(57)【要約】  以下の工程：ａ）標識粒子とリガンドを溶液中に含んでなる試料を提供する工程（ここで標識粒子は、該溶液中に溶解又は分散しているか又は固体支持体上に固定されている）；ｂ）標識粒子を蛍光で励起させて、励起粒子の蛍光を所定温度で検出する工程；ｃ）工程（ａ）と工程（ｂ）をリガンドの該溶液中の異なる濃度で複数回繰り返す工程；及びｄ）標識粒子の蛍光のリガンド濃度依存性の変化に基づいて、標識粒子とリガンドの間の相互作用について決定する工程を含んでなる、標識粒子とリガンドの間の相互作用を測定するための方法（ここで標識粒子は、１種以上の色素で標識される）。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程：
ａ）標識粒子とリガンドを溶液中に含んでなる試料を提供する工程（ここで標識粒子は、該溶液中に溶解又は分散しているか又は固体支持体上に固定されている）；
ｂ）標識粒子を蛍光で励起させて、励起粒子の蛍光を所定温度で検出する工程；
ｃ）工程（ａ）と工程（ｂ）をリガンドの該溶液中の異なる濃度で複数回繰り返す工程；及び
ｄ）標識粒子の蛍光のリガンド濃度依存性の変化に基づいて、標識粒子とリガンドの間の相互作用について決定する工程を含んでなる、標識粒子とリガンドの間の相互作用を測定するための方法であって、ここで標識粒子は、一般式（Ｉ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）又は（ＩＩＩ）：
【化１】
2020527696.tif 000029
[式中：
Ｘ１は、Ｏ、Ｓ、又はＣＲ５Ｒ６であり；
Ｘ２は、Ｏ、Ｓ、又はＣＲ７Ｒ８であり；
Ｒ１とＲ２は、それぞれ独立して、水素と置換されてよいアルキル基からなる群より選択され；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８は、それぞれ独立して、ヒドロキシ、カルボキシ、スルホン酸、チオール又はその塩、水素、ハロゲン、置換されてよいカルボン酸エステル基、ニトロ基、アミン、アミド、置換されてよいアルキル基、置換されてよいアルコキシ基、及び置換されてよいアルケニル基からなる群より選択され；
但し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８の少なくとも１つは、それによって色素が粒子へコンジュゲートされるスペーサー基であり（ここで該スペーサー基は、２個のＣＨ２基より長い）；
ａは、０〜４の整数であり；
ｂは、０〜４の整数であり；そして
ｎは、１〜３の整数、好ましくは１又は２である］；
【化２】
2020527696.tif 000030
【化３】
2020527696.tif 000031
［式中：
Ｘ３とＸ４の一方はＮＲ９であって、Ｘ３とＸ４の他方は、Ｏ、Ｓ、又はＣＲ１３Ｒ１４であり；
Ｒ９は、水素と置換されてよいアルキル基からなる群より選択され；
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、及びＲ１４は、それぞれ独立して、ヒドロキシ、カルボキシ、スルホン酸、チオール又はその塩、水素、ハロゲン、置換されてよいカルボン酸エステル基、ニトロ基、アミン、アミド、置換されてよいアルキル基、置換されてよいアルコキシ基、及び置換されてよいアルケニル基からなる群より選択され；
但し、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、及びＲ１４の少なくとも１つは、それによって色素が粒子へコンジュゲートされるスペーサー基であり（ここで該スペーサー基は、２個のＣＨ２基より長い）；
ｃは、０〜４の整数であり；
ｄは、０〜２の整数であり；
ｅは、０〜４の整数であり；そして
ｍは、１〜３の整数、好ましくは１又は２である］；及び
【化４】
2020527696.tif 000032
［式中：
Ｙは、ＯＲ１８又はＮＲ１９Ｒ２０であり；
Ｚは、Ｏ又は＋ＮＲ２１Ｒ２２であり；
Ｒ１５、Ｒ１６、及びＲ１７は、それぞれ独立して、ヒドロキシ、カルボキシ、スルホン酸、チオール又はその塩、水素、ハロゲン、置換されてよいカルボン酸エステル基、ニトロ基、アミン、アミド、置換されてよいアルキル基、置換されてよいアルコキシ基、及び置換されてよいアルケニル基からなる群より選択され；
但し、Ｒ１７の少なくとも１つは、それによって色素が粒子へコンジュゲートされるスペーサー基であり；
Ｒ１８は、Ｈ又はアルカリ金属イオンであり、
Ｒ１９、Ｒ２０、Ｒ２１、及びＲ２２は、それぞれ独立して、水素と置換されてよいアルキル基からなる群より選択され、好ましくは、Ｒ１９、Ｒ２０、Ｒ２１、及びＲ２２は、それぞれ同じであり；
ｆは、０〜３の整数であり；
ｇは、０〜３の整数であり；そして
ｈは、１〜５の整数である］によって表される色素からなる群より選択される１種以上の色素で標識される、前記方法。
【請求項２】
工程（ｂ）が以下の工程：
ｂ１）標識粒子を蛍光で励起させて、励起粒子の蛍光を第一所定温度で検出する工程；
ｂ２）該溶液を第二所定温度まで加熱するか又は冷却する工程；
ｂ３）標識粒子を蛍光で励起させて、励起粒子の蛍光を第二所定温度で検出する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
式（Ｉ）の前記色素が一般式（Ｉ’）：
【化５】
2020527696.tif 000033
[式中：
Ｘ１は、Ｏ又はＣＲ５Ｒ６であり；
Ｘ２は、Ｏ又はＣＲ７Ｒ８であり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８は、それぞれ独立して、置換されてよいＣ１−２０アルキル基であり；
Ｒ３とＲ４は、それぞれ独立して、水素とスルホン酸又はその塩からなる群より選択され；
但し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８の１つは、それによって色素が粒子へコンジュゲートされるスペーサー基であり（ここで該スペーサー基は、２個のＣＨ２基より長い）；そして
ｎは、１又は２に等しい整数である］によって表される色素である、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
式（ＩＩａ）又は（ＩＩｂ）の前記色素が一般式（ＩＩａ’）又は（ＩＩｂ’）：
【化６】
2020527696.tif 000034
【化７】
2020527696.tif 000035
［式中：
Ｘ３とＸ４の一方はＮＲ９であって、Ｘ３とＸ４の他方はＣＲ１３Ｒ１４であり；
スルホネート基は、ＮＲ９に対して４位にあり；
Ｒ９は、置換されてよいＣ１〜Ｃ２０アルキル基であり；
Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、及びＲ１４は、それぞれ独立して、ヒドロキシ、カルボキシ、スルホン酸、チオール又はその塩、水素、ハロゲン、置換されてよいカルボン酸エステル基、ニトロ基、アミン、アミド、置換されてよいアルキル基、置換されてよいアルコキシ基、及び置換されてよいアルケニル基からなる群より選択され；
但し、Ｒ９、Ｒ１３、及びＲ１４の１つは、それによって色素が粒子へコンジュゲートされるスペーサー基であり（ここで該スペーサー基は、２個のＣＨ２基より長い）；
ｄは、０〜２の整数であり；
ｅは、０〜３の整数であり；そして
ｍは、１又は２に等しい整数である］によって表される色素である、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項５】
一般式（Ｉ）、（Ｉ’）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩａ’）、（ＩＩｂ’）の前記色素中のスペーサー基が置換されてよいＣ４〜Ｃ２０アルキレン鎖であり、ここで該アルキレン鎖の１個以上の炭素原子は、独立して、脂環式基、アリール基、複素環式基、ヘテロアリール基、又はＯ、Ｎ、及びＳからなる群より選択されるヘテロ原子に置き換わってよい、請求項１〜請求項４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
式（ＩＩＩ）の前記色素が一般式（ＩＩＩ’）：
【化８】
2020527696.tif 000036
［式中：
Ｙは、ＯＨ又はＮ（ＣＨ３）２であり；
Ｚは、Ｏ又は＋Ｎ（ＣＨ３）２であり；
Ｒ１５とＲ１６は、それぞれ独立して、水素又はハロゲンであり；
Ｒ１７は、それによって色素が粒子へコンジュゲートされるスペーサー基であり；そして
Ｒ１７ａは、カルボキシ基又はその塩である］によって表される色素である、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項７】
一般式（ＩＩＩ）又は（ＩＩＩ’）の前記色素中のスペーサー基が置換されてよいＣ２〜Ｃ１０アルキレン鎖であり、ここで該アルキレン鎖の１個以上の炭素原子は、独立して、脂環式基、アリール基、ヘテロアリール基、複素環式基、又はＯ、Ｎ、及びＳからなる群より選択されるヘテロ原子に置き換わってよい、請求項１、請求項２、又は請求項６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
所定温度が、−２０℃〜１１５℃、好ましくは０．１℃〜１００℃の範囲、より好ましくは５℃〜６０℃の範囲、なおより好ましくは１０℃〜６０℃の範囲、最も好ましくは１０℃〜４０℃の範囲にある、請求項１〜請求項７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
所定温度が室温とは異なる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
所定温度が＋／−１Ｋ以内、好ましくは＋／−０．５Ｋ以内に制御される、請求項１〜請求項９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
加熱するか又は冷却する工程が、加熱又は冷却液、加熱又は冷却ガス、加熱素子（element）、ペルティエ素子、電磁放射、及びこれらの組合せからなる群より選択される加熱又は冷却源を使用して行われる、請求項２〜請求項１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
第一所定温度と第二所定温度が、−２０℃〜１１５℃、好ましくは０．１℃〜１００℃の範囲、より好ましくは５℃〜６０℃の範囲、なおより好ましくは１０℃〜６０℃の範囲、最も好ましくは１０℃〜４０℃の範囲にある、請求項２〜請求項１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
第一所定温度と第二所定温度が＋／−１Ｋ以内、好ましくは＋／−０．５Ｋ以内に制御される、請求項２〜請求項１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
第二所定温度と第一所定温度の間の差が＋／−０．１Ｋ〜＋／−９０Ｋの範囲、好ましくは＋／−１Ｋと＋／−４０Ｋの範囲、より好ましくは＋／−１Ｋ〜＋／−２０Ｋの範囲にある、請求項２〜請求項１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
粒子が、有機分子、生体分子、ナノ粒子、ミクロ粒子、小胞、生体細胞又は細胞内フラグメント、生体組織、ウイルス粒子、ウイルス、及び細胞小器官からなる群より選択される、請求項１〜請求項１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記生体分子が、タンパク質、ペプチド、酵素、核酸、及びこれらの組合せからなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
標識粒子の溶液中の濃度が１０ピコモル濃度〜１マイクロモル濃度、好ましくは１００ピコモル濃度〜１００ナノモル濃度である、請求項１〜請求項１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
リガンドの濃度が、０．０１ピコモル濃度〜１モル濃度、好ましくは１ピコモル濃度〜１００ミリモル濃度、より好ましくは１０ピコモル濃度〜１０ミリモル濃度である、請求項１〜請求項１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記リガンドが、イオン、金属、化合物、薬物フラグメント、炭水化物、低分子、薬物、プロドラッグ、脂質、タンパク質、ペプチド、ペプトイド、酵素、核酸、ナノ粒子、リポソーム、ＳＵＶ、ＧＵＶ、ポリマー、有機分子、無機分子、金属錯体、ホルモン、フレーバー、着臭剤（odorants）、粒子、及び（マイクロ）ビーズからなる群より選択される、請求項１〜請求項１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
粒子とリガンドが、粒子→リガンドとして示される以下の組合せ：酵素→脂質、受容体→ホルモン、受容体→ケモカイン、酵素→阻害剤、受容体→神経伝達物質、受容体→サイトカイン、酵素→イオン、受容体→イオン、受容体→アミノ酸、酵素→補因子、受容体→脂質、受容体→ステロール、酵素→フラグメント、受容体→ペプチド、受容体→フラグメント、酵素→代謝産物、受容体→受容体、受容体→糖脂質、酵素→ＤＮＡ、受容体→着臭剤、受容体→プロドラッグ、酵素→ＲＮＡ、受容体→薬物、酵素→単糖類／二糖類／多糖類、酵素→脂肪酸、酵素→ビタミン、酵素→プロドラッグ、酵素→薬物、リポソーム→タンパク質、輸送タンパク質→基質、抗体→抗原、ウイルス粒子→受容体、ウイルス→構造タンパク質、抗体→Ｆｃ受容体、シャペロン→ＡＴＰ、ｓｓＤＮＡ→ｓｓＤＮＡ、アプタマー→リガンド、シャペロン→イオン、ＲＮＡ→低分子、多糖類→低分子、シャペロン→タンパク質、ＤＮＡ→低分子、構造タンパク質→構造タンパク質、シグナル伝達タンパク質→シグナル伝達タンパク質、シグナル伝達タンパク質→低分子、シグナル伝達タンパク質→プロドラッグ、シグナル伝達タンパク質→薬物、シグナル伝達タンパク質→脂質、構造タンパク質→イオン、ナノ粒子→タンパク質、細胞小器官→タンパク質、ナノ粒子→ＤＮＡ、細胞小器官→脂質、ナノ粒子→ＲＮＡからなる群より選択される、請求項１〜請求項１９のいずれかの方法。
【請求項２１】
標識粒子とリガンドの間の相互作用を測定する方法が粒子とリガンドの解離定数を測定する方法である、請求項１〜請求項２０のいずれかの方法。
【請求項２２】
２種以上の反応色素を含んでなるタンパク質標識化キットであって、ここで各色素は、独立して、請求項１又は請求項３〜請求項７のいずれかに定義されるような一般式（Ｉ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）又は（ＩＩＩ）によって表される構造単位を含み、該色素は、スペーサー基を有し、該スペーサー基は、該色素のタンパク質へのコンジュゲーションを可能にする反応基を有する、前記キット。
【請求項２３】
請求項１〜請求項２１のいずれか１項の方法の少なくとも１つにおけるキットの使用について説明する説明マニュアルをさらに含んでなる、請求項２２のタンパク質標識化キット。
【請求項２４】
緩衝液交換カラム、精製カラム、標識化緩衝液、アダプター、及びこれらの組合せからなる群より選択される少なくとも１つをさらに含んでなる、請求項２２又は請求項２３のタンパク質標識化キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、粒子の分子間及び／又は分子内相互作用、及び／又は粒子の修飾を測定するための改良法に関する。
【背景技術】
【０００２】
溶媒感受性の蛍光色素、即ちメロシアニン色素は、タンパク質への共有結合によって生体内（in vivo）で造影することに適していると報告されてきた。これらの色素は、タンパク質のコンホメーション変化を研究するために使用することができる（Hahn et al. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 4132-4145 中）。
【０００３】
ポリメチン色素は、核酸やタンパク質のような生体高分子とこれら色素との非共有結合性の相互作用を研究するためのスペクトル−蛍光プローブとして有用であると報告されたことがある（Tatikolov, Journal of Photochemistry and Photobiology C: Photochemistry Reviews 2012, 13, 55-90 中)。
【０００４】
さらに、シアニン色素の光物理的特性は、生体分子内の分子環境によって影響を受けるので、それによりこれらの色素は、生物物理学的研究における蛍光プローブとして好適になると報告されたことがある（Levitus et al. Quaterly Reviews of Biophysics 2010, 1-29 中）。
【０００５】
タンパク質誘発性の蛍光増感は、蛍光プローブの近傍にある核酸へタンパク質が結合する場合に生じる蛍光強度の増加について記載するために報告されてきた効果である。特に、ＤＮＡへ共有結合された状態にあるシアニン色素は、あるタンパク質がＤＮＡへ結合する場合に、蛍光強度の増加を経験する（Myong et al. PNAS 2011, 108, 7414-7418 中; Levitus et al. J. Phys. Chem. Lett. 2015, 6, 1819-1823 中）。
【０００６】
メロシアニン色素は、コンホメーション変化やリガンド結合のようなタンパク質の活動を検出して定量するための色素として有用であると報告されてきた。加えて、ＷＯ２００５／０８８３０８Ａ２には、選択された標的へ結合し得るバイオセンサー分子と、標的の生体分子及びタンパク質の活性を検出するための方法が開示されている。
【０００７】
ＷＯ２００８／０６１７０６Ａ１には、粒子の相互作用、特に生体分子とリガンド間の相互作用を熱光学的な特性決定によって測定するための方法が開示されている。この熱光学的な特性決定は、強い温度勾配の創出より生じる熱泳動（thermophoresis）に基づく。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、粒子の分子間及び／又は分子内相互作用、及び／又は粒子の修飾を測定するための改良法に関する。特に、本発明の方法は、感度の向上を提供する。さらに、本発明の方法は、これまでに知られている方法によっては十分な感度で測定し得なかった相互作用の検出を可能にする色素を利用する。さらに、本方法は、加熱法／加熱源に無関係であって、反応容器のジオメトリーにも無関係である（即ち、本実験は、キャピラリーにおいてだけでなく、ウェルプレートにおいても実施可能である）。
【０００９】
本発明の方法では、１種以上の温度感受性色素で標識される標識粒子を利用する。
第一の側面において、本発明は、標識粒子とリガンドの間の相互作用について測定するための方法に関する。第一の側面の方法は、以下の工程を含む：
ａ）標識粒子とリガンドを溶液中に含んでなる試料を提供する工程（ここで標識粒子は、該溶液中に溶解又は分散しているか又は固体支持体上に固定されている）；
ｂ）標識粒子を蛍光で励起させて、励起粒子の蛍光を所定温度で検出する工程；
ｃ）工程（ａ）と工程（ｂ）をリガンドの該溶液中の異なる濃度で複数回繰り返す工程；及び
ｄ）標識粒子の蛍光のリガンド濃度依存性の変化に基づいて、標識粒子とリガンドの間の相互作用について決定する工程。
【００１０】
第二の側面において、本発明は、分子間及び／又は分子内相互作用を測定するための方法に関する。第二の側面の方法は、以下の工程を含む：
ａ）標識粒子を含んでなる試料を提供する工程；
ｂ）標識粒子を蛍光で励起させて、励起粒子の第一蛍光を第一温度で検出する工程；
ｃ）該試料を第二温度まで加熱するか又は冷却する工程；
ｄ）標識粒子を蛍光で励起させて、励起粒子の第二蛍光を第二温度で検出する工程；
ｅ）第一蛍光と第二蛍光に基づいて、該粒子の分子間及び／又は分子内相互作用、及び／又は修飾／改変について特性決定する工程。
【００１１】
第三の側面において、本発明は、時間依存性の変化を測定するための方法に関する。第三の側面の方法は、以下の工程を含む：
ａ）標識粒子を含んでなる試料を提供する工程；
ｂ）標識粒子を蛍光で励起させて、励起粒子の第一蛍光を検出する工程；
ｃ）所定時間の間待つ工程；
ｄ）標識粒子を蛍光で励起させて、励起粒子の第二蛍光を検出する工程；
ｅ）第一蛍光と第二蛍光に基づいて、該粒子の時間依存性の変化について特性決定する工程。
【００１２】
第四の側面において、本発明は、環境依存性の変化を測定するための方法に関する。第四の側面の方法は、以下の工程を含む：
ａ）標識粒子を含んでなる第一試料を提供する工程；
ｂ）標識粒子を蛍光で励起させて、第一試料中の励起粒子の第一蛍光を検出する工程；
ｃ）標識粒子を実質的に同じ濃度で含んでなる第二試料を提供する工程（ここで第二試料は、第一試料とは異なる）；
ｄ）標識粒子を蛍光で励起させて、第二試料中の励起粒子の第二蛍光を検出する工程；
ｅ）第一蛍光と第二蛍光に基づいて、該粒子の環境依存性の変化について特性決定する工程。
【００１３】
第五の側面において、本発明は、２種の反応色素を含んでなるタンパク質標識化キットに関し、ここで該色素は、スペーサー基を有し、該スペーサー基は、該色素のタンパク質へのコンジュゲーションを可能にする反応基を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図面１は、加熱源としてペルティエ（Peltier）デバイス又はＩＲレーザーを使用する、選択したポリメチン色素とキサンテン色素の温度誘発性の蛍光強度変化を示す。
【図２】図面２は、加熱源としてペルティエデバイスを使用する、様々な色素の温度誘発性の蛍光強度変化を示す。
【図３】図面３は、環境（例、ｐＨ）によって調節される、色素モノスルホＣｙ５と色素ＤＹ６４７Ｐ１の温度誘発性の蛍光強度変化を示す。
【図４】図面４は、ペルティエデバイス又はＩＲレーザーを加熱源として使用する、標識粒子のリガンド誘発性の蛍光強度変化によりリガンドＥｃｏＳＳＢのＣｙ５−ｓｓＤＮＡへの結合親和性について決定することを示す。
【図５】図面５は、単一上昇温度での標識粒子のリガンド誘発性の蛍光強度変化によりリガンドＢＬＩＰのモノスルホＣｙ５−ＴＥＭ１への結合親和性について決定することを示す。
【図６】図面６は、標識粒子の３５℃での温度誘発性の蛍光強度変化とリガンド誘発性の蛍光強度変化により、モノスルホＣｙ５（Ａ）又はＤ６４７Ｐ１（Ｂ）で標識した炭酸脱水酵素（ＣＡＩＩ）へのリガンドフロセミドの結合親和性について決定することを示す。
【図７】図面７は、標識粒子の６℃と２３℃でのリガンド誘発性の蛍光強度変化により、リガンド：トラスツズマブ（Trastuzumab）のモノスルホＣｙ５−プロテインＡへの結合親和性について決定することを示す。
【図８】図面８は、標識粒子の３７℃でのリガンド誘発性の蛍光強度変化により、ＤｙＬｉｇｈｔ６５５Ｂ１〜Ｂ４で標識したＩＬ−Ｒ１タンパク質へのリガンド：アナキンラ（Anakinra）の結合親和性について決定することを示す。
【図９】図面９は、標識粒子の３５℃と２３℃の間で冷却時のリガンド誘発性の蛍光強度変化により、Ｃｙ５で標識したｐ３８αタンパク質へのリガンドＰＤ１６９３１６の結合親和性について決定することを示す。
【図１０】図面１０は、標識粒子の加熱時のリガンド誘発性の蛍光強度変化により、Ｃｙ５、Ｚ−Ｃｙ５、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８−ｔｒｉｓＮＴＡ、ＴＡＭＲＡ、又はＴＡＭＲＡ  Ｘで標識したｐ３８αタンパク質へのリガンドＰＤ１６９３１６とＢＩＲＢの結合親和性について決定することを示す。
【図１１】図面１１は、標識粒子の３７℃と４５℃の間で加熱時のリガンド誘発性の蛍光強度変化により、モノスルホＣｙ５又はＤＹ６４７Ｐ１で標識されている、ＴＥＭ１へのリガンドＢＬＩＰの結合親和性と、ｐ３８αタンパク質へのリガンドＢＩＲＢの結合親和性について決定することを示す。
【図１２】図面１２は、標識粒子の３７℃と４５℃の間で加熱時のリガンド誘発性の蛍光強度変化により、モノスルホＣｙ５、ＤＹ６３０、又はＤＹ６３１で標識されている、ＴＥＭ１へのリガンドＢＬＩＰの結合親和性と、ｐ３８αタンパク質へのリガンドＰＤ１６９３１６の結合親和性について決定することを示す。
【図１３】図面１３は、標識粒子の単一の所与温度でのリガンド誘発性の蛍光強度変化が独自の熱光学的プロフィールをもたらすことを示す。
【図１４】図面１４は、標識粒子のリガンド誘発性の蛍光強度変化に対する、色素と粒子間のスペーサー長さの影響を概略的に示す。
【図１５】図面１５は、ペルティエデバイスを使用する、色素モノスルホＣｙ５と色素ＳｅＴａｕ単独の場合と、ｐ３８αタンパク質とＴＥＭ１へコンジュゲートした場合の温度誘発性の蛍光強度変化を示す。
【図１６】図面１６は、ＭＢＫとＴＥＭ１へコンジュゲートしたモノスルホＣｙ５の温度誘発性の蛍光強度変化により熱的アンフォールディング（thermal unfolding）について決定することを示す。
【図１７】図面１７と図面１８は、蛍光の温度に伴う変化についての例示の概略図を結合状態と非結合状態で示す。
【図１８】図面１７と図面１８は、蛍光の温度に伴う変化についての例示の概略図を結合状態と非結合状態で示す。
【図１９ａ】図面１９ａ〜図面１９ｅは、特定の色素の構造を示す。
【図１９ｂ】図面１９ａ〜図面１９ｅは、特定の色素の構造を示す。
【図１９ｃ】図面１９ａ〜図面１９ｅは、特定の色素の構造を示す。
【図１９ｄ】図面１９ａ〜図面１９ｅは、特定の色素の構造を示す。
【図１９ｅ】図面１９ａ〜図面１９ｅは、特定の色素の構造を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、粒子の分子間及び／又は分子内相互作用、及び／又は粒子の修飾を測定するための方法を提供する。本発明の方法は、感度の向上を提供する。さらに、本発明の方法は、これまでに知られている方法によっては十分な感度で検出し得なかった相互作用の検出を可能にする色素を利用する。
【００１６】
本発明によれば、粒子の修飾には、例えば、粒子のグリコシル化、リン酸化、脂質化、カルボニル化、酸化、等が含まれる。
相互作用という用語は、生体分子（例、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヒアルロン酸、等）間の相互作用だけでなく、（修飾された）（ナノ）粒子／（マイクロ）ビーズと生体分子間の相互作用も含む。
【００１７】
特に、本発明の方法は、生体分子のような分子の安定性、又は分子（特に生体分子）の例えばさらなる（生体）分子（特に、修飾された生体分子）、粒子（例、ナノ粒子又はミクロ粒子）、ビーズ（例、マイクロビーズ）との相互作用を測定することを可能にする。また、本発明の手段及び方法を用いて、上記特性のさらなる組合せについて決定し得る。しかしながら、生体分子の測定／特性決定に本発明が限定されないことが注目される。故に、本明細書に開示される手段及び方法によって、他の化合物／粒子の特性について測定及び決定することができる、例えば分子の動的事象及び相互作用についても決定及び／又は測定し得る。従って、化学反応（無機反応又は有機反応のような）についても本発明の方法によって測定し得る。複合体形成及び／又はそれらの解離について決定することも想定される。
【００１８】
この特性決定は、とりわけ、生物物理学的特性（融点又は融解曲線のような）、複合体形成、タンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質又はペプチドのフォールディング／アンフォールディング、分子内相互作用、分子間相互作用の決定、粒子又は分子間の相互作用の決定、等を含む。
【００１９】
従って、本発明で提供される方法を用いて、とりわけ、生物学的、化学的、又は生物物理学的プロセスを測定、検出、及び／又は証明すること、及び／又は試料（生体試料又は医薬品試料のような）について検討、研究、及び／又は証明することが可能である。また、診断検査が実施可能であって、本発明の態様である。とりわけ、タンパク質又は核酸分子（例えば、二本鎖ＤＮＡ又は二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＤＮＡ／ｄｓＲＮＡ）、又はハイブリッド核酸分子（ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドのような）の融解特徴を測定すること、核酸配列について測定及び／又は解析すること（一塩基多型（ＳＮＰ）の検出及び／又は測定のような）、又は核酸分子の安定性をそれらの長さに対応して、そしてその関数として測定すること；ＰＣＲ最終産物について測定及び／又は証明すること（例えば、一般的な医療診断において、また極体診断、移植前診断、法医学的分析において）が想定されて実施可能である。従って、本発明において提供される手段及び方法が、特に、そして非限定的に、所与の粒子／分子の他の分子／粒子への親和性が関心対象となる測定及び／又は証明において有用であることが当業者には明らかである。例えば、本発明で提供される方法並びにデバイスは、核酸分子及びタンパク質の温度安定性並びに融点の検出及び測定に有用である。故に、例えば、（ＤＮＡ）プライマー及び（ＤＮＡ又はＲＮＡ）プローブについてそれらの合成の後又は間に測定及び／又は証明することは、本発明の範囲内にある。鋳型上の核酸分子（ＤＮＡチップのような）の測定についても想定される。本発明の文脈における「融解」という用語は、核酸（例、ＲＮＡ、ＤＮＡ）又はタンパク質のような生体分子の熱変性を意味する。
【００２０】
本発明の文脈においてまた想定されるのは、例えば、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）の形態又は制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）の形態、等の核酸分子における突然変異及び遺伝的変異の測定、検出、及び／又は証明である。本発明はまた、ヘテロ二本鎖について解析する可能性を提供する。ヘテロ二本鎖は、例えば、野生型及び突然変異体のＤＮＡ分子の混合物の熱変性とリアニーリングによって産生される。特に、ＤＮＡ分子へ結合するタンパク質の前者の安定性に対する効果について測定することも可能である。さらに、タンパク質の熱安定性とその熱変性に対する分子（例、低分子、薬物、薬物候補）の効果について測定することが可能である。
【００２１】
本発明の範囲内には、例えば、タンパク質−タンパク質相互作用（タンパク様構造、又はタンパク質、又はそれらのフラグメントの複合体形成のような）の測定もある。そのような測定は、限定されないが、抗体−抗原結合反応の測定を（単鎖抗体、抗体フラグメント、クロモボディ、等の形態においても）含む。また、本発明の態様は、解離事象（例えば、タンパク質複合体の解離のような）の検出及び／又は測定にも関する。故に、本発明は、解離事象の測定、決定、及び／又は証明においても（タンパク質様複合体（例、抗体−抗原複合体、等）の解離の測定におけるように）有用である。
【００２２】
本発明は、ショートＤＮＡの検出にも、二本鎖又は一本鎖の核酸分子の決定にも限定されない。粒子／分子、例えば、タンパク質、核酸（例、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ）、ナノ粒子、ビーズ、特にマイクロビーズ、脂質、リポソーム、小胞、細胞、バイオポリマー（ヒアルロン酸、アルギン酸塩、等）、二次元脂質シート、無機物質（例、カーボンナノチューブ、バッキーボール、等）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の間の相互作用、それらのコンホメーション、流体力学的半径、結合速度論、及び安定性についても測定し得る。
【００２３】
第一の側面において、本発明は、標識粒子とリガンドの間の相互作用を測定するための方法に関する。この方法において、標識粒子のリガンドとの相互作用は、リガンドの濃度に依存して測定することができる。
【００２４】
本発明の第一の側面の方法は、以下の工程を含む：
ａ）標識粒子とリガンドを溶液中に含んでなる試料を提供する工程（ここで標識粒子は、該溶液中に溶解又は分散しているか又は固体支持体上に固定されている）；
ｂ）標識粒子を蛍光で励起させて、励起粒子の蛍光を所定温度で検出する工程；
ｃ）工程（ａ）と工程（ｂ）をリガンドの該溶液中の異なる濃度で複数回繰り返す工程；及び
ｄ）標識粒子の蛍光のリガンド濃度依存性の変化に基づいて、標識粒子とリガンドの間の相互作用について決定する工程。
【００２５】
好ましくは、標識粒子とリガンドは、工程ａ）において、溶液中の所定濃度で提供されるか又は、標識粒子が固体支持体上に固定されている場合、標識粒子は、所定量で提供されて、リガンドは、所定濃度で提供される。このことは、標識粒子とリガンドの量がそれぞれの蛍光測定において予め決定されていて、工程ａ）と工程ｂ）の間で、例えば洗浄工程によって変化しないことを意味する。さらに、工程ａ）において提供される溶液は、工程ｂ）において、標識粒子を蛍光で励起させて、励起粒子の蛍光を所定温度で検出するために使用される。
【００２６】
本発明の第一の側面の方法を使用して、標識粒子の蛍光のリガンド濃度依存性の変化を示す結合曲線を入手することができる。この結合曲線（「熱光学的プロフィール」とも言及される）より、粒子とリガンドの解離定数を決定することができる。従って、本発明の特に好ましい態様において、標識粒子とリガンドの間の相互作用について測定する方法は、粒子−リガンド結合の解離定数のような、粒子とリガンドの解離定数を測定する方法である。
【００２７】
好ましくは、本発明の第一の側面の方法によって、生体分子／リガンド、タンパク質／リガンド、タンパク質／タンパク質、又は受容体／リガンドの間の相互作用について決定することができる。
【００２８】
本発明の第一の側面の好ましい態様では、工程（ｂ）が以下の工程を含む：
ｂａ）該溶液を所定温度まで加熱するか又は冷却する工程；
ｂｂ）標識粒子を蛍光で励起させて、励起粒子の蛍光を所定温度で検出する工程。
【００２９】
追加の加熱又は冷却工程は、所定温度の特定の調節に有利である。１／１０００の蛍光の相対的差異について測定するためには、ペルティエ素子又はＩＲレーザーのような加熱又は冷却素子を使用して所定温度を制御することが好ましい。経時的な温度ドリフトを回避して、温度変動が＋／−１Ｋより小さい、好ましくは＋／−０．５Ｋより小さいように所定温度を制御することが有利である。
【００３０】
従って、好ましい態様において、本発明の第一の側面の方法は、以下の工程を含む：
ａ）標識粒子とリガンドを溶液中に含んでなる試料を提供する工程（ここで標識粒子は、該溶液中に溶解又は分散しているか又は固体支持体上に固定されている）；
ｂａ）該溶液を所定温度まで加熱するか又は冷却する工程；
ｂｂ）標識粒子を蛍光で励起させて、励起粒子の蛍光を所定温度で検出する工程；
ｃ）工程（ａ）と工程（ｂ）をリガンドの該溶液中の異なる濃度で複数回繰り返す工程；及び
ｄ）標識粒子の蛍光のリガンド濃度依存性の変化に基づいて、標識粒子とリガンドの間の相互作用について決定する工程。
【００３１】
理論に縛られることを望むものではないが、リガンドがその標識粒子（即ち、色素がコンジュゲートした粒子）へ結合する場合の標識粒子の蛍光の変化は、以下の理論的原理に基づく：
熱光学的測定の最重要変数の１つは、以下のように定義される結合振幅（binding amplitude）：ΔＦｎｏｒｍである：
【式１】
【００３２】
2020527696.tif 000002
【００３３】
［ここで、Ｆは、温度Ｔで測定される蛍光値である。出発温度Ｔｓｔａｒｔと異なる最終温度Ｔｅｎｄで蛍光値を比較する。この２つの蛍光値の比率より、正規化蛍光Ｆｎｏｒｍを得る。ΔＦｎｏｒｍの値、即ち結合状態のＦｎｏｒｍ値と非結合状態のＦｎｏｒｍ値の間の差は、信号対雑音比が最適である最適の測定結果を達成するために、可能な限り大きくあるべきである。図面１７は、蛍光の温度に伴う変化についての例示の概略図を結合状態と非結合状態で示す。使用される蛍光値は、適宜示されている。この曲線の実際の経過は、広く変動する可能性がある。さらに、該溶液が冷却される、即ちＴｓｔａｒｔとＴｅｎｄがそれによって交換されるようなやり方でこの測定を行うことも十分考えられる。
【００３４】
一般に、ΔＦｎｏｒｍは、ＴｓｔａｒｔとＴｅｎｄの間の温度差が増加するにつれて高くなる。しかしながら、ΔＦｎｏｒｍは、標識分子と用量増減（titrated）リガンドだけでなく、使用される発蛍光団（fluorophore）にもいつでも依存する。
【式２】
【００３５】
2020527696.tif 000003
【００３６】
多くの相互作用において、
【式３】
【００３７】
2020527696.tif 000004
【００３８】
の式は、用量増減リガンドの濃度に対する依存性をすでに示す。言い換えると、温度変化の無いＴｓｔａｒｔ（即ち、所定温度）の場合には、絶対蛍光値のリガンド依存性をすでに見ることができる。しかしながら、結合状態と非結合状態の間での蛍光の相対的な変化：
【式４】
【００３９】
2020527696.tif 000005
【００４０】
は、ほとんどの場合、ごく小さい（数パーセントの範囲）。試料の産生の間には、液体処理方法がマニュアルでも自動化でも、数パーセントの標的濃度（そしてひいては絶対蛍光値）の偶発偏差が生じて、それによって絶対蛍光値のＴｓｔａｒｔでのリガンド依存性が隠れてしまう（即ち、好ましくない信号対雑音比）。故に、蛍光は、２種の異なる温度で測定して、（異なる温度で測定される）２つの数値の比率（quotient）を計算することが好ましく、それによって液体処理誤差を補正することができる。
【００４１】
しかしながら、リガンドの関数としての温度変化に伴う蛍光の相対的な変化、即ち、相対的な結合振幅Ａｒ：
【式５】
【００４２】
2020527696.tif 000006
【００４３】
も、しばしば小さくて、やはり数パーセントの範囲にあって、ΔＴに依存する。相対値について考慮するのでピペット操作誤差は関係ないが、未知の温度ＴＸより低いすべての温度では、Ａｒが約１である（図面１８）。
【００４４】
ＴＸより高い温度の場合のみ、Ａｒが１から逸脱し始めて、この場合においてのみ結合を高い精度で測定することができる。この測定結果は、Ａｒがより大きくなるか又はより小さくなるにつれて、即ちＡｒが１より大きく逸脱するにつれて、より良好になる。
【００４５】
要約すると、このことは、ピペット操作誤差をなくすためには、蛍光を１つより多くの温度で測定すべきであることを意味する。一方、Ａｒが測定の開始時に１より逸脱する温度ＴＸは、使用される発蛍光団、標識される標的分子、及び用量増減されるリガンドに依存する。このことは、ＴＸを決定するには、広い温度範囲を走査すべきであることを意味する。温度Ｔｅｎｄは、理想的には、ＴＸより高い。Ａｒが１より異なる量に依存して、十分な信号対騒音比を達成するために、いくつかの事例では、より大きなΔＴも好ましい。しかしながら、大きなΔＴ値では、結合の熱力学的平衡がＴｓｔａｒｔでの熱力学的平衡より大きく異なる可能性があるので、小さなΔＴ値が好ましい。
【００４６】
図面１８は、蛍光の温度に伴う変化についての例示の概略図を結合状態と非結合状態で示す。上記に言及したさらなる条件及び数値を明記している。この図面より、Ｔｓｔａｒｔ＞ＴＸである場合にのみ、Ｔｓｔａｒｔが大きくなるにつれてΔＦｓｔａｒｔが大きくなることも明らかである。この図示された蛍光変化は、必ずしも線形である必要はなくて、指数関数的減衰もあり得る。図面１８では、簡素化のために線形関数を示している。
【００４７】
注目すべきことに、本発明の方法は、強い空間的温度勾配の創出より生じる熱泳動に基づく熱光学的な特性決定に依存しない。
従って、本発明の第一の側面のより好ましい態様では、工程（ｂ）が以下の工程を含む：
ｂ１）標識粒子を蛍光で励起させて、励起粒子の蛍光を第一所定温度で検出する工程；
ｂ２）該溶液を第二所定温度まで加熱するか又は冷却する工程；
ｂ３）標識粒子を蛍光で励起させて、励起粒子の蛍光を第二所定温度で検出する工程。
【００４８】
この好ましい態様において、標識粒子の蛍光は、２つの異なる温度で濃度が変動するリガンドの存在下で決定される。上記に説明したように、この手順によりピペット操作誤差をなくすことが可能になる。
【００４９】
この好ましい態様において、標識粒子とリガンドの間の相互作用は、第二所定温度での蛍光Ｆ２を第一所定温度での蛍光Ｆ１で割った比（即ち、Ｆ２／Ｆ１）のリガンド濃度依存性の変化に基づいて決定することができる。
【００５０】
本発明の第一の側面において、所定温度とは、リガンドが標識粒子へ結合するときの温度である。言い換えると、所定温度とは、蛍光励起においてコンホメーション変化を受ける色素の一部がリガンドの標識粒子への結合により変化するときの温度である。さらに、所定温度とは、色素の光異性化率又は内部転換率がリガンドの標識粒子への結合により変化するときの温度である。
【００５１】
本発明の文脈において、リガンドの標識粒子への「結合」という用語は、共有結合か又は、イオン結合、水素結合、及びファン・デル・ワールス力のような分子間力による結合を意味する。
【００５２】
以下において「所定温度」への言及がなされる場合、同じことは、本発明の第一の側面のより好ましい態様における第一所定温度と第二所定温度にも適用される。
所定温度は、各粒子の性質に依拠して選択することが有利である。この点において、所定温度は、好ましくは、粒子が溶解する、アンフォールドする、及び／又は改変するときの温度未満であるべきである。粒子がタンパク質である場合を例とすると、所定温度は、好ましくは、タンパク質の熱変性の開始温度未満であるように調整してよい。開始温度は、とりわけＷＯ２０１７／０５５５８３Ａ１に記載されているような熱安定性測定を実施することによって決定することができる。
【００５３】
本発明の第一の側面における所定温度は、好ましくは、−２０℃〜１１５℃、好ましくは０．１℃〜１００℃の範囲、より好ましくは１０℃〜６０℃の範囲、最も好ましくは１０℃〜４０℃の範囲にある。安定した所定温度をもたらすこと、即ち、所定温度を狭い範囲内に、好ましくは＋／−１Ｋ以内に、より好ましくは＋／−０．５Ｋ以内に制御することが好ましい。
【００５４】
典型的には、室温は、たとえ例えば空気調節によって活発に制御したとしても、＋／−１Ｋより多く変動するものである。故に、所定温度が室温であれば、安定した所定温度を達成するために、所定温度のさらなる制御が必要となる。より好ましくは、所定温度は、室温とは異なる。室温は、２０℃〜２５℃の間の温度、好ましくは２５℃を意味する。
【００５５】
同様に、本発明の第一の側面のより好ましい態様において、加熱又は冷却工程における第一及び第二所定温度は、好ましくは−２０℃〜１１５℃、好ましくは０．１℃〜１００℃の範囲、より好ましくは５℃〜６０℃の範囲、なおより好ましくは１０℃〜６０℃の範囲、最も好ましくは１０℃〜４０℃の範囲にある。第一所定温度は、好ましくは−２０℃〜１１５℃、好ましくは０．１℃〜１００℃の範囲、より好ましくは５℃〜６０℃の範囲、なおより好ましくは１０℃〜６０℃の範囲、最も好ましくは１０℃〜４０℃の範囲にある。第二所定温度は、好ましくは−２０℃〜１１５℃、好ましくは０．１℃〜１００℃の範囲、より好ましくは５℃〜６０℃の範囲、なおより好ましくは１０℃〜６０℃の範囲、最も好ましくは１０℃〜４０℃の範囲にある。加熱工程の場合、第一所定温度は、第二所定温度が上記に記載したその上限を超えないように、十分低く選択されると理解される。同様に、冷却工程の場合、第一所定温度は、第二所定温度が上記に記載したその下限を超えないように、十分高く選択されると理解される。上記に記載したように、ここでも、第一所定温度と第二所定温度は、温度変動を好ましくは＋／−１Ｋより小さいように安定的に制御することが有利である。
【００５６】
第一所定温度と第二所定温度の間の差は、通常、＋／−０．１Ｋ〜＋／−９０Ｋの範囲にある。このことは、この温度差の絶対値：｜Ｔ２ｎｄ−Ｔ１ｓｔ｜が０．１Ｋと９０Ｋの間にある、即ち、温度差は、正（加熱）又は負（冷却）であり得ることを意味する。好ましくは、温度差は、＋／−１Ｋと＋／−４０Ｋの範囲、より好ましくは＋／−１Ｋ〜＋／−２０Ｋの範囲にある。このシステムは、温度の変化によってごくわずかしか混乱しないので、低い温度差が有利である。当業者には、試料全体を冷却することによって、温度感受性の材料に対して損害を与えることなく、より高い温度上昇の振幅（即ち、レーザー加熱による）が可能であることが分かっている。
【００５７】
本発明の第一の側面の好ましい態様の方法において、加熱するか又は冷却する工程は、加熱又は冷却の液体又はガス、加熱素子（例えば、発熱素子、又は金属加熱素子、セラミック加熱素子、ポリマーＰＴＣ加熱素子、複合加熱素子、半導体加熱素子のような、ジュール加熱に基づく他の素子）、又は熱電素子（例えば、ペルティエ素子）、又は電磁放射（ＬＥＤ、例、ＩＲ−ＬＥＤ、又はレーザー、例、ＩＲ−レーザー、又はマイクロ波）からなる群より選択される加熱源又は冷却源を使用して行うことができる。
【００５８】
ペルティエ素子が好ましくは使用されるのは、試料を加熱する、及び／又は試料を冷却する（例えば、試料を環境温度未満に冷却する）ためにそれを使用し得るからである。特に、ペルティエ素子を通して電流の向きを逆転させることによって、加熱から冷却へ変換することが可能である。ペルティエ素子は、加熱するだけでなく室温以下へ能動的に冷却することができる数少ない素子の１つである。
【００５９】
レーザー、好ましくはその電磁放射が試料によって直接吸収されるレーザーが好ましくは使用されるのは、試料中の温度を試料への機械的接触無しに迅速かつ直接的に変化させることができるからである。
【００６０】
レーザー放射は、試料によって直接吸収されて熱へ変換され、例えば、波長：９８０ｎｍ＋／−３０ｎｍ、１４８０ｎｍ＋／−３０ｎｍ、１５５０ｎｍ＋／−３０ｎｍ、１９４０ｎｍ＋／−３０ｎｍのＩＲレーザー光線は、水によって非常によく吸収されて、ごく迅速に熱を上げる。この加熱法には接触が無い、即ち、速やかで汚染のリスクが無い。試料チャンバは、レーザー光線に対して透明でなければならないが、加熱素子による接触加熱とは対照的に、良好な熱伝導性を必要としない。
【００６１】
温度誘発性の蛍光強度変化は、色素の物理化学的特性にのみ依存する（図面１）。温度誘発性の蛍光強度変化の度合いは、色素の物理化学的特性にのみ依存するので、それは、使用される加熱源に無関係である。従って、規定される定時ＩＲ−レーザーでの色素の蛍光強度に基づいて、プローブの温度を推定することができる。
【００６２】
レーザーを用いれば、ナノリットル量の範囲でも加熱されて、その蛍光が蛍光顕微鏡（optics）によって測定される（検出量は、しばしば、１００μｍｘ１００μｍｘ１００μｍ＝１ｎｌ量にすぎない）。より多くの量を加熱する必要がなく、その量では蛍光顕微鏡によって蛍光を検出し得ないことが多い。
【００６３】
本発明の第一の側面の好ましい態様では、工程（ｂ２）と工程（ｂ３）を連続的又は同時的に行うことができる。
本発明の第一の側面によれば、粒子には、生体分子、ナノ粒子、ミクロ粒子、及び小胞が含まれる。粒子には、生体細胞（例、細菌細胞又は真核細胞）又は細胞内フラグメント、ウイルス粒子又はウイルス、及び細胞小器官、等も含まれる。ナノ粒子には、ナノディスクも含まれる。ナノディスクは、疎水性の先端が２つの両親媒性タンパク質によって仕切られたリン脂質の脂質二重層から構成される、合成モデル膜システムである。
【００６４】
生体分子は、好ましくは、アミノ酸、タンパク質、ペプチド、単糖類及び二糖類、多糖類、脂質、糖脂質、脂肪酸、ステロール、ビタミン、神経伝達物質、酵素、ヌクレオチド、代謝産物、核酸、及びこれらの組合せからなる群より選択される。より好ましくは、生体分子は、タンパク質、ペプチド、酵素、核酸、及びこれらの組合せからなる群より選択される。
【００６５】
好ましくは、（標識粒子中の）粒子は、生体分子であり、最も好ましくは、タンパク質又は核酸である。
タンパク質は、酵素（例、炭酸脱水酵素、βラクタマーゼＴＥＭ１、又はＭＥＫ１及びｐ３８のようなキナーゼ）、輸送タンパク質（例、ＭＢＰ）、阻害タンパク質（例、βラクタマーゼ阻害タンパク質ＢＬＩＰ、アナキンラ）、構造タンパク質、シグナル伝達タンパク質、リガンド結合タンパク質、シャペロン（例、熱ショックタンパク質、ＨＳＰ９０）、抗体（例、トラスツズマブ）、及び受容体（例、インターロイキン１受容体）からなる群より選択される。
【００６６】
核酸には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、及びＰＮＡが含まれる。アクセス不能（inaccessible）ＲＮＡと呼ばれることが多いロックト（locked）核酸（ＬＮＡ）は、修飾ＲＮＡヌクレオチドである。ＬＮＡヌクレオチドのリボース部分は、２’酸素と４’炭素を連結する余剰の架橋で修飾されている。ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、ＤＮＡ又はＲＮＡに類似した人工合成ポリマーである。ＤＮＡとＲＮＡがデオキシリボースとリボースの糖骨格をそれぞれ有するのに対し、ＰＮＡの骨格は、ペプチド結合によって連結される反復性のＮ−（２−アミノエチル）−グリシン単位のようなペプチドから構成される。この骨格には、様々なプリン塩基とピリミジン塩基がメチレン架橋（−ＣＨ２−）とカルボニル基（−（Ｃ＝Ｏ）−）によって連結する。
【００６７】
本発明の文脈において、ナノ粒子は、１００ｎｍ未満の平均サイズを有する粒子である。「平均サイズ」という用語は、例えば、Brookhaven Instruments の 90Plus 又は Malvern Zetasizer Z90 粒径測定機器を使用する動的光散乱法によって測定されるような平均有効径について記載する。好ましくは、粒径は、１ｎｍ〜１００ｎｍ、好ましくは１〜７０ｎｍの範囲にある。ナノ粒子は、有機粒子でも無機粒子でもよい。ナノ粒子はまた、有機分子がその表面に付着した無機コアのような、複合粒子としても存在し得る。
【００６８】
ミクロ粒子は、１ｍｍ未満、しかし通常は１００ｎｍ以上の最長寸法を有する微視的粒子である。ミクロ粒子の特性決定をするには、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）、及び準弾性光散乱法（ＱＥＬＳ）を利用するサイズ測定法を使用してよい。ミクロ粒子は、マイクロビーズの形態でも存在し得る。
【００６９】
ミクロ粒子は、例えば、コート化又は未コート化のシリカ／ガラス／生分解性粒子、ポリスチレン／コート化／フローサイトメトリー／ＰＭＭＡ／メラミン／ＮＩＳＴ粒子、アガロース粒子、磁性粒子、コート化又は未コート化の金粒子又は銀粒子又は他の金属粒子、遷移金属粒子、生体材料、半導体、有機及び無機粒子、蛍光ポリスチレンマイクロスフェア、非蛍光ポリスチレンマイクロスフェア、複合材料、リポソーム、細胞、等であり得る。
【００７０】
市販のミクロ粒子は、セラミクス、ガラス、ポリマー、及び金属が含まれる多種多様な材料において利用可能である。日常生活で遭遇するミクロ粒子には、花粉、砂、埃、小麦粉、及び粉砂糖が含まれる。生体系において、ミクロ粒子は、血小板や内皮細胞のような、血流と接触状態にある細胞に由来して血中を循環する、膜結合性の小胞である。
【００７１】
マイクロビーズは、好ましくは、その最大寸法が５ミリメートル未満である固体プラスチック製粒子である。マイクロビーズはまた、典型的には直径０．５〜５００マイクロメートルの均質なポリマー粒子であってよい。
【００７２】
「修飾粒子」又は「修飾ビーズ」という用語は、特に、分子、好ましくは生体分子を含むか又はそれへ連結したビーズ又は粒子に関する。これは、そのようなビーズ又は粒子のこれら（生体）分子でのコーティングも含む。
【００７３】
本発明による粒子又はビーズは、例えば、生体分子（例、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はタンパク質）が粒子又はビーズへ結合し得る（いくつかの態様では、特異的に、及び／又は共有結合的に）ようなやり方で修飾され得る。故に、本発明の範囲内には、ビーズ及び／又は粒子、そしてそのようなビーズ又は粒子へ付着又は連結した分子の特性についての分析がある。特に、そのような分子は、生体分子である。従って、「修飾（マイクロ）ビーズ／（ナノ又はマイクロ）粒子」という用語は、特に、分析されるか又は特性決定される追加の分子を含むビーズ又は粒子に関する。修飾又は非修飾ミクロ粒子／（ナノ又はマイクロ）粒子は、溶液中の生体分子（例、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はタンパク質）のような他の粒子／分子と相互作用することが可能であり得る。
【００７４】
本発明の方法では、１種以上の温度感受性色素で標識された標識粒子を利用する。本発明の文脈において、「標識粒子」は、蛍光手段によって検出することが可能である、蛍光標識された分子／粒子又は他の分子／粒子、例えば、固有の発蛍光団を含んでなる分子／粒子、又は発蛍光団が付着した粒子／分子を意味する。特に、標識粒子は、好ましくは、例えば、色素へ付着した、例えば色素へ共有結合した粒子、又はポリヒスチジンタグ、ＦＬＡＧ−タグ、又は類似物のような高親和性タンパク質タグにより色素へ可逆的に結合した粒子である。
【００７５】
タンパク質タグとは、組換えタンパク質上へ遺伝子工学に移植されるペプチド配列である。これらには、ポリ（Ｈｉｓ）タグ、ＦＬＡＧ−タグのようなポリアニオンアミノ酸、Ｖ５−タグ、Ｍｙｃ−タグ、ＨＡ−タグ、及びＮＥ−タグのようなエピトープタグ、特異的な酵素的修飾（ビオチンリガーゼによるビオチニル化のような）又は化学的修飾（蛍光造影のためのＦｌＡｓＨ−ＥＤＴ２との反応のような）を可能にし得るタグが含まれる。
【００７６】
本発明に有用な色素は、温度依存性の蛍光強度を示す（即ち、温度が冷却又は加熱によって変化するときに色素の蛍光強度が増加するか又は減少する）色素である。この現象は、温度関連性の蛍光強度変化と呼ばれる。本発明の文脈では、この挙動を示す色素を「温度感受性色素」と呼ぶ。好ましくは、本発明において使用される色素は、蛍光強度における温度誘発性の変化だけでなく、粒子、即ち標識粒子へ結合するときに、その蛍光強度の温度依存性において、リガンド結合誘発性の変化も示す。
【００７７】
本発明者は、生体分子のような粒子へ結合している色素の温度依存性を使用して、リガンドと生体分子の間の相互作用パラメータを決定することができることを見出した。
理論に縛られることを望むものではないが、今回の知見は、以下の理論的原理に基づくと考えられる：
Ｃｙ５のようなシアニン色素のトランス（trans）型が蛍光性であるのに対し、シス（cis）型は非蛍光性である。シアニン色素のトランス型が蛍光性であるのは、下記に図示されるような非局在化電子によって引き起こされる共鳴又はメソメリズム（mesomerism）による：
【００７８】
【化１】
2020527696.tif 000007
【００７９】
ポリメチン色素の蛍光量子収率は、プローブが位置する分子環境に強く依存し、そのことがシス−トランス光異性化の効率を決定する。異性化が大きな分子運動を伴う活性化プロセスであるので、蛍光寿命は、温度と溶媒粘度に強く依存する。蛍光の効率は、結合の回転が立体的に妨害されているときに、生体分子のような粒子へ色素が結合しているときに観測されるように、有意に増加する。タンパク質の上又は内部に結合した色素分子は、励起状態のＣ＝Ｃ回転から立体的に妨害されるので、シス異性体へ変換する可能性がより低い。より高い温度では、タンパク質へ結合した色素の振動自由度の増加によって、「暗い」シス状態への変換率が高くなり、それが測定蛍光の減少をもたらす。実施例において示す実験によって実証されるように、生体分子のリガンド誘発性コンホメーション変化は、色素の蛍光強度を調節する（これは、タンパク質へ結合した色素の振動自由度の変化の結果である）。この理由の故に、単一温度での結合親和性の測定が可能なのである。色素の温度依存性だけを使用してリガンドと生体分子間の相互作用パラメータを決定するアプローチは、これまで報告されていない。
【００８０】
光異性体は、生成されるとすぐに熱戻り異性化反応を受けて、熱力学的に安定な全トランス異性体を生じる。他の２つのプロセスに関する光異性化の相対効率は、温度、溶媒粘度、及び立体障害を創出する可能性がある置換基の存在に依存する。重要にも、温度が低いほど、低い異性化率と高い蛍光収率をもたらす。
【００８１】
色素の温度依存性、即ち、蛍光強度の変化を伴う、温度変化に応じて反応する色素の固有特性は、色素の化学構造にのみ依存する。蛍光分子の温度依存性は、その置換基の振動自由度によって影響される。限定されないが、ＡＴＴＯ６４７Ｎ、ＡＴＴＯ６５５、及びＣＦ６４０Ｒのような、強く硬直化した構造を有する色素は、温度上昇に対して、無視し得る蛍光強度の変化で応じる（図面２）。従って、これらの色素は、本発明の目的に適していない。さほど硬直でない構造を有する色素（限定されないが、フルオレセイン、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８、ＤＹ４９５、ローダミン、ＴＡＭＲＡ、ＩＲ６４０のような）は、温度上昇時に蛍光強度の有意な増加を示す。最も感受性が高い色素は、ポリメチン色素のファミリー（限定されないが、Ｃｙ３、モノスルホＣｙ３、ＤＹ５６７、Ｃｙ５、モノスルホＣｙ５、ＤＹ６３０、ＤＹ６４７Ｐ１、ＤＹ６５０、Ａｌｅｘａ  ６４７、及びＤｙＬｉｇｈｔ  ６５５  Ｂ１−Ｂ４のような）に属する。これら色素の蛍光は、強く温度依存的である（図面２）。
【００８２】
色素の温度依存性は、粒子（生体分子）へのコンジュゲーションによって調節され、独自の熱光学的プロフィールをもたらす（図面１５）。温度誘発性の蛍光強度変化は、ポリメチン色素の代表としてのモノスルホＣｙ５について示すように、生体分子の存在下で強く抑制されて、それは、色素へコンジュゲートする生体分子の特性に有意に依存する（図面１５Ａ）。ＳｅＴａｕのようなスクアラインロタキサン類の蛍光強度は、温度変化に対してずっと低感受性である。ＳｅＴａｕの生体分子へのコンジュゲーション時に、温度に対する感受性は、有意には変化しない（図面１５Ｂ）。
【００８３】
中等度〜強度の温度依存性がある色素（限定されないが、キサンテン色素（例、フルオレセイン、ローダミン、ＴＡＭＲＡ、及びＤＹ４９５）とポリメチン色素（例、Ｃｙ３、モノスルホＣｙ３、ＤＹ５４７、Ｃｙ５、モノスルホＣｙ５、ＤＹ６３０、ＤＹ６３１、及びＤＹ６４７Ｐ１）のような）は、熱光学的研究に十分適している。それらの温度依存性は、生体分子へのコンジュゲーションによって有意に影響される。
【００８４】
有意な温度依存性を有する色素（限定されないが、ＤｙＬｉｇｈｔ  ６５５  Ｂ３、ＩＲ６５０のような）は、それらの温度感受性が生体分子へのコンジュゲーションによって影響されないので、熱光学的研究に適さないかもしれない。
【００８５】
従って、温度誘発性の蛍光強度変化をもたらす色素の温度依存性は、熱光学的研究に最適の色素にとって必要条件であるが、十分条件ではない。色素と生体分子間の相互作用こそが色素の熱光学的プロフィールの有効性と感度を独自に決定するのである（図面５と図面１３）。色素の温度依存性だけを使用してリガンドと生体分子の間の相互作用パラメータを決定する今回のアプローチについては、これまで記載されていない。
【００８６】
本発明において使用し得る色素は、遊離形態では、好ましくは＞０．３％／Ｋ、より好ましくは＞０．５％、そして最も好ましくは＞１％／Ｋである温度依存性を明示すべきである。
【００８７】
色素の温度依存性は、標識粒子へのコンジュゲーションによって調節されなければならない。色素は、コンジュゲートした形態において、好ましくは＞０．３％／Ｋ、より好ましくは＞０．５％／Ｋ、そして最も好ましくは＞１％／Ｋである温度依存性を明示すべきである。
【００８８】
色素は、好ましくは、標識化時に標識粒子の凝集を引き起こす傾向をほとんど有さないべきである。
スルホネート基又は類似基の色素中への取込みは、標識生体分子の凝集の抑制をもたらすが、色素の最適な熱光学的プロフィールのためには、生体分子とのコンジュゲーション時の色素の低い正味荷電（好ましくは、≧−２）が好ましい。
【００８９】
リガンド⇔標識粒子の相互作用又は生体分子の熱的アンフォールディングの熱光学的測定に最適の色素は、ポリメチン色素（共役二重結合のあるメチン基（＝ＣＨ−）から構成される鎖を含有する有機化合物として定義される）の成員、好ましくは、限定されないが、対称性及び非対称性のシアニン色素、即ち、一般式：Ｒ２Ｎ［ＣＨ＝ＣＨ］ｎＣＨ＝Ｎ＋Ｒ２⇔Ｒ２Ｎ＋＝ＣＨ［ＣＨ＝ＣＨ］ｎＮＲ２（ここでｎは、小さな数である）の合成色素であって、ここでは通常、窒素と場合によっては共役鎖の一部が、限定されないが、イミダゾール、ピリジン、ピロール、キノリン、及びチアゾールのような複素環式系の一部となる。
【００９０】
リガンド⇔標識粒子の相互作用又は生体分子の熱的アンフォールディングの熱光学的測定に最適の色素は、キサンテン色素の成員（即ち、限定されないがフルオレセインとローダミンベースの色素が含まれる、キサンテンの誘導体である有機化合物であって、その置換基の回転が自由なことを特徴とする）であってもよい。
【００９１】
熱光学的な読出しの感度は、色素と生体分子間のスペーサーの長さや化学的性質を変化させることによって操作することができる（図面１０と図面１４）。Ｚ−Ｃｙ５中の双性イオン特性のような独自の化学的性質があるより長いリンカー基は、典型的なヘキサノイルスペーサーのあるＣｙ５と比較して、リガンド誘発性のコンホメーション変化の広範な感知に貢献する（図面１０Ａ）。ＯｒｅｇｏｎＧｒｅｅｎ  ４８８又はＴＡＭＲＡにあるようにスペーサーがあまりに短いと、生体分子中のリガンド誘発性のコンホメーション変化による微小環境での変化を効率的に感知することが妨げられる場合がある（図面１０Ｂ〜図面１０Ｃ）。このように、色素と生体分子間のスペーサーの長さと化学的性質は、熱光学的プロファイリングの感度を決定する。コンジュゲーション時の色素と生体分子間の距離を支配するスペーサー長さは、最も好ましくは、２個のＣＨ２基より長くあるべきである。
【００９２】
色素の温度依存性の生体分子による調節は、生体分子へのコンジュゲーション後に色素が明示する正味荷電に依存する。ベンゾピリリウムコアと様々な数のスルホネート基を含有するポリメチン色素でＩＬ−Ｒ１が標識された実験で実証されるように、スルホネート基の数の増加は、熱光学的読出しの質に逆相関する（図面８）。標識されたＩＬ−Ｒ１へのリガンド、アナキンラ（Anakinra）の親和性について決定した。スルホネート基の数が大きくなる（＞２）と、この色素の熱光学的プロファイリングへの適用性は、低下した。１個又は２個のスルホネート基をそれぞれ担う、カルボシアニン色素のモノスルホＣｙ５とＤＹ６４７Ｐ１の比較によって同様の効果が示され、このことは、スルホネート基の数がこの色素の熱光学的研究への適用性を重大に決定することを例証する（図面１１）。
【００９３】
最良の信号対雑音比を達成するための特定の応用には、特異的な色素を使用し得る。雑音とは、リガンドの結合が原因ではない、熱光学的信号における変動と定義される。図面１２に示されるように、非対称的なポリメチン色素のＤＹ６３０とＤＹ６３１は、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するアッセイに優れている（図面１２Ａ）が、低分子のタンパク質への結合を検出するアッセイでは、不十分な熱光学的プロフィールを示す（図面１２Ｂ）。一方、対称性のカルボシアニン色素のモノスルホＣｙ５は、低分子のタンパク質への結合を検出するアッセイにおいて優れたプロフィールを示す。
【００９４】
本発明において使用し得る温度感受性色素は、好ましくは、ポリメチン色素とキサンテン色素からなる群より選択される。ポリメチン色素には、好ましくは、ベンゾピリリウムコアを有する対称性及び非対称性のシアニン色素又はポリメチン色素が含まれる。キサンテン色素には、ローダミン色素とフルオレセイン色素が含まれる。
【００９５】
ベンゾピリリウムコアを有する好ましいポリメチン色素には、限定されないが、Ｃｈｒｏｍｅｏ  Ｐ５４３、ＤＹ６３０、ＤＹ６３１、ＤＹ６５０、ＤｙＬｉｇｈｔ  ６５５  Ｂ２、ＤｙＬｉｇｈｔ  ６５５  Ｂ３が含まれる。好ましいシアニン色素には、限定されないが、シアニン２、Ｃｙ３、モノスルホＣｙ３、Ｃｙ５、モノスルホＣｙ５（バージョン１）、モノスルホＣｙ５（バージョン２）、ジスルホＣｙ５、Ｚ−Ｃｙ２、Ｚ−Ｃｙ５、モノスルホＺ−Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ６４７、ＤＹ５４７Ｐ１、及びＤＹ６４７Ｐ１が含まれる。好ましいキサンテン色素には、限定されないが、ＴＡＭＲＡ、ＴＡＭＲＡ  Ｘ、ＤＹ４９５、及びＯｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎが含まれる。より好ましいキサンテン色素には、限定されないが、ＴＡＭＲＡＸ、及びＤＹ４９５が含まれる。
【００９６】
特に好ましい色素は、ＤＹ６３０、ＤＹ６３１、ＤｙＬｉｇｈｔ  ６５５  Ｂ２、ＤｙＬｉｇｈｔ  ６５５  Ｂ３、シアニン２、Ｚ−Ｃｙ２、Ｚ−Ｃｙ５、モノスルホＣｙ５（バージョン１）、モノスルホＣｙ５（バージョン２）、及びＴＡＭ  ＲＡＸである。図面１９ａ〜図面１９ｅは、上記に言及した色素の構造式を示す。図面１９ａ〜図面１９ｅにおいて、色素は、スペーサー基の無い純粋な色素として示す場合もあれば、スペーサーと反応基が含まれる反応色素として示す場合もある。
【００９７】
本発明の第一の側面によれば、標識粒子は、好ましくは、一般式（Ｉ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）又は（ＩＩＩ）：
【００９８】
【化２】
2020527696.tif 000008
【００９９】
[式中：
Ｘ１は、Ｏ、Ｓ、又はＣＲ５Ｒ６であり；
Ｘ２は、Ｏ、Ｓ、又はＣＲ７Ｒ８であり；
Ｒ１とＲ２は、それぞれ独立して、水素と置換されてよいアルキル基からなる群より選択され；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８は、それぞれ独立して、ヒドロキシ、カルボキシ、スルホン酸、チオール又はその塩、水素、ハロゲン、置換されてよいカルボン酸エステル基、ニトロ基、アミン、アミド、置換されてよいアルキル基（好ましくは、Ｃ１−４アルキル）、置換されてよいアルコキシ基、及び置換されてよいアルケニル基からなる群より選択され；
但し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８の少なくとも１つは、それによって色素が粒子へコンジュゲートされるスペーサー基であり（ここで該スペーサー基は、２個のＣＨ２基より長い）；
ａは、０〜４の整数であり；
ｂは、０〜４の整数であり；そして
ｎは、１〜３の整数、好ましくは１又は２である］；
【０１００】
【化３】
2020527696.tif 000009
【０１０１】
【化４】
2020527696.tif 000010
【０１０２】
［式中：
Ｘ３とＸ４の一方はＮＲ９であって、Ｘ３とＸ４の他方は、Ｏ、Ｓ、又はＣＲ１３Ｒ１４であり；
Ｒ９は、水素と置換されてよいアルキル基からなる群より選択され；
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、及びＲ１４は、それぞれ独立して、ヒドロキシ、カルボキシ、スルホン酸、チオール又はその塩、水素、ハロゲン、置換されてよいカルボン酸エステル基、ニトロ基、アミン、アミド、置換されてよいアルキル基（好ましくは、Ｃ１−４アルキル）、置換されてよいアルコキシ基、及び置換されてよいアルケニル基からなる群より選択され；
但し、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、及びＲ１４の少なくとも１つは、それによって色素が粒子へコンジュゲートされるスペーサー基であり（ここで該スペーサー基は、２個のＣＨ２基より長い）；
ｃは、０〜４の整数であり；
ｄは、０〜２の整数であり；
ｅは、０〜４の整数であり；そして
ｍは、１〜３の整数、好ましくは１又は２である］；及び
【０１０３】
【化５】
2020527696.tif 000011
【０１０４】
［式中：
Ｙは、ＯＲ１８又はＮＲ１９Ｒ２０であり；
Ｚは、Ｏ又は＋ＮＲ２１Ｒ２２であり；
Ｒ１５、Ｒ１６、及びＲ１７は、それぞれ独立して、ヒドロキシ、カルボキシ、スルホン酸、チオール又はその塩、水素、ハロゲン、置換されてよいカルボン酸エステル基、ニトロ基、アミン、アミド、置換されてよいアルキル基（好ましくは、Ｃ１−４アルキル）、置換されてよいアルコキシ基、及び置換されてよいアルケニル基からなる群より選択され；
但し、Ｒ１７の少なくとも１つは、それによって色素が粒子へコンジュゲートされるスペーサー基であり；
Ｒ１８は、Ｈ又はアルカリ金属イオンであり、
Ｒ１９、Ｒ２０、Ｒ２１、及びＲ２２は、それぞれ独立して、水素と置換されてよいアルキル基からなる群より選択され、好ましくは、Ｒ１９、Ｒ２０、Ｒ２１、及びＲ２２は、それぞれ同じであり；
ｆは、０〜３の整数であり；
ｇは、０〜３の整数であり；そして
ｈは、１〜５の整数である］によって表される色素からなる群より選択される１種以上の色素で標識される。
【０１０５】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１９、Ｒ２０、Ｒ２１、及びＲ２２のアルキル基は、好ましくは、限定されないが、メチル、エチル、プロピル、ｎ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、メトキシエチルのような、置換されてよいＣ１−４アルキル基である。
【０１０６】
基：Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１９、Ｒ２０、Ｒ２１、及びＲ２２は、好ましくは、リガンドの標識粒子への結合時に蛍光強度変化を妨害する場合がある大きな立体障害を持ち込む、アリール基のような大きな基を含有しない。
【０１０７】
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、及びＲ１７のアルケニル基は、好ましくは、置換されてよいＣ１−４アルケニル基である。Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、及びＲ１７のアルコキシ基は、好ましくは、置換されてよいＣ１−４アルコキシ基である。
【０１０８】
Ｒ１とＲ２のアルキル基は、アルコキシとスルホネート、好ましくはメトキシとスルホネートからなる群より選択される１以上の置換基で置換されてよい。
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８のカルボン酸エステル基、アルキル基、アルケニル基、又はアルコキシ基は、オキソ基とスルホネートからなる群より選択される１以上の置換基で置換されてよくて、好ましくは、置換基無しでよい。
【０１０９】
Ｒ９のアルキル基は、Ｒ１及びＲ２のアルキル基と同じ置換基で置換されてよくて、好ましくは、１以上のスルホネート基で置換されてよい。
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、及びＲ１４のカルボン酸エステル基、アルキル基、アルケニル基、又はアルコキシ基は、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８のアルキル基、アルケニル基、又はアルコキシ基と同じ置換基で置換されてよくて、好ましくは、１以上のアルキル基、好ましくはメチル基で置換されてよい。
【０１１０】
Ｒ１５、Ｒ１６、及びＲ１７のカルボン酸エステル基、アルキル基、アルケニル基、又はアルコキシ基は、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８のアルキル基、アルケニル基、又はアルコキシ基と同じ置換基で置換されてよくて、好ましくは、置換基を有さなくてよい。
【０１１１】
Ｒ１９、Ｒ２０、Ｒ２１、及びＲ２２のアルキル基は、Ｒ１とＲ２のアルキル基と同じ置換基で置換されてよくて、好ましくは、置換基を有さなくてよい。
スペーサー基とは、それによって色素が粒子へコンジュゲートされる基である。最も好ましくは、スペーサー基は、ヘキサノイルスペーサー基のように、２個のＣＨ２基より長い。
【０１１２】
本発明の文脈において、「スルホン酸」及び「スルホネート基」という用語は、交換可能的に使用されて、基「−ＳＯ３−」を意味する。当業者によって理解されるように、この基は、負に帯電している。この負電荷は、対応する正電荷を標識粒子内に必要とする（分子内塩）か又は対応する陽イオンが溶液中に存在しなければならない。この陽イオンは、標識粒子を含んでなる溶液に溶けるどのイオンでもよくて、好ましくは、アンモニウムイオン、アルカリ金属イオン、及びアルカリ土類金属イオンより、最も好ましくはナトリウムイオン又はカリウムイオンより選択され得る。同様に、全体として陽電荷を有する標識粒子には、対応する陰イオンが溶液中に必要とされる。この陰イオンは、標識粒子を含んでなる溶液に溶けるどのイオンでもよくて、好ましくは、ハロゲン化物イオン、硫酸イオン、ヘキサフルオロリン酸イオン、及びテトラフルオロホウ酸イオンより選択され得る。
【０１１３】
式（Ｉ）の色素は、好ましくは、一般式（Ｉ’）：
【０１１４】
【化６】
2020527696.tif 000012
【０１１５】
[式中：
Ｘ１は、Ｏ又はＣＲ５Ｒ６であり；
Ｘ２は、Ｏ又はＣＲ７Ｒ８であり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８は、それぞれ独立して、置換されてよいＣ１−２０アルキル基であり；
Ｒ３とＲ４は、それぞれ独立して、水素とスルホン酸又はその塩からなる群より選択され；
但し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８の１つは、それによって色素が粒子へコンジュゲートされるスペーサー基であり（ここで該スペーサー基は、２個のＣＨ２基より長い）；そして
ｎは、１又は２に等しい整数である］によって表される色素である。
【０１１６】
式（ＩＩａ）又は（ＩＩｂ）の色素は、好ましくは、一般式（ＩＩａ’）又は（ＩＩｂ’）：
【０１１７】
【化７】
2020527696.tif 000013
【０１１８】
【化８】
2020527696.tif 000014
【０１１９】
［式中：
Ｘ３とＸ４の一方はＮＲ９であって、Ｘ３とＸ４の他方はＣＲ１３Ｒ１４であり；
スルホネート基は、ＮＲ９に対して４位にあり；
Ｒ９は、置換されてよいＣ１〜Ｃ２０アルキル基であり；
Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、及びＲ１４は、それぞれ独立して、ヒドロキシ、カルボキシ、スルホン酸、チオール又はその塩、水素、ハロゲン、置換されてよいカルボン酸エステル基、ニトロ基、アミン、アミド、置換されてよいアルキル基（好ましくはＣ１−４アルキル）、置換されてよいアルコキシ基、及び置換されてよいアルケニル基からなる群より選択され；
但し、Ｒ９、Ｒ１３、及びＲ１４の１つは、それによって色素が粒子へコンジュゲートされるスペーサー基であり（ここで該スペーサー基は、２個のＣＨ２基より長い）；
ｄは、０〜２の整数であり；
ｅは、０〜３の整数であり；そして
ｍは、１又は２に等しい整数である］によって表される色素である。
【０１２０】
なおより好ましくは、式（ＩＩａ’）又は（ＩＩｂ’）の色素は、一般式（ＩＩａ’’）又は（ＩＩｂ’’）：
【０１２１】
【化９】
2020527696.tif 000015
【０１２２】
【化１０】
2020527696.tif 000016
【０１２３】
［式中：
Ｘ３とＸ４の一方はＮＲ９であって、Ｘ３とＸ４の他方はＣＲ１３Ｒ１４であり；
スルホネート基は、ＮＲ９に対して４位にあり；
Ｒ９は、置換されてよいＣ３−Ｃ６アルキル基であり；
Ｒ１３とＲ１４は、それぞれ独立して、置換されてよいＣ１−４アルキル基であり；
但し、Ｒ９、Ｒ１３、及びＲ１４の１つは、それによって色素が粒子へコンジュゲートされるスペーサー基であり（ここで該スペーサー基は、２個のＣＨ２基より長い）；そして
ｍは、１又は２に等しい整数である］によって表される色素である。
【０１２４】
式（ＩＩＩ）の色素は、好ましくは、一般式（ＩＩＩ’）：
【０１２５】
【化１１】
2020527696.tif 000017
【０１２６】
［式中：
Ｙは、ＯＨ又はＮ（ＣＨ３）２であり；
Ｚは、Ｏ又は＋Ｎ（ＣＨ３）２であり；
Ｒ１５とＲ１６は、それぞれ独立して、水素又はハロゲンであり；
Ｒ１７は、それによって色素が粒子へコンジュゲートされるスペーサー基であり；そして
Ｒ１７ａは、カルボキシ基又はその塩である］によって表される。
【０１２７】
好ましくは、一般式（Ｉ）、（Ｉ’）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩａ’）、（ＩＩｂ’）、（ＩＩａ’’）又は（ＩＩｂ’’）の前記色素中のスペーサー基は、置換されてよいＣ４〜Ｃ２０アルキレン鎖であって、ここで該アルキレン鎖の１個以上の炭素原子は、独立して、脂環式基、アリール基、複素環式基、ヘテロアリール基、又はＯ、Ｎ、及びＳからなる群より選択されるヘテロ原子に置き換わってよい。より好ましくは、一般式（Ｉ’）、（ＩＩａ’）、（ＩＩｂ’）、（ＩＩａ’’）又は（ＩＩｂ’’）の色素は、この好ましいスペーサー基を含む。なおより好ましくは、一般式（Ｉ’）、（ＩＩａ’）、（ＩＩｂ’）、（ＩＩａ’’）又は（ＩＩｂ’’）の色素は、生体分子へコンジュゲートした、好ましくはタンパク質へコンジュゲートした、この好ましいスペーサー基を含む。
【０１２８】
なおより好ましくは、一般式（Ｉ）、（Ｉ’）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩａ’）、（ＩＩｂ’）、（ＩＩａ’’）又は（ＩＩｂ’’）のスペーサー基は、置換されてよいＣ４〜Ｃ６アルキレン鎖であって、ここで１個の炭素原子は、１つのアリール基に置き換わってよい。なおより好ましくは、一般式（Ｉ’）、（ＩＩａ’）、（ＩＩｂ’）、（ＩＩａ’’）又は（ＩＩｂ’’）の色素は、このなおより好ましいスペーサー基を含む。最も好ましくは、一般式（Ｉ’）、（ＩＩａ’）、（ＩＩｂ’）、（ＩＩａ’’）又は（ＩＩｂ’’）の色素は、生体分子へコンジュゲートした、好ましくはタンパク質へコンジュゲートした、このなおより好ましいスペーサー基を含む。
【０１２９】
好ましくは、一般式（ＩＩＩ）又は（ＩＩＩ’）の前記色素中のスペーサー基は、置換されてよいＣ２〜Ｃ１０アルキレン鎖であって、ここで該アルキレン鎖の１個以上の炭素原子は、独立して、脂環式基、アリール基、ヘテロアリール基、複素環式基、又はＯ、Ｎ、及びＳからなる群より選択されるヘテロ原子に置き換わってよい。より好ましくは、一般式（ＩＩＩ’）の色素は、この好ましいスペーサー基を含む。なおより好ましくは、一般式（ＩＩＩ’）の色素は、生体分子へコンジュゲートした、好ましくはタンパク質へコンジュゲートした、この好ましいスペーサー基を含む。
【０１３０】
なおより好ましくは、一般式（ＩＩＩ）又は（ＩＩＩ’）の前記色素中のスペーサー基は、置換されてよいＣ３〜Ｃ７アルキレン鎖であって、ここで該アルキレン鎖の１個以上の炭素原子は、独立して、Ｏ、Ｎ、及びＳからなる群より選択されるヘテロ原子に置き換わってよい。なおより好ましくは、一般式（ＩＩＩ’）の色素は、このなおより好ましいスペーサー基を含む。最も好ましくは、一般式（ＩＩＩ’）の色素は、生体分子へコンジュゲートした、好ましくはタンパク質へコンジュゲートした、このなおより好ましいスペーサー基を含む。
【０１３１】
一般式（ＩＩＩ）又は（ＩＩＩ’）の色素は、一般式（Ｉ’）、（ＩＩａ’）、（ＩＩｂ’）、（ＩＩａ’’）又は（ＩＩｂ’’）の色素のスペーサー基に関して定義されるようなスペーサー基も含んでよい。
【０１３２】
一般式（Ｉ）、（Ｉ’）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩａ’）、（ＩＩｂ’）、（ＩＩａ’’）、（ＩＩｂ’’）、（ＩＩＩ）又は（ＩＩＩ’）のスペーサー基は、通常、２個の連続したヘテロ原子を含有しない。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、及びＲ１７のいずれものスペーサー基は、通常、メチレン基を介して色素構造へ結合している基であり、即ち、スペーサー基のＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、及びＲ１７は、色素構造の近傍にある末端からメチレン基で始まる。スペーサー基の遠端、即ち、粒子へ付くスペーサー基の末端は、しばしばカルボニル基である。さらに、一般式（Ｉ）、（Ｉ’）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩａ’）、（ＩＩｂ’）、（ＩＩａ’’）、（ＩＩｂ’’）、（ＩＩＩ）又は（ＩＩＩ’）のスペーサー基は、好ましくは、置換されてよいＣ４〜Ｃ２０アルキレン鎖であり、ここで該アルキレン鎖の１個以上の炭素原子は、独立して、Ｏ、Ｎ、及びＳからなる群より選択されるヘテロ原子に置き換わってよく、ここで該スペーサー基の遠端は、３個のＮｉ（ＩＩ）イオンを含むＴｒｉｓＮＴＡ−Ｎｉ錯体である。言い換えると、スペーサー基は、ＴｒｉｓＮＴＡ６４７とｔｒｉｓＮＴＡ  Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８では、図面１９に例示的に示されるように色素へ付く。ＴｒｉｓＮＴＡは、Ｎｉイオンを介して粒子へコンジュゲートする。
【０１３３】
一般式（Ｉ）、（Ｉ’）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩａ’）、（ＩＩｂ’）、（ＩＩａ’’）、（ＩＩｂ’’）、（ＩＩＩ）又は（ＩＩＩ’）のスペーサー基の置換基は、オキソ基、Ｃ１−４アルキレンスルホネート、及びＣ１−４アルキルより選択され得る。
【０１３４】
一般式（Ｉ）、（Ｉ’）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩａ’）、（ＩＩｂ’）、（ＩＩａ’’）又は（ＩＩｂ’’）のスペーサー基のＣ４〜Ｃ２０アルキレン鎖は、オキソ基、Ｃ１−４アルキレンスルホネート、及びＣ１−４アルキル、好ましくは、オキソ基、メチレンスルホネート、及びＣ１−４アルキルからなる群より選択される１以上の置換基で置換されてよい。
【０１３５】
一般式（Ｉ）、（Ｉ’）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩａ’）、（ＩＩｂ’）、（ＩＩａ’’）又は（ＩＩｂ’’）のスペーサー基のＣ４〜Ｃ６アルキレン鎖は、それぞれのＣ４〜Ｃ２０アルキレン鎖と同じ置換基で置換されてよくて、好ましくは、オキソ基からなる群より選択される１以上の置換基で置換されてよい。
【０１３６】
一般式（Ｉ）、（Ｉ’）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩａ’）、（ＩＩｂ’）、（ＩＩａ’’）又は（ＩＩｂ’’）の上記Ｃ４〜Ｃ２０アルキレン鎖中の有ってもよい（optional）Ｎ−ヘテロ原子は、水素とＣ１−４アルキルからなる群より選択される置換基で置換されてよい。
【０１３７】
一般式（ＩＩＩ）又は（ＩＩＩ’）のスペーサー基のＣ２〜Ｃ１０アルキレン鎖は、オキソ基とＣ１−４アルキル、好ましくはオキソ基からなる群より選択される１以上の置換基で置換されてよい。
【０１３８】
一般式（ＩＩＩ）又は（ＩＩＩ’）の上記Ｃ２〜Ｃ１０アルキレン鎖中の有ってもよいＮ−ヘテロ原子は、水素とＣ１−４アルキル、好ましくは水素からなる群より選択される１以上の置換基で置換されてよい。
【０１３９】
一般式（Ｉ）、（Ｉ’）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩａ’）、（ＩＩｂ’）、（ＩＩａ’’）、（ＩＩｂ’’）、（ＩＩＩ）又は（ＩＩＩ’）のスペーサー基のアルキレン鎖中の有ってもよい脂環式基、アリール基、ヘテロアリール基、複素環式基は、オキソ基とＣ１−４アルキル、好ましくはオキソ基からなる群より選択される１以上の置換基で置換されてよい。
【０１４０】
色素は、Dyomics、Thermo Fischer Scientific、Lumiprobe、Cyandye、又は Kerafast より入手することができる。あるいは、本発明において利用される色素は、既知の方法によって製造することができる。ＤＹ６３１のようなベンゾピリリウム色素を製造することの具体的な方法がＵＳ６，９２４，３７２Ｂ２に記載され；ＤＹ６４７Ｐ１とモノスルホＤＹ６４７Ｐ１の製造についてはＵＳ２０１３／０２５１６３７  Ａ９に記載され；Ｚ−Ｃｙ５のような色素の合成についてはＵＳ８，１９７，７５８Ｂ２に記載され；そして、モノスルホＣｙ５を製造する方法がＵＳ５，２６８，４８６に提供されている。これらの文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１４１】
標識粒子は、色素の粒子へのコンジュゲーションを可能にする反応基を有する反応色素と粒子（生体分子のような）を反応させることによって生成することができる。特に好ましい反応基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化エステル（ＮＨＳ）基であり、実施例ではこれを使用した。しかしながら、反応基は、ＮＨＳに限定されないが、色素の粒子へのコンジュゲーションを可能にする、マレイミド、アミド、スルホンアミド、尿素、及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性化エステルとのチオ尿素生成物、塩化スルホニル、イソシアネート、イソチオシアネート、アジド、アルキン、ヒドラジン、カルボン酸、及びアミン基のような他の基も利用してよい。原理的には、生体分子へのそのコンジュゲーションを可能にする色素のどの修飾物も利用することができる。生体分子を修飾する方法については、その全体が参照により本明細書に組み込まれる Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2009; 48(38): 6974-6998 において、E. M. Sletten と C. R. Bertozzi によって研究されたことがある。
【０１４２】
例示の一般的なタンパク質標識手順は、以下の工程を含む：
１．対応する標識化緩衝液において粒子を調製する工程；
２．色素を加えて、それを粒子と混合する工程；
３．暗所にて所与の温度で所与の時間の間（ほとんどの時間、氷上、室温、又は３７℃のいずれかで）インキュベートする工程；及び
４．非結合性の色素を、限定されないが、ゲルクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーのような精製法によって除去する工程（溶出緩衝液としてアッセイ緩衝液を使用してよい）。
【０１４３】
タンパク質−タグの標識化では、すべての色素がタグへ結合した状態にある化学量論的な標識比の故に、遊離色素の除去は、通常必要とされない。
色素は、スペーサー基を介して粒子へ付くので、上記に言及した反応基は、通常、反応色素中のスペーサー基の他端へ付く、即ち、スペーサー基は、一方の端で色素へ付いて、他端で反応基へ付く。反応基を有する反応色素の粒子との反応の後で、色素は、スペーサー基を介して粒子へ付く。
【０１４４】
反応色素は、タンパク質標識化キットにおいて提供することができる。各キットは、２〜８、好ましくは３〜５のタンパク質標識反応のような多重タンパク質標識反応に十分な材料を含有し得る。使用されるタンパク質の量に依存して、概ね１０００マイクロスケールの実験に十分な材料を提供することができる。
【０１４５】
標識化キットには、主要成分として、反応色素が含まれる。好ましくは、該キットには、本発明の第五の側面におけるように、２又は３種の異なる色素、より好ましくは２種の異なる色素といった、１種より多い色素が別々に含まれ得る。タンパク質標識化キットは、好ましくは、本発明の方法の少なくとも１つにおける該キットの使用について説明する取扱いマニュアルをさらに含む。
【０１４６】
付言すると、該キットには、しばしば、緩衝液交換カラム、精製カラム、標識化緩衝液、アダプター、及びこれらの組合せからなる群より選択される少なくとも１つがさらに含まれる。
【０１４７】
タンパク質のような標的生体分子へのリガンド結合は、アミノ酸側鎖、ループ又はドメインの運動といった、広範囲のコンホメーション変化をもたらす可能性がある。本発明の第一の側面において使用し得るリガンドは、（限定されないが）イオン、金属、化合物、薬物フラグメント（生体標的に対してごく弱く結合する場合がある、低分子の化学フラグメント）、炭水化物、ＡＴＰのような低分子（低分子量（＜９００ダルトン）を有する有機化合物；低分子は、生体プロセスを調節するのに役立つ場合があって、通常１ｎｍオーダーのサイズを有する）、薬物、プロドラッグ、脂質、生体分子、ケモカインとサイトカインのようなタンパク質、ペプチド、ペプトイド、酵素、抗原、補因子、核酸、アプタマー、阻害剤、Ｆｃ受容体、ｓｓＤＮＡ、ナノ粒子、リポソーム、単層小胞（小型単層小胞（ＳＵＶ）と大型単層小胞（ＧＵＶ）が含まれる）、ポリマー、有機分子、無機分子、金属錯体、ホルモン、フレーバー、着臭剤、粒子、及び（マイクロ）ビーズからなる群より選択され得る。好ましくは、リガンドは、イオン、金属、化合物、薬物フラグメント、炭水化物、低分子、薬物、プロドラッグ、脂質、タンパク質、ペプチド、ペプトイド、酵素、核酸、アプタマー、ホルモン、フレーバー、及び着臭剤からなる群より選択される。
【０１４８】
以下において、粒子−リガンドの組合せを「粒子→リガンド」の表記法を使用して示す。即ち、矢印の左側に粒子を示して、対応するリガンドを矢印の右側に示す。
好ましい粒子→リガンドの組合せは、酵素→脂質、受容体→ホルモン、受容体→ケモカイン、酵素→阻害剤、受容体→神経伝達物質、受容体→サイトカイン、酵素→イオン、受容体→イオン、受容体→アミノ酸、酵素→補因子、受容体→脂質、受容体→ステロール、酵素→フラグメント、受容体→ペプチド、受容体→フラグメント、酵素→代謝産物、受容体→受容体、受容体→糖脂質、酵素→ＤＮＡ、受容体→着臭剤、受容体→プロドラッグ、酵素→ＲＮＡ、受容体→薬物、酵素→単糖類／二糖類又は多糖類、酵素→脂肪酸、酵素→ビタミン、酵素→プロドラッグ、酵素→薬物、リポソーム→タンパク質、輸送タンパク質→基質、抗体→抗原、ウイルス粒子→受容体、ウイルス→構造タンパク質、抗体→Ｆｃ受容体、シャペロン→ＡＴＰ、ｓｓＤＮＡ→ｓｓＤＮＡ、アプタマー→リガンド、シャペロン→イオン、ＲＮＡ→低分子、多糖類→低分子、シャペロン→タンパク質、ＤＮＡ→低分子、構造タンパク質→構造タンパク質、シグナル伝達タンパク質→シグナル伝達タンパク質、シグナル伝達タンパク質→低分子、シグナル伝達タンパク質→プロドラッグ、シグナル伝達タンパク質→薬物、シグナル伝達タンパク質→脂質、構造タンパク質→イオン、ナノ粒子→タンパク質、細胞小器官→タンパク質、ナノ粒子→ＤＮＡ、細胞小器官→脂質、ナノ粒子→ＲＮＡからなる群より選択される。より好ましい粒子→リガンドの組合せは、酵素→脂質、受容体→ホルモン、受容体→ケモカイン、酵素→阻害剤、受容体→神経伝達物質、受容体→サイトカイン、酵素→イオン、受容体→イオン、受容体→アミノ酸、酵素→補因子、受容体→脂質、受容体→ステロール、酵素→フラグメント、受容体→ペプチド、受容体→フラグメント、酵素→代謝産物、受容体→受容体、受容体→糖脂質、酵素→ＤＮＡ、受容体→着臭剤、受容体→プロドラッグ、酵素→ＲＮＡ、受容体→薬物、酵素→単糖類／二糖類又は多糖類、酵素→脂肪酸、酵素→ビタミン、酵素→プロドラッグ、酵素→薬物、リポソーム→タンパク質、輸送タンパク質→基質、抗体→抗原、ウイルス粒子→受容体、ウイルス→構造タンパク質、抗体→Ｆｃ受容体、シャペロン→ＡＴＰ、ｓｓＤＮＡ→ｓｓＤＮＡ、アプタマー→リガンド、シャペロン→イオン、ＲＮＡ→低分子、シャペロン→タンパク質、ＤＮＡ→低分子、構造タンパク質→構造タンパク質、シグナル伝達タンパク質→シグナル伝達タンパク質、シグナル伝達タンパク質→低分子、シグナル伝達タンパク質→プロドラッグ、シグナル伝達タンパク質→薬物、シグナル伝達タンパク質→脂質、構造タンパク質→イオンからなる群より選択される。
【０１４９】
最も好ましい粒子→リガンドの組合せは、酵素→脂質、受容体→ホルモン、受容体→ケモカイン、酵素→阻害剤、受容体→神経伝達物質、受容体→サイトカイン、酵素→イオン、受容体→イオン、受容体→アミノ酸、酵素→補因子、受容体→脂質、受容体→ステロール、酵素→フラグメント、受容体→ペプチド、受容体→フラグメント、酵素→代謝産物、受容体→受容体、受容体→糖脂質、酵素→ＤＮＡ、受容体→着臭剤、受容体→プロドラッグ、酵素→ＲＮＡ、受容体→薬物、酵素→単糖類／二糖類又は多糖類、酵素→脂肪酸、酵素→ビタミン、酵素→プロドラッグ、酵素→薬物、リポソーム→タンパク質、輸送タンパク質→基質、抗体→抗原、抗体→Ｆｃ受容体、シャペロン→ＡＴＰ、ｓｓＤＮＡ→ｓｓＤＮＡ、アプタマー→リガンド、シャペロン→イオン、ＲＮＡ→低分子、シャペロン→タンパク質、ＤＮＡ→低分子、構造タンパク質→構造タンパク質、シグナル伝達タンパク質→シグナル伝達タンパク質、シグナル伝達タンパク質→低分子、シグナル伝達タンパク質→プロドラッグ、シグナル伝達タンパク質→薬物、シグナル伝達タンパク質→脂質、構造タンパク質→イオンからなる群より選択される。上記の最も好ましい粒子→リガンドの組合せにおいて、粒子とリガンドは、好ましくは、真核細胞から、より好ましくはヒト、マウス、ラット、又は霊長動物の細胞から；又はマラリア原虫（Plasmodium ssp.）、トリパノソーマ（Trypanosoma ssp.）、ビブリオ属菌（Vibrio ssp.）、サルモネラ属菌（Salmonella ssp.）、結核菌（Mycobacterium tubercolosis）のような病原体とジカ、エボラ、マールブルグウイルス、ニパ（Nipah）、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ−ＣｏＶ）、クリミア・コンゴ出血熱（ＣＣＨＦ）、リフトバレー熱（ＲＶＦ）、ＨＩＶのようなウイルスから生じる。
【０１５０】
色素の温度依存性は、色素が存在する局所環境によって影響を受けるので、リガンド−誘発性のコンホメーション変化は、本システム中に存在するリガンドの濃度に依存した独自の熱光学的プロフィールへ翻案されると予測される（図面１３）。タンパク質：ＥｃｏＳＳＢ（即ち、大腸菌一本鎖ＤＮＡ−結合タンパク質、図面４）へのＣｙ５−ｓｓＤＮＡの結合について示されるように、色素が存在する局所環境による、該色素の温度依存性の調節は、熱光学的アプローチとペルティエデバイス又はＩＲレーザーのいずれかを加熱源として使用する、結合親和性の決定に使用し得る（図面４）。この熱光学的アプローチは、プローブが冷却される場合にも適用することができる。図面９に示すように、プローブは、ＩＲレーザーで予熱して、温度誘発性の蛍光変化について冷却時にモニターした。冷却するペルティエデバイスの追加供給源として、冷却液又は冷却ガス（空気が含まれる）を使用することができる。
【０１５１】
タンパク質のような生体分子の熱的アンフォールディングは、大きなコンホメーション変化を特徴とする。色素の温度依存性が局所の微小環境とアンフォールディング時のこの環境変化によって影響されるので、ＭＢＰとＴＥＭ１について示されるように、この熱光学的アプローチを使用して、生体分子の融解温度を決定し得る（図面１６）。
【０１５２】
本発明の第一の側面において使用される試料は、標識粒子とリガンドを含んでなる溶液である。ここで、標識粒子は、該溶液中に溶解又は分散させることができる。あるいは、標識粒子は、リガンドを含有する溶液と接触状態にした固体支持体上に固定することができる。好ましくは、標識粒子は、溶液中に溶解又は分散している。この水溶液は、好ましくは、緩衝液を使用して、２〜１０、より好ましくは４〜１０、なおより好ましくは５〜９、最も好ましくは６〜８．５のｐＨ値へ調整される。
【０１５３】
本発明の第一の側面において、標識粒子の溶液中の好ましい濃度は、１０ピコモル濃度〜１マイクロモル濃度、より好ましくは１００ピコモル濃度〜１００ナノモル濃度である。リガンドの濃度は、好ましくは０．０１ピコモル濃度〜１モル濃度、より好ましくは１ピコモル濃度〜１００ミリモル濃度、なおより好ましくは１０ピコモル濃度〜１０ミリモル濃度である。
【０１５４】
試料は、好ましくは、マルチウェルプレート、マイクロ流体チップ、キャピラリー、キュベット、反応管、ピペットチップ、マイクロ流体素子（microfluidics）、液滴、透明容器からなる群より選択される試料チャンバにおいて提供される。透明容器は、及びガラス容器又はプラスチック容器であり得る。
【０１５５】
試料プローブは、蛍光励起ビームの方向に１μｍ〜５００μｍ、特に１μｍ〜２５０μｍ、特に１μｍ〜１００μｍ、特に３μｍ〜５０μｍ、特に５μｍ〜３０μｍの厚さを有するチャンバ内で提供することが有利である。当業者は、チャンバという用語が、例えば、キャピラリー、マイクロ流体チップ、又はマルチウェルウェルプレートにも関することを理解されよう。
【０１５６】
当業者には、本明細書において利用されるような「蛍光」という用語が「蛍光」それ自体に限定されないこと、本明細書において開示される手段、方法、及びデバイスが他の手段、特に燐光のような発光の使用によっても使用及び利用し得ることが理解される。従って、「前記標識粒子を蛍光で励起させて、前記励起粒子の蛍光を第一に検出及び／又は測定する工程」という用語は、上記の確定された方法における「励起工程」に関して、対応する発光の励起も含み得る、即ち、励起は、後続の放射の検出より短い波長で行われる。故に、本発明の文脈における「粒子の蛍光を第二に検出及び／又は測定する工程」という用語は、励起後の前記放射の検出の工程を意味する。当業者には、本発明の文脈において「励起」波長と「放射」波長が別々でなければならないことがわかっている。
【０１５７】
標識粒子を蛍光で励起させて励起粒子の蛍光を検出する手段は、限定されてなくて、当業者に知られたどの好適な手段も利用してよい。
本発明によれば、標識粒子／分子を励起する、好ましくは蛍光で励起させるのに好ましい手段は、レーザー、ファイバーレーザー、ダイオードレーザー、ＬＥＤ、ハロゲン、ＬＥＤアレイ、ＨＢＯ（ＨＢＯランプとは、例えば、放電アークが水銀蒸気の雰囲気において高い気圧の下で発火するショートアークランプである）、ＨＸＰ（ＨＸＰランプとは、例えば、放電アークが水銀蒸気の雰囲気においてきわめて高い気圧で燃焼するショートアークランプである。例えば、ＨＢＯランプと対照的に、それらは、実質的により高い気圧で操作されて、それらはハロゲンサイクルを利用する。ＨＸＰランプは、ＵＶとかなりの部分の赤色光が含まれる可視光を発生する）からなる群より選択されるどの好適なデバイスでもよい。
【０１５８】
本発明によれば、溶液において励起粒子を検出する、特に蛍光を検出するのの好ましい手段は、ＣＣＤカメラ（２Ｄ又はラインスキャンＣＣＤ）、ライン−カメラ（Line-Camera）、光電子増倍管（ＰＭＴ）、アバランシェフォトダイオード（Avalanche Photodiode）（ＡＰＤ）、ＣＭＯＳ−カメラからなる群より選択されるどの好適なデバイスでもよい。
【０１５９】
本発明の方法は、どの好適なデバイスでも行ってよい。好ましくは、本方法は、以下のデバイス：Monolith NT.115 G/R MO-G009、Monolith NT.115 R/B MO-G008、Monolith NT.115B/G MO-007、又は Monolith NT.115 Pico MO-006 の１つを使用して行ってよいが、それらに限定されない。
【０１６０】
第二の側面において、本発明は、分子間及び／又は分子内相互作用を測定するための方法に関する。第二の側面の方法は、以下の工程を含む：
ａ）標識粒子を含んでなる試料を提供する工程；
ｂ）標識粒子を蛍光で励起させて、励起粒子の第一蛍光を第一温度で検出する工程；
ｃ）該試料を第二温度まで加熱するか又は冷却する工程；
ｄ）標識粒子を蛍光で励起させて、励起粒子の第二蛍光を第二温度で検出する工程；
ｅ）第一蛍光と第二蛍光に基づいて、該粒子の分子間及び／又は分子内相互作用、及び／又は修飾／改変について特性決定する工程。
【０１６１】
本発明の第二の側面の方法には、限定されないが、本発明の第一の側面にあるようなリガンド対標識粒子の結合相互作用が含まれる。さらに、本発明の第二の側面の方法には、化学反応（粒子のグリコシル化、リン酸化、脂質化、カルボニル化、酸化が含まれる、無機又は有機反応のような）並びに複合体形成及び／又はそれらの解離を測定する方法が含まれる。
【０１６２】
第三の側面において、本発明は、時間依存性の変化を測定するための方法に関する。第三の側面の方法は、以下の工程を含む：
ａ）標識粒子を含んでなる試料を提供する工程；
ｂ）標識粒子を蛍光で励起させて、励起粒子の第一蛍光を検出する工程；
ｃ）所定時間の間待つ工程；
ｄ）標識粒子を蛍光で励起させて、励起粒子の第二蛍光を検出する工程；
ｅ）第一蛍光と第二蛍光に基づいて、該粒子の時間依存性の変化について特性決定する工程。
【０１６３】
本発明の第三の側面の方法は、例えば、コンホメーション変化の速度論的測定、結合速度論、又は安定性測定のために、又は品質管理測定のために標識粒子の時間依存性の変化を測定するのに有用である。
【０１６４】
第四の側面において、本発明は、環境依存性の変化を測定するための方法に関する。第四の側面の方法は、以下の工程を含む：
ａ）標識粒子を含んでなる第一試料を提供する工程；
ｂ）標識粒子を蛍光で励起させて、第一試料中の励起粒子の第一蛍光を検出する工程；
ｃ）標識粒子を実質的に同じ濃度で含んでなる第二試料を提供する工程（ここで第二試料は、第一試料とは異なる）；
ｄ）標識粒子を蛍光で励起させて、第二試料中の励起粒子の第二蛍光を検出する工程；
ｅ）第一蛍光と第二蛍光に基づいて、該粒子の環境依存性の変化について特性決定する工程。
【０１６５】
本発明の第四の側面の方法は、標識粒子に対する環境変化の影響を決定するために使用することができる。そのような環境変化には、限定されないが、ｐＨ変化、温度変化、気圧変化、溶媒の変化、塩類のような他の溶質の濃度の変化、等が含まれる。
【０１６６】
本発明の第二、第三、及び第四の側面の方法では、本発明の第一の側面におけるものと同じ色素で標識される同じ標識粒子が利用される。相互作用という用語は、本発明の第一の側面におけるものと同じやり方で使用される。本発明の第二、第三、及び第四の側面が行われる温度は、好ましくは、本発明の第一の側面の所定温度に対応する。本発明の第二の側面における温度差は、好ましくは、本発明の第一の側面におけるものと同じである。同じことが加熱法と冷却法に適用される。本発明の第二、第三、及び第四の側面における、標識粒子の試料溶液中の濃度は、好ましくは、本発明の第一の側面におけるものと同じである。本発明の第二、第三、及び第四の側面における好ましい粒子−リガンドの組合せは、好ましくは、本発明の第一の側面におけるものと同じである。また、同じ試料チャンバを利用してよい。本発明の第二、第三、及び第四の側面における、標識粒子を蛍光で励起させるための手段も、好ましくは、本発明の第一の側面におけるものと同じである。
【０１６７】
米国特許：ＵＳ９，６７６，７８７  Ｂ２には、ある種のベンゾピリリウム化合物と生体分子の標識化におけるそれらの使用が開示されている。この文献では、リガンドが検出されるだけであった。希釈系列を作製したのは、既存の色素と比較して、開示されるベンゾピリリウム色素の検出範囲が改善することを示すためだけである。原理的には、この効果を実証するのであれば、単一のリガンド濃度で十分であったろう。従って、件の色素が免疫ブロット法のような標準的な応用に適していることが実証されただけである。そこでは、蛍光強度は、測定試料中に残存する発蛍光団の数に依存する。詳細には、この文献は、以下の手順について記載する：
（ａ）溶液中で一定濃度の抗原（リガンド）をある表面へ結合させる。
【０１６８】
（ｂ）この抗原溶液を除去して、該表面を洗浄する。
（ｃ）引き続き、蛍光色素で標識した抗体を該表面へ加えて、インキュベートした。
（ｄ）標識抗体を含有する溶液を除去して、該表面を洗浄する。
【０１６９】
（ｅ）抗原を介して該表面へ結合した抗体の蛍光を検出する。
（ｆ）この実験が行われる温度については記載されていない。しかしながら、蛍光の変化が大きいので、その温度の注意深い制御は、必要とされなかった。
【０１７０】
当業者は、ＵＳ９，６７６，７８７  Ｂ２を読めば、蛍光強度の変化が生じたのは、多少の抗原が抗体へ結合していたので、蛍光検出の時点で多少の抗体が該表面へ結合していたことによると仮定されよう。各抗体は、リガンドが結合していてもいなくても、同じ蛍光強度を示すと考えられる。さらに言えば、抗原の検出には、単一濃度の抗原で十分である。これは、本発明とは根本的に異なる。
【０１７１】
本発明の方法では、リガンドと粒子間の結合定数を検出することができて、リガンドの存在を検出するだけではない。このように、すでに本アッセイの開始時点で、リガンドと粒子の濃度は、予め決定されている。主たる違いは、測定される蛍光強度の変化が蛍光で標識される粒子の量の変化より生じるのではなくて、環境を感知する蛍光色素の輝度の変化より生じることである。従って、輝度の変化は、粒子の結合状態に依存する。詳細には、本発明は、上記の文献より、以下のように異なる：
（ａ）それぞれの蛍光測定において、粒子とリガンドの量は予め決定されていて、例えば、洗浄工程によって変化しない。
【０１７２】
（ｂ）各標識（発蛍光団）の輝度は、標識粒子がリガンドへ結合しているか否かに依存する。
（ｃ）予測される蛍光変化がごく小さい可能性があって、小さな温度依存性の蛍光変化によってマスクされる可能性があるので、温度は、注意深く制御される。
【０１７３】
本発明において、蛍光変化は、異なる蛍光粒子量より生じるのではなくて、リガンドが結合しているか否かに基づいた、個々の粒子の蛍光強度の変化より生じる。特に、蛍光は、リガンドが標識（蛍光）粒子へ結合している場合に増加するか又は減少する可能性がある。結合定数（Ｋｄ又はＫａと呼ばれる）を決定するには、希釈系列を必要とする。さらに、リガンドも粒子も、蛍光測定の間、予め決定されたのと同じ濃度で存在する。洗浄工程は、無い。
【０１７４】
本発明は、以下の項目に要約される：
１．以下の工程：
ａ）標識粒子とリガンドを溶液中に含んでなる試料を提供する工程（ここで標識粒子は、該溶液中に溶解又は分散しているか又は固体支持体上に固定されている）；
ｂ）標識粒子を蛍光で励起させて、励起粒子の蛍光を所定温度で検出する工程；
ｃ）工程（ａ）と工程（ｂ）をリガンドの該溶液中の異なる濃度で複数回繰り返す工程；及び
ｄ）標識粒子の蛍光のリガンド濃度依存性の変化に基づいて、標識粒子とリガンドの間の相互作用について決定する工程を含んでなる、標識粒子とリガンドの間の相互作用を測定するための方法。ここで標識粒子は、一般式（Ｉ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）又は（ＩＩＩ）：
【０１７５】
【化１２】
2020527696.tif 000018
【０１７６】
[式中：
Ｘ１は、Ｏ、Ｓ、又はＣＲ５Ｒ６であり；
Ｘ２は、Ｏ、Ｓ、又はＣＲ７Ｒ８であり；
Ｒ１とＲ２は、それぞれ独立して、水素と置換されてよいアルキル基からなる群より選択され；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８は、それぞれ独立して、ヒドロキシ、カルボキシ、スルホン酸、チオール又はその塩、水素、ハロゲン、置換されてよいカルボン酸エステル基、ニトロ基、アミン、アミド、置換されてよいアルキル基（好ましくはＣ１−４アルキル）、置換されてよいアルコキシ基、及び置換されてよいアルケニル基からなる群より選択され；
但し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８の少なくとも１つは、それによって色素が粒子へコンジュゲートされるスペーサー基であり（ここで該スペーサー基は、２個のＣＨ２基より長い）；
ａは、０〜４の整数であり；
ｂは、０〜４の整数であり；そして
ｎは、１〜３の整数、好ましくは１又は２である］；
【０１７７】
【化１３】
2020527696.tif 000019
【０１７８】
【化１４】
2020527696.tif 000020
【０１７９】
［式中：
Ｘ３とＸ４の一方はＮＲ９であって、Ｘ３とＸ４の他方は、Ｏ、Ｓ、又はＣＲ１３Ｒ１４であり；
Ｒ９は、水素と置換されてよいアルキル基からなる群より選択され；
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、及びＲ１４は、それぞれ独立して、ヒドロキシ、カルボキシ、スルホン酸、チオール又はその塩、水素、ハロゲン、置換されてよいカルボン酸エステル基、ニトロ基、アミン、アミド、置換されてよいアルキル基（好ましくはＣ１−４アルキル）、置換されてよいアルコキシ基、及び置換されてよいアルケニル基からなる群より選択され；
但し、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、及びＲ１４の少なくとも１つは、それによって色素が粒子へコンジュゲートされるスペーサー基であり（ここで該スペーサー基は、２個のＣＨ２基より長い）；
ｃは、０〜４の整数であり；
ｄは、０〜２の整数であり；
ｅは、０〜４の整数であり；そして
ｍは、１〜３の整数、好ましくは１又は２である］；及び
【０１８０】
【化１５】
2020527696.tif 000021
【０１８１】
［式中：
Ｙは、ＯＲ１８又はＮＲ１９Ｒ２０であり；
Ｚは、Ｏ又は＋ＮＲ２１Ｒ２２であり；
Ｒ１５、Ｒ１６、及びＲ１７は、それぞれ独立して、ヒドロキシ、カルボキシ、スルホン酸、チオール又はその塩、水素、ハロゲン、置換されてよいカルボン酸エステル基、ニトロ基、アミン、アミド、置換されてよいアルキル基（好ましくはＣ１−４アルキル）、置換されてよいアルコキシ基、及び置換されてよいアルケニル基からなる群より選択され；
但し、Ｒ１７の少なくとも１つは、それによって色素が粒子へコンジュゲートされるスペーサー基であり；
Ｒ１８は、Ｈ又はアルカリ金属イオンであり、
Ｒ１９、Ｒ２０、Ｒ２１、及びＲ２２は、それぞれ独立して、水素と置換されてよいアルキル基からなる群より選択され、好ましくは、Ｒ１９、Ｒ２０、Ｒ２１、及びＲ２２は、それぞれ同じであり；
ｆは、０〜３の整数であり；
ｇは、０〜３の整数であり；そして
ｈは、１〜５の整数である］によって表される色素からなる群より選択される１種以上の色素で標識される。
【０１８２】
２．標識粒子とリガンドが工程ａ）において溶液中の所定濃度で提供されるか又は、標識粒子が固体支持体上に固定された所定量で提供されて、リガンドが所定濃度で提供され；そして、工程ａ）において提供される溶液は、工程ｂ）において、標識粒子を蛍光で励起させて、励起粒子の蛍光を所定温度で検出するために使用される、項目１の方法。
【０１８３】
３．工程（ｂ）が以下の工程：
ｂａ）該溶液を所定温度まで加熱するか又は冷却する工程；
ｂｂ）標識粒子を蛍光で励起させて、励起粒子の蛍光を所定温度で検出する工程を含む、項目１又は項目２に記載の方法。
【０１８４】
４．以下の工程：
ａ）標識粒子とリガンドを溶液中に含んでなる試料を提供する工程（ここで標識粒子は、該溶液中に溶解又は分散しているか又は固体支持体上に固定されている）；
ｂａ）該溶液を所定温度まで加熱するか又は冷却する工程；
ｂｂ）標識粒子を蛍光で励起させて、励起粒子の蛍光を所定温度で検出する工程；
ｃ）工程（ａ）と工程（ｂ）をリガンドの該溶液中の異なる濃度で複数回繰り返す工程；及び
ｄ）標識粒子の蛍光のリガンド濃度依存性の変化に基づいて、標識粒子とリガンドの間の相互作用について決定する工程を含んでなる、項目１又は項目２に記載の方法。
【０１８５】
５．工程（ｂ）が以下の工程：
ｂ１）標識粒子を蛍光で励起させて、励起粒子の蛍光を第一所定温度で検出する工程；
ｂ２）該溶液を第二所定温度まで加熱するか又は冷却する工程；
ｂ３）標識粒子を蛍光で励起させて、励起粒子の蛍光を第二所定温度で検出する工程を含む、項目１又は項目２に記載の方法。
【０１８６】
６．式（Ｉ）の前記色素が一般式（Ｉ’）：
【０１８７】
【化１６】
2020527696.tif 000022
【０１８８】
[式中：
Ｘ１は、Ｏ又はＣＲ５Ｒ６であり；
Ｘ２は、Ｏ又はＣＲ７Ｒ８であり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８は、それぞれ独立して、置換されてよいＣ１−２０アルキル基であり；
Ｒ３とＲ４は、それぞれ独立して、水素とスルホン酸又はその塩からなる群より選択され；
但し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８の１つは、それによって色素が粒子へコンジュゲートされるスペーサー基であり（ここで該スペーサー基は、２個のＣＨ２基より長い）；そして
ｎは、１又は２に等しい整数である］によって表される色素である、項目１〜項目５のいずれかに記載の方法。
【０１８９】
７．式（ＩＩａ）又は（ＩＩｂ）の前記色素が一般式（ＩＩａ’）又は（ＩＩｂ’）：
【０１９０】
【化１７】
2020527696.tif 000023
【０１９１】
【化１８】
2020527696.tif 000024
【０１９２】
［式中：
Ｘ３とＸ４の一方はＮＲ９であって、Ｘ３とＸ４の他方はＣＲ１３Ｒ１４であり；
スルホネート基は、ＮＲ９に対して４位にあり；
Ｒ９は、置換されてよいＣ１〜Ｃ２０アルキル基であり；
Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、及びＲ１４は、それぞれ独立して、ヒドロキシ、カルボキシ、スルホン酸、チオール又はその塩、水素、ハロゲン、置換されてよいカルボン酸エステル基、ニトロ基、アミン、アミド、置換されてよいアルキル基（好ましくはＣ１−４アルキル）、置換されてよいアルコキシ基、及び置換されてよいアルケニル基からなる群より選択され；
但し、Ｒ９、Ｒ１３、及びＲ１４の１つは、それによって色素が粒子へコンジュゲートされるスペーサー基であり（ここで該スペーサー基は、２個のＣＨ２基より長い）；
ｄは、０〜２の整数であり；
ｅは、０〜３の整数であり；そして
ｍは、１又は２に等しい整数である］によって表される色素である、項目１〜項目５のいずれかに記載の方法。
【０１９３】
８．式（ＩＩａ’）又は（ＩＩｂ’）の前記色素が一般式（ＩＩａ’’）又は（ＩＩｂ’’）：
【０１９４】
【化１９】
2020527696.tif 000025
【０１９５】
【化２０】
2020527696.tif 000026
【０１９６】
［式中：
Ｘ３とＸ４の一方はＮＲ９であって、Ｘ３とＸ４の他方はＣＲ１３Ｒ１４であり；
スルホネート基は、ＮＲ９に対して４位にあり；
Ｒ９は、置換されてよいＣ３−Ｃ６アルキル基であり；
Ｒ１３とＲ１４は、それぞれ独立して、置換されてよいＣ１−４アルキル基であり；
但し、Ｒ９、Ｒ１３、及びＲ１４の１つは、それによって色素が粒子へコンジュゲートされるスペーサー基であり（ここで該スペーサー基は、２個のＣＨ２基より長い）；そして
ｍは、１又は２に等しい整数である］によって表される色素である、項目７に記載の方法。
【０１９７】
９．一般式（Ｉ）、（Ｉ’）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩａ’）、（ＩＩｂ’）、（ＩＩａ’’）又は（ＩＩｂ’’）の前記色素中のスペーサー基が置換されてよいＣ４〜Ｃ２０アルキレン鎖であり、ここで該アルキレン鎖の１個以上の炭素原子は、独立して、脂環式基、アリール基、複素環式基、ヘテロアリール基、又はＯ、Ｎ、及びＳからなる群より選択されるヘテロ原子に置き換わってよい、項目１〜項目８のいずれかに記載の方法。
【０１９８】
１０．スペーサー基が置換されてよいＣ４〜Ｃ２０アルキレン鎖であり、ここで１個の炭素原子は、１つのアリール基に置き換わってよい、項目９に記載の方法。
１１．式（ＩＩＩ）の前記色素が一般式（ＩＩＩ’）：
【０１９９】
【化２１】
2020527696.tif 000027
【０２００】
［式中：
Ｙは、ＯＨ又はＮ（ＣＨ３）２であり；
Ｚは、Ｏ又は＋Ｎ（ＣＨ３）２であり；
Ｒ１５とＲ１６は、それぞれ独立して、水素又はハロゲンであり；
Ｒ１７は、それによって色素が粒子へコンジュゲートされるスペーサー基であり；そして
Ｒ１７ａは、カルボキシ基又はその塩である］によって表される色素である、項目１〜項目５のいずれかに記載の方法。
【０２０１】
１２．一般式（ＩＩＩ）又は（ＩＩＩ’）の前記色素中のスペーサー基が置換されてよいＣ２〜Ｃ１０アルキレン鎖であり、ここで該アルキレン鎖の１個以上の炭素原子は、独立して、脂環式基、アリール基、ヘテロアリール基、複素環式基、又はＯ、Ｎ、及びＳからなる群より選択されるヘテロ原子に置き換わってよい、項目１〜項目５又は項目１１のいずれかに記載の方法。
【０２０２】
１３．スペーサー基が置換されてよいＣ３〜Ｃ７アルキレン鎖であり、ここで該アルキレン鎖の１個以上の炭素原子は、独立して、Ｏ、Ｎ、及びＳからなる群より選択されるヘテロ原子に置き換わってよい、項目１２に記載の方法。
【０２０３】
１４．所定温度が、−２０℃〜１１５℃、好ましくは０．１℃〜１００℃の範囲、より好ましくは５℃〜６０℃の範囲、なおより好ましくは１０℃〜６０℃の範囲、最も好ましくは１０℃〜４０℃の範囲にある、項目１〜項目１３のいずれかに記載の方法。
【０２０４】
１５．所定温度が室温とは異なる、項目１４に記載の方法。
１６．所定温度が、リガンドが標的粒子へ結合するときの温度である、項目１４又は項目１５に記載の方法。
【０２０５】
１７．所定温度が、蛍光励起においてコンホメーション変化を受ける色素の一部がリガンドの標識粒子への結合により変化するときの温度である、項目１４又は項目１５に記載の方法。
【０２０６】
１８．所定温度が、色素の光異性化率又は内部転換率がリガンドの標識粒子への結合により変化するときの温度である、項目１４又は項目１５に記載の方法。
１９．所定温度が＋／−１Ｋ以内、好ましくは＋／−０．５Ｋ以内に制御される、項目１〜項目１８のいずれかに記載の方法。
【０２０７】
２０．加熱するか又は冷却する工程が、加熱又は冷却液、加熱又は冷却ガス、加熱素子、ペルティエ素子、電磁放射、及びこれらの組合せからなる群より選択される加熱又は冷却源を使用して行われる、項目３〜項目１９のいずれかに記載の方法。
【０２０８】
２１．第一所定温度が、−２０℃〜１１５℃、好ましくは０．１℃〜１００℃の範囲、より好ましくは５℃〜６０℃の範囲、なおより好ましくは１０℃〜６０℃の範囲、最も好ましくは１０℃〜４０℃の範囲にある、項目５〜項目２１のいずれかに記載の方法。
【０２０９】
２２．第二所定温度が、−２０℃〜１１５℃、好ましくは０．１℃〜１００℃の範囲、より好ましくは５℃〜６０℃の範囲、なおより好ましくは１０℃〜６０℃の範囲、最も好ましくは１０℃〜４０℃の範囲にある、項目５〜項目２０のいずれかに記載の方法。
【０２１０】
２３．第一所定温度と第二所定温度が、−２０℃〜１１５℃、好ましくは０．１℃〜１００℃の範囲、より好ましくは５℃〜６０℃の範囲、なおより好ましくは１０℃〜６０℃の範囲、最も好ましくは１０℃〜４０℃の範囲にある、項目５〜項目２０のいずれかに記載の方法。
【０２１１】
２４．第一所定温度と第二所定温度が＋／−１Ｋ以内、好ましくは＋／−０．５Ｋ以内に制御される、項目５〜項目２３のいずれかに記載の方法。
２５．第二温度と第一温度の間の差が＋／−０．１Ｋ〜＋／−９０Ｋの範囲、好ましくは＋／−１Ｋ〜＋／−４０Ｋの範囲、より好ましくは＋／−１Ｋ〜＋／−２０Ｋの範囲にある、項目５〜項目２４のいずれかに記載の方法。
【０２１２】
２６．試料が、マルチウェルプレート、キャピラリー、キュベット、反応管、ピペットチップ、マイクロ流体素子、液滴、及び透明容器からなる群より選択されるチャンバにおいて提供される、項目１〜項目２５のいずれかに記載の方法。
【０２１３】
２７．粒子が、有機分子、生体分子、ナノ粒子、ミクロ粒子、小胞、生体細胞又は細胞内フラグメント、生体組織、ウイルス粒子、ウイルス、及び細胞小器官からなる群より選択される、項目１〜項目２６のいずれかに記載の方法。
【０２１４】
２８．前記生体分子が、アミノ酸、タンパク質、ペプチド、単糖類及び二糖類、多糖類、脂質、糖脂質、脂肪酸、ステロール、ビタミン、神経伝達物質、酵素、ヌクレオチド、代謝産物、核酸、及びこれらの組合せからなる群より選択される、項目２７に記載の方法。
【０２１５】
２９．前記生体分子が、タンパク質、ペプチド、酵素、核酸、及びこれらの組合せからなる群より選択される、項目２８に記載の方法。
３０．前記タンパク質が、酵素、輸送タンパク質、阻害タンパク質、構造タンパク質、シグナル伝達タンパク質、リガンド結合タンパク質、シャペロン、抗体、及び受容体からなる群より選択される、項目２９に記載の方法。
【０２１６】
３１．前記タンパク質が、酵素、輸送タンパク質、阻害タンパク質、シャペロン、抗体、及び受容体からなる群より選択される、項目３０に記載の方法。
３２．前記核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、及びＰＮＡからなる群より選択される、項目２９に記載の方法。
【０２１７】
３３．標識粒子の溶液中の濃度が１０ピコモル濃度〜１マイクロモル濃度、好ましくは１００ピコモル濃度〜１００ナノモル濃度である、項目１〜項目３２のいずれかに記載の方法。
【０２１８】
３４．リガンドの濃度が、０．０１ピコモル濃度〜１モル濃度、好ましくは１ピコモル濃度〜１００ミリモル濃度、より好ましくは１０ピコモル濃度〜１０ミリモル濃度である、項目１〜項目３４のいずれかに記載の方法。
【０２１９】
３５．前記リガンドが、イオン、金属、化合物、薬物フラグメント、炭水化物、低分子、薬物、プロドラッグ、脂質、タンパク質、ペプチド、ペプトイド、酵素、核酸、ナノ粒子、リポソーム、ＳＵＶ、ＧＵＶ、ポリマー、有機分子、無機分子、金属錯体、ホルモン、フレーバー、着臭剤、粒子、及び（マイクロ）ビーズからなる群より選択される、項目１〜項目３４のいずれかに記載の方法。
【０２２０】
３６．粒子とリガンドが、粒子→リガンドとして示される以下の組合せ：酵素→脂質、受容体→ホルモン、受容体→→ケモカイン、酵素→阻害剤、受容体→神経伝達物質、受容体→サイトカイン、酵素→イオン、受容体→イオン、受容体→アミノ酸、酵素→補因子、受容体→脂質、受容体→ステロール、酵素→フラグメント、受容体→ペプチド、受容体→フラグメント、酵素→代謝産物、受容体→受容体、受容体→糖脂質、酵素→ＤＮＡ、受容体→着臭剤、受容体→プロドラッグ、酵素→ＲＮＡ、受容体→薬物、酵素→単糖類／二糖類又は多糖類、酵素→脂肪酸、酵素→ビタミン、酵素→プロドラッグ、酵素→薬物、リポソーム→タンパク質、輸送タンパク質→基質、抗体→抗原、ウイルス粒子→受容体、ウイルス→構造タンパク質、抗体→Ｆｃ受容体、シャペロン→ＡＴＰ、ｓｓＤＮＡ→ｓｓＤＮＡ、アプタマー→リガンド、シャペロン→イオン、ＲＮＡ→低分子、多糖類→低分子、シャペロン→タンパク質、ＤＮＡ→低分子、構造タンパク質→構造タンパク質、シグナル伝達タンパク質→シグナル伝達タンパク質、シグナル伝達タンパク質→低分子、シグナル伝達タンパク質→プロドラッグ、シグナル伝達タンパク質→薬物、シグナル伝達タンパク質→脂質、構造タンパク質→イオン、ナノ粒子→タンパク質、細胞小器官→タンパク質、ナノ粒子→ＤＮＡ、細胞小器官→脂質、ナノ粒子→ＲＮＡからなる群より選択される、項目１〜項目３５のいずれかの方法。
【０２２１】
３７．標識粒子とリガンドの間の相互作用を測定する方法が粒子とリガンドの解離定数を測定する方法である、項目１〜項目３６のいずれかの方法。
３８．以下の工程：
ａ）標識粒子を含んでなる試料を提供する工程；
ｂ）標識粒子を蛍光で励起させて、励起粒子の第一蛍光を第一温度で検出する工程；
ｃ）該試料を第二所定温度まで加熱するか又は冷却する工程；
ｄ）標識粒子を蛍光で励起させて、励起粒子の第二蛍光を第二温度で検出する工程；
ｅ）第一蛍光と第二蛍光に基づいて、該粒子の分子間及び／又は分子内相互作用、及び／又は修飾／改変について特性決定する工程を含んでなる、分子間及び／又は分子内相互作用を測定するための方法であって、ここで標識粒子は、項目１又は項目６〜項目１３のいずれかに定義されるような一般式（Ｉ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）又は（ＩＩＩ）によって表される色素からなる群より選択される１種以上の色素で標識される。
【０２２２】
３９．以下の工程：
ａ）標識粒子を含んでなる試料を提供する工程；
ｂ）標識粒子を蛍光で励起させて、励起粒子の第一蛍光を検出する工程；
ｃ）所定時間の間待つ工程；
ｄ）標識粒子を蛍光で励起させて、励起粒子の第二蛍光を検出する工程；
ｅ）第一蛍光と第二蛍光に基づいて、該粒子の時間依存性の変化について特性決定する工程を含んでなる、時間依存性の変化を測定するための方法であって、ここで標識粒子は、項目１又は項目６〜項目１３のいずれかに定義されるような一般式（Ｉ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）又は（ＩＩＩ）によって表される色素からなる群より選択される１種以上の色素で標識される。
【０２２３】
４０．以下の工程：
ａ）標識粒子を含んでなる第一試料を提供する工程；
ｂ）標識粒子を蛍光で励起させて、第一試料中の励起粒子の第一蛍光を検出する工程；
ｃ）標識粒子を実質的に同じ濃度で含んでなる第二試料を提供する工程（ここで第二試料は、第一試料とは異なる）；
ｄ）標識粒子を蛍光で励起させて、第二試料中の励起粒子の第二蛍光を検出する工程；
ｅ）第一蛍光と第二蛍光に基づいて、該粒子の環境依存性の変化について特性決定する工程を含んでなる、環境依存性の変化を測定するための方法であって、ここで標識粒子は、項目１又は項目６〜項目１３のいずれかに定義されるような一般式（Ｉ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）又は（ＩＩＩ）によって表される色素からなる群より選択される１種以上の色素で標識される。
【０２２４】
４１．２種以上の反応色素を含んでなるタンパク質標識化キットであって、ここで各色素は、独立して、項目１又は項目６〜項目１３のいずれかに定義されるような一般式（Ｉ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）又は（ＩＩＩ）によって表される構造単位を含み、該色素は、スペーサー基を有し、該スペーサー基は、該色素のタンパク質へのコンジュゲーションを可能にする反応基を有する。
【０２２５】
４２．項目１〜項目３１のいずれか１項の方法の少なくとも１つにおけるキットの使用について説明する説明マニュアルをさらに含んでなる、項目４１のタンパク質標識化キット。
【０２２６】
４３．緩衝液交換カラム、精製カラム、標識化緩衝液、アダプター、及びこれらの組合せからなる群より選択される少なくとも１つをさらに含んでなる、項目４１又は項目４２のタンパク質標識化キット。
【実施例】
【０２２７】
試薬：
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）誘導化色素を Thermo Fischer Scientific（フルオレセイン、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８、ＴＡＭＲＡ）、Lumiprobe（Ｃｙ３、Ｃｙ５、ジスルホＣｙ５、Ｃｙ５．５）、Dyomics（ＤＹ４９５、ＤＹ５６７Ｐ１、ＤＹ６３０、ＤＹ６３１、ＤＹ６４７Ｐ１、ＤＹ６５０）、Seta Biochemicals（ＳｅＴａｕ−６４７）、Cyandye（モノスルホＣｙ３、モノスルホＣｙ５）、及び ATTO TECH（ＡＴＴＯ４８８、ＡＴＴＯ６４７Ｎ、ＡＴＴＯ６５５）より入手した。使用するすべての色素の構造を図面１９ａ〜図面１９ｅに示す。タンパク質（Ｈｓｐ９０、ｐ３８α（ｐ３８アルファ）、ＴＥＭ１、ＢＬＩＰ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ））を Crelux より入手して、炭酸脱水酵素ＩＩ（ＣＡＩＩ）をシグマ・アルドリッチ（Sigma-Aldrich）より購入した。ＮＨＳ標識化緩衝液と色素分離カラムは、NanoTemper Technologies GmbH より入手した。アッセイ緩衝液として、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を補充したＴｒｉｓ−ＭｇＣｌ２緩衝液を使用した［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）。
【０２２８】
タンパク質標識化：
標的タンパク質（ｐ３８α、炭酸脱水酵素、ＴＥＭ１、Ｈｓｐ９０）を炭酸塩緩衝液においてｐＨ８．２で標識した。色素対タンパク質比は、３：１と５：１の間で変動した。標識反応は、室温で３０分間行われた。NanoTemper Technologies によって提供される色素分離カラムを使用して、標識タンパク質より遊離色素を分離した。
【０２２９】
使用デバイス：
Ａ）IR.Red、IR.Green、又は IR.Blue：赤色、緑色、又は青色の蛍光検出チャネルとＩＲレーザー（波長１４８０ｎｍ）を組み込んだ NanoTemper Technologies プロトタイプを加熱源として使用した。使用した光フィルター（励起／放射（ｎｍ））は、IR.Red ５００〜５８０／６５５〜７２０ｎｍ、IR.Green ５１５〜５５５／６１８〜６５２ｎｍ、及び IR.Blue ４５０〜４９０／６００〜６５０ｎｍである。使用したＬＥＤは、IR.Red ２０ｍＡ、２．１Ｖ、６３０ｎｍ；IR.Green ２０ｍＡ、３．４Ｖ、５４０ｎｍ；及び IR.Blue ２０ｍＡ、３．４Ｖ、４８０ｎｍである。これらのデバイスを異なる発蛍光団とそれらの感度の熱光学的特性決定のために使用して、結合事象について報告した。
【０２３０】
Ｂ）Prometheus NT.48：ＵＶ範囲の励起及び検出顕微鏡（optics）を有する、NanoTemper Technologies 製の標準ＮＴ．４８デバイス。試料の加熱は、ペルティエデバイスで達成した。主たる適用は、タンパク質の融解曲線の検出である。
【０２３１】
Ｃ）PR.Red：赤色蛍光検出チャネル（５００〜５８０／６５５〜７２０ｎｍ）と組み合わせてペルティエデバイスベースの試料加熱を使用する、NanoTemper Technologies のプロトタイプ。このデバイスは、異なる発蛍光団と結合事象やタンパク質の熱的アンフォールディングへのそれらの感度の熱光学的特性決定のために使用した。
【０２３２】
蛍光測定：
加熱時の蛍光強度の変化については、ＩＲレーザーを使用してプローブを加熱するには IR.Red、IR.Green、又は IR.Blue を使用して、又はペルティエデバイスを使用してプローブを加熱するには PR.Red を使用して、測定した。実験では、プローブを３８４ウェルプレート又はカスタマイズされたガラス容器のいずれかへロードした。プローブは、遊離色素、所与の濃度で単独的に蛍光標識された標的、又は所与の濃度で蛍光標識された標的と混合した特定リガンドの希釈系列のいずれかを含有した。
【０２３３】
データの獲得及び解析：
データ獲得の間、アナログ−デジタル変換器由来の生データを蛍光強度として（任意単位で）表示した。次いで、それぞれの個別トレース（trace）を１で始まるように正規化した。結合曲線の図示のために、加熱の前と後の間隔を設定して、この間隔内のデータを平均化して、Ｆｎｏｒｍを計算した。結合曲線中の各データ点は、あるリガンド濃度での平均Ｆｎｏｒｍを表す。
【０２３４】
解離定数（Ｋｄ）は、MO Affinity 解析ソフトウェア（NanoTemper Technologies GmbH）又は Origin（Origin Lab）のいずれかで決定した。蛍光強度の温度誘発性の変化は、以下のように正規化した：イニシャル蛍光（Ｆｉ）強度を１と定義して、データを正規化ＦＴ／Ｆｉ（ここでＦＴは、所与の増加温度での蛍光強度である）として正規化した。得られるＦｎｏｒｍを所与のリガンドの増加濃度に対してプロットした。解離定数（Ｋｄ）は、質量作用の法則に従って１：１の化学量論を有する分子相互作用について記載する適合度（fit）に従って決定した。Ｋｄは、等式：
【式６】
【０２３５】
2020527696.tif 000028
【０２３６】
［式中、f(c) は、所与のリガンド濃度 c で結合した分率であり、Unbound は、標的のＦｎｏｒｍ信号であり、Bound は、複合体のＦｎｏｒｍ信号であり、Ｋｄは、解離定数又は結合親和性であって、ｃtarget は、標的のアッセイ中の最終濃度である］に適合させることによって推定する。
【０２３７】
参考実施例１
アッセイ緩衝液中１００ｎＭのＮＨＳ−エステル発蛍光団（ＩＲ色素６５０（LI-COR Biotechnology）、ＣＦ６４７（Biotium）、Ｄｙｌｉｇｈｔ  ６５５  Ｂ１、Ｂ２、及びＢ３（Thermo Scientific）、及びＣＦ６４０Ｒ（Biotium））を Prometheus NT.48 標準処理済キャピラリー（NanoTemper Technologies）の中へ同一２検体でロードして、４、８、１６、２４、３２、及び４０ｍＷのＩＲレーザ出力を使用する、Monolith NT.115 Blue/Red 顕微鏡付きのＩＲ−デバイスでの熱光学的実験へ処した。ＩＲ−レーザー誘発性の蛍光の変化について２０秒間モニターした。同じ試料をペルティエ素子により１Ｋ／分で加熱することによって直線温度ランプへも処した。Monolith NT.115 Blue/Red 顕微鏡（NanoTemper Technologies）を使用して、試料の蛍光を採取した。解析には、この熱光学的実験における相対蛍光損失量を、温度と、ペルティエデバイスにおける線形加熱を使用する実験からの相対蛍光損失量に関連付けた。この結果を図面１に提供する。
【０２３８】
PR.Red で観測された蛍光強度の温度誘発性の変化は、同じ温度での IR.Red で観測された蛍光強度の温度誘発性の変化と完全に相関する（図面１Ａと図面１Ｂ）。
参考実施例２
色素をＤＭＳＯに予め希釈して、アッセイ緩衝液で１００ｎＭの最終濃度までさらに希釈した。次いで、色素を高感度 Prometheus ガラスキャピラリー中へ充填して、PR.Red 中へ同一３検体でロードした。加熱ランプを１Ｋ／分に設定して、データを２９３〜３６８Ｋで記録した。この結果を図面２に提供する。
【０２３９】
参考実施例３
色素をＤＭＳＯに予め希釈して、所与の緩衝液で１００ｎＭの最終濃度までさらに希釈した。次いで、色素を高感度 Prometheus ガラスキャピラリー中へ充填して、PR.Red 中へ同一３検体でロードした。加熱ランプを１Ｋ／分に設定して、データを２９３〜３６８Ｋで記録した。
【０２４０】
図面３に示すように、温度誘発性の蛍光強度変化は、色素が存在する環境によっても追加的に調節されることがわかった。この感度の程度は、色素の構造に依存している。ＤＹ６４７Ｐ１とモノスルホＣｙ５は、ポリメチン色素であるが、スルホネート基の数が異なる。ＤＹ６４７Ｐ１が２つのスルホネート基を保有して、モノスルホＣｙ５は、スルホネート基を１つだけ保有する。
【０２４１】
実施例１
組換えＥｃｏＳＳＢタンパク質を、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Biochemistry, 1993, 32(10), pp 2585-2591 中の Curth U. et al. によって記載されるように精製した。このタンパク質を１μＭより、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び２ｍＭ  ＥＤＴＡの系列希釈液において０．４ｎＭまで希釈して、各濃度につき１０μｌの最終容量とした。引き続き、２０ｎＭ  Ｃｙ５−ＯｌｉｇｏｄＴ３５（Metabion）を同じ緩衝液に含有する１０μｌの溶液をそれぞれのＥｃｏＳＳＢ濃度液へ加えた。各溶液の１０μｌを Monolith NT.LabelFree Premium Coated Capillaries（PR.Red ペルティエデバイスを使用する実験用）と Monolith NT.115 Premium Coated Capillaries（レーザーデバイス IR.Red での実験用）の中へ充填した。PR.Red では７Ｋ／分で２９３Ｋから３６８Ｋへの線形勾配で、そして IR.Red では１６ｍＷのレーザ出力で加熱を実施した。３０２Ｋの温度での正規化蛍光変化をＥｃｏＳＳＢの濃度に対してプロットした。この結果を図面４に提供する。
【０２４２】
実施例２
タンパク質標識化：タンパク質のＴＥＭ１は、ＮＨＳ標識化緩衝液と１：３のタンパク質対色素標識比を使用して、モノスルホ−Ｃｙ５で標識した。故に、１００μｌの２４μＭ色素溶液を１００μｌの８μＭタンパク質溶液と混合して、反応を暗所にて室温で３０分間行った。サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、遊離色素を除去した。このためには、９ｍｌのアッセイ緩衝液を使用してＢカラムを平衡化した後で、標識反応液をロードしてこの樹脂に入れた。３００μｌのアッセイ緩衝液の添加後、６００μｌのアッセイ緩衝液を使用して、標識タンパク質を溶出させた。ここで、最初の１００μｌはどのタンパク質も含有しないので、捨てた。
【０２４３】
系列希釈液の調製：タンパク質標識化の後で、リガンドの系列希釈液を調製した。ＢＬＩＰをアッセイ緩衝液で１μＭへ希釈した。この溶液から始めて、１０μｌの試料容量を使用して１６段階の系列希釈液を調製した。この系列希釈液の調製後、１３２ｎＭの標識ＴＥＭ１の１０μｌをこの希釈系列へ加えた。上下のピペッティング操作によって試料を混合した。premium coated ガラスキャピラリーにロードする前に、試料を４℃及び１５，０００ｇで１０分間遠心分離した。
【０２４４】
PR.Red での測定とデータ解析：この実験は、PR.Red を使用して実施した。ＴＥＭ１のＢＬＩＰへの親和性についての測定は、２０％  ＬＥＤを使用して行った。データは、MO Affinity 解析ソフトウェア（NanoTemper Technologies）を使用して解析した。この結果を図面５に提供する。
【０２４５】
実施例３
タンパク質標識化：タンパク質のＣＡＩＩは、ＮＨＳ標識化緩衝液と１：３のタンパク質対色素標識比を使用して、モノスルホＣｙ５又はＤＹ６４７Ｐ１で標識した。故に、１００μｌの２４μＭ色素溶液を１００μｌの８μＭタンパク質溶液と混合して、反応を暗所にて室温で３０分間行った。実施例２に記載のように、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、遊離色素を除去した。
【０２４６】
系列希釈液の調製：タンパク質標識化の後で、リガンドの系列希釈液を調製した。フロセミドをアッセイ緩衝液で５０μＭへ希釈した。この溶液から始めて、１０μｌの試料容量を使用して１６段階の系列希釈液を調製した。この系列希釈液の調製後、１００ｎＭの標識ＣＡＩＩの１０μｌをこの希釈系列へ加えた。上下のピペッティング操作によって試料を混合した。premium coated ガラスキャピラリーにロードする前に、試料を４℃及び１５，０００ｇで１０分間遠心分離した。
【０２４７】
PR.Red での測定とデータ解析：この実験は、PR.Red を使用して実施した。ＣＡＩＩのフロセミドへの親和性についての測定は、２０％  ＬＥＤを使用して行った。データは、Origin ソフトウェア（Origin Lab Corporation）を使用して解析した。この結果を図面６に提供する。
【０２４８】
実施例４
タンパク質標識化：プロテインＡは、ＮＨＳ標識化緩衝液と１：３のタンパク質対色素標識比を使用して、モノスルホＣｙ５で標識した。故に、１００μｌの２４μＭ色素溶液を１００μｌの８μＭタンパク質溶液と混合して、反応を暗所にて室温で３０分間行った。実施例２に記載のように、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、遊離色素を除去した。
【０２４９】
系列希釈液の調製：タンパク質標識化の後で、リガンドの系列希釈液を調製した。トラスツズマブをＰＢＳ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０緩衝液で２．５μＭへ希釈した。この溶液から始めて、１０μｌの試料容量を使用して１６段階の系列希釈液を調製した。この系列希釈液の調製後、１０ｎＭの標識プロテインＡの１０μｌをこの希釈系列へ加えた。上下のピペッティング操作によって試料を混合した。premium coated ガラスキャピラリーにロードする前に、試料を４℃及び１５，０００ｇで１０分間遠心分離した。
【０２５０】
IR.Red での測定とデータ解析：この実験は、IR.Red を使用して実施した。プロテインＡのトラスツズマブへの親和性についての測定は、２０％  ＬＥＤを使用して行って、ＩＲ−レーザーのスイッチは切った。データは、MO Affinity 解析ソフトウェア（NanoTemper Technologies）と GraphPad Prism 7.0（GraphPad Software 社）を使用して解析した。この結果を図面７に提供する。
【０２５１】
実施例５
タンパク質標識化：ＩＬ−Ｒ１タンパク質は、標準的なＮＨＳ標識化プロトコールに従って、ＤｙＬｉｇｈｔ６５５誘導体で標識した。このために、色素は、ＤＭＳＯに予め希釈して、ＮＨＳ標識化緩衝液で６μＭの最終濃度までさらに希釈した。タンパク質は、同じ標識反応最適化緩衝液で２μＭの最終濃度まで希釈した。標識反応では、１００μｌの色素溶液を１００μｌのタンパク質溶液と混合して、反応を暗所にて室温で３０分間行った。その後、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、遊離色素を除去した。このためには、９ｍｌのアッセイ緩衝液を使用してＢカラムを平衡化した後で、標識反応液をロードしてこの樹脂に入れた。３００μｌのアッセイ緩衝液の添加後、６００μｌのアッセイ緩衝液を使用して、標識タンパク質を溶出させた。ここで、最初の１００μｌはどのタンパク質も含有しないので、捨てた。
【０２５２】
系列希釈液の調製：タンパク質標識化の後で、リガンド・アナキンラ（Anakinra）の系列希釈液を１０μｌの試料容量で調製した。この系列希釈液の調製後、１ｎＭ標識タンパク質の１０μｌをすべてのリガンド希釈液へ加えた。上下のピペッティング操作によって試料を混合した。premium coated ガラスキャピラリーにロードする前に、試料を４℃及び１５，０００ｇで１分間遠心分離した。
【０２５３】
IR.Red での測定とデータ解析：この実験は、IR.Red を１２ｍＷのＩＲ−レーザー出力で使用して、プローブを６０％のＬＥＤ出力で３１０Ｋまで加熱して実施した。データは、MO Affinity 解析ソフトウェア（NanoTemper Technologies）を使用して解析した。この結果を図面８に提供する。
【０２５４】
実施例６
タンパク質標識化：ｐ３８αタンパク質は、ＮＨＳ標識化ケミストリーを使用して、Ｃｙ５で標識した。このために、色素は、ＤＭＳＯに予め希釈して、ＮＨＳ標識化緩衝液で２４μＭの最終濃度までさらに希釈した。タンパク質は、同じ標識反応最適化緩衝液を使用して８μＭの最終濃度まで希釈した。標識反応では、１００μｌの色素溶液を１００μｌのタンパク質溶液と混合して、反応を暗所にて室温で３０分間行った。その後、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、遊離色素を除去した。このためには、９ｍｌのアッセイ緩衝液を使用してＢカラムを平衡化した後で、標識反応液をロードしてこの樹脂に入れた。３００μｌのアッセイ緩衝液の添加後、６００μｌのアッセイ緩衝液を使用して、標識タンパク質を溶出させた。ここで、最初の１００μｌはどのタンパク質も含有しないので、捨てた。
【０２５５】
系列希釈液の調製：タンパク質標識化の後で、リガンドの系列希釈液を調製した。４％  ＤＭＳＯを含むアッセイ緩衝液をアッセイ緩衝液として役立てた。ＰＤ１６９３１６をアッセイ緩衝液で１０μＭと４％  ＤＭＳＯへ希釈した。この溶液から始めて、１０μｌの試料容量を使用して１６段階の系列希釈液を調製した。この系列希釈液の調製後、１００ｎＭの標識タンパク質の１０μｌをすべてのリガンド希釈液へ加えた。上下のピペッティング操作によって試料を混合した。premium coated ガラスキャピラリーにロードする前に、試料を４℃及び１５，０００ｇで１０分間遠心分離した。
【０２５６】
IR.Red での測定とデータ解析：この実験は、IR.Red を２４ｍＷのＩＲ−レーザー出力と２０％のＬＥＤ出力で使用して実施した。プローブは、ＩＲ−レーザーで３０８Ｋの温度まで予熱した。このプローブを２９６Ｋへ冷却してすぐに、蛍光変化をモニターした。データは、MO Affinity 解析ソフトウェア（NanoTemper Technologies）を使用して解析した。この結果を図面９に提供する。
【０２５７】
実施例７
タンパク質標識化：Ｈｉｓタグ付きｐ３８αをＯｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８  ｔｒｉｓ−ＮＴＡ誘導体で標識した。このためには、色素をＰＢＳＴで１００ｎＭの最終濃度へ希釈し、一方タンパク質濃度は、ＰＢＳＴ緩衝液を使用して２００ｎＭへ調整した。両方の試料を２００μｌの最終容量で１：１に混合して、標識反応は、暗所にて室温で３０分間行った。その後、この反応混合物を４℃及び１５，０００ｇで１０分間遠心分離した。
【０２５８】
Ｈｉｓタグ付きｐ３８αは、ＮＨＳ標識化ケミストリーを使用して、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ４８８、Ｃｙ５、ＺＣｙ５、ＴＡＭＲＡ、及びＴＡＭＲＡＸで標識した。このために、色素は、ＤＭＳＯに予め希釈して、ＮＨＳ標識化緩衝液で、Ｚ−Ｃｙ５については６μＭで他の色素については２４μＭの最終濃度までさらに希釈した。タンパク質は、同じ標識反応最適化緩衝液を使用して、Ｚ−Ｃｙ５については２μＭで他の色素については８μＭの最終濃度まで希釈した。標識反応では、１００μｌの色素溶液を１００μｌのタンパク質溶液と混合して、反応を暗所にて室温で３０分間行った。その後、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、遊離色素を除去した。このためには、９ｍｌのアッセイ緩衝液を使用してＢカラムを平衡化した後で、標識反応液をロードしてこの樹脂に入れた。３００μｌのアッセイ緩衝液の添加後、６００μｌのアッセイ緩衝液を使用して、標識タンパク質を溶出させた。ここで、最初の１００μｌはどのタンパク質も含有しないので、捨てた。
【０２５９】
系列希釈液の調製：タンパク質標識化の後で、リガンドの系列希釈液を調製した。４％  ＤＭＳＯを含むアッセイ緩衝液をアッセイ緩衝液として役立てた。Ｚ−Ｃｙ５標識ｐ３８ではＰＤ１６９３１６を、そして他の標識産物ではＢＩＲＢをアッセイ緩衝液で１０μＭと４％  ＤＭＳＯへ希釈した。この溶液から始めて、１０μｌの試料容量を使用して１６段階の系列希釈液を調製した。この系列希釈液の調製後、１００ｎＭの標識タンパク質の１０μｌをすべてのリガンド希釈液へ加えた。上下のピペッティング操作によって試料を混合した。premium coated ガラスキャピラリーにロードする前に、試料を４℃及び１５，０００ｇで１０分間遠心分離した。
【０２６０】
IR.Red での測定とデータ解析：この実験は、IR.Red を２４ｍＷのＩＲ−レーザー出力で使用して実施した。色素：Ｃｙ５、Ｚ−Ｃｙ５、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８、及びＯｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８−ｔｒｉｓ  ＮＴＡでは、プローブを２９６Ｋから３１０Ｋへ、ＴＡＭＲＡとＴＡＭＲＡ  Ｘでは、３１８Ｋへ加熱した。色素の蛍光強度の固有差のために、ＬＥＤ出力は、それぞれの色素について最適化しなければならなかった。ｐ３８α−Ｃｙ５では２０％、一方ｐ３８α  Ｚ−Ｃｙ５では６０％のＬＥＤ出力を使用して測定した。ＴＡＭＲＡとＴＡＭＲＡＸ標識ｐ３８αでは、１００％と４０％のＬＥＤ出力を使用して試験した。Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８とＯｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８−ｔｒｉｓ−ＮＴＡ標識ｐ３８αでは、それぞれ１００％と４０％のＬＥＤ出力を使用して検出した。データは、MO Affinity 解析ソフトウェア（NanoTemper Technologies）を使用して解析した。この結果を図面１０に提供する。
【０２６１】
実施例８
タンパク質標識化：タンパク質のＴＥＭ１とｐ３８αは、ＮＨＳ標識化緩衝液と１：３のタンパク質対色素標識比を使用して、ＤＹ６４７Ｐ１とモノスルホＣｙ５でともに標識した。故に、２４μＭ色素溶液の１００μｌを８μＭタンパク質溶液の１００μｌと混合して、反応を暗所にて室温で３０分間行った。実施例２に記載のように、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、遊離色素を除去した。
【０２６２】
系列希釈液の調製：タンパク質標識化の後で、リガンドの系列希釈液を調製した。４％  ＤＭＳＯを含むアッセイ緩衝液は、ＢＩＲＢに対するｐ３８αのアッセイ緩衝液として役立てた。一方、アッセイ緩衝液は、ＢＬＩＰに対するＴＥＭ１に使用した。ＢＩＲＢとＢＬＩＰをアッセイ緩衝液でそれぞれ１０μＭ及び４％  ＤＭＳＯと１μＭへともに希釈した。これらの溶液から始めて、１０μｌの試料容量を使用して１６段階の系列希釈液を調製した。この系列希釈液の調製後、１００ｎＭの標識ｐ３８α又は１３２ｎＭの標識ＴＥＭ１の１０μｌを希釈系列へ加えた。上下のピペッティング操作によって試料を混合した。premium coated ガラスキャピラリーにロードする前に、試料を４℃及び１５，０００ｇで１０分間遠心分離した。
【０２６３】
IR.Red での測定とデータ解析：この実験は、IR.Red を２４ｍＷのＩＲ−レーザー出力で、３１０Ｋと３１８Ｋの間の温度で使用して実施した。色素の蛍光強度の固有差のために、ＬＥＤ出力は、それぞれの色素について最適化しなければならなかった。ＢＬＩＰについてのＴＥＭ１親和性の測定は、ＤＹ６４７Ｐ１標識ＴＥＭ１では３０％のＬＥＤ出力を使用して、モノスルホ−Ｃｙ５標識ＴＥＭ１では８０％のＬＥＤ出力を使用して行った。ＢＩＲＢについてのｐ３８α−ＤＹ６４７Ｐ１親和性は、３０％のＬＥＤ出力を使用して測定し、一方、ｐ３８モノスルホ−Ｃｙ５については、８０％のＬＥＤ出力を使用して分析した。データは、MO Affinity 解析ソフトウェア（NanoTemper Technologies）を使用して解析した。この結果を図面１１に提供する。
【０２６４】
実施例９
タンパク質標識化：タンパク質のＴＥＭ１とｐ３８αをモノスルホ−Ｃｙ５、ＤＹ６３０、及びＤＹ６３１で、ＮＨＳ標識化ケミストリーと１：３、１：３、及び１：５の色素対タンパク質標識比をそれぞれ使用して標識した。故に、１００μｌの２４μＭ色素溶液を１００μｌの８μＭタンパク質溶液と混合して、反応を暗所にて室温で３０分間行った。実施例２に記載のように、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、遊離色素を除去した。
【０２６５】
系列希釈液の調製：タンパク質標識化の後で、リガンドのＢＬＩＰとＰＤ１６９３１６の系列希釈液を調製した。４％  ＤＭＳＯを含むアッセイ緩衝液は、ＰＤ１６９３１６に対するｐ３８αのアッセイ緩衝液として役立てた。一方、アッセイ緩衝液は、ＢＬＩＰに対するＴＥＭ１に使用した。ＰＤ１６９３１６とＢＬＩＰをアッセイ緩衝液でそれぞれ１０μＭ及び４％  ＤＭＳＯと１μＭへともに希釈した。これらの溶液から始めて、１０μｌの試料容量を使用して１６段階の系列希釈液を調製した。この系列希釈液の調製後、１００ｎＭの標識ｐ３８α又は１３２ｎＭの標識ＴＥＭ１の１０μｌを希釈系列へ加えた。上下のピペッティング操作によって試料を混合した。premium coated ガラスキャピラリーにロードする前に、試料を４℃及び１５，０００ｇで１０分間遠心分離した。
【０２６６】
IR.Red での測定とデータ解析：この実験は、IR.Red を２４ｍＷのＩＲ−レーザー出力で使用して、プローブを３１０Ｋと３１８Ｋの間の温度まで加熱して実施した。色素の蛍光強度の固有差のために、ＬＥＤ出力は、それぞれの色素について最適化しなければならなかった：ＤＹ６３０標識ＴＥＭ１では１００％のＬＥＤ出力、ＤＹ６３１標識ＴＥＭ１では８０％のＬＥＤ出力、そしてモノスルホ−Ｃｙ５標識ＴＥＭ１では６０％のＬＥＤ出力。データは、MO Affinity 解析ソフトウェア（NanoTemper Technologies）を使用して解析した。この結果を図面１２に提供する。
【０２６７】
実施例１０
タンパク質のｐ３８αとＴＥＭ１をモノスルホ−Ｃｙ５でともに標識した。さらに、ＳｅＴａｕ６４７を使用して、ｐ３８αを標識した。このためには、色素をＤＭＳＯに溶かして、ＮＨＳ標識化緩衝液を使用して、２４μＭの最終濃度までさらに希釈した。１：３のタンパク質対色素比のために、ＮＨＳ標識化緩衝液を使用して、タンパク質を８μＭの最終濃度まで希釈した。標識反応では、１００μｌの色素溶液を１００μｌのタンパク質溶液と混合して、反応を暗所にて室温で３０分間行った。その後、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、遊離色素を除去した。このためには、９ｍｌのアッセイ緩衝液を使用してＢカラムを平衡化した後で、標識反応液をロードしてこの樹脂に入れた。３００μｌのアッセイ緩衝液の添加後、６００μｌのアッセイ緩衝液を使用して、標識タンパク質を溶出させた。ここで、最初の１００μｌはどのタンパク質も含有しないので、捨てた。Ｂカラム精製の後で、タンパク質を高感度 Prometheus ガラスキャピラリー（１．６μＭ）中へ直接ロードして、PR.Red を以下のデバイス設定：１Ｋ／分；２９３〜３６８Ｋで使用して、同一２検体で測定した。
【０２６８】
遊離色素をＤＭＳＯに予め希釈して、アッセイ緩衝液で１００ｎＭの最終濃度までさらに希釈した。次いで、色素を高感度 Prometheus ガラスキャピラリー中へ充填して、PR.Red デバイス中へ同一３検体でロードした。加熱ランプを１Ｋ／分に設定して、データを２９３〜３６８Ｋで記録した。マイクロソフト Excel を使用して、データを解析した。この結果を図面１５に提供する。
【０２６９】
実施例１１
タンパク質のＴＥＭ１とＭＢＰを、ＮＨＳ標識化ケミストリーと１：３のタンパク質対色素標識比を使用してモノスルホ−Ｃｙ５で標識した。このためには、色素をＤＭＳＯに溶かして、ＮＨＳ標識化緩衝液において、２４μＭの最終濃度までさらに希釈した。同一の標識反応最適化緩衝液を使用して、タンパク質を８μＭの最終濃度まで希釈した。標識反応では、１００μｌの色素溶液を１００μｌのタンパク質溶液と混合して、反応を暗所にて室温で３０分間行った。その後、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、遊離色素を除去した。このためには、９ｍｌのアッセイ緩衝液を使用してＢカラムを平衡化した後で、標識反応液をロードしてこの樹脂に入れた。３００μｌのアッセイ緩衝液の添加後、６００μｌのアッセイ緩衝液を使用して、標識タンパク質を溶出させた。ここで、最初の１００μｌはどのタンパク質も含有しないので、捨てた。Ｂカラム精製の後で、タンパク質を高感度 Prometheus ガラスキャピラリー（１．６μＭ）中へ直接ロードして、２つのデバイス：PR.Red（１Ｋ／分を２９３〜３６８Ｋで使用する）と Prometheus NT.48（５Ｋ／分を２９３〜３６８Ｋで使用する）を使用して同一２検体で測定した。データは、このデバイスのソフトウェアより直接転送した。この結果を図面１６に提供する。
【図１】
2020527696.tif 000037
【図２】
2020527696.tif 000038
【図３】
2020527696.tif 000039
【図４】
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【図５】
2020527696.tif 000041
【図６】
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【図７】
2020527696.tif 000043
【図８】
2020527696.tif 000044
【図９】
2020527696.tif 000045
【図１０】
2020527696.tif 000046
【図１１】
2020527696.tif 000047
【図１２】
2020527696.tif 000048
【図１３】
2020527696.tif 000049
【図１４】
2020527696.tif 000050
【図１５】
2020527696.tif 000051
【図１６】
2020527696.tif 000052
【図１７】
2020527696.tif 000053
【図１８】
2020527696.tif 000054
【図１９ａ】
2020527696.tif 000055
【図１９ｂ】
2020527696.tif 000056
【図１９ｃ】
2020527696.tif 000057
【図１９ｄ】
2020527696.tif 000058
【図１９ｅ】
2020527696.tif 000059
【国際調査報告】
2020527696.tif 000060
2020527696.tif 000061
2020527696.tif 000062
2020527696.tif 000063