(57)【要約】本開示は、コンピューターで駆動され、分子生物学、自動化、および高度な機械学習プロトコールを統合する、糸状菌細胞を改善するためのＨＴＰゲノム操作プラットフォームを提供する。この統合プラットフォームは、一式のＨＴＰ分子ツールセットを利用して、ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーを生み出す。これらのライブラリーは、とりわけ、科学的洞察および反復パターン認識から得られる。本開示は、伝統的な微生物株改良プログラムに関連した無数の問題を被らない、例えば糸状菌などの多核体生物体のためのハイスループット（ＨＴＰ）ゲノム操作プラットフォームを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
糸状菌株を産生するための方法であって、
ａ．）複数のプロトプラストを提供するステップであって、前記プロトプラストは、糸状菌細胞の培養物から調製されたものである、ステップ；
ｂ．）前記複数のプロトプラストを第１のコンストラクトおよび第２のコンストラクトで形質転換するステップであって、前記第１のコンストラクトは、前記プロトプラストのゲノム中の第１の遺伝子座に相同なヌクレオチドが両側に隣接している第１のポリヌクレオチドを含み、前記第２のコンストラクトは、前記プロトプラストのゲノム中の第２の遺伝子座に相同なヌクレオチドが両側に隣接している第２のポリヌクレオチドを含み、形質転換により、相同組換えによって前記第１の遺伝子座に前記第１のコンストラクトが組み込まれ、前記第２の遺伝子座に前記第２のコンストラクトが組み込まれ、少なくとも前記第２の遺伝子座は、前記プロトプラストのゲノム中の第１の選択可能なマーカー遺伝子であり、前記第１のポリヌクレオチドは、変異および／または遺伝子制御エレメントを含む、ステップ；
ｃ．）選択および対抗選択を実行することによって、同核共存体の形質転換体を精製するステップ；および
ｄ．）前記糸状菌細胞の再生を助長する培地中で、精製した形質転換体を増殖させるステップ
を含む、方法。
【請求項２】
前記第１のコンストラクトが、コンストラクトＡおよびコンストラクトＢに分割され、コンストラクトＡは、前記第１のポリヌクレオチドの第１の部分と、前記第１のポリヌクレオチドの前記第１の部分の５’側に前記第１の遺伝子座に相同なヌクレオチドとを含み、コンストラクトＢは、前記第１のポリヌクレオチドの第２の部分と、前記第１のポリヌクレオチドの前記第２の部分の３’側に前記第１の遺伝子座に相同なヌクレオチドを含み、前記第１のポリヌクレオチドの前記第１の部分および前記第２の部分は、オーバーラップする相補的配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第２のコンストラクトが、コンストラクトＡおよびコンストラクトＢに分割され、コンストラクトＡが、前記第２のポリヌクレオチドの第１の部分と、前記第２のポリヌクレオチドの前記第１の部分の５’側に前記第１の遺伝子座に相同なヌクレオチドとを含み、コンストラクトＢが、前記第２のポリヌクレオチドの第２の部分と、前記第２のポリヌクレオチドの前記第２の部分の３’側に前記第１の遺伝子座に相同なヌクレオチドを含み、前記第２のポリヌクレオチドの前記第１の部分および前記第２の部分が、オーバーラップする相補的配列を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記複数のプロトプラストからの各プロトプラストが、複数の第１のコンストラクトからの単一の第１のコンストラクトおよび複数の第２のコンストラクトからの単一の第２のコンストラクトで形質転換され、前記複数の第１のコンストラクトからの各第１のコンストラクト中の前記第１のポリヌクレオチドが、異なる変異および／または遺伝子制御エレメントを含み、前記複数の第２のコンストラクトからの各第２のコンストラクト中の前記第２のポリヌクレオチドが同一である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ステップａ〜ｄを繰り返して、糸状菌細胞のライブラリーを生成するステップをさらに含み、前記ライブラリー中の各糸状菌細胞は、異なる変異および／または遺伝子制御エレメントを有する第１のポリヌクレオチドを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記第１のポリヌクレオチドが、標的糸状菌遺伝子または異種遺伝子をコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記変異が、一塩基多型である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記遺伝子制御が、プロモーター配列および／またはターミネーター配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記遺伝子制御エレメントが、プロモーター配列であり、前記プロモーター配列は、表１に列挙したプロモーター配列から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記複数のプロトプラストが、マイクロタイタープレートのウェルに分配される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ステップａ〜ｄが、マイクロタイタープレートのウェルで実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記マイクロタイタープレートが、９６ウェル、３８４ウェルまたは１５３６ウェルのマイクロタイタープレートである、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記糸状菌細胞が、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａの種、またはこれらのテレオモルフ、アナモルフ、シノニムもしくは分類学的均等物由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記糸状菌細胞が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記糸状菌細胞が、菌糸体を形成しない表現型を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記糸状菌細胞が、非機能的な非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記非機能的なＮＨＥＪ経路が、前記細胞を、抗体、化学的阻害剤、タンパク質阻害剤、物理的阻害剤、ペプチド阻害剤、または前記ＮＨＥＪ経路のコンポーネントに指向させたアンチセンスもしくはＲＮＡｉ分子に曝露することに起因する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記化学的阻害剤が、Ｗ−７である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１の遺伝子座が、標的糸状菌遺伝子のためのものである、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１の遺伝子座が、前記プロトプラストのゲノム中の第２の選択可能なマーカー遺伝子のためのものである、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記第２の選択可能なマーカー遺伝子が、栄養要求性マーカー遺伝子、発色性マーカー遺伝子、または指向性マーカー遺伝子である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１の選択可能なマーカー遺伝子が、栄養要求性マーカー遺伝子、発色性マーカー遺伝子、または指向性マーカー遺伝子である、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記第２のポリヌクレオチドが、栄養要求性マーカー遺伝子、指向性マーカー遺伝子、または抗生物質耐性遺伝子である、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記発色性マーカー遺伝子が、ａｙｇＡ遺伝子である、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記栄養要求性マーカー遺伝子が、ａｒｇＢ遺伝子、ｔｒｐＣ遺伝子、ｐｙｒＧ遺伝子、またはｍｅｔ３遺伝子である、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記指向性マーカー遺伝子が、アセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）遺伝子、硝酸レダクターゼ遺伝子（ｎｉａＤ）、または硫酸パーミアーゼ（ＳｕｔＢ）遺伝子である、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗生物質耐性遺伝子が、ｂｌｅ遺伝子であり、前記ｂｌｅ遺伝子は、フレオマイシンに対する耐性を付与する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記第１の選択可能なマーカー遺伝子が、ａｙｇＡ遺伝子であり、前記第２のポリヌクレオチドが、ｐｙｒＧ遺伝子である、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記第１の選択可能なマーカー遺伝子が、ｍｅｔ３遺伝子であり、前記第２の選択可能なマーカー遺伝子が、ａｙｇＡ遺伝子であり、前記第２のポリヌクレオチドが、ｐｙｒＧ遺伝子である、請求項２０に記載の方法。
【請求項３０】
前記複数のプロトプラストが、前記糸状菌細胞の培養物中の前記糸状菌細胞から細胞壁を除去すること；前記複数のプロトプラストを単離すること；および
単離された前記複数のプロトプラストを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む混合物中に再懸濁することによって調製され、ＤＭＳＯの最終濃度は、７％ｖ／ｖまたはそれ未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記混合物が、ステップａ〜ｄを実行する前に、少なくとも−２０℃または−８０℃で貯蔵される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記培養物が、少なくとも１リットルの体積である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記培養物が、前記プロトプラストの調製の前に、少なくとも１２時間増殖される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記プロトプラストの少なくとも７０％がより小さくなり、より少ない核を含有するような条件下で、真菌培養物が増殖される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞壁を除去することが、酵素消化によって実行される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
前記酵素消化が、ベータ−グルカナーゼおよびポリガラクツロナーゼを含む酵素の混合物を用いて実行される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記プロトプラストを貯蔵する前に、前記ＤＭＳＯを含む混合物に、４０％ｖ／ｖのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を添加することをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＰＥＧが、８％ｖ／ｖまたはそれ未満の最終濃度まで添加される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
ステップａ〜ｄが、自動化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項４０】
貯蔵のための糸状菌細胞を調製するための方法であって、
糸状菌細胞を含む真菌培養物からプロトプラストを調製するステップであって、前記真菌培養物中の前記糸状菌細胞から細胞壁を除去することを含む、ステップ；
前記プロトプラストを単離するステップ；および
単離された前記プロトプラストを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を７％ｖ／ｖまたはそれ未満の最終濃度で含む混合物中に再懸濁するステップ
を含む、方法。
【請求項４１】
前記混合物が、少なくとも−２０℃または−８０℃で貯蔵される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記真菌培養物が、少なくとも１リットルの体積である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記真菌培養物が、前記プロトプラストの調製の前に、少なくとも１２時間増殖される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記プロトプラストの少なくとも７０％がより小さくなり、より少ない核を有するような条件下で、前記真菌培養物が増殖される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
前記細胞壁を除去することが、酵素消化によって実行される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
前記酵素消化が、ベータ−グルカナーゼおよびポリガラクツロナーゼを含む酵素の混合物を用いて実行される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記プロトプラストを貯蔵する前に、前記ＤＭＳＯを含む混合物に、４０％ｖ／ｖのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を添加することをさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＰＥＧが、８％ｖ／ｖまたはそれ未満の最終濃度まで添加される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記プロトプラストを貯蔵する前に、前記プロトプラストをマイクロタイタープレートに分配するステップをさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項５０】
前記真菌培養物中の前記糸状菌細胞が、菌糸体を形成しない表現型を有する、請求項４０に記載の方法。
【請求項５１】
前記真菌培養物中の前記糸状菌細胞が、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａの種、またはこれらのテレオモルフもしくはアナモルフ、およびシノニムもしくは分類学的均等物から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項５２】
前記真菌培養物中の前記糸状菌細胞が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒまたはそのテレオモルフもしくはアナモルフである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
真菌産生株を生成するためのシステムであって、
１つまたは複数のプロセッサー；および
前記１つまたは複数のプロセッサーの少なくとも１つに作動可能にカップリングされている１つまたは複数のメモリーであって、前記１つまたは複数のプロセッサーの少なくとも１つによって実行されるときに、前記システムに、
ａ．）糸状菌細胞の培養物から得られた複数のプロトプラストを第１のコンストラクトおよび第２のコンストラクトで形質転換するステップであって、前記第１のコンストラクトは、前記プロトプラストのゲノム中の第１の遺伝子座に相同なヌクレオチドが両側に隣接している第１のポリヌクレオチドを含み、前記第２のコンストラクトは、前記プロトプラストのゲノム中の第２の遺伝子座に相同なヌクレオチドが両側に隣接している第２のポリヌクレオチドを含み、形質転換により、相同組換えによって前記第１の遺伝子座に前記第１のコンストラクトが組み込まれ、前記第２の遺伝子座に第２のコンストラクトが組み込まれ、少なくとも前記第２の遺伝子座は、前記プロトプラストのゲノム中の第１の選択可能なマーカー遺伝子であり、前記第１のポリヌクレオチドは、変異および／または遺伝子制御エレメントを含む、ステップ；
ｂ．）選択および対抗選択を実行することによって、同核共存体の形質転換体を精製するステップ；および
ｃ．）前記糸状菌細胞の再生を助長する培地中で、精製した形質転換体を増殖させるステップ
を行わせる命令が記憶されている、メモリー
を含む、システム。
【請求項５４】
前記第１のコンストラクトが、コンストラクトＡおよびコンストラクトＢに分割され、コンストラクトＡは、前記第１のポリヌクレオチドの第１の部分と、前記第１のポリヌクレオチドの前記第１の部分の５’側に前記第１の遺伝子座に相同なヌクレオチドとを含み、コンストラクトＢは、前記第１のポリヌクレオチドの第２の部分と、前記第１のポリヌクレオチドの前記第２の部分の３’側に前記第１の遺伝子座に相同なヌクレオチドとを含み、前記第１のポリヌクレオチドの前記第１の部分および前記第２の部分は、オーバーラップする相補的配列を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記第２のコンストラクトが、コンストラクトＡおよびコンストラクトＢに分割され、コンストラクトＡは、前記第２のポリヌクレオチドの第１の部分と、前記第２のポリヌクレオチドの前記第１の部分の５’側に前記第１の遺伝子座に相同なヌクレオチドを含み、コンストラクトＢが、前記第２のポリヌクレオチドの第２の部分と、前記第２のポリヌクレオチドの前記第２の部分の３’側に前記第１の遺伝子座に相同なヌクレオチドを含み、前記第２のポリヌクレオチドの前記第１の部分および前記第２の部分が、オーバーラップする相補的配列を含む、請求項５３または５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記複数のプロトプラストからの各プロトプラストが、複数の第１のコンストラクトからの単一の第１のコンストラクトおよび複数の第２のコンストラクトからの単一の第２のコンストラクトで形質転換され、前記複数の第１のコンストラクトからの各第１のコンストラクト中の前記第１のポリヌクレオチドが、異なる変異および／または遺伝子制御エレメントを含み、前記複数の第２のコンストラクトからの各第２のコンストラクト中の前記第２のポリヌクレオチドが同一である、請求項５３に記載のシステム。
【請求項５７】
ステップａ〜ｃを繰り返して、糸状菌細胞のライブラリーを生成する命令をさらに含み、前記ライブラリー中の各糸状菌細胞は、異なる変異および／または遺伝子制御エレメントを有する第１のポリヌクレオチドを含む、請求項５３に記載のシステム。
【請求項５８】
前記変異が、一塩基多型である、請求項５３に記載のシステム。
【請求項５９】
前記遺伝子制御エレメントが、プロモーター配列および／またはターミネーター配列である、請求項５３に記載のシステム。
【請求項６０】
前記遺伝子制御エレメントが、プロモーター配列であり、前記プロモーター配列は、表１に列挙したプロモーター配列から選択される、請求項５３に記載のシステム。
【請求項６１】
ステップａ〜ｃが、マイクロタイタープレートのウェルで実行される、請求項５３に記載のシステム。
【請求項６２】
前記マイクロタイタープレートが、９６ウェル、３８４ウェルまたは１５３６ウェルのマイクロタイタープレートである、請求項６１に記載のシステム。
【請求項６３】
前記糸状菌細胞が、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａの種、またはこれらのテレオモルフもしくはアナモルフ、およびシノニムもしくは分類学的均等物から選択される、請求項５３に記載のシステム。
【請求項６４】
前記糸状菌細胞が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒである、請求項５３に記載のシステム。
【請求項６５】
前記糸状菌細胞が、菌糸体を形成しない表現型を有する、請求項５３に記載のシステム。
【請求項６６】
前記糸状菌細胞が、非機能的な非相同末端結合経路を有する、請求項５３に記載のシステム。
【請求項６７】
前記細胞を、抗体、化学的阻害剤、タンパク質阻害剤、物理的阻害剤、ペプチド阻害剤、または前記ＮＨＥＪ経路のコンポーネントに指向させたアンチセンスもしくはＲＮＡｉ分子に曝露することによって、前記ＮＨＥＪ経路が非機能的になる、請求項６６に記載のシステム。
【請求項６８】
前記化学的阻害剤が、Ｗ−７である、請求項６７に記載のシステム。
【請求項６９】
前記第１の遺伝子座が、標的糸状菌遺伝子のためのものである、請求項５３に記載のシステム。
【請求項７０】
前記第１の遺伝子座が、前記プロトプラストのゲノム中の第２の選択可能なマーカー遺伝子のためのものである、請求項５３に記載のシステム。
【請求項７１】
前記第２の選択可能なマーカー遺伝子が、栄養要求性マーカー遺伝子、発色性マーカー遺伝子または指向性マーカー遺伝子から選択される、請求項７０に記載のシステム。
【請求項７２】
前記第１の選択可能なマーカー遺伝子が、栄養要求性マーカー遺伝子、発色性マーカー遺伝子または指向性マーカー遺伝子から選択される、請求項５３に記載のシステム。
【請求項７３】
前記第２のポリヌクレオチドが、栄養要求性マーカー遺伝子、指向性マーカー遺伝子または抗生物質耐性遺伝子から選択される、請求項５３に記載のシステム。
【請求項７４】
前記発色性マーカー遺伝子が、ａｙｇＡ遺伝子である、請求項７１または７２に記載のシステム。
【請求項７５】
前記栄養要求性マーカー遺伝子が、ａｒｇＢ遺伝子、ｔｒｐＣ遺伝子、ｐｙｒＧ遺伝子、またはｍｅｔ３遺伝子から選択される、請求項７１または７２に記載のシステム。
【請求項７６】
前記指向性マーカー遺伝子が、アセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）遺伝子、硝酸レダクターゼ遺伝子（ｎｌａＤ）、または硫酸パーミアーゼ（ＳｕｔＢ）遺伝子から選択される、請求項７１または７２に記載のシステム。
【請求項７７】
前記抗生物質耐性遺伝子が、ｂｌｅ遺伝子であり、前記ｂｌｅ遺伝子は、フレオマイシンに対する耐性を付与する、請求項７３に記載のシステム。
【請求項７８】
前記第１の選択可能なマーカー遺伝子が、ａｙｇＡ遺伝子であり、前記第２のポリヌクレオチドが、ｐｙｒＧ遺伝子である、請求項５３に記載のシステム。
【請求項７９】
前記第１の選択可能なマーカー遺伝子が、ｍｅｔ３遺伝子であり、前記第２の選択可能なマーカー遺伝子が、ａｙｇＡ遺伝子であり、前記第２のポリヌクレオチドが、ｐｙｒＧ遺伝子である、請求項７０に記載のシステム。
【請求項８０】
前記複数のプロトプラストが、前記糸状菌細胞の培養物中の前記糸状菌細胞から細胞壁を除去すること；前記複数のプロトプラストを単離すること；および
単離された前記複数のプロトプラストを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を７％ｖ／ｖまたはそれ未満の最終濃度で含む混合物中に再懸濁すること
によって調製される、請求項５３に記載のシステム。
【請求項８１】
前記混合物が、ステップａ〜ｃを実行する前に、少なくとも−２０℃または−８０℃で貯蔵される、請求項８０に記載のシステム。
【請求項８２】
前記培養物が、少なくとも１リットルの体積である、請求項８０または８１に記載のシステム。
【請求項８３】
前記培養物が、前記プロトプラストの調製の前に、少なくとも１２時間増殖される、請求項８０に記載のシステム。
【請求項８４】
前記プロトプラストの少なくとも７０％がより小さくなり、より少ない核を有するような条件下で、真菌培養物が増殖される、請求項８０に記載のシステム。
【請求項８５】
前記細胞壁を除去することが、酵素消化によって実行される、請求項８０に記載のシステム。
【請求項８６】
前記酵素消化が、ベータ−グルカナーゼおよびポリガラクツロナーゼを含む酵素の混合物を用いて実行される、請求項８５に記載のシステム。
【請求項８７】
前記プロトプラストを貯蔵する前に、前記ＤＭＳＯを含む混合物に、４０％ｖ／ｖのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を添加することをさらに含む、請求項５３に記載のシステム。
【請求項８８】
前記ＰＥＧが、８％ｖ／ｖまたはそれ未満の最終濃度まで添加される、請求項８７に記載のシステム。
【請求項８９】
所望の表現型を獲得するために糸状菌を進化させるゲノム操作のハイスループット（ＨＴＰ）方法であって、
ａ．同じゲノム株バックグラウンドを有する最初の複数の糸状菌微生物のゲノムを撹乱することによって、ユニークな遺伝的バリエーションを有する個々の糸状菌株を含む最初のＨＴＰ遺伝子設計糸状菌株ライブラリーを生み出すステップ；
ｂ．前記最初のＨＴＰ遺伝子設計糸状菌株ライブラリーの個々の株を、前記所望の表現型についてスクリーニングおよび選択するステップ；
ｃ．それぞれ遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の糸状菌微生物を提供することによって、後続のＨＴＰ遺伝子設計糸状菌株ライブラリーを生み出すステップであって、前記遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも２つの個々の糸状菌株に存在する前記遺伝的バリエーションから選択される、ステップ；
ｄ．前記後続のＨＴＰ遺伝子設計糸状菌株ライブラリーの個々の糸状菌株を、前記所望の表現型についてスクリーニングおよび選択するステップ；および
ｅ．糸状菌微生物が前記所望の表現型を獲得するまで、線形または非線形様式でステップｃ）〜ｄ）を１回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するＨＴＰ遺伝子設計糸状菌株ライブラリーの少なくとも２つの個々の糸状菌株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを内包する個々の糸状菌株を含む新しいＨＴＰ遺伝子設計糸状菌株ライブラリーが創製される、ステップ
を含む、方法。
【請求項９０】
前記最初のＨＴＰ遺伝子設計糸状菌株ライブラリーが、プロモータースワップ微生物株ライブラリー、ＳＮＰスワップ微生物株ライブラリー、開始／停止コドン微生物株ライブラリー、最適化配列微生物株ライブラリー、ターミネータースワップ微生物株ライブラリー、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つのライブラリーを含む、請求項８９に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
【請求項９１】
前記最初のＨＴＰ遺伝子設計糸状菌株ライブラリーが、プロモータースワップ微生物株ライブラリーを含む、請求項８９に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
【請求項９２】
前記最初のＨＴＰ遺伝子設計糸状菌株ライブラリーが、少なくとも１つのバイシストロン設計（ＢＣＤ）調節配列を含有するプロモータースワップ微生物株ライブラリーを含む、請求項８９に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
【請求項９３】
前記最初のＨＴＰ遺伝子設計糸状菌株ライブラリーが、ＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーを含む、請求項８９に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
【請求項９４】
前記最初のＨＴＰ遺伝子設計糸状菌株ライブラリーが、
ａ．キメラ生合成酵素をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドであって、前記キメラ生合成酵素は、
ｉ．糸状菌において調節経路に関与する酵素を含み；
ｉｉ．ＤＮＡ結合部位に結合することができるＤＮＡ結合ドメインに翻訳により融合される、
少なくとも１つのポリヌクレオチド；および
ｂ．前記キメラ生合成酵素の前記ＤＮＡ結合ドメインに対応する前記ＤＮＡ結合部位を含む少なくとも１つのＤＮＡ足場配列
を含む微生物株ライブラリーを含む、請求項８９に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
【請求項９５】
前記後続のＨＴＰ遺伝子設計糸状菌株ライブラリーが、前記最初のＨＴＰ遺伝子設計糸状菌株ライブラリーにおける前記遺伝的バリエーションに由来する完全コンビナトリアル株ライブラリーである、請求項８９に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
【請求項９６】
前記後続のＨＴＰ遺伝子設計糸状菌株ライブラリーが、前記最初のＨＴＰ遺伝子設計糸状菌株ライブラリーにおける前記遺伝的バリエーションに由来する完全コンビナトリアル株ライブラリーのサブセットである、請求項８９に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
【請求項９７】
前記後続のＨＴＰ遺伝子設計糸状菌株ライブラリーが、先行するＨＴＰ遺伝子設計糸状菌株ライブラリーにおける前記遺伝的バリエーションに由来する完全コンビナトリアル株ライブラリーである、請求項８９に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
【請求項９８】
前記後続のＨＴＰ遺伝子設計糸状菌株ライブラリーが、先行するＨＴＰ遺伝子設計糸状菌株ライブラリーにおける前記遺伝的バリエーションに由来する完全コンビナトリアル株ライブラリーのサブセットである、請求項８９に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
【請求項９９】
前記ゲノムを撹乱することが、ランダム変異誘発、標的とした配列挿入、標的とした配列欠失、標的とした配列置き換え、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つの方法を利用することを含む、請求項８９に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
【請求項１００】
前記最初の複数の糸状菌微生物が、工業生産糸状菌株に由来するユニークな遺伝的バリエーションを含む、請求項８９に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
【請求項１０１】
前記最初の複数の糸状菌微生物が、Ｓ１Ｇｅｎ１で表される工業生産株微生物およびＳｎＧｅｎｎで表されるこれらに由来する後続の任意の数の微生物世代を含む、請求項８９に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
【請求項１０２】
前記糸状菌が、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａの種、またはこれらのテレオモルフもしくはアナモルフ、およびシノニムもしくは分類学的均等物から選択される、請求項８９に記載のＨＴＰ方法。
【請求項１０３】
前記糸状菌が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒである、請求項８９に記載のＨＴＰ方法。
【請求項１０４】
ＳＮＰスワップ糸状菌株ライブラリーを生成するための方法であって、
ａ．参照糸状菌株および第２の糸状菌株を提供するステップであって、前記第２の糸状菌株は、前記参照糸状菌株内に存在しない一塩基多型、ＤＮＡ挿入、およびＤＮＡ欠失から選択される複数の同定された遺伝的バリエーションを含む、ステップ；および
ｂ．前記参照糸状菌株または前記第２の糸状菌株のいずれかのゲノムを撹乱することによって、複数の個々の株の各株内で見出されたユニークな遺伝的バリエーションを有する前記複数の個々の糸状菌株を含む最初のＳＮＰスワップ糸状菌株ライブラリーを生み出すステップであって、前記ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、前記参照糸状菌株と前記第２の糸状菌株との間の前記複数の同定された遺伝的バリエーションから選択される単一の遺伝的バリエーションに対応する、ステップ
を含む、方法。
【請求項１０５】
前記参照糸状菌株の前記ゲノムが撹乱されて、前記第２の糸状菌株内に見出される同定された一塩基多型、ＤＮＡ挿入、またはＤＮＡ欠失の１つまたは複数が付加される、請求項１０４に記載のＳＮＰスワップ糸状菌株ライブラリーを生成するための方法。
【請求項１０６】
前記第２の糸状菌株の前記ゲノムが撹乱されて、前記参照糸状菌株内に見出されない同定された一塩基多型、ＤＮＡ挿入、またはＤＮＡ欠失の１つまたは複数が除去される、請求項１０４に記載のＳＮＰスワップ糸状菌株ライブラリーを生成するための方法。
【請求項１０７】
結果として生じるユニークな遺伝的バリエーションを有する複数の個々の糸状菌株が、前記参照糸状菌株と前記第２の糸状菌株との間のすべての同定された前記遺伝的バリエーションの完全コンビナトリアルライブラリーを一緒に含む、請求項１０４に記載のＳＮＰスワップ糸状菌株ライブラリーを生成するための方法。
【請求項１０８】
結果として生じるユニークな遺伝的バリエーションを有する複数の個々の糸状菌株が、前記参照糸状菌株と前記第２の糸状菌株との間のすべての前記同定された遺伝的バリエーションの完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットを一緒に含む、請求項１０４に記載のＳＮＰスワップ糸状菌株ライブラリーを生成するための方法。
【請求項１０９】
前記糸状菌が、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａの種、またはこれらのテレオモルフもしくはアナモルフ、およびシノニムもしくは分類学的均等物から選択される、請求項１０４に記載のＳＮＰスワップ糸状菌株ライブラリーを生成するための方法。
【請求項１１０】
前記糸状菌が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒである、請求項１０４に記載のＳＮＰスワップ糸状菌株ライブラリーを生成するための方法。
【請求項１１１】
産生糸状菌株の表現型性能を再建および改善するための方法であって、
ａ．親系統糸状菌株およびそれに由来する産生糸状菌株を提供するステップであって、前記産生糸状菌株は、前記親系統株内に存在しない一塩基多型、ＤＮＡ挿入、およびＤＮＡ欠失から選択される複数の同定された遺伝的バリエーションを含む、ステップ；
ｂ．前記親系統糸状菌株または前記産生糸状菌株のいずれかのゲノムを撹乱して、最初の糸状菌株のライブラリーを生み出すステップであって、前記最初のライブラリーにおける各株は、前記親系統糸状菌株と前記産生糸状菌株との間の前記複数の同定された遺伝的バリエーションからのユニークな遺伝的バリエーションを含む、ステップ；
ｃ．参照糸状菌株に対する表現型性能改善について前記最初のライブラリーの個々の株をスクリーニングおよび選択することによって、表現型性能改善をもたらすユニークな遺伝的バリエーションを同定するステップ；
ｄ．先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも２つの個々の糸状菌株に存在する前記遺伝的バリエーションからのユニークな遺伝的バリエーションの組合せをそれぞれ含む後続の複数の糸状菌微生物を提供することによって、後続の糸状菌株のライブラリーを生み出すステップ；
ｅ．前記参照糸状菌株に対する表現型性能改善について前記後続ライブラリーの個々の株をスクリーニングおよび選択することによって、追加の表現型性能改善をもたらす遺伝的バリエーションのユニークな組合せを同定するステップ；および
ｆ．前記産生糸状菌株の前記表現型性能と比較して、糸状菌株が、所望のレベルの表現型性能の改善を呈するまで、線形または非線形様式でステップｄ）〜ｅ）を１回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、新しい微生物株のライブラリーが創製され、前記新しいライブラリーにおける各株は、先行するライブラリーの少なくとも２つの個々の糸状菌株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せである遺伝的バリエーションを含む、ステップ
を含む、方法。
【請求項１１２】
前記最初の糸状菌株のライブラリーが、前記親系統糸状菌株と前記産生糸状菌株との間の前記同定された遺伝的バリエーションのすべてを含む完全コンビナトリアルライブラリーである、請求項１１１に記載の産生糸状菌株の表現型性能を再建および改善するための方法。
【請求項１１３】
前記最初の糸状菌株のライブラリーが、前記親系統糸状菌株と前記産生糸状菌株との間の前記同定された遺伝的バリエーションのサブセットを含む完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットである、請求項１１１に記載の産生糸状菌株の表現型性能を再建および改善するための方法。
【請求項１１４】
前記後続の糸状菌株のライブラリーが、前記最初のライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーである、請求項１１１に記載の産生糸状菌株の表現型性能を再建および改善するための方法。
【請求項１１５】
前記後続の糸状菌株のライブラリーが、前記最初のライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットである、請求項１１１に記載の産生糸状菌株の表現型性能を再建および改善するための方法。
【請求項１１６】
前記後続の糸状菌株のライブラリーが、先行するライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーである、請求項１１１に記載の産生糸状菌株の表現型性能を再建および改善するための方法。
【請求項１１７】
前記後続の糸状菌株のライブラリーが、先行するライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットである、請求項１１１に記載の産生糸状菌株の表現型性能を再建および改善するための方法。
【請求項１１８】
前記親系統糸状菌株の前記ゲノムが撹乱されて、前記産生糸状菌株内に見出される同定された一塩基多型、ＤＮＡ挿入、またはＤＮＡ欠失の１つまたは複数が付加される、請求項１１１に記載の産生糸状菌株の表現型性能を再建および改善するための方法。
【請求項１１９】
前記産生糸状菌株の前記ゲノムが撹乱されて、前記親系統糸状菌株内に見出されない同定された一塩基多型、ＤＮＡ挿入、またはＤＮＡ欠失の１つまたは複数が除去される、請求項１１１に記載の産生糸状菌株の表現型性能を再建および改善するための方法。
【請求項１２０】
前記ゲノムを撹乱することが、ランダム変異誘発、標的とした配列挿入、標的とした配列欠失、標的とした配列置き換え、およびこれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つの方法を利用することを含む、請求項１１１に記載の産生糸状菌株の表現型性能を再建および改善するための方法。
【請求項１２１】
後続ライブラリーの糸状菌株の前記表現型性能が、前記産生糸状菌株の前記表現型性能と比較して、測定された表現型変数の少なくとも１０％の増大を呈するまで、ステップｄ）〜ｅ）を繰り返す、請求項１１１に記載の産生糸状菌株の表現型性能を再建および改善するための方法。
【請求項１２２】
後続ライブラリーの糸状菌株の前記表現型性能が、前記産生糸状菌株の前記表現型性能と比較して、測定された表現型変数の少なくとも１倍の増大を呈するまで、ステップｄ）〜ｅ）を繰り返す、請求項１１１に記載の産生糸状菌株の表現型性能を再建および改善するための方法。
【請求項１２３】
ステップｆ）の表現型性能の改善が、目的の産物の体積生産性、目的の産物の比生産性、目的の産物の収率、目的の産物の力価、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１１１に記載の産生糸状菌株の表現型性能を再建および改善するための方法。
【請求項１２４】
ステップｆ）の表現型性能の改善が、目的の産物の増大したまたはより効率的な産生であり、前記目的の産物は、低分子、酵素、ペプチド、アミノ酸、有機酸、合成化合物、燃料、アルコール、一次細胞外代謝産物、二次細胞外代謝産物、細胞内コンポーネント分子、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１１１に記載の産生糸状菌株の表現型性能を再建および改善するための方法。
【請求項１２５】
前記同定された遺伝的バリエーションが、プロモータースワップライブラリー由来の人工プロモータースワップ遺伝的バリエーションをさらに含む、請求項１１１に記載の産生糸状菌株の表現型性能を再建および改善するための方法。
【請求項１２６】
前記最初の糸状菌株のライブラリー、または
後続の糸状菌株のライブラリー
のいずれかの少なくとも１つの微生物株のゲノムを、内在性糸状菌標的遺伝子に作動可能に連結したプロモーターラダー由来の１つまたは複数のプロモーターを含むように操作するステップ
をさらに含む、請求項１１１に記載の産生糸状菌株の表現型性能を再建および改善するための方法。
【請求項１２７】
前記糸状菌が、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａの種、またはこれらのテレオモルフもしくはアナモルフ、およびシノニムもしくは分類学的均等物から選択される、請求項１１１に記載の産生糸状菌株の表現型性能を再建および改善するための方法。
【請求項１２８】
前記糸状菌が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒである、請求項１１１に記載の産生糸状菌株の表現型性能を再建および改善するための方法。
【請求項１２９】
プロモータースワップ糸状菌株ライブラリーを生成するための方法であって、
ａ．基準糸状菌株に内在する複数の標的遺伝子、およびプロモーターラダーを提供するステップであって、前記プロモーターラダーは、前記基準糸状菌株において異なる発現プロファイルを呈する複数のプロモーターを含む、ステップ；および
ｂ．前記基準糸状菌株のゲノムを操作することによって、複数の個々の糸状菌株の各株内で見出されたユニークな遺伝的バリエーションを有する前記複数の個々の糸状菌株を含む最初のプロモータースワップ糸状菌株ライブラリーを生み出すステップであって、前記ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、前記基準糸状菌株に内在する前記標的遺伝子の１つに作動可能に連結した前記プロモーターラダー由来のプロモーターの１つまたは複数を含む、ステップ
を含む、方法。
【請求項１３０】
前記糸状菌株が、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａの種、またはこれらのテレオモルフもしくはアナモルフ、およびシノニムもしくは分類学的均等物から選択される、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３１】
前記糸状菌株が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ株である、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３２】
産生糸状菌株の表現型性能を改善するためのプロモータースワップ方法であって、
ａ．基準糸状菌株に内在する複数の標的遺伝子、およびプロモーターラダーを提供するステップであって、前記プロモーターラダーは、前記基準糸状菌株において異なる発現プロファイルを呈する複数のプロモーターを含む、ステップ；
ｂ．前記基準糸状菌株のゲノムを操作することによって、複数の個々の糸状菌株の各株内で見出されたユニークな遺伝的バリエーションを有する前記複数の個々の糸状菌株を含む最初のプロモータースワップ糸状菌株ライブラリーを生み出すステップであって、前記ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、前記基準糸状菌株に内在する前記標的遺伝子の１つに作動可能に連結した前記プロモーターラダー由来のプロモーターの１つまたは複数を含む、ステップ；
ｃ．参照糸状菌株に対する表現型性能改善について前記最初のプロモータースワップ糸状菌株ライブラリーの個々の糸状菌株をスクリーニングおよび選択することによって、表現型性能改善をもたらすユニークな遺伝的バリエーションを同定するステップ；
ｄ．先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも２つの個々の糸状菌株に存在する前記遺伝的バリエーションからのユニークな遺伝的バリエーションの組合せをそれぞれ含む後続の複数の糸状菌微生物を提供することによって、後続のプロモータースワップ糸状菌株ライブラリーを生み出すステップ；
ｅ．前記参照糸状菌株に対する表現型性能改善について前記後続のプロモータースワップ糸状菌株ライブラリーの個々の糸状菌株をスクリーニングおよび選択することによって、追加の表現型性能改善をもたらす遺伝的バリエーションのユニークな組合せを同定するステップ；および
ｆ．前記産生糸状菌株の前記表現型性能と比較して、糸状菌株が、所望のレベルの表現型性能の改善を呈するまで、線形または非線形様式でステップｄ）〜ｅ）を１回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、新しい微生物株のプロモータースワップ糸状菌株ライブラリーが創製され、前記新しいライブラリーにおける各株は、先行するライブラリーの少なくとも２つの個々の糸状菌株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せである遺伝的バリエーションを含む、ステップ
を含む、方法。
【請求項１３３】
前記後続のプロモータースワップ糸状菌株ライブラリーが、前記最初のプロモータースワップ糸状菌株ライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーである、請求項１３２に記載の産生糸状菌株の表現型性能を改善するためのプロモータースワップ方法。
【請求項１３４】
前記後続のプロモータースワップ糸状菌株ライブラリーが、前記最初のプロモータースワップ糸状菌株ライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットである、請求項１３２に記載の産生糸状菌株の表現型性能を改善するためのプロモータースワップ方法。
【請求項１３５】
前記後続のプロモータースワップ糸状菌株ライブラリーが、先行するプロモータースワップ糸状菌株ライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーである、請求項１３２に記載の産生糸状菌株の表現型性能を改善するためのプロモータースワップ方法。
【請求項１３６】
前記後続のプロモータースワップ糸状菌株ライブラリーが、先行するプロモータースワップ糸状菌株ライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットである、請求項１３２に記載の産生糸状菌株の表現型性能を改善するためのプロモータースワップ方法。
【請求項１３７】
後続のプロモータースワップ糸状菌株ライブラリーの糸状菌株の前記表現型性能が、前記産生糸状菌株の前記表現型性能と比較して、測定された表現型変数の少なくとも１０％の増大を呈するまで、ステップｄ）〜ｅ）を繰り返す、請求項１３２に記載の産生糸状菌株の表現型性能を改善するためのプロモータースワップ方法。
【請求項１３８】
後続のプロモータースワップ糸状菌株ライブラリーの糸状菌株の前記表現型性能が、前記産生糸状菌株の前記表現型性能と比較して、測定された表現型変数の少なくとも１倍の増大を呈するまで、ステップｄ）〜ｅ）を繰り返す、請求項１３２に記載の産生糸状菌株の表現型性能を改善するためのプロモータースワップ方法。
【請求項１３９】
ステップｆ）の表現型性能の改善が、目的の産物の体積生産性、目的の産物の比生産性、目的の産物の収率、目的の産物の力価、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１３２に記載の産生糸状菌株の表現型性能を改善するためのプロモータースワップ方法。
【請求項１４０】
ステップｆ）の表現型性能の改善が、目的の産物の増大したまたはより効率的な産生であり、前記目的の産物は、低分子、酵素、ペプチド、アミノ酸、有機酸、合成化合物、燃料、アルコール、一次細胞外代謝産物、二次細胞外代謝産物、細胞内コンポーネント分子、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１３２に記載の産生糸状菌株の表現型性能を改善するためのプロモータースワップ方法。
【請求項１４１】
前記糸状菌株が、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａの種、またはこれらのテレオモルフもしくはアナモルフ、およびシノニムもしくは分類学的均等物から選択される、請求項１３２に記載の産生糸状菌株の表現型性能を改善するためのプロモータースワップ方法。
【請求項１４２】
前記糸状菌株が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ株である、請求項１３２に記載の産生糸状菌株の表現型性能を改善するためのプロモータースワップ方法。
【請求項１４３】
ターミネータースワップ糸状菌株ライブラリーを生成するための方法であって、
ａ．基準糸状菌株に内在する複数の標的遺伝子、およびターミネーターラダーを提供するステップであって、前記ターミネーターラダーは、前記基準糸状菌株において異なる発現プロファイルを呈する複数のターミネーターを含む、ステップ；および
ｂ．前記基準糸状菌株のゲノムを操作することによって、複数の個々の糸状菌株の各株内で見出されたユニークな遺伝的バリエーションを有する前記複数の個々の糸状菌株を含む最初のターミネータースワップ糸状菌株ライブラリーを生み出すステップであって、前記ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、前記基準糸状菌株に内在する前記標的遺伝子の１つに作動可能に連結した前記ターミネーターラダー由来のターミネーターの１つまたは複数を含む、ステップ
を含む、方法。
【請求項１４４】
前記糸状菌株が、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａの種、またはこれらのテレオモルフもしくはアナモルフ、およびシノニムもしくは分類学的均等物から選択される、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１４５】
前記糸状菌株が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ株である、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１４６】
産生糸状菌株の表現型性能を改善するためのターミネータースワップ方法であって、
ａ．基準糸状菌株に内在する複数の標的遺伝子、およびターミネーターラダーを提供するステップであって、前記ターミネーターラダーは、前記基準糸状菌株において異なる発現プロファイルを呈する複数のターミネーターを含む、ステップ；
ｂ．前記基準糸状菌株のゲノムを操作することによって、複数の個々の糸状菌株の各株内で見出されたユニークな遺伝的バリエーションを有する前記複数の個々の糸状菌株を含む最初のターミネータースワップ糸状菌株ライブラリーを生み出すステップであって、前記ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、前記基準糸状菌株に内在する前記標的遺伝子の１つに作動可能に連結した前記ターミネーターラダー由来のターミネーターの１つまたは複数を含む、ステップ；
ｃ．参照糸状菌株に対する表現型性能改善について前記最初のターミネータースワップ糸状菌株ライブラリーの個々の糸状菌株をスクリーニングおよび選択することによって、表現型性能改善をもたらすユニークな遺伝的バリエーションを同定するステップ；
ｄ．先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも２つの個々の糸状菌株に存在する前記遺伝的バリエーションからのユニークな遺伝的バリエーションの組合せをそれぞれ含む後続の複数の糸状菌微生物を提供することによって、後続のターミネータースワップ糸状菌株ライブラリーを生み出すステップ；
ｅ．前記参照糸状菌株に対する表現型性能改善について前記後続のターミネータースワップ糸状菌株ライブラリーの個々の糸状菌株をスクリーニングおよび選択することによって、追加の表現型性能改善をもたらす遺伝的バリエーションのユニークな組合せを同定するステップ；および
ｆ．前記産生糸状菌株の前記表現型性能と比較して、糸状菌株が、所望のレベルの表現型性能の改善を呈するまで、線形または非線形様式でステップｄ）〜ｅ）を１回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、新しい微生物株のターミネータースワップ糸状菌株ライブラリーが創製され、前記新しいライブラリーにおける各株は、先行するライブラリーの少なくとも２つの個々の糸状菌株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せである遺伝的バリエーションを含む、ステップ
を含む、方法。
【請求項１４７】
前記後続のターミネータースワップ糸状菌株ライブラリーが、前記最初のターミネータースワップ糸状菌株ライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーである、請求項１４６に記載の産生糸状菌株の表現型性能を改善するためのターミネータースワップ方法。
【請求項１４８】
前記後続のターミネータースワップ糸状菌株ライブラリーが、前記最初のターミネータースワップ糸状菌株ライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットである、請求項１４６に記載の産生糸状菌株の表現型性能を改善するためのターミネータースワップ方法。
【請求項１４９】
前記後続のターミネータースワップ糸状菌株ライブラリーが、先行するターミネータースワップ糸状菌株ライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーである、請求項１４６に記載の産生糸状菌株の表現型性能を改善するためのターミネータースワップ方法。
【請求項１５０】
前記後続のターミネータースワップ糸状菌株ライブラリーが、先行するターミネータースワップ糸状菌株ライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットである、請求項１４６に記載の産生糸状菌株の表現型性能を改善するためのターミネータースワップ方法。
【請求項１５１】
後続のターミネータースワップ糸状菌株ライブラリーの糸状菌株の前記表現型性能が、前記産生糸状菌株の前記表現型性能と比較して、測定された表現型変数の少なくとも１０％の増大を呈するまで、ステップｄ）〜ｅ）を繰り返す、請求項１４６に記載の産生糸状菌株の表現型性能を改善するためのターミネータースワップ方法。
【請求項１５２】
後続のターミネータースワップ糸状菌株ライブラリーの糸状菌株の前記表現型性能が、前記産生糸状菌株の前記表現型性能と比較して、測定された表現型変数の少なくとも１倍の増大を呈するまで、ステップｄ）〜ｅ）を繰り返す、請求項１４６に記載の産生糸状菌株の表現型性能を改善するためのターミネータースワップ方法。
【請求項１５３】
ステップｆ）の表現型性能の改善が、目的の産物の体積生産性、目的の産物の比生産性、目的の産物の収率、目的の産物の力価、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１４６に記載の産生糸状菌株の表現型性能を改善するためのターミネータースワップ方法。
【請求項１５４】
ステップｆ）の表現型性能の改善が、目的の産物の増大したまたはより効率的な産生であり、前記目的の産物は、低分子、酵素、ペプチド、アミノ酸、有機酸、合成化合物、燃料、アルコール、一次細胞外代謝産物、二次細胞外代謝産物、細胞内コンポーネント分子、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１４６に記載の産生糸状菌株の表現型性能を改善するためのターミネータースワップ方法。
【請求項１５５】
前記糸状菌株が、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａの種、またはこれらのテレオモルフもしくはアナモルフ、およびシノニムもしくは分類学的均等物から選択される、請求項１４６に記載の産生糸状菌株の表現型性能を改善するためのターミネータースワップ方法。
【請求項１５６】
前記糸状菌株が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ株である、請求項１４６に記載の産生糸状菌株の表現型性能を改善するためのターミネータースワップ方法。
【請求項１５７】
糸状菌宿主細胞の内在性遺伝子に作動可能に連結したプロモーターを含む糸状菌宿主細胞であって、前記プロモーターは、前記内在性遺伝子にとって異種であり、前記プロモーターは、配列番号１〜４からなる群から選択される配列を有する、糸状菌宿主細胞。
【請求項１５８】
前記内在性遺伝子に作動可能に連結した前記プロモーターを有さない参照糸状菌株の表現型性能と比較して、所望のレベルの表現型性能の改善を有する、請求項１５７に記載の糸状菌宿主細胞。
【請求項１５９】
Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａの種、またはこれらのテレオモルフもしくはアナモルフ、およびシノニムもしくは分類学的均等物から選択される、請求項１５７に記載の糸状菌宿主細胞。
【請求項１６０】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒである、請求項１５７に記載の糸状菌宿主細胞。
【請求項１６１】
糸状菌株ライブラリーであって、前記ライブラリー中の各糸状菌株は、宿主細胞の内在性遺伝子に作動可能に連結したプロモーターを含み、前記プロモーターは、前記内在性遺伝子にとって異種であり、前記プロモーターは、配列番号１〜４からなる群から選択される配列を有する、糸状菌株ライブラリー。
【請求項１６２】
前記糸状菌株が、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａの種、またはこれらのテレオモルフもしくはアナモルフ、およびシノニムもしくは分類学的均等物から選択される、請求項１６１に記載の糸状菌株ライブラリー。
【請求項１６３】
前記糸状菌株が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒである、請求項１６１に記載の糸状菌株ライブラリー。
【請求項１６４】
単一の真菌胞子に由来するクローン集団を単離するための方法であって、
（ａ）複数の真菌胞子を液状懸濁液において提供するステップであって、前記複数の真菌胞子は、真菌株から得たものである、ステップ；
（ｂ）複数の反応領域を含む基材中の個々の反応領域に、別々の体積の前記液状懸濁液を分散するステップであって、前記複数の反応領域中の各反応領域は、増殖培地を含み、前記分散により、前記個々の反応領域の少なくとも７５％が、前記複数の真菌胞子からの単一の生存可能な真菌胞子のみを含有する確率がもたらされる、ステップ；
（ｃ）増殖培地を含む前記反応領域中の分散された前記単一の生存可能な真菌胞子を培養するステップ；および
（ｄ）前記反応領域中で増殖するクローン集団を選択することによって、単一の真菌胞子に由来するクローン集団を単離するステップ
を含む、方法。
【請求項１６５】
前記別々の体積中の単一の真菌胞子の存在または非存在について、前記別々の体積をスクリーニングするステップをさらに含み、ステップ（ｂ）のために、単一の真菌胞子を含有する前記別々の体積のみが選択される、請求項１６４に記載の方法。
【請求項１６６】
前記分散により、前記個々の反応領域の少なくとも８０％が、前記複数の真菌胞子からの単一の生存可能な真菌胞子のみを含有する確率がもたらされる、請求項１６５に記載の方法。
【請求項１６７】
前記分散により、前記個々の反応領域の少なくとも９０％が、前記複数の真菌胞子からの単一の生存可能な真菌胞子のみを含有する確率がもたらされる、請求項１６５に記載の方法。
【請求項１６８】
前記分散により、前記個々の反応領域の少なくとも９５％が、前記複数の真菌胞子からの単一の生存可能な真菌胞子のみを含有する確率がもたらされる、請求項１６５に記載の方法。
【請求項１６９】
前記分散により、前記個々の反応領域の少なくとも９９％が、前記複数の真菌胞子からの単一の生存可能な真菌胞子のみを含有する確率がもたらされる、請求項１６５に記載の方法。
【請求項１７０】
前記分配により、前記個々の反応領域の実質的にすべてが、前記複数の真菌胞子からの単一の生存可能な真菌胞子のみを含有する確率がもたらされる、請求項１６５に記載の方法。
【請求項１７１】
前記別々の体積をスクリーニングするステップが、前記別々の体積中の単一の真菌胞子の存在または非存在を光学的に区別することを伴う、請求項１６５に記載の方法。
【請求項１７２】
前記スクリーニングが、前記別々の体積中の単一の真菌胞子の存在または非存在を光学的に区別することが可能なマイクロフルイディックデバイスを使用して実行される、請求項１７１に記載の方法。
【請求項１７３】
単一の真菌胞子に由来するクローン集団を単離するための方法であって、
（ａ）複数の真菌胞子を液状懸濁液において提供するステップであって、前記複数の真菌胞子は、真菌株から得たものである、ステップ；
（ｂ）前記液状懸濁液を希釈するステップであって、前記希釈が限界希釈である、ステップ；
（ｃ）複数の反応領域を含む基材中の個々の反応領域に、別々の体積の希釈物を分散するステップであって、前記複数の反応領域中の各反応領域は、増殖培地を含み、前記限界希釈により、各反応領域に分散された前記別々の体積の希釈物が１つの生存可能な胞子を含有するかまたは生存可能な胞子を含有しないかのいずれかであることが、前記複数の反応領域中の前記反応領域の９０％より多くが生存可能な胞子を含有せず、１つまたは複数の生存可能な胞子を含有する反応領域の９０％より多くが単一の生存可能な胞子のみを含有するポアソン分布に従う確率がもたらされる、ステップ；
（ｄ）増殖培地を含む前記反応領域中の分散された前記単一の生存可能な真菌胞子を培養するステップ；および
（ｅ）前記反応領域中で増殖するクローン集団を選択することによって、単一の真菌胞子に由来するクローン集団を単離するステップ
を含む、方法。
【請求項１７４】
前記反応領域が、マイクロタイタープレート中に存在する、請求項１６４または１７３に記載の方法。
【請求項１７５】
前記マイクロタイタープレートが、９６ウェル、３８４ウェルまたは１５３６ウェルを含有する、請求項１７４に記載の方法。
【請求項１７６】
前記真菌株が、糸状菌株である、請求項１６４または１７３に記載の方法。
【請求項１７７】
前記糸状菌株が、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａの種、またはこれらのテレオモルフもしくはアナモルフ、およびシノニムもしくは分類学的均等物から選択される、請求項１７６に記載の方法。
【請求項１７８】
前記糸状菌株が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒまたはそのテレオモルフもしくはアナモルフである、請求項１７７に記載の方法。
【請求項１７９】
前記糸状菌株が、菌糸体ではないペレット状の形態を有する、請求項１７８に記載の方法。
【請求項１８０】
前記糸状菌株が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＬＮ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログの変異形態を発現する、請求項１７９に記載の方法。
【請求項１８１】
前記Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＬＮ１遺伝子の前記Ａ．ｎｉｇｅｒオルソログの前記変異形態の核酸配列が、配列番号１３である、請求項１８０に記載の方法。
【請求項１８２】
前記Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＬＮ１遺伝子の前記Ａ．ｎｉｇｅｒオルソログの前記変異形態が、配列番号１または２から選択されるプロモーター配列に作動可能に連結されている、請求項１７９または１８０に記載の方法。
【請求項１８３】
前記真菌株が、遺伝子撹乱を有する、請求項１６４または１７３に記載の方法。
【請求項１８４】
前記遺伝子撹乱が、一塩基多型、ＤＮＡ挿入、ＤＮＡ欠失またはこれらの任意の組合せから選択される、請求項１８３に記載の方法。
【請求項１８５】
前記遺伝子撹乱が、前記真菌株に由来するプロトプラストをリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ複合体）で形質転換することによって前記プロトプラストに導入される、請求項１８３に記載の方法。
【請求項１８６】
前記ＲＮＰ複合体が、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と複合体化したＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼを含む、請求項１８５に記載の方法。
【請求項１８７】
前記ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼが、クラス２のＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムのＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼである、請求項１８６に記載の方法。
【請求項１８８】
前記クラス２のＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムのＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼが、タイプＩＩ、タイプＶまたはタイプＶＩのＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼである、請求項１８７に記載の方法。
【請求項１８９】
前記クラス２のＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムのＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃまたはこれらの相同体、オルソログ、変異体、バリアントもしくは改変されたバージョンから選択される、請求項１８７に記載の方法。
【請求項１９０】
前記クラス２のＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムのＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９またはこれらの相同体、オルソログもしくはパラログである、請求項１８９に記載の方法。
【請求項１９１】
前記ｇＲＮＡが、単独の、またはトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）にアニールした、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）である、請求項１８６に記載の方法。
【請求項１９２】
前記ｇＲＮＡが、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡを含む単一のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、請求項１８６に記載の方法。
【請求項１９３】
前記ｃｒＲＮＡが、前記真菌株のゲノム内の標的遺伝子に相補的なガイド配列を含み、前記プロトプラストへの前記ＲＮＰ複合体の導入は、前記標的遺伝子への前記遺伝子撹乱の導入を促進する、請求項１９１または１９２に記載の方法。
【請求項１９４】
前記標的遺伝子の前記遺伝子撹乱が、前記ＲＮＰ複合体により前記標的遺伝子が切断されて、前記標的遺伝子にＤＮＡ末端が生成し、続いて非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路により前記標的遺伝子中の前記ＤＮＡ末端が非相同末端結合することによって促進される、請求項１９３に記載の方法。
【請求項１９５】
前記標的遺伝子の変異したバージョンを含むドナーＤＮＡを共形質転換することをさらに含み、前記標的遺伝子の前記変異したバージョンは、標的遺伝子座に相同なヌクレオチドが両側に隣接している、請求項１９３に記載の方法。
【請求項１９６】
前記標的遺伝子の前記遺伝子撹乱が、前記ＲＮＰ複合体により前記標的遺伝子が切断されて、前記標的遺伝子にＤＮＡ末端が生成し、続いて前記標的遺伝子が相同組換えを介して前記ドナーＤＮＡで置き換えられることによって促進される、請求項１９５に記載の方法。
【請求項１９７】
ステップ（ｂ）が、選択可能なマーカーを含むベクターを共形質転換することをさらに含む、請求項１８５に記載の方法。
【請求項１９８】
前記選択可能なマーカーが、ステップ（ｄ）において、形質転換能を有する真菌株に由来するクローン集団を選択するために使用される、請求項１９７に記載の方法。
【請求項１９９】
前記遺伝子撹乱が、複数のプロトプラストを第１のコンストラクトおよび第２のコンストラクトで形質転換することによって前記真菌株に由来するプロトプラストに導入され、前記第１のコンストラクトは、前記プロトプラストのゲノム中の第１の遺伝子座に相同なヌクレオチドが両側に隣接している第１のポリヌクレオチドを含み、前記第２のコンストラクトは、前記プロトプラストのゲノム中の第２の遺伝子座に相同なヌクレオチドが両側に隣接している第２のポリヌクレオチドを含み、前記形質転換により、相同組換えによって前記第１の遺伝子座に前記第１のコンストラクトが組み込まれ、前記第２の遺伝子座に前記第２のコンストラクトが組み込まれ、少なくとも前記第２の遺伝子座は、前記プロトプラストのゲノム中の第１の選択可能なマーカー遺伝子であり、前記第１のポリヌクレオチドは、前記遺伝子撹乱を含む、請求項１８３または１８４に記載の方法。
【請求項２００】
前記選択可能なマーカー遺伝子が、ステップ（ｄ）において、前記遺伝子撹乱を含む真菌株に由来するクローン集団の選択を促進するために使用される、請求項１９９に記載の方法。
【請求項２０１】
前記真菌株が、非機能的な非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路を有する、請求項１９５に記載の方法。
【請求項２０２】
前記真菌株を、抗体、化学的阻害剤、タンパク質阻害剤、物理的阻害剤、ペプチド阻害剤、または前記ＮＨＥＪ経路のコンポーネントに指向させたアンチセンスもしくはＲＮＡｉ分子に曝露することによって、前記ＮＨＥＪ経路が非機能的になる、請求項２０１に記載の方法。
【請求項２０３】
前記化学的阻害剤が、Ｗ−７である、請求項２０２に記載の方法。
【請求項２０４】
糸状菌株を産生するための方法であって、
ａ．）複数のプロトプラストを提供するステップであって、前記複数のプロトプラストは、親糸状菌株の培養物から調製されたものである、ステップ；
ｂ．）前記複数のプロトプラストからの各プロトプラストをリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ複合体）で形質転換するステップ；および
ｃ．）前記親糸状菌株に対する表現型性能改善について形質転換された前記プロトプラストに由来する個々の糸状菌株を選択およびスクリーニングして、表現型性能改善をもたらす選択された前記個々の糸状菌株のゲノムにおける遺伝子撹乱を同定するステップ
を含む、方法。
【請求項２０５】
前記遺伝子撹乱が、一塩基多型、ＤＮＡ挿入、ＤＮＡ欠失またはこれらの任意の組合せから選択される、請求項２０４に記載の方法。
【請求項２０６】
前記ＲＮＰ複合体が、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と複合体化したＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼを含む、請求項２０４に記載の方法。
【請求項２０７】
前記ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼが、クラス２のＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムのＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼである、請求項２０６に記載の方法。
【請求項２０８】
前記クラス２のＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムのＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼが、タイプＩＩ、タイプＶまたはタイプＶＩのＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼである、請求項２０７に記載の方法。
【請求項２０９】
前記クラス２のＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムのＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃまたはこれらの相同体、オルソログ、変異体、バリアントもしくは改変されたバージョンから選択される、請求項２０７に記載の方法。
【請求項２１０】
前記クラス２のＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムのＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９またはこれらの相同体、オルソログもしくはパラログである、請求項２０９に記載の方法。
【請求項２１１】
前記ｇＲＮＡが、単独の、またはトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）にアニールした、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）である、請求項２０６に記載の方法。
【請求項２１２】
前記ｇＲＮＡが、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡを含む単一のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、請求項２０６に記載の方法。
【請求項２１３】
前記ｃｒＲＮＡが、前記親糸状菌株のゲノム内の標的遺伝子に相補的なガイド配列を含み、前記ＲＮＰ複合体の導入は、前記プロトプラスト中の前記標的遺伝子を撹乱する、請求項２１１または２１２に記載の方法。
【請求項２１４】
前記標的遺伝子の前記撹乱が、前記ＲＮＰ複合体により前記標的遺伝子が切断されて、前記標的遺伝子にＤＮＡ末端が生成し、続いて非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路により前記標的遺伝子中の前記ＤＮＡ末端が非相同末端結合することによって促進される、請求項２１３に記載の方法。
【請求項２１５】
ステップ（ｂ）が、前記標的遺伝子の変異したバージョンを含むドナーＤＮＡを共形質転換することをさらに含み、前記標的遺伝子の前記変異したバージョンは、標的遺伝子座に相同なヌクレオチドが両側に隣接している、請求項２１３に記載の方法。
【請求項２１６】
前記標的遺伝子の前記撹乱が、前記ＲＮＰ複合体により前記標的遺伝子が切断されて、前記標的遺伝子にＤＮＡ末端が生成し、続いて前記標的遺伝子が相同組換えを介して前記ドナーＤＮＡで置き換えられることによって促進される、請求項２１５に記載の方法。
【請求項２１７】
ステップ（ｂ）が、選択可能なマーカーを含むベクターを共形質転換することをさらに含む、請求項２０４に記載の方法。
【請求項２１８】
ステップ（ｃ）において、前記親糸状菌株に対する表現型性能改善についての後続のスクリーニングのために形質転換能を有する個々の糸状菌株を選択するために、前記選択可能なマーカーが使用される、請求項２１７に記載の方法。
【請求項２１９】
前記親糸状菌株が、非機能的な非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路を有する、請求項２１５から２１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２０】
前記細胞を、抗体、化学的阻害剤、タンパク質阻害剤、物理的阻害剤、ペプチド阻害剤、または前記ＮＨＥＪ経路のコンポーネントに指向させたアンチセンスもしくはＲＮＡｉ分子に曝露することによって、前記ＮＨＥＪ経路が非機能的になる、請求項２１９に記載の方法。
【請求項２２１】
前記化学的阻害剤が、Ｗ−７である、請求項２２０に記載の方法。
【請求項２２２】
前記糸状菌株の前記表現型性能改善が、前記親糸状菌株の前記表現型性能と比較して、目的の産物に関して測定された表現型変数の少なくとも１０％の増大を含む、請求項２０４に記載の方法。
【請求項２２３】
前記糸状菌株の前記表現型性能改善が、前記親糸状菌株の前記表現型性能と比較して、目的の産物に関して測定された表現型変数の少なくとも１倍の増大を含む、請求項２０４に記載の方法。
【請求項２２４】
前記測定された表現型変数が、前記目的の産物の体積生産性、前記目的の産物の比生産性、前記目的の産物の収率、前記目的の産物の力価、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項２２２または２２３に記載の方法。
【請求項２２５】
前記測定された表現型変数が、前記目的の産物の増大したまたはより効率的な産生である、請求項２２２または２２３に記載の方法。
【請求項２２６】
前記目的の産物が、低分子、酵素、ペプチド、アミノ酸、有機酸、合成化合物、燃料、アルコール、一次細胞外代謝産物、二次細胞外代謝産物、細胞内コンポーネント分子、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項２２２または２２３に記載の方法。
【請求項２２７】
前記親糸状菌株が、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａの種、またはこれらのテレオモルフもしくはアナモルフ、およびシノニムもしくは分類学的均等物から選択される、請求項２０４に記載の方法。
【請求項２２８】
前記糸状菌株が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒまたはそのテレオモルフもしくはアナモルフである、請求項２２７に記載の方法。
【請求項２２９】
前記糸状菌株が、菌糸体ではないペレット状の形態を有する、請求項２２８に記載の方法。
【請求項２３０】
前記糸状菌株が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＬＮ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログの変異形態を発現する、請求項２２９に記載の方法。
【請求項２３１】
前記Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＬＮ１遺伝子の前記Ａ．ｎｉｇｅｒオルソログの前記変異形態の核酸配列が、配列番号１３である、請求項２３０に記載の方法。
【請求項２３２】
前記Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＬＮ１遺伝子の前記Ａ．ｎｉｇｅｒオルソログの前記変異形態が、配列番号１または２から選択されるプロモーター配列に作動可能に連結されている、請求項２３０または２３１に記載の方法。
【請求項２３３】
ステップ（ｃ）の前に、前記個々の糸状菌株に由来する単離されたクローン集団を生成するステップをさらに含む、請求項２０４に記載の方法。
【請求項２３４】
前記単離が、
（ｉ）前記形質転換されたプロトプラストが複数の真菌胞子を生じるように誘導するステップであって、前記複数からの各真菌胞子は、単一の形質転換されたプロトプラストに由来する、ステップ；
（ｉｉ）単一の形質転換されたプロトプラストに由来する前記複数の真菌胞子を液体中に再懸濁して、液状懸濁液を生成するステップ；
（ｉｉｉ）複数の反応領域を含む基材中の個々の反応領域に、別々の体積の前記液状懸濁液を分散するステップであって、前記複数の反応領域中の各反応領域は、増殖培地を含み、前記分散により、前記個々の反応領域の少なくとも７５％が、前記複数の真菌胞子からの単一の生存可能な真菌胞子のみを含有する確率がもたらされる、ステップ；および
（ｉｖ）増殖培地を含む前記反応領域中の分散された前記単一の生存可能な真菌胞子を培養することによって、前記個々の糸状菌株に由来する単離されたクローン集団を生成するステップ
を含む、請求項２３３に記載の方法。
【請求項２３５】
前記別々の体積中の単一の真菌胞子の存在または非存在について、前記別々の体積をスクリーニングするステップをさらに含み、ステップ（ｉｉｉ）のために、単一の真菌胞子を含有する前記別々の体積のみが選択される、請求項２３４に記載の方法。
【請求項２３６】
前記分散により、前記個々の反応領域の少なくとも８０％が、前記複数の真菌胞子からの単一の生存可能な真菌胞子のみを含有する確率がもたらされる、請求項２３５に記載の方法。
【請求項２３７】
前記分散により、前記個々の反応領域の少なくとも９０％が、前記複数の真菌胞子からの単一の生存可能な真菌胞子のみを含有する確率がもたらされる、請求項２３５に記載の方法。
【請求項２３８】
前記分散により、前記個々の反応領域の少なくとも９５％が、前記複数の真菌胞子からの単一の生存可能な真菌胞子のみを含有する確率がもたらされる、請求項２３５に記載の方法。
【請求項２３９】
前記分散により、前記個々の反応領域の少なくとも９９％が、前記複数の真菌胞子からの単一の生存可能な真菌胞子のみを含有する確率がもたらされる、請求項２３５に記載の方法。
【請求項２４０】
前記分散により、前記個々の反応領域の実質的にすべてが、前記複数の真菌胞子からの単一の生存可能な真菌胞子のみを含有する確率がもたらされる、請求項２３５に記載の方法。
【請求項２４１】
前記別々の体積をスクリーニングするステップが、前記別々の体積中の単一の真菌胞子の存在または非存在を光学的に区別することを伴う、請求項２４０に記載の方法。
【請求項２４２】
前記スクリーニングが、前記別々の体積中の単一の真菌胞子の存在または非存在を光学的に区別することが可能なマイクロフルイディックデバイスを使用して実行される、請求項２４１に記載の方法。
【請求項２４３】
前記単離が、（ｉ）前記形質転換されたプロトプラストが複数の真菌胞子を生じるように誘導するステップであって、前記複数からの各真菌胞子は、単一の形質転換されたプロトプラストに由来する、ステップ；（ｉｉ）単一の形質転換されたプロトプラストに由来する前記複数の真菌胞子を液体中に再懸濁して、液状懸濁液を生成するステップ；（ｉｉｉ）前記液状懸濁液を希釈するステップであって、前記希釈が限界希釈である、ステップ；（ｉｖ）複数の反応領域を含む基材中の個々の反応領域に、別々の体積の希釈物を分散するステップであって、前記複数の反応領域中の各反応領域は、増殖培地を含み、前記限界希釈により、各反応領域に分散された前記別々の体積の希釈物が１つの生存可能な胞子を含有するかまたは生存可能な胞子を含有しないかのいずれかであることが、前記複数の反応領域中の前記反応領域の９０％より多くが生存可能な胞子を含有せず、１つまたは複数の生存可能な胞子を含有する反応領域の９０％より多くが単一の生存可能な胞子のみを含有するポアソン分布に従う確率がもたらされる、ステップ；（ｖ）増殖培地を含む前記反応領域中の分散された前記単一の生存可能な真菌胞子を培養するステップ；および（ｖｉ）前記反応領域中で増殖するクローン集団を選択することによって、単一の真菌胞子に由来するクローン集団を単離するステップ
を含む、請求項２３３に記載の方法。
【請求項２４４】
前記反応領域が、マイクロタイタープレート中に存在する、請求項２３４から２４３のいずれかに記載の方法。
【請求項２４５】
前記マイクロタイタープレートが、９６ウェル、３８４ウェルまたは１５３６ウェルを含有する、請求項２４４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、すべての目的のためにその全体において参照によって本明細書に組み込まれる２０１７年６月６日に出願された米国仮出願第６２／５１５，９０７号の優先権の利益を主張する。
【０００２】
分野
本開示は、自動化された真菌ゲノム操作を対象とする。開示された自動化されたゲノム操作プラットフォームは、真菌産生株を生成することに加え、これらの精製を促進するための糸状菌の遺伝子マニピュレーションを伴う。結果として生じる真菌産生株は、例えば、商業的な用途のための目的の産物（例えば、抗生物質、代謝産物、タンパク質など）の大規模生産のための液中での培養における増殖によく適している。
【０００３】
配列表に関する記述
本願に添付された配列表は、紙コピーの代わりにテキストフォーマットで提供されており、参照により本明細書に組み込まれている。配列表を含有するテキストファイルの名称は、ＺＹＭＲ＿００８＿０３ＷＯ＿＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは、約４７ＫＢであり、２０１８年６月６日に作成されたものであり、ＥＦＳ−ウェブを介して電子的に提出されている。
【背景技術】
【０００４】
真核細胞は、ポリペプチドおよび二次代謝産物の産生に好ましい生物である。実際に、糸状菌は、生来のタンパク質や異種タンパク質を高いレベルに発現して、それらを、工業、医薬品、動物衛生ならびに食品および飲料用途のための酵素や他のタンパク質の大規模生産によく適したものにすることができる。しかし、目的の産物の大規模生産のための糸状菌の使用は、前記真菌の遺伝子マニピュレーションに加えて、自動化された機構および設備の使用を必要とすることが多く、糸状菌の生活環のある特定の側面が、遺伝子のマニピュレーションと取り扱いを難しくしていることがある。
【０００５】
例えば、真菌に導入されたＤＮＡは、ゲノム内にランダムに組み込まれて、その結果として大部分がランダムに組み込まれたＤＮＡ断片が生じるが、これはかなりの頻度で複数のタンデムリピートとして組み込まれる可能性がある（例えばCasqueiroら、１９９９年、J.  Bacteriol.１８１巻：１１８１〜１１８８頁を参照）。この発現カセットの制御不能な「ランダムな複数の組込み」は、宿主ゲノムの不要な改変を引き起こす可能性がある潜在的に有害なプロセスであり得る。
【０００６】
さらに、現在の糸状菌のトランスフェクションシステムは極めて面倒であり（総説についてはFincham、１９８９年、Microbiol.  Rev.５３巻：１４８〜１７０頁を参照）、実際には比較的小規模である。これは、プロトプラストの形成、粘性液体の取り扱い（すなわち、ポリエチレングリコール溶液）、ガラスチューブを１つずつ旋回させること、および後続の選択的なプレーティングを含む可能性がある。さらに、プロトプラスト形成の条件を決定することは困難である可能性があり、収率は極めて低い場合が多い。さらに、プロトプラストは複数の核を含有する可能性があり、そのため所望の遺伝子マニピュレーションの導入は、同核共存体のプロトプラストからの分離が困難な異核共存体のプロトプラストの形成を引き起こす可能性がある。
【０００７】
さらに、典型的な糸状菌細胞、例えばプロトプラストに由来するものなどは、菌糸と呼ばれる長い繊維として増殖し、これは菌糸体と呼ばれる菌糸の密なネットワークを形成することができる。これらの菌糸は、遺伝子型が互いに異なる可能性がある複数の核を含有する場合がある。菌糸は、分化し、空気中に容易に分散できる無性胞子を形成することができる。菌糸が異なる遺伝子型の核を含有する場合、胞子もまた核の混合物を含有することになる。このような真菌性増殖の態様に起因して、遺伝子マニピュレーションは、本来的に混成の集団をもたらし、これは、なされた遺伝子変化のあらゆる効果を評価するために均質に精製しなければならない。さらに、自動化された環境では、胞子は、株を精製する能力に悪影響を与える可能性がある設備の汚染を引き起こす場合があり、その設備で実行される他のあらゆる作業を汚染する可能性がある。
【０００８】
胞子の空中への分散を軽減するために、糸状菌は、液中での培養で増殖させてもよい。しかし、液中での培養で菌糸を有する糸状菌を増殖させることによって形成された菌糸体は、ブロスのレオロジー性質に影響を与える可能性がある。一般に、ブロスの粘度が高い程、酸素や栄養素の分布の均一性が低くなり、培養物をかき混ぜるのに必要なエネルギーが大きくなる。一部の場合では、菌糸を有する糸状菌の増殖に起因するブロスの粘度は、酸素や栄養素の溶解を顕著に妨げるほど十分に高くなり、それによって、真菌の増殖、最終的には目的とする任意の望ましい産物の収率および生産性に有害作用を与える。
よって、真菌における伝統的な株構築プログラムに固有の上述した欠点を被らず、有益な変異を発見し、組み込むプロセスを大いに加速する糸状菌を操作する新しい方法について当技術分野における大きな必要性が存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Casqueiroら、１９９９年、J.  Bacteriol.１８１巻：１１８１〜１１８８頁
【非特許文献２】Fincham、１９８９年、Microbiol.  Rev.５３巻：１４８〜１７０頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本開示は、伝統的な微生物株改良プログラムに関連した無数の問題を被らない、例えば糸状菌などの多核体生物体のためのハイスループット（ＨＴＰ）ゲノム操作プラットフォームを提供する。本明細書で提供される方法は糸状菌で試験されるが、前記方法は、他の多核体生物体にも適用および／または利用できることが企図される。一実施形態では、糸状菌は、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａの種、またはこれらのテレオモルフもしくはアナモルフ、およびシノニムもしくは分類学的均等物から選択される。この実施形態に加えて、本方法およびＨＴＰゲノム操作プラットフォームに有用な糸状菌は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒである。
【００１１】
さらに、本明細書で教示されるＨＴＰプラットフォームは、数１０年のランダム変異誘発に基づく株改良プログラムによって有益でない変異を蓄積してきた糸状菌株を再建することができる。
【００１２】
本開示はまた、糸状菌システムにおけるＨＴＰプラットフォームの機能性を支えるユニークなゲノム操作ツールセットおよび手順も提供する。糸状菌は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓの種であってもよい。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓは、Ａ．ｎｉｇｅｒであってもよい。
【００１３】
開示されるＨＴＰゲノム操作プラットフォームは、コンピューターで駆動され、分子生物学、自動化、および高度な機械学習プロトコールを統合する。この統合プラットフォームは、一式のＨＴＰ分子ツールセットを利用して、ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーを生み出す。これらのライブラリーは、とりわけ、科学的洞察および反復パターン認識から得られる。
【００１４】
教示されるＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーは、糸状菌において試験するための特定のゲノム変更のライブラリーを提供することによって、ゲノム操作プロセスのドライバーとして機能する。特定のライブラリーまたはライブラリーの組合せを利用して操作された微生物は、結果として生じる成果、例えば、目的の産物の産生についてＨＴＰ様式で効率的にスクリーニングされる。ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーを利用して微生物において試験するための特定のゲノム変更を明らかにし、次いでこれらの変更を内包する宿主微生物ゲノムを引き続いてスクリーニングするこのプロセスは、効率的な反復様式でインプリメントされる。一部の態様では、ゲノム操作キャンペーンの反復サイクルまたは「ラウンド」は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはそれよりも多くの反復／サイクル／ラウンドであり得る。
【００１５】
よって、一部の態様では、本開示は、糸状菌宿主システムにおいて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、９２５、９５０、９７５、１０００またはそれよりも多くの「ラウンド」のＨＴＰ遺伝子操作（例えば、ＳＮＰスワップ、ＰＲＯスワップ、ターミネーター（ＳＴＯＰ）スワップ、またはこれらの組合せのラウンド）を行う方法を教示する。
【００１６】
一部の実施形態では、本開示は、各後続のＨＴＰ遺伝子操作ラウンドが先のラウンドの遺伝子操作で同定された遺伝的バリエーションに基づく線形手法を教示する。他の実施形態では、本開示は、各後続のＨＴＰ遺伝子操作ラウンドが先に行われた分析を含む任意の先のラウンドの遺伝子操作、および別個のＨＴＰ遺伝子操作ブランチで同定された遺伝的バリエーションに基づく非線形手法を教示する。
【００１７】
これらの反復サイクルからのデータは、大規模データ分析およびパターン認識を可能にし、それは統合プラットフォームによって利用され、ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリー実装の後続のラウンドを通知する。したがって、教示されるプラットフォームで利用されるＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーは、大規模データパターン認識アルゴリズムから利益を得、各反復ラウンドの微生物操作によってより有益となる高度に動的なツールである。このようなシステムはこれまで糸状菌に関して開発されておらず、当技術分野では是が非でも必要とされている。
【００１８】
一部の実施形態では、本開示の遺伝子設計ライブラリーは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、９２５、９５０、９７５、１０００、またはそれ超の個々の遺伝子変化（例えば、少なくともＸの数のＰＲＯスワップライブラリーにおけるプロモーター：遺伝子組合せの）を含む。
【００１９】
一部の実施形態では、本開示は、所望の表現型を獲得するために糸状菌株を進化させるゲノム操作のハイスループット（ＨＴＰ）方法であって、ａ）同じ株バックグラウンドを有する最初の複数の糸状菌株のゲノムを撹乱することによって、ユニークな遺伝的バリエーションを有する個々の株を含む最初のＨＴＰ遺伝子設計糸状菌株ライブラリーを生み出すステップ；ｂ）最初のＨＴＰ遺伝子設計糸状菌株ライブラリーの個々の株を、所望の表現型についてスクリーニングおよび選択するステップ；ｃ）それぞれ遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の糸状菌微生物を提供することによって、後続のＨＴＰ遺伝子設計糸状菌株ライブラリーを生み出すステップであって、前記遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも２つの個々の糸状菌株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップ；ｄ）後続のＨＴＰ遺伝子設計糸状菌株ライブラリーの個々の糸状菌株を、所望の表現型についてスクリーニングおよび選択するステップ；ｅ）糸状菌株が所望の表現型を獲得するまで、線形または非線形様式でステップｃ）〜ｄ）を１回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するＨＴＰ遺伝子設計糸状菌株ライブラリーの少なくとも２つの個々の糸状菌株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを内包する個々の糸状菌株を含む新しいＨＴＰ遺伝子設計糸状菌株ライブラリーが創製される、ステップを含む、方法を教示する。
【００２０】
一部の実施形態では、本開示は、最初のＨＴＰ遺伝子設計糸状菌株ライブラリーが、プロモータースワップ微生物株ライブラリー、ＳＮＰスワップ微生物株ライブラリー、開始／停止コドン微生物株ライブラリー、最適化配列微生物株ライブラリー、ターミネータースワップ微生物株ライブラリー、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つであることを教示する。
【００２１】
一部の実施形態では、本開示は、それぞれ遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の糸状菌株を作製する方法であって、組み合わされた遺伝的バリエーションのそれぞれは、最初のＨＴＰ遺伝子設計糸状菌株ライブラリーまたは先行するステップのＨＴＰ遺伝子設計糸状菌株ライブラリーに由来する、方法を教示する。
【００２２】
一部の実施形態では、後続の複数の糸状菌株における遺伝的バリエーションの組合せが、最初のＨＴＰ遺伝子設計糸状菌株ライブラリーまたは先行するステップのＨＴＰ遺伝子設計糸状菌株ライブラリー中の遺伝的バリエーションのすべての可能性のある組合せのサブセットを含む。
【００２３】
一部の実施形態では、本開示は、後続のＨＴＰ遺伝子設計糸状菌株ライブラリーが、最初のＨＴＰ遺伝子設計糸状菌株ライブラリーまたは先行するステップのＨＴＰ遺伝子設計糸状菌株ライブラリーにおける遺伝的バリエーションに由来する完全コンビナトリアル株ライブラリーであることを教示する。
【００２４】
例えば、先行のＨＴＰ遺伝子設計糸状菌株ライブラリーのみが遺伝的バリエーションＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤを有していたとすれば、前記バリエーションの部分的なコンビナトリアルは、それぞれ遺伝的バリエーションのＡＢ、ＡＣ、またはＡＤのユニークな組合せ（変異が表される順番は重要ではない）のいずれかを含む３つの株を含む後続のＨＴＰ遺伝子設計糸状菌株ライブラリーを含むことができる。先行するステップのＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーの遺伝的バリエーションに由来する完全コンビナトリアル糸状菌株ライブラリーは、それぞれ遺伝的バリエーションのＡＢ、ＡＣ、ＡＤ、ＢＣ、ＢＤ、またはＣＤのユニークな組合せのいずれかを含む６つの微生物を含む。
【００２５】
一部の実施形態では、本開示の方法は、ランダム変異誘発、標的とした配列挿入、標的とした配列欠失、標的とした配列置き換え、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つの方法を利用して糸状菌のゲノムを撹乱することを教示する。
【００２６】
現在開示した方法の一部の実施形態では、最初の複数の糸状菌は、工業生産糸状菌株由来のユニークな遺伝的バリエーションである。
【００２７】
現在開示した方法の一部の実施形態では、最初の複数の糸状菌は、Ｓ１Ｇｅｎ１で表される工業生産糸状菌株、およびＳｎＧｅｎｎで表されるこれらに由来する後続の任意の数の微生物世代を含む。
【００２８】
一部の実施形態では、本開示は、ＳＮＰスワップ糸状菌株ライブラリーを生成するための方法であって、ａ）参照糸状菌株および第２の糸状菌株を提供するステップであって、第２の糸状菌株は、参照株内に存在しない一塩基多型、ＤＮＡ挿入、およびＤＮＡ欠失から選択される複数の同定された遺伝的バリエーションを含む、ステップ；ｂ）参照株または第２の株のいずれかのゲノムを撹乱することによって、複数の個々の株の各株内で見出されたユニークな遺伝的バリエーションを有する前記複数の個々の糸状菌株を含む最初のＳＮＰスワップ糸状菌株ライブラリーを生み出すステップであって、前記ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、参照株と第２の株との間の複数の同定された遺伝的バリエーションから選択される単一の遺伝的バリエーションに対応する、ステップを含む、方法を教示する。
【００２９】
ＳＮＰスワップライブラリーの一部の実施形態では、参照糸状菌株のゲノムが撹乱されて、第２の糸状菌株内に見出される同定された一塩基多型、ＤＮＡ挿入、またはＤＮＡ欠失の１つまたは複数が付加される。
【００３０】
ＳＮＰスワップライブラリーの一部の実施形態では、第２の糸状菌株のゲノムが撹乱されて、参照糸状菌株内に見出されない同定された一塩基多型、ＤＮＡ挿入、またはＤＮＡ欠失の１つまたは複数が除去される。
【００３１】
一部の実施形態では、ＳＮＰスワップライブラリーの遺伝的バリエーションは、参照糸状菌株と第２の糸状菌株との間で同定されたすべての遺伝的バリエーションのサブセットを含む。
【００３２】
一部の実施形態では、ＳＮＰスワップライブラリーの遺伝的バリエーションは、参照糸状菌株と第２の糸状菌株との間で同定された同定された遺伝的バリエーションのすべてを含む。
【００３３】
一部の実施形態では、本開示は、工業用糸状菌株の表現型性能を再建および改善するための方法であって、ａ）親系統糸状菌株およびそれに由来する工業用糸状菌株を提供するステップであって、工業用株は、親系統株中に存在しない一塩基多型、ＤＮＡ挿入、およびＤＮＡ欠失から選択される複数の同定された遺伝的バリエーションを含む、ステップ；ｂ）親系統株または工業用株のいずれかのゲノムを撹乱することによって、複数の個々の株の各株内で見出されたユニークな遺伝的バリエーションを有する前記複数の個々の株を含む最初のＳＮＰスワップ糸状菌株ライブラリーを生み出すステップであって、前記ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、親系統株と工業用株との間の複数の同定された遺伝的バリエーションから選択される単一の遺伝的バリエーションに対応する、ステップ；ｃ）最初のＳＮＰスワップ糸状菌株ライブラリーの個々の株を、参照糸状菌株に対する表現型の性能改善についてスクリーニングおよび選択することによって、前記糸状菌株に表現型の性能改善を付与するユニークな遺伝的バリエーションを同定するステップ；ｄ）それぞれ遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の糸状菌株を提供することによって、後続のＳＮＰスワップ糸状菌株ライブラリーを生み出すステップであって、前記遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも２つの個々の株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップ；ｅ）後続のＳＮＰスワップ糸状菌株ライブラリーの個々の株を、参照株に対する表現型の性能改善についてスクリーニングおよび選択することによって、前記糸状菌株に追加の表現型の性能改善を付与する遺伝的バリエーションのユニークな組合せを同定するステップ；およびｆ）株が、工業用糸状菌株の表現型性能と比較して所望のレベルの表現型性能の改善を呈するまで、線形または非線形様式でステップｄ）〜ｅ）を１回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するＳＮＰスワップ糸状菌株ライブラリーの少なくとも２つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを内包する個々の微生物株を含む新しいＳＮＰスワップ糸状菌株ライブラリーが創製される、ステップを含む、方法を教示する。
【００３４】
一部の実施形態では、本開示は、工業用糸状菌株の表現型性能を再建および改善するための方法であって、親系統糸状菌株のゲノムが撹乱されて、工業用糸状菌株内に見出される同定された一塩基多型、ＤＮＡ挿入、またはＤＮＡ欠失の１つまたは複数が付加される、方法を教示する。
【００３５】
一部の実施形態では、本開示は、工業用糸状菌株の表現型性能を再建および改善するための方法であって、工業用糸状菌株のゲノムが撹乱されて、親系統糸状菌株内に見出されない同定された一塩基多型、ＤＮＡ挿入、またはＤＮＡ欠失の１つまたは複数が除去される、方法を教示する。
【００３６】
一部の実施形態では、本開示は、プロモータースワップ糸状菌株ライブラリーを生成するための方法であって、ａ）基準糸状菌株に内在する複数の標的遺伝子、およびプロモーターラダーを提供するステップであって、前記プロモーターラダーは、基準糸状菌株において異なる発現プロファイルを呈する複数のプロモーターを含む、ステップ；ｂ）基準糸状菌株のゲノムを操作することによって、複数の個々の株の各株内で見出されたユニークな遺伝的バリエーションを有する前記複数の個々の糸状菌株を含む最初のプロモータースワップ糸状菌株ライブラリーを生み出すステップであって、前記ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、基準糸状菌株に内在する標的遺伝子の１つに作動可能に連結したプロモーターラダーからのプロモーターの１つを含む、ステップを含む、方法を教示する。
【００３７】
一部の実施形態では、本開示は、所望の表現型を獲得するために糸状菌株を進化させるゲノム操作のプロモータースワップ方法であって、ａ）基準糸状菌株に内在する複数の標的遺伝子、およびプロモーターラダーを提供するステップであって、前記プロモーターラダーは、基準糸状菌株において異なる発現プロファイルを呈する複数のプロモーターを含む、ステップ；ｂ）基準糸状菌株のゲノムを操作することによって、複数の個々の株の各株内で見出されたユニークな遺伝的バリエーションを有する前記複数の個々の糸状菌株を含む最初のプロモータースワップ糸状菌株ライブラリーを生み出すステップであって、前記ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、基準糸状菌株に内在する標的遺伝子の１つに作動可能に連結したプロモーターラダーからのプロモーターの１つを含む、ステップ；ｃ）最初のプロモータースワップ糸状菌株ライブラリーの個々の株を、所望の表現型についてスクリーニングおよび選択するステップ；ｄ）それぞれ遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の糸状菌株を提供することによって、後続のプロモータースワップ糸状菌株ライブラリーを生み出すステップであって、前記遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも２つの個々の株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップ；ｅ）後続のプロモータースワップ糸状菌株ライブラリーの個々の株を、所望の表現型についてスクリーニングおよび選択するステップ；ｆ）微生物が所望の表現型を獲得するまで、線形または非線形様式でステップｄ）〜ｅ）を１回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するプロモータースワップ糸状菌株ライブラリーの少なくとも２つの個々の株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを内包する個々の株を含む新しいプロモータースワップ糸状菌株ライブラリーが創製される、ステップを含む、方法を教示する。
【００３８】
一部の実施形態では、本開示は、ターミネータースワップ糸状菌株ライブラリーを生成するための方法であって、ａ）基準糸状菌株に内在する複数の標的遺伝子、およびターミネーターラダーを提供するステップであって、前記ターミネーターラダーは、基準糸状菌株において異なる発現プロファイルを呈する複数のターミネーターを含む、ステップ；ｂ）基準糸状菌株のゲノムを操作することによって、複数の個々の株の各株内で見出されたユニークな遺伝的バリエーションを有する前記複数の個々の株を含む最初のターミネータースワップ糸状菌株ライブラリーを生み出すステップであって、前記ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、ターミネーターラダーからのターミネーターの１つまたは複数に作動可能に連結した基準糸状菌株に内在する標的遺伝子の１つを含む、ステップを含む、方法を教示する。
【００３９】
一部の実施形態では、本開示は、所望の表現型を獲得するために糸状菌株を進化させるゲノム操作のターミネータースワップ方法であって、ａ）基準糸状菌株に内在する複数の標的遺伝子、およびターミネーターラダーを提供するステップであって、前記ターミネーターラダーは、基準糸状菌株において異なる発現プロファイルを呈する複数のターミネーターを含む、ステップ；ｂ）基準糸状菌株のゲノムを操作することによって、複数の個々の株の各株内で見出されたユニークな遺伝的バリエーションを有する前記複数の個々の糸状菌株を含む最初のターミネータースワップ糸状菌株ライブラリーを生み出すステップであって、前記ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、ターミネーターラダーからのターミネーターの１つまたは複数に作動可能に連結した基準糸状菌株に内在する標的遺伝子の１つを含む、ステップ；ｃ）最初のターミネータースワップ糸状菌株ライブラリーの個々の微生物株を、所望の表現型についてスクリーニングおよび選択するステップ；ｄ）それぞれ遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の糸状菌株を提供することによって、後続のターミネータースワップ糸状菌株ライブラリーを生み出すステップであって、前記遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも２つの個々の株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップ；ｅ）後続のターミネータースワップ糸状菌株ライブラリーの個々の株を、所望の表現型についてスクリーニングおよび選択するステップ；ｆ）微生物が所望の表現型を獲得するまで、線形または非線形様式でステップｄ）〜ｅ）を１回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するターミネータースワップ糸状菌株ライブラリーの少なくとも２つの個々の株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを内包する個々の株を含む新しいターミネータースワップ糸状菌株ライブラリーが創製される、ステップを含む、方法を教示する。
【００４０】
一部の実施形態では、本開示は、（ａ）（１）１つまたは複数のバックグラウンド糸状菌株に対する遺伝子変化を表す入力、および（２）対応する性能尺度を含む訓練セットで設定された予測モデルにアクセスするステップ；（ｂ）遺伝子変化を表す予測モデルに試験入力を適用するステップであって、試験入力は、これらの遺伝子変化を組み入れる候補糸状菌株に対応する、ステップ；（ｃ）予測モデルに少なくとも部分的に基づいて候補糸状菌株の表現型性能を予測するステップ；（ｄ）これらの予測された性能に少なくとも部分的に基づいて、候補糸状菌株の第１のサブセットを選択するステップ；（ｅ）候補糸状菌株の第１のサブセットの測定された表現型性能を得るステップ；（ｆ）これらの測定された表現型性能に少なくとも部分的に基づいて、候補糸状菌株の第２のサブセットの選択物を得るステップ；（ｇ）予測モデルの訓練セットに、（１）選択された候補糸状菌株の第２のサブセットに対応する入力、それと共に（２）候補糸状菌株の選択された第２のサブセットの対応する測定された性能を加えるステップ；および（ｈ）少なくとも１つの候補糸状菌株の測定された表現型性能が性能測定基準を満たすまで、（ｂ）〜（ｇ）を繰り返すステップによって、候補糸状菌株の設計を反復して改善することを教示する。一部の場合では、予測モデルへの試験入力の第１の適用の間に、試験入力によって表される遺伝子変化が、１つまたは複数のバックグラウンド糸状菌株に対する遺伝子変化を含み、試験入力の後続の適用の間に、試験入力によって表される遺伝子変化が、候補糸状菌株の先に選択された第２のサブセット内の候補糸状菌株に対する遺伝子変化を含む。
【００４１】
一部の実施形態では、第１のサブセットの選択は、上位性効果に基づき得る。これは、第１のサブセットの第１の選択の間に、１つまたは複数のバックグラウンド糸状菌株に対する遺伝子変化を表す複数のそれぞれの入力の適用に応じて、１つまたは複数のバックグラウンド糸状菌株の性能尺度間の相違点の程度を決定するステップと、少なくとも２つの候補糸状菌株内に組み入れられる遺伝子変化の適用に応じて、１つまたは複数のバックグラウンド糸状菌株の性能尺度の相違点の程度に少なくとも部分的に基づいて、少なくとも２つの候補糸状菌株を第１のサブセットに含めるために選択するステップとによって達成することができる。
【００４２】
一部の実施形態では、本開示は、候補糸状菌株の反復改良において上位性効果を適用する方法であって、少なくとも１つの糸状菌バックグラウンド株に行われた対応する遺伝子変化に応じて、測定された性能を表すデータを得るステップと；少なくとも２つの遺伝子変化の対応する応答性能尺度間の相違点の程度に少なくとも部分的に基づいて、少なくとも２つの遺伝子変化の選択物を得るステップであって、相違点の程度が、少なくとも２つの遺伝子変化が異なる生物学的経路を通じたこれらの対応する応答性能尺度に影響する程度に関連する、ステップと；選択された遺伝子変化を含む糸状菌バックグラウンド株に対する遺伝子変化を設計するステップとを含む、方法を教示する。一部の場合では、少なくとも２つの選択された遺伝子変化が設計される糸状菌バックグラウンド株は、測定された応答性能を表すデータが得られた少なくとも１つの糸状菌バックグラウンド株と同じである。
【００４３】
一部の実施形態では、本開示は、単一タイプの遺伝的ライブラリーのみを利用するＨＴＰ糸状菌株改良方法を教示する。例えば、一部の実施形態では、本開示は、ＳＮＰスワップライブラリーのみを利用するＨＴＰ糸状菌株改良方法を教示する。他の実施形態では、本開示は、ＰＲＯスワップライブラリーのみを利用するＨＴＰ糸状菌株改良方法を教示する。一部の実施形態では、本開示は、ＳＴＯＰスワップライブラリーのみを利用するＨＴＰ糸状菌株改良方法を教示する。一部の実施形態では、本開示は、開始／停止コドンスワップライブラリーのみを利用するＨＴＰ糸状菌株改良方法を教示する。
【００４４】
他の実施形態では、本開示は、２つまたはそれよりも多くのタイプの遺伝的ライブラリーを利用するＨＴＰ糸状菌株改良方法を教示する。例えば、一部の実施形態では、本開示は、ＳＮＰスワップおよびＰＲＯスワップライブラリーを組み合わせるＨＴＰ糸状菌株改良方法を教示する。一部の実施形態では、本開示は、ＳＮＰスワップおよびＳＴＯＰスワップライブラリーを組み合わせるＨＴＰ糸状菌株改良方法を教示する。一部の実施形態では、本開示は、ＰＲＯスワップおよびＳＴＯＰスワップライブラリーを組み合わせるＨＴＰ糸状菌株改良方法を教示する。
【００４５】
他の実施形態では、本開示は、複数のタイプの遺伝的ライブラリーを利用するＨＴＰ糸状菌株改良方法を教示する。一部の実施形態では、遺伝的ライブラリーは、組合せ変異（例えば、１つまたは複数の遺伝子に適用されるプロモーター／ターミネーターの組合せラダー）を生成するように組み合わされる。さらに他の実施形態では、本開示のＨＴＰ糸状菌株改良方法は、１つまたは複数の伝統的な株改良方法と組み合わせることができる。
【００４６】
一部の実施形態では、本開示のＨＴＰ糸状菌株改良方法は、改善された糸状菌宿主細胞をもたらす。すなわち、本開示は、１つまたは複数の糸状菌宿主細胞性質を改善する方法を教示する。一部の実施形態では、改善される糸状菌宿主細胞性質は、糸状菌宿主細胞によって産生される目的の産物の体積生産性、比生産性、収率または力価からなる群から選択される。一部の実施形態では、改善される糸状菌宿主細胞性質は、体積生産性である。一部の実施形態では、改善される糸状菌宿主細胞性質は、比生産性である。一部の実施形態では、改善される糸状菌宿主細胞性質は、収率である。
【００４７】
一部の実施形態では、本開示のＨＴＰ糸状菌株改良方法は、ＨＴＰ株改良方法に供されない対照糸状菌宿主細胞に対して、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、またはそれよりも多くの少なくとも１つの糸状菌宿主細胞性質の改善（例えば、これらの間の任意の範囲および部分範囲を組み入れての、目的の生体分子の収率または生産性のＸ％の改善）を呈する糸状菌宿主細胞をもたらす。一部の実施形態では、本開示のＨＴＰ糸状菌株改良方法は、ＳＮＰスワップ、ＰＲＯスワップ、ＳＴＯＰスワップ、およびこれらの組合せからなる群から選択される。
【００４８】
したがって、一部の実施形態では、本開示のＳＮＰスワップ方法は、ＳＮＰスワップ方法に供されない対照糸状菌宿主細胞に対して、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、またはそれよりも多くの少なくとも１つの糸状菌宿主細胞性質の改善（例えば、これらの間の任意の範囲および部分範囲を組み入れての、目的の生体分子の収率または生産性のＸ％の改善）を呈する糸状菌宿主細胞をもたらす。
【００４９】
したがって、一部の実施形態では、本開示のＰＲＯスワップ方法は、ＰＲＯスワップ方法に供されない対照糸状菌宿主細胞に対して、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、またはそれよりも多くの少なくとも１つの糸状菌宿主細胞性質の改善（例えば、これらの間の任意の範囲および部分範囲を組み入れての、目的の生体分子の収率または生産性のＸ％の改善）を呈する糸状菌宿主細胞をもたらす。
【００５０】
したがって、一部の実施形態では、本開示のターミネーター（ＳＴＯＰ）スワップ方法は、ターミネーター（ＳＴＯＰ）スワップ方法に供されない対照糸状菌宿主細胞に対して、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、またはそれよりも多くの少なくとも１つの糸状菌宿主細胞性質の改善（例えば、これらの間の任意の範囲および部分範囲を組み入れての、目的の生体分子の収率または生産性のＸ％の改善）を呈する糸状菌宿主細胞をもたらす。
【００５１】
一態様では、糸状菌株を産生するための方法であって、ａ．）複数のプロトプラストを提供するステップであって、プロトプラストは、糸状菌細胞の培養物から調製されたものである、ステップ；ｂ．）複数のプロトプラストを第１のコンストラクトおよび第２のコンストラクトで形質転換するステップであって、第１のコンストラクトは、プロトプラストのゲノム中の第１の遺伝子座に相同なヌクレオチドが両側に隣接している第１のポリヌクレオチドを含み、第２のコンストラクトは、プロトプラストのゲノム中の第２の遺伝子座に相同なヌクレオチドが両側に隣接している第２のポリヌクレオチドを含み、形質転換により、相同組換えによって第１の遺伝子座に第１のコンストラクトが組み込まれ、第２の遺伝子座に第２のコンストラクトが組み込まれ、少なくとも第２の遺伝子座は、プロトプラストのゲノム中の第１の選択可能なマーカー遺伝子であり、第１のポリヌクレオチドは、変異および／または遺伝子制御エレメントを含む、ステップ；ｃ．）選択および対抗選択を実行することによって、同核共存体の形質転換体を精製するステップ；およびｄ．）糸状菌細胞の再生を助長する培地中で、精製した形質転換体を増殖させるステップを含む、方法が本明細書で提供される。一部の場合では、第１のコンストラクトは、コンストラクトＡおよびコンストラクトＢに分割され、コンストラクトＡは、第１のポリヌクレオチドの第１の部分と、第１のポリヌクレオチドの第１の部分の５’側に第１の遺伝子座に相同なヌクレオチドとを含み、コンストラクトＢは、第１のポリヌクレオチドの第２の部分と、第１のポリヌクレオチドの第２の部分の３’側に第１の遺伝子座に相同なヌクレオチドを含み、第１のポリヌクレオチドの第１の部分および第２の部分は、オーバーラップする相補的配列を含む。一部の場合では、第２のコンストラクトは、コンストラクトＡおよびコンストラクトＢに分割され、コンストラクトＡは、第２のポリヌクレオチドの第１の部分と、第２のポリヌクレオチドの第１の部分の５’側に第１の遺伝子座に相同なヌクレオチドとを含み、コンストラクトＢは、第２のポリヌクレオチドの第２の部分と、第２のポリヌクレオチドの第２の部分の３’側に第１の遺伝子座に相同なヌクレオチドを含み、第２のポリヌクレオチドの第１の部分および第２の部分は、オーバーラップする相補的配列を含む。一部の場合では、複数のプロトプラストからの各プロトプラストは、複数の第１のコンストラクトからの単一の第１のコンストラクトおよび複数の第２のコンストラクトからの単一の第２のコンストラクトで形質転換され、複数の第１のコンストラクトからの各第１のコンストラクト中の第１のポリヌクレオチドは、異なる変異および／または遺伝子制御エレメントを含み、複数の第２のコンストラクトからの各第２のコンストラクト中の第２のポリヌクレオチドが同一である。一部の場合では、本方法は、ステップａ〜ｄを繰り返して、糸状菌細胞のライブラリーを生成するステップをさらに含み、ライブラリー中の各糸状菌細胞は、異なる変異および／または遺伝子制御エレメントを有する第１のポリヌクレオチドを含む。一部の場合では、第１のポリヌクレオチドは、標的糸状菌遺伝子または異種遺伝子をコードする。一部の場合では、変異は、一塩基多型である。一部の場合では、遺伝子制御は、プロモーター配列および／またはターミネーター配列である。一部の場合では、遺伝子制御エレメントは、プロモーター配列であり、プロモーター配列は、表１に列挙したプロモーター配列から選択される。一部の場合では、複数のプロトプラストは、マイクロタイタープレートのウェルに分配される。一部の場合では、ステップａ〜ｄは、マイクロタイタープレートのウェルで実行される。一部の場合では、マイクロタイタープレートは、９６ウェル、３８４ウェルまたは１５３６ウェルのマイクロタイタープレートである。一部の場合では、糸状菌細胞は、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａの種、またはこれらのテレオモルフもしくはアナモルフ、およびシノニムもしくは分類学的均等物から選択される。一部の場合では、糸状菌細胞は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒである。一部の場合では、糸状菌細胞は、菌糸体を形成しない表現型を有する。一部の場合では、糸状菌細胞は、非機能的な非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路を有する。一部の場合では、細胞を、抗体、化学的阻害剤、タンパク質阻害剤、物理的阻害剤、ペプチド阻害剤、またはＮＨＥＪ経路のコンポーネントに指向させたアンチセンスもしくはＲＮＡｉ分子に曝露することによって、ＮＨＥＪ経路が非機能的になる。一部の場合では、化学的阻害剤は、Ｗ−７である。一部の場合では、第１の遺伝子座は、標的糸状菌遺伝子のためのものである。一部の場合では、第１の遺伝子座は、プロトプラストのゲノム中の第２の選択可能なマーカー遺伝子のためのものである。一部の場合では、第２の選択可能なマーカー遺伝子は、栄養要求性マーカー遺伝子、発色性マーカー遺伝子または指向性マーカー遺伝子から選択される。一部の場合では、第１の選択可能なマーカー遺伝子は、栄養要求性マーカー遺伝子、発色性マーカー遺伝子または指向性マーカー遺伝子から選択される。一部の場合では、第２のポリヌクレオチドは、栄養要求性マーカー遺伝子、指向性マー��ー遺伝子または抗生物質耐性遺伝子から選択される。一部の場合では、発色性マーカー遺伝子は、ａｙｇＡ遺伝子である。一部の場合では、栄養要求性マーカー遺伝子は、ａｒｇＢ遺伝子、ｔｒｐＣ遺伝子、ｐｙｒＧ遺伝子、またはｍｅｔ３遺伝子から選択される。一部の場合では、指向性マーカー遺伝子は、アセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）遺伝子、硝酸レダクターゼ遺伝子（ｎｉａＤ）、または硫酸パーミアーゼ（ＳｕｔＢ）遺伝子から選択される。一部の場合では、抗生物質耐性遺伝子は、ｂｌｅ遺伝子であり、ｂｌｅ遺伝子は、フレオマイシンに対する耐性を付与する。一部の場合では、第１の選択可能なマーカー遺伝子は、ａｙｇＡ遺伝子であり、第２のポリヌクレオチドは、ｐｙｒＧ遺伝子である。一部の場合では、第１の選択可能なマーカー遺伝子は、ｍｅｔ３遺伝子であり、第２の選択可能なマーカー遺伝子は、ａｙｇＡ遺伝子であり、第２のポリヌクレオチドは、ｐｙｒＧ遺伝子である。一部の場合では、複数のプロトプラストは、糸状菌細胞の培養物中の糸状菌細胞から細胞壁を除去すること；複数のプロトプラストを単離すること；および単離された複数のプロトプラストを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む混合物中に再懸濁することによって調製され、ＤＭＳＯの最終濃度は、７％ｖ／ｖまたはそれ未満である。一部の場合では、混合物は、ステップａ〜ｄを実行する前に、少なくとも−２０℃または−８０℃で貯蔵される。一部の場合では、培養物は、少なくとも１リットルの体積である。一部の場合では、培養物は、プロトプラストの調製の前に、少なくとも１２時間増殖される。一部の場合では、プロトプラストの少なくとも７０％がより小さくなり、より少ない核を含有するような条件下で、真菌培養物が増殖される。一部の場合では、細胞壁を除去することは、酵素消化によって実行される。一部の場合では、酵素消化は、ベータ−グルカナーゼおよびポリガラクツロナーゼを含む酵素の混合物を用いて実行される。一部の場合では、本方法は、プロトプラストを貯蔵する前に、ＤＭＳＯを含む混合物に、４０％ｖ／ｖのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を添加することをさらに含む。一部の場合では、ＰＥＧは、８％ｖ／ｖまたはそれ未満の最終濃度まで添加される。一部の場合では、ステップａ〜ｄは、自動化されている。
【００５２】
別の態様では、貯蔵のための糸状菌細胞を調製するための方法であって、糸状菌細胞を含む真菌培養物からプロトプラストを調製するステップであって、真菌培養物中の糸状菌細胞から細胞壁を除去することを含む、ステップ；プロトプラストを単離するステップ；および単離されたプロトプラストを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を７％ｖ／ｖまたはそれ未満の最終濃度で含む混合物中に再懸濁するステップを含む、方法が本明細書で提供される。一部の場合では、混合物は、少なくとも−２０℃または−８０℃で貯蔵される。一部の場合では、真菌培養物は、少なくとも１リットルの体積である。一部の場合では、真菌培養物は、プロトプラストの調製の前に、少なくとも１２時間増殖される。一部の場合では、プロトプラストの少なくとも７０％がより小さくなり、より少ない核を有するような条件下で、真菌培養物が増殖される。一部の場合では、細胞壁を除去することは、酵素消化によって実行される。一部の場合では、酵素消化は、ベータ−グルカナーゼおよびポリガラクツロナーゼを含む酵素の混合物を用いて実行される。一部の場合では、本方法は、プロトプラストを貯蔵する前に、ＤＭＳＯを含む混合物に、４０％ｖ／ｖのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を添加することをさらに含む。一部の場合では、ＰＥＧは、８％ｖ／ｖまたはそれ未満の最終濃度まで添加される。一部の場合では、本方法は、プロトプラストを貯蔵する前に、プロトプラストをマイクロタイタープレートに分配するステップをさらに含む。一部の場合では、真菌培養物中の糸状菌細胞は、菌糸体を形成しない表現型を有する。一部の場合では、真菌培養物中の糸状菌細胞は、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａの種、またはこれらのテレオモルフもしくはアナモルフ、およびシノニムもしくは分類学的均等物から選択される。一部の場合では、真菌培養物中の糸状菌細胞は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒまたはそのテレオモルフもしくはアナモルフである。
【００５３】
さらに別の態様では、真菌産生株を生成するためのシステムであって、１つまたは複数のプロセッサー；および１つまたは複数のプロセッサーの少なくとも１つに作動可能にカップリングされている１つまたは複数のメモリーであって、１つまたは複数のプロセッサーの少なくとも１つによって実行されるときに、システムに、ａ．）糸状菌細胞の培養物から得られた複数のプロトプラストを第１のコンストラクトおよび第２のコンストラクトで形質転換するステップであって、第１のコンストラクトは、プロトプラストのゲノム中の第１の遺伝子座に相同なヌクレオチドが両側に隣接している第１のポリヌクレオチドを含み、第２のコンストラクトは、プロトプラストのゲノム中の第２の遺伝子座に相同なヌクレオチドが両側に隣接している第２のポリヌクレオチドを含み、形質転換により、相同組換えによって第１の遺伝子座に第１のコンストラクトが組み込まれ、第２の遺伝子座に第２のコンストラクトが組み込まれ、少なくとも第２の遺伝子座は、プロトプラストのゲノム中の第１の選択可能なマーカー遺伝子であり、第１のポリヌクレオチドは、変異および／または遺伝子制御エレメントを含む、ステップ；ｂ．）選択および対抗選択を実行することによって、同核共存体の形質転換体を精製するステップ；およびｃ．）糸状菌細胞の再生を助長する培地中で、精製した形質転換体を増殖させるステップを行わせる命令が記憶されている、メモリーを含む、システムが本明細書で提供される。一部の場合では、第１のコンストラクトは、コンストラクトＡおよびコンストラクトＢに分割され、コンストラクトＡは、第１のポリヌクレオチドの第１の部分と、第１のポリヌクレオチドの第１の部分の５’側に第１の遺伝子座に相同なヌクレオチドとを含み、コンストラクトＢは、第１のポリヌクレオチドの第２の部分と、第１のポリヌクレオチドの第２の部分の３’側に第１の遺伝子座に相同なヌクレオチドとを含み、第１のポリヌクレオチドの第１の部分および第２の部分は、オーバーラップする相補的配列を含む。一部の場合では、第２のコンストラクトは、コンストラクトＡおよびコンストラクトＢに分割され、コンストラクトＡは、第２のポリヌクレオチドの第１の部分と、第２のポリヌクレオチドの第１の部分の５’側に第１の遺伝子座に相同なヌクレオチドを含み、コンストラクトＢは、第２のポリヌクレオチドの第２の部分と、第２のポリヌクレオチドの第２の部分の３’側に第１の遺伝子座に相同なヌクレオチドを含み、第２のポリヌクレオチドの第１の部分および第２の部分は、オーバーラップする相補的配列を含む。一部の場合では、複数のプロトプラストからの各プロトプラストは、複数の第１のコンストラクトからの単一の第１のコンストラクトおよび複数の第２のコンストラクトからの単一の第２のコンストラクトで形質転換され、複数の第１のコンストラクトからの各第１のコンストラクト中の第１のポリヌクレオチドは、異なる変異および／または遺伝子制御エレメントを含み、複数の第２のコンストラクトからの各第２のコンストラクト中の第２のポリヌクレオチドは同一である。一部の場合では、本システムは、ステップａ〜ｃを繰り返して、糸状菌細胞のライブラリーを生成することをさらに含み、ライブラリー中の各糸状菌細胞は、異なる変異および／または遺伝子制御エレメントを有する第１のポリヌクレオチドを含む。一部の場合では、変異は、一塩基多型である。一部の場合では、遺伝子制御は、プロモーター配列および／またはターミネーター配列である。一部の場合では、遺伝子制御エレメントは、プロモーター配列であり、プロモーター配列は、表１に列挙したプロモーター配列から選択される。一部の場合では、ステップａ〜ｃは、マイクロタイタープレートのウェルで実行される。一部の場合では、マイクロタイタープレートは、９６ウェル、３８４ウェルまたは１５３６ウェルのマイクロタイタープレートである。一部の場合では、糸状菌細胞は、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａの種、またはこれらのテレオモルフもしくはアナモルフ、およびシノニムもしくは分類学的均等物から選択される。一部の場合では、糸状菌細胞は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒである。一部の場合では、糸状菌細胞は、菌糸体を形成しない表現型を有する。一部の場合では、糸状菌細胞は、非機能的な非相同末端結合経路を有する。一部の場合では、細胞を、抗体、化学的阻害剤、タンパク質阻害剤、物理的阻害剤、ペプチド阻害剤、またはＮＨＥＪ経路のコンポーネントに指向させたアンチセンスもしくはＲＮＡｉ分子に曝露することによって、ＮＨＥＪ経路が非機能的になる。一部の場合では、化学的阻害剤は、Ｗ−７である。一部の場合では、第１の遺伝子座は、標的糸状菌遺伝子のためのものである。一部の場合では、第１の遺伝子座は、プロトプラストのゲノム中の第２の選択可能なマーカー遺伝子のためのものである。一部の場合では、第２の選択可能なマーカー遺伝子は、栄養要求性マーカー遺伝子、発色性マーカー遺伝子または指向性マーカー遺伝子から選択される。一部の場合では、第１の選択可能なマーカー遺伝子は、栄養要求性マーカー遺伝子、発色性マーカー遺伝子または指向性マーカー遺伝子から選択される。一部の場合では、第２のポリヌクレオチドは、栄養要求性マーカー遺伝子、指向��マーカー遺伝子または抗生物質耐性遺伝子から選択される。一部の場合では、発色性マーカー遺伝子は、ａｙｇＡ遺伝子である。一部の場合では、栄養要求性マーカー遺伝子は、ａｒｇＢ遺伝子、ｔｒｐＣ遺伝子、ｐｙｒＧ遺伝子、またはｍｅｔ３遺伝子から選択される。一部の場合では、指向性マーカー遺伝子は、アセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）遺伝子、硝酸レダクターゼ遺伝子（ｎｌａＤ）、または硫酸パーミアーゼ（ＳｕｔＢ）遺伝子から選択される。一部の場合では、抗生物質耐性遺伝子は、ｂｌｅ遺伝子であり、ｂｌｅ遺伝子は、フレオマイシンに対する耐性を付与する。一部の場合では、第１の選択可能なマーカー遺伝子は、ａｙｇＡ遺伝子であり、第２のポリヌクレオチドは、ｐｙｒＧ遺伝子である。一部の場合では、第１の選択可能なマーカー遺伝子は、ｍｅｔ３遺伝子であり、第２の選択可能なマーカー遺伝子は、ａｙｇＡ遺伝子であり、第２のポリヌクレオチドは、ｐｙｒＧ遺伝子である。一部の場合では、複数のプロトプラストは、糸状菌細胞の培養物中の糸状菌細胞から細胞壁を除去すること；複数のプロトプラストを単離すること；および単離された複数のプロトプラストを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を７％ｖ／ｖまたはそれ未満の最終濃度で含む混合物中に再懸濁することによって調製される。一部の場合では、混合物は、ステップａ〜ｃを実行する前に、少なくとも−２０℃または−８０℃で貯蔵される。一部の場合では、培養物は、少なくとも１リットルの体積である。一部の場合では、培養物は、プロトプラストの調製の前に、少なくとも１２時間増殖される。一部の場合では、プロトプラストの少なくとも７０％がより小さくなり、より少ない核を有するような条件下で、真菌培養物が増殖される。一部の場合では、細胞壁を除去することは、酵素消化によって実行される。一部の場合では、酵素消化は、ベータ−グルカナーゼおよびポリガラクツロナーゼを含む酵素の混合物を用いて実行される。一部の場合では、本システムは、プロトプラストを貯蔵する前に、ＤＭＳＯを含む混合物に、４０％ｖ／ｖのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を添加することをさらに含む。一部の場合では、ＰＥＧは、８％ｖ／ｖまたはそれ未満の最終濃度まで添加される。
【００５４】
さらに別の態様では、単一の真菌胞子に由来するクローン集団を単離するための方法であって、（ａ）複数の真菌胞子を液状懸濁液において提供するステップであって、複数の真菌胞子は、真菌株から得たものである、ステップ；（ｂ）複数の反応領域を含む基板中の個々の反応領域に、別々の体積の液状懸濁液を分散するステップであって、複数の反応領域中の各反応領域は、増殖培地を含み、分散により、個々の反応領域の少なくとも７５％が、複数の真菌胞子からの単一の生存可能な真菌胞子のみを含有する確率がもたらされる、ステップ；（ｃ）増殖培地を含む反応領域中の分散された単一の生存可能な真菌胞子を培養するステップ；および（ｄ）反応領域中で増殖するクローン集団を選択することによって、単一の真菌胞子に由来するクローン集団を単離するステップを含む、方法が本明細書で提供される。一部の場合では、本方法は、別々の体積中の単一の真菌胞子の存在または非存在について、別々の体積をスクリーニングするステップをさらに含み、ステップ（ｂ）のために、単一の真菌胞子を含有する別々の体積のみが選択される。一部の場合では、分散により、個々の反応領域の少なくとも８０％が、複数の真菌胞子からの単一の生存可能な真菌胞子のみを含有する確率がもたらされる。一部の場合では、分散により、個々の反応領域の少なくとも９０％が、複数の真菌胞子からの単一の生存可能な真菌胞子のみを含有する確率がもたらされる。一部の場合では、分散により、個々の反応領域の少なくとも９５％が、複数の真菌胞子からの単一の生存可能な真菌胞子のみを含有する確率がもたらされる。一部の場合では、分散により、個々の反応領域の少なくとも９９％が、複数の真菌胞子からの単一の生存可能な真菌胞子のみを含有する確率がもたらされる。一部の場合では、分散により、個々の反応領域の実質的にすべてが、複数の真菌胞子からの単一の生存可能な真菌胞子のみを含有する確率がもたらされる。一部の場合では、別々の体積をスクリーニングするステップが、別々の体積中の単一の真菌胞子の存在または非存在を光学的に区別することを伴う。一部の場合では、スクリーニングが、別々の体積中の単一の真菌胞子の存在または非存在を光学的に区別することが可能なマイクロフルイディックデバイスを使用して実行される。一部の場合では、反応領域が、マイクロタイタープレート中に存在する。一部の場合では、マイクロタイタープレートが、９６ウェル、３８４ウェルまたは１５３６ウェルを含有する。一部の場合では、真菌株は、糸状菌株である。一部の場合では、糸状菌株は、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈ���ｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａの種、またはこれらのテレオモルフもしくはアナモルフ、およびシノニムもしくは分類学的均等物から選択される。一部の場合では、糸状菌株は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒまたはそのテレオモルフもしくはアナモルフである。一部の場合では、糸状菌株は、菌糸体ではないペレット状の形態を有する。一部の場合では、糸状菌株は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＬＮ１遺伝子のオルソログの変異形態を発現する。一部の場合では、糸状菌株は、Ａ．ｎｉｇｅｒであり、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＬＮ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログの変異形態の核酸配列は、配列番号１３である。一部の場合では、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＬＮ１遺伝子のオルソログ（例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒオルソログ）の変異形態は、配列番号１または２から選択されるプロモーター配列に作動可能に連結されている。一部の場合では、真菌株は、遺伝子撹乱を有する。一部の場合では、遺伝子撹乱は、一塩基多型、ＤＮＡ挿入、ＤＮＡ欠失またはこれらの任意の組合せから選択される。一部の場合では、遺伝子撹乱は、真菌株に由来するプロトプラストをリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ複合体）で形質転換することによってプロトプラストに導入される。一部の場合では、ＲＮＰ複合体は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と複合体化したＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼを含む。一部の場合では、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼは、クラス２のＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムのＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼである。一部の場合では、クラス２のＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムのＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼは、タイプＩＩ、タイプＶまたはタイプＶＩのＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼである。一部の場合では、クラス２のＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムのＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃまたはこれらの相同体、オルソログ、変異体、バリアントもしくは改変されたバージョンから選択される。一部の場合では、クラス２のＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムのＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９またはこれらの相同体、オルソログもしくはパラログである。一部の場合では、ｇＲＮＡは、単独の、またはトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）にアニールした、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）である。一部の場合では、ｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡを含む単一のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。一部の場合では、ｃｒＲＮＡは、真菌株のゲノム内の標的遺伝子に相補的なガイド配列を含み、プ���トプラストへのＲＮＰ複合体の導入は、標的遺伝子への遺伝子撹乱の導入を促進する。一部の場合では、標的遺伝子の遺伝子撹乱は、ＲＮＰ複合体により標的遺伝子が切断されて、標的遺伝子にＤＮＡ末端が生成され、続いて非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路によって標的遺伝子中のＤＮＡ末端が非相同末端結合することによって促進される。一部の場合では、本方法は、標的遺伝子の変異したバージョンを含むドナーＤＮＡを共形質転換することをさらに含み、標的遺伝子の変異したバージョンは、標的遺伝子座に相同なヌクレオチドが両側に隣接している。一部の場合では、標的遺伝子の遺伝子撹乱は、ＲＮＰ複合体により標的遺伝子が切断されて、標的遺伝子にＤＮＡ末端が生成され、続いて標的遺伝子が相同組換えを介してドナーＤＮＡで置き換えられることによって促進される。一部の場合では、ステップ（ｂ）は、選択可能なマーカーを含むベクターを共形質転換することをさらに含む。一部の場合では、選択可能なマーカーが、ステップ（ｄ）において、形質転換能を有する真菌株に由来するクローン集団を選択するために使用される。一部の場合では、遺伝子撹乱は、複数のプロトプラストを第１のコンストラクトおよび第２のコンストラクトで形質転換することによって真菌株に由来するプロトプラストに導入され、第１のコンストラクトは、プロトプラストのゲノム中の第１の遺伝子座に相同なヌクレオチドが両側に隣接している第１のポリヌクレオチドを含み、第２のコンストラクトは、プロトプラストのゲノム中の第２の遺伝子座に相同なヌクレオチドが両側に隣接している第２のポリヌクレオチドを含み、形質転換により、相同組換えによって第１の遺伝子座に第１のコンストラクトが組み込まれ、第２の遺伝子座に第２のコンストラクトが組み込まれ、少なくとも第２の遺伝子座は、プロトプラストのゲノム中の第１の選択可能なマーカー遺伝子であり、第１のポリヌクレオチドは、遺伝子撹乱を含む。一部の場合では、選択可能なマーカー遺伝子が、ステップ（ｄ）において、遺伝子撹乱を含む真菌株に由来するクローン集団の選択を促進するために使用される。一部の場合では、真菌株は、非機能的な非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路を有する。一部の場合では、真菌株を、抗体、化学的阻害剤、タンパク質阻害剤、物理的阻害剤、ペプチド阻害剤、またはＮＨＥＪ経路のコンポーネントに指向させたアンチセンスまたはＲＮＡｉ分子に曝露することによって、ＮＨＥＪ経路が非機能的になる。一部の場合では、化学的阻害剤は、Ｗ−７である。
【００５５】
別の態様では、単一の真菌胞子に由来するクローン集団を単離するための方法であって、（ａ）複数の真菌胞子を液状懸濁液において提供するステップであって、複数の真菌胞子は、真菌株から得たものである、ステップ；（ｂ）液状懸濁液を希釈するステップであって、希釈が限界希釈である、ステップ；（ｃ）複数の反応領域を含む基材中の個々の反応領域に、別々の体積の希釈物を分散するステップであって、複数の反応領域中の各反応領域は、増殖培地を含み、限界希釈により、各反応領域に分散された別々の体積の希釈物が１つの生存可能な胞子を含有するかまたは生存可能な胞子を含有しないかのいずれかであることが、複数の反応領域中の反応領域の９０％より多くが生存可能な胞子を含有せず、１つまたは複数の生存可能な胞子を含有する反応領域の９０％より多くが単一の生存可能な胞子のみを含有するポアソン分布に従う確率がもたらされる、ステップ；（ｄ）増殖培地を含む反応領域中の分散された単一の生存可能な真菌胞子を培養するステップ；および（ｅ）反応領域中で増殖するクローン集団を選択することによって、単一の真菌胞子に由来するクローン集団を単離するステップを含む、方法が本明細書で提供される。一部の場合では、反応領域が、マイクロタイタープレート中に存在する。一部の場合では、マイクロタイタープレートが、９６ウェル、３８４ウェルまたは１５３６ウェルを含有する。一部の場合では、真菌株は、糸状菌株である。一部の場合では、糸状菌株は、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａの種、またはこれらのテレオモルフもしくはアナモルフ、およびシノニムもしくは分類学的均等物から選択される。一部の場合では、糸状菌株は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒまたはそのテレオモルフもしくはアナモルフである。一部の場合では、糸状菌株は、菌糸体ではないペレット状の形態を有する。一部の場合では、糸状菌株は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＬＮ１遺伝子のオルソログの変異形態を発現する。一部の場合では、糸状菌株は、Ａ．ｎｉｇｅｒであり、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉ��ｅのＳＬＮ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログの変異形態の核酸配列は、配列番号１３である。一部の場合では、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＬＮ１遺伝子のオルソログ（例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒオルソログ）の変異形態は、配列番号１または２から選択されるプロモーター配列に作動可能に連結されている。一部の場合では、真菌株は、遺伝子撹乱を有する。一部の場合では、遺伝子撹乱は、一塩基多型、ＤＮＡ挿入、ＤＮＡ欠失またはこれらの任意の組合せから選択される。一部の場合では、遺伝子撹乱は、真菌株に由来するプロトプラストをリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ複合体）で形質転換することによってプロトプラストに導入される。一部の場合では、ＲＮＰ複合体は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と複合体化したＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼを含む。一部の場合では、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼは、クラス２のＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムのＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼである。一部の場合では、クラス２のＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムのＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼは、タイプＩＩ、タイプＶまたはタイプＶＩのＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼである。一部の場合では、クラス２のＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムのＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃまたはこれらの相同体、オルソログ、変異体、バリアントもしくは改変されたバージョンから選択される。一部の場合では、クラス２のＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムのＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９またはこれらの相同体、オルソログもしくはパラログである。一部の場合では、ｇＲＮＡは、単独の、またはトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）にアニールした、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）である。一部の場合では、ｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡを含む単一のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。一部の場合では、ｃｒＲＮＡは、真菌株のゲノム内の標的遺伝子に相補的なガイド配列を含み、プロトプラストへのＲＮＰ複合体の導入は、標的遺伝子への遺伝子撹乱の導入を促進する。一部の場合では、標的遺伝子の遺伝子撹乱は、ＲＮＰ複合体により標的遺伝子が切断されて、標的遺伝子にＤＮＡ末端が生成され、続いて非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路によって標的遺伝子中のＤＮＡ末端が非相同末端結合することによって促進される。一部の場合では、本方法は、標的遺伝子の変異したバージョンを含むドナーＤＮＡを共形質転換することをさらに含み、標的遺伝子の変異したバージョンは、標的遺伝子座に相同なヌクレオチドが両側に隣接している。一部の場合では、標的遺伝子の遺伝子撹乱は、ＲＮＰ複合体により標的遺伝子が切断されて、標的遺伝子にＤＮＡ末端が生成され、続いて標的遺伝子が相同組換えを介してドナーＤＮＡで置き換えられることによって促進される。一部の場合では、ステップ（ｂ）は、選択可能なマーカーを含むベクターを共形質転換することをさらに含む。一部の場合では、選択可能なマーカーは、ステップ（ｄ）において、形質転換能を有する真菌株に由来するクローン集���を選択するために使用される。一部の場合では、遺伝子撹乱は、複数のプロトプラストを第１のコンストラクトおよび第２のコンストラクトで形質転換することによって真菌株に由来するプロトプラストに導入され、第１のコンストラクトは、プロトプラストのゲノム中の第１の遺伝子座に相同なヌクレオチドが両側に隣接している第１のポリヌクレオチドを含み、第２のコンストラクトは、プロトプラストのゲノム中の第２の遺伝子座に相同なヌクレオチドが両側に隣接している第２のポリヌクレオチドを含み、形質転換により、相同組換えによって第１の遺伝子座に第１のコンストラクトが組み込まれ、第２の遺伝子座に第２のコンストラクトが組み込まれ、少なくとも第２の遺伝子座は、プロトプラストのゲノム中の第１の選択可能なマーカー遺伝子であり、第１のポリヌクレオチドは、遺伝子撹乱を含む。一部の場合では、選択可能なマーカー遺伝子は、ステップ（ｄ）において、遺伝子撹乱を含む真菌株に由来するクローン集団の選択を促進するために使用される。一部の場合では、真菌株は、非機能的な非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路を有する。一部の場合では、真菌株を、抗体、化学的阻害剤、タンパク質阻害剤、物理的阻害剤、ペプチド阻害剤、またはＮＨＥＪ経路のコンポーネントに指向させたアンチセンスまたはＲＮＡｉ分子に曝露することによって、ＮＨＥＪ経路が非機能的になる。一部の場合では、化学的阻害剤は、Ｗ−７である。
【００５６】
一態様では、糸状菌株を産生するための方法であって、ａ．）複数のプロトプラストを提供するステップであって、複数のプロトプラストは、親糸状菌株の培養から調製されたものである、ステップ；ｂ．）複数のプロトプラストからの各プロトプラストを、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ複合体）で形質転換するステップ；およびｃ．）親糸状菌株に対する表現型性能改善について形質転換されたプロトプラストに由来する個々の糸状菌株を選択およびスクリーニングして、表現型性能改善を付与する選択された個々の糸状菌株のゲノムにおける遺伝子撹乱を同定するステップを含む、方法が本明細書で提供される。一部の場合では、遺伝子撹乱は、一塩基多型、ＤＮＡ挿入、ＤＮＡ欠失またはこれらの任意の組合せから選択される。一部の場合では、ＲＮＰ複合体は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と複合体化したＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼを含む。一部の場合では、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼは、クラス２のＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムのＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼである。一部の場合では、クラス２のＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムのＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼは、タイプＩＩ、タイプＶまたはタイプＶＩのＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼである。一部の場合では、クラス２のＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムのＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃまたはこれらの相同体、オルソログ、変異体、バリアントもしくは改変されたバージョンから選択される。一部の場合では、クラス２のＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムのＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９またはこれらの相同体、オルソログもしくはパラログである。一部の場合では、ｇＲＮＡは、単独の、またはトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）にアニールした、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）である。一部の場合では、ｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡを含む単一のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。一部の場合では、ｃｒＲＮＡは、親糸状菌株のゲノム内の標的遺伝子に相補的なガイド配列を含み、ＲＮＰ複合体の導入は、プロトプラスト中の標的遺伝子を撹乱する。一部の場合では、標的遺伝子の撹乱は、ＲＮＰ複合体により標的遺伝子が切断されて、標的遺伝子にＤＮＡ末端が生成し、続いて非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路により標的遺伝子中のＤＮＡ末端が非相同末端結合することによって促進される。一部の場合では、ステップ（ｂ）は、標的遺伝子の変異したバージョンを含むドナーＤＮＡを共形質転換することをさらに含み、標的遺伝子の変異したバージョンは、標的遺伝子座に相同なヌクレオチドが両側に隣接している。一部の場合では、標的遺伝子の撹乱は、ＲＮＰ複合体により標的遺伝子が切断されて、標的遺伝子にＤＮＡ末端が生成し、続いて標的遺伝子が相同組換えを介してドナーＤＮＡで置き換えられることによって促進される。一部の場合では、ステップ（ｂ）は、選択可能なマーカーを含むベクターを共形質転換することをさらに含む。一部の場合では、ステップ（ｃ）において、親糸状菌株に対す��表現型性能改善についての後続のスクリーニングのために形質転換能を有する個々の糸状菌株を選択するために、選択可能なマーカーが使用される。一部の場合では、親糸状菌株は、非機能的な非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路を有する。一部の場合では、細胞を、抗体、化学的阻害剤、タンパク質阻害剤、物理的阻害剤、ペプチド阻害剤、またはＮＨＥＪ経路のコンポーネントに指向させたアンチセンスもしくはＲＮＡｉ分子に曝露することによって、ＮＨＥＪ経路が非機能的になる。一部の場合では、化学的阻害剤は、Ｗ−７である。一部の場合では、糸状菌株の表現型性能改善は、親糸状菌株の表現型性能と比較して、目的の産物に関して測定された表現型変数の少なくとも１０％の増大を含む。一部の場合では、糸状菌株の表現型性能改善は、親糸状菌株の表現型性能と比較して、目的の産物に関して測定された表現型変数の少なくとも１倍の増大を含む。一部の場合では、測定された表現型変数は、目的の産物の体積生産性、目的の産物の比生産性、目的の産物の収率、目的の産物の力価、およびこれらの組合せからなる群から選択される。一部の場合では、測定された表現型変数は、目的の産物の増大したまたはより効率的な産生である。一部の場合では、目的の産物は、低分子、酵素、ペプチド、アミノ酸、有機酸、合成化合物、燃料、アルコール、一次細胞外代謝産物、二次細胞外代謝産物、細胞内コンポーネント分子、およびこれらの組合せからなる群から選択される。一部の場合では、親糸状菌株は、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａの種、またはこれらのテレオモルフもしくはアナモルフ、およびシノニムもしくは分類学的均等物から選択される。一部の場合では、糸状菌株は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒまたはそのテレオモルフもしくはアナモルフである。一部の場合では、糸状菌株は、菌糸体ではないペレット状の形態を有する。一部の場合では、糸状菌株は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＬＮ１遺伝子のオルソログの変異形態を発現する。一部の場合では、糸状菌株は、Ａ．ｎｉｇｅｒであり、Ｓ．ｃｅ���ｅｖｉｓｉａｅのＳＬＮ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログの変異形態の核酸配列は、配列番号１３である。一部の場合では、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＬＮ１遺伝子のオルソログ（例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒオルソログ）の変異形態は、配列番号１または２から選択されるプロモーター配列に作動可能に連結されている。一部の場合では、本方法は、ステップ（ｃ）の前に、個々の糸状菌株に由来する単離されたクローン集団を生成するステップをさらに含む。一部の場合では、単離は、（ｉ）形質転換されたプロトプラストが複数の真菌胞子を生じるように誘導するステップであって、複数からの各真菌胞子は、単一の形質転換されたプロトプラストに由来する、ステップ；（ｉｉ）単一の形質転換されたプロトプラストに由来する複数の真菌胞子を液体中に再懸濁して、液状懸濁液を生成するステップ；（ｉｉｉ）複数の反応領域を含む基材中の個々の反応領域に、別々の体積の液状懸濁液を分散するステップであって、複数の反応領域中の各反応領域は、増殖培地を含み、分散により、個々の反応領域の少なくとも７５％が、複数の真菌胞子からの単一の生存可能な真菌胞子のみを含有する確率がもたらされる、ステップ；および（ｉｖ）増殖培地を含む反応領域中の分散された単一の生存可能な真菌胞子を培養することによって、個々の糸状菌株に由来する単離されたクローン集団を生成するステップを含む。一部の場合では、本方法は、別々の体積中の単一の真菌胞子の存在または非存在について、別々の体積をスクリーニングするステップをさらに含み、ステップ（ｉｉｉ）のために、単一の真菌胞子を含有する別々の体積のみが選択される。一部の場合では、別々の体積をスクリーニングするステップが、別々の体積中の単一の真菌胞子の存在または非存在を光学的に区別することを伴う。一部の場合では、スクリーニングが、別々の体積中の単一の真菌胞子の存在または非存在を光学的に区別することが可能なマイクロフルイディックデバイスを使用して実行される。一部の場合では、分散により、個々の反応領域の少なくとも８０％が、複数の真菌胞子からの単一の生存可能な真菌胞子のみを含有する確率がもたらされる。一部の場合では、分散により、個々の反応領域の少なくとも９０％が、複数の真菌胞子からの単一の生存可能な真菌胞子のみを含有する確率がもたらされる。一部の場合では、分散により、個々の反応領域の少なくとも９５％が、複数の真菌胞子からの単一の生存可能な真菌胞子のみを含有する確率がもたらされる。一部の場合では、分散により、個々の反応領域の少なくとも９９％が、複数の真菌胞子からの単一の生存可能な真菌胞子のみを含有する確率がもたらされる。一部の場合では、分散により、個々の反応領域の実質的にすべてが、複数の真菌胞子からの単一の生存可能な真菌胞子のみを含有する確率がもたらされる。一部の場合では、単離は、（ｉ）形質転換されたプロトプラストが複数の真菌胞子を生じるように誘導するステップであって、複数からの各真菌胞子は、単一の形質転換されたプロトプラストに由来する、ステップ；（ｉｉ）単一の形質転換されたプロトプラストに由来する複数の真菌胞子を液体中に再懸濁して、液状懸濁液を生成するステップ；（ｉｉ���）液状懸濁液を希釈するステップであって、希釈が限界希釈である、ステップ；（ｉｖ）複数の反応領域を含む基材中の個々の反応領域に、別々の体積の希釈物を分散するステップであって、複数の反応領域中の各反応領域は、増殖培地を含み、限界希釈により、各反応領域に分散された別々の体積の希釈物が１つの生存可能な胞子を含有するかまたは生存可能な胞子を含有しないかのいずれかであることが、複数の反応領域中の反応領域の９０％より多くが生存可能な胞子を含有せず、１つまたは複数の生存可能な胞子を含有する反応領域の９０％より多くが単一の生存可能な胞子のみを含有するポアソン分布に従う確率がもたらされる、ステップ；（ｖ）増殖培地を含む反応領域中の分散された単一の生存可能な真菌胞子を培養するステップ；および（ｖｉ）反応領域中で増殖するクローン集団を選択することによって、単一の真菌胞子に由来するクローン集団を単離するステップを含む。一部の場合では、反応領域が、マイクロタイタープレート中に存在する。一部の場合では、マイクロタイタープレートが、９６ウェル、３８４ウェルまたは１５３６ウェルを含有する。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１は、多様性プール中のバリエーションを増加させるための本開示のＤＮＡ組換えの方法を示す。物理的または酵素的／化学的な手段により、ＤＮＡ切片、例えば、関連のある種からのゲノム領域を切断することができる。切断したＤＮＡ領域を融解し、再アニールさせ、その結果、オーバーラップする遺伝的領域が、ポリメラーゼ伸長反応を開始する。産物が１つまたは複数の出発配列に由来するエレメントを含むキメラＤＮＡに再アセンブルされるまで、後続の融解／伸長反応を実施する。
【００５８】
【図２】図２は、選択された配列の改変（例えば、スワップするための１００個のＳＮＰ）を用いて、新しい宿主糸状菌株を生成するための本開示の方法の概要を示す。手短に述べると、方法は以下を含む：（１）所望のＤＮＡ挿入断片を、設計し、本明細書で提供される方法のいずれかを使用して生成する、（２）ＤＮＡ挿入断片を、形質転換コンストラクト中にクローニングする、（３）完成したコンストラクトを、所望の株（例えば、基準株または産生株）中に移入させ、そのコンストラクトが宿主株のゲノム中に組み込まれる、および、（４）選択マーカーおよび他の望まれないＤＮＡエレメントを、宿主株からループアウトする。ＤＮＡアセンブリーの各ステップは、追加の、品質管理（ＱＣ）のステップ、例えば、増幅およびシーケンシングのためにコンストラクトを糸状菌細胞中にクローニングするステップも含むことができる。形質転換ステップは、プロトプラスト形成ステップの前に行うことができる。プロトプラスト形成は、当技術分野で公知の任意のプロトプラスト形成方法を使用して実行することができる。一実施形態では、糸状菌宿主細胞のプロトプラスト形成は、本明細書で提供される方法を使用して実行される。一実施形態では、プロトプラストは、形質転換の前に糸状菌宿主細胞から生成される。
【００５９】
【図３】図３は、どのようにＳＮＰが、スプリットマーカーシステムを使用して糸状菌の特異的な遺伝子座に標的化されるかの表示である。マーカー遺伝子（この実施例ではｐｙｒＧ）は、遺伝子機能を回復させる相同組換えを有さない標的株における変異を補うことができない２つのコンポーネントに増幅される。これらに隣接する断片は、それぞれ遺伝子座に標的化されるＳＮＰを含有するＤＮＡのダイレクトリピートである。各コンストラクト上の非反復ＤＮＡ配列は、生来の相同組換え経路にわたり適した組込みを促進する。これらのコンストラクトは、図２０Ｂのステップ２の間に標的株に配置される。
【００６０】
【図４】図４は、マーカー遺伝子に隣接するダイレクトリピートは、不安定であり、ダイレクトリピート間の相同組換えによりマーカーの除去を引き起こすことを示す。本質的に、ループアウトは、形質転換ＤＮＡに組み入れられたダイレクトリピートによって促進される。選択マーカーについて対抗選択された細胞は、ダイレクトリピート領域が隣接するループＤＮＡの欠失を含有する。
【００６１】
【図５】図５は、本開示の糸状菌株改良プロセスの実施形態を示す。遺伝子改変を含有する宿主株配列（遺伝子設計）を、様々な株バックグラウンドにおいて、株性能の改善（株構築）に関して試験する。有益な変異を示す株を分析し（ヒットＩＤおよび分析）、データを、さらに分析するためにライブラリー（とりわけ、例えば、ＳＮＰスワップライブラリー、ＰＲＯスワップライブラリー、およびこれらの組合せ）に保存する。本開示の選択規則により、追加の反復分析のために１つまたは複数のライブラリーに由来するエレメントの組合せについて予測される効果に基づいて新たに提案される糸状菌宿主株配列が生成される。
【００６２】
【図６Ａ】図６Ａ〜６Ｂは、本開示の実施形態のうちの１つのＤＮＡアセンブリー、形質転換、および糸状菌株スクリーニングのステップを示す。図６Ａは、ＤＮＡ断片を構築するためのステップ、前記ＤＮＡ断片をクローニングするためのステップ、前記断片を宿主糸状菌株に形質転換するためのステップ、および選択配列を対抗選択によりループアウトするためのステップを示す。図６Ｂは、ハイスループット培養するためのステップ、スクリーニングするためのステップ、および選択された糸状菌宿主株を評価するステップを示す。この図はまた、培養タンク中の、選択された糸状菌株の培養、スクリーニングおよび評価を行う任意選択のステップも示す。
【図６Ｂ】図６Ａ〜６Ｂは、本開示の実施形態のうちの１つのＤＮＡアセンブリー、形質転換、および糸状菌株スクリーニングのステップを示す。図６Ａは、ＤＮＡ断片を構築するためのステップ、前記ＤＮＡ断片をクローニングするためのステップ、前記断片を宿主糸状菌株に形質転換するためのステップ、および選択配列を対抗選択によりループアウトするためのステップを示す。図６Ｂは、ハイスループット培養するためのステップ、スクリーニングするためのステップ、および選択された糸状菌宿主株を評価するステップを示す。この図はまた、培養タンク中の、選択された糸状菌株の培養、スクリーニングおよび評価を行う任意選択のステップも示す。
【００６３】
【図７】図７は、本開示の自動化システムの一実施形態を示す。本開示は、宿主糸状菌のクローニング、形質転換、培養、スクリーニングおよび／またはシーケンシングが可能な多様なモジュールを有する自動化されたロボットシステムの使用を教示する。
【００６４】
【図８】図８は、本開示の糸状菌株改良プログラムの実施形態の概要を示す。
【００６５】
【図９】図９は、本開示の方法に従う第１のラウンドのＳＮＰスワッピングの実験を示す。（１）ＣからのＳＮＰをすべて、基準株Ａ中に個々および／またはコンビナトリアルにクローニングする（ＡからＣへの「ウェーブアップ」）。（２）ＣからのＳＮＰをすべて、市販株Ｃから個々および／またはコンビナトリアルに除去する（ＣからＡへの「ウェーブダウン」）。（３）ＢからのＳＮＰをすべて、基準株Ａ中に個々および／またはコンビナトリアルにクローニングする（ＡからＢへのウェーブアップ）。（４）ＢからのＳＮＰをすべて、市販株Ｂから個々および／またはコンビナトリアルに除去する（ＢからＡへのウェーブダウン）。（５）ＣにユニークなＳＮＰをすべて、個々および／またはコンビナトリアルに市販株Ｂ中にクローニングする（ＢからＣへのウェーブアップ）。（６）ＣにユニークなＳＮＰをすべて、市販株Ｃから個々および／またはコンビナトリアルに除去する（ＣからＢへのウェーブダウン）。
【００６６】
【図１０】図１０は、プロモータースワッピングの様々な利用可能な手法を示す。特定には、アノテートされたプロモーターを有する遺伝子のプロモータースワップ設計が示される。
【００６７】
【図１１】図１１は、本開示の実施形態の１つのＤＮＡアセンブリーおよび形質転換のステップを示す。フローチャートは、ＤＮＡ断片を構築するためのステップ、前記ＤＮＡ断片をクローニングするためのステップ、前記ＤＮＡ断片を宿主糸状菌株に形質転換するステップ、および選択配列を対抗選択によりループアウトするためのステップを示す。
【００６８】
【図１２】図１２は、ハイスループット培養するためのステップ、スクリーニングするためのステップ、および選択された宿主糸状菌株を評価するステップを示す。この図はまた、培養タンク中の、選択された糸状菌株の培養、スクリーニングおよび評価を行う任意選択のステップも示す。
【００６９】
【図１３】図１３は、本開示のプロモーターラダーに従って一連の調節性の発現を示す、例示的なプロモーターの発現プロファイルを示す。プロモーターＡの発現は、選択された基質を添加すると、即時にピークに達するが、基質の濃度が低下するにつれて、検出不能なレベルに急速に戻る。プロモーターＢの発現は、選択された基質を添加すると、即時にピークに達し、基質の対応する低下と一緒に、ゆっくり低下して、検出不能なレベルに戻る。プロモーターＣの発現は、選択された基質を添加すると、ピークに達し、培養全体を通して、基質が消散してしまった後でさえ、高度な発現状態を維持する。
【００７０】
【図１４】図１４は、糸状菌株改良のための本開示のＬＩＭＳシステムの実施形態を図示する。
【００７１】
【図１５】図１５は、本開示のＬＩＭＳシステムの実施形態のクラウドコンピューティングのインプリメンテーションを図示する。
【００７２】
【図１６】図１６は、本開示の反復予測の株設計ワークフローの実施形態を示す。
【００７３】
【図１７】図１７は、本開示の実施形態に従うコンピューターシステムの実施形態を図示する。
【００７４】
【図１８】図１８は、本開示の一実施形態に従うＤＮＡアセンブリーに関連するワークフローを示す。このプロセスは、４つの段階：重要部分（part）の生成、プラスミド／コンストラクトアセンブリー、プラスミド／コンストラクトＱＣ、および形質転換のためのプラスミド／コンストラクトの調製に分けられる。重要部分の生成の間に、オリゴのシーケンシングのベンダーから、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＩＭＳ）により設計されたオリゴを発注し、宿主生物から標的配列をＰＣＲにより増幅するために使用する。これらのＰＣＲの重要部分は、清浄して、混入物を除去し、断片の分析により、すなわち、観察される断片サイズと理論的な断片サイズとのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでの品質管理比較、およびＤＮＡの定量を行って、成功について評価する。重要部分を、酵母中にアセンブリーベクターと一緒に形質転換し、プラスミド中に相同組換えによりアセンブルする。アセンブルされたプラスミドを、酵母から単離し、Ｅ．ｃｏｌｉ中に形質転換して、続いて、アセンブリーの品質管理および増幅を行う。プラスミドアセンブリーの品質管理の間に、各プラスミドのいくつかの複製物を単離し、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を使用して増幅し、正確なアセンブリーについて酵素消化および断片の分析により評価する。ＱＣプロセス中に同定した正確にアセンブルされたプラスミドをヒットピッキングし、恒久的なストックを生成し、次いでゲノム組込みを促進するのに必要な任意の隣接配列を含む特異的な遺伝子コンストラクトをプラスミドからＰＣＲ増幅して、線形ＤＮＡ断片を生成し、これを定量してから、標的宿主生物（例えば、糸状菌宿主細胞）に形質転換する。上述したようにプラスミドを生成する代わりに、融合ＰＣＲを、糸状菌宿主細胞においてゲノム組込みを促進するのに必要な任意の隣接配列を含む特異的な遺伝子コンストラクトを生成するのに使用することができる。
【００７５】
【図１９】図１９は、本開示の実施形態に従って、微生物株を設計するための変異の選択における上位性効果の考慮事項を示すフローチャートである。
【００７６】
【図２０Ａ】図２０Ａは、本明細書で提供され、実施例１に記載される同核共存体のプロトプラストの自動化された形質転換、スクリーニングおよび精製の一般的な概要を示す。図２０Ｂは、糸状菌におけるＳＮＰ／ＰＲＯ／ＳＴＯＰスワッピングプロセスのステップを示す。図２０Ｃは、本開示にわたり提供されるスワッピング方法のいずれかを使用して適した組込みのために形質転換体をスクリーニングするプロセスのステップを示す。
【図２０Ｂ】図２０Ａは、本明細書で提供され、実施例１に記載される同核共存体のプロトプラストの自動化された形質転換、スクリーニングおよび精製の一般的な概要を示す。図２０Ｂは、糸状菌におけるＳＮＰ／ＰＲＯ／ＳＴＯＰスワッピングプロセスのステップを示す。図２０Ｃは、本開示にわたり提供されるスワッピング方法のいずれかを使用して適した組込みのために形質転換体をスクリーニングするプロセスのステップを示す。
【図２０Ｃ】図２０Ａは、本明細書で提供され、実施例１に記載される同核共存体のプロトプラストの自動化された形質転換、スクリーニングおよび精製の一般的な概要を示す。図２０Ｂは、糸状菌におけるＳＮＰ／ＰＲＯ／ＳＴＯＰスワッピングプロセスのステップを示す。図２０Ｃは、本開示にわたり提供されるスワッピング方法のいずれかを使用して適した組込みのために形質転換体をスクリーニングするプロセスのステップを示す。
【００７７】
【図２１】図２１は、実施例２に記載されたように、自動化された形質転換およびスクリーニング後、アルギニン含有および非含有の最小培地でのＡ．ｎｉｇｅｒ変異体株の増殖を観察することによって、ａｒｇＢマーカーを利用してＡ．ｎｉｇｅｒ変異体株の共形質転換体をスクリーニングすることを示す。共形質転換の成功により、ａｒｇＢ遺伝子が破壊され、最小培地で増殖しなくなった。
【００７８】
【図２２】図２２は、異核共存体／同核共存体の特徴付けを示す。特定には、この図は、実施例３に記載されたように、自動化された形質転換およびスクリーニング後、最小培地でのＡ．ｎｉｇｅｒ変異体株の増殖を観察することによって、ａｙｇＡ発色性遺伝子マーカーを利用するＡ．ｎｉｇｅｒ変異体株をスクリーニングすることを示す。同核共存体のプロトプラストに由来するコロニーは純粋な黄色であり、黒色の胞子を欠いていた。
【００７９】
【図２３Ａ】図２３Ａ〜Ｂは、本開示の方法に従うＡ．ｎｉｇｅｒの形質転換およびバリデーションの結果を示す。図２３Ａは、Ａ．ｎｉｇｅｒの形質転換体の９６ウェル培地プレートの写真である。形質転換された培養物は、ａｙｇＡにおける変異を含み、このことにより、細胞が、黒色の代わりに、より薄い黄色に見えるようになる（形質転換されたウェルは、白色の円で囲まれている）。図２３Ｂは、形質転換されたＡ．ｎｉｇｅｒの変異体の次世代シーケンシングの結果を示す。Ｘ軸は、形質転換されていない親株との標的ＤＮＡの配列同一性を表す。Ｙ軸は、期待される変異との標的ＤＮＡの配列同一性を表す。チャートの右下辺りのデータ点は、親株との高い類似性、および期待される形質転換された配列との低い類似性を示す。チャートの左上辺りのデータ点は、期待される形質転換された配列に対する高い類似性、および親株との低い同一性を示す。中央にあるデータ点は、複数の核を有する異核共存体を表す可能性がある。
【図２３Ｂ】図２３Ａ〜Ｂは、本開示の方法に従うＡ．ｎｉｇｅｒの形質転換およびバリデーションの結果を示す。図２３Ａは、Ａ．ｎｉｇｅｒの形質転換体の９６ウェル培地プレートの写真である。形質転換された培養物は、ａｙｇＡにおける変異を含み、このことにより、細胞が、黒色の代わりに、より薄い黄色に見えるようになる（形質転換されたウェルは、白色の円で囲まれている）。図２３Ｂは、形質転換されたＡ．ｎｉｇｅｒの変異体の次世代シーケンシングの結果を示す。Ｘ軸は、形質転換されていない親株との標的ＤＮＡの配列同一性を表す。Ｙ軸は、期待される変異との標的ＤＮＡの配列同一性を表す。チャートの右下辺りのデータ点は、親株との高い類似性、および期待される形質転換された配列との低い類似性を示す。チャートの左上辺りのデータ点は、期待される形質転換された配列に対する高い類似性、および親株との低い同一性を示す。中央にあるデータ点は、複数の核を有する異核共存体を表す可能性がある。
【００８０】
【図２４】図２４は、Ａ．ＮｉｇｅｒにおけるＳＮＰスワップのインプリメンテーションを示す。図２４の左側は、ＳＮＰスワップの各ＳＮＰについての遺伝子編集の設計を示す。図２４はさらに、ｐｙｒＧ遺伝子を、ａｙｇＡ野生型遺伝子の遺伝子座中に導入する共形質転換も示す。図２４の右側は、Ａ．ｎｉｇｅｒの形質転換体をスクリーニングするための９６ウェル培地プレートの２つの写真を示す。薄黄色のコロニーは、ａｙｇＡ遺伝子の破壊が成功している形質転換体を表す。図２４内に表示された変異体株を構築するのに使用されたＡ．ｎｉｇｅｒ株は、ＮＨＥＪ経路活性が低減した株であった。
【００８１】
【図２５】図２５は、次世代シーケンシングの結果に基づく、成功したＡ．ｎｉｇｅｒ変異体形質転換体（上のボックス）を同定する品質管理（ＱＣ）チャートを示す。培養プレートから選択された黄色コロニーのうち、全部で２９．２％が、期待されるＳＮＰの遺伝子変化を示す。
【００８２】
【図２６】図２６は、形質転換されたＡ．ｎｉｇｅｒの変異体の次世代シーケンシングの結果を示す。Ｘ軸は、形質転換されていない親株との標的ＤＮＡの配列同一性を表す。Ｙ軸は、期待される変異との標的ＤＮＡの配列同一性を表す。チャートの右下辺りのデータ点は、親株との高い類似性、および期待される形質転換された配列との低い類似性を示す。チャートの左上辺りのデータ点は、期待される形質転換された配列に対する高い類似性、および親株との低い同一性を示す。中央にあるデータ点は、複数の核を有する異核共存体を表す可能性がある。
【００８３】
【図２７】図２７は、５００ｍｌ培養物の複数のバッチを、５００ｍｌのプロトプラスト形成緩衝液中のプロトプラスト形成に供し、続いて生成したプロトプラストを−８０Ｃで貯蔵する大規模なプロトプラスト形成方法を示す。これは、５０〜１００ｍｌのプロトプラスト形成緩衝液中の１００ｍｌの培養物を使用することと比較してスケールアップした方法である。
【００８４】
【図２８】図２８は、多核体生物体（例えば、糸状菌）の株を構築するためのハイスループット（ＨＴＰ）システムのワークフローのプロトプラスト形成部分を示す。
【００８５】
【図２９】図２９は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ（Ａ．ｎｉｇｅｒ）の２つの株（１０１５；１１４１４）に対する化学的阻害剤であるＷ７の最低阻害濃度（ＭＩＣ）を示す。
【００８６】
【図３０】図３０は、ゲノムＤＮＡを急速に単離し、特定のアンプリコンを、遺伝子変更後に単離した生物体を含有するその由来となるウェルと関連付ける同定配列を含有するアンプリコンを調製するステップを示す。本方法は、９６種の形質転換体／形質転換の単離およびスクリーニングを可能にする。形質転換体をＯｍｎｉｔｒａｙに蒔き、胞子形成させ、滅菌した９６個のピンレプリケーターを使用して急速に単離した。
【００８７】
【図３１】図３１は、形質転換体の精選、ならびにそれらの後続の９６ウェルマイクロタイターシードプレートへの移動およびそれにおける胞子形成を示す。コロニーは、爪楊枝（Ｋ−ピック）で精選される。シードプレートは４００μｌの寒天培地を含有する。シードプレートから作製した胞子懸濁液を使用して胞子プレートを作製し、胞子プレートからスタンピング／スクリーニングを行う。
【００８８】
【図３２】図３２は、本明細書で提供される沸騰調製方法を使用して真菌形質転換体からＤＮＡ抽出をした後の核酸断片の増幅後の断片分析器の試行を示す。真菌中の複数の試料からゲノム鋳型を調製することは、細胞壁のために破砕が必要な場合が多いことから困難な場合があり、胞子からＤＮＡを得ることは難しい可能性があり、胞子のＰＣＲはほとんどの真菌でうまく作動しない。示した通り、ＮＧＳのための短い長さのＰＣＲはうまく実行された。沸騰調製方法から、有効なゲノムＤＮＡ精製方法としてＰｒｅｐＭａｎを使用し、自動化できることが示された。
【００８９】
【図３３】図３３は、異なる比率での異なる遺伝的バックグラウンド（すなわち、変異体（ｍ）対親（ｐ））の胞子の混合物を含有する株における発色の差を示す。示した通り、試験した選択スキームにおいて、親の胞子を有さない株（０：１のｐ／ｍ比率）のみが黄色に見える。形質転換体が異核共存体であるかどうかを決定するには、２つの方法、すなわち１．）表現型および２．）シーケンシングがある。この図において、形質転換体を、黄色の表現型およびＮＧＳによってスコア付けした。これらの２つの方法の感受性試験は、形質転換体のスコア付けをワークフローに適合させるために重要である。核酸の１０分の１が黒色である場合、コロニーは黒色に見える場合があり、よって対抗選択の前および後にＮＧＳを使用することができる。
【００９０】
【図３４】図３４は、図３３に示される混合された胞子プレートおよび図３５の上部のプレートからのアンプリコン配列のプロットを示す。Ｙ軸は、標的変異を含有していたアンプリコンのパーセンテージであり、Ｘ軸は、それでもなお親を含有するパーセンテージである。大きいプロットは、プレート全体からのデータを含有し、プレート内の混合された胞子の全範囲を実証する。右のグラフは、プレートからの個々の列のグラフのものである。これらの列のグラフは、核の定義された混合物が試験される場合にＮＧＳで観察されるアンプリコン分布の範囲を定義する。次いでこの分析を使用して、ＳＮＰＳＷＰ株構築からのデータセット内のＳＮＰの分布を予測することができる。この予測は、株構築プロセスにおけるＱＣステップに使用することができる。
【００９１】
【図３５】図３５は、ｐｙｒＧ−バックグラウンド（黒色）またはｍｅｔ３−バックグラウンド（明るい色）のいずれかを有する株を生じる異なる遺伝的バックグラウンドを有する糸状菌からの胞子の混合物中のＳＮＰＳを検出するＮＧＳの能力の試験を示す。ｍｅｔ３−株はメチオニンを含む増殖培地を必要とし、セレナイトに対して耐性である。上部に胞子を含有するプレートは、混合の培養物中で表現型がマスクされる可能性があり、視覚的にスコア付けすることが難しい場合があることを実証する。それより１０倍多くの変異（黄色の）核を含有する列は、それでもなお黒色に見える。ＮＧＳは、視覚的な表現型を検出できない場合に変異を検出することができる。パイ図表は、どのように集団が異なる増殖条件下でシフトできるのかの例である。特定には、ＮＧＳは、選択培地が、核の混合された集団を同核共存体にできることを示した。これは、株の精製に利用できるが、株構築プロセス中の成長および増殖を個々のＳＮＰレベルでモニターする必要があることも実証する。
【００９２】
【図３６】図３６は、ＳＮＰ組込みを実行するための３つの手法（ＳＮＰリピートを有するスプリットマーカー；スプリットマーカーターミネーターリピート；ループインのシングルクロスオーバー）を示す。ＳＮＰリピートを有するスプリットマーカーは、本開示に記載されたように挿入断片がゼロの状態を生成するのに使用することができる。スプリットマーカーターミネーターリピートは、一次組込み体からの所望の表現型を促進する可能性があるという利点を有する。対照的に、ループインのシングルクロスオーバーは、プラスミドのクローニングと調製を必要とし、異所性の組込みが高くなる可能性があり、コンカテマーが生じる可能性がある。
【００９３】
【図３７】図３７は、糸状菌などの多核体生物体においてコンビナトリアルＳＮＰＳＷＰを実行するための２つの部分からなるマーカーの形質転換を利用する実施形態を示す。この図は、様々な誘導性プロモーターを、グルコースによって抑制された異化産物であり得る散在するｐｙｒＧ遺伝子およびプロモーターと組み合わせることができる真菌におけるコンビナトリアルＳＮＰＳＷＰのためのツールを示し、形質転換体は、弱く発現された遺伝子の複数の組込みが優先されるようにグルコースで選択することができ、形質転換体は、ＦＯＡを含む誘導培地上に蒔いてループアウトさせることができる。
【００９４】
【図３８】図３８は、複数の組込み、異所性の組込み、または同じ核におけるＳＮＰおよび非ＳＮＰの存在を検出するためのＮＧＳシーケンシングの使用を示す。
【００９５】
【図３９】図３９は、遺伝子欠失を生成することによるＳＮＰＳＷＰの実行を示す。
【００９６】
【図４０】図４０は、４つの異なる株を生成するために標的遺伝子の前に配置される４つの異なるプロモーターを示す。これらの株を、所望の形質について試験で比較して、理想的なレベルの発現を決定することができる。
【００９７】
【図４１】図４１は、本開示に記載される方法を使用することによってＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍでなされた検討中のインプットデータについての相対的な株性能の分布の例を示す。ゼロの相対的な性能は、操作された株がプレート中の基準株に等しく良好に機能したことを示す。本明細書に記載するプロセスは、ゼロを有意に上回って機能する可能性がある株を同定するように設計される。
【００９８】
【図４２】図４２は、アンプリコンの制限分析によって実証される２つのＢＰ変化を組み込むためのＳＮＰＳＷＰの使用を示す。この図に表示された結果は、ｋｕｓＡ＋株でＳＮＰＳＷＰを実行した実験に関するものである。ここで、ＥｃｏＲＶ部位をＢａｍＨＩ制限部位に変化させる２ｂｐのＳＮＰを付加するために、ＥｃｏＲＶ制限部位をＳＮＰＳＷＰによって標的化した。比色選択（すなわち、黄色のコロニーの精選）を可能にするために、ｐｙｒＧ遺伝子をａｙｇＡ遺伝子座に標的化し、増幅を行い、続いて制限消化して、ＳＮＰの組込みについてスクリーニングした。精選された３６個の黄色の形質転換体のなかでも、３６個中２４個がアンプリコン中にＢａｍＨＩ部位を含有していた。よって、ＳＮＰＳＷＰ共形質転換は、ｋｕｓＡなしでも機能する。
【００９９】
【図４３】図４３は、どのように株およびその改善された後代がクエン酸産生培地に対するこれらの応答の点で異なるかを示す。
【０１００】
【図４４】図４４は、定義された遺伝子機能から独立してゲノムを系統的および包括的に探索するための実験的な設計ストラテジーを示す。この図には、ゲノムにおいて４３個のＳＮＰが異なっている２つの株が表示される。本開示にわたり提供されるＳＮＰＳＷＰ方法を使用して、これらのＳＮＰのそれぞれの単独または組合せの役割は、自動化を用いて検査することができる。
【０１０１】
【図４５】図４５は、本発明で使用するためのスプリットマーカーコンストラクトを生成する融合ＰＣＲの使用を示す。
【０１０２】
【図４６−１】図４６は、図４５に表示したようにして生成したスプリットマーカーコンストラクトの品質管理分析を示す。
【図４６−２】図４６は、図４５に表示したようにして生成したスプリットマーカーコンストラクトの品質管理分析を示す。
【０１０３】
【図４７】図４７は、ｃｒＲＮＡをｔｒａｃｒＲＮＡにアニールし、Ｃａｓ９タンパク質に複合体化することによって、ｃｒＲＮＡ依存性ＤＮＡ切断が可能なＲＮＰを創製することを示す。
【０１０４】
【図４８】図４８は、ＲＮＰをＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒプロトプラストに形質転換するための方法を示す。１００ｕＬまたは１０６個のプロトプラスト（ＰｙｒＧ−）を、１０ｕｌのＳＴＣ緩衝液中でＲＮＰおよびＰｙｒＧマーカーを含有するプラスミドで形質転換する。これらを混合し、氷上で１５分インキュベートする。次いで細胞をＳＴＣ中の４０％ＰＥＧと混合し、室温で１５分置く。形質転換体を、＋０．８％アガロースを含む浸透圧を安定化した最小培地中で混合し、追加の寒天で覆う。次いでコロニーを数え、ＲＮＰ媒介ゲノム編集によって引き起こされる表現型の変化に関してスコア付けする（示されていない）。
【０１０５】
【図４９−１】図４９Ａ〜４９Ｆは、ＡｙｇＡ遺伝子座におけるＣａｓ９のＲＮＰ切断の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復を示す。ＡｙｇＡ遺伝子は、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびＣａｓ９に複合体化した１または２つのｃｒＲＮＡ配列によって標的化される（図４９Ａ）。インデルは、（図４９Ｂ）黒色から（図４９Ｃ）黄色への分生子の色の変化を引き起こし、成功したＲＮＰ形質転換についての表現型のスクリーニングを可能にする。ｔｒａｃｒＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質に複合体化した単一のｃｒＲＮＡで形質転換されたプロトプラストから単離した増幅したゲノムＤＮＡからのトレースファイルの例は、標的部位の近位にインデルが形成されたことを実証する（図４９Ｄ）。７７１ｂｐ離れた２つの部位を標的化するＲＮＰとの形質転換体から単離した増幅されたゲノムＤＮＡのトレースファイルは、両方のＲＮＰが、単一のプロトプラストに共形質転換でき、２つの標的部位間の大きい内部欠失を媒介することを示唆する（図４９Ｅ）。形質転換実験のコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数、および１、２つのまたは対照のｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ配列で形質転換された場合におけるインデルを含有するコロニーの推定されたパーセント（図４９Ｆ）。ＣＦＵは、全形質転換物を１０倍希釈した後に計数される。
【図４９−２】図４９Ａ〜４９Ｆは、ＡｙｇＡ遺伝子座におけるＣａｓ９のＲＮＰ切断の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復を示す。ＡｙｇＡ遺伝子は、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびＣａｓ９に複合体化した１または２つのｃｒＲＮＡ配列によって標的化される（図４９Ａ）。インデルは、（図４９Ｂ）黒色から（図４９Ｃ）黄色への分生子の色の変化を引き起こし、成功したＲＮＰ形質転換についての表現型のスクリーニングを可能にする。ｔｒａｃｒＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質に複合体化した単一のｃｒＲＮＡで形質転換されたプロトプラストから単離した増幅したゲノムＤＮＡからのトレースファイルの例は、標的部位の近位にインデルが形成されたことを実証する（図４９Ｄ）。７７１ｂｐ離れた２つの部位を標的化するＲＮＰとの形質転換体から単離した増幅されたゲノムＤＮＡのトレースファイルは、両方のＲＮＰが、単一のプロトプラストに共形質転換でき、２つの標的部位間の大きい内部欠失を媒介することを示唆する（図４９Ｅ）。形質転換実験のコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数、および１、２つのまたは対照のｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ配列で形質転換された場合におけるインデルを含有するコロニーの推定されたパーセント（図４９Ｆ）。ＣＦＵは、全形質転換物を１０倍希釈した後に計数される。
【０１０６】
【図５０】図５０Ａ〜５０Ｃは、線形ドナーおよびゲノムを標的化するＲＮＰによって媒介されるＨＲの効率の測定を示す。プロトプラストは、ＡｙｇＡ遺伝子を標的化する１つ（Ａｙｇ．１）または２つ（Ａｙｇ．１＋Ａｙｇ．３）のｃｒ／ｔｒａｃｒＲＮＡ、ならびにｐｙｒＧを含有する線形ドナーおよびプラスミドに複合体化した共形質転換Ｃａｓ９である。ドナーは、Ａｙｇ．１切断部位の周辺に相同性を有する４８７または４３８ｂｐに隣接する。ドナーは、プロモーターおよびターミネーターを有するｐｙｒＧ遺伝子（図５０Ａ）または４ｂｐの挿入（図５０Ｂ）を含有する。単一の出芽した胞子からＡｙｇＡ遺伝子座をＰＣＲ増幅した（図５０Ｃ）。結果から、ＲＮＰ、プラスミドおよびドナーを共形質転換することは、標的化したｃｒＲＮＡの存在下ではｐｙｒＧ遺伝子の挿入を媒介するが、対照ｃｒＲＮＡの存在下では媒介しないことが実証される。またこの実験から、ドナーとのＲＮＰ共形質転換（図５０Ｂ）は、８６％のＨＲ編集率を可能にすることも示される。
【０１０７】
【図５１】図５１は、ＤＪＶ＿０３＿ｐｙｒＧ＿ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ＿ｉｎ＿ＡｙｇＡが、ＡｙｇＡ遺伝子に相同性を有する５’および３’領域（大文字）が隣接するプロモーターおよびターミネーター（小文字）を有するｐｙｒＧを示すことを例示する。この図は、配列番号９に対応する。
【０１０８】
【図５２】図５２は、ＤＪＶ＿０７＿４ｂｐ＿ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ＿ｉｎ＿ＡｙｇＡが、ＡｙｇＡ遺伝子に相同性を有する５’および３’領域（大文字）が隣接する４ｂｐの挿入（小文字）を含有することを示す。この図は、配列番号１０に対応する。
【０１０９】
【図５３】図５３は、ゲノム中の配列を導入または変化させるための伝統的なストラテジーを示す。スプリット遺伝子マーカー（左）または組込みコンストラクト（右）は、それぞれ３つまたは１つのクロスオーバー事象により新しい遺伝物質を組み入れるのに使用することができる。マーカーおよび変異周辺の相同性を有する領域は、所望の遺伝子座への組込みを標的化する。その後、マーカーは、ループイン事象について選択するのに使用でき、次いで対抗選択可能なマーカーは、ループアウト事象について選択するのに使用できる。組込み体をループアウトして、（１）に示される野生型配列または（３）に示される新しい変異を産生することができる。
【０１１０】
【図５４】図５４Ａ〜５４Ｂは、伝統的な方法および新しい方法を利用するＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒを改変するためのワークフローを示す。伝統的なワークフローは、２０日を要し、クローン集団は明示的に達成されない（図５４Ａ）。最小培地での増殖は、親株の増殖を阻害するが、同じ細胞中に形質転換された核と形質転換されていない核の両方を含有する異核共存体の増殖は阻害しない。新しいプロトコールは、ステップ２で親の死と純粋なクローン集団をもたらし、１２日しか要しない（図５４Ｂ）。
【０１１１】
【図５５Ａ】図５５Ａ、図５５Ｂ、および図５５Ｃは、ＣｅｌｌｅｎＯＮＥ（Ｃｅｌｌｅｎｉｏｎ、Ｌｙｏｎ、ＦＲ）によって分散された１つの高い忠実度を有する印刷の単一胞子を示す。黄色および黒色の胞子を１：１で、水中で２×１０６個の最終濃度で混合し、ＣｅｌｌｅｎＯＮＥ（Ｃｅｌｌｅｎｉｏｎ、Ｌｙｏｎ、ＦＲ）によって寒天を含有する３個の９６ウェルおよび１個の３８４ウェルのマイクロタイタープレートに分散した。４日後、ウェルを目視で数えた（図５５Ａ）。黒色および黄色胞子で印刷された９６ウェルプレートの画像（図５５Ｂ）。出芽している胞子を含有していなかったウェルのパーセンテージ。これは、印刷ミス（何も分散されていないこと）または生存不可能な胞子の印刷に起因していた可能性がある（図５５Ｃ）。黒色の胞子と黄色の胞子の両方を示すウェルのパーセンテージは、同じ液体粒子に２つの胞子が印刷されたことを示す。
【図５５Ｂ】図５５Ａ、図５５Ｂ、および図５５Ｃは、ＣｅｌｌｅｎＯＮＥ（Ｃｅｌｌｅｎｉｏｎ、Ｌｙｏｎ、ＦＲ）によって分散された１つの高い忠実度を有する印刷の単一胞子を示す。黄色および黒色の胞子を１：１で、水中で２×１０６個の最終濃度で混合し、ＣｅｌｌｅｎＯＮＥ（Ｃｅｌｌｅｎｉｏｎ、Ｌｙｏｎ、ＦＲ）によって寒天を含有する３個の９６ウェルおよび１個の３８４ウェルのマイクロタイタープレートに分散した。４日後、ウェルを目視で数えた（図５５Ａ）。黒色および黄色胞子で印刷された９６ウェルプレートの画像（図５５Ｂ）。出芽している胞子を含有していなかったウェルのパーセンテージ。これは、印刷ミス（何も分散されていないこと）または生存不可能な胞子の印刷に起因していた可能性がある（図５５Ｃ）。黒色の胞子と黄色の胞子の両方を示すウェルのパーセンテージは、同じ液体粒子に２つの胞子が印刷されたことを示す。
【図５５Ｃ】図５５Ａ、図５５Ｂ、および図５５Ｃは、ＣｅｌｌｅｎＯＮＥ（Ｃｅｌｌｅｎｉｏｎ、Ｌｙｏｎ、ＦＲ）によって分散された１つの高い忠実度を有する印刷の単一胞子を示す。黄色および黒色の胞子を１：１で、水中で２×１０６個の最終濃度で混合し、ＣｅｌｌｅｎＯＮＥ（Ｃｅｌｌｅｎｉｏｎ、Ｌｙｏｎ、ＦＲ）によって寒天を含有する３個の９６ウェルおよび１個の３８４ウェルのマイクロタイタープレートに分散した。４日後、ウェルを目視で数えた（図５５Ａ）。黒色および黄色胞子で印刷された９６ウェルプレートの画像（図５５Ｂ）。出芽している胞子を含有していなかったウェルのパーセンテージ。これは、印刷ミス（何も分散されていないこと）または生存不可能な胞子の印刷に起因していた可能性がある（図５５Ｃ）。黒色の胞子と黄色の胞子の両方を示すウェルのパーセンテージは、同じ液体粒子に２つの胞子が印刷されたことを示す。
【０１１２】
【図５６】図５６Ａ〜Ｂは、２つのアニールしたオリゴが、ＰＡＭまたはプロトスペーサー部位のシード領域を変更することなくＳＮＰを創製できることを示す。二本鎖ドナーを、実施例１１に記載されたようにＲＮＰおよびプラスミドで共形質転換した。図５６Ａは、ドナーが、ＡｙｇＡ遺伝子に対して５０ｂｐの相同性で５’および３’側に隣接したナンセンス変異（小文字で示される）を含有することを示す。図５６Ｂは、サンガー技術でシーケンシングされた単離されたコロニーの２つのトレースファイルを示す。第１のものは、野生型配列にアライメントし、第２のトレースファイルは、意図した変異（アスタリスクで示される）を含有する。
【０１１３】
【図５７】図５７は、形態遺伝子（すなわち、ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８；配列番号１３）のプロモータースワッピングを示す。この遺伝子の発現を制御する異なるプロモーターは、形態に影響を与える。ｍａｎＢ融合およびａｍｙＢ融合を含有する株は、１１４１４親株に対して複数の先端を保持するが、より高い発現のｓｒｐＢおよびｍｂｆＡを有するものは、複数の先端の表現型を欠く。この株を、クエン酸産生培地（１４％ｗ／ｖグルコース、ｐＨ２、Ｍｎ＋＋枯渇）中で、３０℃で４８時間増殖させた。１６８時間でそのままインキュベートしたところ、より多くの発現プロモーターを有する株に加えて親対照のすべてが、長い線維状の菌糸を含有していた。プロモーター融合体、ａｍｙＢおよびｍａｎＢからの発現がより低いレベルの株は、ペレット化したままであった。
【０１１４】
【図５８】図５８は、基準の１０１５株および１１４１４産生株における形態遺伝子標的１８のプロモータースワッピングを示す。ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８に関連した遺伝子産物は、浸透圧ストレスに応答するシグナル伝達キナーゼ（すなわち、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログ）である。この図は、生来のプロモーターをより弱いプロモーターで置き換えることによって、前記遺伝子の遺伝子発現が低減する場合、細胞は、より密な、それほど細長くない表現型を維持することを示しており、このような表現型は、本明細書では「ペレット状の」表現型と称される（基準の１０１５株および１１４１４産生株においてｍａｎＢ（ｐ）ｓｎｐ１８遺伝子を発現する細胞に関する右側のパネルを参照）。この株を、クエン酸産生培地（１４％ｗ／ｖグルコース、ｐＨ２、Ｍｎ＋＋枯渇）中で、３０℃で２４時間増殖させた。このタイプの増殖は、撹拌タンク発酵にとって好都合であり得る。
【０１１５】
【図５９】図５９は、ｍａｎＢ（ｐ）プロモーター（配列番号１）の制御下にＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８遺伝子（配列番号１３）を導入することによって基準株（すなわち、Ａ．ｎｉｇｅｒ１０１５）におけるＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８遺伝子産物レベルを低減させたことにより、基準株の遺伝的バックグラウンドでの胞子形成が不可能になることを示す。同じコンストラクトを産生株（すなわち、Ａ．ｎｉｇｅｒ１１４１４）に導入した場合、この表現型は観察されなかった。
【０１１６】
【図６０】図６０は、本開示の方法に従うＡ．ｎｉｇｅｒスプリットマーカー設計形質転換およびバリデーションの結果を示す。データを、形質転換された（スプリットマーカーにより）Ａ．ｎｉｇｅｒ変異体のＮＧＳを使用して作成した。これは、標的における変異へのマッチと、それに対する標的における親へのマッチの分布である。このグラフの左上隅におけるすべての試料は正確であり、ＱＣをパスした。丸の中の試料は、遺伝子座において変異体と親の両方を含有し、ＱＣをパスできる単離物を生成するために、図２０Ｂのステップ４および５により再度処理してもよい。
【０１１７】
【図６１】図６１は、ＳＮＰＳＷＰキャンペーンからのＮＧＳデータのグラフ表示である。この実施例において、３１個の遺伝子座を、図４５に提示した通りに設計されたコンストラクトを使用して標的化した。ここで１２６４個の全単離物を、すべての個々の試料からの各アンプリコン集団をシーケンシングすることによってスクリーニングした。このデータセットは、１００万回を超えるシーケンシングしたアンプリコンを含有していた。１１９個の試料がすべてのＱＣ必要条件をパスした。品質管理は、遺伝子座における親の変異の存在をチェックすることを含み、ウェルからのアンプリコンのすべてが、アンプリコン全体にわたり標的ＤＮＡとマッチしていなければならない。＋記号を有する試料は正確であり、ドット記号を有する試料は、親と変異の両方を含有する可能性がある。
【０１１８】
【図６２】図６２は、基準のＳＮＰ１８を含有する株が低いｐＨの培地でより速く増殖することを示す。
【０１１９】
【図６３】図６３は、基準のＳＮＰ１８を含有する株が、浸透圧ストレスをもたらす培地でより速く増殖することを示す。
【０１２０】
【図６４】図６４は、基準株と産生株との間でＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８を交換することが、胞子形成および放射状の増殖速度に影響を有することを示す。
【０１２１】
【図６５】図６５は、産生株におけるＳＮＰ（すなわち、表４からのＦｕｎｇｉＳＮＰ）を含有するすべてのコード配列の基準株における欠失を示す。
【０１２２】
【図６６】図６６は、ＦｕｎｇｉＳＮＰ１８を含有する遺伝子が、産生株では胞子形成にとってなくてもよいが、基準株ではそうではないことを示す。
【０１２３】
【図６７】図６７は、２つの部分からなるコンストラクトの設計および実施例３に記載されるＰＲＯＳＷＰ実験を行うために使用された一般的なスキームを示す。
【０１２４】
【図６８】図６８は、実施例３で使用されたより弱いプロモーターが形態に影響を与えることを示す。弱いｍａｎＢプロモーター下にＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８（ＳＮＰ１８）を含有する株は、他のプロモーターの組合せを含有する株より密なコロニー形態を有する。ＳＮＰ１８対照の影響は、より低いｐＨ下に比べて、浸透圧ストレス下で顕著である。
【０１２５】
【図６９】図６９は、ｓｎｐ＿１２に作動可能に連結したより低い強度のプロモーターを有するＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１２（ｓｎｐ＿１２）のＰＲＯＳＷＰを示し、それによれば、菌糸において黄色色素が生じ、形態が多少変化した（コロニーの縁で観察された）。この黄色色素は、様々な変異体で共通しており、代謝ストレスのサインと考えられる。
【０１２６】
【図７０】図７０は、より弱いプロモーターによって駆動する場合、ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８（ｓｎｐ＿１８）が、基準株において、産生株の場合より簡素な形態学的な表現型を有することを示す。
【発明を実施するための形態】
【０１２７】
本発明の開示は、自動化されたハイスループットプラットフォームで糸状菌を遺伝的にマニピュレートすることに固有の課題の多くを克服する。本明細書で提供される方法は、形質転換体の自動化されたスクリーニングと組み合わされた自動化された共形質転換を使用して遺伝子変化を組み入れることによって、真菌産生株を生成するように設計されており、それによって、性的な交差を経ることなく２つの株間で遺伝的形質の交換が可能になる。本開示はまた、膨大な数のプロトプラストを生成するための手順、および後の使用のためにそれを貯蔵する手段も含む。容易に利用可能なコンピテント細胞の大きいバッチは、自動化を大いに促進することができる。
定義
【０１２８】
以下の用語は、当業者であればよく理解していると考えられるが、以下の定義を、本開示の主題の説明を容易にするために示す。
【０１２９】
用語「ａ」または「ａｎ」は、そのエンティティの１つまたは複数を指し、すなわち、複数形の指示対象を指すことができる。したがって、用語「ａ」または「ａｎ」、「１つまたは複数」および「少なくとも１つ」は、本明細書で互換的に使用される。さらに、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」による「要素」への言及は、文脈により唯一の要素が存在することが明確に要求されない限り、１つを超える要素が存在する可能性を除外しない。
【０１３０】
用語「細胞生物」、「微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）」または「微生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）」は、本明細書で使用される場合、広く解釈されるべきである。これらの用語は、互換的に使用され、これらに限定されないが、２つの原核生物ドメイン、細菌および古細菌、ならびにある特定の真核真菌（例えば、本明細書に記載される糸状菌）および原生生物を含む。一部の実施形態では、本開示は、本開示内に存在するリスト／表および図面の「微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）」または「細胞生物」または「微生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）」に言及する。この特徴付けは、表および図面の同定された分類学的な属だけでなく、同定された分類学的な種、ならびに前記表または図面内の任意の生物体の様々な新規のおよび新しく同定または設計された株も参照することができる。同じ特徴付けが、実施例などの明細書の他の部分におけるこれらの用語の記述にも当てはまる。
【０１３１】
用語「多核体」または「多核体生物体」は、本明細書で使用される場合、多核細胞または多核細胞を含む生物体を指すことができる。多核細胞は、複数の核分裂と、それに付随してこれらの細胞質分裂が起こらないことによって生じることがあり、細胞の凝集とそれに続く塊内部での細胞の膜の溶解によって生じる融合細胞とは対照的である。多核体生物体の例は、本明細書で提供される方法、組成物およびシステムに関連するものとして、原生生物（例えば、藻類、原生動物、変形菌類（粘菌）、アルベオラータ、植物、真菌（例えば、糸状菌）、および／または後生動物（例えば、Ｄｒｏｓｐｈｉｌａ  ｓｐｐ）を挙げることができる。
【０１３２】
用語「原核生物」は、当技術分野で認識されており、核または他の細胞小器官を含有しない細胞を指す。原核生物は一般に、２つのドメイン、細菌および古細菌の１つに分類される。古細菌と細菌ドメインの生物体間の決定的な差異は、１６ＳリボソームＲＮＡ内のヌクレオチド塩基配列の基本的な差異に基づく。
【０１３３】
用語「古細菌」は、Ｍｅｎｄｏｓｉｃｕｔｅｓ門の生物体のカテゴリー分類を指し、典型的には、珍しい環境内で見つかり、リボソームタンパク質の数および細胞壁におけるムラミン酸の欠如を含めたいくつかの判定基準によって原核生物の残りと区別される。ｓｓｒＲＮＡ分析に基づいて、古細菌は、２つの系統学的に別個の群：ＣｒｅｎａｒｃｈａｅｏｔａおよびＥｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａからなる。これらの生理機能に基づいて、古細菌は、３つのタイプ：メタン生成菌（メタンを産生する原核生物）；高度好塩菌（非常に高濃度の塩（ＮａＣｌ）で生きる原核生物）；および高度（超）好熱菌（thermophilus）（非常に高温で生きる原核生物）へと整理することができる。古細菌を細菌と区別する統一的古細菌フィーチャ（すなわち、細胞壁内にムレインが無いこと、エステル連結膜脂質など）に加えて、これらの原核生物は、これらをその特定の生息環境に適応させるユニークな構造的または生化学的属性を呈する。Ｃｒｅｎａｒｃｈａｅｏｔａは、超好熱性硫黄依存性原核生物から主になり、Ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａは、メタン生成菌および高度好塩菌を含有する。
【０１３４】
「細菌」または「真正細菌」は、原核生物体のドメインを指す。細菌は、以下の少なくとも１１の別個の群を含む：（１）２つの主要な亜門：（１）高Ｇ＋Ｃ群（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、その他）（２）低Ｇ＋Ｃ群（Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｓ）が存在するグラム陽性（グラム＋）細菌；（２）Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、例えば、紅色光合成＋非光合成グラム陰性細菌（最も「一般的な」グラム陰性細菌を含む）；（３）ラン藻類、例えば、酸素発生型光合成生物；（４）スピロヘータおよび関連種；（５）Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｓ；（６）Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａ；（７）Ｃｈｌａｍｙｄｉａ；（８）緑色硫黄細菌；（９）緑色非硫黄細菌（嫌気性光合成生物も）；（１０）放射線抵抗性ミクロコッカスおよび類縁体；（１１）ＴｈｅｒｍｏｔｏｇａおよびＴｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ。
【０１３５】
「真核生物」は、細胞が、膜内に囲まれた核および他の小器官を含有する任意の生物体である。真核生物は、分類群ＥｕｋａｒｙａまたはＥｕｋａｒｙｏｔａに属する。真核細胞を原核細胞（上述の細菌および古細菌）から分離する決定的なフィーチャは、これらが膜結合型小器官、特に、遺伝物質を含有し、核包膜によって囲まれている核を有することである。
【０１３６】
用語「遺伝的に改変された宿主細胞」、「組換え宿主細胞」、および「組換え株」は、本明細書で互換的に使用され、本開示のクローニングおよび形質転換方法によって遺伝的に改変された宿主細胞を指す。よって、この用語は、宿主細胞（例えば、細菌、酵母細胞、真菌細胞、ＣＨＯ、ヒト細胞など）であって、それが由来した天然に存在する生物体と比較して、それが変更された、改変された、または異なる遺伝子型および／または表現型（例えば、遺伝子改変が微生物のコーディング核酸配列に影響するとき）を呈するように遺伝的に変更、改変、または操作された、宿主細胞を含む。一部の実施形態では、この用語は、問題の特定の組換え宿主細胞だけでなく、このような宿主細胞の子孫または潜在的な子孫も指すことが理解される。
【０１３７】
用語「野生型微生物」または「野生型宿主細胞」は、天然に存在する細胞、すなわち、遺伝的に改変されていない細胞を記述する。
【０１３８】
用語「親株」または「親の株」または「親」は、変異体株の由来となる宿主細胞を指すことができる。よって、「親株」または「親の株」は、そのゲノムが当技術分野で公知のおよび／または本明細書で提供される任意の様式によって撹乱されて、１つまたは複数の変異体株を生成する宿主細胞または細胞である。「親株」または「親の株」は、野生型株のゲノムと同一なゲノムを有していてもよいし、または有していなくてもよい。
【０１３９】
用語「遺伝子操作された」は、宿主細胞のゲノムの任意のマニピュレーション（例えば、核酸の挿入、欠失、変異、または置き換えによる）を指すことができる。
【０１４０】
用語「対照」または「対照宿主細胞」は、遺伝子改変または実験処置の効果を決定するための適切な比較宿主細胞（comparator  host  cell）を指す。一部の実施形態では、対照宿主細胞は、野生型細胞である。他の実施形態では、対照宿主細胞は、処置宿主細胞を差別化する遺伝子改変（複数可）を除いて、遺伝的に改変された宿主細胞と遺伝的に同一である。一部の実施形態では、本開示は、対照宿主細胞としての親株（例えば、株改良プログラムの基礎として使用されたＳ１株）の使用を教示する。他の実施形態では、宿主細胞は、処置宿主細胞において試験されている特異的プロモーターまたはＳＮＰを欠く遺伝的に同一の細胞であり得る。
【０１４１】
本明細書で使用される場合、用語「対立遺伝子」は、遺伝子の１つまたは複数の代替形態のいずれかを意味し、これらの対立遺伝子のすべては、少なくとも１つの形質または特性に関する。二倍体細胞では、所与の遺伝子の２つの対立遺伝子は、一対の相同染色体上の対応する遺伝子座を占有する。本開示は、諸実施形態では、ＱＴＬ、すなわち１つまたは複数の遺伝子または調節配列を含む可能性があるゲノム領域に関することから、一部の場合では、「対立遺伝子」の代わりに「ハプロタイプ」（すなわち染色体セグメントの対立遺伝子）を指すことがより正確であるが、そのような例では、用語「対立遺伝子」は、用語「ハプロタイプ」を含むと理解されるものとする。
【０１４２】
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子座（locus）」（遺伝子座（loci）複数形）は、例えば、遺伝子または遺伝子マーカーが見出される染色体上の具体的な１つもしくは複数の場所または部位を意味する。
【０１４３】
本明細書で使用される場合、用語「遺伝的に連結された」は、２種またはそれ超の形質であって、これらが交雑によって分離するのが困難であるように、繁殖中に高い割合で共遺伝される、形質を指す。
【０１４４】
「組換え」または「組換え事象」は、本明細書で使用される場合、染色体交差または独立組合せを指す。用語「組換え体」は、組換え事象の結果として生じる新しい遺伝子構成を有する生物体を指す。
【０１４５】
本明細書で使用される場合、用語「表現型」は、個々の遺伝子構造（すなわち、遺伝子型）と環境との間の相互作用から生じる個々の細胞、細胞培養物、生物体、または生物体の群の観察可能な特性を指す。
【０１４６】
本明細書で使用される場合、用語「キメラの」または「組換えの」は、核酸配列またはタンパク質配列を記述するとき、少なくとも２つの異種ポリヌクレオチドもしくは２つの異種ポリペプチドを連結して単一の巨大分子にする、または少なくとも１つの天然の核酸もしくはタンパク質配列の１つもしくは複数のエレメントを再編成する核酸またはタンパク質配列を指す。例えば、用語「組換えの」は、例えば、化学合成による、または遺伝子操作技法による核酸の単離セグメントのマニピュレーションによる、配列の２つの別の方法で分離されたセグメントの人工の組合せを指すことができる。
【０１４７】
本明細書で使用される場合、「合成ヌクレオチド配列」または「合成ポリヌクレオチド配列」は、天然に存在することが知られていない、または天然に存在しないヌクレオチド配列である。一般に、このような合成ヌクレオチド配列は、任意の他の天然に存在するヌクレオチド配列と比較したとき、少なくとも１つのヌクレオチド差異を含む。
【０１４８】
本明細書で使用される場合、用語「核酸」は、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドのいずれか、またはこれらの類似体の、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。この用語は、分子の一次構造を指し、よって、二本鎖および一本鎖ＤＮＡ、ならびに二本鎖および一本鎖ＲＮＡを含む。これは、修飾核酸、例えば、メチル化および／またはキャッピングされた核酸、修飾塩基、主鎖修飾を含有する核酸なども含む。用語「核酸」および「ヌクレオチド配列」は、互換的に使用される。
【０１４９】
本明細書で使用される場合、用語「ＤＮＡ足場」または「核酸足場」は、人工的に生産された配列、または足場として転用される天然に存在する配列のいずれかである核酸足場を指す。本開示の一実施形態において、核酸足場は、合成デオキシリボ核酸足場である。合成足場のデオキシリボヌクレオチドは、プリンおよびピリミジン塩基または他の天然の、化学的または生化学的に改変された、非天然の、または誘導体化されたデオキシリボヌクレオチド塩基を含んでいてもよい。本明細書でより詳細に記載されるように、本開示の核酸足場は、生物学的な経路に関与する２つまたはそれより多くのタンパク質、すなわち生合成酵素を空間的および時間的にアセンブルおよび固定化して、機能的な複合体を創製するのに利用される。足場上での各生物学的な経路タンパク質のアセンブリーおよび固定化は、足場のタンパク質結合配列、すなわちタンパク質がドッキングする部位の１つと、対応するキメラ生合成酵素のＤＮＡ結合部分との結合相互作用により起こる。よって、核酸足場は、１つまたは複数のサブユニットを含み、各サブユニットは、２つまたはそれより多くの異なるキメラの生物学的な経路タンパク質の結合を受け入れるための２つまたはそれより多くのタンパク質結合配列を含む。
【０１５０】
本明細書で使用される場合、「ＤＮＡ結合配列」または「ＤＮＡ結合部位」は、本開示のキメラ生合成遺伝子のＤＮＡ結合ドメイン部分により認識されてそれと結合する特異的な核酸配列を指す。多くのＤＮＡ結合タンパク質ドメインおよびその同起源の結合パートナーの認識部位（すなわち、タンパク質結合部位）は当技術分野において周知である。例えば、多数のジンクフィンガー結合ドメインおよびその対応するＤＮＡタンパク質結合標的部位は当技術分野で公知であり、本開示での使用に好適である。他のＤＮＡ結合ドメインとしては、これらに限定されないが、ロイシンジッパー結合ドメインおよびその対応するＤＮＡタンパク質結合部位、ウィングドヘリックス結合ドメインおよびその対応するＤＮＡタンパク質結合部位、ウィングドヘリックス−ターン−ヘリックス結合ドメインおよびその対応するＤＮＡタンパク質結合部位、ＨＭＧ−ボックス結合ドメインおよびその対応するＤＮＡタンパク質結合配列、ヘリックス−ループ−ヘリックス結合ドメインおよびその対応するＤＮＡタンパク質結合配列、ならびにヘリックス−ターン−ヘリックス結合ドメインおよびその対応するＤＮＡタンパク質結合配列が挙げられる。公知のＤＮＡタンパク質結合配列を有する他の公知のＤＮＡ結合ドメインとしては、免疫グロブリンＤＮＡドメイン、Ｂ３ＤＮＡ結合ドメイン、およびＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインが挙げられる。本開示の核酸足場サブユニットは、上述のタンパク質結合部位のうち任意の２種またはそれより多くを含んでもよい。
【０１５１】
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子」は、生物学的機能と関連したＤＮＡの任意のセグメントを指す。よって、遺伝子は、これらに限定されないが、コード配列および／またはこれらの発現に要求される調節配列を含む。遺伝子は、例えば、他のタンパク質の認識配列を形成する非発現ＤＮＡセグメントも含み得る。遺伝子は、目的の源からのクローニング、または公知のもしくは予測された配列情報からの合成を含めた、様々な源から得ることができ、所望のパラメータを有するように設計された配列を含み得る。
【０１５２】
本明細書で使用される場合、用語「相同の」または「相同体」または「オルソログ」は、当技術分野で公知であり、共通の祖先またはファミリーメンバーを共有し、配列同一性の程度に基づいて決定される関連配列を指す。用語「相同性」、「相同の」、「実質的に同様の」、および「実質的に対応する」は、本明細書で互換的に使用される。これらは、核酸断片であって、１つまたは複数のヌクレオチド塩基の変化が、遺伝子発現を媒介し、またはある特定の表現型を生じさせる核酸断片の能力に影響しない、核酸断片を指す。これらの用語は、本開示の核酸断片の修飾、例えば、最初の無修飾断片と比べて得られる核酸断片の機能的性質を実質的に変更しない１つまたは複数のヌクレオチドの欠失または挿入も指す。したがって、当業者が十分に理解するように、本開示は、具体的な例示的な配列より多くを包含することが理解される。これらの用語は、１つの種、亜種、種類、栽培品種、または株内に見出される遺伝子と、別の種、亜種、種類、栽培品種、または株内の対応するまたは等価な遺伝子との間の関係を記述する。本開示の目的に関して、相同配列が比較される。「相同配列」または「相同体」または「オルソログ」は、機能的に関連していると見なされ、考えられ、または知られている。機能的関係は、これらに限定されないが、（ａ）配列同一性の程度および／または（ｂ）同じもしくは同様の生物学的機能を含めた、いくつかのやり方のいずれか１つにおいて示され得る。好ましくは、（ａ）および（ｂ）の両方が示される。相同性は、当技術分野で容易に利用可能なソフトウェアプログラム、Current  Protocols  in  Molecular  Biology（F.M.  Ausubelら編、１９８７年）補遺３０、セクション７．７１８、表７．７１に論じられたものなどを使用して決定することができる。いくつかの整列プログラムは、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌｔｄ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｕ．Ｋ．）、ＡＬＩＧＮ  Ｐｌｕｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）、およびＡｌｉｇｎＸ（Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）である。別の整列プログラムは、デフォルトパラメータを使用するＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ）である。
【０１５３】
本明細書で使用される場合、用語「内在性の」または「内在性遺伝子」は、天然に存在する遺伝子であって、それが宿主細胞ゲノム内に天然に見出される場所における天然に存在する遺伝子を指す。本開示との関連で、異種プロモーターを内在性遺伝子に作動可能に連結することは、既存の遺伝子であって、その遺伝子が天然に存在する場所における、既存の遺伝子の前に異種プロモーター配列を遺伝的に挿入することを意味する。本明細書に記載の内在性遺伝子は、本開示の方法のいずれかによって変異された天然に存在する遺伝子の対立遺伝子を含み得る。
【０１５４】
本明細書で使用される場合、用語「外因性の」は、用語「異種の」と互換的に使用され、その生来の源（native  source）以外の何らかの源に由来する物質を指す。例えば、用語「外因性タンパク質」または「外因性遺伝子」は、非生来の源または場所由来であり、生物系に人工的に供給されたタンパク質または遺伝子を指す。
【０１５５】
本明細書で使用される場合、用語「異種改変」は、特定の生物系（例えば、本明細書で提供される宿主細胞）にとって生来の源以外の源によってもたらされる改変、または特定の生物系にとって生来の、ただし非生来の環境／位置／場所で見出される源からの改変を指すことができる。よって改変は、前記改変が導入されたかまたは導入されると予想される生物系（例えば、本明細書で提供される宿主細胞、または宿主細胞内の非生来の環境／位置／場所）への言及において、非生来のまたは天然に存在しないものである。それゆえに異種改変は、人工的に生物系（例えば、本明細書で提供される宿主細胞、または宿主内の異種の環境／位置／場所）に導入されたとみなすことができる。改変は、遺伝的または後成的なバリエーション、破壊または撹乱であってもよい。遺伝的バリエーション、破壊または撹乱は、例えば、遺伝子の生来のプロモーターおよび／またはターミネーターの、前記宿主にとって生来ではないプロモーターおよび／またはターミネーターでの置き換えであってもよいし、または非生来の異種環境／位置／場所に移動した宿主生物内からのプロモーターおよび／またはターミネーターであってもよい。遺伝的バリエーション、破壊または撹乱は、生来のまたは天然に存在する遺伝子の、非生来のまたは天然に存在しない遺伝子、例えば選択可能なマーカー遺伝子などでの置き換えであってもよい。または、遺伝的バリエーション、破壊または撹乱は、生来のまたは天然に存在する遺伝子の、非天然の環境／位置／場所に置かれる宿主ゲノム内からの別の生来の遺伝子（例えばプロモーター）での置き換えまたはスワッピングであってもよい。遺伝的バリエーション、破壊または撹乱は、生来のまたは天然に存在する遺伝子の、その遺伝子の非生来のまたは天然に存在しない形態での置き換えであってもよい。遺伝子の非生来のまたは天然に存在しない形態は、特定の宿主細胞に天然に見出されない遺伝子の変異形態であってもよいし、および／または異種プロモーターおよび／またはターミネーターに作動可能に連結した特定の宿主細胞に天然に見出されない遺伝子の変異形態であってもよい。
【０１５６】
本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオチド変化」は、当技術分野でよく理解されているように、例えば、ヌクレオチド置換、欠失、および／または挿入を指す。例えば、変異は、サイレント置換、付加、または欠失を生じさせるが、コードされるタンパク質の性質もしくは活性、またはタンパク質が作製される方法を変更しない変更を含有する。
【０１５７】
本明細書で使用される場合、用語「タンパク質修飾」は、当技術分野でよく理解されているように、例えば、アミノ酸置換、アミノ酸修飾、欠失、および／または挿入を指す。
【０１５８】
本明細書で使用される場合、用語、核酸またはポリペプチドの「少なくとも一部」または「断片」は、このような配列の最小限のサイズ特性を有する部分、または最大で全長分子の、および全長分子を含めた、全長分子の任意のより大きい断片を意味する。本開示のポリヌクレオチドの断片は、遺伝子調節エレメントの生物活性部分をコードすることができる。遺伝子調節エレメントの生物活性部分は、遺伝子調節エレメントを含む本開示のポリヌクレオチドの１つの部分を単離し、本明細書に記載の活性を評価することによって調製することができる。同様に、ポリペプチドの部分は、４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸などであり得、最大で全長ポリペプチドまで伸び得る。使用される部分の長さは、特定の用途に依存する。ハイブリダイゼーションプローブとして有用な核酸の部分は、１２ヌクレオチドという短さであり得；一部の実施形態では、それは、２０ヌクレオチドである。エピトープとして有用なポリペプチドの部分は、４アミノ酸という短さであり得る。完全長ポリペプチドの機能を果たすポリペプチドの部分は一般に、４アミノ酸より長いはずである。
【０１５９】
バリアントポリヌクレオチドは、ＤＮＡシャッフリングなどの変異誘発および組換え誘導（recombinogenic）手順に由来する配列も包含する。このようなＤＮＡシャッフリングのストラテジーは、当技術分野で公知である。例えば、Stemmer（１９９４年）、PNAS、９１巻：１０７４７〜１０７５１頁；Stemmer（１９９４年）、Nature、３７０巻：３８９〜３９１頁；Crameriら（１９９７年）、Nature  Biotech.、１５巻：４３６〜４３８頁；Mooreら（１９９７年）、J.  Mol.  Biol.、２７２巻：３３６〜３４７頁；Zhangら（１９９７年）、PNAS、９４巻：４５０４〜４５０９頁；Crameriら（１９９８年）、Nature、３９１巻：２８８〜２９１頁；ならびに米国特許第５，６０５，７９３号および同第５，８３７，４５８号を参照。
【０１６０】
本明細書に開示のポリヌクレオチドのＰＣＲ増幅に関して、オリゴヌクレオチドプライマーを、目的の任意の生物体から抽出されたｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡから対応するＤＮＡ配列を増幅するためのＰＣＲ反応で使用するのに設計することができる。ＰＣＲプライマーを設計しＰＣＲクローニングするための方法は、当技術分野で一般に公知であり、Sambrookら（２００１年）、Molecular  Cloning:A  Laboratory  Manual（３版、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、Plainview、New  York）に開示されている。Innisら編（１９９０年）、PCR  Protocols:  A  Guide  to  Methods  and  Applications（Academic  Press、New  York）；InnisおよびGelfand編（１９９５年）、PCR  Strategies（Academic  Press、New  York）；ならびにInnisおよびGelfand編（１９９９年）PCR  Methods  Manual（Academic  Press、New  York）も参照。ＰＣＲの公知の方法としては、これらに限定されないが、対プライマー、ネステッドプライマー、単一特異的プライマー、縮重プライマー、遺伝子特異的プライマー、ベクター特異的プライマー、部分ミスマッチプライマーなどを使用する方法が挙げられる。
【０１６１】
本明細書で使用される用語「プライマー」は、増幅標的にアニールし、ＤＮＡポリメラーゼを結合させ、それによって、プライマー伸長産物の合成が誘導される条件下で、すなわち、ヌクレオチド、およびＤＮＡポリメラーゼなどの重合のための作用物質の存在下で、かつ適当な温度およびｐＨで配置されたとき、ＤＮＡ合成の開始点として機能を果たすことができるオリゴヌクレオチドを指す。（増幅）プライマーは、好ましくは、増幅の効率を最大にするために一本鎖である。好ましくは、プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、重合のための作用物質の存在下で伸長産物の合成をプライムするのに十分長くなければならない。プライマーの正確な長さは、プライマーの温度および組成（Ａ／Ｔ対Ｇ／Ｃ含有量）を含めた多くの因子に依存する。一対の双方向性プライマーは、ＰＣＲ増幅などのＤＮＡ増幅の技術分野で一般に使用されるように、１つの順方向プライマーおよび１つの逆方向プライマーからなる。
【０１６２】
用語「ストリンジェンシー」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、ハイブリッドの安定性に影響するハイブリダイゼーション条件、例えば、温度、塩濃度、ｐＨ、ホルムアミド濃度などを指す。これらの条件は、プライマーまたはプローブのその標的核酸配列への特異的な結合を最大化し、非特異的な結合を最小化するように経験的に最適化される。この用語は、使用される場合、他の配列より大きい程度（例えばバックグラウンドに対して少なくとも２倍）で検出できるようにプローブまたはプライマーがその標的配列にハイブリダイズする条件への言及を含む。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、環境が異なれば異なることになる。配列が長いほど、より高温で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、既定のイオン強度およびｐＨで特異的な配列に対する熱融解点（Ｔｍ）より約５℃低くなるように選択される。Ｔｍは、相補的標的配列の５０％が完全にマッチするプローブまたはプライマーにハイブリダイズする温度（既定のイオン強度およびｐＨで）である。典型的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が、ｐＨ７．０〜８．３で、約１．０Ｍ未満のＮａ＋イオン、典型的には約０．０１〜１．０ＭのＮａ＋イオン濃度（または他の塩）であり、温度が、短いプローブまたはプライマー（例えば１０〜５０ヌクレオチド）の場合、少なくとも約３０℃であり、長いプローブまたはプライマー（例えば５０ヌクレオチドより大きい）の場合、少なくとも約６０℃である条件である。またストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加でも達成することができる。例示的な低いストリンジェントな条件または「低いストリンジェンシーの条件」は、３７℃での、３０％ホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳの緩衝溶液を用いたハイブリダイゼーション、および４０℃での２×ＳＳＣ中での洗浄を含む。例示的な高いストリンジェンシー条件は、３７℃で５０％ホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、および６０℃での０．１×ＳＳＣ中での洗浄を含む。ハイブリダイゼーション手順は当技術分野において周知であり、例えばAusubelら、１９９８年およびSambrookら、２００１年によって記載されている。一部の実施形態では、ストリンジェントな条件は、４５℃での、１ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ、０．５〜２０％のドデシル硫酸ナトリウム、例えば０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％または２０％のドデシル硫酸ナトリウムを含有する０．２５ＭのＮａ２ＨＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．２）中でのハイブリダイゼーション、続いて５５℃〜６５℃での０．１％（ｗ／ｖ）のドデシル硫酸ナトリウムを含有する５×ＳＳＣ中での洗浄である。
【０１６３】
本明細書で使用される場合、「プロモーター」は、コード配列または機能ＲＮＡの発現を制御することができるＤＮＡ配列を指す。一部の実施形態では、プロモーター配列は、近位およびより遠位の上流エレメントからなり、後者のエレメントはエンハンサーと称されることが多い。したがって、「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激することができるＤＮＡ配列であり、プロモーターの固有のエレメントまたはプロモーターのレベルもしくは組織特異性を増強するために挿入される異種エレメントであり得る。プロモーターは、その全体が生来の遺伝子に由来する場合があり、または天然に見出される異なるプロモーターに由来する異なるエレメントから構成される場合があり、または合成ＤＮＡセグメントを含むことさえできる。異なるプロモーターは、異なる組織もしくは細胞型における、または発達の異なる段階における、または異なる環境条件に応じて遺伝子の発現を指示することができることが当業者によって理解されている。本明細書に記載される方法およびシステムで使用するためのプロモーターは、前記プロモーターの制御下での１つまたは複数の遺伝子の発現が特異的な物質の存在および／または非存在によって調節されるように、誘導性であってもよい。誘導性プロモーターは、その転写活性が、化学的または物理的な条件、例えば、アルコール、テトラサイクリン、ステロイド、金属または当技術分野で公知の他の化合物などの存在または非存在によって、または光もしくは低温もしくは高温の存在または非存在によって調節される任意のプロモーターであってもよい。ほとんどの場合、調節配列の正確な境界は、完全に画定されていないので、あるバリエーションのＤＮＡ断片は、同一のプロモーター活性を有し得ることがさらに認識されている。
【０１６４】
本明細書で使用される場合、「ターミネーター」は、一般に、ゲノムＤＮＡ中の遺伝子の末端をマークし、転写を止めることが可能なＤＮＡ配列の区画を指す。ターミネーターは、それらの全体が生来の遺伝子に由来していてもよいし、または天然に見出される異なるターミネーターに由来する異なるエレメントで構成されていてもよいし、または合成ＤＮＡセグメントを含むものであってもよい。当業者であれば、異なるターミネーターは、異なる組織または細胞型において、または異なる発生段階で、または異なる環境条件に応答して、遺伝子の発現を指示し得ることを理解している。
【０１６５】
本明細書で使用される場合、語句「組換えコンストラクト」、「発現コンストラクト」、「キメラコンストラクト」、「コンストラクト」、および「組換えＤＮＡコンストラクト」は、本明細書で互換的に使用される。組換えコンストラクトは、核酸断片の人工の組合せ、例えば、天然に一緒に見出されない調節配列およびコード配列を含む。例えば、キメラコンストラクトは、異なる源に由来する調節配列およびコード配列、または同じ源に由来するが、天然に見出されるものと異なる様式で配列されている調節配列およびコード配列を含み得る。このようなコンストラクトは、それ自体で使用することができ、またはベクターと併せて使用することができる。ベクターが使用される場合、ベクターの選択は、当業者に周知であるように、宿主細胞を形質転換するのに使用される方法に依存する。例えば、プラスミドベクターを使用することができる。当業者は、本開示の単離核酸断片のいずれかを含む宿主細胞を順調に形質転換、選択、および増殖させるためにベクター上に存在しなければならない遺伝子エレメントをよく知っている。当業者は、異なる独立した形質転換事象は、異なるレベルおよびパターンの発現をもたらし（Jonesら（１９８５年）、EMBO  J.、４巻：２４１１〜２４１８頁；De  Almeidaら（１９８９年）、Mol.  Gen.  Genetics、２１８巻：７８〜８６頁）、よって、所望の発現レベルおよびパターンをディスプレイする系（line）を得るために、複数の事象がスクリーニングされなければならないことも認識する。このようなスクリーニングは、とりわけ、ＤＮＡのサザン分析、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析、タンパク質発現のイムノブロッティング分析、または表現型分析によってなしとげることができる。ベクターは、自発的に複製する、または宿主細胞の染色体内に組み込むことができるプラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、プロ−ウイルス、ファージミド、トランスポゾン、人工染色体などであり得る。ベクターは、自律複製していない裸のＲＮＡポリヌクレオチド、裸のＤＮＡポリヌクレオチド、同じ鎖内のＤＮＡおよびＲＮＡの両方から構成されるポリヌクレオチド、ポリリシンコンジュゲートＤＮＡまたはＲＮＡ、ペプチドコンジュゲートＤＮＡまたはＲＮＡ、リポソームコンジュゲートＤＮＡなどでもあり得る。本明細書で使用される場合、用語「発現」は、機能的最終産物、例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質（前駆体または成熟）の産生を指す。
【０１６６】
「作動可能に連結した」は、本文脈において、本開示によるプロモーターポリヌクレオチドのさらなるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとの、前記さらなるポリヌクレオチドの転写をもたらす連続した配置を意味する。
【０１６７】
用語「目的の産物」または「生体分子」は、本明細書で使用される場合、供給原料から微生物によって産生される任意の産物を指す。一部の場合では、目的の産物は、低分子、酵素、ペプチド、アミノ酸、有機酸、合成化合物、燃料、アルコールなどであり得る。例えば、目的の産物または生体分子は、任意の一次または二次細胞外代謝産物であり得る。一次代謝産物は、とりわけ、エタノール、クエン酸、乳酸、グルタミン酸、グルタメート、リシン、トレオニン、トリプトファン、および他のアミノ酸、ビタミン、多糖などであり得る。二次代謝産物は、とりわけ、ペニシリンのような抗生物質化合物、またはシクロスポリンＡのような免疫抑制剤、ジベレリンのような植物ホルモン、ロバスタチンのようなスタチン薬、グリセオフルビンのような殺真菌薬などであり得る。目的の産物、または生体分子は、微生物によって産生される任意の細胞内コンポーネント、例えば、カタラーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、ペクチナーゼ、グルコースイソメラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、ラクターゼ、ストレプトキナーゼ、および多くのその他を含めた微生物酵素でもあり得る。細胞内コンポーネントとしては、組換えタンパク質、例えば、インスリン、Ｂ型肝炎ワクチン、インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子、ストレプトキナーゼなども挙げることができる。また目的の産物は、「目的のタンパク質」を指す場合もある。
【０１６８】
用語「目的のタンパク質」は、一般に、糸状菌で発現されることが望ましい任意のポリペプチドを指す。このようなタンパク質は、酵素、基質結合タンパク質、表面活性タンパク質、構造タンパク質などであってもよく、高いレベルで発現させてもよく、商業化目的であってもよい。目的のタンパク質は、バリアント株および／または親の株に対する内在性遺伝子または異種遺伝子によってコードされていてもよい。目的のタンパク質は、細胞内で、または分泌タンパク質として発現させることができる。目的のタンパク質が天然に分泌されない場合、そのタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の技法に従ってシグナル配列を有するように改変されてもよい。分泌されるタンパク質は、天然に発現されるが異種であり得る内在性タンパク質であり得る。異種は、遺伝子がコードするタンパク質（the  gene  encoded  by  the  protein）が、糸状菌宿主細胞における生来の条件下で生産されないことを意味する。本開示の糸状菌によって産生され得る酵素の例は、カルボヒドラーゼ、例えば、エンドグルカナーゼ、ベータ−グルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼまたはベータ−グルコシダーゼなどのセルラーゼ、ヘミセルラーゼ、またはキシラナーゼ、キシロシダーゼ、マンナナーゼ、ガラクタナーゼ、ガラクトシダーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、アラバナーゼ、ガラクツロナナーゼ、リアーゼなどのペクチン分解酵素、またはデンプン分解酵素；フィターゼなどのホスファターゼ、リパーゼなどのエステラーゼ、タンパク質分解酵素、オキシダーゼなどのオキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、またはイソメラーゼである。
【０１６９】
用語「炭素源」は一般に、細胞増殖のための炭素の源として使用されるのに適した物質を指す。炭素源としては、これらに限定されないが、バイオマス加水分解物、デンプン、スクロース、セルロース、ヘミセルロース、キシロース、およびリグニン、ならびにこれらの基質のモノマーコンポーネントが挙げられる。炭素源は、これらに限定されないが、ポリマー、炭水化物、酸、アルコール、アルデヒド、ケトン、アミノ酸、ペプチドなどを含めた様々な形態での様々な有機化合物を含み得る。これらとしては、例えば、様々な単糖、例えば、グルコース、デキストロース（Ｄ−グルコース）など、マルトース、オリゴ糖、多糖、飽和もしくは不飽和脂肪酸、スクシネート、ラクテート、アセテート、エタノールなど、またはこれらの混合物がある。光合成生物は、光合成の産物として炭素源をさらに産生することができる。一部の実施形態では、炭素源は、バイオマス加水分解物およびグルコースから選択され得る。
【０１７０】
用語「供給原料」は、他の産物が作製され得る微生物または発酵プロセスに供給される原料または原料の混合物として定義される。例えば、バイオマスまたはバイオマスに由来する炭素化合物などの炭素源は、発酵プロセスにおいて目的の産物（例えば、低分子、ペプチド、合成化合物、燃料、アルコールなど）を産生する微生物の供給原料である。しかし、供給原料は、炭素源以外の栄養分を含有し得る。
【０１７１】
用語「体積生産性」または「生産速度」は、単位時間当たり、媒体の体積当たりに形成される産物の量として定義される。体積生産性は、１時間当たり１リットル当たりのグラム（ｇ／Ｌ／ｈ）で報告することができる。
【０１７２】
用語「比生産性」は、産物の形成の速度として定義される。比生産性は、１時間当たり細胞乾燥重量（ＣＤＷ）１グラム当たりの産物のグラム（ｇ／ｇ  ＣＤＷ／ｈ）での比生産性として本明細書でさらに定義される。所与の微生物のＯＤ６００に対するＣＤＷの関係を使用して、比生産性を、１時間当たり６００ｎｍにおける培養ブロスの光学密度（ＯＤ）当たり培養培地１リットル当たりの産物のグラム（ｇ／Ｌ／ｈ／ＯＤ）として表現することもできる。
【０１７３】
用語「収率」は、原料の単位重量当たりに得られる産物の量として定義され、基質１ｇ当たりの産物のｇ（ｇ／ｇ）として表現することができる。収率は、理論的収率のパーセンテージとして表現することができる。「理論的収率」は、産物を作製するのに使用される代謝経路の化学量論比によって決まる所与の量の基質あたりに産生され得る産物の最大量として定義される。
【０１７４】
用語「力価（titre）」または「力価（titer）」は、溶液の強度または溶液中の物質の濃度として定義される。例えば、発酵ブロス中の目的の産物（例えば、低分子、ペプチド、合成化合物、燃料、アルコールなど）の力価は、発酵ブロス１リットル当たりの溶液中の目的の産物のｇ（ｇ／Ｌ）として記述される。
【０１７５】
用語「総力価」は、プロセスにおける初期体積またはプロセスにおける操作体積に対する、プロセスから取り出され、回収される溶液中の目的の産物、適用可能な場合、気相中の目的の産物、および任意の目的の産物を含むがこれらに限定されない、プロセスにおいて産生されるすべての目的の産物の和として定義される。
【０１７６】
本明細書で使用される場合、用語「ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリー」または「ライブラリー」は、本開示による遺伝子撹乱のコレクションを指す。一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、ｉ）データベースまたは他のコンピューターファイル中の配列情報のコレクション、ｉｉ）上述の一連の遺伝子エレメントをコードする遺伝子コンストラクトのコレクション、またはｉｉｉ）前記遺伝子エレメントを含む宿主細胞株として顕在化させ得る。一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、個々のエレメントのコレクション（例えば、ＰＲＯスワップライブラリーのプロモーターのコレクションまたはＳＴＯＰスワップライブラリーのターミネーターのコレクション）を指すことができる。他の実施形態では、本開示のライブラリーは、遺伝子エレメントの組合せ、例えば、プロモーター：：遺伝子、遺伝子：ターミネーター、またはさらにはプロモーター：遺伝子：ターミネーターの組合せも指すことができる。一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、宿主生物におけるライブラリーの各メンバーを適用する効果と関連したメタデータをさらに含む。例えば、本明細書で使用されるライブラリーは、特定の種における１つまたは複数の表現型に対するこれらの組合せの結果として生じる効果と一緒に、プロモーター：：遺伝子配列組合せのコレクションを含み、よって、将来のプロモータースワップにおいて前記組合せを使用することについて将来の予測値を改善することができる。
【０１７７】
本明細書で使用される場合、用語「ＳＮＰ」は、核内低分子多形（複数可）を指し得る。一部の実施形態では、本開示のＳＮＰは、広く解釈されるべきであり、一塩基多型、配列挿入、欠失、反転、および他の配列置き換えを含む。本明細書で使用される場合、用語「非同義の」または「非同義ＳＮＰ」は、宿主細胞タンパク質におけるコード変化をもたらす変異を指し得る。
【０１７８】
ゲノム操作の「ハイスループット（ＨＴＰ）」方法は、自動化設備（例えば、液体ハンドラーまたはプレートハンドラーマシン）の少なくとも１つのピースを利用して、前記方法の少なくとも１つのステップを実行することができる。
【０１７９】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、プラスミドおよびファージ内に存在するものなどの外来遺伝子エレメントに耐性を付与し、獲得した免疫の形態を提供する原核生物免疫系である。ＣＲＩＳＰＲは、クラスター化された等間隔に間隔をあけた短いパリンドロームリピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔ）を表し、ｃａｓは、ＣＲＩＳＰＲ関連システム（ＣＲＩＳＰＲ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｓｙｓｔｅｍ）を表し、ＣＲＩＳＰＲ複合体に結合した小さいｃａｓ遺伝子を指す。
【０１８０】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、クラス１またはクラス２システムのいずれかとして最も広く特徴付けられている。これらの２つのシステム間の主要な顕著なフィーチャは、Ｃａｓ−エフェクターモジュールの性質である。クラス１システムは、複数のＣａｓタンパク質を複合体（「カスケード複合体」と称される）にアセンブルして干渉を媒介することを必要とするが、クラス２システムは、大きい単一のＣａｓ酵素を使用して干渉を媒介する。クラス１およびクラス２システムのそれぞれはさらに、特異的なＣａｓタンパク質の存在に基づいて複数のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタイプに分けられる。例えば、クラス１システムは、以下の３つのタイプ：Ｃａｓ３タンパク質を含有するタイプＩシステム；Ｃａｓ１０タンパク質を含有するタイプＩＩＩシステム；およびＣｓｆ１タンパク質、Ｃａｓ８様タンパク質を含有する推定のタイプＩＶシステムに分けられる。クラス２システムは、全般的にクラス１システムほど一般的ではなく、さらに、以下の３つのタイプ：Ｃａｓ９タンパク質を含有するタイプＩＩシステム；Ｃａｓ１２ａタンパク質（以前はＣｐｆ１として公知であり、本明細書ではＣｐｆ１と称される）、Ｃａｓ１２ｂ（以前はＣ２ｃ１として公知）、Ｃａｓ１２ｃ（以前はＣ２ｃ３として公知）、Ｃａｓ１２ｄ（以前はＣａｓＹとして公知）、およびＣａｓ１２ｅ（以前はＣａｓＸとして公知）を含有するタイプＶシステム；ならびにＣａｓ１３ａ（以前はＣ２ｃ２として公知）、Ｃａｓ１３ｂ、およびＣａｓ１３ｃを含有するタイプＶＩシステムに分けられる。Pyzochaら、ACS  Chemical  Biology、１３巻（２号）、３４７〜３５６頁。一実施形態では、本明細書で提供される方法での使用のためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、クラス２システムである。一実施形態では、本明細書で提供される方法での使用のためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、タイプＩＩ、タイプＶまたはタイプＶＩのクラス２システムである。一実施形態では、本明細書で提供される方法での使用のためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃまたはそれらの相同体、オルソログもしくはパラログから選択される。
【０１８１】
本明細書に開示の方法で使用されるＣＲＩＳＰＲシステムは、本明細書でＣａｓエフェクタータンパク質と称される、１つまたは複数の核酸ガイド型ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ヌクレアーゼを含むＣａｓエフェクターモジュールを含む。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、１つまたは複数のヌクレアーゼドメインを含んでいてもよい。Ｃａｓエフェクタータンパク質は、一本鎖または二本鎖核酸分子（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ核酸）を標的化することができ、二本鎖または一本鎖の破断を生成することができる。一部の実施形態では、Ｃａｓエフェクタータンパク質は、野生型または天然に存在するＣａｓタンパク質である。一部の実施形態では、Ｃａｓエフェクタータンパク質は、親のＣａｓタンパク質と比較して１つまたは複数の変更された特性を有するＣａｓタンパク質がもたらされるように、ＷＴまたは天然に存在するＣａｓタンパク質（例えば、親のＣａｓタンパク質）中に１つまたは複数の変異、挿入、または欠失を生じさせた変異Ｃａｓタンパク質である。
【０１８２】
一部の場合において、Ｃａｓタンパク質は、野生型（ＷＴ）ヌクレアーゼである。本開示での使用のための好適なＣａｓタンパク質の非限定的な例としては、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても公知）、Ｃａｓ１０、Ｃｐｆｌ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１００、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘｌ、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、ＭＡＤ１〜２０、ＳｍＣｓｍ１、これらの相同体、これらのオルソログ、これらのバリアント、これらの変異体、またはこれらの改変されたバージョンが挙げられる。好適な核酸ガイド型ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）は、これらに限定されないが、Ｔｈｉｏｍｉｃｒｏｓｐｉｒａ、Ｓｕｃｃｉｎｉｖｉｂｒｉｏ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ、Ａｃｉｄｏｍｏｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｅｓ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ、Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｋａｎｄｌｅｒｉａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｄｏｒｅａ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｕｓ、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｒｉｄｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｄｅｓｕｌｆｏｎａｔｒｏｎｕｍ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ、Ｈｅｌｃｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｏｐｉｔｕｔａｃｅａｅ、Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ、Ｔｕｂｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ、およびＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒなどの属からの生物体由来であってもよい。このような属の生物体の種は、本明細書において別の方式で論じられたようなものであってもよい。
【０１８３】
好適な核酸ガイド型ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）は、これらに限定されないが、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｔｅｓ、およびＴｅｎｅｒｉｃｕｔｅｓなどの門からの生物体由来であってもよい。好適な核酸ガイド型ヌクレアーゼは、これらに限定されないが、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈｉａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ、Ｂａｃｉｌｌｉ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｌｐｈａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｂｅｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｄｅｌｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｅｐｓｉｌｏｎｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ、およびＭｏｌｌｉｃｕｔｅｓなどの綱からの生物体由来であってもよい。好適な核酸ガイド型ヌクレアーゼは、これらに限定されないが、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｌｅｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌａｌｅｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｌｅｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｌｅｓ、Ｎａｕｔｉｌｉａｌｅｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａｌｅｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｔａｌｅｓ、およびＴｈｉｏｔｒｉｃｈａｌｅｓなどの目からの生物体由来であってもよい。好適な核酸ガイド型ヌクレアーゼは、これらに限定されないが、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃａｃｅａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｎｅａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｒｙｏｍｏｏｒｐｈａｃｅａｅ、Ｒｈｏｄｏｂｉａｃｅａｅ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌａｃｅａｅ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａｃｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｃｅａｅ、Ｎａｕｔｉｌｉａｃｅａｅ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａｃｅａｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｔａｃｅａｅ、およびＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａｃｅａｅなどの科内からの生物体由来であってもよい。
【０１８４】
本開示の方法、システム、および組成物での使用に好適な他の核酸ガイド型ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）としては、例えば、これらに限定されないが、Ｔｈｉｏｍｉｃｒｏｓｐｉｒａ  ｓｐ．ＸＳ５、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌｅ、Ｓｕｃｃｉｎｉｖｉｂｒｉｏ  ｄｅｘｔｒｉｎｏｓｏｌｖｅｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ  ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ  ａｌｖｕｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒａｎｃｈｉｏｐｈｉｌｕｍ、Ａｃｉｄｏｍｏｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ細菌ＣＯＥ１、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｂｒｅｖｉｓ  ＡＴＣＣ１９１８８、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ  ｓｐ．ＳＣＡＤＣ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｂｏｖｏｃｕｌｉ、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｅｓ  ｊｏｎｅｓｉｉ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓの口腔分類群２７４、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎａｄａｉ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｌｙｍｅ  ｓｔｒ．１０、Ａｃｉｄｏｍｏｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．結晶構造（５Ｂ４３）、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓ．ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ、Ｓ．ｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ；Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ、Ｃ．ｃｏｌｉ；Ｎ．ｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ、Ｎ．ｔｅｒｇａｒｃｕｓ；Ｓ．ａｕｒｉｃｕｌａｒｉｓ、Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓ；Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌ．ｉｖａｎｏｖｉｉ；Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃ．ｔｅｔａｎｉ、Ｃ．ｓｏｒｄｅｌｌｉｉ；Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ  ｌ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ａｌｂｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ細菌ＭＣ２０１７  １、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ細菌ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ２＿３３＿１０、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ細菌ＧＷ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ  ｓｐ．ＳＣＡＤＣ、Ｍｉｃｒｏｇｅｎｏｍａｔｅｓ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ細菌ＭＡ２０２０、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ  ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｌｉｇｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｂｏｖｏｃｕｌｉ  ２３７、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎａｄａｉ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ細菌ＮＤ２００６、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ  ３、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｄｉｓｉｅｎｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｍａｃａｃａｅ、Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．ＣＡＧ：２９０、Ｋａｎｄｌｅｒｉａ  ｖｉｔｕｌｉｎａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ細菌ＫＡ００２７４、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ細菌３−２、Ｄｏｒｅａ  ｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｔｕｓ  ＧＤ／７、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｌｕｍｂａｅ  ＤＳＭ７３７４、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＥＦＢ−Ｎ１、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ  ｈａｌｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｖｅｒｓｍｏｌｄｅｎｓｉｓ、およびＦｉｌｉｆａｃｔｏｒ  ａｌｏｃｉｓ  ＡＴＣＣ３５８９６などの生物体に由来するものが挙げられる。それぞれが参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第８，６９７，３５９号；同第８，７７１，９４５号；同第８，７９５，９６５号；同第８，８６５，４０６号；同第８，８７１，４４５号；同第８，８８９，３５６号；同第８，８９５，３０８号；同第８，９０６，６１６号；同第８，９３２，８１４号；同第８，９４５，８３９号；同第８，９９３，２３３号；同第８，９９９，６４１号；同第９，８２２，３７２号；同第９，８４０，７１３号；米国特許出願第１３／８４２，８５９号（ＵＳ２０１４／００６８７９７Ａ１）；同第９，２６０，７２３号；同第９，０２３，６４９号；同第９，８３４，７９１号；同第９，６３７，７３９号；米国特許出願第１４／６８３，４４３号（ＵＳ２０１５／０２４０２６１Ａ１）；米国特許出願第１４／７４３，７６４号（ＵＳ２０１５／０２９１９６１Ａ１）；同第９，７９０，４９０号；同第９，６８８，９７２号；同第９，５８０，７０１号；同第９，７４５，５６２号；同第９，８１６，０８１号；同第９，６７７，０９０号；同第９，７３８，６８７号；米国出願第１５／６３２，２２２号（ＵＳ２０１７／０３６９８７９Ａ１）；米国出願第１５／６３１，９８９号；米国出願第１５／６３２，００１号；および米国特許第９，８９６，６９６号を参照されたい。
【０１８５】
一部の実施形態では、Ｃａｓエフェクタータンパク質は、以下の活性：
【０１８６】
ニッカーゼ活性、すなわち核酸分子の一本鎖を切断する能力；
【０１８７】
二本鎖ヌクレアーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸の両方の鎖を切断し、二本鎖の破断を創製する能力；
【０１８８】
エンドヌクレアーゼ活性；
【０１８９】
エキソヌクレアーゼ活性；および／または
【０１９０】
ヘリカーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸のらせん構造を解く能力
の１つまたは複数を含む。
【０１９１】
本開示の態様において、用語「ガイド核酸」は、１）標的配列にハイブリダイズすることが可能なガイド配列（本明細書では「標的化セグメント」と称される）および２）（単独で、またはｔｒａｃｒＲＮＡ分子と組み合わせてのいずれかで）本明細書に記載の核酸ガイド型ヌクレアーゼと相互作用することが可能な足場配列（本明細書では「足場セグメント」と称される）を含むポリヌクレオチドを指す。ガイド核酸は、ＤＮＡであってもよい。ガイド核酸は、ＲＮＡであってもよい。ガイド核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含んでいてもよい。ガイド核酸は、改変された天然に存在しないヌクレオチドを含んでいてもよい。ガイド核酸がＲＮＡを含む場合、ＲＮＡガイド核酸は、ポリヌクレオチド分子、例えば本明細書に開示のプラスミド、線形コンストラクト、または編集カセット上のＤＮＡ配列によってコードされてもよい。
【０１９２】
一部の実施形態では、本明細書に記載されるガイド核酸は、ＲＮＡガイド核酸（「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」）であり、標的化セグメントおよび足場セグメントを含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの足場セグメントは、１つのＲＮＡ分子中に含まれ、標的化セグメントは、他の別個のＲＮＡ分子中に含まれる。このような実施形態は、本明細書では、「二重分子ｇＲＮＡ」または「２分子ｇＲＮＡ」または「二重ｇＲＮＡ」と称される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、単一のＲＮＡ分子であり、本明細書では「単一ガイドＲＮＡ」または「ｓｇＲＮＡ」と称される。用語「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」は、包括的であり、２分子ガイドＲＮＡとｓｇＲＮＡの両方を指す。
【０１９３】
ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントは、標的核酸配列中の配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。よって、ｇＲＮＡの標的化セグメントは、ハイブリダイゼーション（すなわち、塩基対合）により配列特異的な様式で標的核酸と相互作用し、標的化セグメントのヌクレオチド配列は、ｇＲＮＡが結合する標的ＤＮＡ内の場所を決定する。ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、好適なアライメントアルゴリズムを使用して最適にアライメントさせた場合、約５０％、約６０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７．５％、約９９％またはそれより高い、または約これらの値を超える。最適なアライメントは、配列をアライメントさせるための任意の好適なアルゴリズムの使用により決定することができる。一部の実施形態では、ガイド配列は、長さが、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４５、約５０、約７５またはそれより多くの、または約これらの値を超えるヌクレオチドである。一部の実施形態では、ガイド配列は、長さが、約７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０未満のヌクレオチドである。態様において、ガイド配列は、１０〜３０ヌクレオチドの長さである。ガイド配列は、長さが、１５〜２０ヌクレオチドであってもよい。ガイド配列は、長さが、１５ヌクレオチドであってもよい。ガイド配列は、長さが、１６ヌクレオチドであってもよい。ガイド配列は、長さが、１７ヌクレオチドであってもよい。ガイド配列は、長さが、１８ヌクレオチドであってもよい。ガイド配列は、長さが、１９ヌクレオチドであってもよい。ガイド配列は、長さが、２０ヌクレオチドであってもよい。
【０１９４】
ガイドＲＮＡの足場セグメントは、１つまたは複数のＣａｓエフェクタータンパク質と相互作用して、リボ核タンパク質複合体（本明細書ではＣＲＩＳＰＲ−ＲＮＰまたはＲＮＰ複合体と称される）を形成する。ガイドＲＮＡは、結合したポリペプチドを、上述された標的化セグメントにより、標的核酸配列内の特異的なヌクレオチド配列に方向付ける。ガイドＲＮＡの足場セグメントは、互いに相補的であり、二本鎖化されたＲＮＡ二重鎖を形成するヌクレオチドの２つのストレッチを含む。標的化可能なヌクレアーゼ複合体の形成を促進するのに十分な足場配列内の配列は、二次構造の形成に関与する１または２つの配列領域などの足場配列内の２つの配列領域の長さに沿って、ある程度の相補性を有していてもよい。一部の場合では、１または２つの配列領域は、同じポリヌクレオチドに含まれるかまたはコードされる。一部の場合では、１または２つの配列領域は、別のポリヌクレオチドに含まれるかまたはコードされる。最適なアライメントは、任意の好適なアライメントアルゴリズムによって決定でき、さらに、二次構造、例えば１または２つの配列領域のいずれかの内の自己相補性の要因となり得る。一部の実施形態では、２つのうち短い方の長さに沿った１または２つの配列領域間の相補性の程度は、最適にアライメントさせた場合、約２５％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９７．５％、約９９％またはそれより高い、または約これらの値を超える。一部の実施形態では、２つの配列領域のうち少なくとも１つは、長さが、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２５、約３０、約４０、約５０またはそれより多くの、または約これらの値を超えるヌクレオチドである。
【０１９５】
対象ｇＲＮＡの足場配列は、二次構造を含んでいてもよい。二次構造は、シュードノット領域またはステム−ループ構造を含んでいてもよい。一部の例において、ガイド核酸と核酸ガイド型ヌクレアーゼの適合性は、少なくとも部分的に、ガイドＲＮＡの二次構造領域内の、またはそれに隣接する配列によって決定される。一部の場合では、ガイド核酸の核酸ガイド型ヌクレアーゼへの結合速度は、部分的に、足場配列内の二次構造によって決定される。一部の場合では、ガイド核酸の核酸ガイド型ヌクレアーゼへの結合速度は、部分的に、足場配列を有する核酸配列によって決定される。
【０１９６】
ｇＲＮＡ−Ｃａｓエフェクタータンパク質の組合せに適合性のある足場配列は、生来のＣａｓヌクレアーゼ遺伝子座に隣接する配列をスキャンすることによって見出すことができる。言い換えれば、生来のＣａｓヌクレアーゼは、対応する適合性のあるガイド核酸または足場配列に近接した位置内のゲノムにコードされていてもよい。
【０１９７】
核酸ガイド型ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼ内在性宿主内で見出されないガイド核酸と適合し得る。このようなオルソゴナルなガイド核酸は、実験的試験によって決定することができる。オルソゴナルなガイド核酸は、異なる細菌種に由来していてもよいし、または合成であってもよいし、または天然に存在しないものになるように別の方法で操作されたものでもよい。共通の核酸ガイド型ヌクレアーゼと適合するオルソゴナルなガイド核酸は、１つまたは複数の共通のフィーチャを含んでいてもよい。共通のフィーチャは、シュードノット領域の外側に配列を含み得る。共通のフィーチャは、シュードノット領域を含み得る。共通のフィーチャは、一次配列または二次構造を含み得る。
【０１９８】
ガイド配列が標的配列に相補的であり、それによってガイド配列と標的配列とのハイブリダイゼーションが可能になるようにガイド配列を変更することによって、ガイド核酸を、所望の標的配列を標的化するように操作することができる。操作されたガイド配列を有するガイド核酸は、操作されたガイド核酸と称することができる。操作されたガイド核酸は、天然に存在しないことが多く、天然に見出されない。
【０１９９】
一部の実施形態では、本開示は、ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、ｇＲＮＡをコードする核酸は、発現ベクター、例えば組換え発現ベクター中に含まれる。一部の実施形態では、本開示は、部位指向改変ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、部位特異的改変ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、発現ベクター、例えば組換え発現ベクター中に含まれる。
【０２００】
一部の実施形態では、本開示は、部位特異的改変ポリペプチドと複合体化して、標的核酸配列を含む宿主細胞に導入することが可能なＲＮＰ複合体を形成するｇＲＮＡを提供し、標的核酸配列に対するｇＲＮＡの標的化セグメントは、それに相補的な配列を含む。部位特異的改変ポリペプチドは、核酸ガイド型ヌクレアーゼであってもよい。核酸ガイド型ヌクレアーゼは、当技術分野で公知の、および／または本明細書で提供される任意の核酸ガイド型ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）であってもよい。核酸ガイド型ヌクレアーゼは、ＲＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）によってガイドされ得ることから、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼまたはＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼと称される。
株改良の伝統的な方法
【０２０１】
株改良の伝統的な手法は、２つのタイプの手法：指向株操作およびランダム変異誘発に広く分類され得る。
【０２０２】
株改良の指向操作方法は、特定の生物体の少数の遺伝子エレメントの計画された撹乱を伴う。これらの手法は、典型的には、特定の生合成プログラムまたは発生プログラムをモジュレートすることに着目し、前記経路に影響する遺伝因子および代謝因子の先の知識を利用する。その最も単純な実施形態では、指向操作は、特徴付けられた形質（例えば、遺伝子、プロモーター、または測定可能な表現型を生じさせることができる他の遺伝子エレメント）を、１つの生物体から同じまたは異なる種の別の生物体への移入を伴う。
【０２０３】
株操作のランダム手法は、性能改善を同定するように設計された広範なスクリーニングに加えて、親株のランダム変異誘発を伴う。これらのランダム変異を生じさせる手法には、紫外線への曝露、またはメタンスルホン酸エチルなどの変異誘発化学物質が含まれる。ランダムで概ね予測不可能であるが、株改良のこの伝統的手法は、より指向性の遺伝子マニピュレーションと比較していくつかの利点を有していた。第１に、多くの工業用生物体は、これらの遺伝子レパートリーおよび代謝レパートリーの観点からあまりよく特徴付けられておらず（かつあまりよく特徴付けられていないままであり）、代替の指向改善手法を不可能でなくとも困難にした。
【０２０４】
第２に、比較的よく特徴付けられたシステムにおいてでさえ、工業的性能改善をもたらす遺伝子型の変化は、予測するのが困難であり、時に、既知および未知の機能の多くの遺伝子における累積的変異を必要とする上位性表現型として現れるだけである。
【０２０５】
さらに、長年、所与の工業用生物体において指向ゲノム変異を引き起こすのに要求される遺伝的ツールは、利用可能でなく、または非常に遅く、かつ／もしくは使用するのが困難であった。
【０２０６】
しかし、伝統的な株改良プログラムの適用の拡大により、所与の株系統における獲得が次第に低減し、最終的にさらなる株効率の可能性が枯渇する。有益なランダム変異は、相対的に希有な事象であり、大きいスクリーニングプールおよび高い変異率を必要とする。これは必然的に、「改善された」株における多くの中立のかつ／または有害な（もしくは部分的に有害な）変異の不慮の蓄積をもたらし、それは、最終的に将来の効率向上に対して重荷となる。
【０２０７】
伝統的な累積的改善手法の別の制限事項は、任意の株測定基準に対する任意の特定の変異の効果について分かっている情報が皆無かそれに近いことである。これは基本的に、有益な変異を組み合わせ、統合し、または中立のもしくは有害な変異誘発の「荷物（baggage）」を除去する研究者の能力を制限する。
【０２０８】
変異誘発系統内の株間で変異をランダムに組み換える他の手法および技術が存在する。例えば、ＤＮＡシャッフリング、進化、または分子育種と時に呼ばれる反復的配列組換えのいくつかのフォーマットおよび例は、１９９４年２月１７日に出願された米国特許出願第０８／１９８，４３１号、１９９５年２月１７日に出願された第ＰＣＴ／ＵＳ９５／０２１２６号、１９９５年４月１８日に出願された第０８／４２５，６８４号、１９９５年１０月３０日に出願された第０８／５３７，８７４号、１９９５年１１月３０日に出願された第０８／５６４，９５５号、１９９６年３月２５日に出願された第０８／６２１，８５９号、１９９６年３月２５日に出願された第０８／６２１，４３０号、１９９６年４月１８日に出願された第ＰＣＴ／ＵＳ９６／０５４８０号、１９９６年５月２０日に出願された第０８／６５０，４００号、１９９６年７月３日に出願された第０８／６７５，５０２号、１９９６年９月２７日に出願された第０８／７２１，８２４号、および１９９６年９月２７日に出願された第０８／７２２，６６０号；Stemmer、Science、２７０巻：１５１０頁（１９９５年）；Stemmerら、Gene、１６４巻：４９〜５３頁（１９９５年）；Stemmer、Bio/Technology、１３巻：５４９〜５５３頁（１９９５年）；Stemmer、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.S.A.、９１巻：１０７４７〜１０７５１頁（１９９４年）；Stemmer、Nature、３７０巻：３８９〜３９１頁（１９９４年）；Crameriら、Nature  Medicine、２巻（１号）：１〜３頁（１９９６年）；Crameriら、Nature  Biotechnology、１４巻：３１５〜３１９頁（１９９６年）に記載されている。これらのそれぞれは、すべての目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０２０９】
これらとしては、プロトプラスト融合、および変異された株全体にわたるゲノム組換えを促進する全ゲノムシャッフリングなどの技法が挙げられる。酵母および糸状菌などの一部の工業用微生物について、天然の接合サイクル（mating  cycle）もペアワイズゲノム組換えのために活用することができる。このように、有害な変異を、変異体を親株で「戻し交配する」ことによって除去し、有益な変異を統合することができる。さらに、２つの異なる株系統由来の有益な変異を潜在的に組み合わせることができ、それにより、単一の株系統をそのままで変異させることから入手可能であり得るものよりもさらなる改善可能性がもたらされる。しかし、これらの手法は、多くの制限を受けやすく、それらは、本開示の方法を使用して回避される。
【０２１０】
例えば、上述した伝統的な組換え手法は、遅く、変異をスワップするのに相対的に少数のランダム組換えクロスオーバー事象を利用し、したがって、任意の所与のサイクルまたは期間内に試みることができる組合せの数が限定される。さらに、先行技術における自然組換え事象は、本質的にランダムであるが、これらもゲノムの位置的バイアスを受けやすい。
【０２１１】
最も重要なことに、伝統的な手法はまた、個々の変異の影響についてわずかな情報しか提供せず、組み換えられた変異のランダムな分配に起因して、多くの特定の組合せを生成および評価することができない。
【０２１２】
伝統的な株改良プログラムに関連した上述の問題の多くを克服するために、本開示は、コンピューターで駆動され、分子生物学、自動化、データ分析、および機械学習プロトコールを統合するユニークなＨＴＰゲノム操作プラットフォームを示す。この統合プラットフォームは、ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーを構築するのに使用される一式のＨＴＰ分子ツールセットを利用する。これらの遺伝子設計ライブラリーは、以下で詳しく述べられる。
【０２１３】
現在開示したＨＴＰプラットフォームおよびそのユニークな微生物遺伝子設計ライブラリーは、微生物株発生および進化のパラダイムを基本的にシフトする。例えば、工業用微生物株を開発する伝統的な変異誘発ベース方法は、最終的に、何年ものランダム変異誘発にわたって蓄積された重い変異誘発性ロードを背負った微生物に至る。
【０２１４】
この問題を解決する（すなわち、これらの微生物によって蓄積された遺伝的荷物を除去する）能力は、数十年にわたって微生物研究者が成し遂げられなかった。しかし、本明細書に開示のＨＴＰプラットフォームを利用すると、これらの工業用株を「再建する」ことができ、有害である遺伝子変異を同定および除去することができる。調和して、有益と同定される遺伝子変異を保持し、一部の場合では、改善することができる。結果として生じる微生物株は、これらの親株と比較して優れた表現型形質（例えば、目的の化合物の改善された産生）を実証する。
【０２１５】
さらに、本明細書に教示のＨＴＰプラットフォームは、微生物株性能に対して個々の変異が有する効果を同定し、特徴付け、定量することができる。この情報、すなわち、所与の遺伝子変化ｘが宿主細胞表現型ｙに対してどのような効果を有するか（例えば、目的の化合物または産物の産生）を生成することができ、次いで、以下で論じられる微生物ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーに記憶することができる。すなわち、各遺伝子順列についての配列情報および宿主細胞表現型に対するその効果が１つまたは複数のデータベースに記憶され、後続の分析（例えば、以下で論じられる上位性マッピング（epistasis  mapping））に利用可能である。本開示は、遺伝子挿入コンストラクトの形態で、または前記遺伝子順列を含有する１種または複数の宿主細胞生物体の形態で貴重な遺伝子順列を物理的に保存／記憶する方法も教示する（例えば、以下で論じられるライブラリーを参照）。
【０２１６】
これらのＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーをて洗練されたデータ分析および機械学習プロセスと統合された反復プロセスと結びつけると、宿主細胞を改善するための劇的に異なる方法が出現する。したがって、教示されるプラットフォームは、宿主細胞株を開発する先に論じられた伝統的な方法と基本的に異なる。教示されるＨＴＰプラットフォームは、先の方法に関連した欠点の多くを被らない。これらおよび他の利点は、以下で論じられる、ＨＴＰ分子ツールセットおよび得られる遺伝子設計ライブラリーを参照して明らかである。
概要
【０２１７】
本開示の目的は、糸状菌細胞またはこれに由来するプロトプラストを形質転換し、同核共存体の形質転換体を精製し、精製した形質転換体をスクリーニングするための、ハイスループット方法を提供することによって、上述したすべての限定を回避することである。一般に、本明細書に記載される方法およびシステムは、糸状菌細胞からのプロトプラストを調製すること、調製されたプロトプラストを形質転換すること、プロトプラスト調製のために菌糸体を調製するのに使用される増殖条件を変更することによって、単核を含有するプロトプラストを精製することを伴う。株の精製は、選択および対抗選択を介して、必要に応じて、正確な表現型を有するおよび／または目的の産物を産生する精製した形質転換体をスクリーニングすることを介して達成される。目的の産物は、所望の収率、生産性または力価で産生することができる。好ましくは、プロトプラストが使用されるが、本方法は、他の真菌細胞型にも適用可能である。一部の場合では、本明細書で提供される方法およびシステムは、ハイスループットである。一部の場合では、本明細書で提供される方法およびシステムは、半自動化されたステップ（例えば、形質転換または選択、対抗選択）を含む。一部の場合では、本明細書で提供される方法およびシステムは、完全に自動化されたステップを含む。一部の場合では、本明細書で提供される方法およびシステムは、ハイスループットであり、そこに含まれるステップは、半自動化されているか（例えば、形質転換または選択、対抗選択）または完全に自動化されている。本明細書で使用される場合、ハイスループットは、１日当たり約１，０００個またはそれより多くの形質転換体を評価することが可能な、本明細書で提供される任意の部分的または完全に自動化された方法、特定には、１日当たり５，０００個またはそれより多くの形質転換体を評価することが可能な方法、最も特定には、１日当たり１０，０００個またはそれより多くの形質転換体を評価することが可能な方法を指すことができる。さらに、本方法が実行される好適な体積は、市販の（ディープウェル）マイクロタイタープレートの体積、すなわち１ｍｌより少ないであり、好ましくは５００ｕｌより少ない、より好ましくは２５０ｕｌより少ない、最も好ましくは１．５ｕｌ〜２５０ｕｌ、それでもなお最も好ましくは１０ｕｌ〜１００ｕｌの体積である。
【０２１８】
プロトプラストを調製するのに使用される糸状菌細胞は、それらのホロモルフ、テレオモルフまたはアナモルフを含めた当技術分野で公知の、または本明細書に記載される任意の糸状菌株であり得る。プロトプラストの調製は、本明細書に記載される方法、またはプロトプラスト調製に関する技術分野において公知の任意の方法を使用して実行することができる。
【０２１９】
プロトプラストの形質転換は、本明細書で提供される糸状菌ゲノム中の予め決定された遺伝子座に組み込まれるように設計された少なくとも１つのポリヌクレオチドでなされてもよい。好ましい実施形態では、プロトプラストは、各ポリヌクレオチドコンストラクトが、糸状菌ゲノム中の異なる予め決定された遺伝子座に組み込まれるように設計されるように、本明細書で提供される少なくとも２つのポリヌクレオチドで共形質転換される。予め決定された遺伝子座は、標的糸状菌遺伝子（例えば、そのタンパク質産物がクエン酸産生に関与する遺伝子）または糸状菌ゲノム中に存在する選択可能なマーカー遺伝子に関するものであってもよい。本明細書で提供される方法またはシステムを使用してプロトプラストを形質転換または共形質転換することにおいて使用するためのポリヌクレオチドは、変異および／または遺伝子制御エレメントを含むまたは含有する標的糸状菌遺伝子（例えば、そのタンパク質産物がクエン酸産生に関与する遺伝子）の配列を含んでいてもよい。変異は、核内低分子多形、例えば一塩基多型、配列挿入、欠失、転位、および他の配列の置き換えであり得る。遺伝子制御エレメントは、プロモーター配列（内在性または異種）および／またはターミネーター配列（内在性または異種）であり得る。プロモーターは、誘導性であり得る。本明細書で提供される方法またはシステムを使用してプロトプラストを形質転換または共形質転換することにおいて使用するためのポリヌクレオチドは、選択可能なマーカー遺伝子の配列を含んでいてもよい。本明細書で提供される方法またはシステムを使用してプロトプラストを形質転換または共形質転換することにおいて使用するためのポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの別個の部分のそれぞれが、形質転換されたプロトプラストのゲノム中の同じ標的部位に組み込まれる場合のみ、形質転換されたプロトプラストへのポリヌクレオチド全体の組み込みが起こるように、２つまたはそれより多くの部分に分離することができる。ポリヌクレオチドの各部分は、本明細書で提供される変異および／または遺伝子制御エレメントを含んでいてもよい。一実施形態では、本明細書で提供される方法およびシステムは、第１のポリヌクレオチドが、変異および／または遺伝子制御エレメントを含むまたは含有する標的糸状菌遺伝子（例えば、そのタンパク質産物がクエン酸産生に関与する遺伝子）の配列を含み、一方で第２のポリヌクレオチドが選択可能なマーカー遺伝子の配列を含むように、本明細書で提供されるプロトプラストを２つのポリヌクレオチドで共形質転換することを伴う。この実施形態に加えて、第２のポリヌクレオチドは、プロトプラストのゲノム中の追加の選択可能なマーカー遺伝子に組み込まれるように設計することができ、一方で第１のポリヌクレオチドは、標的糸状菌遺伝子の遺伝子座に、または代替としてよりさらなる選択可能なマーカー遺伝子の遺伝子座に組み込まれるように設計することができる。本明細書で提供される実施形態のいずれかにおける選択可能なマーカー遺伝子は、本明細書に記載される選択可能なマーカー遺伝子のいずれかであってもよい。
【０２２０】
また本開示の目的は、糸状菌細胞から複数のプロトプラストを調製し貯蔵するための方法も提供する。本方法は、真菌培養物中の糸状菌細胞から細胞壁を除去すること、プロトプラストを単離すること、および単離されたプロトプラストを、少なくともジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む混合物中に再懸濁すること、および単離されたプロトプラストを貯蔵することを伴っていてもよい。貯蔵は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または２４時間なされ得る。貯蔵は、少なくとも１、７、１４、３０日またはそれより多くの日数なされ得る。貯蔵は、少なくとも３、６、１２か月、またはそれより多くの月数なされ得る。貯蔵は、４、−２０または−８０℃でなされ得る。真菌培養物は、少なくとも５００ｍｌ、１リットル、２リットル、３リットル、４リットルまたは５リットルの体積を有する培養物であり得る。糸状菌細胞は、本明細書で提供される、または当技術分野で公知の任意の糸状菌であり得る。真菌培養物は、プロトプラストの調製の前に、少なくとも６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２または２４時間増殖させることができる。一実施形態では、真菌培養物が、プロトプラストの調製後、プロトプラストの少なくとも７０％が同核共存体になるような条件下で増殖される。別の実施形態では、細胞壁を除去することは、酵素消化によって実行される。酵素消化は、ベータ−グルカナーゼおよびポリガラクツロナーゼを含む酵素の混合物を用いて実行することができる。酵素消化は、ＶｉｎｏＴａｓｔｅ濃縮物を用いて実行することができる。さらに別の実施形態では、本方法は、プロトプラストを貯蔵する前に、ＤＭＳＯを含む混合物に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を添加することをさらに含む。ＰＥＧは、５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、５％またはそれ未満の最終濃度まで添加できる。さらに別の実施形態では、本方法は、プロトプラストを貯蔵する前に、プロトプラストをマイクロタイタープレートに分配するステップをさらに含む。マイクロタイタープレートは、６ウェル、１２ウェル、２４ウェル、９６ウェル、３８４ウェルまたは１５３６ウェルプレートであり得る。
遺伝子設計＆微生物操作：一式のＨＴＰ分子ツールおよびＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーを利用する株改良の系統的なコンビナトリアル手法
【０２２１】
上述した通り、本開示は、株全体にわたる遺伝子変化の反復性系統的導入および除去によって微生物生物体を操作するための新規ＨＴＰプラットフォームおよび遺伝子設計ストラテジーを提供する。プラットフォームは、ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーの創製を可能にし、所与の宿主株への遺伝子変更の効率的なインプリメンテーションを可能にする一式の分子ツールによって支持される。
【０２２２】
本開示のＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーは、特定の微生物（例えば、糸状菌）株のバックグラウンドに導入され得る可能な遺伝子変更の源として機能を果たす。このように、ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーは、所与の微生物株の初期のまたはさらなる操作に適用され得る遺伝的多様性の宝庫または遺伝子撹乱のコレクションである。宿主株へのインプリメンテーションのために遺伝子設計をプログラムするための技法は、それぞれが本明細書にその全体が参照により組み込まれている、「Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｓｔｒａｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」という表題の係属中の米国特許出願第１５／１４０，２９６号および係属中の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１７／２９７２５号に記載されている。
【０２２３】
このプラットフォームで利用されるＨＴＰ分子ツールセットは、とりわけ、（１）プロモータースワップ（ＰＲＯスワップ）、（２）ＳＮＰスワップ、（３）開始／停止コドン交換、（４）ＳＴＯＰスワップ、および（５）配列最適化を含み得る。本開示のＨＴＰ方法は、（６）上位性マッピングプロトコール、を含めたＨＴＰツールセットの統合／コンビナトリアル使用を指示するための方法も教示する。上述した通り、この一式の分子ツールは、単独または組合せのいずれかで、ＨＴＰ遺伝子設計宿主細胞ライブラリーの創製を可能にする。
【０２２４】
実証されるように、教示されるＨＴＰ微生物操作プラットフォームとの関連で上述のＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーを利用すると、有益な「原因となる」変異または遺伝子区画の同定および統合、ならびにまた、受動変異または有害な変異または遺伝子区画の同定および除去が可能になる。この新しい手法は、伝統的なランダム変異誘発または指向遺伝子操作（directed  genetic  engineering）によって達成することができなかった株性能の急速な改善を可能にする。遺伝的荷重を除去し、または遺伝的荷重を有さない株内に有益な変化を統合すると、さらなる改善を可能にし得る追加のランダム変異誘発の新しい、ロバストな出発点も提供される。
【０２２５】
一部の実施形態では、本開示は、オルソゴナルな有益な変化が、変異誘発株系統の様々な個別分岐にわたって同定されるので、これらを、より良好に働く株へと急速に統合することもできることを教示する。これらの変異はまた、変異誘発系統の一部でない株、例えば、指向遺伝子操作によって獲得される改良を有する株へと統合され得る。
【０２２６】
一部の実施形態では、本開示は、それが、発現および非発現遺伝子エレメントを含む複数の異なるゲノム領域にわたって変異のゲノムワイドコンビナトリアル効果を分析し、集められた情報（例えば、実験結果）を使用して株を増強させることが予期される変異組合せを予測するという点で公知の株改良手法と異なる。
【０２２７】
一部の実施形態では、本開示は、ｉ）開示される開示を介した改良に適用できる工業用微生物および他の宿主細胞、ｉｉ）下流分析のための多様性プールの生成、ｉｉｉ）大きいバリアントプールをハイスループットスクリーニングおよびシーケンシングするための方法およびハードウェア、ｉｖ）ゲノムワイド変異の相乗効果の機械学習コンピューター分析および予測のための方法およびハードウェア、ならびにｖ）ハイスループット株操作のための方法を教示する。
【０２２８】
以下の分子ツールおよびライブラリーは、例示的な微生物例の観点から論じられている。当業者は、本開示のＨＴＰ分子ツールは、真核細胞およびより高等の生命体を含めた任意の宿主細胞、例えば糸状菌細胞（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）における同じ原理およびプロセスを展開できるものなどに適合することを認識する。
【０２２９】
微生物操作プラットフォームで利用される様々なＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーの創製を可能にする同定されたＨＴＰ分子ツールセットのそれぞれを、次に論じる。
１．プロモータースワップ：プロモータースワップ微生物株ライブラリーを得るための分子ツール
【０２３０】
一部の実施形態では、本開示は、全宿主株表現型に対する有益な効果（例えば、収率または生産性）を生じさせるのに最適な発現性質を有するプロモーターを選択する方法を教示する。
【０２３１】
例えば、一部の実施形態では、本開示は、一連の発現強度（例えば、以下に論じられるプロモーターラダー）、または優れた調節性質（例えば、選択された遺伝子のより厳格な調節制御）を呈する、宿主細胞内の１つもしくは複数のプロモーターを同定し、かつ／または１つもしくは複数のプロモーターのバリアントを生成する方法を教示する。これらの同定および／または生成されるプロモーターの特定の組合せを、以下でより詳細に説明されるプロモーターラダーとして一緒にグループ化することができる。
【０２３２】
次いで、問題のプロモーターラダーは、目的の所与の遺伝子と関連させられる。よって、プロモーターＰ１〜Ｐ８（一連の発現強度を呈するように同定および／または生成された８つのプロモーターを表す）を有し、プロモーターラダーを微生物中の目的の単一遺伝子と関連させる（すなわち、所与の標的遺伝子に作動可能に連結した所与のプロモーターで微生物を遺伝的に操作する）場合、８つのプロモーターの各組合せの効果を、操作された微生物が標的遺伝子と関連した特定のプロモーター（複数可）を除いて他の点では同一の遺伝的バックグラウンドを有することを考慮して、各コンビナトリアル取り組みの結果として生じる操作された株のそれぞれを特徴付けることによって確認することができる。
【０２３３】
このプロセスを介して操作された結果として生じる微生物は、ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーを形成する。
【０２３４】
具体的な実施形態では、本明細書で提供されるプロモータースワッピング（ＰＲＯスワップ）方法は、特定の条件下で増殖した場合、糸状菌細胞の形態において役割を果たすかまたはそれに影響することが示された、またはその疑いのある遺伝子（標的の形態学的な遺伝子と称される）と、表１に表示されたプロモーターラダーからの各プロモーターを系統的に関連付けることを伴う。遺伝子の撹乱は、所望の形態学的な表現型を引き起こす可能性がある。産生培地（例えば、ＣＡＰ培地）の液中での培養で増殖させた場合、所望の表現型は、菌糸体ではないペレット状の形態であってもよい。よって、プロモーターＰ１〜Ｐ４（一連の発現強度を呈するように同定および／または生成された表１からの４つのプロモーターを表す）を有し、プロモーターラダーを、微生物中の単一の標的の形態学的な目的の遺伝子と関連付ける場合（すなわち、所与の標的の形態学的な遺伝子に作動可能に連結した所与のプロモーターを有する微生物を遺伝的に操作する場合）、４つのプロモーターの各組合せの効果を、操作された微生物が具体的な標的の形態学的な遺伝子に関連した特定のプロモーターを除いて他の点では同一の遺伝的バックグラウンドを有することを考慮して、各コンビナトリアル取り組みの結果として生じる操作された株のそれぞれを特徴付けることによって確認することができる。このプロセスを介して操作される結果として生じる微生物は、ＨＴＰ形態学的遺伝子設計ライブラリーを形成することができる。糸状菌細胞の形態において役割を果たすかまたはそれに影響することが示された、またはその疑いのある遺伝子は、当技術分野で公知の、および／または本明細書で提供される任意のそのような遺伝子であり得る。
【０２３５】
ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーは、このプロセスを介して形成される実際の物理的な微生物株コレクションを指すことができ、各メンバー株は、他の点では同一の遺伝的バックグラウンドにおいて、特定の標的遺伝子に作動可能に連結した所与のプロモーターを代表し、前記ライブラリーは、「プロモータースワップ微生物株ライブラリー」と呼ばれる。糸状菌（例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒ）の特定の文脈において、ライブラリーは、「プロモータースワップ糸状菌株ライブラリー」、または「プロモータースワップＡ．ｎｉｇｅｒ株ライブラリー」と呼ばれる場合もあるが、この用語は、糸状菌またはＡ．ｎｉｇｅｒが微生物または多核体生物体の具体的な例である場合、同意語として使用することができる。
【０２３６】
さらに、ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーは、遺伝子撹乱のコレクションを指すことができ、この場合、所与のプロモーターｘは、所与の遺伝子ｙに作動可能に連結しており、前記コレクションは、「プロモータースワップライブラリー」と呼ばれる。
【０２３７】
さらに、プロモーターＰ１〜Ｐ８を含む同じプロモーターラダーを利用して微生物を操作することができ、ここで、８つプロモーターのそれぞれは、１０の異なる遺伝子標的に作動可能に連結される。この手順の結果は、目的の標的遺伝子に作動可能に連結した特定のプロモーターを除いて、他の点では遺伝的に同一と仮定される８０の微生物である。これらの８０の微生物は、適切にスクリーニングし、特徴付け、別のＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーを生じさせることができる。ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリー内の微生物株を特徴付けると、リレーショナルデータベース、オブジェクト指向データベース、または大規模分散ＮｏＳＱＬデータベースを含めた任意のデータ記憶コンストラクトに記憶することができる情報およびデータが生じる。このデータ／情報は、例えば、所与の遺伝子標的に作動可能に連結しているときの所与のプロモーター（例えば、Ｐ１〜Ｐ８）の効果であり得る。このデータ／情報は、プロモーターＰ１〜Ｐ８のうちの２つまたはそれ超を所与の遺伝子標的に作動可能に連結することから生じるより広いセットのコンビナトリアル効果でもあり得る。
【０２３８】
８のプロモーターおよび１０の標的遺伝子の上述の例は、単に例示的であり、その理由は、この概念は、一連の発現強度および任意の所与の数の標的遺伝子の呈示に基づいて一緒にグループ化された任意の所与の数のプロモーターを用いて適用することができるためである。当業者は、任意の遺伝子標的の前に２つまたはそれ超のプロモーターを作動可能に連結する能力も認識する。よって、一部の実施形態では、本開示は、プロモーターラダー由来の１、２、３、またはそれ超のプロモーターが１つまたは複数の遺伝子に作動可能に連結したプロモータースワップライブラリーを教示する。
【０２３９】
要約すると、様々なプロモーターを利用して生物体内の様々な遺伝子の発現を駆動することは、目的の形質を最適化する強力なツールである。本発明者らが開発したプロモータースワッピングの分子ツールは、少なくとも１つの条件下で少なくとも１つの遺伝子座の発現を変更することが実証されたプロモーター配列のラダー（例えば、表１）を使用する。次いでこのラダーは、ハイスループットゲノム操作を使用して生物体内の遺伝子の群（例えば、本明細書で提供されるＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８と同じ経路内の）に系統的に適用される。この群の遺伝子は、いくつかの方法のいずれか１つに基づいて目的の形質に影響を与える高い見込みを有すると決定される。これらは、目的の形質に対する公知の機能もしくは影響に基づく選択物、または先に決定された有益な遺伝的多様性に基づくアルゴリズム選択物を含み得る。一部の実施形態では、遺伝子の選択物は、所与の宿主内のすべての遺伝子を含み得る。他の実施形態では、遺伝子の選択物は、ランダムに選択された所与の宿主内のすべての遺伝子のサブセットであり得る。
【０２４０】
次いで、遺伝子に連結したプロモーター配列を含有する生物体の結果として生じるＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーが、ハイスループットスクリーニングモデルにおいて性能について評価され、性能を増大させるプロモーター−遺伝子連鎖が決定され、情報がデータベースに記憶される。遺伝子撹乱（すなわち、所与の遺伝子ｙに作動可能に連結した所与のプロモーターｘ）のコレクションは、「プロモータースワップライブラリー」を形成し、これは、微生物操作処理で利用される潜在的な遺伝子変更の源として利用することができる。経時的に、より大きいセットの遺伝子撹乱は、より多様な宿主細胞バックグラウンドに対してインプリメントされるので、各ライブラリーは、実験的に確認されたデータのコーパスとしてより強力になり、それを使用して目的の任意のバックグラウンドに対する標的とした変化をより正確かつ予想通りに設計することができる。
【０２４１】
生物体内の遺伝子の転写レベルは、生物体挙動に影響するための重要な管理点である。転写は、翻訳（タンパク質発現）としっかりと共役し、このタンパク質は、生物体挙動を決定する量で発現される。細胞は、数千の異なるタイプのタンパク質を発現し、これらのタンパク質は、多数の複雑なやり方で相互作用して機能を生み出す。一連のタンパク質の発現レベルを系統的に変更することによって、機能は、複雑性のために、予測することが困難であるように変更され得る。一部の変更は、性能を増大させることができ、したがって、性能を評価するための機構と連関して、この技法は、機能が改善された生物体の生成を可能にする。
【０２４２】
低分子合成経路との関連で、酵素は、基質で始まり、目的の低分子で終わる、直鎖または分岐鎖中で該酵素の低分子基質および産物を介して相互作用する。これらの相互作用は、順次連結されるので、このシステムは、分散制御を呈し、１つの酵素の発現の増大は、別の酵素が律速となるまで経路フラックスを増大させることができるだけである。
【０２４３】
代謝制御分析（ＭＣＡ）は、実験データおよび第１原理から、どの１つまたは複数の酵素が律速であるかを決定するための方法である。しかし、ＭＣＡは、それが新しい律速な酵素を決定するのに各発現レベル変化後に広範な実験を必要とするので、限定されている。プロモータースワッピングは、この状況において有利であり、その理由は、プロモーターラダーを経路内の各酵素に適用することによって、律速の酵素が見出され、同じことを後続のラウンドで行って律速となる新しい酵素を見出すことができるためである。さらに、機能の読み取りは、目的の低分子のより良好な産生であるので、どの酵素が律速であるかを決定する実験は、産生を増大させる操作と同じであり、よって開発時間を短縮する。一部の実施形態では、本開示は、多ユニット酵素の個々のサブユニットをコードする遺伝子へのＰＲＯスワップの適用を教示する。さらに他の実施形態では、本開示は、個々の酵素、または生合成経路全体の調節を担う遺伝子にＰＲＯスワップ技法を適用する方法を教示する。
【０２４４】
一部の実施形態では、本開示のプロモータースワップツールを使用して、選択された遺伝子標的の最適の発現を同定する。一部の実施形態では、プロモータースワップの目標は、標的遺伝子の発現を増大させて代謝経路または遺伝経路における障壁を低減することであり得る。他の実施形態では、プロモータースワップの目標は、前記標的遺伝子の発現が要求されないとき、標的遺伝子の発現を低減して、宿主細胞内の不要なエネルギー消費を回避することであり得る。
【０２４５】
転写、輸送、またはシグナル伝達のような他の細胞系という状況で、様々な合理的な方法を使用して、どのタンパク質が発現変化の標的であり、その変化が何であるべきかを経験的に試みて見出すことができる。これらの合理的な方法は、性能を改善するものを見出すのに試験されなければならない撹乱の数を低減するが、これらは、かなりのコストでそれを行う。遺伝子欠失スタディにより、その存在が特定の機能に極めて重要であるタンパク質が同定され、次いで重要な遺伝子を過剰発現させることができる。タンパク質相互作用の複雑性に起因して、これは、性能の増大において効果的でないことが多い。細胞におけるタンパク質レベルの関数として転写またはシグナル伝達挙動を第１原理から記述することを試みる異なるタイプのモデルが開発された。これらのモデルは、多くの場合、発現変化が異なる機能または改善された機能をもたらし得る標的を示唆する。これらのモデルの根底をなす仮定は、過度に単純化されており、パラメータは、測定するのが困難であり、したがって、これらが行う予測は、特に非モデル生物体について誤っていることが多い。遺伝子欠失およびモデル化の両方を用いると、ある特定の遺伝子にどのように影響するかを決定するのに要求される実験は、性能を改善する変化を起こすための後続の仕事と異なる。プロモータースワッピングは、これらの課題を回避し、その理由は、特定の撹乱の重要性を強調する構築された株も、すでに改良された株であるためである。
【０２４６】
よって、特定の実施形態では、プロモータースワッピングは、
【０２４７】
１．「ラダー」として作用する一連の「ｘ」プロモーターを選択するステップ。理想的にはこれらのプロモーターは、多重ゲノム遺伝子座全体にわたって高度に多様な発現をもたらすことが示されているが、唯一の要件は、これらが遺伝子発現を何らかのやり方で撹乱することである。
【０２４８】
２．標的にする「ｎ」遺伝子のセットを選択するステップ。このセットは、ゲノム中のあらゆるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、またはＯＲＦのサブセットであり得る。サブセットは、先に実証された有益な撹乱（先のプロモータースワップもしくは先のＳＮＰスワップ）との関連によって、先に生成された撹乱間の上位性相互作用に基づくアルゴリズム選択、標的にする有益なＯＲＦに関する仮説に基づく他の選択判定基準によって、またはランダム選択を介して、機能に関連したＯＲＦについてのアノテーションを使用して選択することができる。他の実施形態では、「ｎ」標的化遺伝子は、非コードＲＮＡを含めた非タンパク質コード遺伝子を含み得る。一実施形態では、「ｎ」遺伝子のセットは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＬＮ１遺伝子のオルソログおよび同じ経路の一部である１つまたは複数の遺伝子のオルソログであり得る。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＬＮ１遺伝子および同じ経路の一部である１つまたは複数の遺伝子のオルソログは、野生型であってもよいし、前記遺伝子の変異形態であってもよい。一実施形態では、糸状菌株または宿主細胞は、Ａ．ｎｉｇｅｒであり、選択された「ｎ」遺伝子のセットは、表４中のＳＮＰである。Ａ．ｎｉｇｅｒが宿主細胞である別の実施形態では、選択された「ｎ」遺伝子のセットは、非ＳＮＰであるか、または表４中のＳＮＰを含有する遺伝子の野生型バージョンである。Ａ．ｎｉｇｅｒが宿主細胞である場合、「ｎ」遺伝子のセットは、表４に見出されるＦｕｎｇｉＳＮＰ＿９に関する遺伝子、それに加えて同じ経路の一部である１つまたは複数の遺伝子であってもよい。Ａ．ｎｉｇｅｒが宿主細胞である場合、「ｎ」遺伝子のセットは、表４に見出されるＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１２に関する遺伝子、それに加えて同じ経路の一部である１つまたは複数の遺伝子であってもよい。Ａ．ｎｉｇｅｒが宿主細胞である場合、「ｎ」遺伝子のセットは、表４に見出されるＦｕｎｇｉＳＮＰ＿４０に関する遺伝子、それに加えて同じ経路の一部である１つまたは複数の遺伝子であってもよい。好ましい実施形態では、Ａ．ｎｉｇｅｒが宿主細胞である場合、「ｎ」遺伝子のセットは、表４からのＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８（すなわち、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＬＮ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログの変異形態）に関する遺伝子、それに加えて同じ経路の一部である１つまたは複数の遺伝子であってもよい。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＬＮ１遺伝子および／または同じ経路中の１つまたは複数の遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログは、その遺伝子の野生型または変異形態であってもよい。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＬＮ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログの変異形態は、配列番号１３を有する形態であってもよい。その経路中の１つまたは複数の遺伝子は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｙｐｄ１、Ｓｋｎ７、Ｓｓｋ１およびＳｓｋ２遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログまたはこれらの任意の組合せであってもよい。同じ経路の一部である１つまたは複数の遺伝子は、配列番号１５、１６、１７、１８、１９またはこれらの任意の組合せによって表される核酸配列から選択することができる。
【０２４９】
３．以下の遺伝子改変を迅速に、かつ一部の実施形態では、並行して実行するためのハイスループット株操作：生来のプロモーターが標的遺伝子ｎの前に存在し、その配列が公知であるとき、生来のプロモーターをラダー内のｘプロモーターのそれぞれで置き換える。生来のプロモーターが存在せず、またはその配列が未知であるとき、ラダー内のｘプロモーターのそれぞれを遺伝子ｎの前に挿入する（例えば、図１０を参照）。このように、株の「ライブラリー」（ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーとも呼ばれる）が構築され、ライブラリーの各メンバーは、他の点では同一の遺伝子状況（genetic  context）においてｎ標的に作動可能に連結したｘプロモーターの一事例である。先に記載したように、プロモーターの組合せを挿入し、ライブラリーが構築される組み合わせの可能性（combinatorial  possibility）の範囲を拡張することができる。
【０２５０】
４．１つまたは複数の測定基準に対する株の性能が最適化されている性能を示す状況における株のライブラリーのハイスループットスクリーニング。
を含むマルチステッププロセスである。
【０２５１】
この基本プロセスを拡張して、とりわけ、（１）相互作用プロセスにおいて１つずつ、または単一ステップにおける複数の変化として、単一株バックグラウンド内に複数の有益な撹乱を統合することによって、株性能をさらに改善することができる。複数の撹乱は、確定した変化の特定のセット、または変化の部分的にランダム化されたコンビナトリアルライブラリーのいずれかであり得る。例えば、標的のセットが経路内のあらゆる遺伝子である場合、撹乱のライブラリーを株の先のライブラリーの改善された１つまたは複数のメンバー内に逐次再生すると、任意の所与の反復においてどの遺伝子が律速であるかにかかわらず経路内の各遺伝子の発現レベルを最適化することができ；（２）ライブラリーの個々のおよびコンビナトリアル生成の結果として生じる性能データを、そのデータを使用して各撹乱の相互作用に基づいて撹乱の最適のセットを予測するアルゴリズムに送り；（３）上記２つの手法の組合せをインプリメントする。
【０２５２】
上記に論じた分子ツールまたは技法は、プロモータースワッピングとして特徴付けられるが、プロモーターに限定されず、一連の標的の発現レベルを系統的に変更する他の配列変化を含み得る。一連の遺伝子の発現レベルを変更するための他の方法は、ａ）リボソーム結合部位（または真核生物内のコザック配列）のラダー；ｂ）各標的の開始コドンの他の開始コドンのそれぞれでの置き換え（すなわち、以下に論じられる開始／停止コドン交換）；ｃ）転写物の５’もしくは３’末端への、または任意の他の場所における配列を安定化し、または不安定にする様々なｍＲＮＡの結合、ｄ）タンパク質中の任意の場所における配列を安定化し、または不安定にする様々なタンパク質の結合を含み得る。
【０２５３】
手法は、工業用微生物を用いて本開示において例示されているが、所望の形質が遺伝子変異体の集団において同定され得る任意の生物体に適用可能である。例えば、これは、ＣＨＯ細胞、酵母、昆虫細胞、藻類、および植物などの多細胞生物の性能を改善するのに使用することができる。
２．ＳＮＰスワップ：ＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーを得るための分子ツール
【０２５４】
ある特定の実施形態では、ＳＮＰスワッピングは、微生物株改良のランダム変異誘発手法ではなく、むしろ、株全体にわたる個々の核内低分子多形ヌクレオチド変異（すなわちＳＮＰ）の系統的な導入または除去を伴う（それが名称「ＳＮＰスワッピング」の由来である）。図９は、概念的に、本発明の糸状菌細胞におけるＳＮＰスワッピングのラウンドを示す。図４２に、糸状菌細胞におけるＳＮＰスワッピングの有用性の実証を示す。
【０２５５】
一実施形態では、本明細書で提供される方法およびシステムは、個々のＳＮＰまたはＳＮＰの組合せを有する糸状菌を含む糸状菌ライブラリーを生成するためのＳＮＰスワッピングに利用される。コンビナトリアルＳＮＰスワッピングは、図３７で例示されるような２つの部分からなる形質転換を使用して達成することができる。
【０２５６】
このプロセスを介して操作される結果として生じる微生物は、ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーを形成する。
【０２５７】
ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーは、このプロセスを介して形成される実際の物理的な微生物株コレクションを指すことができ、各メンバー株は、他の点では同一の遺伝的バックグラウンドにおいて、所与のＳＮＰの存在または非存在を代表し、前記ライブラリーは、「ＳＮＰスワップ微生物株ライブラリー」と呼ばれる。糸状菌（例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒ）の具体的な文脈において、ライブラリーは、「ＳＮＰスワップ糸状菌株ライブラリー」、または「ＳＮＰスワップＡ．ｎｉｇｅｒ株ライブラリー」と呼ぶことができるが、これらの用語は、糸状菌が微生物または多核体生物体の具体的な例であることから、同意語として使用することができる。
【０２５８】
さらに、ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーは、遺伝子撹乱のコレクションを指すことができ、この場合、所与のＳＮＰが存在し、または所与のＳＮＰが存在せず、前記コレクションは、「ＳＮＰスワップライブラリー」と呼ばれる。
【０２５９】
一部の実施形態では、ＳＮＰスワッピングでは、同定された有益な性能効果を有する標的ＳＮＰ「ビルディングブロック」の最適な組合せを用いて宿主生物を再構築する。よって、一部の実施形態では、ＳＮＰスワッピングでは、反復プロセスにおいて１つずつ、または単一ステップにおける複数の変化としてのいずれかで、単一株バックグラウンド内に複数の有益な変異を統合することを伴う。複数の変化は、確定した変化の特定のセット、または変異の部分的にランダム化されたコンビナトリアルライブラリーのいずれかであり得る。
【０２６０】
他の実施形態では、ＳＮＰスワッピングでは、反復プロセスにおいて１つずつ、または単一ステップにおける複数の変化としてのいずれかで、株から有害と同定された複数の変異の除去も関与する。複数の変化は、規定された変化の特定のセット、または変異の部分的にランダム化されたコンビナトリアルライブラリーのいずれかであり得る。一部の実施形態では、本開示のＳＮＰスワッピング方法は、有益なＳＮＰの付加ならびに有害なおよび／または中立の変異の除去の両方を含む。
【０２６１】
ＳＮＰスワッピングは、変異誘発および目的とする形質改善のための選択に供された株の系統における有益および有害な変異の両方を同定および活用する強力なツールである。ＳＮＰスワッピングは、ハイスループットゲノム操作技法を利用して、変異誘発系統における個々の変異の影響を系統的に決定する。ゲノム配列は、既知の性能改善を有する変異誘発系統の１つまたは複数の世代にわたる株について決定される。次いでハイスループットゲノム操作が系統的に使用されて、より早期の系統株における改良された株由来の変異を反復し、かつ／またはより後期の株内の変異をより早期の株配列に戻す。次いでこれらの株の性能が評価され、目的の改善された表現型に対する各個々の変異の寄与を決定することができる。上述した通り、このプロセスから生じる微生物株が分析され／特徴付けられ、宿主株全体にわたる微生物株改良を通知することができるＳＮＰスワップ遺伝子設計ライブラリーの基礎を形成する。
【０２６２】
有害な変異を除去すると、即時に性能を改善することができ、変異誘発荷重に供されていない株バックグラウンド内の有益な変異を統合すると、株性能を迅速かつ大いに改善することができる。ＳＮＰスワッピングプロセスを介して生成される様々な微生物株は、ＨＴＰ遺伝子設計ＳＮＰスワッピングライブラリーを形成し、それは、様々な付加／欠失／または統合されたＳＮＰを含むが、他の点では同一の遺伝的バックグラウンドを有する微生物株である。
【０２６３】
先に論じた通り、性能改善のためのランダム変異誘発および後続のスクリーニングは、工業用株改良のために一般に使用される技法であり、大規模製造に現在使用されている多くの株は、長年、時に数十年の期間にわたって反復してこのプロセスを使用して開発されてきた。ゲノム変異の生成のランダム手法、例えば、ＵＶ放射線またはメタンスルホン酸エチルなどの化学的変異誘発物質への曝露は、工業用株改良の好適な方法であった。その理由は、１）工業用生物体は、遺伝的または代謝的にあまりよく特徴付けられておらず、指向改善手法のための標的選択を困難または不可能にする場合があり、２）相対的に十分に特徴付けられたシステムにおいてでさえ、工業的性能改善をもたらす変化は、予測するのが困難であり、既知の機能を有さない遺伝子の撹乱を必要とする場合があり、３）所与の工業用生物体において指向ゲノム変異を作製するための遺伝的ツールは、利用可能でなく、または非常に遅く、かつ／もしくは使用するのが困難である場合があるためである。
【０２６４】
しかし、このプロセスの上述の利益にもかかわらず、いくつかの公知の不利点も存在する。有益な変異は、相対的に希有な事象であり、定まったスクリーニング能力を用いてこれらの変異を見出すために、変異率は、十分に高くなければならない。これにより、望まれない中立のおよび部分的に有害な変異が有益な変化とともに株内に組み入れられることが多い。経時的に、この「変異誘発荷重」が蓄積し、全体的なロバスト性、および増殖速度などの重要な形質が欠損した株を生じる。最終的に、「変異誘発荷重」は、ランダム変異誘発による性能のさらなる改善を得ることをますます困難または不可能にする。適当なツールを用いない場合、株系統の個別分岐および並列分岐に見出される有益な変異を統合することが不可能である。
【０２６５】
ＳＮＰスワッピングは、変異誘発系統内の株を比較するとき観察される一部またはすべての変異を系統的に反復し、または戻すことによってこれらの制限事項を克服する一手法である。このように、有益な（「原因となる」）変異を同定および統合することもでき、かつ／または有害な変異を同定および除去することもできる。これにより、さらなるランダム変異誘発または標的化遺伝子操作によって達成することができなかった株性能の迅速な改善が可能になる。
【０２６６】
遺伝的荷重を除去し、または有益な変化を遺伝的荷重が無い株内に統合すると、さらなる改善を可能にすることができる追加のランダム変異誘発の新しいロバストな出発点ももたらされる。
【０２６７】
さらに、オルソゴナルな有益な変化が、変異誘発株系統の様々な個別分岐にわたって同定されるので、これらを、より良好に働く株へと急速に統合することができる。これらの変異はまた、変異誘発系統の一部でない株、例えば、指向遺伝子操作によって獲得される改良を有する株へと統合され得る。
【０２６８】
変異誘発系統内の株間の変異をランダムに組み換える他の手法および技術が存在する。これらとしては、プロトプラスト融合、および変異された株全体にわたるゲノム組換えを促進する全ゲノムシャッフリングなどの技法が挙げられる。酵母および糸状菌などの一部の工業用微生物について、天然の接合サイクルもペアワイズゲノム組換えのために活用することができる。このように、有害な変異を、変異体を親株で「戻し交配する」ことによって除去し、有益な変異を統合することができる。しかし、これらの手法は、多くの制限を受けやすく、それは、本開示のＳＮＰスワッピング方法を使用して回避される。
【０２６９】
例えば、これらの手法は、変異をスワップするのに相対的に少数のランダム組換えクロスオーバー事象を利用するので、株性能を最適化するのに組換えおよびスクリーニングの多くのサイクルを要し得る。さらに、天然の組換え事象は、本質的にランダムであるが、これらもゲノムの位置的偏りを受けやすく、一部の変異は、対処するのが困難であり得る。これらの手法はまた、追加のゲノムシーケンシングおよび分析を伴わない個々の変異の影響についてわずかな情報しか提供しない。ＳＮＰスワッピングは、これらの基本的な制限事項を克服し、その理由は、それがランダム手法ではなく、むしろ、株全体にわたる個々の変異の系統的な導入または除去であるためである。
【０２７０】
一部の実施形態では、本開示は、多様性プールの生物体の中に存在するＳＮＰ配列多様性を同定するための方法を教示する。多様性プールは、分析に利用される所与の数ｎの微生物であり得、前記微生物のゲノムは、「多様性プール」を代表する。
【０２７１】
特定の態様では、多様性プールは、特定の時点における「ベースライン」または「参照」遺伝子配列を有する元の親株（Ｓ１）（Ｓ１Ｇｅｎ１）、および次いで前記Ｓ１株に由来し／それから開発された、かつＳ１のベースラインゲノムに関して異なるゲノムを有する任意の数の後続の子孫株（Ｓ２−ｎ）（Ｓ２−ｎＧｅｎ２−ｎ）であり得る。
【０２７２】
例えば、一部の実施形態では、本開示は、多様性プール内の微生物ゲノムをシーケンシングして各株内に存在するＳＮＰを同定することを教示する。一実施形態では、多様性プールの株は、歴史的な微生物産生株である。よって、本開示の多様性プールは、例えば、工業用参照株、および伝統的な株改良プログラムを介して産生された１つまたは複数の変異工業用株を含み得る。
【０２７３】
一部の実施形態では、多様性プール内のＳＮＰは、「参照株」を参照して決定される。一部の実施形態では、参照株は、野生型株である。他の実施形態では、参照株は、任意の変異誘発に供される前の元の工業用株である。参照株は、専門家が定義することができ、元の野生型株または元の工業用株である必要はない。基準株は、前記参照株に由来し、またはそれから開発された後続の株が比較される「基準」、「参照」、または元の遺伝的バックグラウンドと見なされるものを単に代表する。
【０２７４】
多様性プール内のすべてのＳＮＰが同定されると、本開示は、ＳＮＰスワッピングの方法およびスクリーニング方法を教示して、個々にかつ／または群内でＳＮＰの効果（例えば、目的の表現型の創製）を描写する（すなわち、定量し、特徴付ける）。
【０２７５】
一部の実施形態では、本開示のＳＮＰスワッピング方法は、変異株（例えば、Ｓ２−ｎＧｅｎ２−ｎの中からの株）内で同定された１つまたは複数のＳＮＰを参照株（Ｓ１Ｇｅｎ１）または野生型株に導入する（「ウェーブアップ」）ステップを含む。
【０２７６】
他の実施形態では、本開示のＳＮＰスワッピング方法は、変異株（例えば、Ｓ２−ｎＧｅｎ２−ｎの中からの株）内で同定された１つまたは複数のＳＮＰを除去する（「ウェーブダウン」）ステップを含む。
【０２７７】
一部の実施形態では、１つまたは複数のＳＮＰ変化（導入または除去のいずれか）を含むそれぞれの生成された株は、培養され、本開示の１つまたは複数の判定基準（例えば、目的の化学物質または産物の産生）下で分析される。分析された宿主株のそれぞれからのデータは、宿主株内に存在する特定のＳＮＰまたはＳＮＰの群と関連付けられ、または相関付けられ、将来使用するために記録される。よって、本開示は、任意の数の目的の微生物遺伝的または表現型形質に対する所与のＳＮＰの効果を同定することができる、大きい、高度にアノテートされたＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーの創製を可能にする。これらのＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーに記憶された情報は、ＨＴＰゲノム操作プラットフォームの機械学習アルゴリズムに知らせ、プロセスの将来の反復を指示し、それは最終的に、高度に望ましい性質／形質を有する進化した微生物生物体をもたらす。
３．開始／停止コドン交換：開始／停止コドン微生物株ライブラリーを得るための分子ツール
【０２７８】
一部の実施形態では、本開示は、開始および停止コドンバリアントをスワップする方法を教示する。例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよび哺乳動物の典型的な停止コドンは、それぞれＴＡＡ（ＵＡＡ）およびＴＧＡ（ＵＧＡ）である。単子葉植物の典型的な停止コドンは、ＴＧＡ（ＵＧＡ）であり、一方、昆虫およびＥ．ｃｏｌｉは一般に、停止コドンとしてＴＡＡ（ＵＡＡ）を使用する（Dalphinら（１９９６年）、Nucl.  Acids  Res.、２４巻：２１６〜２１８頁）。他の実施形態では、本開示は、ＴＡＧ（ＵＡＧ）停止コドンの使用を教示する。
【０２７９】
本開示は、開始コドンをスワップすることを同様に教示する。一部の実施形態では、本開示は、ほとんどの生物体（特に真核生物）によって利用されているＡＴＧ（ＡＵＧ）開始コドンの使用を教示する。一部の実施形態では、本開示は、原核生物は、ＡＴＧ（ＡＵＧ）を最も多く使用し、その後にＧＴＧ（ＧＵＧ）およびＴＴＧ（ＵＵＧ）が続くことを教示する。
【０２８０】
他の実施形態では、本開示は、ＡＴＧ開始コドンをＴＴＧで置き換えることを教示する。一部の実施形態では、本開示は、ＡＴＧ開始コドンをＧＴＧで置き換えることを教示する。一部の実施形態では、本開示は、ＧＴＧ開始コドンをＡＴＧで置き換えることを教示する。一部の実施形態では、本開示は、ＧＴＧ開始コドンをＴＴＧで置き換えることを教示する。一部の実施形態では、本開示は、ＴＴＧ開始コドンをＡＴＧで置き換えることを教示する。一部の実施形態では、本開示は、ＴＴＧ開始コドンをＧＴＧで置き換えることを教示する。
【０２８１】
他の実施形態では、本開示は、ＴＡＡ停止コドンをＴＡＧで置き換えることを教示する。一部の実施形態では、本開示は、ＴＡＡ停止コドンをＴＧＡで置き換えることを教示する。一部の実施形態では、本開示は、ＴＧＡ停止コドンをＴＡＡで置き換えることを教示する。一部の実施形態では、本開示は、ＴＧＡ停止コドンをＴＡＧで置き換えることを教示する。一部の実施形態では、本開示は、ＴＡＧ停止コドンをＴＡＡで置き換えることを教示する。一部の実施形態では、本開示は、ＴＡＧ停止コドンをＴＧＡで置き換えることを教示する。
４．Ｓｔｏｐスワップ：ＳＴＯＰスワップ微生物株ライブラリーを得るための分子ツール
【０２８２】
一部の実施形態では、本開示は、細胞遺伝子転写の最適化によって宿主細胞生産性を改善する方法を教示する。遺伝子転写は、転写開始（ＲＮＡｐ動員および転写複合体形成）、伸長（鎖合成／拡張）、ならびに転写終結（ＲＮＡｐ脱離および終結）を含めたいくつかの別個の生物学的現象の結果である。多くの関心が、遺伝子の転写モジュレーションによる（例えば、プロモーターを変更し、または調節転写因子を誘導することによる）遺伝子発現の制御に注がれているが、比較的少ない取り組みが遺伝子ターミネーター配列のモジュレーションを介した転写のモジュレーションに向けて行われている。
【０２８３】
転写が遺伝子発現レベルに影響を与える最も明白なやり方は、Ｐｏｌ  ＩＩ開始の速度によるものであり、これは、プロモーターまたはエンハンサー強度およびトランス活性化因子の組合せによってモジュレートすることができる（Kadonaga,  JT.、２００４年、「Regulation  of  RNA  polymerase  II  transcription  by  sequence-specific  DNA  binding  factors」、Cell.、２００４年１月２３日；１１６巻（２号）：２４７〜５７頁）。真核生物では、伸長速度も、オルタナティブスプライシングに影響を与えることによって遺伝子発現パターンを決定する場合がある（Cramer  P.ら、１９９７年、「Functional  association  between  promoter  structure  and  transcript  alternative  splicing.」、Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A.、１９９７年１０月１４日；９４巻（２１号）：１１４５６〜６０頁）。遺伝子上の終結の失敗は、プロモーターのＰｏｌ  ＩＩへのアクセシビリティを低減することによって下流遺伝子の発現を損なわせ得る（Greger  IH.ら、２０００年、「Balancing  transcriptional  interference  and  initiation  on  the  GAL7  promoter  of  Saccharomyces  cerevisiae.」、Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A.、２０００年７月１８日；９７巻（１５号）：８４１５〜２０頁）。このプロセスは、転写干渉として公知であり、下等真核生物において特に関連しており、その理由は、これらが密集した遺伝子を有することが多いためである。
【０２８４】
終結配列も、配列が属する遺伝子の発現に影響し得る。例えば、スタディは、真核生物における非効率な転写終結は、スプライスされていないプレｍＲＮＡを蓄積させることを示す（West,  S.およびProudfoot,  N.J.、２００９年、「Transcriptional  Termination  Enhances  Protein  Expression  in  Human  Cells」、Mol  Cell.、２００９年２月１３日；３３巻（３〜９号）；３５４〜３６４頁を参照）。他のスタディも、３’末端プロセシングが非効率な終結によって遅延され得ることを示した（West,  Sら、２００８年、「Molecular  dissection  of  mammalian  RNA  polymerase  II  transcriptional  termination.」、Mol  Cell.、２００８年３月１４日；２９巻（５号）：６００〜１０頁）。転写終結も、合成の部位から転写物を放出することによってｍＲＮＡ安定性に影響し得る。
真核生物における転写機構の終結
【０２８５】
真核生物における転写終結は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩに関連したタンパク質因子によって認識されるターミネーターシグナルを介して働く。一部の実施形態では、切断・ポリアデニル化特異性因子（ＣＰＳＦ）および切断刺激因子（ＣｓｔＦ）は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩのカルボキシル末端ドメインからポリＡシグナルに移動する。一部の実施形態では、ＣＰＳＦ因子およびＣｓｔＦ因子はまた、終結部位に他のタンパク質を動員し、次いでこれは、転写物を切断し、転写複合体からｍＲＮＡを解放する。終結は、ｍＲＮＡ転写物のポリアデニル化も誘発する。バリデートされた真核生物終結因子の実例およびこれらの保存構造は、本文書の後の部分で論じられている。
【０２８６】
ターミネーター配列またはシグナルは、発現される配列の３’末端に作動可能に連結されていてもよい。様々な公知の真菌ターミネーターが、本開示の宿主株において機能的である可能性が高い。その例は、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ  ｔｒｐＣターミネーター、Ａ．ｎｉｇｅｒアルファ−グルコシダーゼターミネーター、Ａ．ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼターミネーター、Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉカルボキシルプロテアーゼターミネーター（米国特許第５，５７８，４６３号を参照）、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍターミネーター配列、例えばＥＧ６ターミネーター、およびＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉセロビオヒドロラーゼターミネーターである。一実施形態では、ターミネーター配列は、ダイレクトリピート（ＤＲ）である。一実施形態では、ターミネーター配列は、生来のＡ．ｎｉｇｅｒ  ｐｙｒＧターミネーターである。生来のＡ．ｎｉｇｅｒ  ｐｙｒＧ配列は、配列番号５の配列を有していてもよい。
ターミネータースワッピング（ＳＴＯＰスワップ）
【０２８７】
一部の実施形態では、本開示は、最適な発現性質を有する終結配列（「ターミネーター」）を選択して、全体的な宿主株生産性に対して有益な効果を生じさせる方法を教示する。
【０２８８】
例えば、一部の実施形態では、本開示は、一連の発現強度を呈する、宿主細胞内の１つもしくは複数のターミネーターを同定し、かつ／または１つもしくは複数のターミネーターのバリアントを生成する（例えば、以下に論じられるターミネーターラダー）方法を教示する。これらの同定および／または生成されるターミネーターの特定の組合せを、以下でより詳細に説明されるターミネーターラダーとして一緒にグループ化することができる。
【０２８９】
次いで問題のターミネーターラダーを、目的の所与の遺伝子と関連付ける。よって、ターミネーターＴ１〜Ｔ８（１つまたは複数のプロモーターと組み合わされるとき、一連の発現強度を呈するように同定および／または生成された８つのターミネーターを表す）を有し、ターミネーターラダーを宿主細胞内の目的の単一遺伝子と関連付ける（すなわち、所与の標的遺伝子の３’末端に作動可能に連結した所与のターミネーターで宿主細胞を遺伝的に操作する）場合、ターミネーターの各組合せの効果を、操作された宿主細胞が標的遺伝子と関連した特定のターミネーターを除いて他の点では同一の遺伝的バックグラウンドを有することを考慮して、各コンビナトリアル取り組みの結果として生じる操作された株のそれぞれを特徴付けることによって確認することができる。このプロセスを介して操作される結果として生じる宿主細胞は、ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーを形成する。
【０２９０】
ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーは、このプロセスを介して形成される実際の物理的な微生物株コレクションを指すことができ、各メンバー株は、他の点では同一の遺伝的バックグラウンドにおいて、特定の標的遺伝子に作動可能に連結した所与のターミネーターを代表し、前記ライブラリーは、「ターミネータースワップ微生物株ライブラリー」または「ＳＴＯＰスワップ微生物株ライブラリー」と呼ばれる。糸状菌（例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒ）の具体的な文脈において、ライブラリーは、「ターミネータースワップ糸状菌株ライブラリー」、「ターミネータースワップ糸状菌Ａ．ｎｉｇｅｒライブラリー」、「ＳＴＯＰスワップ糸状菌株ライブラリー」、または「ＳＴＯＰスワップＡ．ｎｉｇｅｒ株ライブラリー」と呼ぶことができるが、これらの用語は、糸状菌またはＡ．ｎｉｇｅｒが微生物の具体的な例であることから、同意語として使用することができる。
【０２９１】
さらに、ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーは、遺伝子撹乱のコレクション、この場合、所与の遺伝子ｙに作動可能に連結した所与のターミネーターｘのコレクションを指すことができ、前記コレクションは、「ターミネータースワップライブラリー」または「ＳＴＯＰスワップライブラリー」と呼ばれる。
【０２９２】
さらに、ターミネーターＴ１〜Ｔ８を含む同じターミネーターラダーを利用して、微生物を操作することができ、ここで８つのターミネーターのそれぞれは、１０の異なる遺伝子標的に作動可能に連結されている。この手順の結果は、目的の標的遺伝子に作動可能に連結した特定のターミネーターを除いて、他の点では遺伝的に同一と仮定される８０の宿主細胞株である。これらの８０の宿主細胞株は、適切にスクリーニングし、特徴付け、別のＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーを生じさせることができる。ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーにおける微生物株を特徴付けると、これらに限定されないが、リレーショナルデータベース、オブジェクト指向データベースまたは大規模分散ＮｏＳＱＬデータベースを含む任意のデータベースに記憶することができる情報およびデータが生じる。このデータ／情報としては、例えば、所与の遺伝子標的に作動可能に連結しているときの所与のターミネーター（例えば、Ｔ１〜Ｔ８）の効果を挙げることができる。このデータ／情報は、プロモーターＴ１〜Ｔ８のうち２種またはそれより多くを所与の遺伝子標的に作動可能に連結することから生じるより広いセットのコンビナトリアル効果でもあり得る。
【０２９３】
８のターミネーターおよび１０の標的遺伝子の上述の例は、単に例示的であり、その理由は、この概念は、一連の発現強度および任意の所与の数の標的遺伝子の呈示に基づいて一緒にグループ化された任意の所与の数のプロモーターを用いて適用することができるためである。
【０２９４】
要約すると、様々なターミネーターを利用して生物体内の様々な遺伝子の発現をモジュレートすることは、目的の形質を最適化する強力なツールである。本発明者らが開発したターミネータースワッピングの分子ツールは、少なくとも１つの条件下で少なくとも１つの遺伝子座の発現を変更することが実証されたターミネーター配列のラダーを使用する。次いでこのラダーは、ハイスループットゲノム操作を使用して生物体内の遺伝子の群に系統的に適用される。この群の遺伝子は、いくつかの方法のいずれか１つに基づいて目的の形質に影響を与える高い見込みを有すると決定される。これらは、公知の機能に基づく選択、または目的の形質に対する影響、または先に決定された有益な遺伝的多様性に基づくアルゴリズムによる選択を含み得る。
【０２９５】
次いで、遺伝子に連結したターミネーター配列を含有する生物体の結果として生じるＨＴＰ遺伝子設計微生物ライブラリーが、ハイスループットスクリーニングモデルにおいて性能について評価され、性能を増大させるプロモーター−遺伝子連鎖が決定され、情報がデータベースに記憶される。遺伝子撹乱（すなわち、所与の遺伝子ｙに連結した所与のターミネーターｘ）のコレクションは、「ターミネータースワップライブラリー」を形成し、これは、微生物操作処理で利用される潜在的な遺伝子変更の源として利用することができる。経時的に、より大きいセットの遺伝子撹乱は、より大きい多様性の微生物バックグラウンドに対してインプリメントされるので、各ライブラリーは、実験的に確認されたデータのコーパスとしてより強力になり、それを使用して目的の任意のバックグラウンドに対する標的とした変化をより正確かつ予想通りに設計することができる。すなわち、一部の実施形態では、本開示は、本開示の遺伝子設計ライブラリーのいずれかと関連したメタデータ内に埋もれた先の実験結果に基づく、宿主細胞内への１つまたは複数の遺伝子変化の導入を教示する。
【０２９６】
よって、特定の実施形態では、ターミネータースワッピングは、以下を含むマルチステッププロセスである。
【０２９７】
１．「ラダー」として作用する一連の「ｘ」ターミネーターを選択するステップ。理想的にはこれらのターミネーターは、多重ゲノム遺伝子座全体にわたって高度に多様な発現をもたらすことが示されているが、唯一の要件は、これらが遺伝子発現を何らかのやり方で撹乱することである。
【０２９８】
２．標的にする一連の「ｎ」遺伝子を選択するステップ。このセットは、ゲノム内のあらゆるＯＲＦ、またはＯＲＦのサブセットであり得る。サブセットは、先に実証された有益な撹乱（先のプロモータースワップ、ＳＴＯＰスワップもしくはＳＮＰスワップ）との関連によって、先に生成された撹乱間の上位性相互作用に基づくアルゴリズム選択、標的にする有益なＯＲＦに関する仮説に基づく他の選択判定基準によって、またはランダム選択を介して、機能に関連したＯＲＦについてのアノテーションを使用して選択することができる。他の実施形態では、「ｎ」標的化遺伝子は、非コードＲＮＡを含めた非タンパク質コード遺伝子を含み得る。
【０２９９】
３．以下の遺伝子改変を迅速に、かつ並行して実行するためのハイスループット株操作：生来のターミネーターが標的遺伝子ｎの３’末端に存在し、その配列が公知であるとき、生来のターミネーターをラダー内のｘターミネーターのそれぞれで置き換える。生来のターミネーターが存在せず、またはその配列が未知であるとき、ラダー内のｘターミネーターのそれぞれを遺伝子停止コドンの後に挿入する。
【０３００】
このように、株の「ライブラリー」（ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーとも呼ばれる）が構築され、ライブラリーの各メンバーは、他の点では同一の遺伝子状況においてｎ標的に連結したｘターミネーターの一事例である。先に記載したように、ターミネーターの組合せを挿入し、ライブラリーが構築される組み合わせの可能性の範囲を拡張することができる。
【０３０１】
４．１つまたは複数の測定基準に対する株の性能が最適化されている性能を示す状況における株のライブラリーのハイスループットスクリーニング。
【０３０２】
この基本プロセスを拡張して、とりわけ、（１）相互作用プロセスにおいて１つずつ、または単一ステップにおける複数の変化としてのいずれかで、単一株バックグラウンド内に複数の有益な撹乱を統合することによって、株性能をさらに改善することができる。複数の撹乱は、確定した変化の特定のセット、または変化の部分的にランダム化されたコンビナトリアルライブラリーのいずれかであり得る。例えば、標的のセットが経路内のあらゆる遺伝子である場合、撹乱のライブラリーを株の先のライブラリーの改善された１つまたは複数のメンバー内に逐次再生すると、任意の所与の反復においてどの遺伝子が律速であるかにかかわらず経路内の各遺伝子の発現レベルを最適化することができ；（２）ライブラリーの個々のおよびコンビナトリアル生成の結果として生じる性能データを、そのデータを使用して各撹乱の相互作用に基づいて撹乱の最適のセットを予測するアルゴリズムに送り；（３）上記２つの手法の組合せをインプリメントする。
【０３０３】
手法は、工業用微生物を用いて本開示において例示されているが、所望の形質が遺伝子変異体の集団において同定され得る任意の生物体に適用可能である。例えば、これは、ＣＨＯ細胞、酵母、昆虫細胞、藻類、および植物などの多細胞生物の性能を改善するのに使用することができる。
５．配列最適化：最適化配列微生物株ライブラリーを得るための分子ツール
【０３０４】
一実施形態では、本開示の方法は、宿主生物が発現する１つまたは複数のコドン最適化遺伝子を含む。様々な宿主内での発現を改善するためにコドンを最適化するための方法は、当技術分野で公知であり、文献において記載されている（その全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願公開第２００７／０２９２９１８号を参照）。特定の原核生物宿主または真核生物宿主に好適なコドンを含有する最適化されたコード配列（Murrayら、（１９８９年）、Nucl.  Acids  Res.、１７巻：４７７〜５０８頁も参照）を調製して、例えば、翻訳の速度を増大させ、または非最適配列から産生される転写物と比較して、より長い半減期などの望ましい性質を有する組換えＲＮＡ転写物を生成することができる。
【０３０５】
タンパク質発現は、転写、ｍＲＮＡプロセシング、ならびに翻訳の安定性および開始に影響するものを含めた多数の因子によって支配される。よって、最適化は、任意の特定の遺伝子のいくつかの配列フィーチャのいずれかに対処することができる。具体例として、希少コドン誘導翻訳休止は、タンパク質発現を低減し得る。希少コドン誘導翻訳休止は、宿主生物において稀に使用される目的のポリヌクレオチド中のコドンの存在が、利用可能なｔＲＮＡプールにおけるその不足に起因してタンパク質翻訳に対して負の効果を有し得ることを含む。
【０３０６】
代替の翻訳開始も、異種タンパク質発現を低減し得る。代替翻訳開始は、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）として機能することができるモチーフを偶然に含有する合成ポリヌクレオチド配列を含み得る。これらの部位は、遺伝子内部部位から短縮タンパク質の翻訳を開始することができる。精製中に除去することが困難であり得る短縮タンパク質を産生する可能性を低減する一方法は、最適化ポリヌクレオチド配列から推定上の内部ＲＢＳ配列を排除するステップを含む。
【０３０７】
リピート誘導ポリメラーゼのスリッページは、異種タンパク質発現を低減し得る。リピート誘導ポリメラーゼのスリッページは、フレームシフト変異をもたらし得るＤＮＡポリメラーゼのスリッページまたはスタッタリングを引き起こすことが示されているヌクレオチド配列リピートを伴う。このようなリピートは、ＲＮＡポリメラーゼのスリッページも引き起こし得る。高いＧ＋Ｃ含有量偏りを有する生物体では、ＧまたはＣヌクレオチドリピートから構成されるより高い程度のリピートが存在し得る。したがって、ＲＮＡポリメラーゼのスリッページを誘導する可能性を低減する一方法は、ＧまたはＣヌクレオチドの長いリピートを変更するステップを含む。
【０３０８】
二次構造の干渉も異種タンパク質発現を低減し得る。二次構造は、ＲＢＳ配列または開始コドンを隔離することができ、タンパク質発現の低減と相関している。ステムループ構造も、転写休止および減衰に関与することができる。最適化ポリヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列のＲＢＳおよび遺伝子コード領域内に最小限の二次構造を含有して、転写および翻訳の改善を可能にすることができる。
【０３０９】
例えば、最適化プロセスは、宿主が発現する所望のアミノ酸配列を同定することによって始めることができる。アミノ酸配列から、候補ポリヌクレオチドまたはＤＮＡ配列を設計することができる。合成ＤＮＡ配列の設計中に、コドン使用の頻度を、宿主発現生物体のコドン使用と比較することができ、希有な宿主コドンを合成配列から除去することができる。さらに、合成候補ＤＮＡ配列を、望ましくない酵素制限部位を除去し、任意の所望のシグナル配列、リンカー、または非翻訳領域を付加または除去するために修飾することができる。合成ＤＮＡ配列は、翻訳プロセスを妨害し得る二次構造、例えば、Ｇ／Ｃリピートおよびステムループ構造の存在について分析することができる。
６．上位性マッピング  −  有益な遺伝子統合（genetic  consolidation）を可能にする予測的分析用ツール
【０３１０】
一部の実施形態では、本開示は、宿主細胞内に有益な遺伝子変更を予測し、組み合わせるための上位性マッピング法を教示する。遺伝子変更は、上述のＨＴＰ分子ツールセット（例えば、プロモータースワップ、ＳＮＰスワップ、開始／停止コドン交換、配列最適化、およびＳＴＯＰスワップ）のいずれかによって生み出すことができ、これらの遺伝子変更の効果は、得られたＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーの特徴付けから分かる。よって、本明細書で使用される場合、用語の上位性マッピングは、宿主性能の増大を生じさせる可能性のある遺伝子変更の組合せ（例えば、有益なＳＮＰまたは有益なプロモーター／標的遺伝子の関連付け）を同定する方法を含む。
【０３１１】
諸実施形態では、本開示の上位性マッピング法は、２つの異なる機能群からの有益な変異の組合せは、同じ機能群からの変異の組合せと比較して、宿主性能を改善する可能性が高いというアイデアに基づく。例えば、Costanzo、The  Genetic  Landscape  of  a  Cell、Science、３２７巻、５９６４号、２０１０年１月２２日、４２５〜４３１頁（その全体が本明細書に参照により組み込まれている）を参照されたい。
【０３１２】
同じ機能群からの変異は、同じ機構によって働く可能性が高く、よって、全体的な宿主性能に対して負または中立の上位性を呈する可能性が高い。対照的に、異なる機能群からの変異は、独立した機構によって働く可能性が高く、それは、宿主性能の改善、および一部の事例では相乗効果をもたらし得る。
【０３１３】
よって、一部の実施形態では、本開示は、ＳＮＰ変異を分析して、異なる機能群に属すると予測されるＳＮＰを同定する方法を教示する。一部の実施形態では、ＳＮＰ機能群類似度は、変異相互作用プロファイルの余弦類似度を計算することによって決定される。本開示は、変異類似度マトリックスまたはデンドログラムを介してＳＮＰを比較することも示す。
【０３１４】
よって、上位性マッピング手順は、１つまたは複数の遺伝的バックグラウンドにおいて適用される遺伝子変異の多様性を、１つまたは複数の遺伝的バックグラウンド内に前記変異を効率的かつ有効に統合する目的で、グループ化および／またはランク付けするための方法を提供する。
【０３１５】
諸態様では、統合は、標的生体分子を産生させるのに最適化された新規株を生み出す目的で実施される。教示した上位性マッピング手順によって、変異の機能分類を同定することが可能であり、このような機能分類は、望ましくない上位性効果を最小限にする統合ストラテジーを可能にする。
【０３１６】
先に説明した通り、工業発酵で使用するための微生物の最適化は、経済、社会、および自然界に関する広い暗示を含む重要で困難な問題である。伝統的に、微生物操作は、ランダム変異誘発の遅く不確かなプロセスによって実施されてきた。このような手法は、細胞の自然進化能力を活用して、人工的に課された選択圧に適応させる。このような手法はまた、有益な変異の珍しさ、基礎をなす適応度地形の荒削りさによって制限されており、より一般に、細胞生物学および分子生物学における現況技術を十分に利用しない。
【０３１７】
最新の手法は、機構レベルでの細胞機能の新しい理解および特定の表現型目標への標的化遺伝子マニピュレーションを実施する新しい分子生物学ツールを活用する。実際には、このような合理的手法は、生物学の根本的な複雑性によって混乱する。原因となる機構は、特に、それぞれに有益な効果が観察された２つまたはそれ超の変化を組み合わせようと試みる場合、理解が不十分である。時に、遺伝子変化のこのような統合は、正の結果（所望の表現型活性の増大によって測定される）を生じるが、正味の正の結果は、予期されたものより低くなり得、一部の場合では、予期されたものより高くなり得る。他の事例では、このような組合せは、正味の中立効果または正味の負の効果を生む。この現象は、上位性と呼ばれ、微生物操作（および一般に遺伝子操作）の基本的な課題の１つである。
【０３１８】
上述した通り、本ＨＴＰゲノム操作プラットフォームは、伝統的な微生物操作手法に関連した問題の多くを解決する。本ＨＴＰプラットフォームは、自動化技術を使用して、数百または数千の遺伝子変異を一度に実施する。特定の態様では、上述した合理的手法と異なり、開示したＨＴＰプラットフォームは、その全体が本明細書に参照により組み込まれている、Microbial  Strain  Design  System  And  Methods  For  Improved  Large-Scale  Production  Of  Engineered  Nucleotide  Sequencesという表題の米国出願第１５／１４０，２９６号に開示されている通り、数千の変異体の並列構築を可能にして、関連したゲノム空間の大きいサブセットをより有効に探索する。「あらゆること」を試すことによって、本ＨＴＰプラットフォームは、本発明者らの限られた生物学的理解によって誘導される困難を回避する。
【０３１９】
しかし同時に、本ＨＴＰプラットフォームは、ゲノム空間の組合せによる爆発的サイズ、および遺伝的相互作用の複雑性を考慮して生成されたデータセットを解明する計算手法の有効度によって基本的に制限されるという問題に直面する。所望の結果を生じる組合せの非ランダム選択を最大にするやり方で広大なコンビナトリアル空間のサブセットを探索する技法が必要とされる。
【０３２０】
いくぶん類似のＨＴＰ手法が、酵素最適化の場合において有効であると証明された。このニッチな問題において、目的のゲノム配列（１０００塩基の程度の）は、物理的構成が幾分複雑なタンパク質鎖をコードする。正確な構成は、その構成要素の原子成分間の集団電磁相互作用によって決定される。短いゲノム配列および物理的に制約された折り畳み問題のこの組合せは、貪欲最適化ストラテジーに具体的に役に立つ。すなわち、あらゆる残基において配列を個々に変異させ、結果として生じる変異体をシャッフルして、配列活性応答モデル化（Sequence  Activity  Response  modeling）に適合する分解能で局所的配列空間を有効にサンプリングすることが可能である。
【０３２１】
しかし、生体分子の完全ゲノム最適化に関して、このような残基中心の手法は、いくつかの重要な理由で不十分である。第１に、生体分子のゲノム最適化に伴う関連した配列空間の指数関数的増大のため。第２に、生体分子合成における調節、発現、および代謝相互作用の複雑性の追加のため。本発明者らは、教示される上位性マッピング手順を介してこれらの問題を解決した。
【０３２２】
変異のコレクション間の上位性相互作用を、前記変異を１つまたは複数の遺伝的バックグラウンド内により効率的かつ有効に統合する目的で、モデル化するための教示される方法は、当技術分野において革新的であり、高度に必要とされる。
【０３２３】
上位性マッピング手順を記述する場合、用語「より効率的な」および「より有効な」は、特定の表現型の目的に関して統合株の中での望ましくない上位性相互作用の回避を指す。
【０３２４】
プロセスを上記で一般に詳しく述べてきたので、より具体的なワークフロー例を次に記載する。
【０３２５】
第１に、Ｍ個の変異のライブラリーおよび１つまたは複数の遺伝的バックグラウンド（例えば、親糸状菌株）から始める。ライブラリーの選択も遺伝的バックグラウンドの選択も、ここに記載した方法に特定されない。しかし特定のインプリメンテーションでは、変異のライブラリーは、もっぱら、または組合せで：ＳＮＰスワップライブラリー、プロモータースワップライブラリー、または本明細書に記載の任意の他の変異ライブラリーを含み得る。
【０３２６】
一インプリメンテーションでは、単一の遺伝的バックグラウンドのみが提供される。この場合、別個の遺伝的バックグラウンド（微生物変異体）のコレクションが、この単一のバックグラウンドから最初に生成される。これは、変異の一次ライブラリー（またはそのあるサブセット）を所与のバックグラウンドに適用して、例えば、特定のＳＮＰのＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーまたは特定のプロモーターのＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーを所与の遺伝的バックグラウンドに適用して、それに組み入れられている所与のＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーからの特定の遺伝子変更を除いて同一の遺伝的バックグラウンドを有する微生物変異体の集団（おそらく１００または１，０００）を生み出すことによって達成され得る。以下に詳述する通り、この実施形態は、コンビナトリアルライブラリーまたはペアワイズライブラリーをもたらし得る。
【０３２７】
別のインプリメンテーションでは、別個の公知の遺伝的バックグラウンドのコレクションを単に与えることができる。以下に詳述する通り、この実施形態は、コンビナトリアルライブラリーのサブセットをもたらし得る。
【０３２８】
特定のインプリメンテーションでは、遺伝的バックグラウンドの数およびこれらのバックグラウンド間の遺伝的多様性（変異の数または配列編集距離などで測定した）は、この方法の有効度を最大にするように決定される。
【０３２９】
遺伝的バックグラウンドは、天然の、生来の、もしくは野生型株、または変異された、操作された株であり得る。Ｎ個の別個のバックグラウンド株は、ベクトルｂで表すことができる。一例では、バックグラウンドｂは、Ｎ個の一次変異ｍ０＝（ｍ１、ｍ２、…  ｍＮ）を野生型バックグラウンド株ｂ０に適用して、Ｎ個の変異されたバックグラウンド株ｂ＝ｍ０ｂ０＝（ｍ１ｂ０、ｍ２ｂ０、…  ｍＮ  ｂ０）（式中、ｍｉｂ０は、変異ｍｉのバックグラウンド株ｂ０への適用を表す）を形成することによって形成される操作されたバックグラウンドを表すことができる。
【０３３０】
いずれの場合にも（すなわち、単一の提供された遺伝的バックグラウンドまたは遺伝的バックグラウンドのコレクション）、結果は、Ｎ個の遺伝的に別個のバックグラウンドのコレクションである。関連した表現型が各バックグラウンドについて測定される。
【０３３１】
第２に、Ｍ個の変異のコレクションｍ１内の各変異が、Ｎ個のバックグラウンド株ｂのコレクション内の各バックグラウンドに適用されて、Ｍ×Ｎ個の変異体のコレクションが形成される。Ｎ個のバックグラウンドが変異の一次セットｍ０（上述した）を適用することによってそれ自体得られたインプリメンテーションでは、変異体の結果として生じるセットは、時に、コンビナトリアルライブラリーまたはペアワイズライブラリーと呼ばれる。公知のバックグラウンドのコレクションが明示的に提供された別のインプリメンテーションでは、変異体の結果として生じるセットは、コンビナトリアルライブラリーのサブセットと呼ぶことができる。操作されたバックグラウンドベクトルの生成と同様に、諸実施形態では、入力インターフェース２０２（図１４を参照）は、変異ベクトルｍ１およびバックグラウンドベクトルｂ、ならびに外積などの指定されたオペレーションを受け取る。
【０３３２】
上記操作されたバックグラウンド例を続けて、Ｍ×Ｎコンビナトリアルライブラリーの形成は、ｍ１×ｍ０ｂ０、ｂ＝ｍ０ｂ０のＮ個のバックグラウンドに適用されたｍ１の外積によって形成された行列によって表すことができ、この場合、ｍ１中の各変異は、ｂ内の各バックグラウンド株に適用される。結果として生じるＭ×Ｎ行列の各ｉ番目の行は、バックグラウンドコレクションｂ内のすべての株へのｍ１内のｉ番目の変異の適用を表す。一実施形態では、ｍ１＝ｍ０であり、行列は、出発株ｂ０への同じ変異のペアワイズ適用を表す。その場合、行列は、その対角線回りで対称であり（Ｍ＝Ｎ）、対角線は、任意の分析において無視することができ、その理由は、それが同じ変異の２回の適用を表すためである。
【０３３３】
諸実施形態では、Ｍ×Ｎ行列の形成は、入力インターフェース２０２（図１４を参照）に化合物発現ｍ１×ｍ０ｂ０を入力することによって達成することができる。発現のコンポーネントベクトルは、直接入力することができ、これらの要素は、１つもしくは複数のＤＮＡ仕様を介して、またはインタープリター２０４によるインタープリテーション中にベクトルの検索を可能にするライブラリー２０６への呼出しとして明示的に指定される。「Microbial  Strain  Design  System  and  Methods  for  Improved  Large  Scale  Production  of  Engineered  Nucleotide  Sequences」という表題の米国特許出願第１５／１４０，２９６号に記載されている通り、インタープリター２０４、実行エンジン２０７、発注エンジン（order  placement  engine）２０８、およびファクトリー２１０を介して、ＬＩＭＳシステム２００は、入力された発現によって指定された微生物株を生成する。
【０３３４】
第３に、図１９を参照すると、分析装置２１４（図１４を参照）は、Ｍ×Ｎコンビナトリアルライブラリー行列（４２０２）内の各変異体について表現型応答を測定する。したがって、応答のコレクションは、Ｍ×Ｎ応答行列Ｒと解釈することができる。Ｒの各要素は、ｒｉｊ＝ｙ（ｍｉ，ｍｊ）として表すことができ、式中、ｙは、変異ｍｉによって変異された、操作されたコレクションｂ内のバックグラウンド株ｂｊの応答（性能）を表す。単純性および実用性のために、本発明者らは、ペアワイズ変異を仮定し、この場合、ｍ１＝ｍ０である。今回の場合のように、変異のセットがペアワイズ変異ライブラリーを表す場合、結果として生じる行列は、遺伝子相互作用行列、またはより特定すれば、変異相互作用行列とも呼ばれる場合がある。
【０３３５】
当業者は、一部の実施形態では、上位性効果および予測的株設計に関するオペレーションは、ＬＩＭＳシステム２００の自動化手段を通じて、例えば、分析装置２１４（図１４を参照）によって、または人によるインプリメンテーションによって、または自動化手段およびマニュアル手段の組合せを通じて完全に実施することができることを認識する。オペレーションが完全に自動化されていない場合、ＬＩＭＳシステム２００のエレメント、例えば、分析装置２１４は、例えば、その独自のオペレーション可能な能力を通じた結果を生成するのではなく、オペレーションを人が遂行した結果を受け取ることができる。本明細書の他の場所で記載されている通り、分析装置２１４などのＬＩＭＳシステム２００のコンポーネントは、１つまたは複数のコンピューターシステムによって完全または部分的にインプリメントすることができる。一部の実施形態では、特に、予測的株設計に関するオペレーションが自動化手段およびマニュアル手段の組合せによって実施される場合、分析装置２１４は、コンピューターハードウェア、ソフトウェア、もしくはファームウェア（またはこれらの組合せ）だけでなく、以下の表３に列挙されたもの、例えば、「性能を評価する」のカテゴリー下に列挙された装置などの人のオペレーターが運転する装置も含み得る。
【０３３６】
第４に、分析装置２１２（図１４を参照）は、応答行列を正規化する。正規化は、バイアスを除去し、かつ／またはこの方法に特異的な効果の関連した部分を単離する目的で測定された応答値を調整するマニュアルおよび／またはこの実施形態では、自動化プロセスからなる。図１９に関して、第１のステップ４２０２は、正規化された測定データを得ることを含み得る。一般に、予測的株設計および上位性マッピングを対象とする請求項において、用語「性能尺度」または「測定された性能」などは、未処理であっても、何らかの様式で処理された、例えば、正規化データであっても測定データを反映する測定基準を記述するのに使用され得る。特定のインプリメンテーションでは、正規化は、測定された応答値から先に測定されたバックグラウンド応答を減じることによって実施することができる。そのインプリメンテーションでは、結果として生じる応答要素は、ｒｉｊ＝ｙ（ｍｉ，ｍｊ）−ｙ（ｍｊ）として形成することができ、式中、ｙ（ｍｊ）は、一次変異ｍｊを親株ｂ０に適用することによって引き起こされた操作されたコレクションｂ内の操作されたバックグラウンド株ｂｊの応答である。正規化された応答行列の各行は、その対応する変異の応答プロファイルとして扱われることに留意されたい。すなわち、ｉ番目の行は、ｊ＝１〜Ｎについてすべてのバックグラウンド株ｂｊに適用された対応する変異ｍｉの相対的効果を記述する。
【０３３７】
ペアワイズ変異の例に関して、２つの変異の結果として生じる株の組み合わされた性能／応答は、個々に、変異のそれぞれに対する株の性能／応答より大きい、小さい、またはそれに等しい場合がある。この効果は、「上位性」として公知であり、一部の実施形態では、ｅｉｊ＝ｙ（ｍｉ，ｍｊ）−（ｙ（ｍｉ）＋ｙ（ｍｊ））として表すことができる。この数学的表現の変形は、可能であり、例えば、どのように個々の変化が生物学的に相互作用するかに依存し得る。上述したように、同じ機能群からの変異は、同じ機構によって働く可能性が高く、よって、全体的な宿主性能に対して負または中立の上位性を呈する可能性が高い。対照的に、異なる機能群からの変異は、独立した機構によって働く可能性が高く、それは、例えば、重複する変異効果を低減することによって宿主性能の改善をもたらし得る。よって、同じでない応答を生じる変異は、同様の応答を生じる変異より相加的な様式で組み合わさる可能性が高い。これは、次ステップにおける類似度の計算につながる。
【０３３８】
第５に、分析装置２１４は、応答の中の類似度、ペアワイズ変異例では、応答行列（４２０４）内のｉ番目の変異の効果とｊ番目（例えば、一次）変異の効果との間の類似度を測定する。Ｒのｉ番目の行は、Ｎ個のバックグラウンド株上のｉ番目の変異ｍｉの性能効果を表し、そのそれぞれは、それ自体上述した操作された変異の結果であり得ることを想起されたい。よって、ｉ番目の変異の効果とｊ番目の変異の効果との間の類似度は、ｉ番目の行とｊ番目の行との間の類似度ｓｉｊ、それぞれρｉおよびρｊによって表されて類似度行列Ｓを形成することができる。類似度は、多くの公知の技法、例えば、相互相関または絶対余弦類似度、例えば、ｓｉｊ＝ａｂｓ（ｃｏｓ（ρｉ，ρｊ））を使用して測定され得る。
【０３３９】
余弦類似度のような測定基準の代替または補足として、応答プロファイルをクラスター化して類似度の程度を決定することができる。クラスタリングは、適当な距離尺度（例えば、Ｅｕｃｌｉｄｅａｎ、Ｈａｍｍｉｎｇなど）と併せて距離に基づくクラスタリングアルゴリズム（例えば、ｋ−平均、階層的凝縮型など）を使用することによって実施することができる。代替として、クラスタリングは、適当な類似度尺度（例えば、余弦、相関など）とともに類似度に基づくクラスタリングアルゴリズム（例えば、スペクトル、ミンカットなど）を使用して実施することができる。もちろん、任意の数の標準的な機能的なオペレーション（例えば、指数関数）を介して類似度尺度にマッピングすることができ、逆もまた同様である。一インプリメンテーションでは、階層的凝縮型クラスタリングを絶対余弦類似度と併せて使用することができる。
【０３４０】
クラスタリングの一例として、Ｃを変異ｍｉのｋ個の別個クラスターへのクラスタリングとする。Ｃを、ｃｉｊが、変異ｉがクラスターｊに属する程度、０から１の値であるクラスターメンバーシップ行列とする。そのとき、変異ｉとｊとの間のクラスターに基づく類似度は、Ｃｉ×Ｃｊ（Ｃのｉ番目の行とｊ番目の行とのドット積）によって与えられる。一般に、クラスターに基づく類似度行列は、ＣＣＴ（すなわち、Ｃ×Ｃ−転置行列）によって与えられる。ハードクラスタリング（変異が正確に１つのクラスターに属する）の場合では、２つの変異間の類似度は、これらが同じクラスターに属する場合、１であり、そうでない場合、０である。
【０３４１】
Costanzo、The  Genetic  Landscape  of  a  Cell、Science、３２７巻、５９６４号、２０１０年１月２２日、４２５〜４３１頁（その全体が本明細書に参照により組み込まれている）に記載されている通り、変異応答プロファイルのこのようなクラスタリングは、細胞の根本的な機能的な機構のおおよそのマッピングに関係する。すなわち、一緒にクラスター化する変異は、根本的な生物学的プロセスまたは代謝経路に関係付けられる傾向がある。このような変異は、「機能群」と本明細書で呼ばれる。この方法の重要な知見は、２つの変異が同じ生物学的プロセスまたは経路によって働く場合、観察される効果（特に観察される利益）は、重複し得ることである。反対に、２つの変異が遠位機構によって働く場合、有益な効果が重複する可能性は低い。
【０３４２】
第６に、上位性効果に基づいて、分析装置２１４は、図１９（４２０６）に示した通り、同じでない応答に至る変異の対を選択し、例えば、これらの余弦類似度測定基準は、類似度閾値未満に入り、またはこれらの応答は、十分に分離したクラスター内に入る。これらの相違点に基づいて、選択された変異の対は、同様の対より良好にバックグラウンド株内に統合するはずである。
【０３４３】
十分に異なった応答に至る選択された変異の対に基づいて、ＬＩＭＳシステム（例えば、インタープリター２０４、実行エンジン２０７、発注依頼者（order  placer）２０８、およびファクトリー２１０のすべて、またはある組合せ）を使用して、これらの選択された変異を有する微生物株を設計することができる（４２０８）。諸実施形態では、本明細書で以下に、かつ他の場所で記載する通り、上位性効果を、予測モデルに組み入れる、またはそれと併せて使用して株選択を重み付けまたは選別することができる。
【０３４４】
ある好適な予測モデルを介してライブラリーからの変異のコレクションを特定のバックグラウンド内に統合することによって得られる仮定の株の性能（別名スコア）を推定することが可能であると仮定される。教示される方法で利用される代表的な予測モデルは、「ゲノムワイド遺伝子設計判定基準の効果のコンピューター分析および予測」というより大きいセクションに見出される「予測的株設計」という表題の以下のセクションに提供されている。
【０３４５】
線形回帰などの予測的株設計技法を使用する場合、分析装置２１４は、例えば、回帰結果を選別して十分に同じでない変異のみを保存することによって、低い類似度尺度を有する変異にモデルを制限することができる。代替として、予測モデルは、類似度行列を用いて重み付けることができる。例えば、一部の実施形態は、類似度行列を使用する重み付き最小二乗回帰を使用して、提案された変異の相互依存性を特徴付けることができる。一例として、重み付けは、回帰モデルに「カーネル」トリックを施すことによって実施することができる。（「カーネルトリック」が多くの機械学習モデル化手法に一般的である程度に、この再重み付けストラテジーは、線形回帰に制限されない）。
【０３４６】
このような方法は、当業者に公知である。諸実施形態では、カーネルは、要素１−ｗ＊ｓｉｊを有する行列であり、式中、１は、恒等行列の要素であり、ｗは、０から１の間の実数値である。ｗ＝０であるとき、これは、標準回帰モデルに変換される。実際には、ｗの値は、ペアワイズコンビナトリアルコンストラクトおよびこれらの付随効果ｙ（ｍｉ，ｍｊ）に対して評価されるとき、予測モデルの精度（ｒ２値または二乗平均平方根誤差（ＲＭＳＥ））に関係する。１つの単純なインプリメンテーションでは、ｗは、ｗ＝１−ｒ２と定義される。この場合、モデルが完全に予測的であるとき、ｗ＝１−ｒ２＝０であり、統合は、予測モデルだけに基づき、上位性マッピング手順は、役割を果たさない。一方、予測モデルがまったく予測的でない場合、ｗ＝１−ｒ２＝１であり、統合は、上位性マッピング手順だけに基づく。各反復中、精度を評価してモデル性能が改善しているかどうかを決定することができる。
【０３４７】
本明細書に記載の上位性マッピング手順は、どのモデルが分析装置２１４によって使用されているかに依存しないことが明らかであるはずである。このような予測モデルを考慮すると、コンビナトリアル統合（combinatorial  consolidation）を介して変異ライブラリーにアクセス可能なすべての仮定の株をスコア付けおよびランク付けすることが可能である。
【０３４８】
一部の実施形態では、上位性効果を説明するために、同じでない変異応答プロファイルを分析装置２１４が使用して、予測モデルからの各仮定の株に関連したスコアおよびランクを強化することができる。この手順は、同じでない応答プロファイルを有する候補株（例えば、多様なクラスターから引き出される株）を支持するための、スコアの再重み付けとして広く考えることができる。１つの単純なインプリメンテーションでは、株は、相違点閾値を満たさない、または同じクラスターから引き出された構成要素の変異（適当な重み付けを有する）の数によって低減されたそのスコアを有し得る。特定のインプリメンテーションでは、仮定の株の性能推定値は、仮定の株に関連した構成要素の変異（やはり適当な重み付けを有する）のすべての対に関連した類似度行列の項の和によって低減され得る。仮定の株は、これらの強化されたスコアを使用して再ランク付けすることができる。実際には、このような再重み付け算出は、最初のスコア推定値と併せて実施することができる。
【０３４９】
結果は、混乱させる上位性相互作用をより有効に回避するように強化されたスコアおよびランクを有する仮定の株のコレクションである。仮定の株をこの時構築することができ、またはこれらは、続いて分析または使用するために別の計算方法に送ることができる。
【０３５０】
当業者は、本明細書に記載の上位性マッピングおよび反復性予測的株設計は、ペアワイズ変異のみを使用することに限定されず、はるかに多くの変異をバックグラウンド株に同時に適用するように拡張することができることを認識する。別の実施形態では、追加の変異を、本明細書に記載の予測方法に従って選択された変異を使用して既に変異された株に順次適用することができる。別の実施形態では、上位性効果は、互いにわずかに異なるいくつかの株バックグラウンドに同じ遺伝子変異を適用し、改変された株バックグラウンドの中の正の応答プロファイルにおける任意の有意差に留意することによってインピュートされる。
遺伝子設計および微生物操作：標的化したヌクレアーゼを用いた指向ゲノム編集
【０３５１】
代謝操作は、分子の代謝、調節、および異化に直接的および間接的の両方で関与する主要な遺伝子の変更に大きく依存する。多くの場合、ゲノムに一塩基多型、挿入、または欠失などの小さいおよび大きい変化を正確に導入して、代謝経路を変更することが有用である。このような変化はまた、プロモーター、ターミネーター、遺伝子などの遺伝物質、またはさらには遺伝子クラスターものより大きい領域を、導入する、欠失させる、または置き換えるのに使用することもできる。
【０３５２】
これらのｃｒＲＮＡは、配列相同性を介して、Ｃａｓヌクレアーゼを特定された外因性遺伝物質にガイドするが、この外因性遺伝物質は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）として公知のヌクレアーゼ特異的な配列も含有していなければならない。ＣＲＩＳＰＲ複合体は、外来ＤＮＡに結合し、それを切断する。
【０３５３】
本明細書で提供される一態様では、目的の分子または生物学的物質を産生する目的の代謝経路を含有する真菌（例えば、本明細書で提供される糸状菌）の宿主または親の株が、ＣＲＩＳＰＲによって改変されてもよい。一実施形態では、形質転換可能なプロトプラストは、本明細書で提供されるプロトプラスト形成方法を使用して宿主または親の株から生成され、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ複合体またはＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＰ）で形質転換される。ＲＮＰ複合体は、本明細書で提供されるガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ））と複合体化した本明細書で提供される核酸ガイド型ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）を含む。核酸ガイド型ヌクレアーゼは、ＲＮＡによってガイドされる場合、本明細書ではＲＮＡガイド型ヌクレアーゼまたはＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼと称することができる。ガイド核酸（例えば、ｇＲＮＡ）は、真菌（例えば、本明細書で提供される糸状菌）の宿主または親の株に存在する標的遺伝子または核酸配列の一部に相補的なガイド配列である標的化セグメントを含んでいてもよい。一実施形態では、各ＲＮＰ複合体が、ガイド核酸（例えば、ｇＲＮＡ）と複合体化した核酸ガイド型エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）を含むように、プロトプラストを、２つまたはそれより多くのＲＮＰ複合体で形質転換することができる。一部の場合では、２つまたはそれより多くのＲＮＰ複合体中の各ガイド核酸（例えば、ｇＲＮＡ）は、異なる標的遺伝子または核酸配列に相補的なガイド配列を含んでいてもよい。一部の場合では、２つまたはそれより多くのＲＮＰ複合体中の各ガイド核酸（例えば、ｇＲＮＡ）は、同じ標的遺伝子または核酸配列に対するガイド配列を含んでいてもよい。３つまたはそれより多くのＲＮＰ複合体がある場合、同じ標的遺伝子または核酸配列に相補的なガイド配列を含んでいてもよいＲＮＰ複合体のサブセット、および異なる標的遺伝子または核酸に相補的なガイド配列を含んでいてもよいＲＮＰ複合体の１つまたは複数のサブセットが存在していてもよい。２つまたはそれより多くのＲＮＰ複合体が、これらそれぞれの標的化セグメントにより同じ標的核酸配列に向けられる場合、ＲＮＰ複合体のそれぞれは、前記標的遺伝子または核酸の異なるまたは別個の部分に相補的なガイド配列または標的化セグメントを含んでいてもよい。これらの実施形態に加えて、同じ細胞または生物体中で複数の遺伝子座を標的化する複数のｇＲＮＡを発現させることができる（ｇＲＮＡのマルチプレックス発現）。プールしたｇＲＮＡライブラリーは、所与の表現型にとって重要な遺伝子を同定するのに使用することができる。既存のライブラリーは、遺伝子ノックアウト、ならびに転写活性化または抑制に利用可能である。ＣＲＩＳＰＲは、次世代シーケンシングのパワーと組み合わせることで、ゲノムワイドスクリーニングのためのロバストなシステムであり得る。各ｇＲＮＡは、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）にアニールしたＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含んでいてもよいし、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む単一の転写物を含む単一のｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含んでいてもよい。
【０３５４】
一実施形態では、宿主または親の真菌は、機能性ＮＨＥＪ経路を有する。この実施形態に加えて、単一のＲＮＰ複合体または複数のＲＮＰ複合体を有する宿主または親の真菌に由来するプロトプラストの形質転換は、ゲノム中の標的遺伝子内にＮＨＥＪ経路により修復される鎖の破断を生成する。ＮＨＥＪ経路を使用する修復は、標的遺伝子内にインデルを生じさせる可能性がある。標的遺伝子中のインデルは、標的化した遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内に未成熟停止コドンをもたらすアミノ酸の欠失、挿入、またはフレームシフト変異を生じさせることができる。さらなる実施形態では、標的遺伝子内の鎖の破断は、相同組換え修復（ＨＤＲ）を使用することによって修復することができる。ＨＤＲ媒介修復は、宿主または親の真菌に由来するプロトプラストをドナーＤＮＡ配列で共形質転換することによって促進することができる。ドナーＤＮＡ配列は、所望の遺伝子撹乱（例えば、欠失、挿入、および／または一塩基多型）を含んでいてもよい。この実施形態では、ＲＮＰは、１つまたは複数のｇＲＮＡによって特定された標的遺伝子を切断する。次いで、ドナーＤＮＡを相同組換え機構のための鋳型として使用して、目的の代謝経路または分子／生物学的物質の改変のための所望の遺伝子撹乱を組み入れることができる。ドナーＤＮＡは、一本鎖、二本鎖または二本鎖プラスミドであり得る。ドナーＤＮＡは、ＰＡＭ配列を欠いていてもよいし、または再切断を防ぐために、スクランブル化した、変更された、または非機能的なＰＡＭを含んでいてもよい。一部の場合では、ドナーＤＮＡは、機能的な、または変更されていないＰＡＭ部位を含有していてもよい（図５６Ａ〜Ｂを参照）。ドナーＤＮＡ中の変異または編集された配列（相同性を有する領域も隣接する）は、変異がゲノムに組み入れられた後のＲＮＰによる再切断を防ぐ。一部の実施形態では、ＨＤＲ経路は、機能的なＮＨＥＪ経路を有さない宿主または親の真菌に由来するプロトプラストにおいて形質転換を実行することによって有利にすることができる。ＮＨＥＪ経路に障害を引き起こすことは、本明細書で提供される方法のいずれかを使用して達成することができる。
【０３５５】
一部の実施形態では、プロトプラストは、ＲＮＰ複合体、ドナーＤＮＡおよび選択可能なマーカーを含むベクターで共形質転換させることができる。ベクターは、形質転換能を有するプロトプラストのみの同定および／または生存を可能にすることによって、他のコンポーネントと相互作用することができる。これは、形質転換され正確に編集された株の同定を促進することができる。プラスミドはキュアリングできるため、編集の反復ラウンドが可能である。図５３を参照されたい。
【０３５６】
上記の実施形態に加えて、本明細書で提供される方法での使用のための核酸ガイド型ヌクレアーゼは、当技術分野で公知の、および／または本明細書で提供される核酸ガイド型ヌクレアーゼのいずれであってもよい。一実施形態では、核酸ガイド型ヌクレアーゼは、クラス２のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム核酸ガイド型ヌクレアーゼである。クラス２のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム核酸ガイド型ヌクレアーゼは、本明細書に記載される、以下：タイプＩＩ、タイプＩＩＡ、タイプＩＩＢ、タイプＩＩＣ、タイプＶ、およびタイプＶＩ核酸ガイド型ヌクレアーゼの任意の１つまたは複数から選択することができる。クラス２のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム核酸ガイド型ヌクレアーゼは、以下：Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃまたはこれらの相同体、オルソログ、変異体、バリアントまたは改変されたバージョンの任意の１つまたは複数であってもよい。
遺伝子設計に受け入れられる生物体
【０３５７】
開示されるＨＴＰゲノム操作プラットフォームは、工業用微生物細胞培養物（例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒ）で例示されるが、所望の形質を遺伝子変異体の集団内で同定することができる任意の多核体宿主細胞生物体に適用可能である。
【０３５８】
さらに、導入で記載されたように、本発明の開示は、糸状菌システムにおける宿主細胞の特性を改良し、これまでこのような糸状菌におけるシステムの開発を妨げてきた多くの問題を解決するための、ＨＴＰゲノム操作プラットフォームを提供する。
【０３５９】
よって、本明細書で使用される場合、用語「微生物」は、広く解釈されるべきである。これは、これらに限定されないが、２つの原核生物ドメイン、細菌および古細菌、ならびにある特定の真核真菌および原生生物を含む。しかし、ある特定の態様では、「高等」真核生物、例えば、昆虫、植物、および動物を本明細書に教示の方法において利用することができる。
【０３６０】
適当な宿主細胞としては、これらに限定されないが、細菌細胞、藻類細胞、植物細胞、真菌細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞が挙げられる。一例示的な実施形態では、適当な宿主細胞には、Ａ．ｎｉｇｅｒが含まれる。
【０３６１】
一実施形態では、本明細書で提供される方法およびシステムは、糸状菌に由来する真菌性エレメントであって、培養培地中の他のこのようなエレメントから容易に分離でき、それ自体で複製が可能である真菌性エレメントを使用する。例えば、真菌性エレメントは、胞子、繁殖体、菌糸断片、プロトプラストまたはマイクロペレットであり得る。好ましい実施形態では、本明細書で提供されるシステムおよび方法は、糸状菌に由来するプロトプラストを利用する。好適な糸状菌宿主細胞としては、例えば、Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ門、Ｄｅｕｔｅｒｏｍｙｃｏｔａ門、Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ門または不完全菌類の任意の糸状の形態が挙げられる。好適な糸状菌宿主細胞としては、例えば、Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ亜門の任意の糸状の形態が挙げられる。（例えば、参照によって本明細書に組み込まれるHawksworthら、In  Ainsworth  and  Bisby’s  Dictionary  of  The  Fungi、第８版、１９９５年、CAB  International、University  Press、Cambridge、UKを参照）。ある特定の例示的であるが限定されない実施形態では、糸状菌宿主細胞は、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ、またはこれらのテレオモルフもしくはアナモルフ、およびシノニムもしくは分類学的均等物の種の細胞であり得る。一実施形態では、糸状菌は、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａ．ｏｒｙｚａｅ、Ａ．ｓｏｊａｅ、およびＡ．ｎｉｇｅｒ群のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｉからなる群から選択される。好ましい実施形態では、糸状菌は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒである。
【０３６２】
一実施形態では、糸状菌は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ  ＡＣＭ３９９６（＝ＦＲＲ３５５８）、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ  Ｇｕｙ−１１またはＰｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＲＰ７８から選択される産生株である。別の実施形態では、糸状菌は、当技術分野で公知のＡ．ｎｉｇｅｒ産生株である。本明細書で提供される方法での使用のためのＡ．ｎｉｇｅｒ産生株の例としては、Ａ．ｎｉｇｅｒ  ＡＴＣＣ１１４１４、ＡＴＣＣ１０１５、ＡＣＭ４９９２（＝ＡＴＣＣ９１４２）、ＡＣＭ４９９３（＝ＡＴＣＣ１０５７７）、ＡＣＭ４９９４（＝ＡＴＣＣ１２８４６）、ＡＴＣＣ２６５５０、ＡＴＣＣ１１４１４、Ｎ４０２、ＣＢＳ５１３．８８またはＮＲＲＬ３（ＡＴＣＣ９０２９、ＣＢＳ１２０．４９）を挙げることができる。
【０３６３】
本開示の別の実施形態では、真菌種の特定の変異体が、本明細書に提供される方法およびシステムのために使用される。一実施形態では、本明細書に提供されるハイスループットおよび／または自動化された方法およびシステムに適した真菌種の特定の変異体が使用される。このような変異体の例は、プロトプラストが非常に良好な株；主として、またはより好ましくは、単核を有するプロトプラストのみを産生する株；マイクロタイタープレート中で効率的に再生する株、より速く再生する株および／またはポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）分子を効率的に取り込む株、低粘度の培養物、例えば、培養において、単一クローンの単離を防止し、かつ／または培養物の粘性を上昇させるほどもつれていない菌糸を産生する細胞などを産生する株、ランダム組込みが低減された（例えば、障害のある非相同末端接合経路）株、またはこれらの組合せであり得る。さらに別の実施形態では、本明細書に提供される方法およびシステムにおいて使用するための特定の変異体株は、例えばウリジン要求性変異体株などの選択可能なマーカー遺伝子を欠く株であり得る。これらの変異体株は、それぞれｐｙｒＧまたはｐｙｒＥ遺伝子によってコードされるオロチジン５リン酸デカルボキシラーゼ（ＯＭＰＤ）またはオロテートｐ−リボシルトランスフェラーゼ（ＯＰＲＴ）のいずれかを欠損している場合がある（T.  Goosenら、Curr  Genet.  １９８７年、１１巻：４９９〜５０３頁；J.  Begueretら、Gene.  １９８４年、３２巻：４８７〜９２頁）。
【０３６４】
一実施形態では、本明細書に提供される方法およびシステムで使用するための特定の変異体株は、より短い菌糸およびより酵母様の外観によって特徴付けられる緻密な細胞形態を有する株である。このような変異体の例は、ＵＳ２０１４０２２０６８９に記載されたような、ｇａｓ１発現が変更された糸状菌細胞であり得る。
【０３６５】
さらに別の実施形態では、本明細書に提供される方法およびシステムで使用するための変異体株は、そのＤＮＡ修復システムにおいて、相同組換えにおいて極めて効率的であり、かつ／またはランダム組込みにおいて極めて非効率的であるような方法で改変される。相同組換えによる宿主細胞のゲノムへの核酸コンストラクトの標的化した組込み、すなわち予め決定された標的遺伝子座における組込みの効率は、宿主細胞の増大した相同組換え能力および／または減少した非相同組換え能力によって増大させることができる。相同組換えの増大は、相同組換えに関与する１つまたは複数の遺伝子（例えば、Ｒａｄ５１および／またはＲａｄ５２タンパク質）を過剰発現することによって達成することができる。本開示の宿主細胞における非相同組換えまたは非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路の除去、破壊または低減は、この分野において公知の任意の方法によって、例えば、非相同組換え（ＮＨＲ）またはＮＨＥＪ経路のコンポーネント（例えば、酵母ＫＵ７０、酵母ＫＵ８０またはそれらの相同体）に指向させた、抗体、化学的阻害剤、タンパク質阻害剤、物理的阻害剤、ペプチド阻害剤、またはアンチセンスまたはＲＮＡｉ分子の使用によって達成することができる。ＮＨＥＪ経路の阻害は、その内容が参照によって本明細書に組み込まれるArras  SMD、Fraser  JA（２０１６年）、「Chemical  Inhibitors  of  Non-Homologous  End  Joining  Increase  Targeted  Construct  Integration  in  Cryptococcus  neoformans」PloS  ONE  １１巻（９号）：ｅ０１６３０４９に記載されたものなどの化学的阻害剤を使用して達成することができる。ＮＨＥＪ経路に障害を引き起こすまたは低減を促進するための化学的阻害剤での処理は、プロトプラスト生成の前および／またはその間であってもよい。代替として、本明細書に提供される方法での使用のための宿主細胞は、ＮＨＲ経路の１つまたは複数の遺伝子（例えば、酵母ｋｕ７０、ｋｕ８０またはそれらの相同体）を欠損していてもよい。このような変異体の例は、ＷＯ０５／９５６２４に記載されたようなｈｄｆＡまたはｈｄｆＢ遺伝子が欠損した細胞である。本明細書に提供される方法での使用のための宿主細胞におけるＮＨＲの阻害で使用するための化学的阻害剤の例は、Arras  SDMら（２０１６年）Chemical  Inhibitors  of  Non-Homologous  End  Joining  Increase  Targeted  Construct  Integration  in  Cryptococcus  neoformans.  PloS  One  １１巻（９号）に記載されたような、Ｗ７、クロルプロマジン、バニリン、Ｎｕ７０２６、Ｎｕ７４４１、ミリン（mirin）、ＳＣＲ７、ＡＧ１４３６１またはこれらの組合せであり得る。
【０３６６】
一実施形態では、本明細書に提供される方法およびシステムで使用するための糸状菌細胞の変異体株は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路に障害があるかまたは低減されており、培養（例えば、液中での培養）で増殖させる場合、酵母様の菌糸体を形成しない表現型を有する。
【０３６７】
別の実施形態では、本明細書に提供される方法およびシステムで使用するための糸状菌細胞は、化学的阻害剤（例えば、Ｗ７、クロルプロマジン、バニリン、Ｎｕ７０２６、Ｎｕ７４４１、ミリン、ＳＣＲ７、ＡＧ１４３６１またはこれらの任意の組合せ）での処理に起因してＮＨＥＪ経路に障害があるかまたは低減されており、培養（例えば、液中での培養）で増殖させる場合、酵母様の菌糸体を形成しない表現型を有する。一実施形態では、化学的阻害剤は、Ｗ７である。図２９に反映されているように、糸状菌宿主細胞（例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒ）は、最低阻害濃度（ＭＩＣ）のＷ７で処理することができ、このような濃度は宿主株依存性であり得る。
【０３６８】
一部の実施形態では、胞子、繁殖体、菌糸断片、プロトプラスト、またはマイクロペレットは、単離されてクローン集団になっている。一部の実施形態では、胞子、繁殖体、菌糸断片、プロトプラスト、またはマイクロペレットは、単離の前に形質転換される。一部の実施形態では、胞子、繁殖体、菌糸断片、プロトプラスト、またはマイクロペレットは、マイクロタイタープレートまたはマイクロタイターウェル中で、単離されてクローン集団になっている。上記の実施形態に加えて、クローン集団は、単一胞子、繁殖体、菌糸断片、プロトプラスト、またはマイクロペレットに由来する。一部の実施形態では、胞子、繁殖体、菌糸断片、プロトプラスト、またはマイクロペレットは、希釈した溶液中にあり、単一胞子、繁殖体、菌糸断片、プロトプラスト、またはマイクロペレットのみが、マイクロタイタープレートまたはウェルに移される。一部の実施形態では、胞子、繁殖体、菌糸断片、プロトプラスト、またはマイクロペレットは、単一胞子、繁殖体、菌糸断片、プロトプラスト、またはマイクロペレットとして光学的に区別できる濃度に希釈され、次いでこれは、単独でマイクロタイタープレートまたはウェルに移される。一部の実施形態では、胞子、繁殖体、菌糸断片、プロトプラスト、またはマイクロペレットは、１つのみの胞子、繁殖体、菌糸断片、プロトプラスト、またはマイクロペレットがマイクロタイタープレートまたはウェルに移される統計的確率が存在するポアソン分布を使用して希釈される。一部の実施形態では、胞子、繁殖体、菌糸断片、プロトプラスト、またはマイクロペレットは、マイクロタイタープレートまたはウェルを含めた任意の容器に移される。一部の実施形態では、光学的な区別は、ＣｅｌｌｅｎＯＮＥ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ  Ｌｉｇｈｔｓ  Ｂｅａｃｏｎ機器、ＦＡＣＳ装置、Ｃｙｔｅｎａ、または他の類似の機器によって実行される。本明細書に提供される方法での使用のために単一の胞子、繁殖体、菌糸断片、プロトプラスト、またはマイクロペレットを単離するためのワークフローの例は、図５４Ｂで見ることができる。上記実施形態のいずれかに加えて、胞子、繁殖体、菌糸断片、プロトプラスト、またはマイクロペレットは、本明細書に提供される任意の真菌細胞由来であってもよい。一実施形態では、真菌細胞は、糸状菌細胞である。糸状菌細胞は、本明細書に提供される糸状菌細胞、例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒなどであり得る。
遺伝子設計＆ＨＴＰ微生物操作プラットフォームにおいて利用するための遺伝的多様性プールの生成
【０３６９】
一部の実施形態では、本開示の方法は、遺伝子設計として特徴付けられる。本明細書で使用される場合、用語の遺伝子設計は、新しい優れた宿主細胞を設計および生み出すために特定の遺伝子、遺伝子の部分、プロモーター、停止コドン、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、または他のＤＮＡ配列の最適のバリアントを同定および選択することによる宿主生物のゲノムの再構築または変更を指す。
【０３７０】
一部の実施形態では、本開示の遺伝子設計法における第１のステップは、新しい宿主ゲノムを再構築することができる複数の配列バリエーションを有する最初の遺伝的多様性プール集団を得ることである。
【０３７１】
一部の実施形態では、本明細書に教示の遺伝子設計法における後続のステップは、上述のＨＴＰ分子ツールセット（例えば、ＳＮＰスワッピングまたはプロモータースワッピング）の１つまたは複数を使用して、ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーを構築することであり、次いでこのライブラリーは、宿主細胞において試験するための特定のゲノム変更のライブラリーを提供することによってゲノム操作プロセスのドライバーとして機能する。
既存の野生型株からの多様性プールの利用
【０３７２】
一部の実施形態では、本開示は、所与の野生型集団の微生物の中に存在する配列多様性を同定するための方法を教示する。したがって、多様性プールは、分析に利用される所与の数ｎの野生型微生物であり得、前記微生物のゲノムは、「多様性プール」を代表する。
【０３７３】
一部の実施形態では、多様性プールは、前記野生型微生物の中で天然の遺伝的バリエーション中に存在する既存の多様性の結果であり得る。このバリエーションは、所与の宿主細胞の株バリアントから生じる場合があり、または完全に異なる種である微生物の結果である場合がある。遺伝的バリエーションは、天然に存在するか否かにかかわらず、株の遺伝子配列の任意の差異を含み得る。一部の実施形態では、遺伝的バリエーションは、とりわけ、ＳＮＰスワップ、ＰＲＯスワップ、開始／停止コドンスワップ、またはＳＴＯＰスワップを含み得る。
既存の工業用株バリアントからの多様性プールの利用
【０３７４】
本開示の他の実施形態では、多様性プールは、伝統的な株改良プロセスの間に創製された株バリアント（例えば、ランダム変異を介して生成され、長年にわたって収率改善のために選択された１種または複数の宿主生物株）である。よって、一部の実施形態では、多様性プールまたは宿主生物は、歴史的な産生株のコレクションを含み得る。
【０３７５】
特定の態様では、多様性プールは、特定の時点で「ベースライン」遺伝子配列を有する元の親微生物株（Ｓ１）（Ｓ１Ｇｅｎ１）、およびさらに、前記Ｓ１株に由来し、／それから開発された、かつＳ１のベースラインゲノムに関して異なるゲノムを有する任意の数の後続の子孫株（Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５など、Ｓ２−ｎに一般化可能）（Ｓ２−ｎＧｅｎ２−ｎ）であり得る。
【０３７６】
例えば、一部の実施形態では、本開示は、多様性プール内の微生物ゲノムをシーケンシングして各株に存在するＳＮＰを同定することを教示する。一実施形態では、多様性プールの株は、歴史的な微生物産生株である。よって、本開示の多様性プールは、例えば、工業用基準株、および伝統的な株改良プログラムを介して産生された１種または複数の変異工業用株を含み得る。
【０３７７】
多様性プール内のすべてのＳＮＰが同定されたら、本開示は、個々にかつ群において、ＳＮＰの効果（例えば、目的の表現型の創製）を描写する（すなわち、定量し、特徴付ける）ためのＳＮＰスワッピングの方法およびスクリーニング方法を教示する。よって、上述した通り、教示したプラットフォームにおける最初のステップは、複数の配列バリエーション、例えば、ＳＮＰを有する最初の遺伝的多様性プール集団を得ることであり得る。次いで、教示したプラットフォームにおける後続のステップは、上述のＨＴＰ分子ツールセット（例えば、ＳＮＰスワッピング）の１つまたは複数を使用して、ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーを構築することであり得、次いでこのライブラリーは、微生物において試験するための特定のゲノム変更のライブラリーを提供することによってゲノム操作プロセスのドライバーとして機能する。
【０３７８】
一部の実施形態では、本開示のＳＮＰスワッピング方法は、変異株（例えば、Ｓ２−ｎＧｅｎ２−ｎの中からの株）内で同定された１つまたは複数のＳＮＰを基準株（Ｓ１Ｇｅｎ１）または野生型株に導入するステップを含む。
【０３７９】
他の実施形態では、本開示のＳＮＰスワッピング方法は、変異株（例えば、Ｓ２−ｎＧｅｎ２−ｎの中からの株）内で同定された１つまたは複数のＳＮＰを除去するステップを含む。
変異誘発を介した多様性プールの創製
【０３８０】
一部の実施形態では、細胞の所与の多様性プール集団における目的の変異は、変異誘発化学物質または放射線を含めた、株を変異させる任意の手段によって人工的に生成することができる。用語「変異誘発させること」は、細胞核酸材料において１つまたは複数の遺伝子改変を誘導するための方法を指すのに本明細書で使用される。
【０３８１】
用語「遺伝子改変」は、ＤＮＡの任意の変更を指す。代表的な遺伝子改変は、ヌクレオチド挿入、欠失、置換、およびこれらの組合せを含み、単一塩基という小さいものまたは数万塩基という大きいものであり得る。よって、用語「遺伝子改変」は、染色体の領域を含むＤＮＡの位置または配向が変更されるヌクレオチド配列の反転および他の染色体再配列を包含する。染色体再配列は、染色体内再配列または染色体間再配列を含むことができる。
【０３８２】
一実施形態では、本主張の主題において使用される変異誘発方法は、実質的にランダムであり、その結果、遺伝子改変は、変異誘発される核酸材料内の任意の利用可能なヌクレオチド位置で行うことができる。別の言い方をすれば、一実施形態では、変異誘発させることは、特定のヌクレオチド配列における出現の優先または頻度の増加を示さない。
【０３８３】
本開示の方法は、これらに限定されないが、紫外光、Ｘ線照射、ガンマ照射、Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロソ尿素（ＥＮＵ）、メチルニトロソ尿素（methyinitrosourea）（ＭＮＵ）、プロカルバジン（ＰＲＣ）、トリエチレンメラミン（ＴＥＭ）、アクリルアミドモノマー（ＡＡ）、クロラムブシル（ＣＨＬ）、メルファラン（ＭＬＰ）、シクロホスファミド（ＣＰＰ）、硫酸ジエチル（ＤＥＳ）、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）、メチルメタンスルホネート（ＭＭＳ）、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）、マイトマイシン−Ｃ（ＭＭＣ）、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、３Ｈ２Ｏ、およびウレタン（ＵＲ）を含めた任意の変異誘発剤を使用することができる（例えば、Rinchik、１９９１年；Markerら、１９９７年；およびRussell、１９９０年を参照）。追加の変異誘発剤は、http://www.iephb.nw.ru/〜spirov/hazard/mutagen_lst.htmlに記載されているものを含めて当業者に周知である。
【０３８４】
用語「変異誘発させること」は、細胞機能を変更（例えば、標的化変異によって）またはモジュレートすることによって、変異誘発の速度、品質、または程度を増強する方法も包含する。例えば、細胞を変質させ、またはモジュレートすることによって、ＤＮＡ修復、変異誘発物質代謝、変異誘発物質感受性、ゲノム安定性、またはこれらの組合せが機能していない、または欠損しているようにすることができる。よって、通常ゲノム安定性を維持する遺伝子機能の破壊を使用して変異誘発を増強することができる。破壊の代表的な標的としては、これらに限定されないが、ＤＮＡリガーゼＩ（Bentleyら、２００２年）およびカゼインキナーゼＩ（米国特許第６，０６０，２９６号）が挙げられる。
【０３８５】
一部の実施形態では、本開示の切断酵素をコードする核酸を生成するために、部位特異的変異誘発（例えば、トランスフォーマー部位指向変異誘発キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）などの市販キットを使用するプライマー指向変異誘発）を使用して、核酸配列全体にわたって複数の変化をもたらす。
【０３８６】
１種または複数の変異誘発剤に曝露した際の遺伝子改変の頻度は、処置の用量および／または繰り返しを変更することによってモジュレートすることができ、特定の用途に合わせることができる。
【０３８７】
よって、一部の実施形態では、本明細書で使用される「変異誘発」は、エラープローンＰＣＲ変異誘発、オリゴヌクレオチド指向性変異誘発、部位指向変異誘発、および本明細書に記載の技法のいずれかによる反復的配列組換えを含めて、変異を誘導するためのすべての当技術分野で公知の技法を含む。
多様性を生成するための単一遺伝子座変異
【０３８８】
一部の実施形態では、本開示は、ゲノムＤＮＡの選択された部分を導入し、欠失させ、または置き換えることによって細胞集団を変異させることを教示する。よって、一部の実施形態では、本開示は、特定の遺伝子座に変異を標的化するための方法を教示する。他の実施形態では、本開示は、標的ＤＮＡ領域を選択的に編集するための遺伝子編集技術、例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮＳ、またはＣＲＩＳＰＲの使用を教示する。
【０３８９】
他の実施形態では、本開示は、宿主生物の外で選択されたＤＮＡ領域を変異させ、次いで変異配列を宿主生物内に挿入して戻すことを教示する。例えば、一部の実施形態では、本開示は、生来のプロモーターまたは合成プロモーターを変異させて、様々な発現性質を有する一連のプロモーターバリアント（以下のプロモーターラダーを参照）を生成することを教示する。他の実施形態では、本開示は、ＰｒｏＳＡＲなどの単一遺伝子最適化技法に適合する（本明細書に参照により組み込まれている、Foxら、２００７年、「Improving  catalytic  function  by  ProSAR-driven  enzyme  evolution.」、Nature  Biotechnology、２５巻（３号）、３３８〜３４３頁）。
【０３９０】
一部の実施形態では、ＤＮＡの選択された領域は、自然バリアントの遺伝子シャッフリング、または合成オリゴでのシャッフリング、プラスミド−プラスミド組換え、ウイルスプラスミド組換え、ウイルス−ウイルス組換えを介してｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成される。他の実施形態では、ゲノム領域は、エラープローンＰＣＲを介して生成される。
【０３９１】
一部の実施形態では、選択された遺伝子領域内で変異を生成するステップは、「リアセンブリーＰＣＲ」によって実践される。簡単に言えば、オリゴヌクレオチドプライマー（オリゴ）が、目的の核酸配列のセグメントをＰＣＲ増幅するために合成され、その結果、オリゴヌクレオチドの配列は、２つのセグメントの接合部と重複する。重複領域は、典型的には、長さが約１０〜１００ヌクレオチドである。セグメントのそれぞれは、一連のこのようなプライマーで増幅される。次いでＰＣＲ産物は、アセンブリープロトコールに従って「リアセンブルされる」。簡単に説明すると、アセンブリープロトコールでは、ＰＣＲ産物は、例えば、ゲル電気泳動またはサイズ排除クロマトグラフィーによって最初に精製されてプライマーから離れる。精製産物は、一緒に混合され、追加のプライマーの非存在下で（「セルフプライミング」）、ポリメラーゼおよびデオキシヌクレオシドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）および適切な緩衝塩の存在下で、約１〜１０サイクルの変性、リアニーリング、および伸長に供される。遺伝子に隣接するプライマーを用いた後続のＰＣＲが使用されて、完全にリアセンブルおよびシャッフルされた遺伝子の収量が拡大される。
【０３９２】
本開示の一部の実施形態では、上記に論じたものなどの変異ＤＮＡ領域は、変異体配列について富化され、その結果、複数の変異体スペクトル、すなわち、変異の可能な組合せが、より効率的にサンプリングされる。一部の実施形態では、変異配列は、アセンブリー反応の前に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで親和性精製材料を増幅する好適なステップを用いて、ｍｕｔＳタンパク質親和性マトリックスを介して同定される（Wagnerら、Nucleic  Acids  Res.、２３巻（１９号）：３９４４〜３９４８頁（１９９５年）；Suら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.(U.S.A.)、８３巻：５０５７〜５０６１頁（１９８６年））。次いでこの増幅された材料は、本願の後の部分に記載されているアセンブリーまたはリアセンブリーＰＣＲ反応にかけられる。
プロモーターラダー
【０３９３】
プロモーターは、遺伝子が転写される速度を調節し、様々なやり方で転写に影響を与えることができる。構成的プロモーターは、例えば、内部または外部の細胞条件にかかわらず、定速でこれらの関連する遺伝子の転写を指示し、一方、調節可能な、チューニング可能な、または誘導性のプロモーターは、内部および／または外部の細胞条件、例えば、増殖速度、温度、具体的な環境化学物質に対する応答などに応じて遺伝子が転写される速度を増減する。プロモーターは、これらの正常な細胞コンテクストから単離することができ、操作されて、実質的に任意の遺伝子の発現を調節することができ、細胞増殖、産物収率、および／または目的の他の表現型の有効な改変を可能にする。
【０３９４】
プロモーター配列は、本明細書に提供される糸状菌宿主細胞中で発現される本明細書に提供される任意の配列の５’末端に作動可能に連結されていてもよい。様々な公知の真菌プロモーターが、本開示の宿主株において機能的である可能性が高く、そのようなプロモーターとしては、例えば、Ｃ１エンドグルカナーゼ、５５ｋＤａのセロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ１）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼＡ、Ｃ．ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅのＧＡＲＧ  ２７Ｋのプロモーター配列、およびＣｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ由来の３０ｋＤａのキシラナーゼ（Ｘｙ１Ｆ）プロモーターに加えて、例えば米国特許第４，９３５，３４９号；同第５，１９８，３４５号；同第５，２５２，７２６号；同第５，７０５，３５８号；および同第５，９６５，３８４号；ならびにＰＣＴ出願ＷＯ９３／０７２７７に記載されるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓプロモーターなどが挙げられる。一実施形態では、本明細書に提供される方法およびシステムで使用するためのプロモーターは、誘導性プロモーターである。誘導性プロモーターは、その転写活性が、例えばアルコール、テトラサイクリン、ステロイドなどの化学物質、金属または当技術分野で公知の他の化合物の存在または非存在によって調節される任意のプロモーターであってもよい。誘導性プロモーターは、その転写活性が、光または低温もしくは高温の存在または非存在によって調節される任意のプロモーターであってもよい。一実施形態では、誘導性プロモーターは、ｓｒｐＢ遺伝子、ａｍｙＢ遺伝子、ｍａｎＢ遺伝子またはｍｂｆＡ遺伝子などの糸状菌遺伝子から選択される。一実施形態では、誘導性プロモーターは、表１に列挙したプロモーターから選択される。一実施形態では、誘導性プロモーターは、グルコースによって抑制される異化産物である。グルコースによって抑制される異化産物は、Ａ．ｏｒｙｚａｅ由来のａｍｙＢプロモーターであり得る（図３７を参照）。
【０３９５】
一部の実施形態では、本開示は、下流の遺伝子設計法で使用するためのプロモーターラダーライブラリーを生成するための方法を教示する。例えば、一部の実施形態では、本開示は、一連の発現強度または優れた調節性質を呈する、１つまたは複数のプロモーターを同定し、かつ／または宿主細胞内で１つまたは複数のプロモーターのバリアントを生成する方法を教示する。これらの同定および／または生成されたプロモーターの特定の組合せは、以下でより詳細に説明されるプロモーターラダーとして一緒にグループ化することができる。
【０３９６】
一部の実施形態では、本開示は、プロモーターラダーの使用を教示する。一部の実施形態では、本開示のプロモーターラダーは、連続した範囲の発現プロファイルを呈するプロモーターを含む。例えば、一部の実施形態では、プロモーターラダーは、刺激に応答して、または構成的発現を通じて一連の発現強度を呈する天然の、生来の、または野生型プロモーターを同定することによって創製される（例えば、図１３を参照）。これらの同定されたプロモーターは、プロモーターラダーとして一緒にグループ化することができる。
【０３９７】
他の実施形態では、本開示は、異なる条件にわたって一連の発現プロファイルを呈するプロモーターラダーの創製を教示する。例えば、一部の実施形態では、本開示は、発現ピークが発酵の異なる段階全体にわたって広がったプロモーターのラダーを生み出すことを教示する。他の実施形態では、本開示は、特異的刺激に応答して異なる発現ピークダイナミクスを有するプロモーターのラダーを生み出すことを教示する（例えば、図１３を参照）。当業者は、本開示の調節プロモーターラダーは、任意の１つまたは複数の調節プロファイルの代表であり得ることを認識する。
【０３９８】
一部の実施形態では、本開示のプロモーターラダーは、応答の連続的な範囲にわたって予測可能な様式で遺伝子発現を撹乱するように設計される。一部の実施形態では、プロモーターラダーの連続的な特質は、株改良プログラムに追加の予測力を付与する。例えば、一部の実施形態では、選択された代謝またはシグナル伝達経路のスワッピングプロモーターまたは終結配列は、最も適した発現比率またはプロファイルを同定する宿主細胞性能曲線を生成することができ、標的とした遺伝子が、特定の反応または遺伝的カスケードにとってもはや制限因子でない一方、不適切な環境下で不要な過剰発現または誤発現も回避する株を生成する。選択できるシグナル伝達経路の例は、宿主細胞の形態の制御またはそれに対する影響において役割を果たすことが同定されているかまたはその疑いのあるシグナル伝達経路であり得る。したがって、一部の実施形態では、形態を制御するかまたはそれに影響することが示されているかまたはその疑いのある遺伝子のスワッピングプロモーターは、形態に関して、宿主細胞性能曲線を生成することができ、このような宿主細胞性能曲線は、所望の増殖条件下で所望のペレット状の形態を有する株または宿主細胞を生成し、標的とした遺伝子が、特定の反応または遺伝的カスケードにとってもはや制限因子でない一方、不適切な環境下で不要な過剰発現または誤発現も回避する株を生成するための、特異的な遺伝子の最も適した発現比率またはプロファイルを同定する。形態を制御するかまたはそれに影響することが示されているかまたはその疑いのある遺伝子の例は、当技術分野で公知の、または本明細書に提供される任意のこのような遺伝子であり得る。一部の実施形態では、プロモーターラダーは、所望のプロファイルを呈する天然の、生来の、または野生型プロモーターを同定することによって創製される。他の実施形態では、プロモーターラダーは、天然に存在するプロモーターを変異させて複数の変異プロモーター配列を得ることによって創製される。これらの変異プロモーターのそれぞれは、標的遺伝子発現に対する効果について試験される。一部の実施形態では、編集されたプロモーターは、様々な条件にわたって発現活性について試験され、その結果、各プロモーターバリアントの活性が記録され／特徴付けられ／アノテートされ、かつデータベース内に記憶される。結果として生じる編集されたプロモーターバリアントは、引き続いて組織化されて、これらの発現の強度に基づいて配列されたプロモーターラダーにされる（例えば、頂部付近に高度発現バリアントおよび底部付近に減弱された発現を有し、したがって、用語「ラダー」をもたらす）。
【０３９９】
一部の実施形態では、本開示は、同定された天然に存在するプロモーターおよび変異されたバリアントプロモーターの組合せであるプロモーターラダーを教示する。
【０４００】
一部の実施形態では、本開示は、以下の判定基準：１）構成的プロモーターのラダーを表した；および２）短いＤＮＡ配列、理想的には１００塩基対未満によってコードされ得る、の両方を満たした天然の、生来の、または野生型プロモーターを同定する方法を教示する。一部の実施形態では、本開示の構成的プロモーターは、２つの選択された成長条件（典型的には、工業的な培養中に経験した条件の間で比較した）にわたって一定の遺伝子発現を呈する。一部の実施形態では、本開示のプロモーターは、約６０塩基対のコアプロモーターおよび長さが２６から４０塩基対の間の５’ＵＴＲからなる。
【０４０１】
一部の実施形態では、上述の同定した天然に存在するプロモーター配列の１つまたは複数が、遺伝子編集のために選択される。一部の実施形態では、天然のプロモーターは、上述した変異方法のいずれかを介して編集される。他の実施形態では、本開示のプロモーターは、所望の配列を有する新しいプロモーターバリアントを合成することによって編集される。
【０４０２】
２０１５年１２月７日に出願された米国特許出願第６２／２６４，２３２号、および２０１６年１２月７日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６５６４号の開示全体は、これによってすべての目的のためにその全体が参照によって組み込まれる。
【０４０３】
以下の表１に本開示のプロモーターの非限定的な一覧を提供する。プロモーター配列のそれぞれは、異種プロモーターまたは異種プロモーターポリヌクレオチドと称する場合がある。
【表１】
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【０４０４】
一部の実施形態では、本開示のプロモーターは、上記表１由来のプロモーターと少なくとも１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、または７５％の配列同一性を呈する。
ターミネーターラダー
【０４０５】
一部の実施形態では、本開示は、ＲＮＡコードエレメントの末端の３’位で１つまたは複数の転写終結配列を提供することによって、遺伝子操作された宿主株を改良する方法を教示する。一部の実施形態では、本開示は、終結配列を付加すると、遺伝子操作された宿主内の選択された遺伝子のＲＮＡ転写の効率が改善されることを教示する。他の実施形態では、本開示は、終結配列を付加すると、遺伝子操作された宿主内の選択された遺伝子のＲＮＡ転写の効率が低減されることを教示する。よって、一部の実施形態では、本開示のターミネーターラダーは、一連の転写効率を呈する一連のターミネーター配列（例えば、１つの弱いターミネーター、１つの平均のターミネーター、および１つの強いプロモーター）を含む。
【０４０６】
転写終結配列は、転写で、オープンリーディングフレームをコードするヌクレオチド配列の下流に配置されたとき、オープンリーディングフレームの転写を終了させる任意のヌクレオチド配列であり得る。このような配列は、当技術分野で公知であり、原核生物、真核生物、またはファージ起源のものであり得る。ターミネーター配列の例としては、これらに限定されないが、ＰＴＨ−ターミネーター、ｐＥＴ−Ｔ７ターミネーター、Ｔ３−Ｔφターミネーター、ｐＢＲ３２２−Ｐ４ターミネーター、水疱性口内炎（vesicular  stomatitus）ウイルスターミネーター、ｒｒｎＢ−Ｔ１ターミネーター、ｒｒｎＣターミネーター、ＴＴａｄｃ転写ターミネーター、ならびに酵母認識終結配列、例えば、Ｍａｔα（α−因子）転写ターミネーター、生来のα−因子転写終結配列、ＡＤＲ１転写終結配列、ＡＤＨ２転写終結配列、およびＧＡＰＤ転写終結配列が挙げられる。転写ターミネーター配列の非網羅的なリストは、ｉＧＥＭレジストリにおいて見出すことができ、これは、http://partsregistry.org/Terminators/Catalogで利用可能である。
【０４０７】
一部の実施形態では、転写終結配列は、ポリメラーゼ特異的であっても非特異的であってもよいが、本実施形態において使用するために選択される転写ターミネーターは、選択されたプロモーターとの「機能的組合せ」を形成するべきであり、ターミネーター配列は、プロモーターで開始するＲＮＡポリメラーゼのタイプによって転写を終結することができるべきであることを意味する。例えば、一部の実施形態では、本開示は、真核生物ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩプロモーターおよび真核生物ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩターミネーター、Ｔ７プロモーターおよびＴ７ターミネーター、Ｔ３プロモーターおよびＴ３ターミネーター、酵母認識プロモーターおよび酵母認識終結配列などは一般に、機能的組合せを形成するはずであることを教示する。使用される転写終結配列の実体（identity）は、転写が所与のプロモーターから終結される効率に基づいて選択することもできる。例えば、異種転写ターミネーター配列は、ＲＮＡコードエレメントの転写的に下流に提供されて、所与のプロモーターから少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の終結効率を達成することができる。
【０４０８】
一部の実施形態では、操作された発現コンストラクトからのＲＮＡ転写の効率は、ＲＮＡコードエレメントの末端の３’位で２つまたはそれ超のヘアピンを含む二次構造を形成する核酸配列を提供することによって改善することができる。特定の理論によって束縛されることを望むことなく、二次構造は、転写伸長複合体を不安定化させ、ポリメラーゼをＤＮＡ鋳型から解離した状態にし、それによって、非機能的配列の非生産的転写を最小限にし、所望のＲＮＡの転写を増大させる。したがって、２つまたはそれ超の隣接するヘアピンを含む二次構造を形成する終結配列を提供することができる。一般に、ヘアピンは、それ自体で折り返してアームが一本鎖ループによって接続されている対を成したステム領域を形成することができるパリンドロームヌクレオチド配列によって形成することができる。一部の実施形態では、終結配列は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ超の隣接するヘアピンを含む。一部の実施形態では、隣接するヘアピンは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５の対を成していないヌクレオチドによって分離されている。一部の実施形態では、ヘアピンステムは、長さが４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、またはそれ超の塩基対を含む。ある特定の実施形態では、ヘアピンステムは、長さが１２〜３０塩基対である。ある特定の実施形態では、終結配列は、約９〜２５塩基対を含むステム領域を有する２つまたはそれ超の中型のヘアピンを含む。一部の実施形態では、ヘアピンは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドのループ形成領域を含む。一部の実施形態では、ループ形成領域は、４〜８ヌクレオチドを含む。特定の理論によって束縛されることを望むことなく、二次構造の安定性は、終結効率と相関し得る。ヘアピン安定性は、その長さ、それが含有するミスマッチまたはバルジの数、および対を成した領域の塩基組成によって決定される。グアニンとシトシンとの間の対合は、３つの水素結合を有し、２つしか有さないアデニン−チミン対合と比較してより安定である。ヘアピン形成パリンドロームヌクレオチド配列のＧ／Ｃ含有量は、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％またはそれ超であり得る。一部の実施形態では、ヘアピン形成パリンドロームヌクレオチド配列のＧ／Ｃ含有量は、少なくとも８０％である。一部の実施形態では、終結配列は、原核生物、真核生物、またはファージ起源の１つまたは複数の転写ターミネーター配列に由来する。一部の実施形態では、一連の４、５、６、７、８、９、１０またはそれ超のアデニン（Ａ）をコードするヌクレオチド配列が、終結配列の３’に提供される。
【０４０９】
一部の実施形態では、本開示は、一連のタンデム終結配列の使用を教示する。一部の実施形態では、一連の２、３、４、５、６、７、またはそれ超の第１の転写ターミネーター配列を、ｄｓＲＮＡコードエレメントの最終ヌクレオチドの３’に直接、またはｄｓＲＮＡコードエレメントの最終ヌクレオチドの３’に、少なくとも１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、４５〜５０、５０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜１，０００、もしくはそれ超のヌクレオチドの距離で配置することができる。タンデム転写ターミネーター配列間のヌクレオチドの数は、様々であり得、例えば、転写ターミネーター配列は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、４５〜５０、またはそれ超のヌクレオチドによって分離され得る。一部の実施形態では、転写ターミネーター配列は、構造予測アルゴリズムによって決定されるこれらの予測された二次構造に基づいて選択することができる。構造予測プログラムは、当技術分野で周知であり、例えば、ＣＬＣ  Ｍａｉｎ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈを含む。
【０４１０】
当業者は、本開示の方法が任意の終結配列に適合することを認識している。以下の表１．１に本開示の転写ターミネーター配列の非限定的な一覧を提供する。一実施形態では、本開示の転写ターミネーターは、表１．１に提供される終結配列のオルソログであってもよい。例えば、宿主細胞がＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓである場合、終結配列は、表１．１から選択される非Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ終結配列のオルソログであってもよい。
【表１．１−１】
2020524489.tif 000003
【表１．１−２】
2020524489.tif 000004
仮説主導型多様性プールおよびヒルクライミング
【０４１１】
本開示は、本開示のＨＴＰゲノム操作方法は、宿主細胞性能の有意な獲得を達成するのに先の遺伝的知識を必要としないことを教示する。実際に、本開示は、ランダム変異誘発、および既存の宿主細胞バリアントの中での遺伝的多様性の同定（例えば、野生型宿主細胞と工業用バリアントとの間の比較など）を含めたいくつかの機能にとらわれない（functionally  agnostic）手法を介して多様性プールを生成する方法を教示する。
【０４１２】
しかし、一部の実施形態では、本開示は、下流のＨＴＰ操作に使用される遺伝的多様性変異を設計する仮説主導方法も教示する。すなわち、一部の実施形態では、本開示は、選択された変異の指向設計を教示する。一部の実施形態では、指向変異が、本開示の操作ライブラリー（例えば、ＳＮＰスワップ、ＰＲＯスワップ、またはＳＴＯＰスワップ）中に組み入れられる。
【０４１３】
一部の実施形態では、本開示は、遺伝子アノテーション、仮定された（もしくは確認された）遺伝子機能、またはゲノム内の場所に基づく指向変異の創製を教示する。本開示の多様性プールは、文献において宿主細胞の性能の増大に関連した特異的代謝または遺伝経路に関与すると仮定された遺伝子中の変異を含み得る。他の実施形態では、本開示の多様性プールは、宿主性能の改善に関連した遺伝子への変異も含み得る。さらに他の実施形態では、本開示の多様性プールは、アルゴリズムが予測した機能または他の遺伝子アノテーションに基づく遺伝子への変異も含み得る。
【０４１４】
一部の実施形態では、本開示は、仮説主導型変異の標的に優先順位をつけるための「シェル」ベースの手法を教示する。標的優先順位付けのシェルメタファーは、少数の主要遺伝子のみが宿主細胞の性能の特定の態様（例えば、単一生体分子の産生）のほとんどを担うという仮説に基づく。これらの主要遺伝子は、シェルのコアに位置しており、その後、第２の層における二次効果遺伝子、第３のシェルにおける三次効果などが続く。例えば、一実施形態では、シェルのコアは、選択された代謝経路内の極めて重要な生合成酵素（例えば、クエン酸の産生）をコードする遺伝子を含み得る。第２のシェルに位置した遺伝子は、産物転換またはフィードバックシグナル伝達を担う生合成経路内の他の酵素をコードする遺伝子を含み得る。この例示的なメタファー下の第３の段の遺伝子は、生合成経路の発現のモジュレーションまたは宿主細胞内の全般的な炭素フラックスの調節を担う調節遺伝子を含みやすい。
【０４１５】
本開示は、あらゆる同定された変異からの性能獲得を最適化するための「ヒルクライム」法も教示する。一部の実施形態では、本開示は、ＨＴＰ多様性ライブラリー内のランダム、天然の、または仮説主導型変異が、宿主細胞性能に関連した遺伝子の同定をもたらすことができることを教示する。例えば、本方法は、遺伝子コード配列に、またはその付近に位置した１つまたは複数の有益なＳＮＰを同定することができる。この遺伝子は、宿主細胞性能に関連している場合があり、その同定は、生物体のコンビナトリアル遺伝子変異空間における性能「ヒル」の発見に類似し得る。
【０４１６】
一部の実施形態では、本開示は、ＳＮＰ変異において具現化された同定されたヒル周囲のコンビナトリアル空間を探索する方法を教示する。すなわち、一部の実施形態では、本開示は、その遺伝子ノード（すなわち、ヒルクライミング）から得られる性能獲得を最適化するための同定された遺伝子および関連した調節配列の撹乱を教示する。よって、本開示の方法によれば、遺伝子は、ランダム変異誘発から供給された多様性ライブラリー内で最初に同定することができるが、同じ遺伝子内の別の配列の指向変異によって株改良プログラムにおいて使用するために後に改善され得る。
【０４１７】
ヒルクライミングの概念は、単一遺伝子配列を囲繞するコンビナトリアル空間の探索を超えて拡張することもできる。一部の実施形態では、特定の遺伝子内の変異は、宿主細胞性能に対する特定の代謝経路または遺伝経路の重要性を明らかにすることができる。例えば、一部の実施形態では、単一ＲＮＡ分解遺伝子内の変異が有意な宿主性能獲得をもたらしたという発見を、宿主生物から追加の性能獲得を引き出すための手段として関連したＲＮＡ分解遺伝子を変異させるための基礎として使用することができる。当業者は、上記のバリアントが指向遺伝子設計へのシェルおよびヒルクライム手法を記述することを認識する。
【０４１８】
形態関連の遺伝子
【０４１９】
本明細書に提供される方法、株およびシステムでの使用のための形態関連の遺伝子は、糸状菌の真核微生物（例えば、糸状菌宿主細胞または株）の形態の制御またはそれに対する影響において役割を果たすことが示されているかまたはその疑いのある当技術分野で公知の任意の遺伝子であり得る。宿主細胞の形態を調節する遺伝子は、本明細書に提供されるような任意の遺伝子であってもよい。一実施形態では、遺伝子は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１のオルソログである。別の実施形態では、形態関連の遺伝子は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＬＮ１遺伝子のオルソログと同じ経路由来の任意の遺伝子であり得る。同じ経路の一部である遺伝子は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｙｐｄ１、Ｓｋｎ７、Ｓｓｋ１およびＳｓｋ２遺伝子のオルソログまたはこれらの任意の組合せから選択することができる。別の実施形態では、遺伝子は、核酸配列番号１１を有するＡ．ｎｉｇｅｒ遺伝子のオルソログ、および／または前記核酸配列番号１１を有するＡ．ｎｉｇｅｒ遺伝子のオルソログの同じ生化学的経路における任意の遺伝子である。別の実施形態では、遺伝子は、核酸配列番号１２を有するＡ．ｎｉｇｅｒ遺伝子のオルソログ、および／または前記核酸配列番号１２を有するＡ．ｎｉｇｅｒ遺伝子のオルソログの同じ生化学的経路における任意の遺伝子である。別の実施形態では、遺伝子は、核酸配列番号１４を有するＡ．ｎｉｇｅｒ遺伝子のオルソログ、および／または前記核酸配列番号１４を有するＡ．ｎｉｇｅｒ遺伝子のオルソログの同じ生化学的経路における任意の遺伝子である。
【０４２０】
本明細書に提供される方法、株およびシステムでの使用のための形態関連の遺伝子は、Ａ．ｎｉｇｅｒの形態の制御またはそれに対する影響において役割を果たすことが示されているかまたはその疑いのある当技術分野で公知の任意の遺伝子であり得る。一実施形態では、遺伝子は、配列番号１１、１２、１３または１４（表４を参照）から選択される核酸配列を有するＳＮＰを含有する遺伝子である。一実施形態では、遺伝子は、複数の遺伝子である。複数の遺伝子は、配列番号１１、１２、１３または１４から選択される核酸配列を有するＳＮＰを含有する遺伝子の任意の組合せであってもよい。複数の遺伝子は、配列番号１１から選択される核酸配列を有するＳＮＰを含有する遺伝子および同じ生化学的経路内に存在する任意の遺伝子の任意の組合せであってもよい。複数の遺伝子は、配列番号１２から選択される核酸配列を有するＳＮＰを含有する遺伝子および同じ生化学的経路内に存在する任意の遺伝子の任意の組合せであってもよい。複数の遺伝子は、配列番号１３から選択される核酸配列を有するＳＮＰを含有する遺伝子および同じ生化学的経路内に存在する任意の遺伝子の任意の組合せであってもよい。複数の遺伝子は、配列番号１４から選択される核酸配列を有するＳＮＰを含有する遺伝子および同じ生化学的経路内に存在する任意の遺伝子の任意の組合せであってもよい。一実施形態では、遺伝子は、配列番号１１、１２、１３または１４（表４を参照）から選択される核酸配列を有する遺伝子の野生型またはＳＮＰを含有しないバージョンである。
【０４２１】
一実施形態では、Ａ．ｎｉｇｅｒ宿主細胞の形態を調節する遺伝子は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＬＮ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログである。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＬＮ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログは、野生型形態または変異形態であってもよい。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログの変異形態は、表４からの、または配列番号１３の核酸配列を有するＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８であってもよい。別の実施形態では、形態関連の遺伝子は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＬＮ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログと同じ経路由来の任意の遺伝子であり得る。同じ経路の一部である遺伝子は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｙｐｄ１、Ｓｋｎ７、Ｓｓｋ１およびＳｓｋ２遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログまたはこれらの任意の組合せから選択することができる。同じ経路の一部である遺伝子は、配列番号１５、１６、１７、１８、１９によって表される核酸配列またはこれらの任意の組合せから選択することができる。
【０４２２】
形態関連の遺伝子は、その内容が参照によってその全体において組み込まれるDaiら（「Identification  of  Genes  Associated  with  Morphology  in  Aspergillus  niger  by  Using  Suppression  Subtractive  Hybridization」Applied  and  Environmental  Microbiology、２００４年４月、２４７４〜２４８５頁）に開示されている遺伝子またはこれらのオルソログのいずれであってもよい。形態関連の遺伝子は、ｇａｓ１遺伝子、ｓｆｂ３遺伝子、ｓｅｂ１遺伝子、ｍｐｇ１遺伝子、ｃｒｚ１遺伝子、およびｔｐｓ２遺伝子から選択することができる。形態関連の遺伝子のいずれの発現も、遺伝子が糸状もしくは菌糸体の形態またはペレット状の形態を促進するかどうかに応じて増大または減少させることができる。
【０４２３】
本明細書に記載の通り、本明細書に提供される形態関連の遺伝子またはこれらの変異体のいずれかの発現（例えば、表４からのＦｕｎｇｉＳＮＰの９、１２、１８または４０）は、遺伝子の生来のプロモーターを、生来のプロモーターと異なるレベル（例えば、それより高いまたはそれより低いレベル）での発現をもたらす異種プロモーターで置き換えることによって制御することができる。異種プロモーターは、表１から選択することができる。生来のプロモーターの置き換えは、本明細書に提供されるＰＲＯスワップ方法を使用して実行することができる。
【０４２４】
本発明のさらなる目的は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＬＮ１遺伝子の宿主細胞のオルソログの異種改変を含む糸状菌宿主細胞であって、それによってＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＬＮ１遺伝子の改変されたオルソログは、異種改変を欠く親の糸状菌宿主細胞に比べて、活性が低減され、かつ／または発現が低減されている、糸状菌宿主細胞を提供することである。糸状菌宿主は、菌糸体ではない、ペレットを形成する表現型を有していてもよい。このペレットの表現型は、糸状菌宿主細胞の細胞に、前記異種改変を有さない細胞と比較して実質的に低減された量および／または実質的により低い活性型のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＬＮ１遺伝子の機能的なオルソログを産生させるようなＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＬＮ１遺伝子のオルソログ中の異種改変を糸状菌宿主細胞が有することに起因する可能性がある。糸状菌宿主細胞および前記糸状菌宿主細胞の任意の親の株は、これらに由来しており、当技術分野で公知のおよび／または本明細書に提供される任意の糸状菌、例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒなどであってもよい。一実施形態では、糸状菌宿主細胞は、通常、例えば固体培地などの液中ではない増殖条件下で増殖させた場合の親の株と比較して、胞子形成する。別の実施形態では、糸状菌宿主細胞は、通常、例えば固体培地などの液中ではない増殖条件下で増殖させた場合の親の株と比較して、表４からのＳＮＰを含有する遺伝子のオルソログのうちの１つ、すべてまたは組合せが糸状菌宿主細胞でも発現される場合のみ胞子形成する。一実施形態では、糸状菌宿主細胞は、Ａ．ｎｉｇｅｒであり、前記Ａ．ｎｉｇｅｒ宿主細胞は、通常、例えば固体培地などの液中ではない増殖条件下で増殖させた場合の親の株と比較して、表４からのＳＮＰを含有する遺伝子のうちの１つ、すべてまたは組合せが前記Ａ．ｎｉｇｅｒ宿主細胞でも発現される場合のみ胞子形成する。さらに別の実施形態では、糸状菌宿主細胞は、通常、例えば固体培地などの液中ではない増殖条件下で増殖させた場合の親の株と比較して、表４からのＳＮＰを含有する遺伝子のオルソログのうちの１つ、すべてまたは組合せが糸状菌宿主細胞でも発現される場合のみ胞子形成する。液中での培養条件は、ＣＡＰ培地中でバリアント株を増殖させることを含んでいてもよい。ＣＡＰ培地は、マンガンを含んでいてもよく、実質的にキレート剤非含有であってもよい。マンガンは、少なくとも１３ｐｐｂまたはそれより多くの量で存在していてもよい。
【０４２５】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＬＮ１遺伝子のオルソログの遺伝子変更は、遺伝子の野生型の形態をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＬＮ１遺伝子の変異したオルソログで置き換えること、遺伝子の生来のプロモーターを、生来のプロモーターと比較してＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１タンパク質のオルソログの遺伝子をより弱く発現する異種プロモーターで置き換えること、またはこれらの組合せであってもよい。代替として、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＬＮ１遺伝子のオルソログの遺伝子変更は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＬＮ１遺伝子のオルソログの除去と選択可能なマーカー遺伝子での置き換えであってもよい。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＬＮ１遺伝子のオルソログの変異形態は、ＳＮＰ、ナンセンス変異、ミスセンス変異、欠失、挿入またはこれらの任意の組合せを含んでいてもよい。一実施形態では、糸状菌宿主細胞は、Ａ．ｎｉｇｅｒであり、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１タンパク質のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログは、配列番号１３によってコードされてもよい。異種プロモーターは、表１に列挙したプロモーターから選択することができる。一実施形態では、異種プロモーターは、ｍａｎＢまたはａｍｙＢプロモーターである。この実施形態に加えて、異種プロモーターは、配列番号１または配列番号２であってもよい。選択可能なマーカーは、本明細書に提供される栄養要求性マーカー遺伝子、発色性マーカー遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、または指向性マーカー遺伝子から選択することができる。
【０４２６】
実質的に低減された量および／または実質的により低い活性型のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１タンパク質の機能的なオルソログを有する糸状菌宿主細胞は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＬＮ１遺伝子のオルソログと同じ経路の一部である１つまたは複数の遺伝子における遺伝的破壊または変更をさらに含んでいてもよい。同じ経路の一部である１つまたは複数の遺伝子は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｙｐｄ１、Ｓｋｎ７、Ｓｓｋ１およびＳｓｋ２遺伝子のオルソログまたはこれらの任意の組合せから選択することができる。一実施形態では、糸状菌宿主細胞は、Ａ．ｎｉｇｅｒであり、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１、Ｙｐｄ１、Ｓｋｎ７、Ｓｓｋ１およびＳｓｋ２遺伝子のオルソログは、Ａ．ｎｉｇｅｒオルソログまたはその変異体である。この実施形態に加えて、同じ経路の一部である１つまたは複数の遺伝子は、配列番号１５、１６、１７、１８、１９によって表される核酸配列またはこれらの任意の組合せから選択することができる。糸状菌宿主細胞は、糸状菌の形態の制御において役割を果たすことが公知である異なる経路の一部である１つまたは複数の遺伝子における遺伝的破壊または変更をさらに含んでいてもよい。異なる経路の一部である１つまたは複数の遺伝子は、本明細書に提供される遺伝子のいずれであってもよい。異なる経路の一部である１つまたは複数の遺伝子は、配列番号１１、１２、１４によって表される核酸配列またはこれらの任意の組合せを有する遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログから選択することができる。一実施形態では、糸状菌宿主細胞は、Ａ．ｎｉｇｅｒであり、異なる経路の一部である１つまたは複数の遺伝子は、配列番号１１、１２、１４によって表される核酸配列またはこれらの任意の組合せを有するＡ．ｎｉｇｅｒ遺伝子である。別の実施形態では、糸状菌宿主細胞は、Ａ．ｎｉｇｅｒであり、異なる経路の一部である１つまたは複数の遺伝子は、配列番号１１、１２、１４によって表される核酸配列またはこれらの任意の組合せを有するＡ．ｎｉｇｅｒ遺伝子のＳＮＰを含有しないバージョンである。
【０４２７】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＬＮ１遺伝子のオルソログと同じ経路の一部であるか、または糸状菌の形態の制御において役割を果たすことが公知である異なる経路の一部である１つまたは複数の遺伝子の遺伝的破壊または変更は、遺伝子の野生型の形態を遺伝子の変異形態で置き換えること、遺伝子の生来のプロモーターを、生来のプロモーターと比較して、遺伝子の発現を変更する（例えば、より高く、またはより低く）異種プロモーターで置き換えること、またはこれらの組合せであってもよい。プロモーターは、表１に列挙したプロモーターであってもよい。代替として、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子のオルソログと同じ経路の一部であるか、または糸状菌の形態の制御において役割を果たすことが公知である異なる経路の一部である１つまたは複数の遺伝子の遺伝的破壊または変更は、遺伝子の除去と選択可能なマーカー遺伝子での置き換えであってもよい。選択可能なマーカーは、本明細書に提供される栄養要求性マーカー遺伝子、発色性マーカー遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、または指向性マーカー遺伝子から選択することができる。
【０４２８】
また、実質的に低減された量および／または実質的により低い活性型のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１タンパク質の機能的なオルソログを有する糸状菌宿主細胞を生成するための方法も本明細書に提供される。本方法は、本明細書に提供されるＰＲＯスワップ方法、ＳＮＰスワップ方法またはＰＲＯスワップとＳＮＰスワップ方法の組合せを実行することを含んでいてもよい。
【０４２９】
本発明のさらなる目的は、配列番号１１、１２、１４から選択される核酸配列またはこれらの任意の組合せを有するＡ．ｎｉｇｅｒ遺伝子の宿主細胞のオルソログの異種改変を含む糸状菌宿主細胞であって、それによって配列番号１１、１２、１４から選択される核酸配列またはこれらの任意の組合せを有するＡ．ｎｉｇｅｒ遺伝子の改変されたオルソログは、異種改変を欠く親の糸状菌宿主細胞に比べて、活性が低減され、かつ／または発現が低減されている、糸状菌宿主細胞を提供することである。糸状菌宿主細胞が、配列番号１１、１２、１４またはこれらの任意の組合せの核酸配列を有するＡ．ｎｉｇｅｒ遺伝子のオルソログへの異種改変を有することに起因して、糸状菌宿主は、液中での培養で増殖させた場合の親の株の細胞と比較して、菌糸体ではない、ペレットを形成する表現型を有していてもよい。配列番号１１、１２、１４またはこれらの任意の組合せの核酸配列を有するＡ．ｎｉｇｅｒ遺伝子のオルソログを有することによって、液中での培養条件下で増殖させた場合の親の宿主細胞の細胞と比較して、前記配列番号を有するＡ．ｎｉｇｅｒ遺伝子のオルソログによってコードされた実質的に低減された量および／または実質的により低い活性型の機能性タンパク質を宿主細胞の細胞に産生させることができる。糸状菌宿主細胞および前記糸状菌宿主細胞の親の株は、当技術分野で公知の、および／または本明細書に提供される任意の糸状菌、例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒなどであってもよい。一実施形態では、糸状菌宿主細胞株は、通常、例えば固体培地などの液中ではない増殖条件下で増殖させた場合の親の株と比較して、胞子形成する。一部の場合では、配列番号１１、１２または１４を有するＡ．ｎｉｇｅｒ遺伝子のオルソログは、さらに遺伝子変更される。さらなる遺伝子変更は、遺伝子の生来のプロモーターを、生来のプロモーターと比較して遺伝子をより弱く発現する異種プロモーターで置き換えることであってもよい。代替として、さらなる遺伝子変更は、配列番号１１、１２または１４を有するＡ．ｎｉｇｅｒ遺伝子のオルソログの除去と選択可能なマーカー遺伝子での置き換えであってもよい。選択可能なマーカーは、本明細書に提供される栄養要求性マーカー遺伝子、発色性マーカー遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、または指向性マーカー遺伝子から選択することができる。異種プロモーターは、表１に列挙したプロモーターから選択することができる。一実施形態では、異種プロモーターは、ｍａｎＢまたはａｍｙＢプロモーターである。この実施形態に加えて、異種プロモーターは、配列番号１または配列番号２の核酸配列を有していてもよい。液中での培養条件は、ＣＡＰ培地中でバリアント株を増殖させることを含んでいてもよい。ＣＡＰ培地は、マンガンを含んでいてもよく、実質的にキレート剤非含有であってもよい。マンガンは、少なくとも１３ｐｐｂまたはそれより多くの量で存在していてもよい。糸状菌宿主細胞がＡ．ｎｉｇｅｒである実施形態では、配列番号１１、１２、１４から選択される核酸配列を有するＡ．ｎｉｇｅｒ遺伝子またはこれらの野生型バージョンは、本明細書で詳述される異種改変を含み得ることを理解すべきである。
【０４３０】
配列番号１１、１２または１４から選択される配列を有するＡ．ｎｉｇｅｒ遺伝子のオルソログによってコードされた実質的に低減された量および／または実質的により低い活性型の機能性タンパク質を有する糸状菌宿主細胞は、同じ経路の一部である１つまたは複数の遺伝子における遺伝的破壊または変更をさらに含んでいてもよい。糸状菌宿主細胞は、糸状菌の形態の制御において役割を果たすことが公知である異なる経路の一部である１つまたは複数の遺伝子における遺伝的破壊または変更をさらに含んでいてもよい。異なる経路の一部である１つまたは複数の遺伝子は、本明細書に提供される遺伝子のいずれであってもよい。同じ経路の一部であるか、または糸状菌の形態の制御において役割を果たすことが公知である異なる経路の一部である１つまたは複数の遺伝子の遺伝的破壊または変更は、遺伝子の野生型の形態を遺伝子の変異形態で置き換えること、遺伝子の生来のプロモーターを、生来のプロモーターと比較して遺伝子の発現を変更する（例えば、より高く、またはより低く）異種プロモーターで置き換えること、またはこれらの組合せであってもよい。プロモーターは、表１に列挙したプロモーターであってもよい。代替として、同じ経路の一部であるか、または糸状菌の形態の制御において役割を果たすことが公知である異なる経路の一部である１つまたは複数の遺伝子の遺伝的破壊または変更は、遺伝子の除去と選択可能なマーカー遺伝子での置き換えであってもよい。選択可能なマーカーは、本明細書に提供される栄養要求性マーカー遺伝子、発色性マーカー遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、または指向性マーカー遺伝子から選択することができる。
【０４３１】
また、配列番号１１、１２または１４を有するＡ．ｎｉｇｅｒ遺伝子のオルソログによってコードされた実質的に低減された量および／または実質的により低い活性型の機能性タンパク質を有する糸状菌のバリアント株を生成するための方法も本明細書に提供される。本方法は、本明細書に提供されるＰＲＯスワップ方法、ＳＮＰスワップ方法またはＰＲＯスワップとＳＮＰスワップ方法の組合せを実行することを含んでいてもよい。
【０４３２】
本発明のさらに別の目的は、宿主細胞の形態を調節する遺伝子に作動可能に連結したプロモーターを含む糸状菌宿主細胞であって、プロモーターは、遺伝子にとって異種であり、プロモーターは、配列番号１〜４からなる群から選択される配列を有する、糸状菌宿主細胞を提供することである。糸状菌宿主細胞は、当技術分野で公知の、および／または本明細書に提供される任意の糸状菌、例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒなどであってもよい。一部の場合では、真菌宿主細胞は、通常、例えば固体培地などの液中ではない増殖条件下で増殖させた場合の宿主細胞の親の株と比較して胞子形成するが、液中での培養条件下で増殖させた場合、菌糸体ではないペレット状の形態を形成する。一部の場合では、宿主細胞は、前記１つまたは複数の遺伝子のそれぞれがそれに連結された異種プロモーターを有するように形態を調節する１つまたは複数の遺伝子を含んでいてもよい。宿主細胞の形態を調節する１つまたは複数の遺伝子は、本明細書に提供されるような任意の遺伝子、例えば、単独または組合せのいずれかでの、表４からの配列番号１１、１２、１３もしくは１４によって表されるＳＮＰを含有する遺伝子配列またはこれらのオルソログなどであってもよい。一部の場合では、表４からの配列番号１１、１２、１３もしくは１４によって表されるＳＮＰを含有する遺伝子配列またはこれらのオルソログは、それぞれのＳＮＰを含有する遺伝子配列と同じ経路からの１つまたは複数の遺伝子と組み合わされていてもよい。一実施形態では、１つまたは複数の遺伝子は、単独または組合せのいずれかでの、配列番号１１、１２、１３もしくは１４から選択される核酸配列を有する遺伝子またはこれらのオルソログの野生型またはＳＮＰを含有しないバージョンである。別の実施形態では、配列番号１１、１２、１３もしくは１４から選択される核酸配列を有する遺伝子またはこれらのオルソログの野生型またはＳＮＰを含有しないバージョンは、それぞれの野生型またはＳＮＰを含有しない遺伝子配列と同じ経路からの１つまたは複数の遺伝子と組み合わされていてもよい。一実施形態では、宿主細胞の形態を調節する遺伝子は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＬＮ１遺伝子のオルソログまたは同じシグナル伝達経路中の遺伝子であってもよい。同じシグナル伝達経路の一部である１つまたは複数の遺伝子は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｙｐｄ１、Ｓｋｎ７、Ｓｓｋ１およびＳｓｋ２遺伝子のオルソログまたはこれらの任意の組合せから選択することができる。一実施形態では、糸状菌宿主細胞は、Ａ．ｎｉｇｅｒであり、同じシグナル伝達経路の一部である１つまたは複数の遺伝子は、配列番号１５、１６、１７、１８、１９によって表される核酸配列またはこれらの任意の組合せから選択することができる。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＬＮ１遺伝子のオルソログは、遺伝子の野生型または変異形態であってもよい。一実施形態では、糸状菌宿主細胞は、Ａ．ｎｉｇｅｒであり、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子の変異したＡ．ｎｉｇｅｒオルソログは、配列番号１３の核酸配列を有する。液中での培養条件は、ＣＡＰ培地中でバリアント株を増殖させることを含んでいてもよい。ＣＡＰ培地は、マンガンを含んでいても��く、実質的にキレート剤非含有であってもよい。マンガンは、少なくとも１３ｐｐｂまたはそれより多くの量で存在していてもよい。
細胞培養および発酵
【０４３３】
本開示の細胞は、任意の所望の生合成反応または選択に適切に改変された慣例的な栄養培地中で培養することができる。一部の実施形態では、本開示は、プロモーターを活性化するための誘導培地中での培養を教示する。一部の実施形態では、本開示は、形質転換体（例えば、抗生物質）の選択剤、または阻害条件（例えば、高エタノール条件）下で増殖させるのに適した生物体の選択を含めた選択剤を含む培地を教示する。一部の実施形態では、本開示は、細胞増殖のために最適化された培地中の増殖細胞培養を教示する。他の実施形態では、本開示は、産物収率のために最適化された培地中の増殖細胞培養を教示する。一部の実施形態では、本開示は、細胞増殖を誘導することができ、最終産物産生に必要な前駆体（例えば、エタノール産生のための高レベルの糖）も含有する培地中の増殖培養を教示する。
【０４３４】
例えば、温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞とともに使用するのに適したものであり、当業者に明らかである。述べたように、多くの参考文献が、細菌、植物、動物（哺乳動物を含む）、および古細菌起源の細胞を含めた多くの細胞の培養および産生に利用可能である。例えば、Sambrook、Ausubel（すべて上記）、ならびにBerger、Guide  to  Molecular  Cloning  Techniques、Methods  in  Enzymology、１５２巻、Academic  Press,  Inc.、San  Diego、CA；ならびにFreshney（１９９４年）、Culture  of  Animal  Cells、a  Manual  of  Basic  Technique、３版、Wiley-Liss、New  York、およびそれに引用された参考文献；DoyleおよびGriffiths（１９９７年）、Mammalian  Cell  Culture:Essential  Techniques、John  Wiley  and  Sons、NY；Humason（１９７９年）、Animal  Tissue  Techniques、４版、W.H.  Freeman  and  Company；ならびにRicciardelleら、（１９８９年）、In  Vitro  Cell  Dev.  Biol.、２５巻：１０１６〜１０２４頁を参照。これらのすべては、参照により本明細書に組み込まれている。植物細胞培養および再生について、Payneら（１９９２年）、Plant  Cell  and  Tissue  Culture  in  Liquid  Systems、John  Wiley  &  Sons,  Inc.、New  York、N.Y.；GamborgおよびPhillips（編）（１９９５年）、Plant  Cell,  Tissue  and  Organ  Culture;  Fundamental  Methods  Springer  Lab  Manual、Springer-Verlag（Berlin  Heidelberg  N.Y.）；Jones編（１９８４年）、Plant  Gene  Transfer  and  Expression  Protocols、Humana  Press、Totowa、N.J．、ならびにPlant  Molecular  Biology（１９９３年）、R.  R.  D.  Croy編、Bios  Scientific  Publishers、Oxford、U.K.  ISBN  0  12  198370  6。これらのすべては、参照により本明細書に組み込まれている。一般に細胞培養培地は、AtlasおよびParks（編）、The  Handbook  of  Microbiological  Media（１９９３年）、CRC  Press、Boca  Raton、Fla.に示されており、これは、参照により本明細書に組み込まれている。細胞培養の追加の情報は、Sigma-Aldrich,  Inc（St  Louis、Mo.）からのLife  Science  Research  Cell  Culture  Catalogue（「Sigma-LSRCCC」）、および例えば、やはりSigma-Aldrich,  Inc（St  Louis、Mo.）からのThe  Plant  Culture  Catalogue  and  supplement（「Sigma-PCCS」）などの入手可能な市販の文献に見出され、これらのすべては、参照により本明細書に組み込まれている。
【０４３５】
使用される培養培地は、適当な様式で、それぞれの株の要求を満たさなければならない。様々な微生物の培養培地の記載は、American  Society  for  Bacteriologyの「Manual  of  Methods  for  General  Bacteriology」（Washington  D.C.、USA、１９８１年）に存在する。
【０４３６】
本開示は、目的の産物を発酵調製するためのプロセスであって、ａ）適当な培地中で本開示による微生物を培養し、発酵ブロスをもたらすステップと；ｂ）ａ）の発酵ブロス中、かつ／または微生物の細胞内で目的の産物を濃縮するステップとを含む、プロセスをさらに提供する。
【０４３７】
一部の実施形態では、本開示は、生成される微生物を、所望の有機−化学化合物を産生させる目的で、例えば、ＷＯ０５／０２１７７２に記載されているように連続的に、あるいはバッチプロセス（バッチ培養）またはフェドバッチもしくは繰り返しフェドバッチプロセスで不連続に培養することができることを教示する。公知の培養方法についての全般的な特質の概要は、Chmiel（Bioprozesstechnik.  1:  Einfuehrung  in  die  Bioverfahrenstechnik（Gustav  Fischer  Verlag、Stuttgart、１９９１年））による教科書、またはStorhas（Bioreaktoren  and  periphere  Einrichtungen（Vieweg  Verlag、Braunschweig/Wiesbaden、１９９４年））による教科書において入手可能である。
【０４３８】
一部の実施形態では、本開示の細胞は、バッチまたは連続発酵条件下で増殖される。
【０４３９】
古典的なバッチ発酵は、クローズドシステムであり、培地の組成は、発酵の開始時に設定され、発酵中に人為的な変更に供されない。バッチシステムの変形は、フェドバッチ発酵であり、これは、本開示においても使用を見出す。この変形では、基質は、発酵が進行するにつれて徐々に添加される。フェドバッチシステムは、異化産物抑制が細胞の代謝を阻害する可能性がある、および培地中の基質の量が限定されていることが望ましい場合、有用である。バッチ発酵およびフェドバッチ発酵は、一般的であり、当技術分野で周知である。
【０４４０】
連続発酵は、目的の所望の生体分子産物を処理および回収するために、規定された発酵培地がバイオリアクターに連続的に添加され、等量の馴化培地が同時に除去されるシステムである。一部の実施形態では、連続発酵は一般に、一定の高密度で培養物を維持し、この場合、細胞は、主に、対数期増殖にある。一部の実施形態では、連続発酵は一般に、静止または後期対数／静止期増殖で培養物を維持する。連続発酵システムは、定常状態増殖条件を維持しようと努める。
【０４４１】
連続発酵プロセスのための栄養分および成長因子をモジュレートするための方法、ならびに産物形成の速度を最大化するための技法は、工業微生物学の技術分野で周知である。
【０４４２】
例えば、本開示の培養のための炭素源の限定されないリストとしては、糖および炭水化物、例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、サトウダイコンまたはサトウキビ加工からのスクロース含有溶液、デンプン、デンプン加水分解物、およびセルロースなど；油脂、例えば、ダイズ油、ヒマワリ油、落花生油、およびココナツ脂肪など；脂肪酸、例えば、パルミチン酸、ステアリン酸、およびリノール酸など；アルコール、例えば、グリセロール、メタノール、およびエタノールなど；ならびに有機酸、例えば、酢酸または乳酸などが挙げられる。
【０４４３】
本開示の培養のための窒素源の限定されないリストとしては、有機窒素含有化合物、例えば、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、トウモロコシ浸出液、ダイズ粉、および尿素；または無機化合物、例えば、硫酸アンモニウム、アンモニウムクロリド、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、および硝酸アンモニウムが挙げられる。窒素源は、個々に、または混合物として使用され得る。
【０４４４】
本開示の培養のための可能なリン源の限定されないリストとしては、リン酸、リン酸二水素カリウムもしくはリン酸水素二カリウム、または対応するナトリウム含有塩が挙げられる。
【０４４５】
培養培地は、例えば、金属、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、および鉄などの塩化物または硫酸塩、例えば、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄などの形態で塩をさらに含み得、これらは、増殖に必要である。
【０４４６】
最後に、アミノ酸などの必須の成長因子、例えば、ホモセリンおよびビタミン、例えば、チアミン、ビオチン、またはパントテン酸を、上述した物質に加えて使用することができる。
【０４４７】
一部の実施形態では、培養物のｐＨは、これらに限定されないが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、もしくはアンモニア水を含めた任意の酸もしくは塩基または緩衝塩；あるいは適当な様式でのリン酸または硫酸などの酸性化合物によって制御することができる。一部の実施形態では、ｐＨは一般に、６．０〜８．５、好ましくは６．５〜８の値に調整される。
【０４４８】
一部の実施形態では、本開示の培養物は、例えば、脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を含み得る。一部の実施形態では、本開示の培養物は、例えば、抗生物質などの適当な選択物質を添加することによって、培養物のプラスミドを安定化するように改変される。
【０４４９】
一部の実施形態では、培養は、好気性条件下で実行される。これらの条件を維持するために、酸素または酸素含有気体混合物、例えば、空気などが、培養物に導入される。過酸化水素を富化させた液体を使用することが同様に可能である。発酵は、適切な場合、高圧で、例えば、０．０３〜０．２ＭＰａの高圧で実行される。培養物の温度は、通常２０℃〜４５℃、好ましくは２５℃〜４０℃、特に好ましくは３０℃〜３７℃である。バッチプロセスまたはフェドバッチプロセスでは、培養は、好ましくは、回収されるのに十分な目的の所望の産物（例えば、有機−化学化合物）の量が形成されるまで継続される。この目的は通常、１０時間〜１６０時間以内に達成することができる。連続プロセスでは、より長い培養時間が可能である。微生物の活動により、発酵培地中で、かつ／または前記微生物の細胞内で目的の産物が濃縮（蓄積）される。
【０４５０】
一部の実施形態では、培養は、嫌気性条件下で実行される。
スクリーニング
【０４５１】
一部の実施形態では、本開示は、ハイスループット初期スクリーニングを教示する。他の実施形態では、本開示は、性能データのロバストなタンクベースの検証も教示する（図６Ｂを参照）。
【０４５２】
一部の実施形態では、ハイスループットスクリーニングプロセスが、バイオリアクター内の株の性能を予測するのに設計される。先に記載した通り、培養条件は、生物体に適しており、バイオリアクター条件を反映しているように選択される。個々のコロニーが精選され、９６ウェルプレート中に移され、適当な量の時間にわたってインキュベートされる。細胞は、追加のシード培養のために新しい９６ウェルプレートに、または産生培養に引き続いて移される。培養物は、様々な長さの時間にわたってインキュベートされ、この場合、複数の測定を行うことができる。これらは、産物、バイオマス、またはバイオリアクター内の株の性能を予測する他の特性の測定を含み得る。ハイスループット培養結果は、バイオリアクター性能を予測するのに使用される。
【０４５３】
一部の実施形態では、タンクベースの性能検証が使用されて、ハイスループットスクリーニングによって単離された株の性能が確認される。候補株は、生産性または収率などの関連した株性能特性について、ベンチスケールの発酵反応器（例えば、本開示の表３に開示した反応器）を使用してスクリーニングされる。
産物回収および定量
【０４５４】
目的の産物の産生についてスクリーニングするための方法は、当業者に公知であり、本明細書全体にわたって論じられている。このような方法は、本開示の株をスクリーニングするとき使用することができる。
【０４５５】
一部の実施形態では、本開示は、非分泌型細胞内産物を産生するように設計された株を改善する方法を教示する。例えば、本開示は、細胞内酵素、油、医薬品、または他の貴重な低分子もしくはペプチドを産生する細胞培養物のロバスト性、収率、効率、または全体的な望ましさを改善する方法を教示する。非分泌型細胞内産物の回収または単離は、本明細書に記載のものを含めて当技術分野で周知である溶解技法および回収技法によって達成することができる。
【０４５６】
例えば、一部の実施形態では、本開示の細胞は、遠心分離、濾過、沈殿、または他の方法によって回収することができる。次いで回収された細胞は、当業者に周知である凍結融解サイクリング、超音波処理、機械的破壊、もしくは細胞溶解剤の使用、または他の方法を含めた任意の好都合な方法によって破壊される。
【０４５７】
結果として生じる目的の産物、例えば、ポリペプチドは、当技術分野で公知のいくつかの方法のいずれかによって回収／単離および任意選択で精製することができる。例えば、産物ポリペプチドは、これらに限定されないが、遠心分離、濾過、抽出、噴霧乾燥、蒸発、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、疎水性相互作用、クロマトフォーカシング、およびサイズ排除）、または沈降を含めた慣例的な手順によって栄養培地から単離することができる。最後に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を、最終精製ステップで使用することができる。（例えば、ともに参照により本明細書に組み込まれている、Parryら、２００１年、Biochem.  J.、３５３巻：１１７頁、およびHongら、２００７年、Appl.  Microbiol.  Biotechnol．、７３巻：１３３１頁に記載の細胞内タンパク質の精製を参照）。
【０４５８】
上述した参考文献に加えて、様々な精製方法は、例えば、Sandana（１９９７年）、Bioseparation  of  Proteins、Academic  Press,  Inc.；Bollagら（１９９６年）、Protein  Methods、２版、Wiley-Liss、NY；Walker（１９９６年）、The  Protein  Protocols  Handbook、Humana  Press、NJ；HarrisおよびAngal（１９９０年）、Protein  Purification  Applications:  A  Practical  Approach、IRL  Press  at  Oxford、Oxford、England；HarrisおよびAngal  Protein  Purification  Methods:A  Practical  Approach、IRL  Press  at  Oxford、Oxford、England；Scopes（１９９３年）、Protein  Purification:  Principles  and  Practice、３版、Springer  Verlag、NY；JansonおよびRyden（１９９８年）、Protein  Purification:  Principles,  High  Resolution  Methods  and  Applications、２版、Wiley-VCH、NY；ならびにWalker（１９９８年）、Protein  Protocols  on  CD-ROM、Humana  Press、NJに示されたものを含めて、当技術分野で周知である。これらの文献のすべては、参照により本明細書に組み込まれている。
【０４５９】
一部の実施形態では、本開示は、分泌産物を産生させるように設計された株を改良する方法を教示する。例えば、本開示は、貴重な低分子またはペプチドを産生する細胞培養物のロバスト性、収率、効率、または全体的な望ましさを改善する方法を教示する。
【０４６０】
一部の実施形態では、免疫学的方法は、本開示の細胞によって産生される分泌型または非分泌型産物を検出および／または精製するのに使用することができる。一例示的手法では、従来の方法を使用して産物分子に対して（例えば、インスリンポリペプチドまたはその免疫原性断片に対して）産生される抗体は、ビーズ上に固定化され、エンドグルカナーゼが結合している条件下で細胞培養培地と混合され、沈降される。一部の実施形態では、本開示は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）の使用を教示する。
【０４６１】
他の関連した実施形態では、米国特許第５，５９１，６４５号、米国特許第４，８５５，２４０号、米国特許第４，４３５，５０４号、米国特許第４，９８０，２９８号、およびSe-Hwan  Paekら、「Development  of  rapid  One-Step  Immunochromatographic  assay,  Methods」、２２巻、５３〜６０頁、２０００年）に開示された免疫クロマトグラフィーが使用される。これらの文献のそれぞれは、本明細書に参照により組み込まれている。一般的な免疫クロマトグラフィーは、２つの抗体を使用することによって検体を検出する。第１の抗体は、試験溶液中に、または試験溶液が滴下される、多孔質膜から作製されたおよそ矩形状をした試験片の末端の部分に存在する。この抗体は、ラテックス粒子または金コロイド粒子で標識される（この抗体は、以下で標識抗体と呼ばれる）。滴下された試験溶液が検出されるべき検体を含むとき、標識抗体は、検体を認識して検体と結合する。検体と標識抗体との複合体は、アブソーバーに向けて毛管現象によって流れ、このアブソーバーは、濾紙から作製され、標識抗体を含んだ末端と反対の末端に結合している。流れている間に、検体と標識抗体との複合体は、多孔質膜の中間に存在している第２の抗体（これは、以下でタッピング抗体（tapping  antibody）と呼ばれる）によって認識および捕捉され、この結果として、複合体は、可視シグナルとして多孔質膜上の検出部分に現れ、検出される。
【０４６２】
一部の実施形態では、本開示のスクリーニング方法は、測光検出技法（吸収、蛍光）に基づく。例えば、一部の実施形態では、検出は、抗体に結合したＧＦＰなどのフルオロフォア検出剤の存在に基づき得る。他の実施形態では、測光検出は、細胞培養からの所望の産物の蓄積に基づき得る。一部の実施形態では、産物は、培養物または前記培養物からの抽出物のＵＶを介して検出可能であり得る。
【０４６３】
当業者は、本開示の方法が、目的の任意の望ましい生体分子産物を産生する宿主細胞に適合することを認識する。以下の表２は、本開示の範囲内に含まれる産物カテゴリー、生体分子、および宿主細胞の限定されないリストを提示する。これらの例は、例示的な目的で提供されており、決して本開示の技術の適用性を限定するように意味していない。
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【表２−５】
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選択判定基準および目標
【０４６４】
本開示の方法に適用される選択判定基準は、株改良プログラムの具体的な目標によって変動する。本開示は、任意のプログラム目標を満たすように適応させることができる。例えば、一部の実施形態では、プログラム目標は、差し迫った期限を伴わずに反応の単一バッチ収率を最大化することであり得る。他の実施形態では、プログラム目標は、生合成収率をリバランスして、特異的な産物を産生させ、または特定の比の産物を産生させることであり得る。他の実施形態では、プログラム目標は、産物の化学構造を改変すること、例えば、ポリマーの炭素鎖を長くすることであり得る。一部の実施形態では、プログラム目標は、性能特性、例えば、収率、力価、生産性、副生成物排除、プロセスエクスカーションに対する寛容性、最適な増殖温度、および増殖速度を改善することであり得る。一部の実施形態では、プログラム目標は、微生物によって産生される目的の産物の体積生産性、比生産性、収率、または力価によって測定した宿主性能の改善である。
【０４６５】
他の実施形態では、プログラム目標は、入力量当たりの最終産物収率（例えば、スクロース１ポンド当たりに産生されるエタノールの合計量）の観点から市販の株の合成効率を最適化することであり得る。他の実施形態では、プログラム目標は、例えば、バッチ完了率、または連続培養システムにおける歩留まり率の観点から測定した、合成速度を最適化することであり得る。他の実施形態では、プログラム目標は、特定のファージに対する株の耐性を増大させること、またはさもなければ培養条件下で株の活力／ロバスト性を増大させることであり得る。
【０４６６】
一部の実施形態では、株改良プロジェクトは、１つを超える目標を対象とする場合がある。一部の実施形態では、株プロジェクトの目標は、品質、信頼性、または全体的な収益性次第であり得る。一部の実施形態では、本開示は、上述した株性質の１つまたは複数を有する関連した選択された変異または変異の群の方法を教示する。
【０４６７】
当業者は、特定のプロジェクト目標を満たすように株選択判定基準をどのように合わせるかを認識する。例えば、反応が飽和しているときの株の単一バッチ最大収量の選択は、単一バッチ収量が高い株を同定するのに適切であり得る。一連の温度および条件にわたる収率の一貫性に基づく選択は、ロバスト性および信頼性が増大した株を同定するのに適切であり得る。
【０４６８】
一部の実施形態では、初期のハイスループットフェーズおよびタンクベースの検証の選択判定基準は、同一となる。他の実施形態では、タンクベースの選択は、追加のおよび／または異なる選択判定基準下で働き得る。例えば、一部の実施形態では、ハイスループット株選択は、単一バッチ反応完了収率に基づき得る一方、タンクベースの選択は、反応速度に対する収率に基づく選択を含むように拡張することができる。
シーケンシング
【０４６９】
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載の生物体の全ゲノムシーケンシングを教示する。他の実施形態では、本開示は、本開示の方法の品質対照としてのプラスミド、ＰＣＲ産物、および他のオリゴのシーケンシングも教示する。大および小プロジェクトのためのシーケンシング法は、当業者に周知である。
【０４７０】
一部の実施形態では、核酸をシーケンシングするための任意のハイスループット技法を、本開示の方法において使用することができる。一部の実施形態では、本開示は、全ゲノムシーケンシングを教示する。他の実施形態では、本開示は、遺伝的バリエーションを同定するためのアンプリコンシーケンシング、ウルトラディープシーケンシングを教示する。一部の実施形態では、本開示は、タグメンテーションを含めたライブラリー調製の新規方法も教示する（ＷＯ／２０１６／０７３６９０を参照）。ＤＮＡシーケンシング技法としては、標識ターミネーターまたはプライマー、およびスラブまたはキャピラリーにおけるゲル分離を使用する古典的ジデオキシシーケンシング反応（サンガー法）；可逆的に終止される標識ヌクレオチドを使用する合成によるシーケンシング、ピロシーケンシング；４５４シーケンシング；標識オリゴヌクレオチドプローブのライブラリーへの対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション；ライゲーションが後に続く標識クローンのライブラリーへの対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションを使用する合成によるシーケンシング；重合ステップ中の標識ヌクレオチドの組み入れのリアルタイムモニタリング；ポロニーシーケンシング；およびＳＯＬｉＤシーケンシングが挙げられる。
【０４７１】
本開示の一態様では、固体表面上の個々の分子を空間的に単離するステップであって、個々の分子が並行してシーケンシングされる、ステップを含むシーケンシングのハイスループット方法が使用される。このような固体表面として、非多孔性表面（Ｓｏｌｅｘａシーケンシング、例えば、Bentleyら、Nature、４５６巻：５３〜５９頁（２００８年）またはＣｏｍｐｌｅｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓシーケンシング、例えば、Drmanacら、Science、３２７巻：７８〜８１頁（２０１０年）などにおける）、ビーズ結合鋳型または粒子結合鋳型を含み得るウェルのアレイ（４５４、例えば、Marguliesら、Nature、４３７巻：３７６〜３８０頁（２００５年）、またはイオントレントシーケンシング、米国特許公開２０１０／０１３７１４３号もしくは同第２０１０／０３０４９８２号を用いてなど）、微細加工膜（ＳＭＲＴシーケンシング、例えば、Eidら、Science、３２３巻：１３３〜１３８頁（２００９年）を用いてなど）、またはビーズアレイ（ＳＯＬｉＤシーケンシングまたはポロニーシーケンシング、例えば、Kimら、Science、３１６巻：１４８１〜１４１４頁（２００７年）を用いるような）を挙げることができる。
【０４７２】
別の実施形態では、本開示の方法は、単離分子が固体表面上で空間的に単離される前または後のいずれかに単離分子を増幅するステップを含む。事前の増幅は、エマルジョンＰＣＲなどのエマルジョンに基づく増幅、またはローリングサークル増幅を含み得る。Ｓｏｌｅｘａに基づくシーケンシングも教示されており、この場合、Bentleyら（上記に引用した）に、かつ製造者の指示（例えば、ＴｒｕＳｅｑ（商標）試料調製キットおよびデータシート、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．、２０１０年）に；かつさらに、参照により組み込まれている以下の参考文献：米国特許第６，０９０，５９２号；同第６，３００，０７０号；同第７，１１５，４００号；およびＥＰ０９７２０８１Ｂ１に記載されている通り、個々の鋳型分子が固体表面上で空間的に単離され、その後これらがブリッジＰＣＲによって並行して増幅されて別個のクローン集団またはクラスターを形成し、次いでシーケンシングされる。
【０４７３】
一実施形態では、固体表面上で配置および増幅された個々の分子は、１ｃｍ２当たり少なくとも１０５クラスターの密度で；または１ｃｍ２当たり少なくとも５×１０５の密度で；または１ｃｍ２当たり少なくとも１０６クラスターの密度でクラスターを形成する。一実施形態では、相対的に高い誤り率を有するシーケンシング化学反応が使用される。このような実施形態では、このような化学反応によって生じる平均品質スコアは、配列リード長の単調低下関数である。一実施形態では、このような低下は、配列リードの０．５パーセントが１〜７５位に少なくとも１つの誤差を有し；配列リードの１パーセントが７６〜１００位に少なくとも１つの誤差を有し；配列リードの２パーセントが１０１〜１２５位に少なくとも１つの誤差を有することに対応する。
ゲノムワイド遺伝子設計判定基準の効果のコンピューター分析および予測
【０４７４】
一部の実施形態では、本開示は、所与の宿主株内に組み入れている特定の遺伝子変更の効果を予測する方法を教示する。さらなる態様では、本開示は、所与の宿主株内に、前記宿主が特定の表現型形質または株パラメータを有するために組み入れるべきである提案された遺伝子変更を生成するための方法を提供する。所与の態様では、本開示は、新規宿主株を設計するのに利用することができる予測モデルを提供する。新規宿主株は、例えばＡ．ｎｉｇｅｒなどの糸状菌宿主株であってもよい。
【０４７５】
一部の実施形態では、本開示は、各ラウンドのスクリーニングの性能結果を分析する方法、およびその後のラウンドのスクリーニングで株性能を増強すると予測される新しく提案されたゲノムワイド配列修飾をおこすための方法を教示する。
【０４７６】
一部の実施形態では、本開示は、システムが、先のスクリーニング結果に基づいて宿主株に提案された配列修飾をおこすことを教示する。一部の実施形態では、本システムの推奨は、直前のスクリーニングからの結果に基づく。他の実施形態では、本システムの推奨は、先行するスクリーニングのうちの１つまたは複数の累積的結果に基づく。
【０４７７】
一部の実施形態では、本システムの推奨は、先に開発されたＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーに基づく。例えば、一部の実施形態では、本システムは、同じまたは異なる宿主生物において、先のスクリーニングからの結果を保存し、異なるプロジェクトにこれらの結果を適用するように設計される。
【０４７８】
他の実施形態では、本システムの推奨は、科学的洞察に基づく。例えば、一部の実施形態では、推奨は、遺伝子の公知の性質（アノテートされた遺伝子データベースおよび関連した文献などの源からの）、コドン最適化，転写スリップ、ｕＯＲＦ、または他の仮説主導型配列、および宿主最適化に基づく。
【０４７９】
一部の実施形態では、システムまたは予測モデルが推奨した宿主株への提案された配列修飾は、（１）プロモータースワップ、（２）ＳＮＰスワップ、（３）開始／停止コドン交換、（４）配列最適化、（５）Ｓｔｏｐスワップ、および（５）上位性マッピングを含む開示した分子ツールセットの１つまたは複数の利用によって実行される。
【０４８０】
本明細書に記載のＨＴＰ遺伝子操作プラットフォームは、任意の特定の微生物または表現型形質（例えば、特定の化合物の産生）に関してとらわれない。すなわち、本明細書に教示のプラットフォームおよび方法は、任意の宿主細胞とともに利用して、任意の所望の表現型形質を有するように前記宿主細胞を操作することができる。さらに、１つの新規宿主細胞を生み出すのに使用される所与のＨＴＰ遺伝子操作プロセスから学習した教訓を、教示された方法の間に行われる無数のプロセスパラメータの記憶、特徴付け、および分析の結果として、任意の数の他の宿主細胞に適用することができる。特定の態様では、宿主細胞は、当技術分野で公知の任意の多核体生物体であってもよい。例えば、宿主細胞は、糸状菌宿主細胞であってもよい。本明細書で使用するための糸状菌宿主細胞の例は、Ａ．ｎｉｇｅｒであり得る。
【０４８１】
上位性マッピングセクションにおいて言及したように、ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーからの変異のコレクションをある好適な予測モデルを介して特定のバックグラウンド内に統合することによって得られる仮定の株の性能（別名スコア）を推定することが可能である。このような予測モデルを考慮すると、コンビナトリアル統合を介して変異ラブラリーにアクセス可能なすべての仮定の株をスコア付けおよびランク付けすることが可能である。以下のセクションは、本ＨＴＰプラットフォームにおいて利用される特定のモデルを概説する。
予測的株設計
【０４８２】
遺伝子変化および株性能を記述し、株内の変化の組成に基づいて株性能を予測し、高い予測された性能を有する候補設計を推奨し、予測を選別して二次の考慮事項、例えば、既存の株に対する類似度、上位性、または予測における信頼度を最適化する方法を含む、予測的株設計の手法が本明細書に記載されている。
株設計モデルへの入力
【０４８３】
一実施形態では、例示を容易にする目的で、入力データは、２つのコンポーネント：（１）遺伝子変化のセットおよび（２）相対的株性能を含み得る。当業者は、このモデルは、オーバーフィッティングの対抗する考慮事項に留意しながら、容易に拡張して多種多様な入力を考慮することができることを認識する。遺伝子変化に加えて、調整され得る入力パラメータ（独立変数）の一部は、細胞型（属、種、株、系統発生的特徴付けなど）、および発酵が細胞を用いて行われている下でのプロセスパラメータ（例えば、環境条件、装置のハンドリング、修飾技法など）である。
【０４８４】
遺伝子変化のセットは、ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーと呼ばれる遺伝子撹乱の先に論じたコレクションに由来し得る。相対的株性能は、任意の所与のパラメータまたは目的の表現型形質（例えば、目的の化合物、低分子、または産物の産生）に基づいて評価することができる。
【０４８５】
細胞型は、一般的なカテゴリー、例えば、原核生物システムおよび真核生物システム、属、種、株、組織培養物（分散細胞に対して）などにおいて指定され得る。調整され得るプロセスパラメータは、温度、圧力、反応器構成、および培地組成が挙げられる。反応器構成の例には、プロセスがバッチであっても連続であっても、反応器の体積、および連続である場合、体積流量などが含まれる。もしあれば、細胞が存在する、支持構造体を指定することもできる。培地組成の例としては、電解質の濃度、栄養分、老廃物、酸、ｐＨなどが挙げられる。
予測的株設計モデルを創製するのに次に使用される初期線形回帰モデルで利用される選択されたＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーからの遺伝子変化のセット
【０４８６】
予測的株設計モデルを創製するために、最初に同じ微生物種の株中の遺伝子変化を選択する。各遺伝子変化の歴史（例えば、この株系統における最近の修飾、すなわち「最後の変化」を示す）も提供される。よって、この株の性能をその親の性能と比較することは、「最後の変化」の変異の性能に関するデータ点を表す。
構築された株（built  strain）性能評価
【０４８７】
教示したモデルの目標は、株に導入される遺伝子変化の組成に基づいて株性能を予測することである。比較のための標準を構築するために、株性能をアッセイプレート１つ当たり、株１つ当たりの性能の中央値を最初に算出することによって一般的な参照株と比べて算出する。次いで、相対的性能を、同じプレート内の操作された株と一般的な参照株との間の平均性能の差異として計算する。プレート内の比較に算出を制限することにより、検討中の試料がすべて同じ実験条件を受けたことを保証する。
【０４８８】
図４１は、入力データに関する相対的株性能の分布が検討中の仮説の例を示す。ゼロの相対的性能は、操作された株がプレート内基準または「参照」株と同等によく働いたことを示す。ゼロを有意に上回って働きやすい株を同定する予測モデルの能力が目的のものである。さらに、かつより一般的に、いくつかの判定基準によって任意の所与の株がその親より性能が優れているかどうかが、目的のものである。実際には、判定基準は、親レベルを超えるある閾値を満たす、または超える産物力価であり得るが、所望の方向で親からの統計的に有意な差異を有することも、代替としてまたは追加的に使用することができる。基準株または「参照」株の役割は、プレート内またはプレート間で比較を行うための付加された正規化因子として単に機能を果たすことである。
【０４８９】
留意すべき概念は、親株と参照株との間の差異のものである。親株は、現在のラウンドの変異誘発について使用したバックグラウンドである。参照株は、特にプレート間で比較を促進するためにあらゆるプレートで実行される対照株であり、典型的には、上記に言及した「基準株」である。しかし、基準株（例えば、全体的な性能をベンチマークするのに使用される野生型株または工業用株）は、所与のラウンドの株改良において変異誘発標的であるという意味において必ずしも「基準」である必要はないので、より記述的な用語は、「参照株」である。
【０４９０】
要約すると、基準／参照株は、一般に、構築された株の性能をベンチマークするのに使用され、一方、親株は、関連した遺伝的バックグラウンドにおける特異的な遺伝子変化の性能をベンチマークするのに使用される。
線形回帰を用いた構築された株の性能のランク付け
【０４９１】
開示したモデルの目標は、構築された株内に導入される遺伝子変化の組成の関数として相対的株性能を記述することによって構築された株の性能をランク付けることである。本開示全体にわたって論じられるように、様々なＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーは、操作された株内に導入される可能な遺伝子変化（例えば、遺伝子撹乱／変更）のレパートリーを提供する。線形回帰は、現在記載されている例示的な予測モデルの基礎である。
【０４９２】
次いで遺伝子変化およびこれらの相対的な性能への効果を、回帰ベースのモデル化のために入力する。株性能は、株内に含有される遺伝子変化の組成の関数として、一般的な基準株と比べてランク付けされる。
構築された株を特徴付けるための線形回帰
【０４９３】
線形回帰は、インプリメンテーションおよび解釈の容易さのために、記載されたＨＴＰゲノム操作プラットフォームにとって魅力的な方法である。結果として生じる回帰係数は、各遺伝子変化の存在に帰することができる相対的株性能の平均の増大または低下として解釈することができる。
【０４９４】
例えば、一部の実施形態では、この技法は、本発明者らに、元のプロモーターを別のプロモーターに変化させると、任意の負の上位性相互作用の非存在下で、相対的株性能が平均でおよそ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ユニットまたはそれより多くのユニット改善され、よって潜在的に高度に望ましい変化であると結論付けることを可能にする（注意：入力は、無単位正規化値である）。
【０４９５】
したがって、教示した方法は、様々な教示したライブラリーからの自己のゲノム内に導入された様々な遺伝子撹乱を有する構築された株を記述し／特徴付け、ランク付けるための線形回帰モデルを使用する。
予測的設計モデル化
【０４９６】
構築した株からのデータを利用した上述した線形回帰モデルは、まだ構築されていない株についての性能予測を行うのに使用することができる。
【０４９７】
手順は、以下の通り要約することができる：遺伝子変化のすべての可能な構成をｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで生成する、それに続き、回帰モデルを使用して相対的株性能を予測する、それに続き、性能による候補株設計を注文する。よって、未だ構築されていない株の性能を予測するための回帰モデルを利用することによって、本方法は、より少ない実験を同時に行いながらより高い性能の株の産生を可能にする。
構成の生成
【０４９８】
まだ構築されていない株の性能を予測するモデルを構築するとき、第１のステップは、設計候補の配列を生成することである。これは、株内の遺伝子変化の総数を固定し、次いで遺伝子変化のすべての可能な組合せを明確にすることによって行われる。例えば、潜在的な遺伝子変化／撹乱の総数を２９（例えば、２９の可能なＳＮＰ、もしくは２９の異なるプロモーター、または遺伝子撹乱のユニバースが２９である限り、これらの任意の組合せ）に設定し、次いで２９の潜在的な遺伝子変化のすべての可能な３メンバー組合せを設計する決定を下すことができ、３，６５４の候補株設計がもたらされる。
【０４９９】
上述の３，６５４候補株にコンテクストを提供するために、ｎ！／（（ｎ−ｒ）！×ｒ！）を使用してｎの可能なメンバーからサイズｒの非重複グループの数を算出することができることを考慮されたい。ｒ＝３である場合、ｎ＝２９は、３，６５４を与える。よって、２９の潜在的な変化のすべての可能な３メンバー組合せを設計する場合、結果は、３，６５４候補株である。
新しい株設計の性能の予測
【０５００】
入力としてコンビナトリアル構成を用いて上で構築した線形回帰を使用して、次いで、各候補設計の予期される相対的性能を予測することができる。例えば、上位１００の予測された株設計についての変化の組成を２次元マップに要約でき、ここでｘ軸は、潜在的な遺伝子変化（２９の潜在的な遺伝子変化）のプールを列挙し、ｙ軸は、ランク順序を示す。
【０５０１】
予測精度は、新しい知見がモデルを反復して保持および再フィットするにつれて経時的に増大するはずである。本発明者らによるスタディからの結果は、予測モデルを反復して保持および改善することができる方法を例示する。モデル予測の品質は、予測値と観測値との間の関連性の強度を示す相関係数、または平均モデル誤差の尺度である二乗平均平方根誤差を含めたいくつかの方法によって評価することができる。モデル評価のための選択された測定基準を使用して、システムは、モデルが保持されるべきときの規則を定義することができる。
【０５０２】
上記モデルに対して２つの述べられていない仮定は、（１）上位性相互作用が存在しないこと、および（２）予測モデルを構築する利用される遺伝子変化／撹乱はすべて、遺伝子変化の提案された組合せとして、同じバックグラウンドにおいて作製されたことを含む。
二次フィーチャのフィルタリング
【０５０３】
上記実例は、予測された宿主細胞性能に基づく線形回帰予測に着目した。一部の実施形態では、本線形回帰方法は、非生体分子因子、例えば、飽和バイオマス、耐性、または他の測定可能な宿主細胞フィーチャに適用することもできる。よって、本開示の方法は、構築するための候補に優先順位を付けるとき、予測された性能以外の他のフィーチャを考慮することも教示する。追加の関連したデータが存在すると仮定して、非線形項も、回帰モデルに含められる。
既存の株との密接な関係
【０５０４】
すでに構築されたものと同様である予測された株は、最上位の予測された候補でないにもかかわらず、時間およびコスト削減をもたらすことができる。
変化の多様性
【０５０５】
上述のモデルを構築するとき、遺伝子変化は、上位性相互作用の存在に起因して真に相加的となる（線形回帰によって仮定し、上記仮定として述べた通り）と確認することができない。したがって、遺伝子変化相違点の知識は、正の相加性の見込みを増大させるのに使用することができる。例えば、最上位にランク付けされた株由来の変化が同じ代謝経路上にあり、同様の性能特性を有すると分かると、その情報を使用して、変化の同じでない組成を有する別の最上位ランクの株を選択することができる。上位性マッピングに関して上記セクションに記載した通り、予測された最良の遺伝子変化を選別して十分に同じでない応答プロファイルを有する変異に選択を制限することができる。代替として、線形回帰は、予測に重み付けするために類似度行列を使用する重み付き最小二乗回帰であり得る。
予測された性能の多様性
【０５０６】
最後に、予測モデルを検証し、引き続いて改善するために、中程度のまたは不満足な予測された性能を有する株を設計するように選択することができる。
反復株設計最適化
【０５０７】
諸実施形態では、発注エンジン２０８は、最上位の候補変異を組み入れている微生物株を製造するために工場注文（factory  order）をファクトリー２１０に出す。フィードバック−ループ様式では、結果を分析装置２１４によって分析して、どの微生物が所望の表現型性質を呈するかを決定することができる（３１４）。分析フェーズ中に、修飾された株培養物が評価されて、これらの性能、すなわち、工業規模で産生される能力を含めて、これらの所望の表現型性質の発現が決定される。例えば、分析フェーズでは、とりわけ、プレートの画像データが使用されて、コロニー健康の指標として微生物コロニー増殖が測定される。分析装置２１４が使用されて、遺伝子変化が表現型性能と相関付けられ、結果として生じる遺伝子型−表現型相関データをライブラリー内に保存して（それは、ライブラリー２０６内に記憶され得る）、将来の微生物産生を知らせる。
【０５０８】
特に、十分に高い測定された性能を実際にはもたらす候補変化を、表にデータベース中の行として加えることができる。このようにして、最良に働く変異が、教師付き機械学習様式で予測的株設計モデルに加えられる。
【０５０９】
ＬＩＭＳは、先のファクトリーランから発生した相関に基づいて、設計／構築／試験／分析サイクルを反復する。後続のサイクル中に、分析装置２１４は、単独で、または人のオペレーターと併せて、相関データを使用して遺伝子改変を微調整することによってより微細な粒度を有するより良好な表現型性能を達成して、入力インターフェース２０２に入力して戻すための基準株としての最良候補を選択することができる。このようにして、本開示の実施形態の実験室情報管理システム（ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｓｙｓｔｅｍ）は、品質改善フィードバックループをインプリメントする。
【０５１０】
つまり、図１６のフロー図を参照して、反復予測的株設計ワークフローを以下の通り記述することができる。
【０５１１】
入出力変数、例えば、入力として遺伝子変化および出力として性能フィーチャの訓練セットを生成する（３３０２）。生成は、先の遺伝子変化およびこれらの遺伝子変化を組み入れている微生物株の対応する測定された性能に基づいて分析装置２１４によって実施することができる。
【０５１２】
訓練セットに基づいて初期モデル（例えば、線形回帰モデル）を開発する（３３０４）。これは、分析装置２１４によって実施することができる。
【０５１３】
設計候補株を生成する（３３０６）
【０５１４】
一実施形態では、分析装置２１４は、変化の組合せの形態でバックグラウンド株に行われる遺伝子変化の数を固定することができる。これらの変化を表すために、分析装置２１４は、インタープリター２０４に、変化のこれらの組合せを表す１つまたは複数のＤＮＡの仕様を提供することができる。（これらの遺伝子変化またはこれらの変化を組み入れる微生物株は、「試験入力」と呼ばれる場合がある）。インタープリター２０４は、１つまたは複数のＤＮＡの仕様を解釈し、エグゼキューションエンジン２０７は、ＤＮＡの仕様を実行してこれらの変化について個々の候補設計株を表す分解された出力を有するＤＮＡの仕様をポピュレートする。
【０５１５】
モデルに基づいて、分析装置２１４は、各候補設計株の予期される性能を予測する（３３０８）。
【０５１６】
分析装置２１４は、最高の予測された性能を有する限られた数の候補設計、例えば１００を選択する（３３１０）。
【０５１７】
上位性マッピングに関して本明細書の他の場所で記載したように、分析装置２１４は、例えば、上位性効果について上位の設計を選別し、または予測モデル内に、上位性を計算に入れることによって上位性などの二次効果について説明することができる。
【０５１８】
発注エンジン２０８によって作成された工場注文に基づいて選別された候補株を構築する（ファクトリー２１０で）（３３１２）。
【０５１９】
分析装置２１４は、選択された株の実際の性能を測定し、これらの優れた実際の性能に基づいて限られた数のこれらの選択された株を選択し（３３１４）、設計変化およびこれらの結果として生じる性能を予測モデルに加える（３３１６）。線形回帰の例において、設計変化およびこれらの関連した性能のセットを表中の新しい行として加える。
【０５２０】
次いで分析装置２１４は、新しい設計候補株の生成に戻って反復し（３３０６）、停止条件が満たされるまで反復し続ける。停止条件は、例えば、性能測定基準、例えば、収率、増殖速度、または力価を満たす少なくとも１つの微生物株の測定された性能を含み得る。
【０５２１】
上記例では、株設計の反復最適化は、フィードバックおよび線形回帰を使用して機械学習をインプリメントする。一般に、機械学習は、限られた数の標識データの例を使用し、次いで未知のデータに対して同じタスクを実施して、情報タスク（分類または回帰など）の性能における性能判定基準、例えば、パラメータ、技法、または他のフィーチャの最適化として記述することができる。上記線形回帰の例のものなどの教師付き機械学習では、機械（例えば、演算デバイス）は、例えば、訓練データが呈するパターン、カテゴリー、統計的関係、または他の属性を同定することによって学習する。次いで学習の結果が使用されて、新しいデータが、同じパターン、カテゴリー、統計的関係、または他の属性を呈するかどうかが予測される。
【０５２２】
本開示の実施形態は、訓練データが入手可能であるとき、他の教師付き機械学習技法を使用することができる。訓練データの非存在下で、諸実施形態では、教師なし機械学習が使用される場合がある。代替として、諸実施形態では、少量の標識データおよび大量の未標識データを使用して、半教師付き機械学習が使用され得る。諸実施形態では、フィーチャ選択が使用されて最も関連したフィーチャのサブセットが選択されることによって機械学習モデルの性能が最適化される場合もある。選択される機械学習手法のタイプに応じて、線形回帰の代替として、またはそれに加えて、諸実施形態では、例えば、ロジスティック回帰、ニューラルネットワーク、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）、デシジョンツリー、隠れマルコフモデル、ベイジアンネットワーク、グラムシュミット、強化ベースの学習、階層的クラスタリングを含めたクラスターに基づく学習、遺伝的アルゴリズム、および当技術分野で公知の任意の他の適当な学習機械が使用され得る。特に、諸実施形態では、ロジスティック回帰が使用されて分類自体とともに分類（例えば、異なる機能群への遺伝子の分類）の確率が提供され得る。例えば、Shevade、A  simple  and  efficient  algorithm  for  gene  selection  using  sparse  logistic  regression、Bioinformatics、１９巻、１７号、２００３年、２２４６〜２２５３頁、Lengら、Classification  using  functional  data  analysis  for  temporal  gene  expression  data、Bioinformatics、２２巻、１号、Oxford  University  Press（２００６年）、６８〜７６頁を参照。これらのすべては、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０５２３】
諸実施形態では、グラフィックスプロセシングユニット（ＧＰＵ）加速アーキテクチャが使用される場合があり、これは、特に、ディープニューラルネットワーク（ＤＮＮ）として公知の形態で、機械学習タスクの実施において評判が増大していることが見出されている。本開示の実施形態では、ＧＰＵに基づく機械学習、例えば、GPU-Based  Deep  Learning  Inference:  A  Performance  and  Power  Analysis、NVidia  Whitepaper、２０１５年１１月、Dahlら、Multi-task  Neural  Networks  for  QSAR  Predictions、コンピューターサイエンス学科、トロント大学、２０１４年６月（arXiv:1406.1231  [stat.ML]）に記載されているものが使用され得る。これらの文献のすべては、本明細書にその全体が参照により組み込まれている。本開示の実施形態に適用可能な機械学習技法は、他の参考文献の中でも、Libbrechtら、Machine  learning  applications  in  genetics  and  genomics、Nature  Reviews:  Genetics、１６巻、２０１５年６月、Kashyapら、Big  Data  Analytics  in  Bioinformatics:  A  Machine  Learning  Perspective、Journal  of  Latex  Class  Files、１３巻、９号、２０１４年９月、Prompramoteら、Machine  Learning  in  Bioinformatics、Bioinformatics  Technologiesの第５章、１１７〜１５３頁、Springer  Berlin  Heidelberg、２００５年にも見出すことができ、これらのすべては、本明細書にその全体が参照により組み込まれている。
反復予測的株設計：例
【０５２４】
以下は、上記に概説した反復予測的株設計ワークフローの例示的用途を提供するものである。
【０５２５】
訓練入力変数および出力変数の初期セットを調製した。このセットは、確定した遺伝子組成を有する１８６４のユニークな操作された株を含んでいた。各株は、５から１５の間の操作された変化を含有していた。合計３３６のユニークな遺伝子変化が該訓練に存在した。
【０５２６】
初期の予測コンピューターモデルを開発した。インプリメンテーションは、一般化線形モデル（４次多項式カーネルを用いたカーネルリッジ回帰）を使用した。インプリメンテーションは、２つの個別の表現型（収率および生産性）をモデル化する。これらの表現型を、以下に示す通り、加重和として組み合わせてランク付けのための単一スコアを得た。様々なモデルパラメータ、例えば、正則化係数を、指定された訓練データに対してｋ倍交差検証を介してチューニングした。
【０５２７】
インプリメンテーションは、上記上位性マッピングセクションに記載した相互作用効果のいずれの明確な分析も組み入れない。しかし、当業者が理解するはずであるように、インプリメントされる一般化線形モデルは、カーネルの２、３、および４次項を通じて暗黙的に相互作用効果を捕捉することができる。
【０５２８】
モデルを訓練セットに対して訓練する。訓練後、収率モデルの訓練データへの有意な品質フィッティングを実証することができる。
【０５２９】
次いで候補株を生成する。この実施形態は、親株への新しい遺伝子変化の導入に関連する連続構築制約を含む。ここでは、候補は、所望の数の変化の関数として単に見なされない。代わりに、分析装置２１４は、出発点として、高性能測定基準を有すると分かっている先に設計された株（「シード株」）のコレクションを選択する。分析装置２１４は個々に、遺伝子変化をシード株のそれぞれに適用する。導入された遺伝子変化は、シード株内にすでに存在するものを含まない。様々な技術的、生物学的または他の理由で、ある特定の変異が明示的に要求されるか、または明示的に除外される。
【０５３０】
モデルに基づいて、分析装置２１４は、候補株設計の性能を予測した。分析装置２１４は、目的の２つの表現型（収率および生産性）に関する予測された性能に基づいて「最良」から「最悪」に候補をランク付ける。具体的には、分析装置２１４は、加重和を使用して候補株をスコア付けする：
【０５３１】
スコア＝０．８＊ｙｉｅｌｄ／ｍａｘ（ｙｉｅｌｄｓ））＋０．２＊ｐｒｏｄ／ｍａｘ（ｐｒｏｄｓ）、
式中、ｙｉｅｌｄは、候補株について予測された収率を表し、
ｍａｘ（ｙｉｅｌｄｓ）は、すべての候補株に対する最大収率を表し、
ｐｒｏｄは、候補株についての生産性を表し、
ｍａｘ（ｐｒｏｄｓ）は、すべての候補株に対する最大収率を表す。
【０５３２】
分析装置２１４は、能力の制約およびオペレーションの制約の両方を課すことによって候補のランク付けされたリストから推奨の最終セットを生成する。一部の実施形態では、能力限界は、４８のコンピューター生成候補設計株などの所与の数で設定することができる。
【０５３３】
訓練されたモデル（上述した）を使用して各候補株の予期される性能（収率および生産性についての）を予測することができる。分析装置２１４は、上記に与えたスコア付関数を使用して候補株をランク付けすることができる。次いで能力およびオペレーションの制約を適用して４８の候補株の選別されたセットを得ることができる。次いで選別された候補株を、発注エンジン２０８（３３１２）が作成した工場注文に基づいて構築する（ファクトリー２１０において）。注文は、候補株に対応するＤＮＡの仕様に基づいていてもよい。
【０５３４】
実際には、ビルドプロセスは、予期された失敗率を有し、それによって株のランダムセットを構築しない。
【０５３５】
分析装置２１４を使用して選択された株の実際の収率および生産性性能を測定することもできる。分析装置２１４は、３つの判定基準：モデル精度；株性能の改善；および人間の専門家が作成した設計との同等性（または改善）に基づいて、モデルおよび推奨株を評価することができる。
【０５３６】
収率および生産性表現型を、推奨株について測定し、モデルが予測した値と比較することができる。
【０５３７】
次に、分析装置２１４は、推奨された株のそれぞれの親株からのパーセンテージ性能変化を計算する。
【０５３８】
予測精度は、予測値と観測値との間の関連性の強度を示す相関係数、または平均モデル誤差の尺度である二乗平均平方根誤差を含めたいくつかの方法によって評価することができる。実験の多くのラウンドにわたって、モデル予測がずれる場合があり、新しい遺伝子変化を訓練入力に加えて予測精度を改善することができる。本例に関して、設計変化およびこれらの結果として生じる性能を予測モデルに加えた（３３１６）。
サービスとしてのゲノム設計および操作
【０５３９】
本開示の実施形態では、図１５のＬＩＭＳシステムソフトウェア３２１０を、図１５のクラウドコンピューティングシステム３２０２において実装して、複数のユーザーが本開示の実施形態によって微生物株を設計および構築するのを可能にすることができる。図１５は、本開示の実施形態によるクラウドコンピューティング環境３２０４を例示する。図１５に例示したものなどのクライアントコンピューター３２０６は、インターネットなどのネットワーク３２０８を介してＬＩＭＳシステムにアクセスする。諸実施形態では、ＬＩＭＳシステムアプリケーションソフトウェア３２１０は、クラウドコンピューティングシステム３２０２内に存在する。ＬＩＭＳシステムは、図１５に例示したタイプの１つまたは複数のプロセッサーを使用して１つまたは複数のコンピューターシステムを使用することができる。クラウドコンピューティングシステム自体は、ネットワーク３２０８を介してＬＩＭＳシステムアプリケーション３２１０をクライアントコンピューター３２０６にインターフェースをとるためのネットワークインターフェース３２１２を含む。ネットワークインターフェース３２１２は、アプリケーションプログラミングインターフェース（ＡＰＩ）を含むことによって、クライアントコンピューター３２０６におけるクライアントアプリケーションがＬＩＭＳシステムソフトウェア３２１０にアクセスするのを可能にすることができる。特に、ＡＰＩを通じて、クライアントコンピューター３２０６は、限定することなく、入力インターフェース２０２、インタープリター２０４、実行エンジン２０７、発注エンジン２０８、ファクトリー２１０をランさせるソフトウェア、ならびに試験装置２１２および分析装置２１４を含めたＬＩＭＳシステム２００のコンポーネントにアクセスすることができる。サービス型ソフトウェア（ＳａａＳ）のソフトウェアモジュール３２１４は、クライアントコンピューター３２０６へのサービス型ＬＩＭＳシステムソフトウェア３２１０を提供する。クラウド管理モジュール３２１６は、クライアントコンピューター３２０６によるＬＩＭＳシステム３２１０へのアクセスを管理する。クラウド管理モジュール３２１６は、マルチテナントアプリケーションを使用するクラウドアーキテクチャ、当技術分野で公知の仮想化または他のアーキテクチャが、複数のユーザーにサービスすることを可能にし得る。図４４は、糸状菌宿主細胞系に適用した場合のＬＩＭＳシステムの有用性の原理の証明を示す。
ゲノム自動化
【０５４０】
本開示の方法を自動化すると、同時に複数の試験株バリアントからの標的産物のハイスループット表現型スクリーニングおよび同定が可能になる。
【０５４１】
上述のゲノム操作予測モデルリングプラットフォームは、数百および数千の変異体株がハイスループット様式で構築される事実を前提としている。以下に記載のロボットシステムおよびコンピューターシステムは、このようなハイスループットプロセスを実行することができる構造機構である。
【０５４２】
一部の実施形態では、本開示は、宿主細胞生産性を改善し、または工業用株を再建する方法を教示する。このプロセスの一部として、本開示は、ＤＮＡをアセンブルし、新しい株を構築し、プレート中の培養物をスクリーニングし、タンク発酵のモデルにおける培養物をスクリーニングする方法を教示する。一部の実施形態では、本開示は、新しい宿主株を創製および試験する上述の方法の１つまたは複数は、自動化ロボットによって助けられることを教示する。
【０５４３】
一部の実施形態では、本開示は、図６Ａ〜Ｂに表したハイスループット株操作プラットフォームを教示する。
ＨＴＰロボットシステム
【０５４４】
一部の実施形態では、本明細書に提供される方法およびシステムは、自動化されたステップを含む。例えば、本明細書に記載の通り、プロトプラストの生成、プロトプラストの形質転換、精製前のＮＧＳによる形質転換されたプロトプラストのスクリーニング、選択／対抗選択による同核共存体のプロトプラストの精製、および精製後のＮＧＳによる形質転換されたプロトプラストのスクリーニングは、自動化することができる。本明細書に記載の通り、本方法およびシステムは、目的のタンパク質または代謝産物を産生するために、精製した同核共存体の形質転換体をスクリーニングするさらなるステップを含有していてもよい。本開示の自動化された方法は、ロボットシステムを含んでいてもよい。本明細書に概説したシステムは、一般に９６−または３８４−ウェルマイクロタイタープレートの使用を対象とし得るが、当業者が十分に理解するように、任意の数の異なるプレートまたは構成を使用することができる。さらに、本明細書に概説したステップのいずれかまたはすべてを自動化することができ、よって例えばシステムは、完全にまたは部分的に自動化され得る。自動化された方法およびシステムは、ハイスループットであってもよい。本開示の目的に関して、ハイスループットスクリーニングは、１日当たり約１，０００個またはそれより多くの形質転換体を評価することが可能な、任意の部分的または完全に自動化された方法、特定には、１日当たり５，０００個またはそれより多くの形質転換体を評価することが可能な方法、最も特定には、１日当たり１０，０００個またはそれより多くの形質転換体を評価することが可能な方法を指すことができる。部分的または完全に自動化された方法は、１つまたは複数の液体ハンドリングステップの使用を伴っていてもよい。
【０５４５】
本明細書に記載の通り、本明細書に提供される方法およびシステムは、本明細書に記載の通り生成および精製された形質転換体が、目的の産物の産生についてスクリーニングまたは試験されるようなスクリーニングステップを含んでいてもよい。目的の産物は、本明細書に提供される任意の目的の産物、例えば、アルコール、医薬品、代謝産物、タンパク質、酵素、アミノ酸、または酸（例えば、クエン酸）などであってもよい。よって、本明細書に提供される方法およびシステムは、クローンのコロニーまたは本開示の方法に従って精製した培養物を、目的の産物の発現および分泌を許容する条件下で培養すること、およびその後産生された目的の産物を回収することをさらに含んでいてもよい。本明細書に記載の通り、目的の産物は、外因性および／もしくは異種タンパク質、または外因性およびまたは異種タンパク質の発現の結果として産生された代謝産物であってもよい。
【０５４６】
一部の実施形態では、本開示の自動化された方法は、ロボットシステムを含む。本明細書に概説したシステムは一般に、９６または３８４ウェルマイクロタイタープレートの使用を対象とするが、当業者が十分に理解するように、任意の数の異なるプレートまたは構成を使用することができる。さらに、本明細書に概説したステップのいずれかまたはすべては自動化されていてもよく、よって例えば本システムは、完全にまたは部分的に自動化されていてもよい。
【０５４７】
一部の実施形態では、本開示の自動化システムは、１つまたは複数の作業モジュールを含む。例えば、一部の実施形態では、本開示の自動化システムは、ＤＮＡ合成モジュール、ベクタークローニングモジュール、株形質転換モジュール、スクリーニングモジュール、およびシーケンシングモジュールを含む（図７を参照）。
【０５４８】
当業者が十分に理解する通り、自動化システムは、これらに限定されないが、液体ハンドラー；１つまたは複数のロボットアーム；マイクロプレートを適所配置するためのプレートハンドラー；プレートシーラー、プレートピアサー、非交差汚染プレート上のウェルの蓋を除去および交換するための自動化蓋ハンドラー；使い捨てチップを用いて試料分散するための使い捨てチップアセンブリー；試料分散のための洗浄可能なチップアセンブリー；９６ウェルローディングブロック；一体型サーマルサイクラー；冷却された試薬ラック；マイクロタイタープレートピペットポジション（必要に応じて冷却された）；プレートおよびチップのためのスタッキングタワー；磁気ビーズ処理ステーション；濾過システム；プレートシェーカー；バーコードリーダーおよびアプリケーター；ならびにコンピューターシステムを含めた多種多様なコンポーネントを含み得る。図８は、本開示の一体型糸状菌株改良プログラムの概要を示す。
【０５４９】
一部の実施形態では、本開示のロボットシステムは、ハイスループットピペット操作を可能にして遺伝子標的化および組換え用途のプロセスにおけるすべてのステップを実施する自動化液体および粒子ハンドリングを含む。これは、液体および粒子マニピュレーション、例えば、吸引、分散、混合、希釈、洗浄、正確な容量移送；ピペットチップの取戻しおよび廃棄；ならびに単一試料吸引からの複数の送達についての同一体積の繰り返しピペット操作などを含む。これらのマニピュレーションは、交差汚染のない液体、粒子、細胞、および生物体移送である。機器は、フィルター、膜、および／または娘プレートへのマイクロプレート試料の自動化複製、高密度移送、フルプレート連続希釈、ならびに大容量オペレーションを遂行する。
【０５５０】
自動化システムは、当技術分野で公知の任意の公知の自動化ハイスループットシステムであってもよい。例えば、自動化システムは、自動化された微生物ハンドリングツールであってもよく、これは、日本国公開特許公報第１１−３０４６６６号に記載されている。このデバイスは、個々の細胞を含有する微小液滴を移動させることができ、本開示の真菌株は、これらの形態に基づいて、このデバイスを用いた個々のクローンのマイクロマニピュレーションに適応すると予想される。本開示の方法およびシステムでの使用のための自動化システムの追加の例は、Beydonら、J.  Biomol.  Screening  ５巻：１３〜２１頁（２０００年）に記載される自動化された微生物ハイスループットスクリーニングシステムである。本明細書で使用するための自動化システムは、特注の自動化された液体ハンドリングシステムであってもよい。一部の実施形態では、本開示の特注の自動化された液体ハンドリングシステムは、ＴＥＣＡＮ機械（例えば特注のＴＥＣＡＮ  Ｆｒｅｅｄｏｍ  Ｅｖｏ）である。
【０５５１】
一部の実施形態では、本開示の自動化システムは、マルチウェルプレート、ディープウェルプレート、スクウェアウェルプレート、試薬トラフ、試験管、ミニチューブ、マイクロチューブ、クライオバイアル、フィルター、マイクロアレイチップ、光ファイバー、ビーズ、アガロースゲルおよびアクリルアミドゲルのためのプラットフォームに適合し、他の固相マトリックスまたはプラットフォームは、アップグレード可能なモジュラーデッキ上に収容されている。一部の実施形態では、本開示の自動化システムは、ソースおよび産出試料、試薬、試料および試薬希釈、アッセイプレート、試料および試薬リザーバー、ピペットチップ、ならびにアクティブチップ洗浄ステーションを配置するための多位置作業面のための少なくとも１つのモジュラーデッキを含有する。
【０５５２】
一部の実施形態では、本開示の自動化システムは、ハイスループット電気穿孔システムを含む。一部の実施形態では、ハイープット電気穿孔システムは、９６または３８４−ウェルプレート内で細胞を形質転換することができる。一部の実施形態では、ハイスループット電気穿孔システムとしては、ＶＷＲ（登録商標）ハイスループット電気穿孔システム、ＢＴＸ（商標）、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＭＸｃｅｌｌ（商標）、または他のマルチウェル電気穿孔システムが挙げられる。
【０５５３】
一部の実施形態では、一体型サーマルサイクラーおよび／または温度調節器が、制御ブロックまたはプラットフォームなどの熱交換器の温度を安定化させるのに使用されて、０℃〜１００℃に試料をインキュベートする正確な温度制御をもたらす。
【０５５４】
一部の実施形態では、本開示の自動化システムは、液体、粒子、細胞、および多細胞生物をロボット制御でマニピュレートすることができる、単一もしくは複数の磁気プローブ、親和性プローブ、レプリケーター、またはピペッタを有する交換可能なマシンヘッド（単一またはマルチチャネル）に適合する。マルチウェルまたはマルチチューブ磁気分離器および濾過ステーションは、単一または複数の試料フォーマットにおいて液体、粒子、細胞、および生物体をマニピュレートする。
【０５５５】
一部の実施形態では、本開示の自動化システムは、カメラビジョンおよび／または分光計システムに適合する。よって、一部の実施形態では、本開示の自動化システムは、進行中の細胞培養における色および吸収の変化を検出およびロギングすることができる。
【０５５６】
一部の実施形態では、本開示の自動化システムは、複数のハードウェアアドオンに柔軟であり、適応できることによって、システムが複数のアプリケーションを実行することを可能にするように設計される。ソフトウェアプログラムモジュールは、方法の創製、改変、および試行を可能にする。システムの診断モジュールは、セットアップ、機器整列、およびモータ動作を可能にする。特注のツール、実験機器、ならびに液体および粒子移送パターンは、異なるアプリケーションをプログラムおよび実施することを可能にする。データベースは、方法およびパラメータ記憶を可能にする。ロボットインターフェースおよびコンピューターインターフェースは、機器間の通信を可能にする。
【０５５７】
よって、一部の実施形態では、本開示は、図１１および１２に表したハイスループット株操作プラットフォームを教示する。
【０５５８】
当業者は、本開示のＨＴＰ操作方法を実行することができる様々なロボットプラットフォームを認識する。以下の表３は、図１１および１２に記載した本開示のＨＴＰ操作ステップの各ステップを実行することができる科学的装置の非排他的リストを提供する。
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
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【表３−５】
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【表３−６】
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【表３−７】
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【表３−８】
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コンピューターシステムハードウェア
【０５５９】
図１７は、本開示の実施形態による非一時的コンピューター可読媒体（例えば、メモリー）内に記憶されたプログラムコードを実行するのに使用され得るコンピューターシステム８００の一例を例示する。コンピューターシステムは、入力／出力サブシステム８０２を含み、これは、アプリケーションに応じて人間のユーザーおよび／または他のコンピューターシステムとインターフェースで接続するのに使用することができる。Ｉ／Ｏサブシステム８０２は、例えば、キーボード、マウス、グラフィカルユーザーインターフェース、タッチスクリーン、または入力のための他のインターフェース、および例えば、ＬＥＤもしくは他のフラットスクリーンディスプレイ、あるいはアプリケーションプログラムインターフェース（ＡＰＩ）を含めた出力のための他のインターフェースを含み得る。ＬＩＭＳシステムのコンポーネントなどの本開示の実施形態の他のエレメントは、コンピューターシステム８００のもののようなコンピューターシステムで実装することができる。
【０５６０】
プログラムコードは、二次メモリー８１０もしくはメインメモリー８０８または両方内の永続記憶装置などの非一時的媒体内に記憶することができる。メインメモリー８０８として、ランダムアクセスメモリー（ＲＡＭ）などの揮発性メモリー、またはリードオンリーメモリー（ＲＯＭ）などの不揮発性メモリー、ならびに指示およびデータにより速くアクセスするための異なるレベルのキャッシュメモリーを挙げることができる。二次メモリーとして、永続記憶装置、例えば、ソリッドステートドライブ、ハードディスクドライブ、または光ディスクなどを挙げることができる。１つまたは複数のプロセッサー８０４は、１つまたは複数の非一時的媒体からのプログラムコードを読み込み、コードを実行してコンピューターシステムが本明細書の実施形態によって実施される方法をなしとげることを可能にする。当業者は、プロセッサー（複数可）は、ソースコードを取り込み、ソースコードを解釈またはコンパイルして、プロセッサー（複数可）８０４のハードウェアゲートレベルで理解可能であるマシンコードにすることができることを理解する。プロセッサー（複数可）８０４は、計算集約型タスクを扱うためのグラフィックスプロセシングユニット（ＧＰＵ）を含み得る。特に、機械学習では、１つまたは複数のＣＰＵ  ８０４は、大量のデータの処理を１つまたは複数のＧＰＵ  ８０４にオフロードすることができる。
【０５６１】
プロセッサー（複数可）８０４は、１つまたは複数の通信インターフェース８０７、例えば、ネットワークインターフェースカード、ＷｉＦｉトランシーバーなどを介して外部ネットワークと通信することができる。バス８０５は、Ｉ／Ｏサブシステム８０２、プロセッサー（複数可）８０４、周辺デバイス８０６、通信インターフェース８０７、メモリー８０８、および永続記憶装置８１０を通信可能にカップルする。本開示の実施形態は、この代表的なアーキテクチャに限定されない。代替の実施形態は、異なる配置およびタイプのコンポーネント、例えば、入出力コンポーネントおよびメモリーサブシステムのための別個のバスを使用することができる。
【０５６２】
当業者は、本開示の実施形態のエレメントの一部またはすべて、およびこれらの付随するオペレーションは、コンピューターシステム８００のもののような１つまたは複数のプロセッサーおよび１つまたは複数のメモリーシステムを含む１つまたは複数のコンピューターシステムによって完全または部分的にインプリメントされ得ることを理解する。特に、本明細書に記載のＬＩＭＳシステム２００ならびに任意のロボットおよび他の自動化システムまたはデバイスのエレメントは、コンピューター実装することができる。一部のエレメントおよび機能性は、ローカルにインプリメントすることができ、他のものは、例えば、異なるサーバーを通じたネットワークにわたって分散様式で、例えば、クライアント−サーバー様式でインプリメントすることができる。特に、図１５に示したように、サーバーサイドオペレーションを、サービス型ソフトウェア（ＳａａＳ）様式で複数のクライアントに利用可能にすることができる。
【０５６３】
本文脈における用語のコンポーネントは、ソフトウェア、ハードウェア、もしくはファームウェア（またはこれらの任意の組合せ）コンポーネントを広く指す。コンポーネントは、典型的には、指定された入力（複数可）を使用して有用なデータまたは他の出力を生成することができる機能コンポーネントである。コンポーネントは、自己充足型であってもよく、または自己充足型でなくてもよい。アプリケーションプログラム（「アプリケーション」とも呼ばれる）は、１つもしくは複数のコンポーネントを含み得、またはコンポーネントは、１つもしくは複数のアプリケーションプログラムを含むことができる。
【０５６４】
一部の実施形態は、他のモジュールまたはアプリケーションコンポーネントとともにコンポーネントの一部、すべてを含み、またはどれも含まない。なおさらに、様々な実施形態は、これらのコンポーネントの２つもしくはそれ超を単一モジュール内に組み入れ、かつ／またはこれらのコンポーネントの１つもしくは複数の機能性の一部を異なるコンポーネントと結びつけることができる。
【０５６５】
用語「メモリー」は、情報を記憶させるのに使用される任意のデバイスまたは機構であり得る。本開示の一部の実施形態によれば、メモリーは、これらに限定されないが、揮発性メモリー、不揮発性メモリー、およびダイナミックメモリーの任意のタイプを包含するように意図されている。例えば、メモリーは、ランダムアクセスメモリー、メモリー記憶デバイス、光学メモリーデバイス、磁気媒体、フロッピー（登録商標）ディスク、磁気テープ、ハードドライブ、ＳＩＭＭ、ＳＤＲＡＭ、ＤＩＭＭ、ＲＤＲＡＭ、ＤＤＲ  ＲＡＭ、ＳＯＤＩＭＭＳ、消去可能プログラム可能リードオンリーメモリー（ＥＰＲＯＭ）、電気的消去可能プログラム可能リードオンリーメモリー（ＥＥＰＲＯＭ）、コンパクトディスク、ＤＶＤなどであり得る。一部の実施形態によれば、メモリーは、１つまたは複数のディスクドライブ、フラッシュドライブ、データベース、ローカルキャッシュメモリー、プロセッサーキャッシュメモリー、リレーショナルデータベース、フラットデータベース、サーバー、クラウドベースプラットフォームなどを含み得る。さらに、当業者は、情報を記憶するための多くの追加のデバイスおよび技法をメモリーとして使用することができることを十分に理解する。
【０５６６】
メモリーは、プロセッサー上の１つまたは複数のアプリケーションまたはモジュールをランさせるための指示を記憶させるのに使用され得る。例えば、メモリーは、一部の実施形態では、本願に開示のモジュールおよび／またはアプリケーションの１つまたは複数の機能性を実行するのに必要な指示のすべてまたは一部を収納するのに使用することができる。
遺伝子設計予測に基づくＨＴＰ微生物株操作：例示的なワークフロー
【０５６７】
一部の実施形態では、本開示は、本開示のコンピューター分析システムの推奨に基づく新しい宿主生物の指向操作を教示する。
【０５６８】
一部の実施形態では、本開示は、すべての遺伝子設計およびクローニング方法に適合する。すなわち、一部の実施形態では、本開示は、伝統的なクローニング技法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、制限酵素消化、ライゲーション、相同組換え、ＲＴ  ＰＣＲ、および当技術分野で一般に公知であり、例えば、参照により本明細書に組み込まれている、Sambrookら（２００１年）、Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual（３版、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、Plainview、New  York）に開示されているその他のものなどの使用を教示する。
【０５６９】
一部の実施形態では、クローン化された配列は、本明細書に教示のＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーのいずれか由来の可能なもの、例えば、プロモータースワップライブラリー由来のプロモーター、ＳＮＰスワップライブラリー由来のＳＮＰ、開始コドンもしくは停止コドン交換ライブラリー由来の開始コドンもしくは停止コドン、ＳＴＯＰスワップライブラリー由来のターミネーター、または配列最適化ライブラリー由来の配列最適化を含み得る。
【０５７０】
さらに、特定の構築物内に含まれるべき正確な配列組合せは、上位性マッピング機能によって知らされ得る。
【０５７１】
他の実施形態では、クローン化された配列は、合理的な設計（仮説主導型）に基づく配列および／または科学刊行物などの他のソースに基づく配列も含むことができる。
【０５７２】
一部の実施形態では、本開示は、ｉ）カスタムメイドＳＮＰ特異的ＤＮＡを生成するステップと、ｉｉ）ＳＮＰ特異的コンストラクトをアセンブルするステップと、ｉｉｉ）ＳＮＰ特異的ＤＮＡで標的宿主細胞を形質転換するステップと、ｉｖ）任意の選択マーカーをループアウトさせるステップとを含む、指向操作の方法を教示する（図２を参照）。
【０５７３】
図６Ａは、ＤＮＡを取得およびアセンブルするステップと、任意の必要なベクターをアセンブルするステップと、宿主細胞を形質転換するステップと、選択マーカーを除去するステップとを含む、本開示の株操作方法の一般的なワークフローを示す。
特異的ＤＮＡオリゴヌクレオチドを構築する
【０５７４】
一部の実施形態では、本開示は、宿主細胞生物体のＤＮＡセグメントを挿入することおよび／または置き換えることおよび／または変更することおよび／または欠失させることを教示する。一部の態様では、本明細書に教示の方法は、宿主生物のゲノム内に組み入れる目的のオリゴヌクレオチド（すなわち、標的ＤＮＡセグメント）を構築することを伴う。一部の実施形態では、本開示の標的ＤＮＡセグメントは、公知の鋳型からのコピーもしくはカット、変異、またはＤＮＡ合成を含む、当技術分野で公知の任意の方法を介して得ることができる。一部の実施形態では、本開示は、標的ＤＮＡ配列を生成するための市販の遺伝子合成産物（例えば、ＧｅｎｅＡｒｔ（商標）、ＧｅｎｅＭａｋｅｒ（商標）、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（商標）、Ａｎａｇｅｎ（商標）、Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ（商標）、Ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎ（商標）、ＧｅＮＯｓｙｓ，Ｉｎｃ．、またはＱｉａｇｅｎ（商標））に適合する。
【０５７５】
一部の実施形態では、標的ＤＮＡセグメントは、宿主生物の選択されたＤＮＡ領域内にＳＮＰを組み入れる（例えば、有益なＳＮＰを付加する）ように設計されている。他の実施形態では、ＤＮＡセグメントは、宿主生物のＤＮＡからＳＮＰを除去する（例えば、有害なまたは中立のＳＮＰを除去する）ように設計されている。
【０５７６】
一部の実施形態では、本発明の方法で使用されるオリゴヌクレオチドは、当技術分野で公知の酵素合成または化学合成の方法のいずれかを使用して合成することができる。オリゴヌクレオチドは、固体支持体、例えば、制御細孔ガラス（ＣＰＧ）、ポリスチレンビーズ、またはＣＰＧを含有し得る熱可塑性ポリマーから構成される膜上で合成することができる。オリゴヌクレオチドは、アレイ上で、マイクロフルイディクスを使用して並列のマイクロスケールで（Tianら、Mol.  BioSyst.、５巻、７１４〜７２２頁（２００９年））、または両方の組合せを提供する公知の技術で（Jacobsenら、米国特許出願第２０１１／０１７２１２７号を参照）合成することもできる。
【０５７７】
アレイ上の、またはマイクロフルイディクスによる合成は、より低い試薬使用を通じてコストを低減することによって、慣例的な固体支持体合成に対して利点を提供する。遺伝子合成に要求される規模は低く、したがって、アレイから、またはマイクロフルイディクスを通じて合成されるオリゴヌクレオチド産物の規模は、許容される。しかし、合成されるオリゴヌクレオチドは、固体支持体合成を使用するときより低い品質のものである（Tian、以下を参照；Staehlerら、米国特許出願第２０１０／０２１６６４８号も参照）。
【０５７８】
多数の進歩が、それが１９８０年代に最初に記載されて以来、伝統的な４ステップホスホラミダイト化学において達成されている（例えば、ペルオキシアニオンの脱保護を使用するSierzchalaら、J.  Am.  Chem.  Soc.、１２５巻、１３４２７〜１３４４１頁（２００３年）；代替の保護基についてHayakawaら、米国特許第６，０４０，４３９号；ユニバーサル支持体についてAzhayevら、Tetrahedron、５７巻、４９７７〜４９８６頁（２００１年）；大孔ＣＰＧの使用によるより長いオリゴヌクレオチドの改善された合成についてKozlovら、Nucleosides,  Nucleotides,  and  Nucleic  Acids、２４巻（５〜７号）、１０３７〜１０４１頁（２００５年）；および改善された誘導体化についてDamhaら、NAR、１８巻、３８１３〜３８２１頁（１９９０年）を参照）。
【０５７９】
合成のタイプにかかわらず、次いで結果として生じるオリゴヌクレオチドは、より長いオリゴヌクレオチドのためのより小さいビルディングブロックを形成することができる。一部の実施形態では、より小さいオリゴヌクレオチドは、当技術分野で公知のプロトコール、例えば、ポリメラーゼ鎖アセンブリー（ＰＣＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、および熱力学的にバランスの取れたインサイドアウト合成（thermodynamically  balanced  inside-out  synthesis）（ＴＢＩＯ）を使用して一緒に繋ぐことができる（Czarら、Trends  in  Biotechnology、２７巻、６３〜７１頁（２００９年）を参照）。ＰＣＡでは、所望のより長い産物の全長にまたがるオリゴヌクレオチドが、複数のサイクル（典型的には約５５サイクル）においてアニールおよび伸長されて完全長産物を最終的に達成する。ＬＣＲは、リガーゼ酵素を使用して２つのオリゴヌクレオチドを繋ぎ、これらはともにアニールされて第３のオリゴヌクレオチドになる。ＴＢＩＯ合成は、所望の産物の中心から開始し、遺伝子の５’末端における順方向鎖と、かつ遺伝子の３’末端における逆方向鎖と相同である重複オリゴヌクレオチドを使用することによって両方向で漸次伸長される。
【０５８０】
より大きい二本鎖ＤＮＡ断片を合成する別の方法は、トップストランドＰＣＲ（ＴＳＰ）によってより小さいオリゴヌクレオチドを組み合わせることである。本方法では、複数のオリゴヌクレオチドが所望の産物の全長にわたり、隣接するオリゴヌクレオチド（複数可）に対して重複領域を含有する。増幅は、ユニバーサル順方向プライマーおよび逆方向プライマーを用いて、かつ複数のサイクルの増幅を介して実施することができ、全長の二本鎖ＤＮＡ産物が形成される。次いでこの産物は、任意選択の誤差補正およびさらなる増幅を受けることができ、それにより、所望の二本鎖ＤＮＡ断片最終産物がもたらされる。
【０５８１】
ＴＳＰの一方法では、全長の所望の産物を形成するのに組み合わされるより小さいオリゴヌクレオチドのセットは、４０〜２００塩基の間の長さであり、互いに少なくとも約１５〜２０塩基重複する。実用的な目的のために、重複領域は、オリゴヌクレオチドの特異的アニーリングを保証するために最低でも十分長く、使用される反応温度でアニールするために十分高い融解温度（Ｔｍ）を有するべきである。重複は、所与のオリゴヌクレオチドが隣接するオリゴヌクレオチドによって完全に重複されるポイントまで伸長することができる。重複の量は、最終産物の品質に対していずれの効果も有さないようである。アセンブリー内の最初および最後のオリゴヌクレオチドビルディングブロックは、順方向および逆方向の増幅プライマーのための結合部位を含有するべきである。一実施形態では、最初および最後のオリゴヌクレオチドの末端側終端配列は、同じ相補性を有する配列を含有してユニバーサルプライマーの使用を可能にする。
ＤＮＡ断片のアセンブリー／カスタムプラスミドのクローニング
【０５８２】
一部の実施形態では、本開示は、宿主生物のゲノム内に所望の標的ＤＮＡ切片（例えば特定のＳＮＰを含有する）を挿入することができるＤＮＡ断片を構築するための方法を教示する。図１は、多様性プールにおけるバリエーションを増大させるための本開示のＤＮＡ組換え方法を示す。ＤＮＡ切片、例えば関連種由来のゲノム領域は、物理的または酵素的／化学的な手段により切断することができる。切断されたＤＮＡ領域を融解させ、オーバーラップする遺伝的領域がポリメラーゼ伸長反応を開始するように再アニールさせる。後続の融解／伸長反応は、産物が、１つまたは複数の出発配列からのエレメントとプロモーターを含むキメラＤＮＡに再アセンブルするまで行われる。図２に、ＳＮＰスワップに関する生成、アセンブル、ＱＣ、形質転換、ループアウト、およびＱＣプロセスの全体に関する一般的なスキームを示す。注目すべきことに、このスキームは、本明細書に提供される他のＨＴＰツール（例えば、ＰＲＯｓｗｐ、ＳＴＯＰｓｗｐ）に適用することができる。一部の実施形態では、本開示は、標的ＤＮＡ、相同性アーム、および少なくとも１つの選択マーカーを含む線形ＤＮＡ断片を生成する方法を教示する（図４５および４６を参照）。
【０５８３】
一部の実施形態では、本開示は、宿主生物（例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒなどの糸状菌）内へのＤＮＡ断片の形質転換に適した任意の方法と適合する。一部の実施形態では、本開示は、所望の標的ＤＮＡ切片をクローニングしてそれから増幅させることができるプラスミドまたはアセンブリーベクターの使用を教示する。アセンブリーベクターは、使用される場合、宿主細胞（例えば、酵母および／またはＥ．ｃｏｌｉ）における増殖に必要とされ得る任意の複製起点をさらに含んでいてもよい。ある特定の事例では、標的ＤＮＡは、任意のリポジトリまたはカタログ製品から入手可能なベクター、コンストラクトまたはプラスミド、例えば、市販のベクター（例えば、ＤＮＡ２．０特注またはＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）ベクターを参照）内に挿入することができる。ある特定の事例では、標的ＤＮＡは、任意のリポジトリまたはカタログ製品から入手可能なベクター、コンストラクトまたはプラスミド、例えば、市販のベクター（例えば、ＤＮＡ２．０特注またはＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）ベクターを参照）内に挿入することができる。糸状菌宿主細胞などの宿主細胞を最終的に形質転換するための線形ＤＮＡ断片を生成するためのプラスミドの使用は、宿主ゲノムに組み込まれる所望の遺伝子を含む標的ＤＮＡコンストラクトの部分を合成すること、アセンブリーベクターとともに標的ＤＮＡコンストラクトの部分で酵母細胞を形質転換すること、前記形質転換された酵母細胞から、標的ＤＮＡコンストラクトを含有するアセンブルされたプラスミドを単離すること、Ｅ．ｃｏｌｉ中で単離されたプラスミドを増殖させること、およびＥ．ｃｏｌｉから標的ＤＮＡコンストラクトをＰＣＲ増幅させて、糸状菌宿主細胞の形質転換の前に宿主ゲノムに組み込まれる所望の遺伝子を含む線形ＤＮＡ断片を生成することを伴い得る。
【０５８４】
代替の実施形態では、宿主ゲノム（例えば、糸状菌細胞）に組み込まれる所望の遺伝子を含む線形ＤＮＡ断片のアセンブリーまたは生成は、融合ＰＣＲを使用することを伴い得る。融合ＰＣＲは、例えば、参照によってその全体が本明細書に組み込まれるYuら、Fungal  Genetics  and  Biology、４１巻、９７３〜９８１頁（２００４年）に記載される方法などの当技術分野で公知の任意の融合ＰＣＲ方法を使用して実行することができる。図４５は、それらの間にマーカー遺伝子（すなわち、ｐｙｒＧ）のスプリットを含む２つの線形ＤＮＡ断片を生成するための融合ＰＣＲの使用方法を示す。概念的には、融合ＰＣＲは、本明細書に提供される標的遺伝子変異および／または選択可能なマーカー遺伝子を含むコンストラクトのいずれかを生成するのに使用することができる。
【０５８５】
本明細書に提供される方法での使用のための線形ＤＮＡ断片は、本明細書に記載される選択および／または対抗選択のためのマーカーを含んでいてもよい。マーカーは、当技術分野で公知の、および／または本明細書に提供される任意のマーカーであってもよい。線形ＤＮＡ断片は、本明細書に提供される任意の調節配列をさらに含んでいてもよい。調節配列は、当技術分野で公知の、または本明細書に提供される任意の調節配列、例えば、宿主細胞（例えば、糸状菌細胞）の遺伝機構によって使用される、プロモーター、開始、停止、シグナル、分泌および／または終結配列などであってもよい。
【０５８６】
一部の実施形態では、本開示のアセンブリー／クローニング方法は、以下のアセンブリーストラテジー：ｉ）ＩＩ型慣習的クローニング、ｉｉ）ＩＩ  Ｓ型媒介または「ゴールデンゲート」クローニング（例えば、Engler,  C.、R.  Kandzia、およびS.  Marillonnet、２００８年、「A  one  pot,  one  step,  precision  cloning  method  with  high-throughput  capability」、PLos  One、３巻：ｅ３６４７頁；Kotera,  I.およびT.  Nagai、２００８年、「A  high-throughput  and  single-tube  recombination  of  crude  PCR  products  using  a  DNA  polymerase  inhibitor  and  type  IIS  restriction  enzyme」、J  Biotechnol、１３７巻：１〜７頁；Weber,  E.、R.  Gruetzner、S.  Werner、C.  Engler、およびS.  Marillonnet、２０１１年、Assembly  of  Designer  TAL  Effectors  by  Golden  Gate  Cloning、PloS  One、６巻：ｅ１９７２２頁を参照）、ｉｉｉ）ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）組換え、ｉｖ）ＴＯＰＯ（登録商標）クローニング、エキソヌクレアーゼ媒介アセンブリー（Aslanidisおよびde  Jong、１９９０年、「Ligation-independent  cloning  of  PCR  products  (LIC-PCR)」、Nucleic  Acids  Research、１８巻、２０号、６０６９頁）、ｖ）相同組換え、ｖｉ）非相同末端結合、ｖｉｉ）ギブソンアセンブリー（Gibsonら、２００９年、「Enzymatic  assembly  of  DNA  molecules  up  to  several  hundred  kilobases」、Nature  Methods、６巻、３４３〜３４５頁）、またはこれらの組合せの少なくとも１つを使用することができる。モジュラーＩＩＳ型ベースアセンブリーストラテジーは、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／１５４１４７に開示されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれている。
【０５８７】
一部の実施形態では、本開示は、少なくとも１つの選択マーカーを有するベクターをクローニングすることを教示する。選択圧下で原核細胞（例えば、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ゼオシン、スペクチノマイシン／ストレプトマイシンに対する）、または真核細胞（例えば、ジェネテシン、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、ブラストサイジン、ゼオシン）内の選択について抗生物質耐性機能をコードすることが多い様々な選択マーカー遺伝子が当技術分野で公知である。他のマーカーシステム、例えば、順調に形質導入された宿主細胞において発現されるＸ−ｇａｌまたは緑色もしくは赤色蛍光タンパク質などの蛍光レポーターの存在下で陽性クローンを選択するのに細菌において使用される周知のブルー／ホワイトスクリーニングシステムは、望まれるまたは望まれない細胞のスクリーニングおよび同定を可能にする。そのほとんどが原核生物系内でのみ機能的である選択マーカーの別のクラスは、産生細胞を死滅させる毒性遺伝子産物を発現する、「デス遺伝子（death  gene）」とも呼ばれることが多い対抗選択可能なマーカー遺伝子に関する。このような遺伝子の例としては、ｓａｃＢ、ｒｐｓＬ（ｓｔｒＡ）、ｔｅｔＡＲ、ｐｈｅＳ、ｔｈｙＡ、ｇａｔａ−１、またはｃｃｄＢが挙げられ、その機能は、（Reyratら、１９９８年、「Counterselectable  Markers:  Untapped  Tools  for  Bacterial  Genetics  and  Pathogenesis」、Infect  Immun.、６６巻（９号）：４０１１〜４０１７頁）に記載されている。
【０５８８】
図１８は、本開示の一実施形態に従うＤＮＡアセンブリーに関連するワークフローを示す。このプロセスは、４段階：重要部分の生成、プラスミド／コンストラクトアセンブリー、プラスミド／コンストラクトＱＣ、および形質転換のためのプラスミド／コンストラクトの調製に分けることができる。重要部分の生成の間に、オリゴのシーケンシングのベンダーから、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＩＭＳ）により設計されたオリゴを発注し、宿主生物から標的配列をＰＣＲにより増幅するのに使用する。これらのＰＣＲの重要部分は、清浄して、混入物を除去し、断片の分析により、すなわち、観察される断片サイズと理論的な断片サイズとのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでの品質管理比較、およびＤＮＡの定量を行って、成功について評価する。図１８で示されるように、一実施形態では、重要部分を、酵母中にアセンブリーベクターと一緒に形質転換し、プラスミド中に相同組換えによりアセンブルする。アセンブルされたプラスミドを、酵母から単離し、別個の酵母宿主細胞中に形質転換して、続いて、アセンブリーの品質管理および増幅を行う。プラスミドアセンブリーの品質管理の間に、各プラスミドのいくつかの複製物を単離し、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を使用して増幅し、酵素消化および断片の分析により正確なアセンブリーについて評価する。ＱＣプロセス中に同定した正確にアセンブルされたプラスミドをヒットピッキングして、恒久的なストックを生成し、次いでこのプラスミドからゲノム組込みを促進するのに必要な任意の隣接配列を含む特異的な遺伝子コンストラクトをＰＣＲ増幅して、標的宿主生物（例えば、糸状菌宿主細胞）中に形質転換する前に、断片分析により定量およびＱＣされた線形ＤＮＡ断片を生成する。図１８にも示されるように、別の実施形態では、重要部分を融合ＰＣＲに供して（例えば図４５および４６を参照）、線形ＤＮＡ断片を生成し、これを、標的宿主生物（例えば、糸状菌宿主細胞）中に形質転換する前に、断片および配列分析によりＱＣする。
プロトプラスト形成方法
【０５８９】
一実施形態では、本明細書に提供される方法およびシステムは、本明細書に提供される多核体生物体（例えば、糸状菌細胞）からのプロトプラストの生成を必要とする。プロトプラストを調製するための適当な手順は、例えば、ＥＰ２３８，０２３およびYeltonら（１９８４年、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、８１巻：１４７０〜１４７４頁）に記載されたものを含めて任意の当技術分野で公知のものであり得る。一実施形態では、プロトプラストは、１種または複数の溶菌酵素またはこれらの混合物を用いて前培養された糸状菌細胞の培養物を処理することによって生成される。溶菌酵素は、ベータ−グルカナーゼおよび／またはポリガラクツロナーゼであり得る。一実施形態では、プロトプラストを生成するための酵素混合物は、ＶｉｎｏＴａｓｔｅ濃縮物である。多核体生物体（例えば、糸状菌細胞）の培養物を前培養し、その後、本明細書に提供される方法および組成物で使用するためにそれからプロトプラストを生成および利用するのに利用されるパラメータの多くは、変更することができる。例えば、接種量、接種方法、前培養培地、前培養時間、前培養温度、混合条件、洗浄緩衝液組成、希釈比、溶菌酵素処理中の緩衝液組成、使用される溶菌酵素のタイプおよび／または濃度、溶菌酵素とのインキュベーションの時間、プロトプラスト洗浄手順および／または緩衝液、実際の形質転換中のプロトプラストおよび／またはポリヌクレオチドおよび／または形質転換試薬の濃度、形質転換中の物理的パラメータ、最大で得られる形質転換体までの形質転換後の手順のバリエーションが存在し得る。一部の場合では、これらのバリエーションは、プロトプラストの数および形質転換効率を最適化するのに利用することができる。一実施形態では、多核体生物体は、本明細書に提供される糸状菌細胞（例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒ）である。この実施形態に加えて、前培養の培地は、ＹＰＤまたは完全培地であり得る。前培養の培地の体積は、少なくとも、最大で、または約５０ｍｌ、１００ｍｌ、１５０ｍｌ、２００ｍｌ、２５０ｍｌ、３００ｍｌ、３５０ｍｌ、４００ｍｌ、４５０ｍｌ、５００ｍｌ、５５０ｍｌ、６００ｍｌ、６５０ｍｌ、７００ｍｌ、７５０ｍｌ、８００ｍｌ、８５０ｍｌ、９００ｍｌ、９５０ｍｌまたは１０００ｍｌであり得る。前培養の培地の体積は、約５０ｍｌ〜約１００ｍｌ、約１００ｍｌ〜約１５０ｍｌ、約１５０ｍｌ〜約２００ｍｌ、約２００ｍｌ〜約２５０ｍｌ、約２５０ｍｌ〜約３００ｍｌ、約３００ｍｌ〜約３５０ｍｌ、約３５０ｍｌ〜約４００ｍｌ、約４００ｍｌ〜約４５０ｍｌ、約４５０ｍｌ〜約５００ｍｌ、約５００ｍｌ〜約５５０ｍｌ、約５５０ｍｌ〜約６００ｍｌ、約６００ｍｌ〜約６５０ｍｌ、約６５０ｍｌ〜約７００ｍｌ、約７００ｍｌ〜約７５０ｍｌ、約７５０ｍｌ〜約８００ｍｌ、約８００ｍｌ〜約８５０ｍｌ、約８５０ｍｌ〜約９００ｍｌ、約９００ｍｌ〜約９５０ｍｌまたは約９５０ｍｌ〜約１０００ｍｌであり得る。一部の場合では、複数の培養物が培養され、その後、プロトプラスト形成に供される。複数の培養物は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００個またはそれより多くであり得る。一実施形態では、前培養調製物は、１００ｍｌの富栄養培地（例えば、ＹＰＤまたは完全培地）に１０６胞子／ｍｌを接種すること、および前培養調製物を３０℃で１４〜１８時間インキュベートすることによって調製される。別の実施形態では、前培養調製物は、５００ｍｌの富栄養培地（例えば、酵母・カビ用ブロス、ＹＰＤまたは完全培地）に少なくとも胞子１０６胞子／ｍｌを接種すること、および前培養調製物を３０℃で１４〜１８時間インキュベートすることによって調製される。プロトプラスト形成の前に、多核体生物体は、例えば遠心分離などの当技術分野で公知の任意の方法によって単離することができる。一実施形態では、多核体生物体は、糸状菌（例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒ）である。この実施形態に加えて、酵母・カビ用ブロス（ＹＭＢ）に糸状菌細胞の１０６胞子／ｍｌを接種し、３０℃で１６時間増殖させる。さらにこの実施形態に加えて、糸状菌細胞を前培養調製物中で増殖させ、遠心分離によって単離してもよい。本明細書に提供される方法および組成物で使用するための本明細書に提供される前培養調製物は、後続のプロトプラスト形成のために、約、少なくとも、０．５ｇ、１ｇ、１．５ｇ、２ｇ、２．５ｇ、３ｇ、３．５ｇ、４ｇまたは５ｇの、またはそれより多くの湿重量の量の菌糸を産生することができる。多核体生物体（例えば、糸状菌）の前培養／培養は、ハイスループットシステム（ＨＴＰ）におけるワークフロー、例えば図２８に表示されたものなどの一部であってもよい。ＨＴＰシステムは、自動化または半自動化されていてもよい。図２８で示されるように、生物体の前培養は、小規模の体積（例えば、１００ｍｌ）の胞子形成培地（図２８におけるＰＤＡ培地）に生物体（例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒ）の１０６胞子／ｍｌを接種すること、および３０℃で１４〜１６時間増殖することを伴い得る。図２８で示されるように、前培養中、ワークフローは、前培養された生物体（例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒ）からプロトプラストを生成するための酵素溶液が生成されるステップを含有していてもよい。酵素溶液は、１．２ＭのＭｇＳＯ４を含むリン酸緩衝液中のＶｉｎｏｔａｓｔｅ  ｐｒｏ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）酵素ミックスからなっていてもよい。前培養の後、菌糸は、Ｍｉｒａｃｌｏｔｈで濾過した後に収集することができ、大規模な培養物は、２．８Ｌフラスコ中の約５００ｍｌの完全培地に１０ｕｌ〜２０ｍｌの収集された菌糸を接種することによって培養することができる。接種量は、前培養ステップから得られた培養物のＯＤに基づき変更することができる。大規模な培養物は２００ｒｐｍで振とうしながら、８０％湿度で、３０℃または１８℃のいずれかで６〜１８時間増殖させることができる。培養の後、培養物を遠心分離によって単離し、それに続き１回または複数の洗浄を行い、再懸濁することができる。一実施形態では、培養物を本明細書に記載されるプロトプラスト形成緩衝液に再懸濁し、本明細書に記載されるプロトプラスト形成に供する。遠心分離は、５００ｍｌ遠心管で、５５００〜６１００×ｇで、４℃で１０〜１５分間実行することができる。１回または複数の洗浄のそれぞれを１０〜５０ｍｌの洗浄緩衝液��例えば、１０％グリセロールを含む水）中で実行し、それに続いて５５００〜６１００×ｇで、４℃で１０〜１５分間、遠心分離することができる。
【０５９０】
上述した通り単離した後、多核体生物体（例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒなどの糸状菌細胞）は、プロトプラストを生成するために、プロトプラスト形成緩衝液が本明細書に提供される１つまたは酵素（例えば、ＶｉｎｏＴａｓｔｅ  ｐｒｏ濃縮物（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ））を含むように、プロトプラスト形成緩衝液に再懸濁することができる。一実施形態では、プロトプラスト形成緩衝液は、高濃度の浸透圧調節物質（例えば、１Ｍより大きいかまたはそれに等しい浸透圧調節物質、例えばＭｇＳＯ４）を有する。高い浸透圧調節物質濃度（例えば、１．２ＭのＭｇＳＯ４）を含むプロトプラスト形成緩衝液を利用する実施形態では、酵素処理（例えば、ＶｉｎｏＴａｓｔｅ  ｐｒｏ濃縮物（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ））のためのインキュベーション時間は、約３０℃で約１４〜１６時間であり得る。再懸濁に使用されるプロトプラスト形成緩衝液の体積は、５０ｍｌ、１００ｍｌ、１５０ｍｌ、２００ｍｌ、２５０ｍｌ、３００ｍｌ、３５０ｍｌ、４００ｍｌ、４５０ｍｌ、５００ｍｌ、５５０ｍｌ、６００ｍｌ、６５０ｍｌ、７００ｍｌ、７５０ｍｌ、８００ｍｌ、８５０ｍｌ、９００ｍｌ、９５０ｍｌまたは１０００ｍｌであり得る。再懸濁に使用されるプロトプラスト形成緩衝液の体積は、約５０ｍｌ〜約１００ｍｌ、約１００ｍｌ〜約１５０ｍｌ、約１５０ｍｌ〜約２００ｍｌ、約２００ｍｌ〜約２５０ｍｌ、約２５０ｍｌ〜約３００ｍｌ、約３００ｍｌ〜約３５０ｍｌ、約３５０ｍｌ〜約４００ｍｌ、約４００ｍｌ〜約４５０ｍｌ、約４５０ｍｌ〜約５００ｍｌ、約５００ｍｌ〜約５５０ｍｌ、約５５０ｍｌ〜約６００ｍｌ、約６００ｍｌ〜約６５０ｍｌ、約６５０ｍｌ〜約７００ｍｌ、約７００ｍｌ〜約７５０ｍｌ、約７５０ｍｌ〜約８００ｍｌ、約８００ｍｌ〜約８５０ｍｌ、約８５０ｍｌ〜約９００ｍｌ、約９００ｍｌ〜約９５０ｍｌまたは約９５０ｍｌ〜約１０００ｍｌであり得る。一実施形態では、糸状菌細胞は、例えば図２８で示した通り、５００ｍｌの富栄養培地（例えば、ＹＰＤまたは完全培地）中で増殖され、菌糸（図２８で示されるように約１ｇの湿潤質量であり得る）は、Ｍｉｒａｃｌｏｔｈでの濾過、１００ｍｌの洗浄緩衝液（例えば、１．２ＭのＭｇＳＯ４を含む１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．５）での濯ぎによって単離され、１Ｌのボトル中で、プロトプラスト形成酵素混合物（例えば、ＶｉｎｏＴａｓｔｅ  ｐｒｏ濃縮物（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ））を含む約５００ｍｌのプロトプラスト形成緩衝液（例えば、図２８では、１．２ＭのＭｇＳＯ４を含む１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．５）に再懸濁される。酵素溶液中の菌糸は、顕微鏡検査によってプロトプラスト形成のモニターを続けながら、３０℃で１４〜１６時間、１４０ｒｐｍで振とうしながらインキュベートすることができる。
【０５９１】
一実施形態では、ＮＨＥＪ経路の１つまたは複数の化学的阻害剤が、提供されたプロトプラスト形成緩衝液に添加される。１つまたは複数の化学的阻害剤は、Ｗ７、クロルプロマジン、バニリン、Ｎｕ７０２６、Ｎｕ７４４１、ミリン、ＳＣＲ７、ＡＧ１４３６１またはこれらの任意の組合せから選択することができる。１つまたは複数の化学的阻害剤のプロトプラスト形成緩衝液への添加は、プロトプラスト形成手順中の任意の時点で行うことができる。一実施形態では、１つまたは複数の化学的阻害剤での処理は、プロトプラスト形成手順の全体にわたりなされる。別の実施形態では、１つまたは複数の化学的阻害剤での処理は、プロトプラスト形成手順の全体未満にわたりなされる。１つまたは複数の化学的阻害剤での処理は、約１、５、１０、１５、２０、３０、４５、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２１０、２４０、２７０または３００分間であってもよい。一実施形態では、多核体細胞（例えば、糸状菌細胞）は、Ｗ−７で処理される。別の実施形態では、多核体細胞（例えば、糸状菌細胞）は、ＳＣＲ−７で処理される。
【０５９２】
酵素処理後、プロトプラストは、当技術分野で公知の方法を使用して単離することができる。プロトプラスト単離の前に、濾過したプロトプラストの濾液を得るために、孔が２０〜１００ミクロンのサイズの範囲内にある多孔質バリア（例えばＭｉｒａｃｌｏｔｈ）を介して混合物を濾過することによって未消化の菌糸断片を除去することができる。一実施形態では、次いで濾過したプロトプラストを中程度のレベルの向心力で遠心分離して、遠心管の底部でプロトプラストをペレットにする。向心力は、約５００〜１５００×ｇであり得る。好ましい実施形態では、使用される向心力は、一般に、１０００×ｇ未満（例えば、図２８で示されるように、５分間で８００×ｇ）である。別の実施形態では、より実質的に低い浸透力の緩衝液が、高濃度の浸透圧調節物質を含むプロトプラスト形成緩衝液中でのプロトプラスト生成後のプロトプラスト（例えば、濾過したプロトプラスト）の表面に穏やかに適用される。より実質的に低い浸透力の緩衝液の例としては、１Ｍのソルビトール、１ＭのＮａＣｌ、０．６Ｍの硫酸アンモニウムまたは１ＭのＫＣｌを含む緩衝液（例えば、トリス緩衝液）が挙げられる。一実施形態では、図２８で示されるように、本明細書に提供される方法で使用するためのより低い浸透力の緩衝液は、０．４Ｍのソルビトールを含み、ｐＨ８を有するソルビトール−トリス（ＳＴ）緩衝液である。次いでこの層状の調製物を遠心分離して、プロトプラストをチューブ中の層に蓄積させることができ、プロトプラストはその中間の位置に浮遊する。次いでプロトプラストは、さらなる加工（例えば、貯蔵および／または形質転換）のためにこの層から単離することができる。さらに別の実施形態では、高濃度の浸透圧調節物質（例えば、１．２ＭのＭｇＳＯ４を含む１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ５．５）を含むプロトプラスト形成緩衝液中の生成したプロトプラスト（例えば、濾過したプロトプラスト）を細長い収集容器（例えば、メスシリンダー）に移し、本明細書に提供されるより低い浸透圧モル濃度の緩衝液（例えば、０．４ＭのＳＴ緩衝液、ｐＨ８）をプロトプラスト（例えば、濾過したプロトプラスト）の表面上に載せて層を生成し、プロトプラストをその中間の位置に浮遊させる。細長い収集容器（例えば、メスシリンダー）中の異なる浸透圧モル濃度の緩衝液の組合せは、細長い収集容器（例えば、メスシリンダー；図２７）の表面へのプロトプラストの「浮揚」を促進することができる。プロトプラストは、収集容器の上部にきたら、単離することができる。一実施形態では、本明細書に提供される増殖させたプロトプラスト形成に供した多核体生物体（例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒなどの糸状菌細胞）の５００ｍｌの前培養調製物から、約２５ｍｌのプロトプラストが得られる。
【０５９３】
プロトプラスト単離後、図２８で示されるように、残りの酵素を含有する緩衝液を、浸透性の緩衝液（例えば、１０ｍＭトリス、ｐＨ８を使用して緩衝化された１Ｍソルビトール）中にプロトプラストを再懸濁することによって除去し、遠心分離によって再収集することができる。このステップは、繰り返すことができる。酵素を含有する緩衝液の十分な除去の後、プロトプラストはさらに、塩化カルシウム（例えば、１０ｍＭトリス、ｐＨ８、５０ｍＭのＣａＣｌ２を使用して緩衝化された１Ｍソルビトール）も含有する浸透圧が安定化した緩衝液中で１回または複数回洗浄することができる（例えば、図２８を参照）。
【０５９４】
単離および洗浄の後、プロトプラストは、浸透圧安定化緩衝液に再懸濁することができる。このような緩衝液の組成は、種、アプリケーション、および必要性に応じて変動し得る。しかし、典型的には、これらの緩衝液は、０．５から２Ｍの間のスクロース、シトレート、マンニトールまたはソルビトールのようないずれかの有機成分を含有する。より好ましくは０．７５から１．５Ｍの間；１Ｍが最も好適である。さもなければ、これらの緩衝液は、０．１から１．５Ｍ濃度でＫＣｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＭｇＳＯ４、ＮａＣｌまたはＭｇＣｌ２のような無機浸透圧安定化成分を含有する。好ましくは０．２から０．８Ｍの間、より好ましくは０．３から０．６Ｍの間、最も好ましくは０．４Ｍである。最も好適な安定化緩衝液は、ＳＴＣ（ソルビトール、０．８Ｍ；ＣａＣｌ２、２５ｍＭ；トリス、２５ｍＭ；ｐＨ８．０）またはＫＣｌ−シトレート（ＫＣｌ、０．３〜０．６Ｍ；シトレート、０．２％（ｗ／ｖ））である。プロトプラストは、１×１０５から１×１０１０細胞／ｍｌまたは１〜３×１０７プロトプラスト／ｍｌの濃度で使用することができる。好ましくは、濃度は、１×１０６から１×１０９の間であり；より好ましくは濃度は、１×１０７から５×１０８の間であり；最も好ましくは濃度は、１×１０８細胞／ｍｌである。トランスフェクションの効率を増大させるため、キャリアＤＮＡ（サケ精子ＤＮＡまたは非コードベクターＤＮＡのような）を形質転換混合物に添加することができる。ＤＮＡは、０．０１から１０ｕｇの間；好ましくは０．１から５ｕｇの間、さらにより好ましくは０．２５から２ｕｇの間、最も好ましくは０．５から１ｕｇの間の濃度で使用される。
【０５９５】
一実施形態では、生成ならびに後続の単離および洗浄の後、プロトプラストは、１種または複数の凍結保護物質と混合される。凍結保護物質は、グリコール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ポリオール、糖、２−メチル−２，４−ペンタンジオール（ＭＰＤ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、メチルセルロース、Ｃ−連結凍結防止糖タンパク質（Ｃ−ＡＦＧＰ）、またはこれらの組合せであり得る。本明細書に提供される方法およびシステムにおいて凍結保護物質として使用するためのグリコールは、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール（ＰＥＧ）、グリセロール、またはこれらの組合せから選択することができる。本明細書に提供される方法およびシステムにおいて凍結保護物質として使用するためのポリオールは、プロパン−１，２−ジオール、プロパン−１，３−ジオール、１，１，１−トリス−（ヒドロキシメチル）エタン（ＴＨＭＥ）、および２−エチル−２−（ヒドロキシメチル）−プロパン−１，３−ジオール（ＥＨＭＰ）、またはこれらの組合せから選択することができる。本明細書に提供される方法およびシステムにおいて凍結保護物質として使用するための糖は、トレハロース、スクロース、グルコース、ラフィノース、デキストロース、またはこれらの組合せから選択することができる。一実施形態では、プロトプラストは、ＤＭＳＯと混合される。ＤＭＳＯは、少なくとも、多くて、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１２．５％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、または７５％ｗ／ｖまたはｖ／ｖ、それ未満、それより高い、それに等しい、または約その値の最終濃度でプロトプラストと混合することができる。プロトプラスト／凍結保護物質（例えば、ＤＭＳＯ）混合物は、貯蔵前にマイクロタイタープレートに分配することができる。プロトプラスト／凍結保護物質（例えば、ＤＭＳＯ）混合物は、本明細書に提供される長期貯蔵（例えば、数時間、数日、数週間、数カ月、数年）にわたって、本明細書に提供される任意の温度、例えば、−２０℃または−８０℃などで貯蔵することができる。一実施形態では、追加の凍結保護物質（例えば、ＰＥＧ）が、プロトプラスト／ＤＭＳＯ混合物に添加される。さらに別の実施形態では、追加の凍結保護物質（例えば、ＰＥＧ）が、貯蔵前にプロトプラスト／ＤＭＳＯ混合物に添加される。ＰＥＧは、本明細書に提供される任意のＰＥＧであり得、本明細書に提供される任意の濃度（例えば、ｗ／ｖまたはｖ／ｖ）で添加することができる。一実施形態では、ＰＥＧ溶液は、ＳＴＣ緩衝液中、４０％ｗ／ｖとして調製される。次いでこの４０％のＰＥＧ−ＳＴＣのうち２０％ｖ／ｖをプロトプラストに添加することができる。例えば、８００マイクロリットルの１．２５×１０７個のプロトプラストは、２００マイクロリットルの４０％ＰＥＧ−ＳＴＣを含み、最終容量が１ｍｌになると予想される。次いでこの１ｍｌに、７０マイクロリットルのＤＭＳＯを添加して、この調製物を７％ｖ／ｖのＤＭＳＯにすることができる。
【０５９６】
本明細書に提供される任意の前培養、培養および／またはプロトプラスト形成プロトコールは、ハイスループット様式で実行することができる。例えば、前培養、培養およびプロトプラスト形成は、ワークフローが図２８に表示されたようなハイスループット（ＨＴＰ）プロトコールの一部を表すように、前記ワークフローの一部として実行することができる。ハイスループットプロトコールは、任意のおよび／またはすべてのステップに自動化された液体ハンドリングを利用することができる。
宿主細胞の形質転換
【０５９７】
一部の実施形態では、本開示のベクターまたはコンストラクトは、形質転換、トランスフェクション、形質導入、ウイルス感染、遺伝子銃、またはＴｉ媒介遺伝子移入を含めた様々な技法のいずれかを使用して宿主細胞（例えば、糸状菌細胞またはそれに由来するプロトプラスト）内に導入することができる（Christie,  P.J.、およびGordon,  J.E.、２０１４「The  Agrobacterium  Ti  Plasmids」Microbiol  SPectr.  ２０１４年；２巻（６号）；１０．１１２８頁を参照）。特定の方法としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、または電気穿孔が挙げられる（Davis,  L.、Dibner,  M.、Battey,  I.、１９８６年、「Basic  Methods  in  Molecular  Biology」）。形質転換の他の方法としては、例えば、酢酸リチウム形質転換および電気穿孔が挙げられる。例えば、Gietzら、Nucleic  Acids  Res.  ２７巻：６９〜７４頁（１９９２年）；Itoら、J.  Bacterol.  １５３巻：１６３〜１６８頁（１９８３年）；およびBeckerおよびGuarente、Methods  in  Enzymology  １９４巻：１８２〜１８７頁（１９９１年）を参照されたい。一部の実施形態では、形質転換宿主細胞は、組換え宿主株と称される。
【０５９８】
一部の実施形態では、本開示は、本開示の９６−ウェルプレートロボットプラットフォームおよび液体ハンドリング機械を使用する細胞のハイスループット形質転換を教示する。
【０５９９】
一実施形態では、本明細書に提供される方法およびシステムは、本明細書に記載の糸状菌細胞に由来するプロトプラストへの核酸の移送を必要とする。別の実施形態では、本明細書に提供される方法およびシステムによって利用される形質転換は、本明細書に記載した通り、本質的にハイスループットであり、かつ／または部分的もしくは完全に自動化されている。部分的または完全に自動化された方法は、本明細書に提供される１つまたは複数の液体ハンドリングステップの、自動化された液体ハンドリングの使用を伴い得る。本実施形態に付け加えて、形質転換は、本明細書に記載のコンストラクトまたは発現コンストラクトをマイクロタイタープレートのウェルに添加し、その後、本明細書に提供される方法によって生成されたプロトプラストをマイクロタイタープレートの各ウェルにアリコートすることによって実施される。プロトプラストの形質転換／トランスフェクションの適当な手順は、例えば、国際特許出願ＰＣＴ／ＮＬ９９／００６１８号、同ＰＣＴ／ＥＰ９９／２０２５１６号、FinkelsteinおよびBall（編）、Biotechnology  of  filamentous  fungi,  technology  and  products、Butterworth-Heinemann（１９９２年）、BennettおよびLasure（編）、More  Gene  Manipulations  in  fungi、Academic  Press（１９９１年）、Turner：Puhler（編）、Biotechnology、完全に改訂された第２版、VHC（１９９２年）protoplast  fusionに記載されたもの、ならびにＥＰ６３５５７４Ｂに記載されたＣａ−ＰＥＧ媒介プロトプラスト形質転換を含めて、任意の当技術分野で公知のものであり得る。代替として、糸状菌宿主細胞またはこれらに由来するプロトプラストの形質転換は、電気穿孔、例えば、ChakrabortyおよびKapoor、Nucleic  Acids  Res.、１８巻：６７３７頁（１９９０年）によって記載された電気穿孔など、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ媒介形質転換、例えば、Christiansenら、Curr.  Genet.、２９巻：１００〜１０２頁（１９９５年）；Durandら、Curr.  Genet.、３１巻：１５８〜１６１頁（１９９７年）；およびBarcellosら、Can.  J.  Microbiol.、４４巻：１１３７〜１１４１頁（１９９８年）に記載されたものなどのＤＮＡの微粒子導入、または細胞の「磁気微粒子銃（magneto-biolistic）」トランスフェクション、例えば、米国特許第５，５１６，６７０号および同第５，７５３，４７７号に記載されたものなどによっても実施することができる。一実施形態では、本明細書に提供される方法およびシステムで使用される形質転換手順は、本明細書に提供されるハイスループットおよび／または自動化を受けやすいもの、例えば、ＰＥＧ媒介形質転換などである。
【０６００】
本明細書に記載の方法を使用して生成されるプロトプラストの形質転換は、当技術分野で公知の任意の形質転換試薬を使用することによって促進することができる。適当な形質転換試薬は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＦＵＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ製）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）またはＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）、ＴＲＡＮＳＰＡＳＳ（登録商標）Ｄ１（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ製）、ＬＹＰＯＶＥＣ（登録商標）またはＬＩＰＯＧＥＮ（登録商標）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ製）から選択することができる。一実施形態では、ＰＥＧが最も好適な形質転換／トランスフェクション試薬である。ＰＥＧは、異なる分子量で入手可能であり、異なる濃度で使用することができる。好ましくは、ＰＥＧ４０００が、１０％から６０％の間、より好ましくは２０％から５０％の間、最も好ましくは４０％で使用される。一実施形態では、ＰＥＧは、本明細書に記載した通り、貯蔵前にプロトプラストに添加される。
選択された配列のループアウト
【０６０１】
一部の実施形態では、本開示は、宿主生物からＤＮＡの選択された領域をループアウトする方法を教示する。ループアウト法は、Nakashimaら、２０１４年、「Bacterial  Cellular  Engineering  by  Genome  Editing  and  Gene  Silencing.」、Int.  J.  Mol.  Sci.、１５巻（２号）、２７７３〜２７９３頁に記載された通りのものであり得る。一部の実施形態では、本開示は、陽性形質転換体から選択マーカーをループアウトすることを教示する。ループアウト欠失技法は、当技術分野で公知であり、（Tearら、２０１４年、「Excision  of  Unstable  Artificial  Gene-Specific  inverted  Repeats  Mediates  Scar-Free  Gene  Deletions  in  Escherichia  coli.」、Appl.  Biochem.  Biotech.、１７５巻：１８５８〜１８６７頁）に記載されている。本明細書に提供される方法で使用されるループアウト法は、シングルクロスオーバー相同組換えまたはダブルクロスオーバー相同組換えを使用して実施することができる。一実施形態では、本明細書に記載の選択された領域のループアウトは、本明細書に記載のシングルクロスオーバー相同組換えを使用することを必然的に伴い得る。
【０６０２】
第１に、ループアウトコンストラクトが、宿主生物のゲノム内の選択された標的領域に挿入される（例えば、相同組換え、ＣＲＩＳＰＲ、または他の遺伝子編集技法を介して）。一実施形態では、ダブルクロスオーバー相同組換えが、図３に表したものなどの１つまたは複数のコンストラクトを組み込むために、１つまたは複数のコンストラクトと宿主細胞ゲノムとの間に使用される。挿入された１つまたは複数のコンストラクトは、既存のまたは導入される近傍の宿主配列のダイレクトリピートである配列を用いて設計することができ、その結果、ダイレクトリピートがループアウトおよび欠失を予定しているＤＮＡの領域に隣接する。挿入されると、１つまたは複数のループアウトコンストラクトを含有する細胞を、選択領域の欠失について対抗選択することができる（例えば、図４；選択遺伝子に対する耐性の欠如を参照されたい）。ループインおよびループアウトプロセスのさらなる例示は図３６〜３７に表示される。
【０６０３】
当業者は、ループアウト手順の記載は、ゲノムから望まれない領域を欠失させるための一例示的方法を代表するにすぎないことを認識する。実際に、本開示の方法は、これらに限定されないが、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮＳ、ＦＯＫ、または他のエンドヌクレアーゼを介した遺伝子編集を含めて、ゲノム欠失の任意の方法に適合する。当業者は、相同組換え技法を介してゲノムの望まれない領域を置き換える能力も認識する。
形質転換のためのコンストラクト
【０６０４】
一実施形態では、本明細書に提供される方法およびシステムは、糸状菌細胞またはこれに由来するプロトプラストの、少なくとも１つの核酸での形質転換またはトランスフェクションを伴う。形質転換またはトランスフェクションは、本明細書に記載される方法および試薬の使用であってもよい。プロトプラストの生成は、本明細書に提供される方法のいずれかを使用して実行することができる。プロトプラストの生成および／または形質転換は、本明細書に提供されるように、ハイスループットであってもよいし、および／または自動化されていてもよい。核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはｃＤＮＡであってもよい。核酸は、ポリヌクレオチドであってもよい。本明細書に提供される方法およびシステムを使用して糸状菌細胞またはこれに由来するプロトプラストを形質転換することで使用するための核酸またはポリヌクレオチドは、バリアント株および／または親の株に対する、内在性遺伝子であってもよいし、または異種遺伝子であってもよい。内在性遺伝子または異種遺伝子は、本明細書に記載の産物または目的のタンパク質をコードしていてもよい。本明細書に記載の通り、目的のタンパク質は、糸状菌で発現させるのが望ましいポリペプチドを指すことができる。このようなタンパク質は、酵素、基質結合タンパク質、表面活性タンパク質、構造タンパク質などであってもよく、高いレベルで発現させることができ、商業化目的のためであってもよい。目的のタンパク質は、細胞内で、または分泌タンパク質として発現させることができる。内在性遺伝子または異種遺伝子は、変異を含んでいてもよいし、および／または１つまたは複数の遺伝子制御または調節エレメントの制御下であるか、もしくは１つまたは複数の遺伝子制御または調節エレメントに作動可能に連結されていてもよい。変異は、本明細書に提供される任意の変異、例えば、挿入、欠失、置換および／または一塩基多型などであってもよい。１つまたは複数の遺伝子制御または調節エレメントは、プロモーター配列および／またはターミネーター配列であってもよい。内在性遺伝子または異種遺伝子は、例えば図３６〜３８で示されるような複数の発現コンストラクトにわたる１つの発現コンストラクトまたはスプリットに存在していてもよい。スプリットが複数の発現コンストラクトにわたる場合、内在性遺伝子または異種遺伝子の各部分は、変異を含んでいてもよいし、および／または１つまたは複数の遺伝子制御または調節エレメントの制御下であるか、もしくは１つまたは複数の遺伝子制御または調節エレメントに作動可能に連結されていてもよい。一実施形態では、内在性遺伝子または異種遺伝子は、２つの部分からなり、前記内在性遺伝子または異種遺伝子は、２つの部分に分割され、その結果、前記２つの部分のそれぞれが別個のコンストラクト上に存在する。一実施形態では、遺伝子は、ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿９（配列番号１１）、ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１２（配列番号１２）、ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８（配列番号１３）またはＦｕｎｇｉＳＮＰ＿４０（配列番号１４）である。別の実施形態では、遺伝子は、表１からのプロモーターのいずれかに融合した、またはそれに作動可能に連結した、ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿９（配列番号１１）、ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１２（配列番号１２）、ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８（配列番号１３）またはＦｕｎｇｉＳＮＰ＿４０（配列番号１４）である。一実施形態では、遺伝子は、ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８（配列番号１３）である。別の実施形態では、遺伝子は、表１からのｍａｎ８ｐまたはａｍｙ８ｐプロモーターに融合した、またはそれに作動可能に連結したＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８（配列番号１３）である。
【０６０５】
プロモーター配列および／またはターミネーター配列は、バリアント株および／または親の株に対して内在性または異種であってもよい。プロモーター配列は、発現される配列の５’末端に作動可能に連結されていてもよい。様々な公知の真菌プロモーターが、本開示の宿主株において機能的である可能性が高く、そのようなプロモーターとしては、例えば、Ｃ１エンドグルカナーゼ、５５ｋＤａのセロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ１）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼＡ、Ｃ．ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅのＧＡＲＧ  ２７Ｋのプロモーター配列、およびＣｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ由来の３０ｋＤａのキシラナーゼ（Ｘｙ１Ｆ）プロモーターに加えて、例えば米国特許第４，９３５，３４９号；同第５，１９８，３４５号；同第５，２５２，７２６号；同第５，７０５，３５８号；および同第５，９６５，３８４号；ならびにＰＣＴ出願ＷＯ９３／０７２７７に記載されるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓプロモーターなどが挙げられる。一実施形態では、本明細書に提供される方法およびシステムで使用するためのプロモーターは、誘導性プロモーターである。誘導性プロモーターは、その転写活性が、例えばアルコール、テトラサイクリン、ステロイドなどの化学物質、金属または当技術分野で公知の他の化合物の存在または非存在によって調節される任意のプロモーターであってもよい。誘導性プロモーターは、その転写活性が、光または低温もしくは高温の存在または非存在によって調節される任意のプロモーターであってもよい。一実施形態では、誘導性プロモーターは、グルコースによって抑制される異化産物であり（例えば図３７を参照）、例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒ  アミラーゼＢ遺伝子のプロモーターなどである。一実施形態では、誘導性プロモーターは、ｓｒｐＢ遺伝子、ａｍｙＢ遺伝子、ｍａｎＢ遺伝子またはｍｂｆＡ遺伝子などの糸状菌遺伝子から選択される。一実施形態では、誘導性プロモーターは、表１に列挙したプロモーターから選択される。
【０６０６】
ターミネーター配列は、発現される配列の３’末端に作動可能に連結されていてもよい。様々な公知の真菌ターミネーターが、本開示の宿主株において機能的である可能性が高い。その例は、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ  ｔｒｐＣターミネーター、Ａ．ｎｉｇｅｒアルファ−グルコシダーゼターミネーター、Ａ．ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼターミネーター、Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉカルボキシルプロテアーゼターミネーター（米国特許第５，５７８，４６３号を参照）、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍターミネーター配列、例えばＥＧ６ターミネーター、およびＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉセロビオヒドロラーゼターミネーターである。一実施形態では、ターミネーター配列は、ダイレクトリピート（ＤＲ）である。一実施形態では、本開示の転写ターミネーター配列は、表１．１に列挙したターミネーター配列または表１．１に提供される終結配列のオルソログから選択することができる。例えば、宿主細胞がＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓである場合、終結配列は、表１．１から選択される非Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ終結配列のオルソログであってもよい。
【０６０７】
一実施形態では、糸状菌細胞から生成したプロトプラストは、２つまたはそれより多くの核酸またはポリヌクレオチドで共形質転換される。この実施形態に加えて、２つまたはそれより多くのポリヌクレオチドの少なくとも１つは、プロトプラストを生成した糸状菌株に対する内在性遺伝子または異種遺伝子であり、２つまたはそれより多くのポリヌクレオチドの少なくとも１つは、選択可能なマーカー遺伝子である。選択可能なマーカー遺伝子は、本明細書に提供される任意の選択可能なマーカーであってもよい。本明細書に記載の通り、２つまたはそれより多くの核酸またはポリヌクレオチドのそれぞれは、別個の部分に分割することができ、その結果、各別個の部分が別個のコンストラクト（図３６〜３８を参照）に存在する。
【０６０８】
一実施形態では、糸状菌細胞またはこれに由来するプロトプラストを形質転換またはトランスフェクトするのに使用するための各核酸またはポリヌクレオチドは、核酸またはポリヌクレオチドの５’、３’のいずれかまたは５’および３’末端の両方に形質転換しようとする、糸状菌細胞またはこれに由来するプロトプラストのゲノムの予め決定された標的遺伝子座に存在するＤＮＡ配列に相同な配列を含む。核酸またはポリヌクレオチドは、糸状菌宿主細胞のゲノム中の予め決定された遺伝子座に相同な配列が、内在性、異種または選択可能なマーカー遺伝子に隣接するように、形質転換に使用される糸状菌細胞に対する内在性遺伝子もしくは異種遺伝子、または選択可能なマーカー遺伝子であってもよい。一実施形態では、各核酸またはポリヌクレオチドは、例えば、ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（登録商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などの当技術分野で公知の任意の方法を使用してクローニングベクターにクローニングされる。好適なクローニングベクターは、使用される糸状菌宿主細胞の染色体中の予め決定された標的遺伝子座での組込みが可能なものであり得る。好ましい組込みクローニングベクターは、この予め決定された遺伝子座へのクローニングベクターの組込みを標的化するために欠失または置き換えられるＤＮＡ配列に相同なＤＮＡ断片を含んでいてもよい。標的化した組込みを促進するために、クローニングベクターは、宿主細胞またはこれに由来するプロトプラストの形質転換の前に線形化することができる。好ましくは、線形化は、クローニングベクターの末端の少なくとも一方、ただし好ましくはその両方が、欠失または置き換えさせるＤＮＡ配列に相同な配列と隣接するように実行される。一部の場合では、ＤＮＡの短い相同なストレッチが、組み込まれる核酸またはポリヌクレオチドの両方の側に、例えばＰＣＲにより付加されてもよい。組み込まれる核酸またはポリヌクレオチド配列に隣接する相同配列の長さは、好ましくは２ｋｂ未満、さらに好ましくは１ｋｂ未満、さらにより好ましくは０．５ｋｂ未満、さらにより好ましくは０．２ｋｂ未満、さらにより好ましくは０．１ｋｂ未満、さらにより好ましくは５０ｂｐ未満、最も好ましくは３０ｂｐ未満である。組み込まれる核酸またはポリヌクレオチド配列に隣接する相同配列の長さは、約３０ｂｐから約１０００ｂｐ、約３０ｂｐから約７００ｂｐ、約３０ｂｐから約５００ｂｐ、約３０ｂｐから約３００ｂｐ、約３０ｂｐから約２００ｂｐ、および約３０ｂｐから約１００ｂｐまで様々であり得る。糸状菌細胞またはこれに由来するプロトプラストの形質転換に使用するための核酸またはポリヌクレオチドは、発現カセットとして存在していてもよい。一実施形態では、クローニングベクターは、ｐＵＣ１９である。この実施形態に加えて、本明細書に提供されるマーカー配列を含有するクローニングベクターは、当技術分野で公知のようにギブソンアセンブリーの使用を介してコンストラクトを構築することによって、標的化配列に結合させることができる。代替として、標的化配列は、融合ＰＣＲによって付加されてもよい。マーカーに連結されていない共形質転換のための標的化配列は、ゲノムＤＮＡから増幅させてもよい。
【０６０９】
理論上、糸状菌ゲノム中のすべての遺伝子座は、本明細書に提供される核酸またはポリヌクレオチドを含む発現カセットの標的化した組込みのために選択することができる。好ましくは、標的化が起こる遺伝子座は、この遺伝子座に存在する野生型遺伝子が発現カセット中に含まれる遺伝子によって置き換えられた場合、得られた変異体が、本明細書に記載の例えば選択／対抗選択スキームなどの所与のアッセイによって検出可能な変化を示すようなものである。一実施形態では、本明細書に記載の糸状菌細胞から生成したプロトプラストは、第１のコンストラクトまたは発現カセットがプロトプラストのゲノムの第１の遺伝子座に組み込まれるように設計され、一方で第２のコンストラクトまたは発現カセットがプロトプラストのゲノムの第２の遺伝子座に組み込まれるように設計されるように、第１のコンストラクトまたは発現カセットおよび第２のコンストラクトまたは発現カセットで共形質転換される。第１の遺伝子座および第２の遺伝子座への組込みを促進するために、第１のコンストラクトまたは発現カセットは、第１の遺伝子座に相同な配列に隣接しており、一方で第２のコンストラクトまたは発現カセットは、第２の遺伝子座に相同な配列に隣接している。一実施形態では、第１のコンストラクトまたは発現カセットは、内在性遺伝子の配列を含み、一方で第２のコンストラクトは、選択可能なマーカー遺伝子の配列を含む。この実施形態に加えて、第２の遺伝子座は、本明細書に提供される方法およびシステムで使用されるプロトプラストのゲノム中に存在する追加の選択可能なマーカー遺伝子の配列を含有し、一方で第１の遺伝子座は、本明細書に提供される方法およびシステムで使用されるプロトプラストのゲノム中に存在する内在性標的遺伝子の配列を含有する。別の実施形態では、第１のコンストラクトまたは発現カセットは、内在性遺伝子または異種遺伝子の配列を含み、一方で第２のコンストラクトは、第１の選択可能なマーカー遺伝子の配列を含む。この別の実施形態に加えて、第２の遺伝子座は、本明細書に提供される方法およびシステムで使用されるプロトプラストのゲノム中に存在する第２の選択可能なマーカー遺伝子の配列を含有し、一方で第１の遺伝子座は、本明細書に提供される方法およびシステムで使用されるプロトプラストのゲノム中に存在する第３の選択可能なマーカー遺伝子の配列を含有する。上記の実施形態のそれぞれでは、内在性遺伝子および／または異種遺伝子は、本明細書に提供される変異（例えば、ＳＮＰ）および／または遺伝子制御もしくは調節エレメントを含んでいてもよい。
同核共存体のプロトプラストの精製
【０６１０】
当業者が十分に理解する通り、糸状菌に由来するプロトプラストは、多くの場合、１つより多くの核を含有することができ、その結果、後続の本明細書に提供されるコンストラクト（例えば、挿入ＤＮＡ断片）での形質転換が、コンストラクト（例えば、挿入ＤＮＡ断片）がプロトプラスト中に存在する複数の核のサブセットのみに組み入れられるような異核共存体であるプロトプラストを産生することができる。形質転換後に異核共存体であるプロトプラストの数またはパーセンテージを低減するために、例えば、その内容がその全体において参照によって本明細書に組み込まれるRonceroら、１９８４年、Mutat.  Res.  １２５巻：１９５号に記載される方法などを使用することにより、形質転換の前に、糸状菌宿主細胞に由来するプロトプラストの集団中の単核のプロトプラストのパーセンテージを増大させるストラテジーを使用することができる。
【０６１１】
別の実施形態では、個々の胞子に由来するクローン集団を単離するための方法が本明細書に提供される。一部の場合では、個々の真菌胞子は、真菌株に由来するプロトプラストから、前記プロトプラストの遺伝子撹乱後に胞子を形成する。個々の胞子に由来するクローン集団を単離するための方法は、本明細書に提供される方法のいずれかを使用する遺伝子撹乱後、同核共存体の真菌株の単離を促進したりまたはそれに役立つことができる。この実施形態に加えて、複数の胞子（例えば、最終的に糸状菌細胞または株に由来する胞子）を再懸濁して液状懸濁液を生成することができ、別々の体積の液状懸濁液中の個々の胞子は、例えばマイクロタイタープレートなどの基材のウェルまたは反応領域に配置または分配することができる。マイクロタイタープレートは、９６ウェル、３８４ウェルまたは１５３６ウェルプレートであり得る。
【０６１２】
マイクロタイタープレート中の各反応領域またはウェルが、単一の個々の真菌胞子を含有するかまたは真菌胞子を含有しないかのいずれかの高い統計的確率を達成するために、再懸濁した複数の胞子は、希釈することができる。一実施形態では、希釈は、胞子の懸濁液が、分散されたまたは別々の体積の懸濁液が１つの胞子を含有するかまたは胞子を含有しないかのいずれかである確率がポアソン分布に従う濃度であるようになされる。この実施形態に加えて、９０％より多くのウェルは胞子を含有せず、よって空である。残りのウェルのうち、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．５％より多くが単一細胞を有し、２％、１％、０．５％未満または０％が２つまたはそれより多くの細胞を有する。胞子の懸濁液の分散は、本明細書に提供される（表３を参照）および／または当技術分野で公知の液体ハンドリングデバイスのいずれかを使用して達成することができる。
【０６１３】
別の実施形態では、複数の胞子の再懸濁および希釈の後、別々の体積の懸濁液は、別々の体積中の単一の個々の真菌胞子の存在または非存在についてスクリーニングされる。この実施形態に加えて、別々の体積の懸濁液が単一の個々の真菌胞子のみを含有する場合、前記別々の体積は、ウェルまたは反応領域に分配、配置または分散される。スクリーニングは、本明細書に提供される（表３を参照）および／または当技術分野で公知の単一細胞／胞子を分散するデバイスのいずれかを使用して実行することができる。一実施形態では、デバイスは、単一細胞または胞子を光学的に同定する。デバイスは、ＦＡＣＳデバイス、ＣｅｌｌｅｎＯＮＥデバイス、Ｃｙｔｅｎａ単一細胞プリンターまたはＢｅｒｋｅｌｅｙ  Ｌｉｇｈｔｓ  Ｂｅａｃｏｎデバイスであり得る。再懸濁および希釈の前に、複数の個々の真菌胞子は、本明細書に提供される（表３を参照）および／または当技術分野で公知のデバイスのいずれかを使用して精選または単離することができる。胞子の再懸濁および希釈は、本明細書に提供される（表３を参照）および／または当技術分野で公知のデバイスのいずれかを使用して達成することができる。
【０６１４】
別々の体積中の単一の個々の真菌胞子の存在または非存在についてスクリーニングした後、ウェルまたは反応領域を含む基材のウェルまたは反応領域に個々の胞子を分配または分散するための本明細書に記載の方法は、基材中のウェルまたは反応領域の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９または９９．５％が複数の胞子からの単一の個々の生存可能な胞子を含有するようにすることができる。ウェルまたは反応領域を含む基材のウェルまたは反応領域に個々の胞子を分配するための本明細書に記載の方法を使用することにより、基材中のウェルまたは反応領域の７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９または９９．５％より多くが、複数の胞子からの単一の個々の生存可能な胞子を含有するようにすることができる。ウェルまたは反応領域を含む基材のウェルまたは反応領域に個々の胞子を分配するための本明細書に記載の方法を使用することにより、基材中のウェルまたは反応領域の実質的にすべてが、複数の胞子からの単一の個々の生存可能な胞子を含有するようにすることができる。ウェルまたは反応領域を含む基材のウェルまたは反応領域に個々の胞子を分配するための本明細書に記載の方法を使用することにより、基材中のウェルまたは反応領域のすべてまたは１００％が、複数の胞子からの単一の個々の生存可能な胞子を含有するようにすることができる。ウェルまたは反応領域を含む基材のウェルまたは反応領域に個々の胞子を分配するための本明細書に記載の方法を使用することにより、マイクロタイタープレート中のウェルの７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９または９９．５％より多くまたは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９または９９．５％が、単一の個々の生存可能な胞子を含有する統計的確率をもたらすことができる。ウェルまたは反応領域を含む基材のウェルまたは反応領域に個々の胞子を分配するための本明細書に記載の方法を使用することにより、マイクロタイタープレート中のウェルのすべてまたは実質的にすべてが単一の個々の生存可能な胞子を含有する統計的確率をもたらすことができる。基材は、マイクロタイタープレートであり得る。マイクロタイタープレートは、９６ウェル、３８４ウェルまたは１５３６ウェルプレートであり得る。
【０６１５】
複数の個々の真菌胞子は、糸状菌株に由来していてもよい。糸状菌株は、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａの種、またはこれらのテレオモルフもしくはアナモルフ、およびシノニムもしくは分類学的均等物から選択することができる。一実施形態では、糸状菌株は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒである。別の実施形態では、糸状菌株は、菌糸体を形成しない表現型を有する。さらに別の実施形態では、糸状菌株は、非機能的な非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路を有する。細胞を、抗体、化学的阻害剤、タンパク質阻害剤、物理的阻害剤、ペプチド阻害剤、またはＮＨＥＪ経路のコンポーネントに指向させたアンチセンスまたはＲＮＡｉ分子に曝露することによって、ＮＨＥＪ経路を非機能的にすることができる。
【０６１６】
複数の個々の胞子を再懸濁するのに使用される液体は、培養培地または緩衝液であり得る。さらに、ウェルまたは反応領域は、遺伝的バリエーションに選択的な培地を含む反応領域またはウェル中で分配された個々の真菌胞子を培養することにより所望の遺伝子撹乱を含有していた個々の胞子に由来するコロニーの同定および選択が促進されるように、特異的な遺伝子撹乱を含有する胞子を選択するのに役立ち得る選択培地を含んでいてもよい。
【０６１７】
形質転換前に単核プロトプラストの数またはパーセンテージを増大させるためのストラテジーを使用することのほかに、またはそれに加えて、プロトプラスト（および前記プロトプラストの再生後のこれに由来するコロニー）を、これらが単核かまたは多核かにかかわらず形質転換後に同核共存体にさせるストラテジーを使用することができる。本明細書に提供されるように、所望のまたは目的の標的遺伝子について同核共存体であるプロトプラスト（およびそれに由来するコロニー）の数またはパーセンテージを増大させることは、形質転換されたプロトプラストに由来するコロニーまたは形質転換されたプロトプラストの集団を、１つまたは複数の選択可能なマーカーの存在および／または非存在に基づく選択および／または対抗選択に供することを伴い得る。１つまたは複数の選択可能なマーカーは、本明細書に提供される任意の選択可能なマーカーまたは選択可能なマーカーの組合せであってもよく、選択および／または対抗選択スキームは、本明細書に提供されるような任意のスキームであってもよい。
同核共存体の形質転換体の同定
【０６１８】
本明細書に提供される方法によって産生される同核共存体の形質転換体は、表現型スクリーニング、配列ベースのスクリーニングまたはこれらの組合せの使用により同定することができる。言い換えれば、表現型スクリーニング、配列ベースのスクリーニングまたはこれらの組合せは、プロトプラストをコンストラクト（例えば、挿入ＤＮＡ断片）で形質転換した後、前記プロトプラストに由来するコロニーにおける親の遺伝子型の存在または非存在を検出するのに使用することができる。同核共存体の形質転換体の同定または検出は、前記形質転換体を本明細書に提供される選択および／または対抗選択スキームに供する前および／またはその後に、１つまたは複数の選択可能なマーカー遺伝子の導入および／または損失と合わせて行うことができる。表現型スクリーニングは、見極め可能な表現型（増殖における変化および／または比色変化）を有する形質転換体を同定するのに使用でき、一方で配列ベースのスクリーニングは、本明細書に提供される１つまたは複数のコンストラクトの形質転換および組込み後に、見極め可能な表現型を有するまたは有さない形質転換体を同定するのに使用できる。
配列ベースのスクリーニング
【０６１９】
本明細書に記載の通り、配列ベースのスクリーニングは、形質転換体における所望のまたは標的コンストラクトの存在または非存在を決定するのに使用することができる。このようにして、配列ベースのシーケンシングは、特定の形質転換体において所望の遺伝子またはコンストラクトの組込みが起こったのかどうかを評価するのに使用することができる。配列ベースのスクリーニングは、所望の遺伝子、変異またはコンストラクトを含有する多核細胞または多核細胞の集団における核のパーセンテージを決定するのに使用することができる。さらに、配列ベースのスクリーニングは、所望の標的組込みを経験した形質転換体の集団のパーセンテージを決定するのに使用することができる。コンストラクトは、本明細書に記載の任意のコンストラクトまたは複数のコンストラクトであってもよい。一部の場合では、配列ベースのスクリーニングの結果は、所望の遺伝子、変異またはコンストラクトを含む核と、前記所望の遺伝子、変異またはコンストラクトを欠く核とのパーセンテージまたは比率がある特定の閾値未満である場合、精製スキーム（例えば、同核共存体の精製）を選択するのに使用することができる。
【０６２０】
一般に、配列ベースのスクリーニングは、所望の変異またはコンストラクトを含有し得る形質転換体を単離することを伴い得る。各形質転換体は、複数の核の１つまたはそれぞれが形質転換中に導入された核酸の断片（例えば、変異を含む１つまたは複数のコンストラクトまたは遺伝子）を含有するように、１つまたは複数の核を含有していてもよい。形質転換は、本明細書に提供されるＤＮＡの特定の断片（例えば、変異を含む１つまたは複数のコンストラクトまたは遺伝子）を有する標的化したプロトプラストの形質転換であってもよい。
【０６２１】
一部の場合では、単離後、配列ベースのスクリーニングは、標的遺伝子の純度に影響を与える培地（すなわち、選択培地）または任意の特定の表現型または形質に関して完全に非選択的であり得る培地で、標的遺伝子（導入されたコンストラクト）と野生型または親の遺伝子の両方を有する核の混合物を含有する形質転換体を増殖させること、それによって形質転換体に由来するコロニーを生成することを伴う。一実施形態では、各単離された形質転換体またはこれに由来するコロニーの一部を、例えば、形質転換体またはこれに由来するコロニーの一部が胞子形成する寒天を含むＯｍｎｉｔｒａｙ（図３０、および図３１のシードプレートを参照）などのマイクロタイタープレートのウェルに移すかまたはその中に配置する。マイクロタイタープレートは、９６ウェル、３８４ウェルまたは１５３６ウェルのマイクロタイタープレートであり得る。
【０６２２】
単離単独の後、または単離と増殖の組合せの後、核酸（例えば、ＤＮＡ）は、形質転換体またはコロニーまたはこれに由来する胞子から抽出することができる。図３０で示されるように、核酸の単離は、形質転換体に由来する胞子からの単離であってもよく、マイクロタイタープレート様式で実行してもよく、自動化された液体ハンドリングを利用してもよい。核酸の抽出は、当技術分野で公知の任意の公知の核酸抽出方法、および／または市販のキット、例えばＰｒｅｐｍａｎ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）などを使用して実行することができる。一実施形態では、形質転換体に由来する胞子からの核酸の抽出は、ＤＮＡの増幅を可能にする沸騰調製方法を使用して実行される（図３２を参照）。沸騰調製方法は、少量の増殖培地に胞子を接種させることを含み得る。一実施形態では、胞子は、ＰＣＲに好適なプレート中の９６ウェルに分離され、ここで各ウェルは、少量の増殖培地を含む。胞子は、１０〜１６時間増殖させることができ、これは、胞子がＰＣＲを阻害する可能性がある色素を排出するのを助けることができる。さらに、増殖はまた、数ラウンドの核分裂を促進することもでき、これは、各ウェルのゲノムＤＮＡ含有量を増大させるのに役立つ可能性がある。その後、一晩の「ミニ培養物」に、細胞溶解を補助することに加えて溶解中に放出されることになるＤＮＡを安定化させる緩衝液を補充してもよい。好適な緩衝液の一例は、ＰｒｅｐＭａｎ  Ｕｌｔｒａ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）であり得る。好適な緩衝液の他の例としては、少量のイオン性洗浄剤を含有するトリス緩衝化溶液を挙げることができる。次いでミニ培養物−緩衝液混合物は、サーモサイクラーで、１５分〜１時間のインキュベーション時間の範囲のいずれかで９９℃に加熱してもよい。
【０６２３】
核酸抽出後、配列ベースのスクリーニングを実行して、親核（すなわち、形質転換されていない核）に導入された標的遺伝子またはコンストラクトを含む標的または変異体の核のパーセンテージまたは比率を評価することができる。配列ベースのスクリーニングは、核酸の配列を決定または検出するのに使用できる当技術分野で公知の任意の方法であり得る。配列ベースのスクリーニングを実行するのに使用される方法は、核酸シーケンシング方法またはハイブリダイゼーションベースのアッセイ方法から選択することができる。本明細書に提供される方法によって利用される核酸シーケンシングアッセイまたは技法は、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）システムまたはアッセイであり得る。特定の核酸配列を検出するためのハイブリダイゼーションベースのアッセイは、マイクロアレイまたはｎＣｏｕｎｔｅｒシステム（Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ）の使用を伴い得る。配列ベースのスクリーニングを行う前に、抽出された核酸を、標的遺伝子に指向させたプライマー対を用いたＰＣＲを使用して増幅してもよい。
【０６２４】
核酸シーケンシング手法を利用する実施形態では、ＰＣＲで利用されるプライマー対は、その後にコードされたインデックスプライマーを使用する二次増幅で使用できるアダプター配列を含んでいてもよい。次いで二次増幅反応によって生成したアンプリコンは、コードされたインデックスプライマーに指向させたシーケンシングプライマーを用いたマルチプレックスシーケンシングを使用してシーケンシングすることができる。シーケンシングは、当技術分野で公知の任意のタイプのシーケンシングを使用して実行することができる。一実施形態では、シーケンシングは、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）である。ＮＧＳは、当技術分野で公知の任意の公知のＮＧＳ方法、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＮＧＳなどであってもよい。図３０は、形質転換、胞子形成、核酸抽出およびＮＧＳベースの配列ベースのスクリーニングが自動化または半自動化された様式で実行されるワークフローの実施形態を示す。図２５、２６、３４および３５で示されるように、マルチプレックスシーケンシング反応からのデータは次いで、標的核の存在または非存在を決定するのに使用することができる。一部の場合では、マルチプレックスシーケンシング反応からのデータはまた、標的ウェル内の形質転換体について親の核の変異体核に対する比率を決定するのにも使用することができる（図３４および３５を参照）。この実施形態に加えて、親核の変異体核に対するパーセンテージまたは比率を定量するために、標準曲線を生成することができる。例えば図３３で示されるような公知の比率の親核と変異体核とを含有する株から単離した核酸を増幅およびシーケンシングすることによって標準曲線を生成し、その後、公知の比率で出現する変異体アンプリコンに対する親アンプリコンの比率を使用して、試験試料の純度の近似値を決定することができる。標準曲線を生成するのに使用される株は、試験試料として同じセットのプレートで処理（例えば、単離、増殖および抽出）することができる。
【０６２５】
一実施形態では、配列ベースのシーケンシングは、各形質転換体の同核共存体のステータスを評価または決定するために、選択および／または対抗選択の後に使用される。選択および／または対抗選択後の配列ベースのシーケンシングは、本明細書に記載のマルチプレックスシーケンシングを使用してもよく、自動化または半自動化されていてもよい。選択および／または対抗選択後の配列ベースのシーケンシングはまた、異核共存体である形質転換体の存在および／または量（例えば、比率）を決定する手段として、本明細書に記載の標準曲線の生成を利用してもよい。
形質転換体の純度を決定するための配列ベースのスクリーニングの使用
【０６２６】
本明細書で論じられるように、本明細書に提供される方法、システムおよびワークフローにおいて多核体宿主細胞（例えば、糸状菌宿主細胞）から生成したプロトプラストは、多核であってもよい。その後、本明細書に提供されるものなどの１つまたは複数のコンストラクトで形質転換されたプロトプラストは、これらのゲノムに組み込まれた特定の１つまたは複数のコンストラクトを有するこれらの複数の核の一部またはパーセンテージのみを含有していてもよい。形質転換されたコンストラクトの性質に応じて、形質転換されたプロトプラストに由来するコロニーは、コロニー中に存在する核の混合された集団の存在に起因する見極め可能な表現型を生じさせない可能性がある。よって、所望の１つまたは複数のコンストラクトを含有する核と、それに対して所望の１つまたは複数のコンストラクトを含有しない核との混合された集団中の核のパーセンテージを決定するために、配列ベースのスクリーニングの使用が必須であり得る。図３３〜３５は、核の混合された集団を有する細胞を含有するコロニー中の親の核とそれに対する変異体核とを検出するためのＮＧＳベースのスクリーニングの有用性を示す。一実施形態では、ＮＧＳベースのスクリーニングは、導入された１つまたは複数のコンストラクトを有する所望のパーセンテージの核を含有する形質転換体またはそれに由来する株を同定するのに使用される。所望のパーセンテージは、閾値パーセンテージであって、形質転換体またはそれに由来する株が、前記閾値パーセンテージで、またはそれを超えるパーセンテージで所望の目的の産物またはこれらのレベルを生じさせる閾値パーセンテージであってもよい。目的の産物は、表２に列挙した産物から選択することができる。所望のパーセンテージは、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％であり得る。パーセンテージは、本明細書に記載の標準曲線を利用することによって決定することができる。
表現型スクリーニング
【０６２７】
本明細書に記載の通り、表現型スクリーニングは、配列ベースのスクリーニングまたは形質転換体と組み合わせて使用することができる。一部の場合では、配列ベースのスクリーニングの結果を使用して、同核共存体の形質転換体の単離を確認するために精製スキームを決定することができる。さらに、配列ベースのスクリーニングは、表現型スクリーニング／精製により得られた単離物が同核共存体であるかどうかを評価するために、表現型スクリーニング／精製の後に利用することができる。
【０６２８】
本明細書に提供される方法、組成物またはシステムを使用して生成された形質転換体の表現型スクリーニングは、１つまたは複数の選択可能なマーカーの使用を使用することができる。選択可能なマーカーは、多くの場合、形質転換されていない株にとって外来の特定のタイプの耐性を提供する遺伝子産物をコードしていてもよい。これは、一般に、重金属、抗生物質または殺生剤に対する耐性であり得る。原栄養性も、非抗生物質性の多様性の有用な選択可能なマーカーであり得る。栄養要求性マーカーは、宿主細胞における栄養不足をもたらすことができ、このような不足を修正する遺伝子が、選択に使用することができる。
【０６２９】
当技術分野で使用される多様な選択マーカーがあり、これらのいずれかまたはすべてを本明細書に提供される方法およびシステムに適用することができる。本明細書で使用するための選択可能なマーカー遺伝子は、栄養要求性マーカー、原栄養性マーカー、優性マーカー、劣性マーカー、抗生物質耐性マーカー、異化マーカー、酵素マーカー、蛍光マーカー、発光マーカーまたはこれらの組合せであり得る。これらの例としては、これらに限定されないが、ａｍｄＳ（アセトアミド／フルオロアセタミド）、ｂｌｅ（ブレオマイシン（belomycin）−フレオマイシン耐性）、ｈｙｇ（ハイグロマイシンＲ）、ｎａｔ（ノウルセオトリシン（nourseotricin）Ｒ）、ｐｙｒＧ（ウラシル／５ＦＯＡ）、ｎｉａＤ（ニトレート／クロレート）、ｓｕｔＢ（スルフェート／セレネート）、ｅＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）およびすべての異なる色のバリアント、ａｙｇＡ（発色性マーカー）、ｍｅｔ３（メチオニン／セレネート）、ｐｙｒＥ（オロテートＰ−リボシルトランスフェラーゼ）、ｔｒｐＣ（アントラニル酸合成酵素）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、変異アセト乳酸合成酵素（スルホニル尿素耐性）、およびネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（アミノグリコシド耐性）が挙げられる。
【０６３０】
一実施形態では、多核体生物体のゲノムにおける標的遺伝子の特定の変異の表現型の効果を検査するために、単一の選択マーカーが使用される。多核体生物体は、糸状菌、例えばＡ．ｎｉｇｅｒであり得る。標的遺伝子は、生合成経路に関与する遺伝子、例えば、クエン酸産生に関与する遺伝子などであり得る。このタイプの実施形態の例は、図３９で見ることができる。図３９の上部において、Ａ．ｎｉｇｅｒにおいてクエン酸産生に関与する遺伝子に相同な配列に隣接するｐｙｒＧ遺伝子を含む欠失コンストラクトが、変異（例えば、ＳＮＰ）を含み生来のｐｙｒＧ遺伝子を欠くクエン酸産生遺伝子バージョンを含む宿主プロトプラストに導入される。ｐｙｒＧコンストラクトの相同組換えは、本明細書に記載のｐｙｒＧ遺伝子の存在に基づいて選択できる形質転換体を生成する。さらに、形質転換体は、前記変異がその経路で果たす役割について情報を得るのに使用できる欠失表現型を有していてもよい。代替として、図３９の下部は、宿主プロトプラスト中の生来のｐｙｒＧ遺伝子座に相同な配列に隣接する特定の変異（例えば、ＳＮＰ）を有するクエン酸産生に関与する遺伝子を含むコンストラクトが宿主プロトプラストに導入される実施形態を示す。コンストラクトと生来のｐｙｒＧ遺伝子座との相同組換えは、ＦＯＡを含む培地で前記形質転換体を増殖させることによって選択できる形質転換体を生成することができる。次いで導入されたＳＮＰの表現型の効果を、本明細書に記載の通り評価することができる。
【０６３１】
本開示の別の実施形態は、糸状菌において活性な２つまたはそれより多くの選択マーカーの使用を伴う。使用できる選択マーカーの多様な組合せがあり、これらのすべては、本明細書に提供される選択／対抗選択スキームにおいて適用することができる。例えば、選択／対抗選択スキームは、栄養要求性マーカー、原栄養性マーカー、優性マーカー、劣性マーカー、抗生物質耐性マーカー、異化マーカー、酵素マーカー、蛍光マーカー、および発光マーカーの組合せを利用することができる。第１のマーカーは、フォワード様式で（すなわち活性な組込みが起こった場合）選択するのに使用でき、一方で追加のマーカーは、リバース様式で（すなわち、正しい遺伝子座での活性な組込みが起こった場合）選択するのに使用できる。選択／対抗選択は、選択マーカーが別個のベクター上に存在し得るか、または本明細書に記載の内在性または異種遺伝子と同じ核酸断片またはベクター中に存在し得るように、共形質転換によって行うことができる。
【０６３２】
一実施形態では、本開示の同核共存体のプロトプラストの精製スキームは、糸状菌宿主細胞から生成したプロトプラストを、内在性遺伝子または異種遺伝子の配列を含む第１のコンストラクトおよび第１の選択可能なマーカー遺伝子の配列を含む第２のコンストラクトで共形質転換するステップであって、その結果、第１のコンストラクトが、除去または不活性化される標的遺伝子の配列を含むプロトプラストのゲノムの第１の遺伝子座に指向されており、一方で第２のコンストラクトが、第２の選択可能なマーカー遺伝子の配列を含むプロトプラストのゲノムの第２の遺伝子座に指向されている、ステップを伴う。一実施形態では、第１のコンストラクトは、内在性遺伝子または異種遺伝子の配列を含み、除去または不活性化される標的遺伝子は、第３の選択可能なマーカー遺伝子のためのものである。別の実施形態では、第１のコンストラクトは、除去または不活性化される内在性遺伝子および標的遺伝子の配列を含み、形質転換の前にプロトプラストのゲノム中に存在する内在性遺伝子のコピーである。本明細書に記載の通り、第１のコンストラクトの内在性遺伝子または異種遺伝子は、変異（例えば、ＳＮＰ）および／または遺伝子調節もしくは制御エレメント（例えば、プロモーターおよび／またはターミネーター）を含んでいてもよい。第１、第２および／または第３の選択可能なマーカーは、当技術分野で公知の、および／または本明細書に記載される任意の栄養要求性マーカー、原栄養性マーカー、優性マーカー、劣性マーカー、抗生物質耐性マーカー、異化マーカー、酵素マーカー、蛍光マーカー、発光マーカーであり得る。特異的な遺伝子座に指向されるように、コンストラクトのそれぞれは、本明細書に記載のプロトプラストのゲノム中の所望の遺伝子座に相同なヌクレオチドに隣接する。
【０６３３】
図２３Ａに、第１のコンストラクトが、内在性遺伝子または異種遺伝子の配列を含み、除去または不活性化される標的遺伝子が、第３の選択可能なマーカー遺伝子のためのものである実施形態の例を示す。この例では、第１のコンストラクトは、発色性選択可能マーカー遺伝子ａｙｇＡの遺伝子座に組み込まれるＳＮＰを含む、糸状菌における内在性クエン酸産生に関与する遺伝子の配列を含み、一方で第２のコンストラクトは、栄養要求性マーカー遺伝子ｍｅｔ３の遺伝子座に組み込まれる栄養要求性マーカー遺伝子ｐｙｒＧの配列を含む。この例では、糸状菌宿主細胞は、ｐｙｒＧ陰性またはウラシル栄養要求性である。よって、同核共存体のプロトプラスト形質転換体の精製は、前記形質転換体をウラシルを欠く最小培地で増殖させることを伴う。図２３Ａで示されるように、同核共存体の形質転換体は、ウラシル原栄養体であることに加えて純粋な黄色でもあり、これは、ｐｙｒＧ遺伝子の組入れおよびａｙｇＡ遺伝子の除去を示す。任意の残留した異核共存体コロニーの対抗選択および除去は、その後、ｍｅｔ３＋核酸を有する形質転換体がセレネートの存在下で致死するセレネート含有最小培地（ウラシル含有または非含有）で形質転換体を平板培養することによって達成することができる。ｍｅｔ３遺伝子に同様に作動する別のマーカーは、例えば、硝酸レダクターゼをコードするｎｉａＡ遺伝子であってもよく、これは、この実施形態に記載された選択／対抗選択スキームに使用することができる。ｎｉａＡ遺伝子の場合、糸状菌宿主細胞は、ｎｉａＡ＋であってもよく、それによって第２のコンストラクトの正確な組込みが、対抗選択中に使用されるクロレートに対して耐性であるｎｉａＡ−子孫を生成する。一実施形態では、プロトプラストのゲノムへの第１および／または第２のコンストラクトの正確な組込みの確認は、例えば次世代シーケンシング（ＮＧＳ）などを使用してプロトプラストのゲノムをシーケンシングすることによって確認される。
【０６３４】
図２４に、第１のコンストラクトが、除去または不活性化される内在性遺伝子および標的遺伝子の配列を含み、形質転換の前にプロトプラストのゲノム中に存在する内在性遺伝子のコピーである実施形態の例を示す。この例では、第１のコンストラクトは、前記ＳＮＰを欠く前記内在性遺伝子の遺伝子座に組み込まれるＳＮＰを含む糸状菌における内在性クエン酸産生に関与する遺伝子の配列を含み、一方で第２のコンストラクトは、発色性マーカー遺伝子ａｙｇＡの遺伝子座に組み込まれる栄養要求性マーカー遺伝子ｐｙｒＧの配列を含む。この例では、糸状菌宿主細胞は、ｐｙｒＧ陰性またはウラシル栄養要求性である。よって、同核共存体のプロトプラスト形質転換体の精製は、前記形質転換体をウラシルを欠く最小培地で増殖させることを伴う。図２４で示されるように、同核共存体の形質転換体は、ウラシル原栄養体であることに加えて純粋な黄色でもあり、これは、ｐｙｒＧ遺伝子の組入れおよびａｙｇＡ遺伝子の除去を示す。一実施形態では、プロトプラストのゲノムへの第１および／または第２のコンストラクトの正確な組込みの確認は、例えば次世代シーケンシング（ＮＧＳ）などを使用してプロトプラストのゲノムをシーケンシングすることによって確認される。使用されるＮＧＳシステムまたは方法は、当技術分野で公知の任意のＮＧＳシステムまたは方法、例えばＩｌｌｕｍｉｎａ  ＮＧＳなどであってもよい。
【０６３５】
一実施形態では、第２のコンストラクトは、再利用可能な、または可逆的なマーカーをコードする発現カセットを含む。再利用可能な、または可逆的なマーカーは、破壊ｎｅｏ−ｐｙｒＧ−ｎｅｏ発現カセットであり得る。ｎｅｏ−ｐｙｒＧ−ｎｅｏコンストラクトは、糸状菌宿主細胞（例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒ）のｕｒａ−株において、上記の実施形態で記載される第１のコンストラクトで共形質転換されてもよく、同核共存体の形質転換体は、上述した通りウラシル欠損培地で平板培養し、純粋な黄色のウラシル原栄養体を選択することによって選択することができる。その後、ｐｙｒＧ選択の使用は、前記同核共存体の形質転換体を５−ＦＯＡ含有培地で平板培養し、前記５−ＦＯＡ培地で増殖する形質転換体を選択することによって再生でき、これは、前記形質転換体が、ｐｙｒＧ遺伝子の切り出しを引き起こすｎｅｏリピート間の染色体内組換えを受けたことを示す。
【０６３６】
さらなる実施形態では、本明細書に提供される共形質転換を使用する代わりに、本開示の同核共存体のプロトプラスト精製スキームは、コンストラクトが除去または不活性化される標的遺伝子の配列を含むプロトプラストのゲノムの所望の遺伝子座に指向されるように、特異的な遺伝子の配列を含む欠失コンストラクトで糸状菌宿主細胞から生成したプロトプラストを形質転換することを伴う。特異的な遺伝子座に指向されるように、コンストラクトは、本明細書に記載のプロトプラストのゲノム中の所望の遺伝子座に相同なヌクレオチドに隣接する。このタイプのコンストラクト／形質転換の使用は、特定の遺伝子が特定の生化学的経路で果たす役割に関する情報を提供するのに使用することができる。一実施形態では、プロトプラストのゲノムへの欠失コンストラクトの正確な組込みの確認は、例えば次世代シーケンシング（ＮＧＳ）などを使用してプロトプラストのゲノムをシーケンシングすることによって確認される。使用されるＮＧＳシステムまたは方法は、当技術分野で公知の任意のＮＧＳシステムまたは方法、例えばＩｌｌｕｍｉｎａ  ＮＧＳなどであってもよい。図３９に、この実施形態の例を示す。１つの場合において、糸状菌宿主細胞は、ｐｙｒＧ陰性であり、欠失コンストラクトは、選択可能なマーカーの遺伝子（例えば、図３９ではｐｙｒＧ遺伝子）を含み、一方で標的遺伝子は、ＳＮＰである。よって、同核共存体のプロトプラスト形質転換体の精製は、前記形質転換体をウラシルを欠く最小培地で増殖させることを伴う。別の場合において、糸状菌宿主細胞は、ｐｙｒＧ陽性であり、欠失コンストラクトは、ＳＮＰを含み、一方で標的遺伝子は、選択可能なマーカーの遺伝子（例えば、図３９ではｐｙｒＧ遺伝子）である。よって、同核共存体のプロトプラスト形質転換体の精製は、前記形質転換体をＦＯＡを含む最小培地で増殖させることを伴う。
【０６３７】
さらに別の実施形態では、変異した遺伝子（例えば、ＳＮＰ）は、変異した遺伝子の複数の部分のそれぞれが別個のコンストラクトに存在するように、変異した遺伝子の複数の部分の形質転換および組込みにより多核体生物体（例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒなどの糸状菌）のゲノム中の標的遺伝子座に組み込まれる。複数のコンストラクトの組換えを促進して、生物体のゲノム中で変異した遺伝子の機能的なコピーを生じさせるために、複数のコンストラクトのそれぞれは、変異した遺伝子のユニークな部分に加えて、他の複数のコンストラクトの１つにも存在する変異した遺伝子のオーバーラップする部分を含んでいてもよい。生物体の所望の遺伝子座への変異した遺伝子の各部分の組込みを促進するために、複数のコンストラクトのそれぞれは、コンストラクト中で変異した遺伝子の一部と隣接する生物体のゲノム中の所望の遺伝子座に相同なヌクレオチドをさらに含んでいてもよい。一部の場合では、変異した遺伝子は、２つのコンストラクトにわたり分割され、２つのコンストラクトの２つの部分からなる形質転換により生物体に導入される。図３６に、この概念の一例を表示する。図３６の左側の列で示されるように、コンストラクトのそれぞれが、ｐｙｒＧのユニークな部分および他のコンストラクトとオーバーラップする部分を含むように、ｐｙｒＧマーカー遺伝子は２つのコンストラクトに分割される。さらに、各コンストラクトは、２つのコンストラクト中の相同配列の一部のそれぞれもＳＮＰを含有するように、宿主生物ゲノム中のａｙｇＡマーカー遺伝子に相同な配列をさらに含む。本明細書に提供される方法のいずれかを使用する形質転換後の２つのコンストラクトの組換えは、２つのＳＮＰを含むｐｙｒＧマーカー遺伝子全体の挿入をもたらす。全体的に組み込まれたｐｙｒＧマーカー遺伝子を含有する形質転換体およびループアウトによりｐｙｒＧマーカー遺伝子を失った形質転換体は、本明細書に記載の選択／対抗選択により検出することができる。特定には、ループアウトは、ＦＯＡを含む培地で形質転換体を増殖することによって選択することができる。
【０６３８】
図３７に、２つの部分からなる形質転換のさらなる例を例示する。図３７は、それぞれ単一の形質転換での変異およびスプリットマーカー遺伝子の一部（異なるｐｙｒＧ遺伝子）を含む２つの別個のコンストラクトの親のａｙｇＡ遺伝子への組込みによって、標的遺伝子（すなわち、ａｙｇＡ遺伝子）の複数の変異がプロトプラストのゲノムに導入される、真菌（例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒ）におけるコンビナトリアルＳＮＰＳＷＰの例を示す。図３７で示されるように、それぞれのｐｙｒＧ遺伝子を含有するコンストラクトのオーバーラップ部分間の、およびコンストラクト中のａｙｇＡ遺伝子の相同な部分と宿主ゲノムとの間の組換えが成功すると、ｐｙｒＧ遺伝子全体のそれぞれの発現は、グルコースによる異化産物の抑制によって制御することができる。よって、所望の組換えおよび組込み事象が起こった形質転換体の増殖が優先されるように、形質転換体をグルコースで増殖することによって、形質転換体を選択することができる。さらに、ループアウトは、ＦＯＡを含む培地で形質転換体を増殖することによって促進することができる。当業者が理解できるように、図３７に表示される概念は、変異（例えば、ＳＮＰ）の組合せを標的遺伝子に導入し、その後前記組合せの表現型の効果を試験するのに使用することができる。表現型の効果は、外因性タンパク質の所望の性質または活性の生成であってもよい。目的の性質または活性は、外因性タンパク質に関連した、任意の物理的、物理化学的、化学的、生物学的、もしくは触媒的な性質、またはこのような性質における任意の改善、増大、もしくは減少を意味する場合がある。表現型の効果はまた、１つまたは複数の代謝産物の産生の産生または損失でもあり得る。表現型の効果はまた、タンパク質または代謝産物の量の増大または減少でもあり得る。さらに、変異の特定の組合せを含有する株を構築するために、同様の技法を使用してさらなる変異を導入できることが企図される。
【０６３９】
図３６の中央および右側の列は、標的遺伝子における変異の標的化した組込みを用いて形質転換体を生成するための本明細書に提供される方法およびシステムに使用できる追加の手法を示す。一実施形態では、多核体生物体（例えば、糸状菌）の共形質転換は、宿主生物ゲノム中の所望の遺伝子座に相同な配列、変異（例えば、ＳＮＰ）を有する標的遺伝子、およびターミネーターリピート（例えば、ダイレクトリピート（ＤＲ））に隣接するマーカー遺伝子（例えば、ｐｙｒＧ）の一部を含む第１のコンストラクト、ならびに第１のコンストラクト上のマーカー遺伝子のオーバーラップする部分に加えて第２のターミネーターリピート（ＤＲ）に隣接するマーカー遺伝子の残り、および宿主生物ゲノム中の所望の遺伝子座に相同な配列を含む第２のコンストラクトを使用して実行される。コンストラクトの成功した組換えおよび所望の遺伝子座への組込みを含む形質転換体は、本明細書に提供される選択／対抗選択スキーム（例えば、図３６では、ａｙｇＡベースの選択およびｐｙｒＧ対抗選択の損失）のいずれかを使用して単離することができる。図３６の右側の列は、変異を有する標的遺伝子のコピーおよび１つまたは複数の選択可能なマーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子（ａｍｐＲ）および栄養要求性マーカー遺伝子（ｐｙｒＧ））を含むコンストラクトのループインシングルクロスオーバー事象を使用する標的遺伝子（例えば、ａｙｇＡ）中の変異（例えば、ＳＮＰ）の組込みの例を示す。
ライブラリー生成
【０６４０】
本開示のさらなる態様は、真菌変異体ライブラリーの構築およびスクリーニング、および本明細書に開示の方法によって調製された真菌変異体ライブラリーを含み得る。図５で示されるように、真菌ライブラリーは、真菌株を構築するためのプラットフォームに組み入れられていてもよい。ライブラリーは、当業者に公知の方法を使用する組込み形質転換の任意の手段を用いて、本開示に従って真菌宿主の形質転換により得ることができる。本明細書に提供される方法およびシステムを使用して生成された好ましい宿主株に基づく真菌のライブラリーは、小型化および／またはハイスループット様式のスクリーニング方法で操作され、外因性タンパク質の所望の性質または活性についてスクリーニングすることができる。目的の性質または活性は、ライブラリーメンバーの外因性タンパク質に関連した、任意の物理的、物理化学的、化学的、生物学的、もしくは触媒的な性質、またはこのような性質における任意の改善、増大、もしくは減少を意味する場合がある。またライブラリーは、外因性および／または内在性タンパク質の存在の結果として生じた代謝産物について、または代謝産物に関連した性質もしくは活性についてスクリーニングすることもできる。またライブラリーは、このようなタンパク質または代謝産物の量の増大または減少を生じさせる真菌についてスクリーニングすることもできる。
【０６４１】
一実施形態では、本明細書に提供される方法およびシステムは、複数のプロトプラストからの各プロトプラストが、複数の第１のコンストラクトからの単一の第１のコンストラクトおよび複数の第２のコンストラクトからの単一の第２のコンストラクトで形質転換されるように、複数のプロトプラストを生成する。この実施形態に加えて、複数の第１のコンストラクトからの各第１のコンストラクト中の第１のポリヌクレオチドは、異なる変異および／または遺伝子制御もしくは調節エレメントを含み、一方で複数の第２のコンストラクトからの各第２のコンストラクト中の第２のポリヌクレオチドが同一である。本方法は、ライブラリー中の各糸状菌細胞が、異なる変異および／または遺伝子制御もしくは調節エレメントを有する第１のポリヌクレオチドを含むように糸状菌細胞のライブラリーを生成するために、本明細書に記載の選択／対抗選択を２回またはそれより多くの回数使用して、同核共存体の形質転換体を形質転換および精製するステップをさらに含む。一実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、反復プロセスによってプロトプラスト再生のときに糸状菌細胞のライブラリーが生成されるように、標的糸状菌遺伝子または変異を含む異種遺伝子の配列を含み、その結果、ライブラリーの各メンバーが標的糸状菌遺伝子または別個の変異を有する異種遺伝子を含む。本明細書に記載の通り、宿主生物に導入されたときのコンストラクト間の相同組換えを促進するために、各コンストラクトが第１のポリヌクレオチドのオーバーラップする部分を含み得るように、第１のポリヌクレオチドは、１つより多くのコンストラクト間で分割されていてもよい。さらに、所望の遺伝子座への組み換えられた第１のポリヌクレオチドの組込みを促進するために、第１のポリヌクレオチドのオーバーラップする部分を含む各コンストラクトは、宿主ゲノム中の所望の遺伝子座に相同な配列をさらに含んでいてもよい。一実施形態では、変異は、ＳＮＰであり、本方法はそれによって、ＳＮＰＳｗａｐライブラリーを産生する。一実施形態では、標的糸状菌遺伝子は、クエン酸産生に関与する遺伝子であり、複数の第１のコンストラクトは、表４に提供されるＳＮＰのライブラリーである。別の実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、本明細書に記載される反復プロセスによってプロトプラスト再生のときに糸状菌細胞のライブラリーが生成されるように、遺伝子制御または調節エレメントに作動可能に連結した標的糸状菌遺伝子または異種遺伝子の配列を含み、その結果、ライブラリーの各メンバーが、別個の遺伝子制御または調節エレメントに作動可能に連結した標的糸状菌遺伝子または異種遺伝子を含む。一実施形態では、遺伝子制御または調節エレメントは、プロモーターであり、本方法はそれによって、プロモーターまたはＰＲＯライブラリーを産生する。一実施形態では、遺伝子制御または調節エレメントは、ターミネーターであり、本方法はそれによって、ターミネーターまたはＳＴＯＰライブラリーを産生する。プロモーターおよび／またはターミネーター配列は、本明細書に提供される方法およびシステムで使用される糸状菌宿主細胞における発現のための、本明細書に提供される、および／または当技術分野で公知のプロモーターまたはターミネーター配列であってもよい。一実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーターである。
【０６４２】
【表４−１】
2020524489.tif 000018
【表４−２】
2020524489.tif 000019
【実施例】
【０６４３】
以下の実施例は、本開示の様々な実施形態を例証するために提供するのであって、それらには、いかなる場合であっても、本開示を制限する意図はない。特許請求の範囲により定義される、本開示の精神の範囲内に包含されるその変化および他の使用は、当業者により認識される。
【０６４４】
簡潔な目次（すなわち表５）を、下記に提供するが、これはもっぱら、読者を支援するためである。この目次により、本出願の実施例または開示の範囲を制限する意図は全くない。
【表５−１】
2020524489.tif 000020
【表５−２】
2020524489.tif 000021
（実施例１）
糸状菌のＨＴＰゲノム操作：糸状菌プロトプラストの生成および貯蔵
プロトプラストの生成
【０６４５】
図２０Ａで示されるように、１００ミリリットルの完全培地に１０６分生子／ｍｌのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒを接種し、１５０ｒｐｍで、３０℃で一晩増殖させた。一晩増殖させた後、培養物をＭｉｒａｃｌｏｔｈに通過させて濾過することによって菌糸体を回収した。その後、菌糸体を滅菌水で徹底的に濯いだ。以下の実施例に記載される実験のために、Ａ．ｎｉｇｅｒの２つの株、Ａ．Ｎｉｇｅｒ株１０１５およびＡ．ｎｉｇｅｒ株１１４１４を使用した。次いで回収および洗浄した菌糸体をＶｉｎｏＴａｓｔｅ  Ｐｒｏ（ＶＴＰ）酵素カクテルでの酵素消化に供した。図４３に各株のフィーチャを表示する。
【０６４６】
Ａ．ｎｉｇｅｒ  株１０１５には、まずプロトプラスト形成緩衝液（１．２Ｍの硫酸マグネシウム、５０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ５）中の５０ｍｌの６０ｍｇ／ｍｌのＶＴＰを作製することによって、酵素消化を実行した。ＶＴＰを溶解させた後、緩衝液を清潔なＯａｋｒｉｄｇｅチューブに入れ、１５，０００×ｇで１５分間回転させた。次いで、遠心分離の後、溶液を濾過滅菌した。回収した菌糸体が作製されたら、その一部をＶＴＰ溶液に添加し、菌糸体を３０℃で、８０ｒｐｍで２〜４時間消化した。ＶＴＰ消化中に様々なインターバルで、少量の試料を４００×の倍率でプロトプラスト（すなわち、分生子より大きく浸透圧溶解を受けやすい大きく丸い細胞）の存在に関して検査した。菌糸体のほとんどまたはすべてが消化されたら、プロトプラストを含有する２５ｍｌの通過画分が２本の５０ｍｌファルコンチューブの１本に分けられるように、培養物を滅菌Ｍｉｒａｃｌｏｔｈに通過させて濾過した。２５ｍｌ試料のそれぞれに、５ｍｌの０．４ＭのＳＴ緩衝液（０．４Ｍのソルビトール、１００ｍＭのトリス、ｐＨ８）を穏やかに載せた。次いで載せた試料を、ＳＴ緩衝液と消化緩衝液との間に可視層を形成するために、８００×ｇで、４℃で１５分間回転させた。次いでプロトプラストをピペットで除去し、２５ｍｌのＳＴ溶液（１．０Ｍのソルビトール、５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０）とともに穏やかに混合し、８００×ｇで１０分間再び回転させた。プロトプラストは、チューブの底部にペレット化するはずである。次いでプロトプラストを２５ｍｌのＳＴ溶液に再懸濁し、８００×ｇで１０分間の遠心分離によって収集した。
【０６４７】
Ａ．ｎｉｇｅｒ  株１１４１４には、まずプロトプラスト形成緩衝液（０．６Ｍの硫酸アンモニウム、５０ｍＭのマレイン酸、ｐＨ５．５）中の４０ｍｌの３０ｍｇ／ｍｌのＶＴＰを作製することによって、酵素消化を実行した。回収した菌糸体のすべてをＶＴＰ溶液に添加し、菌糸体を３０℃で、７０ｒｐｍで３〜４時間消化した。ＶＴＰ消化中に様々なインターバルで、少量の試料を４００×の倍率でプロトプラストの存在に関して検査した。菌糸体のほとんどまたはすべてが消化されたら、培養物を滅菌Ｍｉｒａｃｌｏｔｈに通過させて濾過した。次いで濾液を８００×ｇで、４℃で１０分間回転させて、細胞をペレット化した。２５ｍｌのＳＴ溶液（１．０Ｍのソルビトール、５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０）を添加し、細胞を再懸濁し、再び回転させた。次いで細胞を１０ｍｌのＳＴＣ緩衝液（１．０Ｍのソルビトール、５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、５０ｍＭのＣａＣｌ２）中で洗浄し、８００×ｇで１０分間の遠心分離によって収集した。プロトプラスト（約１０８／ｍｌ）を計数し、１．２×１０７個／ｍｌになるように調整した。
【０６４８】
Ａ．ｎｉｇｅｒ株（すなわち、１０１５または１１４１４）のいずれかから生成したプロトプラストには、酵素消化の後、２０％ｖ／ｖの４０％ＰＥＧ溶液（ＳＴＣ緩衝液中の４０％ＰＥＧ−４０００））をプロトプラストに添加し、穏やかに混合し、続いて７％ｖ／ｖのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を添加して、８％ＰＥＧ／７％ＤＭＳＯ溶液を作製した。再懸濁の後、プロトプラストを、図２０Ａに表示したように自動化された液体ハンドラーを使用して９６ウェル（２５〜５０マイクロリットル）マイクロタイタープレートに分配し、続いて形質転換の前に少なくとも−８０℃で貯蔵した。
（実施例２）
糸状菌のＨＴＰゲノム操作：プロトプラストを生成するための代替方法
【０６４９】
図２７で示されるように、５００ミリリットルの完全培地に１０６分生子／ｍｌのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒを接種し、１５０ｒｐｍで、３０℃で一晩増殖させた。一晩増殖させた後、培養物をＭｉｒａｃｌｏｔｈに通過させて濾過することによって菌糸体を回収した。その後、菌糸体を滅菌水で徹底的に濯いだ。次いで回収および洗浄した菌糸体をＶｉｎｏＴａｓｔｅ  Ｐｒｏ（ＶＴＰ）酵素カクテルでの酵素消化に供した。
【０６５０】
まずプロトプラスト形成緩衝液（１．２Ｍの硫酸マグネシウム、５０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ５）中の５０ｍｌの６０ｍｇ／ｍｌのＶＴＰを作製することによって、酵素消化を実行した。ＶＴＰを溶解させた後、緩衝液を清潔なＯａｋｒｉｄｇｅチューブに入れ、１５，０００×ｇで１５分間回転させた。次いで、遠心分離の後、溶液を濾過滅菌した。回収した菌糸体が作製されたら、その一部をＶＴＰ溶液に添加し、菌糸体を３０℃で、８０ｒｐｍで２〜４時間消化した。ＶＴＰ消化中に様々なインターバルで、少量の試料を４００×の倍率でプロトプラスト（すなわち、分生子より大きく浸透圧溶解を受けやすい大きく丸い細胞）の存在に関して検査した。菌糸体のほとんどまたはすべてが消化されたら、培養物を滅菌Ｍｉｒａｃｌｏｔｈに通過させて濾過し、濾液をメスシリンダー中に収集した。濾過したプロトプラストをメスシリンダーに移し、より低い浸透圧調節物質濃度の緩衝液（５ｍｌの０．４ＭのＳＴ緩衝液（０．４Ｍのソルビトール、１００ｍＭのトリス、ｐＨ８）を穏やかに載せた。次いで載せた試料を、８００×ｇで、４℃で１５分間回転させ、次いでプロトプラストをピペットで除去し、２５ｍｌのＳＴ溶液（１．０Ｍのソルビトール、５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０）とともに穏やかに混合し、８００×ｇで１０分間再び回転させた。プロトプラストは、チューブの底部にペレット化するはずである。次いでプロトプラストを２５ｍｌのＳＴ溶液に再懸濁し、８００×ｇで１０分間の遠心分離によって収集した。
（実施例３）
糸状菌のＨＴＰゲノム操作：糸状菌プロトプラストの共形質転換の実証−原理の証明。
標的化ＤＮＡの調製
【０６５１】
図２０Ａ〜Ｃに表示された自動化された糸状菌の形質転換およびスクリーニング方法の概念の証明（ＰＯＣ）を提供する目的で、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ａｒｇＢ遺伝子のＤＮＡ配列を得て、適したリーディングフレームを決定した。次いでＳＮＰのセットを、Ａ．ｎｉｇｅｒ  ゲノムのａｒｇＢ遺伝子座への前記ＳＮＰのいずれかの組込みによってａｒｇＢ遺伝子のヌル変異が生じるように設計した。この設計を、ギブソンアセンブリーを使用してコンストラクトを構築するために使用したオリゴマーのセットを予測したｉｎ  ｓｉｌｉｃｏコンストラクトとして生成した。
プロトプラストの自動化された形質転換
【０６５２】
Ａ．ｎｉｇｅｒ  株１０１５に由来するプロトプラストを生成し、実施例１に記載されたように９６ウェルプレート中に貯蔵し（プロトプラスト１００マイクロリットル／ウェル）、次いでこれを自動化された液体ハンドラーを使用した伝統的なＰＥＧカルシウム媒介型形質転換に供して、９６ウェルプレート中で、ＳＮＰ  ＤＮＡコンストラクトをプロトプラスト−ＰＥＧ／ＤＭＳＯ混合物と合わせた。より具体的には、１００マイクロリットルのプロトプラストに、１〜１０マイクログラムのＳＮＰ  ＤＮＡコンストラクトを（１０マイクロリットルまたはそれ未満の体積で）添加し、混合物を氷上で１５分間インキュベートした。この混合物に、１ｍｌの４０％ＰＥＧを添加し、室温で１５分間インキュベートした。その後、１０ｍｌの最小培地と１Ｍのソルビトールを添加し、８０ｒｐｍで、３０℃で１時間振とうした。このインキュベーションの後、プロトプラストを８００×ｇで５分間遠沈させ、次いで１Ｍのソルビトールおよび０．８％寒天を含有する１２ｍｌの最小培地に再懸濁した。翌日、追加の自動化された液体ハンドリングステップを使用して、プロトプラストを、選択培地（すなわち、最小培地＋アルギニン）および非選択培地（すなわち、最小培地）上に蒔いた。自動化された形質転換プロトコールを用いて生成したプロトプラストの成功した形質転換は、アルギニン栄養要求性であるため、ＳＮＰコンストラクトによるａｒｇＢ遺伝子の標的化に起因してアルギニンを欠く最小培地では増殖しないと予想された。
【０６５３】
図２１で示されるように、形質転換体の約３％が、アルギニンを欠く最小培地における増殖の欠如によって証明された正確な（すなわち、ａｒｇＢ）遺伝子座での標的化ＤＮＡコンストラクトの組込みを示した。正確な遺伝子座におけるＳＮＰを含有するコンストラクトの組込みの確認は、次世代シーケンシングにより確認される。
（実施例４）
糸状菌のＨＴＰゲノム操作：糸状菌プロトプラストの共形質転換の実証-比色選択/対抗選択を使用する原理の証明。
【０６５４】
この実施例は、自動化された糸状菌細胞のＨＴＰ共形質転換の原理の追加の証明を実証し、さらに、所望の形質転換体を単離するための選択／対抗選択の使用を実証する。
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒプロトプラストの形成および形質転換
【０６５５】
真核生物の真菌株Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、ＡＴＣＣ１０１５のプロトプラストの大きな体積（５００ｍｌ）を、実施例１に記載されたように、ベータ−グルカナーゼ活性を含有する市販の酵素混合物を使用して生成した。実施例１に記載される方法によって、プロトプラストを、酵素混合物から遠心分離により単離し、最終的に、塩化カルシウムを含有する緩衝液中に再懸濁させた。
【０６５６】
実施例１に記載されたように、ジメチルスルホキシドおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の懸濁液を含有する容器中に、プロトプラストをアリコートし、−８０℃で凍結した。一部の実施形態では、本開示は、各ウェル中に２５〜５０マイクロリットルのプロトプラストを含有する９６ウェルマイクロタイタープレートのストックを、この技法を使用するゲノム編集の大規模なキャンペーンのための大きなバッチ中で調製し、凍結することができることを教示する。
【０６５７】
従来のＰＥＧカルシウム媒介型形質転換を、９６ウェル中でＤＮＡとプロトプラスト−ＰＥＧの混合物とを組み合わせる自動化された液体ハンドラーにより実施した。形質転換の後に、液体を取り扱う追加の自動化されたステップを使用して、選択培地上に形質転換体を蒔いた。
形質転換体の自動化されたスクリーニング
【０６５８】
下記でより詳細に論じるように、この実施例で使用された機能性のｐｙｒＧ遺伝子を欠いたＡ．ｎｉｇｅｒ細胞（すなわち、ｐｙｒＧ−）は、機能性のｐｙｒＧ遺伝子により形質転換した；このことにより、形質転換された細胞は、ウラシルの非存在下で成長することが可能であった。図２３Ａ〜Ｂで示されるように、この実施例のｐｙｒＧ遺伝子を、さらに設計して、Ａ．ｎｉｇｅｒの野生型ｍｅｔ３遺伝子の場所に組み入れ、したがって、天然に存在するｍｅｔ３遺伝子中に、変異を組み入れた。さらに、ｍｅｔ３遺伝子の破壊により、メチオニン栄養要求性である形質転換体がもたらされ、このことから、形質転換体を同定するための二次スクリーニングの方法も提供される。
【０６５９】
ウラシルを有さない選択培地上で成長させた形質転換体を単離し、第２のマイクロタイタープレートの個々のウェル中に入れた。第２のマイクロタイタープレート中の形質転換体を２〜３日間成長および胞子形成させた後、水および少量の洗剤からなる液体中に再懸濁させて、保存および下流の自動化されたスクリーニングに適切な胞子のストックを生成した。
【０６６０】
次いで、上記の胞子のストックのそれぞれの少量の一定分量を使用して、第３の９６ウェルＰＣＲプレート中の液体培地に播種した。これら少量の培養物を、据置型インキュベーター中で一晩成長させ、その結果、黄色色素を含有する胞子が出芽し、選択および下流のステップにより適している菌糸を形成する。
【０６６１】
培養するステップの後に、第３のＰＣＲプレートの菌糸を、市販の緩衝液を添加し、培養物を９９℃に２０分間加熱することによって溶解した。次いで、プレートを遠心分離して、ＤＮＡ懸濁液の上清を細胞／オルガネラのペレットから分離した。次いで、ＤＮＡ抽出物を使用して、ＰＣＲ分析を行って、所望のＤＮＡ改変を含む細胞株を同定した。
ＳＮＰの組込みのための共形質転換−ＳＮＰの設計
【０６６２】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ遺伝子ａｙｇＡのＤＮＡ配列を得、適切なリーディングフレームを決定した。４つの明確に異なるタイプの変異を設計し、これらは、組み込まれた場合には、ヌル変異という結果になった。
【０６６３】
変異は、停止コドンをインフレームに組み入れている単一の塩基対の変化；小さな、２つの塩基対の欠失：３つの塩基対の組込み；およびより大きな、１００個の塩基対の欠失を含んだ；これらはいずれも、適切に組み込まれた場合には、ａｙｇＡ活性を排除する。ａｙｇＡ活性を欠く株は、黄色胞子の表現型を有する。設計を、ギブソンアセンブリーを使用して構築物を構築するために使用したオリゴマーのセットを予測したｉｎ  ｓｉｌｉｃｏの構築物として生成した。
共形質転換によるＳＮＰの組込み
【０６６４】
上に記載した形質転換のアプローチを使用して、小さな変化を含有するアンプリコンを、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ株１０１５のゲノム中に組み入れた。これまでに論じたように、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒのこの株は、非機能的性のｐｙｒＧ遺伝子を含み、したがって、外因性ウラシルの非存在下で成長することは不可能であった。ｐｙｒＧ遺伝子の組込みに成功している細胞は、この時点では、ウラシルの非存在下で成長することが可能であった。これらのｐｙｒＧ＋形質転換体のうち、ａｙｇＡ遺伝子中に小さな変異もまた組み込んだ分離株は、黄色胞子の表現型を示した。（図２２および２３Ａを参照）。変異の存在はまた、ＳＮＰ交換について標的化される領域を含有する小さなアンプリコンのシーケンシングによっても検出された（図２３Ｂ）。
（実施例５）
糸状菌のＨＴＰゲノム操作：真核生物Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ＡＴＣＣ１１４１４におけるクエン酸産生を改善するためのＨＴＰ  ＳＮＰライブラリー株改良プログラムのインプリメンテーション
【０６６５】
上記の実施例３は、本開示の遺伝子操作技法をハイスループットの様式で自動化するための技法について記載した。この実施例は、上に記載した技法を、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ株ＡＴＣＣ１１４１４の特定のＨＴＰ株改良に適用する。
【０６６６】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒは、発酵によるクエン酸の大規模産生のために使用される、糸状菌の種である。この種の複数の株は、単離され、クエン酸および他の有機酸を産生する種々の能力を有することが示されている。クエン酸の産生を改善するために、本開示のＨＴＰ株操作法を使用して、原因となる対立遺伝子を組み合わせ、有害な対立遺伝子を排除することができる。
天然のＡ．ｎｉｇｅｒ株バリアントに由来するＳＮＰについての遺伝子設計ライブラリーの同定。
【０６６７】
２０世紀前半に、Ａ．ｎｉｇｅｒ株ＡＴＣＣ１０１５は、クエン酸の産生体であることが同定された。後に、ＡＴＣＣ１１４１４と名付けられた、この株の分離株は、その親に対して、クエン酸の収率の増加を示すことが見出された（図４３を参照）。例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒ株ＡＴＣＣ１０１５は、硝酸アンモニウムを含有するが、鉄カチオンおよびマンガンカチオンの両方を欠く培地中で、１４０グラムのグルコースから平均して７グラムのクエン酸を産生する。他方、分離株ＡＴＣＣ１１４１４は、同じ条件下で、収率の１０倍の増加を示す（７０グラムのクエン酸）。さらに、クエン酸産生培地中で、株ＡＴＣＣ１１４１４の胞子は、株１０１５の胞子よりも良好に出芽および成長する。
【０６６８】
表現型のこれらの差について潜在的な遺伝子源を同定するために、株ＡＴＣＣ１０１５および株ＡＴＣＣ１１４１４の両方のゲノムについて、シーケンシングおよび分析した。結果として得られた分析から、株１０１５と株１１４１４とを区別する４３個のＳＮＰ（すなわち、表４）を同定した。
原因となる対立遺伝子の交換
【０６６９】
実施例１に記載されたように、形質転換のためにプロトプラストを株ＡＴＣＣ１０１５（「基準株」）から調製した。次いで、本開示の遺伝子編集の技法により、上記で同定した４３個のＳＮＰのそれぞれを、基準株中に個々に導入した（図２４を参照）。各ＳＮＰを、上に記載した機能性のｐｙｒＧおよびａｙｇＡ遺伝子変異とともに共形質転換した。ａｙｇＡ遺伝子座への遺伝子の標的化に成功した形質転換体は、黄色の胞子をもたらした（図２４）。
成功した組込みについてのスクリーニング
【０６７０】
上述の通り、推定ＳＮＰを含有する形質転換体を単離し、胞子のストックを増殖させた。推定ＳＮＰを含有するＤＮＡ領域を含有するアンプリコンを、次世代シーケンシングにより分析した。このアプローチを使用すれば、親のＤＮＡの存在下であっても、各形質転換体内で、成功した組込みの事象を決定することが可能である。こうすることが可能であることは、同じ細胞中に異なる遺伝子型を有する核を含有する異核共存体として成長することができる真菌中で標的化を決定するのに必須である。
【０６７１】
所望のＳＮＰ変化の存在について、形質転換体をさらにバリデートした。分離株のおよそ３０％において、黄色胞子の表現型を有する共形質転換体はまた、クエン酸ＳＮＰの適切な組込みも含有した（図２５および２６）。
【０６７２】
次に、クエン酸産生に有益なＳＮＰを同定するために、創製したＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーを表現型によりスクリーニングする。この情報は、クエン酸の産生が増加するＡ．ｎｉｇｅｒ株を得るために、本明細書に記載するゲノム操作のＨＴＰ方法の状況で利用される。
（実施例６）
糸状菌のＨＴＰゲノム操作：異なる遺伝的バックグラウンドを有する糸状菌におけるＳＮＰを検出する次世代シーケンシング（ＮＧＳ）の能力の実証。
【０６７３】
この実施例は、標的遺伝子の親の株の特異的なバックグラウンドにおける標的遺伝子の変異を検出するために、どのようにＮＧＳを使用できるのかの例を実証する。
【０６７４】
配列ベースのスクリーニングの感度とそれに対する表現型スクリーニングの感度を試験するために、標的遺伝子（または試験ドメイン）において単一のＳＮＰが異なる一対の株を既知の比率で混合し、９６ウェルマイクロタイタープレート中で増殖させた。使用した株は、親の株（ｐｙｒＧ−、ｍｅｔ＋、（Ｐ））および変異体株（ｐｙｒＧ＋、ｍｅｔ−、（Ｍ））であった。親の株の胞子は、最小培地（ＭＭ）で増殖させると黒色または暗黒色に見えるが、変異体株胞子は、ＭＭで増殖させると黄色または明るい色に見える。試験したＰ：Ｍの比率は、１：０、１０：１、５：１、１：１、１：５、１：１０、および０：１）であった。図３３で示されるように、ウラシルが補充され（＋ＵＵ）メチオニンを欠く（−ｍｅｔ）ＭＭ上に蒔いたところ、親の胞子（Ｐ）のみが増殖し、それに対してｍｅｔを含み（＋ｍｅｔ）ウラシルを欠く（−ＵＵ）ＭＭでは変異体胞子（Ｍ）のみが増殖する。図３３および図３５上部のプレートから分かるように、＋ＵＵおよび＋ｍｅｔのＭＭ上に蒔いたところ、ＰおよびＭ胞子の両方が増殖し、その結果、最も低い比率（１：１０）のＰ／Ｍ胞子でさえも、最大の比率（１０：１）のＰ／Ｍ胞子と見た目に同一な黒色のコロニーを産生した。言い換えれば、ａｙｇＡ遺伝子（Ｍ胞子）における単一の塩基対変異は、黄色胞子の存在をもたらすが、親のａｙｇＡ遺伝子（Ｐ胞子）を含有するほんのわずかな核の存在が、黒色胞子を含有するコロニーをもたらす。よって、表現型スクリーニングによって、非選択培地上の少量の親の胞子を有するコロニーを、変異遺伝子を内包するとスコア付けすることは難しい。言い換えれば、親の遺伝子のほんの少数のコピーでさえも変異の存在をマスクすることから、糸状菌宿主において表現型スクリーニングの限界が強調される。
【０６７５】
表現型スクリーニングの限界に対処するために、図３３からの９６ウェルプレート中のウェルのそれぞれにＮＧＳシーケンシングを使用することにより、標的遺伝子変異の存在を評価した。ここで、図３３で使用される試験ドメインにおいて単一のＳＮＰが異なる対の株からの核酸は、本明細書に記載される沸騰調製方法を使用したものであった。複製プレートの各ウェルでＤＮＡ抽出が実行されるように、図３３のプレートから複製プレートが創製される９６ウェルマイクロタイタープレート様式でＤＮＡ抽出を実行し、その後単離されたＤＮＡを、自動化された液体ハンドリングシステム（例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｒａｖｏシステム）を使用して追加のマイクロタイタープレートに移し、各ウェルでＩｌｌｕｍｉｎａベースのシーケンシング（ＮＧＳシーケンシング）を実行した。図３４から分かるように、ＮＧＳシーケンシングは、親のおよび変異体ＤＮＡならびにそれらの混合物の存在を検出することができ、ＮＧＳデータは明確に同じ試料中の単一の塩基対変化の混合物を示した。図３３および３４の両方で実行された実験は、同核共存体のステータスを強制しない増殖条件を使用して実行されたことを考慮すると、データから、ＮＧＳシーケンシングは、特定の増殖条件下で、特定の株における特定のコンストラクトの形質転換／共形質転換の効率または頻度を評価するための株構築プロセス中の品質管理ステップとして利用できることが示された。言い換えれば、ＮＧＳは、特定の形質転換体の純度を評価または決定するのに使用することができる。一部の場合では、ＮＧＳは、選択／対抗選択が特定の形質転換体に必要かどうかを決定するのに使用することができる。
【０６７６】
選択スキーム後の変異体の標的遺伝子と親の標的遺伝子の存在、非存在またはパーセンテージを検出するＮＧＳの能力を評価するために、変異体または親の遺伝子型のいずれかについて同核共存体であるコロニーの存在を強制する条件下で、図３３に表示された実験からの親の、変異体の、および混合した変異体／親の胞子を増殖させた。より具体的には、混合された集団の一部を、親の遺伝子型または核にとって好ましい培地（すなわち、ウラシルが補充されメチオニンを欠く最小培地）で増殖させ、一方で混合された集団の一部を、変異体の遺伝子型または核にとって好ましい培地（すなわち、ウラシルが補充されメチオニンを欠く最小培地）で増殖させた。図３５から分かるように、選択培地は、ウラシルが補充されメチオニンを欠く最小培地で増殖させた場合は親の核、またはウラシルが補充されメチオニンを欠く最小培地で増殖させた場合は変異体の核のいずれかについて同核共存体のステータスに、核の混合された集団を強制した。さらに、この選択による同核共存体ステータスの強制は、ＮＧＳによって容易に検出された。ＮＧＳは、特定のタイプの核ならびにそれらの混合物について全体的に同核共存体である集団を容易に検出した。よって、特定の選択／対抗選択スキームの効能を評価するために、ＮＧＳを、本明細書に提供される株構築プロセス中に使用することができる。これは、特異的な変異の導入によって、見極め可能な表現型、またはより一層低いパーセンテージの親遺伝子型を含有する核によってマスクされる可能性がある表現型が生成されない場合、特に有用であり得る。またこの実施例は、導入されたＤＮＡ挿入断片について同核共存体の形質転換体、または導入されたＤＮＡ挿入断片を内包する核の閾値パーセンテージを有する形質転換体を単離するために、単独または表現型スクリーニングとの組合せのいずれかで形質転換体をスクリーニングするための方法としてのＮＧＳの有用性も示す。閾値パーセンテージは、前記形質転換体が所望のレベルの産物を産生するパーセンテージであり得る。産物は、当技術分野で公知の任意の産物であり得る。産物は、表２中の産物から選択することができる。閾値パーセンテージは、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％であり得る。
（実施例７）
糸状菌のＨＴＰゲノム操作：糸状菌におけるＳＮＰＳＷＰを検出する次世代シーケンシング（ＮＧＳ）の能力の実証。
【０６７７】
この実施例は、標的遺伝子の親の株の特異的なバックグラウンドにおける標的遺伝子の変異を検出するために、どのようにＮＧＳを使用できるのかの例を実証する。ＳＮＰスワッピングおよびスクリーニング方法に関するプロセス全体の一般的なスキームは、図２０Ｂ〜Ｃに見出すことができる。
【０６７８】
図３８で示されるように、ＮＧＳを使用するシーケンシングベースのスクリーニングの能力を試験して、同じ核における複数の組込み、異所性の組込みならびに／またはＳＮＰおよび非ＳＮＰの存在を検出するために、特異的なコンストラクトが相同組換えを介して宿主Ａ．ｎｉｇｅｒゲノムのａｙｇＡ遺伝子座に導入される３つの異なるシナリオが検査される。第１のシナリオでは、ｐｙｒＧマーカー遺伝子は、２つのコンストラクト間に分割されて、その結果、両方のコンストラクトにｐｙｒＧ遺伝子のオーバーラップする部分が存在する。第１のコンストラクトは、ｐｙｒＧ遺伝子に対して５’に存在する、宿主ゲノム中に存在するａｙｇＡ遺伝子に相同な配列をさらに含み、一方で第２のコンストラクトは、ｐｙｒＧ遺伝子の一部に対して３’に宿主ａｙｇＡ遺伝子の第２の部分に相同な配列をさらに含む。両方のコンストラクトにおいて、ａｙｇＡ遺伝子に相同な配列は、変異（すなわち、ＳＮＰ）をさらに含む。第２のシナリオは、第１のシナリオにおけるものと同様の２つのコンストラクトを利用するが、第２のコンストラクトのみが、ａｙｇＡ遺伝子に相同な配列に変異（すなわち、ＳＮＰ）を含む。最後に、第３のシナリオは、第２のシナリオで使用されるものと同様の２つのコンストラクトを利用するが、第１または第２のコンストラクトのどちらも、ａｙｇＡ遺伝子に相同な配列に変異（すなわち、ＳＮＰ）を含まない。
【０６７９】
実施例４に記載される方法を使用して、Ａ．ｎｉｇｅｒ宿主を培養し、Ａ．ｎｉｇｅｒのプロトプラストを生成し、コンストラクトのそれぞれをプロトプラストに形質転換する。形質転換後、形質転換体を、無傷のａｙｇＡ遺伝子（黒色胞子）の存在または無傷のａｙｇＡ遺伝子の損失（黄色胞子）について表現型でスクリーニングする。さらに、実施例６に記載されたように、形質転換体のそれぞれを複製プレート化し、複製プレートからのＤＮＡを抽出し、ＮＧＳを使用してスクリーニングする。図３８に、表現型および配列ベースのスクリーニングの両方について予想された結果を概要する。
（実施例８）
糸状菌のＨＴＰゲノム操作：スプリットマーカーループアウトを使用した糸状菌におけるＳＮＰＳＷＰの実証。
【０６８０】
この実施例は、図３〜４で示されるスプリットマーカーループアウト手順を使用した糸状菌細胞におけるＳＮＰＳＷＰ方法の原理の証明を実証する。ＳＮＰスワッピングおよびスクリーニング方法のためのプロセス全体の一般的なスキームは、図２０Ｂ〜Ｃに見出すことができる。
【０６８１】
実施例４および５において、糸状菌における標的化したＳＮＰＳＷＰは、ＤＮＡの２つの線形断片を使用した宿主の形質転換によって実行された。断片の１つに、ＤＮＡを取り込んだ細胞の単離を可能にする選択可能なマーカーを含有させた。第２の独立した断片に、所望の表現型への影響に関して試験される単一の塩基対変化を含有させた。この例では、２つの断片が使用されるが、これらの断片の両方は、マーカー遺伝子に隣接するＤＮＡのダイレクトリピート内にＳＮＰを含有する。各断片は、選択可能なマーカーの半分のみを含有する。断片が独立して組込みを行う場合、これらはマーカー遺伝子を再構成せず、形質転換体が生じない。マーカーが組み換えられて機能性の遺伝子を形成する場合、非相同末端結合によりそれが行われる。これが起こると、隣接配列が標的化した遺伝子座で適切に組込みされる可能性がより一層高くなる。マーカーが遺伝子座に組み込まれたら、ダイレクトリピートは、マーカー配列の損失をもたらす可能性がある不安定な組込みを提供する。マーカーを失った株は、その遺伝子にとって適した位置および環境中に所望のＳＮＰをあとに残す。最終的に、ＳＮＰが必須の遺伝子内であり、遺伝子の破壊が致死性であり得る場合、実施例４および５に記載される手法を使用することができる。実施例４および５の手法では、共形質転換の標的化効率は、５から１５％の間で変動し得る。対照的に、この実施例の方法は、マーカーはＳＮＰに連結されているため望ましい可能性があり、標的化効率は１００％に近い。
【０６８２】
この実施例の方法を実行するために、上記の実施例４に記載されたように、さらに図２０Ｂ〜Ｃに表示されたスキームに示されたように、１０１５親の株および１１４１４親の株からのＡ．ｎｉｇｅｒ宿主細胞を培養し、プロトプラストに変換し、形質転換した。この例では、図４６で示されるように、各親の株からのプロトプラストを、２つのコンストラクト（「スプリットマーカーコンストラクト」）で共形質転換した。この場合、２つのコンストラクトのそれぞれは、選択可能なマーカー（すなわち、図４５および４６ではｐｙｒＧ）のオーバーラップする部分を含有し、標的ＳＮＰを含むダイレクトリピート配列に隣接していた。スプリットマーカーコンストラクトを、図４５および４６に表示したように融合ＰＣＲを使用して生成し、図４６で示されるように断片分析器を使用して品質管理を行った（ＱＣした）。さらに、これらのコンストラクトのそれぞれは、宿主細胞ゲノムにおいて標的ＳＮＰへの組込みを指示するために、各コンストラクトのダイレクトリピート部分に隣接する配列を含有していた。正確な組込みを、本明細書に記載の通り配列ベースのスクリーニングを使用して形質転換体をスクリーニングすることによって評価した。
スプリットマーカー手法を使用する遺伝子操作
【０６８３】
スプリットマーカー媒介ＳＮＰ交換の最初のステップは、図２０Ｂでステップ１および２として示した通りであった。ステップ２では、形質転換するＤＮＡは、ＳＮＰを適した遺伝子座に標的化するための相同なＤＮＡに融合したマーカーの非相補的な半分を含有する２つの別個の線形断片からなる。形質転換体を選択培地上に配置し、増殖させた。ＤＮＡの安定な組込みを有する適切に補完された株は、コロニーを形成した。これらのコロニーを、手作業で、または自動化されたプラットフォームによってのいずれかで、１００〜２００マイクロリットルの選択的な寒天培地を含有するマイクロタイタープレート中の個々のウェルに精選した。ステップ４に示したように、精選した形質転換体を増殖させ、胞子を増殖させた。Ａ．ｎｉｇｅｒの胞子は単一核であり、本来的にクローン性である。形質転換された株を精製して、少数の胞子を取りそれらを再び選択培地上で平板培養することによって同核共存体（細胞中のすべての核が同一な遺伝子型を有する）を得た。このプロセスは、図２０Ｂにおいて矢印によって表される。集団を繰り返して減数して少数のクローン胞子にすることにより、各ウェル中に同核共存体を得た。次いでこれらのウェル中の精製した株を、選択可能なマーカーを含有する株にとって毒性の対抗選択物質を含有する培地に蒔いた。ＳＮＰを含有するダイレクトリピートに隣接するマーカーを取り込んだ株は、ダイレクトリピートのサイズに直接相関する頻度でそのマーカーを失った。例えば、１，００塩基対のダイレクトリピートは、１００塩基対のダイレクトリピートほど安定ではない。このループアウトフェーズは、図６０のステップ６である。図６０は、スプリットマーカーの組込みおよびループアウトを利用して実行されたＳＮＰＳＷＰキャンペーンからのデータを含有する。
結果
【０６８４】
この実施例では、１２００個を超える個々のループアウト試料をＮＧＳを使用してスクリーニングした。このセットから、１１９個の成功した株が生成され、そのウェルからのアンプリコンの１００％が産生株からのＳＮＰを含有していたため、これらは図６０の左上の隅にドットとして出現した。丸で囲んだ領域で示された試料は、この遺伝子座に所望のＳＮＰと生来の塩基対を有する両方のアンプリコンを含有していた。これらの株は、図２０Ｂのステップ４および５に提示されるように、胞子の増殖と継代を使用して同核共存体にされた可能性がある。ＱＣを通った１１９個の試料を、所望の株改良形質に対するこれらの影響について分析することができる。図６１に、様々なＳＮＰ位置にわたるＳＮＰ導入の成功率を示す。
（実施例９）
Ｃａｓ９リボ核酸タンパク質（ＲＮＰ）形質転換を使用する糸状菌の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）およびＨＲ媒介ゲノム編集は、所望の編集のための直接選択なしでＳＮＰ、挿入、およびインデルを可能にする。
【０６８５】
この実施例は、所望の編集についての直接選択を行わないＮＨＥＪに熟達したバックグラウンドにおける容易なゲノム編集の追加の手段を実証する。このような方法は、編集の選択または選択可能なマーカーのループアウトを行うことなくゲノム編集の迅速な創製を可能にすることから、ハイスループットゲノム編集に有用であり得る。
【０６８６】
ＡｙｇＡ遺伝子を標的化する２つのｃｒＲＮＡ配列を設計した。この遺伝子の破壊によりヌル変異が起こり、黒色の野生型胞子ではなく黄色色素を含有する胞子を生成する株が創製される。破壊は、ＮＨＥＪ媒介エラープローン修復によって、または遺伝子の翻訳を破壊する相同組換えドナーを提供することによって可能な場合がある。
【０６８７】
Ｃａｓ９  ＲＮＰのアセンブリー（図４７）。化学修飾されたｃｒＲＮＡ（表６を参照）およびｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｓｙｎｔｈｅｇｏから得た）を、ヌクレアーゼ非含有ＴＥ緩衝液で２５０ｐｍｏｌ／μＬにした。５μＬのｃｒＲＮＡ（２５０μＭ）および１０μＬのｔｒａｃｒＲＮＡ（２５０μＭ）を１０μＬの５×アニーリング緩衝液（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）とともに混合し、５０μＬのＨ２０に提供した。混合物を１０分間７８℃にし、次いで３０分間３７℃にすることによって、試料をアニールさせた。次いで試料をそのまま１５分かけて室温にした。１μＬの３．２２μｇ／μＬのＥｎＧｅｎ  Ｃａｓ９（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから得た）を、０．７ｕＬのＳＴＣ緩衝液（１．０Ｍのソルビトール、５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、５０ｍＭのＣａＣｌ２）中の１．５μＬのｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体（２５μＭ）と混合することによって、Ｃａｓ９  ＲＮＰを作製した。これは、１．８７５ｍｏｌのＲＮＡ複合体／１ｍｏｌのＣａｓ９の比率であり、１μｇ／μＬのＣａｓ９の総濃度であった。室温で１０分間のインキュベーションによって複合体が形成された。
【０６８８】
まずＳＴＣでＲＮＰ複合体の２倍希釈液を作製することによって、形質転換を実行した。次いで、１μＬのこの複合体（０．５ｕｇのＣａｓ９を含有）を、ＳＴＣ中合計１０μＬまでの５００ｎｇのＡＭＡ１オリジンとＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ由来のｐｙｒＧとを含有するベクターと混合した。このＲＮＰ混合物を添加し、１００μＬの調製された１０１５（ＰｙｒＧ−）（すなわちＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ１０１５株）の融解プロトプラストに混合し、実施例１で記載されるようにして凍結した。氷上でインキュベートした後、ＳＴＣ中で作製された１ｍＬの室温の４０％ＰＥＧ４０００をプロトプラストＲＮＰ混合物に添加し、これをボルテックスで混合し、室温で１５分間インキュベートした。次いでプロトプラストを、１２ｍＬの融解最小培地＋１Ｍのソルビトールおよび０．８％寒天と混合し、１０ｃｍのペトリ皿上に蒔いた。凝固した後、形質転換体を、追加の８ｍＬの融解最小培地＋１Ｍのソルビトールおよび０．８％寒天で覆った。形質転換体の１０倍希釈液も上記の通りに蒔いた（図４８）。
【０６８９】
【表６】
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【０６９０】
２つのｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体での共形質転換のために、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの対を別々にアニールし、別々にＣａｓ９複合体化した。複合体化の後、等量のｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡに複合体化したＣａｓ９を、形質転換の前に、一緒に混合した。
【０６９１】
相同組換え実験のために、ＰＣＲおよび精製によりｇＢｌｏｃｋを増幅することによってドナーを創製した。精製産物（８００ｎｇ）をＲＮＰおよびプラスミドに添加し、上記の通り形質転換した。ＲＮＰ切断は、ＤＮＡ修復機構を上方調節し、外因的に提供されたドナーでＨＲを刺激した。相同組換えドナー配列を、ａｙｇ．１ｃｒＲＮＡプロトスペーサー切断部位の周りにＡｙｇＡ遺伝子に対して相同性を有する４００〜５００ｂｐに隣接する変異した領域を含有するように設計した。配列は、この実験で使用した２つの相同なドナーを示す。ＤＪＶ＿０３＿ｐｙｒＧ＿ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ＿ｉｎ＿ＡｙｇＡは、ＡｙｇＡ遺伝子に対して相同性を有する５’および３’領域（大文字）に隣接するプロモーターおよびターミネーター（小文字）を有するｐｙｒＧを示す（図５１、配列番号９）。相同性領域は、ｃｒＲＮＡプロトスペーサーＡｙｇＡ．１の予測された切断部位に隣接する。ＤＪＶ＿０７＿４ｂｐ＿ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ＿ｉｎ＿ＡｙｇＡは、ＡｙｇＡ遺伝子に対して相同性を有する５’および３’領域（大文字）に隣接する４ｂｐの挿入部分（小文字）を含有する（図５２、配列番号１０）。
【０６９２】
表現型を、（１）コロニーを計数し、その後、分生子形成したコロニーの色をスコア付けすること、（２）分生子形成前にコロニーを精選し、次いで分生子形成後に個々の単離されたコロニーをスコア付けすること、または（３）形質転換の５〜７日後に個々の胞子を単離し、これらの胞子を出芽させ分生子形成させることによって決定した。図４９は、コロニーの計数および分生子における表現型の色変化のスコア付けの結果を示す。方法１を使用したところ、形質転換されたコロニーの３５〜４０％が黄色の分生子を産生したことが推定された。湿潤したチャンバー中で、定位のインキュベーターで３７℃で一晩、これらの３つの方法のうち１つにより２０μＬの酵母・カビ培地に胞子を接種することによって、遺伝子型を決定した。５０μＬのｐｒｅｐｍａｎ  ｕｌｔｒａ試料調製試薬を混合することによって培養物を溶解させ、混合物を９８℃で３０分間インキュベートし、続いて溶解産物を遠心分離してペレット化した。
【０６９３】
１つまたは複数の切断部位に隣接する領域を増幅し、サンガー化学法によってシーケンシングした（図４９Ｄおよび図４９Ｅ）。結果として生じるシーケンシングされたアンプリコンを使用して、黄色の分生子におけるＮＨＥＪ媒介インデルの存在を確認した。相同組換えに関して試験するために、ＰＣＲプライマーを、フォワードプライマーが修復断片に相同なゲノム領域の上流にアニールし、一方でリバースプライマーが修復断片に相同な領域内にアニールするように設計した。このＰＣＲスキームは、ゲノムＤＮＡのみ存在し、組み込まれなかったドナーが存在しないことが、ＡｙｇＡ遺伝子座でＰＣＲアンプリコンを生じさせることができることを確認する。相同組換えアッセイのために、ＣｅｌｌｅｎＯＮＥによりソートされた胞子を表現型解析し、その後遺伝子型解析した。ｐｙｒＧペイロードは、２６〜３６％の効率で挿入され、４ｂｐのペイロードは、８６％の効率で挿入された（図５０Ａ〜Ｃ）。
（実施例１０）
ＰＡＭ部位のスクランブル化なしで単一のＳＮＰを導入するためのＣａｓ９リボ核酸タンパク質（ＲＮＰ）形質転換を使用する糸状菌のＨＲ媒介ゲノム編集。
【０６９４】
この実施例は、ＰＡＭ部位のスクランブル化または変更を行うことなく、さらに、所望の編集についての直接の選択を行うことなく単一のＳＮＰを導入するのにＣａｓ９  ＲＮＰ複合体の形質転換を使用した、ＮＨＥＪに熟達したバックグラウンドにおける容易なゲノム編集の追加の手段を実証する。このような方法は、編集の選択または選択可能なマーカーのループアウトを行うことなくゲノム編集の迅速な創製を可能にすることから、ハイスループットゲノム編集に有用であり得る。
【０６９５】
０．２μｇのＥｎＧｅｎ  Ｃａｓ９（アニールしたＡｙｇ．１ｃｒ／ｔｒａｃＲＮＡに複合体化した）を、３５０ｎｇの二本鎖ＤＮＡドナーおよび２００ｎｇのＡＭＡ１オリジンとＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ由来のｐｙｒＧとを含有するベクターに混合して、ＳＴＣ緩衝液で４μＬにすることによって、形質転換を実行した。これを４０μＬのプロトプラストに添加し、実施例９の場合のように形質転換した。単一のナンセンス変異をコードする二本鎖ドナーＤＮＡは、５’および３’側でＡｙｇＡ遺伝子に対して相同性を有する５０ｂｐに隣接しており（図５６Ａを参照）、このドナーを、２つの相補的オリゴをアニールすることによって作製した。個々のコロニーを精選し、コロニーからの胞子を使用して、ゲノムＤＮＡを増殖させ、単離し、ＰＣＲで増幅した。単離された２４個のコロニーのうち２個が、黒色胞子と黄色胞子の混合物を含有し、２個が黄色胞子のみを含有し、２０個が黒色胞子のみを含有していた。２４個の配列のうち８個が、うまくＰＣＲで増幅され、シーケンシングされた。これらのなかでも、検査された８個の配列のうち３個が、追加の変異を含まずに、所望の変異を含有していた（図５６Ｂにおける実施例の野生型および変異体のトレースを参照）。配列の残りは野生型ＡｙｇＡ遺伝子であった。結果として、この実施例は、２つのアニールしたオリゴが、プロトスペーサー部位のＰＡＭまたはシード領域を変更することなくＳＮＰを創製できることを実証する。
（実施例１１）
クローン集団に形質転換された真菌株の大規模精製
【０６９６】
多くの糸状菌は、そのライフサイクル中に、栄養成長において個々の細胞中に複数の核が存在する状況が含まれる段階がある。これは、これらの生物体を遺伝的にマニピュレートすることが可能になるという結果をもたらす。所望の変異を含有しない核を避けて精製することによって、１つの核における任意の遺伝子変化をクローン性にしなければならない。これらの核を分離するための１つの方法は、結果として生じる胞子が、すべて同じ遺伝子型の核をほとんど含有しない無性生殖段階を生物体が経由するようにすることである。個々の胞子を分離することによって、これらの胞子から増殖される株は、所望の産生形質を含有することになる。この実施例は、高い忠実度およびハイスループットで、単一胞子、したがって標的変異を含有するクローン真菌株を単離する方法を記述する。本方法は、改善された真菌産生株の迅速な生成および精製を可能にする。
【０６９７】
従来、胞子精製は、選択培地を含有する個々のペトリプレート上に胞子を画線することによって実行することができる。この方法では、胞子懸濁液は、同じ菌糸体内の核の混合物を含有する各形質転換されたコロニーから作製することができる。胞子懸濁液を滅菌したループを使用して集め、次いで寒天プレートに、胞子が画線ごとに希釈されるように四分円に塗り広げることができる。結果として生じるプレートは数個の胞子を含有することになり、これを他のものすべてから分離し、次いでクローン個体として単離することができる。
【０６９８】
本明細書に記載の方法は、各形質転換につき個々のペトリプレート／皿を使用する必要をなくし、株を構築するためのマイクロタイタープレートの使用を促進する。ペトリ皿は大きく、自動化に適合しないため、ハイスループットに規模拡張する能力を制限する。最も重要なことに、本発明の方法は、ウェルの＞９７％でクローン集団を得ることができ、それに対して当技術分野で公知の伝統的な方法は、連続した継代（選択プロセスの繰り返しの適用、これは、非常に非効率的である可能性がある）の後でさえも、必然的にクローン集団が生じない場合がある。本明細書で詳述される手法では、個々のクローンの株は、ハイスループット自動化への単純な組込みを促進することができるさらなるスクリーニングのためのマイクロタイタープレートのウェルに配置される。本方法はまた、株構築の全体をマイクロタイター様式で行うことができるように、ペトリ皿でのコロニーの増殖を必要とすることなく形質転換体の単離を促進することもできる。当技術分野で公知の伝統的な方法とこの実施例に記載の方法とのワークフロー比較に関して、図５４Ａおよび５４Ｂを参照されたい。
【０６９９】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒまたは関連の真菌微生物は、目的の１種または複数の代謝産物、化学物質、または生物学的物質を生産することができる。形質転換プロトコールは、ドナーＤＮＡでのＡ．ｎｉｇｅｒ胞子の形質転換を要する。胞子は、ポアソン分布を介して、または単一細胞の分散に光学的に基づいて、マイクロタイタープレートにクローン的に単離／堆積される。
【０７００】
形質転換において、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒを蒔き、増殖させて、胞子形成させる。結果として生じる胞子を液体に懸濁し、希釈する。希釈は、２つのやり方のうち１つで実行される。
【０７０１】
第１のタイプの希釈において、胞子は、分散された体積中に存在する胞子が１つのみかまたはゼロであるポアソン分布に従う統計的確率が存在する濃度に希釈される。次いで胞子を、ＥＣＨＯ、ＢＩＯＳＰＯＴ、または他の液体ハンドリングデバイスを使用して、それらの出芽が可能なマイクロタイタープレートに分散する。一般にこの手法は、多くの空のウェルを生成することが可能であり、各ウェルが単一胞子を含有し、理想的には２つの胞子を含有するウェルはほとんどない。
【０７０２】
第２のタイプの希釈において、胞子は、それらを単一細胞として光学的に区別することができる濃度に希釈される。濃度は、分散に使用される機器に応じて異なっていてもよい。液体粒子中に単一細胞が存在することが光学的にバリデートされた後、その液体粒子をマイクロタイタープレートに分散する。分散された体積中に複数の胞子があるのか、または胞子がないのかによって、これらを、廃棄コレクションに入れたりまたは再び吸引したりすることができる。ポアソン分布の手法（上記の第１のタイプの希釈）と比較して、出力データの各ウェルがその中に単一細胞を有し、空のまたは２倍の胞子を有するウェルをより一層少なくすることを期待できる。
【０７０３】
第２のタイプの希釈のための機器としては、以下を挙げることができる。（１）ＣｅｌｌｅｎＯＮＥ機器、これは、単一胞子のみが、それらの出芽が可能なマイクロタイタープレートに分散されていることを視覚的に検証するために、マイクロフルイディクスを光学機械と併用する；（２）Ｂｅｒｋｅｌｅｙ  Ｌｉｇｈｔｓ  Ｂｅａｃｏｎ機器、これは、細胞または胞子をマイクロチャネルにフラッシングすることによって作動し、次いでレーザーを使用して、個々の細胞または胞子を、それらの増殖および複製が可能なマイクロホールディングペンに押し込む；（３）ＦＡＣＳ機器、これは、マイクロフルイディックフローチャネルを使用して、個々の細胞を蛍光を検出できる光学センサーに通過させ、これらの蛍光シグナルに基づいて細胞を出力ウェルにソートできる。残念なことに、現在のところ、唯一の市販されているＦＡＣＳ機械は、単一の源から複数の目的地に細胞をソートするか、または多くの源から選択して単一の目的地にソートするように設計されるかのいずれかに限定されている。多くの源から多くの目的地に細胞を容易にソートできる機械が開発されれば、ソートされる細胞が蛍光的に活性である必要がある（天然に、または遺伝子操作を介してのいずれかで）という最終的な必要条件で、この実施例に記載されるハイスループット用途のケースに適切であると予想される；（４）Ｃｙｔｅｎａ機器、これは、ＣｅｌｌｅｎＯＮＥ機器と同様の光学技術およびマイクロフルイディック技術を使用して作動するが、ハイスループット／プレートベースの入力に適合しない。これは、源の液体を保持するために使い捨てのカートリッジを使用するが、このようなカートリッジは、手作業で機械にボルト締めしなければならないことから、ＦＡＣＳ機械と同様のスループットの限界をもたらす。ＣｅｌｌｅｎＯＮＥは、高い忠実度で単一胞子を印刷することができる。図５５Ａ〜５５Ｃを参照されたい。
（実施例１２）
糸状菌のＨＴＰゲノム操作：糸状菌の形態に影響する遺伝子の同定
【０７０４】
この実施例は、真菌細胞の形態の制御において役割を果たす遺伝子を同定するための、糸状菌、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒでのＳＮＰＳＷＡＰ方法におけるＳＮＰスワップライブラリーの使用を実証する。特定には、この実施例は、Ａ．ｎｉｇｅｒ変異体株に菌糸体を形成しないペレット様の形態学的な表現型を付与する遺伝子群の同定を記述し、ここで細胞は、より密な、それほど細長くない表現型を維持し、各細胞は、液中での培養で増殖させた場合、複数の先端を有する。このタイプの増殖は、撹拌タンク発酵にとって好都合であり得る。
【０７０５】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒは、発酵によるクエン酸の大規模産生に使用される糸状菌の種である。この種の複数の株が単離され、クエン酸や他の有機酸を産生する様々な能力を有することが示されている。２０世紀前半に、Ａ．ｎｉｇｅｒ株ＡＴＣＣ１０１５は、クエン酸の産生体であることが同定された。後に、ＡＴＣＣ１１４１４と名付けられた、この株の分離株は、その親に対して、クエン酸の収率の増加を示すことが見出された。例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒ株ＡＴＣＣ１０１５は、硝酸アンモニウムを含有するが、鉄カチオンおよびマンガンカチオンの両方を欠く培地中で、１４０グラムのグルコースから平均して７グラムのクエン酸を産生する。他方、分離株ＡＴＣＣ１１４１４は、同じ条件下で、収率の１０倍の増加を示す（７０グラムのクエン酸）。さらに、クエン酸産生培地中で、株ＡＴＣＣ１１４１４の胞子は、株１０１５の胞子よりも良好に出芽および増殖する。
【０７０６】
表現型のこれらの差について潜在的な遺伝子源を同定するために、株ＡＴＣＣ１０１５および株ＡＴＣＣ１１４１４の両方のゲノムについて、シーケンシングおよび分析した。結果として得られた分析から、株１０１５と株１１４１４とを区別する４３個のＳＮＰ（表４を参照）を同定した。これらの４３個のＳＮＰのうち１８個が、これらそれぞれの遺伝子のコード化ドメイン中に見出された（表４を参照）。
【０７０７】
異なる培養条件下における糸状菌の形態／増殖の制御において潜在的な役割を果たす遺伝子を同定するために、本明細書に記載のＳＮＰスワッププロセスで表４からの４３個のＳＮＰを使用して、表４からのそれぞれ個々のＳＮＰを基準１０１５株に系統的に導入し、得られた親株と変異体株との間で形態学的な観点から表現型の差を検査した。逆に言えば、同じタイプのプロセスを１１４１４産生株で実行し、それにより、すでに１１４１４のゲノム中に存在する表４からのＳＮＰのそれぞれを各遺伝子の野生型バージョンで系統的に置き換え、親株と変異体株との間の形態における任意の得られた差を記録した。
プロトプラストを形質転換するためのコンストラクト
【０７０８】
この実施例では、各株（すなわち、１０１５および１１４１４）を２つのコンストラクト（「スプリットマーカーコンストラクト」）で共形質転換した。この場合、２つのコンストラクトのそれぞれは、選択可能なマーカー（すなわち、図４５および４６ではｐｙｒＧ）のオーバーラップする部分を含有し、図４５および４６で示されるようにダイレクトリピート配列に隣接していた。スプリットマーカーコンストラクトを融合ＰＣＲを使用して生成し、図４６で示されるように断片分析器を使用して品質管理を行った（ＱＣした）。さらに、これらのコンストラクトのそれぞれは、表４からの各ＳＮＰのそれぞれの標的遺伝子において宿主細胞ゲノムでの組込みを指示するために、各コンストラクトのダイレクトリピート部分に隣接する配列をさらに含んでいた。１０１５基準株プロトプラストの場合、スプリットコンストラクト中のダイレクトリピートは、表４からのＳＮＰの１つを含んでいた（図３を参照）。対照的に、１１４１４産生株プロトプラストの場合、ダイレクトリピートは、表４からのＳＮＰを含んでいなかった。
【０７０９】
本明細書に記載の通り、Ａ．ｎｉｇｅｒ基準株１０１５および産生株１１４１４を培養し、プロトプラストに変換し、形質転換し、スクリーニングした。要約すると、これらのステップのそれぞれは以下に従った。
プロトプラストの生成
【０７１０】
Ａ．ｎｉｇｅｒ１０１５基準株およびＡ．ｎｉｇｅｒ１１４１４産生株の両方について、５００ミリリットルの完全培地に１０６分生子／ｍｌを接種し、１５０ｒｐｍで、３０℃で一晩増殖させた。一晩増殖させた後、各培養物をＭｉｒａｃｌｏｔｈに通過させて濾過することによって、菌糸体を回収した。その後、菌糸体を滅菌水で徹底的に濯いだ。次いで両方の株から回収および洗浄した菌糸体を、それぞれ別々にＶｉｎｏＴａｓｔｅ  Ｐｒｏ（ＶＴＰ）酵素カクテルで酵素消化に供した。
【０７１１】
両方の株の菌糸体の酵素消化を、まず、５０ｍｌの、プロトプラスト形成緩衝液（１．２Ｍの硫酸マグネシウム、５０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ５）中６０ｍｇ／ｍｌのＶＴＰを作製することによって実行した。ＶＴＰを溶解させた後、緩衝液を清潔なＯａｋｒｉｄｇｅチューブに入れ、１５，０００×ｇで１５分間回転させた。次いで、遠心分離の後、溶液を濾過滅菌した。回収した菌糸体が作製されたら、その一部をＶＴＰ溶液に添加し、菌糸体を、３０℃で、８０ｒｐｍで約２〜４時間消化した。ＶＴＰ消化中に様々なインターバルで、少量の試料を４００×の倍率でプロトプラスト（すなわち、分生子より大きく浸透圧溶解を受けやすい大きく丸い細胞）の存在に関して検査した。各株につき菌糸体のほとんどまたはすべてが消化されたら、各株からの培養物を滅菌Ｍｉｒａｃｌｏｔｈに通過させて濾過し、濾液をメスシリンダー中に収集した。濾過したプロトプラストをメスシリンダーに移し、より低い浸透圧調節物質濃度の緩衝液（５ｍｌの０．４ＭのＳＴ緩衝液（０．４Ｍのソルビトール、１００ｍＭのトリス、ｐＨ８）を穏やかに載せた。次いで載せた試料を、８００×ｇで、４℃で１５分間回転させ、次いでプロトプラストをピペットで除去し、２５ｍｌのＳＴ溶液（１．０Ｍのソルビトール、５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０）とともに穏やかに混合し、８００×ｇで１０分間再び回転させた。プロトプラストは、チューブの底部にペレット化するはずである。次いで各株からのプロトプラストを、それぞれ別々に２５ｍｌのＳＴ溶液に再懸濁し、８００×ｇで１０分間の遠心分離によって収集した。
【０７１２】
プロトプラストの形質転換
【０７１３】
遠心分離の後、両方の株からのプロトプラストを最終的に塩化カルシウムを含有する緩衝液に再懸濁した。その後、両方の株からのプロトプラストを、自動化された液体ハンドラーを使用して伝統的なＰＥＧカルシウム媒介型形質転換に供することにより、９６ウェル中で、上述したスプリットコンストラクトからのＤＮＡをプロトプラスト−ＰＥＧ混合物と合わせた。
形質転換体についてのスクリーニング
【０７１４】
上述した通り、この実施例で利用されたスプリットマーカーコンストラクトは、ｐｙｒＧマーカー遺伝子に隣接するダイレクトリピートを含有しており、これをその後、マーカー遺伝子をループアウトするのに使用した。結果として、ループアウトコンストラクトを含有する株を、選択領域の欠失（例えば、図４５および図４を参照；ｐｙｒＧ遺伝子の非存在）について対抗選択した。正確な組込みをさらに、本明細書に記載の配列ベースのスクリーニングによって評価した。さらに、変異体株をＮＧＳを使用してスクリーニングして、本明細書に提供される形質転換体の同核共存体の性質を評価した。同核共存体または実質的に同核共存体の変異体株を、様々な補助物質含有（図６２および６３を参照）または非含有（図６４を参照）の最小培地に蒔いて、低いｐＨ（図６２）または浸透圧ストレス（図６３）下で増殖する、または胞子形成する（図６４）前記株の能力を評価した。さらに変異体株を、ＣＡＰ培地中での液中での培養物として増殖させて、液中での産生培地におけるこれらの表現型を評価した。
結果
【０７１５】
表４で共通のＳＮＰのうち４つの個々の基準Ａ．ｎｉｇｅｒ株１０１５への組込みは、形態学的な表現型を生成した。特定には、ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿９（配列番号１１）、ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１２（配列番号１２）、ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８（配列番号１３）またはＦｕｎｇｉＳＮＰ＿４０（配列番号１４）の１０１５ゲノムへの組込みが、液中での培養としてＣＡＰ培地中で増殖させた場合に菌糸体ではないペレット状の形態を生じた変異体株を生成した。
【０７１６】
真菌の形態への影響における４つのＳＮＰを含有する遺伝子の役割はさらに、これらの４つのＳＮＰのそれぞれを除去したところ、観察された形態学的な表現型を取り戻したというウェーブダウン実験で実証された。４つのＳＮＰの配列は、添付の配列表に見出すことができ、一方でこれらの推定上または公知のタンパク質機能は、表４に見出すことができる。
図６２で示されるように、基準のＳＮＰ１８を含有する株は、低いｐＨの培地でより速く増殖する。基準株における産生株（１１４１４）からのＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８の存在（すなわち、図６２では基準ｓｎｐ１８ｐｒｏｄ）は、基準（すなわち、図６２からの基準）と比較して、ｐＨ２培地での結果として生じるコロニーの放射状の増殖を低減した。対照的に、産生株（すなわち、図６２における産生ＳＮＰ１８Ｂａｓｅ）における基準株からのＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８の野生型バージョンの存在は、図６２からの基準株および産生株と比較して、前記株において放射状の増殖を許容した。さらに、産生株中に存在する他のＳＮＰも放射状の増殖を少なくすることに寄与するようである（図６２におけるｓｎｐ１８ｐｒｏｄより少ない産生を参照）。
図６３で示されるように、基準のＳＮＰ１８を含有する株（すなわち、ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８の野生型バージョン）が、浸透圧ストレスを付与する培地でより速く増殖する。基準株における産生株（１１４１４）からのＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８の存在（すなわち、図６３では基準ｓｎｐ１８ｐｒｏｄ）は、基準（すなわち、図６３からの基準）と比較して、浸透圧ストレス下での結果として生じるコロニーの放射状の増殖を低減した。対照的に、産生株における基準株からのＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８の野生型バージョン（すなわち、図６３では産生ＳＮＰ１８Ｂａｓｅ）の存在は、図６３からの基準株および産生株と比較して、前記株における放射状の増殖を許容した。さらに、産生株中に存在する他のＳＮＰも、放射状の増殖を少なくすることに寄与するようである（図６３における基準ｓｎｐ１８ｐｒｏｄよりより少ない産生を参照）。
【０７１７】
興味深いことに、ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿９、ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１２、またはＦｕｎｇｉＳＮＰ＿４０のそれぞれを含有する基準株は、液中での培養で増殖させなかった場合（例えば、プレート上）、正常に増殖し、正常に胞子を形成した。基準株（すなわち、１０１５）におけるＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８の発現は、図６４で示されるように、放射状の増殖速度（低減した）および胞子形成に対して効果を示さなかった。
（実施例１３）
糸状菌のＨＴＰゲノム操作：同定された遺伝子が糸状菌の形態において果たす役割の確認−同定された形態学的な対照遺伝子の欠失
【０７１８】
この実施例は、真菌の形態において役割を果たすとして実施例１２で同定された４つの遺伝子の役割の確認を実証する。特定には、この実施例は、Ａ．ｎｉｇｅｒ株１０１５および１１４１４において本明細書に記載のＨＴＰ方法を使用して４つの遺伝子のそれぞれをノックアウトするかまたは欠失させることを記述する。
【０７１９】
実施例１２に記載されたように、Ａ．ｎｉｇｅｒ基準株１０１５および産生株１１４１４を培養し、プロトプラストに変換し、形質転換し、スクリーニングした。
プロトプラストを形質転換するためのコンストラクト
【０７２０】
この実施例では、各株（すなわち、１０１５および１１４１４）からのプロトプラストを、一連の単一のコンストラクトで形質転換した。ここで一連のコンストラクトのそれぞれが、宿主細胞ゲノムへのマーカー遺伝子の組込みを指向するために、実施例１２で同定された４つの目的の遺伝子の１つに隣接するゲノム配列に相補的な配列に隣接する選択可能なマーカー遺伝子（すなわち、ｐｙｒＧ）を含有していた。図３９で示されるように、４つの遺伝子のうち１つの遺伝子座へのマーカー遺伝子の組込み（１０１５株における４つの野生型遺伝子のうちの１つ、および１１４１４株における４つのＳＮＰのうちの１つ）は本質的に、それぞれの株の遺伝子座から前記野生型遺伝子またはＳＮＰを含有する遺伝子を除去するのに役立った。
【０７２１】
増殖後、変異体株をＮＧＳを使用してスクリーニングして、本明細書に提供される形質転換体の同核共存体の性質を評価した。同核共存体または実質的に同核共存体の変異体株を培地に蒔き、前記株の胞子形成する能力を評価するか、またはＣＡＰ培地中で液中での培養物として増殖させて、液中での産生培地におけるこれらの表現型を評価した。
結果
【０７２２】
１０１５基準株ならびに１１４１４産生株からの４つの遺伝子のそれぞれの除去は、前記４つの遺伝子のそれぞれが真菌の形態への影響において明確に役割を果たすという実施例１２からの結果を確認した。特定には、実施例１２の場合のように、１０１５株におけるＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８を含有する遺伝子または１１４１４株におけるＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８を含有する遺伝子のＳＮＰを含有しないバージョンの除去は、液中での培養条件下で前記株がペレット様の形態を有するという最も印象的な表現型をもたらした。さらに、図６５で示されるように、ＦｕｎｇｉＳＮＰ１８およびＦｕｎｇｉＳＮＰ４０遺伝子の欠失は、すべての条件下で密な形態をもたらした。このデータは、ＳＮＰそのものより欠失表現型のほうがより顕著である（形態に対してより強い影響を有する）ことを考慮すれば、ＳＮＰは機能喪失型変異ではないことを示し得る。よって、これらの遺伝子の発現を変更することは、発酵槽での増殖にとって望ましい様式で形態に影響する可能性があるようである。
【０７２３】
興味深いことに、１０１５株におけるＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８を含有する遺伝子のＳＮＰを含有しないバージョンの欠失は、結果として生じるバリアント１０１５株において陰性の胞子形成表現型を生じ、その結果、前記バリアント１０１５株が胞子形成する能力を失った（図６６を参照）。この胞子形成の損失は、ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８遺伝子が除去された１１４１４株では観察されなかった。１１４１４および１０１５株の遺伝的バックグラウンドは、表４に存在するＳＮＰは別として同一であることを考慮すれば、これは、１１４１４の遺伝的バックグラウンドにおける表４からのＳＮＰの１つの、すべての、または一部の組合せの存在は、ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８が除去された場合に生じた陰性の胞子形成表現型を取り戻すのに十分であることを示唆した。言い換えれば、ＳＮＰ１８活性の非存在下で産生株における胞子形成を維持するように上位で作用する他の変異（ＳＮＰ）がある。
【０７２４】
注目すべきことに、胞子形成の損失は、それぞれＦｕｎｇｉＳＮＰ＿９、ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１２またはＦｕｎｇｉＳＮＰ＿４０を除去することによって産生されるバリアント１１４１４または１０１５株またはこれらのＳＮＰを含有しないバージョンのいずれでも観察されなかった。
【０７２５】
さらに注目すべきことに、この実施例において液中での培養条件下で観察された形態学的な表現型は、４つの遺伝子のそれぞれについて実施例１２でのものより印象的であったが、これは、成功した形質転換体が本質的に欠失表現型を示した実験設計に起因する可能性がある。さらに、１１４１４株における表現型もより顕著であったが、これは、１０１５基準株に対してこの株に存在する他のＳＮＰの１つまたは複数による表現型への寄与に起因する可能性がある。
（実施例１４）
糸状菌のＨＴＰゲノム操作：遺伝子発現を変更することによって糸状菌細胞の形態を変更すること
【０７２６】
この実施例は、糸状菌の形態の制御において役割を果たすと考えられる実施例１および２から同定されたＦｕｎｇｉＳＮＰ＿９、ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１２、ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８およびＦｕｎｇｉＳＮＰ＿４０遺伝子の発現をモジュレートする効果を試験するために、糸状菌細胞における自動化されたＨＴＰ  ＰＲＯＳＷＰ方法の使用を示すことによる糸状菌細胞における自動化されたＨＴＰ  ＰＲＯＳＷＰ方法の原理の証明として役立つ。
【０７２７】
この実施例では、本明細書に記載されるＰＲＯＳＷＰ方法を使用して、アノテートされた生来のプロモーターを表１からの４つのプロモーターのうちの１つで置き換えることによって、実施例１２および１３で同定されたＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８遺伝子（すなわち、配列番号１３）の発現を、Ａ．ｎｉｇｅｒ１０１５基準株およびＡ．ｎｉｇｅｒ１１４１４産生株の両方においてモジュレートした。より具体的には、各ＦｕｎｇｉＳＮＰに対して株（すなわち、１０１５親株または１１４１４親株）のそれぞれにつき、（４つの）バリアントまたは変異体株のセットを生成した。それにおいて、第１のバリアント株は、表１に記載されるｓｒｐ８ｐプロモーターの制御下に前記候補ＦｕｎｇｉＳＮＰ（ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿９（配列番号１１）；＿１２（配列番号１２）；＿１８（配列番号１３）；＿４０（配列番号１４））遺伝子を含む第１のコンストラクトを発現し、第２のバリアント株は、表１に記載されるａｍｙ８ｐプロモーターの制御下に前記候補ＦｕｎｇｉＳＮＰ遺伝子を有し、第３のバリアント株は、表１に記載されるｍａｎ８ｐプロモーターの制御下に前記候補ＦｕｎｇｉＳＮＰ遺伝子を有し、第４のバリアント株は、表１に記載されるｍｂｆＡｐプロモーターの制御下に前記候補ＦｕｎｇｉＳＮＰ遺伝子を有していた。バリアントを生成するのに使用されたコンストラクトのそれぞれは、候補ＦｕｎｇｉＳＮＰ遺伝子に隣接する配列、およびそれぞれの候補ＦｕｎｇｉＳＮＰの遺伝子座へのコンストラクトの組込みを指示するのに役立つプロモーターをさらに含んでいた。図６７に、この実施例で使用された２つの部分からなるコンストラクトの設計および組込みスキームの一般的な説明を示す。
【０７２８】
これらの生成の後、（４つの）バリアント株を生成するのに使用された各候補ＦｕｎｇｉＳＮＰの各コンストラクトを個々に、Ａ．ｎｉｇｅｒ１０１５基準株ならびにＡ．ｎｉｇｅｒ１１４１４産生株の両方につき生成されたプロトプラストに形質転換した。両方の株のプロトプラストを培養し、プロトプラストに変換し、形質転換し、スクリーニングして、上記の実施例に記載された表現型および／または配列ベースのスクリーニングを使用して実質的に同核共存体のプロトプラストについて選択した。よって、一般に図４０に表示したように、それぞれ個々のコンストラクトの形質転換は、各候補ＦｕｎｇｉＳＮＰに対する親の株のそれぞれにつき、４つのバリアントまたは変異体株の生成をもたらした。次いでこれらの株のそれぞれの形態学的な表現型を観察し、前記遺伝子のための生来のプロモーターの制御下に同定された遺伝子を含む変異体株の形態学的な表現型と比較した。次いで理想的なレベルの発現を、同定された遺伝子のそれぞれで決定した。
【０７２９】
結果
全体で表１からの異なるプロモーターを有する各形態制御遺伝子標的（すなわち、ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿９、＿１２、＿１８および＿４０）のプロモータースワッピングから、これらの遺伝子の発現の制御が形態に影響を与えたことが解明された（図６８を参照）。弱いｍａｎＢプロモーター下にＳＮＰ１８を含有する株は、他のプロモーターの組合せを含有する株より密なコロニーの形態を有していた。ＳＮＰ１８対照の影響は、低いｐＨ下より浸透圧ストレス下でより顕著であった。さらに、弱いｍａｎＢプロモーター下にＳＮＰ４０を含有する株は、試験したすべての増殖条件下で、他のプロモーターの組合せを含有する株より、コロニーの形態に強い効果を有していた。
【０７３０】
図６９で示されるように、表１からの異なるプロモーターを有する形態制御遺伝子標的１２（ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１２；配列番号１２）のプロモータースワッピングから、より低い強度のプロモーターは、菌糸に黄色色素をもたらし、一部変更された形態がコロニーの縁で観察されたことが解明された。黄色色素の存在から、バリアントまたは変異体株が代謝ストレスを経験することが示された。
【０７３１】
さらに、形態制御遺伝子標的１８（ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８；配列番号１３）の表１からの異なるプロモーターとのプロモータースワッピングから、２つのより弱いプロモーターでこの遺伝子の発現を制御することは、形態に影響を与えることが解明された（図５７、５８および７０を参照）。例えば、ｍａｎＢ融合およびａｍｙＢ融合を含有する株は複数の先端を有する表現型を保持したが、それに対して、より高い発現のｓｒｐＢおよびｍｂｆＡを有するものは、複数の先端を有する表現型を欠き、その代わりに異常な膨潤を示した（図５７を参照）。図５８の画像は、クエン酸産生培地中で３０℃で２４時間増殖した株の画像である。図５７の画像は、クエン酸産生培地中で３０℃で４８時間増殖した様々な非生来のプロモーター−ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８融合を発現する親１１４１４株ならびに１１４１４株の画像である。１６８時間そのままインキュベートしたところ、より高い発現のプロモーターを有する株ならびに親株対照はすべて、長い線維状の菌糸を含有していた。プロモーター融合、ａｍｙＢおよびｍａｎＢからのより低いレベルの発現を有する株は、ペレット化したままであった。注目すべきことに、図７０で示されるように、より弱いプロモーターによって駆動する場合、ＳＮＰ＿１８は、基準株において、産生株の場合より簡素な形態学的な表現型を有する。
【０７３２】
実施例１３からの欠失実験の結果と同様に、１０１５株におけるＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８遺伝子の発現の低減は、図５９で示されるように、胞子形成の損失を経験した細胞をもたらした。この胞子形成の損失は、１１４１４変異体株では観察されなかった。ここでも、１１４１４および１０１５株の遺伝的バックグラウンドが、表４に存在するＳＮＰは別として同一であることを考慮すれば、これは、１１４１４遺伝的バックグラウンドにおける表４からのＳＮＰの１つの、すべてのまたは一部の組合せの存在は、ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８の発現が低減した場合に生じた陰性の胞子形成表現型を取り戻すのに十分であることを示唆した。
【表７】
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【０７３３】
番号を付けた本開示の実施形態
本開示が企図する他の主題を、以下の番号を付けた実施形態において示す。
１．糸状菌株を産生するための方法であって、
ａ．）複数のプロトプラストを提供するステップであって、前記プロトプラストは、糸状菌細胞の培養物から調製されたものである、ステップ；
ｂ．）前記複数のプロトプラストを第１のコンストラクトおよび第２のコンストラクトで形質転換するステップであって、前記第１のコンストラクトは、前記プロトプラストのゲノム中の第１の遺伝子座に相同なヌクレオチドが両側に隣接している第１のポリヌクレオチドを含み、前記第２のコンストラクトは、前記プロトプラストのゲノム中の第２の遺伝子座に相同なヌクレオチドが両側に隣接している第２のポリヌクレオチドを含み、形質転換により、相同組換えによって前記第１の遺伝子座に前記第１のコンストラクトが組み込まれ、前記第２の遺伝子座に前記第２のコンストラクトが組み込まれ、少なくとも前記第２の遺伝子座は、前記プロトプラストのゲノム中の第１の選択可能なマーカー遺伝子であり、前記第１のポリヌクレオチドは、変異および／または遺伝子制御エレメントを含む、ステップ；
ｃ．）選択および対抗選択を実行することによって、同核共存体の形質転換体を精製するステップ；および
ｄ．）前記糸状菌細胞の再生を助長する培地中で、精製した形質転換体を増殖させるステップ
を含む、方法。
２．前記第１のコンストラクトが、コンストラクトＡおよびコンストラクトＢに分割され、コンストラクトＡは、前記第１のポリヌクレオチドの第１の部分と、前記第１のポリヌクレオチドの前記第１の部分の５’側に前記第１の遺伝子座に相同なヌクレオチドとを含み、コンストラクトＢは、前記第１のポリヌクレオチドの第２の部分と、前記第１のポリヌクレオチドの前記第２の部分の３’側に前記第１の遺伝子座に相同なヌクレオチドを含み、前記第１のポリヌクレオチドの前記第１の部分および前記第２の部分は、オーバーラップする相補的配列を含む、実施形態１に記載の方法。
３．前記第２のコンストラクトが、コンストラクトＡおよびコンストラクトＢに分割され、コンストラクトＡが、前記第２のポリヌクレオチドの第１の部分と、前記第２のポリヌクレオチドの前記第１の部分の５’側に前記第１の遺伝子座に相同なヌクレオチドとを含み、コンストラクトＢが、前記第２のポリヌクレオチドの第２の部分と、前記第２のポリヌクレオチドの前記第２の部分の３’側に前記第１の遺伝子座に相同なヌクレオチドを含み、前記第２のポリヌクレオチドの前記第１の部分および前記第２の部分が、オーバーラップする相補的配列を含む、実施形態１または２に記載の方法。
４．前記複数のプロトプラストからの各プロトプラストが、複数の第１のコンストラクトからの単一の第１のコンストラクトおよび複数の第２のコンストラクトからの単一の第２のコンストラクトで形質転換され、前記複数の第１のコンストラクトからの各第１のコンストラクト中の前記第１のポリヌクレオチドが、異なる変異および／または遺伝子制御エレメントを含み、前記複数の第２のコンストラクトからの各第２のコンストラクト中の前記第２のポリヌクレオチドが同一である、上記の実施形態のいずれか一つに記載の方法。
５．ステップａ〜ｄを繰り返して、糸状菌細胞のライブラリーを生成するステップをさらに含み、前記ライブラリー中の各糸状菌細胞は、異なる変異および／または遺伝子制御エレメントを有する第１のポリヌクレオチドを含む、実施形態４に記載の方法。
６．前記第１のポリヌクレオチドが、標的糸状菌遺伝子または異種遺伝子をコードする、上記の実施形態のいずれか一つに記載の方法。
７．前記変異が、一塩基多型である、上記の実施形態のいずれか一つに記載の方法。
８．前記遺伝子制御が、プロモーター配列および／またはターミネーター配列である、上記の実施形態のいずれか一つに記載の方法。
９．前記遺伝子制御エレメントが、プロモーター配列であり、前記プロモーター配列は、表１に列挙したプロモーター配列から選択される、上記の実施形態のいずれか一つに記載の方法。
１０．前記複数のプロトプラストが、マイクロタイタープレートのウェルに分配される、上記の実施形態のいずれか一つに記載の方法。
１１．ステップａ〜ｄが、マイクロタイタープレートのウェルで実行される、上記の実施形態のいずれか一つに記載の方法。
１２．前記マイクロタイタープレートが、９６ウェル、３８４ウェルまたは１５３６ウェルのマイクロタイタープレートである、実施形態１０または１１に記載の方法。
１３．前記糸状菌細胞が、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａの種、またはこれらのテレオモルフ、アナモルフ、シノニムもしくは分類学的均等物由来である、上記の実施形態のいずれか一つに記載の方法。
１４．前記糸状菌細胞が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ由来である、上記の実施形態のいずれか一つに記載の方法。
１５．前記糸状菌細胞が、菌糸体を形成しない表現型を有する、上記の実施形態のいずれか一つに記載の方法。
１６．前記糸状菌細胞が、非機能的な非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路を有する、上記の実施形態のいずれか一つに記載の方法。
１７．前記非機能的なＮＨＥＪ経路が、前記細胞を、抗体、化学的阻害剤、タンパク質阻害剤、物理的阻害剤、ペプチド阻害剤、または前記ＮＨＥＪ経路のコンポーネントに指向させたアンチセンスもしくはＲＮＡｉ分子に曝露することに起因する、実施形態１６に記載の方法。
１８．前記化学的阻害剤が、Ｗ−７である、実施形態１７に記載の方法。
１９．前記第１の遺伝子座が、前記標的糸状菌遺伝子のためのものである、実施形態６から１８のいずれか一つに記載の方法。
２０．前記第１の遺伝子座が、前記プロトプラストのゲノム中の第２の選択可能なマーカー遺伝子のためのものである、実施形態１から１８のいずれか一つに記載の方法。
２１．前記第２の選択可能なマーカー遺伝子が、栄養要求性マーカー遺伝子、発色性マーカー遺伝子、または指向性マーカー遺伝子である、実施形態２０に記載の方法。
２２．前記第１の選択可能なマーカー遺伝子が、栄養要求性マーカー遺伝子、発色性マーカー遺伝子、または指向性マーカー遺伝子である、上記の実施形態のいずれか一つに記載の方法。
２３．前記第２のポリヌクレオチドが、栄養要求性マーカー遺伝子、指向性マーカー遺伝子、または抗生物質耐性遺伝子である、上記の実施形態のいずれか一つに記載の方法。
２４．前記発色性マーカー遺伝子が、ａｙｇＡ遺伝子である、実施形態２１または２２に記載の方法。
２５．前記栄養要求性マーカー遺伝子が、ａｒｇＢ遺伝子、ｔｒｐＣ遺伝子、ｐｙｒＧ遺伝子、またはｍｅｔ３遺伝子である、実施形態２１から２３のいずれか一つに記載の方法。
２６．前記指向性マーカー遺伝子が、アセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）遺伝子、硝酸レダクターゼ遺伝子（ｎｉａＤ）、または硫酸パーミアーゼ（ＳｕｔＢ）遺伝子である、実施形態２１から２３のいずれか一つに記載の方法。
２７．前記抗生物質耐性遺伝子が、ｂｌｅ遺伝子であり、前記ｂｌｅ遺伝子は、フレオマイシンに対する耐性を付与する、実施形態２３に記載の方法。
２８．前記第１の選択可能なマーカー遺伝子が、ａｙｇＡ遺伝子であり、前記第２のポリヌクレオチドが、ｐｙｒＧ遺伝子である、実施形態１９に記載の方法。
２９．前記第１の選択可能なマーカー遺伝子が、ｍｅｔ３遺伝子であり、前記第２の選択可能なマーカー遺伝子が、ａｙｇＡ遺伝子であり、前記第２のポリヌクレオチドが、ｐｙｒＧ遺伝子である、実施形態２０から２７のいずれか一つに記載の方法。
３０．前記複数のプロトプラストが、前記糸状菌細胞の培養物中の前記糸状菌細胞から細胞壁を除去すること；前記複数のプロトプラストを単離すること；および単離された前記複数のプロトプラストを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む混合物中に再懸濁することによって調製され、ＤＭＳＯの最終濃度は、７％ｖ／ｖまたはそれ未満である、上記の実施形態のいずれか一つに記載の方法。
３１．前記混合物が、ステップａ〜ｄを実行する前に、少なくとも−２０℃または−８０℃で貯蔵される、実施形態３０に記載の方法。
３２．前記培養物が、少なくとも１リットルの体積である、実施形態３０から３１のいずれか一つに記載の方法。
３３．前記培養物が、前記プロトプラストの調製の前に、少なくとも１２時間増殖される、実施形態３０から３１のいずれか一つに記載の方法。
３４．前記プロトプラストの少なくとも７０％がより小さくなり、より少ない核を含有するような条件下で、真菌培養物が増殖される、実施形態３０から３３のいずれか一つに記載の方法。
３５．前記細胞壁を除去することが、酵素消化によって実行される、実施形態３０から３４のいずれか一つに記載の方法。
３６．前記酵素消化が、ベータ−グルカナーゼおよびポリガラクツロナーゼを含む酵素の混合物を用いて実行される、実施形態３５に記載の方法。
３７．前記プロトプラストを貯蔵する前に、前記ＤＭＳＯを含む混合物に、４０％ｖ／ｖのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を添加することをさらに含む、実施形態３０から３６のいずれか一つに記載の方法。
３８．前記ＰＥＧが、８％ｖ／ｖまたはそれ未満の最終濃度まで添加される、実施形態３７に記載の方法。
３９．ステップａ〜ｄが、自動化されている、上記の実施形態のいずれか一つに記載の方法。
４０．貯蔵のための糸状菌細胞を調製するための方法であって、
糸状菌細胞を含む真菌培養物からプロトプラストを調製するステップであって、前記真菌培養物中の前記糸状菌細胞から細胞壁を除去することを含む、ステップ；
前記プロトプラストを単離するステップ；および
単離された前記プロトプラストを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を７％ｖ／ｖまたはそれ未満の最終濃度で含む混合物中に再懸濁するステップ
を含む、方法。
４１．前記混合物が、少なくとも−２０℃または−８０℃で貯蔵される、実施形態４０に記載の方法。
４２．前記真菌培養物が、少なくとも１リットルの体積である、実施形態４０から４１のいずれか一つに記載の方法。
４３．前記真菌培養物が、前記プロトプラストの調製の前に、少なくとも１２時間増殖される、実施形態４０から４２のいずれかに記載の方法。
４４．前記プロトプラストの少なくとも７０％がより小さくなり、より少ない核を有するような条件下で、前記真菌培養物が増殖される、実施形態４０から４３のいずれか一つに記載の方法。
４５．前記細胞壁を除去することが、酵素消化によって実行される、実施形態４０から４４のいずれか一つに記載の方法。
４６．前記酵素消化が、ベータ−グルカナーゼおよびポリガラクツロナーゼを含む酵素の混合物を用いて実行される、実施形態４５に記載の方法。
４７．前記プロトプラストを貯蔵する前に、前記ＤＭＳＯを含む混合物に、４０％ｖ／ｖのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を添加することをさらに含む、実施形態４０から４６のいずれか一つに記載の方法。
４８．前記ＰＥＧが、８％ｖ／ｖまたはそれ未満の最終濃度まで添加される、実施形態４７に記載の方法。
４９．前記プロトプラストを貯蔵する前に、前記プロトプラストをマイクロタイタープレートに分配するステップをさらに含む、実施形態４０から４８のいずれか一つに記載の方法。
５０．前記真菌培養物中の前記糸状菌細胞が、菌糸体を形成しない表現型を有する、実施形態４０から４９のいずれか一つに記載の方法。
５１．前記真菌培養物中の前記糸状菌細胞が、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａの種、またはこれらのテレオモルフもしくはアナモルフ、およびシノニムもしくは分類学的均等物から選択される、実施形態４０から５０のいずれか一つに記載の方法。
５２．前記真菌培養物中の前記糸状菌細胞が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒまたはそのテレオモルフもしくはアナモルフである、実施形態５０に記載の方法。
５３．真菌産生株を生成するためのシステムであって、
１つまたは複数のプロセッサー；および
前記１つまたは複数のプロセッサーの少なくとも１つに作動可能にカップリングされている１つまたは複数のメモリーであって、前記１つまたは複数のプロセッサーの少なくとも１つによって実行されるときに、前記システムに、
ａ．）糸状菌細胞の培養物から得られた複数のプロトプラストを第１のコンストラクトおよび第２のコンストラクトで形質転換するステップであって、前記第１のコンストラクトは、前記プロトプラストのゲノム中の第１の遺伝子座に相同なヌクレオチドが両側に隣接している第１のポリヌクレオチドを含み、前記第２のコンストラクトは、前記プロトプラストのゲノム中の第２の遺伝子座に相同なヌクレオチドが両側に隣接している第２のポリヌクレオチドを含み、形質転換により、相同組換えによって前記第１の遺伝子座に前記第１のコンストラクトが組み込まれ、前記第２の遺伝子座に第２のコンストラクトが組み込まれ、少なくとも前記第２の遺伝子座は、前記プロトプラストのゲノム中の第１の選択可能なマーカー遺伝子であり、前記第１のポリヌクレオチドは、変異および／または遺伝子制御エレメントを含む、ステップ；
ｂ．）選択および対抗選択を実行することによって、同核共存体の形質転換体を精製するステップ；および
ｃ．）前記糸状菌細胞の再生を助長する培地中で、精製した形質転換体を増殖させるステップ
を行わせる命令が記憶されている、メモリー
を含む、システム。
５４．前記第１のコンストラクトが、コンストラクトＡおよびコンストラクトＢに分割され、コンストラクトＡは、前記第１のポリヌクレオチドの第１の部分と、前記第１のポリヌクレオチドの前記第１の部分の５’側に前記第１の遺伝子座に相同なヌクレオチドとを含み、コンストラクトＢは、前記第１のポリヌクレオチドの第２の部分と、前記第１のポリヌクレオチドの前記第２の部分の３’側に前記第１の遺伝子座に相同なヌクレオチドとを含み、前記第１のポリヌクレオチドの前記第１の部分および前記第２の部分は、オーバーラップする相補的配列を含む、実施形態５３に記載の方法。
５５．前記第２のコンストラクトが、コンストラクトＡおよびコンストラクトＢに分割され、コンストラクトＡは、前記第２のポリヌクレオチドの第１の部分と、前記第２のポリヌクレオチドの前記第１の部分の５’側に前記第１の遺伝子座に相同なヌクレオチドを含み、コンストラクトＢが、前記第２のポリヌクレオチドの第２の部分と、前記第２のポリヌクレオチドの前記第２の部分の３’側に前記第１の遺伝子座に相同なヌクレオチドを含み、前記第２のポリヌクレオチドの前記第１の部分および前記第２の部分が、オーバーラップする相補的配列を含む、実施形態５３または５４に記載の方法。
５６．前記複数のプロトプラストからの各プロトプラストが、複数の第１のコンストラクトからの単一の第１のコンストラクトおよび複数の第２のコンストラクトからの単一の第２のコンストラクトで形質転換され、前記複数の第１のコンストラクトからの各第１のコンストラクト中の前記第１のポリヌクレオチドが、異なる変異および／または遺伝子制御エレメントを含み、前記複数の第２のコンストラクトからの各第２のコンストラクト中の前記第２のポリヌクレオチドが同一である、実施形態５３から５５のいずれか一つに記載のシステム。
５７．ステップａ〜ｃを繰り返して、糸状菌細胞のライブラリーを生成する命令をさらに含み、前記ライブラリー中の各糸状菌細胞は、異なる変異および／または遺伝子制御エレメントを有する第１のポリヌクレオチドを含む、実施形態５３から５６のいずれか一つに記載のシステム。
５８．前記変異が、一塩基多型である、実施形態５３から５７のいずれか一つに記載のシステム。
５９．前記遺伝子制御エレメントが、プロモーター配列および／またはターミネーター配列である、実施形態５３から５８のいずれか一つに記載のシステム。
６０．前記遺伝子制御エレメントが、プロモーター配列であり、前記プロモーター配列は、表１に列挙したプロモーター配列から選択される、実施形態５３から５８のいずれか一つに記載のシステム。
６１．ステップａ〜ｃが、マイクロタイタープレートのウェルで実行される、実施形態５３から６０のいずれか一つに記載のシステム。
６２．前記マイクロタイタープレートが、９６ウェル、３８４ウェルまたは１５３６ウェルのマイクロタイタープレートである、実施形態６１に記載のシステム。
６３．前記糸状菌細胞が、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａの種、またはこれらのテレオモルフもしくはアナモルフ、およびシノニムもしくは分類学的均等物から選択される、実施形態５３から６２に記載のシステム。
６４．前記糸状菌細胞が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒである、実施形態５３から６２に記載のシステム。
６５．前記糸状菌細胞が、菌糸体を形成しない表現型を有する、実施形態５３から６４のいずれか一つに記載のシステム。
６６．前記糸状菌細胞が、非機能的な非相同末端結合経路を有する、実施形態５３から６５のいずれか一つに記載のシステム。
６７．前記細胞を、抗体、化学的阻害剤、タンパク質阻害剤、物理的阻害剤、ペプチド阻害剤、または前記ＮＨＥＪ経路のコンポーネントに指向させたアンチセンスもしくはＲＮＡｉ分子に曝露することによって、前記ＮＨＥＪ経路が非機能的になる、実施形態６６に記載のシステム。
６８．前記化学的阻害剤が、Ｗ−７である、実施形態６７に記載のシステム。
６９．前記第１の遺伝子座が、標的糸状菌遺伝子のためのものである、実施形態５３から６８のいずれか一つに記載のシステム。
７０．前記第１の遺伝子座が、前記プロトプラストのゲノム中の第２の選択可能なマーカー遺伝子のためのものである、実施形態５３から６８に記載のシステム。
７１．前記第２の選択可能なマーカー遺伝子が、栄養要求性マーカー遺伝子、発色性マーカー遺伝子または指向性マーカー遺伝子から選択される、実施形態７０に記載のシステム。
７２．前記第１の選択可能なマーカー遺伝子が、栄養要求性マーカー遺伝子、発色性マーカー遺伝子または指向性マーカー遺伝子から選択される、実施形態５３から７１のいずれかに記載のシステム。
７３．前記第２のポリヌクレオチドが、栄養要求性マーカー遺伝子、指向性マーカー遺伝子または抗生物質耐性遺伝子から選択される、実施形態５３から７２のいずれか一つに記載のシステム。
７４．前記発色性マーカー遺伝子が、ａｙｇＡ遺伝子である、実施形態７１または７２に記載のシステム。
７５．前記栄養要求性マーカー遺伝子が、ａｒｇＢ遺伝子、ｔｒｐＣ遺伝子、ｐｙｒＧ遺伝子、またはｍｅｔ３遺伝子から選択される、実施形態７１から７３のいずれか一つに記載のシステム。
７６．前記指向性マーカー遺伝子が、アセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）遺伝子、硝酸レダクターゼ遺伝子（ｎｌａＤ）、または硫酸パーミアーゼ（ＳｕｔＢ）遺伝子から選択される、実施形態７１から７３のいずれか一つに記載のシステム。
７７．前記抗生物質耐性遺伝子が、ｂｌｅ遺伝子であり、前記ｂｌｅ遺伝子は、フレオマイシンに対する耐性を付与する、実施形態７３に記載のシステム。
７８．前記第１の選択可能なマーカー遺伝子が、ａｙｇＡ遺伝子であり、前記第２のポリヌクレオチドが、ｐｙｒＧ遺伝子である、実施形態６９に記載のシステム。
７９．前記第１の選択可能なマーカー遺伝子が、ｍｅｔ３遺伝子であり、前記第２の選択可能なマーカー遺伝子が、ａｙｇＡ遺伝子であり、前記第２のポリヌクレオチドが、ｐｙｒＧ遺伝子である、実施形態５３から６８のいずれか一つに記載のシステム。
８０．前記複数のプロトプラストが、前記糸状菌細胞の培養物中の前記糸状菌細胞から細胞壁を除去すること；前記複数のプロトプラストを単離すること；および
単離された前記複数のプロトプラストを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を７％ｖ／ｖまたはそれ未満の最終濃度で含む混合物中に再懸濁すること
によって調製される、実施形態５３から７９のいずれか一つに記載のシステム。
８１．前記混合物が、ステップａ〜ｃを実行する前に、少なくとも−２０℃または−８０℃で貯蔵される、実施形態８０に記載のシステム。
８２．前記培養物が、少なくとも１リットルの体積である、実施形態８０から８１のいずれか一つに記載のシステム。
８３．前記培養物が、前記プロトプラストの調製の前に、少なくとも１２時間増殖される、実施形態８０から８２のいずれか一つに記載のシステム。
８４．前記プロトプラストの少なくとも７０％がより小さくなり、より少ない核を有するような条件下で、真菌培養物が増殖される、実施形態８０から８３のいずれか一つに記載のシステム。
８５．前記細胞壁を除去することが、酵素消化によって実行される、実施形態８０から８３のいずれか一つに記載のシステム。
８６．前記酵素消化が、ベータ−グルカナーゼおよびポリガラクツロナーゼを含む酵素の混合物を用いて実行される、実施形態８５に記載のシステム。
８７．前記プロトプラストを貯蔵する前に、前記ＤＭＳＯを含む混合物に、４０％ｖ／ｖのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を添加することをさらに含む、実施形態５３から８６のいずれか一つに記載のシステム。
８８．前記ＰＥＧが、８％ｖ／ｖまたはそれ未満の最終濃度まで添加される、実施形態８７に記載のシステム。
８９．所望の表現型を獲得するために糸状菌を進化させるゲノム操作のハイスループット（ＨＴＰ）方法であって、
ａ．同じゲノム株バックグラウンドを有する最初の複数の糸状菌微生物のゲノムを撹乱することによって、ユニークな遺伝的バリエーションを有する個々の糸状菌株を含む最初のＨＴＰ遺伝子設計糸状菌株ライブラリーを生み出すステップ；
ｂ．前記最初のＨＴＰ遺伝子設計糸状菌株ライブラリーの個々の株を、前記所望の表現型についてスクリーニングおよび選択するステップ；
ｃ．それぞれ遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の糸状菌微生物を提供することによって、後続のＨＴＰ遺伝子設計糸状菌株ライブラリーを生み出すステップであって、前記遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも２つの個々の糸状菌株に存在する前記遺伝的バリエーションから選択される、ステップ；
ｄ．前記後続のＨＴＰ遺伝子設計糸状菌株ライブラリーの個々の糸状菌株を、前記所望の表現型についてスクリーニングおよび選択するステップ；および
ｅ．糸状菌微生物が前記所望の表現型を獲得するまで、線形または非線形様式でステップｃ）〜ｄ）を１回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するＨＴＰ遺伝子設計糸状菌株ライブラリーの少なくとも２つの個々の糸状菌株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを内包する個々の糸状菌株を含む新しいＨＴＰ遺伝子設計糸状菌株ライブラリーが創製される、ステップ
を含む、方法。
９０．前記最初のＨＴＰ遺伝子設計糸状菌株ライブラリーが、プロモータースワップ微生物株ライブラリー、ＳＮＰスワップ微生物株ライブラリー、開始／停止コドン微生物株ライブラリー、最適化配列微生物株ライブラリー、ターミネータースワップ微生物株ライブラリー、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つのライブラリーを含む、実施形態８９に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
９１．前記最初のＨＴＰ遺伝子設計糸状菌株ライブラリーが、プロモータースワップ微生物株ライブラリーを含む、実施形態８９に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
９２．前記最初のＨＴＰ遺伝子設計糸状菌株ライブラリーが、少なくとも１つのバイシストロン設計（ＢＣＤ）調節配列を含有するプロモータースワップ微生物株ライブラリーを含む、実施形態８９に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
９３．前記最初のＨＴＰ遺伝子設計糸状菌株ライブラリーが、ＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーを含む、実施形態８９に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
９４．前記最初のＨＴＰ遺伝子設計糸状菌株ライブラリーが、
ａ．キメラ生合成酵素をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドであって、前記キメラ生合成酵素は、
ｉ．糸状菌において調節経路に関与する酵素を含み；
ｉｉ．ＤＮＡ結合部位に結合することができるＤＮＡ結合ドメインに翻訳により融合される、
少なくとも１つのポリヌクレオチド；および
ｂ．前記キメラ生合成酵素の前記ＤＮＡ結合ドメインに対応する前記ＤＮＡ結合部位を含む少なくとも１つのＤＮＡ足場配列
を含む微生物株ライブラリーを含む、実施形態８９に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
９５．前記後続のＨＴＰ遺伝子設計糸状菌株ライブラリーが、前記最初のＨＴＰ遺伝子設計糸状菌株ライブラリーにおける前記遺伝的バリエーションに由来する完全コンビナトリアル株ライブラリーである、実施形態８９に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
９６．前記後続のＨＴＰ遺伝子設計糸状菌株ライブラリーが、前記最初のＨＴＰ遺伝子設計糸状菌株ライブラリーにおける前記遺伝的バリエーションに由来する完全コンビナトリアル株ライブラリーのサブセットである、実施形態８９に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
９７．前記後続のＨＴＰ遺伝子設計糸状菌株ライブラリーが、先行するＨＴＰ遺伝子設計糸状菌株ライブラリーにおける前記遺伝的バリエーションに由来する完全コンビナトリアル株ライブラリーである、実施形態８９に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
９８．前記後続のＨＴＰ遺伝子設計糸状菌株ライブラリーが、先行するＨＴＰ遺伝子設計糸状菌株ライブラリーにおける前記遺伝的バリエーションに由来する完全コンビナトリアル株ライブラリーのサブセットである、実施形態８９に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
９９．前記ゲノムを撹乱することが、ランダム変異誘発、標的とした配列挿入、標的とした配列欠失、標的とした配列置き換え、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つの方法を利用することを含む、実施形態８９に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
１００．前記最初の複数の糸状菌微生物が、工業生産糸状菌株に由来するユニークな遺伝的バリエーションを含む、実施形態８９に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
１０１．前記最初の複数の糸状菌微生物が、Ｓ１Ｇｅｎ１で表される工業生産株微生物およびＳｎＧｅｎｎで表されるこれらに由来する後続の任意の数の微生物世代を含む、実施形態８９に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
１０２．前記糸状菌が、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａの種、またはこれらのテレオモルフもしくはアナモルフ、およびシノニムもしくは分類学的均等物から選択される、実施形態８９に記載のＨＴＰ方法。
１０３．前記糸状菌が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒである、実施形態８９に記載のＨＴＰ方法。
１０４．ＳＮＰスワップ糸状菌株ライブラリーを生成するための方法であって、
ａ．参照糸状菌株および第２の糸状菌株を提供するステップであって、前記第２の糸状菌株は、前記参照糸状菌株内に存在しない一塩基多型、ＤＮＡ挿入、およびＤＮＡ欠失から選択される複数の同定された遺伝的バリエーションを含む、ステップ；および
ｂ．前記参照糸状菌株または前記第２の糸状菌株のいずれかのゲノムを撹乱することによって、複数の個々の株の各株内で見出されたユニークな遺伝的バリエーションを有する前記複数の個々の糸状菌株を含む最初のＳＮＰスワップ糸状菌株ライブラリーを生み出すステップであって、前記ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、前記参照糸状菌株と前記第２の糸状菌株との間の前記複数の同定された遺伝的バリエーションから選択される単一の遺伝的バリエーションに対応する、ステップ
を含む、方法。
１０５．前記参照糸状菌株の前記ゲノムが撹乱されて、前記第２の糸状菌株内に見出される同定された一塩基多型、ＤＮＡ挿入、またはＤＮＡ欠失の１つまたは複数が付加される、実施形態１０４に記載のＳＮＰスワップ糸状菌株ライブラリーを生成するための方法。
１０６．前記第２の糸状菌株の前記ゲノムが撹乱されて、前記参照糸状菌株内に見出されない同定された一塩基多型、ＤＮＡ挿入、またはＤＮＡ欠失の１つまたは複数が除去される、実施形態１０４に記載のＳＮＰスワップ糸状菌株ライブラリーを生成するための方法。
１０７．結果として生じるユニークな遺伝的バリエーションを有する複数の個々の糸状菌株が、前記参照糸状菌株と前記第２の糸状菌株との間のすべての同定された前記遺伝的バリエーションの完全コンビナトリアルライブラリーを一緒に含む、実施形態１０４に記載のＳＮＰスワップ糸状菌株ライブラリーを生成するための方法。
１０８．結果として生じるユニークな遺伝的バリエーションを有する複数の個々の糸状菌株が、前記参照糸状菌株と前記第２の糸状菌株との間のすべての前記同定された遺伝的バリエーションの完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットを一緒に含む、実施形態１０４に記載のＳＮＰスワップ糸状菌株ライブラリーを生成するための方法。
１０９．前記糸状菌が、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａの種、またはこれらのテレオモルフもしくはアナモルフ、およびシノニムもしくは分類学的均等物から選択される、実施形態１０４に記載のＳＮＰスワップ糸状菌株ライブラリーを生成するための方法。
１１０．前記糸状菌が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒである、実施形態１０４に記載のＳＮＰスワップ糸状菌株ライブラリーを生成するための方法。
１１１．産生糸状菌株の表現型性能を再建および改善するための方法であって、
ａ．親系統糸状菌株およびそれに由来する産生糸状菌株を提供するステップであって、前記産生糸状菌株は、前記親系統株内に存在しない一塩基多型、ＤＮＡ挿入、およびＤＮＡ欠失から選択される複数の同定された遺伝的バリエーションを含む、ステップ；
ｂ．前記親系統糸状菌株または前記産生糸状菌株のいずれかのゲノムを撹乱して、最初の糸状菌株のライブラリーを生み出すステップであって、前記最初のライブラリーにおける各株は、前記親系統糸状菌株と前記産生糸状菌株との間の前記複数の同定された遺伝的バリエーションからのユニークな遺伝的バリエーションを含む、ステップ；
ｃ．参照糸状菌株に対する表現型性能改善について前記最初のライブラリーの個々の株をスクリーニングおよび選択することによって、表現型性能改善をもたらすユニークな遺伝的バリエーションを同定するステップ；
ｄ．先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも２つの個々の糸状菌株に存在する前記遺伝的バリエーションからのユニークな遺伝的バリエーションの組合せをそれぞれ含む後続の複数の糸状菌微生物を提供することによって、後続の糸状菌株のライブラリーを生み出すステップ；
ｅ．前記参照糸状菌株に対する表現型性能改善について前記後続ライブラリーの個々の株をスクリーニングおよび選択することによって、追加の表現型性能改善をもたらす遺伝的バリエーションのユニークな組合せを同定するステップ；および
ｆ．前記産生糸状菌株の前記表現型性能と比較して、糸状菌株が、所望のレベルの表現型性能の改善を呈するまで、線形または非線形様式でステップｄ）〜ｅ）を１回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、新しい微生物株のライブラリーが創製され、前記新しいライブラリーにおける各株は、先行するライブラリーの少なくとも２つの個々の糸状菌株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せである遺伝的バリエーションを含む、ステップ
を含む、方法。
１１２．前記最初の糸状菌株のライブラリーが、前記親系統糸状菌株と前記産生糸状菌株との間の前記同定された遺伝的バリエーションのすべてを含む完全コンビナトリアルライブラリーである、実施形態１１１に記載の産生糸状菌株の表現型性能を再建および改善するための方法。
１１３．前記最初の糸状菌株のライブラリーが、前記親系統糸状菌株と前記産生糸状菌株との間の前記同定された遺伝的バリエーションのサブセットを含む完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットである、実施形態１１１に記載の産生糸状菌株の表現型性能を再建および改善するための方法。
１１４．前記後続の糸状菌株のライブラリーが、前記最初のライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーである、実施形態１１１に記載の産生糸状菌株の表現型性能を再建および改善するための方法。
１１５．前記後続の糸状菌株のライブラリーが、前記最初のライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットである、実施形態１１１に記載の産生糸状菌株の表現型性能を再建および改善するための方法。
１１６．前記後続の糸状菌株のライブラリーが、先行するライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーである、実施形態１１１に記載の産生糸状菌株の表現型性能を再建および改善するための方法。
１１７．前記後続の糸状菌株のライブラリーが、先行するライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットである、実施形態１１１に記載の産生糸状菌株の表現型性能を再建および改善するための方法。
１１８．前記親系統糸状菌株の前記ゲノムが撹乱されて、前記産生糸状菌株内に見出される同定された一塩基多型、ＤＮＡ挿入、またはＤＮＡ欠失の１つまたは複数が付加される、実施形態１１１に記載の産生糸状菌株の表現型性能を再建および改善するための方法。
１１９．前記産生糸状菌株の前記ゲノムが撹乱されて、前記親系統糸状菌株内に見出されない同定された一塩基多型、ＤＮＡ挿入、またはＤＮＡ欠失の１つまたは複数が除去される、実施形態１１１に記載の産生糸状菌株の表現型性能を再建および改善するための方法。
１２０．前記ゲノムを撹乱することが、ランダム変異誘発、標的とした配列挿入、標的とした配列欠失、標的とした配列置き換え、およびこれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つの方法を利用することを含む、実施形態１１１に記載の産生糸状菌株の表現型性能を再建および改善するための方法。
１２１．後続ライブラリーの糸状菌株の前記表現型性能が、前記産生糸状菌株の前記表現型性能と比較して、測定された表現型変数の少なくとも１０％の増大を呈するまで、ステップｄ）〜ｅ）を繰り返す、実施形態１１１に記載の産生糸状菌株の表現型性能を再建および改善するための方法。
１２２．後続ライブラリーの糸状菌株の前記表現型性能が、前記産生糸状菌株の前記表現型性能と比較して、測定された表現型変数の少なくとも１倍の増大を呈するまで、ステップｄ）〜ｅ）を繰り返す、実施形態１１１に記載の産生糸状菌株の表現型性能を再建および改善するための方法。
１２３．ステップｆ）の表現型性能の改善が、目的の産物の体積生産性、目的の産物の比生産性、目的の産物の収率、目的の産物の力価、およびこれらの組合せからなる群から選択される、実施形態１１１に記載の産生糸状菌株の表現型性能を再建および改善するための方法。
１２４．ステップｆ）の表現型性能の改善が、目的の産物の増大したまたはより効率的な産生であり、前記目的の産物は、低分子、酵素、ペプチド、アミノ酸、有機酸、合成化合物、燃料、アルコール、一次細胞外代謝産物、二次細胞外代謝産物、細胞内コンポーネント分子、およびこれらの組合せからなる群から選択される、実施形態１１１に記載の産生糸状菌株の表現型性能を再建および改善するための方法。
１２５．前記同定された遺伝的バリエーションが、プロモータースワップライブラリー由来の人工プロモータースワップ遺伝的バリエーションをさらに含む、実施形態１１１に記載の産生糸状菌株の表現型性能を再建および改善するための方法。
１２６．前記最初の糸状菌株のライブラリー、または
後続の糸状菌株のライブラリー
のいずれかの少なくとも１つの微生物株のゲノムを、内在性糸状菌標的遺伝子に作動可能に連結したプロモーターラダー由来の１つまたは複数のプロモーターを含むように操作するステップ
をさらに含む、実施形態１１１に記載の産生糸状菌株の表現型性能を再建および改善するための方法。
１２７．前記糸状菌が、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａの種、またはこれらのテレオモルフもしくはアナモルフ、およびシノニムもしくは分類学的均等物から選択される、実施形態１１１に記載の産生糸状菌株の表現型性能を再建および改善するための方法。
１２８．前記糸状菌が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒである、実施形態１１１に記載の産生糸状菌株の表現型性能を再建および改善するための方法。
１２９．プロモータースワップ糸状菌株ライブラリーを生成するための方法であって、
ａ．基準糸状菌株に内在する複数の標的遺伝子、およびプロモーターラダーを提供するステップであって、前記プロモーターラダーは、前記基準糸状菌株において異なる発現プロファイルを呈する複数のプロモーターを含む、ステップ；および
ｂ．前記基準糸状菌株のゲノムを操作することによって、複数の個々の糸状菌株の各株内で見出されたユニークな遺伝的バリエーションを有する前記複数の個々の糸状菌株を含む最初のプロモータースワップ糸状菌株ライブラリーを生み出すステップであって、前記ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、前記基準糸状菌株に内在する前記標的遺伝子の１つに作動可能に連結した前記プロモーターラダー由来のプロモーターの１つまたは複数を含む、ステップ
を含む、方法。
１３０．前記糸状菌株が、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａの種、またはこれらのテレオモルフもしくはアナモルフ、およびシノニムもしくは分類学的均等物から選択される、実施形態１２９に記載の方法。
１３１．前記糸状菌株が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ株である、実施形態１２９に記載の方法。
１３２．産生糸状菌株の表現型性能を改善するためのプロモータースワップ方法であって、
ａ．基準糸状菌株に内在する複数の標的遺伝子、およびプロモーターラダーを提供するステップであって、前記プロモーターラダーは、前記基準糸状菌株において異なる発現プロファイルを呈する複数のプロモーターを含む、ステップ；
ｂ．前記基準糸状菌株のゲノムを操作することによって、複数の個々の糸状菌株の各株内で見出されたユニークな遺伝的バリエーションを有する前記複数の個々の糸状菌株を含む最初のプロモータースワップ糸状菌株ライブラリーを生み出すステップであって、前記ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、前記基準糸状菌株に内在する前記標的遺伝子の１つに作動可能に連結した前記プロモーターラダー由来のプロモーターの１つまたは複数を含む、ステップ；
ｃ．参照糸状菌株に対する表現型性能改善について前記最初のプロモータースワップ糸状菌株ライブラリーの個々の糸状菌株をスクリーニングおよび選択することによって、表現型性能改善をもたらすユニークな遺伝的バリエーションを同定するステップ；
ｄ．先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも２つの個々の糸状菌株に存在する前記遺伝的バリエーションからのユニークな遺伝的バリエーションの組合せをそれぞれ含む後続の複数の糸状菌微生物を提供することによって、後続のプロモータースワップ糸状菌株ライブラリーを生み出すステップ；
ｅ．前記参照糸状菌株に対する表現型性能改善について前記後続のプロモータースワップ糸状菌株ライブラリーの個々の糸状菌株をスクリーニングおよび選択することによって、追加の表現型性能改善をもたらす遺伝的バリエーションのユニークな組合せを同定するステップ；および
ｆ．前記産生糸状菌株の前記表現型性能と比較して、糸状菌株が、所望のレベルの表現型性能の改善を呈するまで、線形または非線形様式でステップｄ）〜ｅ）を１回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、新しい微生物株のプロモータースワップ糸状菌株ライブラリーが創製され、前記新しいライブラリーにおける各株は、先行するライブラリーの少なくとも２つの個々の糸状菌株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せである遺伝的バリエーションを含む、ステップ
を含む、方法。
１３３．前記後続のプロモータースワップ糸状菌株ライブラリーが、前記最初のプロモータースワップ糸状菌株ライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーである、実施形態１３２に記載の産生糸状菌株の表現型性能を改善するためのプロモータースワップ方法。
１３４．前記後続のプロモータースワップ糸状菌株ライブラリーが、前記最初のプロモータースワップ糸状菌株ライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットである、実施形態１３２に記載の産生糸状菌株の表現型性能を改善するためのプロモータースワップ方法。
１３５．前記後続のプロモータースワップ糸状菌株ライブラリーが、先行するプロモータースワップ糸状菌株ライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーである、実施形態１３２に記載の産生糸状菌株の表現型性能を改善するためのプロモータースワップ方法。
１３６．前記後続のプロモータースワップ糸状菌株ライブラリーが、先行するプロモータースワップ糸状菌株ライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットである、実施形態１３２に記載の産生糸状菌株の表現型性能を改善するためのプロモータースワップ方法。
１３７．後続のプロモータースワップ糸状菌株ライブラリーの糸状菌株の前記表現型性能が、前記産生糸状菌株の前記表現型性能と比較して、測定された表現型変数の少なくとも１０％の増大を呈するまで、ステップｄ）〜ｅ）を繰り返す、実施形態１３２に記載の産生糸状菌株の表現型性能を改善するためのプロモータースワップ方法。
１３８．後続のプロモータースワップ糸状菌株ライブラリーの糸状菌株の前記表現型性能が、前記産生糸状菌株の前記表現型性能と比較して、測定された表現型変数の少なくとも１倍の増大を呈するまで、ステップｄ）〜ｅ）を繰り返す、実施形態１３２に記載の産生糸状菌株の表現型性能を改善するためのプロモータースワップ方法。
１３９．ステップｆ）の表現型性能の改善が、目的の産物の体積生産性、目的の産物の比生産性、目的の産物の収率、目的の産物の力価、およびこれらの組合せからなる群から選択される、実施形態１３２に記載の産生糸状菌株の表現型性能を改善するためのプロモータースワップ方法。
１４０．ステップｆ）の表現型性能の改善が、目的の産物の増大したまたはより効率的な産生であり、前記目的の産物は、低分子、酵素、ペプチド、アミノ酸、有機酸、合成化合物、燃料、アルコール、一次細胞外代謝産物、二次細胞外代謝産物、細胞内コンポーネント分子、およびこれらの組合せからなる群から選択される、実施形態１３２に記載の産生糸状菌株の表現型性能を改善するためのプロモータースワップ方法。
１４１．前記糸状菌株が、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａの種、またはこれらのテレオモルフもしくはアナモルフ、およびシノニムもしくは分類学的均等物から選択される、実施形態１３２に記載の産生糸状菌株の表現型性能を改善するためのプロモータースワップ方法。
１４２．前記糸状菌株が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ株である、実施形態１３２に記載の産生糸状菌株の表現型性能を改善するためのプロモータースワップ方法。
１４３．ターミネータースワップ糸状菌株ライブラリーを生成するための方法であって、
ａ．基準糸状菌株に内在する複数の標的遺伝子、およびターミネーターラダーを提供するステップであって、前記ターミネーターラダーは、前記基準糸状菌株において異なる発現プロファイルを呈する複数のターミネーターを含む、ステップ；および
ｂ．前記基準糸状菌株のゲノムを操作することによって、複数の個々の糸状菌株の各株内で見出されたユニークな遺伝的バリエーションを有する前記複数の個々の糸状菌株を含む最初のターミネータースワップ糸状菌株ライブラリーを生み出すステップであって、前記ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、前記基準糸状菌株に内在する前記標的遺伝子の１つに作動可能に連結した前記ターミネーターラダー由来のターミネーターの１つまたは複数を含む、ステップ
を含む、方法。
１４４．前記糸状菌株が、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａの種、またはこれらのテレオモルフもしくはアナモルフ、およびシノニムもしくは分類学的均等物から選択される、実施形態１４３に記載の方法。
１４５．前記糸状菌株が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ株である、実施形態１４３に記載の方法。
１４６．産生糸状菌株の表現型性能を改善するためのターミネータースワップ方法であって、
ａ．基準糸状菌株に内在する複数の標的遺伝子、およびターミネーターラダーを提供するステップであって、前記ターミネーターラダーは、前記基準糸状菌株において異なる発現プロファイルを呈する複数のターミネーターを含む、ステップ；
ｂ．前記基準糸状菌株のゲノムを操作することによって、複数の個々の糸状菌株の各株内で見出されたユニークな遺伝的バリエーションを有する前記複数の個々の糸状菌株を含む最初のターミネータースワップ糸状菌株ライブラリーを生み出すステップであって、前記ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、前記基準糸状菌株に内在する前記標的遺伝子の１つに作動可能に連結した前記ターミネーターラダー由来のターミネーターの１つまたは複数を含む、ステップ；
ｃ．参照糸状菌株に対する表現型性能改善について前記最初のターミネータースワップ糸状菌株ライブラリーの個々の糸状菌株をスクリーニングおよび選択することによって、表現型性能改善をもたらすユニークな遺伝的バリエーションを同定するステップ；
ｄ．先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも２つの個々の糸状菌株に存在する前記遺伝的バリエーションからのユニークな遺伝的バリエーションの組合せをそれぞれ含む後続の複数の糸状菌微生物を提供することによって、後続のターミネータースワップ糸状菌株ライブラリーを生み出すステップ；
ｅ．前記参照糸状菌株に対する表現型性能改善について前記後続のターミネータースワップ糸状菌株ライブラリーの個々の糸状菌株をスクリーニングおよび選択することによって、追加の表現型性能改善をもたらす遺伝的バリエーションのユニークな組合せを同定するステップ；および
ｆ．前記産生糸状菌株の前記表現型性能と比較して、糸状菌株が、所望のレベルの表現型性能の改善を呈するまで、線形または非線形様式でステップｄ）〜ｅ）を１回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、新しい微生物株のターミネータースワップ糸状菌株ライブラリーが創製され、前記新しいライブラリーにおける各株は、先行するライブラリーの少なくとも２つの個々の糸状菌株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せである遺伝的バリエーションを含む、ステップ
を含む、方法。
１４７．前記後続のターミネータースワップ糸状菌株ライブラリーが、前記最初のターミネータースワップ糸状菌株ライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーである、実施形態１４６に記載の産生糸状菌株の表現型性能を改善するためのターミネータースワップ方法。
１４８．前記後続のターミネータースワップ糸状菌株ライブラリーが、前記最初のターミネータースワップ糸状菌株ライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットである、実施形態１４６に記載の産生糸状菌株の表現型性能を改善するためのターミネータースワップ方法。
１４９．前記後続のターミネータースワップ糸状菌株ライブラリーが、先行するターミネータースワップ糸状菌株ライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーである、実施形態１４６に記載の産生糸状菌株の表現型性能を改善するためのターミネータースワップ方法。
１５０．前記後続のターミネータースワップ糸状菌株ライブラリーが、先行するターミネータースワップ糸状菌株ライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットである、実施形態１４６に記載の産生糸状菌株の表現型性能を改善するためのターミネータースワップ方法。
１５１．後続のターミネータースワップ糸状菌株ライブラリーの糸状菌株の前記表現型性能が、前記産生糸状菌株の前記表現型性能と比較して、測定された表現型変数の少なくとも１０％の増大を呈するまで、ステップｄ）〜ｅ）を繰り返す、実施形態１４６に記載の産生糸状菌株の表現型性能を改善するためのターミネータースワップ方法。
１５２．後続のターミネータースワップ糸状菌株ライブラリーの糸状菌株の前記表現型性能が、前記産生糸状菌株の前記表現型性能と比較して、測定された表現型変数の少なくとも１倍の増大を呈するまで、ステップｄ）〜ｅ）を繰り返す、実施形態１４６に記載の産生糸状菌株の表現型性能を改善するためのターミネータースワップ方法。
１５３．ステップｆ）の表現型性能の改善が、目的の産物の体積生産性、目的の産物の比生産性、目的の産物の収率、目的の産物の力価、およびこれらの組合せからなる群から選択される、実施形態１４６に記載の産生糸状菌株の表現型性能を改善するためのターミネータースワップ方法。
１５４．ステップｆ）の表現型性能の改善が、目的の産物の増大したまたはより効率的な産生であり、前記目的の産物は、低分子、酵素、ペプチド、アミノ酸、有機酸、合成化合物、燃料、アルコール、一次細胞外代謝産物、二次細胞外代謝産物、細胞内コンポーネント分子、およびこれらの組合せからなる群から選択される、実施形態１４６に記載の産生糸状菌株の表現型性能を改善するためのターミネータースワップ方法。
１５５．前記糸状菌株が、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａの種、またはこれらのテレオモルフもしくはアナモルフ、およびシノニムもしくは分類学的均等物から選択される、実施形態１４６に記載の産生糸状菌株の表現型性能を改善するためのターミネータースワップ方法。
１５６．前記糸状菌株が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ株である、実施形態１４６に記載の産生糸状菌株の表現型性能を改善するためのターミネータースワップ方法。
１５７．糸状菌宿主細胞の内在性遺伝子に作動可能に連結したプロモーターを含む糸状菌宿主細胞であって、前記プロモーターは、前記内在性遺伝子にとって異種であり、前記プロモーターは、配列番号１〜４からなる群から選択される配列を有する、糸状菌宿主細胞。
１５８．前記内在性遺伝子に作動可能に連結した前記プロモーターを有さない参照糸状菌株の表現型性能と比較して、所望のレベルの表現型性能の改善を有する、実施形態１５７に記載の糸状菌宿主細胞。
１５９．Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａの種、またはこれらのテレオモルフもしくはアナモルフ、およびシノニムもしくは分類学的均等物から選択される、実施形態１５７に記載の糸状菌宿主細胞。
１６０．Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒである、実施形態１５７に記載の糸状菌宿主細胞。
１６１．糸状菌株ライブラリーであって、前記ライブラリー中の各糸状菌株は、宿主細胞の内在性遺伝子に作動可能に連結したプロモーターを含み、前記プロモーターは、前記内在性遺伝子にとって異種であり、前記プロモーターは、配列番号１〜４からなる群から選択される配列を有する、糸状菌株ライブラリー。
１６２．前記糸状菌株が、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａの種、またはこれらのテレオモルフもしくはアナモルフ、およびシノニムもしくは分類学的均等物から選択される、実施形態１６１に記載の糸状菌株ライブラリー。
１６３．前記糸状菌株が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒである、実施形態１６１に記載の糸状菌株ライブラリー。
１６４．単一の真菌胞子に由来するクローン集団を単離するための方法であって、
（ａ）複数の真菌胞子を液状懸濁液において提供するステップであって、前記複数の真菌胞子は、真菌株から得たものである、ステップ；
（ｂ）複数の反応領域を含む基材中の個々の反応領域に、別々の体積の前記液状懸濁液を分散するステップであって、前記複数の反応領域中の各反応領域は、増殖培地を含み、前記分散により、前記個々の反応領域の少なくとも７５％が、前記複数の真菌胞子からの単一の生存可能な真菌胞子のみを含有する確率がもたらされる、ステップ；
（ｃ）増殖培地を含む前記反応領域中の分散された前記単一の生存可能な真菌胞子を培養するステップ；および
（ｄ）前記反応領域中で増殖するクローン集団を選択することによって、単一の真菌胞子に由来するクローン集団を単離するステップ
を含む、方法。
１６５．前記別々の体積中の単一の真菌胞子の存在または非存在について、前記別々の体積をスクリーニングするステップをさらに含み、ステップ（ｂ）のために、単一の真菌胞子を含有する前記別々の体積のみが選択される、実施形態１６４に記載の方法。
１６６．前記分散により、前記個々の反応領域の少なくとも８０％が、前記複数の真菌胞子からの単一の生存可能な真菌胞子のみを含有する確率がもたらされる、実施形態１６５に記載の方法。
１６７．前記分散により、前記個々の反応領域の少なくとも９０％が、前記複数の真菌胞子からの単一の生存可能な真菌胞子のみを含有する確率がもたらされる、実施形態１６５に記載の方法。
１６８．前記分散により、前記個々の反応領域の少なくとも９５％が、前記複数の真菌胞子からの単一の生存可能な真菌胞子のみを含有する確率がもたらされる、実施形態１６５に記載の方法。
１６９．前記分散により、前記個々の反応領域の少なくとも９９％が、前記複数の真菌胞子からの単一の生存可能な真菌胞子のみを含有する確率がもたらされる、実施形態１６５に記載の方法。
１７０．前記分配により、前記個々の反応領域の実質的にすべてが、前記複数の真菌胞子からの単一の生存可能な真菌胞子のみを含有する確率がもたらされる、実施形態１６５に記載の方法。
１７１．前記別々の体積をスクリーニングするステップが、前記別々の体積中の単一の真菌胞子の存在または非存在を光学的に区別することを伴う、実施形態１６５から１７０のいずれか一つに記載の方法。
１７２．前記スクリーニングが、前記別々の体積中の単一の真菌胞子の存在または非存在を光学的に区別することが可能なマイクロフルイディックデバイスを使用して実行される、実施形態１７１に記載の方法。
１７３．単一の真菌胞子に由来するクローン集団を単離するための方法であって、
（ａ）複数の真菌胞子を液状懸濁液において提供するステップであって、前記複数の真菌胞子は、真菌株から得たものである、ステップ；
（ｂ）前記液状懸濁液を希釈するステップであって、前記希釈が限界希釈である、ステップ；
（ｃ）複数の反応領域を含む基材中の個々の反応領域に、別々の体積の希釈物を分散するステップであって、前記複数の反応領域中の各反応領域は、増殖培地を含み、前記限界希釈により、各反応領域に分散された前記別々の体積の希釈物が１つの生存可能な胞子を含有するかまたは生存可能な胞子を含有しないかのいずれかであることが、前記複数の反応領域中の前記反応領域の９０％より多くが生存可能な胞子を含有せず、１つまたは複数の生存可能な胞子を含有する反応領域の９０％より多くが単一の生存可能な胞子のみを含有するポアソン分布に従う確率がもたらされる、ステップ；
（ｄ）増殖培地を含む前記反応領域中の分散された前記単一の生存可能な真菌胞子を培養するステップ；および
（ｅ）前記反応領域中で増殖するクローン集団を選択することによって、単一の真菌胞子に由来するクローン集団を単離するステップ
を含む、方法。
１７４．前記反応領域が、マイクロタイタープレート中に存在する、実施形態１６４から１７３のいずれかに記載の方法。
１７５．前記マイクロタイタープレートが、９６ウェル、３８４ウェルまたは１５３６ウェルを含有する、実施形態１７４に記載の方法。
１７６．前記真菌株が、糸状菌株である、実施形態１６４から１７５のいずれかに記載の方法。
１７７．前記糸状菌株が、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａの種、またはこれらのテレオモルフもしくはアナモルフ、およびシノニムもしくは分類学的均等物から選択される、実施形態１７６に記載の方法。
１７８．前記糸状菌株が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒまたはそのテレオモルフもしくはアナモルフである、実施形態１７７に記載の方法。
１７９．前記糸状菌株が、菌糸体ではないペレット状の形態を有する、実施形態１７８に記載の方法。
１８０．前記糸状菌株が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＬＮ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログの変異形態を発現する、実施形態１７９に記載の方法。
１８１．前記Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＬＮ１遺伝子の前記Ａ．ｎｉｇｅｒオルソログの前記変異形態の核酸配列が、配列番号１３である、実施形態１８０に記載の方法。
１８２．前記Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＬＮ１遺伝子の前記Ａ．ｎｉｇｅｒオルソログの前記変異形態が、配列番号１または２から選択されるプロモーター配列に作動可能に連結されている、実施形態１７９または１８０に記載の方法。
１８３．前記真菌株が、遺伝子撹乱を有する、実施形態１６４から１８２のいずれかに記載の方法。
１８４．前記遺伝子撹乱が、一塩基多型、ＤＮＡ挿入、ＤＮＡ欠失またはこれらの任意の組合せから選択される、実施形態１８３に記載の方法。
１８５．前記遺伝子撹乱が、前記真菌株に由来するプロトプラストをリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ複合体）で形質転換することによって前記プロトプラストに導入される、実施形態１８３または１８４に記載の方法。
１８６．前記ＲＮＰ複合体が、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と複合体化したＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼを含む、実施形態１８５に記載の方法。
１８７．前記ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼが、クラス２のＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムのＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼである、実施形態１８６に記載の方法。
１８８．前記クラス２のＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムのＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼが、タイプＩＩ、タイプＶまたはタイプＶＩのＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼである、実施形態１８７に記載の方法。
１８９．前記クラス２のＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムのＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃまたはこれらの相同体、オルソログ、変異体、バリアントもしくは改変されたバージョンから選択される、実施形態１８７に記載の方法。
１９０．前記クラス２のＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムのＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９またはこれらの相同体、オルソログもしくはパラログである、実施形態１８９に記載の方法。
１９１．前記ｇＲＮＡが、単独の、またはトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）にアニールした、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）である、実施形態１８６に記載の方法。
１９２．前記ｇＲＮＡが、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡを含む単一のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、実施形態１８６に記載の方法。
１９３．前記ｃｒＲＮＡが、前記真菌株のゲノム内の標的遺伝子に相補的なガイド配列を含み、前記プロトプラストへの前記ＲＮＰ複合体の導入は、前記標的遺伝子への前記遺伝子撹乱の導入を促進する、実施形態１９１または１９２に記載の方法。
１９４．前記標的遺伝子の前記遺伝子撹乱が、前記ＲＮＰ複合体により前記標的遺伝子が切断されて、前記標的遺伝子にＤＮＡ末端が生成し、続いて非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路により前記標的遺伝子中の前記ＤＮＡ末端が非相同末端結合することによって促進される、実施形態１９３に記載の方法。
１９５．前記標的遺伝子の変異したバージョンを含むドナーＤＮＡを共形質転換することをさらに含み、前記標的遺伝子の前記変異したバージョンは、標的遺伝子座に相同なヌクレオチドが両側に隣接している、実施形態１９３に記載の方法。
１９６．前記標的遺伝子の前記遺伝子撹乱が、前記ＲＮＰ複合体により前記標的遺伝子が切断されて、前記標的遺伝子にＤＮＡ末端が生成し、続いて前記標的遺伝子が相同組換えを介して前記ドナーＤＮＡで置き換えられることによって促進される、実施形態１９５に記載の方法。
１９７．ステップ（ｂ）が、選択可能なマーカーを含むベクターを共形質転換することをさらに含む、実施形態１８５から１９６のいずれかに記載の方法。
１９８．前記選択可能なマーカーが、ステップ（ｄ）において、形質転換能を有する真菌株に由来するクローン集団を選択するために使用される、実施形態１９７に記載の方法。
１９９．前記遺伝子撹乱が、複数のプロトプラストを第１のコンストラクトおよび第２のコンストラクトで形質転換することによって前記真菌株に由来するプロトプラストに導入され、前記第１のコンストラクトは、前記プロトプラストのゲノム中の第１の遺伝子座に相同なヌクレオチドが両側に隣接している第１のポリヌクレオチドを含み、前記第２のコンストラクトは、前記プロトプラストのゲノム中の第２の遺伝子座に相同なヌクレオチドが両側に隣接している第２のポリヌクレオチドを含み、前記形質転換により、相同組換えによって前記第１の遺伝子座に前記第１のコンストラクトが組み込まれ、前記第２の遺伝子座に前記第２のコンストラクトが組み込まれ、少なくとも前記第２の遺伝子座は、前記プロトプラストのゲノム中の第１の選択可能なマーカー遺伝子であり、前記第１のポリヌクレオチドは、前記遺伝子撹乱を含む、実施形態１８３または１８４に記載の方法。
２００．前記選択可能なマーカー遺伝子が、ステップ（ｄ）において、前記遺伝子撹乱を含む真菌株に由来するクローン集団の選択を促進するために使用される、実施形態１９９に記載の方法。
２０１．前記真菌株が、非機能的な非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路を有する、実施形態１９５から２００のいずれかに記載の方法。
２０２．前記真菌株を、抗体、化学的阻害剤、タンパク質阻害剤、物理的阻害剤、ペプチド阻害剤、または前記ＮＨＥＪ経路のコンポーネントに指向させたアンチセンスもしくはＲＮＡｉ分子に曝露することによって、前記ＮＨＥＪ経路が非機能的になる、実施形態２０１に記載の方法。
２０３．前記化学的阻害剤が、Ｗ−７である、実施形態２０２に記載の方法。
２０４．糸状菌株を産生するための方法であって、
ａ．）複数のプロトプラストを提供するステップであって、前記複数のプロトプラストは、親糸状菌株の培養物から調製されたものである、ステップ；
ｂ．）前記複数のプロトプラストからの各プロトプラストをリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ複合体）で形質転換するステップ；および
ｃ．）前記親糸状菌株に対する表現型性能改善について形質転換された前記プロトプラストに由来する個々の糸状菌株を選択およびスクリーニングして、表現型性能改善をもたらす選択された前記個々の糸状菌株のゲノムにおける遺伝子撹乱を同定するステップ
を含む、方法。
２０５．前記遺伝子撹乱が、一塩基多型、ＤＮＡ挿入、ＤＮＡ欠失またはこれらの任意の組合せから選択される、実施形態２０４に記載の方法。
２０６．前記ＲＮＰ複合体が、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と複合体化したＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼを含む、実施形態２０４または２０５に記載の方法。
２０７．前記ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼが、クラス２のＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムのＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼである、実施形態２０６に記載の方法。
２０８．前記クラス２のＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムのＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼが、タイプＩＩ、タイプＶまたはタイプＶＩのＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼである、実施形態２０７に記載の方法。
２０９．前記クラス２のＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムのＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃまたはこれらの相同体、オルソログ、変異体、バリアントもしくは改変されたバージョンから選択される、実施形態２０７に記載の方法。
２１０．前記クラス２のＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムのＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９またはこれらの相同体、オルソログもしくはパラログである、実施形態２０９に記載の方法。
２１１．前記ｇＲＮＡが、単独の、またはトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）にアニールした、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）である、実施形態２０６に記載の方法。
２１２．前記ｇＲＮＡが、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡを含む単一のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、実施形態２０６に記載の方法。
２１３．前記ｃｒＲＮＡが、前記親糸状菌株のゲノム内の標的遺伝子に相補的なガイド配列を含み、前記ＲＮＰ複合体の導入は、前記プロトプラスト中の前記標的遺伝子を撹乱する、実施形態２１１または２１２に記載の方法。
２１４．前記標的遺伝子の前記撹乱が、前記ＲＮＰ複合体により前記標的遺伝子が切断されて、前記標的遺伝子にＤＮＡ末端が生成し、続いて非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路により前記標的遺伝子中の前記ＤＮＡ末端が非相同末端結合することによって促進される、実施形態２１３に記載の方法。
２１５．ステップ（ｂ）が、前記標的遺伝子の変異したバージョンを含むドナーＤＮＡを共形質転換することをさらに含み、前記標的遺伝子の前記変異したバージョンは、標的遺伝子座に相同なヌクレオチドが両側に隣接している、実施形態２１３に記載の方法。
２１６．前記標的遺伝子の前記撹乱が、前記ＲＮＰ複合体により前記標的遺伝子が切断されて、前記標的遺伝子にＤＮＡ末端が生成し、続いて前記標的遺伝子が相同組換えを介して前記ドナーＤＮＡで置き換えられることによって促進される、実施形態２１５に記載の方法。
２１７．ステップ（ｂ）が、選択可能なマーカーを含むベクターを共形質転換することをさらに含む、実施形態２０４から２１６のいずれかに記載の方法。
２１８．ステップ（ｃ）において、前記親糸状菌株に対する表現型性能改善についての後続のスクリーニングのために形質転換能を有する個々の糸状菌株を選択するために、前記選択可能なマーカーが使用される、実施形態２１７に記載の方法。
２１９．前記親糸状菌株が、非機能的な非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路を有する、実施形態２１５から２１８のいずれか一項に記載の方法。
２２０．前記細胞を、抗体、化学的阻害剤、タンパク質阻害剤、物理的阻害剤、ペプチド阻害剤、または前記ＮＨＥＪ経路のコンポーネントに指向させたアンチセンスもしくはＲＮＡｉ分子に曝露することによって、前記ＮＨＥＪ経路が非機能的になる、実施形態２１９に記載の方法。
２２１．前記化学的阻害剤が、Ｗ−７である、実施形態２２０に記載の方法。
２２２．前記糸状菌株の前記表現型性能改善が、前記親糸状菌株の前記表現型性能と比較して、目的の産物に関して測定された表現型変数の少なくとも１０％の増大を含む、実施形態２０４から２２１のいずれかに記載の方法。
２２３．前記糸状菌株の前記表現型性能改善が、前記親糸状菌株の前記表現型性能と比較して、目的の産物に関して測定された表現型変数の少なくとも１倍の増大を含む、実施形態２０４から２２１のいずれかに記載の方法。
２２４．前記測定された表現型変数が、前記目的の産物の体積生産性、前記目的の産物の比生産性、前記目的の産物の収率、前記目的の産物の力価、およびこれらの組合せからなる群から選択される、実施形態２２２または２２３に記載の方法。
２２５．前記測定された表現型変数が、前記目的の産物の増大したまたはより効率的な産生である、実施形態２２２または２２３に記載の方法。
２２６．前記目的の産物が、低分子、酵素、ペプチド、アミノ酸、有機酸、合成化合物、燃料、アルコール、一次細胞外代謝産物、二次細胞外代謝産物、細胞内コンポーネント分子、およびこれらの組合せからなる群から選択される、実施形態２２２または２２３に記載の方法。
２２７．前記親糸状菌株が、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａの種、またはこれらのテレオモルフもしくはアナモルフ、およびシノニムもしくは分類学的均等物から選択される、実施形態２０４から２２６のいずれかに記載の方法。
２２８．前記糸状菌株が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒまたはそのテレオモルフもしくはアナモルフである、実施形態２２７に記載の方法。
２２９．前記糸状菌株が、菌糸体ではないペレット状の形態を有する、実施形態２２８に記載の方法。
２３０．前記糸状菌株が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＬＮ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログの変異形態を発現する、実施形態２２９に記載の方法。
２３１．前記Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＬＮ１遺伝子の前記Ａ．ｎｉｇｅｒオルソログの前記変異形態の核酸配列が、配列番号１３である、実施形態２３０に記載の方法。
２３２．前記Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＬＮ１遺伝子の前記Ａ．ｎｉｇｅｒオルソログの前記変異形態が、配列番号１または２から選択されるプロモーター配列に作動可能に連結されている、実施形態２３０または２３１に記載の方法。
２３３．ステップ（ｃ）の前に、前記個々の糸状菌株に由来する単離されたクローン集団を生成するステップをさらに含む、実施形態２０４から２３２のいずれかに記載の方法。
２３４．前記単離が、
（ｉ）前記形質転換されたプロトプラストが複数の真菌胞子を生じるように誘導するステップであって、前記複数からの各真菌胞子は、単一の形質転換されたプロトプラストに由来する、ステップ；
（ｉｉ）単一の形質転換されたプロトプラストに由来する前記複数の真菌胞子を液体中に再懸濁して、液状懸濁液を生成するステップ；
（ｉｉｉ）複数の反応領域を含む基材中の個々の反応領域に、別々の体積の前記液状懸濁液を分散するステップであって、前記複数の反応領域中の各反応領域は、増殖培地を含み、前記分散により、前記個々の反応領域の少なくとも７５％が、前記複数の真菌胞子からの単一の生存可能な真菌胞子のみを含有する確率がもたらされる、ステップ；および
（ｉｖ）増殖培地を含む前記反応領域中の分散された前記単一の生存可能な真菌胞子を培養することによって、前記個々の糸状菌株に由来する単離されたクローン集団を生成するステップ
を含む、実施形態２３３に記載の方法。
２３５．前記別々の体積中の単一の真菌胞子の存在または非存在について、前記別々の体積をスクリーニングするステップをさらに含み、ステップ（ｉｉｉ）のために、単一の真菌胞子を含有する前記別々の体積のみが選択される、実施形態２３４に記載の方法。
２３６．前記分散により、前記個々の反応領域の少なくとも８０％が、前記複数の真菌胞子からの単一の生存可能な真菌胞子のみを含有する確率がもたらされる、実施形態２３５に記載の方法。
２３７．前記分散により、前記個々の反応領域の少なくとも９０％が、前記複数の真菌胞子からの単一の生存可能な真菌胞子のみを含有する確率がもたらされる、実施形態２３５に記載の方法。
２３８．前記分散により、前記個々の反応領域の少なくとも９５％が、前記複数の真菌胞子からの単一の生存可能な真菌胞子のみを含有する確率がもたらされる、実施形態２３４に記載の方法。
２３９．前記分散により、前記個々の反応領域の少なくとも９９％が、前記複数の真菌胞子からの単一の生存可能な真菌胞子のみを含有する確率がもたらされる、実施形態２３４に記載の方法。
２４０．前記分散により、前記個々の反応領域の実質的にすべてが、前記複数の真菌胞子からの単一の生存可能な真菌胞子のみを含有する確率がもたらされる、実施形態２３４に記載の方法。
２４１．前記別々の体積をスクリーニングするステップが、前記別々の体積中の単一の真菌胞子の存在または非存在を光学的に区別することを伴う、実施形態２３５に記載の方法。
２４２．前記スクリーニングが、前記別々の体積中の単一の真菌胞子の存在または非存在を光学的に区別することが可能なマイクロフルイディックデバイスを使用して実行される、実施形態２４１に記載の方法。
２４３．前記単離が、（ｉ）前記形質転換されたプロトプラストが複数の真菌胞子を生じるように誘導するステップであって、前記複数からの各真菌胞子は、単一の形質転換されたプロトプラストに由来する、ステップ；（ｉｉ）単一の形質転換されたプロトプラストに由来する前記複数の真菌胞子を液体中に再懸濁して、液状懸濁液を生成するステップ；（ｉｉｉ）前記液状懸濁液を希釈するステップであって、前記希釈が限界希釈である、ステップ；（ｉｖ）複数の反応領域を含む基材中の個々の反応領域に、別々の体積の希釈物を分散するステップであって、前記複数の反応領域中の各反応領域は、増殖培地を含み、前記限界希釈により、各反応領域に分散された前記別々の体積の希釈物が１つの生存可能な胞子を含有するかまたは生存可能な胞子を含有しないかのいずれかであることが、前記複数の反応領域中の前記反応領域の９０％より多くが生存可能な胞子を含有せず、１つまたは複数の生存可能な胞子を含有する反応領域の９０％より多くが単一の生存可能な胞子のみを含有するポアソン分布に従う確率がもたらされる、ステップ；（ｖ）増殖培地を含む前記反応領域中の分散された前記単一の生存可能な真菌胞子を培養するステップ；および（ｖｉ）前記反応領域中で増殖するクローン集団を選択することによって、単一の真菌胞子に由来するクローン集団を単離するステップ
を含む、実施形態２３３に記載の方法。
２４４．前記反応領域が、マイクロタイタープレート中に存在する、実施形態２３４から２４３のいずれかに記載の方法。
２４５．前記マイクロタイタープレートが、９６ウェル、３８４ウェルまたは１５３６ウェルを含有する、実施形態２４４に記載の方法。
【０７３４】
参照による組込み
本明細書に引用したすべての参考文献、論文、刊行物、特許、特許公開、および特許出願は、すべての目的に関してその全体が参照により組み込まれている。しかし、本明細書に引用した任意の参考文献、論文、刊行物、特許、特許公開、および特許出願の言及は、これらが有効な先行技術を構成するか、または世界のいずれかの国における共通の一般的知識の一部を形成するという承認または何らかの形式の示唆として解釈されず、かつそのように解釈されるべきでない。
【０７３５】
さらに、以下の特定の出願が参照によって本明細書に組み込まれる：２００１６年１２月３０日に出願された米国特許出願第１５／３９６，２３０号（米国特許出願公開第ＵＳ２０１７／０１５９０４５号Ａ１）；２０１６年１２月０７日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６５４６５（ＷＯ２０１７／１００３７７Ａ１）；２０１６年４月２７日に出願された米国特許出願第１５／１４０，２９６号（ＵＳ２０１７／０３１６３５３Ａ１）；２０１７年４月２６日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２９７２５（ＷＯ２０１７／１８９７８４Ａ１）；２０１６年１２月０７日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６５４６４（ＷＯ２０１７／１００３７６Ａ２）；２０１６年１２月０７日に出願された米国仮出願第６２／４３１，４０９号；２０１５年１２月０７日に出願された米国仮出願第６２／２６４，２３２号；および２０１６年７月２９日に出願された米国仮出願第６２／３６８，７８６号。さらに、以下の特定の出願が、参照によって本明細書に組み込まれる：２０１７年１２月２９日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０６９０８６；および２０１６年１２月３０日に出願された米国仮出願第６２／４４１，０４０号。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
2020524489.tif 000031
【図８】
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【図９】
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【図１０】
2020524489.tif 000034
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2020524489.tif 000037
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
2020524489.tif 000059
【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６−１】
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【図４６−２】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９−１】
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【図４９−２】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５Ａ】
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【図５５Ｂ】
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【図５５Ｃ】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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