(57)【要約】  式（Ｉ）、５’ＩＴＲ−Ｂ１−ＢＡ−Ｂ２−ＢＸ−ＢＢ−ＢＹ−Ｂ３−３’ＩＴＲ（Ｉ）、の配列を含むアデノウイルスであって、ＢＹが、ＦＡＰ−ＢｉＴＥ、ＣＸＬ１０、ＣＸＬ９、およびＩＦＮをそれぞれコードする４つの導入遺伝子を含有する導入遺伝子カセットを含む、前記アデノウイルス。本開示はまた、前記ウイルスを含む医薬組成物も包含し、前記ウイルスまたは製剤の使用が治療となる。【選択図】  図１
2020531032.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）の配列を含むアデノウイルスであって、
５’ＩＴＲ−Ｂ１−ＢＡ−Ｂ２−ＢＸ−ＢＢ−ＢＹ−Ｂ３−３’ＩＴＲ（Ｉ）
式中、
Ｂ１は結合であるか、Ｅ１Ａ、Ｅ１ＢまたはＥ１Ａ−Ｅ１Ｂを含み；
ＢＡは−Ｅ２Ｂ−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３−Ｅ２Ａ−Ｌ４を含み；
Ｂ２は結合であるか、Ｅ３を含み；
ＢＸは結合であるか、制限酵素認識部位、１もしくは複数の導入遺伝子、またはその両方を含むＤＮＡ配列であり；
ＢＢはＬ５を含み；
ＢＹは、ＦＡＰ−ＢｉＴＥ、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ９、およびＩＦＮをそれぞれコードする４つの導入遺伝子を含有する導入遺伝子カセットを含み；
Ｂ３は結合であるか、Ｅ４を含む、
前記アデノウイルス。
【請求項２】
前記コードされたＦＡＢ−ＢｉＴＥが、配列番号５、またはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列（配列番号５など）、に示される抗ＣＤ３を含む、請求項１に記載のアデノウイルス。
【請求項３】
前記ＦＡＰ−ＢｉＴＥが、配列番号９、またはそれ対して少なくとも９５％の同一性を有する配列（配列番号９など）、に示される抗ＦＡＰを含む、請求項１または請求項２に記載のアデノウイルス。
【請求項４】
前記コードされたＦＡＢ−ＢｉＴＥが、配列番号７５、配列番号７６、またはそのうちのいずれか１つに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、から選択される配列を含む、請求項１に記載のアデノウイルス。
【請求項５】
前記導入遺伝子カセットが、配列番号１００、またはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列（配列番号１００など）、に示されるＣＸＣＬ１０をコードする、請求項１〜４のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
【請求項６】
前記導入遺伝子カセットが、配列番号９９、またはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列（配列番号９９など）、に示されるＣＸＣＬ９をコードする、請求項１〜５のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
【請求項７】
前記導入遺伝子カセットが、配列番号９８、またはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列（配列番号９８など）、に示されるＩＦＮαをコードする、請求項１〜６のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
【請求項８】
各前記導入遺伝子が機能的に連結されている、請求項１〜７のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
【請求項９】
各前記導入遺伝子が３つの異なる高効率自己開裂型ペプチドで隔てられている、請求項１〜８のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
【請求項１０】
前記各自己開裂型ペプチドが独立してＥ２Ａ、Ｆ２Ａ、Ｐ２Ａ、およびＴ２Ａから選択される、請求項９に記載のアデノウイルス。
【請求項１１】
Ｌ５からＥ４までの各前記導入遺伝子の相対的順序が、例えば図ＸＣに示すように、ＦＡＰ−ＢｉＴＥ、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ９、およびＩＦＮαである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
【請求項１２】
前記導入遺伝子カセットが、配列番号９５に示されるポリヌクレオチド配列、または同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、特に配列番号９５、を有する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
【請求項１３】
配列番号８４を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
【請求項１４】
複製適格性である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
【請求項１５】
腫瘍溶解性である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
【請求項１６】
Ａｄ１１由来のヘキソンおよびファイバーを有する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載のアデノウイルス、および賦形剤、希釈剤、または担体、を含む医薬組成物。
【請求項１８】
治療用、例えばがん治療用の、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のアデノウイルス、または請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載のアデノウイルスまたは請求項１７に記載の医薬組成物を投与することを含む、患者を治療する方法。
【請求項２０】
がん治療用の医薬の製造のための、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のアデノウイルス、または請求項１７に記載の医薬組成物、の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、ＦＡＰ−ＢｉＴＥを搭載した、改変アデノウイルス、特にＥｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ（ＥｎＡｄ）、の組成物、例えば前記アデノウイルスを含む医薬製剤、並びに、前記ウイルスおよびウイルス製剤の、特に治療における、具体的にはがん治療における使用、に関する。本開示はまた、前記ウイルスおよびＦＡＰ−ＢｉＴＥをコードするＤＮＡを作製するための方法も包含する。本開示はまた、本明細書における技術開示と併せて、配列表に記載された新規配列も包含し、例えば、前記技術開示では、例示されたウイルスは、配列表に記載される代替カセットまたは代替ウイルスなどと置換される。
【背景技術】
【０００２】
がんは、社会にとって、患者やその家族の苦労や苦痛の面から、また、患者の治療、ケア、およびサポートの財務コストが高いという点から、未だ極めて大きな社会的負担となっている。
【０００３】
がん細胞の周囲の間質は、腫瘍と戦うために送られてきた免疫細胞をトラップするように働く場合があり、故に物理的な保護となっている。さらに間質は、腫瘍の成長に許容的であり最適でもある、腫瘍の低酸素微小環境を遮蔽する。間質内の細胞が腫瘍のエネルギー源であるという学説もいくつか存在する。
【０００４】
腫瘍間質の大型の構成要素として、がんの目的に適うように損なわれた、線維芽細胞がある。間質に浸潤する他の細胞として、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）があり、これは、免疫応答を抑制するＩＬ−１０などのサイトカインおよびケモカインを分泌することにより腫瘍成長を促進し得る２型（Ｍ２）マクロファージである。
【０００５】
腫瘍間質の標的化は特に難しく、というのも、その環境を構成している細胞が「ネイティブ」な免疫細胞や結合組織細胞であり、これらは体中に存在するためである。すなわち、治療薬によるこれらの細胞の標的化は深刻な非特異的な作用を引き起こす可能性がある。
【０００６】
そのため、最大の治療効果を達成できる、特に間質線維芽細胞に取り囲まれた腫瘍細胞への送達を達成できる、ＢｉＴＥを腫瘍細胞に直接送達するように改善された方法が求められている。
【０００７】
共に参照によって本明細書に援用される国際公開第２０１８／０４１８３８号および同第２０１８／０４１８２７号は、ＢＩＴＥをコードするある特定のアデノウイルスを開示している。しかしながら、活性化サイトカインの組込みにより、このウイルスにコードされたＢｉＴＥの活性を増強することが、有用となることであろう。ＢｉＴＥにごく近接させて２種類のサイトカインを組み込むことは、さほどの困難もなく達成できる。しかし、３種類のサイトカインをＢｉＴＥにごく近接させて配置させた場合、各遺伝子の性質がＢｉＴＥの発現に対し影響し始める。本発明者らは、図１に示される、４種類の導入遺伝子を有するウイルスＮＧ−６１５を作製した。しかしながら、ＢｉＴＥの発現が減少してしまった。驚くべきことに、これらのサイトカインのうち２種を変更した（ＮＧ−６１５との比較）ＮＧ−６４１ウイルスは、良好なＢｉＴＥ発現をはじめとする良好な活性を示した。すなわち、これら４種の導入遺伝子が一緒になることで、ウイルス中に同時に存在することに適合性になると考えられる。
【０００８】
請求の範囲に記載されている発明は、ファイバー、Ｌ５、およびＥ４領域の間に共同配置された、この４種類の導入遺伝子を収容したウイルスに関する。
【発明の概要】
【０００９】
以下の各項目は本開示の概要である：
１．
式（Ｉ）の配列を含むアデノウイルスであって、
５’ＩＴＲ−Ｂ１−ＢＡ−Ｂ２−ＢＸ−ＢＢ−ＢＹ−Ｂ３−３’ＩＴＲ（Ｉ）
式中、
Ｂ１は結合であるか、Ｅ１Ａ、Ｅ１ＢまたはＥ１Ａ−Ｅ１Ｂを含み；
ＢＡは−Ｅ２Ｂ−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３−Ｅ２Ａ−Ｌ４を含み；
Ｂ２は結合であるか、Ｅ３を含み；
ＢＸは結合であるか、制限酵素認識部位、１もしくは複数の導入遺伝子、またはその両方を含むＤＮＡ配列であり；
ＢＢはＬ５を含み；
ＢＹは、ＦＡＰ−ＢｉＴＥ、ＣＸＬ１０、ＣＸＬ９、およびＩＦＮをそれぞれコードする４つの導入遺伝子を含有する導入遺伝子カセットを含み；
Ｂ３は結合であるか、Ｅ４を含む、
前記アデノウイルス。
２．
前記コードされたＦＡＢ−ＢｉＴＥが、配列番号５、またはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列（配列番号５など）、に示される抗ＣＤ３を含む、項目１に記載のアデノウイルス。
３．
前記ＦＡＰ−ＢｉＴＥが、配列番号９、またはそれ対して少なくとも９５％の同一性を有する配列（配列番号９など）、に示される抗ＦＡＰを含む、項目１または項目２に記載のアデノウイルス。
４．
前記コードされたＦＡＢ−ＢｉＴＥが、配列番号７５、配列番号７６、またはそのうちのいずれか１つに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、から選択される配列を含む、項目１に記載のアデノウイルス。
５．
前記導入遺伝子カセットが、配列番号１００、またはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列（配列番号１００など）、に示されるＣＸＬ１０をコードする、項目１〜４のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
６．
前記導入遺伝子カセットが、配列番号９９、またはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列（配列番号９９など）、に示されるＣＸＣＬ９をコードする、項目１〜５のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
７．
前記導入遺伝子カセットが、配列番号９８、またはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列（配列番号９８など）、に示されるＩＦＮαをコードする、項目１〜６のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
８．
各前記導入遺伝子が機能的に連結されている、項目１〜７のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
９．
各前記導入遺伝子が３つの異なる高効率自己開裂型ペプチドで隔てられている、項目１〜８のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
１０．
前記各自己開裂型ペプチドが独立してＥ２Ａ、Ｆ２Ａ、Ｐ２Ａ、およびＴ２Ａから選択される、項目９に記載のアデノウイルス。
１１．
Ｌ５からＥ４までの各前記導入遺伝子の相対的順序が、例えば図１のＮＧ−６４１に示すように、ＦＡＰ−ＢｉＴＥ、ＣＸＬ１０、ＣＸＬ９、およびＩＦＮαである、項目１〜１０のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
１２．
前記導入遺伝子カセットが、配列番号９５に示されるポリヌクレオチド配列、または同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、特に配列番号９５、を有する、項目１〜１１のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
１３．
配列番号８４を含む、項目１〜１２のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
１４．
複製適格性である、項目１〜１３のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
１５．
腫瘍溶解性である、項目１〜１４のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
１６．
Ａｄ１１由来のヘキソンおよびファイバーを有する、項目１〜１５のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
１７．
項目１〜１６のいずれか一項に記載のアデノウイルス、および賦形剤、希釈剤、または担体、を含む医薬組成物。
１８．
治療用、例えばがん治療用の、項目１〜１６のいずれか一項に記載のアデノウイルス、または項目１７に記載の医薬組成物。
１９．
項目１〜１６のいずれか一項に記載のアデノウイルスまたは項目１７に記載の医薬組成物を投与することを含む、患者を治療する方法。
２０．
がん治療用の医薬の製造のための、項目１〜１６のいずれか一項に記載のアデノウイルス、または項目１７に記載の医薬組成物、の使用。
【００１０】
１つの実施形態では、本開示に係るＢｉＴＥ（複数可）は、膜貫通領域を含まないため、がん細胞表面上には発現されず、ウイルスに感染されたがん細胞からのＢｉＴＥ分子の放出を促すためのシグナル配列を含む。
【００１１】
１つの実施形態では、前記導入遺伝子カセットは、内在性プロモーター、例えば主要後期プロモーター（major later promoter）、の制御下にある。
【００１２】
有利な点として、本発明者らは、アデノウイルスにＢｉＴＥ分子を搭載し、この二重特異性抗体フラグメント分子に、アデノウイルスのがん細胞に選択的に感染する能力に「便乗」させることにより、ＢｉＴＥを腫瘍細胞に標的化送達することが可能となることを見出した。
【００１３】
有利な点として、ＢｉＴＥは小型であり、哺乳類細胞で産生することができる。そのため、本開示のアデノウイルスが感染すると、前記ＢｉＴＥ分子が腫瘍細胞によって合成、分泌されて、局所的に作用し、当該ウイルスの直の足跡を超えて広がることができる。これにより、ＢｉＴＥの直接の感染部位以外への拡散が可能となるが、同時に、感染された腫瘍細胞部位から遠く離れ過ぎたウイルスの拡散は制限される。これにより、好ましくない非特異的な作用のリスクが最小限となる。
【００１４】
１つの実施形態では、前記アデノウイルスはＥｎＡｄである。ＥｎＡｄは、他のアデノウイルスプラットフォーム（例えばＡｄ５ベースのプラットフォーム）と比較して、腫瘍溶解活性が増強されていることが示されている。ＥｎＡｄはまた、結腸がん細胞、肺がん細胞、膀胱がん細胞、および腎がん細胞など、ヒト上皮由来癌細胞に対して高い選択性を有することが示されている。このことは、ＥｎＡｄをＢｉＴＥ分子の送達用担体として理想的なものとしており、というのも、Ｔ細胞をＢｉＴＥ分子で活性化して標的細胞を攻撃させると同時に、ＥｎＡｄをがん細胞に感染させ溶解させることができるためである。これは、相乗的な腫瘍溶解効果を発揮する腫瘍に対する２面攻撃をもたらす。
【００１５】
１つの実施形態では、前記ＢｉＴＥの抗ＣＤ３成分は、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、およびＣＤ３δから選択される抗原、特にＣＤ３ε、に対し選択的である。
【００１６】
ＦＡＰは腫瘍間質抗原である。有利な点として、これらの抗原を発現する間質細胞（非形質転換細胞）は、形質転換細胞と同じレベルの変異−抵抗性−選択プロセスを受けない。すなわち、これらの細胞は、「動く標的（moving target）」ではないため、がん治療の標的とし易く、さらに、多くの場合で、間質細胞に存在する受容体の種類は様々な種類のがんの間で共通している場合が多い。そのため、ＦＡＰの標的化は、複数種類のがんに対して有効である可能性が高い。
【００１７】
有利な点として、ＦＡＰは、腫瘍関連線維芽細胞上でアップレギュレートされている。線維芽細胞は、成長、浸潤、および治療介入からの回復を支持する、固形癌の重要な要素である。線維芽細胞は通例、進行癌に含まれる細胞の４０〜６０％を構成する。有利な点として、線維芽細胞は、がん細胞と比べて、治療を回避することが少ない遺伝的に安定な細胞である。活性化型の線維芽細胞も、様々な種類の腫瘍の間で比較的類似している。そのため、本開示のアデノウイルスは、Ｔ細胞を活性化させ、ＦＡＰを発現する腫瘍関連線維芽細胞を標的とさせそれを殺滅させることによって、ＩＬ−１０、ＴＧＦβ、およびＩＤＯが介在する経路など、一連の免疫抑制経路を減弱するのに役立ち得る。
【００１８】
１つの実施形態では、ＢＸは結合ではない。
【００１９】
１つの実施形態では、前記アデノウイルスはキメラである。１つの実施形態では、前記アデノウイルスは腫瘍溶解性である。１つの実施形態では、前記アデノウイルスはキメラであり、且つ腫瘍溶解性である。１つの実施形態では、前記アデノウイルスは複製可能（replication capable）である。１つの実施形態では、前記アデノウイルスはキメラであり、腫瘍溶解性であり、且つ複製可能である。１つの実施形態では、前記アデノウイルスは複製適格性（replication competent）である。別の実施形態では、前記アデノウイルスはキメラであり、腫瘍溶解性であり、且つ複製適格性である。１つの実施形態では、前記アデノウイルスは複製能を欠損しており、すなわちベクターである。
【００２０】
１つの実施形態では、ＢＸは、導入遺伝子または導入遺伝子カセット、特にＢｉＴＥをコードする導入遺伝子カセット、を含む。１つの実施形態では、前記さらなる導入遺伝子は、外来性プロモーター（ＣＭＶプロモーター１など）の制御下にある。
【００２１】
外来性プロモーターは、前記抗体またはフラグメントを強く恒常的に発現でき、患者が非常に広範囲ながんを有する場合など、状況によっては特に有用となる場合があるため、外来性プロモーターの採用はいくつかの実施形態で有益である場合がある。有利な点として、恒常的な外来性プロモーターの使用は、特定の状況で望ましい場合がある導入遺伝子の持続的な転写をもたらす。
【００２２】
１つの実施形態では、前記導入遺伝子カセットは、例えばコード配列の最初に、特に導入遺伝子カセットのＬ５の最後に、コザック配列を含む。
【００２３】
１つの実施形態では、前記導入遺伝子カセットは、例えばその配列の最後に、特に導入遺伝子カセットのＥ４領域の最後に、ポリアデニル化配列をさらに含む。
【００２４】
１つの実施形態では、前記導入遺伝子カセットは、ＮＧ−６４１ウイルスなど、図１に示される配置を有する。
【００２５】
１つの実施形態では、前記ＢｉＴＥ分子は半減期が短く、例えば４８時間以下である。
【００２６】
１つの実施形態では、前記アデノウイルスは１つのみのＢｉＴＥを含有する。
【００２７】
別の実施形態では、前記アデノウイルスは、２つのＢｉＴＥを含有する。
【００２８】
１つの実施形態では、前記ＦＡＰ−ＢｉＴＥは、配列番号１１に記載のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＶＨドメインを含む。
【００２９】
１つの実施形態では、前記ＦＡＰ−ＢｉＴＥは、配列番号１０に記載のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＶＬドメインを含む。
【００３０】
１つの実施形態では、前記ＦＡＰ−ＢｉＴＥの抗ＣＤ３部分は、配列番号６に記載のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＶＨドメインを含む。
【００３１】
１つの実施形態では、前記ＦＡＰ−ＢｉＴＥの抗ＣＤ３部分は、配列番号７に記載のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＶＬドメインを含む。
【００３２】
１つの実施形態では、本開示のアデノウイルスは、配列番号３４もしくは配列番号３５に記載の配列、または同一のｓｃＦｖアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、を含み、特に配列番号３４を含む。
【００３３】
１つの実施形態では、本開示のアデノウイルスは、配列番号６８に記載の配列、配列番号６９に記載の配列、または同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、を含む。
【００３４】
１つの実施形態では、本開示のアデノウイルスは、配列番号９０に記載の配列、または同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、を含む。
【００３５】
１つの実施形態では、本開示のアデノウイルスは、配列番号９１に記載の配列、または同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、を含む。
【００３６】
１つの実施形態では、本開示のアデノウイルスは、配列番号９２に記載の配列、または同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、を含む。
【００３７】
当業者には承知のとおり、ＤＮＡのコードには重複性（reduncy）があるため、本開示は、本明細書で開示されるアミノ酸を有するＢｉＴＥをコードするＥｎＡｄまたはＡｄ１１も包含する
【００３８】
Ｃ末端のＨｉｓアフィニティータグ（１０Ｈｉｓタグまたは６Ｈｉｓタグなど）は、ＢｉＴＥまたはアデノウイルスの精製に有用である。しかし、Ｃ末端のＨｉｓアフィニティータグは任意であり、最終産物などには含まれていなくてもよい。当業者には承知の通り、ＢｉＴＥまたはアデノウイルスの生物学的機能に影響を与えない範囲で、１０Ｈｉｓ以外の他のアフィニティータグを使用することができ、同様に含まれていなくてもよい。
【００３９】
従って、１つの実施形態では、前記ＢｉＴＥは、配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むが、その配列のＣ末端の最後にＨｉｓアフィニティータグを含んでいない（配列番号６１または配列番号６２など）。
【００４０】
１０Ｈｉｓアフィニティータグを含まないことは、１０Ｈｉｓアフィニティータグを含む、本明細書で開示される他の全ての配列にまでさらに及び、すなわち、本開示はＣ末端Ｈｉｓタグを持たない同一のアミノ酸またはＤＮＡ配列を包含する。
【００４１】
１つの態様において、本明細書に記載のアデノウイルスと、希釈剤または担体と、を含む組成物が提供される。
【００４２】
１つの態様において、治療有効量の本明細書に記載のアデノウイルスまたは組成物を投与することを含む、患者を治療する方法が提供される。
【００４３】
１つの実施形態では、前記方法は、がん、例えば上皮がん、特に固形腫瘍、を治療するための方法である。
【００４４】
１つの実施形態では、チェックポイント阻害剤（ＰＤ−１阻害剤またはＰＤＬ１阻害剤など）と組み合わせて、本開示のウイルスを投与することを含み、特には前記チェックポイント阻害剤が前記ウイルスにコードされている、方法が提供される。
【００４５】
１つの実施形態では、チェックポイント阻害剤（例えば、ＰＤ−１阻害剤またはＰＤＬ１阻害剤などの本明細書の他の場所に列挙されるようなチェックポイント阻害剤）と組み合わせずに、本開示のウイルスを投与することを含み、特には前記チェックポイント阻害剤が前記ウイルスにコードされていない、方法が提供される。
【００４６】
本開示のウイルスにコードされたＢｉＴＥは、当該ウイルスの細胞傷害性を増強できる。
【００４７】
驚くべきことに、本開示のウイルスにコードされたＢｉＴＥは、腫瘍の液体環境（腹水など）内のＴ細胞をはじめとする、腫瘍の抑制的環境内の細胞などであっても、ＣＤ４＋細胞および／またはＣＤ８＋細胞を活性化することができる。
【００４８】
有利な点として、本開示のウイルスにコードされたＢｉＴＥは、腫瘍の液体環境（腹水など）内のＴ細胞をはじめとする、腫瘍の抑制的環境内のＴ細胞などであっても、細胞傷害性Ｔ細胞を活性化することができる。
【００４９】
さらなる驚くべき点として、本開示のウイルスにコードされたＢｉＴＥは、Ｔ細胞の増殖を刺激（活性化）することが可能である。
【００５０】
本開示のＢｉＴＥをコードするウイルスは、腫瘍の免疫抑制的微小環境を回避、克服、または逆行させることができると思われる。
【００５１】
１つの実施形態では、Ｔ細胞の活性化は、Ｔ細胞マーカー（例えばＣＤ２５）のアップレギュレーションをもたらす。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
免疫細胞とは、本明細書で使用される場合、免疫系で機能的役割を果たす細胞であり、例えば、マクロファージ、好中球、樹状細胞、ＮＫ細胞、Ｔリンパ球（特に、Ｔ細胞およびＮＫＴ細胞）などのリンパ球が挙げられるが、これらに限定はされない。
【００５３】
抗原結合部位とは、本明細書で使用される場合、当該分子の部分であって、一対の可変領域、特に標的抗原と特異的に相互作用するコグネイトな対、を含む部分を指す。
【００５４】
具体的には、本明細書で用いられる場合、特異的な抗原のみを認識する結合部位、または、非特異的な抗原に対する親和性と比較して、特異的な抗原に対して顕著により高い結合親和性、例えば５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍高い結合親和性、を示す結合部位、を指すことが意図される。親和性はＢＩＡｃｏｒｅなどの技術によって測定することができる。
【００５５】
二重特異性抗体分子とは、本明細書で使用される場合、同じまたは異なる抗原と結合し得る２つの抗原結合領域を有する分子を指す。ＢｉＴＥは二重特異性抗体分子のサブクラスである。
【００５６】
ＢｉＴＥとは、本明細書で使用される場合、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー、特には抗ＣＤ３結合ドメインと、さらなる結合ドメイン、この場合では抗ＦＡＰ結合ドメインとを含む、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーを指す。通常、これらの結合ドメインはｓｃＦｖの形態をとる。ＢｉＴＥを図１２に図示する。
【００５７】
すなわち、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）とは、本明細書で使用される場合、異なる抗体の２つのｓｃＦｖ、または約５５ＫＤａの一本鎖ペプチド上の４つの異なる遺伝子由来のアミノ酸配列を含む、人工の二重特異性モノクローナル抗体の一種を指す。これらのｓｃＦｖの一方が、Ｔ細胞表面に発現されたＣＤ３受容体などの、Ｔ細胞抗原など、免疫細胞に対して特異的である。他方のｓｃＦｖは、従来技術では、通例、腫瘍特異的な分子を介して腫瘍細胞に結合する。従って、ＢｉＴＥは、Ｔ細胞上の抗原に対する特異性および腫瘍細胞上の抗原に対する特異性によって、Ｔ細胞と腫瘍細胞との間に連結を形成することができる。これが、ＭＨＣ  Ｉまたは共刺激分子とは独立に、Ｔ細胞の活性化をもたらし、腫瘍細胞に対する細胞傷害性効果をＴ細胞に発揮させる。
【００５８】
１つの実施形態では、前記Ｔ細胞エンゲージャーは、例えば本明細書で開示されるリンカー配列から独立して選択されるリンカーを用いて、ＶＬ１−リンカー１−ＶＨ１−リンカー２−ＶＨ２−リンカー３−ＶＬ２のフォーマットで配置される。
【００５９】
１つの実施形態では、前記ＢｉＴＥリンカーは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０アミノ酸長など、１０〜３０アミノ酸長の範囲をとる、例えば本明細書で開示されるリンカーである。
【００６０】
間質または間質抗原とは、本明細書で使用される場合、間質中の治療標的となる抗原を指し、例えば、間質マトリックスの分子構造内に発現された抗原、例えば、結合組織分子、もしくは間質マトリックスと関連した分子、または、間質の細胞成分と関連した抗原、例えば、間質に浸潤した、線維芽細胞上、腫瘍関連マクロファージ上、樹状細胞上、ＮＫ細胞上および／もしくはＴ細胞上に発現した抗原、が挙げられる。間質抗原の例としては、ＦＡＰ、ＴＧＦβ、ＴＲＥＭ１、ＩＧＦＢＰ７、ＦＳＰ−１、線維芽細胞関連抗原、ＮＧ２、エンドシアリン（ＣＤ２４８）、血小板由来増殖因子受容体α（ＰＤＧＦＲ−α）、血小板由来増殖因子受容体β（ＰＤＧＦＲ−β）、およびビメンチンが挙げられるが、これらに限定はされない。通常、間質抗原はがん細胞上には発現されず、すなわち、間質細胞上のみに発現される。
【００６１】
線維芽細胞は、抗原として線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）を用いることで、特にＦＡＰに特異的であるがＣＤ２６とは結合しない抗体によって、標的化され得る（参照によって本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１２／０２５８１１９号を参照）。
【００６２】
ＦＡＰは元々、反応性の間質線維芽細胞上のセリンプロテアーゼとして特定された。その後の分子クローニングにより、ＦＡＰが、メラノーマ細胞株によって発現される１７０ｋＤａの膜結合型ゼラチナーゼである、セプラーゼと同一であることが明らかとなった。完全長ｃＤＮＡは、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）と高い相同性を有し、配列全体にわたってのアミノ酸同一性が５２％であり、触媒ドメインにおける同一性が７０％に近い、７６０個のアミノ酸（ａａ）からなるＨ型膜貫通プロテアーゼをコードしていた。米国特許第５，５８７，２９９号（参照によって本明細書に援用される）は、ＦＡＰをコードする核酸分子と、その応用を記載している。
【００６３】
要約すると、ＦＡＰは、そのプロテアーゼ活性と、他の細胞表面分子と複合体を形成するその能力との組み合わせを通じて、細胞依存的にその生物学的機能を発揮する多機能性タンパク質として認知されている。上皮細胞株および線維芽細胞株上のＦＡＰの過剰発現は悪性挙動を促し、これは、ＦＡＰの細胞発現レベルが臨床成績の悪化と相関するという臨床状況を示唆している。
【００６４】
パラクリン型シグナル伝達分子を通じて、がん細胞が、間質線維芽細胞を活性化し、ＦＡＰの発現を誘導し、このＦＡＰが、これらのがん細胞の増殖、浸潤、および転移に影響を与える。最近の研究によって、ＴＧＦ−βがＦＡＰタンパク質発現の促進において支配的な因子であることが明らかにされた（Chen, H et al (2009) Exp and Molec Pathology, doi: 10.1016/j.yexmp. 2009.09.001）。ＦＡＰは、乳房、肺、結腸直腸、および卵巣のヒト上皮癌を含む、ヒト上皮癌の９０％において、反応性間質線維芽細胞上に大量に発現される（Garin-Chesa, P et al (1990) PNAS USA 87: 7236-7239）。最近になって、Ｃｈｅｎらにより、ＦＡＰαがＨＯ−８９１０ＰＭ卵巣がん細胞の浸潤、増殖、および転移に影響していることが示された（Chen, H et al (2009) Exp and Molec Pathology, doi: 10.1016/j.yexmp. 2009.09.001）。
【００６５】
ＦＡＰの標的化は、ＦＡＰ抗原を生体関連分子と結合させ、ＦＡＰの相互作用を立体的に遮断することにより行われ得る。あるいは、またはさらに、ＦＡＰ分子を別のＦＡＰ分子または異なる分子と（例えばＴ細胞に）架橋結合することにより標的化され得る。この架橋結合により、ＦＡＰを有する細胞の、免疫系への注目度が高まり、免疫系が活性化されてＦＡＰを有する細胞が中性化または破壊され得る。
【００６６】
本開示のアデノウイルスは腫瘍細胞に感染する能力を有し、特に、腫瘍細胞に優先的に感染するように選択される。腫瘍溶解性ウイルスの感染は、がん細胞の死滅および溶解を引き起こし、新たに産生されたウイルス粒子の放出が伴う。ＢｉＴＥおよびサイトカインなどの、組み込まれた導入遺伝子は、細胞内で合成され、当該腫瘍細胞によりそれが死ぬまで活発に分泌される。また、いくつかの分子が細胞溶解の際に放出されることになる。
【００６７】
半減期が短いＢｉＴＥなどの抗体分子は、分子が全身循環となった場合に、身体がこの分子を迅速に除去するため、この分子による非特異的な作用が最低限に少なくなるため、本開示での使用に特に好適であり得る。
【００６８】
すなわち、本開示のアデノウイルスは、腫瘍間質を徐々に弱らせる間接的機序を含む、少なくとも２または３つの腫瘍攻撃機序を有する。
【００６９】
導入遺伝子とは、本明細書で用いられる場合、ウイルスにとって非天然（外来性）の、またはウイルスのその特定の部位には通常存在しない遺伝子である、ゲノム配列に挿入された遺伝子を指す。導入遺伝子の例は当該技術分野において公知であり、本明細書で説明されている。導入遺伝子は、本明細書で用いられる場合、挿入された場合に完全長遺伝子の機能または機能の大部分の実行に好適な、遺伝子の一部である、遺伝子の機能性フラグメントも包含する。
【００７０】
本明細書において、文脈上別の意味であることが明らかでない限り、導入遺伝子およびコード配列は、ウイルスゲノムへのインサートの文脈においては同義的に使用される。コード配列とは、本明細書で用いられる場合、例えば、機能的なＲＮＡ、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードするＤＮＡ配列を意味する。通例、コード配列は、目的の機能的なＲＮＡ、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする導入遺伝子のｃＤＮＡである。目的の機能的なＲＮＡ、ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質については以下で説明する。
【００７１】
ウイルスゲノムがＤＮＡのコード配列を含有することは明確である。ウイルスのゲノム配列内の内在性遺伝子（天然遺伝子）は、それらが非天然の位置または非天然の環境に存在するように、組換え技術によって改変されていない限り、本明細書の文脈の中では、導入遺伝子と見なされない。
【００７２】
１つの実施形態では、導入遺伝子とは、本明細書で用いられる、ある生物から単離され、異なる生物、すなわち本開示のウイルス、に導入された、遺伝子を含有するＤＮＡまたはｃＤＮＡ配列のセグメントを指す。１つの実施形態では、この外来のＤＮＡセグメントは、機能的なＲＮＡ、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を生産する能力を保持し得る。
【００７３】
すなわち、１つの実施形態では、挿入された導入遺伝子は、ヒトのまたはヒト化された、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドをコードする。
【００７４】
機能的に連結されたとは、本明細書で用いられる場合、導入遺伝子を機能的とするために、すなわち、ウイルスが細胞内部に入ったとき細胞機構を利用して導入遺伝子を発現させるために、必要な調節エレメントを導入遺伝子が伴っていることを指す。
【００７５】
１または複数の実施形態において、前記カセットは、１または複数の図面または実施例に示されているように配置される。
【００７６】
導入遺伝子カセットとは、本明細書で用いられる場合、１または複数のコード配列および１または複数の調節エレメントの形で、１または複数の導入遺伝子をコードするＤＮＡ配列を指す。
【００７７】
導入遺伝子カセットは、１または複数の単シストロン性ｍＲＮＡ配列および／または多シストロン性ｍＲＮＡ配列をコードし得る。
【００７８】
１つの実施形態では、導入遺伝子または導入遺伝子カセットは、単シストロン性または多シストロン性のｍＲＮＡをコードしており、例えば、前記カセットは、内在性プロモーターまたは外来性プロモーターまたはそれらの組み合わせの制御下にある位置における、アデノウイルスゲノムへの挿入に好適である。
【００７９】
単シストロン性ｍＲＮＡとは、本明細書で用いられる場合、単一の機能的なＲＮＡ、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を指す。
【００８０】
１つの実施形態では、前記導入遺伝子カセットは単シストロン性ｍＲＮＡをコードする。
【００８１】
１つの実施形態では、単シストロン性ｍＲＮＡをコードするカセットの文脈における導入遺伝子カセットは、外来性プロモーター（導入遺伝子がどこで、いつ活性となるかを決定する制御配列）またはスプライス部位（ｍＲＮＡ分子がスプライソソームによっていつ切断されるかを決定する制御配列）、ポリＡシグナル配列および転写終結配列を所望により含有する、通常は目的タンパク質のｃＤＮＡ由来のコード配列（すなわち、導入遺伝子）を所望により含有する、ＤＮＡのセグメントを意味する。
【００８２】
１つの実施形態では、前記導入遺伝子カセットは、１または複数の多シストロン性ｍＲＮＡ配列をコードし得る。
【００８３】
多シストロン性ｍＲＮＡとは、本明細書で用いられる場合、２以上の機能的なＲＮＡ、ペプチド、もしくはタンパク質、またはそれらの組み合わせをコードするｍＲＮＡ分子を指す。１つの実施形態では、前記導入遺伝子カセットは多シストロン性ｍＲＮＡをコードする。
【００８４】
１つの実施形態では、多シストロン性ｍＲＮＡをコードするカセットの文脈における導入遺伝子カセットは、外来性プロモーター（導入遺伝子がどこで、いつ活性となるかを決定する制御配列）またはスプライス部位（ｍＲＮＡ分子がスプライソソームによっていつ切断されるかを決定する制御配列）、例えば各コード配列がＩＲＥＳまたは２Ａペプチドのいずれかによって分離されている、通常は目的タンパク質または目的ペプチドのｃＤＮＡ由来の２以上のコード配列（すなわち、導入遺伝子）を所望により含有する、ＤＮＡのセグメントを意味する。最後に転写されるコード配列の後に、前記カセットは、ポリＡ配列および転写終結配列を所望により含有していてもよい。
【００８５】
１つの実施形態では、前記導入遺伝子カセットは、単シストロン性ｍＲＮＡの後に多シストロン性ｍＲＮＡをコードしている。別の実施形態では、前記導入遺伝子カセットは、多シストロン性ｍＲＮＡの後に単シストロン性ｍＲＮＡをコードしている。
【００８６】
１つの実施形態では、前記アデノウイルスはヒトアデノウイルスである。「アデノウイルス」、「血清型」、または「アデノウイルス血清型」とは、本明細書で用いられる場合、亜群Ａ〜Ｆに分類される、５０を超える現在既知のアデノウイルス血清型のいずれかに割り当てることができる、あらゆるアデノウイルスを指し、さらに、現在のところ未同定または未分類のいかなるアデノウイルス血清型も包含する。表１に示され、例えば、Strauss, "Adenovirus infections in humans," in The Adenoviruses, Ginsberg,  ea., Plenum Press, New York, NY, pp. 451-596 (1984)、およびShenk, "Adenoviridae: The Viruses and Their Replication," in Fields Virology,  Vol.2, Fourth Edition,  Knipe, 35ea., Lippincott Williams  & Wilkins,  pp. 2265-2267 (2001)、を参照されたい。
【００８７】
【表１】
2020531032.tif 000003
【００８８】
１つの実施形態では、本開示のアデノウイルスは、亜群Ｂのウイルス、すなわちＡｄ１１、特にＡｄ１１ｐ（Ｓｌｏｂｉｔｓｋｉ株）、およびその派生物、例えばＥｎＡｄ、である。アデノウイルスは、ヘキソンおよび／またはファイバーなどのカプシドに基づいて群／血清型に割り当てられている。
【００８９】
１つの実施形態では、本開示のアデノウイルスは、Ａ群、Ｃ群、Ｄ群、Ｅ群、およびＦ群ウイルスのいずれでもない。本開示のウイルスはアデノウイルス死タンパク質（adenovirus death protein）を含まない。
【００９０】
１つの実施形態では、本開示のアデノウイルスはキメラアデノウイルスである。アデノウイルスがキメラである場合、外側のカプシドの特徴が血清型の決定に使用されることになる。キメラとは、本明細書で用いられる場合、ウイルスが、同一群内の異なる血清型を含む、少なくとも２つの異なるウイルス血清型由来の、ＤＮＡを含むことを指す。
【００９１】
１つの実施形態では、前記腫瘍溶解性ウイルスは、同一血清型、例えばＡｄ１１、特にＡｄ１１ｐ、に由来する、例えば、そのゲノム配列の３０８１２位〜３１７８９位、１８２５４位〜２１１００位、および１３６８２位〜１５３６７位に存在する（これらのヌクレオチド位置はＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：２１７３０７３９９（受入番号：ＧＣ６８９２０８）に対してのヌクレオチド位置である）、ファイバータンパク質、ヘキソンタンパク質、およびペントンタンパク質を有する。
【００９２】
１つの実施形態では、前記アデノウイルスはＥｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ（別名はＥｎＡｄ、以前はＥｎＡｄ）である。Ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖとは、本明細書で用いられる場合、配列番号２８のキメラアデノウイルスを指す。Ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖは、野生型アデノウイルスと比較して治療特性が増強されている、複製適格性の腫瘍溶解性キメラアデノウイルスである（ＷＯ２００５／１１８８２５参照）。ＥｎＡｄは、Ａｄ１１ｐおよびＡｄ３由来のＤＮＡと、Ｅ３／Ｅ４の欠失とを特徴とする、キメラＥ２Ｂ領域を有している。Ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖにおける構造的変化によって、ゲノムがＡｄ１１ｐよりもおよそ３．５ｋｂ小さくなっており、これにより、導入遺伝子を挿入するための追加の「空間（space）」が与えられている。Ｅ３領域のほぼ全ておよびＥ４領域の一部がＥｎＡｄでは欠失している。従って、Ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖは、生存可能（viable）なままで、追加の遺伝物質を収容するためのかなりの空間をゲノム内に有する。さらに、ＥｎＡｄはＢ亜群のアデノウイルスであるため、ヒトにおいて免疫が既に存在することはＡｄ５などよりもまれである。Ａｄ１１のファイバー、ペントン、およびヘキソンを有するキメラ腫瘍溶解性ウイルスの他の例としては、ＯｖＡｄ１およびＯｖＡｄ２が挙げられる（参照によって援用される、国際公開第２００８／０８０００３号）。すなわち、１つの実施形態では、前記アデノウイルスは、ＯｖＡｄ１またはＯｖＡｄ２に利用された。
【００９３】
ＥｎＡｄは、腫瘍細胞に優先的に感染し、それらの細胞内で急速に複製し、細胞溶解を引き起こすと考えられる。この細胞溶解が、次に、炎症性免疫応答を引き起こして、身体もがんと闘うように刺激し得る。ＥｎＡｄの成功にとって不可欠な要素は、インビボにおけるウイルスの高速複製に関連していると仮定されている。
【００９４】
有利な点として、がん細胞内部で発現が可能なＢｉＴＥなどの特定のタンパク質をコードするＤＮＡをウイルスに搭載することは、例えば、細胞を免疫系に対してより目立たせたり、あるいは、治療用遺伝子／タンパク質を標的腫瘍細胞に優先的に送達したりすることで、身体それ自体の防御力を利用して、より効率的に腫瘍細胞と闘うことが可能となり得る。
【００９５】
導入遺伝子の発現が、ウイルスの複製にも他の有益な特性にも悪影響を及ぼさないことが重要となる。従って、前記１または複数の遺伝子は、ウイルスの複製能および他の有益な特性を損なわない位置に挿入する必要がある。加えて、アデノウイルスのゲノムは密に詰め込まれているため、導入遺伝子を挿入するのに適した位置を見つけることが難しい場合がある。これも、収容できる導入遺伝子のサイズの制限となる。
【００９６】
腫瘍溶解性アデノウイルスとは、本明細書で用いられる場合、がん以外の細胞と比較してがん細胞を優先的に殺滅するアデノウイルスを意味する。１つの実施形態では、前記腫瘍溶解性ウイルスはアポトーシス性である。すなわち、前記腫瘍溶解性ウイルスはプログラム細胞死を促進する。
【００９７】
１つの実施形態では、前記腫瘍溶解性ウイルスは細胞溶解性である。本開示の腫瘍溶解性アデノウイルスの細胞溶解活性を代表的な腫瘍細胞株で測定し、例えばＡｄ５などのＣ亜群に属するアデノウイルスを標準として用いて（すなわち作用強度１が与えられる）、そのデータを作用強度の測定値に変換することができる。細胞溶解活性を測定するのに適した方法はＭＴＳアッセイである（参照によって本明細書に援用される、国際公開第２００５／１１８８２５号の実施例４、図２を参照）。
【００９８】
１つの実施形態では、前記腫瘍溶解性ウイルスは壊死性である。すなわち、前記腫瘍溶解性ウイルスは、細胞の壊死または免疫原性細胞死（immunogenic cell death）を引き起こすか促進する。１つの実施形態では、壊死性細胞死が、患者（宿主）の免疫応答を惹起誘導するため、有利である。
【００９９】
文脈上別の意味であることが明らかでない限り、アデノウイルスとは、本明細書で用いられる場合、複製可能なウイルス（複製適格性ウイルスなど）を指し、また、複製能欠損ウイルスベクターも指す。
【０１００】
複製可能（replication capable）とは、本明細書で用いられる場合、複製適格性ウイルス、または、その複製ががん細胞内の要因、例えばｐ５３などの因子のアップレギュレーション、に依存しているウイルスを指す。
【０１０１】
１つの実施形態では、前記ウイルスは複製適格性である。複製適格性（replication competent）とは、本明細書の文脈においては、インビトロおよびインビボにおいて、細胞内で複製するために必要な機構を全て保持している、すなわちパッケージング細胞株の補助が不要な、ウイルスを指す。例えばＥ１領域に欠失があり、補完的なパッケージング細胞株において複製が可能なウイルスベクターは、本文脈においては、複製適格性ウイルスではない。
【０１０２】
ウイルスベクターは複製能が欠損しているため、複製を可能にするための相補遺伝子の提供を、パッケージング細胞に要求する。
【０１０３】
アデノウイルスゲノムとは、本明細書で用いられる場合、構造タンパク質と、アデノウイルスの機能／生活環に関連する要素とをコードするＤＮＡ配列を意味する。
【０１０４】
現在までに調べられたヒトアデノウイルスゲノムは全て、同じ全体構成を有しており、すなわち、特定の機能をコードする遺伝子がウイルスゲノムの同じ位置に位置している（構造エレメントとも呼ばれる）。ウイルスゲノムの各末端は、逆位末端配列（またはＩＴＲ）として知られている短い配列を有しており、これがウイルス複製に必要となる。ウイルスゲノムは、５種の初期転写ユニット（Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２、Ｅ３、およびＥ４）、３種の後発型初期転写ユニット（ＩＸ、ＩＶａ２、およびＥ２  ｌａｔｅ）、および、処理後に５つの後期ｍＲＮＡファミリー（Ｌ１〜Ｌ５）を生成する１種の後期転写ユニット（主要後期ユニット）を収容している。初期遺伝子にコードされたタンパク質は、複製および感染に対する宿主細胞応答の改変に主に関与し、後期遺伝子はウイルスの構造タンパク質をコードする。初期遺伝子には文字Ｅが接頭辞として付いており、後期遺伝子には文字Ｌが接頭辞として付いている。
【０１０５】
アデノウイルスのゲノムは密に積み込まれているため、すなわち、非コード配列がほとんどないため、導入遺伝子を挿入するのに適した位置を見つけることが難しい場合がある。
【０１０６】
１つの実施形態では、本開示の腫瘍溶解性ウイルスまたは部分腫瘍溶解性ウイルスは、例えば本明細書で開示される配列に例示されるように、Ｅ４領域および／またはＥ３領域の欠失、例えば、Ｅ４領域の一部の欠失またはＥ３領域の完全な欠失、あるいは、Ｅ４領域の一部（Ｅ４ｏｒｆ４など）の欠失およびＥ３領域の完全な欠失、の結果であり得る。
【０１０７】
１つの実施形態では、前記腫瘍溶解性ウイルスは、ＥｎＡｄ、またはこのウイルスの必須不可欠な有益な特性を保持しているその活性誘導体である。ＥｎＡｄは、ＷＯ２００５／１１８８２５（参照によって本明細書に援用される）に開示されており、このウイルスの完全排列は本願では配列番号２８に記載されている。キメラのＥ２Ｂ領域は本願では配列番号６０として開示されている。
【０１０８】
有利な点として、本開示のアデノウイルスは、インビトロにおいて、種々様々な結腸がん細胞株の感染後に、ＥｎＡｄと同様のウイルス活性、例えば複製プロファイルおよび／または感染プロファイルを示す。
【０１０９】
アデノウイルスの構造エレメント
アデノウイルスの構造は通常似通っているため、下記の各エレメントは、当業者に公知の構造エレメントおよび一般的に使用されるその呼称に関して説明がなされる。エレメントが本明細書で言及されている場合、そのエレメントをコードしているＤＮＡ配列、またはアデノウイルスにおけるそのエレメントの同一構造タンパク質をコードしているＤＮＡ配列のことを指している。ＤＮＡコードには冗長性があるため、後者は関連性がある。最適な結果を得るために、そのウイルスのコドン使用頻度の優先度を考慮する必要がある場合がある。
【０１１０】
本開示のウイルスで使用されているアデノウイルス由来のあらゆる構造エレメントは、天然配列を含むかそれからなっていてもよいし、あるいは、所与の長さに対して、少なくとも９５％、例えば９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の類似性を有するものであってもよい。元の配列を改変することで、その遺伝物質の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％を取り除いてもよい。当業者には認識されていることであるが、変化を生じさせる場合、構造タンパク質の発現に混乱が生じるような、ウイルスの読み取り枠の破壊を起こしてはならない。
【０１１１】
１つの実施形態では、所与のエレメントは完全長配列、すなわち完全長遺伝子である。
【０１１２】
１つの実施形態では、所与のエレメントは完全長未満であり、完全長配列と同じまたはそれに相当する機能を保持する。
【０１１３】
所与のエレメントが本開示のコンストラクトにおいて任意である１つの実施形態では、そのＤＮＡ配列は完全長未満で機能性を持たない場合がある。
【０１１４】
アデノウイルスの構造タンパク質または機能タンパク質をコードする構造遺伝子は、通常、ＤＮＡの非コード領域で結ばれている。従って、本開示のウイルスに導入遺伝子を挿入する目的で、目的の構造エレメントのゲノム配列（特にその非コード領域）をどこで「切断」するかについては、いくらかの柔軟性がある。従って、本明細書の目的においては、そのエレメントは、目的に適合し、且つ外来性物質をコードしない範囲で、参照の構造エレメントと見なされる。従って、適切であれば、遺伝子は、例えばウイルスの天然構造に存在するような、好適な非コード領域を伴っている。
【０１１５】
従って、１つの実施形態では、制限酵素認識部位および／または導入遺伝子をコードするＤＮＡなどのインサートが、イントロンまたは遺伝子間配列などのゲノムウイルスＤＮＡの非コード領域に挿入される。しかしながら、アデノウイルスの非コード領域の中には、選択的スプライシング、転写制御、または翻訳制御などにおいて機能を果たすものがある場合があり、これを考慮に入れる必要がある場合がある。
【０１１６】
本明細書においてＬ５領域と関連していると同定された部位（例えば、Ｌ５領域とＥ４領域の間）は、ＲＮＡｉ、サイトカイン、一本鎖タンパク質、または多量体タンパク質、例えば抗体、例えばＢｉＴＥ、などの複雑な実体をコードする種々のＤＮＡ配列を収容するのに好適である。
【０１１７】
遺伝子とは、本明細書で用いられる場合、コード配列および所望によりそれに付随するあらゆる非コード配列、例えばイントロンおよび関連エクソン、を指す。１つの実施形態では、遺伝子は、必須の構造成分、例えばコード領域、のみを含むかそれからなる。
【０１１８】
以下、アデノウイルスの特定の構造エレメントに関して説明する。
【０１１９】
逆位末端配列（ＩＴＲ）は、既知の全てのアデノウイルスに共通のものであり、その対称性からそのように命名され、ウイルス染色体の複製開始点となる。これらの配列のもう１つの特性として、ヘアピン形成能がある。
【０１２０】
５’ＩＴＲとは、本明細書で用いられる場合、適切な位置でアデノウイルスに組み込まれた場合にＩＴＲの機能を保持する、アデノウイルスの５’末端からのＩＴＲの部分または全体を指す。１つの実施形態では、５’ＩＴＲは、配列番号２８のおよそ１ｂｐから１３８ｂｐまでの配列、またはそれの全長に対して９０、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％の同一性を有する配列、を含むかそれからなり、特に、配列番号２８のおよそ１ｂｐから１３８ｂｐまでの配列からなる配列を含むかそれからなる。
【０１２１】
３’ＩＴＲとは、本明細書で用いられる場合、適切な位置でアデノウイルスに組み込まれた場合にＩＴＲの機能を保持する、アデノウイルスの３’末端からのＩＴＲの部分または全体を指す。１つの実施形態では、３’ＩＴＲは、配列番号２８のおよそ３２１８９ｂｐから３２３２６ｂｐまでの配列、またはそれの全長に対して９０、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％の同一性を有する配列、を含むかそれからなり、特に、配列番号２８のおよそ３２１８９ｂｐから３２３２６ｂｐまでの配列からなる配列を含むかそれからなる。
【０１２２】
Ｂ１とは、本明細書で用いられる場合、アデノウイルス由来のＥ１Ａの一部または全体をコードするＤＮＡ配列、アデノウイルスのＥ１Ｂ領域の一部または全体をコードするＤＮＡ配列、並びにアデノウイルスのＥ１ＡおよびＥ１Ｂ領域の一部または全体を独立してコードするＤＮＡ配列を指す。
【０１２３】
Ｂ１が結合である場合、Ｅ１Ａ配列およびＥ１Ｂ配列は前記ウイルスから取り除か得ることになる。１つの実施形態では、Ｂ１が結合であるために、前記ウイルスはベクターである。
【０１２４】
１つの実施形態では、Ｂ１は導入遺伝子をさらに含む。当該技術分野において公知のことであるが、Ｅ１領域は、Ｅ１領域に分断的に（すなわち配列の「真ん中」に）挿入され得る導入遺伝子を収容する可能性があり、あるいは、遺伝物質を収容するためのより多くの空間を得るためにＥ１領域の一部または全体が除去される場合がある。
【０１２５】
Ｅ１Ａとは、本明細書で用いられる場合、アデノウイルスのＥ１Ａ領域の一部または全体をコードするＤＮＡ配列を指す。Ｅ１Ａ領域の一部または全体とは、Ｅ１Ａポリペプチド／タンパク質のことである。Ｅ１Ａは、Ｅ１Ａ遺伝子にコードされるタンパク質が、野生型と同じ機能（すなわち、対応する非変異型タンパク質）を有するような；野生型タンパク質と比較して機能が増大するような；野生型タンパク質と比較して、機能なしなど、機能が低減するような；または、野生型タンパク質と比較した場合に新たな機能を有するような、保存的または非保存的なアミノ酸変化、または必要に応じてその組み合わせ、を有するように、変異されていてもよい。
【０１２６】
Ｅ１Ｂとは、本明細書で用いられる場合、アデノウイルスのＥ１Ｂ領域の一部または全体（すなわちポリペプチドまたはタンパク質）をコードするＤＮＡ配列を指し、Ｅ１Ｂは、Ｅ１Ｂ遺伝子／領域にコードされるタンパク質が、野生型と同じ機能（すなわち、対応する非変異型タンパク質）を有するような；野生型タンパク質と比較して機能が増大するような；野生型タンパク質と比較して、機能なしなど、機能が低減するような；または、野生型タンパク質と比較した場合に新たな機能を有するような、保存的または非保存的なアミノ酸変化、または必要に応じてその組み合わせ、を有するように、変異されていてもよい。
【０１２７】
すなわち、Ｂ１は、野生型のＥ１Ａおよび／またはＥ１Ｂなど、野生型Ｅ１領域と比較して、改変型でも未改変型でもよい。当業者であれば、Ｅ１Ａおよび／またはＥ１Ｂが存在しているか、（部分）欠失しているか、変異しているかを容易に特定できる。
【０１２８】
野生型とは、本明細書で用いられる場合、既知のアデノウイルスを指す。既知のアデノウイルスとは、同定され命名されたアデノウイルスであり、その配列が利用可能であるかどうかは問わない。
【０１２９】
１つの実施形態では、Ｂ１は配列番号２８の１３９ｂｐから３９３２ｂｐまでの配列を有する。
【０１３０】
ＢＡとは、本明細書で用いられる場合、必要に応じて任意の非コード配列を含む、Ｅ２Ｂ−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３−Ｅ２Ａ−Ｌ４領域をコードするＤＮＡ配列を指す。通常、この配列が導入遺伝子を含むことはない。１つの実施形態では、前記配列は、既知のアデノウイルス、例えば表１に示されるアデノウイルス血清型、特にＢ群アデノウイルス血清型、例えばＡｄ３、Ａｄ７、Ａｄ１１、Ａｄ１４、Ａｄ１６、Ａｄ２１、Ａｄ３４、Ａｄ３５、Ａｄ５１、またはこれらの組み合わせ、に由来する連続した配列と実質的に類似または同一であり、例えば、Ａｄ３、Ａｄ１１、またはこれらの組み合わせである。１つの実施形態では、Ｅ２Ｂ−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３−Ｅ２Ａ−Ｌ４とは、これらのエレメントおよびこの領域に付随する他の構造エレメントを含むものを指し、例えばＢＡは通常、例えばＩＶ２Ａ  ＩＶ２ａ−Ｅ２Ｂ−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３−Ｅ２Ａ−Ｌ４のようなＩＶ２ａタンパク質をコードする配列を含むことになる。
【０１３１】
１つの実施形態では、前記Ｅ２Ｂ領域はキメラである。すなわち、前記Ｅ２Ｂ領域は、２種以上の異なるアデノウイルス血清型由来、例えばＡｄ３およびＡｄ１１由来のＤＮＡ配列、例えばＡｄ１１ｐを含む。１つの実施形態では、前記Ｅ２Ｂ領域は、配列番号２８の５０６８ｂｐから１０３５５ｂｐまでの配列、またはその全長に対して９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する配列を有する。
【０１３２】
１つの実施形態では、構成要素ＢＡ内のＥ２Ｂは、配列番号６０に示される配列（国際公開第２００５／１１８８２５号で開示された配列番号３に対応）を含む。
【０１３３】
１つの実施形態では、ＢＡは、配列番号２８の３９３３ｂｐから２７１８４ｂｐまでの配列を有する。
【０１３４】
Ｅ３とは、本明細書で用いられる場合、アデノウイルスのＥ３領域の一部または全体（すなわちタンパク質／ポリペプチド）をコードするＤＮＡ配列を指し、Ｅ３は、Ｅ３遺伝子にコードされるタンパク質が、野生型と同じ機能（すなわち、対応する非変異型タンパク質）を有するような；野生型タンパク質と比較して機能が増大するような；野生型タンパク質と比較して、機能なしなど、機能が低減するような；または、野生型タンパク質と比較した場合に新たな機能を有するような、保存的または非保存的なアミノ酸変化、または必要に応じてその組み合わせ、を有するように、変異されていてもよい。
【０１３５】
１つの実施形態では、前記Ｅ３領域は、表１に示されるアデノウイルス血清型またはそれらの組み合わせ、特にＢ群血清型、例えばＡｄ３、Ａｄ７、Ａｄ１１（特にＡｄ１１ｐ）、Ａｄ１４、Ａｄ１６、Ａｄ２１、Ａｄ３４、Ａｄ３５、Ａｄ５１、またはこれらの組み合わせ、例えば、Ａｄ３、Ａｄ１１（特にＡｄ１１ｐ）、またはこれらの組み合わせ、に由来する。
【０１３６】
１つの実施形態では、前記Ｅ３領域は部分的に欠失しており、例えば、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％が欠失している。
【０１３７】
１つの実施形態では、Ｂ２は結合であり、その場合、Ｅ３領域をコードするＤＮＡは存在しない。
【０１３８】
１つの実施形態では、Ｅ３領域をコードするＤＮＡは、導入遺伝子で置換したり、導入遺伝子を割り込ませたりすることができる。本明細書で使用される場合、「導入遺伝子で置換されたＥ３領域  とは、本明細書で用いられる場合、Ｅ３領域の一部または全体が導入遺伝子で置換されることも包含する。
【０１３９】
１つの実施形態では、Ｂ２は配列番号２８の２７１８５ｂｐから２８１６５ｂｐまでの配列を含む。
【０１４０】
１つの実施形態では、Ｂ２は配列番号２８の２７１８５ｂｐから２８１６５ｂｐまでの配列からなる。
【０１４１】
ＢＸとは、本明細書で用いられる場合、ＢＢのＬ５遺伝子の５’末端の近傍にあるＤＮＡ配列を指す。Ｌ５遺伝子の５’末端の近傍または近位とは、本明細書で用いられる場合、Ｌ５遺伝子またはそれに固有に付随する非コード領域の５’末端（5’ end）に隣接（連続）していること、すなわち、Ｌ５遺伝子またはそれに固有に付随する非コード領域の５’末端（5’ prime end）に接しているまたは連続していること、を指す。あるいは、近傍にある、または近位にあるは、ＢＸ領域とＬ５遺伝子の５’末端との間にコード配列が存在しないほどに、Ｌ５遺伝子と近いことを指す場合もある。
【０１４２】
すなわち、１つの実施形態では、ＢＸは、Ｌ５遺伝子のコード配列の開始などを表すＬ５の塩基に直接繋がっている。
【０１４３】
すなわち、１つの実施形態では、ＢＸは、非コード配列の開始などを表すＬ５の塩基に直接繋がっているか、またはＬ５に天然に付随する非コード領域と直接繋がっている。Ｌ５に天然に付随する非コード領域とは、本明細書で用いられる場合、Ｌ５遺伝子の一部である、またはＬ５遺伝子と連続しているが別の遺伝子の一部ではない、非コード領域の全ての一部（part of all）を指す。
【０１４４】
１つの実施形態では、ＢＸは、配列番号２９の配列を含む。この配列は、例えば導入遺伝子（または導入遺伝子カセット）、制限酵素認識部位、またはこれらの組み合わせを含むＤＮＡ配列が挿入されていてもよい、人工的な非コード配列である。この配列は、ウイルスの安定性および生存度に対する分断による影響を最小に抑えながら、導入遺伝子の位置の正確性にいくらかの柔軟性を許す緩衝域として働くため、有益である。
【０１４５】
前記インサートは、５’末端から、３’末端、またはｂｐ１〜２０１のあらゆる位置において、配列番号２９内のどこにでも生じ得る。１つの実施形態では、ＢＸは、ｂｐ２７〜ｂｐ２８の間に、または配列番号２８の２８１９２ｂｐ〜２８１９３ｂｐの位置に相当する場所に、ＤＮＡ配列が挿入されている、配列番号２９を含む。
【０１４６】
１つの実施形態では、前記インサートは制限酵素認識部位インサートである。１つの実施形態では、前記制限酵素認識部位インサートは、１つまたは２つの制限酵素認識部位を含む。１つの実施形態では、前記制限酵素認識部位は、２つの制限酵素認識部位を含む１９ｂｐの制限酵素認識部位インサートである。１つの実施形態では、前記制限酵素認識部位インサートは、１つの制限酵素認識部位を含む９ｂｐの制限酵素認識部位インサートである。１つの実施形態では、前記制限酵素認識部位インサートは、１つまたは２つの制限酵素認識部位と、少なくとも１つの導入遺伝子、例えば１つまたは２つの導入遺伝子、とを含む。１つの実施形態では、前記制限酵素認識部位は、２つの制限酵素認識部位と、少なくとも１つの導入遺伝子、例えば１つまたは２つの導入遺伝子、とを含む１９ｂｐの制限酵素認識部位インサートである。１つの実施形態では、前記制限酵素認識部位インサートは、１つの制限酵素認識部位と、少なくとも１つの導入遺伝子、例えば１、２または３つの導入遺伝子、例えば１つまたは２つの導入遺伝子、とを含む９ｂｐの制限酵素認識部位インサートである。１つの実施形態では、２つの制限酵素認識部位が、１または複数、例えば２つ、の導入遺伝子（例えば導入遺伝子カセット内の）をサンドイッチする。１つの実施形態では、ＢＸが２つの制限酵素認識部位を含む場合、これらの制限酵素認識部位は互いに異なっている。１つの実施形態では、ＢＸ内の前記１または複数の制限酵素認識部位は、それらが挿入される特定のアデノウイルスゲノムに自然発生的なものではない。１つの実施形態では、ＢＸ内の前記１または複数の制限酵素認識部位は、当該アデノウイルスゲノム内の他の場所に位置する他の制限酵素認識部位と異なっており、例えば、自然発生的な制限酵素認識部位、および／または当該ゲノムの他の部分に導入された制限酵素認識部位、例えばＢＹに導入された制限酵素認識部位、と異なっている。すなわち、１つの実施形態では、前記１または複数の制限酵素認識部位は、そのセクション内のＤＮＡの特異的な切断を可能にする。
【０１４７】
ＢＹに関連したＤＮＡ配列とは、本明細書で用いられる場合、ＢＢのＬ５遺伝子の３’末端の近傍にあるＤＮＡ配列を指す。Ｌ５遺伝子の３’末端の近傍または近位とは、本明細書で用いられる場合、Ｌ５遺伝子またはそれに固有に付随する非コード領域の３’末端（3’ end）に隣接（連続）していること、すなわち、Ｌ５遺伝子またはそれに固有に付随する非コード領域（すなわち、Ｌ５内在性の非コード配列の全体または一部）の３’末端（3’ prime end）に接しているまたは連続していること、を指す。あるいは、近傍にある、または近位にあるは、ＢＹ領域とＬ５遺伝子の３’末端との間にコード配列が存在しないほどに、Ｌ５遺伝子と近いことを指す場合もある。
【０１４８】
すなわち、１つの実施形態では、ＢＹは、コード配列の「終結」を表すＬ５の塩基に直接繋がっている。
【０１４９】
すなわち、１つの実施形態では、ＢＹは、非コード配列の「終結」を表すＬ５の塩基に直接繋がっているか、またはＬ５に天然に付随する非コード領域と直接繋がっている。
【０１５０】
固有にと天然には本明細書では同義的に使用される。１つの実施形態では、ＢＹは配列番号３０の配列を含む。この配列は、例えば導入遺伝子（または導入遺伝子カセット）、制限酵素認識部位、またはこれらの組み合わせを含むＤＮＡ配列が挿入されていてもよい、非コード配列である。この配列は、ウイルスの安定性および生存度に対する分断による影響を最小に抑えながら、導入遺伝子の位置の正確性にいくらかの柔軟性を許す緩衝域として働くため、有益である。
【０１５１】
前記インサートは、５’末端から、３’末端、またはｂｐ１〜３５のあらゆる位置において、配列番号３０内のどこにでも生じさせることができ、例えば、１／２、２／３、３／４、４／５、５／６、６／７、７／８、８／９、９／１０、１０／１１、１１／１２、１２／１３、１３／１４、１４／１５、１５／１６、１６／１７、１７／１８、１８／１９、１９／２０、２０／２１、２１／２２、２２／２３、２３／２４、２４／２５、２５／２６、２６／２７、２７／２８、２８／２９、２９／３０、３０／３１、３１／３２、３２／３３、３３／３４、または３４／３５の塩基対間に生じさせることができる。
【０１５２】
Ｅ４とは、本明細書で用いられる場合、アデノウイルスのＥ４領域の一部または全体（すなわちポリペプチド／タンパク質領域）をコードするＤＮＡ配列を指し、Ｅ４は、Ｅ４遺伝子にコードされるタンパク質が、野生型と同じ機能（すなわち、対応する非変異型タンパク質）を有するような；野生型タンパク質と比較して機能が増大するような；野生型タンパク質と比較して、機能なしなど、機能が低減するような；または、野生型タンパク質と比較した場合に新たな機能を有するような、保存的または非保存的なアミノ酸変化、または必要に応じてその組み合わせ、を有するように、変異されていてもよい。１つの実施形態では、前記Ｅ４領域はＥ４ｏｒｆ４が欠失している。
【０１５３】
１つの実施形態では、前記Ｅ４領域は部分的に欠失しており、例えば、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％が欠失している。１つの実施形態では、前記Ｅ４領域は配列番号２８の３２１８８ｂｐから２９３８０ｂｐまでの配列を含む。
【０１５４】
１つの実施形態では、Ｂ３は結合であり、すなわちその場合Ｅ４は存在しない。
【０１５５】
１つの実施形態では、Ｂ３は配列番号２８の３２１８８ｂｐから２９３８０ｂｐまでからなる配列を有する。
【０１５６】
本明細書で用いられる場合、数値範囲は端点を包含する。
【０１５７】
当業者には理解されることであるが、式（Ｉ）などの、本明細書中の式に含まれるエレメントは隣接しており、本明細書に記載の遺伝子およびコードＤＮＡ配列（構造的特徴）だけでなく、非コードＤＮＡ配列を含んでいてもよい。１または複数の実施形態において、本開示の式は、アデノウイルスゲノムにおける自然発生的な配列を記述しようとしている。これに関連して、当業者には明らかなことであるが、前記式はゲノムの関連性のあるセクションを特徴付ける主要エレメントを参照しており、一連のゲノムＤＮＡの網羅的な説明であるという意図はない。
【０１５８】
Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ３、およびＥ４とは、本明細書で用いられる場合、各々独立して、本明細書に記載されるような各領域の野生型およびその均等物、変異型または部分欠失型を指し、特に、既知のアデノウイルス由来の野生型配列である。
【０１５９】
「インサート」とは、本明細書で用いられる場合、５’末端に、３’末端に、または参照配列を中断するように所与のＤＮＡ配列参照セグメント内に、組み込まれるＤＮＡ配列を指す。ＤＮＡ配列参照セグメントは、インサートがどれに配置されるかに関する基準点として用いられる参照配列である。本開示の関連において、インサートは通常、配列番号２９または配列番号３０の中に生じる。インサートは、制限酵素認識部位インサート、導入遺伝子カセット、またはその両方であり得る。配列が中断された場合、そのウイルスは元の配列を含み続けるが、通常は、その元の配列はインサートを挟む２つの断片として含まれることとなる。
【０１６０】
１つの実施形態では、導入遺伝子または導入遺伝子カセットは、ＴＮ７トランスポゾンまたはその一部などの、偏りなく挿入するトランスポゾンは含まない。Ｔｎ７トランスポゾンとは、本明細書で用いられる場合、国際公開第２００６／０６０３１４号に記載される偏りのない挿入トランスポゾンを指す。
【０１６１】
１つの実施形態では、ＢＸおよびＢＹにおける１または複数の制限酵素認識部位は、本明細書に記載の酵素（例えば、ＮｏｔＩ、ＦｓｅＩ、ＡｓｉＳＩ、ＳｇｆＩ、およびＳｂｆＩ）に特異的な制限酵素認識部位から独立して選択され、特に、挿入される制限酵素認識部位は全て異なり、例えば、ＮｏｔＩに特異的な部位およびＦｓｅＩに特異的な部位はＢＸ配置され、ＳｇｆＩに特異的な部位およびＳｂｆＩに特異的な部位はＢＹに配置される。
【０１６２】
前述の通り、１つの実施形態では、ＢＸ領域および／またはＢＹ領域は制限酵素認識部位を含まない。有利な点として、本開示のウイルスおよびコンストラクトは、制限酵素認識部位なしで、例えば合成法を用いて、作製することができる。これらの方法によって、ウイルスおよびコンストラクトの構築に大きな柔軟性がもたらされる。さらに、本発明者らは、合成法で作製された場合も、ウイルスおよびコンストラクトの特性が減弱されないことを確かめた。
【０１６３】
他の制御配列
「遺伝子発現の調節因子」（または調節因子／調節エレメント）とは、本明細書で用いられる場合、通例転写または翻訳を惹起または増強することによって遺伝子発現で役割を果たす、プロモーター配列、エンハンサー配列、またはスプライスアクセプター配列などの、遺伝的機構を指す。
【０１６４】
「スプライスアクセプター配列」、「スプライスアクセプター」、または「スプライス部位」とは、本明細書で用いられる場合、ｍＲＮＡ分子がスプライソソーム複合体の核内低分子リボ核タンパク質によっていつ認識されるかを決定する制御配列を指す。アセンブル後、スプライソソームは、ｍＲＮＡ分子のスプライスアクセプター部位から上流のスプライスドナー部位までのスプライシングを触媒し、翻訳されて単一のポリペプチドまたはタンパク質を生成できる成熟ｍＲＮＡ分子を生み出す。
【０１６５】
本発明では様々なサイズのスプライスアクセプター配列を使用することができるが、これらは短スプライスアクセプター（小型）、スプライスアクセプター（中型）、および分岐状スプライスアクセプター（大型）と称することができる。
【０１６６】
ＳＳＡとは、本明細書で用いられる場合、通例はスプライス部位だけで構成される、例えば４塩基対の、短スプライスアクセプターを意味する。ＳＡとは、本明細書で用いられる場合、通例は前記短スプライスアクセプターとポリピリミジントラクトとを含む、例えば１６ｂｐの、スプライスアクセプターを意味する。ｂＳＡとは、本明細書で用いられる場合、通例は前記短スプライスアクセプターと、ポリピリミジントラクトと、ブランチポイントとを含む、例えば２６塩基対の、分岐状スプライスアクセプターを意味する。
【０１６７】
１つの実施形態では、本開示のコンストラクトに用いられたＳＡスプライスアクセプターおよびｂＳＡスプライスアクセプターは、それぞれ、配列番号４５および配列番号４６に示される。１つの実施形態では、ＳＳＡが本開示のカセットに用いられており、ヌクレオチド配列ＣＡＧＧを有する。
【０１６８】
１つの実施形態では、ＳＡがカセットに用いられている。１つの実施形態では、ｂＳＡがカセットに用いられている。
【０１６９】
１つの実施形態では、スプライス部位はコンセンサスなコザック配列によって直に進行（proceed）される（すなわち、５’から３’方向に続く）。１つの実施形態では、スプライス部位およびコザック配列は１００以下の塩基対だけ離されている。１つの実施形態では、コザック配列は配列番号４７のヌクレオチド配列を有する。
【０１７０】
通例、内在性プロモーターまたは外来性プロモーター（内在性プロモーターなど）の制御下にある場合、そのコード配列はコザック配列の直後に続くこととなる。コード領域の開始は、開始コドン（ＡＵＧ）によって示され、例えば、配列（ｇｃｃ）ｇｃｃＲｃｃＡＵＧｇ［配列番号４８］のコンテキストの中では、コード配列の「開始」の始まりは太字の塩基で示される。小文字はこの位置で共通の塩基（それでもやはり変動し得る）を表し、大文字は高度に保存された塩基を表し、すなわち、「ＡＵＧＧ」配列は不変であるか、変化があったとしてもまれであり；「Ｒ」はプリン（アデニンまたはグアニン）がこの位置に通常認められることを表しており、角括弧内の配列（ｇｃｃ）は意義不明な配列である。すなわち、１つの実施形態では、開始コドンＡＵＧがコザック配列に組み込まれている。
【０１７１】
配列内リボソーム進入ＤＮＡ配列（Internal Ribosome Entry DNA Sequence）とは、本明細書で用いられる場合、内部リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）をコードするＤＮＡ配列を指す。ＩＲＥＳとは、本明細書で用いられる場合、ｍＲＮＡ配列内で始まる開始を含む、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）配列の翻訳の開始を可能にするヌクレオチド配列を意味する。これは、カセットが多シストロン性ｍＲＮＡをコードする場合に特に有用である。ＩＲＥＳを用いることで、多シストロン性ｍＲＮＡは複数の個々のタンパク質またはペプチドへと翻訳される。１つの実施形態では、内部リボソーム進入ＤＮＡ配列は配列番号４９のヌクレオチド配列を有する。１つの実施形態では、特定のＩＲＥＳがゲノム内で１回だけ用いられる。これはゲノムの安定性に関して利点となり得る。
【０１７２】
「高効率自己開裂型２Ａペプチド」または「２Ａペプチド」とは、本明細書で用いられる場合、翻訳後に効率的に切断されるペプチドを指す。好適な２Ａペプチドとしては、Ｐ２Ａ、Ｆ２Ａ、Ｅ２Ａ、およびＴ２Ａが挙げられる。本発明者らは、所与の２Ａペプチドをコードする特定のＤＮＡ配列が一度使用されると、同一の特定のＤＮＡ配列は二度と使用されない可能性があると述べた。しかし、ＤＮＡコードの冗長性を利用することで、同一の２Ａペプチドに翻訳されるＤＮＡ配列を得てもよい。２Ａペプチドの使用は、カセットが多シストロン性ｍＲＮＡをコードする場合に特に有用である。２Ａペプチドを用いることで、１本鎖ポリペプチドが翻訳され、翻訳後修飾されて、複数の個々のタンパク質またはペプチドが得られる。
【０１７３】
１つの実施形態では、使用された、コードされたＰ２Ａペプチドは配列番号５０のアミノ酸配列を有する。１つの実施形態では、使用された、コードされたＦ２Ａペプチドは配列番号５１のアミノ酸配列を有する。１つの実施形態では、使用された、コードされたＥ２Ａペプチドは配列番号５２のアミノ酸配列を有する。１つの実施形態では、使用された、コードされたＴ２Ａペプチドは配列番号５３のアミノ酸配列を有する。
【０１７４】
１つの実施形態では、ｍＲＮＡ、または導入遺伝子にコードされる各ｍＲＮＡは、例えば配列番号５４に示されるように、通例はｍＲＮＡ配列の最後などに、ポリアデニル化シグナル配列を含む。すなわち、１つの実施形態では、前記導入遺伝子または導入遺伝子カセットは、ポリアデニル化シグナル配列をコードする配列を少なくとも１つ含む。
【０１７５】
「ポリＡ」、「ポリアデニル化シグナル」、または「ポリアデニル化配列」とは、本明細書で用いられる場合、転写されると、新生ｍＲＮＡ分子を切断しポリアデニル化する多タンパク質複合体で認識され得る、ＡＡＴＡＡＡ部位を通常は含有する、ＤＮＡ配列を意味する。
【０１７６】
１つの実施形態では、前記ポリアデニル化配列は配列番号５４のヌクレオチド配列を有する。
【０１７７】
１つの実施形態では、前記コンストラクトはポリアデニル化配列を含まない。１つの実施形態では、遺伝子発現の調節因子はスプライスアクセプター配列である。
【０１７８】
有利な点として、本開示のアデノウイルスは、アデノウイルス内の導入遺伝子にコードされる抗体型（ＢｉＴＥなど）および他のタンパク質（サイトカインなど）を、インビトロでは培養上清中にまたはインビボでは腫瘍組織間質内に、発現および放出する。コードされたタンパク質／ポリペプチドまたはペプチドががん細胞から出ることを、リーダー配列が補助する場合がある。従って、１つの実施形態では、コードされた「タンパク質」はリーダー配列を含む。リーダー配列とは、本明細書で用いられる場合、遺伝子発現を転写レベルまたは翻訳レベルで調節することが可能な、プロモーター配列とコード領域との間に位置する、ポリヌクレオチド配列を指す。
【０１７９】
１つの実施形態では、本開示のアデノウイルスは、ルシフェラーゼ、ＧＦＰもしくはｅＧＦＰ、または赤色蛍光タンパク質などの、生物発光性の蛍光イメージング剤（活性化可能な蛍光イメージング剤を含む）を含むイメージング剤などをコードするレポーター遺伝子である、導入遺伝子を含む。
【０１８０】
レポーター遺伝子またはレポーター配列とは、本明細書で用いられる場合、真核細胞内で検出が容易な産物を生産する遺伝子またはＤＮＡ配列であって、そのＤＮＡが密接に関連または結合している別の遺伝子の活性を測定するためのマーカーとして使用され得る、遺伝子またはＤＮＡ配列を意味する。レポーター遺伝子は、レポーターを発現する細胞または生物に、容易に同定および測定される特徴を付与し、すなわち選択マーカーである。レポーター遺伝子は、特定の遺伝子が細胞集団または生物集団において取り込まれたかどうか、または発現されたかどうか、の指標として用いられる場合が多い。一般的なレポーター遺伝子の例としては、ＬａｃＺ、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ネオマイシンホスフォトランスフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチル基転移酵素、ナトリウム・ヨウ素共輸送体（ＮＩＳ）、ニトロ還元酵素（例えば、ＮｆｓＡ、ＮｆｓＢ）  細胞内金属タンパク質、ＨＳＶ１−ｔｋ、またはエストロゲン受容体が挙げられるが、これらに限定はされない。
【０１８１】
１つの実施形態では、前記遺伝物質（特に前記導入遺伝子）は、イメージング剤、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ、またはｅＧＦＰなどのレポーター遺伝子をコードも発現もしない。
【０１８２】
本開示のウイルスは、腫瘍細胞パネルにおける溶解能を調べることで、特定の腫瘍型に対する選好について調査することができ、例えば、結腸腫瘍細胞株として、ＨＴ−２９、ＤＬＤ−１、ＬＳ１７４Ｔ、ＬＳ１０３４、ＳＷ４０３、ＨＣＴ１１６、ＳＷ４８、およびＣｏｌｏ３２０ＤＭが含まれる。利用可能なものであればいかなる結腸腫瘍細胞株も、そのような評価に等しく有用である。
【０１８３】
前立腺細胞株としてＤＵ１４５細胞およびＰＣ−３細胞が含まれる。膵臓細胞株としてＰａｎｃ−１細胞が含まれる。乳房腫瘍細胞株としてＭＤＡ２３１細胞株が含まれ、卵巣細胞株としてＯＶＣＡＲ−３細胞株が含まれる。造血細胞株としては、Ｂリンパ系細胞のＲａｊｉ細胞およびＤａｕｄｉ細胞、赤芽球様細胞のＫ５６２、骨髄性細胞のＵ９３７、並びにＴリンパ系細胞のＨＳＢ２が含まれるが、これらに限定はされない。他の利用可能な腫瘍細胞株も等しく有用である。
【０１８４】
本開示は本明細書で開示される新規の配列も包含する。１つの実施形態では、前記ウイルスは本明細書で開示される配列のいずれか１つに示されるものである。
【０１８５】
製剤
本開示は本明細書に記載のウイルスの医薬製剤も包含する。
【０１８６】
１つの実施形態において、投与体積当たり１×１０１０〜１×１０１４個の範囲のウイルス粒子の投与を可能にする、本開示の複製可能な腫瘍溶解性の液状非経口製剤、例えば注入用または注射用の製剤、が提供される。
【０１８７】
非経口製剤とは、胃腸管を通じて送達されないように設計された製剤を意味する。通例、非経口送達経路には注射、移植、または注入が含まれる。１つの実施形態では、前記製剤はボーラス送達用の形態で提供される。
【０１８８】
１つの実施形態では、前記非経口製剤は、注射の形態をとる。注射には、静脈内注射、皮下注射、腫瘍内注射、または筋肉内注射が含まれる。注射とは、本明細書で用いられる場合、注射器を介した身体内への液体の挿入を意味する。１つの実施形態では、本開示の方法は、腫瘍内注射を含まない。
【０１８９】
１つの実施形態では、前記非経口製剤は注入の形態をとる。
【０１９０】
注入とは、本明細書で用いられる場合、点滴、注入ポンプ、シリンジポンプ、または均等デバイスによる、より低速の液体の投与を意味する。１つの実施形態では、注入は、１．５分間〜１２０分間の範囲の期間に亘って、例えば、およそ、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１１分、１２分、１３分、１４分、１５分、１６分、１７分、１８分、１９分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、６０分、６５分、７０分、６５分、８０分、８５分、９０分、９５分、１００分、１０５分、１１０分、または１１５分間に亘って投与される。
【０１９１】
１つの実施形態では、前記製剤の１回の投与量は１００ｍｌ未満、例えば３０ｍｌであり、例えばシリンジポンプで投与される。１つの実施形態では、前記製剤の１回の投与量は１０ｍｌ未満であり、例えば９ｍｌ、８ｍｌ、７ｍｌ、６ｍｌ、５ｍｌ、４ｍｌ、３ｍｌ、２ｍｌ、または１ｍｌである。１つの実施形態では、前記製剤の１回の投与量は１ｍｌ未満であり、例えば０．９ｍｌ、０．８ｍｌ、０．７ｍｌ、０．６ｍｌ、０．５ｍｌ、０．４ｍｌ、０．３ｍｌ、０．２ｍｌ、または０．１ｍｌである。
【０１９２】
１つの実施形態では、注射は低速注射として、例えば１．５〜３０分間に亘って投与される。
【０１９３】
１つの実施形態では、前記製剤は静脈内（ＩＶ）投与用である。この経路は、大部分の臓器および組織に迅速にアクセス可能であるため腫瘍溶解性ウイルスの送達に特に有効であり、また、転移の治療、例えば確立した転移の治療に特に有用であり、とりわけ、肝臓および肺などの高度に血管が発達した領域に位置する転移の治療に有用である。
【０１９４】
治療用製剤は通例、製造および貯蔵の条件下で無菌且つ安定となる。前記組成物は、液剤、マイクロエマルジョン、リポソーム、またはヒトへの投与に好適な他の非経口製剤として製剤化することができ、注射器またはバイアルなどの充填済みデバイスとして、特に単回投与として、製剤化できる。
【０１９５】
前記製剤は通常、薬剤的に許容できる希釈剤または担体を含むことになり、例えば、ウイルスと適合性があり、且つウイルスがその中で必要な期間安定である、無毒の等張担体を含む。
【０１９６】
前記担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびその適切な混合物、を含有する溶媒または分散媒とすることができる。適切な流動性は、分散剤または界面活性剤、例えばレシチンまたは非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０またはポリソルベート４０、の使用などによって維持することができる。分散液中で、必要な粒径の維持を、界面活性剤の存在によって補助してもよい。等張剤の例としては、組成物中の、糖類、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムが挙げられる。
【０１９７】
１つの実施形態では、使用される非経口製剤は、以下のうちの１または複数を含み得る：緩衝液、例えば４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸、リン酸緩衝液および／またはトリス緩衝液、糖、例えばブドウ糖、マンノース、スクロースなど、塩、例えば塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、または塩化カリウム、界面活性剤、例えば非イオン性界面活性剤、例えばｂｒｉｊｉ、ＰＳ−８０、ＰＳ−４０など。前記製剤は、ＥＤＴＡもしくはエタノール、またはＥＤＴＡおよびエタノールの組み合わせ、などの保存剤を含んでいてもよく、これらは１または複数の可能性のある分解経路を妨げると考えられている。
【０１９８】
１つの実施形態では、前記製剤は、例えば１×１０１０〜１×１０１４ウイルス粒子／投与の本開示の精製された腫瘍溶解性ウイルスを含み、例えば、１×１０１０〜１×１０１２ウイルス粒子／投与を含む。１つの実施形態では、前記製剤中のウイルスの濃度は、２×１０８〜２×１０１４ｖｐ／ｍＬの範囲内であり、例えば２×１０１２ｖｐ／ｍｌである。
【０１９９】
１つの実施形態では、前記非経口製剤はグリセロールを含む。
【０２００】
１つの実施形態では、前記製剤は、本明細書に記載の腫瘍溶解性アデノウイルスと、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸）と、グリセロールと、緩衝液とを含む。
【０２０１】
１つの実施形態では、前記非経口製剤は、本開示のウイルスと、例えば５ｍＭのＨＥＰＥＳと、例えば５〜２０％（ｖ／ｖ）のグリセロールと、例えばｐＨを７〜８の範囲内に調整するための塩酸と、注射用蒸留水と、からなる。
【０２０２】
１つの実施形態では、２×１０１２ｖｐ／ｍＬの濃度の０．７ｍＬの本開示のウイルスが、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２０％グリセロール中、最終ｐＨ７．８として、製剤化される。
【０２０３】
薬剤的に許容できる担体については、Remington’s Pharmaceutical Sciences（マック出版社（Mack Publishing Company）、ニュージャージー州、１９９１年）で十分な考察がなされている。
【０２０４】
１つの実施形態では、前記製剤は吸入を含む局所投与用の製剤として提供される。
【０２０５】
好適な吸入用製剤としては、吸入用散剤、プロペラントガスを含有する調量エーロゾル、またはプロペラントガスを含有しない吸入用溶液が挙げられる。本開示の吸入用散剤は通常、本明細書に記載のウイルスを、生理的に許容される賦形剤と共に含有する。
【０２０６】
これらの吸入用散剤は、単糖類（例えばグルコースまたはアラビノース）、二糖類（例えばラクトース、ショ糖、マルトース）、オリゴ糖および多糖類（例えばデキストラン）、多価アルコール（例えばソルビトール、マンニトール、キシリトール）、塩（例えば塩化ナトリウム、炭酸カルシウム）、またはこれらを互いに混合した物を含み得る。単糖類または二糖類が好適に用いられ、ラクトースまたはグルコースが、限定はされないが特に水和物の形態で、用いられる。
【０２０７】
肺沈着のための粒子は、１〜９μｍなど、１０μｍ未満の粒径を要求し、例えば０．１〜５μｍであり、特に１〜５μｍである。前記ウイルスを運ぶ粒子サイズは、第一に重要であるため、１つの実施形態では、本開示のウイルスは、所与のサイズのラクトース粒子などの粒子上に吸着または吸収され得る。
【０２０８】
前記吸入用エーロゾルの調製に使用できるプロペラントガスは、当該技術分野において公知のものである。好適なプロペラントガスは、ｎ−プロパン、ｎ−ブタン、またはイソブタンなどの炭化水素、並びに、メタン、エタン、プロパン、ブタン、シクロプロパン、またはシクロブタンを塩素化および／またはフッ素化した誘導体などのハロ炭化水素の中から選択される。上記のプロペラントガスは単独またはこれらの混合物として使用され得る。
【０２０９】
特に好適なプロペラントガスは、ＴＧ１１、ＴＧ１２、ＴＧ１３４ａ、およびＴＧ２２７の中から選択されるハロゲン化アルカン誘導体である。上記のハロゲン化炭化水素の中で、ＴＧ１３４ａ（１，１，１，２−テトラフルオロエタン）およびＴＧ２２７（１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン）並びにそれらの混合物は特に好適である。
【０２１０】
プロペラントガスを含有する吸入用エーロゾルは他の成分を含んでいてもよく、例えば、共溶媒、安定剤、界面活性剤、抗酸化剤、滑沢剤、およびｐＨを調整するための手段などである。これらの成分は全て当該技術分野において公知のものである。
【０２１１】
本発明のプロペラントガスを含有する吸入用エーロゾルは５重量％以下の活性物質を含有し得る。本発明のエーロゾルは、例えば、０．００２〜５重量％、０．０１〜３重量％、０．０１５〜２重量％、０．１〜２重量％、０．５〜２重量％、または０．５〜１重量％の活性成分を含有する。
【０２１２】
あるいは、肺への局所投与は、例えば、噴霧器、例えばコンプレッサに接続された噴霧器（例えば、バージニア州リッチモンドのパリ・レスピラトリー・イクイップメント社（Pari Respiratory Equipment, Inc.）によって製造された、Ｐａｒｉ  Ｍａｓｔｅｒ（登録商標）コンプレッサに接続されたＰａｒｉ  ＬＣ−Ｊｅｔ  Ｐｌｕｓ（登録商標）噴霧器）などのデバイスを用いた、溶液製剤または懸濁液製剤の投与によるものであってもよい。
【０２１３】
本発明のウイルスは、溶媒に分散して、例えば溶液または懸濁液の形態で、例えば非経口製剤についての上述の通りに、送達することができる。本発明のウイルスは、適切な生理溶液、例えば、生理食塩水または他の薬理学的に許容できる溶媒もしくは緩衝液の中に懸濁することができる。当該技術分野において公知の緩衝液は、４．０〜５．０程度のｐＨとなるように、１ｍｌの水当たり、０．０５ｍｇ〜０．１５ｍｇのエデト酸二ナトリウム、８．０ｍｇ〜９．０ｍｇのＮａＣｌ、０．１５ｍｇ〜０．２５ｍｇのポリソルベート、０．２５ｍｇ〜０．３０ｍｇの無水クエン酸、および０．４５ｍｇ〜０．５５ｍｇのクエン酸ナトリウムを含有し得る。
【０２１４】
前記治療用懸濁液または溶液製剤は１または複数の賦形剤を含有することもできる。賦形剤は当該技術分野において周知のものであり、例えば、緩衝液（例えば、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝溶液、および炭酸水素緩衝液）、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質（例えば、血清アルブミン）、ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム、リポソーム、マンニトール、ソルビトール、およびグリセロールが挙げられる。溶液または懸濁液は、リポソームまたは生分解性ミクロスフェア中にカプセル化することができる。前記製剤は通常、無菌の製造工程を用いて実質的に無菌形態で提供されることになる。
【０２１５】
この無菌製造工程は、当業者に周知の方法による、製剤に使用される緩衝溶媒／溶液の濾過、無菌緩衝溶媒溶液中の抗体の無菌的懸濁、および無菌容器への製剤の分注、による製造および滅菌を含み得る。
【０２１６】
本開示の噴霧可能な製剤は、例えば、ホイルエンベロープに詰めた単回投与単位（例えば、密封されたプラスチック製の容器またはバイアル）として提供されてもよい。各バイアルは、ある体積、例えば２ｍＬ、の緩衝溶媒／溶液中に単位量を含有する。
【０２１７】
治療
さらなる態様において、本開示は、治療、特にがん治療で使用される、本明細書に記載のウイルスまたはウイルス製剤を包含する。
【０２１８】
１つの実施形態では、前記治療法は、腫瘍、特に固形腫瘍、の治療で使用されるものである。
【０２１９】
腫瘍とは、本明細書で用いられる場合、制御されず進行性の過剰細胞分裂から生じた、新生物とも称される、異常組織塊を指すことが意図されている。腫瘍は良性（非がん性）であっても悪性であってもよい。腫瘍は全てのがん形態および転移を包含する。
【０２２０】
１つの実施形態では、前記腫瘍は固形腫瘍である。前記固形腫瘍は限局性であっても転移性であってもよい。
【０２２１】
１つの実施形態では、前記腫瘍は上皮由来の腫瘍である。
【０２２２】
１つの実施形態では、前記腫瘍は悪性腫瘍であり、例えば、結腸直腸がん、肝細胞腫、前立腺がん、膵がん、乳がん、卵巣がん、甲状腺がん、腎がん、膀胱がん、頭頸部がん、または肺がんなどである。
【０２２３】
１つの実施形態では、前記腫瘍は結腸直腸悪性腫瘍である。
【０２２４】
悪性腫瘍とは、本明細書で用いられる場合、がん性の細胞群を意味する。
【０２２５】
１つの実施形態では、前記腫瘍溶解性アデノウイルスは転移の治療または予防に使用される。
【０２２６】
１つの実施形態では、前記方法または製剤は、本明細書においては、薬剤耐性がんの治療で使用される。
【０２２７】
１つの実施形態では、前記ウイルスは、さらなるがん治療または療法の投薬と組み合わせて投与される。
【０２２８】
１つの実施形態では、本開示のウイルスまたは製剤の、がん、例えば上記のがん、を治療するための医薬の製造での使用が提供される。
【０２２９】
さらなる態様において、治療有効量の本開示のウイルスまたは製剤を、治療を必要とする患者、例えばヒト患者、に投与することを含む、がんを治療する方法が提供される。
【０２３０】
１つの実施形態では、前記腫瘍溶解性ウイルスまたは製剤は、本明細書において、別の治療法と組み合わせて投与される。
【０２３１】
「組み合わせて」とは、本明細書で使用される場合、腫瘍溶解性ウイルスががん治療または療法の前、同時および／または後に投与される場合を包含することを意図している。
【０２３２】
がん治療には、外科手術、放射線治療、標的療法、および／または化学療法が含まれる。
【０２３３】
がん治療とは、本明細書で用いられる場合、がんの治療を目的とした、治療化合物または生物学的作用物質、例えば抗体、を用いた治療、および／またはその維持療法を指す。
【０２３４】
１つの実施形態では、前記がん治療は、化学療法剤、標的化抗がん剤、放射線療法、放射性同位元素、またはこれらのあらゆる組み合わせを含む、あらゆる他の抗がん治療から選択される。
【０２３５】
１つの実施形態では、腫瘍溶解性アデノウイルスなどの本開示のウイルスを、外科手術などの療法の前処置として使用することで（ネオアジュバント療法）、腫瘍が収縮され、転移が治療され、および／または転移もしくはさらなる転移が予防され得る。前記腫瘍溶解性アデノウイルスを、外科手術などの治療後に使用することで（補助療法）、転移が治療され、および／または転移もしくはさらなる転移が予防され得る。
【０２３６】
同時にとは、本明細書で用いられる場合、腫瘍溶解性アデノウイルス製剤と同時またはほぼ同時の、追加のがん治療の投薬のことである。前記治療は同一製剤に含有されてもよいし、別々の製剤として投与されてもよい。
【０２３７】
１つの実施形態では、前記ウイルスは、化学療法剤の投与と組み合わせて投与される。
【０２３８】
化学療法剤とは、本明細書で用いられる場合、悪性細胞および悪性組織に対し選択的な破壊性を示す、特異的な抗悪性腫瘍性の化学薬品または薬剤を指すことが意図される。例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、アントラサイクリン、植物性アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、および他の抗腫瘍剤などである。化学療法の他の例としては、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、パクリタキセル、カペシタビン、イリノテカン、並びにシスプラチンおよびオキサリプラチンなどのプラチン類が挙げられる。好ましい用量は、治療されるがんの性質に基づいて実施者が選択してよい。
【０２３９】
１つの実施形態では、治療薬は、免疫応答および／または腫瘍血管新生（tumour vasculation）の制御を補助し得るガンシクロビルである。
【０２４０】
１つの実施形態では、本明細書における前記方法で使用される１または複数の治療法は、低用量の抗がん剤を用いた継続的または高頻度の治療であり、他の治療法と同時に与えられる場合が多い、メトロノミック療法である。
【０２４１】
亜群Ｂ腫瘍溶解性アデノウイルス、特にＡｄ１１、およびＥｎＡｄなどのそれ由来のものは、アポトーシスとはほとんど無関係の作用機序を有し、主に壊死性機序によりがん細胞を殺滅すると考えられることから、特に化学療法剤と相乗的であり得る。さらに、化学療法の際に生じる免疫抑制が腫瘍溶解性ウイルスをより効率的に機能させ得る。
【０２４２】
治療量とは、本明細書で用いられる場合、好適な治療レジメンで使用された場合に目的の治療効果を達成するのに適した、例えば疾患の症状または状態を改善するのに適した、腫瘍溶解性アデノウイルスなどの、ウイルスの量を指す。用量は、がんまたは転移の治療において、ウイルス粒子の数が以下をもたらすのに十分であり得る場合に、治療量と見なされ得る：腫瘍もしくは転移成長の鈍化もしくは停止、または腫瘍もしくは転移のサイズ縮小の確認、および／または患者の寿命の延長。適切な治療用量は、一般的に、治療効果と許容可能な毒性との間のバランスであり、例えば、治療によって達成された利益を考慮に入れて、副作用および毒性が許容可能である場合などである。
【０２４３】
１つの実施形態では、本開示のウイルスまたは治療用コンストラクト（それを含む製剤も包含する）は、毎週投与され、例えば、１週目は１日目、３日目、５日目に1回投与され、その後は１週間毎に１回投与される。
【０２４４】
１つの実施形態では、本開示のウイルスまたは治療用コンストラクト（それを含む製剤も包含する）は、２週間毎または３週間毎に投与され、例えば、第１週目に１日目、３日目、および５日目に１回投与され、第２週目または第３週目の１日目、３日目、および５日目にも投与される。この投与計画は必要に応じて何度でも繰り返すことができる。
【０２４５】
１つの実施形態では、本開示のウイルスまたは治療用コンストラクト（それを含む製剤も包含する）は、毎月投与される。
【０２４６】
１つの実施形態では、本開示のウイルスおよびコンストラクトは、組換え技術によって作製される。当業者には理解されることであるが、前記搭載済みアデノウイルスゲノムは、当該ゲノムまたは当該ゲノムの全ての一部を含むプラスミドの完全合成を含む、他の技術手段によって製造することができる。当業者には理解されることであるが、ゲノムを合成する場合、挿入領域は、クローニング法を用いた遺伝子挿入後の人工産物であるために、制限酵素認識部位ヌクレオチドを含まない場合がある。
【０２４７】
本開示は、本明細書における、導入遺伝子または導入遺伝子カセットの挿入から入手されるまたは入手可能な式（Ｉ）またはその部分式のアデノウイルス、をさらに包含する。
【０２４８】
「である（is）」は、本明細書で用いられる場合、含む（comprise）を意味する。
【０２４９】
本明細書との関連において、「含む（comprising）」は、「含む（including）」として解釈されるものとする。
【０２５０】
ある特定の特徴／要素を含む本発明の実施形態は、関連する要素／特徴から「成る」または「本質的に成る」別の実施形態も包含することが意図される。
【０２５１】
技術的に適切であれば、本発明の実施形態は組み合わせてもよい。
【０２５２】
特許および出願などの技術参考文献は参照によって本明細書に援用される。
【０２５３】
本明細書で具体的かつ明示的に記載されたあらゆる実施形態は、単独で、または１もしくは複数の別の実施形態と組み合わせて、権利放棄の根拠を形成する場合がある。
【０２５４】
本願は、参照によって本明細書に援用される、英国特許第１７１３７６５．４号、国際公開第２０１８／０４１８３８号、および国際公開第２０１８／０４１８２７号に基づく優先権を主張するものである。これらの文書は、本明細書中の誤り、特に配列表中の誤りを修正するために使用することができる。本発明を下記の実施例で単なる例示としてさらに説明するが、実施例では以下の添付の図面が参照されている。
【図面の簡単な説明】
【０２５５】
【図１】図１は、導入遺伝子カセットであるＮＧ−６１５、ＮＧ−６４０、およびＮＧ−６４１を模式的に示している。
【図２−１】肺癌細胞株、乳癌細胞株、および膀胱癌細胞株におけるウイルスゲノム複製。Ａ５４９細胞株（Ａ）、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞株（Ｂ）、およびＲＴ４細胞株（Ｃ）を、ウイルス粒子であるＮＧ−６１７、ＮＧ−６１５、ＮＧ−６４０、ＮＧ−６４１、またはＥｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖで最長７日間処理した。処理の２日後、３日後、４日後、および７日後に、ｑＰＣＲで検出されるウイルスゲノムの量を評価した。
【図２−２】同上。
【図３】図３Ａはウイルスを介した肺癌細胞の腫瘍崩壊。Ａ５４９細胞株を、ウイルス粒子であるＮＧ−６１７、ＮＧ−６１５、ＮＧ−６４０、ＮＧ−６４１、またはＥｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖで最長４日間処理した。培養の全体を通じて、ｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅシステムを用いて、細胞生存率を評価した（Ａ）。  図３Ｂは各ウイルス処理について、５０％死滅が確認された時間（ＫＴ５０）を求めた（Ｂ）。
【図４】肺癌細胞および膀胱癌細胞におけるＮＧ−６１５導入遺伝子発現。Ａ５４９（左パネル）およびＲＴ４細胞（右パネル）を、最長７日間、ウイルス粒子であるＮＧ−６１５もしくはＥｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖで処理するか、または非感染のままにした。Ｆｌｔ３リガンド（Ａ）、ＭＩＰ１α（Ｂ）、およびＩＦＮα（Ｃ）の分泌を、細胞上清中で、ＥＬＩＳＡによって評価した。Ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ処理群または未処理対照群の細胞では導入遺伝子発現は検出されなかった（データ未記載）。
【図５】肺癌細胞および膀胱癌細胞におけるＮＧ−６４１導入遺伝子発現。Ａ５４９（左パネル）およびＲＴ４細胞（右パネル）を、最長７日間、ウイルス粒子であるＮＧ−６４１もしくはＥｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖで処理するか、または非感染のままにした。ＣＸＣＬ９（Ａ）、ＣＸＣＬ１０（Ｂ）、またはＩＦＮα（Ｃ）の分泌を、細胞上清中で、ＥＬＩＳＡによって評価した。Ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ処理群または未処理対照群の細胞では導入遺伝子発現は検出されなかった（データ未記載）。
【図６】肺癌細胞における機能的導入遺伝子の発現。Ａ５４９細胞株を、ウイルス粒子であるＮＧ−６１５、ＮＧ−６４１、またはＥｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖで最大４日間処理した。処理の４日後、産生されている機能的なＩＦＮα導入遺伝子（Ａ）または機能的なＭＩＰ１α導入遺伝子（Ｂ）のレベルを、細胞ベースのレポーターアッセイを用いて評価した。
【図７−１】肺癌細胞における機能的ＦＡＰ−ＢｉＴＥの発現。Ａ５４９細胞株を、ウイルス粒子であるＮＧ−６１５、ＮＧ−６４１、またはＥｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖで最大４日間処理した。処理の２日後（Ａ）、３日後（Ｂ）、および４日後（Ｃ）、ＦＡＰを発現する線維芽細胞株ＭＲＣ−５と共培養されたジャーカットＴ細胞株の活性化を測定することにより、細胞上清中の機能的なＦＡＰ−ＢｉＴＥの発現レベルを評価した。
【図７−２】同上。
【図８】図８ＡはＮＧ−６４１感染Ａ５４９細胞から得られた上清中の、導入遺伝子にコードされたＩＦＮαは、Ｊｕｒｋａｔ−Ｄｕａｌレポーター細胞によるＳＥＡＰ産生を誘導する。Ｊｕｒｋａｔ−Ｄｕａｌレポーター細胞を、未感染（ＵＩＣ）またはＥｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ感染（ＥｎＡｄ）もしくはＮＧ−６４１感染のＡ５４９がん細胞株から得られた上清で処理し、分泌型胚性アルカリホスファターゼ（secreted embryonic alkaline phosphatase）（ＳＥＡＰ）レポーターのレベルを測定した。  図８ＢはＮＧ−６４１感染Ａ５４９細胞から得られた上清中の、導入遺伝子にコードされたＣＸＣＬ９／１０は、ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ  β−Ａｒｒｅｓｔｉｎ細胞のＧＰＣＲ経路を活性化する。ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ  β−Ａｒｒｅｓｔｉｎ細胞を、未感染（ＵＩＣ）またはＥｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ感染（ＥｎＡｄ）もしくはＮＧ−６４１感染のＡ５４９がん細胞株から得られた上清で処理し、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）経路のＣＸＣＬ９／１０特異的誘導を、発光により検出した。
【図９】ＮＧ−６４１感染Ａ５４９細胞から得られた上清中の、導入遺伝子にコードされたＣＸＣＬ９／１０は、活性化Ｔ細胞の表面上のＣＸＣＲ３のダウンレギュレーションを誘導する。抗ＣＤ３／ＣＤ２８で活性化されたヒトＴ細胞を、未感染（ＵＩＣ）またはＥｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ感染（ＥｎＡｄ）もしくはＮＧ−６４１感染のＡ５４９がん細胞株から得られた上清で処理し、導入遺伝子であるＣＸＣＬ９／１０によって誘導された、ＣＸＣＲ３のダウンレギュレーションを、フローサイトメトリーで測定した。
【図１０−１】ＥｎＡｄ、ＮＧ−６１５、ＮＧ−６１７、ＮＧ−６４０、もしくはＮＧ−６４１、抗ＣＤ３／２８と共に播種された、または未感染（ＵＩＣ）の、初代ヒト腫瘍試料のエキソビボ培養物中の、内因性腫瘍浸潤性Ｔ細胞の活性化。ウイルス性導入遺伝子産物であるＩＦＮａおよびＦｌｔ３ＬのレベルをＡ）に示し、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−１７Ａ、グランザイムＢ、およびＩＬ−１３のレベルをＢ）に示す。
【図１０−２】同上。
【図１０−３】同上。
【図１１−１】ＥｎＡｄ、ＮＧ−６１７、ＮＧ−６４０、もしくはＮＧ−６４１で処理された、または未感染（ＵＩＣ）の、初代ＮＳＣＬＣ試料のエキソビボ培養物中の、内因性腫瘍浸潤性Ｔ細胞における、表面マーカー発現活性化および細胞内サイトカイン。ＣＤ２５、ＣＤ６９、およびＣＤ１０７ａを発現する、ＣＤ４  Ｔ細胞のレベルおよびＣＤ８  Ｔ細胞のレベルを、それぞれ図１１Ａおよび図１１Ｂに示す。ＣＤ４  Ｔ細胞およびＣＤ８  Ｔ細胞によって発現された細胞内のＩＦＮγレベルおよびＴＮＦαレベルを、それぞれ図１１Ｃおよび図１１Ｄに示す。
【図１１−２】同上。
【図１１−３】同上。
【図１１−４】同上。
【図１１−５】同上。
【図１１−６】同上。
【図１１−７】同上。
【図１１−８】同上。
【図１２】任意のデカヒスチジンアフィニティータグを含むまたは含まない、本開示のＢｉＴＥ抗体の模式図。Ｉｇ  ＳＰ：シグナルペプチド；１０Ｈｉｓ：デカヒスチジンアフィニティータグ；Ｌ：ＧＳリンカー；ＶＬ：軽鎖可変ドメイン；ＶＨ：重鎖可変ドメイン。
【図１３】１３Ａは組み換えＢｉＴＥの定量化を示すドットブロット。  １３ＢはＦＡＰについてのＥＬＩＳＡ結果を示すグラフ。
【図１４−１】１４Ａはフローサイトメトリーを用いて測定された、ＦＡＰ  ＢｉＴＥおよび対照ＢｉＴＥの存在下で、単独またはＮＨＤＦ細胞と共培養されたＴ細胞の、ＣＤ６９の発現レベル（Ａ）およびＣＤ２５の発現レベル（Ｂ）を示すグラフ。
【図１４−２】同上。
【図１４−３】図１４Ｃは細胞内サイトカイン染色で測定された、ＦＡＰ  ＢｉＴＥおよび対照ＢｉＴＥの存在下で、単独またはＮＨＤＦ細胞と共培養されたＴ細胞の、ＩＦＮγ発現レベルを示すグラフ。
【図１５】図１５ＡはＴ細胞およびＦＡＰ  ＢｉＴＥまたは対照ＢｉＴＥと共培養されたＮＨＤＦ細胞の細胞傷害性（cytoxicity）を示す、ＬＤＨアッセイの結果を示すグラフ。  図１５ＢはＴ細胞およびＦＡＰ  ＢｉＴＥまたは対照ＢｉＴＥと共培養されたＢＴＣ１００細胞の細胞傷害性（cytoxicity）を示す、ＬＤＨアッセイの結果を示すグラフ。  図１５ＣはＴ細胞と、ＦＡＰ  ＢｉＴＥまたは対照ＢｉＴＥと共培養した後の、ＮＨＤＦ細胞の画像。
【図１６】複数の細胞および細胞株における、ＥｐＣＡＭ発現細胞およびＦＡＰ発現細胞の割合を示すグラフ。
【図１７−１】図１７ＡはＢｉＴＥ濃度を漸増させた場合の、ＦＡＰ  ＢｉＴＥに対するＮＨＤＦの用量反応を示すグラフ。
【図１７−２】図１７ＢはＴ細胞およびＥｐＣＡＭ  ＢｉＴＥまたは対照ＢｉＴＥと共培養されたＤＬＤ細胞の細胞傷害性（cytoxicity）を示す、ＬＤＨアッセイの結果を示すグラフ。
【図１８】図１８ＡはＦＡＰ抗体または同位体対照抗体によって測定され、フローサイトメトリーで解析された、ＣＨＯ細胞におけるＦＡＰ発現を示すグラフ。  図１８ＢはＴ細胞およびＦＡＰ  ＢｉＴＥまたは対照ＢｉＴＥと共培養されたＣＨＯ細胞またはＣＨＯ−ＦＡＰ細胞の細胞傷害性（cytoxicity）を示す、ＬＤＨアッセイの結果を示すグラフ。
【図１９】フローサイトメトリーを用いて解析された、ＣＨＯ−ＦＡＰ細胞と比較した、ＣＨＯ細胞による、Ｔ細胞の活性化（ＣＤ６９およびＣＤ２５の発現レベルに基づく活性化）を示すグラフ。
【図２０】図２０Ａはフローサイトメトリーを用いて解析された、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化するＦＡＰ  ＢｉＴＥの能力（ＣＤ６９およびＣＤ２５の発現レベルに基づく活性化）を示すグラフ。  図２０ＢはＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞およびＦＡＰ  ＢｉＴＥまたは対照ＢｉＴＥと共培養されたＮＨＤＦ細胞の細胞傷害性（cytoxicity）を示す、ＬＤＨアッセイの結果を示すグラフ。
【図２１】図２１Ａは対照ＢｉＴＥまたはＦＡＰ  ＢｉＴＥと共に培養された、腹水由来のＣＤ３＋Ｔ細胞の数を示すグラフ。  図２１Ｂは対照ＢｉＴＥまたはＦＡＰ  ＢｉＴＥと共に培養された、腹水由来のＴ細胞のＣＤ２５発現レベルを示すグラフ。  図２１Ｃは対照ＢｉＴＥまたはＦＡＰ  ＢｉＴＥと共に培養された、腹水由来のＦＡＰ＋細胞の数を示すグラフ。
【図２２】図２２ＡはＮＧ−６０１、ＮＧ−６０２、ＮＧ−６０３、ＮＧ−６０４、ＮＧ−６０５、ＮＧ−６０６、およびＥｎＡｄについての、細胞当たりで検出されたウイルスゲノム数の定量化を示すグラフ。  図２２ＢはＡ５４９細胞の感染によって評価された、ＮＧ−６０１、ＮＧ−６０２、ＮＧ−６０３、ＮＧ−６０４、ＮＧ−６０５、ＮＧ−６０６、またはＥｎＡｄの腫瘍溶解活性を示すグラフ。
【図２３−１】フローサイトメトリーを用いて解析された、ＣＨＯ−ＦＡＰと共培養された場合の、ＮＧ−６０１、ＮＧ−６０２、ＮＧ−６０５、およびＮＧ−６０６によるＴ細胞の活性化（ＣＤ６９およびＣＤ２５の発現レベルに基づく）を示すグラフ。
【図２３−２】同上。
【図２４】ＮＧ−６０５およびＮＧ−６０６から産生されたＦＡＰ  ＢｉＴＥの量を測定するための実験の結果を示すグラフ。
【図２５】ＮＧ−６０７、ＮＧ−６０８、ＮＧ−６０９、およびＮＧ−６１０を感染させたＡｄ２９３細胞の顕微鏡画像。
【図２６】図２６ＡはＸＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅを用いて解析された、ＮＧ−６０３、ＮＧ−６０４、ＮＧ−６０５、ＮＧ−６０６、およびＥｎＡｄの、ＮＨＤＦ細胞を殺滅する能力を示すグラフ。  図２６ＢはＬＤＨアッセイを用いて解析された、ＮＧ−６０３、ＮＧ−６０４、ＮＧ−６０５、ＮＧ−６０６、およびＥｎＡｄの、ＮＨＤＦ細胞を殺滅する能力を示すグラフ。
【図２７】フローサイトメトリーを用いて解析された、ＮＨＤＦ細胞、ＳＫＯＶ細胞、およびＴ細胞と共培養された、ＮＧ−６０３、ＮＧ−６０４、ＮＧ−６０５、ＮＧ−６０６によるＴ細胞の活性化（ＣＤ６９およびＣＤ２５の発現レベルに基づく）を示すグラフ。
【図２８】図２８Ａはフローサイトメトリーを用いて解析された、ＳＫＯＶ細胞単独と比較した場合の、ＮＨＤＦ細胞およびＳＫＯＶ細胞と共培養された、ＮＧ−６０３、ＮＧ−６０４、ＮＧ−６０５、ＮＧ−６０６によるＴ細胞の活性化（ＣＤ６９およびＣＤ２５の発現レベルに基づく）を示すグラフ。  図２８ＢはＬＤＨアッセイを用いて解析された、ＮＧ−６０５およびＮＧ−６０６に感染したＮＨＤＦ細胞の細胞傷害性を示すグラフ。
【図２９】組換え型のＦＡＰ  ＢｉＴＥ、ＥｎＡｄ、ＮＧ−６０３、またはＮＧ−６０５による、ＮＨＤＦ細胞の溶解の、微速度ビデオから得られた静止画像。
【図３０】ＮＧ−６０７、ＮＧ−６０８、ＮＧ−６０９、またはＮＧ−６１０による、ＮＨＤＦ細胞の溶解の、微速度ビデオから得られた静止画像。
【図３１】ＬＤＨアッセイを用いて解析された、Ｔ細胞存在下またはＴ細胞非存在下における、ＥｎＡｄ、ＮＧ−６０１、ＮＧ−６０２、ＮＧ−６０３、およびＮＧ−６０４に感染したＤＬＤ細胞の細胞傷害性を示すグラフ。
【図３２】図３２Ａは本開示のウイルスに感染した、腹水試料中のＣＤ３＋Ｔ細胞上の、ＣＤ２５の発現レベルを示すグラフ。  図３２Ｂは本開示のウイルスに感染した、腹水試料中のＦＡＰ＋細胞の数を示すグラフ。
【図３３】本開示のウイルスに感染した、がん患者から採取した腹水試料中のＣＤ３＋Ｔ細胞の数を示すグラフ。
【図３４】本開示のウイルスに感染した、がん患者から採取した腹水試料中のＣＤ３＋Ｔ細胞上の、ＣＤ２５発現レベルを示すグラフ。
【図３５】本開示のウイルスに感染した、がん患者から採取した腹水試料中のＦＡＰ＋細胞の数を示すグラフ。
【図３６】図３６Ａはヒト線維芽細胞の存在下における組換えＦＡＰ  ＢｉＴＥタンパク質によるＴ細胞サイトカイン産生の活性化と、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズでのポリクローナル活性化による前記活性化の比較。（Ａ）ＥＬＩＳＡで測定されたＩＦＮγレベル。  図３６Ｂは（Ｂ）サイトカインビーズアレイで測定されたサイトカインレベル。
【図３７−１】図３７ＡＦＡＰ標的化ＢｉＴＥはＴ細胞の脱顆粒、およびＦＡＰ＋細胞の特異的細胞傷害性を誘導する。（Ａ）ＮＨＤＦ細胞と共培養（５：１）されたＴ細胞の脱顆粒、および（Ｂ）ＢｉＴＥを含有する上清。脱顆粒は、ＣＤ１０７ａ特異的抗体との６時間培養後のＣＤ１０７ａの外面化によって評価し、フローサイトメトリーにより測定した。陽性対照としてはＣＤ３／ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄを用いた。
【図３７−２】図３７Ｃは（Ｃ）Ｔ細胞（１：５）、およびＢｉＴＥ含有上清の１０倍連続希釈系列との共培養下、２４時間後のＮＨＤＦ細胞の細胞傷害性。細胞傷害性は、培養上清中へのＬＤＨの放出によって評価した。  図３７Ｄは  （Ｄ）ＬＤＨ放出（左）およびＴ細胞上のＣＤ２５誘導（右）によるＮＨＤＦの溶解を、６人の健常ドナー由来のＰＢＭＣ由来Ｔ細胞（１：５）およびＢｉＴＥ含有上清との２４時間の共培養後に、評価した。
【図３８−１】図３８はＦＡＰ  ＢｉＴＥを発現するＥｎＡｄはＦＡＰ＋線維芽細胞を選択的に殺滅し、腹腔腹水（peritoneal ascites）試料中のＴＧＦｂを減少させる。（Ａ、Ｂ）ＰＢＭＣ由来Ｔ細胞およびＥｎＡｄまたは組換えウイルスとの７２時間の培養後の、ＦＡＰ＋線維芽細胞の数（Ａ）およびＥｐＣＡＭ＋腫瘍細胞の数（Ｂ）。腹水細胞をまず３人の患者の腹水から単離して、エキソビボで増殖させた。感染の７２時間後に、フローサイトメトリーで細胞数を測定した。
【図３８−２】図３８Ｃは（Ｃ）（Ａ）から得られたＰＢＭＣ由来ＣＤ３細胞上の活性化マーカーＣＤ２５の誘導を、感染の７２時間後に測定した。  図３８Ｄは（Ｄ）ＴＧＦｂのレベルを、（Ａ）から採取された上清を用いて、ＥＬＩＳＡにより測定した。
【図３９】図３９ＡはＦＡＰ  ＢｉＴＥタンパク質およびＥｎＡｄ−ＦＡＰＢｉＴＥウイルスによる、患者の悪性腹水生検試料における、内因性腫瘍関連Ｔ細胞の活性化およびそれに伴うＦＡＰ＋細胞の殺滅。（Ａ）ＣＤ２５発現によって測定されたＴ細胞の活性化。  図３９Ｂ（Ｂ）フローサイトメトリーによって測定されたＦＡＰ＋細胞の残存数。
【図４０−１】図４０Ａは患者試料における、ＢｉＴＥを介したＴ細胞の活性化に対する、ＰＤ−Ｌ１阻止抗体の影響。（Ａ）腹腔腹水から最初に単離された後の、内因性Ｔ細胞によるＰＤ１の発現およびＦＡＰ＋細胞上のＰＤ−Ｌ１の発現を、フローサイトメトリーで評価した。  図４０Ｂは（Ｂ）腹腔腹水から得た、純化していない全細胞を、同じ滲出液から得た５０％体液中、遊離ＢｉＴＥ、ＥｎＡｄ、または組換えウイルスの存在下、抗ＰＤ−Ｌ１遮断抗体の存在下または非存在下で、インキュベートした。２日後、全細胞集団を回収し、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の数をフローサイトメトリーで定量化した。
【図４０−２】図４０Ｃは（Ｃ）ＥＬＩＳＡによって測定された、（Ｂ、Ｄ）から得られた培養上清中のインターフェロンγの含量。  図４０Ｄは（Ｄ）（Ｂ）中のＦＡＰ＋細胞の残存数を、フローサイトメトリーを用いて測定した。
【図４１−１】図４１ＡはＢｉＴＥを発現するＥｎＡｄは、患者生検試料由来のＴ細胞を活性化およびリダイレクトして、ＮＨＤＦ線維芽細胞を溶解させる。（Ａ）健常ドナーまたは悪性滲出液がん生検試料からの単離後の内因性Ｔ細胞によるＰＤ−１の発現。ＰＤ−１発現はフローサイトメトリーで測定した。  図４１Ｂは（Ｂ）フローサイトメトリーで測定された、未純化のＰＢＭＣ細胞集団内およびがん生検試料内の、ＣＤ３＋細胞の割合。
【図４１−２】図４１Ｃは（Ｃ）処理の１２０時間後の（Ｂ）から回収された培養上清中の、ＥＬＩＳＡで測定されたインターフェロンγのレベル。  図４１Ｄは（Ｄ）ＮＨＤＦ線維芽細胞の生存率を、ＰＢＭＣ細胞または全がん生検細胞（１：５）およびＢｉＴＥ含有上清との共培養下、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ細胞傷害性アッセイにより、１３０時間に亘ってリアルタイムでモニターした。
【図４２】図４２ＡはＦＡＰ  ＢｉＴＥを介したＰＢＭＣ  Ｔ細胞の活性化および抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを介したＰＢＭＣ  Ｔ細胞の活性化に対する、免疫抑制性腹水試料の影響。（Ａ）抗ＣＤ３／Ｃｄ２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓで活性化されたＰＢＭＣ  Ｔ細胞。  図４２Ｂは（Ｂ）ＮＨＤＦ細胞の存在下、対照ＢＩＴＥまたはＦＡＰ  ＢＩＴＥで活性化されたＰＢＭＣ  Ｔ細胞。ＮＳ：正常血清、Ａ：腹腔腹水。
【図４３−１】図４３ＡはＦＡＰ  ＢｉＴＥを発現するＥｎＡｄは、患者腹水中のＣＤ１１ｂ＋マクロファージをより炎症性の表現型に偏らせる。（Ａ）腹水試料由来の未純化全細胞を、遊離ＢｉＴＥまたはＢｉＴＥ発現ウイルスの存在下、５０％腹水中でインキュベートした。陽性対照として、インターフェロンγ処理を用いた。３日後、全細胞集団を回収し、ＣＤ３＋細胞上の活性化マーカーＣＤ２５の誘導をフローサイトメトリーで測定した。  図４３Ｂは（Ｂ）ＥＬＩＳＡによって測定された、（Ａ）から得られた培養上清中のインターフェロンγのレベル。
【図４３−２】図４３Ｃは（Ｃ）３日後の時点で、（Ａ）から得られたＣＤ１１ｂ＋細胞上のＣＤ６８、ＣＤ８６、ＣＤ２０６、およびＣＤ１６３の発現レベルをフローサイトメトリーで測定した。完全なデータセットと併記して、トリプリケートからの代表的なフローサイトメトリースペクトルが示される。
【図４４−１】固形前立腺腫瘍の構造および細胞構成の特性評価。ＥＬＩＳＡによって測定された、組織スライス培養液中のＩＦＮｇのレベル。指定の時点で悪性組織スライス培養液および良性組織スライス培養液から上清を回収し；悪性組織および良性組織の組織培養液中のＩＬ−２のレベルをＥＬＩＳＡで測定した。
【図４４−２】同上。
【図４４−３】同上。
【図４５】導入遺伝子カセットの模式図。
【図４６】ＮＧ−６１１で処理された腫瘍細胞、ＮＧ−６１２で処理された腫瘍細胞、およびＮＧ−６１７で処理された腫瘍細胞における、１細胞当たりで検出されたウイルスゲノムの数を示すグラフ。
【図４７】ＮＧ−６１２、Ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ、または無処理対照の上清と比較した、ＥｐＣａｍ発現ＳＫＯＶ細胞と、ＮＧ−６１１ウイルス粒子処理の２４時間後、４８時間後、または７２時間後のＡ５４９細胞から回収された上清との共培養後の、ＣＤ６９（ａ）、ＣＤ２５（ｂ）、ＨＬＡ−ＤＲ（ｃ）、ＣＤ４０Ｌ（ｄ）、または細胞表面ＣＤ１０７ａ（ｅ）を発現するＴ細胞の割合。
【図４８】ＮＧ−６１１、Ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ、または無処理対照の上清と比較した、ＦＡＰ発現ＭＲＣ−５細胞と、ＮＧ−６１２ウイルス粒子処理の２４時間後、４８時間後、または７２時間後のＡ５４９細胞から回収された上清との共培養後の、ＣＤ６９（ａ）、ＣＤ２５（ｂ）、ＨＬＡ−ＤＲ（ｃ）、ＣＤ４０Ｌ（ｄ）、または細胞表面ＣＤ１０７ａ（ｅ）を発現するＴ細胞の割合。
【図４９】ＥｐＣＡＭおよびＦＡＰを発現するＭＲＣ−５細胞の割合。
【図５０】ＮＧ−６１１ウイルス粒子、ＮＧ−６１２ウイルス粒子、もしくはＥｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖウイルス粒子による処理の２４時間後、４８時間後、もしくは７２時間後のＡ５４９細胞から回収された上清、または無処理対照上清、と共にインキュベートされた、ＳＫＯＶ細胞（Ａ）またはＭＲＣ−５細胞（Ｂ）と共培養されたＴ細胞の上清中のＩＦＮγ発現。
【図５１】図５１ＡはインビボにおけるＢｉＴＥ発現ウイルスの抗腫瘍効力および免疫活性化。（ａ）生理食塩水、Ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ、またはＮＧ−６１１で処理されたマウスにおける腫瘍体積。  図５１Ｂは（ｂ）Ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ処理または無処理対照と比較した、ＮＧ−６１１処理腫瘍における、ＣＤ４  Ｔ細胞に対するＣＤ８  Ｔ細胞の比率。
【図５２】ＮＧ−６１２で処理された腫瘍細胞およびＮＧ−６１５で処理された腫瘍細胞における、１細胞当たりで検出されたウイルスゲノムの数を示すグラフ。
【図５３】Ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖおよび無処理対照腫瘍細胞の上清と比較した、ＮＧ−６１５の細胞上清中のＩＦＮα、ＭＩＰ１α、およびＦｌｔ３  Ｌの発現。
【図５４】ＮＧ−６１２、Ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ、または無処理対照の上清と比較した、ＦＡＰ発現ＭＲＣ−５細胞と、ＮＧ−６１５ウイルス粒子処理の２４時間後、４８時間後、または７２時間後のＡ５４９細胞から回収された上清との共培養後の、ＣＤ６９（ａ）、ＣＤ２５（ｂ）、ＨＬＡ−ＤＲ（ｃ）、ＣＤ４０Ｌ（ｄ）、または細胞表面ＣＤ１０７ａ（ｅ）を発現するＴ細胞の数。
【図５５】ＮＧ−６１２ウイルス粒子、ＮＧ−６１５ウイルス粒子、もしくはＥｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖウイルス粒子による処理の２４時間後、４８時間後、もしくは７２時間後のＡ５４９細胞から回収された上清、または無処理対照上清、と共にインキュベートされた、ＭＲＣ−５細胞と共培養されたＴ細胞の上清中のＩＦＮγ発現。
【０２５６】
配列
配列番号１：Ｎ末端にシグナル配列、Ｃ末端に１０Ｈｉｓアフィニティータグを有する、抗ＦＡＰ  ＢｉＴＥのＤＮＡコード配列
配列番号２：Ｎ末端にシグナル配列、Ｃ末端に１０Ｈｉｓアフィニティータグを有する、抗ＦＡＰ  ＢｉＴＥのアミノ酸配列
配列番号３：Ｎ末端にシグナル配列、Ｃ末端に１０Ｈｉｓアフィニティータグを有する、対照（抗ＦＨＡ）ＢｉＴＥのＤＮＡコード配列
配列番号４：Ｎ末端にシグナル配列、Ｃ末端に１０Ｈｉｓアフィニティータグを有する、対照（抗ＦＨＡ）ＢｉＴＥのアミノ酸配列
配列番号５：抗ＣＤ３  ＳｃＦｖのアミノ酸配列
配列番号６：抗ＣＤ３  ＶＨ
配列番号７：抗ＣＤ３  ＶＬ
配列番号８：抗ＣＤ３  ＳｃＦｖリンカー配列
配列番号９：抗ＦＡＰ  ＳｃＦｖ
配列番号１０：抗ＦＡＰ  ＶＬドメイン
配列番号１１：抗ＦＡＰ  ＶＨドメイン
配列番号１２：抗ＦＡＰおよび抗ＥｐＣＡＭのリンカー配列
配列番号１３：ＢｉＴＥリーダー配列
配列番号１４：対照ＢｉＴＥ（抗ＦＨＡ）
配列番号１５：対照（抗ＦＨＡ）ＳｃＦｖ
配列番号１６：対照（抗ＦＨＡ）ＶＬ
配列番号１７：対照（抗ＦＨＡ）ＶＨ
配列番号１８：対照（抗ＦＨＡ）ＳｃＦｖリンカー配列
配列番号１９：１０Ｈｉｓタグ配列
配列番号２０：ＦＡＰ  ＢｉＴＥ−Ｐ２Ａ−ＲＦＰ（イタリック体＝リーダー、太字＝フーリン切断部位、下線＝Ｐ２Ａ配列、小文字＝ＲＦＰ）
配列番号２１：対照（抗ＦＨＡ）ＢｉＴＥ−Ｐ２Ａ−ＲＦＰ（イタリック体＝リーダー、太字＝フーリン切断部位、下線＝Ｐ２Ａ配列、小文字＝ＲＦＰ）
配列番号２２：ヒトＦＡＰのＤＮＡコード配列
配列番号２３：ヒトＦＡＰのアミノ酸配列
配列番号２４：ＣＭＶプロモーター配列
配列番号２５：ＳＶ４０  ｌａｔｅポリアデニル化配列
配列番号２６：ＮＧ−６０５（ＥｎＡｄ−ＣＭＶ−ＦＡＰＢｉＴＥ）
配列番号２７：ＮＧ−６０６（ＥｎＡｄ−ＳＡ−ＦＡＰＢｉＴＥ）
配列番号２８：ＥｎＡｄゲノム
配列番号２９：ＥｎＡｄゲノムの２８１６６ｂｐ〜２８３６６ｂｐに対応し、それを含む、ＢＸのＤＮＡ配列
配列番号３０：ＥＮＡＤゲノムの２９３４５〜２９３７９ＢＰに対応し、それを含む、ＢＹのＤＮＡ配列
配列番号３１：ＨＩＳタグ
配列番号３２：スプライスアクセプター配列
配列番号３３：ＳＶ４０ポリアデニル化配列
配列番号３４：ＦＡＰ  ＢｉＴＥ核酸配列（ＯＫＴ３）
配列番号３５：ＦＡＰ  ＢｉＴＥ核酸配列（ａＣＤ３）
配列番号３６：ＮＧ−６１１導入遺伝子カセット
配列番号３７：ＮＧ−６１２導入遺伝子カセット
配列番号３８：ＮＧ−６１３導入遺伝子カセット
配列番号３９：制限酵素認識部位インサート（ＢＸ）
配列番号４０：制限酵素認識部位インサート（ＢＹ）
配列番号４１：ＣＭＶプロモーター配列
配列番号４２：ＰＧＫプロモーター配列
配列番号４３：ＣＢＡプロモーター配列
配列番号４４：短スプライスアクセプター（ＳＳＡ）ＤＮＡ配列
配列番号４５：スプライスアクセプター（ＳＡ）ＤＮＡ配列
配列番号４６：分岐状スプライスアクセプター（ｂＳＡ）ＤＮＡ配列
配列番号４７：コザック配列（ヌル配列）
配列番号４８：開始コドンの例
配列番号４９：内部リボソーム進入配列（Internal Ribosome Entry Sequence）（ＩＲＥＳ）
配列番号５０：Ｐ２Ａペプチド
配列番号５１：Ｆ２Ａペプチド
配列番号５２：Ｅ２Ａペプチド
配列番号５３：Ｔ２Ａペプチド
配列番号５４：ポリアデニル化（ポリＡ）配列
配列番号５５：リーダー配列
配列番号５６：リーダー配列
配列番号５７：ＩＦＮγアミノ酸配列
配列番号５８：ＩＦＮαアミノ酸配列
配列番号５９：ＴＮＦαアミノ酸配列
配列番号６０：ＥｎＡｄゲノムのＥ２Ｂ領域（ｂｐ１０３５５〜５０６８）に対応するＤＮＡ配列
配列番号６１：Ｎ末端にシグナル配列を持ち、Ｃ末端に１０Ｈｉｓアフィニティータグを持たない、抗ＦＡＰ  ＢｉＴＥのＤＮＡコード配列
配列番号６２：Ｎ末端にシグナル配列を持ち、Ｃ末端に１０Ｈｉｓアフィニティータグを持たない、抗ＦＡＰ  ＢｉＴＥのアミノ酸配列
配列番号６３：Ｎ末端にシグナル配列を持ち、Ｃ末端に１０Ｈｉｓアフィニティータグを持たない、対照（抗ＦＨＡ）ＢｉＴＥのＤＮＡコード配列
配列番号６４：Ｎ末端にシグナル配列を持ち、Ｃ末端に１０Ｈｉｓアフィニティータグを持たない、対照（抗ＦＨＡ）ＢｉＴＥのアミノ酸配列
配列番号６５：Ｃ末端に１０Ｈｉｓアフィニティータグを持たない、対照ＢｉＴＥ（抗ＦＨＡ）
配列番号（Q ID NO:）６６：１０Ｈｉｓアフィニティータグを持たない、ＮＧ−６０５（ＥｎＡｄ−ＣＭＶ−ＦＡＰＢｉＴＥ）
配列番号６７：１０Ｈｉｓアフィニティータグを持たない、ＮＧ−６０６（ＥｎＡｄ−ＳＡ−ＦＡＰＢｉＴＥ）
配列番号６８：ＦＡＰ  ＢｉＴＥ核酸配列（ＯＫＴ３）
配列番号６９：ＦＡＰ  ＢｉＴＥ核酸配列（ａＣＤ３）
配列番号７０：ＮＧ−６１１導入遺伝子カセット
配列番号７１：ＮＧ−６１２導入遺伝子カセット
配列番号７２：ＮＧ−６１３導入遺伝子カセット
配列番号７３：ＮＧ−６１４導入遺伝子カセット
配列番号７４：ＮＧ−６１７導入遺伝子カセット
配列番号７５：ＦＡＰ  ＢｉＴＥアミノ酸配列（ＯＫＴ３）
配列番号７６：ＦＡＰ  ＢｉＴＥアミノ酸配列（ａＣＤ３）
配列番号７７：ＮＧ−６１１ゲノム
配列番号７８：ＮＧ−６１２ゲノム
配列番号７９：ＮＧ−６１３ゲノム
配列番号８０：ＮＧ−６１４ゲノム
配列番号８１：ＮＧ−６１７ゲノム
配列番号８２：ＮＧ−６１５ゲノム
配列番号８３：ＮＧ−６４０ゲノム
配列番号８４：ＮＧ−６４１ゲノム
配列番号８５：ヌル配列
配列番号８６：Ｆｌｔ３Ｌ核酸配列
配列番号８７：ヌル配列
配列番号８８：ＭＩＰ１α核酸配列
配列番号８９：可動性リンカー配列
配列番号９０：ＩＦＮα核酸配列
配列番号９１：ＣＸＣＬ１０核酸配列
配列番号９２：ＣＸＣＬ９核酸配列
配列番号９３：ＮＧ−６１５導入遺伝子カセット
配列番号９４：ＮＧ−６４０導入遺伝子カセット
配列番号９５：ＮＧ−６４１導入遺伝子カセット
配列番号９６：ＦＬＴ３Ｌアミノ酸配列
配列番号９７：ＭＩＰ１αアミノ酸配列
配列番号９８：ＩＦＮαアミノ酸配列
配列番号９９：ＣＸＣＬ９アミノ酸配列
配列番号１００：ＣＸＣＬ１０アミノ酸配列
配列番号１０１：ＮＧ−６１８ゲノム
配列番号１０２：ＮＧ−６１８  ＦＡＰ  ＢｉＴＥ核酸配列
配列番号１０３：ＮＧ−６１８導入遺伝子カセット
配列番号１０４〜２７７：リンカー配列
配列番号２７８：ＮＧ−６１６ゲノム
配列番号２７９〜２８１：プライマー
【実施例】
【０２５７】
実施例１
本実施例に記載の通りに、組換えＢｉＴＥを設計し、タンパク質を生産した。
【０２５８】
１．１  ＢｉＴＥの操作
ＢｉＴＥは、特異性が異なる２つの一本鎖抗体フラグメント（ＳｃＦｖ）を可動性Ｇｌｙ４Ｓｅｒリンカーで連結することにより作製される。ＳｃＦｖは、親モノクローナル抗体由来のＶＨドメインおよびＶＬドメインをリンカーで連結することにより作製される。各ＢｉＴＥは、Ｎ末端には哺乳類における分泌用のシグナル配列を、Ｃ末端には検出および精製用のデカヒスチジンアフィニティータグを有するように設計した。ＢｉＴＥは、標準的なＤＮＡクローン技術で操作し、タンパク質発現ベクターに挿入した（図１）。
【０２５９】
抗ＦＡＰ  ＢｉＴＥは、特許、国際公開第２０１００３７８３５号Ａ２からの抗ＦＡＰ  ＳｃＦｖ、および特許、国際公開第２００５０４０２２０号（この中の配列番号６３）からの抗ＣＤ３  ＳｃＦｖを用いて、シグナル配列およびアフィニティータグを付加して、新規に作製した。
【０２６０】
対照ＢｉＴＥには、Hussein et al, 2007 (Hussein AH et al (2007) “Construction and characterization of single-chain variable fragment antibodies directed against the Bordetella pertussis surface adhesins filamentous hemagglutinin and pertactin”. Infect Immunity 75, 5476-5482)からの抗ＦＨＡ（百日咳菌（Bordetella pertussis）由来の繊維状赤血球凝集素）ＳｃＦｖ、および特許、国際公開第２００５０４０２２０号（その中の配列番号６３）からの抗ＣＤ３  ＳｃＦｖを用い、シグナル配列およびアフィニティータグを付加した。
【０２６１】
１．２  組換えＢｉＴＥの生産
組換えＢｉＴＥタンパク質は、タンパク質発現を駆動するためのＣＭＶプロモーター（配列番号２４）を用いて、各配列をｐＳＦ−ＣＭＶベクターにクローニングすることにより生産した（図１）。ｐＳＦ−ＣＭＶ−ＦＡＰＢｉＴＥプラスミドおよびｐＳＦ−ＣＭＶ−ＣｏｎｔｒｏｌＢｉＴＥプラスミドのプラスミドＤＮＡ濃度（表２）は、ＮａｎｏＤｒｏｐで測定した。空ｐＳＦ−ＣＭＶベクターは陰性対照として含まれている。５４．７μｇの各々を４ｍＬのＯｐｔｉＭＥＭで希釈した。１０９．２μｇのＰＥＩ（直鎖状、分子量２５０００、ポリサイエンス社（Polysciences）、米国）を４ｍＬのＯｐｔｉＭＥＭ培地で希釈し、４ｍｌの希釈ＤＮＡと混合して、ＤＮＡ−ＰＥＩ複合体（１：２のＤＮＡ：ＰＥＩ比（ｗ／ｗ））を得た。室温で２０分間インキュベートした後、この混合物にＯｐｔｉＭＥＭを１８ｍＬになるまで加え、このトランスフェクション用混合物を、９０％コンフルエントのＡｄ２９３細胞を含有するＴ１７５フラスコに添加した。細胞をこのトランスフェクション用ミックスと共に３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベートした後、３０ｍＬの細胞培地（グルタミン添加、フェノールレッド非含有のＤＭＥＭ（高グルコース））を細胞に添加し、３７℃、５％ＣＯ２で４８時間フラスコをインキュベートした。並行して、別のフラスコの細胞をｐＳＦ−ＣＭＶ−ＧＦＰでトランスフェクトして、トランスフェクションが効率的であることを確認した。分泌タンパク質を回収するため、トランスフェクト細胞の上清を回収し、３５０ｇ、４℃で５分間遠心して細胞成分を除去した（Ａｌｌｅｇｒａ  Ｘ−１５Ｒ、ベックマン・コールター社）。上清を１０ｋ  ＭＷＣＯ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔ（ミリポア社）に移した。４７５０ｒｐｍ、４℃でスピン後、この濃縮液の体積をフロースルーで調整して、５０倍高い濃度を得た。濃縮タンパク質の一定分量を−８０℃で保存した。
【０２６２】
【表２】
2020531032.tif 000004
【０２６３】
１．３  免疫調節性タンパク質と組み合わせてＦＡＰ−ＢｉＴＥを発現するウイルスの生産
ＦＡＰを標的とするＢｉＴＥ分子および２または３種類の免疫調節性タンパク質をコードする、３種のウイルス（ＮＧ−６４０、ＮＧ−６４１、およびＮＧ−６１５）を作製した（表１）。ＮＧ−６４０は、３種類の導入遺伝子タンパク質、ＦＡＰ−ＢｉＴＥ分子と、ケモカインであるＣＸＣＬ９およびＣＸＣＬ１０とをコードする。ＮＧ−６４１およびＮＧ−６１５は共に４種類の導入遺伝子タンパク質をコードする。ＮＧ−６４１はＦＡＰ−ＢｉＴＥと、ケモカインであるＣＸＣＬ９およびＣＸＣＬ１０と、サイトカインであるＩＦＮαとをコードし、ＮＧ−６１５はＦＡＰ−ＢｉＴＥと、ケモカインであるＭＩＰ１αと、サイトカインであるＦＬＴ３リガンドおよびＩＦＮαとをコードする。ＦＡＰ−ＢｉＴＥ分子のみをコードするウイルスも作製する（ＮＧ−６１７）。
【０２６４】
【表３】
2020531032.tif 000005
【０２６５】
各導入遺伝子カセットにおいて、ＢｉＴＥおよび他の免疫調節性タンパク質をコードするｃＤＮＡの、５’末端には短スプライスアクセプター配列（ＳＳＡ、ＣＡＧＧ）を隣接させ、３’末端にはＳＶ４０  ｌａｔｅポリ（Ａ）配列（ＰＡ、配列番号２５）を隣接させた。各導入遺伝子のｃＤＮＡ配列は、２Ａ高効率自己開裂型ペプチド配列（Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、配列番号５０、５３、および５２）を用いて隔てた。
【０２６６】
ウイルスの生産
プラスミドｐＥｎＡｄ２．４を用いて、合成された導入遺伝子カセット（それぞれ、配列番号９３、９４、および９５）を直接挿入することで、プラスミドｐＮＧ−６１５、ｐＮＧ−６４０、およびｐＮＧ−６４１を作製した。ＮＧ−６１５は、ＦＡＰを標的とするＢｉＴＥ（配列番号１０２）、Ｆｌｔ３Ｌ（配列番号８６）、ＭＩＰ１α（配列番号８８）、およびＩＦＮα（配列番号９０）をコードする４種類の導入遺伝子を含有する。ＮＧ−６４０およびＮＧ−６４１はＦＡＰを標的とするＢｉＴＥ（配列番号１０２）、ＣＸＣＬ９（配列番号９２）、およびＣＸＣＬ１０（配列番号９１）をコードし、ＮＧ−６４１はＩＦＮαをコードする４つ目の導入遺伝子（配列番号９０）も含有する。導入遺伝子カセットの模式図を図１に示す。プラスミドＤＮＡの構築を制限酵素的分析およびＤＮＡシーケンスで確認した。
【０２６７】
プラスミドであるｐＮＧ−６１５、ｐＮＧ−６４０、およびｐＮＧ−６４１を、酵素ＡｓｃＩによる制限酵素消化で直線化することで、ウイルスゲノムを得た。これらのウイルスを下記の方法に従って増幅および精製した。
【０２６８】
消化後のＤＮＡを、フェノール／クロロホルム抽出で精製し、３００μｌの９５％超の分子生物学グレードエタノールおよび１０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム中で、−２０℃で１６時間沈殿させた。沈殿したＤＮＡを１４０００ｒｐｍ、５分間の遠心でペレット化し、５００μｌの７０％エタノールで洗浄後、再度１４０００ｒｐｍで５分間遠心した。このクリーンなＤＮＡペレットを風乾し、１５μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅトランスフェクション試薬を含有する５００μｌのＯｐｔｉＭＥＭで再懸濁し、室温で３０分間インキュベートした。次に、このトランスフェクション用混合物を、７０％コンフルエントまで増殖させた２９３細胞を含有するＴ−２５フラスコに滴下した。細胞をこのトランスフェクション用ミックスと共に３７℃、５％ＣＯ２で２時間インキュベートした後、４ｍｌの細胞培地（グルタミンおよび２％ＦＢＳを添加した、ＤＭＥＭ（高グルコース））を細胞に添加し、３７℃、５％ＣＯ２でフラスコをインキュベートした。
【０２６９】
トランスフェクトした２９３細胞を２４時間毎にモニターし、４８〜７２時間毎に追加の培地を添加した。細胞単層における顕著な細胞変性効果（ＣＰＥ）の確認によって、ウイルスの生産をモニターした。広範なＣＰＥが確認されたら、３回の凍結融解サイクルにより、ウイルスを２９３細胞から回収した。このウイルス株を増幅するため、回収したウイルスを用いて２９３細胞に再感染させた。細胞単層における顕著なＣＰＥの観察により、増幅時の生存ウイルスの生産を確認した。ＣＰＥが確認されたら、３回の凍結融解サイクルにより、ウイルスを２９３細胞から回収した。増幅したウイルス株をさらなる増幅に用いて、その後、このウイルスを二重塩化セシウムバンド形成で精製して、精製されたウイルス株を得た。
【０２７０】
実施例２：ウイルス複製および腫瘍溶解活性の解析
ウイルス複製
肺癌細胞株（Ａ５４９）、乳房癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−４５３）または膀胱癌細胞株（ＲＴ４）に、１ｐｐｃのＮＧ−６１５、ＮＧ−６４０、ＮＧ−６４１、ＮＧ−６１７、Ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ（ＥｎＡｄ）を７２時間接種させるか、または未感染のままとし、これらをｑＰＣＲによるウイルスＤＮＡの定量化に用いた。細胞上清を回収し、１２００ｒｐｍで５分間遠心することにより清澄化した。５０μＬの上清をＤＮＡ解析に用いた。
【０２７１】
キアゲン社製ＤＮｅａｓｙキットを製造業者のプロトコルに従って用いて、この上清試料からＤＮＡを抽出した。ＥｎＡｄウイルス粒子（２．５×１０１０〜２．５×１０５ウイルス粒子）を用いた検量線も作成し、ＤＮｅａｓｙキットを用いて抽出を行った。抽出された試料または標準のそれぞれを、初期遺伝子Ｅ３に対するウイルス遺伝子特異的プライマー／プローブセットを用いるｑＰＣＲで解析した。１細胞当たりの検出されたウイルスゲノムの数を定量化したところ、試験された全てのウイルス（ＮＧ−６１７、ＮＧ−６１５、ＮＧ−６４０、およびＮＧ−６４１）について、Ａ５４９、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、およびＲＴ４におけるウイルス複製が示された（図２）。ウイルス複製は全てのウイルスで同様であり、親ＥｎＡｄウイルスのウイルス複製と同等であった。未感染細胞ではウイルスゲノムは検出できなかった。
【０２７２】
腫瘍溶解活性
１００ｐｐｃのＮＧ−６１５、ＮＧ−６４０、ＮＧ−６４１、ＮＧ−６１７、ＥｎＡｄを接種させた、または未感染のままの肺（Ａ５４９）癌細胞を、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＲＴＣＡ）を用いてモニターした。細胞増殖を６０分毎に最長９６時間モニターした。これらの細胞の腫瘍溶解を、５０％の溶解が達成された時点である半殺滅時間（Killing Time 50）（ＫＴ５０）を算出することにより評価した（図３）。これらのデータは、親ＥｎＡｄウイルスを含む全ての試験ウイルスの間で、同等のＫＴ５０を示した。未処理細胞に対しては、腫瘍溶解作用は確認されなかった。
【０２７３】
まとめると、これらのデータは、ＢｉＴＥおよび２または３種の免疫調節性導入遺伝子を含有しても、ＥｎＡｄウイルスは、複製活性にも腫瘍溶解活性にも重大な影響を受けないことを示している。
【０２７４】
実施例３：ウイルスを介した導入遺伝子発現組換えＢｉＴＥ検出の解析
ＢｉＴＥを検出するために、ウェスタンブロッティングの手法を用いて、抗Ｈｉｓ抗体で、Ｃ末端のデカヒスチジンアフィニティータグをプローブすることができる。タンパク質試料を、溶解緩衝液で、β−メルカプトエタノールおよびＳＤＳを含有する、２．５μＬの６×Ｌａｅｍｍｌｉ  ＳＤＳ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒを含む最終体積１５μＬに調整した。試料を９５℃で５分間インキュベートすることでタンパク質を変性させ、１５ウェルの１０％プレキャストポリアクリルアミドゲル（Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ  ＴＧＸ  Ｐｒｅｃａｓｔ  Ｇｅｌｓ、バイオラド社、英国）に添加した。Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ  Ｔｅｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍ（バイオラド社、英国）内の、１×泳動用緩衝液中、１８０Ｖで４５分間、ゲルを泳動した。Ｍｉｎｉ  Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  Ｃｅｌｌ（バイオラド社、英国）内の、１×転写用緩衝液中、３００ｍＡ、４℃、９０分間のウェット式エレクトロブロッティングにより、タンパク質をＳＤＳゲルからニトロセルロースメンブレンに転写した。転写は、熱を制限するために、アイスパック（ice pack）の存在下で実行した。次に、ニトロセルロースメンブレンを振盪機上、ＰＢＳ−Ｔ中５％ミルクで、室温で１時間ブロッキングし、ＰＢＳ／５％ミルクで１：５０００希釈した抗Ｈｉｓ（Ｃ末端）抗体（マウス抗６×Ｈｉｓ、クローン３Ｄ５、インビトロジェン社、英国、製品番号４６−０６９３）でプローブした。振盪機上で４℃で一晩インキュベートした後、メンブレンを洗浄し、ＨＲＰ標識ポリクローナル抗マウス免疫グロブリン二次抗体（ＰＢＳ／５％ミルクで１：１０．０００、ダコ社、製品番号Ｐ０１６１）で室温で１時間プローブした。可視化のため、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｄｕｒａ  Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｄｕｒａｔｉｏｎ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社、英国）を製造業者の取扱説明書に従って適用し、Ｘ線フィルムに露光して、自動フィルム現像機で現像した。結果から、ＢｉＴＥタンパク質が、ＢｉＴＥ発現プラスミドでトランスフェクトされたＡｄ２９３細胞からは発現および分泌されたが、親ベクターでトランスフェクトされたＡｄ２９３細胞からは発現および分泌されなかったことが示された。
【０２７５】
組換えＢｉＴＥの定量化
組み換えＢｉＴＥタンパク質の量を測定するため、ドットブロットの手法を用いて、ＢｉＴＥシグナルを、Ｈｉｓタグ付（Ｃ末端１０Ｈｉｓ）タンパク質標準（１０×Ｈｉｓタグ付ヒトカテプシンＤ、バイオレジェンド社、製品番号５５６７０４）と比較した。ＢｉＴＥ試料およびタンパク質標準の２倍連続希釈系列を用意し、それぞれ１．５μＬをニトロセルロースメンブレンに直接アプライし、２０分間風乾した。次に、ウェスタンブロッティング用の上記のブロッキング／染色プロトコルを実施した。タンパク質標準のモル濃度は、２５０μｇ／ｍＬのＢｉＴＥ濃度を示すように調整した。結果（図１３Ａ）から、ＢｉＴＥ発現プラスミドでトランスフェクトされたＡｄ２９３細胞からのＢｉＴＥタンパク質の発現および分泌が示された。
【０２７６】
ＦＡＰ結合ＥＬＩＳＡ
ｐＳＦ−ＣＭＶ−ＦＡＰＢｉＴＥまたはｐＳＦ−ＣＭＶ−ＣｏｎｔｒｏｌＢｉＴＥでトランスフェクトされた細胞から分泌された、ＦＡＰ  ＢｉＴＥおよび対照（抗ＦＨＡ）ＢｉＴＥ（配列番号２および４）のＦＡＰ結合活性を、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）で評価した。空ｐＳＦ−ＣＭＶベクター上清は陰性対照として用いた。ＥＬＩＳＡ用プレート（Ｎｕｎｃ  Ｉｍｍｕｎｏ  ＭａｘｉＳｏｒｐ  ９６ウェルマイクロプレート）を、ＰＢＳ緩衝液中、ヒトＦＡＰ／セプラーゼタンパク質（１００ｎｇ／ウェル、シノ・バイオロジカル社（Sino Biological Inc）、１０４６４−Ｈ０７Ｈ−１０）で、４℃で一晩コーティングすることで準備した。その後の全ての結合工程間で、ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０でプレートを洗浄した。プレートを５％ＢＳＡ／ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で室温で１時間ブロッキングした。一定分量のＢｉＴＥタンパク質、または空ｐＳＦ−ＣＭＶベクタートランスフェクションのウェルから回収されたタンパク質を、５％ＢＳＡ／ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で１０倍希釈した。全試料をＦＡＰコートプレートに添加し、室温で２時間インキュベートした。検出用抗体である、抗Ｈｉｓ（Ｃ末端）抗体（マウス抗６ｘＨｉｓ、クローン３Ｄ５、インビトロジェン社、英国、製品番号４６−０６９３）を１：１０００希釈し、室温で１時間アプライした。次に、ＨＲＰ結合型抗マウスＦｃ（ＰＢＳ＋５％ミルク中１：１０００、ダコ社）を室温で１時間アプライし、その後、ＨＲＰ基質溶液３．３．５．５’−テトラ（tera）メチルエチレンジアミン（ＴＭＢ、サーモフィッシャー社）を用いてＨＲＰ検出を実施した。反応を止めるために停止液を使用し、プレートリーダーにより４５０ｎｍで発色を測定した。ＦＡＰ  ＢｉＴＥ上清、対照ＢｉＴＥ上清、および空ベクター上清について、４５０ｎｍの吸光度をプロットしたところ、ＦＡＰタンパク質に対するＦＡＰ  ＢｉＴＥの特異的結合が示された。結果（図１３Ｂ）から、組換えＦＡＰタンパク質に対して、ＦＡＰ  ＢｉＴＥは特異的に結合するが、対照ＢｉＴＥは特異的に結合しないことが分かる。
【０２７７】
ＥＬＩＳＡによる導入遺伝子発現の評価
ケモカインまたはサイトカインの導入遺伝子、ＩＦＮα、ＭＩＰ１α、ＦＬＴ３Ｌ、ＣＸＣＬ１０、およびＣＸＣＬ９、の発現を、ＥＬＩＳＡを用いて評価した。Ａ５４９癌細胞株およびＲＴ４癌細胞株に、最長７日間、１ｐｐｃのＮＧ−６１５、ＮＧ−６４０、ＮＧ−６４１、ＮＧ−６１７、ＥｎＡｄを接種させるか、未感染のままとした。接種の４日後および７日後に、細胞上清を清澄化し、ＥＬＩＳＡで導入遺伝子発現を評価した。
【０２７８】
ＩＦＮα  ＥＬＩＳＡはＶｅｒｉｋｉｎｅ  Ｈｕｍａｎ  ＩＦＮ  ａｌｐｈａ  Ｋｉｔ（ＰＢＬアッセイ・サイエンス社（Pbl assay science））を用いて実施し、ＭＩＰ１α  ＥＬＩＳＡはＨｕｍａｎ  ＣＣＬ３  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄシステムズ社）を用いて実施し、Ｆｌｔ３Ｌ  ＥＬＩＳＡはＦｌｔ３Ｌ  ｈｕｍａｎ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（アブカム社）を用いて実施し、ＣＸＣＬ９  ＥＬＩＳＡはＣＸＣＬ９  ｈｕｍａｎ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（アブカム社）を用いて実施し、ＣＸＣＬ１０  ＥＬＩＳＡはＣＸＣＬ１０  ｈｕｍａｎ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（アブカム社）を用いて実施した。アッセイは全て、製造業者のプロトコルに従って実施した。
【０２７９】
分泌されたＩＦＮα、ＭＩＰα、ＦＬｔ３Ｌ、ＣＸＣＬ９、およびＣＸＣＬ１０の濃度を、検量線からの内挿によって求めた。ＮＧ−６１５処理細胞の細胞上清ではＩＦＮα、ＭＩＰ１α、およびＦｌｔ３Ｌの発現が検出でき、ＮＧ−６４１処理細胞の上清ではＩＦＮα、ＣＸＣＬ９、およびＣＸＣＬ１０が検出でき、ＮＧ−６４０処理細胞の上清ではＣＸＣＬ９およびＣＸＣＬ１０が検出できた（図４および図５）。ＥｎＡｄ処理細胞または無処理対照細胞では、いずれのケモカインまたはサイトカイン導入遺伝子も発現が検出されなかった。
【０２８０】
細胞ベースレポーターアッセイによる機能的導入遺伝子発現の評価
Ｊｕｒｋａｔ−Ｄｕａｌレポーター細胞株（インビボジェン社（Invivogen））を用いたアッセイで、機能的なＦＡＰ−ＢｉＴＥ導入遺伝子およびＩＦＮα導入遺伝子の発現を評価した。これは、２つの誘導性レポーターコンストラクトの安定な組込みによって形質転換したヒト不死化Ｔリンパ球細胞株（ジャーカット）である。これらの誘導性レポーターコンストラクトのうちの１つにより、インターフェロン調節因子（ＩＲＦ）経路のＩＦＮ−α活性化の、分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の分泌および活性を通じた研究が可能となり、２つ目は、Ｔ細胞受容体を通じたシグナル伝達によって活性となる、ＮＦ−ｋＢに応答して分泌されるルシフェラーゼレポーターである。ＳＥＡＰの活性は上清中に存在するＩＦＮ−αのレベルに比例し、Ｑｕａｎｔｉ−Ｂｌｕｅ（商標）基質のＳＥＡＰ誘導性分解を検出することにより測定することができる。機能的なＭＩＰ１αの発現は、ＣＣＲ５レポーター細胞株（ＣＨＯ−Ｋ１  ＣＣＲ５  β−ａｒｒｅｓｔｉｎ、インビボジェン社）を用いて評価した。Ａ５４９癌細胞株に、１ｐｐｃのＮＧ−６１５、ＮＧ−６４０、ＮＧ−６４１、ＮＧ−６１７、ＥｎＡｄを接種させるか、未感染のままとした。接種の２日後、３日後、または４日後に、解析用に、細胞上清を回収して清澄化した。
【０２８１】
ＩＦＮα機能を評価するため、培地で１：１０希釈、１：５０希釈、または１：２５０希釈した２０μＬの各上清を、Ｊｕｒｋａｔ−Ｄｕａｌ細胞（２×１０５細胞／ウェル）に添加し、１６〜２０時間インキュベートした。次に、上清をプレートから回収し、２００μＬのＱｕａｎｔｉ−Ｂｌｕｅ（商標）試薬で１時間処理した。６４０ｎｍの吸光度（Ａｂｓ）を測定するマイクロプレートリーダーを用いて、プレートを解析した。機能的なＩＦＮαの存在を示す反応は、ＮＧ−６１５処理癌細胞およびＮＧ−６４１処理癌細胞から得られた上清では検出できたが、ＮＧ−６４０処理癌細胞、ＮＧ−６１７処理癌細胞、ＥｎＡｄ処理癌細胞、または未感染対照癌細胞から得られた上清では検出できなかった（図６Ａ）。検出された機能的なＩＦＮαのレベルは、ＮＧ−６１５処理上清とＮＧ−６４１処理上清とでは同様のレベルであった。
【０２８２】
ＭＩＰ１α機能を評価するために、ＣＣＲ５レポーター細胞を播種し（５×１０３細胞／ウェル）、２０〜２４時間インキュベートした。次に、処理後の腫瘍細胞から得られた５μＬの上清を各ウェルに添加し、９０分間インキュベートした。次に、検出液、および発光プレートリーダーによる定量化を利用して、ルシフェラーゼレポーター活性を検出した。ＮＧ−６１５処理癌細胞から得られた上清、およびＭＩＰ１ａを発現することが知られている陽性対照ウイルスＮＧ−３４７で処理された細胞から得られた上清で、機能的なＭＩＰ１αの存在を示す反応が検出された（図６Ｂ）。
【０２８３】
ＦＡＰ−ＢｉＴＥ機能を評価するため、ＭＲＣ−５肺線維芽細胞（その細胞膜上にＦＡＰを発現する）を播種し（２×１０４細胞／ウェル）、４時間インキュベートして、細胞をプレートに接着させた。次に、各ウェルに、処理後腫瘍細胞から得られた上清２０μＬと共に、Ｊｕｒｋａｔ−Ｄｕａｌ細胞（２×１０５細胞／ウェル）を添加した。プレートを１６〜２０時間インキュベートした。次に、上清を回収し、５０μＬのＱｕａｎｔｉ−Ｌｕｃ試薬で処理した後、直ちにプレートリーダーでプレートを読んで、ルシフェラーゼ活性を検出した。機能的なＦＡＰ−ＢｉＴＥの存在を示す反応は、ＮＧ−６１７処理癌細胞、ＮＧ−６１５処理癌細胞、ＮＧ−６４０処理癌細胞、およびＮＧ−６４１処理癌細胞の上清では検出されたが、ＥｎＡｄ処理癌細胞または無処理対照の上清では検出されなかった（図７）。ＮＧ−６１５およびＮＧ−６４１によって生産されたＩＦＮαのレベルが同様であったことを考慮すると、驚くべきことに、ＮＧ−６１５処理細胞から得られた上清は、４つの導入遺伝子を含有する他のウイルスＮＧ−６４１を含む、試験された他の全てのＢｉＴＥ発現ウイルスと比較して、機能的なＦＡＰ−ＢｉＴＥの発現レベルが著しく低かった。
【０２８４】
実施例２
ＢｉＴＥ導入遺伝子を保有するＥｎＡｄウイルスの構築に先立ち、いくつかの異なるアッセイで組み換えＢｉＴＥタンパク質の機能活性を評価した。
【０２８５】
ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の単離
ヒトＰＢＭＣを、ＮＨＳ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ（英国、オックスフォード）から入手した、健常ドナーの新鮮ヒト血液試料から、または全血白血球コーン（cone）から、密度勾配遠心により単離した。どちらの場合でも、試料をＰＢＳで１：２希釈し、２５ｍＬのこの混合物を、５０ｍＬファルコンチューブ内で、１３ｍＬのフィコール（１．０７９ｇ／ｍＬ、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ、ＧＥヘルスケア社）の上に積層した。試料を１６００ｒｐｍ、３０分間、２２℃の遠心（Ａｌｌｅｇｒａ  Ｘ−１５Ｒ、ベックマン・コールター社）にかけ、減速設定は最も遅くして相分離を保存した。遠心分離後、４つの層が確認でき、最上層には血漿層、次に、ＰＢＭＣを含有する界面、フィコール層、底には赤血球および顆粒球の層が含まれていた。ＰＢＭＣをパスツールピペットで回収し、ＰＢＳで２回洗浄し（１２００ｒｐｍ、１０分間、室温）、１０％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ培地で再懸濁した。
【０２８６】
ＣＤ３陽性Ｔ細胞の単離
Ｐａｎ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ミルテニーバイオテク社（Miltenyi Biotec）、製品番号１３０−０９６−５３５）を製造業者のプロトコルに従って用いて、ＣＤ３陽性（ＣＤ３＋）Ｔ細胞を非ＣＤ３細胞の枯渇によりＰＢＭＣから抽出した。
【０２８７】
初代腹水試料の処理
卵巣がん、膵がん、乳房がん、および胃がんを含むがこれらに限定はされない複数の適応症を有する患者から得られた初代ヒト腹水試料を、チャーチル病院（オックスフォード大学病院）の腫瘍病棟から入手した。入手後、細胞画分および体液画分を分離し、一定分量の体液を保存およびさらなる解析のために−２０℃で凍結した。細胞画分を、製造業者の取扱説明書に従って赤血球溶解緩衝液（ロシュ社、製品番号１１８１４３８９００１）で処理することで、赤血球を除去した。各試料中に存在する細胞型を、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＦＡＰ、ＣＤ４５、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ５６、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＰＤ１、およびＣＴＬＡ４の染色によって決定し、フローサイトメトリーで解析した。次に、各細胞を、エキソビボでのT細胞活性化および標的細胞溶解実験に新たに用いた。いくつかの場合では、後の実験で使用するために、細胞は１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ中で継代した。
【０２８８】
細胞株の維持
全ての細胞株は、特に記載がない限り、３７℃、５％ＣＯ２の加湿恒温器（ＭＣＯ−１７ＡＩＣ、サンヨー社）内で、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、ギブコ社（商標））および１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシン（１０ｍｇ／ｍＬ、シグマ・アルドリッチ社、英国）を添加した、表３で指定される通りのＤＭＥＭ培地（シグマ・アルドリッチ社、英国）またはＲＰＭＩ培地（シグマ・アルドリッチ社、英国）中で維持した。細胞は、コンフルエントに達する２〜３日前に毎回、トリプシン／ＥＤＴＡ（０．０５％トリプシン、０．０２％ＥＤＴＡ、シグマ・アルドリッチ社、英国）を用いた酵素的剥離により、継代した。この処理では、培地を吸引し、細胞を１５ｍｌのＰＢＳで洗浄した後、細胞を２ｍＬのトリプシン／ＥＤＴＡで３７℃で２〜１０分間処理した。トリプシンを１０ｍＬの１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭで中和し、細胞の一部を新鮮な培地を含んだ新たなフラスコに移した。通例の細胞培養用には、培地には１０％ＦＢＳを添加し、感染およびウイルスプラスミドトランスフェクション用には２％ＦＢＳを添加し、組み換えＢｉＴＥプラスミドトランスフェクション用にはＦＢＳは添加しなかった。
【０２８９】
【表４】
2020531032.tif 000006
【０２９０】
統計
２つの条件が比較されている場合、ｔ検定を用いて統計解析を実施した。他の全ての場合では、一元配置分散分析を用いて統計解析を実施した。
【０２９１】
組換えＦＡＰ  ＢｉＴＥによるヒトＴ細胞活性化の特性評価
正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）の存在下または非存在下の、ＦＡＰ  ＢｉＴＥの、Ｔ細胞の活性化を誘導する能力を比較した。ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞（９６ウェルＵ字底プレート内で７０，０００細胞／ウェル）を、培地単独、または３００ｎｇ／ｍＬ  ＦＡＰＢｉＴＥもしくは対照ＢｉＴＥの存在下で、単独でまたはＮＨＤＦ細胞（１０：１  Ｔ：ＮＨＤＦ）と共培養した。細胞を３７℃で２４時間共培養した後、酵素非含有細胞剥離緩衝液（サーモ社、製品番号１３１５１０１４）で回収した。次に、ＣＤ４５＋Ｔ細胞上のＣＤ６９（図１４Ａ）およびＣＤ２５（図１４Ｂ）の発現レベルを、抗体染色およびフローサイトメトリーによって解析し、幾何平均蛍光（ｇＭＦＩ）値として表した。Ｔ細胞活性化の陽性対照としては、プレートに固定された抗ＣＤ３抗体（７．５μｇ／ｍＬ）を用いた。ＦＡＰ  ＢｉＴＥはＴ細胞上の活性化マーカーＣＤ６９およびＣＤ２５の発現を選択的に誘導し、このことは、ＦＡＰ  ＢｉＴＥがＴ細胞を活性化できたことを示している。
【０２９２】
２つ目の同様の実験では、Ｔ細胞を、ＮＨＤＦ細胞（９６ウェルプレートの各ウェル内の２００，０００個のＣＤ３＋細胞＋４０，０００個のＮＨＤＦ）および３００ｎｇ／ｍＬのＦＡＰ  ＢｉＴＥまたは対照ＢｉＴＥと６時間共培養した後、細胞内サイトカイン染色で評価した。ＣＤ４５＋Ｔ細胞に対し、ＩＦＮγ発現の細胞内染色を行い、ブレフェルジンＡを培地に添加した５時間後に回収した。陽性対照として、Ｔ細胞を可溶性ＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍＬ）およびイオノマイシン（１μｇ／ｍＬ）で刺激した。図１４Ｃに示される結果は、ＮＨＤＦ存在下のＦＡＰ  ＢｉＴＥが、対照ＢｉＴＥと比較して、ＩＦＮγ発現Ｔ細胞の数が著しく増加させたことを示している。
【０２９３】
実施例４：
ＮＧ−６４１内の導入遺伝子から産生されたＩＦＮαの機能性をさらに評価するため、Ｊｕｒｋａｔ−Ｄｕａｌ（商標）細胞を、未感染、または１０粒子／細胞（particles per cell）（ｐｐｃ）のＥｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ（ＥｎＡｄ）もしくはＮＧ−６４１を３日間感染させたＡ５４９腫瘍細胞から得られた上清で処理した。ＳＥＡＰの分泌がＩＦＮα特異的であることを示すために、Ｊｕｒｋａｔ−Ｄｕａｌレポーター細胞株の処理の３０分間前に、ＩＦＮα特異的抗体をＡ５４９上清とインキュベートすることで、ＩＦＮαを遮断した。アイソタイプ対照抗体は陰性対照として用いた。データ（図８Ａ）から分かるように、ＮＧ−６４１で処理された腫瘍細胞上清の、Ｊｕｒｋａｔ−Ｄｕａｌレポーターアッセイにおける活性は、抗ＩＦＮα抗体によって阻害されるが、アイソタイプ対照では阻害されず、すなわちＩＦＮα介在性である。異なるレポーターアッセイシステムを用いて、ＮＧ−６４１内のＣＸＣＬ９およびＣＸＬ１０ケモカイン導入遺伝子の機能性を評価した。このアッセイでは、両ケモカインに対する受容体であるＣＸＣＲ３を発現するＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ  β−Ａｒｒｅｓｔｉｎレポーター細胞株（ユーロフィン社（Eurofins））を用いた。ＧＰＣＲの活性化の後、これらの細胞に発現されたＣＸＣＲ３にＣＸＣＬ９／１０が結合することで、β−アレスチンが当該受容体にリクルートされ、これは、ＥＦＣ（Enzyme Fragment Complementation）技術に基づいたゲイン・オブ・シグナルアッセイ（gain-of-signal assay）を用いて測定される。ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ  β−Ａｒｒｅｓｔｉｎ  ＣＸＣＲ３レポーター細胞を、未感染の、または１０粒子／細胞（ｐｐｃ）のＥｎＡｄもしくはＮＧ−６４１を３日間させたＡ５４９腫瘍細胞から得られた上清で処理した。このアッセイでは、上清中のＣＸＣＬ９／１０の濃度は発光に比例する。ＧＰＣＲ活性化がＣＸＣＬ９／１０特異的であることを示すために、ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ  β−Ａｒｒｅｓｔｉｎ細胞の処理の３０分前に、ＣＸＣＬ９／１０特異的抗体をＡ５４９上清とインキュベートすることで、ＣＸＣＬ９およびＣＸＣＬ１０を遮断した。図８Ｂに示されるデータから分かるように、ＥｎＡｄ対照または未感染対照と比較して、ＮＧ−６４１処理腫瘍細胞から得られた上清の存在下ではＣＸＣＲ３レポーター細胞の活性が増加しており、この増加はＣＸＣＬ９／１０に対する抗体によって遮断されている。
【０２９４】
ケモカイン機能性の別の尺度として、特異的受容体の細胞表面発現をダウンレギュレートするケモカインの能力を、アッセイの基礎として利用し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８で活性化されたヒトＴ細胞上のＣＸＣＲ３受容体のレベルを評価した。Ａ５４９腫瘍細胞を、感染させないか、または１ウイルス粒子／細胞（ｐｐｃ）のＥｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ（ＥｎＡｄ）もしくはＮＧ−６４１に７日間感染させ、上清を回収した。次に、活性化Ｔ細胞をこの上清で３０分間処理し、ＣＸＣＲ３のレベルをフローサイトメトリーで測定し、データを平均蛍光強度（ＭＦＩ）としてプロットした。細胞表面ＣＸＣＲ３のダウンレギュレーションがＣＸＣＬ９／１０特異的であることを示すために、活性化Ｔ細胞の処理の３０分前に、ＣＸＣＬ９／１０特異的抗体をＡ５４９腫瘍細胞上清とインキュベートすることで、ＣＸＣＬ９およびＣＸＣＬ１０を遮断した。図９に示されるデータから分かるように、ＮＧ−６４１感染Ａ５４９腫瘍細胞から得られた上清によって、ＣＤ４  Ｔ細胞上およびＣＤ８  Ｔ細胞上のＣＸＣＲ３発現の選択的なダウンレギュレーションが誘導されており、この効果は抗ＣＸＣＬ９／１０抗体により前処理によって消失した。
【０２９５】
実施例５：エキソビボのヒト腫瘍細胞培養におけるＦＡＰ−ＢｉＴＥ発現ウイルスの機能活性
完全な倫理的承認の下でバイオバンクを介して提供された、計画外科的切除から得られた、新鮮切除ヒト腫瘍の試料を、まず鋏およびスカルペルで刻み、その後ＧｅｎｔｌｅＭＡＣｓ組織分散機（ミルテニーバイオテク社）を用いて単細胞浮遊液を作製した。これらの未分離の細胞調製物は、腫瘍細胞と、線維芽細胞と、Ｔ細胞をはじめとする様々な免疫細胞とを含むことが分かったため、これらを用いて、初代腫瘍細胞に感染し、コードされた導入遺伝子を生産し、培養物中に同様に存在する腫瘍浸潤性Ｔ細胞を活性化する、ウイルスの能力を評価した。細胞を、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘ、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ギブコ社）、１×Ｉｎｓｕｌｉｎ−Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ−Ｓｅｌｅｎｉｕｍ−Ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ＩＴＳ−Ｘ）（ギブコ社）、２．５ｍｇ／ｍＬのアムホテリシンＢ（ギブコ社（商標））、１００ユニット／ｍＬのペニシリン、１００ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン、ピルビン酸ナトリウム、および１０％ＦＢＳからなる培地で再懸濁し、約１×１０６細胞／ｍｌで９６ウェルプレート（０．２５ｍｌ最終体積）または２４ウェルプレート（０．５ｍｌ最終体積）に播種した。細胞は、１０００ｐｐｃのＥｎＡｄ、ＮＧ−６１５、ＮＧ−６１７、ＮＧ−６４０、もしくはＮＧ−６４１を接種するか、未処理（ＵＩＣ）のままとした。Ｔ細胞活性化の陽性対照として、いくつかのウェルを、各２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体でも刺激した。細胞を２連ウェルで７２時間培養した後、上清を回収し、産生された各種サイトカインのレベルをマルチサイトカイン蛍光ビーズベースのキット（ＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘ（商標））およびフローサイトメーターを用いて測定した。３種類の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）試料（Ｔ０１６、Ｔ０１７、Ｔ０２４）、１種類の腎細胞癌（ＲＣＣ）、および１種類の結腸直腸（ＣＲＣ）肝転移試料を試験した。図４〜６の導入遺伝子発現データと一致して、ＩＦＮαは、ＮＧ−６１５で処理された培養物およびＮＧ−６４１で処理された培養物で選択的に産生された（図１０Ａ）。Ｆｌｔ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）はＮＧ−６１５処理後に検出されやすかったが、他のウイルスでは非常に低いレベルしか検出されず、またこれらのレベルは抗ＣＤ３／２８でＴ細胞を活性化させることにより誘導されるレベルと同様であったことから、ＮＧ−６１５培養物中のＦｌｔ３Ｌが導入遺伝子産物であることが示された。他のサイトカインの結果からは、実施例３に記載の腫瘍細胞株接種試験と同様（図７）、図１０ＢのＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−１７、グランザイムＢ、およびＩＬ−１３で示されるように、ＮＧ−６１５接種が、他のＦＡＰ−ＢｉＴＥコードウイルスＮＧ−６１７、ＮＧ−６４０、および他の４導入遺伝子保有ウイルスＮＧ−６４１よりも、かなり低いＴ細胞活性化レベルをもたらすことが示された。
【０２９６】
また、切除ＮＳＣＬＣ腫瘍細胞培養における内因性腫瘍Ｔ細胞の活性化について、フローサイトメトリー測定により、３日間の培養後のＣＤ４  Ｔ細胞およびＣＤ８  Ｔ細胞の両方による、Ｔ細胞活性化マーカー（ＣＤ２５、ＣＤ６９、およびＣＤ１０７ａ）、並びに細胞内サイトカインＩＦＮγおよびＴＮＦα）の発現のレベルを評価した。図１１Ａ〜図１１Ｄに示されるように、ＥｎＡｄは活性化マーカーおよびサイトカイン発現のいずれにもほとんど影響を与えなかったが、一方、ＮＧ−６１７処理、ＮＧ−６４０処理、およびＮＧ−６４１処理は全て、Ｔ細胞活性化について測定されたこれら全てのアップレギュレーションをもたらした。ＦＡＰ−ＢｉＴＥ保持ウイルスを用いた場合に同様の活性化レベルが確認されたが、これは上述のサイトカインデータと一致している（図１０Ｂ）。
【０２９７】
実施例６
本実施例では、組換えＦＡＰ  ＢｉＴＥにより活性化されたＴ細胞の、線維芽細胞標的細胞の死を誘導する能力を評価した。
【０２９８】
ＦＡＰ  ＢｉＴＥはＦＡＰ陽性の細胞株および初代細胞のＴ細胞介在性溶解を誘導する
ＮＨＤＦ（７，０００個の細胞）を、培地単独、または３００ｎｇ／ｍＬの対照ＢｉＴＥもしくはＦＡＰ  ＢｉＴＥの存在下、Ｕ字底９６ウェルプレートのウェル内で、７０，０００個のＴ細胞と共培養した。２４時間の共培養の後、上清を回収し、製造業者の取扱説明書に従ったＬＤＨアッセイにより細胞傷害性を測定した。図１５Ａの結果から分かるように、ＦＡＰ  ＢｉＴＥはＮＨＤＦ細胞の溶解を顕著に誘導した。
【０２９９】
同様の実験で、７，０００個の初代肺線維芽細胞（ＢＴＣ１００）を、３００ｎｇ／ｍＬの対照ＢｉＴＥまたはＦＡＰ  ＢｉＴＥの存在下または非存在下で、７０，０００個のＣＤ３＋Ｔ細胞と共培養した。２４時間の共培養の後、上清を回収し、ＬＤＨアッセイにより細胞傷害性を測定した。図１５Ｂおよび図１５Ｃの結果から分かるように、ＦＡＰ  ＢｉＴＥは初代ヒトがん関連線維芽細胞（ＣＡＦ）の溶解を顕著に増加させた。これらおよび他の患者由来細胞株によるＦＡＰの発現を図１６に示す。
【０３００】
ＦＡＰ  ＢｉＴＥを介した細胞溶解の用量反応関係を、２×１０３〜２×１０−２ｎｇ／ｍＬの範囲のＢｉＴＥ濃度で、８，０００個のＮＨＤＦ細胞と４０，０００個のＴ細胞との共培養により、評価した。３７℃、２４時間の共培養の後、上清に対してＬＤＨアッセイを実施して、標的細胞傷害性を測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍに組み込まれた４パラメーター非線形当てはめモデルを用いて用量反応曲線の当てはめを行ったところ、ＦＡＰ  ＢｉＴＥのＥＣ５０値は３．２ｎｇ／ｍＬとなった。これらの結果（図１７Ａ）は、ＦＡＰ  ＢｉＴＥ濃度とＬＤＨアッセイで測定された細胞傷害性（Ａｂｓ４９０で示される）との間の、用量依存的な関係を示している。
【０３０１】
実施例７
親未トランスフェクト細胞との比較によりＦＡＰ  ＢｉＴＥのＦＡＰ抗原特異性を示すための手段として、安定にＦＡＰを発現するＣＨＯ細胞株およびＡｄ２９３細胞株を作製した。
【０３０２】
ＦＡＰを発現する安定トランスフェクト細胞株の作製
ＦＡＰ遺伝子のタンパク質配列をＮＣＢＩデータベースから入手して（配列番号２３）、逆転写によりＤＮＡコード配列を作製し、オックスフォード・ジェネティクス社（Oxford Genetics Ltd）（オックスフォード、英国）により合成させた。ＦＡＰ遺伝子を標準的なクローン技術でｐＳＦ−Ｌｅｎｔｉベクターにクローニングすることで、ｐＳＦ−Ｌｅｎｔｉ−ＦＡＰベクターを得た。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、このレンチウイルス型ＦＡＰ発現ベクターでトランスフェクトし、同様にｐＳＦ−ＣＭＶ−ＨＩＶ−Ｇａｇ−Ｐｏｌ、ｐＳＦ−ＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇ、ｐＳＦ−ＣＭＶ−ＨＩＶ−Ｒｅｖでも実施した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００をトランスフェクション試薬として用い、ＤＮＡ：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ比が１：２となるようにベクターＤＮＡに添加し、３７℃で細胞とインキュベートした。４８時間後、レンチウイルスを含有する上清を回収し、ポリブレンと混合した（最終濃度、８μｇ／ｍＬ）。このレンチウイルス／ポリブレン混合物を、播種されたＡｄ２９３細胞またはＣＨＯ細胞に添加し、３７℃でインキュベートした。４日目、上清をピューロマイシン（Ａｄ２９３の場合は２μｇ／ｍＬ、ＣＨＯの場合は７．５μｇ／ｍＬ）を含有する培地と交換した。次に、安定な変異株をクローニングによるセレクションにかけ、親細胞株または安定トランスフェクト変異株のＦＡＰ発現を、ＦＡＰまたは同位体対照抗体を用いた染色により決定し、フローサイトメトリーで解析した（図１８Ａ）。
【０３０３】
ＦＡＰ  ＢｉＴＥを介した標的細胞溶解はＦＡＰ発現細胞に特異的である
ＣＨＯ細胞またはＣＨＯ−ＦＡＰ細胞（７，０００個の細胞）を、Ｕ字底９６ウェルプレートのウェル内で、培地単独、または２μｇ／ｍＬの対照ＢｉＴＥもしくはＦＡＰ  ＢｉＴＥの存在下、単独、またはヒトＴ細胞（７０，０００個）と共培養した。２４時間のインキュベーションの後、上清を回収し、実施例４に記載されたようなＬＤＨ細胞傷害性アッセイにより標的細胞傷害性を測定した（図１８Ｂ）。フローサイトメトリーによるＣＤ６９およびＣＤ２５の発現レベルの解析によって、Ｔ細胞活性化も測定した（図１９）。細胞傷害性は、ＣＨＯ−ＦＡＰ細胞がＴ細胞およびＦＡＰ  ＢｉＴＥと共に培養された場合にのみ確認された。このことは、ＦＡＰ  ＢｉＴＥを介したＴ細胞の活性化および標的細胞の溶解が、ＦＡＰ発現細胞に対して高度に特異的且つ限定的であるが、ＦＡＰ陰性の親細胞株に対してはそうではないことを示している。
【０３０４】
実施例８
さらなる実験において、組換えＦＡＰ  ＢｉＴＥタンパク質の、ＣＤ４  Ｔ細胞またはＣＤ８  Ｔ細胞を活性化する能力、および、これらのＴ細胞サブセットの各々の、ＮＨＤＦ細胞を溶解する能力を評価した。ＣＤ３＋Ｔ細胞（３５，０００個）を、Ｕ字底９６ウェルプレートのウェル内で、３００ｎｇ／ｍＬの対照ＢｉＴＥまたはＦＡＰ  ＢｉＴＥの存在下、７，０００個のＮＨＤＦ細胞と共培養し、３７℃で２４時間インキュベートした。細胞を回収し、抗ＣＤ４抗体または抗ＣＤ８抗体と、抗ＣＤ６９抗体および抗ＣＤ２５抗体を用いて染色し、フローサイトメトリーで解析した。結果（図２０Ａ）に示されるとおり、ＦＡＰ  ＢｉＴＥは、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方において、活性化マーカーであるＣＤ６９およびＣＤ２５の増加を誘導した。
【０３０５】
同様の実験で、各Ｔ細胞サブセット（ＣＤ４およびＣＤ８）の標的細胞を殺滅する能力を評価した。ＣＤ４  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ミルテニーバイオテク社、製品番号１３０−０４５−１０１）を製造業者のプロトコルに従って用いるポジティブセレクションにより、ＣＤ４＋Ｔ細胞をＣＤ３精製細胞から抽出し、ＣＤ８細胞は単離されていない素通り画分に含まれた。Ｕ字底９６ウェルプレートのウェル内で、７，０００個のＮＨＤＦを、３００ｎｇ／ｍＬの対照ＢｉＴＥまたはＦＡＰ  ＢｉＴＥと共に、３５，０００個のＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞と共培養し、３７℃でインキュベートした。２４時間後、上清を回収し、ＬＤＨ細胞傷害性アッセイで標的細胞傷害性を測定した。結果（図２０Ｂ）から分かるように、ＦＡＰ  ＢｉＴＥは、ＣＤ４＋Ｔ細胞による、およびＣＤ８＋Ｔ細胞による、ＮＨＤＦ細胞の殺滅の両方を誘導した。
【０３０６】
実施例９
初代悪性腹水から得られた自家腫瘍関連リンパ球のＦＡＰ  ＢｉＴＥ介在性活性化の特性評価
がん患者由来細胞を用いてＢｉＴＥタンパク質の活性を評価するために、ＣＤ３＋Ｔ細胞およびＦＡＰ＋細胞の両方を含有する初代悪性腹水（ascetic fluid）の試料を、試験用に入手した。未純化腹水細胞（すなわち採取時から未変化）を、５００ｎｇ／ｍＬの対照ＢｉＴＥまたはＦＡＰ  ＢｉＴＥの存在下、１００％腹水または１％ヒト血清添加培地中、Ｕ字底９６ウェルプレートの１ウェル当たり２５０，０００個の細胞を播種した。未処理ウェルを陰性対照として用いた。３７℃で５日間インキュベーションした後、総細胞集団を回収し、ＣＤ３＋Ｔ細胞の数（図２１Ａ）およびＣＤ３＋Ｔ細胞上のＣＤ２５の発現レベル（図２１Ｂ）を測定した。１ウェル当たりの総細胞数はＰｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｂｅａｄｓを用いて求めた。その結果、ＦＡＰ  ＢｉＴＥが、がん患者由来の腫瘍関連Ｔ細胞のＴ細胞活性化を顕著に増加させたことが示された。
【０３０７】
上記の実験の延長で、レプリケートのウェルを回収し、ＦＡＰ＋細胞の数をフローサイトメトリーで測定した（図２１Ｃ）。１ウェル当たりの総細胞数はＰｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｂｅａｄｓを用いて求めた。その結果、ＦＡＰ  ＢｉＴＥが、腹水試料中の自家ＦＡＰ発現細胞の数を顕著に減少させたことが示された。
【０３０８】
実施例１０
下記の方法を用いて、組換えＢｉＴＥ発現ＥｎＡｄウイルスの操作、生成、および精製を行った。
【０３０９】
ＢｉＴＥ発現Ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖの作製
ＥｎＡｄは、Ｅ２Ｂ領域におけるＡｄ３のＡｄ１１ｐへの高頻度非相同ヌクレオチド置換と、ほぼ完全なＥ３欠失と、Ｅ４ｏｒｆ４に位置付けられるより小さなＥ４欠失と、を含有する、複製適格性のキメラアデノウイルスＢ群である（Kuhn et al, Directed evolution generates a novel oncolytic virus for the treatment of colon cancer, PLoS One, 2008 Jun 18; 3(6): e2409）。
【０３１０】
プラスミドｐＥｎＡｄ２．４を用い、ＦＡＰ  ＢｉＴＥ（配列番号１）または対照ＢｉＴＥ（配列番号３）をコードするカセットをそのまま挿入することにより、プラスミドのｐｐＥｎＡｄ２．４−ＣＭＶ−ＦＡＰＢｉＴＥ、ｐＥｎＡｄ２．４−ＳＡ−ＦＡＰＢｉＴＥ、ｐＥｎＡｄ２．４−ＣＭＶ−ＣｏｎｔｒｏｌＢｉＴＥ、ｐＥｎＡｄ２．４−ＳＡ−ＣｏｎｔｒｏｌＢｉＴＥ（表４）を作製した。導入遺伝子カセットは、５’の短スプライスアクセプター配列ＣＡＧＧまたは外来性ＣＭＶプロモーター（配列番号２４）と、ＥｐＣＡＭ  ＢｉＴＥ、ＦＡＰ  ＢｉＴＥまたは対照ＢｉＴＥのｃＤＮＡ配列と、３’のポリアデニル化配列（配列番号２５）とを含有する。プラスミドの構築をＤＮＡシーケンスで確認した。この外来性ＣＭＶプロモーターは恒常的に活性型であるため、導入遺伝子の早期発現をもたらす。スプライスアクセプター配列はウイルス主要後期プロモーターの制御下の発現を駆動し、後期の導入遺伝子発現を引き起こし、その後にウイルスゲノム複製が開始される。
【０３１１】
【表５】
2020531032.tif 000007
【０３１２】
ウイルスの生産および特性評価
プラスミドであるＥｎＡｄ２．４−ＣＭＶ−ＥｐＣＡＭＢｉＴＥ、ｐＥｎＡｄ２．４−ＳＡ−ＥｐＣＡＭＢｉＴＥ、ｐＥｎＡｄ２．４−ＣＭＶ−ＦＡＰＢｉＴＥ、ｐＥｎＡｄ２．４−ＳＡ−ＦＡＰＢｉＴＥ、ｐＥｎＡｄ２．４−ＣＭＶ−ＣｏｎｔｒｏｌＢｉＴＥ、ｐＥｎＡｄ２．４−ＳＡ−ＣｏｎｔｒｏｌＢｉＴＥを、ＡｓｃＩ酵素を用いて制限酵素消化で直線化し、直鎖状（liner）ウイルスゲノムを得た。消化後のＤＮＡを、イソプロパノール抽出で精製し、３００μｌの９５％超分子生物学グレードエタノールおよび１０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム中、１６時間、−２０℃の沈殿を行った。沈殿したＤＮＡを１４０００ｒｐｍ、５分間の遠心でペレット化し、５００μｌの７０％エタノールで洗浄後、再度１４０００ｒｐｍで５分間遠心した。このクリーンなＤＮＡペレットを風乾して１００μＬの水に再懸濁した。６．２５μｇのＤＮＡを、ＯｐｔｉＭＥＭ中の１５．６μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅトランスフェクション試薬と混合し、室温で２０分間インキュベートした。次に、このトランスフェクション用混合物を、８０％コンフルエントまで増殖させたＡｄ２９３細胞を含有するＴ−２５フラスコに添加した。細胞をこのトランスフェクション用ミックスと共に３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベートした後、４ｍｌの細胞培地（グルタミンおよび１０％ＦＢＳを添加した、ＤＭＥＭ（高グルコース））を細胞に添加し、３７℃、５％ＣＯ２でフラスコをインキュベートした。トランスフェクトしたＡｄ２９３細胞を２４時間毎にモニターし、４８〜７２時間毎に追加の培地を添加した。細胞単層における顕著な細胞変性効果（ＣＰＥ）の確認によって、ウイルスの生産をモニターした。広範なＣＰＥが確認されたら、３回の凍結融解サイクルにより、ウイルスをＡｄ２９３細胞から回収した。回収されたライセートを連続希釈してＡｄ２９３細胞に再感染させ、単プラークを含むウェルを回収することにより、単一ウイルスクローンを選択した。感染により完全なＣＰＥが達成されたら、ウイルス株を増幅するために、Ａｄ２９３細胞の連続的な感染を実施した。細胞単層における顕著なＣＰＥの観察により、増幅時の生存ウイルスの生産を確認した。
【０３１３】
ウイルスの精製
強力なウイルス株が増幅されたら、二重塩化セシウム密度勾配遠心（バンド形成）によってそのウイルスを精製し、ＮＧ−６０３ウイルス株、ＮＧ−６０４ウイルス株、ＮＧ−６０５ウイルス株、およびＮＧ−６０６ウイルス株を得た。これらの株の力価を、製造業者の取扱説明書に従ったｍｉｃｏＢＣＡアッセイ（ライフテクノロジーズ社）により測定した（表５）。
【０３１４】
【表６】
2020531032.tif 000008
【０３１５】
実施例１１
ＮＧ−６０１ウイルス、ＮＧ−６０２ウイルス、ＮＧ−６０３ウイルス、ＮＧ−６０４ウイルス、ＮＧ−６０５ウイルス、およびＮＧ−６０６ウイルスの活性を、下記の方法を用いて特性評価した。
【０３１６】
癌細胞株における、ＥｎＡｄと比較した、ＢｉＴＥをコードするＥｎＡｄの活性の特性評価
ＮＧ−６０１、ＮＧ−６０２、ＮＧ−６０３、ＮＧ−６０４、ＮＧ−６０５、ＮＧ−６０６、またはＥｎＡｄの複製能をＡ５４９肺癌細胞の感染によって解析し、ｑＰＣＲで評価した。Ａ５４９細胞を２×１０５細胞／ウェルの細胞密度で２４ウェルプレートのウェル内に播種した。プレートを、３７℃、５％ＣＯ２で１８時間インキュベートした後、細胞を１００粒子／細胞（ｐｐｃ）のウイルスに感染させるか、未感染のままとした。感染の２４時間後、４８時間後、または７２時間後にウェル回収を行い、ＰｕｒｅＬｉｎｋ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（インビトロジェン社）を製造業者のプロトコルに従って用いてＤＮＡを精製した。表６に詳細に記載された反応ミックス中のＥｎＡｄヘキソン遺伝子特異的プライマー−プローブセットを使用する、抽出された各試料または標準を用いたｑＰＣＲで、全ウイルスゲノムを定量化した。ｑＰＣＲは表７のプログラムに従って実行した。
【０３１７】
【表７】
2020531032.tif 000009
【０３１８】
【表８】
2020531032.tif 000010
【０３１９】
１細胞当たりに検出されたウイルスゲノムの数の定量化により、ＮＧ−６０１、ＮＧ−６０２、ＮＧ−６０３、ＮＧ−６０４、ＮＧ−６０５、ＮＧ−６０６、およびＥｎＡｄのウイルス複製がＡ５４９細胞株において同等であることが示された（図２２Ａ）。
【０３２０】
ＮＧ−６０１、ＮＧ−６０２、ＮＧ−６０３、ＮＧ−６０４、ＮＧ−６０５、ＮＧ−６０６、またはＥｎＡｄの腫瘍溶解活性を、Ａ５４９の感染によって評価した（図２２Ｂ）。Ａ５４９細胞を１．５×１０４細胞／ウェルの細胞密度で９６ウェルプレートに播種した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で１８時間インキュベートした後、細胞を漸増ｐｐｃのウイルス（５倍連続希釈、４．１×１０−７〜５０００ウイルスｐｐｃ）に感染させるか、未感染のままとした。５日目に、Ａ５４９細胞傷害性をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（ＭＴＳ）（プロメガ社、製品番号Ｇ３５８２）で測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍに組み込まれた４パラメーター非線形当てはめモデルを用いて用量反応曲線の当てはめを行った。ＩＣ５０値を各ウイルスについて求めたところ、ＮＧ−６０１、ＮＧ−６０２、ＮＧ−６０３、ＮＧ−６０４、ＮＧ−６０５、ＮＧ−６０６、およびＥｎＡｄの腫瘍溶解活性は各ウイルスで同等であることが示された。
【０３２１】
ＮＧ−６０３、ＮＧ−６０４、ＮＧ−６０５、ＮＧ−６０６からの機能的なＢｉＴＥ導入遺伝子発現の確認
ＮＧ−６０１ウイルス、ＮＧ−６０２ウイルス、ＮＧ−６０５ウイルス、ＮＧ−６０６ウイルスが機能的なＢｉＴＥを生産するかどうかを確認するために、標的細胞としてＣＨＯ細胞株、ＣＨＯ−ＥｐＣＡＭ細胞株、およびＣＨＯ−ＦＡＰ細胞株を用いるＴ細胞活性化アッセイを実施した。１０，０００個の標的細胞を、培地で１００倍希釈されたＡｄ２９３ウイルス上清と共に、Ｕ字底９６ウェルプレートのウェル内で、５０，０００個のＣＤ３＋Ｔ細胞と共培養し、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。細胞を回収し、抗ＣＤ２５抗体および抗ＣＤ６９抗体を用いて染色し、フローサイトメトリーで解析した。その結果（図２３Ａおよび図２３Ｂ）、ＮＧ−６０１ウイルスおよびＮＧ−６０２ウイルスが、ＣＨＯ−ＥｐＣＡＭ細胞と共培養された場合にＴ細胞を活性化する機能的なＢｉＴＥ導入遺伝子を発現し、ＮＧ−６０５およびＮＧ−６０６が、ＣＨＯ−ＦＡＰ細胞と共培養された場合にＴ細胞を活性化するが、ＣＨＯ細胞と共培養された場合はＴ細胞を活性化しない、機能的なＢｉＴＥ導入遺伝子を発現することが示された。
【０３２２】
結腸癌細胞株におけるＢｉＴＥ発現の定量化
ヒト結腸癌細胞株ＤＬＤのＮＧ−６０１、ＮＧ−６０２、ＮＧ−６０５、ＮＧ−６０６の感染によるＢｉＴＥ発現量を評価した。ＤＬＤ細胞を１．２×１０６細胞／ウェルの密度で６ウェル培養プレートに播種した。播種の１８時間後、ＤＬＤ細胞を、１００ｐｐｃのＥｎＡｄ、ＮＧ−６０１、ＮＧ−６０２、ＮＧ−６０３、ＮＧ−６０４、ＮＧ−６０５、ＮＧ−６０６に感染させた。細胞を７２時間培養した後、上清をウェルから回収し、１２００ｒｐｍで５分間遠心して細胞片を除去した。次に、この清澄化された上清を殺滅アッセイに用いて、細胞傷害性を既知濃度の組み換えＢｉＴＥを用いて作成された検量線と比較することで、ウイルス上清中のＢｉＴＥの量の測定を可能にした。
【０３２３】
ＮＧ−６０５およびＮＧ−６０６から生産されたＦＡＰ  ＢｉＴＥの量を測定するために、細胞傷害性アッセイを実施し、８，０００個のＮＨＤＦを、４０，０００個のＣＤ３＋Ｔ細胞、並びに１／１０３希釈、１／１０４希釈、および１／１０５希釈されたＤＬＤウイルス上清と共培養した。３３３３ｎｇ／μＬから３．３３×１０−４ｎｇ／μＬまでの１０倍連続希釈系列のＦＡＰ  ＢｉＴＥまたは対照ＢｉＴＥと共に、ＮＨＤＦ細胞およびＣＤ３＋Ｔ細胞をインキュベートすることによって、検量線を作成し。処理の２４時間後に上清を回収し、ＬＤＨアッセイで細胞傷害性を測定した。ウイルス上清の細胞傷害性を組み換えＢｉＴＥ検量線のそれと比較することによって、ＢｉＴＥの発現量を求めた。結果（図２４）が示す通り、ＮＧ−６０５ウイルスおよびＮＧ−６０６ウイルスは、１０６個のＤＬＤ細胞当たり、それぞれ９．８μｇおよび４９．２μｇのＦＡＰ  ＢｉＴＥを生産した。
【０３２４】
実施例１２
ＦＡＰ  ＢｉＴＥまたは対照ＢｉＴＥをコードしていることに加え、ＮＧ−６０７ウイルス、ＮＧ−６０８ウイルス、ＮＧ−６０９ウイルス、ＮＧ−６１０ウイルスは、蛍光顕微鏡法を用いた感染細胞の可視化のための赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）導入遺伝子（配列番号２０および配列番号２１、表４）も保有している。これらのウイルスの機能活性を、下記の方法を用いて特性評価した。
【０３２５】
ＮＧ−６０７、ＮＧ−６０８、ＮＧ−６０９、ＮＧ−６１０からの導入遺伝子発現の確認
ＮＧ−６０７ウイルス、ＮＧ−６０８ウイルス、ＮＧ−６０９ウイルス、およびＮＧ−６１０ウイルスの、自身のＢｉＴＥ導入遺伝子を生産する能力を、Ａｄ２９３細胞の感染により評価した。Ａｄ２９３細胞を１×１０６細胞／ウェルで６ウェルプレートに播種した。プレートを、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした後、細胞を１００ｐｐｃのウイルスに感染させるか、未感染のままとした。感染の４８時間後、プラークに蛍光水銀ランプを照射し、写真を撮影した（図１８）。その結果、ＮＧ−６０７ウイルス、ＮＧ−６０８ウイルス、ＮＧ−６０９ウイルス、およびＮＧ−６１０ウイルスはＲＦＰ導入遺伝子を発現することが示された。
【０３２６】
実施例１３
次の一連の実験では、ＥｎＡｄウイルスおよびＦＡＰ  ＢｉＴＥウイルスまたは対照ＢｉＴＥウイルスであるＮＧ−６０３、ＮＧ−６０４、ＮＧ−６０５、ＮＧ−６０６、ＮＧ−６０７、ＮＧ−６０８、ＮＧ−６０９、ＮＧ−６１０の、腫瘍細胞および線維芽細胞を含む標的細胞を殺滅する能力を、評価した。
【０３２７】
最初の試験では、ＥｎＡｄのＤＬＤ細胞を殺滅する能力を、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ技術を用いて評価した。ＤＬＤ細胞を１．２×１０４細胞／ウェルで４８ウェルＥ−ＰＬＡＴＥ内に播種し、３７℃、５％ＣＯ２で１８時間インキュベートした後、細胞を１００ｐｐｃのＥｎＡｄに感染させるか、未感染のままとした。ＸＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅを用いて、８日間のインキュベーション期間に亘って１５分毎に標的細胞傷害性を測定した。
【０３２８】
同様の実験で、ＮＧ−６０３、ＮＧ−６０４、ＮＧ−６０５、ＮＧ−６０６、およびＥｎＡｄの、ＮＨＤＦ細胞を殺滅する能力を、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅを用いた、ＳＫＯＶ腫瘍細胞およびＣＤ３＋Ｔ細胞との共培養において評価した。ＮＨＤＦ細胞およびＳＫＯＶ細胞をそれぞれ４×１０３細胞／ウェルおよび１×１０３細胞／ウェルで４８ウェルＥ−ＰＬＡＴＥに播種した。プレートを、３７℃、５％ＣＯ２で１８時間インキュベートした後、細胞を１００ｐｐｃのＥｎＡｄ、１００ｐｐｃのＮＧ−６０３、ＮＧ−６０４、ＮＧ−６０５、またはＮＧ−６０６に感染させるか、未感染のままとした。２時間のインキュベーションの後、３７，５００個のＣＤ３＋Ｔ細胞を各ウェルに加えた。ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅを用いて１５分毎に標的細胞傷害性を測定した。結果（図２６Ａ）から分かるように、ＦＡＰ  ＢｉＴＥ発現ウイルスであるＮＧ−６０５およびＮＧ６０６は、ＥｎＡｄ、または対照ＢｉＴＥ発現ウイルスであるＮＧ−６０３およびＮＧ−６０４とは異なり、ＢｉＴＥ発現に用いられたプロモーターに依存的な速度論で（ＣＭＶプロモーターを用いた場合より速い）、ＮＨＤＦ細胞の溶解を誘導することができた。
【０３２９】
同様の実験で、ＮＧ−６０３、ＮＧ−６０４、ＮＧ−６０５、ＮＧ−６０６、およびＥｎＡｄのＮＨＤＦ細胞を殺滅する能力を、ＬＤＨ  細胞傷害性アッセイを用いた、ＳＫＯＶ細胞およびＣＤ３＋Ｔ細胞との共培養において評価した。ＮＨＤＦ細胞およびＳＫＯＶ細胞を、それぞれ８×１０３細胞／ウェルおよび２×１０３細胞／ウェルで９６ウェルＵ字底プレート内に播種し、１００ｐｐｃのＥｎＡｄ、１００ｐｐｃのＮＧ−６０３、ＮＧ−６０４、ＮＧ−６０５、またはＮＧ−６０６に感染させるか、未感染のままとした。２時間のインキュベーションの後、７５，０００個のＣＤ３＋Ｔ細胞を各ウェルに加え、プレートを３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。処理後０時間、２４時間、４８時間、および９６時間の時点で上清を回収し、ＬＤＨ細胞傷害性アッセイで細胞傷害性を測定した。結果（図２６Ｂ）から分かるように、ＦＡＰ  ＢｉＴＥ発現ウイルスであるＮＧ−６０５およびＮＧ６０６は、ＥｎＡｄ、または対照ＢｉＴＥ発現ウイルスであるＮＧ−６０３およびＮＧ−６０４とは異なり、ＢｉＴＥ発現に用いられたプロモーターに依存的な速度論で、ＮＨＤＦ細胞の溶解を誘導することができた。
【０３３０】
上記のＬＤＨ実験の延長として、細胞を、処理後０時間、２４時間、４８時間、および９６時間の時点で回収し、ＣＤ４５、ＣＤ６９、およびＣＤ２５に対する抗体で染色し、フローサイトメトリーで解析した。結果（図２７）から分かるように、ＦＡＰ  ＢｉＴＥ発現ウイルスであるＮＧ−６０５およびＮＧ−６０６は、ＥｎＡｄ、または対照ＢｉＴＥ発現ウイルスであるＮＧ−６０３およびＮＧ−６０４とは異なり、ＢｉＴＥ発現に用いられたプロモーターに依存的な速度論で、Ｔ細胞活性化を誘導することができた。
【０３３１】
同様の実験で、ＦＡＰ  ＢｉＴＥを介したＴ細胞活性化の誘導のＦＡＰ依存性を評価した。９６ウェルＵ字底プレート内に、ＳＫＯＶ細胞を２×１０３細胞／ウェルで、単独で、または８×１０３細胞／ウェルのＮＨＤＦ細胞と組み合わせて播種した。ウイルス粒子を各ウェルに１００ｐｐｃで加え、プレートを３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。２時間後、７５，０００個のＣＤ３＋Ｔ細胞を加え、プレートをさらにインキュベートした。感染後９６時間の時点で、細胞を回収し、ＣＤ４５染色およびＣＤ２５染色を行い、フローサイトメトリー解析にかけた（図２８Ａ）。その結果として、ＦＡＰ  ＢｉＴＥ発現ウイルスであるＮＧ−６０５およびＮＧ−６０６は、ＦＡＰ陽性のＮＨＤＦ細胞の存在下でのみＴ細胞の活性化を誘導したことが示されている。
【０３３２】
同様の実験で、ＮＧ−６０５およびＮＧ−６０６におけるプロモーター（ＣＭＶまたはウイルスＭＬＰ／ＳＡ）駆動性ＢｉＴＥ発現の特異性をさらに調べた。９６ウェルＵ字底プレートに、ＮＨＤＦ細胞を４×１０３細胞／ウェルで播種した。１００ウイルス粒子／細胞を各ウェルに加え、プレートを３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。２時間後、４０，０００個のＣＤ３細胞を加え、プレートをさらにインキュベートした。感染後７２時間の時点で、上清を回収し、ＬＤＨ細胞傷害性アッセイにより細胞傷害性を測定した。結果（図２８Ｂ）から分かるように、ＣＭＶ駆動型ＮＧ−６０５ウイルスは、ＳＡ駆動型ＮＧ−６０６とは異なり、ＮＨＤＦ細胞単独への感染時にＮＨＤＦ細胞の殺滅を媒介することができた。
【０３３３】
結果から分かる通り、使用されたプロモーターに応じて動態プロファイルが若干異なるが、ＮＧ−６０５およびＮＧ−６０６の両方が、Ｔ細胞の活性化および標的細胞の溶解を誘導することができた。
【０３３４】
微速度ビデオを撮影して、組換えＦＡＰ  ＢｉＴＥ、ＥｎＡｄ、ＮＧ−６０３、またはＮＧ−６０５による、ウイルスまたはＴ細胞介在性の標的細胞溶解を観察した。製造業者のプロトコルに従って、ＮＨＤＦ細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ  Ｏｒａｎｇｅ  ＣＭＴＭＲ  Ｄｙｅ（ライフ・テック社（Life Tech）、製品番号Ｃ２９２７）で染色し、ＣＤ３＋Ｔ細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ライフ・テック社、製品番号Ｃ３４５５７）で染色した。染色後のＮＨＤＦを、１．３５×１０４個のＤＬＤ腫瘍細胞またはＳＫＯＶ腫瘍細胞と共培養させて、７．５×１０３細胞／ウェルで２４ウェルプレートに播種した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で１８時間インキュベートした。次に、細胞を３００ｎｇ／ｍＬのＦＡＰ  ＢｉＴＥで処理するか、１００ｐｐｃのＥｎＡｄ、ＮＧ−６０３、およびＮＧ−６０５に感染させるか、未処理のままにした。２時間のインキュベーションの後、１００，０００個の染色後ＣＤ３＋Ｔ細胞を必要なウェルに加え、さらに１．５μＭのＣｅｌｌＥｖｅｎｔ  Ｃａｓｐａｓｅ  ３−７試薬（ライフ・テック社、製品番号Ｃ１０４２３）も加えた。ニコン社製ＴＥ２０００−Ｅ  Ｅｃｌｉｐｓｅ倒立顕微鏡上でビデオを撮影し、画像は１５分毎に９６時間取り込んだ。ビデオより得られたフレームを図２９に示す。結果に示されているように、組換えＦＡＰ  ＢｉＴＥおよびＮＧ−６０５は、ＥｎＡｄまたはＮＧ−６０３と異なり、迅速なＮＨＤＦ細胞溶解を誘導することができた。
【０３３５】
同様の実験で、製造業者のプロトコルに従って、ＮＨＤＦ細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ  ＣＭＦＤＡ  Ｄｙｅ（ライフ・テック社、製品番号Ｃ２９２５）で染色し、ＣＤ３＋Ｔ細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ライフ・テック社、製品番号Ｃ３４５５７）で染色した。染色後のＮＨＤＦを、１．３５×１０４個のＤＬＤ腫瘍細胞またはＳＫＯＶ腫瘍細胞と共培養させて、７．５×１０３細胞／ウェルで２４ウェルプレートに播種した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で１８時間インキュベートした。次に、細胞を１００ｐｐｃのＮＧ−６０７、ＮＧ−６０８、ＮＧ−６０９、またはＮＧ−６１０に感染させるか、未感染のままとした。２時間のインキュベーションの後、１００，０００個の染色後ＣＤ３＋Ｔ細胞を必要なウェルに加えた。ニコン社製ＴＥ２０００−Ｅ  Ｅｃｌｉｐｓｅ倒立顕微鏡上でビデオを撮影し、画像は１５分毎に９６時間取り込んだ。ビデオより得られたフレームを図３０に示す。結果に示されているように、全てのウイルスが腫瘍細胞感染（ＲＦＰ、赤色蛍光、陽性）をもたらしたが、共培養されたＮＨＤＦ細胞の迅速な溶解を誘導することができたのはＮＧ−６０９およびＮＧ−６１０だけであった。
【０３３６】
実施例１４
本実施例では、ＥｎＡｄ、ＮＧ−６０３、ＮＧ−６０４、ＮＧ−６０５、およびＮＧ−６０６による、がん患者のＦＡＰ＋初代悪性腹水由来の自家腫瘍関連リンパ球の活性化を評価した。ＣＤ３＋Ｔ細胞およびＦＡＰ＋細胞を含有する患者試料を、さらなる解析に好適と見なした。
【０３３７】
最初の実験で、患者から得られた未純化（すなわち回収時から未変化）の腹水細胞を、１００％腹水中、Ｕ字底９６ウェルプレートの１ウェル当たり２５０，０００細胞で播種した。細胞を１００ｐｐｃのウイルスに感染させ、未処理のウェルは陰性対照として用いた。ＥｎＡｄ−ＣＭＶ−ＧＦＰおよびＥｎＡｄ−ＳＡ−ＧＦＰも、それぞれ、顕微鏡像により感染および後期のウイルス遺伝子発現を確認するためのレポーターとして実験で用いた。３７℃で５日間インキュベートした後、全細胞集団を回収し、ＣＤ３＋Ｔ細胞上のＣＤ２５の発現レベルを測定した（図３２Ａ）。１ウェル当たりの総細胞数はＰｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｂｅａｄｓを用いて求めた。結果に示されているように、ＦＡＰ  ＢｉＴＥウイルスであるＮＧ−６０５およびＮＧ−６０６は、腫瘍関連リンパ球のＴ細胞活性化を顕著に増大させた。
【０３３８】
上記の実験の延長で、レプリケートのウェルを回収し、内在性ＦＡＰ＋細胞の数をフローサイトメトリーで測定した。１ウェル当たりの総細胞数はＰｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｂｅａｄｓを用いて求めた。結果（図４０Ｂ）に示されているように、ＮＧ−６０５およびＮＧ−６０６は腹水試料中の自家ＦＡＰ発現細胞の数を顕著に減少させたが、このことは、一部のＦＡＰ＋細胞が活性化Ｔ細胞によって殺滅されたことを示唆している。
【０３３９】
２つ目の実験では、がん患者から得られた未純化（すなわち回収時から未変化）の腹水細胞を、１００％腹水中または１％ヒト血清添加培地中、Ｕ字底９６ウェルプレートの１ウェル当たり２５０，０００細胞で播種した。細胞を１００ｐｐｃのウイルスに感染させ、未処理のウェルは陰性対照として用いた。ＥｎＡｄ−ＣＭＶ−ＧＦＰおよびＥｎＡｄ−ＳＡ−ＧＦＰも、それぞれ、顕微鏡像により感染および後期のウイルス遺伝子発現を確認するためのレポーターとして用いた。３７℃で５日間インキュベーションした後、総細胞集団を回収し、ＣＤ３＋Ｔ細胞の数（図３３）およびＣＤ３＋Ｔ細胞上のＣＤ２５の発現レベル（図３４）を測定した。１ウェル当たりの総細胞数はＰｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｂｅａｄｓを用いて求めた。結果に示されているように、この患者の場合、組換えＦＡＰ  ＢｉＴＥおよびＮＧ−６０５は、ＮＧ−６０６と異なり、培地中で腫瘍関連リンパ球のＴ細胞活性化を顕著に増大させた。どのウイルスも腹水中では活性化を引き起こさなかった。
【０３４０】
上記の実験の延長で、レプリケートのウェルを回収し、ＦＡＰ＋細胞の数をフローサイトメトリーで測定した（図３５）。１ウェル当たりの総細胞数はＰｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｂｅａｄｓを用いて求めた。結果に示されているように、組換えＦＡＰ  ＢｉＴＥおよびＮＧ−６０５は、ＮＧ−６０６と異なり、培地中で自家ＦＡＰ発現細胞の数を顕著に減少させた。どのウイルスも腹水中ではＦＡＰ＋細胞の減少を引き起こさなかった。
【０３４１】
実施例１５：考察
腫瘍溶解性ウイルスは、単一の標的化された自己複製する媒介物の中で、いくつかの治療モダリティを組み合わせる興味深い新たな戦略を提供する（Keller & Bell, 2016; Seymour & Fisher, 2016）。腫瘍溶解性ウイルスはがん細胞内で選択的に複製し、細胞から細胞へと拡散するため、いくつかの腫瘍溶解性ウイルスは、死につつある細胞からウイルス粒子を脱出させるプロセスの一部として、非アポトーシス性細胞死経路による細胞死を媒介すると考えられている（Ingemarsdotter et al, 2010; Li et al, 2013）。ＥｎＡｄは特に、オンコーシス（oncosis）または虚血性細胞死として知られている炎症誘発性プロセスによって細胞を殺滅する（Ｄｙｅｒ，  ２０１７）。この非アポトーシス性細胞死機構が、ＡＴＰ、ＨＭＧＢ１、およびカルレティキュリンの暴露など、いくつかの炎症誘導性細胞成分の放出を引き起こし（損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）として知られている）（Weerasinghe & Buja, 2012）、効果的な抗がん免疫応答を促進するウイルスの能力にとって極めて重要である可能性がある。しかし、直接的な溶解の影響の他にも、ウイルスは他の抗がん性生物学的製剤をコードおよび発現させるのに有望であり、送達上の課題を取り除いて、確実に、生物学的製剤に腫瘍微小環境内でその最高濃度を達成させる。ＩｍｌｙｇｉｃはＧＭ‐ＣＳＦをコードしているが、ウイルス武装の可能性は実質的に無限であり、相加的または相乗的な抗がん作用を示す多様式の治療方針を設計する、多くの刺激的な機会を提供する（de Gruijl et al, 2015; Hermiston & Kuhn, 2002）。
【０３４２】
腫瘍溶解性ウイルスにＢｉＴＥをコードさせることにより、腫瘍浸潤性リンパ球を活性化させて細胞傷害性にし、抗原陽性標的細胞を溶解させるための強力な手段が得られ、直接的なウイルス性溶解の作用とは全く別の治療モダリティが実現する。本研究では、ＢｉＴＥ標的化細胞傷害性が、完全に抗原特異的であり、ＣＤ４  Ｔ細胞およびＣＤ８  Ｔ細胞の両方に媒介させることができ（Brischwein et al, 2006）、腫瘍溶解性アデノウイルスに組み込んでウイルス複製可能な細胞でのみ発現させることができること、が示された。さらに、本研究は、はじめて、液体がん生検内の内因性Ｔ細胞が、ＢｉＴＥおよびウイルスにコードされたＢｉＴＥでの活性化が可能であり、いかなる追加の刺激も免疫抑制の解除もなしで内因性腫瘍細胞を殺滅させることができることを示している。固形腫瘍の免疫抑制的微小環境の代わりに、腹腔腹水または胸水という微小環境を含む初代体液中であっても、これを引き起こすことができるということが重要である。
【０３４３】
ＢｉＴＥを発現させるような腫瘍溶解性ウイルスへの搭載は、２つの全く異なる治療メカニズムを組み合わせており、１つ目はウイルス感染に許容的な腫瘍細胞の溶解による殺滅をもたらすものであり、２つ目は選択された特異的抗原を介してＴ細胞の細胞傷害性を標的化するものである。これにより、治療アプローチの設計にかなりの柔軟性がうまれ、ウイルスによる直接的な殺滅に対して比較的耐性がある腫瘍関連細胞に細胞傷害性を送達することに、ＢｉＴＥが用いられる可能性がある。例えば、本明細書には癌関連抗原（ＥｐＣＡＭ）を認識するＢｉＴＥを用いる技術が例示されたが、腫瘍関連線維芽細胞または他の間質細胞に細胞傷害性を標的化することにＢｉＴＥアプローチを利用することも可能である。実際には、ＢｉＴＥによる認識の標的が腫瘍微小環境内の発現に限定されない場合であっても、ＢｉＴＥ産生をウイルス複製と関連させることで、ＢｉＴＥの発現を空間的に腫瘍に限定することができ、全身毒性を最小限にすることができる。このことは、静脈内投与されたＢｉＴＥは比較的短い循環動態を示し（Klinger et al, 2012）、かなりの腫瘍外オンターゲット毒性を伴う場合が多い（on‐target off‐tumour toxicity）（Teachey et al, 2013）ため、重要である。
【０３４４】
以前に、エフリンＡ２を標的とするＢｉＴＥを含む腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを用いて、腫瘍溶解性ウイルス内にＢｉＴＥをコードさせる可能性が探られた。この代理人（agent）により、インビトロおよびインビボの両方で、エフリンＢｉＴＥが、ＰＢＭＣの活性化と、腫瘍細胞の抗原標的殺滅とを媒介できることが示された。興味深いことに、このＢｉＴＥはＴ細胞を活性化できた一方で、外来性ＩＬ‐２を添加しないとＴ細胞増殖を引き起こさなかったが、本研究で使用されたＢｉＴＥは、インビトロではＰＢＭＣの増殖を、また、エキソビボでは臨床生検試料を用いた腫瘍関連リンパ球の増殖を、大規模に引き起こした。
【０３４５】
確認された差異は、ＢｉＴＥ設計の違いや使用された腫瘍溶解性ウイルスの違いを反映しているか、あるいは、Ｔ細胞上のＣＤ３の十分な架橋を与える抗原密度によるものかもしれないと考えている。
【０３４６】
腫瘍溶解性ウイルス療法の１つの中心的な目標は、「公有の」腫瘍関連抗原だけでなく患者特有のネオアンチゲンも認識する抗がん性Ｔ細胞応答をつくり出すことである。溶解性ウイルスは、ウイルスに関連した病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）と併せたＤＡＭＰとの関連において、腫瘍細胞を溶解することで、抗原提示の向上を促すことにより、これを成し得る。ＥｎＡｄの静脈内送達後に切除された結腸腫瘍の免疫組織化学染色によって、ウイルスがＣＤ８＋Ｔ細胞の腫瘍組織への強力な流入を促進することが示唆されている（Garcia‐Carbonero, 2017）。しかし、これは非常に強力なアプローチではある一方で、適応Ｔ細胞応答は、標的化された殺滅を可能とするために、腫瘍細胞によるＭＨＣクラスＩ抗原の発現に極端に依存している。ＭＨＣ発現の消失が、腫瘍の免疫回避戦略として詳細に報告されている（Garrido et al, 2016）。
【０３４７】
注目すべきは、ＢｉＴＥ搭載腫瘍溶解性ウイルスによって直に関連し合う両方の細胞傷害戦略が、腫瘍細胞によるＭＨＣクラスＩとは独立して働き、そのため、腫瘍細胞がＭＨＣ発現を失っている場合であっても、これを利用することでがん細胞を殺滅することができる、という点である。
【０３４８】
このように、本研究は、ＥｎＡｄ内にＢｉＴＥをコードさせることで、いくつかの初期の臨床試験で既に研究済みの当該ウイルスの既知の血中安定性および全身生物学的利用能を利用する、播種性腫瘍における標的発現を達成するための特に有望な戦略が、可能となることを示している。特筆すべきは、このウイルスを静脈内投与した数日後に原発性結腸がんを切除した研究で、その後の腫瘍切片の免疫組織学的評価によって、ウイルスが腫瘍中の領域に行きわたって、核内において強力なヘキソンシグナルを提示することが示されたことであり、このことは、腫瘍細胞に選択的な感染およびウイルス複製が成功したことを示している。このことは、このウイルスが１００％ヒト血液中で安定であり、ヒト患者における播種性悪性腫瘍および転移性悪性腫瘍の腫瘍標的感染が可能であるはずことを示している、前臨床データ（Di et al, 2014; Illingworth, 2017）を裏付けるものである。
【０３４９】
腫瘍溶解性病原性を失わせることなくＥｎＡｄにＢｉＴＥをコードさせることができたが、このことは、このウイルスの導入遺伝子パッケージング能力がかなりのものであることを表している。導入遺伝子の存在はウイルス粒子の物理化学的性質に影響を与えることはないため、この改変ウイルスは、親病原体と全く同じ臨床薬物動態を示すはずであり、コードされたＢｉＴＥを、全身の中で腫瘍内選択的に発現することが可能であるはずである。これにより、現在臨床的評価が優先されるべき、全身を標的としたがん免疫療法への、刺激的で潜在的に非常に効果的な新規アプローチが提供される。
【０３５０】
実施例１６
患者の悪性滲出液によるヒトＴ細胞活性化および標的細胞傷害性の免疫抑制
悪性滲出液とは、後期転移性がん患者によく見られる、免疫応答が抑制された、免疫寛容の可能性がある環境を意味する。ＩＬ−１０は、抗炎症性サイトカインであると考えられているが、Ｈｕｍａｎ  ＩＬ−１０  ＥＬＩＳＡ  ＭＡＸキット（バイオレジェンド社、４３０６０４）を用いて、正常血清または患者悪性滲出液（Ａ、腹腔腹水；Ｐ、胸水）中のその含量を測定した。滲出液中のＩＬ−１０レベル（８８．１〜６３３．４ｐｇ／ｍＬ）は、正常血清中で測定されたレベル（７．２〜１０ｐｇ／ｍＬ）を大きく超えていた。
【０３５１】
正常血清、腹水、または胸膜液の存在下でＰＢＭＣ  Ｔ細胞を活性化するＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（ギブコ社、１１１６１Ｄ）の能力を調べた。ヒトＰＢＭＣ  Ｔ細胞（９６ウェルプレート内の１００，０００細胞／ウェル）を、正常血清または患者滲出液（５０％）中で、ＣＤ３／ＣＤ２８  ビーズで処理した（製造業者の説明書に従う）。陰性対照として、Ｔ細胞を各体液中で未処理のままにした。２４時間の培養後、細胞を回収し、ＣＤ３＋Ｔ細胞上のＣＤ６９およびＣＤ２５の発現レベルを抗体染色およびフローサイトメトリーで解析し、ダブルポジティブ（ＣＤ６９＋ＣＤ２５＋細胞）の割合として表した。正常血清中では、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズは、ＣＤ２５およびＣＤ６９がダブルポジティブであるおよそ６０％のＴ細胞をもたらし、一方、腹水の存在は６／１２の体液においてＴ細胞活性化を減弱した。
【０３５２】
同様の実験で、正常血清、腹水、または胸膜液（５０％）の存在下で、１００，０００個のＴ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで処理した。抗ＣＤ１０７ａ抗体またはアイソタイプ対照抗体を培地に直接加えた。１時間後、製造業者の説明書に従ってモネンシンを添加した（ＢＤ  Ｇｏｌｇｉｓｔｏｐ、ＢＤバイオサイエンス社）。さらに５時間後、細胞を回収し、フローサイトメトリー解析により脱顆粒を測定した。正常血清中では、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズは、およそ２２．５％のＴ細胞を脱顆粒させ、一方、腹水の存在は１０／１２の体液においてＴ細胞活性化を減弱した。脱顆粒のレベルは、各体液中のＩＬ−１０の含量と有意に相関していた（ピアソン係数、ｒ＝−０．７６４５；ｐ＝０．００３８）。
【０３５３】
同様の実験で、正常血清、腹水、または胸膜液（５０％）の存在下で、７５，０００個のＴ細胞を１５，０００個のＳＫＯＶ３およびＥｐＣＡＭと共培養した。陰性対照として、Ｔ細胞を各体液中で対照ＢｉＴＥで処理した。２４時間の培養後、細胞を回収し、ＣＤ３＋Ｔ細胞上のＣＤ６９およびＣＤ２５の発現レベルを抗体染色およびフローサイトメトリーで解析し、ダブルポジティブ（ＣＤ６９＋ＣＤ２５＋細胞）の割合として表した。正常血清中では、ＥｐＣＡＭ  ＢｉＴＥは、ＣＤ２５およびＣＤ６９がダブルポジティブであるおよそ６７．６％のＴ細胞をもたらし、一方、腹水の存在は０／１２の体液においてＴ細胞活性化を減弱し、４／１０の体液において活性化をわずかに誘導した。
【０３５４】
同様の実験で、正常血清、腹水、または胸膜液（５０％）の存在下で、７５，０００個のＴ細胞を１５，０００個のＳＫＯＶ３およびＥｐＣＡＭと共培養した。陰性対照として、Ｔ細胞を各体液中で対照ＢｉＴＥで処理した。抗ＣＤ１０７ａ抗体またはアイソタイプ対照抗体を培地に直接加えた。１時間後、製造業者の説明書に従ってモネンシンを添加した（ＢＤ  Ｇｏｌｇｉｓｔｏｐ、ＢＤバイオサイエンス社）。さらに５時間後、細胞を回収し、フローサイトメトリー解析により脱顆粒を測定した。正常血清中では、ＥｐＣＡＭ  ＢｉＴＥビーズは、およそ４１．４％のＴ細胞を脱顆粒させ、一方、腹水の存在は２／１２の体液においてＴ細胞活性化を減弱した。
【０３５５】
悪性滲出液中のＴ細胞介在性標的細胞溶解を誘導するＥｎＡｄ−ＳＡ−ＥｐＣＡＭＢｉＴＥおよびＥｎＡｄ−ＳＡ−対照ＢｉＴＥの能力を、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ技術を用いて評価した。ＳＫＯＶ細胞をそれぞれ１×１０４細胞／ウェルで４８ウェルＥ−ＰＬＡＴＥに播種した。プレートを、３７℃、５％ＣＯ２で１８時間インキュベートした後、細胞を１００粒子／細胞（ｐｐｃ）のウイルスに感染させるか、未感染のままとした。２時間後、正常血清または患者滲出液（最終、５０％）中のＰＢＭＣ  Ｔ細胞（５：１）を加えた。ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅを用いて、標的細胞傷害性を１０分毎に測定した。結果から、Ｔ細胞によるＢｉＴＥ介在性ＳＫＯＶ３溶解は使用された体液に非依存的であることが示唆される。
【０３５６】
未純化の腹水細胞（すなわち、採取時から未変化）を、ＲＰＭＩ培地または腹水中、平底９６ウェルプレートの１ウェル当たり１００，０００細胞で、播種する。細胞をＥｐＣＡＭ  ＢｉＴＥまたは対照ＢｉＴＥで処理し、未処理のウェルは陰性対照として用いた。３７℃で２４時間インキュベートした後、細胞を回収し、ＣＤ３細胞上のＣＤ２５およびＣＤ６９の発現レベルを測定した。結果に示されるように、ＥｐＣＡＭ  ＢｉＴＥは、腹水によってわずかに増加した、腫瘍関連リンパ球のＴ細胞活性化（ＣＤ６９／ＣＤ２５ダブルポジティブ）を顕著に増大させた。
【０３５７】
同様の実験で、未純化の腹水細胞（すなわち、採取時から未変化）を、ＲＰＭＩ培地または腹水中、平底９６ウェルプレートの１ウェル当たり１００，０００細胞で、播種する。細胞をＥｐＣＡＭ  ＢｉＴＥウイルス、対照ＢｉＴＥウイルス、または組み換えＢｉＴＥウイルスで処理し（１００ｖｐ／細胞）、未処理のウェルは陰性対照として用いた。３７℃で５日間インキュベートした後、総細胞集団を回収し、フローサイトメトリーによって、ＣＤ３＋細胞の数、およびＣＤ３細胞上のＣＤ２５の発現レベルを測定し、内在性ＥｐＣａＭ＋細胞の数を測定した。１ウェル当たりの総細胞数はＰｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｂｅａｄｓを用いて求めた。結果に示されているように、ＥｐＣＡＭ  ＢｉＴＥおよびＥｐＣＡＭ  ＢｉＴＥ発現ＥｎＡｄは、ＲＰＭＩ培地中および腹水中の両方で、腫瘍関連リンパ球のＴ細胞活性化（ＣＤ３数、ＣＤ２５）およびＥｐＣＡＭ＋細胞の細胞傷害性を顕著に増大させた。
【０３５８】
上記の実験の延長として、６つのさらなる患者滲出液試料（計７つ）を腹水中で同様に処理し、ＣＤ３＋の数、Ｔ細胞のＣＤ２５発現、およびＥｐＣＡＭ＋細胞の数をフローサイトメトリーで測定した。結果に示されているように、ＥｐＣＡＭ  ＢｉＴＥおよびＥｐＣＡＭ  ＢｉＴＥ発現ＥｎＡｄは、一連の滲出液生検試料中で再現性よく、腫瘍関連リンパ球のＴ細胞活性化（ＣＤ３数、ＣＤ２５）およびＥｐＣＡＭ＋細胞の細胞傷害性を顕著に増大させた。
【０３５９】
実施例１７
ＦＡＰ  ＢｉＴＥはＴ細胞の活性化と、種々のドナーＴ細胞によるＦＡＰ＋細胞の殺滅を媒介する
他の実験で、実施例２に記載の方法を用いて、ＮＨＤＦ細胞およびＴ細胞の共培養において試験された組換えＦＡＰ  ＢｉＴＥタンパク質のＴ細胞活性化特性のさらなる評価を行い、対照ＢｉＴＥ、および抗ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓを用いたポリクローナルＴ細胞活性化と比較した。
【０３６０】
２４時間の培養後に回収した上清を、ＥＬＩＳＡでＩＦＮγについて試験し（図３６Ａ）、サイトカインビーズアレイ（ＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘ  Ｈｕｍａｎ  Ｔ  Ｈｅｌｐｅｒ  Ｓｙｔｏｋｉｎｅ  Ｐａｎｅｌ、バイオレジェンド社、製品番号７４００１）でサイトカインパネルについて試験した（図３６Ｂ）。対照ＢｉＴＥはどのサイトカインにも有意な変化を誘導しなかったが、ＦＡＰ−ＢｉＴＥはγインターフェロン、ＩＬ−２、ＴＮＦα、ＩＬ−１７、およびＩＬ−１０を強力に増加させ、これは異なるＴ細胞サブセットが刺激されることと一致しており、ＩＦＮγの産生は抗ＣＤ３／ＣＤ２８で惹起されたものよりもはるかに多くなった。
【０３６１】
また、ＮＨＤＦ細胞の存在下で、ＦＡＰ  ＢｉＴＥによる刺激は、対照ＢｉＴＥによる刺激と異なり、Ｔ細胞表面上のＣＤ１０７ａ／ＬＡＭＰ１の外在化（フローサイトメトリーで評価される）によって測定される、Ｔ細胞（ＣＤ４＋サブセットおよびＣＤ８＋サブセットの両方）の迅速な脱顆粒（６時間以内）も誘導し、これは標的細胞を殺滅する能力と強く相関している（図３６Ａおよび図３６Ｂ）。このＦＡＰ  ＢｉＴＥによる脱顆粒の誘導は、ＰＢＭＣ  Ｔ細胞（約２．５ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０）との２４時間の共培養後のＬＤＨ放出によって測定される、強力な線維芽細胞溶解（図６９Ｃ）に変換され、Ｔ細胞の活性化および細胞傷害性の誘導は６／６のドナーＴ細胞を用いて確認された（図６９Ｄ）。対照ＢｉＴＥでは細胞傷害性は誘導されなかったが、これはＴ細胞が不活性化状態を維持していることと一致している。
【０３６２】
実施例１８
様々ながん（ancer）患者由来の初代悪性腹水試料中の細胞に対するＦＡＰ  ＢｉＴＥウイルスおよびＥｎＡｄ−ＦＡＰ  ＢｉＴＥウイルスの作用
実施例１６に記載された研究の続きとして、さらなるがん患者由来の新鮮初代悪性腹腔腹水をＥｎＡｄ  ＦＡＰ  ＢｉＴＥウイルス活性の研究用に入手した。ＥｐＣＡＭ＋腫瘍細胞およびＦＡＰ＋線維芽細胞の両方を含有する３つの患者試料をエキソビボで増殖させ、その混合（接着）細胞集団を、ＰＢＭＣ由来Ｔ細胞と、未改変またはＢｉＴＥ発現型のＥｎＡｄウイルスと共に培養した。７２時間後、全細胞を回収し、ＦＡＰ＋細胞（図３８Ａ）およびＥｐＣＡＭ＋細胞（図３８Ｂ）の数をフローサイトメトリーで測定した。さらに、Ｔ細胞の（ＣＤ２５発現による）活性化状態を測定した（図３８Ｃ）。ＥｎＡｄ−ＣＭＶ−ＦＡＰＢｉＴＥ感染およびＥｎＡｄ−ＳＡ−ＦＡＰＢｉＴＥ感染の両方が、全ての患者試料において、Ｔ細胞活性化およびＦＡＰ＋細胞枯渇を誘導し、ＥｐＣＡＭ＋腫瘍細胞のレベルには有意な変化を生じなかった。親ＥｎＡｄまたは対照ウイルスは観察可能なＴ細胞活性化を誘導せず、ＦＡＰ＋細胞数は未感染対照と同様の数を維持した。
【０３６３】
このＦＡＰ＋線維芽細胞の枯渇が、一貫して、上清中に検出される免疫抑制性サイトカインＴＧＦβのレベルを強く減少させたことは、重要なことである（図３８Ｄ）。
【０３６４】
２つ目の一連の実験では、５つの患者生検試料由来の全（且つ未純化）細胞に対し、当該試料中の内因性腫瘍関連Ｔ細胞の活性を査定するための評価を行った。細胞を５０％腹水中に播種し、組換え型の対照ＢｉＴＥタンパク質もしくはＦＡＰ  ＢｉＴＥタンパク質、または１００ｖｐ／ｃｅｌｌのＥｎＡｄウイルスもしくはＥｎＡｄ−ＢｉＴＥウイルスで処理した。５日間のインキュベーションの後、Ｔ細胞活性化（ＣＤ２５発現による）およびＦＡＰ＋細胞の残存数をフローサイトメトリーで測定した（図３９Ａおよび図３９Ｂ）。３つ全ての患者試料で、組換えＦＡＰ−ＢｉＴＥおよびＥｎＡｄ−ＣＭＶ−ＦＡＰ  ＢｉＴＥはＴ細胞活性化を強く誘導し、最大約８０％の患者由来Ｔ細胞を活性化して、ＦＡＰ＋線維芽細胞の顕著な枯渇を引き起こした。興味深いことに、ＥｎＡｄ−ＳＡ−ＦＡＰ−ＢｉＴＥは２／３の試料においてＣＤ２５発現を誘導したが、患者１では活性化もＦＡＰ＋細胞枯渇も確認できなかった。これはおそらく、ウイルスに感染させＢｉＴＥタンパク質を産生させるために存在していた腫瘍細胞が不十分であったことが原因であり（フローサイトメトリーでこの試料中にはＥｐＣＡＭ＋腫瘍細胞が検出されなかった）、ＭＬＰ（ＳＡ）駆動型導入遺伝子発現に腫瘍細胞が必要であることと合致している（これは、図４２〜４４に示される、患者腹水試料を用いた場合で、ＥｎＡｄ−ＳＡ−ＦＡＰ−ＢｉＴＥウイルスによって、Ｔ細胞活性化およびＦＡＰ＋細胞枯渇が生じていないことの説明にもなっている可能性がある）。まとめると、データに示されているように、ＦＡＰ−ＢｉＴＥ発現ＥｎＡｄは、腫瘍細胞感染後に、再現性よく、腫瘍関連Ｔ細胞の活性化を引き起こし、内在性線維芽細胞を殺滅させることができる。
【０３６５】
別の実験で、Ｔ細胞の７３．６％がＰＤ−１陽性であり、ＦＡＰ＋細胞の６２．９％がＰＤＬ１陽性であった（図４０Ａ）患者生検試料を用いて、ＰＤ−１チェックポイントを遮断することにより、ＦＡＰ−ＢｉＴＥ活性を向上させることができるかどうかを調べた。前述の共培養と同様の共培養を、最終濃度２．５μｇ／ｍＬの、精製された遮断用の抗ヒトＰＤＬ１のマウスＩｇＧ２ｂ抗体（バイオレジェンド社、クローン２９Ｅ．２Ａ３）の存在下または非存在下で準備した。２日間の培養の後、全細胞を回収し、残存ＦＡＰ＋細胞およびＴ細胞活性化を測定した。遮断用抗ＰＤＬ１抗体の使用は、ＣＤ２５誘導をわずかに増加させ（図４０Ｂ）、ＩＦＮγ産生を２倍に増やしたが（図４０Ｃ）、ＦＡＰ＋細胞の枯渇には変化を生じず（図４０Ｄ）、いずれの状況においても２日目までにほぼ完全な溶解を引き起こした。
【０３６６】
卵巣がん患者の腹水から単離された腫瘍関連リンパ球（ＴＡＬ）は、ＰＤ−１の発現が豊富であり、細胞傷害性およびＩＦＮｇ産生をはじめとするエフェクター機能が損なわれていることが報告されている。これに合致して、６つのがん患者腹水生検由来のＣＤ３＋細胞上のＰＤ−１発現は、３人の健常ドナー由来の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）中のものよりも、２倍多かった（図４１Ａ）。これらのがん生検試料内でのＴ細胞の機能性を評価するため、ＮＨＤＦ細胞および未純化ＰＢＭＣ細胞または腹水細胞（各試料の％ＣＤ３＋細胞を図４１Ｂに示す）を、対照ＢｉＴＥまたはＦＡＰ  ＢｉＴＥを含有する上清と共培養し、５日後に上清を回収し、ＩＦＮγについてＥＬＩＳＡ試験をおこなった（図４１Ｃ）。ＩＦＮγは対照ＢｉＴＥでは誘導されなかった。３つの腹水細胞試料がＰＢＭＣ試料と同様のレベルでＩＦＮγを産生していたが、他の３つはＦＡＰ  ＢｉＴＥに対する応答が減弱されていた。次に、ＢｉＴＥを介したＮＨＤＦ細胞の溶解を誘導するこれらのＴ細胞の能力が調べられている。ＮＨＤＦを播種し、ＰＢＭＣまたは腹水細胞をＢｉＴＥ含有上清と共に加え、培養物中の細胞の生存率を、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ細胞傷害性アッセイシステムを用いてリアルタイムでモニターした。ＩＦＮγ産生にはばらつきがあったが、全ての腹水試料が、ＦＡＰ  ＢｉＴＥと添加された場合に、十分なＮＨＤＦ細胞傷害性を引き起こし、ＢｉＴＥを介したＮＨＤＦ溶解の速度は、ＰＢＭＣによって達成された場合に確認された速度と全体的に同様であった（図４１Ｄ）。
【０３６７】
ＦＡＰ  ＢｉＴＥが患者悪性滲出液試料（全て５０％）の存在下でＴ細胞活性化をもたらすことができるかどうかを調べるため、５０％正常ヒト血清（ＮＳ）もしくは各種（無細胞）悪性滲出液試料中、ＰＢＭＣ  Ｔ細胞を、ＮＨＤＦ細胞の存在下において対照ＢｉＴＥもしくはＦＡＰ  ＢｉＴＥで活性化するか、または、抗ＣＤ３／ＣＤ２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓで活性化した。正常血清中では抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズによる刺激の２４時間後に７４％のＴ細胞が活性化されたが（ＣＤ２５／ＣＤ６９ダブルポジティブ）、試験された腹水の３／５が、ＮＳ中の応答と比較して、Ｔ細胞活性化を顕著に減弱させた（図４２Ａ）。しかし、ＰＢＭＣをＮＨＤＦと培養し、ＦＡＰ  ＢｉＴＥで刺激した場合、いずれの滲出液の存在下においてもＴ細胞活性化の抑制は確認されず（図４２Ｂ）、このことは、ＦＡＰ  ＢｉＴＥが免疫抑制機構を乗り越えてＴ細胞を活性化できることを示している。
【０３６８】
実施例１９
ＥｎＡｄ−ＦＡＰＢｉＴＥを介した腫瘍崩壊およびＴ細胞刺激は、患者腹水中のＣＤ１１ｂ＋ＴＡＭを、より活性型の表現型へと極性化させる
ＦＡＰ  ＢｉＴＥを介したＴ細胞の活性化と、その後のＦＡＰ＋線維芽細胞の除去（および付随するＴＧＦβ１の減少）による、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、およびＩＬ−２を含むＴｈ１サイトカインの産生が、腫瘍微小環境における、免疫抑制性且つ発癌促進性から抗腫瘍活性へと向けた他の変化と関連しているかどうかを調べるため、未分離の腹水細胞試料中の腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）に対する影響を評価した。未純化の全患者腹水細胞を５０％腹水に播種し、遊離型の対照ＢｉＴＥもしくはＦＡＰ  ＢｉＴＥで処理するか、またはＥｎＡｄ−ＳＡ−対照ＢｉＴＥウイルスもしくはＥｎＡｄ−ＳＡ−ＦＡＰＢｉＴＥウイルス（１００ｖｐ／細胞）に感染させた。並行して、一部の細胞をＩＦＮγで処理して、活性化型のＣＤ１１ｂ骨髄性細胞表現型を誘導した。３日のインキュベーションの後、Ｔ細胞の活性化状態を測定してから；フローサイトメトリーによるＣＤ２５＋細胞の測定およびＥＬＩＳＡによるＩＦＮγ分泌の測定を行った。
【０３６９】
ＦＡＰ  ＢｉＴＥおよびＥｎＡｄ−ＳＡ−ＦＡＰＢｉＴＥによる処理によって、およそ６０％のＣＤ３＋Ｔ細胞がＣＤ２５＋となり（図４３Ａ）、大量のＩＦＮγが培養上清中に分泌された（図４３Ｂ）。ＣＤ２５発現およびＩＦＮγのどちらについても、対照ＢｉＴＥおよび対照ウイルスのどちらによっても、バックグラウンドを超える増加は確認されなかった。ＴＡＭの極性化を評価するため、ＣＤ１１ｂ＋細胞上の、ＣＤ６４およびＣＤ８６（Ｍ１、または「活性化型」マクロファージマーカー）の発現レベル、並びにＣＤ２０６およびＣＤ１６３（Ｍ２、またはＴＡＭマーカー）の発現レベルを、フローサイトメトリーで測定した（図４３Ｃ）。遊離型ＦＡＰ  ＢｉＴＥによる処理もＦＡＰ  ＢｉＴＥ発現ＥｎＡｄによる処理も、より多くの活性化型表現型を誘導していることが、ＩＦＮγを培養物に添加した場合に確認されたものと同様の、ＣＤ６４発現の顕著な増加、並びにＣＤ２０６およびＣＤ１６３の強い減少によって明らかにされている。
【０３７０】
本実験では、遊離型ＦＡＰ  ＢｉＴＥでの処理も対照ウイルスでの処理もバックグラウンドを超えるＣＤ８６の明確な変化を誘導しなかったが、ＦＡＰ  ＢｉＴＥ発現ＥｎＡｄはＣＤ８６発現の大幅な増加を誘導し、このことは、ＥｎＡｄウイルス感染とＦＡＰ  ＢｉＴＥ活性とが協働して、ここで試験された悪性腹水試料などの抑制性腫瘍内微小環境内で、初代骨髄性細胞を活性化し得ることを示している。本研究において、ＩＦＮγ処理はＣＤ８６をわずかにしか減少させなかったが、このことは、ＥｎＡｄ−ＳＡ−ＦＡＰＢｉＴＥで確認されたＣＤ８６の強い増加が、ＩＦＮγとは独立した機構を介したものであり得ることを示している。
【０３７１】
実施例２０
ＥｎＡｄ−ＦＡＰＢｉＴＥはエキソビボの固形前立腺腫瘍生検において腫瘍浸潤性リンパ球を活性化し細胞傷害性を誘導する
組織スライスの培養物は、多様な組織、臓器、および腫瘍の最も現実的な前臨床モデルの１つを提供する。この臨床的にかなりの意義がある状況でＦＡＰ  ＢｉＴＥ発現ウイルスの活性を評価するために、切除されたヒト前立腺から得られた悪性前立腺組織および良性前立腺組織のパンチ生検対をいくつか調べた。最初のスクリーニングでは、前立腺組織が、再現性よく、円環状のＥｐＣＡＭ＋腫瘍細胞（図４４Ａ）を、ＣＤ８  Ｔ細胞（図４４Ｂ）が散らばった大きな間質領域の中に、散在させていることが示された。ＦＡＰの染色は腫瘍領域と隣接した線維芽細胞上に見られた（図４４Ｃ）。
【０３７２】
コアをビブラトームで３００μｍ厚にスライスし、ウイルス（１．５×１０９ウイルス粒子／スライス）の存在下で、または未感染のままで、スライス培養を確立した。７日後、スライスを固定し、パラフィン包埋し、切片を作製し、ＣＤ２５発現の染色による免疫組織化学（ＩＨＣ）でＴ細胞活性化状態を評価した（図４４Ｄ）。ＥｎＡｄ−ＣＭＶ−ＦＡＰＢｉＴＥまたはＥｎＡｄ−ＳＡ−ＦＡＰＢｉＴＥを投与した試料のみが、腫瘍浸潤性Ｔ細胞の活性化を示すことが、ＣＤ２５の強い染色によって明らかとなった。未処理試料および対照ウイルス処理試料のどちらにも、ＣＤ２５陽性細胞は検出されなかった。感染の４日後および７日後に採取されたこれらのスライス培養物の上清を、ＩＦＮγおよびＩＬ−２についてのＥＬＩＳＡ試験にかけたところ、どちらのＦＡＰ  ＢｉＴＥウイルスを感染させた場合も悪性前立腺スライス培養物からはＩＦＮγの増加が検出されたが、良性前立腺スライス培養物からは増加は検出されず（図４４Ｅ）、ＩＬ−２はＥｎＡｄ−ＳＡ−ＦＡＰＢｉＴＥウイルスを用いた場合に培養物中に検出された（図４４Ｆ）。ＥｎＡｄ−ＳＡ−ＦＡＰＢｉＴＥは、ＣＭＶ駆動型のＦＡＰＢｉＴＥウイルスよりも、より多量のＩＦＮγを誘導し、より早期に検出可能にした。
【０３７３】
実施例２１：さらなるＦＡＰ  ＢｉＴＥ発現ＥｎＡｄウイルス
１つのＢｉＴＥをコードする５種のウイルス（ＮＧ−６１１、ＮＧ−６１２、ＮＧ−６１３、ＮＧ−６１４、ＮＧ−６１７）を作製した（表８）。
【０３７４】
表８
【表９】
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【０３７５】
各導入遺伝子カセットにおいて、ＢｉＴＥをコードするｃＤＮＡの５’末端には短スプライスアクセプター配列（ＳＳＡ、ＣＡＧＧ）またはより長いスプライスアクセプター配列（ＳＡ、配列番号４５）を隣接させた。ＢｉＴＥの３’末端には、ＳＶ４０  ｌａｔｅ  ポリ（Ａ）配列（ＰＡ、配列番号５４）をコードさせ、その先にヒスチジンタグ（ＨＩＳ）をコードさせるか、タグ無しにした。ＮＧ−６１１ウイルス、ＮＧ−６１２ウイルス、ＮＧ−６１３ウイルス、およびＮＧ−６１７ウイルスにおいて、ＢｉＴＥ分子の抗ＣＤ３部分は、マウス抗ヒトＣＤ３εモノクローナル抗体ＯＫＴ３の一本鎖バリアントを用いている。
【０３７６】
ウイルスの生産
プラスミドｐＥｎＡｄ２．４を用いて、合成された導入遺伝子カセット（それぞれ、配列番号７０〜７４）を直接挿入することで、プラスミドｐＮＧ−６１１、ｐＮＧ−６１２、ｐＮＧ−６１３、ｐＮＧ−６１４、およびｐＮＧ−６１７を作製した。ｐＮＧ−６１２、ｐＮＧ−６１３、およびｐＮＧ−６１７導入遺伝子カセットは、配列番号７５のＦＡＰ標的ＢｉＴＥをコードしており、ｐＮＧ−６１４導入遺伝子カセットは、配列番号７６のＦＡＰ標的ＢｉＴＥをコードしている。導入遺伝子カセットの模式図を図４５Ａ〜図４５Ｃに示す。制限酵素分析およびＤＮＡシーケンスによりプラスミドＤＮＡの構築を確認した。
【０３７７】
プラスミドのｐＮＧ−６１１、ｐＮＧ−６１２、ｐＮＧ−６１３、ｐＮＧ−６１４、およびｐＮＧ−６１７を、酵素ＡｓｃＩによる制限酵素消化で直線化することで、ウイルスゲノムを得た。これらのウイルスを下記の方法に従って増幅し精製した。
【０３７８】
消化後のＤＮＡを、フェノール／クロロホルム抽出で精製し、３００μｌの９５％超の分子生物学グレードエタノールおよび１０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム中で、−２０℃で１６時間沈殿させた。沈殿したＤＮＡを１４０００ｒｐｍ、５分間の遠心でペレット化し、５００μｌの７０％エタノールで洗浄後、再度１４０００ｒｐｍで５分間遠心した。このクリーンなＤＮＡペレットを風乾し、１５μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅトランスフェクション試薬を含有する５００μｌのＯｐｔｉＭＥＭで再懸濁し、室温で３０分間インキュベートした。次に、このトランスフェクション用混合物を、７０％コンフルエントまで増殖させた２９３細胞を含有するＴ−２５フラスコに滴下した。細胞をこのトランスフェクション用ミックスと共に３７℃、５％ＣＯ２で２時間インキュベートした後、４ｍｌの細胞培地（グルタミンおよび２％ＦＢＳを添加した、ＤＭＥＭ（高グルコース））を細胞に添加し、３７℃、５％ＣＯ２でフラスコをインキュベートした。
【０３７９】
トランスフェクトした２９３細胞を２４時間毎にモニターし、４８〜７２時間毎に追加の培地を添加した。細胞単層における顕著な細胞変性効果（ＣＰＥ）の確認によって、ウイルスの生産をモニターした。広範なＣＰＥが確認されたら、３回の凍結融解サイクルにより、ウイルスを２９３細胞から回収した。このウイルス株を増幅するため、回収したウイルスを用いて２９３細胞に再感染させた。細胞単層における顕著なＣＰＥの観察により、増幅時の生存ウイルスの生産を確認した。広範なＣＰＥが確認されたら、３回の凍結融解サイクルにより、ウイルスを２９３細胞から回収した。増幅したウイルス株をさらなる増幅に用いて、その後、このウイルスを二重塩化セシウムバンド形成で精製して、精製されたウイルス株を得た。
【０３８０】
ｑＰＣＲによるウイルス活性の評価
１ｐｐｃのＮＧ−６１１、ＮＧ−６１２、ＮＧ−６１７、Ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖに７２時間感染させた、または未感染のままの、Ａ５４９細胞をｑＰＣＲによるウイルスＤＮＡの定量化に用いた。細胞上清を回収し、１２００ｒｐｍで５分間遠心することにより清澄化した。キアゲン社製ＤＮｅａｓｙキットを製造業者のプロトコルに従って用いて、４５μＬの上清からＤＮＡを抽出した。Ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖウイルス粒子（２．５×１０１０〜２．５×１０５個のウイルス粒子）を用いた検量線も作成し、ＤＮｅａｓｙキットを用いて抽出を行った。抽出された試料または標準のそれぞれを、初期遺伝子Ｅ３に対するウイルス遺伝子特異的プライマー／プローブセットを用いるｑＰＣＲで解析した。
【０３８１】
１細胞当たりに検出されたウイルスゲノムの数の定量化により、ＮＧ−６１１、ＮＧ−６１２、およびＮＧ−６１７が、Ａ５４９細胞株において顕著なゲノム複製を示すことが示された（図４５Ｄ）。これは、親ウイルスＥｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖを含む試験された全てのウイルスにおいて同様であり、このことは、ＢｉＴＥ導入遺伝子の使用はウイルス複製活性に影響を与えないことを示している。未感染細胞ではウイルスゲノムは検出できなかった（データ未記載）。
【０３８２】
ＢｉＴＥ発現ウイルスを介したＴ細胞の活性化および脱顆粒
癌細胞感染
Ａ５４９細胞を２．５×１０５細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートに播種した。プレートを、３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベートした後、細胞を１ｐｐｃのＮＧ−６１１、ＮＧ−６１２、Ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖに感染させるか、未感染のままとした。感染の２４時間後、４８時間後、または７２時間後に、この細胞から上清を回収し、１２００ｒｐｍで５分間遠心して清澄化し、急速凍結した。
【０３８３】
Ｔ細胞アッセイ
ＦＡＰを発現する肺線維芽細胞株ＭＲＣ−５、またはＥｐＣａｍを発現する卵巣癌細胞ＳＫＯＶ３を、それぞれ５．７×１０４細胞／ウェルおよび１．２×１０５細胞／ウェルの密度で４８ウェルプレートに播種した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベートした後、１５０μＬ／ウェルの、Ａ５４９プレートから回収した解凍上清で培地を交換した。次に、ヒトＰＢＭＣドナーから単離した純化ＣＤ３  Ｔ細胞もプレートに加え、Ｔ細胞とＭＲＣ−５またはＳＫＯＶ３の比を２：１とした。この共培養物を３７℃、５％ＣＯ２で１６時間インキュベートした後、ＥＬＩＳＡ分析用に細胞上清を回収し、フローサイトメトリー分析用にＴ細胞を回収した。非接着細胞を含有する培地を共培養ウェルから取り出し、遠心した（３００×ｇ）。上澄みを慎重に取り出し、５％ＢＳＡ含有ＰＢＳで２倍希釈し、ＥＬＩＳＡ分析用に保存した。接着細胞単層をＰＢＳで１回洗浄した後、トリプシンを用いて剥がした。１０％ＦＢＳ  ＲＰＭＩ培地を用いてトリプシンを失活させ、この細胞を培養上清から回収していた細胞ペレットに加えた。細胞を遠心し（３００×ｇ）、上澄みを捨て、細胞ペレットを２００μＬのＰＢＳで洗浄した。細胞をもう一度遠心した後、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ  Ａｑｕａ（ライフ・テクノロジーズ社（Life tech））を含有する５０μＬのＰＢＳに室温で１５分間再懸濁した。細胞をＦＡＣＳ用緩衝液で１回洗浄した後、以下の直接結合型の抗体パネルで染色した：ＡＦ７００結合型抗ＣＤ３、ＢＶ４２１結合型抗ＣＤ２５、ＰＥ／ＣＹ５結合型抗ＨＬＡ−ＤＲ、ＢＶ６０５結合型抗ＣＤ４０Ｌ、ＰＥ結合型抗ＣＤ６９、およびＦＩＴＣ結合型抗ＣＤ１０７ａ。また、各共培養条件の細胞試料を、関連アイソタイプ対照抗体で染色した。染色は全て、総体積５０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ用緩衝液中、４℃で１５分間実行した。次に、細胞をＦＡＣＳ用緩衝液（２００μＬ）で２回洗浄した後、２００μＬのＦＡＣＳ用緩衝液に再懸濁し、フローサイトメトリー（Ａｔｔｕｎｅ）による分析にかけた。
【０３８４】
Ｔ細胞活性化マーカーのアップレギュレーション
Ｔ細胞活性化のフローサイトメトリー分析では、単一生細胞上の、Ｔ細胞活性化マーカーのＣＤ２５、ＣＤ６９、ＨＬＡ−ＤＲ、およびＣＤ４０Ｌ、またはＴ細胞脱顆粒マーカーのＣＤ１０７ａの発現による評価を行った。これらのデータからは、ＥｐＣａｍ＋  ＳＫＯＶ３細胞との共培養下で、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４０Ｌ、または細胞表面ＣＤ１０７ａを発現するＴ細胞の数は、細胞にＮＧ−６１１上清が添加された場合に、ＮＧ−６１２上清、Ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ上清、または無処理対照上清が添加された場合と比較して、顕著に増加することが示された（図４７）。これら全てのマーカーにおいて、感染２４時間後のＡ５４９細胞の上清はＴ細胞活性化をほとんど惹起しなかったが、感染４８時間後の上清は全てのマーカーにおいて顕著なＴ細胞活性化を惹起した。感染後７２時間にもこれが当てはまった。
【０３８５】
ＦＡＰ＋  ＭＲＣ−５細胞との共培養下で、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４０Ｌ、または細胞表面ＣＤ１０７ａを発現するＴ細胞の数は、細胞にＮＧ−６１２上清が添加された場合に、ＮＧ−６１１上清、Ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ上清、または無処理対照上清が添加された場合と比較して、顕著に増加した（図４８）。ＮＧ−６１１ウイルスを用いた場合でもいくらかのＴ細胞活性化が確認できたが、これは、ＭＲＣ−５細胞株上に低レベルにではあるが検出可能に発現されたＥｐＣａｍ（約５％）が、ＮＧ−６１１ウイルスによって発現されたＥｐＣａｍ  ＢｉＴＥと結合することが原因である可能性がある（図４９）。これら全てのマーカーにおいて、感染２４時間後のＡ５４９細胞の上清はＴ細胞活性化をほとんど惹起しなかったが、感染４８時間後の上清は全てのマーカーにおいて顕著なＴ細胞活性化を惹起した。マーカーのＣＤ２５およびＣＤ６９は感染７２時間後の上清とのインキュベーション後にもアップレギュレートされていたが、活性化マーカーのＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４０Ｌ、およびＣＤ１０７ａは、感染７２時間後に回収された上清を用いた場合では、感染４８時間後と比較して、低レベルに検出された。これは、この感染後期に存在する高レベルのＢｉＴＥが、Ｔ細胞を急速且つ強力に活性化するためである可能性があり、このことは、エフェクター機能の測定は上清とのインキュベーション後１６時間よりも早期の時点で行う必要があることを意味している。
【０３８６】
ＩＦＮγ発現の検出のために、共培養上清を、アッセイ用緩衝液の５％ＢＳＡ／ＰＢＳで希釈し（１：１０〜１：１０００の範囲）、Ｈｕｍａｎ  ＩＦＮ  ｇａｍｍａ  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄシステムズ社）を製造業者のプロトコルに従って用いてＥＬＩＳＡを実施した。分泌されたＩＦＮγの濃度を、検量線からの内挿によって求めた。ＩＦＮγの発現は、ＳＫＯＶ３細胞に対してＮＧ−６１１を用いた共培養物の上清中にのみ（図５０Ａ）、あるいは、ＭＲＣ−５細胞に対してＮＧ−６１１、ＮＧ−６１２を用いた共培養物の上清中にのみ（図５０Ｂ）、検出できた。
【０３８７】
実施例２２：インビボにおけるＢｉＴＥ発現ウイルスの免疫活性化および抗腫瘍活性
ＣＤ３４＋造血幹細胞ヒト化ＮＳＧマウス（ジャクソン研究所から入手）に、移植の１８週間後に、ＨＣＴ１１６腫瘍細胞を両側腹部に皮下移植した。腫瘍が８０〜４００ｍｍ３に達したら、各処置群の腫瘍体積分布が同等となるようにマウスをグループ化し、１群あたり７匹のマウスとした。マウスの腫瘍内に、生理食塩水、Ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ、またはＮＧ−６１１を５×１０９粒子／注射で注射し、１腫瘍につき２回の注射を行った。両側腹部の腫瘍に処置を行った。腫瘍体積を週に３〜４回測定したところ、Ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖまたは無処置対照と比較して、ＮＧ−６１１処置が投与の２０日後まで顕著な抗腫瘍応答をもたらすことが示された（図５１ａ）。投与の２０日後、各群４匹のマウスから、一方の腫瘍をフローサイトメトリー用に処理し、残りの腫瘍はドライアイス上で凍結した。
【０３８８】
フローサイトメトリー
腫瘍試料を、摘出直後に少量のＲＰＭＩ培地中で機械的にばらばらにした。次に、ばらばらにした腫瘍を７０μｍセルストレーナーに通し、３００ｇで１０分間遠心した。細胞ペレットを、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ  Ａｑｕａ（ライフ・テクノロジーズ社）を含有する１００μＬのＰＢＳに氷上で１５分間再懸濁した。細胞をＦＡＣＳ用緩衝液（５％ＢＳＡ／ＰＢＳ）で１回洗浄した後、以下の直接結合型の抗体パネルで染色した：抗ＣＤ８（ＲＰＡ−Ｔ８、ＡＦ７００）；抗ＣＤ４（ＲＰＡ−Ｔ４、ＰＥ）；抗ＣＤ４５（２Ｄ１、ＡＰＣ−Ｆｉｒｅ７５０）；抗ＣＤ３（ＯＫＴ３、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５）；抗ＣＤ２５（Ｍ−Ａ２５１、ＰＥ−Ｄａｚｚｌｅ５９４）；抗ＣＤ６９（ＦＮ５０、ＡＰＣ）；抗ＨＬＡ−ＤＲ（Ｌ２４３、ＢＶ６０５）；抗ＣＤ１０７ａ（Ｈ４Ａ３、ＦＩＴＣ）。また、浮遊腫瘍細胞プールを関連アイソタイプ対照抗体で染色した。染色は全て、総体積５０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ用緩衝液中、４℃で２０分間実行した。細胞をＦＡＣＳ用緩衝液（２００μＬ）で３回洗浄した後、２００μＬのＦＡＣＳ用緩衝液に再懸濁し、フローサイトメトリー（Ａｔｔｕｎｅ）による分析にかけた。ＦＡＣＳ解析では、腫瘍内のＣＤ４  Ｔ細胞に対するＣＤ８  Ｔ細胞の比率が、Ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ処置または無処置対照と比較して、ＮＧ−６１１処置腫瘍において、顕著に増加することが示された（図５１ｂ）。
【０３８９】
実施例２３：ＦＡＰ  ＢｉＴＥと、免疫調節性のサイトカインおよびケモカインとを共発現するＥｎＡｄウイルス
ＦＡＰ  ＢｉＴＥおよび免疫調節性タンパク質をコードする、３種のウイルス（ＮＧ−６１５、ＮＧ−６４０、およびＮＧ−６４１）を作製した（表９）。
【０３９０】
【表１０】
2020531032.tif 000012
【０３９１】
ウイルスの生産
プラスミドｐＥｎＡｄ２．４を用いて、合成された導入遺伝子カセット（それぞれ、配列番号９３〜９５）を直接挿入することで、プラスミドｐＮＧ−６１５、ｐＮＧ−６１６、ｐＮＧ−６４０、およびｐＮＧ−６４１を作製した。ＮＧ−６１５およびＮＧ−６１６は、ＦＡＰを標的とするＢｉＴＥ（配列番号７５）、Ｆｌｔ３Ｌ（配列番号９６）、ＭＩＰ１α（配列番号９７）、およびＩＦＮα（配列番号９８）をコードする４種類の導入遺伝子を含有する。ＮＧ−６４０およびＮＧ−６４１はＦＡＰを標的とするＢｉＴＥ（配列番号７５）、ＣＸＣＬ９（配列番号９９）、およびＣＸＣＬ１０（配列番号１００）をコードし、ＮＧ−６４１はＩＦＮαをコードする４つ目の導入遺伝子（配列番号９８）も含有する。プラスミドＤＮＡの構築を制限酵素的分析およびＤＮＡシーケンスで確認した。
【０３９２】
プラスミドのｐＮＧ−６１５、ｐＮＧ−６１６、ｐＮＧ−６４０、およびｐＮＧ−６４１を、酵素ＡｓｃＩによる制限酵素消化で直線化することで、ウイルスゲノムを得た。これらのウイルスを実施例３３に記載の方法に従って増幅し精製した。
【０３９３】
ウイルス活性のｑＰＣＲおよび導入遺伝子ＥＬＩＳＡによる評価
癌細胞感染
１ｐｐｃのＮＧ−６１５、Ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖに７２時間感染させた、または未感染のままの、Ａ５４９細胞を、ｑＰＣＲによるウイルスＤＮＡの定量化、およびＥＬＩＳＡによる導入遺伝子発現の分析に用いた。細胞上清を回収し、１２００ｒｐｍで５分間遠心することにより清澄化した。４５μＬの上澄みをＤＮＡ解析に用いて、残りの上澄みはＥＬＩＳＡに用いた。
【０３９４】
ｑＰＣＲ
キアゲン社製ＤＮｅａｓｙキットを製造業者のプロトコルに従って用いて、この上清試料からＤＮＡを抽出した。Ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖウイルス粒子（２．５×１０１０〜２．５×１０５個のウイルス粒子）を用いた検量線も作成し、ＤＮｅａｓｙキットを用いて抽出を行った。抽出された試料または標準のそれぞれを、初期遺伝子Ｅ３に対するウイルス遺伝子特異的プライマー／プローブセットを用いるｑＰＣＲで解析した。１細胞当たりに検出されたウイルスゲノムの数の定量化によって、ＮＧ−６１５が、Ａ５４９細胞株において、親ウイルスＥｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖと同レベルの顕著なゲノム複製を示すことが明らかになった（図５２）。これらのデータから、ＢｉＴＥおよび３種の免疫調節性導入遺伝子の使用はウイルスの複製活性に有意な影響を与えないことが示された。未感染細胞ではウイルスゲノムは検出できなかった。
【０３９５】
ＥＬＩＳＡ
ＩＦＮα  ＥＬＩＳＡはＶｅｒｉｋｉｎｅ  Ｈｕｍａｎ  ＩＦＮ  ａｌｐｈａ  Ｋｉｔ（ＰＢＬ・アッセイ・サイエンス社）を用いて実施し、ＭＩＰ１α  ＥＬＩＳＡはＨｕｍａｎ  ＣＣＬ３  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄシステムズ社）を用いて実施し、Ｆｌｔ３Ｌ  ＥＬＩＳＡはＦｌｔ３Ｌ  ｈｕｍａｎ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（アブカム社）を用いて実施した。アッセイは全て、製造業者のプロトコルに従って実施した。
【０３９６】
分泌されたＩＦＮα、ＭＩＰα、またはＦＬｔ３Ｌの濃度を、検量線からの内挿によって求めた。ＩＦＮα、ＭＩＰ１α、およびＦｌｔ３Ｌの発現は、ＮＧ−６１５の細胞上清中には検出できたが、Ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖまたは無処理対照細胞上清中には検出できなかった（図５３）。
【０３９７】
ＢｉＴＥ発現ウイルスを介したＴ細胞の活性化および脱顆粒
癌細胞感染
Ａ５４９細胞を２．５×１０５細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートに播種した。プレートを、３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベートした後、細胞を１ｐｐｃのＮＧ−６１２、ＮＧ−６１５、Ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖに感染させるか、未感染のままとした。感染の２４時間後、４８時間後、または７２時間後に、この細胞から上清を回収し、１２００ｒｐｍで５分間遠心して清澄化し、急速凍結した。
【０３９８】
Ｔ細胞アッセイ
ＦＡＰ発現肺線維芽細胞株のＭＲＣ−５を５．７×１０４細胞／ウェルの密度で４８ウェルプレートに播種した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベートした後、１５０μＬ／ウェルの、Ａ５４９プレートから回収した解凍上清で培地を交換した。次に、ヒトＰＢＭＣドナーから単離した純化ＣＤ３  Ｔ細胞もプレートに加え、Ｔ細胞とＭＲＣ−５の比を２：１とした。この共培養物を３７℃、５％ＣＯ２で１６時間インキュベートした後、実施例２９に詳述した方法に従って、ＥＬＩＳＡ分析用に細胞上清を回収し、フローサイトメトリー分析用にＴ細胞を回収した。
【０３９９】
Ｔ細胞活性化マーカーのアップレギュレーション
Ｔ細胞活性化のフローサイトメトリー分析では、ＣＤ３＋単一生細胞上の、Ｔ細胞活性化マーカーのＣＤ２５、ＣＤ６９、ＨＬＡ−ＤＲ、およびＣＤ４０Ｌ、またはＴ細胞脱顆粒マーカーのＣＤ１０７ａの発現による評価を行った。これらのデータからは、ＦＡＰ＋ＭＲＣ−５細胞との共培養下で、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４０Ｌ、またはＣＤ１０７ａを発現するＴ細胞の数は、細胞にＮＧ−６１５上清またはＮＧ−６１２上清が添加された場合に、Ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ上清、または無処理対照上清が添加された場合と比較して、顕著に増加することが示された（図５４）。
【０４００】
刺激性サイトカインＩＦＮγの分泌
ＩＦＮγ発現の検出のために、共培養上清を、アッセイ用緩衝液の５％ＢＳＡ／ＰＢＳで希釈し（１：１０〜１：１０００の範囲）、Ｈｕｍａｎ  ＩＦＮ  ｇａｍｍａ  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄシステムズ社）を製造業者のプロトコルに従って用いてＥＬＩＳＡを実施した。分泌されたＩＦＮγの濃度を、検量線からの内挿によって求めた。ＩＦＮγの発現は、ＮＧ−６１２感染またはＮＧ−６１５感染Ａ５４９上清を用いた共培養物の上清中にのみ検出できた（図５５）。
【０４０１】
配列番号９５：ＮＧ−６４１導入遺伝子カセット
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【図１】
2020531032.tif 000013
【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
2020531032.tif 000020
【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１１−１】
2020531032.tif 000027
【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１１−５】
2020531032.tif 000031
【図１１−６】
2020531032.tif 000032
【図１１−７】
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【図１１−８】
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【図１２】
2020531032.tif 000035
【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
2020531032.tif 000038
【図１４−３】
2020531032.tif 000039
【図１５】
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【図１６】
2020531032.tif 000041
【図１７−１】
2020531032.tif 000042
【図１７−２】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７−１】
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【図３７−２】
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【図３８−１】
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【図３８−２】
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【図３９】
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【図４０−１】
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【図４０−２】
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【図４１−１】
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【図４１−２】
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【図４２】
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【図４３−１】
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【図４３−２】
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【図４４−１】
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【図４４−２】
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【図４４−３】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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