(57)【要約】  アミノ酸配列が配列番号１又は配列番号２に示されるグルコースオキシダーゼＣｎＧＯＤＡ、そのコード遺伝子、当該遺伝子を含む組換え発現ベクター及び組換え菌株を提供する。さらに、当該グルコースオキシダーゼＣｎＧＯＤＡの調製方法及び使用を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１もしくは配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は
（ｂ）配列番号１もしくは配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと７５％〜９９％の相同性を有し、配列番号１もしくは配列番号２に示されるアミノ酸配列のポリペプチドと同じ活性もしくは特性を有する誘導ポリペプチドである
ことを特徴とするグルコースオキシダーゼＣｎＧＯＤＡ。
【請求項２】
前記誘導ポリペプチドは、配列番号１又は配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと９０％〜９５％の相同性を有することを特徴とする、請求項１に記載のグルコースオキシダーゼＣｎＧＯＤＡ。
【請求項３】
前記誘導ポリペプチドは、配列番号１又は配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと９５％〜９９％の相同性を有することを特徴とする、請求項１に記載のグルコースオキシダーゼＣｎＧＯＤＡ。
【請求項４】
請求項１に記載のグルコースオキシダーゼＣｎＧＯＤＡをコードすることを特徴とする、グルコースオキシダーゼ遺伝子。
【請求項５】
（ａ）配列番号３もしくは配列番号４に示されるヌクレオチド配列を有する、又は
（ｂ）配列番号３もしくは配列番号４に示されるヌクレオチド配列と７５％〜９９％の相同性を有し、コードするポリペプチドが、配列番号１もしくは配列番号２に示されるアミノ酸配列のポリペプチドと同じ活性及び特性を有する
ことを特徴とする、請求項４に記載のグルコースオキシダーゼ遺伝子。
【請求項６】
前記グルコースオキシダーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号３又は配列番号４に示されるヌクレオチド配列と９５％〜９９％の相同性を有し、コードするポリペプチドは、配列番号１又は配列番号２に示されるアミノ酸配列のポリペプチドと同じ活性及び特性を有することを特徴とする、請求項５に記載のグルコースオキシダーゼ遺伝子。
【請求項７】
請求項４に記載のグルコースオキシダーゼ遺伝子を含む、組換え発現ベクター。
【請求項８】
請求項４に記載のグルコースオキシダーゼ遺伝子を含む、組換え発現ベクターｐＰＩＣ９−ＣｎｇｏｄＡ。
【請求項９】
請求項４に記載のグルコースオキシダーゼ遺伝子を含む、組換え菌株。
【請求項１０】
請求項４に記載のグルコースオキシダーゼ遺伝子を含む、組換え菌株ＧＳ１１５／ＣｎｇｏｄＡ。
【請求項１１】
（１）請求項１に記載のグルコースオキシダーゼＣｎＧＯＤＡをコードする遺伝子を含む組換えベクターにより宿主細胞を形質転換して組換え菌株を得る工程と、
（２）組換え菌株を培養し、グルコースオキシダーゼＣｎＧＯＤＡの発現を誘導する工程と、
（３）分離精製してグルコースオキシダーゼＣｎＧＯＤＡを得る工程と、
を含むことを特徴とするグルコースオキシダーゼＣｎＧＯＤＡの調製方法。
【請求項１２】
請求項１に記載のグルコースオキシダーゼＣｎＧＯＤＡの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子工学の分野に関する。具体的には、本発明は、グルコースオキシダーゼＣｎＧＯＤＡ及びその遺伝子ならびに使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルコースオキシダーゼ（ｇｌｕｃｏｓｅ  ｏｘｉｄａｓｅ、ＧＯＤ）は、フラビン依存性の好気性デヒドロゲナーゼであり、酸素のある環境でβ−Ｄ−グルコースを特異的に酸化してグルコン酸と過酸化水素を生成することができる。グルコースオキシダーゼは、動物、植物、及び微生物に広く分布しており、微生物は、成長繁殖速度が速く、供給源が幅広い等の特徴を有するため、グルコースオキシダーゼの主な供給源となっている。
【０００３】
グルコースオキシダーゼは、飼料添加剤の一つとして、巨大な潜在的使用価値がある。また、グルコースオキシダーゼは、さらに、利用可能性が高く、触媒特異性と効率性という利点により、既に食品、飼料、医薬、試験紙、及びバイオセンサーなどの分野に使用されている。
【発明の概要】
【０００４】
本発明の目的は、新たな供給源からのグルコースオキシダーゼを提供することである。
【０００５】
本発明のさらなる目的は、上記グルコースオキシダーゼの遺伝子を提供することである。
【０００６】
本発明のさらなる目的は、上記グルコースオキシダーゼ遺伝子を含む組換えベクターを提供することである。
【０００７】
本発明のさらなる目的は、上記グルコースオキシダーゼ遺伝子を含む組換え菌株を提供することである。
【０００８】
本発明のさらなる目的は、グルコースオキシダーゼの調製方法を提供することである。
【０００９】
本発明のさらなる目的は、上記グルコースオキシダーゼの使用を提供することである。
【００１０】
本発明が最初に解決しようとする課題は、従来技術の不足を克服し、優れた性質を有し、飼料、食品、医薬等の分野での使用に適した新規なグルコースオキシダーゼを提供することである。当該グルコースオキシダーゼＣｎＧＯＤＡは、
（ａ）配列番号１もしくは配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は
（ｂ）配列番号１もしくは配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと７５％〜９９％の相同性を有し、配列番号１もしくは配列番号２に示されるアミノ酸配列のポリペプチドと同じ活性もしくは特性を有する誘導ポリペプチドである。
【００１１】
配列番号１：
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【００１２】
ここで、当該酵素の全長は、６１４個のアミノ酸であり、Ｎ端の１７個のアミノ酸は、シグナルペプチド配列「ＭＨＳＩＨＦＬＡＡＦ  ＬＡＡＶＳＥＡ」である。したがって、成熟グルコースオキシダーゼＧＯＤの理論分子量は６４．７３３ｋＤａであり、そのアミノ酸配列は配列番号２に示される。
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【００１３】
当該グルコースオキシダーゼは、最適ｐＨが７．０であり、ｐＨ６．０〜ｐＨ１０．０の範囲で７０％以上の酵素活性を維持することができ、最適温度が３０℃であり、１５℃〜５０℃の範囲で５０％以上の酵素活性を維持することができ、良好な温度安定性を有する。
【００１４】
本発明はまた、配列番号１又は配列番号２に示されるポリペプチド配列を改変して得られ、即ち、１個又は複数（例えば、１個もしくは数個、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０のような１〜１０から選択される値、又は上記値の間にある範囲）のアミノ酸残基の置換、欠失、及び／又は挿入によって得られ、依然としてグルコースオキシダーゼＣｎＧＯＤＡ活性を有する、上記タンパク質の誘導体を提供する。例えば、通常の策略は、保存的なアミノ酸置換であり、即ち、アミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換するものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーは、本分野において既に明確に定義されている。したがって、グルコースオキシダーゼＣｎＧＯＤＡタンパク質において同一の側鎖類に由来する別のアミノ酸残基で１つ又はいくつかの部位を置換しても、実質的にその酵素活性に影響することはない。また、遺伝子のクローニング操作において、常に適切な酵素切断部位を設計する必要があり、それによって必然的に、発現されるタンパク質の末端に１個又は複数個の関連しない残基が取り込まれるが、目的のタンパク質の活性には影響しないことが、当業者には広く知られている。また、例えば、融合タンパク質を構築し、組換えタンパク質の発現を促進し、宿主細胞外に自発的に分泌する組換えタンパク質を得、又は組換えタンパク質の精製に寄与するために、組換えタンパク質のＮ末端、Ｃ末端又は当該タンパク質内の他の適切な領域に、常にいくつかのアミノ酸を付加する必要があり、例えば、適切なリンカーペプチド、シグナルペプチド、リーダーペプチド、末端伸長、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、プロテインＡ、６ＨｉｓもしくはＦｌａｇのようなタグ、又はＸａ因子、又はトロンビン、又はエンテロペプチダーゼのプロテアーゼ部位を含むが、これらに限定されない。
【００１５】
別の好ましい実施形態において、グルコースオキシダーゼＣｎＧＯＤＡタンパク質は、本発明の配列番号１もしくは配列番号２に示される全長アミノ酸配列と少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、又は少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、又は少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、より好ましくは少なくとも約９８．１％、９８．２％、９８．３％、９８．４％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、ひいては、より好ましくは少なくとも約９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％又はそれ以上の相同性を有する活性タンパク質である。上記値の間にある範囲及び一致性を有する値（例えば、７５〜９０％の相同性又は９８．１〜９９．９％の相同性）も、本発明に含まれる。
【００１６】
本発明の具体的な実施形態によるグルコースオキシダーゼ遺伝子ＣｎｇｏｄＡは、
（ａ）配列番号１もしくは配列番号２に示されるアミノ酸配列のポリペプチドをコードし、又は
（ｂ）配列番号１もしくは配列番号２に示されるアミノ酸配列のポリペプチドの誘導ポリペプチドであって、配列番号１もしくは配列番号２に示されるアミノ酸配列を改変して得られ、配列番号１もしくは配列番号２に示されるアミノ酸配列のポリペプチドの活性及び特性を維持する誘導ポリペプチドをコードする。
【００１７】
本発明の具体的な実施形態によれば、上記グルコースオキシダーゼＣｎＧＯＤＡをコードする遺伝子ＣｎｇｏｄＡは、
（ａ）配列番号３もしくは配列番号４に示されるヌクレオチド配列を有するもの、又は
（ｂ）配列番号３もしくは配列番号４に示されるヌクレオチド配列と７５％〜９９％の相同性を有し、コードするポリペプチドが、配列番号１もしくは配列番号２に示されるアミノ酸配列のポリペプチドと同じ活性及び特性を有するものから選択される。
【００１８】
遺伝子配列  配列番号３：
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【００１９】
グルコースオキシダーゼ遺伝子ＣｎｇｏｄＡは、ｃＤＮＡ全長が１８４２ｂｐであり、シグナルペプチドを含む塩基配列が
「ＡＴＧＣＡＴＴＣＧＡ  ＴＴＣＡＴＴＴＣＣＴ  ＡＧＣＴＧＣＴＴＴＣ  ＣＴＧＧＣＴＧＣＡＧ  ＴＣＴＣＴＧＡＡＧＣ  Ｔ」である。
【００２０】
したがって、成熟遺伝子のコード配列は、配列番号４に示される。
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【００２１】
成熟タンパク質は、理論分子量が６４．７３３ｋＤａである。当該酵素は、グルコース／メタノール／コリンオキシドレダクターゼファミリーに属する。ＧｅｎＢａｎｋでグルコースオキシダーゼ遺伝子ＣｎｇｏｄＡのｃＤＮＡ配列とアミノ酸配列のＢＬＡＳＴ比較を行い、ＣｎＧＯＤＡが新規なグルコースオキシダーゼであることを確認した。
【００２２】
また、１つの実施例において、本発明に係るグルコースオキシダーゼＣｎＧＯＤＡ活性を有するタンパク質は、ストリンジェントな条件下で配列表における配列番号３又は配列番号４に示されるヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む。ここで用いられる「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」という用語は、典型的には互いに少なくとも６０％の相同性を有するヌクレオチド配列が、依然として互いにハイブリダイズできるハイブリダイゼーションと洗浄条件を説明するためのものである。ストリンジェントな条件とは、この条件下で、互いに少なくとも約６５％、より好ましくは少なくとも約７０％、ひいては、より好ましくは少なくとも約７５％又はそれ以上の相同性を有する配列が、一般的に、依然として互いにハイブリダイズできる条件であることが好ましい。このストリンジェントな条件は、当業者に公知のものであり、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6において見出すことができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましく非制限的な実例としては、６×ＳＳＣで約４５℃でハイブリダイズした後、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで５０〜６５℃で１回又は複数回洗浄する。当業者であれば、高度にストリンジェントな条件が、ハイブリダイゼーション温度を例えば、５０℃、５５℃、６０℃又は６５℃に上げることにより実現可能であることを理解することができる。
【００２３】
また、当業者は、自然変異による遺伝的多型性が群の個体間に存在できることを理解することができる。このような自然変異により、一般的に、β−グルコシダーゼ遺伝子のヌクレオチド配列において１〜５％の差異が生じる可能性がある。グルコースオキシダーゼにおける、このような自然変異によるグルコースオキシダーゼＣｎＧＯＤＡの機能活性を変化させない任意の及び全てのヌクレオチド突然変異及び得られたアミノ酸多型性もまた、本発明の範囲内である。したがって、本発明は、配列番号３又は配列番号４に示されるポリヌクレオチド分子の対立遺伝子もしくは天然変異体によりコードされる、グルコースオキシダーゼＣｎＧＯＤＡ活性を有するポリペプチドも含む。
【００２４】
一方、本発明は、配列番号３又は配列番号４の新規なグルコースオキシダーゼ遺伝子を提供する。本発明は、遺伝暗号の縮重性により本発明の配列番号３又は配列番号４に示されるヌクレオチド配列のいずれかとは異なる核酸分子、及びそれによりコードされるβ−グルコシダーゼタンパク質をさらに含む。１つの実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、例えば、ストリンジェントな条件下で配列番号３又は配列番号４に示されるヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列であり、好ましくはその対立遺伝子もしくは天然変異体である。別の実施例において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号１又は配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。さらなる実施例において、本発明の核酸分子は、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列と基本的に同一の全長グルコースオキシダーゼタンパク質、例えば、１個もしくは複数（例えば、１個もしくは数個、又は１〜１０から選択される値）のアミノ酸残基が置換、削除、及び／又は挿入された配列番号１もしくは配列番号２に由来するタンパク質、又は、配列番号１もしくは配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９９％の相同性を有するタンパク質をコードする。当該核酸分子は、配列番号３もしくは配列番号４のヌクレオチド配列と好ましくは少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、又は少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、又は少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、より好ましくは少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９７．７％、９７．８％、９７．９％、又は少なくとも約９８％、９８．１％、９８．２％、９８．３％、９８．４％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、ひいては、より好ましくは少なくとも約９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％又はそれ以上の相同性を有する。上記値の間にある範囲又は一致性を有する値（例えば、７６〜９７％の相同性又は９７．８〜９９．９％の相同性）も、本発明に含まれる。
【００２５】
本発明は、上記グルコースオキシダーゼ遺伝子を含む組換えベクターをさらに提供し、好ましくはｐＰＩＣ９−ＣｎｇｏｄＡである。本発明のグルコースオキシダーゼ遺伝子を発現ベクターの適切な制限酵素切断部位の間に挿入することにより、ヌクレオチド配列が発現調節配列に操作可能に接続されるようになる。本発明の最も好ましい１つの実施形態としては、グルコースオキシダーゼ遺伝子をプラスミドｐＰＩＣ９におけるＥｃｏＲＩとＮｏｔＩ制限酵素切断部位の間に挿入することにより、当該ヌクレオチド配列をＡＯＸ１プロモーターの下流に位置させ、かつ、それにより調節される、組換え酵母発現プラスミドｐＰＩＣ９−ＣｎｇｏｄＡを得ることが好ましい。
【００２６】
ベクターＤＮＡは、通常の形質転換又はトランスフェクション技術により原核又は真核細胞に導入されることができる。宿主細胞を形質転換又はトランスフェクションする適切な方法は、「モレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル」第二版，コールド・スプリング・ハーバー研究所出版社，ＮＹ，１９８９，Ｓａｍｂｒｏｏｋら、及び他のラボラトリー・マニュアルにおいて見出すことができる。
【００２７】
本発明は、上記グルコースオキシダーゼ遺伝子を含む組換え菌株をさらに提供し、好ましくは組換え菌株ＧＳ１１５／ＣｎｇｏｄＡである。
【００２８】
本発明は、
１）上記組換えベクターにより宿主細胞を形質転換して組換え菌株を得る工程、
２）組換え菌株を培養し、組換えグルコースオキシダーゼの発現を誘導する工程、
３）発現したグルコースオキシダーゼを回収して精製する工程、
を含むグルコースオキシダーゼの調製方法をさらに提供する。
【００２９】
ここで、上記宿主細胞は、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞又はハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）細胞であることが好ましく、組換え酵母発現プラスミドでピキア・パストリス細胞（Ｐｉｃｈｉc  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＳ１１５を形質転換して組換え菌株ＧＳ１１５／ＣｎｇｏｄＡを得ることが好ましい。
【００３０】
本発明はさらに、上記グルコースオキシダーゼの使用を提供し、遺伝子工学手段によりグルコースオキシダーゼを工業的に生産する。
【００３１】
本発明は、クラドスポリウムＣｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｎｅｏｐｓｙｃｈｒｏｔｏｌｅｒｎｓ  ＳＬ−１６菌株から新規なグルコースオキシダーゼ遺伝子を得ており、この種におけるこの酵素の発見は初めてである。これによって、グルコースオキシダーゼの研究範囲が拡大され、また、当該酵素は良好な触媒活性を有し、発酵生産も容易である。上述した全ての利点から、新たに発見されたグルコースオキシダーゼが飼料、食品、医薬等の分野においてより重要な使用価値があることが分かる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】本発明の具体的な実施形態に係る組換えグルコースオキシダーゼの最適ｐＨである。
【図２】本発明の具体的な実施形態に係るグルコースオキシダーゼのｐＨ安定性である。
【図３】本発明の具体的な実施形態に係るグルコースオキシダーゼの最適反応温度である。
【図４】本発明の具体的な実施形態に係るグルコースオキシダーゼの熱安定性である。
【実施例】
【００３３】
試験材料と試薬
１、菌株及びベクター：ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＧＳ１１５）；ピキア・パストリス発現ベクターｐＰＩＣ９、及び菌株ＧＳ１１５は、いずれも外部で購入したものである。
２、酵素類及び他の生化学試薬：エンドヌクレアーゼ、リガーゼ、及び他の試薬は、いずれも外部で購入したものである。
３、培地：
（１）酵素生産培地（／Ｌ）：グルコース１７２．１１ｇ、コーンスティープリカー１１．０５ｇ、炭酸カルシウム５２．２９ｇ、ビーフペプトン３．５ｇ、（ＮＨ４）Ｈ２ＰＯ４  ０．５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．１２５ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．１２５ｇ。１２１℃で２０分間殺菌処理した。
（２）大腸菌ＬＢ培地：１％ペプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣＩ、ｐＨ  ７．０。
（３）ＢＭＧＹ培地：１％酵母エキス、２％ペプトン、１．３４％ＹＮＢ、０．００００４９＜ビオチン、１％グリセリン（ｖ／ｖ）。
（４）ＢＭＭＹ培地：グリセリンの代わりに０．５％メタノールを用いた以外、残りの成分は、いずれもＢＭＧＹと同じであった。
【００３４】
説明：以下の実施例において具体的に説明されていない分子生物学実験方法は、いずれもＪ．  サムブルック著「モレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル」（第三版）で挙げられた具体的な方法を参照して、又はキットと製品説明書に従って行った。
【００３５】
［実施例１  グルコースオキシダーゼのコード遺伝子ｇｏｄのクローニング］
（１）クラドスポリウムＣｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｎｅｏｐｓｙｃｈｒｏｔｏｌｅｒｎｓ  ＳＬ−１６の全ＲＮＡの抽出
まず、酵素生産培地で３日間培養した菌を濾紙に収集して加圧乾燥し、高温で殺菌した乳鉢に加え、液体窒素で迅速に粉砕して粉末を得た。その後、粉砕した菌体を８００μＬ  Ｔｒｉｚｏｌが入った新しい１．５ｍＬ遠心管に移し、ピペッティングして均一に混合し、室温で５分間放置した。２００μＬのクロロホルムを加え、１５秒間激しく振とうし、室温で３分間放置し、４℃、１２０００ｒｐｍで１５分間遠心した。上清を抽出し、等容量のイソプロパノールを加え、均一に混合し、室温で１０分間放置し、４℃、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心した。上清を捨て、沈殿物を７０％エタノールで２回洗浄し、空気で５分間乾燥し、適量のＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ脱イオン水を加えてＲＮＡを溶解させた。
【００３６】
（２）グルコースオキシダーゼｃＤＮＡの取得
Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０と逆転写酵素により全ｃＤＮＡの１本鎖を得た後、ＥｃｏＲＩとＮｏｔＩ制限酵素切断部位を有するプライマーＦとＲを設計し合成した（表１を参照）。ＣｎＧＯＤＡの成熟タンパク質のコード領域に対してＰＣＲ増幅を行い、グルコースオキシダーゼのｃＤＮＡ配列を得た。
【００３７】
【表１】
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【００３８】
［実施例２  グルコースオキシダーゼ工学菌株の構築］
（１）発現ベクターの構築及びピキア・パストリスにおける発現
ＥｃｏＲＩとＮｏｔＩにより実施例１におけるＰＣＲ生成物を酵素切断し、発現ベクターｐＰＩＣ９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）に接続して導入し、グルコースオキシダーゼＧＯＤの成熟タンパク質配列を上記発現ベクターのシグナルペプチド配列の下流に挿入し、シグナルペプチドと正確な読み枠を形成し、酵母発現ベクターｐＰＩＣ９−ＣｎｇｏｄＡとして構築し、大腸菌コンピテントセルＴｒａｎｓ１から、陽性形質転換体を選択してＤＮＡシーケンシングを行い、シーケンシングにより配列が正確であることが示された形質転換体を、組換えプラスミドの大量調製に用いた。制限エンドヌクレアーゼＢｇｌＩＩによりプラスミドベクターＤＮＡを線状に発現させ、酵母ＧＳ１１５コンピテントセルをエレクトロポレーションし、３０℃で２〜３日培養し、ＭＤプレートで成長した形質転換体を選択してさらに発現実験を行った。具体的な操作については、ピキア・パストリス発現操作説明書を参照した。
【００３９】
同様にしてシグナルペプチド配列を含む組換え発現ベクターを構築した。
【００４０】
（２）グルコースオキシダーゼ活性の高い形質転換体のスクリーニング
殺菌済みの爪楊枝で形質転換体が成長したＭＤプレートからシングルコロニーをかきとり、番号順にＭＤプレートに添加し、コロニーが成長するまでＭＤプレートを３０℃のインキュベーターで１〜２日培養した。番号の順にＭＤプレートから形質転換体をかきとり、３ｍＬ  ＢＭＧＹ培地が入った遠心管に接種し、３０℃、２２０ｒｐｍでシェーカーにより４８時間培養した。シェーカーにより４８時間培養した菌液を３，０００×ｇで１５分間遠心し、上清を捨て、遠心管に０．５％メタノール含有ＢＭＭＹ培地１ｍＬを加え、３０℃、２２０ｒｐｍで誘導培養した。４８時間誘導培養した後、３，０００×ｇで５分間遠心し、上清を取って酵素活性検出に用い、グルコースオキシダーゼ活性の高い形質転換体をスクリーニングした。具体的な操作については、ピキア・パストリス発現操作説明書を参照した。
【００４１】
［実施例３  組換えグルコースオキシダーゼのピキア・パストリスにおける発酵］
（１）組換えグルコースオキシダーゼの振とうフラスコレベルでの大量発現
スクリーニングされた酵素活性の高い形質転換体をＢＭＧＹ液体培地３００ｍＬに接種し、３０℃、２２０ｒｐｍでシェーカーにより４８時間振とう培養し、菌体を富化させ、４，５００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を軽く捨て、菌体を０．５％メタノール含有ＢＭＭＹ液体培地１００ｍＬに移し、３０℃、２２０ｒｐｍで７２時間誘導培養した。誘導培養中、２４時間おきにメタノール溶液を補充してメタノールの損失を補償し、メタノールの最終濃度を０．５％程度に維持した。１２，０００×ｇで１０分間遠心し、上清発酵液を回収し、酵素活性を検出しＳＤＳ−ＰＡＧＥタンパク質電気泳動分析を行った。
【００４２】
（２）組換えグルコースオキシダーゼの精製
振とうフラスコで発現された組換えグルコースオキシダーゼの上清を回収し、まず、１０ｋＤａ限外ろ過モジュールにより濃縮し、この過程において低塩緩衝液で発酵液中の培地を置換した。その後１０ｋＤａ限外濾過チューブによりさらに濃縮した。一定の倍数に希釈した組換えＣｎＧＯＤＡを濃縮し、イオン交換クロマトグラフィーにより精製した。具体的には、ＣｎＧＯＤＡ濃縮液２．０ｍＬを取り、予め２０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ６．９）で平衡化されたＨｉＴｒａｐ  Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬ陰イオンカラムを通過させ、０−１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌで直線勾配溶出を行い、分別回収された溶出液の酵素活性を検出しタンパク質濃度を測定した。
【００４３】
［実施例４  組換えグルコースオキシダーゼの一部の性質分析］
分光光度法により本発明のグルコースオキシダーゼについて酵素活性を測定した。具体的には、ｐＨ６．０、３０℃の条件下で、ｏ−ジアニシジン緩衝液２．５ｍＬ、１８％グルコース溶液０．３ｍＬ、９０Ｕ／ｍＬホースラディシュペルオキシダーゼ０．１ｍＬ、適当な酵素希釈液０．１ｍＬを含む反応系５ｍＬを３分間反応させ、２Ｍ硫酸２ｍＬを加えて反応を停止させ、冷却した後ＯＤ５４０吸光値を測定した。グルコースオキシダーゼの活性単位については、一定の条件下で、１分間でβ−Ｄ−グルコース１μｍｏｌを酸化してＤ−グルコン酸と過酸化水素を生成することができる酵素量を１つの活性単位（Ｕ）とすると定義した。
【００４４】
（１）グルコースオキシダーゼＣｎＧＯＤＡの最適ｐＨ及びｐＨ安定性
精製された実施例２のグルコースオキシダーゼサンプルを、異なるｐＨで酵素活性を測定して最適反応を確定した。異なるｐＨで用いられた緩衝液：ｐＨ１．０〜３．０ではグリシン−塩酸緩衝液、ｐＨ３．０〜８．０ではクエン酸−リン酸水素二ナトリウム系緩衝液、及びｐＨ８．０〜１０．０ではグリシン−水酸化ナトリウム系緩衝液を調製し、異なるｐＨの緩衝液でｏ−ジアニシジン溶液を調製した。３０℃で測定された最適ｐＨ結果（図１）から、ＣｎＧＯＤＡは、最適ｐＨが７．０であり、ｐＨ６．０〜ｐＨ８．０の範囲で酵素活性を６０％以上に維持できることが示された。
【００４５】
酵素液を異なるｐＨの緩衝液で２５℃で６０分間処理し、最適ｐＨで酵素活性を測定して当該酵素のｐＨ安定性の研究を行った。分析結果（図２）から、ｐＨ６．０〜ｐＨ９．０では基本的に安定しており、８０％以上の酵素活性を維持できることが示された。ｐＨ５．０とｐＨ１０．０で処理されても酵素活性をそれぞれ６０％と７０％程度に維持でき、当該酵素は良好なｐＨ安定性を有することが示された。
【００４６】
（２）グルコースオキシダーゼＣｎＧＯＤＡの最適温度及び熱安定性
ｐＨ６．０の条件下で、異なる温度（０〜５５℃）で精製されたグルコースオキシダーゼサンプルの酵素活性を測定した。分析した実験結果から、当該酵素は、最適反応温度が３０℃であり、１５〜５０℃で依然として５０％以上の酵素活性を有することが示された（図３）。
【００４７】
熱安定性の測定では、グルコースオキシダーゼサンプルを異なる温度（３０℃、３５℃、４０℃）で異なる時間処理した後、３０℃で酵素活性を測定した。熱安定性実験から、当該グルコースオキシダーゼを３５℃で６０分間処理したところ、残留酵素活性は７０％以上であったが、４０℃で２０分間処理したところ、酵素活性は約２０％しか残留しなかったことが示された（図４）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年12月13日(2019.12.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
本発明はまた、配列番号１又は配列番号２に示されるポリペプチド配列を改変して得られ、即ち、１個又は複数（例えば、１個もしくは数個、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０のような１〜１０から選択される値、又は上記値の間にある範囲）のアミノ酸残基の置換、欠失、及び／又は挿入によって得られ、依然としてグルコースオキシダーゼＣｎＧＯＤＡ活性を有する、上記タンパク質の誘導体を提供する。例えば、通常の策略は、保存的なアミノ酸置換であり、即ち、アミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換するものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーは、本分野において既に明確に定義されている。したがって、グルコースオキシダーゼＣｎＧＯＤＡタンパク質において同一の側鎖類に由来する別のアミノ酸残基で１つ又はいくつかの部位を置換しても、実質的にその酵素活性に影響することはない。また、遺伝子のクローニング操作において、常に適切な酵素切断部位を設計する必要があり、それによって必然的に、発現されるタンパク質の末端に１個又は複数個の関連しない残基が取り込まれるが、目的のタンパク質の活性には影響しないことが、当業者には広く知られている。また、例えば、融合タンパク質を構築し、組換えタンパク質の発現を促進し、宿主細胞外に自発的に分泌する組換えタンパク質を得、又は組換えタンパク質の精製に寄与するために、組換えタンパク質のＮ末端、Ｃ末端又は当該タンパク質内の他の適切な領域に、常にいくつかのアミノ酸を付加する必要があり、例えば、適切なリンカーペプチド、シグナルペプチド、リーダーペプチド、末端伸長タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、プロテインＡ、６ＨｉｓもしくはＦｌａｇのようなタグ、又はＸａ因子、又はトロンビン、又はエンテロペプチダーゼのプロテアーゼ部位を含むが、これらに限定されない。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
ここで、上記宿主細胞は、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞又はハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）細胞であることが好ましく、組換え酵母発現プラスミドでピキア・パストリス細胞（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＳ１１５を形質転換して組換え菌株ＧＳ１１５／ＣｎｇｏｄＡを得ることが好ましい。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
試験材料と試薬
１、菌株及びベクター：ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＧＳ１１５）；ピキア・パストリス発現ベクターｐＰＩＣ９、及び菌株ＧＳ１１５は、いずれも外部で購入したものである。
２、酵素類及び他の生化学試薬：エンドヌクレアーゼ、リガーゼ、及び他の試薬は、いずれも外部で購入したものである。
３、培地：
（１）酵素生産培地（／Ｌ）：グルコース１７２．１１ｇ、コーンスティープリカー１１．０５ｇ、炭酸カルシウム５２．２９ｇ、ビーフペプトン３．５ｇ、（ＮＨ４）Ｈ２ＰＯ４  ０．５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．１２５ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．１２５ｇ。１２１℃で２０分間殺菌処理した。
（２）大腸菌ＬＢ培地：１％ペプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．０。
（３）ＢＭＧＹ培地：１％酵母エキス、２％ペプトン、１．３４％ＹＮＢ、０．００００４９％ビオチン、１％グリセリン（ｖ／ｖ）。
（４）ＢＭＭＹ培地：グリセリンの代わりに０．５％メタノールを用いた以外、残りの成分は、いずれもＢＭＧＹと同じであった。
【国際調査報告】
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