(57)【要約】本発明は、癌の治療または予防の分野に関する。特に、本発明は、ＳＬＩＴ２タンパク質由来のペプチド断片、および癌の増殖、浸潤、および転移の抑制における、それらの用途を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式Ｉ：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８    （Ｉ）
に示されるアミノ酸配列を含むペプチドであって、
式中、Ｘ１は疎水性側鎖を有するアミノ酸から選択され；Ｘ２は塩基性側鎖を有するアミノ酸、酸性側鎖を有するアミノ酸、または疎水性側鎖を有するアミノ酸から選択され；Ｘ３は疎水性側鎖を有するアミノ酸から選択され；Ｘ４は疎水性側鎖を有するアミノ酸から選択され；Ｘ５は塩基性側鎖を有するアミノ酸、酸性側鎖を有するアミノ酸、または疎水性側鎖を有するアミノ酸から選択され；Ｘ６は疎水性側鎖を有するアミノ酸から選択され；Ｘ７は疎水性側鎖を有するアミノ酸または親水性側鎖を有するアミノ酸から選択され；そして、Ｘ８は疎水性側鎖を有するアミノ酸または親水性側鎖を有するアミノ酸から選択される、ペプチド、
または、その修飾ペプチドまたはその塩。
【請求項２】
Ｘ１がＦ、Ａ、Ｙ、Ｗから選択され；Ｘ２がＨ、Ｋ、Ｒ、Ａ、およびＥから選択され；Ｘ３がＩまたはＡから選択され；Ｘ４がＶおよびＡから選択され；Ｘ５がＥ、Ｄ、Ｈ、Ｏｒｎ、Ａ、およびＨから選択され；Ｘ６がＬおよびＡから選択され；Ｘ７がＬおよびＳから選択され、そしてＸ８がＡおよびＳから選択される、請求項１のペプチド；または、その修飾ペプチドまたはその塩。
【請求項３】
ＦＨＩＶＥＬＬＡ（ＬＴ１−３）（配列番号９）、ＦＨＡＶＥＬＬＡ（ＬＴ−Ａ３）（配列番号１０）、ＦＫＡＶＥＬＬＡ（ＬＴ−Ｋ２）（配列番号１１）、ＦＲＡＶＥＬＬＡ（ＬＴ−Ｒ２）（配列番号１２）、ＦＨＡＶＤＬＬＡ（ＬＴ−Ｄ５）（配列番号１３）、ＦＨＡＶＨＬＬＡ（ＬＴ−Ｈ５）（配列番号１４）、ＦＨＡＶＯＬＬＡ（ＬＴ−Ｏｒｎ５）（配列番号１５）、ＡＨＡＶＥＬＬＡ（ＬＴ−Ａ１３）（配列番号：１６）、ＦＨＡＡＥＬＬＡ（ＬＴ−Ａ３４）（配列番号：１７）、ＦＨＡＶＥＡＬＡ（ＬＴ−Ａ３６）（配列番号：１８）、ＦＨＡＡＥＡＬＡ（ＬＴ−Ａ３４６）（配列番号１９）、ＦＡＩＶＡＬＬＡ（ＬＴ−Ａ２５）（ＬＴ−Ａ２）（配列番号２０）、ＦＥＡＶＨＬＬＡ（ＬＴ−Ｅ２Ｈ５）（配列番号２１）、ＹＨＡＶＥＬＬＡ（ＬＴ−Ｙ１）（配列番号２２）、ＷＨＡＶＥＬＬＡ（ＬＴ−Ｗ１）（配列番号２３）、ＦＨＡＶＥＬＳＡ（ＬＴ−Ｓ７）（配列番号２４）、ＦＨＡＶＥＬＬＳ（ＬＴ−Ｓ８）（配列番号２５）、ＤＧＮＦＨＩＶＥＬＬＡ（ＬＴ−１１ＡＡ）（配列番号２６）、ＡＨＩＶＥＬＬＡ（ＬＴ−Ａ１）（配列番号２７）、ＦＡＩＶＥＬＬＡ（ＬＴ−Ａ２）（配列番号２８）、ＦＨＩＡＥＬＬＡ（ＬＴ−Ａ４）（配列番号２９）、ＦＨＩＶＡＬＬＡ（ＬＴ−Ａ５）（配列番号：３０）、ＦＨＩＶＥＡＬＡ（ＬＴ−Ａ６）（配列番号３１）、ＦＨＩＶＥＬＡＡ（ＬＴ−Ａ７）（配列番号３２）、または、配列番号９〜３２のいずれかに示されるアミノ酸配列に１つまたは数個のアミノ酸置換、欠失および／または付加を有し、配列番号９〜３２のいずれかに示されるアミノ酸配列の配列のものと同等またはそれ以上の活性を有するアミノ酸配列を含むペプチド、を含む請求項１のペプチド；または、その修飾ペプチドまたはその塩。
【請求項４】
ＦＨＩＶＥＬＬＡ（配列番号９）またはＦＨＡＶＥＬＬＡ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含む、請求項１のペプチド；または、その修飾ペプチドまたはその塩。
【請求項５】
修飾ペプチドが改善された安定性または溶解性を有する、請求項１〜４のいずれか一項のペプチド。
【請求項６】
修飾ペプチドが環状ペプチド、ペグ化ペプチドまたはフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）ペプチドである、請求項１〜４のいずれか一項のペプチド。
【請求項７】
修飾ペプチドがＦｍｏｃペプチドであり、ここで、Ｆｍｏｃは配列番号９〜３２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチドのＮ末端またはＣ末端に結合している、請求項１〜４のいずれか一項のペプチド。
【請求項８】
修飾ペプチドがＰＥＧペプチドであり、ここで、ＰＥＧは配列番号９〜３２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチドのＮ末端またはＣ末端に結合している、請求項１〜４のいずれか一項のペプチド。
【請求項９】
環状ペプチドが、請求項１〜４のいずれか一項のペプチドのＮ末端に、１つ以上の親水性アミノ酸、場合により１つ以上の疎水性アミノ酸を含む、請求項６のペプチド。
【請求項１０】
環状ペプチドが、請求項１〜４のいずれか一項のペプチドのＮ末端に結合する２つの親水性アミノ酸および１つの疎水性アミノ酸を含む、請求項６のペプチド。
【請求項１１】
以下の式ＩＩ：
Ｘａ１−Ｘａ２−Ｘａ３−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８    （ＩＩ）
を有する環状ペプチドであって、
式中、Ｘａ１はヘッドトゥーテールの環化としてＸ８に結合しており、Ｘａ１はＤであり；Ｘａ２はＧであり；Ｘａ３はＮであり；そしてＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７およびＸ８は請求項１において定義されるアミノ酸である、環状ペプチド。
【請求項１２】
環状ペプチドがＤＧＮＦＨＩＶＥＬＬＡ（配列番号２６）のアミノ酸配列を含み、Ｄはヘッドトゥーテールの環化としてＡに結合している、請求項１１の環状ペプチド。
【請求項１３】
ＡＳＡＩＹＳＶＥＴＩＮＤＧＮＦＨＩＶＥＬＬＡＬＤＱＳＬＳＬＳＶＤＧＧＮＰＫＩＩＴＮＬＳＫＱＳＴＬＮＦＤＳＰＬＹＶＧＧＭＰＧＫＳＮＶＡＳＬＲＱＡＰＧＱＮＧＴＳＦＨＧＣＩＲＮＬＹＩＮＳＥ）（配列番号１）のアミノ酸配列を含むペプチド、またはその断片。
【請求項１４】
ペプチドの断片が配列番号２、３、４、５または６に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１３のペプチド。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項のペプチドと、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項１６】
第２の抗癌剤をさらに含む、請求項１５の医薬組成物。
【請求項１７】
第２の抗癌剤が、エルロチニブ、アファチニブ、ゲフィチニブ、ベバシズマブ、ラムシルマブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、エルロチニブ、シスプラチン、パクリタキセル、メトトレキサート、シクロホスファミド、イホスファミド、クロラムブシル、カルムスチン、カルボプラチン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、チオテパ、ロムスチン、セムスチン、５−フルオロウラシル、コルチコステロイド、カルシニューリン阻害剤、ＮＳＡＩＤ、５−リポキシゲナーゼの阻害剤、またはシタラビンである、請求項１６の医薬組成物。
【請求項１８】
請求項１〜１４のいずれか一項のペプチドの有効量を対象に投与することを含む、癌を予防、治療、および／または改善するか、癌の増殖、浸潤、および／または転移を抑制する方法。
【請求項１９】
第２の抗癌剤を投与する段階をさらに含む、請求項１８の方法。
【請求項２０】
第２の抗癌剤が、エルロチニブ、アファチニブ、ゲフィチニブ、ベバシズマブ、ラムシルマブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、エルロチニブ、シスプラチン、パクリタキセル、メトトレキサート、シクロホスファミド、イホスファミド、クロラムブシル、カルムスチン、カルボプラチン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、チオテパ、ロムスチン、セムスチン、５−フルオロウラシル、コルチコステロイド、カルシニューリン阻害剤、ＮＳＡＩＤ、５−リポキシゲナーゼの阻害剤、またはシタラビンである、請求項１９の方法。
【請求項２１】
併用療法または維持療法である、請求項１９の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、癌の治療または予防に関する。特に、本発明は、ＳＬＩＴ２タンパク質由来のペプチド断片、および癌の増殖、浸潤、および転移の抑制における、それらの用途を提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
抗癌ペプチドは近年、注目を集めてきた。しかしながら、ほとんどの従来の抗癌剤は、生物活性が低く、毒性が高い。したがって、高い生物活性と低い毒性を有する抗癌生物活性ペプチドを開発する必要性がある。
【発明の概要】
【０００３】
発明の概要
本開示は、本明細書に記載のアミノ酸配列を含むペプチドを提供する。特定の実施形態は、ＦＨＩＶＥＬＬＡまたはＦＨＡＶＥＬＬＡのアミノ酸配列を含むペプチドを含む。他の特定の実施形態は、本明細書に記載の環状ペプチド、ペグ化ペプチド、およびフルオレニルメチルオキシカルボニルペプチドを含む。
【０００４】
本開示は、本明細書に記載のペプチドを含む、医薬組成物を提供する。
【０００５】
本開示は、本明細書に記載のペプチドの有効量を投与することを含む、癌の増殖、浸潤、および／または転移を抑制する方法を提供する。
【０００６】
本開示は、本明細書に記載のペプチドの有効量を投与することを含む、癌を予防、治療、または改善する方法を提供する。
【０００７】
図面の簡単な説明
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、細胞増殖に対するＦｍｏｃ−ＬＴ１−３（ＬＴ１−３）のアラニン置換の効果を示している。
【図２】図２は、細胞増殖に対するＦｍｏｃ−ＬＴ−Ａ３（ＬＴ−Ａ３）の塩基置換の効果を示している。
【図３】図３は、ＣＬ１−５細胞の増殖抑制におけるＦｍｏｃ−ＬＴ−ペプチド（ＬＴ−ペプチド）の用量効果を示している。
【図４】図４は、様々な肺癌株におけるＦｍｏｃ−ＬＴ１−３およびＦｍｏｃ−ＬＴ−Ａ３の増殖抑制活性を示している。
【図５】図５（Ａ）〜（Ｃ）は、浸潤抑制に対するＦｍｏｃ−ＬＴ１−３（Ａ）、Ｆｍｏｃ−ＬＴ−Ａ３（Ｂ）およびＦｍｏｃ−ＬＴ−Ａ３−ＰＥＧ３（Ｃ）の用量効果を示している。
【図６】図６は、１８日目に異なる量のＬＴ１−３ペプチドで処置したマウスの初期腫瘍形成率を示している。
【図７】図７は、異種移植モデルにおける腫瘍の増殖に対するＦｍｏｃ−ＬＴ１−３の効果を示している。
【図８】図８は、異なるレベルのＬＴ１−３ペプチドで処置した腫瘍のサイズを示している。
【図９】図９は、異なるレベルのＦｍｏｃ−ＬＴ１−３で処置した動物の相対的臓器重量を示している。
【図１０】図１０は、尾静脈から注射したＣＬ１−５細胞の肺転移に対するＦｍｏｃ−ＬＴ１−３の効果を示している。
【図１１】図１１は、維持療法での対照、ＣＤＤＰ、ＬＴ１−３、ＣＤＤＰ＋ＬＴ１−３の生存率、および併用療法でのＣＤＤＰ＋ＬＴ１−３の生存率を示している。
【図１２】図１２は、ＣＬ１−５細胞の浸潤抑制に対するＬＴ−１、−３、−４、−５の効果を示している。
【図１３】図１３は、ＣＬ１−５細胞における細胞浸潤抑制に対するＬＴ１−３ペプチドの効果を示している。
【図１４】図１４は、ＣＬ１−５細胞における細胞浸潤抑制に対するＬＴ−Ａ３ペプチドの効果を示している。
【図１５】図１５は、ＣＬ１−５細胞の細胞浸潤に対するＣペプチドのＮまたはＣ末端修飾の効果を示している。
【図１６】図１６は、ＣＬ１−５細胞における細胞浸潤に対するＬＴ−Ａ３−ＰＥＧペプチドの効果を示している。
【図１７】図１７は、ＣＬ１−５細胞における細胞浸潤に対するＬＴ１−３−ＰＥＧの効果を示している。
【図１８】図１８は、Ａ５４９細胞における細胞浸潤に対するＬＴ１−３−ＰＥＧの効果を示している。
【図１９】図１９は、Ｈ１２９９細胞における細胞浸潤に対するＬＴ１−３−ＰＥＧの効果を示している。
【図２０】図２０（Ａ）および（Ｂ）は、ＣＬ１−５細胞の細胞増殖に対するペプチドのＮまたはＣ末端修飾の効果を示している；（Ａ）ＰＥＧ−ＬＴ１−３、ＰＥＧ−ＬＴ−Ａ３およびＬＴ−Ａ３−ＰＥＧ；（Ｂ）ＬＴ１−３およびＬＴ１−３−ＰＥＧ。
【図２１】図２１は、様々な肺癌細胞株の増殖に対するＬＴ１−３−ＰＥＧの効果を示している。
【図２２】図２２は、ＬＴ１−３がＢｅａｓ２Ｂ、ＨＵＶＥＣ、およびＭＲＣ５正常細胞株の増殖を抑制しないことを示している。
【図２３】図２３は、ＭＣＦ−７、Ｔ−４７Ｄ、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３およびＭＤＡ２３１乳癌細胞の増殖に対するＬＴ１−３−ＰＥＧの効果を示している。
【図２４】図２４は、ＰＫＡ阻害剤（Ｈ８９）がＣＬ１−５細胞に対するＬＴ１−３ペプチドの増殖抑制活性を高めることを示している。
【図２５】図２５は、ＪＮＫ阻害剤（Ｓｐ６００１２５）がＣＬ１−５細胞に対するＬＴ１−３ペプチドの増殖抑制活性を高めることを示している。
【図２６】図２６は、ＰＫＡＣＡの発現のノックダウンがＣＬ１−５細胞に対するＬＴ１−３−ＰＥＧ媒介増殖抑制活性を高めることを示している。
【図２７】図２７は、ＪＮＫ１の発現のノックダウンがＣＬ１−５細胞に対するＬＴ１−３−ＰＥＧ媒介増殖抑制活性を高めることを示している。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
発明の詳細な説明
本明細書において説明される様々な態様および実施形態は、単に例示を提供することを意図しており、特許請求の範囲を限定する役割を果たすものではないことが理解されるであろう。
【００１０】
冠詞「ａ（１つ）」および「ａｎ（１つ）」は、本明細書において、冠詞の文法上の対象の１つまたは複数（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。
【００１１】
アミノ酸の略称は、本開示を通して使用され、当技術分野で知られている標準的な命名法に従う。例えば、当業者によって理解されるように、アラニンはＡｌａまたはＡであり；アルギニンはＡｒｇまたはＲであり；アスパラギンはＡｓｎまたはＮであり；アスパラギン酸はＡｓｐまたはＤであり；システインはＣｙｓまたはＣであり；グルタミン酸はＧｌｕまたはＥであり；グルタミンはＧｌｎまたはＱであり；グリシンはＧｌｙまたはＧであり；ヒスチジンはＨｉｓまたはＨであり；イソロイシンはＩｌｅまたはＩであり；ロイシンはＬｅｕまたはＬであり；リジンはＬｙｓまたはＫであり；メチオニンはＭｅｔまたはＭであり；フェニルアラニンはＰｈｅまたはＦであり；プロリンはＰｒｏまたはＰであり；セリンはＳｅｒまたはＳであり；テオニンはＴｈｒまたはＴであり；トリプトファンはＴｒｐまたはＷであり；チロシンはＴｙｒまたはＹであり；そして、バリンはＶａｌまたはＶである。
【００１２】
疎水性側鎖を有するアミノ酸は、アラニン（Ａ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、およびバリン（Ｖ）の非限定的な例を含む。親水性側鎖を有するアミノ酸は、グリシン（Ｇ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、およびシステイン（Ｃ）の非限定的な例を含む。塩基性側鎖を有するアミノ酸は、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）およびアルギニン（Ｒ）の非限定的な例を含む。酸性側鎖を有するアミノ酸は、アスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）の非限定的な例を含む。典型的な生理学的条件下で正に荷電した側鎖を有するアミノ酸は、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、およびリジン（Ｋ）の非限定的な例を含む。典型的な生理学的条件下で負に荷電した側鎖を有するアミノ酸は、アスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）の非限定的な例を含む。極性の非荷電側鎖を有するアミノ酸は、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、およびグルタミン（Ｑ）の非限定的な例を含む。
【００１３】
非天然アミノ酸は、アゼチジンカルボン酸、２−アミノアジピン酸、３−アミノアジピン酸、β−アラニン、ナフチルアラニン（「ｎａｐｈ」）、アミノプロピオン酸、２−アミノ酪酸、４−アミノ酪酸、６−アミノカプロン酸、２−アミノヘプタン酸、２−アミノイソ酪酸、３−アミノイソ酪酸、２−アミノピメリン酸、ｔｅｒｔ−ブチルグリシン（「ｔＢｕＧ」）、２，４−ジアミノイソ酪酸、デスモシン、２，２’−ジアミノピメリン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、ホモプロリン（「ｈＰｒｏ」または「ｈｏｍｏＰ」）、ヒドロキシリジン、アロヒドロキシリジン、３−ヒドロキシプロリン（「３Ｈｙｐ」）、４−ヒドロキシプロリン（「４Ｈｙｐ」）、イソデスモシン、アロイソロイシン、Ｎ−メチルアラニン（「ＭｅＡｌａ」または「Ｎｉｍｅ」）、Ｎ−メチルグリシンを含むＮ−アルキルグリシン（「ＮＡＧ」）、Ｎ−メチルイソロイシン、Ｎ−メチルペンチルグリシンを含むＮ−アルキルペンチルグリシン（「ＮＡＰＧ」）、Ｎ−メチルバリン、ナフチルアラニン、ノルバリン（「Ｎｏｒｖａｌ」）、ノルロイシン（「Ｎｏｒｌｅｕ」）、オクチルグリシン（「ＯｃｔＧ」）、オルニチン（「Ｏｒｎ」）、ペンチルグリシン（「ｐＧ」または「ＰＧｌｙ」）、ピペコリン酸、チオプロリン（「ＴｈｉｏＰ」または「ｔＰｒｏ」）、ホモリジン（「ｈＬｙｓ」）、およびホモアルギニン（「ｈＡｒｇ」）を含むが、これらに限定はされない。
【００１４】
本明細書で使用される場合、「野生型」（ｗｔ）は、種におけるポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはタンパク質の天然形態（配列を含む）を指す用語である。野生型は、遺伝子変異から生じるポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはタンパク質の変異体から区別される。
【００１５】
本明細書で使用する場合、「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、およびアミノ酸類似体、その構造がそのような立体異性体形態を可能にする場合は、特に明記しない限り、ＤおよびＬ立体異性体にある全てを指す。
【００１６】
本明細書で使用する場合、「ペプチド」または「オリゴペプチド」という用語は、アミノ酸で構成される有機化合物を指し、それらは、環化される前の直鎖（隣接するアミノ酸残基のカルボキシル基とアミノ基の間のペプチド結合によって一緒に結合されている）、または環状、または制約を受けた（例えば「大環状」）形態のいずれかで配列されうる。
【００１７】
本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される塩」という用語は、金属塩（例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなど）およびアンモニアもしくは有機アミンの塩を含むが、これらに限定されない、薬学的使用のための化合物に製剤化されうる塩である。
【００１８】
本明細書において交換可能に使用されるように、用語「個体」、「対象」、「宿主」、および「患者」は、齧歯類（ラット、マウス）、非ヒト霊長類、ヒト、イヌ、ネコ、有蹄動物（例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ）などを含むが、これらに限定されない哺乳類を指す。
【００１９】
本明細書で使用する場合、「予防」処置という用語は、病状を発症するリスクを減少させる目的で、疾患の兆候を示さないか、疾患の初期兆候のみを示す対象に施される処置である。本開示の化合物または組成物は、病状を発症する可能性を低減するか、または発症した場合、病状の重症度を最小限に抑えるための予防的処置として与えられうる。
【００２０】
本明細書で使用する場合、「治療」、「治療する」などの用語は、哺乳動物、特にヒトの疾患のあらゆる治療を包含し、以下を含む：（ａ）病気の素因があるが、まだそれであると診断されていない患者に疾患が発生するのを防ぐこと；（ｂ）疾患の抑制、すなわち、その発症の阻止；および（ｃ）病気の緩和、すなわち、疾患の退行を引き起こすこと。
【００２１】
本明細書で使用する場合、「治療有効量」または「有効量」という用語は、疾患を治療するために哺乳動物または他の対象に投与された場合、そのような疾患の治療を行うのに十分な対象ペプチドの量を指す。
【００２２】
本発明は、驚くべきことに、ＳＬＩＴ２タンパク質の断片が、腫瘍の増殖および浸潤の抑制において有利な効果を有することを見出した。特に、本発明は、腫瘍の増殖と浸潤の両方を抑制する効果があるＳＬＩＴ２由来の９１個のアミノ酸からなる断片を発見した（ＡＳＡＩＹＳＶＥＴＩＮＤＧＮＦＨＩＶＥＬＬＡＬＤＱＳＬＳＬＳＶＤＧＧＮＰＫＩＩＴＮＬＳＫＱＳＴＬＮＦＤＳＰＬＹＶＧＧＭＰＧＫＳＮＶＡＳＬＲＱＡＰＧＱＮＧＴＳＦＨＧＣＩＲＮＬＹＩＮＳＥ）（配列番号１）。本発明は、配列番号１中の以下の５つの重複するペプチド配列が、腫瘍の増殖および／または浸潤に効果的であることを予想外に発見した。
ＬＴ−１：ＡＳＡＩＹＳＶＥＴＩＮＤＧＮＦＨＩＶＥＬＬＡ（配列番号２）
ＬＴ−２：ＦＨＩＶＥＬＬＡＬＤＱＳＬＳＬＳＶＤＧＧＮＰＫＩＩＴ（配列番号３）
ＬＴ−３：ＫＩＩＴＮＬＳＫＱＳＴＬＮＦＤＳＰＬＹＶＧＧ（配列番号４）
ＬＴ−４：ＧＧＭＰＧＫＳＮＶＡＳＬＲＱＡＰＧＱＮＧＴＳＦ（配列番号５）
ＬＴ−５：ＬＲＱＡＰＧＱＮＧＴＳＦＨＧＣＩＲＮＬＹＩＮＳＥ（配列番号６）
【００２３】
ＬＴ−１は、増殖および浸潤活性に対する抑制効果を有する一方、ＬＴ−３、ＬＴ−４およびＬＴ−５は細胞浸潤のみに対して抑制効果を有する。ＬＴ−２のＮ末端配列はＬＴ１−３の配列（配列番号４）を含んでおり、したがって、ＬＴ−２は増殖および浸潤活性に対して抑制効果を有する可能性が高い。
【００２４】
したがって、本開示は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むペプチド、またはその断片を提供する。いくつかの実施形態では、ペプチドの断片は、配列番号２、３、４、５または６に示されるアミノ酸配列を含む。
【００２５】
また、本発明は、ＬＴ−１の２２アミノ酸断片内に３つの断片、１０アミノ酸の断片ＬＴ１−１（ＡＳＡＩＹＳＶＥＴＩ（配列番号７）、１０アミノ酸の断片ＬＴ１−２（ＥＴＩＮＤＧＮＦＨＩ（配列番号８））および８アミノ酸の断片ＬＴ１−３（ＦＨＩＶＥＬＬＡ（配列番号９）を同定できること、そして、ＬＴ１−３は腫瘍の増殖と浸潤の両方の抑制に優れた効果を有することも予想外に見出した。
【００２６】
一つの側面において、本発明は、以下の式Ｉ：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８（Ｉ）
（式中、Ｘ１は疎水性側鎖を有するアミノ酸から選択され；Ｘ２は塩基性側鎖を有するアミノ酸、酸性側鎖を有するアミノ酸、または疎水性側鎖を有するアミノ酸から選択され；Ｘ３は疎水性側鎖を有するアミノ酸から選択され；Ｘ４は疎水性側鎖を有するアミノ酸から選択され；Ｘ５は塩基性側鎖を有するアミノ酸、酸性側鎖を有するアミノ酸、または疎水性側鎖を有するアミノ酸から選択され；Ｘ６は疎水性側鎖を有するアミノ酸から選択され；Ｘ７は疎水性側鎖を有するアミノ酸または親水性側鎖を有するアミノ酸から選択され；そして、Ｘ８は疎水性側鎖を有するアミノ酸または親水性側鎖を有するアミノ酸から選択される）を含むペプチド、または、その修飾ペプチドまたはその塩を提供する。
【００２７】
いくつかの実施形態では、Ｘ１はＦ、Ａ、Ｙ、Ｗから選択され；Ｘ２はＨ、Ｋ、Ｒ、Ａ、およびＥから選択され；Ｘ３はＩまたはＡから選択され；Ｘ４はＶおよびＡから選択され；Ｘ５はＥ、Ｄ、Ｈ、Ｏｒｎ、Ａ、およびＨから選択され；Ｘ６はＬおよびＡから選択され；Ｘ７はＬおよびＳから選択され、そしてＸ８はＡおよびＳから選択され；または、その修飾ペプチドまたはその塩である。
【００２８】
いくつかの実施形態では、ペプチドは、ＦＨＩＶＥＬＬＡ（ＬＴ１−３）（配列番号９）、ＦＨＡＶＥＬＬＡ（ＬＴ−Ａ３）（配列番号１０）、ＦＫＡＶＥＬＬＡ（ＬＴ−Ｋ２）（配列番号１１）、ＦＲＡＶＥＬＬＡ（ＬＴ−Ｒ２）（配列番号１２）、ＦＨＡＶＤＬＬＡ（ＬＴ−Ｄ５）（配列番号１３）、ＦＨＡＶＨＬＬＡ（ＬＴ−Ｈ５）（配列番号１４）、ＦＨＡＶＯＬＬＡ（ＬＴ−Ｏｒｎ５）（配列番号１５）、ＡＨＡＶＥＬＬＡ（ＬＴ−Ａ１３）（配列番号：１６）、ＦＨＡＡＥＬＬＡ（ＬＴ−Ａ３４）（配列番号：１７）、ＦＨＡＶＥＡＬＡ（ＬＴ−Ａ３６）（配列番号：１８）、ＦＨＡＡＥＡＬＡ（ＬＴ−Ａ３４６）（配列番号１９）、ＦＡＩＶＡＬＬＡ（ＬＴ−Ａ２５）（ＬＴ−Ａ２）（配列番号２０）、ＦＥＡＶＨＬＬＡ（ＬＴ−Ｅ２Ｈ５）（配列番号２１）、ＹＨＡＶＥＬＬＡ（ＬＴ−Ｙ１）（配列番号２２）、ＷＨＡＶＥＬＬＡ（ＬＴ−Ｗ１）（配列番号２３）、ＦＨＡＶＥＬＳＡ（ＬＴ−Ｓ７）（配列番号２４）、ＦＨＡＶＥＬＬＳ（ＬＴ−Ｓ８）（配列番号２５）、ＤＧＮＦＨＩＶＥＬＬＡ（ＬＴ−１１ＡＡ）（配列番号２６）、ＡＨＩＶＥＬＬＡ（ＬＴ−Ａ１）（配列番号２７）、ＦＡＩＶＥＬＬＡ（ＬＴ−Ａ２）（配列番号２８）、ＦＨＩＡＥＬＬＡ（ＬＴ−Ａ４）（配列番号２９）、ＦＨＩＶＡＬＬＡ（ＬＴ−Ａ５）（配列番号：３０）、ＦＨＩＶＥＡＬＡ（ＬＴ−Ａ６）（配列番号３１）、ＦＨＩＶＥＬＡＡ（ＬＴ−Ａ７）（配列番号３２）、または、配列番号９〜３２のいずれかに示されるアミノ酸配列に１つまたは数個のアミノ酸置換、欠失および／または付加を有し、配列番号９〜３２のいずれかに示されるアミノ酸配列の配列のものと同等またはそれ以上の活性を有するアミノ酸配列を含むペプチド；または、その修飾ペプチドまたはその塩を含む。
【００２９】
さらなる実施形態では、本開示のペプチドはＦＨＡＶＥＬＬＡ（配列番号１０）；または、その修飾ペプチドまたはその塩である。
【００３０】
本開示に従うペプチドは、式（Ｉ）に示されるアミノ酸配列に１つまたは数個のアミノ酸置換、欠失および／または付加を有するアミノ酸配列を含むペプチド（以下、「修飾ペプチド」ともいう）を包含する。特定のアミノ酸配列に１つまたは数個のアミノ酸置換、欠失および／または付加を有するアミノ酸配列からなるペプチドが、元のペプチドの生物活性を維持しうることは、当業者に広く知られている事実である。
【００３１】
この文脈において、１つまたは数個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換される場合、アミノ酸側鎖の特性は、置換の前後で保存されることが好ましい。アミノ酸側鎖の特性は、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、ヒドロキシ基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子を含む側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸またはアミドを含む側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基を含む側鎖を有するアミノ酸（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族を含む側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）を含む（括弧内の各文字は、アミノ酸の１文字表記を表す）。
【００３２】
さらに、修飾されたペプチドと元のペプチドとの相同性は、好ましくは６０％以上、より好ましくは７５％以上、さらにより好ましくは８５％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上である。
【００３３】
本開示のペプチドは、溶解性または安定性を改善するために修飾されうる。いくつかの実施形態では、修飾ペプチドは、環状ペプチド、ペグ化ペプチド、またはフルオレニルメチルオキシカルボニルペプチドである。例えば、極性残基またはＰＥＧ（ポリエチレングリコール）のセットを本開示のペプチドに任意に追加して、その溶解性を改善することが可能である。ＰＥＧは、本開示のペプチドのＣ末端またはＮ末端に付加されうる。一つの実施形態では、ＰＥＧは、本開示のペプチドのＮ末端またはＣ末端に付加される。いくつかの実施形態では、修飾ペプチドはＰＥＧペプチドであり、ここで、ＰＥＧは配列番号９〜３２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチドのＮ末端またはＣ末端に結合している。一つの実施形態では、ＰＥＧ−ペプチドは、ＰＥＧ−ＬＴ１−３またはＰＥＧ−ＬＴ−Ａ３である（すなわち、配列番号９または１０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチドのＣ末端またはＮ末端にＰＥＧが結合している）。
【００３４】
一つの実施形態では、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）が、安定性を改善するために本開示のペプチドに付加される。いくつかの実施形態では、修飾ペプチドはＦｍｏｃペプチドであり、ここで、Ｆｍｏｃは配列番号９〜３２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチドのＮ末端またはＣ末端に結合している。一つの実施形態では、Ｆｍｏｃ−ペプチドは、Ｆｍｏｃ−ＬＴ１−３またはＦｍｏｃ−ＬＴ−Ａ３である（すなわち、配列番号９または１０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチドのＣ末端またはＮ末端にＦｍｏｃが結合している）。
【００３５】
ペプチドは、例えば合成法および組換え法を含む、当技術分野で公知のポリペプチドを作製するための任意の手段を使用して生成されうる。本開示のペプチドは、それらの比較的小さなサイズのために、従来的な技術に従って溶液中または固体支持体上で直接合成されうる。様々な自動合成機が市販されており、既知のプロトコルに従って利用されうる。例えば、いくつかの実施形態において、ペプチドは、固相合成、メリフィールド型固相合成、ｔ−Ｂｏｃ固相合成、Ｆｍｏｃ固相合成、ＢＯＰ固相合成、および液相合成などといった合成化学技術を使用して合成されうる。他の実施形態では、ペプチドは、例えば、当業者によく知られている組換え技術に従って、細胞または無細胞系でペプチドをコードする核酸からペプチドを発現させることによって生成されうる。ペプチドは、当業者に知られている様々な修飾および保護基のいずれかを組み込むことができる。
【００３６】
一つの実施形態では、本開示の修飾ペプチドは環状の形態である。一つの実施形態では、本開示の修飾ペプチドは１つ以上の親水性アミノ酸、場合により１つ以上の疎水性アミノ酸をペプチドのＮ末端に付加することにより形成される環状である。一つの実施形態では、環状ペプチドは、本開示のペプチドのＮ末端に結合する２つの親水性アミノ酸と１つの疎水性アミノ酸を含む。
【００３７】
一つの実施形態において、本開示のペプチドは、式Ｉのペプチドの環状形態である。さらなる実施形態では、本開示は、以下の式ＩＩを有する環状ペプチド：
Ｘａ１−Ｘａ２−Ｘａ３−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８（ＩＩ）
（式中、Ｘａ１はヘッドトゥーテールの環化としてＸ８に結合しており、Ｘａ１はＤであり；Ｘａ２はＧであり；Ｘａ３はＮであり；そしてＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７およびＸ８は、それぞれ本明細書において定義されるアミノ酸である）を提供する。
【００３８】
本開示に従う環状部分を有するペプチド化合物は、アミノ酸および／またはアミノ酸類似体のアミド結合またはエステル結合により形成され、そして、アミド結合または炭素−炭素結合形成反応などといった共有結合の媒介による環化から生じる環状部分を有する化合物を指す。
【００３９】
本開示の環状部分を有する修飾ペプチド化合物は、ペプチドが環状部位で環化されている限り、特に限定されない。翻訳後の環化部位は、膜透過性と代謝安定性（薬らしさ）の適合性を提供する官能基を形成する環化ユニットであることが要求される。そのような環化方法は、特に制限なく使用されうる。そのような方法の例には、カルボン酸およびアミンからのアミド結合形成、ならびにスズキ反応、ヘック反応およびソノガシラ反応などといった遷移金属を触媒として使用する炭素−炭素結合形成が含まれる。したがって、本開示のペプチド化合物は、そのような結合形成反応が可能な官能基の少なくとも１つのセットを含む。
【００４０】
本開示のペプチド化合物における環状部分は、例えば、翻訳合成後の化学反応による環化により形成される環状部分であることが好ましい。また、環状部分は、翻訳後にＲＮＡやＤＮＡなどの核酸に影響を与えない反応条件下でも形成されうる環状部分であることが好ましい。
【００４１】
さらなる実施形態において、本開示の環状ペプチドは、ＤＧＮＦＨＩＶＥＬＬＡ（配列番号２６）のアミノ酸配列を含み、ここで、ＤはＡにヘッドトゥーテール（ｈｅａｄ  ｔｏ  ｔａｉｌ）の環化で結合している（環状−ＬＴ−１１ＡＡ）。
【００４２】
本開示のペプチドは、腫瘍増殖と浸潤の両方の抑制を示し、したがって、癌を治療するために使用されうる。
【００４３】
別の側面では、本開示は、本明細書に記載のペプチドを含む、医薬組成物、ナノ粒子またはリポソームを提供する。一つの実施形態において、組成物は第２の抗癌剤を含む。例えば、第２の抗癌剤には、エルロチニブ、アファチニブ、ゲフィチニブ、ベバシズマブ、ラムシルマブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、エルロチニブ、シスプラチン、パクリタキセル、メトトレキサート、シクロホスファミド、イホスファミド、クロラムブシル、カルムスチン、カルボプラチン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、チオテパ、ロムスチン、セムスチン、５−フルオロウラシル、コルチコステロイド、カルシニューリン阻害剤、ＮＳＡＩＤ、５−リポキシゲナーゼの阻害剤、およびシタラビンが含まれるが、これらに限定はされない。
【００４４】
治療的または予防的処置のための医薬組成物に関するいくつかの実施形態は、粘膜（経口、鼻腔、吸入、直腸、膣、気管など）、非経口、局部、または局所投与のいずれかに特異的な製剤を提供する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、非経口的に、例えば静脈内、皮下、皮内、または筋肉内に適切に投与される。本開示の医薬組成物は、従来的な方法（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、最新版、Ｍａｒｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、米国）に従って製剤化することができ、薬学的に許容される担体および添加剤も含み得る。例には、界面活性剤、賦形剤、着色剤、香料、防腐剤、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張剤、結合剤、崩壊剤、潤滑剤、流動性促進剤、および矯味薬が含まれるが、これらに限定はされず、他の一般的に使用される担体は適宜使用されうる。担体の具体例には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖トリグリセリド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、ショ糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩などが含まれる。
【００４５】
別の側面において、本開示は、本明細書に記載の有効量のペプチドを対象に投与することを含む、癌を予防、治療、または改善する方法を提供する。
【００４６】
別の側面では、本開示は、本明細書に記載の有効量のペプチドを対象に投与することを含む、癌の増殖、浸潤および／または転移を抑制する方法を提供する。
【００４７】
一つの実施形態では、本開示の方法は、本明細書に記載の第２の抗癌剤を投与する段階をさらに含む。別の実施形態において、本開示のペプチドおよび第２の抗癌剤は、同時にまたは別々に投与される。
【００４８】
例えば、本開示のペプチド、組成物および方法により治療可能な癌には、神経芽腫；胆管癌；肺癌；非小細胞肺癌；肝細胞癌；頭頸部扁平上皮癌；扁平上皮癌リンパ腫；上咽頭癌；胃癌；結腸癌；子宮頸癌；胆嚢癌；前立腺癌；乳癌（ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ）；精巣胚細胞腫瘍；大腸癌；神経膠腫；甲状腺癌；基底細胞癌；消化管間質癌；肝芽腫；子宮内膜癌；卵巣癌；膵臓癌；腎細胞癌、カポジ肉腫、慢性白血病、肉腫、直腸癌、咽喉癌、黒色腫、結腸癌、膀胱癌、肥満細胞腫、乳癌（ｍａｍｍａｒｙ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、乳腺癌、咽頭扁平上皮癌、精巣癌、胃腸癌、または胃癌および尿路上皮癌からなる群が含まれるが、これらに限定はされない。
【００４９】
本明細書に記載の方法により治療される対象は、ヒト対象および、イヌ、ネコ、ウサギ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウシなどの非ヒト（動物）対象の両方を含む哺乳動物対象を包含する。本明細書で使用される「並行的に投与される（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔｌｙ  ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ）」という用語は、２つの化合物が、複合（免疫）効果を達成するのに十分近い時間で投与されることを意味する。したがって、並行投与（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）は、連続投与または同時投与（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）（例えば、共通または同じ担体中での同時投与）によって実施されうる。
【００５０】
いくつかの実施形態では、開示のペプチドおよび組成物は、注射（皮下、腹腔内、静脈内、くも膜下腔内、筋肉内、脳室内、および脊髄注射）、鼻腔内、経口、経皮、非経口、吸入、鼻咽頭または経粘膜吸収を含むが、これらに限定されない任意の適切な投与経路によって投与されうる。投与は、医薬組成物として製剤化された本明細書に記載の少なくとも１つのペプチドを提供することを包含する。薬学的に許容される担体は、当業者に周知である。特定の医薬製剤および所与の治療のための治療有効量および投与計画の決定は、例えば、患者の年齢、体重、性別、民族、臓器（例えば、肝臓および腎臓）機能、所望される治療の範囲、疾患および関連症状の病期と重症度、および治療に対する患者の許容度を考慮し、当業者の能力の範囲内である。
【００５１】
治療用途に関連する実施形態では、対象の疾患をすでに患っている対象に対して、投与が実施されうる。疾患の潜伏期または急性期の患者は、適切に特定の疾患／状態、患者、および組み合わせに基づいて、単独または他の治療と組み合わせて、本明細書に記載の方法により治療されうる。当業者は、併用療法がいつ適切であり、いつ適切でないかを決定することができるであろう。治療方法および使用において、本明細書に記載のペプチドおよび組成物は、症状および／または合併症を治療する、または少なくとも部分的に停止させるのに十分な量で、対象に投与されうる。これを達成するのに十分な量は、しばしば「治療有効用量」と呼ばれる。この使用に有効な量は、ペプチド、組成物、投与方法、治療中の状態の段階と重症度、患者の年齢、体重、および一般的な健康状態、ならびに処方医の判断に一部依存するであろう。
【００５２】
さらに詳述することなく、当業者は前述の説明に基づいて本開示を最大限に利用できると考えられる。したがって、以下の実施例は、単なる例示として解釈されるべきであり、決して本開示の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００５３】
実施例
実施例１  ＬＴペプチドの調製。
ＬＴ−ペプチドを溶解するための溶媒として、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；＞９９．９％）およびγ−シクロデキストリン（γ−ＣＤ；ＲＰＭＩ−１６４０中で２．５ｍＭ（無血清））を使用した。ＬＴペプチドをＤＭＳＯまたはγ−ＣＤに溶解して最終濃度を２．５ｍＭとし、３０分間ボルテックスした。ペプチド溶液をさらに、ＲＰＭＩ培地を使用して１ｍＭ、０．５ｍＭ、および５０μＭに希釈した。ＬＴ１−３−ＰＥＧペプチドはＲＰＭＩ−１６４０に直接溶解可能である。ペプチド溶液を顕微鏡下で観察して、溶解性を調べた。
【００５４】
実施例２  細胞増殖アッセイ
下記のペプチドをＦｍｏｃで修飾し、ＤＭＳＯおよびγ−ＣＤに溶解した後、細胞増殖アッセイに使用した。１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地中でＣＬ１−５細胞を８０％コンフルエンスまで培養した。剥離後、３×１０４個の細胞を１２ウェルプレートに播種した。１６時間のインキュベーション後、細胞を処置前に回収するか（０時間と指定）、または２４時間ＬＴペプチドで処置し（２４時間と指定）、生細胞を計数した。細胞数の相対的な倍率変化または細胞増殖の増加率（％）は、次の式により計算した：（細胞数２４時間−細胞数０時間）／（対照の細胞数２４時間−対照の細胞数０時間）。
【００５５】
結果は、Ｆｍｏｃ−ＬＴ−Ａ３が最も良い増殖抑制能力を有することを示した。Ｆ−ｍｏｃ−ＬＴ−Ａ１、ＬＴ−Ａ２、ＬＴ−Ａ４、ＬＴ−Ａ６、およびＬＴ−Ａ７もまた、Ｆ−ｍｏｃ−ＬＴ１−３ペプチドよりも良好な抑制活性を示した（図１）。ＬＴ−Ａ３ペプチドのさらなる修飾は、Ｆｍｏｃ−ＬＴ−Ａ３ペプチドよりも低い増殖抑制活性を明らかにした（図２）。また、用量効果実験も、Ｆｍｏｃ−ＬＴ−Ａ３が最も良い増殖抑制能力を有していることを実証した（図３）。また我々は、Ｆｍｏｃ−ＬＴ１−３およびＦｍｏｃ−ＬＴ−Ａ３が異なる肺癌細胞株の増殖抑制に及ぼす影響も決定した。結果は、Ｆｍｏｃ−ＬＴ１−３およびＦｍｏｃ−ＬＴ−Ａ３が、ＣＬ１−５、Ｈ１３５５およびＨ４６０肺癌細胞株を大いに抑制し、Ｈ１２９９細胞株を部分的に抑制し、そしてＡ５４９細胞株には影響を及ぼさないことを示した（図４）。増殖抑制の傾向は、Ｆｍｏｃ−ＬＴ１−３とＦｍｏｃ−Ａ３の間で類似しており、これら２つのペプチドが増殖抑制において特異的に機能することを示唆している。
【００５６】
実施例３  細胞浸潤アッセイ。
Ｆｍｏｃ−ＬＴ１−３ペプチドを細胞浸潤アッセイにおいて使用した。ポリカーボネート膜（８−μｍ孔径）を備えた２４ウェル修飾ボイデンチャンバーをｉｎ  ｖｉｔｒｏ浸潤アッセイに使用した。膜は１８μｇのマトリゲル（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＲＰＭＩ−１６４０で希釈）でコーティングした。様々な濃度のペプチドを含むＲＰＭＩ培地中のＣＬ１−５細胞（３×１０４細胞／ウェル）を上部チャンバーに播種した。下部チャンバーでは、ＲＰＭＩ−１６４０培地のみを使用した。２４時間のインキュベーション後、細胞を氷冷した１００％メタノールで固定し、１０％ギムザで染色した。染色後、膜の上側の細胞を綿棒で取り除いた。ポリカーボネート膜の下面に付着した浸潤細胞の数を光学顕微鏡下で計数した。全ての実験を３回実施した。図５Ａおよび５Ｂに示されるように、Ｆｍｏｃ−ＬＴ１−３とＦｍｏｃ−ＬＴ−Ａ３の両方が細胞浸潤を抑制したが、Ｆｍｏｃ−ＬＴ１−３はＦｍｏｃ−ＬＴ−Ａ３よりも優れた浸潤抑制能力を有していた。興味深いことに、Ｆｍｏｃ−ＬＴ−Ａ３のＣ末端のペグ化は、浸潤抑制活性を大幅に増加させた（図５Ｃ）。
【００５７】
実施例４  異種移植動物モデルにおける腫瘍増殖に対するＦｍｏｃ−ＬＴ１−３の効果
６週齢の免疫不全ＢＡＬＢ／ＣＡｎＮ．Ｃｇ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ／ＣｒｌＢｌｔｗマウスを個別換気ケージ（ＩＶＣ）に収容した。１００μＬのＰＢＳ中の合計２×１０６個のＣＬ１−５肺癌細胞を１００μＬの１０×マトリゲルと混合した。肺癌細胞／マトリゲル混合物をマウスの背中下部に皮下注射した。３日後、マウスに１日あたり０、１０、２０、または３０ｎｍｏｌのＦｍｏｃ−ＬＴ−１−３を皮下投与した。Ｆｍｏｃ−ＬＴ−１−３ペプチドを１００％ＤＭＳＯに溶解し、３日目から１７日目までＰＢＳで所望の濃度に希釈した。１８日目に、我々は、対照群の動物の８０％、１０ｎｍｏｌ群の動物の４０％、２０ｎｍｏｌ群の動物の２０％、および３０ｎｍｏｌ群の動物の４０％で腫瘍が生じたことを観察した。腫瘍のない動物の割合は、Ｆｍｏｃ−ＬＴ１−３のレベルが１０ｎｍｏｌと２０ｎｍｏｌの間で増加するにつれて増加した。しかし、３０ｎｍｏｌ群は、腫瘍のない動物の割合のさらなる増加を示さなかった（図６）。この現象は、高濃度のＦｍｏｃ−ＬＴ１−３の溶解度が低いためである可能性がある。したがって、我々は、溶媒をＤＭＳＯからγ−ＣＤに置き換え、１８日目以降の注入に望ましい濃度にペプチドを希釈した。腫瘍の体積は定期的に測定した。結果は、２０ｎｍｏｌのＦｏｍｃ−ＬＴ１−３が腫瘍増殖抑制に最大の効果を有することを示した（図７）。１０ｎｍｏｌおよび３０ｎｍｏｌのＦｍｏｃ−ＬＴ１−３／ＤＭＳＯは、図６に示されているように、１８日目までに同じ初期腫瘍発生率を示したが、３０ｎｍｏｌのＦｍｏｃ−ＬＴ１−３／γ−ＣＤ治療群は、溶媒をγ−ＣＤに置き換えた後、腫瘍の増殖を有意に抑制した（図７）。３９日目に動物を屠殺した。腫瘍と臓器の重さを計り、固定し、パラフィンに包埋した。組織学的分析のために、包埋組織を切片化し、ヘマトキシリン・エオシンで染色した。図８に示されるように、２０ｎｍｏｌおよび３０ｎｍｏｌのＦｍｏｃ−ＬＴ−１−３は、ベシクル対照群と比較して、腫瘍重量を有意に抑制した。図９は、治療群と対照群の間で臓器の相対重量に有意差がないことを示している。組織学的分析は、Ｆｍｏｃ−ＬＴ１−３で処置した場合、動物における明らかな毒性を示さなかった。
【００５８】
実施例５  肺癌の転移に対するＦｍｏｃ−ＬＴ１−３ペプチドの効果
５週齢の免疫不全ＢＡＬＢ／ＣＡｎＮ．Ｃｇ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ／ＣｒｌＢｌｔｗマウスをＩＶＣに収容した。ＣＬ１−５細胞を２４時間、２００μＭのＦｍｏｃ−ＬＴ１−３で前処理した後、細胞を回収する６時間前にＦｍｏｃ−ＬＴ１−３ペプチドを含む新鮮な培地で培養した。ＣＬ１−５細胞を剥離し、遠心分離し、注射のために２００μＭのＦｍｏｃ−ＬＴ１−３ペプチドを含むＰＢＳ中に再懸濁した。尾静脈注射の３０分前に、マウスを２０ｎｍｏｌのＦｍｏｃ−ＬＴ１−３でも皮下的に処置した。合計１×１０６個のＣＬ１−５細胞をマウスに静脈内注射した。尾静脈注射後２日目、１日あたり２０ｎｍｏｌのＦｍｏｃ−ＬＴ１−３／０．５％ＤＭＳＯまたはＦｍｏｃ−ＬＴ１−３／γ−ＣＤをマウスに皮下注射した。５６日目までに、動物を屠殺し、全ての臓器の転移形成を調べた。肺の表面の転移性結節を解剖顕微鏡下で計数した。臓器を固定し、パラフィンに包埋した。組織学的分析のために、包埋組織を切片化し、ヘマトキシリン・エオシンで染色した。図１０に示されるように、Ｆｍｏｃ−ＬＴ１−３は両溶媒において、尾静脈注射によりＣＬ１−５細胞の転移を有意に抑制した。
【００５９】
実施例６  Ｆｍｏｃ−ＬＴ１−３ペプチドおよびシスプラチンの治療
ＣＬ１−５細胞を洗浄し、剥離し、ＰＢＳに再懸濁した。その後、８０μＬのＰＢＳ中に２×１０６個の細胞を含む単一の細胞懸濁液を２０μＬの１０×マトリゲル（コーニング、５１１７０１２）と混合した。細胞懸濁液を免疫不全ＢＡＬＢ／ＣＡｎＮ．Ｃｇ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ／ＣｒｌＢｌｔｗマウスの背中上部に皮下注射した。腫瘍を１０日間増殖させ、その間にマウスの９０％が腫瘍を生じた。担癌マウスを５群に分けた（ｎ＝８／群）。５つの群：対照、Ｆｍｏｃ−ＬＴ１−３、シスプラチン、維持療法、および併用療法における平均腫瘍体積は１２０〜１４０ｍｍ３であった。１３日目に、Ｆｍｏｃ−ＬＴ１−３群のマウスに１日あたり２０ｎｍｏｌのＦｍｏｃ−ＬＴ１−３／γ−ＣＤを背中下部に皮下注射した。シスプラチン群のマウスには、４ｍｇ／ｋｇのシスプラチンの腹腔内注射（ＩＰ）を毎週、合計４回施した。維持療法群のマウスには、シスプラチンのＩＰを４回与え、シスプラチンの３回目のＩＰ注射の際に１日あたり２０ｎｍｏｌのＦｍｏｃ−ＬＴ１−３／γ−ＣＤを投与した。併用療法群のマウスには、シスプラチンのＩＰを週に４回、１日あたり２０ｎｍｏｌのＦｍｏｃ−ＬＴ１−３／γ−ＣＤを投与した。各治療の過程で、腫瘍体積を３日ごとに測定した。マウスの死亡率を記録したところ、腫瘍体積が１５００ｍｍ３を超えるマウスが含まれていた。生存率の割合が図１１に記録されており、各群の生存期間の中央値が表１において計算されている。結果は、ベシクル対照群の生存期間中央値が２７．５日であり、シスプラチンのみとＦｍｏｃ−ＬＴ１−３のみの群は生存期間中央値が３７．５日まで延長し、シスプラチンとＦｍｏｃ−ＬＴ１−３の併用療法は生存期間中央値をさらに４７．５日まで延長し、そして、維持療法群も生存期間中央値を４４日間に延長することを示した。興味深いことに、我々の観察では、シスプラチンのみの群におけるシスプラチン注射後と維持群の最初の２サイクルにおいてマウスが死亡したが、併用療法群では死亡しなかったため、Ｆｍｏｃ−ＬＴ１−３は、シスプラチンが誘発する毒性を軽減するように思われた（図１１）。さらに、併用療法のマウスは、シスプラチンのみの群よりも活動的で健康的であった。したがって、Ｆｍｏｃ−ＬＴ１−３は、腫瘍の増殖と転移を阻害するだけでなく、シスプラチンの毒性も低下させ、シスプラチンとの併用療法における動物の生存率を有意に高める。
【００６０】
【表１】
2020518658.tif 000002
【００６１】
実施例７  ＬＴ（配列番号１）内の断片の細胞増殖および浸潤アッセイ
０μＭ、１２．５μＭ、２５μＭおよび５０μＭの濃度のペプチド断片ＬＴ−１、ＬＴ−２、ＬＴ−３、ＬＴ−４およびＬＴ−５の細胞増殖アッセイおよび浸潤アッセイを、実施例２および３に記載の方法に従ってアッセイした。ＬＴ−１は、増殖および浸潤活性に対する抑制効果を有する一方、ＬＴ−３、ＬＴ−４およびＬＴ−５は細胞浸潤のみに対して抑制効果を有する。ペプチド合成中の環化効果のために、最終分析用の完全長ＬＴ−２ペプチドは得られなかった。しかしながら、ＬＴ−２のＮ末端配列はＬＴ１−３の配列を含んでおり、したがって、ＬＴ−２は増殖および浸潤活性に対して抑制効果を有する可能性が高い（図１２および以下の表を参照）。
【００６２】
【化１】
2020518658.tif 000003
【００６３】
【表２】
2020518658.tif 000004
【００６４】
実施例８  ＣＬ１−５肺癌細胞の細胞浸潤に対するＬＴペプチドの効果
ＬＴ１−３およびＬＴ−Ａ３は疎水性である。ＬＴ−Ａ３はＬＴ１−３よりも増殖抑制活性が優れている一方（図１）、ＬＴ１−３はＬＴ−Ａ３よりも細胞浸潤抑制が優れている（図１３および図１４）。ペプチドの溶解性を高めるために、ＬＴ１−３およびＬＴ−Ａ３のＮまたはＣ末端のいずれかにＰＥＧ修飾を適用した。結果は、ＬＴ−１−３およびＬＴ−Ａ３ペプチドのＮ末端のＰＥＧ３修飾（ＰＥＧ−１−３およびＰＥＧ−Ａ３）が、ＣＬ１−５細胞の浸潤抑制活性を無効にするのに対し、ＬＴ−Ａ３（Ａ３−ＰＥＧ）は、良好な浸潤抑制活性を有することを示した（図１５）。肺癌細胞の浸潤抑制に対するＬＴ−Ａ３−ＰＥＧの用量効果は、ＬＴ−Ａ３と比較して（図１４）、ＬＴ−Ａ３−ＰＥＧがペプチドの浸潤抑制活性を大幅に増強することを明らかにした（図１６）。Ｃ末端ＰＥＧ３修飾ＬＴ−１−３（ＬＴ１−３−ＰＥＧ）は、ＬＴ１−３と比較した場合（図１３）、浸潤抑制活性も増強した（図１７）。
【００６５】
実施例９  Ａ５４９およびＨ１２９９肺癌細胞の細胞浸潤に対するＬＴ−１−３−ＰＥＧの効果
ＬＴペプチドがＣＬ１−５以外の肺癌細胞の発達を抑制するか否かを調べることは重要である。結果は、ＬＴ１−３−ＰＥＧがＡ５４９およびＨ１２９９細胞の浸潤も効率的に抑制することを示した（図１８および１９）。ＬＴ１−３−ＰＥＧは、Ｈ４６０およびＨ１３５５肺癌細胞の浸潤も抑制したが、これら２つの細胞株に対するＬＴ１−３−ＰＥＧの用量効果は現在調査中である。
【００６６】
実施例１０  ＣＬ１−５細胞の細胞増殖に対するＰＥＧ修飾ＬＴペプチドの効果
ＬＴ−Ａ３は、ＣＬ１−５細胞において優れた増殖抑制活性を有するが、ＬＴ−Ａ３のＮ末端またはＣ末端のＰＥＧ３修飾（ＰＥＧ−Ａ３＆Ａ３−ＰＥＧ）およびＬＴ１−３のＮ末端ＰＥＧ３修飾（ＰＥＧ−１−３）は、増殖抑制活性を無効にした（図２０Ａ）。幸いなことに、Ｃ末端ＰＥＧ３修飾ＬＴ１−３（ＬＴ１−３−ＰＥＧ）は、増殖抑制活性を保持していた（図２０Ｂ）。
【００６７】
実施例１１  様々な肺癌細胞株の細胞増殖に対するＬＴ１−３−ＰＥＧの効果
様々な細胞株の細胞増殖に対するＬＴ１−３−ＰＥＧの用量効果を調べた。結果は、ＬＴ１−３−ＰＥＧがＣＬ１−５、Ａ５４９、Ｈ４６０およびＨ１３５５の増殖を効果的に抑制するが、Ｈ１２９９ではそうでないことを示した（図２１）。
【００６８】
実施例１２  正常細胞型に対するＬＴペプチドの効果
ＬＴペプチドが正常な細胞株にどのように影響するかを調査することは重要である。我々は、ＳＶ４０形質転換ヒト気管支上皮細胞Ｂｅａｓ２Ｂ、ヒト胚性肺線維芽細胞ＭＲＣ５、およびＨＵＶＥＣをＬＴペプチドで処置し、細胞増殖アッセイを実施している。我々の予備的な結果は、ＬＴペプチドがこれらの正常細胞の増殖を抑制しないことを示した（図２２）。
【００６９】
実施例１３  乳癌細胞の増殖に対するＬＴ１−３−ＰＥＧの効果
ＬＴ１−３−ＰＥＧは、ＭＣＦ−７、Ｔ−４７Ｄ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＭＤＡ−ＭＢ−４５３乳癌細胞株の増殖も抑制した（図２３）。
【００７０】
実施例１４  ＰＫＡおよびＪＮＫ活性の遮断はＬＴペプチドを介した増殖抑制を強化した
ＰＫＡ阻害剤（Ｈ８９）およびＪＮＫ阻害剤（ＳＰ６００１２５）は、ＣＬ１−５肺癌細胞におけるＬＴ１−３およびＬＴ１−３−ＰＥＧを介した増殖抑制を強化した（図２４および２５）。これらの観察結果を確認するために、ＣＬ１−５細胞においてＰＫＡおよびＪＮＫ１の触媒サブユニットをｓｉＲＮＡによって妨げた後、細胞にＬＴペプチド処置を行った。結果は、ＰＫＡおよびＪＮＫの活性の低下が、ＬＴ−１−３−ペプチドが媒介する増殖に対する抑制効果を高めることを証明した（図２６および２７）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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