(57)【要約】  本発明は、２０ｍｍ未満の直径を有する無血管性または乏血管性微小腫瘍を治療するための血管破壊剤（ＶＤＡ）、例えば、コンブレタスタチンに関する。【選択図】図１
2020526518.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２０ｍｍ未満の直径を有する無血管性または乏血管性（ａｖａｓｃｕｌａｒ
ｏｒ  ｈｙｐｏｖａｓｃｕｌａｒ）微小腫瘍を治療するための、血管破壊剤（Ｖ
ＤＡ）またはその塩若しくは溶媒和物若しくはプロドラッグ。
【請求項２】
無血管性（ａｖａｓｃｕｌａｒ）腫瘍を治療するための、請求項１に記載の血管破壊剤（ＶＤＡ）またはその塩若しくは溶媒和物若しくはプロドラッグ。
【請求項３】
前記腫瘍が、内臓器官、例えば、肝臓、脾臓、腎臓または肺内で生じる、請求項１または２に記載の微小腫瘍を治療するための血管破壊剤（ＶＤＡ）またはその塩若しくは溶媒和物若しくはプロドラッグ。
【請求項４】
前記腫瘍が、硬変肝組織内で生じる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の微小腫瘍を治療するための血管破壊剤（ＶＤＡ）またはその塩若しくは溶媒和物若しくはプロドラッグ。
【請求項５】
前記腫瘍が、１〜１０ｍｍの直径を有するヒト腫瘍である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の微小腫瘍を治療するための血管破壊剤（ＶＤＡ）またはその塩若しくは溶媒和物若しくはプロドラッグ。
【請求項６】
前記腫瘍が、修正４スケールＥｄｍｏｎｄｓｏｎおよびＳｔｅｉｎｅｒ体系により定義されるグレードＩ〜ＩＶの腫瘍である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の微小腫瘍を治療するための血管破壊剤（ＶＤＡ）またはその塩若しくは溶媒和物若しくはプロドラッグ。
【請求項７】
前記腫瘍が、修正４スケールＥｄｍｏｎｄｓｏｎおよびＳｔｅｉｎｅｒ体系により定義されるグレードＩまたはＩＩの腫瘍である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の微小腫瘍を治療するための血管破壊剤（ＶＤＡ）またはその塩若しくは溶媒和物若しくはプロドラッグ。
【請求項８】
前記腫瘍が、癌腫、例えば、原発性肝細胞癌（ＨＣＣ）または肉腫、例えば、横紋筋肉腫（ｒｈａｂｄｏｍｙｏｓａｒｃｏｍａ）である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の腫瘍を治療するための血管破壊剤（ＶＤＡ）またはその塩若しくは溶媒和物若しくはプロドラッグ。
【請求項９】
ＶＤＡが、チューブリン結合スチルベノイドまたはジヒドロスチルベノイドである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の微小腫瘍を治療するための血管破壊剤（ＶＤＡ）またはその塩若しくは溶媒和物若しくはプロドラッグ。
【請求項１０】
ＶＤＡが、コンブレタスタチンＡ−４（ＣＡ４）、ＺＤ６１６２若しくはＳＴＡ−９５８４またはそれらのプロドラッグ、塩若しくは溶媒和物である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の微小腫瘍を治療するための血管破壊剤（ＶＤＡ）またはその塩若しくは溶媒和物若しくはプロドラッグ。
【請求項１１】
補助療法との組合せにおける、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の微小腫瘍を治療するための血管破壊剤（ＶＤＡ）またはその塩若しくは溶媒和物若しくはプロドラッグ。
【請求項１２】
前記補助療法が、壊死組織を標的化する治療剤の血管内投与を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の微小腫瘍を治療するための血管破壊剤（ＶＤＡ）またはその塩若しくは溶媒和物若しくはプロドラッグ。
【請求項１３】
前記治療剤が、放射線治療剤、例えば、ヨウ素−１３１標識ヒペリシンである、請求項１２に記載の微小腫瘍を治療するための血管破壊剤（ＶＤＡ）またはその塩若しくは溶媒和物若しくはプロドラッグ。
【請求項１４】
２０ｍｍ未満の直径を有する無血管性または乏血管性腫瘍を治療する方法であって、有効量の血管破壊剤（ＶＤＡ）またはその塩若しくは溶媒和物若しくはプロドラッグを投与するステップを含む方法。
【請求項１５】
有効な補助療法と組み合わせ、または有効な補助療法が続く、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記補助療法が、前記ＶＤＡ剤の投与の１日後のさらなる治療剤の血管内投与である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記さらなる治療剤が、壊死組織を標的とする放射線治療剤である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記さらなる治療剤が、ヨウ素−１３１標識化ヒペリシンである、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項１９】
前記微小腫瘍が、１０ｍｍ未満の直径を有する、請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、無血管性（ａｖａｓｃｕｌａｒ）および乏血管性（ｈｙｐｏｖａｓｃｕｌａｒ）腫瘍の治療に関する。
【０００２】
本発明はさらに、腫瘍治療法における血管破壊剤（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ａｇｅｎｔｓ）の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
南アフリカのヤナギ樹木コンブレタム・カフラム（Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｃａｆｆｒｕｍ）からコンブレタスタチンファミリーメンバーとして最初に誘導されたコンブレタスタチンＡ４リン酸（ＣＡ４Ｐ）は、過去１０年間にわたり癌治療法のための主な血管破壊剤（ＶＤＡ）になってきた［Ｔｏｚｅｒら、（２００５）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ．５，４２３−４３５；Ｈｉｎｎｅｎ  ＆  Ｅｓｋｅｎｓ（２００７）Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．９６，１１５９−１１６５］。ＣＡ４Ｐは、強力な可逆的チューブリン脱重合剤として作用して既存の腫瘍血管に損傷を与える［Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ  ＆  Ｒｕｓｔｉｎ、（２００７）Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．１９，４４３−４５６］。
前臨床研究において実施された種々の移植腫瘍モデルにおいて、ＣＡ４Ｐは、１時間未満ほどの早い急速な腫瘍血管破壊を誘導し、１２時間以内の広範な腫瘍内壊死をもたらす［Ｃｏｏｎｅｙら、（２００６）Ｎａｔ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒａｃｔ  Ｏｎｃｏｌ．３，６８２−６９２；Ｓｉｅｍａｎｎら、（２００９）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ  １８，１８９−１９７］。
それにもかかわらず、ＶＤＡ療法は、腫瘍周囲における残留癌細胞の層からなる生存辺縁（ｖｉａｂｌｅ  ｒｉｍ）を特色とし、続いて数日間にわたる腫瘍再発をもたらす[Ｌｉら、（２０１１）Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ  ２６０，７９９−８０７］。
これは、ＣＡ４Ｐ治療を他の治療物、例えば、化学療法［Ｂｉｌｅｎｋｅｒら、（２００５）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１１，１５２７−１５３３］、慣用の放射線療法［Ｎｇら、（２０１２）Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ．２３，２３１−２３７］、内部標的放射線療法および抗血管新生療法［Ｃｈｅｎら、（２０１２）ＰＬＯＳ  ＯＮＥ  ７，ｅ４１１４０；Ｋｏｈら、（２００９）Ｅｕｒ  Ｒａｄｉｏｌ．１９，２７２８−２２３８］と組み合わせる必要性を強調する。
これまで、進行性非小細胞肺癌［Ｚｗｅｉｆｅｌら、（２０１１）Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ．２２，２０３６−２０４１］、未分化甲状腺癌および白金耐性卵巣癌を有する患者における、ＣＡ４Ｐと化学療法の安全性および有効性が、第ＩＩ／ＩＩＩ相臨床試験において評価段階にある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、以下の記述でまとめられる。
１．２０ｍｍ未満の直径を有する、無血管性または乏血管性微小腫瘍を治療するための、血管破壊剤（ＶＤＡ）またはその塩若しくは溶媒和物若しくはプロドラッグ。
典型的には、微小腫瘍は、ヒト微小腫瘍である。
本発明の方法において治療される腫瘍は、無血管性または乏血管性であるため、それらのサイズは、限定される酸素および栄養素の供給を考慮して本質的に限定される。
以下に詳述されるとおり、微小腫瘍の最大サイズは、動物により左右される。
２．無血管性微小腫瘍を治療するための、記述１に記載の血管破壊剤（ＶＤＡ）またはその塩若しくは溶媒和物若しくはプロドラッグ。
３．前記腫瘍が、内臓器官、例えば、肝臓、脾臓、腎臓または肺内で生じる、記述１または２に記載の微小腫瘍を治療するための血管破壊剤（ＶＤＡ）またはその塩若しくは溶媒和物若しくはプロドラッグ。
具体的な実施形態は、血管を供給するための門部が不存在である膵臓中の腫瘍の治療を排除する。
４．前記腫瘍が、硬変または正常肝組織内で生じる、記述１〜３のいずれか１つに記載の微小腫瘍を治療するための血管破壊剤（ＶＤＡ）またはその塩若しくは溶媒和物若しくはプロドラッグ。
５．前記腫瘍が、１〜１０ｍｍ、または１〜５ｍｍの直径を有するヒト腫瘍である、記述１〜４のいずれか１つに記載の微小腫瘍を治療するための血管破壊剤（ＶＤＡ）またはその塩若しくは溶媒和物若しくはプロドラッグ。
６．前記腫瘍が、修正４スケールＥｄｍｏｎｄｓｏｎおよびＳｔｅｉｎｅｒ体系により定義されるグレードＩ〜ＩＶ腫瘍である、記述１〜５のいずれか１つに記載の微小腫瘍を治療するための血管破壊剤（ＶＤＡ）またはその塩若しくは溶媒和物若しくはプロドラッグ。
７．前記腫瘍が、修正４スケールＥｄｍｏｎｄｓｏｎおよびＳｔｅｉｎｅｒ体系により定義されるグレードＩまたはＩＩ腫瘍である、記述１〜６のいずれか１つに記載の微小腫瘍を治療するための血管破壊剤（ＶＤＡ）またはその塩若しくは溶媒和物若しくはプロドラッグ。
８．前記腫瘍が、カルシノーマ、例えば、原発性肝細胞癌（ＨＣＣ）または肉腫、例えば、横紋筋肉腫である、記述１〜７のいずれか１つに記載の微小腫瘍を治療するための血管破壊剤（ＶＤＡ）またはその塩若しくは溶媒和物若しくはプロドラッグ。
９．ＶＤＡがチューブリン結合スチルベノイドまたはジヒドロスチルベノイドである、記述１〜８のいずれか１つに記載の微小腫瘍を治療するための血管破壊剤（ＶＤＡ）またはその塩若しくは溶媒和物若しくはプロドラッグ。
１０．ＶＤＡがコンブレタスタチンＡ−４（ＣＡ４）、ＺＤ６１６２若しくはＳＴＡ−９５８４またはそれらのプロドラッグ、塩若しくは溶媒和物である、記述１〜９のいずれか１つに記載の微小腫瘍を治療するための血管破壊剤（ＶＤＡ）またはその塩若しくは溶媒和物若しくはプロドラッグ。
上記記述のいずれかに記載の微小腫瘍を治療するための医薬組成物は、追加の抗癌医薬品をさらに含有し得る。
活性成分は、一緒にまたは別個に配合することができる。これらは、同一経路を介する、または異なる経路を介した投与のために製剤することができる。
１１．２０ｍｍ未満、典型的には、１０ｍｍ未満の直径を有する無血管性または乏血管性微小腫瘍を治療する方法であって、有効量の血管破壊剤（ＶＤＡ）またはその塩若しくは溶媒和物若しくはプロドラッグを投与するステップを含む方法。このような方法は、有効な補助療法と組み合わせ、または有効な補助療法が続いて、より治癒的なアウトカムに到達することができる。
【０００５】
より治癒的な効果を得るため、典型的には、ＶＤＡ剤の投与後翌日に、ＶＤＡ誘導腫瘍壊死が、一旦、形成されたら、次いで第２の有効な補助療法の血管内投与を行うことができる。このようなさらなる治療剤は、典型的には、壊死組織を標的化する薬剤である。
【０００６】
第２の有効な補助療法は、標的放射線治療剤、例えば、ヨウ素−１３１標識ヒペリシン（例示的な代表的な小分子ネクローシス・アヴィッド（ｎｅｃｒｏｓｉｓ−ａｖｉｄ）化合物である）の血管内投与により実施することができる。これらの化合物は壊死腫瘍において蓄積し、ある浸透距離でイオン化放射線、例えば、高エネルギーベータ粒子を放出して隣接する残留生存癌細胞を殺傷する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】実験設計のフローチャート。ＤＥＮＡ：ジエチルニトロソアミン；ＨＣＣ：肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）；Ｔ２ＷＩ：Ｔ２強調イメージング（Ｔ２−ｗｅｉｇｈｔｅｄ  ｉｍａｇｉｎｇ）；Ｔ１ＷＩ：Ｔ１強調イメージング（Ｔ１−ｗｅｉｇｈｔｅｄ  ｉｍａｇｉｎｇ）；ＤＷＩ：拡散強調イメージング（ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ−ｗｅｉｇｈｔｅｄ  ｉｍａｇｉｎｇ）；ＣＥ：造影増強（ｃｏｎｔｒａｓｔ−ｅｎｈａｎｃｅｄ）；ＣＡ４Ｐ：コンブレタスタチンＡ４リン酸；ｎ：動物数；ｔ：腫瘍数；φ：直径；ｈ：時間；ｉｖ：静脈内。
【図２】微小ＨＣＣおよび大型ＨＣＣ間のＣＡ４Ｐ治療効力の比較。  Ａ．≦５ｍｍの微小ＨＣＣおよび＞５ｍｍのＨＣＣにおける、ＣＡ４Ｐにより誘導された腫瘍壊死の割合の散布図。有意な負の線形相関が、ＣＡ４Ｐにより誘導された腫瘍壊死および＞５ｍｍの直径を有する腫瘍間で同定された一方（Ｐ＜０．０５）、腫瘍壊死は、≦５ｍｍの直径を有する腫瘍と線形相関しなかった。  Ｂ．≦５ｍｍの微小ＨＣＣおよび＞５ｍｍの大型ＨＣＣ間のＣＡ４Ｐにより誘導された腫瘍壊死の平均割合を比較する棒グラフ（*Ｐ＜０．０１）。
【図３Ａ−Ｂ】ＣＡ４Ｐにより誘導されたほぼ完全な壊死を有する代表的な微小ＨＣＣのインビボＭＲＩおよび死後検証。  Ａ．微小癌の腫瘍１（矢印）のインビボＭＲＩ所見：Ｔ２ＷＩにおける、処理前の高信号および１２時間後における増加した高信号（ａ１〜ｂ１）；造影前Ｔ１ＷＩにおいて、明らかな変化は存在せず、ほぼ等信号である（ａ２〜ｂ２）；ＡＤＣマップ上、ベースラインにおける中程度の高信号および１２時間後における増加したシグナル（ａ３〜ｂ３）；および、ＣＥ−Ｔ１ＷＩ上、ベースラインにおける最小の増強およびＣＡ４Ｐ処理１２時間後における遅延した造影増強（ａ４〜ｃ４）。  Ｂ．乏しい腫瘍血管性を示す、対応する微小血管造影（ａ１）超接写写真（Ｍａｃｒｏｐｈｏｔｏｇｒａｐｈ）（ｂ１）および病理組織診断（Ｈ＆Ｅ染色；ｃ１、原寸の２５倍、スケールバー＝４００μｍ；ｃ２、原寸の２００倍、スケールバー＝５０μｍ。ＮＴ：壊死腫瘍；ＶＴ：生存腫瘍；Ｌ：肝臓）は、ほぼ完全な腫瘍内壊死を明らかにした。Ｃ．ＤＷＩに由来するＡＤＣの定量。ＡＤＣperf（ａ）は、血液灌流（ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）がＣＡ４Ｐ処理後に硬変肝中で急激に減少したことを示し（Ｐ＜０．０１）、腫瘍中でも降下を伴った。ＡＤＣdiff（ｂ）は、１２時間後においてわずかに増加し、ＣＡ４Ｐにより誘導された腫瘍内壊死を示唆し；その一方、肝臓のＡＤＣdiffは、有意な変化を示さなかった。
【図３Ｃ】ＣＡ４Ｐにより誘導されたほぼ完全な壊死を有する代表的な微小ＨＣＣのインビボＭＲＩおよび死後検証。  Ａ．微小癌の腫瘍１（矢印）のインビボＭＲＩ所見：Ｔ２ＷＩにおける、処理前の高信号および１２時間後における増加した高信号（ａ１〜ｂ１）；造影前Ｔ１ＷＩにおいて、明らかな変化は存在せず、ほぼ等信号である（ａ２〜ｂ２）；ＡＤＣマップ上、ベースラインにおける中程度の高信号および１２時間後における増加したシグナル（ａ３〜ｂ３）；および、ＣＥ−Ｔ１ＷＩ上、ベースラインにおける最小の増強およびＣＡ４Ｐ処理１２時間後における遅延した造影増強（ａ４〜ｃ４）。  Ｂ．乏しい腫瘍血管性を示す、対応する微小血管造影（ａ１）超接写写真（Ｍａｃｒｏｐｈｏｔｏｇｒａｐｈ）（ｂ１）および病理組織診断（Ｈ＆Ｅ染色；ｃ１、原寸の２５倍、スケールバー＝４００μｍ；ｃ２、原寸の２００倍、スケールバー＝５０μｍ。ＮＴ：壊死腫瘍；ＶＴ：生存腫瘍；Ｌ：肝臓）は、ほぼ完全な腫瘍内壊死を明らかにした。Ｃ．ＤＷＩに由来するＡＤＣの定量。ＡＤＣperf（ａ）は、血液灌流（ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）がＣＡ４Ｐ処理後に硬変肝中で急激に減少したことを示し（Ｐ＜０．０１）、腫瘍中でも降下を伴った。ＡＤＣdiff（ｂ）は、１２時間後においてわずかに増加し、ＣＡ４Ｐにより誘導された腫瘍内壊死を示唆し；その一方、肝臓のＡＤＣdiffは、有意な変化を示さなかった。
【図４】肝硬変に基づく微小ＨＣＣにおけるＣＡ４Ｐにより誘導された壊死の死後検証。Ａ．微小血管造影（ａ１〜ｆ１）は、腫瘍壊死が生じた腫瘍２〜６において現れたまばらな血管密度を示唆し、希少な腫瘍壊死が誘導された腫瘍７において大きい血管湖（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｌａｋｅｓ）が存在することを示唆し；拡大写真（ｐｈｏｔｏｍａｃｒｏｇｒａｐｈｓ）（ａ２〜ｆ２）および顕微鏡観察（Ｈ＆Ｅ染色；ａ３〜ｆ３、原寸の１２．５倍、スケールバー＝８００μｍ；ａ４〜ｆ４、原寸の１００倍、スケールバー＝１００μｍ）は、腫瘍２〜５において生じたほぼ完全な壊死、腫瘍６において誘導された部分的な壊死、および腫瘍７において希少な壊死を検証した（ＮＴ：壊死腫瘍；ＶＴ；生存腫瘍；Ｌ：肝臓；Ｖ：血管湖（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｌａｋｅ））。腫瘍２、３および７の硬変肝周辺（ｓｏｕｎｄｉｎｇ  ｃｉｒｒｈｏｔｉｃ  ｌｉｖｅｒ）中には斑状壊死（鏃印）も散在した。Ｂ．病理組織診断（Ｈ＆Ｅ染色；ａ１、ｂ１、原寸の５０倍、スケールバー＝２００μｍ；ａ２、ｂ２、原寸の２００倍、スケールバー＝５０μｍ）は、壊死病巣（鏃印）が硬変肝実質（ｃｉｒｒｈｏｔｉｃ  ｌｉｖｅｒ  ｐａｒｅｎｃｈｙｍａ）中に存在したことを実証した（ＮＬ：壊死肝；ＶＬ：生存肝）。
【図５】長軸および短軸の直径が３．３および２．５の微小横紋筋肉腫Ｒ１腫瘍を、肝に移植したラットにおける、ＣＡ４Ｐ処理の１２時間後の代表例を示す。図５Ａ：Ｔ２強調水平断ＭＲＩにおいて、楕円形の高信号肝病変（矢印）が左肝葉（ＬＬ）中に現れる；ＲＬ、右肝葉；Ｓ、胃；およびＣ、結腸。Ｂ：造影剤Ｇｄ−ＤＯＴＡ投与の１５分後、左肝（ＬＬ）病変は、壊死を示唆する中央の暗色領域により増強される（矢印）；ＲＬ、右肝葉；Ｓ、胃；およびＣ、結腸。Ｃ：小型すぎて表面から見ることができない微小横紋筋肉腫Ｒ１腫瘍（矢印）を含む肝標本。Ｄ：対応する微小血管造影は、壊死を示唆する陰影欠損（ｆｉｌｌｉｎｇ  ｄｅｆｅｃｔ）として病変を示す（矢印）。Ｅ：病変（矢印）は、肝切片（上段）および対応する微小血管造影（下段）上でトレースすることができる。Ｆ：低出力ＨＥ染色顕微鏡観察は、この実質的に乏血管性〜無血管性のＲ１腫瘍の周囲の組織反応および考えられる腫瘍残留物を伴う大量および部分的出血性腫瘍壊死を明らかにする。Ｇ：高出力ＨＥ染色顕微鏡観察は、中心壊死および顕著な腫瘍内血管系を有さない生存するＲ１腫瘍細胞の周囲の数層を明らかに示す。Ｈ：対応する免疫組織化学ＣＤ３４−ＰＡＳ二重染色顕微鏡観察は、ＨＥ染色を用いた所見を裏付ける。
【図６】異なる倍率（２５および１００倍）における、処理していない微小腫瘍の組織形態学的検査。上段パネルは、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色による染色を示す。下段パネルは、ＣＤ３４および過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）二重染色を示す。
【図７】巨大癌と微小癌との間の模式的な治療の有効性。備考：Ｔ：悪性腫瘍；ＴＮ：ＣＡ４Ｐにより誘導された腫瘍壊死；β粒子は、浸透が約２．０ｍｍであり（点線間の領域）、それは治癒効果についてのδよりも大きい。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
発明の詳細な説明全体にわたり使用される略語
ＶＤＡ：血管破壊剤；
ＣＡ４Ｐ：コンブレタスタチンＡ−４リン酸；
ＨＣＣ：肝細胞癌；
ＭＲＩ：磁気共鳴イメージング；
Ｔ２ＷＩ：Ｔ２強調イメージング；
ＤＷＩ：拡散強調イメージング；
ＣＥ：造影増強（ｃｏｎｔｒａｓｔ−ｅｎｈａｎｃｅｄ；
Ｔ１ＷＩ：Ｔ１強調イメージング；
ＡＤＣ：見かけの拡散計数（ａｐｐａｒｅｎｔ  ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）；
ＲＥＣＩＳＴ：固形腫瘍における治療効果判定基準（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｔｕｍｏｒｓ）；
ＤＣＥ：ダイナミック造影増強（ｄｙｎａｍｉｃ  ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｅｎｈａｎｃｅｄ）；
ＤＥＮＡ：ジエチルニトロソアミン；
ＴＳＥ：ターボスピンエコー；
ＥＰＩ：エコープラナーイメージング；
ＳＤ：Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ；
ＲＯＩ：関心領域（ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ）；
ＳＩ：シグナル強度；
Ｈ＆Ｅ：ヘマトキシリンおよびエオシン；
ＳＥＭ：標準誤差。
【０００９】
以下の詳細な説明は、事実上例示にすぎず、本発明または用途および本発明の使用を限定するものではない。
さらに、前述の本発明の背景技術または以下の詳細な説明に提示されるいかなる理論によっても拘束されるものではない。
【００１０】
本発明の以下の詳細な説明は、添付の図面を参照する。異なる図面における同一の参照番号は、同一または類似の要素を特定する。さらに、以下の詳細な説明は、本発明を限定するものではない。その代わり、本発明の範囲は、付属の特許請求の範囲およびその均等物により定義される。
【００１１】
いくつかの文書が本明細書の本文全体にわたり引用されている。本明細書に記載された文献のそれぞれ（任意の製造業者の仕様書、説明書などを含む）は、参照により本明細書に組み込まれ；しかしながら、いかなる引用文書も事実上本発明の先行技術であることを承認するものではない。
【００１２】
本発明は、特定の実施形態に関して、およびある図面を参照して記載されるが、本発明はそれらに限定されるものではなく、特許請求の範囲によってのみ限定される。記載される図面は、模式的なものにすぎず、非限定的である。
図面において、要素の一部のサイズは、説明目的のために強調され、一定の縮尺で描画されないことがある。寸法および相対寸法は、本発明の実施のための実際の縮図に対応しない。
【００１３】
さらに、詳細な説明中および特許請求の範囲中の第１、第２、第３などの用語は、類似の要素間の区別のために使用され、必ずしも順序または時系列を記載するために使用されない。そのように使用される用語は、適切な状況下で互換的であることおよび本明細書に記載の本発明の実施形態は、本明細書に記載または説明される以外の他の順序においても操作が可能であることを理解すべきである。
【００１４】
さらに、詳細な説明中および特許請求の範囲中の頂部、底部、上方、下方などの用語は、説明目的として使用されるものであり、必ずしも相対的位置を記載するものではない。そのように使用される用語は、適切な状況下で互換的であることおよび本明細書に記載の本発明の実施形態は、本明細書に記載または説明される以外の方向に操作が可能であることを理解すべきである。
【００１５】
特許請求の範囲において使用される用語「含む」は、その後に列挙される手段に限定するものと解釈すべきではなく；それは他の要素もステップも除外しないことに留意すべきである。したがって、言及されるとおり、記述される特色、整数、ステップまたは構成成分の存在を規定するものであるが、１つ以上の他の特色、整数、ステップ若しくは構成成分、またはその群の存在も追加も排除するものではないと解釈すべきである。したがって、「手段ＡおよびＢを含む装置」という表現の範囲は、構成成分ＡおよびＢのみからなる装置に限定されるべきではない。本発明に関して、それは、装置の唯一の関連する構成成分がＡおよびＢであることを意味する。
【００１６】
本明細書全体にわたる「一実施形態」または「実施形態」への言及は、その実施形態に関連して記載される特定の特色、構造または特徴が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書の全体にわたる種々の箇所における語句「一実施形態において」または「実施形態において」の出現は、全て必ずしも同一の実施形態を指すわけではないが、そうであってもよい。さらに、特定の特色、構造または特徴は、１つ以上の実施形態において、本開示から当業者に自明であるとおり、任意の好適な様式で組み合わせることができる。
【００１７】
同様に、本開示を合理化し、種々の本発明の態様の１つ以上の理解を補助する目的のため、本発明の例示的な実施形態の説明において、種々の本発明の特色を、単一の実施形態、図面またはその説明中において一緒にグループ化する場合があることを認識すべきである。
しかしながら、本開示のこの方法は、特許請求される本発明が、それぞれの請求項において明記されるよりも多くの特色を要求する意図を反映するものであると解釈されるべきではない。むしろ、以下の特許請求の範囲が反映するとおり、本発明の態様は、上記で開示された単一の実施形態の全ての特色よりも少ない特色で存在する。したがって、詳細な説明に続く特許請求の範囲は、本明細書によりこの詳細な説明に明示的に組み込まれ、それぞれの請求項は本発明の個々の実施形態としてそれ自体で成立する。
【００１８】
さらに、本明細書に記載の一部の実施形態は、他の実施形態に含まれる一部の特色を含むが、他の特色を含まない一方、異なる実施形態の特色の組合せは、本発明の範囲内にあることを意味し、当業者により理解されるとおり異なる実施形態を形成する。例えば、以下の特許請求の範囲において、クレームされた実施形態のいずれかを任意の組合せで使用することができる。
【００１９】
本明細書に記載される詳細な説明において、多数の具体的な詳細が記載される。しかしながら、本発明の実施形態は、これらの具体的な詳細なしで実施することができることが理解される。他の例において、この詳細な説明の理解が不明瞭にならないために、周知の方法、構造および技術は詳細に示さなかった。
【００２０】
本発明の他の実施形態は、本明細書の考慮および本明細書に開示される本発明の実施から当業者に自明である。
【００２１】
本明細書および実施例は、例示にすぎないとみなされることを意図する。
【００２２】
いずれの請求項も、本発明の実施形態として本明細書に組み込まれる。したがって、特許請求の範囲は、詳細な説明の一部であり、さらなる説明であり、本発明の好ましい実施形態に追加される。
【００２３】
請求項のそれぞれは、本発明の特定の実施形態を記載する。
【００２４】
本発明の特定および好ましい態様は、添付の独立および従属請求項に記載される。従属請求項からの特色は、独立請求項の特色と、および他の従属請求項の特色と適宜組み合わせることができ、特許請求の範囲に明記されているもののみに限らない。
【００２５】
したがって、詳細な説明に続く特許請求の範囲は、本明細書に明示的に詳細な説明に組み込まれ、それぞれの請求項は本発明の別個の実施形態としてそれ自体で成立する。
【００２６】
本発明に関する「血管破壊剤」（ＶＤＡ）は、既に樹立された腫瘍血管系の内皮細胞および周囲細胞を標的とする化合物の機能的定義を指す。
これらの化合物は、腫瘍における新血管形成プロセスを阻止するために使用される抗血管新生化合物と異なる。ＶＤＡという一般的用語はまた、薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、またはプロドラッグも包含する。
【００２７】
最良に特徴付けされたＶＤＡは、チューブリン結合剤およびフラボノイドである。
【００２８】
チューブリン結合剤は、内皮チューブリンの［ベータ］サブユニットに作用することにより機能し、微小管の脱重合並びにアクチンおよびチューブリンの脱組織化をもたらす。これらは、細胞骨格の、および細胞間ジャンクション構成タンパク質の破壊を決定する。
これらは、内皮細胞形状の重大な変化、血管浸透性の増加、血流の阻害が続く間質圧の増加および血管収縮を誘導する。結果は、血流の急速崩壊、顕著な虚血、壊死および腫瘍出血である。これらの効果は、腫瘍の中心区域においてより顕著である。
【００２９】
具体的なクラスのＶＤＡは、コンブレタスタチンである。これらは、コンブレタスタチンＡ４に構造的に関連する化合物である。
【００３０】
全てのものがコルヒチンに構造的に関連し、それとしては、コンブレタスタチンＡ−４（ＣＡ４）、そのプロドラッグＣＡ４リン酸（ＣＡ４Ｐ）、ＣＡ４Ｐアナログ［３−メトキシ−２−ホスホナトオキシ−６−［（Ｚ）−２−（３，４，５−トリメトキシフェニル）エテニル］フェニル］リン酸（Ｏｘｉ４５０３）（コンブレタスタチンＡ１リン酸）、および（２Ｓ）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−Ｎ−［２−メトキシ−５−［（Ｚ）−２−（３，４，５−トリメトキシフェニル）エテニル］フェニル］プロパンアミド（ＡＶＥ８０６２）、メチル−［５−［［４−［［（２Ｓ）−２−アミノプロパノイル］アミノ］フェニル］スルファニル］−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル］カルバメート一塩酸塩（ＭＮ−０２９）、Ｎ−アセチルコチノール（ａｃｅｔｙｌｃｏｃｈｉｎｏｌ）−Ｏ−リン酸（ＺＤ６１２６）、（３Ｚ，６Ｚ）−３−［（５−ｔｅｒｔ−ブチル−１Ｈ−イミダゾール−４−イル）メチレン］−６−（フェニルメチレン）−２，５−ピペラジンジオン（ＮＰＩ−２３５８）、およびＮ−エチル−Ｎ＿−［２−メトキシ−４−［５−メチル−４−［［（１Ｓ）−１−（３−ピリジニル）ブチル］アミノ］−２−ピリミジニル］フェニル］ウレア（ＣＹＴ９９７）が挙げられる。
【００３１】
このようなアナログの一例は、活性代謝産物ＲＰＲ２５８０６３に変換されるプロドラッグのオンブラブリンである。
【００３２】
具体的な実施形態において、ＶＤＡは、ＣＡ４Ｐ、ＺＤ６１６２、およびＳＴＡ−９５８４からなる群から選択される。
【００３３】
以下のチューブリン結合剤は、臨床開発に入れられている：ＣＡ４Ｐ、ＡＶＥ８０６２、ＡＢＴ−７５１、ＮＰＩ−２３５８、ドラスタチン−１０、ＭＰＣ６８２７、ＣＹＴ９９７、ＴＺＴ−１０２７、ＺＤ６１２６、ＢＮＣ１０５Ｐ、ＥＰＣ２４０７、ＭＮ−０２９およびＯｘｉ４５０３。
【００３４】
多数のＶＤＡが、当分野において記載されている。上記段落に挙げられ、以下の引用文献に開示される全てのＶＤＡは、参照により本出願に組み込まれ、コンブレタスタチンＡ−４（ＣＡ４）およびそのプロドラッグＣＡ４リン酸（ＣＡ４Ｐ）の妥当な代替物である。
【００３５】
特許および非特許文献の非限定的なリストを以下に列挙する。
【００３６】
米国特許出願公開第９３５８３０３８号明細書は、ＶＤＡ、例えば、コルヒチン、コルヒチノイド、コンブレタスタチン、フェンスタチン、ポドフィロトキシン、ステガナシン、アンフェチニル（ａｍｐｈｅｔｈｉｎｉｌｅ）、スチルベンおよびフラボノイドを記載している。具体的なコルヒチン様分子は、アザデメチルコルヒチン、アザコルヒチン、Ｎ−メチルデスアセチルコルヒチンおよびデスアセチルコルヒチンである。
【００３７】
米国特許出願公開第２０１０１６８０３６号明細書は、コンブレタスタチンＡ−４、コンブレタスタチンＡ−４リン酸、コンブレタスタチンＡ−１、コンブレタスタチンＡ−１二リン酸を開示している。
【００３８】
米国特許出願公開第２００７０１７８１０７号明細書は、コンブレタスタチンＡ−４リン酸二ナトリウム、ＺＤ６１２６、ＡＶＥ８０６２、およびＯｘｉ４５０３；並びにフラボノイド、ＤＭＸＡＡを開示している。
【００３９】
米国特許出願公開第２００８０２１４５０９号明細書は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる種々のコンブレタスタチン構造アナログを記載している。
【００４０】
Ｍａｈａｌら、（２０１６）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．１１８，９−２０は、コンブレタスタチンＡ−４由来の、５−（１−メチル−４−フェニル−イミダゾール−５−イル）インドールを記載している。
【００４１】
Ｍａｃｄｏｎｏｕｇｈら、（２０１３）Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２１，６８３１−６８４３は、２−（３’−ヒドロキシ−４’−メトキシフェニル）−３−（３’’，４’’，５’’−トリメトキシベンゾイル）−６−メトキシインドール（ＯＸｉ８００６）に由来するインドール系抗癌剤を開示している。
【００４２】
Ｒａｊａｋら、（２０１３）Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ．１９，１９２３−１９５５は、コンブレタスタチンシス拘束型異性体アナログを開示している。
【００４３】
Ｆｏｌｅｙら、（２０１２）Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ．３４３，５２９−５３８は、血管破壊剤ＳＴＡ−９５８４を開示している。
【００４４】
Ｓｈｉｒａｉｓｈｉら、（２０１２）Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．２９，１７８−１８６は、種々のコンブレタスタチン誘導体を記載している。
【００４５】
Ｄｅｌｍｏｎｔｅ  ＆  Ｓｅｓｓａ（２００９）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ．１８，１５４１−１５４８は、新たなコンブレタスタチン誘導体のＡＶＥ８０６２を開示している。
【００４６】
Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら、（２００６）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ  １７，２５−３１は、腫瘍血管破壊剤のＮＰＩ−２３５８を開示している。
【００４７】
Ｗａｌｌａｃｅら、（２００７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６７，７０１１−７０１９は、血管破壊剤ＤＭＸＡＡを開示している。
【００４８】
Ｄｕｐｅｙｒｅら、（２００６）Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．１４，  ４４１０−４４２６は、抗血管剤としての（３，４，５−トリメトキシフェニル）インドール−３−イルメタン誘導体を開示している。
【００４９】
ＶＤＡフラボノイドの一例は、フラボン−８−酢酸アナログＡＳＡ４０４（バジメザン）である。
【００５０】
腫瘍血管系を標的化する他の化合物としては、リガンド指向ＶＤＡ［エンド−ＴＡＧ（カチオン性脂質パクリタキセル）、ＡＤＨ−１のｅｘｈｅｒｉｎ、サイトカイン、例えば、腫瘍ホーミングペプチド−ＴＮＦ、細胞毒性剤、例えば、パプリタキセル（ｐａｐｌｉｔａｘｅｌ）が挙げられる。
【００５１】
上記の化合物の薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、またはプロドラッグが同様に想定される。
【００５２】
本明細書に記載の化合物は、化合物それ自体として投与することができ、または医薬品として製剤化することができる。医薬品／医薬組成物は、場合により、１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤、例えば、担体、希釈剤、増量剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、着色剤、色素、安定剤、保存剤、酸化防止剤、または溶解度向上剤を含み得る。
【００５３】
任意の特定の個々の対象についての具体的な用量レベルおよび投薬の頻度は変えることができ、種々の因子、例として、用いられる具体的な化合物の活性、その化合物の代謝安定性および作用の長さ、年齢、体重、全身健康状態、性別、食事、投与方式および時間、排泄速度、薬物組合せ、特定の病態の重症度、並びに治療法を受ける個々の対象に依存する。
【００５４】
本明細書に開示の化合物は、他の治療剤との、特に他の抗癌薬との組合せで使用することができる。
【００５５】
ＶＤＡは、典型的には、静脈内または腹腔内投与により投与される。あるＶＤＡは、経口投与することができることが当分野において公知である。
【００５６】
薬物の用量および薬物の投与の頻度は、動物モデルおよび臨床試験において評価され、パラメータ、例えば、腫瘍のサイズ、腫瘍のグレード、副作用および他の薬物との最終的な同時投与に依存する。
【００５７】
本発明に関する「微小癌」または「微小腫瘍」は、５ｍｍ未満の直径を有するラット中の腫瘍を指す。ヒト（または大型動物、例えば、ウマ、非ヒト霊長類、およびウシ）中の微小癌または微小腫瘍は、２０ｍｍ未満、１５ｍｍ未満、または１０ｍｍ未満の直径を有する腫瘍を指す。
【００５８】
「無血管性」または「乏血管性」腫瘍はそれぞれ、明白な血管を有さない、または対応する健常組織中の血管よりも少ない血管を有する悪性腫瘍塊を指す。これは、対応する健常組織中の血管よりも多い血管を有する血管過多性腫瘍と対照的である。
【００５９】
本発明の具体的な実施形態は、無血管性または乏血管性肝細胞癌（ＨＣＣ）［例として、不明瞭な結節状の分化した腫瘍（「早期」ＨＣＣ）］、および、「古典的」大型ＨＣＣと類似する組織学的特色を有する明瞭な結節状の病変（明瞭な結節型の小型ＨＣＣ）、または肝臓への転移性腫瘍若しくは肝臓以外の器官中の腫瘍の治療に関する。
【００６０】
本発明に関する「治療」は、治療中の対象の健康状態の改善を指し、それとしては、腫瘍の成長の遅延、腫瘍の成長の阻害および典型的には腫瘍の縮小が挙げられる。健康状態の改善の他の指標としては、腫瘍の壊死の発生、腫瘍若しくは転移の消失、または重症度の低い腫瘍グレード分類への腫瘍の分類が挙げられる。
【００６１】
血管破壊剤（ＶＤＡ）の抗癌活性は、残留癌細胞により包囲される腫瘍壊死および「正」の容量応答関係を特色付ける。
本発明者らは、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）および死後技術を使用して、ラット中の肝細胞癌（ＨＣＣ）の腫瘍サイズに関して、ＶＤＡコンブレタスタチンＡ−４リン酸（ＣＡ４Ｐ）の効力を調査した。１９匹のラットに、肝硬変に、直径２．８〜２０．９ｍｍの４３個の原発性ＨＣＣを化学的に誘導させた。
ラットは、ＣＡ４Ｐを静脈内で１０ｍｇ／ｋｇを受容した。
腫瘍直径を、Ｔ２強調イメージング（Ｔ２ＷＩ）により計測して、大型ＨＣＣに対して、微小癌（O＜５ｍｍ）を規定した。血管応答および組織壊死を、拡散強調（ＤＷＩ）および造影増強Ｔ１強調イメージング（ＣＥ−Ｔ１ＷＩ）により検出し、それらを微小血管造影および病理組織診断により検証した。
ＤＷＩに由来するあきらかな拡散係数（ＡＤＣ）マップおよびＣＥ−Ｔ１ＷＩは、７つの微小ＨＣＣのうち５つにおいてほぼ完全な壊死を明らかにしたが、大型ＨＣＣにおいては多様な治療的壊死を明らかにし、腫瘍サイズとの正の相関を示した。
微小ＨＣＣにおける壊死は、大型ＨＣＣよりも３６．９％多かった。ＡＤＣperfは、微小ＨＣＣにおいてもまた降下を伴う、硬変肝において急激に減少した血液灌流（ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）を示した。
ＡＤＣdiff増加は、腫瘍壊死を示唆し、硬変肝はほぼ不変であった。
微小血管造影および病理組織診断は、微小癌における、大量の、部分的なおよび軽度の腫瘍壊死が、それぞれ、５：１：１であり、そして、硬変肝中の斑状の壊死病巣を明らかにした。
この試験において、より完全なＣＡ４Ｐ応答は、硬変肝中のＣＡ４Ｐにより誘導された壊死病巣とともに、ラット中の微小ＨＣＣにおいて予想外に生じた。
ＭＲＩは、血管反応および腫瘍壊死の検出を可能とした。これらは、ＨＣＣおよび肝硬変を有する患者におけるＶＤＡの臨床応用の計画を補助し得る。
【００６２】
他の化学療法に関して、ＶＤＡ処理後の「逆の」容量応答関係が留意されてきた。それというのも、ＶＤＡの抗腫瘍効力は腫瘍が大きく成長するにつれて増加すると考えられたためであった［Ｇａｒｏｎら、（２０１６）ＯｎｃｏＴａｒｇｅｔｓ  Ｔｈｅｒ．９，７２７５−７２８３］。
腫瘍サイズの増加およびＶＤＡのより良好な治療効果間のこのような相関が、前臨床試験における複数のネズミアログラフトおよびゼノグラフトモデルにおいて観察されている［Ｎｉｅｌｓｅｎら、（２０１０）Ａｃｔａ  Ｏｎｃｏｌ．４９，９０６−９１３；Ｌａｎｄｕｙｔら、（２０００）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．３６，１８３３−１８４３；Ｓｉｅｍａｎｎ  ＆  Ｒｏｊｉａｎｉ（２００５）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｒａｄｉａｔ  Ｏｎｃｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｐｈｙｓ．６２，８４６−８５３］。
例えば、皮下横紋筋肉腫のラットアログラフトモデルにおいて、大型腫瘍（≧１４ｃｍ3）におけるＣＡ４Ｐ効力は、小型腫瘍（＜１ｃｍ3）におけるものよりも１６．６倍強力であった。
同様に、ＺＤ６１２６の腹腔内注射は、げっ歯類肉腫、扁平上皮癌および線維肉腫、並びにヒト腎細胞癌、カポジ肉腫および乳癌を含む、いくつかのマウスのゼノグラフトモデルにおいて、０．３ｇ未満の小型腫瘍における約たったの２５％と比較して、１ｇよりも大きい腫瘍においてほぼ９０％の壊死を齎した。
さらに、この傾向は、進行性未分化甲状腺癌の臨床試験においても示されている［Ｓｏｓａら、（２０１３）Ｔｈｙｒｏｉｄ  ２４，２３２−２４０］。
これらの強力な証拠にもかかわらず、その機序は依然として解明されていない。小型腫瘍におけるＶＤＡの劣った効果は、血液供給のそれらの主要部分が大部分、周囲の正常組織の血管から由来（ｒｏｏｔｉｎｇ）することに起因する可能性が高い［Ｄｏｎｇ  ＆  Ｌｉｎ（１９９３）Ｊ  Ｖａｓｃ  Ｉｎｔｅｒｖ  Ｒａｄｉｏｌ  ４，６２１−６２４］。
実際、直径が５ｍｍよりも小さい腫瘍は、それら自体の血管系を欠くことが多く、それらの宿主器官から拡散される栄養素により栄養供給される。
【００６３】
ＣＡ４Ｐは、数時間以内に急性腫瘍壊死を引き起こすため、ＶＤＡ試験の終点において定型的に採用される慣用のイメージング基準の固形腫瘍における治療効果判定基準（ＲＥＣＩＳＴ）は、腫瘍サイズの変化前に生じる早期および一過的腫瘍血管反応を検出する必要性の高まりを完全には満たし得ない。
磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）は、２ｍｍほど小型のラット肝腫瘍を識別するほどの高い感度および優れた軟組織造影のものであることが公知である［Ｎｉら、（１９９２）Ｉｎｖｅｓｔ  Ｒａｄｉｏｌ  ２７，６８９−６９７］。
これまで、マルチパラメトリック法（例として、ダイナミック造影増強（ＤＣＥ）−ＭＲＩおよび拡散強調イメージング（ＤＷＩ））が、機能的情報（例えば、血液灌流（ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）、流体拡散、血液容量、血管浸透性および血管外細胞外空間）を取得するため、並びにリアルタイムの血管応答を非侵襲的にモニタリングするために、前臨床および臨床試験の両方においてますます適用されてきている［Ｗａｎｇら、（２００９）Ｉｎｖｅｓｔ  Ｒａｄｉｏｌ．４４，４４−５３；Ｗａｎｇら、（２０１０）Ｅｕｒ  Ｒａｄｉｏｌ．２０，２０１３−２０２６］。
【００６４】
本試験において、本発明者らは、ラットにおける化学的に誘導された原発性肝臓癌または肝細胞癌（ＨＣＣＳ）モデルを用い、異なるサイズ、特に、２〜５ｍｍの範囲の直径の肝臓微小癌病変における、ＨＣＣに対するＣＡ４Ｐの治療効力を評価した。
換言すると、ヒトリストコイルを用いる３．０Ｔ臨床ＭＲＩを利用して、１２時間以内のＣＡ４Ｐに対するインビボ早期血管応答を特徴付けし、イメージング所見をエクスビボ微小血管造影および病理組織診断によりさらに検証した。
【００６５】
硬変肝中のＨＣＣの発症は、腫瘍血液供給の多段階リモデリングにより特徴付けられる［Ｙａｎｇ  ＆  Ｐｏｏｎ（２００７）Ａｎａｔ  Ｒｅｃ  ９１，７２１−７３４．］。
ＨＣＣは、一般に、主に肝動脈枝により供給される血管過多性固形腫瘍である［Ｐａｒｋ（１９９８）Ａｍ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｐａｔｈｏｌ．２２，６５６−６６２］。
しかしながら、ヒト患者における小型ＨＣＣ（＜２ｃｍ）は血管過多性でないことが多く［Ｇｏｌｆｉｅｒｉ  Ｒら、（２００７）Ｄｉｇ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓ．３９，８８３−８９０］、２つのタイプ、すなわち、不明瞭な結節状の高分化腫瘍（「早期」ＨＣＣ）、および「古典的」大型ＨＣＣと類似する組織学的特色を有する明瞭な結節状の病変（明瞭な結節型の小型ＨＣＣ）にさらに分類することができる［Ｅｆｒｅｍｉｄｉｓら、（２００７）Ｅｕｒ  Ｒａｄｉｏｌ．１７，２９６９−２９８２］。
同様に、ＤＥＮＡにより誘導されたラット肝臓癌において、５ｍｍよりも小さい肝腫瘍結節が根本的に門脈（ｐｏｒｔａｌ  ｖｅｉｎ）により供給されることが示されており、それは、大型ラットＨＣＣと区別する。
多様なＨＣＣ血管性を考慮すると、早期ＨＣＣを微小ＨＣＣのサブグループとして分析することが有益である。
【００６６】
この前臨床試験において、本発明者らは、硬変肝バックグラウンド上に散在する処理により誘導された壊死病巣とともに、ラットにおけるＤＥＮＡで誘導された原発性ＨＣＣの微小癌（＜５ｍｍ）におけるほぼ完全なＣＡ４Ｐ治療応答を、初めて報告した。
ＡＤＣから計算された灌流（ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）および拡散は、肝臓全体の血液供給の劇的な低下に続く、早期腫瘍血管反応および壊死を説明するのに役立った。
２つの主な因子が、微小癌におけるＣＡ４Ｐのこの優れた効力に相乗的に寄与し得る、
１）そのような「早期ＨＣＣ」、「小型ＨＣＣ」または微小ＨＣＣにおける、無血管性および／または乏血管性の特色；および、
２）ＣＡ４Ｐが媒介する抗チューブリン効果に対しても脆弱な硬変肝実質中の新血管形成。
結果的に、宿主肝中の血管遮断および虚血性壊死により、微小ＨＣＣから必要不可欠な栄養素が奪われ得、目下の逆説的な所見がもたらされる。
【００６７】
肝硬変は、慢性ウイルス肝炎、アルコール、アフラトキシンなどに起因し得る高リスクの前癌性病態として広く考慮されている［Ｍａｉｅｒ  ＫＰ．（１９９８）Ｐｒａｘｉｓ  ８７，１４６２−１４６５；Ｓｃｈｌａｇｅｔｅｒら、（２０１４）Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  ２０，１５９５５−１５９６４］。
げっ歯類における発癌性物質ＤＥＮＡの適用は、この病理学的進行を刺激し得、最終的に、肝硬変を前提として原発性肝臓癌を誘導する［Ｌｉｕ、（２０１５）Ｑｕａｎｔ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｍｅｄ  Ｓｕｒｇ．５，７０８−７２９］。
肝線維症の発症は、硬変肝に特有の異常な血管構築を徐々に形成する病的血管新生を伴う［Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら、（２００９）Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ．５０，６０４−６２０；Ｉｗａｋｉｒｉら、（２０１４）Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．６１，９１２−９２４］。
特に、本発明者らの試験において見られる、硬変肝におけるＣＡ４Ｐにより誘導された壊死は、肝線維形成進行における新血管形成が、ＶＤＡにより同等に標的化され得る腫瘍血管新生と共通する何かを共有し得ることを示す。
しかしながら、移植されたＲ１腫瘍を有する正常肝に関する本発明者らの補助試験は、新血管系を有する硬変肝に対するＣＡ４Ｐの攻撃がそれらの微小癌における続発性の大量壊死の原因となり得るという仮定を支持するとは考えられない。このような不可解な観察の根本をなす真の機序をさらに解明する必要がある。
【００６８】
ＤＷＩは、早期のＶＤＡで誘導された腫瘍血管応答をモニタリングし、さらに腫瘍壊死を示すための著名なイメージングマーカーであるが、本発明者らの試験における腫瘍灌流（ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）および拡散に関して計算されたＡＤＣの変化は、それほど有意であるとは見えなかった。
関連する理由は、腫瘍容積が小型すぎる場合のＭＲＩアーチファクトの増加、および本試験におけるリクルートされた肝臓微小癌の症例の少なさであり得る。
第２に、硬変肝における血液供給の有意な変更および臨床試験における肝硬変におけるそのようなＶＤＡの副作用に関する報告の欠落を考慮すると、正常および硬変肝におけるＶＤＡ効果を比較するための並行試験を実施することが有益である。
【００６９】
結局、本所見は、硬変バックグラウンドにおける肝臓内微小転移巣だけでなく、再発性ヘパトーマ病巣に対する、ＣＡ４Ｐの阻止的効果にも光を当てた。
しかしながら、他方、このような現象はまた、慢性肝疾患を基礎として硬変に達している患者において、硬変肝および後続の肝不全におけるＣＡ４Ｐで誘導された壊死の潜在的な形成のため、将来的なＣＡ４Ｐ療法の間には、基本的に、肝機能を保護するという認識も上昇させる。
これらは、ＨＣＣおよび肝硬変を有するヒト対象において、ＣＡ４Ｐのさらなる臨床適用の計画に潜在的に有益であり得る。
【００７０】
微小癌におけるＶＤＡ、例えば、ＣＡ４Ｐ、の強力な効果の発見は、癌患者の臨床管理において大いに重要であり得る。
特に、ＶＤＡ単剤療法が無効であることが証明されたことを認識することで、壊死標的化二重療法の組合せは、残留癌組織を最小化して潜在的に治癒的な応答を付与することを要求する。
原発性ＨＣＣおよび続発性横紋筋肉腫Ｒ１腫瘍の両方の微小癌に関する本発明者らの試験は、従来技術の二重療法がより完全な治療アウトカムを達成し得ることを示唆する。それというのも、残留生存腫瘍細胞は、周囲において実に最小であるためであり、それは、131Ｉヨウ化ネクローシス・アヴィッド小分子、例えば、ヒペリシン、から放出される高エネルギーβ粒子の２ｍｍの浸透距離内に十分に存在する。
したがって、腫瘍塊軽減緩和措置としての後期癌患者における使用に代えて、そのような二重標的療法は、それが極めて早期、すなわち、微小癌段階において適用することができる場合、治癒的アウトカムを生じさせ得る。
【実施例】
【００７１】
一般的条件
合計４３個の原発性ＨＣＣ病変を、１９匹のラットにおいて良好に生成させた。これらのうち、７匹のラットを、それぞれの１つの微小ＨＣＣを有すると同定した。全てのラットは、肝細胞癌生成のためのジエチルニトロソアミン（ＤＥＮＡ）強制投与、ガス麻酔、造影剤投与を伴うＭＲＩスキャニング、および静脈内ＣＡ４Ｐ処理を含む実験手順にわたり生存した。
全てのラットを、インビボ試験の終点としてのＣＡ４Ｐ処理の１２時間後に屠殺した。
【００７２】
大型ＨＣＣにおける「正の」容量応答関係
本発明者らは最初に、種々の腫瘍直径における４３個のＨＣＣ間で、ＣＡ４Ｐにより誘導された腫瘍壊死を比較して、ＣＡ４Ｐの抗腫瘍効力および原発性ＨＣＣの腫瘍サイズ間の関係を調査した（図１）。
ＣＡ４Ｐが大型腫瘍において増加した活性を示した従来の研究と一致して、この試験におけるＣＡ４Ｐ効力は、５．７ｍｍ〜２０．９ｍｍの範囲の直径を有する大型ＨＣＣと正に相関すると考えられたが、治療壊死の割合において、大きい相違を示した（図２Ａ）。
【００７３】
肝臓微小癌におけるＣＡ４Ｐの逆説的効果
驚くべきことに、広範な治療の腫瘍壊死は、小型ＨＣＣ、すなわち、直径が５ｍｍよりも小さい肝臓微小癌のサブグループにおいて高頻度に生じた（図２Ａ）。
８０％〜ほぼ１００％の範囲の腫瘍壊死が、７つの微小癌病変のうち５つにおいて見出された。
定量的には、肝臓微小癌における腫瘍壊死の割合は、ＣＡ４Ｐ処理後の大型ＨＣＣよりも、３６．９３％高かった（図２Ｂ）。
【００７４】
肝臓微小癌における早期の劇的な反応は、代表的な肝臓微小癌の腫瘍１により実証されたように、リアルタイムマルチパラメトリックＭＲＩにより検出することができた（図３Ａ）。
ベースラインにおいて、微小癌は、Ｔ２ＷＩにおいて、わずかに高信号で現れ（図３Ａａ１）、Ｔ１ＷＩにおいて、ほぼ等信号で現れ（図３Ａａ２）、ＡＤＣマップ上で中程度に高信号で現れ（図３Ａａ３）、ＣＥ−Ｔ１ＷＩ上でほぼ無増強で現れ、それは乏血管性を示唆した（図３Ａａ４）。
ＣＡ４Ｐ処理の１２時間後、大量腫瘍壊死が誘導され、Ｔ２ＷＩにおいて、腫瘍全体内の強力な高信号（図３Ａｂ１）、腫瘍ＡＤＣの増加（図３Ａｂ３）、および造影前Ｔ１ＷＩ（図３Ａｂ２）と比較したＣＥ−Ｔ１ＷＩにおける造影増強の遅延（図３Ａｂ４）により明らかになった。
これらのイメージングの所見を、死後微小血管造影および病理組織学的評価により検証した（図３Ｂ）。
微小血管造影は、腫瘍血管密度の低減を示した（図３Ｂａ）。担腫瘍肝組織の肉眼的標本（図３Ｂｂ）および対応するＨ＆Ｅ染色顕微鏡写真は、硬変肝上で重ね合わせるとほぼ完全な腫瘍壊死を裏付けた（図３Ｂｃ１、３Ｂｃ２）。
【００７５】
硬変肝における血液灌流（ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）の降下は、微小癌における大量壊死の原因であるか？
小型腫瘍が、それら自体の樹立された血管系の欠落に起因して、ＶＤＡ処理に不十分に応答する傾向があるという全体的な合意を考慮し、本発明者らは、次に、硬変肝の周辺における血液供給が同様にＣＡ４Ｐにより影響を受け、したがって、それが微小癌における続発性の虚血性壊死を引き起こしたという本発明者らの仮説を試験した。
腫瘍および硬変肝の周辺の両方における血管挙動を、ＡＤＣ計算により評価した。
定量的ＡＤＣperfは、第１に、ベースラインにおいて、硬変肝が微小ＨＣＣと比べて有意に過灌流（ｈｙｐｅｒｐｅｒｆｕｓｅｄ  ）であることが考えられることを示し（ｐ＜０．０５）；第２に、ＣＡ４Ｐは、肝周辺における血液灌流（ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）を急激に減少させ（ｐ＜０．０５）、その結果、腫瘍灌流（ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）の降下を伴った（図３Ｃａ）。
この所見は、硬変肝の血管系もまた、ＣＡ４Ｐにより重度に影響を受け、少なくとも１２時間の継続的な肝虚血および肝周辺からの供給に完全に依存する肝臓微小癌に続発性の損傷をもたらすことを示唆する。
その一方で、腫瘍ＡＤＣdiffはわずかに上昇したが、肝周辺においてはほぼ不変であり、腫瘍壊死形成を示唆した（図３Ｃｂ）。
【００７６】
硬変肝における散在壊死を伴う肝臓微小癌における大量壊死
病理組織学的および微小血管造影分析により、ＣＡ４Ｐ療法に対する腫瘍反応を、それらの７つ全ての微小癌においてさらに比較した。
一貫して、ほぼ完全な壊死（８２．７７〜９６．４５％）が、乏血管性グレードＩ〜ＩＩの高分化微小ＨＣＣ、すなわち、腫瘍１〜５（図３Ｂ；図４Ａａ１〜ａ５、４Ａｂ１〜ｂ５、４Ａｃ１〜ｃ５、４Ａｄ１〜ｄ５）において誘導された。；
その一方、部分的な腫瘍壊死（２３．１５％）が、血管過多性グレードＩＩＩの低分化腫瘍６において見られ（図４Ａｅ１〜ｅ５）、最小の壊死が、大部分が血管湖により構成されるグレードＩＶの未分化腫瘍７において見られた（図４Ａｆ１〜ｆ５）。
その上、壊死巣は、顕微鏡観察により見られるとおり、硬変肝中で散在し、同様にＣＡ４Ｐ処理により影響を受け得る硬変実質中の新血管系を伴った（図４Ｂ）。
【００７７】
血管破壊剤により標的化可能な微小癌
技術水準は、新たな毛細血管をリクルート（すなわち、新血管形成）することなく、腫瘍がミリメートル直径を超えて拡大できないこと、およびＶＤＡが既存の異常な腫瘍血管を破壊することにより癌を治療することを示し、それは、数ミリメートルよりも小さい腫瘍（新血管形成前段階）は、ＶＤＡにより影響を受けて腫瘍壊死を齎すことはないことを意味する。
これは、これまで、ＶＤＡに関する全てのインビボ研究が、直径がほぼ１ｃｍまたはそれよりも大きい腫瘍塊を有する動物モデルにおいて実施されてきた主な理由である。
げっ歯類内臓器官中の極小の腫瘍を取り扱うことは、別の理由を提示する。
本発明者らの知識では初めて、本発明者らは、多様な腫瘍サイズおよび悪性腫瘍の程度の化学的に誘導された多発性肝細胞癌（ＨＣＣ）を有するラットにおけるＶＤＡ  ＣＡ４Ｐを試験し、それは、サイズが２〜５ｍｍの微小ＨＣＣ間でＣＡ４Ｐの性能を探索する機会を与えた。
驚くべきことに、本発明者らは、７つのＨＣＣのうち５つが、ＣＡ４Ｐにより、８０％超壊死されたことを見出し、その全てが、無血管性または乏血管性分化ＨＣＣであり、残り２つは治療的壊死の割合がかなり低い血管過多である。
【００７８】
上記の予測外の所見を他の型の固形腫瘍において支持することができるか否かを検証するため、本発明者らは、非侵襲性縦方向ＭＲＩによりモニタリングし、そして、死後技術により検証したように、直径が１〜５ｍｍの範囲の横紋筋肉腫（Ｒ１）を肝に移植したラットの群において、ＣＡ４Ｐを意図的に試験した。
Ｒ１は、ＶＤＡ研究に関して以前に広範に研究されてきたが、かなり大型の腫瘍サイズにおいて研究されてきた。一貫して、１１個のそのような病変のうち１０個が９０％超の壊死を示し、それらの全てが、図５により例示されるとおり、無血管性または乏血管性腫瘍のいずれかとして格付けすることができる。
【００７９】
明確な腫瘍血管の欠落にかかわらず、なぜそれらの微小癌がＶＤＡに対して十分に応答したかという難題に関する洞察を得るため、標準的なＨＥ染色を比較する組織学検査および免疫組織化学的染色を図６に実証されるとおり実施した。
肝臓中の微小腫瘍の顕微鏡画像は、慣用のヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色（上行）により、腫瘍が無血管性または乏血管性（すなわち、腫瘍血管系の欠落のために、ＶＤＡ、例えば、ＣＡ４Ｐ、が小型癌においても微小癌においても機能しないという概念の原因となり得る明確な血管構造を有さない）であると見える。
しかしながら、免疫組織学的なＣＤ３４および過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）の二重染色（下行）により、組織全体にわたり細胞のネットワークを形成する、正に染色された新血管内皮は、高密度で同定することができる。
これらの細胞は、ＶＤＡの標的であると見え、そして、小型または微小癌を用いる本発明者らの実験におけるほぼ完全な腫瘍壊死を説明し得る。
【００８０】
ＶＤＡおよび放射線標識ネクローシス・アヴィッド化合物（ｎｅｃｒｏｓｉｓ−ａｖｉｄ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）、例えば、131Ｉ−ヒペリシン（131Ｉ−Ｈｙｐ）の組合せによる微小癌における治癒的見込みを予測するため、本発明者らは、図７に示されるとおり、数学的モデリングを実施した。
【００８１】
半径ｒ1の球体１の体積についての式は、
【数１】
2020526518.tif 000003
であり；半径ｒ2の球体２の体積についての式は、
【数２】
2020526518.tif 000004
であり；Ｖ2は、Ｖ1のα％（例えば、０．８＝８０％）であることを想定し；それは、Ｖ2＝αＶ1；すなわち、
【数３】
2020526518.tif 000005
であり；したがって、
【数４】
2020526518.tif 000006
【数５】
2020526518.tif 000007
であり；生存腫瘍辺縁δの厚さは、
【数６】
2020526518.tif 000008
である。
【００８２】
ＶＤＡまたはＣＡ４Ｐは、腫瘍壊死の５０〜９９％（α）を誘導し得ることが公知である。
上記の式による計算時、直径が２〜１０ｃｍの巨大癌の１０％未満のみが、２日間連続の１回のＣＡ４Ｐおよび131Ｉ−Ｈｙｐの静脈内投与によって、治癒的効力を達成し得る一方、大多数の腫瘍が一時的な緩和効果を示す。
しかしながら、直径が２ｃｍ未満のほぼ全ての微小癌を、そのような１回の二重ｉｖ送達のみにより根絶することができた（図７）。
【００８３】
図７に示されるとおり、巨大腫瘍は、ＶＤＡ処理後にも、周辺組織から酸素および栄養素を受容する生存細胞のかなりの層を依然として含む。
壊死組織に結合する放射性医薬品は、放射線をある程度で放出するにすぎない（図７における点線間の領域）。この領域外の細胞は生存し、再発をもたらす。
【００８４】
微小腫瘍において、周辺生存細胞の領域全体を放射線照射し、腫瘍の完全な根絶をもたらすことができる。
【００８５】
この組合せ二重標的化アプローチにより、微小癌間でのこのような治癒的効力の原理を証明するため、以下の実験プロトコルを適用する：
１）多種の動物モデルは、ブランク対照、単一標的化および二重標的化処理の群（それぞれ、ｎ＝１０）におけるＶＸ２腫瘍移植肝を有するウサギおよびＲ１腫瘍移植肝を有するラットを含み；
２）磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）は、腫瘍成長および治療効力をモニタリングし；
３）処理は、ＣＡ４Ｐ  ２０ｍｇ／ｋｇ  ｉｖ、２ｍＣｉ／ｋｇにおける131Ｉ−ｈｙｐ  ｉｖおよび対照としての通常の生理食塩水を含み；および
４）エンドポイントは、
ａ）動物全生存数、
ｂ）インビボのＭＲＩおよび病理組織診断により計測される腫瘍サイズ、および
ｃ）標的化可能性の証拠のためのオートラジオグラフィー
で、群間で異なる時点において比較した、
【００８６】
材料および方法
動物および試薬
雄Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットを、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｔ．Ａｕｂａｉｎ  ｌｅｓ  Ｅｌｂｅｕｆ，Ｆｒａｎｃｅ）から購入した。
ジエチルニトロソアミン（ＤＥＮＡ、Ｎ０２５８）を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から調達した。
ＣＡ４Ｐ（Ｃ６４３０２５）を、Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｃ．（Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｃａｎａｄａ）から入手した。
ＭＲＩ造影剤Ｄｏｔａｒｅｍ（Ｇｄ−ＤＯＴＡ、ガドテル酸メグルミン；Ｄｏｔａｒｅｍ（登録商標）、Ｇｕｅｒｂｅｔ，Ｆｒａｎｃｅ）、硫酸バリウム懸濁液（Ｍｉｃｒｏｐａｑｕｅ（登録商標）、Ｇｕｅｒｂｅｔ，Ｆｒａｎｃｅ）およびガス麻酔薬イソフルラン（Ｆｏｒａｎｅ（登録商標）；Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）も商業的に入手した。
【００８７】
インビボＭＲＩ
画像を、臨床３．０Ｔ  ＭＲＩスキャナ（ＭＡＧＮＥＴＯＭ  Ｐｒｉｓｍａ；Ｓｉｅｍｅｎｓ，Ｅｒｌａｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびヒトリストコイル（Ｈａｎｄ／Ｗｒｉｓｔ１６、Ａ１．５Ｔ  Ｔｉｍコイル、Ｓｉｅｍｅｎｓ）上で取得した。
２０個の軸位像（ａｘｉａｌ  ｉｍａｇｅｓ）を取得し、スライス厚さは２．０ｍｍであり、ギャップは０．４ｍｍであった。
Ｔ２強調（反復時間、４０００ｍｓ；エコー時間、７０ｍｓ；フリップ角、１５０°；視野、７５×５６ｍｍ2；マトリックス、２５６×１９２）およびＴ１強調（反復時間、６２６ｍｓ；エコー時間、１５ｍｓ；フリップ角、１６０°；視野、７５×５６ｍｍ2；マトリックス、２５６×１９２）ターボスピンエコー（ＴＳＥ）画像（Ｔ２ＷＩ、Ｔ１ＷＩ）を週１回実施して腫瘍成長をモニタリングした一方、Ｔ２ＷＩ、Ｔ１ＷＩ、拡散強調イメージング（ＤＷＩ）および連続造影増強（ＣＥ−）Ｔ１ＷＩを取得してＣＡ４Ｐ処理を評価した。
ＤＷＩについて、二次元ＳＥエコープラナーイメージング（ＥＰＩ）シーケンス（反復時間、３５００ｍｓ；エコー時間、６２ｍｓ；フリップ角、９０°；視野、１３６×７４ｍｍ2；マトリックス、９６×５２）を８つのｂ値（０、５０、１００、１５０、４００、６００、８００および１０００秒／ｍｍ2）で取得した。
ＣＥ−ＭＲＩについて、０．２ｍｍｏｌ／ｋｇのＧｄ−ＤＯＴＡのボーラス（Ｂｏｌｕｓ）を注射してから一連のＣＥ−Ｔ１ＷＩを取得した。
【００８８】
実験設計
この動物実験は、ＫＵ  Ｌｅｕｖｅｎ大学の動物管理および使用倫理委員会の承認後に欧州および国内規制に従って実施した。
強制食餌、腫瘍移植、薬物注射、およびイメージングを含む全てのインビボ手順は、ガス麻酔システム（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）を使用して、２０％の酸素および８０％の室内空気の混合物中の２％のイソフルランによるガス麻酔下で実施した。
【００８９】
図１に説明されるとおり、多発性原発性肝臓癌を、８週間の１日１回の１０ｍｇ／ｋｇ／日におけるＤＥＮＡの強制食餌により、体重３００〜３５０ｇの１９匹の雄Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットに樹立させた。
腫瘍成長を、ＤＥＮＡ投与後の９週目から、最大腫瘍病変が直径１ｍｍ超に達するまでＭＲＩにより週１回モニタリングした。
全てのリクルートされた担癌ラットは、１０ｍｇ／ｋｇにおけるＣＡ４Ｐの単一静脈内注射を受容した。
Ｔ２ＷＩ、Ｔ１ＷＩ、ＤＷＩおよびＣＥ−Ｔ１ＷＩを、ＣＡ４Ｐ療法の４時間前および１２時間後に実施した。
ラットをＭＲＩの最後の時点後に、死後微小血管造影および病理組織診断のために安楽死させた。
【００９０】
ＭＲ画像分析
画像分析は、Ｓｉｅｍｅｎｓワークステーション（バージョンＮｕｍａｒｉｓ／４  Ｓｙｎｇｏ  ＭＲ  Ａ３０）およびＭｅＶｉｓＬａｂ（バージョン２．６．２、ＭｅＶｉｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ＡＧ，Ｂｒｅｍｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上のビルトインソフトウェアを使用して実施した。
以下の計測の全てを、同意を得た３人の著者により取得した。
【００９１】
１）腫瘍直径の計測
Ｔ２ＷＩ上で、腫瘍直径は、処理４時間前の最大腫瘍横断面を有する腫瘍含有画像から手作業により計測した。
【００９２】
２）腫瘍ＡＤＣの別個の計算
ＤＷＩ上で、腫瘍領域（ｔｕｍｏｒ  ａｒｅａ）は、全ての腫瘍含有画像上の操作者が定義した関心領域（ＲＯＩ）により手作業で輪郭抽出（ｃｏｎｔｏｕｒｅｄ）した。
ＡＤＣマップを、ＤＷＩから計算して、以下の単一指数式により治療応答を定量した：Ｓi＝Ｓ0×ｅｘｐ（−ｂi×ＡＤＣ）、
式中、Ｓiは、ｉ番目のｂ値画像上で計測されるシグナル強度（ＳＩ）であり、ｂｉは、対応するｂ値であり、そして、Ｓ0は、固有のＳＩ（ｂ＝０秒／ｍｍ2に対して）を推定する変数である。
【００９３】
異なるＡＤＣ値の計算のため、腫瘍を、１０００ｓ／ｍｍ2のｂ値におけるオリジナルのＤＷＩ上の最大横断面積を有する中央スライス上でのみフリーハンドで輪郭を描いて部分容積効果を回避した。
それぞれの腫瘍病変の描写を、異なるｂ値を有する全ての画像に自動的に複写した。
次いで、腫瘍当たりおよびｂ値当たりの平均ＳＩを決定した。
ＡＤＣlow（ｂ＝０、５０および１００ｓ／ｍｍ2）およびＡＤＣhigh（ｂ＝６００、８００および１０００ｓ／ｍｍ2）間の差を、組織微小毛細血管灌流（ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）を反映するために、ＡＤＣperfとして定義した一方、ＡＤＣhighをＡＤＣdiffとして定義した［Ｃｈｅｎら、（２００７）Ｍｅｔｈｏｄｓ．４３，１２−２０］。
【００９４】
デジタル微小血管造影
最後のＭＲＩスキャニング後、ラットを５０ｍｇ／ｋｇのペントバルビタールの腹腔内注射により麻酔した。
次いで開腹（ｌａｐａｒｏｔｏｍｙ）を実施し、カニューレ挿入された後大静脈および腹部大動脈（ｐｏｓｔｃａｖａ  ａｎｄ  ａｂｄｏｍｉｎａｌ  ａｏｒｔａ）を介して血液を回収し、それを介してバリウム懸濁液を注射してから、担腫瘍肝全体を摘出した。
デジタルマンモグラフィーユニット（Ｅｍ−ｂｒａｃｅ；Ａｇｆａ−Ｇｅｖａｅｒｔ，Ｍｏｒｔｓｅｌ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を用いて、死後肝動脈造影を、２６ｋＶ、３２ｍＡｓにおいて行って、腫瘍血管性の変化を報告した。
次いで、肝臓を固定し、ＭＲ画像に対応する軸平面で３ｍｍの切片にスライスし、それらの切片を定性的分析のために、２６ｋＶ、１８ｍＡｓにおいて放射線撮影した。
【００９５】
病理組織診断
微小血管造影後、ＡｘｉｏＣａｍ  ＭＲモノクロデジタルカメラを備えるＡｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍ顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｉｎｃ，Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用し、ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ  ４．８ソフトウェアによる顕微鏡分析のために腫瘍切片をパラフィン包埋し、５μｍ厚にスライスし、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）により染色した。
【００９６】
ＨＣＣの診断
ヒト肝臓癌において観察される病理組織学的進行と高い類似性に起因して、ラット原発性ＨＣＣを古典的組織形態学的特色：広い索状物（ｔｒａｂｅｃｕｌａｅ）（＞３つの細胞層）、顕著な肺胞パターン（ｎｏｔｉｃｅａｂｌｅ  ａｃｉｎａｒ  ｐａｔｔｅｒｎ）、小さい細胞変化、細胞異型（ｃｙｔｏｌｏｇｉｃ  ａｔｙｐｉａ）、核突出（ｐｒｏｍｉｎｅｎｔ  ｎｕｃｌｅｏｌｉ）、有糸分裂活性（ｍｉｔｏｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）、血管浸潤、クッパー細胞の不存在およびレチクリンネットワーク（ｒｅｔｉｃｕｌｉｎ  ｎｅｔｗｏｒｋ）の損失を有する多血管性であることが多い（ｏｆｔｅｎ  ｗｅｌｌ  ｖａｓｃｕｌａｒｉｚｅｄ）、悪性肝細胞腫瘍、に従って診断した。
修正４スケールＥｄｍｏｎｄｓｏｎおよびＳｔｅｉｎｅｒ体系［Ｓｃｈｌａｇｅｔｅｒら、上記引用］を使用して、ラットＨＣＣの分化をグレードＩ〜ＩＶにさらに分類した。
【００９７】
２）ＣＡ４Ｐ誘導腫瘍内壊死の計算
１２．５の倍率における腫瘍スライスのデジタル画像を使用して、ＩｍａｇｅＪソフトウェア［Ｂｕｉｊｓら、（２０１１）Ｊ  Ｖａｓｃ  Ｉｎｔｅｒｖ  Ｒａｄｉｏｌ  ２２，１１７５−１１８０］により腫瘍壊死の割合を推定した。
簡潔に述べると、関心領域を、腫瘍全体および壊死腫瘍の周囲の輪郭をそれぞれ描き、「それぞれの切片における壊死比」を得た。
それぞれの腫瘍切片について、この腫瘍ブロックを表す軸方向スライド（ａｘｉａｌ  ｓｌｉｄｅ）を「切片面積」として選択した。
それぞれのＨ＆Ｅ染色スライス上の腫瘍壊死を、２人の病理学者により独立して推定し、式：腫瘍内壊死比（％）＝Σ［それぞれの切片上の壊死比（％）×切片面積（ｍｍ2）］×切片厚さ（ｍｍ）／［４／３πｒ3］（ｍｍ3）、により計算した。
【００９８】
統計的分析
統計的分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（バージョン７．０２、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）により実施した。
ピアソン相関係数を、病理組織診断により計算された腫瘍壊死の百分率およびＴ２ＷＩから計測された腫瘍直径間で計算した。
数値データを、平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として提示した。
腫瘍壊死の百分率の比較を、対応のない二元ｔ検定により実施し；腫瘍および肝臓バックグラウンド間のＡＤＣの結果を、二元ＡＮＯＶＡにより比較した。Ｐ＜０．０５で有意差が結論付けられた。
【図１】
2020526518.tif 000009
【図２】
2020526518.tif 000010
【図３Ａ−Ｂ】
2020526518.tif 000011
【図３Ｃ】
2020526518.tif 000012
【図４】
2020526518.tif 000013
【図５】
2020526518.tif 000014
【図６】
2020526518.tif 000015
【図７】
2020526518.tif 000016
【国際調査報告】
2020526518.tif 000017
2020526518.tif 000018
2020526518.tif 000019
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