(57)【要約】  本発明は、特に、治療又は診断に有用な多重特異性抗体の産生に使用するための、抗体鎖(例えば、真に共通のL鎖又はH鎖)を産生するための、細胞及び非ヒト脊椎動物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体軽鎖遺伝子座(第一の遺伝子座)を含み、遺伝子座が(5'から3'方向に)、
(a)軽鎖イントロンエンハンサー;
(b)再構成された抗体Vドメインをコードする再構成された抗体可変領域;及び
(c)軽鎖Cドメインをコードする抗体軽鎖定常領域
を含み、遺伝子座が、(NからC末端方向に)前記再構成されたVドメイン及び前記Cドメインを含む抗体鎖を発現するように作動可能である、細胞。
【請求項２】
遺伝子座がカッパ軽鎖遺伝子座であり、エンハンサーがEiκである、請求項1に記載の細胞。
【請求項３】
細胞がマウス細胞であり、遺伝子座がラムダ軽鎖遺伝子座であり、エンハンサーがマウスラムダ2-4又は4-10エンハンサーである、請求項1に記載の細胞。
【請求項４】
(a)再構成されたVドメインがVκであり、CドメインがCκであり;
(b)再構成されたVドメインがVκであり、CドメインがCλであり;
(c)再構成されたVドメインがVλであり、CドメインがCλであり;又は
(d)再構成されたVドメインがVλであり、CドメインがCκである、請求項1から3のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項５】
抗体重鎖遺伝子座(第一の遺伝子座)を含み、遺伝子座が(5'から3'方向に)、
(a)重鎖イントロンエンハンサー(Eμ);
(b)再構成された抗体Vドメインをコードする再構成された抗体可変領域;
(c)任意選択のスイッチ配列;及び
(d)重鎖CH1ドメインをコードする抗体重鎖定常領域
を含み、遺伝子座が、(NからC末端方向に)前記再構成されたVドメイン及び前記CH1ドメインを含む抗体鎖を発現するように作動可能である、細胞。
【請求項６】
遺伝子座が(5'から3'方向に)、
(a)可変領域の転写を促進する作動可能なプロモーター;
(b)可変ドメインシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列;
(c)前記イントロンエンハンサー;
(d)前記再構成された抗体可変領域;及び
(e)前記抗体軽鎖定常領域
を含み、遺伝子座は、(NからC末端方向に)前記可変ドメインのアミノ酸配列に融合された前記シグナルペプチド配列をコードするRNA転写物を発現するように作動可能である、請求項1から5のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項７】
ES、iPS、ハイブリドーマ又はB細胞である、請求項1から6のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項８】
再構成されたVドメインが、カッパ又はラムダVドメインである、請求項1から7のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項９】
可変領域が第一の所定の抗原又は第一のエピトープに対する結合特異性を有するVドメインをコードし、遺伝子座が前記特異性を保持するVドメインを含む抗体鎖を発現するように作動可能である、請求項1から8のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１０】
細胞が、第二の抗体鎖を発現するように作動可能である第二の抗体遺伝子座を含み、第二の鎖が、第一の再構成されたVドメインと共に結合部位を形成する第二の再構成されたVドメインを含み、結合部位が所定の抗原又はエピトープに特異的に結合可能である、請求項1から9のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１１】
所定の抗原が互いに異なり、前記他の及び第二のVドメインが異なり;又はエピトープが互いに異なり、前記他の及び第二のVドメインが異なる、請求項9に従属する場合の請求項10に記載の細胞。
【請求項１２】
(a)第一のドメインがVLドメインであり、第二の及び前記他のVドメインがVHドメインであり;又は
(b)第一のドメインがVHドメインであり、第二の及び前記他のVドメインがVLドメインである、請求項11に記載の細胞。
【請求項１３】
可変領域がエンハンサーの3'に、0.5kb内にある、請求項1から12のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１４】
遺伝子座が定常領域の3'にある第二のエンハンサーを含む、請求項1から13のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１５】
細胞が非ヒト哺乳動物、マウス、ラット又はげっ歯類細胞である、請求項1から14のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１６】
前記定常領域が細胞の内因性抗体遺伝子座にある、請求項1から15のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１７】
前記内因性遺伝子座が内因性カッパ鎖遺伝子座である、請求項1に従属する場合の請求項16に記載の細胞。
【請求項１８】
前記内因性遺伝子座が内因性重鎖遺伝子座である、請求項5に従属する場合の請求項16に記載の細胞。
【請求項１９】
遺伝子座が、内因性抗体遺伝子座の外側の位置で細胞のゲノムによって含まれる導入遺伝子によって含まれる、請求項1から15のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２０】
細胞が前記遺伝子座に関してホモ接合性である、請求項1から19のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２１】
細胞ゲノムが第二の抗体遺伝子座を含み、第二の遺伝子座が(5'から3'方向に)、
(a)1つ又は複数のVH遺伝子セグメント;
(b)1つ又は複数のDH遺伝子セグメント;
(c)1つ又は複数のJH遺伝子セグメント;及び
(d)1つ又は複数のCHドメインをコードする重鎖定常領域を含む、再構成されていない抗体重鎖遺伝子座であり;
重鎖遺伝子座が、任意選択で複数の抗原特異性又は親和性を含む、複数の重鎖を発現するように作動可能であり、各前記重鎖は、第一の遺伝子座によってコードされる抗体鎖と対合可能で、抗原結合部位を含む対合した鎖を産生する、請求項1に従属する場合の請求項1から20のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２２】
細胞が1つ又は複数の更なる抗体遺伝子座を含み、各更なる遺伝子座が、軽鎖を発現可能であり、各前記軽鎖は、第一の遺伝子座によってコードされる抗体鎖と対合可能で、抗原結合部位を含む対合した鎖を産生する、請求項5に従属する場合の請求項1から20のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２３】
各可変領域又は遺伝子セグメントがヒトである、請求項1から22のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２４】
細胞がマウス細胞であり、各定常領域がマウス、ラット又はヒト定常領域である、請求項1から23のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２５】
各前記エンハンサーが細胞の内因性エンハンサーである、請求項1から24のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２６】
細胞がマウス細胞であり、各前記エンハンサーがマウスエンハンサーである、請求項1から25のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２７】
(a)細胞がマウス細胞であり、可変領域がヒト可変領域であり、イントロンエンハンサーが細胞の内因性抗体遺伝子座でのマウスイントロンエンハンサーであり、前記定常領域がマウス、ラット又はヒト定常領域である;又は
(b)細胞がラット細胞であり、可変領域がヒト可変領域であり、イントロンエンハンサーが細胞の内因性抗体遺伝子座でのラットイントロンエンハンサーであり、前記定常領域がマウス、ラット又はヒト定常領域である、請求項1から26のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２８】
再構成された可変領域が、
(a)ヒトIGLV3-21及びIGLJ3の再構成であり、任意選択でヒト生殖系列IGLV3-21プロモーター及び/又はシグナルペプチドコードヌクレオチド配列に作動可能に連結されている;
(b)ヒトIGK1-39及びIGKJ1又は5の再構成であり、任意選択でヒト生殖系列IGKV1-39プロモーター及び/又はシグナルペプチドコードヌクレオチド配列に作動可能に連結されている;
(c)ヒトIGK3-20及びIGKJ1又は5の再構成であり、任意選択でヒト生殖系列IGKV3-20プロモーター及び/又はシグナルペプチドコードヌクレオチド配列に作動可能に連結されている;
(d)ヒトVpreB及びJλ5の再構成であり、任意選択でヒト生殖系列VpreBプロモーター及び/又はシグナルペプチドコードヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、請求項1から27のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２９】
請求項1から28のいずれか一項に記載の複数の細胞を含むトランスジェニック非ヒト脊椎動物。
【請求項３０】
前記脊椎動物の生殖系列が、請求項1から28のいずれか一項に規定される、第一の遺伝子座(及び任意選択で第二の遺伝子座)を含む、請求項29に記載の脊椎動物。
【請求項３１】
脊椎動物が、前記細胞と第一の遺伝子座を含まない複数の他の細胞のキメラであり、脊椎動物の生殖系列が前記第一の遺伝子座を含まない、請求項29に記載の脊椎動物。
【請求項３２】
第一の複数の細胞及び第二の複数の細胞を含み、第一の複数の細胞が同じ第一の同一の抗体遺伝子座を含み、第二の複数の細胞が同じ追加の同一の抗体遺伝子座を含み、各前記抗体遺伝子座が、請求項1から28のいずれか一項に規定の第一の遺伝子座の通りであり、脊椎動物が、前記第一の同一の遺伝子座からの第一の複数の抗体鎖及び前記追加の遺伝子座からの第二の複数の抗体鎖を発現可能であり、並びに第一の細胞の抗体遺伝子座が、第二の細胞の抗体遺伝子座と異なる、請求項29から31のいずれか一項に記載の脊椎動物。
【請求項３３】
脊椎動物が第三の複数の細胞を含み、第三の複数の細胞が同じ更なる抗体遺伝子座を含み、更なる遺伝子座が請求項1から28のいずれか一項に規定され且つ第一及び第二の細胞の前記抗体遺伝子座と異なり、脊椎動物が、更なる遺伝子座からの第三の複数の抗体鎖を発現可能である、請求項32に記載の脊椎動物。
【請求項３４】
脊椎動物が、前記細胞と請求項1から28のいずれか一項に規定の第一の遺伝子座又は前記追加の又は更なる遺伝子座を含まない複数の他の細胞のキメラである、請求項32又は33に記載の脊椎動物。
【請求項３５】
抗体軽鎖レパートリーが、単一の再構成されたVLドメイン種に関して少なくとも95%純粋である、トランスジェニック非ヒト脊椎動物。
【請求項３６】
レパートリーが、単一の再構成されたVLドメイン種に関して少なくとも99%純粋である、請求項35に記載の脊椎動物。
【請求項３７】
軽鎖レパートリーの軽鎖の残りが、前記VLドメイン種の変異体を含む、請求項35又は36に記載の脊椎動物。
【請求項３８】
トランスジェニック非ヒト脊椎動物であって、脊椎動物の抗体軽鎖レパートリーの全てのVLドメインの少なくとも95%が、脊椎動物のゲノムによって含まれる同じ軽鎖可変領域配列によってコードされる、トランスジェニック非ヒト脊椎動物。
【請求項３９】
前記組換えに由来する全てのVLドメインの少なくとも99%が、同じVLアミノ酸配列を含む、請求項38に記載の脊椎動物。
【請求項４０】
請求項1から28のいずれか一項に規定の複数の第一の遺伝子座を含む、請求項29から39のいずれか一項に記載の脊椎動物の複数の脾臓、骨髄、B細胞又は血液細胞。
【請求項４１】
脾臓、骨髄、B細胞、ハイブリドーマ、CHO細胞、HEK細胞、MEF細胞、COS細胞、HeLa細胞又は血液細胞の集団であって、各細胞が請求項1又は請求項1に従属する場合の請求項2から28のいずれか一項に規定され;任意選択で、細胞が少なくとも10の異なる抗体種を発現し、
(a)少なくとも95%の抗体が同じ軽鎖VLドメインを共有し、集団が少なくとも10の異なるVHドメイン種を含み;又は
(b)抗体が、第一のVL遺伝子セグメント及び第一のJL遺伝子セグメントの組換えに由来するVLドメインを含み、前記組換えに由来する全ての前記VLドメインの少なくとも95%が、同じVLアミノ酸配列を含み、集団が少なくとも10の異なるVHドメイン種を含む、集団。
【請求項４２】
集団によって含まれる少なくとも95%の抗体が同じ軽鎖VLドメインを共有し、集団が少なくとも10の異なるVHドメイン種を含む、ポリクローナル抗体集団。
【請求項４３】
第一のVL遺伝子セグメント及び第一のJL遺伝子セグメントの組換えに由来するVLドメインを含むポリクローナル抗体集団であって、前記組換えに由来する全ての前記VLドメインの少なくとも95%が、同じVLアミノ酸配列を含み、集団が少なくとも10の異なるVHドメイン種を含む、ポリクローナル抗体集団。
【請求項４４】
抗体、抗体可変ドメイン、抗体若しくは抗体可変ドメインをコードするヌクレオチド配列、又は抗体若しくはドメインを発現可能である発現ベクター若しくは宿主細胞を同定する若しくは得るための方法であって、抗体若しくはドメインが、標的抗原に特異的に結合可能であり、方法が、
(a)請求項41に記載の細胞集団又は請求項42若しくは43に記載の抗体集団を、前記抗原と接触させる工程;
(b)前記集団によって発現される又は含まれる抗体を前記抗原に結合させる工程;及び
(c)抗原に結合する1つ又は複数の抗体を単離する又は同定する工程、又は前記1つ又は複数の抗体のVH及び/又はVLドメインを単離する又は同定する工程;又は前記VH又はVLをコードするヌクレオチド配列を同定する工程;及び
(d)任意選択で、
(i)同定された前記抗体又はドメインを、それをコードするヌクレオチド配列と相関させ、それによって、前記配列を同定する工程;
(ii)前記配列を増幅する工程及びコードされる抗体又はドメインの発現のために配列を発現ベクター又は宿主細胞ゲノムに挿入する工程;及び
(iii)任意選択で、前記抗体又はドメインを発現させる工程及び単離する工程
を含み、工程(i)及び(ii)は、任意の順序で実施することができる、方法。
【請求項４５】
同定された抗体のVH及びVLドメインをコードするVH及びVLヌクレオチド配列を増幅する方法を使用する工程を含み、VH及びVLヌクレオチド配列を、VH及びVLの共発現のためにベクター又は細胞に挿入して、抗原に結合可能な対合したVH/VL結合部位を生成する工程、及び結合部位を発現させる工程(及び任意選択で単離する工程)を更に含む、請求項44に記載の方法。
【請求項４６】
VHドメインの更なる種の存在下でVH及びVLを発現させる工程を含み、VL及び更なるVHが、更なる抗原に結合可能な更なる対合したVH/VL部位を形成し、更なる抗原及び請求項45に記載された抗原が異なり、方法が、結合部位を共発現させる工程(及び任意選択で単離する工程)を含み、結合部位が、ベクター又は細胞によってコードされる二重特異性抗体によって含まれ、二重特異性抗体が、各前記抗原に対するそれぞれの結合部位を含む、請求項45に記載の方法。
【請求項４７】
二重特異性抗体が、第一の重鎖-軽鎖対及び第二の重鎖-軽鎖対を含む4鎖抗体であり、
(a)第一及び第二の対における軽鎖が、前記VLドメインを含み、
(b)第一の対の重鎖が、請求項45に記載されたVHドメインを含み、VHドメインが、前記VLドメインとVH/VL結合部位を形成し、及び結合部位が、請求項45に記載された前記抗原に特異的に結合可能であり;
(c)第二の対の重鎖が、前記VLドメインとVH/VL結合部位を形成する、前記更なるVHドメインを含み、及び結合部位が、請求項46に記載された前記更なる抗原に特異的に結合可能である、請求項46に記載の方法。
【請求項４８】
各4鎖抗体が変異型重鎖定常領域を含み、第一及び第二の重鎖-軽鎖対の重鎖の対合を促進し;任意選択で、変異がノブ-イン-ホール変異又は荷電対合変異である、請求項47に記載の方法。
【請求項４９】
請求項42又は43に記載のポリクローナル抗体集団を発現する複数のB細胞、ハイブリドーマ、CHO細胞、HEK細胞、MEF細胞、COS細胞、HeLa細胞。
【請求項５０】
VL及び/又はVHコードヌクレオチド配列を請求項41又は47に規定の細胞から得る工程及び工程(d)(i)において、ヌクレオチド配列を使用して、その1つ又は複数と、抗原を結合する前記抗体の1つ又は複数のVH及び/又はVLドメインとを相関させる工程を含む、請求項44から48のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
抗体又は抗体可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を得るための方法であって、抗体若しくはドメインが、標的抗原に特異的に結合可能であり、方法が、
(a)VL及び/又はVHコードヌクレオチド配列を請求項41又は47に規定の細胞から得る工程;
(b)前記配列を増幅する工程;及び
(c)任意選択で、コードされる抗体又はドメインの発現のために配列を発現ベクター又は宿主細胞ゲノムに挿入する工程
を含む、方法。
【請求項５２】
抗原に特異的に結合する抗体の産生のための、抗体産生細胞株を得るための方法であって、VH及びVLコードヌクレオチド配列を、宿主細胞のゲノムに挿入する工程を含み、
(a)各VH配列が、VH及びCドメインを含む細胞による重鎖の発現のために抗体重鎖定常領域の5'に作動可能に挿入され;
(b)各VL配列が、VL及びCドメインを含む細胞による軽鎖の発現のために抗体軽鎖定常領域の5'に作動可能に挿入され;
(c)発現される重鎖が、軽鎖と対合可能で、重鎖-軽鎖対を産生し、各対が、抗原に結合可能なVH/VL結合部位を含み;及び
(d)VH及びVLコードヌクレオチド配列が、請求項41又は47に規定の1つ又は複数の細胞のVH及びVLコードヌクレオチド配列の配列である、方法。
【請求項５３】
第一及び第二のVHコードヌクレオチド配列を細胞ゲノムに挿入する工程を含み、
(a)第一のVH(第一の重鎖の一部として発現される場合)が、VL(軽鎖の一部として発現される場合)と対合可能で、第一の抗原に特異的に結合可能な第一のVH/VL結合部位を形成し;
(b)第二のVH(第二の重鎖の一部として発現される場合)が、VL(軽鎖の一部として発現される場合)と対合可能で、第二の抗原に特異的に結合可能な第二のVH/VL結合部位を形成し;及び
(c)第一及び第二の抗原が、異なり;
第一及び第二の重鎖及び軽鎖が、対合可能で、第一の重鎖-軽鎖対及び第二の重鎖-軽鎖対を含む二重特異性4鎖抗体を産生し、
(d)第一の重鎖-軽鎖対の重鎖が、第一のVHを含み;及び
(e)第二の重鎖-軽鎖対の重鎖が、第二のVHドメインを含む、請求項52に記載の方法。
【請求項５４】
二重特異性4鎖抗体を産生するための方法であって、二重特異性抗体が、第一及び第二の抗原に対する、それぞれの結合部位を含み、抗原が互いに異なり、各抗体が第一の重鎖-軽鎖対及び第二の重鎖-軽鎖対を含み、
(a)第一の重鎖-軽鎖対の重鎖が、第一のVHを含み、第一のVH(第一の重鎖の一部として発現される場合)が、VL(軽鎖の一部として発現される場合)と対合可能で、第一の抗原に特異的に結合可能な第一のVH/VL結合部位を形成し;及び
(b)第二の重鎖-軽鎖対の重鎖が、第二のVHを含み、第二のVH(第二の重鎖の一部として発現される場合)が、前記VL(軽鎖の一部として発現される場合)と対合可能で、第二の抗原に特異的に結合可能な第二のVH/VL結合部位を形成し;
方法が、
(c)(i)第一の細胞ゲノムに前記第一のVHをコードするヌクレオチド配列を挿入する工程であって、VH配列が、第一のVH及びCドメインを含む第一の重鎖の発現のために抗体重鎖定常領域の5'に作動可能に挿入される工程;及び(ii)細胞を培養して第一の重鎖を発現する第一の細胞株を産生する工程によって第一の重鎖を発現可能な第一の細胞株を産生する工程;
(d)(i)第二の細胞ゲノムに前記第二のVHをコードするヌクレオチド配列を挿入する工程であって、VH配列が、第二のVH及びCドメインを含む第二の重鎖の発現のために抗体重鎖定常領域の5'に作動可能に挿入される工程;及び(ii)細胞を培養して第二の重鎖を発現する第二の細胞株を産生する工程によって第二の重鎖を発現可能な第二の細胞株を産生する工程;
(e)第一の重鎖を第一の細胞株から、及び第二の重鎖を第二の細胞株から発現させる工程及び前記第一のVHを含む第一の重鎖、前記第二のVHを含む第二の重鎖及び前記VLを含む軽鎖を一緒に混合する工程であって、それによって、(iii)第一の重鎖が、軽鎖と対合して前記第一の重鎖-軽鎖対を産生し、(iv)第二の重鎖が、軽鎖と対合して前記第二の重鎖-軽鎖対を産生し;及び(v)第一の重鎖-軽鎖対が、第二の重鎖-軽鎖対と対合し、それによって、前記二重特異性抗体を産生する工程
を含み、VH及び/又はVLコードヌクレオチド配列が、請求項41又は47に規定の1つ又は複数の細胞のVH及び/又はVLコードヌクレオチド配列の配列である、方法。
【請求項５５】
(a)(i)第三の細胞ゲノムに前記VLをコードするヌクレオチド配列を挿入する工程であって、VL配列が、VL及びCドメインを含む軽鎖の発現のために抗体軽鎖定常領域の5'に作動可能に挿入される工程;及び(ii)細胞を培養して軽鎖を発現する第三の細胞株を産生する工程によって軽鎖を発現可能な第三の細胞株を産生する工程;
(b)軽鎖を第三の細胞株から発現させる工程であって、軽鎖が、請求項54に規定の工程(e)の軽鎖である工程
を含む、請求項54に記載の方法。
【請求項５６】
(a)第一及び/又は第二の細胞又は細胞株のゲノムに前記VLをコードするヌクレオチド配列を挿入する工程であって、VL配列が、VL及びCドメインを含む軽鎖の発現のために抗体軽鎖定常領域の5'に作動可能に挿入される工程;及び
(b)軽鎖をVH配列を含む細胞株から発現させる工程であって、軽鎖が、請求項54に規定の工程(e)の軽鎖である工程
を含む、請求項54に記載の方法。
【請求項５７】
前記鎖を混合する工程が、細胞株を共培養する工程によって実施される、請求項54、55又は56に記載の方法。
【請求項５８】
前記鎖を混合する工程が、細胞株によって発現される鎖を単離する工程及び単離された鎖を一緒に混合する工程によって実施される、請求項54、55又は56に記載の方法。
【請求項５９】
二重特異性4鎖抗体を産生するための方法であって、二重特異性抗体が、第一及び第二の抗原に対する、それぞれの結合部位を含み、抗原が互いに異なり、各抗体が第一の重鎖-軽鎖対及び第二の重鎖-軽鎖対を含み、
(a)第一の重鎖-軽鎖対の重鎖が、第一のVHを含み、第一のVH(第一の重鎖の一部として発現される場合)が、VL(軽鎖の一部として発現される場合)と対合可能で、第一の抗原に特異的に結合可能な第一のVH/VL結合部位を形成し;及び
(b)第二の重鎖-軽鎖対の重鎖が、第二のVHを含み、第二のVH(第二の重鎖の一部として発現される場合)が、前記VL(軽鎖の一部として発現される場合)と対合可能で、第二の抗原に特異的に結合可能な第二のVH/VL結合部位を形成し;
方法が、
(c)前記第一のVHを含む第一の重鎖、前記第二のVHを含む第二の重鎖及び前記VLを含む軽鎖を一緒に混合する工程であって、それによって、(i)第一の重鎖が、軽鎖と対合して前記第一の重鎖-軽鎖対を産生し、(ii)第二の重鎖が、軽鎖と対合して前記第二の重鎖-軽鎖対を産生し;及び(iii)第一の重鎖-軽鎖対が、第二の重鎖-軽鎖対と対合し、それによって、前記二重特異性抗体を産生する工程を含み、
VH及び/又はVLが、VH及び/又はVLコードヌクレオチド配列によってコードされ、ヌクレオチド配列が、請求項41又は47に規定の1つ又は複数の細胞のVH及び/又はVLコードヌクレオチド配列の配列である、方法。
【請求項６０】
各4鎖抗体が変異型重鎖定常領域を含み、第一及び第二の重鎖-軽鎖対の重鎖の対合を促進し;任意選択で、変異がノブ-イン-ホール変異又は荷電対合変異である、請求項54から59のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
ヒト又は非ヒト動物対象における疾患又は状態を治療する又は予防するための医薬組成物を産生するための方法であって、
(a)抗体を請求項52又は53に記載の方法によって産生される細胞株から発現させる工程;及び
(b)抗体を希釈剤又は賦形剤と混合する工程
を含み、
(c)任意選択で、抗体が、請求項54から60のいずれか一項に記載の方法によって得られる抗体と同一である、方法。
【請求項６２】
ヒト又は非ヒト動物対象における疾患又は状態を治療する又は予防するための医薬組成物を産生するための方法であって、二重特異性抗体を希釈剤又は賦形剤と混合する工程を含み、抗体が、請求項54から60のいずれか一項に記載の方法によって得られる抗体と同一である、方法。
【請求項６３】
請求項1から28のいずれか一項に記載の細胞又は請求項29から39のいずれか一項に記載の脊椎動物を産生するための方法であって、
(a)再構成された抗体Vドメインをコードする再構成された抗体可変領域を含む核酸を得る工程;及び
(b)可変領域又はそのコピーを細胞のゲノムに挿入し、それによって、可変領域が前記ゲノム中の抗体遺伝子座によって含まれる工程であって、
遺伝子座が(5'から3'方向に)、
(c)抗体遺伝子座イントロンエンハンサー;
(d)前記再構成された抗体可変領域;及び
(e)抗体Cドメインをコードする抗体定常領域
を含み、遺伝子座が(NからC末端方向に)前記再構成されたVドメイン及び前記Cドメインを含む抗体鎖を発現するように作動可能である工程;及び
(f)任意選択で、細胞が非ヒト脊椎動物ES細胞又はiPS細胞であり、方法が、請求項29から39のいずれか一項に記載の非ヒト脊椎動物を細胞から生成する工程を更に含む、方法。
【請求項６４】
可変ドメインがVLであり、CドメインがCLである、請求項63に記載の方法。
【請求項６５】
前記挿入する工程が、細胞の染色体DNAとの相同組換え又は部位特異的組換えを使用して実施される、請求項63又は64に記載の方法。
【請求項６６】
(5'から3'方向に)、
(a)前記イントロンエンハンサー;
(b)前記再構成された抗体可変領域;及び
(c)前記抗体定常領域
を含む導入遺伝子を得る工程;及び
前記導入遺伝子を細胞のゲノムに挿入し、それによって、前記抗体遺伝子座が、細胞によって含まれる工程
を含む、請求項63から65のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記可変領域を、
(a)細胞ゲノムの軽鎖遺伝子座のCLとイントロンエンハンサーとの間;又は
(b)細胞ゲノムの重鎖遺伝子座のCμとイントロンエンハンサー(Eμ)との間
に挿入する工程を含む、請求項63から65のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
可変領域が、所定の抗原に特異的に結合する抗体のVドメインをコードする、請求項63から67のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
請求項63に記載された再構成された抗体可変領域を含む核酸を得る工程が、
(a)請求項68に記載された前記抗体を発現する更なる細胞を得る工程;
(b)i.Vドメインをコードする再構成された可変領域配列を含む、更なる細胞のDNA配列を得る又はコピーする工程;又は
ii.Vドメインをコードする再構成された可変領域配列を含む更なる細胞のRNA配列を得る又はコピーする工程、及び前記RNA配列のDNAコピーを生じさせる工程
を含み、それによって、前記核酸を得る、請求項68に記載の方法。
【請求項７０】
結果として生じる細胞を培養して、複数の細胞を産生する工程を含み、各細胞が請求項1から28のいずれか一項に記載される、請求項63から69のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
請求項1から28のいずれか一項に記載の又は請求項63から70のいずれか一項に記載の方法に従って得られる、ES又はiPS細胞を移植された非ヒト脊椎動物胚盤胞又は前桑実胚。
【請求項７２】
請求項66に記載の方法に使用するための導入遺伝子を含み、導入遺伝子が(5'から3'方向に)、
(a)前記イントロンエンハンサー;
(b)前記再構成された抗体可変領域;及び
(c)前記抗体定常領域
を含む、核酸。
【請求項７３】
請求項67に記載の方法に使用するための再構成されたVドメインをコードする再構成された可変領域配列を含み、
(a)細胞ゲノムの第一のヌクレオチド配列にハイブリダイズするための相同アームが5'に隣接する、及び/又は
(b)細胞ゲノムの第二のヌクレオチド配列にハイブリダイズするための相同アームが3'に隣接する
前記再構成された可変領域配列を含み;
(c)5'相同アームが、細胞の抗体軽鎖遺伝子座の配列であって、そのCL領域の5'にある配列に相同的であり、及び3'相同アームが、前記遺伝子座の配列であって、遺伝子座のイントロンエンハンサーの3'にある配列に相同的であり、それによって、相同アームと細胞のゲノムの間の相同組換えが、可変領域配列を挿入可能とし、それによって、(5'から3'方向に)、イントロンエンハンサー、前記可変領域及びCL領域を含む遺伝子座を産生する;又は
(d)5'相同アームが、細胞の重鎖抗体遺伝子座の配列であって、そのCμ領域の5'にある配列に相同的であり、及び3'相同アームが、前記遺伝子座の配列であって、遺伝子座のイントロンエンハンサー(Eμ)の3'にある配列に相同的であり、それによって、相同アームと細胞のゲノムの間の相同組換えが、可変領域配列を挿入可能とし、それによって、(5'から3'方向に)、イントロンエンハンサー、前記可変領域及びCμ領域を含む遺伝子座を産生する、核酸。
【請求項７４】
核酸又は5'相同アームが(5'から3'方向に)、
(a)可変領域の転写を促進する作動可能なプロモーター;
(b)可変ドメインシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列;及び
(c)任意選択で、前記イントロンエンハンサー配列
を含み、可変領域配列が細胞ゲノムに挿入される場合、可変領域が、(NからC末端方向に)シグナル配列-Vドメイン-Cドメインを含む抗体鎖の発現のために、プロモーター及びシグナルペプチドコード配列の3'に作動可能に連結するように挿入される、請求項73に記載の核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に、治療又は診断に有用な多重特異性抗体の産生に使用するための、抗体鎖を産生するための、細胞及び非ヒト脊椎動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体は、急速に成長している薬物クラスである。典型的な4鎖抗体は、2つの同一の重鎖及び2つの同一の軽鎖を含有し、二価及び単一特異性の抗原結合特徴を有する分子を形成する。二重特異性抗体は、同時に、2つの異なる抗原又は同じ抗原の2つの異なるエピトープに結合することができる新しいクラスの薬物である。疾患処置用の二重特異性抗体のいくつかの適用が存在する。この概念の最も広く使用される適用は、がん免疫療法であり、この療法では、二重特異性抗体が細胞傷害性T細胞をエンゲージし、破壊されるべき腫瘍細胞をその標的にする。それらはまた、2つの標的に対して同時に遮断する(Klein、Cら、MABs. 2016. 8: 1010-20.)又は酵素経路に関するコファクターとして機能する(Kitazawa、T.ら、Nat Med. 2012. 18: 1570-4.)ために適用することができる。カツマキソマブ(抗EpCAMx抗CD3)及びブリナツモマブ(抗19x抗CD3)の2つの二重特異性抗体は、治療に関して承認されており、また、いくつかの追加の二重特異性抗体が現在臨床開発中である。二重特異性抗体に関して5つの異なる構造群、すなわち、(i)二重特異性IgG(BsIgG)、(ii)追加の抗原結合性部分に添付されるIgG、(iii)BsAb断片、(iv)二重特異性融合タンパク質及び(v)BsAbコンジュゲート(Spiess、C.ら、Mol. Immunol. 2015. 67:95-106.)が存在する。中でも、BsIgGは、IgG分子に近い分子量を有する二重特異性抗体である。それは、典型的なIgGと類似する生物学的及び生物物理学的な特徴を通常有する。細胞における2つの抗体の共発現によるBsIgGの産生は、所望のBsIgGが低収率であり、密接に関連する誤対合IgG分子を除去することが困難であることから、非常に難関である。2つの重鎖は、ホモ二量体並びに所望のヘテロ二量体を形成することができる。加えて、軽鎖は、コグネートではない重鎖と誤対合することができる。結果的に、2つの抗体の同時発現は、重鎖対合及び軽鎖対合問題に起因して9つの望まれないIgG種と僅かに1つの所望のBsIgGをもたらす。
【０００３】
ヘテロ二量体化を支持する重鎖を操作することは、「ノブ-イントゥ-ホール(knob-into-hole)」技術(Ridgway、J.B.ら、Protein Eng. 1996. 9: 617-21.;Atwell、S.ら、J. Mol. Biol. 1997. 270: 26-35.)又は「荷電対合(charge pairing)」技術(Gunasekaran、K.ら、J. Biol. Chem. 2010. 285: 19637-46.;Strop、P.ら、J. Mol. Biol. 2012. 420: 204-19.)によって実証されている。これらの技術は、重鎖対合問題を解決することを目的としている。軽鎖対合問題は、共通の軽鎖を使用する抗体の発現によって避けられる(Merchant、M.ら、Nat. Biotechnol. 1998. 16: 677-81.)。「ノブ-イントゥ-ホール」又は「荷電対合」、及び共通軽鎖技術、1つの軽鎖及び2つの重鎖の同時発現を適用することにより、1つの優勢なBsIgG及び3つの微量な誤対合種がもたらされる。ノブ-イントゥ-ホール技術は、US5,731,168及びWO98/50431に記載される。陽イオン交換を使用する精製工程(Sampei、Z.ら、PLoS One. 2013. 8: e57479.)又は示差プロテインA結合(differential protein A binding)(Smith、E.J.ら、Sci. Rep. 2015. 5: 17943.)が、この優勢に発現されるBsIgGを単離するのに適用されている。
【０００４】
BsIgGのための共通軽鎖を同定することは、困難である。コグネートではない重鎖及び軽鎖の強制的な対合は、分子の発現の低収率又は不安定性を通常もたらす。2つのコグネートの対合した軽鎖の間の軽鎖シャッフリングを使用して、共通軽鎖が同定された(Sampei、Z.ら、PLoS One. 2013. 8: e57479.)。しかしながら、これは、単調で退屈な工程及び多くの努力に依存しており、結果も不確かである。この方法と比較して、「共通軽鎖トランスジェニック」技術は、より直接的で単純であることが有望であり、インビボ選択に依存して、天然の対合分子を生成する。これらの適用では、僅か1つのキメラ軽鎖コード配列(ヒト可変及びマウス定常領域)を含有するように操作されているマウスを使用して、類似性を共有するが、必ずしも同一の軽鎖であるとは限らない抗体が同定される、その理由は、挿入された再構成された軽鎖配列が、体細胞超変異(SHM)に対してなおも感受性であるからである。また、1つの軽鎖配列挿入を有する生殖系列伝達マウスに依存するので、挿入された軽鎖選択は限定される。WO2004/106375、WO2009/1577771、EP2147594及びWO2014/160179は、二重特異性抗体及び共通軽鎖マウスの産生に関連する技術を考察している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】EP519596
【特許文献２】WO2017/50431
【特許文献３】WO2017/106375
【特許文献４】WO2017/1577771
【特許文献５】US8147843B2
【特許文献６】WO2017/160179
【特許文献７】WO2017/118598
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Klein、Cら、MABs. 2016. 8: 1010-20.
【非特許文献２】Kitazawa、T.ら、Nat Med. 2012. 18: 1570-4.
【非特許文献３】Spiess、C.ら、Mol. Immunol. 2015. 67:95-106.
【非特許文献４】Ridgway、J.B.ら、Protein Eng. 1996. 9: 617-21.
【非特許文献５】Atwell、S.ら、J. Mol. Biol. 1997. 270: 26-35.
【非特許文献６】Gunasekaran、K.ら、J. Biol. Chem. 2010. 285: 19637-46.
【非特許文献７】Strop、P.ら、J. Mol. Biol. 2012. 420: 204-19.
【非特許文献８】Merchant、M.ら、Nat. Biotechnol. 1998. 16: 677-81.
【非特許文献９】Sampei、Z.ら、PLoS One. 2013. 8: e57479.
【非特許文献１０】Smith、E.J.ら、Sci. Rep. 2015. 5: 17943.
【非特許文献１１】Sampei、Z.ら、PLoS One. 2013. 8: e57479.
【非特許文献１２】Spiess、C.、et al.,. Mol. Immunol. (2015)
【非特許文献１３】「The Merck Manual of Diagnosis and Therapy」、19th Edition、published by Merck Research Laboratories、2006 (ISBN 0-911910-19-0)
【非特許文献１４】Robert S. Porterら、(eds.)、The Encyclopedia of Molecular Biology、published by Blackwell Science Ltd.、1994 (ISBN 0-632-02182-9)
【非特許文献１５】Benjamin Lewin、Genes X、published by Jones & Bartlett Publishing、2009 (ISBN-10: 0763766321)
【非特許文献１６】Kendrewら、(eds.)、、Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference、published by VCH Publishers、Inc.、1995 (ISBN 1-56081-569-8)
【非特許文献１７】Current Protocols in Protein Sciences 2009、Wiley Intersciences、Coligan et al.、eds
【非特許文献１８】Sambrook et al.、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4 ed.)、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.、USA (2012)
【非特許文献１９】Davis et al.、Basic Methods in Molecular Biology、Elsevier Science Publishing、Inc.、New York、USA (1995)
【非特許文献２０】Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques Vol.152、S. L. Berger and A. R. Kimmel Eds.、Academic Press Inc.、San Diego、USA (1987)
【非特許文献２１】Current Protocols in Protein Science (CPPS) (John E. Coligan、et. al.、ed.、John Wiley and Sons、Inc.)
【非特許文献２２】Current Protocols in Cell Biology (CPCB) (Juan S. Bonifacino et. al. ed.、John Wiley and Sons、Inc.)
【非特許文献２３】Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique by R. Ian Freshney、Publisher: Wiley-Liss; 5th edition (2005)
【非特許文献２４】Animal Cell Culture Methods (Methods in Cell Biology、Vol. 57、Jennie P. Mather and David Barnes editors、Academic Press、1st edition、1998
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明者らは、抗体鎖遺伝子座(antibody chain locus)中のイントロンエンハンサー(intronic enhancer)の3'に可変領域配列をコードするVドメインを提供することにより、V領域のSHMの最小化を実現し、これにより、本発明を使用して、これらと対合して抗原結合部位を生成することができる真の共通軽鎖、VLドメイン及びVHドメインを同定及び使用することが可能になる。
【０００８】
それ故、第一の態様において、本発明は、以下を提供する:
抗体軽鎖遺伝子座(第一の遺伝子座)を含み、遺伝子座が(5'から3'方向に)、
(a)軽鎖イントロンエンハンサー;
(b)再構成された抗体Vドメインをコードする再構成された抗体可変領域;及び
(c)軽鎖Cドメインをコードする抗体軽鎖定常領域
を含み、遺伝子座が、(NからC末端方向に)前記再構成されたVドメイン及び前記Cドメインを含む抗体鎖を発現するように作動可能である、細胞。
【０００９】
第二の態様において、本発明は、以下を提供する:
抗体重鎖遺伝子座(第一の遺伝子座)を含み、遺伝子座が(5'から3'方向に)、
(a)重鎖イントロンエンハンサー(Eμ);
(b)再構成された抗体Vドメインをコードする再構成された抗体可変領域;
(c)任意選択のスイッチ配列;及び
(d)重鎖CH1ドメインをコードする抗体重鎖定常領域
を含み、遺伝子座が、(NからC末端方向に)前記再構成されたVドメイン及び前記CH1ドメインを含む抗体鎖を発現するように作動可能である、細胞。
【００１０】
第三の態様において、本発明は、以下を提供する:
本発明に従う複数の細胞を含むトランスジェニック非ヒト脊椎動物。
【００１１】
第四の態様において、本発明は、以下を提供する:
抗体軽鎖レパートリーが、単一の再構成されたVLドメイン種に関して少なくとも95%純粋である、トランスジェニック非ヒト脊椎動物。
【００１２】
第五の態様において、本発明は、以下を提供する:
抗体軽鎖レパートリーが、第一のVL遺伝子セグメント及び第一のJL遺伝子セグメントの組換えに由来するVLドメインを含む、トランスジェニック非ヒト脊椎動物であって、前記組換えに由来する全てのVLドメインの少なくとも95%が、同じVLアミノ酸配列を含む、トランスジェニック非ヒト脊椎動物。
【００１３】
第六の態様において、本発明は、以下を提供する:
複数の前記第一の遺伝子座を含む本発明に従う脊椎動物の複数の脾臓、骨髄、B細胞又は血液細胞。
【００１４】
第七の態様において、本発明は、以下を提供する:
脾臓、骨髄、B細胞、ハイブリドーマ、CHO細胞、HEK細胞、MEF細胞、COS細胞、HeLa細胞又は血液細胞の集団であって、各細胞が本発明に従い、
(a)少なくとも95%の抗体が同じ軽鎖VLドメインを共有し、集団が少なくとも10の異なるVHドメイン種を含み;又は
(b)抗体が、第一のVL遺伝子セグメント及び第一のJL遺伝子セグメントの組換えに由来するVLドメイン
を含み、前記組換えに由来する全ての前記VLドメインの少なくとも95%が、同じVLアミノ酸配列を含み、集団が少なくとも10の異なるVHドメイン種を含む、集団。
【００１５】
第八の態様において、本発明は、以下を提供する:
集団によって含まれる少なくとも95%の抗体が同じ軽鎖VLドメインを共有し、集団が少なくとも10の異なるVHドメイン種を含む、ポリクローナル抗体集団。
【００１６】
第九の態様において、本発明は、以下を提供する:
第一のVL遺伝子セグメント及び第一のJL遺伝子セグメントの組換えに由来するVLドメインを含むポリクローナル抗体集団であって、前記組換えに由来する全ての前記VLドメインの少なくとも95%が、同じVLアミノ酸配列を含み、集団が少なくとも10の異なるVHドメイン種を含む、ポリクローナル抗体集団。
【００１７】
第十の態様において、本発明は、以下を提供する:
抗体、抗体可変ドメイン、抗体若しくは抗体可変ドメインをコードするヌクレオチド配列、又は抗体若しくはドメインを発現可能である発現ベクター若しくは宿主細胞を同定する若しくは得る方法であって、抗体又はドメインが、標的抗原に特異的に結合可能であり、方法が、
(a)本発明の細胞集団又は本発明の抗体集団を、(例えば、固体支持体に固定化された)前記抗原と接触させる工程;
(b)前記集団によって発現される又は含まれる抗体を前記抗原に結合させる工程;及び
(c)抗原に結合する1つ又は複数の抗体を単離する又は同定する工程、又は前記1つ又は複数の抗体のVH及び/又はVLドメインを単離する又は同定する工程;又は前記VH又はVLをコードするヌクレオチド配列を同定する工程;及び
(d)任意選択で、
(i)同定された前記抗体又はドメインを、それをコードするヌクレオチド配列と相関させ、それによって、前記配列を同定する工程;
(ii)前記配列を(例えば、PCRを使用して)増幅する工程及びコードされる抗体又はドメインの発現のために配列を発現ベクター又は宿主細胞ゲノムに挿入する工程;及び
(iii)任意選択で、前記抗体又はドメインを発現させる工程及び単離する工程(例えば、ドメインが、抗体鎖によって含まれる)
を含み、工程(i)及び(ii)は、任意の順序で実施することができる、方法。
【００１８】
第十一の態様において、本発明は、以下を提供する:
本発明のポリクローナル抗体集団を発現する複数のB細胞、ハイブリドーマ、CHO細胞、HEK細胞、MEF細胞、COS細胞、HeLa細胞。
【００１９】
第十二の態様において、本発明は、以下を提供する:
抗体又は抗体可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を得る方法であって、抗体若しくはドメインが、標的抗原に特異的に結合可能であり、方法が、
(a)VL及び/又はVHコードヌクレオチド配列を本発明の細胞から得る工程;
(b)前記配列を、(例えば、PCRを使用して)増幅する工程;及び
(c)任意選択で、コードされる抗体又はドメインの発現のために配列を発現ベクター又は宿主細胞ゲノムに挿入する工程
を含む、方法。
【００２０】
第十三の態様において、本発明は、以下を提供する:
抗原に特異的に結合する抗体の産生のための、抗体産生細胞株を得る方法であって、VH及びVLコードヌクレオチド配列を、宿主細胞(例えば、CHO、HEK、MEF、COS又はHeLa細胞)のゲノムに挿入する工程を含み、
(a)各VH配列が、VH及びCドメインを含む細胞による重鎖の発現のために抗体重鎖定常領域(例えば、ヒト定常領域)の5'に作動可能に挿入され;
(b)各VL配列が、VL及びCドメインを含む細胞による軽鎖の発現のために抗体軽鎖定常領域(例えば、ヒト定常領域)の5'に作動可能に挿入され;
(c)発現される重鎖が、軽鎖と対合可能で、重鎖-軽鎖対を産生し、各対が、抗原に結合可能なVH/VL結合部位を含み;及び
(d)VH及びVLコードヌクレオチド配列が、本発明の1つ又は複数の細胞のVH及びVLコードヌクレオチド配列の配列である、方法。
【００２１】
第十四の態様において、本発明は、以下を提供する:
二重特異性4鎖抗体を産生する方法であって、二重特異性抗体が、第一及び第二の抗原に対する、それぞれの結合部位を含み、抗原が互いに異なり、各抗体が第一の重鎖-軽鎖対及び第二の重鎖-軽鎖対を含み、
(a)第一の重鎖-軽鎖対の重鎖が、第一のVHを含み、第一のVH(第一の重鎖の一部として発現される場合)が、VL(軽鎖の一部として発現される場合)と対合可能で、第一の抗原に特異的に結合可能な第一のVH/VL結合部位を形成し;及び
(b)第二の重鎖-軽鎖対の重鎖が、第二のVHを含み、第二のVH(第二の重鎖の一部として発現される場合)が、前記VL(軽鎖の一部として発現される場合)と対合可能で、第二の抗原に特異的に結合可能な第二のVH/VL結合部位を形成し;
方法が、
(c)(i)第一の細胞ゲノムに前記第一のVHをコードするヌクレオチド配列を挿入する工程であって、VH配列が、第一のVH及びCドメインを含む第一の重鎖の発現のために抗体重鎖定常領域(例えば、ヒト定常領域)の5'に作動可能に挿入される工程;及び(ii)細胞を培養して第一の重鎖を発現する第一の細胞株を産生する工程によって第一の重鎖を発現可能な第一の細胞株を産生する工程;
(d)(i)第二の細胞ゲノムに前記第二のVHをコードするヌクレオチド配列を挿入する工程であって、VH配列が、第二のVH及びCドメインを含む第二の重鎖の発現のために抗体重鎖定常領域(例えば、ヒト定常領域)の5'に作動可能に挿入される工程;及び(ii)細胞を培養して第二の重鎖を発現する第二の細胞株を産生する工程によって第二の重鎖を発現可能な第二の細胞株を産生する工程;
(e)第一の重鎖を第一の細胞株及び第二の重鎖を第二の細胞株から発現させる工程及び前記第一のVHを含む第一の重鎖、前記第二のVHを含む第二の重鎖及び前記VLを含む軽鎖を一緒に混合する工程であって、それによって、(iii)第一の重鎖が、軽鎖と対合して前記第一の重鎖-軽鎖対を産生し、(iv)第二の重鎖が、軽鎖と対合して前記第二の重鎖-軽鎖対を産生し;及び(v)第一の重鎖-軽鎖対が、第二の重鎖-軽鎖対と対合し、それによって、前記二重特異性抗体を産生する工程
を含み、
VH及び/又はVLコードヌクレオチド配列が、本発明の1つ又は複数の細胞のVH及び/又はVLコードヌクレオチド配列の配列である、方法。
【００２２】
第十五の態様において、本発明は、以下を提供する:
二重特異性4鎖抗体を産生する方法であって、二重特異性抗体が、第一及び第二の抗原に対する、それぞれの結合部位を含み、抗原が互いに異なり、各抗体が第一の重鎖-軽鎖対及び第二の重鎖-軽鎖対を含み、
(a)第一の重鎖-軽鎖対の重鎖が、第一のVHを含み、第一のVH(第一の重鎖の一部として発現される場合)が、VL(軽鎖の一部として発現される場合)と対合可能で、第一の抗原に特異的に結合可能な第一のVH/VL結合部位を形成し;及び
(b)第二の重鎖-軽鎖対の重鎖が、第二のVHを含み、第二のVH(第二の重鎖の一部として発現される場合)が、前記VL(軽鎖の一部として発現される場合)と対合可能で、第二の抗原に特異的に結合可能な第二のVH/VL結合部位を形成し;
方法が、
(c)前記第一のVHを含む第一の重鎖、前記第二のVHを含む第二の重鎖及び前記VLを含む軽鎖を一緒に混合する工程であって、それによって、(i)第一の重鎖が、軽鎖と対合して前記第一の重鎖-軽鎖対を産生し、(ii)第二の重鎖が、軽鎖と対合して前記第二の重鎖-軽鎖対を産生し;及び(iii)第一の重鎖-軽鎖対が、第二の重鎖-軽鎖対と対合し、それによって、前記二重特異性抗体を産生する工程を含み、
VH及び/又はVLが、VH及び/又はVLコードヌクレオチド配列によってコードされ、ヌクレオチド配列が、本発明の1つ又は複数の細胞のVH及び/又はVLコードヌクレオチド配列の配列である、方法。
【００２３】
第十六の態様において、本発明は、以下を提供する:
ヒト又は非ヒト動物対象における疾患又は状態(例えば、がん)を治療する又は予防するための医薬組成物を産生する方法であって、(a)抗体を本発明の方法によって産生される細胞株から発現させる工程;
(b)抗体を希釈剤又は賦形剤と混合する工程
を含み、
(c)任意選択で、抗体が、本発明の方法によって得られる抗体と同一である、方法。
【００２４】
第十七の態様において、本発明は、以下を提供する:
ヒト又は非ヒト動物対象における疾患又は状態(例えば、がん)を治療する又は予防するための医薬組成物を産生する方法であって、二重特異性抗体を希釈剤又は賦形剤と混合する工程を含み、抗体が、本発明の方法によって得られる抗体と同一である、方法。
【００２５】
第十八の態様において、本発明は、以下を提供する:
本発明の細胞又は脊椎動物を産生する方法であって、
(a)再構成された抗体Vドメインをコードする再構成された抗体可変領域を含む核酸を得る工程;及び
(b)可変領域又はそのコピーを細胞のゲノムに挿入し、それによって、可変領域が前記ゲノム中の抗体遺伝子座によって含まれる工程であって、
遺伝子座が(5'から3'方向に)、
(c)抗体遺伝子座イントロンエンハンサー;
(d)前記再構成された抗体可変領域;及び
(e)抗体Cドメインをコードする抗体定常領域
を含み、遺伝子座が、(NからC末端方向に)前記再構成されたVドメイン及び前記Cドメインを含む抗体鎖を発現するように作動可能である、工程;及び
(f)任意選択で、細胞が非ヒト脊椎動物ES細胞又はiPS細胞であり、本発明の非ヒト脊椎動物を細胞から生成する工程
を更に含む、方法。
【００２６】
第十九の態様において、本発明は、以下を提供する:
本発明に従う又は本発明の方法に従って得られる、ES又はiPS細胞を移植された非ヒト脊椎動物(例えば、げっ歯類、ラット又はマウス)胚盤胞又は前桑実胚(pre-morula embryo)。
【００２７】
第二十の態様において、本発明は、以下を提供する:
本発明の方法に使用するための導入遺伝子を含み、導入遺伝子が(5'から3'方向に)、
(a)前記イントロンエンハンサー;
(b)前記再構成された抗体可変領域;及び
(c)前記抗体定常領域を
含む、核酸。
【００２８】
第二十一の態様において、本発明は、以下を提供する:
本発明の方法に使用するための再構成されたVドメインをコードする再構成された可変領域配列を含み、
(a)細胞ゲノムの第一のヌクレオチド配列にハイブリダイズするための相同アームが5'に、及び/又は
(b)細胞ゲノムの第二のヌクレオチド配列にハイブリダイズするための相同アームが3'に
隣接する前記再構成された可変領域配列を含み;
(c)第一のヌクレオチド配列が、細胞の抗体軽鎖(例えば、カッパ)遺伝子座の配列であって、そのCL領域の5'にある配列に相同的であり、及び第二のヌクレオチド配列が、前記遺伝子座の配列であって、遺伝子座のイントロンエンハンサー(例えば、Eiκ)の3'にある配列に相同的であり、それによって、相同アームと細胞のゲノムの間の相同組換えが、可変領域配列を挿入可能であり、それによって、(5'から3'方向に)、イントロンエンハンサー、前記可変領域及びCL領域を含む遺伝子座を産生する;又は
(d)第一のヌクレオチド配列が、細胞の重鎖抗体遺伝子座の配列であって、そのCμ領域の5'にある配列に相同的であり、及び第二のヌクレオチド配列が、前記遺伝子座の配列であって、遺伝子座のイントロンエンハンサー(Eμ)の3'にある配列に相同的であり、それによって、相同アームと細胞のゲノムの間の相同組換えが、可変領域配列を挿入可能であり、それによって、(5'から3'方向に)、イントロンエンハンサー、前記可変領域及びCμ領域を含む遺伝子座を産生する、核酸。
【００２９】
更なる例示は、実施例及びデータにより以下に提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】共通軽鎖対立遺伝子を生成するターゲティング戦略の概略図である。マウスES細胞中のマウスκイントロンエンハンサー及びマウスκ定常領域(4.6kb)を、EF1α-Puro-2A-EGFPカセット、ヒトVλ3-21の天然プロモーター及びシグナルペプチド、マウスκイントロンエンハンサー、並びにTarget Xに特異的に結合する抗体からの組換えヒト共通ラムダ軽鎖対立遺伝子を含有する、6.8kbの合成したDNA断片によって置き換えた。
【図２】共通軽鎖ノックインキメラマウスからの、ヒトλ軽鎖を有する抗体を発現し、ヒトTarget Xに特異的に結合する、脾臓B細胞を単離するソーティング戦略の概略図である。ソーティング戦略には、リンパ球選択、続いて単一細胞選択、続いて生細胞選択、続いてCD19+ B細胞選択及び最終的にヒトラムダ陽性且つ抗原(Target X)陽性細胞選択が関与する。SSC:  側方散乱。FSC:前方散乱。SSC-A:側方散乱面積。
【図３】共通軽鎖ノックインキメラマウスからの、ヒトλ軽鎖を有する抗体を発現し、ヒトTarget Xに特異的に結合する、脾臓B細胞の単離を示すソーティングプロットである。グラフA-Fは、ソーティングプロットであり、ソーティングの流れを示す。第一のソーティング(sort)において選択された細胞を引き続く選別に使用し、選択プロセスを継続した。A.  リンパ球を選択するソーティングプロット。SSC-A(側方散乱面積)対FSC-A(前方散乱面積)。B.  単一細胞を選択するソーティングプロット。FSC-W(前方散乱幅)対FSC-A(前方散乱面積)。C.  単一細胞を選択するソーティングプロット。SSC-W(側方散乱幅)対SSC-A(側方散乱面積)。D.  生細胞を選択するソーティングプロット。SSC-A(側方散乱面積)対生/死  7-AAD。E. CD19+ B細胞を選択するソーティングプロット。Y軸は、CD19-PBに対し使用されたマーカーを示す。F.  ヒトラムダ軽鎖を発現し、ヒト  Target Xに特異的に結合するB細胞のソーティングプロット。AF647で標識されたヒト  Target X抗原対PEで標識されたラムダ軽鎖。
【図４】本質的に全て、ノックイン共通軽鎖対立遺伝子と同じ6つの非生殖系列変異を保持する、NGSによって回収された軽鎖のVL領域。
【図５】標的化ES細胞(標的化Rag-/-)でマイクロインジェクションされたRag-/-胚盤胞から生成されたキメラマウスは、野生型マウス(野生型)と比較して、類似する全生存脾臓細胞数を有していた。
【図６】標的化ES細胞(標的化Rag-/-)でマイクロインジェクションされたRag-/-胚盤胞から生成されたキメラマウスは、野生型マウス(野生型)と比較して、類似するCD19陽性、B220陽性B細胞数を有していた。
【図７】標的化ES細胞(標的化Rag-/-)でマイクロインジェクションされたRag-/-胚盤胞から生成されたキメラマウス中のCD19陽性、B220陽性の脾臓B細胞集団パーセンテージは、野生型マウス(野生型)と類似していた。
【図８】標的化ES細胞(標的化Rag-/-)でマイクロインジェクションされたRag-/-胚盤胞から生成されたキメラマウス中のCD19陽性、B220陽性の脾臓B細胞集団パーセンテージは、野生型マウス(野生型)と類似していた。
【図９】標的化ES細胞(標的化Rag-/-)でマイクロインジェクションされたRag-/-胚盤胞から生成されたキメラマウス中の抗原陽性IgG B細胞集団パーセンテージは、野生型マウス(野生型)と類似していた。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本明細書中の態様は、マウスである非ヒト脊椎動物の観点から表現されうるが、げっ歯類、ラット、ウサギ又は任意の他の非ヒト脊椎動物が、本発明を実施するため適切でありうることが理解されるべきである。
【００３２】
発明者らは、抗体鎖遺伝子座中のイントロンエンハンサーの3'のVドメインコード可変領域配列の抗体軽鎖又は重鎖遺伝子座の提供により、V領域のSHMの最小化を実現し、これにより、本発明を使用して真の共通軽鎖又は重鎖を同定することが可能になる。幾つかの実施形態において、遺伝子座は、野生型又はトランスジェニック脊椎動物細胞又は非ヒト脊椎動物の内因性抗体遺伝子座の改変バージョンである。他の実施形態において、遺伝子座は、内因性抗体鎖遺伝子座にないが、代わりに、Rosa26又は遺伝子座が抗体鎖を発現可能な別の遺伝子座に挿入される遺伝子座によって含まれる。例えば、本発明の遺伝子座は、細胞又は脊椎動物ゲノム中にランダムに挿入された導入遺伝子によって含まれる。V領域のSHMを最小化する又は排除することにより、単一(すなわち「共通」)軽鎖が、細胞又は脊椎動物によって含まれる細胞によって発現される可能性がより高い。SHMが排除される場合、可変領域は、脊椎動物によって発現される異なるVHドメインと対合しうる単一タイプのVLドメインだけを発現し、これにより、VLと機能的に対合し、抗原又はエピトープに対するVH/VL結合部位を形成しうる、1つ又は複数のVHドメインのスクリーニング及び同定が可能になる。いくつかの変異を生じうるとしても、この可能性を本発明は制限し、同じV-J組換えによって産生されるVLドメインの純度は、(例えば、以下に更に記載される通り少なくとも95%又は100%のレベルで)単一の再構成されたVLがはるかに優勢となる可能性が高い。したがって、所望の共通軽鎖の発現が、(例えば、遺伝子座又は導入遺伝子中の既知の可変領域(又は軽鎖)配列、例えば、所定の抗原又はエピトープに特異的に結合することができる既知の抗体のVL(又は軽鎖)をコードする既知の再構成された可変領域(又は軽鎖)配列を提供することによって)あらかじめ決定することができることは有効である。有利には、軽鎖配列(例えば、抗原又はエピトープに対する既知の結合特異性及び/又は親和性の所定のヒト抗体のヒト再構成VκJκCκ)を使用する実施形態の能力は有用であり、その理由は、本発明の脊椎動物における、インビボでの対合及び選択が、その後、最終的な抗体産物(例えば、二重特異性抗体医薬)に使用される完全なヒト軽鎖との関連で可能となるからである。
【００３３】
任意選択で、共通軽鎖は、配列番号1のアミノ酸配列又はそれと少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98又は99%同一であるアミノ酸配列を含む又はそれからなる。任意選択で、共通軽鎖の可変ドメインは、配列番号1の軽鎖配列の可変ドメインを含む又はそれからなり、任意選択で、5以下、4以下、3以下、2又は1アミノ酸変化を有する。各変化は、アミノ酸欠失、置換又は付加であってもよい。一例では、可変ドメインの配列は、Kabatナンバリングによって決定される。一例では、可変ドメインの配列は、IMGTナンバリングによって決定される。
【００３４】
多重又は二重特異性抗体のための共通軽鎖を同定する、キメラマウス(又は他のヒトではない脊椎動物)を使用するインビボアプローチの例が、提供され、ここで、マウスからのB細胞は、再構成された軽鎖遺伝子座を有するES細胞に由来し、単一又は非常に限定数の軽鎖可変ドメインを有する免疫グロブリン軽鎖レパートリーを発現する。キメラマウスは、例えば、野生型、RAGノックアウト又はノックイン再構成ヒト軽鎖コード配列及び再構成されていないヒト又は内因性IgH遺伝子座を保持するマウスES細胞が注入されるIgHノックアウトマウス胚盤胞から生成される。再構成されたヒト軽鎖のDNA配列は、体細胞超変異(SHM)フリーでありうるように挿入される。共通軽鎖を発現する、そのようなキメラマウス又は他の非ヒト脊椎動物を作製するための方法が、提供される。二重特異性抗体として有用な(例えば、ヒトにおけるがん療法のための)抗原特異的共通軽鎖抗体を同定するための方法が、そのような抗体自体及びこれらを発現する細胞として、提供される。
【００３５】
ワークフローの特定の例は、以下であってもよい:
1.  第一のヒトVH及びVLドメインを含む第一の抗体を得る工程であって、抗体が、第一の所定の抗原に特異的に結合する工程;又は抗体の前記VL又は軽鎖をコードするヌクレオチド配列を得る工程;
2.複数の異なるヒトVHドメインを発現させるためのヒト化可変領域を含む、IgH遺伝子座を(ヘテロ接合又はホモ接合型で)含む、トランスジェニックマウスES細胞を得る工程;
3.抗体の軽鎖又はそのVLをコードするヌクレオチド配列をES細胞のゲノムに挿入する工程であって、挿入がES細胞ゲノムのカッパ遺伝子座対立遺伝子のEiκとCκの間である、工程;
4.任意選択で、他のカッパ遺伝子座対立遺伝子を改変(故に、カッパ軽鎖を発現可能ではない)又は対立遺伝子を改変し、それによって、第一又は第二の抗体又はそのVLの軽鎖をコードするヌクレオチド配列が、前記他のカッパ遺伝子座対立遺伝子のEiκとCκの間に挿入される、工程;
5.(例えば、ES細胞をレシピエント胚盤胞又は前桑実胚(例えば、RAG及び/又はIgHノックアウト胚盤胞又は前桑実胚)に移植する工程及び胚盤胞又は前桑実胚を偽妊娠雌性マウスに移植し、それによって、1つ又は複数の子が雌から出産される工程によって)ES細胞をマウスに発生させる工程であって、マウス又は子が、そのように発生して、軽鎖又はVLを発現可能な少なくとも1つのカッパ遺伝子座を含み、軽鎖又はVLが、マウスによって発現される重鎖又はVHと対合し、VH/VL抗原結合部位を形成する、工程;
6.任意選択で、子孫マウスを得る工程であって、子孫が、軽鎖又はVLを発現可能な少なくとも1つのカッパ遺伝子座を各々含み、軽鎖又はVLが、子孫マウスによって発現される重鎖又はVHと対合し、VH/VL抗原結合部位を形成する、工程;
7.第一及び第二の抗原が異なる、工程5のマウス又は前記子孫マウス(第二の抗原を有する)を免疫する工程;
8.工程7の免疫化マウスから(例えば、工程7の免疫化マウスのB細胞のDNAのPCR及び/又はB細胞のハイブリドーマ技術を使用して)、VL(又は軽鎖のVLと対合する重鎖のVH)と対合するVH(第二のVH)をコードするヌクレオチド配列を得る工程であって、第二のVH及びVLが、第二の抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成する、工程;
9.任意選択で、第一のVHをコードするヌクレオチド配列、第二のVHをコードするヌクレオチド配列、及びVLをコードするヌクレオチド配列を、1つ又は複数の発現ベクターに又は1つ又は複数の宿主細胞のゲノムに挿入する工程であって、各Vヌクレオチド配列が、それぞれ第一の抗体重鎖、第二の抗体重鎖又は抗体軽鎖の発現のために、それぞれ抗体第一CH、第二CH又はCL領域の5'に作動可能に連結されており;任意選択で、第一及び第二のCH領域が、(例えば、荷電対合(charge pair)変異又はノブ-イン-ホール(knob-in-hole)変異を使用して)、一緒に対合する、変異型ヒトCHドメインである第一及び第二のCHドメインをコードする、及び/又は第一及び第二の鎖が、(例えば、0.5-1pI単位で分けられる)異なるpIを有する、工程;
10.任意選択で、工程9の宿主細胞を得、宿主細胞において重鎖及び軽鎖を発現させ、それによって、二重特異性抗体が、産生され、各々が第一の抗原に特異的に結合可能なVH/VL結合部位を含む第一の重鎖-軽鎖対、及び第二の抗原に特異的に結合可能なVH/VL結合部位を含む第二の重鎖-軽鎖対を含む、工程;並びに
11.任意選択で、前記二重特異性抗体を単離する工程。
【００３６】
代替的に、抗原の第一及び第二のエピトープは、第一及び第二の抗原の代わりに使用される。一実施形態において、方法は、工程1から8;1から9;1から10又は1から11を含む。一例において、二重特異性抗体を得るための方法が提供され、その方法は工程7で始められる。一例において、二重特異性抗体を得るための方法が提供され、その方法は工程8で始められる。一例において、二重特異性抗体を得るための方法が提供され、その方法は工程9で始められる。一例において、二重特異性抗体を得るための方法が提供され、その方法は工程10で始められる。一例において、二重特異性抗体を得るための方法が提供され、その方法は工程11で始められる。
【００３７】
一例において、工程7に使用される各マウスの軽鎖レパートリーは、VLに関して、少なくとも95、96、97、98又は99%純粋(又は100%純粋)である。これは、例えば、B細胞サンプル(例えば、脾臓及び/又は骨髄B細胞サンプル)をマウスから得ること、そのVLコードヌクレオチド配列(例えば、mRNA又はcDNA)を得ること、及び次世代シークエンシング(NGS)を実施して、サンプルにとったヌクレオチド配列中のVL(及び任意の他のVL種)のパーセンテージを決定することによって、決定することができる。当業者は、ルーチンのNGS技術に精通している。それ故、例えば、本明細書中、VLについて、「95%純粋」は、レパートリー(例えば、マウスのサンプルにとったレパートリー)が、例えば、NGSによって決定されるような、95%又はそれ以上のレパートリー又はサンプルの比率で、前記所定のVLをコードする配列(例えば、mRNA、cDNA又はDNA)を含むことを意味する。一実施形態において、マウスによって発現される全て(又は実質的に全て)のVLドメインは、工程1の抗体のVLと同一である。これは、イントロンエンハンサーの3'でのVLコード配列の本発明に従う位置決め(例えば、このエンハンサーと定常領域の間)のために有利に達成されうる。
【００３８】
代替的に、VLコード可変領域配列(例えば、上記の工程3及び4において)は、マウスラムダ2-4とCλの間又はマウスラムダ4-10エンハンサーとCλの間での細胞又はマウスのラムダ遺伝子座対立遺伝子における挿入物である。加えて、一実施形態において、VLコード可変領域配列は、EiκとCκの間での細胞又はマウスのカッパ遺伝子座対立遺伝子における挿入物である。
【００３９】
代替的に、ラムダ遺伝子座対立遺伝子の1つだけが前記挿入物を含み;カッパ遺伝子座対立遺伝子の1つだけが前記挿入物を含む。
【００４０】
ラムダ及びカッパ中又は2つのラムダ又は2つのカッパ対立遺伝子中のVLコード可変領域挿入物は、同じであってもよい又は異なっていてもよい(すなわち、同じ又は異なるVL、例えば、同じ又は異なる抗原に対する所定の特異性の2つの異なる抗体のVLをコードする)。
【００４１】
一実施形態において、第一及び第二のマウス(又は他の非ヒト脊椎動物、例えば、ラット)ES細胞は、改変されて本発明の第一及び第二の遺伝子座を含み、例えば、各細胞は工程1から4に従って改変されるが、細胞中のVLコードヌクレオチド配列挿入物は、異なる(すなわち、異なるVLドメイン、例えば、異なる抗原又はエピトープ特異性の異なる抗体のVLドメインをコードする)。第一及び第二のES細胞(又はその子孫)は、同じ胚盤胞又は前桑実胚及び発生したマウス(又はその子孫)に移植され、マウス又は子孫は、マウス又は子孫によって発現されるVHドメイン(例えば、ヒトVH)との対合に関して前記異なるVLドメインを発現する。
【００４２】
有利には、第一世代のマウス(すなわち、本明細書中のES細胞-移植胚盤胞又は前桑実胚から直接的に成長させる)は、引き続く世代のマウスへの更なる繁殖を必要とすることなく免疫することができるので、有用である。これにより、時間が節約され、繁殖の複雑性が省かれる。例えば、胚盤胞又は前桑実胚にとって、ES細胞移植片を受けて、そのIgH遺伝子座のノックアウトを含むか又はRAGノックアウトであることが望ましい場合がある、その理由は、このことにより、第一世代のマウス(又は引き続く世代のマウス)中で産生される全ての増殖性B細胞を、ES細胞由来であるように強制させ、それによって、全ての増殖性B細胞が本発明の1つ又は複数の遺伝子座を含むことが保証されるからである。
【００４３】
したがって、任意選択で、非ヒト脊椎動物子孫又は系統中の本発明の遺伝子座の生殖系列伝達を得ることが必要とされず、代わりに、胚盤胞又は前桑実胚から成長させたキメラ脊椎動物で働くことが可能であることが、一般に有利であり得、これにより、軽鎖対立遺伝子改変の生殖系列伝達が記載される先行技術に優る顕著な時間的な利点が提供される。したがって、一実施形態では、本発明のマウス又は脊椎動物は、第一の複数の本発明の細胞及び本発明に従わない第二の複数の細胞(例えば、本発明の遺伝子座を含まない野生型又はトランスジェニック細胞)を含むキメラである。任意選択で、キメラは、本発明に従うが、第一の複数の細胞の本発明の遺伝子座によって発現されるVドメインとは異なるVドメインを発現可能である遺伝子座を含む本発明に従う第三の複数の細胞を含みうる。したがって、異なるが、本発明の遺伝子座から発現されるように、あらかじめ決定される、第一及び第二のVLドメインを発現することができるキメラ脊椎動物を発生させることが可能である。脊椎動物中の重鎖及び軽鎖が第一及び任意選択の第三の複数の細胞によってのみ寄与をうけるように、第二の複数の細胞の1つ又は複数の軽鎖及び/又は重鎖遺伝子座の発現をノックアウトすることは有利でありうる。加えて又は代わりに、第二の複数の細胞は、RAG(例えば、RAG-1及び/又はRAG-2)ノックアウトを有し、そのような脊椎動物における細胞からの抗体鎖寄与を排除する。
【００４４】
代替的な態様において、そのような本発明のキメラ及び第一世代非ヒト脊椎動物の生成及び使用は、繁殖の必要性がなく、また時間の節約になると記載されていることから有利であり、これがイントロンエンハンサーの3'に可変領域挿入を提供することを対象とする本発明の特徴に依存しないことが認識された。したがって、本明細書中の任意の特徴が代替に準用されうる、代替的な態様が提供され、ここで、本発明の遺伝子座がイントロンエンハンサーの5'に前記可変領域を含み、それによって、遺伝子座はV及びCドメインを含む抗体鎖を発現可能である。更に、代替的な態様において、可変領域は、複数のVH遺伝子セグメント、1つ又は複数のD遺伝子セグメント及び1つ又は複数のJH遺伝子セグメントを含む再構成されていない可変領域であってもよく、ここで、可変領域は、複数の異なるVHドメインの発現のために再構成可能である;又は可変領域は、複数のVL遺伝子セグメント及び1つ又は複数のJH遺伝子セグメントを含む再構成されていない可変領域であってもよく、ここで、可変領域は、複数の異なるVLドメインの発現のために再構成可能である;又は僅か一、二、三、四又は5つの再構成された可変領域は、Vドメイン(例えば、VLドメイン)の制限された多様性を発現させるためにエンハンサーの5'にあってもよい。特に、この態様は有用であり、ここで、脊椎動物はキメラであり、そのような第一世代の脊椎動物は本明細書に記載される。本発明の代替的な態様は、そのようなキメラ又は脊椎動物を抗原で免疫する及び抗原に特異的に結合する抗体、そのVHドメイン、そのVLドメイン、又はこれらのいずれかをコードするヌクレオチド配列を単離する方法も提供する。この方法が、繁殖サイクルを必要とすることなく作製される脊椎動物を免疫する可能性によって簡素化されることは有益である。
【００４５】
特定の抗原又はエピトープに「特異的に結合する」又は「特異的な」Vドメイン又は結合部位は、他の抗原又はエピトープに実質的に結合することなく、その特定の抗原又はエピトープに結合するものである。例えば、抗原又はエピトープに対する結合は、抗体が、1mM以下、例えば、100μM以下、10μM以下、1μM以下、100nM以下、例えば、10nM以下、1nM以下、500pM以下、100pM以下、又は10pM以下のKDで結合する場合に特異的である。結合親和性(KD)は、当業者に知られている標準手順、例えば、ELISAにおける結合及び/又は表面プラズモン共鳴(例えば、Biacore(商標)、Proteon(商標)又はKinExA(商標)溶相親和性測定、これは、fM親和性まで検出することができる(Sapidyne Instruments、Idaho))を使用する親和性決定を使用して決定することができる。一実施形態において、表面プラズモン共鳴(SPR)は、25℃で実施される。別の実施形態において、SPRは、37℃で実施される。一実施形態において、SPRは、約pH7等の生理学的pHで、又は約pH7.6で(例えば、pH7.6でのHepes緩衝生理食塩水(HBS-EPとも称される)を使用して)実施される。一実施形態において、SPRは、生理学的塩分レベル、例えば、150mMのNaClで実施される。一実施形態において、SPRは、0.05体積%以下の洗剤レベルで、例えば、0.05%のP20(ポリソルベート20、例えば、Tween-20(商標))及び3mMのEDTAの存在下で、実施される。一例では、SPRは、pH7.6の緩衝液、150mMのNaCl、0.05%の洗剤(例えば、P20)、及び3mMのEDTA中で、25℃又は37℃で、実施される。緩衝液は、10mMのHepesを含有し得る。一例では、SPRは、HBS-EP中で25℃又は37℃で実施される。HBS-EPは、Teknova Inc(カリフォルニア、カタログ番号H8022)から入手可能である。
【００４６】
一例では、親和性は、
1.抗マウス(又は抗体のC領域に適合する、他の関連性のある非ヒト脊椎動物、例えば)IgG(例えば、Biacore BR-1008-38)をバイオセンサーチップ(例えば、GLMチップ)に、例えば、一級アミンカップリングによってカップリングする工程;
2.抗マウスIgG(非ヒト脊椎動物抗体)を、試験IgG抗体又は重鎖に曝露して、チップに試験抗体を捕捉する工程;
3.試験抗原を、0nM(すなわち、緩衝液のみ)と共に、1024nM、256nM、64nM、16nM、4nMで、チップの捕捉表面を通過させる工程;及び
4.及び、試験抗体の試験抗原/鎖の結合の親和性を、表面プラズモン共鳴を使用して、例えば、上で考察したSPR条件下で(例えば、生理学的緩衝液中25℃で)決定する工程によってSPRを使用して決定される。SPRは、Biacore(商標)等の任意の標準的なSPR装置を使用するか、又はProteOn XPR36(商標)(Bio-Rad(登録商標))を使用して実施することができる。
【００４７】
捕捉表面の再生は、pH1.7の10mMのグリシンで実施され得る。これにより、捕捉された抗体が除去され、表面を別の相互作用に使用することが可能になる。結合データは、標準的な技法を使用して、例えば、ProteOn XPR36(商標)分析ソフトウェアに固有のモデルを使用して、1:1の固有モデルに適合させ得る。
【００４８】
「抗体」という用語には、モノクローナル抗体(免疫グロブリンFc領域を有する完全長抗体を含む)、ポリエピトープ特異性を有する抗体組成物、多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体、ダイアボディ、及び単一鎖分子、並びに対合したVH/VL抗原結合部位を有する抗体断片(例えば、Fab、F(ab')2)が含まれる。
【００４９】
「ドメイン」は、フォールディングしたタンパク質構造であり、タンパク質の残りの部分に非依存性の三次構造を有する。一般的には、ドメインはタンパク質の別個の機能的特性を担っており、多くの場合タンパク質及び/又はドメインの残りの部分の機能を損なうことなく、付加し、除去し又は他のタンパク質に移すことができる。
【００５０】
任意選択で、本明細書中の任意の多重特異性抗体は、二重特異性抗体である。これには、DVD-Ig、mAb2、FIT-Ig、mAb-dAb、dock及びlock、Fab-arm交換、SEEDbody、Triomab、LUZ-Y、Fcab、κλ-ボディ、オルトゴナルFab、scダイアボディ-Fc、ダイアボディ-Fc、直列型のscFv-Fc、Fab-scFv-Fc、Fab-scFv、イントラボディ(intrabody)、BiTE、ダイアボディ、DART、TandAb、scダイアボディ、scダイアボディ-CH3、ダイアボディ-CH3、トリプルボディ、ミニ抗体、ミニボディ、TriBiミニボディ、scFv-CH3 KIH、scFv-CH-CL-scFv、F(ab')2-scFv、scFv-KIH、Fab-scFv-Fc、四価HCab、ImmTAC、ノブ-イン-ホール(knobs-in-holes)、共通軽鎖を有するノブ-イン-ホール、共通軽鎖を有するノブ-イン-ホール及び荷電対合、荷電対合、共通軽鎖を有する荷電対合、DT-IgG、DutaMab、IgG(H)-scFv、scFv-(H)IgG、IgG(L)-scFv、scFv-(L)IgG、IgG(L,H)-Fv、IgG(H)-V、V(H)-IgG、IgG(L)-V、V(L)-IgG、KIH IgG-scFab、2scFv-IgG、IgG-2scFv、scFv4-Ig及びzybody等の形式が含まれる。二重特異性形式の総説については、Spiess、C.、et al.,. Mol. Immunol. (2015)を参照されたい。任意選択で、多重特異性リガンドは、DVD-Ig、mAb2、FIT-Ig、mAb-dAb、dock及びlock、SEEDbody、scダイアボディ-Fc、ダイアボディ-Fc、直列型のscFv-Fc、Fab-scFv-Fc、Fab-scFv、イントラボディ(intrabody)、BiTE、ダイアボディ、DART、TandAb、scダイアボディ、scダイアボディ-CH3、ダイアボディ-CH3、ミニボディ、ノブ-イン-ホールリガンド、共通軽鎖を有するノブ-イン-ホールリガンド、共通軽鎖を有するノブ-イン-ホールリガンド及び荷電対合、荷電対合、共通軽鎖と共に荷電対合を有するリガンドであり;各ケースにおいて、少なくとも1つのVH/VL抗原結合部位を含む。
【００５１】
任意選択で、軽鎖遺伝子座中の再構成された可変領域(例えば、VL、Vλ又はVκドメイン、例えば、ヒトドメインをコードする再構成された可変領域)は、以下の対のプロモーター及びシグナルペプチド(すなわち、プロモーター、SP及びV領域を5'から3'の順序)の上流のものを含む:
1)マウスVλプロモーター+マウスVλ  SP
2)マウスVλプロモーター+非マウスげっ歯類Vλ  SP
3)マウスVλプロモーター+ヒトVλ  SP
4)マウスVλプロモーター+非ヒト霊長類Vλ  SP
【００５２】
5)マウスVKプロモーター+マウスVλ  SP
6)マウスVKプロモーター+非マウスげっ歯類Vλ  SP
7)マウスVKプロモーター+ヒトVλ  SP
8)マウスVKプロモーター+非ヒト霊長類Vλ  SP
【００５３】
9)非マウスげっ歯類Vλプロモーター+マウスVλ  SP
10)非マウスげっ歯類Vλプロモーター+非マウスげっ歯類Vλ  SP
11)非マウスげっ歯類Vλプロモーター+ヒトVλ  SP
12)非マウスげっ歯類Vλプロモーター+非ヒト霊長類Vλ  SP
【００５４】
13)非マウスげっ歯類VKプロモーター+マウスVλ  SP
14)非マウスげっ歯類VKプロモーター+非マウスげっ歯類Vλ  SP
15)非マウスげっ歯類VKプロモーター+ヒトVλ  SP
16)非マウスげっ歯類VKプロモーター+非ヒト霊長類Vλ  SP
【００５５】
17)ヒトVλプロモーター+マウスVλ  SP
18)ヒトVλプロモーター+非マウスげっ歯類Vλ  SP
19)ヒトVλプロモーター+ヒトVλ  SP
20)ヒトVλプロモーター+非ヒト霊長類Vλ  SP
【００５６】
21)ヒトVKプロモーター+マウスVλ  SP
22)ヒトVKプロモーター+非マウスげっ歯類Vλ  SP
23)ヒトVKプロモーター+ヒトVλ  SP
24)ヒトVKプロモーター+非ヒト霊長類Vλ  SP
【００５７】
25)非ヒト霊長類Vλプロモーター+マウスVλ  SP
26)非ヒト霊長類Vλプロモーター+非マウスげっ歯類Vλ  SP
27)非ヒト霊長類Vλプロモーター+ヒトVλ  SP
28)非ヒト霊長類Vλプロモーター+非ヒト霊長類Vλ  SP
【００５８】
29)非ヒト霊長類VKプロモーター+マウスVλ  SP
30)非ヒト霊長類VKプロモーター+非マウスげっ歯類Vλ  SP
31)非ヒト霊長類VKプロモーター+ヒトVλ  SP
32)非ヒト霊長類VKプロモーター+非ヒト霊長類Vλ  SP
【００５９】
33)マウスVλプロモーター+マウスVK SP
34)マウスVλプロモーター+非マウスげっ歯類VK SP
35)マウスVλプロモーター+ヒトVK SP
36)マウスVλプロモーター+非ヒト霊長類VK SP
【００６０】
37)マウスVKプロモーター+マウスVK SP
38)マウスVKプロモーター+非マウスげっ歯類VK SP
39)マウスVKプロモーター+ヒトVK SP
40)マウスVKプロモーター+非ヒト霊長類VK SP
【００６１】
41)非マウスげっ歯類Vλプロモーター+マウスVK SP
42)非マウスげっ歯類Vλプロモーター+非マウスげっ歯類VK SP
43)非マウスげっ歯類Vλプロモーター+ヒトVK SP
44)非マウスげっ歯類Vλプロモーター+非ヒト霊長類VK SP
【００６２】
45)非マウスげっ歯類VKプロモーター+マウスVK SP
46)非マウスげっ歯類VKプロモーター+非マウスげっ歯類VK SP
47)非マウスげっ歯類VKプロモーター+ヒトVK SP
48)非マウスげっ歯類VKプロモーター+非ヒト霊長類VK SP
【００６３】
49)ヒトVλプロモーター+マウスVK SP
50)ヒトVλプロモーター+非マウスげっ歯類VK SP
51)ヒトVλプロモーター+ヒトVK SP
52)ヒトVλプロモーター+非ヒト霊長類VK SP
【００６４】
53)ヒトVKプロモーター+マウスVK SP
54)ヒトVKプロモーター+非マウスげっ歯類VK SP
55)ヒトVKプロモーター+ヒトVK SP
56)ヒトVKプロモーター+非ヒト霊長類VK SP
【００６５】
57)非ヒト霊長類Vλプロモーター+マウスVK SP
58)非ヒト霊長類Vλプロモーター+非マウスげっ歯類VK SP
59)非ヒト霊長類Vλプロモーター+ヒトVK SP
60)非ヒト霊長類Vλプロモーター+非ヒト霊長類VK SP
【００６６】
61)非ヒト霊長類VKプロモーター+マウスVK SP
62)非ヒト霊長類VKプロモーター+非マウスげっ歯類VK SP
63)非ヒト霊長類VKプロモーター+ヒトVK SP
64)非ヒト霊長類VKプロモーター+非ヒト霊長類VK SP
【００６７】
げっ歯類の例は、ラット、ビーバー、ジリス(gopher)、ハムスター、アレチネズミ、ヤマアラシ(porcupine)、チンチラ、レミング又はハタネズミである。非ヒト霊長類の例は、チンパンジー、類人猿(ape)、ゴリラ、オランウータン、サル(simian)、サル(例えば、アカゲザル又はカニクイザル)、キツネザル(lemur)又はヒヒである。プロモーター及び/又はSPについての配列の供給源には、例えば、ww.imgt.org、www.ensembl.org及び当業者には容易に明らかな、げっ歯類又は霊長類又はヒトからのサンプル(例えば、血液サンプル及び配列のPCR)を使用して得られる配列が含まれる。
【００６８】
一例では、本発明の細胞、脊椎動物、哺乳動物又はマウスの軽鎖遺伝子座は、選択マーカーを欠く。以下の例では、選択マーカーは保持され、遺伝子座は望ましく実施された。代替的に、削除可能な選択マーカーは、遺伝子座を構築する場合に含められてもよく、続いてマーカーの削除後に、脊椎動物又はマウスを発生させる。一例では、マーカーは、piggyBac末端反復に隣接し、PBaseは、遺伝子座が構築されているES細胞中で一過性に発現され、それによって、マーカーを削除する。一例では、マーカーは、piggyBac末端反復に隣接するpuro-delta-tkを含む。
【００６９】
本発明は、以下の記載により例示され得る。
記載:
1.  抗体軽鎖遺伝子座(第一の遺伝子座)を含み、遺伝子座が(5'から3'方向に)、
(a)軽鎖イントロンエンハンサー;
(b)再構成された抗体Vドメイン(例えば、VH、Vλ又はVκ、例えば、VL)をコードする再構成された抗体可変領域;及び
(c)軽鎖Cドメインをコードする抗体軽鎖定常領域
を含み、遺伝子座が、(NからC末端方向に)前記再構成されたVドメイン及び前記Cドメインを含む抗体鎖を発現するように作動可能である、細胞。
【００７０】
例えば、Vドメイン及びCドメインは、ヒトである。例えば、Vドメイン及びCドメインは、例えば、所定の抗原(例えば、上記の第一の抗原)に結合する既知の抗体によって含まれるような、ヒトVκ及びヒトCκである。例えば、Vドメイン及びCドメインは、例えば、所定の抗原(例えば、上記の第一の抗原)に結合する既知の抗体によって含まれるような、ヒトVλ及びヒトCλである。例えば、細胞は、げっ歯類、ラット又はマウス細胞である。
【００７１】
任意選択で、可変ドメインは、配列番号1の軽鎖配列の可変ドメインを含む又はそれからなり、任意選択で、5以下、4以下、3以下、2又は1アミノ酸変化を有する。各変化は、アミノ酸欠失、置換又は付加であってもよい。一例では、可変ドメインの配列は、Kabatナンバリングによって決定される。一例では、可変ドメインの配列は、IMGTナンバリングによって決定される。任意選択で、可変ドメインは、タンパク質抗原、例えば、ヒトタンパク質抗原に特異的に結合する。
【００７２】
例えば、細胞は、げっ歯類、ラット又はマウス細胞であり、Vドメイン及びCドメインは、例えば、所定の抗原(例えば、上記の第一の抗原)に結合する既知の抗体によって含まれるような、ヒトVκ及びマウスCκである;又はVドメイン及びCドメインは、例えば、所定の抗原(例えば、上記の第一の抗原)に結合する既知の抗体によって含まれるような、ヒトVλ及びマウスCλである。
【００７３】
一例では、定常領域はCκ又はCλをコードし、前記定常領域の3'に更なるCドメインコードヌクレオチド配列は存在しない。
【００７４】
好ましくは、Vドメインは、例えば、抗体のVH/VL結合部位によって含まれる場合に、抗原、例えば、ヒト抗原を特異的に結合可能である。
【００７５】
任意選択で、本発明の細胞は、脊椎動物、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、げっ歯類、マウス、ラット又はヒト細胞である。任意選択で、細胞は、ヒト又はげっ歯類(例えば、マウス又はラット)細胞である。任意選択で、細胞又はマウスは、129又はC57BL/6株細胞又はマウス(例えば、ハイブリッド129又はハイブリッドC57BL/6株細胞又はマウス)である。任意選択で、細胞又はマウスは、ハイブリッド129/C57BL/6株細胞又はマウス、例えば、F1H4株細胞又はマウスである。
【００７６】
任意選択で、遺伝子座は、細胞ゲノムにランダムに挿入される導入遺伝子によって含まれる又は細胞の内因性抗体遺伝子座外側の位置にある。任意選択で、遺伝子座は、細胞の内因性抗体遺伝子座である。任意選択で、遺伝子座は、細胞の内因性抗体遺伝子座に直接隣接する又は細胞の内因性抗体遺伝子座の10、5、1若しくは0.5kb内にある(例えば、その3'又は5')。任意選択で、エンハンサー及び/又は定常領域は、細胞の内因性抗体遺伝子座エンハンサー又は定常領域である。任意選択で、定常領域は、細胞の内因性抗体遺伝子座定常領域(の直ぐ5'、又は5'に500、400、300、200、100又は50bp内等)の5'にある。例えば、本発明の遺伝子座の定常領域(例えば、ヒトCκ又はCλ)は、細胞の内因性Cκ定常領域の直ぐ5'又は5'の500、400、300、200、100又は50bp内にある。
【００７７】
任意選択で、本発明の任意の細胞において、抗体可変領域は、遺伝子座のエンハンサーの400、300、200、150、100、50、30、20、10又は5bp以下3'(又は代替的な態様において5')にある。
【００７８】
任意選択で、本発明の任意の細胞において、抗体可変領域は、遺伝子座の定常領域の400、300、200、150、100、50、30、20、10又は5bp以下5'にある。
【００７９】
代替的な態様において、抗体可変領域は、細胞(例えば、細胞は、げっ歯類、マウス又はラット細胞である)の内因性抗体(例えば、カッパ又はラムダ)遺伝子座の3'エンハンサーの3'にある。任意選択で、この態様において、抗体可変領域は、3'エンハンサーの400、300、200、150、100、50、30、20、10又は5bp以下3'にある。
【００８０】
一例では、本発明の遺伝子座の定常領域は、細胞(例えば、細胞は、げっ歯類、マウス又はラット細胞である)の内因性抗体定常領域である。別の例では、本発明の遺伝子座の定常領域は、ヒト抗体定常領域(例えば、細胞は、げっ歯類、マウス又はラット細胞である)であり、任意選択で、ヒト定常領域は、細胞の内因性抗体定常領域(例えば、内因性Cκ又はCλ)の5'にある。
【００８１】
例えば、遺伝子座が(5'から3'方向に)、
(a)軽鎖イントロンエンハンサー;
(b)再構成された抗体Vドメイン(例えば、ヒトVドメイン)をコードする再構成された抗体ヒト可変領域;
(c)軽鎖Cドメインをコードするヒト又はマウス又はラット抗体軽鎖定常領域
を含み、遺伝子座が、(NからC末端方向に)前記再構成されたVドメイン及び前記Cドメインを含む抗体鎖を発現するように作動可能である。
【００８２】
例えば、遺伝子座が(5'から3'方向に)、
(a)軽鎖イントロンエンハンサー;
(b)再構成された抗体Vドメイン(例えば、ヒトVドメイン)をコードする再構成された抗体可変領域;
(c)軽鎖Cドメインをコードする外因性抗体軽鎖定常領域(例えば、ヒトCκ又はCλ);及び
(d)細胞(例えば、細胞は、げっ歯類、マウス又はラット細胞である)の内因性抗体軽鎖定常領域
を含み、遺伝子座が、(NからC末端方向に)前記再構成されたVドメイン及び前記Cドメインを含む抗体鎖を発現するように作動可能である。
【００８３】
例えば、遺伝子座が(5'から3'方向に)、
(a)細胞(例えば、細胞は、げっ歯類、マウス又はラット細胞である)の内因性軽鎖イントロンエンハンサー;
(b)再構成された抗体Vドメイン(例えば、ヒトVドメイン)をコードする再構成された抗体可変領域;
(c)軽鎖Cドメイン(例えば、細胞が、げっ歯類、マウス又はラット細胞である場合、例えば、ヒトCドメイン)をコードする抗体軽鎖定常領域;及び
(d)任意選択で、細胞の内因性抗体軽鎖定常領域
を含み、遺伝子座が、(NからC末端方向に)前記再構成されたVドメイン及び前記Cドメインを含む抗体鎖を発現するように作動可能である。
【００８４】
好ましくは、イントロンエンハンサーは、細胞(例えば、細胞は、げっ歯類、マウス又はラット細胞である)の内因性エンハンサーであり、好ましくは、カッパ遺伝子座Eiκエンハンサーである;好ましくは、細胞は、第一の種又は株(例えば、マウス又はラット種又は株)の細胞であり、本発明のイントロンエンハンサーは、前記種又は株の野生型イントロンエンハンサー配列を含む。例えば、細胞は、F1H4、129又はC57BL6株細胞であり、エンハンサーは、前記株のイントロンエンハンサーである;任意選択で、エンハンサーはEiκであり及び/又は可変領域は細胞の内因性カッパ  定常領域の上流(例えば、細胞の内因性可変領域(例えば、マウス細胞中のヒト又はマウス可変領域)と細胞のカッパ遺伝子座の内因性Cκ(例えば、マウスCκ)の間)の挿入物である。
【００８５】
2.  遺伝子座がカッパ軽鎖遺伝子座であり、エンハンサーがEiκである、記載1の細胞。
【００８６】
一例では、エンハンサーはEiκであり、例えば、遺伝子座はラムダ軽鎖遺伝子座である。好ましくは、この例又は記載では、Vドメイン及びCドメインは、例えば、所定の抗原(例えば、上記の第一の抗原)に結合する既知の抗体によって含まれるような、ヒトVκ及びヒトCκである;又はVドメイン及びCドメインは、例えば、所定の抗原(例えば、上記の第一の抗原)に結合する既知の抗体によって含まれるような、ヒトVλ及びマウスCλであり、この例では、細胞は、げっ歯類、ラット又はマウス細胞である。
【００８７】
例えば、遺伝子座はカッパ軽鎖遺伝子座であり、エンハンサーはEiκであり、細胞はマウス細胞であり、Vドメイン及びCドメインは、例えば、所定の抗原(例えば、上記の第一の抗原)に結合する既知の抗体によって含まれるような、ヒトVκ及びマウスCκである。例えば、遺伝子座はカッパ軽鎖遺伝子座であり、エンハンサーはEiκであり、細胞はマウス細胞であり、Vドメイン及びCドメインは、例えば、所定の抗原(例えば、上記の第一の抗原)に結合する既知の抗体によって含まれるような、ヒトVλ及びマウスCλである。
【００８８】
一実施形態において、細胞は、げっ歯類、マウス又はラット細胞であり、エンハンサーは、それぞれ、げっ歯類、マウス又はラットイントロンエンハンサー(例えば、Eiκ)である。
【００８９】
一例では、軽鎖定常領域はCκであり、遺伝子座はCκの3'に作動可能に連結されているカッパ3'エンハンサーを含む。別の例では、軽鎖定常領域は、Cλである。
【００９０】
任意選択で、定常領域は、ヒト定常領域である。任意選択で、定常領域は、マウス定常領域である。任意選択で、定常領域は、ラット定常領域である。
【００９１】
任意選択で、定常領域は、ヒトCκである。任意選択で、定常領域は、マウスCκである。任意選択で、定常領域は、ラットCκである。
【００９２】
任意選択で、定常領域は、ヒトCλである。任意選択で、定常領域は、マウスCλである。任意選択で、定常領域は、ラットCλである。
【００９３】
任意選択で、エンハンサーは、ヒトエンハンサーである。任意選択で、エンハンサーは、マウスエンハンサーである。任意選択で、エンハンサーは、ラットエンハンサーである。
【００９４】
任意選択で、エンハンサーは、ヒトEiκエンハンサーである。任意選択で、エンハンサーは、マウスEiκエンハンサーである。任意選択で、エンハンサーは、ラットEiκエンハンサーである。
【００９５】
任意選択で、エンハンサーは、ヒトラムダエンハンサーである。任意選択で、エンハンサーは、マウスラムダエンハンサーである。任意選択で、エンハンサーは、ラットラムダエンハンサーである。
【００９６】
一例では、エンハンサーは、5'及び/又は3'を、ヒトカッパ又はラムダ可変領域イントロン配列に直接隣接する(例えば、エンハンサーはマウスエンハンサーであり、細胞はマウス又はラット細胞である;又はエンハンサーはラットエンハンサーであり、細胞はマウス又はラット細胞である)。任意選択で、各隣接配列は、シグナルペプチドコード配列と前記Vドメイン(Vドメインは前記VLである)をコードするヌクレオチド配列のVLコード配列の間でヒトVLイントロンによって含まれる配列である。例えば、遺伝子座は、VLドメイン(又はVLを含む軽鎖)を発現可能なB細胞のゲノム断片を含み、ここで、断片は、(5'から3'の順序で)、プロモーター、VLシグナルペプチドコード配列、第一のイントロン配列、前記エンハンサー、第二のイントロン配列、可変領域及び任意選択で定常領域を含み、ここで、第一及び第二のイントロン配列は、B細胞ゲノムにおいて天然で近接する又は500、400、300、200、100、50又は20bp(bp=塩基対)以下のスペースをあけておかれる。
【００９７】
例えば、遺伝子座は、抗体(例えば、抗体は、所定の抗原又はエピトープに特異的に結合する)の再構成された軽鎖(例えば、カッパ又はラムダ鎖)をコードするヌクレオチド配列を含む。例えば、前記ヌクレオチド配列は、抗体を発現する抗体産生細胞(例えば、B細胞又はハイブリドーマ)からのクローン化したゲノム断片によって含まれる。一例では、ヌクレオチド配列は、前記可変領域のプロモーターから、可変領域まで(及び可変領域を含み)、任意選択で可変領域に作動可能に連結されている定常領域まで(及び定常領域を含む)の配列を含む前記抗体産生細胞のクローン化したゲノム配列である。例えば、細胞はマウス又はラット細胞であり、ゲノム断片は所定の抗原に特異的なカッパ抗体産生細胞のゲノム断片の配列を含み、ここで、ゲノム配列は、前記可変領域の、可変領域に対する(及び含む)プロモーターからのヌクレオチド配列を含み;任意選択で、配列は、本発明の遺伝子座によって、遺伝子座のヒトCκ定常領域の5'に含まれる。例えば、細胞はマウス又はラット細胞であり、ゲノム断片は所定の抗原に特異的なラムダ抗体産生細胞のゲノム断片の配列を含み、ゲノム配列は、前記可変領域の、可変領域に対する(及び含む)プロモーターからのヌクレオチド配列を含み;任意選択で、配列は、本発明の遺伝子座によって、遺伝子座のヒトCλ又はCκ定常領域の5'に含まれる。一例では、ヌクレオチド配列は、例えば、細胞のカッパ又はラムダ遺伝子座の内因性3'エンハンサーの5'に作動可能に連結される、細胞のカッパ又はラムダ遺伝子座中の挿入物である。
【００９８】
本明細書中の本発明の任意の細胞、脊椎動物又は他の態様の例では、細胞又は脊椎動物の内因性ラムダ及び/又はカッパ鎖発現は、不活性である又は実質的に不活性である。一実施形態において、不活性化は、50%(すなわち、抗体又は転写物の50%以下が前記内因性抗体鎖のものである)、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%を超える。例えば、一実施形態において、前記内因性ラムダ鎖発現は、実質的に不活性であり、脊椎動物のラムダ鎖レパートリーの85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%以下が内因性ラムダ鎖によって提供される。例えば、内因性ラムダ鎖発現は、不活性であり、脊椎動物のラムダ鎖レパートリーが内因性ラムダ鎖によって提供されない又は実質的に提供されない。例えば、一実施形態において、前記内因性カッパ鎖発現は、実質的に不活性であり、脊椎動物のカッパ鎖レパートリーの85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%以下が内因性カッパ鎖によって提供される。例えば、内因性カッパ鎖発現は、不活性であり、脊椎動物のカッパ鎖レパートリーが内因性カッパ鎖によって提供されない又は実質的に提供されない。
【００９９】
一例では、本発明の遺伝子座は、細胞の内因性カッパ遺伝子座対立遺伝子の改変であり、任意選択で細胞は前記改変に関してヘテロ接合性又はホモ接合性である。一実施形態において、細胞は改変に関してヘテロ接合性であり、細胞は他のカッパ遺伝子座対立遺伝子に野生型又はヒト化遺伝子座を含む。
【０１００】
一例では、本発明の遺伝子座は、細胞の内因性ラムダ遺伝子座対立遺伝子の改変であり、任意選択で細胞は前記改変に関してヘテロ接合性又はホモ接合性である。一実施形態において、細胞は改変に関してヘテロ接合性であり、細胞は他のラムダ遺伝子座対立遺伝子に野生型又はヒト化遺伝子座を含む。
【０１０１】
3.  細胞がマウス細胞であり、遺伝子座がラムダ軽鎖遺伝子座であり、エンハンサーがマウスラムダ2-4又は4-10エンハンサーである、記載1の細胞。
【０１０２】
4.
(a)再構成されたVドメインがVκであり、CドメインがCκであり;
(b)再構成されたVドメインがVκであり、CドメインがCλであり;
(c)再構成されたVドメインがVλであり、CドメインがCλであり;又は
(d)再構成されたVドメインがVλであり、CドメインがCκである、いずれかの先行する記載の細胞。
【０１０３】
5.  抗体重鎖遺伝子座(第一の遺伝子座)を含み、遺伝子座が(5'から3'方向に)、
(a)重鎖イントロンエンハンサー(Eμ);
(b)再構成された抗体Vドメイン(例えば、VL、Vλ又はVκ、例えば、VH)をコードする再構成された抗体可変領域;
(c)任意選択のスイッチ配列;及び
(d)重鎖CH1ドメインをコードする抗体重鎖定常領域
を含み、遺伝子座が、(NからC末端方向に)前記再構成されたVドメイン及び前記CH1ドメインを含む抗体鎖を発現するように作動可能である、細胞。
【０１０４】
任意選択で、定常領域は、抗体Fc(例えば、Nから末端方向に:CH1-任意選択のヒンジ-CH2-CH3)をコードする。
【０１０５】
任意選択で、例えば、細胞がマウス細胞である場合に、CH1はヒト又はマウスCH1である。
【０１０６】
一例では、定常領域は抗体Fc(例えば、NからC末端方向に:CH1-任意選択のヒンジ-CH2-CH3)をコードし、前記定常領域の3'に更なるCドメインコードヌクレオチド配列は存在しない。
【０１０７】
6.  遺伝子座が(5'から3'方向に)、
(a)可変領域の転写を促進する作動可能なプロモーター;
(b)可変ドメインシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列;
(c)前記イントロンエンハンサー;
(d)前記再構成された抗体可変領域;及び
(e)前記抗体軽鎖定常領域
を含み、遺伝子座は、(NからC末端方向に)前記可変ドメインのアミノ酸配列に融合された前記シグナルペプチド配列をコードするRNA転写物を発現するように作動可能である、いずれかの先行する記載の細胞。
【０１０８】
任意選択で、プロモーター及び/又はシグナルペプチドコード配列は、可変領域(又はそのV遺伝子セグメント配列)と、野生型細胞(例えば、V領域がヒト細胞によって含まれるヒトV領域である場合にヒト細胞である)、B細胞又はハイブリドーマ、例えば、抗原特異的Vドメインを発現させるための前記可変領域と同一の配列を含むB細胞又はハイブリドーマにおいて作動可能なものである。
【０１０９】
7.  細胞がES(例えば、129、C57BL/6、AB2.1、AB2.2、JM8又はF1H4タイプES細胞)、iPS、ハイブリドーマ又はB細胞である、いずれかの先行する記載の細胞。
【０１１０】
8.  再構成されたVドメインが、カッパ又はラムダVドメイン、例えば、再構成されたヒトカッパ又はラムダVドメインである、いずれかの先行する記載の細胞。
【０１１１】
9.  可変領域が第一の所定の抗原又は第一のエピトープに対する結合特異性を有するVドメインをコードし(例えば、別の再構成されたVドメインと対合された場合)、遺伝子座が前記特異性を保持するVドメインを含む抗体鎖を発現するように作動可能である(例えば、前記他のVドメインと対合された場合)、いずれかの先行する記載の細胞。
【０１１２】
例えば、可変領域が、第一の所定の抗原又は第一のエピトープに対する結合特異性を有するVLドメインをコードし(例えば、再構成されたVHドメインと対合された場合)、遺伝子座が、前記特異性を保持するVLドメインを含む抗体軽鎖を発現するように作動可能である(例えば、前記VHドメインと対合された場合)。例えば、VL及びVHは、所定の抗原に特異的に結合可能な既知の抗体のVL及びVHと同一である。
【０１１３】
10.  細胞が、第二の抗体鎖を発現するように作動可能な第二の抗体遺伝子座を含み、第二の鎖が第一の再構成されたVドメインと共に結合部位を形成する第二の再構成されたVドメインを含み、結合部位が所定の抗原又はエピトープに特異的に結合可能である、いずれかの先行する記載の細胞。
【０１１４】
例えば、第一の遺伝子座はVLドメインをコードし、第二の遺伝子座はVHドメインをコードし、VL及びVHは、前記所定の抗原又はエピトープに対してVH/VL結合部位を形成可能である。
【０１１５】
11.  所定の抗原が互いに異なり、前記他の及び第二のVドメインが異なり;又はエピトープが互いに異なり、前記他の及び第二のVドメインが異なる、記載9に従属する場合の記載10の細胞。
【０１１６】
例えば、エピトープは、同じ抗原によって含まれる異なるエピトープである。
【０１１７】
12.
(a)第一のドメインがVL(例えば、Vκ又はVλ)ドメインであり、第二の及び前記他のVドメインがVHドメインであり;又は
(b)第一のドメインがVHドメインであり、第二の及び前記他のVドメインがVL(例えば、両方Vκ又はVλ)ドメインである、記載11の細胞。
【０１１８】
13.  可変領域が、エンハンサーの3'に、0.5、0.4、0.3、0.2又は0.1kb内にある、いずれかの先行する記載の細胞。
【０１１９】
任意選択で、可変領域は、イントロンエンハンサーから0.5、0.4、0.3、0.2又は0.1kb以下のスペースをあけておかれる。
【０１２０】
14.  遺伝子座が定常領域の3'にある第二のエンハンサーを含む、いずれかの先行する記載の細胞。
【０１２１】
任意選択で、遺伝子座(例えば、記載5に従う)は重鎖遺伝子座であり、第二のエンハンサーは重鎖3'エンハンサーである。
【０１２２】
任意選択で、遺伝子座(例えば、記載1に従う)はカッパ鎖遺伝子座であり、第二のエンハンサーはカッパ鎖3'エンハンサーである。
【０１２３】
任意選択で、遺伝子座(例えば、記載1に従う)はラムダ鎖遺伝子座であり、第二のエンハンサーはラムダ鎖3'エンハンサー、例えば、マウスラムダ3-1エンハンサーである。
【０１２４】
15.  細胞が、非ヒト哺乳動物又はげっ歯類(例えば、マウス又はラット)細胞である、いずれかの先行する記載の細胞。
【０１２５】
16.  前記定常領域が、細胞の内因性抗体遺伝子座にある、いずれかの先行する記載の細胞。
【０１２６】
任意選択で、更なる可変領域(例えば、マウス可変領域又はヒト可変領域)が、イントロンエンハンサーの5'にあり;例えば、更なる可変領域は、可変ドメインの発現に関して不活性である。任意選択で、可変領域(例えば、マウス可変領域又はヒト可変領域)が、イントロンエンハンサーの5'にはない。任意選択で、更なる可変領域は、病変(例えば、J領域病変又はJ遺伝子セグメントの欠如である)又はneo(ネオマイシン耐性)マーカーを含み、それによって、前記更なる可変領域における再構成を不活化する。
【０１２７】
17.  前記内因性遺伝子座が、内因性カッパ鎖遺伝子座である、記載1に従属する場合の記載16の細胞。
【０１２８】
18.  前記内因性遺伝子座が、内因性重鎖遺伝子座である、記載5に従属する場合の記載16の細胞。
【０１２９】
19.  遺伝子座が、内因性抗体遺伝子座の外側の位置で(例えば、Rosa26で)細胞のゲノムによって含まれる導入遺伝子によって含まれる、記載1から15のいずれか1つの細胞。
任意選択で、細胞ゲノムは、複数の前記導入遺伝子を含む。
【０１３０】
20.  細胞が前記遺伝子座に関してホモ接合性である、いずれかの先行する記載の細胞。
或いは、細胞は、前記遺伝子座に関してヘテロ接合性である。
【０１３１】
21.  細胞ゲノムが第二の抗体遺伝子座を含み、第二の遺伝子座が(5'から3'方向に)、
(a)1つ又は複数のVH遺伝子セグメント;
(b)1つ又は複数のDH遺伝子セグメント;
(c)1つ又は複数のJH遺伝子セグメント;及び
(d)1つ又は複数のCHドメインをコードする重鎖定常領域
を含む、再構成されていない抗体重鎖遺伝子座であり;
重鎖遺伝子座が、任意選択で複数の抗原特異性又は親和性を含む、複数の重鎖を発現するように作動可能であり、各前記重鎖は、第一の遺伝子座によってコードされる抗体鎖(例えば、カッパ又はラムダ軽鎖)と対合可能で、抗原結合部位を含む対合した鎖を産生する、記載1に従属する場合のいずれかの先行する記載の細胞。
【０１３２】
好ましくは、VH(例えば、VH、DH及びJH)遺伝子セグメントは、ヒト遺伝子セグメントである。任意選択で、CHは、(例えば、細胞がマウス又はラット細胞である場合に)げっ歯類、例えば、マウス又はラット、又はヒトCHである。
【０１３３】
任意選択で、代替的に、本発明の細胞は、複数の異なる重鎖を発現させるための、重鎖定常領域(例えば、マウス、ラット又はヒト定常領域)の5'に作動可能に連結される、再構成されていない重鎖可変領域(例えば、ヒトV領域)を含む重鎖導入遺伝子を含む。
【０１３４】
一例では、記載21に従う第二の遺伝子座又は導入遺伝子の前記重鎖可変領域は、IGHV1-3、IGHV1-8、IGHV1-18、IGHV1-46、IGHV3-7、IGHV3-9、IGHV3-11、IGHV3-15、IGHV3-20、IGHV3-21、IGHV3-23、IGHV3-30、IGHV3-33、IGHV3-48、IGHV3-53、IGHV4-4、IGHV4-31、IGHV4-34、IGHV4-39、IGHV4-59、IGHV4-61、IGHV5-51、IGHV6-1及びIGHV7-4-1からなる群の少なくとも5、10、15又は全てのヒトVH遺伝子セグメントを含む。
【０１３５】
一例では、本発明の第一の遺伝子座は、軽鎖をコードし、軽鎖は、IGHV1-3、IGHV1-8、IGHV1-18、IGHV1-46、IGHV3-7、IGHV3-9、IGHV3-11、IGHV3-15、IGHV3-20、IGHV3-21、IGHV3-23、IGHV3-30、IGHV3-33、IGHV3-48、IGHV3-53、IGHV4-4、IGHV4-31、IGHV4-34、IGHV4-39、IGHV4-59、IGHV4-61、IGHV5-51、IGHV6-1及びIGHV7-4-1からなる群の少なくとも5、10、15又は全てのヒトVH遺伝子セグメントと対合する又は対合可能である。
【０１３６】
一例では、軽鎖は、本発明の脊椎動物において、ヒトVH遺伝子セグメントIGHV1-3、IGHV1-8、IGHV1-18、IGHV1-46、IGHV3-7、IGHV3-9、IGHV3-11、IGHV3-15、IGHV3-20、IGHV3-21、IGHV3-23、IGHV3-30、IGHV3-33、IGHV3-48、IGHV3-53、IGHV4-4、IGHV4-31、IGHV4-34、IGHV4-39、IGHV4-59、IGHV4-61、IGHV5-51、IGHV6-1及びIGHV7-4-1と対合する又は対合可能である。
【０１３７】
一例では、記載21に従う第二の遺伝子座又は導入遺伝子の前記重鎖可変領域は、IGHV1-3*01、IGHV1-8*01、IGHV1-18*01、IGHV1-46*03、IGHV3-7*01、IGHV3-9*01、IGHV3-11*01、IGHV3-15*01、IGHV3-20*d01、IGHV3-21*03、IGHV3-23*04、IGHV3-30*18、IGHV3-33*01、IGHV3-48*02、IGHV3-53*01、IGHV4-4*02、IGHV4-31*03、IGHV4-34*01、IGHV4-39*01、IGHV4-59*01、IGHV4-61*01、IGHV5-51*01、IGHV6-1*01及びIGHV7-4-1*01からなる群の少なくとも5、10、15又は全てのヒトVH遺伝子セグメントを含む。
【０１３８】
一例では、本発明の第一の遺伝子座は、軽鎖をコードし、軽鎖は、IGHV1-3*01、IGHV1-8*01、IGHV1-18*01、IGHV1-46*03、IGHV3-7*01、IGHV3-9*01、IGHV3-11*01、IGHV3-15*01、IGHV3-20*d01、IGHV3-21*03、IGHV3-23*04、IGHV3-30*18、IGHV3-33*01、IGHV3-48*02、IGHV3-53*01、IGHV4-4*02、IGHV4-31*03、IGHV4-34*01、IGHV4-39*01、IGHV4-59*01、IGHV4-61*01、IGHV5-51*01、IGHV6-1*01及びIGHV7-4-1*01からなる群の少なくとも5、10、15又は全てのヒトVH遺伝子セグメントと対合する又は対合可能である。
【０１３９】
一例では、軽鎖は、本発明の脊椎動物において、ヒトVH遺伝子セグメントIGHV1-3*01、IGHV1-8*01、IGHV1-18*01、IGHV1-46*03、IGHV3-7*01、IGHV3-9*01、IGHV3-11*01、IGHV3-15*01、IGHV3-20*d01、IGHV3-21*03、IGHV3-23*04、IGHV3-30*18、IGHV3-33*01、IGHV3-48*02、IGHV3-53*01、IGHV4-4*02、IGHV4-31*03、IGHV4-34*01、IGHV4-39*01、IGHV4-59*01、IGHV4-61*01、IGHV5-51*01、IGHV6-1*01及びIGHV7-4-1*01と対合する又は対合可能である。
【０１４０】
任意選択で、細胞は、それぞれ、マウス又はラットに発生可能なマウス又はラットES細胞であり、マウス又はラットは、任意選択で複数の抗原特異性又は親和性を含む、複数の重鎖を発現可能であり、各前記重鎖は、第一の遺伝子座によってコードされる抗体鎖(例えば、カッパ又はラムダ軽鎖)と対合可能で、抗原結合部位を含む対合した鎖を産生する。
【０１４１】
22.  細胞が1つ又は複数の更なる抗体遺伝子座を含み、各更なる遺伝子座が軽鎖を発現可能であり、各前記軽鎖は、第一の遺伝子座によってコードされる抗体鎖(例えば、VH-Fc)と対合可能で、抗原結合部位を含む対合した鎖を産生する、記載5に従属する場合の記載1から20のいずれか1つの細胞。
【０１４２】
任意選択で、細胞は、それぞれ、マウス又はラット(又は他の脊椎動物)に発生可能なマウス又はラット(又は他の脊椎動物)ES細胞であり、マウス又はラット(又は他の脊椎動物)は、任意選択で複数の抗原特異性又は親和性を含む、1つ又は複数の軽鎖を発現可能であり、各前記軽鎖は、第一の遺伝子座によってコードされる抗体鎖(例えば、VH-Fc)と対合可能で、抗原結合部位を含む対合した鎖を産生する。これは、二重特異性抗体を産生する以下の方法の実践に有用でありうる:
(i)直接先行する段落に従う非ヒト脊椎動物(例えば、マウス又はラット)を提供する工程であって、第一の遺伝子座の可変領域が、第一の所定の抗原に特異的に結合する抗体のVHドメインをコードする工程;
(ii)脊椎動物を第二の所定の抗原で免疫する工程であって、脊椎動物が、複数の前記軽鎖を発現し、鎖のVLドメインが、前記VHのコピーと対合して、第二の抗原に特異的に結合するVH/VL抗原結合部位を形成する工程;
(iii)第一及び第二の抗原に結合する1つ又は複数のVH/VL対を単離する工程;又は抗原を結合する前記VH/VL対を発現する、1つ又は複数のB細胞又はハイブリドーマを得る工程;又は前記対のVLをコードするヌクレオチド配列及び/又は前記対のVHのヌクレオチド配列を得る工程;
(iv)任意選択で、ヌクレオチド配列を、VH/VL対合結合部位を含む二重特異性抗体を発現させるための、1つ又は複数の発現ベクター又は1つ又は複数の宿主細胞に挿入する工程であって、各結合部位が、第一及び第二の抗原に特異的に結合可能である工程;及び
(v)任意選択で、前記二重特異性抗体を発現させる工程及び単離する工程
を含む方法。
【０１４３】
一例では、工程(i)の脊椎動物は、前記1つ又は複数の軽鎖を発現する、本明細書に記載の通りのキメラである。
【０１４４】
以下も提供される:
宿主細胞株から複数の抗体を発現させる工程を含む、二重特異性抗体を産生する方法であって、宿主細胞株が、工程(i)から(iv)によって得られる又はそのように得られる細胞から培養される方法。
【０１４５】
以下も提供される:
宿主細胞株から複数の抗体を発現させる工程を含む、二重特異性抗体を産生する方法であって、各宿主細胞ゲノムが、二重特異性抗体の重鎖可変ドメインをコードする発現可能なヌクレオチド配列を含み、可変ドメインが、第一の抗原を特異的に結合可能であり、ヌクレオチド配列が、本発明の脊椎動物のB細胞のヌクレオチド配列と同一(又は少なくとも80、85、90又は95%同一)であり、脊椎動物が、第一の抗原で免疫されている方法。一例では、各宿主細胞ゲノムは、B細胞のヌクレオチド配列と同一(又は少なくとも80、85、90又は95%同一)である、軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含み、重鎖及び軽鎖ドメインが対合したVH/VL第一抗原結合部位を形成する。任意選択で、方法は、そのような複数の二重特異性抗体を単離する工程及び任意選択で、抗体を担体、希釈剤又は賦形剤で更に製剤化して、組成物(例えば、医薬組成物)を産生する工程を含む。本発明はまた、この方法又は本発明の任意の他の方法によって得られる又は入手可能な、そのような複数の抗体又は組成物に関する。
【０１４６】
代替的に、VHをコードする第一の遺伝子座の代わりに、第一の遺伝子座はVL又は軽鎖を代わりにコードし、脊椎動物は、任意選択で、複数の抗原特異性又は親和性を含む、1つ又は複数の重鎖を発現可能であり、各前記重鎖は、第一の遺伝子座によってコードされる抗体鎖(例えば、軽鎖)と対合可能で、抗原結合部位を含む対合した鎖を産生する。そのような脊椎動物は、工程(i)等を含み、VLが、第一の抗原に特異的に結合する抗体のVLである、方法に必要な変更を加えて使用されうる。
【０１４７】
このようにして、チェインシャッフリングを本発明に従いインビボで実施することができ、開始点は既知の抗原結合特異性の抗体の固定された所定のVH又はVLであってもよい。VH/VL結合部位が、第一及び第二の抗原(又は代替的に同じ抗原の第一及び第二のエピトープ)に対して、それら自体、二重特異性である抗体が最終的な成果である。
【０１４８】
23.  各可変領域又は遺伝子セグメントがヒトであり、任意選択で前記定常領域がヒトである、いずれかの先行する記載の細胞。
【０１４９】
任意選択で、各遺伝子セグメントは、ヒト生殖系列遺伝子セグメントである。
【０１５０】
24.  細胞がマウス細胞であり、各定常領域がマウス、ラット又はヒト定常領域である、いずれかの先行する記載の細胞。
【０１５１】
例えば、各定常領域は、ヒト定常領域である。
【０１５２】
25.  各前記エンハンサーが、細胞の内因性エンハンサーである、いずれかの先行する記載の細胞。
【０１５３】
一例では、細胞は、細胞の内因性エンハンサー配列を含む又は細胞ゲノムへの挿入物(例えば、内因性エンハンサー配列と同一であるエンハンサー配列を含む挿入物)を含むことから、イントロンエンハンサーは同じ種又は株のものである。
【０１５４】
26.  細胞がマウス細胞であり、各前記エンハンサーがマウスエンハンサーである、いずれかの先行する記載の細胞。
【０１５５】
例えば、エンハンサーは、129ハイブリッド又はC57BL6ハイブリッド株エンハンサーである(及び、任意選択で、細胞は、それぞれ、129ハイブリッド又はC57BL6ハイブリッド株である)。例えば、エンハンサーは129エンハンサーである及び細胞はF1H4又はAB2.1細胞である。
【０１５６】
27.  (a)細胞はマウス細胞であり、可変領域はヒト可変領域であり、イントロンエンハンサーは細胞の内因性抗体遺伝子座(例えば、カッパ遺伝子座)でのマウスイントロンエンハンサー(例えば、内因性マウスイントロンエンハンサーと同一の配列)であり、前記定常領域はマウス、ラット又はヒト定常領域(例えば、細胞の内因性マウス定常領域)である;又は
(b)細胞はラット細胞であり、可変領域はヒト可変領域であり、イントロンエンハンサーは細胞の内因性抗体遺伝子座(例えば、カッパ遺伝子座)でのラットイントロンエンハンサー(例えば、内因性ラットイントロンエンハンサーと同一の配列)であり、前記定常領域はマウス、ラット又はヒト定常領域(例えば、細胞の内因性ラット定常領域)である、いずれかの先行する記載の細胞。
【０１５７】
例えば、細胞はマウス細胞であり、可変領域はヒト可変領域であり、イントロンエンハンサーは内因性マウスイントロンエンハンサーと同一の配列を含み且つ細胞の内因性カッパ遺伝子座にあり、前記定常領域はヒト定常領域である。
【０１５８】
例えば、細胞はマウスF1H4細胞であり、可変領域はヒト可変領域であり、イントロンエンハンサーはマウス129Eiκイントロンエンハンサーと同一の配列を含み且つ細胞の内因性カッパ遺伝子座にあり、前記定常領域はヒト定常領域である。例えば、細胞はマウスAB2.1細胞であり、可変領域はヒト可変領域であり、イントロンエンハンサーはマウス129Eiκイントロンエンハンサーと同一の配列を含み且つ細胞の内因性カッパ遺伝子座にあり、前記定常領域はヒト定常領域である。
【０１５９】
例えば、細胞はマウスF1H4細胞であり、可変領域はヒトラムダ可変領域であり、イントロンエンハンサーはマウス129Eiκイントロンエンハンサーと同一の配列を含み且つ細胞の内因性カッパ遺伝子座にあり、前記定常領域はヒトラムダ定常領域である。例えば、細胞はマウスAB2.1細胞であり、可変領域はヒトラムダ可変領域であり、イントロンエンハンサーはマウス129Eiκイントロンエンハンサーと同一の配列を含み且つ細胞の内因性カッパ遺伝子座にあり、前記定常領域はヒトラムダ定常領域である。
【０１６０】
例えば、細胞はマウスF1H4細胞であり、可変領域はヒトカッパ可変領域であり、イントロンエンハンサーはマウス129Eiκイントロンエンハンサーと同一の配列を含み且つ細胞の内因性カッパ遺伝子座にあり、前記定常領域はヒトカッパ定常領域である。例えば、細胞はマウスAB2.1細胞であり、可変領域はヒトカッパ可変領域であり、イントロンエンハンサーはマウス129Eiκイントロンエンハンサーと同一の配列を含み且つ細胞の内因性カッパ遺伝子座にあり、前記定常領域はヒトカッパ定常領域である。
【０１６１】
28.  再構成された可変領域が、
(a)ヒトIGLV3-21及びIGLJ3(例えば、IGLV3-21*01及びIGLJ3*02)の再構成であり、任意選択でヒト生殖系列IGLV3-21(例えば、IGLV3-21*01)プロモーター及び/又はシグナルペプチドコードヌクレオチド配列に作動可能に連結されている;
(b)ヒトIGK1-39及びIGKJ1又は5の再構成であり、任意選択でヒト生殖系列IGKV1-39プロモーター及び/又はシグナルペプチドコードヌクレオチド配列に作動可能に連結されている;
(c)ヒトIGK3-20及びIGKJ1又は5の再構成であり、任意選択でヒト生殖系列IGKV3-20プロモーター及び/又はシグナルペプチドコードヌクレオチド配列に作動可能に連結されている;
(d)ヒトVpreB及びJλ5の再構成であり、任意選択でヒト生殖系列VpreBプロモーター及び/又はシグナルペプチドコードヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、いずれかの先行する記載の細胞。
【０１６２】
29.  いずれかの先行する記載に従う複数の細胞を含むトランスジェニック非ヒト脊椎動物。
【０１６３】
例えば、脊椎動物は、本発明の細胞として、その細胞の少なくとも20、30、40又は50%を含む胚である。例えば、脊椎動物は、例えば、被膜色(例えば、白色対アグーチ被膜色の総面積)のパーセンテージとして示されるような、本発明の細胞として、その細胞の少なくとも20、30、40又は50%を含むげっ歯類(例えば、マウス又はラット)の子である。
【０１６４】
30.  前記脊椎動物の生殖系列が、記載1から28のいずれか1つで規定される、第一の遺伝子座(及び任意選択で第二の遺伝子座)を含む、記載29の脊椎動物。
【０１６５】
例えば、本発明は、いずれかの先行する記載に従う複数の細胞を含むトランスジェニック非ヒト脊椎動物キメラを提供する。任意選択で、前記キメラ(又は記載31のキメラ)の生殖系列が、記載1から28のいずれか1つで規定される、第一の遺伝子座を含まない(及び任意選択で第二の遺伝子座も含まない)。したがって、キメラを単純に生成し、生殖系列伝達なしで使用することができるので、本発明では、遺伝子座の生殖系列伝達を示す脊椎動物を生成するのに必要とされる時間及び努力が省かれ、これが先行技術の態様に優る利点となる。
【０１６６】
31.  脊椎動物が、前記細胞と第一の遺伝子座を含まない複数の他の細胞(例えば、他の細胞が、野生型抗体遺伝子座を含む)のキメラであり、脊椎動物の生殖系列が第一の遺伝子座を含まない、記載29の脊椎動物。
【０１６７】
任意選択で、前記他の細胞は、RAGノックアウトを含む。これは有用であり、その理由は、キメラ中の増殖性成熟B細胞が、本発明の細胞のみから生じ、それによって、望まれないバックグラウンドが除去されるからである。ここで、増殖性は、脊椎動物の抗体レパートリーに寄与する抗体を発現することができるB細胞を指す。
【０１６８】
一例では、本発明の細胞は、F1H4、AB2.1、AB2.2、129又はC57BL6株細胞であり、前記他の細胞は、F1H4、AB2.1、AB2.2、129又はC57BL6株細胞である(例えば、野生型胚盤胞又は前桑実胚の子孫細胞;又はRAGノックアウト胚盤胞又は前桑実胚)。
【０１６９】
32.  第一の複数の細胞及び第二の複数の細胞を含む、記載29から31のいずれか1つの脊椎動物であって、第一の複数の細胞が同じ第一の同一の抗体遺伝子座を含み、第二の複数の細胞が同じ追加の同一の抗体遺伝子座を含み、各前記抗体遺伝子座が、記載1から28のいずれか1つの第一の遺伝子座に従い、脊椎動物が、前記第一の同一の遺伝子座からの第一の複数の抗体鎖及び前記追加の遺伝子座からの第二の複数の抗体鎖を発現可能であり、並びに第一の細胞の抗体遺伝子座が、第二の細胞の抗体遺伝子座と異なる。
【０１７０】
33.  脊椎動物が第三の複数の細胞を含み、第三の複数の細胞が同じ更なる抗体遺伝子座を含み、更なる遺伝子座が記載1から28のいずれか1つに従い且つ第一及び第二の細胞の前記抗体遺伝子座と異なり、脊椎動物が更なる遺伝子座からの第三の複数の抗体鎖を発現可能である、記載32の脊椎動物。
【０１７１】
34.  脊椎動物が、前記細胞と記載1から28のいずれか1つに従う第一の遺伝子座又は前記追加の又は更なる遺伝子座を含まない複数の他の細胞(例えば、他の細胞が、野生型抗体遺伝子座を含む)のキメラである、記載32又は33の脊椎動物。
【０１７２】
35.  抗体軽鎖レパートリーが、単一の再構成されたVLドメイン種に関して少なくとも95、96、97、98又は99%純粋である(又は100%純粋である)、トランスジェニック非ヒト脊椎動物。
【０１７３】
これは、したがって、脊椎動物によって発現される全てのVLが前記VLドメイン種である、又はVLの僅か5%未満が別の種のものであることを意味する。
【０１７４】
一例では、本明細書中の脊椎動物は、ナイーブである。別の例では、脊椎動物は、抗原で免疫される(例えば、ヒト抗原で免疫される)。
【０１７５】
純度は、例えば、標準NGS及び任意選択でサンプルによって含まれるVLコードヌクレオチド配列のPCR増幅を共に使用して、脊椎動物の血液サンプル又はVLコードヌクレオチド配列サンプルから決定されうる。任意選択で、サンプルからの又はサンプルから産生されるB細胞又はハイブリドーマは、1つ又は複数のプレートの個々のウェルにソーティングされ、次に、そのVLコードヌクレオチド配列の任意選択のPCR、続いてNGSに付して、各ウェル中のヌクレオチド配列の配列が決定される。配列が分析されて、前記単一の再構成されたVLドメイン種をコードする比率が決定される。
【０１７６】
一例では、VL種は、ヒトVκである。一例では、VL種は、ヒトVλである。
【０１７７】
36.  レパートリーが、単一の再構成されたVLドメイン種に関して少なくとも99%純粋である、記載35の脊椎動物。
【０１７８】
37.  軽鎖レパートリーの軽鎖の残りが、前記VLドメイン種の変異体を含む、記載35又は36の脊椎動物。
【０１７９】
38.  抗体軽鎖レパートリーが、第一のVL遺伝子セグメント及び第一のJL遺伝子セグメントの組換えに由来するVLドメインを含み、前記組換えに由来する全てのVLドメインの少なくとも95%が、同じVLアミノ酸配列を含む、トランスジェニック非ヒト脊椎動物。
【０１８０】
別の実施形態において、本発明は、脊椎動物の抗体軽鎖レパートリーの全てのVLドメインの少なくとも95、96、97、98又は99%(又は100%)が、脊椎動物のゲノムによって含まれる同じ軽鎖可変領域配列によってコードされる、トランスジェニック非ヒト脊椎動物を提供する。
【０１８１】
別の実施形態において、本発明は、脊椎動物のヒトVLレパートリーの全てのVLドメインの少なくとも95、96、97、98又は99%(又は100%)が、脊椎動物のゲノムによって含まれる同じ軽鎖可変領域配列によってコードされる、トランスジェニック非ヒト脊椎動物を提供する。
【０１８２】
39.  前記組換えに由来する全てのVLドメインの少なくとも99%が、同じVLアミノ酸配列を含む、記載38の脊椎動物。
【０１８３】
40.  記載1から28のいずれか1つに従う複数の第一の遺伝子座を含む、記載29から39のいずれか1つ又は記載38の前記他の実施形態に従う、脊椎動物の複数の脾臓、骨髄、B細胞又は血液細胞。
【０１８４】
41.  脾臓、骨髄、B細胞、ハイブリドーマ、CHO細胞、HEK細胞、MEF細胞、COS細胞、HeLa細胞又は血液細胞の集団であって、各細胞が記載1又は記載1に従属する場合の記載2から28のいずれか1つに従い;及び任意選択で、細胞が、少なくとも10の異なる抗体種を発現し、
(a)少なくとも95、96、97、98又は99%(又は100%)の抗体が同じ軽鎖VLドメインを共有し、集団が少なくとも10の異なるVHドメイン種を含み;又は
(b)抗体が、第一のVL遺伝子セグメント及び第一のJL遺伝子セグメントの組換えに由来するVLドメイン(例えば、ヒト生殖系列Vκ及びJκ遺伝子セグメント又はヒト生殖系列Vλ及びJλ遺伝子セグメント)を含み、前記組換えに由来する全ての前記VLドメインの少なくとも95%が、同じVLアミノ酸配列を含み、集団が少なくとも10の異なるVHドメイン種を含む、集団。
【０１８５】
任意選択で、細胞は、HEK293細胞、例えば、HEK293T又はS細胞、COS-1又はCOS-7細胞である。
【０１８６】
任意選択で、細胞は、少なくとも100、1000、10000、100000、1000000、10000000、100000000,又は1000000000の異なる抗体種を発現する。任意選択で、集団は、少なくとも100、1000、10000、100000、1000000、10000000、100000000、又は1000000000の異なるVHドメイン種を含む。
【０１８７】
42.  集団によって含まれる少なくとも95、96、97、98又は99%(又は100%)の抗体が同じ軽鎖VLドメインを共有し、集団が少なくとも10の異なるVHドメイン種を含む、ポリクローナル抗体集団。
【０１８８】
任意選択で、集団は、少なくとも100、1000、10000、100000、1000000、10000000、100000000、又は1000000000の異なるVHドメイン種を含む。
【０１８９】
一例では、本明細書中の抗体集団は、試験管、ペトリ皿又はフラスコ中に滅菌又は医療用容器に含有される。任意選択で、集団はB細胞と混合され、B細胞は本発明に従う遺伝子座を含む。
【０１９０】
43.  第一のVL遺伝子セグメント及び第一のJL遺伝子セグメントの組換えに由来するVLドメイン(例えば、ヒト生殖系列Vκ及びJκ遺伝子セグメント又はヒト生殖系列Vλ及びJλ遺伝子セグメント)を含み、前記組換えに由来する全ての前記VLドメインの少なくとも95、96、97、98又は99%(又は100%)が、同じVLアミノ酸配列を含み、集団が少なくとも10の異なるVHドメイン種を含む、ポリクローナル抗体集団。
任意選択で、集団は、少なくとも100、1000、10000、100000、1000000、10000000、100000000、又は1000000000の異なるVHドメイン種を含む。
【０１９１】
44.  抗体、抗体可変ドメイン、抗体若しくは抗体可変ドメインをコードするヌクレオチド配列(例えば、DNA又はRNA配列)、又は抗体若しくはドメインを発現可能である発現ベクター若しくは宿主細胞を同定する若しくは得る方法であって、抗体若しくはドメインが、標的抗原に特異的に結合可能であり、方法が、
(a)記載41の細胞集団又は記載42若しくは43の抗体集団を、(例えば、固体支持体に固定化された)前記抗原と接触させる工程;
(b)前記集団によって発現される又は含まれる抗体を前記抗原に結合させる工程;及び
(c)抗原に結合する1つ又は複数の抗体を単離する又は同定する工程、又は前記1つ又は複数の抗体のVH及び/又はVLドメインを単離する又は同定する工程;又は前記VH又はVLをコードするヌクレオチド配列を同定する工程;及び
(d)任意選択で、
(i)同定された前記抗体又はドメインを、それをコードするヌクレオチド配列(例えば、DNA、cDNA、RNA又はmRNA配列)と相関させ、それによって、前記配列を同定する工程;
(ii)前記配列を(例えば、PCRを使用して)増幅する工程及びコードされる抗体又はドメインの発現のために配列を発現ベクター又は宿主細胞ゲノムに挿入する工程;及び
(iii)任意選択で、前記抗体又はドメインを発現させる工程及び単離する工程(例えば、ドメインが、抗体鎖によって含まれる)
を含み、工程(i)及び(ii)は、任意の順序で実施することができる、方法。
【０１９２】
NGSを、例えば、前記相関させる工程に使用してもよい。
【０１９３】
45.  同定された抗体のVH及びVLドメインをコードするVH及びVLヌクレオチド配列を増幅する方法を使用する工程を含み、VH及びVLヌクレオチド配列を、VH及びVLの共発現のためにベクター又は細胞に挿入して、抗原に結合可能な対合したVH/VL結合部位を生成する工程、及び結合部位(例えば、ベクター又は細胞によってコードされる抗体によって含まれる)を発現させる工程(及び任意選択で単離する工程)を更に含む、記載44の方法。
【０１９４】
46.  VHドメインの更なる種の存在下でVH及びVLを発現させる工程を含み、VL及び更なるVHが、更なる抗原に結合可能な更なる対合したVH/VL部位を形成し、更なる抗原及び記載45に列挙される抗原が異なり、方法が、結合部位(例えば、ベクター又は細胞によってコードされる二重特異性抗体によって含まれ、二重特異性抗体が、各前記抗原に対するそれぞれの結合部位を含む)を共発現させる工程(及び任意選択で単離する工程)を含む、記載45の方法。
【０１９５】
47.  二重特異性抗体が、第一の重鎖-軽鎖対及び第二の重鎖-軽鎖対を含む4鎖抗体であり、
(a)第一及び第二の対における軽鎖が、前記VLドメインを含み、
(b)第一の対の重鎖が、記載45に列挙されるVHドメインを含み、VHドメインが、前記VLドメインとVH/VL結合部位を形成し、及び結合部位が、記載45に列挙される前記抗原に特異的に結合可能であり;
(c)第二の対の重鎖が、前記VLドメインとVH/VL結合部位を形成する、前記更なるVHドメインを含み、及び結合部位が、記載46に列挙される前記更なる抗原に特異的に結合可能である、記載46の方法。
【０１９６】
48.  各4鎖抗体が、変異型重鎖定常領域を含み、第一及び第二の重鎖-軽鎖対の重鎖の対合を促進する;任意選択で、変異がノブ-イン-ホール変異又は荷電対合変異である、記載47の方法。
【０１９７】
例えば、各定常領域は、発現ベクターによって含まれる重鎖定常領域配列によってコードされる。
【０１９８】
有利には、一例では、第一の対の重鎖は第一のpIを有し、第二の対の重鎖は第二のpIを有し、pI値は、異なり、例えば、0.5-1.5pI単位まで異なり、例えば、0.5-1pI単位まで異なる。これは、鎖のインビトロ精製の間に第二の鎖から第一の鎖を分離するために有用であり、それ自体、抗体製造及びスケールアップの間にが有用である。例えば、各pIは、5から6.5の範囲にある。
【０１９９】
49.  記載42又は43のポリクローナル抗体集団を発現する複数のB細胞、ハイブリドーマ、CHO細胞、HEK細胞、MEF細胞、COS細胞、HeLa細胞。
【０２００】
任意選択で、細胞は、HEK293細胞、例えば、HEK293T又はS細胞、COS-1又はCOS-7細胞である。
【０２０１】
50.  VL及び/又はVHコードヌクレオチド配列を記載41又は47の細胞から得る工程及び工程(d)において、ヌクレオチド配列を使用して、その1つ又は複数と、抗原を結合する前記抗体の1つ又は複数のVH及び/又はVLドメインとを相関させる工程を含む、記載44から48のいずれか1つの方法。
【０２０２】
51.  抗体又は抗体可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を得る方法であって、抗体若しくはドメインが、標的抗原に特異的に結合可能であり、方法が、
(a)VL及び/又はVHコードヌクレオチド配列を記載41又は47の細胞から得る工程;
(b)前記配列を、(例えば、PCRを使用して)増幅する工程;及び
(c)任意選択で、コードされる抗体又はドメインの発現のために配列を発現ベクター又は宿主細胞ゲノムに挿入する工程
を含む、方法。
【０２０３】
一例では、本明細書中の発現ベクターは、CHO宿主細胞に使用するためのCHO細胞発現ベクターである。一例では、本明細書中の発現ベクターは、HEK293宿主細胞に使用するためのHEK293細胞発現ベクターである。
【０２０４】
52.  抗原に特異的に結合する抗体の産生のための、抗体産生細胞株を得る方法であって、VH及びVLコードヌクレオチド配列を、宿主細胞(例えば、CHO、HEK、MEF、COS又はHeLa細胞)のゲノムに挿入する工程を含み、
(a)各VH配列が、VH及びCドメインを含む細胞による重鎖の発現のために抗体重鎖定常領域(例えば、ヒト定常領域)の5'に作動可能に挿入され;
(b)各VL配列が、VL及びCドメインを含む細胞による軽鎖の発現のために抗体軽鎖定常領域(例えば、ヒト定常領域)の5'に作動可能に挿入され;
(c)発現される重鎖が、軽鎖と対合可能で、重鎖-軽鎖対を産生し、各対が、抗原に結合可能なVH/VL結合部位を含み;及び
(d)VH及びVLコードヌクレオチド配列が、記載41又は47の1つ又は複数の細胞のVH及びVLコードヌクレオチド配列の配列である、方法。
【０２０５】
任意選択で、宿主細胞は、HEK293細胞、例えば、HEK293T又はS細胞、COS-1又はCOS-7細胞である。
【０２０６】
53.  第一及び第二のVHコードヌクレオチド配列を細胞ゲノムに挿入する工程を含み、
(a)第一のVH(第一の重鎖の一部として発現される場合)が、VL(軽鎖の一部として発現される場合)と対合可能で、第一の抗原に特異的に結合可能な第一のVH/VL結合部位を形成し;
(b)第二のVH(第二の重鎖の一部として発現される場合)が、VL(軽鎖の一部として発現される場合)と対合可能で、第二の抗原に特異的に結合可能な第二のVH/VL結合部位を形成し;及び
(c)第一及び第二の抗原が、異なり;
第一及び第二の重鎖及び軽鎖が、対合可能で、第一の重鎖-軽鎖対及び第二の重鎖-軽鎖対を含む二重特異性4鎖抗体を産生し、
(d)第一の重鎖-軽鎖対の重鎖が、第一のVHを含み;及び
(e)第二の重鎖-軽鎖対の重鎖が、第二のVHドメインを含む、記載52の方法。
【０２０７】
54.  二重特異性4鎖抗体を産生する方法であって、二重特異性抗体が、第一及び第二の抗原に対する、それぞれの結合部位を含み、抗原が互いに異なり、各抗体が第一の重鎖-軽鎖対及び第二の重鎖-軽鎖対を含み、
(a)第一の重鎖-軽鎖対の重鎖が、第一のVHを含み、第一のVH(第一の重鎖の一部として発現される場合)が、VL(軽鎖の一部として発現される場合)と対合可能で、第一の抗原に特異的に結合可能な第一のVH/VL結合部位を形成し;及び
(b)第二の重鎖-軽鎖対の重鎖が、第二のVHを含み、第二のVH(第二の重鎖の一部として発現される場合)が、前記VL(軽鎖の一部として発現される場合)と対合可能で、第二の抗原に特異的に結合可能な第二のVH/VL結合部位を形成し;
方法が、
(c)(i)第一の細胞ゲノムに前記第一のVHをコードするヌクレオチド配列を挿入する工程であって、VH配列が、第一のVH及びCドメインを含む第一の重鎖の発現のために抗体重鎖定常領域(例えば、ヒト定常領域)の5'に作動可能に挿入される工程;及び(ii)細胞を培養して第一の重鎖を発現する第一の細胞株を産生する工程によって第一の重鎖を発現可能な第一の細胞株を産生する工程;
(d)(i)第二の細胞ゲノムに前記第二のVHをコードするヌクレオチド配列を挿入する工程であって、VH配列が、第二のVH及びCドメインを含む第二の重鎖の発現のために抗体重鎖定常領域(例えば、ヒト定常領域)の5'に作動可能に挿入される工程;及び(ii)細胞を培養して第二の重鎖を発現する第二の細胞株を産生する工程によって第二の重鎖を発現可能な第二の細胞株を産生する工程;
(e)第一の重鎖を第一の細胞株及び第二の重鎖を第二の細胞株から発現させる工程及び前記第一のVHを含む第一の重鎖、前記第二のVHを含む第二の重鎖及び前記VLを含む軽鎖を一緒に混合する工程であって、それによって、(iii)第一の重鎖が、軽鎖と対合して前記第一の重鎖-軽鎖対を産生し、(iv)第二の重鎖が、軽鎖と対合して前記第二の重鎖-軽鎖対を産生し;及び(v)第一の重鎖-軽鎖対が、第二の重鎖-軽鎖対と対合し、それによって、前記二重特異性抗体を産生する工程
を含み、VH及び/又はVLコードヌクレオチド配列が、記載41又は47の1つ又は複数の細胞のVH及び/又はVLコードヌクレオチド配列の配列である、方法。
【０２０８】
任意選択で、第一の重鎖及び第二の重鎖は、本明細書に記載の通りの第一及び第二の異なるpI値を有し、方法は、鎖を共発現させて混合物を産生し、混合物のpH変化を使用して第一の鎖を第二の鎖から分離(例えば、マトリックスから溶出)し、それによって、第二の鎖の集団から分離される第一の鎖の集団を産生する工程;及び第一及び第二の鎖を軽鎖と組み合わせて、二重特異性抗体を産生する工程を更に含む。
【０２０９】
本発明は、本発明の方法によって得られる又は入手可能な抗体(例えば、二重特異性抗体)を更に提供する。任意選択で、抗体は、ヒト又は動物対象における疾患又は状態を治療する又は予防するためのものである。
【０２１０】
55.
(a)(i)第三の細胞ゲノムに前記VLをコードするヌクレオチド配列を挿入する工程であって、VL配列が、VL及びCドメインを含む軽鎖の発現のために抗体軽鎖定常領域(例えば、ヒト定常領域)の5'に作動可能に挿入される工程;及び(ii)細胞を培養して軽鎖を発現する第三の細胞株を産生する工程によって軽鎖を発現可能な第三の細胞株を産生する工程;
(b)軽鎖を第三の細胞株から発現させる工程であって、軽鎖が、記載54の工程(e)の軽鎖である工程
を含む、記載54の方法。
【０２１１】
56.
(a)第一及び/又は第二の細胞又は細胞株のゲノムに前記VLをコードするヌクレオチド配列を挿入する工程であって、VL配列が、VL及びCドメインを含む軽鎖の発現のために抗体軽鎖定常領域(例えば、ヒト定常領域)の5'に作動可能に挿入される工程;及び
(b)軽鎖をVH配列を含む細胞株から発現させる工程であって、軽鎖が、記載54の工程(e)の軽鎖である工程
を含む、記載54の方法。
【０２１２】
57.  鎖の前記混合する工程が、細胞株を共培養する工程によって実施される、記載54、55又は56の方法。
【０２１３】
58.  鎖の前記混合する工程が、細胞株によって発現される鎖を単離する工程及び単離された鎖を一緒に(例えば、前記細胞を含まない容器中で)混合する工程によって実施される、記載54、55又は56の方法。
【０２１４】
前記単離する工程は、例えば、本明細書に記載の通り、鎖の異なるpIを使用して実施することができる。
【０２１５】
59.  二重特異性4鎖抗体を産生する方法であって、二重特異性抗体が、第一及び第二の抗原に対する、それぞれの結合部位を含み、抗原が互いに異なり、各抗体が第一の重鎖-軽鎖対及び第二の重鎖-軽鎖対を含み、
(a)第一の重鎖-軽鎖対の重鎖が、第一のVHを含み、第一のVH(第一の重鎖の一部として発現される場合)が、VL(軽鎖の一部として発現される場合)と対合可能で、第一の抗原に特異的に結合可能な第一のVH/VL結合部位を形成し;及び
(b)第二の重鎖-軽鎖対の重鎖が、第二のVHを含み、第二のVH(第二の重鎖の一部として発現される場合)が、前記VL(軽鎖の一部として発現される場合)と対合可能で、第二の抗原に特異的に結合可能な第二のVH/VL結合部位を形成し;
方法が、
(c)前記第一のVHを含む第一の重鎖、前記第二のVHを含む第二の重鎖及び前記VLを含む軽鎖を一緒に混合する工程であって、それによって、(i)第一の重鎖が、軽鎖と対合して前記第一の重鎖-軽鎖対を産生し、(ii)第二の重鎖が、軽鎖と対合して前記第二の重鎖-軽鎖対を産生し;及び(iii)第一の重鎖-軽鎖対が、第二の重鎖-軽鎖対と対合し、それによって、前記二重特異性抗体を産生する工程を含み、
VH及び/又はVLが、VH及び/又はVLコードヌクレオチド配列によってコードされ、ヌクレオチド配列が、記載41又は47の1つ又は複数の細胞のVH及び/又はVLコードヌクレオチド配列の配列である、方法。
【０２１６】
60.  各4鎖抗体が変異型重鎖定常領域を含み、第一及び第二の重鎖-軽鎖対の重鎖の対合を促進し;任意選択で、変異がノブ-イン-ホール変異又は荷電対合変異である、記載54から59のいずれか1つの方法。
【０２１７】
例えば、発現ベクターは、VHコード配列が、変異型ヒト重鎖定常領域コードヌクレオチド配列と作動可能に連結して5'に挿入されて提供することができ、ここで、変異は、別の重鎖とのノブ-イン-ホール対合に関する又は別の重鎖との荷電対合に関する。したがって、第一の重鎖-軽鎖対の重鎖のVHは、そのようなベクターに第一の変異型重鎖定常領域の5'に挿入することができ、第二の重鎖-軽鎖対の重鎖のVHは、そのようなベクター(同じ又は異なるベクター)に第二の変異型重鎖定常領域の5'に挿入することができ、ここで、第一及び第二の重鎖は、ベクターから発現可能であり、ノブ-イン-ホール又は荷電対合変異を使用して対合することができる。或いは、VHコード配列は、前記重鎖の発現のために、同じ又は異なる宿主細胞のゲノム中のそれぞれの定常領域の5'に挿入される。
【０２１８】
61.  ヒト又は非ヒト動物対象における疾患又は状態(例えば、がん又は自己免疫疾患)を治療する又は予防するための医薬組成物を産生する方法であって、
(a)抗体を記載52又は53の方法によって産生される細胞株から発現させる工程;及び
(b)抗体を希釈剤又は賦形剤と混合する工程
を含み、
(c)任意選択で、抗体が、記載54から60のいずれか1つの方法によって得られる抗体と同一である又はそれと同一である可変ドメインを含む、方法。
【０２１９】
62.  ヒト又は非ヒト動物対象における疾患又は状態(例えば、がん又は自己免疫疾患)を治療する又は予防するための医薬組成物を産生する方法であって、二重特異性抗体を希釈剤又は賦形剤と混合する工程を含み、抗体が、記載54から60のいずれか1つの方法によって得られる抗体と同一である又はそれと同一である可変ドメインを含む、方法。
【０２２０】
63.  記載1から28のいずれか1つの細胞又は記載29から39のいずれか1つの脊椎動物を産生する方法であって、
(a)再構成された抗体Vドメインをコードする再構成された抗体可変領域を含む核酸(例えば、DNA又はcDNA)を得る工程;及び
(b)可変領域又はそのコピーを細胞のゲノムに挿入し、それによって、可変領域が前記ゲノム中の抗体遺伝子座によって含まれる工程であって、
遺伝子座が(5'から3'方向に)、
(c)抗体遺伝子座イントロンエンハンサー;
(d)前記再構成された抗体可変領域;及び
(e)抗体Cドメインをコードする抗体定常領域
を含み、遺伝子座が、(NからC末端方向に)前記再構成されたVドメイン及び前記Cドメインを含む抗体鎖を発現するように作動可能である工程;及び
(f)任意選択で、細胞が非ヒト脊椎動物ES細胞又はiPS細胞であり、記載29から39のいずれか1つの非ヒト脊椎動物を細胞から生成する工程
を更に含む、方法。
【０２２１】
任意選択で、細胞は多能性、ES又はiPS細胞であり、細胞はヒト又はヒト胚を生成可能ではない。例えば、細胞は、ヒトES又はiPS又は多能性幹細胞ではない。
【０２２２】
任意選択で、細胞は、非ヒト脊椎動物(例えば、げっ歯類、マウス又はラット)細胞、例えば、ES又はiPS細胞である。
【０２２３】
本発明のES又はiPS細胞を使用するトランスジェニック非ヒト脊椎動物(例えば、マウス及びラット)を産生する標準技術は当業者には知られており且つ容易に利用可能である。例えば、本発明の1つ又は複数のES細胞は、レシピエント胚盤胞又は前桑実胚に導入した後に、雌性非ヒト脊椎動物(例えば、ES及び胚盤胞/前桑実胚が、それぞれマウス又はラットである場合、偽妊娠マウス又はラット)に移植することができる。任意選択で、前記他の細胞、胚盤胞又は前桑実胚は、RAGノックアウト(例えば、RAG-1及び/又はRAG-2ノックアウト)を含む。これは、全ての抗体鎖、例えば、本発明の細胞及び遺伝子座によって産生される鎖が、胚盤胞又は前桑実胚細胞ではなく、本発明の遺伝子座による非ヒト脊椎動物に100%寄与することを保証するのに有用である。加えて又は代替的に、内因性IgH発現は、ノックアウト又は不活化され、本発明の非ヒト脊椎動物は、(例えば、脊椎動物の細胞によって含まれるトランスジェニックIgH遺伝子座から)ヒト可変ドメイン及びヒト又は非ヒト脊椎動物定常ドメインを含む抗体重鎖を発現可能である。
【０２２４】
任意選択で、工程(a)の核酸は、(5'から3'方向に)前記再構成された抗体可変領域及び1つ又は複数の抗体Cドメイン(例えば、Cκ、Cλ又は重鎖Fc)をコードする定常領域を含む。任意選択で、核酸は、(可変領域の5'に)、可変領域の転写を促進するために作動可能なプロモーター、及び可変ドメインシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を更に含み、核酸はシグナルペプチド-Vドメイン-Cドメインをコードする。
【０２２５】
任意選択で、遺伝子座は抗体軽鎖遺伝子座(第一の遺伝子座)であり、遺伝子座は(5'から3'方向に)、
(g)軽鎖イントロンエンハンサー;
(h)再構成された抗体Vドメインをコードする再構成された抗体可変領域;及び
(i)軽鎖Cドメインをコードする抗体軽鎖定常領域
を含み、遺伝子座が、細胞において、(NからC末端方向に)前記再構成されたVドメイン及び前記Cドメインを含む抗体鎖を発現するように作動可能である。
【０２２６】
任意選択で、遺伝子座は、抗体軽鎖遺伝子座(第一の遺伝子座)であり、遺伝子座は、(5'から3'方向に)軽鎖イントロンエンハンサー及び再構成された軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含み、遺伝子座は、細胞において、軽鎖を発現するように作動可能である。
【０２２７】
任意選択で、細胞は、げっ歯類(例えば、マウス又はラット細胞)であり、遺伝子座は、抗体カッパ軽鎖遺伝子座(第一の遺伝子座)であり、遺伝子座は、(5'から3'方向に)マウス又はラットEiκイントロンエンハンサー及び再構成されたヒト軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含み、遺伝子座は、細胞において、軽鎖を発現するように作動可能である。
【０２２８】
本発明の任意の細胞、脊椎動物、集団、組成物又は方法の例において、VドメインはVκ(例えば、ヒトVκ)であり、CドメインはCκ(例えば、ヒトCκ)である。一例では、VドメインはVλ(例えば、ヒトVλ)であり、CドメインはCλ(例えば、ヒトCλ)である。例えば、核酸は、抗体(例えば、抗体は、所定の抗原又はエピトープに特異的に結合する)の再構成された軽鎖をコードする。
【０２２９】
64.  可変ドメインがVL(例えば、ヒトVλ又はVκ)であり、CドメインがCL(例えば、ヒトCλ又はCκ)である、記載63の方法。
【０２３０】
例えば、可変ドメインはヒトVλであり、CドメインはヒトCλである。例えば、可変ドメインはヒトVκであり、CドメインはヒトCκである。
【０２３１】
65.  前記挿入する工程が、細胞の染色体DNAとの相同組換え又は部位特異的組換えを使用して(例えば、lox部位を使用して)実施される、記載63又は64の方法。
【０２３２】
66.  (5'から3'方向に)、
(a)前記イントロンエンハンサー(例えば、Eiκ、例えば、マウス又はラットEiκ);
(b)前記再構成された抗体可変領域(例えば、ヒトVLコード可変領域);及び
(c)前記抗体定常領域(例えば、ヒトCLコード領域)
を含む導入遺伝子を得る工程;及び
前記導入遺伝子を細胞のゲノムに挿入する工程
を含み、それによって、前記抗体遺伝子座が、細胞によって含まれる、記載63から65のいずれか1つの方法。
【０２３３】
例えば、挿入は、細胞のRosa26遺伝子座で又はそれに隣接する又はランダムにゲノムに作られる。
【０２３４】
67.  前記可変領域を、
(a)細胞ゲノムのイントロンエンハンサーと軽鎖遺伝子座のCL;又は
(b)細胞ゲノムのイントロンエンハンサー(Eμ)と重鎖遺伝子座のCμ
の間に挿入する工程を含む、記載63から65のいずれか1つの方法。
【０２３５】
ここで、任意の挿入において、レシピエント核酸(例えば、細胞染色体DNA)のヌクレオチド配列は、同時に又は連続して削除されて欠失を伴ってもよい。或いは、挿入は、レシピエント核酸配列の欠失を伴わない。
【０２３６】
68.  可変領域が、所定の抗原に特異的に結合する抗体のVドメイン(例えば、VLドメイン)をコードする、記載63から67のいずれか1つの方法。
【０２３７】
69.  記載63に列挙される再構成された抗体可変領域を含む核酸を得る工程が、
(a)記載68に列挙される前記抗体を発現する更なる細胞(例えば、ハイブリドーマ又はB細胞)を得る工程;
(b)i.Vドメインをコードする再構成された可変領域配列を含む、更なる細胞のDNA(例えば、染色体DNA又はcDNA)配列得る又はコピーする工程;又は
ii.Vドメインをコードする再構成された可変領域配列を含む更なる細胞のRNA配列(例えば、mRNA配列を得る又はコピーする工程、及び前記RNA配列のDNAコピーを生じさせる(例えば、PCRを使用して)工程
を含み、それによって、前記核酸を得る、記載68の方法。
【０２３８】
一例では、RNAを使用して、そのcDNAコピーを産生してもよく、cDNAは本発明の方法に使用される。
【０２３９】
70.  結果として生じる細胞を培養して、複数の細胞を産生する工程を含み、各細胞が記載1から28のいずれか1つに従う、記載63から69のいずれか1つの方法。
【０２４０】
任意選択で、前記複数は少なくとも100、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011又は1012細胞を含み、各細胞は本発明に従う(任意選択で、各細胞は他の細胞と同一である又は細胞は本発明の同じ第一の遺伝子座を含む)。
【０２４１】
71.  記載1から28のいずれか1つに従う又は記載63から70のいずれか1つの方法に従って得られる、ES又はiPS細胞を移植された非ヒト脊椎動物(例えば、げっ歯類、ラット又はマウス)胚盤胞又は前桑実胚。
【０２４２】
任意選択で、前記胚盤胞又は前桑実胚は、RAGノックアウト(例えば、RAG-1及び/又はRAG-2ノックアウト)を含む。これは、胚盤胞又は前桑実胚から成長させた非ヒト脊椎動物における全ての抗体鎖が、胚盤胞又は前桑実胚細胞ではなく、本発明の遺伝子座による非ヒト脊椎動物に100%寄与することを保証するのに有用である。一例では、レシピエント胚盤胞又は前桑実胚はマウス株、例えば、C57BL/6のものであり、任意選択で、ES又はiPS細胞は、129、129ハイブリッド、F1H4又はAB2.1株のものである。
【０２４３】
72.  記載66の方法に使用するための導入遺伝子を含み、導入遺伝子が(5'から3'方向に)、
(a)前記イントロンエンハンサー;
(b)前記再構成された抗体可変領域;及び
(c)前記抗体定常領域
を含む、核酸(例えば、DNA)。
【０２４４】
73.  記載67の方法に使用するための再構成されたVドメインをコードする再構成された可変領域配列を含み、
(a)細胞ゲノムの第一のヌクレオチド配列にハイブリダイズするための相同アームが5'に、及び/又は
(b)細胞ゲノムの第二のヌクレオチド配列にハイブリダイズするための相同アームが3'に
隣接する前記再構成された可変領域配列を含み;
(c)5'相同アームが、細胞の抗体軽鎖(例えば、カッパ)遺伝子座の配列であって、そのCL領域の5'にある配列に相同的であり、及び3'相同アームが、前記遺伝子座の配列であって、遺伝子座のイントロンエンハンサー(例えば、Eiκ)の3'にある配列に相同的であり、それによって、相同アームと細胞のゲノムの間の相同組換えが、可変領域配列を挿入可能であり、それによって、(5'から3'方向に)、イントロンエンハンサー、前記可変領域及びCL領域を含む遺伝子座を産生する;又は
(d)5'相同アームが、細胞の重鎖抗体遺伝子座の配列であって、そのCμ領域の5'にある配列に相同的であり、及び3'相同アームが、前記遺伝子座の配列であって、遺伝子座のイントロンエンハンサー(Eμ)の3'にある配列に相同的であり、それによって、相同アームと細胞のゲノムの間の相同組換えが、可変領域配列を挿入可能であり、それによって、(5'から3'方向に)、イントロンエンハンサー、前記可変領域及びCμ領域を含む遺伝子座を産生する、核酸。
【０２４５】
74.  核酸又は5'相同アームが(5'から3'方向に)、
(a)可変領域の転写を促進する作動可能なプロモーター;
(b)可変ドメインシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列;及び
(c)任意選択で、前記イントロンエンハンサー配列
を含み、可変領域配列が細胞ゲノムに挿入される場合、可変領域は(NからC末端方向に)シグナル配列-Vドメイン-Cドメインを含む抗体鎖の発現のために、プロモーター及びシグナルペプチドコード配列の3'に作動可能に連結するように挿入される、記載73の核酸。
【０２４６】
本発明は、本明細書に開示の通り、本発明の方法によって得られる又は入手可能な抗体、二重特異性抗体、抗体鎖(例えば、軽鎖)、VL又はそのヌクレオチド配列を含む組成物(例えば、医薬組成物又は医学的な使用のための組成物)を更に提供し;任意選択で、組成物は、希釈剤、賦形剤又は担体を含み、任意選択で、組成物は、IV容器(例えば、及びIVバッグ)又はIVシリンジに連結された容器に含有される。組成物が医薬組成物又は医学的な使用のための組成物である場合、希釈剤、賦形剤又は担体は薬学的に許容されるものである。「薬学的に許容される」は、動物(ヒトを含む)における使用について、連邦政府又は州政府の規制機関によって承認される又は承認可能である或いは米国薬局方又は他の一般に認識されている薬局方に列挙されていることを指す。「薬学的に許容される担体、賦形剤、又はアジュバント」は、本明細書に記載される任意の抗体、VL又は抗体鎖等の剤と一緒に、対象に投与することができる担体、賦形剤、又はアジュバントを指し、これは、剤の治療量を送達するするのに十分な用量で投与される場合に、その薬理学的な活性を破壊せず、無毒である。
【０２４７】
単数形「a」、「an」、及び「the」は、文脈が別途明確に示さない限り、複数の指示対象を含む。同様に、「又は」という語は、文脈が別途明確に示さない限り、「及び」を含むことを意図している。本明細書に記載のものと同様又は等価である方法及び材料を本開示の実施又は試験において使用することができるが、適切な方法及び材料を以下に記載する。略記「例えば(e.g.)」は、ラテン語のexempli gratiaに由来し、本明細書では非限定的な例を示すために使用される。故に、略記「e.g.」は、「例えば(for example)」という用語と同義である。
【０２４８】
細胞生物学及び分子生物学における共通の用語の定義は、「The Merck Manual of Diagnosis and Therapy」、19th Edition、published by Merck Research Laboratories、2006 (ISBN 0-911910-19-0);Robert S. Porterら、(eds.)、The Encyclopedia of Molecular Biology、published by Blackwell Science Ltd.、1994 (ISBN 0-632-02182-9);Benjamin Lewin、Genes X、published by Jones & Bartlett Publishing、2009 (ISBN-10: 0763766321);Kendrewら、(eds.)、、Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference、published by VCH Publishers、Inc.、1995 (ISBN 1-56081-569-8)及びCurrent Protocols in Protein Sciences 2009、Wiley Intersciences、Coligan et al.、eds.中に見出すことができる。
【０２４９】
特に明記しない限り、本発明は、例えば、全てが参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Sambrook et al.、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4 ed.)、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.、USA (2012);Davis et al.、Basic Methods in Molecular Biology、Elsevier Science Publishing、Inc.、New York、USA (1995);又はMethods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques Vol.152、S. L. Berger and A. R. Kimmel Eds.、Academic Press Inc.、San Diego、USA (1987);Current Protocols in Protein Science (CPPS) (John E. Coligan、et. al.、ed.、John Wiley and Sons、Inc.)、Current Protocols in Cell Biology (CPCB) (Juan S. Bonifacino et. al. ed.、John Wiley and Sons、Inc.)、及びCulture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique by R. Ian Freshney、Publisher: Wiley-Liss; 5th edition (2005)、Animal Cell Culture Methods (Methods in Cell Biology、Vol. 57、Jennie P. Mather and David Barnes editors、Academic Press、1st edition、1998)に記載のような標準手順を使用して実施された。
他の用語は、本明細書に本発明の様々な態様の記載の中で定義される。
【０２５０】
本出願全体で引用する参照文献、発行済み特許、公開特許出願、及び同時係属特許出願(これらのいずれかの米国の対応するものを含む)を含む、全ての特許及び他の刊行物は、例えば、本明細書に記載の技術と組み合わせ使用し得る、そのような刊行物に記載されている方法を記載及び開示する目的で、参照により明確に本明細書に組み込まれる。これらの刊行物は、本出願の出願日に先行するそれらの開示のみのために提供される。これに関するいずれも、発明者らが、先行発明又は任意の他の理由によって、そのような開示に先行する資格がないことの承認であると解釈されるべきではない。全ての日付についての記述又はこれらの文書の内容についての表現は、出願者らが利用可能な情報に基づいており、これらの文書の日付又は内容の正確性についてのいずれの承認をも構成しない。
【０２５１】
本開示の実施形態の記載は、徹底的であること、又は本開示を開示されている正確な形式に限定することを意図していない。本開示の特定の実施形態及び例が例示目的で本明細書に記載されるが、当業者であれば認識するであろう通り、様々な等価の改変が本開示の範囲内で可能である。例えば、方法ステップ又は機能は、所与の順番で提示されるが、代替的な実施形態では、異なる順番で機能を実施してもよく、或いは機能が実質的に同時に実施されてもよい。本明細書に提供される本開示の教示は、必要に応じて他の手順又は方法に適用することができる。本明細書に記載の様々な実施形態を組み合わせて、更なる実施形態を提供することができる。本開示の態様は、必要であれば、上記の参照及び出願の組成、機能、及び概念を用いるように改変して、本開示のまた更なる実施形態を提供することができる。更に、生物学的機能等価性の検討に起因して、種類又は量における生物学的又は化学的活性に影響することなくタンパク質構造を一部変更することができる。これら及び他の変更は、詳細な説明に照らして開示に対して行うことができる。全てのそのような改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図される。
【０２５２】
前述の実施形態のうちのいずれの特定の要素も、他の実施形態における要素と組み合わせる又はそれらで置き換えることができる。更に、本開示のある特定の実施形態に関連する利点は、これらの実施形態の文脈において記載されているが、他の実施形態もそのような利点を呈し得、本開示の範囲内に含まれるために、全ての実施形態が必ずしもそのような利点を呈する必要はない。
【０２５３】
本明細書に記載された特定の態様(configuration)、態様(aspect)、実施例、実施形態は、例示として示されており、本発明の限定として示されていないことが理解される。本発明の主たる特徴は、本発明の範囲を逸脱することなく、様々な実施形態に採用することができる。当業者は、ルーチンの研究だけを使用して、本明細書に記載される特定の手順に対する多数の同等物を認識する又は確認することが可能である。そのような均等物は、本発明の範囲内であると考えられ、特許請求の範囲によって包含される。本明細書中で言及されている全ての刊行物及び特許出願は、本発明が関係する当業者の技術レベルを示している。全ての公開及び特許出願(米国の同等物を含む)は、それぞれ個別の公開又は特許出願が参照により組み込まれると具体的且つ個別に示されているのと同じ程度まで参照により本明細書に組み込まれる。特許請求の範囲及び/又は本明細書において、「を含む(comprising)」という用語と共に使用されるときの、「ある(a)」又は「ある(an)」という語の使用は、「1つの」を意味しうるが、また、「1つ又は複数の」、「少なくとも1つの」、及び「1つ又は1つを超える」という意味とも合致する。特許請求の範囲における「又は」という用語の使用は、代替物だけ、又は代替物が相互に排他的であることを指すことが明示的に指し示されない限りにおいて、「及び/又は」を意味するように使用されるが、本開示は、代替物だけ、及び「及び/又は」を指す定義を支持する。本出願を通して、「約」という用語は、値が、値を決定するのに採用されるデバイス、方法についての誤差の固有の変動、又は研究対象間に存在する変動を含むことを指し示すように使用される。
【０２５４】
本明細書及び特許請求の範囲において使用される「含む(comprising)」(並びに、「含む(comprise)」及び「含む(comprises)」等、「含む(comprising)」の任意の形態)、「有すること(having)」(並びに、「有する(have)」及び「有する(has)」等、「有すること(having)」の任意の形態)、「含む(including)」(並びに、「含む(includes)」及び「含む(include)」等、「含む(including)」の任意の形態)、又は「含有する(containing)」(並びに、「含有する(contains)」及び「含有する(contain)」等、「含有する(containing)」の任意の形態)という語は、包含的又はオープンエンドなものであり、列挙されていない、更なる要素又は方法の工程を除外するものではない。
【０２５５】
文脈から明らかでない限り、本開示の任意の部分は、本開示の任意の他の部分と組み合わせて読むことができる。
【０２５６】
本明細書において開示され、特許請求される組成物及び/又は方法の全ては、本開示に照らして、不要な実験を伴わずに作製し、実行することができる。本発明の組成物及び方法を、好ましい実施形態の観点から記載してきたが、当業者には、本発明の概念、精神、及び範囲から逸脱しない限りにおいて、本明細書において記載される組成物及び/若しくは方法、並びに方法の工程又は工程の順番に、変動を適用しうることが明らかである。当業者に明らかなこれらの類似の代用及び改変は全て、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の精神、範囲及び概念の範囲内にあるとみなされる。
【０２５７】
本発明は、以下の非限定的な実施例において、より詳細に記載される。
【実施例】
【０２５８】
(実施例1)
マウスES細胞ターゲティングのためのターゲティングベクターの構築
1.1  pUC57_N128L_KIベクターDNA合成
N128Lは、ヒトIGLV3-21*01及びIGLJ3*02(VLドメイン配列は、以下で与えられる)から再構成されたヒトλ軽鎖である。野生型ヒトIGLV3-21*01プロモーター(pVλ)及びシグナルペプチド(SP)、マウスイントロンκエンハンサー(miEκ)、及びN128L軽鎖可変領域及び定常領域を含有するDNA断片を、Genscriptで合成した。カッパ遺伝子座中のVκとJκ領域の間の1kb断片及びマウスκ定常領域(Cκ)とマウス3'κエンハンサー(m3'Eκ)の間の1kb断片を、N128Lノックインカセットをターゲティングするための相同アームとして使用した。ターゲティングの成功後、マウスCκを含むカッパ対立遺伝子DNAを、N128Lノックインによって置き換えた(図1)。
【０２５９】
1.2  pUC57_N128L_EF1α_Puro_2A_EGFP_SV40pAターゲティングベクター
EF1α_Puro_2A_EGFP_SV40pAベクターを、NotI及びAscIで消化した。3.6kb断片を、添付の指示マニュアル中に記載される方法によってQIAquick(商標)PCR精製Ki(QIAGEN)を使用して精製した。pUC57_N128L_KIベクターを、NotI及びAscIで消化した。7.9kb断片を、添付の指示マニュアル中に記載される方法によってQIAquick PCR精製キット(QIAGEN)を使用して精製した。NotI-AscI-消化EF1α_Puro_2A_EGFP_SV40pA及びpUC57_N128L_KI断片を、添付の指示マニュアル中に記載される方法に従いT4リガーゼ(New England Biolabs)を使用してライゲーションした。大腸菌DH10B株(ElectroMax(商標)DH10B(Invitrogen))を、ライゲーション溶液で形質転換した。それぞれのプラスミドDNAを、QIAprep(商標)Spin Miniprep Kit(QIAGEN)を使用して、得られたアンピシリン耐性クローンから単離した。生じたそれぞれのアンピシリン耐性形質転換体を、サンガーシークエンシングによって挿入を有することを確認した。
【０２６０】
1.3  マウスES細胞ターゲティングのためのプラスミドDNAの調製
pUC57_N128L_EF1α_Puro_2A_EGFP_SV40pAターゲティングベクターに関して、プラスミドDNAを、添付の指示マニュアル中に記載される方法によってQIAprep Maxi plus Kit(商標)(QIAGEN)を使用してシークエンシング検証クローンから単離した。それぞれのプラスミドDNAを、サンガーシークエンシングによって挿入を有することを確認した。
【０２６１】
(実施例2)
N128LノックインマウスES細胞株の生成
2.1  マウスES細胞の調製
2つの独立のマウス胚性幹細胞(ES)株からの細胞を、エレクトロポレーションのためにSTOフィーダープレートで増殖させた。ES細胞は、それらが顕微鏡下で80%から85%集密に到達するまで新鮮なM15培地を与えられた。ノックイン構築物を、エレクトロポレーションを使用して導入した。
【０２６２】
ES細胞を、ピューロマイシン(1μg/mL)を補充したM15培地中で培養した。エレクトロポレーション後七日、ピューロマイシン耐性コロニーは、ピッキングするのに十分な大きさであった。
【０２６３】
2.2  標的化マウスES細胞クローンのマイクロインジェクション
標的化ES細胞を、C57BL6株胚盤胞にインジェクションした。インジェクション後、胚盤胞を、インジェクション前に3日間、精管切除した雄とつがいにしたC57BL6株F1ハイブリッド雌の子宮に移した。キメラ胚を、軽鎖ノックインを含む子に発生する偽妊娠レシピエントにおいて出産予定日まで発生させた。
【０２６４】
(実施例3)
共通軽鎖マウス
共通軽鎖ノックイン対立遺伝子及びIgH遺伝子座に機能的な再構成されていないヒトVH領域を有する八匹のキメラマウスを、ヒト  TargetXで免疫した。
【０２６５】
ノックインは、(NからC末端方向に)以下のN128L VLをコードする:
SYVLTQPPSVSVAPGETARITCGGDNIGRKSVYWYQQKSGQAPVLVIYYDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDGSSDHWVFGGGTKLTVL
【０２６６】
免疫後、ソーティングを、PEで標識されたヒトλ軽鎖及びAF647で標識されたヒト  Target Xに対するモノクローナル抗体を使用して脾臓B細胞で実施した(図2及び3)。PE及びAF647の両方に対して陽性であるB細胞を、単一細胞として96ウェルプレート上の個々のウェルにソーティングした。単一細胞NGSライブラリーを、標準プロトコールを使用して構築し、NGSシークエンシングに付した。
【０２６７】
本発明者らの実験に含まれるPCR対照から配列を除去後、本発明者らは346クローンを見出し、その全てが、IGLV3-21*01及びIGLJ3*02に由来する期待されるλ軽鎖組合せを含んでいた。軽鎖配列をノックイン軽鎖対立遺伝子のものとクラスタリングすることにより、346クローンのうち339が未変異型であり、他の7クローンが1つ又は複数の変異を有することが実証された(図4)。
【０２６８】
【表１】
2020530760.tif 000002
【０２６９】
挿入された軽鎖配列に対して完全(すなわち、100%)マッチの配列と比較して、完全マッチではないものは、より低い信頼度スコア(81.6%信頼度スコア(100%マッチを割り当てた配列の平均に関して)対31.7%信頼度スコア(7つの他の配列の平均に関して)、100%は最高信頼度を表し、0%は最低信頼度を表す)を有する。したがって、本発明者らは、ヒトIGLV3-21*01及びIGLJ3*02組合せに基づく全てのVLのものが、98%が同一のインプットした共通軽鎖V配列を含むことを見出した。
【０２７０】
バイオインフォマティクス分析後、望ましく、クローンのヒト重鎖Vドメイン配列レパートリーが多様であることが見出された。バイオインフォマティクス分析によって同定される優勢なヒトVH、DH又はJH使用はなかった。これは、ナイーブキメラマウスからの脾臓B細胞中の重鎖の可変領域のバルクNGS分析にマッチした(データ示さず)。
【０２７１】
ヒトVH遺伝子セグメント使用は、以下を含んでいた:
IGHV1-3*01、IGHV1-8*01、IGHV1-18*01、IGHV1-46*03、IGHV3-7*01、IGHV3-9*01、IGHV3-11*01、IGHV3-15*01、IGHV3-20*d01、IGHV3-21*03、IGHV3-23*04、IGHV3-30*18、IGHV3-33*01、IGHV3-48*02、IGHV3-53*01、IGHV4-4*02、IGHV4-31*03、IGHV4-34*01、IGHV4-39*01、IGHV4-59*01、IGHV4-61*01、IGHV5-51*01、IGHV6-1*01及びIGHV7-4-1*01。
【０２７２】
(実施例4)
マウスES細胞ターゲティングのための共通軽鎖ターゲティングベクターの構築
更なる共通軽鎖マウスは、以下の通り作られた。
共通軽鎖ターゲティングベクターの生成
野生型ヒトVλプロモーター(pVλ)及びシグナルペプチド(SP)、マウスイントロンκエンハンサー(miEκ)、及びヒト軽鎖可変領域及び定常領域をコードするヌクレオチド配列を含有するDNA断片を合成した。軽鎖可変ドメインは、以下に使用されるTarget Y以外の標的(Target Z)に対し特異性を有する。VκとJκ(1-5)の間の1kb断片及びマウスκ定常領域(Cκ)とマウス3'κエンハンサー(m3'Eκ)の間の1kb断片を、共通軽鎖ノックインカセットをターゲティングするための相同アームとして使用した。ターゲティングの成功後、ヒトJκ(1-5)及びマウスCκは、共通軽鎖ノックインカセットによって1つ又は両方の対立遺伝子を置き換えられる。
【０２７３】
共通軽鎖標的化マウスES細胞の生成
2つの独立のマウス胚性幹細胞(ES)株からの細胞を、エレクトロポレーションのためにSTOフィーダープレートで増殖させた。ES細胞は、それらが顕微鏡下で80%から85%集密に到達するまで新鮮なM15培地を与えられた。
【０２７４】
エレクトロポレーション前二時間、ES細胞は新鮮なM15培地を与えられた。エレクトロポレーション前、ES細胞を、PBSで二回洗浄し、トリプシンを付加することによってプレートから解離させた。37℃で20分間インキュベーション後、トリプシンを、同じ容量のM15培地を付加することによって不活化した。ES細胞を、繰り返しピペッティングすることによって単一細胞懸濁液に解離させた。ES細胞を、1,100rpmで4分間遠心分離することによってペレット化し、添付の指示マニュアル中に記載された方法によってエレクトロポレーション緩衝液(Lonza)に再懸濁した。
【０２７５】
エレクトロポレーションを、プリセットマウスES細胞プロトコールを使用し、Lonza Amaxa(商標)機器を使用して実施した。エレクトロポレーション後、各エレクトロポレーションからのES細胞を、新鮮なM15培地に再懸濁し、10cmフィーダープレートにプレーティングした。
【０２７６】
ES細胞を、エレクトロポレーション後3日間M15培地を与えた。各エレクトロポレーションからのES細胞を、1:3で3つの10cmフィーダープレートに継代した。継代の二日後、ES細胞を、ピューロマイシン(1μg/mL)を補充したM15培地中で培養した。エレクトロポレーション後七日、ピューロマイシン耐性コロニーは、ピッキングするのに十分な大きさであった。
【０２７７】
10cm STOフィーダープレート上のピューロマイシン耐性コロニーを、新鮮なM15培地を2時間与えた後にピッキングした。50μlのトリプシンを、96ウェル丸底プレートの各ウェルに付加した。10cm STOフィーダープレート上のコロニーを、PBS緩衝液で二回洗浄した。10mlのPBS緩衝液を、各10cmプレートに付加した。
【０２７８】
単一コロニーを、Gilsonピペットを使用してフィーダープレートからピッキングし、96ウェルプレートのトリプシンを有するウェルに移した(1コロニー/ウェル)。1つのプレートを完了後(96コロニーをピッキング)、トリプシンプレートを37℃で30分間インキュベートした。その後、150μlの新鮮なM15培地を、各ウェルに付加した。コロニーを、繰り返しピペッティングすることによって解離させた。単一細胞懸濁液を、96ウェルフィーダープレートに移し、TCインキュベーター中37℃で培養した。ES細胞は、それらが顕微鏡下で80%から85%集密に到達するまで新鮮なM15培地を与えられた。
【０２７９】
共通軽鎖マウスES細胞の継代
継代前二時間、ES細胞は新鮮なM15培地を与えられた。継代前、ES細胞を、PBS緩衝液で二回洗浄し、トリプシンを付加することによってプレートから解離させた。37℃で20分間インキュベーション後、トリプシンを、同じ容量のM15培地を付加することによって不活化した。ES細胞を、繰り返しピペッティングすることによって単一細胞  懸濁液に解離させた。
【０２８０】
単一ES細胞懸濁液を、1:4で4つの96ウェル  STOフィーダープレートに分けた。ES細胞は、それらが顕微鏡下で80%から85%集密に到達するまで新鮮なM15培地を与えられた。
【０２８１】
ES細胞の96ウェルプレートでの凍結
凍結前二時間、ES細胞は新鮮なM15培地を与えられた。凍結前、ES細胞を、PBS緩衝液で二回洗浄し、トリプシンを付加することによってプレートから解離させた。37℃で20分間インキュベーション後、トリプシンを、同じ容量の2X凍結培地(新たに調製した60%DMEM、20%FBS、20%DMSO)を付加することによって不活化した。ES細胞を、繰り返しピペッティングすることによって単一細胞懸濁液に解離させた。96ウェルプレートを、密封し、-80℃フリーザー内でポリスチレンボックスに配置して非常に緩徐な凍結プロセスを促進させた。
【０２８２】
ゲノムDNA抽出
ES細胞をPBS緩衝液で二回洗浄し、プロテイナーゼK(1mg/mL)を有する50μLのES細胞溶解緩衝液(10mM Tris-HCl、pH7.5、10mM EDTA、0.5%SDS、10mM NaCl)を96ウェルプレートの各ウェルに付加した。プレートを、密封し、ウェットティッシュで包み、ランチボックスに配置した。ランチボックスを一晩55℃でインキュベートした。
【０２８３】
第二日、100μLの氷冷エタノール/NaCl混合物(1.5mLの5M NaClを98.5mLの100%エタノールに付加)を、96ウェルプレートの各ウェルに付加した。プレートを約30分間室温にした。インキュベーション後、プレートを、3,000rpmで20分間遠心分離した。プレートを、反転して液体をデカントし、ペーパータオル上で乾燥して過剰な液体を除去した。プレートを、150μLの冷70%エタノールを付加することによって二回洗浄し、ペーパータオル上で完全に乾燥させた。DNAペレットを乾燥させた後、30μLのTE(pH8.0)緩衝液を付加し、DNAを55℃で30分間インキュベーションすることによって再懸濁させた。
【０２８４】
共通軽鎖マウスES細胞クローンの解凍及び増殖
凍結した96ウェルプレートを、-80℃フリーザーから取り出し、プレートのすべてのウェルが透明になるまで37℃インキュベーター中で解凍した。2mLの新鮮なM15培地を、24ウェルSTOフィーダープレートの各ウェルに付加した。96ウェルプレートの所望のウェルからの全ての内容物を、24ウェルプレートのウェルに移した。全ての標的化クローンを24ウェルプレートに移した後に、プレートをTCインキュベーター中37℃で培養した。ES細胞は、それらが顕微鏡下で80%から85%集密に到達するまで新鮮なM15培地を与えられた。それらがコンフルエントになったら、それらを1:1で6ウェルSTOフィーダープレートに継代し、マイクロインジェクションのために凍結した。
【０２８５】
共通軽鎖マウスES細胞クローンのマイクロインジェクション
マウスES細胞を、解凍し、インジェクション前に増殖させた。インジェクション前二時間、ES細胞は新鮮なM15培地を与えられた。インジェクション前、ES細胞を、PBS緩衝液で二回洗浄し、トリプシンを付加することによってプレートから解離させた。37℃で20分間インキュベーション後、トリプシンを、同じ容量の新鮮なM15培地を付加することによって不活化した。ES細胞を、繰り返しピペッティングすることによって単一細胞懸濁液に解離させ、インジェクションのために氷上に置いた。
【０２８６】
標的化ES細胞を、E3.5 Rag-/-胚盤胞にインジェクションした。インジェクション後、胚盤胞を、インジェクション前に3日間、精管切除した雄とつがいにしたCBA;C57BL6/J F1ハイブリッド雌の子宮に移した。キメラ胚を、偽妊娠レシピエントにおいて出産予定日まで発生させた。生じたマウスは、操作されたES細胞由来の細胞を含み、その細胞ゲノムには、1つのマウスカッパ遺伝子座(他のカッパ遺伝子座をJ領域中の欠失によって不活化した)にヒトラムダ軽鎖ノックイン及びホモ接合性のIgH遺伝子座によって含まれる再構成されていないヒト重鎖可変領域を含む。
【０２８７】
(実施例5)
Target Yに対する抗体の産生
免疫
共通軽鎖キメラマウスを、以下に記載の通りTarget Yで免疫した。第一の免疫として、CpG(Sigma)及びAlum(1:1抗原)によってエマルジョン化した、40μg/頭のTarget Yを、皮下に投与した。四週後、CpG(Sigma)及びAlum(1:1抗原)によってエマルジョン化した、5μg/頭のTarget Yを、腹腔内注射によって投与した(第一の追加免疫)。一週後、四匹のマウスを屠殺し、脾臓を摘出した。第一の追加免疫後四週、CpG(Sigma)及びAlum(1:1抗原)によってエマルジョン化した、2μg/頭のTarget Yを、別の四匹のマウスに腹腔内注射によって投与した(第二の追加免疫)。一週後、これらのマウスを屠殺し、脾臓を摘出した。
【０２８８】
抗原特異的なBセルソーティング
採取及び処理した脾臓組織を、20mLの3%FBS/PBS中に再懸濁した。細胞を、40℃で10秒間、300gでペレット化し、300μlの3%FBS/PBS緩衝液中に再懸濁した。
20ulのFcブロッカーを、10秒間付加し、使用前4℃で保管した。
【０２８９】
Alexa-647標識ヒト  Target Yストック溶液(0.8mg/mL)を、20μg/mLに希釈し、染色のために1:40希釈で使用した(最終濃度0.5μg/mL)。
【０２９０】
CD19-PB、IgM-APC-Cy7、IgD-APC-Cy7、CD38-FITC、CD95-PE、Hu-Target Y-Alexa647を含有する100μlの染色カクテルを、混合し、300μlの脾臓細胞懸濁液に付加した。4℃で20分間のインキュベーション後、5mlの3%FBS/PBS緩衝液を、サンプルに付加した。細胞を、10分間、300gでペレット化し、400μlの3%FBS/PBS緩衝液中に再懸濁し、30μm細胞ストレーナーを通して濾過した。ソーティング前五分、8μlの7AAD(1:100希釈)を付加した。ソーティングのためのゲーティング戦略は、以下に示される。
【０２９１】
B細胞スクリーニング(BCT)及び発現のためのカップリングした抗体重鎖及び軽鎖の回収
BCT技術は、本明細書中に参照によって組み込まれる、WO2015/040401に一般に記載される。
【０２９２】
RTに関して、0.1μLのIgG定常領域特異的プライマー(10μM)、0.1μLのIgK定常領域特異的プライマー(10μM)、0.05μLのIgL定常領域特異的プライマー(10μM)、1μLのdNTP混合物(10mM)、2μLの5X First-Strand Buffer、1μLの0.1M DTT、0.4μLのRNaseOUT(商標)RNase  阻害剤(Invitrogen)、0.25μLのSuperScript(商標)III RT(200単位/μl、Invitrogen)、及び1.1μLのRNase不含水を、各ウェルに付加して最終的な容量の10μLを作った。RT反応を実施して、第1鎖cDNAを生成した。
【０２９３】
第1ラウンドのPCRに関して、12.5μLの2X Q5マスター混合物、0.15μLのVH特異的プライマーの混合物(10μM)、0.1μLのVL特異的プライマーの混合物(10μM)、0.15μLのVK特異的プライマーの混合物(10μM)、0.1μLのIgG定常領域特異的プライマー(10μM)、0.1μLのIgK定常領域特異的プライマー(10μm)、0.1μLのIgL定常領域特異的プライマー(10μm)、及び1.8μLのRNase不含水の混合物を、各ウェル中の10μLのRT産物と混合して最終的な容量の25μLを作った。PCR反応を実施して重鎖及び軽鎖可変領域を増幅した。
【０２９４】
第2ラウンドのPCRに関して、12.5μLの2X Q5マスター混合物、0.2μLのVHネステッドPCRプライマー(10μM)、0.2μLのVKネステッドPCRプライマー(10μM)、0.2μLのVLネステッドPCRプライマー(10μM)、0.2μLのIgG定常領域ネステッドPCRプライマー(10μM)、0.2μLのIgK定常領域ネステッドPCRプライマー(10μM)、0.2μLのIgL定常領域ネステッドPCRプライマー(10μM)、及び10.3μLのRNase不含水の混合物を、各ウェル中の1μLの第1ラウンドのPCR産物と混合して最終的な容量の25μLを作った。PCR反応を実施して重鎖及び軽鎖可変領域を増幅した。
【０２９５】
ブリッジPCRに関して、15μLの2X Q5マスター混合物、0.1μLの重鎖ベクター(Heavy Vector)(100ng/μl)、0.05μLのカッパベクター(100ng/μl)、及び1μLのHLP479/480混合物(各10μM)、及び12.85μLのRNase不含水の混合物を、各ウェル中の1μLの第2ラウンドのPCR産物と混合して最終的な容量の25μLを作った。PCR反応を実施して重鎖及び軽鎖可変領域を増幅した。
【０２９６】
Expi293F細胞トランスフェクション
抗体発現及び精製のより詳細については実施例6及び7を参照されたい。
【０２９７】
トランスフェクション前一日、培養したExpi293F細胞(Invitrogen)を、細胞播種計算のために計数した。Expi293F細胞を、300rpmで10分間ペレット化した。細胞を、予め温めた新鮮なExpi293発現培地中に再懸濁して、2.5x106細胞/mlの最終的な希釈物を得た。200mlの細胞懸濁液を、次の朝までKuhner振盪培養器(37℃、140rpm、8%CO2)中でインキュベートした。
【０２９８】
トランスフェクションの日に、培養したExpi293F細胞を、計数し、新鮮なExpi293発現培地を使用して4X106細胞/mlに希釈した。500μlの細胞懸濁液を、Multidrop Combiを使用して96ウェルのディープウェルプレートの各ウェルに分注した。分配後、プレートを、Duetzサンドイッチカバーで覆い、Kuhner振盪培養器(37℃、300rpm、50mmオービタルスロー(orbital throw)、湿度80%)中で2-2.5時間インキュベートした。
【０２９９】
各トランスフェクションに関して、2つの混合物を調製した。
混合物1: 1ウェル当たり25μlのB細胞ブリッジ産物+55μlのRSM+100ngのPBase
混合物2: 1μlのExpiFectamine(商標)293(Invitrogen)+79μlのRSM
【０３００】
混合物2を、混合物1に付加し、室温で15分間インキュベートした。インキュベートした混合物を、次に500μlの細胞培養液に付加し、Kuhner振盪培養器(37℃、300rpm、50mmオービタルスロー)中で一週間インキュベートした。
【０３０１】
(実施例6)
抗体の発現
哺乳動物の一過性発現システムにより、タンパク質の可動性及び急速な産生を可能にする。それらは、ヒト又は他の哺乳動物タンパク質の発現について理想的であり、その理由は、これらのシステムが、よりネイティブなフォールディング及び翻訳後修飾を有する組換えタンパク質を生成するからである。
1.  トランスフェクションの前日、Expi293細胞を、自動細胞カウンター(Eve細胞カウンター)で計数し、約1.7x106細胞/mlの密度で予め温めた発現培地に播種し、回転振盪機インキュベーター(37℃、8%CO2、140rpm)中で一晩インキュベートした。
2.  トランスフェクションの日、細胞を計数し、細胞数を2.5x106細胞/mlに調整した。2000μlの細胞懸濁液を、24ディープウェルプレートに分配し、Kuhner振盪培養器(37℃、8%CO2、225rpm)に配置した。
【０３０２】
DNA溶液の調製
プラスミドDNAを含有する混合溶液を、Expi293細胞のトランスフェクションのために調製した。2mLの細胞培養に関して、各1μgの重鎖発現プラスミド及び軽鎖発現プラスミドを使用した。超純水中に希釈された2μgのDNAプラスミド混合物を、各トランスフェクションについて使用した。
トランスフェクション
混合物1: 40μlのOpti-MEM(登録商標)I培地中に希釈した2μgのプラスミドDNA。
混合物2: 80μlのExpiFectamine(商標)293トランスフェクション試薬+40μlのOptiMEM I培地の2つの混合物を調製した。
混合物2を、混合物1と組み合わせ、室温で20-30分間インキュベートした。インキュベーションが完了した後、165μlのDNA-ExpiFectamine(商標)293試薬複合体を、24ディープウェルプレートの各ウェルに分配した。細胞を、Kuhner振盪培養器(37℃、8%CO2、225rpm)において6日間インキュベートした。細胞培養上清を、トランスフェクション後6日で採取した。
【０３０３】
(実施例7)
共通軽鎖マウスからの抗体の精製
96ウェルプレート精製を採用して、Expi293F細胞培養上清から抗体を精製した。この方法により、抗体スクリーニング実験における複数サンプルの急速なスモールスケールの親和性抗体精製が可能になる。高い回収%を達成するために、MabSelect Sure LX(商標)が使用される、これはプロテインA親和物であり、非常に動的な結合活性(60mgのヒトIgG/ml培地)、長時間の滞留時間、アルカリ寛容性及び低いリガンド漏出性を有する。
【０３０４】
手順
1.  MabSelect Sure LX樹脂(GE Healthcare)を、1X PBS(Gibco)中に平衡化して、貯蔵緩衝液を除去して、10%スラリーの最終濃度とした。
2.  600μlの10%スラリーが、96ウェルプレート  AcroPrep(商標)Advance(Pall)の各ウェルに付加される。
3.  樹脂を、70x rcfで1分、4℃で遠心分離した。
4.  樹脂を、300μlの1X PBSで洗浄し、70x rcfで1分スピンした。この工程を、二回反復した。
5.  2mlの細胞培養上清(pH7-8)を、96ウェル精製プレート中のMabSelect Sure LX樹脂にローディングし、70-100x rcfで1分間遠心分離した。
6.  プレートを、600μlの1x PBSを使用して洗浄し、70-100x rcfで1分間遠心分離した。この工程は、全体で四回実施された。
7.  70μlの溶出緩衝液(IgG Elute Pierce)を、各ウェルに付加し、1分インキュベートした。
8.  プレートを、70-100x rcfで1分間遠心分離して溶出液を採取した。この工程は、全体で二回実施された。
【０３０５】
(実施例8)
抗原Yに対する抗体のSPR分析
実験の目的
SPR分析を実施して、Target Yに対するHit 1(すなわち、本発明者らの共通軽鎖マウスからのラムダタイプ抗体)の相互作用の結合親和性及び動力学を決定した。精製された抗体の親和性及び動力学を、ベンチマーク及びアイソタイプ対照(ISTC)と比較した。
【０３０６】
方法
表面プラズモン共鳴(SPR)を使用して抗原Yに対する結合親和性(KD)を決定した(動力学定数  オン率(kon)及びオフ率(koff))。Biacore 8K(GE Healthcare)システムを使用して分析を実施した。
【０３０７】
抗ヒトIgG Fc抗体を、製造者の指示に従いCM4チップ(GE Healthcareカタログ番号BR100534)に固定化した。アミンカップリングキット(BioRad)を使用してチップの表面を活性化した。引き続いて、表面を、1Mエタノールアミンでブロックした。固定化の実施を、固定化ランニング緩衝液としてHBS-EPを使用して25℃で実施した。
実施例7からの精製された単一特異性抗体(リガンドと呼ばれる)を、およそ2ug/mlで抗ヒトIgG Fc CM4表面に捕捉した。リガンドを、全8フローチャネルの全てのアクティブチャネル中に10ul/分で60秒間インジェクションした。この実施を、ランニング緩衝液として中性pHのHBS-P 1X+CaCl2 2.5mMを使用して25℃で実施した。
【０３０８】
ヒト抗原Yを、ランニング緩衝液中で1mg/mlに再構成し、分析物として使用した。抗原Yを、マルチプルサイクルキネティックス(MCK)モードで3つの濃度(1.5uM、500nM及び166.7nM)でインジェクションし、120秒間の会合フェーズ及び200秒間の解離フェーズ、流速30ul/秒で、アクティブ及び参照チャネルの両方で行った。10mMグリシンpH1.5の三回のインジェクションを60秒、再生フェーズについては10μl/分を使用した。
【０３０９】
アイソタイプ対照抗体hIgG4PE KYAB2229(ISTC;これは、抗原Yを特異的に結合しない)を、1ug/ml、60秒、10μl/分での参照チャネル中で捕捉した。アイソタイプ対照抗体hIgG4PEはまた、陰性対照としてアクティブチャネル中に捕捉された。抗原Yに対する2つの抗体を、ベンチマーク(ベンチマーク1及びベンチマーク2)として使用した。データは、参照及び緩衝液を引いて、ラングミュア1:1モデルにフィッティングさせた。第一の30秒間の解離を、モデルにおいて評価した。
【０３１０】
【表２】
2020530760.tif 000003
【０３１１】
相互作用の会合及び解離データを、生体分子反応モデル(1:1ラングミュアモデル)を使用してフィッティングした。会合速度定数(kon)、解離速度定数(koff)及び解離定数(KD)についての値を、BIAevaluationソフトウェアによって結合データから計算した。
ベンチマーク1:抗体  抗抗原Y
ベンチマーク2:抗体  抗抗原Y
NB:結合観察されず
hIgG4PE ISTC:ヒトアイソタイプ対照IgG4
Hit 1抗体は、IgG4PE形式であった。
【０３１２】
結論
Hit 1は、表2に提供される親和性レンジ中で抗原Yに対する結合及び抗原Yに対する速い会合(kon)及び解離(koff)率を示した。抗原Yに対する結合は、ISTCで観察されなかった。
Hit 1抗体は、ベンチマーク抗体と比べて抗原Yに対して類似する動力学速度及び結合親和性を示す。これにより、本発明者らの共通軽鎖マウスが、望ましい結合動力学で標的抗原に特異的に結合するヒト可変ドメインを有する抗体を生成することができることが示される。
【０３１３】
(実施例9)
共通軽鎖マウスからのB細胞集団の分析
本発明者らは、本発明のマウスのB細胞コンパートメントを分析した。結果は、以下の通り図5から図9に示される。「標的化Rag-/-」マウスは、操作されたES細胞に由来する、実施例4に記載された通り産生されたマウスである。したがって、マウスのゲノムは、再構成されたヒトラムダ軽鎖ノックイン及びIgH遺伝子座によって含まれる再構成されていないヒト重鎖可変領域を含んでいた。
【０３１４】
図5
標的化ES細胞(標的化Rag-/-)でマイクロインジェクションされたRag-/-胚盤胞から生成されたキメラマウスは、野生型マウス(野生型)と比較して、類似する全生存脾臓細胞数を有していた。未開示抗原(Target Y)での免疫化(初回抗原刺激、続いて二回の抗原追加免疫)後の全生存脾臓細胞数。対照として、未免疫Rag-/-欠損マウスは、低い全生存脾臓細胞数を提示した。標的化Rag-/-、標的化ES細胞及びRag-/-欠損胚盤胞に由来するキメラマウス;野生型、野生型マウス;Rag-/-ナイーブ、未免疫Rag-/-欠損マウス。
【０３１５】
図6
標的化ES細胞(標的化Rag-/-)でマイクロインジェクションされたRag-/-胚盤胞から生成されたキメラマウスは、野生型マウス(野生型)と比較して、類似するCD19陽性、B220陽性B細胞数を有していた。未開示抗原(Target Y)での免疫化(初回抗原刺激、続いて二回の抗原追加免疫)後の全脾臓B細胞数。対照として、未免疫Rag-/-欠損マウス(Rag-/-ナイーブ)は、最小の全B細胞(CD19+/B220+)数を提示した。標的化Rag-/-、標的化ES細胞及びRag-/-欠損胚盤胞に由来するキメラマウス;野生型、野生型マウス;Rag-/-ナイーブ、未免疫Rag-/-欠損マウス。
【０３１６】
図7
標的化ES細胞(標的化Rag-/-)でマイクロインジェクションされたRag-/-胚盤胞から生成されたキメラマウス中のCD19陽性、B220陽性の脾臓B細胞集団パーセンテージは、野生型マウス(野生型)と類似していた。未開示抗原(Target Y)での免疫化(初回抗原刺激、続いて二回の抗原追加免疫)後のCD19陽性、B220陽性脾臓B細胞集団パーセンテージ。対照として、未免疫Rag-/-欠損マウス(Rag-/-ナイーブ)は、最小のCD19陽性、B220陽性脾臓B細胞集団パーセンテージを提示した。標的化Rag-/-、標的化ES細胞及びRag-/-欠損胚盤胞に由来するキメラマウス;野生型、野生型マウス;Rag-/-ナイーブ、未免疫Rag-/-欠損マウス。
【０３１７】
図8
標的化ES細胞(標的化Rag-/-)でマイクロインジェクションされたRag-/-胚盤胞から生成されたキメラマウス中のCD19陽性、B220陽性の脾臓B細胞集団パーセンテージは、野生型マウス(野生型)と類似していた。未開示抗原(Target Y)での免疫化(初回抗原刺激、続いて一回又は二回いずれかの抗原追加免疫)後のCD19陽性、B220陽性脾臓B細胞集団パーセンテージ。対照として、未免疫Rag-/-欠損マウス(Rag-/-ナイーブ)は、最小のCD19陽性、B220陽性脾臓B細胞集団パーセンテージを提示した。標的化Rag-/-、標的化操作ES細胞及びRag-/-欠損胚盤胞に由来するキメラマウス;野生型、野生型マウス;Rag-/-ナイーブ、未免疫Rag-/-欠損マウス。
【０３１８】
図9
標的化ES細胞(標的化Rag-/-)でマイクロインジェクションされたRag-/-胚盤胞から生成されたキメラマウス中の抗原陽性IgG B細胞集団パーセンテージは、野生型マウス(野生型)と類似していた。未開示抗原(Target Y)での免疫化(初回抗原刺激、続いて一回又は二回いずれかの抗原追加免疫)後の抗原陽性、CD19陽性又はB220陽性、IgM陰性及びIgD陰性脾臓B細胞集団パーセンテージ。標的化Rag-/-、標的化操作ES細胞及びRag-/-欠損マウスに由来するキメラマウス;野生型、野生型マウス。
【０３１９】
結論
Rag-/-欠損胚盤胞にマイクロインジェクションされた操作されたES細胞に由来する「標的化Rag-/-」キメラマウスは、野生型マウスと類似する様式で、初回抗原刺激及び一回又は二回いずれかの抗原追加免疫後にIgM陰性、IgD陰性、抗原陽性脾臓B細胞を産生した。比較して、非キメラRag-/-欠損マウスは、脾臓B細胞を産生しなかった。これらの観察は、Rag-/-胚盤胞にマイクロインジェクションされた操作されたES細胞から生成されたマウスが、機能的な免疫応答を有し、免疫化計画に応答して、抗原陽性IgG B細胞を生成するとの本発明者らの観察を支持している。
【０３２０】
有用なことに、共通軽鎖のそれぞれのコピーは、Target Yに結合する抗体(本発明の免疫された共通軽鎖マウスから単離された)からの重鎖のコピー及びTarget Zに結合する抗体からの重鎖のコピーと対合してY及びZに特異的に結合する二重特異性4鎖抗体を産生することができる。これを、(i)軽鎖をコードする発現可能なヌクレオチド配列;(ii)Target Yに特異的に結合する重鎖をコードする発現可能なヌクレオチド配列;及び(iii)Target Zに特異的に結合する重鎖をコードする発現可能なヌクレオチド配列を含む細胞(例えば、真核生物、哺乳動物、ヒト、CHO、Cos又はHEK293細胞)から発現させることができる。或いは、細胞が(i)及び(ii)を含み、第二の細胞が(iii)を含み、細胞の重鎖及び軽鎖発現産物が混合されて二重特異性抗を産生することができる。或いは、細胞が(i)及び(iii)を含み、第二の細胞が(ii)を含み、細胞の重鎖及び軽鎖発現産物が混合されて二重特異性抗を産生することができる。或いは、細胞が(ii)及び(iii)を含み、第二の細胞が(i)を含み、細胞の重鎖及び軽鎖発現産物が混合されて二重特異性抗を産生することができる。或いは、(i)、(ii)及び(iii)が、別々に、それぞれの細胞によって含まれ、細胞の抗体鎖発現産物が混合されて二重特異性抗が産生される。一例では、重鎖定常領域は、抗Target Y重鎖と抗Target Z重鎖の対合を促進する、モチーフ又は変異(例えば、荷電対合又はノブ-イン-ホールモチーフ、上記参照を参照されたい)を含む。
【０３２１】
方法:
イントロダクション
抗原Yでの免疫化後、前記抗原に特異的なクラススイッチした抗体を発現する脾臓B細胞を、処理し、単一細胞をソーティングした。標的化Rag-/-キメラマウスを、機能的な免疫システムの証拠について分析し、野生型対照マウスと比較した。また追加の比較を非キメラRag-/-マウスに対して行い、最小のベースライン免疫応答が実証された。
【０３２２】
材料:
【０３２３】
【表３】
2020530760.tif 000004
【０３２４】
方法:
サンプルの処理:
免疫化マウスから脾臓を、除去し、無菌的な手順を使用する40μm細胞ストレーナーを使用して均質化した。細胞を遠心分離(350rcfで10分間、4℃)によってペレット化し、上清を慎重に吸引した。赤血球を1mlのACK溶解緩衝液を使用する溶解によって除去し、2分間、室温でインキュベートした。溶解反応を、過剰の3%FBS/RPMI緩衝液を付加することによって終了させた。引き続いて、細胞を、40μm細胞ストレーナーを使用して濾過し、以前の通りペレット化し、340μl緩衝液に再懸濁した。処理した細胞において発現された任意のFc受容体を、ブロックし、B細胞の非特異的な染色を除去し、Fcブロッカーを使用して抗体媒介性の特異的な染色を維持した。この段階で、全細胞数を取得した。
【０３２５】
染色:
脾臓から調製した単一細胞懸濁液を、以下の様式で染色した。成熟し、クラススイッチしたB細胞脾臓集団を、BUV395-コンジュゲート抗CD45R(選択)、BUV395-コンジュゲート抗CD19(選択)、BV786-コンジュゲート抗IgM(枯渇)及びBV605-コンジュゲート抗IgD(枯渇)を使用して規定した。B細胞以外の細胞、例えば、好中球及び単球、CD8陽性T細胞、マクロファージ、CD4陽性T細胞及び樹状細胞を、それぞれ、APCCy7-コンジュゲート抗Ly-6G/C、APC-H7-コンジュゲート抗CD8a、APCCy7-コンジュゲート抗F4/80、APC-H7-コンジュゲート抗CD4及びAPC-Cy7-コンジュゲート抗CD11cを使用して除外した。抗原陽性集団を、Alexa-647で標識された免疫化に使用された同じ抗原を使用して同定した。生存可能ではない細胞を、7-AADを使用して除外した。細胞の抗原-未標識対照プールを生じさせて、FMO(Fluorescence Minus One)が誘導されることを可能にした。追加の陽性染色対照及び7AAD(生/死)対照も取った。全ての染色反応を、3%FBSを有する100μlのPBS中の1×106細胞を使用して4℃で20分インキュベートした。サンプルを、3%FBSを有する400μlのPBS中で二回洗浄し、BD FACSAria Fusionフローサイトメーター(BD Biosciences)で分析した。全ての獲得されたデータを、Flow-Jo(商標)ソフトウェアを使用して分析した。所望の細胞は、RNA溶解緩衝液を含有する96ウェルプレートに直接的にソーティングされた単一細胞であった。次に、サンプルを、B-Cell Technology(BCT)を使用して処理した。
【図１】
2020530760.tif 000005
【図２】
2020530760.tif 000006
【図３】
2020530760.tif 000007
【図４】
2020530760.tif 000008
【図５】
2020530760.tif 000009
【図６】
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【図７】
2020530760.tif 000011
【図８】
2020530760.tif 000012
【図９】
2020530760.tif 000013
【配列表】
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【国際調査報告】
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2020530760.tif 000015
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