(57)【要約】  いくつかの側面において、本開示は、導入遺伝子を改変する組成物および方法に関する。いくつかの態様において、本開示は、ＭｅＣＰ２導入遺伝子を含む、自己調節する組み換え核酸、ウイルスベクター、および医薬組成物を提供する。いくつかの態様において、本開示によって記載される組成物および方法は、機能喪失型突然変異に関連する疾患および障害、例えばレット症候群を処置するのに有用である。
2020522269.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
導入遺伝子を改変する方法であって、方法が、
（ａ）細胞中の第１産物をコードする第１遺伝子を選択すること；
（ｂ）ｍｉＲＮＡを選択すること、ここでｍｉＲＮＡの発現が、細胞中の第１産物によって正に調節される；および、
（ｃ）第１産物をコードするコード領域とｍｉＲＮＡのための１つ以上の結合部位を含む３’−非コード領域とを有する転写産物を発現する導入遺伝子を改変すること
を含む、前記方法。
【請求項２】
導入遺伝子を改変する方法であって、方法が、
（ａ）細胞中の第１産物をコードする第１遺伝子を選択すること；
（ｂ）細胞中の第２産物をコードする第２遺伝子を選択すること；
（ｃ）第２産物の発現が細胞中の第１産物によって正に調節されることを決定すること；
（ｄ）ｍｉＲＮＡを選択すること；
（ｅ）ｍｉＲＮＡの発現が細胞中の第２産物によって正に調節されることを決定すること；および、
（ｆ）第１産物をコードするコード領域とｍｉＲＮＡのための１つ以上の結合部位を含む３’−非コード領域とを有する転写産物を細胞中に発現するように導入遺伝子を改変すること
を含む、前記方法。
【請求項３】
第１産物が、タンパク質である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
タンパク質が、ＭｅＣＰ２、任意にＭｅＣＰ２アイソフォームｅ１またはＭｅＣＰ２アイソフォームｅ２であり得る、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
第２産物が、タンパク質または核酸であり、任意に核酸が、ｍｉＲＮＡであり得る、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ｍｉＲＮＡが、miR-132である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
方法が、さらに
１以上の脱標的ｍｉＲＮＡのための１つ以上の結合部位を含むように転写産物の３’−非コード領域を改変すること
を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
１以上の脱標的ｍｉＲＮＡが、肝臓、心臓、肺、筋肉、膵臓、または抗原提示細胞からの導入遺伝子の発現を阻害する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
１以上の脱標的ｍｉＲＮＡが、miR-122、miR-1、またはmiR-122およびmiR-1である、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
導入遺伝子を改変するというステップが、導入遺伝子をベクター中へ挿入することを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ベクターが、クローニングベクター、発現ベクター、プラスミド、またはウイルスベクターである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
導入遺伝子を改変する方法であって、方法が、
（ａ）細胞中の第１産物をコードする第１遺伝子を選択すること；
（ｂ）その発現が細胞中の第１産物によって正に調節されるｍｉＲＮＡを選択すること；および、
（ｃ）第１産物をコードするコード領域を有しかつｍｉＲＮＡのための１以上の結合部位を有する転写産物を発現する導入遺伝子を改変すること
を含む、前記方法。
【請求項１３】
導入遺伝子を改変する方法であって、方法が、
（ａ）細胞中の第１産物をコードする第１遺伝子を選択すること；
（ｂ）細胞中の第２産物をコードする第２遺伝子を選択すること；
（ｃ）第２産物の発現が細胞中の第１産物によって正に調節されることを決定すること；
（ｄ）ｍｉＲＮＡを選択すること；
（ｅ）ｍｉＲＮＡの発現が細胞中第２産物によって正に調節されることを決定すること；および、
（ｆ）第１産物をコードするコード領域を有しかつｍｉＲＮＡのための１以上の結合部位を有する転写産物を細胞中に発現する導入遺伝子を改変すること
を含む、前記方法。
【請求項１４】
タンパク質の自己調節発現のための組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターであって、ｒＡＡＶベクターが、標的組織の細胞中、タンパク質をコードする転写産物を発現するように改変された核酸を含み、ここで転写産物が、第１ｍｉＲＮＡに特異的な、少なくとも１つの第１ｍｉＲＮＡ結合部位を含み、ここで第１ｍｉＲＮＡの発現が、細胞中のタンパク質の発現によって正に調節される、前記ｒＡＡＶベクター。
【請求項１５】
請求項１４に記載のｒＡＡＶベクターを内包するカプシドを含む組み換えＡＡＶであって、ここでカプシドが、標的組織の細胞の選択的形質導入を容易にするカプシドタンパク質を含む、前記組み換えＡＡＶ。
【請求項１６】
ｉ）タンパク質をコードするコード領域、およびｉｉ）２つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位を有する、転写産物をコードする組み換え核酸であって、２つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位が、
（ａ）標的組織の細胞中のタンパク質の発現によって正に調節される第１ｍｉＲＮＡに特異的な、少なくとも１つの第１ｍｉＲＮＡ結合部位；および
（ｂ）非標的組織の細胞中のタンパク質の発現とは無関係に発現される第２ｍｉＲＮＡに特異的な、少なくとも１つの第２ｍｉＲＮＡ結合部位
を含む、前記組み換え核酸。
【請求項１７】
ヒトＭｅＣＰ２タンパク質をコードするコード領域またはその機能的フラグメントと、２つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位を含む３’−非コード領域とを有する転写産物をコードする組み換え核酸であって、ここで２つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位が、
（ａ）転写産物の発現を負に調節するｍｉＲＮＡに特異的な、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位；および
（ｂ）非標的組織の細胞中の転写産物の発現を阻害するｍｉＲＮＡに特異的な、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位
を含む、前記組み換え核酸。
【請求項１８】
コード領域が、ＭｅＣＰ２アイソフォームｅ１をコードする、請求項１７に記載の組み換え核酸。
【請求項１９】
ヒトＭｅＣＰ２が、配列番号１で表される配列を含む、請求項１７または１８に記載の組み換え核酸。
【請求項２０】
転写産物の発現を負に調節するｍｉＲＮＡに特異的な少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位が、miR-132結合部位を含み、任意にここで、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位が、２つまたは３つのmiR-132結合部位であり得る、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の組み換え核酸。
【請求項２１】
非標的組織中の転写産物の発現を阻害するｍｉＲＮＡに特異的な少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位が、miR-1結合部位か、mir-122結合部位か、またはmiR-1およびmiR-122の結合部位かを含む、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の組み換え核酸。
【請求項２２】
１以上のｍｉＲＮＡ結合部位の各々が、コード領域の最後のコドンと、転写産物のポリＡテールとの間に位置付けられる、請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の組み換え核酸。
【請求項２３】
さらにプロモーター、任意にマウスＭｅＣＰ２プロモーターであり得る、を含む、請求項１７〜２２のいずれか一項に記載の組み換え核酸。
【請求項２４】
マウスＭｅＣＰ２プロモーターが、配列番号３で表される配列を含む、請求項２３に記載の組み換え核酸。
【請求項２５】
組み換え核酸が、プラスミド上に位置付けられる、請求項１７〜２４のいずれか一項に記載の組み換え核酸。
【請求項２６】
請求項１７〜２４のいずれか一項に記載の組み換え核酸を含むウイルスベクターであって、任意にウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、またはバキュロウイルスベクターであり得る、前記ウイルスベクター。
【請求項２７】
（ａ）ヒトＭｅＣＰ２またはその機能的フラグメントをコードするコード領域；および、
（ｂ）１以上のｍｉＲＮＡ結合部位を含む３’−非コード領域
を有する転写産物をコードする組み換え核酸であって、ここで転写産物が、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復（ＩＴＲ）の脇に配置される、前記組み換え核酸。
【請求項２８】
コード領域が、ＭｅＣＰ２アイソフォームｅ１をコードする、請求項２７に記載の組み換え核酸。
【請求項２９】
ヒトＭｅＣＰ２が、配列番号１で表される配列を含む、請求項２７または２８に記載の組み換え核酸。
【請求項３０】
１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位が、miR-1結合部位、miR-122結合部位、もしくはmiR-132結合部位、またはそれらのいずれかの組み合わせである、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の組み換え核酸。
【請求項３１】
転写産物が、miR-1結合部位、mir-122結合部位、および少なくとも１つのmiR-132結合部位を含む、請求項３０に記載の組み換え核酸。
【請求項３２】
少なくとも１つのmiR-132結合部位が、２つまたは３つのmir-132結合部位である、請求項３１に記載の組み換え核酸。
【請求項３３】
１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位が、コード領域の最後のコドンと転写産物のポリＡテールとの間に位置付けられる、請求項２７〜３２のいずれか一項に記載の組み換え核酸。
【請求項３４】
さらにプロモーター、任意にマウスＭｅＣＰ２プロモーターであり得る、を含む、請求項２７〜３３のいずれか一項に記載の組み換え核酸。
【請求項３５】
マウスＭｅＣＰ２プロモーターが、配列番号３で表される配列を含む、請求項３４に記載の組み換え核酸。
【請求項３６】
ＩＴＲが、ＡＡＶ２のＩＴＲである、請求項２７〜３５のいずれか一項に記載の組み換え核酸。
【請求項３７】
請求項１７〜２４または２７〜３６のいずれか一項に記載の組み換え核酸を内包するカプシド
を含む、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。
【請求項３８】
核酸が、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、またはＡＡＶ６のＩＴＲから選択される少なくとも１つのＩＴＲを含む、請求項３７に記載のｒＡＡＶ。
【請求項３９】
カプシドが、血液脳関門を越えるｒＡＡＶの通過を容易にするカプシドタンパク質を含む、請求項３７または３８に記載のｒＡＡＶ。
【請求項４０】
カプシドタンパク質が、AAV-PHP.B、AAV1、AAV2、AAV2i8、AAV2.5、AAV5、AAV6、AAV8、AAVrh8、AAV9、AAVrh10、AAV-B1、AAV9.45A-String（例として、AAV9.45-AS）、AAV9.45Angiopep、AAV9.47-Angiopep、AAV9.47-AS、AAV-CAM130、およびAAV9HRからなる群から選択される血清型を有する、請求項３９に記載のｒＡＡＶ。
【請求項４１】
カプシドタンパク質が、配列番号１４または１５で表される配列（AAV-PHP.B、AAV9）を含むかまたはこれからなる、請求項３７〜４０のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
【請求項４２】
請求項１７〜２４もしくは２７〜３６のいずれか一項に記載の組み換え核酸、または請求項３７〜４１のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ、および薬学的に許容し得る賦形剤を含む、組成物。
【請求項４３】
組成物が、注射のために製剤化され、任意にここで、注射が、全身注射（例として、静脈内注射）または髄腔内注射であり得る、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
対象におけるレット症候群を処置する方法であって、方法が、レット症候群を有するかまたはこれを有すると疑われる対象へ、有効量の：
（ａ）請求項１７〜２４もしくは２７〜３６のいずれか一項に記載の組み換え核酸；
（ｂ）請求項３７〜４１のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ；または、
（ｃ）請求項４２または４３に記載の組成物
を投与することを含む、前記方法。
【請求項４５】
対象が、ヒト対象であり、任意にここで、対象が、生後１年未満であり得る、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
対象が、ＭｅＣＰ２遺伝子の少なくとも１つのコピー中の突然変異によって特徴付けられ、任意にここで、突然変異が、機能喪失型突然変異であり得る、請求項４４または４５に記載の方法。
【請求項４７】
投与が、注射、任意に全身注射（例として、静脈内注射）または髄腔内注射であり得る、請求項４４〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
投与が、対象の血液脳関門を横断する有効量の（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）をもたらす、請求項４４〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
投与が、対象の脳中、無毒性レベルのＭｅＣＰ２発現をもたらす、請求項４４〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、2017年6月6日に出願された米国仮出願第62/516,060号の出願日の35 U.S.C.§119(e)下の利益を主張するものであり、その内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
背景
レット(Rett)症候群は、ＭｅＣＰ２における機能喪失型突然変異によって引き起こされる神経学的疾患である。ＭｅＣＰ２の発現が出生後に回復すること(restoration)は、ＭｅＣＰ２マウスに見られる表現型のいくつかを修復する(reversing)のに有効であることが観察されたが、しかし安全性への懸念は残る。加えて、ｅ１アイソフォームをコードするあるＭｅＣＰ２ベクターの治療上の有効性を調べる研究によって、レット表現型は部分的にしか救済されないことが観察された。これらの研究は、主として(typically)新生仔の血管内（ＩＶ）または脳室内（ＩＣＶ）送達に重点を置いており、いくつかの実例において、致死的な肝臓毒性および後肢の握り締め(clasping)に直面した。
【発明の概要】
【０００３】
概要
本開示の側面は、ｍｉＲＮＡ調節要素（ＭＲＥ）のある組み合わせ、例えば、遺伝子発現の負のフィードバックループに関連するｍｉＲＮＡ結合部位と、非標的組織からの導入遺伝子発現を脱標的にする(de-target)ｍｉＲＮＡ結合部位との組み合わせが、正常なタンパク質の機能に適合する狭い範囲内で調整可能な導入遺伝子発現と、オフターゲット導入遺伝子の毒性回避とを可能にするという発見に関する。したがって、いくつかの態様において、本開示によって記載される組成物および方法は、機能喪失型突然変異に関連する疾患および障害、例えばＭＥＣＰ２遺伝子における機能喪失型突然変異に関連するレット症候群を処置するのに有用である。
【０００４】
結果的に、いくつかの側面において、本開示は、導入遺伝子を改変する方法を提供するが、その方法は以下を含む：細胞中の第１産物をコードする第１遺伝子を選択すること；細胞中の第２産物をコードする第２遺伝子を選択すること；第２産物の発現が細胞中の第１産物によって正に調節されることを決定すること；ｍｉＲＮＡを選択すること；ｍｉＲＮＡの発現が細胞中第２産物によって正に調節されることを決定すること；および、第１産物をコードするコード領域を有し、かつｍｉＲＮＡのための１以上の結合部位を有する転写産物を細胞中発現するよう導入遺伝子を改変すること。
【０００５】
いくつかの側面において、本開示は、導入遺伝子を改変する方法を提供するが、その方法は以下を含む：細胞中の第１産物をコードする第１遺伝子を選択すること；ｍｉＲＮＡを選択すること、ここでその発現は細胞中の第１産物によって正に調節される；および、第１産物をコードするコード領域と、ｍｉＲＮＡのための１以上の結合部位を含む３’−非コード領域とを有する転写産物を発現する導入遺伝子を改変すること。
【０００６】
いくつかの側面において、本開示は、導入遺伝子を改変する方法を提供するが、その方法は以下を含む：細胞中の第１産物をコードする第１遺伝子を選択すること；細胞中の第２産物をコードする第２遺伝子を選択すること；第２産物の発現が細胞中の第１産物によって正に調節されることを決定すること；ｍｉＲＮＡを選択すること；ｍｉＲＮＡの発現が細胞中第２産物によって正に調節されることを決定すること；および、第１産物をコードするコード領域と、ｍｉＲＮＡのための１以上の結合部位を含む３’−非コード領域とを有する転写産物を細胞中発現するよう導入遺伝子を改変すること。
【０００７】
いくつかの側面において、本開示は、ｉ）タンパク質をコードするコード領域およびｉｉ）２以上のｍｉＲＮＡ結合部位を有する転写産物をコードする組み換え核酸を提供するが、ここで２以上のｍｉＲＮＡ結合部位は以下を含む：標的組織の細胞中タンパク質の発現によって正に調節される第１ｍｉＲＮＡに特異的な、少なくとも１つの第１ｍｉＲＮＡ結合部位；および、非標的組織の細胞中、タンパク質の発現とは無関係に発現される第２ｍｉＲＮＡに特異的な、少なくとも１つの第２ｍｉＲＮＡ結合部位。
【０００８】
いくつかの側面において、本開示は、ヒトＭｅＣＰ２タンパク質またはその機能的フラグメントをコードするコード領域と、１以上のｍｉＲＮＡ結合部位を含む３’−非コード領域とを有する転写産物をコードする組み換え核酸を提供するが、ここで１以上のｍｉＲＮＡ結合部位は以下を含む：転写産物の発現を負に調節するｍｉＲＮＡに特異的な、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位；および、非標的組織中の転写産物の発現を阻害するｍｉＲＮＡに特異的な、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位。
【０００９】
いくつかの側面において、本開示は、ヒトＭｅＣＰ２またはその機能的フラグメントをコードするコード領域と、１以上のｍｉＲＮＡ結合部位を含む３’−非コード領域とを有する転写産物をコードする組み換え核酸を提供するが、ここで転写産物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復(inverted terminal repeats (ITRs))（ＩＴＲ）の脇に配置される。いくつかの態様において、ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、またはＡＡＶ６のＩＴＲである。いくつかの態様において、ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ２ ＩＴＲである。いくつかの態様において、ＩＴＲは、例えばWO/2016/172008に開示されるとおり、ＩＴＲ機能を置き換える人工の配列である。
【００１０】
いくつかの側面において、本開示は、本開示によって記載されるとおりの組み換え核酸を含むウイルスベクターを提供する。いくつかの態様において、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、またはバキュロウイルスベクターである。
【００１１】
いくつかの側面において、本開示は、以下を含む組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を提供する：本開示によって記載されるとおりの組み換え核酸；少なくとも１つのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復（ＩＴＲ）；およびカプシドタンパク質。
【００１２】
いくつかの側面において、本開示は、自己調節タンパク質の発現のための組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターであって、タンパク質をコードする転写産物を標的組織の細胞中発現するよう改変された核酸を含むｒＡＡＶベクターを提供するが、ここで転写産物は、第１ｍｉＲＮＡに特異的な少なくとも１つの第１ｍｉＲＮＡ結合部位を含み、ここで第１ｍｉＲＮＡの発現は、細胞中のタンパク質の発現によって正に調節される。
【００１３】
いくつかの側面において、本開示は、本開示によって記載されるとおりの組み換え核酸または本開示によって記載されるとおりのｒＡＡＶ、および薬学的に許容し得る賦形剤を含む組成物を提供する。いくつかの態様において、組成物は、注射、例えば全身注射（例として、静脈内注射）または髄腔内注射のために製剤化される。
【００１４】
いくつかの態様において、第１産物は、タンパク質である。いくつかの態様において、タンパク質は、ＭｅＣＰ２、例えばＭｅＣＰ２アイソフォームｅ１またはＭｅＣＰ２アイソフォームｅ２である。いくつかの態様において、第１産物は、ｍｉＲＮＡまたは長鎖(long)非コードＲＮＡである。
【００１５】
いくつかの態様において、第２産物は、タンパク質、または核酸である。いくつかの態様において、第２産物は、骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）である。いくつかの態様において、核酸は、ｍｉＲＮＡ（例として、miR-132）である。いくつかの態様において、第１ｍｉＲＮＡは、miR-132である。
【００１６】
いくつかの態様において、転写産物の発現を負に調節するｍｉＲＮＡに特異的な少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位は、miR-132結合部位、例えば２つまたは３つのmiR-132結合部位を含む。
【００１７】
いくつかの態様において、非標的組織中の転写産物の発現を阻害するｍｉＲＮＡに特異的な少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位は、miR-1結合部位か、mir-122結合部位か、またはmiR-1およびmiR-122の結合部位を含む。いくつかの態様において、非標的組織中の転写産物の発現を阻害するｍｉＲＮＡに特異的な少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位は、３つのmiR-1結合部位（例として、3x-miR-1）および３つのmiR-122結合部位（例として、3x-miR-122）を含む。
【００１８】
いくつかの態様において、本開示によって記載される方法はさらに、１以上の脱標的ｍｉＲＮＡのための１以上の結合部位を含むよう転写産物の３’−非コード領域を改変するというステップを含む。いくつかの態様において、１以上の脱標的ｍｉＲＮＡは、肝臓、心臓、肺、筋肉、膵臓、または免疫（例として、抗原提示）細胞からの導入遺伝子の発現を阻害する。いくつかの態様において、１以上の脱標的ｍｉＲＮＡは、miR-122か、miR-1か、またはmiR-122およびmiR-1かである。いくつかの態様において、１以上の脱標的ｍｉＲＮＡは、抗原提示細胞（例として、樹状細胞、マクロファージ等々）などの免疫細胞中の導入遺伝子の発現を阻害する。いくつかの態様において、１以上の脱標的ｍｉＲＮＡは、miR-15a、miR-16-1、miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1、miR-21、miR-29a、miR-29b、miR-29c、miR-30b、miR-31、miR-34a、miR-92a-1、miR-106a、miR-125a、miR-125b、miR-126、miR-142-3p、miR-146a、miR-150、miR-155、miR-181a、miR-223またはmiR-424である。
【００１９】
いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡ結合部位（単数）またはｍｉＲＮＡ結合部位（複数）は、コード領域の最後のコドンと転写産物のポリＡテールとの間に位置付けられる。
本開示によって記載される方法のいくつかの態様において、導入遺伝子を改変するというステップは、導入遺伝子をベクター中へ挿入することを含む。いくつかの態様において、ベクターは、クローニングベクター、発現ベクター、プラスミド、またはウイルスベクターである。
【００２０】
いくつかの態様において、組み換え核酸はさらに、プロモーター、例えばマウスＭｅＣＰ２プロモーターを含む。いくつかの態様において、マウスＭｅＣＰ２プロモーターは、配列番号３で表される配列を含む。
いくつかの態様において、組み換え核酸は、プラスミド上に位置付けられる。
【００２１】
いくつかの態様において、カプシドタンパク質は、対象の血液脳関門を越えるｒＡＡＶの横断を容易にするカプシドタンパク質である。いくつかの態様において、カプシドタンパク質は、AAV-PHP.B、AAV1、AAV2、AAV2i8、AAV2.5、AAV5、AAV6、AAV8、AAVrh8、AAV9、AAVrh10、AAV-B1、AAV9.45A-String（例として、AAV9.45-AS）、AAV9.45Angiopep、AAV9.47-Angiopep、およびAAV9.47-AS、AAV5、AAVrh39、AAVrh43、CAM130、およびAAV9HRからなる群から選択される血清型を有する。いくつかの態様において、カプシドタンパク質は、WO2015/127128、WO2016/054554、WO2016/054557、またはWO2016/065001に記載されるとおりの血清型を有する。いくつかの態様において、カプシドタンパク質は、配列番号１４または１５で表される配列（例として、AAV-PHP.BまたはAAV9）を含むかまたはこれらからなる。
【００２２】
いくつかの側面において、本開示は、対象におけるレット症候群を処置する方法を提供するが、その方法は、レット症候群を有するかまたはこれを有すると疑われる対象へ、有効量の：本開示によって記載されるとおりの組み換え核酸；本開示によって記載されるとおりのｒＡＡＶ；または、本開示によって記載されるとおりの組成物を投与することを含む。
【００２３】
いくつかの態様において、対象は、ヒト対象である。いくつかの態様において、対象は、生後１年未満である。いくつかの態様において、対象は、ＭｅＣＰ２遺伝子の少なくとも１つのコピーにおける突然変異、例えば機能喪失型突然変異によって特徴付けられる。
【００２４】
いくつかの態様において、本開示によって記載されるとおりの組み換え核酸、ｒＡＡＶ、または組成物は、注射、例えば全身注射（例として、静脈内注射）または髄腔内注射によって投与される。いくつかの態様において、投与は、対象の血液脳関門を横断する有効量の組み換え核酸、ｒＡＡＶ、または組成物をもたらす。いくつかの態様において、投与は、対象の脳中、無毒性レベルのＭｅＣＰ２発現をもたらす。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
図面の簡単な記載
【図１Ａ−Ｂ】図１Ａ〜１Ｂは、レット症候群における安全かつ有効な遺伝子治療のための、新しいAAV-MeCP2ベクターの特徴付けを示す。図１Ａは、ＭｅＣＰ２自動調節(auto-regulation)の恒常性維持機構の図式的な描写(schematic depiction)を示す。図１Ｂは、マウスＭｅＣＰ２プロモーター（−２２３〜＋５６）下ｍｙｃタグ付きヒトＭｅＣＰ２−ｅ１をコードする自己調節されたAAV-MeCP2ベクター、および種々のマイクロＲＮＡ認識要素（例として、miR-122/1T；miR-132T）の構造の図式的な描写を示す。
【００２６】
【図２Ａ−Ｂ】図２Ａ〜２Ｃは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中AAV2-MeCP2の有効な発現を示す。図２Ａは、ウェスタンブロットによって測定されたＭｅＣＰ２発現を示す。図２Ｂは、正規化タンパク質発現アッセイによって測定されたＭｅＣＰ２発現を示す（図２Ｂ）。
【図２Ｃ】図２Ｃは、３０，０００ｇｃ／細胞の用量にて４日間AAV2-MeCP2で形質導入された２９３Ｔ細胞の毒性プロファイルを示す。
【００２７】
【図３Ａ−Ｂ】図３Ａ〜３Ｃは、マウス皮質ニューロンにおけるAAV2-MeCP2発現を示す。図３Ａは、マウス初代皮質ニューロンが、対照としてAAV-GFPを包含する１Ｅ３〜１Ｅ５ ｖｇ／細胞に及ぶＡＡＶベクター用量にて形質導入されたことを示す。図３Ｂは、3E4ベクターゲノム（用量）／細胞で感染されたから５日後のニューロンにおけるhMeCP2-myc発現のウェスタンブロット分析を示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、AAV2-MeCP2再送達に応答したmiR-132発現を示す。
【００２８】
【図４Ａ−Ｂ】図４Ａ〜４Ｃは、in vivoマウス実験から得られた代表的なデータを示す。図４Ａは、0、1x、2x、または3x miR-132標的配列を含有するヒトＭｅＣＰ２のｅ１アイソフォームをコードするＡＡＶが顔面静脈を介して注射された出生後１日目の野生型マウスを示す。野生型動物は注射から３カ月後に安楽死させられ、全脳、心臓、および肝臓組織は、総ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成、およびヒトＭｅＣＰ２のｅ１アイソフォームに特異的なプライマーを使用するｑＲＴ−ＰＣＲに供された。データは、3x miR-132標的配列を含有するAAV-MeCP2に対して正規化され、これを１に設定した。図４Ｂは、AAV-MeCP2の頭蓋内注射後の野生型マウスの脳中ヒトＭｅＣＰ２アイソフォームｅ１の遺伝子発現分析を示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、AAV-MeCP2の頭蓋内注射後の野生型マウスの脳中ヒトＭｅＣＰ２アイソフォームｅ１の遺伝子発現分析を示す。
【００２９】
【図５】図５は、本開示によって記載される構築物によって推進されるＭｅＣＰ２発現が、心臓および肝臓から有効に脱標的にされることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
詳細な記載
本開示の側面は、過剰発現に関する毒性を防ぐために導入遺伝子（例として、ＭｅＣＰ２）発現レベルを自己調節することが可能なＡＡＶベクターに一部関する。いくつかの態様において、自己調節機構は、導入遺伝子カセットの３’ＵＴＲ中の、複数コピーのｍｉＲＮＡ調節要素（例として、１以上のmiR-132結合部位）の存在に基づく。例のセクションにおいてさらに記載されるとおり、導入遺伝子発現を自己調節することが可能なＡＡＶベクターは、いくつかの態様において、他のＡＡＶベクター、例えば天然の(native)導入遺伝子プロモーターのみを含むＡＡＶベクターと比較して、改善された有効性および安全性のプロファイルを有する。miR-132／ＭｅＣＰ２構築物の文脈において例のセクションに記載される所見が、タンパク質発現を（例として、負のフィードバックループを通して）調節する他のmiRの結合部位を含む他の導入遺伝子発現構築物へも適用可能であることは、認識されるべきである。
【００３１】
いくつかの態様において、ＣＮＳへの広範囲な(global)遺伝子送達を媒介する可能性が最も高い送達ルート（例として、全身注射および髄腔内注射）は、導入遺伝子（例として、ＭｅＣＰ２）発現が毒性を示すようになり得る末梢器官への高レベル形質導入をもたらす可能性が高い。本開示は、ｍｉＲＮＡ結合部位（例として、miR-122結合部位およびmiR-1結合部位）などのｍｉＲＮＡ調節要素（ＭＲＥ）を、タンパク質発現を調節する負のフィードバックループに関連するＭＲＥ（例として、ＭｅＣＰ２のためのmiR-132結合部位）と組み合わせることが、末梢器官において導入遺伝子発現レベルと脱標的導入遺伝子発現とを同時に調節するという認識に一部基づく。
【００３２】
結果的に、いくつかの側面において、本開示は、導入遺伝子を改変する方法を提供するが、その方法は以下を含む：細胞中の第１産物をコードする第１遺伝子を選択すること；ｍｉＲＮＡを選択すること、ここでその発現は、細胞中の第１産物によって正に調節される；および、第１産物をコードするコード領域とｍｉＲＮＡのための１以上の結合部位とを有する転写産物を発現する導入遺伝子を改変すること。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡのための１以上の結合部位は、転写産物の３’−非コード領域中に位置付けられる。
【００３３】
いくつかの側面において、本開示は、導入遺伝子を改変する方法を提供するが、その方法は以下を含む：細胞中の第１産物をコードする第１遺伝子を選択すること；細胞中の第２産物をコードする第２遺伝子を選択すること；第２産物の発現が細胞中の第１産物によって正に調節されることを決定すること；ｍｉＲＮＡを選択すること；ｍｉＲＮＡの発現が細胞中第２産物によって正に調節されることを決定すること；および、第１産物をコードするコード領域とｍｉＲＮＡのための１以上の結合部位とを有する転写産物を細胞中発現するよう導入遺伝子を改変すること。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡのための１以上の結合部位は、転写産物の３’−非コード領域中に位置付けられる。
【００３４】
本明細書に使用されるとき、「導入遺伝子を改変すること」は、例えばSambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.に記載されるとおり、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、制限酵素消化、およびin vitro核酸ライゲーションなどの遺伝子クローニング技法を使用して、組み換え核酸を産生（例として、合成）することを指す。
【００３５】
本明細書に使用されるとき、「産物」または「遺伝子産物」は、核酸（例として、ＤＮＡまたはＲＮＡ）配列から転写および／または翻訳された核酸（例として、ＲＮ転写産物、ｄｓＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等々）、ペプチド、タンパク質、またはポリペプチドを指す。いくつかの態様において、産物は、タンパク質をコードする領域を含むＲＮＡ転写産物である。いくつかの態様において、タンパク質をコードする領域は、機能喪失型突然変異によって引き起こされる疾患に関連するタンパク質（例として、ＭｅＣＰ２）をコードする。機能喪失型突然変異によって引き起こされる疾患に関連するタンパク質の追加例は、これらに限定されないが、チロシナーゼ（チロシン血症）、リソソーム酸ベータ−ガラクトシダーゼ（ＧＭ１−ガングリオシドーシス）、ベータ−ヘキソサミニダーゼＡおよびＢ（テイ・サックス病およびサンドホフ病）、アスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ；カナバン病）、アスパルチルグルコサミニダーゼ（アスパルチルグルコサミン尿症）、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ（幼児(Infantile)バッテン病）、トリペプチジルペプチダーゼ（後期幼児バッテン病）、α−ガラクトシダーゼ（ファブリー病）、α−フコシダーゼ（フコシドーシス）、防御(Protective)タンパク質／カテプシンＡ（ガラクトシアリドーシス）、β−グルコシダーゼ（ゴーシェ病）、ガラクトシルセラミダーゼ（グロボイド細胞白質ジストロフィー）、α−マンノシダーゼ（α−マンノシドーシス）、アリールスルファターゼＡ（異染性白質ジストロフィー）、α−Ｌ−イズロニダーゼ（ムコ多糖症Ｉ）、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（ムコ多糖症ＩＩＩＢ）、アリールスルファターゼＢ（ムコ多糖症ＶＩ）、β−グルクロニダーゼ（ムコ多糖症ＶＩＩ）、酸性スフィンゴミエリナーゼ（ニーマン・ピック病）、α−グルコシダーゼ（ポンぺ病）および酸性リパーゼ（ウォルマン病）、ＦＯＸＧ１（ＦＯＸＧ１症候群）、ＣＤＫＬ５、Ｎ−ＧｌｙＩ、Ｇｌｕｔ−１（デビボ病）等々を包含する。
【００３６】
いくつかの態様において、産物は、干渉核酸、例えば遺伝子産物の発現または活性を調節するｍｉＲＮＡである。
いくつかの態様において、ある産物は、第２産物の遺伝子発現またはタンパク質発現を調節する。遺伝子産物の発現または翻訳の調節は、正であっても、または負であってもよい。「正の調節」は、遺伝子発現または活性の増大（例として、別の遺伝子産物の発現または活性の結果として）を指す。「負の調節」は、遺伝子発現または活性の減少または阻害（例として、フィードバックループを通した別の遺伝子産物の発現または活性の結果として）を指す。
【００３７】
いくつかの態様において、遺伝子産物、たとえば成長因子、転写因子（例として、Wang et al. Nucleic Acids Res. 2010 Jan; 38 (Database issue): D119-D122に記載されるとおり）等々は、細胞または対象において導入遺伝子発現または活性を調節することが可能である。成長因子の例は、ニューロトロフィン、たとえば、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン３、ニューロトロフィン４、グリア由来(glial derived)神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ１〜２３）、ニュールツリン、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、インスリン様成長因子２（ＩＧＦ−２）等々を包含する。
【００３８】
いくつかの態様において、本開示によって記載されるとおりの導入遺伝子は、遺伝子発現調節ループ（例として、負のフィードバックループ、正のフィードバックループ等々）に関連する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ調節要素（例として、ｍｉＲＮＡ結合部位）を含むよう改変される。一般に、遺伝子発現調節ループは、細胞に対して内在性のものであっても、または人工のものであってもよい（例として、フィードバックループの１以上の要素は、導入遺伝子と併せて提供される）。負のフィードバックループの一例において、細胞中のＭｅＣＰ２の発現は、細胞中の脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の増大を引き起こし、これが次にmiR-132の発現を増大させ、これが次にＭｅＣＰ２発現を調節する（図１）。いくつかの態様において、本開示が、導入遺伝子発現を増幅するために使用され得る正のフィードバックループに関することは解されるべきである。
【００３９】
いくつかの態様において、本開示によって記載されるとおりの導入遺伝子は、１以上の非標的組織から導入遺伝子の発現を脱標的にする少なくとも１つのｍｉＲＮＡ調節要素（例として、ｍｉＲＮＡ結合部位）を含むよう改変される。本明細書に使用されるとき、「非標的組織」は、導入遺伝子の発現が望まれていない組織（例として、組織の細胞）を指す。例えば、いくつかの態様において、細胞中のＭｅＣＰ２の過剰発現は、肝細胞傷害をもたらす；この文脈において、肝臓組織（例として、肝臓細胞）は、非標的組織である。いくつかの態様において、非標的組織は、肝臓（例として、肝臓細胞）、心臓（例として、心臓細胞）、膵臓（例として、膵臓細胞）、筋肉（例として、筋肉細胞）、免疫細胞（例として、抗原提示細胞等々）、またはこれらのいずれの組み合わせである。
【００４０】
本明細書に使用されるとき、「標的組織」は、非標的組織などの他の組織と比べて、導入遺伝子の発現が好ましい組織（例として、組織の細胞）を指す。いくつかの態様において、標的組織は、ＣＮＳ組織（例として、ニューロンなどのＣＮＳ細胞）である。ＣＮＳ組織の非限定例は、脳組織（例として、ニューロン、グリア細胞等々）および脊髄組織を包含する。
【００４１】
一般に、導入遺伝子によってコードされる転写産物の１以上のｍｉＲＮＡ結合部位は、転写産物の３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）中に位置付けられる。いくつかの態様において、１以上のｍｉＲＮＡ結合部位は、転写産物のコード領域の最後のコドンと転写産物のポリＡテールとの間に位置付けられる。しかしながら、いくつかの態様において、１以上のｍｉＲＮＡ結合部位が、転写産物の３’ＵＴＲ以外の領域中、例えば転写産物の５’端でのイントロン中に位置付けられることは、解されるべきである。本開示によって記載されるとおりの導入遺伝子中へ改変されるｍｉＲＮＡ結合部位の数は、導入遺伝子によってコードされる遺伝子産物に応じて変動するであろう。またこれは、過度の実験量を要さずに当業者によって経験的に決定され得る。
【００４２】
例えば、いくつかの態様において、本開示によって記載されるとおりの導入遺伝子は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のｍｉＲＮＡ結合部位を含む。いくつかの態様において、本開示によって記載されるとおりの導入遺伝子は、１０より多く（例として、１１と１００との間のいずれの整数）のｍｉＲＮＡ結合部位を含む。いくつかの態様において、本開示によって記載されるとおりの導入遺伝子は、３、４、または５つのｍｉＲＮＡ結合部位を含む。１以上のｍｉＲＮＡ結合部位は各々、同じｍｉＲＮＡか、または異なるｍｉＲＮＡに結合してもよい。いくつかの態様において、本開示によって記載されるとおりの導入遺伝子は、１以上の（例として、３つの）ｍｉＲ−１２２結合部位（単数または複数）、１以上の（例として、３つの）ｍｉＲ−１結合部位（単数または複数）、および３つのｍｉＲ−１３２結合部位を含む。
【００４３】
組み換え核酸
いくつかの態様において、本開示によって記載されるとおりの導入遺伝子は、組み換え核酸によってコードされる。「核酸」配列は、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列を指す。いくつかの態様において、本開示のタンパク質および核酸は、単離されたものである。本明細書に使用されるとき、用語「単離された(isolated)」は、人工的に産生されたことを意味する。核酸に関し本明細書に使用されるとき、用語「単離された」は、以下を意味する：（ｉ）例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、in vitroで増幅された；（ｉｉ）クローニングによって、組み換えで産生された；（ｉｉｉ）切断およびゲル分離などによって(as by cleavage and gel separation)、精製された；または（ｉｖ）例えば化学合成によって、合成された。単離された核酸は、当該技術分野において周知の組み換えＤＮＡ技法による容易な取扱が可能なものである。
【００４４】
よって、ベクター（その５’および３’の制限部位が知られているか、またはそのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマー配列が開示されている）に含有されるヌクレオチド配列は、単離されているとみなされるが、しかしその自然宿主中その天然状態で存在する核酸配列は、そうではない。単離された核酸は、実質的に精製されていてもよいが、しかしそうである必要はない。例えば、クローニングベクターまたは発現ベクター内に単離された核酸は、これが存在している細胞中の材料をごくわずかなパーセンテージで含み得るという点で、純粋ではない。しかしながら、かかる核酸は、その用語が本明細書に使用されるとき、単離されている。なぜなら、それは、当業者に知られている標準的な技法による容易な操作が可能であるからである。タンパク質またはペプチドに関し本明細書に使用されるとき、用語「単離された」は、その自然環境から単離されたか、もしくは人工的に（例として、化学合成によって、組み換えＤＮＡ技術によって、等々）産生された、タンパク質またはペプチドを指す。
【００４５】
当業者はまた、保存的アミノ酸置換が、カプシドタンパク質の機能的に等価なバリアントまたはホモログを提供するようになされ得ることも、認識するであろう。いくつかの側面において、本開示は、保存的アミノ酸置換をもたらす配列変異(sequence alterations)を含む(embraces)。本明細書に使用されるとき、保存的アミノ酸置換は、アミノ酸置換がなされるタンパク質の電荷またはサイズの相対的な特徴を変更しないアミノ酸置換を指す。バリアントは、当業者に知られているポリペプチド配列を変更するための方法（かかる方法をまとめた参考文献、例として、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989、またはCurrent Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New Yorkから見出されるものなど）に従って調製され得る。アミノ酸の保存的置換は、以下の群内のアミノ酸の間でなされる置換を包含する：（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ；（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ；（ｄ）Ａ、Ｇ；（ｅ）Ｓ、Ｔ；（ｆ）Ｑ、Ｎ；および（ｇ）Ｅ、Ｄ。したがって、本明細書に開示のタンパク質およびポリペプチドのアミノ酸配列に対し、保存的アミノ酸置換を生じさせ得る。
【００４６】
いくつかの態様において、本開示によって記載されるとおりの核酸は、ベクター内に含有される。本明細書に使用されるとき、用語「ベクター」は、適正な制御要素に結び付けられたとき複製することが可能であり、かつ細胞間で遺伝子配列を移送し(transfer)得る、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、人工染色体、ウイルス、ビリオン等々のいずれの遺伝要素をも包含する。よって、前記用語は、クローニングビヒクルおよび発現ビヒクル、ならびにウイルスベクターを包含する。ウイルスベクターの例は、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、バキュロウイルスベクター等々を包含する。
【００４７】
ＭｅＣＰ２
いくつかの側面において、本開示は、細胞または対象においてＭｅＣＰ２タンパク質を発現するための組成物および方法に関する。「ＭｅＣＰ２」は、メチルＣｐＧ結合タンパク質２を指すが、これは、ＭｅＣＰ２遺伝子によってコードされ、成熟ニューロンなどの神経細胞において重要な役割（例として、転写リプレッサーまたは転写アクチベーターとしての機能）を果たす。ＭｅＣＰ２遺伝子の一例は、GenBankアクセッション番号NM_001110792（ＭｅＣＰ２−ｅ１）によって表される。ＭｅＣＰ２遺伝子の別の例は、GenBankアクセッション番号NM_001110792（ＭｅＣＰ２−ｅ２）によって表される。ＭｅＣＰ２遺伝子は、ＭｅＣＰ２アイソフォームｅ１およびＭｅＣＰ２アイソフォームｅ２と称される、ＭｅＣＰ２タンパク質の２つのアイソフォームをコードするが、これらは、それらのＮ末端の長さが異なる。いくつかの態様において、ＭｅＣＰ２アイソフォームｅ１は、配列番号１で表される配列によって表される。いくつかの態様において、ＭｅＣＰ２アイソフォームｅ２は、配列番号２で表される配列によって表される。
【００４８】
いくつかの態様において、導入遺伝子（例として、組み換え核酸）は、ＭｅＣＰ２タンパク質の機能的フラグメント（例として、アイソフォームｅ１またはアイソフォームｅ２のフラグメント）をコードする。ＭｅＣＰ２の「機能的フラグメント」は、野生型（例として、全長）ＭｅＣＰ２タンパク質の自然の機能（例として、転写アクチベーターまたは転写リプレッサー）を保持するトランケート型(truncated)ＭｅＣＰ２タンパク質である。いくつかの態様において、ＭｅＣＰ２の機能的フラグメントは、全長ＭｅＣＰ２タンパク質と比べて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のアミノ酸トランケーションを含む。いくつかの態様において、ＭｅＣＰ２の機能的フラグメントは、全長ＭｅＣＰ２タンパク質と比べて、約１と１０との間、５と５０との間、２０と１００との間のアミノ酸トランケーションを含む。
【００４９】
いくつかの態様において、導入遺伝子（例として、組み換え核酸）は、ＭｅＣＰ２タンパク質のバリアント（例として、アイソフォームｅ１またはアイソフォームｅ２のバリアント）をコードする。ＭｅＣＰ２タンパク質のバリアントは、野生型ＭｅＣＰ２タンパク質（例として、配列番号１または配列番号２）に対して約５０％と約９９．９％との間の同一性を有していてもよい。いくつかの態様において、ＭｅＣＰ２バリアントは、野生型ＭｅＣＰ２タンパク質（例として、配列番号１または配列番号２）と約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または約９９％の同一性を有する。
【００５０】
ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ結合部位
本開示は、ｍｉＲＮＡ結合部位（例として、miR-122結合部位およびmiR-1結合部位）などのｍｉＲＮＡ調節要素（ＭＲＥ）を、タンパク質発現を調節する負のフィードバックループに関連するＭＲＥ（例として、ＭｅＣＰ２のためのmiR-132結合部位）と組み合わせることが、末梢器官において導入遺伝子発現レベルと脱標的導入遺伝子発現とを同時に調節するという認識に一部基づく。
【００５１】
ｍｉＲＮＡおよび他の低分子干渉核酸は、標的ＲＮＡ転写産物の切断／分解または標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳抑制を介して、遺伝子発現を調節する。ｍｉＲＮＡは、典型的には、最終的に１９〜２５の非翻訳ＲＮＡ産物として、天然に発現される。ｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）との配列特異的相互作用を通して、それらの活性を呈する。内在的に発現されるこれらのｍｉＲＮＡは、ヘアピン前駆体を形成し、続いてプロセシングされてｍｉＲＮＡ二重鎖になり、さらに「成熟」一本鎖ｍｉＲＮＡ分子になる。この成熟ｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの（例として、３’ＵＴＲ領域における）標的部位を、成熟ｍｉＲＮＡに対するそれらの相補性に基づき同定する多タンパク質複合体ｍｉＲＩＳＣをガイドする。
【００５２】
ｍｉＲＮＡ遺伝子、およびそれらのホモログの以下の非限定的なリストは、本開示の方法および組成物（例として、自己調節発現または導入遺伝子の脱標的を媒介するための）において有用である：hsa-let-7a、hsa-let-7a*、hsa-let-7b、hsa-let-7b*、hsa-let-7c、hsa-let-7c*、hsa-let-7d、hsa-let-7d*、hsa-let-7e、hsa-let-7e*、hsa-let-7f、hsa-let-7f-1*、hsa-let-7f-2*、hsa-let-7g、hsa-let-7g*、hsa-let-7i、hsa-let-7i*、hsa-miR-1、hsa-miR-100、hsa-miR-100*、hsa-miR-101、hsa-miR-101*、hsa-miR-103、hsa-miR-105、hsa-miR-105*、hsa-miR-106a、hsa-miR-106a*、hsa-miR-106b、hsa-miR-106b*、hsa-miR-107、hsa-miR-10a、hsa-miR-10a*、hsa-miR-10b、hsa-miR-10b*、hsa-miR-1178、hsa-miR-1179、hsa-miR-1180、hsa-miR-1181、hsa-miR-1182、hsa-miR-1183、hsa-miR-1184、hsa-miR-1185、hsa-miR-1197、hsa-miR-1200、hsa-miR-1201、hsa-miR-1202、hsa-miR-1203、hsa-miR-1204、hsa-miR-1205、hsa-miR-1206、hsa-miR-1207-3p、hsa-miR-1207-5p、hsa-miR-1208、hsa-miR-122、hsa-miR-122*、hsa-miR-1224-3p、hsa-miR-1224-5p、hsa-miR-1225-3p、hsa-miR-1225-5p、hsa-miR-1226、hsa-miR-1226*、hsa-miR-1227、hsa-miR-1228、hsa-miR-1228*、hsa-miR-1229、hsa-miR-1231、hsa-miR-1233、hsa-miR-1234、hsa-miR-1236、hsa-miR-1237、hsa-miR-1238、hsa-miR-124、hsa-miR-124*、hsa-miR-1243、hsa-miR-1244、hsa-miR-1245、hsa-miR-1246、hsa-miR-1247、hsa-miR-1248、hsa-miR-1249、hsa-miR-1250、hsa-miR-1251、hsa-miR-1252、hsa-miR-1253、hsa-miR-1254、hsa-miR-1255a、hsa-miR-1255b、hsa-miR-1256、hsa-miR-1257、hsa-miR-1258、hsa-miR-1259、hsa-miR-125a-3p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-125b、hsa-miR-125b-1*、hsa-miR-125b-2*、hsa-miR-126、hsa-miR-126*、hsa-miR-1260、hsa-miR-1261、hsa-miR-1262、hsa-miR-1263、hsa-miR-1264、hsa-miR-1265、hsa-miR-1266、hsa-miR-1267、hsa-miR-1268、hsa-miR-1269、hsa-miR-1270、hsa-miR-1271、hsa-miR-1272、hsa-miR-1273、hsa-miR-127-3p、hsa-miR-1274a、hsa-miR-1274b、hsa-miR-1275、hsa-miR-127-5p、hsa-miR-1276、hsa-miR-1277、hsa-miR-1278、hsa-miR-1279、hsa-miR-128、hsa-miR-1280、hsa-miR-1281、hsa-miR-1282、hsa-miR-1283、hsa-miR-1284、hsa-miR-1285、hsa-miR-1286、hsa-miR-1287、hsa-miR-1288、hsa-miR-1289、hsa-miR-129*、hsa-miR-1290、hsa-miR-1291、hsa-miR-1292、hsa-miR-1293、hsa-miR-129-3p、hsa-miR-1294、hsa-miR-1295、hsa-miR-129-5p、hsa-miR-1296、hsa-miR-1297、hsa-miR-1298、hsa-miR-1299、hsa-miR-1300、hsa-miR-1301、hsa-miR-1302、hsa-miR-1303、hsa-miR-1304、hsa-miR-1305、hsa-miR-1306、hsa-miR-1307、hsa-miR-1308、hsa-miR-130a、hsa-miR-130a*、hsa-miR-130b、hsa-miR-130b*、hsa-miR-132、hsa-miR-132*、hsa-miR-1321、hsa-miR-1322、hsa-miR-1323、hsa-miR-1324、hsa-miR-133a、hsa-miR-133b、hsa-miR-134、hsa-miR-135a、hsa-miR-135a*、hsa-miR-135b、hsa-miR-135b*、hsa-miR-136、hsa-miR-136*、hsa-miR-137、hsa-miR-138、hsa-miR-138-1*、hsa-miR-138-2*、hsa-miR-139-3p、hsa-miR-139-5p、hsa-miR-140-3p、hsa-miR-140-5p、hsa-miR-141、hsa-miR-141*、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-142-5p、hsa-miR-143、hsa-miR-143*、hsa-miR-144、hsa-miR-144*、hsa-miR-145、hsa-miR-145*、hsa-miR-146a、hsa-miR-146a*、hsa-miR-146b-3p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-147、hsa-miR-147b、hsa-miR-148a、hsa-miR-148a*、hsa-miR-148b、hsa-miR-148b*、hsa-miR-149、hsa-miR-149*、hsa-miR-150、hsa-miR-150*、hsa-miR-151-3p、hsa-miR-151-5p、hsa-miR-152、hsa-miR-153、hsa-miR-154、hsa-miR-154*、hsa-miR-155、hsa-miR-155*、hsa-miR-15a、hsa-miR-15a*、hsa-miR-15b、hsa-miR-15b*、hsa-miR-16、hsa-miR-16-1*、hsa-miR-16-2*、hsa-miR-17、hsa-miR-17*、hsa-miR-181a、hsa-miR-181a*、hsa-miR-181a-2*、hsa-miR-181b、hsa-miR-181c、hsa-miR-181c*、hsa-miR-181d、hsa-miR-182、hsa-miR-182*、hsa-miR-1825、hsa-miR-1826、hsa-miR-1827、hsa-miR-183、hsa-miR-183*、hsa-miR-184、hsa-miR-185、hsa-miR-185*、hsa-miR-186、hsa-miR-186*、hsa-miR-187、hsa-miR-187*、hsa-miR-188-3p、hsa-miR-188-5p、hsa-miR-18a、hsa-miR-18a*、hsa-miR-18b、hsa-miR-18b*、hsa-miR-190、hsa-miR-190b、hsa-miR-191、hsa-miR-191*、hsa-miR-192、hsa-miR-192*、hsa-miR-193a-3p、hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-193b、hsa-miR-193b*、hsa-miR-194、hsa-miR-194*、hsa-miR-195、hsa-miR-195*、hsa-miR-196a、hsa-miR-196a*、hsa-miR-196b、hsa-miR-197、hsa-miR-198、hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-19a、hsa-miR-19a*、hsa-miR-19b、hsa-miR-19b-1*、hsa-miR-19b-2*、hsa-miR-200a、hsa-miR-200a*、hsa-miR-200b、hsa-miR-200b*、hsa-miR-200c、hsa-miR-200c*、hsa-miR-202、hsa-miR-202*、hsa-miR-203、hsa-miR-204、hsa-miR-205、hsa-miR-206、hsa-miR-208a、hsa-miR-208b、hsa-miR-20a、hsa-miR-20a*、hsa-miR-20b、hsa-miR-20b*、hsa-miR-21、hsa-miR-21*、hsa-miR-210、hsa-miR-211、hsa-miR-212、hsa-miR-214、hsa-miR-214*、hsa-miR-215、hsa-miR-216a、hsa-miR-216b、hsa-miR-217、hsa-miR-218、hsa-miR-218-1*、hsa-miR-218-2*、hsa-miR-219-1-3p、hsa-miR-219-2-3p、hsa-miR-219-5p、hsa-miR-22、hsa-miR-22*、hsa-miR-220a、hsa-miR-220b、hsa-miR-220c、hsa-miR-221、hsa-miR-221*、hsa-miR-222、hsa-miR-222*、hsa-miR-223、hsa-miR-223*、hsa-miR-224、hsa-miR-23a、hsa-miR-23a*、hsa-miR-23b、hsa-miR-23b*、hsa-miR-24、hsa-miR-24-1*、hsa-miR-24-2*、hsa-miR-25、hsa-miR-25*、hsa-miR-26a、hsa-miR-26a-1*、hsa-miR-26a-2*、hsa-miR-26b、hsa-miR-26b*、hsa-miR-27a、hsa-miR-27a*、hsa-miR-27b、hsa-miR-27b*、hsa-miR-28-3p、hsa-miR-28-5p、hsa-miR-296-3p、hsa-miR-296-5p、hsa-miR-297、hsa-miR-298、hsa-miR-299-3p、hsa-miR-299-5p、hsa-miR-29a、hsa-miR-29a*、hsa-miR-29b、hsa-miR-29b-1*、hsa-miR-29b-2*、hsa-miR-29c、hsa-miR-29c*、hsa-miR-300、hsa-miR-301a、hsa-miR-301b、hsa-miR-302a、hsa-miR-302a*、hsa-miR-302b、hsa-miR-302b*、hsa-miR-302c、hsa-miR-302c*、hsa-miR-302d、hsa-miR-302d*、hsa-miR-302e、hsa-miR-302f、hsa-miR-30a、hsa-miR-30a*、hsa-miR-30b、hsa-miR-30b*、hsa-miR-30c、hsa-miR-30c-1*、hsa-miR-30c-2*、hsa-miR-30d、hsa-miR-30d*、hsa-miR-30e、hsa-miR-30e*、hsa-miR-31、hsa-miR-31*、hsa-miR-32、hsa-miR-32*、hsa-miR-320a、hsa-miR-320b、hsa-miR-320c、hsa-miR-320d、hsa-miR-323-3p、hsa-miR-323-5p、hsa-miR-324-3p、hsa-miR-324-5p、hsa-miR-325、hsa-miR-326、hsa-miR-328、hsa-miR-329、hsa-miR-330-3p、hsa-miR-330-5p、hsa-miR-331-3p、hsa-miR-331-5p、hsa-miR-335、hsa-miR-335*、hsa-miR-337-3p、hsa-miR-337-5p、hsa-miR-338-3p、hsa-miR-338-5p、hsa-miR-339-3p、hsa-miR-339-5p、hsa-miR-33a、hsa-miR-33a*、hsa-miR-33b、hsa-miR-33b*、hsa-miR-340、hsa-miR-340*、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-342-5p、hsa-miR-345、hsa-miR-346、hsa-miR-34a、hsa-miR-34a*、hsa-miR-34b、hsa-miR-34b*、hsa-miR-34c-3p、hsa-miR-34c-5p、hsa-miR-361-3p、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-362-3p、hsa-miR-362-5p、hsa-miR-363、hsa-miR-363*、hsa-miR-365、hsa-miR-367、hsa-miR-367*、hsa-miR-369-3p、hsa-miR-369-5p、hsa-miR-370、hsa-miR-371-3p、hsa-miR-371-5p、hsa-miR-372、hsa-miR-373、hsa-miR-373*、hsa-miR-374a、hsa-miR-374a*、hsa-miR-374b、hsa-miR-374b*、hsa-miR-375、hsa-miR-376a、hsa-miR-376a*、hsa-miR-376b、hsa-miR-376c、hsa-miR-377、hsa-miR-377*、hsa-miR-378、hsa-miR-378*、hsa-miR-379、hsa-miR-379*、hsa-miR-380、hsa-miR-380*、hsa-miR-381、hsa-miR-382、hsa-miR-383、hsa-miR-384、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-409-5p、hsa-miR-410、hsa-miR-411、hsa-miR-411*、hsa-miR-412、hsa-miR-421、hsa-miR-422a、hsa-miR-423-3p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-424、hsa-miR-424*、hsa-miR-425、hsa-miR-425*、hsa-miR-429、hsa-miR-431、hsa-miR-431*、hsa-miR-432、hsa-miR-432*、hsa-miR-433、hsa-miR-448、hsa-miR-449a、hsa-miR-449b、hsa-miR-450a、hsa-miR-450b-3p、hsa-miR-450b-5p、hsa-miR-451、hsa-miR-452、hsa-miR-452*、hsa-miR-453、hsa-miR-454、hsa-miR-454*、hsa-miR-455-3p、hsa-miR-455-5p、hsa-miR-483-3p、hsa-miR-483-5p、hsa-miR-484、hsa-miR-485-3p、hsa-miR-485-5p、hsa-miR-486-3p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-487a、hsa-miR-487b、hsa-miR-488、hsa-miR-488*、hsa-miR-489、hsa-miR-490-3p、hsa-miR-490-5p、hsa-miR-491-3p、hsa-miR-491-5p、hsa-miR-492、hsa-miR-493、hsa-miR-493*、hsa-miR-494、hsa-miR-495、hsa-miR-496、hsa-miR-497、hsa-miR-497*、hsa-miR-498、hsa-miR-499-3p、hsa-miR-499-5p、hsa-miR-500、hsa-miR-500*、hsa-miR-501-3p、hsa-miR-501-5p、hsa-miR-502-3p、hsa-miR-502-5p、hsa-miR-503、hsa-miR-504、hsa-miR-505、hsa-miR-505*、hsa-miR-506、hsa-miR-507、hsa-miR-508-3p、hsa-miR-508-5p、hsa-miR-509-3-5p、hsa-miR-509-3p、hsa-miR-509-5p、hsa-miR-510、hsa-miR-511、hsa-miR-512-3p、hsa-miR-512-5p、hsa-miR-513a-3p、hsa-miR-513a-5p、hsa-miR-513b、hsa-miR-513c、hsa-miR-514、hsa-miR-515-3p、hsa-miR-515-5p、hsa-miR-516a-3p、hsa-miR-516a-5p、hsa-miR-516b、hsa-miR-517*、hsa-miR-517a、hsa-miR-517b、hsa-miR-517c、hsa-miR-518a-3p、hsa-miR-518a-5p、hsa-miR-518b、hsa-miR-518c、hsa-miR-518c*、hsa-miR-518d-3p、hsa-miR-518d-5p、hsa-miR-518e、hsa-miR-518e*、hsa-miR-518f、hsa-miR-518f*、hsa-miR-519a、hsa-miR-519b-3p、hsa-miR-519c-3p、hsa-miR-519d、hsa-miR-519e、hsa-miR-519e*、hsa-miR-520a-3p、hsa-miR-520a-5p、hsa-miR-520b、hsa-miR-520c-3p、hsa-miR-520d-3p、hsa-miR-520d-5p、hsa-miR-520e、hsa-miR-520f、hsa-miR-520g、hsa-miR-520h、hsa-miR-521、hsa-miR-522、hsa-miR-523、hsa-miR-524-3p、hsa-miR-524-5p、hsa-miR-525-3p、hsa-miR-525-5p、hsa-miR-526b、hsa-miR-526b*、hsa-miR-532-3p、hsa-miR-532-5p、hsa-miR-539、hsa-miR-541、hsa-miR-541*、hsa-miR-542-3p、hsa-miR-542-5p、hsa-miR-543、hsa-miR-544、hsa-miR-545、hsa-miR-545*、hsa-miR-548a-3p、hsa-miR-548a-5p、hsa-miR-548b-3p、hsa-miR-548b-5p、hsa-miR-548c-3p、hsa-miR-548c-5p、hsa-miR-548d-3p、hsa-miR-548d-5p、hsa-miR-548e、hsa-miR-548f、hsa-miR-548g、hsa-miR-548h、hsa-miR-548i、hsa-miR-548j、hsa-miR-548k、hsa-miR-548l、hsa-miR-548m、hsa-miR-548n、hsa-miR-548o、hsa-miR-548p、hsa-miR-549、hsa-miR-550、hsa-miR-550*、hsa-miR-551a、hsa-miR-551b、hsa-miR-551b*、hsa-miR-552、hsa-miR-553、hsa-miR-554、hsa-miR-555、hsa-miR-556-3p、hsa-miR-556-5p、hsa-miR-557、hsa-miR-558、hsa-miR-559、hsa-miR-561、hsa-miR-562、hsa-miR-563、hsa-miR-564、hsa-miR-566、hsa-miR-567、hsa-miR-568、hsa-miR-569、hsa-miR-570、hsa-miR-571、hsa-miR-572、hsa-miR-573、hsa-miR-574-3p、hsa-miR-574-5p、hsa-miR-575、hsa-miR-576-3p、hsa-miR-576-5p、hsa-miR-577、hsa-miR-578、hsa-miR-579、hsa-miR-580、hsa-miR-581、hsa-miR-582-3p、hsa-miR-582-5p、hsa-miR-583、hsa-miR-584、hsa-miR-585、hsa-miR-586、hsa-miR-587、hsa-miR-588、hsa-miR-589、hsa-miR-589*、hsa-miR-590-3p、hsa-miR-590-5p、hsa-miR-591、hsa-miR-592、hsa-miR-593、hsa-miR-593*、hsa-miR-595、hsa-miR-596、hsa-miR-597、hsa-miR-598、hsa-miR-599、hsa-miR-600、hsa-miR-601、hsa-miR-602、hsa-miR-603、hsa-miR-604、hsa-miR-605、hsa-miR-606、hsa-miR-607、hsa-miR-608、hsa-miR-609、hsa-miR-610、hsa-miR-611、hsa-miR-612、hsa-miR-613、hsa-miR-614、hsa-miR-615-3p、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-616、hsa-miR-616*、hsa-miR-617、hsa-miR-618、hsa-miR-619、hsa-miR-620、hsa-miR-621、hsa-miR-622、hsa-miR-623、
hsa-miR-624、hsa-miR-624*、hsa-miR-625、hsa-miR-625*、hsa-miR-626、hsa-miR-627、hsa-miR-628-3p、hsa-miR-628-5p、hsa-miR-629、hsa-miR-629*、hsa-miR-630、hsa-miR-631、hsa-miR-632、hsa-miR-633、hsa-miR-634、hsa-miR-635、hsa-miR-636、hsa-miR-637、hsa-miR-638、hsa-miR-639、hsa-miR-640、hsa-miR-641、hsa-miR-642、hsa-miR-643、hsa-miR-644、hsa-miR-645、hsa-miR-646、hsa-miR-647、hsa-miR-648、hsa-miR-649、hsa-miR-650、hsa-miR-651、hsa-miR-652、hsa-miR-653、hsa-miR-654-3p、hsa-miR-654-5p、hsa-miR-655、hsa-miR-656、hsa-miR-657、hsa-miR-658、hsa-miR-659、hsa-miR-660、hsa-miR-661、hsa-miR-662、hsa-miR-663、hsa-miR-663b、hsa-miR-664、hsa-miR-664*、hsa-miR-665、hsa-miR-668、hsa-miR-671-3p、hsa-miR-671-5p、hsa-miR-675、hsa-miR-7、hsa-miR-708、hsa-miR-708*、hsa-miR-7-1*、hsa-miR-7-2*、hsa-miR-720、hsa-miR-744、hsa-miR-744*、hsa-miR-758、hsa-miR-760、hsa-miR-765、hsa-miR-766、hsa-miR-767-3p、hsa-miR-767-5p、hsa-miR-768-3p、hsa-miR-768-5p、hsa-miR-769-3p、hsa-miR-769-5p、hsa-miR-770-5p、hsa-miR-802、hsa-miR-873、hsa-miR-874、hsa-miR-875-3p、hsa-miR-875-5p、hsa-miR-876-3p、hsa-miR-876-5p、hsa-miR-877、hsa-miR-877*、hsa-miR-885-3p、hsa-miR-885-5p、hsa-miR-886-3p、hsa-miR-886-5p、hsa-miR-887、hsa-miR-888、hsa-miR-888*、hsa-miR-889、hsa-miR-890、hsa-miR-891a、hsa-miR-891b、hsa-miR-892a、hsa-miR-892b、hsa-miR-9、hsa-miR-9*、hsa-miR-920、hsa-miR-921、hsa-miR-922、hsa-miR-923、hsa-miR-924、hsa-miR-92a、hsa-miR-92a-1*、hsa-miR-92a-2*、hsa-miR-92b、hsa-miR-92b*、hsa-miR-93、hsa-miR-93*、hsa-miR-933、hsa-miR-934、hsa-miR-935、hsa-miR-936、hsa-miR-937、hsa-miR-938、hsa-miR-939、hsa-miR-940、hsa-miR-941、hsa-miR-942、hsa-miR-943、hsa-miR-944、hsa-miR-95、hsa-miR-96、hsa-miR-96*、hsa-miR-98、hsa-miR-99a、hsa-miR-99a*、hsa-miR-99b、およびhsa-miR-99b*。
【００５３】
いくつかの態様において、本開示によって記載されるとおりの構築物（例として、組み換え核酸、ＡＡＶベクター、ｒＡＡＶ等々）の１以上の結合部位は、免疫系の細胞（例として、抗原提示細胞（ＡＰＣ））から導入遺伝子発現を脱標的にする。いくつかの態様において、免疫細胞（例として、抗原提示細胞）から導入遺伝子発現を脱標的にするｍｉＲＮＡは、免疫関連ｍｉＲＮＡと称される。いくつかの態様において、免疫関連ｍｉＲＮＡは、非免疫細胞（例として、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、間葉細胞等々の対照細胞）と比較して、免疫細胞中少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍のより高いレベルの発現を呈する、免疫細胞中に発現されるｍｉＲＮＡである。いくつかの態様において、免疫関連ｍｉＲＮＡが発現される免疫系の細胞（免疫細胞）は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、キラーＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、γδ Ｔ細胞、樹状細胞、マクロファージ、単球、血管内皮細胞、または他の免疫細胞である。
【００５４】
いくつかの態様において、免疫系の細胞は、以下のマーカーの１以上を発現するＢ細胞である：B220、BLAST-2（EBVCS）、Bu-1、CD19、CD20（L26）、CD22、CD24、CD27、CD57、CD72、CD79a、CD79b、CD86、chB6、D8/17、FMC7、L26、M17、MUM-1、Pax-5（BSAP）、およびPC47H。いくつかの態様において、免疫系の細胞は、以下のマーカーの１以上を発現するＴ細胞である：ART2、CD1a、CD1d、CD11b（Mac-1）、CD134（OX40）、CD150、CD2、CD25（インターロイキン２受容体アルファ）、CD3、CD38、CD4、CD45RO、CD5、CD7、CD72、CD8、CRTAM、FOXP3、FT2、GPCA、HLA-DR、HML-1、HT23A、Leu-22、Ly-2、Ly-m22、MICG、MRC OX 8、MRC OX-22、OX40、PD-1（Programmed death-1）、RT6、TCR（Ｔ細胞受容体）、Thy-1（CD90）、およびTSA-2（Thymic shared Ag-2）。いくつかの態様において、免疫関連ｍｉＲＮＡは、以下から選択される：miR-15a、miR-16-1、miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-19b-1、miR-20a、miR-21、miR-29a/b/c、miR-30b、miR-31、miR-34a、miR-92a-1、miR-106a、miR-125a/b、miR-142-3p、miR-146a、miR-150、miR-155、miR-181a、miR-223およびmiR-424、miR-221、miR-222、let-7i、miR-148、およびmiR-152。
【００５５】
組み換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶベクター）
本開示の「組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクター」は、典型的には、最小限、導入遺伝子およびその調節配列と、５’および３’ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）とから構成される。それは、カプシドタンパク質中へパッケージングされて、選択された標的細胞へ送達される、この組み換えＡＡＶベクターである。いくつかの態様において、導入遺伝子は、関心のあるポリペプチド、タンパク質、機能性ＲＮＡ分子（例として、ｇＲＮＡ）、または他の遺伝子産物をコードするベクター配列に対して異種の核酸配列である。核酸コード配列は、標的組織の細胞中の導入遺伝子の転写、翻訳、および／または発現を許容するやり方で、調節性の構成要素へ作動可能に(operatively)連結されている。
【００５６】
いくつかの態様において、本開示は、導入遺伝子へ動作可能に(operably)連結されたプロモーターを包含する、核酸配列を含む組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターに関するが、ここで導入遺伝子は、ＭｅＣＰ２タンパク質（例として、ＭｅＣＰ２アイソフォームｅ１）をコードする。いくつかの態様において、ｒＡＡＶベクターはさらに、１以上のＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、例えばＡＡＶ２ ＩＴＲをコードする核酸配列を含む。いくつかの態様において、ｒＡＡＶベクターはさらに、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、およびＡＡＶ６からなる群から選択される１以上のＡＡＶ ＩＴＲをコードする核酸配列を含む。いくつかの態様において、ＩＴＲは、例えばWO/2016/172008に開示されるとおりの、ＩＴＲ機能を置き換える人工的な配列である。
【００５７】
ベクターのＡＡＶ配列は、典型的には、シス作用性の５’および３’逆方向末端反復配列（例として、B. J. Carter, in “Handbook of Parvoviruses”, ed., P. Tijsser, CRC Press, pp. 155 168 (1990)を参照）を含む。ＩＴＲ配列は、約１４５ｂｐ長である。好ましくは、実質的に、ＩＴＲをコードする配列の全体が分子中に使用されるが、これらの配列へのある程度の微修飾は許容され得る。これらのＩＴＲ配列を修飾する能力は、当該技術分野の技能の範囲内である。（例として、Sambrook et al, “Molecular Cloning. A Laboratory Manual”, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989)などの教科書；およびK. Fisher et al., J Virol., 70:520 532 (1996)を参照）。本開示において採用されるかかる分子の例は、導入遺伝子を含有する「シス作用性の」プラスミドであるが、ここで選択された導入遺伝子配列および関連する調節要素は、５’および３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列の脇に配置されている。ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、現在同定されている哺乳動物のＡＡＶ型を包含するいずれの知られているＡＡＶから得られるものであってもよい（例として、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、またはＡＡＶ６のＩＴＲ配列）。
【００５８】
組み換えＡＡＶベクターについて上で同定された主要素に加えて、ベクターはまた、本開示によって産生されたプラスミドベクターがトランスフェクトされたかまたはウイルスに感染された細胞中のその転写、翻訳、および／または発現を許容するやり方で、導入遺伝子へ動作可能に連結されることが必要な制御要素も包含する。本明細書に使用されるとき、「動作可能に連結された(operably linked)」配列は、関心のある遺伝子と連続した発現制御配列と、関心のある遺伝子を制御するためにトランスでまたは少し離れて(at a distance)作用する発現制御配列との両方を包含する。
【００５９】
発現制御配列は、適切な転写開始、終結、プロモーター、およびエンハンサー配列；スプライシングおよびポリアデニル化（ポリＡ）シグナルなどの、効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質のｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を増強する配列（すなわち、コザックコンセンサス配列）；タンパク質安定性を増強する配列；および、所望の場合、コードされた産物の分泌を増強する配列を包含する。天然の、構成的な、誘導性の、および／または組織特異的のプロモーターを包含する、大多数の発現制御配列は、当該技術分野において知られており、かつ利用されてもよい。
【００６０】
本明細書に使用されるとき、核酸配列（例として、コード配列）および調節配列は、それらが調節配列の影響下またはその制御下に核酸配列の発現または転写を置くように共有結合で連結されているとき、「動作可能に」連結されていると言われる。核酸配列が翻訳されて機能性タンパク質になることが所望されるとき、５’調節配列中のプロモーターの誘導がコード配列の転写をもたらす場合、かつ２つのＤＮＡ配列間の連結の性質が、（１）フレームシフト突然変異の導入ももたらさず、（２）プロモーター領域の、コード配列を転写に向かわせる能力にも干渉せず、（３）対応するＲＮＡ転写産物の、翻訳されてタンパク質になる能力にも干渉しない場合、２つのＤＮＡ配列は、動作可能に連結されていると言われる。
【００６１】
よって、プロモーター領域が核酸配列の転写を、その結果得られる転写産物が翻訳されて所望のタンパク質またはポリペプチドになるように、生じさせることが可能であったなら、プロモーター領域は、そのＤＮＡ配列へ動作可能に連結されていたであろう。同様に、２以上のコード領域は、それらが、２以上のタンパク質の発現をもたらし、フレーム単位で(in frame)翻訳されるように連結されているとき、動作可能に連結されている。いくつかの態様において、動作可能に連結されたコード配列は、融合タンパク質を生産する。いくつかの態様において、動作可能に連結されたコード配列は、機能性ＲＮＡ（例として、ｇＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）を生産する。
【００６２】
タンパク質をコードする核酸について、ポリアデニル化配列は一般に、導入遺伝子配列の後、かつ３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列の前に挿入される。本開示において有用なｒＡＡＶ構築物はまた、プロモーター／エンハンサー配列と導入遺伝子との間に望ましく位置付けられるイントロンを含有していてもよい。あり得るイントロン配列の１つはＳＶ−４０に由来し、ＳＶ−４０ Ｔイントロン配列と称される。使用されてもよい別のベクター要素は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）である。ＩＲＥＳ配列は、単一の遺伝子転写産物からの１より多くのポリペプチドを産生するために使用される。ＩＲＥＳ配列は、１より多くのポリペプチド鎖を含有するタンパク質を産生するために使用されるであろう。これらのおよび／または他のベクター要素の選択は、必要に応じて(as appropriate)実施され得、多くのかかる配列は入手可能である［例として、Sambrookら、および例えばその3.18 3.26頁および16.17 16.27頁に引用された参考文献、およびAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York、1989を参照］。
【００６３】
いくつかの態様において、口蹄疫ウイルス２Ａ配列は、ポリタンパク質に包含される；これは、ポリタンパク質の切断を媒介することが示された小ペプチド（およそ１８アミノ酸長）である（Ryan, M D et al., EMBO, 1994; 4: 928-933；Mattion, N M et al., J Virology, November 1996; p. 8124-8127；Furler, S et al., Gene Therapy, 2001; 8: 864-873；およびHalpin, C et al., The Plant Journal, 1999; 4: 453-459）。２Ａ配列の切断活性はこれまでに、プラスミドおよび遺伝子治療ベクター（ＡＡＶおよびレトロウイルス）を包含する人工系において実証されていた（Ryan, M D et al., EMBO, 1994; 4: 928-933；Mattion, N M et al., J Virology, November 1996; p. 8124-8127；Furler, S et al., Gene Therapy, 2001; 8: 864-873；およびHalpin, C et al., The Plant Journal, 1999; 4: 453-459；de Felipe, P et al., Gene Therapy, 1999; 6: 198-208；de Felipe, P et al., Human Gene Therapy, 2000; 11: 1921-1931.；およびKlump, H et al., Gene Therapy, 2001; 8: 811-817）。
【００６４】
宿主細胞中の遺伝子発現にとって必要とされる調節配列の正確な性質は、種間、組織間、または細胞型間で変動し得るが、しかし一般に、転写および翻訳の開始夫々に関与する５’非転写配列および５’非翻訳配列、たとえばＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列、エンハンサー要素等を、必要に応じて(as necessary)、包含するであろう。とくに、かかる５’非転写調節配列は、動作可能に結び付けられた遺伝子の転写制御のためのプロモーター配列を包含するプロモーター領域を包含するであろう。調節配列はまた、要望どおり、エンハンサー配列または上流のアクチベーター配列を包含していてもよい。本開示のベクターは任意に、５’リーダー配列またはシグナル配列を包含していてもよい。適切なベクターの選出および設計は、当業者の能力および裁量の範囲内である
【００６５】
構成的プロモーターの例は、限定せずに、レトロウイルスであるラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意にＲＳＶエンハンサーをもつ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（任意にＣＭＶエンハンサーをもつ）［例として、Boshart et al, Cell, 41:521-530 (1985)を参照］、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β−アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、およびＥＦ１αプロモーター［Invitrogen］を包含する。いくつかの態様において、プロモーターは、増強されたニワトリβ−アクチンプロモーターである。
【００６６】
誘導プロモーターは、遺伝子発現の調節を可能にさせ、外因的に供給される(exogenously supplied)化合物、温度などの環境因子、もしくは特定の生理学的状態の存在、例として急性期、細胞の具体的な分化状態によって、または複製細胞のみにおいて、調節され得る。誘導プロモーターおよび誘導系は、限定せずに、Invitrogen、Clontech、およびAriadを包含する、様々な商業的供給源から入手可能である。多くの他の系も記載され、当業者によって容易に選択され得る。外因的に供給されるプロモーターによって調節される誘導プロモーターの例は、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオネイン（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導性マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系（WO 98/10088）；エクジソン昆虫プロモーター（No et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3346-3351 (1996)）、テトラサイクリン抑制系（Gossen et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)）、テトラサイクリン誘導系（Gossen et al, Science, 268:1766-1769 (1995)、またHarvey et al, Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518 (1998)も参照）、ＲＵ４８６誘導系（Wang et al, Nat. Biotech., 15:239-243 (1997)およびWang et al, Gene Ther., 4:432-441 (1997)）およびラパマイシン誘導系（Magari et al, J. Clin. Invest., 100:2865-2872 (1997)）を包含する。これに関連して有用であり得る誘導プロモーターの更なる他の型は、特定の生理学的状態、例として温度、急性期、細胞の具体的な分化状態によって、または複製細胞のみにおいて、調節されるものである。
【００６７】
別の態様において、導入遺伝子のための天然のプロモーターが使用されるであろう。導入遺伝子の発現が天然の発現を模倣すべきであることが所望されるとき、天然のプロモーターが好ましいこともある。導入遺伝子の発現が、時間的にもしくは発生的に、または組織特異的なやり方で、または特定の転写刺激に応答して、調節されなければならないとき、天然のプロモーターが使用されてもよい。例えば、いくつかの態様において、天然のプロモーターは、マウスＭｅＣＰ２プロモーターなどのＭｅＣＰ２プロモーターである。いくつかの態様において、マウスＭｅＣＰ２プロモーターは、配列番号３で表される配列によって表される。さらなる態様において、エンハンサー要素、ポリアデニル化部位、またはコザックコンセンサス配列などの、他の天然の発現制御要素はまた、天然の発現を模倣するために使用されてもよい。
【００６８】
いくつかの態様において、調節配列は、組織特異的な遺伝子発現能を授ける。いくつかのケースにおいて、組織特異的な調節配列は、組織特異的なやり方で転写を誘導する組織特異的な転写因子に結合する。かかる組織特異的な調節配列（例として、プロモーター、エンハンサー等々）は、当該技術分野において周知である。例示の組織特異的な調節配列は、これらに限定されないが、以下の組織特異的なプロモーター：目特異的なレチノスキシンプロモーターもしくはＫ１２プロモーター、肝臓特異的なチオレキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、インスリンプロモーター、グルカゴンプロモーター、ソマトスタチンプロモーター、膵臓ポリペプチド（ＰＰＹ）プロモーター、シナプシン−１（Ｓｙｎ）プロモーター、クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、哺乳動物デスミン（ＤＥＳ）プロモーター、α−ミオシン重鎖（ａ−ＭＨＣ）プロモーター、または心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）プロモーターを包含する。
【００６９】
他の例示のプロモーターは、ベータ−アクチンプロモーター、Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター、Sandig et al., Gene Ther., 3:1002-9 (1996)；アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）プロモーター、Arbuthnot et al., Hum.Gene Ther., 7:1503-14 (1996))、骨オステオカルシンプロモーター（Stein et al., Mol. Biol. Rep., 24:185-96 (1997)）；骨シアロタンパク質プロモーター（Chen et al., J. Bone Miner. Res., 11:654-64 (1996)）、ＣＤ２プロモーター（Hansal et al., J. Immunol., 161:1063-8 (1998)）；免疫グロブリン重鎖プロモーター；Ｔ細胞受容体α鎖プロモーター、ニューロンの、たとえばニューロン特異的な、エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（Andersen et al., Cell. Mol. Neurobiol., 13:503-15 (1993)）、ニューロフィラメント軽鎖遺伝子プロモーター（Piccioli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5611-5 (1991)）、およびニューロン特異的なｖｇｆ遺伝子プロモーター（Piccioli et al., Neuron, 15:373-84 (1995)）を包含し、数ある中でも当業者にとって明らかであろうものも包含する。
【００７０】
いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡの１以上のための１以上の結合部位は、導入遺伝子を内包する対象の１以上の組織において導入遺伝子の発現を阻害するために、ｒＡＡＶベクターの導入遺伝子に組み込まれる。当業者は、結合部位が導入遺伝子の発現を組織特異的なやり方で制御するために選択され得ることを解するであろう。例えば、肝臓特異的なmiR-122のための結合部位は、肝臓において導入遺伝子の発現を阻害するために、その導入遺伝子中へ組み込まれ得る。ｍＲＮＡ中の標的部位は、５’ＵＴＲ中、３’ＵＴＲ中、またはコード領域中にあってもよい。典型的には、標的部位は、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ中にある。さらにまた、導入遺伝子は、複数のｍｉＲＮＡが、同じ部位または複数の部位を認識することによってｍＲＮＡを調節できるように、設計され得る。複数のｍｉＲＮＡ結合部位の存在は、複数のＲＩＳＣの共同作用をもたらし得、かつ発現の高度に効率的な阻害を提供し得る。標的部位の配列は、総計５〜１００の、１０〜６０の、またはより多くのヌクレオチドを含んでいてもよい。標的部位の配列は、標的遺伝子結合部位の配列の少なくとも５ヌクレオチドを含んでいてもよい。
【００７１】
組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）
いくつかの側面において、本開示は、単離されたＡＡＶを提供する。ＡＡＶに関し本明細書に使用されるとき、用語「単離された」は、人工的に産生されたかまたは得られたＡＡＶを指す。単離されたＡＡＶは、組み換え方法を使用して産生されてもよい。かかるＡＡＶは本明細書中、「組み換えＡＡＶ」と称される。組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、好ましくは、ｒＡＡＶのヌクレアーゼおよび／または導入遺伝子が１以上の所定の組織（単数または複数）へ特異的に送達されるように、組織特異的な標的能を有する。ＡＡＶカプシドは、これらの組織特異的な標的能を決定する際の重要な要素である。よって、標的にされる組織に適切なカプシドを有するｒＡＡＶが選択され得る。
【００７２】
所望されるカプシドタンパク質を有する組み換えＡＡＶを得るための方法は、当該技術分野において周知である。（例えば、US 2003/0138772を参照、それらの内容は、それら全体が参照されることによって本明細書に組み込まれる）。典型的には、方法は、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸配列；機能性ｒｅｐ遺伝子；ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）と導入遺伝子とから構成される組み換えＡＡＶベクター；およびＡＡＶカプシドタンパク質中への組み換えＡＡＶベクターパッケージングを許容するのに充分なヘルパー機能、を含有する宿主細胞を培養することを伴う。いくつかの態様において、カプシドタンパク質は、ＡＡＶのｃａｐ遺伝子によってコードされる構造タンパク質である。ＡＡＶは、３つのカプシドタンパク質であるビリオンタンパク質１〜３（ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３と名付けられる）を含むが、それらのすべては、選択的スプライシングを介して単一ｃａｐ遺伝子のから転写される。いくつかの態様において、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３の分子量は夫々、約８７ｋＤａ、約７２ｋＤａ、および約６２ｋＤａである。いくつかの態様において、翻訳の際、カプシドタンパク質は、ウイルスゲノムの周りに６０マー(60-mer)の球状タンパク質シェルを形成する。いくつかの態様において、カプシドタンパク質の機能は、ウイルスゲノムを保護すること、ゲノムを送達すること、および宿主と相互作用することである。いくつかの側面において、カプシドタンパク質は、組織特異的なやり方でウイルスゲノムを宿主へ送達する。
【００７３】
いくつかの態様において、本開示によって記載されるｒＡＡＶは、血液脳関門を横断することが可能な１以上のカプシドタンパク質を含む。いくつかの態様において、少なくとも１つのカプシドタンパク質は、AAV1、AAV2、AAV2i8、AAV2.5、AAV6、AAV8、AAVrh8、AAV9、AAVrh10、AAV-B1、AAV9.45A-String（例として、AAV9.45-AS）、AAV9.45Angiopep、AAV9.47-Angiopep、およびAAV9.47-ASからなる群から選択される血清型を有する。いくつかの態様において、少なくとも１つのカプシドタンパク質は、例えば米国特許第9,585,971号に記載されるとおり、AAV-PHP.B血清型を有する。いくつかの態様において、カプシドタンパク質は、WO2015/127128、WO2016/054554、WO2016/054557、またはWO2016/065001に記載されるとおりの血清型を有する。
【００７４】
ｒＡＡＶベクターをＡＡＶカプシド中にパッケージングするための宿主細胞において培養されるべき構成要素は、トランスで宿主細胞へ提供され得る。代わりに、要求される構成要素（例として、組み換えＡＡＶベクター、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、および／またはヘルパー機能）のいずれか１以上は、当業者に知られている方法を使用して、要求される構成要素の１以上を含有するよう改変されている安定した宿主細胞によって提供され得る。最も好適には、かかる安定した宿主細胞は、誘導プロモーターの制御下で、要求される構成要素（単数または複数）を含有するであろう。
【００７５】
しかしながら、要求される構成要素（単数または複数）は、構成的プロモーターの制御下にあってもよい。好適な誘導性および構成的プロモーターの例は、導入遺伝子との使用に好適な調節要素の考察において、本明細書に提供される。もう１つの他の選択肢において、選択された安定した宿主細胞は、構成的プロモーターの制御下の選択された構成要素（単数または複数）および１以上の誘導プロモーターの制御下の他の選択された構成要素（単数または複数）を含有してもよい。例えば、２９３細胞（これは構成的プロモーターの制御下でＥ１ヘルパー機能を含有する）に由来するが、しかし誘導プロモーターの制御下でｒｅｐタンパク質および／またはｃａｐタンパク質を含有する安定した宿主細胞が生成され得る。更なる他の安定した宿主細胞が、当業者によって生成され得る。
【００７６】
いくつかの態様において、本開示は、タンパク質（例として、ＭｅＣＰ２アイソフォームｅ１などの、ＭｅＣＰ２タンパク質）をコードするコード配列を含む核酸を含有する宿主細胞に関する。いくつかの態様において、本開示は、上に記載の宿主細胞を含む組成物に関する。いくつかの態様において、上の宿主細胞を含む組成物はさらに、凍結保存剤(cryopreservative)を含む。
【００７７】
本開示のｒＡＡＶを産生するのに要求される組み換えＡＡＶベクター、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、およびヘルパー機能は、いずれか適切な遺伝学的要素（ベクター）を使用して、パッケージング宿主細胞へ送達され得る。選択される遺伝学的要素は、本明細書に記載の方法を包含する、いずれの好適な方法によっても送達され得る。本開示のいずれの態様を構築するために使用される方法は、核酸操作の技能をもつ者らに知られており、遺伝子工学(genetic engineering)、組み換え改変(recombinant engineering)、および合成技法を包含する。例として、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.を参照。同様に、ｒＡＡＶビリオンを生成する方法は周知であり、好適な方法の選択は、本開示へ限定を課すものではない。例として、K. Fisher et al., J. Virol., 70:520-532 (1993)および米国特許第5,478,745号を参照。
【００７８】
いくつかの態様において、組み換えＡＡＶは、トリプルトランスフェクション方法（米国特許第6,001,650号に詳細に記載される）を使用して産生され得る。典型的には、組み換えＡＡＶは、ＡＡＶ粒子中へパッケージングされるべき組み換えＡＡＶベクター（導入遺伝子を含む）、ＡＡＶヘルパー機能ベクター、および補助機能ベクターを宿主細胞にトランスフェクトすることによって産生される。ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、より結果をもたらす(productive)ＡＡＶ複製およびカプシド形成のためにトランスで機能する「ＡＡＶヘルパー機能」配列（すなわち、ｒｅｐおよびｃａｐ）をコードする。好ましくは、ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、検出可能ないずれの野生型ＡＡＶビリオン（すなわち、機能性のｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を含有するＡＡＶビリオン）も生成せずに、効率的なＡＡＶベクター産生を後押しする。
【００７９】
本開示との使用に好適なベクターの非限定例は、米国特許第6,001,650号に記載のpHLP19、および米国特許第6,156,303号に記載のpRep6cap6ベクター（これらはともにその全体が参照されることによって本明細書に組み込まれる）を包含する。補助機能ベクターは、ＡＡＶが複製のために依存する非ＡＡＶ由来ウイルス機能および／または細胞機能（すなわち、「補助機能」）のためのヌクレオチド配列をコードする。補助機能は、、ＡＡＶ複製に要求されるそれら機能(those functions)を包含するが、これらは限定せずに、ＡＡＶ遺伝子転写の活性化、ステージ特異的なＡＡＶ ｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶ ＤＮＡ複製、ｃａｐ発現産物の合成、およびＡＡＶカプシド集合に関与するそれら機能(those moieties)を包含する。ウイルスベースの補助機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（１型単純ヘルペスウイルス以外の）、およびワクシニアウイルスなどの、知られているヘルパーウイルスのいずれにも由来し得る。
【００８０】
いくつかの側面において、本開示は、トランスフェクトされた宿主細胞を提供する。用語「トランスフェクション」は、細胞による外来ＤＮＡの取り込みを指すために使用され、細胞は、外来性のＤＮＡが細胞膜内部に導入されたとき「トランスフェクトされた」。数多のトランスフェクション技法は一般に、当該技術分野において知られている。例として、Graham et al. (1973) Virology, 52:456、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York、Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier、およびChu et al. (1981) Gene 13:197を参照。かかる技法は、ヌクレオチド組込み型(integration)ベクターおよび他の核酸分子などの１以上の外来性の核酸を好適な宿主細胞中へ導入するために使用され得る。
【００８１】
「宿主細胞」は、関心のある物質を内包するかまたはこれを内容することが可能ないずれの細胞をも指す。しばしば宿主細胞は、哺乳動物の細胞である。宿主細胞は、ＡＡＶヘルパー構築物、ＡＡＶミニ遺伝子プラスミド、補助機能ベクター、または組み換えＡＡＶの産生に関連する他のトランスファー(transfer)ＤＮＡのレシピエントとして使用されてもよい。前記用語は、トランスフェクトされた起源細胞(original cell)の子孫(progeny)を包含する。よって、「宿主細胞」は、本明細書に使用されるとき、外来性のＤＮＡ配列がトランスフェクトされた細胞を指すこともある。単一の親細胞の子孫が、自然の、偶然の、または意図的な突然変異に起因して、形態学において、またはゲノムもしくは全ＤＮＡ相補体において、当初の親(original parent)と完全に同一である必要はなくてもよいことは、理解される。
【００８２】
本明細書に使用されるとき、用語「細胞株」は、in vitroでの継続的または持続的な成長および分裂が可能な細胞の集団を指す。しばしば、細胞株は、単一の前駆細胞に由来するクローン集団である。自発的変化または誘導された変化が、かかるクローン集団の保管または移送の間に核型に生じることは、当該技術分野においてさらに知られている。したがって、言及された細胞株に由来する細胞は、祖先細胞または培養物と正確に同一でなくてもよく、言及された細胞株は、かかるバリアントを包含する。
【００８３】
本明細書に使用されるとき、用語「組み換え細胞」は、生物学的に活性なポリペプチドの転写またはＲＮＡなどの生物学的に活性な核酸の産生に繋がるＤＮＡセグメントなどの外来性のＤＮＡセグメントが導入された細胞を指す。
【００８４】
本明細書に使用されるとき、用語「ベクター」は、適正な制御要素と結び付けられたとき複製することが可能でありかつ細胞間で遺伝子配列を移送し得るいずれの遺伝学的要素、たとえば、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、人工染色体、ウイルス、ビリオン等々を包含する。よって、前記用語は、クローニングおよび発現ビヒクル、ならびにウイルスベクターを包含する。いくつかの態様において、有用なベクターは、転写されるべき核酸セグメントがプロモーターの転写制御下に配置された(positioned)それらベクターであることが企図される。「プロモーター」は、遺伝子の特定の転写を開始するのに要求される細胞の合成機械または導入された合成機械によって認識されるＤＮＡ配列を指す。
【００８５】
句「制御下」または「転写制御下」で、「作動可能に(operatively)配置された」は、ＲＮＡポリメラーゼの開始および遺伝子の発現を制御する核酸に関して、プロモーターが正しい場所および配向にあることを意味する。用語「発現ベクターまたは構築物」は、配列をコードする核酸の一部または全部が転写されることが可能である核酸を含有するいずれの型の遺伝学的構築物をも意味する。いくつかの態様において、発現は、核酸、例えば転写された遺伝子から生物学的に活性なポリペプチド産物または機能性ＲＮＡ（例として、ガイドＲＮＡ）を生成するための核酸の転写を包含する
【００８６】
本開示のｒＡＡＶを産生するために所望されるＡＡＶカプシドに組み換えベクターをパッケージングするための上記の方法は、限定することを意図されておらず、他の好適な方法も当業者には明らかであろう。
【００８７】
投与方法
本開示によって記載される組成物（例として、組み換え核酸、ｒＡＡＶ、医薬組成物等々）は、当該技術分野において知られているいずれの適切な方法に従って対象へ送達され得る。組成物（例として、組み換え核酸、ｒＡＡＶ、医薬組成物等々）は、好ましくは生理学的に適合性のある担体中に（すなわち、組成物中に）懸濁されており、対象、すなわち、ヒト、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ヒツジ、ウサギ、ウマ、ウシ、ヤギ、ブタ、モルモット、ハムスター、ニワトリ、シチメンチョウ、または霊長目の非ヒト動物(例として、マカク(Macaque))などの宿主動物に投与され得る。いくつかの態様において、宿主動物は、ヒトを包含しない。いくつかの態様において、対象は、ヒトである。いくつかの態様において、対象は、１歳未満、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１カ月齢である。
【００８８】
哺乳動物の対象への組成物の送達は、例えば、全身注射（例として、静脈内注射）または髄腔内注射によることもできる。対象のＣＮＳへ組成物を投与するさらなる方法、例えば、頭蓋内注射、線条体内注射等々もまた用いることができる。投与方法の組み合わせ（例として、局所投与および基質内注射）もまた用いることができる。
【００８９】
いくつかの態様において、本開示の組成物は、ｒＡＡＶを単独で、または１以上の他のウイルス（例として、１以上の異なる導入遺伝子を有するコードする第２ｒＡＡＶ）と組み合わせて、含んでいてもよい。いくつかの態様において、組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０種またはそれ以上の異なるｒＡＡＶ（各々が、１以上の異なる導入遺伝子を有する）を含む。
【００９０】
いくつかの態様において、組成物はさらに薬学的に許容し得る担体を含む。好適な担体は、組成物が向けられる適応症を考慮し当業者によって容易に選択され得る。例えば、１つの好適な担体は、様々な緩衝溶液（例として、リン酸緩衝生理食塩水）とともに製剤化されてもよい生理食塩水を包含する。他の例示の担体は、滅菌生理食塩水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナツ油、ゴマ油、および水を包含する。担体の選択は、本開示の限定ではない。
【００９１】
任意に、本開示の組成物は、組み換え核酸またはｒＡＡＶおよび担体（単数または複数）に加えて、防腐剤または化学安定剤などの他の医薬成分を含有していてもよい。好適な例示の防腐剤は、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、およびパラクロロフェノールを包含する。好適な化学安定剤は、ゼラチンおよびアルブミンを包含する。
【００９２】
組成物は、過度の悪影響なしに、所望される組織（例として、ＣＮＳ組織）の細胞にトランスフェクトし、遺伝子のトランスファーおよび発現の充分なレベルを提供するのに充分な量で投与される。薬学的に許容し得る投与ルートの例は、これらに限定されないが、選択された器官への直接送達（例として、目への基質内送達）、経口、吸入（経鼻および気管内送達を包含する）、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腫瘍内、および他の非経口投与ルートを包含する。投与ルートは、所望されるなら、組み合わされてもよい。
【００９３】
具体的な「治療的効果」を達成するのに要求されるｒＡＡＶビリオンの用量、例として、ゲノムコピー／キログラム体重あたり（ＧＣ／ｋｇ）での用量の単位は、以下を包含するがこれらに限定されない複数の因子に基づき変動するであろう：ｒＡＡＶビリオンの投与ルート、治療的効果を達成するのに要求される遺伝子またはＲＮＡの発現レベル、処置される特定の疾患または障害、および遺伝子またはＲＮＡの産物安定性。当業者は、具体的な疾患または障害を有する患者を処置するためのｒＡＡＶビリオン用量範囲を、前述の因子ならびに他の因子に基づき容易に決定し得る。
【００９４】
組成物（例として、組み換え核酸、ｒＡＡＶ、医薬組成物等々）の有効量は、動物を標的感染させ、所望の組織を標的にするのに充分な量である。いくつかの態様において、ｒＡＡＶの有効量は、安定した体細胞遺伝子導入動物モデルを産生するのに充分な量である。有効量は、対象の種、年齢(age)、重量、健康状態、および標的にされるべき組織などの因子に主に依存し、よって動物および組織の間で変動し得る。例えば、ｒＡＡＶの有効量は、一般に、約１０９〜１０１６ゲノムコピーを含有する溶液の約１ｍｌから約１００ｍｌまでの範囲にある。いくつかのケースにおいて、約１０１１〜１０１２ｒＡＡＶゲノムコピーの間の投薬量が適切である。ある態様において、１０１０または１０１１ｒＡＡＶゲノムコピーが、ＣＮＳ組織（例として、角膜組織）を標的にするのに有効である。いくつかのケースにおいて、安定したトランスジェニック動物は、ｒＡＡＶの複数回用量によって産生される。
【００９５】
いくつかの態様において、組成物の用量は、暦日（例えば、２４時間）に１回以下で対象に投与される。いくつかの態様において、組成物の用量は、２、３、４、５、６、または７暦日あたり１回以下で対象に投与される。いくつかの態様において、組成物の用量は、暦週（例えば、７暦日）に１回以下で対象に投与される。いくつかの態様において、組成物の用量は、隔週（例えば、暦２週間に１回）以下で対象に投与される。いくつかの態様において、組成物の用量は、暦月あたり１回以下（例えば、３０暦日に１回）対象に投与される。いくつかの態様において、組成物の用量は、６暦月に１回以下で対象に投与される。いくつかの態様において、組成物の用量は、暦年に１回以下（例えば、３６５日または閏年で３６６日）対象に投与される。
【００９６】
いくつかの態様において、組成物は、その組成物において、具体的にはｒＡＡＶが高濃度（例として、〜１０１３ＧＣ／ｍｌ以上）で存在する組成物において、ＡＡＶ粒子の凝集を低減させるように製剤化される。凝集を低減させるための適切な方法は、例えば、界面活性剤の添加、ｐＨ調整、塩濃度調整等々を包含し得る。（例として、Wright FR, et al., Molecular Therapy (2005) 12, 171-178を参照、その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる。）
【００９７】
薬学的に許容し得る賦形剤および担体溶液の製剤化は、様々な処置レジメンにおいて本明細書に記載の具体的な組成物を使用するための好適な投薬および処置レジメンの開発がそうであるように、当業者に周知である。典型的には、これらの製剤は、活性化合物の少なくとも約０．１％以上を含有してもよいが、活性成分（単数または複数）のパーセンテージはもちろん変動してもよく、便宜的に、総製剤の重量または体積の約１または２％と約７０％または８０％以上との間であってもよい。当然のことながら、治療的に有用な各組成物中の活性化合物の量は、好適な投薬量が化合物のいかなる単位用量でも得られるように、調製されてもよい。可溶性、バイオアベイラビリティ、生物学的半減期、投与ルート、製品有効期間、ならびに他の薬理学的な検討事項などの因子が、かかる医薬製剤を調製する当業者によって企図されるであろう。これを踏まえて、様々な投薬量および処置レジメンが所望され得る。
【００９８】
いくつかの態様において、本明細書に開示される好適に製剤化された医薬組成物中の組成物（例として、組み換え核酸、ｒＡＡＶ、医薬組成物等々）は、標的組織に直接送達され、例えばＣＮＳ組織（例として、脳、脊髄等々）に直接送達される。しかしながら、ある状況では、別のルート、例として、皮下に、膵臓内に、鼻腔内に、非経口的に、静脈内に、筋肉内に、くも膜下腔内に、または経口的に、腹腔内に、または吸入によって、組成物を個別にまたは加えて送達することが所望されるであろう。いくつかの態様において、米国特許第5,543,158号；第5,641,515号および第5,399,363号（各々は、その全体が参照により本明細書に具体的に組み込まれる）に記載のとおりの投与手法(the administration modalities)が、ｒＡＡＶを送達するのに使用されてもよい。いくつかの態様において、好ましい投与モードは、静脈内注射による。
【００９９】
注射可能な使用に好適な医薬形態は、滅菌された注射可能な溶液または分散液の即時調製のための、滅菌された水性溶液または分散液および滅菌された粉末を包含する。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中でも、ならびに油中でも、調製されてもよい。保管および使用の通常の条件下、これらの調製物は、微生物の成長を防止するための防腐剤を含有する。多くのケースにおいて、その形態は滅菌されており、注射針が楽に通過する程度に(to the extent that easy syringability exists)流動性がある。それは、製造および保管の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に抗して保存されなければならない。
【０１００】
担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例として、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール、等）、これらの好適な混合物、および／または植物油を含有する溶媒または分散媒であり得る。適した流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散媒のケースにおいては要求される粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持されてもよい。微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によってもたらされ得る。多くのケースにおいて、等張剤、例えば、糖類または塩化ナトリウムを包含することが好ましいであろう。注射可能な組成物の長期的な吸収は、吸収を遅延させる剤、例えばモノアステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの、組成物における使用によってもたらされ得る。
【０１０１】
注射可能な水性溶液の投与のために、例えば、溶液は、必要ならば、好適に緩衝化されてもよく、液体の希釈剤は、充分な生理食塩水またはグルコースで最初に等張にされる。これらの具体的な水性溶液は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内の投与にとくに好適である。これに関連して、好適な滅菌水性媒体が、用いられ得る。例えば、１投薬量が、１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液に溶解されて、１０００ｍｌの皮下注入用流体へ加えられるかまたは提案の注入部位にて注射されるかのいずれかであってもよい（例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」第15版、1035〜1038および1570〜1580頁を参照）。投薬量のいくつかのバリエーションは、宿主の状態に応じて、必然的に生じるであろう。投与に対して責任を持つ者は、いずれにしても、個々の宿主にとって適切な用量を決定するであろう。
【０１０２】
滅菌された注射可能な溶液は、要求される量の活性組成物（例として、組み換え核酸、ｒＡＡＶ、医薬組成物等々）を、本明細書に列挙された様々な他の成分とともに（そう要求されるとき）、適切な溶媒に組み込むこと、その後に濾過滅菌が続くことによって調製される。一般に、分散液は、基礎分散媒および上に列挙されたものからの要求される他の成分を含有する滅菌ビヒクル中へ、様々な滅菌活性成分を組み込むことによって調製される。滅菌された注射可能な溶液の調製のための滅菌された粉末のケースにおいて、好ましい調製の方法は、真空乾燥技法および凍結乾燥技法であるが、これらは、先に滅菌濾過されたその溶液から、活性成分の粉末を、いずれか所望の追加成分を加えて産み出す。
【０１０３】
本明細書に開示の組成物（例として、組み換え核酸、ｒＡＡＶ、医薬組成物等々）はまた、中性または塩の形態で製剤化されてもよい。薬学的に許容し得る塩は、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基とともに形成された）、ならびに、例えば塩酸またはリン酸などの無機酸あるいは酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等などの有機酸とともに形成された酸付加塩を包含する。遊離カルボキシル基とともに形成された塩はまた、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン等の有機塩基にも由来し得る。製剤化されると、溶液は、投薬製剤に適合性のあるやり方で、かつ治療的に有効であるような量で、投与されるであろう。製剤は、注射可能な溶液、薬物放出カプセル等などの様々な剤形(dosage forms)で楽に投与される。
【０１０４】
本明細書に使用されるとき、「担体」は、ありとあらゆる溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング剤、希釈剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁液、コロイド等を包含する。薬学的に活性な物質のためのかかる媒体および剤の使用は、当該技術分野において周知である。補助的な活性成分もまた、組成物中へ組み込まれ得る。句「薬学的に許容し得る」は、宿主へ投与されたとき、アレルギーまたは同様の有害反応を生み出さない分子実体(molecular entities)および組成物を指す。
【０１０５】
リポソーム、ナノカプセル、微粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、ベシクル等などの送達ビヒクルは、好適な宿主細胞中への本開示の組成物の導入のために使用されてもよい。とりわけ、ｒＡＡＶベクターによって送達される導入遺伝子は、脂質粒子、リポソーム、ベシクル、ナノスフェア、もしくはナノ粒子、または同種のもののいずれかにカプセル化されて送達されるために製剤化されてもよい。
【０１０６】
かかる製剤は、本明細書に開示の核酸またはｒＡＡＶコンストラクトの薬学的に許容し得る製剤の導入のために、好ましいこともある。リポソームの形成および使用は一般に、当業者に知られている。近年、改善された血清安定性および循環半減時間をもつリポソームが開発された（米国特許第5,741,516号）。さらに、潜在的な薬物担体としてのリポソームおよびリポソーム様調製物の様々な方法が記載されている（米国特許第5,567,434号；第5,552,157号；第5,565,213号；第5,738,868号および第5,795,587号）。
【０１０７】
リポソームは、通常、他の手順によるトランスフェクションに抵抗性である数々の細胞型とともに、首尾よく使用されている。加えて、リポソームは、ウイルスベースの送達系に典型的なＤＮＡ長に制約がない。リポソームは、遺伝子、薬物、放射線治療剤、ウイルス、転写因子およびアロステリックエフェクターを様々な培養細胞株および動物中へ導入するのに効果的に使用されている。加えて、リポソーム媒介薬物送達の有効性を検査する数件の成功した臨床試験が完了している。
【０１０８】
リポソームは、水性媒体に分散されたリン脂質から形成され、自然に多重膜同心二層ベシクル（また多重膜ベシクル（ＭＬＶ）とも呼ばれる）を形成する。ＭＬＶは一般に、２５ｎｍから４μｍまでの直径を有する。ＭＬＶの超音波処理は、コア中に水性溶液を含有する、２００〜５００.ANG.の範囲の直径をもつ小さな一枚膜ベシクル（ＳＵＶ）の形成をもたらす。
【０１０９】
代わりに、ｒＡＡＶのナノカプセル製剤が使用されてもよい。ナノカプセルは一般に、物質を安定かつ再現性のあるように封入し得る。細胞内ポリマー過負荷(intracellular polymeric overloading)に起因する副作用を避けるために、かかる超微細粒子（ほぼ０．１μｍのサイズである）が、in vivoで分解され得るポリマーを使用して設計されるべきである。これらの要求を満たす生分解性ポリアルキル−シアノアクリラートナノ粒子が、使用を企図される。
【０１１０】
レット症候群を処置するための方法
いくつかの側面において、本開示は、レット症候群を処置するための組成物および方法に関する。レット症候群は、例えばSuter et al. J Autism Dev Disord. 2014 Mar; 44(3): 703-711に記載されているように、ＭｅＣＰ２遺伝子の１つ以上の機能喪失型突然変異によって引き起こされる遺伝的神経学的障害である。いくつかの実施形態では、レット症候群を有する対象は、ＭｅＣＰ２遺伝子において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の機能喪失型突然変異を有する。
【０１１１】
本明細書で使用される「処置(treatment)」、「処置する(treating)」、および「治療(therapy)」という用語は、治療的処置および予防的または予防的操作を指す。この用語にはさらに、既存の兆候の改善、さらなる兆候の予防、兆候の根本的な原因の改善または予防、兆候の原因、例えば機能喪失型突然変異に起因する疾患、例えばレット症候群の予防または逆進が含まれる。よって、用語は、障害（例として、レット症候群）を有する対象、またはそのような障害を発症する可能性のある対象に有益な結果が付与されたことを示す。さらに、用語「処置」は、疾患、疾患の兆候または疾患に対する素因を治癒(cure)、治癒(heal)、緩和(alleviate)、緩和(relieve)、変更(alter)、治療(remedy)、改善(ameliorate)、改善(improve)または影響(affect)することを目的として、対象、または疾患、疾患の兆候または疾患に対する素因を有する可能性のある対象からの単離された組織または細胞株への剤（例として、治療剤または治療組成物）の適用または投与として定義される。
【０１１２】
治療剤または治療組成物は、具体的な疾患（例として、レット症候群）の兆候を予防および／または軽減する薬学的に許容し得る形態の化合物を含んでいてもよい。例えば、治療組成物は、レット症候群の兆候を予防および／または軽減する医薬組成物であり得る。本発明の治療組成物は、任意の好適な形態で提供されるであろうと考えられる。治療組成物の形態は、本明細書に記載の投与の様式を含む数多の因子に依存するだろう。治療組成物は、本明細書に記載の他の成分の中でも、希釈剤、アジュバント、および賦形剤を含んでもよい。
【０１１３】
例
例１：in vitroでのヒトＭｅＣＰ２アイソフォームｅ１の遺伝子発現分析
レットの症例のおよそ８０％は、成熟したニューロンで高いレベルで発現するエピジェネティック調節因子であるメチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）をコードするＸ連鎖遺伝子(X-linked gene)の変異によって引き起こされる。ほとんどのレット患者は、ＭｅＣＰ２の正常はおよび突然変異アレルを保有している。疾患は、ランダムなＸ染色体のいくつかの不活性化に起因し、ニューロンの〜５０％が正常なアレルの不活性化によりＭｅＣＰ２欠損しているのに対し、ニューロンの他の〜５０％では突然変異アレルがサイレンシングされ、野生型ＭｅＣＰ２の正常な発現が保持されている。ＣＮＳにおけるＭｅＣＰ２欠乏症の不均質性(heterogeneity)は、レット症候群の遺伝子治療アプローチの開発に重要な密接な関係を有する。レットマウスモデルでは、成体における正常なＭｅＣＰ２発現の回復後に、神経学的表現型の逆進性が観察されている。これらのトランスジェニック実験では、復元されたＭｅＣＰ２発現は、そのネイティブゲノム遺伝子座から駆動され、および活性化が達成された。しかしながら、体細胞遺伝子導入は、これらの成功のいずれもまだ再現していない。
【０１１４】
一般に、ＭｅＣＰ２遺伝子座の重複を有する患者は、典型的には、運動および認知発達の遅延、ならびに重度の知的障害を示すので、ＭｅＣＰ２は、安全な発現レベルの非常に狭い幅(window)がある。ＭｅＣＰ２の異所性の発現は、野生型動物では有毒であるが、胚発生の間に導入遺伝子の発現が始まる場合、ＭｅＣＰ２欠損マウスの疾患表現型を改善するのに安全および部分的に有効であるので、トランスジェニックマウスモデルでの実験は、この概念を確証している。とりわけ、ＭｅＣＰ２遺伝子は、代わりにスプライシングされて、ＭｅＣＰ２−ｅ１およびＭｅＣＰ２−ｅ２と呼ばれる異なるＮ末端を有する２つのタンパク質を生成する。ＭｅＣＰ２遺伝子座重複を有する患者は、両方のＭｅＣＰ２アイソフォームを過剰発現する。したがって、ＭｅＣＰ２遺伝子座重複を有する患者の兆候およびトランスジェニックマウスの結果は、発達の間のＭｅＣＰ２−ｅ２アイソフォームの過剰発現および導入遺伝子発現のタイミングによって説明され得る。
【０１１５】
以前のAAV9-MeCP2-e1の治療的実験は、新生児の血管内（ＩＶ）または脳室内（ＩＣＶ）の送達に焦点を合わせており、いくつかの場合には、致死的な肝臓毒性と後肢のクラスピングに遭遇した。さらにまた、かかる実験で処置されたマウスの齢は、ほとんどのレット患者で実施される可能性のある年齢と必ずしも対応せず、おそらく兆候発症後（６〜１８月）に治療されるであろう。ヒトでは、シナプス形成の主要相は最初の２年で起こり、ニューロンの非ＣＧ ＤＮＡメチル化の迅速な増加、ならびにレット患者の兆候の発症が符合する。マウスでは、シナプス形成は2週齢および4週齢の間に起こる。したがって、出生後０〜１日以降の関係のある発達段階でのAAV-MeCP2遺伝子送達の有効性と潜在的な毒性を調査することが重大なことである。加えて、ＣＮＳ障害を処置するために全身性のＡＡＶ遺伝子送達を実施することに対する重要な制限は、体内で最も高いＡＡＶ向性を持つ臓器である肝臓など、脳以外の器官の形質導入である。
【０１１６】
末梢器官における遺伝子発現を排除し、ＭｅＣＰ２の発現を自己調節もする一連の新しいAAV-MeCP2ベクターを設計した。一般に、ＭｅＣＰ２ ｍＲＮＡは短い（１．８ｋｂ）または長い（〜１０ｋｂ）３’ＵＴＲを保持し、後者は脳での優先的なアイソフォーム発現する。この例に記載するＭｅＣＰ２ ｍＲＮＡコンストラクトは、ＭｅＣＰ２アイソフォームｅ１タンパク質コード配列およびいくつかのｍｉＲＮＡ調節エレメント（ＭＲＥ）を含む。ＣＮＳにおけるＭｅＣＰ２の翻訳は、ＭｅＣＰ２発現に応答した脳由来神経栄養因子（ＢＮＤＦ）レベルの変化を包含する恒常性機構を介してmiR-132によって調節されることが観察された（図１Ａ）。このメカニズムに基づき、骨格筋および肝臓からのＡＡＶ遺伝子発現を脱標的するため、miR-132 MRE（miR-132結合部位）の数が増加した一連のAAV-MeCP2ベクターをmiR-1およびmiR-122の固定数のＭＲＥ（例として、3x-miR-1および3x-mir-122結合部位）に結合した（図１Ｂ）。
【０１１７】
一連のin vitroでの実験を実施した。簡単には、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に３０，０００ｇｃ／細胞のAAV2-MeCP2を４日間トランスフェクトした。図２Ａ〜２Ｂは、ウェスタンブロット（図２Ａ）および正規化タンパク質発現アッセイ（図２Ｂ）により測定される、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＡＡＶ２−ＭｅＣＰ２の効果的な発現を示す。図２Ｃは、３０，０００ｇｃ／細胞の用量で４日間ＡＡＶ２−ＭｅＣＰ２で形質導入した２９３Ｔ細胞の毒性プロファイルを示す。
【０１１８】
マウス一次皮質ニューロンの用量応答の研究は、AAV-GFPおよびAAV-MeCP2ベクターの細胞生存に匹敵する効果を示し（図３Ａ）、ｍｙｃタグ付きヒトＭｅＣＰ２の発現が短いマウスＭｅＣＰ２プロモーター（−２２３から＋５６）は、培養中の初代ニューロンに対して無毒である。加えて、MeCP2-mycタンパク質レベルは、MeCP2-myc転写物に存在するmiR-132 MRE（例として、miR-132結合部位）の数に反比例することが観察された（図３Ｂ）。図３Ｃは、ＡＡＶ感染の５日後のAAV2-MeCP2に応答したmiR-132発現を示す。
【０１１９】
例２：AAV-MeCP2の全身性送達後の野生型マウスにおけるヒトＭｅＣＰ２アイソフォームｅ１の遺伝子発現分析
例１に記載のmiR-132標的配列の挿入によるＭｅＣＰ２レベルの力価能力を示すin vitroでの所見を拡張するために、出生後１日の野生型マウスに、０、１ｘ、２ｘ、または３ｘのmiR-132標的配列を含むヒトＭｅＣＰ２のｅ１アイソフォームをコードするＡＡＶで顔面静脈（例として、頭蓋内注射）を介して注射した。脳組織の遺伝子発現分析は、MeCP2レベルがmiR132標的配列の数に反比例することを示した（図４Ａ〜４Ｃ）。
【０１２０】
いくつかの態様において、いくつかのＡＡＶ血清型の全身投与は、中枢神経系の外側の組織を形質導入することができ、肝臓、心臓および骨格組織におけるＭｅＣＰ２の上昇した発現は有害な生理学的な結果に関連することが観察されている。ＭｅＣＰ２の心臓および肝臓の形質導入を最小化するため、本開示によって記載されるAAV-MeCP2ベクターは、少なくとも１つのmiR-1（例として、3x-miR-1）および少なくとも１つのmiR-122（例として、3x-miR-122）標的配列（例として、結合部位）を含み、それぞれ、心臓および肝臓からのＭｅＣＰ２発現を脱標的する。ｅ２ヒトＭｅＣＰ２（検出不可能であった）、およびｅ１およびｅ２マウスＭｅＣＰ２（変化がなかった）に対するプライマーを用いてｑＲＴ−ＰＣＲ分析を実行した。野生型動物の心臓および肝臓組織の遺伝子発現分析は、脳と比較して実質的に低減された発現によって明らかにされたように、ＭｅＣＰ２が心臓および肝臓から効果的に脱標的されることを示した（図４Ａおよび図５）。
【０１２１】
例３：自己調節するAAV-MeCP2ベクターの治療的有効性および安全性
AAV-MeCP2-e1ベクターの治療的有効性と安全性は、マウスにおいて調査した。いくつかの態様において、AAV-PHP.Bカプシドタンパク質は、改善されたニューロン形質導入効率を有するので、このカプシドが用いられた。４週齢のＭｅｃｐ２ヌルマウス（Mecp2tm1.1Bird/J；オス−／ｙおよびメス＋／−）は、異なるＭＲＥカセットを運ぶAAV-PHP.B-MeCP2-e1ベクターの全身投与によって（例として、1E11、3E11、1E12 vg／マウスのベクター用量で）処置し、体重および表現型スコアのを２週ごとにモニターした。対照として、ビヒクルを注射したＭｅＣＰ２／Mecp2tm1.1Birdマウスおよび野生型マウスを使用する。各コホートのマウスのサブセット（ｎ＝８；オス４匹とメス４匹）を注射後８週間で屠殺し、ＭｅＣＰ２発現をウェスタンブロットで定量化し、グループ間で比較する。脳内の形質導入効率は、ＭｅＣＰ２およびニューロン（ニューロンマーカーＮｅｕＮを使用）の二重免疫蛍光染色によって評価され、皮質、線条体、視床、海馬、および小脳の形質導入ニューロン（ＭｅＣＰ２＋、ＮｅｕＮ＋）の定量化を実行する。PSD-95のレベルは、脳切片のウェスタンブロットおよび免疫染色によって評価される；PSD-95は、ＭｅＣＰ２ヌルマウスの脳でレベルが低減するシナプス成熟の重要な足場タンパク質である。
【０１２２】
ベクター生体内分布分析を行うために、ゲノムＤＮＡは、ＣＮＳおよび末梢器官の異なる領域から単離され、デジタルＰＣＲによって分析される。各コホートの動物の別のサブセット（ｎ＝１６；オス８匹およびメス８匹）は、挙動（例として、オープンフィールド；社会的相互作用）および運動パフォーマンス（例として、ロータロッド、グリッドウォーク）の生存および縦断分析ならびにＭｅＣＰ２ヌルマウスに特徴的な呼吸パターンと無呼吸を評価する全身プレチスモグラフィに使用される。エンドポイント研究は、処置後８週間と同じである。ベクターの安全性は、７、３０、９０、および１８０日のエンドポイントで、上記で示した用量と同一のものを使用して、ＣＮＳおよび末梢組織の毒性の証拠を評価する用量漸増試験においても評価される。ＡＡＶベクターの生体分布およびＭｅＣＰ２発現を十分に評価する。
【０１２３】
例４：神経系発達の異なるステージでのAAV-MeCP2遺伝子トランスファー後の形質導入ニューロンのゲノム／転写産物の変化の特徴づけ
レットに対する安全で有効な遺伝子治療アプローチの開発における重要な側面は、ＭｅＣＰ２のde novo発現がエピジェネティックなランドスケープおよび形質導入されたニューロンの転写産物プロファイルに与える影響を詳細に特徴付けることである。この目的のために、IRES-GFPカセットを運ぶAAV-PHP.B-MeCP2-e1ベクターが作製され、ＦＡＣＳまたはレーザーキャプチャーマイクロダイセクションとそれに続く全ゲノム重亜硫酸シークエンス（ＭｅｔｈｙｌＣ−Ｓｅｑ）、small RNA-seq（マイクロＲＮＡ）、およびRNA-Seq（ｍＲＮＡおよび非コーディングＲＮＡ）のいずれかによって、脳、小脳、脊髄からの形質導入ＧＦＰ＋細胞の分離が可能になる。ＭｅＣＰ２−／ｙオス、ＭｅＣＰ２−／＋メスおよび野生型対照（オスおよびメス）は、AAV-PHP.B-MeCP2-e1-IRES-GFP、対照ベクター（ＭｅＣＰ２ ｃＤＮＡなし）およびビヒクルの全身注射を、１、７、１４、２８日ならびに１２週齢の最適用量で行う。上記のパラメータを評価するために、マウス（ｎ＝８；オス４匹、メス４匹）を注射後１または３ヵ月で安楽死させる。ＭｅＣＰ２発現に応答して過剰発現されるマイクロＲＮＡに関する情報は、miR-132に基づくものに加えて、遺伝子発現調節の追加の層を確立するために使用される。
【０１２４】
例５：発達の異なる段階での干渉の機能としての神経学的兆候の治療的成功または発症に対するＭｅＣＰ２アイソフォームの寄与
生理学的に正常なレベルの１．６〜６倍のＭｅＣＰ２発現は、ＭｅＣＰ２遺伝子座重複（正常の２倍以上）を有する患者およびトランスジェニックマウスモデルの両方で神経学的兆候を引き起こすことが観察されている。患者およびトランスジェニックマウスモデルの間の他の共通点は、両方ともＭｅＣＰ２−ｅ２アイソフォームを過剰発現することであり、これは、ｅ１アイソフォームとは異なり、培養中の１次ニューロンに対して毒性があるように思われる。いくつかの態様において、この毒性効果は、突然変異がレット症候群に関連する別の遺伝子であるＦｏｘＧ１の共発現によって排除される。いくつかの態様において、ＦｏｘＧ１とＭｅＣＰ２との共発現は、ＭｅＣＰ２過剰発現に関連する副作用を制御する追加のメカニズムである。ＭｅＣＰ−ｅ１、ＭｅＣＰ２−ｅ２、ＭｅＣＰ２−ｅ２およびＦｏｘＧ１をコードするAAV-PHP.Bベクター、またはＦｏｘＧ１単独で用いた、治療、安全性およびエピゲノムの／転写産物の実験は、齢が一致したＭｅＣＰ２−／ｙオス、ＭｅＣＰ２＋／−メスおよび野生型の対照で実施される。
【０１２５】
配列
> 配列番号１；ヒトＭｅＣＰ２アイソフォームｅ１アミノ酸配列（NM_001110792）
MAAAAAAAPSGGGGGGEEERLEEKSEDQDLQGLKDKPLKFKKVKKDKKEEKEGKHEPVQPSAHHSAEPAEAGKAETSEGSGSAPAVPEASASPKQRRSIIRDRGPMYDDPTLPEGWTRKLKQRKSGRSAGKYDVYLINPQGKAFRSKVELIAYFEKVGDTSLDPNDFDFTVTGRGSPSRREQKPPKKPKSPKAPGTGRGRGRPKGSGTTRPKAATSEGVQVKRVLEKSPGKLLVKMPFQTSPGGKAEGGGATTSTQVMVIKRPGRKRKAEADPQAIPKKRGRKPGSVVAAAAAEAKKKAVKESSIRSVQETVLPIKKRKTRETVSIEVKEVVKPLLVSTLGEKSGKGLKTCKSPGRKSKESSPKGRSSSASSPPKKEHHHHHHHSESPKAPVPLLPPLPPPPPEPESSEDPTSPPEPQDLSSSVCKEEKMPRGGSLESDGCPKEPAKTQPAVATAATAAEKYKHRGEGERKDIVSSSMPRPNREEPVDSRTPVTERVS
【０１２６】
> 配列番号２；ヒトＭｅＣＰ２アイソフォームｅ２アミノ酸配列（NM_004992）
MVAGMLGLREEKSEDQDLQGLKDKPLKFKKVKKDKKEEKEGKHEPVQPSAHHSAEPAEAGKAETSEGSGSAPAVPEASASPKQRRSIIRDRGPMYDDPTLPEGWTRKLKQRKSGRSAGKYDVYLINPQGKAFRSKVELIAYFEKVGDTSLDPNDFDFTVTGRGSPSRREQKPPKKPKSPKAPGTGRGRGRPKGSGTTRPKAATSEGVQVKRVLEKSPGKLLVKMPFQTSPGGKAEGGGATTSTQVMVIKRPGRKRKAEADPQAIPKKRGRKPGSVVAAAAAEAKKKAVKESSIRSVQETVLPIKKRKTRETVSIEVKEVVKPLLVSTLGEKSGKGLKTCKSPGRKSKESSPKGRSSSASSPPKKEHHHHHHHSESPKAPVPLLPPLPPPPPEPESSEDPTSPPEPQDLSSSVCKEEKMPRGGSLESDGCPKEPAKTQPAVATAATAAEKYKHRGEGERKDIVSSSMPRPNREEPVDSRTPVTERVS
【０１２７】
> 配列番号３；マウスＭｅＣＰ２プロモーターのＤＮＡ配列
AATTGAGGGCGTCACCGCTAAGGCTCCGCCCCAGCCTGGGCTCCACAACCAATGAAGGGTAATCTCGACAAAGAGCAAGGGGTGGGGCGCGGGCGCGCAGGTGCAGCAGCACACAGGCTGGTCGGGAGGGCGGGGCGCGACGTCTGCCGTGCGGGGTCCCGGCATCGGTT
> 配列番号４；miR-122結合部位のＤＮＡ配列
ACAAACACCATTGTCACACTCCA
【０１２８】
> 配列番号５；miR-1結合部位のＤＮＡ配列
ATACATACTTCTTTACATTCCA
> 配列番号６；miR-132結合部位のＤＮＡ配列
CGACCATGGCTGTAGACTGTTA
【０１２９】
> 配列番号７；ＭｅＣＰ２のin vitro構築核酸配列（scAAV-Mec229-hMeCP2-miR132(1x)miR122-1(3x)プラスミド）
CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGTAGCCATGCTCTAGGAAGATCAATTCGGTACAATTCACGCGTCGACAATTGAGGGCGTCACCGCTAAGGCTCCGCCCCAGCCTGGGCTCCACAACCAATGAAGGGTAATCTCGACAAAGAGCAAGGGGTGGGGCGCGGGCGCGCAGGTGCAGCAGCACACAGGCTGGTCGGGAGGGCGGGGCGCGACGTCTGCCGTGCGGGGTCCCGGCATCGGTTGCGCGCGCGCTCCCTCCTCTCGGAGAGAGGGCTGTGGTAAAACCCGTCCGGAAAATGGCTGCAGCCGCTGCCGCAGCGCCGAGCGGCGGAGGTGGCGGTGGCGAGGAGGAGAGACTGGAAGAAAAGTCAGAAGACCAGGACCTCCAGGGCCTCAAGGACAAACCCCTCAAGTTTAAAAAGGTGAAGAAAGATAAGAAAGAAGAGAAAGAGGGCAAGCATGAGCCCGTGCAGCCATCAGCCCACCACTCTGCTGAGCCCGCAGAGGCAGGCAAAGCAGAGACATCAGAAGGGTCAGGCTCCGCCCCGGCTGTGCCGGAAGCTTCTGCCTCCCCCAAACAGCGGCGCTCCATCATCCGTGACCGGGGACCCATGTATGATGACCCCACCCTGCCTGAAGGCTGGACACGGAAGCTTAAGCAAAGGAAATCTGGACGCTCTGCTGGGAAGTATGATGTGTATTTGATCAATCCCCAGGGAAAAGCCTTTCGCTCTAAAGTGGAGTTGATTGCGTACTTCGAAAAGGTAGGCGACACATCCCTGGACCCTAATGATTTTGACTTCACGGTAACTGGGAGAGGGAGCCCCTCCCGGCGAGAGCAGAAACCACCTAAGAAGCCCAAATCTCCCAAAGCTCCAGGAACTGGCAGAGGTCGGGGACGCCCCAAAGGGAGCGGCACCACGAGACCCAAGGCAGCTACGTCAGAGGGTGTGCAGGTGAAAAGGGTCCTGGAGAAAAGTCCTGGGAAGCTCCTTGTCAAGATGCCTTTTCAAACTTCGCCAGGGGGCAAGGCTGAGGGGGGTGGGGCCACCACATCCACCCAGGTCATGGTGATCAAACGCCCCGGCAGGAAGCGAAAAGCTGAGGCAGACCCTCAGGCCATTCCCAAGAAACGGGGTCGAAAGCCGGGGAGTGTGGTGGCAGCCGCTGCCGCCGAGGCCAAAAAGAAAGCCGTGAAGGAGTCTTCTATCCGATCTGTGCAGGAGACCGTACTCCCCATCAAGAAGCGCAAGACCCGGGAGACGGTCAGCATCGAGGTCAAGGAAGTGGTGAAGCCCCTGCTGGTGTCCACCCTCGGTGAGAAGAGCGGGAAAGGACTGAAGACCTGTAAGAGCCCTGGGCGGAAAAGCAAGGAGAGCAGCCCCAAGGGGCGCAGCAGCAGCGCCTCCTCACCCCCCAAGAAGGAGCACCACCACCATCACCACCACTCAGAGTCCCCAAAGGCCCCCGTGCCACTGCTCCCACCCCTGCCCCCACCTCCACCTGAGCCCGAGAGCTCCGAGGACCCCACCAGCCCCCCTGAGCCCCAGGACTTGAGCAGCAGCGTCTGCAAAGAGGAGAAGATGCCCAGAGGAGGCTCACTGGAGAGCGACGGCTGCCCCAAGGAGCCAGCTAAGACTCAGCCCGCGGTTGCCACCGCCGCCACGGCCGCAGAAAAGTACAAACACCGAGGGGAGGGAGAGCGCAAAGACATTGTTTCATCCTCCATGCCAAGGCCAAACAGAGAGGAGCCTGTGGACAGCCGGACGCCCGTGACCGAGAGAGTTAGCGAGCAGAAGCTGATCTCAGAGGAGGACCTGTGACGACCATGGCTGTAGACTGTTACTCGAGATACATACTTCTTTACATTCCAATACATACTTCTTTACATTCCAATACATACTTCTTTACATTCCACCATGGACTAGTACAAACACCATTGTCACACTCCAACAAACACCATTGTCACACTCCAACAAACACCATTGTCACACTCCAGCGGCCGCTTCGATCCGATCTTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGCCTAGGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCCTTAATTAACCTAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGCTTACAATTTAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAGATTTAATTAAGGCCTTAATTAGG
【０１３０】
> 配列番号８；ＭｅＣＰ２のin vitro構築核酸配列（scAAV-Mec229-hMeCP2-miR132(2x)miR122-1(3x)プラスミド）
CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGTAGCCATGCTCTAGGAAGATCAATTCGGTACAATTCACGCGTCGACAATTGAGGGCGTCACCGCTAAGGCTCCGCCCCAGCCTGGGCTCCACAACCAATGAAGGGTAATCTCGACAAAGAGCAAGGGGTGGGGCGCGGGCGCGCAGGTGCAGCAGCACACAGGCTGGTCGGGAGGGCGGGGCGCGACGTCTGCCGTGCGGGGTCCCGGCATCGGTTGCGCGCGCGCTCCCTCCTCTCGGAGAGAGGGCTGTGGTAAAACCCGTCCGGAAAATGGCTGCAGCCGCTGCCGCAGCGCCGAGCGGCGGAGGTGGCGGTGGCGAGGAGGAGAGACTGGAAGAAAAGTCAGAAGACCAGGACCTCCAGGGCCTCAAGGACAAACCCCTCAAGTTTAAAAAGGTGAAGAAAGATAAGAAAGAAGAGAAAGAGGGCAAGCATGAGCCCGTGCAGCCATCAGCCCACCACTCTGCTGAGCCCGCAGAGGCAGGCAAAGCAGAGACATCAGAAGGGTCAGGCTCCGCCCCGGCTGTGCCGGAAGCTTCTGCCTCCCCCAAACAGCGGCGCTCCATCATCCGTGACCGGGGACCCATGTATGATGACCCCACCCTGCCTGAAGGCTGGACACGGAAGCTTAAGCAAAGGAAATCTGGACGCTCTGCTGGGAAGTATGATGTGTATTTGATCAATCCCCAGGGAAAAGCCTTTCGCTCTAAAGTGGAGTTGATTGCGTACTTCGAAAAGGTAGGCGACACATCCCTGGACCCTAATGATTTTGACTTCACGGTAACTGGGAGAGGGAGCCCCTCCCGGCGAGAGCAGAAACCACCTAAGAAGCCCAAATCTCCCAAAGCTCCAGGAACTGGCAGAGGTCGGGGACGCCCCAAAGGGAGCGGCACCACGAGACCCAAGGCAGCTACGTCAGAGGGTGTGCAGGTGAAAAGGGTCCTGGAGAAAAGTCCTGGGAAGCTCCTTGTCAAGATGCCTTTTCAAACTTCGCCAGGGGGCAAGGCTGAGGGGGGTGGGGCCACCACATCCACCCAGGTCATGGTGATCAAACGCCCCGGCAGGAAGCGAAAAGCTGAGGCAGACCCTCAGGCCATTCCCAAGAAACGGGGTCGAAAGCCGGGGAGTGTGGTGGCAGCCGCTGCCGCCGAGGCCAAAAAGAAAGCCGTGAAGGAGTCTTCTATCCGATCTGTGCAGGAGACCGTACTCCCCATCAAGAAGCGCAAGACCCGGGAGACGGTCAGCATCGAGGTCAAGGAAGTGGTGAAGCCCCTGCTGGTGTCCACCCTCGGTGAGAAGAGCGGGAAAGGACTGAAGACCTGTAAGAGCCCTGGGCGGAAAAGCAAGGAGAGCAGCCCCAAGGGGCGCAGCAGCAGCGCCTCCTCACCCCCCAAGAAGGAGCACCACCACCATCACCACCACTCAGAGTCCCCAAAGGCCCCCGTGCCACTGCTCCCACCCCTGCCCCCACCTCCACCTGAGCCCGAGAGCTCCGAGGACCCCACCAGCCCCCCTGAGCCCCAGGACTTGAGCAGCAGCGTCTGCAAAGAGGAGAAGATGCCCAGAGGAGGCTCACTGGAGAGCGACGGCTGCCCCAAGGAGCCAGCTAAGACTCAGCCCGCGGTTGCCACCGCCGCCACGGCCGCAGAAAAGTACAAACACCGAGGGGAGGGAGAGCGCAAAGACATTGTTTCATCCTCCATGCCAAGGCCAAACAGAGAGGAGCCTGTGGACAGCCGGACGCCCGTGACCGAGAGAGTTAGCGAGCAGAAGCTGATCTCAGAGGAGGACCTGTGACGACCATGGCTGTAGACTGTTACGACCATGGCTGTAGACTGTTACTCGAGATACATACTTCTTTACATTCCAATACATACTTCTTTACATTCCAATACATACTTCTTTACATTCCACCATGGACTAGTACAAACACCATTGTCACACTCCAACAAACACCATTGTCACACTCCAACAAACACCATTGTCACACTCCAGCGGCCGCTTCGATCCGATCTTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGCCTAGGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCCTTAATTAACCTAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGCTTACAATTTAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAGATTTAATTAAGGCCTTAATTAGG
【０１３１】
> 配列番号９；ＭｅＣＰ２のin vitro構築核酸配列（scAAV-Mec229-hMeCP2-miR132(3x) miR122-1(3x)プラスミド）
CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGTAGCCATGCTCTAGGAAGATCAATTCGGTACAATTCACGCGTCGACAATTGAGGGCGTCACCGCTAAGGCTCCGCCCCAGCCTGGGCTCCACAACCAATGAAGGGTAATCTCGACAAAGAGCAAGGGGTGGGGCGCGGGCGCGCAGGTGCAGCAGCACACAGGCTGGTCGGGAGGGCGGGGCGCGACGTCTGCCGTGCGGGGTCCCGGCATCGGTTGCGCGCGCGCTCCCTCCTCTCGGAGAGAGGGCTGTGGTAAAACCCGTCCGGAAAATGGCTGCAGCCGCTGCCGCAGCGCCGAGCGGCGGAGGTGGCGGTGGCGAGGAGGAGAGACTGGAAGAAAAGTCAGAAGACCAGGACCTCCAGGGCCTCAAGGACAAACCCCTCAAGTTTAAAAAGGTGAAGAAAGATAAGAAAGAAGAGAAAGAGGGCAAGCATGAGCCCGTGCAGCCATCAGCCCACCACTCTGCTGAGCCCGCAGAGGCAGGCAAAGCAGAGACATCAGAAGGGTCAGGCTCCGCCCCGGCTGTGCCGGAAGCTTCTGCCTCCCCCAAACAGCGGCGCTCCATCATCCGTGACCGGGGACCCATGTATGATGACCCCACCCTGCCTGAAGGCTGGACACGGAAGCTTAAGCAAAGGAAATCTGGACGCTCTGCTGGGAAGTATGATGTGTATTTGATCAATCCCCAGGGAAAAGCCTTTCGCTCTAAAGTGGAGTTGATTGCGTACTTCGAAAAGGTAGGCGACACATCCCTGGACCCTAATGATTTTGACTTCACGGTAACTGGGAGAGGGAGCCCCTCCCGGCGAGAGCAGAAACCACCTAAGAAGCCCAAATCTCCCAAAGCTCCAGGAACTGGCAGAGGTCGGGGACGCCCCAAAGGGAGCGGCACCACGAGACCCAAGGCAGCTACGTCAGAGGGTGTGCAGGTGAAAAGGGTCCTGGAGAAAAGTCCTGGGAAGCTCCTTGTCAAGATGCCTTTTCAAACTTCGCCAGGGGGCAAGGCTGAGGGGGGTGGGGCCACCACATCCACCCAGGTCATGGTGATCAAACGCCCCGGCAGGAAGCGAAAAGCTGAGGCAGACCCTCAGGCCATTCCCAAGAAACGGGGTCGAAAGCCGGGGAGTGTGGTGGCAGCCGCTGCCGCCGAGGCCAAAAAGAAAGCCGTGAAGGAGTCTTCTATCCGATCTGTGCAGGAGACCGTACTCCCCATCAAGAAGCGCAAGACCCGGGAGACGGTCAGCATCGAGGTCAAGGAAGTGGTGAAGCCCCTGCTGGTGTCCACCCTCGGTGAGAAGAGCGGGAAAGGACTGAAGACCTGTAAGAGCCCTGGGCGGAAAAGCAAGGAGAGCAGCCCCAAGGGGCGCAGCAGCAGCGCCTCCTCACCCCCCAAGAAGGAGCACCACCACCATCACCACCACTCAGAGTCCCCAAAGGCCCCCGTGCCACTGCTCCCACCCCTGCCCCCACCTCCACCTGAGCCCGAGAGCTCCGAGGACCCCACCAGCCCCCCTGAGCCCCAGGACTTGAGCAGCAGCGTCTGCAAAGAGGAGAAGATGCCCAGAGGAGGCTCACTGGAGAGCGACGGCTGCCCCAAGGAGCCAGCTAAGACTCAGCCCGCGGTTGCCACCGCCGCCACGGCCGCAGAAAAGTACAAACACCGAGGGGAGGGAGAGCGCAAAGACATTGTTTCATCCTCCATGCCAAGGCCAAACAGAGAGGAGCCTGTGGACAGCCGGACGCCCGTGACCGAGAGAGTTAGCGAGCAGAAGCTGATCTCAGAGGAGGACCTGTGACGACCATGGCTGTAGACTGTTACGACCATGGCTGTAGACTGTTACGACCATGGCTGTAGACTGTTACTCGAGATACATACTTCTTTACATTCCAATACATACTTCTTTACATTCCAATACATACTTCTTTACATTCCACCATGGACTAGTACAAACACCATTGTCACACTCCAACAAACACCATTGTCACACTCCAACAAACACCATTGTCACACTCCAGCGGCCGCTTCGATCCGATCTTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGCCTAGGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCCTTAATTAACCTAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGCTTACAATTTAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAGATTTAATTAAGGCCTTAATTAGG
【０１３２】
> 配列番号１０；MeCP2のin vivo構築核酸配列（scAAV-Mec229-hMeCP2-miR132(1x)miR122-1(3x)ベクターゲノム）
CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGTAGCCATGCTCTAGGAAGATCAATTCGGTACAATTCACGCGTCGACAATTGAGGGCGTCACCGCTAAGGCTCCGCCCCAGCCTGGGCTCCACAACCAATGAAGGGTAATCTCGACAAAGAGCAAGGGGTGGGGCGCGGGCGCGCAGGTGCAGCAGCACACAGGCTGGTCGGGAGGGCGGGGCGCGACGTCTGCCGTGCGGGGTCCCGGCATCGGTTGCGCGCGCGCTCCCTCCTCTCGGAGAGAGGGCTGTGGTAAAACCCGTCCGGAAAATGGCTGCAGCCGCTGCCGCAGCGCCGAGCGGCGGAGGTGGCGGTGGCGAGGAGGAGAGACTGGAAGAAAAGTCAGAAGACCAGGACCTCCAGGGCCTCAAGGACAAACCCCTCAAGTTTAAAAAGGTGAAGAAAGATAAGAAAGAAGAGAAAGAGGGCAAGCATGAGCCCGTGCAGCCATCAGCCCACCACTCTGCTGAGCCCGCAGAGGCAGGCAAAGCAGAGACATCAGAAGGGTCAGGCTCCGCCCCGGCTGTGCCGGAAGCTTCTGCCTCCCCCAAACAGCGGCGCTCCATCATCCGTGACCGGGGACCCATGTATGATGACCCCACCCTGCCTGAAGGCTGGACACGGAAGCTTAAGCAAAGGAAATCTGGACGCTCTGCTGGGAAGTATGATGTGTATTTGATCAATCCCCAGGGAAAAGCCTTTCGCTCTAAAGTGGAGTTGATTGCGTACTTCGAAAAGGTAGGCGACACATCCCTGGACCCTAATGATTTTGACTTCACGGTAACTGGGAGAGGGAGCCCCTCCCGGCGAGAGCAGAAACCACCTAAGAAGCCCAAATCTCCCAAAGCTCCAGGAACTGGCAGAGGTCGGGGACGCCCCAAAGGGAGCGGCACCACGAGACCCAAGGCAGCTACGTCAGAGGGTGTGCAGGTGAAAAGGGTCCTGGAGAAAAGTCCTGGGAAGCTCCTTGTCAAGATGCCTTTTCAAACTTCGCCAGGGGGCAAGGCTGAGGGGGGTGGGGCCACCACATCCACCCAGGTCATGGTGATCAAACGCCCCGGCAGGAAGCGAAAAGCTGAGGCAGACCCTCAGGCCATTCCCAAGAAACGGGGTCGAAAGCCGGGGAGTGTGGTGGCAGCCGCTGCCGCCGAGGCCAAAAAGAAAGCCGTGAAGGAGTCTTCTATCCGATCTGTGCAGGAGACCGTACTCCCCATCAAGAAGCGCAAGACCCGGGAGACGGTCAGCATCGAGGTCAAGGAAGTGGTGAAGCCCCTGCTGGTGTCCACCCTCGGTGAGAAGAGCGGGAAAGGACTGAAGACCTGTAAGAGCCCTGGGCGGAAAAGCAAGGAGAGCAGCCCCAAGGGGCGCAGCAGCAGCGCCTCCTCACCCCCCAAGAAGGAGCACCACCACCATCACCACCACTCAGAGTCCCCAAAGGCCCCCGTGCCACTGCTCCCACCCCTGCCCCCACCTCCACCTGAGCCCGAGAGCTCCGAGGACCCCACCAGCCCCCCTGAGCCCCAGGACTTGAGCAGCAGCGTCTGCAAAGAGGAGAAGATGCCCAGAGGAGGCTCACTGGAGAGCGACGGCTGCCCCAAGGAGCCAGCTAAGACTCAGCCCGCGGTTGCCACCGCCGCCACGGCCGCAGAAAAGTACAAACACCGAGGGGAGGGAGAGCGCAAAGACATTGTTTCATCCTCCATGCCAAGGCCAAACAGAGAGGAGCCTGTGGACAGCCGGACGCCCGTGACCGAGAGAGTTAGCGAGCAGAAGCTGATCTCAGAGGAGGACCTGTGACGACCATGGCTGTAGACTGTTACTCGAGATACATACTTCTTTACATTCCAATACATACTTCTTTACATTCCAATACATACTTCTTTACATTCCACCATGGACTAGTACAAACACCATTGTCACACTCCAACAAACACCATTGTCACACTCCAACAAACACCATTGTCACACTCCAGCGGCCGCTTCGATCCGATCTTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGCCTAGGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAG
【０１３３】
> 配列番号１１；ＭｅＣＰ２のin vivo構築核酸配列（scAAV-Mec229-hMeCP2-miR132(2x)miR122-1(3x)ベクターゲノム）
CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGTAGCCATGCTCTAGGAAGATCAATTCGGTACAATTCACGCGTCGACAATTGAGGGCGTCACCGCTAAGGCTCCGCCCCAGCCTGGGCTCCACAACCAATGAAGGGTAATCTCGACAAAGAGCAAGGGGTGGGGCGCGGGCGCGCAGGTGCAGCAGCACACAGGCTGGTCGGGAGGGCGGGGCGCGACGTCTGCCGTGCGGGGTCCCGGCATCGGTTGCGCGCGCGCTCCCTCCTCTCGGAGAGAGGGCTGTGGTAAAACCCGTCCGGAAAATGGCTGCAGCCGCTGCCGCAGCGCCGAGCGGCGGAGGTGGCGGTGGCGAGGAGGAGAGACTGGAAGAAAAGTCAGAAGACCAGGACCTCCAGGGCCTCAAGGACAAACCCCTCAAGTTTAAAAAGGTGAAGAAAGATAAGAAAGAAGAGAAAGAGGGCAAGCATGAGCCCGTGCAGCCATCAGCCCACCACTCTGCTGAGCCCGCAGAGGCAGGCAAAGCAGAGACATCAGAAGGGTCAGGCTCCGCCCCGGCTGTGCCGGAAGCTTCTGCCTCCCCCAAACAGCGGCGCTCCATCATCCGTGACCGGGGACCCATGTATGATGACCCCACCCTGCCTGAAGGCTGGACACGGAAGCTTAAGCAAAGGAAATCTGGACGCTCTGCTGGGAAGTATGATGTGTATTTGATCAATCCCCAGGGAAAAGCCTTTCGCTCTAAAGTGGAGTTGATTGCGTACTTCGAAAAGGTAGGCGACACATCCCTGGACCCTAATGATTTTGACTTCACGGTAACTGGGAGAGGGAGCCCCTCCCGGCGAGAGCAGAAACCACCTAAGAAGCCCAAATCTCCCAAAGCTCCAGGAACTGGCAGAGGTCGGGGACGCCCCAAAGGGAGCGGCACCACGAGACCCAAGGCAGCTACGTCAGAGGGTGTGCAGGTGAAAAGGGTCCTGGAGAAAAGTCCTGGGAAGCTCCTTGTCAAGATGCCTTTTCAAACTTCGCCAGGGGGCAAGGCTGAGGGGGGTGGGGCCACCACATCCACCCAGGTCATGGTGATCAAACGCCCCGGCAGGAAGCGAAAAGCTGAGGCAGACCCTCAGGCCATTCCCAAGAAACGGGGTCGAAAGCCGGGGAGTGTGGTGGCAGCCGCTGCCGCCGAGGCCAAAAAGAAAGCCGTGAAGGAGTCTTCTATCCGATCTGTGCAGGAGACCGTACTCCCCATCAAGAAGCGCAAGACCCGGGAGACGGTCAGCATCGAGGTCAAGGAAGTGGTGAAGCCCCTGCTGGTGTCCACCCTCGGTGAGAAGAGCGGGAAAGGACTGAAGACCTGTAAGAGCCCTGGGCGGAAAAGCAAGGAGAGCAGCCCCAAGGGGCGCAGCAGCAGCGCCTCCTCACCCCCCAAGAAGGAGCACCACCACCATCACCACCACTCAGAGTCCCCAAAGGCCCCCGTGCCACTGCTCCCACCCCTGCCCCCACCTCCACCTGAGCCCGAGAGCTCCGAGGACCCCACCAGCCCCCCTGAGCCCCAGGACTTGAGCAGCAGCGTCTGCAAAGAGGAGAAGATGCCCAGAGGAGGCTCACTGGAGAGCGACGGCTGCCCCAAGGAGCCAGCTAAGACTCAGCCCGCGGTTGCCACCGCCGCCACGGCCGCAGAAAAGTACAAACACCGAGGGGAGGGAGAGCGCAAAGACATTGTTTCATCCTCCATGCCAAGGCCAAACAGAGAGGAGCCTGTGGACAGCCGGACGCCCGTGACCGAGAGAGTTAGCGAGCAGAAGCTGATCTCAGAGGAGGACCTGTGACGACCATGGCTGTAGACTGTTACGACCATGGCTGTAGACTGTTACTCGAGATACATACTTCTTTACATTCCAATACATACTTCTTTACATTCCAATACATACTTCTTTACATTCCACCATGGACTAGTACAAACACCATTGTCACACTCCAACAAACACCATTGTCACACTCCAACAAACACCATTGTCACACTCCAGCGGCCGCTTCGATCCGATCTTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGCCTAGGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAG
【０１３４】
> 配列番号１２；ＭｅＣＰ２のin vivo構築核酸配列（scAAV-Mec229-hMeCP2-miR132(3x) miR122-1(3x)ベクターゲノム）
CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGTAGCCATGCTCTAGGAAGATCAATTCGGTACAATTCACGCGTCGACAATTGAGGGCGTCACCGCTAAGGCTCCGCCCCAGCCTGGGCTCCACAACCAATGAAGGGTAATCTCGACAAAGAGCAAGGGGTGGGGCGCGGGCGCGCAGGTGCAGCAGCACACAGGCTGGTCGGGAGGGCGGGGCGCGACGTCTGCCGTGCGGGGTCCCGGCATCGGTTGCGCGCGCGCTCCCTCCTCTCGGAGAGAGGGCTGTGGTAAAACCCGTCCGGAAAATGGCTGCAGCCGCTGCCGCAGCGCCGAGCGGCGGAGGTGGCGGTGGCGAGGAGGAGAGACTGGAAGAAAAGTCAGAAGACCAGGACCTCCAGGGCCTCAAGGACAAACCCCTCAAGTTTAAAAAGGTGAAGAAAGATAAGAAAGAAGAGAAAGAGGGCAAGCATGAGCCCGTGCAGCCATCAGCCCACCACTCTGCTGAGCCCGCAGAGGCAGGCAAAGCAGAGACATCAGAAGGGTCAGGCTCCGCCCCGGCTGTGCCGGAAGCTTCTGCCTCCCCCAAACAGCGGCGCTCCATCATCCGTGACCGGGGACCCATGTATGATGACCCCACCCTGCCTGAAGGCTGGACACGGAAGCTTAAGCAAAGGAAATCTGGACGCTCTGCTGGGAAGTATGATGTGTATTTGATCAATCCCCAGGGAAAAGCCTTTCGCTCTAAAGTGGAGTTGATTGCGTACTTCGAAAAGGTAGGCGACACATCCCTGGACCCTAATGATTTTGACTTCACGGTAACTGGGAGAGGGAGCCCCTCCCGGCGAGAGCAGAAACCACCTAAGAAGCCCAAATCTCCCAAAGCTCCAGGAACTGGCAGAGGTCGGGGACGCCCCAAAGGGAGCGGCACCACGAGACCCAAGGCAGCTACGTCAGAGGGTGTGCAGGTGAAAAGGGTCCTGGAGAAAAGTCCTGGGAAGCTCCTTGTCAAGATGCCTTTTCAAACTTCGCCAGGGGGCAAGGCTGAGGGGGGTGGGGCCACCACATCCACCCAGGTCATGGTGATCAAACGCCCCGGCAGGAAGCGAAAAGCTGAGGCAGACCCTCAGGCCATTCCCAAGAAACGGGGTCGAAAGCCGGGGAGTGTGGTGGCAGCCGCTGCCGCCGAGGCCAAAAAGAAAGCCGTGAAGGAGTCTTCTATCCGATCTGTGCAGGAGACCGTACTCCCCATCAAGAAGCGCAAGACCCGGGAGACGGTCAGCATCGAGGTCAAGGAAGTGGTGAAGCCCCTGCTGGTGTCCACCCTCGGTGAGAAGAGCGGGAAAGGACTGAAGACCTGTAAGAGCCCTGGGCGGAAAAGCAAGGAGAGCAGCCCCAAGGGGCGCAGCAGCAGCGCCTCCTCACCCCCCAAGAAGGAGCACCACCACCATCACCACCACTCAGAGTCCCCAAAGGCCCCCGTGCCACTGCTCCCACCCCTGCCCCCACCTCCACCTGAGCCCGAGAGCTCCGAGGACCCCACCAGCCCCCCTGAGCCCCAGGACTTGAGCAGCAGCGTCTGCAAAGAGGAGAAGATGCCCAGAGGAGGCTCACTGGAGAGCGACGGCTGCCCCAAGGAGCCAGCTAAGACTCAGCCCGCGGTTGCCACCGCCGCCACGGCCGCAGAAAAGTACAAACACCGAGGGGAGGGAGAGCGCAAAGACATTGTTTCATCCTCCATGCCAAGGCCAAACAGAGAGGAGCCTGTGGACAGCCGGACGCCCGTGACCGAGAGAGTTAGCGAGCAGAAGCTGATCTCAGAGGAGGACCTGTGACGACCATGGCTGTAGACTGTTACGACCATGGCTGTAGACTGTTACGACCATGGCTGTAGACTGTTACTCGAGATACATACTTCTTTACATTCCAATACATACTTCTTTACATTCCAATACATACTTCTTTACATTCCACCATGGACTAGTACAAACACCATTGTCACACTCCAACAAACACCATTGTCACACTCCAACAAACACCATTGTCACACTCCAGCGGCCGCTTCGATCCGATCTTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGCCTAGGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAG
【０１３５】
> 配列番号１３；ＡＡＶ２カプシドアミノ酸配列
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL
【０１３６】
> 配列番号１４；ＡＡＶ９カプシドアミノ酸配列
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQSAQAQAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL
【０１３７】
> 配列番号１５；AAV-PHP.Bカプシドアミノ酸配列
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQSAQTLAVPFKAQAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL
【図１Ａ−Ｂ】
2020522269.tif 000003
【図２Ａ−Ｂ】
2020522269.tif 000004
【図２Ｃ】
2020522269.tif 000005
【図３Ａ−Ｂ】
2020522269.tif 000006
【図３Ｃ】
2020522269.tif 000007
【図４Ａ−Ｂ】
2020522269.tif 000008
【図４Ｃ】
2020522269.tif 000009
【図５】
2020522269.tif 000010
【配列表】
2020522269000001.app
【国際調査報告】
2020522269.tif 000011
2020522269.tif 000012
2020522269.tif 000013