(57)【要約】本開示は、ＣＲＩＳＰＲに使用するための改変オリゴヌクレオチドを含有する化合物を提供する。ある特定の実施形態において、そのような改変オリゴヌクレオチドによりｃｒＲＮＡの特性は改善する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
３５〜４５の連結ヌクレオシドからなる修飾ｃｒＲＮＡを含む化合物。
【請求項２】
修飾ｃｒＲＮＡを含む化合物であって、前記修飾ｃｒＲＮＡのＣＲＩＳＰＲ認識部分が１７〜２０の連結ヌクレオシドからなる、前記化合物。
【請求項３】
修飾ｃｒＲＮＡを含む化合物であって、前記修飾ｃｒＲＮＡの標的認識部分が１８〜２３の連結ヌクレオシドからなる、前記化合物。
【請求項４】
修飾ｃｒＲＮＡを含む化合物であって、前記修飾ｃｒＲＮＡが少なくとも１個のリンカーヌクレオシドを含む、前記化合物。
【請求項５】
５’−安定化修飾ｃｒＲＮＡを含む化合物。
【請求項６】
前記化合物が安定化コンジュゲート基を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の化合物。
【請求項７】
前記ｃｒＲＮＡが安定化修飾を含有する少なくとも１個のリンカーヌクレオシドを含む、請求項１〜５のいずれかに記載の化合物。
【請求項８】
前記修飾ｃｒＲＮＡが５’−安定化である、請求項１〜４のいずれかに記載の化合物。
【請求項９】
前記修飾ｃｒＲＮＡが３’−安定化である、請求項１〜８のいずれかに記載の化合物。
【請求項１０】
前記修飾ｃｒＲＮＡの前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分がＣｐｆ１ヌクレアーゼに結合する、請求項１〜９のいずれかに記載の化合物。
【請求項１１】
前記修飾ｃｒＲＮＡの前記標的認識部分が、標的のＤＮＡまたはＲＮＡに対する前記ｃｒＲＮＡの親和性を増加させる少なくとも１つの修飾を含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の化合物。
【請求項１２】
前記修飾ｃｒＲＮＡの前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分が、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼに対する前記ｃｒＲＮＡの親和性を増加させる少なくとも１つの修飾を含む、請求項１０〜１１のいずれかに記載の化合物。
【請求項１３】
前記修飾ｃｒＲＮＡの少なくとも１つの核酸塩基がチミンである、請求項１〜１２のいずれかに記載の化合物。
【請求項１４】
前記修飾ｃｒＲＮＡの少なくとも１つの核酸塩基が修飾核酸塩基である、請求項１〜１３のいずれかに記載の化合物。
【請求項１５】
前記修飾核酸塩基が５−メチルシトシンである、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１６】
前記修飾ｃｒＲＮＡが３５〜４２個の連結ヌクレオシドから成る、請求項１〜１５のいずれかに記載の化合物。
【請求項１７】
前記修飾ｃｒＲＮＡが３６〜４０個の連結ヌクレオシドから成る、請求項１〜１５のいずれかに記載の化合物。
【請求項１８】
前記修飾ｃｒＲＮＡが少なくとも２個のリンカーヌクレオシドを含む、請求項１〜１７のいずれかに記載の化合物。
【請求項１９】
少なくとも２個のリンカーヌクレオシドが前記修飾ｃｒＲＮＡ．の前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分に連結される、請求項１８に記載の化合物。
【請求項２０】
少なくとも２個のリンカーヌクレオシドが前記修飾ｃｒＲＮＡの前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の５’末端に連結される、請求項１９に記載の化合物。
【請求項２１】
前記修飾ｃｒＲＮＡの前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分が１８〜２０個の連結ヌクレオシドから成る、請求項１〜２０のいずれかに記載の化合物。
【請求項２２】
前記修飾ｃｒＲＮＡの前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分が１８個の連結ヌクレオシドから成る、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２３】
前記修飾ｃｒＲＮＡの前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分が１９個の連結ヌクレオシドから成る、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２４】
前記修飾ｃｒＲＮＡの前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分が２０個の連結ヌクレオシドから成る、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２５】
前記修飾ｃｒＲＮＡの前記標的認識部分が１８〜２２個の連結ヌクレオシドから成る、請求項１〜２４のいずれかに記載の化合物。
【請求項２６】
前記修飾ｃｒＲＮＡの前記標的認識部分が１８〜２０個の連結ヌクレオシドから成る、請求項１〜２４のいずれかに記載の化合物。
【請求項２７】
前記修飾ｃｒＲＮＡの前記標的認識部分が１８個の連結ヌクレオシドから成る、請求項２６に記載の化合物。
【請求項２８】
前記修飾ｃｒＲＮＡの前記標的認識部分が１９個の連結ヌクレオシドから成る、請求項２６に記載の化合物。
【請求項２９】
前記修飾ｃｒＲＮＡの前記標的認識部分が２０個の連結ヌクレオシドから成る、請求項２６に記載の化合物。
【請求項３０】
前記修飾ｃｒＲＮＡの少なくとも１つのヌクレオシド間結合が、修飾ヌクレオシド間結合である、請求項１〜２９のいずれかに記載の化合物。
【請求項３１】
少なくとも１つのヌクレオシド間結合がホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、請求項３０に記載の化合物。
【請求項３２】
前記修飾ｃｒＲＮＡの各ヌクレオシド間結合が修飾ヌクレオシド間結合である、請求項３０または３１に記載の化合物。
【請求項３３】
少なくとも１つのヌクレオシド間結合が、中性のヌクレオシド間結合である、請求項３０〜３２のいずれかに記載の化合物。
【請求項３４】
少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合がメトキシプロピル基を含む、請求項３３に記載の化合物。
【請求項３５】
少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合がホスホノ酢酸を含む、請求項３３に記載の化合物。
【請求項３６】
少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合がメチルホスホン酸を含む、請求項３３に記載の化合物。
【請求項３７】
前記修飾ｃｒＲＮＡの各ヌクレオシド間結合がホスホジエステルヌクレオシド間結合またはホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、請求項１〜３１のいずれかに記載の化合物。
【請求項３８】
前記修飾ｃｒＲＮＡの少なくとも２つのヌクレオシド間結合が修飾ヌクレオシド間結合である、請求項３０、３１、または３３〜３７のいずれかに記載の化合物。
【請求項３９】
前記修飾ｃｒＲＮＡの少なくとも２つの修飾ヌクレオシド間結合が互いに同じである、請求項３８に記載の化合物。
【請求項４０】
前記修飾ｃｒＲＮＡが、前記修飾ｃｒＲＮＡの５’末端に１〜５個の連続的なホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む、請求項１〜３９のいずれかに記載の化合物。
【請求項４１】
前記修飾ｃｒＲＮＡが、前記修飾ｃｒＲＮＡの５’末端に１つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む、請求項４０に記載の化合物。
【請求項４２】
前記修飾ｃｒＲＮＡが前記修飾ｃｒＲＮＡの５’末端に２つの連続的なホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む、請求項４０に記載の化合物。
【請求項４３】
前記修飾ｃｒＲＮＡが、修飾ヌクレオシド間結合によって前記修飾ｃｒＲＮＡの前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分に連結される、少なくとも１個のリンカーヌクレオシドを含む、請求項１〜４２のいずれかに記載の化合物。
【請求項４４】
前記修飾ｃｒＲＮＡの前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分に、少なくとも１個のリンカーヌクレオシド  で連結する前記修飾ヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、請求項４３に記載の化合物。
【請求項４５】
前記修飾ｃｒＲＮＡが２つのリンカーヌクレオシドを含む、請求項４４に記載の化合物。
【請求項４６】
前記リンカーヌクレオシドが、修飾ヌクレオシド間結合によって互いに連結される、請求項４５に記載の化合物。
【請求項４７】
互いに前記リンカーヌクレオシドを連結する前記修飾ヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、請求項４６に記載の化合物。
【請求項４８】
前記修飾ｃｒＲＮＡが２つを超えるリンカーヌクレオシドを含む、請求項４３〜４４のいずれかに記載の化合物。
【請求項４９】
前記修飾ｃｒＲＮＡが前記修飾ｃｒＲＮＡの前記標的認識部分内に１〜６個の修飾ヌクレオシド間結合を含む、請求項１〜４８のいずれかに記載の化合物。
【請求項５０】
前記修飾ｃｒＲＮＡの前記標的認識部分内の前記１〜６個の修飾ヌクレオシド間結合が連続的である、請求項４９に記載の化合物。
【請求項５１】
前記修飾ｃｒＲＮＡの前記標的認識部分内の前記１〜６個の修飾ヌクレオシド間結合が、未修飾のヌクレオシド間結合と交互に生じる、請求項４９に記載の化合物。
【請求項５２】
前記修飾ｃｒＲＮＡの前記標的認識部分の３’末端が前記１〜６個の修飾ヌクレオシド間結合を含む、請求項４９〜５１のいずれかに記載の化合物。
【請求項５３】
前記修飾ｃｒＲＮＡの前記標的認識部分が１つの修飾ヌクレオシド間結合を含む、請求項５０〜５２のいずれかに記載の化合物。
【請求項５４】
前記修飾ｃｒＲＮＡの前記標的認識部分が２つの修飾ヌクレオシド間結合を含む、請求項５０〜５２のいずれかに記載の化合物。
【請求項５５】
前記修飾ｃｒＲＮＡの前記標的認識部分が３つの修飾ヌクレオシド間結合を含む、請求項５０〜５２のいずれかに記載の化合物。
【請求項５６】
前記修飾ｃｒＲＮＡの前記標的認識部分が４つの修飾ヌクレオシド間結合を含む、請求項５０〜５２のいずれかに記載の化合物。
【請求項５７】
前記修飾ｃｒＲＮＡの前記標的認識部分が５つの修飾ヌクレオシド間結合を含む、請求項５０〜５２のいずれかに記載の化合物。
【請求項５８】
前記修飾ｃｒＲＮＡの前記標的認識部分が６つの修飾ヌクレオシド間結合を含む、請求項５０〜５２のいずれかに記載の化合物。
【請求項５９】
前記修飾ｃｒＲＮＡの前記標的認識部分内の少なくとも１つのヌクレオシド間結合がホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、請求項４９〜５８のいずれかに記載の化合物。
【請求項６０】
前記修飾ｃｒＲＮＡの前記標的認識部分内のすべての前記修飾ヌクレオシド間結合がホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、請求項４９〜５８のいずれかに記載の化合物。
【請求項６１】
前記修飾ｃｒＲＮＡの前記標的認識部分が、前記修飾ｃｒＲＮＡの前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の３’末端に直接的または間接的に連結される、請求項１〜６０のいずれかに記載の化合物。
【請求項６２】
前記修飾ｃｒＲＮＡの少なくとも１つのヌクレオシドが修飾糖部分を含む、請求項１〜６１のいずれかに記載の化合物。
【請求項６３】
前記ｃｒＲＮＡの５’末端ヌクレオシドが修飾糖部分を含む、請求項６２に記載の化合物。
【請求項６４】
前記５’末端ヌクレオシドが直線状の修飾糖部分を含む、請求項６３に記載の化合物。
【請求項６５】
前記５’末端のヌクレオシドが２’−修飾糖部分を含む、請求項６４に記載の化合物。
【請求項６６】
前記５’末端ヌクレオシドが二環糖部分を含む、請求項６３に記載の化合物。
【請求項６７】
前記５’末端ヌクレオシドが２’−Ｏ−メチル、２’−ＭＯＥ、２’−Ｆ、ｃＥｔ、及びＬＮＡの中から選択される修飾糖部分を含む、請求項６３に記載の化合物。
【請求項６８】
前記５’末端ヌクレオシドがリンカーヌクレオシドである、請求項１〜６７のいずれかに記載の化合物。
【請求項６９】
前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の５’末端から５番目のヌクレオシドが修飾糖部分を含む、請求項６２〜６８のいずれかに記載の化合物。
【請求項７０】
前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の５’末端から６番目のヌクレオシドが修飾糖部分を含む、請求項６２〜６９のいずれかに記載の化合物。
【請求項７１】
前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の５’末端から７番目のヌクレオシドが修飾糖部分を含む、請求項６２〜７０のいずれかに記載の化合物。
【請求項７２】
前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の５’末端から１０番目のヌクレオシドが修飾糖部分を含む、請求項６２〜７１のいずれかに記載の化合物。
【請求項７３】
前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の５’末端から１４番目のヌクレオシドが修飾糖部分を含む、請求項６２〜７２のいずれかに記載の化合物。
【請求項７４】
前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の３’末端から１番目のヌクレオシドが修飾糖部分を含む、請求項６２〜７３のいずれかに記載の化合物。
【請求項７５】
少なくとも１つの修飾糖部分が２’−Ｏ−メチル、２’−ＭＯＥ、２’−Ｆ、ｃＥｔ、及びＬＮＡの中から選択される、請求項６９〜７４のいずれかに記載の化合物。
【請求項７６】
各修飾糖部分が２’−Ｏ−メチル、２’−ＭＯＥ、２’−Ｆ、ｃＥｔ、及びＬＮＡの中から独立して選択される、請求項６９〜７４のいずれかに記載の化合物。
【請求項７７】
前記修飾ｃｒＲＮＡの３’末端ヌクレオシドが修飾糖部分を含む、請求項６２に記載の化合物。
【請求項７８】
前記３’末端ヌクレオシドが直鎖状の修飾糖部分を含む、請求項７７に記載の化合物。
【請求項７９】
前記３’末端のヌクレオシドが２’−修飾糖部分を含む、請求項７８に記載の化合物。
【請求項８０】
前記３’末端ヌクレオシドが二環糖部分を含む、請求項７７に記載の化合物。
【請求項８１】
前記３’末端ヌクレオシドが２’−Ｏ−メチル、２’−ＭＯＥ、２’−Ｆ、ｃＥｔ、及びＬＮＡの中から選択される修飾糖部分を含む、請求項７７に記載の化合物。
【請求項８２】
前記標的認識部分の５’末端から１番目のヌクレオシドが修飾糖部分を含む、請求項６２〜８１のいずれかに記載の化合物。
【請求項８３】
前記標的認識部分の５’末端から８番目のヌクレオシドが修飾糖部分を含む、請求項６２〜８２のいずれかに記載の化合物。
【請求項８４】
前記標的認識部分の５’末端から９番目のヌクレオシドが修飾糖部分を含む、請求項６２〜８３のいずれかに記載の化合物。
【請求項８５】
前記修飾ｃｒＲＮＡの前記標的認識部分の１〜５個の３’末端ヌクレオシドがそれぞれ修飾糖部分を含む、請求項６２〜８４のいずれかに記載の化合物。
【請求項８６】
前記修飾ｃｒＲＮＡの前記標的認識部分の１〜５個の３’末端ヌクレオシドがそれぞれ同一の修飾糖部分を含む、請求項８５に記載の化合物。
【請求項８７】
前記標的認識部分の１〜５個の３’末端ヌクレオシドの前記修飾糖部分が、２’−Ｏ−メチル、２’−ＭＯＥ、２’−Ｆ、ｃＥｔ、及びＬＮＡの中からそれぞれ独立して選択される、請求項８４または８５に記載の化合物。
【請求項８８】
前記修飾ｃｒＲＮＡの前記標的認識部分が少なくとも１つの未修飾糖部分を含む、請求項１〜８７のいずれかに記載の化合物。
【請求項８９】
前記修飾ｃｒＲＮＡの前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分が少なくとも１つの未修飾糖部分を含む、請求項１〜８８のいずれかに記載の化合物。
【請求項９０】
前記修飾ｃｒＲＮＡが未修飾糖部分を含む少なくとも１つのリンカーヌクレオシドを含む、請求項１〜８９のいずれかに記載の化合物。
【請求項９１】
前記化合物が前記修飾ｃｒＲＮＡから成る、請求項１〜９０のいずれかに記載の化合物。
【請求項９２】
前記修飾ｃｒＲＮＡの前記標的認識部分の核酸塩基配列が、少なくとも標的のＤＮＡまたはＲＮＡに対して少なくとも９０％相補的である、請求項１〜９１のいずれかに記載の化合物。
【請求項９３】
前記修飾ｃｒＲＮＡの前記標的認識部分の前記核酸塩基配列が、標的のＤＮＡまたはＲＮＡに対して１００％相補的である、請求項９２に記載の化合物。
【請求項９４】
前記修飾ｃｒＲＮＡが自己相補的な領域を含む、請求項１〜９３のいずれかに記載の化合物。
【請求項９５】
前記自己相補的な領域が、前記修飾ｃｒＲＮＡの前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分内にある、請求項９４に記載の化合物。
【請求項９６】
前記自己相補的な領域がヘアピンを形成することができる、請求項９４または９５に記載の化合物。
【請求項９７】
前記自己相補的な領域が、前記自己相補的な領域の安定性を増加させる少なくとも１つの修飾を含む、請求項９４〜９６のいずれかに記載の化合物。
【請求項９８】
前記自己相補的な領域が、前記自己相補的な領域のハイブリダイゼーション親和性を増加させる少なくとも１つの修飾を含む、請求項９４〜９７のいずれかに記載の化合物。
【請求項９９】
前記修飾ｃｒＲＮＡの前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の前記核酸塩基配列が、表Ａから選択される配列の少なくとも１２個の連続的な核酸塩基を含む、請求項１〜９８のいずれかに記載の化合物。
【請求項１００】
前記修飾ｃｒＲＮＡの前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の前記核酸塩基配列が、表Ａから選択される配列または配列の部分から成る、請求項１〜９８のいずれかに記載の化合物。
【請求項１０１】
前記修飾ｃｒＲＮＡの前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の前記核酸塩基配列が、配列ＸＣＸＡＣＸを含み、ここで各Ｘは独立してＵ核酸塩基またはＴ核酸塩基である、請求項１〜１００のいずれかに記載の化合物。
【請求項１０２】
前記修飾ｃｒＲＮＡの前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の前記核酸塩基配列が、配列ＧＸＡＧＡＸを含み、ここで各Ｘは独立してＵ核酸塩基またはＴ核酸塩基である、請求項１〜１００のいずれかに記載の化合物。
【請求項１０３】
前記修飾ｃｒＲＮＡの前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の前記核酸塩基配列が、前記配列ＸＣＸＡＣＸ及び前記配列ＧＸＡＧＡＸを含み、ここで各Ｘは独立してＵ核酸塩基またはＴ核酸塩基である、請求項１〜１００のいずれかに記載の化合物。
【請求項１０４】
前記化合物がコンジュゲート基を含む、請求項１〜９０、または９２〜１０３のいずれかに記載の化合物。
【請求項１０５】
前記コンジュゲート基がＧａｌＮＡｃを含む、請求項１０４に記載の化合物。
【請求項１０６】
前記コンジュゲート基が親油性である、請求項１０４に記載の化合物。
【請求項１０７】
前記コンジュゲート基が脂質である、請求項１０６に記載の化合物。
【請求項１０８】
請求項１〜１０７のいずれかに記載の化合物を含む、医薬組成物。
【請求項１０９】
細胞を、請求項１〜１０８のいずれかに記載の化合物または組成物と接触させることを含む方法。
【請求項１１０】
前記細胞がＣｐｆ１ヌクレアーゼを発現する、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
細胞を、請求項１〜１０８のいずれかに記載の化合物または組成物及びＣｐｆ１ヌクレアーゼをコードするプラスミドと接触させることを含む方法。
【請求項１１２】
細胞を、請求項１〜１０８のいずれかに記載の化合物または組成物及びＣｐｆ１ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡと接触させることを含む方法。
【請求項１１３】
前記修飾ｃｒＲＮＡが、トランスフェクション試薬のない状態で前記細胞によって取り込まれる、請求項１０９〜１１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１１４】
前記細胞が動物内に存在する、請求項１０９〜１１３のいずれかに記載の化合物。
【請求項１１５】
請求項１〜１０８のいずれかに記載の化合物または組成物を、動物に投与することを含む方法。
【請求項１１６】
前記投与が、皮下である、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
前記投与が、髄腔内である、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１８】
Ｃｐｆ１ヌクレアーゼをコードするプラスミドを投与することを含む、請求項１１５〜１１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１１９】
前記動物がＣｐｆ１ヌクレアーゼを発現する、請求項１１５〜１１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１２０】
前記プラスミドが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を介して前記動物内の細胞に送達される、請求項１１１または１１８に記載の方法。
【請求項１２１】
前記プラスミドが、レンチウイルスを介して前記動物内の細胞に送達される、請求項１１１または１１８に記載の方法。
【請求項１２２】
標的遺伝子が編集される、請求項１０９〜１２１のいずれかに記載の方法。
【請求項１２３】
前記修飾ｃｒＲＮＡは、細胞内で前記標的遺伝子が編集された後に前記細胞内で分解される、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
前記Ｃｐｆ１ヌクレアーゼは、前記修飾ｃｒＲＮＡがない状態でヌクレアーゼ活性を示さない、請求項１１０〜１１２、または１１８〜１２３のいずれかに記載の方法。
【請求項１２５】
前記細胞を、前記修飾ｃｒＲＮＡまたはＣｐｆ１ヌクレアーゼの前記活性または発現を低下または抑制する第２の化合物と接触させることを含む、請求項１０９〜１２４のいずれかに記載の方法。
【請求項１２６】
前記細胞を、標的遺伝子を編集した後に前記第２の化合物と接触させる、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
前記第２の化合物が、前記修飾ｃｒＲＮＡに相補的であるオリゴヌクレオチドを含む、請求項１２５または１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
前記第２の化合物が、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ遺伝子を標的にするｃｒＲＮＡを含む、請求項１２５または１２６に記載の方法。
【請求項１２９】
前記第２の化合物が、Ｃｐｆ１転写物に相補的なオリゴヌクレオチドを含む、請求項１２５または１２６に記載の方法。
【請求項１３０】
前記Ｃｐｆ１ヌクレアーゼの発現が抑制される、請求項１２８または１２９に記載の方法。
【請求項１３１】
前記動物がヒトである、請求項１１４〜１３０のいずれかに記載の方法。
【請求項１３２】
少なくとも１つのオフターゲット遺伝子の編集が、未修飾ｃｒＲＮＡまたは４５個を超えるヌクレオシドを含む化合物が前記修飾ｃｒＲＮＡの代わりに使用される場合の前記少なくとも１つのオフターゲット遺伝子の編集と比較して低減される、請求項１０９〜１３１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３３】
前記投与が、硝子体内である、請求項１１５または１１８〜１３２のいずれかに記載の方法。
【請求項１３４】
前記細胞が、植物細胞である、請求項１０９〜１１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１３５】
前記細胞が、Ｔ細胞である、請求項１０９〜１１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１３６】
個体の疾患を治療する方法であって、請求項１〜１０７のいずれかに記載の化合物または請求項１０８に記載の組成物を前記個体に投与することによって前記個体の前記疾患を治療する、前記方法。
【請求項１３７】
疾患の治療のための、請求項１〜１０７のいずれかに記載の化合物または請求項１０８に記載の組成物の使用。
【請求項１３８】
薬物の調合のための、請求項１〜１０７のいずれかに記載の化合物または請求項１０８に記載の組成物の使用。
【請求項１３９】
請求項１〜１０７のいずれかに記載の化合物または請求項１０８に記載の組成物を動物に投与し、そしてヒトへの移植のために前記動物から器官を回収する方法。
【請求項１４０】
前記５’末端ヌクレオシドがｃＥｔ修飾糖部分を含む、請求項９０〜１０７のいずれかに記載の化合物。
【請求項１４１】
前記修飾ｃｒＲＮＡの前記標的認識部分の３’末端が２つの連続的なホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む、請求項１４０に記載の化合物。
【請求項１４２】
前記修飾ｃｒＲＮＡの前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の各ヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエートである、請求項１４０〜１４１のいずれかに記載の化合物。
【請求項１４３】
前記修飾ｃｒＲＮＡの前記標的認識部分の２つの３’末端ヌクレオシドが、それぞれ２’−Ｏ−メチル修飾糖部分を含む、請求項１４０〜１４２のいずれかに記載の化合物。
【請求項１４４】
前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の５’末端から１番目のヌクレオシドが未修飾糖部分を含む、請求項１４０〜１４３のいずれかに記載の化合物。
【請求項１４５】
前記修飾ｃｒＲＮＡが３０〜３８個の未修飾糖部分を含む、請求項１４０〜１４４のいずれかに記載の化合物。
【請求項１４６】
前記修飾ｃｒＲＮＡが３６個の未修飾糖部分を含む、請求項１４５に記載の化合物。
【請求項１４７】
請求項１４０〜１４６のいずれかに記載の化合物を含む医薬組成物。
【請求項１４８】
細胞を、請求項１４０〜１４７のいずれかに記載の化合物または組成物と接触させることを含む方法。
【請求項１４９】
前記細胞がＣｐｆ１ヌクレアーゼを発現する、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５０】
細胞を、請求項１４０〜１４７のいずれかに記載の化合物または組成物及びＣｐｆ１ヌクレアーゼをコードするプラスミドと接触させることを含む方法。
【請求項１５１】
細胞を、請求項１４０〜１４７のいずれかに記載の化合物または組成物及びＣｐｆ１ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡと接触させることを含む方法。
【請求項１５２】
前記修飾ｃｒＲＮＡが、トランスフェクション試薬のない状態で前記細胞によって取り込まれる、請求項１４８〜１５１のいずれかに記載の方法。
【請求項１５３】
前記細胞が動物内に存在する、請求項１４８〜１５２のいずれかに記載の方法。
【請求項１５４】
請求項１４０〜１４７のいずれかに記載の化合物または組成物を動物に投与することを含む方法。
【請求項１５５】
前記投与が、皮下である、請求項１５４に記載の方法。
【請求項１５６】
前記投与が、髄腔内である、請求項１５４に記載の方法。
【請求項１５７】
Ｃｐｆ１ヌクレアーゼをコードするプラスミドを投与することを含む、請求項１５４〜１５６のいずれかに記載の方法。
【請求項１５８】
前記動物がＣｐｆ１ヌクレアーゼを発現する、請求項１５４〜１５６のいずれかに記載の方法。
【請求項１５９】
前記プラスミドが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を介して前記動物内の細胞に送達される、請求項１５０または１５７に記載の方法。
【請求項１６０】
前記プラスミドが、レンチウイルスを介して前記動物内の細胞に送達される、請求項１５０または１５７に記載の方法。
【請求項１６１】
標的遺伝子が編集される、請求項１４８〜１６０のいずれかに記載の方法。
【請求項１６２】
前記修飾ｃｒＲＮＡは、細胞内で前記標的遺伝子が編集された後に前記細胞内で分解される、請求項１６１に記載の方法。
【請求項１６３】
前記Ｃｐｆ１ヌクレアーゼが、前記修飾ｃｒＲＮＡがない状態でヌクレアーゼ活性を示さない、請求項１４９〜１５１または１５７〜１６２のいずれかに記載の方法。
【請求項１６４】
前記細胞を、前記修飾ｃｒＲＮＡまたはＣｐｆ１ヌクレアーゼの前記活性または発現を低下または抑制する第２の化合物と接触させることを含む、請求項１４８〜１６３のいずれかに記載の方法。
【請求項１６５】
前記細胞を、標的遺伝子を編集した後に前記第２の化合物と接触させる、請求項１６４に記載の方法。
【請求項１６６】
前記第２の化合物が、前記修飾ｃｒＲＮＡに相補的であるオリゴヌクレオチドを含む、請求項１６４または１６５に記載の方法。
【請求項１６７】
前記第２の化合物が、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ遺伝子を標的にするｃｒＲＮＡを含む、請求項１６４または１６５に記載の方法。
【請求項１６８】
前記第２の化合物が、Ｃｐｆ１転写物に相補的なオリゴヌクレオチドを含む、請求項１６４または１６５に記載の方法。
【請求項１６９】
前記Ｃｐｆ１ヌクレアーゼの発現が抑制される、請求項１６７または１６８に記載の方法。
【請求項１７０】
前記動物がヒトである、請求項１５３〜１６９のいずれかに記載の方法。
【請求項１７１】
少なくとも１つのオフターゲット遺伝子の編集が、未修飾ｃｒＲＮＡまたは４５個を超えるヌクレオシドを含む化合物が前記修飾ｃｒＲＮＡの代わりに使用される場合の前記少なくとも１つのオフターゲット遺伝子の編集と比較して低減される、請求項１４８〜１７０のいずれかに記載の方法。
【請求項１７２】
前記投与が、硝子体内である、請求項１５４または１５７〜１７１のいずれかに記載の方法。
【請求項１７３】
前記細胞が、植物細胞である、請求項１４８〜１５２のいずれかに記載の方法。
【請求項１７４】
前記細胞が、Ｔ細胞である、請求項１４８〜１５３のいずれかに記載の方法。
【請求項１７５】
個体の疾患を治療する方法であって、請求項１４０〜１４６のいずれかに記載の化合物または請求項１４７に記載の組成物を前記個体に投与することを含む、前記方法。
【請求項１７６】
個体の疾患を治療する方法であって、請求項１４０〜１４６のいずれかに記載の化合物または請求項１４７に記載の組成物を前記個体に投与することによって、前記個体の前記疾患を治療することを含む、前記方法。
【請求項１７７】
疾患を治療するための、請求項１４０〜１４６のいずれかに記載の化合物または請求項１４７に記載の組成物の使用。
【請求項１７８】
薬剤の調合のための、請求項１４０〜１４６のいずれかに記載の化合物または請求項１４７に記載の組成物の使用。
【請求項１７９】
請求項１４０〜１４６のいずれかに記載の化合物または請求項１４７に記載の組成物を動物に投与し、そしてヒトへの移植のために前記動物から器官を回収する方法。
【請求項１８０】
前記修飾ｃｒＲＮＡの少なくとも１つの修飾ヌクレオシドが２’−デオキシヌクレオシドである、請求項９１〜１０７または１４０〜１４６のいずれかに記載の化合物。
【請求項１８１】
前記修飾ｃｒＲＮＡの少なくとも１つの修飾ヌクレオシドが２’−Ｈ置換を有する直鎖状の修飾糖部分を含む、請求項９１〜１０７または１４０〜１４６のいずれかに記載の化合物。
【請求項１８２】
前記修飾ｃｒＲＮＡの少なくとも１つの修飾ヌクレオシドが、天然のＤＮＡに見いだされるような修飾２’−Ｈ（Ｈ）糖部分を有する、請求項９１〜１０７または１４０〜１４６のいずれかに記載の化合物。
【請求項１８３】
前記修飾ｃｒＲＮＡが４０個の連結ヌクレオシドから成る、請求項９１〜１０７、１４０〜１４６または１８０〜１８２のいずれかに記載の化合物。
【請求項１８４】
前記修飾ｃｒＲＮＡが４３個の連結ヌクレオシドから成る、請求項９１〜１０７、１４０〜１４６または１８０〜１８２のいずれかに記載の化合物。
【請求項１８５】
前記修飾ｃｒＲＮＡが４５個の連結ヌクレオシドから成る、請求項９１〜１０７、１４０〜１４６または１８０〜１８２のいずれかに記載の化合物。
【請求項１８６】
前記修飾ｃｒＲＮＡの前記標的認識部分が、ＤＮＭＴ１核酸に対して少なくとも９０％相補的である、請求項９１〜１０７、１４０〜１４６または１８０〜１８５のいずれかに記載の化合物。
【請求項１８７】
前記標的認識部分が、ＤＮＭＴ１核酸に対して１００％相補的である、請求項１８６に記載の化合物。
【請求項１８８】
前記ＤＮＭＴ１核酸が、デオキシリボ核酸である、請求項１８６または１８７に記載の化合物。
【請求項１８９】
前記ＤＮＭＴ１核酸が、ヒトのデオキシリボ核酸である、請求項１８８に記載の化合物。
【請求項１９０】
前記修飾ｃｒＲＮＡの前記標的認識部分が、ＬＤＬＲ核酸に対して少なくとも９０％相補的である、請求項９１〜１０７、１４０〜１４６または１８０〜１８５のいずれかに記載の化合物。
【請求項１９１】
前記標的認識部分が、ＬＤＬＲ核酸に対して１００％相補的である、請求項１９０に記載の化合物。前記ＬＤＬＲ核酸が、デオキシリボ核酸である、請求項１９０または１９１に記載の化合物。
【請求項１９２】
前記ＬＤＬＲ核酸が、ヒトのデオキシリボ核酸である、請求項１９１に記載の化合物。
【請求項１９３】
前記修飾ｃｒＲＮＡの２つの３’末端ヌクレオシドが、独立して選択された修飾糖部分を含む、請求項９１〜１０７、１４０〜１４６または１８０〜１９２のいずれかに記載の化合物。
【請求項１９４】
前記修飾ｃｒＲＮＡの３つの３’末端ヌクレオシドが、独立して選択された修飾糖部分を含む、請求項９１〜１０７、１４０〜１４６または１８０〜１９２のいずれかに記載の化合物。
【請求項１９５】
前記修飾ｃｒＲＮＡの４つの３’末端ヌクレオシドが、独立して選択された修飾糖部分を含む、請求項９１〜１０７、１４０〜１４６または１８０〜１９２のいずれかに記載の化合物。
【請求項１９６】
前記修飾ｃｒＲＮＡの５つの３’末端ヌクレオシドが、独立して選択された修飾糖部分を含む、請求項９１〜１０７、１４０〜１４６または１８０〜１９２のいずれかに記載の化合物。
【請求項１９７】
前記３’末端修飾ヌクレオシドの前記修飾糖部分が２’−Ｈ（Ｈ）、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｆ、ｃＥｔ、及びＬＮＡ修飾糖部分の中から選択される、請求項７７または１９３〜１９６のいずれかに記載の化合物。
【請求項１９８】
前記３’末端修飾ヌクレオシドの前記修飾糖部分が２’−Ｈ（Ｈ）、２’−Ｏ−メチル、及びｃＥｔ修飾糖部分の中から選択される、請求項１９７に記載の化合物。
【請求項１９９】
前記３’末端修飾ヌクレオシドの前記修飾糖部分が２’−Ｈ（Ｈ）及び２’−Ｏ−メチル修飾糖部分の中から選択される、請求項１９７に記載の化合物。
【請求項２００】
前記３’末端修飾ヌクレオシドの前記修飾糖部分がｃＥｔ及びＬＮＡ修飾糖部分の中から選択される、請求項１９７に記載の化合物。
【請求項２０１】
前記標的認識部分の５’末端から１番目のヌクレオシドが２’−Ｈ（Ｈ）または２’−Ｆ修飾糖部分を含む、請求項８２〜１０７、１４０〜１４６、または１８０〜２００のいずれかに記載の化合物。
【請求項２０２】
前記標的認識部分の５’末端から８番目のヌクレオシドが２’−Ｈ（Ｈ）または２’−Ｆ修飾糖部分を含む、請求項８２〜１０７、１４０〜１４６、または１８０〜２０１のいずれかに記載の化合物。
【請求項２０３】
前記標的認識部分の５’末端から９番目のヌクレオシドが２’−Ｈ（Ｈ）または２’−Ｆ修飾糖部分を含む、請求項８２〜１０７、１４０〜１４６、または１８０〜２０２のいずれかに記載の化合物。
【請求項２０４】
請求項９１〜１０７、１４０〜１４６、または１８０〜２０３のいずれかに記載の化合物であって、前記修飾ｃｒＲＮＡが以下の特徴の少なくとも３つを含む、前記化合物：
ａ．前記修飾ｃｒＲＮＡの前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の５’末端に連結される２つのリンカーヌクレオシド；
ｂ．独立して２’−Ｆまたは２’−Ｈ（Ｈ）修飾糖部分を含有する、前記修飾ｃｒＲＮＡの前記標的認識部分の５’末端から１番目、８番目、及び／または９番目のヌクレオシド
ｃ．前記修飾ｃｒＲＮＡの３’及び５’末端のそれぞれにおける少なくとも１つの末端ホスホロチオエートヌクレオシド間結合
ｄ．未修飾糖部分を含む、前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の各ヌクレオシド
ｅ．独立して選択される修飾糖部分を含む、前記修飾ｃｒＲＮＡの１〜５個の３’末端ヌクレオシド 。
【請求項２０５】
前記修飾ｃｒＲＮＡが塩である、請求項１〜１０７、１４０〜１４６、または１８０〜２０４のいずれかに記載の化合物。
【請求項２０６】
請求項１８０〜２０５のいずれかに記載の化合物を含む、医薬組成物。
【請求項２０７】
前記医薬組成物がリボ核タンパク質複合体を含む、請求項１０８、１４７、または２０６のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２０８】
前記リボ核タンパク質複合体が、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ及び前記修飾ｃｒＲＮＡを含有する前記化合物を含む、請求項２０７に記載の医薬組成物。
【請求項２０９】
細胞を、請求項１８０〜２０８のいずれかに記載の化合物または組成物と接触させることを含む方法。
【請求項２１０】
細胞を、請求項１８０〜２０７のいずれかに記載の化合物または組成物と接触させることを含む方法であって、ここで前記細胞はＣｐｆ１ヌクレアーゼを発現する、前記方法。
【請求項２１１】
細胞を、請求項１８０〜２０７のいずれかに記載の化合物または組成物及びＣｐｆ１ヌクレアーゼをコードするプラスミドと接触させることを含む方法。
【請求項２１２】
細胞を、請求項１８０〜２０７のいずれかに記載の化合物または組成物及びＣｐｆ１ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡと接触させることを含む方法。
【請求項２１３】
前記修飾ｃｒＲＮＡが、トランスフェクション試薬のない状態で前記細胞によって取り込まれる、請求項２０９〜２１２のいずれかに記載の方法。
【請求項２１４】
前記細胞が動物内に存在する、請求項２０９〜２１３のいずれかに記載の方法。
【請求項２１５】
請求項１８０〜２０８のいずれかに記載の化合物または組成物を、動物に投与することを含む方法。
【請求項２１６】
前記投与が、皮下である、請求項２１５に記載の方法。
【請求項２１７】
前記投与が、髄腔内である、請求項２１５に記載の方法。
【請求項２１８】
Ｃｐｆ１ヌクレアーゼをコードするプラスミドを投与することを含む、請求項２１５〜２１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２１９】
前記動物がＣｐｆ１ヌクレアーゼを発現する、請求項２１５〜２１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２２０】
前記プラスミドが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を介して前記動物内の細胞に送達される、請求項２１１または２１８に記載の方法。
【請求項２２１】
前記プラスミドが、レンチウイルスを介して前記動物内の細胞に送達される、請求項２１１または２１８に記載の方法。
【請求項２２２】
標的遺伝子が編集される、請求項２０９〜２２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２２３】
前記修飾ｃｒＲＮＡは、細胞内で前記標的遺伝子が編集された後に前記細胞内で分解される、請求項２２２に記載の方法。
【請求項２２４】
前記Ｃｐｆ１ヌクレアーゼは、前記修飾ｃｒＲＮＡがない状態でヌクレアーゼ活性を示さない、請求項２１０〜２１２、または２１５〜２２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２２５】
前記細胞を、前記修飾ｃｒＲＮＡまたはＣｐｆ１ヌクレアーゼの前記活性または発現を低下または抑制する第２の化合物と接触させることを含む、請求項２０９〜２２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２２６】
前記細胞を、標的遺伝子を編集した後に前記第２の化合物と接触させる、請求項２２５に記載の方法。
【請求項２２７】
前記第２の化合物が、前記修飾ｃｒＲＮＡに相補的であるオリゴヌクレオチドを含む、請求項２２５または２２６に記載の方法。
【請求項２２８】
前記第２の化合物が、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ遺伝子を標的にするｃｒＲＮＡを含む、請求項２２５または２２６に記載の方法。
【請求項２２９】
前記第２の化合物が、Ｃｐｆ１転写物に相補的なオリゴヌクレオチドを含む、請求項２２５または２２６に記載の方法。
【請求項２３０】
前記Ｃｐｆ１ヌクレアーゼの発現が抑制される、請求項２２８または２２９に記載の方法。
【請求項２３１】
前記動物がヒトである、請求項２１４〜２３０のいずれかに記載の方法。
【請求項２３２】
少なくとも１つのオフターゲット遺伝子の編集が、未修飾ｃｒＲＮＡまたは４５個を超えるヌクレオシドを含む化合物が前記修飾ｃｒＲＮＡの代わりに使用される場合の前記少なくとも１つのオフターゲット遺伝子の編集と比較して低減される、請求項２０９〜２３１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３３】
前記投与が、硝子体内である、請求項２１５または２１８〜２３２のいずれかに記載の方法。
【請求項２３４】
前記細胞が、植物細胞である、請求項２０９〜２１３のいずれかに記載の方法。
【請求項２３５】
前記細胞が、Ｔ細胞である、請求項２０９〜２１４のいずれかに記載の方法。
【請求項２３６】
個体の疾患を治療する方法であって、請求項１８０〜２０５のいずれかに記載の化合物または請求項２０６〜２０８のいずれかに記載の組成物を前記個体に投与することを含む、前記方法。
【請求項２３７】
個体の疾患を治療する方法であって、請求項１８０〜２０５のいずれかに記載の化合物または請求項２０６〜２０８のいずれかに記載の組成物を前記個体に投与することによって前記個体の前記疾患を治療することを含む、前記方法。
【請求項２３８】
疾患を治療するための、請求項１８０〜２０５のいずれかに記載の化合物または請求項２０６〜２０８のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項２３９】
薬物の調合のための、請求項１８０〜２０５のいずれかに記載の化合物または請求項２０６〜２０８のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項２４０】
請求項１８０〜２０５のいずれかに記載の化合物または請求項２０６〜２０８のいずれかに記載の組成物を動物に投与し、そしてヒトへの移植のために前記動物から器官を回収する方法。
【請求項２４１】
前記修飾ｃｒＲＮＡの前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分が少なくとも１つの未修飾糖部分を含む、請求項１〜１０７、１４０〜１４６、または１８０〜２０５のいずれかに記載の化合物。
【請求項２４２】
前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の少なくとも１つの修飾糖部分が直鎖状の修飾糖部分である、請求項２４１に記載の化合物。
【請求項２４３】
前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の少なくとも１つの修飾糖部分が二環糖部分である、請求項２４１に記載の化合物。
【請求項２４４】
前記二環糖部分がｃＥｔまたはＬＮＡである、請求項２４３に記載の化合物。
【請求項２４５】
前記二環糖部分がｃＥｔである、請求項２４３に記載の化合物。
【請求項２４６】
前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の３’末端から２番目のヌクレオシドが少なくとも１つの修飾糖部分を含む、請求項２４１〜２４５のいずれかに記載の化合物。
【請求項２４７】
前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の３’末端から３番目のヌクレオシドが少なくとも１つの修飾糖部分を含む、請求項２４１〜２４５のいずれかに記載の化合物。
【請求項２４８】
前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の３’末端から４番目のヌクレオシドが少なくとも１つの修飾糖部分を含む、請求項２４１〜２４５のいずれかに記載の化合物。
【請求項２４９】
前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の３’末端から５番目のヌクレオシドが少なくとも１つの修飾糖部分を含む、請求項２４１〜２４５のいずれかに記載の化合物。
【請求項２５０】
前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の３’末端から６番目のヌクレオシドが少なくとも１つの修飾糖部分を含む、請求項２４１〜２４５のいずれかに記載の化合物。
【請求項２５１】
前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の３’末端から７番目のヌクレオシドが少なくとも１つの修飾糖部分を含む、請求項２４１〜２４５のいずれかに記載の化合物。
【請求項２５２】
前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の３’末端から８番目のヌクレオシドが少なくとも１つの修飾糖部分を含む、請求項２４１〜２４５のいずれかに記載の化合物。
【請求項２５３】
前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の３’末端から９番目のヌクレオシドが少なくとも１つの修飾糖部分を含む、請求項２４１〜２４５のいずれかに記載の化合物。
【請求項２５４】
前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の３’末端から１１番目のヌクレオシドが少なくとも１つの修飾糖部分を含む、請求項２４１〜２４５のいずれかに記載の化合物。
【請求項２５５】
前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の３’末端から１２番目のヌクレオシドが少なくとも１つの修飾糖部分を含む、請求項２４１〜２４５のいずれかに記載の化合物。
【請求項２５６】
前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の３’末端から１３番目のヌクレオシドが少なくとも１つの修飾糖部分を含む、請求項２４１〜２４５のいずれかに記載の化合物。
【請求項２５７】
前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の３’末端から１８番目のヌクレオシドが少なくとも１つの修飾糖部分を含む、請求項２４１〜２４５のいずれかに記載の化合物。
【請求項２５８】
前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の３’末端から１１番目及び１２番目のヌクレオシドが、それぞれ修飾糖部分を含む、請求項２４１〜２４５のいずれかに記載の化合物。
【請求項２５９】
前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の３’末端から１番目のヌクレオシドが、未修飾糖部分を含む、請求項２４１〜２５８のいずれかに記載の化合物。
【請求項２６０】
前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の３’末端から１０番目のヌクレオシドが、未修飾糖部分を含む、請求項２４１〜２５９のいずれかに記載の化合物。
【請求項２６１】
前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の３’末端から１４番目のヌクレオシドが、未修飾糖部分を含む、請求項２４１〜２６０のいずれかに記載の化合物。
【請求項２６２】
前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の３’末端から１５番目のヌクレオシドが、未修飾糖部分を含む、請求項２４１〜２６１のいずれかに記載の化合物。
【請求項２６３】
前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の３’末端から１６番目のヌクレオシドが、未修飾糖部分を含む、請求項２４１〜２６２のいずれかに記載の化合物。
【請求項２６４】
前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の３’末端から１７番目のヌクレオシドが、未修飾糖部分を含む、請求項２４１〜２６３のいずれかに記載の化合物。
【請求項２６５】
前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の５’末端から１番目のヌクレオシドが、未修飾糖部分を含む、請求項２４１〜２６４のいずれかに記載の化合物。
【請求項２６６】
前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の５’末端から２番目のヌクレオシドが、未修飾糖部分を含む、請求項２４１〜２６５のいずれかに記載の化合物。
【請求項２６７】
前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の５’末端から３番目のヌクレオシドが、未修飾糖部分を含む、請求項２４１〜２６６のいずれかに記載の化合物。
【請求項２６８】
前記標的認識部分の５’末端から１４番目のヌクレオシドが、修飾糖部分を含む、請求項１〜１０７、１４０〜１４６、１８０〜２０５または２４１〜２６７のいずれかに記載の化合物。
【請求項２６９】
前記標的認識部分の５’末端から１５番目のヌクレオシドが、修飾糖部分を含む、請求項１〜１０７、１４０〜１４６、１８０〜２０５または２４１〜２６８のいずれかに記載の化合物。
【請求項２７０】
前記標的認識部分の５’末端から１６番目のヌクレオシドが、修飾糖部分を含む、請求項１〜１０７、１４０〜１４６、１８０〜２０５または２４１〜２６９のいずれかに記載の化合物。
【請求項２７１】
前記標的認識部分の５’末端から１４、１５、及び／または１６の位置の各修飾糖部分が、直鎖状の修飾糖部分である、請求項２６８〜２７０のいずれかに記載の化合物。
【請求項２７２】
前記標的認識部分の５’末端から１４、１５、及び／または１６の位置の各修飾糖部分が、２’−Ｈ（Ｈ）及び２’−Ｆ修飾糖部分から独立して選択される、請求項２７１に記載の化合物。
【請求項２７３】
前記標的認識部分の５’末端から１４、１５、及び／または１６の位置の各修飾糖部分が、２’−Ｈ（Ｈ）修飾糖部分である、請求項２７２に記載の化合物。
【請求項２７４】
請求項１〜１０７、１４０〜１４６、１８０〜２０５、または２４１〜２７３のいずれかに記載の化合物であって、前記修飾ｃｒＲＮＡが以下の特徴の少なくとも３つを含む、前記化合物
（ａ）前記修飾ｃｒＲＮＡの前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の５’末端に連結される２つのリンカーヌクレオシド
（ｂ）独立して２’−Ｆまたは２’−Ｈ（Ｈ）修飾糖部分を含有する、前記修飾ｃｒＲＮＡの前記標的認識部分の５’末端から１番目、８番目、及び／または９番目のヌクレオシド
（ｃ）前記修飾ｃｒＲＮＡの３’及び５’末端のそれぞれにおける少なくとも１つの末端ホスホロチオエートヌクレオシド間結
（ｄ）修飾糖部分を含む、前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の３’末端から５、６、７、８、１１、または１２の位置の少なくとも１つのヌクレオシド
（ｅ）独立して選択される修飾糖部分を含む、前記修飾ｃｒＲＮＡの１〜５個の３’末端ヌクレオシド
【請求項２７５】
前記修飾ｃｒＲＮＡが特徴（ａ）、（ｃ）、及び（ｅ）を含む、請求項２７４に記載の化合物。
【請求項２７６】
前記修飾ｃｒＲＮＡが特徴（ａ）、（ｃ）、及び（ｄ）を含む、請求項２７４に記載の化合物。
【請求項２７７】
前記修飾ｃｒＲＮＡが特徴（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）を含む、請求項２７４に記載の化合物。
【請求項２７８】
前記修飾ｃｒＲＮＡが特徴（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｅ）を含む、請求項２７４に記載の化合物。
【請求項２７９】
前記修飾ｃｒＲＮＡが特徴（ａ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）を含む、請求項２７４に記載の化合物。
【請求項２８０】
前記修飾ｃｒＲＮＡが特徴（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、及び（ｅ）を含む、請求項２７４に記載の化合物。
【請求項２８１】
請求項２４１〜２８０のいずれかに記載の化合物を含む、医薬組成物。
【請求項２８２】
前記医薬組成物が、リボ核タンパク質複合体を含む、請求項２８１に記載の医薬組成物。
【請求項２８３】
前記リボ核タンパク質複合体が、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ及び前記修飾ｃｒＲＮＡを含有する前記化合物を含む、請求項２８２に記載の医薬組成物。
【請求項２８４】
細胞を、請求項２４１〜２８３のいずれかに記載の化合物または組成物と接触させることを含む方法。
【請求項２８５】
細胞を請求項２４１〜２８３のいずれかに記載の化合物または組成物と接触させる方法であって、ここで前記細胞はＣｐｆ１ヌクレアーゼを発現する、前記方法。
【請求項２８６】
細胞を、請求項２４１〜２８３のいずれかに記載の化合物または組成物及びＣｐｆ１ヌクレアーゼをコードするプラスミドと接触させることを含む方法。
【請求項２８７】
細胞を、請求項２４１〜２８３のいずれかに記載の化合物または組成物及びＣｐｆ１ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡと接触させることを含む方法。
【請求項２８８】
前記修飾ｃｒＲＮＡが、トランスフェクション試薬のない状態で前記細胞によって取り込まれる、請求項２８４〜２８７のいずれかに記載の方法。
【請求項２８９】
前記細胞が動物内に存在する、請求項２８４〜２８８のいずれかに記載の方法。
【請求項２９０】
請求項２４１〜２８３のいずれかに記載の化合物または組成物を、動物に投与することを含む方法。
【請求項２９１】
前記投与が皮下である、請求項２９０に記載の方法。
【請求項２９２】
前記投与が髄腔内である、請求項２９０に記載の方法。
【請求項２９３】
Ｃｐｆ１ヌクレアーゼをコードするプラスミドを投与することを含む、請求項２９０〜２９２のいずれかに記載の方法。
【請求項２９４】
前記動物がＣｐｆ１ヌクレアーゼを発現する、請求項２９０〜２９２のいずれかに記載の方法。
【請求項２９５】
前記プラスミドがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を介して前記動物内の細胞に送達される、請求項２８６または２９３に記載の方法。
【請求項２９６】
前記プラスミドがレンチウイルスを介して前記動物内の細胞に送達される、請求項２８６または２９３に記載の方法。
【請求項２９７】
標的遺伝子が編集される、請求項２８４〜２９６のいずれかに記載の方法。
【請求項２９８】
前記修飾ｃｒＲＮＡは、細胞内で前記標的遺伝子が編集された後に前記細胞内で分解される、請求項２９７に記載の方法。
【請求項２９９】
前記Ｃｐｆ１ヌクレアーゼが前記修飾ｃｒＲＮＡのない状態でヌクレアーゼ活性を示さない、請求項２８５〜２８７、または２９３〜２９８のいずれかに記載の方法。
【請求項３００】
前記細胞を、前記修飾ｃｒＲＮＡまたはＣｐｆ１ヌクレアーゼの前記活性または発現を低下または抑制する第２の化合物と接触させることを含む、請求項２８４〜２９９のいずれかに記載の方法。
【請求項３０１】
前記細胞を、標的遺伝子を編集した後に前記第２の化合物と接触させる、請求項３００に記載の方法。
【請求項３０２】
前記第２の化合物が、前記修飾ｃｒＲＮＡに相補的であるオリゴヌクレオチドを含む、請求項３００または３０１に記載の方法。
【請求項３０３】
前記第２の化合物が、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ遺伝子を標的にするｃｒＲＮＡを含む、請求項３００または３０１に記載の方法。
【請求項３０４】
前記第２の化合物が、Ｃｐｆ１転写物に相補的なオリゴヌクレオチドを含む、請求項３００または３０１に記載の方法。
【請求項３０５】
前記Ｃｐｆ１ヌクレアーゼの発現が抑制される、請求項３０３または３０４に記載の方法。
【請求項３０６】
前記動物がヒトである、請求項２８９〜３０５のいずれかに記載の方法。
【請求項３０７】
少なくとも１つのオフターゲット遺伝子の編集が、未修飾ｃｒＲＮＡまたは４５個を超えるヌクレオシドを含む化合物が前記修飾ｃｒＲＮＡの代わりに使用される場合の前記少なくとも１つのオフターゲット遺伝子の編集と比較して低減される、請求項２８４〜３０６のいずれかに記載の方法。
【請求項３０８】
前記投与が、硝子体内である、請求項２９０または２９３〜２９７のいずれかに記載の方法。
【請求項３０９】
前記細胞が、植物細胞である、請求項２８４〜２８８のいずれかに記載の方法。
【請求項３１０】
前記細胞が、Ｔ細胞である、請求項２８４〜２８９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１１】
個体の疾患を治療する方法であって、請求項２４１〜２８０のいずれかに記載の化合物または請求項２８１〜２８３のいずれかに記載の組成物を前記個体に投与することを含む、前記方法。
【請求項３１２】
個体の疾患を治療する方法であって、請求項２４１〜２８０のいずれかに記載の化合物または請求項２８１〜２８３のいずれかに記載の組成物を前記個体に投与することによって前記個体の前記疾患を治療することを含む、前記方法。
【請求項３１３】
疾患を治療するための、請求項２４１〜２８０のいずれかに記載の化合物または請求項２８１〜２８３のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項３１４】
薬物の調合のための、請求項２４１〜２８０のいずれかに記載の化合物または請求項２８１〜２８３のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項３１５】
請求項２４１〜２８０のいずれかに記載の化合物または請求項２８１〜２８３のいずれかに記載の組成物を動物に投与し、そしてヒトへの移植のために前記動物から器官を回収する方法。
【請求項３１６】
リポソームまたは脂質ナノ粒子を含む、請求項１０８、１４７、２０６、または２８１のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項３１７】
Ｃｐｆ１ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む、請求項１０８、１４７、２０６、２８１、または３１６のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項３１８】
前記修飾ｃｒＲＮＡ及びＣｐｆ１ヌクレアーゼをコードする前記ｍＲＮＡを含む前記化合物が、リポソームまたは脂質ナノ粒子の中に含まれる、請求項３１７に記載の医薬組成物。
【請求項３１９】
前記Ｃｐｆ１ヌクレアーゼをコードする前記ｍＲＮＡ及び前記修飾ｃｒＲＮＡを含む前記化合物が、リポソームまたは脂質ナノ粒子の中に含まれる、請求項２１２〜２１４、１５１〜１５３、２１２〜２１４または２８７〜２８９のいずれかに記載の方法。
【請求項３２０】
個体の疾患を治療する方法であって、請求項３１６〜３１８のいずれかに記載の医薬組成物を前記個体に投与することを含む、前記方法。
【請求項３２１】
個体の疾患を治療する方法であって、請求項３１６〜３１８のいずれかに記載の医薬組成物を前記個体に投与することによって前記個体の前記疾患を治療することを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表
本出願は、配列表とともに電子形式で出願されている。配列表は、２０１７年１２月１５日に作成されたＣＯＲＥ０１４１ＷＯＳＥＱ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名前のファイルとして提供され、サイズは９４８Ｋｂである。この配列表の電子形式の情報は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子を編集または無効にするためのＣｌｕｓｔｅｒ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）の使用が記載されている。例えば、Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ３３７：８１６−８２１（２０１２）、Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ３３９：８２３−８２６（２０１３）を参照されたい。
【０００３】
発明の概要
種々のＣＲＩＳＰＲシステムが記載されている。例えば、ＷＯ２０１３／１７６７７２、ＷＯ２０１５／００６７４７、Ｑｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １５２：１  １７３−１（２０１３）、Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １５４：１−１０（２０１３）、Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７：８１６−８２１（２０１２）、Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９：８２３−８２６（２０１３）、Ｄｏｕｄｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４６：６２１３（２０１４）を参照されたい。また、例えばＺｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ１６３：１−１３（２０１５）も参照されたい。本発明はＣＲＩＳＰＲシステムにおいて、ｃｒＲＮＡとして使用するための修飾オリゴヌクレオチドを提供する。ある特定の実施形態において、このような修飾ｃｒＲＮＡは、未修飾ｃｒＲＮＡと比べて向上した安定性を有する。ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡは、５’末端及び／または３’末端で安定化される。ある特定の実施形態において、このような安定化ｃｒＲＮＡは、エキソヌクレアーゼ消化及び／またはエンドヌクレアーゼ消化に耐性がある。ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡは未修飾ｃｒＲＮＡと比べて、標的のＤＮＡまたはＲＮＡに対する改善した親和性を有する。ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡは、未修飾ｃｒＲＮＡと比べて標的のＤＮＡまたはＲＮＡに対する改善した選択性を有する。ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡは、未修飾ｃｒＲＮＡと比べて改善した細胞取り込みを有する。ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡは未修飾ｃｒＲＮＡと比べてＣＲＩＳＰＲシステムの遺伝子編集活性を高める。
【０００４】
ある特定の実施形態において、ｃｒＲＮＡ修飾により、標的のＤＮＡまたはＲＮＡに対する親和性が増加して修飾ｃｒＲＮＡを短縮することが可能となると同時に、標的ＤＮＡもしくはＲＮＡにハイブリダイズ及び／または他のＣＲＩＳＰＲシステム成分と会合するのに十分な親和性を保持することが可能となる。このように、ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡは、未修飾よりも短い。ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡは、３５〜４５個の連結ヌクレオシド長である。ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡは、３５〜４３個の連結ヌクレオシド長である。ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡは、３５〜４２個の連結ヌクレオシド長である。ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡは、３６〜４３個の連結ヌクレオシド長である。ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡは、３６〜４２個の連結ヌクレオシド長である。ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡは、３６〜４０個の連結ヌクレオシド長である。ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡの標的認識部分は１５〜２３個の連結ヌクレオシド長である。ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡの標的認識部分は１５〜２２個の連結ヌクレオシド長である。ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡの標的認識部分は１６〜２２個の連結ヌクレオシド長である。ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡの標的認識部分は１７〜２２個の連結ヌクレオシド長である。ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡの標的認識部分は１８〜２２個の連結ヌクレオシド長である。ある特定の実施形態において修飾ｃｒＲＮＡの標的認識部分は１６〜２０個の連結ヌクレオシド長である。ある特定の実施形態において修飾ｃｒＲＮＡの標的認識部分は１８〜２０個の連結ヌクレオシド長である。ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡのＣＲＩＳＰＲ修飾ｃｒＲＮＡ認識部分は１７〜２０個の連結ヌクレオシド長である。ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡのＣＲＩＳＰＲ修飾ｃｒＲＮＡ認識部分は１８〜２０個の連結ヌクレオシド長である。ある特定の実施形態において、このようなより短いｃｒＲＮＡは、より長いｃｒＲＮＡよりも改善した取り込み特性及び／または合成の容易性を有する。ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡはトランスフェクション試薬またはエレクトロポレーションなしで細胞に取り込まれる。ある特定のこのような実施形態において、細胞は、動物の中に存在する。ある特定の実施形態において、動物はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを発現する。ある特定の実施形態において、動物はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを発現する手段で予めまたは同時に処置される。ある特定のこのような実施形態において、このような処置にはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを送達するためのベクターの投与が含まれる。ある特定のこのような実施形態において、このようなベクターはウイルスベクター、例えばアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。ある特定のこのような実施形態において、ウイルスベクターは、ＡＡＶベクターに適合する細菌由来のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを発現する。ある特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼはＣｐｆ１ヌクレアーゼである。
【０００５】
ある特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲシステムは、標的遺伝子が編集された後に抑制される。ある特定のこのような実施形態において、細胞内の修飾ｃｒＲＮＡは、標的遺伝子が編集された後に分解される。ある特定のこのような実施形態において、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは細胞内で発現され続けるが、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼがヌクレアーゼ活性を示すにはｃｒＲＮＡが必要であるため、もはや活性ではない。ある特定のこのような実施形態において、ＣＲＩＳＰＲシステムのオフターゲット効果、例えばオフターゲット遺伝子の望まない切断などは、ヌクレアーゼ活性に必要な全ての成分が、例えばウイルスベクターによって無期限に発現され続けるＣＲＩＳＰＲシステムと比べて減少している。ある特定のこのような実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡの分解は、ｃｒＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションによって促進される。ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡの分解は、細胞に存在するヌクレアーゼによって促進される。
【０００６】
ある特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲシステムは、標的遺伝子が、細胞内のｔｒａｃｒＲＮＡの分解を介して編集された後に抑制される。ある特定のこのような実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡの分解は、ｔｒａｃｒＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドにハイブリダイゼーションすることによって促進される。ある特定の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡの分解は、細胞内に存在するヌクレアーゼによって促進される。
【０００７】
ある特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲシステムは、標的遺伝子がＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの発現抑制を介して編集された後に抑制される。ある特定のこのような実施形態において、ヌクレアーゼ遺伝子は、修飾ｃｒＲＮＡによって編集される。ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼ転写物は、ヌクレアーゼ転写物に相補的なオリゴヌクレオチドへのヌクレアーゼ転写物のハイブリダイゼーション後に分解される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】実施例１２に記載される修飾ｃｒＲＮＡによる、ＤＮＭＴ１の過剰な遺伝子編集を例証するゲルを示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
前述の一般的な説明及び以下の発明を実施するための形態はどちらも例示的かつ説明的なものにすぎず、特許請求される発明を限定するものではないと理解すべきである。本明細書において、単数形の使用は、別途明確に記述されない限り、複数形を含む。本明細書で使用されるとき、「ｏｒ（または）」の使用は、別途記述されない限り、「及び／または（ａｎｄ／ｏｒ）」を意味する。さらに、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（〜を含む）」という用語、ならびに「ｉｎｃｌｕｄｅｓ（〜を含む）」及び「ｉｎｃｌｕｄｅｄ（含まれる）」等の他の形態の使用は、限定的なものではない。また、「要素」または「成分」等の用語は、別途明確に記述されない限り、１つのユニットを含む要素及び成分、ならびに２つ以上のサブユニットを含む要素及び成分の両方を包含する。
【００１０】
本明細書で使用される節の見出しは、単に構成目的のものであり、記載される主題を限定するものと解釈されるべきではない。特許、特許出願、記事、書籍、及び論文を含むが、これらに限定されない本出願において引用されるすべての文書または文書の一部は、参照によりそれらの全体があらゆる目的のために本明細書に明確に組み込まれる。
【００１１】
定義
別途示されない限り、以下の用語は、以下の意味を有する。本明細書で使用する場合、「２’−デオキシヌクレオシド」は、天然のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）に見いだされるような２’−Ｈ（Ｈ）フラノシル糖部分を含有するヌクレオシドを意味する。ｃｒＲＮＡにおいて、２’−デオキシヌクレオシドは、修飾ヌクレオシドである。
【００１２】
本明細書で使用する場合、「２’−置換ヌクレオシド」または「２−修飾ヌクレオシド」は、２’−置換または２’−修飾糖部分を含有するヌクレオシドを意味する。本明細書で使用する場合、ｃｒＲＮＡにおける糖部分に関する「２’−置換」または「２−修飾」は、未修飾糖部分の２’−ＯＨの代わりに２’−置換基を含有するフラノシル糖部分を意味する。
【００１３】
本明細書で使用する場合、修飾オリゴヌクレオチドに関する「３’−安定化」は、少なくとも１つの安定化修飾を含む、または安定化コンジュゲート基に結合される修飾オリゴヌクレオチドを意味し、ここで少なくとも１つの修飾及び／またはコンジュゲート基は、少なくとも１つの安定化修飾を含まないか安定化コンジュゲート基に結合されない対応するオリゴヌクレオチドと比べて、細胞内または動物内の修飾オリゴヌクレオチドの３’末端の安定性を増大させる。ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡは３’−安定化である。ある特定のこのような実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡの３’末端ヌクレオシドには、安定化修飾が含まれる。ある特定の実施形態において、ｃｒＲＮＡの３’末端ヌクレオシド間連結は、安定化修飾を含む。
【００１４】
本明細書で使用する場合、修飾オリゴヌクレオチドに関する「５’−安定化」は、少なくとも１つの安定化修飾を含む、または安定化コンジュゲート基に結合される修飾オリゴヌクレオチドを意味し、ここで少なくとも１つの修飾及び／またはコンジュゲート基は、少なくとも１つの安定化修飾を含まないか安定化コンジュゲート基に結合されない対応するオリゴヌクレオチドと比べて、細胞内または動物内の修飾オリゴヌクレオチドの５’末端の安定性を増加させる。ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡは５’−安定化である。ある特定のこのような実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡの５’末端ヌクレオシドには、安定化修飾が含まれる。ある特定のこのような実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡの５’末端ヌクレオシドは、リンカーヌクレオシドである。
【００１５】
本明細書で使用されるとき、「二環ヌクレオシド」または「ＢＮＡ」とは、二環糖部分を含むヌクレオシドを意味する。本明細書で使用する場合、「二環糖」または「二環糖部分」は、２つの環を含有する修飾糖部分を意味し、ここで第２の環は、第１の環における原子の２つを結びつける架橋を介して形成されることにより、二環構造を形成する。ある特定の実施形態において、二環糖部分の第１の環は、フラノシル部分である。ある特定の実施形態において、二環糖部分はフラノシル部分を含まない。
【００１６】
本明細書で使用する場合、「細胞標的化部分」は、特定の細胞型（複数可）に結合することができるコンジュゲート基またはコンジュゲート基の部分を意味する。
【００１７】
本明細書で使用する場合、オリゴヌクレオチドに関して「相補的な」は、２つの核酸塩基配列が反対方向に整列している場合、そのようなオリゴヌクレオチドの核酸塩基配列またはその１つ以上の領域が、別のオリゴヌクレオチドまたは核酸もしくはその１つ以上の領域の核酸塩基配列と一致することを意味する。核酸塩基一致または相補的な核酸塩基は、本明細書に記載される場合、別に明記されない限り、アデニン（Ａ）及びチミン（Ｔ）、アデニン（Ａ）及びウラシル（Ｕ）、シトシン（Ｃ）及びグアニン（Ｇ）、ならびに５−メチルシトシン（ｍＣ）及びグアニン（Ｇ）に限定される。相補的なオリゴヌクレオチド及び／または核酸は、各ヌクレオシドで相補的な核酸塩基を持つ必要はない。むしろ、いくつかのミスマッチが許容される。本明細書で使用する場合、オリゴヌクレオチドに関して「完全に相補的な」または「１００％相補的な」は、このようなオリゴヌクレオチドが他のオリゴヌクレオチドまたは核酸に対して各ヌクレオシドで相補的であることを意味する。このような実施形態において、ミスマッチは許容されない。
【００１８】
本明細書で使用する場合、「コンジュゲート基」は親化合物、例えばオリゴヌクレオチドに直接的または間接的に結合する原子団を意味する。
【００１９】
本明細書で使用する場合、「コンジュゲートリンカー」は、親化合物、例えばオリゴヌクレオチドにコンジュゲート基を結合させる原子団を意味する。
【００２０】
本明細書で使用する場合、オリゴヌクレオチドの文脈において「連続的な」は、互いに直接隣接するヌクレオシド、核酸塩基、糖部分、またはヌクレオシド間結合を指す。例えば、「連続的な核酸塩基」は、互いに直接隣接する核酸塩基を意味する。
【００２１】
本明細書で使用する場合、「ｃｒＲＮＡ」または「ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ」は、標的認識部分及びＣＲＩＳＰＲ認識部分を含むオリゴヌクレオチドを意味する。本明細書で使用する場合、「標的認識部分」はＤＮＡまたはＲＮＡの標的に相補的な核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの部分を意味する。本明細書で使用する場合、「ＣＲＩＳＰＲ認識部分」はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに結合、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと会合、またはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼとの結合もしくは会合に寄与することができるオリゴヌクレオチドの一部分、またはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに結合もしくはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと会合する分子である。ｃｒＲＮＡのＣＲＩＳＰＲ認識部分は、ｃｒＲＮＡの標的認識部分のＤＮＡまたはＲＮＡの標的に相補的ではない。したがってｃｒＲＮＡの標的認識部分はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと会合し得るが、ｃｒＲＮＡの標的認識及びＣＲＩＳＰＲ認識部分は重複しない。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ｃｒＲＮＡと直接的または間接的に会合し、そして標的のＤＮＡまたはＲＮＡを分解するタンパク質である。ある特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼはＣｐｆ１ヌクレアーゼである。ある特定のこのような実施形態において、ｃｒＲＮＡのＣＲＩＳＰＲ認識部分はＣｐｆ１ヌクレアーゼに結合またはＣｐｆ１ヌクレアーゼと会合する。ある特定の実施形態において、ｃｒＲＮＡのＣＲＩＳＰＲ認識部分はｔｒａｃｒＲＮＡに結合またはｔｒａｃｒＲＮＡと会合する。ある特定の実施形態において、ｃｒＲＮＡには自己相補的な領域が含まれる。ある特定のこのような実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ認識部分は、自己相補的な領域と部分的に、または完全に重複する。ある特定の実施形態において、ｃｒＲＮＡには１個以上のリンカーヌクレオシドが含まれる。
【００２２】
本明細書で使用する場合、ｃｒＲＮＡの文脈において「リンカーヌクレオシド」は、ｃｒＲＮＡの標的認識部分及び／またはＣＲＩＳＰＲ認識部分に連結する１個以上のヌクレオシドを意味する。リンカーヌクレオシドは、ｃｒＲＮＡの標的認識部分またはＣＲＩＳＰＲ認識部分のいずれの部分でもない。ある特定の実施形態において、このようなリンカーヌクレオシドは、ｃｒＲＮＡの５’末端、ｃｒＲＮＡの３’末端、及び／またはｃｒＲＮＡの標的認識部分及びＣＲＩＳＰＲ認識部分の間に位置する。
【００２３】
本明細書で使用する場合、オリゴヌクレオチドに関して「完全修飾」は、各糖部分が修飾されている修飾オリゴヌクレオチドを意味する。オリゴヌクレオチドに関して「均一に修飾された」とは、各糖部分のそれぞれの少なくとも１つの修飾が同じである完全修飾オリゴヌクレオチドを意味する。例えば、均一に修飾されたオリゴヌクレオチドのヌクレオシドは、それぞれ２’−ＭＯＥ修飾であるが、異なる核酸塩基を有することができ、そしてヌクレオシド間結合は異なっても良い。
【００２４】
本明細書で使用する場合、「遺伝子編集」はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び修飾または未修飾のｃｒＲＮＡを含む複合体によって媒介される任意のプロセスを意味し、これには遺伝子ノックダウン、遺伝子ノックアウト、遺伝子破壊、欠失、挿入、及び遺伝子活性化が含まれるが、これらに限定されない。
【００２５】
本明細書で使用する場合、「ハイブリダイゼーション」はオリゴヌクレオチド及び／または核酸に相補的な対形成またはアニーリングを意味する。特定の機構に限定されないが、最も一般的なハイブリダイゼーションの機構には水素結合が含まれ、これは相補的な核酸塩基間のワトソン・クリック型、フーグスティーン型、または逆フーグスティーン型の水素結合であっても良い。
【００２６】
本明細書で使用する場合、修飾オリゴヌクレオチドによって媒介される効果に関して「増加する」は、ある特定の修飾を含まない対応するオリゴヌクレオチドの存在下の効果より、ある特定の修飾を含むオリゴヌクレオチドの存在下でその効果がより高まることを意味する。
【００２７】
本明細書で使用する場合、用語「ヌクレオシド間結合」は、オリゴヌクレオチドにおいて隣接するヌクレオシド間の共有結合を形成する基を意味する。本明細書で使用する場合、「修飾ヌクレオシド間結合」は、天然のリン酸ヌクレオシド間結合以外の任意のヌクレオシド間結合を意味する。天然の非リン酸結合は、修飾ヌクレオシド間結合として本明細書で称される。「ホスホロチオエート結合」は、リン酸結合のホスホジエステル結合が、非架橋酸素原子の１つを硫黄原子で置換することによって修飾されているヌクレオシド間の結合を意味する。ホスホロチオエート結合は、修飾ヌクレオシド間結合である。
【００２８】
本明細書で使用する場合、「直鎖状修飾糖」または「直鎖状修飾糖部分」は、非環式または非架橋修飾を含む修飾糖部分を意味する。このような直鎖状修飾は二環糖修飾とは異なる。
【００２９】
本明細書で使用する場合、「連結ヌクレオシド」とは、連続配列で連結（すなわち、連結されたものの間に追加のヌクレオシドが存在しない）及びそれらがヌクレオシド間結合によって連結されているヌクレオシドである。
【００３０】
本明細書で使用する場合、「ミスマッチ」は第１及び第２のオリゴマー化合物が整列している場合に、第２のオリゴヌクレオチドまたは標的核酸の対応する核酸塩基と対形成することができない第１のオリゴヌクレオチドの核酸塩基を意味する。
【００３１】
本明細書で使用する場合、「ＭＯＥ」は、メトキシエチルを意味する。「２’−ＭＯＥ」は、フラノシル環の２’位の−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３基を意味する。
【００３２】
本明細書で使用する場合、「モチーフ」は、オリゴヌクレオチドにおける、未修飾及び／または修飾の糖部分、核酸塩基及び／またはヌクレオシド間結合を意味する。
【００３３】
本明細書で使用する場合、「天然の」は自然に存在していることを意味する。
【００３４】
本明細書で使用する場合、「核酸塩基」は第２の異なる核酸塩基と対形成することができる複素環部分を意味する。本明細書で使用する場合、「核酸塩基配列」は、任意の糖またはヌクレオシド結合修飾と関係のない連続的な核酸塩基の順序を意味する。本明細書で使用する場合、「修飾核酸塩基」は、５つの未修飾核酸塩基として本明細書に定義されるアデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）及びグアニン（Ｇ）以外の核酸塩基を意味する。ユニバーサル塩基は、５つの未修飾核酸塩基の任意の１つと対形成できる核酸塩基である。
【００３５】
本明細書で使用する場合、「ヌクレオシド」は、核酸塩基及び糖部分を含有する化合物を意味する。核酸塩基及び糖部分はそれぞれ、独立して修飾されないか、または修飾される。本明細書で使用する場合、「修飾ヌクレオシド」は、修飾核酸塩基及び／または修飾糖部分を含有するヌクレオシドを意味する。修飾ヌクレオシドには脱塩基ヌクレオシドが含まれる。
【００３６】
本明細書で使用する場合、「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオシド間結合を介して結合した一本鎖の連結ヌクレオシドを意味し、ここで各ヌクレオシド及びヌクレオシド間結合は修飾されてもまたは修飾されなくても良い。別に示されない限り、オリゴヌクレオチドは８〜５０個の連結ヌクレオシドから成る。本明細書で使用する場合、「修飾オリゴヌクレオチド」は、少なくとも１つのヌクレオシドまたはヌクレオシド間結合が修飾されている、オリゴヌクレオチドを意味する。本明細書で使用する場合、「未修飾オリゴヌクレオチド」は、いずれのヌクレオシド修飾またはヌクレオシド間修飾も含まないオリゴヌクレオチドを意味する。
【００３７】
本明細書で使用されるとき、「薬剤的に許容される担体または希釈剤」とは、動物への投与における使用に好適な任意の物質を意味する。ある特定のそのような担体は、医薬組成物を、例えば、対象による経口摂取のための丸剤、錠剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液、及びトローチ剤として製剤化することを可能にする。
【００３８】
「薬学的に許容される塩」とは、オリゴマー化合物などの化合物の生理学的かつ薬学的に許容される塩、すなわち、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、かつそれに望ましくない毒物学的影響を与えない塩を意味する。
【００３９】
本明細書で使用する場合、「医薬組成物」とは、対象への投与に適した物質の混合物を意味する。例えば、医薬組成物はｃｒＲＮＡ化合物及び滅菌水溶液を含み得る。ある特定の実施形態において、医薬組成物は、ある特定の細胞株での自由取り込みアッセイ（ｆｒｅｅ  ｕｐｔａｋｅ  ａｓｓａｙ）において活性を示す。
【００４０】
本明細書で使用する場合、「リン部分」は、リン原子を含む原子団を意味する。ある特定の実施形態において、リン部分には、モノ−、ジ−、もしくはトリ−リン酸またはホスホロチオエートが含まれる。
【００４１】
本明細書で使用する場合、「プロドラッグ」とは、内因性酵素または他の化学物質及び／または条件の生理学的作用により、体内またはその細胞内で活性形態に変換される不活性形態の治療薬を意味する。
【００４２】
本明細書で使用する場合、オリゴヌクレオチドに関して「自己相補的な」とは、それ自体に対して少なくとも部分的に相補的であるオリゴヌクレオチドを意味する。ある特定の実施形態において、自己相補的なオリゴヌクレオチドは、自己相補的なオリゴヌクレオチドの一部がそれ自体に対してハイブリダイズする場合、ヘアピンを形成する。
【００４３】
本明細書で使用する場合、「糖部分」は、他の基に核酸塩基を結合させることができる原子団、例えばヌクレオシド間結合、コンジュゲート基、または末端基を意味する。ある特定の実施形態において、糖部分は核酸塩基に結合してヌクレオシドを形成する。本明細書で使用する場合、ｃｒＲＮＡの文脈における「未修飾糖部分」は、ＲＮＡで見られるような２’−ＯＨ（Ｈ）フラノシル部分を意味する。未修飾糖部分は１’、３’、及び４’位のそれぞれに１個の水素、３’位に１個の酸素、５’位に２個の水素を有する。本明細書で使用する場合、「修飾糖部分」または「修飾糖」は、未修飾糖部分に対して任意の置換を含有する糖代替物またはフラノシル部分を意味する。ある特定の実施形態において、修飾糖部分は２’−置換糖部分である。このような修飾糖部分には二環糖及び直鎖状の修飾糖が含まれる。
【００４４】
本明細書で使用する場合、「糖代替物」は、別の基（例えばヌクレオシド間結合、コンジュゲート基、または末端基）に核酸塩基を連結することができる、フラノシル糖部分以外を有する修飾糖部分を意味する。糖代替物を含む修飾ヌクレオシドは、オリゴヌクレオチド内の１つ以上の位置に組み込まれ得る。ある特定の実施形態においてこのようなオリゴヌクレオチドは、相補的なオリゴマー化合物または核酸にハイブリダイズすることができる。
【００４５】
本明細書で使用する場合、「標的核酸」、「標的ＲＮＡ」、「標的ＤＮＡ」、「標的遺伝子」及び「核酸標的」は、ｃｒＲＮＡの標的認識部分に対して核酸が相補的であることを意味する。ある特定のこのような実施形態において、ｃｒＲＮＡは、標的核酸に作用するように設計される。「オフターゲット遺伝子」は、ｃｒＲＮＡが作用するように設計されていない遺伝子である。ある特定の実施形態において、オフターゲット遺伝子の編集は、有害である。
【００４６】
本明細書で使用する場合、「末端基」は、オリゴヌクレオチドの末端に共有結合する、化学基または原子団を意味する。
【００４７】
［ＣＲＩＳＰＲシステム及びＣＲＩＳＰＲシステムに使用するためのある特定のオリゴヌクレオチド］
ある特定のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）
ある特定の実施形態において、本発明はＣＲＩＳＰＲに使用するための修飾オリゴヌクレオチドを提供する。典型的に、ＣＲＩＳＰＲは標的のＤＮＡまたはＲＮＡにハイブリダイズし、標的のＤＮＡまたはＲＮＡを分解するヌクレアーゼを直接的または間接的に補充するＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を使用する。したがって、このようなシステムのｃｒＲＮＡは、以下の２つの機能、すなわち（１）標的ＤＮＡまたはＲＮＡの認識及びハイブリダイゼーション、ならびに（２）ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを補充する分子による認識を有する。典型的に、このようなシステムにおいてｃｒＲＮＡには、これらの２つの機能に対応する２つの部分、すなわち標的認識部分及びＣＲＩＳＰＲ認識部分が含まれる。本発明は、ｃｒＲＮＡとして使用され得る修飾オリゴヌクレオチドを提供する。このような修飾オリゴヌクレオチドは、標的認識部分及び／またはＣＲＩＳＰＲ認識部分に修飾を有し得る。
【００４８】
ある特定の実施形態において、ｃｒＲＮＡのＣＲＩＳＰＲ認識部分は、細菌性生物由来の直接反復配列の一部を含み、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼまたはＣｐｆ１オーソログを有する。ある特定のこのような実施形態において、ｃｒＲＮＡのＣＲＩＳＰＲ認識部分は、下表から選択される配列を含む。ある特定の実施形態において、ｃｒＲＮＡのＣＲＩＳＰＲ認識部分は、下表から選択される配列の１６、１７、１８、１９、または２０個の核酸塩基を含む。ある特定の実施形態において、ｃｒＲＮＡのＣＲＩＳＰＲ認識部分は、下表から選択される配列の１６、１７、１８、１９、または２０個の核酸塩基を含む。
【表１−１】
2020503017.tif 000003
【００４９】
ある特定の実施形態において、ｃｒＲＮＡの標的認識部分は、標的ＤＮＡに相補的な核酸塩基配列を含む。ある特定のこのような実施形態において、標的認識部分の全体の核酸塩基配列は、標的ＤＮＡに相補的である。ある特定の実施形態において、標的認識部分の核酸塩基配列は、標的ＤＮＡに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％相補的である。ある特定の実施形態において、標的ＤＮＡは、ＤＮＭＴ１遺伝子である。ある特定の実施形態において、標的ＤＮＭＴ１遺伝子の核酸塩基配列は、本明細書で配列番号６６として称される核酸塩基１５０６４２４〜１５６９０１３から切り取られたＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＮＴ＿０１１２９５．１０である。ある特定の実施形態において、標的ＤＮＡは、ＧＲＩＮ２Ｂ遺伝子である。ある特定の実施形態において、標的ＧＲＩＮ２Ｂ遺伝子の核酸塩基配列は、本明細書で配列番号６７として称される核酸塩基１３５３４００１〜１３９８５０００から切り取られたＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＮＣ＿００００１２．１２である。ある特定の実施形態において、標的ＤＮＡは、ＬＤＬＲ遺伝子である。ある特定の実施形態において、標的ＬＤＬＲ遺伝子の核酸塩基配列は、本明細書で配列番号６８として称される、核酸塩基１１０８６００１〜１１１３７０００から切り取られたＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＮＣ＿００００１９．１０である。ある特定の実施形態において、標的ＤＮＡは、補体第５成分（Ｃ５）遺伝子である。ある特定の実施形態において、標的Ｃ５遺伝子の核酸塩基配列は、本明細書で配列番号６９として称される核酸塩基１２０９４９００１〜１２１０７８０００から切り取られたＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＮＣ＿０００００９．１２である。ある特定の実施形態において、標的ＤＮＡは、ｅｍｐｔｙ  ｓｐｉｒａｃｌｅｓ  ｈｏｍｏｌｏｇ１（ＥＭＸ１）遺伝子である。ある特定の実施形態において、標的ＥＭＸ１遺伝子の核酸塩基配列は、本明細書で配列番号７０として称される核酸塩基７２９０８００１〜７２９４００００から切り取られたＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＮＣ＿０００００２．１２である。
【００５０】
ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡは、標的認識部分、ＣＲＩＳＰＲ認識部分、及びリンカーヌクレオシドを含む。リンカーヌクレオシドは、ｃｒＲＮＡの標的認識部分またはＣＲＩＳＰＲ認識部分の一部ではない。ある特定の実施形態において、リンカーヌクレオシドはヌクレアーゼを安定にするために修飾される。ある特定のこのような実施形態において、リンカーヌクレオシドはエキソヌクレアーゼを安定にする。ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡはリンカーヌクレオシドを含まない。ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡは２つのリンカーヌクレオシドを含む。
【００５１】
ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡはＣＲＩＳＰＲ認識部分、標的認識部分及び、任意選択で１つ以上のリンカーヌクレオシドを含む。ＣＲＩＳＰＲ認識部分及び標的認識部分ならびに任意選択のリンカーヌクレオシドは、下記に示すように互いに対して任意の配向であって良く、ここで「ＣＲ」はＣＲＩＳＰＲ認識部分であり、「Ｔａ」は、標的認識部分であり、「Ｌｎ」はリンカーヌクレオシド（複数可）である。ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡは以下の形態の１つによって表される。
５’−ＣＲ−Ｔａ−３’
５’−Ｌｎ−ＣＲ−Ｔａ−３’
５’−ＣＲ−Ｔａ−Ｌｎ−３’
５’−Ｌｎ−ＣＲ−Ｔａ−Ｌｎ−３’
５’−ＣＲ−Ｌｎ−Ｔａ−３’
５’−Ｌｎ−ＣＲ−Ｌｎ−Ｔａ−３’
５’−Ｌｎ−ＣＲ−Ｌｎ−Ｔａ−Ｌｎ−３’
５’−Ｔａ−ＣＲ−３’
５’−Ｔａ−ＣＲ−Ｌｎ−３’  
５’−Ｌｎ−Ｔａ−ＣＲ−３’
５’−Ｌｎ−Ｔａ−ＣＲ−Ｌｎ−３’
５’−Ｔａ−Ｌｎ−ＣＲ−Ｌｎ−３’
５’−Ｔａ−Ｌｎ−ＣＲ−３’
５’−Ｌｎ−Ｔａ−Ｌｎ−ＣＲ−Ｌｎ−３’
【００５２】
ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡを含有する化合物は、コンジュゲート基を含む。ある特定のこのような実施形態において、コンジュゲート基は修飾ｃｒＲＮＡの５’末端に結合される。ある特定の実施形態において、コンジュゲート基は修飾ｃｒＲＮＡの３’末端に結合される。ある特定の実施形態において、コンジュゲート基は修飾ｃｒＲＮＡのヌクレオシド内またはヌクレオシド間結合に結合される。
【００５３】
ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡは５’−安定化及び／または３’−安定化である。ある特定のこのような実施形態において、５’−または３’−安定化ｃｒＲＮＡの５’−または３’末端ヌクレオシドは、それぞれ安定化修飾を含む。ある特定の実施形態において、安定化修飾を含有するヌクレオシドは、ＣＲＩＳＰＲ認識部分の末端ヌクレオシドである。ある特定の実施形態において、安定化修飾を含有するヌクレオシドは、標的認識部分の末端ヌクレオシドである。ある特定の実施形態において、安定化修飾を含有するヌクレオシドは、リンカーヌクレオシドである。ある特定の実施形態において、５’−または３’−安定化ｃｒＲＮＡは、それぞれ５’−または３’末端の安定化コンジュゲート基に結合される。ある特定のこのような実施形態において、コンジュゲート基は切断可能な部分を含まない。
【００５４】
ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡは、修飾オリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡは修飾オリゴヌクレオチドから成る。本明細書に記載される修飾オリゴヌクレオチドは、ｃｒＲＮＡとしての使用に適している。
【００５５】
ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡは以下の特徴の少なくとも３つを含む：
ａ．修飾ｃｒＲＮＡのＣＲＩＳＰＲ認識部分の５’末端に連結される２つのリンカーヌクレオシド；
ｂ．独立して２’−Ｆまたは２’−Ｈ（Ｈ）修飾糖部分を含有する、修飾ｃｒＲＮＡの標的認識部分の５’末端から１番目、８番目、及び／または９番目のヌクレオシド；
ｃ．修飾ｃｒＲＮＡの３’及び５’末端のそれぞれにおける少なくとも１つの末端ホスホロチオエートヌクレオシド間結合
ｄ．未修飾糖部分を含む、ＣＲＩＳＰＲ認識部分の各ヌクレオシド
ｅ．独立して選択される修飾糖部分を含む、修飾ｃｒＲＮＡの１〜５個の３’末端ヌクレオシド。
ある特定のこのような実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡは特徴（ｂ）、（ｄ）、及び（ｅ）を含む。ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡは特徴（ｂ）、（ｃ）、及び（ｅ）を含む。ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡは特徴（ｂ）、（ｃ）、及び（ｄ）を含む。ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡは特徴（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）を含む。ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡは特徴（ａ）、（ｂ）、及び（ｅ）を含む。ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡは特徴（ａ）、（ｃ）、及び（ｅ）を含む。ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡは特徴（ａ）、（ｂ）、及び（ｄ）を含む。ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡは特徴（ａ）、（ｂ）、（ｄ）及び（ｅ）を含む。ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡは特徴（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｅ）を含む。ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡは特徴（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）を含む。
【００５６】
ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡは以下の特徴の少なくとも３つを含む：
ａ．修飾ｃｒＲＮＡのＣＲＩＳＰＲ認識部分の５’末端に連結される２つのリンカーヌクレオシド；
ｂ．独立して２’−Ｆまたは２’−Ｈ（Ｈ）修飾糖部分を含有する、修飾ｃｒＲＮＡの標的認識部分の５’末端から１番目、８番目、及び／または９番目のヌクレオシド；
ｃ．修飾ｃｒＲＮＡの３’及び５’末端のそれぞれにおける少なくとも１つの末端ホスホロチオエートヌクレオシド間結合
ｄ．修飾糖部分を含む、ＣＲＩＳＰＲ認識部分の３’末端から５、６、７、８、１１、または１２の位置の少なくとも１つのヌクレオシド
ｅ．独立して選択される修飾糖部分を含む、修飾ｃｒＲＮＡの１〜５個の３’末端ヌクレオシド。
ある特定のこのような実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡは特徴（ｂ）、（ｄ）、及び（ｅ）を含む。ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡは特徴（ｂ）、（ｃ）、及び（ｅ）を含む。ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡは特徴（ｂ）、（ｃ）、及び（ｄ）を含む。ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡは特徴（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）を含む。ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡは特徴（ａ）、（ｂ）、及び（ｅ）を含む。ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡは特徴（ａ）、（ｃ）、及び（ｅ）を含む。ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡは特徴（ａ）、（ｂ）、及び（ｄ）を含む。ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡは特徴（ａ）、（ｂ）、（ｄ）及び（ｅ）を含む。ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡは特徴（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｅ）を含む。ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡは特徴（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）を含む。
【００５７】
ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡは下表に掲載される特徴（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、及び（ｅ）の任意の組み合わせを含み、ここで１つの選択が（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、及び（ｅ）のそれぞれに対してなされる。
【表１−２】
2020503017.tif 000004
【表１−３】
2020503017.tif 000005
【００５８】
ある特定の修飾オリゴヌクレオチドは、１つ以上の不斉中心を有するため、エナンチオマー、ジアステレオマー、及び糖のアノマーなどの（Ｒ）もしくは（Ｓ）のように、またはアミノ酸などの（Ｄ）もしくは（Ｌ）のように絶対立体化学の観点から定義され得る他の立体異性体配置をもたらす。本明細書で提供される修飾オリゴヌクレオチドには、別様に明記しない限り、これらのラセミ体及び工学的に純粋な形態を含む、全てのこのような可能性のある異性体が含まれる。同様に全てのシス異性体及びトランス異性体ならびに互変異性形態も含まれる。
【００５９】
ある特定の実施形態において、このような修飾オリゴヌクレオチドには本明細書に記載の修飾糖部分、修飾核酸塩基、修飾ヌクレオシド間結合、モチーフ、及び／または長さの任意の組み合わせが含まれ得る。
【００６０】
［修飾ｃｒＲＮＡを含む、ある特定の使用方法］
ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡを含有する化合物と細胞を接触させることを含む方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法である。ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡを含有する化合物と細胞を接触させることを含む方法は、ｅｘ  ｖｉｖｏでの方法である。ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡを含有する化合物と細胞を接触させることを含む方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの方法である。
【００６１】
種々のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ変異体には、天然及び遺伝子改変型の両方が、本明細書に記載される方法に使用可能である。このような変異体には、遺伝子活性化など標的核酸切断を必要としない用途に使用される不活性ヌクレアーゼ変異体、及びＡＡＶベクターなどのある特定のベクターでの発現に適切な切断型ヌクレアーゼ変異体が含まれるが、これらに限定されない。ある特定のこのような実施形態において、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ変異体は、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ変異体である。
【００６２】
ある特定の実施形態において、細胞を、修飾ｃｒＲＮＡを含有する化合物と接触させることを含む方法には、標的遺伝子を編集した後に、その細胞を第２の化合物と接触させてＣＲＩＳＰＲシステムを抑制（または遮断）することがさらに含まれる。
【００６３】
ある特定の実施形態において、細胞を、修飾ｃｒＲＮＡを含有する化合物と接触させることを含む遺伝子編集方法は、本発明の修飾ｃｒＲＮＡの代わりに未修飾ｃｒＲＮＡを使用する遺伝子編集方法より少ない及び／またはいっそう少ない有害性のオフターゲット効果をもたらす。
【００６４】
本開示には、以下の番号付けされた実施形態が含まれる。
実施形態１．３５〜４５個の連結ヌクレオシドからなる修飾ｃｒＲＮＡを含む化合物。
【００６５】
実施形態２．修飾ｃｒＲＮＡを含む化合物であって、前記修飾ｃｒＲＮＡのＣＲＩＳＰＲ認識部分が１７〜２０個の連結ヌクレオシドからなる、前記化合物。
【００６６】
実施形態３．修飾ｃｒＲＮＡを含む化合物であって、前記修飾ｃｒＲＮＡの標的認識部分が１８〜２３個の連結ヌクレオシドからなる、前記化合物。
【００６７】
実施形態４．修飾ｃｒＲＮＡを含む化合物であって、前記修飾ｃｒＲＮＡが少なくとも１個のリンカーヌクレオシドを含む、前記化合物。
【００６８】
実施形態５．５’−安定化修飾ｃｒＲＮＡを含む化合物。
【００６９】
実施形態６．前記化合物が安定化コンジュゲート基を含む、実施形態１〜５のいずれかに記載の化合物。
【００７０】
実施形態７．前記ｃｒＲＮＡが安定化修飾を含有する少なくとも１個のリンカーヌクレオシドを含む、実施形態１〜５のいずれかに記載の化合物。
【００７１】
実施形態８．前記修飾ｃｒＲＮＡが５’−安定化である、実施形態１〜４のいずれかに記載の化合物。
【００７２】
実施形態９．前記修飾ｃｒＲＮＡが３’−安定化である、実施形態１〜８のいずれかに記載の化合物。
【００７３】
実施形態１０．前記修飾ｃｒＲＮＡの前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分がＣｐｆ１ヌクレアーゼに結合する、実施形態１〜９のいずれかに記載の化合物。
【００７４】
実施形態１１．前記修飾ｃｒＲＮＡの前記標的認識部分が、標的のＤＮＡまたはＲＮＡに対する前記ｃｒＲＮＡの親和性を増加させる少なくとも１つの修飾を含む、実施形態１〜１０のいずれかに記載の化合物。
【００７５】
実施形態１２．前記修飾ｃｒＲＮＡの前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分が、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼに対する前記ｃｒＲＮＡの親和性を増加させる少なくとも１つの修飾を含む、実施形態１０〜１１のいずれかに記載の化合物。
【００７６】
実施形態１３．前記修飾ｃｒＲＮＡの少なくとも１つの核酸塩基がチミンである、実施形態１〜１２のいずれかに記載の化合物。
【００７７】
実施形態１４．前記修飾ｃｒＲＮＡの少なくとも１つの核酸塩基が修飾核酸塩基である、実施形態１〜１３のいずれかに記載の化合物。
【００７８】
実施形態１５．前記修飾核酸塩基が５−メチルシトシンである、実施形態１４に記載の化合物。
【００７９】
実施形態１６．前記修飾ｃｒＲＮＡが３５〜４２個の連結ヌクレオシドから成る、実施形態１〜１５のいずれかに記載の化合物。
【００８０】
実施形態１７．前記修飾ｃｒＲＮＡが３６〜４０個の連結ヌクレオシドから成る、実施形態１〜１５のいずれかに記載の化合物。
【００８１】
実施形態１８．前記修飾ｃｒＲＮＡが少なくとも２個のリンカーヌクレオシドを含む、実施形態１〜１７のいずれかに記載の化合物。
【００８２】
実施形態１９．少なくとも２個のリンカーヌクレオシドが前記修飾ｃｒＲＮＡ．の前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分に連結される、実施形態１８に記載の化合物。
【００８３】
実施形態２０．少なくとも２個のリンカーヌクレオシドが前記修飾ｃｒＲＮＡの前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の５’末端に連結される、実施形態１９に記載の化合物。
【００８４】
実施形態２１．前記修飾ｃｒＲＮＡの前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分が１８〜２０個の連結ヌクレオシドから成る、実施形態１〜２０のいずれかに記載の化合物。
【００８５】
実施形態２２．前記修飾ｃｒＲＮＡの前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分が１８個の連結ヌクレオシドから成る、実施形態２１に記載の化合物。
【００８６】
実施形態２３．前記修飾ｃｒＲＮＡの前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分が１９個の連結ヌクレオシドから成る、実施形態２１に記載の化合物。
【００８７】
実施形態２４．前記修飾ｃｒＲＮＡの前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分が２０個の連結ヌクレオシドから成る、実施形態２１に記載の化合物。
【００８８】
実施形態２５．前記修飾ｃｒＲＮＡの前記標的認識部分が１８〜２２個の連結ヌクレオシドから成る、実施形態１〜２４のいずれかに記載の化合物。
【００８９】
実施形態２６．前記修飾ｃｒＲＮＡの前記標的認識部分が１８〜２２個の連結ヌクレオシドから成る、実施形態１〜２４のいずれかに記載の化合物。
【００９０】
実施形態２７．前記修飾ｃｒＲＮＡの前記標的認識部分が１８個の連結ヌクレオシドから成る、実施形態２６に記載の化合物。
【００９１】
実施形態２８．前記修飾ｃｒＲＮＡの前記標的認識部分が１９個の連結ヌクレオシドから成る、実施形態２６に記載の化合物。
【００９２】
実施形態２９．前記修飾ｃｒＲＮＡの前記標的認識部分が２０個の連結ヌクレオシドから成る、実施形態２６に記載の化合物。
【００９３】
実施形態３０．前記修飾ｃｒＲＮＡの少なくとも１つのヌクレオシド間結合が、修飾ヌクレオシド間結合である、実施形態１〜２９のいずれかに記載の化合物。
【００９４】
実施形態３１．少なくとも１つのヌクレオシド間結合がホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、実施形態３０に記載の化合物。
【００９５】
実施形態３２．前記修飾ｃｒＲＮＡの各ヌクレオシド間結合が修飾ヌクレオシド間結合である、実施形態３０または３１に記載の化合物。
【００９６】
実施形態３３．少なくとも１つのヌクレオシド間結合が、中性のヌクレオシド間結合である、実施形態３０〜３２のいずれかに記載の化合物。
【００９７】
実施形態３４．少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合がメトキシプロピル基を含む、実施形態３３に記載の化合物。
【００９８】
実施形態３５．少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合がホスホノ酢酸を含む、実施形態３３に記載の化合物。
【００９９】
実施形態３６．少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合がメチルホスホン酸を含む、実施形態３３に記載の化合物。
【０１００】
実施形態３７．前記修飾ｃｒＲＮＡの各ヌクレオシド間結合がホスホジエステルヌクレオシド間結合またはホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、実施形態１〜３１のいずれかに記載の化合物。
【０１０１】
実施形態３８．前記修飾ｃｒＲＮＡの少なくとも２つのヌクレオシド間結合が修飾ヌクレオシド間結合である、実施形態３０、３１、または３３〜３７のいずれかに記載の化合物。
【０１０２】
実施形態３９．前記修飾ｃｒＲＮＡの少なくとも２つの修飾ヌクレオシド間結合が互いに同じである、実施形態３８に記載の化合物。
【０１０３】
実施形態４０．前記修飾ｃｒＲＮＡが、前記修飾ｃｒＲＮＡの５’末端に１〜５個の連続的なホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む、実施形態１〜３９のいずれかに記載の化合物。
【０１０４】
実施形態４１．前記修飾ｃｒＲＮＡが、前記修飾ｃｒＲＮＡの５’末端に１個のホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む、実施形態４０に記載の化合物。
【０１０５】
実施形態４２．前記修飾ｃｒＲＮＡが前記修飾ｃｒＲＮＡの５’末端に２つの連続的なホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む、実施形態４０に記載の化合物。
【０１０６】
実施形態４３．前記修飾ｃｒＲＮＡが、修飾ヌクレオシド間結合によって前記修飾ｃｒＲＮＡの前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分に連結される、少なくとも１個のリンカーヌクレオシドを含む、実施形態１〜４２のいずれかに記載の化合物。
【０１０７】
実施形態４４．前記修飾ｃｒＲＮＡの前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分に、少なくとも１個のリンカーヌクレオシドで連結する前記修飾ヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、実施形態４３に記載の化合物。
【０１０８】
実施形態４５．前記修飾ｃｒＲＮＡが２個のリンカーヌクレオシドを含む、実施形態４４に記載の化合物。
【０１０９】
実施形態４６．前記リンカーヌクレオシドが、修飾ヌクレオシド間結合によって互いに連結される、実施形態４５に記載の化合物。
【０１１０】
実施形態４７．互いに前記リンカーヌクレオシドを連結する前記修飾ヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、実施形態４６に記載の化合物。
【０１１１】
実施形態４８．前記修飾ｃｒＲＮＡが２つを超えるリンカーヌクレオシドを含む、実施形態４３〜４４のいずれかに記載の化合物。
【０１１２】
実施形態４９．前記修飾ｃｒＲＮＡが前記修飾ｃｒＲＮＡの前記標的認識部分内に１〜６個の修飾ヌクレオシド間結合を含む、実施形態１〜４８のいずれかに記載の化合物。
【０１１３】
実施形態５０．前記修飾ｃｒＲＮＡの前記標的認識部分内の前記１〜６個の修飾ヌクレオシド間結合が連続的である、実施形態４９に記載の化合物。
【０１１４】
実施形態５１．前記修飾ｃｒＲＮＡの前記標的認識部分内の前記１〜６個の修飾ヌクレオシド間結合が、未修飾のヌクレオシド間結合と交互に生じる、実施形態４９に記載の化合物。
【０１１５】
実施形態５２．前記修飾ｃｒＲＮＡの前記標的認識部分の３’末端が前記１〜６個の修飾ヌクレオシド間結合を含む、実施形態４９〜５１のいずれかに記載の化合物。
【０１１６】
実施形態５３．前記修飾ｃｒＲＮＡの前記標的認識部分が１つの修飾ヌクレオシド間結合を含む、実施形態５０〜５２のいずれかに記載の化合物。
【０１１７】
実施形態５４．前記修飾ｃｒＲＮＡの前記標的認識部分が２つの修飾ヌクレオシド間結合を含む、実施形態５０〜５２のいずれかに記載の化合物。
【０１１８】
実施形態５５．前記修飾ｃｒＲＮＡの前記標的認識部分が３つの修飾ヌクレオシド間結合を含む、実施形態５０〜５２のいずれかに記載の化合物。
【０１１９】
実施形態５６．前記修飾ｃｒＲＮＡの前記標的認識部分が４つの修飾ヌクレオシド間結合を含む、実施形態５０〜５２のいずれかに記載の化合物。
【０１２０】
実施形態５７．前記修飾ｃｒＲＮＡの前記標的認識部分が５つの修飾ヌクレオシド間結合を含む、実施形態５０〜５２のいずれかに記載の化合物。
【０１２１】
実施形態５８．前記修飾ｃｒＲＮＡの前記標的認識部分が６つの修飾ヌクレオシド間結合を含む、実施形態５０〜５２のいずれかに記載の化合物。
【０１２２】
実施形態５９．前記修飾ｃｒＲＮＡの前記標的認識部分内の少なくとも１つのヌクレオシド間結合がホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、実施形態４９〜５８のいずれかに記載の化合物。
【０１２３】
実施形態６０．前記修飾ｃｒＲＮＡの前記標的認識部分内のすべての前記修飾ヌクレオシド間結合がホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、実施形態４９〜５８のいずれかに記載の化合物。
【０１２４】
実施形態６１．前記修飾ｃｒＲＮＡの前記標的認識部分が、前記修飾ｃｒＲＮＡの前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の３’末端に直接的または間接的に連結される、実施形態１〜６０のいずれかに記載の化合物。
【０１２５】
実施形態６２．前記修飾ｃｒＲＮＡの少なくとも１つのヌクレオシドが修飾糖部分を含む、実施形態１〜６１のいずれかに記載の化合物。
【０１２６】
実施形態６３．前記ｃｒＲＮＡの５’末端ヌクレオシドが修飾糖部分を含む、実施形態６２に記載の化合物。
【０１２７】
実施形態６４．前記５’末端ヌクレオシドが直鎖状の修飾糖部分を含む、実施形態６３に記載の化合物。
【０１２８】
実施形態６５．前記５’末端のヌクレオシドが２’−修飾糖部分を含む、実施形態６４に記載の化合物。
【０１２９】
実施形態６６．前記５’末端ヌクレオシドが二環糖部分を含む、実施形態６３に記載の化合物。
【０１３０】
実施形態６７．前記５’末端ヌクレオシドが２’−Ｏ−メチル、２’−ＭＯＥ、２’−Ｆ、ｃＥｔ、及びＬＮＡの中から選択される修飾糖部分を含む、実施形態６３に記載の化合物。
【０１３１】
実施形態６８．前記５’末端ヌクレオシドがリンカーヌクレオシドである、実施形態１〜６７のいずれかに記載の化合物。
【０１３２】
実施形態６９．前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の５’末端から５番目のヌクレオシドが修飾糖部分を含む、実施形態６２〜６８のいずれかに記載の化合物。
【０１３３】
実施形態７０．前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の５’末端から６番目のヌクレオシドが修飾糖部分を含む、実施形態６２〜６９のいずれかに記載の化合物。
【０１３４】
実施形態７１．前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の５’末端から７番目のヌクレオシドが修飾糖部分を含む、実施形態６２〜７０のいずれかに記載の化合物。
【０１３５】
実施形態７２．前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の５’末端から１０番目のヌクレオシドが修飾糖部分を含む、実施形態６２〜７１のいずれかに記載の化合物。
【０１３６】
実施形態７３．前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の５’末端から１４番目のヌクレオシドが修飾糖部分を含む、実施形態６２〜７２のいずれかに記載の化合物。
【０１３７】
実施形態７４．前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の３’末端から１番目のヌクレオシドが修飾糖部分を含む、実施形態６２〜７３のいずれかに記載の化合物。
【０１３８】
実施形態７５．少なくとも１つの修飾糖部分が２’−Ｏ−メチル、２’−ＭＯＥ、２’−Ｆ、ｃＥｔ、及びＬＮＡの中から選択される、実施形態６９〜７４のいずれかに記載の化合物。
【０１３９】
実施形態７６．各修飾糖部分が２’−Ｏ−メチル、２’−ＭＯＥ、２’−Ｆ、ｃＥｔ、及びＬＮＡの中から独立して選択される、実施形態６９〜７４のいずれかに記載の化合物。
【０１４０】
実施形態７７．前記修飾ｃｒＲＮＡの３’末端ヌクレオシドが修飾糖部分を含む、実施形態６２に記載の化合物。
【０１４１】
実施形態７８．前記３’末端ヌクレオシドが直鎖状の修飾糖部分を含む、実施形態７７に記載の化合物。
【０１４２】
実施形態７９．前記３’末端のヌクレオシドが２’−修飾糖部分を含む、実施形態７８に記載の化合物。
【０１４３】
実施形態８０．前記３’末端ヌクレオシドが二環糖部分を含む、実施形態７７に記載の化合物。
【０１４４】
実施形態８１．前記３’末端ヌクレオシドが２’−Ｏ−メチル、２’−ＭＯＥ、２’−Ｆ、ｃＥｔ、及びＬＮＡの中から選択される修飾糖部分を含む、実施形態７７に記載の化合物。
【０１４５】
実施形態８２．前記標的認識部分の５’末端から１番目のヌクレオシドが修飾糖部分を含む、実施形態６２〜８１のいずれかに記載の化合物。
【０１４６】
実施形態８３．前記標的認識部分の５’末端から８番目のヌクレオシドが修飾糖部分を含む、実施形態６２〜８２のいずれかに記載の化合物。
【０１４７】
実施形態８４．前記標的認識部分の５’末端から９番目のヌクレオシドが修飾糖部分を含む、実施形態６２〜８３のいずれかに記載の化合物。
【０１４８】
実施形態８５．前記修飾ｃｒＲＮＡの前記標的認識部分の１〜５個の３’末端ヌクレオシドがそれぞれ修飾糖部分を含む、実施形態６２〜８４のいずれかに記載の化合物。
【０１４９】
実施形態８６．前記修飾ｃｒＲＮＡの前記標的認識部分の１〜５個の３’末端ヌクレオシドがそれぞれ同一の修飾糖部分を含む、実施形態８５に記載の化合物。
【０１５０】
実施形態８７．前記標的認識部分の１〜５個の３’末端ヌクレオシドの前記修飾糖部分が、２’−Ｏ−メチル、２’−ＭＯＥ、２’−Ｆ、ｃＥｔ、及びＬＮＡの中からそれぞれ独立して選択される、実施形態８４または８５に記載の化合物。
【０１５１】
実施形態８８．前記修飾ｃｒＲＮＡの前記標的認識部分が少なくとも１つの未修飾糖部分を含む、実施形態１〜８７のいずれかに記載の化合物。
【０１５２】
実施形態８９．前記修飾ｃｒＲＮＡの前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分が少なくとも１つの未修飾糖部分を含む、実施形態１〜８８のいずれかに記載の化合物。
【０１５３】
実施形態９０．前記修飾ｃｒＲＮＡが未修飾糖部分を含む少なくとも１つのリンカーヌクレオシドを含む、実施形態１〜８９のいずれかに記載の化合物。
【０１５４】
実施形態９１．前記化合物が、前記修飾ｃｒＲＮＡから成る、実施形態１〜９０のいずれかに記載の化合物。
【０１５５】
実施形態９２．前記修飾ｃｒＲＮＡの前記標的認識部分の核酸塩基配列が、少なくとも標的のＤＮＡまたはＲＮＡに対して少なくとも９０％相補的である、実施形態１〜９１のいずれかに記載の化合物。
【０１５６】
実施形態９３．前記修飾ｃｒＲＮＡの前記標的認識部分の前記核酸塩基配列が、標的のＤＮＡまたはＲＮＡに対して１００％相補的である、実施形態９２に記載の化合物。
【０１５７】
実施形態９４．前記修飾ｃｒＲＮＡが自己相補的な領域を含む、実施形態１〜９３のいずれかに記載の化合物。
【０１５８】
実施形態９５．前記自己相補的な領域が、前記修飾ｃｒＲＮＡの前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分内にある、実施形態９４に記載の化合物。
【０１５９】
実施形態９６．前記自己相補的な領域がヘアピンを形成することができる、実施形態９４または９５に記載の化合物。
【０１６０】
実施形態９７．前記自己相補的な領域が、前記自己相補的な領域の安定性を増加させる少なくとも１つの修飾を含む、実施形態９４〜９６のいずれかに記載の化合物。
【０１６１】
実施形態９８．前記自己相補的な領域が、前記自己相補的な領域のハイブリダイゼーション親和性を増加させる少なくとも１つの修飾を含む、実施形態９４〜９７のいずれかに記載の化合物。
【０１６２】
実施形態９９．前記修飾ｃｒＲＮＡの前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の前記核酸塩基配列が、表Ａから選択される配列の少なくとも１２個の連続的な核酸塩基を含む、実施形態１〜９８のいずれかに  記載の化合物。
【０１６３】
実施形態１００．前記修飾ｃｒＲＮＡの前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の前記核酸塩基配列が、表Ａから選択される配列または配列の部分から成る、実施形態１〜９８のいずれかに記載の化合物。
【０１６４】
実施形態１０１．前記修飾ｃｒＲＮＡの前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の前記核酸塩基配列が、配列ＸＣＸＡＣＸを含み、ここで各Ｘは独立してＵ核酸塩基またはＴ核酸塩基である、実施形態１〜１００のいずれかに記載の化合物。
【０１６５】
実施形態１０２．前記修飾ｃｒＲＮＡの前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の前記核酸塩基配列が、配列ＧＸＡＧＡＸを含み、ここで各Ｘは独立してＵ核酸塩基またはＴ核酸塩基である、実施形態１〜１００のいずれかに記載の化合物。
【０１６６】
実施形態１０３．前記修飾ｃｒＲＮＡの前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の前記核酸塩基配列が、前記配列ＸＣＸＡＣＸ及び前記配列ＧＸＡＧＡＸを含み、ここで各Ｘは独立してＵ核酸塩基またはＴ核酸塩基である、実施形態１〜１００のいずれかに記載の化合物。
【０１６７】
実施形態１０４．前記化合物がコンジュゲート基を含む、実施形態１〜９０、または９２〜１０３のいずれかに記載の化合物。
【０１６８】
実施形態１０５．前記コンジュゲート基がＧａｌＮＡｃを含む、実施形態１０４に記載の化合物。
【０１６９】
実施形態１０６．前記コンジュゲート基が親油性である、実施形態１０４に記載の化合物。
【０１７０】
実施形態１０７．前記コンジュゲート基が脂質である、実施形態１０６に記載の化合物。
【０１７１】
実施形態１０８．実施形態１〜１０７のいずれかに記載の化合物を含有する、医薬組成物。
【０１７２】
実施形態１０９．細胞を、実施形態１〜１０８のいずれかに記載の化合物または組成物と接触させることを含む方法。
【０１７３】
実施形態１１０．前記細胞がＣｐｆ１ヌクレアーゼを発現する、実施形態１０９に記載の方法。
【０１７４】
実施形態１１１．細胞を、実施形態１〜１０８のいずれかに記載の化合物または組成物及びＣｐｆ１ヌクレアーゼをコードするプラスミドと接触させることを含む方法。
【０１７５】
実施形態１１２．細胞を、実施形態１〜１０８のいずれかに記載の化合物または組成物及びＣｐｆ１ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡと接触させることを含む方法。
【０１７６】
実施形態１１３．前記修飾ｃｒＲＮＡが、トランスフェクション試薬のない状態で前記細胞によって取り込まれる、実施形態１０９〜１１２のいずれかに記載の方法。
【０１７７】
実施形態１１４．前記細胞が動物内に存在する、実施形態１０９〜１１３のいずれかに記載の方法。
【０１７８】
実施形態１１５．実施形態１〜１０８のいずれかに記載の化合物または組成物を、動物に投与することを含む方法。
【０１７９】
実施形態１１６．前記投与が、皮下である、実施形態１１５に記載の方法。
【０１８０】
実施形態１１７．前記投与が、髄腔内である、実施形態１１５に記載の方法。
【０１８１】
実施形態１１８．Ｃｐｆ１ヌクレアーゼをコードするプラスミドを投与することを含む、実施形態１１５〜１１７のいずれかに記載の方法。
【０１８２】
実施形態１１９．前記動物がＣｐｆ１ヌクレアーゼを発現する、実施形態１１５〜１１７のいずれかに記載の方法。
【０１８３】
実施形態１２０．前記プラスミドが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を介して前記動物内の細胞に送達される、実施形態１１１または１１８に記載の方法。
【０１８４】
実施形態１２１．前記プラスミドが、レンチウイルスを介して前記動物内の細胞に送達される、実施形態１１１または１１８に記載の方法。
【０１８５】
実施形態１２２．標的遺伝子が編集される、実施形態１０９〜１２１のいずれかに記載の方法。
【０１８６】
実施形態１２３．前記修飾ｃｒＲＮＡは、細胞内で前記標的遺伝子が編集された後に前記細胞内で分解される、実施形態１２２に記載の方法。
【０１８７】
実施形態１２４．前記Ｃｐｆ１ヌクレアーゼは、前記修飾ｃｒＲＮＡがない状態でヌクレアーゼ活性を示さない、実施形態１１０〜１１２、または１１８〜１２３のいずれかに記載の方法。
【０１８８】
実施形態１２５．前記細胞を、前記修飾ｃｒＲＮＡまたはＣｐｆ１ヌクレアーゼの前記活性または発現を低下または抑制する第２の化合物と接触させることを含む、実施形態１０９〜１２４のいずれかに記載の方法。
【０１８９】
実施形態１２６．前記細胞を、標的遺伝子を編集した後に前記第２の化合物と接触させる、実施形態１２５に記載の方法。
【０１９０】
実施形態１２７．前記第２の化合物が、前記修飾ｃｒＲＮＡに相補的であるオリゴヌクレオチドを含む、実施形態１２５または１２６に記載の方法。
【０１９１】
実施形態１２８．前記第２の化合物が、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ遺伝子を標的にするｃｒＲＮＡを含む、実施形態１２５または１２６に記載の方法。
【０１９２】
実施形態１２９．前記第２の化合物が、Ｃｐｆ１転写物に相補的なオリゴヌクレオチドを含む、実施形態１２５または１２６に記載の方法。
【０１９３】
実施形態１３０．前記Ｃｐｆ１ヌクレアーゼの発現が抑制される、実施形態１２８または１２９に記載の方法。
【０１９４】
実施形態１３１．前記動物がヒトである、実施形態１１４〜１３０のいずれかに記載の方法。
【０１９５】
実施形態１３２．少なくとも１つのオフターゲット遺伝子の編集が、未修飾ｃｒＲＮＡまたは４５個を超えるヌクレオシドを含む化合物が前記修飾ｃｒＲＮＡの代わりに使用される場合の前記少なくとも１つのオフターゲット遺伝子の編集と比較して低減される、実施形態１０９〜１３１のいずれかに記載の方法。
【０１９６】
実施形態１３３．前記投与が、硝子体内である、実施形態１１５または１１８〜１３２のいずれかに記載の方法。
【０１９７】
実施形態１３４．前記細胞が、植物細胞である、実施形態１０９〜１１３のいずれかに記載の方法。
【０１９８】
実施形態１３５．前記細胞が、Ｔ細胞である、実施形態１０９〜１１４のいずれかに記載の方法。
【０１９９】
実施形態１３６．個体の疾患を治療する方法であって、実施形態１〜１０７のいずれかに記載の化合物または実施形態１０８に記載の組成物を前記個体に投与することによって前記個体の前記疾患を治療する、前記方法。
【０２００】
実施形態１３７．疾患の治療のための、実施形態１〜１０７のいずれかに記載の化合物または実施形態１０８に記載の組成物の使用。
【０２０１】
実施形態１３８．薬物の調合のための、実施形態１〜１０７のいずれかに記載の化合物または実施形態１０８に記載の組成物の使用。
【０２０２】
実施形態１３９．実施形態１〜１０７のいずれかに記載の化合物または実施形態１０８に記載の組成物を動物に投与し、そしてヒトへの移植のために前記動物から器官を回収する方法。
【０２０３】
実施形態１４０．前記５’末端ヌクレオシドがｃＥｔ修飾糖部分を含む、実施形態９０〜１０７のいずれかに記載の化合物。
【０２０４】
実施形態１４１．前記修飾ｃｒＲＮＡの前記標的認識部分の３’末端が２つの連続的なホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む、実施形態１４０に記載の化合物。
【０２０５】
実施形態１４２．前記修飾ｃｒＲＮＡの前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の各ヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエートである、実施形態１４０〜１４１のいずれかに記載の化合物。
【０２０６】
実施形態１４３．前記修飾ｃｒＲＮＡの前記標的認識部分の２つの３’末端ヌクレオシドが、それぞれ２’−Ｏ−メチル修飾糖部分を含む、実施形態１４０〜１４２のいずれかに記載の化合物。
【０２０７】
実施形態１４４．前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の５’末端から１番目のヌクレオシドが未修飾糖部分を含む、実施形態１４０〜１４３のいずれかに記載の化合物。
【０２０８】
実施形態１４５．前記修飾ｃｒＲＮＡが３０〜３８個の未修飾糖部分を含む、実施形態１４０〜１４４のいずれかに記載の化合物。
【０２０９】
実施形態１４６．前記修飾ｃｒＲＮＡが３６個の未修飾糖部分を含む、実施形態１４５に記載の化合物。
【０２１０】
実施形態１４７．実施形態１４０〜１４６のいずれかに記載の化合物を含む医薬組成物。
【０２１１】
実施形態１４８．細胞を、実施形態１４０〜１４７のいずれかに記載の化合物または組成物と接触させることを含む方法。
【０２１２】
実施形態１４９．前記細胞がＣｐｆ１ヌクレアーゼを発現する、実施形態１４８に記載の方法。
【０２１３】
実施形態１５０．細胞を、実施形態１４０〜１４７のいずれかに記載の化合物または組成物及びＣｐｆ１ヌクレアーゼをコードするプラスミドと接触させることを含む方法。
【０２１４】
実施形態１５１．細胞を、実施形態１４０〜１４７のいずれかに記載の化合物または組成物及びＣｐｆ１ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡと接触させることを含む方法。
【０２１５】
実施形態１５２．前記修飾ｃｒＲＮＡが、トランスフェクション試薬のない状態で前記細胞によって取り込まれる、実施形態１４８〜１５１のいずれかに記載の方法。
【０２１６】
実施形態１５３．前記細胞が動物内に存在する、実施形態１４８〜１５２のいずれかに記載の方法。
【０２１７】
実施形態１５４．実施形態１４０〜１４７のいずれかに記載の化合物または組成物を動物に投与することを含む方法。
【０２１８】
実施形態１５５．前記投与が、皮下である、実施形態１５４に記載の方法。
【０２１９】
実施形態１５６．前記投与が、髄腔内である、実施形態１５４に記載の方法。
【０２２０】
実施形態１５７．Ｃｐｆ１ヌクレアーゼをコードするプラスミドを投与することを含む、実施形態１５４〜１５６のいずれかに記載の方法。
【０２２１】
実施形態１５８．前記動物がＣｐｆ１ヌクレアーゼを発現する、実施形態１５４〜１５６のいずれかに記載の方法。
【０２２２】
実施形態１５９．前記プラスミドが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を介して前記動物内の細胞に送達される、実施形態１５０または１５７に記載の方法。
【０２２３】
実施形態１６０．前記プラスミドが、レンチウイルスを介して前記動物内の細胞に送達される、実施形態１５０または１５７に記載の方法。
【０２２４】
実施形態１６１．標的遺伝子が編集される、実施形態１４８〜１６０のいずれかに記載の方法。
【０２２５】
実施形態１６２．前記修飾ｃｒＲＮＡは、細胞内で前記標的遺伝子が編集された後に前記細胞内で分解される、実施形態１６１に記載の方法。
【０２２６】
実施形態１６３．前記Ｃｐｆ１ヌクレアーゼが、前記修飾ｃｒＲＮＡがない状態でヌクレアーゼ活性を示さない、実施形態１４９〜１５１または１５７〜１６２のいずれかに記載の方法。
【０２２７】
実施形態１６４．前記細胞を、前記修飾ｃｒＲＮＡまたはＣｐｆ１ヌクレアーゼの前記活性または発現を低下または抑制する第２の化合物と接触させることを含む、実施形態１４８〜１６３のいずれかに記載の方法。
【０２２８】
実施形態１６５．前記細胞を、標的遺伝子を編集した後に前記第２の化合物と接触させる、実施形態１６４に記載の方法。
【０２２９】
実施形態１６６．前記第２の化合物が、前記修飾ｃｒＲＮＡに相補的であるオリゴヌクレオチドを含む、実施形態１６４または１６５に記載の方法。
【０２３０】
実施形態１６７．前記第２の化合物が、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ遺伝子を標的にするｃｒＲＮＡを含む、実施形態１６４または１６５に記載の方法。
【０２３１】
実施形態１６８．前記第２の化合物が、Ｃｐｆ１転写物に相補的なオリゴヌクレオチドを含む、実施形態１６４または１６５に記載の方法。
【０２３２】
実施形態１６９．前記Ｃｐｆ１ヌクレアーゼの発現が抑制される、実施形態１６７または１６８に記載の方法。
【０２３３】
実施形態１７０．前記動物がヒトである、実施形態１５３〜１６９のいずれかに記載の方法。
【０２３４】
実施形態１７１．少なくとも１つのオフターゲット遺伝子の編集が、未修飾ｃｒＲＮＡまたは４５個を超えるヌクレオシドを含む化合物が前記修飾ｃｒＲＮＡの代わりに使用される場合の前記少なくとも１つのオフターゲット遺伝子の編集と比較して低減される、実施形態１４８〜１７０のいずれかに記載の方法。
【０２３５】
実施形態１７２．前記投与が、硝子体内である、実施形態１５４または１５７〜１７１のいずれかに記載の方法。
【０２３６】
実施形態１７３．前記細胞が、植物細胞である、実施形態１４８〜１５２のいずれかに記載の方法。
【０２３７】
実施形態１７４．前記細胞が、Ｔ細胞である、実施形態１４８〜１５３のいずれかに記載の方法。
【０２３８】
実施形態１７５．個体の疾患を治療する方法であって、実施形態１４０〜１４６のいずれかに記載の化合物または実施形態１４７に記載の組成物を前記個体に投与することを含む、前記方法。
【０２３９】
実施形態１７６．個体の疾患を治療する方法であって、実施形態１４０〜１４６のいずれかに記載の化合物または実施形態１４７に記載の組成物を前記個体に投与することによって、前記個体の前記疾患を治療することを含む、前記方法。
【０２４０】
実施形態１７７．疾患を治療するための実施形態１４０〜１４６のいずれかに記載の化合物または実施形態１４７に記載の組成物の使用。
【０２４１】
実施形態１７８．薬剤の調合のための、実施形態１４０〜１４６のいずれかに記載の化合物または実施形態１４７に記載の組成物の使用。
【０２４２】
実施形態１７９．実施形態１４０〜１４６のいずれかに記載の化合物または実施形態１４７に記載の組成物を動物に投与し、そしてヒトへの移植のために前記動物から器官を回収する方法。
【０２４３】
実施形態１８０．前記修飾ｃｒＲＮＡの少なくとも１つの修飾ヌクレオシドが２’−デオキシヌクレオシドである、実施形態９１〜１０７または１４０〜１４６のいずれかに記載の化合物。
【０２４４】
実施形態１８１．前記修飾ｃｒＲＮＡの少なくとも１つの修飾ヌクレオシドが２’−Ｈ置換を有する直鎖状の修飾糖部分を含む、実施形態９１〜１０７または１４０〜１４６のいずれかに記載の化合物。
【０２４５】
実施形態１８２．前記修飾ｃｒＲＮＡの少なくとも１つの修飾ヌクレオシドが、天然のＤＮＡに見いだされるような修飾２’−Ｈ（Ｈ）糖部分を有する、実施形態９１〜１０７または１４０〜１４６のいずれかに記載の化合物。
【０２４６】
実施形態１８３．前記修飾ｃｒＲＮＡが４０個の連結ヌクレオシドから成る、実施形態９１〜１０７、１４０〜１４６または１８０〜１８２のいずれかに記載の化合物。
【０２４７】
実施形態１８４．前記修飾ｃｒＲＮＡが４３個の連結ヌクレオシドから成る、実施形態９１〜１０７、１４０〜１４６または１８０〜１８２のいずれかに記載の化合物。
【０２４８】
実施形態１８５．前記修飾ｃｒＲＮＡが４５個の連結ヌクレオシドから成る、実施形態９１〜１０７、１４０〜１４６または１８０〜１８２のいずれかに記載の化合物。
【０２４９】
実施形態１８６．前記修飾ｃｒＲＮＡの前記標的認識部分が、ＤＮＭＴ１核酸に対して少なくとも９０％相補的である、実施形態９１〜１０７、１４０〜１４６または１８０〜１８５のいずれかに記載の化合物。
【０２５０】
実施形態１８７．前記標的認識部分が、ＤＮＭＴ１核酸に対して１００％相補的である、実施形態１８６に記載の化合物。
【０２５１】
実施形態１８８．前記ＤＮＭＴ１核酸が、デオキシリボ核酸である、実施形態１８６または１８７に記載の化合物。
【０２５２】
実施形態１８９．前記ＤＮＭＴ１核酸が、ヒトのデオキシリボ核酸である、実施形態１８８に記載の化合物。
【０２５３】
実施形態１９０．前記修飾ｃｒＲＮＡの前記標的認識部分が、ＬＤＬＲ核酸に対して少なくとも９０％相補的である、実施形態９１〜１０７、１４０〜１４６または１８０〜１８５のいずれかに記載の化合物。
【０２５４】
実施形態１９１．前記標的認識部分が、ＬＤＬＲ核酸に対して１００％相補的である、実施形態１９０に記載の化合物。前記ＬＤＬＲ核酸が、デオキシリボ核酸である、実施形態１９０または１９１に記載の化合物。
【０２５５】
実施形態１９２．前記ＬＤＬＲ核酸が、ヒトのデオキシリボ核酸である、実施形態１９１に記載の化合物。
【０２５６】
実施形態１９３．前記修飾ｃｒＲＮＡの２つの３’末端ヌクレオシドが、独立して選択された修飾糖部分を含む、実施形態９１〜１０７、１４０〜１４６または１８０〜１９２のいずれかに記載の化合物。
【０２５７】
実施形態１９４前記修飾ｃｒＲＮＡの３つの３’末端ヌクレオシドが、独立して選択された修飾糖部分を含む、実施形態９１〜１０７、１４０〜１４６または１８０〜１９２のいずれかに記載の化合物。
【０２５８】
実施形態１９５．前記修飾ｃｒＲＮＡの４つの３’末端ヌクレオシドが、独立して選択された修飾糖部分を含む、実施形態９１〜１０７、１４０〜１４６または１８０〜１９２のいずれかに記載の化合物。
【０２５９】
実施形態１９６．前記修飾ｃｒＲＮＡの５つの３’末端ヌクレオシドが、独立して選択された修飾糖部分を含む、実施形態９１〜１０７、１４０〜１４６または１８０〜１９２のいずれかに記載の化合物。
【０２６０】
実施形態１９７．前記３’末端修飾ヌクレオシドの前記修飾糖部分が２’−Ｈ（Ｈ）、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｆ、ｃＥｔ、及びＬＮＡ修飾糖部分の中から選択される、実施形態７７または１９３〜１９６のいずれかに記載の化合物。
【０２６１】
実施形態１９８．前記３’末端修飾ヌクレオシドの前記修飾糖部分が２’−Ｈ（Ｈ）、２’−Ｏ−メチル、及びｃＥｔ修飾糖部分の中から選択される、実施形態１９７に記載の化合物。
【０２６２】
実施形態１９９．前記３’末端修飾ヌクレオシドの前記修飾糖部分が２’−Ｈ（Ｈ）及び２’−Ｏ−メチル修飾糖部分の中から選択される、実施形態１９７に記載の化合物。
【０２６３】
実施形態２００．前記３’末端修飾ヌクレオシドの前記修飾糖部分がｃＥｔ及びＬＮＡ修飾糖部分の中から選択される、実施形態１９７に記載の化合物。
【０２６４】
実施形態２０１．前記標的認識部分の５’末端から１番目のヌクレオシドが２’−Ｈ（Ｈ）または２’−Ｆ修飾糖部分を含む、実施形態８２〜１０７、１４０〜１４６、または１８０〜２００のいずれかに記載の化合物。
【０２６５】
実施形態２０２．前記標的認識部分の５’末端から８番目のヌクレオシドが２’−Ｈ（Ｈ）または２’−Ｆ修飾糖部分を含む、実施形態８２〜１０７、１４０〜１４６、または１８０〜２０１のいずれかに記載の化合物。
【０２６６】
実施形態２０３．前記標的認識部分の５’末端から９番目のヌクレオシドが２’−Ｈ（Ｈ）または２’−Ｆ修飾糖部分を含む、実施形態８２〜１０７、１４０〜１４６、または１８０〜２０２のいずれかに記載の化合物。
【０２６７】
実施形態２０４．実施形態９１〜１０７、１４０〜１４６、または１８０〜２０３のいずれかに記載の化合物であって、前記修飾ｃｒＲＮＡが以下の特徴の少なくとも３つを含む、前記化合物：
ａ．前記修飾ｃｒＲＮＡの前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の５’末端に連結される２つのリンカーヌクレオシド；
ｂ．独立して２’−Ｆまたは２’−Ｈ（Ｈ）修飾糖部分を含有する、前記修飾ｃｒＲＮＡの前記標的認識部分の５’末端から１番目、８番目、及び／または９番目のヌクレオシド；
ｃ．前記修飾ｃｒＲＮＡの３’及び５’末端のそれぞれにおける少なくとも１つの末端ホスホロチオエートヌクレオシド間結合
ｄ．未修飾糖部分を含む、前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の各ヌクレオシド
ｅ．独立して選択される修飾糖部分を含む、前記修飾ｃｒＲＮＡの１〜５個の３’末端ヌクレオシド。
【０２６８】
実施形態２０５．前記修飾ｃｒＲＮＡが塩である、実施形態１〜１０７、１４０〜１４６、または１８０〜２０４のいずれかに記載の化合物。
【０２６９】
実施形態２０６．実施形態１８０〜２０５のいずれかに記載の化合物を含む、医薬組成物。
【０２７０】
実施形態２０７．前記医薬組成物がリボ核タンパク質複合体を含む、実施形態１０８、１４７、または２０６のいずれかに記載の医薬組成物。
【０２７１】
実施形態２０８．前記リボ核タンパク質複合体が、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ及び前記修飾ｃｒＲＮＡを含有する前記化合物を含む、実施形態２０７に記載の医薬組成物。
【０２７２】
実施形態２０９．細胞を、実施形態１８０〜２０８のいずれかに記載の化合物または組成物と接触させることを含む方法。
【０２７３】
実施形態２１０．細胞を、実施形態１８０〜２０７のいずれかに記載の化合物または組成物と接触させることを含む方法であって、ここで前記細胞はＣｐｆ１ヌクレアーゼを発現する、前記方法。
【０２７４】
実施形態２１１．細胞を、実施形態１８０〜２０７のいずれかに記載の化合物または組成物及びＣｐｆ１ヌクレアーゼをコードするプラスミドと接触させることを含む方法。
【０２７５】
実施形態２１２．細胞を、実施形態１８０〜２０７のいずれかに記載の化合物または組成物及びＣｐｆ１ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡと接触させることを含む方法。
【０２７６】
実施形態２１３．前記修飾ｃｒＲＮＡが、トランスフェクション試薬のない状態で前記細胞によって取り込まれる、実施形態２０９〜２１２のいずれかに記載の方法。
【０２７７】
実施形態２１４．前記細胞が動物内に存在する、実施形態２０９〜２１３のいずれかに記載の方法。
【０２７８】
実施形態２１５．実施形態１８０〜２０８のいずれかに記載の化合物または組成物を、動物に投与することを含む方法。
【０２７９】
実施形態２１６．前記投与が、皮下である、実施形態２１５に記載の方法。
【０２８０】
実施形態２１７．前記投与が、髄腔内である、実施形態２１５に記載の方法。
【０２８１】
実施形態２１８．Ｃｐｆ１ヌクレアーゼをコードするプラスミドを投与することを含む、実施形態２１５〜２１７のいずれかに記載の方法。
【０２８２】
実施形態２１９．前記動物がＣｐｆ１ヌクレアーゼを発現する、実施形態２１５〜２１７のいずれかに記載の方法。
【０２８３】
実施形態２２０．前記プラスミドが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を介して前記動物内の細胞に送達される、実施形態２１１または２１８に記載の方法。
【０２８４】
実施形態２２１．前記プラスミドが、レンチウイルスを介して前記動物内の細胞に送達される、実施形態２１１または２１８に記載の方法。
【０２８５】
実施形態２２２．標的遺伝子が編集される、実施形態２０９〜２２１のいずれかに記載の方法。
【０２８６】
実施形態２２３．前記修飾ｃｒＲＮＡは、細胞内で前記標的遺伝子が編集された後に前記細胞内で分解される、実施形態２２２に記載の方法。
【０２８７】
実施形態２２４．前記Ｃｐｆ１ヌクレアーゼは、前記修飾ｃｒＲＮＡがない状態でヌクレアーゼ活性を示さない、実施形態２１０〜２１２、または２１５〜２２３のいずれかに記載の方法。
【０２８８】
実施形態２２５．前記細胞を、前記修飾ｃｒＲＮＡまたはＣｐｆ１ヌクレアーゼの前記活性または発現を低下または抑制する第２の化合物と接触させることを含む、実施形態２０９〜２２４のいずれかに記載の方法。
【０２８９】
実施形態２２６．前記細胞を、標的遺伝子を編集した後に前記第２の化合物と接触させる、実施形態２２５に記載の方法。
【０２９０】
実施形態２２７．前記第２の化合物が、前記修飾ｃｒＲＮＡに相補的であるオリゴヌクレオチドを含む、実施形態２２５または２２６に記載の方法。
【０２９１】
実施形態２２８．前記第２の化合物が、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ遺伝子を標的にするｃｒＲＮＡを含む、実施形態２２５または２２６に記載の方法。
【０２９２】
実施形態２２９．前記第２の化合物が、Ｃｐｆ１転写物に相補的なオリゴヌクレオチドを含む、実施形態２２５または２２６に記載の方法。
【０２９３】
実施形態２３０．前記Ｃｐｆ１ヌクレアーゼの発現が抑制される、実施形態２２８または２２９に記載の方法。
【０２９４】
実施形態２３１．前記動物がヒトである、実施形態２１４〜２３０のいずれかに記載の方法。
【０２９５】
実施形態２３２．少なくとも１つのオフターゲット遺伝子の編集が、未修飾ｃｒＲＮＡまたは４５個を超えるヌクレオシドを含む化合物が前記修飾ｃｒＲＮＡの代わりに使用される場合の前記少なくとも１つのオフターゲット遺伝子の編集と比較して低減される、実施形態２０９〜２３１のいずれかに記載の方法。
【０２９６】
実施形態２３３．前記投与が、硝子体内である、実施形態２１５または２１８〜２３２のいずれかに記載の方法。
【０２９７】
実施形態２３４．前記細胞が、植物細胞である、実施形態２０９〜２１３のいずれかに記載の方法。
【０２９８】
実施形態２３５．前記細胞が、Ｔ細胞である、実施形態２０９〜２１４のいずれかに記載の方法。
【０２９９】
実施形態２３６．個体の疾患を治療する方法であって、実施形態１８０〜２０５のいずれかに記載の化合物または実施形態２０６〜２０８のいずれかに記載の組成物を前記個体に投与することを含む、前記方法。
【０３００】
実施形態２３７．個体の疾患を治療する方法であって、実施形態１８０〜２０５のいずれかに記載の化合物または実施形態２０６〜２０８のいずれかに記載の組成物を前記個体に投与することによって前記個体の前記疾患を治療することを含む、前記方法。
【０３０１】
実施形態２３８．疾患を治療するための、実施形態１８０〜２０５のいずれかに記載の化合物または実施形態２０６〜２０８のいずれかに記載の組成物の使用。
【０３０２】
実施形態２３９．薬物の調合のための、実施形態１８０〜２０５のいずれかに記載の化合物または実施形態２０６〜２０８のいずれかに記載の組成物の使用。
【０３０３】
実施形態２４０．実施形態１８０〜２０５のいずれかに記載の化合物または実施形態２０６〜２０８のいずれかに記載の組成物を動物に投与し、そしてヒトへの移植のために前記動物から器官を回収する方法。
【０３０４】
実施形態２４１．前記修飾ｃｒＲＮＡの前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分が少なくとも１つの未修飾糖部分を含む、実施形態１〜１０７、１４０〜１４６、または１８０〜２０５のいずれかに記載の化合物。
【０３０５】
実施形態２４２．前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の少なくとも１つの修飾糖部分が直鎖状の修飾糖部分である、実施形態２４１に記載の化合物。
【０３０６】
実施形態２４３．前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の少なくとも１つの修飾糖部分が二環糖部分である、実施形態２４１に記載の化合物。
【０３０７】
実施形態２４４．前記二環糖部分がｃＥｔまたはＬＮＡである、実施形態２４３に記載の化合物。
【０３０８】
実施形態２４５．前記二環糖部分がｃＥｔである、実施形態２４３に記載の化合物。
【０３０９】
実施形態２４６．前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の３’末端から２番目のヌクレオシドが少なくとも１つの修飾糖部分を含む、請求項２４１〜２４５のいずれかに記載の化合物。
【０３１０】
実施形態２４７．前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の３’末端から３番目のヌクレオシドが少なくとも１つの修飾糖部分を含む、請求項２４１〜２４５のいずれかに記載の化合物。
【０３１１】
実施形態２４８．前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の３’末端から４番目のヌクレオシドが少なくとも１つの修飾糖部分を含む、請求項２４１〜２４５のいずれかに記載の化合物。
【０３１２】
実施形態２４９．前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の３’末端から５番目のヌクレオシドが少なくとも１つの修飾糖部分を含む、請求項２４１〜２４５のいずれかに記載の化合物。
【０３１３】
実施形態２５０．前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の３’末端から６番目のヌクレオシドが少なくとも１つの修飾糖部分を含む、請求項２４１〜２４５のいずれかに記載の化合物。
【０３１４】
実施形態２５１．前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の３’末端から７番目のヌクレオシドが少なくとも１つの修飾糖部分を含む、請求項２４１〜２４５のいずれかに記載の化合物。
【０３１５】
実施形態２５２．前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の３’末端から８番目のヌクレオシドが少なくとも１つの修飾糖部分を含む、請求項２４１〜２４５のいずれかに記載の化合物。
【０３１６】
実施形態２５３．前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の３’末端から９番目のヌクレオシドが少なくとも１つの修飾糖部分を含む、請求項２４１〜２４５のいずれかに記載の化合物。
【０３１７】
実施形態２５４．前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の３’末端から１１番目のヌクレオシドが少なくとも１つの修飾糖部分を含む、請求項２４１〜２４５のいずれかに記載の化合物。
【０３１８】
実施形態２５５．前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の３’末端から１２番目のヌクレオシドが少なくとも１つの修飾糖部分を含む、請求項２４１〜２４５のいずれかに記載の化合物。
【０３１９】
実施形態２５６．前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の３’末端から１３番目のヌクレオシドが少なくとも１つの修飾糖部分を含む、請求項２４１〜２４５のいずれかに記載の化合物。
【０３２０】
実施形態２５７．前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の３’−末端から１８番目のヌクレオシドが少なくとも１つの修飾糖部分を含む、請求項２４１〜２４５のいずれかに記載の化合物。
【０３２１】
実施形態２５８．前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の３’末端から１１番目及び１２番目のヌクレオシドが、それぞれ修飾糖部分を含む、請求項２４１〜２４５のいずれかに記載の化合物。
【０３２２】
実施形態２５９．前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の３’末端から１番目のヌクレオシドが、未修飾糖部分を含む、請求項２４１〜２５８のいずれかに記載の化合物。
【０３２３】
実施形態２６０．前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の３’末端から１０番目のヌクレオシドが未修飾糖部分を含む、請求項２４１〜２５９のいずれかに記載の化合物。
【０３２４】
実施形態２６１．前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の３’末端から１４番目のヌクレオシドが、未修飾糖部分を含む、請求項２４１〜２６０のいずれかに記載の化合物。
【０３２５】
実施形態２６２．前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の３’末端から１５番目のヌクレオシドが、未修飾糖部分を含む、請求項２４１〜２６１のいずれかに記載の化合物。
【０３２６】
実施形態２６３．前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の３’末端から１６番目のヌクレオシドが、未修飾糖部分を含む、請求項２４１〜２６２のいずれかに記載の化合物。
【０３２７】
実施形態２６４．前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の３’末端から１７番目のヌクレオシドが、未修飾糖部分を含む、請求項２４１〜２６３のいずれかに記載の化合物。
【０３２８】
実施形態２６５．前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の５’末端から１番目のヌクレオシドが、未修飾糖部分を含む、請求項２４１〜２６４のいずれかに記載の化合物。
【０３２９】
実施形態２６６．前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の５’末端から２番目のヌクレオシドが、未修飾糖部分を含む、請求項２４１〜２６５のいずれかに記載の化合物。
【０３３０】
実施形態２６７．前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の５’末端から３番目のヌクレオシドが、未修飾糖部分を含む、請求項２４１〜２６６のいずれかに記載の化合物。
【０３３１】
実施形態２６８．前記標的認識部分の５’末端から１４番目のヌクレオシドが、修飾糖部分を含む、請求項１〜１０７、１４０〜１４６、１８０〜２０５または２４１〜２６７のいずれかに記載の化合物。
【０３３２】
実施形態２６９．前記標的認識部分の５’末端から１５番目のヌクレオシドが、修飾糖部分を含む、請求項１〜１０７、１４０〜１４６、１８０〜２０５または２４１〜２６８のいずれかに記載の化合物。
【０３３３】
実施形態２７０．前記標的認識部分の５’末端から１６番目のヌクレオシドが、修飾糖部分を含む、請求項１〜１０７、１４０〜１４６、１８０〜２０５または２４１〜２６９のいずれかに記載の化合物。
【０３３４】
実施形態２７１．前記標的認識部分の５’末端から１４、１５、及び／または１６の位置の各修飾糖部分が、直鎖状の修飾糖部分である、請求項２６８〜２７０のいずれかに記載の化合物。
【０３３５】
実施形態２７２．前記標的認識部分の５’末端から１４、１５、及び／または１６の位置の各修飾糖部分が、２’−Ｈ（Ｈ）及び２’−Ｆ修飾糖部分から独立して選択される、請求項２７１に記載の化合物。
【０３３６】
実施形態２７３．前記標的認識部分の５’末端から１４、１５、及び／または１６の位置の各修飾糖部分が、２’−Ｈ（Ｈ）修飾糖部分である、請求項２７２に記載の化合物。
【０３３７】
実施形態２７４．請求項１〜１０７、１４０〜１４６、１８０〜２０５、または２４１〜２７３のいずれかに記載の化合物であって、前記修飾ｃｒＲＮＡが以下の特徴の少なくとも３つを含む、前記化合物：
（ａ）前記修飾ｃｒＲＮＡの前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の５’末端に連結される２つのリンカーヌクレオシド；
（ｂ）独立して２’−Ｆまたは２’−Ｈ（Ｈ）修飾糖部分を含有する、前記修飾ｃｒＲＮＡの前記標的認識部分の５’末端から１番目、８番目、及び／または９番目のヌクレオシド；
（ｃ）前記修飾ｃｒＲＮＡの３’及び５’末端のそれぞれにおける少なくとも１つの末端ホスホロチオエートヌクレオシド間結合
（ｄ）修飾糖部分を含む、前記ＣＲＩＳＰＲ認識部分の３’末端から５、６、７、８、１１、または１２の位置の少なくとも１つのヌクレオシド
（ｅ）独立して選択される修飾糖部分を含む、前記修飾ｃｒＲＮＡの１〜５個の３’末端ヌクレオシド。
【０３３８】
実施形態２７５．前記修飾ｃｒＲＮＡが特徴（ａ）、（ｃ）、及び（ｅ）を含む、請求項２７４に記載の化合物。
【０３３９】
実施形態２７６．前記修飾ｃｒＲＮＡが特徴（ａ）、（ｃ）、及び（ｄ）を含む、請求項２７４に記載の化合物。
【０３４０】
実施形態２７７．前記修飾ｃｒＲＮＡが特徴（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）を含む、請求項２７４に記載の化合物。
【０３４１】
実施形態２７８．前記修飾ｃｒＲＮＡが特徴（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｅ）を含む、請求項２７４に記載の化合物。
【０３４２】
実施形態２７９．前記修飾ｃｒＲＮＡが特徴（ａ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）を含む、請求項２７４に記載の化合物。
【０３４３】
実施形態２８０．前記修飾ｃｒＲＮＡが特徴（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、及び（ｅ）を含む、請求項２７４に記載の化合物。
【０３４４】
実施形態２８１．請求項２４１〜２８０のいずれかに記載の化合物を含む、医薬組成物。
【０３４５】
実施形態２８２．前記医薬組成物が、リボ核タンパク質複合体を含む、請求項２８１に記載の医薬組成物。
【０３４６】
実施形態２８３．前記リボ核タンパク質複合体が、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ及び前記修飾ｃｒＲＮＡを含有する前記化合物を含む、請求項２８２に記載の医薬組成物。
【０３４７】
実施形態２８４．細胞を、請求項２４１〜２８３のいずれかに記載の化合物または組成物と接触させることを含む方法。
【０３４８】
実施形態２８５．細胞を請求項２４１〜２８３のいずれかに記載の化合物または組成物と接触させる方法であって、ここで前記細胞はＣｐｆ１ヌクレアーゼを発現する、前記方法。
【０３４９】
実施形態２８６．細胞を、請求項２４１〜２８３のいずれかに記載の化合物または組成物及びＣｐｆ１ヌクレアーゼをコードするプラスミドと接触させることを含む方法。
【０３５０】
実施形態２８７．細胞を、請求項２４１〜２８３のいずれかに記載の化合物または組成物及びＣｐｆ１ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡと接触させることを含む方法。
【０３５１】
実施形態２８８．前記修飾ｃｒＲＮＡが、トランスフェクション試薬のない状態で前記細胞によって取り込まれる、請求項２８４〜２８７のいずれかに記載の方法。
【０３５２】
実施形態２８９．前記細胞が動物内に存在する、請求項２８４〜２８８のいずれかに記載の方法。
【０３５３】
実施形態２９０．請求項２４１〜２８３のいずれかに記載の化合物または組成物を、動物に投与することを含む方法。
【０３５４】
実施形態２９１．前記投与が、皮下である、請求項２９０に記載の方法。
【０３５５】
実施形態２９２．前記投与が、髄腔内である、請求項２９０に記載の方法。
【０３５６】
実施形態２９３．Ｃｐｆ１ヌクレアーゼをコードするプラスミドを投与することを含む、請求項２９０〜２９２のいずれかに記載の方法。
【０３５７】
実施形態２９４．前記動物がＣｐｆ１ヌクレアーゼを発現する、請求項２９０〜２９２のいずれかに記載の方法。
【０３５８】
実施形態２９５．前記プラスミドが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を介して前記動物内の細胞に送達される、請求項２８６または２９３に記載の方法。
【０３５９】
実施形態２９６．前記プラスミドが、レンチウイルスを介して前記動物内の細胞に送達される、請求項２８６または２９３に記載の方法。
【０３６０】
実施形態２９７．標的遺伝子が編集される、請求項２８４〜２９６のいずれかに記載の方法。
【０３６１】
実施形態２９８．前記修飾ｃｒＲＮＡは、細胞内で前記標的遺伝子が編集された後に前記細胞内で分解される、請求項２９７に記載の方法。
【０３６２】
実施形態２９９．前記Ｃｐｆ１ヌクレアーゼが前記修飾ｃｒＲＮＡのない状態でヌクレアーゼ活性を示さない、請求項２８５〜２８７、または２９３〜２９８のいずれかに記載の方法。
【０３６３】
実施形態３００．前記細胞を、前記修飾ｃｒＲＮＡまたはＣｐｆ１ヌクレアーゼの前記活性または発現を低下または抑制する第２の化合物と接触させることを含む、請求項２８４〜２９９のいずれかに記載の方法。
【０３６４】
実施形態３０１．前記細胞を、標的遺伝子を編集した後に前記第２の化合物と接触させる、請求項３００に記載の方法。
【０３６５】
実施形態３０２．前記第２の化合物が、前記修飾ｃｒＲＮＡに相補的であるオリゴヌクレオチドを含む、請求項３００または３０１に記載の方法。
【０３６６】
実施形態３０３．前記第２の化合物が、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ遺伝子を標的にするｃｒＲＮＡを含む、請求項３００または３０１に記載の方法。
【０３６７】
実施形態３０４．前記第２の化合物が、Ｃｐｆ１転写物に相補的なオリゴヌクレオチドを含む、請求項３００または３０１に記載の方法。
【０３６８】
実施形態３０５．前記Ｃｐｆ１ヌクレアーゼの発現が抑制される、請求項３０３または３０４に記載の方法。
【０３６９】
実施形態３０６．前記動物がヒトである、請求項２８９〜３０５のいずれかに記載の方法。
【０３７０】
実施形態３０７．少なくとも１つのオフターゲット遺伝子の編集が、未修飾ｃｒＲＮＡまたは４５個を超えるヌクレオシドを含む化合物が前記修飾ｃｒＲＮＡの代わりに使用される場合の、前記少なくとも１つのオフターゲット遺伝子の編集と比較して低減される、請求項２８４〜３０６のいずれかに記載の方法。
【０３７１】
実施形態３０８．前記投与が、硝子体内である、請求項２９０または２９３〜２９７のいずれかに記載の方法。
【０３７２】
実施形態３０９．前記細胞が、植物細胞である、請求項２８４〜２８８のいずれかに記載の方法。
【０３７３】
実施形態３１０．前記細胞が、Ｔ細胞である、請求項２８４〜２８９のいずれかに記載の方法。
【０３７４】
実施形態３１１．個体の疾患を治療する方法であって、請求項２４１〜２８０のいずれかに記載の化合物または請求項２８１〜２８３のいずれかに記載の組成物を前記個体に投与することを含む、前記方法。
【０３７５】
実施形態３１２．個体の疾患を治療する方法であって、請求項２４１〜２８０のいずれかに記載の化合物または請求項２８１〜２８３のいずれかに記載の組成物を前記個体に投与することによって前記個体の前記疾患を治療することを含む、前記方法。
【０３７６】
実施形態３１３．疾患を治療するための、請求項２４１〜２８０のいずれかに記載の化合物または請求項２８１〜２８３のいずれかに記載の組成物の使用。
【０３７７】
実施形態３１４．薬物の調合のための、請求項２４１〜２８０のいずれかに記載の化合物または請求項２８１〜２８３のいずれかに記載の組成物の使用。
【０３７８】
実施形態３１５．請求項２４１〜２８０のいずれかに記載の化合物または請求項２８１〜２８３のいずれかに記載の組成物を動物に投与し、そしてヒトへの移植のために前記動物から器官を回収する方法。
【０３７９】
実施形態３１６．リポソームまたは脂質ナノ粒子を含む、実施形態１０８、１４７、２０６、または２８１のいずれかに記載の医薬組成物。
【０３８０】
実施形態３１７．Ｃｐｆ１ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む、実施形態１０８、１４７、２０６、２８１、または３１６のいずれかに記載の医薬組成物
【０３８１】
実施形態３１８．前記修飾ｃｒＲＮＡ及びＣｐｆ１ヌクレアーゼをコードする前記ｍＲＮＡを含む前記化合物が、リポソームまたは脂質ナノ粒子の中に含まれる、実施形態３１７に記載の医薬組成物
【０３８２】
実施形態３１９．前記Ｃｐｆ１ヌクレアーゼをコードする前記ｍＲＮＡ及び前記修飾ｃｒＲＮＡを含む前記化合物が、リポソームまたは脂質ナノ粒子の中に含まれる、実施形態２１２〜２１４、１５１〜１５３、２１２〜２１４または２８７〜２８９のいずれかに記載の方法
【０３８３】
実施形態３２０．個体の疾患を治療する方法であって、実施形態３１６〜３１８のいずれかに記載の医薬組成物を前記個体に投与することを含む、前記方法
【０３８４】
実施形態３２１．個体の疾患を治療する方法であって、実施形態３１６〜３１８のいずれかに記載の医薬組成物を前記個体に投与することによって前記個体の前記疾患を治療することを含む、前記方法
【０３８５】
Ａ．ある特定の修飾ヌクレオシド
本発明のある特定の化合物には修飾ヌクレオシドが組み込まれる。別段の定めがない限り、以下の修飾ヌクレオシドはｃｒＲＮＡとして使用するための修飾オリゴヌクレオチドに、このように組み込まれるのに適しているが、限定されない。ある特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオシドを含む。そのような修飾ヌクレオシドには、修飾糖部分もしくは修飾核酸塩基または修飾糖部分及び修飾核酸塩基の両方が含まれる。
【０３８６】
１．ある特定の糖部分
ある特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチド、例えば修飾ｃｒＲＮＡには、修飾糖部分を含有する１つ以上の修飾ヌクレオシドが含まれる。１つ以上の糖修飾ヌクレオシドを含有する、そのような修飾オリゴヌクレオチドは、そのような糖修飾ヌクレオシドを欠いているオリゴヌクレオチドと比べて、増強したヌクレアーゼ安定性または標的核酸との増大した結合親和性などの所望の特性を有し得る。ある特定の実施形態において、修飾糖部分は直鎖状の修飾糖部分である。ある特定の実施形態において、修飾糖部分は二環または三環糖部分である。ある特定の実施形態において、修飾糖部分は、糖代替物である。そのような糖代替物は、１つ以上の置換をそれらの対応する置換糖部分に有し得る。
【０３８７】
ある特定の実施形態において、修飾糖部分は、２’及び／または５’位に置換基を含むが、これらに限定されない１つ以上の非環式置換基を有するフラノシル環を含む直鎖状修飾糖部分である。修飾ｃｒＲＮＡに使用するための直鎖状修飾糖部分に適した２’−置換基には、２’−Ｈ、２’−Ｆ、２’−ＯＣＨ３（「ＯＭｅ」または「Ｏ−メチル」）、及び２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＯＣＨ３（「ＭＯＥ」）が含まれるが、これらに限定されない。そのような直鎖状修飾糖部分の２’−置換基は、未修飾糖部分に存在する２’−ＯＨ基に取って代わる。ある特定の実施形態において、２’−置換基は、ハロ、アリル、アミノ、アジド、ＳＨ、ＣＮ、ＯＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、Ｏ−Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、Ｏ−Ｃ１〜Ｃ１０置換アルコキシ、Ｏ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｏ−Ｃ１〜Ｃ１０置換アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ（Ｒｍ）−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ（Ｒｍ）−アルケニル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ（Ｒｍ）−アルケニル、Ｏ−アルキレニル（ａｌｋｙｌｅｎｙｌ）−Ｏ−アルキル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリル、Ｏ−アラルキル、Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（Ｒｍ）（Ｒｎ）またはＯＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）の中から選択され、式中各Ｒｍ及びＲｎは、独立してＨ、アミノ保護基、または未置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキルである。ある特定の実施形態のこれらの２’−置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ（ＮＯ２）、チオール、チオアルコキシ、チオアルキル、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル及びアルキニルの中から独立して選択される１つ以上の置換基でさらに置換され得る。直鎖状の修飾糖部分に対して適切な５’−置換基の例には、５’−メチル（ＲまたはＳ）、５’−ビニル、及び５’−メトキシが含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、直鎖状の修飾糖部分は、２つ以上の非架橋糖置換、例えば２’−Ｆ−５’−メチル糖部分を含む（例えばさらなる２’，５’−ビス置換糖部分及びヌクレオシドについて、国際公開特許第２００８／１０１１５７号を参照されたい）。
【０３８８】
ある特定の実施形態において、２’−置換ヌクレオシドまたは２’−直鎖状糖部分はＨ、Ｆ、ＮＨ２、Ｎ３、ＯＣＦ３、ＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）３ＮＨ２、ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、ＯＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（Ｒｍ）（Ｒｎ）、Ｏ（ＣＨ２）２Ｏ（ＣＨ２）２Ｎ（ＣＨ３）２、及びＮ−置換アセトアミド（ＯＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ））から選択される直鎖状２’−置換基を含有する糖部分を含み、式中各Ｒｍ及びＲｎは、独立してＨ、アミノ保護基、またはＣ１〜Ｃ１０アルキルである。
【０３８９】
ある特定の実施形態において、２’−置換ヌクレオシドまたは２’−直鎖状修飾ヌクレオシドはＨ、Ｆ、ＯＣＦ３、ＯＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２、Ｏ（ＣＨ２）２Ｏ（ＣＨ２）２Ｎ（ＣＨ３）２、及びＯＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｈ）ＣＨ３（「ＮＭＡ」）から選択される直鎖状２’−置換基を含有する糖部分を含む。
【０３９０】
ある特定の実施形態において、２’−置換ヌクレオシドまたは２’−直鎖状修飾ヌクレオシドはＨ、Ｆ、ＯＣＨ３、及びＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３から選択される直鎖状２’−置換基を含有する糖部分を含む。
【０３９１】
直鎖状修飾糖部分などの修飾糖部分を含むヌクレオシドは、そのヌクレオシドの糖部分における置換（複数可）の位置（複数可）により参照される。例えば、２’−置換または２−修飾糖部分を含有するヌクレオシドは、２’−置換ヌクレオシドまたは２−修飾ヌクレオシドのように称される。
【０３９２】
ある特定の修飾糖部分は、第２の環を形成して二環糖部分をもたらす架橋糖置換基を含む。ある特定のそのような実施形態において、二環糖部分は、４’フラノース環原子と２’フラノース環原子との間に橋を含む。そのような４’と２’を架橋する糖置換には、４’−ＣＨ２−２’、４’−（ＣＨ２）２−２’、４’−（ＣＨ２）３−２’、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’（「ＬＮＡ」）、４’−ＣＨ２−Ｓ−２’、４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’（「ＥＮＡ」）、４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’（Ｓ配置の場合に「拘束エチル」または「ｃＥｔ」と称される）、４’−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−２’、４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−２’、４’−ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）−Ｏ−２’（「拘束ＭＯＥ」または「ｃＭＯＥ」）及びその類似体（例えば、米国特許第７，３９９，８４５号を参照）、４’−Ｃ（ＣＨ３）（ＣＨ３）−Ｏ−２’及びその類似体（例えば、ＷＯ２００９／００６４７８を参照）、４’−ＣＨ２−Ｎ（ＯＣＨ３）−２’及びその類似体（例えば、ＷＯ２００８／１５０７２９を参照）、４’−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−２’（例えば、ＵＳ２００４／０１７１５７０を参照）、４’−ＣＨ２−Ｃ（Ｈ）（ＣＨ３）−２’（例えば、Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００９，７４，１１８−１３４を参照）、４’−ＣＨ２−Ｃ（＝ＣＨ２）−２’及びその類似体（公開ＰＣＴ国際出願ＷＯ２００８／１５４４０１を参照）、４’−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’、４’−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−２’、４’−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−２’、及び４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’（式中各Ｒ、Ｒａ、及びＲｂは、独立してＨ、保護基、またはＣ１〜Ｃ１２アルキルである（例えば、米国特許第７，４２７，６７２号を参照））が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３９３】
ある特定の実施形態において、このような４’と２’の架橋は−［Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）］ｎ−、−［Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）］ｎ−Ｏ−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ−、−Ｃ（＝ＮＲａ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｓ）−、−Ｏ−、−Ｓｉ（Ｒａ）２−、−Ｓ（＝Ｏ）ｘ−、及び−Ｎ（Ｒａ）−から独立して選択される１〜４個の結合基を独立して含み、
式中、
ｘは、０、１、または２であり、
ｎは、１、２、３、または４であり、
各Ｒａ及びＲｂは、独立してＨ、保護基、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、置換Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、Ｃ５〜Ｃ２０アリール、置換Ｃ５〜Ｃ２０アリール、複素環基、置換複素環基、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、Ｃ５〜Ｃ７脂環基、置換Ｃ５〜Ｃ７脂環基、ハロゲン、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＣＯＯＪ１、アシル（Ｃ（＝Ｏ）−Ｈ）、置換アシル、ＣＮ、スルホニル（Ｓ（＝Ｏ）２−Ｊ１）、またはスルホニル（Ｓ（＝Ｏ）−Ｊ１）、ならびに
各Ｊ１及びＪ２は、独立してＨ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、置換Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、Ｃ５〜Ｃ２０アリール、置換Ｃ５〜Ｃ２０アリール、アシル（Ｃ（＝Ｏ）−Ｈ）、置換アシル、複素環基、置換複素環基、Ｃ１〜Ｃ１２アミノアルキル、置換Ｃ１〜Ｃ１２アミノアルキル、または保護基である。
【０３９４】
さらなる二糖部分には、例えば、Ｆｒｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，２５（２２），４４２９−４４４３、Ａｌｂａｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００６，７１，７７３１−７７４０、Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９８，４，４５５−４５６、Ｋｏｓｈｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９８，５４，３６０７−３６３０、Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，２０００，９７，５６３３−５６３８、Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９８，８，２２１９−２２２２、Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，６３，１００３５−１００３９、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００１７，１２９，８３６２−８３７９、Ｅｌａｙａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｉｎｖｅｎｓ．Ｄｒｕｇｓ，２００１，２，５５８−５６１、Ｂｒａａｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２００１，８，１−７、Ｏｒｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２００１，３，２３９−２４３、米国特許第７，０５３，２０７号、同第６，２６８，４９０号、同第６，７７０，７４８号、同第６，７９４，４９９号、同第７，０３４，１３３号、同第６，５２５，１９１号、同第６，６７０，４６１号、及び同第７，３９９，８４５号、ＷＯ２００４／１０６３５６、ＷＯ１９９４／１４２２６、ＷＯ２００５／０２１５７０、及びＷＯ２００７／１３４１８１、米国特許公開番号ＵＳ２００４／０１７１５７０、ＵＳ２００７／０２８７８３１、及びＵＳ２００８／００３９６１８、米国特許出願シリアル番号第１２／１２９，１５４号、同第６０／９８９，５７４号、同第６１／０２６，９９５号、同第６１／０２６，９９８号、同第６１／０５６，５６４号、同第６１／０８６，２３１号、同第６１／０９７，７８７号、及び同第６１／０９９，８４４号、ならびにＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６４５９１、ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６６１５４、及びＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６８９２２が当分野で知られる。
【０３９５】
ある特定の実施形態において、二環糖部分及びそのような二環糖部分を組み込むヌクレオシドは、異性体配置によってさらに定義される。例えば、ＬＮＡヌクレオシド（上記の）は、α−Ｌ配置またはβ−Ｄ配置であっても良い。
【化１】
2020503017.tif 000006
α−Ｌ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）またはα−Ｌ−ＬＮＡ二環ヌクレオシドはオリゴヌクレオチドに組み込まれている（Ｆｒｉｅｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００３，２１，６３６５−６３７２）。本明細書では、二環ヌクレオシドの一般的な描写に両方の異性体配置が含まれる。特定の二環ヌクレオシド（例えばＬＮＡまたはｃＥｔ）の位置が本明細書の例示的な実施形態で特定される場合、別様に明記されない限り、それらはβ−Ｄ配置である。
【０３９６】
ある特定の実施形態において、修飾糖部分は１つ以上の非架橋糖置換及び１つ以上の架橋糖置換（例えば５’−置換及び４’−２’架橋糖）を含む。（例えばＬＮＡヌクレオシドがさらに例えば、５’−メチルまたは５’−ビニル基で置換されるＷＯ２００７／１３４１８１を参照、及び例えば米国特許第７，５４７，６８４号、同第７，７５０，１３１号、同第８，０３０，４６７号、同第８，２６８，９８０号、同第７，６６６，８５４号及び同第８，０８８，７４６号を参照）。
【０３９７】
ある特定の実施形態において、修飾糖部分は、糖代替物である。ある特定のこのような実施形態において、糖部分の酸素原子は、例えば硫黄、炭素または窒素原子で置換される。ある特定のこのような実施形態において、このような修飾糖部分は、上記のように架橋及び／または非架橋置換も含む。例えば、ある特定の糖代替物には、４’−硫黄原子ならびに２’位（例えばＵＳ２００５／０１３０９２３を参照）及び／または５’位に置換が含まれる。
【０３９８】
ある特定の実施形態において、糖代替物は５原子以外を有する環を含む。例えば、ある特定の実施形態において、糖代替物は６員のテトラヒドロピラン（「ＴＨＰ」）を含む。このようなテトラヒドロピランは、さらに修飾または置換され得る。このような修飾テトラヒドロピランを含有するヌクレオシドには、限定されないが、ヘキシトール核酸（「ＨＮＡ」）、アニトール核酸（「ＡＮＡ」）、マニトール核酸（「ＭＮＡ」）（Ｌｅｕｍａｎｎ，ＣＪ．Ｂｉｏｏｒｇ．＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００２，１０，８４１−８５４）、フルオロＨＮＡ：
【化２】
2020503017.tif 000007
（「Ｆ−ＨＮＡ」、Ｆ−ＨＮＡはＦ−ＴＨＰまたは３’−フルオロテトラヒドロピランとしても称され、例えば米国特許第８，０８８，９０４号、同第８，４４０，８０３号、及び同第８，７９６，４３７号を参照されたい）、及びさらに修飾された以下の式を有するＴＨＰ化合物を含有するヌクレオシドが含まれ、
【化３】
2020503017.tif 000008
式中、上記の修飾ＴＨＰヌクレオシドのそれぞれについて、独立してＢｘは核酸塩基部分であり、
Ｔ３及びＴ４は、それぞれ独立して、修飾ＴＨＰヌクレオシドをオリゴヌクレオチドの残部に結合するヌクレオシド間結合基であり、またはＴ３及びＴ４の一方は、修飾ＴＨＰヌクレオシドをオリゴヌクレオチドの残部に結合するヌクレオシド間結合基であり、ならびにＴ３及びＴ４の他方は、Ｈ、ヒドロキシル保護基、結合コンジュゲート基、または５’もしくは３’末端基であり、
ｑ１、ｑ２、ｑ３、ｑ４、ｑ５、ｑ６及びｑ７はそれぞれ、独立してＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、または置換Ｃ２〜Ｃ６アルキニルであり、及び
Ｒ１及びＲ２は水素、ハロゲン、置換または非置換のアルコキシ、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＯＣ（＝Ｘ）Ｊ１、ＯＣ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２、ＮＪ３Ｃ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２、及びＣＮの中から独立して選択され、式中ＸはＯ、ＳまたはＮＪ１、ならびにＪ１、Ｊ２、及びＪ３は、独立してＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである。
【０３９９】
ある特定の実施形態において、修飾ＴＨＰヌクレオシドが提供され、ここでｑ１、ｑ２、ｑ３、ｑ４、ｑ５、ｑ６及びｑ７はそれぞれＨである。ある特定の実施形態において、少なくとも１つのｑ１、ｑ２、ｑ３、ｑ４、ｑ５、ｑ６及びｑ７はそれぞれＨ以外である。ある特定の実施形態において、少なくとも１つのｑ１、ｑ２、ｑ３、ｑ４、ｑ５、ｑ６及びｑ７はメチルである。ある特定の実施形態において、修飾ＴＨＰヌクレオシドが提供され、ここでＲ１及びＲ２の１つはＦである。ある特定の実施形態において、Ｒ１はＦであり、かつＲ２はＨであり、ある特定の実施形態において、Ｒ１はメトキシであり、かつＲ２はＨであり、ならびにある特定の実施形態において、Ｒ１はメトキシエトキシであり、かつＲ２はＨである。
【０４００】
ある特定の実施形態において、糖代替物は５を超える原子及び２つ以上のヘテロ原子を有する環を含む。例えば、モルホリノ糖部分を含有するヌクレオシド及びオリゴヌクレオチドにおけるそれらの使用が報告されている（例えば、Ｂｒａａｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，４１，４５０３−４５１０ならびに米国特許第５，６９８，６８５号、同第５，１６６，３１５号、同第５，１８５，４４４号、及び同第５，０３４，５０６号を参照）。本明細書で使用する場合、用語「モルホリノ」は以下の構造を有する糖代替物を意味する。
【化４】
2020503017.tif 000009
特定の実施形態において、例えば、上記モルホリノ構造の様々な置換基を付加するか改変することによって、モルホリノが修飾されていてもよい。このような糖代替物は、本明細書において「修飾モルホリノ」と称される。
【０４０１】
ある特定の実施形態において、糖代替物は非環式部分を含む。そのような非環式糖代替物を含有するヌクレオシド及びオリゴヌクレオチドの例には、ペプチド核酸（「ＰＮＡ」），非環式ブチル核酸（例えばＫｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１３，１１，５８５３−５８６５を参照）、及びＷＯ２０１１／１３３８７６に記載されるヌクレオシド及びオリゴヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。
【０４０２】
多くの他の二環糖及び三環糖ならびに糖代替物の環構造が当技術分野で知られており、これらは修飾ヌクレオシドに使用することができる（例えばＬｅｕｍａｎｎ，Ｊ．Ｃ，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，１０，８４１−８５４を参照）。
【０４０３】
２．ある特定の修飾核酸塩基
ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡなどの修飾オリゴヌクレオチドは、未修飾核酸塩基を含有する１つ以上のヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、修飾核酸塩基を含有する１つ以上のヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは脱塩基ヌクレオシドと称される核酸塩基を含まない、１つ以上の核酸塩基を含む。
【０４０４】
ある特定の実施形態において、修飾核酸塩基は５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、アルキルまたはアルキニル置換ピリミジン、アルキル置換プリン、ならびにＮ−２、Ｎ−６及びＯ−６置換プリンから選択される。ある特定の実施形態において、修飾核酸塩基は２−アミノプロピルアデニン、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−Ｎ−メチルグアニン、６−Ｎ−メチルアデニン、２−プロピルアデニン、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−プロピニル（−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ３）ウラシル、５−プロピニルシトシン、６−アゾウラシル、６−アゾシトシン、６−アゾチミン、５−リボシルウラシル（プソイドウラシル（ｐｓｅｕｄｏｕｒａｃｉｌ））、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル、８−アザ及び他の８−置換プリン、５−ハロ、とりわけ５−ブロモ、５−トリフルオロメチル、５−ハロウラシル、及び５−ハロシトシン、７−メチルグアニン、７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、３−デアザグアニン、３−デアザアデニン、６−Ｎ−ベンゾイルアデニン、２−Ｎ−イソブチリルグアニン、４−Ｎ−ベンゾイルシトシン、４−Ｎ−ベンゾイルウラシル、５−メチル４−Ｎ−ベンゾイルシトシン、５−メチル４−Ｎ−ベンゾイルウラシル、ユニバーサル塩基、疎水性塩基、無差別な塩基（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ  ｂａｓｅ）、サイズ拡張塩基（ｓｉｚｅ−ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｂａｓｅ）、及びフッ素化塩基から選択される。さらに修飾核酸塩基には、三環ピリミジン、例えば１，３−ジアザフェノキサジン−２−オン、１，３−ジアザフェノチアジン−２−オン及び９−（２−アミノエトキシ）−１，３−ジアザフェノキサジン−２−オン（Ｇ−クランプ）が含まれる。修飾核酸塩基にはまた、プリンまたはピリミジン塩基が他の複素環、例えば７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン及び２−ピリドンで置換されたものも含まれ得る。さらに核酸塩基には米国特許第３，６８７，８０８号に開示されるもの、Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９０，８５８−８５９、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３、Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ１５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄｓ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３，２７３−２８８に開示されるもの、ならびにＡｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｒｏｏｋｅ  Ｓ．Ｔ．，Ｅｄ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，２００８，１６３−１６６及び４４２−４４３のＣｈａｐｔｅｒ６及び１５で開示されるものが含まれる。
【０４０５】
上記の修飾核酸塩基ならびに他の修飾核酸塩基のある特定の調製を教示する代表的な米国特許には、ＵＳ２００３／０１５８４０３、Ｕ．Ｓ．３，６８７，８０８、４，８４５，２０５、５，１３０，３０２、５，１３４，０６６、５，１７５，２７３、５，３６７，０６６、５，４３２，２７２、５，４３４，２５７、５，４５７，１８７、５，４５９，２５５、５，４８４，９０８、５，５０２，１７７、５，５２５，７１１、５，５５２，５４０、５，５８７，４６９、５，５９４，１２１、５，５９６，０９１、５，６１４，６１７、５，６４５，９８５、５，６８１，９４１、５，７５０，６９２、５，７６３，５８８、５，８３０，６５３及び６，００５，０９６が含まれるが、これらに限定されない。
【０４０６】
Ｂ．ある特定の修飾ヌクレオシド間結合
ある特定の実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡなどの修飾オリゴヌクレオチドのヌクレオシドは任意のヌクレオシド間結合を用いて共に結合され得る。ヌクレオシド間結合基の２つの主な分類は、リン原子の存在または不在によって定義される。代表的なリンを含有するヌクレオシド間結合には、ホスホジエステル結合（「Ｐ＝Ｏ」）（未修飾または天然の結合とも称される）、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、ホスホロアミダート、及びホスホロチオエート（「Ｐ＝Ｓ」）、及びホスホロジチオエート（「ＨＳ−Ｐ＝Ｓ」）を含むリン酸が含まれるが、これらに限定されない。代表的な非リン酸を含有するヌクレオシド間結合基には、メチレンメチルイミノ（−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−）、チオジエステル（−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｓ−）、チオノカルバメート（−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）（ＮＨ）−Ｓ−）、シロキサン（−Ｏ−ＳｉＨ２−Ｏ−）、及びＮ，Ｎ’−ジメチルヒドラジン（−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−）が含まれるが、これらに限定されない。天然のリン酸結合と比較して、修飾ヌクレオシド間結合は、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を変える（通常は増加させる）ために使用され得る。ある特定の実施形態において、キラル原子を有するヌクレオシド間結合は、ラセミ混合物として、または別個の鏡像異性体として調製され得る。代表的なキラルなヌクレオシド間結合には、アルキルホスホネート及びホスホロチオエートが含まれるが、これらに限定されない。リン含有及び非リン含有ヌクレオシド間結合の調製方法は、当業者に周知である。
【０４０７】
中性のヌクレオシド間結合には、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、ＭＭＩ（３’−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−５’）、アミド−３（３’−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−５’）、アミド−４（３’−ＣＨ２−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（＝Ｏ）−５’）、ホルムアセタール（３’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−５’）、メトキシプロピル、及びチオホルムアセタール（３’−Ｓ−ＣＨ２−Ｏ−５’）が含まれるが限定されない。さらに中性なヌクレオシド間結合には、シロキサン（ジアルキルシロキサン）、カルボン酸エステル、カルボキサミド、スルフィド、スルホン酸エステル及びアミド（例えば、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｙ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｖｉ  ａｎｄ  Ｐ．Ｄ．Ｃｏｏｋ，Ｅｄｓ．，ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ５８０、Ｃｈａｐｔｅｒｓ３ａｎｄ４，４０−６５を参照）を含む、非イオン性結合が含まれる。さらに中性のヌクレオシド間結合には、入り混じったＮ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２成分部分を含有する非イオン性結合が含まれる。
【０４０８】
Ｃ．ある特定のコンジュゲート基及び末端基
ある特定の実施形態において、ｃｒＲＮＡとして使用するためのオリゴヌクレオチドには、コンジュゲート基及び／または末端基がさらに含まれる。ある特定の実施形態において、ｃｒＲＮＡとして使用するためのオリゴヌクレオチドを含有する化合物には、コンジュゲート基または末端基がさらに含まれる。ある特定のこのような実施形態において、オリゴヌクレオチドは１つ以上のコンジュゲート基に共有結合する。ある特定の実施形態において、コンジュゲート基は薬力学的特性、薬物動態学的特性、安定特性、結合特性、吸収特性、細胞分布特性、細胞取り込み特性、電荷特性及びクリアランス特性を含むが、これらに限定されない、結合オリゴヌクレオチドの１つ以上の特性を修飾する。ある特定の実施形態において、コンジュゲート基は、結合オリゴヌクレオチドに新たな特性、例えばオリゴヌクレオチドの検出を可能にする蛍光色素基またはレポーター基を付与する。コンジュゲート基及び／または末端基は、上記の任意の修飾またはモチーフを有するオリゴヌクレオチドに付加しても良い。
【０４０９】
コンジュゲート基には、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、糖、ビタミン部分、ポリエチレングリコール、チオエーテル、ポリエーテル、コレステロール、チオコレステロール、コール酸部分、葉酸、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、フェナントリジン、アントラキノン、アダマンタン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、蛍光色素、及び色素が含まれるが、これらに限定されない。前述したある特定のコンジュゲート基は、例えば、コレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６，６５５３−６５５６）、コリン酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９４，４，１０５３−１０６０）、チオエーテル、例えばヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０，３０６−３０９、Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３，２７６５−２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９２，２０，５３３−５３８）、脂肪族鎖、例えばド−デカン−ジオール）またはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９９１，１０，１１１１−１１１８、Ｋａｂａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９，３２７−３３０、Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５，４９−５４），リン脂質、例えばジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチル−アンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１−３６５４、Ｓｈｅａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９０，１８，３７７７−３７８３）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４，９６９−９７３）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１−３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４，２２９−２３７）、オクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７，９２３−９３７）、トコフェロール基（Ｎｉｓｈｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，２０１５，４，ｅ２２０；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｎａ．２０１４．７２及びＮｉｓｈｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２００８，１６，７３４−７４０）、またはＧａｌＮＡｃクラスター（例えばＷＯ２０１４／１７９６２０）である。
【０４１０】
ある特定の実施形態において、コンジュゲート基には、有効な製剤原料、例えばアスピリン、ワーファリン、フェニルブタゾン、イブプロフェン、スプロフェン、フェンブフェン（ｆｅｎ−ｂｕｆｅｎ）、ケトプロフェン、（Ｓ）−（＋）−プラノプロフェン、カルプロフェン、ダンシルサルコシン、２，３，５−トリヨード安息香酸、フィンゴリモド、フルフェナム酸、フォリン酸、ベンゾチアジアジン、クロロチアジド、ジアゼピン、インドメタシン（ｉｎｄｏ−ｍｅｔｈｉｃｉｎ）、バルビツレート、セファロスポリン、サルファ薬、糖尿病治療薬、抗菌薬、または抗生物質が含まれる。
【０４１１】
コンジュゲート基は、ｃｒＲＮＡオリゴヌクレオチドなどの親化合物に直接的に、または任意選択でコンジュゲートリンカーを介して結合する。ある特定の実施形態において、コンジュゲート基はオリゴヌクレオチドに直接結合する。ある特定の実施形態において、コンジュゲート基はコンジュゲートリンカーを介してオリゴヌクレオチドに間接的に結合する。ある特定の実施形態において、コンジュゲートリンカーは、ヒドロカルビル鎖、またはエチレングリコールもしくはアミノ酸単位などの繰り返し単位のオリゴマーなどの鎖構造を含む。ある特定の実施形態において、コンジュゲート基は切断可能な部分を含む。ある特定の実施形態において、コンジュゲート基は切断可能な部分を介してオリゴヌクレオチドに結合する。ある特定の実施形態において、コンジュゲートリンカーは切断可能な部分を含む。ある特定のこのような実施形態において、コンジュゲートリンカーは切断可能な部分を介してオリゴヌクレオチドに結合する。
【０４１２】
ある特定の実施形態において、コンジュゲートリンカーは、アルキル、アミノ、オキソ、アミド、ジスルフィド、ポリエチレングリコール、エーテル、チオエーテル、及びヒドロキシルアミノから選択される１つ以上の基を含む。ある特定のこのような実施形態において、コンジュゲートリンカーは、アルキル、アミノ、オキソ、アミド及びエーテル基から選択される基を含む。ある特定の実施形態において、コンジュゲートリンカーは、アルキル及びアミド基から選択される基を含む。ある特定の実施形態において、コンジュゲートリンカーは、アルキル及びエーテル基から選択される基を含む。ある特定の実施形態において、コンジュゲートリンカーは、少なくとも１つのリン部分を含む。ある特定の実施形態において、コンジュゲートリンカーは、少なくとも１つのリン酸基を含む。ある特定の実施形態において、コンジュゲートリンカーは、少なくとも１つの中性結合基を含む。
【０４１３】
ある特定の実施形態において、上記のコンジュゲートリンカーを含有するコンジュゲートリンカーは、二官能性の結合部分、例えば本明細書で提供されるｃｒＲＮＡオリゴヌクレオチドなど、親化合物への結合コンジュゲート基として有用であることが当分野で知られているものである。一般に、二官能性結合部分には少なくとも２つの官能基が含まれる。官能基のうち１つは、親化合物の特定の部位に結合するために選択され、他方はコンジュゲート基に結合するために選択される。二官能性結合部分に使用される官能基の例には、求核性基と反応するための求電子基及び求電子基と反応するための求核性基が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、二官能性結合部分にはアミノ、ヒドロキシル、カルボン酸、チオール、アルキル、アルケニル、及びアルキニルから選択される１つ以上の基が含まれる。
【０４１４】
コンジュゲートリンカーの例には、ピロリジン、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸（ＡＤＯ）、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）及び６−アミノヘキサン酸（ＡＨＥＸまたはＡＨＡ）が含まれるが、これらに限定されない。他のコンジュゲートリンカーには、限定されないが、置換もしくは未置換のＣ１〜Ｃ１０アルキル、置換もしくは未置換のＣ２〜Ｃ１０アルケニルまたは置換もしくは未置換のＣ２〜Ｃ１０アルキニルが含まれ、ここで好ましい置換基の非限定的な一覧には、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル及びアルキニルが含まれる。
【０４１５】
ある特定の実施形態において、切断可能な部分は、切断可能な結合である。ある特定の実施形態において、切断可能な部分は、切断可能な結合を含む。ある特定の実施形態において、切断可能な部分は、少なくとも１つの切断可能な結合を含有する原子団である。ある特定の実施形態において、切断可能な部分は、１個、２個、３個、４個、または４個以上の切断可能な結合を有する原子団を含む。ある特定の実施形態において、切断可能な部分は、リソソームなどの細胞内部または細胞内区画で選択的に切断される。ある特定の実施形態において、切断可能部分はヌクレアーゼなどの内因性酵素によって選択的に切断される。
【０４１６】
ある特定の実施形態において、切断可能な結合は、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、一方または両方のホスホジエステル結合、リン酸エステル結合、カルバメート結合、またはジスルフィド結合の中から選択される。ある特定の実施形態において、切断可能な結合は、一方または両方のホスホジエステルのエステルである。ある特定の実施形態において、切断可能な部分は、リン酸またはホスホジエステルを含む。ある特定の実施形態において、切断可能な部分はオリゴヌクレオチドとコンジュゲートリンカーまたはコンジュゲート基の間のリン酸結合である。
【０４１７】
コンジュゲート基はオリゴヌクレオチドの末端及び／または任意の内側の部位の一方または両方に結合し得る。ある特定の実施形態において、コンジュゲート基は修飾オリゴヌクレオチドのヌクレオシドの２’位に結合する。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドの一方または両方の末端に結合するコンジュゲート基は、末端基である。ある特定のこのような実施形態において、コンジュゲート基または末端基は、オリゴヌクレオチドの３’及び／または５’末端に結合する。ある特定のこのような実施形態において、コンジュゲート基（または末端基）は、オリゴヌクレオチドの３’末端に結合する。ある特定の実施形態において、コンジュゲート基はオリゴヌクレオチドの３’末端付近に結合する。ある特定の実施形態において、コンジュゲート基（または末端基）はオリゴヌクレオチドの５’末端に結合する。ある特定の実施形態において、コンジュゲート基はオリゴヌクレオチドの５’末端付近に結合する。
【０４１８】
末端基の例にはコンジュゲート基、キャッピング基、リン酸部分、保護基、修飾または未修飾のヌクレオシド、及び独立して修飾または未修飾である２つ以上のヌクレオシドが含まれるが、これらに限定されない。
【０４１９】
ある特定の実施形態において、コンジュゲート基は細胞標的化部分である。ある特定の実施形態において、コンジュゲート基、任意選択のコンジュゲートリンカー、及び任意選択の切断可能部分は、以下の一般式を有し：
【化５】
2020503017.tif 000010
式中、ｎは１〜約３であり、ｎが１の場合ｍは０、ｎが２以上の場合ｍは１、ｊは１または０、及びｋは１または０である。
【０４２０】
ある特定の実施形態において、ｎは１、ｊは１及びｋは０である。ある特定の実施形態において、ｎは１、ｊは０及びｋは１である。ある特定の実施形態において、ｎは１、ｊは１及びｋは１である。ある特定の実施形態において、ｎは２、ｊは１、及びｋは０である。ある特定の実施形態において、ｎは２、ｊは０、及びｋは１である。ある特定の実施形態において、ｎは２、ｊは１、及びｋは１である。ある特定の実施形態において、ｎは３、ｊは１、及びｋは０である。ある特定の実施形態において、ｎは３、ｊは０、及びｋは１である。ある特定の実施形態において、ｎは３、ｊは１、及びｋは１である。
【０４２１】
ある特定の実施形態において、コンジュゲート基は少なくとも１つのテザーリガンドを有する細胞標的化部分を含む。ある特定の実施形態において、細胞標的化部分は、分枝基に共有結合する２つのテザーリガンドを含む。ある特定の実施形態において、細胞標的化部分は分枝基に共有結合する３つのテザーリガンドを含む。
【０４２２】
ある特定の実施形態において、細胞標的化部分は、アルキル、アミノ、オキソ、アミド、ジスルフィド、ポリエチレングリコール、エーテル、チオエーテル、及びヒドロキシアミノ基から選択される１つ以上の基を含有する分枝基を含む。ある特定の実施形態において、分枝基はアルキル、アミノ、オキソ、アミド、ジスルフィド、ポリエチレングリコール、エーテル、チオエーテル及びヒドロキシルアミノ基から選択される基を含有する分枝の脂肪族基を含む。ある特定のこのような実施形態において、分枝の脂肪族基はアルキル、アミノ、オキソ、アミド、及びエーテル基から選択される基を含む。ある特定のこのような実施形態において、分枝の脂肪族基は、アルキル、アミノ、及びエーテル基から選択される基を含む。ある特定のこのような実施形態において、分枝の脂肪族基は、アルキル及びエーテル基から選択される基を含む。ある特定の実施形態において、分岐基は、単環式または多環式環系を含む。
【０４２３】
ある特定の実施形態において、細胞標的化部分の各テザーは、任意の組み合わせで、アルキル、置換アルキル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、アミノ、オキソ、アミド、ホスホジエステル及びポリエチレングリコール基から選択される１個以上の基を含む。ある特定の実施形態において、各テザーは、任意の組み合わせで、アルキル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、アミノ、オキソ、アミド、及びポリエチレングリコールから選択される１個以上の基を含む直線状脂肪族基である。ある特定の実施形態において、各テザーは、任意の組み合わせで、アルキル、ホスホジエステル、エーテル、アミノ、オキソ及びアミドから選択される１個以上の基を含む直線状脂肪族基である。ある特定の実施形態において、各テザーは、任意の組み合わせで、アルキル、エーテル、アミノ、オキソ、及びアミドから選択される１個以上の基を含む直線状脂肪族基である。ある特定の実施形態において、各テザーは、任意の組み合わせで、アルキル、アミノ、及びオキソから選択される１個以上の基を含む直線状脂肪族基である。ある特定の実施形態において、各テザーは、任意の組み合わせで、アルキル及びオキソから選択される１個以上の基を含む直線状脂肪族基である。ある特定の実施形態において、各テザーは、任意の組み合わせで、アルキル及びホスホジエステルから選択される１個以上の基を含む直線状脂肪族基である。ある特定の実施形態において、各テザーは、少なくとも１個のリン結合基または中性結合基を含む。ある特定の実施形態において、各テザーは、約６〜約２０原子長の鎖を含む。ある特定の実施形態において、各テザーは、約１０〜約１８原子長の鎖を含む。ある特定の実施形態において、各テザーは約１０原子の鎖長を含む。
【０４２４】
ある特定の実施形態において、細胞標的化部分の各リガンドは、標的細胞上の少なくとも１つの受容体型に親和性を有する。ある特定の実施形態において、各リガンドは哺乳動物の肝臓細胞の表面上の少なくとも１つの受容体型に親和性を有する。ある特定の実施形態において、各リガンドは、肝臓のアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰ−Ｒ）に親和性を有する。ある特定の実施形態において、各リガンドは、糖である。ある特定の実施形態において、各リガンドはガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、マンノース、グルコース、グルコサミン及びフコースから独立して選択される。ある特定の実施形態において、各リガンドは、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）である。ある特定の実施形態において、細胞標的化部分は、３つのＧａｌＮＡｃリガンドを含む。ある特定の実施形態において、細胞標的化部分は、２つのＧａｌＮＡｃリガンドを含む。ある特定の実施形態において、細胞標的化部分は、１つのＧａｌＮＡｃリガンドを含む。
【０４２５】
ある特定の医薬組成物
ある特定の実施形態において、本発明は１つ以上のｃｒＲＮＡを含有する医薬組成物を提供する。ある特定の実施形態において、そのような医薬組成物はｔｒａｃｒＲＮＡを含む。ある特定の実施形態において、医薬組成物にはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを発現する手段が含まれる。ある特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを発現する手段は、プラスミドまたはウイルスベクターである。ある特定のこのような実施形態において、医薬組成物には適切な薬学的に許容される希釈剤または担体が含まれる。ある特定の実施形態において医薬組成物には修飾ｃｒＲＮＡが含まれる。ある特定のこのような実施形態において、修飾ｃｒＲＮＡはリボ核タンパク質の粒子または複合体（ＲＮＰ）である。ある特定のこのような実施形態において、ＲＮＰにはヌクレアーゼも含まれる。ある特定のこのような実施形態において、ヌクレアーゼはＣｐｆ１ヌクレアーゼである。ある特定の実施形態において医薬組成物にはリポソームまたは脂質ナノ粒子が含まれる。ある特定のこのような実施形態において、リポソームまたは脂質ナノ粒子には修飾ｃｒＲＮＡが含まれる。ある特定のこのような実施形態において、リポソームまたは脂質ナノ粒子にはＣｐｆ１ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡが含まれる。ある特定の実施形態において、医薬組成物は、滅菌生理食塩溶液及び１個以上のアンチセンス化合物を含む。ある特定の実施形態において、そのような医薬組成物は、滅菌生理食塩溶液及び１個以上のアンチセンス化合物からなる。ある特定の実施形態において、滅菌生理食塩水は、医薬品グレードの生理食塩水である。ある特定の実施形態において、医薬組成物は、１個以上のアンチセンス化合物及び滅菌水を含む。ある特定の実施形態において、医薬組成物は、１個のアンチセンス化合物及び滅菌水からなる。ある特定の実施形態において、滅菌水は医薬品グレードの水である。ある特定の実施形態において、医薬組成物は、１個以上のアンチセンス化合物及びリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。ある特定の実施形態において、医薬組成物は、１個以上のアンチセンス化合物及び滅菌ＰＢＳからなる。ある特定の実施形態において、滅菌ＰＢＳは医薬品グレードのＰＢＳである。
【０４２６】
［参照による非限定的な開示及び組み込み］
明細書に記載されるある特定の化合物、組成物、及び方法が特定の実施形態に従って具体的に記載されているが、以下の実施例は、本明細書に記載される化合物を例証する役割のみを果たし、それを限定するようには意図されていない。本出願に列挙される参考文献、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号等の各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０４２７】
本出願に添付される配列表が必要に応じて各配列を「ＲＮＡ」または「ＤＮＡ」のいずれか一方と特定するが、実際には、それらの配列は、任意の組み合わせの化学修飾で修飾され得る。当業者であれば、修飾オリゴヌクレオチドを説明するための「ＲＮＡ」または「ＤＮＡ」のそのような指定が、ある特定の事例において、任意であることを容易に認識する。例えば、２’−ＯＨ糖部分及びチミン塩基を含むヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドは、修飾糖を有するＤＮＡ（ＤＮＡの天然２’−Ｈに対して２’−ＯＨ）または修飾塩基を有するＲＮＡ（ＲＮＡの天然ウラシルに対して、チミン（メチル化ウラシル））と記載され得る。
【０４２８】
したがって、配列表中のものを含むが、これらに限定されない本明細書に提供される核酸配列は、修飾核酸塩基を有するそのような核酸を含むが、これらに限定されない天然または修飾ＲＮＡ及び／またはＤＮＡの任意の組み合わせを含有する核酸を包含するよう意図される。さらなる例として限定するものではないが、核酸塩基配列「ＡＴＣＧＡＴＣＧ」を有するオリゴマー化合物は、修飾または未修飾に関わらず、配列「ＡＵＣＧＡＵＣＧ」を有するようなＲＮＡ塩基を含有するそのような化合物、及び「ＡＵＣＧＡＴＣＧ」など一部のＤＮＡ塩基と一部のＲＮＡ塩基を有するもの、及び「ＡＴｍＣＧＡＵＣＧ」など他の修飾塩基または天然の塩基を有するオリゴマー化合物を含有するが、これらに限定されないそのような核酸塩基配列を有する任意のオリゴマー化合物を包含し、ここでｍＣは、５位にメチル基を含有するシトシン塩基を示す。
【実施例】
【０４２９】
実施例
以下の実施例は、本発明のある特定の実施形態を例示し、限定するものではない。さらに、特定の実施形態が提供される場合、本発明者らは、それらの特定の実施形態の一般的適用を企図している。例えば、特定のモチーフを有するオリゴヌクレオチドの開示は、そのモチーフまたは同様のモチーフを有するさらなるオリゴヌクレオチドへの合理的な支持を提供する。同様に、例えば、特定の高親和性修飾が特定の位置に出現する場合、同一の位置での他の高親和性修飾は、別途示されない限り、好適であると見なされる。
【０４３０】
実施例１：切断ｃｒＲＮＡの遺伝子編集作用
ＤＮＡ（シトシン５）−メチルトランスフェラーゼ１（ＤＮＭＴ１）に相補的である標的認識部分を含む切断ｃｒＲＮＡを設計かつ合成して、ＤＮＭＴ１の遺伝子編集におけるその作用を試験した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞はＣｐｆ１をコードするプラスミド及び下表に列挙されるｃｒＲＮＡをコードする２本鎖ｇｂｌｏｃｋ（ＩＤＴ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，Ｉｏｗａ）でトランスフェクションした。４８時間後、ゲノムＤＮＡを細胞から単離し、製造業者の指示に従ってＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した。ＤＮＭＴ１遺伝子のｃｒＲＮＡ標的部位を増幅させるために使用されたＰＣＲプライマーは、順方向：５’−ＣＴＧＧＧＡＣＴＣＡＧＧＣＧＧＧＴＣＡＣ−３’（配列番号１）及び逆方向：５’−ＣＣＴＣＡＣＡＣＡＡＣＡＧＣＴＴＣＡＴＧＴＣＡＧＣ−３’（配列番号２）であった。ＣｅｌＩ切断後、ＤＮＡをゲルで泳動した。ＤＮＭＴ１の遺伝子編集は、ＤＭＴ１内の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の程度を測定することにより評価した。ゲルのバンドの定量化は、Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトトウェアを用いて行い、ＮＨＥＪ発生率は以下の式を用いて算出した。ＮＨＥＪ（％）＝１００ｘ（１−（標的遺伝子の画分切り取り）０．５）、式中の標的遺伝子の画分切り取りは、切り取った標的遺伝子の断片（複数可）を、切り取った遺伝子断片（複数可）とインタクトな遺伝子断片（複数可）の全ての蛍光シグナルで割ることによって決定される。各切断型ｃｒＲＮＡに対するＮＨＥＪ発生率は、陽性対照である完全長ｃｒＲＮＡ００２のＮＨＥＪ発生率に対して標準化され、そしてその標準化した値を遺伝子破壊率と称した。下表に示す結果は、複数の切断型ｃｒＲＮＡが標的遺伝子を編集したことを示す。項目「ｎ．ｄ．」は、ゲルに検出可能な切断バンドがないためにデータがないことを示す。
【表１−４】
2020503017.tif 000011
上表における全てのヌクレオシドは、２’−ヒドロキシ糖部分を含む未修飾リボヌクレオシドであり、そして上表における全てのヌクレオシド間結合は、リン酸ヌクレオシド間結合である。各ｃｒＲＮＡの下線部分は、標的認識部分であり、下線のない部分は各ｃｒＲＮＡのＣＲＩＳＰＲ認識部分である。表１において、ｃｒＲＮＡのＣＲＩＳＰＲ認識部分は、Ｃｐｆ１を認識する。
【０４３１】
実施例２：修飾ｃｒＲＮＡの遺伝子編集作用
ＤＮＭＴ１に相補的である標的認識部分を含有する修飾ｃｒＲＮＡを設計かつ合成し、ＤＮＭＴ１の遺伝子編集におけるこれらの作用を試験した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００を用いてＣｐｆ１をコードしているプラスミドでトランスフェクションした（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）。翌朝、細胞をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉ  ｍａｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、下表に掲載される修飾ｃｒＲＮＡでトランスフェクションした。２４時間後、ゲノムＤＮＡを細胞から単離し、そしてＤＮＭＴ１の遺伝子編集の程度を決定するために、実施例１に記載されるように解析した。各修飾ｃｒＲＮＡについてのＮＨＥＪ発生率は、実施例１でも試験されたｃｒＲＮＡ１０３４６２１について観察されたＮＨＥＪ発生率に対して標準化した。標準化した値は、遺伝子破壊率と称した。下表に示す結果は、複数の修飾ｃｒＲＮＡが標的遺伝子を編集したことを示す。「ｎ．ｄ．」の項目は、ゲル中に検出可能な切断バンドがないためにデータがないことを示す。
【表２】
2020503017.tif 000012
下付き文字「ｍ」は、２’−Ｏ−メチル修飾を示す。下付き文字「ｒ」は、未修飾の、２’−ヒドロキシ糖部分を示す。下付き文字「ｏ」はリン酸ヌクレオシド間結合を示し、下付き文字「ｓ」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を示す。各ｃｒＲＮＡの下線部分は、標的認識部分であり、下線のない部分はｃｒＲＮＡのＣＲＩＳＰＲ認識部分である。上表において、ｃｒＲＮＡのＣＲＩＳＰＲ認識部分は、Ｃｐｆ１を認識する。
【０４３２】
実施例３：修飾ｃｒＲＮＡの遺伝子編集作用
ＤＮＭＴ１に相補的である標的認識部分を含有する修飾ｃｒＲＮＡを設計かつ合成し、ＤＮＭＴ１の遺伝子編集におけるこれらの作用を試験した。修飾ｃｒＲＮＡを除く、実施例２に記載されるようにトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を下表に掲載する。ゲノムＤＮＡは、実施例１に記載されるように単離され、そして解析された。各修飾ｃｒＲＮＡについてのＮＨＥＪ発生率は、実施例１及び２でも試験されたｃｒＲＮＡ１０３４６２１について観察されたＮＨＥＪ発生率に対して標準化した。標準化した値は、遺伝子破壊率と称した。下表に示される結果は、修飾ｃｒＲＮＡが標的遺伝子を編集したことを示す。下表のほぼ全ての修飾ｃｒＲＮＡが未修飾の対照より高い効率で標的遺伝子を編集した（ｃｒＲＮＡ１０３４６２１）。
【表３】
2020503017.tif 000013
下付き文字「ｍ」は、２’−Ｏ−メチル修飾を示す。下付き文字「ｒ」は、未修飾の、２’−ヒドロキシ糖部分を示す。下付き文字「ｏ」はリン酸ヌクレオシド間結合を示し、下付き文字「ｓ」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を示す。各ｃｒＲＮＡの下線部分は、標的認識部分であり、太字のヌクレオシドはリンカーヌクレオシドである。太字でもなく下線もない部分は、各ｃｒＲＮＡのＣＲＩＳＰＲ認識部分である。上表において、ｃｒＲＮＡのＣＲＩＳＰＲ認識部分は、Ｃｐｆ１を認識する。修飾ｃｒＲＮＡの１０３８２７３、１０３８２７４、１０３８２７６及び９９０５０９は５’−安定化である。ｃｒＲＮＡ１０３８２７３及び１０３８２７４のＣＲＩＳＰＲ認識部分には１つ以上の５’−安定化修飾が含まれる。ｃｒＲＮＡ１０３８２７６及び９９０５０９のリンカーヌクレオシドには、１つ以上の５’−安定化修飾が含まれる。
【０４３３】
実施例４：修飾ｃｒＲＮＡの遺伝子編集作用
ＤＮＭＴ１に相補的である標的認識部分を含有する修飾ｃｒＲＮＡを設計かつ合成し、ＤＮＭＴ１の遺伝子編集におけるこれらの作用を試験した。修飾ｃｒＲＮＡを除く、実施例２に記載されるようにトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を下表に掲載する。ゲノムＤＮＡは、実施例１に記載されるように単離され、そして解析された。各修飾ｃｒＲＮＡについてのＮＨＥＪ発生率は、本実験で試験されたこれらの中で最も高い活性を有したｃｒＲＮＡ１０３８２９９について観察されたＮＨＥＪ発生率に対して標準化した。標準化した値は、遺伝子破壊率と称した。下表に示す結果は、複数の修飾ｃｒＲＮＡが標的遺伝子を編集したことを示す。
【表４】
2020503017.tif 000014
下付き文字「ｍ」は、２’−Ｏ−メチル修飾を示す。下付き文字「ｒ」は、未修飾の、２’−ヒドロキシ糖部分を示す。下付き文字の「ｆ」は、２’−Ｆ修飾を示す。下付き文字「ｏ」はリン酸ヌクレオシド間結合を示し、下付き文字「ｓ」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を示す。各ｃｒＲＮＡの下線部分は、標的認識部分であり、太字のヌクレオシドはリンカーヌクレオシドである。太字でもなく下線もない部分は、各ｃｒＲＮＡのＣＲＩＳＰＲ認識部分である。上表において、ｃｒＲＮＡのＣＲＩＳＰＲ認識部分は、Ｃｐｆ１を認識する。上表の修飾ｃｒＲＮＡは５’−安定化であり、そしてリンカーヌクレオシドには５’−安定化修飾が含まれる。
【０４３４】
実施例５：修飾ｃｒＲＮＡの遺伝子編集作用
ＤＮＭＴ１に相補的である標的認識部分を含有する修飾ｃｒＲＮＡを設計かつ合成し、ＤＮＭＴ１の遺伝子編集におけるこれらの作用を試験した。修飾ｃｒＲＮＡを除く、実施例２に記載されるようにトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を下表に掲載する。ゲノムＤＮＡは、実施例１に記載されるように単離され、そして解析された。各修飾ｃｒＲＮＡについてのＮＨＥＪ発生率は、実施例１〜３でも試験されたｃｒＲＮＡ１０３４６２１について観察されたＮＨＥＪ発生率に対して標準化した。標準化した値は、遺伝子破壊率と称した。項目「ｎ．ｄ．」は、ゲルに検出可能な切断バンドがないため、データがないことを示す。下表に示す結果は、複数の修飾ｃｒＲＮＡが標的遺伝子を編集したことを示し、そして多くの場合、これらは未修飾ｃｒＲＮＡ１０３４６２１よりも、より効果的である。結果はまた、標的認識部分において核酸塩基の変化に耐容性を示す、ある特定の位置（例えば、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３４，８６９（２０１６）を参照）が、修飾糖にも耐容性を示すことを示した。
【表５】
2020503017.tif 000015
下付き文字「ｍ」は、２’−Ｏ−メチル修飾を示す。「Ｃ」に隣接する上付き文字「ｍ」は、５−メチルシトシンを示す。下付き文字「ｒ」は、未修飾の、２’−ヒドロキシ糖部分を示す。下付き文字の「ｆ」は、２’−Ｆ修飾を示す。下付き文字「ｋ」は、ｃＥｔ修飾を示す。下付き文字「ｏ」はリン酸ヌクレオシド間結合を示し、下付き文字「ｓ」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を示す。各ｃｒＲＮＡの下線部分は、標的認識部分であり、太字のヌクレオシドはリンカーヌクレオシドである。太字でもなく下線もない部分は、各ｃｒＲＮＡのＣＲＩＳＰＲ認識部分である。上表において、修飾ｃｒＲＮＡのＣＲＩＳＰＲ認識部分はＣｐｆ１を認識する。ｃｒＲＮＡ１０３４６２１以外の、上表の修飾ｃｒＲＮＡは５’−安定化であり、そしてリンカーヌクレオシドには５’−安定化修飾が含まれる。
【０４３５】
実施例６：修飾ｃｒＲＮＡの遺伝子編集作用
ＤＮＭＴ１に相補的である標的認識部分を含有する修飾ｃｒＲＮＡを設計かつ合成し、ＤＮＭＴ１の遺伝子編集におけるこれらの作用を試験した。修飾ｃｒＲＮＡを除く、実施例２に記載されるようにトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を下表に掲載する。ゲノムＤＮＡは、実施例１に記載されるように単離され、そして解析された。各修飾ｃｒＲＮＡについてのＮＨＥＪ発生率は、ｃｒＲＮＡ９８９５４９について観察されたＮＨＥＪ発生率に対して標準化した。標準化した値は、遺伝子破壊率と称した。下表に示される結果は、修飾ｃｒＲＮＡが標的遺伝子を編集したことを示す。
【表６】
2020503017.tif 000016
下付き文字「ｍ」は、２’−Ｏ−メチル修飾を示す。下付き文字「ｒ」は、未修飾の、２’−ヒドロキシ糖部分を示す。下付き文字「ｏ」はリン酸ヌクレオシド間結合を示し、下付き文字「ｓ」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を示す。各ｃｒＲＮＡの下線部分は、標的認識部分であり、太字のヌクレオシドはリンカーヌクレオシドである。太字でもなく下線もない部分は、各ｃｒＲＮＡのＣＲＩＳＰＲ認識部分である。上表において、ｃｒＲＮＡのＣＲＩＳＰＲ認識部分は、Ｃｐｆ１を認識する。上表の修飾ｃｒＲＮＡは５’−安定化であり、そしてリンカーヌクレオシドには５’−安定化修飾が含まれる。
【０４３６】
実施例７：修飾ｃｒＲＮＡの遺伝子編集作用
下記及び実施例４、５、及び６に記載される修飾ｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ９８９５４９と比較したＤＮＭＴ１の遺伝子編集におけるこれらの作用について試験した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を実施例２に記載されるように、下表に掲載される、３μＬの１００μＭ  ｃｒＲＮＡでトランスフェクションした。ゲノムＤＮＡは、実施例１に記載されるように単離され、そして解析された。各修飾ｃｒＲＮＡについてのＮＨＥＪ発生率は、ｃｒＲＮＡ９８９５４９について観察されたＮＨＥＪ発生率に対して標準化した。標準化した値は、遺伝子破壊率と称した。下表に示す結果は、複数の修飾ｃｒＲＮＡが標的遺伝子を編集したことを示す。
【表７】
2020503017.tif 000017
下付き文字「ｍ」は、２’−Ｏ−メチル修飾を示す。下付き文字「ｒ」は、未修飾の、２’−ヒドロキシ糖部分を示す。下付き文字「ｏ」はリン酸ヌクレオシド間結合を示し、下付き文字「ｓ」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を示す。下付き文字の「ｆ」は、２’−Ｆ修飾を示す。各ｃｒＲＮＡの下線部分は、標的認識部分であり、太字のヌクレオシドはリンカーヌクレオシドである。太字でもなく下線もない部分は、各ｃｒＲＮＡのＣＲＩＳＰＲ認識部分である。上表において、ｃｒＲＮＡのＣＲＩＳＰＲ認識部分は、Ｃｐｆ１を認識する。上表の修飾ｃｒＲＮＡは５’−安定化であり、そしてリンカーヌクレオシドには５’−安定化修飾が含まれる。
【表８ａ】
2020503017.tif 000018
【表８ｂ】
2020503017.tif 000019
【０４３７】
実施例８：修飾ｃｒＲＮＡの遺伝子編集作用
ＤＮＭＴ１に相補的である標的認識部分を含有する修飾ｃｒＲＮＡを設計かつ合成し、ＤＮＭＴ１の遺伝子編集におけるこれらの作用を試験した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を実施例２に記載されるように、下表に掲載される、３μＬの１００μＭ  ｃｒＲＮＡでトランスフェクションした。ゲノムＤＮＡは、実施例１に記載されるように単離され、そして解析された。表９の各修飾ｃｒＲＮＡについてのＮＨＥＪ発生率は、修飾ｃｒＲＮＡ１０９０６２６について観察されたＮＨＥＪ発生率に対して標準化した。標準化した値は、遺伝子破壊率と称した。表１０の各修飾ｃｒＲＮＡのＮＨＥＪ発生率は標準化されておらず、観察された遺伝子破壊の絶対的率が掲載されている。下表に示す結果は、複数の修飾ｃｒＲＮＡが標的遺伝子を編集したことを示す。
【表９】
2020503017.tif 000020
【表１０】
2020503017.tif 000021
上記の表の下付き文字「ｒ」は、未修飾の２’−ヒドロキシ糖部分を示す。下付き文字「ｄ」は、修飾された２’−デオキシ糖部分を示す。下付き文字「ｏ」は、リン酸ヌクレオシド間結合を示す。上付き文字「ｍ」に続く「Ｃ」は、５−メチルシトシンを示す。各ｃｒＲＮＡの下線部分は、標的認識部分であり、太字のヌクレオシドはリンカーヌクレオシドである。太字でもなく下線もない部分は、各ｃｒＲＮＡのＣＲＩＳＰＲ認識部分である。ｃｒＲＮＡのＣＲＩＳＰＲ認識部分は、Ｃｐｆ１を認識する。
【０４３８】
実施例９：修飾ｃｒＲＮＡの遺伝子編集作用
低密度リポタンパク質受容体に相補的である標的認識部分を含有する修飾ｃｒＲＮＡを、設計かつ合成してＬＤＬＲの遺伝子編集に対するこれらの作用を試験した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を実施例２に記載されるように、下表に掲載される、３μＬの１００μＭ  ｃｒＲＮＡでトランスフェクションした。ＬＤＬＲ遺伝子のｃｒＲＮＡ標的部位を増幅させるために使用されたＰＣＲプライマーが順方向：５’−ＧＧＡＧＡＣＣＣＡＡＡＴＡＣＡＡＣＡＡＡＴＣ−３’（配列番号５６）及び逆方向：５’−ＣＴＡＧＡＣＴＣＣＧＴＣＴＣＡＡＡＧＡＡＧ−３’（配列番号５７）であったことを除いて、実施例１に記載されるようにゲノムＤＮＡを単離して解析した。各修飾ｃｒＲＮＡについてのＮＨＥＪ発生率は、ｃｒＲＮＡ１０９１１５２について観察されたＮＨＥＪ発生率に対して標準化した。標準化した値は、遺伝子破壊率と称した。下表に示される結果は、修飾ｃｒＲＮＡが標的遺伝子を編集したことを示す。
【表１１ａ】
2020503017.tif 000022
【表１１ｂ】
2020503017.tif 000023
下付き文字「ｍ」は、２’−Ｏ−メチル修飾を示す。下付き文字「ｒ」は、未修飾の、２’−ヒドロキシ糖部分を示す。下付き文字「ｄ」は、修飾された２’−デオキシ糖部分を示す。下付き文字「ｏ」はリン酸ヌクレオシド間結合を示し、下付き文字「ｓ」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を示す。各ｃｒＲＮＡの下線部分は、標的認識部分であり、太字のヌクレオシドはリンカーヌクレオシドである。太字でもなく下線もない部分は、各ｃｒＲＮＡのＣＲＩＳＰＲ認識部分である。上表において、ｃｒＲＮＡのＣＲＩＳＰＲ認識部分は、Ｃｐｆ１を認識する。
【０４３９】
実施例１０：修飾ｃｒＲＮＡの遺伝子編集作用
ＬＤＬＲに相補的である標的認識部分を含有する修飾ｃｒＲＮＡを設計かつ合成し、実施例９に記載されるようにＬＤＬＲの遺伝子編集に対するこれらの作用を試験した。各ｃｒＲＮＡのＮＨＥＪ発生率は標準化しなかった。下表の値は、絶対的な遺伝子破壊率である。この結果は、修飾ｃｒＲＮＡが標的遺伝子を編集したことを示す。
【表１２】
2020503017.tif 000024
下付き文字「ｍ」は、２’−Ｏ−メチル修飾を示す。下付き文字「ｒ」は、未修飾の、２’−ヒドロキシ糖部分を示す。下付き文字「ｄ」は、修飾された２’−デオキシ糖部分を示す。下付き文字の「ｆ」は、２’−Ｆ修飾を示す。下付き文字「ｏ」はリン酸ヌクレオシド間結合を示し、下付き文字「ｓ」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を示す。各ｃｒＲＮＡの下線部分は、標的認識部分であり、太字のヌクレオシドはリンカーヌクレオシドである。太字でもなく下線もない部分は、各ｃｒＲＮＡのＣＲＩＳＰＲ認識部分である。上表において、ｃｒＲＮＡのＣＲＩＳＰＲ認識部分は、Ｃｐｆ１を認識する。
【０４４０】
実施例１１：ｃｒＲＮＡの遺伝子編集作用
種々の標的に相補的な標的認識部分を含有するｃｒＲＮＡを設計かつ合成して、遺伝子編集に対するそれらの作用を試験した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を実施例２に記載されるように、下表に掲載される、３μＬの１００μＭ  ｃｒＲＮＡでトランスフェクションした。ゲノムＤＮＡは、ｃｒＲＮＡ標的部位を増幅するために使用されたＰＣＲプライマーが、第５成分遺伝子（Ｃ５、表１３）については順方向：５’−ＣＡＴＧＧＧＧＴＡＡＣＣＣＡＧＣＡＡＡＣ−３’（配列番号５８）及び逆方向：５’−ＧＧＡＡＡＴＡＡＧＴＧＡＴＧＧＧＧＣＡＧＧ−３’（配列番号：５９）、Ｅｍｐｔｙ  Ｓｐｉｒａｃｌｅｓ  Ｈｏｍｅｏｂｏｘ１遺伝子（ＥＭＸ１、表１４）については順方向：５’−ＣＣＡＴＣＣＣＣＴＴＣＴＧＴＧＡＡＴＧＴ−３’（配列番号６０）及び逆方向：５’−ＧＧＡＧＡＴＴＧＧＡＧＡＣＡＣＧＧＡＧＡ−３’（配列番号６１）、イオンチャネル型グルタミン酸受容体のＮＭＤＡサブユニット２Ｂ型遺伝子（ＧＲＩＮ２ｂ、表５）については順方向：５’−ＧＣＡＴＡＣＴＣＧＣＡＴＧＧＣＴＡＣＣＴ−３’（配列番号６２）及び逆方向：５’−ＣＴＣＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＣＴＴＴＴＴＡ−３’（配列番号６３）、トランスサイレチン遺伝子（ＴＴＲ、表１６）については順方向：５’−ＣＡＧＡＡＴＣＡＧＣＡＧＧＴＴＴＧＣＡＧ−３’（配列番号６４）及び逆方向：５’−ＣＡＡＡＣＣＴＡＡＴＧＣＡＣＣＡＡＡＧＣ−３’（拝謁番号６５）のうちの１つであったことを除いて、実施例１に記載されるように単離かつ解析した。各ｃｒＲＮＡのＮＨＥＪ発生率は標準化しなかった。下表の値は、絶対的遺伝子破壊率である。下表に示す結果は、多くのｃｒＲＮＡが対応する標的遺伝子を編集したこと、そして異なる標的間でいくらか変動性があることを示す。
【表１３】
2020503017.tif 000025
【表１４】
2020503017.tif 000026
【表１５】
2020503017.tif 000027
【表１６】
2020503017.tif 000028
表１２の説明文は、表１３〜１６にも適用される。
【０４４１】
実施例１２：修飾ｃｒＲＮＡの遺伝子編集作用
ＤＮＭＴ１に相補的である標的認識部分を含む修飾ｃｒＲＮＡを設計かつ合成し、未修飾ｃｒＲＮＡ９８９５４９と比べたＤＮＭＴ１の遺伝子編集におけるその作用を試験した（表６参照）。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を実施例２に記載されるように、下表に掲載される、３μＬの１００μＭの修飾ｃｒＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ９８９５４９（「ＲＮＡコントロール」）またはｃｒＲＮＡ無し（「ネガティブコントロール」）でトランスフェクションした。ＮＨＥＪ発生率を定量化しなかったことを除いて、実施例１に記載されるようにゲノムＤＮＡを単離かつ分析した。図１に示される、結果として生じたＤＮＡゲルは、ＣＲＩＳＰＲ認識部分において少なくとも１つの修飾糖部分を含有する複数の修飾ｃｒＲＮＡが、標的遺伝子を編集したことを示す。
【表１７】
2020503017.tif 000029
下付き文字「ｍ」は、２’−Ｏ−メチル修飾を示す。下付き文字「ｒ」は、未修飾の、２’−ヒドロキシ糖部分を示す。下付き文字「ｋ」は、ｃＥｔ修飾を示す。下付き文字「ｏ」はリン酸ヌクレオシド間結合を示し、下付き文字「ｓ」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を示す。各ｃｒＲＮＡの下線部分は、標的認識部分であり、太字のヌクレオシドはリンカーヌクレオシドである。太字でもなく下線もない部分は、各ｃｒＲＮＡのＣＲＩＳＰＲ認識部分である。上表において、ｃｒＲＮＡのＣＲＩＳＰＲ認識部分は、Ｃｐｆ１を認識する。
【０４４２】
実施例１３：修飾ｃｒＲＮＡの遺伝子編集作用
ＤＮＭＴ１に相補的な標的認識部分を含む修飾ｃｒＲＮＡを設計してＤＮＭＴ１の遺伝子編集におけるそれらの作用を試験した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を実施例２に記載されるようにトランスフェクションした。ゲノムＤＮＡを実施例１に記載されるように単離して分析した。
【表１８】
2020503017.tif 000030
下付き文字「ｍ」は、２’−Ｏ−メチル修飾を示す。下付き文字「ｒ」は、未修飾の、２’−ヒドロキシ糖部分を示す。下付き文字「ｄ」は、修飾された２’−デオキシ糖部分を示す。下付き文字「ｋ」は、ｃＥｔ修飾を示す。下付き文字の「ｆ」は、２’−Ｆ修飾を示す。下付き文字「ｏ」はリン酸ヌクレオシド間結合を示し、下付き文字「ｓ」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を示す。各ｃｒＲＮＡの下線部分は、標的認識部分であり、太字のヌクレオシドはリンカーヌクレオシドである。太字でもなく下線もない部分は、各ｃｒＲＮＡのＣＲＩＳＰＲ認識部分である。上表において、ｃｒＲＮＡのＣＲＩＳＰＲ認識部分は、Ｃｐｆ１を認識する。
【図１】
2020503017.tif 000031
【国際調査報告】
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2020503017.tif 000033