(57)【要約】  本発明は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）−コレステロールを低下させる調製物、特に、血漿ＬＤＬ−コレステロールレベルを低下させるための薬物としての使用のための細菌細胞抽出物に関し、これにおいて該抽出物は、細胞を混合物と混合しながら、８℃と３７℃の間において、１０分間と４８時間の間にわたり抽出することによって得られ、かつこれにおいて、ｌｄｌ−コレステロールを低下させる細胞抽出物および食品サプリメント、ｌｄｌ−コレステロールを低下させる細胞抽出物および食品サプリメント、ロドスピリルム・ルブルム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍ）細胞は、６０℃と８０℃の間の沸点を有する石油エーテルと、塩化ナトリウムを含むメタノールとの、１０：１と１：１０の間の体積比の混合物を用いて抽出される。より具体的には、本発明は、６０℃と８０℃の間の沸点を有する石油エーテルと塩化ナトリウムを含むメタノールとの混合物を用いてロドスピリルム・ルブルム細胞を抽出することによって得られるロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物に関する。本発明はまた、患者の血漿中のＬＤＬ−コレステロールを低下させるための方法における使用のための、本発明のロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物に関する。本発明はさらに、医薬調製物、前記調製物を含有する食品サプリメント、および前記食品サプリメントを含有する食料品、ならびにそれらを調製するための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
６０℃と８０℃の間の沸点を有する石油エーテルと、塩化ナトリウムを含むメタノールとの混合物を用いて、ロドスピリルム・ルブルム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍ）細胞を抽出することによって得られる、ロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物であって、これにおいて前記抽出物が、前記細胞を前記混合物と混合しながら、８℃と３７℃の間において、１０分間と４８時間の間にわたり抽出することによって得られ、かつこれにおいてロドスピリルム・ルブルム細胞が、６０℃と８０℃の間の沸点を有する石油エーテルと、塩化ナトリウムを含むメタノールとの、１０：１と１：１０の間の体積比の混合物を用いて抽出される、該ロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物。
【請求項２】
前記抽出物が、前記細胞を前記混合物と混合しながら、１０℃と３０℃の間、好ましくは約１２℃と２７℃の間、より好ましくは１５℃と２５℃の間において、２０分間と２４時間の間、好ましくは３０分間と１６時間の間、より好ましくは４５分間と８時間の間、最も好ましくは１時間と３時間の間にわたり抽出することによって得られる、請求項１に記載のロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物。
【請求項３】
前記抽出物が、６０℃と８０℃の間の沸点を有する石油エーテルと、塩化ナトリウムを含むメタノールとの混合物を、ロドスピリルム・ルブルム細胞の前記混合物とのインキュベーション後に、１５℃と２５℃の間において、約１０分間と６０分間の間、遠心分離することによって得られる、請求項１または２に記載のロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物。
【請求項４】
ロドスピリルム・ルブルム細胞が、６０℃と８０℃の間の沸点を有する石油エーテルと、塩化ナトリウムを含むメタノールとの、８：１と１：８の間、好ましくは５：１と１：５の間、より好ましくは２：１と１：２の間、最も好ましくは１：１の体積比の、６０℃と８０℃の間の沸点を有する石油エーテルと、塩化ナトリウムを含むメタノールとの混合物を用いて抽出される、請求項１から３のいずれか１項に記載のロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物。
【請求項５】
前記抽出物が、前記細胞を前記混合物と混合しながら、１５℃と２５℃の間の温度において、１時間と３時間の間にわたり抽出することによって得られ、かつこれにおいてロドスピリルム・ルブルム細胞が、６０℃と８０℃の間の沸点を有する石油エーテルと、塩化ナトリウムを含むメタノールとの、１：１の体積比の混合物を用いて抽出される、請求項１から４のいずれか１項に記載のロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物。
【請求項６】
ロドスピリルム・ルブルム細胞が、６０℃と８０℃の間の沸点を有する石油エーテルと、約０．０２重量％と０．０４重量％の間の塩化ナトリウムを含み、好ましくは約０．０３重量％の塩化ナトリウムを含むメタノールとの混合物を用いて抽出される、請求項１から５のいずれか１項に記載のロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物。
【請求項７】
前記抽出物が、１つ以上のカロテノイドおよび／または１つ以上のキノンを含む、請求項１から６のいずれか１項に記載のロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物。
【請求項８】
ロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物であって、これにおいて前記抽出物が、カロテノイド類であるロドビブリン、１−ヒドロキシ−スピリロキサンチン、３，４−ジデヒドロロドピン、クロロキサンチン、バクテリオフェオフィチンａ、ロドピン、スピリロキサンチン、３，４−ジヒドロスピリロキサンチン、およびバクテリオフェオフィチンａのフィチル誘導体から選択される１つ以上のカロテノイド、および／または、キノン類であるユビキノール−１０、ユビキノン−９、ユビキノン−１０、およびロドキノン−１０から選択される１つ以上のキノンを含む、請求項７に記載のロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物。
【請求項９】
前記抽出物が、ロドビブリン、１−ヒドロキシ−スピリロキサンチン、３，４−ジデヒドロロドピン、クロロキサンチン、バクテリオフェオフィチンａ、ロドピン、スピリロキサンチン、３，４−ジヒドロスピリロキサンチン、およびバクテリオフェオフィチンａのフィチル誘導体、ユビキノール−１０、ユビキノン−９、ユビキノン−１０、およびロドキノン−１０を含む、請求項７に記載のロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物。
【請求項１０】
薬物として使用するための、請求項１から９のいずれか１項に記載のロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物。
【請求項１１】
患者の血漿中のＬＤＬ−コレステロールを低下させることに使用するための、請求項１から９のいずれか１項に記載のロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物。
【請求項１２】
患者の血漿中のＬＤＬ−コレステロールを低下させるための方法において使用するための、請求項１から９のいずれか１項に記載のロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物。
【請求項１３】
前記患者が、心臓血管疾患、アテローム性動脈硬化症、脂質異常症、動脈硬化症、高コレステロール血症、家族性高コレステロール血症、高脂血症、少なくとも７０ｍｇ／ｄＬのＬＤＬ血漿レベル、少なくとも２００ｍｇ／ｄＬの総コレステロールレベル、少なくとも１４ｍｇ／ｄＬのＬｐ（ａ）レベル、炎症、炎症性疾患、虚血、感染症のいずれか１つ以上に苦しんでいるかまたはリスクが増大している、請求項１１または１２に記載の使用のための、請求項１から９のいずれか１項に記載のロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物。
【請求項１４】
前記抽出物が経口的に投与される、請求項１１から１３のいずれか１項に記載の使用のための、請求項１から９のいずれか１項に記載のロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物。
【請求項１５】
請求項１から９のいずれか１項に記載のロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物を含む、ＬＤＬ−コレステロール低下特性をもつ食品サプリメント。
【請求項１６】
請求項１５に記載の食品サプリメントを含む、食料品。
【請求項１７】
ロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物の製造のための方法であって：
ａ）  ロドスピリルム・ルブルム細胞を提供すること、および６０℃と８０℃の間の沸点を有する石油エーテルと、約０．０３重量％の塩化ナトリウムを含むメタノールとの、約１：１の体積比の二相混合物を提供すること；
ｂ）  工程ａ）の前記細胞を工程ａ）の前記混合物と、１５℃と２５℃の間において、約１時間と３時間の間、好ましくは約２時間にわたり混合すること；および
ｃ）  ロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物を、約０．０３重量％の塩化ナトリウムを含有するメタノールから分離し、それによりロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物を提供すること、
の工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）−コレステロールを低下させる調製物、特に、血漿ＬＤＬ−コレステロールレベルを低下させるための薬物としての使用のための細菌細胞抽出物に関する。より具体的には、本発明は、６０℃と８０℃の間の沸点を有する石油エーテルと塩化ナトリウムを含むメタノールとの混合物を用いてロドスピリルム・ルブルム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍ）細胞を抽出することによって得られるロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物に関する。本発明はまた、患者の血漿中のＬＤＬ−コレステロールを低下させるための方法における使用のための、本発明のロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物に関する。本発明はさらに、医薬調製物、前記調製物を含有する食品サプリメント、および前記食品サプリメントを含有する食料品、ならびにそれらを調製するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
心臓血管疾患は、数多くの相乗因子によって引き起こされ、最も重要であるのは高すぎる血中コレステロールレベルである。コレステロールは、細胞膜の成分であることから、動物およびヒトの細胞のための必須の基本成分である。ヒトの細胞はそれら自身のコレステロールを合成し得るが、コレステロールはまた食物からも吸収される。双方のプロセスが、コレステロール代謝において重要な役割を果たしている。
【０００３】
コレステロールは、細胞膜の基本成分としてのその必須の生物学的役割は別として、心臓血管疾患（例えば、心筋梗塞、脳卒中、および末梢血疾患など）の原因として、より具体的には血管壁におけるアテローム性動脈硬化症の病変の発症との関係において、ヒトの健康に負の影響も及ぼす。血漿コレステロールレベルの上昇は、心臓血管疾患およびアテローム性動脈硬化症の発症の最も重要な予測危険因子である。
【０００４】
血漿中では、コレステロールはいわゆるリポタンパク質中で輸送され、該リポタンパク質は、それらの直径および比密度に基づき、多数の異なるクラスに細分され得る。極低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、中密度リポタンパク質（ＩＤＬ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ），および高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）が、リポタンパク質の最も重要なクラスを構成する。
【０００５】
実験的および臨床的研究は、ＶＬＤＬ、ＩＤＬ、およびＬＤＬクラスのリポタンパク質中で輸送されるコレステロール（いわゆるプロアテローム形成性コレステロール）の量が、心臓血管疾患の発症の危険因子であることを示してきた。対照的に、ＨＤＬ粒子中で輸送されるコレステロールは、心臓血管疾患の発生に対し防御する（抗アテローム形成性コレステロール）。
【０００６】
無作為化され、プラセボを対照とした、前向き臨床試験は、血漿コレステロールを低下させることが心臓血管疾患の発生率および死亡率に好影響を及ぼすことを実証した。しかしながら、コレステロールの低下は、好ましくは抗アテローム形成性コレステロールのレベルは基本的に不変のままで、主としてまたは実質的に、ＶＬＤＬ、ＩＤＬ、およびＬＤＬ中に存在するプロアテローム形成性コレステロールの減少によるべきであることが必要条件である。
【０００７】
それ故、心臓血管疾患の治療および予防のためには、プロアテローム形成性コレステロールを低下させること、および抗アテローム形成性コレステロールを絶対的または相対的な割合で増加させることが肝要である。
【０００８】
血漿コレステロールを低下させるためには、数多くのアプローチが利用可能である。最も重要であるのは：
−  コレステロール生合成を阻害すること；
−  組織から腸管腔へのコレステロール（および／またはその代謝物、特に胆汁酸）の除去を増加させること；
−  胃腸管からのコレステロールおよび胆汁酸の吸収を低下させること、
である。
【０００９】
コレステロール合成を阻害するために使用される薬物は、しばしば、コレステロール合成経路の律速酵素である酵素、ヒドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡレダクターゼ（ＨＭＧＣｏＡレダクターゼ）、の阻害剤である。これらのいわゆる「スタチン」は、酵素活性を阻害する分子である。例は、シンバスタチン、プラバスタチン、およびアトルバスタチンである。スタチンは一般に、天然産真菌代謝物の化学合成された誘導体である。
【００１０】
コレステロール除去を増加させるために、胆汁酸吸収樹脂を使用できる（例えば、コレスチラミン）。胆汁酸の該樹脂への吸収の故に、便中でのその分泌が増大され、かつ腸から血中へのその再吸収が低減され、結果として身体からの胆汁酸の相対的な損失を生じる。それ故、肝臓がコレステロールの胆汁酸への変換を増加させ、身体からのコレステロール（代謝物）分泌の正味の増加を生じる結果となる。胆汁酸は（コレステロールを可溶化することにより）管腔から腸組織内へのコレステロールの取り込みに不可欠であることから、腸管腔内の胆汁酸含量の低下もまたコレステロールの取り込みの低下を生じる結果となるであろう。
【００１１】
腸上皮細胞において、コレステロール（および関連ステロール）の細胞輸送系を阻害することにより、腸管腔から血液へのコレステロールの能動輸送を阻害する薬物が、開発中である。
【００１２】
コレステロールホメオスタシス
コレステロールホメオスタシスの維持は、健康状態にとり極めて重要であり、コレステロール合成、吸収、代謝、および排泄に関与する遺伝子から構成される制御ネットワークを介して達成される。環境および遺伝子因子の結果としてのコレステロールレベルの不均衡は、アテローム性動脈硬化症（すなわち、動脈の柔毛状付着物（ｆｕｒｒｉｎｇ）の硬化）ならびに随伴する冠動脈および脳血管疾患の主な危険因子である、高コレステロール血症をもたらす。高コレステロール血症及びそれに随伴する心臓血管疾患は、現在我々が直面している最大の世界規模の経済的、社会的、および医学的課題の１つに相当する。
【００１３】
コレステロール系を阻害するスタチンのような、血中コレステロールを制御するための治療薬の幅広い使用にもかかわらず、合衆国の人口の５０％より多くがボーダーラインレベル（すなわち、＞２ｇ／Ｌ）のコレステロールレベルをもつと推定されるという事実が、依然として存在する。加えて、コレステロールレベルを制御するための治療薬に関連して、ミオパシー、肝障害、および潜在的な薬物間相互作用などの副作用が報告されてきた。それ故、コレステロールレベルを制御するための、特により良好な安全性プロフィールを備えたものについての、さらなる療法の開発が是認される。
【００１４】
中国特許文献（特許文献１）は、血中脂肪を減少させる減量食品用のロドスピリルムの調製物、および前記調製物を製造するための方法を開示する。
【００１５】
中国特許文献（特許文献２）は、ヒトの消化管の治療において使用するための液体ロドスピリルム調製物、および前記調製物を得るための方法を開示する。
【００１６】
日本国特許文献（特許文献３）は、糖尿病、心不全の治療に用いられる飲物または食物における使用のための、ロドスピリルム培地およびロドスピリルム乾燥細胞を開示する。
【００１７】
しかしながら、これらの文献はいずれも、細胞を詳細な抽出プロトコールに供して得られた特定の細胞部分および／または特定の細胞画分が、主張された薬剤活性の原因であろうという情報は何ら提供していない。
【００１８】
特許（特許文献４）は、薬物としての使用のため、食品サプリメントに使用するため、食料品に使用するための、ロドスピリルムの膜画分の調製を開示しており、これにおいて前記使用は、血漿コレステロールを低下させるためである。さらに特許文献４は、かかるロドスピリルムの膜画分を提供するための方法を開示しており、前記方法は：ロドスピリルム細胞を多細胞培養物へ培養すること；前記細胞を超音波処理すること；遠心分離により膜性物質を細胞質物質から分離すること；先の工程において回収されたペレットをさらに洗浄すること、および遠心分離すること、の工程を含む。
【００１９】
しかしながら、特に食品産業における使用のための、および好ましくは人間栄養を目的とした、コレステロールを低下する調製物が依然として必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】中国特許第１２７４５８４号明細書
【特許文献２】中国特許第１１７２６５３号明細書
【特許文献３】特開平０８−２０５８１９号公報
【特許文献４】欧州特許第１５６９６６７号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明の一態様は、６０℃と８０℃の間の沸点を有する石油エーテルと、塩化ナトリウムを含むメタノールとの混合物を用いて、ロドスピリルム・ルブルム細胞を抽出することによる、ロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物に関する。
【００２２】
本発明の一態様は、６０℃と８０℃の間の沸点を有する石油エーテルと、塩化ナトリウムを含むメタノールとの混合物を用いて、ロドスピリルム・ルブルム細胞を抽出することによって得られるロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物であって、これにおいて該抽出物が、細胞を混合物と混合しながら、８℃と３７℃の間において、１０分間と４８時間の間にわたり抽出することによって得られ、かつこれにおいてロドスピリルム・ルブルム細胞が、６０℃と８０℃の間の沸点を有する石油エーテルと、塩化ナトリウムを含むメタノールとの、１０：１と１：１０の間の体積比の混合物を用いて抽出される、該抽出物である。
【００２３】
好ましい本発明のロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物は、これにおいて抽出が、細胞を混合物と混合しながら、１５℃と２５℃の間の温度において、１時間と３時間の間にわたり抽出することによって得られ、かつこれにおいてロドスピリルム・ルブルム細胞が、６０℃と８０℃の間の沸点を有する石油エーテルと、塩化ナトリウムを含むメタノールとの、１：１の体積比の混合物を用いて抽出される、該抽出物である。
【００２４】
本発明の一態様は、薬物として使用するための、本発明のロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物に関する。
【００２５】
本発明の一態様は、患者の血漿中のＬＤＬ−コレステロールを低下させることに使用するための、本発明のロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物に関する。
【００２６】
本発明の一態様は、患者の血漿中のＬＤＬ−コレステロールを低下させるための方法に使用するための、本発明のロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物に関する。
【００２７】
本発明の一態様は、心臓血管疾患、アテローム性動脈硬化症、脂質異常症、動脈硬化症、高コレステロール血症、家族性高コレステロール血症、高脂血症、少なくとも７０ｍｇ／ｄＬのＬＤＬ血漿レベル、少なくとも２００ｍｇ／ｄＬの総コレステロールレベル、少なくとも１４ｍｇ／ｄＬのＬｐ（ａ）レベル、炎症、炎症性疾患、虚血、感染症のいずれかの治療に使用するための、本発明のロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物に関する。
【００２８】
本発明の一態様は、本発明のロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物含む、ＬＤＬ−コレステロール低下特性をもつ食品サプリメントに関する。
【００２９】
本発明の一態様は、本発明の食品サプリメントを含む、食料品に関する。
【００３０】
本発明の一態様は、ロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物の製造のための方法に関し、前記方法は：
ａ）  ロドスピリルム・ルブルム細胞を提供すること、および６０℃と８０℃の間の沸点を有する石油エーテルと、約０．０３重量％の塩化ナトリウムを含むメタノールとの、約１：１の体積比の二相混合物を提供すること；
ｂ）  工程ａ）の細胞を工程ａ）の混合物と、１８℃と２４℃の間において、約１時間と３時間の間、好ましくは約２時間にわたり混合すること；および
ｃ）  ロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物を、約０．０３重量％の塩化ナトリウムを含有するメタノールから分離し、それによりロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物を提供すること、
を含む。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】血漿コレステロール低下効果を、インビボの動物モデルにおいて、ＬＤＬ−コレステロールについて示す図である。動物は、対照食餌またはロドスピリルム・ルブルム抽出物を強化した食餌を給餌された。
【図２】ロドスピリルム・ルブルム抽出物のＭａｌｄｉ  ＴＯＦ分析を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
ロドスピリルムは、ロドスピリルム目およびアルファ−プロテオバクテリア綱の紅色非硫黄細菌科である、ロドスピリラセアエ（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌａｃｅａｅ）科における属である。ロドスピリラセアエは、他の特徴の中でも、光栄養性であること、およびエネルギー源として光を使用して、好気的にも嫌気的にも増殖することによって特徴づけられる。その目的のため、該細菌はクロロフィルｂを含有する。ロドスピリルム属の中では、いくつかの種が区別されており、例えば、ロドスピリルム・ルブルム、ロドスピリルム・センテヌム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｃｅｎｔｅｎｕｍ）、ロドスピリルム・フォトメトリクム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｕｍ）、ロドスピリルム・オリザエ（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｏｒｙｚａｅ）、ロドスピリルム・スルフレキシゲンス（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｕｌｆｕｒｅｘｉｇｅｎｓ）、ロドスピリルム・サレキシゲンズ（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓａｌｅｘｉｇｅｎｓ）、ロドスピリルム・サリナルム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓａｌｉｎａｒｕｍ）、ロドスピリルム・ソドメンス（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｏｄｏｍｅｎｓｅ）、およびロドスピリルム・テヌエ（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｔｅｎｕｅ）である。
【００３３】
ロドスピリルム・ルブルムは、とりわけ、天然水中、泥中、および下水処理場において見出される。該細菌は、下水浄化において、動物用飼料のバイオマス生産のため（例えば、家禽および魚用の餌として）、および肥料として使用される。光栄養細菌のバイオマスは、そのビタミンおよびアミノ酸含量が高いことから、動物用飼料のための優れた原料と考えられている。
【００３４】
動物用飼料としてのロドスピリルム・ルブルムの使用は、しばらくの間実施されてきた。Ｒ．ルブルム細胞が、血漿中および／または血清（血液）中のコレステロールレベルを低下させることにより心臓血管疾患の防止に有意に貢献し得ることが見出されている。
【００３５】
コレステロール低下特性は、本明細書では、組成物、例えば細胞抽出物、医薬組成物、調製物、食品サプリメント、または食料品が、動物患者、例えばヒト患者などの患者の身体へ投与されたとき、前記患者の血液のコレステロールまたはＬＤＬ−コレステロールレベルを低下させるその能力として定義される。血中コレステロールのレベルを測定するための方法は、当業者には周知である。
【００３６】
本発明の第１の態様は、６０℃と８０℃の間の沸点を有する石油エーテルと、塩化ナトリウムを含むメタノールとの混合物を用いて、ロドスピリルム・ルブルム細胞を抽出することによる、ロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物に関する。
【００３７】
本発明のさらなる態様は、６０℃と８０℃の間の沸点を有する石油エーテルと、塩化ナトリウムを含むメタノールとの混合物を用いてロドスピリルム・ルブルム細胞を抽出することによって得られたロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物であって、これにおいて該抽出物が、細胞を混合物と混合しながら、８℃と３７℃の間において、１０分間と４８時間の間にわたり抽出することによって得られ、かつこれにおいてロドスピリルム・ルブルム細胞が、６０℃と８０℃の間の沸点を有する石油エーテルと、塩化ナトリウムを含むメタノールとの、１０：１と１：１０の間の体積比の混合物を用いて抽出される、該抽出物に関する。
【００３８】
本明細書全体を通して、用語「６０℃と８０℃の間の沸点を有する石油エーテル」は、その通常の科学的な意味を有するものであり、本明細書では、脂肪族炭化水素からなり、かつ６０℃と８０℃の間の範囲で沸騰する石油留分を指す。
【００３９】
ロドスピリルムｓｐｐ．（１つ以上の種）の調製物とは、本明細書では、何らかの方法で加工された、ロドスピリルムｓｐｐ．の一量の細胞物質として定義される。ロドスピリルムｓｐｐ．の調製物は、本発明によれば、コレステロール低下特性を有する石油エーテル抽出物であって、例えば、ロドスピリルム・ルブルム細胞を、６０℃と８０℃の間の沸点を有する石油エーテルと、塩化ナトリウムを含むメタノールとの混合物を用いて本発明に従って抽出することによる、ロドスピリルム・ルブルム細胞の石油エーテル抽出物である。
【００４０】
本発明の調製物は、ロドスピリルム属の１つの種に由来する石油エーテル抽出物からなるか、または本発明の調製物は、例えば、ロドスピリルム・ルブルム、ロドスピリルム・センテヌム、ロドスピリルム・フォトメトリクム、ロドスピリルム・オリザエ、ロドスピリルム・スルフレキシゲンス、ロドスピリルム・サレキシゲンズ、ロドスピリルム・サリナルム、ロドスピリルム・ソドメンス、およびロドスピリルム・テヌエから選択される、異なるロドスピリルムｓｐｐ．の混合物に由来する石油エーテル抽出物からなる。
【００４１】
ファエオスピリルム（Ｐｈａｅｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属は、ロドスピリラセアエ科の別のメンバーであり、この属には、ファエオスピリルム・フルブム（Ｐｈａｅｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｆｕｌｖｕｍ）、ファエオスピリルム・カンドラモハニ（Ｐｈａｅｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｃｈａｎｄｒａｍｏｈａｎｉｉ）、ファエオスピリルム・オリザエ（Ｐｈａｅｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｏｒｙｚａｅ）、ファエオスピリルム・チラキ（Ｐｈａｅｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｔｉｌａｋｉｉ）、およびファエオスピリルム・モリスキアヌム（Ｐｈａｅｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｍｏｌｉｓｃｈｉａｎｕｍ）が含まれる。それ故、代替えとして、本発明の調製物は、ファエオスピリルム属からの１つの種に由来する石油エーテル抽出物から構成されるか、または本発明の調製物は、ファエオスピリルム・フルブム、ファエオスピリルム・カンドラモハニ、ファエオスピリルム・オリザエ、ファエオスピリルム・チラキ、およびファエオスピリルム・モリスキアヌムから選択される、異なるファエオスピリルムｓｐｐ．の混合物に由来する石油エーテル抽出物から構成される。
【００４２】
当然ながら、本発明のさらなる代替え調製物は、ファエオスピリルム属からの少なくとも１つの種と、ロドスピリルム属からの少なくとも１つの種とに由来する、石油エーテル抽出物から構成される。
【００４３】
好ましくは、ロドスピリルムｓｐｐ．および／またはファエオスピリルムｓｐｐ．の調製物は、ロドスピリルム・ルブルムおよび／またはファエオスピリルム・モリスキアヌムの、さらになお好ましくは、ロドスピリルム・ルブルム種のＡＴＣＣ  １１１７０株（株ＤＳＭ４６７）またはＡＴＣＣ  ２５９０３株、および／またはファエオスピリルム・モリスキアヌムＤＳＭ  １２０株（ＡＴＣＣ、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ））；ＤＳＭＺ（ドイツ微生物細胞培養コレクション（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ））の、石油エーテル抽出物を含む。
【００４４】
本発明のロドスピリルムｓｐｐ．および／またはファエオスピリルムｓｐｐ．の調製物は、２０−１００％（ｗ／ｗ）、好ましくは４０−１００％（ｗ／ｗ）、より好ましくは６０−１００％（ｗ／ｗ）、および最適には８０−１００％（ｗ／ｗ）の、ロドスピリルムｓｐｐ．からのおよび／またはファエオスピリルムｓｐｐ．からの細胞物質を含有し得るが、前記細胞物質は、本発明による細胞の石油エーテル抽出物である。加えて調製物は、選択された調製物が製造されるべき方法に依存して、別の成分を含有し得る。例えば、調製物はさらに水を、或いは凍結乾燥された調製物の場合には、例えばグリセロールもしくはスクロース、または双方を含有し得る。
【００４５】
好ましい実施形態においては、本発明の石油エーテル抽出物を含むロドスピリルムｓｐｐ．および／またはファエオスピリルムｓｐｐ．の凍結乾燥された調製物は、充填物質、例えば微結晶セルロース（ＭＣＣ）またはマンニトールと、バインダー、例えばヒドロキシプロピル−セルロース（ＨＰＣ）、および／または潤滑剤、例えばステアリン酸および／または他の賦形剤とともに混合され、そして乾燥粉末としてペレット化されるか、または異なる方法で適用するために調製される。
【００４６】
本発明のロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物は、細胞を、６０℃と８０℃の間の沸点を有する石油エーテルと、塩化ナトリウムを含むメタノールとの混合物と混合しながら、１５℃と２５℃の間、好ましくは約１８℃と２４℃の間、より好ましくはほぼ室温において、１時間と３時間の間、好ましくは約２時間にわたり抽出することによって得られる石油エーテル抽出物である。
【００４７】
好ましいのは、本発明のロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物において、抽出物が、細胞を混合物と混合しながら、１０℃と３０℃の間、好ましくは１２℃と２７℃の間、より好ましくは１５℃と２５℃の間の温度において、２０分間と２４時間の間、好ましくは３０分間と１６時間の間、より好ましくは４５分間と８時間の間、最も好ましくは１時間と３時間の間にわたり抽出することによって得られる、該ロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物である。
【００４８】
本発明の一実施形態においては、本発明のロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物は、細胞を、６０℃と８０℃の間の沸点を有する石油エーテルと、塩化ナトリウムを含むメタノールとの混合物と混合しながら、室温で約２時間にわたり抽出することによるものである。
【００４９】
用語「室温」は、本明細書で使用される場合、その通常の意味を有しており、かつ本明細書では、２０℃と２２℃の間の温度を指す。
【００５０】
本発明のロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物は、好ましくは、ロドスピリルム・ルブルム細胞を、６０℃と８０℃の間の沸点を有する石油エーテルと、塩化ナトリウムを含むメタノールとの混合物とインキュベートした後の、１８℃と２４℃の間、好ましくは約２０℃と２２℃の間、より好ましくは室温における、約１０分間と６０分間の間、好ましくは約２０分間にわたる、前記混合物の遠心分離によるものである。
【００５１】
好ましいのは、本発明のロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物において、ロドスピリルム・ルブルム細胞が、６０℃と８０℃の間の沸点を有する石油エーテルと、塩化ナトリウムを含むメタノールとの、８：１と１：８の間、好ましくは５：１と１：５の間、より好ましくは２：１と１：２の間、最も好ましくは１：１の体積比の、６０℃と８０℃の間の沸点を有する石油エーテルと、塩化ナトリウムを含むメタノールとの混合物を用いて抽出される、該ロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物である。
【００５２】
したがって、本発明のロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物は、好ましくは、６０℃と８０℃の間の沸点を有する石油エーテルと、塩化ナトリウムを含むメタノールとの、約１：１の体積比、好ましくは１：１の体積比の混合物を用いて、ロドスピリルム・ルブルム細胞を抽出することによるものである。
【００５３】
特に好ましいのは、本発明のロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物において、抽出物が、細胞を混合物と混合しながら、１５℃と２５℃の間の温度において、１時間と３時間の間にわたり抽出することによって得られ、かつこれにおいてロドスピリルム・ルブルム細胞が、６０℃と８０℃の間の沸点を有する石油エーテルと、塩化ナトリウムを含むメタノールとの、１：１の体積比の混合物で抽出される、該ロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物である。
【００５４】
本発明のロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物は、好ましくは、ロドスピリルム・ルブルム細胞を、６０℃と８０℃の間の沸点を有する石油エーテルと、約０．０２重量％と０．０４重量％の間の塩化ナトリウムを含み、好ましくは約０．０３重量の塩化ナトリウムを含むメタノールとの混合物を用いて抽出することによって得られる。
【００５５】
本発明のロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物は、好ましくは、１つ以上のカロテノイドおよび／または１つ以上のキノンを含む。好ましくは、本発明のロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物は、１つ以上のカロテノイドおよび１つ以上のキノンを含む。
【００５６】
本発明のロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物は、好ましくは、カロテノイド類であるロドビブリン、１−ヒドロキシ−スピリロキサンチン、３，４−ジデヒドロロドピン、クロロキサンチン、バクテリオフェオフィチンａ、ロドピン、スピリロキサンチン、３，４−ジヒドロスピリロキサンチン、およびバクテリオフェオフィチンａのフィチル誘導体から選択される１つ以上のカロテノイド、および／または、キノン類であるユビキノール−１０、ユビキノン−９、ユビキノン−１０、およびロドキノン−１０から選択される１つ以上のキノンを含む。
【００５７】
本発明のロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物は、好ましくはロドビブリン、１−ヒドロキシ−スピリロキサンチン、３，４−ジデヒドロロドピン、クロロキサンチン、バクテリオフェオフィチンａ、ロドピン、スピリロキサンチン、３，４−ジヒドロスピリロキサンチン、およびバクテリオフェオフィチンａのフィチル誘導体、ユビキノール−１０、ユビキノン−９、ユビキノン−１０、およびロドキノン−１０を含む。
【００５８】
理論に束縛されることを望むものではないが、パーソンおよびラドニー（Ｐａｒｓｏｎ＆Ｒｕｄｎｅｙ）は、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカルケミストリー（（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１９６５年４月、第２４０巻、第４号）において、ロドスピリルム・ルブルムにおけるｐ−ヒドロキシベンゾエートおよびｎ−ヒドロキシベンズアルデヒドからの、ユビキノンおよびロドキノンの生合成を報告している。これらの筆者により、増殖中のＲ．ルブルムが、ユビキノンを誘導体ロドキノンへ異化することを示すデータが提示されている。
【００５９】
好ましくは、本発明のロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物は、本発明によれば、例えば、ＩｏｎＴｒａｐ（イオントラップ）ｎａｎｏＥＳＩ−ＭＳ高分解能トリプル飛行時間型質量分析器（Ｂｒｕｋｅｒ（ブルカー））を用いて得られるナノエレクトロンスプレーイオン化−質量分析（ｎａｎｏＥＳＩ−ＭＳ）スペクトルにおいて、７５２．７および／または７６９．３のｍ／ｚ値を有するピークを生じる少なくとも２１００Ｄａの分子量をもつ化合物を含んでおり、７５２．７および／または７６９．３のｍ／ｚ値を有する前記１つのピークまたは前記２つのピークは、６６５．８および８８３．６のｍ／ｚ値を有するｎａｎｏＥＳＩ−ＭＳスペクトルにおけるさらなるピークの少なくとも１つ、好ましくは双方の、少なくとも２倍の強度、好ましくは約５倍の強度であるｎａｎｏＥＳＩ−ＭＳスペクトルにおける強度を有する。
【００６０】
本発明によれば、好ましくは、本発明のロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物は、例えば、ＩｏｎＴｒａｐ  ｎａｎｏＥＳＩ−ＭＳ高分解能トリプル飛行時間型質量分析器（Ｂｒｕｋｅｒ）を用いて得られたｎａｎｏＥＳＩ−ＭＳスペクトルにおいて、７５２．７および７６９．３のｍ／ｚ値を有するピークを生じる少なくとも２１００Ｄａの分子量をもつ化合物を含んでおり、７５２．７および７６９．３のｍ／ｚ値を有する前記ピークは、６６５．８および８８３．６のｍ／ｚ値を有するｎａｎｏＥＳＩ−ＭＳスペクトルにおけるさらなるピークの少なくとも２倍の強度、好ましくは約５倍の強度である、ｎａｎｏＥＳＩ−ＭＳスペクトルにおける強度を有する。
【００６１】
本発明によれば、好ましくは、本発明のロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物を用いたｎａｎｏＥＳＩ−ＭＳ分析および測定は、アセトニトリル中の１％ｖ／ｖギ酸中に希釈された前記石油エーテル抽出物を用いて実施される。
【００６２】
本発明によれば、好ましくは、本発明のロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ）質量分析（ＭＳ）スペクトルにおいて、５００．３、８８２．５、および８９８．５のｍ／ｚ値を有する１つ以上のピーク、好ましくは３つのピークを生じる化合物を含んでおり、それぞれ５００．３、８８２．５、および８９８．５のｍ／ｚ値を有する前記１つ以上のピークは、約１：１：２、好ましくは約１：１：３、より好ましくは約１：１：４の割合で、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳ質量スペクトルにおける強度を有する。
【００６３】
本発明によれば、好ましくは、本発明のロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物は、少なくとも３つのピークを生じる化合物を含み、前記ピークは、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳスペクトルにおいて、それぞれ５００．３、８８２．５、および８９８．５のｍ／ｚ値を有しており、それぞれ５００．３、８８２．５、および８９８．５のｍ／ｚ値を有する前記３つのピークは、約１：１：２、好ましくは約１：１：３、より好ましくは約１：１：４の割合で、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳ質量スペクトルにおける強度を有する。
【００６４】
上述のＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳ質量スペクトルは、例えば、５０Ｈｚの出力周波数を用いて３５５ｎｍで操作する、Ｎｄ：ＹＡＧレーザーを具備したＱｔｏｆプルミエ（Ｐｒｅｍｉｅｒ）質量分析計（ウォーターズ）を用いて得られ、これにおいて飛行時間型質量分析は、約１０．０００の分解能においてリフレクションモードで実施される。次いで、本発明の石油エーテル抽出は、好ましくは（ＤＣＴＢ）トランス−２−［３−（４−ｔｅｒｔブチルフェニル）−２−メチルプロプ−２−エニリデン］マロノニトリルマトリックスを使用して分析される。
【００６５】
本発明によれば、好ましくは、本発明のロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物を用いた上述のＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳ分析および測定は、テトラヒドロフラン中に溶解された前記石油エーテル抽出物を用いて実施される。
【００６６】
本発明によれば、好ましくは、本発明のロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物は、少なくとも２つのピークを生じる化合物を含み、前記少なくとも２つのピークは、例えばトリプル飛行時間型質量分析器（ＡＢＳＣＩＥＸ）を用いて得られるｎａｎｏＥＳＩ−ＭＳスペクトルにおいて、それぞれ６５１．６および６４７．６のｍ／ｚ値を有しており、それぞれ６５１．６および６４７．６のｍ／ｚ値を有する前記２つのピークは、約１：１、好ましくは約５：４、より好ましくは約２：１の割合で、ｎａｎｏＥＳＩ−ＭＳスペクトルにおける強度を有する。
【００６７】
本発明によれば、好ましくは、本発明のロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物は、少なくとも２つのピークを生じる化合物を含み、前記少なくとも２つのピークは、例えばトリプル飛行時間型質量分析器（ＡＢＳＣＩＥＸ）を用いて得られるｎａｎｏＥＳＩ−ＭＳスペクトルにおいて、それぞれ８８１．５および９２７．５のｍ／ｚ値を有しており、それぞれ８８１．５および９２７．５のｍ／ｚ値を有する前記２つのピークは、約１：１、好ましくは約３：２、より好ましくは約２：１の割合で、ｎａｎｏＥＳＩ−ＭＳスペクトルにおける強度を有する。
【００６８】
本発明によれば、好ましくは、ＡＢＳＣＩＥＸを使用した本発明のロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物の上述のｎａｎｏＥＳＩ−ＭＳ分析および測定は、９９％ｖ／ｖアセトニトリルおよび１％ｖ／ｖギ酸からなる溶液中に溶解された、前記石油エーテル抽出物を用いて実施される。
【００６９】
本発明のさらなる態様は、薬物として使用するための、本発明のロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物に関する。
【００７０】
本発明の一態様は、患者の血漿中のＬＤＬ−コレステロールを低下させることに使用するための、本発明のロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物に関する。
【００７１】
本発明の一態様は、患者の血漿中のＬＤＬ−コレステロールを低下させるための方法において使用するための、本発明のロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物に関する。同様に、本発明の一態様は、患者の血漿中の高いＬＤＬ−コレステロールを治療するための薬物の製造のための、本発明のロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物の使用に関する。さらに、本発明の一態様は、患者の血漿中のＬＤＬ−コレステロールを低下させるための薬物の製造のための、本発明のロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物の使用に関する。
【００７２】
本発明の一態様は、心臓血管疾患、アテローム性動脈硬化症、脂質異常症、動脈硬化症、高コレステロール血症、家族性高コレステロール血症、高脂血症、少なくとも７０ｍｇ／ｄＬのＬＤＬ血漿レベル、少なくとも２００ｍｇ／ｄＬの総コレステロールレベル、少なくとも１４ｍｇ／ｄＬのＬｐ（ａ）レベル、炎症、炎症性疾患、虚血、感染症のいずれかの治療における使用のための、本発明のロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物に関する。
【００７３】
本発明の一態様においては、心臓血管疾患、アテローム性動脈硬化症、脂質異常症、動脈硬化症、高コレステロール血症、家族性高コレステロール血症、高脂血症、少なくとも７０ｍｇ／ｄＬのＬＤＬ血漿レベル、少なくとも２００ｍｇ／ｄＬの総コレステロールレベル、少なくとも１４ｍｇ／ｄＬのＬｐ（ａ）レベル、炎症、炎症性疾患、虚血、感染症のいずれかの治療における本発明のロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物の使用は、前記上述の疾患のいずれかまたは健康問題について苦しんでいるかまたは増大している患者の血漿において、ＬＤＬ−コレステロールを低下させるためである。
【００７４】
ロドスピリルムｓｐｐ．の上述の調製物および／またはファエオスピリルムｓｐｐ．の上述の調製物は、血漿コレステロールレベルを、好ましくはヒトの血漿において、低下させるための薬物としてまたは医薬調製物としての使用に、非常に適した石油エーテル抽出物である。
【００７５】
好ましくは、本発明のロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物は、本発明の薬物として使用するためのものであり、これにおいて前記使用は、患者の血漿中のＬＤＬ−コレステロールを低下させることにある。
【００７６】
本発明の一実施形態においては、ロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物は、患者の血漿中のＬＤＬ−コレステロールを低下させるために使用され、これにおいて該患者は、心臓血管疾患、アテローム性動脈硬化症、脂質異常症、動脈硬化症、高コレステロール血症、家族性高コレステロール血症、高脂血症、少なくとも７０ｍｇ／ｄＬのＬＤＬ血漿レベル、少なくとも２００ｍｇ／ｄＬの総コレステロールレベル、少なくとも１４ｍｇ／ｄＬのＬｐ（ａ）レベル、炎症、炎症性疾患、虚血、感染症のいずれか１つ以上に苦しんでいるかまたはリスクが増大している。
【００７７】
本発明のロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物が患者の血漿中のＬＤＬ−コレステロールを低下させることに使用するためである場合、本発明のロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物は、好ましくは血漿中のＬＤＬ−コレステロールレベルを低下させ、これに対し総コレステロールのレベルは基本的に変わらず、および／または、これに対しＨＤＬ−コレステロールのレベルは基本的に変わらない。
【００７８】
驚いたことに、本発明者らは、血漿コレステロールレベルを低下させるための薬物として、または医薬調製物として使用するための、本発明のロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物が、血漿中のＬＤＬ−コレステロールを少なくとも４０％、例えば約４６％低下させる一方で、同時に、総コレステロールのレベルおよびＨＤＬ−コレステロールのレベルの双方は基本的に変わらないことを見出した。
【００７９】
本発明によれば、好ましくは、血漿コレステロールレベルを低下させるための薬物としてまたは医薬調製物としての使用のための、本発明のロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物は、血漿中のＬＤＬ−コレステロールを少なくとも２０％、好ましくは約４０から８０％、より好ましくは約５０％低下させる一方で、同時に、総コレステロールのレベルおよびＨＤＬ−コレステロールのレベルの双方は基本的に変わらない。
【００８０】
本発明に従って患者の血漿中のＬＤＬ−コレステロールを低下させるために使用するための、本発明のロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物は、好ましくは経口的に投与される。
【００８１】
本発明による、ロドスピリルム・ルブルムｓｐｐ．および／またはファエオスピリルムｓｐｐ．の石油エーテル抽出物を含む調製物の、様々な実施形態が等しく可能である。例えば、本発明の調製物は、水溶液中に懸濁されるか、分散されるか、または乳化された固体成分を含有し、本発明の組成物を提供する、本発明の液体調製物として供給され得る。かかる本発明の組成物は、本発明のロドスピリルム・ルブルムｓｐｐ．および／またはファエオスピリルムｓｐｐ．の石油エーテル抽出物を含む調製物として、直接使用されてもよく、或いは別の実施形態では、食品サプリメントへ加工されてもよい。
【００８２】
本発明によれば、本発明の一態様は、ロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物を含む、ＬＤＬ−コレステロール低下特性をもつ食品サプリメントに関する。
【００８３】
本発明においては、食品サプリメントは、通常の食餌に加えて消費され、かつ通常の食餌では生じないか、または少量もしくは不充分な量で生じる成分であって、これらの成分の充分なもしくは増大された消費が所望される、該成分を含有する製剤として定義される。好ましくは、本発明の食品サプリメントは、ヒトの消費に適するように構成される。その結果、本発明において定義されるような食品サプリメントは、好ましくは、テクスチャー、味、および匂いをもつべきであるが、また栄養価ももつべきであり、このことは該サプリメントをヒトの消費に適するようする。
【００８４】
本発明によれば、本発明の複数の実施形態においては、コレステロール低下特性をもつ食品サプリメントは、ロドスピリルムｓｐｐ．および／またはファエオスピリルムｓｐｐ．の調製物を含んでおり、前記調製物は、ロドスピリルムｓｐｐ．および／またはファエオスピリルムｓｐｐ．の石油エーテル抽出物を含む。
【００８５】
本発明の食品サプリメントは、好ましくは、０．１％と９９．９％（ｗ／ｗ）の間の、ロドスピリルムｓｐｐ．の石油エーテル抽出物を含むロドスピリルムｓｐｐ．の調製物を含有する。好ましくは、食品サプリメントは、１０％と９０％（ｗ／ｗ）の間、より好ましくは３０％と７５％（ｗ／ｗ）の間の、本発明のロドスピリルムｓｐｐ．および／またはファエオスピリルムｓｐｐ．の調製物を含有する。
【００８６】
ロドスピリルムｓｐｐ．および／またはファエオスピリルムｓｐｐ．の石油エーテル抽出物を含むロドスピリルムｓｐｐ．および／またはファエオスピリルムｓｐｐ．の調製物を含む食品サプリメントを、消費に適するようにするため、好ましくは、例えばテクスチャー、味、または匂いを改善するための成分が、本発明に従って添加される。
【００８７】
その結果、本発明の食品サプリメントは、好ましくは、（追加の）タンパク質、炭水化物、および脂肪の供給源、ならびにビタミン、ミネラル、電解質、微量元素、および他の適当な成分を含んでいるため、食品サプリメント自体が滋養物としての使用に適している。
【００８８】
タンパク質の供給源としては、栄養製剤における使用に適した１つ１つのタンパク質、およびそれらの混合物が、好ましくは本発明の食品サプリメントにおいて使用される。このタイプのタンパク質は、例えば、乳清タンパク質、乳清タンパク質濃縮物、乳清粉末、卵タンパク質、卵アルブミン、カゼイン、または乳アルブミンなどの動物性タンパク質、および大豆タンパク質、大豆粕、または豆乳由来のタンパク質などの植物性タンパク質を包含する。使用されるべきタンパク質の供給源を選ぶためには、タンパク質の生物価が重要な基準を構成し得る。例えば、カルシウムカゼイネートを含むカゼイン塩は、また乳清、乳アルブミン、卵アルブミン、および全卵タンパク質も、これらが高い割合の必須アミノ酸を含有することから、非常に高い生物価をもつタンパク質である。
【００８９】
本発明の食品サプリメントにおいて使用されるべき適当な炭水化物は、例えば、好ましくはモノ−およびジサッカライドなどの単純な短鎖炭水化物であるが、しかしまたポリサッカライドまたは双方の組合せでもある。好ましくは、炭水化物は、本発明によれば、その適切な感覚刺激性の特性の故に選択される。好ましくは、複合炭水化物は、本発明に従って、食物繊維として適宜使用される。
【００９０】
本発明の食品サプリメントは、好ましくは、いくつかの実施形態において、単純および複合炭水化物の双方の組合せを含有する。本発明の食品サプリメントは、好ましくは、いくつかの実施形態において、全ての食用油および食用脂から選択される脂肪を含有する。
【００９１】
ビタミンおよびミネラルは、好ましくは、管理衛生当局（ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｈｅａｌｔｈ  ａｕｔｈｏｒｉｔｉｅｓ）の規則に従って、本発明の調製物へ添加され、かつ好ましくは、上記当局によって承認された全てのビタミンおよびミネラル、例えば、ビタミンＡ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ１２、Ｃ、Ｄ、Ｂ、およびＫ、ならびに葉酸、ナイアシン、パントテン酸、およびビオチンを包含する。ミネラルとしては、例えば、鉄、亜鉛、ヨウ素、カルシウム、マグネシウム、クロム、およびセレンが、好ましくは本発明の調製物へ添加される。
【００９２】
電解質、例えばナトリウム、カリウム、および塩化物などのイオン、ならびに微量元素および他の添加剤もまた、好ましくは本発明の食品サプリメントの一部を形成する。かかる成分は、存在する場合には、好ましくは推奨される濃度において使用される。加えて、本発明の食品サプリメントは、好ましくは、そのテクスチャーを改善する成分、着色料および香味料、芳香物質、香辛料、充填剤、乳化剤、安定化化合物、保存料、酸化防止剤、繊維、および他の補助剤、例えばアミノ酸、コリン、レシチン、脂肪酸などを含有する。かかる成分の選択は、配合、デザイン、および嗜好に依存する。添加されるかかる成分の量は、当業者には公知であるが、添加されるべき量の選択は、好ましくは、小児および成人のために推奨される一日量（ＲＤＡ）を考慮することによって導かれる。
【００９３】
乳化剤は、好ましくは、本発明の最終生産物を安定化させるために添加される。本発明によれば、許容される乳化剤の例は、レシチン（例えば、大豆由来または卵由来）、および／またはモノ−およびジ−グリセリドである。本発明によれば、安定化剤としては、例えばキャロブ、グアー、またはカラギーナンが、好ましくは使用される。
【００９４】
保存料は、好ましくは、本発明の製品の貯蔵寿命を延ばすために添加される。
【００９５】
好ましくは、ソルビン酸ナトリウム、ソルビン酸カリウム、安息香酸カリウム、安息香酸ナトリウム、またはＥＤＴＡカルシウム二ナトリウムなどの保存料が、本発明の調製物において使用される。
【００９６】
上述の炭水化物に加えて、天然または合成の甘味料、例えばサッカライド、チクロ、アスパルテーム、アセスルファムカリウム、および／またはソルビトールが、好ましくは、本発明に従って食品サプリメントへ添加される。
【００９７】
消費されるべき本発明の食品サプリメントの量は、サイズで異なり、助言される用量に記載の用量に必ずしも制限される必要はない。用語「食品サプリメント」は、特定の重量、または特定の用量の食品サプリメントに制限されることを意味しない。
【００９８】
本発明の食品サプリメントの組成物は、本発明によれば、原則的に、ヒトまたは動物の消費に適した任意の形態をとる。
【００９９】
本発明の好ましい実施形態においては、食品サプリメントは、コーヒー、紅茶、ブロス、および果汁などの水溶液中に、懸濁、分散、または乳化されるのに適した乾燥粉末である。この目的のため、粉末は好ましくは、本発明のディスペンサーにおいて供給される。
【０１００】
本発明の別の好ましい実施形態においては、食品サプリメントは、乾燥粉末から出発して、錠剤として製剤される。このため、本発明の食品サプリメントの組成物は、微結晶セルロース（ＭＣＣ）およびマンニトールなどの充填剤、ヒドロキシプロピル−セルロース（ＨＰＣ）、ステアリン酸などの潤滑剤、および他の賦形剤とともに適宜供給される。
【０１０１】
本発明の食品サプリメントは、一実施形態において、好ましくは、固体成分がその中に懸濁、分散、または乳化されている、液体として供給される。本発明のかかる組成物は、好ましくは、食料品へ直接混合されるか、または好ましくは、例えば顆粒もしくは他の形態へ押出しおよび成形される。
【０１０２】
本発明の別の一実施形態においては、食品サプリメントは、好ましくは固体形態、例えばバー、ビスケット、またはロールに製剤される。
【０１０３】
本発明の食品サプリメントは、好ましくは、許容される担体と組合せてカプセル、錠剤、水混和性粉末、または投与に適した別の形態で、経口消費用に製剤される。これに代えて、本発明の食品サプリメントは、好ましくは、本発明の食料品に加工される。
【０１０４】
本発明の一態様は、本発明の食品サプリメントを含む食料品に関する。
【０１０５】
本発明の別の一態様は、本発明の調製物、食品サプリメント、または食料品を、製造するための方法に関する。
【０１０６】
本発明のさらなる一態様は、本発明のロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物の製造のための方法であって、前記方法が：
ａ）  ロドスピリルム・ルブルム細胞を提供すること、および６０℃と８０℃の間の沸点を有する石油エーテルと、約０．０３重量％の塩化ナトリウムを含むメタノールとの、１：１の体積比の二相混合物を提供すること；
ｂ）  工程ａ）の細胞を工程ａ）の混合物と、１８℃と２４℃の間において、好ましくは約２０℃と２２℃の間において、より好ましくは室温において、約１時間と３時間の間、好ましくは約２時間にわたり混合すること；および
ｃ）  ロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物を、約０．０３重量％の塩化ナトリウムを含有するメタノールから分離し、それによりロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物を提供すること、
を含む、該方法に関する。
【０１０７】
本発明の調製物の製造のための方法は、好ましくは、１つ以上のロドスピリルムｓｐｐ．のおよび／またはファエオスピリルムｓｐｐ．の細胞を培養して、前記培養物中の細胞を収穫するため、および前記培養物の細胞を調製物に加工するために、必要な工程を含む。
【０１０８】
かかる方法の詳細は、とりわけ、以下に述べられる実施例において記載される。当業者は、種々の変法が使用可能であることを理解するであろう。
【０１０９】
ロドスピリルムｓｐｐ．のおよび／またはファエオスピリルムｓｐｐ．の細胞の培養中は、嫌気的および光栄養的条件が適用される。炭素源としては、種々の有機栄養物が好ましくは使用される。ロドスピリルムｓｐｐ．のおよび／またはファエオスピリルムｓｐｐ．の細胞に非常に適した培地および増殖条件は、例えば、「セガーズおよびヴェルストラエテ（Ｓｅｇｅｒｓ  ａｎｄ  Ｖｅｒｓｔｒａｅｔｅ）培地」（セガーズおよびヴェルストラエテ、１９８３年）であり、炭素源として乳酸（約２．７グラム／Ｌ）を、約６．８−６．９のｐＨにおいて、かつ２５−３７℃の温度において、好ましくは関与する微生物の特定の要件に合わせて、例えば細長い蛍光灯（光強度３００μＭ  ｑｕａｎｔａ．ｍ−２．ｓ−１）からの一定の光強度において、嫌気的に使用する。ロドスピリルムｓｐｐ．を培養するため、および／またはファエオスピリルムｓｐｐ．を培養するために適した別の培地は、例えば、「改変ロドスピリラセアエ（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌａｃｅａｅ）培地」（ＤＭＳＺ培地、＃２７、ＤＭＳＺ  ＧｍｂＨ、独国、ブラウンシュヴァイク（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ））、またはセンス（Ｃｅｎｓ）培地（ＤＭＳＺ培地＃７４８）である。細胞は、細胞の湿重量に基づき、０．０１ｍｇ／ｍＬと５０ｍｇ／ｍＬの間、好ましくは１ｍｇ／ｍＬと５ｍｇ／ｍＬの間の密度まで培養されるのに適している。
【０１１０】
細胞は、水道水中に３．１ｍｌ／Ｌの６０％ＤＬ−ラクテート溶液、３ｇ／Ｌの細菌用ペプトン、および３ｇ／Ｌの酵母エキスを含有する培地を有する１リットルフラスコ内で、３０℃において嫌気的に等しく増殖され、培地のｐＨは６．８であり、かつ４０Ｗの３つのタングステンランプを使用して、５０μＭｑｕａｎｔａ．ｍ−２．ｓ−１の平均光子照射強度で照射される。３日間の増殖の後、６６０ｎｍにおける光学密度は、３．５（１．２ｇ／ｋｇ乾燥重量）に達した。
【０１１１】
ひとたび細胞が適当な細胞密度に達すれば、それらは増殖培地からの分離、または例えば遠心分離もしくは濾過による収穫を用いて、本発明の調製物へ加工される。
【０１１２】
濃縮された細胞塊は次に、さらなる加工の後、本発明の調製物として使用される。
【０１１３】
本発明のロドスピリルムｓｐｐ．のおよび／またはファエオスピリルムｓｐｐ．の石油エーテル抽出物を含む使用可能な調製物を得るための、ロドスピリルムｓｐｐ．のおよび／またはファエオスピリルムｓｐｐ．の細胞物質の加工におけるさらなる工程は、例えば、洗浄工程を含み、また抽出による細胞のさらなる加工、および任意で凍結乾燥も含む。
【０１１４】
ミンニキン、オドンネルら（Ｍｉｎｎｉｋｉｎ、Ｏ‘Ｄｏｎｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ）は、細菌イソプレノイドキノンおよび極性脂質の抽出のための、統合された手順を記載した（ジャーナル・オブ・マイクロバイオロジカル・メソヅ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）２、１９８４年、ｐ．２３３−２４１）。細菌細胞からのイソプレノイドキノンおよび極性脂質の連続抽出のための手順は、これらの筆者により概説されている。石油エーテル（ｂ．ｐ．６０−８０℃）とメタノール性食塩水との二相混合物を用いた抽出は、イソプレノイドキノンを含有する上相を生じる。この方法の例として、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、マイコバクテリウム・アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ）、シュードモナス・ジミヌタ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａ）、およびストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）のイソプレノイドキノンが、抽出および分析された。
【０１１５】
本発明の一態様は、本発明の方法により得られるロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物に関する。
【０１１６】
本発明の食品サプリメントは、腸のコレステロール吸収を減少させ、したがって血漿のコレステロールレベルを低下させるべく、適宜使用し得る。
【０１１７】
本発明の別の実施形態では、本発明の食品サプリメントは、コレステロール低下特性をもつ食料品において適用される。
【０１１８】
本発明のコレステロール低下特性の食料品を調製する方法は、本発明の食品サプリメントを取り込んでいる食料品の製造を含む。かかる方法は、好ましくは、まず食料品が通常の方法で調製される工程を含み、それに続き、ロドスピリルムｓｐｐ．のおよび／またはファエオスピリルムｓｐｐ．の調製物が、調製された食料品に添加される。また、ロドスピリルムｓｐｐ．のおよび／またはファエオスピリルムｓｐｐ．の調製物を、食料品へ、その製造中に添加することも可能である。
【０１１９】
本発明のコレステロール低下特性をもつ食料品は、典型的には０．１％と２０％（ｗ／ｗ）の間、好ましくは１％と１０％（ｗ／ｗ）の間の、本発明のおよび上記記載の食品サプリメントを含有する。
【０１２０】
最後に、本発明は、血漿コレステロールレベルを低下させ、好ましくは血漿中のＬＤＬ−コレステロールを低下させる一方、血漿中の総コレステロールレベルは基本的に変わらないまま、および／または血漿中のＨＤＬ−コレステロールレベルは基本的に変わらないままにするための薬物において使用されるべき、ロドスピリルムｓｐｐ．のおよび／またはファエオスピリルムｓｐｐ．の石油エーテル抽出物を含む、ロドスピリルムｓｐｐ．のおよび／またはファエオスピリルムｓｐｐ．の調製物を含む。好ましくは、ロドスピリルムｓｐｐ．のおよび／またはファエオスピリルムｓｐｐ．の石油エーテル抽出物を含む、本発明のかかる調製物は、ロドスピリルム・ルブルム種および／またはファエオスピリルム・モリスキアヌム種を含む。
【０１２１】
本発明はさらに以下の実施例によって例証されるが、それらは何ら本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１２２】
実験手順
ロドスピリルム・ルブルム株Ｓ１Ｈを、１０％ｗ／ｗスクロースおよび０．８５％ｗ／ｗ生理食塩水中で、液体窒素中に保存した。株を再増殖させるため、細胞を液体窒素から取出し、室温で３０分間融解させた。細胞を、シストロム（ｓｉｓｔｒｏｍ）スクシネート寒天プレートおよび富栄養ルリア−ベルターニ（Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ）（ＬＢ）培地上に画線して、コロニー形成単位を成長させた。寒天プレートを、暗中および嫌気的条件において、３０℃で４日間インキュベートした。
【０１２３】
４日後、１０個のシングルコロニーをピックアップして、２ｍＬのシストロム（Ｓｉｓｔｒｏｍ）スクシネート液体培地を入れた１０本のチューブに移し、暗中で嫌気的に、かつ１５０ｒｐｍで軌道振盪しながら３０℃でインキュベートした。４−５日後、細胞は増殖し、ＯＤ６８０＝０．５−０．６に達した。培養物の純粋培養性（ａｘｅｎｉｃｉｔｙ）をチェックするため、細胞をシストロムスクシネート寒天プレートおよび富栄養ＬＢ培地寒天プレート上に画線し、１週間インキュベートして従属栄養性の汚染菌を探した。純粋培養性が承認された場合、２ｍＬの培養物を１５ｍＬのシストロムスクシネート液体培地へ移し、暗中で嫌気的に、かつ１５０ｒｐｍで軌道振盪しながら３０℃でインキュベートした。４−５日後、細胞は増殖し、ＯＤ６８０＝０．５−０．６に達した。次に、１５ｍＬの培養物を１００ｍＬのシストロムスクシネート液体培地へ移し、暗中で嫌気的に、かつ１００ｒｐｍで軌道振盪しながら３０℃でインキュベートした。４−５日後、細胞は増殖し、ＯＤ６８０＝０．５−０．６に達した。ひとたび純粋培養性がシストロムスクシネートおよびＬＢ培地上でチェックされれば、これらの細胞を接種源培養物とみなした。
【０１２４】
細胞培養
培養条件
バイオリアクター
光嫌気的条件を、ロドスピリルム・ルブルム株Ｓ１Ｈ細胞の培養に適用した。１０個の純粋培養性の接種源培養物を、５０００＊ｇで１０分間の遠心分離によりペレット化した。上清を捨て、そしてペレットを、アセテートを炭素源として有する２５ｍＬのメリッサ（Ｍｅｌｉｓｓａ）液体培地中にプールして（セガーズおよびヴェルストラエテ、１９８３年）、濃縮された接種物とした。
【０１２５】
バイオリアクターは、オートクレーブ内で１２１℃および１．２ｂａｒにおいて２０分間水蒸気暴露する、湿式加熱滅菌により滅菌した。滅菌後、リアクターを閉じた。メリッサ培地を入れたボトル、１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を入れたボトル、および排水用のボトルを、クリーンベンチ（ＬＡＦ）内で無菌的に連結した。
【０１２６】
抽出プロトコール
ロドスピリルム・ルブルム株Ｓ１Ｈ細胞の３０ｇの細菌ペレットを、石油エーテル（ｂ．ｐ．６０−８０℃）とメタノール性食塩水との二相混合物４４０ｍｌを用いて、室温で２時間混合する（二相混合物：２０ｍｌの０．３重量％のＮａＣｌと２００ｍｌのメタノールとを含有する２２０ｍｌ＋石油エーテル（ｂ．ｐ．６０−８０℃）２２０ｍｌ）。室温で２０分間の５０００ＲＰＭでの遠心分離の後、上相（石油エーテル相）を取出し、室温で保存した。下相（メタノール性食塩水）は、任意で、２２０ｍｌの追加の石油エーテルを用いた室温で２時間の第２の抽出に供された。第２の上相を、第１のものと混合し、ロータリーエバポレーターシステムを使用して乾燥させた。結果として得られた粘性の液体を「画分（ＦＲＡＣＴＩＯＮ）Ｉ．１」もしくは「ｆＩ．１」、または図１では「抽出物（Ｅｘｔｒａｃｔ）Ｉ．１」と命名した。
【０１２７】
ロドスピリルム・ルブルム株Ｓ１Ｈ細胞の別の抽出物を得るため、２６０ｍｌのＣＨＣｌ３／ＣＨ３ＯＨ／ＮａＣｌ  ０．３％（９：１０：３）溶液を、上述の下相（メタノール性食塩水）に添加し、次に室温で４時間にわたり攪拌下にインキュベートした。濾過により不溶性の細菌物質を除去した後、上清を、１４５ｍｌのＣＨＣｌ３および１４５ｍｌの０．３％ＮａＣｌと混合し、次いで室温で攪拌下に１時間インキュベートした。最後に、得られた有機相（下相）を取出し、ロータリーエバポレーターを使用して乾燥させ、そして「画分（ＦＲＡＣＴＩＯＮ）Ｉ．２」もしくは「ｆＩ．２」、または図１では「抽出物（Ｅｘｔｒａｃｔ）Ｉ．２」と命名した。
【０１２８】
第３の抽出物、「抽出物（Ｅｘｔｒａｃｔ）ＩＩＩ」、または「画分（ＦＲＡＣＴＩＯＮ）ＩＩＩ」、または「ｆＩＩＩ」は、以下のようにして得られた。ロドスピリルム・ルブルム株Ｓ１Ｈ細胞の膜を、３０ｇの細菌ペレットから分離し、これを５ｍＭ  リン酸塩緩衝液、ｐＨ７．０中で洗浄した。洗浄された細菌ペレットを、超音波処理（３０秒間を３回、４℃で振幅量１００）、１回の凍結−融解サイクル、および２回のフレンチプレスサイクル（サーモ（Ｔｈｅｒｍｏ）、ハイ・プレッシャー・セル（Ｈｉｇｈ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｃｅｌｌ）、１５００ｐｓｉ）のサイクルにより破壊した。細菌ホモジェネートを５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、細胞破片を除去し、この第１の遠心分離工程からの上清を、第２の遠心分離工程において１５，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、膜をペレット化した。抽出物ＩＩＩは、第２の遠心分離工程後の上清である。
【０１２９】
質量分析のための材料および方法
ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ
マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ）質量スペクトルは、５０Ｈｚの出力周波数を用いて３５５ｎｍで操作する、Ｎｄ：ＹＡＧレーザーを具備したＱＴｏＦプルミエ質量分析計を用いて記録した。飛行時間型質量分析は、約１０．０００の分解能においてリフレクションモードで実施した。ｆＩ．１およびｆＩ．２の試料を、（ＤＣＴＢ）トランス−２−［３−（４−ｔｅｒｔブチルフェニル）−２−メチルプロプ−２−エニリデン］マロノニトリルを使用して分析した。このマトリックスは、ＣＨＣｌ３中の４０ｍｇ／ｍＬの溶液として調製された。マトリックス溶液（１ｍｇ／ｍＬ）をステンレス鋼標的に塗布して風乾した。試料をＴＨＦ中に溶解し、この溶液の１マイクロリットルのアリコートを、既にマトリックス結晶を担持している標的領域上に塗布し、そして風乾した。一段階ＭＳスペクトルの記録のためには、四重極（ｒｆのみのモード）を２００から２５００Ｔｈまでのイオンを通過させるべく設定し、全てのイオンを、飛行時間型分析器のプッシャー（電極）領域内へ移し、そこで１秒間のインテグレーション時間を用いて質量分析した。
【０１３０】
ＱｔＯＦ（５６００ＡＢＳＣＩＥＸ）−ｎａｎｏＥＳＩ−ＭＳ
ｆＩ．１およびｆＩ．２の試料を、アセトニトリル中の０．１％ギ酸中に希釈し、室温で１３，０００ＲＰＭにおいて５分間遠心分離し、上清を、ｎａｎｏ−ｅｓｉソースを用いる質量分析計（流速：８９マイクロリットル／時間）に直接注入した。取得パラメータは：イオンソースガス１：４；カーテンガス１５；イオンスプレーボルテージフローティング２．３００；ヒーター温度１５０℃；極性：正；ＴｏＦ質量範囲：１００−２．０００であった。
【０１３１】
イオントラップ（ＨＣＴウルトラブルカー（Ｕｌｔｒａ  Ｂｒｕｃｋｅｒ））−ｎａｎｏＥＳＩ−ＭＳ
ｆＩ．１およびｆＩ．２の試料を、アセトニトリル中の０．１％ギ酸中に希釈し、室温で１３，０００ＲＰＭにおいて５分間遠心分離し、上清を、ｎａｎｏ−ｅｓｉソースを用いる質量分析計（流速：８９マイクロリットル／時間）に直接注入した。取得パラメータは：キャピラリー１．９００ボルト；ドライガス：６ｌ／分；乾燥温度：２５０℃；極性：正；スキャンモード：スタンダード−エンリッチド；スキャン範囲：１００−２．０００；スマートターゲット２０．０００；最大蓄積時間：２００ｍｓであった。
【０１３２】
結果
ｆＩ．１およびｆＩ．２のＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ分析は、ｆＩ．１およびｆＩ．２が多数の化合物を含んでいることを示した。図２には、画分Ｉ．１および画分Ｉ．２のＭＡＬＤＩ  ＴｏＦ分析の結果が示されている。１０μｌの各画分をマトリックスの存在下で乾燥させた。
【０１３３】
Ｍａｌｄｉ−ＴｏＦデータを用いて、カロテノイドおよびキノンがｆＩ．１において観察された（分子イオンをＭ＋Ｈ＋値として括弧内に示す）：ロドビブリン（５８５．５）、１−ヒドロキシ−スピリロキサンチン（５８３．５）、３，４−ジデヒドロロドピン（５８７．５）、クロロキサンチン（５５７．５）、バクテリオフェオフィチンａ（ＢＰｈａ；８８３．５）、ロドプシン（５５５．４）、スピリロキサンチン（５９７．４）、３，４−ジヒドロスピリロキサンチン（５９９．５）、およびバクテリオフェオフィチンａのフィチル誘導体（ＢＰｈａ（ｐｈｙｔｙｌ）；８８９．５）、ユビキノール−１０（８６５．７）、ユビキノン−９（７９５．６）、ユビキノン−１０（８４８．７）、およびロドキノン−１０（８６３．７）。ｎａｎｏＥＳＩ  Ｑ−ＴｏＦ分析を適用した場合、同じカロテノイドおよびキノンがｆＩ．１抽出物において同定された。
【０１３４】
ｆＩ．１抽出物を用いたＭａｌｄｉ−ＴｏＦデータ分析は、とりわけ、以下のｍ／ｚ値においてピークを示した（括弧はおよその相対強度）：５００．３（１）；８８２．５（１）；８９８．５（４）。
【０１３５】
ｆＩ．２抽出物を用いたＭａｌｄｉ−ＴｏＦデータ分析は、とりわけ、以下のｍ／ｚ値においてピークを示した（括弧はおよその相対強度）：５００．３（０）；８８２．５（３）；８９８．５（１）。
【０１３６】
Ｑ−ｔＯＦ（５６００  ＡＢＳＣＩＥＸ）−ｎａｎｏＥＳＩ−ＭＳを用いたｆＩ．１抽出物の分析は、ｆＩ．１中に存在する上記に列記されたカロテノイドおよびキノンの存在を裏付けた。ＮａｎｏＥＳＩ  ＭＳスペクトルは、画分Ｉ．１および画分Ｉ．２について、アセトニトリル９９％、１％ＨＣＯＯＣを有機溶媒として用いるトリプルｔｏｆ質量分析計（ＡＢＳＣＩＥＸ）によって得られる。
【０１３７】
ｆＩ．１についてのＱ−ｔＯＦ（５６００  ＡＢＳＣＩＥＸ）−ｎａｎｏＥＳＩ−ＭＳスペクトルでは、とりわけ、以下のｍ／ｚ値においてピークが示された（括弧はおよその相対強度）：６４７．６（２．５）；６５１．６（３．３）；８８１．５（２）；９２７．５（１）。
【０１３８】
ｆＩ．２についてのＱ−ｔＯＦ（５６００  ＡＢＳＣＩＥＸ）−ｎａｎｏＥＳＩ−ＭＳスペクトルでは、とりわけ、以下のｍ／ｚ値においてピークが示された（括弧はおよその相対強度）：６４７．６（２−３）；６５１．６（１６）；８８１．５（５）；９２７．５（１）。
【０１３９】
ｆＩ．１についてのイオントラップ（ＨＣＴ  Ｕｌｔｒａ  Ｂｒｕｃｋｅｒ）−ｎａｎｏＥＳＩ−ＭＳスペクトルでは、とりわけ、相対的に高い強度をもつピークが以下のｍ／ｚ値において示された：６５２．３；６８６．４；６９０．６；７５２．７；７６９．３；８８１．９；８９７．８；９１３；８；９２７．７。ｎａｎｏＥＳＩ  ＭＳスペクトルは、画分Ｉ．１および画分Ｉ．２について、ＩｏｎＴｒａｐ質量分析計（Ｂｒｕｋｅｒ）により、アセトニトリルの１％ＨＣＯＯＣを用いて得られる。
【０１４０】
ロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物ｆＩ．１は、ＩｏｎＴｒａｐ  ｎａｎｏＥＳＩ−ＭＳ高分解能トリプル飛行時間型質量分析器（Ｂｒｕｋｅｒ）を用いて得られるｎａｎｏＥＳＩ−ＭＳスペクトルにおいて、７５２．７および７６９．３のｍ／ｚ値を有するピークを生じる少なくとも２１００Ｄａの分子量をもつ化合物を含んでいたが、７５２．７および７６９．３のｍ／ｚ値を有する前記ピークは、ｎａｎｏＥＳＩ−ＭＳスペクトルにおいて６６５．８および８８３．６のｍ／ｚ値を有する２つのさらなるピークの約５倍の強度である、ｎａｎｏＥＳＩ−ＭＳスペクトルにおける強度を有する。
【０１４１】
ｆＩ．２のＩｏｎＴｒａｐ（ＨＣＴ  Ｕｌｔｒａ  Ｂｒｕｃｋｅｒ）−ｎａｎｏＥＳＩ−ＭＳスペクトルにおいて、とりわけ、相対的に高い強度をもつピークが以下のｍ／ｚ値：６６５．８；８８３．６；８９９．８；９１５．６おいて示された。
【０１４２】
ロドスピリルム・ルブルムの石油エーテル抽出物ｆＩ．２は、ＩｏｎＴｒａｐ  ｎａｎｏＥＳＩ−ＭＳ高分解能トリプル飛行時間型質量分析器（Ｂｒｕｋｅｒ）を用いて得られるｎａｎｏＥＳＩ−ＭＳスペクトルにおいて、６６５．８および８８３．６のｍ／ｚ値を有するピークを生ずる化合物を含んでいたが、６６５．８および８８３．６のｍ／ｚ値を有する前記ピークは、ｎａｎｏＥＳＩ−ＭＳスペクトルにおいて７５２．７および７６９．３のｍ／ｚ値を有する２つのさらなるピークの少なくとも５倍の強度である、ｎａｎｏＥＳＩ−ＭＳスペクトルにおける強度を有する。
【０１４３】
マウス試験−血漿コレステロールレベルに対するｆＩ．１、ｆＩ．２、およびｆＩＩＩの効果
血漿コレステロールレベルに対するｆＩ．１またはｆＩ．２またはｆＩＩＩを含む食餌の影響を調べるためのマウス試験は、４０匹のＣ５７ＢＬ／６雄マウスの２週間の環境順化の後、ＳＣＫ／ＣＥＮ動物シェルター（ａｎｉｍａｌａｒｉｕｍ）（ベルギー国）において実施した。餌およびマウスの最初の秤量後、それらを個別換気ケージに配置した。餌消費を毎日チェックし、ヒドロゲルを２日ごとに秤量した。予め実施された予備的嗜好性試験に基づき、細菌抽出物をヒマワリ油中に溶解し、かつ５％スクロースを固形飼料（カフェタリアダイエット（Ｃａｆｅｔａｒｉａ−ｄｉｅｔ））へ添加して、高い嗜好性を確保した。
【０１４４】
最初の週は、第１群のマウスは、カフェタリアダイエット＋Ｒ．ルブルム抽出物ｆＩ．１またはｆＩ．２またはｆＩＩＩに代わるヒマワリ油を自由に与えられ、一方第２群のマウスは、カフェタリアダイエット＋Ｒ．ルビルム抽出物ｆＩ．１またはｆＩ．２またはｆＩＩＩに代わる対照食を自由に与えられた。
【０１４５】
第２週は、対照群は同じ餌を継続し、一方３つの実験群は、カフェタリアダイエット＋ヒマワリ油中の１０％のｆＩ．１抽出物またはｆＩ．２抽出物またはｆＩＩＩ抽出物のいずれかを与えられた。したがって、第１グループのマウスはロドスピリルム・ルブルムのｆＩ．１石油エーテル抽出物を含む食餌を給餌され、第２グループのマウスはロドスピリルム・ルブルムのｆＩ．２石油エーテル抽出物を含む食餌を給餌され、第３グループのマウスはロドスピリルム・ルブルムのｆＩＩＩ石油エーテル抽出物を含む食餌を給餌され、対照グループである第４のグループのマウスは、ロドスピリルム・ルブルムの抽出物を何ら含まない食餌を給餌された。
【０１４６】
対照の食餌、またはｆＩ．１もしくはｆＩ．２もしくはｆＩＩＩのいずれかを含む食餌の、血漿中のコレステロールレベルに対する効果は、以下に詳述される。
【０１４７】
マウス試験の終了
２週間の試験の後、マウスを秤量し、ペントバルビタールの腹腔内注射を用いて、解剖に先立ち安楽死させた。全血をＥＤＴＡチューブに取出し、遠心分離して血漿を得、さらなる分析のため４℃に置いた。
【０１４８】
マウス体重
１週間後と２週間後で、グループ間に何ら差異は検出されなかった。
【０１４９】
血液分析
総コレステロール、ＨＤＬ、およびＬＤＬ画分
図１は、コレステロール−、ＨＤＬ−、およびＬＤＬ分析の結果を示す。
【０１５０】
抽出物Ｉ．１（画分Ｉ．１、ｆＩ．１）は、血漿ＬＤＬ−コレステロールを、対照グループに比較して４０％より多く、すなわち約４６％減少させた（ｐ＜０．００１）のに対し、総コレステロールは基本的に変わらないままであったことから、血漿ＬＤＬ−コレステロールに対する有意な効果をもつ。図１を参照のこと。さらにまた、ｆＩ．１画分を給餌されたマウスグループでは、ＨＤＬ−コレステロールレベルは、試験期間の後に基本的に不変のままであった。血漿中の総コレステロールは、それぞれ、対照グループの４，４６μｇ／μｌに比較して、ｆＩ．１グループのマウスでは４，３９μｇ／μｌであり、ＨＤＬ−コレステロールは、ｆＩ．１グループで２，９３μｇ／μｌであり、かつ対照グループで２，７２μｇ／μｌであり、そしてＬＤＬ−コレステロールは、ｆＩ．１グループで０，３６μｇ／μｌであり（ｐ＜０．００１）、かつ対照グループで０，６７μｇ／μｌであった。
【０１５１】
抽出物Ｉ．２（画分Ｉ．１、ｆＩ．２）は、しかしながら、総コレステロール、ＨＤＬ−コレステロール、およびＬＤＬ−コレステロールレベルに関しては、いずれのコレステロールレベルにも何ら影響を及ぼさなかった。図１を参照のこと。血漿中の総コレステロールは、それぞれ、対照グループの４，４６μｇ／μｌに比較して、ｆＩ．２グループのマウスでは４，４５μｇ／μｌであり、ＨＤＬ−コレステロールは、ｆＩ．２グループで３，００μｇ／μｌであり、かつ対照グループで２，７２μｇ／μｌであり、そしてＬＤＬ−コレステロールは、ｆＩ．２グループで０，６０μｇ／μｌであり（ｐ＜０．００１）、かつ対照グループで０，６７μｇ／μｌであった。
【０１５２】
抽出物ＩＩＩ（画分ＩＩＩ、ｆＩＩＩ）は、抽出物Ｉ．１に類似していたが、総コレステロール、ＨＤＬ−コレステロール、およびＬＤＬ−コレステロールレベルに関しては、コレステロールレベルに何ら影響を及ぼさなかった。すなわち、血漿中の総コレステロールは、それぞれ、ｆＩＩＩグループのマウスでは対照グループに比較して、４，４６μｇ／μｌのまま変わらず、ＨＤＬ−コレステロールは、ｆＩＩＩグループで２，９３μｇ／μｌであり、かつ対照グループで２，７２μｇ／μｌであり、そしてＬＤＬ−コレステロールは、ｆＩＩＩグループで０，６０μｇ／μｌであり、かつ対照グループで０，６７μｇ／μｌであった。
【０１５３】
Ｒ．ルブルムＳ１Ｈ抽出物ｆＩ．１およびｆＩ．２およびｆＩＩＩを用いたこのマウス試験から、石油エーテル抽出物ｆＩ．１が、該抽出物が経口的に投与された場合、ＬＤＬ−コレステロールレベルを大いに低下させる一方、ＨＤＬ−コレステロールレベルは基本的に変わらずに保つことにおいて有益効果をもつことが明らかである。Ｒ．ルブルムＳ１Ｈ抽出物ｆＩ．２または抽出物ｆＩＩＩを用いたマウス試験は、これらの抽出物が経口的に投与された場合、これらの抽出物中の化合物が、総コレステロール、ＨＤＬ−コレステロール、およびＬＤＬ−コレステロールレベルに何ら有意に影響しないことを示した。
【０１５４】
参考文献
Ｄ．Ｅ．Ｍｉｎｎｉｋｉｎ、Ａ．Ｇ．Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ、Ｍ．Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ、Ｇ．Ａｌｄｅｒｓｏｎ、Ｍ．Ａｔｈａｌｙｅ、Ａ．Ｓｃｈａａｌ、およびＪ．Ｈ．Ｐａｒｌｅｔｔ、「Ａｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄ  ｑｕｉｎｏｎｅｓ  ａｎｄ  ｐｏｌａｒ  ｌｉｐｉｄｓ（細菌イソプレノイドキノンおよび極性脂質の抽出のための統合された手順）」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２、エルゼビア、１９８４年、ｐ．２３３−２４１。
Ｓｅｇｅｒｓ，Ｌ．およびＶｅｒｓｔｒａｅｔｅ，Ｗ、「Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｏｒｇａｎｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｔｏ  Ｈ２  ｂｙ  Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌａｃｅａｅ  ｇｒｏｗｎ  ｗｉｔｈ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｏｒ  ｄｉｎｉｔｒｏｇｅｎ  ａｓ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｓｏｕｒｃｅ（窒素源としてグルタメートまたは二窒素を用いて増殖されたロドスピリラセアエによる有機酸のＨ２への変換」，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、１９８３年、第２５巻、Ｐ．２８４３−２８５３。
Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｗ．ＰａｒｓｏｎおよびＨａｒｒｙ  Ｒｕｄｎｅｙ、「Ｔｈｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ  ａｎｄ  Ｒｈｏｄｏｑｕｉｎｏｎｅ  ｆｒｏｍ  ｐ−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅ  ａｎｄ  ｎ−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚａｌｄｅｈｙｄｅ  ｉｎ  Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍ（ロドスピリルム・ルブルムにおけるｐ−ヒドロキシベンゾエートおよびｎ−ヒドロキシベンズアルデヒドからの、ユビキノンおよびロドキノンの生合成）」、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９６５年４月、第２４０巻、第４号、Ｐ．１８５５−１８６３。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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