植物を生成することができない部位であるか、または、誘導して有性生殖及び／または無性生殖を実施可能な完全な植物を生成できない部位である。特定の実施形態では、植物部位の再生不可能部位は、形質転換種子、さや、葉、花、茎または根の部位である。
【００８０】
本明細書ではまた、昆虫またはＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ阻害量のＢＣＷ毒性タンパク質を含む形質転換植物を作製するための方法を提供する。本明細書で提供するＢＣＷ毒性タンパク質のいずれかをコードする組換えポリヌクレオチドを植物細胞に導入して、昆虫またはＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ阻害量のＢＣＷ毒性タンパク質を発現する上記植物細胞から誘導した植物を選抜することにより、このような植物を作製することができる。再生、種子、花粉または分裂組織形質転換技術により、植物細胞から植物を誘導することができる。
【００８１】
植物を形質転換するための方法は当技術分野において周知である。例えば、アグロバクテリウム媒介形質転換については、米国特許出願公開２００９／０１３８９８５Ａ１（ダイズ）、２００８／０２８０３６１Ａ１（ダイズ）、２００９／０１４２８３７Ａ１（トウモロコシ）、２００８／０２８２４３２（綿）、２００８／０２５６６６７（綿）、２００３／０１１０５３１（小麦）、２００１／００４２２５７Ａ１（サトウダイコン）、米国特許５，７５０，８７１（キャノーラ）、７，０２６，５２８（小麦）及び６，３６５，８０７（イネ）、ならびにｉｎ  Ａｒｅｎｃｉｂｉａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．７：２１３−２２２（サトウキビ）に記載されている。
【００８２】
本明細書ではまた、昆虫またはＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａの蔓延を抑制するための、昆虫またはＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ阻害量のＢＣＷ毒性タンパク質を発現する形質転換植物の使用を提供する。本明細書で提供する昆虫またはＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａの蔓延から植物を保護するための方法に、上記の形質転換植物のいずれかを使用することができる。Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ活性タンパク質、例えば、Ｃｒｙ１Ａタンパク質（米国特許番号５，８８０，２７５）、Ｃｒｙ１Ｂ（米国特許出願番号１０／５２５３１８）、Ｃｒｙ１Ｃ（米国特許番号６，０３３，８７４）、Ｃｒｙ１Ｆ、Ｃｒｙ１Ａ／Ｆキメラ（米国特許番号７，０７０，９８２、６，９６２，７０５及び６，７１３，０６３）、及び、Ｃｒｙ２Ａｂタンパク質（米国特許番号７，０６４，２４９）などを発現する形質転換植物を得るための方法についても十分特徴が明らかとなっている。
【００８３】
本明細書ではまた、ＢＣＷ毒性タンパク質を生成するための、上記の形質転換宿主細胞のいずれかの使用を提供する。
【００８４】
本発明の更なる態様は、抗体、ならびに、ＢＣＷ毒性タンパク質または極めて特徴的なそのフラグメント及びセグメントをコードするポリヌクレオチドを検出するための方法、タンパク質種の別の昆虫阻害性要素、配合を同定するための方法、昆虫の増殖及び／または蔓延を抑制するための方法、及び、このような抑制を植物及びその他の受容宿主にもたらすための方法を含む。
【００８５】
特定の実施形態では、植物製品は、形質転換植物または形質転換植物部位に由来する日用品またはその他の商品を含んでいてもよく、日用品またはその他の製品は、ヌクレオチドセグメント、または、ＢＣＷ毒性タンパク質の極めて特徴的な部位をコードするかまたはそれらを含む発現ＲＮＡもしくは発現タンパク質を検出することにより、商業を介して追跡することができる。このような日用品またはその他の商品としては、植物部位、バイオマス、油、荒粉、砂糖、動物飼料、穀粉、フレーク、糠、綿花、加工種子及び種子が挙げられるがこれらに限定されない。
【００８６】
本明細書ではまた加工植物製品を提供し、上記加工製品は、ＢＣＷ毒性タンパク質、そのセグメント、その昆虫阻害性フラグメントまたは極めて特徴的な任意のその部位をコードする検出可能量の組換えポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、加工製品は、植物バイオマス、油、荒粉、動物飼料、穀粉、フレーク、糠、綿花、もみ殻及び加工種子からなる群から選択される。特定の実施形態では、加工製品は再生不可能である。
【００８７】
本明細書ではまた、昆虫を防除するための方法を提供する。特定の実施形態では、作物植物におけるＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａの蔓延を抑制する。このような方法は、昆虫またはＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ阻害量のＢＣＷ毒性タンパク質を含む植物を栽培することを含んでいてもよい。特定の実施形態では、このような方法は、（ｉ）ＢＣＷ毒性タンパク質を含むかまたはコードする任意の組成物を、植物またはその植物を生じる種子に散布すること、及び／または、（ｉｉ）植物またはその植物を生じる植物細胞を、ＢＣＷ毒性タンパク質をコードするポリヌクレオチドで形質転換すること、のうちのいずれか１つまたは複数を更に含んでいてもよい。特定の実施形態では、植物は、昆虫またはＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ阻害量のＢＣＷ毒性タンパク質を発現する導入遺伝子を含む一過性または安定的に形質転換された形質転換植物である。特定の実施形態では、植物は、ＢＣＷ毒性タンパク質を含む組成物を散布した非形質転換植物である。このような方法の特定の実施形態では、植物はトウモロコシまたはサトウキビ植物である。特定の実施形態では、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ種はＡｇｒｏｔｉｓ  ｉｐｓｉｌｏｎである。特定の実施形態では、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ種はＤｉａｔｒａｅａ  ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓである。特定の実施形態では、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ種は作物田畑にいる。
【００８８】
植物においてまたはプロセスによって本明細書で開示するタンパク質を濃縮することは、組換えポリペプチド／タンパク質を発現／生成する条件下で組換えＢｔ細胞を培養することを含んでいてもよい。このようなプロセスとしては、上記組換えポリペプチドを発現／生成する組換えＢｔ細胞の培養液の乾燥、凍結乾燥、ホモジナイゼーション、抽出、濾過、遠心分離、沈殿または濃縮による調製を挙げることができる。このようなプロセスにより、Ｂｔ細胞抽出液、細胞懸濁液、細胞ホモジネート、細胞溶解液、細胞上清、細胞濾液または細胞ペレットをもたらすことができる。そのように生成した組換えポリペプチド／タンパク質を得ることにより、組換えポリペプチド／タンパク質を含む組成物に細菌細胞、細菌芽胞及び副芽胞封入体を含ませることができ、農業用昆虫阻害性噴霧製品または食餌バイオアッセイに用いる昆虫阻害性製剤を含む様々な用途用にその組成物を製剤化することができる。
【００８９】
一実施形態では、開示組換えポリペプチド／タンパク質を含む昆虫阻害性組成物／製剤は、同一のＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ昆虫種に対して昆虫阻害活性を示すが、ＢＣＷ毒性タンパク質またはその他のＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ昆虫阻害性組成物に対するＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ昆虫の耐性発現率を低下させる、組換えポリペプチドとは異なる少なくとも１種の別のポリペプチドを更に含んでいてもよい。このようなポリペプチドは、昆虫阻害性タンパク質、昆虫阻害性ｄｓＲＮＡ分子及び化合物からなる群から選択される。このようなリボヌクレオチド配列を、昆虫害虫を防除するために使用する１つの例は、米国特許出願公開番号２００６／００２１０８７に記載されている。その他のこのような組成物の例としては、Ｃｒｙ１Ａ（米国特許番号５，８８０，２７５）、Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ａｃ、Ｃｒｙ１Ａｅ、Ｃｒｙ１Ｂ（米国特許出願番号１０／５２５，３１８）、Ｃｒｙ１Ｃ（米国特許番号６，０３３，８７４）、Ｃｒｙ１Ｅ、Ｃｒｙ１Ｆ、ならびに、Ｃｒｙ１Ａ／Ｆキメラ（米国特許番号７，０７０，９８２、６，９６２，７０５及び６，７１３，０６３）、Ｃｒｙ１Ｇ、Ｃｒｙ１Ｈ、Ｃｒｙ１Ｉ、Ｃｒｙ１Ｊ、Ｃｒｙ１Ｋ、Ｃｒｙ１Ｌ、Ｃｒｙ２Ａ、Ｃｒｙ２Ａｂ（米国特許番号７，０６４，２４９）、Ｃｒｙ２Ａｅ、Ｃｒｙ４Ｂ、Ｃｒｙ６、Ｃｒｙ７、Ｃｒｙ８、Ｃｒｙ９、Ｃｒｙ１５、Ｃｒｙ４３Ａ、Ｃｒｙ４３Ｂ、ＥＴ３５、ＥＴ６６、ＴＩＣ４００、ＴＩＣ８００、ＴＩＣ８０７、ＴＩＣ８３４、ＴＩＣ８５３及びＴＩＣ１４１５が挙げられるがこれらに限定されない。その他の非限定例は、本明細書で開示するタンパク質と組み合わせることができるＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ活性タンパク質ＶＩＰ、Ａｘｍｉ及びＤＩＧであり、限定するわけではないが例えば、Ｖｉｐ３Ａ、ＶＩＰ３Ａｂ、ＡＸＭＩ−１８４、ＡＸＭＩ−１９６、ＤＩＧ−３、ＤＩＧ−４、ＤＩＧ−５及びＤＩＧ−１１などである。
【００９０】
その他の実施形態では、このような組成物は、得られた昆虫阻害スペクトルを広げるために、別の昆虫阻害性ＢＣＷ毒性タンパク質による阻害を受けない昆虫に対して昆虫阻害活性を示す少なくとも１種の別のポリペプチドを更に含んでいてもよい。例えば、Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａｎ害虫を防除するために、昆虫阻害性ＢＣＷ毒性タンパク質を、Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａｎ活性タンパク質、限定するわけではないが例えば、Ｃｒｙ１Ｃ変異体、Ｃｒｙ３Ａ変異体、Ｃｒｙ３Ｂｂ（米国特許番号６，５０１，００９）、Ｃｒｙ３４／３５、５３０７、Ａｘｍｉ１８４、Ａｘｍｉ２０５、ＡｘｍｉＲ１、ＴＩＣ４０７、ＴＩＣ４１７、ＴＩＣ４３１、ＴＩＣ９０１、ＴＩＣ１２０１、ＴＩＣ３１３１、ＤＩＧ−１０及びｅＨＩＰ（米国特許出願公開番号２０１０／００１７９１４）などと組み合わせて使用してもよい。
【００９１】
特定の殺虫剤に対する耐性を昆虫が発現する可能性については、当該技術分野において文書化されている。昆虫抵抗性管理戦略の１つは、異なる作用機序で作用する２種類の異なる昆虫阻害剤を発現する形質転換作物を採用することである。それゆえ、昆虫阻害剤のうちのいずれか一方に対して耐性を有する任意の昆虫を、もう一方の昆虫阻害剤で防除することができる。別の昆虫抵抗性管理戦略では、避難場所を設けるために、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ害虫種に対して保護されていない植物の使用を採用する。１つの詳細な例が米国特許番号６，５５１，９６２に記載されている。
【００９２】
本明細書で開示するその他の実施形態は、種子の処理にタンパク質と共に使用される、本明細書で開示するタンパク質によっても防除される害虫を防除するために設計された局所散布型の殺虫性化合物を含む。噴霧式、滴下式または塗布式の製剤を、直接土壌（土壌灌注）に散布してもよく、本明細書で開示するタンパク質を発現する生育中の植物に散布してもよく、または、開示タンパク質のうちの１種または複数種をコードする１種または複数種の導入遺伝子を含む種子に散布するために製剤化されてもよい。種子の処理に使用されるこのような製剤を、当該技術分野において周知の様々な展着剤及び粘着付与剤と共に散布してもよい。このような製剤は、ＭＯＡにおいて開示タンパク質と相乗的な殺虫剤を含有していてもよく、それにより、配合殺虫剤が異なるＭＯＡで作用し、開示タンパク質で防除可能な同一または同様の害虫を防除する、または、このような殺虫剤が作用し、より広い宿主範囲内の害虫、例えば、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ種もしくはＨｅｍｉｐｔｅｒａｎ種など、または、効果的には防除されないその他の植物害虫種、例えば、Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａｎ種などを防除する。
【００９３】
上記の組成物／製剤は、農業的に許容される担体、例えば、毒餌、粉末剤、粉剤、ペレット剤、顆粒剤、噴霧剤、エマルション剤、コロイド懸濁液、水溶液など、Ｂａｃｉｌｌｕｓ芽胞／結晶体製剤、種子処理剤、形質転換されて１種または複数種のタンパク質を発現する組換え植物細胞／植物組織／種子／植物、または、形質転換されて１種または複数種のタンパク質を発現する細菌を更に含んでいてもよい。組換えポリペプチド固有の昆虫阻害性または殺虫阻害のレベル、及び植物に散布するまたは食餌アッセイに適用する製剤のレベルに応じ、組成物／製剤は、様々な重量％の組換えポリペプチド、例えば、０．０００１重量％〜０．００１重量％〜０．０１重量％〜１重量％〜９９重量％の組換えポリペプチドを含んでいてもよい。
【００９４】
本明細書で開示するタンパク質を、植物の表面、土壌に局所散布する製剤中に混合させてもよく、種子処理用の製剤中に混合させてもよく、またＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ種の標的害虫に対する毒性を有するその他の薬剤を含む製剤中に混合させてもよい。このような薬剤としては、Ｃｒｙ１Ａタンパク質、Ｃｒｙ１Ｂ、Ｃｒｙ１Ｃ、Ｃｒｙ１Ｆ、Ｃｒｙ１Ａ／Ｆキメラ、及び、Ｃｒｙ２Ａｂタンパク質が挙げられるがこれらに限定されない。
【実施例】
【００９５】
以下に開示する実施形態は本発明の単なる代表であり、様々な形態で実施され得る。それゆえ、本明細書で開示する特定の構造的詳細及び機能的詳細は限定するものと解釈されるべきではない。本明細書に引用したそれぞれの参照文献の開示内容全体は参照により本明細書に組み込まれると理解すべきである。
【００９６】
実施例１
本実施例は、毒性タンパク質ＢＣＷ  ００１の発見及び解析、ならびに、キメラ毒性ＢＣＷ  ００２及びＢＣＷ  ００３の構築について教示する。
【００９７】
芽胞結晶体製剤を使用した食餌バイオアッセイにおいて、Ｂｔ株ＥＧ４３８４がＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ活性を付与することを確認した。この株のゲノムの配列を作製し、生シークエンスリードを加工し、加工リードからコンティグをアセンブリし、Ｃｒｙ１タンパク質に対して相同性を示すオープンリーディングフレームを同定し、演繹アミノ酸配列を解析した。配列番号：１に記載の特定のオープンリーディングフレームは、当該技術分野において周知の多くのＣｒｙ１タンパク質と比較して新規のアミノ酸配列を示すタンパク質（ＢＣＷ  ００１、配列番号：２）の演繹アミノ酸配列をコードすることが確認された。オープンリーディングフレームから演繹されたタンパク質は新規Ｃｒｙ１型タンパク質の特徴の全てを有しているが、実際は１１８０アミノ酸長であり、既知のＣｒｙ１タンパク質に対するアライメントにより、このタンパク質が、約６００〜６３０のアミノ末端アミノ酸内に特徴的な３ドメイン構造、及び、Ｃｒｙ１Ａ型に固有のプロトキシンアミノ酸配列構造を有していることが示された。この予測アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列は、Ｃｒｙ１に固有でもあるオープンリーディングフレーム、すなわち、毒素の予測ドメインＩのＣ末端領域をコードするＤＮＡセグメント内のＮｈｅＩ制限部位、及び、予測プロトキシンドメインのＮ末端部位をコードするＤＮＡセグメント内のＫｐｎＩ制限部位を含有している。
【００９８】
ＢＣＷ  ００１毒素のアミノ酸配列をＣｒｙ１Ａｃと比較することにより、ドメインＩに相当するアミノ酸セグメント（約１位から約２５８位までのアミノ酸）がＣｒｙ１Ａｃ内のその同一セグメントに対してせいぜい約６７％の同一性を示し、ドメインＩＩに相当するアミノ酸セグメント（約５８位から約４６０位までのアミノ酸）がＣｒｙ１Ａｃ内のその同一のセグメントに対して極めて低いパーセント同一性を示し、ドメインＩＩＩに相当するアミノ酸セグメント（約４６０位から約６０７位までのアミノ酸）がＣｒｙ１Ａｈ２のドメインＩＩＩセグメントに対して約６３％の同一性を示すことが明らかとなった。
【００９９】
Ｃｒｙ１ＡｃをコードするＤＮＡセグメントを含有する発現ベクター内で、ＮｈｅＩ制限部位からＫｐｎＩ制限部位までの予測ドメインＩＩ及びＩＩＩを実質的にコードするＤＮＡセグメントを切除してＣｒｙ１Ａｃコード配列の対応するセグメントに置換することにより、Ｃｒｙ１ＡｃのドメインＩをコードする第１のセグメント、ＢＣＷ  ００１のドメインＩＩ及びＩＩＩをコードする第２のセグメント、及び、Ｃｒｙ１Ａｃ毒性タンパク質のプロトキシンドメインをコードする第３のセグメントからなり、５プライムから３プライムにかけてこの連続順でインフレームに連結したオープンリーディングフレームをもたらした。このキメラ構築物（配列番号：３）は、本明細書ではＢＣＷ  ００２（配列番号：４）と呼ぶキメラ毒性タンパク質をコードする。ドメインＩとドメインＩＩの間の区切り点をわずかにずらすことにより、本明細書ではＢＣＷ  ００３（配列番号：６）と呼ぶキメラ毒性タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（配列番号：５）（ＢＣＷ  ００２とは酸位置２５９のみが異なるアミノ酸配列を有する）がもたらされた。ＢＣＷ  ００３がＢＣＷ  ００１と同様に２５９位にスレオニン（Ｔ）を含有している一方で、ＢＣＷ  ００２はその位置にイソロイシン（Ｉ）を含有している。ＢＣＷ  ００１は主に毒素のドメインＩ内（すなわち、アミノ酸１〜２０２）においてＢＣＷ  ００２及びＢＣＷ  ００３とは異なっており、上に記載したとおり、ＢＣＷ  ００２とＢＣＷ  ００３は、２５９位のＩ／Ｔの差異を除き事実上同一である。
【０１００】
実施例２
本実施例は、ＢＣＷ  ００１、００２及び００３タンパク質の効果的なＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ害虫防除生物活性について教示する。
【０１０１】
ＢＣＷ  ００１、００２及び００３毒性タンパク質を発現する構築物を、Ｅ．ｃｏｌｉまたは適用可能なＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓもしくはその他のＢａｃｉｌｌｉに形質転換することにより、バイオアッセイによる発現タンパク質の試験、及び、クロヨトウムシに対して毒性を有する当該技術分野において周知のタンパク質、例えば、Ｃｒｙ１Ｆａ及びＣｒｙ１Ａｃなどとの比較が可能となった。得られた組換え株が、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ害虫に対して活性を有する組換えタンパク質を発現することが認められた。バイオアッセイ活性は、クロヨトウムシ幼虫及びオオタバコガ幼虫に対して試験を行った際に特に強力であった。発明を実施するための形態、背景技術及び発明の概要において上で明記したとおり、クロヨトウムシに対する任意の顕著なレベルの生物活性を示すことが発見されている毒性タンパク質は極めて少ないことから、クロヨトウムシの蔓延から植物を保護するためにこのような植物に用いられるこのようなタンパク質を同定すること、及び、現在使用されている任意のクロヨトウムシ活性タンパク質、例えば、Ｃｒｙ１Ｆａ毒性タンパク質などに対する耐性の任意の発現を克服するのに利用可能なこのような補助的なクロヨトウムシ活性タンパク質の十分な供給を確保することが当該技術分野において求められている。
【０１０２】
実施例３
本実施例は、ＢＣＷ  ００１のドメインＩＩ及びＩＩＩをその他のＣｒｙ１毒素などの対応するドメインに置換する際に、このようなドメインが、クロヨトウムシ生物活性をその他のＣｒｙ１毒性タンパク質に伝えるのに十分であることについて教示する。
【０１０３】
Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａに対する活性を有する多くのＢＣＷ毒素キメラを同定したが、特に２種類のキメラがＢＣＷ、ＷＢＣ及びＳＣＢに対して強力な活性を示した。
【０１０４】
Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ａｃ及びＣｒｙ１Ｃａをコードするヌクレオチド配列を有する構築物を使用して、Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ａｃ及びＣｒｙ１Ｃａの適用可能なドメインに置換したドメインＩＩ及びドメインＩＩＩ  ＢＣＷ  ００１セグメントを含有するキメラを構築し、芽胞結晶体バイオアッセイで得られた天然タンパク質及びキメラタンパク質を試験した。このような食餌バイオアッセイにおけるＢＣＷ、ＦＡＷ及びＣＥＷに対する活性を表にした。試験を行った実験条件下において、Ｃｒｙ１ＡｃはＦＡＷ、ＢＣＷ及びＣＥＷに対して活性を示し、Ｃｒｙ１ＡｂはＦＡＷ及びＣＥＷに対して活性を示したが、ＢＣＷに対しては活性を示さず、Ｃｒｙ１ＣａはＦＡＷ、ＢＣＷに加えＣＥＷに対して活性を示さなかった。ＢＣＷ  ００１はＢＣＷ及びＣＥＷに対して活性を示したが、ＦＡＷに対しては活性を示さなかった。ＢＣＷ  ００３と比較して、ＢＣＷに対するＣｒｙ１Ａｃの活性はＣｒｙ１Ａｃにおいて約１０倍低かった。ＢＣＷ  ００１のドメインＩＩ及びＩＩＩを含有するＣｒｙ１Ａｂキメラ及びＣｒｙ１Ａｃキメラは、ＦＡＷ、ＢＣＷ及びＣＥＷに対するバイオアッセイで試験を行った際に毒性特性を示した。Ｃｒｙ１ＡｃはＣＥＷに対して毒性を示さず、Ｃｒｙ１ＡｂはＢＣＷに対して毒性を示さなかった。Ｃｒｙ１ＣａドメインＩＩＩをＢＣＷ  ００１の対応するドメインに置換したＣｒｙ１Ｃａ／ＢＣＷ  ００１キメラを構築したが、得られたキメラ毒素がＦＡＷ、ＢＣＷ及びＣＥＷに対して毒性特性を示した一方で、Ｃｒｙ１Ｃａ毒素はこれら害虫のうちのいずれかに対して試験を行った際に効果を示さなかった。
【０１０５】
実施例４
本実施例では、様々なＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ害虫に対するバイオアッセイで試験を行った際のＢＣＷ  ００１、００２及び００３の毒性特性について説明する。
【０１０６】
バイオアッセイ、ならびに、昆虫の死亡率及び成長阻害をスコアリングするためのプロトコルは当該技術分野において周知であり、その例については、ＰＣＴ特許出願公開番号ＷＯ２０１２／１３９００４及び米国特許番号７，９２７，５９８に記載されている。
【０１０７】
図１は、様々なＢＣＷ  ００１、００２及び００３毒性タンパク質の、食餌バイオアッセイにおける昆虫種による殺虫活性との相関を示している。これら毒性タンパク質のそれぞれはＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ昆虫に対して活性を示した。
【０１０８】
実施例５
本実施例は、植物、植物に使用する植物ベクター及び構築物の作製、ならびに、本発明のタンパク質を発現する植物の生成に使用する、本発明のタンパク質をコードする合成配列の構築について教示する。
【０１０９】
米国特許５，５００，３６５に記載の方法に従い、ＢＣＷ  ００１タンパク質をコードするヌクレオチド配列（配列番号：１）、ＢＣＷ  ００２タンパク質をコードするヌクレオチド配列（配列番号：３）及びＢＣＷ  ００３タンパク質をコードするヌクレオチド配列（配列番号：５）を設計して合成した。植物における発現用に設計されたこれらの遺伝子操作コード領域を、ＢＣＷ  ００１をコードする配列番号：７、ＢＣＷ  ００２をコードする配列番号：９、及びＢＣＷ  ００３をコードする配列番号：１１として本明細書で提供する。
【０１１０】
配列番号：７、９及び１１に記載の配列を用いて様々な植物発現カセットを構築した。このような発現カセットは、植物プロトプラストにおける一過性発現または植物細胞の形質転換に有用である。細胞内における最終的なタンパク質の配置を基準として標準的な発現カセットを設計した。タンパク質が翻訳されて細胞質基質内に残るような様式で１セットの発現カセットを設計した。毒性タンパク質に隣接する移行ペプチドが細胞の細胞器官（例えば、葉緑体またはプラスチドなど）を標的とするように別のセットの発現カセットを設計した。全ての発現カセットを５´末端においてプロモーターで開始するように設計したが、導入遺伝子の発現を増強させるための連続して連結した複数のプロモーターエレメント及びエンハンサーエレメントからなっていてもよい。プロモーター配列は通常、プロモーターの３´側にある１つまたは複数のリーダー配列に連続して続いていた。イントロン配列は、導入遺伝子の発現を向上させるためにリーダー配列の３´側に設けられていた。毒素または移行ペプチド用のコード配列、及び毒素用のコード配列は、プロモーター、リーダー及びイントロン構成の３´側に配置されていた。転写の終了を容易とし得られた転写物のポリアデニル化に重要な配列をもたらすために、コード配列の３´側に配列を設けた。上記のエレメントの全ては、多くの場合、発現カセットの構築用に設けられた別の配列、例えば、制限エンドヌクレアーゼ部位またはライゲーション非依存性クローニング部位などを伴い連続して配列された。
【０１１１】
トウモロコシ植物において、Ｍｅｘｉｃａｎａユビキチン１プロモーターを含むＢＣＷ  ００１、Ｏｒｙｓｚａ  ｓａｔｉｖａアクチン１５プロモーターまたは３５Ｓプロモーターを含むＢＣＷ  ００２、及び３５Ｓプロモーターを含むＢＣＷ  ００３の細胞質基質発現用に、１セットの発現カセットを設計した。
【０１１２】
ＢＣＷ  ００２及びＢＣＷ  ００３昆虫毒性タンパク質のトウモロコシ植物における標的発現用に、葉緑体ペプチドコード配列（例えば、ＣＴＰ２）がＢＣＷ毒性タンパク質をコードするＤＮＡのセグメントの５´末端にインフレームで融合した、別のセットの発現カセット（Ｏｒｙｓｚａ  ｓａｔｉｖａアクチン１５プロモーターまたは３５Ｓプロモーター、及び３５Ｓプロモーターを含む配列を含む）を設計した。
【０１１３】
植物形質転換ベクターを用いて、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター、または３５Ｓプロモーターに機能的に連結するＰＣｌＳＶ．ＦＬｔプロモーターを含むサトウキビ植物発現カセットを構築した。一部の例では、葉緑体標的化Ｃｒｙ２Ａｂを発現するカセットを含ませた。
【０１１４】
３齢のＢＣＷ、ＷＢＣ、ＣＥＷ、ＳＷＣ及びＳＣＢの幼虫に対して、本発明のタンパク質を発現する植物を試験した。ＢＣＷ  ００１用の細胞質基質発現カセット、ならびに、ＢＣＷ  ００２及びＢＣＷ  ００３用の細胞質基質及びプラスチド標的発現カセットをクローニングし、それらを使用して、これらのタンパク質を発現する形質転換トウモロコシイベントを生じさせた。当該技術分野において周知の方法を用いて形質転換細胞を誘導して植物を生成した。米国特許８，３４４，２０７に記載のとおり同様に、植物のリーフディスクを用いたバイオアッセイを実施した。昆虫により摂食されたリーフディスクの割合に基づき０（０％の摂食）〜１１（５０％超の摂食）のスケールで葉損傷評定（ＬＤＲ）の評定スコアを割り当てた。評定スコアの段階は５％毎に漸増する。同一遺伝子のトウモロコシ株を使用して陰性対照としての組織を誘導し、その結果を評価した。ＢＣＷ  ００２昆虫毒性タンパク質とＢＣＷ  ００３昆虫毒性タンパク質のプラスチド標的発現と細胞質基質発現の両方は、非形質転換対照と比較して食害を抑制した。これらの昆虫に対するリーフディスクアッセイの結果は、上に示した実施例のバイオアッセイデータと一致した。細胞質基質発現用のＢＣＷ  ００３カセットを含む１つの構築物は、３４の形質転換イベントをもたらし、これらのうちの２５はＢＣＷ新生虫の完全な防除を示した。ＢＣＷ  ００１とＢＣＷ  ００３を細胞質基質内に発現するトウモロコシ植物についても、ＣＥＷ、ＳＷＣ及びＦＡＷに対して試験した。ＢＣＷ  ００３を発現する植物はＣＥＷ及びＳＷＣの１００％の防除を示し、ＬＤＲの値は１〜２の範囲であった。ＢＣＷ  ００１を発現する３つの形質転換イベントはＣＥＷ及びＳＷＣに対する効果を示す植物をもたらし、ＬＤＲの値は１〜３の範囲であった。このことは、これまでの実施例に示す食餌バイオアッセイデータと一致する。
【０１１５】
ＢＣＷ  ００３を発現する形質転換サトウキビ植物を作製し、バイオアッセイでＳＣＢに対して試験した。それぞれのバイオアッセイは、陰性対照としての野生型サトウキビ由来のリーフディスク、及び高レベルのＣｒｙ２Ａｂを発現する陽性対照を含んでいた。蔓延の４日後に昆虫の死亡率及び葉の損傷を評価した。ＢＣＷ  ００３を発現するいくつかの形質転換サトウキビイベントに由来するリーフディスクがｉｎ  ｐｌａｎｔａでサトウキビメイガを防除することが判明し、陽性対照と同様の２未満の損傷評定、及び９０〜１００％の平均昆虫死亡率を示した。
【０１１６】
ＢＣＷ  ００３とＣｒｙ２Ａｂを発現する形質転換イベントは、ＢＣＷ  ００３のみを発現するイベントと比較してより優れたＳＣＢの防除を示した。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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