(57)【要約】  循環血清ベースのマイクロRNAを同定、検証、確認するためのバイオマーカー及び方法。このマイクロRNA(PARKmiR)は、アルツハイマー病(AD)に罹患している患者を、非AD患者と識別するために使用され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト患者においてアルツハイマー病を決定するための方法であって:
前記ヒト患者からのサンプルを用意する工程、及び
前記サンプル中の、配列番号22、25、及び77の群から選択される少なくとも1種のmiRNAの存在を決定する工程
を含む方法。
【請求項２】
前記サンプル中の、残りの配列番号22、25、又は77並びに配列番号2〜21、23、24、26〜76、及び78〜86からなる群から選択される少なくとも1種のさらなるmiRNAの存在を決定する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記サンプル中の、残りの配列番号22、25、又は77並びに配列番号2、3、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、24、27、28、31、30、32、33、37、38、40、42、43、44、46、47、48、49、50、51、55、56、57、58、59、60、62、63、64、67、68、71、72、74、75、78、80、81、85、及び86からなる群から選択される少なくとも1種のさらなるmiRNAの存在を決定する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記サンプル中の、残りの配列番号22、25、又は77並びに配列番号配列番号4、17、18、19、20、21、23、26、29、34、35、36、39、45、52、53、54、61、65、66、69、70、73、76、79、82、83、及び84からなる群から選択される少なくとも1種のさらなるmiRNAの存在を決定する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
前記サンプル中の、残りの配列番号22、25、又は77並びに配列番号15、21、24、52、54、及び55からなる群から選択される少なくとも1種のさらなるmiRNAの存在を決定する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
前記サンプル中の、残りの配列番号22、25、又は77並びに配列番号2〜21、23、24、26〜76、及び78〜86からなる群から選択される少なくとも2種のさらなるmiRNAの存在を決定する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
前記サンプル中の、残りの配列番号22、25、又は77並びに配列番号2、3、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、24、27、28、31、30、32、33、37、38、40、42、43、44、46、47、48、49、50、51、55、56、57、58、59、60、62、63、64、67、68、71、72、74、75、78、80、81、85、及び86からなる群から選択される少なくとも2種のさらなるmiRNAの存在を決定する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
前記サンプル中の、残りの配列番号22、25、又は77並びに配列番号4、17、18、19、20、21、23、26、29、34、35、36、39、45、52、53、54、61、65、66、69、70、73、76、79、82、83、及び84からなる群から選択される少なくとも2種のさらなるmiRNAの存在を決定する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
前記サンプル中の、残りの配列番号22、25、又は77並びに配列番号15、21、24、52、54、及び55からなる群から選択される少なくとも2種のさらなるmiRNAの存在を決定する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
前記サンプルが、血清、血漿、又は全血である、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記miRNAの存在が、qRT-PCRを使用して決定される、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記miRNAの存在が、標識されたアンチセンスヌクレオチド配列を使用して決定される、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記miRNAの存在が、標識された抗体を使用して決定される、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
標識された抗体が、モノクローナルである、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記miRNAの存在が、マイクロアレイプロファイリングを使用して決定される、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記miRNAの存在が、ハイスループットNGSシーケンシングを使用して決定される、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
サンプルが、ヒトの体外で、前記miRNAを決定するために用意され、前記決定の結果は、患者に伝えられる、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記サンプル中の、配列番号22、25、及び77からなる群から選択される少なくとも2種のmiRNAの存在を決定する工程を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１９】
前記少なくとも2種のmiRNAが、配列番号22及び25を含む、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
前記少なくとも2種のmiRNAが、配列番号22及び77を含む、請求項18に記載の方法。
【請求項２１】
前記少なくとも2種のmiRNAが、配列番号25及び77を含む、請求項18に記載の方法。
【請求項２２】
前記サンプル中の、配列番号22、25、及び77のそれぞれの存在を決定する工程を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項２３】
配列番号15及び22の存在を決定する工程を含む、請求項2に記載の方法。
【請求項２４】
配列番号21及び22の存在を決定する工程を含む、請求項2に記載の方法。
【請求項２５】
配列番号22及び24の存在を決定する工程を含む、請求項2に記載の方法。
【請求項２６】
配列番号22及び52の存在を決定する工程を含む、請求項2に記載の方法。
【請求項２７】
配列番号22及び54の存在を決定する工程を含む、請求項2に記載の方法。
【請求項２８】
配列番号22及び55の存在を決定する工程を含む、請求項2に記載の方法。
【請求項２９】
配列番号15及び25の存在を決定する工程を含む、請求項2に記載の方法。
【請求項３０】
配列番号21及び25の存在を決定する工程を含む、請求項2に記載の方法。
【請求項３１】
配列番号24及び25の存在を決定する工程を含む、請求項2に記載の方法。
【請求項３２】
配列番号25及び52の存在を決定する工程を含む、請求項2に記載の方法。
【請求項３３】
配列番号25及び54の存在を決定する工程を含む、請求項2に記載の方法。
【請求項３４】
配列番号25及び55の存在を決定する工程を含む、請求項2に記載の方法。
【請求項３５】
配列番号15及び77の存在を決定する工程を含む、請求項2に記載の方法。
【請求項３６】
配列番号21及び77の存在を決定する工程を含む、請求項2に記載の方法。
【請求項３７】
配列番号24及び77の存在を決定する工程を含む、請求項2に記載の方法。
【請求項３８】
配列番号52及び77の存在を決定する工程を含む、請求項2に記載の方法。
【請求項３９】
配列番号54及び77の存在を決定する工程を含む、請求項2に記載の方法。
【請求項４０】
配列番号55及び77の存在を決定する工程を含む、請求項2に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
1.発明の分野
本発明は、概して、アルツハイマー病に罹患している患者を識別することに加えて、臨床医がこのような患者に対する治療プロトコールを決定することを支援するための血清ベースのマイクロRNA及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
2.背景技術の簡単な説明
アルツハイマー病(AD)は、最も一般的な神経変性疾患であり、症状軽減のみのために利用できる治療を受けている個人の記憶及び他の認識能力の喪失を特徴とする。アルツハイマー病は、気分変化、挙動変化、発語困難、嚥下困難、歩行困難、失見当識、及びより重篤な記憶喪失を含む症状が、次第に重症化して進行する進行性疾患である。使用されている薬物の組合せは、一時的に症状を緩和するのみであるが、神経細胞死の過程を逆行させることはできない。AD診断のための客観的試験も、確立されたバイオマーカーも存在しない。さらに、この疾患の多様性、亜型、及び進行によって、特定の治療効果のある候補物質を開発することは一層複雑になっている。このため、治療剤の有効性を増大させるためには、早期に疾患を診断することが肝要である。
【０００３】
AD及びAD関連認知症は、現時点で、世界中の約4千4百万人が罹患している。治療初期の数年は、AD患者の効果的な管理が可能であり、その後、衰弱性であることが多い一連の合併症が生じる。ADに対する現行の治療には、特定の症状を治療するための、コリンエステラーゼ阻害薬、抗うつ薬、抗不安薬、抗精神病薬、及び鎮静剤を含む多剤レジメンが含まれる。β-アミロイド、β-セクレターゼ、タウタンパク質、炎症、及び5HT6受容体等を含むAD関連タンパク質並びに過程を標的とすることによって、この疾患の過程自体を変化させることができる多くの新薬が開発されつつある。
【０００４】
脳内では、神経細胞が、シナプスにおいて連結し、情報伝達しており、シナプスでは、神経伝達物質と呼ばれる化合物の極小さなバーストが、1つの細胞から別の細胞に情報を伝えている。神経細胞は、アルツハイマー病によって破壊される主な細胞である。したがって、アルツハイマー病は、シナプスを破壊し、神経細胞を死滅させて、脳の情報伝達ネットワークを損ない、最終的に破壊する。
【０００５】
現行のFDA承認アルツハイマー病薬は、2つの異なる機構を介して、この情報伝達過程を維持する:
1)コリンエステラーゼ阻害薬は、重要な神経伝達物質を分解する過程を遅延させることによって作用する。具体的には、コリンエステラーゼ阻害薬は、アルツハイマー病によって、脳内で枯渇した神経伝達物質であるアセチルコリンを提供することで細胞間伝達のレベルを上昇させる。ドネペジル、ガランタミン、及びリバスチグミンは、コリンエステラーゼ阻害薬である。
2)メマンチンは、NMDA(N-メチル-D-アスパラギン酸)受容体アンタゴニストであり、脳内の神経伝達物質であるグルタミン酸塩の活性を調節することによって作用する。細胞表面のNMDA受容体にグルタミン酸塩が付着することによって、細胞へのカルシウム移行が可能となる。この過程は、細胞のシグナル伝達に加えて、学習及び記憶のために重要である。アルツハイマー病では、過剰なグルタミン酸塩が、損傷した細胞から放出され、慢性的なカルシウムへの過剰曝露を招くことがあり、これは、細胞損傷を速める可能性がある。メマンチンは、NMDA受容体を部分的に遮断することによって、この破壊的な事象の連鎖を防ぐことに役立つ。
【０００６】
コリンエステラーゼ阻害薬及びメマンチンの効果は、集団中で大幅に変動するが、治療剤の有効性を増大させるためには、早期にADの個人を診断することが肝要である。しかし、AD診断のための客観的試験も、確立されたバイオマーカーも存在しない。加えて、この疾患の多様性、亜型、及び進行によって、特定の治療効果のある候補物質を開発することは困難になっている。
【０００７】
マイクロRNA(「miRNA」)は、遺伝子発現の調節において重要な役割を果たす非コードRNAのクラスである。miRNAは、転写後の段階で働き、哺乳動物のタンパク質をコードしている遺伝子全ての30%ほどの発現を微調整する。成熟miRNAは、短い一本鎖RNA分子であり、約22ヌクレオチド長である。miRNAは、複数の遺伝子座によってコードされていることがあり、直列的に同時転写されたクラスター内に構成されることがある。miRNA遺伝子は、RNAポリメラーゼIIによって転写され、大きな一次転写産物(pri-マイクロRNA)となり、これは、リボヌクレアーゼIII酵素であるDrosha、DGCR8、及び他の補因子を含有するタンパク質複合体によって処理され、約70ヌクレオチドの前駆体マイクロRNA(pre-miRNA)を形成する(Cathew RW、Cell、2009年; Kim VN、Nat Rev Mol Cel Biol、2009年; Siomi H、Mol Cel、2010年; Bartel DP、Cell、2004年; Lee Y、Nature 2003年; Han J、Genes Dev、2004年)。pre-miRNAは、エクスポーチン5によって細胞質に輸送され、ここで、RNA誘導サイレンシング複合体(RNA Induced Silencing Complex)中のTRBP、PACT、及びAgo2と共に、第2のリボヌクレアーゼIII酵素であるDICERによって処理され、二本鎖miRNAとなる(Kim VN、Nat Rev Mol Cel Biol、2009年; Gregory RI、Nature 2004年; MAcRae IJ、PNAS、2008年)。二本鎖miRNAのガイド鎖は、分離し、Ago2と会合してリボ核粒子(ribonuclear particle)に取り込まれ、遺伝子サイレンシングを媒介するRNA誘導サイレンシング複合体であるRISCを形成する。miRNAの機構は、mRNAの直接的な分解又はサイレンシング及び翻訳の抑制から、転写後のアップレギュレーションにわたる。(MacRae IJ、PNAS、2008年)
【０００８】
miRNAは、血液、脳脊髄液(CSF)、血漿、血清、及び唾液を含む体液中に、検出可能なレベルで存在することが報告されている。miRNAの組織特異性は、様々な生理学的過程における、その極めて重要で不可欠な役割を示唆する。その組織濃縮によって、診断用バイオマーカー及び潜在的な治療標的としての新しいがあまり研究されていない役割が見込まれる。血中のmiRNAは、細胞溶解若しくはアポトーシスの結果として生じる損傷した組織からの受動的な漏出、エクソソームなどの微小胞を介した細胞からの能動輸送、又はRISCタンパク質複合体内への結合に由来することが理解されている(Etheridge他、2011年)。エクソソーム及び浸透圧ポンプによって媒介される、小RNA分子の脳及びCNSへの送達は、それぞれmiRNAに基づく治療法の限界を克服する解決策を提供する(Alvarez-Erviti他、2011年; Koval他、2013年、Hum. Mol. Gen)。miRNAは、極めて安定しており、このため、潜在的なバイオマーカーの強力な候補物質として存在することが証明されている(Chen他、2008年; Grasso、2014年)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国出願第62/291,619号
【特許文献２】国際出願PCT/US2017/016412
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Cathew RW、Cell、2009年
【非特許文献２】Kim VN、Nat Rev Mol Cel Biol、2009年
【非特許文献３】Siomi H、Mol Cel、2010年
【非特許文献４】Bartel DP、Cell、2004年
【非特許文献５】Lee Y、Nature 2003年
【非特許文献６】Han J、Genes Dev、2004年
【非特許文献７】Gregory RI、Nature 2004年
【非特許文献８】MAcRae IJ、PNAS、2008年
【非特許文献９】Koval他、2013年、Hum. Mol. Gen
【非特許文献１０】the Norwegian ParkWest study
【非特許文献１１】the Swedish NYPUM study
【非特許文献１２】the Dementia Study of Western Norway
【非特許文献１３】http://www.parkvest.no
【非特許文献１４】Harlow及びLane、Antibodies: A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press、1988年)
【非特許文献１５】Friefelder、「Physical Biochemistry: Applications to biochemistry and molecular biology」(W.H. Freeman and Co.、1976年)
【非特許文献１６】Pierce Catalog and Handbook、1994〜1995年(Pierce Chemical Co.、Rockford、IL)
【非特許文献１７】Kuby、J.、Immunology、第3編、W.H. Freeman & Co.、New York (1998年)
【非特許文献１８】Huse他、Science、Vol. 246 (1989年) 1275〜81頁
【非特許文献１９】Winter及びHarris、Immunol. Today、Vol. 14 (1993年) 243〜46頁
【非特許文献２０】Ward他、Nature、Vol. 341 (1989年) 544〜46頁
【非特許文献２１】Hilyard他、Protein Engineering: A practical approach (IRL Press 1992年)
【非特許文献２２】Borrabeck、Antibody Engineering、第2編(Oxford University Press 1995年)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
アルツハイマー病に罹患している患者に関連するmiRNAを同定することが、本発明の目的である。
【００１２】
アルツハイマー病に罹患している患者を決定するための方法を提供することが、本発明の別の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
これらの目的及び他の目的は、又はアルツハイマー病に罹患している患者を決定するために、単独で、対で、若しくは組合せで使用することができるmiRNAバイオマーカーを提供する本発明によって達成される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】AD患者と健常対照の間での3種のPARKmiRNAの平均倍率変化を示す図である。
【図２】AD患者と健常対照の間でのPARKmiRNAの3つの組合せの平均倍率変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
我々は、「PDの診断対象患者」に記載される通り、ベースラインにおける対照及びPD患者の血清サンプルに対して、マイクロアレイ分析(the Norwegian ParkWest studyの発見段階(discovery phase))、qRT-PCRによる確認(発見段階からの同サンプル)、qRT-PCRによる検証(the Norwegian Parkwest studyからの大規模なサンプルセット)、及びqRT-PCRによる妥当性確認(the Swedish NYPUM studyからの独立コホート)を行った。この全データは、2016年2月5日に出願された米国出願第62/291,619号及び2017年2月3日に出願された国際出願PCT/US2017/016412から得られ、そこで検討されたものであり、これにより、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれている。
【００１６】
診断用PD miRNAプロジェクトのためのデータ収集の間に、我々は、該Parkwest studyのPD集団と同じノルウェーの地域を示しているthe DemVest studyで、新たに診断されたAD患者からの45の血清サンプルを使用して、候補miRNA(PARKmiR)の特異性に関する試験も行った。本発明者は、このPARKmiRが、対照血清サンプルの場合と同じ存在量であることが示され、PARKmiRのPDに対する特異性が証明されるであろうことを期待した。予想外に、このPARKmiRのレベルは、対照血清サンプルと比較して、ADの血清サンプルで有意な低下を示した。使用したADの血清サンプル及び技術が妥当であったことを確認するため、我々は、miR-445-3p及び対照の小RNA(U6)の存在量が変化するかどうかを試験した。対照血清中、PDの血清及びADの血清の両miRNAの存在量は変化せず、我々の発見の妥当性が確認された。
【００１７】
方法
血清サンプルの取扱い及び分類
全ての患者及び対照は、PD及び認知症/ADそれぞれの発症率、神経生物学、及び予後を検討する、進行中の集団に基づく前向き縦断的コホート研究であるthe Norwegian ParkWest study及びthe Dementia Study of Western Norway (DemVest study)に参加した。the Norwegian ParkWest studyは、西及び南ノルウェーのパーキンソン病(PD)の事象を有する患者を対象とした前向き縦断的多施設共同コホート研究である。2004年11月1日〜2006年8月31日の間、研究地域内のパーキンソン病の新規症例全てをリクルートするよう尽力した。この研究の開始以降、それらの患者の265名中212名(80%)及びこれらの患者と年齢/性別が一致した対照群を追跡した。この計画のさらなる情報は、http://www.parkvest.noで入手可能である。the Dementia Study of Western Norwayは、初回認知症診断(ミニメンタルステート検査(MMSE)スコア>15)を受けた患者を対象とした前向き縦断的多施設共同コホート研究である。患者のリクルートは2005年に開始し、患者の追跡は年に1度行われた。急性譫妄若しくは錯乱、末期疾患、又は現行若しくは既往の双極性障害若しくは精神病性障害を有する患者又は重度の身体疾患と最近診断された患者は、本研究から除外された。
【００１８】
AD患者の非選択的コホート及び集団代表的コホートを確立するためのあらゆる努力が行われた。研究参加時に血清を提出し、最近の追跡時に、National Institute of Neurological and Communicative Diseases and Stroke/Alzheimer's Disease and Related Disorders Association (NINCDS/ARDRA)基準に従うADの診断基準を満たした患者を含めた。対照被験者は、友人、配偶者、及び高齢者に関しては公共団体を含む複数の供給源からリクルートされ、血清を提出した者を、本研究に含めた。ADに対する可能性のあるバイオマーカーに関する本研究では、二段階の手順を適用した。最初の発見段階のため、患者16名及び対照8名の血清を無作為に選択した。検証目的のため、本研究に適格である残りのAD患者45名及び対照182名を選択した。血清サンプルは、臨床検査と同日に採取され、その後、ドライアイス上でニューヨークの施設に輸送されるまで、-70℃で凍結保存された。
【００１９】
実施例１
qPCRによる差次的に発現されたヒトmiRNAの分析
血清サンプルからのRNA単離及びQC
氷上で解凍後、24の血清サンプル(対照8、PDのサンプル16)を3000xgで5分間遠心分離し、残屑を除去した。上清を用いて、miRCURY RNA Isolation Kit - Biofluids(Exiqon社、MA)を使用した小RNA単離を実施した。RNA単離前、溶解緩衝液に、0.267fmol/ulのスパイクイン対照cel-miR-39-3p(Qiagen社、CA)を添加した。製造業者のプロトコールに準拠してRNA単離の残る部分を実施し、単離されたRNAをNanodrop 2000(Thermo Scientific社、MA)で定量した。このRNAを用いてAffymetrix v4マイクロRNAマイクロアレイチップを稼働させ、続くcDNA合成及びqPCRを行った。上記の通り、256の血清サンプル(対照190、ParkWest計画からのPD16、DemVest計画からのAD45)からRNAを単離し、Nanodropによってこれらを定量しなかったが、これらのサンプルから得られたqPCRデータを、参照小RNAであるscaRNA17によって正規化した。
【００２０】
miRNAマイクロアレイ及びデータ分析
Yale Center for Genome Analysis(http://medicine.yale.edu/keck/ycga/index.aspx)によって、患者24名の血清サンプルから単離されたRNAが定量され、Affymetrix GeneChip(登録商標)miRNA 4.0 Arrayに用いられた。Affymetrix Expression Consoleソフトウエアから得た、正規化したCELファイルを、分析のためにPartek Genomics Suiteバージョン6.6著作権(C)2012(Partek社、MO)に読み込んだ。「マイクロRNA発現ワークフロー」を使用して差次的に発現されたmiRNAを検出し、ANOVAを使用して、対照コホートとPDコホートの間で有意に(p<0.05)発現されたmiRNAのリストを得た。検出されたmiRNAを、さらなるqPCRによる検証のために使用した。
【００２１】
定量的ポリメラーゼ連鎖反応
製造業者のプロトコールに準拠してqScript(商標)microRNA cDNA Synthesis kit(Quanta Biosciences社、MD)を使用し、miRNA特異的qPCRのためのcDNAを合成し、続くqPCRを、miRNA特異的フォワードプライマー(表
【数１】
2020524509.tif 000002
)及びPerfeCTa(登録商標)Universal PCR primer(Quanta Biosciences社、MD)を使用して実施した。qPCR Cq値を正規化するための参照小RNAとしてscaRNA17及びU6を使用したのに対して、スパイクイン対照としてcel-miR-39-3pを使用した。PerfeCTa(登録商標)SYBR(登録商標)GREEN SuperMix for IQ(商標)(Quanta Biosciences社、MD)を、MyiQ(商標)Single color Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad社、CA)における全てのqPCRに対して使用した。MS Excelにおいて、R2=0.97882及びPCR効率92.96%としてcel-miR-39-3pの標準曲線を分析した。必要な箇所には、鋳型なしの対照(No Template Control)(NTC)を含めた。
【００２２】
PDモデルに基づいたデータ分析
PD診断に関するmiRNAの識別能は、IBM SPSS Statisticsバージョン21を用いたROC分析から評価されたが、miRNAの組合せにおける試験変数は、転帰としてPD診断(あり/なし)を用いたロジスティック回帰からの予測確率であった。かみ合った際の(on the fit)かけ離れた値(outlying values)の影響を最小限に抑えるため、対数変換したmiRNA値を用いたロジスティック回帰を行った。
【００２３】
the Norwegian ParkWest studyからのPD患者の血清サンプル中で差次的に発現されたヒトmiRNAを、miRNAマイクロアレイを使用して決定した。以下に提示されるのは、1.2倍を上回る差次的発現を有するmiRNAである。
【００２４】
1.2を上回る倍率変化を有する85の差次的に発現されたヒトpre-miRNA及び成熟miRNA
hsa-miR-548ac、hsa-miR-335-5p、hsa-miR-548x-3p、hsa-miR-520g、hsa-miR-520h、hsa-miR-548ae、hsa-miR-3910-1、hsa-miR-4708-3p、hsa-miR-16-2-3p、hsa-miR-603、hsa-miR-3613-3p、hsa-miR-4797-5p、hsa-miR-548aj-3p、hsa-miR-450b-5p、hsa-miR-548ap-3p、hsa-miR-1184、hsa-miR-2277-5p、hsa-miR-1323、hsa-miR-548aa、hsa-miR-548t-3p、hsa-miR-221-5p、hsa-miR-190a-3p、hsa-miR-6873-5p、hsa-miR-155-3p、hsa-miR-510-5p、hsa-miR-4313、hsa-miR-3616、hsa-miR-8075、hsa-miR-4306、hsa-miR-6776、hsa-miR-6075、hsa-miR-8052、hsa-miR-532、hsa-miR-4791、hsa-miR-320b-1、hsa-miR-548y、hsa-miR-7973、hsa-miR-3136-5p、hsa-miR-606、hsa-miR-500a-3p、hsa-miR-4788、hsa-miR-4769-3p、hsa-miR-299-5p、hsa-miR-4431、hsa-miR-6749-5p、hsa-miR-138-2-3p、hsa-miR-1289-2、hsa-miR-548au、hsa-miR-6850、hsa-miR-561、hsa-miR-34b-5p、hsa-miR-3934-5p、hsa-miR-6739-5p、hsa-miR-4325、hsa-miR-4672、hsa-miR-215-5p、hsa-miR-4685-5p、hsa-miR-3160-1、hsa-miR-3160-2、hsa-miR-6793-5p、hsa-miR-8089、hsa-miR-6081、hsa-miR-892b、hsa-miR-936、hsa-miR-548ag、hsa-miR-345、hsa-miR-548k、hsa-miR-3188、hsa-miR-181b-5p、hsa-let-7e、hsa-miR-4487、hsa-miR-509-3p、hsa-miR-3689a-3p、hsa-miR-4771、hsa-miR-520a-5p、hsa-miR-3150b、hsa-miR-6782-5p、hsa-miR-937-5p、hsa-miR-455-3p、hsa-miR-6865-3p、hsa-miR-4749-5p、hsa-miR-378b、hsa-miR-7706、hsa-miR-4445、及びhsa-miR-2355-5p。
【００２５】
1.2を上回る倍率変化を有する57の差次的に発現された成熟miRNA
hsa-miR-548ac、hsa-miR-335-5p、hsa-miR-548x-3p、hsa-miR-548ae、hsa-miR-4708-3p、hsa-miR-16-2-3p、hsa-miR-603、hsa-miR-3613-3p、hsa-miR-4797-5p、hsa-miR-548aj-3p、hsa-miR-450b-5p、hsa-miR-548ap-3p、hsa-miR-1184、hsa-miR-2277-5p、hsa-miR-1323、hsa-miR-548aa、hsa-miR-548t-3p、hsa-miR-221-5p、hsa-miR-190a-3p、hsa-miR-6873-5p、hsa-miR-155-3p、hsa-miR-510-5p、hsa-miR-4313、hsa-miR-4306、hsa-miR-8052、hsa-miR-4791、hsa-miR-7973、hsa-miR-3136-5p、hsa-miR-606、hsa-miR-500a-3p、hsa-miR-4769-3p、hsa-miR-299-5p、hsa-miR-6749-5p、hsa-miR-138-2-3p、hsa-miR-34b-5p、hsa-miR-3934-5p、hsa-miR-6739-5p、hsa-miR-4325、hsa-miR-215-5p、hsa-miR-4685-5p、hsa-miR-6793-5p、hsa-miR-936、hsa-miR-548ag、hsa-miR-548k、hsa-miR-181b-5p、hsa-let-7e、hsa-miR-509-3p、hsa-miR-3689a-3p、hsa-miR-4771、hsa-miR-520a-5p、hsa-miR-6782-5p、hsa-miR-937-5p、hsa-miR-455-3p、hsa-miR-6865-3p、hsa-miR-4749-5p、hsa-miR-378b、及びhsa-miR-2355-5p。
【００２６】
1.2を上回る倍率変化を有する28の差次的に発現された前駆体miRNA
hsa-miR-520g、hsa-miR-520h、hsa-miR-3910-1、hsa-miR-3616、hsa-miR-8075、hsa-miR-6776、hsa-miR-6075、hsa-miR-532、hsa-miR-320b-1、hsa-miR-548y、hsa-miR-4788、hsa-miR-4431、hsa-miR-1289-2、hsa-miR-548au、hsa-miR-6850、hsa-miR-561、hsa-miR-4672、hsa-miR-3160-1、hsa-miR-3160-2、hsa-miR-8089、hsa-miR-6081、hsa-miR-892b、hsa-miR-345、hsa-miR-3188、hsa-miR-4487、hsa-miR-3150b、hsa-miR-7706、及びhsa-miR-4445。
【００２７】
これらの差次的に発現されたmiRNA配列を、対照として使用した参照/ハウスキーピング小RNAであるcel-miR-39-3p、U6、及びScaRNA17と共に、以下のTable 1(表1)に例示する。cel-miR-39-3pは、RNAサンプルの安定性を実証するスパイクイン対照である。U6及びScaRNA17は、残りのmiRNA又は候補miRNAの測定値を正規化するための内部対照として使用される。
【００２８】
【表１Ａ】
2020524509.tif 000003
【００２９】
【表１Ｂ】
2020524509.tif 000004
【００３０】
【表１Ｃ】
2020524509.tif 000005
【００３１】
【表１Ｄ】
2020524509.tif 000006
【００３２】
実施例１
AD患者45名及び対照182名のサンプルコホートにおけるqPCRによるヒト成熟miRNAの発現
PARKmiRであるhsa-miR-335-5p、hsa-miR-3613-3p、及びhsa-miR-6865-3pについて、AD患者と健常対照の間の平均log倍率変化を図1に例示した。
【００３３】
実施例２
AD患者45名及び対照182名のサンプルコホートにおけるPARKmiRの組合せであるhsa-miR-335-5p/hsa-miR-3613-3p、hsa-miR-3613-3p/hsa-miR-6865-3p、及びhsa-miR-335-5p/hsa-miR-6865-3pの分析
潜在的な診断用バイオマーカーを同定するため、実施例1のqPCR技術を使用した。PARKmiRの組合せは、AD診断のための予測性が高いことを示すと決定された。AD患者と健常対照の間のhsa-miR-335-5p/hsa-miR-6865-3p、hsa-miR-335-5p/hsa-miR-3613-3p、及びhsa-miR-6865-3p/hsa-miR-3613-3pを用いたモデルの結果を図2に例示した。
【００３４】
実施例３
85の同定されているmiRNAのリストからの3種以上のマイクロRNAのいずれの組合せも、患者におけるAD発症を診断するために使用することができることが証明されている。
【００３５】
実施例４
患者からの血清中の2種以上のmiRNAの組合せのレベルの測定は、潜在的AD患者と健常者の間を明確に識別する助けとなり得る。血清サンプルは、ADの疑いがある患者から採取した血液から得る。この血清を、全マイクロRNAの単離及び濃縮に使用する。次に、qPCRを用いて、実施例1に記載されている85のmiRNAのうちのいずれか2種以上又は実施例5〜7に記載されている3種のmiRNAのうちのいずれか1種のレベルを測定するために、このRNAを試験する。前記85のmiRNAのうちのいずれか2種以上又は前記3種のmiRNAのうちのいずれか1種が検出可能なレベルであることは、その患者がADであることを確定する。所望とあれば、血漿、静脈血若しくは動脈血、又は腰椎穿刺によって採取したCSFサンプルを含む他のサンプル体液を利用してもよい。このような血漿、血液、又はCSFサンプルは、例えば、ヒト又は動物の体外で、処理及び評価するためのサンプルを用意するため、血清に関して上記で検討した通りに処理される。試験マトリックスで使用される組合せ又は組合せのセット中の2種を上回るmiRNAの測定が、AD診断の精度を望ましくも高めることが理解されるであろう。診断後、その結果は患者に伝えられる。
【００３６】
実施例５
miRNAの組合せは、診断のために使用され得ることから、コホートに基づくあらゆる変動を排除するために、全ての候補物質を試験することは賢明であると思われる。該当するmiRNAのいかなる検出可能な量も、ADの病理を示唆するであろうことは理解されている。しかし、当業者は、診断のための人為的な閾値を設定するため、45対182のサンプルの値を使用することが、臨床的に有用である可能性があることを認識している。差次的なmiRNAレベルは、臨床試験に加えて、診断において臨床医に使用され得る診断用バイオマーカーキットを開発するために使用され得る。本研究において、血清からのmiRNAの存在及び定量が、このRNAを増幅及び数値化するqRT-PCRによって決定されたことは疑問である。本明細書では、代替方法として、標識されたアンチセンス配列及び標識された抗体の使用を含む、当業者に知られている他の適当な技術を利用してもよい。典型的に、測定条件下でバックグラウンドの分子会合の10〜100倍を上回る2つの分子間の結合反応を指す適当な抗体が優先的に選択される。このため、指定されたイムノアッセイの条件下で、所定の抗体が、特定のmiRNA配列に結合し、これによってその存在が同定される。このような条件下での抗体への特異的結合には、特定のmiRNAに対するその特異性について選択される抗体が必要とされる。例えば、特定のmiRNAに対して惹起した抗体は、他の分子と交差反応する抗体を取り除くことによって選択され得る。特定のmiRNAに対して特異的な免疫反応性を有する抗体を選択するために、固相ELISAイムノアッセイを含む様々なイムノアッセイ形式を使用してよい(特異的な免疫反応性を決定するために使用し得るイムノアッセイ形式及びその条件の解説のため、Harlow及びLane、Antibodies, A Laboratory Manual (1988年)等を参照)。2つの分子が特異的に相互作用するかどうかを決定するための方法は、その中で公開されており、結合の親和性及び特異性を決定する方法は、当該分野で公知である(例えば、Harlow及びLane、Antibodies: A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press、1988年); Friefelder、「Physical Biochemistry: Applications to biochemistry and molecular biology」(W.H. Freeman and Co.、1976年)を参照)。本明細書で用いる場合、「抗体」という用語は、天然に存在する抗体に加えて、例えば、一本鎖抗体、キメラ抗体、二機能性抗体、及びヒト化抗体を含む天然に存在しない抗体、同様にその抗原結合断片(例えば、Fab'、F(ab')2、Fab、Fv、及びrIgG)を包含する。同じく、Pierce Catalog and Handbook、1994〜1995年(Pierce Chemical Co.、Rockford、IL)を参照。同じく、例えば、Kuby、J.、Immunology、第3編、W.H. Freeman & Co.、New York (1998年)を参照。このような天然に存在しない抗体は、固相ペプチド合成を使用して構成され得るか、組換えにより産生され得るか、又は例えば、Huse他、Science、Vol. 246 (1989年) 1275〜81頁に記載される通り、可変の重鎖及び可変の軽鎖からなるコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって得られ得る。例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、CDR移植抗体、一本鎖抗体、及び二機能性抗体を生成するこれらの及び他の方法は、当業者によく知られている(Winter及びHarris、Immunol. Today、Vol. 14 (1993年) 243〜46頁; Ward他、Nature、Vol. 341 (1989年) 544〜46頁; Harlow及びLane、上記、1988年; Hilyard他、Protein Engineering: A practical approach (IRL Press 1992年); Borrabeck、Antibody Engineering、第2編(Oxford University Press 1995年))。同定されているRNA配列からモノクローナル及びポリクローナル抗体の両方を産生するための方法は、当該分野において公知である。
【００３７】
実施例６
症状に加えて、病理学的マーカーに関して言えば、多くの神経変性疾患は、相互に綿密に関連する。1種の神経変性疾患に対する血中の診断用マーカーは、他の疾患の診断のために有用である可能性がある。パーキンソン病、レビー小体型認知症(DLB)、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、多系統萎縮症(MSA)、大脳皮質基底核変性症(CBD)、進行性核上性麻痺(PSP)のような他の神経変性疾患を診断するための方法も、上記の候補物質の同様のmiRNA測定を使用して開発され得る。疾患特異的なキットは、[0020]に記載されたmiRNAの様々な組合せを用いて、上記と同様に開発され得る。
【００３８】
実施例７
1種又は複数の組合せで検出されたmiRNAは、細胞内でいくつかのタンパク質を制御することができる。ADのための新規のタンパク質標的は、これらのマイクロRNA及びそれらの組合せを使用して発見され得る。ADの病因におけるこれらのタンパク質の関与をさらに確立して、治療のためにそれらを標的とすることが可能である。
【００３９】
実施例８
我々は、ドーパミン作動性神経細胞株における、hsa-miR-335-5pによるLRRK2及びhsa-miR-3613-3pによるSNCA の予測される制御を、実験的に確認した。前述の新規の標的を制御するための治療的介入は、RNA干渉技術によって達成され得る。
【００４０】
実施例９
上記のmiRNAに由来する小核酸分子は、ADの脳内の遺伝子を特異的に標的とすることによって治療的に介入し、完全又は部分的な改善を達成するように設計されるであろう。上記で検討した効果は、脳細胞における正確な標的化のために達成されるであろう。
【図１】
2020524509.tif 000007
【図２】
2020524509.tif 000008
【配列表】
2020524509000001.app
【国際調査報告】
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