(57)【要約】  本明細書に開示されている本発明は、上皮成長因子受容体(EGFR)の細胞外部分に結合することができる第1の可変ドメイン及びMETがん原遺伝子、受容体チロシンキナーゼ(cMET)の細胞外部分に結合することができる第2の可変ドメインを含む二重特異性抗体に関する。抗体は共通軽鎖を含んでよく、ヒト抗体であってよい。抗体は全長抗体であってよい。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、1:1の抗EGFR、抗cMET化学量論を有するIgG1フォーマット抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、EGFRに結合することができる1つの可変ドメイン及びcMETに結合することができる1つの可変ドメインを有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト上皮成長因子受容体(EGFR)の細胞外部分に結合することができる第1の可変ドメイン及びヒトMETがん原遺伝子、受容体チロシンキナーゼ(cMET)の細胞外部分に結合することができる第2の可変ドメインを含む二重特異性抗体。
【請求項２】
共通軽鎖を含む、請求項1に記載の二重特異性抗体。
【請求項３】
ヒト抗体である、請求項1又は請求項2に記載の二重特異性抗体。
【請求項４】
全長抗体である、請求項1から3のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項５】
1:1の抗EGFR、抗cMET化学量論を有するIgG1フォーマット抗体である、請求項1から4のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項６】
EGFRに結合することができる1つの可変ドメイン及びcMETに結合することができる1つの可変ドメインを有する、請求項1から5のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項７】
ヒトEGFRに結合することができる可変ドメインがカニクイザル及びマウスEGFRにも結合することができる、請求項1から6のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項８】
ヒトEGFRに結合することができる可変ドメインがヒトEGFRのドメインIIIに結合する、請求項1から7のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項９】
cMETに結合することができる可変ドメインが抗体5D5のcMETへの結合を遮断する、請求項1から8のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１０】
cMETに結合することができる可変ドメインがHGFのcMETへの結合を遮断する、請求項1から9のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１１】
1つのCH3ドメインの405位及び409位のアミノ酸が、他のCH3ドメインの対応する位置のアミノ酸と同じである(EUナンバリング)、請求項1から10のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１２】
第1の可変ドメインが、CDR1配列SYGIS;CDR2配列WISAYX1X2NTNYAQKLQG及び配列X3X4X5X6HWWLX7Aを含むCDR3を有する重鎖可変領域を含み、ここで
X1=N又はS;X2=A又はG;X3=D又はG;X4=R、S又はY;X5=H、L又はY;X6=D又はW及びX7=D又はGであり;X1〜X7以外の位置に0〜5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組合せを有し、第2の可変ドメインが、0〜10個、好ましくは0〜5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組合せを有する配列番号1〜23の配列の1つのアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１３】
X1=N; X2=G; X3=D; X4=S; X5=Y; X6=W及びX7=G;
X1=N; X2=A; X3=D; X4=S; X5=Y; X6=W及びX7=G;
X1=S; X2=G; X3=D; X4=S; X5=Y; X6=W及びX7=G;
X1=N; X2=G; X3=D; X4=R; X5=H; X6=W及びX7=D;
X1=N; X2=A; X3=D; X4=R; X5=H; X6=W及びX7=D;
X1=S; X2=G; X3=D; X4=R; X5=H; X6=W及びX7=D;
X1=N; X2=G; X3=G; X4=Y; X5=L; X6=D及びX7=G;
X1=N; X2=A; X3=G; X4=Y; X5=L; X6=D及びX7=G;又は
X1=S; X2=G; X3=G; X4=Y; X5=L; X6=D及びX7=G
である、請求項12に記載の二重特異性抗体。
【請求項１４】
X1=N; X2=G; X3=D; X4=R; X5=H; X6=W及びX7=D;
X1=N; X2=A; X3=D; X4=R; X5=H; X6=W及びX7=D;又は
X1=S; X2=G; X3=D; X4=R; X5=H; X6=W及びX7=D
である、請求項12又は請求項13に記載の二重特異性抗体。
【請求項１５】
X1=N; X2=G; X3=D; X4=R; X5=H; X6=W及びX7=D;又は
X1=N; X2=A; X3=D; X4=R; X5=H; X6=W及びX7=D
である、請求項12から14のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１６】
第2の可変ドメインの重鎖可変領域が、0〜10個、好ましくは0〜5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組合せを有する配列番号1〜3; 7; 8; 10; 13; 15; 16; 17; 21; 22又は23の配列の1つのアミノ酸配列を含む、請求項1から15のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１７】
第2の可変ドメインの重鎖可変領域が、0〜10個、好ましくは0〜5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組合せを有する配列番号2; 7; 8; 10; 13又は23の配列の1つのアミノ酸配列を含む、請求項1から16のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１８】
第1の可変ドメインが、CDR1配列SYGIS;CDR2配列WISAYNGNTNYAQKLQG及び配列DRHWHWWLDAを含むCDR3を有する重鎖可変領域を含み、第2の可変ドメインが、CDR1配列SYSMN;CDR2配列WINTYTGDPTYAQGFTG及びCDR3配列ETYYYDRGGYPFDPを有する重鎖可変領域を含む、請求項1から17のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１９】
第1の可変ドメインが、CDR1配列SYGIS;CDR2配列WISAYNANTNYAQKLQG及び配列DRHWHWWLDAを含むCDR3を有する重鎖可変領域を含み、第2の可変ドメインが、CDR1配列TYSMN;CDR2配列WINTYTGDPTYAQGFTG及び配列ETYFYDRGGYPFDPを含むCDR3を有する重鎖可変領域を含む、請求項1から17のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項２０】
第1及び第2の可変ドメインが、共通軽鎖、好ましくは図9Bの軽鎖を含む、請求項1から19のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項２１】
HGF増殖応答性細胞のHGF誘導増殖を阻害する、請求項1から20のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２２】
EGF増殖応答性細胞のEGF誘導増殖を阻害する、請求項1から21のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２３】
異常細胞が関与する疾患の処置における使用のための、請求項1から22のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２４】
腫瘍を有する対象の処置における使用のための、請求項1から23のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項２５】
腫瘍が、EGFR陽性腫瘍、cMET陽性腫瘍又はEGFR及びcMET陽性腫瘍である、請求項24に記載の使用のための二重特異性抗体。
【請求項２６】
腫瘍が、乳がん、大腸がん、膵臓がん、胃がん、卵巣がん、結腸直腸がん、頭頚部がん、非小細胞肺がんを含む肺がん又は膀胱がんである、請求項24又は請求項25に記載の使用のための二重特異性抗体。
【請求項２７】
腫瘍が、EGFRチロシンキナーゼ阻害剤による処置に耐性である、請求項24から26のいずれか一項に記載の使用のための二重特異性抗体。
【請求項２８】
EGFRチロシンキナーゼ阻害剤が、エルロチニブ、ゲフィチニブ、又はアファチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ又はアファチニブの類似体、又は1つ若しくは複数のそれぞれの化合物及び/又はそれらの類似体の組合せである、請求項27に記載の二重特異性抗体。
【請求項２９】
EGFRチロシンキナーゼ阻害剤がエルロチニブである、請求項28に記載の使用のための二重特異性抗体。
【請求項３０】
処置が、EGFRチロシンキナーゼ阻害剤による処置を更に含む、請求項23から29のいずれか一項に記載の使用のための二重特異性抗体。
【請求項３１】
EGFRチロシンキナーゼ阻害剤がエルロチニブである、請求項30に記載の使用のための二重特異性抗体。
【請求項３２】
前記二重特異性抗体が、前記EGFRチロシンキナーゼ阻害剤と同時に、順次、又は別々に投与される、請求項30又は31に記載の使用のための二重特異性抗体。
【請求項３３】
前記二重特異性抗体が、EGFRチロシンキナーゼ阻害剤と同時に、順次、又は別々に投与される、異常細胞が関与する疾患を処置する際における使用のための、請求項1から22のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項３４】
請求項1から22のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を、それを必要とする個体に投与する工程を含む、腫瘍を有する対象の処置の方法。
【請求項３５】
個体が、異常細胞が関与する疾患を有する、請求項34に記載の方法。
【請求項３６】
腫瘍が、EGFR陽性腫瘍、cMET陽性腫瘍又はEGFR及びcMET陽性腫瘍である、請求項34又は請求項35に記載の方法。
【請求項３７】
腫瘍が、乳がん、大腸がん、膵臓がん、胃がん、卵巣がん、結腸直腸がん、頭頚部がん、非小細胞肺がんを含む肺がん又は膀胱がんである、請求項34から36のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
腫瘍が、EGFRチロシンキナーゼ阻害剤による処置に耐性である、請求項34から37のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
EGFRチロシンキナーゼ阻害剤が、エルロチニブ、ゲフィチニブ、又はアファチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ又はアファチニブの類似体、又は1つ若しくは複数のそれぞれの化合物及び/又はそれらの類似体の組合せである、請求項38に記載の方法。
【請求項４０】
EGFRチロシンキナーゼ阻害剤がエルロチニブである、請求項39に記載の方法。
【請求項４１】
処置が、EGFRチロシンキナーゼ阻害剤を、それを必要とする個体に投与する工程を更に含む、請求項34から40のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
EGFRチロシンキナーゼ阻害剤がエルロチニブである、請求項41に記載の方法。
【請求項４３】
前記二重特異性抗体が、前記EGFRチロシンキナーゼ阻害剤と同時に、順次、又は別々に投与される、請求項41又は請求項42に記載の方法。
【請求項４４】
異常細胞が関与する疾患の処置のための医薬の製造における使用のための、請求項1から22のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項４５】
ヒトEGFR、マウスEGFR及びカニクイザルEGFRの細胞外部分に結合することができる可変ドメインを含む抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体の分野に関する。特に、本発明は、異常細胞が関与する疾患の処置のための、ヒト抗体を含む治療用抗体の分野に関する。更に、本発明は、多重特異性抗体を含むEGFR及びcMETに結合する抗体、並びにEGFR及びcMET陽性細胞、特に腫瘍細胞の結合におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
上皮成長因子(EGF)受容体(EGFR)は、細胞外タンパク質リガンドの上皮成長因子ファミリー(EGFファミリー)のメンバーの細胞表面受容体である。EGFRはErbB-1受容体としても公知である。受容体は従来から、様々な名称が与えられてきた(EGFR; ERBB; ERBB1; HER1; PIG61; mENA)。本発明では、ヒトの名称ErbB-1、EGFR又はHER1が交換可能に使用される。EGFRは、受容体のErbBファミリー、4つの近縁の受容体チロシンキナーゼ: ErbB-1(EGFR)、ErbB-2(HER2/c-neu; Her2)、ErbB-3(Her 3)及びErbB-4 (Her 4)のサブファミリーのメンバーである。
【０００３】
EGFRは細胞表面に存在し、上皮成長因子及び形質転換成長因子α(TGFα)を含む、その特異的リガンドの結合によって活性化され得る。その成長因子リガンドによる活性化時に、受容体は不活性なほぼ単量体形態から活性なホモ二量体に移行し得る。リガンド結合後のホモ二量体の形成に加えて、EGFRはErbB受容体ファミリーの別のメンバー、例えばErbB2と対をなし、活性化されたヘテロ二量体を形成することができる。二量体は、リガンド結合の不在下でも形成され、活性化されたEGFRのクラスターはリガンド結合後に形成され得る。
【０００４】
EGFR二量体化は、内因性の細胞内タンパク質チロシンキナーゼ(PTK)活性を刺激する。この活性は、細胞増殖及び分化をもたらすいくつかのシグナル伝達カスケードを誘導する。EGFRのキナーゼドメインは、それと複合体を形成する他の受容体のチロシン残基を交差リン酸化することができ、その方法によりそれ自体活性化され得る。
【０００５】
EGFRが関与する変異は、いくつかの型のがんで同定されてきた。これは、抗がん治療の拡大するクラスの標的である。そのような治療は、肺がんのためのゲフィチニブ及びエルロチニブのようなEGFRチロシンキナーゼ阻害剤(EGFR-TKI)、並びに大腸がん及び頭頚部がんのためのセツキシマブ及びパニツムマブのような抗体を含む。
【０００６】
セツキシマブ及びパニツムマブは、受容体を阻害するモノクローナル抗体である。臨床開発中の他のモノクローナル抗体は、ザルツムマブ、ニモツズマブ、及びマツズマブである。モノクローナル抗体は、主に受容体へのリガンドの結合を遮断することにより、細胞外リガンド誘導受容体活性化を遮断することを目的とする。結合部位が遮断されると、シグナル誘導分子は効果的に結合できず、それにより下流のシグナル伝達を活性化することもできない。リガンド誘導受容体活性化は、不活性な受容体構造の安定化によっても阻害され得る(マツズマブ)。
【０００７】
現在まで、EGFR標的化治療は、経時的な処置耐性の発生と関連してきた。EGFR-TKIに対する耐性の様々なメカニズムが記載されている。進行した非小細胞肺がん(NSCLC)を有する患者では、耐性のメカニズムは二次変異の発生(例えばT790M、C797S)、代わりのシグナル伝達の活性化(例えばMet, HGF, AXL, Hh, IGF-1R)、異常な下流の経路(例えば、AKT変異、PTEN欠損)、EGFR-TKI-媒介アポトーシス経路の障害(BCL2様11/BIM欠失多型)及び組織学的形質転換を含む。耐性のいくつかのメカニズムが同定されたが、その他は同定されないままである。同様に、EGFR抗体によって処置される直腸結腸がんを有する患者も、経時的に耐性を発生する。これは、KRAS変異の出現によって生じ得る。KRAS変異の無いものの中では、METがん原遺伝子の増幅が、抗EGFR治療中に獲得された耐性と関連し得る(Bardelliら、2013年; Cancer Discov. Jun;3(6):658〜73頁. doi: 10.1158/2159-8290.CD-12-0558)。腫瘍は最初から耐性である、又は処置中に耐性を発生し得る。EGFR標的化治療に対する耐性は、多くのEGFR陽性がんにみられ、標準的な治療を改善し、EGFR標的化治療耐性を扱う能力に関して優れているより有効なEGFRがん処置の必要性を当技術分野において実証した。
【０００８】
METがん原遺伝子、受容体チロシンキナーゼ(cMET)及び肝細胞増殖因子(HGF)の調節不全は、様々な腫瘍で報告されている。リガンド駆動性cMET活性化は、いくつかのがんで観察されている。血清及び腫瘍内HGFの上昇は、肺、乳がん、及び多様なミエローマで観察される(J. M. Siegfriedら、Ann Thorac Surg 66, 1915 (1998年); P. C. Maら、Anticancer Res 23, 49 (2003年); B. E. Elliottら、Can J Physiol Pharmacol 80, 91 (2002年); C. Seidel,ら、Med Oncol 15, 145 (1998年))。cMETの過剰発現、cMET増幅又は変異が、直腸結腸、肺、胃、及び腎臓がんのような様々ながんで報告されており、リガンド非依存的な受容体活性化を駆動し得る(C. Birchmeierら、Nat Rev Mol Cell Biol 4, 915 (2003年); G. Maulik ら、Cytokine Growth Factor Rev 13, 41 (2002年))。HGFの発現は、HGF/cMETシグナル伝達経路の活性化とも関連し、EGFR標的化治療による選択下の腫瘍の回避メカニズムの1つでもある。
【０００９】
cMET受容体は、共通前駆体の、一回膜貫通のジスルフィド結合したα/βヘテロ二量体へのタンパク質プロセシングによって形成される。cMETの細胞外部分は3つのドメイン型からなる。N末端領域の折りたたみは、αサブユニット全体及びβサブユニットの一部を包含する大きなセマフォリン(Sema)ドメインを形成する。プレキシン-セマフォリン-インテグリン(PSI)ドメインはSemaドメインに続き、4つのジスルフィド結合を含む。このドメインは、免疫グロブリン様ドメインに関係する4つの免疫グロブリン-プレキシン-転写(IPT)ドメインを介して膜貫通ヘリックスに連結される。細胞内に、cMET受容体は特有の膜近傍配列及びカルボキシ末端配列に挟まれたチロシンキナーゼ触媒ドメインを含有する(その全体が参照により本明細書に組み込まれるOrgan and Tsao. Therapeutic advances in medical oncology 3.1_suppl (2011年): S7〜S19)。
【００１０】
cMETのリガンド、肝細胞増殖因子(HGF;散乱係数としても公知)及びそのスプライシングアイソフォーム(NK1、NK2)は、cMET受容体の公知のリガンドである。HGFは、強力なマイトゲン/モルホゲンとして1991年に同定された。HGF/cMETシグナル伝達経路は、様々ながんの発生及び進行に重要な役割を果たす。ヒトがんにおけるHGF又はcMETの調節不全及び/又は過剰活性化は、予後不良と関連する。cMETは、過剰発現、増幅、又は変異によって活性化され得る。活性化は、がんの発生、進行、浸潤性増殖、及び転移を促進し得る。cMETは、HGF関連様式及びHGF非依存的様式で活性化され得る。HGF非依存的な活性化は、cMET過剰発現の場合に起こる。大量のcMETは、リガンドの不在下でも(ヘテロ)二量体化及び細胞内シグナル伝達を誘引し得る。さらなるリガンドは、そのようなcMET過剰発現細胞の機能に影響しないようである。cMET増幅はcMET過剰発現と関連し、腫瘍サブタイプのバイオマーカーとなっている。
【００１１】
HGFは、体中に一様に発現され、この増殖因子が全身的に利用可能なサイトカインであることを示しており、並びに腫瘍間質から生じる。cMET活性化の正のパラクライン及び/又はオートクラインループはさらなるcMET発現をもたらすことができる。HGF特異抗体リロツムマブ(AMG102)は胃がんのために開発された。フェーズI及びフェーズII試験は期待できるようであったが、胃がんの第一選択治療としてシスプラチン及びカペシタビンによるフェーズIII試験(RILOMET-2)は、治験20070622の事前計画データ監視委員会の安全審査に従って中止された。
【００１２】
EGFR標的化治療に対する耐性におけるcMET/HGFシグナル伝達の関連性は、耐性に対処する方法の開発を刺激してきた。現在までに、抗HGF抗体;抗cMET又はcMET抗体及びcMET/EGFRを含む抗体ベースの手法(Leeら、2015年; Immunotargets and Therapy 4: 35〜44頁に記載された)は臨床的に有効ではなかった。cMET抗体、オナルツズマブ(MetMab(商標))及びエミベツズマブ(LY-2875358)はフェーズII臨床試験で評価された。これらのオナルツズマブは、EGFR阻害剤エルロチニブとの併用処置で直腸結腸がんに対して有効なようである。しかしながら、これらの結果は、無作為化されたフェーズIII臨床試験では繰り返されなかった。MetMAbは、cMETに対する一価のモノクローナル抗体(mAb)であり、cMETへのHGFの結合及び続く経路の活性化を遮断する(Jinら、2008年 Cancer Research Vol. 68: 4360〜68頁)。
【００１３】
抗EGFR、cMET及びHGF免疫療法による問題を克服するため、本発明は、上皮成長因子受容体(EGFR)の細胞外部分に結合することができる第1の可変ドメイン及びcMETがん原遺伝子、受容体チロシンキナーゼ(cMET)の細胞外部分に結合することができる第2の可変ドメインを含む、新規の二重特異性抗体を提供する。
【００１４】
現在までに、特定の二重特異性EGFR×cMET抗体が当技術分野で記載されている。Castoldi R.ら(2013年)は、抗体5D5(又はMetMAb)のcMET結合部位及びセツキシマブのEGFR結合部位を有するMetHer1と名付けられた二重特異性EGFR×cMET抗体を記載する。二重特異性抗体は、2:1の固定されたEGFR及びcMET結合化学量論を有する(添付の図面参照)。
【００１５】
米国特許出願公開第20140378664号は、様々な他の二重特異性抗体の中にcMET×EGFR二重特異性抗体を記載する。完全な二重特異性抗体は、単一のタンパク質として産生され、後にタンパク質分解により切断される。2つのVH/VLドメインは、一本鎖Fv断片として産生される。抗体の結合は、胃がん細胞系のcMET分解及びAktリン酸化を誘導する。Mooresら(2016年)は、EUナンバリングに従って405位及び409位に変異を有する制御されたFabアーム交換(cFAE)によって産生され、免疫原性である可能性があるJNJ-61186372と名付けられた二重特異性cMET×EGFR抗体を記載する。JNJ-61186372は、cMETリガンドHGFを発現する腫瘍細胞系H1975による異種移植片モデルを使用してインビボで活性であることが示された。この腫瘍モデルは、抗体のADCC活性に依存することが公知である(Ahmedら、2015年)。JNJ-61186372は、EGFRよりもcMETに対しておよそ40×高い親和性の、報告された親和性不均衡を有し(Mooresら(2016年))、ザルツムマブ由来の抗EGFRアームは、他の問題の中でも、注入関連反応、皮膚障害を起こすことが公知である。
【００１６】
LY3164530は、二重特異性cMET×EGFR抗体であり、cMET結合抗体LY2875358(エミベツズマブ;Kim and Kim 2017年)の重鎖可変ドメインに融合した一本鎖Fv断片としてセツキシマブのEGFR結合ドメインを含有する。それぞれの抗原に対する2つの結合部位を含むいわゆる二重可変ドメイン抗体である。抗体に対するHGF阻害に関してデータは提供されない。報告によれば、抗体は、活性にアゴニストではなくcMET及びEGFRに結合し、内部移行する。筆者らは、様々なcMET、EGFR、及びcMET×EGFR標的化治療を記載し、現在まで、これらの阻害剤のいずれも臨床試験において顕著な有効性を示さなかったという結論を示す。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】米国特許出願公開第20140378664号
【特許文献２】国際特許出願PCT/NL2015/050124
【特許文献３】国際公開第2015/130172号
【特許文献４】国際公開第2009/157771号
【特許文献５】米国特許出願公開第13/866,747号(現在米国特許第9,248,181号として発行)
【特許文献６】米国特許出願公開第14/081,848号(現在米国特許第9,358,286号として発行)
【特許文献７】国際出願PCT/NL2013/050294(国際公開第2013/157954号として公開)
【特許文献８】国際公開第2013/157954号
【特許文献９】国際公開第2013/157953号
【特許文献１０】国際公開第2017/069628号
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Bardelliら、2013年; Cancer Discov. Jun;3(6):658〜73頁doi: 10.1158/2159-8290.CD-12-0558
【非特許文献２】J. M. Siegfriedら、Ann Thorac Surg 66, 1915 (1998年)
【非特許文献３】P. C. Maら、Anticancer Res 23, 49 (2003年)
【非特許文献４】B. E. Elliottら、Can J Physiol Pharmacol 80, 91 (2002年)
【非特許文献５】C. Seidel,ら、Med Oncol 15, 145 (1998年)
【非特許文献６】C. Birchmeierら、Nat Rev Mol Cell Biol 4, 915 (2003年)
【非特許文献７】G. Maulikら、Cytokine Growth Factor Rev 13, 41 (2002年)
【非特許文献８】Organ and Tsao. Therapeutic advances in medical oncology 3.1_suppl (2011年): S7〜S19
【非特許文献９】Leeら、2015年; Immunotargets and Therapy 4: 35〜44頁
【非特許文献１０】Jinら、2008年 Cancer Research Vol. 68: 4360〜68頁
【非特許文献１１】Olayioye MAら; EMBO J (2000年) Vol 19:3159〜3167頁
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【非特許文献１４】J.C. Almagro1 and J. Fransson (2008年) Frontiers in Bioscience 13, 1619〜1633頁
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【非特許文献１６】Ji H., Zhao X; PNAS 103:7817〜7822頁(2006年)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
したがって、本明細書に記載の優れた特性を有し得るものを含む、新規の二重特異性cMET×EGFR抗体の必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
一態様では、本発明はヒト上皮成長因子受容体(EGFR)の細胞外部分に結合することができる第1の可変ドメイン及びヒトMETがん原遺伝子、受容体チロシンキナーゼ(cMET)の細胞外部分に結合することができる第2の可変ドメインを含む二重特異性抗体を提供する。
【００２１】
二重特異性抗体は、共通軽鎖を含み得る。第1及び第2の可変ドメインは、好ましくは同じ又は実質的に同じ(共通)軽鎖可変領域を含む。前記共通軽鎖可変領域は、組換えされた多様なヒト可変領域遺伝子セグメントとよく対をなすことが公知のものであってよい。より好ましくは、前記共通軽鎖は、好ましくは生殖系列Vk遺伝子セグメントにコードされた可変領域であり、好ましくはO12/IgVκ1-39*01可変領域遺伝子セグメントである。好ましい軽鎖可変領域は、再編成されたIgVκ1-39*01/IGJκ1*01又はIgVκ1-39*01/IGJκ5*01を含む。cMET結合アームの軽鎖及びEGFR結合アームの軽鎖は、好ましくは同じ(共通)軽鎖である。共通軽鎖は、好ましくはヒト軽鎖定常領域に接合した再編成されたカッパ軽鎖IgVκ1-39*01/IGJκ1*01又はIgVκ1-39*01/IGJκ5*01である。二重特異性抗体はヒト抗体であってよい。二重特異性抗体は、全長抗体であってよい。それは、EGFRに結合することができる1つの可変ドメイン及びcMETに結合することができる1つの可変ドメインを有し得る。一態様では、ヒトEGFRに結合することができる可変ドメインは、マウスEGFR及び/又はカニクイザルEGFRにも有利に結合することができる。ヒトEGFRに結合することができる可変ドメインは、ヒトEGFRのドメインIIIに結合することができる。cMETに結合することができる可変ドメインは、抗体5D5のcMETへの結合を遮断し得る。cMETに結合することができる可変ドメインは、HGFのcMETへの結合を遮断し得る。cMETに対する抗体のKdは、EGFRに対する抗体のKdより少なくとも10分の1である。1つのCH3ドメインの405位及び409位のアミノ酸は、他のCH3ドメインの対応する位置のアミノ酸と同じであり得る(EUナンバリング)。
【００２２】
第1の可変ドメインは、CDR1配列SYGIS;CDR2配列WISAYX1X2NTNYAQKLQG及び配列X3X4X5X6HWWLX7Aを含むCDR3を有する重鎖可変領域を含み、ここで、X1=N又はS;X2=A又はG;X3=D又はG;X4=R、S又はY;X5=H、L又はY;X6=D又はW及びX7=D又はGであり;X1〜X7以外の位置に0〜5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組合せを有し得る。
【００２３】
第2の可変ドメインは、0〜10、好ましくは0〜5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組合せを有する配列番号1〜23の配列の1つのアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含み得る。
【００２４】
二重特異性抗体が記載され、ここで、
X1=N; X2=G; X3=D; X4=S; X5=Y; X6=W及びX7=G;
X1=N; X2=A; X3=D; X4=S; X5=Y; X6=W及びX7=G;
X1=S; X2=G; X3=D; X4=S; X5=Y; X6=W及びX7=G;
X1=N; X2=G; X3=D; X4=R; X5=H; X6=W及びX7=D;
X1=N; X2=A; X3=D; X4=R; X5=H; X6=W及びX7=D;
X1=S; X2=G; X3=D; X4=R; X5=H; X6=W及びX7=D;
X1=N; X2=G; X3=G; X4=Y; X5=L; X6=D及びX7=G;
X1=N; X2=A; X3=G; X4=Y; X5=L; X6=D及びX7=G;又は
X1=S; X2=G; X3=G; X4=Y; X5=L; X6=D及びX7=Gである。いくつかの実施形態では、
X1=N; X2=G; X3=D; X4=R; X5=H; X6=W及びX7=D;
X1=N; X2=A; X3=D; X4=R; X5=H; X6=W及びX7=D;又は
X1=S; X2=G; X3=D; X4=R; X5=H; X6=W及びX7=Dである。
【００２５】
好ましい実施形態では、X3-X7=DRHWD並びにX1及びX2はNG; SG又はNAである。
【００２６】
二重特異性抗体が記載され、ここで第2の可変ドメインの重鎖可変領域は、0〜10、好ましくは0〜5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組合せを有する配列番号1〜3; 7; 8; 10; 13; 15; 16; 17; 21; 22又は23の配列の1つのアミノ酸配列を含む。
【００２７】
本発明は、本明細書に記載の二重特異性抗体を、それを必要とする個体に投与する工程を含む、腫瘍を有する対象の処置の方法も提供する。典型的には、個体は、異常細胞が関与する疾患を患っているものであり、例えば、個体は腫瘍を患っていてもよい。
【００２８】
本発明は、上皮成長因子受容体(EGFR)の細胞外部分に結合することができる第1の可変ドメイン及びMETがん原遺伝子、受容体チロシンキナーゼ(cMET)の細胞外部分に結合することができる第2の可変ドメインを含む二重特異性抗体も提供し、ここで第1の可変ドメインは、CDR1配列SYGIS;CDR2配列WISAYX1X2NTNYAQKLQG及び配列X3X4X5X6HWWLX7Aを含むCDR3を有する重鎖可変領域を含み、ここで、
X1=N又はS;X2=A又はG;X3=D又はG;X4 = R、S又はY;X5=H、L又はY;X6=D又はW及びX7=D又はGであり、X1〜X7以外の位置に0〜5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組合せを有し、ここで第2の可変ドメインは、0〜10個、好ましくは0〜5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組合せを有する配列番号1〜23の配列の1つのアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。
【００２９】
第1の可変ドメインは、好ましくはCDR1配列SYGIS;CDR2配列WISAYNGNTNYAQKLQG及び配列DRHWHWWLDAFDYを含むCDR3を有する重鎖可変領域を含み、第2の可変ドメインは、好ましくはCDR1配列SYSMN;CDR2配列WINTYTGDPTYAQGFTG及びCDR3配列ETYYYDRGGYPFDPを有する重鎖可変領域を含む。
【００３０】
本発明は、腫瘍のような異常細胞が関与する疾患を有する対象の処置における使用のための本明細書に開示されている発明の二重特異性抗体も提供する。
【００３１】
腫瘍又はがんのような異常細胞が関与する疾患の処置のための医薬品の製造における、本明細書に開示されている発明の二重特異性抗体の使用も提供する。
【００３２】
二重特異性抗体を、それを必要とする個体に投与する工程を含む、腫瘍、好ましくはEGFR陽性腫瘍、cMET陽性腫瘍又はEGFR及びcMET陽性腫瘍を有する対象の処置の方法も提供する。
【００３３】
本明細書に開示されている発明の抗体は、好ましくは、創傷治癒アッセイにおけるHGF誘導性のEBC1細胞の遊走を阻害する。好ましくは、阻害は、セツキシマブとMetMabの組合せよりも優れている。例えば、EGF有り又は無しでHGFの存在下での創傷閉鎖の防止によって阻害を達成することが好ましい(HGFは15ng/mlで存在し、存在する場合EGFは12,5ng/mlの量で存在する)。
【００３４】
本明細書に開示されている発明の抗体は、TKIと組み合わせて使用した場合、EGFR  TKI耐性腫瘍細胞系PC-9及びHCC827のHGF及びEGF/HGF誘導増殖を阻害する。TKIは好ましくはゲフィチニブである。
【００３５】
本明細書に開示されている発明の抗体は、HGF応答性細胞、好ましくはEGFR  TKI耐性腫瘍細胞系PC-9又はHCC827のHGF誘導増殖を阻害する。
【００３６】
本明細書に開示されている発明の抗体は、高親和性の二価のEGFR抗体と関連する発疹及び下痢のような毒性を誘導することなく、EGF応答性細胞のEGF誘導増殖を阻害する。これは抗体をそれ自体の毒性プロファイルを有するTKIとの組合せにとって理想的にする。
【００３７】
本発明は、本明細書に開示されている二重特異性抗体を含む医薬組成物を更に含む。
【００３８】
本発明の抗体は、EGFRチロシンキナーゼ阻害剤による処置に耐性である、例えばエルロチニブ、ゲフィチニブ、又はアファチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ又はアファチニブの類似体、又は1つ若しくは複数のそれぞれの化合物及び/又はそれらの類似体の組合せに耐性の腫瘍の処置に使用され得る。
【００３９】
本発明に記載の処置は、EGFRチロシンキナーゼ阻害剤による処置を更に含んでよく、例えばここでEGFRチロシンキナーゼ阻害剤はエルロチニブである。
【００４０】
したがって、本発明の二重特異性抗体は、EGFRチロシンキナーゼ阻害剤と同時に、順次、又は別々に投与され得る。
【００４１】
本発明は、本明細書に開示されている二重特異性抗体又はそれらの変異体の重鎖又は重鎖可変領域を単独で又は一緒にコードする核酸分子又は核酸分子の群を更に含む。本明細書に開示されている抗体をコードする核酸分子又は核酸分子の群も提供する。
【００４２】
好ましい実施形態では、重鎖はIgG1抗体、好ましくはヒトIgG1抗体の定常領域を含む。前記IgG1定常領域のCH2領域は、抗体のADCC及び/又はCDC活性を変更する、又は変更しないように工学的に改変され得る。好ましい実施形態では、前記変更は増強したADCC及び/又はCDC活性をもたらす。好ましい実施形態では、抗体のCH3領域は、EGFRに結合する第1の重鎖及びcMETに結合する第2の重鎖を含む重鎖のヘテロ二量体化を促進するように工学的に改変される。
【００４３】
本発明は、本明細書に開示されている二重特異性抗体又はそれらの変異体を単独で又は一緒にコードする1つ若しくは複数の核酸分子を含む細胞を更に含む。好ましくは、細胞の培養からの二重特異性抗体又はそれらの変異体の回収と一緒に、記載した細胞を使用して本明細書に開示されている二重特異性抗体又はそれらの変異体を産生する方法も提供する。
【００４４】
本発明は、本明細書に開示されている二重特異性抗体又はそれらの変異体を含む細胞システムを更に含む。
【００４５】
本発明は、二重特異性抗体を発現する、及び/又は前記二重特異性抗体をコードする核酸分子を含む細胞を更に提供する。
【００４６】
本発明は、標識、好ましくはインビボ画像化のための標識を更に含む本明細書に開示されている二重特異性抗体を更に含む。
【００４７】
EGFRは、Her-又はcErbB-1、-2、-3、及び-4と名付けられた、4つの受容体チロシンキナーゼ(PTK)のファミリーのメンバーである。EGFRは、4つのサブドメインからなり、その2つがリガンド結合に含まれ、その1つがホモ二量体化及びヘテロ二量体化に含まれる細胞外ドメイン(ECD)を有する(Ferguson(2008年))。この節に使用される参照番号は、それぞれ参照により組み込まれる、頭に「本明細書で引用した」を付けたリストの参照の番号付けを指す。EGFRは、様々なリガンドからの細胞外シグナルを組込み、多様な細胞内応答を生じる(Yardenら、2001年;及びJorrisenら、2003年)。EGFRは、いくつかのヒト上皮悪性腫瘍、特に乳がん、膀胱がん、非小細胞肺がん、肺がん、大腸がん、卵巣がん、頭頚部がん、及び脳がんに関係する。遺伝子の活性化変異、並びにオートクライン活性化ループを起こす受容体及びそのリガンドの過剰発現が見出された(検討のため、Robertsonら、2000年参照)。したがって、このRTKはがん治療の標的として広く使用されている。RTKを標的化する小分子阻害剤と細胞外リガンド結合ドメインに対するモノクローナル抗体(mAb)の両方が開発されており、今までのところ患者の群の選択にほとんど関わらず、いくつかの臨床的な成功が示されている。ヒトEGFRタンパク質及びそれをコードする遺伝子のデータベース受入番号は、(GenBank NM_005228.3)である。遺伝子及び/又はタンパク質の他のデータベース識別子は、HGNC:3236; Entrez Gene: 1956; Ensembl: ENSG00000146648; OMIM: 131550及びUniProtKB: P00533である。受入番号は、主に標的としてEGFRタンパク質の同定のさらなる方法を提供するために与えられ、抗体に結合されたEGFRタンパク質の実際の配列は、例えばいくつかのがん等で生じるもののようなコードする遺伝子における変異のために多様であり得る。本明細書でEGFRについて参照する場合、他に指定しない限りヒトEGFRを指す。EGFRに結合する抗原結合部位は、EGFR、及びいくつかのEGFR陽性腫瘍において発現されたもののようなそれらの多種の変異体に結合する。
【００４８】
本明細書で使用する場合、用語「EGFRリガンド」は、EGFRに結合及び活性化するポリペプチドを指す。EGFRリガンドの例としては、限定はされないが、EGF、TGF-α、HB-EGF、アンフィレグリン、ベータセルリン、及びエピレグリンが挙げられる(検討のため、Olayioye MAら; EMBO J (2000年) Vol 19:3159〜3167頁)。用語は、生物学的に活性な断片及び/又は自然発生のポリペプチドの変異体を含む。
【００４９】
チロシン-タンパク質キナーゼMET又は肝細胞増殖因子受容体(HGFR)とも呼ばれるcMETは、ヒトにおいてMET遺伝子によってコードされるタンパク質である。タンパク質はチロシンキナーゼ活性を持つ。初期の一本鎖前駆体タンパク質は転写後に切断され、アルファ及びベータサブユニットを産生し、ジスルフィド結合され成熟受容体を形成する。
【００５０】
異常に活性化されたcMETは、腫瘍増殖、腫瘍に養分を供給する新しい血管の形成(血管新生)、及び他の臓器に広がるがん(転移)を誘導し得る。cMETは、腎臓がん、肝臓がん、胃がん、乳がん、及び脳がんを含むヒト悪性腫瘍の多くの型で脱調節される。cMET遺伝子は、METがん原遺伝子、受容体チロシンキナーゼ;肝細胞増殖因子受容体、チロシン-タンパク質キナーゼMet;分散因子受容体;がん原遺伝子C-Met; HGF/SF受容体; HGF受容体; SF受容体; EC 2.7.10.1; Metがん原遺伝子; EC 2.7.10; DFNB97; AUTS9; RCCP2; C-Met; MET; HGFR; cMETのその他のIDはHGNC: 7029; Entrez Gene: 4233; Ensembl: ENSG00000105976; OMIM: 164860及びUniProtKB: P08581のようないくつかの異なる名称の下で公知である。受入番号は、主に標的としてcMETタンパク質の同定のさらなる方法を提供するために与えられ、抗体によって結合されるcMETタンパク質の実際の配列は、例えばいくつかのがん等で生じるもののようなコードする遺伝子における変異のために多様であり得る。本明細書でcMETについて参照する場合、他に指定しない限りヒトcMETを指す。cMETに結合する抗原結合部位は、cMET、及びいくつかのcMET陽性腫瘍において発現されたもののようなそれらの多種の変異体に結合する。
【００５１】
抗体は、典型的には抗原の一部のみを認識する。抗原は、必ずしもそうではないが、典型的にはタンパク質である。抗体によって結合される抗原の認識又は結合部位は、エピトープと呼ばれ、エピトープは線状又は立体構造であり得る。抗体の抗原への結合は、典型的には特異的である。抗体の「特異性」は、特定のエピトープのその選択性を指し、「親和性」は、抗体の抗原結合部位とそれが結合するエピトープの間の相互作用の強さを指す。
【００５２】
本明細書に開示されている発明の例示的な抗体は、EGFR及びcMET、好ましくはヒトEGFR及びヒトcMETに結合する。本明細書に開示されている発明のEGFR/cMET二重特異性抗体はEGFRに結合し、別の同一の条件下では、同じ種の相同受容体ErbB-2及びErbB-4に対して少なくとも100分の1である。本明細書に開示されている発明のEGFR/cMET二重特異性抗体はcMETに結合し、別の同一の条件下では、同じ種の受容体ErbB-2及びErbB-4に対して少なくとも100分の1である。受容体が細胞表面受容体であることを考慮すると、結合は受容体を発現する細胞上でアッセイされ得る。本明細書に開示されている発明の二重特異性抗体は、好ましくはヒト、カニクイザルEGFR及び/又はマウスEGFRに結合する。
【００５３】
EGFR及びcMETに結合する抗体は、そのような他のタンパク質が同じエピトープを含有する場合、他のタンパク質にも同様に結合し得る。したがって、用語「結合する」は、別のタンパク質又は同じエピトープを含有するタンパク質への抗体の結合を除外しない。そのような結合は、典型的には交差反応性と呼ばれる。EGFR/cMET二重特異性抗体は、典型的には、出生後の、好ましくは成人の細胞の膜上のEGFR及び/又はcMET以外の他のタンパク質に結合しない。本明細書に開示されている発明に記載の抗体は、以下により詳細に概説したように、典型的には、少なくとも1×10e-6Mの結合親和性(すなわち平衡解離定数Kd)でEGFRに結合することができる。
【００５４】
本明細書で使用する用語「抗体」は、タンパク質性分子を意味し、好ましくはタンパク質の免疫グロブリンクラスに属する。抗体は、典型的には、抗原上のエピトープに結合する2つの可変ドメインを含有する。そのようなドメインは、抗体の可変ドメインに由来し、又は抗体の可変ドメインと配列相同性を共有する。本明細書に開示されている発明の二重特異性抗体は、好ましくは2つの可変ドメインを含む。治療用途の抗体は、好ましくは処置される対象の天然の抗体に可能な限り近い(例えば、ヒト対象のためのヒト抗体)。抗体結合は、特異性及び親和性の観点で表され得る。特異性は、どの抗原又はそれらのエピトープが、結合ドメインによって特異的に結合されるか決定する。典型的には、治療用途の抗体は、1×10e-10M又はそれ以上までの親和性を有し得る。本明細書に開示されている発明の二重特異性抗体のような抗体は、好ましくは天然の抗体の定常ドメイン(Fc部分)を含む。本明細書に開示されている発明の抗体は、典型的には二重特異性全長抗体、好ましくはヒトIgGサブクラスの抗体である。好ましくは、本発明の抗体は、ヒトIgG1サブクラスの抗体である。本明細書に開示されている発明のそのような抗体は、良好なADCC特性を有し、ヒトへのインビボ投与時に有利な半減期を有し、CH3工学技術が存在し、クローン細胞での共発現時にホモ二量体よりもヘテロ二量体を優先的に形成する改変重鎖を提供することができる。抗体のADCC活性は、当業者に公知の技術によって改善もされ得る。
【００５５】
本明細書に開示されている発明の抗体は、好ましくは「全長」抗体である。本明細書に開示されている発明による用語「全長」は、基本的に完全な抗体を含むものと規定されるが、無傷な抗体の全ての機能を必ずしも有するわけではない。疑義を回避するため、全長抗体は2つの重鎖及び2つの軽鎖を含有する。各鎖は、定常(C)領域及び可変(V)領域を含有し、CH1、CH2、CH3、VH、及びCL、VLと名付けられたドメインに分解され得る。典型的には、抗体は、Fab部分に含有される可変ドメインを介して抗原に結合し、結合後、定常ドメインによって、たいていはFc部分によって免疫系の分子及び細胞と相互作用することができる。本明細書に開示されている発明による全長抗体は、所望の特徴を提供する変異が存在し得る抗体を包含する。生じる抗体の特異性及び/又は親和性特徴を基本的に変えることなく1つ又はいくつかののアミノ酸残基が欠失した抗体は、用語「全長抗体」に包含される。例えば、IgG抗体は、定常領域に1〜20アミノ酸残基の挿入、欠失、又は置換若しくはこれらの組合せを有し得る。
【００５６】
本明細書に開示されている発明に記載の抗体は、好ましくは二重特異性IgG抗体、好ましくは二重特異性全長IgG1抗体及びより好ましくはヒトIgG1である。全長IgG抗体は、それらの典型的に有利な半減期及び免疫原性のため完全に自己(ヒト)分子に近いように維持する要求のために好まれる。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は全長IgG1、全長IgG2、全長IgG3又は全長IgG4抗体である。
【００５７】
本明細書に開示されている発明は、EGFRの細胞外部分に結合することができる第1の可変ドメイン及びcMETの細胞外部分に結合することができる第2の可変ドメインを含む二重特異性抗体を含み、ここで第1の可変ドメインは、0.39nMのKdを有するセツキシマブより低い親和性でEGFRに結合する(Kimら2008年)。第1の可変ドメインは、好ましくは10e-6Mと10e-9Mの間のKdでEGFRに結合する。Kdは、好ましくは10e-7Mと10e-9Mの間であり、好ましくは10e-8Mと10e-9Mの間である。第2の可変ドメインは、好ましくは10e-7M以下のKdでcMETに結合する。Kdは、好ましくは10e-7Mと10e-11Mの間である。第2の可変ドメインは、好ましくは第1の可変ドメインがEGFRに対して有するよりもcMETに対してより高い親和性を有する。言い換えると、この好ましい実施形態では、cMETに対する抗体のKdはEGFRに対する抗体のKdより低い。好ましい実施形態では、cMETに対する抗体のKdは、EGFRに対する抗体のKdよりも少なくとも5分の1、好ましくは10分の1である。この実施形態では、それぞれの抗原に対するKdの値は、好ましくはこの節に示した通りである。この親和性の適当な不均衡は、本明細書に開示されている発明の二重特異性抗体を好ましくはEGFRへの結合を介して細胞にドッキングさせ、リガンドHGFのcMETへの結合を遮断する。
【００５８】
EGFRに結合することができる可変ドメインは、好ましくは二価の単特異性抗体の状況で、A431細胞のEGF誘導死を阻害する可変ドメインである。EGF誘導細胞死の阻害は、好ましくは10mM EGF及び10μg/ml抗体の濃度で測定される。EGF誘導細胞死の阻害は、A431細胞増殖を許容する(EGFは許容しない)条件下でA431の培養の3〜7日後の、抗体有り又は無しでの細胞の数を比較することによって検出可能である。理論に縛られることなく、抗体のEGFRへの結合はEGFのEGFRへの結合を遮断すると考えられる。EGFRに結合することができる可変ドメインは、好ましくは二価の単特異性抗体の状況で、BxPC3又はBxPC3-luc2細胞のEGF誘導増殖を阻害する可変ドメインである。
【００５９】
本明細書に開示されている発明の抗体は、好ましくは創傷治癒アッセイにおけるHGF誘導性のEBC1細胞の遊走を阻害する。創傷治癒アッセイは、好ましくは実施例に記載したアッセイである。創傷治癒の阻害は、セツキシマブとMetMabの組合せよりも優れている。阻害は、典型的には100%ではない。いくつかの創傷治癒は、阻害抗体の存在下でも生じる。
【００６０】
本明細書に開示されている発明の抗体は、TKIと組み合わせて使用した場合、EGFR TKI耐性腫瘍細胞系PC-9及びHCC827のHGF及びEGF/HGF誘導増殖を阻害する。TKIは好ましくはゲフィチニブである。
【００６１】
本明細書に開示されている発明の抗体は、HGF応答性細胞、好ましくはEGFR TKI耐性腫瘍細胞系PC-9又はHCC827のHGF誘導増殖を阻害する。
【００６２】
本明細書に開示されている発明の抗体は、高親和性の二価のEGFR抗体と関連する発疹及び下痢等のような顕著な一般的な毒性を誘導することなく、EGF応答性細胞のEGF誘導増殖を阻害する。これは抗体をそれ自体の毒性プロファイルを有するTKIとの組合せにとって理想的にする。
【００６３】
誘導された増殖は、好ましくは実施例に記載のアッセイを使用して測定される。阻害は、典型的には100%ではない。いくつかの増殖は、阻害抗体の状況下でも生じる。
【００６４】
EGFRに結合することができ、本明細書に示したMF3370又はその変異体のアミノ酸配列を含む可変ドメインは、好ましくはEGFRドメインIIIに結合する(本明細書に参照により組み込まれる国際特許出願PCT/NL2015/050124;国際公開第2015/130172号のtable4(表4)参照)。EGFRへの可変ドメインの結合は、セツキシマブによって阻害され得る。可変ドメインは、セツキシマブ及びザルツムマブによって認識されるエピトープとは異なるエピトープに結合する。例えば、可変ドメインはマウスEGFRに結合するが、セツキシマブ及びザルツムマブは結合せず、マウスとヒトEGFRドメインIIIの間で異なる1つ又は複数の残基がセツキシマブ及びザルツムマブ結合に役割を果たすが、本明細書に記載の本発明の抗体では役割を果たさないことを示している。ヒト、マウス、カニクイザルEGFR交差反応性を有する本明細書に記載の本発明の二重特異性抗体の利点は、ヒトがんモデルの異種移植片試験の使用を許容し、受容体を有する正常なマウス細胞にも結合する抗体として有効性及び毒性に関してより予測的であるが、カニクイザルの毒性試験においても使用することができることである。一態様では、本発明は、ヒト上皮成長因子受容体(EGFR)の細胞外部分に結合することができる第1の可変ドメイン及びヒトMETがん原遺伝子、受容体チロシンキナーゼ(cMET)の細胞外部分に結合することができる第2の可変ドメインを含む二重特異性抗体を提供し、ここで前記第1の可変ドメインはマウスEGFR、カニクイザルEGFR又は両方にも結合することができる。
【００６５】
cMET可変ドメインは、好ましくは本明細書に示したMF4356又はその変異体のアミノ酸配列を含み、好ましくは抗体MetMabのcMETへの結合を遮断する。可変ドメインは、好ましくはリガンドHGFのcMETへの結合を遮断する。可変ドメインは、飽和量の前記可変ドメインの存在下で、最大半量の結合条件でのMetMabのcMETへの結合が少なくとも40%、好ましくは少なくとも60%減少された場合、抗体MetMabのcMETへの結合を遮断する。可変ドメインは、好ましくは二価単一特異性抗体の状況で提供される。cMET可変ドメインは、好ましくはcMETのsemaドメインに結合できる。本発明のcMET可変ドメインは、cMETへの結合に関して5D5と競合してもよく、5D5のような報告した抗cMET参照抗体と競合しなくてもよい。
【００６６】
本明細書に開示されている発明の可変ドメインは、EGFRに結合することができ(第1の可変ドメイン)、好ましくは、CDR1配列SYGIS;CDR2配列WISAYX1X2NTNYAQKLQG及び配列X3X4X5X6HWWLX7Aを含むCDR3を有する重鎖可変領域を含み、ここで、X1=N又はS;X2=A又はG;X3=D又はG;X4=R、S又はY;X5=H、L又はY;X6=D又はW及びX7=D又はGである。
【００６７】
X1〜7は、好ましくは:
X1=N; X2=G; X3=D; X4=S; X5=Y; X6=W及びX7=G;
X1=N; X2=A; X3=D; X4=S; X5=Y; X6=W及びX7=G;
X1=S; X2=G; X3=D; X4=S; X5=Y; X6=W及びX7=G;
X1=N; X2=G; X3=D; X4=R; X5=H; X6=W及びX7=D;
X1=N; X2=A; X3=D; X4=R; X5=H; X6=W及びX7=D;
X1=S; X2=G; X3=D; X4=R; X5=H; X6=W及びX7=D;
X1=N; X2=G; X3=G; X4=Y; X5=L; X6=D及びX7=G;
X1=N; X2=A; X3=G; X4=Y; X5=L; X6=D及びX7=G;又は
X1=S; X2=G; X3=G; X4=Y; X5=L; X6=D及びX7=Gである。
【００６８】
好ましい実施形態では、
X1=N; X2=G; X3=D; X4=R; X5=H; X6=W及びX7=D;
X1=N; X2=A; X3=D; X4=R; X5=H; X6=W及びX7=D;又は
X1=S; X2=G; X3=D; X4=R; X5=H; X6=W及びX7=Dである。
好ましくは、X1=N; X2=G; X3=D; X4=R; X5=H; X6=W及びX7=Dである。
【００６９】
第1の可変ドメインのCDR3配列における配列X3X4X5X6HWWLX7Aのアミノ酸Aに続くアミノ酸は、変化し得る。配列X3X4X5X6HWWLX7Aに続くアミノ酸配列はFDYであってよい。第1の可変ドメインのCDR3は、好ましくは配列X3X4X5X6HWWLX7AF、好ましくはX3X4X5X6HWWLX7AFD、より好ましくはX3X4X5X6HWWLX7AFDYを含む。
【００７０】
第1の可変ドメインは、好ましくはCDR1配列SYGIS;CDR2配列WISAYNGNTNYAQKLQG及びCDR3配列X3X4X5X6HWWLX7Aを有する重鎖可変領域を含む。
【００７１】
第1の可変ドメインは、好ましくはCDR1配列SYGIS;CDR2配列WISAYNGNTNYAQKLQG及び配列DRHWHWWLDAを含むCDR3を有する重鎖可変領域を含む。第1の可変ドメインのCDR3配列の配列LDAに続くアミノ酸は、変化し得る。配列LDAに続くアミノ酸配列はFDYであってよい。第1の可変ドメインのCDR3は、好ましくは配列DRHWHWWLDAF、好ましくはDRHWHWWLDAFD、より好ましくはDRHWHWWLDAFDYを含む。
【００７２】
第1の可変ドメインは、好ましくは、示した配列に関して最大10、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10及び好ましくは0、1、2、3、4又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換又はこれらの組合せを有する図7に示したMF3353; MF8229; MF8228; MF3370; MF8233; MF8232; MF3393; MF8227又はMF8226のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。好ましい実施形態では、第1の可変ドメインは、図7に示したMF3353; MF8229; MF8228; MF3370; MF8233; MF8232; MF3393; MF8227又はMF8226のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。
【００７３】
cMETに結合することができる可変ドメイン(第2の可変ドメイン)は、好ましくは0〜10、好ましくは0〜5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組合せを有する配列番号1〜23の配列の1つのアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。第2の可変ドメインの重鎖可変領域は、好ましくは0〜10個、好ましくは0〜5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組合せを有する配列番号1〜3; 7; 8; 10; 13; 15; 16; 17; 21; 22又は23の配列の1つのアミノ酸配列を含む。第2の可変ドメインの重鎖可変領域は、好ましくは0〜10、好ましくは0〜5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組合せを有する配列番号2; 7; 8; 10; 13又は23の配列の1つのアミノ酸配列を含む。第2の可変ドメインの重鎖可変領域は、好ましくは0〜10個、好ましくは0〜5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組合せを有する配列番号13又は配列番号23の配列のアミノ酸配列を含む。
【００７４】
好ましい実施形態では、第1の可変ドメインは、CDR1配列SYGIS;CDR2配列WISAYNGNTNYAQKLQG及び配列DRHWHWWLDA、好ましくはDRHWHWWLDAFDYを含むCDR3を有する重鎖可変領域を含み、ここで第2の可変ドメインは、CDR1配列SYSMN;CDR2配列WINTYTGDPTYAQGFTG及びCDR3配列ETYYYDRGGYPFDPを有する重鎖可変領域を含む。第1及び第2の可変ドメインの軽鎖のCDR1、CDR2及びCDR3は、好ましくはそれぞれアミノ酸配列CDR1-QSISSY、CDR2-AAS、CDR3-QQSYSTP、すなわちIGKV1〜39のCDR(IMGTより)を含む。
【００７５】
好ましい実施形態では、第1の可変ドメインは、CDR1配列SYGIS;CDR2配列WISAYNGNTNYAQKLQG及び配列DRHWHWWLDAを含むCDR3を有する重鎖可変領域を含み、ここで第2の可変ドメインは、CDR1配列TYSMN;CDR2配列WINTYTGDPTYAQGFTG及び配列ETYFYDRGGYPFDPを含むCDR3を有する重鎖可変領域を含む。第1及び第2の可変ドメインの軽鎖のCDR1、CDR2及びCDR3は、好ましくはそれぞれアミノ酸配列CDR1-QSISSY、CDR2-AAS、CDR3-QQSYSTP、すなわちIGKV1〜39のCDR(IMGTより)を含む。
【００７６】
二重特異性抗体は、EGFRの細胞外部分に結合することができる第1の可変ドメイン及びcMETの細胞外部分に結合することができる第2の可変ドメインを含み、ここで第1の可変ドメインは、CDR1配列SYGIS;CDR2配列WISAYNANTNYAQKLQG及び配列DRHWHWWLDAを含むCDR3を有する重鎖可変領域を含み、ここで第2の可変ドメインは、CDR1配列SYSMN;CDR2配列WINTYTGDPTYAQGFTG及びCDR3配列ETYYYDRGGYPFDPを有する重鎖可変領域を含む。第1及び第2の可変ドメインの軽鎖のCDR1、CDR2及びCDR3は、好ましくはそれぞれアミノ酸配列CDR1-QSISSY、CDR2-AAS、CDR3-QQSYSTP、すなわちIGKV1〜39のCDR(IMGTより)を含む。
【００７７】
二重特異性抗体は、EGFRの細胞外部分に結合することができる第1の可変ドメイン及びcMETの細胞外部分に結合することができる第2の可変ドメインを含み、ここで第1の可変ドメインは、CDR1配列SYGIS;CDR2配列WISAYNANTNYAQKLQG及び配列DRHWHWWLDAを含むCDR3を有する重鎖可変領域を含み、ここで第2の可変ドメインは、CDR1配列TYSMN;CDR2配列WINTYTGDPTYAQGFTG及び配列ETYFYDRGGYPFDPを含むCDR3を有する重鎖可変領域を含む。第1及び第2の可変ドメインの軽鎖のCDR1、CDR2及びCDR3は、好ましくはそれぞれアミノ酸配列CDR1-QSISSY、CDR2-AAS、CDR3-QQSYSTP、すなわちIGKV1〜39のCDR(IMGTより)を含む。
【００７８】
二重特異性抗体は、EGFRの細胞外部分に結合することができる第1の可変ドメイン及びcMETの細胞外部分に結合することができる第2の可変ドメインを含み、ここで第1の可変ドメインは、CDR1配列SYGIS;CDR2配列WISAYSGNTNYAQKLQG及び配列DRHWHWWLDAを含むCDR3を有する重鎖可変領域を含み、ここで第2の可変ドメインは、CDR1配列SYSMN;CDR2配列WINTYTGDPTYAQGFTG及びCDR3配列ETYYYDRGGYPFDPを有する重鎖可変領域を含む。第1及び第2の可変ドメインの軽鎖のCDR1、CDR2及びCDR3は、好ましくはそれぞれアミノ酸配列CDR1-QSISSY、CDR2-AAS、CDR3-QQSYSTP、すなわちIGKV1〜39のCDR(IMGTより)を含む。
【００７９】
二重特異性抗体は、EGFRの細胞外部分に結合することができる第1の可変ドメイン及びcMETの細胞外部分に結合することができる第2の可変ドメインを含み、ここで第1の可変ドメインは、CDR1配列SYGIS;CDR2配列WISAYSGNTNYAQKLQG及び配列DRHWHWWLDAを含むCDR3を有する重鎖可変領域を含み、ここで第2の可変ドメインは、CDR1配列TYSMN;CDR2配列WINTYTGDPTYAQGFTG及び配列ETYFYDRGGYPFDPを含むCDR3を有する重鎖可変領域を含む。第1及び第2の可変ドメインの軽鎖のCDR1、CDR2及びCDR3は、好ましくはそれぞれアミノ酸配列CDR1-QSISSY、CDR2-AAS、CDR3-QQSYSTP、すなわちIGKV1〜39のCDR(IMGTより)を含む。
【００８０】
本明細書に記載の第1及び第2の可変ドメインの軽鎖のCDR1、CDR2及びCDR3は、好ましくはそれぞれアミノ酸配列CDR1-QSISSY、CDR2-AAS、CDR3-QQSYSTP、すなわちIGKV1〜39のCDR(IMGTより)を含む。本明細書に記載の二重特異性抗体のいくつかの実施形態では、第1及び第2の可変ドメインは共通軽鎖、好ましくは図9Bの軽鎖を含む。
【００８１】
別の好ましい実施形態では、EGFR/cMET二重特異性抗体は、図1に示したMF3755の重鎖可変領域のCDR1、CDR2、及びCDR3を含む、ヒトEGFRの細胞外部分に結合することができる第1の可変ドメイン並びに図1に示したMF4297の重鎖可変領域のCDR1、CDR2、及びCDR3を含む、ヒトcMETの細胞外部分に結合することができる第2の可変ドメインを含む。前記第1及び第2の可変ドメインの軽鎖可変領域は、好ましくは本明細書に記載の共通軽鎖可変領域である。第1及び第2の可変ドメインの軽鎖のCDR1、CDR2、及びCDR3は、好ましくはそれぞれアミノ酸配列CDR1-QSISSY、CDR2-AAS、CDR3-QQSYSTP、すなわちIGKV1〜39のCDR(IMGTより)を含む。好ましい実施形態では、抗体は、示した配列に関して最大10、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10及び好ましくは0、1、2、3、4又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換又はこれらの組合せを有する図1に示したMF3755のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。好ましい実施形態では、第1の可変ドメインは、図1に示したMF3755のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。cMETに結合することができる可変ドメイン(第2の可変ドメイン)は、0〜10個、好ましくは0〜5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組合せを有する図1に示したMF4297のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。第2の可変ドメインの重鎖可変領域は、好ましくは図1に示したMF4297のアミノ酸配列を含む。
【００８２】
本発明の文脈で、用語「二重特異性」(bs)は、抗体が、2つの異なる標的又は同じ標的の2つのエピトープに結合することができることを意味し、例えば、抗体の1つの可変ドメイン(上記した通り)はEGFRのエピトープに結合し、第2の可変ドメインはcMETのエピトープに結合する。発現レベル、二重特異性抗体によって認識される2つの抗原の(亜)細胞局在性及び化学量論に応じて、抗体の両方のFabアームはそれらのエピトープに同時に結合してもしなくてもよい。二重特異性抗体の1つのアームは、典型的には1つの抗体の可変ドメインを含有し、他のアームは別の抗体の可変ドメインを含有する(すなわち、二重特異性抗体の1つのアームは、1つの軽鎖と対をなす1つの重鎖によって形成され、他のアームは、軽鎖と対をなす異なる重鎖によって形成される)。したがって、本明細書に開示されている発明の好ましい二重特異性抗体の化学量論は1:1、EGFR:cMET結合である。
【００８３】
本明細書に開示されている発明の二重特異性抗体の重鎖可変領域は、典型的には互いに異なるが、軽鎖可変領域は好ましくは同じである。異なる重鎖可変領域が同じ軽鎖可変領域と会合する二重特異性抗体は、共通軽鎖可変領域(cLcv)を有する二重特異性抗体とも呼ばれる。軽鎖定常領域も同じであることが好ましい。そのような二重特異性抗体は、共通軽鎖(cLc)を有すると言われる。したがって、本明細書に開示されている発明による二重特異性抗体が更に提供され、両方のアームは共通軽鎖を含む。
【００８４】
本明細書に開示されている発明に記載の用語「共通軽鎖」は、同一である又は同じアミノ酸配列差を有し得るが、全長抗体の結合特異性は影響されない二重特異性抗体の2つ以上の軽鎖を指す。例えば、本明細書で使用する共通軽鎖の定義の範囲内で、例えば、保存的アミノ酸変化、重鎖と対をなした場合に結合特異性に寄与しない又は部分的に寄与する領域のアミノ酸の変化等を導入及び試験することによって、同一ではないが依然として機能的に等価な軽鎖を調製又は見出すことが可能である。用語「再編成された」の付加有り又は無しで、用語「共通軽鎖」、「共通LC」、「cLC」、「単一軽鎖」は、全て交換可能に使用される。用語「再編成された」の付加有り又は無しで、用語「共通軽鎖可変領域」、「共通VL」、「共通LCv」、「cLCv」、「単一VL」は、全て交換可能に使用される。少なくとも2つ、好ましくは複数の異なる結合特異性の重鎖(可変領域)と結合し、機能性抗原結合ドメインを有する抗体を形成することができる共通軽鎖(可変領域)を二重特異性抗体が有することは、本発明の好ましい態様である(例えば、国際公開第2009/157771号)。共通軽鎖(可変領域)は、好ましくはヒト軽鎖(可変領域)である。共通軽鎖(可変領域)は、好ましくは生殖系列配列を有する。好ましい生殖系列配列は、良好な熱力学安定性、収率、及び可溶性を有する軽鎖可変領域である。好ましい生殖系列軽鎖は、O12である、共通軽鎖は、好ましくは生殖系列ヒトVk遺伝子セグメントによってコードされる軽鎖を含み、好ましくは再編成された生殖系列ヒトカッパ軽鎖IgVκ1-39*01/IGJκ1*01である(図9A)。共通軽鎖可変領域は、好ましくは再編成された生殖系列ヒトカッパ軽鎖IgVκ1-39*01/IGJκ1*01の可変領域である。共通軽鎖は、好ましくは図9B又は0〜5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組合せを有する図9Dに示した軽鎖可変領域を含む。共通軽鎖は、好ましくは軽鎖定常領域、好ましくはカッパ軽鎖定常領域を更に含む。共通軽鎖をコードする核酸は、共通軽鎖タンパク質を発現するために使用される細胞系にコドン最適化され得る。コード核酸は生殖系列核酸配列から外れ得る。
【００８５】
好ましい実施形態では、軽鎖は、0〜10個、好ましくは0〜5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組合せを有する図9Aに示したO12/IgVκ1-39*01遺伝子セグメントのアミノ酸配列を含む軽鎖領域を含む。句「O12軽鎖」は、明細書全体を通して、「0〜10個、好ましくは0〜5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組合せを有する図9Aに示したO12/IgVκ1-39*01遺伝子セグメントのアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む軽鎖」の短縮形として使用される。IgVκ1-39は、免疫グロブリン可変カッパ1〜39遺伝子の短縮形である。遺伝子は、免疫グロブリンカッパ可変1-39; IGKV139; IGKV1-39; O12a又はO12としても公知である。遺伝子のその他のIdは、HGNC: 5740; Entrez Gene: 28930; Ensembl: ENSG00000242371である。IgVκ1-39の好ましいアミノ酸配列は、図9Eに示される。これは、V領域の配列を列挙する。V領域は、5つのJ領域の1つと組合され得る。図9B及び9Dは、J領域と組み合わせたIgVκ1-39の2つの好ましい配列を記載する。合わせた配列は、IGKV1-39/jk1及びIGKV1-39/jk5と示され、代わりの名称はIgVκ1-39*01/IGJκ1*01又はIgVκ1-39*01/IGJκ5*01である(IMGTデータベースワールドワイドウェブimgt.orgによる命名)。
【００８６】
軽鎖可変領域を含むO12/IgVκ1-39*01は、生殖系列配列であることが好ましい。軽鎖可変領域を含むIGJκ1*01又は/IGJκ5*01は、生殖系列配列であることが更に好ましい。好ましい実施形態では、IGKV1-39/jk1又はIGKV1-39/jk5軽鎖可変領域は、生殖系列配列である。
【００８７】
好ましい実施形態では、軽鎖可変領域は、生殖系列O12/IgVκ1-39*01を含む。好ましい実施形態では、軽鎖可変領域は、カッパ軽鎖IgVκ1-39*01/IGJκ1*01又はIgVκ1-39*01/IGJκ5*01を含む。好ましい実施形態では、IgVκ1-39*01/IGJκ1*01。軽鎖可変領域は、好ましくは生殖系列カッパ軽鎖IgVκ1-39*01/IGJκ1*01又は生殖系列カッパ軽鎖IgVκ1-39*01/IGJκ5*01、好ましくは生殖系列IgVκ1-39*01/IGJκ1*01を含む。
【００８８】
O12軽鎖を有する抗体を産生する成熟B細胞は、生殖系列配列、すなわち、生物の非リンパ系細胞における正常配列に関して1つ又は複数の変異を有する軽鎖を産生することが多い。これらの変異の原因となる方法は、体細胞(高頻度)変異と呼ばれることが多い。生じる軽鎖は、親和性成熟軽鎖と呼ばれる。そのような軽鎖は、O12生殖系列配列に由来する場合、O12由来軽鎖である。本明細書では、句「共通軽鎖」は共通軽鎖由来軽鎖を含み、句「O12軽鎖」はO12由来軽鎖を含む。体細胞(高頻度)変異によって導入される変異は、実験室で人工的にも導入され得る。実験室では、必ずしも量ではないが、軽鎖の性質に本質的に影響せずに他の変異も導入され得る。0〜10個、好ましくは0〜5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組合せを有する図9A、図9B、図9D又は図9Eに示した配列を含む場合、軽鎖は、少なくともO12軽鎖である。好ましい実施形態では、O12軽鎖は、0〜9個、0〜8個、0〜7個、0〜6個、0〜5個、0〜4個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組合せを有する図9A;図9B;図9D又は図9Eに示した配列を含む軽鎖である。好ましい実施形態では、O12軽鎖は、0〜5個、好ましくは0〜4個、より好ましくは0〜3個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組合せを有する図9A、図9B、図9D又は図9Eに示した配列を含む軽鎖である。好ましい実施形態では、O12軽鎖は、0〜2個、より好ましくは0〜1個、最も好ましくは0個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組合せを有する図9A、図9B;図9D又は図9Eに示した配列を含む軽鎖である。好ましい実施形態では、O12軽鎖は、記載したアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組合せを有する図9A又は図9Bに示した配列を含む軽鎖である。好ましい実施形態では、軽鎖は、図9Aの配列を含む。好ましい実施形態では、軽鎖可変領域は、図9Bの配列を含む。記載した1、2、3、4又は5個のアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換であり、挿入、欠失、置換又はこれらの組合せは、好ましくはVL鎖のCDR3領域においてではなく、好ましくはVL鎖のCDR1、CDR2若しくはCDR3領域又はFR4領域においてではない。
【００８９】
共通軽鎖は、ラムダ軽鎖を有してよく、したがってこれは本明細書に開示されている発明の状況でも提供されるが、カッパ軽鎖が好ましい。本明細書に開示されている発明の共通軽鎖の定常部分は、カッパ又はラムダ軽鎖の定常領域であってよい。それは、好ましくはカッパ軽鎖の定常領域であり、好ましくはここで前記共通軽鎖は生殖系列軽鎖、好ましくはIgVKl-39遺伝子セグメントを含む再編成された生殖系列ヒトカッパ軽鎖、最も好ましくは再編成された生殖系列ヒトカッパ軽鎖IgVKl-39*01/IGJKl*01(図9)である。用語、再編成された生殖系列ヒトカッパ軽鎖IgVκ1-39*01/IGJκ1*01、IGKV1-39/IGKJ1、huVκ1-39軽鎖、又は短縮してhuVκ1-39、若しくは単に1-39は本明細書を通して交換可能に使用される。
【００９０】
共通軽鎖を産生する細胞は、例えば再編成された生殖系列ヒトカッパ軽鎖IgVκ1-39*01/IGJκ1*01及びラムダ定常領域に融合された記載した軽鎖の可変領域を含む軽鎖を産生することができる。
【００９１】
好ましい実施形態では、軽鎖可変領域は、0〜10個、好ましくは0〜5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組合せを有するアミノ酸配列DIQMT QSPSS LSASV GDRVT ITCRA SQSIS SYLNW YQQKP GKAPK LLIYA ASSLQ SGVPS RFSGS GSGTD FTLTI SSLQP EDFAT YYCQQ SYSTP PTFGQ GTKVE IK又はDIQMT QSPSS LSASV GDRVT ITCRA SQSIS SYLNW YQQKP GKAPK LLIYA ASSLQ SGVPS RFSGS GSGTD FTLTI SSLQP EDFAT YYCQQ SYSTP PITFG QGTRL EIKを含む。好ましい実施形態では、軽鎖可変領域は、示したアミノ酸配列に関して0〜9個、0〜8個、0〜7個、0〜6個、0〜5個、0〜4個、好ましくは0〜3個、好ましくは0〜2個、好ましくは0〜1個、及び好ましくは0個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組合せを有する。挿入、欠失、付加、又は置換の組合せは、アラインした配列が5より多くの位置で異ならない場合に請求される組合せである。好ましい実施形態では、軽鎖可変領域は、アミノ酸配列DIQMT QSPSS LSASV GDRVT ITCRA SQSIS SYLNW YQQKP GKAPK LLIYA ASSLQ SGVPS RFSGS GSGTD FTLTI SSLQP EDFAT YYCQQ SYSTP PTFGQ GTKVE IK又はDIQMT QSPSS LSASV GDRVT ITCRA SQSIS SYLNW YQQKP GKAPK LLIYA ASSLQ SGVPS RFSGS GSGTD FTLTI SSLQP EDFAT YYCQQ SYSTP PITFG QGTRL EIKを含む。好ましい実施形態では、軽鎖可変領域は、アミノ酸配列DIQMT QSPSS LSASV GDRVT ITCRA SQSIS SYLNW YQQKP GKAPK LLIYA ASSLQ SGVPS RFSGS GSGTD FTLTI SSLQP EDFAT YYCQQ SYSTP PTFGQ GTKVE IKを含む。別の好ましい実施形態では、軽鎖可変領域は、アミノ酸配列DIQMT Q
SPSS LSASV GDRVT ITCRA SQSIS SYLNW YQQKP GKAPK LLIYA ASSLQ SGVPS RFSGS GSGTD FTLTI SSLQP EDFAT YYCQQ SYSTP PITFG QGTRL EIKを含む。
【００９２】
アミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組合せは、好ましくは軽鎖可変領域のCDR3領域においてではなく、好ましくは、軽鎖可変領域のCDR1又はCDR2領域においてではない。好ましい実施形態では、軽鎖可変領域は、示した配列に関して欠失、付加又は挿入を含まない。この実施形態では、重鎖可変領域は、示したアミノ酸配列に関して0〜5個のアミノ酸置換を有し得る。アミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換である。本発明の抗体の軽鎖のCDR1、CDR2及びCDR3は、好ましくはそれぞれアミノ酸配列CDR1 - QSISSY、CDR2 - AAS、CDR3 - QQSYSTP、すなわちIGKV1-39のCDRを含む(IMGTより)。
【００９３】
本明細書に記載の二重特異性抗体は、好ましくはEGFRの細胞外部分に結合する1つの重鎖可変領域/軽鎖可変領域(VH/VL)組合せ及びcMETの細胞外部分に結合する第2のVH/VL組合せを有する。好ましい実施形態では、前記第1のVH/VL組合せのVLは前記第2のVH/VL組合せのVLに類似している。より好ましい実施形態では、第1及び第2のVH/VL組合せのVLは、同一である。好ましい実施形態では、二重特異性抗体は、EGFRの細胞外部分に結合する1つの重/軽(H/L)鎖組合せ及びcMETの細胞外部分に結合する1つのH/L鎖組合せを有する全長抗体である。好ましい実施形態では、前記第1のH/L鎖組合せの軽鎖は、前記第2のH/L鎖組合せの軽鎖と類似している。より好ましい実施形態では、前記第1及び第2のH/L鎖組合せの軽鎖は同一である。
【００９４】
その発現が二重特異性抗体又は逆に、単一特異性抗体の産生に好ましい宿主細胞を産生するいくつかの方法が報告されている。本発明では、抗体分子の細胞発現は、それぞれの単一特異性抗体の産生よりも二重特異性抗体の産生に好ましい。それは、典型的には、それらがホモ二量体化よりもヘテロ二量体化(すなわち、他の重/軽鎖組合せの重鎖と二量体化)を好むように重鎖の定常領域を改変することによって達成される。好ましい実施形態では、本明細書に開示されている発明の二重特異性抗体は、互換性のヘテロ二量体化ドメインを有する2つの異なる免疫グロブリン重鎖を含む。様々な互換性のヘテロ二量体化ドメインが当技術分野で記載されている。互換性のヘテロ二量体化ドメインは、好ましくは互換性の免疫グロブリン重鎖CH3ヘテロ二量体化ドメインである。野生型CH3ドメインが使用される場合、2つの異なる重鎖(A及びB)及び共通軽鎖の共発現は、3つの異なる抗体種、AA、AB及びBBを生じる。AA及びBBは、2つの単一特異性、二価抗体を示し、ABは二重特異性抗体を示す。所望の二重特異性産物(AB)の割合を増加するため、CH3の工学的な改変が用いられ、又は言い換えると、以下に記載したように互換性のヘテロ二量体化ドメインを有する重鎖を使用することができる。そのような重鎖のヘテロ二量体化が達成され得る様々な方法が当技術分野で記載されている。1つの方法は、「ノブイントゥーホール」型二重特異性抗体を生成することである。
【００９５】
本明細書で使用する用語「互換性のヘテロ二量体化ドメイン」は、工学的に改変されたドメインA'が工学的に改変されたドメインB'と優先的にヘテロ二量体を形成する、逆にA'-A'とB'-B'の間のホモ二量体化が排除されるように工学的に改変されたタンパク質ドメインを指す。
【００９６】
米国特許出願公開第13/866,747号(現在米国特許第9,248,181号として発行)、米国特許出願公開第14/081,848号(現在米国特許第9,358,286号として発行)、及び国際出願PCT/NL2013/050294(国際公開第2013/157954号として公開;参照により本明細書に組み込まれる)では、互換性のヘテロ二量体化ドメインを使用する二重特異性抗体を産生する方法及び手段が開示されている。これらの手段及び方法は、本発明にも好都合に用いられ得る。特に、本明細書に開示されている発明の二重特異性抗体は、好ましくは変異を含み、宿主細胞において二重特異性全長IgG分子の実質的な発現をもたらす。好ましい変異は、第1のCH3ドメイン('KK-変異体'重鎖)におけるアミノ酸置換L351K及びT366K並びに第2のドメイン('DE-変異体'重鎖)におけるアミノ酸置換L351D又はL368E、又はその逆である。米国特許第9,248,181号及び米国特許第9,358,286号並びに国際公開第2013/157954号PCT出願(本明細書に参照により組み込まれる)は、DE変異体及びKK変異体が優先的に対をなし、ヘテロ二量体を形成することを実証した(いわゆる、'DEKK'二重特異性分子)。DE変異体重鎖のホモ二量体化(DEDEホモ二量体)は、同一の重鎖間のCH3-CH3インターフェースにおける荷電残基間の反発により不利である。
【００９７】
二重特異性抗体は、効率的なヘテロ二量体化及び二重特異性抗体の形成を確実にするように工学的に改変されたCH3である軽鎖及び2つの異なる重鎖をコードするプラスミドの(一過性)トランスフェクションによって生成され得る。単一細胞におけるこれらの鎖の産生は、単一特異性抗体の形成よりも二重特異性抗体の有利な形成をもたらす。基本的に二重特異性全長IgG1分子のみを産生する好ましい変異は、351位及び366位のアミノ酸置換、例えば第1のCH3ドメイン('KK変異体'重鎖)におけるL351K及びT366K(EUナンバリングによる番号付け)及び351位及び368位のアミノ酸置換、例えば第2のCH3ドメイン('DE変異体'重鎖)におけるL351D及びL368E、又はその逆である(例えば、図10E及び10F参照)。
【００９８】
一実施形態では、EGFRに結合する可変ドメインを含む重鎖/軽鎖組合せは、重鎖のDE変異体を含む。この実施形態では、cMETに結合することができる可変ドメインを含む重鎖/軽鎖組合せは、重鎖のKK変異体を含む。cMETに結合する重鎖のKK変異体はホモ二量体を産生せず、それにより二重特異性抗体によるHGF誘導cMET活性化阻害の観察された効果を非常に正確にする。それは二価のcMET抗体によって観察されることがあるcMETの活性化を阻害する(アゴニズム)。
【００９９】
Fc領域は、補体依存性細胞傷害(CDC)、抗体依存性細胞傷害(ADCC)及び抗体依存性細胞貪食(ADCP)のような抗体のエフェクター機能を媒介する。治療用抗体又はFc融合タンパク質適用により、エフェクター機能を低下又は増加することが望ましいことがある。本明細書に開示されている発明の実施形態のいくつかでのように、免疫応答が活性化、増強又は刺激される場合、低下したエフェクター機能が望ましいことがある。エフェクター機能が低下した抗体が使用され、中でも免疫細胞の細胞表面分子を標的化することができる。
【０１００】
エフェクター機能が低下した抗体は、好ましくは、例えば、Fc受容体相互作用を低下する、又はC1q結合を低下する改変CH2/低ヒンジ領域を含むIgG抗体である。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、二重特異性IgG抗体のFcガンマ受容体との相互作用が低下されるように成熟CH2及び/又は低ヒンジドメインを有するIgG抗体である。変異CH2領域を含む抗体は、好ましくはIgG1抗体である。そのような変異IgG1 CH2及び/又は低ヒンジドメインは、好ましくは235位及び/又は236位(EUナンバリング)にアミノ酸置換、好ましくはL235G及び/又はG236R置換を含む(図10D)。
【０１０１】
本明細書に開示されている発明の抗体は、好ましくはエフェクター機能を有する。本明細書に開示されている発明の二重特異性抗体は、好ましくは抗体依存性細胞傷害(ADCC)を含む。抗体は工学的に改変されADCC活性を増強することができる(検討のため、Cancer Sci. 2009年9月;100(9):1566〜72頁Engineered therapeutic antibodies with improved effector functions. Kubota T, Niwa R, Satoh M, Akinaga S, Shitara K, Hanai N参照)。ADCCの誘発における抗体又はエフェクター細胞の有効性を決定するためのいくつかのインビトロの方法が存在する。これらの中には、クロミウム-51[Cr51]放出アッセイ、ユーロピウム[Eu]放出アッセイ、及び硫黄-35[S35]放出アッセイがある。通常、特定の表面露出抗原を発現する標識した標的細胞系は、抗原に特異的な抗体とインキュベートされる。洗浄後、Fc受容体CD16を発現するエフェクター細胞は、抗体標識した標的細胞とコインキュベートされる。標的細胞溶解は、続いてシンチレーションカウンター又は分光光度法により細胞内標識の放出によって測定される。一態様では、本明細書に開示されている発明の二重特異性抗体は、ADCC活性を示す。そのような態様では、二重特異性抗体は、改善されたADCC活性を有し得る。別の態様では、本明細書に開示されている発明の二重特異性抗体は、ADCC活性を示さない。そのような態様では、抗体は、本明細書の別のところに記載した1つ又は複数のCH2変異の手段により、及び当技術分野で公知の技術により、低下したADCCを有し得る。抗体のADCCを増強するための一技術はアフコシル化である(例えば、Junttila, T. T., K. Parsonsら(2010年). "Superior In vivo Efficacy of Afucosylated Trastuzumab in the Treatment of HER2-Amplified Breast Cancer." Cancer Research 70(11): 4481〜4489頁参照)。したがって、アフコシル化される本明細書に開示されている発明による二重特異性抗体が更に提供される。代わりに、又は更に、例えば糖鎖工学(Kyowa Hakko/Biowa社、GlycArt (Roche)社及びEureka Therapeutics社)及び変異誘発を含む複数の他の戦略が使用されADCC増強を達成することができ、その全てが、低親和性活性化FcγRIIIaへのFc結合を改善、及び/又は低親和性阻害FcγRIIbへの結合を低下しようとする。本明細書に開示されている発明の二重特異性抗体は、好ましくはADCC活性を増強するためにアフコシル化される。本明細書に開示されている発明の二重特異性抗体は、正常なCHO細胞において産生された同じ抗体と比較した場合、低下した量のFc領域のN-結合糖鎖構造のフコシル化を含む。
【０１０２】
本明細書に記載の抗体又は二重特異性抗体の変異体は、抗体又は二重特異性抗体の機能性部分、誘導体及び/又は類似体を含む。変異体は、(二重特異性)抗体の結合特異性を維持する。機能性部分、誘導体及び/又は類似体は、(二重特異性)抗体の結合特異性を維持する。結合特異性は、本明細書に記載の第1の膜タンパク質及び第2の膜タンパク質の細胞外部分に結合する能力によって規定される。
【０１０３】
本明細書に開示されている発明の二重特異性抗体は、好ましくはヒトで使用される。本発明の好ましい抗体はヒト又はヒト化抗体である。本明細書に開示されている発明の二重特異性抗体の定常領域は、好ましくはヒト定常領域である。定常領域は、自然発生のヒト抗体の定常領域と、1つ又は複数の、好ましくは10より多くなく、好ましくは5より多くないアミノ酸差を含有し得る。定常部分は、完全に自然発生のヒト抗体由来であることが好ましい。本明細書で産生した様々な抗体は、ヒト抗体可変ドメインライブラリー由来である。そのように、これらの可変ドメインはヒトである。ユニークなCDR領域はヒト由来、合成又は別の生物由来であり得る。自然発生のヒト抗体の可変領域のアミノ酸配列と同一であるが、CDR領域ではないアミノ酸配列を有する場合、可変領域はヒト化可変領域と考えられる。そのような実施形態では、本明細書に開示されている発明のEGFR又はcMETに結合する抗体の可変ドメインのVHは、CDR領域のアミノ酸配列において可能な差を数えずに、自然発生のヒト抗体の可変領域と、1つ又は複数の、好ましくは10より多くなく、好ましくは5より多くないアミノ酸差を含有し得る。本明細書に開示されている発明の抗体におけるEGFR結合ドメイン及び/又はcMET結合ドメインの軽鎖可変領域は、CDR領域のアミノ酸配列において可能な差を数えずに、自然発生のヒト抗体の可変領域と、1つ又は複数の、好ましくは10より多くなく、好ましくは5より多くないアミノ酸差を含有し得る。本明細書に開示されている発明の抗体の軽鎖は、CDR領域のアミノ酸配列において可能な差を数えずに、自然発生のヒト抗体の可変領域と、1つ又は複数の、好ましくは10より多くなく、好ましくは5より多くないアミノ酸差を含有し得る。そのような変異は、体細胞(高頻度)変異の状況で自然にも生じる。
【０１０４】
抗体は、少なくとも重鎖可変領域に関して、様々な動物種由来であってよい。そのような例えばマウス重鎖可変領域をヒト化することは一般的な方法である。これが達成され得る様々な方法があり、その中には、マウス重鎖可変領域の3-D構造にマッチする3D構造を有するヒト重鎖可変領域へのCDR移植;好ましくはマウス重鎖可変領域から公知の又は予測されるT-又はB-細胞エピトープを除去することによって行われる、マウス重鎖可変領域の脱免疫化がある。除去は、典型的には、それがもはやT-又はB-細胞エピトープではないようにエピトープの配列が改変されるように、エピトープの1つ又は複数のアミノ酸を別の(典型的には保存的)アミノ酸に置換することによる。
【０１０５】
脱免疫化マウス重鎖可変領域は、オリジナルのマウス重鎖可変領域よりもヒトに免疫原性ではない。好ましくは、本明細書に開示されている発明の可変領域又はドメインは、更にヒト化、例えば化粧張りされる。化粧張り技術を使用することにより、免疫系に容易に遭遇する外部の残基は、選択的にヒトの残基によって置き換えられ、免疫原性の弱い又は実質的に免疫原性が無い化粧張りされた表面のいずれかを含むハイブリッド分子を提供する。本明細書に開示されている発明で使用する動物は、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくは霊長類、最も好ましくはヒトである。
【０１０６】
本明細書に開示されている発明による二重特異性抗体は、好ましくはヒト抗体の定常領域を含む。それらの重鎖定常領域の違いにより、抗体は5つのクラス又はアイソタイプ: IgG、IgA、IgM、IgD、及びIgEにグループ分けされる。これらのクラス又はアイソタイプは、対応するギリシャ文字によって名付けられた少なくとも1つの前記重鎖を含む。好ましい実施形態は、前記定常領域がIgG、IgA、IgM、IgD、及びIgE定常領域の群から選択される抗体を含み、より好ましくは前記定常領域はIgG定常領域を含み、すなわちIgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4からなる群から選択される。好ましくは、前記定常領域はIgG1又はIgG4定常領域であり、より好ましくは変異したIgG1定常領域である。IgG1の定常領域のいくつかの変異は、自然に生じる及び/又は生じる抗体の免疫特性を変更することなく可能である。変異は、人工的に導入され、抗体又はそれらの部分に特定の好ましい性質を取り付けることができる。そのような特性は、例えばCH2及びCH3の状況で本明細書に記載される。典型的には、約1〜10の間のアミノ酸挿入、欠失、置換又はこれらの組合せが定常領域において可能である。
【０１０７】
図1、7又は8のVH鎖は、図1、7又は8に示したVH鎖に関して好ましくは最大15、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個のアミノ酸挿入、欠失、置換又はこれらの組合せを有し、図1、7又は8に示したVH鎖に関して好ましくは0、1、2、3、4又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換又はこれらの組合せ、図1、7又は8に示したVH鎖に関して好ましくは0、1、2、3又は4個の挿入、欠失、置換又はこれらの組合せ、好ましくは0、1、2又は3個の挿入、欠失、置換又はこれらの組合せ、より好ましくは0、1又は2挿入、欠失、置換又はこれらの組合せ、及び好ましくは0又は1個の挿入、欠失、置換又はこれらの組合せを有する。1つ又は複数のアミノ酸挿入、欠失、置換又はこれらの組合せは、好ましくはVH鎖のCDR1、CDR2及び/又はCDR3領域においてではない。それらは、好ましくはFr4領域にも存在しない。アミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換である。
【０１０８】
合理的な方法は、ヒト状況下で非ヒト残基の含量を最小化するように進化してきた。別の抗体への抗体の抗原結合特性を成功裏に移植する様々な方法が利用可能である。抗体の結合特性は、CDR3領域の正確な配列に優先的に存在し、全体として可変ドメインの適切な構造と合わせた可変ドメインのCDR1及びCDR2領域の配列によって支持されることが多い。本明細書に示したCDR領域のアミノ酸配列は、Kabat定義によって決定される。CDR領域を別の抗体の好適な可変ドメインに移植する様々な方法が現在利用可能である。これらの方法のいくつかは、本明細書に参照により含まれるJ.C. Almagro1 and J. Fransson (2008年) Frontiers in Bioscience 13, 1619〜1633頁に記載される。本明細書に開示されている発明は、したがって、EGFRに結合する第1の抗原結合部位及びcMETに結合する第2の抗原結合部位を含むヒト又はヒト化二重特異性抗体を更に提供し、ここで可変ドメインは図1のMF3370に示したVH CDR3配列を含むEGFR結合部位を含み、ここで可変ドメインは図1のMF4356に示したVH CDR3領域を含むcMET結合部位を含む。EGFR結合部位を含むVH可変領域は、好ましくは図1のMF3370に示したVH鎖のCDR1領域、CDR2領域及びCDR3領域の配列を含む。cMET結合部位を含むVH可変領域は、好ましくは図1のMF4356に示したVH鎖のCDR1領域、CDR2領域及びCDR3領域の配列を含む。CDR移植は、図1のVHのCDR領域を有するが、異なるフレームワークを有するVH鎖を産生するためにも使用され得る。異なるフレームワークは、別のヒトVHのもの、又は異なる哺乳動物のものであってよい。本明細書に開示されている発明は、したがって、EGFRに結合する第1の抗原結合部位及びcMETに結合する第2の抗原結合部位を含むヒト又はヒト化二重特異性抗体を更に提供し、ここで可変ドメインは図7のMF8233に示したVH CDR3配列を含むEGFR結合部位を含み、ここで可変ドメインは図8のMF8230に示したVH CDR3領域を含むcMET結合部位を含む。EGFR結合部位を含むVH可変領域は、好ましくは図7のMF8233に示したVH鎖のCDR1領域、CDR2領域及びCDR3領域の配列を含む。cMET結合部位を含むVH可変領域は、好ましくは図8のMF8230に示したVH鎖のCDR1領域、CDR2領域及びCDR3領域の配列を含む。CDR移植は、図7又は図8のVHのCDR領域を有するが、異なるフレームワークを有するVH鎖を産生するためにも使用され得る。異なるフレームワークは、別のヒトVHのもの、又は異なる哺乳動物のものであってよい。
【０１０９】
本明細書に開示されている発明は、したがって、EGFRに結合する第1の抗原結合部位及びcMETに結合する第2の抗原結合部位を含むヒト又はヒト化二重特異性抗体を更に提供し、ここで可変ドメインは図1のMF3370に示したVH CDR3配列を含むEGFR結合部位を含み、ここで可変ドメインは図8のMF8230に示したVH CDR3領域を含むcMET結合部位を含む。EGFR結合部位を含むVH可変領域は、好ましくは図1のMF3370に示したVH鎖のCDR1領域、CDR2領域及びCDR3領域の配列を含む。cMET結合部位を含むVH可変領域は、好ましくは図8のMF8230に示したVH鎖のCDR1領域、CDR2領域及びCDR3領域の配列を含む。CDR移植は、図7又は図8のVHのCDR領域を有するが、異なるフレームワークを有するVH鎖を産生するためにも使用され得る。異なるフレームワークは、別のヒトVHのもの、又は異なる哺乳動物のものであってよい。
【０１１０】
本明細書に開示されている発明は、したがって、EGFRに結合する第1の抗原結合部位及びcMETに結合する第2の抗原結合部位を含むヒト又はヒト化二重特異性抗体を更に提供し、ここで可変ドメインは図7のMF8233に示したVH CDR3配列を含むEGFR結合部位を含み、ここで可変ドメインは図8のMF4356に示したVH CDR3領域を含むcMET結合部位を含む。EGFR結合部位を含むVH可変領域は、好ましくは図7のMF8233に示したVH鎖のCDR1領域、CDR2領域及びCDR3領域の配列を含む。cMET結合部位を含むVH可変領域は、好ましくは図8のMF4356に示したVH鎖のCDR1領域、CDR2領域及びCDR3領域の配列を含む。CDR移植は、図7又は図8のVHのCDR領域を有するが、異なるフレームワークを有するVH鎖を産生するためにも使用され得る。異なるフレームワークは、別のヒトVHのもの、又は異なる哺乳動物のものであってよい。
【０１１１】
本明細書に開示されている発明は、したがって、EGFRに結合する第1の抗原結合部位及びcMETに結合する第2の抗原結合部位を含むヒト又はヒト化二重特異性抗体を更に提供し、ここで可変ドメインは図7のMF8232に示したVH CDR3配列を含むEGFR結合部位を含み、ここで可変ドメインは図8のMF8230に示したVH CDR3領域を含むcMET結合部位を含む。EGFR結合部位を含むVH可変領域は、好ましくは図7のMF8233に示したVH鎖のCDR1領域、CDR2領域及びCDR3領域の配列を含む。cMET結合部位を含むVH可変領域は、好ましくは図8のMF8230に示したVH鎖のCDR1領域、CDR2領域及びCDR3領域の配列を含む。CDR移植は、図7又は図8のVHのCDR領域を有するが、異なるフレームワークを有するVH鎖を産生するためにも使用され得る。異なるフレームワークは、別のヒトVHのもの、又は異なる哺乳動物のものであってよい。
【０１１２】
本明細書に開示されている発明は、したがって、EGFRに結合する第1の抗原結合部位及びcMETに結合する第2の抗原結合部位を含むヒト又はヒト化二重特異性抗体を更に提供し、ここで可変ドメインは図7のMF8232に示したVH CDR3配列を含むEGFR結合部位を含み、ここで可変ドメインは図8のMF4356に示したVH CDR3領域を含むcMET結合部位を含む。EGFR結合部位を含むVH可変領域は、好ましくは図7のMF8232に示したVH鎖のCDR1領域、CDR2領域及びCDR3領域の配列を含む。cMET結合部位を含むVH可変領域は、好ましくは図8のMF4356に示したVH鎖のCDR1領域、CDR2領域及びCDR3領域の配列を含む。CDR移植は、図7又は図8のVHのCDR領域を有するが、異なるフレームワークを有するVH鎖を産生するためにも使用され得る。異なるフレームワークは、別のヒトVHのもの、又は異なる哺乳動物のものであってよい。
【０１１３】
本発明は、EGFRに結合する第1の可変ドメイン及びcMETに結合する第2の可変ドメインを含むヒト又はヒト化二重特異性抗体を更に提供し、ここで第1の可変ドメインは、最大10、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10、及び好ましくは0、1、2、3、4又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換又はこれらの組合せを有する図7に示したMF3370のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含み、ここで第2の可変ドメインは、0〜10個、好ましくは0〜5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組合せを有する図8(配列番号23)に示したMF4356のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。本発明は、EGFRに結合する第1の可変ドメイン及びcMETに結合する第2の可変ドメインを含むヒト又はヒト化二重特異性抗体を更に提供し、ここで第1の可変ドメインは、最大10、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10、及び好ましくは0、1、2、3、4又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換又はこれらの組合せを有する図7に示したMF8233のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含み、ここで第2の可変ドメインは、0〜10個、好ましくは0〜5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組合せを有する図8(配列番号13)に示したMF8230のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
【０１１４】
本発明は、EGFRに結合する第1の可変ドメイン及びcMETに結合する第2の可変ドメインを含むヒト又はヒト化二重特異性抗体を更に提供し、ここで第1の可変ドメインは、最大10、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10、及び好ましくは0、1、2、3、4又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換又はこれらの組合せを有する図7に示したMF3370のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含み、ここで第2の可変ドメインは、0〜10個、好ましくは0〜5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組合せを有する図8(配列番号13)に示したMF8230のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
【０１１５】
本発明は、EGFRに結合する第1の可変ドメイン及びcMETに結合する第2の可変ドメインを含むヒト又はヒト化二重特異性抗体を更に提供し、ここで第1の可変ドメインは、最大10、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10、及び好ましくは0、1、2、3、4又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換又はこれらの組合せを有する図7に示したMF8233のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含み、ここで第2の可変ドメインは、0〜10個、好ましくは0〜5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組合せを有する図8(配列番号23)に示したMF4356のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
【０１１６】
本発明は、EGFRに結合する第1の可変ドメイン及びcMETに結合する第2の可変ドメインを含むヒト又はヒト化二重特異性抗体を更に提供し、ここで第1の可変ドメインは、最大10、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10、及び好ましくは0、1、2、3、4又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換又はこれらの組合せを有する図7に示したMF8232のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含み、ここで第2の可変ドメインは、0〜10個、好ましくは0〜5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組合せを有する図8(配列番号23)に示したMF4356のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
【０１１７】
本発明は、EGFRに結合する第1の可変ドメイン及びcMETに結合する第2の可変ドメインを含むヒト又はヒト化二重特異性抗体を更に提供し、ここで第1の可変ドメインは、最大10、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10、及び好ましくは0、1、2、3、4又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換又はこれらの組合せを有する図7に示したMF8232のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含み、ここで第2の可変ドメインは、0〜10個、好ましくは0〜5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組合せを有する図8(配列番号23)に示したMF8230のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
【０１１８】
記載した最大15、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10、及び好ましくは0、1、2、3、4又は5個のアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換であり、挿入、欠失、置換又はこれらの組合せは、好ましくはVH鎖のCDR3領域においてではなく、好ましくはVH鎖のCDR1、CDR2又はCDR3領域においてではなく、好ましくはFR4領域においてではない。
【０１１９】
二重特異性抗体を産生する様々な方法が利用可能である。一方法は、細胞における2つの異なる重鎖及び2つの異なる軽鎖の発現、並びに細胞によって産生された抗体を回収する工程を含む。この方法で産生された抗体は、典型的には重鎖及び軽鎖の異なる組合せを有する抗体のコレクションを含有し、そのいくつかは所望の二重特異性抗体である。二重特異性抗体は、続いてコレクションから精製され得る。細胞によって産生される他の抗体に対する二重特異性抗体の比は、様々な方法で増加され得る。好ましい実施形態では、比は、細胞において2つの異なる軽鎖ではなく共通軽鎖を発現する工程によって増加される。共通軽鎖が2つの異なる重鎖と発現される場合、細胞によって産生される他の抗体に対する二重特異性抗体の比は、2つの異なる軽鎖の発現よりも著しく改善される。細胞によって産生される二重特異性抗体の比は、2つの同一の重鎖の対合よりも2つの異なる重鎖の互いの対合を刺激する工程によって更に改善され得る。(単一細胞から)二重特異性抗体を産生するための方法及び手段が開示され、それにより、単一特異性抗体の形成よりも二重特異性抗体の形成を好む手段が提供される。これらの方法は、本発明においても好都合に用いられ得る。したがって、本明細書に開示されている発明は、一態様では、単一細胞から二重特異性抗体を産生するための方法を提供し、ここで前記二重特異性抗体は、インターフェースを形成することができる2つのCH3ドメインを含み、前記方法は前記細胞においてa)重鎖を含む第1のCH3ドメインをコードする第1の核酸分子、b)重鎖を含む第2のCH3ドメインをコードする第2の核酸分子を産生する工程を含み、ここで前記核酸分子は重鎖を含む前記第1及び第2のCH3ドメインの選択対合の手段によって提供され、前記方法は前記宿主細胞を培養する工程及び前記2つの核酸分子の発現及び培養から前記二重特異性抗体を回収する工程を可能にする。前記第1及び第2の核酸分子は、同じ核酸分子、ベクター又は遺伝子送達ビヒクルの一部であってよく、宿主細胞のゲノムの同じ部位に組み込まれてよい。代わりに、前記第1及び第2の核酸分子は、前記細胞に別々に提供される。
【０１２０】
好ましい実施形態は、本明細書に開示されている発明によれば、単一細胞から二重特異性抗体を産生する方法を提供し、ここで前記二重特異性抗体は、インターフェースを形成することができる2つのCH3ドメインを含み、前記方法は、
-  a)EGFRに結合し、第1のCH3ドメインを含有する抗原結合部位を含む重鎖をコードする第1の核酸分子、及びb)ErbB-3に結合し、第2のCH3ドメインを含有する抗原結合部位を含む重鎖をコードする第2の核酸分子を有する細胞
を提供する工程を含み、ここで前記核酸分子は前記第1及び第2のCH3ドメインの選択対合の手段によって提供され、
前記方法は前記細胞を培養する工程及び前記2つの核酸分子によってコードされるタンパク質の発現及び培養から前記二重特異性IgG抗体を回収する工程を可能にする。特に好ましい実施形態では、前記細胞は共通軽鎖をコードする第3の核酸分子も有する。前記第1、第2及び第3の核酸分子は、同じ核酸分子、ベクター又は遺伝子送達ビヒクルの一部であってよく、宿主細胞のゲノムの同じ部位に組み込まれてよい。代わりに、前記第1、第2及び第3の核酸分子は、前記細胞に別々に提供される。好ましい共通軽鎖は、上記のようにO12に基づき、好ましくは再編成された生殖系列ヒトカッパ軽鎖IgVκ1 39*01/IGJκ1*01である。前記第1及び前記第2のCH3ドメインの選択対合のための手段は、好ましくは重鎖コード領域のCH3ドメインにおける対応する変異である。二重特異性抗体を選択的に産生する好ましい変異は、第1のCH3ドメインにおけるアミノ酸置換L351K及びT366K(EUナンバリング)、並びに第2のCH3ドメインにおけるアミノ酸置換L351D及びL368E、又はその逆である。したがって、二重特異性抗体を産生するための本明細書に開示されている発明による方法が更に提供され、ここで前記第1のCH3ドメインはアミノ酸置換L351K及びT366K(EUナンバリング)を含み、ここで前記第2のCH3ドメインはアミノ酸置換L351D及びL368Eを含み、前記方法は前記細胞を培養する工程及び前記核酸分子によってコードされるタンパク質の発現及び培養から前記二重特異性抗体を回収する工程を可能にする。二重特異性抗体を産生するための本明細書に開示されている発明による方法も提供され、ここで前記第1のCH3ドメインはアミノ酸置換L351D及びL368E(EUナンバリング)を含み、ここで前記第2のCH3ドメインはアミノ酸置換L351K及びT366Kを含み、前記方法は前記細胞を培養する工程及び前記核酸分子の発現及び培養から前記二重特異性抗体を回収する工程を更に含む。これらの方法によって産生され得る抗体も、本発明の一部である。CH3ヘテロ二量体化ドメインは、好ましくはIgG1ヘテロ二量体化ドメインである。CH3ヘテロ二量体化ドメインを含む重鎖定常領域は、好ましくはIgG1定常領域である。
【０１２１】
本発明の一実施形態では、抗体重鎖可変領域をコードする核酸分子を含む。核酸分子(典型的にはインビトロ、単離又は組換え核酸分子)は、好ましくは図7又は図8に示した重鎖可変領域、又は1、2、3、4又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換又はこれらの組合せを有する図7又は図8に示した重鎖可変領域をコードする。好ましい実施形態では、核酸分子は図7又は図8に示したアミノ酸配列をコードするコドン最適化核酸配列を含む。コドン最適化は、抗体産生細胞の種及び/又は細胞型に最適化される。例えば、CHO産生のため、分子の核酸配列はチャイニーズハムスター細胞にコドン最適化される。本発明は図7又は図8の重鎖をコードする核酸分子を更に提供する。
【０１２２】
本明細書に開示されている発明で使用する核酸分子は、典型的ではあるが排他的ではなくリボ核酸(RNA)又はデオキシリボ核酸(DNA)である。代わりの核酸は当業者に利用可能である。本明細書に開示されている発明による核酸は、例えば細胞に含まれる。前記核酸が前記細胞において発現される場合、前記細胞は本明細書に開示されている発明による抗体を産生し得る。したがって、本発明の一実施形態では、本明細書に開示されている発明による抗体及び/又は本明細書に開示されている発明による核酸を含む細胞を含む。前記細胞は、好ましくは動物細胞、より好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくは霊長類細胞、最も好ましくはヒト細胞である。好適な細胞は、本明細書に開示されている発明による抗体及び/又は本明細書に開示されている発明による核酸を含む及び好ましくは産生することができる任意の細胞である。
【０１２３】
本明細書に開示されている発明は、本明細書に開示されている発明による抗体を含む細胞を更に提供する。好ましくは、前記細胞(典型的にはインビトロ、単離又は組換え細胞)は、前記抗体を産生する。前記細胞は、保管から取り出し、培養した場合、前記抗体を産生することができる保存された細胞であってもよい。好ましい実施形態では、前記細胞はハイブリドーマ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、NS0細胞又はPER-C6(商標)細胞である。特定の好ましい実施形態では、前記細胞はCHO細胞である。本明細書に開示されている発明による細胞を含む細胞培養が更に提供される。例えば臨床使用のため、様々な研究所及び会社が抗体の大規模産生のための細胞系を開発した。そのような細胞系の非限定的な例は、CHO細胞、NS0細胞又はPER.C6(商標)細胞である。これらの細胞は、タンパク質の産生のような他の目的のためにも使用される。タンパク質及び抗体の産業規模の産生のために開発された細胞系は、本明細書において、更に産業細胞系と呼ばれる。したがって、好ましい実施形態は、本明細書に開示されている発明の抗体の産生のための抗体の大規模産生のために開発された細胞系の使用を含み、好ましくは図7又は図8に示したVH、VL及び/又は重鎖をコードする核酸分子を含む抗体を産生するための細胞を含む。
【０１２４】
本発明は、本明細書に開示されている発明の細胞を培養する工程及び前記培養から前記抗体を回収する工程を含む抗体を産生する方法を更に提供する。好ましくは、前記細胞は無血清培地で培養される。好ましくは、前記細胞は浮遊増殖に適応される。本明細書に開示されている発明による抗体を産生する方法によって得ることができる抗体が更に提供される。抗体は、好ましくは培養の培地から精製される。好ましくは前記抗体はアフィニティー精製される。
【０１２５】
本明細書に開示されている発明の細胞は、例えばハイブリドーマ細胞系、CHO細胞、293F細胞、NS0細胞又は臨床目的のための抗体産生へのその適合が公知の別の細胞型である。特定の好ましい実施形態では、前記細胞はヒト細胞である。好ましくは、細胞はアデノウイルスE1領域又はその機能性等価物によってトランスフォームされる。そのような細胞系の好ましい例は、PER.C6TM細胞系又はその等価物である。特定の好ましい実施形態では、前記細胞はCHO細胞又はその変異体である。好ましくは、変異体は抗体の発現のためのグルタミン合成酵素(GS)ベクターシステムを使用する。
【０１２６】
本明細書に開示されている発明の抗体は、浮遊293F細胞において一過性トランスフェクション後、>50mg/Lのレベルで産生され得る。二重特異性抗体は、収率>70%で、98%より高い純度に精製され得る。分析的特徴研究は、二価の単一特異性IgG1と同等である、二重特異性IgG1抗体プロファイルを示す。機能活性に関して、本明細書に開示されている発明の二重特異性抗体は、インビトロ及びインビボでセツキシマブと比較して優れた能力を実証し得る。
【０１２７】
本発明は、本明細書に開示されている発明による抗体を含む医薬組成物を更に提供する。医薬組成物は、好ましくは好ましく薬学的に許容される賦形剤又は担体を含む。
【０１２８】
抗体は標識、好ましくはインビボ画像化のための標識を含むことができる。そのような標識は、典型的には必ずしも治療用途のためではない。例えば診断設定では、標識は、例えば、体内での標的細胞の可視化において役立ち得る。様々な標識が適しており、多くは当技術分野で周知である。好ましい実施形態では、標識は検出のための放射線標識である。別の好ましい実施形態では、標識は赤外線標識である。好ましくは赤外線標識はインビボ画像化に適している。様々な赤外線標識が当業者に利用可能である。好ましい赤外線標識は、例えばIRDye 800; IRDye 680RD; IRDye 680LT; IRDye 750; IRDye 700DX; IRDye 800RS IRDye 650; IRDye 700ホスホラミダイト; IRDye 800ホスホラミダイト(LI-COR社 USA; 4647 Superior Street; Lincoln, Nebraska)である。
【０１２９】
本発明は、本明細書に開示されている発明による抗体又は医薬組成物を、それを必要としている対象に投与する工程を含む、腫瘍を有する又は前記腫瘍を有するリスクがある対象の処置のための方法を更に提供する。腫瘍は、好ましくはEGFR、cMET又はEGFR/cMET陽性腫瘍である。前記処置の開始前、方法は、好ましくは前記対象がそのようなEGFR、cMET又はEGFR/cMET陽性腫瘍を有するかどうか決定する工程を更に含む。本発明は、EGFR、cMET又はEGFR/cMET陽性腫瘍を有する又は有するリスクがある対象の処置における使用のための本明細書に開示されている発明の抗体又は医薬組成物を更に提供する。
【０１３０】
腫瘍がEGFR陽性であるかどうか立証するため、当業者は、例えばEGFR増幅及び/又は免疫組織化学染色を決定することができる。生検中の腫瘍細胞の少なくとも10%が陽性であるはずである。生検はまた、20%、30%、40%、50%、60%、70%又はそれ以上の陽性細胞も含有し得る。腫瘍がcMET陽性であるかどうか立証するため、当業者は、例えばcMET増幅及び/又は免疫組織化学での染色を決定することができる。生検中の腫瘍細胞の少なくとも10%が陽性であるはずである。生検はまた、20%、30%、40%、50%、60%、70%又はそれ以上の陽性細胞も含有し得る。
【０１３１】
本明細書に開示されている本発明は、乳がん、大腸がん、膵臓がん、胃がん、卵巣がん、結腸直腸がん、頭頚部がん、非小細胞肺がんを含む肺がん、膀胱がん等のような広範ながんに適用され得る。腫瘍は、EGFR、cMET又はEGFR/cMET陽性がんであってよい。本発明の実施形態は、好ましくは、乳がん、例えば初期の乳がんである陽性がんを処置し得る。本発明の別の実施形態では、好ましくは、結腸直腸がんであるEGFR、cMET又はEGFR/cMET陽性がんを処置し得る。本明細書に開示されている本発明は、乳がん、大腸がん、膵臓がん、胃がん、卵巣がん、結腸直腸がん、頭頚部がん、非小細胞肺がんを含む肺がん、膀胱がん等のような広範なEGFR、cMET又はEGFR/cMET陽性がんに適用され得る。対象は、好ましくはヒト対象である。対象は好ましくは、セツキシマブのようなEGFR特異的抗体を使用する抗体療法に適格な対象である。好ましい実施形態では、本発明は好ましくは腫瘍、好ましくはEGFR/cMET陽性がん、好ましくはEGFR RTK耐性表現型を有する腫瘍/がん、EGFRモノクローナル抗体耐性表現型又はこれらの組合せを含む対象を処置し得る。
【０１３２】
患者に投与される抗体の量は、典型的には、治療効果を得るために十分な量が使用されるが、その量が許容されない程度の副作用をもたらす閾値を超えないことを意味する治療濃度域内である。所望の治療効果を得るために必要とされる抗体の量が下がると、治療濃度域は典型的には増加する。本明細書に開示されている発明による抗体は、低投与量で十分な治療効果を発揮し、したがって好ましい。投与量は、セツキシマブの投与レジメンの範囲内であってよい。投与量はより少なくてもよい。
【０１３３】
本明細書に開示されている発明による二重特異性抗体は、好ましくは、他の同様の条件下でのセツキシマブと比較して、皮膚毒性が弱い。本明細書に開示されている発明による二重特異性抗体は、好ましくは、他の同様の条件下でのセツキシマブと比較して、好ましくはCXCL14の炎症性サイトカインの産生が少ない。本明細書に開示されている発明による二重特異性抗体は、好ましくは、他の同様の条件下でのセツキシマブと比較して、抗菌RNAse、好ましくはRNAse7の障害が少ない。
【０１３４】
本発明は、中でもEGFR及びcMET受容体を標的化し、インビトロでのがん細胞系の強い増殖阻害及びインビボでの腫瘍増殖阻害をもたらす抗体を記載する。本明細書に開示されている発明の二重特異的抗体は、高効率での低毒性プロファイルを兼ね備え得る。本明細書に開示されている発明の抗体は、EGFR標的化治療の様々な型及び系で有用であり得る。本明細書に開示されている発明の抗体は、両アームによって同じ抗原に結合する抗体と比較した場合、治療濃度域が増加し得る。本明細書に開示されている発明の二重特異性抗体は、セツキシマブ抗体と比較した場合、インビトロ、インビボ又はこれらの組合せで良好な増殖阻害効果を示し得る。
【０１３５】
本発明は、1つ又は複数の様々な異なる種類の腫瘍を有し得る対象の処置における使用のための、本明細書に開示されている発明の二重特異性抗体も提供する。腫瘍は、EGFR陽性腫瘍、cMET陽性腫瘍又はEGFR及びcMET陽性腫瘍であってよい。腫瘍は、乳がん、大腸がん、膵臓がん、胃がん、卵巣がん、結腸直腸がん、頭頚部がん、非小細胞肺がんを含む肺がん、又は膀胱がんであってよい。腫瘍は、EGFRチロシンキナーゼ阻害剤による処置に耐性であり得る。EGFRチロシンキナーゼ阻害剤は、好ましくはエルロチニブ、ゲフィチニブ、若しくはアファチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ若しくはアファチニブの類似体、又はそれぞれの化合物及び/若しくはこれらの類似体の1つ又は複数の組合せである。処置は、好ましくはEGFRチロシンキナーゼ阻害剤による処置を更に含む。EGFRチロシンキナーゼ阻害剤と併用処置する場合、腫瘍は、EGFRチロシンキナーゼ阻害剤による処置に耐性であり得る。併用処置は、チロシンキナーゼ阻害剤に対する腫瘍の感受性を少なくとも部分的に回復する。EGFRチロシンキナーゼ阻害剤は、第一世代EGFRチロシンキナーゼ阻害剤であり得る。臨床的に関連する第一世代EGFRチロシンキナーゼ阻害剤の例は、エルロチニブ及びゲフィチニブである。この及び他の実施形態では、腫瘍はHGF関連腫瘍であってよい。
【０１３６】
EGFR陽性腫瘍は、典型的にはEGFR活性化変異を有する不要である。EGFR活性化変異は、EGF/EGFRシグナル伝達経路の活性化をもたらすEGFRの変異である。EGFR活性化変異は、腫瘍のがん性状態に重要であり得る。そのような腫瘍がEGFR標的化治療に感受性でなくなり得る1つの方法は、HGF/cMETシグナル伝達経路の活性化による。腫瘍は、HGF関連腫瘍であってよい。cMET/HGFシグナル伝達経路の活性化は、EGFR陽性腫瘍がEGFR標的化治療による処置を回避することができる1つの方法である。cMET/HGF経路は様々な方法で活性化され得る。活性化の様々な方法が当技術分野で記載され、そのいくつかは本明細書に詳細に記載される。本明細書に開示されている発明の抗体は、cMET/HGFシグナル伝達経路の活性化がHGFの存在又は過剰なHGFと関連する場合、腫瘍の処置に特に好適である。そのようなcMET陽性腫瘍は、HGF関連腫瘍又はHGF依存性腫瘍と呼ばれる。本明細書に開示されている発明の抗体は、EGFR陽性腫瘍のこの可能な回避メカニズムを少なくとも部分的に阻害するためにも使用され得る。そのような腫瘍は、更にcMET/HGFシグナル伝達経路が活性化される腫瘍細胞の選択された派生物によりEGFR標的化治療を回避し得る。そのような細胞は、EGFR標的化治療の開始時に存在し得る。そのような細胞は、HGF/cMETシグナル伝達陰性腫瘍細胞よりも選択的な増殖利点を有する。腫瘍は、HGF/cMETシグナル伝達経路が活性化される腫瘍であってよい。腫瘍は、肝細胞増殖因子(HGF)のレベルの上昇又はHGF受容体cMETの過剰発現と関連する腫瘍であってよい。腫瘍は、EGF及び/又はHGFによって増殖が駆動される腫瘍であってよい。シグナル伝達経路が増殖因子の存在に応答して腫瘍の細胞において活性化され、増殖因子の除去が腫瘍の細胞の増殖の阻害をもたらす場合、腫瘍は、特定の増殖因子によって駆動されると言われる。減少は、細胞分裂の減少及び/又はアポトーシス等の細胞死の誘導によって測定され得る。腫瘍は、他は腫瘍の増殖を許容する条件下で、HGFの存在下で腫瘍増殖又は増殖加速する場合、HGF関連腫瘍である。
【０１３７】
様々な腫瘍のEGFR標的化治療は、Vecchioneら、"EGFR-targeted therapy." Experimental cell research Vol 317 (2011年): 2765〜2771頁に記載されている。一般的なEGFR標的化治療は、EGFRと相互作用し、細胞においてEGFR媒介シグナル伝達を阻害する分子による治療である。
【０１３８】
本明細書に示した処置の方法又は処置における使用のための抗体は、好ましくは、腫瘍がHGF関連腫瘍であるか決定する工程を更に含む。
【０１３９】
本明細書に開示されている発明の抗体は、HGF関連腫瘍の増殖を阻害し得る。
【０１４０】
cMET結合可変ドメインがCDR2配列「WINTYTGDPTYAQGFTG」を有すると記載されるいくつかの実施形態では、CDR2配列は「WINTYTGDPTYAQGFT」であってもよい。
【０１４１】
本明細書において範囲が数1と数2の間で与えられる場合、範囲は数1と数2を含む。例えば、2〜5の間の範囲は、数2と5を含む。
【０１４２】
本明細書において別のものより高い親和性について言及する場合、Kd=他のKdより低い。疑義を回避するため、Kd 10e-9MはKd 10e-8Mより低い。標的に対してKd 10e-9Mの抗体の親和性は、Kdが10e-8Mである場合より高い。
【０１４３】
本明細書において引用される特許文献又は他の事象についての言及は、その文献又は事象が公知である、又はそれが含有する情報が、いずれかの請求項の優先日での一般知識の一部であったことの承認と捉えるべきではない。
【０１４４】
明確及び簡潔な記載のために、特徴は同じ又は別々の実施形態の一部として本明細書に記載されるが、本明細書に開示されている本発明の範囲は全ての又はいくつかの記載した特徴の組合せを有する実施形態を含み得ることが認識される。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】図1は、本出願に言及される可変ドメインの重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す図である。
【図２】図2は、A431細胞のEGF誘導死の阻害における抗EGFR  cLC二価抗体の機能性を示す図である。Y軸(数)は、使用した抗体の濃度(X軸)の関数として、代謝的に活性な細胞の数を想定する、アッセイの蛍光の検出を示す。PG3370は、EGF誘導細胞死を阻害することができ、したがって、抗体濃度の増加により細胞の増殖が増強されたことを示している。本明細書でセツキシマブ又は参照抗体セツキシマブと呼ばれるセツキシマブ/アービタックスの可変領域アミノ酸配列を有する分子は、実験において内部標準として使用された(黒い点)。
【図３】図3は、H385細胞(パネルA)及びEBC-1細胞(パネルB)の創傷治癒におけるcMET×EGFR二重特異性の効果を示す図である。細胞は、5つの個々のcMET×EGFR二重特異性を添加するEGF  12.5ng/ml又はHGF  15ng/ml又はHGFとEGF(15ng/mlと12.5ng/ml)の組合せ無し(モック)又は有りのいずれかでインキュベートされた。対照として、2994Fabと組み合わせたセツキシマブが含まれた。Y軸は、経時的顕微鏡検査によって測定された創傷閉鎖の割合を示す。
【図４】図4は、TKI耐性NSCLC細胞、HCC827細胞及びPC-9細胞におけるEGFR及びcMET発現分析のFACS分析を示す図である。(A)両細胞系は、蛍光標識した抗体を使用してEGFR(x軸)及びcMET(y軸)の発現を特徴付けられた。全てのHCC827細胞がEGFR発現を示し、EGFRhigh、cMETpos集団及びEGFRpos、cMETneg集団に分けることができる。PC-9細胞は、EGFRhigh及びcMETpos細胞の小集団、並びにEGFRpos及びcMETneg細胞の最小集団を含有する。(B)グラフはPC-9細胞及びHCC827細胞の異なる細胞集団の分布を表す。
【図５】図5は、PC-9細胞(パネルA)及びHCC827細胞(パネルB)におけるTKI阻害剤に対するHGF誘導耐性へのPB8532及びPB8388の効果の例を示す図である。細胞は、二重特異性PB8532、PB8388、又はセツキシマブ/5D5  Fab混合物によって前処置され、TKI阻害剤と組み合わせてHGF及び/又はEGFとインキュベートされ、その後増殖が測定された。PB8532は、PC-9細胞及びHCC827細胞におけるHGF媒介及びEGF媒介ゲフィチニブ耐性を阻害する。
【図６】図6は、PC-9及びHCC827細胞におけるHGF誘導cMETリン酸化又はEGF誘導EGFRリン酸化への示した抗体による処置の効果を示す図である。細胞抽出物が生成された後、抗体(100nM)は、37℃で15分間インキュベートされ、(p)EGFR及び(p)cMETの検出のためウェスタンブロット分析に供された。抗ビンクリン抗体は、タンパク質ローディング対照として含まれた。
【図７】図7は、MF3370及びそれらの変異体を示す図である。MF8226のCDR1、CDR2及びCDR3配列は、左から右へ下線を引いた。他の配列のCDRは、対応する位置にある。
【図８】図8は、MF4356及びそれらの変異体を示す図である。MF4356のCDR1、CDR2及びCDR3配列は、左から右へ下線を引いた。他の配列のCDRは、対応する位置にある。
【図９ＡＢＣ】図9は、単一特異性及び二重特異性IgGにおいて使用される共通軽鎖を示す図である。図9Aは、共通軽鎖アミノ酸配列を示す図である。図9Bは、共通軽鎖可変ドメインDNA配列及び翻訳(IGKV1-39/jk1)を示す図である。図9Cは、共通軽鎖定常領域DNA配列及び翻訳を示す図である。
【図９ＤＥ】図9は、単一特異性及び二重特異性IgGにおいて使用される共通軽鎖を示す図である。図9Dは、IGKV1-39/jk5共通軽鎖可変ドメイン翻訳を示す図である。図9Eは、V領域IGKV1-39Aを示す図である。
【図１０ＡＢＣ】図10は、二重特異性分子の生成のためのIgG重鎖を示す図である。図10Aは、CH1領域を示す図である。図10Bは、ヒンジ領域を示す図である。図10Cは、CH2領域を示す図である。
【図１０ＤＥＦ】図10は、二重特異性分子の生成のためのIgG重鎖を示す図である。図10Dは、L235G及びG236Rサイレンシング置換を含有するCH2を示す図である。図10Eは、L351K及びT366K(KK)置換を含有するCH3ドメインを示す図である。図10Fは、L351D及びL368E(DE)置換を含有するCH3ドメインを示す図である。
【図１１】図11は、ELISAにおける組換えEGFRへのEGF結合の阻害を示す図である。ビオチン化EGFを、段階希釈したIgGの存在下でコートしたEGFRに結合させる。セツキシマブは陽性対照として使用され、PG2708は陰性対照抗体として使用された(Neg ctrl Ab)。EGF結合は、ストレプトアビジンHRPによって検出された。
【図１２】図12は、FACS分析によるカニクイザルEGFR交差反応性の決定を示す図である。CHO-K1細胞は、ヒトEGFR又はカニクイザルEGFR構築物によってトランスフェクトされた。抗体は、5μg/mlでトランスフェクト細胞及びCHO-K1細胞に結合させた。セツキシマブは陽性対照として使用され、PG2708は陰性対照抗体として使用された(Neg ctrl Ab)。結合した抗体はPEコンジュゲート抗体によって検出された。
【図１３】図13は、ELISAによるマウスEGFR及びcMET交差反応性の決定を示す図である。上のパネル:固定した濃度の抗体(5μg/ml)は、マウスEGFR及びヒトEGFRでコートしたマイクロタイタープレートにおける段階タイトレーションで試験された。抗EGFR抗体及びPG2708(neg Ctrl Ab)を結合させ、HRPコンジュゲート抗体によって検出した。下のパネル:抗体の段階タイトレーションをコートしたヒト及びマウスcMETに結合させた。ヒト/マウス交差反応性抗体BAF527は陽性対照抗体として含まれ、PG2708は陰性対照として加えられた(Neg Ctrl Ab)。結合した抗体はストレプトアビジンHRPによって検出された。
【図１４Ａ】図14は、リガンド依存的なN87増殖の阻害を示す図である。段階抗体タイトレーションは、HGF(A)の存在下でN87細胞とインキュベートされた。細胞増殖はアラマーブルーによって測定された。等モル濃度のFab 5D5/セツキシマブは陽性対照抗体として含まれた。Y軸は、細胞増殖の指標として蛍光強度を表す。X軸は、試験した抗体の異なる濃度を表す。
【図１４Ｂ】図14は、リガンド依存的なN87増殖の阻害を示す図である。段階抗体タイトレーションは、EGF(B)の存在下でN87細胞とインキュベートされた。細胞増殖はアラマーブルーによって測定された。等モル濃度のFab 5D5/セツキシマブは陽性対照抗体として含まれた。Y軸は、細胞増殖の指標として蛍光強度を表す。X軸は、試験した抗体の異なる濃度を表す。
【図１４Ｃ】図14は、リガンド依存的なN87増殖の阻害を示す図である。段階抗体タイトレーションは、EGF/HGF(C)の存在下でN87細胞とインキュベートされた。細胞増殖はアラマーブルーによって測定された。等モル濃度のFab 5D5/セツキシマブは陽性対照抗体として含まれた。Y軸は、細胞増殖の指標として蛍光強度を表す。X軸は、試験した抗体の異なる濃度を表す。
【図１５Ａ】高親和性FcγRIIIa ADCCレポーターアッセイを使用するN87細胞(A)におけるcMET×EGFR二重特異性抗体のADCC活性の例を示す図である。X軸は、添加した抗体濃度を表す。Y軸は、ADCC活性の検出として発光(RLU)を表す。抗EGFR抗体セツキシマブは、陽性対照抗体として含まれた。
【図１５Ｂ】高親和性FcγRIIIa ADCCレポーターアッセイを使用するMKN-45細胞(B)におけるcMET×EGFR二重特異性抗体のADCC活性の例を示す図である。X軸は、添加した抗体濃度を表す。Y軸は、ADCC活性の検出として発光(RLU)を表す。抗EGFR抗体セツキシマブは、陽性対照抗体として含まれた。
【図１６Ａ】PC-9細胞(A)におけるTKIエルロチニブ及びゲフィチニブの有効性へのHGFの効果を示す図である。細胞は、300nMのエルロチニブ又はゲフィチニブと組み合わせて漸増濃度(0〜120ng/mL)のHGFとインキュベートされ、その後、細胞増殖が測定された。両方の細胞系において、HGFはTKIに対して用量依存的な耐性を誘導した。
【図１６Ｂ】HCC827細胞(B)におけるTKIエルロチニブ及びゲフィチニブの有効性へのHGFの効果を示す図である。細胞は、300nMのエルロチニブ又はゲフィチニブと組み合わせて漸増濃度(0〜120ng/mL)のHGFとインキュベートされ、その後、細胞増殖が測定された。両方の細胞系において、HGFはTKIに対して用量依存的な耐性を誘導した。
【図１７】ADCC-増強したcMET×EGFR変異体の親和性結合の試験を示す図である。EGFRを安定に発現するCHO-K1細胞(A)又はc-METを内因的に発現するMKN-45細胞(B)は、示したように漸増濃度の抗体と2×105個の細胞/ウェルでインキュベートされた。洗浄後、結合は抗ヒトIgG-PE(3μg/ml)によって検出された。染色された細胞はiQueシステムで分析され、平均蛍光強度(MFI)が算出された。対照抗体はMF1337×MF1337;TT×TT陰性対照;下の暗い三角)及びMF4356×MF3770(PB8532p04; c-METのc-MET×EGFR陽性対照;黒い三角)である。TTは、破傷風トキソイドを意味する。ADCCは、IgG1のFc領域からフコース残基を除去するRMD酵素をコードするDNAとのコトランスフェクションによってADCC機能を増強した抗体を示す。
【図１８】増強したADCCエフェクター機能を確認するADCCレポーターアッセイの結果を示す図である。EGFR発現B×PC-3細胞(左)又はc-MET発現MKN-45細胞(右)は、15:1のE:T比でADCCエフェクター細胞と混合され、試験抗体のタイトレーション(0.01〜10μg/ml)の存在下でインキュベートされた。6時間後、Bio-Glo試薬が添加され、マイクロプレートリーダーを使用して発光が測定された。発光のレベルが強いほど、試験抗体によって誘導された標的とエフェクター細胞の間の相互作用の程度は大きかった。上のパネルは高親和性アッセイの結果を示し、下のパネルは低親和性アッセイのものを示す。陰性対照抗体はPG1337p218(抗TT、下の明るい三角);他の対照抗体は3178×4280(HER3×EGFR、ADCC-増強、明るい閉じた円(左上のパネルの上);3178×4280(HER3×EGFR、非ADCC増強、黒い十字、下);4356×3370(c-MET×EGFR、ADCC-増強、開いた明るい円);3370×4356(EGFR×cMET、非ADCC-増強、黒い十字及び点線);及びセツキシマブ(抗EGFR、小さい黒い円)である。
【図１９】図19は、エルロチニブが、マウスが処置を受けている限り、HCC827細胞を移植したNGS-hHGFkiマウスにおいて抗腫瘍応答を誘導することを示す図である。黒い矢印は、処置の開始を示す。
【図２０】図20は、PB8532単独で、及びエルロチニブと組み合わせて、HCC827細胞を移植したNGS-hHGFkiマウスにおいて抗腫瘍応答を誘導することを示す図である。黒い矢印は、処置の開始を示し;X軸のグレーの矢印は、毎週の抗体処置を示す。
【図２１】図21は、PB8532単独で、及びエルロチニブと組み合わせて誘導された抗腫瘍応答が、処置を停止した後でさえも、エルロチニブのものよりも優れていることを示す図である。黒い矢印は、処置の開始を示し;X軸のグレーの矢印は、毎週の抗体処置を示す。
【図２２】図22は、PB8532単独で、及びエルロチニブと組み合わせて誘導された抗腫瘍応答が、エルロチニブのものよりも優れていることを示す図である。黒い矢印は、処置の開始を示し;X軸のグレーの矢印は、毎週の抗体処置を示す。エルロチニブ処置有り又は無しでのcMET抗体LY2875358による処置は、エルロチニブ処置無しでさえもPB8532よりも有効ではなかった。
【図２３】図23は、cMET×EGFR二重特異性抗体PB19478によって誘導された抗腫瘍応答が、腫瘍がエルロチニブに対する耐性を発生する場合でも有効であることを示す図である。黒い矢印は、エルロチニブ処置の開始及びPB19478処置の開始を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１４６】
本明細書で使用する場合、式中Xが独立して数字0〜9である「MFXXXX」は、VHが4つのアラビア数字によって同定されるアミノ酸配列を有する可変ドメインを含むFabを指す。他に指定しない限り、可変ドメインの軽鎖可変領域は、典型的には図9Aの配列、典型的には図9Bを有する。「MFXXXX VH」は、4つのアラビア数字によって同定されるVHのアミノ酸配列を指す。MFは、軽鎖の定常領域及び通常軽鎖の定常領域と相互作用する重鎖の定常領域を更に含む。PGは、同一の重鎖及び軽鎖を含む単一特異性抗体を指す。PBは、2つの異なる重鎖を有する二重特異性抗体を指す。重鎖のVH可変領域は異なり、典型的にはCH3領域もであり、重鎖の1つはそのCH3ドメインのKK変異を有し、その他はそのCH3ドメインの相補的なDE変異を有する(検討のため、国際出願PCT/NL2013/050294 (国際公開第2013/157954号として公開)参照。)
【０１４７】
(実施例1)
材料及び方法
細胞系:
EBC-1[JCRB0820]、PC-9 [RCB0446]、H358[ATCC(登録商標) CRL-5807(商標)]、HCC827[ATCC(登録商標)CRL-2868(商標)]、MKN-45[DSMZ ACC 409] N87[ATCC(登録商標)CRL-5822(商標)]及びA431[ATCC(登録商標)CRL-1555(商標)]細胞系は、購入され、10%の熱失活したウシ胎仔血清(FBS)を補充した増殖培地で通常どおり維持された。HEK293F FreeStyle細胞はInvitrogen社から得られ、293 FreeStyle培地で通常どおり維持された。
【０１４８】
cDNA構築物:
安定発現細胞系(cMET及びEGFR)の生成のため及び免疫化(cMET)のためのcMET及びEGFR発現ベクターの生成
クローニングのための特有の制限部位を含む各標的の全長cDNA及び効率的な翻訳のためのコザックコンセンサス配列は、合成されるか、又は標的cDNAを含有する市販の発現構築物の、クローニングのための特有の制限部位及び効率的な翻訳のためのコザックコンセンサス配列を導入する特異的なプライマーによるPCR増幅によって得られた。各標的の全長cDNAは、pcDNA3.1のような真核生物の発現構築物にクローニングされたが、細胞外ドメインはpVAX1及びpDisplayにクローニングされた。挿入配列は、NCBI参照アミノ酸配列との比較によって確かめられた。
【０１４９】
細胞表面での発現のためのアミノ酸配列全長ヒトEGFRインサート(GenBank: NP_00533と同一):
MRPSGTAGAALLALLAALCPASRALEEKKVCQGTSNKLTQLGTFEDHFLSLQRMFNNCEVVLGNLEITYVQRNYDLSFLKTIQEVAGYVLIALNTVERIPLENLQIIRGNMYYENSYALAVLSNYDANKTGLKELPMRNLQEILHGAVRFSNNPALCNVESIQWRDIVSSDFLSNMSMDFQNHLGSCQKCDPSCPNGSCWGAGEENCQKLTKIICAQQCSGRCRGKSPSDCCHNQCAAGCTGPRESDCLVCRKFRDEATCKDTCPPLMLYNPTTYQMDVNPEGKYSFGATCVKKCPRNYVVTDHGSCVRACGADSYEMEEDGVRKCKKCEGPCRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFMRRRHIVRKRTLRRLLQERELVEPLTPSGEAPNQALLRILKETEFKKIKVLGSGAFGTVYKGLWIPEGEKVKIPVAIKELREATSPKANKEILDEAYVMASVDNPHVCRLLGICLTSTVQLITQLMPFGCLLDYVREHKDNIGSQYLLNWCVQIAKGMNYLEDRRLVHRDLAARNVLVKTPQHVKITDFGLAKLLGAEEKEYHAEGGKVPIKWMALESILHRIYTHQSDVWSYGVTVWELMTFGSKPYDGIPASEISSILEKGERLPQPPICTIDVYMIMVKCWMIDADSRPKFRELIIEFSKMARDPQRYLVIQGDERMHLPSPTDSNFYRALMDEEDMDDVVDADEYLIPQQGFFSSPSTSRTPLLSSLSATSNNSTVACIDRNGLQSCPIKEDSFLQRYSSDPTGALTEDSIDDTFLPVPEYINQSVPKRPAGSVQNPVYHNQPLNPAPSRDPHYQDPHSTAVGNPEYLNTVQPTCVNSTFDSPAHWAQKGSHQISLDNPDYQQDFFPKEAKPNGIFKGSTAENAEYLRVAPQSSEFIGA
その:
-  MRPSGTAGAALLALLAALCPASR:シグナルペプチド。
-  ALEEKKVCQGTSNKLTQLGTFEDHFLSLQRMFNNCEVVLGNLEITYVQRNYDLSFLKTIQEVAGYVLIALNTVERIPLENLQIIRGNMYYENSYALAVLSNYDANKTGLKELPMRNLQEILHGAVRFSNNPALCNVESIQWRDIVSSDFLSNMSMDFQNHLGSCQKCDPSCPNGSCWGAGEENCQKLTKIICAQQCSGRCRGKSPSDCCHNQCAAGCTGPRESDCLVCRKFRDEATCKDTCPPLMLYNPTTYQMDVNPEGKYSFGATCVKKCPRNYVVTDHGSCVRACGADSYEMEEDGVRKCKKCEGPCRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPS:ヒトEGFRのECD。
-  IATGMVGALLLLLVVALGIGLFM:予測されるTM領域。
-  RRRHIVRKRTLRRLLQERELVEPLTPSGEAPNQALLRILKETEFKKIKVLGSGAFGTVYKGLWIPEGEKVKIPVAIKELREATSPKANKEILDEAYVMASVDNPHVCRLLGICLTSTVQLITQLMPFGCLLDYVREHKDNIGSQYLLNWCVQIAKGMNYLEDRRLVHRDLAARNVLVKTPQHVKITDFGLAKLLGAEEKEYHAEGGKVPIKWMALESILHRIYTHQSDVWSYGVTVWELMTFGSKPYDGIPASEISSILEKGERLPQPPICTIDVYMIMVKCWMIDADSRPKFRELIIEFSKMARDPQRYLVIQGDERMHLPSPTDSNFYRALMDEEDMDDVVDADEYLIPQQGFFSSPSTSRTPLLSSLSATSNNSTVACIDRNGLQSCPIKEDSFLQRYSSDPTGALTEDSIDDTFLPVPEYINQSVPKRPAGSVQNPVYHNQPLNPAPSRDPHYQDPHSTAVGNPEYLNTVQPTCVNSTFDSPAHWAQKGSHQISLDNPDYQQDFFPKEAKPNGIFKGSTAENAEYLRVAPQSSEFIGA:細胞内尾部。
【０１５０】
エキソン2〜7のインフレーム欠失によって生じるヒトEGFRvarIII自然発生EGFR変異体VAR_066493[Ji H., Zhao X; PNAS 103:7817〜7822頁(2006年)]の細胞外ドメインのアミノ酸配列。以下の_はアミノ酸30_297が欠失している位置を示す。
MRPSGTAGAALLALLAALCPASRALEEKK_GNYVVTDHGSCVRACGADSYEMEEDGVRKCKKCEGPCRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPS
その:
-  MRPSGTAGAALLALLAALCPASR:シグナルペプチド。
-  ALEEKK_GNYVVTDHGSCVRACGADSYEMEEDGVRKCKKCEGPCRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPS:EGFRvarIIIのECD
【０１５１】
キメラマカク(アカゲザル)細胞外EGFRドメインの細胞表面での発現のためのヒトEGFR膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインとのハイブリッドのアミノ酸配列(GenBank: XP_014988922.1と同一)。ヒトEGFR配列は、以下の例に下線を引いた。
【０１５２】
【化１】
2020530028.tif 000002
【０１５３】
その:
-  MGPSGTAGAALLALLAALCPASR:シグナルペプチド。
-  LEEKKVCQGTSNKLTQLGTFEDHFLSLQRMFNNCEVVLGNLEITYVQRNYDLSFLKTIQEVAGYVLIALNTVERIPLENLQIIRGNMYYENSYALAVLSNYDANKTGLKELPMRNLQEILHGAVRFSNNPALCNVESIQWRDIVSSDFLSNMSMDFQNHLGSCQKCDPSCPNGSCWGAGEENCQKLTKIICAQQCSGRCRGKSPSDCCHNQCAAGCTGPRESDCLVCRKFRDEATCKDTCPPLMLYNPTTYQMDVNPEGKYSFGATCVKKCPRNYVVTDHGSCVRACGADSYEMEEDGVRKCKKCEGPCRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPS:cyEGFRのECD
【０１５４】
細胞表面での発現のための全長ヒトcMETインサートのアミノ酸配列(GenBank: P08581-2と同一)。配列は755位での755:S→STWWKEPLNIVSFLFCFAS挿入により参照配列と異なる
MKAPAVLAPGILVLLFTLVQRSNGECKEALAKSEMNVNMKYQLPNFTAETPIQNVILHEHHIFLGATNYIYVLNEEDLQKVAEYKTGPVLEHPDCFPCQDCSSKANLSGGVWKDNINMALVVDTYYDDQLISCGSVNRGTCQRHVFPHNHTADIQSEVHCIFSPQIEEPSQCPDCVVSALGAKVLSSVKDRFINFFVGNTINSSYFPDHPLHSISVRRLKETKDGFMFLTDQSYIDVLPEFRDSYPIKYVHAFESNNFIYFLTVQRETLDAQTFHTRIIRFCSINSGLHSYMEMPLECILTEKRKKRSTKKEVFNILQAAYVSKPGAQLARQIGASLNDDILFGVFAQSKPDSAEPMDRSAMCAFPIKYVNDFFNKIVNKNNVRCLQHFYGPNHEHCFNRTLLRNSSGCEARRDEYRTEFTTALQRVDLFMGQFSEVLLTSISTFIKGDLTIANLGTSEGRFMQVVVSRSGPSTPHVNFLLDSHPVSPEVIVEHTLNQNGYTLVITGKKITKIPLNGLGCRHFQSCSQCLSAPPFVQCGWCHDKCVRSEECLSGTWTQQICLPAIYKVFPNSAPLEGGTRLTICGWDFGFRRNNKFDLKKTRVLLGNESCTLTLSESTMNTLKCTVGPAMNKHFNMSIIISNGHGTTQYSTFSYVDPVITSISPKYGPMAGGTLLTLTGNYLNSGNSRHISIGGKTCTLKSVSNSILECYTPAQTISTEFAVKLKIDLANRETSIFSYREDPIVYEIHPTKSFISTWWKEPLNIVSFLFCFASGGSTITGVGKNLNSVSVPRMVINVHEAGRNFTVACQHRSNSEIICCTTPSLQQLNLQLPLKTKAFFMLDGILSKYFDLIYVHNPVFKPFEKPVMISMGNENVLEIKGNDIDPEAVKGEVLKVGNKSCENIHLHSEAVLCTVPNDLLKLNSELNIEWKQAISSTVLGKVIVQPDQNFTGLIAGVVSISTALLLLLGFFLWLKKRKQIKDLGSELVRYDARVHTPHLDRLVSARSVSPTTEMVSNESVDYRATFPEDQFPNSSQNGSCRQVQYPLTDMSPILTSGDSDISSPLLQNTVHIDLSALNPELVQAVQHVVIGPSSLIVHFNEVIGRGHFGCVYHGTLLDNDGKKIHCAVKSLNRITDIGEVSQFLTEGIIMKDFSHPNVLSLLGICLRSEGSPLVVLPYMKHGDLRNFIRNETHNPTVKDLIGFGLQVAKGMKYLASKKFVHRDLAARNCMLDEKFTVKVADFGLARDMYDKEYYSVHNKTGAKLPVKWMALESLQTQKFTTKSDVWSFGVLLWELMTRGAPPYPDVNTFDITVYLLQGRRLLQPEYCPDPLYEVMLKCWHPKAEMRPSFSELVSRISAIFSTFIGEHYVHVNATYVNVKCVAPYPSLLSSEDNADDEVDTRPASFWETS
その:
-  MKAPAVLAPGILVLLFTLVQRSNG:シグナルペプチド
-  ECKEALAKSEMNVNMKYQLPNFTAETPIQNVILHEHHIFLGATNYIYVLNEEDLQKVAEYKTGPVLEHPDCFPCQDCSSKANLSGGVWKDNINMALVVDTYYDDQLISCGSVNRGTCQRHVFPHNHTADIQSEVHCIFSPQIEEPSQCPDCVVSALGAKVLSSVKDRFINFFVGNTINSSYFPDHPLHSISVRRLKETKDGFMFLTDQSYIDVLPEFRDSYPIKYVHAFESNNFIYFLTVQRETLDAQTFHTRIIRFCSINSGLHSYMEMPLECILTEKRKKRSTKKEVFNILQAAYVSKPGAQLARQIGASLNDDILFGVFAQSKPDSAEPMDRSAMCAFPIKYVNDFFNKIVNKNNVRCLQHFYGPNHEHCFNRTLLRNSSGCEARRDEYRTEFTTALQRVDLFMGQFSEVLLTSISTFIKGDLTIANLGTSEGRFMQVVVSRSGPSTPHVNFLLDSHPVSPEVIVEHTLNQNGYTLVITGKKITKIPLNGLGCRHFQSCSQCLSAPPFVQCGWCHDKCVRSEECLSGTWTQQICLPAIYKVFPNSAPLEGGTRLTICGWDFGFRRNNKFDLKKTRVLLGNESCTLTLSESTMNTLKCTVGPAMNKHFNMSIIISNGHGTTQYSTFSYVDPVITSISPKYGPMAGGTLLTLTGNYLNSGNSRHISIGGKTCTLKSVSNSILECYTPAQTISTEFAVKLKIDLANRETSIFSYREDPIVYEIHPTKSFISGGSTITGVGKNLNSVSVPRMVINVHEAGRNFTVACQHRSNSEIICCTTPSLQQLNLQLPLKTKAFFMLDGILSKYFDLIYVHNPVFKPFEKPVMISMGNENVLEIKGNDIDPEAVKGEVLKVGNKSCENIHLHSEAVLCTVPNDLLKLNSELNIEWKQAISSTVLGKVIVQPDQNFT:ヒトcMETのECD
-  GLIAGVVSISTALLLLLGFFLWL:膜貫通領域
-  KKRKQIKDLGSELVRYDARVHTPHLDRLVSARSVSPTTEMVSNESVDYRATFPEDQFPNSSQNGSCRQVQYPLTDMSPILTSGDSDISSPLLQNTVHIDLSALNPELVQAVQHVVIGPSSLIVHFNEVIGRGHFGCVYHGTLLDNDGKKIHCAVKSLNRITDIGEVSQFLTEGIIMKDFSHPNVLSLLGICLRSEGSPLVVLPYMKHGDLRNFIRNETHNPTVKDLIGFGLQVAKGMKYASKKFVHRDLAARNCMLDEKFTVKVADFGLARDMYDKEYYSVHNKTGAKLPVKWMALESLQTQKFTTKSDVWSFGVLLWELMTRGAPPYPDVNTFDITVYLLQGRRLLQPEYCPDPLYEVMLKCWHPKAEMRPSFSELVSRISAIFSTFIGEHYVHVNATYVNVKCVAPYPSLLSSEDNADDEVDTRPASFWETS:細胞内領域
【０１５５】
参照抗体
抗cMET抗体は、当技術分野で公知である(Table1(表1))。単一特異性二価cMET抗体は、公表された情報に従って構築され、293F Freestyle細胞で発現される。Table1(表1)は関連する開示された情報を示す。cMETに対する単一特異性二価抗体は、公表された情報に従って構築され、293F Freestyle細胞で発現される。HGFリガンド遮断アッセイでは、特許由来抗-cMET抗体のVH-及びVL-コード遺伝子セグメントは、糸状バクテリオファージに提示するためファージディスプレイベクターに再クローニングされた。
【０１５６】
参照抗体セツキシマブ(アービタックス)は、EGFR Fabパネルの参照抗体として使用された。
【０１５７】
2994 Fabタンパク質は、パパイン消化により精製されたPG2994 IgGから生成された。したがって、PG2994は、ビーズに結合したパパイン(Pierce社#44985)とインキュベートされ、回転しながら37℃で5.5時間消化させた。Fab断片は、MabSelectSure LXでの濾過により消化混合物から精製された。Fabタンパク質を含有するフロースルー画分は、vivaspin20  10kDaを使用して3mlに濃縮され、PBS中でsuperdex75 16/600カラムを使用するゲル濾過によって更に精製された。
【０１５８】
(実施例2)
二価のモノクローナル抗体の生成及び抗体特徴付け
VH遺伝子配列及びいくつかのこれらの配列変異体によって判断される、特有の抗体のVH遺伝子はIgG1骨格ベクターにクローニングされた。浮遊適応293F Freestyle細胞は、3.0×106個の細胞/mlの密度まで定常な振盪機においてT125フラスコで培養された。細胞は、24深ウェルプレートの各ウェルに0.3〜0.5×106個の生存細胞/mlの密度で播種された。細胞は、個々の滅菌DNA:PEI混合物で一過的にトランスフェクトされ、更に培養された。トランスフェクションの7日後、上清を回収し、0.22μM(Sartorius社)を通して濾過し、バッチ精製を使用してプロテインAビーズで精製し、PBSに緩衝液交換した。
【０１５９】
EGF媒介アポトーシスの阻害
高濃度(10nM)のEGFは、A431細胞において(アポトーシス性の)細胞死を誘導する(Gulliら、1996)。この効果は、セツキシマブ等のリガンドを遮断する抗EGFR抗体の添加によって用量依存的に復帰され得る。
【０１６０】
二価の抗EGFR IgGの、A431細胞のEGF誘導細胞死を阻害する能力を試験するため、抗体は10nM EGFの存在下で10μg/ml以降、段階タイトレーションでインキュベートされた。各アッセイプレートは、参照対照となる段階希釈の陰性(Ctrl Ab; PG2708)及び陽性対照抗体(セツキシマブ)を含有した。3日目に、アラマーブルー(Invitrogen社、#DAL1100)が添加され(ウェル当たり20μl)、アラマーブルーとのインキュベーション(37℃)の6時間後にBiotek Synergy 2 Multi-modeマイクロプレートリーダーにおいて560nm励起及び590nm検出を使用して蛍光が測定された。図2は、セツキシマブ及び対照抗体のものと比較したcLC EGFR抗体の活性を示す。抗体PG4280、3755及び3752はセツキシマブと比較してより強力であったが、抗体PG4281及びPG3370は低い有効性を示した。
【０１６１】
EGF遮断ELISA
EGFR特異的ファージは、モル過剰量のリガンド(EGF)の不在及び存在下で組換えEGFRへの結合を試験された。したがって、5μg/mlのヤギ抗ヒトIgGは、4℃で終夜、MAXISORP(商標)ELISAプレートにコートされた。ELISAプレートのウェルは、振盪(700rpm)しながら、室温で1時間、2%ELKを含有するPBS(pH7.2)によってブロッキングされた。次に、5μg/mlの組換えヒトEGFR-Fcを室温で1時間インキュベートさせた。その間に、IgGは、室温で1時間、ヒトビオチン化EGFと段階タイトレーションで混合された。未結合のヒトEGFR-Fcを洗浄後、抗体/EGF混合物が添加され、室温で1時間結合させた。結合したEGFはHRP-ストレプトアビジンによって室温で1時間検出された。対照として、手順は、コートした抗原(示さない)及び陰性対照ファージ(Neg Ctrl Ab)に特異的な抗体と同時に実施された。結合した二次抗体は、TMB/H2O2染色によって可視化され、染色はOD450nm測定の手段によって定量された。図11は、EGF媒介アポトーシスの阻害の能力が弱いPG3370抗体が、セツキシマブとの比較で同様のEGF遮断活性を示すことを示す。
【０１６２】
カニクイザルEGFR及びマウスEGFR交差反応性試験
抗EGFR IgGがカニクイザルEGFRと反応性であるか試験するため、全長ヒトEGFRをコードする構築物、並びに細胞内ヒトEGFRに融合するカニクイザルのECDをコードする発現構築物は、両方とも(抗原陰性の)CHO細胞にトランスフェクトされ、次いで細胞は5μg/mlで抗EGFR抗体によって染色され、最終的にFACSによって分析された。染色の陽性対照として、カニクイザルEGFRと交差反応性であることが公知であるため、臨床的に使用された抗体セツキシマブが使用された。キメラ受容体を発現する細胞のものと視覚的に区別できないヒトEGFRを発現する細胞の染色として、PG3370、PG3752、PG4280及びPG4281は、カニクイザルEGFRと反応性であることが示された(図12)。
【０１６３】
抗EGFR  IgGのマウスEGFRとのそれらの交差反応性を試験するため、ELISAが実施された。5μg/mlで開始し、0.038μg/mlまで希釈した組換えマウスEGFR ECD-Fcの段階タイトレーションは、4℃で終夜、MAXISORP(商標)ELISAプレートにコートされた。この抗原に対する抗EGFR IgGの結合は、5μg/mlの固定濃度で試験され、室温で1時間結合させた。抗体の免疫反応性の陽性対照として、同じELISA設定が抗原としてヒトEGFR ECD-Fc融合タンパク質(R&Dsystems社)を使用して実施された。次に、ヤギ抗マウスIgG HRPコンジュゲート(BD Biosciences社)を室温で2時間結合させた。結合したIgGはOD450nm測定によって検出された。抗体PG3370は、マウスEGFR、並びに同様の親和性でヒトEGFRを認識することが示された(図13、上のパネル)。セツキシマブは、マウスEGFRを認識しない(125084 Erbitux Pharmacology Review Part 2 - FDA)。したがって、PG3370及びセツキシマブはヒトEGFRの同じエピトープを認識しない。
【０１６４】
マウスcMET交差反応性試験
PG3342のマウスcMETに対するその交差反応性を試験するため、ELISAが実施された。固定濃度のマウスHGF R/c-MET Fc(R&Dsystems社)はPBSで2.5μg/mlに希釈され、4℃で終夜、MAXISORP(商標)ELISAプレートにコートされた。この抗原に対する抗cMET IgGの結合は、10μg/mlで開始して片対数タイトレーションで試験された。抗体は、室温で1時間結合させた。抗体の免疫反応性の陽性対照として、同じELISA設定が抗原としてヒトHGF R/c-MET Fc融合タンパク質(R&Dsystems社)を使用して実施された。次に、ヤギ抗マウスIgG HRPコンジュゲート(BD Biosciences社)が添加され、室温で2時間結合させた。結合したIgGはOD450nm測定によって検出された。ビオチンに結合したマウスcMETに対して抗原親和性精製されたポリクローナルヤギIgG、BAF527は、陽性対照抗体として含まれた。PG3342抗体によりマウスcMETに対する交差反応性は観察されなかった(図13下のパネル)。
【０１６５】
cMET抗体の交差遮断アッセイ
cMET特異的ファージは、ELISAにおいてcMET参照抗体との競合を試験された。したがって、2.5μg/mlのcMET-Fc融合タンパク質は、4℃で終夜、MAXISORP(商標)ELISAプレートにコートされた。ELISAプレートのウェルは、振盪(700rpm)しながら、室温で1時間、2%ELKを含有するPBS(pH7.2)によってブロッキングされた。次に、参照又は陰性対照IgGを5μg/mlの濃度で添加し、700rpm、室温で15分間結合させた。次に5μlのPEG沈殿したファージを添加し、700rpm、室温で1時間結合させた。700rpm、室温で1時間、HRP標識抗M13抗体によって結合したファージが検出された。対照として、手順は、コートした抗原及び陰性対照ファージに特異的な抗体と同時に実施された。結合した二次抗体は、TMB/H2O2染色によって可視化され、染色はOD450nm測定によって定量された。Table2(表2)は、MF4040及びMF4356が5D5参照抗体との競合を示すことを実証する。MF4297は、より低い程度まで13.3.2及びC8H241と競合する。陽性対照ファージは全て、対応するIgGと完全な競合を示すが、抗体対照は競合アッセイに影響しない。
【０１６６】
二重特異性抗体の生成
二重特異性抗体は、効率的なヘテロ二量体化及び二重特異性抗体の形成を確実にする所有のCH3工学技術を使用して、異なるVHドメインを有するIgGをコードする2つのプラスミドの一過性コトランスフェクションによって生成された。共通軽鎖も、同じプラスミド又は別のプラスミドのいずれかで同じ細胞にコトランスフェクトされる。本発明者らの同族係属中の出願において(例えば国際公開第2013/157954号及び国際公開第2013/157953号;参照により本明細書に組み込まれる)、本発明者らは単一細胞から二重特異性抗体を産生する方法及び手段を開示し、それにより手段は単一特異性抗体の形成よりも二重特異性抗体を形成するように提供される。これらの方法は、本発明にも有利に用いられ得る。特に、基本的に二重特異性全長IgG分子のみを産生する好ましい変異は、351位及び366位のアミノ酸置換、例えば第1のCH3ドメイン(「KK-変異体」重鎖)のL351K及びT366K(EUナンバリングによる番号付け)及び351位及び368位のアミノ酸置換、例えば第2のCH3ドメイン(「DE-変異体」重鎖)のL351D及び10L368E又はその逆である。本発明者らの同族係属中の出願において、負帯電DE変異体重鎖及び正帯電KK変異体重鎖が優先的に対をなし、ヘテロ二量体を形成する(いわゆる「DEKK」二重特異性分子)ことが先に実証された。DE変異体重鎖(DE-DEホモ二量体)又はKK変異体重鎖(KK-KKホモ二量体)のホモ二量体化は、同一の重鎖間のCH3-CH3インターフェースにおける荷電残基間の強い反発により不利である。
【０１６７】
cMET及びEGFR Fabアームは、適切なKK及びDEベクターにクローニングされた(Table3(表3))。産生後、二重特異性IgGはプロテインAバッチ精製によって精製され、緩衝液がPBSに交換された。産生の成功は、2つの異なる標的結合Fab断片の特異的な組合せを同定する特有のコード(PBnnnnn;ここでnnnnnは無作為に作成された数を表す)に割り当てられた0.1mg/mlの最小濃度のIgG1全長抗体を生じる。産生に成功した二重特異性IgGは、ELISAでそれらのそれぞれの標的への結合を試験された。
【０１６８】
(実施例3)
EGF/HGF並びにHGF及びEGF増殖アッセイでのc-MET×EGFR二重特異性抗体のスクリーニング
cMET×EGFR二重特異性抗体のパネルの能力は、HGF/EGF、HGF及びEGFアッセイを使用してN87細胞で試験された。N87細胞系、正式名NCl-N87は、転移部由来の胃癌細胞系であり、EGFR発現レベルが高く、cMET発現レベルを仲介する(Zhangら、2010年)。抗体は、10μg/mlから3.16ng/mlの範囲の8段階の片対数タイトレーションで試験された。各抗体は2回ずつ試験された。抗RSV-G抗体PG2708は、陰性対照として使用された。参照抗体2994FabはHGFアッセイの陽性対照として使用され、参照抗体セツキシマブはEGFアッセイの陽性対照として使用された。
【０１６９】
等モル1:1のセツキシマブ/5D5 Fabは、EGF、HGF及びEGF/HGFアッセイの陽性対照として使用された。
【０１７０】
リガンドの1つ、又はリガンドの組合せ、並びに培地対照のいずれかを有するウェルは、アッセイウィンドウの決定に含まれる。抗体は、化学的に規定された飢餓培地(CDS: ml当たり80Uのペニシリン及び80μgのストレプトマイシン、0.05%(w/v)BSA及び10μg/mlホロ-トランスフェリンを含有するRPMI1640培地)中で希釈され、50μlの希釈した抗体が96ウェルの黒ウェル透明底プレート(Costar社)のウェルに添加された。リガンドが添加された(CDS中で希釈された400ng/ml HGF及び4ng/ml EGF、並びに4ng/ml EGF/400ng/ml HGFのEGF/HGF濃度を含有するストック溶液のウェル当たり50μl: R&D systems社、カタログ番号396-HB及び236-EG)。N87細胞はトリプシン処理され、回収及びカウントされ、100μlのCDS中8000個の細胞がプレートの各ウェルに添加された。エッジ効果を避けるため、プレートは、3日間37℃の細胞培養インキュベーター内の容器に置かれる前に室温で1時間置かれた。4日目に、アラマーブルー(Invitrogen社、＃DAL1100)が添加され(ウェル当たり20μl)、アラマーブルーとのインキュベーション(37℃)の6時間後にBiotek Synergy 2 Multi-modeマイクロプレートリーダーにおいて、560nm励起及び590nm検出を使用して蛍光が測定された。蛍光値は、非阻害増殖(抗体無しだが、両リガンド添加)に正規化された。HGF、EGF及びEGF/HGF増殖アッセイの例は、図14に示される(それぞれ図14A、B及びC)。
【０１７１】
Table4(表4)は、様々な実験の結果を列挙する。N87 HGF/EGFアッセイでは、参照単一特異性抗体(セツキシマブと5D5 Fabの等モル混合)に匹敵する能力を有する14個の異なるcMET×EGFR二重特異性が同定された: PB7679、PB7686、PB8218、PB8244、PB8292、PB8316、PB8340、PB8364、PB8388、PB8511、PB8535、PB8583、PB8607及びPB8640。
【０１７２】
N87 EGFアッセイでは、単一特異性セツキシマブに匹敵する能力を有する11個の異なるcMET×EGFR二重特異性が同定された: PB7679、PB8244、PB8292、PB8340、PB8364、PB8388、PB8511、PB8535、PB8583、PB8607及びPB8640。それらは全て、EGFR FabアームMF3755を含有する。HGF N87アッセイでは、単一特異性5D5 Fab参照抗体と比較して高い能力を示す9個の二重特異性が同定された:PB8218、PB8388、PB8511、PB8532、PB8535、PB8545、PB8583、PB8639及びPB8640。それらは6個の異なるcMET FabアームMF4040、MF4297、MF4301、MF4356、MF4491及びMF4506を含有する。
【０１７３】
ADCC活性
24 cMetxEGFR二重特異性のADCC活性は、腫瘍細胞系N87(EGFR-高、cMET-低)及びMKN-45(EGFR-低、cMET-増幅)に対して試験された。ADCCアッセイは、384ウェルプレートフォーマットでPromega ADCC Bioassay kitを使用して実施された。抗体は、10μg/ml〜1ng/mlの範囲の片対数段階希釈で9個の異なる濃度で二回ずつ試験された。
【０１７４】
参照セツキシマブ抗体は、アッセイのための陽性対照として含まれ、PG2708は陰性対照抗体として使用された。抗体又はアッセイ培地対照(IgG無し)は、ADCCエフェクター細胞及び標的細胞(N87又はMKN-45)と37℃で誘導の6時間インキュベートされた。ルシフェラーゼ活性は、Bio-Gloルシフェラーゼ試薬を使用して定量された。
【０１７５】
ADCCアッセイの例は、図15に示される。cMET×EGFR二重特異性のいずれも、両細胞系において著しいADCC活性を示さなかった。陽性対照参照セツキシマブ抗体は、用量依存的ADCC活性を両細胞系に示した。
【０１７６】
N87 HGF/EGFアッセイにおいて高い効率を示し、高い配列多様性を示した(Table5(表5))EGFR及びcMETアームからなる5つの二重特異性が、さらなる分析のために選択された。5つの二重特異性からの2つは、cMETへの結合を5D5と競合するMF4356を含有する(Table2(表2))。Table5(表5)は、選択された候補の特徴を要約する。
【０１７７】
創傷治癒細胞遊走アッセイ
2つのNSCLC細胞系は、創傷治癒アッセイで試験された;EBC-1及びH358。これらの細胞系は、高レベルのEGFR及びcMETを発現するため選択された(Zhangら、2010年; Fongら、2013年)。アッセイは、製造業者の指示に従って、CytoSelect(商標) 24-ウェルプレート創傷治癒アッセイ(Cell Biolabs社、CBA-120)を使用して実施された。簡単に言うと、2.5〜4×105個のがん細胞が各ウェルに播種され、37℃で終夜インキュベートされ、単層が形成された。ウェルの挿入物が次いで除去され、0.9mmの創傷フィールドが作成された。死細胞及び創傷領域のデブリを除去するPBSによる洗浄後、細胞は、二重特異性(100nM)又はセツキシマブ:Fab2994対照抗体混合物(100nM、1:1モル比)を含有する完全培地(0.5% FBS)により37℃で15分間インキュベートされた。次いで、各ウェルは増殖因子: HGF(15ng/ml)、EGF(12.5ng/ml)又は両方の組合せ(15及び12.5ng/ml)を補充された。創傷閉鎖のこま撮りのモニタリングは、共焦点顕微鏡(Zeiss社  LSM780)により37℃で14時間実施された。創傷閉鎖の程度(%)は、未処置対照に対して示される。
【０１７８】
H358細胞は、HGF又はEGFいずれか単独への暴露時に遊走の増加を示し(創傷閉鎖割合)、これはHGFとEGFの組合せによって最も効果的であった(図3)。この遊走の増加は、多くの二重特異性の添加によって廃止され、PB8532により最も明白であった。この阻害は、EGF/HGFの存在下での遊走の阻害を除き、セツキシマブ及び5D5 Fab組合せに匹敵した。
【０１７９】
EBC-1細胞は、HGFの添加による遊走のわずかな増加を示し、EGF又はEGF/HGFの組合せの存在下で遊走の増加を示さなかった。しかしながら、創傷閉鎖は、二重特異性、特にPB8532により、全てのアッセイ条件において阻害され得る。PB8532は、セツキシマブ/5D5 Fabの組合せよりも効果的、又はより効果的(EGF/HGF)であった。
【０１８０】
フローサイトメトリーによるPC-9及びHCC827細胞でのEGFR及びcMET発現の分析
エルロチニブに対する獲得された耐性は、HGF媒介c-MET活性化の異常な活性化から生じ得る。NSCLC細胞系PC-9及びHCC827は、チロシンキナーゼ阻害剤(TKI)耐性設定におけるリガンド媒介増殖を阻害するcMET×EGFR二重特異性抗体の能力を調べるために選択された。両細胞系はEGFR変異を持たず、HGFの存在下でエルロチニブ及びゲフィチニブの両方又はゲフィチニブ及びエルロチニブの組合せ(PC-9のみ)に耐性である。PC-9細胞において、HGF誘導エルロチニブ耐性はcMET阻害剤によって廃止され得(Nakadeら、2014年)、ゲフィチニブ耐性は抗HGF抗体によって廃止され得る(Yano、2008年)ことが報告されている。PC-9及びHCC827は、蛍光標識した抗体を使用するFACS分析によってcMET及びEGFRの発現を特徴付けられた。細胞は、PBS 2mM EDTAによって回収された。単一細胞懸濁液(50μl中、10e6細胞)は、染色緩衝液(PBS 2% FBS 2mM EDTA)中20分間氷上で蛍光標識した抗体とインキュベートした。以下の抗体が単独で又は組み合わせて使用された: Met Alexa Fluor 488コンジュゲート(Clone D1C2、Cell Signaling社、1:50希釈); EGF Receptor Alexa Fluor 647コンジュゲート(Clone D38B1、Cell Signaling社、1:50希釈)。インキュベーション後、細胞は染色緩衝液によって洗浄され、FACS分析はBD FACSVerseフローサイトメーターで実施された。
【０１８１】
全てのHCC827細胞がEGFR発現を示し、EGFRhigh、cMETpos集団及びEGFRpos、cMETneg集団に細分され得る(図4)。PC-9細胞は、EGFRhigh及びcMETpos細胞の小集団、並びにEGFRpos及びcMETneg細胞の最小集団を含有する。
【０１８２】
PC-9及びHCC827増殖アッセイ
最初の実験は、PC-9及びHCC827細胞においてエルロチニブ及びゲフィチニブ耐性を確立するHGFの濃度を決定するために実施された。0.5% FBSを含有する培地中での終夜の飢餓状態時に、細胞は、10% FBS中、300nMエルロチニブ又はゲフィチニブを補充した0〜120ng/mLの範囲の漸増濃度のHGFとインキュベートされた。インキュベーションの72時間後、細胞増殖は、製造業者の指示に従ってWST-1試薬を使用して評価された。吸光度は、試験時に、それぞれ参照波長450nm及び630nmで、マイクロプレートリーダーによって測定された。PC-9(図16A)及びHCC827(図16B)の両方において、HGFの添加は用量依存的にTKIに対する耐性を誘導した。
【０１８３】
PB8532及びPB8388は、TKI耐性設定においてそれらの有効性を試験された。4×103個のがん細胞は、96ウェルプレートの100μLの完全RPMI1640(10% FBS)中に播種された。0.5% FBSを含有する培地中での終夜の飢餓状態時に、細胞は、Biclonics(登録商標)(100nM)又はセツキシマブ:Fab2994対照単一特異性抗体混合物(100nM、1:1モル比)と37℃で15分間前もってインキュベートされた。次いで、各ウェルは、HGF(30ng/ml)、EGF(30ng/ml)又は両方の組合せ(30ng/ml)有り又は無しで、ゲフィチニブ又はエルロチニブ(300nM)を含有する完全培地(10% FBS)を補充された。インキュベーションの72時間後、細胞増殖は、WST-1法を使用して評価された。
【０１８４】
図5は、PB8532がPC-9細胞においてHGF媒介及びEGF媒介ゲフィチニブ耐性を阻害し得ることを示す。HCC827細胞において、PB8532はHGF媒介TKI耐性を阻害し、二重の単一特異性セツキシマブ5D5 Fabの投与の組合せよりも強力であった。匹敵する結果がTKIエルロチニブで得られた。
【０１８５】
(実施例4)
EGF及びcMETリン酸化のPB8532阻害
FBSを含まない培地中での終夜の飢餓状態後、細胞は、PB8532(100nM)又はセツキシマブ:Fab2994対照単一特異性抗体混合物(100nM、1:1モル比)を含有する培地(0.5% FBS)により37℃で15分間インキュベートされた。次いで、細胞は、増殖因子:HGF(30ng/ml)又はEGF(50ng/ml)によって37℃で15分間刺激された。刺激後、細胞は、1mMオルトバナデート(Sigma-Aldrich社)の存在下でPBSによって洗浄された。タンパク質抽出は、Complete Protease Inhibitor Cocktail(Roche社)、PhosSTOPホスファターゼ阻害剤(Roche社)及びオルトバナデート(1mM、Sigma-Aldrich社)を補充したRIPA溶解緩衝液(50mM Tris HCl pH 8、150mM NaCl、1%Triton X-100、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、0.1%SDS)を使用して実施された。ライセートは、4℃で15分間遠心分離し、細胞のデブリを除去する前に、30分間氷上でインキュベートされた。遠心分離後、上清が回収され、タンパク質濃度が製造業者の指示に従ってビシンコニン酸(BCA)試薬(Pierce社)を使用して決定された。タンパク質試料は、ローディング緩衝液6X(β-メルカプトエタノール0.6M; SDS 8%; Tris-HCl 0.25M pH 6,8;グリセロール40%;ブロモフェノールブルー0.2%)の添加及び5分間95℃でのインキュベーションによって変性された。電気泳動後、タンパク質は、Trans-Blot(登録商標)Turbo(商標)Blotting System(Bio-Rad社)を使用してニトロセルロース膜に移された。膜は、トリス緩衝食塩水-Tween 0.1%(50mM Tris HCl ph 7.6、150mM NaCl、0.1% Tween; TBS-T)中5%脱脂粉乳で、室温(RT)で1時間、非特異的結合をブロッキングされ、4℃で終夜(ON)一次抗体とインキュベートされた。以下の一次抗体が使用された: Phospho-Met(Tyr1234/1235、Clone D26、Cell Signaling社) TBS-T 5% BSA中1:500; Met(Clone D1C2、Cell Signaling社)TBS-T 5% BSA中1:1000; Phospho-EGF Receptor (Tyr1068、Clone D7A5、Cell Signaling社) TBS-T 5%脱脂粉乳中1:1000; EGF Receptor(Clone D38B1、Cell Signaling社) TBS-T 5% BSA中1:1000;ビンクリン(Monoclonal anti-Vinculin、V9131、SIGMA Aldrich社) TBS-T 5%脱脂粉乳中1:4000。示した一次抗体とのインキュベーション後、膜はTBS-T中で15分間洗浄され、室温で1時間二次抗体(TBS-T 5%脱脂粉乳中1:5000)とインキュベートされた。以下の二次抗体が使用された:ヤギ抗ウサギIgG-HRP(sc-2004、Santa Cruz biotechnology社); ヤギ抗マウスIgG-HRP(sc-2005、Santa Cruz biotechnology社)。シグナルは、Enhanced Chemiluminescent Reagents(ECL; Invitrogen社)又はSuperSignal West Femto Chemiluminescent Substrate(Thermo Scientific社)によってデジタルイメージャー(ImageQuant LAS 4000、GE Health Care Life Science Technologies社)で可視化された。
【０１８６】
図6は実施した実験のウェスタンブロット分析を示す。
PC-9細胞において、PB8532及び5D5/セツキシマブはHGF誘導リン酸化を減少させることができる。更に、両抗体は、EGFの不在下及び存在下でEGFリン酸化をわずかに減少させた。
【０１８７】
HCC827細胞において、PB8532は、HGFの存在下及び不在下でcMETのリン酸化を減少させた。5D5/セツキシマブの組合せによっては効果が観察されなかった。更に、この細胞系において、PB8532は、5D5のセツキシマブとの組合せと対照的にEGFRのEGF誘導リン酸化を減少させた。
【０１８８】
(実施例5)
図7は、本明細書に開示されているEGFR結合可変ドメインの重鎖の代替えの可変領域の様々な配列を示す。図8は、本明細書に開示されているcMET結合可変ドメインの重鎖の代替えの可変領域の様々な配列を示す。重鎖可変領域は、多くの異なるcMET×EGFR二重特異性抗体を作成するために使用された。これらの抗体の軽鎖は、図9Bに示した配列を有する。二重特異性抗体は、実施例1に記載のように産生された。抗体は、ADCC増強バージョンとしても産生された。ADCC増強バージョンは、抗体構築物のコトランスフェクションに、IgG1のFc領域からフコース残基を除去する還元酵素をコードするDNAを含むことによって産生された。
【０１８９】
図17は、実施例2(パネルA)に記載したCHO-K1 EGFR細胞上及びc-METを内在的に発現するMKN-45細胞(パネルB)上の様々な産生された二重特異性抗体のタイトレーションを示す図である。細胞は、示したように漸増濃度の抗体と、2×105個の細胞/ウェルでインキュベートされた。洗浄後、結合は、抗ヒトIgG-PE(3μg/ml)で検出された。染色された細胞は、iQueシステムで分析され、平均蛍光強度(MFI)及び曲線下面積(AUC)が算出された。対照抗体は、MF1337×MF1337(PG1337p218; TTxTT陰性対照;下の暗い三角)及びMF4356×MF3770(PB8532p04; c-MET×EGFR陽性対照;黒三角)。TTは破傷風トキソイドを意味する。MF1337(図1参照)のVHを含む可変ドメイン及び本明細書に記載の共通軽鎖は、破傷風トキソイドに結合し、したがって、CHO-K1 EGFR細胞及びMKN-45細胞に結合すると考えられない。注釈(ADCC)は、抗体がIgG1のFc領域からフコース残基を除去するRMD酵素をコードするDNAとのコトランスフェクションによってADCC機能が増強された抗体が産生されることを示す。使用した二重特異性抗体及びそれらのPBコードのリストはtable6(表6)参照。
【０１９０】
ADCCレポーターアッセイ
ADCCレポーターアッセイは、RMDコードDNAのコトランスフェクションがADCCエフェクター機能を成功裏に増強したかどうか決定するために実施された。全ての試料は、BxPC3細胞(EGFRを発現する)及びMKN-45細胞(c-METを発現する)で、高親和性及び低親和性アッセイの両方を使用して2回試験された。アッセイの高親和性エフェクター細胞は、ヒトFcyRIIIaのV変異体を発現し、低親和性エフェクター細胞はF変異体を発現する。
【０１９１】
簡単に言うと、BxPC3及びMKN45標的細胞は回収され、30μL中1000個の細胞/ウェルでプレートされ、37℃、5%CO2、95%相対湿度で終夜インキュベートされた。次の日、培地が除去され、10μLの抗体希釈が各ウェルに添加された(抗体希釈1.5×; 1ng/ml〜10μg/mlのアッセイ濃度を生じる片対数希釈工程による9段階希釈)。同じ日に、エフェクター細胞は37℃で解凍され、630μLが1.5mlチューブ中の3.6mlアッセイ緩衝液に添加され、回転しながら混合され;5μLのこの溶液(15,000個の細胞)は、次いでアッセイプレートのウェルに添加された。15μLのBio-Glo試薬のアッセイウェルへの添加前に、プレートは37℃、5%CO2、95%相対湿度で6時間インキュベートされた。発光は、EnVisionプレートリーダーを使用して測定された。
【０１９２】
試験した試料のリストはTable(表6)に提供し、アッセイの結果は図18に提供する。非ADCC増強抗HER-3×EGFR対照抗体(バッチPB4522p25;国際公開第2015/130172号に記載のMF4280×MF3178)は4つのアッセイ全てに陰性であった(図18に黒いバツ印と実線で示される(上から4番目))。これに対して、この抗体(PB4522p34)のADCC増強バージョンは、4つのアッセイ全てに陽性であった(オレンジの塗りつぶした円で示される)。同様に、非ADCC増強抗体cMET×EGFR対照抗体(PB8532p04)は、4つのアッセイ全てで陰性であり(図18に黒いバツ印と点線で示される)、PB8532p05バッチも非ADCC増強であった(緑のアスタリスクで示される)。アスタリスクを有する3つの線は全て、4つのパネルの下部にある。しかしながら、ADCC増強p06変異体(PB8532p06)は、全てのアッセイで陽性であった(オレンジの塗りつぶさない円によって示される)。PB8532p06のものと類似した増強したADCCエフェクター機能は、5つの二重特異性にもみられた(PB19474からPB19478)。これは、RMDコードDNAのコトランスフェクションが、ADCCエフェクター機能を成功裏に増強したことを意味する。
【０１９３】
(実施例6)
PB8532のcMET可変ドメインの重鎖可変領域(VH)は、例えば図8に示したMF4356のアミノ酸を含む。PB19748のcMET可変ドメインのVHは、MF8230のアミノ酸配列を含む(図8参照)。PB8532のEGFR可変ドメインのVHは、例えば図7に示したMF3370のアミノ酸を含む。PB19748のEGFR可変ドメインのVHは、図7のMF8233のアミノ酸配列を含む。PB8532とPB19748の軽鎖は同じであり、図9Bに示される。cMET抗体LY2875358抗体は、中でもKim及びKim 2017年に記載された。cMET×EGFR二重特異性抗体PB8532又はPB19748のインビボで腫瘍増殖を阻害する能力は、異種移植片マウスモデルにおいて単独で、及び受容体チロシンキナーゼ阻害剤エルロチニブとの組合せで試験された。選択されたモデルでは、HCC827腫瘍細胞は、内在性マウスHGFの代わりにヒトHGF(cMETのリガンド)を発現する、免疫不全NOD SCIDガンマ(NSG)ヒト肝細胞増殖因子ノックイン(hHGFki)マウスに移植された。NSG hHGFkiマウスは、略さずにNOD.Cg-Hgftm1.1(HGF)Aveo Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/J(stk#014553)(NOD.Cg-Hgftm1.1(HGF)Aveo Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/J)として公知である。それらは、T細胞又はB細胞を持たず、機能性NK細胞を欠如し、サイトカインシグナル伝達を欠損し、腫瘍移植をより可能にする。HCC827は、EGFR及びcMETを発現し、HGFの存在下でエルロチニブに耐性であることが公知の確立されたヒト非小細胞肺癌(NSCLC)細胞系である。
【０１９４】
このモデルにおける腫瘍増殖へのエルロチニブの効果を確立するため、2つの群のマウスで第1の実験が行われた。腫瘍細胞移植の前に、HCC827細胞の細胞周期は、80%を超えない培養密度で20%ウシ胎仔血清(FBS)を補充した培地中で細胞を終夜培養することによってブーストされた。次の日、NSG-hHGFkiマウス(The Jackson Laboratory)は、300μl PBSプラス高濃度の基底膜マトリックスを含有する30%マトリゲル中に懸濁した17×10e6個のHCC827腫瘍細胞を皮下に接種された。生じる腫瘍は、キャリパーを使用して各週2回測定された。平均腫瘍容積がおよそ200mm3に達すると、マウスは2つの群に無作為化され(腫瘍成長及び容積に応じて群当たり4〜7匹のマウス)、薬物治療が開始された。
【０１９５】
エルロチニブの微細懸濁液は、超音波処理により水中0.05%ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)及び0.2%Tween-80で毎週新しく調製された。
【０１９６】
19日目から、エルロチニブ溶液が使用され、6mg/kgの用量で経管栄養を介して1日1回(QD)5匹のマウスを処置し(n=5)、4匹のマウスの群は200μlのビヒクル(水中0.05% HPMC及び0.1% Tween 80)を経管栄養によって1日1回与えられた。腫瘍容積はキャリパーを使用して各週2回測定され、平均腫瘍容積(及びSEM)が各群について算出された。腫瘍サイズが1500mm3に達すると、マウスは安楽死させた。処置は48日後に停止され、生存するマウスの腫瘍容積が62日目まで測定された。
【０１９７】
このモデルにおける腫瘍増殖を阻害するPB8532二重特異性抗体の能力(単独及びエルロチニブと組合せて)を試験する第2の実験では、腫瘍(上記のように生成された)を有するNSG-hHGFkiマウスは6つの処置の1つ又は併用処置を与えられたが、抗体は腹腔内(i.p.)注射によって毎週与えられ、エルロチニブ又はビヒクルは経管栄養によって1日1回(QD)与えられた。陰性対照として、マウスは、無関係な標的に特異的なFabアームと組み合わせて、PB8532と同じ抗c-MET Fabアームからなる二重特異性抗体、PB17160によっても処置された。無関係な標的は、例えばマウス及び腫瘍に存在しない標的である。破傷風トキソイド特異的可変ドメインが使用されることが多い。好適な破傷風トキソイド結合可変ドメインは、MF1337のVH(図1参照)及び本明細書に開示されている共通軽鎖、好ましくは図9の配列を有する。標的化アーム及び非標的化(TT)アームを有する二重特異性抗体は、中でも本明細書に参照により組み込まれる国際公開第2017/069628号に記載され、MF1337参照されたい。別の無関係な標的は、RSV-Gである。好適なRSV-G可変ドメインは図1のMF2708のVH及び共通軽鎖、好ましくは図9の1つ、好ましくは図9Bを有する。
【０１９８】
21日目に、平均腫瘍容積がおよそ200mm3に達すると、マウスは6つの群に無作為化され(腫瘍成長及び容積に応じて群当たり5〜7匹のマウス)、薬物治療が開始された:ビヒクル単独の毎日の経管栄養(n=5); 25mg/kg PB8532抗体の毎週のi.p.注射とビヒクルの毎日の経管栄養(n=7); 25mg/kg PB17160抗体の毎週のi.p.注射とビヒクルの毎日の経口経管栄養(n=6); 6mg/kgエルロチニブの毎日の経口経管栄養(n=7); 25mg/kg PB8532抗体の毎週のi.p.注射と6mg/kgエルロチニブの毎日の経口経管栄養(n=7);又は25mg/kg PB17160抗体の毎週のi.p.注射と6mg/kgエルロチニブの毎日の経口経管栄養(n=7)。前述のように、腫瘍容積がモニターされ、平均腫瘍容積(及びSEM)が各群で算出された。60日後、全ての処置は停止され、生存マウスの腫瘍容積が82日目まで測定された。
【０１９９】
第3の実験では、このモデルにおける腫瘍増殖を阻害するPB19478二重特異性抗体の能力(単独及びエルロチニブと組合せて)が試験された。腫瘍(上記のように生成された)を有するNSG-hHGFkiマウスは6つの処置の1つ又は併用処置を与えられたが、抗体は腹腔内(i.p.)注射によって毎週与えられ、エルロチニブ又はビヒクルは経管栄養によって1日1回(QD)与えられた。
【０２００】
23日目に、平均腫瘍容積がおよそ200mm3に達すると、マウスは6つの群に無作為化され(腫瘍成長及び容積に応じて群当たり5〜6匹のマウス)、薬物治療が開始された:ビヒクル単独の毎日の経管栄養(n=5); 25mg/kg PB19478抗体の毎週のi.p.注射とビヒクルの毎日の経管栄養(n=5); 6mg/kgエルロチニブの毎日の経口経管栄養(n=6); 25mg/kg PB19478抗体の毎週のi.p.注射と6mg/kgエルロチニブの毎日の経口経管栄養(n=4、実験中1匹のマウスが死亡した); 25mg/kg LY2875358抗体の毎週のi.p.注射とビヒクルの毎日の経口栄養(n=5); 25mg/kg LY2875358抗体の毎週のi.p.注射と6mg/kgエルロチニブの毎日の経口経管栄養(n=3、実験中2匹のマウスが死亡した)。前述のように、腫瘍容積がモニターされ、平均腫瘍容積(及びSEM)が各群で算出された。93日後、全ての処置が停止され、生存マウスの腫瘍容積が93日目まで測定された。
【０２０１】
第4の実験では、PB19478の遅い投与の効果が試験された。腫瘍(上記のように生成された)を有するNSG-hHGFkiマウスは2つの処置の1つを与えられたが、抗体は腹腔内(i.p.)注射によって毎週与えられ、エルロチニブ又はビヒクルは経管栄養によって1日1回(QD)与えられた。
【０２０２】
21日目に、平均腫瘍容積がおよそ200mm3に達すると、14匹全てのマウスは6mg/kgエルロチニブの毎日の経口経管栄養処置が開始された。51日目に、平均腫瘍容積が500mm3の印をはっきりと通過すると、マウスは2つの群に無作為化された。6匹の1つの群は6mg/kgエルロチニブの毎日の経口経管栄養によって処置され、8匹の群は25mg/kg PB19478抗体の毎週のi.p.注射と6mg/kgエルロチニブの毎日の経管栄養を受けた。前述のように、腫瘍容積がモニターされ、平均腫瘍容積(及びSEM)が各群で算出された。72日後、全ての処置は停止された。
【０２０３】
第1の実験の結果は、エルロチニブが、HCC827細胞を移植されたNGS-hHGFkiマウスにおける抗腫瘍応答を誘導できたが、マウスが処置を受けている限りのみであったことを実証する(図19)。処置の約4週間後に開始した薬物を使用しない期間では、腫瘍容積はエルロチニブによって処置されたマウスにおいて明確に増加した。
【０２０４】
抗cMET×EGFR二重特異性抗体PB8532は、HCC827細胞を移植されたNGS-hHGFkiマウスにおける抗腫瘍応答も誘導することができた(図20)。この効果は、抗体が1日量のエルロチニブと組み合わせて与えられた場合により大きかった。2.5週以内に、PB8532のエルロチニブとの組合せにより全ての腫瘍が消滅した。1つのFabアームを有するcMET標的化対照抗体PB17160は、エルロチニブ有り又は無しのいずれでも、抗腫瘍応答を誘導しなかった。したがって、二重特異性抗体PB8532におけるEGFR標的化Fabアームとの組合せによるcMET Fabアームの特異的標的化は、HGF媒介エルロチニブ耐性を克服し得る。処置の約5と1/2週後に開始した薬物を使用しない期間では、PB8532は腫瘍容積の減少にエルロチニブよりも明確に効果的であり(図21)、PB8532+エルロチニブ組合せ群では腫瘍の再増殖は観察されなかった。
【０２０５】
抗cMET×EGFR二重特異性抗体PB19478は、HCC827細胞を移植されたNSG-hHGFkiマウスにおける抗腫瘍応答も誘導することができた(図22)。この効果は、抗体が1日量のエルロチニブと組み合わせて与えられた場合により大きかった。2週間以内に、PB19478のエルロチニブとの組合せ又はエルロチニブ無しにより全ての腫瘍が消滅した。エルロチニブにより、腫瘍は、試験期間中再出現しなかった。エルロチニブ無しでは、腫瘍は、わずかおよそ50日で再出現し、最終的に80日目に更に成長するまで検出レベルにとどまった。ヒト化モノクローナル抗体エミベツズマブ(LY3875358)は、EGFR阻害剤エルロチニブと組み合わせた場合も効果的ではなかった。したがって、二重特異性抗体PB8532又はPB19478においてEGFR標的化Fabアームとの組合せによるcMET Fabアームの特異的標的化は、HGF媒介エルロチニブ耐性を克服し得る。
【０２０６】
図23は、エルロチニブ耐性が発生し始める時点で腫瘍を処置する場合、二重特異性抗体PB19478の即時効果があることを示す。
【０２０７】
まとめると、免疫不全NSG-hHGFkiマウスに移植されたHCC827腫瘍細胞のこの異種移植片モデルからのデータは、PB8532、PB19478並びに図7及び図8に示した類似のVH配列を有する抗体が、インビボでHGF媒介エルロチニブ耐性を克服する能力を有することを示す。併用処置は、処置の停止後も有効であり続ける。
【０２０８】
［引用文献］
2020530028.tif 000003
2020530028.tif 000004
【０２０９】
【表１】
2020530028.tif 000005
【０２１０】
【表２】
2020530028.tif 000006
【０２１１】
【表３】
2020530028.tif 000007
【０２１２】
【表４】
2020530028.tif 000008
【０２１３】
【表５】
2020530028.tif 000009
【０２１４】
【表６】
2020530028.tif 000010
【図１】
2020530028.tif 000011
【図２】
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【図３】
2020530028.tif 000013
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図８−１】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
2020530028.tif 000023
【図９Ｅ】
2020530028.tif 000024
【図１０ＡＢＣ】
2020530028.tif 000025
【図１０ＤＥＦ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
2020530028.tif 000037
【図１８】
2020530028.tif 000038
【図１９】
2020530028.tif 000039
【図２０】
2020530028.tif 000040
【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
2020530028.tif 000043
【配列表】
2020530028000001.app
【国際調査報告】
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