(57)【要約】本発明は、ミニブタ試料において、抗薬物抗体（ADA）の、もしくは薬物／ADA免疫複合体の、存在または非存在を決定するためのインビトロ方法に関連する。本発明はさらに、本発明の方法に適用可能な、ミニブタIgGに特異的に結合する抗体に関連する。2020530901.tif 000026
2020530901.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミニブタ試料において抗薬物抗体（ADA）の存在または非存在を決定するためのインビトロ方法であって、以下の段階を含む、方法：
a)  薬物／ADA複合体を形成させるために、試料を、過剰量の、ADAが結合する薬物と接触させる段階；
b)  i.  SEQ ID NO: 3の重鎖のCDR1、SEQ ID NO: 4の重鎖のCDR2、およびSEQ ID NO: 5の重鎖のCDR3、SEQ ID NO: 6の軽鎖のCDR1、SEQ ID NO: 7の軽鎖のCDR2、およびSEQ ID NO: 8の軽鎖のCDR3を含む、抗体、
ii.  SEQ ID NO: 19の重鎖のCDR1、SEQ ID NO: 20の重鎖のCDR2、およびSEQ ID NO: 21の重鎖のCDR3、SEQ ID NO: 22の軽鎖のCDR1、SEQ ID NO: 23の軽鎖のCDR2、およびSEQ ID NO: 24の軽鎖のCDR3を含む、抗体、または
iii.  SEQ ID NO: 27の重鎖のCDR1、SEQ ID NO: 28の重鎖のCDR2、およびSEQ ID NO: 29の重鎖のCDR3、SEQ ID NO: 30の軽鎖のCDR1、SEQ ID NO: 31の軽鎖のCDR2、およびSEQ ID NO: 32の軽鎖のCDR3を含む、抗体
から選択される、ミニブタIgGに特異的に結合する抗体であって、ヒトIgGには結合しない、ミニブタIgGに特異的に結合する抗体
と、薬物／ADA複合体とを接触させる段階；ならびに
c)  ADAが試料中に存在するかどうかを決定するために、ミニブタIgGに特異的に結合する抗体の、薬物／ADA複合体への結合を決定する段階。
【請求項２】
段階a)において、薬物が支持体に固定化されている、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
ミニブタ試料において、薬物と該薬物に特異的に結合する抗体とを含む免疫複合体（薬物／ADA複合体）の存在または非存在を決定するためのインビトロ方法であって、以下の段階を含む、方法：
a)  ミニブタ試料中に存在する薬物／ADA複合体を固定化するために、ミニブタ試料を、薬物と特異的に結合する固定化されている抗体と、接触させる段階；
b)  i.  SEQ ID NO: 3の重鎖のCDR1、SEQ ID NO: 4の重鎖のCDR2、およびSEQ ID NO: 5の重鎖のCDR3、SEQ ID NO: 6の軽鎖のCDR1、SEQ ID NO: 7の軽鎖のCDR2、およびSEQ ID NO: 8の軽鎖のCDR3を含む、抗体、
ii.  SEQ ID NO: 19の重鎖のCDR1、SEQ ID NO: 20の重鎖のCDR2、およびSEQ ID NO: 21の重鎖のCDR3、SEQ ID NO: 22の軽鎖のCDR1、SEQ ID NO: 23の軽鎖のCDR2、およびSEQ ID NO: 24の軽鎖のCDR3を含む、抗体、または
iii.  SEQ ID NO: 27の重鎖のCDR1、SEQ ID NO: 28の重鎖のCDR2、およびSEQ ID NO: 29の重鎖のCDR3、SEQ ID NO: 30の軽鎖のCDR1、SEQ ID NO: 31の軽鎖のCDR2、およびSEQ ID NO: 32の軽鎖のCDR3を含む、抗体
から選択される、ミニブタIgGに特異的に結合する抗体であって、ヒトIgGには結合しない、ミニブタIgGに特異的に結合する抗体
と、薬物／ADA複合体とを接触させる段階；ならびに
c)  ADAが試料中に存在するかどうかを決定するために、ミニブタIgGに特異的に結合する抗体の、薬物／ADA複合体への結合を決定する段階。
【請求項４】
ミニブタIgGに特異的に結合する抗体が、マウスIgGには特異的に結合しない、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
ミニブタIgGに特異的に結合する抗体が、
a)  SEQ ID NO: 1のVH配列およびSEQ ID NO: 2のVL配列；
b)  SEQ ID NO: 17のVH配列およびSEQ ID NO: 18のVL配列；または
c)  SEQ ID NO: 25のVH配列およびSEQ ID NO: 26のVL配列
を含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
ミニブタIgGに特異的に結合する抗体が、ミニブタIgGのFabドメインに特異的に結合する、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
薬物が抗体医薬（DA）である、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
抗体医薬がヒトIgG抗体またはヒト化IgG抗体である、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
抗体医薬がFab断片である、請求項7〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
方法がサンドイッチアッセイであって、
段階a)において、薬物／ADA複合体を、ヒトIgGに特異的に結合する抗体と接触させ、ここでヒトIgGに特異的に結合する抗体は支持体に固定化されており、それにより薬物／ADA複合体を支持体に固定化し、
続いて段階b)によって、固定化された薬物／ADA複合体を、ミニブタIgGに特異的に結合する抗体と接触させる、
請求項8または9に記載の方法。
【請求項１１】
ミニブタIgGに特異的に結合する抗体が、検出可能な標識にコンジュゲートされている、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
a)  SEQ ID NO: 3の重鎖のCDR1、SEQ ID NO: 4の重鎖のCDR2、およびSEQ ID NO: 5の重鎖のCDR3、SEQ ID NO: 6の軽鎖のCDR1、SEQ ID NO: 7の軽鎖のCDR2、およびSEQ ID NO: 8の軽鎖のCDR3；
b)  SEQ ID NO: 19の重鎖のCDR1、SEQ ID NO: 20の重鎖のCDR2、およびSEQ ID NO: 21の重鎖のCDR3、SEQ ID NO: 22の軽鎖のCDR1、SEQ ID NO: 23の軽鎖のCDR2、およびSEQ ID NO: 24の軽鎖のCDR3；または
c)  SEQ ID NO: 27の重鎖のCDR1、SEQ ID NO: 28の重鎖のCDR2、およびSEQ ID NO: 29の重鎖のCDR3、SEQ ID NO: 30の軽鎖のCDR1、SEQ ID NO: 31の軽鎖のCDR2、およびSEQ ID NO: 32の軽鎖のCDR3
を含む、ミニブタIgGに特異的に結合する抗体。
【請求項１３】
a)  SEQ ID NO: 1のアミノ酸配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するVH配列、およびSEQ ID NO: 2のアミノ酸配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するVL配列を含む、抗体；
b)  SEQ ID NO: 17のアミノ酸配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するVH配列、およびSEQ ID NO: 18のアミノ酸配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するVL配列を含む、抗体；または
c)  SEQ ID NO: 25のアミノ酸配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するVH配列、およびSEQ ID NO: 26のアミノ酸配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するVL配列を含む、抗体
から選択される、請求項13に記載の抗体。
【請求項１４】
ミニブタ試料において抗薬物抗体（ADA）の存在または非存在を決定するための方法における使用のための、請求項13または14に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野
本発明は、ミニブタ試料において抗薬物抗体を決定するためのインビトロ方法、およびミニブタIgGに特異的に結合する抗体に関連する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
新規な治療用抗体の臨床開発は、それらの潜在的な免疫原性の、適切なアッセイによる評価を必要とする（Kaliyaperumal, A. and Jing, S., Curr. Pharm. Biotechnol. 10 (2009) 352-358（非特許文献1））。抗薬物抗体（ADA）の試験は通常、2階層のアプローチを含む：(1) ADAの検出のためのアッセイ、および(2) ADAの特徴付けのためのアッセイ。ADA検出アッセイは、スクリーニングアッセイおよび特異性確認（確認用）アッセイを含む。マイクロタイタープレートベースの酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）は、その高スループットの効率性、容易さ、および高感度のゆえに、ADAをスクリーニングするためにもっとも広く使用されるフォーマットである（Geng, D., et al., J. Pharm. Biomed. Anal. 39 (2005) 364-375（非特許文献2））。ADA ELISAは多くの場合、高い選択性、すべてのアイソタイプの検出、およびすべての種のADA検出能力を提供するブリッジフォーマットとして設計される（Mire-Sluis, A.R., et al., J. Immunol. Methods 289 (2004) 1-16（非特許文献3））。サル種に由来する試料においてADAを検出するためのADA ELISAは、WO 2008031532 A1（特許文献1）に開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】WO 2008031532 A1
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Kaliyaperumal, A. and Jing, S., Curr. Pharm. Biotechnol. 10 (2009) 352-358
【非特許文献２】Geng, D., et al., J. Pharm. Biomed. Anal. 39 (2005) 364-375
【非特許文献３】Mire-Sluis, A.R., et al., J. Immunol. Methods 289 (2004) 1-16
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、ミニブタ試料において抗薬物抗体（ADA）の存在または非存在を決定するためのインビトロ方法に関連し、該方法は以下の段階を含む：
−  薬物／ADA複合体を形成させるために、試料を、過剰量の、ADAが結合する薬物と接触させる段階、
−  薬物／ADA複合体を、ミニブタIgGに特異的に結合する抗体と接触させる段階であって、ミニブタIgGに特異的に結合する抗体はヒトIgGには特異的に結合しない、段階、
−  ADAが試料中に存在するかどうかを決定するために、ミニブタIgGに特異的に結合する抗体の、薬物／ADA複合体への結合を決定する段階。
【０００６】
別の局面において、本発明は、ミニブタ試料において、薬物と該薬物に特異的に結合する抗体とを含む免疫複合体（薬物／ADA複合体）の存在または非存在を決定するためのインビトロ方法に関連し、該方法は以下の段階を含む：
a)  ミニブタ試料中に存在する薬物／ADA複合体を固定化するために、ミニブタ試料を、薬物と特異的に結合する固定化されている抗体と、接触させる段階、
b)  薬物／ADA複合体を、ミニブタIgGに特異的に結合する抗体と接触させる段階であって、ミニブタIgGに特異的に結合する抗体はヒトIgGには特異的に結合しない、段階、および
c)  ADAが試料中に存在するかどうかを決定するために、ミニブタIgGに特異的に結合する抗体の、薬物／ADA複合体への結合を決定する段階。
【０００７】
本発明の1つの態様において、ミニブタIgGに特異的に結合する抗体は、ヒトIgGには特異的に結合しない。本発明の1つの態様において、ミニブタIgGに特異的に結合する抗体は、マウスIgGには特異的に結合しない。
【０００８】
本発明の1つの態様において、ミニブタIgGに特異的に結合する抗体は、ミニブタIgGのFcドメインに特異的に結合する。1つの態様において、ミニブタIgGのFcドメインに特異的に結合する抗体は、SEQ ID NO: 3の重鎖のCDR1、SEQ ID NO: 4の重鎖のCDR2、およびSEQ ID NO: 5の重鎖のCDR3、SEQ ID NO: 6の軽鎖のCDR1、SEQ ID NO: 7の軽鎖のCDR2、およびSEQ ID NO: 8の軽鎖のCDR3（本明細書において開示される抗体「2.8.14」の6つのCDRに対応）を含む。
【０００９】
本発明の1つの態様において、ミニブタIgGに特異的に結合する抗体は、ミニブタIgGのFabドメインに特異的に結合する。1つの態様において、ミニブタIgGのFabドメインに特異的に結合する抗体は、SEQ ID NO: 11の重鎖のCDR1、SEQ ID NO: 12の重鎖のCDR2、およびSEQ ID NO: 13の重鎖のCDR3、SEQ ID NO: 14の軽鎖のCDR1、SEQ ID NO: 15の軽鎖のCDR2、およびSEQ ID NO: 16の軽鎖のCDR3（本明細書において開示される抗体「1.2.6」の6つのCDRに対応）を含む。1つの態様において、ミニブタIgGのFabドメインに特異的に結合する抗体は、SEQ ID NO: 19の重鎖のCDR1、SEQ ID NO: 20の重鎖のCDR2、およびSEQ ID NO: 21の重鎖のCDR3、SEQ ID NO: 22の軽鎖のCDR1、SEQ ID NO: 23の軽鎖のCDR2、およびSEQ ID NO: 24の軽鎖のCDR3（本明細書において開示される抗体「2.3.8」の6つのCDRに対応）を含む。1つの態様において、ミニブタIgGのFabドメインに特異的に結合する抗体は、SEQ ID NO: 27の重鎖のCDR1、SEQ ID NO: 28の重鎖のCDR2、およびSEQ ID NO: 29の重鎖のCDR3、SEQ ID NO: 30の軽鎖のCDR1、SEQ ID NO: 31の軽鎖のCDR2、およびSEQ ID NO: 32の軽鎖のCDR3（本明細書において開示される抗体「2.11.16」の6つのCDRに対応）を含む。
【００１０】
本発明の1つの態様において、薬物は抗体医薬（DA）である。
【００１１】
本発明の1つの態様において、方法はサンドイッチアッセイであり、該方法においては、段階a)において、薬物／ADA複合体を、ヒトIgGに特異的に結合する抗体と接触させ、ここでヒトIgGに特異的に結合する抗体は支持体に固定化されており、それにより薬物／ADA複合体を支持体に固定化し、続いて段階b)によって、固定化された薬物／ADA複合体を、ミニブタIgGに特異的に結合する抗体と接触させる。
【００１２】
本発明の別の局面は、SEQ ID NO: 3の重鎖のCDR1、SEQ ID NO: 4の重鎖のCDR2、およびSEQ ID NO: 5の重鎖のCDR3、SEQ ID NO: 6の軽鎖のCDR1、SEQ ID NO: 7の軽鎖のCDR2、およびSEQ ID NO: 8の軽鎖のCDR3（本明細書において開示される抗体「2.8.14」の6つのCDRに対応）を含む、ミニブタIgGに特異的に結合する抗体である。
【００１３】
本発明の別の局面は、SEQ ID NO: 11の重鎖のCDR1、SEQ ID NO: 12の重鎖のCDR2、およびSEQ ID NO: 13の重鎖のCDR3、SEQ ID NO: 14の軽鎖のCDR1、SEQ ID NO: 15の軽鎖のCDR2、およびSEQ ID NO: 16の軽鎖のCDR3（本明細書において開示される抗体「1.2.6」の6つのCDRに対応）を含む、ミニブタIgGに特異的に結合する抗体である。
【００１４】
本発明の別の局面は、SEQ ID NO: 19の重鎖のCDR1、SEQ ID NO: 20の重鎖のCDR2、およびSEQ ID NO: 21の重鎖のCDR3、SEQ ID NO: 22の軽鎖のCDR1、SEQ ID NO: 23の軽鎖のCDR2、およびSEQ ID NO: 24の軽鎖のCDR3（本明細書において開示される抗体「2.3.8」の6つのCDRに対応）を含む、ミニブタIgGに特異的に結合する抗体である。
【００１５】
本発明の別の局面は、SEQ ID NO: 27の重鎖のCDR1、SEQ ID NO: 28の重鎖のCDR2、およびSEQ ID NO: 29の重鎖のCDR3、SEQ ID NO: 30の軽鎖のCDR1、SEQ ID NO: 31の軽鎖のCDR2、およびSEQ ID NO: 32の軽鎖のCDR3（本明細書において開示される抗体「2.11.16」の6つのCDRに対応）を含む、ミニブタIgGに特異的に結合する抗体である。
【００１６】
本発明の別の局面は、ミニブタ試料において抗薬物抗体（ADA）の存在または非存在を決定するための方法における使用のための、ミニブタIgGに特異的に結合する、本発明による抗体である。
【００１７】
本発明の方法および抗体は、ミニブタ試料、たとえば血漿、硝子体液、および眼房水における、ADAの、および薬物／ADA複合体の、信頼性のある検出を可能にする。本発明の抗体は、ヒト由来のIgGまたはマウス由来のIgGに対して、有意な交差反応性を示さない。本発明の抗体は、それらが低いシグナル対ノイズ比を示すために、本発明の方法において適用されるのに特に適している。本発明の方法は、高い薬物用量の存在下、たとえば硝子体液試料中において、信頼性のある検出を可能にする。したがって、該方法は、たとえば、眼科用の薬物に反応して形成されるADAを評価するために好都合である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】モノクローナル抗ミニブタIgG 2.8.14、ならびに市販の、Abd-SerotecからのHRPコンジュゲートポリクローナル抗ブタIgG（pAb）およびジゴキシゲニン化モノクローナル抗ブタIgG（mAb）の、ミニブタ、ヒト、ヒヒ、アカゲザル、カニクイザル、マーモセット、イヌ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、およびウサギ由来のIgGへの結合（実施例3に記載される評価）。
【図２】モノクローナル抗ミニブタIgG 2.8.14および2.3.8、ならびに市販のポリクローナル抗ブタIgG抗体の、ヒトIgG1クラスの種々の抗体医薬への結合（実施例4に記載される評価）。
【図３】ミニブタ試料からの薬物／ADA複合体の検出のための方法（プレインキュベーション無しのICアッセイ）［本発明の方法］の、例示となる図解。
【図４】ミニブタ試料において薬物／ADA複合体を検出するための本発明の方法（薬物とのプレインキュベーション無しのICアッセイ）における、市販の抗ブタIgG抗体と対比させた、本発明のモノクローナル抗ミニブタIgG抗体の適用。実験の説明については実施例5を参照されたい。
【図５】ミニブタ試料からのADAの検出のための方法（プレインキュベーション有りのICアッセイ）［本発明の方法］の、例示となる図解。
【図６】ミニブタ試料においてADAを検出するための本発明の方法（薬物とのプレインキュベーション有りのICアッセイ）における、市販の抗ブタIgG抗体と対比させた、本発明のモノクローナル抗ミニブタIgG抗体の適用。実験の説明については実施例6を参照されたい。
【図７】実施例7に記載されるブリッジングアッセイを介した検出と比較した、ミニブタ試料からのADAの、本発明の方法（薬物とのプレインキュベーション有りのICアッセイ）を用いた検出。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の詳細な説明
1.  定義
本明細書において別途定義されない限り、本発明に関して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈によって別途定められる場合を除き、単数形の用語は複数を含むものとし、かつ複数形の用語は単数を含むものとする。本開示の方法および技術は、概して、当技術分野において周知である従来の方法にしたがって実施される。概して、本発明に関して使用される学術用語、ならびに本明細書において記載される生化学、酵素学、分子生物学および細胞生物学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質化学および核酸化学、ならびにハイブリダイゼーションの技術は、周知であり、かつ当技術分野において一般的に使用されているものである。
【００２０】
本明細書において別途定義されない限り、「含む」との語は、「からなる」との語を含むものとする。
【００２１】
「抗体」との語は、本明細書において、もっとも広い意味において使用され、かつ、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（たとえば二重特異性抗体）、および抗体断片を含むがこれらに限定されないさまざまな抗体構造を、それらが所望の抗原結合活性を示す限り、包含する。
【００２２】
「抗ミニブタIgG抗体」および「ミニブタIgGに結合する抗体」との語は、ミニブタIgGを標的化する際に抗体が診断剤として有用であるように、十分な親和性を有してミニブタIgGに結合することができる抗体を指す。ある態様において、ミニブタIgGに結合する抗体は、1 μM以下、100 nM以下、10 nM以下、1 nM以下、0.1 nM以下、0.01 nM以下、または0.001 nM以下（たとえば10-8 M以下、たとえば10-8 M〜10-13 M、たとえば10-9 M〜10-13 M）の解離定数（Kd）を有する。
【００２３】
抗体が1μM以下のKdを有する場合に、抗体はその標的に「特異的に結合する」と言われる。したがって、その標的に「特異的に結合しない」抗体とは、本明細書において、1μM超のKdを有するものとして理解される。
【００２４】
「薬物」との語は、本明細書において使用される場合、治療上有効な化合物を意味する。「抗体医薬」との語は、本明細書において使用される場合、疾患の処置のために個体に投与され得る抗体、たとえば治療用モノクローナル抗体を意味する。抗体医薬（治療用モノクローナル抗体）は、腫瘍学的疾患（たとえば、非ホジキンリンパ腫、乳がん、および大腸がんを含む、血液学的な悪性腫瘍ならびに固形の悪性腫瘍）、免疫学的疾患、中枢神経疾患、血管の疾患、または感染性疾患などのさまざまな疾患の処置のために広く使用されている。そのような抗体は、たとえば、Levene, A.P., et al., Journal of the Royal Society of Medicine 98 (2005) 145-152に記載されている。そのような抗体は、たとえば、CD20、CD22、HLA-DR、CD33、CD52、EGFR、G250、GD3、HER2、PSMA、CD56、VEGF、VEGF2、CEA、Lewis Y抗原、IL-6受容体、またはIGF-1受容体に対する抗体である。治療用抗体はまた、Groner, B., et al., Curr. Mol. Meth. 4 (2004) 539-547；Harris, M., Lancet Oncol. 5 (2004) 292-302に記載されている。
【００２５】
「抗薬物抗体」または「ADA」とは、本明細書において使用される場合、薬物、たとえば抗体医薬に、特異的に結合する抗体を意味する。ADAは、抗体療法の間に、患者の免疫性の反応として形成され得る（Pan, Y., et al., FASEB J. 9 (1995) 43-49を参照されたい）。薬物が抗体医薬である場合、ADAは、たとえば抗体医薬の可変ドメイン、定常ドメイン、または糖構造（glycostructure）といった抗体医薬の任意の領域に、特異的に結合してもよい。しかしながら多くの場合、ADAは、抗体医薬の相補的決定領域の1つまたは複数に結合し得る。
【００２６】
「可変ドメイン」または「可変領域」とは、本明細書において使用される場合、抗体の抗原への結合に直接的に関与する、軽鎖および重鎖のペアのそれぞれを意味する。軽鎖の可変ドメインは「VL」と略され、かつ軽鎖の可変ドメインは「VH」と略される。ヒト軽鎖および重鎖の可変ドメインは同じ全体構造を有する。それぞれの可変ドメインは4つのフレームワーク（FR）領域を含み、それらの配列は広く保存されている。FRは3つの「超可変領域」（または「相補性決定領域」、CDR）によって連結されている。それぞれの鎖におけるCDRは、そのようなフレームワークアミノ酸によって隔てられている。したがって、抗体の軽鎖および重鎖は、N末端からC末端へという方向で、FR1ドメイン、CDR1ドメイン、FR2ドメイン、CDR2ドメイン、FR3ドメイン、CDR3ドメイン、およびFR4ドメインを含む。FRはβシート立体構造をとっており、かつCDRは、βシート構造を連結するループを形成し得る。それぞれの鎖におけるCDRは、FRによって、それらの3次元構造中に保持されており、かつ他方の鎖からのCDRとともに「抗原結合部位」を形成する。とりわけ、重鎖のCDR3は、抗原結合にもっとも寄与する領域である。CDR領域およびFR領域は、Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) の標準的な定義にしたがって決定される。
【００２７】
本明細書における目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」は、以下に定義されるようなヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに由来する軽鎖可変ドメイン（VL）フレームワークもしくは重鎖可変ドメイン（VH）フレームワークのアミノ酸配列を含む、フレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに「由来する」アクセプターヒトフレームワークは、それらと同じアミノ酸配列を含んでよく、または、アミノ酸配列の変化を含んでよい。いくつかの態様において、アミノ酸の変化の数は、10個以下、9個以下、8個以下、7個以下、6個以下、5個以下、4個以下、3個以下、または2個以下である。いくつかの態様において、VLアクセプターヒトフレームワークは、VLヒト免疫グロブリンフレームワーク配列またはヒトコンセンサスフレームワーク配列と、配列において同一である。
【００２８】
「親和性成熟した」抗体とは、1つまたは複数の超可変領域（HVR）において1つまたは複数の変更を、そのような変更を有さない親抗体と比較した場合に有する抗体を指し、そのような変更は、抗原に対する抗体の親和性の改善をもたらす。
【００２９】
「抗体断片」とは、インタクトな抗体の一部分を含む、インタクトな抗体以外の分子を指し、インタクトな抗体の一部分は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合する。抗体断片の例は、Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；ダイアボディ；線状（linear）抗体；単鎖抗体分子（たとえばscFv）；および抗体断片から形成される多重特異性抗体を含むが、これらに限定されない。
【００３０】
本明細書において使用される場合、「Fab断片」とは、軽鎖（CL）のVLドメインおよび定常ドメインを含む軽鎖断片、ならびに重鎖のVHドメインおよび第一の定常ドメイン（CH1）を含む抗体断片を指す。
【００３１】
「Fc領域」との語は、本明細書において、定常領域の少なくとも一部分を含む、免疫グロブリン重鎖のC末端領域を定義するために、使用される。該語は、天然の配列のFc領域、および変異体のFc領域を含む。
【００３２】
抗体の「クラス」とは、その重鎖が有する定常ドメインまたは定常領域のタイプを指す。抗体には5種類の主要なクラス：IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMがあり、かつ、これらのうちいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、たとえばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2へと、さらに分類され得る。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。
【００３３】
「フレームワーク」または「FR」とは、超可変領域（HVR）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのFRは、一般的に4つのFRドメイン：FR1、FR2、FR3、およびFR4からなる。したがって、HVRおよびFRの配列は、一般的に、VH（またはVL）中に以下の順序：FR1−H1(L1)−FR2−H2(L2)−FR3−H3(L3)−FR4で現れる。
【００３４】
「全長抗体」、「インタクトな抗体」、および「全抗体」との語は、本明細書において、天然の抗体構造に実質的に類似した構造を有する抗体、または本明細書において定義されるFc領域を含む重鎖を有する抗体を、互換性をもって指すために使用される。
【００３５】
「超可変領域」または「HVR」との語は、本明細書において使用される場合、配列が超可変である（「相補性決定領域」もしくは「CDR」）、および／または構造が定義されたループを形成する（「超可変ループ」）、および／または抗原接触残基を含む（「抗原接触域」）、抗体可変ドメインの領域のそれぞれを指す。一般的に抗体は、6つのHVR：VHにおける3つ（H1、H2、H3）およびVLにおける3つ（L1、L2、L3）を含む。例示的なHVRは、本明細書においては以下を含む：
(a)  アミノ酸残基26〜32（L1）、50〜52（L2）、91〜96（L3）、26〜32（H1）、53〜55（H2）、および96〜101（H3）において生じる超可変ループ（Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）；
(b)  アミノ酸残基24〜34（L1）、50〜56（L2）、89〜97（L3）、31〜35b（H1）、50〜65（H2）、および95〜102（H3）において生じるCDR（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）；
(c)  アミノ酸残基27c〜36（L1）、46〜55（L2）、89〜96（L3）、30〜35b（H1）、47〜58（H2）、および93〜101（H3）において生じる抗原接触域（MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)）；ならびに
(d)  HVRアミノ酸残基46〜56（L2）、47〜56（L2）、48〜56（L2）、49〜56（L2）、26〜35（H1）、26〜35b（H1）、49〜65（H2）、93〜102（H3）、および94〜102（H3）を含む、(a)、(b)、ならびに／または（c）の組み合わせ。
【００３６】
抗ミニブタIgG抗体に関して本明細書において示される相補性決定領域（CDR）は、IMGTナンバリングシステム（Lefranc, M.-P. et al., Nucleic Acids Research, 27, 209-212 (1999)）によって決定されている。
【００３７】
参照ポリペプチド配列に対する「パーセント（%）アミノ酸配列同一性」とは、配列をアラインし、そして必要であれば、最大のパーセント配列同一性を達成するためにギャップを導入し、そしていかなる保存的置換も、アラインメントの目的のための配列同一性の一部とはみなされない、とした上で、参照ポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一である、候補配列のアミノ酸残基のパーセンテージとして、定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定するという目的のためのアラインメントは、当技術分野における技能の範囲内のさまざまな手法で、たとえばBLAST、BLAST-2、Clustal W、Megalign（DNASTAR）ソフトウェア、またはFASTAプログラムパッケージなどの公衆に利用可能なコンピューターソフトウェアを用いて達成され得る。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインするための適切なパラメーターを決定することができる。一方、本明細書における目的のためには、%アミノ酸配列同一性の値は、FASTAパッケージのバージョン36.3.8cまたはそれ以降のggsearchプログラムを、BLOSUM50比較マトリックスとともに用いて生成されている。FASTAプログラムパッケージは、W. R. Pearson and D. J. Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85:2444-2448；W. R. Pearson (1996) "Effective protein sequence comparison" Meth. Enzymol. 266:227-258；およびPearson et. al. (1997) Genomics 46:24-36によって作成されており、かつ fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml から公衆に利用可能である。あるいは、 fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi においてアクセス可能な公開サーバーが、配列を比較するために使用され得、その際、ローカルアラインメントではなくグローバルアラインメントが確実に実施されるようにするために、ggsearch（グローバルタンパク質：タンパク質）プログラム、およびデフォルトのオプション（BLOSUM50; open: -10; ext: -2; Ktup = 2）が用いられる。パーセントアミノ酸同一性は、出力アラインメントのヘッダーに示される。
【００３８】
1つの態様において、本発明による抗体はモノクローナル抗体である。「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」との語は、本明細書において使用される場合、単一のアミノ酸組成の抗体分子の調製物を指す。
【００３９】
「ヒト抗体」とは、ヒトによってもしくはヒト細胞によって産生された抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するもの、またはヒト抗体レパートリーを利用するもしくは他のヒト抗体をコードする配列を利用する非ヒト供給源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を、明確に除外する。
【００４０】
「ヒト化」抗体とは、非ヒトHVRからのアミノ酸残基およびヒトFRからのアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。ある態様において、ヒト化抗体は、少なくとも1つの可変ドメインの、および典型的には2つの可変ドメインのすべてを実質的に含み得、ここでHVR（たとえばCDR）のすべてまたは実質的にすべては、非ヒト抗体のものに対応しており、かつFRのすべてまたは実質的にすべては、ヒト抗体のものに対応している。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の、少なくとも一部分を含んでよい。抗体、たとえば非ヒト抗体の「ヒト化型」とは、ヒト化を経ている抗体を指す。
【００４１】
抗体が「ヒト由来のIgGに対して有意な交差反応性を示さない」との語、もしくは抗体が「マウス由来のIgGに対して有意な交差反応性を示さない」との語、またはそれらの等価物は、本明細書において使用される場合、それぞれヒトIgGまたはマウスIgGに特異的に結合しない抗体、すなわちそれぞれの抗原からの10-7 mol/L以上の解離定数（Kd）を示す抗体を指す。
【００４２】
「ミニブタ試料」との語は、任意の量の、ミニブタから単離された物質を含む。そのような物質は、前臨床の通常の作業においてもっとも広く使用される試料の供給源である、そのような個体からの全血、血清、または血漿を含むが、これらに限定されない。そのような物質はまた、硝子体液または眼房水を含む。
【００４３】
「支持体」または「固相」との語は、本発明の方法に関して本明細書において使用される場合、そこにIgG分子を固定化させるのに適した固体のものを意味する。両方の語は互換性をもって使用され得る。支持体は、ポリマー、金属（常磁性や強磁性の粒子）、ガラス、ならびにセラミックなどの素材から作製される粒子（微粒子およびビーズを含む）；シリカ、アルミナ、およびポリマーゲルなどのゲル状物質；ポリマー製、金属製、ガラス製、および／またはセラミック製であり得るキャピラリー；ゼオライトおよび他の多孔性の物質；電極；マイクロタイタープレート；固体のストリップ；キュベット、チューブ、または分光計の試料用の他の容器を含む。支持体は、チューブ、ストリップ、キュベット、もしくはマイクロタイタープレートなどの、固定的な構成要素であってよく、またはビーズおよび微粒子などの、固定的でない構成要素であってよい。
【００４４】
イムノアッセイは当業者に周知である。そのようなアッセイを実施するための方法とともに、実際的な適用および手順は、関連する教本に要約されている。関連する教本の例は、"Practice and theory of enzyme immunoassays", Burdon, R.H. and v. Knippenberg, P.H. (eds.), Elsevier, Amsterdam (1990) pp. 221-278におけるTijssen, P., "Preparation of enzyme-antibody or other enzyme-macromolecule conjugates"、ならびにColowick, S.P. and Caplan, N.O. (eds.), "Methods in Enzymology", Academic Pressの免疫学的検出方法を論じるさまざまな巻、とりわけ70、73、74、84、92、および121巻である。
【００４５】
「検出可能な標識」との語は、本明細書において使用される場合、当技術分野において公知の手段によって検出されることができる物質を指す。検出可能な標識は、たとえばクロモゲン（蛍光基もしくは発光基、および色素）のように直接的に検出可能であってよく、または間接的に検出可能、たとえば、ジゴキシゲニンなどの酵素もしくはハプテンであってよい。1つの態様において、検出可能な標識はハプテンであり、かつ検出は、酵素に連結された、ハプテンに特異的な抗体を用いて、ハプテンに特異的な抗体の、ハプテンとの結合を、色変化試験において酵素活性を評価することによって可視化することにより、実施される。
【００４６】
2.  本発明の態様の詳細な説明
1つの局面において、本発明は、ミニブタから単離される試料から、ミニブタに適用される薬物に反応して形成される抗薬物抗体（ADA）の存在または非存在を決定するための方法を提供する。方法は、薬物をミニブタ試料と接触させる際に形成される、薬物とADAとを含む免疫複合体（「薬物／ADA複合体」）の検出を可能にする、イムノアッセイである。薬物／ADA複合体は、ミニブタIgGに特異的に結合する抗体（「抗ミニブタIgG抗体」）によって結合され、そして次に、抗ミニブタIgG抗体の、薬物／ADA複合体への結合が検出され、そしてこの結合は、試料におけるADAの存在を示す。この方法は、ミニブタ試料中にすでに存在していた薬物／ADA複合体と、初期試料からの複合体化されていないADAとの、両方の検出を可能にする。
【００４７】
したがって、1つの局面において、本発明は、ミニブタ試料において抗薬物抗体（ADA）の存在または非存在を決定するためのインビトロ方法に関連し、該方法は以下の段階を含む：
a)  薬物／ADA複合体を形成させるために、試料を、過剰量の、ADAが結合する薬物と接触させる段階、
b)  薬物／ADA複合体を、ミニブタIgGに特異的に結合する抗体と接触させる段階であって、ミニブタIgGに特異的に結合する抗体はヒトIgGには結合しない、段階、および
c)  ADAが試料中に存在するかどうかを決定するために、ミニブタIgGに特異的に結合する抗体の、薬物／ADA複合体への結合を決定する段階。
【００４８】
1つの態様において、段階a)において、薬物は支持体に固定化されている。
【００４９】
別の局面において、本発明は、ミニブタ試料において薬物／ADA複合体の存在または非存在を決定するための方法を提供する。方法は、ミニブタ試料から薬物／ADA複合体の直接検出を可能にするイムノアッセイであり、これは、ミニブタ試料を薬物とプレインキュベートする段階を含まない。試料からの薬物／ADA複合体は、薬物に特異的に結合する抗体によって結合され、そして次に、薬物／ADA複合体の、薬物に特異的に結合する抗体への結合が検出され、そしてこの結合は、試料における薬物／ADA複合体の存在を示す。
【００５０】
したがって、この局面において、本発明は、ミニブタ試料において、薬物と該薬物に特異的に結合する抗体とを含む免疫複合体（薬物／ADA複合体）の存在または非存在を決定するためのインビトロ方法に関連し、該方法は以下の段階を含む：
a)  ミニブタ試料中に存在する薬物／ADA複合体を固定化するために、ミニブタ試料を、薬物と特異的に結合する固定化されている抗体と、接触させる段階、
b)  薬物／ADA複合体を、ミニブタIgGに特異的に結合する抗体と接触させる段階であって、ミニブタIgGに特異的に結合する抗体はヒトIgGには結合しない、段階、および
c)  ADAが試料中に存在するかどうかを決定するために、ミニブタIgGに特異的に結合する抗体の、薬物／ADA複合体への結合を決定する段階。
【００５１】
本発明の方法は両方とも、記載されている連続的な順番で実施される、すなわち、段階a)の後に段階b)が続き、次に段階c)が後に続く。以下の態様は、本発明の方法の両方、すなわち、ミニブタ試料においてADAの存在または非存在を検出するための方法のみならず、ミニブタ試料において薬物／ADA複合体の存在または非存在を検出するための方法にも、適用する。
【００５２】
本発明の方法の1つの態様において、ミニブタIgGに特異的に結合する抗体は、ヒトIgGには特異的に結合しない。本発明の方法の1つの態様において、ミニブタIgGに特異的に結合する抗体は、マウスIgGには特異的に結合しない。本発明の方法の1つの態様において、ミニブタIgGに特異的に結合する抗体は、ヒトIgGおよびマウスIgGには特異的に結合しない。
【００５３】
それにより、たとえば、ヒトもしくはマウス種の抗体医薬への結合によって引き起こされるバックグラウンド変動が最小化され得る、または排除さえされ得るので、アッセイの感度および信頼性が改善される。
【００５４】
本発明の方法の1つの態様において、ミニブタIgGに特異的に結合する抗体は、ミニブタIgGのFcドメインに特異的に結合する。
【００５５】
本発明の方法の1つの態様において、ミニブタIgGに特異的に結合する抗体は、ミニブタIgGのFabドメインに特異的に結合する。
【００５６】
本発明の方法の1つの態様において、ミニブタIgGのFabドメインに特異的に結合する少なくとも1種の抗体、およびミニブタIgGのFcドメインに特異的に結合する少なくとも1種の抗体が、段階b)において使用される。
【００５７】
本発明の方法の1つの態様において、段階a)において使用される薬物は、支持体に固定化されている。
【００５８】
本発明の方法の1つの態様において、薬物は抗体医薬（DA）である。1つの態様において、抗体医薬はヒト抗体またはヒト化抗体である。1つの態様において、抗体医薬はIgG抗体である。1つの態様において、抗体医薬はヒトIgG抗体またはヒト化IgG抗体である。1つの態様において、抗体医薬はFab断片である。
【００５９】
本発明の方法の1つの態様において、抗体医薬はFab断片であり、段階b)は、ミニブタIgGのFabドメインに特異的に結合する抗体を用いて実施される。
【００６０】
本発明の方法の1つの態様において、方法はサンドイッチアッセイであり、該方法においては、薬物／ADA複合体を、ヒトIgGに特異的に結合する抗体と接触させ、ここでヒトIgGに特異的に結合する抗体は支持体に固定化されており、それにより薬物／ADA複合体を支持体に固定化し、続いて本発明の方法の段階b)によって、固定化された薬物／ADA複合体を、ミニブタIgGに特異的に結合する抗体と接触させる。
【００６１】
本発明の方法の1つの態様において、ミニブタIgGに特異的に結合する抗体は、検出可能な標識にコンジュゲートされている。1つの態様において、検出可能な標識はハプテンである。1つの態様において、検出可能な標識はジゴキシゲニンである。
【００６２】
本発明はまた、ミニブタIgGに特異的に結合する抗体にも関連する。本発明の抗体は、ミニブタIgGのFc部分またはFab部分のいずれかに特異的に結合するが、ヒト由来のIgGおよびマウス由来のIgGに対して有意な交差反応性を示さない。本発明の抗体は、ミニブタ試料において抗薬物抗体（ADA）の存在または非存在を決定するための本発明の方法において特に有用である。
【００６３】
1つの局面において、本発明は、SEQ ID NO: 3の重鎖のCDR1、SEQ ID NO: 4の重鎖のCDR2、およびSEQ ID NO: 5の重鎖のCDR3、SEQ ID NO: 6の軽鎖のCDR1、SEQ ID NO: 7の軽鎖のCDR2、およびSEQ ID NO: 8の軽鎖のCDR3を含む、ミニブタIgGに特異的に結合する抗体に関連する。1つの態様において、前記抗体は、SEQ ID NO: 1のアミノ酸配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するVH配列；およびSEQ ID NO: 2のアミノ酸配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するVL配列を含む。1つの態様において、前記抗体は、SEQ ID NO: 1のVH配列、およびSEQ ID NO: 2のVL配列を含む。該CDRならびにVHおよびVLのアミノ酸配列は、本明細書において開示される、ミニブタIgGのFcドメインに特異的に結合する抗体「2.8.14」のCDRおよび可変ドメインに対応する。
【００６４】
1つの局面において、本発明は、SEQ ID NO: 11の重鎖のCDR1、SEQ ID NO: 12の重鎖のCDR2、およびSEQ ID NO: 13の重鎖のCDR3、SEQ ID NO: 14の軽鎖のCDR1、SEQ ID NO: 15の軽鎖のCDR2、およびSEQ ID NO: 16の軽鎖のCDR3を含む、ミニブタIgGに特異的に結合する抗体に関連する。1つの態様において、前記抗体は、SEQ ID NO: 9のアミノ酸配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するVH配列；およびSEQ ID NO: 10のアミノ酸配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するVL配列を含む。1つの態様において、前記抗体は、SEQ ID NO: 9のVH配列、およびSEQ ID NO: 10のVL配列を含む。該CDRならびにVHおよびVLのアミノ酸配列は、本明細書において開示される、ミニブタIgGのFabドメインに特異的に結合する抗体「1.2.6」のCDRおよび可変ドメインに対応する。
【００６５】
1つの局面において、本発明は、SEQ ID NO: 19の重鎖のCDR1、SEQ ID NO: 20の重鎖のCDR2、およびSEQ ID NO: 21の重鎖のCDR3、SEQ ID NO: 22の軽鎖のCDR1、SEQ ID NO: 23の軽鎖のCDR2、およびSEQ ID NO: 24の軽鎖のCDR3を含む、ミニブタIgGに特異的に結合する抗体に関連する。1つの態様において、前記抗体は、SEQ ID NO: 17のアミノ酸配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するVH配列；およびSEQ ID NO: 18のアミノ酸配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するVL配列を含む。1つの態様において、前記抗体は、SEQ ID NO: 17のVH配列、およびSEQ ID NO: 18のVL配列を含む。該CDRならびにVHおよびVLのアミノ酸配列は、本明細書において開示される、ミニブタIgGのFabドメインに特異的に結合する抗体「2.3.8」のCDRおよび可変ドメインに対応する。
【００６６】
1つの局面において、本発明は、SEQ ID NO: 27の重鎖のCDR1、SEQ ID NO: 28の重鎖のCDR2、およびSEQ ID NO: 29の重鎖のCDR3、SEQ ID NO: 30の軽鎖のCDR1、SEQ ID NO: 31の軽鎖のCDR2、およびSEQ ID NO: 32の軽鎖のCDR3を含む、ミニブタIgGに特異的に結合する抗体に関連する。1つの態様において、前記抗体は、SEQ ID NO: 25のアミノ酸配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するVH配列；およびSEQ ID NO: 26のアミノ酸配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するVL配列を含む。1つの態様において、前記抗体は、SEQ ID NO: 25のVH配列、およびSEQ ID NO: 26のVL配列を含む。該CDRならびにVHおよびVLのアミノ酸配列は、本明細書において開示される、ミニブタIgGのFabドメインに特異的に結合する抗体「2.11.16」のCDRおよび可変ドメインに対応する。
【００６７】
本発明の別の局面は、ミニブタ試料において抗薬物抗体（ADA）の存在または非存在を決定するための方法における、本発明の抗体の使用である。1つの態様において、本発明の抗体は、本発明の方法において使用される。
【００６８】
3.  本発明の具体的な態様
以下に、本発明の具体的な態様が列挙される。
1.  ミニブタ試料において抗薬物抗体（ADA）の存在または非存在を決定するためのインビトロ方法であって、以下の段階を含む方法：
a)  薬物／ADA複合体を形成させるために、試料を、過剰量の、ADAが結合する薬物と接触させる段階、
b)  薬物／ADA複合体を、ミニブタIgGに特異的に結合する抗体と接触させる段階であって、ミニブタIgGに特異的に結合する抗体はヒトIgGには結合しない、段階、および
c)  ADAが試料中に存在するかどうかを決定するために、ミニブタIgGに特異的に結合する抗体の、薬物／ADA複合体への結合を決定する段階。
2.  段階a）において、薬物が支持体に固定化されている、態様1の方法。
3.  ミニブタ試料において、薬物と該薬物に特異的に結合する抗体とを含む免疫複合体（薬物／ADA複合体）の存在または非存在を決定するためのインビトロ方法であって、以下の段階を含む方法：
a)  ミニブタ試料中に存在する薬物／ADA複合体を固定化するために、ミニブタ試料を、薬物と特異的に結合する固定化されている抗体と、接触させる段階、
b)  薬物／ADA複合体を、ミニブタIgGに特異的に結合する抗体と接触させる段階であって、ミニブタIgGに特異的に結合する抗体はヒトIgGには結合しない、段階、および
c)  ADAが試料中に存在するかどうかを決定するために、ミニブタIgGに特異的に結合する抗体の、薬物／ADA複合体への結合を決定する段階。
4.  ミニブタIgGに特異的に結合する抗体が、ヒトIgGには特異的に結合しない、態様1〜3のうちの1つの方法。
5.  ミニブタIgGに特異的に結合する抗体が、マウスIgGには特異的に結合しない、態様1〜4のうちの1つの方法。
6.  ミニブタIgGに特異的に結合する抗体が、ミニブタIgGのFcドメインに特異的に結合する、態様1〜5のうちの1つの方法。
7.  ミニブタIgGのFcドメインに特異的に結合する抗体が、SEQ ID NO: 3の重鎖のCDR1、SEQ ID NO: 4の重鎖のCDR2、およびSEQ ID NO: 5の重鎖のCDR3、SEQ ID NO: 6の軽鎖のCDR1、SEQ ID NO: 7の軽鎖のCDR2、およびSEQ ID NO: 8の軽鎖のCDR3（本明細書において開示される抗体「2.8.14」の6つのCDRに対応）を含む、態様6の方法。
8.  ミニブタIgGのFcドメインに特異的に結合する抗体が、SEQ ID NO: 1のVH配列およびSEQ ID NO: 2のVL配列（本明細書において開示される抗体「2.8.14」の可変ドメインに対応）を含む、態様6または7の方法。
9.  ミニブタIgGに特異的に結合する抗体が、ミニブタIgGのFabドメインに特異的に結合する、態様1〜5のうちの1つの方法。
10.  ミニブタIgGのFabドメインに特異的に結合する抗体が、SEQ ID NO: 11の重鎖のCDR1、SEQ ID NO: 12の重鎖のCDR2、およびSEQ ID NO: 13の重鎖のCDR3、SEQ ID NO: 14の軽鎖のCDR1、SEQ ID NO: 15の軽鎖のCDR2、およびSEQ ID NO: 16の軽鎖のCDR3（本明細書において開示される抗体「1.2.6」の6つのCDRに対応）を含む、態様9の方法。
11.  ミニブタIgGのFabドメインに特異的に結合する抗体が、SEQ ID NO: 9のVH配列およびSEQ ID NO: 10のVL配列（本明細書において開示される抗体「1.2.6」の可変ドメインに対応）を含む、態様9または10の方法。
12.  ミニブタIgGのFabドメインに特異的に結合する抗体が、SEQ ID NO: 19の重鎖のCDR1、SEQ ID NO: 20の重鎖のCDR2、およびSEQ ID NO: 21の重鎖のCDR3、SEQ ID NO: 22の軽鎖のCDR1、SEQ ID NO: 23の軽鎖のCDR2、およびSEQ ID NO: 24の軽鎖のCDR3（本明細書において開示される抗体「2.3.8」の6つのCDRに対応）を含む、態様9の方法。
13.  ミニブタIgGのFabドメインに特異的に結合する抗体が、SEQ ID NO: 17のVH配列およびSEQ ID NO: 18のVL配列（本明細書において開示される抗体「2.3.8」の可変ドメインに対応）を含む、態様9または12の方法。
14.  ミニブタIgGのFabドメインに特異的に結合する抗体が、SEQ ID NO: 27の重鎖のCDR1、SEQ ID NO: 28の重鎖のCDR2、およびSEQ ID NO: 29の重鎖のCDR3、SEQ ID NO: 30の軽鎖のCDR1、SEQ ID NO: 31の軽鎖のCDR2、およびSEQ ID NO: 32の軽鎖のCDR3（本明細書において開示される抗体「2.11.16」の6つのCDRに対応）を含む、態様9の方法。
15.  ミニブタIgGのFabドメインに特異的に結合する抗体が、SEQ ID NO: 25のVH配列およびSEQ ID NO: 26のVL配列（本明細書において開示される抗体「2.11.16」の可変ドメインに対応）を含む、態様9または14の方法。
16.  ミニブタIgGのFabドメインに特異的に結合する少なくとも1種の抗体、およびミニブタIgGのFcドメインに特異的に結合する少なくとも1種の抗体が、段階b)において使用される、前記態様のうちの1つの方法。
17.  薬物が抗体医薬（DA）である、態様1〜16のうちの1つの方法。
18.  抗体医薬がヒト抗体またはヒト化抗体である、態様17の方法。
19.  抗体医薬がIgG抗体である、態様17または18の方法。
20.  抗体医薬がFab断片である、態様17〜19のうちの1つの方法。
21.  ミニブタIgGのFabドメインに特異的に結合する抗体が、段階b)において使用される、態様20の方法。
22.  ミニブタIgGのFabドメインに特異的に結合する抗体が、態様7〜13において定義される抗体から選択される、態様21の方法。
23.  方法がサンドイッチアッセイであって、段階a)において、薬物／ADA複合体を、ヒトIgGに特異的に結合する抗体と接触させ、ここでヒトIgGに特異的に結合する抗体は支持体に固定化されており、それにより薬物／ADA複合体を支持体に固定化し、かつ
続いて段階b)によって、固定化された薬物／ADA複合体を、ミニブタIgGに特異的に結合する抗体と接触させる、
態様17〜22のうちの1つの方法。
24.  ミニブタIgGに特異的に結合する抗体が、検出可能な標識にコンジュゲートされている、態様1〜23のうちの1つの方法。
25.  検出可能な標識がジゴキシゲニンである、態様24の方法。
26.  SEQ ID NO: 3の重鎖のCDR1、SEQ ID NO: 4の重鎖のCDR2、およびSEQ ID NO: 5の重鎖のCDR3、SEQ ID NO: 6の軽鎖のCDR1、SEQ ID NO: 7の軽鎖のCDR2、およびSEQ ID NO: 8の軽鎖のCDR3（本明細書において開示される抗体「2.8.14」の6つのCDRに対応）を含む、ミニブタIgGに特異的に結合する抗体。
27.  SEQ ID NO: 1のアミノ酸配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するVH配列；およびSEQ ID NO: 2のアミノ酸配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するVL配列を含む、態様26に記載の抗体。
28.  SEQ ID NO: 1のVH配列およびSEQ ID NO: 2のVL配列（本明細書において開示される抗体「2.8.14」の可変ドメインに対応）を含む、態様26または27に記載の抗体。
29.  SEQ ID NO: 11の重鎖のCDR1、SEQ ID NO: 12の重鎖のCDR2、およびSEQ ID NO: 13の重鎖のCDR3、SEQ ID NO: 14の軽鎖のCDR1、SEQ ID NO: 15の軽鎖のCDR2、およびSEQ ID NO: 16の軽鎖のCDR3（本明細書において開示される抗体「1.2.6」の6つのCDRに対応）を含む、ミニブタIgGに特異的に結合する抗体。
30.  SEQ ID NO: 9のアミノ酸配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するVH配列；およびSEQ ID NO: 10のアミノ酸配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するVL配列を含む、態様29の抗体。
31.  SEQ ID NO: 9のVH配列およびSEQ ID NO: 10のVL配列（本明細書において開示される抗体「1.2.6」の可変ドメインに対応）を含む、態様29の抗体。
32.  SEQ ID NO: 19の重鎖のCDR1、SEQ ID NO: 20の重鎖のCDR2、およびSEQ ID NO: 21の重鎖のCDR3、SEQ ID NO: 22の軽鎖のCDR1、SEQ ID NO: 23の軽鎖のCDR2、およびSEQ ID NO: 24の軽鎖のCDR3（本明細書において開示される抗体「2.3.8」の6つのCDRに対応）を含む、ミニブタIgGに特異的に結合する抗体。
33.  SEQ ID NO: 17のアミノ酸配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するVH配列；およびSEQ ID NO: 18のアミノ酸配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するVL配列を含む、態様32の抗体。
34.  SEQ ID NO: 17のVH配列およびSEQ ID NO: 18のVL配列（本明細書において開示される抗体「2.3.8」の可変ドメインに対応）を含む、態様32の抗体。
35.  SEQ ID NO: 27の重鎖のCDR1、SEQ ID NO: 28の重鎖のCDR2、およびSEQ ID NO: 29の重鎖のCDR3、SEQ ID NO: 30の軽鎖のCDR1、SEQ ID NO: 31の軽鎖のCDR2、およびSEQ ID NO: 32の軽鎖のCDR3（本明細書において開示される抗体「2.11.16」の6つのCDRに対応）を含む、ミニブタIgGに特異的に結合する抗体。
36.  SEQ ID NO: 25のアミノ酸配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するVH配列；およびSEQ ID NO: 26のアミノ酸配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するVL配列を含む、態様35の抗体。
37.  SEQ ID NO: 25のVH配列およびSEQ ID NO: 26のVL配列（本明細書において開示される抗体「2.11.16」の可変ドメインに対応）を含む、態様35の抗体。
38.  ミニブタ試料において抗薬物抗体（ADA）の存在または非存在を決定するための方法における使用のための、態様26〜37のうちの1つの抗体。
39.  態様1〜25のうちの1つの方法における使用のための、態様26〜37のうちの1つの抗体。
【００６９】
アミノ酸配列の記述
2020530901.tif 000003
2020530901.tif 000004
2020530901.tif 000005
【実施例】
【００７０】
以下の実施例は、本発明の理解を助けるために提供されており、本発明の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に記載される。本発明の精神から逸脱することなく、記載される手順に改変がなされ得ることが理解される。
【００７１】
実施例1：
ミニブタIgGの作製
ミニブタからの血清は、Aerosil（登録商標）380を用いて脱脂され、そして硫酸アンモニウム（2.0 Mまで）を用いて沈殿させた。ペレットは、リン酸塩緩衝液中でホモジナイズされ、そしてpH 7.0のリン酸塩緩衝液に対して透析された。混合物は、pH 7.0でのDEAEイオン交換クロマトグラフィーによって分離され、そしてフロースルー中のIgGは濃縮され、そしてゲルろ過により精製された。
【００７２】
実施例2：
モノクローナル抗ミニブタIgG抗体の作製
抗ミニブタ抗体は、ミニブタ血清に由来するミニブタIgGを用いたマウスの免疫感作、およびそれに続くハイブリドーマ選択によって作製された。適切なクローンのスクリーニングは、ヒトまたはヒト化IgG抗体医薬に対するADAを検出するという意図される適用のためにもっとも有力な抗体を選択するために、ヒトIgGの存在下で実施された。
【００７３】
a)  マウスの免疫感作
雌のBALB/cマウスまたはNMRIマウスはそれぞれ、CFA（完全フロイントアジュバント）と混合された90 μgのミニブタIgGを用いて、腹腔内に初回の免疫感作を受けた。IFA（不完全フロイントアジュバント）とともに製剤化された90 μgのミニブタIgGによる、2回のさらなる腹腔内免疫感作が、初回の免疫感作の6週間後および10週間後に続いた。続いて、動物を屠殺して後述のように脾細胞をハイブリドーマの作製のために使用する3日前、および2日前に、PBS緩衝溶液中で製剤化された50 μgのミニブタIgGによる1回の腹腔内追加免疫、およびPBS緩衝溶液中で製剤化された25 μgのミニブタIgGによる1回の静脈内追加免疫が、それぞれ実施された。
【００７４】
b)  融合およびクローニング
a)にしたがって免疫感作されたマウスの脾臓細胞の、骨髄腫細胞との融合は、ポリエチレングリコールを用いる標準的な手順によって実施された。手短に述べると、およそ1 x 108個の脾細胞は、RPMI-1640中で、およそ2 x 107個の骨髄腫細胞（P3x63-Ag8.653）と混合され、そして遠心分離（10分、250 x g）された。細胞はRPMI-1640で1回洗浄され、そして再び遠心分離された。その後、1 mlのPEG（ポリエチレングリコール）が細胞ペレットに滴下された。37℃の水浴中での1分間のインキュベーション後、5 mlのRPMI-1640が細胞に滴下された。続いて細胞懸濁液は、RPMI-1640を足して30 mlにされた。遠心分離（10分、180 x g）の後、細胞は、選択培地（10% FCS、100 U/ml IL-6、2 mM L-グルタミン、100 μM NEAA、1 mM ピルビン酸ナトリウム、24 μM 2-メルカプトエタノール、1x アザセリン／ヒポキサンチンを添加したRPMI-1640（Sigma-Aldrich））中に再懸濁された。37℃での24時間の培養後、細胞は、96ウェルの細胞培養プレートにプレーティングされた。10日間の培養後、初代の培養物は、ミニブタIgGに特異的な抗体の産生に関して後述のようにアッセイされた。選択された初代の培養物は、フローサイトメーター（FACSAria, BD Biosciences）を用いるシングルセルソーティングによってクローニングされた。細胞クローンは、10% FCS、50 U/ml IL-6、2 mM L-グルタミン、100 μM NEAA、1 mM ピルビン酸ナトリウム、および24 μM 2-メルカプトエタノールを添加したRPMI-1640中で増殖させた。確立されたモノクローナルハイブリドーマ細胞株は、特異性に関して後述のように再試験された。
【００７５】
c)  ヒトIgGに対して有意な交差反応性を有さない抗ミニブタ抗体を発現するハイブリドーマの選択
一回目のスクリーニング
抗ミニブタ抗体を分泌するハイブリドーマの同定のため、ストレプトアビジンでプレコートされたマイクロタイタープレート（MTP）（MicroCoat, Bernried, Germany）は、1ウェルにつき100 μlのビオチン化ミニブタIgG（PBS／1.0% (w/v) BSA中で250 ng/ml）で、室温（RT）で1時間コートされた。続いてウェルは、洗浄緩衝液（0.9% (w/v) NaCl／0.05% Tween（登録商標）20）で3回洗浄された。その後、75 μLのハイブリドーマ細胞培養上清が各ウェルに添加され、そしてRTで1時間インキュベートされた。洗浄した後、100 μLの、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識された、ポリクローナルヒツジ抗マウスFcγ抗体のF(ab')2断片が、結合した抗体の検出のために添加され、そしてRTで1時間インキュベートされた。洗浄した後、100 μLのABTS（登録商標）（Roche, Germany）が各ウェルに添加され、そして吸光度（OD）が、マイクロタイタープレートリーダー中で、405 nmおよび492 nm [405/492]において測定された。このスクリーニングは、ミニブタIgGに結合する抗体の選択をもたらした。
【００７６】
二回目のスクリーニング
ヒトIgGに対して最少の交差反応性を示すそれら抗ミニブタ抗体を同定するため、以下の競合アッセイが実施された。組み換えストレプトアビジンでプレコートされたMTP（MicroCoat）は、上述のように、1ウェルにつき100 μlのビオチン化ミニブタIgG（PBS／1.0% BSA中で250 ng/ml）でコートされた。続いて、コートされたプレートは、0.9% NaCl／0.05% Tween-20（登録商標）で洗浄された。次の段階において、37.5 μlの抗ミニブタ抗体（ハイブリドーマ細胞培養上清）と37.5 μlのポリクローナルヒトIgG（40 mg/mlの最終濃度）との混合物が、ウェルに添加された。対照実験において、37.5 μLのそれぞれの抗ミニブタ抗体（ハイブリドーマ細胞培養上清）と37.5 μlの緩衝液（PBS／1.0 % BSA）との混合物が、ウェルに添加された。プレートは、RTで1時間インキュベートされた。0.9% NaCl／0.05% Tween-20（登録商標）で洗浄した後、100 μl／ウェルの、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識された、ポリクローナルヒツジ抗マウスFcγ抗体のF(ab')2断片（100 ng/ml）が、結合した試料抗体の検出のために添加された。RTで1時間のインキュベーション後、プレートは上述のように洗浄された。最後に、100 μl／ウェルのABTS（登録商標）（Roche Diagnostics GmbH）が添加され、そして吸光度（OD）が405 nmおよび492 nm [405/492]において測定された。ポリクローナルヒトIgGの存在下でシグナルの最少の減少を示す（緩衝液対照と比較して）抗ミニブタIgG抗体は、最少の交差反応性を示す。
【００７７】
このスクリーニングアプローチは、ミニブタIgGに申し分なく結合する一方でヒトIgGに対して有意な交差反応性を示さない抗体の選択をもたらした。
【００７８】
d)  作製された抗ミニブタ抗体の結合領域の同定
抗ミニブタ抗体の結合領域を同定するため、組み換えストレプトアビジンでプレコートされたMTP（MicroCoat）は、1ウェルにつき100 μlのビオチン化ミニブタIgG（PBS／1.0% BSA中で250 ng/ml）で、1ウェルにつき100 μlのビオチン化ミニブタFab断片（PBS／1.0% BSA中で250 ng/ml）で、または1ウェルにつき100 μlのビオチン化ミニブタIgG Fc断片（PBS／1.0% BSA中で250 ng/ml）で、それぞれコートされた。コートされたMTPを0.9% NaCl／0.05% Tween-20（登録商標）で洗浄した後、100 μLの抗ミニブタ抗体（ハイブリドーマ細胞培養上清；PBS／1.0% BSA中で1:2希釈）をウェルに添加した。プレートは、RTで1時間インキュベートされた。続いて、コートされたプレートを、0.9% NaCl／0.05% Tween-20（登録商標）で洗浄した。0.9% NaCl／0.05 % Tween-20（登録商標）で洗浄した後、100 μl／ウェルの、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識された、ポリクローナルヒツジ抗マウスFcγ抗体のF(ab')2断片（100 ng/ml）が、結合した抗体の検出のために添加された。RTでの1時間のインキュベーション後、プレートは上述のように洗浄された。最後に、100 μl／ウェルのABTS（登録商標）（Roche Diagnostics GmbH）が添加され、そして吸光度（OD）が405 nmおよび492 nm [405/492]において測定された。
【００７９】
上述のELISAの結果を確認するため、競合ELISAが実施された。手短に述べると、組み換えストレプトアビジンでプレコートされたMTP（MicroCoat）は、1ウェルにつき100 μlのビオチン化ミニブタIgG（PBS／1.0% BSA中で250 ng/ml）で、1ウェルにつき100 μlのビオチン化ミニブタFab断片（PBS／1.0% BSA中で250 ng/ml）で、または1ウェルにつき100 μlのビオチン化ミニブタIgG Fc断片（PBS／1.0% BSA中で250 ng/ml）で、それぞれコートされた。続いて、コートされたプレートは、0.9% NaCl／0.05% Tween-20（登録商標）で洗浄された。次の段階において、50 μlの抗ミニブタ抗体（ハイブリドーマ細胞培養上清）と50 μlのポリクローナルミニブタFab断片（PBS／1.0% BSA中で5 μg/mlの最終濃度、RTで30分間プレインキュベート）との混合物が、ウェルに添加された。対照実験において、50 μLのそれぞれの抗ミニブタ抗体（ハイブリドーマ細胞培養上清）と50 μlの緩衝液（PBS／1.0% BSA）との混合物が、ウェルに添加された。プレートは、RTで1時間インキュベートされた。0.9% NaCl／0.05% Tween-20（登録商標）で洗浄した後、100 μl／ウェルの、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識された、ポリクローナルヒツジ抗マウスFcγ抗体のF(ab')2断片（100 ng/ml）が、結合した試料抗体の検出のために添加された。RTでの1時間のインキュベーション後、プレートは上述のように洗浄された。最後に、100 μl／ウェルのABTS（登録商標）（Roche Diagnostics GmbH）が添加され、そして吸光度（OD）が405 nmおよび492 nm [405/492]において測定された。
【００８０】
このELISAスクリーニングアプローチは、ミニブタのFab断片またはFc断片のいずれかに結合する抗体の同定をもたらした。
【００８１】
以下のクローン（表1）が、適した候補として選択された。
【００８２】
（表１）抗ミニブタIgGクローン
2020530901.tif 000006
【００８３】
e)  免疫グロブリンの作製
作製されたモノクローナルハイブリドーマ細胞株は、1 mLにつき細胞1.0 x 105個〜2.2 x 105個の初期細胞密度で、5% FCS、50 U/ml IL-6、50 μM β-メルカプトエタノール、および20 μM エタノールアミンを添加したHybridoma-SFM培地（Gibco）に接種された。細胞は、スピナーフラスコ中で、7〜14日の期間中、増殖させた。続いて細胞培養上清が採取され、そして抗体が、標準的なタンパク質化学的方法によって上清から精製された（たとえばBruck, C., et al., Methods Enzymol. 121 (1986) 587-596を参照されたい）。
【００８４】
実施例3：
作製されたモノクローナル抗ミニブタIgG抗体の、他の種由来のIgGに対する交差反応性
実施例2において作製された抗ミニブタIgG抗体2.8.14の交差反応性を、評価し、そして、2種類の市販の抗ミニブタIgG抗体である、HRPコンジュゲートヤギポリクローナル抗ブタIgG抗体（AbD-Serotec, Cat. AAI41P）、および自社でジゴキシゲニン化したマウスモノクローナル抗ブタIgG抗体（AbD-Serotec, クローンK139 3C8, Cat. MCA635GA）と比較した。明確化のために、ミニブタはブタの1種なので、抗ブタ抗体は当然ながらミニブタ抗原に対して反応性である点、すなわち、抗ブタIgG抗体はミニブタIgGに特異的に結合する点に、言及しておく。以下の抗体が比較された：
−  ジゴキシゲニン化抗ミニブタIgG抗体「2.8.14」
−  上で述べられた、Abd-SerotecからのHRPコンジュゲートポリクローナル抗ブタIgG 「pAb」
−  ジゴキシゲニン化モノクローナル抗ブタIgG 「mAb」
【００８５】
交差反応性は、イムノアッセイにおいて評価された。手短に述べると、12の異なる種からの血清または血漿を、アルカリ性NaHCO3緩衝液中の、5%のマトリックス濃縮希釈物として、NUNC Maxisorpプレートに結合させた。ヒヒ、アカゲザル、カニクイザル、マーモセット、イヌ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、およびウサギからの試料に加え、2種類のヒト試料および2種類のミニブタ試料が使用された。プレートは、3種類の試験される抗ミニブタIgG抗体2 μg/mlとインキュベートされた、これら抗体は、述べられたように、ジゴキシゲニン化されているか、または西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）とコンジュゲートされているかのいずれかであった。ジゴキシゲニン化抗ミニブタIgGとのインキュベーションの後に、ポリクローナルHRPコンジュゲート抗ジゴキシゲニンFab断片（Roche Diagnostics, Cat. 11633716001）とのインキュベーションが続いた。検出は、ABTS（登録商標）基質を使用し、そして405 nmにおいて標準的なELISAリーダーを用いてシグナルを検出する（参照波長：490 nm（[405/490] nm））、色変化の評価によってなされた。
【００８６】
結果は図1に示される。試験された市販のポリクローナル抗体は、多数の種由来のIgGに対して有意に交差反応する。試験された市販のモノクローナル抗体は、このアッセイにおいては、ミニブタを含む試験された種のいずれにも有意な結合を示さなかった。
【００８７】
本発明によるモノクローナル抗体2.8.14は、このアッセイにおいては、ミニブタ以外の試験された種のいずれに由来するIgGに対しても交差反応性を示さなかった。
【００８８】
実施例4：
作製されたモノクローナル抗ミニブタIgG抗体の、ヒトIgG抗体医薬に対する交差反応性
実施例2において作製された抗ミニブタIgG抗体2.8.14および2.3.8の、いくつかのヒトIgG抗体医薬に対する交差反応性を、イムノアッセイにおいて評価し、そして市販のポリクローナル抗ミニブタIgG抗体（実施例3に記載される「pAb」）と比較した。
【００８９】
試験は、ヒトIgGアイソタイプの全13種類の異なる抗体医薬を用いて進められ、薬物は、野生型抗体のドメイン配置の全長IgG（「h-IgG」と表示される）、全長IgG CrossMab（Klein et al.［MAbs. 2012 Nov-Dec;4(6):653-63］に記載されるようなドメイン交換を含む；「XMab」と表示される）、またはFab断片（「h-Fab」と表示される）のいずれかであった。ミニブタIgG（ミニブタ血清から自社で調製）は陽性対照として使用された。全長IgGである薬物3、5、7、および8に関しては、図2に示されるように、抗体の断片も同様に試験された。
【００９０】
抗薬物抗体に対する交差反応性の検出のため、陽性対照および抗体医薬はMaxisorpプレートに結合され、そして、その後にHRPコンジュゲート抗ジゴキシゲニン抗体とのインキュベーションが続くジゴキシゲニン化モノクローナル抗体2.8.14および2.3.8を用いて、また、Abd-SerotecからのHRPコンジュゲートポリクローナル抗ブタIgG（実施例3に記載される「pAb」）を用いて、検出された。検出は、ABTS（登録商標）基質を使用し、そして405 nmにおいて標準的なELISAリーダーを用いてシグナルを検出する（参照波長：490 nm（[405/490] nm））、色変化の評価によってなされた。
【００９１】
結果は図2に示される。本発明によるモノクローナル抗体2.8.14および2.3.8は、試験された抗体医薬に対しても、それらの断片に対しても、交差反応性を示さなかった。試験された市販のポリクローナル抗ブタ抗体は、試験されたすべての全長IgG抗体医薬およびそれらのFc断片に対して有意に交差反応する。
【００９２】
実施例5：
ミニブタ試料において薬物／ADA複合体を検出するための本発明の方法（薬物とのプレインキュベーション無し）における、市販の抗ブタIgG抗体と対比させた、作製されたモノクローナル抗ミニブタIgG抗体の適用可能性
ミニブタ試料からの、インビボで形成された薬物／ADA複合体の検出のための本発明の方法における、種々の抗ミニブタIgG抗体の適用可能性を評価するため、いくつかの市販の抗体が、本発明の抗体と比較された。以下の抗体が使用された：
−  モノクローナル抗ブタ抗体 MAb<ブタ-IgG>M-F007-1241-IgG-Dig（BD Pharmingen, Cat. 552554）（「mAb1」）
−  モノクローナル抗ブタ抗体 MAb<ブタ-IgG>M-K139-3E1-IgG（AbD Serotec, Cat. MCA633GA）（「mAb2」）
−  モノクローナル抗ブタ抗体 MAb<ブタ-IgG>M-K139-3C8-IgG（AbD Serotec, Cat. MCA633GA）（「mAb3」）
−  ポリクローナル抗ブタ抗体 PAb<ブタ-IgG-Fc>ウサギ-IgG-HRP（Rockland, Cat. 614-4303）（「pAb1」）
−  ポリクローナル抗ブタ抗体 PAb<ブタ-IgG-Fc>ヤギ-IgG-HRP（Bethyl (Biomol), Cat. A100-104P）（「pAb2」）
−  ポリクローナル抗ブタ抗体 PAb<ブタ-IgG-Fc>ヤギ-IgG-HRP（AbD-Serotec, Cat. AAI41P）（「pAb3」）
−  モノクローナル抗ミニブタIgG抗体 2.8.14
−  モノクローナル抗ミニブタIgG抗体 2.3.8
−  モノクローナル抗ミニブタIgG抗体 2.11.16
【００９３】
ミニブタ試料からの、インビボで形成された薬物／ADA複合体の検出のため、以下のアッセイ（本発明による）が使用された。
【００９４】
ビオチン化抗ヒトIgG-Fab（カッパ）モノクローナル抗体 MAb<h-IgG-カッパ>M-1.7.10-Fab'（Roche、WO 2012/022682に開示）は、第一の段階において、ストレプトアビジンでコートされたマイクロタイタープレート（SA-MTP）のウェルに結合させた。過剰な、未結合のFab'断片は、洗浄により除去された。
【００９５】
薬物／ADA複合体を模倣するために、ヒトIgG／ブタIgGコンジュゲートが調製された。そのため、ポリクローナルヒトIgG（ヒト血清から精製）は、ポリクローナルブタIgG（ブタ血清から精製）と、化学的にコンジュゲートされた。そのような由来のヒトIgG／ブタIgGコンジュゲートは、低濃度、中濃度、および高濃度で、2%ミニブタプール血漿に加えられて、陽性対照として使用された（ここで「LPC」は低濃度の、「MPC」は中濃度の、および「HPC」は高濃度の、陽性対照を指す）。ミニブタプール血漿（ヒトIgG／ブタIgGコンジュゲートを加えられていない）は、陰性対照として使用された。
【００９６】
したがって、対照がウェルに添加され、そしてその中でインキュベートされた。未結合の物質を洗い流した後、ヒトIgG／ブタIgGコンジュゲート（薬物／ADA複合体を模倣する）は、記載のジゴキシゲニン化抗ミニブタ抗体を用いて検出され、それに西洋ワサビペルオキシダーゼ標識された抗ジゴキシゲニン抗体とのインキュベーションが続いた。抗体−酵素コンジュゲートは、ABTS（登録商標）基質の呈色反応を触媒する。シグナルは、標準的なELISAリーダーによって、405 nmの波長で測定された（参照波長：490 nm（[405/490] nm））。各試料の吸光度の値は、2度繰り返して決定された。
【００９７】
薬物／ADA複合体の直接検出に適したこの試験システムの例示となる図解が、図3に示される。
【００９８】
結果は図4に示される、ここで「NC」とは陰性対照を指し、「LPC」とは低レベルのヒトIgG／ブタIgGコンジュゲートを有する陽性対照を指し、「MPC」とは中レベルのヒトIgG／ブタIgGコンジュゲートを有する陽性対照を指し；「HPC」とは高レベルのヒトIgG／ブタIgGコンジュゲートを有する陽性対照を指す。
【００９９】
試験された市販のモノクローナル抗体は、かなり高いバックグラウンドを示した（mAb2）か、または有意なシグナルをまったく示さなかった（mAb1、mAb3）。試験された市販のポリクローナル抗体は、妥当なシグナル対ノイズ比を示し、この検出方法に適しているようである。試験された本発明の抗体はすべて、試験されたポリクローナル抗体よりもわずかに優れたシグナル対ノイズ比を示した。
【０１００】
実施例6：
ミニブタ試料においてADAを検出するための本発明の方法（薬物とのプレインキュベーション有り）における、市販の抗ブタIgG抗体と対比させた、作製されたモノクローナル抗ミニブタIgG抗体の適用可能性
ミニブタ試料からのADAの検出のための本発明の方法における、種々の抗ミニブタIgG抗体の適用可能性を評価するため、実施例5において使用された市販のポリクローナル抗体を、本発明の抗体と比較した。
【０１０１】
ミニブタ試料からのADAの検出のために、以下のアッセイ（本発明による）が使用された。
【０１０２】
ビオチン化抗ヒトIgG-Fab（カッパ）モノクローナル抗体 MAb<h-IgG-カッパ>M-1.7.10-Fab'は、第一の段階において、ストレプトアビジンでコートされたマイクロタイタープレート（SA-MTP）のウェルに結合させた。過剰な、未結合のFab'断片は、洗浄により除去された。
【０１０３】
対照試料は、実施例5に記載されるように使用された（LPC、MPC、HPC、およびNC）。
【０１０４】
分析のため、対照試料がマイクロタイタープレートのウェルに添加され、そしてその中でインキュベートされた。未結合の物質を洗い流した後、ヒトIgG／ブタIgGコンジュゲート（薬物／ADA複合体を模倣する）は、記載のジゴキシゲニン化抗ミニブタ抗体を用いて検出され、続いて西洋ワサビペルオキシダーゼ標識された抗ジゴキシゲニン抗体とのインキュベーションを行った。抗体−酵素コンジュゲートは、ABTS（登録商標）基質の呈色反応を触媒する。シグナルは、ELISAリーダーによって、405 nmの波長で測定された（参照波長：490 nm（[405/490] nm））。各試料の吸光度の値は、2度繰り返して決定された。
【０１０５】
ミニブタ試料からのADAの検出および薬物／ADA複合体の検出に適したこの試験システムの例示となる図解が、図5に示される。
【０１０６】
結果は図6に示され、ここで「NC」とは陰性対照を指し、「LPC」とは低レベルのヒトIgG／ブタIgGコンジュゲートを有する陽性対照を指し、「MPC」とは中レベルのヒトIgG／ブタIgGコンジュゲートを有する陽性対照を指し；「HPC」とは高レベルのヒトIgG／ブタIgGコンジュゲートを有する陽性対照を指す。
【０１０７】
試験された市販のポリクローナル抗体は、ヒトIgGに対する交差反応性のために生じるようであるかなり高いバックグラウンドノイズを表す、低いシグナル対ノイズ比を示した。試験された本発明の抗体はすべて、先行技術の抗体よりも良好なシグナル対ノイズ比を示した。
【０１０８】
実施例7：
モノクローナル抗ミニブタIgG 2.8.14を用いる、本発明の方法によるミニブタ試料からのADAの検出
ヒトIgG1抗体医薬を用いた異なるインビボ研究に由来するミニブタ試料からのADAの検出が、モノクローナル抗ミニブタIgG 2.8.14を用いて、本発明の方法によって実施された。
【０１０９】
結果は、検出用の適切にコンジュゲートされた抗体医薬を用いる、ミニブタ試料からのADAの検出のための直接イムノアッセイ（「ブリッジングアッセイ」）と比較された。
【０１１０】
ブリッジングアッセイ（比較例）は、以下のように実施された。
【０１１１】
手短に述べると、試料のタイプに応じて適切に希釈されたミニブタ試料を、捕捉抗体としてのビオチン化抗体医薬、およびジゴキシゲニンに連結された抗体医薬と、同時にプレインキュベートする。ストレプトアビジンでコートされたマイクロタイタープレート上で、ミニブタ試料からのADAと、ビオチンに連結された抗体医薬およびジゴキシゲニンに連結された抗体医薬との結合が、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識された抗ジゴキシゲニン抗体とのインキュベーションによって検出される。抗体−酵素コンジュゲートは、ABTS（登録商標）基質の呈色反応を触媒する。シグナルは、ELISAリーダーによって、405 nmの波長で測定された（参照波長：490 nm（[405/490] nm））。
【０１１２】
本発明の方法による、ミニブタ試料からのADAの検出（本明細書においてはさらに、「プレインキュベーション有りのICアッセイ」とも称される）は、先にスクリーニングされたミニブタ試料の代わりに、記載のインビボ研究からの試料が使用され、そして1:20の比で希釈された、という点で差異を有しつつも、実施例6に記載されるように実施された。ミニブタ試料は、2種類の異なる眼科用の抗体医薬のインビボ研究から取得され、ここで薬物Aはヒト全長IgG1 CrossMabであり、かつ薬物BはヒトIgG1 Fab断片であった。
【０１１３】
陽性対照として、2%ミニブタCTAD血漿に加えられた、ブタIgG（ブタ血清から精製、自社での調製）と化学的にコンジュゲートされたヒトIgG（ヒト血清から精製、自社での調製）が使用された。ミニブタプール血漿は、陰性対照として使用された。
【０１１４】
結果は表2〜10に示され、これらは、該当する場合には、表示される薬物の適用経路および用量、試料タイプ、表示される処置を受けたミニブタの対象識別名、薬物を適用した後の試料採取の時間、ならびにADA検出の結果（陽性は［陽］として、かつ陰性は［陰］として区分）を示す。スクリーニングのカットポイント（CP）は、浮動CPおよびノンパラメトリックな判定を用いて、Shankar et al. (J Pharm Biomed Anal. 2008 Dec 15;48(5):1267-81)にしたがって評価された。プレート特異的CP（正規化係数を乗じた、プールされた未処理の血漿であるブランク）を算出することにより、スクリーニング陰性（プレート特異的CP、PSCP未満）の試料、およびスクリーニング陽性（PSCP以上）の試料が同定された。方法の妥当性確認は、現行のガイドラインにしたがって、十分に実施された。これは、本発明のアッセイのそれぞれについて個々に、比較例として使用されたブリッジングアッセイと同様になされた。
【０１１５】
硝子体液試料についての、以下の表7および9に示される薬物Bの硝子体内注入からの結果はまた、両方のアッセイによって評価された絶対OD値を示す図7においても示される。
【０１１６】
（表２）1.5 mg／眼球の薬物Aの硝子体内注入、血漿試料
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【０１１７】
（表３）1.5 mg／眼球の薬物Aの硝子体内注入、硝子体液試料
2020530901.tif 000008
【０１１８】
（表４）0.3 mg/kgの薬物A（ヒトIgG1）の静脈内注入、血漿試料
2020530901.tif 000009
【０１１９】
（表５）5 mg／眼球の薬物Bの硝子体内注入、血漿試料
2020530901.tif 000010
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【０１２０】
（表６）10 mg／眼球の薬物Bの硝子体内注入、血漿試料
2020530901.tif 000012
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【０１２１】
（表７）5 mg／眼球の薬物Bの硝子体内注入、硝子体液試料
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【０１２２】
（表８）5 mg／眼球の薬物Bの硝子体内注入、眼房水試料
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【０１２３】
（表９）10 mg／眼球の薬物Bの硝子体内注入、硝子体液試料
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【０１２４】
（表１０）10 mg／眼球の薬物Bの硝子体内注入、眼房水試料
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【０１２５】
要約すると、結果は、本発明の方法が信頼性をもってミニブタ試料からADAを検出することを証明する。いくつかの試料では、ADAが、プレインキュベーション有りのICアッセイ（本発明の方法）により検出されるが、ブリッジングアッセイでは検出されないことから、プレインキュベーション有りのICアッセイは、ブリッジングアッセイよりも高感度であるようである。
【０１２６】
実施例8
本発明の方法の比較研究：モノクローナル抗ミニブタIgG2.8.14を使用した、プレインキュベーション有りのICアッセイを用いるミニブタ試料におけるADAの検出、およびモノクローナル抗ミニブタIgG2.8.14を使用した、プレインキュベーション無しのICアッセイを用いる薬物／ADA複合体の検出
ヒトIgG1抗体医薬を用いた異なるインビボ研究に由来するミニブタ試料からのADAの検出は、モノクローナル抗ミニブタIgG 2.8.14を用いて、本発明の方法によって、実施例7に記載される実験設定（プレインキュベーション有りのICアッセイ）において実施された。
【０１２７】
ヒトIgG1抗体医薬を用いた異なるインビボ研究に由来するミニブタ試料からの薬物／ADA複合体の検出は、モノクローナル抗ミニブタIgG 2.8.14を用いて、別の本発明の方法、すなわち実施例5に記載される設定によって実施された（インビボで形成された薬物／ADA複合体の検出のために使用されるこの方法はさらに、本明細書においては「プレインキュベーション無しのICアッセイ」とも称される）。実施例5に記載される設定から逸脱して、低レベル、中レベル、および高レベルの薬物／ADA複合体を有する先にスクリーニングされたミニブタ試料の代わりに、インビボ研究からの試料が、記載のように使用され、そして1:20の比で希釈された。ミニブタ試料は、2種類の異なる眼科用の抗体医薬のインビボ研究から取得され、ここで薬物Aはヒト全長IgG1 CrossMabであり、かつ薬物BはヒトIgG1 Fab断片であった。
【０１２８】
2%ミニブタCTAD血漿に加えられた、ブタIgG（ブタ血清から精製、自社での調製）と化学的にコンジュゲートされたヒトIgG（ヒト血清から精製、自社での調製）が、陽性対照として使用された。ミニブタプール血漿は、陰性対照として使用された。
【０１２９】
結果は表11〜16に示され、これらは、該当する場合には、表示される薬物の適用経路および用量、試料タイプ、表示される処置を受けたミニブタの対象識別名、薬物を適用した後の試料採取の時間、ならびにADA検出の結果（陽性は［陽］として、かつ陰性は［陰］として区分）を示す。スクリーニングのカットポイント（CP）は、浮動CPおよびノンパラメトリックな判定を用いて、Shankar et al. (J Pharm Biomed Anal. 2008 Dec 15;48(5):1267-81) にしたがって評価された。プレート特異的CP（正規化係数を乗じた、プールされた未処理の血漿であるブランク）を算出することにより、スクリーニング陰性（プレート特異的CP、PSCP未満）の試料、およびスクリーニング陽性（PSCP以上）の試料が同定された。方法の妥当性確認は、現行のガイドラインにしたがって、十分に実施された。これは、本発明のアッセイのそれぞれについて個々に、比較例として使用されたブリッジングアッセイと同様になされた。
【０１３０】
（表１１）5 mg／眼球の薬物Bの硝子体内注入、血漿試料
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【０１３１】
（表１２）10 mg／眼球の薬物Bの硝子体内注入、血漿試料
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【０１３２】
（表１３）5 mg／眼球の薬物Bの硝子体内注入、硝子体液試料
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【０１３３】
（表１４）5 mg／眼球の薬物Bの硝子体内注入、眼房水試料
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【０１３４】
（表１５）10 mg／眼球の薬物Bの硝子体内注入、硝子体液試料
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【０１３５】
（表１６）10 mg／眼球の薬物Bの硝子体内注入、眼房水試料
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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