(57)【要約】本発明は、２つまたはそれを超える単一特異性抗体および１つまたはそれを超える二重特異性抗体の混合物から単離された抗体のサブセットを含む多重特異性抗体混合物の生成であって、前記サブセット中のすべての抗体が同じ共通重鎖を有する生成に関する。本発明はまた、少なくとも１つのアフィニティークロマトグラフィー工程を使用することにより、抗体のこのようなサブセットを単離し、精製しまたは他の方法で産生する方法に関する。本発明はまた、様々な治療適応において抗体のこのようなサブセットを使用する方法に関する。
2020527158.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つまたはそれを超える単一特異性抗体および１つまたはそれを超える二重特異性抗体から構成される抗体混合物から単離された抗体のサブセットであって、前記サブセット中のすべての抗体が共通重鎖を含む、サブセット。
【請求項２】
すべてがカッパ軽鎖の少なくとも一部を含む抗体からなる、請求項１に記載のサブセット。
【請求項３】
すべてがラムダ軽鎖の少なくとも一部を含む抗体からなる、請求項１に記載のサブセット。
【請求項４】
すべてがカッパ軽鎖の少なくとも一部およびラムダ軽鎖の少なくとも一部を含む抗体からなる、請求項１に記載のサブセット。
【請求項５】
請求項２に記載のサブセットを単離する方法であって、少なくとも１つのアフィニティークロマトグラフィー工程を使用して、抗体混合物から前記サブセットを精製することを含む、方法。
【請求項６】
カッパ定常または可変ドメイン特異的アフィニティークロマトグラフィー媒体を使用して、前記精製工程を実施する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項３に記載のサブセットを単離する方法であって、少なくとも１つのアフィニティークロマトグラフィー工程を使用して、抗体混合物から前記サブセットを精製することを含む、方法。
【請求項８】
ラムダ定常特異的アフィニティークロマトグラフィー媒体を使用して、前記精製工程を実施する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項４に記載のサブセットを単離する方法であって、少なくとも第１のアフィニティークロマトグラフィー工程および第２のアフィニティークロマトグラフィー工程を使用して、抗体混合物から前記サブセットを精製することを含む、方法。
【請求項１０】
カッパ定常または可変ドメイン特異的アフィニティークロマトグラフィー媒体を使用して、前記第１の精製工程を実施し、ラムダ定常特異的アフィニティークロマトグラフィー媒体を使用して、前記第２の精製工程を実施する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ラムダ定常特異的アフィニティークロマトグラフィー媒体を使用して、前記第１の精製工程を実施し、カッパ定常または可変ドメイン特異的アフィニティークロマトグラフィー媒体を使用して、前記第２の精製工程を実施する、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
３つまたはそれを超える抗体から構成される抗体混合物から単離された抗体のサブセットを単離するための方法であって、前記混合物中の少なくとも２つの抗体が非同一抗体であり、
前記方法が、
ｉ）単一組換え宿主細胞において、共通免疫グロブリン重鎖ならびに少なくとも第１の免疫グロブリン軽鎖および第２の免疫グロブリン軽鎖をコードする１つまたはそれを超える核酸配列を発現させることにより、抗体混合物を産生することであって、ここで、前記第１および第２の免疫グロブリン軽鎖が非同一であり、前記第１および第２の免疫グロブリン軽鎖のそれぞれが、前記共通免疫グロブリン重鎖と対形成して機能的抗原結合ドメインを形成することができ、それにより、前記共通重鎖を含む３つまたはそれを超える抗体を産生すること；ならびに
ｉｉ）少なくとも１つのアフィニティークロマトグラフィー工程を使用して、抗体のサブセットを単離すること
を含む、方法。
【請求項１３】
前記第１の免疫グロブリン軽鎖がカッパ軽鎖の少なくとも一部を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第２の免疫グロブリン軽鎖がラムダ軽鎖の少なくとも一部を含む、請求項１２に記載のサブセット。
【請求項１５】
前記第１の免疫グロブリン軽鎖がカッパ軽鎖の少なくとも一部を含み、前記第２の免疫グロブリン軽鎖がラムダ軽鎖の少なくとも一部を含む、請求項１２に記載のサブセット。
【請求項１６】
カッパ定常特異的アフィニティークロマトグラフィー媒体を使用して、前記単離工程を実施する、請求項１２または１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ラムダ定常特異的アフィニティークロマトグラフィー媒体を使用して、前記単離工程を実施する、請求項１２または１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記単離工程が、少なくとも第１のアフィニティークロマトグラフィー工程および第２のアフィニティークロマトグラフィー工程を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
カッパ定常または可変ドメイン特異的アフィニティークロマトグラフィー媒体を使用して、前記第１の精製工程を実施し、ラムダ定常特異的アフィニティークロマトグラフィー媒体を使用して、前記第２の精製工程を実施する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ラムダ定常特異的アフィニティークロマトグラフィー媒体を使用して、前記第１の精製工程を実施し、カッパ定常または可変ドメイン特異的アフィニティークロマトグラフィー媒体を使用して、前記第２の精製工程を実施する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記組換え宿主細胞から、または前記宿主細胞の培養物から前記３つまたはそれを超える非同一抗体を回収する工程をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
前記３つまたはそれを超える抗体の少なくとも２つが、同じ標的抗原の異なるエピトープを標的とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
前記３つまたはそれを超える抗体の少なくとも２つが、異なる抗原を標的とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項２３】
前記３つまたはそれを超える抗体が単一特異性抗体および二重特異性抗体を含む、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１７年７月２１日に出願された米国仮出願第６２／５３５，３５４号（この内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）の利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、２つまたはそれを超える単一特異性抗体および１つまたはそれを超える二重特異性抗体の混合物から単離された抗体のサブセットを含む多重特異性抗体混合物の生成であって、前記サブセット中のすべての抗体が同じ共通重鎖を有する生成に関する。本発明はまた、少なくとも１つのアフィニティークロマトグラフィー工程を使用することにより、抗体のこのようなサブセットを単離し、精製しまたは他の方法で産生する方法に関する。本発明はまた、様々な治療適応において抗体のこのようなサブセットを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
過去２０年間、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は重要な治療モダリティとなり、様々な適応症において大きな利益を患者にもたらしている。ｍＡｂの成功は、部分的には、それらの標的抗原に対する高い特異性および低い固有毒性によるものである。これらの特性は、他のクラスの薬物と比較した場合に、オフターゲット副作用を大きく制限する。承認された治療用ｍＡｂの大部分は、ＩｇＧアイソタイプの非改変抗体である。
【０００４】
しかしながら、標準的なｍＡｂにより可能となる単一タンパク質のターゲティングは、有意な治療効果を達成するために必ずしも十分ではない場合がある（Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．２００８  ３（８）：８３３−８３９）。
【０００５】
有効性を増加させる明らかな選択肢は、２つのｍＡｂを組み合わせて使用することである。この戦略は、例えば、免疫チェックポイント分子をターゲティングする抗体、例えば抗ＣＴＬＡ４抗体および抗ＰＤ−１抗体について臨床的に追求されている（Ｌａｒｋｉｎら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０１５；３７３：２３−３４；Ｈａｒｒｉｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ．２０１６  １３（２）：１７１−９３）。しかしながら、ｍＡｂ組み合わせの開発には、大きなコストおよび開発の障害が伴う。特に、２つの別個の製造プロセスを導入しなければならず、コストの大きな増加につながる（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら、Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ２０１２  ５２６：３９−１４５）。３つまたはそれを超えるタンパク質または抗原のターゲティングを検討する場合、これらの問題はさらに重要になる。
【０００６】
これまでに、複数のタンパク質または抗原をターゲティングするためのいくつかのアプローチが使用されている。２つのｍＡｂを組み合わせて使用することが追求されているが、大きなコストおよび開発の障害により妨げられることが多い。二重特異性抗体（ＢｉＡｂ）は、多重特異性ターゲティングを達成するための急速に発展している代替手段であり、これまでに、６０個を超えるフォーマットが記載されており（Ｓｐｉｅｓｓら、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１５  ６７：９５−１０６；Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ｍＡｂｓ  ２０１７  ９：１８２−２１２）、２つまたはさらにそれを超えるタンパク質のターゲティングを達成するための別のアプローチは、抗体混合物または組換えポリクローナル混合物の生成である。しかしながら、これらの多重特異性フォーマットのごく一部しか、治療用途について承認されていない。
したがって、複数のタンパク質、エピトープおよび／または抗原を標的とすることができる多重特異性抗体混合物を生成する必要性が存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．２００８  ３（８）：８３３−８３９
【非特許文献２】Ｌａｒｋｉｎら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０１５；３７３：２３−３４
【非特許文献３】Ｈａｒｒｉｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ．２０１６  １３（２）：１７１−９３
【非特許文献４】Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら、Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ２０１２  ５２６：３９−１４５
【非特許文献５】Ｓｐｉｅｓｓら、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１５  ６７：９５−１０６
【非特許文献６】Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ｍＡｂｓ  ２０１７  ９：１８２−２１２
【発明の概要】
【０００８】
本開示は、２つまたはそれを超える単一特異性抗体および１つまたはそれを超える二重特異性抗体の混合物から単離された抗体のサブセットを含む抗体混合物であって、前記サブセット中のすべての抗体が同じ共通重鎖を有する抗体混合物を提供する。これらの混合物は、単一細胞において複数の軽鎖が共通重鎖と共発現されるときに産生される。いくつかの実施形態では、精製サブセットは、少なくともカッパ軽鎖を含有する抗体のみを含む。いくつかの実施形態では、精製サブセットは、少なくともラムダ軽鎖を含有する抗体のみを含む。いくつかの実施形態では、精製サブセットは、カッパ軽鎖およびラムダ軽鎖を含有する抗体のみを含む。
【０００９】
本開示はまた、少なくとも１つのアフィニティークロマトグラフィー工程を使用することにより、２つまたはそれを超える単一特異性抗体および１つまたはそれを超える二重特異性抗体の混合物から単離された抗体のサブセットを単離し、精製しまたは他の方法で産生する方法であって、前記サブセット中のすべての抗体が同じ共通重鎖を有する方法を提供する。いくつかの実施形態では、カッパ定常または可変ドメイン特異的アフィニティークロマトグラフィー媒体を使用して、精製工程を実施する。いくつかの実施形態では、ラムダ定常または可変ドメイン特異的アフィニティークロマトグラフィー媒体を使用して、精製工程を実施する。いくつかの実施形態では、２段階アフィニティークロマトグラフィープロセスを使用して、精製工程を実施する。いくつかの実施形態では、カッパ定常または可変ドメイン特異的アフィニティークロマトグラフィー媒体を使用して、第１の精製工程を実施し、ラムダ定常特異的アフィニティークロマトグラフィー媒体を使用して、第２の精製工程を実施する。いくつかの実施形態では、ラムダ定常特異的アフィニティークロマトグラフィー媒体を使用して、第１の精製工程を実施し、カッパ定常または可変ドメイン特異的アフィニティークロマトグラフィー媒体を使用して、第２の精製工程を実施する。
【００１０】
本明細書で提供される多重特異性抗体混合物および方法は、様々な治療、診断および／または予防適応のいずれにおいても有用である。例えば、多重特異性抗体混合物は、がんまたは他の新生物状態の症状の処置または予防が望まれる被験体への抗体混合物の投与による、がんまたは他の新生物状態の症状の処置、予防および／またはその進行の遅延または緩和において有用である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗体混合物は、血液悪性腫瘍および／または固形腫瘍の処置において有用である。例えば、本明細書に記載される多重特異性抗体混合物は、ＣＤ４７＋腫瘍、メソセリン＋腫瘍およびそれらの組み合わせの処置において有用である。非限定的な例として、本明細書に記載される多重特異性抗体混合物は、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、乳がん、卵巣がん、頭頸部がん、膀胱がん、黒色腫、中皮腫、結腸直腸がん、胆管癌、膵臓がん（膵臓腺癌を含む）、肺がん（肺腺癌を含む）、平滑筋腫、平滑筋肉腫、腎臓がん、神経膠腫、膠芽腫、子宮内膜がん、食道がん、胆管胃がんおよび前立腺がんの処置において有用である。固形腫瘍としては、例えば、乳腺腫瘍、卵巣腫瘍、肺腫瘍、膵臓腫瘍、前立腺腫瘍、黒色腫腫瘍、結腸直腸腫瘍、肺腫瘍、頭頸部腫瘍、膀胱腫瘍、食道腫瘍、肝腫瘍および腎臓腫瘍が挙げられる。
【００１１】
いくつかの実施形態では、多重特異性抗体混合物は、自己免疫疾患および／または炎症性障害の症状の処置または予防が望まれる被験体への抗体混合物の投与による、自己免疫疾患および／または炎症性障害の症状の処置、予防および／またはその進行の遅延または緩和において有用である。自己免疫疾患としては、例えば、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ、これは自己免疫成分を伴うウイルス性疾患である）、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫アディソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性リンパ増殖性症候群（ＡＬＰＳ）、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、ベーチェット病、心筋症、セリアックスプルー−疱疹状皮膚炎；慢性疲労免疫機能障害症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発神経障害（ＣＩＰＤ）、瘢痕性類天疱瘡（ｃｉｃａｔｒｉｃｉａｌ  ｐｅｍｐｈｉｇｏｌｄ）、寒冷凝集素症、クレスト症候群、クローン病、デゴス病、若年性皮膚筋炎、円盤状ループス、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛症−線維筋炎、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、インスリン依存性糖尿病、若年性慢性関節炎（スティル病）、若年性関節リウマチ、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、悪性貧血（ｐｅｒｎａｃｉｏｕｓ  ａｎｅｍｉａ）、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺症候群、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症（進行性全身性硬化症（ＰＳＳ）、全身性硬化症（ＳＳ）としても公知）、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、白斑およびウェゲナー肉芽腫症が挙げられる。
【００１２】
炎症性障害としては、例えば、慢性炎症性障害および急性炎症性障害が挙げられる。炎症性障害の例としては、アルツハイマー病、喘息、慢性閉塞性肺疾患、アトピー性アレルギー、アレルギー、アテローム性動脈硬化症、気管支喘息、湿疹、糸球体腎炎、移植片対宿主病、溶血性貧血、変形性関節症、敗血症、脳卒中、組織および臓器の移植、血管炎、糖尿病性網膜症ならびに人工呼吸器誘発性肺傷害が挙げられる。
【００１３】
いくつかの実施形態では、多重特異性抗体混合物は、Ｔ細胞のリターゲティングにおいて有用である。
【００１４】
本発明の医薬組成物は、本発明による多重特異性抗体混合物および担体を含み得る。これらの医薬組成物は、例えば治療キットおよび／または診断キットなどのキットに含められ得る。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃは、組換え抗体混合物を生成するための様々なアプローチの一連の概略図である。図１Ａは、独立して発現させて精製したモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を混合してｍＡｂの混合物を産生する方法を示す。図１Ｂは、ポリクローナル細胞バンクとも称される細胞株を混合して、単一の発酵リアクターにおいてｍＡｂのみの混合物を産生する方法を示す。図１Ｃは、単一細胞株において複数の抗体鎖を共発現させて、ｍＡｂおよび二重特異性抗体（ＢｉＡｂ）の混合物を産生する方法を示す。
【００１６】
【図２】図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃは、複数の軽鎖を単一の共通重鎖と共発現させる方法、および得られる産生された抗体混合物の一連の概略図である。図２Ａは、２つの抗体軽鎖と単一の重鎖との共発現が、３つの異なる抗体（各Ｆａｂにおいてそれぞれが同じ軽鎖を組み込んだ２つのｍＡｂ、および各Ｆａｂにおいて異なる軽鎖を組み込んだ単一のＢｉＡｂ）の分泌をどのようにもたらすかを示す。図２Ｂは、３つの抗体軽鎖と単一の重鎖との共発現が、６つの異なる抗体（各Ｆａｂにおいてそれぞれが同じ軽鎖を組み込んだ３つのｍＡｂ、および各Ｆａｂにおいて異なる軽鎖を組み込んだ３つのＢｉＡｂ）の分泌をどのようにもたらすかを示す。図２Ｃは、４つの抗体軽鎖と単一の重鎖との共発現が、１０個の異なる抗体（各Ｆａｂにおいてそれぞれが同じ軽鎖を組み込んだ４つのｍＡｂ、および各Ｆａｂにおいて異なる軽鎖を組み込んだ６つのＢｉＡｂ）の分泌をどのようにもたらすかを示す。
【００１７】
【図３】図３は、単一細胞において２つのラムダ軽鎖、１つのカッパ軽鎖および単一の共通重鎖を共発現させて、２つのＩｇＧλλ  ｍＡｂ、１つのＩｇＧκκ  ｍＡｂ、２つのＩｇＧκλ  ＢｉＡｂおよび１つのＩｇＧλλ  ＢｉＡｂの混合物（混合物１）の分泌をもたらす方法の概略図である。示されているように、異なるアフィニティークロマトグラフィー工程を使用して、混合物１から異なるサブ混合物（submixture）を単離し得る。
【００１８】
【図４】図４は、単一細胞において２つのラムダ軽鎖、２つのカッパ軽鎖および単一の共通重鎖を共発現させて、２つのＩｇＧλλ  ｍＡｂ、２つのＩｇＧκκ  ｍＡｂ、４つのＩｇＧκλ  ＢｉＡｂ、１つのＩｇＧλλ  ＢｉＡｂおよび１つのＩｇＧκκ  ＢｉＡｂ（混合物１）の分泌をもたらす方法の概略図である。示されているように、異なるアフィニティークロマトグラフィー工程を使用して、混合物１から異なるサブ混合物を単離し得る。
【００１９】
【図５】図５は、単一細胞において３つのラムダ軽鎖、１つのカッパ軽鎖および単一の共通重鎖を共発現させて、３つのＩｇＧλλ  ｍＡｂ、１つのＩｇＧκκ  ｍＡｂ、３つのＩｇＧκλ  ＢｉＡｂ、３つのＩｇＧλλ  ＢｉＡｂおよび１つのＩｇＧκκ  ＢｉＡｂの混合物（混合物１）の分泌をもたらす方法の概略図である。示されているように、異なるアフィニティークロマトグラフィー工程を使用して、混合物１から異なるサブ混合物を単離し得る。
【００２０】
【図６】図６は、本開示の方法の一般的な概略図である。
【００２１】
【図７Ａ】図７Ａは、ＣＤ４７および腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の２つのエピトープをターゲティングする２つの二重特異性抗体の概略図である。
【００２２】
【図７Ｂ】図７Ｂは、カッパ特異的アフィニティー媒体、続いてラムダ特異的アフィニティー媒体を使用した２段階アフィニティークロマトグラフィーにより（逆もまた同様）、２つのＢｉＡｂ（ＣＤ４７ｘＴＡＡエピトープ１およびＣＤ４７ｘＴＡＡエピトープ２）を含有するサブセットを精製する方法の概略図である。
【００２３】
【図８Ａ】図８Ａは、ＣＤ４７および第１の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ１）をターゲティングする第１の二重特異性抗体、ならびにＣＤ４７および第２の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ２）をターゲティングする第２の二重特異性抗体の概略図である。
【００２４】
【図８Ｂ】図８Ｂは、カッパ特異的アフィニティー媒体、続いてラムダ特異的アフィニティー媒体を使用した２段階アフィニティークロマトグラフィーにより（逆もまた同様）、２つのＢｉＡｂ（ＣＤ４７ｘＴＡＡ１およびＣＤ４７ｘＴＡＡ２）を含有するサブセットを精製する方法の概略図である。
【００２５】
【図９Ａ】図９Ａは、複数の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ１、ＴＡＡ２  以下）および／またはＴＡＡ上の複数のエピトープをターゲティングする二重特異性抗体の概略図である。
【００２６】
【図９Ｂ】図９Ｂは、カッパ特異的アフィニティー媒体、続いてラムダ特異的アフィニティー媒体を使用した２段階アフィニティークロマトグラフィーにより（逆もまた同様）、４つの異なるＢｉＡｂ（ＣＤ４７ｘＴＡＡ１；ＣＤ４７ｘＴＡＡ２；ＰＤ−Ｌ１ｘＴＡＡ１；ＰＤ−Ｌ１ｘＴＡＡ２）を含有するサブセットを精製する方法の概略図である。
【００２７】
【図１０Ａ】図１０Ａは、Ｔ細胞を複数の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ１、ＴＡＡ２  以下）および／またはＴＡＡ上の複数のエピトープにリターゲティングするための二重特異性抗体の概略図である。
【００２８】
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、カッパ特異的アフィニティー媒体、続いてラムダ特異的アフィニティー媒体を使用した２段階アフィニティークロマトグラフィーにより（逆もまた同様）、２つの異なるＢｉＡｂ（ＣＤ３ｘＴＡＡ１；ＣＤ３ｘＴＡＡ２）を含有するサブセットを精製する方法の概略図である。
【００２９】
【図１１Ａ】図１１Ａは、二価ターゲティングを回避すべき第１および第２のＴＡＡをターゲティングするＢｉＡｂと組み合わせた、第１のＴＡＡをターゲティングするｍＡｂの混合物の概略図である。
【００３０】
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、カッパ特異的アフィニティー媒体、続いてラムダ特異的アフィニティー媒体を使用した２段階アフィニティークロマトグラフィーにより（逆もまた同様）、ＢｉＡｂ（ＴＡＡ１ｘＴＡＡ２）および抗ＴＡＡ１  ｍＡｂを含有するサブセットを精製する方法の概略図である。
【００３１】
【図１２】図１２Ａ、１２Ｂおよび１２Ｃは、漸増濃度の様々な二重特異性抗体および／またはモノクローナル抗体ならびに二重特異性抗体の組み合わせの存在下で膵臓腺癌ＨＰＡＣ細胞株において観察された、食作用指数として示されている抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）のレベルを示す一連のグラフを示す。
【００３２】
【図１３】図１３Ａ、１３Ｂおよび１３Ｃは、漸増濃度の様々な二重特異性抗体および／またはモノクローナル抗体ならびに二重特異性抗体の組み合わせの存在下で卵巣腺癌ＣａＯＶ細胞株において観察された、食作用指数として示されているＡＤＣＰのレベルを示す一連のグラフを示す。
【００３３】
【図１４】図１４Ａ、１４Ｂおよび１４Ｃは、漸増濃度の様々な二重特異性抗体および／またはモノクローナル抗体ならびに二重特異性抗体の組み合わせの存在下で胃癌ＮＣＩ−Ｎ８７細胞株において観察された、食作用指数として示されているＡＤＣＰのレベルを示す一連のグラフを示す。
【００３４】
【図１５】図１５は、漸増濃度の様々な二重特異性抗体および異なる比の二重特異性抗体を使用した組み合わせの存在下で胃癌ＮＣＩ−Ｎ８７細胞株において観察された、食作用指数として示されているＡＤＣＰのレベルを示すグラフである。
【００３５】
【図１６Ａ】図１６Ａは、１つの重鎖および３つの異なる軽鎖の共発現により得られ、プロテインＡクロマトグラフィーにより上清から精製されたＩｇＧ混合物（レーン１）のサンプルの等電点電気泳動ゲルの写真である。２つの二重特異性抗体から構成されるＫ２Ｏ２５Ｏ３０サブ混合物をレーン２にロードした。
【００３６】
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、Ｋ２Ｏ２５Ｏ３０サブ混合物の疎水性相互作用クロマトグラフィー後に得られたクロマトグラムである。溶出時間およびピーク特性は、挿入された表に示されている。
【００３７】
【図１７】図１７は、漸増濃度のＫ２Ｏ２５Ｏ３０サブ混合物およびＫ２Ｏ２５とＫ２Ｏ３０との等モル組み合わせの存在下で胃癌ＮＣＩ−Ｎ８７細胞株において観察された、食作用指数として示されているＡＤＣＰのレベルを示すグラフである。
【００３８】
【図１８】図１８Ａは、肝臓がんのＭＳＬＮトランスフェクトＨｅｐＧ２マウスモデルにおける２つのＣＤ４７ｘＭＳＬＮκλボディ（Ｋ２Ｏ３８およびＫ２Ｏ４１）およびそれらの組み合わせ（Ｋ２Ｏ３８＋Ｋ２Ｏ４１）の抗腫瘍活性を示す。図１８Ｂは、曲線下面積および統計分析を示す。図１８Ｃは、異なる処置群において観察された腫瘍成長阻害を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
詳細な説明
本明細書で提供される多重特異性抗体混合物および方法は、他の抗体フォーマットおよび／または抗体混合物で見られる制限を克服する。現在のところ、承認されているモノクローナル抗体フォーマットのほとんどは、ＩｇＧ１アイソタイプの非改変抗体である。しかしながら、単一抗原のターゲティングは、所望の治療効果を達成するために必ずしも十分ではない（Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．２００８  ３（８）：８３３−８３９）。効率を増加させるために、２つのｍＡｂが組み合わせて使用されている。この戦略は、例えば、免疫チェックポイント分子をターゲティングする抗体、例えば抗ＣＴＬＡ４抗体および抗ＰＤ−１抗体について臨床的に追求されている（Ｌａｒｋｉｎら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０１５；３７３：２３−３４；Ｈａｒｒｉｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ．２０１６  １３（２）：１７１−９３）。しかしながら、ｍＡｂ組み合わせの開発には、大きなコストおよび開発の障害が伴う。特に、２つの別個の製造プロセスを導入しなければならず、コストの大きな増加につながる（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら、Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ２０１２  ５２６：３９−１４５）。３つまたはそれを超えるタンパク質または抗原のターゲティングを検討する場合、これらの問題はさらに重要になる。
【００４０】
多重特異性ターゲティングを達成するための代替手段として二重特異性抗体（ＢｉＡｂ）が開発されており、これまでに、６０個を超えるフォーマットが記載されている（Ｓｐｉｅｓｓら、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１５  ６７：９５−１０６；Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ｍＡｂｓ  ２０１７  ９：１８２−２１２）。２つの結合部位が同じ分子に組み込まれるので、ｍＡｂまたはｍＡｂ組み合わせによりサポートされないユニークな作用様式が、ＢｉＡｂにより可能になる（Ｆｉｓｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｌｅｇｅｒ  Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ．２００７  ７４（１）：３−１４）。このようなユニークな作用様式の例は、腫瘍細胞へのＴ細胞またはＮＫ細胞のリターゲティング、血液脳関門を通過する輸送の増加による中枢神経系へのＢｉＡｂ送達、凝固第ＶＩＩＩ因子模倣活性、複数の細胞タイプ上において発現される受容体の選択的ターゲティングである。
【００４１】
２つまたはさらにそれを超えるタンパク質のターゲティングを達成するためのさらに別のアプローチは、抗体混合物または組換えポリクローナル混合物の生成である。各ｍＡｂが別々に産生される上記２つのｍＡｂの組み合わせとは対照的に、混合物中の抗体は、混合物として一緒に産生される。混合物を生成するための様々なアプローチが記載されている（例えば、Ｒａｊｕ  ａｎｄ  Ｓｔｒｏｈｌ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１３  １３（１０）：１３４７−１３５２；Ｗａｎｇら、２０１３  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ２０１３  ２：１−１１を参照のこと）。組換えポリクローナル混合物の産生に関する一般的な課題は、混合物の各成分が一定に維持し、それにより、混合物の全体的な組成および生物学的活性が一貫するように、バッチ間の一貫性を達成することである。
【００４２】
１つのアプローチでは、それぞれが単一のモノクローナル抗体を発現する異なる安定な細胞株を混合して、産生のための単一のバイオリアクターにおいて使用されるポリクローナル細胞バンクを作製する。この場合、異なる細胞株により異なる抗体が培地に分泌され、すべての抗体を一緒に精製して、最終的な組換え抗体混合物を得る（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら、Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ２０１２  ５２６：３９−１４５）。この場合、組換えポリクローナル混合物のバッチ間の一貫性を確保するために、発酵中の個々の細胞株の再現可能な成長および生産性特徴を極めてよく制御しなければならない。１つの細胞株のより速い成長または生産性の増加は、混合物の組成に直接的な影響を有する。このような制御レベルの達成は容易ではなく、このアプローチの大きな障害となる。それにもかかわらず、最大２５個の独立した抗体の非常に複雑な混合物が、ポリクローナル細胞株を使用して開発され、臨床試験において評価されている（Ｈｊｅｌｍｓｔｒｏｅｍら、Ｂｌｏｏｄ  ２００８  １１２：１９８７）。
【００４３】
別の戦略は、単一細胞内において複数の抗体の重鎖および／または軽鎖を共発現させることである。この場合、異なる重鎖および軽鎖が対形成して、混合物が生成され得る。得られる混合物の複雑性は、共発現される異なる鎖の数に依存する。このアプローチでは、非機能的分子の産生を回避するために、異なる可能な対形成が機能的抗原結合部位を再構成することを確実にすることが重要である。この対形成の問題は、共通重鎖もしくは共通軽鎖の使用により、または所望の対形成を優先的に形成するようにタンパク質インターフェースを操作することにより解決され得る（例えば、Ｆｉｓｃｈｅｒら、Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｓ  ２０１５６：６１１３  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ７１１３を参照のこと）。独立した細胞株の混合に依拠する以前のアプローチとは対照的に、このアプローチは、ｍＡｂおよびＢｉＡｂの両方の生成につながる。大きな利点は、それは標準的なｍＡｂプロセスに類似するので、安定な方法で異なる抗体鎖を発現する細胞株が同定されたら、発酵および産生が簡素化されることである。しかしながら、すべての対形成が可能である場合には、混合物成分（ｍＡｂおよびＢｉＡｂ）の複雑性が非常に大きくなり得るので、共通重鎖または軽鎖に依拠する抗体が好ましい。
【００４４】
組換え抗体混合物を生成するための異なるアプローチ、それらの利点および制限は表１に列挙されており、図１Ａ〜１Ｃに示されている。
【表１】
2020527158.tif 000003
【００４５】
上記アプローチのいくつかを使用して、いくつかの混合物が開発され、臨床段階に達しているが、これは、この治療モダリティが興味深い実現可能なものであることを示している。混合物は、単一の抗体で達成され得ないユニークな作用様式を可能にする。
【００４６】
例えば、ＨＥＲ／ＥｒｂＢファミリーの受容体のターゲティングは、抗体混合物を用いて積極的に調査されている。受容体チロシンキナーゼのこのファミリーは、成長因子受容体ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ１、ＨＥＲ−２／ＥｒｂＢ２、ＨＥＲ−３／ＥｒｂＢ３およびＨＥＲ−４／ＥｒｂＢ４を含む。ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２をターゲティングするいくつかのモノクローナル抗体は、臨床使用について承認されている。研究では、複数のエピトープをターゲティングする抗体の混合物であって、これらの標的に同時に係合することができる抗体の混合物は、インビトロおよびインビボ実験におけるがん細胞成長の阻害の増加につながることが報告されている。これは、ＨＥＲ／ＥｒｂＢファミリーのメンバーに対して向けられたいくつかの抗体混合物の開発につながった。一例は、前臨床モデルにおいて、承認された抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂセツキシマブと比較して有意に優れた活性を示した２つの抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂの混合物であるＳｙｍ００４である（Ｋｏｅｆｏｅｄら、ｍＡｂｓ  ２０１１  ３：６，５８４−５９５）。ＭＭ−１５１は、ＥＧＦＲ上の異なる非重複エピトープをターゲティングする３つのヒトｍＡｂから構成される別の混合物である（Ａｒｅｎａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０１６  ８（３２４），３２４ｒａ１４）。この混合物は、単一ｍＡｂ療法と比較した場合、受容体のより有効な遮断を提供し、耐性の出現を制限する。ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３をターゲティングする６つのｍＡｂ（各標的上の非重複エピトープに対して向けられた２つのｍＡｂ）から構成されるより複雑な混合物Ｓｙｍ０１３もまた、臨床開発段階に達している。この受容体ファミリーに対する混合物で観察される優れた全体的活性は、この部分的に冗長なシグナル伝達経路のより完全な停止、抗体媒介性受容体架橋による内在化および分解の増加、Ｆｃ媒介性細胞殺滅の増加などのいくつかの要因により説明され得る。
【００４７】
抗体混合物が顕著な優位性を示した別の治療分野は、感染性疾患の処置である（Ｏｌｅｋｓｉｅｗｉｃｚら、Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ２０１２  ５２６：１２４−１３１；Ｐｏｈｌら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２０１３  ８１（６）：１８８０−１８８８）。例えば、ボツリヌス毒素Ａなどの可溶性毒素のマルチエピトープターゲティングは、毒素の中和だけではなく、循環からのそのクリアランスも増加させる。全体として、ｍＡｂアプローチは、他の治療分野とは対照的に、感染症の処置に非常に有効であると証明されていない。これは、自然免疫系のものと類似のポリクローナル抗体応答が、病原体などの複雑な生物に対する有効な保護に必要であることを反映している可能性がある。
【００４８】
ロズロリムパブは、抗体混合物がどれほど複雑であり得るかの顕著な例である。アカゲザルＤ抗原に対する２５個のｍＡｂのこの混合物は、図１Ｂに例示されているポリクローナル細胞バンクアプローチを使用して産生され、免疫性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）の処置のために開発された。この複雑な混合物の利点は、それが、集団に存在する多数のアカゲザルＤ変異体の有効なカバレッジを提供することである（Ｒｏｂａｋら、Ｂｌｏｏｄ．２０１２  １２０（１８）：３６７０−７６）。
【００４９】
これらの例は、混合物が、単一ｍＡｂ療法と比較して提供し得る機構的利点を強調している。これらの機構としては、限定されないが、受容体の内在化および分解の増加、可溶性標的の迅速な優れたクリアランス、Ｆｃ依存性エフェクター機能の増加、単一の標的または複数の標的および経路上の複数のエピトープをターゲティングする相乗効果、標的変異体のより良いカバレッジならびにエスケープ変異の予防が挙げられる。
【００５０】
本発明は、ｉ）二重特異性抗体（ＢｉＡｂ）のみまたはｉｉ）モノクローナル抗体（ｍＡｂ）およびＢｉＡｂのいずれかの定義された抗体混合物を生成する手段を提供する。前記方法は、混合物中の抗体のすべてのＦｖ領域に共通する単一の抗体重鎖と、カッパまたはラムダファミリーのいずれかのいくつかの軽鎖との共発現に依拠する。この共発現およびＩｇＧ分子へのランダム取り込みにより、すべてが同じ重鎖を含有する単一特異性ｍＡｂまたはＢｉＡｂの混合物の単一細胞からの分泌をもたらす。次いで、米国特許出願公開第２０１４０１７９５４７号に以前に記載されているように、例えば、ＩｇＧのＦｃ領域に結合する親和性試薬、例えばプロテインＡを使用して、完全な混合物を精製し得る。本発明は、分泌された混合物の異なるサブセットを選択的に精製することを可能にするので、以前の方法を改善する。特に、それは、ＢｉＡｂの混合物の簡便な費用対効果の高い生成を可能にする。これは、単一のｍＡｂまたはｍＡｂ混合物により可能ではない作用様式のために、ＢｉＡｂの混合物を使用する可能性を開く。本発明は、単一の産生細胞株を使用する利点と、最終精製混合物の組成を制御する可能性とを組み合わせて、所望の生物学的活性を最大化する。
【００５１】
共通重鎖と共発現される軽鎖の数に応じて、様々なタイプの抗体混合物が生成され得る。このプロセスは、以下のように一般化され得る：
ｎ＝共通重鎖と共に発現される異なる軽鎖の数である場合、
異なるｍＡｂの数＝ｎ
異なるＢｉＡｂの数＝（ｎ２−ｎ）／２
異なる抗体の総数＝ｎ＋（ｎ２−ｎ）／２
【００５２】
表２は、２〜１０個の異なる軽鎖の共発現に関するこれらの数を掲載しており、３つの例が以下でさらに詳述される：
１−２つの抗体軽鎖が単一の重鎖と共発現される場合、３つの異なる抗体が分泌される：各Ｆａｂにおいてそれぞれが同じ軽鎖を組み込んだ２つのｍＡｂ、および各Ｆａｂにおいて異なる軽鎖を組み込んだ単一のＢｉＡｂ（図２Ａを参照のこと）。しかしながら、３つの形態の存在量は、２つの軽鎖の相対的な発現およびアセンブリに依存する。発現およびアセンブリが同等であれば、理論分布は、各ｍＡｂについては２５％であり、ＢｉＡｂについては５０％である。
２−３つの抗体軽鎖が単一の重鎖と共発現される場合、６つの異なる抗体が分泌される：各Ｆａｂにおいてそれぞれが同じ軽鎖を組み込んだ３つのｍＡｂ、および各Ｆａｂにおいて異なる軽鎖を組み込んだ３つのＢｉＡｂ（図２Ｂを参照のこと）。発現およびアセンブリが同等であれば、理論分布は、各ｍＡｂについては１１．１％であり、各ＢｉＡｂについては２２．２％である。
３−４つの抗体軽鎖が単一の重鎖と共発現される場合、１０個の異なる抗体が分泌される：各Ｆａｂにおいてそれぞれが同じ軽鎖を組み込んだ４つのｍＡｂ、および各Ｆａｂにおいて異なる軽鎖を組み込んだ６つのＢｉＡｂ（図２Ｃを参照のこと）。発現およびアセンブリが同等であれば、理論分布は、各ｍＡｂについては６．２５％であり、各ＢｉＡｂについては１２．５％である。
【表２】
2020527158.tif 000004
【００５３】
共発現される異なる軽鎖がカッパタイプまたはラムダタイプのものであるかに応じて、カッパまたはラムダ軽鎖を含有するｍＡｂおよびＢｉＡｂの分布は変動するので、このアプローチにより生成され得る混合物のタイプがさらに多様化される。例えば、２つのラムダ軽鎖および１つのカッパ軽鎖が共通重鎖と共発現される場合、図３に示されているように、２つのＩｇＧλλ  ｍＡｂ、１つのＩｇＧκκ  ｍＡｂ、２つのＩｇＧκλ  ＢｉＡｂおよび１つのＩｇＧλλ  ＢｉＡｂが産生される。４つの軽鎖が共発現される場合、分子分布は、２つのカッパおよび２つのラムダ軽鎖を使用する場合（図４）、または３つのラムダおよび１つのカッパ軽鎖を使用する場合（図５）で変動する。
【００５４】
所定の多重特異性混合物で生成される抗体形態の得られる数は、以下のように一般化され得る：
ｎ＝カッパ軽鎖の数
ｍ＝ラムダ軽鎖の数
である場合、
ＩｇＧκκ  ｍＡｂの数＝ｎ
ＩｇＧλλ  ｍＡｂの数＝ｍ
ＩｇＧκλ  ＢｉＡｂの数＝ｎ×ｍ
ＩｇＧκκ  ＢｉＡｂの数＝（ｎ２−ｎ）／２
ＩｇＧλλ  ＢｉＡｂの数＝（ｍ２−ｍ）／２
【００５５】
異なる軽鎖の発現およびアセンブリが同一であれば、得られる各形態の理論分布は、以下のように一般化され得る：
ｎ＝カッパ軽鎖の数
ｍ＝ラムダ軽鎖の数
である場合、
ＩｇＧκκ  ｍＡｂの割合＝ｎ／（ｎ×ｍ）
ＩｇＧλλ  ｍＡｂの割合＝ｍ／（ｎ×ｍ）
ＩｇＧκλ  ＢｉＡｂの割合＝（ｎ×ｍ）×２／（ｎ×ｍ）
ＩｇＧκκ  ＢｉＡｂの割合＝（ｎ２−ｎ）／（ｎ×ｍ）
ＩｇＧλλ  ＢｉＡｂの割合＝（ｍ２−ｍ）／（ｎ×ｍ）
【００５６】
本発明は、上記の通り、様々な数のカッパおよび／またはラムダ軽鎖の共発現により生成され得る多種多様な異なる混合物から、ｉ）ＢｉＡｂのみまたはｉｉ）ｍＡｂおよびＢｉＡｂのいずれかの明確に定義されたサブセットを精製する手段を提供する。本発明は、Ｆｃ部分に特異的に結合する樹脂と、カッパ定常領域またはラムダ定常領域に特異的に結合する樹脂とを使用した多段階アフィニティークロマトグラフィーに依拠する。このようにして、これらの複雑な混合物を含む抗体形態のサブセットを容易に単離し、使用される樹脂のタイプおよび所望の作用様式に応じて、それらの組成を調整し得る。
【００５７】
例えば、２つのラムダ軽鎖および１つのカッパ軽鎖と共通重鎖との共発現は、２つのＩｇＧλλ  ｍＡｂ、１つのＩｇＧκκ  ｍＡｂ、２つのＩｇＧκλ  ＢｉＡｂおよび１つのＩｇＧλλ  ＢｉＡｂから構成される混合物を生成する（図３）。これらの抗体形態はすべてＦｃ部分を含有し、例えば、プロテインＡクロマトグラフィーを使用して容易かつ有効に精製され得る。カッパまたはラムダ鎖のいずれかに特異的に結合し、それにより、それぞれ少なくとも１つのカッパまたはラムダ鎖を含有するすべての抗体形態の捕捉を可能にするアフィニティークロマトグラフィー媒体を使用して、この混合物（図３に示されている混合物１）から、抗体の異なる定義されたサブセットを容易に単離し得る（それぞれ図３のサブ混合物２および３を参照のこと）。サブ混合物２は、１つのＩｇＧκκ  ｍＡｂおよび２つのＩｇＧκλ  ＢｉＡｂを含有する。サブ混合物３は、２つのＩｇＧλλ  ｍＡｂ、２つのＩｇＧκλ  ＢｉＡｂおよび１つのＩｇＧλλ  ＢｉＡｂを含有する。カッパおよびラムダ鎖に特異的に結合する媒体を使用した２連続アフィニティークロマトグラフィー工程により、２つのＩｇＧκλ  ＢｉＡｂを含有する（ｍＡｂを含まない）サブ混合物を単離し得る（図３のサブ混合物４）。
【００５８】
４つの異なる軽鎖が共発現される場合、得られる混合物はより複雑であり、共発現されるカッパおよびラムダ軽鎖の割合に依存する。２つの例が図４および５に記載されており、２つのラムダ軽鎖および２つのカッパ軽鎖または３つのラムダ軽鎖および１つのカッパ軽鎖がそれぞれ共発現されている。
【００５９】
２つのラムダ軽鎖および２つのカッパ軽鎖と共通重鎖との共発現は、２つのＩｇＧλλ  ｍＡｂ、２つのＩｇＧκκ  ｍＡｂ、４つのＩｇＧκλ  ＢｉＡｂ、１つのＩｇＧλλ  ＢｉＡｂおよび１つのＩｇＧκκ  ＢｉＡｂから構成される混合物（混合物１、図４）を生成する。これらの抗体形態はすべてＦｃ部分を含有し、例えば、プロテインＡクロマトグラフィーを使用して有効に精製され得る。上記のように、カッパまたはラムダ鎖のいずれかに特異的に結合し、それにより、それぞれ少なくとも１つのカッパまたはラムダ鎖を含有するすべての抗体形態の捕捉を可能にするアフィニティークロマトグラフィー媒体を使用して、この初期混合物１から、抗体の異なる定義されたサブセットを容易に単離し得る（それぞれ図４のサブ混合物２および３）。サブ混合物２は、２つのＩｇＧκκ  ｍＡｂ、４つのＩｇＧκλ  ＢｉＡｂおよび１つのＩｇＧκκ  ＢｉＡｂを含有する。サブ混合物３は、２つのＩｇＧλλ  ｍＡｂ、４つのＩｇＧκλ  ＢｉＡｂおよび１つのＩｇＧλλ  ＢｉＡｂを含有する。最後に、カッパおよびラムダ鎖に特異的に結合する媒体を使用した２連続アフィニティークロマトグラフィー工程により、４つのＩｇＧκλ  ＢｉＡｂを含有する（ｍＡｂを含まず、ラムダのみまたはカッパ鎖のみを含有するＢｉＡｂも含まない）混合物を単離し得る（図４のサブ混合物４）。
【００６０】
３つのラムダ軽鎖および１つのカッパ軽鎖が共通重鎖と共発現される状況では、３つのＩｇＧλλ  ｍＡｂ、１つのＩｇＧκκ  ｍＡｂ、３つのＩｇＧκλ  ＢｉＡｂ、３つのＩｇＧλλ  ＢｉＡｂおよび１つのＩｇＧκκ  ＢｉＡｂから構成される混合物（混合物１、図５）が生成される。これらの抗体形態はすべてＦｃ部分を含有し、例えば、プロテインＡクロマトグラフィーを使用して有効に精製され得る。上記のように、カッパまたはラムダ軽鎖定常ドメインのいずれかに特異的に結合し、それにより、それぞれ少なくとも１つのカッパ鎖またはラムダ鎖を含有するすべての抗体形態の捕捉を可能にするアフィニティークロマトグラフィー媒体（例えば、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  ＦａｂカッパおよびＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  Ｆａｂラムダアフィニティーマトリックス（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））を使用して、この初期混合物１（図５）から、抗体の異なる定義されたサブセットを容易に単離し得る（それぞれ図５のサブ混合物２および３）。サブ混合物２は、１つのＩｇＧκκ  ｍＡｂおよび３つのＩｇＧκλ  ＢｉＡｂを含有する。サブ混合物３は、３つのＩｇＧλλ  ｍＡｂ、３つのＩｇＧκλ  ＢｉＡｂおよび３つのＩｇＧλλ  ＢｉＡｂを含有する。最後に、カッパおよびラムダ鎖に特異的に結合する媒体を使用した２連続アフィニティークロマトグラフィー工程により、３つのＩｇＧκλ  ＢｉＡｂを含有する（ｍＡｂを含まず、ラムダ鎖のみまたはカッパ鎖のみを含有するＢｉＡｂも含まない）サブ混合物を単離し得る（図５のサブ混合物４）。
【００６１】
上記２つの状況は、各場合では４つの軽鎖が共発現されるが、発現される鎖の性質（すなわち、２つのカッパ軽鎖および２つのラムダ軽鎖または３つのラムダ軽鎖および１つのカッパ軽鎖）が、本発明の方法を適用することにより容易かつ有効に単離され得る非常に異なる混合物サブセットの生成および精製につながることを強調している。これらの状況は選択された例のみを表し、本発明の適用を他の状況に限定しない。
【００６２】
本発明は、一般に、複雑な混合物からｍＡｂおよび／またはＢｉＡｂのサブセットを、それらのカッパおよびラムダ軽鎖のそれぞれの含有量に基づいて、単離するために使用され得ることは明らかである。いずれの状況においても、カッパまたはラムダ抗体軽鎖のいずれかの定常または可変ドメインに特異的に結合するアフィニティークロマトグラフィー媒体を使用して、３つのタイプの混合物サブセットを精製することが可能である。
１．ｍＡｂおよびＢｉＡｂの両方を含む、少なくとも１つのカッパ軽鎖を含有するすべての抗体分子
２．ｍＡｂおよびＢｉＡｂの両方を含む、少なくとも１つのラムダ軽鎖を含有するすべての抗体分子
３．１つのカッパ軽鎖および１つのラムダ軽鎖を含有するすべてのＢｉＡｂ分子
【００６３】
本発明はまた、米国特許出願公開第２０１４０１７９５４７号に記載されているように、ハイブリッド軽鎖を含有する抗体混合物の抗体サブセットを精製するためにさらに適用され得る。これらのハイブリッド鎖は、
１．定常ラムダドメインに融合された可変カッパドメイン、または
２．定常カッパドメインに融合された可変ラムダドメイン
のいずれかから構成される。
【００６４】
全長のラムダまたはカッパ軽鎖と同様に、これらのハイブリッド分子は、
・カッパ定常ドメイン（例えば、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＬＣ−カッパ（Ｈｕ）アフィニティーマトリックス（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｚｕｇ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）
・いくつかのカッパ可変ドメイン（例えば、プロテインＬ）
・ラムダ定常ドメイン（例えば、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＬＣ−ラムダ（Ｈｕ）アフィニティーマトリックス（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｚｕｇ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）
のいずれかに結合するクロマトグラフィー媒体を使用することにより、それらの可変および定常ドメインの組成に応じて選択的に分離され得る。
【００６５】
本発明の一般的な用途は、図６に記載されている。
【００６６】
本開示の多重特異性抗体混合物は、様々な適応症において有用である。抗体混合物のサブセットは、ｍＡｂ、ｍＡｂ混合物またはＢｉＡｂにより可能ではない作用様式に依拠する治療モダリティの開発のための複数の用途を有し得る。
【００６７】
特に、本発明は、単一細胞株を使用した完全ヒトＢｉＡｂ混合物の簡単な生成を可能にするが、これは大きな利点を表す。実際、上記のように、２つの個々のｍＡｂの組み合わせは、コストの大きな増加につながる。ＢｉＡｂの生成は標準的なｍＡｂよりも複雑かつ高コストであるので、２つの個々のＢｉＡｂを組み合わせなければならない場合には、この制限は明らかにさらに重要である。ＢｉＡｂの潜在的に興味深い混合物の例、および本発明を使用してこれらの混合物を生成し得る方法は、以下により詳細に記載される。
【００６８】
ＣＤ４７遮断と組み合わせた腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）のマルチエピトープターゲティング：ＣＤ４７は、自然免疫系のチェックポイントとして作用する遍在的に発現される受容体であり、ＳＩＲＰαとの相互作用を介して食作用を抑制する（例えば、Ｏｌｄｅｎｂｏｒｇ，Ｐ．Ａ．，ＣＤ４７：Ａ  Ｃｅｌｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｗｈｉｃｈ  Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ，ＩＳＲＮ  Ｈｅｍａｔｏｌ．２０１３；２０１３：６１４６１９；Ｓｏｔｏ−Ｐａｎｔｏｊａ  ＤＲら、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＣＤ４７（２０１２），Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｔｈｅｒ  Ｔａｒｇｅｔｓ．２０１３  Ｊａｎ；１７（１）：８９−１０３；Ｓｉｃｋ  Ｅら、ＣＤ４７  Ｕｐｄａｔｅ：ａ  ｍｕｌｔｉｆａｃｅｄ  ａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｕｍｏｒ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１２  Ｄｅｃ；１６７（７）：１４１５−３０を参照のこと）。ＢｉＡｂアプローチによるＣＤ４７の遮断は、ＣＤ４７に対して向けられたｍＡｂで観察される毒性を回避する。ＣＤ４７ｘＴＡＡ  ＢｉＡｂは、ＴＡＡ発現細胞上においてのみＣＤ４７の限定的な阻害を可能にし、それにより、毒性および不十分な薬物動態特性を回避する。単一の受容体上の２つのエピトープをターゲティングする２つのＢｉＡｂであって、それぞれが抗ＴＡＡアームおよび抗ＣＤ４７アームを併せ持つ２つのＢｉＡｂの混合物は、優れた抗ＣＤ４７遮断、Ｆｃカバレッジの増加、および最終的にはより優れた腫瘍細胞殺滅をもたらすはずである（図７Ａ）。実際、このような状況では、各ＴＡＡ分子について、２つのＣＤ４７受容体が遮断され得、２つのＦｃが標的細胞表面に存在し、Ｆｃガンマ受容体相互作用を介してエフェクター細胞の動員を増強する。
【００６９】
以下のものとの共通重鎖の共発現：
・ＴＡＡ上の第１のエピトープに対する特異性を推進する第１のラムダ軽鎖
・ＴＡＡ上の第２のエピトープに対する特異性を推進する第２のラムダ軽鎖
・ＣＤ４７に対する特異性を推進するカッパ軽鎖
【００７０】
カッパ特異的アフィニティー媒体、続いてラムダ特異的アフィニティー媒体を使用した２段階アフィニティークロマトグラフィーにより（逆もまた同様）、得られた混合物から、２つのＢｉＡｂ（ＣＤ４７ｘＴＡＡエピトープ１およびＣＤ４７ｘＴＡＡエピトープ２）を含有するサブセットを精製し得る（図７B）。
【００７１】
ＣＤ４７遮断と組み合わせたマルチＴＡＡターゲティング：上記例は、標的がん細胞により発現される２つのＴＡＡに適用され得る。２つのＴＡＡをターゲティングする２つのＢｉＡｂであって、それぞれが抗ＴＡＡアームおよび抗ＣＤ４７アームを併せ持つ２つのＢｉＡｂの混合物もまた、優れた抗ＣＤ４７遮断、ＴＡＡの遮断に関連する効果とさらに組み合わせたＦｃカバレッジの増加、および最終的にはより優れた腫瘍細胞殺滅をもたらすはずである（図８Ａ）。
【００７２】
以下のものとの共通重鎖の共発現：
・第１のＴＡＡに対する特異性を推進する第１のラムダ軽鎖
・第２のＴＡＡに対する特異性を推進する第２のラムダ軽鎖
・ＣＤ４７に対する特異性を推進するカッパ軽鎖
【００７３】
カッパ特異的アフィニティー媒体、続いてラムダ特異的アフィニティー媒体を使用した２段階アフィニティークロマトグラフィーにより（逆もまた同様）、得られた混合物から、２つのＢｉＡｂ（ＣＤ４７ｘＴＡＡ１およびＣＤ４７ｘＴＡＡ２）を含有するサブセットを精製し得る（図８B)。
【００７４】
いくつかのチェックポイント分子の遮断と組み合わせたマルチＴＡＡまたはエピトープターゲティング：上記例において使用されているアプローチは、２つのチェックポイント受容体、例えばＣＤ４７およびＰＤ−Ｌ１を遮断するアームと組み合わせて、標的がん細胞により発現される２つのＴＡＡ（または同じＴＡＡ上の２つのエピトープ）に拡張され得る。このような混合物は、免疫チェックポイントの一般的な単一特異性遮断に関連する毒性を回避しながら、ＣＤ４７遮断、ＰＤ−Ｌ１遮断、Ｆｃカバレッジの増加、ならびに最終的にはより優れた腫瘍細胞殺滅および潜在的に非常に長く続く免疫系応答をもたらすはずである（図９Ａ）。
【００７５】
以下のものとの共通重鎖の共発現：
・第１のＴＡＡに対する特異性を推進する第１のラムダ軽鎖
・第２のＴＡＡに対する特異性を推進する第２のラムダ軽鎖
・ＣＤ４７に対する特異性を推進するカッパ軽鎖
・ＰＤ−Ｌ１に対する特異性を推進するカッパ軽鎖
【００７６】
カッパ特異的アフィニティー媒体、続いてラムダ特異的アフィニティー媒体を使用した２段階アフィニティークロマトグラフィーにより（逆もまた同様）、得られた混合物から、４つの異なるＢｉＡｂ（ＣＤ４７ｘＴＡＡ１；ＣＤ４７ｘＴＡＡ２；ＰＤ−Ｌ１ｘＴＡＡ１；ＰＤ−Ｌ１ｘＴＡＡ２）を含有するサブセットを精製し得る（図９Ｂ）。
【００７７】
Ｔ細胞のマルチＴＡＡリターゲティング：Ｔ細胞リターゲティングは、腫瘍学において臨床的に検証され広く追求されているアプローチである（Ｃｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｂａｔｙ  ＭＡｂｓ．２００９  １（６）：５３９−４７）。ＢｉＡｂの混合物は、２つの異なるＴＡＡ（または同じＴＡＡ上のエピトープ）へのＴ細胞のリターゲティングを可能にして、処置有効性を潜在的に改善するはずである（図１０Ａ）。
【００７８】
以下のものとの共通重鎖の共発現：
・第１のＴＡＡに対する特異性を推進する第１のラムダ軽鎖
・第２のＴＡＡに対する特異性を推進する第２のラムダ軽鎖
・ＣＤ３に対する特異性を推進するカッパ軽鎖
【００７９】
カッパ特異的アフィニティー媒体、続いてラムダ特異的アフィニティー媒体を使用した２段階アフィニティークロマトグラフィーにより（逆もまた同様）、得られた混合物から、２つの異なるＢｉＡｂ（ＣＤ３ｘＴＡＡ１；ＣＤ３ｘＴＡＡ２）を含有するサブセットを精製し得る（図１０Ｂ）。
【００８０】
上記例は例示的なものであり、本発明を適用することにより追求され得る可能な用途を限定しない。さらに、任意の例で提供される任意のカッパ鎖をラムダ鎖で置き換え得ることは明らかである（逆もまた同様）。
【００８１】
本発明の別の重要なタイプの用途は、ｍＡｂの１つまたは複数の形態を排除するｍＡｂおよびＢｉＡｂ混合物の生成である。この特徴は、いくつかの標的について重要であり、ｍＡｂによる単一特異性二価係合は有害であり、毒性および他の望ましくない効果につながり得る。例えば、抗ｃＭｅｔ抗体は、一価抗体の開発につながった望ましくないアゴニスト活性につながることが公知である。抗ｃＭｅｔ抗体を含有する混合物を生成するが抗ｃ−Ｍｅｔ  ｍＡｂを回避することは、本発明を使用すれば簡単である。上記のように、ｍＡｂによるＣＤ４７のターゲティングは、ヒトにおける有意な毒性につながる。抗ＣＤ４７  ｍＡｂは、他の受容体をターゲティングするｍＡｂと、別の受容体と併せてＣＤ４７をターゲティングするＢｉＡｂとの混合物から除去され得る。同様に、モノクローナル抗ＣＤ３もまた、ＣＤ３結合成分を含有する抗混合物から排除される必要がある。
【００８２】
２つの腫瘍関連抗原の複合的な一価および二価ターゲティング：例えば、二価ターゲティングを回避すべき第１および第２のＴＡＡをターゲティングするＢｉＡｂと組み合わせた、第１のＴＡＡをターゲティングするｍＡｂの混合物。この戦略は、ｃＭｅｔおよびＥＧＦＲなどのＴＡＡに適用され得る（図１１Ａ）。
【００８３】
以下のものとの共通重鎖の共発現：
・第１のＴＡＡに対する特異性を推進するラムダ軽鎖
・第２のＴＡＡに対する特異性を推進するカッパ軽鎖
【００８４】
ラムダ特異的アフィニティー媒体を使用したアフィニティークロマトグラフィーにより、得られた混合物から、ＢｉＡｂ（ＴＡＡ１ｘＴＡＡ２）および抗ＴＡＡ１  ｍＡｂを含有するサブセットを精製し得る（図１１Ｂ）。
【００８５】
この場合もやはり、抗体混合物のサブセットの他の用途を合理化することができ、上記例は本発明の範囲を制限しない。
【００８６】
抗体の異なるサブ混合物を分離するために、親和性または他のクロマトグラフィー試薬が利用可能である限り、同じ原理が、任意の抗体アイソタイプおよび非ヒト種の抗体形態（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒｍ  ｎｏｎ−ｈｕｍａｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ）に適用される。
【００８７】
さらに、本発明の同じ原理を、単一のＶＨＣＨ１が２つまたはそれを超えるＶκＣκまたはＶλＣλと共発現されるＦ（ａｂ’）２フォーマットに適用して、単一特異性および二重特異性Ｆ（ａｂ’）２分子の混合物の分泌をもたらし得る。次いで、本発明の方法にしたがって、カッパまたはラムダ軽鎖の一部に結合するアフィニティークロマトグラフィー媒体を使用して、これらを、明確に定義されたサブ混合物へと分離し得る。同様に、ハイブリッドＶκＣλおよびＶλＣκもまた、本発明の方法を実施する場合に使用され得る。
【実施例】
【００８８】
実施例１：二重特異性抗体生成のための抗体候補の選択
ｈＭＳＬＮ上の異なるエピトープをターゲティングする４つの抗体、およびすべてがラムダ軽鎖を含有する抗ｈＣＤ１９抗体、ならびにカッパ軽鎖を含有する抗ｈＣＤ４７抗体を、抗体混合物の生成のために選択した。これらの抗体はすべて、ＰＣＴ公開の国際公開第２０１４／０８７２４８号および２０１７年５月２６日に出願された「Ａｎｔｉ−ＣＤ４７  ｘ  Ａｎｔｉ−Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｕｓｅ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」という表題の同時係属中の特許出願である米国特許出願第６２／５１１，６６９号に記載されている同じ重鎖を含有し、米国特許出願公開第２０１４０１７９５４７号に記載されているκλボディフォーマットに基づく二重特異性抗体の生成に適切である。選択した抗体は表３に列挙されており、配列は以下に示されている。
【表３】
2020527158.tif 000005
【００８９】
表３の抗ｈＭＳＬＮ、抗ｈＣＤ１９および抗ｈＣＤ４７抗体はそれぞれ、配列番号１に示されている核酸配列によりコードされる共通重鎖（配列番号２）を含む。
【化１】
2020527158.tif 000006
【化２】
2020527158.tif 000007
【００９０】
表３の抗ｈＭＳＬＮ、抗ｈＣＤ１９および抗ｈＣＤ４７抗体はそれぞれ、配列番号３に示されている核酸配列によりコードされる共通可変重ドメイン（配列番号４）を含む。
【化３】
2020527158.tif 000008
【化４】
2020527158.tif 000009
【００９１】
Ｏ２５抗体は、配列番号１に示されている核酸配列によりコードされる共通重鎖（配列番号２）を含み、配列番号５に示されている核酸配列によりコードされるラムダ軽鎖（配列番号６）を含む。以下のアミノ酸配列において、ラムダ軽鎖の可変領域は太字である。
【化５】
2020527158.tif 000010
【００９２】
Ｏ２５抗体は、配列番号３に示されている核酸配列によりコードされる共通可変重ドメイン（配列番号４）を含み、配列番号７に示されている核酸配列によりコードされるラムダ可変軽ドメイン（配列番号８）を含む。
【化６】
2020527158.tif 000011
【化７】
2020527158.tif 000012
【００９３】
Ｏ３０抗体は、配列番号１に示されている核酸配列によりコードされる共通重鎖（配列番号２）を含み、配列番号９に示されている核酸配列によりコードされるラムダ軽鎖（配列番号１０）を含む。以下のアミノ酸配列において、ラムダ軽鎖の可変領域は太字である。
【化８】
2020527158.tif 000013
【００９４】
Ｏ３０抗体は、配列番号３に示されている核酸配列によりコードされる共通可変重ドメイン（配列番号４）を含み、配列番号１１に示されている核酸配列によりコードされるラムダ可変軽ドメイン（配列番号１２）を含む。
【化９】
2020527158.tif 000014
【００９５】
Ｏ３５抗体は、配列番号１に示されている核酸配列によりコードされる共通重鎖（配列番号２）を含み、配列番号１３に示されている核酸配列によりコードされるラムダ軽鎖（配列番号１４）を含む。以下のアミノ酸配列において、ラムダ軽鎖の可変領域は太字である。
【化１０】
2020527158.tif 000015
【００９６】
Ｏ３５抗体は、配列番号３に示されている核酸配列によりコードされる共通可変重ドメイン（配列番号４）を含み、配列番号１５に示されている核酸配列によりコードされるラムダ可変軽ドメイン（配列番号１６）を含む。
【化１１】
2020527158.tif 000016
【００９７】
Ｏ３８抗体は、配列番号１に示されている核酸配列によりコードされる共通重鎖（配列番号２）を含み、配列番号３０に示されている核酸配列によりコードされるラムダ軽鎖（配列番号２９）を含む。
【化１２】
2020527158.tif 000017
【化１３】
2020527158.tif 000018
【００９８】
Ｏ３８抗体は、配列番号３に示されている核酸配列によりコードされる共通可変重ドメイン（配列番号４）を含み、配列番号３２に示されている核酸配列によりコードされるラムダ可変軽ドメイン（配列番号３１）を含む。
【化１４】
2020527158.tif 000019
【００９９】
Ｏ４１抗体は、配列番号１に示されている核酸配列によりコードされる共通重鎖（配列番号２）を含み、配列番号１７に示されている核酸配列によりコードされるラムダ軽鎖（配列番号１８）を含む。以下のアミノ酸配列において、ラムダ軽鎖の可変領域は太字である。
【化１５】
2020527158.tif 000020
【化１６】
2020527158.tif 000021
【０１００】
Ｏ４１抗体は、配列番号３に示されている核酸配列によりコードされる共通可変重ドメイン（配列番号４）を含み、配列番号１９に示されている核酸配列によりコードされるラムダ可変軽ドメイン（配列番号２０）を含む。
【化１７】
2020527158.tif 000022
【０１０１】
Ｌ７−２抗体は、配列番号１に示されている核酸配列によりコードされる共通重鎖（配列番号２）を含み、配列番号２１に示されている核酸配列によりコードされるラムダ軽鎖（配列番号２２）を含む。
【化１８】
2020527158.tif 000023
【化１９】
2020527158.tif 000024
【０１０２】
Ｃ２抗体は、配列番号１１３に示されている核酸配列によりコードされる共通可変重ドメイン（配列番号１１４）を含み、配列番号２３に示されている核酸配列によりコードされるラムダ可変軽ドメイン（配列番号２４）を含む。
【化２０】
2020527158.tif 000025
【０１０３】
Ｋ２抗体は、配列番号１に示されている核酸配列によりコードされる共通重鎖（配列番号２）を含み、配列番号２５に示されている核酸配列によりコードされるカッパ軽鎖（配列番号２６）を含む。
【化２１】
2020527158.tif 000026
【化２２】
2020527158.tif 000027
【０１０４】
Ｋ２抗体は、配列番号３に示されている核酸配列によりコードされる共通可変重ドメイン（配列番号４）を含み、配列番号２７に示されている核酸配列によりコードされるカッパ可変軽ドメイン（配列番号２８）を含む。
【化２３】
2020527158.tif 000028
【０１０５】
実施例２：ラムダおよびカッパ軽鎖を有する二重特異性抗体の発現および精製。
同じ細胞における１つの重鎖および２つの軽鎖の同時発現は、３つの異なる抗体のアセンブリにつながり得る。共発現させるべき鎖の１つを発現する複数のベクターのトランスフェクションなどの異なる方法で、または複数の遺伝子発現を推進する（drive）ベクターを使用することにより、同時発現を達成し得る。米国特許出願公開第２０１２／０１８４７１６号および国際公開第２０１２／０２３０５３号（これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書によって組み込まれる）に記載されているように、ベクターのｐＮｏｖｉκＨλを先に生成して、１つの重鎖、１つのカッパ軽鎖および１つのラムダ軽鎖の共発現を可能にした。ヒトサイトメガロウイルスプロモーター（ｈＣＭＶ）により３つの遺伝子の発現を推進し、そのベクターはまた、安定な細胞株の選択および確立を可能にするグルタミンシンテターゼ遺伝子（ＧＳ）を含有する。哺乳動物細胞における一過性発現のために、抗ｈＭＳＬＮ  ＩｇＧλ、抗ｈＣＤ１９  ＩｇＧλまたは抗ｈＣＤ４７  ＩｇＧκのＶＬ遺伝子をベクターｐＮｏｖｉκＨλにクローニングした。ピーク細胞を増幅し、ウシ胎仔血清を含有する４５ｍＬの培養培地中、細胞８×１０６個／フラスコの濃度でＴ１７５フラスコに分割した。製造業者の指示にしたがってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００トランスフェクション試薬を使用して、３０μｇのプラスミドＤＮＡを細胞にトランスフェクトした。産生中のいくつかの時点において、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）技術を使用して、トランスフェクトした細胞の血清含有上清中の抗体濃度を測定した。ＯｃｔｅｔＲＥＤ９６機器およびプロテインＡバイオセンサーを定量に使用した（Ｐａｌｌ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。２００μＬの上清を使用して、ＩｇＧ濃度を決定した；バイオセンサーを前準備し、１０ｍＭグリシンｐＨ１．７を使用して再生し、馴化ＰＥＡＫ細胞培地で希釈したＩｇＧキャリブレーターを標準曲線作成のために調製した。用量反応５ＰＬ加重Ｙ標準曲線方程式および初期傾斜結合速度方程式を使用して、濃度を決定した。抗体濃度にしたがって、トランスフェクションの７〜１０日後に上清を回収し、１３００ｇで１０分間の遠心分離により清澄化した。精製プロセスは、３つのアフィニティー工程から構成されていた。最初に、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＩｇＧ−ＣＨ１アフィニティーマトリックス（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）をＰＢＳで洗浄し、次いで、清澄化上清に添加した。＋４℃における一晩のインキュベーション後、上清を１０００ｇで１０分間遠心分離し、フロースルーを保存し、樹脂をＰＢＳで２回洗浄した。次いで、樹脂をスピンカラムに移し、ｐＨ３．０の５０ｍＭグリシンを含有する溶液を溶出に使用した。いくつかの溶出画分を生成し、プールし、５０  ｋＤａＡｍｉｃｏｎ（登録商標）超遠心フィルタユニット（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して２５ｍＭヒスチジン／１２５ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ６．０緩衝液に対して脱塩した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）を使用して、上清由来の���ヒトＩｇＧを含有する最終生産物を定量し、適切な容量のＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＬＣ−カッパ（Ｈｕ）アフィニティーマトリックス（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）と共に室温および２０ｒｐｍで３０分間インキュベートした。先に記載した通り、インキュベーション工程、樹脂回収工程、溶出工程および脱塩工程を実施した。ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＬＣ−ラムダ（Ｈｕ）アフィニティーマトリックス（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して、２つの前述の精製と同じプロセスを適用して、最後のアフィニティー精製工程を実施した。Ｎａｎｏｄｒｏｐを使用して、最終生産物を定量した。変性および還元条件における電気泳動により、精製二重特異性抗体を分析した。製造業者（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）により記載されているように、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００バイオアナライザーをＰｒｏｔｅｉｎ  ８０キットと共に使用した。４μＬの精製サンプルを、ジチオスレイトール（ＤＴＴ；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を補充したサンプル緩衝液と混合した。サンプルを９５℃で５分間加熱し、次いで、チップにロードした。（二重特異性抗体および両方の単一特異性ｍＡｂを含有する）第１の精製工程からのアリコートと最終生産物のアリコートとを等電点電気泳動（ＩＥＦ）ゲルにロードして、最終精製二重特異性抗体（ｍＡｂ混入なし）の純度を評価した。ＳＥＣ−ＨＰＬＣにより、凝集レベルを決定した。最後に、ＯｃｔｅｔＲＥＤ９６を使用して、両標的への二重特異性抗体の結合を評価した。簡潔に言えば、ビオチン化標的（ｈＭＳＬＮ、ｈＣＤ１９、ｈＣＤ４７および無関係な標的）をストレプトアビジンバイオセンサーにロードした。次いで、このバイオセンサーを、二重特異性抗体を含有する溶液に浸漬し、結合をリアルタイムでモニタリングした。カブトガニ血球抽出成分試験（ＬＡＬ；Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）を使用して、エンドトキシン汚染について、すべてのサンプルを試験した。以下の二重特異性抗体を発現させ、精製した：
【表４】
2020527158.tif 000029
【０１０６】
実施例３：ｈＭＳＬＮおよびｈＣＤ４７をターゲティングする個々の二重特異性抗体ならびに二重特異性抗体の組み合わせの食作用アッセイにおける活性  腫瘍細胞の表面において発現されるタンパク質または抗原をターゲティングする二重特異性抗体であって、同じ腫瘍細胞上のＣＤ４７を共係合することができる二重特異性抗体は、ＳＩＲＰαとのＣＤ４７の相互作用により媒介される阻害シグナルを妨げることにより、マクロファージの食作用活性の増加を媒介し得る。この原理は、ＰＣＴ公開の国際公開第２０１４／０８７２４８号および２０１７年５月２６日に出願された「Ａｎｔｉ−ＣＤ４７  ｘ  Ａｎｔｉ−Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｕｓｅ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」という表題の同時係属中の特許出願である米国特許出願第６２／５１１，６６９号に記載されている。本明細書では、本発明者らは、図７に示されているように、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）のマルチエピトープターゲティングの仮説を試験した（この場合、ＣＤ４７遮断と組み合わせたｈＭＳＬＮ）。ＭＳＬＮ分子当たりより高密度のＦｃおよびより高いＣＤ４７遮断を有することの利益を評価するために、本発明者らは、個々のｈＣＤ４７／ｈＭＳＬＮ二重特異性抗体のいずれかにより、または二重特異性抗体のペアワイズの組み合わせにより媒介される食作用活性を比較した。ｈＣＤ１９はアッセイに存在しないので、一価抗ｈＣＤ４７対照としてｈＣＤ４７／ｈＣＤ１９二重特異性抗体Ｋ２Ｌ７−２を使用した。異なるレベルのｈＣＤ４７およびｈＭＳＬＮを発現する３つの腫瘍細胞株ＮＣＩ−Ｎ８７、ＨＰＡＣおよびＣａｏｖ−３を試験した。ＮＣＩ−Ｎ８７細胞のＣＤ４７およびメソセリンの細胞表面発現のレベルは、それぞれ４３，０００および２７，０００であった。ＨＰＡＣ細胞のＣＤ４７およびメソセリンの細胞表面発現のレベルは、それぞれ１０５，０００および１３，０００であった。Ｃａｏｖ−３細胞のＣＤ４７およびメソセリンの細胞表面発現のレベルは、それぞれ２２０，０００および３８，０００であった。
【０１０７】
末梢血単球から分化したヒトマクロファージおよびＮＣＩ−Ｎ８７、ＨＰＡＣまたはＣａＯＶ３を標的細胞として用いて、アッセイを実施した。マクロファージを、カルセインＡＭ標識標的細胞（エフェクター：標的比１：１）と共に、漸増濃度の二重特異性または一価抗体の存在下、３７℃で２．５時間コインキュベートした。インキュベーション期間の終了時に、上清を完全培養培地で置き換えた。ＣＸ５イメージングプラットフォームを用いてプレートをイメージングし、１条件当たり１５００個のマクロファージを取得および分析した。二重陽性事象により食作用を証明し、ソフトウェアにより食作用指数を計算した。
【０１０８】
これらの用量反応実験は、３つの細胞タイプすべてにおいて、Ｋ２Ｏ３０＋Ｋ２Ｏ４１の組み合わせにより媒介される食作用活性がＫ２Ｏ３０またはＫ２Ｏ４１のいずれかの活性よりも優れていたことを示している（図１２Ａ、１３Ａおよび１４Ａ）。同様に、３つの細胞タイプすべてにおいて、Ｋ２Ｏ３５＋Ｋ２Ｏ４１の組み合わせにより媒介される食作用活性は、Ｋ２Ｏ３５またはＫ２Ｏ４１のいずれかの活性よりも優れていた（図１２Ｂ、１３Ｂおよび１４Ｂ）。加えて、ＮＣＩ−Ｎ８７細胞およびＨＰＡＣ細胞では、Ｋ２Ｏ３８＋Ｋ２Ｏ４１の組み合わせにより媒介される食作用活性は、Ｋ２Ｏ３８またはＫ２Ｏ４１のいずれかの活性よりも優れていた（図１２Ｃおよび１４Ｃ）。ＮＣＩ−Ｎ８７細胞では、Ｋ２Ｏ３０＋Ｋ２Ｏ２５の組み合わせは、Ｋ２Ｏ３０またはＫ２Ｏ２５のいずれかの活性よりも優れていた（図１５）。すべての場合において、陰性対照ＩｇＧ（ＰＣＴ公開の国際公開第２００８／１０６２００号に記載されているＮＩ−０８０１と称される）または一価抗ｈＣＤ４７対照は、最小の食作用活性しか誘導しなかったか、または食作用活性を全く誘導しなかった。これらの例すべてにおいて、２つの二重特異性抗体を等量（すなわち、５０：５０の比）で添加した。この等モル比のわずかな変化が活性に影響を与えるかを評価するために、Ｋ２Ｏ３０およびＫ２Ｏ２５を４０：６０および６０：４０の比で混合し、試験した。すべての比により同様の結果が得られたが、これは、２つの二重特異性抗体間の比のわずかな差異が、組み合わせの食作用活性の増加に有意な影響を与えないことを示している（図１５Ａ）。
【０１０９】
実施例４：単一ベクターからの４つの抗体鎖の発現
さらなる軽鎖の発現を可能にするように、ベクターｐＮｏｖｉκＨλを改変した。新たなベクターｐＮｏｖｉＨ３Ｌは、１つの重鎖および３つの軽鎖の発現を推進する４つのプロモーターを含有する。Ｋ２抗ＣＤ４７カッパ軽鎖ならびに２つの抗ｈＭＳＬＮラムダ軽鎖Ｏ３０およびＯ２５をこの単一ベクターにクローニングした。配列決定により、すべてのコード配列およびクローニングジャンクションを検証した。実施例２に記載されているように、一過性トランスフェクションにおいてこのベクターを使用して、その機能性（すなわち、二重特異性抗体が産生され得ること）を検証した。次いで、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞へのエレクトロポレーションのために、ベクターを線状化した。
【０１１０】
実施例５：二重特異性抗体および単一特異性抗体を含有する抗体混合物の発現。
本明細書に提示されている研究では、化学的に定義された動物成分を含まない（ＣＤＡＣＦ）製造プロセスを使用して、安定なＣＨＯ株をトランスフェクトおよび成長させた。エレクトロポレーションによるトランスフェクションおよびＭＳＸによる選択の後、ＦＡＣＳによるスクリーニングを実施した。フェドバッチ条件における産生のために、最も高い産生プールを選択した。Ｏｃｔｅｔ技術により、異なるプールについて、総ＩｇＧ生産性を評価した。実施例２に記載されているように、アフィニティー精製を実施した。プロテインＡクロマトグラフィー工程後であるためすべてのＩｇＧ形態を含有する材料を、Ａｇｉｌｅｎｔバイオアナライザーを使用して等電点電気泳動ゲル（ＩＥＦ）により、ポリペプチド含有量について分析し、ＳＥＣ−ＨＰＬＣにより、凝集レベルを決定した。最後に、ＯｃｔｅｔＲＥＤ９６を使用して、両標的への二重特異性抗体の結合を評価した。簡潔に言えば、ビオチン化標的（ｈＭＳＬＮ、ｈＣＤ４７および無関係な標的）をストレプトアビジンバイオセンサーにロードした。次いで、このバイオセンサーを、二重特異性抗体を含有する溶液に浸漬し、結合をリアルタイムでモニタリングした。カブトガニ血球抽出成分試験（ＬＡＬ；Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）を使用して、エンドトキシン汚染について、すべてのサンプルを試験した。
【０１１１】
実施例６：２つの二重特異性を含有するサブ混合物の精製
実施例５において発現させて精製したすべてのＩｇＧ形態（二重特異性ＩｇＧおよび単一特異性ＩｇＧ）の混合物を、カッパまたはラムダ軽鎖定常ドメインと特異的に相互作用する媒体、例えばＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  ＦａｂカッパおよびＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  Ｆａｂラムダアフィニティーマトリックス（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した２段階のクロマトグラフィーにさらに供した。図６および７Ｂに示されているように、これらの２つの工程により、カッパ軽鎖およびラムダ軽鎖の両方を含有するすべてのＩｇＧ形態を回収することが可能になった。次いで、全ＩｇＧを、１０容量のＰＢＳで平衡化したＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  Ｆａｂカッパアフィニティーマトリックス（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を含有するカラムに適用した。次いで、カラムを５〜１０カラム容量のＰＢＳで洗浄した。５カラム容量の０．１ＭグリシンｐＨ３．０を適用することにより、カッパ軽鎖を有するすべての免疫グロブリン分子をカラムから溶出させ、画分を収集した。ＰＢＳで平衡化したＡｍｉｃｏｎ緩衝液交換カラム（Ｍｅｒｃｋ）の緩衝液交換前に、抗体を含有する画分をプールした。次いで、抗体を、１０容量のＰＢＳで平衡化したＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  Ｆａｂラムダアフィニティーマトリックスを含有する第２のカラムに適用した。次いで、カラムを５〜１０カラム容量のＰＢＳで洗浄した。カッパ軽鎖のみを有するすべての免疫グロブリン分子はカラムに結合し、フロースルーにおいて見られた。５カラム容量の０．１ＭグリシンｐＨ３．０を適用することにより、ラムダ軽鎖を有する抗体をカラムから溶出させ、画分を収集した。ＰＢＳで平衡化したＡｍｉｃｏｎ緩衝液交換カラム（Ｍｅｒｃｋ）の緩衝液交換前に、二重特異性抗体を含有する画分をプールした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、各精製工程のフロースルーおよび溶出画分を分析したところ、ラムダ軽鎖を有する抗体は、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  Ｆａｂカッパアフィニティーマトリックスのフロースルーにおいて見られ、逆に、カッパ軽鎖を有する抗体は、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  Ｆａｂラムダアフィニティーマトリックスのフロースルーにおいて見られたことが示された。
【０１１２】
プロテインＡ工程後に得られたすべてのＩｇＧ形態の混合物と、上記のように精製した２つの二重特異性抗体形態を含有するＫ２Ｏ２５Ｏ３０サブ混合物とをＩＥＦにより分析した（図１６Ａ）。予想どおり、プロテインＡ後に得られた混合物については、異なる単一および二重特異性抗体形態に対応する６つのバンドを見ることができた。３回のアフィニティー精製工程後、カッパおよびラムダ軽鎖を含有する二重特異性形態に対応する２つのバンドを見ることができた。疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）により、精製Ｋ２Ｏ２５Ｏ３０サブ混合物をさらに分析して、２つの二重特異性抗体形態の相対含有量を決定した。２つの異なるピークの積分により、Ｋ２Ｏ２５Ｏ３０は、６９％のＫ２Ｏ２５および３１％のＫ２Ｏ３０を含有することが明らかになった（図１６Ｂ）。
【０１１３】
実施例７：ｈＭＳＬＮおよびｈＣＤ４７をターゲティングする２つの二重特異性抗体を含有するサブ混合物、ならびに同じ２つの二重特異性抗体の組み合わせの食作用アッセイにおける活性
次いで、実施例３に記載されているＮＣＩ−Ｎ８７細胞を使用したインビトロ食作用アッセイにおいて、実施例６において単離したＫ２Ｏ２５Ｏ３０サブ混合物の活性を、Ｋ２Ｏ２５およびＫ２Ｏ３０の等モル組み合わせと比較した。Ｋ２Ｏ２５Ｏ３０ならびにＫ２Ｏ２５およびＫ２Ｏ３０の等モル組み合わせの活性は同一であったが（図１７）、これは、サブ混合物が、実施例３に記載されている個々の二重特異性抗体の活性と比較して、組み合わせの活性の増加を再現することを示している。
【０１１４】
実施例８：二重特異性抗体組み合わせのインビボ抗腫瘍活性
肝臓がんのＭＳＬＮトランスフェクトＨｅｐＧ２モデルにおいて、２つのＣＤ４７ｘＭＳＬＮ  κλボディ（Ｋ２Ｏ３８およびＫ２Ｏ４１）およびＣＤ４７ｘＭＳＬＮ  κλボディの１つの組み合わせ（Ｋ２Ｏ３８＋Ｋ２Ｏ４１）の抗腫瘍活性を評価した。３×１０６個のＨｅｐＧ２−ＭＳＬＮ細胞をＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに皮下移植した。（以下の式：（長さ×幅２）／２を使用して）腫瘍体積を週２〜３回測定した。腫瘍が１５０〜２００ｍｍ３に達したら、処置を開始した。マウスを８つの群に無作為化した（マウス６〜７匹／群）。この実験では、ＣＤ４７ｘＭＳＬＮ  κλボディの組み合わせの効果を、ＣＤ４７ｘＭＳＬＮ  κλボディのみおよびＭＳＬＮ  Ｍａｂアマツキシマブの効果と比較した。実験の終了（ｄ２８）まで、抗体を週１回静脈内注射した。すべての抗体を６０ｍｇ／ｋｇ／注射で投与した。腫瘍体積測定値を使用して、個々の各マウスの曲線下面積（ＡＵＣ）を計算した。統計分析では、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して、一元配置ＡＮＯＶＡを実施し、続いて、多重比較検定（テューキー多重比較）を実施した。ｐ＜０．０５を統計的に有意であるとみなす。式：％ＴＧＩ＝｛１−［（Ｔｔ−Ｔ０）／（Ｖｔ−Ｖ０）］｝×１００を使用して、腫瘍体積に基づいて、アイソタイプ対照群と比較した腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）率も決定した；Ｔｔ＝時間ｔにおいて処置した腫瘍体積の中央値；Ｔ０＝時間０において処置した腫瘍体積の中央値；Ｖｔ＝時間ｔにおける対照の腫瘍体積の中央値およびＶ０＝時間０における対照の腫瘍体積の中央値。
【０１１５】
図１８に示されているように、２つのＣＤ４７ｘＭＳＬＮ  κλボディによる処置は、ｈＩｇＧ１対照と比較して、腫瘍成長を有意に減少させ、ＴＧＩは、Ｋ２Ｏ４１では２１％であり、Ｋ２Ｏ３８では４６％であった。組み合わせは、単一アプローチと比較して、腫瘍成長に対する優れた効果を示し、ＴＧＩは、Ｋ２Ｏ４１＋Ｋ２Ｏ３８では８０％であった。最後に、単一のＣＤ４７ｘＭＳＬＮ  κλボディおよびそれらの組み合わせは両方とも、現在臨床研究中のアマツキシマブ（ＭＳＬＮを認識する中和ｍＡｂ）と比較して優れた抗腫瘍効果を示した。
他の実施形態
【０１１６】
その詳細な説明と併せて本発明を説明したが、前述の説明は、例示であり、添付の特許請求の範囲の範囲により定義される本発明の範囲を限定するものではない。他の態様、利点および改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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