(57)【要約】癌を治療するための医薬キットがここに開示される。本医薬キットは、薬剤及び改変ナチュラルキラー細胞を具備する。薬剤は癌細胞における腫瘍関連抗体の発現を増加させることができ、その後にその癌細胞は腫瘍関連抗原特異キメラ抗原受容体を有する改変ナチュラルキラー細胞によって標的とされて破壊される。癌の治療のための本医薬キットの使用法もここに開示される。【選択図】  図４Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体における癌を治療するための医薬キットであって、
前記癌における腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の発現を増加させる薬剤を含む第１の容器と、
前記ＴＡＡに特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を有する改変ナチュラルキラー細胞を含む第２の容器と、
を具備する医薬キット。
【請求項２】
前記ＴＡＡが癌胎児性抗原（ＣＥＡ）であり、
前記ＣＡＲが、配列番号１と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を具備する可変ドメインを具備する、
請求項１に記載の医薬キット。
【請求項３】
前記ＣＡＲは、前記可変ドメインのＣ末端に配置されたヒンジドメイン及びエフェクタードメインをさらに具備し、前記ヒンジドメイン及び前記エフェクタードメインは、配列番号２及び３と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列をそれぞれ具備する、請求項２に記載の医薬キット。
【請求項４】
前記ＴＡＡがＣＥＡであり、
前記ＣＡＲが、配列番号４と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を具備する、
請求項１に記載の医薬キット。
【請求項５】
前記薬剤は、５−アザシチジン、５、６−ジヒドロ−５−アザシチジン、５−アザ−２′−デオキシシチジン、アラビノフラノシル−５−アザシトシン、トリコスタチンＡ、フェニル酪酸、酪酸ナトリウム、バルプロ酸、及びスベロイルアニリドヒドロキサム酸からなる群から選択される、請求項１に記載の医薬キット。
【請求項６】
前記癌は、胃癌、肺癌、膀胱癌、乳癌、肝臓癌、腎癌、結腸癌、直腸癌、子宮頸癌、卵巣癌、脳腫瘍、前立腺癌、肝細胞癌、黒色腫、食道癌、多発性骨髄腫及び頭頸部扁平上皮癌からなる群から選択される、請求項１に記載の医薬キット。
【請求項７】
前記癌は、化学療法、放射線療法又は免疫療法に対して耐性がある、請求項６に記載の医薬キット。
【請求項８】
被検体における癌を治療するための医薬品の調製のための薬剤及び改変ナチュラルキラー細胞の組合せの使用法であって、前記薬剤が前記癌における腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の発現を増加させ、前記改変ナチュラルキラー細胞は前記ＴＡＡに特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を有する、使用法。
【請求項９】
前記ＴＡＡが癌胎児性抗原（ＣＥＡ）であり、
前記ＣＡＲが、配列番号１と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を具備する可変ドメインを具備する、
請求項８に記載の使用法。
【請求項１０】
前記ＣＡＲは、前記可変ドメインのＣ末端に配置されたヒンジドメイン及びエフェクタードメインをさらに具備し、前記ヒンジドメイン及び前記エフェクタードメインは、配列番号２及び３と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列をそれぞれ具備する、請求項９に記載の使用法。
【請求項１１】
前記ＴＡＡがＣＥＡであり、
前記ＣＡＲが、配列番号４と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を具備する、
請求項８に記載の使用法。
【請求項１２】
前記薬剤は、５−アザシチジン、５、６−ジヒドロ−５−アザシチジン、５−アザ−２′−デオキシシチジン、アラビノフラノシル−５−アザシトシン、トリコスタチンＡ、フェニル酪酸、酪酸ナトリウム、バルプロ酸、及びスベロイルアニリドヒドロキサム酸からなる群から選択される、請求項８に記載の使用法。
【請求項１３】
前記癌は、胃癌、肺癌、膀胱癌、乳癌、肝臓癌、腎癌、結腸癌、直腸癌、子宮頸癌、卵巣癌、脳腫瘍、前立腺癌、肝細胞癌、黒色腫、食道癌、多発性骨髄腫及び頭頸部扁平上皮癌からなる群から選択される、請求項８に記載の使用法。
【請求項１４】
前記癌は、化学療法、放射線療法又は免疫療法に対して耐性がある、請求項１３に記載の使用法。
【請求項１５】
被検体の癌を治療する方法であって、前記癌における腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の発現を増加させる第１の有効量の薬剤及び前記ＴＡＡに特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を有する第２の有効量の改変ナチュラルキラー細胞を前記被検体に投与するステップを具備する方法。
【請求項１６】
前記ＴＡＡが癌胎児性抗原（ＣＥＡ）であり、
前記ＣＡＲが、配列番号１と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を具備する可変ドメインを具備する、
請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＣＡＲは、前記可変ドメインのＣ末端に配置されたヒンジドメイン及びエフェクタードメインをさらに具備し、前記ヒンジドメイン及び前記エフェクタードメインは、配列番号２及び３と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列をそれぞれ具備する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＴＡＡがＣＥＡであり、
前記ＣＡＲが、配列番号４と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を具備する、
請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記薬剤は、５−アザシチジン、５、６−ジヒドロ−５−アザシチジン、５−アザ−２′−デオキシシチジン、アラビノフラノシル−５−アザシトシン、トリコスタチンＡ、フェニル酪酸、酪酸ナトリウム、バルプロ酸、及びスベロイルアニリドヒドロキサム酸からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記癌は、胃癌、肺癌、膀胱癌、乳癌、肝臓癌、腎癌、結腸癌、直腸癌、子宮頸癌、卵巣癌、脳腫瘍、前立腺癌、肝細胞癌、黒色腫、食道癌、多発性骨髄腫及び頭頸部扁平上皮癌からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記癌は、化学療法、放射線療法又は免疫療法に対して耐性がある、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１７年８月６日出願の米国仮特許出願第６２／５４１，７７８号に関するとともにその利益を主張し、同出願の内容がその全体において参照としてここに取り込まれる。
【０００２】
本開示は、概略として癌治療の分野に関する。より具体的には、本開示は、癌を治療するための医薬品を調製するための医薬キット及びその使用法に関する。
【背景技術】
【０００３】
癌は、細胞の異常かつ未制御な成長に特徴付けられる複雑な疾患である。癌細胞は、以下を含む多くの態様において正常な細胞とは異なる：（１）細胞伝達：正常な細胞と比較して、癌細胞は、細胞の成長又は死滅を制御するシグナルに対してあまり反応しない、（２）侵襲能力：癌細胞において通常は細胞接着分子が下方制御されることにより、制限されにくい細胞が血液又はリンパ液を介して身体の他の領域に容易に転移又は拡散し得る、（３）細胞特性：癌細胞は、正常な細胞と比較して未分化であり又はあまり分化されない、及び（４）免疫抑制：癌細胞は、種々の免疫抑制細胞（例えば、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）又は骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ））を活性化すること及び／又は免疫抑制因子（例えば、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）又はインターロイキン１０（ＩＬ−１０））の発現を刺激することによって免疫反応を抑制する。
【０００４】
癌の最も一般的な治療法は、外科手術、放射線療法及び化学療法を含む。残念ながら、これらの治療法は、腫瘍の成長を抑制することに加え、正常な組織に対する損傷又は細胞毒性のリスクにも関連付けられる。そのため、副作用をもたらすことなく癌細胞を死滅させるように設計された代替の治療法が、研究及び前臨床試験において試されている。これらの治療法の中で、免疫療法は、腫瘍特異的免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞（ＤＣ）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）及びナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞））を活性化すること及び／又は抗癌因子（例えば、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）及びグランザイム）の発現／放出を刺激することによって腫瘍を消滅させる最も有望な治療法の１つである。活性化された免疫細胞は、それらの標的化特異性によって特徴付けられ、すなわち、これらの免疫細胞は癌細胞上に過剰に発現又は固有に発現した腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を認識して結合することによって癌細胞を特異的に標的化することができる。それでもなお、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）及びそこに存在するＴＡＡの双方が癌細胞上で下方制御され又は消失することが多く、これが免疫監視を逃れるためのメカニズムの１つとなっていることに起因して、臨床現場における免疫療法の治療有効性は未だに実現をくじかれている。その上、ＮＫ細胞の治療有効性は癌細胞によって分泌される免疫抑制因子（例えば、ＴＧＦ−β又はＩＬ−１０）によって損なわれ得ることが報告されている。
【０００５】
上記の観点から、関連技術において、癌患者を効果的に治療することにより、癌患者の生活の質及び／又は寿命を向上するための改善された方法のニーズがある。
【発明の概要】
【０００６】
以下に、基本的な理解を読者に与えるために開示の簡略な概要を提示する。この概要は、開示の詳細な概観ではなく、本発明の鍵となる／重要な要素を特定するものでも本発明の範囲を詳述するものでもない。その専らの目的は、ここに開示される幾つかの概念を、後述のさらに詳細な説明の序章としての簡略な形態で提示することである。
【０００７】
ここに具現化されるとともに広く記載されるように、開示の一態様は、癌を有する又は有するものと疑われる被検体を治療する際に有用な医薬キットに向けられる。本医薬キットは、薬剤を含む第１の容器と、改変ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む第２の容器とを具備する。本開示の実施形態によると、前記薬剤は前記癌における腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の発現を増加させることができ、前記改変ＮＫ細胞は前記ＴＡＡに特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を有する。
【０００８】
本開示の他の態様は、癌を有する又は有するものと疑われる被検体を本医薬キットの使用によって治療する方法に関する。方法は、前記癌におけるＴＡＡの発現を増加させる第１の有効量の本薬剤を前記被検体に投与するステップ、及び前記ＴＡＡに特異的なＣＡＲを有する第２の有効量の本改変ＮＫ細胞を前記被検体に投与するステップを具備する。
【０００９】
本開示のある実施形態によると、前記ＴＡＡは、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）である。これらの実施形態では、前記ＣＡＲの可変ドメイン、ヒンジドメイン及びエフェクタードメインはそれぞれ、配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：）１、２及び３と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を具備する。効果的な実施例によると、前記ＣＡＲは、配列番号４と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を具備する。
【００１０】
概略として、前記薬剤は、５−アザシチジン、５、６−ジヒドロ−５−アザシチジン、５−アザ−２′−デオキシシチジン、アラビノフラノシル−５−アザシトシン、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、フェニル酪酸（ＰＢ）、酪酸ナトリウム（ＮａＢ）、バルプロ酸（ＶＰＡ）及びスベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）からなる群から選択される。効果的な一実施例によると、前記薬剤は、５−アザシチジン又は酪酸ナトリウムである。
【００１１】
本医薬キット及び／又は方法で治療可能な例示の癌は、これに限定されないが、胃癌、肺癌、膀胱癌、乳癌、肝臓癌、腎癌、結腸癌、直腸癌、子宮頸癌、卵巣癌、脳腫瘍、前立腺癌、肝細胞癌、黒色腫、食道癌、多発性骨髄腫及び頭頸部扁平上皮癌を含む。本開示のある実施形態によると、癌は、化学療法、放射線療法又は免疫療法に対して耐性がある。
【００１２】
本開示の付随する構成及び効果の多くは、添付図面との関連で検討される以下の詳細な説明を参照してより深く理解されることになる。
【００１３】
本説明は、添付図面を考慮して読まれる以降の詳細な説明からより深く理解されることになる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、本開示の実施例２による指定の癌細胞におけるＣＥＡ発現を示すヒストグラムである。
【図２】図２は、本開示の実施例２による指定の癌細胞におけるＮＫ９２ＭＩ−ＣＥＡの細胞毒性効果を示す折れ線グラフである。
【図３Ａ】図３Ａは、本開示の実施例３による５−アザシチジンで治療された癌細胞に対するＮＫ９２ＭＩ−ＣＥＡ細胞の細胞毒性効果を示す折れ線グラフである。
【図３Ｂ】図３Ｂは、本開示の実施例３による酪酸ナトリウムで治療された癌細胞に対するＮＫ９２ＭＩ−ＣＥＡ細胞の細胞毒性効果を示す折れ線グラフである。
【図４Ａ】図４Ａは、本開示の実施例４による指定の治療法を施されたマウスの腫瘍体積を示す折れ線グラフである。
【図４Ｂ】図４Ｂは、本開示の実施例４による指定の治療法を施されたマウスの腫瘍体積を示すヒストグラムである。
【図４Ｃ】図４Ｃは、本開示の実施例４による指定の治療法を施されたマウスのＣＥＡ血清レベルを示すヒストグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
添付図面との関連で以下に与えられる詳細な説明は、本実施例の説明としてのものであり、本実施例が構成又は利用され得る形態のみを示すものではない。その説明は、実施例の機能及び実施例を構成して動作させるためのステップのシーケンスを説明する。ただし、同一又は同等の機能及びシーケンスは、異なる実施例によっても実現され得る。
【００１６】
１．定義
便宜上、明細書、実施例及び付随する特許請求の範囲において採用される所定の用語をここにまとめる。ここで特に断りがない限り、本開示で採用される科学的及び技術的用語は、一般的に当業者に理解及び使用される意味を有するものとする。また、文脈によってそれ以外が必要とされない限り、単数形の語はその複数形を含むものとし、複数形の語は単数形を含むものとすることが理解される。具体的には、ここで及び特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」及び「ａｎ」は、それ以外を文脈が明示しない限り、複数の参照を含む。また、ここで及び特許請求の範囲で使用されるように、用語「少なくとも１つの」及び「１以上の」は、同じ意味を有し、１、２、３又はそれ以上を含む。
【００１７】
発明の広い範囲を説明する数値範囲及びパラメータは概数であるものの、特定の実施例で説明される数値は可能な限り厳密に報告される。ただし、いずれの数値も、それぞれの試験測定値に見られる標準偏差から必然的にもたらされる所定の誤差を本来的に含む。また、ここで使用されるように、用語「約」は、所与の値又は範囲の１０％、５％、１％又は０．５％内を一般に意味する。あるいは、用語「約」は、当業者によって検討される場合の平均の許容標準誤差内を意味する。有効な／効果的な実施例以外においても、明示の断りがない限り、ここに開示されるその材料の量、継続時間、温度、動作条件、量の比率などに対するものなどの数値範囲、量、値及び割合の全ては、いずれの場合においても用語「約」によって変更されるものとして理解されるべきである。したがって、逆のことが示されない限り、本開示及び添付の特許請求の範囲で説明される数値パラメータは、所望のように変化し得る概数である。少なくとも、各数値パラメータは、報告される有効数字の数を考慮してかつ通常の四捨五入手段を適用して少なくとも解釈されるべきである。
【００１８】
ここで同定されるポリペプチド配列に対する「パーセント（％）のアミノ酸配列同一性」は、配列をアライメントさせるとともに必要に応じてギャップを導入して最大パーセントの配列同一性を達成した後の特定のポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同じ候補配列におけるポリペプチド残基の割合として定義され、配列同一性の部分としていずれの保存的置換も考慮しない。パーセント配列同一性を決定する目的のためのアライメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公に入手可能なコンピュータソフトウェアを用いる当技術内の種々の態様で達成可能である。当業者であれば、対比されている配列の全長にわたって最大アライメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含む、アライメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。ここでの目的のため、２つのポリペプチド配列間の配列比較は、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）によってオンラインで提供されるコンピュータプログラムＢｌａｓｔｐ（ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ＢＬＡＳＴ）によって実行された。所与のポリペプチド配列Ｂに対する所与のポリペプチド配列Ａのパーセントアミノ酸配列同一性（あるいは、所与のポリペプチド配列Ｂに対して所定％のアミノ酸配列同一性を有する所与のポリペプチド配列Ａということもできる）は、以下の式で計算される。
Ｘ／Ｙ×１００％
ここで、Ｘは、そのプログラムのＡ及びＢのアライメントにおいて配列アライメントプログラムＢＬＡＳＴによる完全な一致としてスコアリングされたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、どちらか短い方のＡ又はＢにおけるアミノ酸残基の合計数である。
【００１９】
ここで使用されるように、用語「周期」、「治療の周期」及び「治療周期」は互換可能であり、治療が患者に施される期間をいう。通常、癌療法では、治療の周期の後に治療が行われない休止期間が続く。休止期間に続き、治療の１以上の更なる周期が施されてもよく、各々に追加の休止期間が続く。
【００２０】
用語「治療する」は、癌に関連する症状、続発性障害又は状態を部分的又は完全に予防、改善、軽減及び／又は管理することを包含する。ここで使用される用語「治療する」は、癌に関連する１以上の症状、続発性障害又は特徴を部分的又は完全に緩和し、改善し、軽減し、その発症を遅らせ、その進行を抑制し、その深刻度を低減し、及び／又はその発生を減少させる目的で、癌に関連する症状、続発性障害又は状態を有する被検体に本開示の１以上の化合物／細胞を適用又は投与することをいう。癌に関連する症状、続発性障害又は状態は、これに限定されないが、発熱、衰弱、疲労、体重の減少、疼痛、咳、出血、皮膚の変化、下痢又は便秘、吐き気、嘔吐及び食欲減退を含む。治療は、癌に関連する症状、続発性障害及び／又は状態の進行のリスクを減少させる目的のために、そのような症状、障害及び／又は状態の初期の兆候のみを示す被検体に施され得る。治療は一般に、その用語がここで定義されるように１以上の症状又は臨床マーカーが低減される場合に「有効」となる。あるいは、治療は、症状、障害又は状態の伝達が軽減又は停止される場合に「有効」となる。
【００２１】
ここでいう用語「有効量」は、所望の反応をもたらすのに充分な量の成分を示す。治療の目的のため、有効量は、治療的に有益な効果が成分の任意の毒性又は有害な効果を上回る量でもある。具体的な有効な又は充分な量は、治療されている特定の状態、患者の肉体的状態（例えば、患者の体重、年齢又は性別）、治療されている哺乳類又は動物の種類、治療の継続期間、（それがある場合には）同時に行われる治療の性質、並びに採用される具体的調剤及び化合物又はその誘導体の構造といった要因とともに変化することになる。有効量は、例えば、細胞数、グラム、ミリグラム若しくはマイクログラムで、又は体重の１キログラムあたりのミリグラム（ｍｇ／Ｋｇ）として表現され得る。あるいは、有効量は、媒体の体積あたりの細胞数などの活性成分（例えば、本改変ＮＫ細胞）の密度で表現されることもあれば、モル濃度、質量濃度、体積濃度、重量モル濃度、モル分率、質量分率及び混合比のような活性成分（例えば、本薬剤）の濃度で表現されることもある。具体的には、ここに記載される薬剤又は改変ＮＫ細胞との関連で使用される用語「治療上有効量」は、被検体における癌に関連する症状を緩和又は改善するのに充分な薬剤又は改変ＮＫ細胞の量をいう。当業者であれば、動物モデルから決定された用量に基づいて（本薬剤などの）医薬品についてのヒト等価用量（ＨＥＤ）を計算できるはずである。例えば、ヒト被検体での使用に対する最大安全投与量を推定する際に、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって発行された工業用ガイダンス「Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓａｆｅ  Ｓｔａｒｔｉｎｇ  Ｄｏｓｅ  ｉｎ  Ｉｎｉｔｉａｌ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｉｎ  Ａｄｕｌｔ  Ｈｅａｌｔｈｙ  Ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ」に従うことができる。
【００２２】
ここで使用されるように、用語「腫瘍関連抗原」すなわち「ＴＡＡ」は、腫瘍／癌細胞の表面に優先的に発現するタンパク質又はポリペプチドを含む。この文脈で用いられる表現「優先的に発現される」は、非腫瘍細胞上の抗原の発現レベルよりも少なくとも１０％高い（例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１５０％、２００％、４００％又はそれ以上の）レベルで抗原が腫瘍細胞上に発現することを意味する。ある実施形態では、抗原は、胃癌、肺癌、膀胱癌、乳癌、肝臓癌、腎癌、結腸癌、直腸癌、子宮頸癌、卵巣癌、脳腫瘍、前立腺癌、肝細胞癌、黒色腫、食道癌、多発性骨髄腫及び頭頸部扁平上皮癌からなる群から選択された腫瘍細胞の表面に優先的に発現する抗原である。
【００２３】
ここで使用されるように、用語「キメラ抗原受容体」すなわち「ＣＡＲ」は、Ｔ細胞又はＮＫ細胞などの細胞に対して抗体の特異性を与えるのに使用される改変受容体のことをいう。より具体的には、改変受容体は、抗原に結合可能な細胞外ドメイン、細胞外ドメインに由来するポリペプチドとは異なるポリペプチドに由来する膜貫通ドメイン、及び少なくとも１つの細胞内ドメインを備える。「キメラ抗原受容体」は、「キメラ受容体」、「Ｔ体」又は「キメラ免疫受容体（ＣＩＲ）」といわれることもある。「抗原に結合可能な細胞外ドメイン」は、所定の抗原に結合することができる任意のオリゴペプチド又はポリペプチドを意味する。「細胞内ドメイン」は、細胞における生物学的プロセスの活性化又は阻害をもたらすシグナルを伝達するドメインとして機能することが知られる任意のオリゴペプチド又はポリペプチドを意味する。「膜貫通ドメイン」は、細胞膜に拡がり、細胞外ドメインとシグナル伝達ドメインを連結するように機能し得るものとして知られる任意のオリゴペプチド又はポリペプチドを意味する。キメラ抗原受容体は、細胞外ドメインと膜貫通ドメインの間のリンカーとして作用する「ヒンジドメイン」を選択的に備え得る。
【００２４】
ここで使用される用語「改変する」、「改変している」又は「改変された」は、バイオテクノロジー技術において一般に知られた、ＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又はタンパク質の生体分子の遺伝子的操作又は変性などの技術をいう。
【００２５】
用語「被検体」は、本発明の方法で治療可能なヒト種を含む哺乳類をいう。用語「被検体」は、ある性別が具体的に示されない限り、雄及び雌の両方をいうものとする。
【００２６】
２．好適な実施形態の詳細な説明
ＴＡＡの発現／過発現は通常、腫瘍形成に関連付けられる。例えば、あるＴＡＡ（例えば、成長因子又はその受容体、シグナル伝達物質、及び転写因子）は細胞の増殖又は侵襲を誘発するものとして知られる一方で、他のＴＡＡ（例えば、サイトカイン又はその受容体及び免疫チェックポイント）は免疫監視を逃れる際に役割を果たす。また、ＴＡＡが癌細胞における化学療法の耐性に関連し得ることも報告されている。ＴＡＡの腫瘍促進性に基づいて、現在の治療の多くは、ＴＡＡ発現を中和又は下方制御して抗腫瘍効果を達成するように開発されている。本発明は、ＴＡＡ発現を誘発する薬剤が腫瘍形成を促進するのではなく免疫療法の抗腫瘍効果を相加的又は相乗的に高め得るという知見に少なくともある程度基づく。
【００２７】
したがって、本開示の第１の態様は、その必要がある被検体、例えば、癌を有する又は有するものと疑われる被検体を治療するための医薬キットに向けられる。本開示の実施形態によると、本医薬キットは、癌におけるＴＡＡの発現レベルを高める第１の薬剤を含む第１の容器、及びＴＡＡを特異的に認識して結合するＣＡＲを有する改変ＮＫ細胞を含む第２の容器を備える。本医薬キットが被検体に投与されると、ＴＡＡ特異的ＣＡＲを有する改変ＮＫ細胞は、そこにＴＡＡが発現した癌細胞を特異的に標的化して破壊することになる。
【００２８】
一般に、癌におけるＴＡＡの発現レベルを高める薬剤は、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害薬、例えば、トリコスタチンＡ、フェニル酪酸、酪酸ナトリウム、バルプロ酸及びスベロイルアニリドヒドロキサム酸であり得る。あるいは、薬剤は、５−アザシチジン、５，６−ジヒドロ−５−アザシチジン、５−アザ−２′−デオキシシチジン、及びアラビノフラノシル−５−アザシトシンなどのＤＮＡ脱メチル化剤であり得る。本開示の効果的な一実施例によると、薬剤は、５−アザシチジンである。本開示の他の効果的な実施例によると、薬剤は、酪酸ナトリウムである。
【００２９】
選択的に、薬剤は、癌におけるＴＡＡ発現（例えば、ＣＥＡ発現）を刺激又は強化する能力を有するポリペプチド、例えば、組換えインターフェロン（例えば、組換えＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β及びＩＦＮ−γ）であり得る。ポリペプチドは、当業者に周知の方法、例えば、そこにポリペプチドを発現及び生成するようにポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを適切な細胞（例えば、２９３Ｔ）に導入することによって調製され得る。あるいは、ポリペプチドは、アルファ−アミノ基のｔ−ＢＯＣ又はＦＭＯＣ保護などの一般に使用される方法によって合成され得る。いずれの方法も、ペプチドのＣ末端から始まる各工程において単一のアミノ酸が添加される段階的合成を伴う。発明のポリペプチドは、公知の固相ペプチド合成法によっても合成可能である。
【００３０】
ＴＡＡの非限定的例は、ＣＥＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ５６、ＣＤ７３、ＣＤ１２３、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌抗原１２５（ＣＡ−１２５、ムチン１６すなわちＭＵＣ１６としても知られる）、ムチン１（ＭＵＣ−１）、ＣＯ１７−１Ａ（ＧＡ７３３、ＫＳ１−４、ＫＳＡ又はＥｐＣＡＭとしても知られる）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、黒色腫関連抗原（ＭＡＡ）、チロシナーゼ、エラスターゼ、カテプシンＧ（ＣａｔＧ）、ウィルムス腫瘍（ＷＴ１）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−５）、インスリン様成長因子受容体１（ＩＧＦ−１Ｒ）、ＬｅｗｉｓＹ抗原、変異型ｐ５３、変異型ｒａｓ、ヒト上皮細胞成長因子受容体２（ＨＥＲ２、Ｎｕｅ、ＥｒｂＢ−２又はＣＤ３４０としても知られる）、上皮細胞成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、ＨＩＶ−１エンベローブ糖タンパクｇｐ１２０、ＨＩＶ−１エンベローブ糖タンパクｇｐ４１、ＧＤ２、ＧＤ３、ｃ−Ｍｅｔ（肝細胞成長因子受容体すなわちＨＧＦ受容体としても知られる）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ヒト内在性レトロウイルス−Ｋ（ＨＥＲＶ−Ｋ）、ＩＬ−１１Ｒ−アルファ、サバイビン、及びコンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）を含む。本開示のある実施形態によると、ＴＡＡはＣＥＡである。
【００３１】
本医薬キットを構成するＮＫ細胞は、好ましくは、癌細胞の対応するＴＡＡを特異的に認識して結合するキメラ受容体をそこに発現させるように改変される。ＮＫ細胞を改変する際に有用な方法は、これに限定されないが、トランスフェクション法（すなわち、物理的及び／又は化学的処理によってポリヌクレオチドをＮＫ細胞に導入すること）、ウイルス形質導入法（すなわち、ウイルス又はウイルスベクターによってポリヌクレオチドをＮＫ細胞に導入すること）及び遺伝子導入法（すなわち、ポリペプチドをＮＫ細胞に導入するように特定の電圧及び試薬をＮＫ細胞に添加すること）を含む。本開示の一実施形態によると、本改変ＮＫ細胞は、レンチウイルスの形質導入によって生成される。
【００３２】
好ましくは、本ＮＫ細胞の各々は、ＣＥＡに特異的なＣＡＲを発現させるように改変され、ＣＡＲは可変ドメイン、ヒンジドメイン及びエフェクタードメインをＮ末端からＣ末端にかけて備える。本開示のある実施形態によると、ＣＥＡを認識する際に有用な可変ドメインは、配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：）１と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を備え、すなわち、ＣＥＡ特異的可変ドメインは、配列番号１と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であり得る。好ましくは、ＣＥＡ特異的可変ドメインのアミノ酸配列は、配列番号１と少なくとも９０％同一である。より好ましくは、ＣＥＡ特異的可変ドメインのアミノ酸配列は、配列番号１と少なくとも９５％同一である。本開示の効果的な一実施例によると、ＣＥＡ特異的可変ドメインは、配列番号１と１００％同一のアミノ酸配列を備える。
【００３３】
ヒンジドメインは、可変ドメインとエフェクタードメインとを連結するリンカーとして作用する。一般に、ヒンジドメインは、ＣＡＲの安定性、発現及び機能に影響し得る。本開示のある実施形態によると、本ＣＡＲのヒンジドメインは、配列番号２と少なくとも８５％同一の、例えば、配列番号２と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を備える。好ましくは、ヒンジドメインのアミノ酸配列は、配列番号２と少なくとも９０％同一である。より好ましくは、ヒンジドメインのアミノ酸配列は、配列番号２と少なくとも９５％同一である。本開示の特定の一実施例によると、ヒンジドメインは、配列番号２と１００％同一のアミノ酸配列を備える。
【００３４】
本ＣＡＲのエフェクタードメインは、ＣＥＡ抑制癌細胞を破壊するＮＫ細胞を誘発する活性化シグナルをＮＫ細胞に伝達する。本開示のある実施形態によると、本ＣＡＲのエフェクタードメインは、配列番号３と少なくとも８５％同一の、例えば、配列番号３と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を備える。好ましくは、エフェクタードメインのアミノ酸配列は、配列番号３と少なくとも９０％同一である。より好ましくは、エフェクタードメインのアミノ酸配列は、配列番号３と少なくとも９５％同一である。本開示の特定の一実施例によると、エフェクタードメインは、配列番号３と１００％同一のアミノ酸配列を備える。
【００３５】
本開示のある実施形態によると、本ＣＡＲは、配列番号４と少なくとも８５％同一の、例えば、配列番号４と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を備える。好ましくは、本ＣＡＲのアミノ酸配列は、配列番号４と少なくとも９０％同一である。より好ましくは、本ＣＡＲのアミノ酸配列は、配列番号４と少なくとも９５％同一である。本開示の効果的な一実施例によると、本ＣＡＲは、配列番号４と１００％同一のアミノ酸配列を備える。
【００３６】
薬剤及び／又は改変ＮＫ細胞を保持するのに適した容器は、ガラス又はプラスチックのような様々な材料から形成され得る。第１の容器は、本薬剤又はその医薬製剤を、癌のＴＡＡ発現を高めるのに有効な量で保持し得る。第２の容器は、本薬剤又はその医薬製剤を、癌を死滅させるのに有効な量で保持し得る。キットは、容器上に又は容器に関連付けてラベル又はパッケージインサートをさらに備え得る。ラベル又はパッケージインサートは、第１及び第２の容器にそれぞれ収容された薬剤及び改変ＮＫ細胞が指定の癌を治療するために使用されることを示す。代替的又は追加的に、キットは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、リンガー溶液又はデキストロース溶液のような医薬的に許容可能な緩衝液を備える第３の容器をさらに備えていてもよい。それは、他の緩衝液、希釈剤、フィルタ、針及びシリンジを含む、商業的及びユーザ視点から所望される他の材料をさらに含んでいてもよい。キットは、薬剤及び改変ＮＫ細胞の投与のための説明書をさらに含んでいてもよい。
【００３７】
本開示の第２の態様は、本医薬キットの使用によって、その必要がある被検体（例えば、癌を患う被検体又は癌を有していると疑われる被検体）を治療する方法に向けられる。方法は、
（ａ）第１の有効量の本薬剤を被検体に投与するステップ、及び
（ｂ）第２の有効量の本改変ＮＫ細胞を被検体に投与するステップ
を備える。
【００３８】
ステップ（ａ）では、本薬剤が被検体に投与されて癌細胞上のＴＡＡ発現を増加させる。ある実施形態によると、被検体はマウスであり、薬剤は１日あたり被検体の体重１Ｋｇあたり０．１ｍｇ〜１Ｋｇの量で投与される（すなわち、０．１ｍｇ〜１Ｋｇ／Ｋｇ／日）。好ましくは、薬剤は、１ｍｇ〜１００ｇ／Ｋｇ／日の量で投与される。より好ましくは、薬剤は、１０ｍｇ〜１０ｇ／Ｋｇ／日の量で投与される。本開示の効果的な一実施例によると、癌細胞上のＴＡＡ発現を増加させることによって本改変ＮＫ細胞の抗腫瘍効果を高めるには１００〜５００ｍｇ／Ｋｇ／日の本薬剤で充分である。
【００３９】
当業者であれば、動物モデルから決定された用量に基づいて薬剤についてのヒト等価用量（ＨＥＤ）を計算できるはずである。したがって、薬剤は、１日あたり被検体の体重１Ｋｇあたり１μｇ〜１００ｇ（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０若しくは９９０μｇ、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０若しくは９９０ｍｇ、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０若しくは１００ｇ）の量でヒトに投与される。好ましくは、薬剤は、１０μｇ〜１０ｇ／Ｋｇ／日の量でヒトに投与される。より好ましくは、薬剤は、１００μｇ〜１０００ｍｇ／Ｋｇ／日の量でヒトに投与される。
【００４０】
あるいは、薬剤は、被検体の体表面に応じて投与されてもよい。例えば、被検体がマウスである場合には、薬剤は１日あたり被検体の体表面１ｍ２あたり０．１ｍｇ〜１Ｋｇ（０．１ｍｇ〜１Ｋｇ／ｍ２／日）の量で投与され得る。この場合、ＨＥＤは、約１μｇ〜１００ｇ／ｍ２／日である。
【００４１】
所望の目的に応じて、薬剤は、任意の適切な経路、例えば、経腸、経口、経鼻、非経口（腫瘍内、筋肉内、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、脳内、脳室内又は髄腔内注入など）、局所性、経粘膜的な投与によって投与され得る。
【００４２】
ＴＡＡ発現を効果的に増加させる目的のため、薬剤は、被検体に１回以上投与され得る。例えば、薬剤は、治療の全過程に対して１回投与され得る。あるいは、薬剤は、少なくとも７日間、例えば、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８日又はそれ以上にわたって毎日被検体に投与され得る。本開示のある実施形態によると、酪酸ナトリウムは、癌細胞上のＴＡＡ発現を高めるように９用量分毎日被検体に投与される。
【００４３】
ステップ（ｂ）では、改変ＮＫ細胞は、１日あたり被検体の体表面１ｍ２あたり１×１０４〜５×１０１１個の細胞（例えば、１×１０４、１．５×１０４、２×１０４、２．５×１０４、３×１０４、３．５×１０４、４×１０４、４．５×１０４、５×１０４、５．５×１０４、６×１０４、６．５×１０４、７×１０４、７．５×１０４、８×１０４、８．５×１０４、９×１０４、９．５×１０４、１×１０５、１．５×１０５、２×１０５、２．５×１０５、３×１０５、３．５×１０５、４×１０５、４．５×１０５、５×１０５、５．５×１０５、６×１０５、６．５×１０５、７×１０５、７．５×１０５、８×１０５、８．５×１０５、９×１０５、９．５×１０５、１×１０６、１．５×１０６、２×１０６、２．５×１０６、３×１０６、３．５×１０６、４×１０６、４．５×１０６、５×１０６、５．５×１０６、６×１０６、６．５×１０６、７×１０６、７．５×１０６、８×１０６、８．５×１０６、９×１０６、９．５×１０６、１×１０７、１．５×１０７、２×１０７、２．５×１０７、３×１０７、３．５×１０７、４×１０７、４．５×１０７、５×１０７、５．５×１０７、６×１０７、６．５×１０７、７×１０７、７．５×１０７、８×１０７、８．５×１０７、９×１０７、９．５×１０７、１×１０８、１．５×１０８、２×１０８、２．５×１０８、３×１０８、３．５×１０８、４×１０８、４．５×１０８、５×１０８、５．５×１０８、６×１０８、６．５×１０８、７×１０８、７．５×１０８、８×１０８、８．５×１０８、９×１０８、９．５×１０８、１×１０９、１．５×１０９、２×１０９、２．５×１０９、３×１０９、３．５×１０９、４×１０９、４．５×１０９、５×１０９、５．５×１０９、６×１０９、６．５×１０９、７×１０９、７．５×１０９、８×１０９、８．５×１０９、９×１０９、９．５×１０９、１×１０１０、１．５×１０１０、２×１０１０、２．５×１０１０、３×１０１０、３．５×１０１０、４×１０１０、４．５×１０１０、５×１０１０、５．５×１０１０、６×１０１０、６．５×１０１０、７×１０１０、７．５×１０１０、８×１０１０、８．５×１０１０、９×１０１０、９．５×１０１０、１×１０１１、１．５×１０１１、２×１０１１、２．５×１０１１、３×１０１１、３．５×１０１１、４×１０１１、４．５×１０１１又は５×１０１１個の細胞）の量で被検体に投与される。
【００４４】
本開示のある実施形態によると、被検体はマウスである。ある実施形態では、改変ＮＫ細胞は、１日あたり被検体の体表面１ｍ２あたり１×１０６〜５×１０１１個の細胞、好ましくは、１日あたり被検体の体表面１ｍ２あたり１×１０７〜５×１０１０個の細胞、より好ましくは、１日あたり被検体の体表面１ｍ２あたり１×１０８〜５×１０９個の細胞の量で被検体に投与される。改変ＮＫ細胞は、４週間にわたって１週あたり２〜４回（例えば、２、３又は４回、好ましくは２回）被検体に投与され、又は第１週に４〜６回（例えば、４、５又は６回、好ましくは５回）、第２週に１〜３回（例えば、１、２又は３回、好ましくは２回）及び第３週に１〜３回（例えば、１、２又は３回、好ましくは１回）被検体に投与され得る。あるいは、改変ＮＫ細胞は１日あたり１×１０４〜１×１０１１個の細胞、好ましくは、１日あたり１×１０５〜１×１０１０個の細胞、より好ましくは、１日あたり１×１０６〜１×１０９個の細胞の量で被検体に投与されてもよく、ここで、改変ＮＫ細胞は少なくとも１カ月にわたって５〜８日毎に１回（例えば、５、６、７又は８日毎に１回）被検体に投与されてもよい。効果的な一実施例によると、改変ＮＫ細胞は、４日毎に１回被検体に投与される。
【００４５】
被検体がヒトである場合、改変ＮＫ細胞は、１日あたり被検体の体表面１ｍ２あたり１〜５×１０９個の細胞の量で投与される。ある実施形態によると、改変ＮＫ細胞は、２日間連続で被検体に投与される。ある実施形態によると、改変ＮＫ細胞は、治療間に約１２時間から数ヵ月の間隔をおいて１以上の治療周期で被検体に投与される。所望の効果に応じて、治療の間隔は、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２若しくは２３時間、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０若しくは２５日又は１、２、３、４カ月若しくはそれ以上であり得る。好ましくは、改変ＮＫ細胞は、治療の各周期の１、３及び５日目に被検体に投与される。例えば、改変ＮＫ細胞は、治療の１日目に１×１０９個の細胞／ｍ２体表面、治療の３日目に３×１０９個の細胞／ｍ２体表面、及び治療の５日目に５×１０９個の細胞／ｍ２体表面の量で被検体に投与され得る。
【００４６】
あるいは、本薬剤及び改変ＮＫ細胞の実際の投与量は、被検体の肉体的及び生理的因子に基づいて主治医によって決定され得るものであり、それらの因子は、これに限定されないが、年齢、性別、体重、体表面、治療される疾患、状態の深刻度、既往歴、他の薬剤の存在、投与の経路などを含む。
【００４７】
非限定的な投与の経路は、これに限定されないが、経腸、経口、経鼻、非経口、局所性又は経粘膜的投与を含み、非経口投与は、腫瘍内、筋肉内、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、脳内、脳室内又は髄腔内の注入のいずれかであり得る。
【００４８】
本開示の実施形態によると、そこに発現したＴＡＡ特異的ＣＡＲを有する改変ＮＫ細胞は、本薬剤で治療又は前治療された癌細胞への結合親和性及び特異性を示す。これらの実施形態では、本薬剤は、本改変ＮＫ細胞の抗腫瘍効果を相加的又は相乗的に高め得る。
【００４９】
理解されるように、本薬剤は、改変ＮＫ細胞の投与前又は投与と同時に被検体に投与され得る。好ましくは、本薬剤は、改変ＮＫ細胞の治療の前に被検体に投与される。選択的に、本薬剤は少なくとも２つの独立した投与量で投与され、改変ＮＫ細胞の治療が続く。例えば、各投与量が約１日間隔で投与される場合に、本薬剤が３、４、５、６、７、８、９、１０回又はそれ以上被検体に投与されてから、１、２、３回又はそれ以上にわたって改変ＮＫ細胞を投与され得る。
【００５０】
本医薬キット及び／又はキットによって治療可能な癌は、化学療法（例えば、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ））、放射線療法（例えば、紫外線（ＵＶ）照射）又は免疫療法（例えば、養子免疫細胞療法（ＡＩＴ））に耐性があり得る。したがって、本医薬キット及び／又は方法は、癌療法に対して耐性を生じる癌患者を治療する有望な手段を提供する。
【００５１】
あるいは、本改変ＮＫ細胞は、本薬剤の治療（例えば、併用治療又は前治療）なしに独立して癌患者に投与され得る。より具体的には、癌患者におけるＴＡＡ発現が健康な被検体におけるものよりも高い場合には、癌患者は薬剤の投与なしに本改変ＮＫ細胞で直接治療可能となる。例えば、癌患者におけるＣＥＡ発現レベルが健康な被検体と比較して増加する場合には、ＣＥＡ特異的ＣＡＲを備える改変ＮＫ細胞（例えば、ＣＡＲは配列番号１のアミノ酸配列を備える可変ドメインを備える）は、ＣＥＡ発現癌細胞を消滅させるように癌患者に投与され得る。
【００５２】
本改変ＮＫ細胞、医薬キット及び／又はキットによって治療可能な例示の癌は、これに限定されないが、胃癌、肺癌、膀胱癌、乳癌、肝臓癌、腎癌、結腸癌、直腸癌、子宮頸癌、卵巣癌、脳腫瘍、前立腺癌、肝細胞癌、黒色腫、食道癌、多発性骨髄腫及び頭頸部扁平上皮癌を含む。本開示の具体的な一実施例によると、癌は、結腸癌又は直腸癌である。
【００５３】
基本的に、被検体は哺乳類、例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ヤギ、サル及びウマである。好ましくは、被検体は、ヒトである。
【００５４】
以下の実施例は、本発明の所定の態様を説明して本発明の実施の際に当業者を補助するために提供される。これらの実施例は、いかなる態様においても発明の範囲を限定するものとしてみなされるべきではない。更なる詳述なしに、当業者であれば、ここでの説明に基づいて、本発明をその最大の範囲で利用することができるはずである。ここに引用される全ての刊行物は、その全体において参照によってここに取り込まれる。
【実施例】
【００５５】
材料及び方法
ＮＫ９２ＭＩ−ＣＥＡ細胞の調製
ＮＫ９２ＭＩ−ＣＥＡ細胞を以下の説明によって生成した。ｍＡｂＴ８４．６６の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域をそれぞれコードする配列をオーバーラップＰＣＲ反応によって増幅及び構築した。抗ＣＲＡ  ｓｃＦｖフラグメント及びＣＤ８α（アミノ酸１０５−１６５）のヒンジ領域をコードする配列を、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−ＨＩＳ（著作権）ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡにクローニングした。完全なＣＡＲ配列は、結果として得られるｐｃＤＮＡ３．１−ｓｃＦｖ（抗ＣＥＡ）−ＣＤ８ａ−ＣＤ３ｚ構築物に由来し、変性レトロウイルスｐＬＮＣＸベクターにクローニングされ、それは組換えレトロウイルスベクターｐＬＮＣＸ−ｓｃＦｖ（抗ＣＥＡ抗体）−ＣＤ８α−ＣＤ３ζを生成するようにＳｆｉＩ及びＣｌａＩクローニング部位を介してリーダー配列及びＨＡタグを備えていた。その後、ｐＬＮＣＸ−ｓｃＦｖ（抗ＣＥＡ抗体）−ＣＤ８α−ＣＤ３ζを、ｐＶＳＶ−Ｇプラスミド（エンベローププラスミド）とともにパッケージング細胞株ＧＰ２−２９３に共トランスフェクトした。レトロウイルス粒子を含有する上清を、トランスフェクションの４８時間後に培地から収穫し、０．４５μｍ低タンパク質結合フィルタでフィルタ処理した。次に、フィルタ処理済み上清を、ポリブレン（５μｇ／ｍＬ）の存在下でＮＫ９２ＭＩ細胞株に添加した。形質導入されたＮＫ９２ＭＩ細胞を３８℃で２４時間にわたってインキュベートした後、腫瘍抗原ＣＥＡに特異的なＣＡＲ（配列番号４）を有するＮＫ９２ＭＩ−ＣＥＡ細胞を生成するように硫酸ネオマイシンＧ４１８（５００ｍｇ／ｍｌ）によってスクリーニングした。
【００５６】
細胞培養
ヒト結腸癌細胞株ＬＳ１７４Ｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＬ−１８８（商標））及びＷｉＤｒ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＬＬ−２１８（商標））を、１．５ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム及び１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するアルファ改変型のイーグル最小必須培地（α−ＭＥＭ）において維持した。ＨＣＴ１１６細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−２４７（商標））を、１．５ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム、４．５ｇ／Ｌのグルコース、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１．０ｍＭのピルビン酸ナトリウム及び１０％ＦＢＳを含有するマッコイ５Ａ培地において培養した。ＮＫ９２ＭＩ及びＮＫ９２ＭＩ−ＣＥＡ細胞を、１．５ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム、０．２ｍＭのイノシトール、０．０２ｍＭの葉酸、０．０１ｍＭの２−メルカプトエタノール、１０％ＦＢＳ及び１２．５％ウマ血清が補充されたα−ＭＥＭにおいて培養した。全ての細胞を５％ＣＯ２による加湿インキュベータにおいて３７℃でインキュベートした。
【００５７】
ＣＥＡ発現の測定
癌細胞上のＣＥＡの発現レベルをフローサイトメトリーによって測定した。癌細胞をヒトＣＥＡ特異抗体で染色し、フローサイトメトリーの解析が続く。少なくとも１０５個の細胞の蛍光強度を記録し、ソフトウェアによって解析した。幾何平均を平均蛍光強度（ＭＦＩ）として選択した。
【００５８】
細胞毒性アッセイ
この実験では、癌細胞（すなわち、ＨＣＴ１１６又はＷｉＤｒ細胞）及びＮＫ細胞（すなわち、ＮＫ９２ＭＩ又はＮＫ９２ＭＩ−ＣＥＡ細胞）が、それぞれ標的細胞及びエフェクター細胞として作用した。簡単に説明すると、標的細胞を、丸底９６ウェル培養プレートにおいて、１０：１、５：１、１：１及び０．５：１を含む種々のエフェクター／標的比（Ｅ／Ｔ）で共インキュベートした。３７℃で２４時間インキュベートした後、５０μｌの上清を単離し、平底９６ウェル酵素アッセイプレートにおいて５０μｌのＣＹＴＯＴＯＸ９６（登録商標）試薬と混合した。混合物を室温で３０分間インキュベートした後に５０μｌの停止溶液（Ｈ２ＳＯ４）を添加して反応を停止させた。吸光度を４９０ｎｍで測定した。各エフェクター：標的細胞比に対する細胞毒性の割合を以下の式によって計算した。
（実験試料−培養培地バックグラウンド）−（エフェクター細胞自然放出−培養培地バックグラウンド）−（標的自然放出−培養培地バックグラウンド）／（標的最大放出−液量補正対照−標的自然放出−培養培地バックグラウンド）×１００
【００５９】
動物実験
２×１０６個のＷｉＤｒ細胞を９週齢のＳＣＩＤマウスの背中に皮下注入した。腫瘍が１００〜２００ｍｍ３の体積に達した場合、マウスは連続５日間にわたって２００ｍｇ／ｋｇの酪酸ナトリウムを腹腔内に投与された。その後、マウスを５つのグループに割り当てた：（１）マウスが毎日ＰＢＳを経口投与され、４日毎にＰＢＳを腹腔内投与された、対照グループ、（２）マウスが毎日５ｇ／ｋｇの酪酸ナトリウムを経口投与され、４日毎にＰＢＳを腹腔内投与された、ＮａＢグループ、（３）マウスが毎日ＰＢＳを経口投与され、４日毎にＮＫ９２ＭＩ細胞を腹腔内投与された、ＮＫ９２ＭＩグループ、（４）マウスが毎日ＰＢＳを経口投与され、４日毎にＮＫ９２ＭＩ−ＣＥＡ細胞を腹腔内投与された、ＮＫ９２ＭＩ−ＣＥＡグループ、及び（５）マウスが毎日５ｇ／ｋｇの酪酸ナトリウムを経口投与され、４日毎にＮＫ９２ＭＩ−ＣＥＡを腹腔内投与された、ＮＫ９２ＭＩ−ＣＥＡ＋ＮａＢグループ。マウスの腫瘍体積を２〜３日毎に測定し、腫瘍体積を以下の式を用いて計算した。
長さ×幅２÷２（＊ｐ＜０．０５）
【００６０】
統計
生体内実験について、腫瘍体積を、複数の比較のためにボンフェローニのポストホックテストによる一元配置分散分析テストを用いて比較した。
【実施例１】
【００６１】
実施例１  ＣＥＡ発現と薬剤耐性の相関
ＣＥＡの発現は化学療法の耐性に相関付けられることが報告された。５−フルオロウラシル耐性におけるＣＥＡ過発現の効果をこの実施例において調査した。
【００６２】
ＨＣＴ１１６及びＷｉＤｒ細胞を、酪酸ナトリウム（０．１ｍＭ）又は５−アザシチジン（１μＭ）及び異なる濃度の５−フルオロウラシル（１．２、２．４、４．８、９．６及び１９．２μＭ）で７２時間にわたって併用治療した。５−フルオロウラシル治療のみと比べて、５−ＦＵのＩＣ５０値は、酪酸ナトリウム又は５−アザシチジンで併用治療された細胞において高かった（表１及び２）。データは、５−アザシチジン又は酪酸ナトリウムは癌細胞における薬剤耐性を誘発したことを示した。
【表１】
2020530485.tif 000003
【表２】
2020530485.tif 000004
【実施例２】
【００６３】
実施例２  ＣＥＡ発現陽性の癌細胞に対するＮＫ９２ＭＩ−ＣＥＡ細胞の効果
ＣＥＡの発現が改変ＮＫ細胞の細胞毒性効果に影響するか否かを評価するため、まず、ＨＣＴ細胞、ＷｉＤｒ細胞及びＬＳ１７４Ｔ細胞に対して、ＣＥＡ発現を測定するフローサイトメトリーを行った。図１に示すように、ＬＳ１７４Ｔは、ＨＣＴ１１６及びＷｉＤｒ細胞と比較して最も高いＣＥＡ発現を有した。そして、当該３個の癌細胞株に対するＮＫ９２ＭＩ−ＣＥＡ細胞の細胞毒性効果が、図１において測定されたようにそれらのそれぞれのＣＥＡ発現レベルで相関付けられ、溶解されたＬＳ１７４Ｔの割合がこれら３種の細胞の中で非常に高かったことが見出された（図２）。
【００６４】
結果は、ＮＫ９２ＭＩ−ＣＥＡ細胞がＣＥＡ発現癌細胞に対して結合親和性及び細胞毒性を示し、細胞毒性効果はＣＥＡ発現レベルに陽性相関したことを示した。
【実施例３】
【００６５】
実施例３  抗癌剤で前治療された癌細胞に対するＮＫ９２ＭＩ−ＣＥＡ細胞の効果
この実施例では、癌細胞が、ＮＫ９２ＭＩ−ＣＥＡ細胞の治療を受ける前に、まず種々の種類の抗癌剤で治療された。データは、所定の抗癌剤（例えば、５−アザシチジン及び酪酸ナトリウム）が化学療法及び放射線療法に耐性のある癌細胞をもたらしたことを示した（データ不図示）。ただし、癌治療耐性がＣＥＡ発現に関係したことも発見された（データ不図示）。結果によると、５−アザシチジン又は酪酸ナトリウムの投与は、癌細胞上のＣＥＡ発現を大幅に増加させた（データ不図示）。
【００６６】
結果に基づいて、５−アザシチジン又は酪酸ナトリウムで治療されたＨＣＴ１１６細胞を、１０：１、５：１、１：１又は０．５：１のエフェクター／標的比（Ｅ／Ｔ比）でＮＫ９２ＭＩ−ＣＥＡ細胞と共培養した。対照グループ（すなわち、ＨＣＴ１１６及び未改変ＮＫ細胞の共インキュベーション）及び未治療グループ（すなわち、ＨＣＴ１１６及び改変ＮＫ細胞の共インキュベーション）と比較すると、５−アザシチジン（図３Ａ）又は酪酸ナトリウム（図３Ｂ）の投与は、ＮＫ９２ＭＩ−ＣＥＡ細胞の細胞毒性効果を大幅に高めた。
【実施例４】
【００６７】
実施例４  動物モデルにおけるＮＫ９２ＭＩ−ＣＥＡ細胞の効果
ＮＫ９２ＭＩ−ＣＥＡ細胞の生体内抗腫瘍活性をこの実施例において評価した。マウスを「材料及び方法」に従って治療し、データを図４Ａ〜４Ｃに示した。
【００６８】
図４Ａのデータは、対照グループ、ＮａＢグループ及びＮＫ９２ＭＩグループと比較して、ＮＫ９２ＭＩ−ＣＥＡ細胞の治療は腫瘍の成長を大幅に抑制したことを示した。また、酪酸ナトリウムの併用治療はＮＫ９２ＭＩ−ＣＥＡ細胞の抗腫瘍効果を明らかに高めたことが注記される。
【００６９】
図４Ｂに示すデータのように、酪酸ナトリウム又はＮＫ９２ＭＩ細胞の治療は、対照グループと比較して腫瘍の成長を明らかには抑制しなかった。しかし、腫瘍サイズは、ＮＫ９２ＭＩ−ＣＥＡ細胞での治療によって大幅に低減され、ＮＫ９２ＭＩ−ＣＥＡ細胞及び酪酸ナトリウムの合併治療に応じてさらに低減された。
【００７０】
ＥＬＩＳＡデータは、酪酸ナトリウム、酪酸ナトリウムのみ又は酪酸ナトリウムとＮＫ９２ＭＩ−ＣＥＡ細胞の組合せのいずれかを受けたマウスにおける血清循環ＣＥＡ（ｃＣＥＡ）の発現レベルは対照マウス（すなわち、ＰＢＳ、ＮＫ９２ＭＩ細胞又はＮＫ９２ＭＩ−ＣＥＡ細胞で治療されたマウス）のものよりも高かったことを示した（図４Ｃ）。マウスの血清におけるｃＣＥＡの濃度はそれぞれ、５２０ｐｇ／ｍｌ（対照グループ）、９９０ｐｇ／ｍｌ（ＮａＢグループ）、２００ｐｇ／ｍｌ（ＮＫ９２ＭＩグループ）、５４０ｐｇ／ｍｌ（ＮＫ９２ＭＩ−ＣＥＡグループ）及び８７０ｐｇ／ｍｌ（ＮＫ９２ＭＩ−ＣＥＡ＋ＮａＢグループ）であった。
【００７１】
結論として、本開示は、治療される癌細胞上のＴＡＡ（例えば、ＣＥＡ）発現を増加させることができる薬剤（例えば、５−アザシチジン又は酪酸ナトリウム）を含む第１のユニット、及びＴＡＡ（例えば、ＮＫ９２ＭＩ−ＣＥＡ細胞）に特異的な受容体を発現させるように改変されたＮＫ細胞を含む第２のユニットを備える医薬キットを提供する。本医薬キットは癌、特に従来の癌治療に反応しない癌を治療し、したがって、癌患者の生活の質又は寿命を改善する有望な手段を提供するのに有用である。
【００７２】
実施形態の上記説明は例示のみのために与えられること及び種々の変形が当業者によってなされ得ることが理解されるはずである。上記仕様、実施例及びデータは、発明の例示的実施形態の構造及び使用の完全な説明を与える。発明の種々の実施形態がある程度の特殊性で又は１以上の個別の実施形態を参照して上述されたが、当業者であれば、本発明の趣旨又は範囲から逸脱することなく開示の実施形態に対して多数の変更を行うことができるはずである。
【図１】
2020530485.tif 000005
【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年3月30日(2020.3.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体における癌を治療するための医薬キットであって、
前記癌における腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の発現を増加させる薬剤を含む第１の容器と、
前記ＴＡＡに特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を有する改変ナチュラルキラー細胞を含む第２の容器と、
を具備する医薬キット。
【請求項２】
前記ＴＡＡが癌胎児性抗原（ＣＥＡ）であり、
前記ＣＡＲが、配列番号１と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を具備する可変ドメインを具備する、
請求項１に記載の医薬キット。
【請求項３】
前記ＣＡＲは、前記可変ドメインのＣ末端に配置されたヒンジドメイン及びエフェクタードメインをさらに具備し、前記ヒンジドメイン及び前記エフェクタードメインは、配列番号２及び３と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列をそれぞれ具備する、請求項２に記載の医薬キット。
【請求項４】
前記ＴＡＡがＣＥＡであり、
前記ＣＡＲが、配列番号４と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を具備する、
請求項１に記載の医薬キット。
【請求項５】
前記薬剤は、５−アザシチジン、５、６−ジヒドロ−５−アザシチジン、５−アザ−２′−デオキシシチジン、アラビノフラノシル−５−アザシトシン、トリコスタチンＡ、フェニル酪酸、酪酸ナトリウム、バルプロ酸、及びスベロイルアニリドヒドロキサム酸からなる群から選択される、請求項１に記載の医薬キット。
【請求項６】
前記癌は、胃癌、肺癌、膀胱癌、乳癌、肝臓癌、腎癌、結腸癌、直腸癌、子宮頸癌、卵巣癌、脳腫瘍、前立腺癌、肝細胞癌、黒色腫、食道癌、多発性骨髄腫及び頭頸部扁平上皮癌からなる群から選択される、請求項１に記載の医薬キット。
【請求項７】
前記癌は、化学療法、放射線療法又は免疫療法に対して耐性がある、請求項６に記載の医薬キット。
【請求項８】
被検体における癌を治療するための医薬品の調製のための薬剤及び改変ナチュラルキラー細胞の組合せの使用法であって、前記薬剤が前記癌における腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の発現を増加させ、前記改変ナチュラルキラー細胞は前記ＴＡＡに特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を有する、使用法。
【請求項９】
前記ＴＡＡが癌胎児性抗原（ＣＥＡ）であり、
前記ＣＡＲが、配列番号１と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を具備する可変ドメインを具備する、
請求項８に記載の使用法。
【請求項１０】
前記ＣＡＲは、前記可変ドメインのＣ末端に配置されたヒンジドメイン及びエフェクタードメインをさらに具備し、前記ヒンジドメイン及び前記エフェクタードメインは、配列番号２及び３と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列をそれぞれ具備する、請求項９に記載の使用法。
【請求項１１】
前記ＴＡＡがＣＥＡであり、
前記ＣＡＲが、配列番号４と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を具備する、
請求項８に記載の使用法。
【請求項１２】
前記薬剤は、５−アザシチジン、５、６−ジヒドロ−５−アザシチジン、５−アザ−２′−デオキシシチジン、アラビノフラノシル−５−アザシトシン、トリコスタチンＡ、フェニル酪酸、酪酸ナトリウム、バルプロ酸、及びスベロイルアニリドヒドロキサム酸からなる群から選択される、請求項８に記載の使用法。
【請求項１３】
前記癌は、胃癌、肺癌、膀胱癌、乳癌、肝臓癌、腎癌、結腸癌、直腸癌、子宮頸癌、卵巣癌、脳腫瘍、前立腺癌、肝細胞癌、黒色腫、食道癌、多発性骨髄腫及び頭頸部扁平上皮癌からなる群から選択される、請求項８に記載の使用法。
【請求項１４】
前記癌は、化学療法、放射線療法又は免疫療法に対して耐性がある、請求項１３に記載の使用法。
【国際調査報告】
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