(57)【要約】  肝臓を人工的に操作することによって目的のタンパク質を発現するためのプラットフォーム、特に、異常に機能または発現する疾病遺伝子の代わりに、正常に機能または発現できる導入遺伝子（例えば治療用遺伝子）を高発現分泌遺伝子に挿入することにより発現を誘導することによって遺伝性疾患を緩和もしくは治療するための、または、身体機能を改善するためのプラットフォームを提供する。高発現分泌遺伝子はＨＰまたはＡＰＯＣ３遺伝子を含む。導入遺伝子は、肝細胞ゲノムにおけるプロモーターを使用して高発現されて細胞から分泌されるものを含む。
2020527030.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝細胞のゲノムに人工的に挿入された導入遺伝子を発現するための肝臓生体工場プラットフォーム（ＬＢＰ）システムであって、
前記導入遺伝子は、前記高発現分泌遺伝子の配列に位置し、
前記高発現分泌遺伝子は、肝細胞のゲノムに存在するＡＬＢ遺伝子、ＦＴＬ遺伝子、ＦＴＨ１遺伝子、ＡＣＴ遺伝子、ＨＰ遺伝子、ＡＰＯＣ３遺伝子、ＳＯＤ２遺伝子、ＯＲＭ１遺伝子、Ｆ９遺伝子から成る群から選択される少なくとも１つであり、
前記導入遺伝子は挿入前と比較して高発現される、または、前記導入遺伝子は前記肝細胞において新たに発現される、
ＬＢＰシステム。
【請求項２】
前記高発現分泌遺伝子は、ＨＰ遺伝子およびＡＰＯＣ３遺伝子のうち少なくとも１つである、請求項１に記載のＬＢＰシステム。
【請求項３】
前記導入遺伝子は、前記高発現分泌遺伝子のイントロンおよびエクソンの一部のうち少なくとも１つに挿入される、請求項１に記載のＬＢＰシステム。
【請求項４】
前記導入遺伝子は、肝細胞のゲノムに元々存在するプロモーターによって発現される、請求項１に記載のＬＢＰシステム。
【請求項５】
前記導入遺伝子はＦ９遺伝子である、請求項１に記載のＬＢＰシステム。
【請求項６】
前記導入遺伝子の発現によって生成されるタンパク質は肝細胞の外に分泌される、請求項１に記載のＬＢＰシステム。
【請求項７】
肝細胞のゲノムに人工的に挿入された導入遺伝子を発現するように遺伝子を改変するための組成物であって、
前記導入遺伝子を高発現分泌遺伝子に組み込むためのプログラム可能ヌクレアーゼを含み、
前記高発現分泌遺伝子は、ＦＴＬ遺伝子、ＦＴＨ１遺伝子、ＡＣＴＢ遺伝子、ＨＰ遺伝子、ＡＰＯＣ３遺伝子、ＳＯＤ２遺伝子、ＯＲＭ１遺伝子、Ｆ９遺伝子から成る群から選択される少なくとも１つである、
組成物。
【請求項８】
前記プログラム可能ヌクレアーゼは、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）‐ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）から成る群から選択される少なくとも１つである、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記高発現分泌遺伝子は、ＨＰ遺伝子およびＡＰＯＣ３遺伝子のうち少なくとも１つである、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記導入遺伝子はＦ９遺伝子である、請求項７に記載の組成物。
【請求項１１】
肝細胞のゲノムに人工的に挿入された導入遺伝子を発現するように遺伝子を改変するための組成物であって、
肝細胞のゲノムに存在する高発現分泌遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子の標的配列のガイド核酸と、
エディタータンパク質、または、前記エディタータンパク質をコードする核酸と、
前記導入遺伝子を含むドナーと
を備える組成物。
【請求項１２】
前記エディタータンパク質は、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィラス由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・アウレウス由来Ｃａｓ９タンパク質、ナイセリア・メニンジティディス由来Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質から成る群から選択される少なくとも１つである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記標的配列は、前記高発現分泌遺伝子の配列における、エクソン、イントロン、５'‐ＵＴＲ、３'‐ＵＴＲ、および、エンハンサーの一部のうち少なくとも１つに位置する、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記標的配列は、前記高発現分泌遺伝子の配列におけるエクソンおよびイントロンの一部のうち少なくとも１つに位置する、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記標的配列は、配列識別番号１〜３４８から成る群から選択される少なくとも１つである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記高発現分泌遺伝子は、ＨＰ遺伝子およびＡＰＯＣ３遺伝子のうち少なくとも１つである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ガイド核酸は、前記高発現分泌遺伝子に位置する標的配列に対応するガイドドメインを含み、
前記ガイドドメインは、前記標的配列とミスマッチする０〜５ヌクレオチドである、
請求項１１に記載の組成物。
【請求項１８】
前記ガイド核酸は、ＨＰまたはＡＰＯＣ３遺伝子のヌクレオチド配列における配列識別番号１〜３４８から成る群から選択される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ガイド核酸は、配列識別番号１〜１１、３７〜５１、１５４〜１６７、１６８〜１８２から成る群から選択される標的配列に対応する、請求項１１に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ガイド核酸は、配列識別番号１〜４０、および、１５４〜１６７から成る群から選択される標的配列に対応し、
前記組成物は更に、カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質、または、前記Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸を含む、
請求項１１に記載の組成物。
【請求項２１】
前記ガイド核酸は、配列識別番号４１〜１３４、および、１６８〜３３２から成る群から選択される標的配列に対応し、
前記組成物は更に、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質、または、前記Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸を含む、
請求項１１に記載の組成物。
【請求項２２】
前記ガイド核酸は、配列識別番号１３５〜１５３、および、３３３〜３４８から成る群から選択される標的配列に対応し、
前記組成物は更に、ストレプトコッカス・アウレウス由来Ｃａｓ９タンパク質、または、前記Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸を含む、
請求項１１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記導入遺伝子はＦ９遺伝子である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項２４】
前記ガイド核酸、前記エディタータンパク質、および前記ドナーはそれぞれ、ヌクレオチド配列の形態で、少なくとも１つのベクターにおいてコードされる、請求項１１に記載の組成物。
【請求項２５】
前記ベクターはウイルスベクターシステムである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項２６】
前記ウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクチニアウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルス、および、レンチウイルスから成る群から選択される少なくとも１つである、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記ガイド核酸は、配列識別番号１〜３４８から成る群から選択される標的配列に対応するガイド核酸。
【請求項２８】
前記ガイド核酸は、配列識別番号１〜１２、３７〜５１、１５４〜１６７、および、１６８〜１８２から成る群から選択される標的配列に対応する、請求項２７に記載のガイド核酸。
【請求項２９】
前記ガイド核酸は、１８〜２５ｂｐのヌクレオチド配列である、請求項２７に記載のガイド核酸。
【請求項３０】
前記肝細胞のゲノムに人工的に挿入される導入遺伝子を発現する肝細胞であって、
前記導入遺伝子は高発現分泌遺伝子に挿入され、
前記高発現分泌遺伝子は、ＦＴＬ遺伝子、ＦＴＨ１遺伝子、ＡＣＴＢ遺伝子、ＨＰ遺伝子、ＡＰＯＣ３遺伝子、ＳＯＤ２遺伝子、ＯＲＭ１遺伝子およびＦ９遺伝子から成る群から選択される少なくとも１つである、
ことを含む幹細胞。
【請求項３１】
前記高発現分泌遺伝子は、ＨＰ遺伝子およびＡＰＯＣ３遺伝子のうち少なくとも１つである、請求項３０に記載の肝細胞。
【請求項３２】
前記導入遺伝子は、前記高発現分泌遺伝子の前記エクソンまたは前記イントロンに位置する、請求項３０に記載の肝細胞。
【請求項３３】
前記導入遺伝子は、前記肝細胞ゲノムにおいて元々存在するプロモーターによって発現される、請求項３０に記載の肝細胞。
【請求項３４】
前記導入遺伝子はＦ９遺伝子である、請求項３０に記載の肝細胞。
【請求項３５】
肝細胞のゲノムにおける高発現分泌遺伝子に導入遺伝子を挿入することによって、目的のタンパク質を発現するように肝細胞のゲノムを改変するための方法であって、
プログラム可能ヌクレアーゼおよびドナーを前記肝細胞に導入する段階を含み、
前記プログラム可能は、ＦＴＬ遺伝子、ＦＴＨ１遺伝子、ＡＣＴＢ遺伝子、ＨＰ遺伝子、ＡＰＯＣ３遺伝子、ＳＯＤ２遺伝子、ＯＲＭ１遺伝子およびＦ９遺伝子から成る群から選択される前記高発現分泌遺伝子のうち少なくとも１つを操作または改変するためのものであり、
前記ドナーは前記導入遺伝子を含む、
方法。
【請求項３６】
前記高発現分泌遺伝子は、ＨＰ遺伝子およびＡＰＯＣ３遺伝子のうち少なくとも１つである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記導入遺伝子はＦ９遺伝子である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記プログラム可能ヌクレアーゼはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムであり、
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、
（ｉ）肝細胞のゲノムにおける前記高発現分泌遺伝子に存在する標的配列に対応するガイド核酸と、
（ｉｉ）エディタータンパク質と
を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記標的配列は、前記高発現分泌遺伝子配列の配列におけるエクソン、イントロン、５'‐ＵＴＲ、３'ＵＴＲ、および、エンハンサーの一部のうち少なくとも１つに位置する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記標的配列は、前記高発現分泌遺伝子の配列におけるエクソンおよびイントロンの一部のうち少なくとも１つに位置する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記ガイド核酸は、前記高発現分泌遺伝子の前記ヌクレオチド配列における配列識別番号１〜３４８から成る群から選択される少なくとも１つの標的配列に対応する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記ガイド核酸は、配列識別番号１〜１５、３７〜５１、１５４〜１６７、および、１６８〜１８２から成る群から選択される少なくとも１つの標的配列に対応する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
前記エディタータンパク質は、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィラス由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・アウレウス由来Ｃａｓ９タンパク質、ナイセリア・メニンジティディス由来Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質から成る群から選択される少なくとも１つである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
前記ガイド核酸、前記エディタータンパク質および前記ドナーはそれぞれ、ヌクレオチド配列の形態で少なくとも１つのベクターにおいてコードされる、請求項３５または３８に記載の方法。
【請求項４５】
前記ベクターはウイルスベクターシステムである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記ウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクチニアウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルス、および、レンチウイルスから成る群から選択される少なくとも１つである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記ベクターは、全身または局所投与によって前記肝細胞に導入される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記全身投与は静脈内投与である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記プログラム可能ヌクレアーゼおよび前記ドナーを前記第１肝細胞に導入することは、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで実行される、請求項３５に記載の方法。
【請求項５０】
血友病を治療する方法であって、
肝細胞のゲノムに人工的に挿入された導入遺伝子を発現するために対象に組成物を導入する段階を含み、
前記組成物は、ＣＲＩＳＰＲ‐Ｃａｓシステム、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮから選択されるプログラム可能ヌクレアーゼを含み、
ドナー配列に含まれる前記導入遺伝子は、前記ＨＰ遺伝子およびＡＰＯＣ３遺伝子配列のうち少なくとも１つに人工的に挿入され、
前記導入遺伝子はＦ９遺伝子である、
方法。
【請求項５１】
前記組成物はＣＲＩＳＰＲ‐Ｃａｓシステムであり、
前記ＣＲＩＳＰＲ‐Ｃａｓシステムは、
（ｉ）肝細胞のゲノムに存在する高発現分泌遺伝子の群から選択される少なくとも１つの標的配列に対応するガイド核酸と、
（ｉｉ）エディタータンパク質、または前記エディタータンパク質をコードする核酸と
を含み、前記エディタータンパク質は、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィラス由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・アウレウス由来Ｃａｓ９タンパク質、ナイセリア・メニンジティディス由来Ｃａｓ９タンパク質およびＣｐｆ１タンパク質から成る群から選択される少なくとも１つである、
請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記ガイド核酸は、ＨＰまたはＡＰＯＣ３遺伝子のヌクレオチド配列における配列識別番号１〜３４８から成る群から選択される少なくとも１つの標的配列に対応する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記ガイド核酸は、配列識別番号１〜１１、３７〜５１、１５４〜１６７、１６８〜１８２から成る群から選択される少なくとも１つの標的配列に対応する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記ガイド核酸、前記エディタータンパク質および前記ドナーは、ヌクレオチド配列の形態で少なくとも１つのベクターにおいてそれぞれコードされる、請求項５０または５１に記載の方法。
【請求項５５】
前記ベクターはウイルスベクターである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記組成物は、全身投与によって対象に導入される、請求項５０に記載に方法。
【請求項５７】
前記全身投与は静脈内投与である、請求項５６に記載に方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝臓を人工的に操作または改変することによって、目的のタンパク質を発現するためのプラットフォームに関する。より具体的には、本発明は、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質を使用して、異常に機能または発現し得る疾病遺伝子の代わりに、通常に機能または発現し得る導入遺伝子（例えば、治療用遺伝子）の発現を誘導することによって、遺伝性疾患を緩和または治療する、または、身体機能を改善するためのプラットフォームに関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子療法は、人間工学の新時代において、非常に大きい可能性を有する。遺伝子療法は、遺伝子破壊、遺伝子改変、および、融合された特定の外因性プロモーター、または、ゲノム挿入部位に見つかる内在性プロモーターによって調節できる導入遺伝子の挿入などのゲノム編集技法を含む。
【０００３】
今日、難治性の血友病、または、リソソーム蓄積症には、好適な治療剤が無く、酵素またはタンパク質の代替物を使用する代替的な治療法が主に治療のために使用されているが、根本的な治療法ではない。加えて、ＡＡＶを使用して治療用遺伝子を発現するための方法が臨床試験において行われているが、これらの方法はまた、ＡＡＶが発現している間のみ効果的であると予想され得て、したがって、それらは、根本的かつ長期的な治療方法になり得ない。
【０００４】
したがって、より長く、より効果的な治療のために、患者のゲノムに実際の治療用遺伝子を挿入することによる恒久的な発現を可能にする治療用プラットフォームの必要性がある。そのような治療用プラットフォームは、治療剤の一時的、および、反復的な投与を用いる既存の治療方法とは異なる。効率的な治療用プラットフォームは、遺伝子修正に効果的な標的特異的プログラム可能ヌクレアーゼを使用して治療用遺伝子を患者のゲノムに挿入することによって開発できる。
【０００５】
この理由から、発明者は、標的特異的プログラム可能ヌクレアーゼを使用して、目的の遺伝子を持続的に発現可能な治療用プラットフォームを開発することを目指している。特に、高い効率のために、臓器または組織（例えば肝臓）において高発現する遺伝子の部位を目的の遺伝子の挿入の部位として決定することによって、効果的プラットフォームが開発された。
【０００６】
［開示］
［技術的課題］
本発明は、ＣＲＩＳＰＲ‐Ｃａｓシステムを使用して、肝細胞において目的のタンパク質を発現するプラットフォームを提供することに関する。
【０００７】
また、本発明は、目的のタンパク質、または、それをコードする配列、および、ＣＲＩＳＰＲ‐Ｃａｓシステムの使用を含む、目的のタンパク質を発現するための組成物、ならびに、その様々な使用を提供することに関する。
【０００８】
本発明はまた、ＣＲＩＳＰＲ‐Ｃａｓシステムを使用して、目的のタンパク質を発現する細胞、および、それを調製する方法を提供することに関する。
【０００９】
また、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ‐Ｃａｓシステムを使用して、肝細胞において目的のタンパク質を発現する方法を提供することに関する。
【００１０】
本発明はまた、肝細胞において目的のタンパク質を発現するための組成物を、治療の対象に投与する段階を備える、遺伝性疾患を治療する方法を提供することに関する。
【００１１】
本発明はまたは、肝細胞において目的のタンパク質を発現するために対応する標的遺伝子の操作において使用可能なガイド核酸およびエディタータンパク質を提供することに関する。
【００１２】
［技術的解決策］
上述の課題を解決するべく、本発明は、肝細胞において目的のタンパク質を発現するプラットフォームを提供する。より具体的には、本発明は、高いレベルでタンパク質を持続的に発現し、人工的に改変された細胞、臓器または組織を提供するために、ＣＲＩＳＰＲ‐Ｃａｓシステムを使用して、目的のタンパク質をコードする遺伝子を標的遺伝子に挿入することによって、身体機能を改善し、遺伝性疾患を治療するためのプラットフォームを提供する。
【００１３】
ここで使用される「肝臓生体工場プラットフォーム」とは、特定の導入遺伝子を肝細胞に挿入することによって、目的のタンパク質を持続的に発現可能なシステムであり、それらに直接的または間接的に関与する、すべての組成物、方法、および、使用を含む。
【００１４】
例において、人工的に挿入される導入遺伝子は、肝細胞において高発現分泌遺伝子に組み込まれ得る。
【００１５】
高発現分泌遺伝子は、肝細胞のゲノムに存在するＡＬＢ遺伝子、ＦＴＬ遺伝子、ＦＴＨ１遺伝子、ＡＣＴ遺伝子、ＨＰ遺伝子、ＡＰＯＣ３遺伝子、ＳＯＤ２遺伝子、ＯＲＭ１遺伝子、および、Ｆ９遺伝子から成る群から選択される少なくとも１つである。 導入遺伝子は、挿入前と比較して、高発現する、または、導入遺伝子は、肝細胞において、新たに発現する。
【００１６】
加えて、ここで開示される開示は、肝細胞において目的のタンパク質を発現するための標的特異的プログラム可能ヌクレアーゼを含む組成物に関し、特に、導入遺伝子を高発現分泌遺伝子に挿入するためのプログラム可能ヌクレアーゼを含み、高発現分泌遺伝子の群から選択される１または複数の遺伝子である遺伝子を操作するための組成物に関する。
【００１７】
一例において、本発明は、肝臓において発現される高発現分泌遺伝子の群から選択される１または複数の遺伝子の標的配列に対応するガイド核酸と、エディタータンパク質をコードするエディタータンパク質または核酸と、目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むドナーとを含む目的のタンパク質を発現するための組成物を提供する。
【００１８】
「高発現分泌遺伝子」は、発現産物が肝細胞の外へ分泌されるように、肝細胞において高発現する、予め定められたレベル以上で肝細胞において発現する遺伝子を指す。高発現分泌遺伝子は、肝細胞のゲノムにおいて高いレベルで持続的に発現できる部位に存在し、セーフハーバー部位の機能を有し得る。
【００１９】
高発現分泌遺伝子は、ＡＬＢ遺伝子、ＦＴＬ遺伝子、ＦＴＨ１遺伝子、ＡＣＴＢ遺伝子、ＨＰ遺伝子、ＡＰＯＣ３遺伝子、ＳＯＤ２遺伝子、ＯＲＭ１遺伝子、ＡＡＶＳ１遺伝子、Ｒｏｓａ遺伝子、ＨＰＲＴ遺伝子およびＣＣＲ５遺伝子から成る群から選択される少なくとも１つであり得る。
【００２０】
高発現分泌遺伝子は、好ましくは、ＨＰ遺伝子またはＡＰＯＣ３遺伝子であり得る。
【００２１】
プログラム可能ヌクレアーゼは、例において、人工的に設計されたヌクレアーゼを意味する。プログラム可能ヌクレアーゼは、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ  （ＣＲＩＳＰＲ）‐ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）から成る群から選択される少なくとも１つである。
【００２２】
ヌクレオチド配列における改変は、ＣＲＩＳＰＲ‐Ｃａｓシステムを使用することによって、無制限に、および、人工的に操作され得る。
【００２３】
「ＣＲＩＳＰＲ‐Ｃａｓシステム」は、目的の遺伝子の配列を認識して、それに結合するガイド核酸と、標的遺伝子を切断するエディタータンパク質との間の相互作用によって形成されるシステムを指し、ＣＲＩＳＰＲ‐Ｃａｓシステムは、ガイド核酸およびエディタータンパク質を含む。
【００２４】
ＣＲＩＳＰＲ‐Ｃａｓシステムは標的を改変し得る。標的は、標的核酸、遺伝子、染色体またはタンパク質であり得る。
【００２５】
エディタータンパク質は、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィラス由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・アウレウス由来Ｃａｓ９タンパク質、ナイセリア・メニンジティディス由来Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質から成る群から選択される１または複数のタンパク質、または、それらをコードする核酸である。例として、エディターは、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質またはカンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質であり得る。
【００２６】
標的配列は、高発現分泌遺伝子配列のエクソン領域に位置する連続の１０ｂｐ〜２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
【００２７】
標的配列は、高発現分泌遺伝子配列のイントロン領域に位置する連続の１０ｂｐ〜２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
【００２８】
標的配列は、配列識別番号１〜３４８から成る群から選択される少なくとも１つであり得る。
【００２９】
ガイド核酸は、高発現分泌遺伝子の群から選択される少なくとも１つの遺伝子のヌクレオチド配列の一部と相補結合を形成し得る。ガイド核酸は、標的配列とミスマッチする０〜５、０〜４、０〜３、または、０〜２ヌクレオチドを含み得る。
【００３０】
一実施形態において、ここで開示される開示は、ＡＬＢ遺伝子、ＦＴＬ遺伝子、ＦＴＨ１遺伝子、ＡＣＴＢ遺伝子、ＨＰ遺伝子、ＡＰＯＣ３遺伝子、ＳＯＤ２遺伝子、ＯＲＭ１遺伝子、ＡＡＶＳ１遺伝子、Ｒｏｓａ遺伝子、ＨＰＲＴ遺伝子およびＣＣＲ５遺伝子から成る群から選択される少なくとも１つである、高発現分泌遺伝子のためのガイド核酸を含む。
【００３１】
例において、ＨＰ遺伝子配列の配列識別番号１〜１５３から成る群から選択される標的配列のためのガイド核酸、ＡＰＯＣ３遺伝子配列の配列識別番号１６８〜３４８から成る群から選択される標的配列のためのガイド核酸の群から選択される１または複数のガイド核酸が提供され得る。実施形態において、遺伝子を改変するための組成物は、配列識別番号１‐４０、および、１５４〜１６７から成る群から選択される標的配列に対応するガイド核酸を提供する。組成物は更に、カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質、または、Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸を含む。
【００３２】
別の実施形態において、遺伝子を改変するための組成物は、配列識別番号４１〜１３４および１６８〜３３２から成る群から選択される標的配列に対応するガイド核酸を提供する。組成物は更に、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質、または、Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸を含む。
【００３３】
ガイド核酸は、これらに限定されないが、１８〜２５ｂｐ、１８〜２４ｂｐ、１８〜２３ｂｐ、１９〜２３ｂｐ、および、２０〜２３ｂｐのヌクレオチド配列のいずれか１つであり得る。
【００３４】
ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含むデュアルＲＮＡ、または、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の形態で存在し得る。
【００３５】
ここで開示される開示は、目的のタンパク質をコードする遺伝子導入遺伝子を含む。
【００３６】
目的のタンパク質の発現は、既存のタンパク質を置換するように、または、新しいタンパク質を提供するように機能し得る。代替的に、身体において欠乏している、または、不存在であるタンパク質が発現され、それにより、タンパク質の欠乏または不存在によって引き起こされる疾患を治療する、または、対応するタンパク質の機能を強化する。
【００３７】
例えば、目的のタンパク質は、既存のタンパク質とは異なる特性（例えば、血清半減期の増加など）を有するタンパク質であり得る。
【００３８】
例えば、目的のタンパク質は、特定の疾患の治療用遺伝子であり得る。治療用遺伝子は、遺伝性疾患に関与する病因遺伝子の発現および機能に影響する遺伝子であり得る。治療用遺伝子は、遺伝性疾患に関与する病因遺伝子（正常遺伝子の変異型）の正常型遺伝子の一部（例えば機能ドメイン）であり得る。
【００３９】
疾患は、抗体によって治療できる疾患であり得る。
【００４０】
疾患は、様々な遺伝子における変異によって引き起こされ得る。例えば、疾患は、「遺伝性代謝異常」に関連する疾患であり得る。例えば、疾患は血友病であり得る。
【００４１】
治療用遺伝子、すなわち、病因遺伝子の正常型は、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、および、異なる凝固因子から成る群から選択され得る。
【００４２】
治療用遺伝子、すなわち、病因遺伝子の正常型は、ＩＤＵＡ、Ｉ２Ｓ、ＳＧＳＨ、ＮＡＧＬＵ、ＨＧＳＮＡＴ、ＧＮＳ、ＧＡＬＮＳ、ＧＬＢ１、ＡＲＳＢ、ＧＵＳＢ、ＨＹＡＬ、ＮＥＵ、ＧＮＰＴＡＢおよびＭＣＯＬＮ１から成る群から選択され得る。
【００４３】
治療用遺伝子、すなわち、病因遺伝子の正常型は、ＳＡＨ１、ＧＡＬＣ、ＣＴＳＡ、ＧＬＡ、ＮＡＧＡ、ベータガラクトシダーゼ、ヘキソサミニダーゼ、ＧＢＡ、ＳＭＰＤ１、ＡＲＳＡ、ＳＵＭＦから成る群から選択され得る。
【００４４】
治療用遺伝子、すなわち、病因遺伝子の正常型は、ＮＰＣ、ＰＰＴ、ＴＰＰ１、ＣＬＮ３、ＣＬＮ６、ＰＰＴ１、ＤＮＡＪＣ５、ＣＴＳＦ、ＣＬＮ７、ＣＬＮ８およびＣＴＳＤから成る群から選択され得る。
【００４５】
治療用遺伝子、すなわち、病因遺伝子の正常型はＧＡＡまたはＬＡＭＰ２であり得る。
【００４６】
治療用遺伝子、すなわち、病因遺伝子の正常型は、ＣＴＮＳ、ＣＴＳＫ、または、ＳＬＣ１７Ａ５であり得る。
【００４７】
治療用遺伝子、すなわち、病因遺伝子の正常型は、ＭＡＮ２Ｂ、ＭＡＮ２Ｃ、ＭＡＮＢＡ、ＡＧＡ、ＦＵＣＡ１およびＬＡＬから成る群から選択され得る。
【００４８】
治療用遺伝子、すなわち、病因遺伝子の正常型は、メチルマロン酸尿症ＣｂＩＡ型（ＭＭＡＡ）タンパク質、メチルマロン酸尿症ＣｂＩＢ型（ＭＭＡＢ）タンパク質、メチルマロン酸尿症ＣｂＩＣ型（ＭＭＡＤＨＣ）タンパク質、５‐メチルテトラヒドロ葉酸‐ホモシステインメチルトランスフェラーゼレダクターゼ（ＭＴＲＲ）タンパク質、リソソーム膜タンパク質ドメイン（ＬＭＢＲＤ１）タンパク質、５‐メチルテトラヒドロ葉酸‐ホモシステインメチルトランスフェラーゼ（ＭＴＲ）タンパク質、プロピオニルＣｏＡタンパク質、グルコース‐６‐リン酸トランスポーター（Ｇ６ＰＴ）タンパク質、グルコース‐６‐ホスファターゼ（Ｇ６Ｐａｓｅ）タンパク質、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）タンパク質、低密度リポタンパク質受容体アダプタータンパク質１（ＬＤＬＲＡＰ‐１タンパク質）、Ｎ‐アセチルグルタミン酸シンセターゼ（ＮＡＧＳ）タンパク質、カルバモイルリン酸シンセターゼ１（ＣＰＳ１）タンパク質、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）タンパク質、アルギニノコハク酸シンセターゼ（ＡＳＳ）タンパク質、アルギニノコハク酸リアーゼ（ＡＳＬ）タンパク質、アルギナーゼ（ＡＲＧ１）タンパク質、溶質キャリアファミリー２５タンパク質、ＵＤＰグルクロノシルトランスフェラーゼ１ファミリー、ポリペプチドＡ１（ＵＧＴ１Ａ１）タンパク質、フマリルアセト酢酸加水分解酵素（ＦＡＨ）、アラニングリオキシレートアミノトランスフェラーゼ（ＡＧＸＴ）タンパク質、グリオキシル酸レダクターゼ／ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ（ＧＲＨＰＲ）タンパク質、ＡＰＴａｓｅ  Ｃｕ（２＋）輸送ベータ（ＡＴＰ７Ｂ）タンパク質、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）タンパク質、リポタンパク質リアーゼ（ＬＰＬ）タンパク質から成る群から選択されるタンパク質をコードする遺伝子であり得る。
【００４９】
治療用遺伝子は、抗体をコードする遺伝子であり得る。すなわち、治療用遺伝子は、抗体によって疾患の原因に関与する特定の因子またはシグナル経路を阻害するタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子であり得る。
【００５０】
治療用遺伝子は、血液脳関門（ＢＢＢ）など、特定の組織に浸透できる特定のペプチド、または、治療用遺伝子の治療効果を改善可能な機能性ペプチドと融合され得る。
【００５１】
加えて、明細書は、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質を使用して、導入遺伝子が挿入された、人工的に改変された細胞、組織または臓器を提供する。
【００５２】
改変された細胞、組織または臓器は、ＣＲＩＳＰＲ‐Ｃａｓシステムを使用して、目的のゲノム遺伝子における標的配列に導入遺伝子を挿入することによって、目的のタンパク質が発現された臓器または組織である。人工的に改変された細胞、組織または臓器において、目的のタンパク質は、肝臓細胞における高発現分泌遺伝子位置に挿入されることによって、特定のレベル以上で持続的に高発現される。
【００５３】
ここで開示される開示の例示的な一実施形態において、高発現分泌遺伝子は、ＦＴＬ遺伝子、ＦＴＨ１遺伝子、ＡＣＴＢ遺伝子、ＨＰ遺伝子、ＡＰＯＣ３遺伝子、ＳＯＤ２遺伝子、ＯＲＭ１遺伝子、Ｆ９遺伝子から成る群から選択される少なくとも１つであり得る。導入遺伝子は高発現分泌遺伝子に人工的に挿入される。肝細胞は、導入遺伝子から発現される目的のタンパク質を含む。
【００５４】
一例において、高発現分泌遺伝子は、ＨＰ遺伝子またはＡＰＯＣ３遺伝子であり得る。
【００５５】
導入遺伝子は、高発現分泌遺伝子のエクソンまたはイントロンに含まれ得る。
【００５６】
導入遺伝子は、肝細胞ゲノムに元々存在するプロモーターによって発現される。
【００５７】
肝細胞は無制限に操作される座位（例えば、高発現分泌遺伝子座位）を含む肝臓幹細胞であり得る。本明細書の方法および組成物と共に使用できる特定の幹細胞の種類には、成人幹細胞、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）が含まれる。
【００５８】
ここで開示される開示の別の例示的な実施形態において、導入遺伝子を肝細胞ゲノムに人工的に挿入することによって目的のタンパク質を発現するように肝細胞を人工的に操作する方法として、当該方法は、肝細胞ゲノムに存在する高発現分泌遺伝子を操作するためのプログラム可能ヌクレアーゼ、および、導入遺伝子を含むドナー配列を肝細胞に導入する段階を含み、導入遺伝子は、肝細胞ゲノムに存在する高発現分泌遺伝子に挿入され、高発現分泌遺伝子は、ＦＴＬ、ＦＴＨ１、ＡＣＴＢ、ＨＰ、ＡＰＯＣ３、ＳＯＤ２、ＯＲＭ１、Ｆ９から選択される１または複数の遺伝子である。
【００５９】
ガイド核酸、エディタータンパク質およびドナーを肝細胞へ導入することは、リポソーム、プラスミド、ウイルスベクター、ナノ粒子またはタンパク質移行ドメイン（ＰＴＤ）融合タンパク質から選択される１または複数の手段によって実行され得る。
【００６０】
ガイド核酸、エディタータンパク質およびドナーは、核酸配列の形態で少なくとも１つのベクターにおいてそれぞれコードされ得る。
【００６１】
ベクターはウイルスベクターシステムであり得る。ウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクチニアウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスおよびレンチウイルスから成る群から選択される少なくとも１つであり得る。
【００６２】
また、プログラム可能ヌクレアーゼおよびドナーを肝細胞に導入することがｉｎ  ｖｉｖｏで実行される。
【００６３】
対象内送達法は、全身または局所適用であり得る。全身投与は静脈内投与であり得る。
【００６４】
また、プログラム可能ヌクレアーゼおよびドナーを肝細胞へ導入することはｅｘ  ｖｉｖｏで実行される。対象内送達法はエレクトロポレーションであり得る。
【００６５】
ここで開示される開示の更に別の例示的な実施形態において、特定の疾患を治療するために、特定のレベル以上で肝細胞において目的のタンパク質を持続的に発現するための組成物を投与する段階を含む、特定の疾患を治療する方法が提供される。
【００６６】
特定の疾患は、特定のタンパク質の欠乏または不存在によって引き起こされる疾患であり得る。
【００６７】
治療方法は、活性成分として、肝細胞ゲノムに人工的に挿入された導入遺伝子を発現するために遺伝子を操作するための組成物を含む組成物を治療対象に投与する段階を含む。
【００６８】
遺伝子を改変するための組成物は、ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）‐ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、または、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）から選択される少なくとも１つを含み得る。
【００６９】
例えば、血友病を治療する方法として、導入遺伝子Ｆ９を肝細胞におけるＨＰまたはＡＰＯＣ３遺伝子配列に挿入するために遺伝子を操作するための組成物を投与する段階を含む、血友病を治療する方法が開示される。
【００７０】
治療の対象は、ヒトおよびサルなどの霊長動物を含む哺乳動物、ならびに、マウスおよびラットなどの齧歯動物のうち、いずれか１つであり得る。
【００７１】
ここで開示される開示の更に別の例示的な実施形態において、特定の疾患に対する治療用途のすべての態様が提供される。
【００７２】
［発明の有利な効果］
ここで開示されるように、肝細胞において目的のタンパク質を発現するためのプラットフォーム、高いレベルで持続的に発現できる目的のタンパク質、および、身体機能を改善し遺伝性疾患を治療するための基本的な治療剤が提供され得る。
【００７３】
例えば、特定のタンパク質の欠乏または不存在によって引き起こされる遺伝性疾患は、本明細書において説明される組成物によって、欠乏または欠失したタンパク質を発現するために、治療用タンパク質を生成することによって、または、異なる特性（例えば、半減期の増加）を有する新しいタンパク質を提供することによって、防止または治療できる。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】高発現分泌遺伝子を選択するためのＲＮＡシーケンシングの結果を示すグラフである。
【００７５】
【図２】高発現分泌遺伝子の人工的操作によって形成される肝臓生体工場プラットフォームの図である。
【００７６】
【図３】ハプトグロビン（ＨＰ）を標的化するｇＲＮＡの活性を確認するためのＴ７Ｅ１アッセイの結果を示す。
【００７７】
【図４】Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑを使用してオフターゲット部位を確認するグラフの組である。
【００７８】
【図５】ヒト細胞株、すなわちＨＥＫ２９３細胞において、ＮＧＳを使用して、標的化されたディープシーケンシングを通してオフターゲット活性を確認するグラフの組である。
【００７９】
【図６】デュアルＡＡＶにおけるＣＲＩＳＰＲ‐ＳｐＣａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ‐ＣｊＣａｓ９、および、Ｆ９遺伝子のパッケージングを示す図である。
【００８０】
【図７】ｐＡＡＶ‐ＣＭＶ‐ＣｊＣａｓ９‐Ｕ６‐ｓｇＲＮＡおよびｐＡＡＶ‐ｈＦ９‐ドナーがトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞株のゲノムＤＮＡにおいてＦ９治療用遺伝子のノックインが生じることを確認する、サンガーシーケンシングによって取得されるｈＨＰ遺伝子へのＦ９遺伝子のＨＤＲ媒介ノックインを確認するためのプライマー設計を示す。
【００８１】
【図８】ホモロジーアームの左アームとｈＨＰ遺伝子との間のＦ９挿入（左グラフ）、および、ホモロジーアームの右アームとｈＨＰ遺伝子との間のＦ９挿入（右グラフ）を示すグラフの組である。
【００８２】
【図９】ＡＶ６‐ＥＦＳ‐ＳｐＣａｓ９（５ｘ１０１１μｇ）およびＡＡＶ６‐ｈＦ９‐ｄｏｎｏｒ‐ＡＰＯＣ３‐Ｓｐ（５ｘ１０１１μｇ）のデュアルＡＡＶがヒト初代培養肝細胞に導入されたときの、ゲノムＤＮＡを使用するオンターゲット活性（図９のＡ）、および、上清試料を使用してノックインによって取得されるｈＦ９の分泌量（図９のＢ）を示すグラフの組である。
【発明を実施するための形態】
【００８３】
特別の定めのない限り、本明細書において使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明の当業者によって一般に理解される意味と同一である。本明細書に記載されるものと同様または同一の方法および材料が本発明の実践または試験において使用され得るが、適切な方法および材料は下に記載される。本明細書において言及されるすべての公報、特許出願、特許、および、他の参考文献は、参照によって全体として引用される。加えて、物質、方法、例は、説明を目的とするものに過ぎず、これらに限定されることを意図するものではない。
【００８４】
ここで開示される開示は、肝臓において目的のタンパク質を発現するためのプラットフォームに関する。
【００８５】
より具体的には、ここで開示される開示は、ＣＲＩＳＰＲ‐Ｃａｓシステムを使用して高発現分泌遺伝子を人工的に操作することによって目的のタンパク質を発現するための組成物と、目的のタンパク質を発現するために人工的に操作された細胞、臓器または組織と、特定の遺伝性疾患を治療、防止または軽減する、または、身体機能を改善するための、組成物、細胞、臓器または組織の使用とを含む。
【００８６】
［肝臓生体工場プラットフォーム（ＬＢＰ）］
ここで開示される例示的な一実施形態は、「目的のタンパク質を発現するためのプラットフォーム」に関する。目的のタンパク質を発現するためのプラットフォームは、野性型ゲノムに導入遺伝子を人工的に挿入することによって、特定の臓器または組織において、大量の目的のタンパク質を持続的に生成（発現）できるシステムの総称であり、組成物、使用、および、方法の態様を含む。
【００８７】
加えて、プラットフォームは、生成（発現）される目的のタンパク質を細胞の外へ分泌するためのシステムを含む。したがって、生成された目的のタンパク質は、導入遺伝子が挿入された臓器または組織だけでなく、タンパク質が分泌された臓器または組織においても機能し得る。
【００８８】
例示的な一実施形態において、プラットフォームは、特定のレベル以上で、目的のタンパク質を十分に生成し得る。
【００８９】
別の例示的な実施形態において、プラットフォームは、生成された目的のタンパク質を細胞の外へ十分に分泌し得て、異なる臓器または組織においても作用できる。
【００９０】
本明細書において、目的のタンパク質を発現するためのプラットフォームを実現する特定の臓器または組織は、肝臓または肝臓組織である。
【００９１】
肝臓は、身体において発生するすべての出来事に関与する人体の化学工場と呼ばれる臓器であり、天然の種類の酵素を通して、栄養素の代謝、解毒、および、免疫機能を担う。特に、人体は、好適な機能に必要な様々な物質を生成および保存し、その後、肝静脈を通して、当該物質を全身に送達することができる。
【００９２】
例えば、大量の特定のタンパク質が、肝臓において特定の遺伝子を高発現することによって生成され得て、生成されたタンパク質を全身へ分泌することによって、対応するタンパク質が、必要な臓器へ提供され得る。
【００９３】
以降、肝臓生体工場プラットフォーム（以降、「ＬＢＰ」と呼ぶ）を説明する。
【００９４】
ここで開示される一態様において、ＬＢＰは、肝臓組織において目的のタンパク質を持続的に生成するためのシステムであり、当該システムは、生成されたタンパク質を細胞の外へ分泌することに直接的または間接的に関与するすべての物質、組成物、方法および使用を含む。
【００９５】
ＬＢＰは、肝細胞、例えば、肝細胞におけるゲノムを人工的に操作することによって、肝細胞において目的のタンパク質を生成するシステムを含む。
【００９６】
例えば、ＬＢＰは、肝細胞ゲノム配列の人工的改変を含む。
【００９７】
例示的な一実施形態において、ＬＢＰは、肝細胞ゲノムの特定の遺伝子の部分的配列の切断を含む。
【００９８】
別の例示的な実施形態において、ＬＢＰは、目的のタンパク質をコードする導入遺伝子を、肝細胞ゲノムの切断された配列に挿入することを含む。
【００９９】
ここで開示される開示において、ＬＢＰは、様々な種類の肝臓由来細胞を使用し得る。
【０１００】
例えば、ＬＢＰは、肝細胞、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）または異なる種類の幹細胞（胚性幹細胞、造血性幹細胞、または、間葉系幹細胞）を含み得るが、本発明はこれに限定されない。
【０１０１】
ＬＢＰは、肝臓において目的のタンパク質を高発現するために、肝細胞ゲノムにおける特定の領域を利用し得る。
【０１０２】
一例において、導入遺伝子が肝細胞のゲノムにおけるセーフハーバー部位に挿入され得る。
【０１０３】
「セーフハーバー部位」は、外来遺伝子が挿入されても、例えば癌などの深刻な副作用が無い、ゲノムにおける特定の領域であり、特定の領域に挿入された外来遺伝子は、高いレベルで恒久的かつ安全に発現できる。
【０１０４】
別の例において、導入遺伝子は、肝細胞のゲノムにおける遺伝子発現調節領域を使用可能な領域に挿入され得る。
【０１０５】
「遺伝子調節領域」とは、肝細胞ゲノムに存在する遺伝子発現の調節のために重要な役割を果たす領域であり、例えば、遺伝情報を含む配列に隣接するプロモーターおよび／または調節因子（エンハンサー、転写促進因子など）を含む領域の総称である。プロモーターおよび／または調節因子を使用して挿入される外来遺伝子は、高い効率で高発現され得る。
【０１０６】
ＬＢＰは、肝細胞においてゲノムの特定の部位を使用して、高いレベルで導入遺伝子を持続的に発現することにより、目的のタンパク質を大量に生成し得る。
【０１０７】
高発現分泌遺伝子
ここで開示される開示において、導入遺伝子が肝細胞ゲノムに挿入される特定の部位は、「高発現分泌遺伝子」の配列の一部に含まれ得る。明細書において、高発現分泌遺伝子はまた、肝細胞ゲノムにおける人工的操作を実現する標的遺伝子と称される。
【０１０８】
「高発現分泌遺伝子」は、肝細胞において持続的に高発現し、細胞の外へ発現産物を分泌し得る遺伝子を指す。
【０１０９】
例えば、高発現分泌遺伝子は、肝細胞のゲノムにおけるセーフハーバー部位のいずれか１つに含まれ得る。
【０１１０】
例えば、高発現分泌遺伝子は、肝細胞のゲノムにおいて持続的に遺伝子を高発現し得るプロモーターおよび調節因子を含み得る。
【０１１１】
高発現分泌遺伝子は、肝細胞のゲノムに存在する野性型遺伝子であり得る。
【０１１２】
「野性型」という用語は、天然において最も一般に示される遺伝子、または、正常として指定される対立遺伝子を意味する。例えば、野性型は、特定の疾患を示さない正常な状態の遺伝子の種類であり得る。
【０１１３】
加えて、高発現分泌遺伝子は、肝細胞のゲノムにおいて通常に機能しない遺伝子であり得る。
【０１１４】
ここで、高発現分泌遺伝子は、野性型と比較して、１または複数の特定のヌクレオチドが改変された遺伝子であり得る。例えば、改変は、１または複数のヌクレオチドの欠失、置換、および／または挿入を含む。改変された高発現分泌遺伝子は、全体的に、または、部分的に発現され得る、または、まったく発現されないことがあり得る。
【０１１５】
ここで開示される開示において、所望のタンパク質を発現可能な導入遺伝子は、高発現分泌遺伝子配列に組み込まれる。
【０１１６】
ここで、対応する高発現分泌遺伝子は、全体的に、または、部分的に発現され得る。すなわち、導入遺伝子および高発現分泌遺伝子は共に発現し得る。
【０１１７】
代替的に、対応する高発現分泌遺伝子は、肝細胞において発現されて血液内に分泌され得る。
【０１１８】
代替的に、対応する高発現分泌遺伝子は、まったく発現されないことがあり得る。
【０１１９】
高発現分泌遺伝子は、例えば、ＡＬＢ遺伝子、ＦＴＬ遺伝子、ＦＴＨ１遺伝子、ＡＣＴＢ遺伝子、ＨＰ遺伝子、ＡＰＯＣ３遺伝子、ＳＯＤ２遺伝子、ＯＲＭ１遺伝子、ＡＡＶＳ１遺伝子、Ｒｏｓａ遺伝子またはＨＰＲＴ遺伝子であり得る。別の例において、高発現分泌遺伝子は、ＩＤＵＡ遺伝子、ＩＤＳ遺伝子、ＧＬＡ遺伝子またはＧＢＡ遺伝子であり得る。
【０１２０】
例において、高発現分泌遺伝子はＨＰ遺伝子であり得る。
【０１２１】
ＨＰ遺伝子は、ハプトグロビンをコードする遺伝子を意味する。一例において、ＨＰ遺伝子は、ヒトＨＰをコードする遺伝子（例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００１１１９５７４、ＮＰ＿００１３０５０６７、ＮＰ＿００５１３４）またはマウスＨＰ（ＮＰ＿００１３１６８９４、ＮＰ＿０５９０６６）、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００１１２６１０２、ＮＭ＿００５１４３またはＮＭ＿００１３１８１３８によって発現されるＨＰ遺伝子などの遺伝子から成る群から選択される１または複数の遺伝子であり得るが、本発明はこれらに限定されない。
【０１２２】
別の実施形態において、高発現分泌遺伝子はＡＰＯＣ３遺伝子であり得る。
【０１２３】
アポリポタンパク質Ｃ３（ＡＰＯＣ３）遺伝子は、超低比重リポタンパク質（ＶＬＤＬ）のコンポーネントであるアポリポタンパク質Ｃ‐ＩＩＩをコードする遺伝子を意味する。ＡＰＯＣ３遺伝子は、ヒトＡＰＯＣ３をコードする遺伝子（例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００００３１）、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００００４０によって発現されるＡＰＯＣ３遺伝子などの遺伝子から成る群から選択される１または複数の遺伝子であり得るが、本発明はこれらに限定されない。
【０１２４】
ここで開示される開示の一例において、肝細胞ゲノムに人工的に挿入された導入遺伝子を発現するＬＢＰシステムが提供される。 導入遺伝子は、高発現分泌遺伝子に組み込まれる。
【０１２５】
高発現分泌遺伝子は、ＡＬＢ遺伝子、ＦＴＬ遺伝子、ＦＴＨ１遺伝子、ＡＣＴＢ遺伝子、ＨＰ遺伝子、ＡＰＯＣ３遺伝子、ＳＯＤ２遺伝子、ＯＲＭ１遺伝子およびＦ９遺伝子から成る群から選択される少なくとも１つであり得る。
【０１２６】
ＬＢＰシステムでは、導入遺伝子は、挿入前と比較して、より高発現される、または、導入遺伝子は、肝細胞において新しく発現される。
【０１２７】
［目的のタンパク質を発現するための組成物］
ここで開示される開示の例示的な一実施形態は、「目的のタンパク質を発現するためのプラットフォーム」を実現できる組成物に関する。組成物は、肝細胞ゲノムに人工的に挿入される導入遺伝子を発現するＬＢＰシステムを実現可能な組成物を含む。
【０１２８】
例示的な一実施形態において、高発現分泌遺伝子を人工的に操作するための組成物が提供される。
【０１２９】
高発現分泌遺伝子を人工的に操作するための組成物は、高発現分泌遺伝子における任意の領域を改変し得る。
【０１３０】
「人工的に操作された」という用語は、天然状態で生じるそのままの状態ではなく、人工的改変が適用された状態を意味する。例えば、遺伝子の一部のヌクレオチドは、欠失または置換され得て、遺伝子は、外来ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを挿入することによって改変され得る。
【０１３１】
高発現分泌遺伝子を人工的に操作するための組成物はプログラム可能ヌクレアーゼを含む。
【０１３２】
「プログラム可能ヌクレアーゼ」は、ゲノムを切断するために目的の染色体における特定の部位を認識するすべての種類のヌクレアーゼを含む。特に、プログラム可能ヌクレアーゼは、染色体上の特定の標的配列を認識するドメインであるｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ  （ＣＲＩＳＰＲ）‐ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）システム、植物病原性遺伝子に由来するｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ‐ｌｉｋｅ（ＴＡＬ）エフェクタードメインおよび切断ドメインが融合された転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ＲＮＡ‐ｇｕｉｄｅｄ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＲＧＥＮ）、Ｃｐｆ１、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼ、または、それらの組み合わせであり得るが、本発明はそれらに限定されない。
【０１３３】
プログラム可能ヌクレアーゼは好ましくはＣＲＩＳＰＲ‐Ｃａｓシステムであるが、本発明はこれに限定されない。
【０１３４】
［ＣＲＩＳＰＲ‐Ｃａｓシステム］
ここで開示される別の例示的な実施形態は、高発現分泌遺伝子を人工的に操作するためにＣＲＩＳＰＲ‐Ｃａｓシステムを使用することを含む組成物に関する。
【０１３５】
ＣＲＩＳＰＲ‐Ｃａｓシステムは、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質から成り得る。
【０１３６】
ここで開示される例示的な一実施形態において、高発現分泌遺伝子を操作するための組成物は、高発現分泌遺伝子を操作するためのガイド核酸を含み得る。
【０１３７】
「ガイド核酸」という用語は、標的核酸、遺伝子または染色体を認識してエディタータンパク質と相互作用できるヌクレオチド配列を意味する。ここで、ガイド核酸は、標的核酸、遺伝子または染色体における一部のヌクレオチドと相補結合を形成し得る。
【０１３８】
ガイド核酸は、ガイド核酸‐エディタータンパク質複合体を形成し、ガイド核酸‐エディター複合体を、標的核酸、遺伝子または染色体の標的領域に配置することを可能にするように機能し得る。
【０１３９】
ガイド核酸は、標的ＤＮＡ特異的ｇＲＮＡ、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡ、または、ＤＮＡ／ＲＮＡ混合物であり得る。
【０１４０】
ガイド核酸はｇＲＮＡであり得る。
【０１４１】
「ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）」はｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写され得て、特に、オリゴヌクレオチド二本鎖またはプラスミド鋳型から転写され得るが、本発明はこれに限定されない。
【０１４２】
ガイド核酸は１つの連続核酸配列であり得る。
【０１４３】
例えば、１つの連続する核酸配列は、（Ｎ）ｍであり得て、ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧ、または、Ａ、Ｕ、ＣまたはＧであり、ｍは１〜１５０の整数である。
【０１４４】
ガイド核酸は２つ以上の連続核酸配列であり得る。
【０１４５】
例えば、２つ以上の連続する核酸配列は、（Ｎ）ｍおよび（Ｎ）ｏであり得て、ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧ、または、Ａ、Ｕ、ＣまたはＧを表し得て、ｍおよびｏは、１〜１５０の整数であり、同一または互いに異なり得る。
【０１４６】
ガイド核酸は１または複数のドメインを含み得る。
【０１４７】
ドメインは、ガイドドメイン、第１相補ドメイン、リンカードメイン、第２相補ドメイン、近位ドメイン、または、尾部ドメインなどの機能ドメインであり得るが、本発明はこれらに限定されない。
【０１４８】
ここで、１つのガイド核酸は２以上の機能ドメインを有し得る。ここで、２以上の機能ドメインは、互いに異なり得る。代替的に、１つのガイド核酸に含まれる２以上の機能ドメインは同一であり得る。例えば、１つのガイド核酸は、２つ以上の近位ドメインを有し得て、別の例として、１つのガイド核酸は２つ以上の尾部ドメインを有し得る。しかしながら、「１つのガイド核酸に含まれる機能ドメインが同一である」という表現は、２つの機能ドメインの配列が同一であることを意味するものではなく、配列が異なっていても、これらのドメインが機能的に同一の機能を実行するとき、それらは同一のドメインであると見なすことができる。
【０１４９】
ドメインは以下で説明される。
【０１５０】
［ｉ）ガイドドメイン］
「ガイドドメイン」という用語は、標的遺伝子または核酸上の標的配列と相補結合を形成可能な相補的ガイド配列を有するドメインであり、標的遺伝子または核酸と特異的に相互作用するように機能する。例えば、ガイドドメインは、標的遺伝子または核酸の特定のヌクレオチド配列を有する場所にガイド核酸‐エディタータンパク質複合体を誘導する機能を実行し得る。
【０１５１】
ガイドドメインは、１０〜３５塩基の配列であり得る。例において、ガイドドメインは、１０〜３５、１５〜３５、２０〜３５、２５〜３５、３０〜３５塩基の配列であり得る。
【０１５２】
別の例において、ガイドドメインは、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５塩基の配列であり得る。
【０１５３】
ガイドドメインはガイド配列を有し得る。
【０１５４】
ガイド配列は、例えば、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上の相補性または完全相補性を有する、標的遺伝子または核酸上の標的配列と相補的な核酸配列であり得る。
【０１５５】
ガイド配列は、１０〜２５塩基配列であり得る。
【０１５６】
例において、ガイド配列は、１０〜２５、１５〜２５、２０〜２５、２０〜５０、２５〜５０、３０〜５０、３５〜５０、４０〜５０、または４５〜５０塩基配列であり得る。
【０１５７】
別の例において、ガイド配列は、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５塩基配列であり得る。
【０１５８】
加えて、ガイドドメインは、追加の塩基配列を含み得る。
【０１５９】
追加の塩基配列は、ガイドドメインの機能を改善または低減するために利用され得る。
【０１６０】
追加の塩基配列は、ガイド配列の機能を改善または低減するために利用され得る。
【０１６１】
追加の塩基配列は、１〜１０塩基配列であり得る。
【０１６２】
一例において、追加の塩基配列は、２〜１０、４〜１０、６〜１０、８〜１０塩基配列であり得る。
【０１６３】
別の例において、追加の塩基配列は、１〜３、３〜６、７〜１０塩基配列であり得る。
【０１６４】
具体例として、追加の塩基配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０塩基配列であり得る。
【０１６５】
一例において、追加的ヌクレオチド配列は、１塩基配列Ｇ（グアニン）または２塩基配列ＧＧであり得る。
【０１６６】
追加の塩基配列は、ガイド配列の５'末端に位置し得る。
【０１６７】
追加の塩基配列は、ガイド配列の３'末端に位置し得る。
【０１６８】
［ＩＩ）第１相補ドメイン］
「第１相補ドメイン」という用語は、第２相補ドメインと相補的な核酸配列を含む核酸配列であり、十分な相補性を有するので、第２相補ドメインと二本鎖を形成する。一例において、第１相補ドメインは、例えば、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上の相補性または完全相補性を有する第２相補ドメインと相補的な核酸配列であり得る。第１相補ドメインは、第２相補ドメインとの相補結合によって二本鎖を形成し得る。ここで、形成された二本鎖は、エディタータンパク質の一部のアミノ酸との相互作用によって、ガイド核酸‐エディタータンパク質複合体を形成するように機能し得る。
【０１６９】
第１相補ドメインは、５〜３５塩基配列であり得る。
【０１７０】
例において、第１相補ドメインは、５〜３５、１０〜３５、１５〜３５、２０〜３５、２５〜３５または３０〜３５塩基配列であり得る。
【０１７１】
別の例において、第１相補ドメインは、１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０または３０〜３５塩基配列であり得る。
【０１７２】
［ｉｉｉ）リンカードメイン］
「リンカードメイン」という用語は、２つ以上の同一または異なるドメインである２つ以上のドメインを接続する核酸配列である。リンカードメインは、共有結合または非共有結合によって２つ以上のドメインに接続され得るか、または、共有結合または非共有結合によって２つ以上のドメインを接続し得る。
【０１７３】
リンカードメインは１〜３０の塩基配列であり得る。
【０１７４】
一例において、リンカードメインは、１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５または２５〜３０塩基配列であり得る。
【０１７５】
別の例において、リンカードメインは、１〜３０、５〜３０、１０〜３０、１５〜３０、２０〜３０または２５〜３０塩基配列であり得る。
【０１７６】
［ｉｖ）第２相補ドメイン］
「第２相補ドメイン」という用語は、第１相補ドメインと相補的な核酸配列を含む核酸配列のことであり、十分な相補性を有するので、第１相補ドメインと二本鎖を形成する。
【０１７７】
一例において、第２相補ドメインは、例えば、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上の相補性または完全相補性を有する第１相補ドメインに相補的な核酸配列であり得る。
【０１７８】
第２相補ドメインは、第１相補ドメインとの相補結合によって二本鎖を形成し得る。ここで、形成された二本鎖は、エディタータンパク質の一部のアミノ酸との相互作用によって、ガイド核酸‐エディタータンパク質複合体を形成するように機能し得る。
【０１７９】
第２相補ドメインは第１相補ドメインと相補的な塩基配列、および、第１相補ドメインと相補性を有しない塩基配列、例えば、第１相補ドメインと二本鎖を形成しない塩基配列を有し得るので、第１相補ドメインより長い塩基配列を有し得る。
【０１８０】
第２相補ドメインは５〜３５塩基配列を有し得る。
【０１８１】
例において、第２相補ドメインは、１〜３５、５〜３５、１０〜３５、１５〜３５、２０〜３５、２５〜３５または３０〜３５塩基配列であり得る。
【０１８２】
別の例において、第２相補ドメインは、１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０または３０〜３５塩基配列であり得る。
【０１８３】
［ｖ）近位ドメイン］
「近位ドメイン」という用語は、第２相補ドメインに隣接して配置される核酸配列である。
【０１８４】
近位ドメインは、その中に相補的塩基配列を有し得て、相補的塩基配列に起因して二本鎖に形成され得る。
【０１８５】
近位ドメインは、１〜２０塩基配列であり得る。
【０１８６】
一例において、近位ドメインは、１〜２０、５〜２０、１０〜２０、または、１５〜２０塩基配列であり得る。
【０１８７】
別の例において、近位ドメインは、１〜５、５〜１０、１０〜１５、または１５〜２０塩基配列であり得る。
【０１８８】
［ｖｉ）尾部ドメイン］
「尾部ドメイン」という用語は、ガイド核酸の両端のうち１または複数の末端に位置する核酸配列である。
【０１８９】
尾部ドメインは、その中に相補的塩基配列を有し得て、相補的塩基配列に起因して、二本鎖に形成され得る。
【０１９０】
尾部ドメインは、１〜５０塩基配列であり得る。
【０１９１】
例において、尾部ドメインは、５〜５０、１０〜５０、１５〜５０、２０〜５０、２５〜５０、３０〜５０、３５〜５０、４０〜５０、または、４５〜５０塩基配列であり得る。
【０１９２】
別の例において、尾部ドメインは、１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、または、４５〜５０塩基配列であり得る。
【０１９３】
一方、ドメインに含まれる核酸配列、すなわち、ガイドドメイン、第１相補ドメイン、リンカードメイン、第２相補ドメイン、近位ドメインおよび尾部ドメインの一部または全部は、選択的に、または、追加的に化学修飾を含み得る。
【０１９４】
化学修飾は、これらに限定されないが、メチル化、アセチル化、リン酸化、ホスホロチオエート結合、架橋型核酸（ＬＮＡ）、２'‐Ｏ‐メチル３'ホスホロチオエート（ＭＳ）、または、２'‐Ｏ‐メチル３'ｔｈｉｏＰＡＣＥ（ＭＳＰ）であり得る。
【０１９５】
ガイド核酸は１または複数のドメインを含む。
【０１９６】
ガイド核酸はガイドドメインを含み得る。
【０１９７】
ガイド核酸は、第１相補ドメインを含み得る。
【０１９８】
ガイド核酸はリンカードメインを含み得る。
【０１９９】
ガイド核酸は第２相補ドメインを含み得る。
【０２００】
ガイド核酸は近位ドメインを含み得る。
【０２０１】
ガイド核酸は尾部ドメインを含み得る。
【０２０２】
ここで、１、２、３、４、５、６以上のドメインがあり得る。
【０２０３】
ガイド核酸は、１、２、３、４、５、６またはより多くのガイドドメインを含み得る。
【０２０４】
ガイド核酸は、１、２、３、４、５、６またはより多くの第１相補ドメインを含み得る。
【０２０５】
ガイド核酸は、１、２、３、４、５、６またはより多くのリンカードメインを含み得る。
【０２０６】
ガイド核酸は、１、２、３、４、５、６またはより多くの第２相補ドメインを含み得る。
【０２０７】
ガイド核酸は、１、２、３、４、５、６またはより多くの近位ドメインを含み得る。
【０２０８】
ガイド核酸は、１、２、３、４、５、６またはより多くの尾部ドメインを含み得る。
【０２０９】
ここで、ガイド核酸において、１つの種類のドメインが重複し得る。
【０２１０】
ガイド核酸は、重複を有する、または、有しないいくつかのドメインを含み得る。
【０２１１】
ガイド核酸は、同一の種類のドメインを含み得る。ここで、同一の種類のドメインは、同一の核酸配列または異なる核酸配列を有し得る。
【０２１２】
ガイド核酸は２種類のドメインを含み得る。ここで、２つの異なる種類のドメインは、異なる核酸配列または同一の核酸配列を有し得る。
【０２１３】
ガイド核酸は、３種類のドメインを含み得る。ここで、３つの異なる種類のドメインは、異なる核酸配列または同一の核酸配列を有し得る。
【０２１４】
ガイド核酸は、４種類のドメインを含み得る。ここで、４つの異なる種類のドメインは、異なる核酸配列または同一の核酸配列を有し得る。
【０２１５】
ガイド核酸は、５種類のドメインを含み得る。ここで、５つの異なる種類のドメインは、異なる核酸配列または同一の核酸配列を有し得る。
【０２１６】
ガイド核酸は、６種類のドメインを含み得る。ここで、６つの異なる種類のドメインは、異なる核酸配列または同一の核酸配列を有し得る。
【０２１７】
例えば、ガイド核酸は、［ガイドドメイン］‐［第１相補ドメイン］‐［リンカードメイン］‐［第２相補ドメイン］‐［リンカードメイン］‐［ガイドドメイン］‐［第１相補ドメイン］‐［リンカードメイン］‐［第２相補ドメイン］から成り得る。ここで、２つのガイドドメインは、異なる、または、同一の標的に対するガイド配列を含み得て、２つの第１相補ドメインおよび２つの第２相補ドメインは、同一または異なるヌクレオチド配列を有し得る。ガイドドメインが、異なる標的に対するガイド配列を含むとき、ガイド核酸は、２つの異なる標的に特異的に結合し得て、ここでは、特異的結合は、同時または順次に実行され得る。加えて、リンカードメインは、特定の酵素によって切断され得て、ガイド核酸は、特定の酵素の存在下で、２または３つの部分に分割され得る。
【０２１８】
ここで開示される例示的な一実施形態において、高発現分泌遺伝子を操作するためのガイド核酸は、高発現分泌遺伝子を操作するためのｇＲＮＡであり得る。
【０２１９】
ｇＲＮＡはｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写され得て、特に、オリゴヌクレオチド二本鎖またはプラスミド鋳型から転写され得るが、本発明はこれに限定されない。
【０２２０】
ここで使用される「ｇＲＮＡ」という用語は、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成してＣａｓタンパク質を標的ＤＮＡへ誘導できる標的ＤＮＡ特異的ＲＮＡを指す。
【０２２１】
ｇＲＮＡは複数のドメインを含み得る。各ドメインは、ｇＲＮＡの３次元形態または活性型の鎖内または鎖間の相互作用を有し得る。
【０２２２】
例示的な一実施形態において、一本鎖ｇＲＮＡは、５'から３'方向にガイドドメイン、例えば、標的遺伝子または核酸と相補結合を形成できるガイド配列を有するドメイン；第１相補ドメイン；リンカードメイン：第１相補ドメインの配列と相補的な配列を有するので第１相補ドメインと二本鎖核酸を形成可能なドメインである第２相補ドメイン；近位ドメイン；および選択的に尾部ドメインを含み得る。
【０２２３】
別の例示的な実施形態において、デュアルｇＲＮＡは、５'から３'の方向にガイドドメイン、例えば、標的遺伝子または核酸と相補結合を形成できるガイド配列を有するドメインおよび第１相補ドメインを含む第１鎖、ならびに、第１相補ドメイン、近位ドメイン、および、選択的に尾部ドメインの配列に相補的な配列を有する第１相補ドメインと二本鎖核酸を形成可能なドメインである第２相補ドメインを含む第２鎖を含み得る。
【０２２４】
ここで、第１鎖はｃｒＲＮＡと称され得て、第２鎖はｔｒａｃｒＲＮＡと称され得る。ｃｒＲＮＡは、ガイドドメインおよび第１相補ドメインを含み得て、ｔｒａｃｒＲＮＡは、第２相補ドメイン、近位ドメイン、選択的に尾部ドメインを含み得る。
【０２２５】
更に、別の例示的な実施形態において、一本鎖ｇＲＮＡは、５'から３'方向においてガイドドメイン、例えば、標的遺伝子または核酸との相補結合を形成できるガイド配列を有するドメイン；第１相補ドメイン；ならびに、第１相補ドメインの配列に相補的な配列を有するので第１相補ドメインと二本鎖核酸を形成可能なドメインである第２相補ドメインを含み得る。
【０２２６】
ここで、第１相補ドメインは、天然に発生する第１相補ドメインとの相同性を有し得る、または、天然に発生する第１相補ドメインに由来し得る。加えて、第１相補ドメインは、天然に存在する種に応じて、第１相補ドメインのヌクレオチド配列の差異を有し得て、天然に存在する種を含む第１相補ドメインに由来し得る、または、天然に存在する種を含む第１相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有し得る。
【０２２７】
例示的な一実施形態において、第１相補ドメインは、ストレプトコッカス・ピオゲネス、カンピロバクター・ジェジュニ、ストレプトコッカス・サーモフィラス、ストレプトコッカス・アウレウスまたはナイセリア・メニンジティディスの第１相補ドメイン、または、それらに由来する第１相補ドメインとの部分的、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性、または、完全相同性を有し得る。
【０２２８】
例えば、第１相補ドメインがストレプトコッカス・ピオゲネスの第１相補ドメイン、または、それに由来する第１相補ドメインであるとき、第１相補ドメインは、５'‐ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ‐３'であり得る、または、５'‐ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ‐３'との部分的、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性、もしくは、完全相同性を有する塩基配列であり得る。ここで、第１相補ドメインは更に、（Ｘ）ｎを含み得て、５'‐ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ（Ｘ）ｎ‐３'となる。Ｘは、塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧから成る群から選択され得て、ｎは、塩基の数を表し得て、５〜１５の整数である。ここで、（Ｘ）ｎは、同一の塩基のｎ回反復、または、混在したｎ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧであり得る。別の実施形態において、第１相補ドメインがカンピロバクター・ジェジュニの第１相補ドメイン、または、それに由来する第１相補ドメインであるとき、第１相補ドメインは、５'‐ＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＵＵＵＵＵＡＡＡＵＵＵＣＵＵ‐３'であり得る、または、５'‐ＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＵＵＵＵＵＡＡＡＵＵＵＣＵＵ‐３'との部分的、すなわち、少なくとも５０％以上、または、完全相同性を有する塩基配列であり得る。ここで、第１相補ドメインは更に、（Ｘ）ｎを含み得て、５'‐ＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＵＵＵＵＵＡＡＡＵＵＵＣＵＵ（Ｘ）ｎ‐３'となる。Ｘは、塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧから成る群から選択され得て、ｎは、塩基の数を表し得て、５〜１５の整数である。ここで、（Ｘ）ｎは、同一の塩基のｎ回反復、または、混在したｎ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧを表し得る。
【０２２９】
別の実施形態において、第１相補ドメインは、パルクバクテリア・バクテリウム（ＧＷＣ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７）、ラクノスピラバクテリウム（ＭＣ２０１７）、ブチリビブリオ・プロテオクラスチクス、ペレグリニバクテリア・バクテリウム（ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ＿３３＿１０）、アシダミノコッカス属（ＢＶ３Ｌ６）、ポルフィロモナス・マカカエ、ラクノスピラバクテリウム（ＮＤ２００６）、ポルフィロモナス・クレビオリカニ、プレボテラ・ディシエンス、モラクセラ・ボーボクリ（２３７）、スミセラ属（ＳＣ＿ＫＯ８Ｄ１７）、レプトスピラ・イナダイ、ラクノスピラバクテリウム（ＭＡ２０２０）、フランシセラノビサイダ（Ｕ１１２）、カンディダツス・メタノプラズマ・テルミタム、もしくは、ユウバクテリウム・エリゲンスの第１相補ドメイン、または、それに由来する第１相補ドメインと部分的、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性、または、完全相同性を有し得る。例えば、第１相補ドメインがパルクバクテリア・バクテリウムの第１相補ドメイン、または、それに由来する第１相補ドメインであるとき、第１相補ドメインは、５'‐ＵＵＵＧＵＡＧＡＵ‐３'であり得る、または、５'‐ＵＵＵＧＵＡＧＡＵ‐３'と部分的な、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。ここで、第１相補ドメインは更に、（Ｘ）ｎを含み得て、５'‐（Ｘ）ｎＵＵＵＧＵＡＧＡＵ‐３'となる。Ｘは、塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧから成る群から選択され得て、ｎは、塩基の数を表し得て、１〜５の整数である。ここで、（Ｘ）ｎは、同一の塩基のｎ回反復、または、混在したｎ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧを表し得る。
【０２３０】
ここで、リンカードメインは、第１相補ドメインを第２相補ドメインに連結するように機能するヌクレオチド配列であり得る。
【０２３１】
リンカードメインは、第１相補ドメインおよび第２相補ドメインの各々と共有結合または非共有結合し得る。
【０２３２】
リンカードメインは、共有結合または非共有結合で第１相補ドメインを第２相補ドメインに連結し得る。
【０２３３】
リンカードメインは、一本鎖ｇＲＮＡ分子における使用について好適であり、デュアルｇＲＮＡの第１鎖および第２鎖との共有または非共有結合を形成し得る、または、第１鎖と第２鎖との間の共有または非共有連結によって、一本鎖ｇＲＮＡを生成するために使用され得る。
【０２３４】
リンカードメインは、デュアルｇＲＮＡのｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡと共有または非共有結合を形成し得る、または、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの間の共有または非共有連結によって一本鎖ｇＲＮＡを生成するために使用され得る。
【０２３５】
ここで、第２相補ドメインは、天然に発生する第２相補ドメインとの相同性を有し得る、または、天然に発生する第２相補ドメインに由来し得る。加えて、第２相補ドメインは、天然に存在する種に応じて、第２相補ドメインのヌクレオチド配列の差異を有し得る、または、天然に存在する種に含まれる第２相補ドメインに由来し得る、または、天然に存在する種に含まれる第２相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有し得る。
【０２３６】
例示的な実施形態において、第２相補ドメインは、ストレプトコッカス・ピオゲネス、カンピロバクター・ジェジュニ、ストレプトコッカス・サーモフィラス、ストレプトコッカス・アウレウスまたはナイセリア・メニンジティディスとの部分的、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性、または、完全相同性を有する第２相補ドメイン、または、それに由来する第２相補ドメインを有し得る。例えば、第２相補ドメインがストレプトコッカス・ピオゲネスの第２相補ドメイン、または、それに由来する第２相補ドメインであるとき、第２相補ドメインは、５'‐ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ‐３'であり得る、または、５'‐ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ‐３'と部分的な、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る（第１相補ドメインと共に二本鎖を形成する塩基配列を下線で示す）。ここで、第２相補ドメインは更に、（Ｘ）ｎおよび／または（Ｘ）ｍを含み得て、５'‐（Ｘ）ｎ  ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ（Ｘ）ｍ‐３'となる。Ｘは、塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧから成る群から選択され得て、ｎおよびｍの各々は、塩基の数を表し得て、ｎは１〜１５の整数であり得て、ｍは、１〜６の整数であり得る。ここで、（Ｘ）ｎは、同一の塩基のｎ回反復、または、混在したｎ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧを表し得る。加えて、（Ｘ）ｍは、同一の塩基のｍ回反復、または、混在したｍ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧを表し得る。
【０２３７】
別の例において、第２相補ドメインがカンピロバクター・ジェジュニの第２相補ドメイン、または、それに由来する第２相補ドメインであるとき、第２相補ドメインは、５'‐ＡＡＧＡＡＡＵＵＵＡＡＡＡＡＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＵ‐３'であり得る、または、５'‐ＡＡＧＡＡＡＵＵＵＡＡＡＡＡＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＵ‐３'と部分的、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る（第１相補ドメインと共に二本鎖を形成する塩基配列を下線で示す）。ここで、第２相補ドメインは更に、（Ｘ）ｎおよび／または（Ｘ）ｍを含み得て、５'‐（Ｘ）ｎＡＡＧＡＡＡＵＵＵＡＡＡＡＡＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＵ（Ｘ）ｍ‐３'となる。Ｘは、塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧから成る群から選択され得て、ｎおよびｍの各々は、塩基の数を表し得て、ｎは１〜１５の整数であり得て、ｍは１〜６の整数であり得る。ここで、（Ｘ）ｎは、同一の塩基のｎ回反復、または、混在したｎ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧを表し得る。加えて、（Ｘ）ｍは、同一の塩基のｍ回反復、または、混在したｍ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧを表し得る。
【０２３８】
別の実施形態において、第２相補ドメインは、パルクバクテリア・バクテリウム（ＧＷＣ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７）、ラクノスピラバクテリウム（ＭＣ２０１７）、ブチリビブリオ・プロテオクラスチクス、ペレグリニバクテリア・バクテリウム（ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ＿３３＿１０）、アシダミノコッカス属（ＢＶ３Ｌ６）、ポルフィロモナス・マカカエ、ラクノスピラバクテリウム（ＮＤ２００６）、ポルフィロモナス・クレビオリカニ、プレボテラ・ディシエンス、モラクセラ・ボーボクリ（２３７）、スミセラ属（ＳＣ＿ＫＯ８Ｄ１７）、レプトスピラ・イナダイ、ラクノスピラバクテリウム（ＭＡ２０２０）、フランシセラノビサイダ（Ｕ１１２）、カンディダツス・メタノプラズマ・テルミタム、もしくは、ユウバクテリウム・エリゲンスの第１相補ドメイン、または、それに由来する第２相補ドメインと部分的、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性、または、完全相同性を有し得る。
【０２３９】
例えば、第２相補ドメインがパルクバクテリア・バクテリウムの第２相補ドメイン、または、それに由来する第２相補ドメインであるとき、第２相補ドメインは、５'‐ＡＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵ‐３'であり得る、または、５'‐ＡＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵ‐３'と部分的、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る（第１相補ドメインと共に二本鎖を形成する塩基配列を下線で示す）。ここで、第２相補ドメインは更に、（Ｘ）ｎおよび／または（Ｘ）ｍを含み得て、５'‐（Ｘ）ｎ  ＡＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵ（Ｘ）ｍ‐３'となる。Ｘは、塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧから成る群から選択され得て、ｎおよびｍの各々は、塩基の数を表し得て、ｎは１〜１０の整数であり得て、ｍは１〜６の整数であり得る。ここで、（Ｘ）ｎは、同一の塩基のｎ回反復、または、混在したｎ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧを表し得る。加えて、（Ｘ）ｍは、同一の塩基のｍ回反復、または、混在したｍ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧを表し得る。
【０２４０】
ここで、第１相補ドメインおよび第２相補ドメインは相補的に結合し得る。
【０２４１】
第１相補ドメインおよび第２相補ドメインは、相補的結合によって二本鎖を形成し得る。
【０２４２】
形成された二本鎖は、ＣＲＩＳＰＲ酵素と相互作用し得る。
【０２４３】
選択的に、第１相補ドメインは、第２鎖の第２相補ドメインと相補結合を形成しない追加的ヌクレオチド配列を含み得る。
【０２４４】
ここで、追加的ヌクレオチド配列は、１〜１５ヌクレオチドの配列であり得る。例えば、追加的ヌクレオチド配列は、１〜５ヌクレオチド、５〜１０ヌクレオチド、または、１０〜１５ヌクレオチドの配列であり得る。
【０２４５】
ここで、近位ドメインは、第２相補ドメインの３'末端方向に位置し得る。
【０２４６】
加えて、近位ドメインは、天然近位ドメインとの相同性を有し得る、または、天然近位ドメインに由来し得る。加えて、近位ドメインは、天然に存在する種に従って、塩基配列において差異を有し得て、天然に存在する種に含まれる近位ドメインに由来し得て、または、天然に存在する種に含まれる近位ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有し得る。
【０２４７】
例示的な実施形態において、近位ドメインは、ストレプトコッカス・ピオゲネス、カンピロバクター・ジェジュニ、ストレプトコッカス・サーモフィラス、ストレプトコッカス・アウレウスまたはナイセリア・メニンジティディスの近位ドメイン、または、それらに由来する近位ドメインとの部分的、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性、または、完全相同性を有し得る。
【０２４８】
例えば、近位ドメインがストレプトコッカス・ピオゲネスの近位ドメイン、または、それに由来する近位ドメインであるとき、近位ドメインは、５'‐ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ‐３'であり得る、または、５'‐ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ‐３'との部分的、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。ここで、近位ドメインは更に、（Ｘ）ｎを含み得て、５'‐ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ（Ｘ）ｎ‐３'となる。Ｘは、塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧから成る群から選択され得て、ｎは塩基の数を表し得て、１〜１５の整数である。ここで、（Ｘ）ｎは、同一の塩基のｎ回反復、または、混在したｎ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧを表し得る。
【０２４９】
更なる別の例において、近位ドメインがカンピロバクター・ジェジュニの近位ドメイン、または、それに由来する近位ドメインであるとき、近位ドメインは、５'‐ＡＡＡＧＡＧＵＵＵＧＣ‐３'であり得る、または、５'‐ＡＡＡＧＡＧＵＵＵＧＣ‐３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。ここで、近位ドメインは更に、（Ｘ）ｎを含み得て、５'‐ＡＡＡＧＡＧＵＵＵＧＣ（Ｘ）ｎ‐３'となる。Ｘは、塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧから成る群から選択され得て、ｎは、塩基の数を表し得て、１〜４０の整数である。ここで、（Ｘ）ｎは、同一の塩基のｎ回反復、または、混在したｎ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧを表し得る。
【０２５０】
ここで、尾部ドメインは、一本鎖ｇＲＮＡの３'末端、または、デュアルｇＲＮＡの第１もしくは第２鎖に選択的に追加され得る。
【０２５１】
加えて、尾部ドメインは、天然尾部ドメインと相同性を有し得る、または、天然尾部ドメインに由来し得る。加えて、尾部ドメインは、天然に存在する種に応じて、塩基配列において差異を有し得て、天然に存在する種に含まれる尾部ドメインに由来し得て、または、天然に存在する種に含まれる尾部ドメインと部分的相同性または完全相同性を有し得る。例示的な一実施形態において、尾部ドメインは、ストレプトコッカス・ピオゲネス、カンピロバクター・ジェジュニ、ストレプトコッカス・サーモフィラス、ストレプトコッカス・アウレウスまたはナイセリア・メニンジティディスの尾部ドメイン、または、それらに由来する尾部ドメインと部分的、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性、または、完全相同性を有し得る。例えば、尾部ドメインが、ストレプトコッカス・ピオゲネスの尾部ドメイン、または、それに由来する尾部ドメインであるとき、尾部ドメインは、５'‐ＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ‐３'であり得る、または、５'‐ＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ‐３'と部分的、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。ここで、尾部ドメインは更に、（Ｘ）ｎを含み得て、５'‐ＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（Ｘ）ｎ‐３'となる。Ｘは、塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧから成る群から選択され得て、ｎは塩基の数を表し得て、１〜１５の整数である。ここで、（Ｘ）ｎは、同一の塩基のｎ回反復、または、Ａ、Ｔ、ＵおよびＧなどの混在したｎ個の塩基を表し得る。別の例において、尾部ドメインがカンピロバクター・ジェジュニの尾部ドメイン、または、それに由来する尾部ドメインであるとき、尾部ドメインは、５'‐ＧＧＧＡＣＵＣＵＧＣＧＧＧＧＵＵＡＣＡＡＵＣＣＣＣＵＡＡＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵ‐３'であり得る、または、５'‐ＧＧＧＡＣＵＣＵＧＣＧＧＧＧＵＵＡＣＡＡＵＣＣＣＣＵＡＡＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵ‐３'と部分的、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。ここで、尾部ドメインは更に、（Ｘ）ｎを含み得て、５'‐ＧＧＧＡＣＵＣＵＧＣＧＧＧＧＵＵＡＣＡＡＵＣＣＣＣＵＡＡＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵ（Ｘ）ｎ‐３'となる。Ｘは、塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧから成る群から選択され得て、ｎは塩基の数を表し得て、１〜１５の整数である。ここで、（Ｘ）ｎは、同一の塩基のｎ回反復、または、混在したｎ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧを表し得る。別の実施形態において、尾部ドメインは、３'末端において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ転写法に関与する１〜１０塩基配列を含み得る。
【０２５２】
例えば、ｇＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写においてＴ７プロモーターが使用されるとき、尾部ドメインは、ＤＮＡ鋳型の３'末端に存在する任意の塩基配列であり得る。加えて、Ｕ６プロモーターがｉｎ  ｖｉｖｏ転写において使用されるとき、尾部ドメインはＵＵＵＵＵＵであり得て、Ｈ１プロモーターが転写において使用されるとき、尾部ドメインはＵＵＵＵであり得て、ｐｏｌ‐ＩＩＩプロモーターが使用されるとき、尾部ドメインはいくつかのウラシル塩基または代替的な塩基を含み得る。ｇＲＮＡは、上記の複数のドメインを含み得て、したがって、ヌクレオチド配列の長さは、ｇＲＮＡに含まれるドメインに従って調節され得て、各ドメインに起因して、ｇＲＮＡの３次元構造または活性型の鎖において、または、これらの鎖の間で相互作用が生じ得る。
【０２５３】
ｇＲＮＡは、一本鎖ｇＲＮＡ（単一のＲＮＡ分子）、または、デュアルｇＲＮＡ（１つより多くの、一般的には２つの別個のＲＮＡ分子を含む）と称され得る。
【０２５４】
［デュアルｇＲＮＡ］
デュアルｇＲＮＡは、第１鎖および第２鎖から成る。
【０２５５】
ここで、第１鎖は、５'‐［ガイドドメイン］‐［第１相補ドメイン］‐３'から成り得て、第２鎖は、５'‐［第２相補ドメイン］‐［近位ドメイン］‐３'、または、５'‐［第２相補ドメイン］‐［近位ドメイン］‐［尾部ドメイン］‐３'から成り得る。
【０２５６】
ここで、第１鎖はｃｒＲＮＡと称され得て、第２鎖はｔｒａｃｒＲＮＡと称され得る。
【０２５７】
加えて、第１鎖および第２鎖は任意で、追加の塩基配列を含み得る。
【０２５８】
例示的な一実施形態において、第１鎖は、５'‐（Ｎｔａｒｇｅｔ）‐（Ｑ）ｍ‐３'または５'‐（Ｘ）ａ‐（Ｎｔａｒｇｅｔ）‐（Ｘ）ｂ‐（Ｑ）ｍ‐（Ｘ）ｃ‐３'であり得る。
【０２５９】
ここで、Ｎｔａｒｇｅｔは、標的遺伝子または核酸上の標的配列との相補結合を形成可能な塩基配列であり、標的遺伝子または核酸上の標的配列に従って変化し得る塩基配列領域である。ここで、（Ｑ）ｍは、第２鎖の第２相補ドメインとの相補結合を形成可能な第１相補ドメインを含む塩基配列である。（Ｑ）ｍは、天然に存在する種の第１相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有する配列であり得て、第１相補ドメインの塩基配列は、由来の種に従って変化し得る。Ｑは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ｍは塩基の数であり得て、５〜３５の整数である。例えば、第１相補ドメインが、ストレプトコッカス・ピオゲネスの第１相補ドメイン、または、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来の第１相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｑ）ｍは、５'‐ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ‐３'であり得る、または、５'‐ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ‐３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。別の例において、第１相補ドメインが、カンピロバクター・ジェジュニの第１相補ドメイン、または、カンピロバクター・ジェジュニ由来の第１相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｑ）ｍは、５'‐ＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＵＵＵＵＵＡＡＡＵＵＵＣＵＵ‐３'であり得る、または、５'‐ＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＵＵＵＵＵＡＡＡＵＵＵＣＵＵ‐３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【０２６０】
更に別の例において、第１相補ドメインが、ストレプトコッカス・サーモフィラスの第１相補ドメイン、または、ストレプトコッカス・サーモフィラス由来第１相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｑ）ｍは、５'‐ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＧＵＧＵＵＧＵＵＵＣＧ‐３'であり得る、または、５'‐ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＧＵＧＵＵＧＵＵＵＣＧ‐３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。加えて、（Ｘ）ａ、（Ｘ）ｂ、（Ｘ）ｃの各々は、選択的に、追加の塩基配列であり、Ｘは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され、ａ、ｂ、ｃの各々は塩基の数であり得て、０または１〜２０の整数であり得る。
【０２６１】
例示的な一実施形態において、第２鎖は、５'‐（Ｚ）ｈ‐（Ｐ）ｋ‐３'、または、５'‐（Ｘ）ｄ‐（Ｚ）ｈ‐（Ｘ）ｅ‐（Ｐ）ｋ‐（Ｘ）ｆ‐３'であり得る。
【０２６２】
別の実施形態において、第２鎖は、５'‐（Ｚ）ｈ‐（Ｐ）ｋ‐（Ｆ）ｉ‐３'、または、５'‐（Ｘ）ｄ‐（Ｚ）ｈ‐（Ｘ）ｅ‐（Ｐ）ｋ‐（Ｘ）ｆ‐（Ｆ）ｉ‐３'であり得る。
【０２６３】
ここで、（Ｚ）ｈは、第１鎖の第１相補ドメインとの相補結合を形成可能な第２相補ドメインを含む塩基配列である。（Ｚ）ｈは、天然に存在する種の第２相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有する配列であり得て、第２相補ドメインの塩基配列は、由来の種に従って改変され得る。Ｚは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ｈは塩基の数であり得て、５〜５０の整数である。
【０２６４】
例えば、第２相補ドメインが、ストレプトコッカス・ピオゲネスの第２相補ドメイン、または、それに由来する第２相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｚ）ｈは、５'‐ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ‐３'であり得る、または、５'‐ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ‐３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【０２６５】
別の例において、第２相補ドメインが、カンピロバクター・ジェジュニの第２相補ドメイン、または、それに由来する第２相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｚ）ｈは、５'‐ＡＡＧＡＡＡＵＵＵＡＡＡＡＡＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＵ‐３'であり得る、または、５'‐ＡＡＧＡＡＡＵＵＵＡＡＡＡＡＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＵ‐３'との少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【０２６６】
更に別の例において、第２相補ドメインが、ストレプトコッカス・サーモフィラスの第２相補ドメイン、または、それに由来する第２相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｚ）ｈは、５'‐ＣＧＡＡＡＣＡＡＣＡＣＡＧＣＧＡＧＵＵＡＡＡＡＵ‐３'であり得る、または、５'‐ＣＧＡＡＡＣＡＡＣＡＣＡＧＣＧＡＧＵＵＡＡＡＡＵ‐３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【０２６７】
（Ｐ）ｋは天然に存在する種の近位ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有し得る近位ドメインを含む塩基配列であり、近位ドメインの塩基配列は由来の種に従って改変され得る。Ｐは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ｋは塩基の数であり得て、１〜２０の整数である。
【０２６８】
例えば、近位ドメインがストレプトコッカス・ピオゲネスの近位ドメイン、または、それに由来する近位ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｐ）ｋは、５'‐ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ‐３'であり得る、または、５'‐ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ‐３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【０２６９】
別の例において、近位ドメインがカンピロバクター・ジェジュニの近位ドメイン、または、それに由来する近位ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｐ）ｋは、５'‐ＡＡＡＧＡＧＵＵＵＧＣ‐３'であり得る、または、５'‐ＡＡＡＧＡＧＵＵＵＧＣ‐３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【０２７０】
更に別の例において、近位ドメインが、ストレプトコッカス・サーモフィラスの近位ドメイン、または、それに由来する近位ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｐ）ｋは、５'‐ＡＡＧＧＣＵＵＡＧＵＣＣＧ‐３'であり得る、または、５'‐ＡＡＧＧＣＵＵＡＧＵＣＣＧ‐３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【０２７１】
（Ｆ）ｉは、尾部ドメインを含む塩基配列であり得て、天然に存在する種の尾部ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有し、尾部ドメインの塩基配列は、由来の種に従って改変され得る。Ｆは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ｉは塩基の数であり得て、１〜５０の整数である。
【０２７２】
例えば、尾部ドメインがストレプトコッカス・ピオゲネスの尾部ドメイン、または、それに由来する尾部ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｆ）ｉは、５'‐ＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ‐３'であり得る、または、５'‐ＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ‐３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【０２７３】
別の例において、尾部ドメインがカンピロバクター・ジェジュニの尾部ドメイン、または、それに由来する尾部ドメインと部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｆ）ｉは、５'‐ＧＧＧＡＣＵＣＵＧＣＧＧＧＧＵＵＡＣＡＡＵＣＣＣＣＵＡＡＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵ‐３'であり得る、または、５'‐ＧＧＧＡＣＵＣＵＧＣＧＧＧＧＵＵＡＣＡＡＵＣＣＣＣＵＡＡＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵ‐３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【０２７４】
更に別の例において、尾部ドメインがストレプトコッカス・サーモフィラスの尾部ドメイン、または、それに由来する尾部ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｆ）ｉは、５'‐ＵＡＣＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＧＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＵＵＣＧＧＵＧＵＵＵＵＵ‐３'であり得る、または、５'‐ＵＡＣＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＧＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＵＵＣＧＧＵＧＵＵＵＵＵ‐３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【０２７５】
加えて、（Ｆ）ｉは３'末端において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ転写法に関与する１〜１０塩基の配列を含み得る。
【０２７６】
例えば、ｇＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写においてＴ７プロモーターが使用されるとき、尾部ドメインは、ＤＮＡ鋳型の３'末端に存在する任意の塩基配列であり得る。加えて、Ｕ６プロモーターがｉｎ  ｖｉｖｏ転写において使用されるとき、尾部ドメインはＵＵＵＵＵＵであり得て、Ｈ１プロモーターが転写において使用されるとき、尾部ドメインはＵＵＵＵであり得て、ｐｏｌ‐ＩＩＩプロモーターが使用されるとき、尾部ドメインはいくつかのウラシル塩基または代替的な塩基を含み得る。
【０２７７】
加えて、（Ｘ）ｄ、（Ｘ）ｅおよび（Ｘ）ｆは、選択的に追加される塩基配列であり得て、Ｘは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ｄ、ｅ、ｆの各々は、塩基の数であり得て、０または１〜２０の整数である。
【０２７８】
［一本鎖ｇＲＮＡ］
一本鎖ｇＲＮＡは、第１の一本鎖ｇＲＮＡおよび第２の一本鎖ｇＲＮＡの２種類に分類され得る。
【０２７９】
［第１の一本鎖ｇＲＮＡ］
まず、デュアルｇＲＮＡの第１鎖または第２鎖がリンカードメインによって連結されている第１の一本鎖ｇＲＮＡがある。
【０２８０】
具体的には、一本鎖ｇＲＮＡは、５'‐［ガイドドメイン］‐［第１相補ドメイン］‐［リンカードメイン］‐［第２相補ドメイン］‐３'、５'‐［ガイドドメイン］‐［第１相補ドメイン］‐［リンカードメイン］‐［第２相補ドメイン］‐［近位ドメイン］‐３'、または、５'‐［ガイドドメイン］‐［第１相補ドメイン］‐［リンカードメイン］‐［第２相補ドメイン］‐［近位ドメイン］‐［尾部ドメイン］‐３'から成り得る。第１の一本鎖ｇＲＮＡは、選択的に、追加的ヌクレオチド配列を含み得る。
【０２８１】
例示的な一実施形態において第１の一本鎖ｇＲＮＡは、５'‐（Ｎｔａｒｇｅｔ）‐（Ｑ）ｍ‐（Ｌ）ｊ‐（Ｚ）ｈ‐３'、５'‐（Ｎｔａｒｇｅｔ）‐（Ｑ）ｍ‐（Ｌ）ｊ‐（Ｚ）ｈ‐（Ｐ）ｋ‐３'、または、５'‐（Ｎｔａｒｇｅｔ）‐（Ｑ）ｍ‐（Ｌ）ｊ‐（Ｚ）ｈ‐（Ｐ）ｋ‐（Ｆ）ｉ‐３'であり得る。
【０２８２】
別の例示的な実施形態において、一本鎖ｇＲＮＡは、５'‐（Ｘ）ａ‐（Ｎｔａｒｇｅｔ）‐（Ｘ）ｂ‐（Ｑ）ｍ‐（Ｘ）ｃ‐（Ｌ）ｊ‐（Ｘ）ｄ‐（Ｚ）ｈ‐（Ｘ）ｅ‐３'、５'‐（Ｘ）ａ‐（Ｎｔａｒｇｅｔ）‐（Ｘ）ｂ‐（Ｑ）ｍ‐（Ｘ）ｃ‐（Ｌ）ｊ‐（Ｘ）ｄ‐（Ｚ）ｈ‐（Ｘ）ｅ‐（Ｐ）ｋ‐（Ｘ）ｆ‐３'、または、５'‐（Ｘ）ａ‐（Ｎｔａｒｇｅｔ）‐（Ｘ）ｂ‐（Ｑ）ｍ‐（Ｘ）ｃ‐（Ｌ）ｊ‐（Ｘ）ｄ‐（Ｚ）ｈ‐（Ｘ）ｅ‐（Ｐ）ｋ‐（Ｘ）ｆ‐（Ｆ）ｉ‐３'であり得る。
【０２８３】
ここで、Ｎｔａｒｇｅｔは、標的遺伝子または核酸の二本鎖のうち、いずれかの一本鎖の部分的配列に相補的なヌクレオチド配列であり、Ｎｔａｒｇｅｔは、標的遺伝子または核酸の標的配列に従って変化し得るヌクレオチド配列部位である。
【０２８４】
（Ｑ）ｍは、第１相補ドメインを含むヌクレオチド配列であり、第２相補ドメインとの相補結合を形成できるヌクレオチド配列を含む。（Ｑ）ｍは、天然に存在する種の第１相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有する配列であり得て、第１相補ドメインのヌクレオチド配列は、由来の種に従って変化し得る。Ｑは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ｍはヌクレオチドの数であり得て、５〜３５の整数である。
【０２８５】
例えば、第１相補ドメインがストレプトコッカス・ピオゲネスの第１相補ドメインである、または、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来第１相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｑ）ｍは、５'‐ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ‐３'であり得る、または、５'‐ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ‐３'との少なくとも５０％の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０２８６】
別の例において、第１相補ドメインがカンピロバクター・ジェジュニの第１相補ドメイン、または、カンピロバクター・ジェジュニ由来第１相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｑ）ｍは、５'‐ＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＵＵＵＵＵＡＡＡＵＵＵＣＵＵ‐３'、５'‐ＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＵＵ‐３'、または、５'‐ＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＵＵＵＵＵＡＡＡＵＵＵＣＵＵ‐３'もしくは５'‐ＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＵＵ‐３'と少なくとも５０％の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０２８７】
更に別の例において、第１相補ドメインがストレプトコッカス・サーモフィラスの第１相補ドメインである、または、ストレプトコッカス・サーモフィラス由来第１相補ドメインと部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｑ）ｍは、５'‐ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＧＵＧＵＵＧＵＵＵＣＧ‐３'、または、５'‐ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＧＵＧＵＵＧＵＵＵＣＧ‐３'と少なくとも５０％の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０２８８】
加えて、（Ｌ）ｊは、リンカードメインを含むヌクレオチド配列、ならびに、第１相補ドメインおよび第２相補ドメインの連結を通して一本鎖ｇＲＮＡを生成できるヌクレオチド配列である。ここで、Ｌは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ｊはヌクレオチドの数であり得て、１〜３０の整数である。
【０２８９】
（Ｚ）ｈは、第２相補ドメインを含むヌクレオチド配列であり、第１相補ドメインと相補結合を形成できるヌクレオチド配列を含む。（Ｚ）ｈは、天然に存在する種の第２相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有する配列であり得て、第２相補ドメインのヌクレオチド配列は、由来の種に応じて変化し得る。Ｚは、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から各々独立に選択され得て、ｈは、５〜５０の整数であるヌクレオチドの数であり得る。
【０２９０】
例えば、第２相補ドメインがストレプトコッカス・ピオゲネスの第２相補ドメインである、または、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来第２相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｚ）ｈは、５'‐ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ‐３'であり得る、または、５'‐ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ‐３'との少なくとも５０％の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０２９１】
別の例において、第２相補ドメインがカンピロバクター・ジェジュニの第２相補ドメインである、または、カンピロバクター・ジェジュニ由来第２相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｚ）ｈは、５'‐ＡＡＧＡＡＡＵＵＵＡＡＡＡＡＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＵ‐３'、５'‐ＡＡＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＵ‐３'、または、５'‐ＡＡＧＡＡＡＵＵＵＡＡＡＡＡＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＵ‐３'もしくは５'‐ＡＡＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＵ‐３'と少なくとも５０％の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０２９２】
更に、別の例において、第２相補ドメインがストレプトコッカス・サーモフィラスの第２相補ドメインである、または、ストレプトコッカス・サーモフィラス由来第２相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｚ）ｈは、５'‐ＣＧＡＡＡＣＡＡＣＡＣＡＧＣＧＡＧＵＵＡＡＡＡＵ‐３'、または、５'‐ＣＧＡＡＡＣＡＡＣＡＣＡＧＣＧＡＧＵＵＡＡＡＡＵ‐３'と少なくとも５０％の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０２９３】
（Ｐ）ｋは、近位ドメインを含むヌクレオチド配列、および、天然に存在する種の近位ドメインと部分的相同性または完全相同性を有する配列、および、由来の種に応じて変化し得る近位ドメインのヌクレオチド配列であり得る。Ｐは、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から各々独立に選択され得て、ｋは、１〜２０の整数であるヌクレオチドの数であり得る。
【０２９４】
例えば、近位ドメインがストレプトコッカス・ピオゲネスの近位ドメインである、または、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来近位ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｐ）ｋは、５'‐ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ‐３'、または、５'‐ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ‐３'と少なくとも５０％の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０２９５】
別の例において、近位ドメインがカンピロバクター・ジェジュニの近位ドメインである、または、カンピロバクター・ジェジュニ由来近位ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｐ）ｋは、５'‐ＡＡＡＧＡＧＵＵＵＧＣ‐３'、または、５'‐ＡＡＡＧＡＧＵＵＵＧＣ‐３'と少なくとも５０％の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０２９６】
更に別の例において、近位ドメインが、ストレプトコッカス・サーモフィラスの近位ドメインである、または、ストレプトコッカス・サーモフィラス由来近位ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｐ）ｋは、５'‐ＡＡＧＧＣＵＵＡＧＵＣＣＧ‐３'、または、５'‐ＡＡＧＧＣＵＵＡＧＵＣＣＧ‐３'と少なくとも５０％の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０２９７】
（Ｆ）ｉは、尾部ドメインを含むヌクレオチド配列、および、天然に存在する種の尾部ドメインと部分的相同性または完全相同性を有する配列、および、由来の種に応じて変化し得る尾部ドメインのヌクレオチド配列であり得る。Ｆは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ｉはヌクレオチドの数であり得て、１〜５０の整数である。
【０２９８】
例えば、尾部ドメインがストレプトコッカス・ピオゲネスの尾部ドメインである、または、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来尾部ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｆ）ｉは、５'‐ＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ‐３'、または、５'‐ＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ‐３'と少なくとも５０％の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０２９９】
別の例において、尾部ドメインがカンピロバクター・ジェジュニの尾部ドメインである、または、カンピロバクター・ジェジュニ由来尾部ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｆ）ｉは、５'‐ＧＧＧＡＣＵＣＵＧＣＧＧＧＧＵＵＡＣＡＡＵＣＣＣＣＵＡＡＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵ‐３'、または、５'‐ＧＧＧＡＣＵＣＵＧＣＧＧＧＧＵＵＡＣＡＡＵＣＣＣＣＵＡＡＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵ‐３'と少なくとも５０％の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０３００】
更に別の例において、尾部ドメインが、ストレプトコッカス・サーモフィラスの尾部ドメインである、または、ストレプトコッカス・サーモフィラス由来尾部ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｆ）ｉは、５'‐ＵＡＣＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＧＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＵＵＣＧＧＵＧＵＵＵＵＵ‐３'、または、５'‐ＵＡＣＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＧＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＵＵＣＧＧＵＧＵＵＵＵＵ‐３'と少なくとも５０％の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０３０１】
加えて、（Ｆ）ｉは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ転写法に関与する３'末端に１〜１０ヌクレオチド配列を含み得る。
【０３０２】
例えば、ｇＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写においてＴ７プロモーターが使用されるとき、尾部ドメインは、ＤＮＡ鋳型の３'末端に存在する任意のヌクレオチド配列であり得る。加えて、Ｕ６プロモーターがｉｎ  ｖｉｖｏ転写に使用されるとき、尾部ドメインはＵＵＵＵＵＵであり得て、Ｈ１プロモーターが転写に使用されるとき、尾部ドメインはＵＵＵＵであり得て、ｐｏｌ‐ＩＩＩプロモーターが使用されるとき、尾部ドメインは、いくつかのウラシルヌクレオチドから成り得る、または、代替形態であり得るヌクレオチドを含み得る。
【０３０３】
加えて、（Ｘ）ａ、（Ｘ）ｂ、（Ｘ）ｃ、（Ｘ）ｄ、（Ｘ）ｅおよび（Ｘ）ｆは、選択的に追加され得るヌクレオチド配列であり、Ｘは、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から各々独立に選択され得て、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆは、０、または、１〜２０の整数であり得るヌクレオチドの数である。
【０３０４】
［第２の一本鎖ｇＲＮＡ］
第２の一本鎖ｇＲＮＡは、ガイドドメイン、第１相補ドメインおよび第２相補ドメインから成る一本鎖ｇＲＮＡであり得る。
【０３０５】
ここで、第２の一本鎖ｇＲＮＡは、上記のように５'‐［第２相補ドメイン］‐［第１相補ドメイン］‐［ガイドドメイン］‐３'、または、５'‐［第２相補ドメイン］‐［リンカードメイン］‐［第１相補ドメイン］‐［ガイドドメイン］‐３'から成り得る。
【０３０６】
第２の一本鎖ｇＲＮＡは選択的に、追加的ヌクレオチド配列を含み得る。
【０３０７】
例示的な一実施形態において、第２の一本鎖ｇＲＮＡは、５'‐（Ｚ）ｈ‐（Ｑ）ｍ‐（Ｎｔａｒｇｅｔ）‐３'、または、５'‐（Ｘ）ａ‐（Ｚ）ｈ‐（Ｘ）ｂ‐（Ｑ）ｍ‐（Ｘ）ｃ‐（Ｎｔａｒｇｅｔ）‐３'であり得る。
【０３０８】
別の例示的な実施形態において、一本鎖ｇＲＮＡは、５'‐（Ｚ）ｈ‐（Ｌ）ｊ‐（Ｑ）ｍ‐（Ｎｔａｒｇｅｔ）‐３'、または、５'‐（Ｘ）ａ‐（Ｚ）ｈ‐（Ｌ）ｊ‐（Ｑ）ｍ‐（Ｘ）ｃ‐（Ｎｔａｒｇｅｔ）‐３'であり得る。
【０３０９】
ここで、Ｎｔａｒｇｅｔは、標的遺伝子または核酸の二本鎖のうち、いずれかの一本鎖の部分的配列に相補的なヌクレオチド配列であり、Ｎｔａｒｇｅｔは、標的遺伝子または核酸の標的配列に従って変化し得るヌクレオチド配列部位である。
【０３１０】
（Ｑ）ｍは、第１相補ドメインを含むヌクレオチド配列であり、第２相補ドメインとの相補結合を形成できるヌクレオチド配列を含む。（Ｑ）ｍは、天然に存在する種の第１相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有する配列であり得て、第１相補ドメインのヌクレオチド配列は、由来の種に従って変化し得る。Ｑは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ｍはヌクレオチドの数であり得て、５〜３５の整数である。
【０３１１】
例えば、第１相補ドメインがパルクバクテリア・バクテリウムの第１相補ドメインである、または、パルクバクテリア・バクテリウム由来第１相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｑ）ｍは、５'‐ＵＵＵＧＵＡＧＡＵ‐３'、または、５'‐ＵＵＵＧＵＡＧＡＵ‐３'と少なくとも５０％の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０３１２】
（Ｚ）ｈは、第２相補ドメインを含むヌクレオチド配列であり、第１相補ドメインと相補結合を形成できるヌクレオチド配列を含む。（Ｚ）ｈは、天然に存在する種の第２相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有する配列であり得て、第２相補ドメインのヌクレオチド配列は、由来の種に応じて変化し得る。Ｚは、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から各々独立に選択され得て、ｈは、５〜５０の整数であるヌクレオチドの数であり得る。
【０３１３】
例えば、第２相補ドメインがパルクバクテリア・バクテリウムの第２相補ドメインである、または、パルクバクテリア・バクテリウム由来第２相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｚ）ｈは、５'‐ＡＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵ‐３'、または、５'‐ＡＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵ‐３'と少なくとも５０％の相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０３１４】
加えて、（Ｌ）ｊは、リンカードメインを有するヌクレオチド配列、および、第１相補ドメインと第２相補ドメインとを連結するヌクレオチド配列である。ここで、Ｌは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ｊはヌクレオチドの数であり得て、１〜３０の整数である。
【０３１５】
加えて、（Ｘ）ａ、（Ｘ）ｂおよび（Ｘ）ｃは、選択的に追加され得るヌクレオチド配列を表し、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から各々独立に選択され得て、ａ、ｂ、ｃは、ヌクレオチドの数であり得て、その各々は０または１〜２０の整数であり得る。
【０３１６】
ここで開示される開示の態様として、ガイド核酸は、高発現分泌遺伝子の標的配列に相補的に結合できるｇＲＮＡである。
【０３１７】
高発現分泌遺伝子は、上に記載したものと同一である。
【０３１８】
ｇＲＮＡは、分泌細胞における高発現分泌遺伝子から選択される任意の配列に結合できるｇＲＮＡである。
【０３１９】
高発現分泌遺伝子は、ガイド核酸によって認識され、標的遺伝子または標的配列は、エディタータンパク質によって切断される。
【０３２０】
「標的配列」は、標的遺伝子または核酸に存在するヌクレオチド配列を指し、具体的には、標的遺伝子または核酸におけるヌクレオチド配列の部分的な標的領域を指す。ここで、「標的領域」は、標的遺伝子または核酸におけるガイド核酸‐エディタータンパク質によって改変できる部位である。
【０３２１】
以降、標的配列は、両方のヌクレオチド配列についての情報の用語として使用され得る。例えば、標的遺伝子の場合、標的配列は、標的遺伝子ＤＮＡの転写鎖の配列情報、または、非転写鎖の配列情報のヌクレオチドを意味し得る。本明細書において、２つの態様を含む標的配列を使用するガイド核酸は、「標的配列のガイド核酸」と称される。例えば、標的配列は、標的遺伝子Ａの標的領域における部分的なヌクレオチド配列（転写鎖）である５'‐ＡＴＣＡＴＴＧＧＣＡＧＡＣＴＡＧＴＴＣＧ‐３'、または、５'‐ＡＴＣＡＴＴＧＧＣＡＧＡＣＴＡＧＴＴＣＧ‐３'（非転写鎖）と相補的なヌクレオチド配列である５'‐ＣＧＡＡＣＴＡＧＴＣＴＧＣＣＡＡＴＧＡＴ‐３'を意味し得る。
【０３２２】
標的配列は、５〜５０のヌクレオチドの配列であり得る。
【０３２３】
実施形態において、標的配列は、１６ヌクレオチド配列、１７ヌクレオチド配列、１８ヌクレオチド配列、１９ヌクレオチド配列、２０ヌクレオチド配列、２１ヌクレオチド配列、２２ヌクレオチド配列、２３ヌクレオチド配列、２４ヌクレオチド配列、または、２５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３２４】
標的配列は、ガイド核酸の結合配列または非結合配列を含む。
【０３２５】
ガイド核酸の「結合配列」は、ガイド核酸のガイドドメインに含まれるガイド配列との部分的または完全相補性を有するヌクレオチド配列であり、ガイド核酸のガイドドメインに含まれるガイド配列に相補的に結合し得る。標的配列およびガイド核酸結合配列は、標的遺伝子または核酸に従って変化し得るヌクレオチド配列、すなわち、遺伝子操作または修正の対象であり、標的遺伝子または核酸に応じて、様々な種類で設計され得る。
【０３２６】
ガイド核酸の「非結合配列」は、ガイド核酸のガイドドメインに含まれるガイド配列との部分的相同性または完全相同性を有するヌクレオチド配列であり、ガイド核酸のガイドドメインに含まれるガイド配列に相補的に結合しないことがあり得る。加えて、非ガイド核酸結合配列は、ガイド核酸結合配列との相補性を有するヌクレオチド配列であり、ガイド核酸結合配列に相補的に結合し得る。
【０３２７】
ガイド核酸結合配列は、標的配列の部分的なヌクレオチド配列、および、標的配列の２つの異なる配列順序を有するヌクレオチド配列のうち１つのヌクレオチド配列、すなわち、互いに相補的に結合できる２つのヌクレオチド配列であり得る。ここで、非ガイド核酸結合配列は、標的配列のガイド核酸結合配列以外のヌクレオチド配列であり得る。
【０３２８】
例えば、標的遺伝子Ａの標的領域における部分的なヌクレオチド配列である５'‐ＡＴＣＡＴＴＧＧＣＡＧＡＣＴＡＧＴＴＣＧ‐３'に相補的なヌクレオチド配列である５'‐ＣＧＡＡＣＴＡＧＴＣＴＧＣＣＡＡＴＧＡＴ‐３'が標的配列として使用されるとき、ガイド核酸結合配列は、２つの標的配列、すなわち、５'‐ＡＴＣＡＴＴＧＧＣＡＧＡＣＴＡＧＴＴＣＧ‐３'または５'‐ＣＧＡＡＣＴＡＧＴＣＴＧＣＣＡＡＴＧＡＴ‐３'のうち１つであり得る。ここで、非ガイド核酸結合配列は、ガイド核酸結合配列が５'‐ＡＴＣＡＴＴＧＧＣＡＧＡＣＴＡＧＴＴＣＧ‐３'であるとき、５'‐ＣＧＡＡＣＴＡＧＴＣＴＧＣＣＡＡＴＧＡＴ‐３'であり得る、または、ガイド核酸結合配列が５'‐ＣＧＡＡＣＴＡＧＴＣＴＧＣＣＡＡＴＧＡＴ‐３'であるとき、５'‐ＡＴＣＡＴＴＧＧＣＡＧＡＣＴＡＧＴＴＣＧ‐３'であり得る。
【０３２９】
ガイド核酸結合配列は、標的配列と同一のヌクレオチド配列、すなわち転写鎖、および、非転写鎖と同一のヌクレオチド配列から選択される１つのヌクレオチド配列であり得る。ここで、非ガイド核酸結合配列は、標的配列のガイド核酸結合配列と同一のヌクレオチド配列、すなわち、転写鎖、および、非転写鎖と同一のヌクレオチド配列から選択される１つのヌクレオチド配列以外のヌクレオチド配列であり得る。
【０３３０】
結合配列は標的配列と同一の長さであり得る。
【０３３１】
非結合配列は、標的配列または結合配列と同一の長さであり得る。
【０３３２】
結合配列は、５〜５０ヌクレオチド配列であり得る。
【０３３３】
実施形態において、結合配列は、１６ヌクレオチド配列、１７ヌクレオチド配列、１８ヌクレオチド配列、１９ヌクレオチド配列、２０ヌクレオチド配列、２１ヌクレオチド配列、２２ヌクレオチド配列、２３ヌクレオチド配列、２４ヌクレオチド配列、または、２５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３３４】
非結合配列は、５〜５０ヌクレオチド配列であり得る。
【０３３５】
実施形態において、非結合配列は、１６ヌクレオチド配列、１７ヌクレオチド配列、１８ヌクレオチド配列、１９ヌクレオチド配列、２０ヌクレオチド配列、２１ヌクレオチド配列、２２ヌクレオチド配列、２３ヌクレオチド配列、２４ヌクレオチド配列、または、２５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３３６】
ガイド核酸結合配列は、ガイド核酸のガイドドメインに含まれるガイド配列に部分的または完全に相補的に結合し得て、ガイド核酸結合配列の長さは、ガイド配列と同一であり得る。
【０３３７】
ガイド核酸結合配列は、ガイド核酸のガイドドメインに含まれるガイド配列に相補的なヌクレオチド配列、例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％相補的な、または、完全に相補的なヌクレオチド配列であり得る。
【０３３８】
一例において、ガイド核酸結合配列は、ガイド核酸のガイドドメインに含まれるガイド配列に相補的でない１〜８ヌクレオチドの配列を有する、または、含み得る。
【０３３９】
非ガイド核酸結合配列は、ガイド核酸のガイドドメインに含まれるガイド配列との部分的相同性または完全相同性を有し得て、非ガイド核酸結合配列の長さは、ガイド配列と同一であり得る。
【０３４０】
非ガイド核酸結合配列は、ガイド核酸のガイドドメインに含まれるガイド配列との相同性を有するヌクレオチド配列、例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上の相同性または完全相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０３４１】
一例において、非ガイド核酸結合配列は、ガイド核酸のガイドドメインに含まれるガイド配列との相同性を有しない１〜８ヌクレオチドの配列を有する、または、含み得る。
【０３４２】
非ガイド核酸結合配列は、ガイド核酸結合配列と相補的に結合し得て、非ガイド核酸結合配列は、ガイド核酸結合配列と同一の長さを有し得る。
【０３４３】
非ガイド核酸結合配列は、ガイド核酸結合配列に相補的なヌクレオチド配列、例えば、少なくとも９０％、または、９５％相補的な、または、完全に相補的なヌクレオチド配列であり得る。
【０３４４】
一例において、非ガイド核酸結合配列は、ガイド核酸結合配列に相補的でない１または２つのヌクレオチド配列を有する、または、含み得る。
【０３４５】
加えて、ガイド核酸結合配列は、エディタータンパク質によって認識できるヌクレオチド配列に隣接する場所に位置するヌクレオチド配列であり得る。
【０３４６】
一例において、ガイド核酸結合配列は、エディタータンパク質によって認識できるヌクレオチド配列の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の５〜５０ヌクレオチドの配列であり得る。
【０３４７】
加えて、非ガイド核酸結合配列は、エディタータンパク質によって認識できるヌクレオチド配列に隣接するヌクレオチド配列であり得る。
【０３４８】
一例において、非ガイド核酸結合配列は、エディタータンパク質によって認識できるヌクレオチド配列の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の５〜５０ヌクレオチドの配列であり得る。
【０３４９】
実施形態において、標的配列は、高発現分泌遺伝子のプロモーター領域に位置する連続の１０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３５０】
標的配列は、１０〜３５ヌクレオチド配列、１５〜３５ヌクレオチド配列、２０〜３５ヌクレオチド配列、２５〜３５ヌクレオチド配列、または、３０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３５１】
標的配列は、１０〜１５ヌクレオチド配列、１５〜２０ヌクレオチド配列、２０〜２５ヌクレオチド配列、２５〜３０ヌクレオチド配列、または、３０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３５２】
例において、標的配列は、ＨＰ遺伝子のプロモーター領域に位置する連続の１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。 別の例において、標的配列は、ＡＰＯＣ３遺伝子のプロモーター領域に位置する連続の１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３５３】
別の例において、標的配列は、高発現分泌遺伝子のイントロンのプロモーター領域に位置する連続の１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３５４】
標的配列は、１０〜３５ヌクレオチド配列、１５〜３５ヌクレオチド配列、２０〜３５ヌクレオチド配列、２５〜３５ヌクレオチド配列、または３０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。 標的配列は、１０〜１５ヌクレオチド配列、１５〜２０ヌクレオチド配列、２０〜２５ヌクレオチド配列、２５〜３０ヌクレオチド配列、または、３０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３５５】
例において、標的配列は、ＨＰ遺伝子のイントロンに位置する連続の１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３５６】
別の例において、標的配列は、ＡＰＯＣ３遺伝子のイントロンに位置する連続の１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。 例において、標的配列は、高発現分泌遺伝子のエクソンに位置する連続の１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３５７】
標的配列は、１０〜３５ヌクレオチド配列、１５〜３５ヌクレオチド配列、２０〜３５ヌクレオチド配列、２５〜３５ヌクレオチド配列、または、３０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３５８】
標的配列は、１０〜１５ヌクレオチド配列、１５〜２０ヌクレオチド配列、２０〜２５ヌクレオチド配列、２５〜３０ヌクレオチド配列、または、３０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３５９】
例において、標的配列は、ＨＰ遺伝子のエクソンに位置する連続の１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３６０】
別の例において、標的配列は、ＡＰＯＣ３遺伝子のエクソンに位置する連続の１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３６１】
例において、標的配列は、高発現分泌遺伝子のエンハンサーに位置する連続の１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３６２】
標的配列は、１０〜３５ヌクレオチド配列、１５〜３５ヌクレオチド配列、２０〜３５ヌクレオチド配列、２５〜３５ヌクレオチド配列、または、３０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３６３】
標的配列は、１０〜１５ヌクレオチド配列、１５〜２０ヌクレオチド配列、２０〜２５ヌクレオチド配列、２５〜３０ヌクレオチド配列、または、３０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３６４】
例において、標的配列は、ＨＰ遺伝子のエンハンサーに位置する連続の１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３６５】
例において、標的配列は、ＡＰＯＣ３遺伝子のエンハンサーに位置する連続の１０〜２５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３６６】
ここで開示される標的配列は、高発現分泌遺伝子のコード部分、非コード部分、または、混在部分に位置する連続の１０〜３５ヌクレオチドの配列であり得る。
【０３６７】
標的配列は、１０〜３５ヌクレオチド配列、１５〜３５ヌクレオチド配列、２０〜３５ヌクレオチド配列、２５〜３５ヌクレオチド配列、または、３０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３６８】
代替的に、標的配列は、１０〜１５ヌクレオチド配列、１５〜２０ヌクレオチド配列、２０〜２５ヌクレオチド配列、２５〜３０ヌクレオチド配列、または、３０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３６９】
一例において、標的配列は、ＨＰ遺伝子のコード部分、非コード部分、または、混在部分に位置する連続の１０〜２５ヌクレオチドの配列であり得る。
【０３７０】
別の例において、標的配列は、ＡＰＯＣ３遺伝子のコード部分、非コード部分、または、混在部分に位置する連続の１０〜２５ヌクレオチドの配列であり得る。
【０３７１】
ここで開示される標的配列は、高発現分泌遺伝子のプロモーター、エンハンサー、３'ＵＴＲ、ポリＡ尾部、または、それらの混在部分に位置する連続の１０〜３５ヌクレオチドの配列であり得る。
【０３７２】
標的配列は、１０〜３５ヌクレオチド配列、１５〜３５ヌクレオチド配列、２０〜３５ヌクレオチド配列、２５〜３５ヌクレオチド配列、または、３０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３７３】
標的配列は、１０〜１５ヌクレオチド配列、１５〜２０ヌクレオチド配列、２０〜２５ヌクレオチド配列、２５〜３０ヌクレオチド配列、または、３０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３７４】
一例において、標的配列は、ＨＰ遺伝子のプロモーター、エンハンサー、３'ＵＴＲ、または、ポリＡ尾部に位置する連続の１０〜２５ヌクレオチド、または、それらの混在部分の配列であり得る。
【０３７５】
別の例において、標的配列は、ＡＰＯＣ３遺伝子のプロモーター、エンハンサー、３'ＵＴＲ、または、ポリＡ尾部に位置する連続の１０〜２５ヌクレオチド、または、それらの混在部分の配列であり得る。
【０３７６】
ここで開示される標的配列は、高発現分泌遺伝子のエクソンまたはイントロンに位置する連続の１０〜３５ヌクレオチド、または、それらの混在部分の配列であり得る。
【０３７７】
標的配列は、１０〜３５ヌクレオチド配列、１５〜３５ヌクレオチド配列、２０〜３５ヌクレオチド配列、２５〜３５ヌクレオチド配列、または、３０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３７８】
標的配列は、１０〜１５ヌクレオチド配列、１５〜２０ヌクレオチド配列、２０〜２５ヌクレオチド配列、２５〜３０ヌクレオチド配列、または、３０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３７９】
一例において、標的配列は、ＨＰ遺伝子のエクソンまたはイントロンに位置する連続の１０〜２５ヌクレオチド、または、それらの混在部分の配列であり得る。
【０３８０】
別の例において、標的配列は、ＡＰＯＣ３遺伝子のエクソンまたはイントロンに位置する連続の１０〜２５ヌクレオチド、または、それらの混在部分の配列であり得る。
【０３８１】
ここで開示される標的配列は、高発現分泌遺伝子の変異部分（例えば、野性型遺伝子とは異なる部分）を含む、または、それに隣接する連続の１０〜３５ヌクレオチドの配列であり得る。
【０３８２】
標的配列は、１０〜３５ヌクレオチド配列、１５〜３５ヌクレオチド配列、２０〜３５ヌクレオチド配列、２５〜３５ヌクレオチド配列、または、３０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３８３】
標的配列は、１０〜１５ヌクレオチド配列、１５〜２０ヌクレオチド配列、２０〜２５ヌクレオチド配列、２５〜３０ヌクレオチド配列、または、３０〜３５ヌクレオチド配列であり得る。
【０３８４】
一例において、標的配列は、ＨＰ遺伝子の変異部分を含む、または、それに隣接する連続の１０〜２５ヌクレオチドの配列であり得る（例えば、野性型遺伝子とは異なる部分）。
【０３８５】
別の例において、標的配列は、ＡＰＯＣ３遺伝子の変異部分を含む、または、それに隣接する連続の１０〜２５ヌクレオチドの配列であり得る（例えば、野性型遺伝子とは異なる部分）。
【０３８６】
ここで開示される標的配列は、高発現分泌遺伝子のヌクレオチド配列におけるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の１０〜３５ヌクレオチドの配列であり得る。
【０３８７】
「プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列」は、エディタータンパク質によって認識されるヌクレオチド配列である。ここで、ＰＡＭ配列は、エディタータンパク質の種類、および、由来の種に応じて、ヌクレオチド配列に差異を有し得る。
【０３８８】
ＰＡＭ配列は、例えば、以下の配列（５'から３'の方向に記載される）のうち１または複数であり得る。
ＮＧＧ（ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧ）
ＮＮＮＮＲＹＡＣ（Ｎの各々は、独立して、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＲはＡまたはＧであり、ＹはＣまたはＴである）
ＮＮＡＧＡＡＷ（Ｎの各々は、独立して、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＷはＡまたはＴである）
ＮＮＮＮＧＡＴＴ（Ｎの各々は、独立して、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧである）
ＮＮＧＲＲ（Ｔ）（Ｎの各々は、独立して、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＲはＡまたはＧである）
ＴＴＮ（ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧである）
【０３８９】
例において、標的配列は、１０〜３５、１５〜３５、２０〜３５、２５〜３５、３０〜３５塩基配列であり得る。
【０３９０】
例において、標的配列は、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５塩基配列であり得る。
【０３９１】
一例において、標的配列は、ＨＰ遺伝子のヌクレオチド配列におけるＰＡＭ配列の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の１０〜２５ヌクレオチドの配列であり得る。
【０３９２】
例示的な一実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＮＧＧ‐３'、５'‐ＮＡＧ‐３'および／または５'‐ＮＧＡ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）であるとき、標的配列は、ＨＰ遺伝子ヌクレオチド配列における５'‐ＮＧＧ‐３'、５'‐ＮＡＧ‐３'、および／または、５'‐ＮＧＡ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の１０〜２５ヌクレオチドの配列であり得る。
【０３９３】
別の例示的な実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＮＧＧＮＧ‐３'および／または５'‐ＮＮＡＧＡＡＷ‐３'（Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）であるとき、標的配列は、ＨＰ遺伝子のヌクレオチド配列における５'‐ＮＧＧＮＧ‐３'および／または５'‐ＮＮＡＧＡＡＷ‐３'（Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の１０〜２５ヌクレオチドの配列であり得る。
【０３９４】
更に別の例示的な実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＮＮＮＮＧＡＴＴ‐３'および／または５'‐ＮＮＮＧＣＴＴ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）であるとき、標的配列は、ＨＰ遺伝子のヌクレオチド配列における５'‐ＮＮＮＮＧＡＴＴ‐３'および／または５'‐ＮＮＮＧＣＴＴ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の１０〜２５ヌクレオチドの配列であり得る。
【０３９５】
例示的な一実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＮＮＮＶＲＹＡＣ‐３'（Ｖ＝Ｇ、ＣまたはＡ；Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｙ＝ＣまたはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）であるとき、標的配列は、ＨＰ遺伝子のヌクレオチド配列における５'‐ＮＮＮＶＲＹＡＣ‐３'（Ｖ＝Ｇ、ＣまたはＡ；Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｙ＝ＣまたはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の１０〜２５ヌクレオチドの配列であり得る。
【０３９６】
別の例示的な実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＮＡＡＲ‐３'（Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）であるとき、標的配列は、ＨＰ遺伝子のヌクレオチド配列における５'‐ＮＡＡＲ‐３'（Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の１０〜２５ヌクレオチドの配列であり得る。
【０３９７】
更に別の例示的な実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＮＮＧＲＲ‐３'、５'‐ＮＮＧＲＲＴ‐３'、および／または、５'‐ＮＮＧＲＲＶ‐３'（Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｖ＝Ｇ、ＣまたはＡ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）であるとき、標的配列は、ＨＰ遺伝子のヌクレオチド配列における５'‐ＮＮＧＲＲ‐３'、５'‐ＮＮＧＲＲＴ‐３'、および／または、５'‐ＮＮＧＲＲＶ‐３'（Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｖ＝Ｇ、ＣまたはＡ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の１０〜２５ヌクレオチドの配列であり得る。
【０３９８】
例示的な一実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＴＴＮ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）であるとき、標的配列は、ＨＰ遺伝子のヌクレオチド配列における５'‐ＴＴＮ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の１０〜２５ヌクレオチドの配列であり得る。
【０３９９】
別の例において、標的配列は、ＡＰＯＣ３遺伝子のヌクレオチド配列におけるＰＡＭ配列の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の１０〜２５ヌクレオチドの配列であり得る。
【０４００】
例示的な一実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＮＧＧ‐３'、５'‐ＮＡＧ‐３'および／または５'‐ＮＧＡ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）であるとき、標的配列は、ＡＰＯＣ３遺伝子ヌクレオチド配列における５'‐ＮＧＧ‐３'、５'‐ＮＡＧ‐３'、および／または、５'‐ＮＧＡ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の１０〜２５ヌクレオチドの配列であり得る。
【０４０１】
別の例示的な実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＮＧＧＮＧ‐３'および／または５'‐ＮＮＡＧＡＡＷ‐３'（Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）であるとき、標的配列は、ＡＰＯＣ３遺伝子のヌクレオチド配列における５'‐ＮＧＧＮＧ‐３'および／または５'‐ＮＮＡＧＡＡＷ‐３'（Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の１０〜２５ヌクレオチドの配列であり得る。
【０４０２】
更に別の例示的な実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＮＮＮＮＧＡＴＴ‐３'および／または５'‐ＮＮＮＧＣＴＴ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）であるとき、標的配列は、ＡＰＯＣ３遺伝子のヌクレオチド配列における５'‐ＮＮＮＮＧＡＴＴ‐３'および／または５'‐ＮＮＮＧＣＴＴ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の１０〜２５ヌクレオチドの配列であり得る。
【０４０３】
例示的な一実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＮＮＮＶＲＹＡＣ‐３'（Ｖ＝Ｇ、ＣまたはＡ；Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｙ＝ＣまたはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）であるとき、標的配列は、ＡＰＯＣ３遺伝子のヌクレオチド配列における５'‐ＮＮＮＶＲＹＡＣ‐３'（Ｖ＝Ｇ、ＣまたはＡ；Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｙ＝ＣまたはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の１０〜２５ヌクレオチドの配列であり得る。
【０４０４】
別の例示的な実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＮＡＡＲ‐３'（Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）であるとき、標的配列は、ＡＰＯＣ３遺伝子のヌクレオチド配列における５'‐ＮＡＡＲ‐３'（Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の１０〜２５ヌクレオチドの配列であり得る。
【０４０５】
更に別の例示的な実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＮＮＧＲＲ‐３'、５'‐ＮＮＧＲＲＴ‐３'、および／または、５'‐ＮＮＧＲＲＶ‐３'（Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｖ＝Ｇ、ＣまたはＡ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）であるとき、標的配列は、ＡＰＯＣ３遺伝子のヌクレオチド配列における５'‐ＮＮＧＲＲ‐３'、５'‐ＮＮＧＲＲＴ‐３'、および／または、５'‐ＮＮＧＲＲＶ‐３'（Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｖ＝Ｇ、ＣまたはＡ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の１０〜２５ヌクレオチドの配列であり得る。
【０４０６】
例示的な一実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＴＴＮ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）であるとき、標的配列は、ＡＰＯＣ３遺伝子のヌクレオチド配列における５'‐ＴＴＮ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の１０〜２５ヌクレオチドの配列であり得る。
【０４０７】
以降、ここで開示される例示的な一実施形態において使用できる標的配列の例を以下のテーブルにまとめる。以下のテーブルにおいて示される標的配列は、非ガイド核酸結合配列であり、開示された配列から、相補的配列、すなわちガイド核酸結合配列を予想できる。
【０４０８】
テーブル１．ＨＰ遺伝子およびＡＰＯＣ３遺伝子の標的配列
【表１】
2020527030.tif 000003
【表２】
2020527030.tif 000004
【表３】
2020527030.tif 000005
【表４】
2020527030.tif 000006
【表５】
2020527030.tif 000007
【表６】
2020527030.tif 000008
【表７】
2020527030.tif 000009
【表８】
2020527030.tif 000010
【表９】
2020527030.tif 000011
【表１０】
2020527030.tif 000012
【表１１】
2020527030.tif 000013
別の例において、高発現分泌遺伝子を改変するための組成物は、ガイド核酸およびエディタータンパク質を含み得る。
【０４０９】
例えば、組成物は、肝臓において発現する高発現分泌遺伝子の群から選択される１または複数の遺伝子の標的配列のガイド核酸、および、エディタータンパク質をコードするエディタータンパク質または核酸を含み得る。
【０４１０】
高発現分泌遺伝子に関連する説明は、上に記載したものと同一である。
【０４１１】
（１）エディタータンパク質
「エディタータンパク質」という用語は、直接的な結合の有無に関わらず、核酸と直接的に結合または相互作用可能なペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を指す。エディタータンパク質はまた、「人工的改変ヌクレアーゼ」またはＧＥＮ（ＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼ）と概念的に称される。エディタータンパク質は酵素であり得る。
【０４１２】
「酵素」という用語は、核酸、遺伝子、染色体またはタンパク質を切断可能なドメインを含むタンパク質を指す。酵素は、ヌクレアーゼまたは制限酵素であり得る。
【０４１３】
エディタータンパク質は完全活性酵素を含み得る。
【０４１４】
ここで、「完全活性酵素」とは、野性型酵素の機能と同一の機能を有する酵素を指し、例えば、ＤＮＡの二本鎖を切断する野性型酵素は、ＤＮＡの二本鎖を全体的に切断する完全な酵素活性を有する。更に別の例において、アミノ酸配列の部分的配列が、ＤＮＡの二本鎖を切断する野性型酵素の人工的操作によって欠失または置換されるとき、人工的に操作された酵素バリアントが野性型酵素のようにＤＮＡの二本鎖を切断する場合、人工的に操作された酵素バリアントは、完全活性酵素であり得る。
【０４１５】
加えて、完全活性酵素は、野性型酵素の機能と比較して改善された機能を有する酵素を含み、例えば、ＤＮＡの二本鎖を切断する野性型酵素の、特定の改変または操作された種類は、野性型酵素と比較して改善された完全な酵素活性、すなわち、ＤＮＡの二本鎖を切断する活性を有する。
【０４１６】
エディタータンパク質は、不完全または部分的な活性酵素を含み得る。
【０４１７】
ここで、「不完全または部分的活性酵素」は、核酸、遺伝子または染色体を切断する元の野性型酵素の機能の一部を有する酵素を意味する。例えば、ＤＮＡの二本鎖を切断する野性型酵素の特異的に改変または操作された種類は、第１機能を有する種類、または、第２機能を有する種類であり得る。ここで、第１機能は、ＤＮＡの二本鎖のうち第１鎖を切断する機能であり得て、第２機能は、ＤＮＡの二本鎖のうち第２鎖を切断する機能であり得る。ここで、第１機能を有する酵素、または、第２機能を有する酵素は、不完全または部分的活性酵素であり得る。
【０４１８】
エディタータンパク質は、不活性酵素を含み得る。
【０４１９】
ここで、「不活性酵素」は、野性型酵素の機能が完全に不活性化された酵素を指す。例えば、野性型酵素の特異的に改変または操作された種類は、第１および第２機能の両方が失われた種類、すなわち、ＤＮＡの二本鎖のうち第１鎖を切断する第１機能、および、ＤＮＡの二本鎖のうち第２鎖を切断する第２機能の両方が失われた種類であり得る。ここで、第１および第２機能の両方を失う酵素は、不活性酵素であり得る。
【０４２０】
エディタータンパク質は融合タンパク質であり得る。
【０４２１】
ここで、融合タンパク質とは、酵素を追加のドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質と融合させることによって生成されるタンパク質を指す。
【０４２２】
追加のドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、酵素と同一または異なる機能を有する機能ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質であり得る。融合タンパク質は、酵素のＮ末端またはその近位、酵素のＣ末端またはその近位、酵素の中央領域、および、それらの組み合わせのうちの１または複数に、追加のドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含み得る。ここで、機能ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性もしくは核酸結合活性を有するドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質、または、タンパク質（ペプチドを含む）の単離および精製のためのタグもしくはレポーター遺伝子であり得るが、本発明はこれに限定されない。機能ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質はデアミナーゼであり得る。
【０４２３】
タグは、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ‐Ｇタグおよびチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグを含み、レポーター遺伝子は、グルタチオン‐Ｓ‐トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチル基転移酵素（ＣＡＴ）βガラクトシダーゼ、βグルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、自家蛍光タンパク質（緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）および青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含む）を含むが、本発明はこれらに限定されない。
【０４２４】
加えて、機能ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、核局在配列もしくはシグナル（ＮＬＳ）、または、核外搬出配列もしくはシグナル（ＮＥＳ）であり得る。
【０４２５】
ＮＬＳは、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶを有する、ＳＶ４０ウイルスのラージＴ抗原のＮＬＳ、ヌクレオプラスミンに由来するＮＬＳ（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫを有するヌクレオプラスミン双節型ＮＬＳ）、アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤまたはＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰを有するｃ‐ｍｙｃ  ＮＬＳ、または、配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹを有するｈＲＮＰＡ１  Ｍ９  ＮＬＳ、インポーチンα由来ＩＢＢドメイン配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ、筋腫Ｔタンパク質配列ＶＳＲＫＲＰＲＰおよびＰＰＫＫＡＲＥＤ、ヒトｐ５３配列ＰＯＰＫＫＫＰＬ、マウスｃ‐ａｂｌ  ＩＶ配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ、インフルエンザウイルスＮＳ１配列ＤＲＬＲＲおよびＰＫＱＫＫＲＫ、Ｄ型肝炎ウイルス抗原配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ、マウスＭｘ１タンパク質配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ、ヒトポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼ配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ、または、ステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイド配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫであり得るが、本発明はこれらに限定されない。
【０４２６】
追加のドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、特定の機能を示さない非機能ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質であり得る。ここで、非機能ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、酵素機能に影響しないドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質であり得る。
【０４２７】
融合タンパク質は、非機能ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質が酵素のアミノ末端またはその付近、酵素のカルボキシル末端またはその付近、酵素の中央部分、または、それらの組み合わせのうち１または複数に追加された種類であり得る。
【０４２８】
エディタータンパク質は、天然酵素または融合タンパク質であり得る。
【０４２９】
エディタータンパク質は、部分的に改変された天然酵素または融合タンパク質の形態として存在し得る。
【０４３０】
エディタータンパク質は、天然に存在しない人工的に生成された酵素または融合タンパク質であり得る。エディタータンパク質は、天然に存在しない、部分的に改変された人工酵素または融合タンパク質の形態で存在し得る。
【０４３１】
ここで、改変は、エディタータンパク質に含まれるアミノ酸の置換、除去、追加、または、それらの組み合わせであり得る。
【０４３２】
加えて、改変は、エディタータンパク質をコードする塩基配列におけるいくつかの塩基の置換、除去、追加、または、それらの組み合わせであり得る。
【０４３３】
ガイド核酸およびエディタータンパク質は、ガイド核酸‐エディタータンパク質複合体を形成し得る。
【０４３４】
ガイド核酸‐エディタータンパク質複合体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成され得る。
【０４３５】
ガイド核酸‐エディタータンパク質複合体は、細胞における細胞質において形成され得る。
【０４３６】
ガイド核酸‐エディタータンパク質複合体は、細胞における核において形成され得る。
【０４３７】
ガイド核酸‐エディタータンパク質複合体において、エディタータンパク質は、標的遺伝子またはヌクレオチド配列に存在するＰＡＭを認識し得る。
【０４３８】
ガイド核酸‐エディタータンパク質複合体において、ガイド核酸は、標的遺伝子またはヌクレオチド配列に相補的に結合し得る。
【０４３９】
ガイド核酸‐エディタータンパク質複合体が標的遺伝子またはヌクレオチド配列に結合するとき、標的遺伝子またはヌクレオチド配列は、ガイド核酸‐エディタータンパク質複合体のエディタータンパク質によって切断または改変され得る。
【０４４０】
ここで開示される開示の一態様において、エディタータンパク質はＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
【０４４１】
例えば、組成物は、肝臓において発現する高発現分泌遺伝子の群から選択される１または複数の遺伝子の標的配列のｇＲＮＡ、および、ＣＲＩＳＰＲ酵素またはＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸を含み得る。
【０４４２】
ｇＲＮＡの説明は上記と同一である。
【０４４３】
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的遺伝子または核酸の二本鎖を切断する機能を有するヌクレアーゼまたは制限酵素であり得る。
【０４４４】
「ＣＲＩＳＰＲ酵素」は、ＣＲＩＳＰＲ‐Ｃａｓシステムの主要なタンパク質コンポーネントであり、ｇＲＮＡと混合される、または、標的配列を認識してＤＮＡを切断する複合体を形成するヌクレアーゼを指す。
【０４４５】
「ＣＲＩＳＰＲ‐Ｃａｓシステム」は、外部から侵入した病原性微生物の遺伝情報を保存してから遺伝情報を切断する獲得免疫系に由来し、所望の標的配列を認識するよう遺伝情報を人工的に操作するｇＲＮＡと、ＤＮＡを認識するＣａｓタンパク質とから成る、遺伝子機能を除去または調節する遺伝子修正システムを指す。
【０４４６】
Ｃａｓタンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と複合体を形成し得て、それにより、その活性を示す。
【０４４７】
ここで、Ｃａｓタンパク質は、ｇＲＮＡと協働することによって活性化されるエンドヌクレアーゼまたはニッカーゼとして機能するすべてのバリアント、および天然タンパク質を含む概念として使用される。活性化されたエンドヌクレアーゼまたはニッカーゼは、標的ＤＮＡ切断、および、それを使用する遺伝子修正を引き起こし得る。加えて、不活性化バリアントは、それを使用して、所望のＤＮＡの転写調節または単離を引き起こし得る。
【０４４８】
Ｃａｓタンパク質は、完全な活性を有するＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
【０４４９】
「完全活性ＣＲＩＳＰＲ酵素」は、核酸、遺伝子または染色体を切断する元の野性型酵素機能と同一の機能を有する酵素を指す。すなわち、完全活性ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＤＮＡの二本鎖のうち第１鎖を切断する機能と、ＤＮＡの二本鎖のうち第２鎖を切断する第２機能との両方を有する状態を指す。
【０４５０】
人工的に操作されたＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントが、野性型酵素のように、ＤＮＡの二本鎖を切断する酵素であるとき、人工的に操作されたＣＲＩＳＰＲ酵素はまた、完全活性酵素に含まれ得る。
【０４５１】
人工的に操作されたＣＲＩＳＰＲ酵素は、ヌクレオチド配列の一部が欠失、置換または追加された酵素であり得る。
【０４５２】
人工的に操作されたＣＲＩＳＰＲ酵素は、アミノ酸配列のうち１または複数のアミノ酸が欠失、置換または追加された酵素であり得る。
【０４５３】
アミノ酸の追加された改変は、野性型酵素のＮ末端および／またはＣ末端、または、これの隣接領域であり得る。加えて、改変はそれらの組み合わせであり得る。
【０４５４】
ＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントは、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素と比較して改善された機能を有する完全活性酵素であり得る。
【０４５５】
例えば、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の特異的に改変または操作された種類、すなわちＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントは、切断されるべきＤＮＡ二本鎖の特定の距離の付近において、または、ＤＮＡ二本鎖との特異的結合を形成しながら、ＤＮＡ二本鎖を切断し得る。ここで、特異的結合は、酵素の特異的位置におけるアミノ酸の切断位置におけるＤＮＡヌクレオチド配列との結合であり得る。この場合、改変または操作された種類は、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素と比較して機能的活性が低下した完全活性ＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
【０４５６】
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、不完全または部分的活性ＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
【０４５７】
「不完全または部分的活性」とは、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の機能、すなわち、ＤＮＡ二本鎖の第１鎖を切断する第１機能、および、ＤＮＡ二本鎖の第２鎖を切断する第２機能から選択される１つを有する状態を意味する。この状態におけるＣＲＩＳＰＲ酵素は、不完全または部分的活性ＣＲＩＳＰＲ酵素と称され得る。加えて、不完全または部分的活性ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ニッカーゼと称され得る。
【０４５８】
「ニッカーゼ」は、標的遺伝子または核酸の二本鎖のうち一本鎖のみを切断するように操作または改変されたＣＲＩＳＰＲ酵素を指し、ニッカーゼは、一本鎖、例えば、標的遺伝子または核酸のｇＲＮＡとの非相補鎖または相補鎖を切断するヌクレアーゼ活性を有する。したがって、二本鎖を切断するには、２つのニッカーゼのヌクレアーゼ活性が必要である。
【０４５９】
例えば、ニッカーゼは、ＲｕｖＣドメインによって引き起こされるヌクレアーゼ活性を有し得る。すなわち、ニッカーゼは、ＨＮＨドメインによって引き起こされるヌクレアーゼ活性を有しないことがあり得て、したがって、ＨＮＨドメインは操作または改変され得る。
【０４６０】
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ヘリカーゼ活性、すなわち、上述のヌクレアーゼ活性以外に、二本鎖核酸のらせん構造を解く機能を有し得る。
【０４６１】
加えて、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のヘリカーゼ活性が完全活性、不完全もしくは部分的活性、または不活性になるように改変され得る。
【０４６２】
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列を有する核酸またはポリペプチド（またはタンパク質）であり得て、代表的には、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素である。
【０４６３】
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素の結晶構造は、２種類以上の天然の微生物ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素分子に関する研究（Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ３４３（６１７６）：１２４７９９７，  ２０１４）、および、ｇＲＮＡと複合化されたストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）に関する研究（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ，  １５６：９３５‐９４９，  ２０１４；Ａｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，２０１４，  ｄｏｉ：  １０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１３５７９）に従って決定された。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９であり得る。
【０４６４】
「Ｃａｓ９」は、ｇＲＮＡと結合して、標的遺伝子または核酸における標的配列または位置を切断または改変する酵素であり、ｇＲＮＡに結合する相補的な核酸鎖を切断可能なＨＮＨドメインと、ｇＲＮＡへの非相補的結合を有する核酸鎖を切断可能なＲｕｖＣドメインと、標的を認識可能なＲＥＣドメインと、ＰＡＭを認識可能なＰＩドメインとから成り得る。Ｃａｓ９の具体的な構造的特徴については、Ｈｉｒｏｓｈｉ  Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１４）  Ｃｅｌｌ  １５６：９３５‐９４９を参照されたい。
【０４６５】
ここで、ＲｕｖＣドメインは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素を有する、天然に存在する微生物ファミリーのメンバーと構造類似性を共有し、例えば、標的遺伝子または核酸の非相補鎖、すなわち、ｇＲＮＡとの相補結合を形成しない鎖などの一本鎖を切断する。ＲｕｖＣドメインは、当技術分野において、ＲｕｖＣＩドメイン、ＲｕｖＣＩＩドメイン、または、ＲｕｖＣＩＩＩドメインと称され、一般に、ＲｕｖＣＩ、ＲｕｖＣＩＩまたはＲｕｖＣＩＩＩと呼ばれる。ＨＮＨドメインは、ＨＮＨエンドヌクレアーゼと構造類似性を共有し、例えば、標的核酸分子の相補鎖、すなわち、ｇＲＮＡとの相補結合を形成する鎖など、一本鎖を切断する。ＨＮＨドメインは、ＲｕｖＣ  ＩＩとＩＩＩモチーフとの間に位置する。
【０４６６】
Ｃａｓ９は、完全活性Ｃａｓ９、または、不活性Ｃａｓ９であり得る。
【０４６７】
不活性Ｃａｓ９は、完全不活性化Ｃａｓ９、および、部分的不活性化Ｃａｓ９（例えばニッカーゼ）を含み得る。
【０４６８】
当該Ｃａｓ９は、ストレプトコッカス・ピオゲネス、ストレプトコッカス・サーモフィラス、ストレプトコッカスｓｐ．、スタフィロコッカス・アウレウス 、ノカルジオプシス‐ダッソンビエイ、ストレプトマイセス・プリスチナエスピラリス、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネ、ストレプトスポランジウム・ロゼウム、アリシクロバチルス・アシドカルダリウス、バチルス・シュードミコイデス、バチルス・セレニティレドセンス、エクシグオバクテリウム・シビリカム、ラクトバチルス・デルブルエッキイー、ラクトバチルス・サリバリウス、マイクロシーラ・マリナ、バークホルデリア・バクテリウム、ポラロモナス・ナフタレニボランス、ポラロモナスｓｐ．、クロコスファエラ・ワトソニー、クロコスファエラｓｐ．、ミクロキスティス・エルギノーサ、シネココッカスｓｐ．、アセトハロビウム・アラビティカム、アンモニフェックス・デゲンシ、カルディセルロシルプター・ベスシー、カンジダ・デスルフォルディス、クロストリジウム・ボツリナム、クロストリジウム・ディフィシル、フィネゴルディア・マグナ、ナトラナエロビウス・サーモフィルス、ペロトマクルム・サーモプロピオニカム、アシジチオバシラス・カルダス、アシディチオバチルス・フェロオキシダンス、アロクロマチウム・ビノスム、マリノバクターｓｐ．、ニトロソコッカス・ハロフィラス、ニトロソコッカス・ワトソニイ、シュードアルテロモナス・ハロプランクティス、クテドノバクター・ラセミファー、メタノハロビウム・エベスチガタム、アナベナ・バリアビリス、ノジュラリア・スプミゲナ、ノストックｓｐ．、アルスロスピラ・マキシマ、アルスロスピラ・プラテンシス、アルスロスピラｓｐ．、リングビアｓｐ．、ミクロコレウス・クソノプラステス、オシキラトリアｓｐ．、ペトロトガ・モビリス、サーモシフォ・アフリカヌス、または、アカリオクロリス・マリナなどの様々な微生物に由来し得るＣａｓ９である。
【０４６９】
Ｃａｓ９は、天然状態に存在する、または、組み換えもしくは合成方法によって非天然に生成された微生物から単離され得る。
【０４７０】
加えて、ＣＲＩＳＰＲ酵素はＶ型ＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。 Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲｕｖＣドメインに対応する同様のＲｕｖＣドメインを含み、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素のＨＮＨドメインの代わりにＮｕｃドメインと、標的を認識するＲＥＣおよびＷＥＤドメインと、ＰＡＭを認識するＰＩドメインとから成り得る。Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ酵素の具体的な構造特性については、Ｔａｋａｓｈｉ  Ｙａｍａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１６）  Ｃｅｌｌ  １６５：９４９‐９６２を参照されたい。
【０４７１】
Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ｇＲＮＡと相互作用し得て、それにより、ｇＲＮＡ‐ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体、すなわち、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成し、ｇＲＮＡと協働して、ＰＡＭ配列を含む標的配列にガイド配列が接近することを可能にし得る。ここで、標的遺伝子または核酸との相互作用のためのＶ型ＣＲＩＳＰＲ酵素の能力は、ＰＡＭ配列に依存する。ＰＡＭ配列は、標的遺伝子または核酸に存在する配列であり、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ酵素のＰＩドメインによって認識され得る。ＰＡＭ配列は、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ酵素の由来に従って変動し得る。すなわち、種に応じて特異的に認識されることが可能な異なるＰＡＭ配列がある。一例において、Ｃｐｆ１によって認識されるＰＡＭ配列は、５'‐ＴＴＮ‐３'（ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧ）であり得る。
【０４７２】
しかしながら、上述の酵素の由来に応じてＰＡＭが決定されることが一般的に理解されているが、進行している対応する起源に由来する酵素の変異体についての研究の結果に従って、ＰＡＭは変動し得る。
【０４７３】
Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ酵素はＣｐｆ１であり得る。当該Ｃｐｆ１は、ストレプトコッカス、カンピロバクター、ニトラチフラクター、スタフィロコッカス、パルビバクラム、ローズブリア、ナイセリア、グルコアセトバクター、アゾスピリラム、スフェロケタ、ラクトバシラス、ユーバクテリウム、コリネバクター、カルノバクテリウム、ロドバクター、リステリア、パルディバクター、クロストリジウム、ラクノスピラ、クロストリジウム、レプトトリキア、フランシセラ、レジオネラ、アリシクロバチルス、メタノメチオフィラス、ポルフィロモナス、プレボテラ、バクテロイデス、ヘルココッカス、レトスピラ、デススルホビブリオ、デスルフォナトロナム、オピトゥトゥス、チュベリバチルス、バチルス、ブレビバチルス、メチロバクテリウムまたはアシダミノコッカスに由来し得る。
【０４７４】
Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９のＲｕｖＣドメインと同様の対応するＲｕｖＣドメイン、Ｃａｓ９のＨＮＨドメイン無しのＮｕｃドメイン、標的を認識するＲＥＣドメイン、ＷＥＤドメイン、および、ＰＡＭを認識するＰＩドメインから成り得る。Ｃｐｆ１の具体的な構造特性については、Ｔａｋａｓｈｉ  Ｙａｍａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１６）  Ｃｅｌｌ  １６５：９４９‐９６２を参照されたい。
【０４７５】
Ｃｐｆ１は完全活性Ｃｐｆ１または不活性Ｃｐｆ１であり得る。
【０４７６】
不活性Ｃｐｆ１は、完全不活性化Ｃｐｆ１および部分不活性化Ｃｐｆ１（例えばニッカーゼ）を含み得る。
【０４７７】
Ｃｐｆ１酵素において、ＲｕｖＣ、Ｎｕｃ、ＷＥＤ、ＲＥＣおよび／またはＰＩドメインに存在するアミノ酸の１、２、またはより多くのアミノ酸が変異し得る。
【０４７８】
Ｃｐｆ１酵素は、ＦｎＣｐｆ１のアミノ酸のうちＤ９１７、Ｅ１００６またはＤ１２５５；ＡｓＣｐｆ１のアミノ酸のうちＤ９０８、Ｅ９９３またはＤ１２６３；ＬｂＣｐｆ１のアミノ酸のうちＤ８３２、Ｅ９２５、Ｄ９４７またはＤ１１８０；または、異なる各Ｃｐｆ１オーソログに対応するアミノ酸のグループにおける１、２、またはより多くのアミノ酸の変異を含み得る。
【０４７９】
Ｃａｓ９またはＣｐｆ１タンパク質のＣＲＩＳＰＲ酵素は、天然に存在する微生物から単離され得る、または、組み換えまたは合成方法によって非天然に生成され得る。
【０４８０】
Ｃａｓタンパク質、または、それをコードする核酸は、核において機能し得る。
【０４８１】
加えて、単離されたＣａｓタンパク質は、容易に細胞へ導入され得る。例として、Ｃａｓタンパク質は、細胞膜透過ペプチドまたはタンパク質形質導入ドメインに連結され得る。タンパク質形質導入ドメインは、ポリアルギニンまたはＨＩＶ由来ＴＡＴタンパク質であり得るが、本発明はこれに限定されない。上記の種類以外に、様々な種類の細胞膜透過ペプチドまたはタンパク質形質導入ドメインが当技術分野において知られているので、限定されないが、当業者によって、様々な例が明細書に適用され得る。
【０４８２】
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素を人工的に操作または改変することによって調製されたＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントであり得る。
【０４８３】
一例において、ＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントは、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素のアミノ酸配列のうち少なくとも１つのアミノ酸を置換、欠失および／または追加することによって調製され得る。
【０４８４】
ＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントは、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の機能、すなわち、ＤＮＡの二本鎖のうち第１鎖を切断する第１機能、および、ＤＮＡの二本鎖のうち第２鎖を切断する第２機能を改変するべく人工的に操作または改変されたＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントであり得る。
【０４８５】
加えて、ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は更に、ＣＲＩＳＰＲ酵素の先天的特性に加え、機能ドメインを任意で含み得て、そのようなＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、先天的特性に加えて追加的特性を有し得る。ここで、機能ドメインは、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性、または、核酸結合活性を有するドメイン、または、タンパク質（ペプチドを含む）を単離および精製するためのタグまたはレポーター遺伝子であり得るが、本発明はこれらに限定されない。タグは、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ‐Ｇタグおよびチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグを含み、レポーター遺伝子は、グルタチオン‐Ｓ‐トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチル基転移酵素（ＣＡＴ）βガラクトシダーゼ、βグルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、自家蛍光タンパク質（緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）および青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含む）を含むが、本発明はこれらに限定されない。
【０４８６】
機能ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、デアミナーゼであり得る。
【０４８７】
例えば、不完全または部分的なＣＲＩＳＰＲ酵素は、機能ドメインとしてシチジンデアミナーゼを追加的に含み得る。例示的な一実施形態において、シチジンデアミナーゼ、例えば、アポリポタンパク質Ｂ編集複合体１（ＡＰＯＢＥＣ１）は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼに追加され得て、それにより、融合タンパク質を生成する。それにより形成される［ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ］‐［ＡＰＯＢＥＣ１］は、塩基修復、または、ＣをＴもしくはＵにする編集、または、ＧをＡにする編集において使用され得る。
【０４８８】
別の例において、アデノシンデアミナーゼは更に、機能ドメインとして、不完全または部分的ＣＲＩＳＰＲ酵素に含まれ得る。例示的な実施形態として、融合タンパク質は、例えば、ＴａｄＡバリアント、ＡＤＡＲ２バリアント、ＡＤＡＴ２バリアントなどのアデノシンデアミナーゼをＳｐＣａｓ９ニッカーゼに追加することによって生成され得る。上に記載されるように調製される［ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ］‐［ＴａｄＡバリアント］‐［ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ］‐［ＡＤＡＲ２バリアント］または［ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ］‐［ＡＤＡＴ２バリアント］において、ヌクレオチドＡは、イノシンに改変され、改変されたイノシンは、ポリメラーゼによって、ヌクレオチドＧとして認識される。それにより、ヌクレオチドＡをＧへのヌクレオチド修正または編集を実質的に実行する効果が発揮され、改変されたイノシンは、ヌクレオチドＡのＧへのヌクレオチド修正または編集において、または、ヌクレオチドＴのＣへのヌクレオチド修正または編集において使用され得る。
【０４８９】
加えて、機能ドメインは、核局在配列もしくはシグナル（ＮＬＳ）、または、核外搬出配列もしくはシグナル（ＮＥＳ）であり得る。
【０４９０】
一例において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は１または複数のＮＬＳを含み得る。ここで、１または複数のＮＬＳは、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＮ末端もしくはその近位、酵素のＣ末端もしくはその近位、または、それらの組み合わせに含まれ得る。ＮＬＳは、以下のＮＬＳ、すなわち、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶを有するＳＶ４０ウイルスのラージＴ抗原のＮＬＳ、ヌクレオプラスミンからのＮＬＳ（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫを有するヌクレオプラスミン双節型ＮＬＳ）、アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤもしくはＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰを有するｃ‐ｍｙｃ  ＮＬＳ、配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹを有するｈＲＮＰＡ１  Ｍ９  ＮＬＳ、インポーチンαのＩＢＢドメインの配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ、筋腫Ｔタンパク質の配列ＶＳＲＫＲＰＲＰおよびＰＰＫＫＡＲＥＤ、ヒトｐ５３の配列ＰＯＰＫＫＫＰＬ、マウスｃ‐ａｂｌ  ＩＶの配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ、インフルエンザウイルスＮＳ１の配列ＤＲＬＲＲおよびＰＫＱＫＫＲＫ、Ｄ型肝炎ウイルス抗原の配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ、マウスＭｘ１タンパク質の配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ、ヒトポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼの配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ、または、ステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイドの配列に由来するＮＬＳ配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫに由来するＮＬＳ配列であり得るが、本発明はこれらに限定されない。
【０４９１】
本発明において説明されるＣＲＩＳＰＲ酵素またはＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、ポリペプチド、タンパク質、または、それをコードする配列を有する核酸であり得て、ＣＲＩＳＰＲ酵素またはＣＲＩＳＰＲ酵素変異体を導入するべく対象に対してコドン最適化され得る。
【０４９２】
「コドン最適化」という用語は、宿主細胞における発現を改善するように、天然配列の少なくとも１つのコドンを、宿主細胞においてより頻繁にまたは最も頻繁に使用されるコドンと置換しながら、天然アミノ酸配列を維持することによってヌクレオチド配列を改変するプロセスを指す。様々な種は、特定のアミノ酸の特定のコドンへの特定のバイアスを有し、コドンバイアス（生物間におけるコドン使用率の差異）は、翻訳されるコドンの特徴、および、特定のｔＲＮＡ分子の入手可能性に依存すると考えられる、ｍＲＮＡの翻訳の効率と頻繁に相関する。細胞において選択されるｔＲＮＡの優位性（ｄｏｍｉｎａｎｃｅ）は一般的に、ペプチド合成において最も頻繁に使用されるコドンを反映する。したがって、遺伝子は、コドン最適化に基づいて、所与の生物における最適な遺伝子発現によりカスタマイズされ得る。
【０４９３】
ｇＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ酵素は、ｇＲＮＡ‐ＣＩＲＳＰＲ酵素複合体を形成し得る。
【０４９４】
「ｇＲＮＡ‐ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体」は、ｇＲＮＡとＣＩＲＳＰＲ酵素との間の相互作用によって形成された複合体を指す。
【０４９５】
ｇＲＮＡ‐ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成され得る。
【０４９６】
ｇＲＮＡ‐ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体は、細胞における細胞質において形成され得る。
【０４９７】
ｇＲＮＡ‐ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体は、細胞における核において形成され得る。
【０４９８】
ｇＲＮＡ‐ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的遺伝子またはヌクレオチド配列に存在するＰＡＭを認識し得る。
【０４９９】
ｇＲＮＡ‐ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体において、ｇＲＮＡは、標的遺伝子またはヌクレオチド配列に相補的に結合し得る。
【０５００】
ｇＲＮＡ‐ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体が標的遺伝子またはヌクレオチド配列に結合するとき、ｇＲＮＡ‐ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体のＣＲＩＳＰＲ酵素によって標的化される遺伝子またはヌクレオチド配列は切断または改変され得る。
【０５０１】
別の例示的な実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ‐Ｃａｓシステムは、ｇＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ酵素の複合体を形成するリボ核タンパク質（ＲＮＰ）の形態で存在し得る。
【０５０２】
ここで開示される開示の例示的な一実施形態において、目的のタンパク質は、高発現分泌遺伝子を操作することによって発現され得る。
【０５０３】
目的のタンパク質を発現するために、高発現分泌遺伝子を操作するための組成物は、ｇＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ酵素に加えて、ドナーを更に含み得る。
【０５０４】
例えば、組成物は、肝臓において発現される高発現分泌遺伝子の群から選択される１または複数の遺伝子の標的配列のガイド核酸と、エディタータンパク質をコードするエディタータンパク質または核酸と、目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むドナーとを含み得る。「ドナー」とは、導入遺伝子を対象に挿入する必要がある配列を含む外因性ヌクレオチドを指す。ドナーは、導入遺伝子だけでなく、遺伝子転写および発現に影響する組み換え、および、配列に必要な配列も含む分子である。
【０５０５】
ドナー分子は、核酸の一種、すなわち、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。
【０５０６】
ドナー分子は、一本鎖または二本鎖であり得る。いくつかの場合において、ドナー分子は、一本鎖オリゴヌクレオチドＤＮＡ鋳型（ｓｓＯＤＴ）であり得る。
【０５０７】
ドナー分子は、ポリヌクレオチドまたはタンパク質の形態であり得る。
【０５０８】
ドナー分子は、線状、分岐状、または、環状であり得て、任意の長さを有し得る。
【０５０９】
ここで、線状ドナー分子が導入されるとき、ドナー配列の末端は、当業者に知られている方法によって保護され得る。例えば、１または複数のジデオキシヌクレオチド残基が、形成された分子の３'末端に追加され得て、自己相補性オリゴヌクレオチドが１つの端または両端に結合し得る。
【０５１０】
特定の例示的な実施形態において、ドナー分子の分解を保護するべく、追加的に、末端アミノ基の追加、および、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロアミダート、Ｏ‐メチルリボースまたはデオキシリボースヌクレオチド間連結の使用が含まれ得るが、本発明はこれに限定されない。
【０５１１】
ドナー分子は、デュプレックスを形成し、また、トリプレックス形成核酸を含み得る。
【０５１２】
ドナー配列は、任意の長さ、例えば、１０ｂｐ〜２０ｋｂ（または、１０ｂｐから２０ｋｂの間、または、２０ｋｂ以上の任意の整数）、好ましくは、約１００ｂｐ〜１０ｋｂ（または、１００ｂｐから１０ｋｂの間の任意の整数）、より好ましくは、約２００ｂｐ〜５ｋｂを有し得る。
【０５１３】
ドナーは、導入される対象に応じてコドン最適化され得る。例えば、対象がヒトであるとき、ヒトコドンによって最適化された配列を有するドナーであり得る。
【０５１４】
ここで開示される開示の例示的な一実施形態において、目的のタンパク質を発現するべく、導入遺伝子は、高発現分泌遺伝子を操作するための組成物に含まれるドナーに含まれ得る。
【０５１５】
「導入遺伝子」という用語は、高発現分泌遺伝子に挿入される外因性ヌクレオチドを指す。例えば、導入遺伝子は、エディタータンパク質およびガイド核酸を使用して、切断された肝細胞におけるゲノム切断部位に挿入され得る。
【０５１６】
導入遺伝子は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。
【０５１７】
導入遺伝子は、野性型肝細胞において生成されるタンパク質をコードする外因性ヌクレオチドであり得る。
【０５１８】
導入遺伝子は、野性型肝細胞を除く細胞において生成されるタンパク質をコードする外因性ヌクレオチドであり得る。
【０５１９】
導入遺伝子は、対象とは異なる種に由来し得る。
【０５２０】
導入遺伝子は野性型遺伝子であり得る。例えば、対象においてタンパク質の欠乏または欠如があるとき、対応するタンパク質をコードする正常遺伝子と同一である配列を有する導入遺伝子、すなわち野性型遺伝子がドナーに含まれ得る。
【０５２１】
導入遺伝子は、変異体遺伝子であり得る。ここで、変異は、野性型遺伝子の１または複数のヌクレオチドの欠失、置換、または追加であり得る。
【０５２２】
導入遺伝子は融合タンパク質であり得る。
【０５２３】
一例において、導入遺伝子と融合するタンパク質は、外因性遺伝子に由来し得る。
【０５２４】
別の例において、導入遺伝子と融合されたタンパク質は内在性遺伝子に由来し得る。
【０５２５】
例えば、導入遺伝子と融合されるタンパク質は、高発現分泌遺伝子に由来し得る。
【０５２６】
導入遺伝子と融合されるタンパク質は、外因性タンパク質のアミノ（Ｎ）末端またはその付近に存在し得る。
【０５２７】
導入遺伝子と融合されるタンパク質は、外因性タンパク質のカルボキシル（Ｃ）末端またはその付近に存在し得る。
【０５２８】
導入遺伝子に融合されたタンパク質は、外因性タンパク質のアミノ（Ｎ）末端およびカルボキシル（Ｃ）末端の両方、または、それらの付近に、または、それらの混合形態で存在し得る。
【０５２９】
導入遺伝子は、所望の特定の機能を強化または改善するための機能性遺伝子であり得る。
【０５３０】
一例において、導入遺伝子は、肝細胞における内在性遺伝子の機能を増強し得る。
【０５３１】
別の例において、導入遺伝子は、野性型遺伝子の発現を増加させるように機能し得る。例えば、導入遺伝子が、肝細胞におけるタンパク質欠乏をコードする遺伝子であるとき、欠乏タンパク質は、肝細胞において生成され得て、対応するタンパク質の機能は正常に作用し得る、または、対応する疾患が治療され得る。
【０５３２】
一例において、導入遺伝子は、変異遺伝子を修正するように機能し得る。
【０５３３】
別の例において、導入遺伝子は、標的遺伝子におけるゲノム配列の発現を調節するように機能し得る。
【０５３４】
一例において、導入遺伝子は、既存のタンパク質を置換する、または、新規タンパク質を発現するように機能し得る。
【０５３５】
加えて、１または複数の標的配列を部分的または完全に不活性化するために、導入遺伝子は高発現分泌遺伝子に挿入され得る。
【０５３６】
導入遺伝子は、目的のタンパク質をコードする遺伝子であり得る。
【０５３７】
目的のタンパク質は、身体における機能を強化するためのタンパク質であり得る。例えば、目的のタンパク質は、代謝作用の機能を増強し得る。
【０５３８】
目的のタンパク質は、疾患を防止するためのタンパク質であり得る。
【０５３９】
目的のタンパク質は、疾患を緩和するためのタンパク質であり得る。
【０５４０】
目的のタンパク質は、疾患を治療するためのタンパク質であり得る。
【０５４１】
ここで開示される開示の例示的な実施形態は、肝細胞を人工的に操作することによって、目的のタンパク質を発現することによって、疾患を治療するためのものである。
【０５４２】
明細書において、輸血、規則的な間隔でのタンパク質投与、および、対応する疾患に関与する因子を抑制するための抗体に基づく治療法などの、既存の代替的な治療法と比較して、疾患を治療するべく、治療用遺伝子を高発現分泌遺伝子に挿入することによって、対応する遺伝子を高いレベルで持続的に発現することによって、疾患が恒久的かつ徹底的に治療され得る。
【０５４３】
疾患の種類は以下の通りである。
【０５４４】
疾患は、抗体によって予防または治療できる疾患であり得る。抗体をコードする遺伝子を高発現分泌遺伝子に挿入して遺伝子を発現することによって、例えば、ＨＩＶ、アルツハイマー病、または、筋萎縮性側索硬化症などの疾患が治療され得る。
【０５４５】
疾患は、特定の遺伝子の発現の減少に起因して発生する疾患であり得る。例えば、分泌遺伝子産物の欠如によって引き起こされる疾患は、欠乏遺伝子を高発現分泌遺伝子に挿入して遺伝子を発現することによって治療され得る。
【０５４６】
疾患は、特定の遺伝子の変異に起因する正常機能の阻害によって発生する遺伝性疾患であり得る。一例において、単一遺伝子の様々な変異によって引き起こされる疾患は、野性型遺伝子を高発現分泌遺伝子に挿入し、遺伝子を発現することによって治療され得る。例えば、そのような遺伝性疾患は血友病であり得る。
【０５４７】
疾患は、遺伝性代謝異常に関連する疾患であり得る。
【０５４８】
「遺伝性代謝異常」は、身体の生化学的代謝経路を担う酵素または補酵素の欠乏に起因して生じる疾患である。遺伝性代謝異常は、最終的な産物が正常に生成されないことがあり得るので欠乏が生じ、不必要な前駆体が様々な主要臓器（脳、心臓、肝臓、腎臓など）に蓄積され、結果として知的障害などの過剰症状が生じる状態を指す。
【０５４９】
遺伝性代謝異常の例には、免疫不全、高コレステロール血症、血友病、肺気腫、嚢胞性線維症、フェニルケトン尿症、シトルリン血症、メチルマロン酸血症、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ欠損症、ハーラー症候群、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症、および、テイサックス病を含み得る。
【０５５０】
遺伝性代謝異常の他の例には、血友病Ａ、血友病Ｂ、血友病Ｃが含まれる。
【０５５１】
例えば、血友病Ａは、Ｘ染色体に位置するＦ８遺伝子の変異によって引き起こされ、血友病Ｂは、Ｆ８遺伝子の近くに位置するＦ９遺伝子の変異によって引き起こされ、血友病Ｃは、Ｆ１１遺伝子の変異によって引き起こされる。
【０５５２】
疾患はリソソーム蓄積症であり得る。
【０５５３】
リソソーム蓄積症は、ムコ多糖症、リソソーム酸性リパーゼ欠乏症、グリコーゲン貯蔵病、ガラクトース血症、鎌状赤血球貧血、嚢胞性線維症、テイサックス病、フェニルケトン尿症、白皮症、中鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠損症、ファーバー病、クラッベ病、ガラクトシアリドーシス、ガングリオシドーシス、アルファガラクトシダーゼ、ファブリー病、シンドラー病、サンドホフ病、ゴーシェ病、ニーマン・ピック病、スルファチドシス、異染性白質ジストロフィー、複数のスルファターゼ欠乏症、ハーラー症候群、シェーイ症候群、ハーラー・シェーイ症候群、ハンター症候群、サンフィリッポ症候群、モルキオ症候群、マロトーラミー症候群、スライ症候群、ヒアルロニダーゼ欠損症、ムコリピドーシス、シアリドーシス、Ｉ細胞疾患、疑似ハーラー多発性ジストロフィー、ムコリピジン１欠乏症、リピドーシス、サンタブオリ・ハルティア病、ヤンスキー・ビールショウスキー病、バッテン・スピルマイヤー・ヴォッグ病、クフ病、ウォルマン病、アルファマンノシドーシス、ベータマンノシドーシス、アスパルチルグルコサミヌリア、フコシドーシス、シスチン症、ピクノディスストーシス、サラ病、乳児遊離シアル酸蓄積症、ポンペ病、ダノン病、またはコレステロールエステル蓄積症であり得る。
【０５５４】
ここで開示される開示の例示的な実施形態として、ドナーに含まれる導入遺伝子は、遺伝性疾患を治療するための治療用遺伝子であり得る。
【０５５５】
治療用遺伝子は、特定の遺伝性疾患の治療剤として使用可能なタンパク質をコードし得る。
【０５５６】
治療用遺伝子は、特定の遺伝性疾患に関与する疾病遺伝子（正常遺伝子の変異型）の野性型遺伝子（正常遺伝子型）、または、野性型遺伝子の一部（例えば機能ドメイン）を含み得る。
【０５５７】
例示的な実施形態において、治療用遺伝子は、ＩＤＵＡ、Ｉ２Ｓ、ＳＧＳＨ、ＮＡＧＬＵ、ＨＧＳＮＡＴ、ＧＮＳ、ＧＡＬＮＳ、ＧＬＢ１、ＡＲＳＢ、ＧＵＳＢ、ＨＹＡＬ、ＮＥＵ、ＧＮＰＴＡＢおよびＭＣＯＬＮ１から成る群から選択され得る。
【０５５８】
別の例示的な実施形態において、治療用遺伝子は、ＳＡＨ１、ＧＡＬＣ、ＣＴＳＡ、ＧＬＡ、ＮＡＧＡ、ベータガラクトシダーゼ、ヘキソサミニダーゼ、ＧＢＡ、ＳＭＰＤ１、ＡＲＳＡ、ＳＵＭＦから成る群から選択され得る。
【０５５９】
更に別の例において、治療用遺伝子、すなわち、病因遺伝子の正常型は、ＮＰＣ、ＰＰＴ、ＴＰＰ１、ＣＬＮ３、ＣＬＮ６、ＰＰＴ１、ＤＮＡＪＣ５、ＣＴＳＦ、ＣＬＮ７、ＣＬＮ８およびＣＴＳＤから成る群から選択され得る。
【０５６０】
更に別の例において、治療用遺伝子、すなわち、病因遺伝子の正常型は、ＧＡＡまたはＬＡＭＰ２であり得る。
【０５６１】
更に別の例において、治療用遺伝子、すなわち、病因遺伝子の正常型は、ＣＴＮＳ、ＣＴＳＫまたはＳＬＣ１７Ａ５であり得る。
【０５６２】
更に別の例において、治療用遺伝子、すなわち、病因遺伝子の正常型が、ＭＡＮ２Ｂ、ＭＡＮ２Ｃ、ＭＡＮＢＡ、ＡＧＡ、ＦＵＣＡ１およびＬＡＬから成る群から選択され得る。
【０５６３】
更に別の例において、治療用遺伝子、すなわち、病因遺伝子の正常型は、メチルマロン酸尿症ＣｂＩＡ型（ＭＭＡＡ）タンパク質、メチルマロン酸尿症ＣｂＩＢ型（ＭＭＡＢ）タンパク質、メチルマロン酸尿症ＣｂＩＣ型（ＭＭＡＤＨＣ）タンパク質、５‐メチルテトラヒドロ葉酸‐ホモシステインメチルトランスフェラーゼレダクターゼ（ＭＴＲＲ）タンパク質、リソソーム膜タンパク質ドメイン（ＬＭＢＲＤ１）タンパク質、５‐メチルテトラヒドロ葉酸‐ホモシステインメチルトランスフェラーゼ（ＭＴＲ）タンパク質、プロピオニルＣｏＡタンパク質、グルコース‐６‐リン酸トランスポーター（Ｇ６ＰＴ）タンパク質、グルコース‐６‐ホスファターゼ（Ｇ６Ｐａｓｅ）タンパク質、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）タンパク質、低密度リポタンパク質受容体アダプタータンパク質１（ＬＤＬＲＡＰ‐１タンパク質）、Ｎ‐アセチルグルタミン酸シンセターゼ（ＮＡＧＳ）タンパク質、カルバモイルリン酸シンセターゼ１（ＣＰＳ１）タンパク質、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）タンパク質、アルギニノコハク酸シンセターゼ（ＡＳＳ）タンパク質、アルギニノコハク酸リアーゼ（ＡＳＬ）タンパク質、アルギナーゼ（ＡＲＧ１）タンパク質、溶質キャリアファミリー２５タンパク質、ＵＤＰグルクロノシルトランスフェラーゼ１ファミリー、ポリペプチドＡ１（ＵＧＴ１Ａ１）タンパク質、フマリルアセト酢酸加水分解酵素（ＦＡＨ）、アラニングリオキシレートアミノトランスフェラーゼ（ＡＧＸＴ）タンパク質、グリオキシル酸レダクターゼ／ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ（ＧＲＨＰＲ ）タンパク質、ＡＰＴａｓｅ  Ｃｕ（２＋）輸送ベータ（ＡＴＰ７Ｂ）タンパク質、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）タンパク質、リポタンパク質リアーゼ（ＬＰＬ）タンパク質から成る群から選択されるタンパク質をコードする遺伝子であり得る。
【０５６４】
更に別の例において、治療用遺伝子、すなわち、病因遺伝子の正常型は、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、ＦＸ、ＦＸＩ、ＦＸＩＩ、および、他の凝固因子から成る群から選択され得る。
【０５６５】
例えば、血友病の場合、導入遺伝子をコードする遺伝子は、内在性ＡＰＯＣ３遺伝子の座位に挿入され得て、ＡＰＯＣ３遺伝子の調節因子の発現により、高いタンパク質発現を有する。ここで、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、ＦＸ、ＦＸＩ、ＦＸＩＩを高いレベルで発現する、または、凝固因子の発現を助ける任意のペプチドまたはタンパク質は高発現し得る。
【０５６６】
例示的な一実施形態において、治療用遺伝子は、抗体をコードする遺伝子であり得る。
【０５６７】
治療用遺伝子は、抗体によって、疾患の発生に関与する特定の因子またはシグナル経路を阻害するタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子である。
【０５６８】
例えば、治療用遺伝子は、アルツハイマー病を治療するためにベータアミロイドと結合する抗体をコードする遺伝子であり得る。
【０５６９】
例えば、ＨＩＶを治療するために、治療用遺伝子は、ヌクレオシド類似体逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）のうち、ジドブジン（ＡＺＴ）、ジダノシン（ｄｄｌ）、ザルシタビン（ｄｄＣ）、ラミブジン（３ＴＣ）、スタブジン（ｄ４Ｔ）、アバカビル（ＴＤＦ）、もしくは、エムトリシタビン（ＦＴＣ）をコードする遺伝子、または、非ヌクレオシド類似体逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）のうち、ネビラピン（ＮＶＰ）もしくはエファビレンツ（ＥＦＶ）をコードする遺伝子、または、プロテアーゼ阻害剤のうち、サンキナビル（ＳＱＶ）、リトナビル（ＲＴＶ）、インディナビル（ＩＤＶ）、ネルフィナビル（ＮＦＶ）、ロピナビル（ＬＰＶ）、アタザナビル（ＡＴＶ）またはアンプレナビル（ＡＰＶ）をコードする遺伝子であり得る。
【０５７０】
別の例示的な実施形態において、治療用遺伝子は、野性型遺伝子の発現を調節する因子を挿入することによって、野性型遺伝子の発現を増加または減少させることによって、遺伝性疾患を治療し得る。
【０５７１】
更に別の例示的な実施形態において、治療用遺伝子は、野性型遺伝子の部分的配列を欠失、追加、または、置換することによって、改善された、または、新しい機能を有するタンパク質を生成することによって、遺伝性疾患を治療し得る。
【０５７２】
例えば、治療用遺伝子は、血液脳関門（ＢＢＢ）などの特定の組織に浸透できる特定のペプチド、または、治療用遺伝子の治療効果を改善可能な機能性ペプチドと融合され得る。
【０５７３】
ここで開示された開示の例示的な一実施形態において、ドナーは、標的ゲノムにおいて導入遺伝子を挿入および／または合成するための遺伝子を更に含み得る。
【０５７４】
標的ゲノムにおける導入遺伝子の挿入および／または合成は、相同組換え（ＨＤＲ）または非相同組換え（非相同末端結合；ＮＨＥＪ）によって引き起こされ得る。
【０５７５】
「組み換え」という用語は、非相同組換え（ＮＨＥＪ）および相同組換え（ＨＤＲ）によって挿入される導入遺伝子を含む、２つのポリヌクレオチド間で遺伝情報を交換するプロセスを指す。
【０５７６】
ここで開示される「非相同組換え（ＮＨＥＪ）」は、配列相同性を共有しない、または、部位特異的な組み換え配列において示されないＤＮＡ配列の間で生じる交換の特殊な形態を指す。
【０５７７】
ここで、導入遺伝子は、非相同組換えによって高発現分泌遺伝子に挿入され得る。
【０５７８】
例えば、導入遺伝子の部分的配列、および、標的遺伝子の部分的配列が同一であるとき、同一の部分的配列は、同一の部位特異的なヌクレアーゼによって切断され得て、導入遺伝子は、非相同組換えに起因して、標的遺伝子欠失配列またはそれに隣接する部位に挿入され得る。
【０５７９】
ここで開示される「相同組換え（ＨＤＲ）」は、例えば、相同組換え修復機構を通して、細胞における二本鎖切断修復中に生じる交換の特殊な形態を指す。
【０５８０】
ドナー配列は、導入遺伝子の相同組換えのためのホモロジーアームを含み得る。
【０５８１】
ホモロジーアームは、標的配列またはそれに隣接する配列と同一または相補的である配列を含み得る。
【０５８２】
ホモロジーアームは、標的配列またはそれに隣接する配列と相同であるが同一でない配列、または、標的配列と相同であるが完全に相同でない配列を含み得る。
【０５８３】
高発現分泌遺伝子と相同または同一の配列を有するホモロジーアームは、高発現分泌遺伝子の配列に対する、少なくとも１つのヌクレオチドのミスマッチを含み得る。
【０５８４】
特定の例示的な実施形態において、標的配列と相同のドナー配列の大部分は、置換されるゲノム配列に関して、約８０〜９９％（または、８０〜９０％の間の任意の値）の配列同一性を示す。
【０５８５】
ホモロジーアームは、標的配列と同一でない配列、すなわち導入遺伝子が標的配列に挿入される相同組換えを可能にし得る。
【０５８６】
例えば、ガイド核酸およびエディタータンパク質によって二本鎖が破壊される領域において、ドナー配列と相同の配列があるとき、導入遺伝子は、相同組換えによって、相同配列の隣の導入遺伝子配列に挿入され得る。
【０５８７】
ドナー分子は、高発現分泌遺伝子と相同であるいくつかの非連続領域を含み得る。
【０５８８】
ドナー配列に含まれるホモロジーアームは、高発現分泌遺伝子の切断部位における一方向（例えば上流）のヌクレオチド配列との相同性を有するヌクレオチド配列を含み得る。
【０５８９】
ドナー配列に含まれるホモロジーアームは、高発現分泌遺伝子の切断部位における異なる方向（例えば下流）のヌクレオチド配列との相同性を有するヌクレオチド配列を含み得る。
【０５９０】
ドナー配列に含まれるホモロジーアームは、高発現分泌遺伝子の切断部位の上流および下流のヌクレオチド配列の各々との相同性を有するヌクレオチド配列を含み得る。
【０５９１】
例えば、導入遺伝子が標的配列における切断部位の両側から３０ｂｐ以上離れた部位に挿入されるとき、ドナー配列における導入遺伝子の両端は、切断部位から３０ｂｐ離れた位置に存在する遺伝子配列と相同性を有する、または同一である配列を有するホモロジーアームを含む。
【０５９２】
ホモロジーアームの各々は、少なくとも１５ｂｐ〜約３ｋｂの長さ（例えば、約８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００ｂ、またはｂｐ長）を有する。
【０５９３】
一例において、ホモロジーアームはそれぞれ、５００〜１５００ｂｐ長であり得る。好ましくは、ホモロジーアームはそれぞれ、８００〜１２００ｂｐ長であり得る。
【０５９４】
一般的に、ホモロジーアームは、一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドとして提供され得る。鋳型である例示的な一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドは、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１５０、１１００、１１５０、１２００ｂもしくはｂｐ、または、少なくとも約８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０ｂｐもしくは１３００ｂｐの長さを有し得る。
【０５９５】
加えて、ここで開示される開示の例示的な一実施形態において、ドナーは更に、導入遺伝子に加えて、転写および発現を調節する遺伝子を含み得る。
【０５９６】
ドナーは、１または複数の遺伝子またはｃＤＮＡ分子を含み得て、コード領域または非コード領域を含み得る。
【０５９７】
ドナーは、遺伝子転写および発現を制御する調節配列、すなわち、エンハンサー、インスレーター、内部リボソーム進入部位、２Ａペプチドおよび／またはポリアデニル化シグナル、または、プロモーターをコードする配列を含み得る。
【０５９８】
加えて、ドナーは更に、レポーター遺伝子（例えばＧＦＰ）または選択マーカーを含み得る。
【０５９９】
ドナー配列による高発現分泌遺伝子への導入遺伝子の挿入は、ドナーにおける配列と、標的配列における標的配列との間の相同性領域の存在、および、その使用によって決定される。
【０６００】
［送達および送達方法］
ここで開示される開示の例示的な一実施形態において、ガイド核酸、エディタータンパク質および／またはドナー分子は、それをコードする配列を含むベクター、非ベクター、またはそれらの組み合わせによって、対象に送達または導入され得る。
【０６０１】
ガイド核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡの形態、または、その混合物の形態で対象に送達または導入され得る。
【０６０２】
エディタータンパク質は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ混合物、ペプチド、エディタータンパク質をコードするポリペプチド、または、タンパク質の形態で対象に送達または導入され得る。
【０６０３】
ドナーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または、一本鎖オリゴヌクレオチドＤＮＡ鋳型（ｓｓＯＤＴ）の形態で対象に送達または導入され得る。
【０６０４】
例えば、ドナーが対象に送達または導入されるとき、導入遺伝子の全部または一部は、組み換えを通して、標的遺伝子に挿入され得る。
【０６０５】
ガイド核酸、エディタータンパク質および／またはドナーは、様々な方法によって対象に送達され得る。
【０６０６】
ガイド核酸、エディタータンパク質および／またはドナーは、ベクターを使用することによって送達され得る。
【０６０７】
ここで、ベクターは、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターであり得る。
【０６０８】
ガイド核酸、エディタータンパク質、および／またはドナーは、非ベクターを使用することによって送達され得る。
【０６０９】
（１）ベクター
ベクターは、ウイルスまたは非ウイルスベクター（例えばプラスミド）であり得る。
【０６１０】
「ベクター」という用語は、遺伝子配列を細胞に送達し得る。典型的には、「ベクターコンストラクト」、「発現ベクター」、および、「遺伝子導入ベクター」は、目的の遺伝子の発現に関連し得て、遺伝子配列を標的細胞へ送達可能な任意の核酸コンストラクトを意味する。したがって、この用語は、すべてのクローニングおよび発現ビヒクルおよびベクターを含む。
【０６１１】
ベクターは、ガイド核酸、エディタータンパク質および／またはドナーをコードするヌクレオチド配列を含み得る。
【０６１２】
ここで、ガイド核酸、エディタータンパク質および／またはドナーは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの混合物であり得る。
【０６１３】
ガイド核酸、エディタータンパク質および／またはドナーは、同一または異なるベクターを使用することによって送達され得る。例えば、ドナーは、プラスミドによって送達され得るが、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質は、１または複数のウイルスベクターによって送達され得る。
【０６１４】
ガイド核酸、エディタータンパク質および／またはドナーは、１または複数のベクターを使用することによって送達または導入され得る。
【０６１５】
一例において、ガイド核酸、エディタータンパク質および／またはドナーは、同一のベクターを使用することによって送達または導入され得る。
【０６１６】
別の例において、ガイド核酸およびエディタータンパク質の両方は、ヌクレオチド配列の形態で１つのベクターを含み得て、ドナーは、異なるベクターを使用することによって送達または導入され得る。
【０６１７】
一例において、ガイド核酸およびドナーポリヌクレオチドの両方は、１つのベクターに含まれ得て、エディタータンパク質は、ヌクレオチド配列の形態で、異なるベクターを使用することによって送達または導入され得る。
【０６１８】
別の例において、エディタータンパク質およびドナーの両方は、ヌクレオチド配列の形態で、１つのベクターに含まれ得て、ガイド核酸は、異なるベクターを使用することによって送達または導入され得る。
【０６１９】
例えば、ガイド核酸、エディタータンパク質および／またはドナーは、それぞれ、異なるベクターに含まれ得る。
【０６２０】
ガイド核酸に含まれるすべてのドメインは、１つのベクターに含まれ得る、または、各ドメインは、異なるベクターに含まれ得る。
【０６２１】
エディタータンパク質の場合、エディタータンパク質をコードするヌクレオチド配列は、１つのベクターに含まれ得る、または、分割され、次いで、いくつかのベクターに含まれ得る。
【０６２２】
ベクターは、１または複数の調節／制御コンポーネントを含み得る。
【０６２３】
ここで、調節／制御成分は、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化シグナル、コザックコンセンサス配列、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、スプライシングアクセプターおよび／または２Ａ配列を含み得る。
【０６２４】
加えて、ベクターは更に、レポーター遺伝子（例えばＧＦＰ）またはベクターを含む宿主細胞を選択するための選択マーカーを含み得て、複製可能ベクターは更に、複製起点を含み得る。
【０６２５】
ベクターは、導入遺伝子の左側および右側、または、それに隣接するスプライシングアクセプター（ＳＡ）配列を含み得る。
【０６２６】
プロモーターは、標的領域における内在性プロモーターまたは外因性プロモーターであり得る。
【０６２７】
プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＩＩＩによって認識されるプロモーターであり得る。
【０６２８】
プロモーターは、構成的プロモーターであり得る。
【０６２９】
プロモーターは、誘導性プロモーターであり得る。
【０６３０】
プロモーターは、標的特異的プロモーターであり得る。
【０６３１】
プロモーターは、ウイルスまたは非ウイルスプロモーターであり得る。
【０６３２】
プロモーターとして、好適なプロモーターは、制御領域（すなわち、ガイド核酸、エディタータンパク質、または導入遺伝子）に応じて使用され得る。例えば、ガイド核酸に有用なプロモーターは、Ｈ１、ＥＦ‐１ａ、ｔＲＮＡまたはＵ６プロモーターであり得る。
【０６３３】
例えば、エディタータンパク質に有用なプロモーターは、ＣＭＶ、ＥＦ‐１ａ、ＥＦＳ、ＭＳＣＶ、ＰＧＫ、または、ＣＡＧプロモーターであり得る。例えば、導入遺伝子に有用なプロモーターは、ＡＰＯＣ３またはＨＰプロモーターであり得る。
【０６３４】
ベクターは、ウイルスベクターまたは組み換えウイルスベクターであり得る。ウイルスはＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスであり得る。
【０６３５】
ここで、ＤＮＡウイルスは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ウイルスまたは一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ウイルスであり得る。
【０６３６】
ここで、ＲＮＡウイルスは、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）ウイルスであり得る。
【０６３７】
ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、フォックスウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス、ワクチニアウイルス、または、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであり得るが、本発明は、これに限定されない。
【０６３８】
ウイルスを使用して、ガイド核酸、エディタータンパク質および／またはドナー分子が標的生物に導入されるとき、ガイド核酸、エディタータンパク質および／またはドナー分子は、対象において一時的に発現され得る。代替的に、ガイド核酸、エディタータンパク質および／またはドナー分子は、長時間にわたり持続的に発現し得る。例えば、ガイド核酸、エディタータンパク質および／またはドナー分子は、１、２もしくは３週間、１、２、３、４、５もしくは６ヶ月、１もしくは２年にわたって、または恒久的に発現し得る。
【０６３９】
ウイルスのパッケージング能力は、ウイルスの種類に従って、少なくとも２ｋｂから５０ｋｂまで変動し得る。そのようなパッケージング能力によれば、ガイド核酸を含むウイルスベクター、または、単独のエディタータンパク質を設計すること、または、ガイド核酸およびエディタータンパク質の両方を含むウイルスベクターを設計することが可能である。代替的に、ガイド核酸、エディタータンパク質、および、追加の成分を含むウイルスベクターが設計され得る。
【０６４０】
例えば、レトロウイルスベクターは、最大で６〜１０ｋｂの外来配列のパッケージング能力を有し、ｃｉｓ‐長末端反復（ＬＴＲ）から成る。そのようなレトロウイルスベクターは、治療用遺伝子を細胞に挿入し、恒久的な導入遺伝子発現を提供するために使用される。
【０６４１】
別の例において、ＡＡＶベクターは、細胞分裂に関係なく、様々な細胞（筋肉、脳、肝臓、肺、網膜、耳、心臓、血管など）における非常に高い形質導入効率に起因して、反復的に投与することができ、病原性が無く、ウイルスゲノムの大部分を治療用遺伝子と置換できるので免疫反応を誘発しない。加えて、ＡＡＶが標的細胞の染色体に挿入され、治療用タンパク質は長時間にわたって安定的に発現する。例えば、それは、以前はｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成されてきた核酸およびペプチドを、細胞の標的核酸へｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏで形質導入するのに有用である。しかしながら、ＡＡＶはサイズが小さく、４．５ｋｂ以下のパッケージング能力を有する。
【０６４２】
一例において、ガイド核酸、エディタータンパク質および／またはドナー分子をコードするヌクレオチド配列が、組み換えレンチウイルスによって、対象に送達または導入され得る。
【０６４３】
別の例において、ガイド核酸、エディタータンパク質および／またはドナー分子をコードするヌクレオチド配列は、組み換えアデノウイルスによって送達または導入され得る。
【０６４４】
一例において、ガイド核酸、エディタータンパク質および／またはドナー分子をコードするヌクレオチド配列が、組み換えＡＡＶによって送達または導入され得る。
【０６４５】
ベクターは、核酸、架橋型核酸（ＬＮＡ）、２'‐Ｏ‐メチル３'ホスホロチオエート（ＭＳ）、または、２'‐Ｏ‐メチル３'ｔｈｉｏＰＡＣＥ（ＭＳＰ）のホスホロチオエート結合などの改変を含み得る。
【０６４６】
ガイド核酸、エディタータンパク質および／またはドナー分子をコードするヌクレオチド配列は、非ウイルスベクターによって送達または導入され得る。
【０６４７】
非ウイルスベクターは、ガイド核酸、エディタータンパク質および／またはドナー分子をコードするヌクレオチド配列を含み得る。
【０６４８】
例えば、非ウイルスベクターは、プラスミドであり得て、追加的に、レポーター遺伝子、核酸標的配列を含み得る。これら以外に、他の添加剤が含まれ得る。
【０６４９】
（２）非ベクター
ガイド核酸、エディタータンパク質および／またはドナー分子は、非ベクターを使用することによって、対象に送達または導入され得る。
【０６５０】
ガイド核酸、エディタータンパク質および／またはドナー分子をコードするヌクレオチド配列が、非ベクターを使用することによって、対象に送達または導入され得る。
【０６５１】
非ベクターは、ネイキッドＤＮＡ、ＤＮＡ複合体、ｍＲＮＡまたはそれらの混合物であり得る。
【０６５２】
非ベクターは、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、遺伝子銃、ウイロゾーム、リポソーム、免疫リポゾーム、脂質媒介トランスフェクション、またはそれらの組み合わせによって対象に送達または導入され得る。
【０６５３】
一例において、非ベクターは、正電荷リポソーム法によって、対象に移入され得る。ＤＰＯＥは、正電荷の両親媒性分子、および、中性のヘルパー脂質から成るので、この方法は、安定的なリポソームを形成するために使用される。ここで、リポソームＤＮＡ複合体は正電荷なので、負電荷の細胞表面に結合して、エンドサイトーシスを通じて細胞に導入され得る。
【０６５４】
別の例において、ＤＮＡは、金粒子で被覆され、細胞に注入され得る。
【０６５５】
追加的に、ＥｎＧｅｎｅＩＣ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｖｅｈｉｃｌｅ（ＥＤＶ）に送達される核酸は、パッケージングされてから、送達または導入され得る。具体的には、ＥＤＶは、その二重特異性抗体を使用することによって標的組織に送達され、抗体の一方のアームは、標的組織に対する特異性を有し、他方のアームは、ＥＤＶに対する特異性を有する。抗体は、標的細胞の表面にＥＤＶを運搬し、次に、ＥＤＶは、エンドサイトーシスによって細胞に入り得る。
【０６５６】
ガイド核酸‐エディタータンパク質複合体は、核酸およびタンパク質の混合物の形態で対象に送達または導入されるように形成され得る。
【０６５７】
ガイド核酸およびエディタータンパク質は、核酸タンパク質混合物の形態で対象に送達または導入され得る。
【０６５８】
代替的に、ガイド核酸およびエディタータンパク質は、ガイド核酸‐エディタータンパク質複合体の形態で、対象に送達または導入され得る。
【０６５９】
ガイド核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または、それらの混合物であり得る。加えて、エディタータンパク質は、ポリヌクレオチドまたはタンパク質の形態であり得る。
【０６６０】
例示的な一実施形態において、ＲＮＡ型ガイド核酸およびタンパク質型エディタータンパク質は、ガイド核酸‐エディタータンパク質複合体、すなわち、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）の形態で対象に送達または導入され得る。
【０６６１】
（３）送達方法
ｉｎ  ｖｉｖｏ送達方法
ガイド核酸およびエディタータンパク質は、ガイド核酸およびエディタータンパク質、または、ガイド核酸‐エディタータンパク質複合体（リボ核タンパク質（ＲＮＰ））をコードする核酸を含むベクターまたは非ベクターの形態で対象に直接投与され得る。
【０６６２】
加えて、ドナー分子は、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質の両方または各々をコードするヌクレオチド配列を含むベクターまたは非ベクターの形態で対象に直接投与され得る。
【０６６３】
注射は、全身投与または局所適用を通じて、対象への送達または導入によって実行され得る。しかしながら、本発明はこれに限定されない。
【０６６４】
全身投与は、例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、または、皮下注射であり得る。好ましくは静脈内全身投与が使用される。
【０６６５】
ガイド核酸、エディタータンパク質および／またはドナー分子が２つ以上の異なるベクターに含まれるとき、それらは、異なる経路（筋肉内注射、尾静脈注射、他の静脈内注射、および／または腹腔内注射）を介して投与され得る。
【０６６６】
加えて、ガイド核酸、エディタータンパク質および／またはドナー分子が２つ以上の異なるベクターに含まれるとき、それらは、同時に、または、ランダムで順次に送達され得る。
【０６６７】
ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ送達方法
ガイド核酸、エディタータンパク質および／またはドナー分子は、対象個人から体外移植された細胞、または、多能性造血幹細胞に送達され得て、次に、細胞は対象に再移植され得る。
【０６６８】
当該送達方法は、ｉ）ガイド核酸、エディタータンパク質および／またはドナー分子を細胞に接触させ、ｉｉ）接触した細胞を対象に直接投与することによって、対象に送達するのに使用され得る。
【０６６９】
具体的には、細胞内で接触させる段階において、ガイド核酸およびエディタータンパク質は、ガイド核酸または／およびエディタータンパク質、または、ガイド核酸‐エディタータンパク質複合体（リボ核タンパク質（ＲＮＰ））をコードするヌクレオチド配列を含むベクターまたは非ベクターの形態で細胞に導入され得る。代替的に、ドナー分子は、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質の両方または各々をコードするヌクレオチド配列を含むベクターまたは非ベクターの形態で細胞に導入され得る。
【０６７０】
例えば、ガイド核酸およびエディタータンパク質がベクターの形態で細胞に導入されるとき、接触させる段階（ｉ）は、エレクトロポレーション、リポソーム、ナノ粒子、および、タンパク質移行ドメイン（ＰＴＤ）融合タンパク質法から選択される１または複数の方法によって実行され得る。
【０６７１】
別の例において、ガイド核酸およびエディタータンパク質がベクターの形態で細胞に導入されるとき、接触させる段階（ｉ）は、プラスミドである非ウイルスベクター、および、ウイルスベクターから成る群から選択される１または複数によって実行され得る。
【０６７２】
段階ｉｉは、段階ｉにおいて取得された、接触させた細胞を対象に直接投与するためのものであり、細胞は、全身投与または局所適用によって対象に送達または導入され得る。しかしながら、本発明はこれに限定されない。
【０６７３】
全身投与は、例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内または皮下内注射であり得る。好ましくは、静脈内全身投与が使用される。
【０６７４】
ここで開示される開示は、ガイド核酸、エディタータンパク質および／またはドナーを対象に導入または送達することによって改変された対象を含む。
【０６７５】
改変された対象は、導入遺伝子を肝細胞ゲノムに挿入することによって取得され得る。
【０６７６】
改変された対象の１つの具体例は、人工的に操作された肝細胞である。
【０６７７】
改変された肝細胞は、人工的に操作された高発現分泌遺伝子を含む肝細胞であり得る。
【０６７８】
人工的に操作された高発現分泌遺伝子は、導入遺伝子が高発現分泌遺伝子に挿入された遺伝子であり得る。
【０６７９】
人工的に操作された遺伝子は、高発現分泌遺伝子のコード領域に導入された導入遺伝子を有し得る。
【０６８０】
一例において、導入遺伝子は、高発現分泌遺伝子のエクソン領域にあり得る。
【０６８１】
例えば、高発現分泌遺伝子のうち、ＡＰＯＣ３遺伝子のコード配列には、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４があり得る。
【０６８２】
導入遺伝子は、ＡＰＯＣ３遺伝子のエクソン１に位置し得る。
【０６８３】
導入遺伝子は、ＡＰＯＣ遺伝子のエクソン２に位置し得る。
【０６８４】
導入遺伝子は、ＡＰＯＣ遺伝子のエクソン３であり得る。
【０６８５】
導入遺伝子は、ＡＰＯＣ遺伝子のエクソン４に位置し得る。
【０６８６】
別の例において、高発現分泌遺伝子のうち、ＨＰ遺伝子のコード配列には、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、および、エクソン５があり得る。
【０６８７】
ここで、導入遺伝子は、ＨＰ遺伝子のエクソン１に位置し得る。
【０６８８】
ここで、導入遺伝子は、ＨＰ遺伝子のエクソン２に位置し得る。
【０６８９】
ここで、導入遺伝子は、ＨＰ遺伝子のエクソン３に位置し得る。
【０６９０】
ここで、導入遺伝子は、ＨＰ遺伝子のエクソン４に位置し得る。
【０６９１】
ここで、導入遺伝子は、ＨＰ遺伝子のエクソン５に位置し得る。
【０６９２】
加えて、人工的に操作された遺伝子は、導入遺伝子が高発現分泌遺伝子の非コード配列に挿入される形態であり得る。
【０６９３】
導入遺伝子は、プロモーター、エンハンサー、イントロン、３'ＵＴＲ、ポリＡ尾部、または、それらの混成に位置する領域に導入され得る。
【０６９４】
一例において、導入遺伝子は、高発現分泌遺伝子のイントロン領域に挿入され得る。
【０６９５】
例えば、高発現分泌遺伝子のうちＡＰＯＣ３遺伝子のコード配列に位置するイントロン１、イントロン２、および、イントロン３など、３つのイントロンがあり得る。
【０６９６】
ここで、導入遺伝子は、ＡＰＯＣ３遺伝子のイントロン１に位置し得る。
【０６９７】
ここで、導入遺伝子は、ＡＰＯＣ３遺伝子のイントロン２に位置し得る。
【０６９８】
ここで、導入遺伝子は、ＡＰＯＣ３遺伝子のイントロン３に位置し得る。
【０６９９】
別の例において、イントロン１、イントロン２、イントロン３およびイントロン４は、高発現分泌遺伝子のうち、ＨＰ遺伝子のコード配列に位置し得る。
【０７００】
ここで、導入遺伝子は、ＨＰ遺伝子のイントロン１に位置し得る。
【０７０１】
ここで、導入遺伝子は、ＨＰ遺伝子のイントロン２に位置し得る。
【０７０２】
ここで、導入遺伝子は、ＨＰ遺伝子のイントロン３に位置し得る。
【０７０３】
ここで、導入遺伝子は、ＨＰ遺伝子のイントロン４に位置し得る。
【０７０４】
導入遺伝子は、エクソン、イントロン、または、それら両方に挿入され得る。
【０７０５】
一例において、導入遺伝子は、ＡＰＯＣ３遺伝子のエクソンおよびイントロン領域の両方に位置し得る。
【０７０６】
導入遺伝子は、ＡＰＯＣ３遺伝子のエクソン１およびイントロン１領域の両方に位置し得る。
【０７０７】
導入遺伝子は、ＡＰＯＣ３遺伝子のイントロン１およびエクソン２領域の両方に位置し得る。
【０７０８】
導入遺伝子は、ＡＰＯＣ３遺伝子のエクソン２およびイントロン２領域の両方に位置し得る。
【０７０９】
導入遺伝子は、ＡＰＯＣ３遺伝子のイントロン２およびエクソン３領域の両方に位置し得る。
【０７１０】
導入遺伝子は、ＡＰＯＣ３遺伝子のエクソン３およびイントロン３領域の両方に位置し得る。
【０７１１】
導入遺伝子は、ＡＰＯＣ３遺伝子のイントロン３およびエクソン４領域の両方に位置し得る。
【０７１２】
別の例において、導入遺伝子は、ＨＰ遺伝子のエクソンおよびイントロン領域の両方に位置し得る。
【０７１３】
導入遺伝子は、ＨＰ遺伝子のエクソン１およびイントロン１領域の両方に位置し得る。
【０７１４】
導入遺伝子は、ＨＰ遺伝子のイントロン１およびエクソン２領域の両方に位置し得る。
【０７１５】
導入遺伝子は、ＨＰ遺伝子のエクソン２およびイントロン２領域の両方に位置し得る。
【０７１６】
導入遺伝子は、ＨＰ遺伝子のイントロン２およびエクソン３領域の両方に位置し得る。
【０７１７】
導入遺伝子は、ＨＰ遺伝子のエクソン３およびイントロン３領域の両方に位置し得る。
【０７１８】
導入遺伝子は、ＨＰ遺伝子のイントロン３およびエクソン４領域の両方に位置し得る。
【０７１９】
導入遺伝子は、ＨＰ遺伝子のエクソン４およびイントロン４領域の両方に位置し得る。
【０７２０】
導入遺伝子は、ＨＰ遺伝子のイントロン４およびエクソン５領域の両方に位置し得る。
【０７２１】
加えて、導入遺伝子は、高発現分泌遺伝子の変異部分（例えば、野性型遺伝子とは異なる部分）を含む領域に挿入され得る。
【０７２２】
加えて、導入遺伝子は、高発現分泌遺伝子のヌクレオチド配列におけるＰＡＭ配列の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の１０〜３５ヌクレオチドの配列に挿入され得る。
【０７２３】
ここで、ＰＡＭ配列は、例えば、以下の配列（５'から３'の方向に記載される）のうち１または複数であり得る。
【０７２４】
ＮＧＧ（ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧ）
ＮＮＮＮＲＹＡＣ（Ｎの各々は、独立して、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＲはＡまたはＧであり、ＹはＣまたはＴである）
ＮＮＡＧＡＡＷ（Ｎの各々は、独立して、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＷはＡまたはＴである）
ＮＮＮＮＧＡＴＴ（Ｎの各々は、独立して、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧである）
ＮＮＧＲＲ（Ｔ）（Ｎの各々は、独立して、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＲはＡまたはＧであり、ＹはＣまたはＴである）
ＴＴＮ（ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧである）
【０７２５】
ここで、導入遺伝子は、１０〜３５ヌクレオチド、１５〜３５ヌクレオチド、２０〜３５ヌクレオチド、２５〜３５ヌクレオチド、または、３０〜３５ヌクレオチドの配列にあり得る。
【０７２６】
代替的に、導入遺伝子は、１０〜１５ヌクレオチド、１５〜２０ヌクレオチド、２０〜２５ヌクレオチド、２５〜３０ヌクレオチド、または、３０〜３５ヌクレオチドの配列にあり得る。
【０７２７】
例示的な一実施形態において、エディタータンパク質を認識するＰＡＭ配列が５'‐ＮＧＧ‐３'、５'‐ＮＡＧ‐３'、および／または、５'‐ＮＧＡ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）であるとき、導入遺伝子は、ＨＰ遺伝子のヌクレオチド配列における５'‐ＮＧＧ‐３'、５'‐ＮＡＧ‐３'、および／または、５'‐ＮＧＡ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の１０〜２５ヌクレオチドに位置し得る。
【０７２８】
別の例示的な実施形態において、エディタータンパク質を認識するＰＡＭ配列が５'‐ＮＧＧＮＧ‐３'および／または５'‐ＮＮＡＧＡＡＷ‐３'（Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）であるとき、導入遺伝子は、ＨＰ遺伝子のヌクレオチド配列における５'‐ＮＧＧＮＧ‐３'および／または５'‐ＮＮＡＧＡＡＷ‐３'（Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の１０〜２５ヌクレオチドに位置し得る。
【０７２９】
更に別の例示的な実施形態において、エディタータンパク質を認識するＰＡＭ配列が５'‐ＮＮＮＮＧＡＴＴ‐３'および／または５'‐ＮＮＮＧＣＴＴ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）であるとき、導入遺伝子は、ＨＰ遺伝子のヌクレオチド配列における５'‐ＮＮＮＮＧＡＴＴ‐３'および／または５'‐ＮＮＮＧＣＴＴ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の１０〜２５ヌクレオチドに位置し得る。
【０７３０】
例示的な一実施形態において、エディタータンパク質を認識するＰＡＭ配列が５'‐ＮＮＮＶＲＹＡＣ‐３'（Ｖ＝Ｇ、ＣまたはＡ；Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｙ＝ＣまたはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）であるとき、導入遺伝子は、ＨＰ遺伝子のヌクレオチド配列における５'‐ＮＮＮＶＲＹＡＣ‐３'（Ｖ＝Ｇ、ＣまたはＡ；Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｙ＝ＣまたはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する１０〜２５の連続ヌクレオチドに位置し得る。
【０７３１】
別の例示的な実施形態において、エディタータンパク質を認識するＰＡＭ配列が５'‐ＮＡＡＲ‐３'（Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）であるとき、導入遺伝子は、ＨＰ遺伝子のヌクレオチド配列における５'‐ＮＡＡＲ‐３'（Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の１０〜２５ヌクレオチドに位置し得る。
【０７３２】
更に別の例示的な実施形態において、エディタータンパク質を認識するＰＡＭ配列が５'‐ＮＮＧＲＲ‐３'、５'‐ＮＮＧＲＲＴ‐３'、および／または、５'‐ＮＮＧＲＲＶ‐３'（Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｖ＝Ｇ、ＣまたはＡ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）であるとき、導入遺伝子は、ＨＰ遺伝子のヌクレオチド配列における５'‐ＮＮＧＲＲ‐３'、５'‐ＮＮＧＲＲＴ‐３'、および／または、５'‐ＮＮＧＲＲＶ‐３' （Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｖ＝Ｇ、ＣまたはＡ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の１０〜２５ヌクレオチドに位置し得る。
【０７３３】
例示的な一実施形態において、エディタータンパク質を認識するＰＡＭ配列が５'‐ＴＴＮ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）であるとき、導入遺伝子は、ＨＰ遺伝子のヌクレオチド配列における５'‐ＴＴＮ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の１０〜２５ヌクレオチドに位置し得る。
【０７３４】
別の例において、導入遺伝子は、ＡＰＯＣ３遺伝子のヌクレオチド配列におけるＰＡＭ配列の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の１０〜２５ヌクレオチドの配列にあり得る。
【０７３５】
例示的な一実施形態において、エディタータンパク質を認識するＰＡＭ配列が５'‐ＮＧＧ‐３'、５'‐ＮＡＧ‐３'、および／または、５'‐ＮＧＡ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）であるとき、導入遺伝子は、ＡＰＯＣ３遺伝子のヌクレオチド配列における５'‐ＮＧＧ‐３'、５'‐ＮＡＧ‐３'、および／または、５'‐ＮＧＡ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の１０〜２５ヌクレオチドに位置し得る。
【０７３６】
別の例示的な実施形態において、エディタータンパク質を認識するＰＡＭ配列が５'‐ＮＧＧＮＧ‐３'および／または５'‐ＮＮＡＧＡＡＷ‐３'（Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）であるとき、導入遺伝子は、ＡＰＯＣ３遺伝子のヌクレオチド配列における５'‐ＮＧＧＮＧ‐３'および／または５'‐ＮＮＡＧＡＡＷ‐３'（Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の１０〜２５ヌクレオチドに位置し得る。
【０７３７】
更に別の例示的な実施形態において、エディタータンパク質を認識するＰＡＭ配列が５'‐ＮＮＮＮＧＡＴＴ‐３'および／または５'‐ＮＮＮＧＣＴＴ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）であるとき、導入遺伝子は、ＡＰＯＣ３遺伝子のヌクレオチド配列における５'‐ＮＮＮＮＧＡＴＴ‐３'および／または５'‐ＮＮＮＧＣＴＴ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の１０〜２５ヌクレオチドに位置し得る。
【０７３８】
例示的な一実施形態において、エディタータンパク質を認識するＰＡＭ配列が５'‐ＮＮＮＶＲＹＡＣ‐３'（Ｖ＝Ｇ、ＣまたはＡ；Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｙ＝ＣまたはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）であるとき、導入遺伝子は、ＡＰＯＣ３遺伝子のヌクレオチド配列における５'‐ＮＮＮＶＲＹＡＣ‐３'（Ｖ＝Ｇ、ＣまたはＡ；Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｙ＝ＣまたはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する１０〜２５の連続ヌクレオチドに位置し得る。
【０７３９】
別の例示的な実施形態において、エディタータンパク質を認識するＰＡＭ配列が５'‐ＮＡＡＲ‐３'（Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）であるとき、導入遺伝子は、ＡＰＯＣ３遺伝子のヌクレオチド配列における５'‐ＮＡＡＲ‐３'（Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の１０〜２５ヌクレオチドに位置し得る。
【０７４０】
更に別の例示的な実施形態において、エディタータンパク質を認識するＰＡＭ配列が５'‐ＮＮＧＲＲ‐３'、５'‐ＮＮＧＲＲＴ‐３'、および／または、５'‐ＮＮＧＲＲＶ‐３'（Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｖ＝Ｇ、ＣまたはＡ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）であるとき、標的配列は、ＡＰＯＣ３遺伝子のヌクレオチド配列における５'‐ＮＮＧＲＲ‐３'、５'‐ＮＮＧＲＲＴ‐３'、および／または、５'‐ＮＮＧＲＲＶ‐３' （Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｖ＝Ｇ、ＣまたはＡ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の１０〜２５ヌクレオチドにおいて導入遺伝子を有し得る。
【０７４１】
例示的な一実施形態において、エディタータンパク質を認識するＰＡＭ配列が５'‐ＴＴＮ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）であるとき、標的配列は、ＡＰＯＣ３遺伝子のヌクレオチド配列における５'‐ＴＴＮ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の１０〜２５ヌクレオチドにおいて導入遺伝子を有し得る。
【０７４２】
改変された肝細胞は、人工的に操作された高発現分泌遺伝子によって発現されるタンパク質（以降、「人工発現タンパク質」と称される）を含む肝細胞であり得る。
【０７４３】
人工発現タンパク質において、高発現分泌遺伝子および／または導入遺伝子が発現される。
【０７４４】
一例において、肝細胞は、導入遺伝子を発現することによって生成されるタンパク質を含み得る。
【０７４５】
別の例において、肝細胞は、導入遺伝子を発現することによって生成されるタンパク質、および、人工的に操作された高発現分泌遺伝子を発現することによって生成されるタンパク質の両方を含み得る。
【０７４６】
加えて、高発現分泌遺伝子の発現量は、人工的操作によって調節され得る。
【０７４７】
一例において、高発現分泌遺伝子の発現量は、高発現分泌遺伝子が人工的に操作される前より高いことがあり得る。
【０７４８】
別の例において、高発現分泌遺伝子の発現量は、高発現分泌遺伝子が人工的に操作される前より低いことがあり得る。
【０７４９】
加えて、目的の発現タンパク質は、肝細胞に存在する遺伝子の野性型タンパク質であり得る。
【０７５０】
一例において、予め定められたレベル以下で肝細胞において発現するタンパク質は、目的のタンパク質の発現による、発現量の増加を示し得る。
【０７５１】
別の例において、肝細胞に存在する遺伝子が変異し、異常機能を有するとき、野性型遺伝子が発現し得て、それにより、正常機能を有し得る。この場合、肝細胞には、変異タンパク質および野性型タンパク質の両方があり得る。代替的に、肝細胞における変異タンパク質は、発現されないことがあり得るが、野性型タンパク質は発現され得る。
【０７５２】
代替的に、目的の発現タンパク質は、肝細胞において発現されない新しいタンパク質であり得る。
【０７５３】
一例において、目的の発現タンパク質は治療用タンパク質であり得る。ここで、治療用タンパク質は、肝細胞において天然に発現されないタンパク質であり、遺伝性疾患を含む疾患を治療、軽減または防止するために使用され得る。
【０７５４】
目的の発現タンパク質は、（野性型タンパク質を部分的に改変することによって生成される）変異タンパク質であり得る。
【０７５５】
一例において、目的の発現タンパク質は、いくつかの野性型遺伝子のヌクレオチドを部分的に改変することによって発現されるタンパク質であり得る。
【０７５６】
例えば、野性型タンパク質と比較して、変異タンパク質のいくつかの機能が強化され得る。
【０７５７】
目的の発現タンパク質は、融合タイプのタンパク質であり得る。
【０７５８】
一例において、目的のタンパク質は、対象における内在性遺伝子を外来遺伝子と結合することによって発現される融合タンパク質であり得る。
【０７５９】
別の例において、目的のタンパク質は、外来遺伝子を共に結合することによって発現される融合タンパク質であり得る。
【０７６０】
例えば、目的のタンパク質は、異なる内在性遺伝子を結合することによって発現される融合タンパク質であり得る。
【０７６１】
したがって、ここで開示される開示は、人工的に操作された高発現分泌遺伝子によって改変される肝細胞を含む。
【０７６２】
加えて、ここで開示される開示は、改変された肝細胞によって改変される肝臓組織を含む。
【０７６３】
加えて、ここで開示される開示は、改変された肝臓組織によって改変される肝臓を含む。
【０７６４】
ここで、肝臓は、部分的または全体的に改変され得る。
【０７６５】
［目的のタンパク質を発現する方法］
ここで開示される開示の例示的な一実施形態は、肝臓における目的のタンパク質を発現する方法に関連する。
【０７６６】
当該方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで実行される。
【０７６７】
いくつかの実施形態において、方法は、ｉ）プログラム可能ヌクレアーゼおよび導入遺伝子を臓器、組織または細胞に導入する段階を含む。
【０７６８】
例示的な一実施形態において、方法は、段階ｉとして、（ａ）高発現分泌遺伝子の群から選択される１または複数の遺伝子のヌクレオチド配列と同一の配列と相補結合を形成する、または、それを含むガイド核酸と、（ｂ）エディタータンパク質またはそれをコードする核酸と、（ｃ）導入遺伝子を含むドナーとを対象に導入する段階を含み得る。
【０７６９】
１または複数の遺伝子は、ＦＴＬ、ＦＴＨ１、ＡＣＴＢ、ＨＰ、ＡＰＯＣ３、ＳＯＤ２、ＯＲＭ１、Ｆ９などの高発現分泌遺伝子から選択され得る。好ましくは、遺伝子は、ＡＰＯＣ３またはＨＰ遺伝子であり得る。
【０７７０】
ガイド核酸（ａ）は、配列識別番号１〜３４８の標的配列と同一の配列を有し得る、または、それと相補結合を形成し得るガイド核酸を含み得る。 エディタータンパク質（ｂ）は、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィラス由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・アウレウス由来Ｃａｓ９タンパク質、ナイセリア・メニンジティディス由来Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質から成る群から選択される１または複数のエディタータンパク質を含み得る。 導入遺伝子（ｃ）は、目的のタンパク質をコードする遺伝子であり得る。例えば、導入遺伝子は治療用遺伝子であり得る。
【０７７１】
治療用遺伝子の説明は上に記載した通りである。
【０７７２】
遺伝子を操作するための組成物の説明は、上に記載の通りである。
【０７７３】
導入段階はｉｎ  ｖｉｖｏで実行され得る。
【０７７４】
ここで、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、ベクターまたは非ベクターによって送達され得る。
【０７７５】
ベクター、非ベクターおよび送達方法の説明は、上記と同一である。
【０７７６】
肝臓において目的のタンパク質を発現する方法は更に、段階ｉ）によって改変された臓器、組織または細胞における導入遺伝子発現を確認する段階を含み得る。
【０７７７】
ここで、段階ｉｉ）において、段階ｉにおいて改変された臓器または組織は、導入遺伝子が天然状態の臓器または組織ゲノムに挿入された臓器または組織であり得る。
【０７７８】
段階ｉ）において改変された臓器または組織は導入遺伝子を含み得る。
【０７７９】
ここで、改変された臓器または組織に含まれる導入遺伝子は、改変された臓器または組織において発現され得る。
【０７８０】
改変された臓器または組織における導入遺伝子の発現は、導入遺伝子のｍＲＮＡまたはタンパク質発現によって確認され得る。
【０７８１】
導入遺伝子のｍＲＮＡ発現を確認する方法として、ＰＣＲが使用され得る。
【０７８２】
導入遺伝子のタンパク質発現を確認する方法として、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡまたはＩＰが使用され得る。
【０７８３】
別の例において、方法は、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏによって実行され得る。ここで、目的のタンパク質を発現させるために、人工的に操作された肝細胞を調製する方法が使用され得る。
【０７８４】
例示的な一実施形態において、方法は、目的のタンパク質を発現する、操作された動物細胞を調製する方法であり得て、（ａ）動物細胞と、（ｂ）ＡＬＢ、ＦＴＬ、ＦＴＨ１、ＡＣＴＢ、ＨＰ、ＡＰＯＣ３、ＳＯＤ２、ＯＲＭ１、Ｆ９など、高発現分泌遺伝子から選択される１または複数の遺伝子に導入遺伝子を人工的に挿入するために遺伝子を操作するための組成物とを接触させる段階を含み得る。
【０７８５】
ここで、動物細胞（ａ）は、ヒト由来体細胞または幹細胞であり得る。
【０７８６】
具体的には、ヒト由来体細胞は、肝細胞であり得る。
【０７８７】
遺伝子（ｂ）を操作するための組成物は以下の通りである。
【０７８８】
接触させる段階は、遺伝子（ｂ）を操作するための組成物を動物細胞（ａ）に導入する段階を含み得る。
【０７８９】
この方法において使用される動物細胞は、ヒトおよびサルなどの霊長動物を含む哺乳動物、ならびに、マウスおよびラットなどの齧歯動物に由来する動物細胞であり得る。
【０７９０】
［使用］
ここで開示される開示の例は治療用途を含む。
【０７９１】
例えば、治療用途は、対象、または、導入遺伝子が挿入された肝細胞の肝細胞ゲノムに導入遺伝子を挿入するための組成物の投与を含み得る。
【０７９２】
治療される対象は、哺乳動物、例えば、ヒトまたはサルなどの霊長動物、および、マウスまたはラットなどの齧歯動物であり得る。
【０７９３】
１）医薬組成物
本明細書の例示的な一実施形態は、治療用遺伝子を高発現することによって疾患を治療するために使用される組成物、および、それを調製する方法を含む。
【０７９４】
例えば、組成物は、導入遺伝子を肝細胞ゲノムおよび治療用遺伝子に人工的に挿入するために人工的に操作されるヌクレアーゼを含む組成物であり得る。組成物は、治療用組成物または医薬組成物と称され得る。
【０７９５】
例示的な実施形態において、組成物はプログラム可能ヌクレアーゼを含み得る。
【０７９６】
プログラム可能ヌクレアーゼは、ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）‐ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、および、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）のうち１つであり得る。
【０７９７】
例示的な実施形態において、組成物は治療用遺伝子を含み得る。
【０７９８】
治療用遺伝子は、身体における欠乏タンパク質または酵素をコードする遺伝子であり得る。
【０７９９】
例えば、治療用遺伝子はＦ９であり得る。ここで、組成物は、血友病を治療するための組成物であり得る。
【０８００】
組成物は更に、プログラム可能ヌクレアーゼおよび治療用遺伝子に加えて、薬学的に許容される賦形剤、および／または、当技術分野において知られている他の化合物を含み得る。例えば、組成物は、水、塩類、デキストロース、グリセロール、エタノール、および、それらの組み合わせを含み得る。
【０８０１】
追加的に、少量の添加剤として、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定剤、または、医薬組成物の有効性を増強する別の試薬が含まれ得る。
【０８０２】
２）治療方法
明細書において説明される例示的な一実施形態は、組成物を必要とする患者に上述の組成物の有効量を投与する段階を含む特定の疾患を治療する方法である。
【０８０３】
例えば、抗体によって治療できる疾患を治療する方法が含まれる。
【０８０４】
例えば、遺伝子の変異によって引き起こされる疾患を治療する方法が含まれる。
【０８０５】
例えば、遺伝性代謝異常を治療する方法が含まれる。
【０８０６】
例えば、特定のタンパク質の欠乏または不存在によって引き起こされる疾患を治療する方法が含まれる。
【０８０７】
例えば、疾患は、治療用組成物を患者の身体に注射することにより、治療用遺伝子を恒久的に発現させることによって治療できる疾患であり得る。
【０８０８】
治療方法は、全身投与を通じて治療用組成物を患者に送達する方法によって実行され得る。
【０８０９】
治療方法は、患者の特定の身体部分に治療用組成物を注射することによって実行され得る。ここで、特定の身体部分は、細胞外に分泌される治療用遺伝子を高発現できる細胞を含む臓器であり得る。
【０８１０】
例えば、細胞は肝細胞であり得る。
【０８１１】
例えば、細胞は幹細胞であり得る。
【０８１２】
治療方法は、プログラム可能ヌクレアーゼを使用して、遺伝子を直接操作することによって、動物細胞の遺伝子発現に影響する治療方法であり得る。そのような治療方法は、生体の身体における遺伝子を操作するためのプログラム可能ヌクレアーゼを含む、遺伝子を操作するための組成物、および、治療用遺伝子を身体に直接注射することによって実行され得る。
【０８１３】
プログラム可能ヌクレアーゼは、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質であり得る。
【０８１４】
治療用遺伝子はＦ９であり得る。
【０８１５】
遺伝子を操作するための組成物は上に記載した通りである。
【０８１６】
組成物が投与される対象は、ヒト、サルなどの霊長動物、および、マウス、ラットなどの齧歯動物を含む哺乳動物のいずれか１つであり得る。
【０８１７】
組成物の投与は、注射、輸血、インプラント、または、移植などの便利ないずれかの方法によって実行され得る。組成物は、皮下、皮内、腫瘍内、結節内、髄内、筋肉内、静脈内、リンパ管内、または腹腔内投与され得る。
【０８１８】
好ましくは、組成物は静脈内全身投与を通じて投与される。
【０８１９】
別の例において、投与は、治療対象の腎臓；胃、膵臓、十二指腸、回腸および／または結腸を含む消化器系；心臓；肺；脳、特に、神経細胞および／または一般的に中枢神経系；網膜組織を含む目；内耳を含む耳；皮膚；筋肉；骨および／または肝臓から選択される、いずれかの１または複数の臓器に投与され得る。
【０８２０】
好ましくは、臓器は肝臓である。
【０８２１】
例示的な一実施形態において、組成物の用量（所望の効果を得るための薬学的有効量）は、ＡＡＶを使用する人体への送達中にｍＬあたり約１×１０８〜１×１０１８の機能性ＡＡＶを含む約０．０１〜１０ｍＬの生理食塩水であり得る。明細書の例示的な一実施形態において、ＡＡＶ含有量は一般的に、約１×１０５〜１×１０５０ゲノムＡＡＶ、約１×１０８〜１×１０２０ゲノムＡＡＶ、約１×１０１０〜１×１０１６ゲノムＡＡＶ、または、約１×１０１１〜１×１０１６ゲノムＡＡＶの濃度範囲である。そのような濃度のＡＡＶは、約０．００１〜１００ｍＬ、約０．０１〜５０ｍＬ、または約０．０５〜１０ｍＬの担体溶液で送達され得る。しかしながら、組成物の用量は、投与対象の年齢、健康および体重、同時に受ける治療の種類、治療の頻度、ならびに、所望の効果の特徴を考慮して、好適に処方され得るが、本発明はこれらに限定されない。
【０８２２】
例示的な一実施形態において、治療方法は、血友病を治療する方法であり得る。
【０８２３】
治療方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏで実行され得る。
【０８２４】
治療方法は、対象を治療するために活性成分として肝細胞ゲノムに人工的に挿入された導入遺伝子を発現するために遺伝子を操作するための組成物を含む組成物を投与する段階を含み、遺伝子を操作するための組成物は、ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）‐ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、および、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）のいずれか１つのプログラム可能ヌクレアーゼを含み、人工的に挿入された導入遺伝子は、ＨＰ遺伝子およびＡＰＯＣ３遺伝子の１または複数の遺伝子配列に位置し、導入遺伝子はＦ９である。
【０８２５】
血友病は、プログラム可能ヌクレアーゼを使用する遺伝子編集治療によって、恒久的に治療され得る。
【０８２６】
明細書において説明される方法および組成物を使用して導入遺伝子を肝細胞ゲノムに挿入し、遺伝子を高発現することによって、欠乏タンパク質の発現が増加され得て、最終的な遺伝子産物は、生化学的代謝経路の正常な機能によって生成され得て、身体機能が改善され得る。
【０８２７】
［実施例］
以降、実施例を参照しつつ明細書について更に詳細に記載する。これらの実施例は、明細書を例示するために提供されるに過ぎず、実施例によって明細書の範囲が限定されるものと解釈されるべきではない。
【０８２８】
実施例１：ＲＮＡシーケンシング
ウイリアムス培地を含む２４ウェルプレートにおいて、ヒト初代培養細胞を２日間にわたって培養してから、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＲＮＡを単離した。
【０８２９】
Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒを使用して、ＲＮＡ  Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  Ｎｕｍｂｅｒ  （ＲＩＮ）が７以上の試料を選択し、１μｇのＲＮＡ、および、オリゴｄＴを有する磁気ビードを使用して、ｍＲＮＡ濃縮にかけ、続いて、短い断片化、および、逆転写を通じて、ｃＤＮＡライブラリを構築した。
【０８３０】
その後、ＴｒｕｅＳｅｑ  ＲＮＡ  ｓａｍｐｌｅ  ｐｒｅｐ  ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、カリフォルニア州）を使用してシーケンシングアダプタを取り付け、電気泳動およびＡｇｉｌｅｎｔ  Ｈｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ＤＮＡ  ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カリフォルニア州）を使用して、ｃＤＮＡライブラリサイズ（３５０〜４５０ｂｐ）および品質をチェックしてから、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ２５００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、カリフォルニア州）を使用してシーケンシングを実行した。
【０８３１】
その後、Ｔｏｐｈａｔプログラムを使用して、（「Ｎ」と示される）１０％以上のスキップされた塩基に対応する低品質リード、および、２０未満の品質スコアをフィルタリングするリードをヒト基準ゲノムにマッピングし、Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ  ｖ２．１．１プログラムを使用して各転写産物のＦＰＫＭ値を計算した。
【０８３２】
分泌タンパク質をコードするハプトグロビンおよびＡＰＯＣ３、ならびに、疾患ごとの治療用遺伝子に対応するＦ９、ＩＤＵＡ、ＩＤＳ、ＧＬＡ、および、ＧＢＡの転写活性をＦＰＫＭ結果から確認した。
【０８３３】
図１に示されるように、ハプトグロビンおよびＡＰＯＣ３遺伝子は、他の治療用遺伝子より、約１７０倍以上の転写活性を発揮する。
【０８３４】
例２：ｓｇＲＮＡの設計
ヒトＨＰ１およびＡＰＯＣ３遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的部位は、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＧＥＮ  Ｔｏｏｌｓ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂａｓｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、韓国）を使用して識別した。各遺伝子の標的部位は、ＣＲＩＳＰＲ酵素の種類に従って変動し得て、ＣｊＣａｓ９についてのＨＰおよびＡＰＯＣ３遺伝子の標的配列は、テーブル２および３にまとめられている。ＳｐＣａｓ９についてのＨＰおよびＡＰＯＣ３遺伝子の標的配列は、テーブル４および５にまとめられている。
【０８３５】
［テーブル２］
【表１２】
2020527030.tif 000014
［テーブル３］
【表１３】
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［テーブル４］
【表１４】
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［テーブル５］
【表１５】
2020527030.tif 000017
例３：ｇＲＮＡの活性の検証およびオフターゲット解析
３．１  Ｔ７Ｅ１アッセイ
ｇＲＮＡ配列がそれぞれクローニングされた、ｓｇＲＮＡを発現するための２５０ｎｇのベクター、および、Ｃａｓ９を発現するための７５０ｎｇのベクターを、リポフェクタミン（登録商標）２０００で、または、エレクトロポレーションによって、ＨＥＫ２９３細胞株にトランスフェクトした。加えて、１μｇのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写されたｓｇＲＮＡおよび４μｇのＣａｓ９を、ＲＮＰ複合体の形態で混合し、エレクトロポレーションによって、ジャーカット細胞株にトランスフェクトした。
【０８３６】
約２〜３日後、ゲノムＤＮＡを抽出し、オンターゲット部位を増幅するためにＰＣＲにかけ、続いて、Ｔ７Ｅ１アッセイを通じて活性を確認した、または、Ｎｅｘｔ‐Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇのためのシーケンシングプライマーに特定のアダプタ、および、ＴｒｕＳｅｑ  ＨＴダブルインデックスプライマーを取り付けた追加なＰＣＲを実行した。ｇＲＮＡの活性は、Ｔ７Ｅ１によって切断されたバンドでチェックした。
【０８３７】
図３に示すように、ＨＰ遺伝子の、テーブル２に示される標的配列＃１〜１１について、ＣｊＣａｓ９を用いてｇＲＮＡ活性を調査し、標的配列＃８、９、１０、１１においてＴ７Ｅ１活性が示された。
【０８３８】
３．２  標的配列のインデル率（％）の確認
その後、ゲノム上のオンターゲット部位における挿入または欠失（インデル）を検出することによって、対になったシーケンシングによって取得されたリードを解析し、ｇＲＮＡの活性を評価した。結果をテーブル２、３、４および５に示す。
【０８３９】
テーブル２および４において示すように、すべてのインデルが、ＨＰ遺伝子の対応する標的配列において生じることが確認された。インデル率（％）は最大８６．４％であり、高い遺伝子編集効率が確認された。
【０８４０】
また、テーブル３および５において示すように、すべてのインデルが、ＡＰＯＣ３遺伝子の対応する標的配列において生じることが確認された。インデル率（％）は最大９６．２％であり、高い遺伝子編集効率が確認された。
【０８４１】
それぞれの遺伝子を標的化するｇＲＮＡのうち、Ｃａｓ９の種類に従って、高い活性を有するもののＤＮＡ標的部位を太字で示す。
【０８４２】
［３．３  オフターゲット解析］
選択されたｇＲＮＡのオフターゲット解析のために、第１に、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＧＥＮ  ＴｏｏｌのＣａｓ‐Ｏｆｆｉｎｄｅｒを使用するｉｎ‐ｓｉｌｉｃｏの方法によって、３塩基ミスマッチを有するオフターゲットのリストを選択し、標的化ディープシーケンシングによって、ヒト細胞株ＨＥＫ２９３において、各オフターゲットに対応するゲノムにおける特定の部位の変異を検証した。
【０８４３】
第２に、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質を用いて３７℃で一晩処理した全ヒトゲノムＤＮＡを、全ゲノムシーケンシングにかけ、次に、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑによって潜在的なリストを確保した。その後、標的化ディープシーケンシングによって、ヒト細胞株ＨＥＫ２９３から、各オフターゲット候補のゲノムにおける特定の部位の変異を検証した。
【０８４４】
図４および図５に示されるように、ＨＰ１‐Ｃｊについての１０個のオフターゲット、および、ＡＰＯＣ３‐Ｃｊについての６個のオフターゲットを検出するディープシーケンシングの結果として、重要なオフターゲットは無く、高効率でインデル変異が生じたことが確認された。
【０８４５】
例４：ベクターおよびドナーの構築
ＳｐＣａｓ９の適用のために、ＡＡＶ２の逆向き反復配列（ＩＴＲ）間に、哺乳動物における発現のためのプロモーターであるＥＦＳ、ＣまたはＮ末端にＮＬＳおよびＨＡタグを有するヒトコドン最適化ＳｐＣａｓ９、ＢＧＨＡを含むベクター（ｐＡＡＶ‐ＥＦＳ‐ＳｐＣａｓ９）と、Ｕ６プロモーター、ｓｇＲＮＡ配列、および、ヒトコドン最適化Ｆ９ドナーを含むベクター（ｐＡＡＶ‐ｈＦ９‐ｄｏｎｏｒ‐Ｕ６‐ｓｇＲＮＡ）とを個々に合成して構築した。
【０８４６】
ＣｊＣａｓ９の適用のために、哺乳動物における発現のためのプロモーターであるＣＭＶ、ＣまたはＮ末端にＮＬＳおよびＨＡタグを有するヒトコドン最適化ＣｊＣａｓ９、ＢＧＨＡ、Ｕ６プロモーター、およびｓｇＲＮＡ配列を含むベクター（ｐＡＡＶ‐ＣＭＶ‐ＣｊＣａｓ９‐Ｕ６‐ｓｇＲＮＡ）と、ヒトコドン最適化Ｆ９ドナーを含むベクター（ｐＡＡＶ‐ｈＦ９‐ｄｏｎｏｒ）とを個々に合成して、ＡＡＶ２  ＩＴＲの間に構築した。すなわち、ＣｊＣａｓ９については、ＡＡＶパッケージング能力を考慮して、Ｕ６およびｓｇＲＮＡがＣａｓ９発現配列で送達され得る。
【０８４７】
各ベクターに導入されたドナーは、ホモロジーアーム間のスプライシングアクセプター（ＳＡ）ヒトコドン最適化Ｆ９‐ｂＧＨＡから成り、各々は８００〜１２００ｂｐ長であり、ヒトＨＰ１またはＡＰＯＣ３ゲノム（図６）において、Ｃａｓ９によって生成された二本鎖切断の両側に存在する。
【０８４８】
［例５：ヒト細胞株のＨＤＲの確認］
リポフェクタミン（登録商標）２０００で、ヒトＨＰ１ゲノムを標的化する５００ｎｇのｐＡＡＶ‐ＣＭＶ‐ＣｊＣａｓ９‐Ｕ６‐ｓｇＲＮＡ、および、５００ｎｇのｐＡＡＶ‐ｈＦ９‐ｄｏｎｏｒをＨＥＫ２９３細胞株にトランスフェクトした。
【０８４９】
３日後、ゲノムＤＮＡを抽出し、ＨＰ１標的部位のホモロジーアームの外側領域、および、ＨＤＲによってノックインされた領域から、それぞれプライマーでＰＣＲバンドを取得し、ＴＡベクターにクローニングした。
【０８５０】
その後、生成されたコロニーからプラスミドを抽出し、サンガーシーケンシングにかけ、両側のノックインされたジャンクションの配列を確認した。
【０８５１】
図８は、左アームおよび右アームのジャンクションにおけるノックイン、ならびに、正確に二本鎖切断の領域における、Ｆ９配列の改変無しで生じるノックインを確認する結果が両方のアームで確認されたことを示す。ｇＲＮＡ配列は、Ｃｊ９：５'‐ＴＣＣＡＧＧＡＡＡＧＡＧＡＡＡＣＣＴＣＣＣ‐３'、および、Ｃｊ１０：５'‐ＣＡＴＴＣＡＧＧＡＡＡＧＴＡＣＡＴＴＧＧＣ‐３'であった。
【０８５２】
［例６：ＡＡＶの構築］
ＡＡＶを生成するべく、疑似タイプＡＡＶカプシドのベクター、構築されたｐＡＡＶ‐ＥＦＳ‐ＳｐＣａｓ９、ｐＡＡＶ‐ｈＦ９‐ｄｏｎｏｒ‐Ｕ６‐ｓｇＲＮＡ、ｐＡＡＶ‐ＣＭＶ‐ＣｊＣａｓ９‐Ｕ６‐ｓｇＲＮＡまたはｐＡＡＶ‐ｈＦ９‐ｄｏｎｏｒ、およびｐＨｅｌｐｅｒベクターを、１：１：１のモル比でＨＥＫ２９３細胞に同時にトランスフェクトした。
【０８５３】
７２時間後、細胞融合によって取得されたウイルス粒子を、ｓｔｅｐ‐ｇｒａｄｉｅｎｔ超遠心機を使用してイオジキサノール（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ）で単離および精製し、ｑＰＣＲを使用した滴定を通じてＡＡＶの定量的解析を実行した。
【０８５４】
［例７：肝細胞からのインデルおよびＫＩ（ノックイン）遺伝子の高発現の確認］
２４ウェルプレートにおいて、６×１０５個の肝細胞を維持し、次に、５×１０１１μｇのＡＡＶ６‐ＥＦＳ‐ＳｐＣａｓ９、および、５×１０１１μｇのＡＡＶ６‐ｈＦ９‐ｄｏｎｏｒ‐ＡＰＯＣ３‐Ｓｐで感染させた。
【０８５５】
ＡＰＯＣ３‐Ｓｐ標的の配列として、５'‐ＣＣＴＡＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＡＴＧＡＧＧ‐３'を使用した。感染の翌日（２Ｄ）に培地を変更し、５Ｄ、８Ｄ、最終的に１０Ｄに培養上清試料を調製し、最後の１０Ｄに、ゲノムＤＮＡを肝細胞から抽出した。
【０８５６】
プライマーセット（フォワード：５'‐ＡＣＧＧＡＡＡＡＴＡＴＣＡＡＧＡＡＧＴＡ‐３'、リバース：５'‐ＣＡＧＣＡＡＧＣＣＣＴＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧ‐３'）を使用して、ＡＰＯＣ３‐Ｓｐのオンターゲットのアンプリコンを取得し、プライマー特異的アダプタおよびＴｒｕＳｅｑ  ＨＴ  Ｄｕａｌ  Ｉｎｄｅｘプライマーを付着する追加のＰＣＲが実行された。
【０８５７】
次に、オンターゲットゲノム位置のインデルの検出によってＣＲＩＳＰＲ活性を評価するべく、対になったシーケンシングを通じて取得されたリードを解析した。
【０８５８】
ノックインされたヒトＦ９の高発現は、因子ＩＸヒトＥＬＩＳＡキット（Ａｂｃａｍ）を使用して、肝細胞培養上清から分泌されるＦ９タンパク質について、ＥＬＩＳＡによって検出した。
【０８５９】
図９のＡに示すように、非ＡＡＶ治療対照群およびドナーだけの群（Ｄ‐ｏｎｌｙ‐ｈＡＰＯＣ３‐Ｓｐ）と比較して、デュアルＡＡＶ処理群（ｈＡＰＯＣ３‐Ｓｐ）は、平均９．６％のインデルを示した。
【０８６０】
加えて、図９のＢに示すように、ｈＦ９の分泌量は、対照群において、平均で４２．５ｎｇ／ｍｌ、ドナーだけの群において、７４．１ｎｇ／ｍｌ、デュアルＡＡＶ処理群において、３７８．２ｎｇ／ｍｌである。
【０８６１】
統計解析のために、スチューデントのｔ検定を使用した。有意については、＊はｐ＜０．０５を表し、＊＊はｐ＜０．０１を表し、＊＊＊はｐ＜０．００１を表す。
【０８６２】
［配列表フリーテキスト］
配列識別番号１〜配列識別番号１５は、ＨＰ遺伝子の標的配列表を表す。配列識別番号１５４〜配列識別番号３４８は、ＡＰＯＣ３遺伝子の標的配列表を表す。
【図１】
2020527030.tif 000018
【図２】
2020527030.tif 000019
【図３】
2020527030.tif 000020
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2020527030.tif 000024
【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年2月17日(2020.2.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
導入遺伝子を発現するための肝臓生体工場プラットフォーム（ＬＢＰ）システムであって、
肝細胞のゲノムにおける高発現分泌遺伝子をコードする領域に人工的に挿入された前記導入遺伝子を含む前記肝細胞を備え、
前記高発現分泌遺伝子は前記肝細胞のゲノムに存在するＡＬＢ遺伝子、ＦＴＬ遺伝子、ＦＴＨ１遺伝子、ＡＣＴ遺伝子、ＨＰ遺伝子、ＡＰＯＣ３遺伝子、ＳＯＤ２遺伝子、ＯＲＭ１遺伝子およびＦ９遺伝子から成る群から選択される少なくとも１つであり、
前記導入遺伝子は、挿入前と比較して高発現する、または、前記導入遺伝子は、前記肝細胞において新たに発現し、
前記導入遺伝子を発現することによって生成されるタンパク質は、前記肝細胞に存在する、または、前記肝細胞の外に分泌される、
ＬＢＰシステム。
【請求項２】
前記導入遺伝子は、前記肝細胞のゲノムにおける内在性プロモーターによって発現される、請求項１に記載のＬＢＰシステム。
【請求項３】
前記導入遺伝子はＦ９遺伝子である、請求項１または２に記載のＬＢＰシステム。
【請求項４】
導入遺伝子を肝細胞のゲノムに人工的に挿入するための組成物であって、
ガイド核酸、または前記ガイド核酸をコードする核酸であって、
前記ガイド核酸は、前記肝細胞のゲノムにおける高発現分泌遺伝子の配列における標的配列に対応するガイドドメインを含み、
前記ガイドドメインは、１８〜２５ｎｔであり、前記標的配列とミスマッチする０〜５ヌクレオチドを含む、
ガイド核酸、または前記ガイド核酸をコードする核酸と、
エディタータンパク質、または前記エディタータンパク質をコードする核酸と、
ドナー、または前記ドナーをコードする核酸であって、
前記ドナーは前記導入遺伝子を含む、
ドナー、または前記ドナーをコードする核酸と
を備え、
前記高発現分泌遺伝子は、前記肝細胞のゲノムに存在するＡＬＢ遺伝子、ＦＴＬ遺伝子、ＦＴＨ１遺伝子、ＡＣＴ遺伝子、ＨＰ遺伝子、ＡＰＯＣ３遺伝子、ＳＯＤ２遺伝子、ＯＲＭ１遺伝子およびＦ９遺伝子から成る群から選択される少なくとも１つである、
組成物。
【請求項５】
前記エディタータンパク質は、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィラス由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・アウレウス由来Ｃａｓ９タンパク質、ナイセリア・メニンジティディス由来Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮから成る群から選択される少なくとも１つである、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記標的配列は、配列識別番号１〜３４８から成る群から選択される少なくとも１つである、請求項４または５に記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物は、以下の組の少なくとも１つを含み、
（ａ）前記標的配列が配列識別番号１〜４０および１５４〜１６７から成る群から選択されるとき、前記エディタータンパク質はカンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質であり、
（ｂ）前記標的配列が配列識別番号４１〜１３４および１６８〜３３２から成る群から選択されるとき、前記エディタータンパク質はストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質であり、
（ｃ）前記標的配列が配列識別番号１３５〜１５３および３３３〜３４８から成る群から選択されるとき、前記エディタータンパク質はストレプトコッカス・アウレウス由来Ｃａｓ９タンパク質である、
請求項４から６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記導入遺伝子はＦ９遺伝子である、請求項４から７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記ガイド核酸、前記エディタータンパク質および前記ドナーは、ヌクレオチド配列の形態で、少なくとも１つのベクターにおいてそれぞれコードされる、請求項４から８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクチニアウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスおよびレンチウイルスから成る群から選択される少なくとも１つのウイルスベクターである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
肝細胞のゲノムにおける高発現分泌遺伝子をコードする領域に導入遺伝子を挿入することによって目的のタンパク質を発現するように肝細胞のゲノムを改変するための方法であって、
ｉ）ガイド核酸、または、前記ガイド核酸をコードする核酸であって、
前記ガイド核酸は、前記高発現分泌遺伝子における標的配列に対応するガイドドメインを含み、
前記ガイドドメインは、１８〜２５ｎｔであり、前記標的配列とミスマッチする０〜５ヌクレオチドを含む、
ガイド核酸、または、前記ガイド核酸をコードする核酸と、
ｉｉ）エディタータンパク質、または前記エディタータンパク質をコードする核酸と、
ｉｉｉ）ドナー、または前記ドナーをコードする核酸であって、
前記ドナーは前記導入遺伝子を含む、
ドナー、または前記ドナーをコードする核酸と
を導入する段階を備え、
前記高発現分泌遺伝子は、ＦＴＬ遺伝子、ＦＴＨ１遺伝子、ＡＣＴＢ遺伝子、ＨＰ遺伝子、ＡＰＯＣ３遺伝子、ＳＯＤ２遺伝子、ＯＲＭ１遺伝子およびＦ９遺伝子から成る群から選択される、
方法。
【請求項１２】
前記導入遺伝子はＦ９遺伝子である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記標的配列は、配列識別番号１〜３４８から成る群から選択される少なくとも１つである、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記エディタータンパク質は、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィラス由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・アウレウス由来Ｃａｓ９タンパク質、ナイセリア・メニンジティディス由来Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮから成る群から選択される少なくとも１つである、請求項１１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ガイド核酸、前記エディタータンパク質および前記ドナーは、ヌクレオチド配列の形態で少なくとも１つのベクターにおいてそれぞれコードされる、請求項１１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクチニアウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスおよびレンチウイルスから成る群から選択される少なくとも１つのウイルスベクターである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ベクターは、全身投与または局所投与によって前記肝細胞に導入される、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
エディタータンパク質、または前記エディタータンパク質をコードする前記核酸と、前記ドナー、または前記ドナーをコードする前記核酸とを前記肝細胞に導入するプロセスは、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで実行される、請求項１１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０８６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０８６１】
統計解析のために、スチューデントのｔ検定を使用した。
有意については、＊はｐ＜０．０５を表し、＊＊はｐ＜０．０１を表し、＊＊＊はｐ＜０．００１を表す。
（項目１）
肝細胞のゲノムに人工的に挿入された導入遺伝子を発現するための肝臓生体工場プラットフォーム（ＬＢＰ）システムであって、
上記導入遺伝子は、上記高発現分泌遺伝子の配列に位置し、
上記高発現分泌遺伝子は、肝細胞のゲノムに存在するＡＬＢ遺伝子、ＦＴＬ遺伝子、ＦＴＨ１遺伝子、ＡＣＴ遺伝子、ＨＰ遺伝子、ＡＰＯＣ３遺伝子、ＳＯＤ２遺伝子、ＯＲＭ１遺伝子、Ｆ９遺伝子から成る群から選択される少なくとも１つであり、
上記導入遺伝子は挿入前と比較して高発現される、または、上記導入遺伝子は上記肝細胞において新たに発現される、
ＬＢＰシステム。
（項目２）
上記高発現分泌遺伝子は、ＨＰ遺伝子およびＡＰＯＣ３遺伝子のうち少なくとも１つである、項目１に記載のＬＢＰシステム。
（項目３）
上記導入遺伝子は、上記高発現分泌遺伝子のイントロンおよびエクソンの一部のうち少なくとも１つに挿入される、項目１に記載のＬＢＰシステム。
（項目４）
上記導入遺伝子は、肝細胞のゲノムに元々存在するプロモーターによって発現される、項目１に記載のＬＢＰシステム。
（項目５）
上記導入遺伝子はＦ９遺伝子である、項目１に記載のＬＢＰシステム。
（項目６）
上記導入遺伝子の発現によって生成されるタンパク質は肝細胞の外に分泌される、項目１に記載のＬＢＰシステム。
（項目７）
肝細胞のゲノムに人工的に挿入された導入遺伝子を発現するように遺伝子を改変するための組成物であって、
上記導入遺伝子を高発現分泌遺伝子に組み込むためのプログラム可能ヌクレアーゼを含み、
上記高発現分泌遺伝子は、ＦＴＬ遺伝子、ＦＴＨ１遺伝子、ＡＣＴＢ遺伝子、ＨＰ遺伝子、ＡＰＯＣ３遺伝子、ＳＯＤ２遺伝子、ＯＲＭ１遺伝子、Ｆ９遺伝子から成る群から選択される少なくとも１つである、
組成物。
（項目８）
上記プログラム可能ヌクレアーゼは、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）‐ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）から成る群から選択される少なくとも１つである、項目７に記載の組成物。
（項目９）
上記高発現分泌遺伝子は、ＨＰ遺伝子およびＡＰＯＣ３遺伝子のうち少なくとも１つである、項目７に記載の組成物。
（項目１０）
上記導入遺伝子はＦ９遺伝子である、項目７に記載の組成物。
（項目１１）
肝細胞のゲノムに人工的に挿入された導入遺伝子を発現するように遺伝子を改変するための組成物であって、
肝細胞のゲノムに存在する高発現分泌遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子の標的配列のガイド核酸と、
エディタータンパク質、または、上記エディタータンパク質をコードする核酸と、
上記導入遺伝子を含むドナーと
を備える組成物。
（項目１２）
上記エディタータンパク質は、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィラス由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・アウレウス由来Ｃａｓ９タンパク質、ナイセリア・メニンジティディス由来Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質から成る群から選択される少なくとも１つである、項目１１に記載の組成物。
（項目１３）
上記標的配列は、上記高発現分泌遺伝子の配列における、エクソン、イントロン、５'‐ＵＴＲ、３'‐ＵＴＲ、および、エンハンサーの一部のうち少なくとも１つに位置する、項目１１に記載の組成物。
（項目１４）
上記標的配列は、上記高発現分泌遺伝子の配列におけるエクソンおよびイントロンの一部のうち少なくとも１つに位置する、項目１１に記載の組成物。
（項目１５）
上記標的配列は、配列識別番号１〜３４８から成る群から選択される少なくとも１つである、項目１１に記載の組成物。
（項目１６）
上記高発現分泌遺伝子は、ＨＰ遺伝子およびＡＰＯＣ３遺伝子のうち少なくとも１つである、項目１１に記載の組成物。
（項目１７）
上記ガイド核酸は、上記高発現分泌遺伝子に位置する標的配列に対応するガイドドメインを含み、
上記ガイドドメインは、上記標的配列とミスマッチする０〜５ヌクレオチドである、
項目１１に記載の組成物。
（項目１８）
上記ガイド核酸は、ＨＰまたはＡＰＯＣ３遺伝子のヌクレオチド配列における配列識別番号１〜３４８から成る群から選択される、項目１１に記載の組成物。
（項目１９）
上記ガイド核酸は、配列識別番号１〜１１、３７〜５１、１５４〜１６７、１６８〜１８２から成る群から選択される標的配列に対応する、項目１１に記載の組成物。
（項目２０）
上記ガイド核酸は、配列識別番号１〜４０、および、１５４〜１６７から成る群から選択される標的配列に対応し、
上記組成物は更に、カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質、または、上記Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸を含む、
項目１１に記載の組成物。
（項目２１）
上記ガイド核酸は、配列識別番号４１〜１３４、および、１６８〜３３２から成る群から選択される標的配列に対応し、
上記組成物は更に、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質、または、上記Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸を含む、
項目１１に記載の組成物。
（項目２２）
上記ガイド核酸は、配列識別番号１３５〜１５３、および、３３３〜３４８から成る群から選択される標的配列に対応し、
上記組成物は更に、ストレプトコッカス・アウレウス由来Ｃａｓ９タンパク質、または、上記Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸を含む、
項目１１に記載の組成物。
（項目２３）
上記導入遺伝子はＦ９遺伝子である、項目１１に記載の組成物。
（項目２４）
上記ガイド核酸、上記エディタータンパク質、および上記ドナーはそれぞれ、ヌクレオチド配列の形態で、少なくとも１つのベクターにおいてコードされる、項目１１に記載の組成物。
（項目２５）
上記ベクターはウイルスベクターシステムである、項目１１に記載の組成物。
（項目２６）
上記ウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクチニアウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルス、および、レンチウイルスから成る群から選択される少なくとも１つである、項目２５に記載の組成物。
（項目２７）
上記ガイド核酸は、配列識別番号１〜３４８から成る群から選択される標的配列に対応するガイド核酸。
（項目２８）
上記ガイド核酸は、配列識別番号１〜１２、３７〜５１、１５４〜１６７、および、１６８〜１８２から成る群から選択される標的配列に対応する、項目２７に記載のガイド核酸。
（項目２９）
上記ガイド核酸は、１８〜２５ｂｐのヌクレオチド配列である、項目２７に記載のガイド核酸。
（項目３０）
上記肝細胞のゲノムに人工的に挿入される導入遺伝子を発現する肝細胞であって、
上記導入遺伝子は高発現分泌遺伝子に挿入され、
上記高発現分泌遺伝子は、ＦＴＬ遺伝子、ＦＴＨ１遺伝子、ＡＣＴＢ遺伝子、ＨＰ遺伝子、ＡＰＯＣ３遺伝子、ＳＯＤ２遺伝子、ＯＲＭ１遺伝子およびＦ９遺伝子から成る群から選択される少なくとも１つである、
ことを含む幹細胞。
（項目３１）
上記高発現分泌遺伝子は、ＨＰ遺伝子およびＡＰＯＣ３遺伝子のうち少なくとも１つである、項目３０に記載の肝細胞。
（項目３２）
上記導入遺伝子は、上記高発現分泌遺伝子の上記エクソンまたは上記イントロンに位置する、項目３０に記載の肝細胞。
（項目３３）
上記導入遺伝子は、上記肝細胞ゲノムにおいて元々存在するプロモーターによって発現される、項目３０に記載の肝細胞。
（項目３４）
上記導入遺伝子はＦ９遺伝子である、項目３０に記載の肝細胞。
（項目３５）
肝細胞のゲノムにおける高発現分泌遺伝子に導入遺伝子を挿入することによって、目的のタンパク質を発現するように肝細胞のゲノムを改変するための方法であって、
プログラム可能ヌクレアーゼおよびドナーを上記肝細胞に導入する段階を含み、
上記プログラム可能は、ＦＴＬ遺伝子、ＦＴＨ１遺伝子、ＡＣＴＢ遺伝子、ＨＰ遺伝子、ＡＰＯＣ３遺伝子、ＳＯＤ２遺伝子、ＯＲＭ１遺伝子およびＦ９遺伝子から成る群から選択される上記高発現分泌遺伝子のうち少なくとも１つを操作または改変するためのものであり、
上記ドナーは上記導入遺伝子を含む、
方法。
（項目３６）
上記高発現分泌遺伝子は、ＨＰ遺伝子およびＡＰＯＣ３遺伝子のうち少なくとも１つである、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
上記導入遺伝子はＦ９遺伝子である、項目３５に記載の方法。
（項目３８）
上記プログラム可能ヌクレアーゼはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムであり、
上記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、
（ｉ）肝細胞のゲノムにおける上記高発現分泌遺伝子に存在する標的配列に対応するガイド核酸と、
（ｉｉ）エディタータンパク質と
を含む、項目３５に記載の方法。
（項目３９）
上記標的配列は、上記高発現分泌遺伝子配列の配列におけるエクソン、イントロン、５'‐ＵＴＲ、３'ＵＴＲ、および、エンハンサーの一部のうち少なくとも１つに位置する、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
上記標的配列は、上記高発現分泌遺伝子の配列におけるエクソンおよびイントロンの一部のうち少なくとも１つに位置する、項目３８に記載の方法。
（項目４１）
上記ガイド核酸は、上記高発現分泌遺伝子の上記ヌクレオチド配列における配列識別番号１〜３４８から成る群から選択される少なくとも１つの標的配列に対応する、項目３８に記載の方法。
（項目４２）
上記ガイド核酸は、配列識別番号１〜１５、３７〜５１、１５４〜１６７、および、１６８〜１８２から成る群から選択される少なくとも１つの標的配列に対応する、項目３８に記載の方法。
（項目４３）
上記エディタータンパク質は、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィラス由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・アウレウス由来Ｃａｓ９タンパク質、ナイセリア・メニンジティディス由来Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質から成る群から選択される少なくとも１つである、項目３８に記載の方法。
（項目４４）
上記ガイド核酸、上記エディタータンパク質および上記ドナーはそれぞれ、ヌクレオチド配列の形態で少なくとも１つのベクターにおいてコードされる、項目３５または３８に記載の方法。
（項目４５）
上記ベクターはウイルスベクターシステムである、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
上記ウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクチニアウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルス、および、レンチウイルスから成る群から選択される少なくとも１つである、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
上記ベクターは、全身または局所投与によって上記肝細胞に導入される、項目４４に記載の方法。
（項目４８）
上記全身投与は静脈内投与である、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
上記プログラム可能ヌクレアーゼおよび上記ドナーを上記第１肝細胞に導入することは、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで実行される、項目３５に記載の方法。
（項目５０）
血友病を治療する方法であって、
肝細胞のゲノムに人工的に挿入された導入遺伝子を発現するために対象に組成物を導入する段階を含み、
上記組成物は、ＣＲＩＳＰＲ‐Ｃａｓシステム、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮから選択されるプログラム可能ヌクレアーゼを含み、
ドナー配列に含まれる上記導入遺伝子は、上記ＨＰ遺伝子およびＡＰＯＣ３遺伝子配列のうち少なくとも１つに人工的に挿入され、
上記導入遺伝子はＦ９遺伝子である、
方法。
（項目５１）
上記組成物はＣＲＩＳＰＲ‐Ｃａｓシステムであり、
上記ＣＲＩＳＰＲ‐Ｃａｓシステムは、
（ｉ）肝細胞のゲノムに存在する高発現分泌遺伝子の群から選択される少なくとも１つの標的配列に対応するガイド核酸と、
（ｉｉ）エディタータンパク質、または上記エディタータンパク質をコードする核酸と
を含み、上記エディタータンパク質は、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィラス由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・アウレウス由来Ｃａｓ９タンパク質、ナイセリア・メニンジティディス由来Ｃａｓ９タンパク質およびＣｐｆ１タンパク質から成る群から選択される少なくとも１つである、
項目５０に記載の方法。
（項目５２）
上記ガイド核酸は、ＨＰまたはＡＰＯＣ３遺伝子のヌクレオチド配列における配列識別番号１〜３４８から成る群から選択される少なくとも１つの標的配列に対応する、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
上記ガイド核酸は、配列識別番号１〜１１、３７〜５１、１５４〜１６７、１６８〜１８２から成る群から選択される少なくとも１つの標的配列に対応する、項目５１に記載の方法。
（項目５４）
上記ガイド核酸、上記エディタータンパク質および上記ドナーは、ヌクレオチド配列の形態で少なくとも１つのベクターにおいてそれぞれコードされる、項目５０または５１に記載の方法。
（項目５５）
上記ベクターはウイルスベクターである、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
上記組成物は、全身投与によって対象に導入される、項目５０に記載に方法。
（項目５７）
上記全身投与は静脈内投与である、項目５６に記載に方法。
【国際調査報告】
2020527030.tif 000027
2020527030.tif 000028
2020527030.tif 000029
2020527030.tif 000030
2020527030.tif 000031
2020527030.tif 000032