(57)【要約】  本発明は、高分子電解質多層フィルムによってマルチウェルプレートの少なくとも１つのウェルの底面をコーティングするためのロボット方法、その方法によって得ることができるマルチウェルプレート、及び細胞培養のためのその使用に関する。
2020503012.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マルチウェルプレートの少なくとも１つのウェルの底面を高分子電解質多層フィルムによってコーティングする方法であって、ｎ回の連続するシーケンスを含み、ｎは１から２０００までの整数であり、各シーケンスは、
ａ）  アミノ基を含むカチオン性ポリマー、又はアニオン性ポリマーのいずれかである、第１の高分子電解質ＰＥ１の溶液の体積ＶＰＥ１を、マルチウェルプレートの少なくとも１つのウェルの底面上にロボット堆積させる工程、次いで、
ｂ）  前記ＰＥ１の溶液の、ＶＰＥ１以上である吸引体積ＶａｓｐＰＥ１を、ロボット吸引する工程、次いで
ｃ）  ＰＥ１がアニオン性ポリマーである場合はアミノ基を含むカチオン性ポリマーであり又はＰＥ１がアミノ基を含むカチオン性ポリマーである場合はアニオン性ポリマーである第２の高分子電解質ＰＥ２の溶液の体積ＶＰＥ２を、前記底面上にロボット堆積させる工程、次いで、
ｄ）  前記ＰＥ２の溶液の、ＶＰＥ２以上である吸引体積ＶａｓｐＰＥ２を、ロボット吸引する工程、
を含む、方法。
【請求項２】
各シーケンスは、
−  工程ａ）と工程ｂ）との間に、１から３０分までの期間、好ましくは５から１５分までの期間、第１の高分子電解質ＰＥ１の溶液を底面と接触させたままにする、インキュベーションの工程ａ’）、及び
−  工程ｃ）と工程ｄ）との間に、１から３０分までの期間、好ましくは５から１５分までの期間、第２の高分子電解質ＰＥ２の溶液を底面と接触させたままにする、インキュベーションの工程ｃ’）、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
各シーケンスは、
−  工程ｂ）と工程ｃ）との間に、
ｂ２）  すすぎ溶液の体積ＶｒｉｎｓｅＰＥ１を前記底面上にロボット堆積させるサブ工程、次いで
ｂ３）  前記すすぎ溶液の、ＶｒｉｎｓｅＰＥ１以上である吸引体積ＶａｓｐｒｉｎｓｅＰＥ１を、ロボット吸引するサブ工程、
を含み、繰返しが可能である、すすぎ工程と、
−  工程ｄ）の後に、
ｄ２）  すすぎ溶液の体積ＶｒｉｎｓｅＰＥ２を前記底面上にロボット堆積させるサブ工程、次いで
ｄ３）  前記すすぎ溶液の、ＶｒｉｎｓｅＰＥ２以上である吸引体積ＶａｓｐｒｉｎｓｅＰＥ２を、ロボット吸引するサブ工程、
を含み、繰返しが可能である、すすぎ工程と
を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
各シーケンスは、
−  工程ｂ２）と工程ｂ３）との間に、０．２から１０分までの期間、好ましくは１から５分までの期間、すすぎ溶液を底面と接触させたままにする、インキュベーションの工程ｂ２’）、及び
−  工程ｄ２）と工程ｄ３）との間に、０．２から１０分までの期間、好ましくは１から５分までの期間、すすぎ溶液を底面と接触させたままにする、インキュベーションの工程ｄ２’）
を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
第１のシーケンスの工程ａ）の前に、前記少なくとも１つのウェルは、第１の高分子電解質ＰＥ１の溶液の体積Ｖｗｅｔで充填され、ｍＬで表される体積Ｖｗｅｔが、
Ｖｗｅｔｍｉｎ＝０．５×π（ｄ／２）２から
Ｖｗｅｔｍａｘ＝（２／３）×π（ｄ／２２）×Ｈ
（式中、
−  ｄは、ｍｍで表したウェルの直径であり、
−  Ｈは、ｍｍで表したウェルの高さである）までである、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
各シーケンスで、ＶａｓｐＰＥ１＝ＶＰＥ１及びＶａｓｐＰＥ２＝ＶＰＥ２である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
第１のシーケンスの工程ａ）の前に、第１のシーケンスの工程ａ）で堆積がその上で行われることになる各ウェルの底面上に、第１の高分子電解質ＰＥ１の溶液の体積Ｖｗｅｔをロボット堆積させる工程ａ０）を含む、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
第１のシーケンスの工程ａ）の前に、
ａ１）  第１の高分子電解質ＰＥ１の溶液の、Ｖｗｅｔよりも多い体積Ｖａ１）を、第１のシーケンスの工程ａ）で堆積がその上で行われることになる各ウェルの底面上にロボット堆積させる工程、次いで、
ａ２）  Ｖａ２）＝Ｖａ１）−Ｖｗｅｔ
である、前記第１の高分子電解質ＰＥ１の溶液の吸引体積Ｖａ２）を、ロボット吸引する工程、
を含む、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項９】
各シーケンスについて、各工程ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、及び存在する場合には各工程ｂ２）、ｂ３）、ｄ２）及びｄ３）で、前記底面は、水平の面に対して５から４０°までの傾き角αで傾いている、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
各シーケンスは、請求項２で規定の工程ａ’）及び工程ｃ’）を含み、及び／又は請求項４で規定の工程ｂ２’）及び工程ｄ２’）を含み、並びに、各シーケンスについて、工程ａ’）及び工程ｃ’）並びに／又は工程ｂ２’）及び工程ｄ２’）では、底面が水平の面内にある、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
各シーケンスでは、吸引体積ＶａｓｐＰＥ１は１．０５ＶＰＥ１から１．２０×ＶＰＥ１までであり、吸引体積ＶａｓｐＰＥ２は１．０５ＶＰＥ２から１．２０×ＶＰＥ２までである、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
アニオン性ポリマーはカルボキシル基を含み、ｎ回のシーケンスの後に、
ｅ）  カップリング剤の存在下で前記アミノ基とカルボキシル基とを反応させて、アミド結合を形成し且つ高分子電解質多層フィルムを架橋する工程、次いで
ｆ）  前記架橋高分子電解質多層フィルムをタンパク質含有溶液、好ましくは増殖因子型タンパク質含有溶液で処理して、前記架橋高分子電解質多層フィルムの上及び内部に前記タンパク質を組み込む工程
を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
工程ｅ）と工程ｆ）との間、又は工程ｆ）の後に、高分子電解質多層フィルムを乾燥する工程ｇ）を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ｎ回のシーケンスの後に、前記底面上に第３の高分子電解質ＰＥ３の溶液の体積ＶＰＥ３をロボット堆積させる工程ｅ’）を含み、
−  高分子電解質ＰＥ３は少なくともペプチドに連結し、
−  第３の高分子電解質ＰＥ３は、ＰＥ２がアニオン性ポリマーである場合はアミノ基を含むカチオン性ポリマーであり、又はＰＥ２がアミノ基を含むカチオン性ポリマーである場合はアニオン性ポリマーである、
請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法によって得ることができるマルチウェルプレート。
【請求項１６】
細胞培養のための、請求項１５に記載のマルチウェルプレートの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高度に再現性があり且つ確実な様式で並びに非常に高度な空間的均一性を備えた状態でフィルムを調製することを可能とする、高分子電解質多層フィルムによってマルチウェルプレートをコーティングするためのロボット方法に関する。
【０００２】
高分子電解質多層（ＰＥＭ）の堆積は、取扱いが非常に容易で用途が広いツールとして浮上してきた。この技法によれば、ポリカチオン及びポリアニオンの交互吸着に基づいて、調節可能な特性を備えたフィルムをビルドアップすることが可能となる：高分子電解質の化学的性質、ｐＨ及びイオン強度、浸漬及びすすぎ時間、フィルムの後処理等のいくつかのパラメータを調整することによって、ほぼ千変万化の構造を入手することが可能である。
【０００３】
静電交互積層（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ｌａｙｅｒ−ｂｙ−ｌａｙｅｒ）（ＬｂＬ）の組立技法は、その多能性、とりわけ広範囲のビルディングブロック及び組立条件、並びに小治療薬及び増殖因子等のタンパク質を局所的に送達する可能性の観点から、生物医学的用途にとっての非常に有力なツールとして近年浮上してきた。広範囲の、テンプレート（形状、サイズ）、表面改質に利用可能な（生物学的又は合成の）層材料、及びＬｂＬ組立技法の印象に残るパネルは全て、この技法の広範な使用に寄与してきた。
【０００４】
出願ＥＰ  １  ５３５  ９５２には、カップリング剤の存在下で、多層フィルムを構成するポリマー中に存在する相補的な官能基であるカルボキシル基とアミノ基との反応を含み、それによってアミド結合が形成される、架橋高分子電解質多層フィルムの調製方法が開示されている。
【０００５】
出願ＷＯ  ２０１０／０８１８８４には表面をコーティングする方法であって、以下の工程：（ａ）少なくとも１層の交互吸着高分子電解質を表面に順次堆積させて、相補的なアミノ反応基とカルボキシル反応基とを提示するコーティング表面を提供する工程であり、ここで、第１の（又は逆に第２の）高分子電解質は前記アミノ基を含むカチオン性ポリマーであり、第２の（又は逆に第１の）高分子電解質は前記カルボキシル基を含むアニオン性ポリマーである、工程、（ｂ）カップリング剤の存在下でコーティング表面の前記相補的な反応基と反応基とを反応させて、前記相補的反応基間にアミド結合を形成して、それによって架橋高分子電解質多層フィルムを生じる工程、並びに（ｃ）前記架橋高分子電解質多層フィルムを、タンパク質含有溶液、好ましくは増殖因子型タンパク質含有溶液で処理して、前記タンパク質を前記高分子電解質多層フィルムの上及び内部に組み込む工程を含む、方法を開示する。したがって、得られたフィルムはタンパク質を含有する。フィルムは９６ウェルプレート中に構築されたが、分注工程及び吸引工程についてはマルチチャンネルピペットが手動で使用された。しかし、この方法はユーザ依存性であり、したがって、再現性がなく、時間を要し且つ人的エラーを受けやすい。
【０００６】
ＬｂＬフィルムの堆積を自動化するために様々な戦略がすでに開発されてきた。一番使われている技法はディップコーティング、スプレー及びスピンコーティングであるが、こういった技法は、大きな基板にむしろ適しており、大量の液体が必要であり、細胞培養プレートには適合し得ない。
【０００７】
最近、Ｊａｋｌｅｎｅｃら（ＡＣＳ  Ａｐｐｌ  Ｍａｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ、２０１６、８（３）：２２５５〜６１頁）は、自動リキッドハンドリング（ｌｉｑｕｉｄ  ｈａｎｄｌｉｎｇ）ロボットを使用して、広いｐＨ範囲にわたる合成ポリマー（ポリアクリル酸／ポリアリルアミン塩酸塩、ＰＡＡ／ＰＡＨ）から、含む層の数を増加させた高分子電解質フィルムを調製した。この目的のため、高分子電解質フィルムを、プロフィロメトリーによって次いで分析するために、並びに使用して細胞の付着及び伸展についてスクリーニングするために、シリコンウェハに付けられた（底無し）シリコン９６ウェルプレート上に構築した。しかし、著者らは、残っているいくつかの技術的問題を特定した：ｉ）フィルムの厚さの放射状の不均一性、特にコーヒーリング効果；ｉｉ）フィルムの特性評価及び分析を自動化する困難性。また、細胞培養プレートおいてインサイチュでの高分子電解質フィルムに関する特性評価もなく、生物活性分子をフィルム中に担持させ得るという証明も、そしてその生物活性分子が生物活性の点で有効であり得るという証明もない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＥＰ  １  ５３５  ９５２
【特許文献２】ＷＯ  ２０１０／０８１８８４
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｊａｋｌｅｎｅｃら（ＡＣＳ  Ａｐｐｌ  Ｍａｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ、２０１６、８（３）：２２５５〜６１頁）
【非特許文献２】Ｐｉｃａｒｔら、Ａｄｖ．  Ｆｕｎｃｔ．  Ｍａｔ  ２００５：１５、８３〜９４頁
【非特許文献３】Ｃｒｏｕｚｉｅｒ  Ｔら、Ｓｍａｌｌ  ２００９、５：５９８〜６０８頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、フィルムの調製を可能にする、マルチウェルプレートにおける自動静電交互積層組立技法を
−  高度に再現性があり且つ確実な様式で、
−  細胞培養を最適化するために、各ウェル内部で及び異なるウェル間で非常に高度な空間的均一性を備えた状態で、
開発することが、依然として必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
この目的のために、本発明は、マルチウェルプレートの少なくとも１つのウェルの底面を高分子電解質多層フィルムによってコーティングする方法であって、ｎ回の連続するシーケンスを含み、ｎは１から２０００までの整数であり、各シーケンスは、
ａ）  アミノ基を含むカチオン性ポリマー、又はアニオン性ポリマーのいずれかである、第１の高分子電解質ＰＥ１の溶液の体積ＶＰＥ１を、マルチウェルプレートの少なくとも１つのウェルの底面上にロボット堆積させる工程、次いで、
ｂ）  前記ＰＥ１の溶液の、ＶＰＥ１以上である吸引体積ＶａｓｐＰＥ１を、ロボット吸引する工程、次いで
ｃ）  ＰＥ１がアニオン性ポリマーである場合はアミノ基を含むカチオン性ポリマーであり又はＰＥ１がアミノ基を含むカチオン性ポリマーである場合はアニオン性ポリマーである第２の高分子電解質ＰＥ２の溶液の体積ＶＰＥ２を、前記底面上にロボット堆積させる工程、次いで、
ｄ）  前記ＰＥ２の溶液の、ＶＰＥ２以上である吸引体積ＶａｓｐＰＥ２を、ロボット吸引する工程、
を含む、方法に関する。
【００１２】
ロボット工程は通常、ロボットとしてピペッティングアームを備えた自動リキッドハンドリングマシン（ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｌｉｑｕｉｄ  ｈａｎｄｌｉｎｇ  ｍａｃｈｉｎｅ）を用いて、例えばＴＥＣＡＮ  Ｆｒｅｅｄｏｍ  ＥＶＯ（登録商標）１００ロボットを用いて行われる。ロボットのアームの端部には、溶液を堆積させ且つ吸引することを可能にするチップが備えられている。リキッドハンドリングアームは、そのそれぞれのリザーバの溶液をピペッティングし、その溶液を選択されたウェルに分注する。吸引された後、溶液は廃棄物に捨てられる。
【００１３】
工程ａ）及び工程ｃ）は分注工程である。工程ａ）では、ロボットは、第１の高分子電解質ＰＥ１の溶液を、前記溶液を含有しているリザーバから吸引し、前記溶液をマルチウェルプレートの少なくとも１つのウェルの底面に搬送する。工程ｃ）では、ロボットは、第２の高分子電解質ＰＥ２の溶液を、前記溶液を含有しているリザーバから吸引し、前記溶液をマルチウェルプレートのウェルの底面に搬送する。好ましくは、工程ａ）及び工程ｃ）を実行するために、ロボットのアームの端部は１ｍＬのピペットチップが備えられている。
【００１４】
工程ｂ）及び工程ｄ）は吸引工程である。工程ｂ）及び工程ｄ）では、ロボットは溶液をウェルから吸引し、それを廃棄物に搬送する。好ましくは、工程ｂ）及び工程ｄ）を実行するために、ロボットのアームの端部は２００μＬのピペットチップが備えられている。このようなより小さなチップによって、吸引工程に関してより良好な精度、したがって、得られたフィルムに関して良好な均一性が可能となる。
【００１５】
典型的なピペッティング速度は、分注の工程ａ）及び工程ｃ）については４００から８００μＬ／秒までであり、吸引の工程ｂ）及び工程ｄ）については３０から１５０μＬ／秒までである。
【００１６】
好ましくは、方法の各シーケンスは、
−  工程ａ）と工程ｂ）との間に、１から３０分までの期間、好ましくは５から１５分までの期間、第１の高分子電解質ＰＥ１の溶液を底面と接触させたままにする、インキュベーションの工程ａ’）、及び
−  工程ｃ）と工程ｄ）との間に、１から３０分までの期間、好ましくは５から１５分までの期間、第２の高分子電解質ＰＥ２の溶液を底面と接触させたままにする、インキュベーションの工程ｃ’）、
を含む。
【００１７】
本方法は、ＰＥの溶液の吸引体積ＶａｓｐＰＥをロボット吸引する工程ｂ）及び工程ｄ）を含み、ここで、吸引体積ＶａｓｐＰＥはＶＰＥ以上であり、ＰＥはＰＥ１（工程ｂ））又はＰＥ２（工程ｄ））のいずれかである。
【００１８】
一実施形態では、ＶａｓｐＰＥ１＝ＶＰＥ１及びＶａｓｐＰＥ２＝ＶＰＥ２である。
【００１９】
別の実施形態では、ＶａｓｐＰＥ１はＶＰＥ１よりも多く、ＶａｓｐＰＥ２はＶＰＥ２よりも多い。典型的には、ＶａｓｐＰＥ１及びＶａｓｐＰＥ２は、それぞれ１．０１×ＶａｓｐＰＥ１及び１．０１×ＶａｓｐＰＥ２よりも多く、とりわけ１．０２×ＶａｓｐＰＥ１及び１．０２×ＶａｓｐＰＥ２よりも多く、例えば１．０５×ＶａｓｐＰＥ１及び１．０５×ＶａｓｐＰＥ２よりも多く、最も好ましくはおよそ１．１０×ＶａｓｐＰＥ２である。全体として、ＶａｓｐＰＥ１及びＶａｓｐＰＥ２はそれぞれ１．５０×ＶａｓｐＰＥ１及び１．５０×ＶａｓｐＰＥ２よりも少ない。
【００２０】
これは、ロボットのアームが、堆積した溶液の体積と比較して更なる吸引体積を吸引することを意味する。実際に、ロボットは堆積した溶液と空気との混合物を吸引する。
【００２１】
本発明は、堆積した溶液の体積以上の体積を吸引すると、高度な空間的均一性を有するフィルムがもたらされる、すなわち、各個々のウェルの内側に堆積したフィルムに関して高度な空間的均一性と共に、異なるウェル間（自動マシンの独立した流れで構築された、単一のプレート内で及び異なるプレートにおいて）でのフィルム堆積に関しても高度な再現性がもたらされるという発見に、基づいている。
【００２２】
複数のチャンネルを装備したロボットアームを使用すると、交互積層法を自動化し、ワークフローを最適化することが可能となる。並行処理は、ＬｂＬフィルムのビルドアップにとって重要ないくつかの利点を提供する：ｉ）  堆積の再現性を確実にする、ｉｉ）  細胞スクリーニングアッセイ向けにスループットを向上させる、ｉｉｉ）  いかなる製造業者であれ、あらゆる種類のロボットアームに適応可能である。
【００２３】
本発明による方法を市販のリキッドハンドリングマシンで実行すれば、バイオテクノロジー及び再生医療向けの生体分子スクリーニング又は細胞スクリーニングにおける用途に鑑みて、良好に制御されたＬｂＬコーティングによって提供される可能性の範囲が間違いなく広がる。
【００２４】
本方法は、マルチウェルプレート、例えば６、１２、２４、４８又は９６のウェルプレートを含む。９６ウェルプレートのフォーマットは、複数の条件を並行でスクリーニングすることができ、ウェルあたりに必要な細胞数が少ないので（通常は５０００細胞／ウェル以下）、細胞スクリーニングアッセイからみて、特に興味深い。
【００２５】
マルチウェルプレートの全てのウェルで、又はそれらの一部のみ（好ましくは少なくとも２つのウェル）で方法を実行することが可能である。
【００２６】
第１のシーケンスの工程ａ）での堆積のために選択されたウェルは、多層フィルムがその上に形成されるマルチウェルプレートのウェルである。全体として、本方法の全ての工程は同じウェル上で行われ、ｍは本方法を実行するのに使用される選択されたウェルの数である。したがって、ｍは、１（方法が１つのウェルのみで実行される実施形態）からマルチウェルプレートのウェルの数（例えば、９６ウェルプレートについては９６）までの整数、好ましくは２からマルチウェルプレートのウェルの数までの整数である。実際、多層フィルムの層対を構築するために、工程ｂ）、工程ｃ）及び工程ｄ）の堆積又は吸引は、第１のシーケンスの工程ａ）で第１の高分子電解質ＰＥ１の溶液がその上で堆積する底面のウェルと同じウェル上で行われる。同様に、全シーケンスの全ての工程には、第１のシーケンスの工程ａ）で選択されたものと同じウェルが関与する。自動ハンドリングロボットのソフトウェアは、ウェルの数ｍ、及び交互積層フィルムを堆積する必要がある特定の位置を規定することを可能にする。
【００２７】
プレートの全てのウェルは、高さＨを有する。ウェルの底は、様々な形態、Ｕ形態、Ｖ形態、又は平面の円形形態を有することができる。ウェルは好ましくは、平面な底、通常は直径ｄを有する円形の底面を有する。
【００２８】
方法の各シーケンスによって、多層フィルムの層対が堆積することが可能となる。方法の最後に得られる多層フィルムは、ｎ個の層対を含む。
【００２９】
方法を通して調製された高分子電解質多層フィルム中の層対の数「ｎ」は、広範囲で変化することができ、所望の厚さ次第である。好ましくは、ｎは、２から２０００までの、特に５から２０００までの、好ましくは５から１０００までの、更に好ましくは５から１００までの整数である。厚い高分子電解質フィルムが望ましい場合、ｎは１５から１０００まで、好ましくは２０から５００まで（特に２０から６０まで）変化することができる。
【００３０】
各層対は、高分子電解質ＰＥ１の層と反対の電荷の高分子電解質ＰＥ２の層とを含む。フィルム構造は正確に設計されており、１から５０  ０００ｎｍまでの、好ましくは１００ｎｍから３０μｍまでの範囲で１ｎｍの精度に制御することができる。フィルムの厚さは一般に、１ｎｍから５０  ０００ｎｍまで、好ましくは５００ｎｍから２０μｍまで、より好ましくは１から１０μｍまで変化することができる。その厚さが３００ｎｍ超である場合、そのフィルムは厚膜とみなされる。
【００３１】
本方法は、第１の高分子電解質ＰＥ１、次いで第２の高分子電解質ＰＥ２を順次堆積させる工程を含み、それらの内の一方はアミノ基を含むカチオン性ポリマーであり、他方はアニオン性ポリマーである。
【００３２】
本発明において、用語「アニオン性ポリマー」とは、負電荷を持ちやすい少なくとも１つの基を含むポリマーを指す。アニオン性ポリマーは、好ましくは、カルボキシル基、リン酸基、硫酸基及び／又はスルホン酸基を含む。カルボキシル基は、酸、酸ハロゲン化物（好ましくは酸塩化物）、酸無水物又はＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル若しくはｎ−パラニトロフェニルエステル等の活性化エステルの形態で存在することができる。アニオン性基は使用のポリマーに共有結合している。
【００３３】
本方法では、任意のアニオン性ポリマーを使用することができ、限定されないが、ポリ（アクリル）酸、ポリ（メタクリル）酸、ポリ（グルタミン）酸、ポリウロン酸（アルギン酸、ガラクツロン酸、グルクロン酸等）、グリコサミノグリカン類（ヒアルロン酸又はその塩（たとえばナトリウム）−ヒアルロナンとも呼ばれる−、デルマタン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸）、ポリ（アスパラギン酸）及びポリスチレンスルホネート（ＰＳＳ）、ポリアミノ−酸類（Ｄ型及び／又はＬ型の）の任意の組合せ、及びそれらの混合物が挙げられる。
【００３４】
用語「カチオン性ポリマー」とは、正電荷を持ちやすい少なくとも１つの基を含むポリマーに関する。
【００３５】
本発明の意味において、アミノ基はヒドロキシルアミン、ヒドラジド及びアミン官能基の形態で存在することができる。アミノ基は使用のポリマーに共有結合している。
【００３６】
本方法では、アミノ基を含む任意のカチオン性ポリマーを使用することができ、限定されないが、ポリ（Ｄ−、Ｌ−リジン）等のポリ（リジン）、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）、ポリ（アリルアミン）、ポリ（エチレン）イミン、キトサン、ポリ（Ｌ−アルギニン）等のポリアルギニン、ポリ（オルニチン）、ポリ（Ｄ、Ｌ−ヒスチジン）等のポリヒスチジン、ポリ（マンノサミン）、ポリアリルアミン塩酸塩（ＰＡＨ）、及びより一般的にはポリアミノ酸類（Ｄ型及び／又はＬ型）の任意の組合せ、並びにそれらの混合物が挙げられる。
【００３７】
好ましくは、アミノ基を含むカチオン性ポリマーは、ポリ（Ｌ−リジン）（又はＰＬＬ）、ポリアリルアミン塩酸塩（ＰＡＨ）若しくはキトサン（ＣＨＩ）であり、及び／又は、アミノ基を含むアニオン性ポリマーは、ヒアルロン酸若しくはヒアルロナンナトリウム（一般にＨＡとも呼ばれる）等のその塩、ヘパリン（ＨＥＰ）、ポリスチレンスルホネート（ＰＳＳ）、ポリ（Ｌ−グルタミン酸）（ＰＧＡ）又はそれらの混合物である。
【００３８】
高分子電解質多層フィルムは、（ＰＬＬ／ＨＡ）フィルム、（ＰＳＳ／ＰＡＨ）フィルム、（ＰＬＬ／ＰＧＡ）フィルム又は（ＣＨＩ／ＰＧＡ）フィルムであることがより好ましい。
【００３９】
上で特定のポリマーの分子量は広い範囲で変化することができる。より好ましくは、分子量は０．５ｋＤａから２０，０００ｋＤａまでの範囲内であり、より一層好ましくは分子量は５から２，０００ｋＤａまでの範囲内である。
【００４０】
全体として、同じ高分子電解質ＰＥ１及び高分子電解質ＰＥ２が全シーケンスについて使用される。
【００４１】
全体として、第１の高分子電解質ＰＥ１の同じ溶液が各シーケンスの全べての工程ａ）に対して使用され、第２の高分子電解質ＰＥ２の同じ溶液が各シーケンスの全べての工程ｃ）に対して使用される。
【００４２】
全体として、ＶＰＥ１は全シーケンスについて同じであり、ＶａｓｐＰＥ１は全シーケンスについて同じであり、ＶＰＥ２は全シーケンスについて同じであり、ＶａｓｐＰＥ２は全シーケンスについて同じである。
【００４３】
全体として、本方法は、各高分子電解質堆積工程の後に少なくともすすぎ工程を含む。したがって、本方法は通常、以下：
−  各シーケンスの工程ｂ）と工程ｃ）との間に、
ｂ２）  すすぎ溶液の体積ＶｒｉｎｓｅＰＥ１を前記底面上にロボット堆積させるサブ工程、次いで
ｂ３）  前記すすぎ溶液の、ＶｒｉｎｓｅＰＥ１以上である吸引体積ＶａｓｐｒｉｎｓｅＰＥ１を、ロボット吸引するサブ工程、
を含み、繰返しが可能である、すすぎ工程と、
−  各シーケンスの工程ｄ）の後に、
ｄ２）  すすぎ溶液の体積ＶｒｉｎｓｅＰＥ２を前記底面上にロボット堆積させるサブ工程、次いで
ｄ３）  前記すすぎ溶液の、ＶｒｉｎｓｅＰＥ２以上である吸引体積ＶａｓｐｒｉｎｓｅＰＥ２を、ロボット吸引するサブ工程、
を含み、繰返しが可能である、すすぎ工程と
を含む。
【００４４】
工程ｂ２）及び工程ｄ２）では、ロボットは、すすぎ溶液を、前記溶液を含有するリザーバから吸引し、前記溶液をマルチウェルプレートのウェルの底面に搬送する。好ましくは、工程ｂ２）及び工程ｄ２）を実行するために、ロボットのアームの端部に１ｍＬのピペットチップが備えられている。
【００４５】
工程ｂ３）及び工程ｄ３）では、ロボットはウェルから溶液を吸引し、それを廃棄物に搬送する。好ましくは、工程ｂ３）及び工程ｄ３）を実行するために、ロボットのアームの端部に２００μＬのピペットチップが備えられている。
【００４６】
通常、ＶａｓｐＰＥ１＝ＶＰＥ１及びＶａｓｐＰＥ２＝ＶＰＥ２の場合、ＶａｓｐｒｉｎｓｅＰＥ１＝ＶｒｉｎｓｅＰＥ１及びＶａｓｐｒｉｎｓｅＰＥ２＝ＶｒｉｎｓｅＰＥ２である。同じように、通常、ＶａｓｐＰＥ１がＶＰＥ１よりも多く、ＶａｓｐＰＥ２がＶＰＥ２よりも多い場合、ＶａｓｐｒｉｎｓｅＰＥ１はＶｒｉｎｓｅＰＥ１よりも多く、ＶａｓｐｒｉｎｓｅＰＥ２はＶｒｉｎｓｅＰＥ２よりも多い。典型的には、それらの全てに対して同じ更なる体積パーセンテージが使用される。言い換えれば、典型的には、ＶａｓｐＰＥ１＝β×ＶＰＥ１、ＶａｓｐＰＥ２＝β×ＶＰＥ２、ＶａｓｐｒｉｎｓｅＰＥ１＝β×ＶｒｉｎｓｅＰＥ１、及びＶａｓｐｒｉｎｓｅＰＥ２＝β×ＶｒｉｎｓｅＰＥ２であり、ここで、βは１．００（すなわち、更なる体積の吸引はなかった）から１．３０までの数である。
【００４７】
好ましくは、本方法がこれらのすすぎ工程を含む場合、その各シーケンスはまた、
−  工程ｂ２）と工程ｂ３）との間に、０．２から１０分までの期間、好ましくは１から５分までの期間、すすぎ溶液を底面と接触させたままにする、インキュベーションの工程ｂ２’）、及び
−  工程ｄ２）と工程ｄ３）との間に、０．２から１０分までの期間、好ましくは１から５分までの期間、すすぎ溶液を底面と接触させたままにする、インキュベーションの工程ｄ２’）
を含む。
【００４８】
全体として、同じすすぎ溶液が全シーケンスについて全ての工程ｂ２’）に対して使用され、同じすすぎ溶液が全シーケンスについて全ての工程ｄ２’）に対して使用される。
【００４９】
可能であれば、工程ｂ２）で使用されるすすぎ溶液は、工程ｄ２）で使用されるものと同じであり、なぜなら、このことによって、本方法が容易となるからである。全体として、同じすすぎ溶液が工程ｂ２）及び工程ｄ２）の両方に対して使用される場合、本方法には３つの溶液が関与する：第１の高分子電解質ＰＥ１の溶液、第２の高分子電解質ＰＥ２の溶液及び工程ｂ２）及び工程ｄ２）の両方に対して使用されるすすぎ溶液。
【００５０】
異なるすすぎ溶液が工程ｂ２）及び工程ｄ２）で必要とされる場合、本方法には典型的には４つの溶液が関与する：すなわち第１の高分子電解質ＰＥ１の溶液、第２の高分子電解質ＰＥ２の溶液、並びに工程ｂ２）に対して使用されるすすぎ溶液及び工程ｄ２）に対して使用されるすすぎ溶液。
【００５１】
高分子電解質溶液及びすすぎ溶液に適した溶媒は、水、塩の水性溶液（例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｎＣｌ２、（ＮＨ４）２ＳＯ４）、あらゆる種類の生理学的バッファ（Ｈｅｐｅｓ、リン酸バッファ、最小必須培地等の培養培地、Ｍｅｓ−トリス、Ｍｅｓ、トリス、バッファ）、並びに水混和性非イオン性溶媒、例えばＣ１〜Ｃ４−アルカノール、Ｃ３〜Ｃ６−ケトン、それにはシクロヘキサノン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメチルスルホキシド、エチレングリコール、プロピレングリコール及びエチレングリコール及びプロピレングリコールのオリゴマー、並びにそれらのエーテルであり、開鎖アミド及び環式アミド、例えばジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン等がある。クロロホルム又は塩化メチレン等の極性の水不混和性溶媒は、上記有機溶媒と混和性である限り、ある分量の上記有機溶媒を含有することができるが、これらは特別な場合にのみ考慮されるであろう。水又はその一成分が水である溶媒混合物を使用するのが好ましい。実行される高分子電解質の溶解度によって許容される場合、溶媒として水のみが使用され、なぜなら、このことによって、本方法が単純化するからである。
【００５２】
形成されたフィルムの更なる空間的均一性を改善するために、異なる２つの実施形態を開発した。それらを以下に説明する。
【００５３】
第１の実施形態では、以下「ウエット面」と呼ばれるが、典型的には底面をリカバリする液体層を形成するために、第１の高分子電解質ＰＥ１溶液の体積Ｖｗｅｔを最初に（すなわち、フィルムのビルドアップの前に、上記のシーケンスの前に）各ウェルに添加する。
【００５４】
この第１の実施形態では、上で規定の本方法において、第１のシーケンスの工程ａ）の前に、工程ａ）がその上で行われることになる少なくとも１つのウェルは、第１の高分子電解質ＰＥ１の溶液の体積Ｖｗｅｔで充填され、ｍＬで表される体積Ｖｗｅｔが、
Ｖｗｅｔｍｉｎ＝０．５×π（ｄ／２）２から
Ｖｗｅｔｍａｘ＝（２／３）×π（ｄ／２）２×Ｈ
（式中、
−  ｄは、ｍｍで表したウェルの直径であり、
−  Ｈは、ｍｍで表したウェルの高さである）までである。
【００５５】
体積Ｖｗｅｔは、マルチウェルプレートのウェルの直径（ｄ）及び高さ（Ｈ）に依存する。
【００５６】
体積Ｖｗｅｔは、Ｖｗｅｔｍｉｎ＝０．５×π（ｄ／２）２以上であり、これは、最低の液体高さと考えられる０．５ｍｍの液体高さを可能にする体積に相応する。
【００５７】
体積Ｖｗｅｔは、Ｖｗｅｔｍａｘ＝（２／３）×π（ｄ／２）２×Ｈ以下であり、これは、ウェルの高さの（２／３）の液体高さを可能にする体積に相応する。好ましくは、体積Ｖｗｅｔは、（１／２）×π（ｄ／２）２×Ｈ以下、更には（１／３）×π（ｄ／２）２×Ｈ以下である。
【００５８】
マルチウェルプレートの通常の高さ及び直径並びに相応するＶｗｅｔｍｉｎ及びＶｗｅｔｍａｘの例を、下のＴａｂｌｅ  １（表１）に提供する。
【００５９】
【表１】
2020503012.tif 000003
【００６０】
好ましくは、体積Ｖｗｅｔはマルチウェルプレートの最小推奨有効体積、すなわちマルチウェルプレートのデータシート上で推奨される最小有効体積である。
【００６１】
第１の高分子電解質ＰＥ１の溶液の体積Ｖｗｅｔで充填されたウェルを得るためには、２つの選択肢が可能である。
【００６２】
一選択肢によれば、本方法は、第１のシーケンスの工程ａ）の前に、第１のシーケンスの工程ａ）で堆積がその上で行われることになる各ウェルの底面上に、第１の高分子電解質ＰＥ１の溶液の体積Ｖｗｅｔをロボット堆積させる工程ａ０）を含む。
【００６３】
この選択肢は、１つだけの更なる工程が必要な点で興味深い。
【００６４】
第２の選択肢によれば、本方法は、第１のシーケンスの工程ａ）の前に以下：
ａ１）  第１の高分子電解質ＰＥ１の溶液の、Ｖｗｅｔよりも多い体積Ｖａ１）を、第１のシーケンスの工程ａ）で堆積がその上で行われることになる各ウェルの底面上にロボット堆積させる工程、次いで、
ａ２）  Ｖａ２）＝Ｖａ１）−Ｖｗｅｔ
である、前記第１の高分子電解質ＰＥ１の溶液の吸引体積Ｖａ２）を、ロボット吸引する工程、
を含む。
【００６５】
したがって、この第２の選択肢には、ｎ回のシーケンスを行う前に更なる２つの工程が必要である。しかし、これによって底面上で溶液の均一な分布が可能となるので、これは興味深い。したがって、体積ＶｗｅｔがＶｗｅｔｍｉｎに近い場合、この選択肢は興味深く、なぜなら、少量の溶液が底面の表面全体に分布することはより難しいからである。
【００６６】
通常、吸引体積Ｖａ２）がＶａ１）からＶｗｅｔを減じたものに等しいことを確実にするために、溶液を吸引するのに使用されるロボットのチップの端部を溶液に浸漬する。したがって、空気は吸引されず、ロボットに進入する吸引体積はＶａ２）である。
【００６７】
この第１の実施形態では、ＶａｓｐＰＥ１＝ＶＰＥ１及びＶａｓｐＰＥ２＝ＶＰＥ２が特に好ましい。この場合、溶液の一定体積（すなわちＶｗｅｔ）が各ウェルの内部に残り、これによって、表面が常時液体で覆われたままであることを確実にする。そうすることによって、高分子電解質フィルムの上の湿潤／乾燥状態の局所的差異が回避され、より均一なフィルムが得られる。更に、フィルムが形成されている各ウェルの内部には常置の液体フィルムが存在するので、ロボットのアームのチップの端部と底面との間の距離を最適化することは不要である。
【００６８】
典型的には、本方法のこの第１の実施形態では、各すすぎ工程は３回繰り返される（すなわち、本方法の各シーケンスは、その順序で、各工程ａ）、ｂ）、ｂ２）、ｂ３）、ｂ２）、ｂ３）、ｂ２）、ｂ３）、ｂ２）、ｂ３）、ｃ）、ｄ）、ｄ２）、ｄ３）、ｄ２）、ｄ３）、ｄ２）、ｄ３）、ｄ２）及びｄ３）を含む）。溶液の一定体積（すなわちＶｗｅｔ）が各ウェルの内部に残るので、効果的なすすぎのためには多数のすすぎ工程が必要である。
【００６９】
第２の実施形態では、以下「傾斜」と呼ばれるが、堆積工程及び吸引工程中に液体の均一性を改善するためにプレートを傾ける（図１）。
【００７０】
この第２の実施形態では、この第２の実施形態による本方法の各シーケンスについて、各工程ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、及び存在する場合には各工程ｂ２）、ｂ３）、ｄ２）及びｄ３）で、底面は水平の面に対して５から４０°まで、好ましくは１０から３０°まで、より好ましくはおよそ２０°の傾き角αで傾いている。好ましくは、角度αは、各工程ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、並びに存在する場合には各工程ｂ２）、ｂ３）、ｄ２）及びｄ３）について全て同じである。この傾斜は、吸引工程中にウェルから全ての液体を除去する助けとなる。
【００７１】
典型的には、底面を傾けるために、プレートキャリアを傾き角αで傾ける（図１）。
【００７２】
好ましくは、上で規定のインキュベーション工程の間、底面は水平の面内にある（すなわち、底面は傾いていない）。したがって、好ましくは、各シーケンスについて、各シーケンスが、上で規定の工程ａ’）及び工程ｃ’）を含み且つ／又は上で規定の工程ｂ２’）及び工程ｄ２’）を含む場合、各シーケンスについて、工程ａ’）及び工程ｃ’）並びに／又は工程ｂ２’）及び工程ｄ２’）では、底面は水平の面内にある。これはまた均一なフィルムを得る助けにもなり、なぜなら、液体がウェルの底面で均一に伸展するからである。
【００７３】
典型的には、マルチウェルプレートを傾けて工程ａ）を実行し、次いで、水平の面に戻して工程ａ’）を実行し、次いで傾けて工程ｂ）及び工程ｂ２）を実行し、次いで水平の面に戻して工程ｂ２’）を実行し、次いで傾けて工程ｂ３）及び工程ｃ）を実行し、次いで水平の面に戻して工程ｃ’）を実行し、次いで傾けて工程ｄ）及び工程ｄ２）を実行し、次いで水平の面に戻して工程ｄ２’）を実行し、次いで傾けて工程ｄ３）を実行する（図１）。
【００７４】
典型的には、本方法のこの第２の実施形態では、各すすぎ工程は１回繰り返される（すなわち、本方法の各シーケンスは、その順序で、各工程ａ）、ｂ）、ｂ２）、ｂ３）、ｂ２）、ｂ３）、ｃ）、ｄ）、ｄ２）、ｄ３）、ｄ２）及びｄ３）を含む）。典型的には、マルチウェルプレートを傾けて工程ａ）を実行し、次いで、水平の面に戻して工程ａ’）を実行し、次いで傾けて工程ｂ）及び工程ｂ２）を実行し、次いで水平の面に戻して工程ｂ２’）を実行し、次いで傾けて工程ｂ３）及び工程ｂ２）を実行し、次いで水平の面に戻して工程ｂ２’）を実行し、次いで傾けて工程ｂ３）及び工程ｃ）を実行し、次いで水平の面に戻して工程ｃ’）を実行し、次いで傾けて工程ｄ）及び工程ｄ２）を実行し、次いで水平の面に戻して工程ｄ２’）を実行し、次いで傾けて工程ｄ３）及び工程ｄ２）を実行し、次いで水平の面に戻して工程ｄ２’）を実行し、次いで傾けて工程ｄ３）を実行する。
【００７５】
本方法のこの第２の実施形態では、ＶａｓｐＰＥ１はＶＰＥ１に等しくすることができ、ＶａｓｐＰＥ２はＶＰＥ２に等しくすることができる。しかし、その場合、ロボットのアームのチップの端部と底面との間の距離が０．３ｍｍ未満である場合、より良好な均一性が得られる。更に、本発明者らは、最初に堆積した高分子電解質の溶液の体積を全て除去することが非常に困難であること、及び残留溶液が不均一性を引き起こすことを発見した。
【００７６】
この困難を回避し、フィルムの均一性を更に改善するために、傾斜によって各ウェル内の体積の吸引を最適化することを、更なる体積の吸引と組み合わせるのが好ましく、このことによって、過剰体積を事実上吸引することによってウェルから全液体を効率的に吸うことが可能となる。したがって、吸引体積ＶａｓｐＰＥ１は、好ましくはＶＰＥ１よりも多く、とりわけ１．０５ＶＰＥ１から１．２０×ＶＰＥ１までであり、吸引体積ＶａｓｐＰＥ２は、好ましくはＶＰＥ２よりも多く、とりわけ１．０５ＶＰＥ２から１．２０×ＶＰＥ２までである。この場合、ロボットのアームのチップの端部と底面との間の距離を最適化することは不要である。
【００７７】
この第２の実施形態では、第１のシーケンスの工程ａ）の前に、工程ａ）がその上で行われることになる少なくとも１つのウェルは、高分子電解質の溶液を含まない（又はより一般的には、いかなる溶液をも含まない、すなわち空である）のが好ましい。したがって、状況は、本方法の第１の実施形態が行われる場合の状況とは異なり、この場合、第１のシーケンスの工程ａ）の前に、工程ａ）がその上で行われることになる少なくとも１つのウェルは、第２の高分子電解質ＰＥ２の溶液を含む。
【００７８】
得られた高分子電解質多層フィルムのこの高度な空間的均一性によって、最適化された条件下で細胞培養アッセイを実施することが可能となる。生物医学的用途にとってことさら重要なのは、生物学的活性に影響を及ぼし得る表面の均一性の制御である。これらのフィルムは生物活性分子を含有し、制御された細胞接着及び分化を誘発することができる。
【００７９】
更に、マルチウェル細胞培養プレートの底に直接フィルムを構築することは、これによって、インサイチュフィルム特性評価法とハイスループット細胞アッセイとを組み合わせることが可能となるので、特に興味深い。
【００８０】
とりわけ、吸光度、蛍光、更にはルミネセンスの測定を、マイクロプレートリーダーを使用してルーチンで行うことができる。
【００８１】
加えて、培養プレートが慎重に選択されるのであれば、様々な解像度で光学イメージングを同時に実施することも可能であるが、ただし、プレートの底が光学的に透明であり、高解像度対物レンズ（×６３以上）に対応するように十分に薄いことを、条件とする。９６ウェルプレートフォーマットは、薬物、ペプチド、増殖因子等の高価な分子を含有する表面コーティングのハイスループットスクリーニングに特に適していると思われ、なぜなら、これによって、少量の生物活性分子、少数の細胞を使用すること、及び生体分子及び細胞のインサイチュイメージングを実施することが可能となるからである。９６ウェルプレートフォーマットはまた、ハイスループットの光学的及び分光分析と組み合わせることができるので、特に有利である。とりわけ、底が薄い（およそ１８０μｍ）９６ウェルプレートは、蛍光／吸光度マイクロプレートリーダーを使用して分析することができるとともに、高解像度（６３×以上の対物レンズ）で蛍光顕微鏡下で画像化することもできる。
【００８２】
フィルムの生物活性は、高分子電解質に会合したペプチドを挿入することで、又はタンパク質を埋め込むことを通してそれらを官能化することによって達成し得る。
【００８３】
したがって、本方法は、ｎ回のシーケンスの後に、前記底面上に第３の高分子電解質ＰＥ３の溶液の体積ＶＰＥ３をロボット堆積させる工程ｅ’）を含むことができ、
−  高分子電解質ＰＥ３は少なくともペプチドに連結し、
−  第３の高分子電解質ＰＥ３は、ＰＥ２がアニオン性ポリマーである場合はアミノ基を含むカチオン性ポリマーであり、又はＰＥ２がアミノ基を含むカチオン性ポリマーである場合はアニオン性ポリマーである。
【００８４】
好ましくは、ペプチドはＲＧＤである。最も好ましくは、高分子電解質ＰＥ３はＰＧＡ−ＲＧＤである。
【００８５】
更に、アニオン性ポリマーがカルボキシル基を含む実施形態では、本方法は、ｎ回のシーケンスの後に、
ｅ）  カップリング剤の存在下で前記アミノ基とカルボキシル基とを反応させて、アミド結合を形成し且つ高分子電解質多層フィルムを架橋する工程、次いで
ｆ）  前記架橋高分子電解質多層フィルムをタンパク質含有溶液で、好ましくは増殖因子型タンパク質含有溶液で処理して、前記架橋高分子電解質多層フィルムの上及び内部に前記タンパク質を組み込む工程
を含むことができる。
【００８６】
カップリング剤によって、高分子電解質多層のカルボキシル基とアミノ基との間のアミド結合（又はその誘導体）の形成が可能となる。カップリング剤は、後で除去することができる触媒として、又は形成したアミド結合間にスペーサー（又は連結）を創製する反応体として、作用することができる。例えば、カップリング剤は、任意選択で、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド化合物の存在下で、例えばＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド、より好ましくはＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドパラ−ニトロフェノール、又はジメチルアミノピリジンの存在下で、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）等のカルボジイミド化合物である。
【００８７】
工程ｅ）は、水溶性溶液中で実施するのが好ましく、より好ましくは水性溶液中、例えば無塩溶液中、又はＫＣｌ、ＮａＣｌ等の塩を含有する水性溶液中、若しくはＭｅｓ、トリス、Ｈｅｐｅｓ等の任意の種類のバッファ、若しくはリン酸バッファを含有する水性溶液中で行われる。工程ｅ）は、４から６までの範囲のｐＨで行われるのが好ましい。
【００８８】
架橋度はまた、溶液中のカップリング剤の濃度を変えることによっても制御することができる。
【００８９】
工程ｆ）は、好ましくは２から９まで、より好ましくは２から５．５までの範囲のｐＨで行われる。
【００９０】
タンパク質含有溶液は、好ましくは、Ｍｅｓバッファ等のバッファ、好ましくは低イオン強度の溶液、より好ましくは、ＨＣｌ（例えば、１ｍＭのＨＣｌ）等の、いかなる塩をも含まないバッファである。
【００９１】
使用してよい増殖因子タンパク質には、特に治療用途及び／又は細胞生物学用途に有用であるものを挙げることができる。本発明によるフィルムに組み込むことができる増殖因子の例としては、全ての骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、全ての線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、増殖分化因子５及び９（ＧＤＦ５、ＧＤＦ９）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、肝細胞癌由来増殖因子（ＨＤＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、ミオスタチン（ＧＤＦ−８）、神経増殖因子（ＮＧＦ）及びその他のニューロトロフィン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、トランスフォーミング増殖因子、間質細胞由来因子−１（ＳＤＦ−１）及び血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、脳由来神経細胞増殖因子（ＢＤＮＦ）である。
【００９２】
増殖因子タンパク質の内、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）ファミリーは、このファミリーが、例えば骨前駆細胞並びに骨芽細胞の増殖及び分化の調節を通して骨形成において本質的役割を演じるので、選択のカテゴリーである。骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）は、ＴＧＦファミリーのメンバーであり、特に筋芽細胞の骨芽細胞系への分化を刺激する。その組換えヒト型ｒｈＢＭＰ−２は、ポリマー等の生物学的材料と会合して送達される場合、より効果的である。
【００９３】
工程ｆ）で使用するタンパク質は、増殖因子型タンパク質、好ましくはトランスフォーミング増殖因子とすることができる。より具体的には、増殖因子は、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ２）又は骨形成タンパク質７（ＢＭＰ−７）、間質細胞由来因子−１（ＳＤＦ−１）、又はキメラ１若しくはキメラ２である。増殖因子は、生物学的方法又は化学的方法を含めて、様々な方法によって調製することができる。組換え形態は特定の実施形態である。化学的方法は一般に自動ペプチド合成装置を実行する。例えば、野生型ＳＤＦ−１は、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）化学を使用して完全自動ペプチド合成装置上でＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相法により合成することができる。
【００９４】
本方法は、工程ｅ）と工程ｆ）との間、又は工程ｆ）の後に、高分子電解質多層フィルムを乾燥する工程ｇ）を含むことができる。この工程はマルチウェルプレートを保管し、これを搬送するのに有利である。高分子電解質多層フィルムは有利には、使用直前に再水和することができる。
【００９５】
第２の目的によれば、本発明は上記の方法にしたがって得ることができるマルチウェルプレートに関する。このマルチウェルプレートは少なくとも１つのウェルを含み、その底面は高分子電解質多層フィルムでコーティングされている。
【００９６】
このマルチウェルプレートは、前記高分子電解質多層フィルムが高度な空間均一性を有することを特徴とする。この空間的均一性は、例えば以下の実施例で規定の手順及びパラメータによって容易に評価することができる（とりわけＳＤ及びＣＶ）。
【００９７】
工程ｆ）の終わりに得られるタンパク質が担持されている架橋高分子電解質多層フィルムは、それらが筋芽細胞前駆体及び骨芽細胞前駆体等の様々な種類の細胞と接触している場合、特に有用であり、細胞は非常に効率的に、接着、増殖及び任意選択で分化し得る。有利には、得られた高分子電解質多層フィルム上の細胞の接着及び伸展は均一である。細胞はウェルの面全体に均一に分布し、良好に伸展した細胞の唯一集団が観察される。反対に、高分子電解質多層フィルムが不均一である場合、細胞の接着及び伸展はウェル内部の空間的位置に応じて様々である：典型には、細胞は多数でありウェルの中心で良好に伸展しているが、細胞数の低下も、ウェルの境界に向かって伸展している細胞数の低下も、両方存在する。したがって、不均一のフィルムでは、同じウェル内に異なるいくつかの細胞集団がもたらされ、細胞の接着及び伸展において空間的不均一性がもたらされる。したがって、本発明による方法によって得られるような均一な高分子電解質多層フィルムは、細胞培養にとって興味深いものである。したがって、第３の目的によれば、本発明は細胞培養のためのマルチウェルプレートの使用に関する。
【００９８】
以下の図及び実施例は本発明を例示するものであるが、本出願の範囲を限定するものとみなすべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】マルチウェル細胞培養プレートにおけるハイスループットでの交互積層の概略図である。傾斜の実施形態が操作される場合の方法の作業原理。プレートは、主要な堆積及びすすぎの４つの工程全てにおいて：ポリカチオン及びそのすすぎ、ポリアニオン及びそのすすぎにおいて、全ての堆積工程及び吸引工程の間、傾けられている。
【図２】マルチウェルプレート及び（Ｘ、Ｙ、Ｚ）座標の規定に関する例示の図であり、各ウェルの中心の（Ｘ、Ｙ）座標は市販の細胞培養プレートについては既知である；Ｚ０は、溶液の分注時のチップの初期位置であるが、ユーザが規定する必要がある。
【図３】各ウェル内部のフィルムの厚さの均一性を評価するために選択された４極位置（Ｎ、Ｗ、Ｅ、Ｓ）と中心位置（Ｃ）の規定の図である。各個々のウェル中のそれぞれ５つの位置のイメージングプロセスは、共焦点顕微鏡ソフトウェアを使用してカスタムメイドのマクロを使用して自動化された。
【図４】ウェルの底面からの距離Ｚに応じた、高解像度イメージングを介して取得された蛍光強度の図である。フィルムの厚さｈ＝Ｚ２−Ｚ１は、Ｉｍａｇｅ  Ｊを使用してカスタムメイドのマクロを使用して測定した。
【図５】マルチチャンネルピペットを使用したハンドメイドフィルムの場合の各ウェルについて異なる極位置（Ｎ、Ｗ、Ｃ、Ｅ、Ｓ）で測定されたフィルムの厚さ（比較例）の図である。ｈＮ、ｈＷ、ｈＣ、ｈＥ、及びｈＳのそれぞれの平均＋標準偏差（平均±ＳＤ）（ｍ＝４８ウェルについて）が各位置についてプロットされている。図５については、データを、マルチウェルプレートあたりそれぞれ２４ウェルを用いて、独立した２つの実験についてプールした（ｍ＝合計で４８ウェル）。
【図６】マルチチャンネルピペットを使用したハンドメイドフィルムの場合の各ウェルについて異なる極位置（Ｎ、Ｗ、Ｃ、Ｅ、Ｓ）で測定されたＣＶ（％）（比較例）の図である。図６については、データを、マルチウェルプレートあたりそれぞれ２４ウェルを用いて、独立した２つの実験についてプールした（ｍ＝合計で４８ウェル）。
【図７】マルチチャンネルピペットを使用したハンドメイドフィルムの場合のｍ個の独立したウェルにわたる、ウェルあたり平均厚さ（ｈＷＥＬＬ）の箱ひげ図（比較例）である。図７については、データを、マルチウェルプレートあたりそれぞれ２４ウェルを用いて、独立した２つの実験についてプールした（ｍ＝合計で４８ウェル）。
【図８】マルチチャンネルピペットを使用したハンドメイドフィルムの場合のｈＷＥＬＬ（ｍ＝４８ウェルを有する）のＣＶ（比較例）の図である。図８については、データを、マルチウェルプレートあたりそれぞれ２４ウェルを用いて、独立した２つの実験についてプールした（ｍ＝合計で４８ウェル）。
【図９】実施例１の条件ＮＴ＿０％についてのロボットメイドフィルムの場合の、各ウェルについて異なる極位置（Ｎ、Ｗ、Ｃ、Ｅ、Ｓ）で測定されたフィルムの厚さ（μｍ）±ＳＤの図である。図９については、データは、独立した２つの実験からの、条件あたり合計で９ウェルについての平均±ＳＤ及びＣＶである。
【図１０】実施例１の条件ＮＴ＿０％についてのロボットメイドフィルムの場合の各ウェルについて異なる極位置（Ｎ、Ｗ、Ｃ、Ｅ、Ｓ）で測定されたＣＶ（％）の図である。図１０については、データは、独立した２つの実験からの、条件あたり合計で９ウェルについての平均±ＳＤ及びＣＶである。
【図１１】実施例１の条件ＮＴ＿１０％についてのロボットメイドフィルムの場合の、各ウェルについて異なる極位置（Ｎ、Ｗ、Ｃ、Ｅ、Ｓ）で測定されたフィルムの厚さ（μｍ）±ＳＤの図である。図１１については、データは、独立した２つの実験からの、条件あたり合計で９ウェルについての平均±ＳＤ及びＣＶである。
【図１２】実施例１の条件ＮＴ＿１０％についてのロボットメイドフィルムの場合の各ウェルについて異なる極位置（Ｎ、Ｗ、Ｃ、Ｅ、Ｓ）で測定されたＣＶ（％）の図である。図１２については、データは、独立した２つの実験からの、条件あたり合計で９ウェルについての平均±ＳＤ及びＣＶである。
【図１３】実施例１の条件Ｔ＿０％についてのロボットメイドフィルムの場合の、各ウェルについて異なる極位置（Ｎ、Ｗ、Ｃ、Ｅ、Ｓ）で測定されたフィルムの厚さ（μｍ）±ＳＤの図である。図１３については、データは、独立した２つの実験からの、条件あたり合計で９ウェルについての平均±ＳＤ及びＣＶである。
【図１４】実施例１の条件Ｔ＿０％についてのロボットメイドフィルムの場合の各ウェルについて異なる極位置（Ｎ、Ｗ、Ｃ、Ｅ、Ｓ）で測定されたＣＶ（％）の図である。図１４については、データは、独立した２つの実験からの、条件あたり合計で９ウェルについての平均±ＳＤ及びＣＶである。
【図１５】実施例１の条件Ｔ＿１０％についてのロボットメイドフィルムの場合の、各ウェルについて異なる極位置（Ｎ、Ｗ、Ｃ、Ｅ、Ｓ）で測定されたフィルムの厚さ（μｍ）±ＳＤの図である。図１５については、データは、独立した２つの実験からの、条件あたり合計で９ウェルについての平均±ＳＤ及びＣＶである。
【図１６】実施例１の条件Ｔ＿１０％についてのロボットメイドフィルムの場合の各ウェルについて異なる極位置（Ｎ、Ｗ、Ｃ、Ｅ、Ｓ）で測定されたＣＶ（％）の図である。図１６については、データは、独立した２つの実験からの、条件あたり合計で９ウェルについての平均±ＳＤ及びＣＶである。
【図１７】実施例１の条件表面ウエットについてのロボットメイドフィルムの場合の、各ウェルについて異なる極位置（Ｎ、Ｗ、Ｃ、Ｅ、Ｓ）で測定されたフィルムの厚さ（μｍ）±ＳＤの図である。図１７については、データは、独立した２つの実験からの、条件あたり合計で９ウェルについての平均±ＳＤ及びＣＶである。
【図１８】実施例１の条件表面ウエットについてのロボットメイドフィルムの場合の各ウェルについて異なる極位置（Ｎ、Ｗ、Ｃ、Ｅ、Ｓ）で測定されたＣＶ（％）の図である。図１８については、データは、独立した２つの実験からの、条件あたり合計で９ウェルについての平均±ＳＤ及びＣＶである。
【図１９】ロボットアームを使用して９６ウェルプレートに作製した（ＰＬＬ／ＨＡ）１２フィルムについてのウェルあたりの平均厚さ（ｈＷＥＬＬ）の図である。５つの位置の平均として、各個々のマイクロウェルについて、ウェルあたりの平均厚さを計算した。それぞれ５つの実験条件について、全ての平均厚さ測定値を箱ひげ図としてプロットした。データは、ＮＴ条件についての３３マイクロウェルから（独立した３回の実験から）；Ｔ条件については８１ウェルに対して（独立した４つの実験から）、及び表面ウエット条件については１２ウェルからである（実施例１）。データ表示：データは、第一の四分位数、中央値、第三の四分位数、それぞれ限界が１０及び９０％、極値が５及び９５％を示す箱ひげ図として表されている。
【図２０】図１９に例示したウェルあたりの平均厚さ毎に相応する、ロボットアームを使用して９６ウェルプレートに作製した（ＰＬＬ／ＨＡ）１２フィルムについてのＣＶ（実施例１）の図である。
【図２１】各実験条件（図２１：ＮＴ＿０％）について、各ウェル内の全ピクセルの蛍光強度に関する代表な３つの曲線（共焦点顕微鏡のタイルスキャンオプションを使用して取得した）を示す（実線、破線及び点線の黒い線）（実施例１）図である。その高さの標準偏差をＴａｂｌｅ  ２（表２）に示す。
【図２２】各実験条件（図２２：ＮＴ＿１０％）について、各ウェル内の全ピクセルの蛍光強度に関する代表な３つの曲線（共焦点顕微鏡のタイルスキャンオプションを使用して取得した）を示す（実線、破線及び点線の黒い線）（実施例１）図である。その高さの標準偏差をＴａｂｌｅ  ２（表２）に示す。
【図２３】各実験条件（図２３：Ｔ＿０％）について、各ウェル内の全ピクセルの蛍光強度に関する代表な３つの曲線（共焦点顕微鏡のタイルスキャンオプションを使用して取得した）を示す（実線、破線及び点線の黒い線）（実施例１）図である。その高さの標準偏差をＴａｂｌｅ  ２（表２）に示す。
【図２４】各実験条件（図２４：Ｔ＿１０％）について、各ウェル内の全ピクセルの蛍光強度に関する代表な３つの曲線（共焦点顕微鏡のタイルスキャンオプションを使用して取得した）を示す（実線、破線及び点線の黒い線）（実施例１）図である。その高さの標準偏差をＴａｂｌｅ  ２（表２）に示す。
【図２５】各実験条件（図２５：表面ウエット）について、各ウェル内の全ピクセルの蛍光強度に関する代表な３つの曲線（共焦点顕微鏡のタイルスキャンオプションを使用して取得した）を示す（実線、破線及び点線の黒い線）（実施例１）図である。その高さの標準偏差をＴａｂｌｅ  ２（表２）に示す。
【図２６】それぞれ４つの実験位置について、５つの極位置（Ｎ、Ｗ、Ｃ、Ｅ、Ｓ）での及びチップの端部と底面との間の異なる距離（Ｚ−段階）での厚さの測定値（図２６：ＮＴ＿０％）の図である。チップの端部については、マイクロプレートの底の上の異なる４つの高さ、Ｚ０＝＋０．１から＋１ｍｍまで＋０．３ｍｍの段階で位置決めした（例えば、ウェルの底の上、＋０．１；＋０．４；＋０．７及び＋１ｍｍ（ｎ＝６ウェル毎条件））。各箱ひげ図は、各ウェル内部の５つの位置での独立した６つのウェルに関する合計３０の厚さの測定値を表す。
【図２７】それぞれ４つの実験位置について、５つの極位置（Ｎ、Ｗ、Ｃ、Ｅ、Ｓ）での及びチップの端部と底面との間の異なる距離（Ｚ−段階）での厚さの測定値（図２７：  ＮＴ＿１０％）の図である。チップの端部については、マイクロプレートの底の上の異なる４つの高さ、Ｚ０＝＋０．１から＋１ｍｍまで＋０．３ｍｍの段階で位置決めした（例えば、ウェルの底の上、＋０．１；＋０．４；＋０．７及び＋１ｍｍ（ｎ＝６ウェル毎条件））。各箱ひげ図は、各ウェル内部の５つの位置での独立した６つのウェルに関する合計３０の厚さの測定値を表す。
【図２８】それぞれ４つの実験位置について、５つの極位置（Ｎ、Ｗ、Ｃ、Ｅ、Ｓ）での及びチップの端部と底面との間の異なる距離（Ｚ−段階）での厚さの測定値（図２８：  Ｔ＿０％）の図である。チップの端部については、マイクロプレートの底の上の異なる４つの高さ、Ｚ０＝＋０．１から＋１ｍｍまで＋０．３ｍｍの段階で位置決めした（例えば、ウェルの底の上、＋０．１；＋０．４；＋０．７及び＋１ｍｍ（ｎ＝６ウェル毎条件））。各箱ひげ図は、各ウェル内部の５つの位置での独立した６つのウェルに関する合計３０の厚さの測定値を表す。
【図２９】それぞれ４つの実験位置について、５つの極位置（Ｎ、Ｗ、Ｃ、Ｅ、Ｓ）での及びチップの端部と底面との間の異なる距離（Ｚ−段階）での厚さの測定値（図２９：  Ｔ＿１０％）の図である。チップの端部については、マイクロプレートの底の上の異なる４つの高さ、Ｚ０＝＋０．１から＋１ｍｍまで＋０．３ｍｍの段階で位置決めした（例えば、ウェルの底の上、＋０．１；＋０．４；＋０．７及び＋１ｍｍ（ｎ＝６ウェル毎条件））。各箱ひげ図は、各ウェル内部の５つの位置での独立した６つのウェルに関する合計３０の厚さの測定値を表す。
【図３０】ＢＭＰ−２初期担持濃度の関数としての、３つの実験条件についてＣ２Ｃ１２細胞によって覆われた表面積の％（マイクロウェルのタイルスキャン画像から計算した）の図である。データは少なくとも１０ウェルの平均±ＳＤである（実施例３）。
【図３１】ＢＭＰ−２初期担持濃度の関数としての、４つの実験条件について細胞によるＡＬＰ活性（ａ．ｕ．）（実施例３）の図である。Ｃ２Ｃ１２細胞に対するマトリックス結合ＢＭＰ−２の生物活性。ロボットアームを使用して構築した（ＰＬＬ／ＨＡ）フィルムを（ＥＤＣ３０で）架橋し、５、１０、２５及び５０μｇ／ｍＬでＢＭＰ−２にてポスト担持させ、それらの生物活性について評価した。増殖培地中５０００細胞／ウェルでプレーティングしたＣ２Ｃ１２細胞を３日の培養後にＡＬＰについて染色した。（実施例３）
【図３２】ＢＭＰ−７の初期担持濃度の関数としての、Ｔ＿１０％条件についての幹細胞のＡＬＰ活性（ａ．ｕ．）の図である。Ｄ１幹細胞に対するマトリックス結合ＢＭＰ−２の生物活性。Ｔ＿１０％条件でロボットアームを使用して調製した、架橋（ＰＬＬ／ＨＡ）１２フィルム（ＥＤＣ１０で架橋した）にマトリックス結合ＢＭＰ−７を担持させた。Ｄ１マウス間葉系幹細胞を各マイクロウェルにプレーティングし、ＧＭ中で最大２日間まで培養した後、更なる７日間ＤＭに切り替えた。ＡＬＰ活性を酵素アッセイにより定量化した。２．５から５０μｇ／ｍＬまでの増加する４つのＢＭＰ−７担持濃度を、ＢＭＰ−７の非存在下でのフィルムと比較して試験した。３日目のＡＬＰ発現が、高分子電解質フィルム中のＢＭＰ−７担持用量の関数としてプロットされている。データは各実験条件についての独立した３つのウェルの平均±ＳＤである。
【図３３】ｎ（層対の数）の関数としての（ＰＳＳ／ＰＡＨ）高分子電解質フィルムのフィルムの厚さの図である。１０から４０まで増加する層対の数を含有する（ＰＳＳ／ＰＡＨ）フィルムを、ＰＤＭＳマイクロウェルを使用してシリコン基板上に条件Ｔ＿１０％でロボットアームを使用して堆積させた。フィルム堆積後、ＰＤＭＳウェルを除去し、試料をＡＦＭによってプローブした。フィルムをスクラッチした後、フィルムの厚さを測定する。データは、２５の測定値の平均±標準偏差である（試料あたり独立した５の測定値、各実験条件について５試料）。データの直線的フィット（Ｙ＝６．３４Ｘ−７．１１、Ｒ＝０．９７４）はこれらのフィルムの直線的成長を裏付ける。
【図３４】スキャナーを使用して目視観察によって評価した、ＢＭＰ応答性骨格筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２細胞）に対するマトリックス結合ＢＭＰの生物活性の図である。ＢＭＰ担持フィルム（ＥＤＣ７０に架橋した）上で３日間培養したＣ２Ｃ１２筋芽細胞のＡＬＰ活性を、染色の強度によって各単一ウェルについてハイスループットで視覚化した。異なる５種類のＢＭＰ（ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−９、及びＢＶ２６５）と異なる４つのＢＭＰ担持量（溶液中の初期ＢＭＰ濃度は２．５から２０μｇ／ｍＬまで）とについて試験した。
【図３５】ＢＭＰ応答性骨格筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２細胞）上のマトリックス結合ＢＭＰの生物活性の図である。ＡＬＰ活性（ａ．ｕ．）を、バイオミメティックフィルムにおける担持段階時の溶液中のＢＭＰの初期濃度の関数として測定した。Ｔ＿１０％条件でロボットアームを使用して調製した架橋（ＰＬＬ／ＨＡ）１２フィルム（ＥＤＣ７０で架橋した）にマトリックス結合ＢＭＰを担持させた。Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞を各マイクロウェルにプレーティングし、ＧＭ中で３日間培養した。ＡＬＰ活性を、マルチリードモードでＴｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  １０００マイクロプレートリーダーを使用して５７０ｎｍでの吸光度を測定して定量化した（各単一マイクロウェル中の異なる７６の位置の平均値）。各ＢＭＰ（ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−９、及びＢＶ２６５）について、ＢＭＰの非存在下でのフィルムと比較して、２．５から２０μｇ／ｍＬまでの増加する４つのＢＭＰ担持濃度を試験した。３日目のＡＬＰ発現が、溶液中の初期ＢＭＰ濃度の関数としてプロットされている。データは各実験条件について独立した２つのウェルの平均±ＳＤである。
【図３６】５層対からなるＰＧＡ／ＰＬＬフィルムでコーティングされた単一のマイクロウェル（直径６．４ｍｍ）のタイルスキャンイメージングの図である。フィルムをＰＬＬ−ＦＩＴＣを使用することによって視覚化した。
【図３７】無血清培地中で１時間培養した後のＰＧＡ−ペプチド末端バイオミメティックフィルム上に接着しているＣ２Ｃ１２筋芽細胞の数（ｍｍ２あたり）の図である。異なる４つのフィルム架橋条件（ＣＬ０、ＣＬ５、ＣＬ１０、ＣＬ３０）を研究し、異なる４つのＰＧＡ／ＰＧＡ−ＲＧＤペプチドを研究した（ペプチド無し、比率２／１、比率１／２、及びＰＧＡ−ペプチドのみ）。データは各実験条件について独立した３つのウェルの平均±ＳＤである。
【図３８】筋芽細胞の伸展面積の定量化（数値ＸＹに関しては同じ実験条件）の図である。細胞伸展面積を、Ｉｍａｇｅ  Ｊを使用するカスタムメイドのマクロを使用して自動的に定量化し、それによって、細胞によって覆われた細胞面積を計算し、平均細胞伸展面積を導き出した。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【０１００】
高分子電解質
様々な種類の高分子電解質をフィルムビルドアップに使用した：ポリカチオンとしては、ポリ（Ｌ−リジン）臭化水素酸塩（ＰＬＬ、Ｓｉｇｍａ、Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ、フランス）、ポリ（アリルアミン塩酸塩）、キトサン（ＣＨＩ、ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ社）及びポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社、フランス）；ポリアニオンとしては、ヒアルロン酸（ＨＡ、Ｌｉｆｅｃｏｒｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ社、米国）、ポリスチレンスルホネート（ＰＳＳ）及びポリ（Ｌ−グルタミン酸）（ＰＧＡ、両方ともＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製、フランス）。ＰＧＡを、Ｐｉｃａｒｔら、Ａｄｖ．  Ｆｕｎｃｔ．  Ｍａｔ  ２００５：１５、８３〜９４頁に記載の通り、ＲＧＤ含有ペプチドにグラフトした。
【０１０１】
異なる４つのポリカチオン／ポリアニオン対を選択した：
−  （ＰＬＬ／ＨＡ）フィルムは指数関数的に成長するフィルムのモデル系である。１２層対からなるフィルムについては、厚さはおよそ１．５〜２μｍ、すなわち共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）による検出の解像限界に近ことが求められる。
−  （ＰＳＳ／ＰＡＨ）フィルムは、堆積層の数と共に直線的に成長することが知られている別のモデル系である。
−  （ＣＨＩ／ＰＧＡ）フィルムを第３の高分子電解質フィルムとして選択して、他の高分子電解質でのロボットの可能性を示した。
−  （ＰＬＬ／ＰＧＡ）フィルムを第４の高分子電解質フィルムとして選択して、ロボットが、他のポリアニオンを堆積させる可能性、並びに、ロボットと最終層としてＰＧＡ及びＰＧＡ−ＲＧＤの混合物を有するフィルムとを使用して調製したフィルム上での細胞の接着及び伸展のハイスループットスクリーニングを行う可能性を示した。
【０１０２】
フィルムビルドアップ向けのバッファ
（ＰＬＬ／ＨＡ）フィルムビルドアップの場合、ＰＬＬ（０．５ｍｇ／ｍＬ）、ＨＡ（１ｍｇ／ｍＬ）及びＰＥＩ（２ｍｇ／ｍＬ）をＨＥＰＥＳ−ＮａＣｌバッファ（ｐＨ７．４で２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）に溶かした。基板へのフィルム吸着を改善するために、ＰＥＩの第１の層を堆積させ、続いてＨＡ層を堆積させた。その後、所望の層数に達するまで、すすぎ工程を間に入れたポリカチオン（ＰＬＬ）とポリアニオン（ＨＡ）との繰返し堆積法を開始した。フィルムビルドアップ中のすすぎ工程は全て、ｐＨ６．５の０．１５Ｍ  ＮａＣｌにて実施した。
【０１０３】
（ＰＬＬ／ＰＧＡ）フィルムビルドアップの場合、ＰＬＬ及びＰＧＡを、Ｈｅｐｅｓ−ＮａＣｌバッファ中に１ｍｇ／ｍＬで溶かした。
【０１０４】
（ＰＳＳ／ＰＡＨ）フィルムビルドアップの場合、ＰＡＨ及びＰＳＳをトリス−ＮａＣｌバッファ（×０．１５ＭのＮａＣｌを含有するｐＨ７．４）中に５ｍｇ／ｍＬで溶かした。
【０１０５】
ＣＨＩ／ＰＧＡフィルムビルドアップの場合、ＣＨＩ及びＰＧＡを０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含有するｐＨ５の０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファ中に溶かした。イメージングのために、ＣＨＩを、ｐＨ６．０での２時間の反応以外は、製造業者のプロトコールにしたがってＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、アミン反応性プローブ）で蛍光標識した。生成物の精製及び非結合の染料の除去は、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５サイズ排除カラム（ＰＤ−１０、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、スウェーデン）を使用し行った。１２層対からなるフィルムを、１０×対物レンズを備えたＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ７００共焦点顕微鏡を使用して大気中で画像化した。
【０１０６】
比較例
マルチチャンネルピペットを使用する手作業によるフィルム堆積
マルチチャンネルマイクロピペット（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（登録商標）ｐｒｏ  ３００、ドイツ）、通常は８つのチップを有するチャンネルを使用して、ＬｂＬフィルムを手作業で９６ウェル細胞培養プレートに構築した。高分子電解質を各ウェルに分注し、８分間インキュベートした。ポリカチオンの分注とポリアニオンの分注には、２分の２回のすすぎ工程を間に入れた。プレートの傾斜よって液体を慎重に分注した。プレートの上下を逆にすることで液体を投げ捨てた。１２対の層からなる（ＰＬＬ／ＨＡ）フィルムを、８アームマルチチャンネルピペットを使用して２４ウェルに手動で堆積させた。ＰＬＬ−ＦＩＴＣを使用してフィルムを染色した。
【０１０７】
第１に、この手順は単調であり、実験者が数時間高度に集中する必要がある。加えて、フィルム堆積に必要とされる合計時間は非常に長い場合もあるので時間がかかる：これは堆積した層対の数ｎに比例する。例えば、２４対の層からなるフィルムを手動で調製するにはまる２日間までの作業が必要である。
【０１０８】
加えて、手作業による高分子電解質フィルムの堆積は、異なる極位置でのフィルム厚さの分析で観察されるように（図５〜図８）、単一のウェル内部で高度に不均一であることが明らかになった。異なる極位置についての変動係数は各特定の位置で１０〜２３％の間で変動し、ウェルあたりの平均厚さは独立したウェル間で２０％のオーダーで変動した（一緒にプールされた独立した２つの実験について）。理論に束縛されることを望むものではないが、本発明者らは、これらの空間的不均一性が毛細管効果に由来する可能性があると想定したが、この効果はそういった長さスケールで重要であることが知られている。
【０１０９】
（実施例１）
リキッドハンドリングマシンを使用する自動（ＰＬＬ／ＨＡ）フィルムビルドアップ
大規模セットのインサイチュ物理化学的特性評価及び生物学的研究を同じプレートで実施した：ｉ）ＬｂＬ堆積（実施例１）、ｉｉ）インサイチュでのＬｂＬフィルム均一性の特性評価（実施例１）、ｉｉｉ）生物活性タンパク質の担持及びその特性評価（実施例３）、ｉｖ）マイクロプレート中のインサイチュでの細胞培養上のタンパク質担持ＬｂＬフィルムの生物活性のアセスメント：短期間の接着及びＡＬＰ活性を、光学顕微鏡及び分光法を使用してハイスループットで定量化した（実施例３）。
【０１１０】
リキッドハンドリングマシンを使用する自動フィルムビルドアップ
共焦点顕微鏡による、及び蛍光／吸光度マイクロプレートリーダーを使用して、インサイチュでのその後の特性評価のために（液体又は大気中で）、ＬｂＬフィルムを９６ウェル細胞培養プレート（レファレンス６５５９８６、Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ社、ドイツ）に直接堆積させた。自動リキッドハンドリングマシン（ＴＥＣＡＮ  Ｆｒｅｅｄｏｍ  ＥＶＯ（登録商標）１００）を使用して、マルチウェルプレートにハイスループットで交互積層フィルムを堆積させるためのプロトコールを開発した（図１）。
【０１１１】
この装置によるフィルムビルドアップは、すすぎ工程を間に入れたポリカチオン分注とポリアニオン分注とのシーケンスで構成されていた。その原理は、リキッドハンドリングピペッティングアームを使用することで構成されていた。このリキッドハンドリングアームによって、それぞれのリザーバ内の液体をピペッティングし、マルチウェルプレートの選択されたウェルにこれを分注した（図２）。高分子電解質及びすすぎ溶液を含有するトラフをワークテーブル上に置いた。３つのトラフを使用した：ポリカチオン用に１つ、ポリアニオン用に１つ及びすすぎ溶液用に１つ（すすぎ溶液が異なる場合は２つ）及び廃棄物。マルチウェル培養プレート（１つ又は複数）をワークテーブルに置いた。
【０１１２】
本発明者らは、市販の傾斜プレートキャリアを使用して、分注工程及び吸引工程中にプレートを傾けるためのオプションを作製した（図１）：マルチウェルプレートは、ユーザによって規定され且つ典型的には５〜２０度の間で変化することができる角度αで傾くことができ、以下の実施例では２０度であった。この状態については以下、ワークテーブル上のプレートの標準位置（α＝０度）に対して「傾斜」（Ｔ）対「傾斜無し」（ＮＴ）と称する。
【０１１３】
第１に、ロボットソフトウェアでカスタムメイドのマクロを使用して、本発明者らは、本発明者らが交互積層フィルムを堆積しようとしたウェルの数と特定の位置を規定した。
【０１１４】
シーケンス、すなわち一対の層は、以下の工程からなるものであった：
−  リキッドハンドリングアームは、チップ（図２）を使用して、トラフから高分子電解質を吸引し、これを選択されたウェル（典型的には５０μＬ）に分注し、この工程を「分注」と呼ぶ、
−  ６分の高分子電解質溶液中でのインキュベーション時間、
−  各ウェルの液体をバック吸引し、廃棄物に分注した。この工程の間に、更なる吸引体積を加えることが可能である。
下の実施例では、規定の体積は更なる吸引体積であり、その特定のウェルに最初に堆積した体積に対して％の過剰体積として規定されたものである（０、５、１０、１５又は２０％、それぞれ上で規定の、１．００×ＶａｓｐＰＥ、１．０５×ＶａｓｐＰＥ、１．１５×ＶａｓｐＰＥ及び１．２０×ＶａｓｐＰＥに相応する（ＰＥはＰＥ１又はＰＥ２のいずれかである））；例えば：更なる吸引が１０％に固定されている場合、ロボットは最初の分注体積５０μＬに対して５５μＬをバック吸引する。
−  液体をすすぎトラフから吸引した（すすぎ量８０μＬ）ことの他は、同じ手順にしたがって２回のすすぎ工程を行った。
−  液体アームがトラフから反対に荷電した高分子電解質（典型的には５０μＬ）を吸引し、それを選択されたウェルに分注した、
−  ６分の反対に荷電した高分子電解質のインキュベーション時間。
−  各ウェルの高分子電解質をバック吸引し、廃棄物に分注した。
−  液体をすすぎトラフから次いで吸引した（すすぎ量８０μＬ）ことの他は、反対に荷電した高分子電解質（典型的には８０μＬ）のｘ洗浄工程（典型的には２回）を、同じ手順にしたがって行った。
【０１１５】
ピペッティングの精度を高めるために、２００μＬ等の最も適切なピペッティングチップで分注を行うことができる。吸引は１ｍＬのチップで行うことができる。
【０１１６】
このシーケンスをｎ回繰り返して、ｎ層対からなる交互積層フィルムを構築した。
【０１１７】
実験条件
本発明者らは５つの実験条件を比較した：
マイクロプレートの傾斜（傾斜無し又は水平の面に対して２０°の傾き角αを有する傾斜条件、それぞれ「ＮＴ」又は「Ｔ」）及び更なる吸引体積（０％又は１０％に固定）を制御することによる：
以下のように称する合計４つの条件が存在する：ＮＴ＿０％；ＮＴ＿１０％；Ｔ＿０％；Ｔ＿１０％。
【０１１８】
第５の及び最後の条件は、傾斜無し／０％の更なる吸引（すなわち（ＶａｓｐＰＥ１＝ＶＰＥ１及びＶａｓｐＰＥ２＝ＶＰＥ２））であるが、ビルドアップの方法の間は常置の過剰体積（すなわち、Ｖｗｅｔ）を有する。本発明者らはこれを以下、「表面ウエット」条件と称する。
【０１１９】
この条件では、実験の開始当初に、体積のＰＥ１高分子電解質溶液を各ウェルの内部に分注した（９６ウェルプレートのウェルについては、この体積を３０μＬに設定した）。これにより、表面が液体で常に覆われたままであることを確実にするために、各ウェルの内部に一定量の溶液が残ることが可能となる。そうすることによって、本発明者らは、高分子電解質フィルムの上の液体フィルムの高さの局所的な差異を回避することを目的とする。
【０１２０】
ピペッティングスピード
ピペッティングスピードは、ロボットアームの作業範囲内でユーザによって制御することができる。典型的なピペッティングスピードを、分注工程については４００〜８００μＬ／秒に設定し、吸引工程については３０〜１５０μＬ／秒に設定した。
【０１２１】
ウェル内部のフィルムの均一性の特性評価（タイルスキャン及び横断面）
フィルム成分の一つが蛍光染料で標識されているのであれば、共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ７００、Ｌｅ  Ｐｅｃｋ、フランス）のタイルスキャンオプション及び１０×対物レンズを使用して、所与のウェル内部の全体的なフィルム均一性を画像化することが可能である。このオプションによって、画像のサブセットを取得することによってウェルを自動的にスキャンすることが可能となる。
【０１２２】
フィルムの厚さ「ｈ」
本発明者らは、（ＰＬＬ／ＨＡ）フィルムにはＰＬＬ−ＦＩＴＣ、（ＣＨＩ／ＰＧＡ）フィルムには（ＣＨＩ−ＦＩＴＣ）を使用して、フィルムを視覚化した。実際、指数関数的に成長するフィルムについては、最後の層がフィルム全体内に拡散可能であることが知られている。したがって、蛍光帯の厚さを測定することにより、フィルムの厚さを容易に測定することができる。
【０１２３】
各ウェル内部のフィルムの均一性を高度な空間分解能で評価するために、本発明者らは、各ウェル内部の異なる５つの位置（ノース、ウエスト、中心、イースト及びサウス、それぞれＮ、Ｗ、Ｃ、Ｅ、Ｓ、図３）でフィルムの厚さを測定した。ユーザによって評価された通り、中心はほぼウェルの中心であった。その他の極は、それぞれＸ方向及びＹ方向で、中心から＋２ｍｍで位置していた。これらの位置でフィルムの厚さを測定するために（位置の総数はウェルの総数×５に等しい）、本発明者らは、６３×オイル対物レンズ及びＺｅｎソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ社）によるカスタムメイドのマクロを使用して０，３６μｍ間隔で横断面の取得を自動化した。次いで、Ｉｍａｇｅ  Ｊ（ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ）のカスタムメイドのマクロを使用して、蛍光強度プロファイルから各厚さを自動的に導き出した（図４）。通常の蛍光強度プロファイルは、ノイズレベル（０に近い）で始まり、焦点面がフィルムへと更に深く移動するにつれてピーク値まで増大し、次いでノイズレベルに戻る。要するに、最大強度（ＦＭＡＸ）を最初に決定した。本発明者らは、Ｉ＝Ｃ×ＦＭＡＸであるように閾値係数Ｃを適用した。次いで、本発明者らは、この線が蛍光強度プロファイルをインターセプトするＺ位置（Ｚ１、Ｚ２）を導き出した。フィルムの厚さｈは容易に導き出すことができる：ｈ＝Ｚ２−Ｚ１（μｍで）。注目すべきことに、このマクロは、手動で測定されたフィルムの厚さを比較することによって、原子間力顕微鏡によって、及び同じ画像上のマクロによって検証された。
【０１２４】
フィルムの厚さを各ウェル内部の異なる位置Ｎ、Ｗ、Ｃ、Ｅ、Ｓで決定し、相応する厚さｈＮ、ｈＷ、ｈＣ、ｈＥ及びｈＳを決定した。
【０１２５】
ウェルあたりの平均厚さ「ｈＷＥＬＬ」
ウェルあたりの平均厚さ「ｈＷＥＬＬ」は、極位置（Ｎ、Ｗ、Ｅ、Ｓ）及び中心（Ｃ）での５つの厚さ測定値全ての合計と５の商で計算した。したがって、式
【０１２６】
【数１】
2020503012.tif 000004
【０１２７】
を使用して、これを計算した。
【０１２８】
独立したｍ個のウェルの平均厚さ「ｈＭＥＡＮ」
ｈＭＥＡＮを：
【０１２９】
【数２】
2020503012.tif 000005
【０１３０】
として計算した。
【０１３１】
独立したｍ個のウェルについての、ウェルあたりの平均厚さ平均厚さ（ｈＷＥＬＬ）の標準偏差（ＳＤ）
ＳＤを：
【０１３２】
【数３】
2020503012.tif 000006
【０１３３】
をとして計算した。
【０１３４】
平均厚さの変動係数「ＣＶ」
それぞれ５つの位置について、又は各ウェルについての平均厚さの変動係数（ＣＶ）を：
【０１３５】
【数４】
2020503012.tif 000007
【０１３６】
によって計算した。
【０１３７】
ＣＶは、その厚さの絶対値とはかかわりなく試料を比較することを可能にする。
【０１３８】
エクスサイチュ特性評価のためのシリコンウェハ上のＰＤＭＳマイクロウェルにおけるフィルム堆積
赤外分光法、プロフィロメトリー及びＡＦＭ顕微鏡を使用するエクスサイチュ特性評価には、シリコンウェハ（直径２’’、Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ社、米国）上に構築したフィルムを必要とした。
【０１３９】
本発明者らは、９６ウェルプレートのウェルと同様のサイズのポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ、Ｓｙｌｇａｒｄ  １８４キット、Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ社）ウェルを備えたカスタムメイドのシリコン基板を設計した。ＰＤＭＳを１０分の間硬化剤（１０：１）と混合し、２０分間デシケーターに置いて気泡を除去した。次いで、これを型に導入し、再び２０分の間脱気し、６５℃で少なくとも４時間オーブンに置いた後、型から慎重に取り出して長方形の切片に切断した。９６ウェルプレートと同じ直径及び同じ位置の円形の穴を作った。シリコン基板とＰＤＭＳ基板の両方を、１０分間ＵＶ処理して（ＰＳＤ−ＵＶオゾン洗浄システム、Ｎｏｖａｓｃａｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、それら基板の間の結合強度を増大した。その後、処理面を接触させ、加圧して接着し、１００℃で１時間３０分間オーブンに導入して、互いにくっつけた。次いで、（ＰＳＳ／ＰＡＨ）高分子電解質フィルム及び（ＰＬＬ／ＨＡ）高分子電解質フィルムを、上記の通り、ロボットアームを使用して堆積させた。
【０１４０】
エクスサイチュフィルム特性評価には、更なる乾燥工程が必須であった。
【０１４１】
（ＰＬＬ／ＨＡ）フィルムについては、Ｈｅｐｅｓ−ＮａＣｌバッファ中に貯蔵した架橋フィルムをＭｉｌｌｉＱ水ですすぎ、次いで乾燥した。
【０１４２】
（ＰＳＳ／ＰＡＨ）フィルムについては、フィルムをＭｉｌｌｉＱ水で単にすすぎ、次いで乾燥した。フィルム乾燥を３７℃で２時間、インキュベーターで行った。手順の終了時に、ＰＤＭＳの型を取り除き、フィルムを４℃に保った。各ＦＴＩＲ及びプロフィロメトリー分析の前に、湿度変化による起こり得る任意の影響を排除するために、フィルムを３７℃で１時間インキュベーターに置いた。乾燥フィルムを、ＡＦＭによっても特徴付けした。
【０１４３】
赤外分光法、プロフィロメトリー及び原子間力顕微鏡を使用するエクスサイチュ分析
ＦＴＩＲ分析
高感度ＭＣＴ（水銀−カドミウム−テルライド）検出器を使用して、透過モードでＶｅｒｔｅｘ  ７０分光光度計（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｏｐｔｉｃｓ  Ｇｍｂｈ社、Ｅｔｔｌｉｎｇｅｎ、ドイツ）を使用して実験を行った。フィルム分析に先立ち、透過アクセサリーを使用して試料区画に裸のシリコン基板を導入した後にバックグラウンドシグナルを取得した。シリコン基板上に構築した乾燥フィルムを試料ホルダーに置き、これらのスペクトルを２５６のインターフェログラムを合計することによって取得した。ＯＰＵＳソフトウェアｖ６．５（Ｂｒｕｋｅｒ社、ドイツ）を使用してスペクトル分析を行い、Ｈ２Ｏ及びＣＯ２の寄与を除去し、手動でベースラインを補正して、各スペクトルにおいて同じ基準点を常時選択した。各条件について、最終スペクトルは、同じ試料の（ただし異なるウェルからの）異なる３つのスペクトルの平均である。
【０１４４】
プロフィロメトリー
シリコン基板上に構築したフィルムの厚さ測定を、プロフィロメーター（Ｄｅｋｔａｋ  ＸＴ、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、米国）を使用して実施した。同時に構築した異なる５つのウェルに相応する、各条件の５つの試料をスクラッチして、物理的な段階を作製し、ソフトウェアＶｉｓｉｏｎ  ６４（登録商標）（ｖ５．４、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、米国）にて試料あたり３つの測定値を取得した。長さ１０００μｍで３０秒のスキャンを、半径１２．５μｍの針と１ｍｇに設定された圧とで実施した。したがって、１５の測定の平均値を、各条件に対するフィルムの厚さとした。
【０１４５】
ＡＦＭ
シリコン上に堆積した高分子電解質フィルムのＡＦＭ画像を、シリコンカンチレバー（ＯＭＣＬ−ＡＣ２４０ＴＳ、Ｏｌｙｍｐｕｓ社）を使用するＮａｎｏＳｃｏｐｅ  ＩＩＩａ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒコントローラを備えたＤＩ  ３１００  ＡＦＭ（Ｖｅｅｃｏ社）によるタッピングモードで得た。観察前に、フィルムコーティング基材を水中で洗浄し、風乾した。基材トポグラフィーを、１Ｈｚの周波数で５１２×５１２ピクセルで画像化した。
【０１４６】
単一のウェル内及びウェル間のフィルムの均一性に対する、傾斜（「Ｔ」）／傾斜無し（「ＮＴ」）の、更なる吸引の、及び「表面ウエット」条件の影響
各ウェル内部のフィルム均一性を５つの極位置で評価した（図９〜図１８）。結果を以下のＴａｂｌｅ  ２（表２）及びＴａｂｌｅ  ３（表３）に提供する。
【０１４７】
【表２】
2020503012.tif 000008
【０１４８】
５つの条件の比較を容易にするために、実験値に基づいて、各基準についてスコアを帰した。スコアが高いほど、パラメータは良好である。次いで、合計平均スコアを計算した。
【０１４９】
【表３】
2020503012.tif 000009
【０１５０】
ｔａｂｌｅ  ３（表３）のランキングによって、一番良い３つの条件が得られる：Ｔ＿１０％＞ＳＷ＞Ｔ＿０％。ＮＴ＿０％とＮＴ＿１０％とは非常に近く、他のものをはるかに下回っている。
【０１５１】
したがって、絶対厚さ測定値（図９、図１１、図１３、図１５、及び図１７）並びに各極のＣＶ（図１０、図１２、図１４、図１６、及び図１８）の両方から、
−  「表面ウエット」状態（上に記載の第１の実施形態）、及び
−  傾斜ありの条件（第２の実施形態で上に記載）、
−  更なる吸引無し（ＶａｓｐＰＥ１＝ＶＰＥ１及びＶａｓｐＰＥ２＝ＶＰＥ２）、
−  又は１０％の更なる吸引あり（ＶａｓｐＰＥ１＝１．１０ＶＰＥ１及びＶａｓｐＰＥ２＝１．１０ＶＰＥ２）のいずれか
によって、より均一なフィルムがもたらされると、思われる。
【０１５２】
加えて、ウェルあたりの平均厚さ（図１９）もまた、傾斜ありの実験、特に傾斜及び１０％の更なる吸引ありの条件について、並びに表面ウエット条件については、変化がかなり小さい。
【０１５３】
ＣＶ値（図２０）は、「傾斜無し」（ＮＴ）条件については一貫して１５％超であり、Ｔ＿０％条件については１０から１５％の間であり、Ｔ＿１０％及び表面ウエットの両方については８％未満である。
【０１５４】
フィルムを可視化するためにＰＬＬ−ＦＩＴＣを使用するウェルの全体像及び共焦点顕微鏡ソフトウェアのタイルスキャンオプションによって、各ウェルにおける全体的なフィルム均一性に関する補足的な情報が提供された。蛍光強度の３つの代表的ヒストグラムを図２１〜図２５にプロットする。得られた画像、並びにヒストグラムは、「傾斜無し」（ＮＴ）条件と比較して、蛍光分布がＴ＿０％（図２３）及びＴ＿１０％（図２４）の条件で、並びに表面ウエット条件（図２５）で、より均一であることを、明らかに示した。
【０１５５】
フィルムの厚さに対するピペッティングチップの位置決めの影響
実験の開始前に、ユーザは、分注工程及び吸引工程の初期座標を規定するために、（Ｘ、Ｙ、Ｚ）で基準位置を規定する必要がある。９６ウェルプレートのウェルの中心の座標を知っていれば、（Ｘ、Ｙ）座標の規定は容易である。
【０１５６】
以下の手順にしたがって、ウェルへの溶液の分注及びウェルからの吸引の間にプレート底の近傍でチップのＺ位置を制御した。実験の開始に先立ち、チップをプレートの底とごく接近して位置決めした。マイクロプレートに対して動きが一切不可能となるまで、チップをマイクロプレートと接触させてまず配置した。次いで、チップをＺにおいて１段階だけ（使用したロボットで１００μｍ）上昇させた。この位置を基準Ｚ位置、Ｚ０と定めた。
【０１５７】
したがって、本発明者らは、チップのＺ位置決めがフィルムの厚さの測定に影響を与えるかどうか及びどれほど影響を与えるか、調べた。この目的のために、基準位置Ｚ０（すなわち、プレートの底の上、０．１ｍｍ）から０．３ｍｍずつ段階的に増加させて、異なる４つのＺ位置でフィルムを構築した（図２６〜図２９）。
【０１５８】
フィルムの厚さの分散はＮＴ条件とＴ＿０％についてはＺと共に増大したが、Ｔ＿１０％条件については、値はＺとはほとんど無関係のままであった。したがって、この後者の条件は、ユーザにとってより融通があるように思われ、ユーザはＺ０の最適化において高度に的確である必要がない。
【０１５９】
「表面ウエット」条件に関しては、各ウェルの内部に常置の液体フィルムが存在するので、実験に先立ちピペットチップの初期Ｚ位置、Ｚ０、を正確に調整する必要はない。
【０１６０】
（実施例２）
リキッドハンドリングマシンを使用する、自動（ＰＳＳ／ＰＡＨ）フィルム又は（ＣＨＩ／ＰＧＡ）フィルムビルドアップ
自動堆積法を、他の種類の高分子電解質フィルムにも適用した。本発明者らは、高分子電解質系、すなわち（ＰＳＳ／ＰＡＨ）フィルムを選択したが、これは直線的に成長することが知られているとともに「モデル系」とみなされている。予想されたように、それらの乾燥厚については、４０対の層からなるフィルムについておよそ２５０ｎｍまで、堆積層対の数（図３３）と共に直線的に成長することが見出された。
【０１６１】
本発明者らは、高分子電解質フィルムがウェルの底に効率的に堆積し得ることを、（ＣＨＩ／ＰＧＡ）からなる別の高分子電解質系についてもチェックした。（ＣＨＩ／ＰＧＡ）１２フィルムの厚さは、共焦点顕微鏡イメージングから測定して２．２６±０．１４μｍであった。
【０１６２】
（実施例３）
（ＰＬＬ／ＨＡ）フィルム中への生物活性タンパク質の担持
実施例１及び実施例２で調製した高分子電解質フィルムにポスト担持させたタンパク質の均一性を評価した。
【０１６３】
（ＰＬＬ／ＨＡ）フィルムにおけるフィルム架橋及び生物活性タンパク質の担持
生物活性タンパク質を、Ｃｒｏｕｚｉｅｒ  Ｔら、Ｓｍａｌｌ  ２００９、５：５９８〜６０８頁に以前に記載の通りに（ＰＬＬ／ＨＡ）フィルムに担持させた。
【０１６４】
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ−プロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ、最終濃度１０、３０又は７０ｍｇ／ｍＬ）及び触媒としてＮ−ヒドロスルホスクシンイミドナトリウム塩（スルホ−ＮＨＳ、最終濃度１１ｍｇ／ｍＬ）を使用して、ｐＨ５．５で０．１５Ｍ  ＮａＣｌ溶液中で、フィルムをまず化学架橋した。フィルムを４℃で一晩インキュベートし、次いでＨＥＰＥＳ−ＮａＣｌバッファで十分に洗浄した。
【０１６５】
Ｃｒｏｕｚｉｅｒ  Ｔら、Ｓｍａｌｌ  ２００９、５：５９８〜６０８頁に以前に記載の通りにしたがって、（ＰＬＬ／ＨＡ）高分子電解質フィルムに、生物活性タンパク質として骨形成タンパク質（ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−９、又は２つのＢＭＰキメラ、すなわちキメラ１及びキメラ２）をマルチチャンネルピペットを使用して酸性ｐＨで、手動で担持させた。
【０１６６】
生物活性高分子電解質フィルムに対する細胞培養及び細胞応答
本発明者らは、ＢＭＰ−２応答性細胞、Ｃ２Ｃ１２骨格筋芽細胞（＜２５継代、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＡＴＣＣから入手した）を使用して、高分子電解質フィルムの生物活性を評価した。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、フランス）及び１００Ｕ／ｍＬペニシリンＧ及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ社、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、フランス）を補った、１：１ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）：ハムＦ１２培地（Ｇｉｂｃｏ社、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、フランス）中で、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で、組織培養ペトリ皿中で以前に記載の通りに（Ｃｒｏｕｚｉｅｒ  Ｔら、Ｓｍａｌｌ  ２００９、５：５９８〜６０８頁）、細胞を培養した。次いで、それらの培地中に含まれる１５０００細胞／ｃｍ２を各ウェルに播種した。４時間及び２４時間の接着後、位相差画像を取得し、試料はまた４％パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ、フランス）に固定した。核は、ＤＡＰＩ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使用して及びアクチン細胞骨格はローダミン−ファロイジン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）を使用して染色した。
【０１６７】
Ｄ１マウス間葉系幹細胞（Ｄ１）の培養
Ｄ１細胞培養を、増殖培地（８９％ａＭＥＭ（ｓｉｇｍａ社Ｍ４５２６）、１％抗生物質（ペニシリンストレプトマイシンミックス、１５１４０１２２  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社））を含む１０％ＦＢＳ中でまず２日間行い、続いて、分化培地（５０μｇ／ｍｌのＬ−アスコルビン酸２−リン酸及びセスキマグネシウム塩水和物（Ｓｉｇｍａ社Ａ８９６０）及び１０ｍＭ  β−グリセロールリン酸二ナトリウム塩五水和物（Ｓｉｇｍａ社５００２０）を補充した増殖培地）中で、７日まで行った。各ウェルに９３７５細胞を播種した。細胞培養を停止した後、ＡＬＰ活性を酵素アッセイにより評価した。
【０１６８】
ヒト骨膜由来幹細胞（ｈＰＤＳＣ）の培養
ヒト骨膜由来幹細胞（１０から１４の間継代）を、２５０μＭアスコルビン酸２リン酸の存在下の１０％ＦＢＳの存在下でＤＭＥＭ／高グルコース中で培養した。それらをほぼ２００μＬの培地中に５０００細胞／ｃｍ２（ウェルあたりほぼ１７００細胞）の密度で播種した。培地は２〜３日毎に交換し、細胞培養は２週間行った。
【０１６９】
アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の生物活性
所定の日数の培養後（Ｃ２Ｃ１２について３日間、Ｄ１細胞について３日間及びｈＰＤＳＣについて１４日間）、増殖培地を除去し、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した。製造者の取扱い説明書にしたがって、０．０１％（ｗ／ｖ）ナフトールＡＳ−ＭＸ溶液中に含まれるＡＬＰ活性ファストブルーＲＲ塩（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）に、それらを染色した。
【０１７０】
ＡＬＰ酵素活性。
培養培地を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄し、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００のＰＢＳ  ５００ｍＬ中で５秒にわたって超音波処理することによって溶解した。次いで、これらの溶解物のＡＬＰ活性を標準的プロトコールを使用して定量化し、相応する総タンパク質含有量に対して正規化し、タンパク質含量は、ビシンコニン酸タンパク質アッセイキット（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ社、フランス）を使用して決定した。
【０１７１】
高分子電解質フィルムに担持された生物活性タンパク質の均一性の分析
（ＰＬＬ／ＨＡ）フィルムにおけるＢＭＰ−２担持の均一性を評価するために、カルボキシフルオレセインで標識したＢＭＰ−２（ＢＭＰ−２ＣＦ）を使用し（総ＢＭＰ−２濃度の５％）、マトリックス結合ＢＭＰ−２のみを得るためにフィルムを十分にすすいだ後、Ｈｅｐｅｓ−ＮａＣｌバッファ中でウェルのタイルスキャンを実施した。
【０１７２】
ＢＭＰタンパク質の生物活性をＢＭＰ応答性細胞を使用して評価した。
【０１７３】
始めに、本発明者らは、３０ｍｇ／ｍＬのＥＤＣ最終濃度で架橋されたフィルム（すなわちＥＤＣ３０と注記）で作業することを選択したが、なぜなら、これらのフィルムがマトリックス結合様式でＢＭＰ−２を提示していない場合、フィルムは細胞に対して接着性が劣ることが知られているからである。フィルムが不均一なほど、マトリックス結合ＢＭＰに対する細胞応答の差があると予想される。
【０１７４】
ＥＤＣ３０フィルム上のマトリックス結合ＢＭＰ−２によって細胞の接着及び伸展が劇的に増大するので、本発明者らは２４時間での細胞接着をまず評価した。（図３０）。
【０１７５】
これらの実験では、ＮＴ＿１０％とＴ＿１０％との２つの「極端な条件」を選択し且つ表面ウエット条件を選択した。
【０１７６】
細胞は、ＮＴ＿１０％条件では円形で接着性が劣るように見えたが、Ｔ＿１０％条件ではより多数で且つより伸展もしていた。
【０１７７】
ＢＭＰ−２の生物活性は、早期の骨マーカーである、アルカリホスファターゼの発現に染色することによって迅速に評価することができる（図３１）。細胞染色及び相応する定量化の後にみることができるように、全ての条件によって、ＢＭＰ−２用量依存性で且つ有意なＡＬＰ発現がもたらされる。
【０１７８】
幹細胞の接着と運命のハイスループットスクリーニング
本発明者らは、Ｔ＿１０％条件を選択して、幹細胞上の細胞プロセスをハイスループットでスクリーニングするためのマトリックス結合タンパク質の汎用性を更に証明した。
【０１７９】
本発明者らは、マトリックス結合ＢＭＰ−７がマウスＤ１幹細胞に対して生物活性であるかどうかまず試験した（図３２）。この目的のために、細胞を生物活性高分子電解質フィルム上で９日までの間培養した。本発明者らは、細胞がマトリックス結合ＢＭＰ−７に選択的に接着し、少なくとも９日までの間、増殖できることを見出した。注目すべきことに、細胞はマトリックス結合ＢＭＰ−７の非存在下では剥離し、その存在下では結節を形成した。細胞のＡＬＰ発現は、マトリックス結合ＢＭＰ−７の量に直接左右され、プラトー値まで指数関数的に大きくなる（図３２のグラフのフィット）。
【０１８０】
本発明者らは、マトリックス結合ＢＭＰがマウスＣ２Ｃ１２骨格筋芽細胞に対して生物活性であるかかどうか、更に試験した（図３４及び図３５）。
【０１８１】
この目的のため、本発明者らは、これらのＢＭＰをバイオミメティックフィルムに効果的に担持し得ることをまず確認した（Ｔａｂｌｅ  ４（表４））。
【０１８２】
【表４】
2020503012.tif 000010
【０１８３】
細胞を生物活性高分子電解質フィルム（異なる５つのＢＭＰタンパク質及び異なる４つのＢＭＰ担持濃度）上で３日間培養した。本発明者らは、細胞がマトリックス結合ＢＭＰに選択的に接着し、この期間に増殖することを見出した。細胞のＡＬＰ発現を、異なる２つの方法を使用してハイスループットで評価した：第１に、ＡＬＰ染色をスキャナーを使用して可視化し、マイクロプレート全体の画像を撮像し、各個々のウェルにおけるＡＬＰ発現を示した（図３４）。第２に、ウェルモード毎のマルチプルリードを使用して５７０ｎｍでの吸光度を定量化することにより、ＡＬＰ染色をＴｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  １０００マイクロプレートリーダーを使用してハイスループットで定量化した（異なる７６の位置を各個々のマイクロウェルで測定し、これら７６の位置の平均値を取った）。この定量化は、溶液中のＢＭＰの初期濃度の関数としてＡＬＰをプロットすることを可能にし（図３５）、これによって、用量依存的なＡＬＰ応答が明確に示されている：ＡＬＰ強度はＢＭＰの種類に左右され（ＢＭＰ−９＞ＢＶ２６５＞ＢＭＰ−２＞ＢＭＰ−４＞ＢＭＰ−７の順序で）且つＢＭＰの用量に依存する（ＢＭＰ濃度の増大と共にＡＬＰ発現の増加）。プラトー値に向かっての相応する指数関数的フィット（実線及び破線）は、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−９、ＢＶ２６５、ＢＭＰ−４に対しても得られるが、フィットはＢＭＰ−７に対しては直線的であった（実線）。
【０１８４】
（実施例４）
リキッドハンドリングマシンを使用する、自動（ＰＬＬ／ＰＧＡ）フィルムビルドアップ及び細胞の接着及び伸展のハイスループットスクリーニング
自動堆積法を、別の種類の高分子電解質フィルムにも、すなわち本発明者らが細胞接着について以前に研究した（ＰＧＡ／ＰＬＬ）フィルムにも適用した（Ｐｉｃａｒｔら、Ａｄｖ．  Ｆｕｎｃｔ  Ｍａｔ  ２００５）。
【０１８５】
この研究では、本発明者らは、Ｔ＿１０％の条件のみを使用して作製したフィルムを使用した。
【０１８６】
（ＰＧＡ／ＰＬＬ）フィルムは、５層対（例えば（ＰＧＡ／ＰＬＬ）５フィルム）からなり、そのままであるか（例えば架橋されていない、ＣＬ０）又は異なる程度に架橋されているか（ＣＬ５、ＣＬ１０、ＣＬ３０、以下ＥＤＣ５、ＥＤＣ１０，  ＥＤＣ３０ｎと称する）のいずれかであった。したがって、合計で異なる４つのフィルム条件が存在した。リキッドハンドリングマシンを使用してＨｅｐｅｓ−ＮａＣｌバッファでフィルムを最後にすすいだ。これらのフィルムの上面に、最終層を堆積させた。それは、固定された比率でのＰＧＡとＰＧＡ−ＲＧＤペプチド（ＰＧＡにグラフトされたＲＧＤ含有ペプチド）の混合物より構成されている。最終層の異なる４つの条件を研究するために、最終層の堆積に使用されたＰＧＡ／ＰＧＡ−ＲＧＤ比は様々であった：Ｐ０（３／０）；Ｐ１（２／１）；Ｐ２（１／２）；Ｐ３：（０／３）。Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２を９６ウェルマイクロプレートに３５００細胞／ウェル（およそ１０  ５００細胞／ｃｍ２）の密度で播種した。
【０１８７】
本発明者らは、顕微鏡のタイルスキャンオプションを使用して観察して、バイオミメティックフィルムが各ウェル内部で均一であることをまず確認した（図３６、直径約６ｍｍのウェル全体を示す）。
【０１８８】
無血清培地中における異なるバイオミメティックフィルムの上面での１時間の細胞培養後に、細胞の接着及び伸展について次に定量化した。そのために、細胞の核（ヘキストで染色）及び細胞骨格（ローダミンファロイジンで染色）を染色した。自動Ｚｅｉｓｓ蛍光顕微鏡を使用して、２つのチャンネルにて２０×対物レンズでハイスループットで画像を自動的に取得した。接着細胞の数は、未架橋フィルム（ＣＬ  ０）及び低架橋度フィルム（ＣＬ  ５）についてはＲＧＤ−ペプチドの濃度と共に増加するが、より高いＣＬフィルム（ＣＬ  １０及びＣＬ  ３０）についてはペプチド非依存性であった（図３７）。細胞伸展面積（図３８）に関しては、ペプチドの量が増加した場合、筋芽細胞の伸展が増強された状態で、明確なペプチド依存性の細胞伸展面積が目視可能であった。したがって、本発明者らは、ペプチド格子層を含有する（ＰＧＡ／ＰＬＬ）バイオミメティックフィルムは、ハイスループットで細胞の接着及び伸展を行うために使用できると、結論できる。
【図１】
2020503012.tif 000011
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
2020503012.tif 000048
【手続補正書】
【提出日】令和1年8月14日(2019.8.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マルチウェルプレートの少なくとも１つのウェルの底面を高分子電解質多層フィルムによってコーティングする方法であって、ｎ回の連続するシーケンスを含み、ｎは１から２０００までの整数であり、各シーケンスは、
ａ）  アミノ基を含むカチオン性ポリマー、又はアニオン性ポリマーのいずれかである、第１の高分子電解質ＰＥ１の溶液の体積ＶＰＥ１を、マルチウェルプレートの少なくとも１つのウェルの底面上にロボット堆積させる工程、次いで、
ｂ）  前記ＰＥ１の溶液の、ＶＰＥ１以上である吸引体積ＶａｓｐＰＥ１を、ロボット吸引する工程、次いで
ｃ）  ＰＥ１がアニオン性ポリマーである場合はアミノ基を含むカチオン性ポリマーであり又はＰＥ１がアミノ基を含むカチオン性ポリマーである場合はアニオン性ポリマーである第２の高分子電解質ＰＥ２の溶液の体積ＶＰＥ２を、前記底面上にロボット堆積させる工程、次いで、
ｄ）  前記ＰＥ２の溶液の、ＶＰＥ２以上である吸引体積ＶａｓｐＰＥ２を、ロボット吸引する工程、
を含む、方法。
【請求項２】
各シーケンスは、
−  工程ａ）と工程ｂ）との間に、１から３０分までの期間、第１の高分子電解質ＰＥ１の溶液を底面と接触させたままにする、インキュベーションの工程ａ’）、及び
−  工程ｃ）と工程ｄ）との間に、１から３０分までの期間、第２の高分子電解質ＰＥ２の溶液を底面と接触させたままにする、インキュベーションの工程ｃ’）、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
各シーケンスは、
−  工程ｂ）と工程ｃ）との間に、
ｂ２）  すすぎ溶液の体積ＶｒｉｎｓｅＰＥ１を前記底面上にロボット堆積させるサブ工程、次いで
ｂ３）  前記すすぎ溶液の、ＶｒｉｎｓｅＰＥ１以上である吸引体積ＶａｓｐｒｉｎｓｅＰＥ１を、ロボット吸引するサブ工程、
を含み、繰返しが可能である、すすぎ工程と、
−  工程ｄ）の後に、
ｄ２）  すすぎ溶液の体積ＶｒｉｎｓｅＰＥ２を前記底面上にロボット堆積させるサブ工程、次いで
ｄ３）  前記すすぎ溶液の、ＶｒｉｎｓｅＰＥ２以上である吸引体積ＶａｓｐｒｉｎｓｅＰＥ２を、ロボット吸引するサブ工程、
を含み、繰返しが可能である、すすぎ工程と
を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
各シーケンスは、
−  工程ｂ２）と工程ｂ３）との間に、０．２から１０分までの期間、すすぎ溶液を底面と接触させたままにする、インキュベーションの工程ｂ２’）、及び
−  工程ｄ２）と工程ｄ３）との間に、０．２から１０分までの期間、すすぎ溶液を底面と接触させたままにする、インキュベーションの工程ｄ２’）
を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
第１のシーケンスの工程ａ）の前に、前記少なくとも１つのウェルは、第１の高分子電解質ＰＥ１の溶液の体積Ｖｗｅｔで充填され、ｍＬで表される体積Ｖｗｅｔが、
Ｖｗｅｔｍｉｎ＝０．５×π（ｄ／２）２から
Ｖｗｅｔｍａｘ＝（２／３）×π（ｄ／２２）×Ｈ
（式中、
−  ｄは、ｍｍで表したウェルの直径であり、
−  Ｈは、ｍｍで表したウェルの高さである）までである、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
各シーケンスで、ＶａｓｐＰＥ１＝ＶＰＥ１及びＶａｓｐＰＥ２＝ＶＰＥ２である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
第１のシーケンスの工程ａ）の前に、第１のシーケンスの工程ａ）で堆積がその上で行われることになる各ウェルの底面上に、第１の高分子電解質ＰＥ１の溶液の体積Ｖｗｅｔをロボット堆積させる工程ａ０）を含む、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
第１のシーケンスの工程ａ）の前に、
ａ１）  第１の高分子電解質ＰＥ１の溶液の、Ｖｗｅｔよりも多い体積Ｖａ１）を、第１のシーケンスの工程ａ）で堆積がその上で行われることになる各ウェルの底面上にロボット堆積させる工程、次いで、
ａ２）  Ｖａ２）＝Ｖａ１）−Ｖｗｅｔ
である、前記第１の高分子電解質ＰＥ１の溶液の吸引体積Ｖａ２）を、ロボット吸引する工程、
を含む、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項９】
各シーケンスについて、各工程ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、及び存在する場合には各工程ｂ２）、ｂ３）、ｄ２）及びｄ３）で、前記底面は、水平の面に対して５から４０°までの傾き角αで傾いている、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
各シーケンスは、請求項２で規定の工程ａ’）及び工程ｃ’）を含み、及び／又は請求項４で規定の工程ｂ２’）及び工程ｄ２’）を含み、並びに、各シーケンスについて、工程ａ’）及び工程ｃ’）並びに／又は工程ｂ２’）及び工程ｄ２’）では、底面が水平の面内にある、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
各シーケンスでは、吸引体積ＶａｓｐＰＥ１は１．０５ＶＰＥ１から１．２０×ＶＰＥ１までであり、吸引体積ＶａｓｐＰＥ２は１．０５ＶＰＥ２から１．２０×ＶＰＥ２までである、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
アニオン性ポリマーはカルボキシル基を含み、ｎ回のシーケンスの後に、
ｅ）  カップリング剤の存在下で前記アミノ基とカルボキシル基とを反応させて、アミド結合を形成し且つ高分子電解質多層フィルムを架橋する工程、次いで
ｆ）  前記架橋高分子電解質多層フィルムをタンパク質含有溶液で処理して、前記架橋高分子電解質多層フィルムの上及び内部に前記タンパク質を組み込む工程
を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
工程ｅ）と工程ｆ）との間、又は工程ｆ）の後に、高分子電解質多層フィルムを乾燥する工程ｇ）を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ｎ回のシーケンスの後に、前記底面上に第３の高分子電解質ＰＥ３の溶液の体積ＶＰＥ３をロボット堆積させる工程ｅ’）を含み、
−  高分子電解質ＰＥ３は少なくともペプチドに連結し、
−  第３の高分子電解質ＰＥ３は、ＰＥ２がアニオン性ポリマーである場合はアミノ基を含むカチオン性ポリマーであり、又はＰＥ２がアミノ基を含むカチオン性ポリマーである場合はアニオン性ポリマーである、
請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法によって得ることができるマルチウェルプレート。
【請求項１６】
細胞培養のための、請求項１５に記載のマルチウェルプレートの使用。
【国際調査報告】
2020503012.tif 000049
2020503012.tif 000050