(57)【要約】  本発明は、三次元多孔性足場と、筋芽細胞またはそれらの前駆細胞、少なくとも１種の細胞外（ＥＣＭ）分泌細胞および内皮細胞またはそれらの前駆細胞を含む複数の細胞型とをインキュベートすることと、筋芽細胞の筋管への分化を誘導することと、を含む、食用組成物を製造するための方法に関する。【選択図】図なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
食用組成物を製造するための方法であって、
ａ．三次元多孔性足場ならびに（ｉ）筋芽細胞またはそれらの前駆細胞；および（ｉｉ）少なくとも１種の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）分泌細胞、または（ｉｉｉ）内皮細胞またはそれらの前駆細胞のうちの少なくとも１つを含む複数の細胞型をインキュベートすることであって、前記筋芽細胞またはそれらの前駆細胞および前記内皮細胞またはそれらの前駆細胞は、１０：１〜１：１０の範囲の比でインキュベートされる、インキュベートすることと、
ｂ．筋芽細胞またはそれらの前駆細胞を筋管への分化に誘導することであって、
それによって、前記食用組成物が産生される、誘導することと、を含む、方法。
【請求項２】
前記複数の細胞型が、筋芽細胞またはそれらの前駆細胞、少なくとも１種の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）分泌細胞、および内皮細胞またはそれらの前駆細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＥＣＭ分泌細胞が、間質細胞、線維芽細胞、周皮細胞、平滑筋細胞およびそれらの前駆細胞からなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記複数の細胞型が、筋芽細胞、ＥＣＭ分泌細胞および内皮細胞を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記筋芽細胞の前駆細胞が衛星細胞である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記内皮細胞が、骨格微小血管内皮細胞、大動脈平滑筋細胞、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記複数の細胞型が、衛星細胞、ＥＣＭ分泌細胞、および内皮細胞を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記筋芽細胞またはそれらの前駆細胞およびＥＣＭ分泌細胞が、１０：１〜１：１の範囲の比でインキュベートされる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＥＣＭ分泌細胞および内皮細胞が、１：１０〜１：１の範囲の比でインキュベートされる、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記衛星細胞、前記ＥＣＭ分泌細胞、および前記内皮細胞が、１０：１：１〜２：１：１０の範囲の比でインキュベートされる、請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＥＣＭ分泌細胞が、線維芽細胞、その前駆細胞、またはその組み合わせである、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記三次元多孔性足場が、テクスチャ加工タンパク質、非テクスチャ加工タンパク質、および多糖類からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記テクスチャ加工タンパク質が、テクスチャ加工大豆タンパク質である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記三次元多孔性足場が、２０〜１，０００マイクロメートルの範囲の平均直径を有する細孔を含む、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記複数の細胞型が非ヒト細胞である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記複数の細胞が家畜哺乳類に由来する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記筋芽細胞またはそれらの前駆細胞および前記三次元多孔性足場は、前記筋芽細胞またはそれらの前駆細胞が、前記三次元多孔性足場１０ｍｇに１０３〜１０７の範囲の比でインキュベートされる、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記三次元多孔性足場が細胞外マトリックスをさらに含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ａ．三次元多孔性足場と、
ｂ．前記三次元多孔性足場１ｍｍ３あたり１０，０００〜２５０，０００個の筋管核を含む筋管と、
ｃ．複数の細胞型であって、（ｉ）筋芽細胞またはそれらの前駆細胞；および（ｉｉ）少なくとも１種のＥＣＭ分泌細胞；または（ｉｉｉ）前記複数の細胞の１５％未満を構成する、内皮細胞またはそれらの前駆細胞のうちの少なくとも１つからなる群から選択される複数の細胞型と、を含む、組成物。
【請求項２０】
前記複数の細胞型が、筋芽細胞またはそれらの前駆細胞、少なくとも１種の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）分泌細胞、および内皮細胞またはそれらの前駆細胞を含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記筋芽細胞の前駆細胞が衛星細胞である、請求項１９または２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記複数の細胞型が、衛星細胞、ＥＣＭ分泌細胞、および内皮細胞を含む、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記ＥＣＭ分泌細胞が、線維芽細胞、その前駆細胞、またはその組み合わせである、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記三次元多孔性足場が、テクスチャ加工タンパク質、非テクスチャ加工タンパク質、および多糖類からなる群から選択される、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記テクスチャ加工タンパク質が、テクスチャ加工大豆タンパク質である、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記三次元多孔性足場が、２０〜１，０００マイクロメートルの範囲の平均直径を有する細孔を含む、請求項１９または２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記複数の細胞型が非ヒト細胞である、請求項１９〜２６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８】
前記複数の細胞が家畜哺乳類に由来する、請求項１９〜２７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２９】
前記三次元多孔性足場が細胞外マトリックスをさらに含む、請求項１９〜２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３０】
前記組成物が食用である、請求項１９〜２９のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１７年７月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／５３２，９９８号の優先権の利益を主張し、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、とりわけ、培養肉の組成物およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
人工食肉またはクリーンミートとしても知られる培養肉は、組織工学技術を使用して、細胞培養から生産され、生きた動物を使用する従来の食肉生産の重要な代替物である。過去１０年間に、この概念は、特に最初の人工培養ビーフバーガーの生産後、世論、有力メディア、投資家、科学界において一層注目を集めた。動物が生涯を通じて大量の食物を消費するため、動物を用いての食物の生産は、非効率的であると考えられている。この生産では、カロリーの８０〜９０％が、動物の代謝および非食用組織の生産において浪費される。様々な業界を比較したときに、食肉は最大の環境影響を有するが、一般に、動物ベースのすべての製品は、土壌および水の需要、ならびに温室効果ガス（ＧＨＧ）の排出に関して、植物ベースの製品と比較してより大きい環境フットプリントを有する。国連食糧農業機関の報告書によれば、家畜部門はＧＨＧ排出量の１８％の原因であり、地球の地形の３０％または耕地の７０％、および世界の淡水の８％を使用している。さらに、世界の食肉需要は２０５０年までに倍増することが予想されており、これは、従来の食肉生産システムが持続可能でないことを意味する。いくつかの肉源と比較して、培養肉では、エネルギー使用の７〜４５％、ＧＨＧ排出の７８〜９６％、土地使用の９９％、および水使用の８２〜９６％を減少させると推定される。
【０００４】
集中的な工場農業および十分でない動物福祉条件は、豚および鳥インフルエンザなどの食品由来疾患、および食肉内で見つけることのできる大腸菌、サルモネラ菌、およびカンピロバクターの拡散の原因である。無菌管理環境で食肉を生産することは、食品の安全性を改善する助けとなり得る。さらに、米国で使用されている全抗生物質の７０％は、抗菌剤耐性株の選択を助長し、多剤耐性菌の可能性を高める食品添加物として家畜に与えられる。抗生物質の過剰使用は、抗生物質耐性菌の出現の主な原因であり、米国のみで年間５５０億ドルの経済的負担、２００万件の感染、２５０，０００件の入院、少なくとも２３，０００件の死亡の原因となっている。近年、抗生物質の最後の手段であるコリスチンに耐性のある細菌が中国の養豚場で出現した。
【０００５】
現在の培養肉技術では、衛星細胞培養に焦点が当てられている。細胞は、二次元（２Ｄ）フラスコまたは懸濁液中のマイクロキャリア上で成長し、分離し、分化し、かつ採取される。しかし、組織は細胞のみで構成されているのではない。糖タンパク質およびオリゴ糖などの巨大分子で構成され、かつ組織に生化学的特性および生体力学的特性を付与する細胞外マトリックス（ＥＣＭ）は、組織の大部分である。ＥＣＭは、細胞の挙動を調節し、その組成に影響を及ぼす。したがって、ＥＣＭ産生細胞は培養肉に必須であり、細胞採取などのプロセスは回避する必要がある。さらに、三次元（３Ｄ）細胞培養は、自然の細胞環境を模倣しており、かつ細胞の生化学的内容物に影響を及ぼす正確な細胞の挙動にとって重要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
いくつかの実施形態では、本発明は、筋管を含む食用組成物、および食用組成物を製造するための方法に関する。
【０００７】
本発明は、複数の細胞型（例えば、衛星細胞、ＥＣＭ分泌細胞および内皮細胞）を含む細胞培養が、三次元多孔性足場で成長したときなどに、対照と比較して、良好な生存、増殖および筋管形成を示したという発見に一部基づく。
【０００８】
本発明は、非ヒト衛星細胞などの衛星細胞が、高内皮細胞（ＥＣ）濃度ではなく低内皮細胞（ＥＣ）濃度で共培養されたときに、より良好な分化活性を有したという驚くべき発見にさらに一部基づく。
【０００９】
一態様によれば、食用組成物を製造するための方法を提供し、本方法は、以下のステップを含む：（ａ）三次元多孔性足場ならびに（ｉ）筋芽細胞またはそれらの前駆細胞；および（ｉｉ）少なくとも１種の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）分泌細胞、または（ｉｉｉ）内皮細胞もしくはそれらの前駆細胞のうちの少なくとも１つを含む複数の細胞型をインキュベートすることであって、筋芽細胞またはそれらの前駆細胞および内皮細胞またはそれらの前駆細胞が、１０：１から１：１０の範囲の比でインキュベートされる、インキュベートすることと、（ｂ）筋芽細胞またはそれらの前駆細胞の筋管への分化を誘導し、それにより食用組成物を産生することと、を含む。
【００１０】
いくつかの実施形態では、複数の細胞型は、筋芽細胞またはそれらの前駆細胞、少なくとも１種の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）分泌細胞、および内皮細胞またはそれらの前駆細胞を含む。
【００１１】
いくつかの実施形態では、ＥＣＭ分泌細胞は、間質細胞、線維芽細胞、周皮細胞、平滑筋細胞およびそれらの前駆細胞からなる群から選択される。
【００１２】
いくつかの実施形態では、複数の細胞型は、筋芽細胞、ＥＣＭ分泌細胞および内皮細胞を含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、筋芽細胞の前駆細胞は、衛星細胞である。
【００１４】
いくつかの実施形態では、内皮細胞は、骨格微小血管内皮細胞、大動脈平滑筋細胞、またはそれらの組み合わせから選択される。
【００１５】
いくつかの実施形態では、複数の細胞型は、衛星細胞、ＥＣＭ分泌細胞、および内皮細胞を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、筋芽細胞またはそれらの前駆細胞およびＥＣＭ分泌細胞は、１０：１〜１：１の範囲の比でインキュベートされる。
【００１７】
いくつかの実施形態では、ＥＣＭ分泌細胞および内皮細胞は、１：１０〜１：１の範囲の比でインキュベートされる。
【００１８】
いくつかの実施形態では、衛星細胞、ＥＣＭ分泌細胞、および内皮細胞は、１０：１：１〜２：１：１０の範囲の比でインキュベートされる。
【００１９】
いくつかの実施形態では、ＥＣＭ分泌細胞は、線維芽細胞、その前駆細胞、またはその組み合わせである。
【００２０】
いくつかの実施形態では、三次元多孔性足場は、テクスチャ加工タンパク質、非テクスチャ加工タンパク質、および多糖類からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、テクスチャ加工タンパク質は、テクスチャ加工大豆タンパク質である。いくつかの実施形態では、三次元多孔性足場は、２０〜１，０００マイクロメートルの範囲の平均直径を有する細孔を含む。
【００２１】
いくつかの実施形態では、複数の細胞型は、非ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、複数の細胞は、家畜哺乳類に由来する。
【００２２】
いくつかの実施形態では、筋芽細胞またはそれらの前駆細胞および三次元多孔性足場は、筋芽細胞またはそれらの前駆細胞が、三次元多孔性足場１０ｍｇに１０３〜１０７の範囲の比でインキュベートされる。いくつかの実施形態では、三次元多孔性足場は、細胞外マトリックスをさらに含む。
【００２３】
別の態様によれば、（ａ）三次元多孔性足場；（ｂ）三次元多孔性足場１ｍｍ３あたり１００，０００〜２５０，０００の筋管核を含む筋管；および（ｃ）複数の細胞型であって、（ｉ）筋芽細胞またはそれらの前駆細胞；および（ｉｉ）少なくとも１種のＥＣＭ分泌細胞、または、（ｉｉｉ）複数の細胞の１５％未満を構成する、内皮細胞またはそれらの前駆細胞のうちの少なくとも１つからなる群から選択される、複数の細胞型を含む組成物が提供される。
【００２４】
いくつかの実施形態では、組成物は食用である。
【００２５】
特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および／または科学用語は、本発明が関係する当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似のまたは同等の方法および材料を本発明の実施形態の実施または試験に使用できるが、例示的な方法および／または材料を以下に記載する。一致しない場合、定義を含む特許明細書が優先される。さらに、材料、方法、および例は単なる例示であり、必ずしも限定することを意図するものではない。
【００２６】
本発明のさらなる実施形態および適用可能性の全範囲は、以下に与えられる詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明および特定の例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、発明を実施するための形態から本発明の趣旨および範囲内の様々な変更および修正が当業者に明らかになるため、例示としてのみ与えられることを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１Ａ−図１Ｃ。市販のＴＳＰを示す写真である。（Ａ）ＴＳＰの大、中、小のチャンク製品を示す。（Ｂ）および（Ｃ）は、ＴＶＰ（左）およびＡｒｃｏｎ（右）の注釈が付いた２つの他の市販のＴＳＰフレーク製品を示す。
【図２】図２Ａ−図２Ｂ。ＴＳＰ足場の調製（Ａ）、および細胞を含むＴＳＰ足場（Ｂ）を示す写真である。
【図３】図３Ａ−図３Ｂ。大きいＴＳＰ（Ａ）および中程度のＴＳＰ（Ｂ）の倍率１００倍のＳＥＭ画像である。
【図４】図４Ａ−図４Ｂ。大きいＴＳＰ（Ａ）および中程度のＴＳＰ（Ｂ）の２ｘ１０５倍率のＳＥＭ画像である。
【図５】図５Ａ−図５Ｃ。線維芽細胞の播種後の８日目（Ａ）、１８日目（Ｂ）、および２１日目（Ｃ）に、線維芽細胞（赤）および内皮細胞（緑）が取り込まれたＴＳＰ足場の共焦点顕微鏡の画像である。
【図６】大、中、小、９０°から中として示される異なる供給源から得た足場の三つの異なるサンプル（サンプル１〜３）に２０万線維芽細胞（赤）を播種して１４日後に撮影した共焦点顕微鏡の画像である。９０°から中と示される足場は、足場調製手順ＴＳＰ足場のＴＳＰの細孔側から切り取ったものである。スケールバー＝１ｍｍ。
【図７】１４日間ＴＳＰ足場で培養した筋芽細胞の共焦点顕微鏡の画像（青ーＤＡＰＩ、緑ーデスミン）である。
【図８】１４日間ＴＳＰ足場で培養したウシ骨格筋細胞の共焦点顕微鏡の画像（青−ＤＡＰＩ、緑−ファロイジン）である。
【図９】図９Ａ−図９Ｅ。異なる培地に播種されたウシ大動脈平滑筋細胞（ＢＡＯＳＭＣ）（８継代）の顕微鏡写真である。（Ａ）基礎培地、（Ｂ）市販の培地、（Ｃ）胎児ウシ血清（１５％）添加、（Ｄ）非必須アミノ酸添加、および（Ｅ）ピルビン酸塩添加。スケールバー＝１００μｍ。
【図１０】図１０Ａ−図１０Ｂ。培養の３日後の継代９（Ａ）および継代１０（Ｂ）でのウシ大動脈平滑筋細胞の増殖について、異なる培地での比較を示す縦棒グラフである。
【図１１】図１１Ａ−図１１Ｂ。ウシ真皮線維芽細胞（ＢＤＦ）（Ａ）およびウシ大動脈平滑筋細胞（ＢＡＯＳＭＣ；Ｂ）の成長速度を実証するグラフである。
【図１２】図１２Ａ−図１２Ｌ。２日目（Ａ、Ｄ、ＧおよびＪ）、６日目（Ｂ、Ｅ、ＨおよびＫ）、および８日目（Ｃ、Ｆ、ＩおよびＬ）に支持細胞との共培養において播種された、蛍光標識ウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）細胞の画像である。ＢＡＥＣ細胞（緑）には、ウシ大動脈平滑筋細胞（ＳＭＣ；Ａ〜Ｆ）、またはウシ真皮線維芽細胞（ＢＤＦ；Ｇ〜Ｌ）（両方とも赤である）のいずれかを播種した。Ａ〜ＣおよびＧ〜Ｉは、５倍率での３ｘ３のタイルスキャンである。Ｄ〜ＦおよびＪ〜Ｌは、倍率２０倍である。スケールバー＝１００μｍ。
【図１３】図１３Ａ−図１３Ｌ。２日目（Ａ、Ｄ、ＧおよびＪ）、６日目（Ｂ、Ｅ、ＨおよびＫ）、および８日目（Ｃ、Ｆ、ＩおよびＬ）での支持細胞との共培養で播種された蛍光標識ウシ骨格筋微小血管内皮細胞（ＢＳｋＭＶＥＣ）細胞の画像である。ＢＳｋＭＶＥＣ細胞（緑）には、ウシ大動脈平滑筋細胞（ＳＭＣ  Ａ〜Ｆ）、またはウシ真皮線維芽細胞（ＢＤＦ；Ｇ〜Ｌ）（両方とも赤である）のいずれかを播種した。Ａ〜ＣおよびＧ〜Ｉは、５倍率での３ｘ３のタイルスキャンである。Ｄ〜ＦおよびＪ〜Ｌは、倍率２０倍である。スケールバー＝１００μｍ。
【図１４】図１４Ａ−図１４Ｆ。異なる比でＢＡＥＣおよびＳＭＣを含む蛍光標識細胞の共培養物の画像である。（ＡおよびＤ）ＢＡＥＣ対ＳＭＣ５：１；（ＢおよびＥ）ＢＡＥＣ対ＳＭＣ１：１（ＣおよびＦ）は、それぞれ、ＢおよびＥのより高倍率のものである。Ａ〜Ｃは、２日目に撮影した画像であり、Ｄ〜Ｆは、６日目に撮影した。ＢＡＥＣは赤である。スケールバー＝１００μｍ。
【図１５】図１５Ａ−図１５Ｅ。異なる比でＢＡＥＣおよびＢＤＦを含む蛍光標識細胞の共培養物の画像である。（ＡおよびＣ）ＢＡＥＣ対ＳＭＣ５：１、（ＢおよびＤ）ＢＡＥＣ対ＳＭＣ１：１。（Ｅ）は、Ｄのより高い倍率のものである。ＡおよびＢは、２日目に撮影した画像である。ＣおよびＤは、６日目に撮影した。ＢＡＥＣは赤である。スケールバー＝１００μｍ。
【図１６】図１６Ａ−図１６Ｌ。異なる比でＢＡＥＣおよびＳＭＣを含む蛍光標識細胞の共培養物の画像である。（Ａ〜Ｄ）ＢＡＥＣ対ＳＭＣ１：３；（Ｅ〜Ｈ）ＢＡＥＣ対ＳＭＣ１：１；および（Ｉ〜ＬおよびＦ）ＢＡＥＣ対ＳＭＣ５：１。（Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、ＪおよびＬ）は、それぞれ（Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、ＩおよびＫ）のより倍率が高いものである。（Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ、ＩおよびＪ）は、２日目に撮影した画像であり、（Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、ＫおよびＬ）は、６日目に撮影したものである。ＢＡＥＣは赤である。スケールバー＝１００μｍ。
【図１７】図１７Ａ−図１７Ｇ。ウシ衛星細胞（ＢＳＣ）の分化および筋管の形成を示す図である。（Ａ〜Ｃ）は、分化前ＢＳＣ細胞の画像である。（Ｄ〜Ｆ）は、分化後ＢＳＣ細胞の画像である。（Ｇ）は、サンプルの融合指数（ＦＩ）を示す縦棒グラフである。（ＡおよびＤ）光学顕微鏡、（ＢおよびＥ）ヘキスト、ならびに（ＣおよびＦ）ミオゲニン。自動ＦＩと手動ＦＩとの間の差はなかったが、分化前と分化後の自動ＦＩの差は、（Ｐ値＝０．００００３）統計的に有意であることが見出された。
【図１８】図１８Ａ−図１８Ｇ。分化の０日目でのＢＳＣの明視野顕微鏡写真である。（Ａ）対照、（Ｂ）ウシ線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、（Ｃ）上皮成長因子（ＥＧＦ）、（Ｄ）ＩＧＦ−１（インスリン様成長因子１）、（Ｅ）Ｐｒｏ−ＬＩＦ（成長因子ＬＩＦ（白血病阻害因子）非含有増殖培地）、（Ｆ）ウィーニング、および（Ｇ）Ｄｉｌ。スケールバー＝３００μｍ。
【図１９】図１９Ａ−図１９Ｇ。分化の４日目でのＢＳＣの明視野顕微鏡写真である。（Ａ）対照；（Ｂ）ウシ線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）；（Ｃ）上皮成長因子（ＥＧＦ）；（Ｄ）ＩＧＦ−１（インスリン様成長因子１）；（Ｅ）Ｐｒｏ−ＬＩＦ；（Ｆ）ウィーニング；および（Ｇ）Ｄｉｌ。スケールバー＝３００μｍ。
【図２０】図２０Ａ−図２０Ｈ。分化の７日目でのＢＳＣの筋管形成を実証する図である。（Ａ〜Ｇ）は、（Ａ）対照、（Ｂ）ウシ線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、（Ｃ）上皮成長因子（ＥＧＦ）、（Ｄ）ＩＧＦ−１（インスリン様成長因子１）、（Ｅ）Ｐｒｏ−ＬＩＦ、（Ｆ）ウィーニング、および（Ｇ）Ｄｉｌの明視野顕微鏡写真である。スケールバー＝３００μｍ。（Ｈ）は、異なる拡張条件のそれぞれについて定量化した筋管面積％の縦棒グラフである。
【図２１】成長培地またはＰｒｏ−ＬＩＦ培地の多孔性足場での、７日目の細胞被覆の定量値を示す縦棒グラフである。
【図２２】図２２Ａ−図２２Ｌ。多孔性足場で分化し、蛍光標識されたＢＳＣの共焦点顕微鏡の画像である。拡張期：（Ａ〜Ｄ）成長培地で培養した細胞、（Ｅ〜Ｈ）Ｐｒｏ−ＬＩＦ培地上で培養した細胞、（Ｉ〜Ｌ）Ｐｒｏ−ＬＩＦ−ｂＦＧＦ培地で培養した細胞である。分化期：（Ａ、ＥおよびＩ）いずれの成長因子（ＧＦ）も分化培地に添加しなかった。（Ｂ、ＦおよびＪ）ＩＧＦ−１を分化培地に添加した。（Ｃ、ＧおよびＫ）ＥＧＦを分化培地に添加した。（Ｄ、ＨおよびＬ）ＩＧＦ−１およびＥＧＦを分化培地に添加した。Ｄｉｌ（赤）、デスミン（緑）、スケールバー＝１００μｍ。
【図２３】図２３Ａ−図２３Ｏ。播種１４日後に撮影した、ＰＬＬＡ／ＰＬＧＡ足場で成長させた三培養の免疫蛍光顕微鏡の写真である。ＢＳＣ、ＳＭＣおよびＢＡＥＣは、異なる細胞密度（Ａ〜Ｅ）２：１：１および（Ｆ〜Ｊ）２：１：５でＰＬＬＡ／ＰＬＧＡ足場に播種した。（Ｋ〜Ｏ）は、（Ａ〜Ｅ）の倍率である。足場は、ＤＡＰＩ（Ａ、ＦおよびＫ）、ミオゲニン（Ｂ、ＧおよびＬ）、ＤｉＩ（Ｃ、ＨおよびＭ）、ＣＤ３１（Ｄ、ＩおよびＮ）で染色した。（Ｅ、ＪおよびＯ）は、合体させた画像である。スケールバー＝１００μｍ（Ａ〜Ｊ）；１０μｍ（Ｋ〜Ｏ）。
【図２４】図２４Ａ−図２４Ｆ。播種１４日後、ＰＬＬＡ／ＰＬＧＡ足場の免疫蛍光顕微鏡の写真である。ＢＳＣ、ＳＭＣおよびＢＥＣは、異なる細胞密度（Ａ〜Ｃ）２：１：１および（Ｄ〜Ｆ）２：１：５でＰＬＬＡ／ＰＬＧＡ足場に播種した。（ＡおよびＤ）ＢＳＣおよびＳＭＣ（２：１）、（ＢおよびＥ）ＢＳＣおよびＢＥＣ（２：１）、ならびに（ＣおよびＦ）ＢＳＣのみの単一培養。足場は、ＤＡＰＩ（青）、ミオゲニン（灰色）、ＤｉＩ（赤）、およびＣＤ３１（緑）で染色した。スケールバー＝１００μｍ。
【図２５】図２５Ａ−図２５Ｈ。播種１４日後のテクスチャ加工大豆タンパク質足場でＳＭＣと共培養したＢＳＣの免疫蛍光顕微鏡の写真である。異なる細胞密度（Ａ〜Ｄ）２：１：１および（Ｅ〜Ｈ）２：１：５の試験を行った。足場は、ＤＡＰＩ（ＡおよびＥ）、ミオゲニン（ＢおよびＦ）、ＤｉＩ（ＣおよびＧ）で染色した。（Ｄ）および（Ｈ）は、それぞれの（Ａ〜Ｃ）および（Ｅ〜Ｇ）の合体させた画像である。スケールバー＝１００μｍ。
【図２６】図２６Ａ−図２６Ｅ。播種１４日後に、テクスチャ加工大豆タンパク質足場で三培養したＢＳＣ、ＳＭＣおよびＢＥＣの免疫蛍光顕微鏡の写真である。足場は、（Ａ）ＤＡＰＩ、（Ｂ）ミオゲニン、（Ｃ）のＤｉＩ、および（Ｄ）ＣＤ３１で染色した。（Ｅ）は、（Ａ〜Ｄ）の合体させた画像である。
【図２７】図２７Ａ−図２７Ｂ。播種１４日後、２：１：１の比でＰＬＬＡ／ＰＬＧＡ足場に播種したＢＳＣ、ＳＭＣおよびＢＥＣの三培養のトリクローム染色の顕微鏡写真である。（Ａ）５倍率のタイルスキャンおよび（Ｂ）１０倍率のタイルスキャン。足場は、トリクローム染色した。陽性細胞外マトリックス（ＥＣＭ）染色は、丸で囲んでいる。スケールバー＝１００μｍ。
【図２８】図２８Ａ−図２８Ｃ。筋原性分化および培養内の異なる細胞比の重要性に及ぼす支持細胞の効果を示す縦棒グラフである。筋原性分化は、細胞密度（Ａ）２：１：１、（Ｂ）ＰＬＬＡ／ＰＬＧＡ足場での２：１：５、（Ｃ）テクスチャ加工大豆タンパク質での２：１：１での三培養（ＢＳＣ：ＳＭＣ：ＢＥＣ）および対照（共培養または単一培養）について、統計分析により示されている。
【図２９】図２９Ａ−図２９Ｎ。テクスチャ加工タンパク質足場での三培養の分化について記載している図である。（Ａ〜Ｌ）は、１４日播種後、免疫染色されたテクスチャ加工大豆タンパク質足場の蛍光画像である。細胞をテクスチャ加工大豆タンパク質足場（Ａ、Ｅ、およびＩ）ＢＳＣ、（Ｂ、Ｆ、およびＪ）ＢＳＣ＋ＢＥＣ、（Ｃ、Ｇ、およびＫ）ＢＳＣ＋ＳＭＣ、および（Ｄ、Ｈ、およびＬ）ＢＳＣ＋ＳＭＣ＋ＢＥＣの三培養に播種した。（Ａ〜Ｄ）ｘ２０倍率、（Ｅ〜Ｈ）ｘ２０のタイルスキャン、および（Ｉ〜Ｌ）ミオゲニン染色、ｘ６３倍率。足場は、ＤＡＰＩ（青）、ミオゲニン（灰色）、ＤｉＩ（赤）、およびＣＤ３１（緑）で染色した。スケールバー＝１００μｍ。（Ｍ）は、単一培養（ＢＳＣのみ）、共培養（ＢＳＣ＋ＢＥＣ；またはＢＳＣ＋ＳＭＣ）、および三培養（ＢＳＣ＋ＳＭＣ＋ＢＥＣ）におけるＴＳＰ足場でのミオゲニン発現定量化の縦棒グラフである。（Ｎ）は、単一培養およびＳＭＣとの共培養におけるＴＳＰ足場でのＢＳＣ被覆定量化の縦棒グラフである。
【図３０】播種の１４日後、Ｇｅｌｆｏａｍ足場にゲルなしで播種された免疫染色されたＢＳＣの蛍光画像である。足場は、ＤＡＰＩ（青）、ミオゲニン（灰色）、ＤｉＩ（赤）、およびＣＤ３１（緑）で染色した。スケールバー＝５０μｍ。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明は、食物の消費のための培養肉を製造するための組成物、キットおよび方法に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、多孔性テクスチャ加工タンパク質と、それに付着した筋芽細胞と、１つ以上の細胞型を含む三次元多型細胞組織とを含む食用組成物に関する。本発明は、特定の条件下で筋芽細胞および１つ以上の細胞型を三次元多孔性足場（例えば、多孔性テクスチャ加工タンパク質）と共にｉｎ−ｖｉｔｒｏ培養することによる組成物の製造方法にさらに関する。
【００２９】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、ヒト、非ヒト動物、またはその両方による消費を目的とし得る。いくつかの実施形態では、培養肉製品は、ヒトが消費するための食品である。他の実施形態では、培養肉製品は、家畜用飼料、水産養殖用飼料、または家庭用ペット用飼料などの動物飼料に使用される。
【００３０】
いくつかの実施形態では、本発明は、以下を含む食用組成物を製造するための方法に関する：
ａ．三次元多孔性足場、ならびに筋芽細胞、および脂肪細胞、線維芽細胞、およびそれらの前駆細胞からなる群から選択される少なくとも１つのＥＣＭ分泌細胞型、ならびに内皮細胞またはその前駆細胞を含む複数の細胞型をインキュベートすることと、
ｂ．複数の細胞型が三次元多孔性足場で拡張できるようにすることと、
ｃ．筋芽細胞の筋管への分化を誘導することと、を含み、
これにより、細胞が、筋肉細胞および多孔性テクスチャ加工タンパク質を含む三次元多型細胞組織を含む食用組成物を形成できるようになる。
【００３１】
本明細書で使用される「筋管」という用語は、複数の筋芽細胞および／または筋細胞の融合から形成される多核繊維を指す。本明細書で使用される「筋肉細胞」という用語は、筋肉組織に寄与する任意の細胞を指し、筋芽細胞、衛星細胞（ＳＣ）、筋管、筋繊維、および筋原線維組織を包含し得る。
【００３２】
いくつかの実施形態では、この方法には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで筋芽細胞を培養すること、これらの細胞を骨格筋細胞または平滑筋細胞などの特定の型の筋肉細胞に分化させることを含む。
【００３３】
いくつかの実施形態では、本発明は、多孔性テクスチャ加工タンパク質、および筋肉細胞を含む三次元多型細胞組織を含む食用組成物に関し、ここで、三次元多型細胞組織は、多孔性テクスチャ加工タンパク質に付着し、かつ、三次元多型細胞組織は、筋芽細胞、ならびに脂肪細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞、内皮細胞およびそれらの前駆細胞から選択される１つ以上の細胞型を含む複数の細胞型を多孔性テクスチャ加工タンパク質と共にｉｎ−ｖｉｔｒｏで培養することに由来する。
【００３４】
以下に例示するように、組成物は、細胞にさらなる構造的および機械的支持をもたらす細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を形成するなどの細胞外分子を分泌する線維芽細胞を含んでもよい。
【００３５】
以下にさらに例示されるように、組成物は、組織支持を提供するため、シグナル伝達を提供するため、および／または毛細血管内皮を形成するための内皮細胞（ＥＣ）または内皮前駆細胞（ＥＰＣ）を含み得る。
【００３６】
いくつかの実施形態では、三次元多型細胞組織は、骨格筋細胞、平滑筋細胞、および衛星細胞などの筋肉細胞を含む。いくつかの実施形態では、三次元多型細胞組織は、脂肪細胞（ｆａｔ  ｃｅｌｌ）（例えば、脂肪細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ））を含む。いくつかの実施形態では、三次元多型細胞組織は、特殊な細胞（例えば、線維芽細胞）によって分泌される余分な細胞マトリックスを含む。いくつかの実施形態では、三次元多型細胞組織は、これらに限定されないが、大動脈内皮細胞および骨格微小血管内皮細胞などの内皮細胞または内皮細胞により形成された毛細血管内皮を含む。いくつかの実施形態では、三次元多型細胞組織は、余分な細胞マトリックスをさらに含む。いくつかの実施形態では、三次元多型細胞組織は、脂肪細胞をさらに含む。いくつかの実施形態では、三次元多型細胞組織は、毛細管をさらに含む。
【００３７】
いくつかの実施形態では、本発明は、多孔性テクスチャ加工タンパク質および細胞培養培地を含む細胞増殖に好適である組成物に関する。別の実施形態では、細胞増殖に好適である組成物は、増殖因子、サイトカイン、生物活性剤、栄養素、アミノ酸、抗生物質化合物、抗炎症性化合物、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む。細胞の生存率および成長に好適である好適な培地および化合物は、当業者に公知である。
【００３８】
いくつかの実施形態では、本発明は、筋芽細胞、ならびに脂肪細胞、線維芽細胞内皮細胞、平滑筋細胞、およびそれらの前駆細胞から選択される１つ以上の細胞型を含み、多孔性テクスチャ加工タンパク質に付着する複数の細胞型を含む組成物に関する。
【００３９】
いくつかの実施形態では、本発明は、三次元多孔性足場（例えば、多孔性テクスチャ加工タンパク質）、ならびに、筋芽細胞ならびに脂肪細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞、内皮細胞、およびそれらの前駆細胞から選択される１つ以上の細胞型を含む、複数の細胞型を含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、食用組成物を製造するためのものである。いくつかの実施形態では、キットは、細胞培養培地、成長因子、分化培地、分化誘導剤から選択される少なくとも１つの成分をさらに含む。いくつかの実施形態では、キットは、細胞培養培地をさらに含む。別の実施形態では、細胞培養培地は、乾燥粉末培地、顆粒調製物、水性液体または培地濃縮物から選択される。いくつかの実施形態では、複数の細胞型が凍結されている。いくつかの実施形態では、キットは、使用説明書をさらに含む。
複数の細胞型
【００４０】
当業者に理解されるように、多数の細胞型または細胞集団を三次元多孔性足場と共に培養でき、これにより、三次元多型細胞組織アーキテクチャを形成できるようになる。いくつかの実施形態では、１つ以上の細胞型は、筋芽細胞、ＥＣＭ分泌細胞、内皮細胞から選択される。
【００４１】
いくつかの実施形態では、１つ以上の細胞型は、筋芽細胞の前駆細胞である。いくつかの実施形態では、１つ以上の細胞型は、ＥＣＭ分泌細胞の前駆細胞である。いくつかの実施形態では、１つ以上の細胞型は、内皮細胞の前駆細胞である。
【００４２】
本明細書で使用される前駆細胞は、間葉系幹細胞（ＭＳｃ）、胚性幹細胞（ＥＳｃ）、成体幹細胞、分化ＥＳｃ、分化成体幹細胞、および人工多能性幹細胞（ｉＰＳｃ）を含む。本明細書で使用される「前駆細胞」という用語は、筋芽細胞、線維芽細胞、脂肪細胞、間質細胞、線維芽細胞、周皮細胞、平滑筋細胞、および内皮細胞など、複数の系統で分化細胞を生じさせ得る細胞を指す。「前駆細胞」は、典型的には、広範な自己複製能力を有さないという点で幹細胞とは異なる。
【００４３】
いくつかの実施形態では、本発明の複数の細胞型の細胞は、前駆細胞である。いくつかの実施形態では、前駆細胞は、単一培養で培養される。いくつかの実施形態では、前駆細胞は、単一培養で分化される。いくつかの実施形態では、前駆細胞は単一培養で分化され、次いで、本発明の方法に従って複数の細胞と共に三次元多孔性足場でインキュベートされる。非限定的な例としては、これらに限定されないが、間葉系幹細胞を培養して、分化させて筋芽細胞とし、その後、分化した筋芽細胞を三次元多孔性足場に播種し、その後インキュベートすることが挙げられる。前駆細胞を培養し、成熟細胞への分化を誘導する方法は、当業者には明らかであろう。
【００４４】
いくつかの実施形態では、複数の細胞型は、筋芽細胞および線維芽細胞を含む。いくつかの実施形態では、複数の細胞型は、筋芽細胞、線維芽細胞および／または線維芽細胞前駆細胞を含む。いくつかの実施形態では、複数の細胞型は、筋芽細胞、線維芽細胞、および脂肪細胞を含む。いくつかの実施形態では、複数の細胞型は、筋芽細胞、線維芽細胞、脂肪細胞、ならびに／または線維芽細胞前駆細胞および／もしくは脂肪細胞前駆細胞を含む。いくつかの実施形態では、複数の細胞型は、筋芽細胞、線維芽細胞および内皮細胞を含む。いくつかの実施形態では、複数の細胞型は、筋芽細胞、線維芽細胞および内皮細胞、ならびに／または線維芽細胞前駆細胞、および／もしくは内皮前駆細胞を含む。いくつかの実施形態では、複数の細胞型は、筋芽細胞および平滑筋細胞を含む。いくつかの実施形態では、複数の細胞型は、筋芽細胞、平滑筋細胞および内皮細胞を含む。いくつかの実施形態では、複数の細胞型は、筋芽細胞、平滑筋細胞、内皮細胞、および脂肪細胞を含む。いくつかの実施形態では、複数の細胞型は、筋芽細胞、線維芽細胞、内皮細胞、および脂肪細胞を含む。いくつかの実施形態では、複数の細胞型は、筋芽細胞、線維芽細胞、内皮細胞、脂肪細胞および／または線維芽細胞前駆細胞、および／または脂肪細胞前駆細胞、および／または内皮前駆細胞を含む。
【００４５】
いくつかの実施形態では、複数の細胞型は、生きている動物から得られ、初代細胞株として培養される。非限定的な例として、細胞は生検によって得られてもよく、またｅｘ  ｖｉｖｏで培養されてもよい。別の非限定的な例では、細胞は、商業的供給源から入手され得る。
【００４６】
いくつかの実施形態では、複数の細胞型は、多能性胚性幹細胞などの幹細胞に由来する。別の実施形態では、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）が使用される。当業者に公知であるように、ＭＳＣは、筋肉細胞、脂肪細胞、骨細胞、および軟骨細胞となり得る。別の実施形態では、細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳまたはｉＰＳＣ）である。別の実施形態では、細胞は、これらの動物の胚盤胞期、受精卵、胎盤、または臍帯からの細胞などの全能性胚性幹細胞に由来する。
【００４７】
いくつかの実施形態では、複数の細胞型は、非ヒト細胞に由来する。いくつかの実施形態では、複数の細胞型は、哺乳類、鳥類、魚類、無脊椎動物、爬虫類、両生類、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される非ヒト細胞に由来する。いくつかの実施形態では、複数の細胞型は、哺乳類に由来する。いくつかの実施形態では、複数の細胞型は、非ヒト哺乳類に由来する。いくつかの実施形態では、複数の細胞型は、家畜哺乳類に由来する。本明細書で使用される「家畜」は、飼いならされた哺乳類、半分飼いならされた哺乳類または捕獲飼育下の野生哺乳類を含む。非ヒト哺乳類の非限定的な例としては、アンテロープ、クマ、ビーバー、バイソン、イノシシ、ラクダ、トナカイ、ウシ、シカ、ゾウ、エルク、キツネ、キリン、ヤギ、ウサギ、ウマ、アイベックス、カンガルー、ライオン、ラマ、ムース、ペッカリー、ブタ、ウサギ、アザラシ、ヒツジ、リス、トラ、クジラ、ヤク、およびシマウマ、またはそれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態では、複数の細胞型は、鳥細胞に由来する。鳥の非限定的な例としては、ニワトリ、アヒル、エミュー、ガチョウ、ライチョウ、ダチョウ、キジ、ハト、ウズラ、およびシチメンチョウ、またはそれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態では、複数の細胞型は、魚類に由来する。魚の非限定的な例としては、バス、ナマズ、コイ、タラ、ウナギ、ヒラメ、フグ、ハタ、ハドック、オヒョウ、ニシン、サバ、マヒ、カジキ、オレンジラフィー、パーチ、カワカマス、スケトウダラ、サーモン、サーディン、サメ、フエダイ、ヒラメ、メカジキ、ティラピア、マス、マグロ、およびウォールアイ、またはそれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態では、複数の細胞型は、無脊椎動物に由来する。無脊椎動物の非限定的な例としては、ロブスター、カニ、エビ、アサリ、カキ、ムール貝、およびウニが挙げられる。いくつかの実施形態では、複数の細胞型は、爬虫類に由来する。爬虫類の非限定的な例としては、ヘビ、ワニ、およびカメが挙げられる。いくつかの実施形態では、複数の細胞型は、両生類に由来する。両生類の非限定的な例としては、カエルが挙げられる。
細胞の播種および培養
【００４８】
当業者によって理解されるように、本明細書に記載の組成物および方法において使用される細胞の各型は、細胞密度の好ましいまたは最適な範囲を有し得、細胞の生存率に好適である培地または成長因子を優先し得る。いくつかの実施形態では、各細胞型は、特定の細胞密度で播種される。いくつかの実施形態では、細胞は、同時にまたは連続して播種される。
【００４９】
いくつかの実施形態では、筋芽細胞は、１０ｍｇの多孔性テクスチャ加工タンパク質に１０３〜１０７細胞の細胞密度で播種される。いくつかの実施形態では、異なる細胞型が、特定の比で播種される。いくつかの実施形態では、播種された筋芽細胞対播種された線維芽細胞の比は、１：１，０００〜１，０００：１の範囲である。いくつかの実施形態では、播種された筋芽細胞および播種された線維芽細胞対播種された内皮細胞の比は、１：２０〜２０：１の範囲である。いくつかの実施形態では、播種された筋芽細胞および播種された線維芽細胞対播種された脂肪細胞の比は、１：５０００〜５０００：１の範囲である。いくつかの実施形態では、播種された衛星細胞対播種された平滑筋細胞の比は、５：１〜１：５の範囲である。いくつかの実施形態では、播種された衛星細胞対播種された骨格微小血管内皮細胞の比は、１０：１〜１：１０の範囲である。いくつかの実施形態では、播種された平滑筋細胞対播種された骨格微小血管内皮細胞の比は１０：１〜１：１０の範囲である。いくつかの実施形態では、播種された衛星細胞対播種された平滑筋細胞対播種された骨格微小血管内皮細胞の比は、１０：１：１〜２：１：１０の範囲である。一実施形態では、播種された衛星細胞対播種された平滑筋細胞対播種された骨格微小血管内皮細胞の比は、２：１：１〜２：１：５、またはその間の任意の比である。一実施形態では、播種された衛星細胞対播種された平滑筋細胞対播種された骨格微小血管内皮細胞の比は、２：１：１〜２：１：２、またはその間の任意の比である。一実施形態では、播種された衛星細胞対播種された平滑筋細胞対播種された骨格微小血管内皮細胞の比は、２：１：１〜２：１：３、またはその間の任意の比である。一実施形態では、播種された衛星細胞対播種された平滑筋細胞対播種された骨格微小血管内皮細胞の比は、２：１：１〜２：１：４、またはその間の任意の比である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００５０】
いくつかの実施形態では、播種された細胞密度およびインキュベートされた細胞密度はほぼ同じである。
【００５１】
一実施形態では、「被覆率％」は、細胞または筋管と接触している多孔性足場の面積または体積を指す。別の実施形態では、被覆率％は、細胞または筋管によって占められている多孔性足場の面積または体積を指す。本明細書で使用されるとき、足場と接触している細胞は、その上、内部、またはそれらの組み合わせにある。
【００５２】
いくつかの実施形態では、複数の細胞の被覆率％は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０、または少なくとも９９％である。いくつかの実施形態では、複数の細胞の被覆率％は５〜２０％、１５〜３０％、２５〜４０％、３５〜５０％、４５〜６０％、５５〜７０％、６５〜８０％、７５〜９０％、８５〜１００％、またはそれらの間の任意の範囲である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００５３】
いくつかの実施形態では、衛星細胞の被覆率％は、少なくとも３５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０、または少なくとも９９％である。いくつかの実施形態では、衛星細胞の被覆率％は、２５〜４０％、３５〜５０％、４５〜６０％、５５〜７０％、６５〜８０％、７５〜９０％、８５〜１００％、またはそれらの間の任意の範囲である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００５４】
いくつかの実施形態では、内皮細胞の被覆率％は、最大で２％、最大で５％、最大で１０％、最大で１５％、最大で２０％、最大で２５％、最大で３０％、最大で３５％、最大で４０％、最大で４５％、または最大で５０％である。いくつかの実施形態では、内皮細胞の被覆率％は５〜１５％、１０〜２５％、２０〜３５％、３０〜５０％、またはそれらの間の任意の範囲である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００５５】
いくつかの実施形態では、内皮細胞は、筋芽細胞またはそれらの前駆細胞の増殖を増加させるために使用される。いくつかの実施形態では、内皮細胞は、筋芽細胞またはそれらの前駆細胞の筋管への分化を阻害する。いくつかの実施形態では、内皮細胞は、筋芽細胞またはそれらの前駆細胞の成長および増殖を補助する。いくつかの実施形態では、内皮細胞は、筋芽細胞またはそれらの前駆細胞の分化には不要である。いくつかの実施形態では、本発明の方法によれば、内皮細胞活性（例えば、筋原性物質の分泌、筋芽細胞の成長、生存、またはその両方を補助する）は、定義された期間維持される。いくつかの実施形態では、内皮活性の定義された期間とは、筋芽細胞またはそれらの前駆細胞が、三次元多孔性足場の少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９９％の被覆率を達成するために必要な期間である。いくつかの実施形態では、内皮活性の定義された期間は、筋芽細胞またはそれらの前駆細胞が少なくとも３０％の被覆率を達成するために必要な期間である。
【００５６】
いくつかの実施形態では、筋管の被覆率％は、少なくとも５％、少なくとも２０％、少なくとも３５％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９０％、または少なくとも９９％である。いくつかの実施形態では、筋管の被覆率％は１〜１０％、５〜２０％、１５〜３５％、３０〜５０％、４０〜６５％、６０〜８５％、８０〜９０％、９０〜１００％、またはその間の任意の範囲である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００５７】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物の筋管は、三次元多孔性足場の１ｍｍ３あたり１０，０００〜１００，０００の核、三次元多孔性足場の１ｍｍ３あたり１０，０００〜１００，０００の核、三次元多孔性足場の１ｍｍ３あたり１５，０００〜２００，０００の核、三次元多孔性足場の１ｍｍ３あたり５０，０００〜５００，０００の核、三次元多孔性足場の１ｍｍ３あたり５，０００〜１，０００，０００の核、三次元多孔性足場の１ｍｍ３あたり１００，０００〜２５０，０００の核、三次元多孔性足場の１ｍｍ３あたり１０，０００〜１，５００，０００の核、またはそれらの間の任意の範囲の核を含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００５８】
当業者には明らかであるように、ＥＣＭは、筋管への筋芽細胞の分化に影響を及ぼす。いくつかの実施形態では、本発明の方法に従って利用されるＥＣＭ分泌細胞により、筋芽細胞の分化が改善される。いくつかの実施形態では、ＥＣＭ分泌細胞は、組織の物理的特性をシミュレートすることにより、筋芽細胞の分化を改善した。
【００５９】
本明細書において定義されるように、「改善された」および「増加した」という用語は同義である。
【００６０】
いくつかの実施形態では、改善は、少なくとも５％、少なくとも２０％、少なくとも３５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２５０％、少なくとも５００％、少なくとも７５０％、少なくとも１，０００％、少なくとも２，５００％、または少なくとも５，０００％である。いくつかの実施形態では、改善は、５〜１５％、１０〜３５％、２５〜４５％、４０〜７０％、６５〜９０％、８５〜１５０％、１００〜５００％、または２５０〜１，０００％である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００６１】
組織の物理的特性の非限定的な例としては、これらに限定されないが、頑強性、多孔性、柔軟性、剛性などが挙げられる。組織は、そのヤング率、粘度率、または他のパラメータに従って物理的に定義でき、それらはすべて当業者には明らかであろう。
【００６２】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、多孔性テクスチャ加工タンパク質を滅菌するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、多孔性テクスチャ加工タンパク質は、複数の細胞型を播種またはインキュベートする前に滅菌される。いくつかの実施形態では、滅菌はガンマ線照射による。別の実施形態では、滅菌は、エタノールベースの滅菌である。滅菌の手順は、当業者には明らかであろう。
【００６３】
当業者であれば、細胞の播種および／または培養が細胞培養培地の存在下で行われることを理解するであろう。別の実施形態では、細胞培養培地は、成長因子、サイトカイン、生物活性剤、栄養素、アミノ酸、抗生物質化合物、抗炎症性化合物、またはそれらの任意の組み合わせを含む。細胞の生存率および成長に好適である好適な培地および化合物は、当業者に公知である。
【００６４】
本発明の方法および組成物で使用できる成長因子としては、これらに限定されないが、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）が挙げられる。ＰＤＧＦおよびＩＧＦ−１は、分裂促進、走化性、および増殖（分化）細胞応答を刺激することが知られている。成長因子は、これらに限定されないが、次の１つ以上であり得る：ＰＤＧＦ、例えば、ＰＤＧＦ  ＡＡ、ＰＤＧＦ  ＢＢ；ＩＧＦ、例えば、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ；線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、例えば、酸性ＦＧＦ、塩基性ＦＧＦ、β−内皮細胞成長因子、ＦＧＦ  ４、ＦＧＦ  ５、ＦＧＦ  ６、ＦＧＦ  ７、ＦＧＦ  ８、およびＦＧＦ  ９；トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、例えば、ＴＧＦ−Ｐ１、ＴＧＦ  β１．２、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β５；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、例えば、ＢＭＰ  １、ＢＭＰ  ２、ＢＭＰ  ３、ＢＭＰ  ４；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、例えば、ＶＥＧＦ、胎盤成長因子；上皮成長因子（ＥＧＦ）、例えば、ＥＧＦ、アンフィレグリン、ベータセルリン、ヘパリン結合ＥＧＦ；インターロイキン、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、ＣＳＦ−Ｇ、ＣＳＦ−ＧＭ、ＣＳＦ−Ｍ；神経成長因子（ＮＧＦ）；幹細胞因子；肝細胞成長因子、および毛様体神経栄養因子。
【００６５】
以下に例示するように、ウシ由来細胞の場合、最適化された衛星細胞（ＳＣ）拡張培地（すなわち、Ｐｒｏ−ＬＩＦ培地）は、ウシＳＣ（ＢＳＣ）成長培地（９９％）、アムホテリシンＢ（ＡＢ／ＡＭ；１％１ｘ）、ＺｎＣｌ２（５０μＭ）、ＥＧＦ（６２ｎｇ／ｍｌ）、ＩＧＦ−１（１００ｎｇ／ｍｌ）、およびｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を含む。
【００６６】
以下に例示するように、ウシ由来細胞の場合、最適化されたＳＣ成長培地は、ＤＭＥＭ／ＨＥＰＥＳ（４３．５％）、ＨａｍのＦ−１０栄養素ミックス（４３．５％）、胎児ウシ血清（１０％）、ＭＥＭ  ＮＥＡＡ（１％１ｘ）、ＧｌｕｔａＭＡＸ（１％）、およびＡＢ／ＡＭ（１％１ｘ）を含む。
【００６７】
以下に例示されるように、ウシ由来細胞の場合、最適化されたＳＣ分化培地は、ＤＭＥＭ／ＨＥＰＥＳ（９７％）、ドナーウマ血清（２％）、ＡＢ／ＡＭ（１％１ｘ）、ＩＧＦ−１（１００ｎｇ／ｍｌ）、およびＥＧＦ（６２ｎｇ／ｍｌ）を含む。
多孔性足場
【００６８】
いくつかの実施形態では、本発明の複数の細胞は、多孔性足場と共にインキュベートされる。本明細書で使用される「足場」という用語は、細胞の固着／付着、成熟、分化、および増殖に好適である表面を提供する物質を含む構造を指す。足場により、機械的安定性および補助がさらにもたらされ得る。足場は、増殖する細胞の集団によって想定される三次元の形状または形態に影響を与えるまたは範囲を定めるために、特定の形状または形態であってもよい。いくつかの実施形態では、本発明の多孔性足場は、三次元である。
【００６９】
いくつかの実施形態では、多孔性足場の平均孔径は、２０マイクロメートル（μｍ）〜１０００μｍ、２０μｍ〜９００μｍ、２０μｍ〜８００μｍ、２０μｍ〜７００μｍ、２０μｍ〜６００μｍ、２０μｍ〜５００μｍ、２０μｍ〜４００μｍ、２０μｍ〜３００μｍ、２０μｍ〜２００μｍ、２０μｍ〜１００μｍ、５０μｍ〜１０００μｍ、５０μｍ〜９００μｍ、５０μｍ〜８００μｍ、５０μｍ〜７００μｍ、５０μｍ〜６００μｍ、５０μｍ〜５００μｍ、５０μｍ〜４００μｍ、５０μｍ〜３００μｍ、５０μｍ〜２００μｍ、５０μｍ〜１００μｍ、１００μｍ〜１０００μｍ、１００μｍ〜９００μｍ、１００μｍ〜８００μｍ、１００μｍ〜７００μｍ、１００μｍ〜６００μｍ、１００μｍ〜５００μｍ、１００μｍ〜４００μｍ、１００μｍ〜３００μｍ、１００μｍ〜２００μｍ、５００μｍ〜１０００μｍ、５００μｍ〜９００μｍ、５００μｍ〜８００μｍ、５００μｍ〜７００μｍ、または５００μｍ〜６００μｍの範囲である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、多孔性足場の平均孔径は、２０μｍ〜１０００μｍの範囲である。
【００７０】
いくつかの実施形態では、多孔性足場は食用である。いくつかの実施形態では、多孔性足場は、テクスチャ加工タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、多孔性足場は、多糖類を含む。いくつかの実施形態では、テクスチャ加工タンパク質は、テクスチャ加工された植物性タンパク質である。いくつかの実施形態では、テクスチャ加工タンパク質は、テクスチャ加工大豆タンパク質（ＴＳＰなど）である。
【００７１】
本明細書では、用語「テクスチャ」は、様々なサイズ、形状、および構成に容易に形成でき、かつ水に非分散性である個々の細胞の剛性の塊、または柔軟な塊を指すために使用される。
【００７２】
本明細書で使用するのに好適である粒子状テクスチャ加工タンパク質物質は、乾燥重量基準において３０％〜１００％のタンパク質、およびタンパク質源物質または添加されたアジュバント物質に関連する０％〜７０％の物質から構成され得る。アジュバント物質の例としては、炭水化物、ビタミン、香料、着色料などである。いくつかの実施形態では、タンパク質粒子は、乾燥重量で５０％〜１００％のタンパク質、または５０％〜８０％のタンパク質で構成されている。
【００７３】
テクスチャ加工粒子状タンパク質物質を形成するためにテクスチャ加工可能な好適な非テクスチャ加工タンパク質は、様々な供給源から入手できる。非限定的な例として、こうしたタンパク質の供給源は、植物性タンパク質および特定の真菌タンパク質であるが、動物性タンパク質を使用してもよい。好適な動物性タンパク質の例としては、カゼイン、コラーゲン、および卵白である。好適な植物性タンパク質源の例は、大豆、ベニバナ種子、トウモロコシ、ピーナッツ、小麦、小麦グルテン、エンドウ豆、ヒマワリ種子、ヒヨコマメ、綿実、ココナッツ、ナタネ、ゴマ種子、葉タンパク質、グルテン、酵母などの単細胞タンパク質などである。
【００７４】
好適なタンパク質源の別の例は、キノコである。いくつかの実施形態では、キノコタンパク質源は、乾燥重量で、１５〜２０％（ｗ／ｗ）、２０〜３０％（ｗ／ｗ）、２８〜４５％（ｗ／ｗ）、または１０〜４０％（ｗ／ｗ）のタンパク質の量である。
【００７５】
一般に、タンパク質源が植物性タンパク質である場合、使用前のタンパク質は比較的純粋な形態で置かれる。したがって、例えば、タンパク質源が大豆である場合、大豆をヘキサンなどで溶媒抽出して、そこから油を除去してもよい。得られた油分非含有大豆ミールには、約５０％のタンパク質が含まれている。
【００７６】
大豆ミールは、既知の方法で加工して、炭水化物を除去し、より高レベルのタンパク質を含む製品、例えば、約７０％のタンパク質を含む大豆タンパク質濃縮物または約９０％以上のタンパク質を含む大豆タンパク質分離物を得ることができる。次に、大豆ミール、濃縮物、分離物、および他の食用タンパク質担持物質を、好適なテクスチャ加工された粒子状タンパク質物質に変換するために、様々な好適な先行技術プロセスを用いることができる。
【００７７】
テクスチャ加工されていない動物性および植物性タンパク質担持物質を粒子状テクスチャ加工タンパク質に変換するための好適な方法は、例えば、１９５４年６月２９日にＢｏｙｅｒに付与された米国特許第２，６８２，４６６号、１９６４年７月２８日にＫｉｔｃｈｅｌに付与された米国特許第３，１４２，５７１号、１９７０年１月６日にＡｔｋｉｎｓｏｎに付与された米国特許第３，４８８，７７０号、１９７０年３月３日にＣａｌｖｅｒｔらに付与された米国特許第３，４９８，７９４号、１９７３年９月１８日にＬｏｅｐｉｋｔｉｅらに付与された米国特許第３，７５９，７１５号、１９７３年１２月１１日にＳｔｒｏｍｍｅｒに付与された米国特許第３，７７８，５２２号、１９７４年２月２６日にＤａｎｎｅｒｔらに付与された米国特許第３，７９４，７３１号、１９７４年６月４日にＹａｎｇらに付与された米国特許第３，８１４，８２３号、および１９７２年４月２８日に出願され、共通譲渡された米国特許出願番号２４８，５８１号、現在は、１９７４年１０月８日にＬｉｅｐａらに付与された米国特許第３，８４０，６７９号に開示され、これらの特許は、すべて参照により本明細書に組み込まれる。
【００７８】
代替的実施形態では、多孔性テクスチャ加工タンパク質は、摂取可能な食用であると共に咀嚼可能な他の多孔性組成物で置き換えることができる。本明細書で使用される「摂取可能な」および「食用」という用語は、体内に安全に摂取され得る組成物を指す。これらの組成物としては、吸収されるもの、および吸収されないもの、ならびに消化可能であるおよび消化不可能なものが挙げられる。本明細書で使用するとき、用語「咀嚼可能な」とは、嚥下する前に咀嚼することにより、より小さい片に破壊する／破砕することができる組成物を指す。当業者は、好適な食用組成物が、所望の用途（例えば、ヒト成人による消費）に対する物理的特性（例えば、ヤング率、粘度率、頑強性など）に従って選択され得ることを理解するであろう。
【００７９】
本発明の方法によれば、複数の細胞型は、それ自体が、三次元多孔性足場に播種されている。いくつかの実施形態では、三次元多孔性足場に播種された複数の細胞型は、いかなる固化剤も必要としない。いくつかの実施形態では、三次元多孔性足場に播種された複数の細胞型は、固化剤を必要とする。いくつかの実施形態では、固化剤により、三次元多孔性足場に対する複数の細胞型の固着または付着が増加する。固化剤の非限定的な例としては、トロンビンまたはフィブリンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８０】
本明細書で使用される場合、「ゲル化剤」および「固化剤」という用語は同義である。
【００８１】
特に明記しない限り、本議論において、本発明の実施形態の特徴または複数の特徴の条件または関係特性を修飾する「実質的に」および「約」などの形容詞は、その条件または特性が、意図された用途のための実施形態の動作に対して受け入れ可能である許容範囲内で定義されることを意味すると理解される。特に明記しない限り、明細書および請求項の「または」という用語は、包括的な「または」ではなく排他的な「または」とみなされ、結合する項目のうちの少なくとも１つまたは任意の組み合わせを示す。
【００８２】
上記および本明細書の他の場所で使用される「ａ」および「ａｎ」という用語は、列挙された構成要素のうちの「１つ以上」を指すことを理解されたい。特に明記しない限り、単数形の使用が複数形を含むことは当業者には明らかであろう。このため、「ａ」、「ａｎ」、および「少なくとも１つ」という用語は、本明細書では同じ意味で使用される。
【００８３】
本教示をよりよく理解する目的で、特に教示の範囲を限定することなく、特に明記しない限り、本明細書および特許請求の範囲で使用される量、百分率または割合、および他の数値を表すすべての数値は、すべての場合、用語「約」によって修飾されるものとして理解されるべきである。したがって、そうでないことが示されない限り、以下の明細書および添付の特許請求の範囲に示される数値パラメータは、得ようとする所望の特性に応じて変化し得る近似値である。少なくとも、各数値パラメータは、報告された有効数字の数を考慮して、および通常の四捨五入法を適用して、少なくとも解釈されるべきである。
【００８４】
本出願の説明および特許請求の範囲において、動詞「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」および「有する（ｈａｖｅ）」およびそれらの活用形のそれぞれは、動詞の目的語（複数可）が必ずしも動詞の主語（複数可）の構成要素、要素または部分を完全に列挙していないことを示すために使用される。
【００８５】
本明細書で使用される他の用語は、当技術分野におけるそれらの周知の意味によって定義されることを意味する。
【００８６】
本発明の追加の目的、利点、および新規の特徴は、限定することを意図するものではなく、以下の実施例を検討するときに、当業者にとって明らかになるであろう。加えて、本明細書中上記で詳述され、以下の特許請求の範囲で請求される本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれは、以下の実施例で実験的裏付けを見出す。
【００８７】
明確にするために別個の実施形態の文脈に記載されている本発明の特定の特徴はまた、単一の実施形態に組み合わせて提供され得ることは認識されるであろう。逆に、簡潔にするために単一の実施形態の文脈に記載される本発明の様々な特徴は、別個に、または任意の好適な下位の組み合わせで、または本発明の任意の他の記載された実施形態において好適であるものとして提供されてもよい。様々な実施形態の文脈に記載されている特定の特徴は、実施形態がそれらの構成要素なく動作できない場合を除き、それらの実施形態の本質的な特徴と見なされるべきではない。
実施例
【００８８】
一般に、本明細書で使用される命名法、および本発明で利用される実験室手順としては、分子、生化学、微生物学および組換えＤＮＡ技術が挙げられる。こうした技術は、文献内で徹底的に説明されている。例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９年）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」第Ｉ−ＩＩＩ巻、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，編（１９９４年）；Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９年）；Ｐｅｒｂａｌ、「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８年）；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎら、（編）「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」、第１−４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８年）；米国特許第４，６６６，８２８号；同第４，６８３，２０２号；同第４，８０１，５３１号；同第５，１９２，６５９号および同第５，２７２，０５７号に記載の方法、「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」、Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．，編集（１９９４年）；「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ−Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９９４年）、第３版；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ｃｏｌｉｇａｎ  Ｊ．Ｅ．，編（１９９４年）；Ｓｔｉｔｅｓら、（編）、「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ（１９９４年）；Ｍｉｓｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｈｉｉｇｉ（編）、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ」ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６年）；「Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」第１巻：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ、ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓを参照されたい。これはすべて参照によって組み込まれる。他の一般的な参照は、本文書全体で提供される。
材料および方法
テクスチャ加工大豆タンパク質
【００８９】
テクスチャ加工大豆タンパク質（ＴＳＰ）は、いくつかの異なる製品として市販されている。ＴＳＰ足場は、市販のＴＳＰの５つの異なる供給源から調製した−３つのＴＳＰチャンク（図１Ａ）は、地元の健康食品店から得て、２つのＴＳＰフレーク（図１Ｂ〜１Ｃ）は、ＡＤＭから得た。ＴＳＰは、２５〜４０ｋＧｙのガンマ線照射で３．５時間滅菌し、滅菌環境で保管するか、７０％（ｖ／ｖ）エタノールを１５分間使用した。続いて、ＰＢＳで３回洗浄した。
ＴＳＰ足場の調製
【００９０】
ＴＳＰフレーク（ＡｒｃｏｎまたはＴＶＰ）は、グレーフェピンセットを使用して、約２００〜４００μｍ（１層あたり）の類似の厚さになるように選択した。フレークを５〜１０ｍｌの滅菌ＤＤＷで３７℃で一晩（５０ｍｌファルコン）インキュベートした。翌日、フレークを、フード内で非ＴＣ  １０ｃｍプレート上にて６ｍｍ生検パンチを使用して６ｍｍ足場に切断した。パスツールピペットを使用して、足場を生検パンチから取り出し、５ｍｌの成長培地を含むファルコンに移した。ＴＳＰチャンクをＤＤＷで３７℃で一晩インキュベートした。次に、生検パンチを使用してチャンクをシリンダー状（図２Ａの挿入図）に切断し、ナイフを使用して厚さ１ｍｍの円板に切断した（図２Ａ）。その後、足場を５ｍｌの成長培地に入れた。
足場播種
【００９１】
１つの足場につき、２ｘ１０６ＢＳＣをエッペンドルフに移し、１，５００ｒｃｆで４分間遠心分離した。一方、各足場は、成長培地を含む５０μｌで非ＴＣ  ６ウェルプレートのウェルに入れた。遠心分離後、培地をエッペンドルフ管から吸引し、細胞のペレットを残した。次に、エッペンドルフごとに、次の手順を実行した：（１）ピンセットを使用して足場から培地を完全に吸引し、足場をゆっくり圧絞し、培地残留物を吸引した。（２）７μｌのトロンビン（ＰＢＳ中２０ＭＨＵ／ｍｌ  ｓｉｇｍａ）および７μｌのフィブリノゲン（ＰＢＳ中１５ｍｇ／ｍｌ  ｓｉｇｍａ）を加えた。（３）次に、細胞を足場に播種した。（４）足場を、乾燥するまで３７℃で３０分間インキュベートし、その後、２ｍｌの拡張培地をウェルに加えた。（５）翌日、足場を滅菌グレーフェピンセットを使用して新しい容器（例えば、カバースリップ底付き２４非ＴＣウェル）に移し、２ｍｌの拡張培地を加えた。（６）足場は３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートした。（７）足場は７日間拡張培地で維持した。（８）培地は、２日ごとに交換した（２ｍｌ）。（９）７日後、拡張培地をＢＳＣ分化培地に交換した。（１０）５日間、２日ごとに分化培地を交換した。
細胞培養
【００９２】
ウシ衛星細胞（ＢＳＣ）は、ＢＳＣ増殖培地（４３．５％ＤＭＥＭ／ＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ）、４３．５％Ｆ−１０  Ｎｕｔ  Ｍｉｘ（Ｇｉｂｃｏ）、１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）、１％ＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ）、１％  ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ）、および１％ペニシリン−ストレプトマイシン−アムホテリシンＢ溶液（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（Ａｂ／Ａｍ，ＢＩ）、以下を添加、５０μＭ  ＺｎＣｌ２（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、６２ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１００ｎｇ／ｍｌ  ＩＧＦ−１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１０ｎｇ／ｍｌ  ＬＩＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）および１０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ））で培養した。ＢＳＣ分化培地は、２％ＦＢＳおよび１％Ａｂ／Ａｍを添加したＤＭＥＭ／ＨＥＰＥＳで構成した。赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）発現真皮線維芽細胞（Ｌｏｎｚａ、ＵＳＡ）は、１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１％非必須アミノ酸（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、０．２％βメルカプトエタノール（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、および１００単位／ｍｌペニシリンおよび０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｉｓｒａｅｌ）を添加したダルベッコ最小必須培地（ＤＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で培養される。筋芽細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）は、１０％ＦＢＳ、２．５％ＨＥＰＥＳバッファー（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）および１％Ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ溶液を添加したＤＭＥＭで培養する。筋芽細胞分化培地は、２％ＦＢＳ、２．５％ＨＥＰＥＳバッファー、および１％Ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ溶液が添加されたＤＭＥＭで構成されている。すべてのインキュベーションは、３７℃の５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２加湿雰囲気で行う。ウシ平滑筋細胞（ＳＭＣ；ＣｅｌｌＡｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）は、表３に記載のとおり培養した。ウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ；ＣｅｌｌＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）は、市販の培地（ＣｅｌｌＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）で培養した。ウシ骨格筋微小血管ＥＣ（ＢＳｋＭＶＥＣ；ＡｎｇｉｏＰｒｏｔｅｏｍｉｅ）は、１０％総ＦＢＳを含むＥＣＭ市販培地（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ）で培養した。ウシ真皮線維芽細胞（ＢＤＦ；Ｓｃｉｅｎｃｅｌｌ）は、市販の培地（ＦＭ−２；ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ）または１５％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ高グルコース培地で培養した。
免疫組織化学
【００９３】
足場をＰＢＳで２回すすぎ、その後シェーカーで２０分間４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定する。足場をシェーカー上でＰＢＳにより５分間３回洗浄し、次いで０．３％トリトンＸ−１００（Ｂｉｏ  Ｌａｂ  Ｌｔｄ）で１０分間透過処理する。次に、足場をＰＢＳにより５分間３回洗浄し、次いで、５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を含むＰＢＳに一晩４℃で浸漬する。足場を室温で３時間、２５０μｌの一次抗体（５％ＢＳＡを含むＰＢＳ）と共にインキュベートする。インキュベーション後、足場をＰＢＳにより５分間４回洗浄する。次に、細胞を室温で３時間、シェーカーで、二次抗体（ＰＢＳ中）および４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、ＰＢＳで１：１０００；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共に、スズ箔で覆ったプレートでインキュベートする。足場をシェーカー上でＰＢＳにより５分間洗浄し、共焦点顕微鏡（ＬＳＭ  ７００、Ｚｅｉｓｓ）で撮像する。
ウシ大動脈平滑筋細胞（ＢＡＭＳＣ）
【００９４】
４つの異なる培地配合物の細胞増殖に対する効果を、市販の培地（ＢＳＭ）と比較した（表３）。実験開始時、細胞は８継代で、６ウェルプレートにおいて４，０００細胞／ｃｍ２で播種した。３日目に、細胞をトリプシン処理し、血球計でカウントし、４，０００細胞／ｃｍ２で再播種した。各条件に同じ細胞を使用して、実験を２回実行した。一元配置分散分析を使用して、統計的有意性の試験を行った。
細胞成長動態
【００９５】
およそ４ｘ１０３細胞／ｃｍ２が播種され、６日間にわたって血球計で毎日数を数えた。数えた値をプロットした。
細胞染色
【００９６】
支持細胞（ＢＤＦまたはＢＡＳＭＣ）は、１５μｌの親油性トレーサーＤｉＤ（無水エタノールで希釈した１ｍｇ／ｍｌ；＃Ｄ７７５７、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（登録商標）、ＵＳＡ）を含む３ｍｌの新鮮培地で染色した。ウシ内皮細胞（ＢＥＣ；ＢＡＥＣまたはＢＳｋＭＶＥＣ）は、５μｌの親油性トレーサーＤｉＩ（無水エタノールで希釈した３ｍｇ／ｍｌ；＃Ｄ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（登録商標）、ＵＳＡ）を含む３ｍｌの新鮮培地で染色し、３０分間３７℃でインキュベートした。培地で１回洗浄し、次にＰＢＳでさらに２回洗浄した後、細胞をトリプシン処理し、以下に記載するように播種の準備を行った。
多孔性足場上の細胞の播種
【００９７】
ウシＥＣ（１．２５ｘ１０５）および支持細胞（０．２５ｘ１０５）を、５ｍｇ／ｍｌフィブリノゲン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）と２０  ＮＩＨｕ／ｍｌトロンビン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）の１：１混合液５μｌに再懸濁した。フィブリノゲン溶液は、４０ｍＭグリシン−トリスバッファー中で凍結乾燥ヒトフィブリノゲン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を希釈することにより調製した。トロンビン溶液は、トロンビン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を４０ｍＭ塩化カルシウムで希釈することにより調製した。次に、共培養懸濁液を直径４ｍｍの円形ＰＬＬＡ−ＰＬＧＡ多孔性足場に播種し、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で１２ウェルの非組織プレート内で３０分間固化させた。固化後、追加の５％ＦＢＳおよび２ｎＭ  ＶＥＧＦを添加した２ｍｌの内皮培養培地（ＥＣＭ、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ）を各ウェルに添加した。培地は、一日ごとに交換した。
【００９８】
多孔性足場に播種された細胞の比をさらに調整するために、細胞は以下の変更を加えて、上記のように播種した：細胞は、最初に１：１培地（ｂＥＢＭ、ＡｎｇｉｏＰｒｏｔｅｏｍｉｅ：支持細胞の市販培地）で播種し、また、１５ｍｇ／ｍｌフィブリノゲン（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ）および２Ｕ／ｍｌトロンビン（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ）の１：１混合液５μｌに再懸濁した。
２Ｄでのウシ衛星細胞（ＢＳＣ）の分化
【００９９】
５ｘ１０４ＢＳＣ（４継代）は、カバースリップ底部を備えたＴＣ２４ウェルプレート上に３回播種した。細胞は、次のように筋管形成プロトコルに従って成長した。成長培地で４日間、分化培地で７日間（ｔ＝０は、分化培地を使用時の開始時点を指す）。その後、細胞は−１日目および７日目にヘキストおよびミオゲニンで染色した。
２ＤでのＢＳＣ分化の最適化
【０１００】
ＢＳＣ（４継代）は、異なるＧＦ（下記に記載）を含む拡張培地で４日間成長させ、その後、分化培地（ＤＭＥＭ−ＨＥＰＥＳ＋２％ＨＳ）で７日間成長させた。０日目は、培地が分化培地に交換された日として定義した。
拡張培地配合物には、以下を含む：（１）対照−成長培地（ＧＦ添加なし）；（２）ウシ線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ；１０ｎｇ／ｍｌ）；（３）上皮成長因子（ＥＧＦ；６２ｎｇ／ｍｌ）；（３）インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１；１００ｎｇ／ｍｌ）；（４）Ｐｒｏ−ＬＩＦ；ｂＦＧＦ  １０ｎｇ／ｍｌ、ＥＧＦ６２ｎｇ／ｍｌ、ＩＧＦ−１  １００ｎｇ／ｍｌ、およびＺｎＣｌ２  ５０μＭ）；（６）ＧＦウィーニング：Ｐｒｏ−ＬＩＦ培地で３日間、その後成長培地で３回洗浄（５分ごと）し、その後成長培地で１日。（７）細胞は、ＤｉＩで染色し、成長培地で成長させ、細胞を追跡するために追加された蛍光色であるＤｉＩが細胞分化に影響を及ぼすかを確認した。
【０１０１】
本発明者らは、分化期中のＧＦ：ＩＧＦ−１、ＥＧＦおよびそれらの組み合わせの効果をさらに確認した。ＢＳＣ（４継代）は、成長培地で４日間成長させ、その後、異なるＧＦを含む分化培地で７日間成長させた（以下に記載）。分化培地配合物には、以下を含む：（１）対照−元の分化培地（ＤＭＥＭ−ＨＥＰＥＳ＋２％ＨＳ）、（２）ＩＧＦ−１（１００ｎｇ／ｍｌ）；（３）ＥＧＦ（６２ｎｇ／ｍｌ）；および（４）ＩＧＦ−１（１００ｎｇ／ｍｌ）＋ＥＧＦ（６２ｎｇ／ｍｌ）。上記のすべての場合について、明視野顕微鏡を使用して細胞を可視化した。
３Ｄ足場でのＢＳＣ拡張の最適化
【０１０２】
この目的のために、次のように、二重要素実験（播種量および拡張培地配合物）を重複して設定した。（１）播種量および細胞数：（ａ）１０μｌ播種量および１ｘ１０６ＢＳＣ；（ｂ）１０μｌ播種量および２ｘ１０６ＢＳＣ；ならびに（ｃ）２０μｌ播種量および２ｘ１０６ＢＳＣ。（２）拡張培地：（ａ）成長培地；および（ｂ）Ｐｒｏ−ＬＩＦ培地（成長培地＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ＋ＩＧＦ−１＋ＺｎＣｌ２）。ＢＳＣ（４継代）はＤｉＩを使用して染色した後、Ａｒｃｏｎ播種プロトコルに従って多孔性足場（Ａｒｃｏｎ）に播種した。
３Ｄ足場でのＢＳＣ分化の最適化
【０１０３】
この目的のために、次のように二重要素実験（１週目の拡張培地および２週目の分化培地）を設定した。（１）拡張培地：（ａ）対照（成長培地）；（ｂ）Ｐｒｏ−ＬＩＦ；および（ｃ）Ｐｒｏ−ＬＩＦ−ｂＦＧＦ。（２）分化培地は単独であるか、または次のとおり添加した：（ａ）対照（２％ウマ血清を含む分化培地）；（ｂ）＋ＩＧＦ−１；（ｃ）＋ＥＧＦ；および（ｄ）＋ＩＧＦ−１＋ＥＧＦ。ＢＳＣ（４継代）は、ＤｉＩを使用して染色した。４ｍｍの多孔性足場に、５μｌのフィブリンに０．５ｘ１０６ＢＳＣ（４継代）を播種した。細胞は、播種後２日目、７日目および１４日目に撮像した。次に、足場をデスミンで染色した。染色は、一次ポリクローナル抗体１：１００ヤギαデスミン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｃａｔ．Ｎｏ．ｓｃ−７５５９）および二次抗体Ａｌｅｘａ  １：２００  ４８８ロバαヤギ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１１０５５）を使用したホールマウント染色プロトコルに従って行った。
播種前のウシ衛星細胞（ＢＳＣ）の染色
【０１０４】
ＢＳＣは、５μｌの親油性トレーサーＤｉＩ（無水エタノール、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（登録商標）、ＵＳＡで希釈した３ｍｇ／ｍｌ）を含む１ｍｌの新鮮培地で染色し、３７℃で３０分間インキュベートした。培地で１回洗浄し、その後、ＰＢＳで２回洗浄し、その後、細胞をトリプシン処理し、記載したとおり播種の準備をした。
ＰＬＬＡ−ＰＬＧＡでの細胞の播種
【０１０５】
ウシ衛星細胞（ＢＳＣ）（ウシＥＣ（ＢＥＣ）を含む場合、および含まない場合、ならびに支持細胞を含む場合、および含まない場合）は、１５ｍｇ／ｍｌフィブリノゲン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）と２０ＮＩＨＵ／ｍｌトロンビン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）との１：１混合液６μｌに再懸濁した。フィブリノゲン溶液は、４０ｍＭグリシン−トリスバッファー中で凍結乾燥ヒトフィブリノゲン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を希釈することにより調製した。トロンビン溶液は、トロンビン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を４０ｍＭ塩化カルシウムで希釈することにより調製した。次に、細胞懸濁液を直径４ｍｍの円形ＰＬＬＡ−ＰＬＧＡ足場に播種し、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で１２ウェルの非組織プレートで３０分間固化させた。固化後、内皮培養培地とＢＳＣ成長培地（Ｐｒｏ−ＬＩＦ）の１：１混合液１ｍｌを各ウェルに加えた。培地は、一日ごとに交換した。１週間後、培地をさらに１週間ＢＳＣ分化培地（ＩＧＦ−１およびＥＧＦを添加）に交換した。
テクスチャ加工大豆タンパク質足場での細胞の播種
【０１０６】
ウシ衛星細胞（ＢＳＣ）（ウシＥＣを含む場合、および含まない場合、ならびに支持細胞を含む場合、および含まない場合）は、１５ｍｇ／ｍｌフィブリノゲン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）と２０ＮＩＨＵ／ｍｌトロンビン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）との１：１混合液１５μｌに再懸濁した。フィブリノゲン溶液は、４０ｍＭグリシン−トリスバッファー中で凍結乾燥ヒトフィブリノゲン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を希釈することにより調製した。トロンビン溶液は、トロンビン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を４０ｍＭ塩化カルシウムで希釈することにより調製した。次に、細胞懸濁液を直径６ｍｍの円形のテクスチャ加工大豆タンパク質足場の両側に播種し、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で１２ウェルの非組織プレートで４５分間固化させた。固化後、内皮培養培地とＢＳＣ成長培地（Ｐｒｏ−ＬＩＦ）の１：１混合液１ｍｌを各ウェルに加えた。培地は、一日ごとに交換した。１週間後、培地をさらに１週間ＢＳＣ分化培地（ＩＧＦ−１およびＥＧＦを添加）に交換した。
【０１０７】
以下の表に記載されているように、２つの播種比および２種類の内皮細胞（および適切な培地）の試験を行った：
【表１】
2020527054.tif 000002
【表２】
2020527054.tif 000003
【０１０８】
ウシ衛星細胞（ＢＳＣ）を１５μｌのＢＳＣ成長培地に再懸濁した。次に、細胞懸濁液を直径６ｍｍのセリンダーＧｅｌｆｏａｍ（ｃ）足場の両側に播種し、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で１２ウェルの非組織プレートで３０分間固化させた。固化後、１ｍｌのＢＳＣ増殖培地（Ｐｒｏ−ＬＩＦ）を各ウェルに加えた。培地は、一日ごとに交換した。１週間後、培地をさらに１週間ＢＳＣ分化培地（ＩＧＦ−１およびＥＧＦを添加）に交換した。
足場での細胞成長
【０１０９】
播種の１週間後および２週間後、細胞成長を評価するために共焦点顕微鏡を使用して、ＰＬＬＡ／ＰＬＧＡおよびＡｒｃｏｎ足場に播種したＤｉＩ標識ＢＳＣを撮像した。
ホールマウント免疫蛍光染色
【０１１０】
播種の２週間後、足場を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ；Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で２０分間固定した後、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で３回洗浄した。０．３％トリトンＸ−１００（Ｂｉｏ  Ｌａｂ  Ｌｔｄ）で、室温（ＲＴ）で１５分間足場をインキュベートすることにより、透過処理を行った。ＰＢＳで３回洗浄した後、足場をブロッキングバッファー（１０％ＦＢＳ、１％（ｗ／ｖ）グリシンおよび０．０１％トリトン、ＰＢＳ中）で一晩４℃でインキュベートした。その後、足場を一次抗体と共に一晩４℃でインキュベートした：１：５０ヤギ抗ＣＤ３１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、１：５０マウス抗ＭＹＨ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）の有無にかかわらず、ブロッキングバッファーで希釈。ＰＢＳで数回洗浄した後、サンプルを１：４００ロバ抗ヤギＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）、１：５０  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ  ６４７共役マウス抗ミオゲニン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）および１：１，０００  ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（１：３００  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ  ６４７抗マウスを含む場合、または含まない場合）ＲＴで３時間、インキュベートした。ＰＢＳで数回洗浄した後、Ｚｅｎソフトウェアを使用して、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ７００共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）で足場を直ちに撮像した。ＦＩＪＩソフトウェアを使用して、画像処理およびさらなる分析を行った。ＰＬＬＡ／ＰＬＧＡ足場もまた、播種後１週間にホールマウント免疫蛍光染色した。
凍結切断および三色染色
【０１１１】
各実験の最後に、足場を３０％（ｗ／ｖ）スクロース溶液で一晩４℃でインキュベートした。その後、足場を最適な切断温度（ＯＣＴ）化合物（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｃ、米国）に埋め込み、その後の凍結切断のために凍結した。ＯＣＴを埋め込んだ足場は、凍結切断を行って、厚さ５μｍおよび１０μｍの切片にした。次に、５μｍ厚の切片を、トリクローム標準染色プロトコルに従って染色した。
実施例１
ＴＳＰ多孔性足場の三次元構造解析
【０１１２】
ＴＳＰ足場は、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）を使用して検査し、ミクロンスケールおよびナノスケールの両方で三次元（３Ｄ）構造を解析した。１００倍の画像は、ＴＳＰが１００〜１，０００μｍの孔径の多孔性であり、細胞培養に使用できることを示した。大きいＴＳＰの壁は、中程度の供給源のＴＳＰと比較して厚いことが示された（図３Ａおよび図３Ｂ）。大きいＴＳＰのＳＥＭ画像（倍率２ｘ１０５）は、ＴＳＰが３０ｎｍのボール形状のタンパク質クラスターを含むことを示した。中程度のＴＳＰの解析では、これらのクラスターの間に、より非晶質の接着剤様の物質が示された（図４Ａおよび図４Ｂ）。
実施例２
多孔性足場で培養した線維芽細胞の成長および増殖
【０１１３】
ＴＳＰ足場での線維芽細胞の付着および増殖を調べた。まず、ＲＦＰで標識した５０，０００の真皮線維芽細胞をＴＳＰ足場に播種し、培養した。１４日間のインキュベーション後、真皮線維芽細胞が取り込まれたＴＳＰ足場は、さらに２００，０００内皮細胞が播種され、さらに７日間インキュベートした。細胞を取り込んだＴＳＰのサンプルを免疫染色し、共焦点顕微鏡を使用して、線維芽細胞の播種から８日後、１８日後、および２１日後に撮像した。これらの結果は、低細胞数５０，０００細胞で播種された場合でも、線維芽細胞が増殖して、ＴＳＰ足場を覆ったことを示した（図５Ａ）。内皮細胞の播種後（図５Ｂ）、内皮細胞が集まってクラスターとなった（図５Ｃ）。次に、各足場源の足場およびＴＳＰの面方向に対して９０°から切断した足場を調べた。足場の各々には、２０万線維芽細胞を播種し、１４日間インキュベートした。これらの結果は、線維芽細胞が、大きいＴＳＰ足場および中程度のＴＳＰ足場で成長し、増殖することを実証した（図６）。これらの結果は、細胞が、培養１４日後に足場を埋めることができることを示している。
実施例３
多孔性足場で培養された筋芽細胞の成長
【０１１４】
筋肉組織の生成の適用性を評価するために、実験を実施して、筋肉細胞がＴＳＰ足場で成長できるか否かを調べる。
【０１１５】
この目的のために、０．５ｘ１０６筋芽細胞は、ＴＳＰ足場に播種し、血清では低く、従って培養肉の生産のためにより良く適合している分化培地の存在下で培養した。１４日目（図７）の筋芽細胞の画像により、ＴＳＰ足場で筋芽細胞が増殖したことが示され、これにより、細胞は、培養の１４日後に足場を埋めることができることが示された。
実施例４
ＴＳＰで培養されたウシ骨格筋細胞の増殖
【０１１６】
ヒトの消費のための適用性を評価するために、ウシ骨格筋細胞（ｂＳｋＭＣ）をＴＳＰ足場に播種した。具体的には、０．５ｘ１０６ｂＳｋＭＣ細胞は、各足場に播種され、分化培地の存在下で培養した。１４日目に、細胞を、共焦点顕微鏡を使用して撮像した。画像（図８）は、ｂＳｋＭＣがＴＳＰ足場で増殖することが示され、これは、ＴＳＰが培養肉の生産に適用可能であることを示している。
実施例５
ウシ大動脈平滑筋細胞（ＳＭＣ）の増殖
【０１１７】
本発明者らは、市販の培地（ＢＳＭ；表３）と比較して、以下に記載の培地中において播種されたＳＭＣの増殖に及ぼす４つの異なる培地配合物の効果を調べた（図９Ａ〜図９Ｅ）。
【表３】
2020527054.tif 000004
【０１１８】
３日目に、５つの異なる培地（図１０Ａ）では、細胞数の有意差は検出できなかった。以下の実験（図１０エラー！参照元が見つかりません。Ｂ）の３日目には、４つの異なる処理で有意差が観察され（Ｐ＜０．０１）、事後分析では、ＮＥＡＡ添加培地および１５％ＦＢＳ添加培地（Ｐ値は、それぞれ＜０．０５、および＜０．０１）と比較して、ピルビン酸塩添加培地に供された細胞の数が有意に高いことが明らかになった。市販の培地とピルビン酸ナトリウム添加培地との差がわずかに有意であった（Ｐ＝０．０５２）。したがって、本発明者らは、ＢＡＯＳＭＣ培養のためのピルビン酸ナトリウム添加培地（１ミリモル）で進めた。
実施例６
定義された条件下でのＢＤＦおよびＳＭＣの成長特性
【０１１９】
カスタム培地配合物を定義後に、本発明者らは、これらの条件（実施例５）下で、それらの成長速度を調べた。ＢＤＦ（図１１Ａ）およびＢＡＯＳＭＣの成長速度は、非常に類似している（図１１Ｂ）ことが見出された。
実施例７
血管新生に対するＥＣおよび支持細胞の効果
【０１２０】
支持細胞との共培養において播種されたウシ内皮細胞（ＥＣ；ＢＡＥＣ−ウシ大動脈内皮細胞またはＢＳｋＭＶＥＣ−ウシ骨格筋微小血管内皮細胞）により、血管新生および足場被覆率を向上させるか否かの試験を行うために、ＢＡＥＣが、ＢＤＦまたはＢＡＳＭＣのいずれかと共同播種された。実際に、筋芽細胞および内皮細胞と共に線維芽細胞を共培養することにより、経時的に、操作された筋肉構築物の血管新生が増え、かつ血管構造の安定化が向上していることがわかっている。細胞は、足場全体を覆うことがわかった（図１２）。さらに、本発明者らは、ＢＡＳＭＣとの共培養でＢＡＥＣを播種したときに（図１２エラー！参照元が見つかりません。Ａ）、ＥＣの染色が経時的に減少していることに気付いた。また、この組み合わせにおいて２日目に、血管様構造が明らかであった。ＢＤＦとの共培養でＢＡＥＣを播種したときは（図１２Ｂ）、発明者らは、血管様構造に気付かなかった。ＢＡＳＭＣとの共培養でＢＳｋＭＶＥＣを播種したときに（図１３Ａ）、本発明者らは、ＢＡＳＭＣがＢＳｋＭＶＥＣよりはるかに多いことに気付いた。また、全実験期間を通して、ＢＡＳＭＣ（図１３Ａ）およびＢＤＦ（図１３Ｂ）を用いた場合に、血管様構造が明らかであった。
実施例８
特定の細胞比により、血管網形成が改善
【０１２１】
さらに、血管網を改善するために、本発明らは、ウシＢＡＥＣと支持細胞（ＢＤＦまたはＢＡＳＭＣ）とを異なる比で播種した。発明者らは、３つの異なる比、ＥＣ対支持細胞１：３、１：１および５：１を調べた。本発明者らは、２日目などの早期に、ＢＡＳＭＣ（図１４および図１６）の存在下において、血管が形成されたＢＡＥＣ細胞（図１４〜図１６）の自己集合を明確に観察した。本発明者らはまた、６日目までにＥＣが２日目よりも少なくなり、かつＢＡＥＣにより、ＢＡＥＣ対ＢＡＳＭＣの比が１：１である血管網の領域が形成されたことにも気づいた。ＢＡＥＣは、ＢＤＦの存在下では、血管を形成しないと考えられた（図１５）。
実施例９
細胞培養におけるウシ衛星細胞（ＢＳＣ）の分化
【０１２２】
次に、本発明者らは、ＢＳＣからの筋管形成の前後にミオゲニン発現を調べ、融合指数（ＦＩ）の測定のためにＤＡＰＩ−ミオゲニンを使用する能力をさらに評価した。本発明者らは、未分化ＢＳＣにおけるミオゲニン発現のエビデンスをほとんど発見しなかった（図１７）。ミオゲニンの発現は、主に筋管の核および筋管周辺のいくつかの核で生じた。融合指数（ＦＩ）は、ミオゲニン／ヘキスト核数の比によって自動的に計算できることが示され、これにより、手動のＦＩ計算に匹敵することがわかった。このプロトコルは、筋管形成の定量化でさらに使用された。
実施例１０
細胞培養におけるＢＳＣ分化の最適化
【０１２３】
次に、発明者らは、２ＤでのＢＳＣ分化の最適化を望んだ。発明者らは、（１）分化段階で筋管形成を阻害しない拡張期、および（２）筋管のサイズおよびＦＩを増加させる分化期の終わりに、いずれの成長因子（ＧＦ）を追加できるかを確認した。
【０１２４】
拡張期の後、および分化期の前に、ｂＦＧＦを含まないサンプルに自発性筋管が出現していることは（図１８）、ｂＦＧＦが筋管形成を阻害することを示唆するものである。ＥＧＦ、ＩＧＦ−１およびＤｉＩは、筋管形成に影響を与えないと考えられた。ＩＧＦ−１、Ｐｒｏ−ＬＩＦ、ウィーニングで細胞密度が増加した。分化の４日目に、本発明者らは、ｂＦＧＦおよびＰｒｏ−ＬＩＦ培養条件下で総筋管の増加を観察している。ｂＦＧＦは、ＢＳＣの幹細胞性を維持し、一旦細胞を除去させると、分化状態になる（図１９）。分化の７日目に、本発明者らは、他の試験条件と比較して、対照、ウィーニングおよびＤｉＩにおいて筋管面積が高いことを観察した（図２０）。本発明者らは、筋管形成と細胞死とは紙一重であると結論付けた。従って、細胞は、集密度に達するまでｂＦＧＦ（単独で、またはＰｒｏ−ＬＩＦと共に）を含有する拡張培地で成長させ、その後２〜５日の短い期間に、分化培地に移す必要がある。さらに、ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−１およびＥＧＦを細胞培養培地に添加した場合の筋管の豊富さが示された。
実施例１１
多孔性足場でのＢＳＣ拡張の最適化
【０１２５】
次に、発明者らは、以前の実験が多孔性足場での低い細胞被覆率を示したため、ＴＳＰ足場でＢＳＣ被覆率を６０％超に増加させることを試みた。したがって、ＧＦが拡張期に追加され、播種時の初期細胞数が増加した。細胞被覆面積の定量化により、ＧＦ添加成長培地（すなわち、Ｐｒｏ−ＬＩＦ）で培養された細胞は、足場の７２±１５％を被覆し、成長培地のみで培養された細胞は、足場の約１８％を被覆した（図２１）ことが示された。２つの処置間で統計的に有意であることが判明した差（Ｐ値＝０．０００９）。
実施例１２
多孔性足場でのＢＳＣ分化の最適化
【０１２６】
３Ｄ足場における筋管形成の最適条件を見つけるために、発明者らは、拡張培地とその後の分化培地との複数の組み合わせを走査した。分化培地にＧＦを含まずに形成された筋管（図２２Ａ、ＥおよびＩ）は小さく、丸形であった。ＩＧＦ−１を分化培地に添加することで、筋管が生じた。これは、成長培地ではほとんど観察されず（図２２Ｂ）、Ｐｒｏ−ＬＩＦ−ｂＦＧＦでは一般的であり（図２２Ｊ）、Ｐｒｏ−ＬＩＦ培地では豊富であった（図２２Ｆ）。ＥＧＦを分化培地に添加することにより、すべての拡張培地に筋管が形成された（図２２Ｃ、Ｇ、Ｋ）。ＩＧＦ−１＋ＥＧＦを加えると、成長培地（図２２Ｄ）およびＰｒｏ−ＬＩＦ−ｂＦＧＦ（図２２Ｌ）に筋管が生じ、Ｐｒｏ−ＬＩＦに豊富な筋管（図２２Ｈ）が生じた。
実施例１３
三培養による、多孔性足場でのＢＳＣの増殖、伸長、および被覆の増加
【０１２７】
次に、発明者らは、一定量の平滑筋細胞（ＳＭＣ）および異なる量の骨格微小血管内皮（ＳｋＭＶＥＣ）（それぞれ２：１：１および２：１：５）とのＢＳＣの三培養のＢＳＣの生存、増殖、および筋管分化（分化マーカー−ミオゲニンに陽性）に対する効果を調べることにした。本発明者らは、低ＳｋＭＶＥＣ濃度（２：１：１）では、より高い濃度のＳｋＭＶＥＣ（２：１：５；図２８）とインキュベートした場合の外観と比較して、ＢＳＣがより伸長するように見えることを観察した。本発明者らはまた、ＢＳＣが多孔性足場に対する被覆を増加させ、単一培養またはＢＳＣを含む共培養（対照）のいずれかと比較してより分化しているように見えることも観察した。本発明者らは、三培養が、両方のインキュベーション比において他の試験群と比較してＢＳＣの増殖および分化をよりよく支持すると結論付け、ＢＳＣ分化能を以下のようにまとめた：ＢＳＣのみ＜ＢＳＣ＋ＥＣ＜ＢＳＣ＋ＳＭＣ＜ＢＳＣ＋ＥＣ＋ＳＭＣ（図２３〜図２６および図２８）。本発明者らは、ＢＳＣ＋ＳＭＣ＋ＳｋＭＶＥＣ（２：１：１）の三培養において細胞外マトリックス（ＥＣＭ）分泌も観察した（図２７Ａ〜図２７Ｂ）。
実施例１４
三培養により、テクスチャ加工大豆タンパク質足場でのＢＳＣ分化が増加する。
【０１２８】
次に、発明者らは、一定量の平滑筋細胞（ＳＭＣ）および骨格微小血管内皮（ＳｋＭＶＥＣ）を用いたＢＳＣの三培養（それぞれ２：１：１）が、ＢＳＣの生存、増殖、および筋管分化（分化マーカー−ミオゲニンに陽性）に及ぼす効果を調べることにした。本発明者らは、ＳＭＣとの共培養またはＳＭＣとＢＥＣとの三培養のいずれかで播種するときに、ＢＳＣがＴＳＰ足場の被覆を増加させるのみでなく、単一培養（ＢＳＣのみ）または共培養（ＢＳＣおよびＢＥＣ；図２９）のいずれかと比較して、より分化しているように見えることを観察した。
実施例１５
固化ゲルを添加せずにＢＳＣを播種
【０１２９】
次に、発明者らは、固化剤（例えば、フィブリン）を添加せずに、ＦＤＡ承認のコラーゲンベースの足場（Ｇｅｌｆｏａｍ（登録商標））にＢＳＣを播種する効果を調べることにした。本発明者らは、筋管形成によって実証されるように、ＢＳＣ分化の成功を観察した（図３０）。
【０１３０】
本明細書では、本発明の特定の特徴を例示および説明してきたが、多くの修正、置換、変更、および同等物が当業者に生じるであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の趣旨の範囲内にあるこうしたすべての修正および変更を網羅することを意図していることを理解されたい。
【図１Ａ】
2020527054.tif 000005
【図１Ｂ】
2020527054.tif 000006
【図１Ｃ】
2020527054.tif 000007
【図２Ａ】
2020527054.tif 000008
【図２Ｂ】
2020527054.tif 000009
【図３Ａ】
2020527054.tif 000010
【図３Ｂ】
2020527054.tif 000011
【図４Ａ】
2020527054.tif 000012
【図４Ｂ】
2020527054.tif 000013
【図５Ａ】
2020527054.tif 000014
【図５Ｂ】
2020527054.tif 000015
【図５Ｃ】
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【図６】
2020527054.tif 000017
【図７】
2020527054.tif 000018
【図８】
2020527054.tif 000019
【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図１０】
2020527054.tif 000025
【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
2020527054.tif 000028
【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
2020527054.tif 000030
【図１２Ｅ】
2020527054.tif 000031
【図１２Ｆ】
2020527054.tif 000032
【図１２Ｇ】
2020527054.tif 000033
【図１２Ｈ】
2020527054.tif 000034
【図１２Ｉ】
2020527054.tif 000035
【図１２Ｊ】
2020527054.tif 000036
【図１２Ｋ】
2020527054.tif 000037
【図１２Ｌ】
2020527054.tif 000038
【図１３Ａ】
2020527054.tif 000039
【図１３Ｂ】
2020527054.tif 000040
【図１３Ｃ】
2020527054.tif 000041
【図１３Ｄ】
2020527054.tif 000042
【図１３Ｅ】
2020527054.tif 000043
【図１３Ｆ】
2020527054.tif 000044
【図１３Ｇ】
2020527054.tif 000045
【図１３Ｈ】
2020527054.tif 000046
【図１３Ｉ】
2020527054.tif 000047
【図１３Ｊ】
2020527054.tif 000048
【図１３Ｋ】
2020527054.tif 000049
【図１３Ｌ】
2020527054.tif 000050
【図１４Ａ】
2020527054.tif 000051
【図１４Ｂ】
2020527054.tif 000052
【図１４Ｃ】
2020527054.tif 000053
【図１４Ｄ】
2020527054.tif 000054
【図１４Ｅ】
2020527054.tif 000055
【図１４Ｆ】
2020527054.tif 000056
【図１５Ａ】
2020527054.tif 000057
【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
2020527054.tif 000061
【図１６Ａ】
2020527054.tif 000062
【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
2020527054.tif 000064
【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
2020527054.tif 000066
【図１６Ｆ】
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【図１６Ｇ】
2020527054.tif 000068
【図１６Ｈ】
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【図１６Ｉ】
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【図１６Ｊ】
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【図１６Ｋ】
2020527054.tif 000072
【図１６Ｌ】
2020527054.tif 000073
【図１７】
2020527054.tif 000074
【図１８Ａ】
2020527054.tif 000075
【図１８Ｂ】
2020527054.tif 000076
【図１８Ｃ】
2020527054.tif 000077
【図１８Ｄ】
2020527054.tif 000078
【図１８Ｅ】
2020527054.tif 000079
【図１８Ｆ】
2020527054.tif 000080
【図１８Ｇ】
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【図１９Ａ】
2020527054.tif 000082
【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【図１９Ｆ】
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【図１９Ｇ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２０Ｅ】
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【図２０Ｆ】
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【図２０Ｇ】
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【図２０Ｈ】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２２Ｅ】
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【図２２Ｆ】
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【図２２Ｇ】
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【図２２Ｈ】
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【図２２Ｉ】
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【図２２Ｊ】
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【図２２Ｋ】
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【図２２Ｌ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２３Ｅ】
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【図２３Ｆ】
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【図２３Ｇ】
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【図２３Ｈ】
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【図２３Ｉ】
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【図２３Ｊ】
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【図２３Ｋ】
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【図２３Ｌ】
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【図２３Ｍ】
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【図２３Ｎ】
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【図２３Ｏ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２４Ｄ】
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【図２４Ｅ】
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【図２４Ｆ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２５Ｅ】
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【図２５Ｆ】
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【図２５Ｇ】
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【図２５Ｈ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２６Ｄ】
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【図２６Ｅ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図２９Ｃ】
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【図２９Ｄ】
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【図２９Ｅ】
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【図２９Ｆ】
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【図２９Ｇ】
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【図２９Ｈ】
2020527054.tif 000154
【図２９Ｉ】
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【図２９Ｊ】
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【図２９Ｋ】
2020527054.tif 000157
【図２９Ｌ】
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【図２９】
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【図３０】
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【国際調査報告】
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