(57)【要約】  本発明は、植物（例えば、タバコ植物）のアルカロイド含有量を調節するための方法、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現を調節することによって前記植物を改変することを含む方法を提供する。本発明は、植物のアルカロイド含有量を調節するための少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の使用、及び本発明により得られる、タバコ細胞、植物、植物繁殖材料、収穫された葉、処理されたタバコ、又はタバコ製品も提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物若しくはその一部、又は細胞培養物のアルカロイド含有量を調節する方法であって、前記方法が、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現を調節することによって前記植物又は細胞培養物を改変することを含み、前記少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子が、配列番号８、若しくは配列番号１２、若しくは配列番号１６、若しくは配列番号２０、若しくは配列番号２４、若しくは配列番号２８、若しくは配列番号３２において提示されるアミノ酸配列、又はそれらの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含むポリペプチドをコードするか、或いは前記ＥＲＦ遺伝子が、配列番号３、若しくは配列番号５、若しくは配列番号９、若しくは配列番号１３、若しくは配列番号１７、若しくは配列番号２１、若しくは配列番号２５、若しくは配列番号２９において提示されるヌクレオチド配列、又はそれらの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含む、前記方法。
【請求項２】
タバコ植物若しくはその植物の一部におけるタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ、tobacco specific nitrosamine）、又はＴＳＮＡの前駆体の含有量を調節する方法であって、前記方法が、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現を調節することによって前記植物又は細胞培養物を改変することを含み、前記少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子が、配列番号８、若しくは配列番号１２、若しくは配列番号１６、若しくは配列番号２０、若しくは配列番号２４、若しくは配列番号２８、若しくは配列番号３２において提示されるアミノ酸配列、又はそれらの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含むポリペプチドをコードするか、或いは前記ＥＲＦ遺伝子が、配列番号３、若しくは配列番号５、若しくは配列番号９、若しくは配列番号１３、若しくは配列番号１７、若しくは配列番号２１、若しくは配列番号２５、若しくは配列番号２９において提示されるヌクレオチド配列、又はそれらの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含む、前記方法。
【請求項３】
細胞又は植物若しくはその一部、或いは細胞培養物のアルカロイド含有量を調節するための、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の使用であって、前記少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子が、配列番号８、若しくは配列番号１２、若しくは配列番号１６、若しくは配列番号２０、若しくは配列番号２４、若しくは配列番号２８、若しくは配列番号３２において提示されるアミノ酸配列、又はそれらの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含むポリペプチドをコードするか、或いは前記ＥＲＦ遺伝子が、配列番号３、配列番号５、若しくは配列番号９、若しくは配列番号１３、若しくは配列番号１７、若しくは配列番号２１、若しくは配列番号２５、若しくは配列番号２９において提示されるヌクレオチド配列、又はそれらの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含む、前記使用。
【請求項４】
アルカロイド含有量が調節された植物若しくはその一部、細胞培養物、植物繁殖材料、葉、カットされ、収穫された葉、処理された葉、又は、カット及び処理された葉を作出するための方法であって、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現を調節するために前記植物又は細胞培養物を改変することを含み、前記少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子が、配列番号８、若しくは配列番号１２、若しくは配列番号１６、若しくは配列番号２０、若しくは配列番号２４、若しくは配列番号２８、若しくは配列番号３２において提示されるアミノ酸配列、又はそれらの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含むポリペプチドをコードするか、或いは前記ＥＲＦ遺伝子が、配列番号３、配列番号５、若しくは配列番号９、若しくは配列番号１３、若しくは配列番号１７、若しくは配列番号２１、若しくは配列番号２５、若しくは配列番号２９において提示されるヌクレオチド配列、又はそれらの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含む、前記方法。
【請求項５】
アルカロイド含有量が、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現が調節されるように改変されていない植物又は細胞培養物と比べ、調節されている、請求項１〜４のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項６】
未改変植物又は未改変細胞培養物と比べ、アルカロイド含有量における調節が達成されるように改変されている植物若しくはその一部、又は細胞培養物であって、前記改変が、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現の調節である、前記植物若しくはその一部、又は細胞培養物。
【請求項７】
請求項６に記載の植物から、又は請求項４若しくは５のいずれかに記載の方法によって作出される植物若しくは細胞培養物から得ることができる、植物繁殖材料。
【請求項８】
植物のアルカロイド含有量が、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現が調節されるように改変されていない植物又は細胞培養物と比べ、減少している、請求項１〜４のいずれかに記載の方法若しくは使用、或いは請求項６に記載の植物若しくはその一部、又は細胞培養物、或いは請求項７に記載の植物繁殖材料。
【請求項９】
少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現が減少している、請求項８に記載の方法若しくは使用、請求項８に記載の植物若しくはその一部、又は細胞培養物、或いは請求項８に記載の植物繁殖材料。
【請求項１０】
植物又は細胞培養物のアルカロイド含有量が、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現が調節されるように改変されていない植物と比べ、増加している、請求項１〜５のいずれかに記載の方法若しくは使用、或いは請求項６に記載の植物若しくはその一部、又は細胞培養物、或いは請求項７に記載の植物繁殖材料。
【請求項１１】
植物が、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現が増加するように改変され、かつ、植物又は細胞培養物が、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現が調節されるように改変されていない植物又は細胞培養物と比べ、アルカロイド含有量の増加を示す、請求項１〜５又は１０のいずれかに記載の方法又は使用、請求項６又は１０に記載の植物若しくはその一部、又は細胞培養物、或いは請求項７又は１０に記載の植物繁殖材料。
【請求項１２】
植物又は細胞培養物の総アルカロイド含有量が調節されている、請求項１〜５又は５〜１１のいずれかに記載の方法又は使用、請求項６又は８〜１１に記載の植物若しくはその一部、又は細胞培養物、或いは請求項７〜１１に記載の植物繁殖材料。
【請求項１３】
ニコチン、ノルニコチン、アナバシン、ミオスミン、及びアナタビンから選択される１又は２以上のアルカロイドの含有量が調節され、好ましくは、ニコチンの含有量が調節されている、請求項１〜５又は８〜１２のいずれかに記載の方法又は使用、請求項６又は８〜１２に記載の植物若しくはその一部、又は細胞培養物、或いは請求項７〜１２に記載の植物繁殖材料。
【請求項１４】
植物又は植物細胞がナス科（Solanaceae）由来である、請求項１〜５又は８〜１３のいずれかに記載の方法又は使用、請求項６又は８〜１３に記載の植物若しくはその一部、又は細胞培養物、或いは請求項７〜１３に記載の植物繁殖材料。
【請求項１５】
植物又は植物細胞がナス属（Solanum）由来である、請求項１〜５又は８〜１４のいずれかに記載の方法又は使用、請求項６又は８〜１４に記載の植物若しくはその一部、又は細胞培養物、或いは請求項７〜１４に記載の植物繁殖材料。
【請求項１６】
植物又は植物細胞がタバコ属（Nicotiana）由来である、請求項１〜５又は８〜１４のいずれかに記載の方法又は使用、請求項６又は８〜１４に記載の植物若しくはその一部、又は細胞培養物、或いは請求項７〜１４に記載の植物繁殖材料。
【請求項１７】
ニコチン含有量が調節されている、請求項１６に記載の方法又は使用、請求項１６に記載のタバコ植物若しくはその一部、又はタバコ細胞培養物、或いは請求項１６に記載の植物繁殖材料。
【請求項１８】
ニコチン含有量が減少している、請求項１６に記載の方法又は使用、請求項１６に記載のタバコ植物若しくはその一部、又はタバコ細胞培養物、或いは請求項１６に記載の植物繁殖材料。
【請求項１９】
少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子が、
配列番号８において提示されるアミノ酸配列、又はその機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含むポリペプチドをコードするか、或いは
配列番号５において提示されるヌクレオチド配列、又はその機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含む、
請求項１〜５又は８〜１８のいずれかに記載の方法又は使用、請求項６若しくは８又は１１〜１８に記載の植物若しくはその一部、又は細胞培養物、或いは請求項７又は１１〜１８に記載の植物繁殖材料。
【請求項２０】
追加のＥＲＦ遺伝子が調節され、
前記追加のＥＲＦ遺伝子が、
少なくとも１つのＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子であり、配列番号４０、若しくは配列番号４４、若しくは配列番号４８、若しくは配列番号５２、若しくは配列番号５６、若しくは配列番号６０、若しくは配列番号６４、若しくは配列番号６８、若しくは配列番号７２において提示されるアミノ酸配列、又はそれらの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含むポリペプチドをコードするか、或いは
少なくとも１つのＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子であり、配列番号３７、若しくは配列番号４１、若しくは配列番号４５、若しくは配列番号４９、若しくは配列番号５３、若しくは配列番号５７、若しくは配列番号６１、若しくは配列番号６５、若しくは配列番号６９において提示されるヌクレオチド配列を含む、
請求項１〜５又は８〜１９のいずれかに記載の方法又は使用、請求項６若しくは８又は１１〜１９に記載の植物若しくはその一部、又は細胞培養物、或いは請求項７又は１１〜１９に記載の植物繁殖材料。
【請求項２１】
追加のＥＲＦ遺伝子が調節され、前記追加のＥＲＦ遺伝子が、少なくとも１つのＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子であり、かつ、配列番号６９において提示されるヌクレオチド配列、又はその機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含むか、或いは配列番号７２において提示されるアミノ酸配列、又はその機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含むポリペプチドをコードする、請求項１〜５又は８〜２０のいずれかに記載の方法又は使用、請求項６若しくは８又は１１〜２０に記載の植物若しくはその一部、又は細胞培養物、或いは請求項７又は１１〜２０に記載の植物繁殖材料。
【請求項２２】
植物を育種するための、請求項６又は８〜２１のいずれかに記載の植物若しくはその一部、又は細胞培養物、或いは請求項４若しくは５又は８〜２０のいずれかに記載の方法によって作出される植物の使用。
【請求項２３】
製品の製造のための、請求項６又は８〜２１のいずれかに記載の植物若しくはその一部、又は細胞培養物、或いは請求項４若しくは５又は８〜２０のいずれかに記載の方法によって作出される植物の使用。
【請求項２４】
作物を作るための、請求項６又は８〜２１のいずれかに記載の植物又はその一部、或いは請求項４若しくは５又は８〜２０のいずれかに記載の方法によって作出される植物の使用。
【請求項２５】
葉を生産するための、請求項６又は８〜２１のいずれかに記載の植物又はその一部、或いは請求項４若しくは５又は８〜２０のいずれかに記載の方法によって作出される植物の使用。
【請求項２６】
請求項６又は８〜２１のいずれかに記載の植物の、或いは請求項６〜２１のいずれかに記載の繁殖材料から繁殖された植物から得ることができるか、或いは請求項２又は２２〜２４のいずれかに記載の使用によって得られる植物から得ることができるか、或いは請求項４若しくは５又は８〜２１のいずれかに記載の方法によって作出される植物から得ることができる、収穫された葉。
【請求項２７】
植物の収穫された葉が、カットされ、収穫された葉である、請求項２６に記載の植物の収穫された葉。
【請求項２８】
請求項２又は２２〜２４のいずれかに記載の使用から得ることができる植物から得ることができるか、
請求項５又は７〜２１のいずれかに記載の植物を処理することによって得ることができるか、
請求項６〜２１のいずれかに記載の植物繁殖材料から繁殖された植物から得ることができるか、
請求項２６又は２７に記載の植物の収穫された葉を処理することによって得ることができるか、或いは
請求項４若しくは５又は８〜２１のいずれかに記載の方法によって作出される植物から得ることができる、
処理された葉、好ましくは、処理されたタバコ葉、好ましくは、成長できない処理されたタバコ葉。
【請求項２９】
葉が、乾燥処理、発酵、殺菌、又はこれらの組み合わせによって処理されている、請求項２８に記載の処理された葉。
【請求項３０】
カットされ、処理された葉である、請求項２８又は２９に記載の処理された葉。
【請求項３１】
請求項１６〜２１のいずれかに記載の植物若しくはその一部、又はその抽出物で作製された乾燥処理されたタバコ材料。
【請求項３２】
請求項３１に記載の乾燥処理されたタバコ材料を含むタバコブレンド。
【請求項３３】
請求項１６〜２１のいずれかに記載のタバコ植物若しくはその一部、又は請求項１６〜２１のいずれかに記載のタバコ細胞培養物、
請求項１６に記載のタバコ植物繁殖材料から繁殖されたタバコ植物若しくはその一部、
請求項２５又は２６に記載の植物の収穫された葉であって、前記植物がタバコである、収穫された葉、
請求項２７〜２９のいずれかに記載の処理された葉であって、前記植物がタバコである、処理された葉、或いは
請求項１６に記載の方法によって作出される植物
から調製されるタバコ工業製品。
【請求項３４】
タバコ製品が可燃性喫煙物品である、請求項３３に記載のタバコ工業製品。
【請求項３５】
タバコ製品が無煙タバコ製品である、請求項３３に記載のタバコ工業製品。
【請求項３６】
タバコ加熱デバイス又はエアゾール発生デバイス等の不燃性エアゾール提供システムである、請求項３３に記載のタバコ製品。
【請求項３７】
細胞培養物中でアルカロイド含有量を調節するための、請求項１６に記載のタバコ細胞の使用。
【請求項３８】
請求項６〜２１のいずれかに記載の植物若しくはその一部、又はその抽出物（例えば、タバコ抽出物）、或いは請求項１６〜２１のいずれかに記載のタバコ細胞培養物、或いは請求項３１に記載の乾燥処理されたタバコ材料、或いは請求項３２に記載のタバコブレンドを含む、可燃性喫煙物品、不燃性エアゾール提供システム、無煙タバコ製品、又はタバコ加熱デバイス。
【請求項３９】
調節された（例えば、低減された）アルカロイド含有量、及び／又はタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）若しくはＴＳＮＡの前駆体の調節された（例えば、低減された）含有量を有する植物を選択するための、配列番号３、若しくは配列番号５、若しくは配列番号９、若しくは配列番号１３、若しくは配列番号１７、若しくは配列番号２１、若しくは配列番号２５、若しくは配列番号２９から選択される少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子のヌクレオチド配列、又はそれらの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログの使用。
【請求項４０】
少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子のヌクレオチド配列における遺伝的変異を有する植物の変異体であって、前記Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子が、配列番号３、若しくは配列番号５、若しくは配列番号９、若しくは配列番号１３、若しくは配列番号１７、若しくは配列番号２１、若しくは配列番号２５、若しくは配列番号２９、又はそれらの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログから選択され、前記遺伝的変異が、前記少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現を調節し（例えば、減少させ）、前記変異体植物が、前記遺伝的変異を有しない同等の植物に対して、アルカロイド含有量が調節され（例えば、減少し）、及び／又はタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）若しくはＴＳＮＡの前駆体の含有量が調節されている、前記植物の変異体。
【請求項４１】
請求項４０に記載の遺伝的変異を有する変異体植物の子孫又は種子。
【請求項４２】
少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子のヌクレオチド配列における改変を含む植物から生産した、収穫された葉、処理された葉、又は乾燥処理されたタバコ材料であって、
前記少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子が、配列番号３、若しくは配列番号５、若しくは配列番号９、若しくは配列番号１３、若しくは配列番号１７、若しくは配列番号２１、若しくは配列番号２５、若しくは配列番号２９、又はそれらの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログから選択され、
前記改変が、前記少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現を調節し（例えば、減少し）、かつ
前記植物が、前記少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子における前記改変を有しない同等の植物に対して、アルカロイド含有量が調節され（例えば、減少し）、及び／又はタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）若しくはＴＳＮＡの前駆体の含有量が調節されている、
前記収穫された葉、処理された葉、又は乾燥処理されたタバコ材料。
【請求項４３】
明細書及び図面を参照して本明細書に記載される方法、葉、植物、植物繁殖材料、収穫された葉、処理されたタバコ、タバコ製品、使用、又はこれらの組み合わせ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物又はその一部の、アルカロイド含有量、例えば、ニコチン含有量を調節する方法に関する。本発明は、植物内のアルカロイド含有量を調節する遺伝子によってコードされるポリペプチドの発現及び／又は活性を調節する方法にも及ぶ。或いは、本発明は、植物内のアルカロイド含有量を調節するポリペプチドをコードする遺伝子の発現及び／又は活性を調節する方法を提供する。本発明は、ポリペプチドを調節するために使用することができるコンストラクト、このようなコンストラクトで形質転換された植物細胞、及び遺伝子導入植物それ自体にも及ぶ。本発明は、アルカロイド含有量を調節するための遺伝子コンストラクトで形質転換されたこのような遺伝子導入植物由来の収穫された（harvested）葉の使用、及びこのような葉を含む喫煙物品（例えば、可燃性喫煙物品）にも関する。
【背景技術】
【０００２】
アルカロイドは、大抵は塩基性窒素原子を含有し、細菌、真菌、植物及び動物を含む各種の生物体によって産生される、天然に存在する化合物のグループである。アルカロイドは、炭素骨格、例えば、インドール、イソキノリン及びピリジン様の類似性に従って分類され得る。ピリジン誘導体は、単量体アルカロイドの１つのクラスであり、このクラスは、ピリジンの単純な誘導体、多環式縮合及び非縮合ピリジン誘導体、並びにセスキテルペンピリジン誘導体を含む。例は、ニコチン、ノルニコチン、アナバシン、ミオスミン及びアナタビンである。アルカロイドの公知の生物学的機能のほとんどは、保護に関する。タバコ中のアルカロイドは、喫煙官能特性を増強する。
【０００３】
ニコチンは、植物のいくつかの品種中で天然に存在するが、タバコ植物中で最も高いレベルで見出される。ニコチンは、野生及び栽培されたタバコ（Nicotiana）種中で産生され、草食動物及び昆虫に対する植物防御において重要な役割を果たし（Voelckel, C., Krugel, T., Gase, K., Heidrich, N., van Dam, N. M., Winz, R., and Baldwin, I. T. (2001). Anti-sense expression of putrescine N-methyltransferase confirms defensive role of nicotine in Nicotiana sylvestris against Manduca sexta. Chemoecology 11, 121-126、参照によって本明細書に組み込まれる）、総アルカロイド含有量の約９０％を占める。アルカロイドプールの残りの１０％は、主に、ノルニコチン、アナタビン、ミオスミン及びアナバシンによって構成される。
【０００４】
タバコ中のアルカロイド含有量の制御は複雑である。遺伝子型、環境、施肥及び農業の慣行（例えば、トッピング）を含むいくつかの要因が、タバコ植物中のアルカロイドレベルに影響を与える。
【０００５】
１９３０年代に、あるキューバの葉巻タバコ（ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum））のタイプが、非常に低いアルカロイド含量を有するとして特定され、この形質が米国のタバコ育種系統に導入された（Valleau W. 1949. Breeding low-nicotine tobacco. Journal of Agricultural Research 78: 171-181、参照によって本明細書に組み込まれる）。その後、低アルカロイド形質は、戻し交配の複数世代を通して栽培品種のバーレー（Burley）２１（Ｂ２１）の遺伝的背景に組み込まれた（Legg PD, Collins GB, Litton CC. 1970. Registration of La Burley-21 Tobacco Germplasm. Crop Science 10(2): 212、参照によって本明細書に組み込まれる）。
【０００６】
低アルカロイドのバーレー２１（ＬＡ−Ｂ２１）を使用する遺伝学研究は、遺伝子座Ａ及びＢと最初に称されたが（Legg P, Chaplin J, Collins G. (1969). Inheritance of percent total alkaloids in Nicotiana tabacum L.: populations derived from crosses of low alkaloid lines with burley and flue-cured varieties. Journal of Heredity 60: 213-217、参照によって組み込まれる）、後にＮｉｃ１及びＮｉｃ２として公知の２つの非連鎖遺伝子座が、ニコチン生合成のための制御性遺伝子座としてタバコ葉中のニコチンレベルに寄与することを示唆した（Legg P., and G., C. (1971). Inheritance of percent total alkaloids in Nicotiana tabacum L. II. genetic effects of two loci in Burley21 X LA Burley 21 populations. Canadian Journal of Genetics and Cytology 13, 287-291、参照によって組み込まれる；Hibi, N., Higashiguchi, S., Hashimoto, T., and Yamada, Y. (1994). Gene-Expression in Tobacco Low-Nicotine Mutants. Plant Cell 6, 723-735、参照によって組み込まれる））。ＬＡ  Ｂ２１は、植物防御におけるアルカロイドの役割と一致して、昆虫の損害に対してより影響を受けやすいことが報告された。低総アルカロイド（おおよそ０．２％）を有する熱風乾燥処理されたタバコの同質遺伝子系統が、より低い収量を有することも報告されている。野生型又は高アルカロイドＢ２１（ＨＡ−Ｂ２１、ＡＡＢＢ）×ＬＡ−Ｂ２１（ａａｂｂ）の間の交雑種由来のＦ１子孫の半数体倍加の手段によって、Collins et al.（Collins, G. B., Legg, P. D., and Kasperba.Mj (1974). Use of Anther-Derived Haploids in Nicotiana .1. Isolation of breeding lines differing in total alkaloid content. Crop Science 14, 77-80、参照によって組み込まれる）は、高中間体アルカロイド（ＨＩ−Ｂ２１、ＡＡｂｂ）及び低中間体（ＬＩ−Ｂ２１、ａａＢＢ）を有するＢ２１の別の２つの同質遺伝子系統（ＮＩＬ）を開発し、後に、これらは１９８８年に品種として登録された（Nielsen, M. T., Legg, P. D., and Collins, G. B. (1988). Registration of HI and LI burley 21 tobacco germplasms.  Crop Science 28, 206-207、参照によって組み込まれる）。準同質遺伝子系統（ＮＩＬ、near isogenic line）は、本明細書において、バーレー２１（Ｂ２１、Ｎｉｃ１Ｎｉｃ２）、高中間体（ＨＩ、Ｎｉｃ１ｎｉｃ２）、低中間体（ＬＩ、ｎｉｃ１Ｎｉｃ２）及び低アルカロイドＢ２１（ＬＡ、ｎｉｃ１ｎｉｃ２）と称する。
【０００７】
その後の研究は、これらの２つの遺伝子座が、ストレス応答遺伝子等のニコチン生合成と無関係の多数の遺伝子の発現も制御していることを示した（Kidd, S. K., Melillo, A. A., Lu, R. H., Reed, D. G., Kuno, N., Uchida, K., Furuya, M., and Jelesko, J. G. (2006). The A and B loci in tobacco regulate a network of stress response genes, few of which are associated with nicotine biosynthesis. Plant Mol Biol 60, 699-716、参照によって組み込まれる）。Ｎｉｃ２遺伝子座は、大きな欠失の特定に基づいて特徴付けられたが（Shoji, T., Kajikawa, M., and Hashimoto, T. (2010). Clustered transcription factor genes regulate nicotine biosynthesis in tobacco. The Plant Cell 22, 3390-3409、参照によって本明細書に組み込まれる）、タバコ中のＮｉｃ１遺伝子座の場所の解明が、マップに基づくクローニングアプローチを妨げるアルカロイドレベル等の量的形質の複雑性に起因して、困難であることが証明された。
【０００８】
植物（例えば、タバコ）におけるアルカロイド含有量の改変は、いくつかの商業上の利点を有し得る。例えば、植物中の総アルカロイド含有量を減少させることで、バイオマス源として前記植物の価値を高めることができる。例えば、アルカロイド含有量の改変は、タバコ植物のアルカロイド含有量、例えば、ニコチン含有量の低減を含み得る。低減されたニコチンを有するタバコ植物及び製品は、「ニコチン上限」、即ち、タバコ製品中のニコチンの平均上限の可能性がある規制を考慮すると、望ましくあり得る。或いは、植物、例えば、タバコ植物中のアルカロイド含有量の増加は、昆虫及び草食動物に対して植物を保護するのを助けることができる。調節されたアルカロイド含有量、例えば、調節されたニコチン含有量、改善された商業的に望ましい形質を有する植物、及びそれを生産するための方法についての必要性が残されている。
【０００９】
タバコピリジンアルカロイドは、収穫後の葉を乾燥処理する間に形成されるタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ、tobacco-specific nitrosamine）の前駆体である。乾燥処理されたタバコ葉中で見出された４つの主なＴＳＮＡは、Ｎ’−ニトロソノルニコチン（ＮＮＮ、N'-nitrosonornicotine）、Ｎ’−ニトロソアナタビン（ＮＡＴ、N'-nitrosoanatabine）、Ｎ’−ニトロソアナバシン（ＮＡＢ、N'-nitrosoanabasine）及び４−（メチルニトロソアミノ）−１−（３−ピリジル）−１−ブタノン（ＮＮＫ、4-(methyl nitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone）である。
【００１０】
亜酸化窒素種（例えば、ＮＯ、ＮＯ２、Ｎ２Ｏ３及びＮ２Ｏ４）がタバコアルカロイドと反応すると、ＴＳＮＡが形成される。ＮＡＴ及びＮＡＢは、それぞれ、二次アルカロイドであるアナタビン及びアナバシンのニトロソ化を経て形成される。初期の研究は、ＮＮＮがニコチン及びノルニコチンの両方が起源であると主張したが、より最近の報告は、乾燥処理されたタバコ葉中のＮＮＮの存在がニコチン含有量ではなくノルニコチン含有量と相関することを実証している（Bush et al., Rec. Adv. Tob. Sci. 27; 23-46 (2001)；Bush et al., Rec. Adv. Tob. Sci. 27; 23-46 (2001)）。ノルニコチンは、総アルカロイド含有量の９０％を占めるタバコ中の主なアルカロイドであるニコチンの脱メチル化誘導体である（Saitoh et al., 1985 Phytochemistry, 24 pp. 477-480）。ＮＮＫ形成の前駆体／生成物の関係はあまり明確ではない。いくつかの研究は、ＮＮＫはニコチンのニトロソ化生成物であるが、ニコチンのニトロソ化の遅い反応速度に起因して、ニコチンそれ自体よりもむしろニコチンの酸化誘導体がＮＮＫの直接の前駆体としての機能を果たす可能性があると述べている（Caldwell et al Ann. N.Y. Acad. Sci. 686, 213-228 (1993)）。ＴＳＮＡ前駆体の産生及び制御の原因である遺伝子を特定することは非常に重要である。
【００１１】
ノルニコチンは、典型的には、タバコ植物中の総ピリジンアルカロイド含有量の２〜４％のみを占めるが、高ノルニコチン含有変換植物の自然出現をもたらす遺伝的不安定性は、タバコの生産における長期にわたる課題である。低ノルニコチンレベルを維持することで、このアルカロイドに関連する不愉快なフレーバー及びアロマを防ぐことができ、並びにノルニコチンが直接前駆体であるタバコ工業製品におけるＮ−ニトロソノルニコチン（ＮＮＮ）の形成を低減する。
【００１２】
主なノルニコチンへのニコチンの変換の原因である遺伝子は、チトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼをコードするニコチンデメチラーゼ遺伝子のＣＹＰ８２Ｅ４である（Siminszky et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102 (2005), pp. 14919-14924；Xu et al., Physiol. Plantarum, 129 (2007), pp. 307-319）。タバコにおけるニコチンデメチラーゼ遺伝子ファミリーは、広範囲に特徴付けられているが、ノルニコチンレベルに影響を与え得る他の細胞プロセスについてはほとんど知られていない。タバコ植物及びタバコ植物から製造された製品におけるＴＳＮＡのレベルをさらに低減させることができる方法論を考案する大きな必要性が依然として存在している。
【００１３】
実施例において記載するように、本発明者らは、植物中のアルカロイド含有量を調節すること、例えば、タバコ植物中のニコチン含有量を減少させることを目的として、アルカロイド合成の原因である遺伝子を調べようと努力した。これらの調査は、本研究者らを、バーレー２１（Ｂ２１）の交雑種である、正常／高アルカロイドＢ２１（ＨＡ）×低中間体アルカロイドＢ２１（ＬＩ）、正常／高アルカロイドＢ２１（ＨＡ）×低アルカロイドＢ２１（ＬＡ）及び高中間体Ｂ２１（ＨＩ）×低アルカロイドＢ２１（ＬＡ）のタバコ植物を生み出すことに駆り立てた。得られるＦ２植物のアルカロイド含有量を分析した。ＳＮＰジェノタイピングを、ＨＡ×ＬＡ及びＨＡ×ＬＩのＦ２個体群からの最高又は最低のアルカロイド含有量を有するＦ２に対して行って、さらなる解析のための多型マーカーを特定した。ＨＩ×ＬＡ個体群も、ファインマッピングのために発生させた。本発明者らは、Ｎｉｃ１遺伝子座で分離したマーカーを開発した。エチレン応答因子（ＥＲＦ、ethylene response factor）サブファミリー由来の９つの遺伝子を、アルカロイド合成の潜在的な転写因子のレギュレーターとして特定した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Voelckel, C., Krugel, T., Gase, K., Heidrich, N., van Dam, N. M., Winz, R., and Baldwin, I. T. (2001). Anti-sense expression of putrescine N-methyltransferase confirms defensive role of nicotine in Nicotiana sylvestris against Manduca sexta. Chemoecology 11, 121-126
【非特許文献２】Valleau W. 1949. Breeding low-nicotine tobacco. Journal of Agricultural Research 78: 171-181
【非特許文献３】Legg PD, Collins GB, Litton CC. 1970. Registration of La Burley-21 Tobacco Germplasm. Crop Science 10(2): 212
【非特許文献４】Legg P, Chaplin J, Collins G. (1969). Inheritance of percent total alkaloids in Nicotiana tabacum L.: populations derived from crosses of low alkaloid lines with burley and flue-cured varieties. Journal of Heredity 60: 213-217
【非特許文献５】Legg P., and G., C. (1971). Inheritance of percent total alkaloids in Nicotiana tabacum L. II. genetic effects of two loci in Burley21 X LA Burley 21 populations. Canadian Journal of Genetics and Cytology 13, 287-291
【非特許文献６】Hibi, N., Higashiguchi, S., Hashimoto, T., and Yamada, Y. (1994). Gene-Expression in Tobacco Low-Nicotine Mutants. Plant Cell 6, 723-735
【非特許文献７】Collins, G. B., Legg, P. D., and Kasperba.Mj (1974). Use of Anther-Derived Haploids in Nicotiana .1. Isolation of breeding lines differing in total alkaloid content. Crop Science 14, 77-80
【非特許文献８】Nielsen, M. T., Legg, P. D., and Collins, G. B. (1988). Registration of HI and LI burley 21 tobacco germplasms.  Crop Science 28, 206-207
【非特許文献９】Kidd, S. K., Melillo, A. A., Lu, R. H., Reed, D. G., Kuno, N., Uchida, K., Furuya, M., and Jelesko, J. G. (2006). The A and B loci in tobacco regulate a network of stress response genes, few of which are associated with nicotine biosynthesis. Plant Mol Biol 60, 699-716
【非特許文献１０】Shoji, T., Kajikawa, M., and Hashimoto, T. (2010). Clustered transcription factor genes regulate nicotine biosynthesis in tobacco. The Plant Cell 22, 3390-3409
【非特許文献１１】Bush et al., Rec. Adv. Tob. Sci. 27; 23-46 (2001)
【非特許文献１２】Lewis et al., Plant Biotech J. 6: 346-354 (2008)
【非特許文献１３】Saitoh et al., 1985 Phytochemistry, 24 pp. 477-480
【非特許文献１４】Caldwell et al Ann. N.Y. Acad. Sci. 686, 213-228 (1993)
【非特許文献１５】Siminszky et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102 (2005), pp. 14919-14924
【非特許文献１６】Xu et al., Physiol. Plantarum, 129 (2007), pp. 307-319
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
驚くべきことに、本明細書において教示するように、Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現を調節することによって、植物のアルカロイド含有量を調節することができることを見出した。その結果、タバコ製品の消費者によって求められている、調節されたアルカロイド含有量及び商業的に望ましい形質を有するタバコ製品を製造することができる。いくつかの例において、消費者は、低レベルのアルカロイド含有量、例えば、低レベルのニコチン含有量を有する製品を望んでいる場合がある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、植物（タバコ及び他のタバコ種等）が、タンパク質、ペプチド及び代謝産物の産生のために、例えば、抗生物質、ウイルス様粒子又は栄養補助食品若しくは低分子等の治療及び医薬品の製造のために使用される植物分子農業の分野において、特に有用であり得る。タバコは、PharmPlant and Medicago Inc.社がＥｕ資金プロジェクトと呼ぶＨＩＶ中和抗体の開発のために使用されており、カナダは、インフルエンザワクチン製造のためのウイルス様粒子の産生のために、タバコに基づくプラットフォームに取り組んでいる。
【００１７】
このように、本発明による植物は、ニコチン及び／又は他のニコチンアルカロイドの存在を低減又は取り除く分子農業のために使用され得る。低ニコチン植物又は根茎の使用は、分子農業において有益であり、精製に関連する下流の処理コストを低減するだろう。
【００１８】
他の例において、ニコチンが、例えば、ニコチンを含有する液体を利用するデバイス（例えば、電子タバコ）又はタバコ加熱デバイス内での使用のための純粋なニコチン製品を製造するためにタバコ植物から精製され得るように、高アルカロイドレベル、例えば、高レベルのニコチン含有量を有する植物を生産することが望まれている場合がある。例えば、高レベルのニコチンを含有する葉を有する植物の生産は、電子タバコ用の電子液体の製造のためのニコチン抽出物のコストを低減することができる。
【００１９】
本発明者らは、タバコ植物におけるニコチン生合成の制御を調べた。本発明者らは、ニコチンに関連する構造遺伝子及び他の無関連の遺伝子の発現をコントロールすると考えられる制御性遺伝子座Ｎｉｃ１及びＮｉｃ２を調べた。本発明者らの１つの目的は、アルカロイド含有量の変更を提供することであった。９つのＥＲＦ遺伝子が、同じ条件下で生育する同等の野生型植物と比較して、改変されたタバコ植物中のアルカロイド含有量を予想外に調節するＮｉｃ１領域において特定された。
【００２０】
本発明者らは、驚くべきことに、ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現を調節することによって、タバコ植物のアルカロイド含有量、例えば、ニコチン含有量を調節するための方法を見つけ出した。タバコ植物のニコチン含有量は、ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現を阻害することによって減少させることができる。本発明の前に、本明細書に記載のＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現の調節がアルカロイド含有量を調節するために使用することができることは知られていなかった。
【００２１】
本発明者らは、Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の調節が、改変植物のアルカロイド含有量を驚くべき低レベルに低減することができることを見つけ出した。
【００２２】
ＬＩ（低中間体、ａａＢＢ）系統は、通常、ＨＡ（高アルカロイド、ＡＡＢＢ）系統と比較して、約半分のアルカロイド含有量を産生する。しかしながら、実施例１３において、ＬＩ系統と同等のＥＭＳ系統を生産した。Ｎｉｔａｂ４．５＿０００３０９０ｇ００３０．１（ＥＲＦ１９９）中に変異を有するＥＭＳ系統を生産した。これらの変異体のＥＭＳ系統は、ＨＡ系統と比較して、約３分の１のアルカロイド含有量を産生し、これは、ＬＩ系統について予想されるよりもはるかに低いだろう。
【００２３】
別の例において、Ｎｉｃ１  ＥＲＦ  Ｎｉｔａｂ４．５＿０００３０９０ｇ００３０．１（ＥＲＦ１９９）がＨＩ系統（ＡＡｂｂ）の遺伝子編集によってノックアウトされた場合、ノックアウト系統のアルカロイド含有量が、同等のＬＡ系統（ａａｂｂ）のアルカロイド含有量よりもはるかに低かった（実施例１４を参照されたい）。これらのデータは、驚くべきことに、Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子（例えば、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００３０９０ｇ００３０．１又はＥＲＦ１９９）単独の活性又は発現の調節（例えば、活性又は発現のノックダウン又はノックアウト）が、植物又はその一部のアルカロイド含有量を調節する（例えば、低減する）のに十分であることを示唆する。
【００２４】
第１の態様によれば、本発明は、植物若しくはその一部、又は細胞培養物のアルカロイド含有量を調節する方法であって、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現を調節することによって前記植物又は細胞培養物を改変することを含み、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子が、配列番号８、若しくは配列番号１２、若しくは配列番号１６、若しくは配列番号２０、若しくは配列番号２４、若しくは配列番号２８、若しくは配列番号３２において提示されるアミノ酸配列、又はそれらの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含むポリペプチドをコードするか、或いはＥＲＦ遺伝子が、配列番号３、若しくは配列番号５、若しくは配列番号９、若しくは配列番号１３、若しくは配列番号１７、若しくは配列番号２１、若しくは配列番号２５、若しくは配列番号２９において提示されるヌクレオチド配列、又はそれらの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含む、方法を提供する。
【００２５】
別の態様において、タバコ植物若しくはその一部におけるタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）、又はＴＳＮＡの前駆体の含有量を調節する方法であって、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現を調節することによって前記植物又は細胞培養物を改変することを含み、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子が、配列番号８、若しくは配列番号１２、若しくは配列番号１６、若しくは配列番号２０、若しくは配列番号２４、若しくは配列番号２８、若しくは配列番号３２において提示されるアミノ酸配列、又はそれらの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含むポリペプチドをコードするか、或いはＥＲＦ遺伝子が、配列番号３、若しくは配列番号５、若しくは配列番号９、若しくは配列番号１３、若しくは配列番号１７、若しくは配列番号２１、若しくは配列番号２５、若しくは配列番号２９において提示されるヌクレオチド配列、又はそれらの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含む、方法を提供する。
【００２６】
別の態様において、細胞（例えば、タバコ細胞）又は植物若しくはその一部、或いは細胞培養物のアルカロイド含有量を調節するためのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の使用であって、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子が、配列番号８、若しくは配列番号１２、若しくは配列番号１６、若しくは配列番号２０、若しくは配列番号２４、若しくは配列番号２８、若しくは配列番号３２において提示されるアミノ酸配列、又はそれらの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含むポリペプチドをコードするか、或いはＥＲＦ遺伝子が、配列番号３、若しくは配列番号５、若しくは配列番号９、若しくは配列番号１３、若しくは配列番号１７、若しくは配列番号２１、若しくは配列番号２５、若しくは配列番号２９において提示されるヌクレオチド配列、又はそれらの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含む、使用を提供する。
【００２７】
本発明は、さらなる態様において、アルカロイド含有量が調節されている、植物若しくはその一部、細胞培養物、植物繁殖材料、タバコ葉、カットされ、収穫されたタバコ葉、処理された（processed）タバコ葉、又はカット及び処理されたタバコ葉を生産するための方法であって、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現を調節するために前記植物又は細胞培養物を改変することを含み、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子が、配列番号８、若しくは配列番号１２、若しくは配列番号１６、若しくは配列番号２０、若しくは配列番号２４、若しくは配列番号２８、若しくは配列番号３２において提示されるアミノ酸配列、又はそれらの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含むポリペプチドをコードするか、或いはＥＲＦ遺伝子が、配列番号３、若しくは配列番号５、若しくは配列番号９、若しくは配列番号１３、若しくは配列番号１７、若しくは配列番号２１、若しくは配列番号２５、若しくは配列番号２９において提示されるヌクレオチド配列、又はそれらの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含む、方法を提供する。
【００２８】
適切には、本発明による使用のための少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子は、配列番号８に提示されるアミノ酸配列、又はその機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含むポリペプチドをコードし得る。
【００２９】
適切には、本発明による使用のための少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子は、配列番号５に提示されるヌクレオチド配列、又はその機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含み得る。
【００３０】
１つの態様において、アルカロイド含有量が、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現が調節されるように改変されていない植物又は細胞培養物と比べて調節されている、本発明の方法又は使用を提供する。
【００３１】
別の態様において、未改変植物又は未改変細胞培養物と比べて、アルカロイド含有量における調節が達成されるように改変されている、植物若しくはその一部、又は細胞培養物であって、改変が、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現の調節である、植物若しくはその一部、又は細胞培養物を提供する。
【００３２】
別の態様において、本発明による植物若しくは細胞培養物から、又は本発明の方法によって生産される植物から得ることができる植物繁殖材料を提供する。
【００３３】
１つの態様において、植物のアルカロイド含有量が、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現が調節されるように改変されていない植物と比べて減少している、本発明の方法若しくは使用、又は本発明の植物若しくはその一部、又は本発明の植物繁殖材料を提供する。
【００３４】
１つの態様において、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現が減少している、本発明の方法若しくは使用、本発明の植物若しくはその一部、又は本発明の植物繁殖材料を提供する。
【００３５】
別の態様において、植物のアルカロイド含有量が、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現が調節されるように改変されていない植物と比べて増加している、本発明の方法若しくは使用、又は本発明の植物若しくはその一部、又は本発明の植物繁殖材料を提供する。
【００３６】
１つの態様において、植物が、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現が増加するように改変され、植物が、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現が調節されるように改変されていない植物と比べて、アルカロイド含有量の増加を示す、本発明の方法若しくは使用、本発明の植物若しくはその一部、又は本発明の植物繁殖材料を提供する。
【００３７】
１つの態様において、植物の総アルカロイド含有量が調節されている、本発明の方法若しくは使用、本発明の植物若しくはその一部、又は本発明の植物繁殖材料を提供する。
【００３８】
１つの態様において、ニコチン、ノルニコチン、アナバシン、ミオスミン及びアナタビンから選択される１又は２以上のアルカロイドの含有量が調節されている、本発明の方法若しくは使用、本発明の植物若しくはその一部、又は本発明の植物繁殖材料を提供する。１つの態様において、ニコチン含有量が調節されている。
【００３９】
１つの態様において、植物がナス科（Solanaceae）由来である、本発明の方法若しくは使用、本発明の植物若しくはその一部、又は本発明の植物繁殖材料を提供する。
【００４０】
１つの態様において、植物がナス属（Solanum）由来である、本発明の方法若しくは使用、本発明の植物若しくはその一部、又は本発明の植物繁殖材料を提供する。
【００４１】
別の態様において、植物がタバコ属（Nicotiana）由来である、本発明の方法若しくは使用、本発明の植物若しくはその一部、又は本発明の植物繁殖材料を提供する。
【００４２】
１つの態様において、ニコチン含有量が調節されている、本発明の方法若しくは使用、本発明のタバコ植物若しくはその一部、又は本発明の植物繁殖材料を提供する。
【００４３】
１つの態様において、ニコチン含有量が減少している、本発明の方法若しくは使用、本発明のタバコ植物若しくはその一部、又は本発明の植物繁殖材料を提供する。
【００４４】
１つの態様において、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子が、配列番号８において提示されるアミノ酸配列、又はその機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含むポリペプチドをコードするか、或いは少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子が、配列番号５において提示されるヌクレオチド配列、又はその機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含む、本発明の方法若しくは使用、本発明の植物若しくはその一部、又は本発明の植物繁殖材料を提供する。
【００４５】
１つの態様において、追加のＥＲＦ遺伝子が調節され、追加のＥＲＦ遺伝子が、Ｎｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子であり、配列番号４０、若しくは配列番号４４、若しくは配列番号４８、若しくは配列番号５２、若しくは配列番号５６、若しくは配列番号６０、若しくは配列番号６４、若しくは配列番号６８、若しくは配列番号７２において提示されるアミノ酸配列、又はそれらの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含むポリペプチドをコードするか、或いは追加のＥＲＦ遺伝子が、Ｎｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子であり、配列番号３７、若しくは配列番号４１、若しくは配列番号４５、若しくは配列番号４９、若しくは配列番号５３、若しくは配列番号５７、若しくは配列番号６１、若しくは配列番号６５、若しくは配列番号６９において提示されるヌクレオチド配列、又はそれらの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含む、本発明の方法若しくは使用、本発明の植物若しくはその一部、又は本発明の植物繁殖材料を提供する。
【００４６】
１つの態様において、追加のＥＲＦ遺伝子が調節され、追加のＥＲＦ遺伝子が、Ｎｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子であり、配列番号６９において提示されるヌクレオチド配列、又はその機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含むか、或いは配列番号７２において提示されるアミノ酸配列、又はその機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含むポリペプチドをコードする、本発明の方法若しくは使用、本発明の植物若しくはその一部、又は本発明の植物繁殖材料を提供する。
【００４７】
１つの態様において、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子が、配列番号８において提示されるアミノ酸配列、又はその機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含むポリペプチドをコードするか、或いは少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子が、配列番号５において提示されるヌクレオチド配列、又はその機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含み、追加のＥＲＦ遺伝子が調節され、
追加のＥＲＦ遺伝子が、少なくとも１つのＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子、例えば、配列番号４０、若しくは配列番号４４、若しくは配列番号４８、若しくは配列番号５２、若しくは配列番号５６、若しくは配列番号６０、若しくは配列番号６４、若しくは配列番号６８、若しくは配列番号７２において提示されるアミノ酸配列、又はそれらの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含むポリペプチドをコードするＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子であり、或いは
追加のＥＲＦ遺伝子がＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子、例えば、配列番号３７、若しくは配列番号４１、若しくは配列番号４５、若しくは配列番号４９、若しくは配列番号５３、若しくは配列番号５７、若しくは配列番号６１、若しくは配列番号６５、若しくは配列番号６９において提示されるヌクレオチド配列、又はそれらの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含むＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子である、
本発明の方法若しくは使用、本発明の植物若しくはその一部、又は本発明の植物繁殖材料を提供する。
【００４８】
１つの態様において、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子が、配列番号８において提示されるアミノ酸配列、又はその機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含むポリペプチドをコードするか、或いは少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子が、配列番号５において提示されるヌクレオチド配列、又はその機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含み、追加のＥＲＦ遺伝子が調節され、追加のＥＲＦ遺伝子が、配列番号６９において提示されるヌクレオチド配列、又はその機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含むか、或いは配列番号７２において提示されるアミノ酸配列、又はその機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含むポリペプチドをコードする、Ｎｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子である、本発明の方法若しくは使用、本発明の植物若しくはその一部、又は本発明の植物繁殖材料を提供する。
【００４９】
別の態様において、植物を育種するための、本発明の植物若しくはその一部、又は本発明の方法によって生産される植物の使用を提供する。
【００５０】
別の態様において、製品（例えば、タバコ工業製品）の製造のための、本発明の植物若しくはその一部、又は本発明の方法によって生産される植物の使用を提供する。
【００５１】
別の態様において、作物を生育するための、本発明の植物若しくはその一部、又は本発明の方法によって生産される植物の使用を提供する。
【００５２】
１つの態様において、本発明は、本発明による植物若しくはその一部又はその抽出物、或いは本発明によるタバコ細胞培養物で作製された乾燥処理されたタバコ材料を提供する。
【００５３】
別の態様において、本発明による前記乾燥処理されたタバコ材料を含むタバコブレンドを提供する。
【００５４】
別の態様において、葉を生産するための、本発明の植物若しくはその一部、又は本発明の方法によって生産される植物の使用を提供する。
【００５５】
１つの態様において、本発明の植物の、又は本発明の繁殖材料から繁殖された植物から得ることができるか、或いは本発明の使用によって得られる植物から得ることができるか、或いは本発明の方法によって生産される植物から得ることができる、収穫された葉を提供する。
【００５６】
１つの態様において、植物の収穫された葉が、カットされ、収穫された葉である、本発明の植物の収穫された葉を提供する。
【００５７】
本発明は、別の態様において、
本発明の使用から得ることができる植物から得ることができるか、
本発明の植物を処理することによって得ることができるか、
本発明の植物繁殖材料から繁殖された植物から得ることができるか、又は
本発明の植物の収穫された葉を処理することによって得ることができるか、又は
本発明の方法によって生産される植物から得ることができる、
処理された葉、好ましくは、成長できない処理されたタバコ葉を提供する。
【００５８】
１つの態様において、葉が、乾燥処理、発酵、殺菌又はこれらの組み合わせによって処理されている、本発明の処理された葉を提供する。
【００５９】
１つの態様において、処理された葉が、カットされ、処理された葉である、本発明の処理された葉を提供する。
【００６０】
本発明は、別の態様において、
本発明のタバコ植物若しくはその一部、
本発明のタバコ植物繁殖材料から繁殖されたタバコ植物若しくはその一部、
本発明のタバコ植物の収穫された葉、
本発明の処理されたタバコ葉、又は
本発明の方法によって生産されるタバコ植物
から調製されるタバコ製品を提供する。
【００６１】
本発明は、別の態様において、
ｉ）本発明のタバコ植物若しくはその一部、又は本発明のタバコ細胞培養物、
ii）本発明のタバコ植物繁殖材料から繁殖されたタバコ植物若しくはその一部、
iii）本発明のタバコ植物の収穫された葉、
iv）本発明の処理されたタバコ葉
から調製されるタバコ工業製品を提供する。
【００６２】
１つの態様において、タバコ製品が可燃性喫煙物品である、本発明のタバコ製品を提供する。
【００６３】
別の態様において、タバコ製品が無煙タバコ製品である、本発明のタバコ工業製品を提供する。
【００６４】
１つの態様において、タバコ工業製品が、タバコ加熱デバイス又はエアゾール発生デバイス等の不燃性エアゾール提供システムである、本発明のタバコ工業製品を提供する。
【００６５】
１つの態様において、細胞培養物中のアルカロイド含有量を調節するための本発明の細胞（例えば、タバコ細胞）の使用を提供する。
【００６６】
１つの態様において、本発明による植物若しくはその一部又はその抽出物（例えば、タバコ抽出物）、或いは本発明によるタバコ細胞培養物、或いは本発明による乾燥処理されたタバコ材料、或いは本発明によるタバコブレンドを含む、喫煙物品、無煙タバコ製品又はタバコ加熱デバイスを提供する。
【００６７】
１つの態様において、本発明は、調節された（例えば、低減された）アルカロイド含有量、及び／又はタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）若しくはＴＳＮＡの前駆体の調節された（例えば、低減された）含有量を有する植物を選択するための、配列番号３、若しくは配列番号５、若しくは配列番号９、若しくは配列番号１３、若しくは配列番号１７、若しくは配列番号２１、若しくは配列番号２５、若しくは配列番号２９から選択される少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子のヌクレオチド配列、又はそれらの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログの使用を提供する。
【００６８】
適切には、この使用は、前記植物中の、配列番号３、若しくは配列番号５、若しくは配列番号９、若しくは配列番号１３、若しくは配列番号１７、若しくは配列番号２１、若しくは配列番号２５、若しくは配列番号２９から選択される少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子、又はそれらの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログにおける改変の存在を決定することを含んでいてもよく、前記改変が、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現を調節する（例えば、減少させる）。適切には、改変は、前記植物中のＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子のタンパク質発現又は機能が検出可能ではないように、Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の発現又は機能を低減又はノックアウトし得る。
【００６９】
１つの態様において、本発明は、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子のヌクレオチド配列における遺伝的変異を有する植物の変異体であって、Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子が、配列番号３、若しくは配列番号５、若しくは配列番号９、若しくは配列番号１３、若しくは配列番号１７、若しくは配列番号２１、若しくは配列番号２５、若しくは配列番号２９、又はそれらの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログから選択され、前記遺伝的変異が、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現を調節し（例えば、減少し）、変異体植物が、前記遺伝的変異を有しない同等の植物に対して、アルカロイド含有量が調節され（例えば、減少され）、及び／又はタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）若しくはＴＳＮＡの前駆体の含有量が調節されている、植物の変異体を提供する。
【００７０】
遺伝的変異は、技術的手段によってもたらされ、即ち、遺伝的変異は、操作され、天然に生じる変異ではない。任意の技術的手段を使用して、遺伝的変異が誘導され得る。適切には、遺伝的変異は、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ、ethyl methanesulfonate）処理等の化学的変異誘発、物理的照射、及びＴ−ＤＮＡを含む挿入剤によって、ＵＶ変異誘発又は遺伝子編集技術（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ等）によって、もたらされ得る。別の態様において、本発明は、本発明による遺伝的変異を有する変異体植物の子孫又は種子を提供する。
【００７１】
１つの態様において、本発明は、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子のヌクレオチド配列における改変を含む植物から生産した、収穫された葉、処理された葉又は乾燥処理されたタバコ材料であって、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子が、配列番号３、若しくは配列番号５、若しくは配列番号９、若しくは配列番号１３、若しくは配列番号１７、若しくは配列番号２１、若しくは配列番号２５、若しくは配列番号２９、又はそれらの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログから選択され、前記改変が、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現を調節し（例えば、減少し）、前記植物が、前記少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子における前記改変を有しない同等の植物に対して、アルカロイド含有量が調節され（例えば、減少され）、及び／又はタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）若しくはＴＳＮＡの前駆体の含有量が調節されている、収穫された葉、処理された葉又は乾燥処理されたタバコ材料を提供する。
【００７２】
本発明は、本明細書及び図面を参照して、本明細書に記載される、方法、葉、植物、植物繁殖材料、収穫された葉、処理されたタバコ、タバコ製品、使用、又はこれらの組み合わせをさらに提供する。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
本発明の実施形態を、ここに、添付の図面を参照して、例としてのみ記載する。
【図１】パネルＡは、親系統、及びＨＡ×ＬＩの交雑種に由来するＦ２についての総アルカロイドレベルを示す。パネルＢは、親系統、及びＨＡ×ＬＡの交雑種に由来するＦ２についてのニコチンレベルを示す。各親系統について３０個の個々の植物及び各個体群について２００個のＦ２を、アルカロイドレベルの化学的分析のために選択した。
【図２】図２は、Ｎ．タバカム（N.tabacum）の30k Infinium HDコンセンサスマップ２０１５を用いて、ＨＡ×ＬＩ及びＨＡ×ＬＡの交雑種由来の選択されたＦ２個体の遺伝子マップの比較を示す。破線は、Ｆ２マップ及びコンセンサスマップの間で特定されたマーカーを表し、鎖線は、２つのＦ２マップの間で特定されたマーカーを表す。太字フォントは、２以上のマップに共通のマーカーを表す。ＨＡ×ＬＡ又はＨＡ×ＬＩマップのいずれかにおいて特定されたマーカーのみをコンセンサスマップに示し、他のマーカーの位置を、黒の水平線として示す。
【図３】パネルＡ及びパネルＢは、ＳＮＰ４  ＣＡＰＳマーカーを有するＨＡ（ＡＡＢＢ）×ＬＩ（ａａＢＢ）の交雑種由来の選択されたＦ２個体のジェノタイピングを示す。パネルＡは、最低のアルカロイドレベルを有する２０個のＦ２を示す。パネルＢは、最高のアルカロイドレベルを有する２４個のＦ２を示す。パネルＣ及びパネルＤは、ＳＮＰ４  ＣＡＰＳマーカーを有するＨＡ（ＡＡＢＢ）×ＬＡ（ａａｂｂ）の交雑種由来の選択されたＦ２個体のジェノタイピングを示す。パネルＣは、最低のアルカロイドレベルを有する２４個のＦ２を示す。パネルＤは、最高のアルカロイドレベルを有する２０個のＦ２を示す。ＨＡ、ＨＩ並びにＬＩ及びＬＡを対照として使用した。有望な組換えを矢印で表す。
【図４】パネルＡは、ＬＡ、ＬＩ、ＨＩ及びＨＡについての総アルカロイドレベルの表現型値の比較を示す。３０個の植物についての平均値は、ＬＡ＝０．４％、ＬＩ＝１．６９％、ＨＩ＝２．８９％、ＨＡ＝３．０６％である。パネルＢは、ＬＡ、ＬＩ、ＨＩ及びＨＡについてのニコチン含有量の表現型値の比較を示す。３０個の植物についての平均値は、ＬＡ＝０．３９％、ＬＩ＝１．６１％、ＨＩ＝２．７６％、ＨＡ＝２．９２％である。
【図５】パネルＡは、親系統ＨＩ及びＬＡ、並びにＡＡ（Ｆ２−ＡＡ）及びａａ（Ｆ２−ａａ）としてジェノタイピングされたＦ２植物についての総アルカロイドレベルを示す。パネルＢは、親系統ＨＩ及びＬＡ、並びにＡＡ（Ｆ２−ＡＡ）及びａａ（Ｆ２−ａａ）としてジェノタイピングされたＦ２植物についてのニコチンレベルを示す。パネル中で矢印によって表された最低アルカロイド又はニコチンレベルを有するがＡＡとしてジェノタイピングされた植物を、Ｆ３種子を収集するために入手した。
【図６】パネルＡは、親系統ＨＩ及びＬＡ、並びに入手したＦ２植物に由来するＦ３についての総アルカロイド含有量を示す。パネルＢは、親系統ＨＩ及びＬＡ、並びに入手したＦ２植物に由来するＦ３についてのニコチンレベルを示す。表現型分離は、４０個のＦ３植物で観察されなかった。
【図７】図７は、Ｎｉｃ１についての遺伝子マップを示す。それぞれのマーカーを有する観察された組換えの数が与えられる。各マーカーについての遺伝学的な距離（ｃＭ）を染色体の左側に表す。ＳＮＰ４を有する共分離したＮｉｃ１遺伝子座は、ＳＮＰ２／ＳＮＰ３及びＳＮＰ５に隣接する。Ｎｉｃ１遺伝子座の周辺にある５００ｋｂよりも大きな欠失領域（ＩＮＤＥＬ１）が、Adams et al.によって報告された（米国特許出願公開２０１６／０３７４３８７Ａ１号、参照によって本明細書に組み込まれる）。その上流及び下流（１３及び１４）でＳＮＰと一緒に、ゲノム欠失は、Ｎｉｃ１遺伝子座の区切られた領域の外側にある。
【図８】図８は、Ｎｉｃ２遺伝子座についての遺伝子マップを示す。それぞれのマーカーを有する観察された組換えの数が与えられる。各マーカーについての遺伝学的な距離（ｃＭ）を染色体の左側に表した。Ｎｉｃ２遺伝子座は、ＳＮＰ１７及びＳＮＰ１８で共分離される。
【図９】図９は、Ｎｉｃ１  ＥＲＦによって形質転換された（ＬＡバックグラウンド）の毛状根のアルカロイド分析を示す。空ベクターで形質転換されたＨＩ及びＬＡの毛状根を対照として使用した。
【図１０】下記に記載の配列番号１を示す図である。
【図１１】下記に記載の配列番号２を示す図である。
【図１２】下記に記載の配列番号３を示す図である。
【図１３】下記に記載の配列番号４を示す図である。
【図１４】下記に記載の配列番号５を示す図である。
【図１５】下記に記載の配列番号６を示す図である。
【図１６】下記に記載の配列番号７を示す図である。
【図１７】下記に記載の配列番号８を示す図である。
【図１８】下記に記載の配列番号９を示す図である。
【図１９】下記に記載の配列番号１０を示す図である。
【図２０】下記に記載の配列番号１１を示す図である。
【図２１】下記に記載の配列番号１２を示す図である。
【図２２】下記に記載の配列番号１３を示す図である。
【図２３】下記に記載の配列番号１４を示す図である。
【図２４】下記に記載の配列番号１５を示す図である。
【図２５】下記に記載の配列番号１６を示す図である。
【図２６】下記に記載の配列番号１７を示す図である。
【図２７】下記に記載の配列番号１８を示す図である。
【図２８】下記に記載の配列番号１９を示す図である。
【図２９】下記に記載の配列番号２０を示す図である。
【図３０】下記に記載の配列番号２１を示す図である。
【図３１】下記に記載の配列番号２２を示す図である。
【図３２】下記に記載の配列番号２３を示す図である。
【図３３】下記に記載の配列番号２４を示す図である。
【図３４】下記に記載の配列番号２５を示す図である。
【図３５】下記に記載の配列番号２６を示す図である。
【図３６】下記に記載の配列番号２７を示す図である。
【図３７】下記に記載の配列番号２８を示す図である。
【図３８】下記に記載の配列番号２９を示す図である。
【図３９】下記に記載の配列番号３０を示す図である。
【図４０】下記に記載の配列番号３１を示す図である。
【図４１】下記に記載の配列番号３２を示す図である。
【図４２】下記に記載の配列番号３３を示す図である。
【図４３】下記に記載の配列番号３４を示す図である。
【図４４】下記に記載の配列番号３５を示す図である。
【図４５】下記に記載の配列番号３６を示す図である。
【図４６】下記に記載の配列番号３７を示す図である。
【図４７】下記に記載の配列番号３８を示す図である。
【図４８】下記に記載の配列番号３９を示す図である。
【図４９】下記に記載の配列番号４０を示す図である。
【図５０】下記に記載の配列番号４１を示す図である。
【図５１】下記に記載の配列番号４２を示す図である。
【図５２】下記に記載の配列番号４３を示す図である。
【図５３】下記に記載の配列番号４４を示す図である。
【図５４】下記に記載の配列番号４５を示す図である。
【図５５】下記に記載の配列番号４６を示す図である。
【図５６】下記に記載の配列番号４７を示す図である。
【図５７】下記に記載の配列番号４８を示す図である。
【図５８】下記に記載の配列番号４９を示す図である。
【図５９】下記に記載の配列番号５０を示す図である。
【図６０】下記に記載の配列番号５１を示す図である。
【図６１】下記に記載の配列番号５２を示す図である。
【図６２】下記に記載の配列番号５３を示す図である。
【図６３】下記に記載の配列番号５４を示す図である。
【図６４】下記に記載の配列番号５５を示す図である。
【図６５】下記に記載の配列番号５６を示す図である。
【図６６】下記に記載の配列番号５７を示す図である。
【図６７】下記に記載の配列番号５８を示す図である。
【図６８】下記に記載の配列番号５９を示す図である。
【図６９】下記に記載の配列番号６０を示す図である。
【図７０】下記に記載の配列番号６１を示す図である。
【図７１】下記に記載の配列番号６２を示す図である。
【図７２】下記に記載の配列番号６３を示す図である。
【図７３】下記に記載の配列番号６４を示す図である。
【図７４】下記に記載の配列番号６５を示す図である。
【図７５】下記に記載の配列番号６６を示す図である。
【図７６】下記に記載の配列番号６７を示す図である。
【図７７】下記に記載の配列番号６８を示す図である。
【図７８】下記に記載の配列番号６９を示す図である。
【図７９】下記に記載の配列番号７０を示す図である。
【図８０】下記に記載の配列番号７１を示す図である。
【図８１】下記に記載の配列番号７２を示す図である。
【図８２】図８２は、スキャフォールド及びマーカーの場所を示すＮｉｃ１ゲノム領域の部分的に完全な物理的マップを示す（スケールは描かない）。黒い細線は、Edwards, K. D., Fernandez-Pozo, N., Drake-Stowe, K., Humphry M., Evans, A. D., Bombarely, A., Allen, F., Hurst, R., White, B., Kernodle, S. P., Bromley, J. R., Sanchez-Tamburrino, J. P., Lewis, R.  S., and Mueller, L.A. (2017) A reference genome for Nicotiana tabacum enables map-based cloning of homeologous loci implicated in nitrogen utilization efficiency. BMC Genomics 18, 448（参照によって本明細書に組み込まれる）の偽染色体により、それらが下に配置された暗灰色のスキャフォールドを有するBioNanoハイブリッドスキャフォールドを表す。黒線の点線部は、非連続配列領域を表し、小さな隙間は、BioNanoスーパースキャフォールドの間の限界点を表す（詳細については、Edwards, K. D., Fernandez-Pozo, N., Drake-Stowe, K., Humphry M., Evans, A. D., Bombarely, A., Allen, F., Hurst, R., White, B., Kernodle, S. P., Bromley, J. R., Sanchez-Tamburrino, J. P., Lewis, R.  S., and Mueller, L.A. (2017) A reference genome for Nicotiana tabacum enables map-based cloning of homeologous loci implicated in nitrogen utilization efficiency. BMC Genomics 18, 448を参照されたい）。薄灰色は、Sierro, N., Battey, J. N., Ouadi, S., Bakaher, N., Bovet, L., Willig, A., Goepfert, S., Peitsch, M. C., and Ivanov, N. V. (2014). The tobacco genome sequence and its comparison with those of tomato and potato. Nature Communications 5, 3833（参照によって本明細書に組み込まれる）のゲノムに対する相互ＢＬＡＳＴ解析に基づいて推定されたスキャフォールドの場所を表す。淡いスキャフォールドは、１つの遺伝子マップにおける関連マーカーの位置に基づいて推定された場所を表す。おおよそのＳＮＰ／ＩＮＤＥＬマーカーの場所を下記のスキャフォールドに示した。点線の灰色のボックスは、Adams, A. C., De Godoy Lusso, M. S., Pramod, S., and Xu, D. (2016). Compositions and Methods for Producing Tobacco Plants and Products Having Altered Alkaloid Levels. US patent application 20160374387A1によって特定された配列領域を表す。
【図８３】図８３は、スキャフォールド及びマーカーの場所を示すＮｉｃ２ゲノム領域の部分的に完全な物理的マップを示す（スケールは描かない）。黒い細線は、Edwards, K. D., Fernandez-Pozo, N., Drake-Stowe, K., Humphry M., Evans, A. D., Bombarely, A., Allen, F., Hurst, R., White, B., Kernodle, S. P., Bromley, J. R., Sanchez-Tamburrino, J. P., Lewis, R.  S., and Mueller, L.A. (2017) A reference genome for Nicotiana tabacum enables map-based cloning of homeologous loci implicated in nitrogen utilization efficiency. BMC Genomics 18, 448の偽染色体により、それらが下に配置された暗灰色のスキャフォールドを有するBioNanoハイブリッドスキャフォールドを表す。黒線の小さな隙間は、BioNanoスーパースキャフォールドの間の限界点を表す（詳細については、Edwards, K. D., Fernandez-Pozo, N., Drake-Stowe, K., Humphry M., Evans, A. D., Bombarely, A., Allen, F., Hurst, R., White, B., Kernodle, S. P., Bromley, J. R., Sanchez-Tamburrino, J. P., Lewis, R.  S., and Mueller, L.A. (2017) A reference genome for Nicotiana tabacum enables map-based cloning of homeologous loci implicated in nitrogen utilization efficiency. BMC Genomics 18, 448を参照されたい）。薄灰色は、Sierro, N., Battey, J. N., Ouadi, S., Bakaher, N., Bovet, L., Willig, A., Goepfert, S., Peitsch, M. C., and Ivanov, N. V. (2014). The tobacco genome sequence and its comparison with those of tomato and potato. Nature Communications 5, 3833のゲノムに対する相互ＢＬＡＳＴ解析に基づいて推定されたスキャフォールドの場所を表す。淡いスキャフォールドは、１つの遺伝子マップにおける関連マーカーの位置に基づいて推定された場所を表す。おおよそのＳＮＰマーカーの場所を下記のスキャフォールドに示す。点線の灰色のボックスは、Adams, A. C., De Godoy Lusso, M. S., Pramod, S., and Xu, D. (2016). Compositions and Methods for Producing Tobacco Plants and Products Having Altered Alkaloid Levels. US patent application 20160374387A1によって特定された配列領域を表す。
【図８４】図８４は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００３０９０ｇ００３０．１（ＥＲＦ１９９）における変異の状態によってグループ分けされている、ＥＭＳ変異した植物の個体群の分離における総アルカロイドレベル（ニコチン、ノルニコチン、アナバシン及びアナタビン）を示す。変異体植物についてのアミノ酸変化を、遺伝子識別子の後の括弧内に示す。ｐ＜０．０１又はｐ＜０．０５（スチューデントのｔ検定）のそれぞれの野生型植物からの有意差を、それぞれ、２つ又は１つのアスタリスクによって表す。
【図８５】図８５は、ヘテロ接合性変異系統Ｌ１におけるＮｉｔａｂ４．５＿０００３０９０ｇ００３０．１（ＥＲＦ１９９）の遺伝子編集に関係するノックアウトの配列解析を示す。Ｌ１は、未成熟終止コドンをもたらす「Ａ」−挿入を有する変異対立遺伝子を含有していた。プライマーのペア（配列番号１１１及び配列番号１１２）で増幅されたＰＣＲ産物を、pGEM-T Easy Vectorにクローニングし、少なくとも１０個のコロニーを配列決定するために選択した。
【図８６】図８６は、遺伝子編集された変異体Ｌ１のＴ１植物を用いる、アナタビン、アナバシン、ノルニコチン及びニコチンのアルカロイド分析を示す。Ｎｉｔａｂ４．５＿０００３０９０ｇ００３０．１のノックアウトは、ＨＩ植物（Ａ）におけるアルカロイド含有量を顕著に減少させ、ホモ接合性変異体におけるアルカロイドレベルは、ＬＡ植物（Ｂ）におけるアルカロイド含有量のほぼ１／１０であった。ＷＴ−Ｔ１、Ｈｅｔ−Ｔ１及びＭｕｔ−Ｔ１を、それぞれ、野生型、ヘテロ接合性及びホモ接合性変異体の３つのＴ１植物の遺伝子型を表すために使用した。少なくとも１５個の個々の植物をそれぞれの遺伝子型について測定した。ＨＩ及びＬＡ植物を対照として使用した。
【図８７】図８７は、ＨＩ及びＬＡの間のＮｉｔａｂ４．５＿０００３０９０ｇ００３０．１（ＥＲＦ１９９）対立遺伝子についてのＲＴ−ＰＣＲ解析の相対的発現レベルを示す。Ｎｉｔａｂ４．５＿０００３０９０ｇ００３０．１発現は、根特異的であり、これは、ＬＡ植物においてダウンレギュレートされる。アクチンを内部対照として使用した。Ｎｉｔａｂ４．５＿０００３０９０ｇ００３０．１を増幅するために使用したプライマーペアは、5'AGTCCTAGCTCAAGTTTTAGCAGCTTCGA3'（配列番号７３）及び5'CGGACTCGGAGTACTTTTCATGGGAT3'（配列番号１７２）であり、アクチンについては、5'ACGCAAGTACAGTGTCTGGA3'（配列番号１７３）及び5'GCAGATGAGCTCCTCCCTTT3'（配列番号７４）であった。
【発明を実施するための形態】
【００７４】
配列表
主題明細書の全体にわたって使用される配列識別子及び対応する配列表の要約を以下に提供する。
配列番号１は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００３０９０ｇ００２０．１として公知の遺伝子、又はそうでなければＥＲＦ１７Ｌ３ΔＮとして公知の遺伝子をコードするヌクレオチド配列に相当する。
配列番号２は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００３０９０ｇ００２０．１（ＥＲＦ１７Ｌ３ΔＮ）のｃＤＮＡ配列に相当する。
配列番号３は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００３０９０ｇ００２０．１（ＥＲＦ１７Ｌ３ΔＮ）のｃｄｓに相当する。
配列番号４は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００３０９０ｇ００２０．１（ＥＲＦ１７Ｌ３ΔＮ）ポリペプチドのアミノ酸配列に相当する。
配列番号５は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００３０９０ｇ００３０．１として公知の遺伝子、又はそうでなければＥＲＦ１９９として公知の遺伝子をコードするヌクレオチド配列に相当する。
配列番号６は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００３０９０ｇ００３０．１（ＥＲＦ１９９）のｃＤＮＡ配列に相当する。
配列番号７は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００３０９０ｇ００３０．１（ＥＲＦ１９９）のｃｄｓに相当する。
配列番号８は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００３０９０ｇ００３０．１（ＥＲＦ１９９）ポリペプチドのアミノ酸配列に相当する。
配列番号９は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００３６６５ｇ００４０．１として公知の遺伝子、又はそうでなければＪＲＥ５Ｌ２として公知の遺伝子をコードするヌクレオチド配列に相当する。
配列番号１０は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００３６６５ｇ００４０．１（ＪＲＥ５Ｌ２）のｃＤＮＡ配列に相当する。
配列番号１１は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００３６６５ｇ００４０．１（ＪＲＥ５Ｌ２）のｃｄｓに相当する。
配列番号１２は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００３６６５ｇ００４０．１（ＪＲＥ５Ｌ２）ポリペプチドのアミノ酸配列に相当する。
配列番号１３は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００４６２０ｇ００１０．１として公知の遺伝子、又はそうでなければＥＲＦ２１０として公知の遺伝子をコードするヌクレオチド配列に相当する。
配列番号１４は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００４６２０ｇ００１０．１（ＥＲＦ２１０）のｃＤＮＡ配列に相当する。
配列番号１５は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００４６２０ｇ００１０．１（ＥＲＦ２１０）のｃｄｓに相当する。
配列番号１６は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００４６２０ｇ００１０．１（ＥＲＦ２１０）ポリペプチドのアミノ酸配列に相当する。
配列番号１７は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００４６２０ｇ００３０．１として公知の遺伝子、又はそうでなければＥＲＦ９１として公知の遺伝子をコードするヌクレオチド配列に相当する。
配列番号１８は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００４６２０ｇ００３０．１（ＥＲＦ９１）のｃＤＮＡ配列に相当する。
配列番号１９は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００４６２０ｇ００３０．１（ＥＲＦ９１）のｃｄｓに相当する。
ａｂ４．５＿０００４６２０ｇ００３０．１（ＥＲＦ９１）ポリペプチドのアミノ酸配列に相当する。
配列番号２１は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００４６２０ｇ００８０．１として公知の遺伝子、又はそうでなければＥＲＦ２９として公知の遺伝子をコードするヌクレオチド配列に相当する。
配列番号２２は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００４６２０ｇ００８０．１（ＥＲＦ２９）のｃＤＮＡ配列に相当する。
配列番号２３は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００４６２０ｇ００８０．１（ＥＲＦ２９）のｃｄｓに相当する。
配列番号２４は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００４６２０ｇ００８０．１（ＥＲＦ２９）ポリペプチドのアミノ酸配列に相当する。
配列番号２５は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００４６２０ｇ００９０．３として公知の遺伝子、そうでなければＥＲＦ１３０として公知の遺伝子をコードするヌクレオチド配列に相当する。
配列番号２６は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００４６２０ｇ００９０．３（ＥＲＦ１３０）のｃＤＮＡ配列に相当する。
配列番号２７は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００４６２０ｇ００９０．３（ＥＲＦ１３０）のｃｄｓに相当する。
配列番号２８は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００４６２０ｇ００９０．３（ＥＲＦ１３０）ポリペプチドのアミノ酸配列に相当する。
配列番号２９は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００４６２０ｇ００９５．１として公知の遺伝子、そうでなければＥＲＦ１６として公知の遺伝子をコードするヌクレオチド配列に相当する。
配列番号３０は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００４６２０ｇ００９５．１（ＥＲＦ１６）のｃＤＮＡ配列に相当する。
配列番号３１は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００４６２０ｇ００９５．１（ＥＲＦ１６）のｃｄｓに相当する。
配列番号３２は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００４６２０ｇ００９５．１（ＥＲＦ１６）ポリペプチドのアミノ酸配列に相当する。
配列番号３３は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００６３８２ｇ００４０．１として公知の遺伝子、そうでなければＥＲＦ１１０として公知の遺伝子をコードするヌクレオチド配列に相当する。
配列番号３４は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００６３８２ｇ００４０．１（ＥＲＦ１１０）のｃＤＮＡ配列に相当する。
配列番号３５は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００６３８２ｇ００４０．１（ＥＲＦ１１０）のｃｄｓに相当する。
配列番号３６は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００６３８２ｇ００４０．１（ＥＲＦ１１０）ポリペプチドのアミノ酸配列に相当する。
配列番号３７は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００２９２４ｇ００１０．１として公知の遺伝子、そうでなければＥＲＦ１７ＬＩとして公知の遺伝子をコードするヌクレオチド配列に相当する。
配列番号３８は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００２９２４ｇ００１０．１（ＥＲＦ１７ＬＩ）のｃＤＮＡ配列に相当する。
配列番号３９は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００２９２４ｇ００１０．１（ＥＲＦ１７ＬＩ）のｃｄｓに相当する。
配列番号４０は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００２９２４ｇ００１０．１（ＥＲＦ１７ＬＩ）ポリペプチドのアミノ酸配列に相当する。
配列番号４１は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００２９２４ｇ００２０．２として公知の遺伝子、そうでなければＥＲＦ１７９として公知の遺伝子をコードするヌクレオチド配列に相当する。
配列番号４２は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００２９２４ｇ００２０．２（ＥＲＦ１７９）のｃＤＮＡ配列に相当する。
配列番号４３は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００２９２４ｇ００２０．２（ＥＲＦ１７９）のｃｄｓに相当する。
配列番号４４は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００２９２４ｇ００２０．２（ＥＲＦ１７９）ポリペプチドのアミノ酸配列に相当する。
配列番号４５は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００２９２４ｇ００４０．２として公知の遺伝子、そうでなければＥＲＦ１７として公知の遺伝子をコードするヌクレオチド配列に相当する。
配列番号４６は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００２９２４ｇ００４０．２（ＥＲＦ１７）のｃＤＮＡ配列に相当する。
配列番号４７は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００２９２４ｇ００４０．２（ＥＲＦ１７）のｃｄｓに相当する。
配列番号４８は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００２９２４ｇ００４０．２（ＥＲＦ１７）ポリペプチドのアミノ酸配列に相当する。
配列番号４９は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００２９２４ｇ００４５．１として公知の遺伝子、そうでなければＥＲＦ１６８として公知の遺伝子をコードするヌクレオチド配列に相当する。
配列番号５０は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００２９２４ｇ００４５．１（ＥＲＦ１６８）のｃＤＮＡ配列に相当する。
配列番号５１は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００２９２４ｇ００４５．１（ＥＲＦ１６８）のｃｄｓに相当する。
配列番号５２は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００２９２４ｇ００４５．１（ＥＲＦ１６８）ポリペプチドのアミノ酸配列に相当する。
配列番号５３は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００２９２４ｇ００５０．２として公知の遺伝子、そうでなければＥＲＦ１１５として公知の遺伝子をコードするヌクレオチド配列に相当する。
配列番号５４は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００２９２４ｇ００５０．２（ＥＲＦ１１５）のｃＤＮＡ配列に相当する。
配列番号５５は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００２９２４ｇ００５０．２（ＥＲＦ１１５）のｃｄｓに相当する。
配列番号５６は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００２９２４ｇ００５０．２（ＥＲＦ１１５）ポリペプチドのアミノ酸配列に相当する。
配列番号５７は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００６４９９ｇ００１０．１として公知の遺伝子、そうでなければＥＲＦ１０４として公知の遺伝子をコードするヌクレオチド配列に相当する。
配列番号５８は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００６４９９ｇ００１０．１（ＥＲＦ１０４）のｃＤＮＡ配列に相当する。
配列番号５９は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００６４９９ｇ００１０．１（ＥＲＦ１０４）のｃｄｓに相当する。
配列番号６０は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００６４９９ｇ００１０．１（ＥＲＦ１０４）ポリペプチドのアミノ酸配列に相当する。
配列番号６１は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００６４９９ｇ００２０．２として公知の遺伝子、そうでなければＥＲＦ２２１として公知の遺伝子をコードするヌクレオチド配列に相当する。
配列番号６２は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００６４９９ｇ００２０．２（ＥＲＦ２２１）のｃＤＮＡ配列に相当する。
配列番号６３は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００６４９９ｇ００２０．２（ＥＲＦ２２１）のｃｄｓに相当する。
配列番号６４は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００６４９９ｇ００２０．２（ＥＲＦ２２１）ポリペプチドのアミノ酸配列に相当する。
配列番号６５は、Ｎｉｔａｂ４．５＿００１２６６７ｇ００２０．２（ＥＲＦ９１Ｌ１）として公知の遺伝子をコードするヌクレオチド配列に相当する。
配列番号６６は、Ｎｉｔａｂ４．５＿００１２６６７ｇ００２０．２（ＥＲＦ９１Ｌ１）のｃＤＮＡ配列に相当する。
配列番号６７は、Ｎｉｔａｂ４．５＿００１２６６７ｇ００２０．２（ＥＲＦ９１Ｌ１）のｃｄｓに相当する。
配列番号６８は、Ｎｉｔａｂ４．５＿００１２６６７ｇ００２０．２（ＥＲＦ９１Ｌ１）ポリペプチドのアミノ酸配列に相当する。
配列番号６９は、Ｎｉｔａｂ４．５＿００１５０５５ｇ００１０．２として公知の遺伝子、そうでなければＥＲＦ１８９として公知の遺伝子をコードするヌクレオチド配列に相当する。
配列番号７０は、Ｎｉｔａｂ４．５＿００１５０５５ｇ００１０．２（ＥＲＦ１８９）のｃＤＮＡ配列に相当する。
配列番号７１は、Ｎｉｔａｂ４．５＿００１５０５５ｇ００１０．２（ＥＲＦ１８９）のｃｄｓに相当する。
配列番号７２は、Ｎｉｔａｂ４．５＿００１５０５５ｇ００１０．２（ＥＲＦ１８９）ポリペプチドのアミノ酸配列に相当する。
本明細書に開示されたいくつかの配列は、ヌクレオチド配列中に「Ｎ」を含有する。「Ｎ」は、任意のヌクレオチド、或いは１若しくは２以上のヌクレオチドの欠失又は挿入であり得る。例えば、いくつかの場合において、「Ｎ」の文字列が示される。「Ｎ」の数は、必ずしも、その位置でのヌクレオチドの実際の数と相関するわけではない。これらは、配列中で「Ｎ」と示されたものよりも多いか、又は少ないヌクレオチドであってもよい。
【００７５】
詳細な説明
最初に、本発明者らは、植物（例えば、タバコ植物）中の少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現を調節することによって、植物のアルカロイド及び／又はＴＳＮＡの含有量を調節することができることを示した。
【００７６】
少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子は、配列番号８、若しくは配列番号１２、若しくは配列番号１６、若しくは配列番号２０、若しくは配列番号２４、若しくは配列番号２８、若しくは配列番号３２において提示されるアミノ酸配列、又はそれらの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含むポリペプチドをコードする遺伝子を含む群から選択されるか、或いはＥＲＦ遺伝子は、配列番号５、若しくは配列番号９、若しくは配列番号１３、若しくは配列番号１７、若しくは配列番号２１、若しくは配列番号２５、若しくは配列番号２９において提示されるヌクレオチド配列、又はそれらの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含む。
【００７７】
適切には、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子は、配列番号８、若しくは配列番号１２、若しくは配列番号１６、若しくは配列番号２０、若しくは配列番号２４、若しくは配列番号２８、若しくは配列番号３２において提示されるアミノ酸配列、又はそれらの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含むポリペプチドをコードする遺伝子を含む群から選択される、１つ、又は２つ、又は３つ、又は４つ、又は５つ、又は６つ、又は７つの遺伝子であり得るか、或いはＥＲＦ遺伝子は、配列番号５、若しくは配列番号９、若しくは配列番号１３、若しくは配列番号１７、若しくは配列番号２１、若しくは配列番号２５、若しくは配列番号２９において提示されるヌクレオチド配列、又はそれらの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含む。
【００７８】
１つの態様において、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子は、配列番号８において提示されるアミノ酸配列、又はその機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含むポリペプチドをコードするか、或いはＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子は、配列番号５において提示されるヌクレオチド配列、又はその機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含む。
【００７９】
１つの態様において、少なくとも１つの追加のＮｉｃ１  ＥＲＦの活性又は発現が調節されている。適切には、表１から選択される少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、又は少なくとも８つの追加のＮｉｃ１  ＥＲＦも調節され得る。
【００８０】
１つの態様において、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子は、配列番号８において提示されるアミノ酸配列、又はその機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含むポリペプチドをコードするか、或いは配列番号５において提示されるヌクレオチド配列、又はその機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含む少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子が調節され、少なくとも１つの追加のＮｉｃ１  ＥＲＦの活性又は発現は、調節されている。適切には、少なくとも１つの追加のＮｉｃ１  ＥＲＦは、配列番号４、若しくは配列番号１２、若しくは配列番号１６、若しくは配列番号２０、若しくは配列番号２４、若しくは配列番号２８、若しくは配列番号３２、若しくは配列番号３６において提示されるアミノ酸配列、又はそれらの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含むポリペプチドをコードするＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子から選択され得るか、或いはＥＲＦ遺伝子は、配列番号１、若しくは配列番号３、若しくは配列番号９、若しくは配列番号１３、若しくは配列番号１７、若しくは配列番号２１、若しくは配列番号２５、若しくは配列番号２９、若しくは配列番号３３において提示されるヌクレオチド配列、又はそれらの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含む。適切には、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、又は少なくとも８つの追加のＮｉｃ１  ＥＲＦが調節され得る。
【００８１】
１つの実施形態において、本発明は、植物（例えば、タバコ植物）又はその一部のアルカロイド含有量を調節する方法、少なくとも１つのＥＲＦ遺伝子の活性又は発現を調節することによって前記植物を改変することを含む方法を提供する。
【００８２】
「調節すること」という用語は、本明細書において、増加させること又は減少させることのいずれかを意味するために使用される。
【００８３】
「アルカロイド含有量を増加させること」という用語は、本明細書において、本発明の生産物（例えば、植物、その一部（例えば、葉））、処理された葉若しくは植物から作製された製品（例えば、タバコ製品）中の濃度及び／又は総アルカロイド含有量が、本発明に従って改変されていない同等品と比較して、より高いことを意味するために使用される。
【００８４】
「アルカロイド含有量を減少させること」という用語は、本明細書において、本発明の生産物（例えば、植物、その一部（例えば、葉））、処理された葉若しくは植物から作製された製品（例えば、タバコ製品）中の濃度及び／又は総アルカロイド含有量が、本発明に従って改変されていない同等品と比較して、より低いことを意味するために使用される。
【００８５】
１つの実施形態において、本発明は、植物（例えば、タバコ植物）又はその一部中のタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）又はＴＳＮＡの前駆体の含有量を調節する（即ち、増加させる、又は低減する）方法、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現を調節することによって前記植物を改変することを含む方法を提供する。
【００８６】
１つの実施形態において、ＴＳＮＡは、Ｎ’−ニトロソノルニコチン（ＮＮＮ）であるか、及び／又は前駆体は、ノルニコチンである。
【００８７】
１つの実施形態において、ＴＳＮＡは、Ｎ’−ニトロソノルニコチン（ＮＮＮ）、Ｎ’−ニトロソアナタビン（ＮＡＴ）、Ｎ’−ニトロソアナバシン（ＮＡＢ）及び４−（メチルニトロソアミノ）−１−（３−ピリジル）−１−ブタノン（ＮＮＫ）から選択される群の１又は２以上であり得る。
【００８８】
好ましい実施形態において、ＴＳＮＡは、Ｎ’−ニトロソノルニコチン（ＮＮＮ）である。
【００８９】
ＴＳＮＡは、処理されたタバコ、例えば、乾燥処理されたタバコ又は再構成されたタバコ中で測定され得る。１つの実施形態において、ＴＳＮＡ含有量は、乾燥処理されたタバコ植物若しくはその一部（例えば、乾燥処理されたタバコ葉）において測定及び／又は改変（例えば、低減）される。
【００９０】
本明細書において使用される「タバコ特異的ニトロソアミン」又は「ＴＳＮＡ」という用語は、当技術分野におけるその通常の意味、すなわち、タバコ製品又は他のニコチン含有製品においてのみ見出されるニトロソアミンという意味を有する。適切には、少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミンは、４−（メチルニトロソアミノ）−１−（３−ピリジル）−１−ブタノン（ＮＮＫ）、Ｎ’−ニトロソノルニコチン（ＮＮＮ）、Ｎ’−ニトロソアナタビン（ＮＡＴ）又はＮ−ニトロソアナバシン（ＮＡＢ）であり得る。
【００９１】
より適切には、少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミンはＮＮＫ又はＮＮＮであり得る。１つの実施形態において、タバコ特異的ニトロソアミンはＮＮＮである。
【００９２】
少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミンに関連して使用される場合、「それらへの前駆体」という用語は、タバコ特異的ニトロソアミンの形成をもたらすか、又はタバコ特異的ニトロソアミンの生成をもたらすニトロソ化反応に関与する、タバコ植物の１若しくは２以上の化学物質又は化合物を指す。適切には、「それらへの前駆体」という用語は、ナイトレート、ナイトライト又は一酸化窒素を指し得る。
【００９３】
１つの実施形態において、ＴＳＮＡの前駆体は、ノルニコチン、アナバシン、アナタビン、及びプソイドオキシニコチン（ＰＯＮ、pseudooxynicotine）等のニコチンの酸化誘導体から選択される群の１又は２以上である。
【００９４】
好ましい実施形態において、ＴＳＮＡの前駆体はノルニコチンである。
【００９５】
１つの実施形態において、ＴＳＮＡの前駆体はＰＯＮであり得る。ＴＳＮＡの前駆体（例えば、ＮＮＮ、ＮＮＫ、ＮＡＢ及び／又はＮＡＴ）は、例えば、処理する前に、例えば、乾燥処理する前に、緑色のタバコ葉において測定され得る。１つの実施形態において、ＴＳＮＡの前駆体（例えば、ＮＮＮ、ＮＮＫ、ＮＡＢ及び／又はＮＡＴ）は、例えば、処理する前に、例えば、乾燥処理する前に、緑色のタバコ葉において測定及び／又は改変（例えば、低減）される。
【００９６】
１つの実施形態において、本発明の方法及び／又は使用を行うことで、本発明に従って改変されていないタバコ植物（又はその一部）と比較した場合に、改変されたタバコ植物（又はその一部）中の少なくとも１つのＴＳＮＡ又はそれらへの前駆体の低減をもたらす。
【００９７】
「少なくとも１つのＴＳＮＡ若しくはそれらへの前駆体を低減すること」又は「少なくとも１つのＴＳＮＡ若しくはそれらへの前駆体の低減」という用語は、本明細書において、本発明の製品、方法又は使用における少なくとも１つのＴＳＮＡ若しくはそれらへの前駆体の濃度及び／又は含有量が、同等の生産物、方法又は使用に関連して、より低いことを意味するために使用される。例えば、同等のタバコ工業製品は、本発明に従って改変されていないが、すべての他の関連する特徴が同じである（例えば、植物種、生育条件、タバコを処理する方法等）タバコ植物に由来する。
【００９８】
少なくとも１つのＴＳＮＡ若しくはそれらへの前駆体の濃度及び／又はレベルを決定するための当技術分野において公知の任意の方法が使用され得る。特に、このような方法は、重水素標識内部標準の添加、水性抽出及び濾過を含み得、続いてタンデム質量分析を備えた逆相高速液体クロマトグラフィー（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を使用した分析を使用し得る。タバコ特異的ニトロソアミンへの前駆体の濃度及び／又はレベルを決定するための他の例としては、すべて、参照によって本明細書に組み込まれる、CORESTA recommended method CRM-72: Determination of Tobacco Specific Nitrosamines in Tobacco and Tobacco Products by LC-MS/MS；CRM being developed into ISO/DIS 21766 or Wagner et al. Analytical Chemistry (2005), 77(4), 1001-1006において詳述されている方法等の方法が挙げられる。
【００９９】
適切には、少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン若しくはそれらへの前駆体の濃度及び／又は総含有量は、本発明の方法及び／又は使用を行うことによって低減され得る。適切には、少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン若しくはそれらへの前駆体の濃度及び／又はレベルは、本発明に従って改変されていないタバコ植物中の少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン若しくはそれらへの前駆体の濃度及び／又はレベルと比較した場合に、本発明のタバコ植物（例えば、本発明の方法及び／又は使用によって得ることができるか、若しくは得られる）中で低減され得る。
【０１００】
少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン若しくはそれらへの前駆体の濃度及び／又は総含有量は、本発明に従って改変されていないタバコ植物（又はタバコ植物の一部、又はタバコ細胞培養物）から得ることができるか、若しくは得られる、タバコ葉、収穫された葉、処理されたタバコ葉、タバコ工業製品又はこれらの組み合わせと比較した場合に、本発明のタバコ植物（又はタバコ植物の一部、又はタバコ細胞培養物）から得ることができるか、若しくは得られる、タバコ葉、収穫された葉、処理されたタバコ葉、タバコ工業製品又はこれらの組み合わせ中で低減され得る。
【０１０１】
適切には、少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン若しくはそれらへの前駆体の濃度及び／又は総含有量は、処理されたタバコ葉中で低減され得る。
【０１０２】
適切には、少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン若しくはそれらへの前駆体の濃度及び／又はレベルは、タバコ工業製品中で低減され得る。
【０１０３】
１つの実施形態において、少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン若しくはそれらへの前駆体は、少なくとも約１％、少なくとも約３％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％まで低減され得る。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン若しくはそれらへの前駆体は、約５％〜約９５％の間まで、約１０％〜約９０％の間まで、２０％〜約８０％の間まで、３０％〜約７０％の間まで、又は約４０％〜６０％の間まで低減され得る。
【０１０４】
処理された（例えば、乾燥処理された）タバコ葉（例えば、乾燥処理された、又は再構成された）との関係において、少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン若しくはそれらへの前駆体は、約５０００ｎｇ／ｇ〜約５０ｎｇ／ｇの間まで、約４０００ｎｇ／ｇ〜約１００ｎｇ／ｇの間まで、約３０００ｎｇ／ｇ〜５００ｎｇ／ｇの間まで、又は２０００ｎｇ／ｇ〜１０００ｎｇ／ｇの間まで低減され得る。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン若しくはそれらへの前駆体は、少なくとも約５０００ｎｇ／ｇ、少なくとも約４０００ｎｇ／ｇ、少なくとも約３０００ｎｇ／ｇ、少なくとも約２０００ｎｇ／ｇ、少なくとも約１０００ｎｇ／ｇ、少なくとも約５００ｎｇ／ｇ、少なくとも約１００ｎｇ／ｇ、又は少なくとも約５０ｎｇ／ｇまで低減され得る。
【０１０５】
本明細書において定義される「同等の生産物」という用語は、本発明に従って改変されていないが、すべての他の関連する特徴が同じである（例えば、植物種、生育条件、植物（例えば、タバコ等）を処理する方法等）植物（例えば、タバコ植物）に由来する生産物である。本発明による同等の生産物は、植物（例えば、タバコ植物）若しくはその一部、例えば、葉（例えば、タバコ葉）、収穫された葉（例えば、収穫されたタバコ葉）、カットされ、収穫された葉（例えば、カットされ、収穫されたタバコ葉）、処理された葉（例えば、処理されたタバコ葉）若しくは植物繁殖材料（例えば、タバコ植物繁殖材料）、又は前記植物若しくはそれらの一部を含む生産物、例えば、Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子（又は、１若しくは２以上のＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子と１若しくは２以上のＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子との組み合わせ）の活性又は発現を調節するために、例えば、本発明に従って改変されていない植物から得ることができるか、若しくは得られる、タバコ製品又はそれらの組み合わせを意味し得る。同等の生産物は、対照として、又は野生型として公知でもあり得る。１つの実施形態において、同等の生産物は、その活性又は発現が調節されているＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子を含まない生産物である。１つの実施形態において、同等の生産物は、その活性若しくは発現が調節されているＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子、又はその活性若しくは発現が調節されているＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子のいずれも含まない生産物である。
【０１０６】
本明細書において定義される「未改変植物」という用語は、Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現を調節するために本発明に従って改変されておらず、すべての他の関連する特徴が同じである（例えば、植物種、生育条件、タバコを処理する方法等）植物（例えば、タバコ植物）である。１つの実施形態において、未改変植物は、その活性又は発現が調節されているＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子を含まない生産物である。１つの実施形態において、同等の生産物は、その活性若しくは発現が調節されているＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子、又はその活性若しくは発現が調節されているＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子のいずれも含まない生産物である。
【０１０７】
本発明による適切な植物としては、例えば、タバコ、トマト、チョウセンアサガオ、ナス、マンドレイク、致死性イヌホオズキ（ベラドンナ）、トウガラシ属（capsicum）（パプリカ、トウガラシ）及びジャガイモを含む、ナス科由来の植物が挙げられる。１つの実施形態において、ナス科の適切な属は、ナス属、例えば、トマト（Solanum lycopersicum）又はジャガイモ（Solanum tuberosum）である。１つの実施形態において、ナス科の適切な属は、タバコ属である。適切には、タバコ属は、ニコチアナ・タバカム種であり得る。適切なタバコ属の種は、本明細書において、タバコ植物、又は単にタバコと称し得る。
【０１０８】
Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子（又はＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子）の「活性又は発現」とは、Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子（又は、それぞれＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子）によってコードされるタンパク質の、転写のレベル、翻訳、即ち、タンパク質の発現、又は活性を指し得る。Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子（又はＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子）の活性は、アルカロイドの生合成における転写因子として機能するその能力に関する。Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子（又はＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子）の活性は、アルカロイド合成の産物を測定することによって、即ち、アルカロイド含有量を測定することによって決定され得る。
【０１０９】
本発明の１つの態様によれば、遺伝子発現は、転写及び／又は翻訳を阻害することによって、減少（又は阻害）され得る。１つの実施形態において、遺伝子の活性又は発現は、転写のレベル、即ち、生成したｍＲＮＡの量、又は翻訳、即ち、生成したタンパク質のレベル若しくは量を指し得る。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、アルカロイド含有量の調節は、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現が増加している、アルカロイド含有量の増加を指す。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、アルカロイド含有量の調節は、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現が減少している（又は阻害されている）、アルカロイド含有量の減少を指す。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、アルカロイド含有量の調節は、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現及び少なくとも１つのＮｉｃ２  ＥＲＦの活性又は発現が組み合わせにおいて増加している、アルカロイド含有量の増加を指す。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、アルカロイド含有量の調節は、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現及び少なくとも１つのＮｉｃ２  ＥＲＦの活性又は発現が組み合わせにおいて減少（又は阻害）する、アルカロイド含有量の減少を指す。
【０１１４】
さらなる態様において、アルカロイド含有量は、葉から測定される。１つの態様において、アルカロイド含有量は、緑色の葉から測定される。さらなる態様において、アルカロイド含有量は、乾燥処理された葉、例えば、空気乾燥処理された葉、熱風乾燥処理された葉、火力乾燥処理された葉又は天日乾燥処理された葉から測定される。さらなる態様において、アルカロイド含有量は、熱風乾燥処理された葉から測定される。さらなる態様において、アルカロイド含有量は、空気乾燥処理された葉から測定される。
【０１１５】
「アルカロイド含有量」という用語は、本明細書において、アルカロイドとして分類される化合物の群全体の濃度及び／又は総量を意味するために使用される。タバコ中に典型的に存在するアルカロイドとしては、ニコチン、アナタビン、アナバシン、ミオスミン及びノルニコチンが挙げられる。１つの実施形態において、ニコチン、アナタビン、アナバシン、ミオスミン及びノルニコチンから選択される１又は２以上のアルカロイドの含有量が調節されている。１つの実施形態において、ニコチン、アナタビン、アナバシン、ミオスミン及びノルニコチンから選択される１又は２以上のアルカロイドの含有量が低減されている。１つの実施形態において、ニコチン、アナタビン、アナバシン、及びノルニコチンから選択される１又は２以上のアルカロイドの含有量が増加している。適切には、ニコチン含有量が調節されている。１つの実施形態において、ニコチン含有量が低減されている。
【０１１６】
アルカロイドの濃度及び／又は総含有量を決定するための当技術分野において公知に任意の方法が使用され得る。アルカロイド含有量を分析するための１つの好ましい方法は、ガスクロマトグラフィー−水素炎イオン化検出方法（ＧＣ−ＦＩＤ）による分析を含む。
【０１１７】
１つの実施形態において、アルカロイド含有量が調節された本発明の植物によって得ることができるか、若しくは得られる、植物（例えば、タバコ植物）若しくはその一部、植物繁殖材料（例えば、タバコ植物繁殖材料）、細胞（例えば、タバコ細胞）、葉（例えば、タバコ葉）、収穫された葉（例えば、収穫されたタバコ葉）、カットされ、収穫された葉（例えば、カットされ、収穫されたタバコ葉）、処理された葉（例えば、処理されたタバコ葉）、カット及び処理された葉（例えば、カット及び処理されたタバコ葉）、前記植物若しくはその一部を含む製品（例えば、タバコ製品）、又はこれらの組み合わせを生産するための方法であって、Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現を調節するために前記タバコを改変することを含む方法を提供する。調節されたアルカロイド含有量は、植物（例えば、タバコ植物）若しくはその一部、植物繁殖材料（例えば、タバコ植物繁殖材料）、細胞（例えば、タバコ細胞）、葉（例えば、タバコ葉）、収穫された葉（例えば、収穫されたタバコ葉）、カットされ、収穫された葉（例えば、カットされ、収穫されたタバコ葉）、処理された葉（例えば、処理されたタバコ葉）、カット及び処理された葉（例えば、カット及び処理されたタバコ葉）、本発明の植物若しくはその一部を含む製品、例えば、タバコ製品、又は同等の生産物とのこれらの組み合わせ中のアルカロイド含有量を比較することによって決定され得る。
【０１１８】
適切には、アルカロイド含有量は、植物、例えば、タバコ植物、例えば、改変されたタバコ植物中で調節され得る。適切には、アルカロイド含有量は、葉（例えば、タバコ葉、例えば、改変されたタバコ植物由来のタバコ葉）中で調節され得る。適切には、アルカロイド含有量は、収穫された葉（例えば、改変されたタバコ植物由来の収穫されたタバコ葉）中で調節され得る。適切には、アルカロイド含有量は、カットされ、収穫された葉（例えば、改変されたタバコ植物由来の、カットされ、収穫されたタバコ葉）中で調節され得る。適切には、アルカロイド含有量は、処理された葉（例えば、処理されたタバコ葉、例えば、改変されたタバコ植物由来の処理されたタバコ葉）中で調節され得る。適切には、アルカロイド含有量は、カット及び処理された葉（例えば、カット及び処理されたタバコ葉、例えば、改変されたタバコ植物由来のカット及び処理されたタバコ葉）中で調節され得る。適切には、アルカロイド含有量は、乾燥処理された葉（例えば、改変されたタバコ植物由来の乾燥処理されたタバコ葉）中で調節され得る。適切には、アルカロイド含有量は、緑色の葉の抽出物（例えば、改変されたタバコ植物由来の緑色のタバコ葉）中で調節され得る。適切には、アルカロイド含有量は、本発明の植物又はその一部を含む製品（例えば、タバコ製品、例えば、改変されたタバコ植物又はその一部から製造されたタバコ製品）中で調節され得る。適切には、アルカロイド含有量は、上記生産物又はその組み合わせのいずれか１つ中で調節され得る。適切には、上記に記載のアルカロイド含有量の調節は、アルカロイド含有量の増加であり得る。適切には、上記に記載のアルカロイド含有量の調節は、アルカロイド含有量の減少であり得る。
【０１１９】
１つの実施形態において、ニコチン、アナタビン、アナバシン、ミオスミン及びノルニコチンから選択される１又は２以上のアルカロイドの含有量が減少している。
【０１２０】
適切には、上記に記載のアルカロイド含有量の調節は、ニコチン含有量の減少であり得る。
【０１２１】
１つの実施形態において、改変植物（例えば、タバコ植物）、植物繁殖材料（例えば、タバコ植物繁殖材料）、葉（例えば、タバコ葉）、収穫された葉（例えば、収穫されたタバコ葉）、カットされ、収穫された葉（例えば、カットされ、収穫されたタバコ葉）、処理された葉（例えば、処理されたタバコ葉）、カット及び処理された葉（例えば、カット及び処理されたタバコ葉）、又は改変されたタバコ植物由来のタバコ製品のニコチン含有量が減少している。
【０１２２】
１つの実施形態において、植物（例えば、タバコ植物）又はその一部のアルカロイド含有量は、それぞれ、同様の生育条件下で生育した少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子（又は、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子と少なくとも１つのＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子との組み合わせ）の活性若しくは発現が調節されるように改変されていない植物（例えば、タバコ植物）又はその一部のアルカロイド含有量と比較した場合に、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、又は１０倍まで調節され得る。適切には、アルカロイド含有量は、約２倍〜約１０倍、好ましくは、約３倍〜約１０倍、適切には、約３倍〜約５倍まで調節され得る。適切には、改変は、アルカロイド含有量の増加又は減少であり得る。適切には、調節は、ニコチン、アナタビン、アナバシン、ミオスミン及びノルニコチンから選択される１又は２以上のアルカロイドの含有量の調節であり得る。適切には、改変は、ニコチン含有量の改変である。
【０１２３】
本発明の１つの実施形態において、植物（例えば、タバコ植物）又はその一部のアルカロイド含有量は、本発明に従って改変されていない植物（例えば、タバコ植物）又はその一部と比べて、１％、２％、５％、８％、１０％、１２％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％まで調節され得る。調節は、未改変植物（例えば、タバコ植物）又はその一部と比較した場合に、アルカロイド含有量の増加又は減少であり得る。適切には、調節は、総アルカロイド含有量の調節であり得る。適切には、調節は、ニコチン、アナタビン、アナバシン、ミオスミン及びノルニコチンから選択される１又は２以上のアルカロイドの含有量の調節であり得る。適切には、改変は、ニコチン含有量の改変である。
【０１２４】
１つの実施形態において、本方法又は使用は、Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子（又は、Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子及びＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子）の活性若しくは発現が調節されるように改変されていない植物（例えば、タバコ植物）又はその一部と比べて、より具体的には、導入された調節が非存在の植物（例えば、タバコ植物）による発現と比較して、又はこれに対して、調節されたアルカロイド含有量をもたらす。
【０１２５】
実施形態において、植物（例えば、タバコ植物）又はその一部は、それぞれ、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子（又は、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子及び少なくとも１つのＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子）の活性又は発現が調節されるように改変されていない植物（例えば、タバコ植物）又はその一部と比べて、アルカロイド含有量における調節が達成されるように改変されている。
【０１２６】
本明細書において使用される「改変すること」又は「改変された」という用語は、変えたか、又は変更されている植物（例えば、タバコ植物）を意味する。本発明は、植物の遺伝子改変、又は植物の非遺伝子改変のための技術を使用する植物の改変を含む。このような方法は、当技術分野において周知であり、遺伝子改変技術の例としては、形質転換、遺伝子導入、シスジェニック及び遺伝子編集方法が挙げられる。非遺伝子改変技術の例としては、高速中性子変異誘発、化学変異誘発、例えば、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）変異誘発、及び最新の個体群解析アプローチが挙げられる。
【０１２７】
１つの実施形態において、改変されたＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子を有する天然のバリアントが選択され、その形質又は遺伝子が、商業的に望ましい形質を有する第２の植物に育種される。
【０１２８】
１つの実施形態において、本発明による植物（例えば、タバコ植物）は、遺伝子導入植物であり得る。
【０１２９】
別の実施形態において、本発明による植物（例えば、タバコ植物）は、非遺伝子導入植物であり得る。
【０１３０】
適切には、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子（又は、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子及び少なくとも１つのＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の組み合わせ）の調節は、ＬＡ  バーレー２１に存在しない。
【０１３１】
適切には、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子（又は、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子及び少なくとも１つのＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の組み合わせ）の調節は、バーレー２１に存在しない。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子（又は、少なくとも１つのＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子）の活性又は発現を減少させ、それによってアルカロイド含有量を減少させる改変は、
少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子（又は、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子及び少なくとも１つのＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の両方）の転写、翻訳若しくは発現を、減少させること、妨げること又は弱めること；
少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子（又は、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子及び少なくとも１つのＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の両方の組み合わせ）によってコードされるポリペプチドの合成、又は細胞内ストアからのその放出を阻害すること；又は
少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子（又は、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子及び少なくとも１つのＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の組み合わせ）によってコードされるポリペプチドの分解の速度を増加させること
からなる群から選択される。
【０１３３】
１つの実施形態において、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現を減少させる改変（又は、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子及び少なくとも１つのＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の組み合わせの活性を減少させる１若しくは２以上の改変）は、１又は２以上のＥＲＦ遺伝子における変異を含む。
【０１３４】
１つの実施形態において、変異は、１又は２以上のＥＲＦ遺伝子全体を欠失させる。
【０１３５】
１つの実施形態において、１又は２以上のＥＲＦ遺伝子は、遺伝子内に１又は２以上の変異を含み得る。適切には、１又は２以上の変異は、変異された遺伝子中の低減又は取り除かれた遺伝子活性をもたらす。１つの実施形態において、１又は２以上の変異は、不活性遺伝子をもたらす。１つの実施形態において、変異は、欠失であり得る。１つの実施形態において、変異は、挿入であり得る。１つの実施形態において、変異は、早期終止コドンを導入し得る。１つの実施形態において、標的部位は、標的ＥＲＦ遺伝子に対してユニークであり、他のＥＲＦ遺伝子に存在しない。１つの実施形態において、変異は、タンパク質のコード領域の５’末端を標的とする。
【０１３６】
１つの実施形態において、変異は、ナンセンス変異である。
【０１３７】
１つの実施形態において、変異体は、総アルカロイドが低減されているか、及び／又はニコチンレベルが低減されている。
【０１３８】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号４のアミノ酸配列、若しくはこれと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％の同一性を有する配列を含む（又は、からなる）ポリペプチドをコードするＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子における１又は２以上の変異を提供する。
【０１３９】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号８のアミノ酸配列、若しくはこれと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％の同一性を有する配列を含む（又は、からなる）ポリペプチドをコードするＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子における１又は２以上の変異を提供する。
【０１４０】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号１２のアミノ酸配列、若しくはこれと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％の同一性を有する配列を含む（又は、からなる）ポリペプチドをコードするＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子における１又は２以上の変異を提供する。
【０１４１】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号１６のアミノ酸配列、若しくはこれと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％の同一性を有する配列を含む（又は、からなる）ポリペプチドをコードするＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子における１又は２以上の変異を提供する。
【０１４２】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号２０のアミノ酸配列、若しくはこれと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％の同一性を有する配列を含む（又は、からなる）ポリペプチドをコードするＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子における１又は２以上の変異を提供する。
【０１４３】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号２４のアミノ酸配列、若しくはこれと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％の同一性を有する配列を含む（又は、からなる）ポリペプチドをコードするＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子における１又は２以上の変異を提供する。
【０１４４】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号２８のアミノ酸配列、若しくはこれと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％の同一性を有する配列を含む（又は、からなる）ポリペプチドをコードするＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子における１又は２以上の変異を提供する。
【０１４５】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号３２のアミノ酸配列、若しくはこれと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％の同一性を有する配列を含む（又は、からなる）ポリペプチドをコードするＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子における１又は２以上の変異を提供する。
【０１４６】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号３６のアミノ酸配列、若しくはこれと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％の同一性を有する配列を含む（又は、からなる）ポリペプチドをコードするＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子における１又は２以上の変異を提供する。
【０１４７】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号１において提示されるヌクレオチド配列、若しくはこれと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％の同一性を有する配列を含む（又は、からなる）Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子における１又は２以上の変異を提供する。
【０１４８】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号３において提示されるコード配列、若しくはこれと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％の同一性を有する配列を含む（又は、からなる）Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子における１又は２以上の変異を提供する。
【０１４９】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号５において提示されるヌクレオチド配列、若しくはこれと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％の同一性を有する配列を含む（又は、からなる）Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子における１又は２以上の変異を提供する。
【０１５０】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号９において提示されるヌクレオチド配列、若しくはこれと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％の同一性を有する配列を含む（又は、からなる）Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子における１又は２以上の変異を提供する。
【０１５１】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号１３において提示されるヌクレオチド配列、若しくはこれと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％の同一性を有する配列を含む（又は、からなる）Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子における１又は２以上の変異を提供する。
【０１５２】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号１７において提示されるヌクレオチド配列、若しくはこれと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％の同一性を有する配列を含む（又は、からなる）Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子における１又は２以上の変異を提供する。
【０１５３】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号２１において提示されるヌクレオチド配列、若しくはこれと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％の同一性を有する配列を含む（又は、からなる）Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子における１又は２以上の変異を提供する。
【０１５４】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号２５において提示されるヌクレオチド配列、若しくはこれと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％の同一性を有する配列を含む（又は、からなる）Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子における１又は２以上の変異を提供する。
【０１５５】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号２９において提示されるヌクレオチド配列、若しくはこれと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％の同一性を有する配列を含む（又は、からなる）Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子における１又は２以上の変異を提供する。
【０１５６】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号３３において提示されるヌクレオチド配列、若しくはこれと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％の同一性を有する配列を含む（又は、からなる）Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子における１又は２以上の変異を提供する。
【０１５７】
例として、本方法は以下を含み得る：
・配列番号４、若しくは配列番号８、若しくは配列番号１２、若しくは配列番号１６、若しくは配列番号２０、若しくは配列番号２４、若しくは配列番号２８、若しくは配列番号３２、若しくは配列番号３６として示されるアミノ酸配列、又はこれらと少なくとも７０％（好ましくは、少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９６％、好ましくは、少なくとも９８％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列における変異を提供すること；
・配列番号４、若しくは配列番号８、若しくは配列番号１２、若しくは配列番号１６、若しくは配列番号２０、若しくは配列番号２４、若しくは配列番号２８、若しくは配列番号３２、若しくは配列番号３６として示されるアミノ酸配列、又はこれらと少なくとも７０％（好ましくは、少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９６％、好ましくは、少なくとも９８％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列のプロモーターにおける変異を提供すること；
・配列番号１、若しくは配列番号３、配列番号５、若しくは配列番号９、若しくは配列番号１３、若しくは配列番号１７、若しくは配列番号２１、若しくは配列番号２５、若しくは配列番号２９、若しくは配列番号３３、又はこれらと少なくとも７０％（好ましくは、少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９６％、好ましくは、少なくとも９８％）の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むＥＲＦ遺伝子の核酸配列における変異を提供すること；
・配列番号１、若しくは配列番号３、配列番号５、若しくは配列番号９、若しくは配列番号１３、若しくは配列番号１７、若しくは配列番号２１、若しくは配列番号２５、若しくは配列番号２９、若しくは配列番号３３、又はこれらと少なくとも７０％（好ましくは、少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９６％、好ましくは、少なくとも９８％）の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むＥＲＦ遺伝子の核酸配列のプロモーターにおける変異を提供すること；
・配列番号４、若しくは配列番号８、若しくは配列番号１２、若しくは配列番号１６、若しくは配列番号２０、若しくは配列番号２４、若しくは配列番号２８、若しくは配列番号３２、若しくは配列番号３６として示されるアミノ酸配列、又はこれらと少なくとも７０％（好ましくは、少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９６％、好ましくは、少なくとも９８％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列のレベルを低減する、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、或いはｍｉＲＮＡを提供すること；
・配列番号１、配列番号３、若しくは配列番号５、若しくは配列番号９、若しくは配列番号１３、若しくは配列番号１７、若しくは配列番号２１、若しくは配列番号２５、若しくは配列番号２９、若しくは配列番号３３の核酸配列、又はこれらと少なくとも７０％（好ましくは、少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９６％、好ましくは、少なくとも９８％）の配列同一性を有するヌクレオチド配列のレベルを低減する、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、或いはｍｉＲＮＡを提供すること。
【０１５８】
１つの実施形態において、１又は２以上のＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子を調節する（例えば、変異する）ことと同様に、１又は２以上のＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子も調節されている（例えば、変異される）。
【０１５９】
適切には、本明細書において教示されるＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子改変（例えば、変異）のいずれか一つは、Ｎｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の１又は２以上の改変と組み合わせて使用され得、Ｎｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子は、配列番号４０、若しくは配列番号４４、若しくは配列番号４８、若しくは配列番号５２、若しくは配列番号５６、若しくは配列番号６０、若しくは配列番号６４、若しくは配列番号６８、若しくは配列番号７２において提示されるアミノ酸配列、又はそれらの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含むポリペプチドをコードするか、或いはＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子は、配列番号３７、若しくは配列番号４１、若しくは配列番号４５、若しくは配列番号４９、若しくは配列番号５３、若しくは配列番号５７、若しくは配列番号６１、若しくは配列番号６５、若しくは配列番号６９において提示されるヌクレオチド配列、又はそれらの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含む。
【０１６０】
例として、本方法は、以下を含み得る：
・配列番号４０、若しくは配列番号４４、若しくは配列番号４８、若しくは配列番号５２、若しくは配列番号５６、若しくは配列番号６０、若しくは配列番号６４、若しくは配列番号６８、若しくは配列番号７２として示されるアミノ酸配列、又はこれらと少なくとも７０％（好ましくは、少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９６％、好ましくは、少なくとも９８％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列における変異を提供すること；
・配列番号４０、若しくは配列番号４４、若しくは配列番号４８、若しくは配列番号５２、若しくは配列番号５６、若しくは配列番号６０、若しくは配列番号６４、若しくは配列番号６８、若しくは配列番号７２として示されるアミノ酸配列、又はこれらと少なくとも７０％（好ましくは、少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９６％、好ましくは、少なくとも９８％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列のプロモーターにおける変異を提供すること；
・配列番号３７、若しくは配列番号４１、配列番号４５、若しくは配列番号４９、若しくは配列番号５３、若しくは配列番号５７、若しくは配列番号６１、若しくは配列番号６５、若しくは配列番号６９、又はこれらと少なくとも７０％（好ましくは、少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９６％、好ましくは、少なくとも９８％）の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むＥＲＦ遺伝子の核酸配列における変異を提供すること；
・配列番号３７、若しくは配列番号４１、若しくは配列番号４５、若しくは配列番号４９、若しくは配列番号５３、若しくは配列番号５７、若しくは配列番号６１、若しくは配列番号６５、若しくは配列番号６９、又はこれらと少なくとも７０％（好ましくは、少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９６％、好ましくは、少なくとも９８％）の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むＥＲＦ遺伝子の核酸配列のプロモーターにおける変異を提供すること；
・配列番号４０、若しくは配列番号４４、若しくは配列番号４８、若しくは配列番号５２、若しくは配列番号５６、若しくは配列番号６０、若しくは配列番号６４、若しくは配列番号６８、若しくは配列番号７２として示されるアミノ酸配列、又はこれらと少なくとも７０％（好ましくは、少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９６％、好ましくは、少なくとも９８％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列のレベルを低減する、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、或いはｍｉＲＮＡを提供すること；
・配列番号３７、若しくは配列番号４１、若しくは配列番号４５、若しくは配列番号４９、若しくは配列番号５３、若しくは配列番号５７、若しくは配列番号６１、若しくは配列番号６５、若しくは配列番号６９の核酸配列、又はこれらと少なくとも７０％（好ましくは、少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９６％、好ましくは、少なくとも９８％）の配列同一性を有するヌクレオチド配列のレベルを低減する、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、或いはｍｉＲＮＡを提供すること。
【０１６１】
１つの実施形態において、これらは、配列番号４、若しくは配列番号８、若しくは配列番号１２、若しくは配列番号１６、若しくは配列番号２０、若しくは配列番号２４、若しくは配列番号２８、若しくは配列番号３２、若しくは配列番号３６として示されるアミノ酸配列、又はこれらと少なくとも７０％（好ましくは、少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９６％、好ましくは、少なくとも９８％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列における１又は２以上の変異、或いは配列番号１、若しくは配列番号３、若しくは配列番号５、若しくは配列番号９、若しくは配列番号１３、若しくは配列番号１７、若しくは配列番号２１、若しくは配列番号２５、若しくは配列番号２９、若しくは配列番号３３、又はこれらと少なくとも７０％（好ましくは、少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９６％、好ましくは、少なくとも９８％）の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むＥＲＦ遺伝子の核酸配列における１又は２以上の変異からなる群から選択される少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子における変異と；少なくとも１つのＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子における変異、具体的には、配列番号４０、配列番号４４、配列番号４８、配列番号５２、配列番号５６、配列番号６４、配列番号６８若しくは配列番号７２のアミノ酸配列、又はこれらと少なくとも７０％（好ましくは、少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９６％、好ましくは、少なくとも９８％）の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列における１又は２以上の変異、或いは配列番号３７、配列番号４１、配列番号４５、配列番号４９、若しくは配列番号５３、若しくは配列番号５７、若しくは配列番号６１、若しくは配列番号６５、若しくは配列番号６９を含む核酸配列、又はこれらと少なくとも７０％（好ましくは、少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９６％、好ましくは、少なくとも９８％）の配列同一性を有するヌクレオチド配列における１又は２以上の変異とが組み合わせて使用され、より具体的には、Ｎｉｃ２  ＥＲＦ変異は、配列番号７２のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも７０％（好ましくは、少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９６％、好ましくは、少なくとも９８％）の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、或いは配列番号６９のヌクレオチド配列、又はこれと少なくとも７０％（好ましくは、少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９６％、好ましくは、少なくとも９８％）の配列同一性を有するヌクレオチド配列における１又は２以上の変異である。
【０１６２】
１つの実施形態において、これらは、配列番号８として示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも７０％（好ましくは、少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９６％、好ましくは、少なくとも９８％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列における１又は２以上の変異、及び配列番号５を含むＥＲＦ遺伝子の核酸配列、又はこれと少なくとも７０％（好ましくは、少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９６％、好ましくは、少なくとも９８％）の配列同一性を有するヌクレオチド配列における１又は２以上の変異からなる少なくともＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子における変異；並びに少なくとも１つのＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子における変異、具体的には、配列番号４０、配列番号４４、配列番号４８、配列番号５２、配列番号５６、配列番号６０、配列番号６４、配列番号６８、若しくは配列番号７２のアミノ酸配列、又はこれらと少なくとも７０％（好ましくは、少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９６％、好ましくは、少なくとも９８％）の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列における１又は２以上の変異、或いは配列番号３７、配列番号４１、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５３、配列番号５７、配列番号６１、配列番号６５、若しくは配列番号６９を含むヌクレオチド配列、又はこれらと少なくとも７０％（好ましくは、少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９６％、好ましくは、少なくとも９８％）の配列同一性を有するヌクレオチド配列における１又は２以上の変異の組み合わせで使用される。
【０１６３】
１つの実施形態において、これらは、配列番号８として示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも７０％（好ましくは、少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９６％、好ましくは、少なくとも９８％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列における１又は２以上の変異、及び配列番号５を含むＥＲＦ遺伝子の核酸配列、又はこれと少なくとも７０％（好ましくは、少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９６％、好ましくは、少なくとも９８％）の配列同一性を有するヌクレオチド配列における１又は２以上の変異からなる少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子における変異；並びに配列番号７２として示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも７０％（好ましくは、少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９６％、好ましくは、少なくとも９８％）の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列における１又は２以上の変異、或いは配列番号６９として示されるヌクレオチド配列、及びこれと少なくとも７０％（好ましくは、少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９６％、好ましくは、少なくとも９８％）の配列同一性を有するヌクレオチド配列における１又は２以上の変異からなる少なくとも１つのＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子における変異の組み合わせで使用される。
【０１６４】
１又は２以上のＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子は、表２から選択される、１つ、又は２つ、又は３つ、又は４つ、又は５つ、又は６つ、又は７つ、又は８つ、又は９つのＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子であり得る。
【０１６５】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子（又は、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子及び少なくとも１つのＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の組み合わせ）の活性又は発現を減少させ、それによって、アルカロイド含有量を減少させる改変は、１又は２以上のＥＲＦ遺伝子における、点変異、欠失、挿入、重複、及び反転からなる群から選択される１又は２以上である。適切には、改変は、ランダム変異誘発及び標的化変異誘発から選択される方法によって導入される。適切には、改変は、例えば、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、遺伝子編集及びＣＲＩＳＰＲから選択される標的化変異誘発方法によって導入され得る。
【０１６６】
本明細書で使用される場合、「変異」という用語は、天然の遺伝的バリアント又は操作されたバリアントを包含する。
【０１６７】
特に、「変異」という用語は、配列番号４、若しくは配列番号８、若しくは配列番号１２、若しくは配列番号１６、若しくは配列番号２０、若しくは配列番号２４、若しくは配列番号２８、若しくは配列番号３２、若しくは配列番号３６として示される配列、又はタンパク質の発現又は機能を低減させる、これらと少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列と比較して、アミノ酸配列における変形を指す。
【０１６８】
「変異」という用語は、配列番号１、若しくは配列番号３、若しくは配列番号５、若しくは配列番号９、若しくは配列番号１３、若しくは配列番号１７、若しくは配列番号２１、若しくは配列番号２５、若しくは配列番号２９、若しくは配列番号３３として示される配列、又はこれらと少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列と比較して、ヌクレオチド配列における変形を指し得る。
【０１６９】
好ましい実施形態において、配列番号１、若しくは配列番号３、若しくは配列番号５、若しくは配列番号９、若しくは配列番号１３、若しくは配列番号１７、若しくは配列番号２１、若しくは配列番号２５、若しくは配列番号２９、若しくは配列番号３３、又はこれらと少なくとも７０％の同一性を有する配列として示される配列、或いは配列番号４、若しくは配列番号８、若しくは配列番号１２、若しくは配列番号１６、若しくは配列番号２０、若しくは配列番号２４、若しくは配列番号２８、若しくは配列番号３２、若しくは配列番号３６として示される配列、又は植物中に存在するこれらと少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含むタンパク質をコードする核酸配列のそれぞれのコピーは、本明細書において定義されるように変異される（例えば、植物中の前記タンパク質をコードする遺伝子のそれぞれのゲノムコピーが変異される）。例えば、タバコの異質四倍体ゲノムにおける遺伝子のそれぞれのコピーが変異され得る。
【０１７０】
好ましい実施形態において、本発明による植物又は植物細胞は、変異についてホモ接合性である。
【０１７１】
１つの実施形態において、好ましくは、本発明による植物又は植物細胞は、変異された核酸のみを発現する。言い換えれば、いくつかの実施形態において、内因性（又は内因性及び機能性）タンパク質は、本発明による植物中に存在しない。言い換えれば、任意の内因性タンパク質が存在する場合、これは、好ましくは、不活性及び／又はトランケートされた形態である。
【０１７２】
変異は、本明細書において詳述されるタンパク質をコードする核酸配列を中断していてもよい。
【０１７３】
中断は、転写及び／又は翻訳されない核酸配列を引き起こし得る。
【０１７４】
核酸配列は、例えば、タンパク質の翻訳が低減又は防がれるように、核酸配列のＡＴＧ開始コドンを欠失、又はそうでなければ改変することによって、中断され得る。
【０１７５】
核酸配列は、タンパク質の発現を低減若しくは防ぐか、又はタンパク質の輸送に影響を与える、１又は２以上のヌクレオチドの変化を含み得る。例えば、タンパク質の発現は、オープンリーディングフレームにおいて、１又は２以上の未成熟終止コドン、フレームシフト、スプライス変異、又は非許容アミノ酸置換の導入によって、低減又は防がれ得る。
【０１７６】
未成熟終止コドンは、オープンリーディングフレームに終止コドンを導入し、アミノ酸配列全体の翻訳を防ぐ変異を指す。未成熟終止コドンは、ＴＡＧ（「ａｍｂｅｒ」）、ＴＡＡ（「ｏｃｈｒｅ」）、又はＴＧＡ（「ｏｐａｌ」又は「ｕｍｂｅｒ」）コドンであり得る。
【０１７７】
適切には、未成熟終止コドンは、配列番号５〜７のいずれかにおいて示されるように、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００３０９０ｇ００３０．１（ＥＲＦ１９９）に導入され得る。
【０１７８】
適切には、未成熟終止コドンは、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００３０９０ｇ００３０．１（ＥＲＦ１９９）に導入され得、配列番号５〜７のいずれかにおいて示されるように、ＴＧＡ（「ｏｐａｌ」又は「ｕｍｂｅｒ」）未成熟終止コドンであり得る。
【０１７９】
フレームシフト変異（フレーミングエラー又はリーディングフレームシフトとも呼ばれる）は、３で割り切れない核酸配列におけるヌクレオチドの数の欠失挿入（挿入又は欠失）によって引き起こされる変異である。コドンによる遺伝子発現のトリプレット性に起因して、挿入又は欠失は、リーディングフレームを変化させることができ、元とは完全に異なる翻訳をもたらす。フレームシフト変異は、多くの場合、異なるアミノ酸についてコードする変異後に、コドンの読み取りを引き起こす。フレームシフト変異は、一般に、未成熟終止コドンの導入をもたらす。
【０１８０】
スプライス変異は、スプライシングが、成熟メッセンジャーＲＮＡへの前駆体メッセンジャーＲＮＡのプロセシングの間に起こる、特定の部位におけるいくつかのヌクレオチドを挿入、欠失又は変化させる。スプライシング部位の欠失は、成熟ｍＲＮＡに残った１又は２以上のイントロンをもたらし、異常タンパク質の産生をもたらし得る。
【０１８１】
非許容アミノ酸置換は、タンパク質の機能の低減又は消失（ablate）をもたらすタンパク質において非同義アミノ酸置換を引き起こす変異を指す。
【０１８２】
核酸配列における変異を提供するための当技術分野において公知の任意の方法を、本方法において使用し得る。例えば、相同組換えを使用してもよく、ここで、関連核酸配列が変異され、植物又は植物細胞を形質転換するために使用されるベクターが作製される。次いで、変異配列を発現する組換え植物又は植物細胞が選択され得る。
【０１８３】
核酸配列は、全体的又は部分的に欠失し得る。欠失は、連続的であってもよく、又は配列の複数のセクションを含んでいてもよい。欠失は、好ましくは、核酸配列が機能タンパク質をコードすることがもはや無いように、ヌクレオチド配列の十分な量を除去する。欠失は、例えば、核酸配列のコーディング部分の少なくとも、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％を除去し得る。
【０１８４】
欠失は、全体であってもよく、この場合において、同等の未改変植物の対応するゲノムと比較した場合に、核酸配列のコーディング部分の１００％が存在しない。
【０１８５】
植物中の核酸配列の欠失のための方法は、当技術分野において公知である。例えば、相同組換えを使用してもよく、ここで、関連核酸配列を消失させ、植物又は植物細胞を形質転換するために使用されるベクターが作製される。次いで、配列の新しい部分を発現する組換え植物又は植物細胞が選択され得る。
【０１８６】
上記に記載のベクターで形質転換された植物細胞は、アミノ酸、植物ホルモン、ビタミン等のような必要な成長因子が補充された適切な培養液中で細胞を培養することによって等の周知の組織培養方法に従って、増殖及び維持され得る。
【０１８７】
核酸配列の改変は、標的化変異誘発方法（標的化ヌクレオチド交換（ＴＮＥ、targeted nucleotide exchange）又はオリゴ指向変異誘発（ＯＤＭ、oligo-directed mutagenesis）とも称される）を使用して行われ得る。標的化変異誘発方法としては、限定されないが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ（国際公開第２０１１／０７２２４６号パンフレット及び国際公開第２０１０／０７９４３０号パンフレットを参照されたい）、Ｃａｓ−９様のＣａｓ９／ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ若しくはＣａｓ９／ｇＲＮＡ  ＣＲＩＳＰＲシステム（国際公開第２０１４／０７１００６号パンフレット及び国際公開第２０１４／０９３６２２号を参照されたい）、メガヌクレアーゼ（国際公開第２００７／０４７８５９号パンフレット及び国際公開第２００９／０５９１９５号パンフレットを参照されたい）、又は場合により、植物プロトプラストに遺伝子に対して相補的な配列で変異誘発を増強するための化学的に修飾されたヌクレオチドを含有する変異原性オリゴヌクレオチド（例えば、KeyBase（登録商標）又はＴＡＬＥＮ）を利用する標的化変異誘発方法が挙げられる。
【０１８８】
或いは、ＴＩＬＬＩＮＧ（Targeting Induced Local Lesions IN Genomics、ゲノミクスにおける標的化誘導局所破壊；McCallum et al., 2000, Nat Biotech 18:455及びMcCallum et al. 2000, Plant Physiol. 123, 439-442、両方とも参照によって本明細書に組み込まれる）等の変異誘発システムを使用して、変異を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む植物系統を発生させ得る。ＴＩＬＬＩＮＧは、従来の化学的変異誘発（例えば、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）変異誘発）、続いて、変異についてのハイスループットスクリーニングを使用する。したがって、望ましい変異を有する遺伝子を含む、植物、種子及び組織が得られ得る。
【０１８９】
本方法は、植物の種子に変異誘発する（例えば、ＥＭＳ変異誘発）ステップ、植物個体又はＤＮＡをプールするステップ、所望の領域のＰＣＲ増幅のステップ、ヘテロ二本鎖形成及びハイスループット検出のステップ、変異体植物の特定のステップ、変異体ＰＣＲ産物を配列決定するステップを含み得る。他の変異誘発及び選択方法を、このような改変植物を発生させるために同じように使用し得ることが理解される。種子は、例えば、照射又は化学的に処理され得、植物は、改変された表現型についてスクリーニングされ得る。
【０１９０】
改変植物は、ＤＮＡ中に存在する変異等の分子方法によって、及び改変された表現型の特性によって、非改変植物、即ち、野生型植物と区別され得る。改変植物は、変異について、ホモ接合性又はヘテロ接合性であり得る。
【０１９１】
適切には、本方法は、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現を阻害する能力がある遺伝子コンストラクト（又は、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子及び少なくとも１つのＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の組み合わせの活性若しくは発現を阻害する能力があるコンストラクト）で、植物（例えば、タバコ植物）の細胞を形質転換することを含み得る。
【０１９２】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子（又は、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子及び少なくとも１つのＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の組み合わせ）の活性又は発現を増加させ、それによって、アルカロイド含有量を増加させる改変は、
少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子（又は、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子及び少なくとも１つのＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の組み合わせ）の転写、翻訳若しくは発現を、増加させること、促進すること、又は増大させること；
少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子（又は、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子及び少なくとも１つのＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の組み合わせ）若しくは細胞内ストアからのその放出によってコードされるポリペプチドの合成を増加させること；並びに
少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子（又は、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子及び少なくとも１つのＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の組み合わせ）によってコードされるポリペプチドの分解の速度を減少させること
からなる群から選択される。
【０１９３】
適切には、本方法は、少なくとも１つの外因性Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子をコードする（又は、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子及び少なくとも１つのＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の両方の組み合わせをコードする）か、或いは少なくとも１つの内因性Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子（又は、少なくとも１つの内因性Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子及び少なくとも１つの内因性Ｎｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の組み合わせ）を、促進するか、又は増大させる能力があるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、遺伝子コンストラクトで、植物（例えば、タバコ植物）の細胞を形質転換することを含み得る。これらの選択肢のそれぞれが、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子（又は、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子及び少なくとも１つのＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の組み合わせ）によってコードされるポリペプチドの活性及び発現の増加をもたらすことが理解される。本方法は、形質転換細胞から植物を再生することを含み得る。
【０１９４】
したがって、コンストラクトで形質転換された植物においてアルカロイド含有量を増加させるために、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子（又は、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子及び少なくとも１つのＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の組み合わせ）によってコードされるポリペプチドの活性及び／又は発現を増加させる能力がある遺伝子コンストラクトの使用を提供する。
【０１９５】
遺伝子コンストラクトは、配列番号４、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２４、配列番号２８、配列番号３２、若しくは配列番号３６において提示されるアミノ酸配列、又はそれらの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含むポリペプチドをコードし得る。このコンストラクトは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号９、配列番号１３、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２５、配列番号２９、若しくは配列番号３３において提示されるヌクレオチド配列、又はそれらの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含み得る。
【０１９６】
いくつかの実施形態において、本発明による方法又は使用は、Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現を増加させること、及びＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現を増加させることによって、植物（例えば、タバコ植物）のアルカロイド含有量を増加させることを含む。
【０１９７】
適切には、アルカロイド含有量を増加させるための方法又は使用は、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子及びＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現を増加させることを含み、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子は、実質的に、配列番号４、若しくは配列番号８、若しくは配列番号１２、若しくは配列番号１６、若しくは配列番号２０、若しくは配列番号２４、若しくは配列番号２８、若しくは配列番号３２、若しくは配列番号３６において提示されるアミノ酸配列、又はそれらの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含むポリペプチドをコードするか、或いはＥＲＦ遺伝子は、実質的に、配列番号１、若しくは配列番号３、若しくは配列番号５、若しくは配列番号９、若しくは配列番号１３、若しくは配列番号１７、若しくは配列番号２１、若しくは配列番号２５、若しくは配列番号２９、若しくは配列番号３３において提示されるヌクレオチド配列、又はそれらの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含み、Ｎｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子は、実質的に、配列番号４０、若しくは配列番号４４、若しくは配列番号４８、若しくは配列番号５２、若しくは配列番号５６、若しくは配列番号６０、若しくは配列番号６４、若しくは配列番号６８、若しくは配列番号７２において提示されるアミノ酸配列、又はそれらの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含むポリペプチドをコードし、或いは、Ｎｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子は、実質的に、配列番号３７、若しくは配列番号４１、若しくは配列番号４５、若しくは配列番号４９、若しくは配列番号５３、若しくは配列番号５７、若しくは配列番号６１、若しくは配列番号６５、若しくは配列番号６９において提示されるヌクレオチド配列を含む。
【０１９８】
適切には、アルカロイド含有量を増加させるための方法又は使用は、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子及びＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現を増加させることを含み、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子が、配列番号４、若しくは配列番号８、若しくは配列番号１２、若しくは配列番号１６、若しくは配列番号２０、若しくは配列番号２４、若しくは配列番号２８、若しくは配列番号３２、若しくは配列番号３６において提示されるアミノ酸配列、又はそれらの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含むポリペプチドをコードするか、或いはＥＲＦ遺伝子が、配列番号１、若しくは配列番号３、若しくは配列番号５、若しくは配列番号９、若しくは配列番号１３、若しくは配列番号１７、若しくは配列番号２１、若しくは配列番号２５、若しくは配列番号２９、若しくは配列番号３３において提示されるヌクレオチド配列、又はそれらの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含み、Ｎｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子が、配列番号７２において提示されるアミノ酸配列、又はその機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含むポリペプチドをコードするか、或いはＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子が、配列番号６９において提示されるヌクレオチド配列を含む。
【０１９９】
本明細書において使用される「阻害すること」（例えば、Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現を阻害すること）という用語は、Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現が、同等の生産物における遺伝子の活性若しくは遺伝子の発現と比較して、より低いか、又は減少され、或いはＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子によって産生されるタンパク質の量又は活性が、より低いことを意味する。
【０２００】
１つの実施形態において、本明細書において使用される「阻害すること」（例えば、Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現を阻害すること）という用語は、Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現が、同等の生産物における遺伝子の活性若しくは遺伝子の発現と比較して、より低いことを意味する。
【０２０１】
特定のＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性は、遺伝子の転写を測定することによって測定することができる。転写を測定するための方法は、当技術分野において周知であり、とりわけ、ノーザンブロット、ＲＮＡ−Ｓｅｑ、インサイチュハイブリダイゼーション、ＤＮＡマイクロアレイ、及びＲＴ−ＰＣＲが挙げられる。或いは、遺伝子の活性は、遺伝子産物、例えば、前記遺伝子によってコードされるタンパク質のレベルを測定することによって、間接的に測定され得る。
【０２０２】
いくつかの実施形態において、Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現は、本発明に従って改変されていない植物（例えば、タバコ植物）におけるＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現と比較した場合に、少なくとも約１０％、２０％、３０％、又は４０％、適切には、少なくとも約５０％、６０％、７０％、より適切には、少なくとも約８０％、９０％、９５％、又は１００％まで、調節、即ち、増加又は減少され得る。
【０２０３】
適切には、Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の発現又は機能は、Ｎｉｃ１  ＥＲＦのタンパク質の発現又は機能が検出可能ではないように、低減、部分的に不活性化、阻害、取り除き、ノックアウト又は喪失し得る。
【０２０４】
１つの態様において、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子はノックアウトされる。言い換えれば、Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子は、完全に無効にされている。
【０２０５】
１つの態様において、配列番号８において提示されるアミノ酸配列、又はその機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含むポリペプチドをコードするか、或いは配列番号５において提示されるヌクレオチド配列、又はその機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含むＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子は、ノックアウトされる。
【０２０６】
好ましい実施形態において、Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子は、実質的に、活性又は発現を有さなくてもよく、これは、植物が、好ましくは、Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現が阻害されるように改変されていない植物と比較した場合に、約１％未満（適切には、約０．１％未満）の活性又は発現を含み得ることを意味する。
【０２０７】
いくつかの実施形態において、Ｎｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現は、本発明に従って改変されていない植物（例えば、タバコ植物）におけるＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現と比較した場合に、少なくとも約１０％、２０％、３０％、又は４０％、適切には、少なくとも約５０％、６０％、７０％、より適切には、少なくとも約８０％、９０％、９５％、又は１００％まで、調節、即ち、増加又は減少され得る。
【０２０８】
好ましい実施形態において、Ｎｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子は、実質的に、活性又は発現を有さなくてもよく、これは、植物が、好ましくは、Ｎｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現が阻害されるように改変されていない植物と比較した場合に、約１％未満（適切には、約０．１％未満）の活性又は発現を含み得ることを意味する。
【０２０９】
本明細書において使用される「ＥＲＦ遺伝子」は、エチレン応答因子（ＥＲＦ）のサブファミリーに属する転写因子の遺伝子を指す。
【０２１０】
本明細書において使用される「Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子」は、本発明者らが、Ｎｉｃ１領域へのマッピングとして本明細書の実施例において特定したＥＲＦ遺伝子をさす。本明細書において使用されるＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子を、それらの対応するヌクレオチド、ｃＤＮＡ、ｃｄｓ及びアミノ酸配列の識別子とともに、下記の表１に列挙する。
【０２１１】
【表１】
2020524508.tif 000003
【０２１２】
適切には、本発明における使用のための少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子は、表１に列挙されたもののいずれか１つである。
【０２１３】
それぞれのＮｉｃ１  ＥＲＦのゲノム配列及び上記の表に列挙されたＮｉｃ２  ＥＲＦは、Ｎｉｃ１  ＥＲＦ  ＥＲＦ１７Ｌ３を除いて、それらの対応するコード配列と同一である。ＥＲＦ１７Ｌ３のゲノム配列（配列番号１）は、ＥＲＦ１７Ｌ３のコード配列（配列番号３）と同一ではない。
【０２１４】
本明細書において使用される「Ｎｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子」は、本発明者らが、Ｎｉｃ２領域へのマッピングとして本明細書の実施例において特定したＥＲＦ遺伝子をさす。本明細書において使用されるＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子を、それらの対応するヌクレオチド、ｃＤＮＡ、ｃｄｓ及びアミノ酸配列の識別子とともに、下記の表２に列挙する。
【０２１５】
【表２】
2020524508.tif 000004
【０２１６】
適切には、本発明における使用のためのＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子は、表２に列挙されたもののいずれか１つである。
【０２１７】
１つの実施形態において、本明細書において言及される少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子は、以下を含むポリヌクレオチド配列によってコードされ得る：
ｉ）本明細書において、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号９、配列番号１３、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２５、配列番号２９、若しくは配列番号３３として示されるポリヌクレオチド配列；又は
ii）機能的断片がＮｉｃ１  ＥＲＦ合成遺伝子をコードする、ｉ）において示されるポリヌクレオチド配列の機能的断片；又は
iii）本明細書において、配列番号４、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２４、配列番号２８、配列番号３２、若しくは配列番号３６として示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；又は
iv）高ストリンジェンシー条件下で、上記ｉ）、ii）若しくはiii）において教示されるポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド配列；又は
ｖ）上記ｉ）、ii）若しくはiii）において示されるポリヌクレオチドと少なくとも７０％（好ましくは、８０％、好ましくは、８５％、好ましくは、９０％、好ましくは、９５％、より好ましくは、９６％、より好ましくは、９７％、より好ましくは、９８％）の同一性を有するポリヌクレオチド配列；又は
vi）遺伝コードの縮重に起因して、ｉ）、ii）若しくはiii）において示されるポリヌクレオチドと異なるポリヌクレオチド配列。
【０２１８】
１つの実施形態において、本明細書において言及される少なくとも１つのＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子は、以下を含むポリヌクレオチド配列によってコードされ得る：
ｉ）本明細書において、配列番号３７、配列番号４１、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５３、配列番号５７、配列番号６１、配列番号６５、若しくは配列番号６９として示されるポリヌクレオチド配列；又は
ii）機能的断片がＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子をコードする、ｉ）において示されるポリヌクレオチド配列の機能的断片；又は
iii）本明細書において、配列番号４０、配列番号４４、配列番号４８、配列番号５２、配列番号５６、配列番号６０、配列番号６４、配列番号６８、若しくは配列番号７２として示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；又は
iv）高ストリンジェンシー条件下で、上記ｉ）、ii）若しくはiii）において教示されるポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド配列；又は
ｖ）上記ｉ）、ii）若しくはiii）において示されるポリヌクレオチドと少なくとも７０％（好ましくは、８０％、好ましくは、８５％、好ましくは、９０％、好ましくは、９５％、より好ましくは、９６％、より好ましくは、９７％、より好ましくは、９８％）の同一性を有するポリヌクレオチド配列；又は
vi）遺伝コードの縮重に起因して、ｉ）、ii）若しくはiii）において示されるポリヌクレオチドと異なるポリヌクレオチド配列。
【０２１９】
１つの実施形態において、本発明に従う使用のための少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子は、植物（例えば、タバコ植物）にとって内因性であり得る。
【０２２０】
１つの実施形態において、本発明に従う使用のための少なくとも１つのＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子は、植物（例えば、タバコ植物）にとって内因性であり得る。
【０２２１】
本明細書における「内因性」遺伝子への参照は、その天然の形態（即ち、任意の人間の介入なし）で植物において見られる問題の遺伝子に言及するだけでなく、植物（導入遺伝子）又は植物細胞に実質的に（再）導入された単離された形態のその同じ遺伝子（又は、実質的に相同の核酸／遺伝子）にも言及する。例えば、このような導入遺伝子を含有する遺伝子導入植物は、導入遺伝子の発現の相当の低減、及び／又は内因性遺伝子の発現の相当の低減に遭遇し得る。単離された遺伝子は、生物体から単離され得、又は例えば、化学合成による人工のものであり得る。
【０２２２】
別の実施形態において、本発明に従う使用のための少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子は、植物（例えば、タバコ植物）にとって外因性であり得る。
【０２２３】
別の実施形態において、本発明に従う使用のための少なくとも１つのＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子は、植物（例えば、タバコ植物）にとって外因性であり得る。
【０２２４】
「外因性遺伝子」という用語は、未改変植物に形質転換される遺伝子が、外部源由来、即ち、形質転換される植物と異なる種由来であることを意味し得る。外因性ＥＲＦ遺伝子は、未改変植物中の内因性ＥＲＦ遺伝子と実質的に同一又は異なる核酸配列を含み得る。外因性遺伝子は、任意の種由来のＥＲＦ遺伝子に相当するゲノム又はｃＤＮＡ配列に由来し得る。外因性遺伝子は、キメラ遺伝子を形成し得る。外因性遺伝子は、表１において提示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、又はそれらの機能的バリアント若しくは断片又はオルソログをコードし得る。外因性遺伝子は、表２において提示されるヌクレオチド配列、又はそれらの機能的バリアント若しくは断片又はオルソログを含み得る。
【０２２５】
本発明は、植物のアルカロイド含有量を調節するためのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の使用も提供する。
【０２２６】
１つの実施形態において、本発明は、追加のＥＲＦ遺伝子が本明細書において表２に記載されるＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子である、追加のＥＲＦ遺伝子の使用をさらに提供する。
【０２２７】
遺伝子又は遺伝子産物の発現を減少させるための方法は、当技術分野において十分に実証されている。Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現を調節するための本明細書に記載の任意の方法を使用して、Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子及びＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の両方の活性又は発現を改変し得る。
【０２２８】
１つの実施形態において、Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現、又は両方のＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現は、当技術分野において公知の任意の方法によって阻害され得る。別の実施形態において、Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現、又はＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現は、当技術分野において公知の任意の方法によって阻害され得る。
【０２２９】
Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現、又はＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子及びＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の両方の活性若しくは発現を阻害するための方法としては、遺伝子編集、標的化変異誘発、ＲＮＡ干渉、アンチセンス又はセンス共抑制（参照によって本明細書に組み込まれるWang and Wagner 2003, Planta Volume 216, Issue 4, pp 686-691を参照されたい）が挙げられ得る。１つの実施形態において、遺伝子の活性又は発現の阻害は、遺伝子編集の使用によって達成され得る。遺伝子編集は、当技術分野において公知の任意の方法を使用して行われ得る。いくつかの非限定的な例を本明細書に提示する。
【０２３０】
１つの実施形態において、Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現、又はＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子及びＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の両方の活性若しくは発現の阻害は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの使用を含む、ＣＲＩＳＰＲを含む遺伝子編集方法を使用して達成され得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集ツールは、Clontech社（Avenue du President Kennedy 78100 Saint-Germain-en-Laye、フランス）製の「Guide-it」等、市販されている。
【０２３１】
適切には、遺伝子編集ベクターpRGEB-M24を発生させるために、ベクターpRGEB31中のコメsnoRNA U3プロモーターは、HindIII及びBsaIで補助されるインフュージョンクローニングによって、pSiM24（Sahoo, D. K., Dey, N., and Maiti, I. B. (2014). pSiM24 is a novel versatile gene expression vector for transient assays as well as stable expression of foreign genes in plants. PLoS One 9, e98988、参照によって本明細書に組み込まれる）から増幅されたM24プロモーターで置換され得る。ベクターpRGEB-M24においてｓｇＲＮＡ配列の完全性及びBsaI認識部位を維持するために、M24プロモーターは、最初にBsaI認識部位（HindIII_EcoRI_M24F：GATTACGCCAAGCTTTCCCGTATACCCCGGGGAATTCGT（配列番号１３９）；BsaI_M24pro_R：gagacctcggtctccAGATGAGAGATTTCGATTCCG（配列番号１４０））に結合したプライマーで増幅することができる。希釈されたＰＣＲ産物は、消失したｓｇＲＮＡ配列（HindIII_EcoRI_M24F; gRNA_ BsaI_R：ttctagctctaaaacCGAGACCTCGGTCTCCAGATGA（配列番号１４１））に結合したプライマーで増幅される。下記の表中の候補遺伝子のそれぞれを特異的に標的とするために、１対のオリゴを設計することができる。
【０２３２】
【表３】
2020524508.tif 000005
【０２３３】
上記の表３中の下線を付した塩基は、標的部位のセンス又はアンチセンス配列を表す。
【０２３４】
オリゴのペアは、最初にアニールされて、両端で４−ｎｔ５’オーバーハングとの二本鎖断片を生成し、次いで、BsaIで消化されたpRGEB-M24ベクターに連結される。
【０２３５】
遺伝子を編集する別の方法としては、市販のキット（例えば、Addgene社製、1Kendall Sq. Ste. B7102、Cambridge、MA 02139、米国）を用いるＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、transcription activator-like effector nuclease）技術の使用を含む。１つの実施形態において、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現、又は少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子及び少なくとも１つのＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の両方の活性若しくは発現の阻害は、ＴＡＬＥＮを使用して達成され得る。
【０２３６】
別の実施形態において、本方法は、Sigma-Aldrich社から入手可能なCompoZr（登録商標）ジンクフィンガーヌクレアーゼ技術等のジンクフィンガーヌクレアーゼの使用を含み得る。別の実施形態は、Silva et al. Curr Gene Ther. Feb 2011; 11(1): 11-27（この教示は、参照によって本明細書に組み込まれる）に記載のメガヌクレアーゼ（又は、さらなる方法）の使用を含み得る。
【０２３７】
１つの実施形態において、Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子若しくはＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現を阻害するための方法は、標的化変異誘発であり得る。標的化変異誘発の任意の方法を使用し得る。１つの実施形態において、この方法は、Keygene社（Agro Business Park 90、6708 PW Wageningen、オランダ）から入手可能なKeyBase（登録商標）等のオリゴヌクレオチド指向変異誘発（ＯＤＭ）であり得る。別の実施形態において、Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現、又はＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子及びＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の両方の活性若しくは発現の阻害は、コンストラクト又はベクター（例えば、プラスミド）の使用によって達成され得る。
【０２３８】
本発明の遺伝子コンストラクトは、発現カセットの形態であり得、これは、宿主細胞におけるＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現、又はＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子及びＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の両方の活性若しくは発現の阻害のため、或いは宿主細胞におけるＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現、又はＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子及びＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の両方の活性若しくは発現を増加させるために適切であり得る。遺伝子コンストラクトは、それがベクターに組み込まれることなく、宿主細胞に導入され得る。例えば、核酸分子であり得る遺伝子コンストラクトは、リポソーム又はウイルス粒子内に組み込まれ得る。或いは、精製された核酸分子（例えば、ヒストンなしのＤＮＡ又はネイキッドＤＮＡ）は、適切な手段、例えば、直接エンドサイトーシス取り込みによって、宿主細胞に直接挿入され得る。遺伝子コンストラクトは、トランスフェクション、感染、マイクロインジェクション、細胞融合、プロトプラスト融合又は弾道衝撃によって、宿主対象（例えば、植物）の細胞に直接導入され得る。或いは、本発明の遺伝子コンストラクトは、パーティクルガンを使用して、宿主細胞に直接導入され得る。
【０２３９】
或いは、遺伝子コンストラクトは、適切な宿主細胞での発現のために、組換えベクター内に含まれ得るか、又は内包され得る。組換えベクターは、プラスミド、コスミド又はファージであり得る。このような組換えベクターは、本発明の遺伝子コンストラクトを有する宿主細胞を形質転換するため、及びそれらにおいて発現カセットを複製するために、非常に有用である。当業者であれば、本発明の遺伝子コンストラクトが、発現の目的で多くのタイプの主鎖ベクターと組み合わされ得ることは理解されよう。主鎖ベクターは、バイナリーベクター、例えば、大腸菌（E. coli）及びアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の両方において複製することができるものであり得る。例えば、適切なベクターは、pBIN19（Bevan M., 1984, Nucleic Acids Research 12:8711-21）等のpBINプラスミドであり得る。
【０２４０】
組換えベクターは、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現、又は少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子及び少なくとも１つのＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の両方の活性若しくは発現を阻害する配列に加えて、様々な他の機能的エレメントを含み得る。例えば、ベクターは、プロモーターを含み得る。加えて、組換えベクターは、それが宿主細胞のサイトゾルにおいて自発的に複製するように、設計され得る。この場合において、ＤＮＡ複製を誘導又は制御するエレメントは、組換えベクターにおいて必要であり得る。或いは、組換えベクターは、それが宿主細胞のゲノムに統合されるように、設計され得る。この場合において、（例えば、相同組換えによる）標的化統合に好都合であるＤＮＡ配列が想定される。
【０２４１】
組換えベクターは、クローニングプロセスにおける選択可能マーカーとして使用され得る、即ち、トランスフェクト又は形質転換された細胞の選択を可能にし、異種ＤＮＡを組み込むベクターを内包する細胞の選択を可能にする、遺伝子のためのＤＮＡコードも含み得る。ベクターは、コード配列の発現の制御に関与するか、又は発現したポリペプチドを宿主細胞のある部分、例えば、毛状突起若しくは腺毛状突起を標的にするためのＤＮＡも含み得る。このように、ベクターは、選択可能マーカー遺伝子（例えば、抗生物質耐性遺伝子）、ポリペプチド終結シグナル、及びタンパク質標的化配列（例えば、輸送ペプチド）からなる群から選択される少なくとも１つの追加エレメントを含み得る。
【０２４２】
１つの実施形態において、本方法又は使用は、オリゴヌクレオチドの干渉を使用して、Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現、又はＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子及びＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の両方の活性若しくは発現を阻害することを含み得る。１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドはＲＮＡに基づく。１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ、RNA interference）、例えば、ｄｓＲＮＡｉである。１つの実施形態において、本方法は、Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現、又はＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子及びＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の両方の活性若しくは発現を阻害する、ＲＮＡｉ分子、例えば、ｄｓＲＮＡｉで、植物（例えば、タバコ植物）の細胞を形質転換することを含み得る。
【０２４３】
１つの実施形態において、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現は、野生型植物におけるポリペプチドの活性又は発現と比較して、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくはそれ以上まで、又は１００％まで、減少している。
【０２４４】
１つの実施形態において、少なくとも１つのＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現は、野生型植物におけるポリペプチドの活性又は発現と比較して、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくはそれ以上まで、又は１００％まで、減少している。
【０２４５】
１つの実施形態において、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子及び少なくとも１つのＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の両方の活性又は発現は、野生型植物におけるポリペプチドの活性又は発現と比較して、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくはそれ以上まで、又は１００％まで、減少している。
【０２４６】
少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現、又は少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子及び少なくとも１つのＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の両方の活性若しくは発現は、当技術分野において公知の任意の方法によって阻害され得る。先行する実施形態のいずれかにおいて、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現、又は少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子及び少なくとも１つのＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の両方の活性若しくは発現は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムの使用を含む、ＣＲＩＳＰＲを含む遺伝子編集方法、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、アンチセンス若しくはセンス共抑制、遺伝子編集又は標的化変異誘発を含む任意の方法によって阻害され得る。先行する実施形態のいずれかにおいて、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現、又は少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子及び少なくとも１つのＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の両方の活性若しくは発現は、ＲＮＡｉ方法を使用して、例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを使用して、阻害され得る。
【０２４７】
１つの実施形態において、Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現、又は少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子及び少なくとも１つのＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の両方の活性若しくは発現を調節するコンストラクトは、ベクターに含まれ得る。適切には、ベクターはプラスミドであり得る。
【０２４８】
１つの実施形態において、本発明における使用のためのベクターは、アグロバクテリウム（Agrobacterium）系プラスミドである。
【０２４９】
したがって、１つの実施形態において、Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の発現、又はＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子及びＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の両方の活性若しくは発現が調節されている、植物（例えば、タバコ植物）及び植物繁殖材料（例えば、タバコ植物繁殖材料）、葉（例えば、タバコ葉）、カットされ、収穫された葉、処理された葉（例えば、処理されたタバコ葉）、又はカット及び処理された葉（例えば、カット及び処理されたタバコ葉）を提供する。
【０２５０】
別の実施形態において、細胞（例えば、タバコ細胞）、植物（例えば、タバコ植物）若しくはその一部、及び／又は植物繁殖材料は、Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現、又はＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子及びＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の両方の活性若しくは発現を調節するコンストラクトを含み得る。１つの実施形態において、コンストラクトは、Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現、又はＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子及びＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の両方の活性若しくは発現を減少させる。別の実施形態において、コンストラクトは、Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現、又はＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子及びＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の両方の活性若しくは発現を増加させる。
【０２５１】
さらなる実施形態において、本発明による細胞（例えば、タバコ細胞）、植物（例えば、タバコ植物）若しくはその一部、及び／又は植物繁殖材料は以下を含み得る：
ｉ）本明細書において、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号９、配列番号１３、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２５、配列番号２９、若しくは配列番号３３として示されるポリヌクレオチド配列；又は
ii）機能的断片がＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子をコードする、ｉ）において示されるポリヌクレオチド配列の機能的断片；又は
iii）本明細書において、配列番号４、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２４、配列番号２８、配列番号３２、若しくは配列番号３６として示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；又は
iv）高ストリンジェンシー条件下で、上記ｉ）、ii）若しくはiii）において教示されるポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド配列；又は
ｖ）上記ｉ）、ii）若しくはiii）において示されるポリヌクレオチドと少なくとも７０％（好ましくは、８０％、好ましくは、８５％、好ましくは、９０％、好ましくは、９５％、より好ましくは、９６％、より好ましくは、９７％、より好ましくは、９８％）の同一性を有するポリヌクレオチド配列；又は
vi）遺伝コードの縮重に起因して、ｉ）、ii）若しくはiii）において示されるポリヌクレオチドと異なるポリヌクレオチド配列。
【０２５２】
１つの実施形態において、細胞（例えば、タバコ細胞）は、細胞培養において増殖する。
【０２５３】
１つの実施形態において、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子（又は、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子及び少なくとも１つのＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の両方）は、細胞又は細胞培養物（例えば、タバコ細胞培養物）中のアルカロイド含有量（例えば、ニコチン含有量）を調節するために使用される。
【０２５４】
有利な実施形態において、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現、又は少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子及び少なくとも１つのＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の両方の活性若しくは発現の阻害は、アルカロイド含有量の減少をもたらし得る。適切には、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現、又は少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子及び少なくとも１つのＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の両方の活性若しくは発現の阻害は、ニコチン含有量の減少をもたらし得る。
【０２５５】
別の実施形態において、Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現、又はＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子及びＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の両方の活性若しくは発現を増加させることで、アルカロイド含有量の増加をもたらし得る。適切には、Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現、又はＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子及びＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の両方の活性若しくは発現を増加させることで、ニコチン含有量の増加をもたらし得る。
【０２５６】
１つの実施形態において、植物又はその一部はタバコ植物である。１つの実施形態において、本発明によるタバコ植物又はその一部は、本発明に従って改変されたバーレー又は熱風乾燥処理された植物である。１つの実施形態において、本発明は、本発明に従って改変されたバーレー又は熱風乾燥処理された植物に関する。１つの実施形態において、本発明によるタバコ植物（例えば、改変されたタバコ植物）は、オリエンタル（Oriental）又はトルコ（Turkish）タバコ植物である。
【０２５７】
１つの実施形態において、タバコ植物又はその一部は乾燥処理される。１つの実施形態において、タバコ植物又はその一部は、乾燥処理、例えば、空気乾燥処理、熱風乾燥処理、火力乾燥処理、又は天日乾燥処理される。さらなる態様において、タバコ植物又はその一部は熱風乾燥処理される。さらなる態様において、タバコ植物又はその一部は空気乾燥処理される。
【０２５８】
熱風乾燥処理は、当技術分野において周知であり、燃焼ボックス又はガス燃料システムによって供給される送気管を用いてタバコを乾燥処理するプロセスを指す。このプロセスは、タバコを煙に曝すことなく熱乾燥処理し、乾燥処理の過程でゆっくりと温度を上昇させる。この方法は、糖が高く、中〜高レベルのニコチンを有するタバコを製造する。スミスタバコ乾燥部屋は、伝統的な熱風乾燥処理するタバコ乾燥部屋の例である。
【０２５９】
空気乾燥処理されたタバコとしては、バーレータバコ、メリーランドタバコ及び暗色タバコが挙げられる。共通の要因は、乾燥処理が、主に、熱及び湿気の人工源なしであることである。バーレータバコは、淡褐色〜暗褐色の色で、油分が高く、糖が低い。バーレータバコは、乾燥小屋で空気乾燥処理される。バーレーを栽培している主要な国は、アルゼンチン、ブラジル、イタリア、マラウイ及び米国である。バーレータバコ植物としては、例えば、クレイ（Clay）４０２、クレイ４０３、クレイ５０２、Ｋｙ１４、Ｋｙ９０７、Ｋｙ９１０、Ｋｙ８９５９、ＮＣ２、ＮＣ３、ＮＣ４、ＮＣ５、ＮＣ２０００、ＴＮ８６、ＴＮ９０、ＴＮ９７、Ｒ６１０、Ｒ６３０、Ｒ７１１、Ｒ７１２、ＮＣＢＨ１２９、Ｂｕ２１×Ｋｙ１０、ＨＢ０４Ｐ、Ｋｙ１４×Ｌ８、Ｋｔ２００、ニュートン（Newton）９８、ペディゴ（Pedigo）５６１、Ｐｆ５６１、及びＶａ５０９が挙げられる。
【０２６０】
メリーランドタバコは、良好な燃焼性、低ニコチン及び中性アロマを有する。メリーランドを栽培している主要な国は、米国及びイタリアが挙げられる。暗色の空気乾燥処理されたタバコは、中から暗褐色の色及び独特のアロマの暗色の空気乾燥処理されたタバコを与える、その発酵プロセスによって、主に他のタイプと区別される。これらの葉は、低糖含有量であるが、高ニコチン含有量を有する。暗色の空気乾燥処理されたタバコは、主に、噛みタバコ及び嗅ぎタバコの製造において使用される。暗色の火力乾燥処理されたタバコについて主に栽培される地域は、米国のテネシー、ケンタッキー及びバージニアである。
【０２６１】
本明細書において使用される「機能的断片」という用語は、ポリヌクレオチドと同じ方法で機能する能力があるポリヌクレオチドの一部分を指す。例えば、ポリヌクレオチドがＥＲＦ遺伝子である場合、その結果、機能的断片は、ＥＲＦ遺伝子として機能する能力がなければならず、例えば、機能的断片は、ＥＲＦ遺伝子の活性を保持する。機能的断片は、全長ポリヌクレオチドの活性のレベルと等しいか、又はそれよりも大きい活性のレベルを有し得る。
【０２６２】
１つの実施形態において、機能的断片は、少なくとも５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個、又は１０００個の連続的なヌクレオチドを含む、本明細書において議論されるＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の一部分であり得る。いくつかの実施形態において、機能的断片は、本明細書において議論されるＮｉｃ１  ＥＲＦの少なくとも１５０個のヌクレオチドを含み得る。
【０２６３】
１つの実施形態において、Ｎｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の機能的断片は、少なくとも５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個、又は１０００個の連続的なヌクレオチドを含む、本明細書において議論されるＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の一部分であり得る。いくつかの実施形態において、機能的断片は、本明細書において議論されるＮｉｃ２  ＥＲＦの少なくとも１５０個のヌクレオチドを含み得る。
【０２６４】
本明細書において使用される「機能的バリアント」という用語は、遺伝子の機能及び／又はタンパク質の機能のいずれかにおいて活性の顕著な喪失なく、ゲノム配列において生じ得る可変性を指す。例えば、ポリペプチド中に存在するいくつかのアミノ酸（又は、ポリヌクレオチド中に存在するいくつかのヌクレオチド）は、活性の顕著な喪失なく、置換され得る。機能的バリアントは、非バリアントポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドの活性のレベルと等しいか、又はそれよりも大きい活性のレベルを有し得る。遺伝コードの縮重に起因する本明細書に開示のＥＲＦ遺伝子と異なる配列は、機能的バリアントである。バリアントは、わずか１０個、わずか９個、わずか８個、わずか７個、わずか６個、わずか５個、わずか４個、わずか３個、わずか２個、又はわずか１個のアミノ酸が所望の配列と異なり得る。
【０２６５】
本明細書において使用される「遺伝コードの縮重」という用語は、アミノ酸を特定する多様な３コドンの組み合わせとして示されるポリペプチド配列をコードするコドンの重複性を指す。例えば、アミノ酸のイソロイシンを有するポリペプチドをコードするｍＲＮＡ分子において、イソロイシンは、ＡＵＵ、ＡＵＣ又はＡＵＡによってコードされ得る。これは、ＲＮＡをコードするＤＮＡ分子は、複数の配列を有することができるが、生じるポリペプチドは同じ配列を有することを意味する。言い換えれば、多型ヌクレオチド配列は、同じポリペプチド産物をコードすることができる。これは、１つの核酸配列は、同じポリペプチド配列をコードするが、第２の配列と非常に低い配列同一性を有する配列を含むことができる。
【０２６６】
本明細書に記載の特異的な性質を有するポリペプチドのアミノ酸配列、又は本明細書に記載の任意のヌクレオチド配列とある程度の配列同一性若しくは配列相同性を有する配列は、機能的バリアントであり得る。
【０２６７】
本明細書において使用される「オルソログ」という用語は、共通の先祖遺伝子に由来し、スペシエーションの結果として異なる種において見出される、遺伝子を指す。オルソログは、ヌクレオチド配列及び／又はアミノ酸配列のレベルで、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれよりも大きい配列同一性を共有し得る。オルソログ遺伝子は、多くの場合、同じ又は同様の機能を共有し、即ち、保存的機能を有する。
【０２６８】
本発明のいくつかの実施形態において、プロモーターが提供され得る。本発明における使用のためのプロモーターは、構成的プロモーター、老化特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、発生学的に制御されるプロモーター、及び誘導プロモーターからなる群から選択される１又は２以上であり得る。１つの実施形態において、プロモーターは構成的プロモーターであり得る。
【０２６９】
構成的プロモーターは、植物の発育の間、連続的に、植物の様々な部分にわたって遺伝子の発現を方向づけるが、遺伝子がすべての細胞のタイプにおいて同じレベルで発現されるわけではない場合がある。公知の構成的プロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウイルス35S転写物（Odell JT, Nagy F, Chua NH (1985) Identification of DNA sequences required for activity of the cauliflower mosaic virus 35S promoter, Nature 313 810-2）、コメアクチン１遺伝子（Zhang W, McElroy D, Wu R. (1991) Analysis of rice Act1 5' region activity in transgenic rice plants (Plant Cell 3 1155-65)）、及びトウモロコシユビキチン１遺伝子（Cornejo MJ, Luth D, Blankenship KM, Anderson OD, Blechl AE. (1993). Activity of a maize ubiquitin promoter in transgenic rice. Plant Molec. Biol. 23 567-81）に関連するものが挙げられ、これらは、参照によって本明細書に組み込まれる。構成的プロモーターとしては、カーネーションエッチドリングウイルス（ＣＥＲＶ、Carnation Etched Ring Virus）プロモーターが挙げられる。カーネーションエッチドリングウイルスのＤＮＡの配列は、カリフラワーモザイクウイルス及びレトロウイルスと比較される（Hull R, Sadler J, Longstaff M 1986 EMBO Journal, 5(2):3083-3090、これは、参照によって本明細書に組み込まれる）。
【０２７０】
構成的プロモーターは、カーネーションエッチドリングウイルス（ＣＥＲＶ）プロモーター、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター）、コメアクチン１遺伝子又はトウモロコシユビキチン１遺伝子に由来のプロモーターから選択され得る。適切には、プロモーターは、ＣＥＲＶプロモーターであり得る。
【０２７１】
或いは、いくつかの実施形態において、プロモーターは、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター）ではない場合がある。１つの実施形態において、プロモーターは老化特異的プロモーターであり得る。「老化特異的プロモーター」（ＳＡＧ、senescence-specific promoter）は、老化関連遺伝子の発現のコントロールと関連するプロモーターであり得る。そのため、このプロモーターは、それが、老化した組織において、実質的に排他的に作動可能に連結されるコード配列（すなわち、遺伝子）の発現を制限することができる。したがって、老化特異的プロモーターは、植物組織が老化を受けている場合にのみ実質的に３’タンパク質コード領域の発現が起こるように、発生が制御された方法で植物組織における遺伝子発現を優先的に促進する能力があるプロモーターであり得る。老化は、より古い葉等の植物のより古い部分で起こる傾向があり、種子等の植物のより若い部分において起こらない傾向があることが理解される。
【０２７２】
多数の老化関連遺伝子を発現することが公知の植物の１つの例は、シロイヌナズナ（Arabidopsis）である。そのため、このプロモーターは、シロイヌナズナにおける老化関連遺伝子から単離され得る。参照によって本明細書に組み込まれるGepstein et al.（The Plant Journal, 2003, 36, 629-642）は、ＳＡＧ及びモデルとしてシロイヌナズナを使用するこれらのプロモーターの詳細な研究を実施した。遺伝子コンストラクトは、この論文中で開示されたＳＡＧのいずれかに由来のプロモーターを含み得る。例えば、適切なプロモーターは、ＳＡＧ１２、ＳＡＧ１３、ＳＡＧ１０１、ＳＡＧ２１及びＳＡＧ１８、並びにそれらの機能的バリアント若しくは機能的断片からなる群から選択され得る。
【０２７３】
１つの実施形態において、プロモーターはＳＡＧ１２又はＳＡＧ１３プロモーターであり得る。１つの実施形態において、プロモーターは、当業者に公知であるＳＡＧ１２プロモーター、又はそれらの機能的バリアント若しくは機能的断片であり得る（Gan & Amasino, 1997, Plant Physiology, 113: 313-319、参照によって本明細書に組み込まれる）。適切なプロモーター及びその配列は、国際公開第２０１０／０９７６２３号パンフレット（参照によって本明細書に組み込まれる）において見出され得る。
【０２７４】
別の実施形態において、プロモーターは組織特異的プロモーターであり得る。組織特異的プロモーターは、通常、その植物の一部の寿命全体にわたって、植物の１つの（又はわずかな）一部において遺伝子の発現を方向づけるプロモーターである。組織特異的プロモーターのカテゴリーは、一般に、特異性が絶対的ではないプロモーターも含み、すなわち、これらはまた、好ましい組織以外の組織においてより低いレベルで発現を方向づけ得る。いくつかの組織特異的プロモーターは、当技術分野において公知であり、ジャガイモ塊茎において発現するパタチン遺伝子、及び小麦、大麦又はトウモロコシの胚乳において発現する高分子量のグルテニン遺伝子に関連するプロモーターが挙げられる。これらのプロモーターのいずれかが本発明において使用され得る。
【０２７５】
適切には、組織特異的プロモーターは、葉特異的プロモーターであり得る。適切には、葉特異的プロモーターとしては、非対称葉１（ＡＳ１、ASYMMETRIC LEAVES 1）が挙げられ得る。
【０２７６】
特に好ましい実施形態において、組織特異的プロモーターは、根特異的プロモーターである。
【０２７７】
別の実施形態において、プロモーターは、発生学的に制御されるプロモーターであり得る。発生学的に制御されるプロモーターは、植物の発生の間、特定の時期で植物の１又は２以上の一部における遺伝子の発現の変化を方向づける。遺伝子は、異なる（通常、より低い）レベルで、他の時にその植物の一部で発現され得、他の植物の一部においても発現され得る。
【０２７８】
１つの実施形態において、プロモーターは誘導プロモーターであり得る。誘導プロモーターは、誘導因子に応答して遺伝子の発現を方向づける能力がある。誘導因子の非存在中において、遺伝子は、発現しない。誘導因子は、プロモーター配列において直接作用し得るか、又はリプレッサー分子の効果に対抗することによって作用し得る。この誘導因子は、代謝産物、タンパク質、成長調節物質、若しくは毒性エレメント等の化学物質、熱、傷、若しくは浸透圧等の生理的ストレス、又は病原体若しくは有害生物の作用の間接的な結果であり得る。発生学的に制御されるプロモーターは、植物によって産生される内因性誘導因子、又は植物のライフサイクルの特定のポイントでの環境刺激に応答する特定のタイプの誘導プロモーターとして記載される可能性がある。公知の誘導プロモーターの例としては、参照によって本明細書に組み込まれるWarner SA, Scott R, Draper J. (1993)（Isolation of an asparagus intracellular PR gene (AoPR1) wound-responsive promoter by the inverse polymerase chain reaction and its characterization in transgenic tobacco. Plant J. 3 191-201）に記載のような傷の応答、参照によって本明細書に組み込まれるBenfey & Chua (1989)（Benfey, P.N., and Chua, N-H. (1989) Regulated genes in transgenic plants. Science 244 174-181）に開示の温度応答、及び参照によって本明細書に組み込まれるGatz (1995)（Gatz, C. (1995) Novel inducible/repressible gene expression systems. Methods in Cell Biol. 50 411-424）に記載のような化学的誘導に関連するプロモーターが挙げられる。
【０２７９】
このように、１つの実施形態において、プロモーターは、ＣＥＲＶプロモーター、（完全又はトランケートされた）カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、ルビスコプロモーター、エンドウプラストシアニンプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、クロロフィルｒ／ｂ結合プロモーター、高分子量グルテニンプロモーター、α，β−グリアジンプロモーター、ホルデインプロモーター、及びパタチンプロモーターからなる群から選択され得る。
【０２８０】
１つの実施形態において、プロモーターは、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター、又は重複エンハンサー領域又は二重エンハンサー領域を有する改変３５Ｓプロモーター（参照によって本明細書に組み込まれるR. Kay et al. Science. 1987 Jun 5;236(4806):1299-302）であり得る。
【０２８１】
１つの実施形態において、プロモーターはネイティブプロモーターであり得る。
【０２８２】
本明細書で使用される場合、「ネイティブプロモーター」は、遺伝子に対して内因性である、即ち、実質上、遺伝子に作動可能に連結された、プロモーターを指す。
【０２８３】
組換えベクターは、クローニングプロセスにおける選択可能マーカーとして使用され得る、即ち、トランスフェクト又は形質転換された細胞の選択を可能にし、異種ＤＮＡを組み込むベクターを内包する細胞の選択を可能にする、遺伝子のためのＤＮＡコードも含み得る。ベクターは、コード配列の発現の制御に関与するか、又は発現したポリペプチドを宿主細胞のある一部、例えば、葉緑体を標的にするためのＤＮＡも含み得る。このように、ベクターは、選択可能マーカー遺伝子（例えば、抗生物質耐性遺伝子）、ポリペプチド終結シグナル、及びタンパク質標的化配列（例えば、葉緑体輸送ペプチド）からなる群から選択される少なくとも１つの追加エレメントを含み得る。
【０２８４】
適切なマーカー遺伝子の例としては、カナマイシン、ジェネティシン（Ｇ４１８）及びハイグロマイシン（ｎｐｔ−ＩＩ、ｈｙｇ−Ｂ）に対する耐性をもたらす遺伝子等の抗生物質耐性遺伝子；参照によって本明細書に組み込まれるホスフィノトリシン系及びスルホンアミド系除草剤に対する耐性をもたらす遺伝子（それぞれ、ｂａｒ及びｓｕＩ；欧州特許出願公開第２４２２４６号明細書、欧州特許出願公開第０２４９６３７号明細書）等の除草剤耐性遺伝子；並びに参照によって本明細書に組み込まれるベータ−グルクロニダーゼ（英国特許第２１９７６５３号明細書）、ルシフェラーゼ及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ、green fluorescent protein）等のスクリーニング可能マーカーが挙げられる。マーカー遺伝子は、種子に存在し得るか、又は存在し得ない細胞中での発現を可能にする第２のプロモーターによってコントロールされていてもよく、それによって、植物の発生の任意の段階でマーカーを含有する細胞又は組織の選択を可能にする。適切な第２のプロモーターは、アグロバクテリウムのノパリンシンターゼ遺伝子のプロモーター、及び３５Ｓカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ、cauliflower mosaic virus）転写物をコードする遺伝子に由来するプロモーターである。しかしながら、任意の他の適切な第２のプロモーターを使用してもよい。
【０２８５】
商業的に望ましい形質
１つの実施形態において、本発明の植物は、総アルカロイド含有量が低減され、並びに／又はニコチン、ノルニコチン、アナバシン、ミオスミン及びアナタビンから選択される１若しくは２以上のアルカロイドの含有量が低減され、並びに／又はニコチンが低減されているが、フレーバー特性及び／又は他の商業的に望ましい形質が少なくとも維持されている。１つの実施形態において、本発明の植物は、本発明に従って改変されていない植物と同様のグレード及び／又は品質の葉を生産する。
【０２８６】
１つの実施形態において、本発明の植物は、（例えば、本発明に従って改変されていない同じ植物と比較して）植物のフレーバー特性における顕著な変化がなく、低減されたニコチン含有量を有する。
【０２８７】
１つの実施形態において、本発明の植物は、（例えば、本発明に従って改変されていない同じ植物と比較して）植物の他の商業的に望ましい形質における顕著な変化（例えば、減少）がなく、低減されたニコチン含有量を有する。特に、改変植物の収量は、好ましくは、本発明に従って改変されていない同じ植物と比較して、低減されない。
【０２８８】
したがって、１つの実施形態において、本発明の方法及び使用は、総アルカロイド含有量の低減、並びに／又はニコチン、ノルニコチン、アナバシン及びアナタビンから選択される１若しくは２以上のアルカロイドの低減、並びに／又はニコチンの低減に関し、さらにフレーバー特性及び／又は他の商業的に望ましい形質（例えば、収量）の維持に関する。
【０２８９】
「商業的に望ましい形質」という用語は、収量、成熟した植物の高さ、収穫可能な葉の数、平均節の長さ、カッター葉の長さ、カッター葉の幅、品質、非生物的（例えば、干ばつ）ストレス耐性、除草剤耐性及び／又は生物的（例えば、昆虫、細菌又は真菌）ストレス耐性等の形質を含む。
【０２９０】
本明細書において教示される「商業的に望ましい形質」という用語は、同様の圃場条件で生育した場合、同等の植物の熱風乾燥処理された親における前記形質と同等の、干ばつ耐性、有害生物耐性、成熟した植物の高さ、収穫可能な葉の数、平均節の長さ、カッター葉の長さ、カッター葉の幅、及び収量等の形質を含む。
【０２９１】
特に断りのない限り、本明細書で使用される場合、タバコの収量は、標準的な農学及び乾燥処理の慣行の後、標準的な圃場の条件下での１エーカー当たりの乾燥処理されたタバコ葉の重量に基づいて計算された乾燥処理された葉の収量を指す。
【０２９２】
１つの態様において、本発明の植物（例えば、タバコ植物）は、同様の圃場の条件で生育した場合、同等の植物の収量の、５０％〜１５０％の間、５５％〜１４５％の間、６０％〜１４０％の間、６５％〜１３５％の間、７０％〜１３０％の間、７５％〜１２５％の間、８０％〜１２０％の間、８５％〜１１５％の間、９０％〜１１０％の間、９５％〜１０５％の間、５０％〜１００％の間、５５％〜１００％の間、６０％〜１００％の間、６５％〜１００％の間、７０％〜１００％の間、７５％〜１００％の間、８０％〜１００％の間、８５％〜１００％の間、９０％〜１００％の間、９５％〜１００％の間、１００％〜１５０％の間、１０５％〜１５０％の間、１１０％〜１５０％の間、１１５％〜１５０％の間、１２０％〜１５０％の間、１２５％〜１５０％の間、１３０％〜１５０％の間、１３５％〜１５０％の間、１４０％〜１５０％の間、又は１４５％〜１５０％の間の収量を有する。
【０２９３】
別の態様において、本発明の植物（例えば、タバコ植物）の収量は、同様の圃場の条件で生育した場合、同等の植物の収量の、およそ１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、２．１倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、２．５倍、２．６倍、２．７倍、２．８倍、２．９倍、又は３．０倍である。
【０２９４】
別の態様において、本発明のタバコ植物の収量は、同様の圃場の条件で生育した場合、熱風乾燥処理された同等の植物の収量と同等である。
【０２９５】
１つの態様において、本発明のタバコ植物は、約１２００〜３５００ポンド／エーカーの間、１３００〜３４００ポンド／エーカーの間、１４００〜３３００ポンド／エーカーの間、１５００〜３２００ポンド／エーカーの間、１６００〜３１００ポンド／エーカーの間、１７００〜３０００ポンド／エーカーの間、１８００〜２９００ポンド／エーカーの間、１９００〜２８００ポンド／エーカーの間、２０００〜２７００ポンド／エーカーの間、２１００〜２６００ポンド／エーカーの間、２２００〜２５００ポンド／エーカーの間、及び２３００〜２４００ポンド／エーカーの間からなる群から選択される収量を提供する。
【０２９６】
別の態様において、本発明のタバコ植物は、約１２００〜３５００ポンド／エーカーの間、１３００〜３５００ポンド／エーカーの間、１４００〜３５００ポンド／エーカーの間、１５００〜３５００ポンド／エーカーの間、１６００〜３５００ポンド／エーカーの間、１７００〜３５００ポンド／エーカーの間、１８００〜３５００ポンド／エーカーの間、１９００〜３５００ポンド／エーカーの間、２０００〜３５００ポンド／エーカーの間、２１００〜３５００ポンド／エーカーの間、２２００〜３５００ポンド／エーカーの間、２３００〜３５００ポンド／エーカーの間、２４００〜３５００ポンド／エーカーの間、２５００〜３５００ポンド／エーカーの間、２６００〜３５００ポンド／エーカーの間、２７００〜３５００ポンド／エーカーの間、２８００〜３５００ポンド／エーカーの間、２９００〜３５００ポンド／エーカーの間、３０００〜３５００ポンド／エーカーの間、及び３１００〜３５００ポンド／エーカーの間からなる群から選択される収量を提供する。
【０２９７】
さらなる態様において、本発明のタバコ植物は、約１２００〜３５００ポンド／エーカーの間、１２００〜３４００ポンド／エーカーの間、１２００〜３３００ポンド／エーカーの間、１２００〜３２００ポンド／エーカーの間、１２００〜３１００ポンド／エーカーの間、１２００〜３０００ポンド／エーカーの間、１２００〜２９００ポンド／エーカーの間、１２００〜２８００ポンド／エーカーの間、１２００〜２７００ポンド／エーカーの間、１２００〜２６００ポンド／エーカーの間、１２００〜２５００ポンド／エーカーの間、１２００〜２４００ポンド／エーカーの間、１２００〜２３００ポンド／エーカーの間、１２００〜２２００ポンド／エーカーの間、１２００〜２１００ポンド／エーカーの間、１２００〜２０００ポンド／エーカーの間、１２００〜１９００ポンド／エーカーの間、１２００〜１８００ポンド／エーカーの間、１２００〜１７００ポンド／エーカーの間、１２００〜１６００ポンド／エーカーの間、１２００〜１５００ポンド／エーカーの間、及び１２００〜１４００ポンド／エーカーの間からなる群から選択される収量を提供する。
【０２９８】
植物
本発明による適切な植物としては、例えば、チョウセンアサガオ、ナス、マンドレイク、致死性イヌホオズキ（ベラドンナ）、トウガラシ属（パプリカ、トウガラシ）、ジャガイモ及びタバコを含む、ナス科の植物が挙げられる。
【０２９９】
１つの実施形態において、ナス科の適切な属は、ナス属、例えば、トマトである。
【０３００】
１つの実施形態において、ナス科の適切な属は、タバコ属、例えば、ニコチアナ・タバカム、又はニコチアナ・ルスティカ（Nicotiana rustica）である。
【０３０１】
適切なタバコ属の種は、ニコチアナ・タバカムであり得る。タバコ属の種は、本明細書において、タバコ植物、又は単にタバコと称し得る。
【０３０２】
タバコ植物
本発明は、植物（例えば、タバコ植物）、並びに細胞（例えば、タバコ細胞）、植物（例えば、タバコ植物）及び植物繁殖材料を対象とする方法、使用を提供する。
【０３０３】
本明細書において使用される「タバコ」という用語は、タバコ製品の製造において使用されるタバコ属の植物を指す。適切な「タバコ」植物の非限定的な例としては、Ｎ．タバカム及びＮ．ルスティカ（N. rustica）（例えば、Ｎ．タバカムＬ．（N. tabacum L.）、ＬＡ  Ｂ２１、ＬＮ  ＫＹ１７１、Ｔｌ  １４０６、バスマ（Basma）、ガルパオ（Galpao）、ペリック（Perique）、バインハート（Beinhart）１０００−１、及びペティコ（Petico））が挙げられる。
【０３０４】
１つの実施形態において、適切なタバコ植物は、任意のＮ．タバカムの生殖質、系統又は品種であり得る。
【０３０５】
別の実施形態において、適切なタバコ植物は、非タバカム種であり得る。
【０３０６】
タバコ材料は、一般に、バーレー品種、フルー（flue）又は明色品種、及び暗色品種として公知の、ニコチアナ・タバカムタイプの品種に由来するか、又はこれから得ることができるものであってもよい。いくつかの実施形態において、タバコ材料は、バーレー、バージニア（Virginia）又は暗色タバコ植物に由来する。タバコ植物は、バーレータバコ、レアタバコ、スペシャリティータバコ、膨張タバコ等から選択され得る。
【０３０７】
タバコ栽培品種、及び優良タバコ栽培品種の使用も本明細書において考慮される。したがって、本明細書における使用のためのタバコ植物は、タバコ品種又は優良タバコ栽培品種であり得る。特に有用なニコチアナ・タバカム品種としては、熱風乾燥処理されたバージニアタイプ、バーレータイプ及びオリエンタルタイプが挙げられる。
【０３０８】
いくつかの実施形態において、タバコ植物は、例えば、１又は２以上の以下の品種から選択され得る：Ｌ．栽培品種Ｔ．Ｉ．１０６８、ＡＡ３７−１、Ｂ１３Ｐ、クサンティ（Xanthi）（ミッチェル−モー（Mitchell-Mor））、ＫＴ  Ｄ＃３ハイブリッド１０７、Ｂｅｌ−Ｗ３、７９−６１５、サムスン  ホームズ（Samsun Holmes）ＮＮ、ＢＵ２１×ホヤ  パラド（Hoja Parado）交雑種由来のＦ４、系統９７、ＫＴＲＤＣ＃２ハイブリッド４９、ＫＴＲＤＣ＃４ハイブリッド１  １０、バーレー２１、ＰＭ０１６、ＫＴＲＤＣ＃５ＫＹ  １６０  ＳＩ、ＫＴＲＤＣ＃７ＦＣＡ、ＫＴＲＤＣ＃６ＴＮ８６  ＳＩ、ＰＭ０２１、Ｋ１４９、Ｋ３２６、Ｋ３４６、Ｋ３５８、Ｋ３９４、Ｋ３９９、Ｋ７３０、ＫＹ１０、ＫＹ１４、ＫＹ１６０、ＫＹ１７、ＫＹ８９５９、ＫＹ９、ＫＹ９０７、ＭＤ６０９、マクネアー（McNair）３７３、ＮＣ２０００、ＰＧ０１、ＰＧ０４、Ｐ０１、Ｐ０２、Ｐ０３、ＲＧ１１、ＲＧ１７、ＲＧ８、スペイト（Speight）Ｇ−２８、ＴＮ８６、ＴＮ９０、ＶＡ５０９、ＡＳ４４、バンケット（Banket）Ａ１、バスマ  ドラマ（Basma Drama）Ｂ８４／３１、バスマIジクナ（Basma I Zichna）ＺＰ４／Ｂ、バスマ  クサンティ（Basma Xanthi）ＢＸ２Ａ、バテク（Batek）、ベスキ  ジェンバー（Besuki Jember）、Ｃ１０４、コーカー（Coker）３１９、コーカー３４７、クリオロ  ミシオネロ（Criollo Misionero）、ＰＭ０９２、デルクレスト（Delcrest）、ジェベル（Djebel）８１、ＤＶＨ  ４０５、ガルパオ  コマム（Galpao Comum）、ＨＢ０４Ｐ、ヒックス  ブロードリーフ（Hicks Broadleaf）、カバクラック  エラソーナ（Kabakulak Elassona）、ＰＭ１０２、クツァゲ（Kutsage）Ｅ１、ＫＹ１４×Ｌ８、ＫＹ１７１、ＬＡ  ＢＵ２１、マクネアー９４４、ＮＣ２３２６、ＮＣ７１、ＮＣ２９７、ＮＣ３、ＰＶＨ０３、ＰＶＨ０９、ＰＶＨ１９、ＰＶＨ２１１０、レッド  ラッシアン（Red Russian）、サムスン（Samsun）、サプラック（Saplak）、シンマバ（Simmaba）、タルガー（Talgar）２８、ＰＭ１３２、ウィスリカ（Wislica）、ヤヤルダグ（Yayaldag）、ＮＣ４、ＴＲマドーレ（Madole）、プリレプ（Prilep）ＨＣ−７２、プリレプＰ２３、プリレプＰＢ１５６／１、プリレプＰ１２−２／１、ヤカ（Yaka）ＪＫ−４８、ヤカＪＢ１２５／３、ＴＩ−１０６８、ＫＤＨ−９６０、ＴＩ−１０７０、ＴＷ１３６、ＰＭ２０４、ＰＭ２０５、バスマ、ＴＫＦ４０２８、Ｌ８、ＴＫＦ２００２、ＴＮ９０、ＧＲ１４１、バスマ  クサンティ、ＧＲ１４９、ＧＲ１５３、及びプチ  ハバナ（Petit Havana）。
【０３０９】
品種又は栽培品種の非限定的な例は以下である：ＢＤ６４、ＣＣ１０１、ＣＣ２００、ＣＣ２７、ＣＣ３０１、ＣＣ４００、ＣＣ５００、ＣＣ６００、ＣＣ７００、ＣＣ８００、ＣＣ９００、コーカー１７６、コーカー３１９、コーカー３７１ゴールド、コーカー４８、ＣＤ２６３、ＤＦ９１１、ＤＴ５３８  ＬＣ、ガルパオタバコ、ＧＬ２６Ｈ、ＧＬ３５０、ＧＬ６００、ＧＬ７３７、ＧＬ９３９、ＧＬ９７３、ＨＢ０４Ｐ、ＨＢ０４Ｐ  ＬＣ、ＨＢ３３０７ＰＬＣ、ハイブリッド４０３ＬＣ、ハイブリッド４０４ＬＣ、ハイブリッド５０１  ＬＣ、Ｋ１４９、Ｋ３２６、Ｋ３４６、Ｋ３５８、Ｋ３９４、Ｋ３９９、Ｋ７３０、ＫＤＨ９５９、ＫＴ２００、ＫＴ２０４ＬＣ、ＫＹ１０、ＫＹ１４、ＫＹ１６０、ＫＹ１７、ＫＹ１７１、ＫＹ９０７、ＫＹ９０７ＬＣ、ＫＴＹ１４×Ｌ８ＬＣ、リトル  クリッテンデン（Little Crittenden）、マクネアー３７３、マクネアー９４４、ｍｓＫＹ１４×Ｌ８、ナロー  リーフ  マドーレ（Narrow Leaf Madole）、ナロー  リーフ  マドーレＬＣ、ＮＢＨ９８、Ｎ−１２６、Ｎ−７７７ＬＣ、Ｎ−７３７１  ＬＣ、ＮＣ１００、ＮＣ１０２、ＮＣ２０００、ＮＣ２９１、ＮＣ２９７、ＮＣ２９９、ＮＣ３、ＮＣ４、ＮＣ５、ＮＣ６、ＮＣ７、ＮＣ６０６、ＮＣ７１、ＮＣ７２、ＮＣ８１０、ＮＣ  ＢＨ１２９、ＮＣ２００２、ニール  スミス  マドーレ（Neal Smith Madole）、オックスフォード（OXFORD）２０７、ＰＤ７３０２  ＬＣ、ＰＤ７３０９  ＬＣ、ＰＤ７３１２  ＬＣ「ペリーク（periq'e）タバコ」、ＰＶＨ０３、ＰＶＨ０９、ＰＶＨ１９、ＰＶＨ５０、ＰＶＨ５１、Ｒ６１０、Ｒ６３０、Ｒ７−１  １、Ｒ７−１２、ＲＧ１７、ＲＧ８１、ＲＧＨ５１、ＲＧＨ４、ＲＧＨ５１、ＲＳ１４１０、スペイト１６８、スペイト１７２、スペイト１７９、スペイト２１０、スペイト２２０、スペイト２２５、スペイト２２７、スペイト２３４、スペイトＧ−２８、スペイトＧ−７０、スペイトＨ−６、スペイトＨ２０、スペイトＮＦ３、Ｔｌ  １４０６、Ｔｌ  １２６９、ＴＮ８６、ＴＮ８６ＬＣ、ＴＮ９０、ＴＮ９７、ＴＮ９７ＬＣ、ＴＮ  Ｄ９４、ＴＮ  Ｄ９５０、ＴＲ（トム  ロッソン（Tom Rosson））マドーレ、ＶＡ３０９、ＶＡ３５９、ＡＡ３７−１、Ｂ１３Ｐ、クサンティ（ミッチェル−モー）、Ｂｅｌ−Ｗ３、７９−６１５、サムスン  ホームズＮＮ、ＫＴＲＤＣナンバー２ハイブリッド４９、バーレー２１、ＫＹ８９５９、ＫＹ９、ＭＤ６０９、ＰＧ０１、ＰＧ０４、Ｐ０１、Ｐ０２、Ｐ０３、ＲＧ１  １、ＲＧ８、ＶＡ５０９、ＡＳ４４、バンケットＡ１、バスマ  ドラマＢ８４／３１、バスマＩジクナＺＰ４／Ｂ、バスマ  クサンティＢＸ  ２Ａ、バテク、ベスキ  ジェンバー、Ｃ１０４、コーカー３４７、クリオロ  ミシオネロ、デルクレスト、ジェベル８１、ＤＶＨ４０５、ガルパオ  コマム、ＨＢ０４Ｐ、ヒックス  ブロードリーフ、カバクラック  エラソーナ、クツァゲＥ１、ＬＡ  ＢＵ２１、ＮＣ２３２６、ＮＣ２９７、ＰＶＨ２１  １０、レッド  ラッシアン、サムスン、サプラック、シンマバ、タルガー２８、ウィスリカ、ヤヤルダグ、プリレプＨＣ−７２、プリレプＰ２３、プリレプＰＢ１５６／１、プリレプＰ１２−２／１、ヤカＪＫ−４８、ヤカＪＢ１２５／３、ＴＩ−１０６８、ＫＤＨ−９６０、Ｔｌ−１０７０、ＴＷ１３６、バスマ、ＴＫＦ４０２８、Ｌ８、ＴＫＦ２００２、ＧＲ１４１、バスマ  クサンティ、ＧＲ１４９、ＧＲ１５３、プチ  ハバナ。本明細書において具体的に特定されていないとしても、上記の低変換亜変種も考慮される。
【０３１０】
タバコ植物は、バーレー、熱風乾燥処理されたバージニア、又はオリエンタルであり得る。
【０３１１】
１つの実施形態において、植物繁殖材料は、本発明の植物（例えば、タバコ植物）から得ることができる。本明細書において使用される「植物繁殖材料」は、さらなる植物が生産し得る植物から採取される任意の植物体を指す。適切には、植物繁殖材料は種子であり得る。適切には、植物繁殖材料は花粉であり得る。
【０３１２】
１つの実施形態において、本発明の細胞（例えば、タバコ細胞）、植物（例えば、タバコ植物）及び／又は植物繁殖材料は、Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子、若しくはＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子及びＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の両方の調節された活性又は発現を含み得る。別の実施形態において、細胞（例えば、タバコ細胞）、植物（例えば、タバコ植物）及び／又は植物繁殖材料は、本発明によるコンストラクト又はベクターを含み得る。別の実施形態において、細胞（例えば、タバコ細胞）、植物（例えば、タバコ植物）及び／又は植物繁殖材料は、本発明による方法によって得ることができる（例えば、得られ得る）。
【０３１３】
適切には、本発明による植物（例えば、タバコ植物）又はその一部は、Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子（又は、Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子及びＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の両方）の活性若しくは発現が調節されるように改変されていない植物（例えば、タバコ植物）又はその一部と比較した場合に、Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子（又は、Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子及びＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の両方）の調節された活性若しくは発現を含み得る。
【０３１４】
１つの実施形態において、本発明による植物（例えば、タバコ植物）又はその一部は、本発明の細胞（例えば、タバコ細胞）を含む。別の実施形態において、植物繁殖材料は、本発明の植物（例えば、タバコ植物）から得ることができる（例えば得られ得る）。
【０３１５】
１つの実施形態において、製品（例えば、タバコ製品）の製造のための前述の実施形態のために提供された細胞（例えば、タバコ細胞）の使用を提供する。加えて、植物（例えば、タバコ植物）を育種するための本明細書に記載の植物（例えば、タバコ植物）の使用を提供する。
【０３１６】
本発明は、別の実施形態において、製品（例えば、タバコ製品）の製造のための前述の実施形態の植物（例えば、タバコ植物）の使用も提供する。別の実施形態において、作物を生育するための本発明の植物（例えば、タバコ植物）の使用を提供する。１つの実施形態において、本発明によるＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子又はＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子及びＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の両方の使用は、植物（例えば、タバコ植物）のアルカロイド含有量の調節をもたらす。
【０３１７】
１つの実施形態において、本発明によるＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子又はＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子及びＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の両方の方法又は使用は、アルカロイド含有量の調節をもたらし得る。別の実施形態において、Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子又はＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子及びＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の両方の使用（例えば、これらの活性又は発現の減少）は、１又は２以上のアルカロイドの含有量の減少をもたらし得る。適切には、アナタビン、アナバシン、ミオスミン、ノルニコチン若しくはニコチンの１又は２以上の含有量が低減され得る。適切には、ニコチン含有量が低減されている。適切には、これは、Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現、若しくはＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子及びＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の両方の活性又は発現が野生型植物と比較して減少する場合に、観察され得る。
【０３１８】
別の実施形態において、Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子、又はＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子及びＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の両方の方法又は使用（例えば、これらの活性又は発現の増加）は、１又は２以上のアルカロイドの含有量の増加をもたらし得る。適切には、アナタビン、アナバシン、ノルニコチン若しくはニコチンの１又は２以上の含有量が増加し得る。適切には、ニコチン含有量が低減されている。適切には、これは、Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現が野生型植物と比較して増加している場合に、観察され得る。
【０３１９】
１つの実施形態において、適切には、植物（例えば、タバコ植物）又はその一部、例えば、葉、又は収穫された葉若しくは収穫された処理された葉、或いはこの植物を含む製品（例えば、タバコ製品）は、本発明の改変された（例えば、変異又は欠失された）Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子（又は、本発明による改変された（例えば、変異又は欠失された）Ｎｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子との組み合わせにおける改変された（例えば、変異又は欠失された）Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子）を含む。
【０３２０】
１つの実施形態において、本発明は、タバコ細胞培養物（例えば、インビトロ培養物）を提供する。タバコ細胞培養物は、タバコ細胞懸濁培養物であり得る。これらのインビトロで培養されたタバコ細胞は、例えば、従来のタバコ粒子、刻みタバコ、細切り若しくは長切りタバコ葉身の代替物として、添加物成分として、又は代替物及び添加物の両方として、タバコ製品に組み込まれ得る。
【０３２１】
１つの実施形態において、タバコ製品の製造のための、本発明による、タバコ細胞培養物、例えば、採取及び／若しくは処理されたタバコ細胞培養物、又はこれからの抽出物の使用を提供する。
【０３２２】
インビトロ培養物から採取されたタバコ細胞は、乾燥、例えば、凍結乾燥されて、例えば、粉末が生成し得る。
【０３２３】
当業者は、タバコ細胞のインビトロ培養物を確立するための公知の方法を承知している。例として、以下の方法のみが使用され得る：所望のタバコ植物から種子を収集すること、及びそれらの外部を殺菌消毒して望まない生物体を取り除くこと、前記種子を播種して所望のタバコ植物を生育すること、外植片としての使用のためにタバコ植物から（例えば、タバコ茎から）組織を除去すること、タバコ外植片からカルス培養物を確立すること、カルス培養物から細胞懸濁培養物を確立すること、並びに培養材料（例えば、タバコ細胞を含む）を採取してタバコ細胞培養物を生産させること。
【０３２４】
タバコ細胞は、濾過、例えば、真空濾過を含む各種の方法によって採取することができる。サンプルは、水を添加することによってフィルター中で洗浄されてもよく、残った液体は、濾過、例えば、真空濾過で除去された。
【０３２５】
採取されたタバコ細胞培養物は、さらに、処理、例えば、空気乾燥及び／又は凍結乾燥等で乾燥され得る。採取されたタバコ細胞培養物若しくは乾燥された採取されたタバコ細胞培養物、又はこれらからの抽出物は、本発明によるタバコ製品に組み込まれ得る。
【０３２６】
１つの実施形態において、本発明は、分子農業における使用のためのタバコ植物又はその一部を提供する。適切には、本発明に従って改変された植物又はその一部は、治療薬、例えば、抗生物質、ウイルス様粒子、栄養補助食品又は低分子等のタンパク質の製造において使用され得る。
【０３２７】
１つの実施形態において、本発明は、タンパク質（例えば、治療用タンパク質）の製造のための方法であって、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現を調節することによって、前記タンパク質（例えば、治療用タンパク質）を産生する能力がある植物又はその一部を改変することであって、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子が、配列番号４、若しくは配列番号８、若しくは配列番号１２、若しくは配列番号１６、若しくは配列番号２０、若しくは配列番号２４、若しくは配列番号２８、若しくは配列番号３２、若しくは配列番号３６において提示されるアミノ酸配列、又はそれらの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含むポリペプチドをコードするか、或いはＥＲＦ遺伝子が、配列番号１、配列番号３、若しくは配列番号５、若しくは配列番号９、若しくは配列番号１３、若しくは配列番号１７、若しくは配列番号２１、若しくは配列番号２５、若しくは配列番号２９、若しくは配列番号３３において提示されるヌクレオチド配列、又はそれらの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含み、並びに前記タンパク質（例えば、治療用タンパク質）の産生を可能にする十分な条件下で植物を培養することを含む、方法を提供する。
【０３２８】
製品
本発明は、本発明によるタバコから得ることができるか、又は得られる製品も提供する。Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現、又はＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子及びＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の両方の活性若しくは発現が調節され、調節されたアルカロイド含有量を含む、タバコ植物から得ることができるか、又は得られる製品を提供する。
【０３２９】
本明細書で使用される場合、「タバコ工業製品」という用語は、シガレット、シガリロ、葉巻タバコ、パイプ若しくは手巻きタバコのためのタバコ等の可燃性喫煙物品（タバコ、タバコ誘導体、膨張タバコ、再構成されたタバコ、タバコ代替物又は他の喫煙可能材料のいずれかに基づく）；電子タバコ、タバコ加熱製品、及び基材材料の組み合わせからエアゾールを発生させるためのハイブリッドシステム、例えば、液体若しくはゲル若しくは固体の基材、並びにエアゾール提供システム内で使用されるエアゾール化可能基材材料を含有するハイブリッドシステム等の燃焼なしの基材材料から化合物を放出する加熱製品等の不燃性エアゾール提供システム；並びに薬用キャンディー剤、ガム、パッチ等のエアゾール無しの送達物品、通気性粉末を含む物品、及びスヌース及び嗅ぎタバコ等の無煙タバコ製品を含むことを意図し、このエアゾール無しの送達物品は、ニコチンを送達してもよく、又は送達しなくてもよい。
【０３３０】
適切には、タバコ工業製品は、本発明によるタバコ植物又はその一部から調製され得る（例えば、含み得る）。
【０３３１】
適切には、タバコ工業製品は、本発明によるタバコ細胞培養物から調製され得る。
【０３３２】
適切には、タバコ工業製品は、本発明によるタバコ植物繁殖材料から繁殖されたタバコ植物又はその一部から調製され得る（例えば、含み得る）。
【０３３３】
適切には、タバコ工業製品は、本発明によるタバコ植物の収穫された葉から調製され得る（例えば、含み得る）。
【０３３４】
適切には、タバコ工業製品は、本発明による処理されたタバコ葉から調製され得る（例えば、含み得る）。
【０３３５】
適切には、タバコ工業製品は、本発明による乾燥処理されたタバコ材料から調製され得る（例えば、含み得る）。
【０３３６】
適切には、タバコ工業製品は、本発明によるタバコブレンドから調製され得る（例えば、含み得る）。
【０３３７】
１つの実施形態において、タバコ工業製品は、シガレット、シガリロ及び葉巻タバコからなる群から選択される可燃性喫煙物品である。
【０３３８】
１つの実施形態において、タバコ工業製品は、可燃性喫煙物品の１又は２以上の構成要素、例えば、フィルター、フィルターロッド、フィルターロッドセグメント、タバコ、タバコロッド、タバコロッドセグメント、栓、カプセル等の追加の放出構成要素、スレッド、ビーズ、プラグラップ、チップペーパー又はタバコ紙等の紙を含む。
【０３３９】
１つの実施形態において、タバコ工業製品は不燃性エアゾール提供システムである。
【０３４０】
１つの実施形態において、タバコ工業製品は、ヒーター及びエアゾール化可能基材等の不燃性エアゾール提供システムの１又は２以上の構成要素を含む。
【０３４１】
１つの実施形態において、エアゾール提供システムは、タバコ吸入デバイスとしても公知の電子タバコである。
【０３４２】
１つの実施形態において、電子タバコは、ヒーター、ヒーターに粉末を供給する能力があるパワーサプライ、液体又はゲル等のエアゾール化可能基材、ハウジングを含み、マウスピースを含んでいてもよい。
【０３４３】
１つの実施形態において、エアゾール化可能基材は、基材容器に収容される。１つの実施形態において、基材容器は、ヒーターと組み合わされるか、又はヒーターを含む。
【０３４４】
１つの実施形態において、タバコ工業製品は、燃焼によってではないが、基材材料を加熱することによって、１又は２以上の化合物を放出する加熱製品である。基材材料は、例えば、タバコ、又はニコチンを含有していてもよく、若しくは含有していなくてもよい他の非タバコ製品であり得る、エアゾール化可能材料である。１つの実施形態において、加熱製品はタバコ加熱製品である。
【０３４５】
１つの実施形態において、加熱製品は電子デバイスである。
【０３４６】
１つの実施形態において、タバコ加熱製品は、ヒーター、ヒーターに粉末を供給する能力があるパワーサプライ、固体又はゲル材料等のエアゾール化可能基材を含む。
【０３４７】
１つの実施形態において、加熱製品は非電子物品である。
【０３４８】
１つの実施形態において、加熱製品は、固体又はゲル材料等のエアゾール化可能基材、及び任意の電子的手段なしで、例えば、炭等の燃焼材料を燃焼させることによって、エアゾール化可能基材に熱エネルギーを供給する能力がある熱源を含む。
【０３４９】
１つの実施形態において、加熱製品は、エアゾール化可能基材を加熱することによって発生したエアゾールを濾過する能力があるフィルターも含む。
【０３５０】
いくつかの実施形態において、エアゾール化可能基材材料は、べーパー若しくはエアゾール発生剤、又はグリセロール、プロピレングリコール、トリアセチン又はジエチレングリコール等の保湿剤を含み得る。
【０３５１】
１つの実施形態において、タバコ工業製品は、燃焼によってではないが、基材材料の組み合わせを加熱することによって、エアゾールを発生するハイブリッドシステムである。基材材料は、例えば、ニコチンを含有していてもよく、若しくは含有していなくてもよい、固体、液体又はゲルを含み得る。１つの実施形態において、ハイブリッドシステムは、液体又はゲル基材及び固体基材を含む。固体基材は、例えば、タバコ、又はニコチンを含有していてもよく、若しくは含有していなくてもよい他の非タバコ製品であり得る。１つの実施形態において、ハイブリッドシステムは、液体又はゲル基材及びタバコを含む。
【０３５２】
別の実施形態において、製品は、Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現が調節され、アルカロイド含有量が減少した、本発明のコンストラクトを含み得る。
【０３５３】
別の実施形態において、製品は、Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現、及びＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現の両方が調節された本発明の１又は２以上のコンストラクトを含み得、前記製品はアルカロイド含有量が調節されている。
【０３５４】
１つの実施形態において、葉（例えば、タバコ葉）を生産させるための本発明の植物（例えば、タバコ植物）の使用を提供する。適切には、葉（例えば、タバコ葉）は、処理等の下流の適用に付され得る。このように、１つの実施形態において、前述の実施形態の使用は、処理された葉（例えば、処理されたタバコ葉）を提供し得る。適切には、タバコ葉は、乾燥処理、発酵、殺菌又はこれらの組み合わせに付され得る。
【０３５５】
別の実施形態において、葉（例えば、タバコ葉）はカットされ得る。いくつかの実施形態において、葉（例えば、タバコ葉）は、乾燥処理、発酵、殺菌又はこれらの組み合わせに付される前又は後にカットされ得る。
【０３５６】
１つの実施形態において、本発明は、本発明の植物（例えば、タバコ植物）の収穫された葉を提供する。１つの実施形態において、収穫された葉は、調節されたＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現、又は調節されたＮｉｃ１  ＥＲＦ及びＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の両方の活性若しくは発現を有する、植物（例えば、タバコ植物）から得ることができる。適切には、収穫された葉はアルカロイド含有量が調節されている。さらなる実施形態において、収穫された葉は、本発明の繁殖材料から繁殖された植物（例えば、タバコ植物）から得ることができる（例えば、得られる）ものであってもよい。別の実施形態において、本発明の方法又は使用から得ることができる収穫された葉を提供する。適切には、収穫された葉は、カットされ、収穫された葉であり得る。いくつかの実施形態において、収穫された葉は生存細胞（例えば、生存タバコ細胞）を含み得る。いくつかの実施形態において、収穫された葉は生存細胞（例えば、生存タバコ細胞）を含まない。他の実施形態において、収穫された葉はさらなる処理に付され得る。
【０３５７】
いくつかのタバコ植物は、茎をカットし、すべての葉を同時に収穫することによって収穫され得る（例えば、バーレータバコで）。他のタバコ植物（例えば、熱風乾燥処理されたタバコ）は、プライミング等のプロセスの段階で収穫され得、個々の葉がそれらが成熟するように茎から除去される。
【０３５８】
本明細書で使用される「プライミング」は、タバコ植物からの葉の除去を指す。これは、熱風乾燥処理された植物の成熟又は熟した葉の除去を指す場合がある。
【０３５９】
処理された葉（例えば、処理されたタバコ葉）も提供する。処理された葉（例えば、処理されたタバコ葉）は、本発明の植物（例えば、タバコ植物）から得ることができる。適切には、処理された葉は、本発明の方法及び／又は使用のいずれかに従って得られた植物から得ることができる。１つの実施形態において、処理された葉（例えば、処理されたタバコ葉）は、好ましくは、対照の葉と比較した場合に、即ち、本発明によって改変されていない植物（例えば、タバコ植物）由来の葉と比較した場合に、Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現、又はＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子及びＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の両方の活性若しくは発現が調節され、アルカロイド含有量が調節された、植物（例えば、タバコ植物）から得ることができる。処理された葉（例えば、処理されたタバコ葉）は、Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現、又はＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子及びＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の両方の活性若しくは発現における調節、及び調節されたアルカロイド含有量を含み得る。
【０３６０】
別の実施形態において、処理された葉（例えば、処理されたタバコ葉）は、本発明による植物（例えば、タバコ植物）繁殖材料から繁殖された植物（例えば、タバコ植物）から得ることができる。本発明の処理された葉（例えば、処理されたタバコ葉）は、本発明の収穫された葉を処理することによって得ることができる。
【０３６１】
本明細書において使用される「処理された葉」という用語は、当技術分野において葉が付される１又は２以上の処理ステップを受けている葉を指す。「処理された葉」は、生存細胞を含まないか、又は実質的に含まない。
【０３６２】
本明細書において使用される「処理されたタバコ葉」という用語は、当技術分野においてタバコが付される１又は２以上の処理ステップを受けているタバコ葉を指す。「処理されたタバコ葉」は、生存細胞を含まないか、又は実質的に含まない。
【０３６３】
「生存細胞」という用語は、増殖することが可能であり、及び／又は代謝的に活性である、細胞を指す。このように、細胞が生存できないと言う場合、「非生存」とも称され、したがって、細胞は、生存細胞の特性を示さない。
【０３６４】
「実質的に生存細胞なし」という用語は、総細胞の約５％未満が生存していることを意味する。好ましくは、総細胞の、約３％未満、より好ましくは、約１％未満、さらにより好ましくは、約０．１％未満が生存している。
【０３６５】
１つの実施形態において、処理されたタバコ葉は、乾燥処理、発酵及び／又は殺菌の１又は２以上によって処理され得る。適切には、処理されたタバコ葉は、乾燥処理することによって処理され得る。タバコ葉は、当技術分野において公知の任意の方法によって乾燥処理され得る。１つの実施形態において、タバコ葉は、空気乾燥処理、火力乾燥処理、熱風乾燥処理及び天日乾燥処理からなる群から選択される１又は２以上の乾燥処理方法によって乾燥処理され得る。適切には、タバコ葉は空気乾燥処理され得る。適切には、タバコ葉は熱風乾燥処理され得る。
【０３６６】
典型的には、空気乾燥処理は、換気の良い部屋においてタバコ葉を吊り下げ、乾燥させることによって達成される。これは、通常、４〜８週間の期間にわたって行われる。空気乾燥処理は、特に、バーレータバコに適切である。
【０３６７】
適切には、タバコ葉は火力乾燥処理され得る。火力乾燥処理は、典型的には、広葉樹の火が、連続的又は断続的に、低いくすぶりで維持された大きな部屋にタバコ葉を吊り下げることによって達成され、プロセス及びタバコに応じて、通常、３日〜１０週間の間かかる。
【０３６８】
別の実施形態において、タバコ葉は熱風乾燥処理され得る。熱風乾燥処理は、タバコスティック上にタバコ葉を一列に並べること、及び乾燥処理部屋で積み上げたポールからそれらを吊り下げることを含み得る。部屋は、通常、外部から供給するファイアボックスから通じる送気管を有する。典型的には、これは、煙に曝されずに加熱乾燥処理されたタバコをもたらす。通常、温度は、乾燥処理の過程でゆっくりと上昇し、プロセス全体でおよそ１週間かかる。
【０３６９】
適切には、タバコ葉は天日乾燥処理され得る。この方法は、典型的には、覆われていないタバコを日光に曝すことを含む。
【０３７０】
適切には、処理されたタバコ葉は、発酵することによって処理され得る。発酵は、当技術分野において公知の任意の方法で行うことができる。典型的には、発酵の間、タバコ葉は、例えば、水分を保持するための黄麻布で覆われた乾燥処理されたタバコのスタック（バルク）に積み上げられる。葉の内部の残った水分及びタバコの重量の組み合わせが、タバコを熟させる天然の熱を発生する。バルクの中心の温度は、毎日監視される。いくつかの方法において、毎週、バルク全体が開けられる。次いで、葉は、除去して振動させ、湿らせ、バルクを、内側の葉が外側になり、底部の葉がバルクの上部に置かれるように、回転させる。これは、バルク全体にわたる均一な発酵を保証する。葉に水分を付与し、かつ葉それ自体が実際に回転することで熱が発生し、タバコの天然アンモニアが放出され、ニコチンが低減され、同時に色も濃くなり、タバコのアロマが改善される。典型的には、発酵プロセスは、タバコの品種、葉の茎の位置、葉の厚さ及び意図する使用に応じて、６カ月までの間、継続される。
【０３７１】
適切には、処理されたタバコ葉は、殺菌することによって処理され得る。殺菌は、タバコ葉が、無煙タバコ製品、最も好ましくは、スヌースを作製するために使用される場合、特に好ましくあり得る。タバコ葉の殺菌は、当技術分野において公知の任意の方法によって行われ得る。例えば、殺菌は、J Foulds, L Ramstrom, M Burke, K Fagerstrom. Effect of smokeless tobacco (snus) on smoking and public health in Sweden. Tobacco Control (2003) 12: 349-359に詳述されているようにして行うことができ、この教示は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０３７２】
スヌースの製造の間、殺菌は、典型的には、タバコが２４〜３６時間蒸気で加熱処理される（温度がおよそ１００℃に達する）プロセスによって行われる。これは、ほぼ無菌の製品をもたらし、理論に縛られることを望まないが、この結果として、さらなるＴＳＮＡ形成が制限されると考えられる。
【０３７３】
１つの実施形態において、殺菌は、蒸気殺菌であり得る。
【０３７４】
いくつかの実施形態において、処理されたタバコ葉はカットされ得る。処理されたタバコ葉は、処理の前又は後にカットされ得る。適切には、処理されたタバコ葉は、処理の後にカットされ得る。
【０３７５】
いくつかの実施形態において、タバコ植物、タバコ植物の収穫された葉及び／又は処理されたタバコ葉は、ニコチンを抽出するために使用され得る。ニコチンの抽出は、当技術分野において公知の任意の方法を使用して達成することができる。例えば、タバコからニコチンを抽出するための方法は、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第２，１６２，７３８号明細書において教示されている。
【０３７６】
１つの態様において、本発明は、本発明によるタバコ植物又はその一部で作製された乾燥処理されたタバコ材料を提供する。
【０３７７】
別の態様において、本発明は、本発明によるタバコ植物又はその一部で作製されたタバコ材料を含むタバコブレンドを提供する。１つの態様において、本発明は、本発明による乾燥処理されたタバコ材料を含むタバコブレンドを提供する。
【０３７８】
適切には、本発明によるタバコブレンドは、本発明によるタバコ植物又はその一部から、およそ１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％のタバコを含み得る。適切には、タバコブレンドは、本発明によるタバコ植物又はその一部からおよそ１０％のタバコを含み得る。適切には、タバコブレンドは、本発明によるタバコ植物又はその一部からおよそ２０％のタバコを含み得る。適切には、タバコブレンドは、本発明によるタバコ植物又はその一部からおよそ３０％のタバコを含み得る。適切には、タバコブレンドは、本発明によるタバコ植物又はその一部からおよそ４０％のタバコを含み得る。適切には、タバコブレンドは、本発明によるタバコ植物又はその一部からおよそ５０％のタバコを含み得る。適切には、タバコブレンドは、本発明によるタバコ植物又はその一部からおよそ６０％のタバコを含み得る。適切には、タバコブレンドは、本発明によるタバコ植物又はその一部からおよそ７０％のタバコを含み得る。適切には、タバコブレンドは、本発明によるタバコ植物又はその一部からおよそ８０％のタバコを含み得る。適切には、タバコブレンドは、本発明によるタバコ植物又はその一部からおよそ９０％のタバコを含み得る。
【０３７９】
１つの態様において、本発明のタバコブレンド製品は、本発明によるタバコ植物又はその一部から、乾燥処理されたタバコの乾燥重量で、少なくとも約５パーセント、１０パーセント、２０パーセント、３０パーセント、４０パーセント、５０パーセント、６０パーセント、７０パーセント、８０パーセント、９０パーセント、又は９５パーセントを含む。
【０３８０】
適切には、乾燥処理されたタバコ材料は空気乾燥処理され得る。適切には、乾燥処理されたタバコ材料は熱風乾燥処理され得る。適切には、乾燥処理されたタバコ材料は天日乾燥処理され得る。
【０３８１】
本発明によるタバコ製品又は喫煙物品は、本発明によるタバコ材料（例えば、乾燥処理されたタバコ材料）を含み得る。
【０３８２】
別の態様において、本発明はタバコ製品を提供する。適切には、タバコ製品はブレンドされたタバコ製品であり得る。１つの実施形態において、タバコ製品は、本発明のタバコ植物又はその一部から調製され得る。１つの実施形態において、タバコ製品は、Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現、又はＮｉｃ１  ＥＲＦ及びＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の両方の活性若しくは発現が調節されている、タバコ植物から調製され得る。タバコ製品は、Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現の低減、及び低減されたアルカロイド含有量を含み得る。適切には、タバコ植物又はその一部は、本発明によるタバコ植物繁殖材料から繁殖され得る。
【０３８３】
植物（例えば、タバコ植物）の文脈で本明細書において使用される「その一部」という用語は、植物（例えば、タバコ植物）の一部を指す。好ましくは、「その一部」は、植物（例えば、タバコ植物）の葉である。
【０３８４】
別の実施形態において、タバコ製品は、本発明の収穫された葉から調製され得る。さらなる実施形態において、タバコ製品は、本発明の処理されたタバコ葉から調製され得る。適切には、タバコ製品は、乾燥処理、発酵及び／又は殺菌の１又は２以上によって処理されたタバコ葉から調製され得る。適切には、タバコ製品は、任意に、前述の実施形態に従って処理され、カットされたタバコ葉を含み得る。
【０３８５】
１つの実施形態において、タバコ製品は喫煙物品であり得る。本明細書で使用される場合、「喫煙物品」という用語は、タバコ、タバコ誘導体、膨張タバコ、再構成タバコ又はタバコ代替品のいずれかに基づく、巻きタバコ、シガレット、葉巻タバコ及びシガリロ等の喫煙可能製品を含み得る。
【０３８６】
別の実施形態において、タバコ製品は無煙タバコ製品であり得る。本明細書において使用される「無煙タバコ製品」という用語は、喫煙及び／又は燃焼に付されることを意図していないタバコ製品を指す。１つの実施形態において、無煙タバコ製品としては、スヌース、嗅ぎタバコ、噛みタバコ等が挙げられ得る。
【０３８７】
さらなる実施形態において、タバコ製品は、タバコ加熱デバイス、又はハイブリッドデバイス、又は電子タバコ等であり得る。典型的には、加熱デバイス又はハイブリッドデバイスにおいて、エアゾールは、熱源の内部、周辺又は下流に位置し得る、物理的に分離されたエアゾール形成基材又は材料への熱源からの熱の移動によって発生する。喫煙の間、揮発性化合物は、熱源からの伝熱によってエアゾール形成基材から放出され、喫煙物品を通して引き込まれた空気を取り込む。放出された化合物が冷却されると、これらは、凝縮して、使用者によって吸入されるエアゾールを形成する。
【０３８８】
タバコ加熱デバイスを消費又は喫煙するためのエアゾール発生物品及びデバイスは、当技術分野において公知である。これらは、例えば、エアゾールが、エアゾール発生デバイスの１又は２以上の電子加熱要素からタバコ加熱デバイスのエアゾール形成基材に熱を移動することによって発生する、電子的加熱エアゾール発生デバイスを含み得る。典型的には、タバコ加熱デバイスは、エアゾール発生デバイスであり得る。
【０３８９】
好ましくは、タバコ加熱デバイスは、ヒート−ノット−バーン  デバイス（heat-not-burn device）であり得る。ヒート−ノット−バーン  デバイスは、当技術分野において公知であり、タバコを燃焼によってではないが加熱することによって化合物を放出する。適切なヒート−ノット−バーン  デバイスの例は、参照によって本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１３／０３４４５９号パンフレット又は英国特許第２５１５５０２号明細書において教示され得る。
【０３９０】
１つの実施形態において、タバコ加熱デバイスのエアゾール形成基材は、本発明によるタバコ製品であり得る。
【０３９１】
１つの実施形態において、タバコ加熱デバイスはハイブリッドデバイスであり得る。
【０３９２】
ポリヌクレオチド／ポリペプチド／コンストラクト
本発明のある実施形態において、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子（又は、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子及び少なくとも１つのＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の両方）の活性又は発現を調節するコンストラクトは、適切には、プロモーターの方向づけの下、植物細胞に形質転換され得る。
【０３９３】
本発明のある実施形態において、Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子（又は、Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子及びＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の両方）の活性又は発現を減少させる（即ち、阻害する）コンストラクトは、プロモーターの方向づけの下、植物細胞に形質転換され得る。遺伝子コンストラクトは、遺伝子編集コンストラクトであり得るか、又は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ、small interfering RNA）若しくは短ヘアピンループ（ｓｈＲＮＡ、short hairpin loop）分子を含み得るＲＮＡｉ分子を含み得る。
【０３９４】
本発明のある実施形態において、Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子（又は、Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子及びＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の両方）の活性又は発現を増加させるコンストラクトは、プロモーター、例えば、内因性Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子をコードするコンストラクトの方向づけの下、植物細胞に形質転換され得る。
【０３９５】
コンストラクトは、適切なベクター、例えば、植物形質転換ベクターによって、本発明による植物に導入され得る。植物形質転換ベクターは、転写の方向の５’−３’で、プロモーター配列、Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子を標的とする（又はＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子及びＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の両方を標的とする）コンストラクト配列を含み、ＲＮＡポリメラーゼのための停止シグナル及びポリアデニラーゼのためのポリアデニル化シグナルを含む３’未翻訳のターミネーター配列を含んでいてもよい、発現カセットを含み得る。プロモーター配列は、１又は２以上のコピーに存在し得、このようなコピーは、上記に記載のプロモーター配列と同一又はそのバリアントであり得る。ターミネーター配列は、植物、細菌又はウイルスの遺伝子から得られるものであってもよい。適切なターミネーター配列は、例えば、エンドウｒｂｃＳ  Ｅ９ターミネーター配列、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのノパリンシンターゼ遺伝子に由来するｎｏｓターミネーター配列、及びカリフラワーモザイクウイルス由来の３５Ｓターミネーター配列である。当業者は、他の適切なターミネーター配列を容易に承知している。
【０３９６】
本発明のコンストラクトは、プロモーターの強度を増加させるための遺伝子発現増強機構も含み得る。このようなエンハンサーエレメントの例は、エンドウプラストシアニン遺伝子のプロモーターの一部に由来するものであり、これは、参照によって本明細書に組み込まれる国際特許出願公開第９７／２００５６号パンフレットの主題である。適切なエンハンサーエレメントは、例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのノパリンシンターゼ遺伝子に由来するｎｏｓエンハンサーエレメント、及びカリフラワーモザイクウイルス由来の３５Ｓエンハンサーエレメントであり得る。
【０３９７】
これらの制御領域は、プロモーターＤＮＡ配列と同じ遺伝子に由来していてもよく、或いはニコチアナ・タバカム又は他の生物体由来、例えば、ナス科の植物由来若しくはヤコウカ（Cestroideae）亜科由来の異なる遺伝子に由来していてもよい。すべての制御領域は、形質転換される組織の細胞中で操作する能力がなければならない。
【０３９８】
プロモーターＤＮＡ配列は、所望の遺伝子と同じ遺伝子、例えば、プロモーターが方向づけを行う遺伝子、例えば、本発明において使用されるコード配列である本発明のＮｉｃ１  ＥＲＦをコードする遺伝子に由来していてもよく、或いはニコチアナ・タバカム又は他の生物体由来、例えば、ナス科の植物由来若しくはヤコウカ亜科由来の異なる遺伝子に由来していてもよい。
【０３９９】
発現カセットは、pBIN 19 Plus、pBI 101、pKYLX71:35S2、pCAMBIA2300又は当技術分野において公知の他の適切な植物形質転換ベクター等の基本的な植物形質転換ベクターに組み込まれ得る。発現カセットに加えて、植物形質転換ベクターは、形質転換プロセスのために必要なこのような配列を含有する。これらは、アグロバクテリウムｖｉｒ遺伝子、１若しくは２以上のＴ−ＤＮＡ境界配列、及び選択可能マーカー又は遺伝子導入植物細胞を特定する他の手段を含み得る。
【０４００】
「植物形質転換ベクター」という用語は、インビボ又はインビトロで発現する能力があるコンストラクトを意味する。好ましくは、発現ベクターは、生物体のゲノムに組み込まれる。「組み込まれた」という用語は、好ましくは、ゲノムへの安定的な組み込みに及ぶ。
【０４０１】
植物を形質転換するための技術は、当技術分野内で周知であり、例えば、アグロバクテリウム媒介形質転換が挙げられる。遺伝子改変植物の構築における基本原理は、所望の遺伝物質の安定的な維持が得られるように、植物のゲノムに遺伝情報を挿入することである。一般的な技術の概説は、Potrykus（Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225）及びChriston（AgroFood-Industry Hi-Tech March/April1994 17-27）による論説に見出すことができ、これらは参照によって本明細書に組み込まれる。
【０４０２】
典型的には、アグロバクテリウム媒介形質転換において、所望の外来ＤＮＡ、即ち、Ｎｉｃ１  ＥＲＦコンストラクトを運ぶバイナリーベクターは、標的植物からの外植片とのアグロバクテリウムの共培養によって、適切なアグロバクテリウム株から標的植物に移行される。次いで、形質転換された植物組織は、選択培地上で再生され、この選択培地は、選択可能マーカー及び植物成長ホルモンを含む。代替法は、フローラルディップ方法（Clough & Bent, 1998 Plant J. 1998 Dec;16(6):735-43、これは参照によって本明細書に組み込まれる）であり、これにより、インタクトな植物の花芽を、キメラ遺伝子を含有するアグロバクテリウム株の懸濁液と接触させ、種子のセットの後、形質転換された個体が発芽し、選択培地上での生育によって特定される。アグロバクテリウムによる植物組織の直接感染は、幅広く利用されており、参照によって本明細書に組み込まれるButcher D. N. et al., (1980), Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, eds.: D. S. Ingrams and J.P. Helgeson, 203-208に記載されている単純な技術である。
【０４０３】
さらに適切な形質転換方法は、例えば、ポリエチレングリコール又はエレクトロポレーション技術、微粒子銃、マイクロインジェクション、及び炭化ケイ素繊維の使用を使用して、プロトプラストに直接遺伝子を移行することを含む。炭化ケイ素ウィスカー技術を含む弾道形質転換を使用する植物の形質転換は、参照によって本明細書に組み込まれるFrame B R, Drayton P R, Bagnaall S V, Lewnau C J, Bullock W P, Wilson H M, Dunwell J M, Thompson J A & Wang K (1994)において教示されている。炭化ケイ素ウィスカー媒介形質転換による稔性の遺伝子導入トウモロコシ植物の生産は、参照によって本明細書に組み込まれるThe Plant Journal 6: 941-948において教示されており、ウイルス形質転換技術は、例えば、参照によって本明細書に組み込まれるMeyer P, Heidmann I & Niedenhof I (1992)において教示されている。植物のためのベクター系としてキャッサバモザイクウイルスの使用は、参照によって本明細書に組み込まれるGene 110: 213-217において教示されている。植物形質転換に対するさらなる教示は、参照によって本明細書に組み込まれる欧州特許出願公開第０４４９３７５号明細書において見出され得る。
【０４０４】
さらなる態様において、本発明は、コンストラクトを運び、植物、適切にはタバコ植物等の生物体のゲノムにそれを導入するベクター系に関する。ベクター系は、１つのベクターを含んでいてもよいが、これは、２つのベクターを含んでいてもよい。２つのベクターの場合において、ベクター系は、通常、バイナリーベクター系と称される。バイナリーベクター系は、Gynheung Anetal, (1980), Binary Vectors, Plant Molecular Biology Manual A3, 1-19にさらに詳細に記載されており、これは、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０４０５】
植物細胞の形質転換のための広範囲に利用される１つの系は、参照によって本明細書に組み込まれる、An et al., (1986), Plant Physiol. 81, 301-305及びButcher D. N. et al., (1980), Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, eds.: D. S. Ingrams and J.P. Helgeson, 203-208に記載されているアグロバクテリウム・ツメファシエンス由来のTiプラスミド、又はアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）由来のRiプラスミドを使用する。植物における本発明による望ましい外因性遺伝子のそれぞれの導入方法の後、さらなるＤＮＡ配列の存在及び／又は挿入が必要であり得る。植物細胞の形質転換のためのＴ−ＤＮＡの使用は、集中的に研究されており、参照によって本明細書に組み込まれる、欧州特許出願公開第１２０５１６号明細書；Hoekema: The Binary Plant Vector System Offset-drukkerij Kanters B. B., Amsterdam, 1985, Chapter V；Fraley, et al., Crit. Rev. Plant Sci., 4:1-46；及びAnetal., EMBO J (1985) 4:277-284に記載されている。
【０４０６】
Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子又はＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子及びＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の両方の活性又は発現を調節するコンストラクトで形質転換された植物細胞は、アミノ酸、植物ホルモン、ビタミン等のような必要な成長因子が補充された適切な培養液中で細胞を培養することによる等の周知の組織培養方法に従って、増殖及び維持され得る。
【０４０７】
本発明との関連における「遺伝子導入植物」という用語は、本発明によるＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子（又は、Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子及びＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の両方）の活性又は発現を調節するコンストラクトを含む任意の植物を含む。したがって、遺伝子導入植物は、本発明によるコンストラクトで形質転換されている植物である。好ましくは、遺伝子導入植物は、本発明による、調節されたＮｉｃ１  ＥＲＦの活性若しくは発現（又は、Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子及びＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子の両方の活性若しくは発現）、及び調節されたアルカロイド含有量を示す。「遺伝子導入植物」という用語は、その天然環境にもあるそれらのネイティブプロモーターのコントロール下にある場合、それらの天然環境にあるネイティブヌクレオチドコード配列には及ばない。
【０４０８】
１つの態様において、本発明によるＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子、コンストラクト、植物形質転換ベクター又は植物細胞は、単離された形態である。「単離された」という用語は、配列が天然において天然に関連し、天然で見出される少なくとも１つの他の構成要素を少なくとも実質的に含まないことを意味する。
【０４０９】
１つの態様において、本発明によるＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子、コンストラクト、植物形質転換ベクター又は植物細胞は、精製された形態である。「精製された」という用語は、相対的に純粋な状態、例えば、少なくとも約９０％の純度、又は少なくとも約９５％の純度、又は少なくとも約９８％の純度であることを意味する。
【０４１０】
本明細書において使用される「ヌクレオチド配列」という用語は、オリゴヌクレオチド配列又はポリヌクレオチド配列、並びにこれらのバリアント、ホモログ、断片及び誘導体（これらの一部等）を指す。ヌクレオチド配列は、ゲノム又は合成又は組換え起源であり得、これは、センス又はアンチセンス鎖を表そうとなかろうと、二本鎖又は一本鎖であり得る。
【０４１１】
本発明との関連における「ヌクレオチド配列」という用語は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。好ましくは、これは、本発明についてコードする、ＤＮＡ、より好ましくは、ｃＤＮＡ配列を意味する。
【０４１２】
好ましい実施形態において、ヌクレオチド配列は、本発明の範囲自体、即ちＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子に関連する場合、及びこれによって包含される場合に、その天然の環境にある場合、及びその天然の環境にもあるその天然に関連する配列に結合している場合のネイティブヌクレオチド配列を含む。参照を容易にするために、我々は、この好ましい実施形態を「ネイティブヌクレオチド配列」と称することとする。これに関連して、「ネイティブヌクレオチド配列」という用語は、そのネイティブな環境にある全ヌクレオチド配列を意味し、それが天然に関連するプロモーター全体に作動可能に連結される場合、このプロモーターもそのネイティブな環境にある。
【０４１３】
本明細書において定義されるＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子として特異的な性質を有するタンパク質、又は改変のために適切なタンパク質のいずれかをコードするヌクレオチド配列は、前記タンパク質を産生する任意の細胞若しくは生物体から、特定及び／又は単離及び／又は精製され得る。各種の方法は、ヌクレオチド配列の特定及び／又は単離及び／又は精製のために、当技術分野内で周知である。例として、より多くの配列を調製するためのＰＣＲ増幅技術は、適切な配列が特定及び／又は単離及び／又は精製されるとすぐに、使用され得る。
【０４１４】
よりさらなる代替において、ＥＲＦ転写因子をコードするヌクレオチド配列は、確立された標準方法、例えば、参照によって本明細書に組み込まれるBeucage S.L. et al., (1981) Tetrahedron Letters 22, p 1859-1869に記載されているホスホロアミダイト方法、又は参照によって本明細書に組み込まれるMatthes et al., (1984) EMBO J. 3, p 801-805に記載されている方法によって、合成的に調製され得る。ホスホロアミダイト方法において、オリゴヌクレオチドは、例えば、自動ＤＮＡ合成装置で合成され、精製され、アニーリングされ、連結され、及び適切なベクター中でクローニングされる。
【０４１５】
本明細書で使用される場合、「アミノ酸配列」という用語は、「ポリペプチド」という用語及び／又は「タンパク質」という用語と同義である。いくつかの例において、「アミノ酸配列」という用語は、「ペプチド」という用語と同義である。いくつかの例において、「アミノ酸配列」という用語は、「酵素」という用語と同義である。
【０４１６】
本発明は、本明細書において定義される特異的な性質を有するポリペプチド、又は任意のヌクレオチド配列、即ち、このようなポリペプチドをコードするＥＲＦ遺伝子のアミノ酸配列と、ある程度の配列同一性又は配列相同性を有する配列の使用も包含する（本明細書の以下で、「相同配列」と称する）。ここで、「ホモログ」という用語は、対象のアミノ酸配列及び対象のヌクレオチド配列とある相同性を有する実体を意味する。ここで、「相同性」という用語は「同一性」と同一視することができる。
【０４１７】
相同のアミノ酸配列及び／又はヌクレオチド配列及び／又は断片は、ＥＲＦ遺伝子の機能的活性を保持し、及び／若しくはＥＲＦ遺伝子の活性を増強するポリペプチドを、提供並びに／又はコードしなければならない。典型的には、相同配列は、例えば、対象のアミノ酸配列と同じ活性部位等を含むか、又は同じ活性部位をコードする。相同性は、類似性（即ち、同様の化学的性質／機能を有するアミノ酸残基）の観点からも考慮することができるが、本発明の文脈において、これは、配列同一性の観点から相同性を述べるために好ましい。相同配列は、典型的には、機能ドメイン又はモチーフを保持する。
【０４１８】
１つの実施形態において、相同配列は、対象の配列と比較して、１つ、２つ若しくはいくつかの付加、欠失及び／又は置換を有する、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列を含むと解釈される。
【０４１９】
相同性又は同一性の比較は、目によって、又はより通常には、容易に入手可能な配列比較プログラムの助けで、実施することができる。これらの市販のコンピュータープログラムは、２又は３以上の配列の間の相同性％を計算することができる。相同性％又は同一性％は、連続する配列に対して計算されてもよく、即ち、１つの配列は他の配列とアラインされ、一方の配列中のそれぞれのアミノ酸は、他方の配列中の対応するアミノ酸と、一度に１残基ずつ直接比較される。これは「ギャップなし」アライメントと呼ばれる。典型的には、このようなギャップなしアライメントは、比較的短い数の残基に対してのみ行われる。
【０４２０】
これは非常に単純で着実な方法であるが、例えば、配列の他の同一のペアにおいて、１つの挿入又は欠失で、アライメントが機能しない次のアミノ酸残基を引き起こすことを考慮に入れておらず、このため、グローバルアライメントが行われる場合、相同性％が大きく低下する可能性がある。その結果として、ほとんどの配列比較方法は、全体的な相同性スコアに過度のペナルティをもたらすことなく、可能な挿入及び欠失を考慮して、最適なアライメントを生成するように設計される。これは、局所相同性の最大化を試みるために、配列アラインメントに「ギャップ」を挿入することによって、達成される。
【０４２１】
しかしながら、これらのより複雑な方法は、同じ数の同一アミノ酸について、できるだけ少ないギャップを有する配列アラインメント−２つの比較された配列の間のより高い関連性を反映する−が、多くのギャップを有するものよりも高いスコアを達成するように、アライメントに起こるそれぞれのギャップに「ギャップペナルティ」を割り当てる。典型的には、ギャップの存在について比較的高いコスト、及びギャップ中の後のそれぞれの残基についてより小さなペナルティを負わせる「アフィンギャップコスト」が使用される。これは、最も一般的に使用されるギャップスコアリングシステムである。当然ながら、高ギャップペナルティは、より少ないギャップを有する最適化されたアライメントを生成する。ほとんどのアライメントプログラムは、ギャップペナルティを修正することが可能である。しかしながら、配列比較のためにこのようなソフトウェアを使用する場合、デフォルト値を使用することが好ましい。
【０４２２】
したがって、最大相同性％の計算は、最初に、ギャップペナルティを考慮する最適アライメントの生成が必要である。このようなアライメントを行うための適切なコンピュータープログラムは、Vector NTI（Invitrogen Corp.社）である。配列比較を行うことができるソフトウェアの例としては、限定されないが、例えば、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ausubel et al. 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed - Chapter 18を参照されたい）、ＢＬＡＳＴ２（FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50；FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8及びtatiana＠ncbi.nlm.nih.govを参照されたい）、ＦＡＳＴＡ（Altschul et al. 1990 J. Mol. Biol. 403-410)及びAlignXが挙げられる。少なくともＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ２及びＦＡＳＴＡは、オフライン及びオンライン検索に利用可能である（Ausubel et al. 1999, pages 7-58 to 7-60を参照されたい）。
【０４２３】
最終の相同性％は同一性の観点で測定することができるが、アライメントプロセス自体は、典型的には、絶対的なペアの比較に基づかない。代わりに、化学的類似性又は進化距離に基づいたそれぞれのペアワイズ比較にスコアを割り当てる調整された類似性スコア行列が、一般に使用される。一般に使用されるこのような行列の例は、ＢＬＡＳＴの一組のプログラムについてのデフォルトの行列であるＢＬＯＳＵＭ６２行列である。Vector NTIプログラムは、一般に、公開されているデフォルト値、又は提供されている場合はカスタムシンボル比較テーブルのいずれかを使用する（さらなる詳細についてはユーザーマニュアルを参照されたい）。いくつかの適用のために、Vector NTIパッケージのためのデフォルト値を使用することが好ましい。
【０４２４】
或いは、相同性の百分率は、ＣＬＵＳＴＡＬ（Higgins DG & Sharp PM (1988), Gene 73(1), 237-244）に類似のアルゴリズムに基づいて、Vector NTI（Invitrogen Corp.社）で多重アライメント特徴を使用して計算され得る。ソフトウェアが最適アライメントを生成したら、相同性％、好ましくは、配列同一性％を計算することが可能である。ソフトウェアは、典型的には、配列比較の一部としてこれを行い、計算結果を発生する。
【０４２５】
配列同一性を決定する場合に、ギャップペナルティを使用しなければならず、その結果、好ましくは、以下のパラメーターがペアワイズアラインメントのために使用される。
【０４２６】
【表４】
2020524508.tif 000006
【０４２７】
１つの実施形態において、ＣＬＵＳＴＡＬは、上記に定義されるギャップペナルティ及びギャップ拡張のセットとともに使用され得る。いくつかの実施形態において、ＢＬＡＳＴ又はＣＬＵＳＴＡＬアライメントのために使用されるギャップペナルティは、上記に詳述するものと相違していてもよい。当業者は、ＢＬＡＳＴ及びＣＬＵＳＴＡＬアライメントを行うための標準パラメーターが、定期的に変化し得、その時点で、ＢＬＡＳＴ又はＣＬＵＳＴＡＬアライメントのアルゴリズムについて詳述された標準パラメーターに基づいて、適切なパラメーターを選択することが可能であることを理解する。
【０４２８】
適切には、ヌクレオチド配列に関する同一性の程度は、少なくとも５０個にわたって連続するヌクレオチド、好ましくは、少なくとも６０個にわたって連続するヌクレオチド、好ましくは、少なくとも７０個にわたって連続するヌクレオチド、好ましくは、少なくとも８０個にわたって連続するヌクレオチド、好ましくは、少なくとも９０個にわたって連続するヌクレオチド、好ましくは、少なくとも１００個にわたって連続するヌクレオチド、好ましくは、少なくとも１５０個にわたって連続するヌクレオチド、好ましくは、少なくとも２００個にわたって連続するヌクレオチド、好ましくは、少なくとも２５０個にわたって連続するヌクレオチド、好ましくは、少なくとも３００個にわたって連続するヌクレオチド、好ましくは、少なくとも３５０個にわたって連続するヌクレオチド、好ましくは、少なくとも４００個にわたって連続するヌクレオチド、好ましくは、少なくとも４５０個にわたって連続するヌクレオチド、好ましくは、少なくとも５００個にわたって連続するヌクレオチド、好ましくは、少なくとも５５０個にわたって連続するヌクレオチド、好ましくは、少なくとも６００個にわたって連続するヌクレオチド、好ましくは、少なくとも６５０個にわたって連続するヌクレオチド、又は好ましくは、少なくとも７００個にわたって連続するヌクレオチドが決定される。
【０４２９】
適切には、ヌクレオチド、ｃＤＮＡ、ｃｄｓ又はアミノ酸配列に関する同一性の程度は、全配列にわたって決定され得る。
【０４３０】
配列は、サイレント変化を生じ、機能的に同等の物質をもたらす、アミノ酸残基の欠失、挿入又は置換も有し得る。計画的なアミノ酸置換は、物質の二次的結合活性が保持されている限り、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性及び／又は両親媒性の類似性に基づいて、行われ得る。例えば、負に帯電したアミノ酸としては、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられ、正に帯電したアミノ酸としては、リジン及びアルギニンが挙げられ、同様の親水性値を有する無電荷極性頭部基を有するアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン及びチロシンが挙げられる。
【０４３１】
保存的置換は、例えば、下記の表に従って行われ得る。２番目の列の同じブロックにあるアミノ酸、及び好ましくは、３番目の列の同じ列中のアミノ酸は、互いに置換し得る。
【０４３２】
【表５】
2020524508.tif 000007
【０４３３】
本発明は、起こり得る相同的置換（置換及び置き換えは両方とも、本明細書において、既存のアミノ酸残基の代替の残基との交換を意味するために使用される）、すなわち、塩基性について塩基性、酸性について酸性、極性について極性等のような同種置換も包含する。非相同置換は、即ち、あるクラスの残基から別のクラスでも生じ得るか、又は代わりにオルニチン（本明細書の以下で、Ｚと称する）、ジアミノ酪酸オルニチン（本明細書の以下で、Ｂと称する）、ノルロイシンオルニチン（本明細書の以下で、Ｏと称する）、ピリルアラニン、チエニルアラニン、ナフチルアラニン及びフェニルグリシン等の非天然アミノ酸の包含を含む。
【０４３４】
置き換えは、非天然アミノ酸によっても行われ得、以下を含む：アルファ＊及びアルファ−二置換＊アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸＊、乳酸＊、トリフルオロチロシン＊、ｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン＊、ｐ−Ｂｒ−フェニルアラニン＊、ｐ−Ｉ−フェニルアラニン＊等の天然アミノ酸のハライド誘導体、Ｌ−アリル−グリシン＊、β−アラニン＊、Ｌ−α−アミノ酪酸＊、Ｌ−γ−アミノ酪酸＊、Ｌ−α−アミノイソ酪酸＊、Ｌ−ε−アミノカプロン酸＃、７−アミノヘプタン酸＊、Ｌ−メチオニンスルホン＃＊、Ｌ−ノルロイシン＊、Ｌ−ノルバリン＊、ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン＊、Ｌ−ヒドロキシプロリン＃、Ｌ−チオプロリン＊、４−メチル−Ｐｈｅ＊、ペンタメチル−Ｐｈｅ＊等のフェニルアラニン（Ｐｈｅ）のメチル誘導体、Ｌ−Ｐｈｅ（４−アミノ）＃、Ｌ−Ｔｙｒ（メチル）＊、Ｌ−Ｐｈｅ（４−イソプロピル）＊、Ｌ−Ｔｉｃ（１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸）＊、Ｌ−ジアミノプロピオン酸＃及びＬ−Ｐｈｅ（４−ベンジル）＊。記号＊は、（相同的又は非相同的置換に関連する）上記の議論の目的のために、誘導体の疎水性を示すために利用されているが、＃は、誘導体の親水性を示すために利用され、＃＊は両親媒特性を示す。
【０４３５】
バリアントアミノ酸配列は、グリシン若しくはβ−アラニン残基等のアミノ酸スペーサーに加えて、メチル、エチル又はプロピル基等のアルキル基を含む配列の任意の２個のアミノ酸残基の間に挿入され得る適切なスペーサー基を含み得る。さらなる変形の形態は、当業者によって十分に理解されるペプトイド形態の１個又は２個以上のアミノ酸残基の存在を含む。誤解を避けるために、「ペプトイド形態」は、α−炭素置換基が、α−炭素ではない残基の窒素原子上にある、バリアントアミノ酸残基を指すために使用される。ペプトイド形態のペプチドを調製するためのプロセスは、当技術分野において、例えば、Simon RJ et al., PNAS (1992) 89(20), 9367-9371及びHorwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13(4), 132-134で公知である。
【０４３６】
本発明における使用のためのヌクレオチド配列は、その中に、合成又は修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい。オリゴヌクレオチドに対するいくつかの異なるタイプの修飾は当技術分野において公知である。これらは、メチルホスホネート及びホスホロチオエート主鎖、並びに／或いは分子の３’及び／若しくは５’末端でのアクリジン又はポリリジン鎖の付加を含む。本発明の目的のために、本明細書に記載のヌクレオチド配列は、当技術分野において利用可能な任意の方法によって修飾され得ることが理解されるべきである。このような修飾は、本発明のヌクレオチド配列のインビボ活性又は寿命を増強するために行われ得る。
【０４３７】
本発明は、本発明の核酸配列に相補的な配列、又は本発明の配列若しくはそれらに相補的な配列のいずれかとハイブリダイズする能力がある配列も包含する。本明細書において使用される「ハイブリダイゼーション」という用語は、「核酸の鎖が塩基対合によって相補的な鎖と連結されるプロセス」及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、polymerase chain reaction）技術で行われる増幅のプロセスを含むものとする。
【０４３８】
本発明は、本発明のヌクレオチド配列（本明細書で示されるものと相補的な配列を含む）をハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列にも関する。好ましくは、ハイブリダイゼーションは、ストリンジェンシーな条件（例えば、５０℃、及び０．２×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸Ｎａ３、ｐＨ７．０｝）下で決定される。より好ましくは、ハイブリダイゼーションは、高ストリンジェンシーな条件（例えば、６５℃、及び０．１×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸Ｎａ３、ｐＨ７．０｝）下で決定される。
【０４３９】
１つの態様において、本発明における使用のための配列は、合成配列、即ち、インビトロの化学的又は酵素的合成によって調製される配列である。これは、限定されないが、宿主生物体のための最適なコドンの用法で作製された配列を含む。
【０４４０】
「発現ベクター」という用語は、インビボ又はインビトロで発現する能力があるコンストラクトを意味する。１つの実施形態において、本発明のベクターは、本明細書に記載のＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子を発現する。１つの実施形態において、本発明のベクターは、本明細書に記載のＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子をさらに発現する。好ましくは、発現ベクターは、適切な宿主生物体のゲノムに組み込まれる。「組み込まれた」という用語は、好ましくは、ゲノムへの安定的な組み込みに及ぶ。
【０４４１】
本発明における使用のためのヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列が適切な宿主生物体によるヌクレオチド配列の発現を提供する能力がある制御配列と作動可能に連結されたベクター中に存在し得る。本発明における使用のためのコンストラクトは、本発明のポリペプチドの発現を提供するために、本明細書に記載の適切な宿主細胞に形質転換され得る。ベクター、例えば、プラスミド、コスミド又はファージベクターの選択は、多くの場合、ベクターが導入される宿主細胞に依存する。ベクターは、例えば、ＲＮＡの生成のためにインビトロで使用され得るか、又は宿主細胞にトランスフェクト、形質転換、形質導入若しくは感染させるために使用され得る。
【０４４２】
いくつかの適用において、本発明における使用のためのヌクレオチド配列は、宿主細胞の選択による等のヌクレオチド配列の発現を提供する能力がある制御配列に作動可能に連結される。例として、本発明は、このような制御配列と作動可能に連結された本明細書に記載のＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子のヌクレオチド配列を含むベクターに及び、即ち、ベクターは発現ベクターである。適切には、ベクターは、追加で、制御配列に作動可能に連結された本明細書に記載のＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子のヌクレオチド配列を含み得る。
【０４４３】
「作動可能に連結された」という用語は、記載された成分が、それらの意図された方法でそれらが機能することを可能にする関係にある近位を指す。コード配列に「作動可能に連結された」制御配列は、コード配列の発現がコントロール配列に適合する条件下で達成されるような方法で連結される。
【０４４４】
「制御配列」という用語は、プロモーター及びエンハンサー、並びに他の発現制御シグナルを含む。「プロモーター」という用語は、当技術分野における通常の意味、例えば、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位で使用される。Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子又はＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子及びＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子をコードするコンストラクト内のヌクレオチド配列は、少なくともプロモーターに作動可能に連結され得る。
【０４４５】
「カセット」又は「ベクター」等の用語と同義である「コンストラクト」という用語は、プロモーターに直接的又は間接的に結合する、本発明による使用のためのヌクレオチド配列を含む。
【０４４６】
間接的な結合の例は、本発明のプロモーター及びヌクレオチド配列の中間のＳｈ１−イントロン又はＡＤＨイントロン等のイントロン配列等の適切なスペーサー基の提供である。同じことは、直接的又は間接的な結合を含む本発明に関する「融合」という用語に当てはまる。いくつかの例において、この用語は、野生型遺伝子のプロモーターに元々関連するタンパク質についてコードするヌクレオチド配列の天然の組み合わせ、及びこれらが両方ともそれらの天然環境にある場合には及ばない。コンストラクトは、マーカーを含有するか、又は発現することさえでき、これは、遺伝子コンストラクトの選択を可能にする。
【０４４７】
植物を形質転換するために使用される一般的な技術の概説は、Potrykus（Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225）及びChristou（Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27）による論説に見出すことができ、これらは参照によって本明細書に組み込まれる。植物形質転換に対するさらなる教示は、参照によって本明細書に組み込まれる欧州特許出願公開第０４４９３７５号明細書において見出され得る。
【０４４８】
１つの実施形態において、植物（例えば、タバコ植物）におけるＮｉｃ１遺伝子座のジェノタイピングにおける使用のためのＳＮＰを本明細書において提供する。
【０４４９】
１つの実施形態において、植物（例えば、タバコ植物）におけるＮｉｃ１遺伝子座のジェノタイピングにおける使用のためのマーカーを本明細書において提供する。１つの実施形態において、植物（例えば、タバコ植物）におけるＮｉｃ１遺伝子座のジェノタイピングにおける使用のためのプライマーのペアを本明細書において提供する。１つの実施形態において、タバコ植物におけるＮｉｃ１遺伝子座のジェノタイピングのためのプライマーを表４に提示する。
【０４５０】
１つの実施形態において、植物（例えば、タバコ植物）におけるＮｉｃ２遺伝子座のジェノタイピングにおける使用のためのマーカーを本明細書において提供する。１つの実施形態において、植物（例えば、タバコ植物）におけるＮｉｃ２遺伝子座のジェノタイピングにおける使用のためのプライマーのペアを本明細書において提供する。１つの実施形態において、タバコ植物におけるＮｉｃ２遺伝子座のジェノタイピングのためのプライマーを表５及び６に提示する。
【０４５１】
本明細書で使用される場合、「ＳＮＰ」又は「一塩基多型」は、ゲノム配列中の単一のヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｃ又はＧ）が参照配列に関して変更されるか、又は可変である場合に生じる配列多様性を意味する。「ＳＮＰマーカー」は、ＳＮＰがゲノムの部位にマッピングされる場合に存在する。
【０４５２】
本明細書で使用される場合、「マーカー」又は「ＳＮＰマーカー」は、ゲノムにおける特定の遺伝子座を特徴付けるために十分にユニークな核酸配列又はアミノ酸配列を意味する。多型形質は、それが、差次的に遺伝し、所望の表現型形質と連鎖不平衡を示す場合、マーカーとして使用することができる。形質が所与のマーカーと連鎖すると述べられる場合、配列が形質に影響を与える実際のＤＮＡセグメントは、通常、マーカーと共分離されることが理解される。
【０４５３】
１つの実施形態において、表４において特定された任意のＳＮＰは、Ｎｉｃ１遺伝子座の存在、非存在又は改変を特定するために植物（例えば、タバコ植物）をジェノタイピングする方法において使用され得る。１つの実施形態において、表４において特定された任意のプライマーのペアは、Ｎｉｃ１遺伝子座の存在又は非存在を特定するために植物（例えば、タバコ植物）をジェノタイピングする方法において使用され得る。
【０４５４】
１つの実施形態において、表５又は表６において特定された任意のＳＮＰは、Ｎｉｃ２遺伝子座の存在又は非存在を特定するために植物（例えば、タバコ植物）をジェノタイピングする方法における使用のためである。１つの実施形態において、表４又は表７において特定された任意のプライマーのペアは、Ｎｉｃ１遺伝子座の存在又は非存在を特定するために植物（例えば、タバコ植物）をジェノタイピングする方法において使用され得る。
【０４５５】
他に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 20 ED., John Wiley and Sons, New York (1994)及びHale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991)は、本開示において使用される多くの用語の一般的な辞書を当業者に提供する。
【０４５６】
本開示は、本明細書に開示される例示的な方法及び材料に限定されるものではなく、本明細書に記載されたものと同様又は同等の任意の方法及び材料を、本開示の実施形態の実施又は試験において、使用することができる。数値範囲は、範囲を定義する数字を含む。他の指示がない限り、それぞれ、任意の核酸配列を、左から右に５’から３’の方向で記載し、アミノ酸配列を、左から右にアミノからカルボキシの方向で記載する。
【０４５７】
本明細書において提供される見出しは、全体として本明細書を参照することによって有することができる本開示の様々な態様又は実施形態を限定するものではない。したがって、直下で定義される用語は、全体として本明細書を参照することによってより完全に定義される。
【０４５８】
アミノ酸は、本明細書において、アミノ酸の名称、３文字略称又は１文字略称を使用して言及される。本明細書で使用される場合、「タンパク質」という用語は、タンパク質、ポリペプチド及びペプチドを含む。本明細書で使用される場合、「アミノ酸配列」という用語は、「ポリペプチド」という用語及び／又は「タンパク質」という用語と同義である。いくつかの例において、「アミノ酸配列」という用語は、「ペプチド」という用語と同義である。いくつかの例において、「アミノ酸配列」という用語は、「酵素」という用語と同義である。
【０４５９】
本開示及び特許請求の範囲において、アミノ酸残基についての従来の１文字及び３文字表記を使用し得る。アミノ酸の３文字表記は、生化学命名に関するＩＵＰＡＣ  ＩＵＢ合同委員会（ＪＣＢＮ、Joint Commission on Biochemical Nomenclature）に準拠して定義した。ポリペプチドが、遺伝コードの縮重に起因する２以上のヌクレオチド配列によってコードされ得ることも理解される。
【０４６０】
用語の他の定義は、本明細書全体から明らかであり得る。例示的な実施形態をより詳細に記載する前に、本開示が、記載された特定の実施形態に限定されるものではなく、当然ながら、それ自体が変化し得ることが理解される。また、本開示の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書において使用される専門用語は、特定の実施形態を記載することのみを目的としており、限定することを意図するものではないことが理解されるべきである。
【０４６１】
値の範囲が提供される場合、文脈が他を明確に指示しない限り、その範囲の上限及び下限の間の、それぞれの間にある値はまた、下限の単位の１０分の１まで、具体的に開示されることが理解される。言及された範囲内の任意の言及された値又は間にある値、及び言及された範囲内のその他の言及された値又は間にある値の間のより小さなそれぞれの範囲は、本開示内に包含される。これらのより小さな範囲の上限及び下限は、独立して、範囲内に含まれ得るか、又は除外され得、いずれか、どちらも又は両方の限定がより小さな範囲に含まれるそれぞれの範囲は、言及された範囲内の任意の具体的に除外する限定に対する対象も、本開示内に包含する。言及された範囲が、一方又は両方の限定を含む場合、限定を含むいずれか又は両方を除外する範囲も本開示に含まれる。
【０４６２】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「そのｔｈｅ」は、文脈が他を明確に指示しない限り、複数形を含むことに留意すべきである。このように、例えば、「酵素」又は「硝酸還元酵素」への言及は、複数のこのような候補薬剤及び当業者に公知のこれらの均等物等を含む。
【０４６３】
優位性
驚くべきことに、本明細書において教示するように、Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現を調節することによって、植物のアルカロイド含有量及び／又はＴＳＮＡ含有量を調節することができることを見出した。その結果、タバコ製品の消費者によって求められている、調節されたアルカロイド含有量及び／又はＴＳＮＡ含有量、並びに商業的に望ましい形質を有するタバコ製品を製造することができる。
【０４６４】
本発明者らは、驚くべきことに、Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現を調節することによって、タバコ植物のアルカロイド含有量、例えば、ニコチン含有量及び／又はＴＳＮＡ含有量を調節するための方法を見つけ出した。タバコ植物のニコチン含有量又はＴＳＮＡは、Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現を阻害することによって減少させることができる。本発明の前に、本明細書に記載のＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現の調節がアルカロイド含有量及び／又はＴＳＮＡ含有量を調節するために使用することができることは知られていなかった。
【０４６５】
本発明者らは、Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の調節が、改変植物のアルカロイド含有量を驚くべき低レベルに低減することができることを見つけ出した。
【０４６６】
・本明細書において実証されるように、野生型バックグラウンドにおけるＥＲＦ１９９の単一ノックアウト変異は、ＬＩ（ａａＢＢ）におけるｎｉｃ１変異よりもアルカロイド含有量の大きな低減をもたらす。
【０４６７】
ＬＩ（低中間体、ａａＢＢ）系統は、通常、ＨＡ（高アルカロイド、ＡＡＢＢ）系統と比較して、約半分のアルカロイド含有量を産生する。しかしながら、実施例１３において、ＬＩ系統と同等のＥＭＳ系統を生産した。Ｎｉｔａｂ４．５＿０００３０９０ｇ００３０．１（ＥＲＦ１９９）における変異を有するＥＭＳ系統を生産した。これらの変異体ＥＭＳ系統は、ＨＡ系統と比較して、約３分の１のアルカロイド含有量を産生し、これは、ＬＩ系統について予想されるよりもはるかに低かった。
【０４６８】
・本明細書において実証されるように、ＨＩバックグラウンド（ＡＡｂｂ）において、ＥＲＦ１９９におけるノックアウト変異は、驚くべきことに、ＬＡバーレー２１（ａａｂｂ）よりも非常に低いアルカロイド含有量を与える。
【０４６９】
Ｎｉｃ１  ＥＲＦ  Ｎｉｔａｂ４．５＿０００３０９０ｇ００３０．１（ＥＲＦ１９９）がＨＩ系統（ＡＡｂｂ）の遺伝子編集によってノックアウトされ、ノックアウト系統のアルカロイド含有量は、同等のＬＡ系統（ａａｂｂ）のアルカロイド含有量よりもはるかに低かった（実施例１４を参照されたい）。これらのデータは、驚くべきことに、Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子（例えば、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００３０９０ｇ００３０．１又はＥＲＦ１９９）単独の活性又は発現（例えば、活性若しくは発現のノックダウン又はノックアウト）の調節が、植物又はその一部のアルカロイド含有量を調節する（例えば、低減する）のに十分であることを示唆する。
【０４７０】
・ＨＩ（ＡＡｂｂ）におけるｎｉｃ２変異が単一の植物においてＥＲＦ１９９変異と組み合わされる場合、アルカロイドの低減は、エピスタシスが示唆するそれらの組み合わされた相加効果よりもはるかに大きい。
【０４７１】
本明細書において議論された刊行物は、本出願の出願日の前のそれらの開示のためにのみ単に提供される。本明細書において、そのような刊行物が本明細書に添付された特許請求の範囲に対する先行技術を構成することの自認として決して解釈されるべきではない。
［実施例］
【実施例１】
【０４７２】
バーレー２１の準同質遺伝子系統のアルカロイド分析
本発明者らは、植物中のアルカロイド含有量の変化の原因となるＮｉｃ１遺伝子を特定しようとした。バーレー２１（Ｂ２１）の４つのＮＩＬである、正常／高アルカロイドＢ２１（ＨＡ−Ｂ２１）、高中間体アルカロイドＢ２１（ＨＩ−Ｂ２１）、低中間体アルカロイドＢ２１（ＬＩ−Ｂ２１）及び低アルカロイドＢ２１（ＬＡ−Ｂ２１）（本明細書の以下で、ＨＡ、ＨＩ、ＬＩ及びＬＡと称する）を、温室内で、PRO-MIX土壌を入れた５つの排水孔を有する６．５インチ深さ×６．５インチ直径のポットにおいて、それらが２カ月齢になるまで生育させ、根のサンプルをＲＮＡ−ｓｅｑ分析のために収集した。３個の異なるＦ２分離個体群は、独立に、ＨＡ（ＡＡＢＢ）×ＬＩ（ａａＢＢ）、ＨＡ（ＡＡＢＢ）×ＬＡ（ａａｂｂ）及びＨＩ（ＡＡｂｂ）×ＬＡ（ａａｂｂ）の交雑種に由来した。それぞれＨＡ×ＬＡ及びＨＡ×ＬＩの交雑種由来の２００個のＦ２個体を圃場で生育させ、アルカロイドレベルを、３カ月齢ですべての系統について測定した。６００個のＨＩ×ＬＡのＦ２を、それらが３カ月齢になるまで圃場で生育させ、上記の通りアルカロイド含有量についてアッセイした。
【０４７３】
結果  −  ＨＡ（ＡＡＢＢ）×ＬＩ（ａａＢＢ）及びＨＡ（ＡＡＢＢ）×ＬＡ（ａａｂｂ）の交雑種に由来するＦ２のフェノタイピング
ＨＡ×ＬＩ及びＨＡ×ＬＡの交雑種に由来するＦ２植物についての総アルカロイドレベルは、連続的であることが見出され（図１、パネルＡは、親系統及びＨＡ×ＬＩの交雑種に由来するＦ２の総アルカロイドレベルを示し、パネルＢは、親系統及びＨＡ×ＬＡ（Ｂ）の交雑種に由来するＦ２のニコチンレベルを示す）、したがって、両方の個体群についてのＮｉｃ１の遺伝子型は、表現型の値に基づいて、明確に推察することができなかった。これは、特に、ＨＡ×ＬＩ由来のＦ２個体群における場合であり、ここで、親系統についての表現型の値の範囲は重複している（図１Ａ）。Ｎｉｃ１遺伝子座にマッピングするために、我々は、ＨＡ×ＬＩ及びＨＡ×ＬＡの個体群から、最低の２０個及び２４個、並びに最高の２４個及び２０個のＦ２系統を、それぞれ選択した。最低又は最高のアルカロイドレベルを有するＦ２植物（合計で８８個）は、ホモ接合性の劣性（ａａ）又は優性（ＡＡ）としてジェノタイピングすることが可能であろう。
【実施例２】
【０４７４】
マーカーの開発及び連鎖解析
アルカロイド含有量を変更する原因となる候補遺伝子を決定するために、ＨＡ×ＬＡ及びＨＡ×ＬＩのＦ２個体群から最も極端に高いか、又は最も極端に低いアルカロイドレベルを有する実施例１の４４個のＦ２を、それらのそれぞれの親を用いて、特別注文のタバコの30K Infinium iSelect HD BeadChip（Illumina Inc.社、サンディエゴ、カリフォルニア）によるＳＮＰジェノタイピングのために選択した。ＳＮＰクラスターを、GenomeStudioバージョン２０１１．１（Illumina Inc.社、サンディエゴ、カリフォルニア）を使用して発生させ、特定されたすべての多型マーカーをさらなる解析のために使用した。両方の個体群についての遺伝子連鎖マップを、回帰マッピング関数を使用するJoinmapバージョン３．０（Stam, P. (1993). Construction of integrated genetic linkage maps by means of a new computer package - Joinmap. Plant Journal 3, 739-744）のソフトウェアを使用し、デフォルト設定で構築した。Ｎｉｃ１及びＮｉｃ２遺伝子座の簡単なマッピングのために、区間マッピングを、MapQTLバージョン６．０（Van Ooijen J. W. (2009). MapQTL 6: Software for the mapping of quantitative trait loci in experimental populations of diploid species. Wageningen (The Netherlands): Kyazma BV、参照によって本明細書に組み込まれる）を使用して、選択された選択的ジェノタイピングオプション及び１ｃＭのステップサイズで、２つの個体群に対して行った。
【０４７５】
２つの上記個体群においてＲＮＡ−ｓｅｑ、又は特別注文の30K Infinium iSelect HD BeadChipの使用によるいずれかから特定されたＳＮＰを、それぞれの遺伝子型を配列決定すること、及びＨＡの配列に対して比較することによって、検証した。すべての確認されたＳＮＰを、ＣＡＰＳ又はｄＣＡＰＳマーカー（Neff, M. M., Turk, E., and Kalishman, M. (2002). Web-based primer design for single nucleotide polymorphism analysis. Trends in Genetics 18, 613-5、参照によって本明細書に組み込まれる）のいずれかに転換し、ＨＩ×ＬＡのＦ２個体群についてのマップを発生させるために使用した。この個体群についての遺伝子マップを、Joinmapを使用し、上記の設定を使用して、構築した。ジェノタイピングのために使用するＤＮＡを、ＣＴＡＢ方法（Doyle, J. J. and J. L. Doyle. 1987. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin 19: 11-15、参照によって本明細書に組み込まれる）を使用して、すべての系統の葉のサンプルから抽出した。
【０４７６】
ＲＮＡの単離及びＲＮＡの配列決定
製造者のマニュアルに従って、総ＲＮＡを、QIAGEN Plant RNeasy mini kit（QIAGEN社）を使用することによって単離し、DNase Iで処理して、残ったＤＮＡ混入物を除去した。ＲＮＡサンプルの量及び品質を、BioAnalyzer 2100（Agilent Genomics社）で評価した。ＲＮＡ−ｓｅｑライブラリーを、Illumina TruSeq RNA Sample Prep Kit（Illumina社）を使用して構築した。すべてのライブラリーを、Illumina Hiseq Rapid Mode 150-Cycleプラットフォームにおいて配列決定した。ベースコーリング及びサンプルの逆多重化を、Illumina HiSeq Controlソフトウェア及びCASAVA pipelineソフトウェアを使用して行った。
【０４７７】
ＲＮＡ−ｓｅｑデータ解析及びＳＮＰコーリング
サンプルの分離、及びアダプター／バーコードのトリミングを、標準Illuminaソフトウェアを使用して行い、トリミングされたリードの品質をFastQCでチェックした。２つの参照トランスクリプトームを、ＲＮＡ配列決定のデータマイニングのために使用した。１つは、Rushton PJ, Bokowiec MT, Han SC, Zhang HB, Brannock JF, Chen XF, Laudeman TW, Timko MP. 2008. Tobacco transcription factors: Novel insights into transcriptional regulation in the Solanaceae. Plant Physiology 147: 280-295（参照によって本明細書に組み込まれる）によってアノテートされた２３９のＥＲＦ遺伝子を含有する。他の１つは、ＴＮ  ９０ドラフトゲノム（Sierro, N., Battey, J. N., Ouadi, S., Bakaher, N., Bovet, L., Willig, A., Goepfert, S., Peitsch, M. C., and Ivanov, N. V. (2014). The tobacco genome sequence and its comparison with those of tomato and potato. Nature Communications 5, 3833、参照によって本明細書に組み込まれる）における遺伝子予測によって発生させた。ＲＮＡ−ｓｅｑリードを、TopHat  ｖ２．０．９ calling Bowtie2 ｖ２．１．０（Langmead, B., and Salzberg, S. L. (2012). Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods 9, 357-9、参照によって本明細書に組み込まれる）を使用して、一般的な特徴フォーマットファイル（ＧＦＦ、general feature format file）を有するタバコ参照トランスクリプトームにアライメントさせた。Genome Analysis Toolkit Unified Genotyper（GATK；バージョン２．８−１−ｇ９３２ｃｄ３ａ）を使用して、４つの系統におけるＳＮＰをコールし、マルチサンプルのバリアントコールフォーマット（VCF、variant call format）ファイル（McKenna, A., Hanna, M., Banks, E., Sivachenko, A., Cibulskis, K., Kernytsky, A., Garimella, K., Altshuler, D., Gabriel, S., Daly, M., and DePristo, M. A. (2010). The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome Research 20, 1297-303、参照によって本明細書に組み込まれる）を得た。その後、２０未満の品質のバリアントコールを、ＶＣＦフィルターで除去した。
【０４７８】
物理的マッピング及び候補遺伝子の特定
Ｎｉｃ１又はＮｉｃ２遺伝子座のいずれかに遺伝子学的に近接して連鎖することが分かっているＳＮＰマーカーを、タバコについての高密度コンセンサス遺伝子マップ（Nicotiana tabacum 30k Infinium HD consensus map 2015；https://solgenomics.net/cview/map.pl?map_version_id=178、参照によって本明細書に組み込まれる）に対してアライメントさせた。改善されたタバコゲノムアセンブリー（Edwards, K. D., Fernandez-Pozo, N., Drake-Stowe, K., Humphry M., Evans, A. D., Bombarely, A., Allen, F., Hurst, R., White, B., Kernodle, S. P., Bromley, J. R., Sanchez-Tamburrino, J. P., Lewis, R.  S., and Mueller, L.A. (2017) A reference genome for Nicotiana tabacum enables map-based cloning of homeologous loci implicated in nitrogen utilization efficiency. BMC Genomics 18, 448、参照によって本明細書に組み込まれる）に対してユニークに固定することが可能なＮｉｃ１及びＮｉｃ２遺伝子座周辺の所望の領域内のマーカーを使用して、２つの領域に対応するBioNanoハイブリッドスキャフォールド（即ち、偽染色体領域）を特定した。その後、配列中のギャップを、基本ローカルアライメント検索ツール（ＢＬＡＳＴ、Basic Local Alignment Search Tool）バージョン２．２．２４＋（https://BLAST.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST.cgi）のデフォルト設定でメガブラストオプションを使用して、Edwards, K. D., Fernandez-Pozo, N., Drake-Stowe, K., Humphry M., Evans, A. D., Bombarely, A., Allen, F., Hurst, R., White, B., Kernodle, S. P., Bromley, J. R., Sanchez-Tamburrino, J. P., Lewis, R.  S., and Mueller, L.A. (2017) A reference genome for Nicotiana tabacum enables map-based cloning of homeologous loci implicated in nitrogen utilization efficiency. BMC Genomics 18, 448（上述）のゲノムから所望の２つの領域における遺伝子モデル（コード領域）の配列と同一マッチを含有するタバコ品種ＴＮ９０（Sierro, N., Battey, J. N., Ouadi, S., Bakaher, N., Bovet, L., Willig, A., Goepfert, S., Peitsch, M. C., and Ivanov, N. V. (2014). The tobacco genome sequence and its comparison with those of tomato and potato. Nature Communications 5, 3833、参照によって本明細書に組み込まれる）から同等のスーパースキャフォールドを特定することによって埋めた。次いで、相互ＢＬＡＳＴ比較を、BioNanoスーパースキャフォールドにマッピングすることが可能ではない２つの領域におけるEdwards, K. D., Fernandez-Pozo, N., Drake-Stowe, K., Humphry M., Evans, A. D., Bombarely, A., Allen, F., Hurst, R., White, B., Kernodle, S. P., Bromley, J. R., Sanchez-Tamburrino, J. P., Lewis, R.  S., and Mueller, L.A. (2017) A reference genome for Nicotiana tabacum enables map-based cloning of homeologous loci implicated in nitrogen utilization efficiency. BMC Genomics 18, 448（上述）のゲノムスキャフォールドをさらに特定するために、ＴＮ９０スーパースキャフォールドにおいて行った。Edwards, K. D., Fernandez-Pozo, N., Drake-Stowe, K., Humphry M., Evans, A. D., Bombarely, A., Allen, F., Hurst, R., White, B., Kernodle, S. P., Bromley, J. R., Sanchez-Tamburrino, J. P., Lewis, R.  S., and Mueller, L.A. (2017) A reference genome for Nicotiana tabacum enables map-based cloning of homeologous loci implicated in nitrogen utilization efficiency. BMC Genomics 18, 448のスキャフォールドの大多数がＴＮ９０にマッピングすることが可能である場合においてのみ、スーパースキャフォールドをリストに含めた。ゲノムスキャフォールドにユニークにマッピングすることが可能であるが、BioNanoハイブリッドスキャフォールドに存在しないマーカーも、コンセンサスのＨＡ×ＬＡ又はＨＡ×ＬＩ遺伝子マップにおけるそれらの相対的な場所に基づいて、所望の２つの領域内の対応するスキャフォールドを配置するために使用した。次いで、２つの更新された領域における遺伝子モデル候補を、ＲＮＡ−ｓｅｑデータ（Edwards, K. D., Fernandez-Pozo, N., Drake-Stowe, K., Humphry M., Evans, A. D., Bombarely, A., Allen, F., Hurst, R., White, B., Kernodle, S. P., Bromley, J. R., Sanchez-Tamburrino, J. P., Lewis, R.  S., and Mueller, L.A. (2017) A reference genome for Nicotiana tabacum enables map-based cloning of homeologous loci implicated in nitrogen utilization efficiency. BMC Genomics 18, 448、上述）に対して比較し、必要により補正した。
【０４７９】
この研究において特定された領域をAdams, A. C., De Godoy Lusso, M. S., Pramod, S., and Xu, D. (2016). Compositions and Methods for Producing Tobacco Plants and Products Having Altered Alkaloid Levels. US patent application 20160374387A1（参照によって本明細書に組み込まれる）の領域と比較するために、ＢＬＡＳＴ解析を、Edwards, K. D., Fernandez-Pozo, N., Drake-Stowe, K., Humphry M., Evans, A. D., Bombarely, A., Allen, F., Hurst, R., White, B., Kernodle, S. P., Bromley, J. R., Sanchez-Tamburrino, J. P., Lewis, R.  S., and Mueller, L.A. (2017) A reference genome for Nicotiana tabacum enables map-based cloning of homeologous loci implicated in nitrogen utilization efficiency. BMC Genomics 18, 448（上述）のゲノムに対して、Adams, A. C., De Godoy Lusso, M. S., Pramod, S., and Xu, D. (2016). Compositions and Methods for Producing Tobacco Plants and Products Having Altered Alkaloid Levels. US patent application 20160374387A1（上述）からのゲノム配列を使用して、上記のようにして行った。少なくとも１ｋｂにわたって最低で９９％の同一性を示す配列のヒットをマッチの証拠と見なした。
【０４８０】
結果
ＨＡ×ＬＡ及びＨＡ×ＬＩに由来する選択されたＦ２のiSelect HD BeadChipジェノタイピング
特別注文の30K Infinium iSelect HD BeadChipを使用して、我々は、ＨＡ×ＬＩ及びＨＡ×ＬＡ個体群の両方におけるいくつかの他の非連鎖群を特定し（データは示さない）、より多くのＮｉｃ１及びＮｉｃ２領域が、ＨＡ及びＬＡの間で分離していることを示す。これは、２つの親の間で多型性のマーカーのマッピングのみから、Ｎｉｃ１領域を見つける可能性が低いことを示唆している。MapQTLにおける選択的ジェノタイピング方法によるＱＴＬ解析は、総アルカロイド含有量に有意に関連する（最大ＬＯＤスコアは、それぞれ、３１．１３及び２６．９５）ＨＡ×ＬＩ及びＨＡ×ＬＡのＦ２個体群の両方に共通するいくつかのマーカーを含有する連鎖群を特定し、この形質における５１．２％及び４６．２％の変動をそれぞれ説明した。これらのマーカーは、Ｎ．タバカムの30k Infinium HDコンセンサスマップ２０１５の連鎖群７（Edwards, K. D., Fernandez-Pozo, N., Drake-Stowe, K., Humphry M., Evans, A. D., Bombarely, A., Allen, F., Hurst, R., White, B., Kernodle, S. P., Bromley, J. R., Sanchez-Tamburrino, J. P., Lewis, R.  S., and Mueller, L.A. (2017) A reference genome for Nicotiana tabacum enables map-based cloning of homeologous loci implicated in nitrogen utilization efficiency. BMC Genomics 18, 448（前述）ゲノムの偽染色体７）におけるマーカーと同一の場所に位置していた。
【０４８１】
図２は、Ｎ．タバカム（N.tabacum）の30k Infinium HDコンセンサスマップ２０１５を用いて、ＨＡ×ＬＩ及びＨＡ×ＬＡの交雑種由来の選択されたＦ２個体の遺伝子マップの比較を示す。破線は、Ｆ２マップ及びコンセンサスマップの間で特定されたマーカーを表し、鎖線は、２つのＦ２マップの間で特定されたマーカーを表す。太字フォントは、２以上のマップに共通のマーカーを表す。ＨＡ×ＬＡ又はＨＡ×ＬＩマップのいずれかにおいて特定されたマーカーのみをコンセンサスマップに示し、他のマーカーの位置を、黒の水平線として示す。
【０４８２】
この群に加えて、ＨＡ×ＬＡのＦ２個体群における総アルカロイド含有量と有意な関連（最大ＬＯＤスコアが１４．０１）を有する別の群も特定したが、連鎖群７におけるマーカーとしてこの形質についての変動のおよそ半分であることのみを説明した（最大２７．６％の変動が説明された）。この群もＮｉｃ２に対する優性遺伝子特異的マーカー（Qin, Q., Li, D., Dai, X., Zhao, P., Miller, R., Jack, A., and Yang, S. (2015) Development of user-friendly marker for Nic2 in tobacco. SRC, Tobacco Science Research Conference, 69, abstract 79；図２においてＮＩＣ２と標識付け）を含有していた。この群からのマーカーは、コンセンサスマップの連鎖群１９（Edwards, K. D., Fernandez-Pozo, N., Drake-Stowe, K., Humphry M., Evans, A. D., Bombarely, A., Allen, F., Hurst, R., White, B., Kernodle, S. P., Bromley, J. R., Sanchez-Tamburrino, J. P., Lewis, R.  S., and Mueller, L.A. (2017) A reference genome for Nicotiana tabacum enables map-based cloning of homeologous loci implicated in nitrogen utilization efficiency. BMC Genomics 18, 448（前述）ゲノムの偽染色体１９）におけるマーカーと同一の場所に位置しており、これは、Ｎｉｃ２遺伝子座の提案されたゲノム領域（Kajikawa, M., Sierro, N., Kawaguchi, H., Bakaher, N., Ivanov, N. I., Hashimoto, T., and Shoji, T. (2017). Genomic insights into the evolution of the nicotine biosynthesis pathway in tobacco. Plant Physiology 174, 999-1011）と一致した。
【０４８３】
ＲＮＡ配列決定に基づくＥＲＦ遺伝子についてのＳＮＰの特定
転写因子とタバコゲノムのアノテーションにより、タバコゲノムにおける２３９のＥＲＦ遺伝子が明らかになった（Rushton PJ, Bokowiec MT, Han SC, Zhang HB, Brannock JF, Chen XF, Laudeman TW, Timko MP. 2008. Tobacco transcription factors: Novel insights into transcriptional regulation in the Solanaceae. Plant Physiology 147: 280-295、参照によって本明細書に組み込まれる）。ＨＡ、ＨＩ、ＬＩ及びＬＡのＲＮＡ−ｓｅｑ解析に基づくＳＮＰの特定は、ＥＲＦ１１０（Ｎｉｔａｂ４．５＿０００６３８２ｇ００４０．１；表１）における１つのＳＮＰを明らかにした。制限酵素BstZ17Iの助けにより、ＥＲＦ１１０中のＳＮＰをＣＡＰＳマーカーに転換し、ＳＮＰ４と指定した（表７）。ＨＡ×ＬＩ及びＨＡ×ＬＡの交雑種に由来する選択された８８個のＦ２個体での連鎖解析は、アルカロイドレベルが最低の４４個のＦ２から検出された６つの組換え体によって、ＳＮＰ４がＮｉｃ１遺伝子座に連鎖していることを実証した（図３）。
【０４８４】
【表６】
2020524508.tif 000008
2020524508.tif 000009
【０４８５】
さらにまた、30K Infinium iSelect HD BeadChipマーカーによるＳＮＰ４の連鎖解析は、両方の個体群において総アルカロイド含有量と有意に関連している連鎖群７におけるマーカーと近接して連鎖することを示した（図２）。しかしながら、個々のＦ２植物についての遺伝子型が前に述べるようにしてその表現型データから正確に決定することができないという事実に起因して、観察された組換えは、ミスフェノタイピングに起因し得る。したがって、Ｎｉｃ１遺伝子座のマッピングに対してより適切な個体群を分離することが必要である。
【実施例３】
【０４８６】
Ｂ２１のＮＩＬについての表現型の比較
次いで、Ｂ２１のそれぞれのＮＩＬについての３０個の植物を選択して、それらのアルカロイド含有量を測定した（図４）。異なる系統についての総アルカロイド又はニコチンレベルを、平均ベースで、表現型的に容易に特定することができる。しかしながら、ＬＩ及びＨＩ、ＬＩ及びＨＡ、並びにＨＩ及びＨＡ等の異なる系統の個々の植物の間に、かなりの表現型の重複があるため（図４）、単一の植物ベースでの特定は一致しない。
【０４８７】
同じ系統内であっても、総アルカロイド又はニコチンレベルは、ＬＡ系統を除いて、個々の植物の間で非常に劇的に変化し得る。したがって、我々は、ＨＩ及びＬＡの間の交雑種に由来するＦ２個体群を発生させ、この個体群の総アルカロイド分析を行った（図５）。
【実施例４】
【０４８８】
ＳＮＰ４  ＣＡＰＳマーカーによるＨＩ×ＬＡの６００個のＦ２のジェノタイピング
ＨＡ×ＬＩ及びＨＡ×ＬＡ個体群のジェノタイピングからの結果に基づいて、我々は、より多くの個体群におけるＳＮＰ４  ＣＡＰＳマーカーの診断能力を試験するために決定した。
【０４８９】
ＳＮＰ４を有するＨＩ×ＬＡに由来する６００個のＦ２植物のジェノタイピングは、ＡＡ：Ａａ：ａａが１５０：２８９：１６１の分離比を明らかにし、これは、予想した１：２：１（Ｘ２＝１．２１、ｄｆ＝２、Ｐ＝０．５５）にフィットする。我々は、アルカロイド分析のために、１５０個の予測ホモ接合性優性（ＡＡ）及び１６１個の予測ホモ接合性劣性（ａａ）のＦ２植物を選択した。この２つのＦ２群は、重複なく、分離されていた。予測ａａ遺伝子型を有するすべての個体は、ＬＡ親（０．１８〜０．３８％）の範囲内で、低アルカロイドレベル（０．１７〜０．４１％）を有していた（図５）。
【０４９０】
同様に、アルカロイドレベルは、予測ＡＡ植物について高く、ＬＡ親の範囲内にあるものはなかった。しかしながら、いくつかの予測ＡＡ植物は、ＨＩ親の範囲外であることが観察された。ＡＡとしてジェノタイピングされたが、最低のニコチン含有量を含有する植物（図５において矢印によって表す）においてＮｉｃ１遺伝子型を確認するために、我々は、この個体に対する次世代において、遺伝子型及びアルカロイド表現型の分離をチェックした。すべてのＦ３系統は、ＳＮＰ４マーカーでアッセイされた場合に、予測ＡＡ遺伝子型を保持していた。
【０４９１】
この系統に由来する４０個のＦ３の化学的分析は、すべての植物が、ＨＩに対して同等のレベルのアルカロイドを含有すること（図６）、ＬＡのアルカロイドレベルの範囲内にある植物がないことを明らかにし、選択されたＦ２がホモ接合性であり、我々が開発したＳＮＰマーカーがＮｉｃ１遺伝子座で共分離されているという仮説を実証する。
【実施例５】
【０４９２】
ＨＩ×ＬＡのＦ２個体群におけるＮｉｃ１の遺伝子マッピング
我々は、30K Infinium iSelect HD BeadChipを使用してＮｉｃ１遺伝子座に近接して連鎖すると特定された配列の多型性を確認するために、４個のＢ２１のＮＩＬのＤＮＡ配列決定を行った（図３）。６つのこれらのＳＮＰは、ＰＣＲベースのＣＡＰＳ又はｄＣＡＰＳマーカーに転換することが可能であった（表４は、Ｎｉｃ１領域についての特別注文の30K Infinium iSelect HD BeadChip解析に基づいて特定されたＳＮＰ及び転換されたマーカーを示す。）。Ｎｉｃ１遺伝子座の遺伝子マッピングについてより多くのマーカーを特定するために、我々は、公開されているＴＮ９０のゲノムの参照配列（Sierro, N., Battey, J. N., Ouadi, S., Bakaher, N., Bovet, L., Willig, A., Goepfert, S., Peitsch, M. C., and Ivanov, N. V. (2014). The tobacco genome sequence and its comparison with those of tomato and potato. Nature Communications 5, 3833、参照によって組み込まれる）を使用するＲＮＡ配列決定に基づくＳＮＰの特定を実施した。６を超えるＳＮＰを、Ｎｉｃ１について分離されているＢ２１のＮＩＬの間で検出し、このすべてをＣＡＰＳ又はｄＣＡＰＳマーカーに転換した（表７）。我々は、可能性があるＮｉｃ１欠失領域を解析する以前の研究から２つのＳＮＰについてのＣＡＰＳマーカーも発生させ、図７及び表７においてＳＮＰ１３及びＳＮＰ１４と標識した（Adams, A. C., De Godoy Lusso, M. S., Pramod, S., and Xu, D. (2016). Compositions and Methods for Producing Tobacco Plants and Products Having Altered Alkaloid Levels. US patent application 20160374387A1、参照によって本明細書に組み込まれる）における、それぞれ、配列番号１３３及び１３６）。加えて、我々は、この欠失領域について優性マーカー（図７においてＩＮＤＥＬ１と標識される）を開発するために、同じ刊行物から５００ｋｂの欠失（Adams, A. C., De Godoy Lusso, M. S., Pramod, S., and Xu, D. (2016). Compositions and Methods for Producing Tobacco Plants and Products Having Altered Alkaloid Levels. US patent application 20160374387A1において配列番号３及び４としてアノテートされる）を特徴付けるために使用されるプライマーを利用した。Ｎｉｃ１遺伝子座の遺伝子マッピングを、ＨＩ×ＬＡに由来する１６１個の劣勢Ｆ２植物（ａａ）を使用することによって、表４及び表７におけるマーカーを用いて行った（図７）。遺伝子マップから分かるように、ＳＮＰ４と共分離されているＮｉｃ１遺伝子座は、ＳＮＰ３及びＳＮＰ５に隣接しており（図７）、Adams, A. C., De Godoy Lusso, M. S., Pramod, S., and Xu, D. (2016). Compositions and Methods for Producing Tobacco Plants and Products Having Altered Alkaloid Levels. US patent application 20160374387A1（参照によって本明細書に組み込まれる）によって特定された領域と遺伝子学的に区別される。
【０４９３】
【表７】
2020524508.tif 000010
【実施例６】
【０４９４】
ＨＡ×ＬＡのＦ２個体群におけるＮｉｃ２の遺伝子マッピング
Ｎｉｃ２周辺の領域においてＰＣＲベースのマーカーを開発するために、我々は、ＨＡ×ＬＡのＦ２個体群に基づいて、この遺伝子座に連鎖することが見出されているＳＮＰチップマーカーにおいて、上記のようにして配列決定を行った。６つのこれらのＳＮＰは、ＰＣＲベースＣＡＰＳ又はｄＣＡＰＳマーカーに転換することが可能であった（表５）。
【０４９５】
Ｎｉｃ１遺伝子座のように、我々は、Ｎｉｃ２遺伝子座に連鎖するより多くのＳＮＰを特定するためにＲＮＡ−ｓｅｑを利用した。ｄＣＡＰＳマーカーに転換することが可能な３を超えるＳＮＰを特定した（表６）。Ｎｉｃ２遺伝子座の遺伝子マッピングを、ＨＡ×ＬＡの１８８個のＦ２を使用することによって、表５及び表６におけるマーカーで行った（図８）。遺伝子マップから分かるように、Ｎｉｃ２遺伝子座（Qin, Q., Li, D., Dai, X., Zhao, P., Miller, R., Jack, A., and Yang, S. (2015) Development of user-friendly marker for Nic2 in tobacco. SRC, Tobacco Science Research Conference, 69, abstract 79からのＮＩＣ１マーカーによって定義される）は、ＳＮＰ１７及び１８と共分離される（図８）。
【０４９６】
【表８】
2020524508.tif 000011
【０４９７】
【表９】
2020524508.tif 000012
【実施例７】
【０４９８】
Edwards, K. D., Fernandez-Pozo, N., Drake-Stowe, K., Humphry M., Evans, A. D., Bombarely, A., Allen, F., Hurst, R., White, B., Kernodle, S. P., Bromley, J. R., Sanchez-Tamburrino, J. P., Lewis, R.  S., and Mueller, L.A. (2017) A reference genome for Nicotiana tabacum enables map-based cloning of homeologous loci implicated in nitrogen utilization efficiency. BMC Genomics 18, 448のゲノム配列に基づくＮｉｃ１及びＮｉｃ２の物理的局在化
Ｎ．タバカムの30k Infinium HDコンセンサスマップ２０１５とＨＡ×ＬＩ及びＨＡ×ＬＡのＦ２遺伝子マップとの比較から近接して連鎖すると特定されたマーカーを使用して、我々は、マーカーのＮｔ１ＡＢ６５９１及びＮｔ１ＡＡ９７７７によって固定されたＮｉｃ１遺伝子座を包含する融合ゲノム領域を特定した。Edwards, K. D., Fernandez-Pozo, N., Drake-Stowe, K., Humphry M., Evans, A. D., Bombarely, A., Allen, F., Hurst, R., White, B., Kernodle, S. P., Bromley, J. R., Sanchez-Tamburrino, J. P., Lewis, R.  S., and Mueller, L.A. (2017) A reference genome for Nicotiana tabacum enables map-based cloning of homeologous loci implicated in nitrogen utilization efficiency. BMC Genomics 18, 448（参照によって本明細書に組み込まれる）のBioNanoハイブリッドアセンブリーを利用して、我々は、この領域の大部分に及ぶ偽染色体にマッピングされたスキャフォールドを特定することが可能であった（図８２、表８の「証拠」欄を参照されたい）。Sierro, N., Battey, J. N., Ouadi, S., Bakaher, N., Bovet, L., Willig, A., Goepfert, S., Peitsch, M. C., and Ivanov, N. V. (2014). The tobacco genome sequence and its comparison with those of tomato and potato. Nature Communications 5, 3833（参照によって本明細書に組み込まれる）のゲノムアセンブリーからのＴＮ９０スーパースキャフォールドに対する相互ＢＬＡＳＴ解析は、配列アセンブリーにおける可能性のあるギャップを埋めるこの領域におけるEdwards, K. D., Fernandez-Pozo, N., Drake-Stowe, K., Humphry M., Evans, A. D., Bombarely, A., Allen, F., Hurst, R., White, B., Kernodle, S. P., Bromley, J. R., Sanchez-Tamburrino, J. P., Lewis, R.  S., and Mueller, L.A. (2017) A reference genome for Nicotiana tabacum enables map-based cloning of homeologous loci implicated in nitrogen utilization efficiency. BMC Genomics 18, 448のスキャフォールドをさらに特定することが可能であった（図８２、表８における「ＴＮ９０スーパースキャフォールド」欄を参照されたい）。最後に、上記の方法のいずれかに基づいて統合することが可能ではないが、Edwards, K. D., Fernandez-Pozo, N., Drake-Stowe, K., Humphry M., Evans, A. D., Bombarely, A., Allen, F., Hurst, R., White, B., Kernodle, S. P., Bromley, J. R., Sanchez-Tamburrino, J. P., Lewis, R.  S., and Mueller, L.A. (2017) A reference genome for Nicotiana tabacum enables map-based cloning of homeologous loci implicated in nitrogen utilization efficiency. BMC Genomics 18, 448のゲノムにおけるスキャフォールドにユニークにマッピングすることが可能であったマーカーを、コンセンサスのＨＡ×ＬＡ又はＨＡ×ＬＩ遺伝子マップのいずれかのそれらの位置に基づいて統合した（図８２）。スキャフォールドの場所について相反する証拠がある場合には、BioNanoハイブリッドアセンブリーにおけるスキャフォールドの場所を使用した。
【０４９９】
Ｎｉｃ１領域をファインマッピングするために、我々は、ＨＩ×ＬＡに由来するＦ２個体群からの遺伝子マップを利用した（図７）。30K Infinium iSelect HD BeadChip及びＲＮＡ−ｓｅｑ（表４及び５）の両方から発生させたＳＮＰマーカーを、上記で特定したマーカーによって固定された融合ゲノム領域にマッピングした。この領域内に新たなＳＮＰマーカーを含有するスキャフォールドを、上記のコンセンサスのＨＡ×ＬＡ及びＨＡ×ＬＩ遺伝子マップのように融合ゲノム領域に追加した。ＨＩ×ＬＡのＦ２個体群において特定された組換えに基づいて（図７）、我々は、我々の所望の領域を、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００３５５３及びＮｉｔａｂ４．５＿０００７０２７のスキャフォールドに隣接する融合ゲノム領域に限定した（図８２）。この領域は、特に、ＥＲＦ転写因子であるとしてアノテートされた９遺伝子のクラスターを含有する（表８）。次いで、我々は、表８におけるこの特定された領域内の遺伝子（配列番号を表１に示す）についての遺伝子モデルを改善するために、Edwards, K. D., Fernandez-Pozo, N., Drake-Stowe, K., Humphry M., Evans, A. D., Bombarely, A., Allen, F., Hurst, R., White, B., Kernodle, S. P., Bromley, J. R., Sanchez-Tamburrino, J. P., Lewis, R.  S., and Mueller, L.A. (2017) A reference genome for Nicotiana tabacum enables map-based cloning of homeologous loci implicated in nitrogen utilization efficiency. BMC Genomics 18, 448（参照によって本明細書に組み込まれる）からのＲＮＡ−ｓｅｑ情報を利用した。
【０５００】
次いで、我々は、特定したＮｉｃ１領域を、Adams, A. C., De Godoy Lusso, M. S., Pramod, S., and Xu, D. (2016). Compositions and Methods for Producing Tobacco Plants and Products Having Altered Alkaloid Levels. US patent application 20160374387A1（参照によって本明細書に組み込まれる）によって特定されたＬＩ系統において欠失しているスキャフォールド（配列番号８５）と比較した。これは、Edwards, K. D., Fernandez-Pozo, N., Drake-Stowe, K., Humphry M., Evans, A. D., Bombarely, A., Allen, F., Hurst, R., White, B., Kernodle, S. P., Bromley, J. R., Sanchez-Tamburrino, J. P., Lewis, R.  S., and Mueller, L.A. (2017) A reference genome for Nicotiana tabacum enables map-based cloning of homeologous loci implicated in nitrogen utilization efficiency. BMC Genomics 18, 448（参照によって本明細書に組み込まれる）のゲノムスキャフォールドに対してこの配列のＢＬＡＳＴ解析を行うことによって行った。遺伝子マッピングの結果（図７）と一致して、Adams, A. C., De Godoy Lusso, M. S., Pramod, S., and Xu, D. (2016). Compositions and Methods for Producing Tobacco Plants and Products Having Altered Alkaloid Levels. US patent application 20160374387A1によって以前に特定された領域は、我々が特定したＮｉｃ１領域の上流の物理的領域にある（図８２を参照されたい）。
【０５０１】
Ｎｉｃ２領域をより良好に特徴付けるために、我々は、マーカーのＮｔ１ＡＡ９３７０及びＮｔ１ＡＣ６４９９によって固定されたゲノム領域について、上記と同じ解析を行った（図２）。この領域を、Ｎｉｃ２のファインマッピングにおいて使用したマーカーのＳＮＰ１５及びＳＮＰ１８／１９によってさらに区切った（図８）。この領域における遺伝子の評価は、多くの以前に特定された遺伝子を含む（Shoji, T., Kajikawa, M., and Hashimoto, T. (2010). Clustered transcription factor genes regulate nicotine biosynthesis in tobacco. The Plant Cell 22, 3390-3409、Kajikawa, M., Sierro, N., Kawaguchi, H., Bakaher, N., Ivanov, N. I., Hashimoto, T., and Shoji, T. (2017). Genomic insights into the evolution of the nicotine biosynthesis pathway in tobacco. Plant Physiology 174, 999-1011）、ＥＲＦ転写因子であるとしてアノテートされた９遺伝子のクラスターを含有していることを示した（表９）。我々は、特定されたこの領域内のＥＲＦ遺伝子（表９；配列番号を表２に示す）についての遺伝子モデルを改善するために、Edwards, K. D., Fernandez-Pozo, N., Drake-Stowe, K., Humphry M., Evans, A. D., Bombarely, A., Allen, F., Hurst, R., White, B., Kernodle, S. P., Bromley, J. R., Sanchez-Tamburrino, J. P., Lewis, R.  S., and Mueller, L.A. (2017) A reference genome for Nicotiana tabacum enables map-based cloning of homeologous loci implicated in nitrogen utilization efficiency. BMC Genomics 18, 448からのＲＮＡ−ｓｅｑ情報を利用した。この領域は、ＢＬＡＳＴ解析によって、Ｎｉｃ１領域（Adams, A. C., De Godoy Lusso, M. S., Pramod, S., and Xu, D. (2016). Compositions and Methods for Producing Tobacco Plants and Products Having Altered Alkaloid Levels. US patent application 20160374387A1における配列番号２）のように、Adams, A. C., De Godoy Lusso, M. S., Pramod, S., and Xu, D. (2016). Compositions and Methods for Producing Tobacco Plants and Products Having Altered Alkaloid Levels. US patent application 20160374387A1（参照によって本明細書に組み込まれる）によって特定された配列とも比較した。この比較の結果は、Ｎｉｃ２についてのAdams, A. C., De Godoy Lusso, M. S., Pramod, S., and Xu, D. (2016). Compositions and Methods for Producing Tobacco Plants and Products Having Altered Alkaloid Levels. US patent application 20160374387A1（参照によって本明細書に組み込まれる）の配列が、以前の結果（Shoji, T., Kajikawa, M., and Hashimoto, T. (2010). Clustered transcription factor genes regulate nicotine biosynthesis in tobacco. The Plant Cell 22, 3390-3409（参照によって本明細書に組み込まれる）及びKajikawa, M., Sierro, N., Kawaguchi, H., Bakaher, N., Ivanov, N. I., Hashimoto, T., and Shoji, T. (2017). Genomic insights into the evolution of the nicotine biosynthesis pathway in tobacco. Plant Physiology 174, 999-1011（参照によって本明細書に組み込まれる））と一致して、Ｎｉｃ２についての我々のゲノム領域（図８３を参照されたい）と一致した。
【０５０２】
【表１０】
2020524508.tif 000013
【０５０３】
【表１１】
2020524508.tif 000014
【実施例８】
【０５０４】
所望のＮｉｃ１／Ｎｉｃ２領域における遺伝子のバイオインフォマティクス解析
所望の両方の領域におけるＥＲＦ転写因子のクラスターの発生率を考えると、我々は、それらが相同遺伝子（即ち、祖先のゲノムのＮ．シルベストリス（N. sylvestris）及びＮ．トメントシフォルミス（N. tomentosiformis）由来の同等の遺伝子）を表し得るか否かについて関心があった。Edwards, K. D., Fernandez-Pozo, N., Drake-Stowe, K., Humphry M., Evans, A. D., Bombarely, A., Allen, F., Hurst, R., White, B., Kernodle, S. P., Bromley, J. R., Sanchez-Tamburrino, J. P., Lewis, R.  S., and Mueller, L.A. (2017) A reference genome for Nicotiana tabacum enables map-based cloning of homeologous loci implicated in nitrogen utilization efficiency. BMC Genomics 18, 448（参照によって本明細書に組み込まれる）のゲノムに対するそれぞれのＥＲＦ遺伝子についての現在の遺伝子モデルのコード配列のＢＬＡＳＴ解析（デフォルト設定でｂｌａｓｔｎオプションを使用する）は、多くの遺伝子について、最も類似性が高いヒットが同等の相反する場所にあるＥＲＦ遺伝子であったことを示した（表１０）。これは、２つの領域における多くのＥＲＦが相同遺伝子を表すことを示唆する。
【０５０５】
表８及び表９におけるスキャフォールドによって区切られた所望の２つの領域の解析を拡張するために、我々は、全領域が相同染色体セグメントを表し得るか否かについて関心があった。推定のＮｉｃ１及びＮｉｃ２領域におけるスキャフォールドの調査は、それらが、大部分が、それぞれ、Ｎ．シルベストリス又はＮ．トメントシフォルミス起源であったことを示し（データは示さない）、それらが相同染色体由来であるという仮説を支持する。
【０５０６】
所望の２つの領域におけるそれぞれの遺伝子のＢＬＡＳＴ解析（上記の通り）は、多数の遺伝子のベストヒットが相反する領域にあったことを示した。加えて、両方の領域についての遺伝子の順序は大部分が保持され、非常にわずかなゲノムの再配列が、Ｎ．タバカムの形成の後から、これらの２つの領域において起こったことを示唆する。２つの特定されたゲノム領域の間の相同遺伝子の存在に基づいて、我々は、さらなる解析のためにＮｉｃ１領域におけるＥＲＦ転写因子であるとしてアノテートされた遺伝子に注目した。
【０５０７】
【表１２】
2020524508.tif 000015
2020524508.tif 000016
2020524508.tif 000017
【実施例９】
【０５０８】
ベクターの構築
Ｎｉｃ１候補遺伝子についての過剰発現ベクターを発生させるために、タンパク質コード領域のｃＤＮＡ断片を増幅し、ゲートウェイクローニング技術（Chakrabarty, R., Banerjee, R., Chung, S. M., Farman, M., Citovsky, V., Hogenhout, S. A., Tzfira, T., and Goodin, M. (2007). PSITE vectors for stable integration or transient expression of autofluorescent protein fusions in plants: probing Nicotiana benthamiana-virus interactions. Molecular Plant-Microbe Interactions 20, 740-50、参照によって本明細書に組み込まれる）によってpSITE-4NBベクターに挿入した。Ｎｉｃ１候補のためのコード配列の増幅のために使用するゲートウェイ組換え配列を有するプライマーを表１１に列挙する。Ａｔｔｂはゲートウェイ組換え配列を指す。
Ａｔｔｂ１：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT（配列番号１０５）
Ａｔｔｂ２：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT（配列番号１０６）
【０５０９】
【表１３】
2020524508.tif 000018
【０５１０】
それらのネイティブプロモーターのコントロール下でＮｉｃ１候補についてベクターを構築するために、コード領域、プロモーター及び３’−ＵＴＲを含むゲノム配列を、HindIII認識部位のアダプターと結合したプライマー（表１２）で増幅した。直線化したベクターの末端に相同の１６塩基を小文字で示し、大文字はタバコ遺伝子配列を示した。HindIIIでの消化の後、増幅された産物を、インフュージョンクローニング（Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., and Freeman, G. J. (2007). In-fusion assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. Biotechniques 43, 354-9、参照によって本明細書に組み込まれる）によってベクターpCAMBIA1305.1にクローニングした。
【０５１１】
【表１４】
2020524508.tif 000019
【実施例１０】
【０５１２】
細菌人工染色体（ＢＡＣ、Bacterial Artificial Chromosome）配列決定
全ゲノムプロファイリング（ＷＧＰ、Whole Genome Profiling）配列タグを、スキャフォールドアセンブリーをさらに助けるＳＮＰマーカーによって固定された所望のＮｉｃ１領域内でスキャフォールドと矛盾なくマッチする細菌人工染色体（ＢＡＣ）を特定するために、Edwards, K. D., Fernandez-Pozo, N., Drake-Stowe, K., Humphry M., Evans, A. D., Bombarely, A., Allen, F., Hurst, R., White, B., Kernodle, S. P., Bromley, J. R., Sanchez-Tamburrino, J. P., Lewis, R.  S., and Mueller, L.A. (2017) A reference genome for Nicotiana tabacum enables map-based cloning of homeologous loci implicated in nitrogen utilization efficiency. BMC Genomics 18, 448のゲノムスキャフォールドにアライメントさせた。ＤＮＡを、QIAGEN Plasmid Midi Kitを使用して、製造者の使用説明書（QIAGEN社）によりＢＡＣクローンから伸長させ、直線化し、マップへのロングリードを提供するために、Oxford Nanopore MinIONデバイスを使用して、製造者の使用説明書（Oxford Nanopore Technologies社）により配列決定した。Illumina社のペアエンド配列リードは、ＢＡＣクローンの正確なショートリードを提供する。Ｎｉｃ１領域内に位置するとして特定されたタバコゲノムスキャフォールドは、重複するＢＡＣクローンのOxford Nanopore／Illumina配列リードの組み合わせに再マッピングされて、連続配列を作成する。遺伝子モデルを、Edwards, K. D., Fernandez-Pozo, N., Drake-Stowe, K., Humphry M., Evans, A. D., Bombarely, A., Allen, F., Hurst, R., White, B., Kernodle, S. P., Bromley, J. R., Sanchez-Tamburrino, J. P., Lewis, R.  S., and Mueller, L.A. (2017) A reference genome for Nicotiana tabacum enables map-based cloning of homeologous loci implicated in nitrogen utilization efficiency. BMC Genomics 18, 448により改善されたＮｉｃ１領域のために開発した。
【実施例１１】
【０５１３】
毛状根形質転換によるＮｉｃ１  ＥＲＦの過剰発現
材料及び方法
候補Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子を、毛状根の形質転換によってタバコ植物中で過剰発現させた。毛状根の形質転換のために使用されるタバコ植物をマゼンタボックスから生育させ、葉を０．５ｃｍ×０．５ｃｍ片にカットした。バイナリーベクターを内包するアグロバクテリウム・リゾゲネス株Ａｑｕａ１を使用して葉片に感染させた。殺菌及び薬物耐性選択を、１５０ｍｇ／Ｌの硫酸カナマイシン及び２５０ｍｇ／Ｌのチカルシリンを含有する固化Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ及びＳｋｏｏｇ培地で実施した。遺伝子導入根を、共焦点顕微鏡を使用して、赤色蛍光レポーターで識別した。選択された根系統を、暗所において、８０ｒｐｍでの一定の振盪で、１０ｍｌの液体Ｇａｍｂｏｒｇ  Ｂ５培地で２週間ごとに継代培養することによって維持した。
【０５１４】
タバコ形質転換
安定遺伝子導入植物を、アグロバクテリウム・ツメファシエンス媒介形質転換（Schardl et al., 1987 Gene, Volume 61, Issue 1, 1987, Pages 1-11、参照によって本明細書に組み込まれる）によって発生させた。アグロバクテリウム株ＧＶ３１０１を使用して、無菌葉ディスクに感染させた。タバコ形質転換のために使用される生育チャンバーを、２３℃で１６時間の明所、及び２０℃で８時間の暗所にプログラムした。簡潔には、タバコ葉をマゼンタボックス内で生育した植物から摘出し、０．４ｃｍのディスクにカットした。葉ディスクを、標的プラスミドを含有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスの懸濁液（ＯＤ６００＝０．３〜１）中で３０分間インキュベートした。ＭＳ培地中での３日間の共培養の後、葉ディスクを、再生又は選択のためにＴＯＭ培地（２０ｇスクロース／Ｌ、１ｍｇ／ＬのＩＡＡ、２．５ｍｇ／ＬのＢＡＰを有するＭＳ培地）に移した。チカルシリン（２５０ｍｇ／Ｌ）を使用して、過剰のアグロバクテリウムを死滅させた。pSITE-4NBコンストラクトのための硫酸カナマイシン（３００ｍｇ／Ｌ）、又はpCAMBIA1305.1のためのハイグロマイシンＢ（４０ｍｇ／Ｌ）及び遺伝子編集コンストラクトを、それぞれ、形質転換選択として使用した。再生した苗条を、葉ディスクから除去し、発根のためにチカルシリン（２５０ｍｇ／Ｌ）を含有するＭＳ培地に移した。３又は４つの根（少なくとも２ｃｍ）が発生した後、小植物を土壌に移植した。
【０５１５】
結果
我々は、毛状根形質転換を使用して、Ｎｉｃ１  ＥＲＦについての遺伝子の機能を評価した。化学的分析は、すべてのコンストラクトがＬＡ毛状根においてアルカロイドレベルを増加させたことを明らかにした（図９）。しかしながら、我々は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００４６２０ｇ００９０．３について毛状根を採取することに失敗した。この遺伝子で形質転換された毛状根は、最初は正常に発達したが、継代培養の間に徐々に黒くなり、生存することができなかった。致死性の効果は、これらの毛状根における高レベルのニコチン酸によって引き起こされた可能性があり、さらに調べる必要がある。毛状根形質転換に基づいて、Ｎｉｃ１遺伝子座での少なくとも６つのＥＲＦは、異なる効果を伴なってアルカロイド生合成を制御することが可能である：Ｎｉｔａｂ４．５＿０００３０９０ｇ００３０．１（ＥＲＦ１９９）；Ｎｉｔａｂ４．５＿０００３６６５ｇ００４０．１（ＪＲＥ５Ｌ２）；Ｎｉｔａｂ４．５＿０００４６２０ｇ００１０．１（ＥＲＦ２１０）；Ｎｉｔａｂ４．５＿０００４６２０ｇ００３０．１（ＥＲＦ９１）；Ｎｉｔａｂ４．５＿０００４６２０ｇ００８０．１（ＥＲＦ２９）及びＮｉｔａｂ４．５＿０００４６２０ｇ００９５．１（ＥＲＦ１６）。
【実施例１２】
【０５１６】
安定遺伝子導入植物におけるＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の発現
我々は、安定形質転換アッセイでＮｉｃ１  ＥＲＦの機能も検証した。３５Ｓプロモーターのコント−ロール下でのＮｉｃ１  ＥＲＦの過剰発現についてそれぞれ、少なくとも１２個の遺伝子導入植物を得た。化学的分析は、ＬＡ植物におけるＮｉｔａｂ４．５＿０００３０９０ｇ００３０．１、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００４６２０ｇ００８０．１及びＮｉｔａｂ４．５＿０００４６２ｇ００９０．３の過剰発現が、アルカロイド含有量を顕著に増加させたことを明らかにした。特に、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００３０９０ｇ００３０．１の過剰発現は、ＨＩ植物と同等のアルカロイドレベルをもたらした。
【０５１７】
我々は、ネイティブプロモーター、コード領域、及びＮｉｔａｂ４．５＿０００３０９０ｇ００３０．１のための３’−ＵＴＲ（非翻訳領域）を含むゲノム配列をＬＡ植物に移入した。Ｔ０植物での化学的分析は、アルカロイド産生が、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００３０９０ｇ００３０．１の遺伝子形質転換によって顕著に改善されたことを示した。Ｎｉｔａｂ４．５＿０００３０９０ｇ００３０．１のゲノムコンストラクトを含有する形質転換体におけるアルカロイドレベルが、ＨＩのアルカロイドレベルよりわずかに低く、これが、Ｔ０植物の半接合性によって引き起こされる可能性があることは注目に値する。
【実施例１３】
【０５１８】
誘導されたＥＭＳ  Ｎｉｃ１変異体
Ｎｉｃ１  ＥＲＦの安定形質転換による相補性試験は、ｎｉｃ１表現型を修復することが可能であることを示した。しかしながら、我々は、これらの遺伝子のいずれかのノックアウトが、ｎｉｃ１表現型それ自身によって表現型模写できるかを決定することを希望した。
【０５１９】
したがって、およそ２０００個のＥＭＳ変異系統を、変異した遺伝子を含有するタバコ植物を特定する目的のために、ＴＩ１０６８品種から発生させた。上記の表１から所望のＮｉｃ１領域におけるＥＲＦ遺伝子の変異、及びＮｉｃ２領域からのＥＲＦ１８９（Ｎｉｔａｂ４．５＿００１５０５５ｇ００１０．２）の変異を、Rigola, D., van Oeveren, J., Janssen, A., Bonne, A., Schneiders, H., van der Poel, H. J. A., van Orsouw, N. J., Hogers, R. C. J., de Both, M. T. J., and van Eijk, M. J. T. (2009) High-Throughput Detection of Induced Mutations and Natural Variation Using KeyPointTM Technology. PLOS ONE 4, e4761. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004761（参照によって本明細書に組み込まれる）により、この個体群由来のプールされたＭ２系統を使用するＤＮＡ配列決定によって特定した。
【０５２０】
Ｎｉｔａｂ４．５＿０００３０９０ｇ００３０．１における変異を含有するとして特定されたＭ２種子プール由来のＭ２変異系統を温室内で生育させ、１１週齢で、上記のようにして、アルカロイド含有量についてアッセイした。
【０５２１】
この遺伝子についてホモ接合性及びヘテロ接合性のＭ２変異系統を、ＤＮＡ配列決定によって特定し、無効な分離体を、それぞれの変異系統についての対照植物として使用した。平均アルカロイドレベルを、それぞれの遺伝子型のクラスから決定し、野生型及び変異体／ヘテロ接合体群の間の有意差を、スチューデントのｔ検定によって決定した（図８４）。それぞれの遺伝子型のクラスの４個体の最小値をこの解析のために使用した。化学的分析は、未成熟終止コドン（アミノ酸変化Ｑ２５＊）を引き起こすＮｉｔａｂ４．５＿０００３０９０ｇ００３０．１におけるホモ接合性変異が野生型対照と比較して、およそ３分の１のアルカロイド含有量を有する植物をもたらしたことを示した。
【実施例１４】
【０５２２】
遺伝子編集
ＨＩバックグラウンドのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子を変異させるために遺伝子編集を使用して、ＬＡ系統に相当する植物を発生させることができるかを決定した。
【０５２３】
Ａの１ｂｐの挿入によって引き起こされるＬ１と呼ばれるヘテロ接合性変異体系統を、Ｔ０でＮｉｔａｂ４．５＿０００３０９０ｇ００３０．１について特定した。
【０５２４】
早期終止コドンを、Ｌ１におけるＮｉｔａｂ４．５＿０００３０９０ｇ００３０．１の変異対立遺伝子に導入し、それに応じて遺伝子機能が破壊された（図８５）。Ｎｉｔａｂ４．５＿０００３０９０ｇ００３０．１によってもたらされる表現型効果をより良好に特徴付けるために、我々は、Ｌ１の種子を採取し、Ｔ１世代で化学的分析を行った。Ｔ１植物、野生型（ＷＴ−Ｔ１）、ヘテロ接合体（Ｈｅｔ−Ｔ１）及びホモ接合性変異体（Ｍｕｔ−Ｔ１）の遺伝子型をＤＮＡ配列決定によって決定した。ＷＴ−Ｔ１の総アルカロイドレベルは、ＨＩ植物の総アルカロイドレベルに匹敵した（図８６Ａ）。
【０５２５】
Ｈｅｔ−Ｔ１植物におけるアルカロイドレベルの低減は有意ではなかったが、平均では、これらの表現型の値は、ＷＴ−Ｔ１植物の半分のレベルに減少した。ホモ接合性変異体であるＭｕｔ−Ｔ１について、アルカロイド含有量は、かろうじて認識され、これは、ＬＡ植物のアルカロイド含有量よりも非常に低かった（図８６Ａ）。図８６Ｂから分かるように、ＨＩ系統におけるＮｉｔａｂ４．５＿０００３０９０ｇ００３０．１のノックアウトは、ＬＡ植物のアルカロイドレベルのほぼ１／１０をもたらした。
【０５２６】
Ｍｕｔ−Ｔ１のアルカロイドレベルがＬＡ植物のアルカロイドレベルよりも非常に低かった理由を理解するために、我々は、ＨＩ及びＬＡ系統の間でＮｉｔａｂ４．５＿０００３０９０ｇ００３０．１対立遺伝子についての配列及び発現レベルの多型性を調べた。
【０５２７】
我々は、開始コドンのおよそ２．２ｋｂ上流、コード配列、及び終止コドンのおよそ１．２ｋｂ下流の配列を決定したが、ＳＮＰは、これら２つの対立遺伝子間で特定されなかった。リアルタイム（ＲＴ、Real-time）ＰＣＲ解析は、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００３０９０ｇ００３０．１が、根において特異的に発現することを明らかにし、これは、ニコチン生合成が根特異的である理由を説明する。
【０５２８】
ＨＩ系統との比較において、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００３０９０ｇ００３０．１の発現は、ＬＡ系統においてダウンレギュレートされる（図８７）。したがって、ＨＩ及びＬＡの間の表現型の相違は、Ｎｉｃ１遺伝子の異なる発現によって導入される。
【０５２９】
Ｎｉｃ１の弱い発現は、ＬＡの低アルカロイドレベルをもたらすが、超低アルカロイド含有量がＮｉｃ１の完全な破壊によって達成することができると予想され、これは、Ｍｕｔ−Ｔ１植物における我々の観察と一致する（図８６Ｂ）。
【０５３０】
上記の明細書において言及されたすべての刊行物は、本明細書に参照によって組み込まれる。本発明の記載の方法及びシステムの様々な改変及び変形は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、当業者には明らかである。本発明を、特定の好ましい実施形態と関連して記載したが、特許請求の範囲に係る本発明は、このような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実際に、生化学及びバイオテクノロジー又は関連する分野の当業者には自明である本発明を行うための記載された様式の様々な改変は、以下の特許請求の範囲内であることが意図される。
【０５３１】
（参考文献）
Adams, A. C., De Godoy Lusso, M. S., Pramod, S., and Xu, D. (2016). Compositions and Methods for Producing Tobacco Plants and Products Having Altered Alkaloid Levels. US patent application 20160374387A1.
Bindler, G., Plieske, J., Bakaher, N., Gunduz, I., Ivanov, N., Hoeven, R., Ganal, M., and Donini, P. (2011). A high density genetic map of tobacco (Nicotiana tabacum L.) obtained from large scale microsatellite marker development. Theoretical and Applied Genetics 123, 219-230.
Collins, G. B., Legg, P. D., and Kasperba.Mj (1974). Use of Anther-Derived Haploids in Nicotiana .1. Isolation of breeding lines differing in total alkaloid content. Crop Science 14, 77-80.
Chakrabarty, R., Banerjee, R., Chung, S. M., Farman, M., Citovsky, V., Hogenhout, S. A., Tzfira, T., and Goodin, M. (2007). PSITE vectors for stable integration or transient expression of autofluorescent protein fusions in plants: probing Nicotiana benthamiana-virus interactions. Molecular Plant-Microbe Interactions 20, 740-50.
Edwards, K. D., Fernandez-Pozo, N., Drake-Stowe, K., Humphry M., Evans, A. D., Bombarely, A., Allen, F., Hurst, R., White, B., Kernodle, S. P., Bromley, J. R., Sanchez-Tamburrino, J. P., Lewis, R.  S., and Mueller, L.A. (2017) A reference genome for Nicotiana tabacum enables map-based cloning of homeologous loci implicated in nitrogen utilization efficiency. BMC Genomics 18, 448.
Hibi, N., Higashiguchi, S., Hashimoto, T., and Yamada, Y. (1994). Gene-Expression in Tobacco Low-Nicotine Mutants. Plant Cell 6, 723-735.
Horsch, R. B., Fry, J. E., Hoffmann, N. L., Eichholtz, D., Rogers, S. G., and Fraley, R. T. (1985). A simple and general method for transferring genes into plants. Science 227, 1229-1231.
Kajikawa, M., Sierro, N., Kawaguchi, H., Bakaher, N., Ivanov, N. I., Hashimoto, T., and Shoji, T. (2017). Genomic insights into the evolution of the nicotine biosynthesis pathway in tobacco. Plant Physiology 174, 999-1011.
Kidd, S. K., Melillo, A. A., Lu, R. H., Reed, D. G., Kuno, N., Uchida, K., Furuya, M., and Jelesko, J. G. (2006). The A and B loci in tobacco regulate a network of stress response genes, few of which are associated with nicotine biosynthesis. Plant Mol Biol 60, 699-716.
Langmead, B., and Salzberg, S. L. (2012). Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods 9, 357-9.
Legg P, Chaplin J, Collins G. (1969). Inheritance of percent total alkaloids in Nicotiana tabacum L.: populations derived from crosses of low alkaloid lines with burley and flue-cured varieties. Journal of Heredity 60: 213-217.
Legg P., and G., C. (1971). Inheritance of percent total alkaloids in Nicotiana tabacum L. II. genetic effects of two loci in Burley21 X LA Burley 21 populations. Canadian Journal of Genetics and Cytology 13, 287-291.
Legg PD, Collins GB, Litton CC. 1970. Registration of La Burley-21 Tobacco Germplasm. Crop Science 10(2): 212.
McKenna, A., Hanna, M., Banks, E., Sivachenko, A., Cibulskis, K., Kernytsky, A., Garimella, K., Altshuler, D., Gabriel, S., Daly, M., and DePristo, M. A. (2010). The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome Research 20, 1297-303.
Neff, M. M., Turk, E., and Kalishman, M. (2002). Web-based primer design for single nucleotide polymorphism analysis. Trends in Genetics 18, 613-5.
Nielsen, M. T., Legg, P. D., and Collins, G. B. (1988). Registration of HI and LI burley 21 tobacco germplasms.  Crop Science 28, 206-207.
Qin, Q., Li, D., Dai, X., Zhao, P., Miller, R., Jack, A., and Yang, S. (2015) Development of user-friendly marker for Nic2 in tobacco. SRC, Tobacco Science Research Conference, 69, abstract 79.
Reed, D. G., and Jelesko, J. G. (2004). The A and B loci of Nicotiana tabacum have non-equivalent effects on the mRNA levels of four alkaloid biosynthetic genes. Plant Science 167 1123-1130.
Rigola, D., van Oeveren, J., Janssen, A., Bonne, A., Schneiders, H., van der Poel, H. J. A., van Orsouw, N. J., Hogers, R. C. J., de Both, M. T. J., and van Eijk, M. J. T. (2009) High-Throughput Detection of Induced Mutations and Natural Variation Using KeyPointTM Technology. PLOS ONE 4, e4761. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004761.
Rushton PJ, Bokowiec MT, Han SC, Zhang HB, Brannock JF, Chen XF, Laudeman TW, Timko MP. 2008. Tobacco transcription factors: Novel insights into transcriptional regulation in the Solanaceae. Plant Physiology 147: 280-295.
Sahoo, D. K., Dey, N., and Maiti, I. B. (2014). pSiM24 is a novel versatile gene expression vector for transient assays as well as stable expression of foreign genes in plants. PLoS One 9, e98988.
Shoji, T., Kajikawa, M., and Hashimoto, T. (2010). Clustered transcription factor genes regulate nicotine biosynthesis in tobacco. The Plant Cell 22, 3390-3409.
Sierro, N., Battey, J. N., Ouadi, S., Bakaher, N., Bovet, L., Willig, A., Goepfert, S., Peitsch, M. C., and Ivanov, N. V. (2014). The tobacco genome sequence and its comparison with those of tomato and potato. Nature Communications 5, 3833.
Stam, P. (1993). Construction of integrated genetic linkage maps by means of a new computer package - Joinmap. Plant Journal 3, 739-744.
Valleau W. 1949. Breeding low-nicotine tobacco. Journal of Agricultural Research 78: 171-181.
Van Ooijen J. W. (2009). MapQTL 6: Software for the mapping of quantitative trait loci in experimental populations of diploid species. Wageningen (The Netherlands): Kyazma BV.
Voelckel, C., Krugel, T., Gase, K., Heidrich, N., van Dam, N. M., Winz, R., and Baldwin, I. T. (2001). Anti-sense expression of putrescine N-methyltransferase confirms defensive role of nicotine in Nicotiana sylvestris against Manduca sexta. Chemoecology 11, 121-126.
Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., and Freeman, G. J. (2007). In-fusion assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. Biotechniques 43, 354-9.
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２６】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３２】
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【図４０】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５２】
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【図５５】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図７１】
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【図７３】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１】
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【図８２】
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【図８３】
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【図８４】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年2月18日(2020.2.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物若しくはその一部、又は細胞培養物のアルカロイド含有量を調節する方法であって、前記方法が、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現を調節することによって前記植物又は細胞培養物を改変することを含み、前記少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子が、配列番号８、若しくは配列番号１２、若しくは配列番号１６、若しくは配列番号２０、若しくは配列番号２４、若しくは配列番号２８、若しくは配列番号３２において提示されるアミノ酸配列、又はそれらの機能的バリアント若しくはオルソログを含むポリペプチドをコードするか、或いは前記ＥＲＦ遺伝子が、配列番号３、若しくは配列番号５、若しくは配列番号９、若しくは配列番号１３、若しくは配列番号１７、若しくは配列番号２１、若しくは配列番号２５、若しくは配列番号２９において提示されるヌクレオチド配列、又はそれらの機能的バリアント若しくはオルソログを含む、前記方法。
【請求項２】
タバコ植物若しくはその植物の一部におけるタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ、tobacco specific nitrosamine）、又はＴＳＮＡの前駆体の含有量を調節する方法であって、前記方法が、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現を調節することによって前記植物又は細胞培養物を改変することを含み、前記少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子が、配列番号８、若しくは配列番号１２、若しくは配列番号１６、若しくは配列番号２０、若しくは配列番号２４、若しくは配列番号２８、若しくは配列番号３２において提示されるアミノ酸配列、又はそれらの機能的バリアント若しくはオルソログを含むポリペプチドをコードするか、或いは前記ＥＲＦ遺伝子が、配列番号３、若しくは配列番号５、若しくは配列番号９、若しくは配列番号１３、若しくは配列番号１７、若しくは配列番号２１、若しくは配列番号２５、若しくは配列番号２９において提示されるヌクレオチド配列、又はそれらの機能的バリアント若しくはオルソログを含む、前記方法。
【請求項３】
細胞又は植物若しくはその一部、或いは細胞培養物のアルカロイド含有量を調節するための、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の使用であって、前記少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子が、配列番号８、若しくは配列番号１２、若しくは配列番号１６、若しくは配列番号２０、若しくは配列番号２４、若しくは配列番号２８、若しくは配列番号３２において提示されるアミノ酸配列、又はそれらの機能的バリアント若しくはオルソログを含むポリペプチドをコードするか、或いは前記ＥＲＦ遺伝子が、配列番号３、配列番号５、若しくは配列番号９、若しくは配列番号１３、若しくは配列番号１７、若しくは配列番号２１、若しくは配列番号２５、若しくは配列番号２９において提示されるヌクレオチド配列、又はそれらの機能的バリアント若しくはオルソログを含む、前記使用。
【請求項４】
アルカロイド含有量が調節された植物若しくはその一部、細胞培養物、植物繁殖材料、葉、カットされ、収穫された葉、処理された葉、又は、カット及び処理された葉を作出するための方法であって、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現を調節するために前記植物又は細胞培養物を改変することを含み、前記少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子が、配列番号８、若しくは配列番号１２、若しくは配列番号１６、若しくは配列番号２０、若しくは配列番号２４、若しくは配列番号２８、若しくは配列番号３２において提示されるアミノ酸配列、又はそれらの機能的バリアント若しくはオルソログを含むポリペプチドをコードするか、或いは前記ＥＲＦ遺伝子が、配列番号３、配列番号５、若しくは配列番号９、若しくは配列番号１３、若しくは配列番号１７、若しくは配列番号２１、若しくは配列番号２５、若しくは配列番号２９において提示されるヌクレオチド配列、又はそれらの機能的バリアント若しくはオルソログを含む、前記方法。
【請求項５】
アルカロイド含有量が、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現が調節されるように改変されていない植物又は細胞培養物と比べ、調節されている、請求項１〜４のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項６】
未改変植物又は未改変細胞培養物と比べ、アルカロイド含有量が調節されている改変植物若しくはその一部、又は改変細胞培養物であって、前記改変が、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現の調節であり、
前記少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子が、
配列番号８、若しくは配列番号１２、若しくは配列番号１６、若しくは配列番号２０、若しくは配列番号２４、若しくは配列番号２８、若しくは配列番号３２において提示されるアミノ酸配列、又はそれらの機能的バリアント若しくはオルソログを含むポリペプチドをコードするか、或いは
配列番号３、若しくは配列番号５、若しくは配列番号９、若しくは配列番号１３、若しくは配列番号１７、若しくは配列番号２１、若しくは配列番号２５、若しくは配列番号２９において提示されるヌクレオチド配列、又はそれらの機能的バリアント若しくはオルソログを含む、
前記改変植物若しくはその一部、又は改変細胞培養物。
【請求項７】
請求項６に記載の植物から、又は請求項４若しくは５のいずれかに記載の方法によって作出される植物若しくは細胞培養物から得ることができる、植物繁殖材料。
【請求項８】
植物のアルカロイド含有量が、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現が調節されるように改変されていない植物又は細胞培養物と比べ、減少している、請求項１〜４のいずれかに記載の方法若しくは使用、或いは請求項６に記載の植物若しくはその一部、又は細胞培養物、或いは請求項７に記載の植物繁殖材料。
【請求項９】
少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現が減少している、請求項８に記載の方法若しくは使用、請求項８に記載の植物若しくはその一部、又は細胞培養物、或いは請求項８に記載の植物繁殖材料。
【請求項１０】
植物又は細胞培養物のアルカロイド含有量が、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現が調節されるように改変されていない植物と比べ、増加している、請求項１〜５のいずれかに記載の方法若しくは使用、或いは請求項６に記載の植物若しくはその一部、又は細胞培養物、或いは請求項７に記載の植物繁殖材料。
【請求項１１】
植物が、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現が増加するように改変され、かつ、植物又は細胞培養物が、少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現が調節されるように改変されていない植物又は細胞培養物と比べ、アルカロイド含有量の増加を示す、請求項１〜５又は１０のいずれかに記載の方法又は使用、請求項６又は１０に記載の植物若しくはその一部、又は細胞培養物、或いは請求項７又は１０に記載の植物繁殖材料。
【請求項１２】
植物又は細胞培養物の総アルカロイド含有量が調節されている、請求項１〜５又は５〜１１のいずれかに記載の方法又は使用、請求項６又は８〜１１に記載の植物若しくはその一部、又は細胞培養物、或いは請求項７〜１１に記載の植物繁殖材料。
【請求項１３】
ニコチン、ノルニコチン、アナバシン、ミオスミン、及びアナタビンから選択される１又は２以上のアルカロイドの含有量が調節され、好ましくは、ニコチンの含有量が調節されている、請求項１〜５又は８〜１２のいずれかに記載の方法又は使用、請求項６又は８〜１２に記載の植物若しくはその一部、又は細胞培養物、或いは請求項７〜１２に記載の植物繁殖材料。
【請求項１４】
植物又は植物細胞がナス科（Solanaceae）由来である、請求項１〜５又は８〜１３のいずれかに記載の方法又は使用、請求項６又は８〜１３に記載の植物若しくはその一部、又は細胞培養物、或いは請求項７〜１３に記載の植物繁殖材料。
【請求項１５】
植物又は植物細胞がナス属（Solanum）由来である、請求項１〜５又は８〜１４のいずれかに記載の方法又は使用、請求項６又は８〜１４に記載の植物若しくはその一部、又は細胞培養物、或いは請求項７〜１４に記載の植物繁殖材料。
【請求項１６】
植物又は植物細胞がタバコ属（Nicotiana）由来である、請求項１〜５又は８〜１４のいずれかに記載の方法又は使用、請求項６又は８〜１４に記載の植物若しくはその一部、又は細胞培養物、或いは請求項７〜１４に記載の植物繁殖材料。
【請求項１７】
ニコチン含有量が調節されている、請求項１６に記載の方法又は使用、請求項１６に記載のタバコ植物若しくはその一部、又はタバコ細胞培養物、或いは請求項１６に記載の植物繁殖材料。
【請求項１８】
ニコチン含有量が減少している、請求項１６に記載の方法又は使用、請求項１６に記載のタバコ植物若しくはその一部、又はタバコ細胞培養物、或いは請求項１６に記載の植物繁殖材料。
【請求項１９】
少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子が、
配列番号８において提示されるアミノ酸配列、又はその機能的バリアント若しくはオルソログを含むポリペプチドをコードするか、或いは
配列番号５において提示されるヌクレオチド配列、又はその機能的バリアント若しくはオルソログを含む、
請求項１〜５又は８〜１８のいずれかに記載の方法又は使用、請求項６若しくは８又は１１〜１８に記載の植物若しくはその一部、又は細胞培養物、或いは請求項７又は１１〜１８に記載の植物繁殖材料。
【請求項２０】
追加のＥＲＦ遺伝子が調節され、
前記追加のＥＲＦ遺伝子が、
少なくとも１つのＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子であり、配列番号４０、若しくは配列番号４４、若しくは配列番号４８、若しくは配列番号５２、若しくは配列番号５６、若しくは配列番号６０、若しくは配列番号６４、若しくは配列番号６８、若しくは配列番号７２において提示されるアミノ酸配列、又はそれらの機能的バリアント若しくはオルソログを含むポリペプチドをコードするか、或いは
少なくとも１つのＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子であり、配列番号３７、若しくは配列番号４１、若しくは配列番号４５、若しくは配列番号４９、若しくは配列番号５３、若しくは配列番号５７、若しくは配列番号６１、若しくは配列番号６５、若しくは配列番号６９において提示されるヌクレオチド配列を含む、
請求項１〜５又は８〜１９のいずれかに記載の方法又は使用、請求項６若しくは８又は１１〜１９に記載の植物若しくはその一部、又は細胞培養物、或いは請求項７又は１１〜１９に記載の植物繁殖材料。
【請求項２１】
追加のＥＲＦ遺伝子が調節され、前記追加のＥＲＦ遺伝子が、少なくとも１つのＮｉｃ２  ＥＲＦ遺伝子であり、かつ、配列番号６９において提示されるヌクレオチド配列、又はその機能的バリアント若しくはオルソログを含むか、或いは配列番号７２において提示されるアミノ酸配列、又はその機能的バリアント若しくはオルソログを含むポリペプチドをコードする、請求項１〜５又は８〜２０のいずれかに記載の方法又は使用、請求項６若しくは８又は１１〜２０に記載の植物若しくはその一部、又は細胞培養物、或いは請求項７又は１１〜２０に記載の植物繁殖材料。
【請求項２２】
植物を育種するための、請求項６又は８〜２１のいずれかに記載の植物若しくはその一部、又は細胞培養物、或いは請求項４若しくは５又は８〜２０のいずれかに記載の方法によって作出される植物の使用。
【請求項２３】
製品の製造のための、請求項６又は８〜２１のいずれかに記載の植物若しくはその一部、又は細胞培養物、或いは請求項４若しくは５又は８〜２０のいずれかに記載の方法によって作出される植物の使用。
【請求項２４】
作物を作るための、請求項６又は８〜２１のいずれかに記載の植物又はその一部、或いは請求項４若しくは５又は８〜２０のいずれかに記載の方法によって作出される植物の使用。
【請求項２５】
葉を生産するための、請求項６又は８〜２１のいずれかに記載の植物又はその一部、或いは請求項４若しくは５又は８〜２０のいずれかに記載の方法によって作出される植物の使用。
【請求項２６】
請求項６又は８〜２１のいずれかに記載の植物の、或いは請求項６〜２１のいずれかに記載の繁殖材料から繁殖された植物から得ることができるか、或いは請求項２又は２２〜２４のいずれかに記載の使用によって得られる植物から得ることができるか、或いは請求項４若しくは５又は８〜２１のいずれかに記載の方法によって作出される植物から得ることができる、収穫された葉。
【請求項２７】
植物の収穫された葉が、カットされ、収穫された葉である、請求項２６に記載の植物の収穫された葉。
【請求項２８】
請求項２又は２２〜２４のいずれかに記載の使用から得ることができる植物から得ることができるか、
請求項５又は７〜２１のいずれかに記載の植物を処理することによって得ることができるか、
請求項６〜２１のいずれかに記載の植物繁殖材料から繁殖された植物から得ることができるか、
請求項２６又は２７に記載の植物の収穫された葉を処理することによって得ることができるか、或いは
請求項４若しくは５又は８〜２１のいずれかに記載の方法によって作出される植物から得ることができる、
処理された葉、好ましくは、処理されたタバコ葉、好ましくは、成長できない処理されたタバコ葉。
【請求項２９】
葉が、乾燥処理、発酵、殺菌、又はこれらの組み合わせによって処理されている、請求項２８に記載の処理された葉。
【請求項３０】
カットされ、処理された葉である、請求項２８又は２９に記載の処理された葉。
【請求項３１】
請求項１６〜２１のいずれかに記載の植物若しくはその一部、又はその抽出物で作製された乾燥処理されたタバコ材料。
【請求項３２】
請求項３１に記載の乾燥処理されたタバコ材料を含むタバコブレンド。
【請求項３３】
請求項１６〜２１のいずれかに記載のタバコ植物若しくはその一部、又は請求項１６〜２１のいずれかに記載のタバコ細胞培養物、
請求項１６に記載のタバコ植物繁殖材料から繁殖されたタバコ植物若しくはその一部、
請求項２５又は２６に記載の植物の収穫された葉であって、前記植物がタバコである、収穫された葉、
請求項２７〜２９のいずれかに記載の処理された葉であって、前記植物がタバコである、処理された葉、或いは
請求項１６に記載の方法によって作出される植物
から調製されるタバコ工業製品。
【請求項３４】
タバコ製品が可燃性喫煙物品である、請求項３３に記載のタバコ工業製品。
【請求項３５】
タバコ製品が無煙タバコ製品である、請求項３３に記載のタバコ工業製品。
【請求項３６】
タバコ加熱デバイス又はエアゾール発生デバイス等の不燃性エアゾール提供システムである、請求項３３に記載のタバコ製品。
【請求項３７】
細胞培養物中でアルカロイド含有量を調節するための、請求項１６に記載のタバコ細胞の使用。
【請求項３８】
請求項６〜２１のいずれかに記載の植物若しくはその一部、又はその抽出物（例えば、タバコ抽出物）、或いは請求項１６〜２１のいずれかに記載のタバコ細胞培養物、或いは請求項３１に記載の乾燥処理されたタバコ材料、或いは請求項３２に記載のタバコブレンドを含む、可燃性喫煙物品、不燃性エアゾール提供システム、無煙タバコ製品、又はタバコ加熱デバイス。
【請求項３９】
調節された（例えば、低減された）アルカロイド含有量、及び／又はタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）若しくはＴＳＮＡの前駆体の調節された（例えば、低減された）含有量を有する植物を選択するための、配列番号３、若しくは配列番号５、若しくは配列番号９、若しくは配列番号１３、若しくは配列番号１７、若しくは配列番号２１、若しくは配列番号２５、若しくは配列番号２９から選択される少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子のヌクレオチド配列、又はそれらの機能的バリアント若しくはオルソログの使用。
【請求項４０】
少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子のヌクレオチド配列における遺伝的変異を有する植物の変異体であって、前記Ｎｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子が、配列番号３、若しくは配列番号５、若しくは配列番号９、若しくは配列番号１３、若しくは配列番号１７、若しくは配列番号２１、若しくは配列番号２５、若しくは配列番号２９、又はそれらの機能的バリアント若しくはオルソログから選択され、前記遺伝的変異が、前記少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現を調節し（例えば、減少させ）、前記変異体植物が、前記遺伝的変異を有しない同等の植物に対して、アルカロイド含有量が調節され（例えば、減少し）、及び／又はタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）若しくはＴＳＮＡの前駆体の含有量が調節されている、前記植物の変異体。
【請求項４１】
請求項４０に記載の遺伝的変異を有する変異体植物の子孫又は種子。
【請求項４２】
少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子のヌクレオチド配列における改変を含む植物から生産した、収穫された葉、処理された葉、又は乾燥処理されたタバコ材料であって、
前記少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子が、配列番号３、若しくは配列番号５、若しくは配列番号９、若しくは配列番号１３、若しくは配列番号１７、若しくは配列番号２１、若しくは配列番号２５、若しくは配列番号２９、又はそれらの機能的バリアント若しくはオルソログから選択され、
前記改変が、前記少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現を調節し（例えば、減少し）、かつ
前記植物が、前記少なくとも１つのＮｉｃ１  ＥＲＦ遺伝子における前記改変を有しない同等の植物に対して、アルカロイド含有量が調節され（例えば、減少し）、及び／又はタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）若しくはＴＳＮＡの前駆体の含有量が調節されている、
前記収穫された葉、処理された葉、又は乾燥処理されたタバコ材料。
【国際調査報告】
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