(57)【要約】  本発明は、食道癌がＥＲＢＢ３  阻害薬（例えば抗ＥＲＢＢ３  抗体）による治療に対して感受性であるかまたは耐性であるかを予測する方法であって、具体的には、ＳＤＣ、ＰＴＧＥＳ、ＮＣＦ２、ＮＯＸＡ１、ＣＡＲＤ６、ＧＮＡＺから選択される少なくとも一種のマーカーの腫瘍サンプル中のＲＮＡ  レベルまたはタンパク質レベルの発現を測ることにより予測する方法を開示する。【選択図】図１２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
食道癌が抗ＥＲＢＢ３抗体処理に対して感受性であるかまたは耐性であるかを予測する方法であって、
前記方法は、
（ａ）前記食道癌のサンプル中のＳＤＣ２、ＰＴＧＥＳ、ＮＣＦ２、ＮＯＸＡ１、ＣＡＲＤ６およびＧＮＡＺから選択される一つまたは複数のバイオマーカーの発現レベルを測り、
（ｂ）前記発現レベルを対応するバイオマーカーの閾値発現レベルと比較することを含み、
前記ＳＤＣ２および／またはＧＮＡＺの発現レベルが前記閾値発現レベル以下、および／またはＰＴＧＥＳ、ＮＣＦ２、ＮＯＸＡ１またはＣＡＲＤ６から選択される一つまたは複数のバイオマーカーの発現レベルが前記閾値発現レベル以上である場合、前記食道癌は抗ＥＲＢＢ３抗体処理に対して感受性であると予測する方法。
【請求項２】
前記バイオマーカーはＮＲＧ１をさらに含み、ＮＲＧ１の発現レベルが前記閾値発現レベル以上である場合、前記食道癌は抗ＥＲＢＢ３抗体処理に対して感受性であることを表す請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗ＥＲＢＢ３抗体は以下の免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む抗体から選択される請求項１または２に記載の方法。
（ａ）（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、および
（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域、
（ｂ）（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、および
（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域、
（ｃ）（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２  のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、および
（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域、
（ｄ）（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、および
（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域、
（ｅ）（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、および
（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域、
（ｆ）（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、および
（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域、および
（ｇ）（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、および
（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域
【請求項４】
前記抗ＥＲＢＢ３抗体は以下の免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む抗体から選択される請求項１または２に記載の方法。
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン重鎖可変領域、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン軽鎖可変領域、
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン重鎖可変領域、およびＳＥＱ  ＩＤＮＯ：１８のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン軽鎖可変領域、
（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン重鎖可変領域、およびＳＥＱ  ＩＤＮＯ：２８のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン軽鎖可変領域、
（ｄ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン重鎖可変領域、およびＳＥＱ  ＩＤＮＯ：３７  のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン軽鎖可変領域、
（ｅ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン重鎖可変領域、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン軽鎖可変領域、
（ｆ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン重鎖可変領域、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン軽鎖可変領域、および
（ｇ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン重鎖可変領域、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン軽鎖可変領域
【請求項５】
前記抗ＥＲＢＢ３抗体は以下の免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖を含む抗体から選択される請求項１または２に記載の方法。
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン重鎖、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン軽鎖、
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン重鎖、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン軽鎖、
（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン重鎖、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン軽鎖、
（ｄ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン重鎖、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン軽鎖、
（ｅ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン重鎖、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン軽鎖、
（ｆ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン重鎖、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン軽鎖、および
（ｇ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン重鎖、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン軽鎖
【請求項６】
前記抗ＥＲＢＢ３抗体は、
（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、およびＳＥＱＩＤ  ＮＯ：３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、および
（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域
を含む請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
前記抗ＥＲＢＢ３抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン重鎖可変領域、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
前記抗ＥＲＢＢ３抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン重鎖、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン軽鎖を含む請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
前記バイオマーカーの発現レベルはバイオマーカーのタンパク質発現レベルである請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
前記バイオマーカーの発現レベルはバイオマーカーのｍＲＮＡ発現レベルである請求項１または２に記載の方法。
【請求項１１】
ＳＤＣ２、ＰＴＧＥＳ、ＮＣＦ２、ＮＯＸＡ１、ＣＡＲＤ６およびＧＮＡＺから選択される一つまたは複数のバイオマーカーの食道癌のサンプル中の発現レベルを測る試薬の、食道癌が抗ＥＲＢＢ３抗体処理に対して感受性であるかまたは耐性であるかを予測するキットの製造における使用。
【請求項１２】
前記キットは、
（ａ）前記試薬を用いて食道癌のサンプル中のＳＤＣ２、ＰＴＧＥＳ、ＮＣＦ２、ＮＯＸＡ１、ＣＡＲＤ６およびＧＮＡＺから選択される一つまたは複数のバイオマーカーの発現レベルを測り、および
（ｂ）前記発現レベルを対応するバイオマーカーの閾値発現レベルと比較する方法により食道癌が抗ＥＲＢＢ３抗体処理に対して感受性であるかまたは耐性であるかを予測する使用であって、
前記ＳＤＣ２および／またはＧＮＡＺの発現レベルが前記閾値発現レベル以下、および／またはＰＴＧＥＳ、ＮＣＦ２、ＮＯＸＡ１またはＣＡＲＤ６から選択される一つまたは複数のバイオマーカーの発現レベルが前記閾値発現レベル以上である場合、前記食道癌は抗ＥＲＢＢ３抗体処理に対して感受性であることを表す請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記バイオマーカーはＮＲＧ１をさらに含み、ＮＲＧ１の発現レベルが前記閾値発現レベル以上である場合、前記食道癌は抗ＥＲＢＢ３抗体処理に対して感受性であることを表す請求項１１に記載の使用。
【請求項１４】
前記抗ＥＲＢＢ３抗体は以下の免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む抗体から選択される請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の使用。
（ａ）（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、および
（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域、
（ｂ）（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、および
（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域、
（ｃ）（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、および
（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域、
（ｄ）（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、および
（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域、
（ｅ）（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、および
（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域、
（ｆ）（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、および
（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域、および
（ｇ）（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、および
（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域
【請求項１５】
前記抗ＥＲＢＢ３抗体は以下の免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む抗体から選択される請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の使用。
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン重鎖可変領域、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン軽鎖可変領域、
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン重鎖可変領域、およびＳＥＱ  ＩＤＮＯ：１８のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン軽鎖可変領域、
（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン重鎖可変領域、およびＳＥＱ  ＩＤＮＯ：２８のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン軽鎖可変領域、
（ｄ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン重鎖可変領域、およびＳＥＱ  ＩＤＮＯ：３７のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン軽鎖可変領域、
（ｅ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン重鎖可変領域、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン軽鎖可変領域、
（ｆ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン重鎖可変領域、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン軽鎖可変領域、および
（ｇ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン重鎖可変領域、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン軽鎖可変領域
【請求項１６】
前記抗ＥＲＢＢ３抗体は以下の免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖を含む抗体から選択される請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の使用。
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン重鎖、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン軽鎖、
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン重鎖、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン軽鎖、
（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン重鎖、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン軽鎖、
（ｄ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン重鎖、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン軽鎖、
（ｅ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン重鎖、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン軽鎖、
（ｆ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン重鎖、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン軽鎖、および
（ｇ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン重鎖、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン軽鎖
【請求項１７】
ＳＤＣ２、ＰＴＧＥＳ、ＮＣＦ２、ＮＯＸＡ１、ＣＡＲＤ６およびＧＮＡＺから選択される一つまたは複数のバイオマーカーの食道癌のサンプル中の発現レベルを測る試薬を含む、食道癌が抗ＥＲＢＢ３抗体処理に対して感受性であるかまたは耐性であるかを予測するキット。
【請求項１８】
ＮＲＧ１発現レベルを測る試薬をさらに含む請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
一種または複数種の対照としての他の遺伝子の発現レベルを測る試薬をさらに含む請求項１７に記載のキット。
【請求項２０】
前記抗ＥＲＢＢ３抗体は以下の免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む抗体から選択される請求項１７または１８に記載のキット。
（ａ）（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、および
（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域、
（ｂ）（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、および
（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域、
（ｃ）（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、および
（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域、
（ｄ）（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、および
（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域、
（ｅ）（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、および
（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域、
（ｆ）（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、および
（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域、および
（ｇ）（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、および
（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域
【請求項２１】
前記抗ＥＲＢＢ３抗体は以下の免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む抗体から選択される請求項１７または１８に記載のキット。
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン重鎖可変領域、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン軽鎖可変領域、
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン重鎖可変領域、およびＳＥＱ  ＩＤＮＯ：１８のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン軽鎖可変領域、
（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン重鎖可変領域、およびＳＥＱ  ＩＤＮＯ：２８のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン軽鎖可変領域、
（ｄ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン重鎖可変領域、およびＳＥＱ  ＩＤＮＯ：３７のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン軽鎖可変領域、
（ｅ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン重鎖可変領域、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン軽鎖可変領域、
（ｆ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン重鎖可変領域、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン軽鎖可変領域、および
（ｇ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン重鎖可変領域、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン軽鎖可変領域
【請求項２２】
前記抗ＥＲＢＢ３抗体は以下の免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖を含む抗体から選択される請求項１７または１８に記載のキット。
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン重鎖、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン軽鎖、
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン重鎖、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン軽鎖、
（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン重鎖、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン軽鎖、
（ｄ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン重鎖、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン軽鎖、
（ｅ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン重鎖、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン軽鎖、
（ｆ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン重鎖、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン軽鎖、および
（ｇ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン重鎖、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン軽鎖
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は腫瘍の臨床分子診断に関する。
【背景技術】
【０００２】
大多数の抗腫瘍薬は一部の腫瘍患者には有效であるが、他の患者には無効である。これは腫瘍間に遺伝子変化が存在するためであり、同一患者の異なる腫瘍においても見られる。標的治療について言えば、患者の応答はさらに各々異なってくる。従って、どの患者がどの薬の恩恵を受けるかを予測する適切な方法がないと、標的治療のポテンシャルを全て発揮できない。ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）によれば、用語「バイオマーカー」とは「客観的に測れる特徴であり、且つ、当該特徴は正常な生物の発病過程として、或いは治療的介入に対する薬理学的応答の指示薬として評価される」と定義されている（Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎｓ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ、２００１、Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．６９：８９−９５）。
【０００３】
どのような患者が特定の薬剤に対して臨床応答を最も示す可能性があるかを事前に鑑定することで新薬の研究開発を加速させることができる。同時に、これは臨床試験の規模、継続時間およびコストも顕著に縮小できる。現在、ゲノミクス、プロテオミクスおよび分子イメージングなどの技術により、特定の遺伝子変異、具体的な遺伝子の発現レベルおよび他の分子バイオマーカーを迅速に、高感度に、確実に検出可能となっている。複数種の技術が腫瘍分子の特徴付けに用いられているが、既知の癌バイオマーカーは非常に少ないため、癌バイオマーカーの臨床応用はほとんどまだ実現されていない。例えば、最近のレビュー論文では、癌の診断および治療を改善するために、バイオマーカーおよびそれらの使用の研究開発を加速させる必要が非常にあると記されている（Ｃｈｏ、２００７、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ６：２５）。
【０００４】
癌バイオマーカーに関する別のレビュー論文でも次のように指摘されている。現在の課題は癌バイオマーカーを発見することである。臨床では既に複数種の腫瘍（例えば慢性骨髄性白血病、消化管間質腫瘍、肺癌および多形性膠芽腫）において分子標的試薬の使用に成功しているが、標的試薬に対する患者の応答を評価する効果的な戦略が不足しているため、これら分子標的試薬の幅広い応用には制限がある。問題は主に、新薬を評価するために、分子定義された癌を用いて臨床試験を行う患者を選択できないことにある。従って、特定の試薬の恩恵を受ける可能性が最も高い患者を確実に鑑定できるバイオマーカーが必要である（Ｓａｗｙｅｒｓ、２００８、Ｎａｔｕｒｅ４５２：５４８−５５２、ａｔ５４８）。
【０００５】
上記の文献に記されているように、臨床で使用されるバイオマーカーおよびこの種のバイオマーカーに基づく診断方法を見つける必要がある。
【０００６】
以下の３種類の異なる癌バイオマーカーが知られている：（１）予後バイオマーカー、（２）予測バイオマーカー、および（３）薬力学（ＰＤ）バイオマーカー。予後バイオマーカーは、侵襲性（即ち、成長率および／または転移の速さ、および治療に対する不応）に基づいて癌を分類するために用いられ、例えば固形腫瘍である。これは「不良效果」腫瘍と区別するために、「良好效果」腫瘍と呼ばれることがある。予測バイオマーカーは特定の患者が特定の薬剤による治療の恩恵を受ける可能性を評価するために用いられる。例えば、乳癌を患っている患者は、そのＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）遺伝子が増幅されている場合、トラスツズマブによる治療の恩恵を受ける可能性があるが、ＥＲＢＢ２遺伝子が増幅されていない患者は、トラスツズマブによる治療の恩恵を受けない可能性がある。患者が薬を服用すると、ＰＤバイオマーカーはその分子標的に対する薬の作用を示す。従って、ＰＤバイオマーカーは通常、新薬臨床研究開発の早期段階で、用量レベルおよび投与頻度を指導するために用いられる。癌バイオマーカーの議論についてはＳａｗｙｅｒｓ、２００８、Ｎａｔｕｒｅ４５２：５４８−５５２を参照可能である。
【０００７】
ＥＧＦＲまたはＨＥＲ２によって駆動される腫瘍は、通常、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ２の阻害薬による処理に反応するが、これら腫瘍は常にこれら阻害薬に対して耐性を生じる。抗ＥＧＦＲまたは抗ＨＥＲ２治療に対して耐性を生じるメカニズムの一つはＥＲＢＢ３（ＨＥＲ３とも称する）シグナル伝達の活性化である。例えばＥｎｇｅｌｍａｎ等、２００６、Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１２：４３７２、Ｒｉｔｔｅｒ等、２００７、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１３：４９０９、Ｓｅｒｇｉｎａ等、２００７、Ｎａｔｕｒｅ４４５：４３７を参照されたい。この他、ＮＲＧ１誘導ＨＥＲ２−ＥＲＢＢ３ヘテロダイマーの活性化は、ＥＧＦＲ阻害薬に対する耐性にも関係している（Ｚｈｏｕ等、２００６、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ１０：３９）。従って、ＥＲＢＢ３は薬剤耐性の研究開発において重要な役割を果たし、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２と形成したヘテロダイマーにより腫瘍の阻害および保持に関わる。ＥＲＢＢ３はキナーゼ活性が欠如しているため、ＥＲＢＢ３阻害薬、特に抗ＥＲＢＢ３抗体の研究開発に注目が集まっている。
【０００８】
他の種類の標的治療と同様に、全てではないが一部の腫瘍は抗ＥＲＢＢ３の治療に反応している。従って、腫瘍がＥＲＢＢ３阻害薬（例えば抗ＥＲＢＢ３抗体）による治療に対して応答を生じる可能性がある（またはその可能性がない）患者を鑑定するのに用いることができる予測バイオマーカーに基づく方法が必要である。
【０００９】
近年、ニューレグリン−１（ＮＲＧ１）の発現はＥＲＢＢ３阻害薬（例えば抗ＥＲＢＢ３抗体）による治療に対する腫瘍の感受性と関連することが分かっている。ＥＲＢＢ３の一つの主要なリガンドとして、ＮＲＧ１はＥＲＢＢ３と他のＥＲＢＢファミリーメンバーのヘテロダイマー化を促進することで複数種の細胞内シグナル経路を活性化できる。Ｍｅｅｔｚｅ等の報告によれば、抗ＥＲＢＢ３抗体が引き起こす腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）はＥＲＢＢ３の発現レベルと関連せず、ＮＲＧ１の発現レベルと有意に相関している。即ち、腫瘍のサンプル中のＮＲＧ１発現レベルがある閾値以上である場合、前記腫瘍は抗ＥＲＢＢ３抗体による処理に応答を生じる可能性がある。従ってＮＲＧ１は腫瘍がＥＲＢＢ３阻害薬（例えば抗ＥＲＢＢ３抗体）による治療に対して応答を生じるか否かを予測するための効果的なバイオマーカーとして期待される（ＣＮ１０３９５９０６５ＡおよびＳｅｒｇｉｎａ等、２０１５、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ；２１（５）、１１０６−１１１３参照）。
【００１０】
しかし、本発明者は、食道癌異種移植モデルにおいて、ＮＲＧ１発現レベルの低いモデルは常に抗ＥＲＢＢ３抗体に対して感受性ではないが、ＮＲＧ１発現レベルの高いモデルは抗ＥＲＢＢ３抗体処理に対して応答を生じるまたは応答を生じない可能性があることを発見した（実施例２参照）。これはバイオマーカーとしてＮＲＧ１を単独で使用することにより食道癌がＥＲＢＢ３抗体による処理に応答を生じるか否かを予測するのはあまり効果的ではないことを示す。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】ＣＮ１０３９５９０６５Ａ
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎｓ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ、２００１、Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．６９：８９−９５
【非特許文献２】Ｃｈｏ、２００７、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ６：２５
【非特許文献３】Ｓａｗｙｅｒｓ、２００８、Ｎａｔｕｒｅ４５２：５４８−５５２、ａｔ５４８
【非特許文献４】Ｅｎｇｅｌｍａｎ等、２００６、Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１２：４３７２
【非特許文献５】Ｒｉｔｔｅｒ等、２００７、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１３：４９０９
【非特許文献６】Ｓｅｒｇｉｎａ等、２００７、Ｎａｔｕｒｅ４４５：４３７
【非特許文献７】Ｚｈｏｕ等、２００６、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ１０：３９
【非特許文献８】Ｓｅｒｇｉｎａ等、２０１５、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ；２１（５）、１１０６−１１１３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
従って、単独使用する、またはＮＲＧ１と合わせて使用するときに、食道癌がＥＲＢＢ３抗体による処理に応答を生じるか否かを正確に予測できる他のバイオマーカーの提供が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の一部は次のような発見に基づいている：食道癌から得られた組織サンプル中、ＳＤＣ２、ＰＴＧＥＳ、ＮＣＦ２、ＮＯＸＡ１、ＣＡＲＤ６、ＧＮＡＺの発現レベルは、ＥＲＢＢ３抗体による処理に対する食道癌の感受性に関連している。驚くべきことに、本発明者は、この相関性が、上記６個のバイオマーカーＳＤＣ２、ＰＴＧＥＳ、ＮＣＦ２、ＮＯＸＡ１、ＣＡＲＤ６およびＧＮＡＺのそれぞれの単独の発現レベルが全て、食道癌がＥＲＢＢ３抗体による処理に対して感受性であるかまたは耐性であるかを予測するのに十分に用いることができるほど非常に強いことを発見した。本発明者はさらに、上記バイオマーカーの併用（即ち、２個以上のバイオマーカーを使用すること）がＥＲＢＢ３抗体による処理に対する食道癌の感受性を予測する有効性をさらに高めることを発見した。従って、本発明は食道癌がＥＲＢＢ３阻害薬（  例えば抗ＥＲＢＢ３抗体）処理に対して感受性であるかまたは耐性であるかを予測する方法を提供する。前記方法は、（ａ）食道癌のサンプル中のＳＤＣ２、ＰＴＧＥＳ、ＮＣＦ２、ＮＯＸＡ１、ＣＡＲＤ６およびＧＮＡＺから選択される一つまたは複数のバイオマーカーの発現レベルを測り、（ｂ）前記発現レベルを対応するバイオマーカーの閾値発現レベルと比較することを含み、前記ＳＤＣ２および／またはＧＮＡＺの発現レベルが前記閾値発現レベル以下、および／またはＰＴＧＥＳ、ＮＣＦ２、ＮＯＸＡ１またはＣＡＲＤ６から選択される一つまたは複数のバイオマーカーの発現レベルが前記閾値発現レベル以上である場合、前記食道癌はＥＲＢＢ３阻害薬（例えば抗ＥＲＢＢ３抗体）処理に対して感受性であることを表す。逆に、前記ＳＤＣ２および／またはＧＮＡＺの発現レベルが前記閾値発現レベルより高い、および／またはＰＴＧＥＳ、ＮＣＦ２、ＮＯＸＡ１またはＣＡＲＤ６から選択される一つまたは複数のバイオマーカーの発現レベルが前記閾値発現レベルより低い場合、前記食道癌はＥＲＢＢ３阻害薬（例えば抗ＥＲＢＢ３抗体）処理に対して耐性であることを表す。
【００１５】
一つの実施形態において、本発明の方法はＮＲＧ１遺伝子の発現レベルを測ることをさらに含み、前記ＮＲＧ１発現レベルがその閾値発現レベル以上である場合、当該食道癌はＥＲＢＢ３阻害薬（例えば抗ＥＲＢＢ３抗体）処理に対して感受性であることを表す。
【００１６】
一つの実施形態において、本発明の方法は、（ａ）食道癌のサンプル中のＳＤＣ２、ＰＴＧＥＳ、ＮＣＦ２、ＮＯＸＡ１、ＣＡＲＤ６およびＧＮＡＺから選択される一つまたは複数のバイオマーカーの発現レベルを測り、（ｂ）前記発現レベルを対応するバイオマーカーの閾値発現レベルと比較することを含み、前記ＳＤＣ２および／またはＧＮＡＺの発現レベルが前記閾値発現レベル以下であり、且つＰＴＧＥＳ、ＮＣＦ２、ＮＯＸＡ１またはＣＡＲＤ６から選択される一つまたは複数のバイオマーカーの発現レベルが前記閾値発現レベル以上である場合、前記食道癌はＥＲＢＢ３阻害薬（例えば抗ＥＲＢＢ３抗体）処理に対して感受性であることを表す。
【００１７】
本発明のバイオマーカー（即ちＳＤＣ２、ＰＴＧＥＳ、ＮＣＦ２、ＮＯＸＡ１、ＣＡＲＤ６およびＧＮＡＺならびにＮＲＧ１）の発現レベルとはタンパク質の発現レベルまたはｍＲＮＡの発現レベルを指す。タンパク質の発現は当業者に周知の各種の方法により測ることができる。例えば免疫組織化学（ＩＨＣ）分析、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロッティング、免疫蛍光法等である。ｍＲＮＡの発現レベルも当業者に周知の各種の方法により測ることができる。例えば定量ＰＣＲ、マイクロアレイ、デジタルＰＣＲ、トランスクリプトームシークエンシング（ＲＮＡｓｅｑ）等である。
【００１８】
本発明の別の面において、ＳＤＣ２、ＰＴＧＥＳ、ＮＣＦ２、ＮＯＸＡ１、ＣＡＲＤ６およびＧＮＡＺから選択される一つまたは複数のバイオマーカーの食道癌のサンプル中の発現レベルを測る試薬の、食道癌がＥＲＢＢ３抗体処理に対して感受性であるかまたは耐性であるかを識別する診断テストキットの製造における使用を提供する。一つの実施形態において、上記バイオマーカーはＮＲＧ１をさらに含む。
【００１９】
本発明の別の面において、ＳＤＣ２、ＰＴＧＥＳ、ＮＣＦ２、ＮＯＸＡ１、ＣＡＲＤ６およびＧＮＡＺから選択される一つまたは複数のバイオマーカーの食道癌のサンプル中の発現レベルを測る試薬を含む、食道癌が抗ＥＲＢＢ３抗体処理に対して感受性であるかまたは耐性であるかを予測する診断テストキットを提供する。一つの実施形態において、本発明のキットはＮＲＧ１発現レベルを測る試薬をさらに含む。前記試薬は当業者に周知である遺伝子のｍＲＮＡまたはタンパク質発現レベルを測る試薬である。例えば、リアルタイム定量ＰＣＲでｍＲＮＡ発現レベルを測るとき、前記試薬は本発明のバイオマーカーを特異的に増幅するプライマー、ＤＮＡポリメラーゼおよびその発現レベルを測る緩衝液、反応物等を含む。ＩＨＣ分析でタンパク質発現レベルを測るとき、前記試薬は本発明のバイオマーカーに対する抗体（一次抗体）および一次抗体と結合する検出抗体（二次抗体）等を含む。一つの実施形態において、本発明のキットは一種または複数種の対照としての他の遺伝子の発現レベルを測る試薬をさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】抗ＥＲＢＢ３抗体の免疫グロブリン重鎖可変領域配列のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３配列（Ｋａｂａｔ定義）を示す概略図であり、前記抗体はＣＡＮ０１７、０４Ｄ０１、０９Ｄ０３、１１Ｇ０１、１２Ａ０７、１８Ｈ０２および２２Ａ０２として表される（図２の囲み枠で示される領域に対応）。
【図２】抗ＥＲＢＢ３抗体の完全な免疫グロブリン重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す概略図であり、前記抗体はＣＡＮ０１７、０４Ｄ０１、０９Ｄ０３、１１Ｇ０１、１２Ａ０７、１８Ｈ０２および２２Ａ０２として表される。各抗体のアミノ酸配列を照合し、相補性決定配列（ＣＤＲ）（Ｋａｂａｔ定義）、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３は囲み枠で示される。囲み枠外の配列はフレームワーク（ＦＲ）配列を表す。
【図３】抗ＥＲＢＢ３抗体の免疫グロブリン軽鎖可変領域配列のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３配列（Ｋａｂａｔ定義）を示す概略図であり、前記抗体はＣＡＮ０１７、０４Ｄ０１、０９Ｄ０３、１１Ｇ０１、１２Ａ０７、１８Ｈ０２および２２Ａ０２として表される（図４の囲み枠で示される領域に対応）。
【図４】抗ＥＲＢＢ３抗体の完全な免疫グロブリン軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す概略図であり、前記抗体はＣＡＮ０１７、０４Ｄ０１、０９Ｄ０３、１１Ｇ０１、１２Ａ０７、１８Ｈ０２および２２Ａ０２として表される。各抗体のアミノ酸配列を互いに照合し、相補性決定配列（ＣＤＲ）（Ｋａｂａｔ定義）、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３は囲み枠で示される。囲み枠外の配列はフレームワーク（ＦＲ）配列を表す。
【図５】（Ａ）全長ＣＡＮ０１７免疫グロブリン重鎖および（Ｂ）全長ＣＡＮ０１７免疫グロブリン軽鎖を定義するアミノ酸配列を提供する図である。
【図６】（Ａ）全長０４Ｄ０１免疫グロブリン重鎖および（Ｂ）全長０４Ｄ０１免疫グロブリン軽鎖を定義するアミノ酸配列を提供する図である。
【図７】（Ａ）全長０９Ｄ０３免疫グロブリン重鎖および（Ｂ）全長０９Ｄ０３免疫グロブリン軽鎖を定義するアミノ酸配列を提供する図である。
【図８】（Ａ）全長１１Ｇ０１免疫グロブリン重鎖および（Ｂ）全長１１Ｇ０１免疫グロブリン軽鎖を定義するアミノ酸配列を提供する図である。
【図９】（Ａ）全長１２Ａ０７免疫グロブリン重鎖および（Ｂ）全長１２Ａ０７免疫グロブリン軽鎖を定義するアミノ酸配列を提供する図である。
【図１０】（Ａ）全長１８Ｈ０２免疫グロブリン重鎖および（Ｂ）全長１８Ｈ０２免疫グロブリン軽鎖を定義するアミノ酸配列を提供する図である。
【図１１】（Ａ）全長２２Ａ０２免疫グロブリン重鎖および（Ｂ）全長２２Ａ０２免疫グロブリン軽鎖を定義するアミノ酸配列を提供する図である。
【図１２】食道癌異種移植モデルにおいて、ｈＩｇＧ（２０ｍｇ／ｋｇ）および抗ＥＲＢＢ３抗体ＣＡＮ０１７（２０ｍｇ／ｋｇ）の腫瘍阻害活性を測った実験結果のまとめである。
【図１３】上図は散布図であり、２０個の異種移植物モデルにおけるＣＡＮ０１７の生体内効力（腫瘍成長阻害の百分比（ＴＧＩ）として表される）とＳＤＣ２のｍＲＮＡ発現レベルとの関係を示す。２０個のデータポイントは（黒丸）で表示され、実線はＳＤＣ２のｍＲＮＡ発現レベルと腫瘍成長阻害との相関性を示す。下図はＳＤＣ２のｍＲＮＡ発現レベルと腫瘍成長阻害との相関性の有意差分析である。
【図１４】上図は散布図であり、２０個の異種移植物モデルにおけるＣＡＮ０１７の生体内効力（腫瘍成長阻害の百分比（ＴＧＩ）として表される）とＧＮＡＺのｍＲＮＡ発現レベルとの関係を示す。２０個のデータポイントは（黒丸）で表示され、実線はＧＮＡＺのｍＲＮＡ発現レベルと腫瘍成長阻害との相関性を示す。下図はＧＮＡＺのｍＲＮＡ発現レベルと腫瘍成長阻害との相関性の有意差分析である。
【図１５】上図は散布図であり、２０個の異種移植物モデルにおけるＣＡＮ０１７の生体内効力（腫瘍成長阻害の百分比（ＴＧＩ）として表される）とＮＣＦ２のｍＲＮＡ発現レベルとの関係を示す。２０個のデータポイントは（黒丸）で表示され、実線はＮＣＦ２のｍＲＮＡ発現レベルと腫瘍成長阻害との相関性を示す。下図はＮＣＦ２のｍＲＮＡ発現レベルと腫瘍成長阻害との相関性の有意差分析である。
【図１６】上図は散布図であり、２０個の異種移植物モデルにおけるＣＡＮ０１７の生体内効力（腫瘍成長阻害の百分比（ＴＧＩ）として表される）とＮＯＸＡ１のｍＲＮＡ発現レベルとの関係を示す。２０個のデータポイントは（黒丸）で表示され、実線はＮＯＸＡ１のｍＲＮＡ発現レベルと腫瘍成長阻害との相関性を示す。下図はＮＯＸＡ１のｍＲＮＡ発現レベルと腫瘍成長阻害との相関性の有意差分析である。
【図１７】上図は散布図であり、２０個の異種移植物モデルにおけるＣＡＮ０１７の生体内効力（腫瘍成長阻害の百分比（ＴＧＩ）として表される）とＰＴＧＥＳのｍＲＮＡ発現レベルとの関係を示す。２０個のデータポイントは（黒丸）で表示され、実線はＰＴＧＥＳのｍＲＮＡ発現レベルと腫瘍成長阻害との相関性を示す。下図はＰＴＧＥＳのｍＲＮＡ発現レベルと腫瘍成長阻害との相関性の有意差分析である。
【図１８】上図は散布図であり、２０個の異種移植物モデルにおけるＣＡＮ０１７の生体内効力（腫瘍成長阻害の百分比（ＴＧＩ）として表される）とＣＡＲＤ６のｍＲＮＡ発現レベルとの関係を示す。２０個のデータポイントは（黒丸）で表示され、実線はＣＡＲＤ６のｍＲＮＡ発現レベルと腫瘍成長阻害との相関性を示す。下図はＣＡＲＤ６のｍＲＮＡ発現レベルと腫瘍成長阻害との相関性の有意差分析である。
【図１９】ＧＮＡＺおよびＮＲＧ１の発現レベルと腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）百分比との関係を示す概略図である。Ｙ軸に平行な実線はＮＲＧ１の閾値発現レベル２．０５を示し、Ｘ軸に平行な実線はＧＮＡＺの閾値発現レベル１．１を示す。黒菱形はＴＧＩ＜７０％を示し、白三角はＴＧＩ＞７０％を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
定義
本明細書で使用されるように、「ＣＡＮ０１７」とはヒト化抗ヒトＥＲＢＢ３モノクローナル抗体を指し、その全長重鎖アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９であり、その全長軽鎖アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０である。
【００２２】
本明細書で使用されるように、「ＥＲＢＢ３」（ＨＥＲ３とも称される）とは下記遺伝子およびその対立遺伝子変異体によってコード化されたヒトタンパク質を指し、前記遺伝子はＥｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ  Ｎｏ．２０６５として識別される。
【００２３】
本明細書で使用されるように、「ＥＲＢＢ３阻害薬」とはＥＲＢＢ３と結合し、ＥＲＢＢ３の腫瘍細胞中の生物学的活性を阻害、中和、防止または除去する分子（小分子または高分子、例えば抗体またはその抗原結合断片）を指す。
【００２４】
本明細書で使用されるように、「ＮＲＧ１」（ニューレグリン−１、ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ、ＨＲＧまたはＨＲＧ１とも称される）とはＥｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ  Ｎｏ．３０８４およびその対立遺伝子変異体によってコード化されたヒトタンパク質を指す。
【００２５】
本明細書で使用されるように、「ＳＤＣ２」（シンデカン２とも称される）とはＥｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ  Ｎｏ．６３８３およびその対立遺伝子変異体によってコード化されたヒトタンパク質を指す。
【００２６】
本明細書で使用されるように、「ＮＣＦ２」（好中球サイトカイン２とも称される）とはＥｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ  Ｎｏ．４６８８およびその対立遺伝子変異体によってコード化されたヒトタンパク質を指す。
【００２７】
本明細書で使用されるように、「ＮＯＸＡ１」（ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性剤１とも称される）とはＥｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ  Ｎｏ．１０８１１およびその対立遺伝子変異体によってコード化されたヒトタンパク質を指す。
【００２８】
本明細書で使用されるように、「ＧＮＡＺ」（Ｇタンパク質サブユニットαＺとも称される）とはＥｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ  Ｎｏ．２７８１およびその対立遺伝子変異体によってコード化されたヒトタンパク質を指す。
【００２９】
本明細書で使用されるように、「ＰＴＧＥＳ」（プロスタグランジンＥ合成酵素とも称される）とはＥｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ  Ｎｏ．９５３６およびその対立遺伝子変異体によってコード化されたヒトタンパク質を指す。
【００３０】
本明細書で使用されるように、「ＣＡＲＤ６」（カスパーゼ動員ドメインファミリーメンバー６とも称される）とはＥｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ  Ｎｏ．８４６７４およびその対立遺伝子変異体によってコード化されたヒトタンパク質を指す。
【００３１】
本明細書で使用されるように、処理に対して生じる「反応」または「応答」とは処理される腫瘍について言えば、腫瘍が（ａ）成長緩慢、（ｂ）成長停止、または（Ｃ）衰退することを示すことを指す。
【００３２】
本明細書で使用されるように、「発現レベル」とは本発明の食道癌のサンプル中のバイオマーカーの発現レベルを指す。例えば、発現レベルは（１）ＲＮＡｓｅｑで測ったｍＲＮＡ発現レベル（ＦＰＫＭにより標準化）、または（２）ＩＨＣテストにおける染色強度として表すことができる。閾値発現レベルを用いて本発明のバイオマーカーの発現レベルを説明することができ、これは、例えばＲＯＣ曲線分析を用いて、閾値測定分析において経験的に測定できる。
【００３３】
本明細書で使用されるように、「閾値測定分析」とは、食道癌のサンプル中の当該バイオマーカーの閾値発現レベルを測定するために、食道癌のデータセットを分析することを指す。
【００３４】
本明細書で使用されるように、「閾値発現レベル」とは、当該発現レベル（ＮＲＧ１、ＮＣＦ２、ＮＯＸＡ１、ＰＴＧＥＳおよびＣＡＲＤ６の場合）以上、または当該発現レベル（ＳＤＣ２およびＧＮＡＺの場合）以下であるというような発現レベルを指し、食道癌の腫瘍はＥＲＢＢ３阻害薬による処理に対して感受性であると分類される。
【００３５】
ＥＲＢＢ３抗体
本明細書に開示される方法はＥＲＢＢ３阻害薬による処理に対する食道癌の応答を予測するために用いることができ、前記阻害薬は例えば抗ＥＲＢＢ３抗体または抗ＥＲＢＢ３抗体の抗原結合断片である。幾つかの実施形態において、食道癌はＥＲＢＢ３抗体（またはその抗原結合断片）に対して感受性であるかまたは耐性であるかに分けられ、前記抗体はＮＲＧ１（例えばＮＲＧ１−β１）とＥＲＢＢ３の結合を阻害または防止し、これによりＥＲＢＢ３のリガンド誘導のダイマー化（例えば抗ＥＲＢＢ３抗体ＣＡＮ０１７、０４Ｄ０１、１２Ａ０７、１８Ｈ０２および２２Ａ０２）を間接的に阻害または防止する。他の実施形態において、腫瘍は抗体（またはその抗原結合断片）に対して感受性であるかまたは耐性であるかに分類され、前記抗体はＮＲＧ１とＥＲＢＢ３の結合（例えば抗ＥＲＢＢ３抗体０９Ｄ０３および１１Ｇ０１）を妨げない条件下でＥＲＢＢ３のダイマー化を阻害または防止する。
【００３６】
例示的な実施形態において、ＥＲＢＢ３阻害薬は以下の抗体ＣＡＮ０１７、０４Ｄ０１、１２Ａ０７、１８Ｈ０２、２２Ａ０２、１１Ｇ０１および０９Ｄ０３のうちの１つである。
【００３７】
抗ＥＲＢＢ３抗体ＣＡＮ０１７は免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、図１に示されるように、前記免疫グロブリン重鎖可変領域はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ３を含む。図３に示されるように、前記免疫グロブリン軽鎖可変領域はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ３を含む。例示的な実施形態において、抗体ＣＡＮ０１７は免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、図２に示されるように、前記免疫グロブリン重鎖可変領域はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のアミノ酸配列を含む。図４に示されるように、前記免疫グロブリン軽鎖可変領域はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のアミノ酸配列を含む。別の例示的な実施形態において、図５に示されるように、抗体ＣＡＮ０１７はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９の免疫グロブリン重鎖アミノ酸配列、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０の免疫グロブリン軽鎖アミノ酸配列を含む。
【００３８】
抗ＥＲＢＢ３抗体０４Ｄ０１は免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、図１に示されるように、前記免疫グロブリン重鎖可変領域はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ３を含む。図３に示されるように、前記免疫グロブリン軽鎖可変領域はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ３を含む。例示的な実施形態において、抗体０４Ｄ０１は免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、図２に示されるように、前記免疫グロブリン重鎖可変領域はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７のアミノ酸配列を含む。図４に示されるように、前記免疫グロブリン軽鎖可変領域はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８のアミノ酸配列を含む。別の例示的な実施形態において、図６に示されるように、抗体０４Ｄ０１はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９の免疫グロブリン重鎖アミノ酸配列、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０の免疫グロブリン軽鎖アミノ酸配列を含む。
【００３９】
抗ＥＲＢＢ３抗体０９Ｄ０３は免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、図１に示されるように、前記免疫グロブリン重鎖可変領域はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ３を含む。図３に示されるように、前記免疫グロブリン軽鎖可変領域はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ３を含む。例示的な実施形態において、抗体０９Ｄ０３は免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、図２に示されるように、前記免疫グロブリン重鎖可変領域はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７のアミノ酸配列を含む。図４に示されるように、前記免疫グロブリン軽鎖可変領域はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸配列を含む。別の例示的な実施形態において、図７に示されるように、抗体０９Ｄ０３はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９の免疫グロブリン重鎖アミノ酸配列、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０の免疫グロブリン軽鎖アミノ酸配列を含む。
【００４０】
抗ＥＲＢＢ３抗体１１Ｇ０１は免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、図１に示されるように、前記免疫グロブリン重鎖可変領域はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ３を含む。図３に示されるように、前記免疫グロブリン軽鎖可変領域はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ３を含む。例示的な実施形態において、抗体１１Ｇ０１は免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、図２に示されるように、前記免疫グロブリン重鎖可変領域はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６のアミノ酸配列を含む。図４に示されるように、前記免疫グロブリン軽鎖可変領域はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７のアミノ酸配列を含む。別の例示的な実施形態において、図８に示されるように、抗体１１Ｇ０１はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８の免疫グロブリン重鎖アミノ酸配列、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９の免疫グロブリン軽鎖アミノ酸配列を含む。
【００４１】
抗ＥＲＢＢ３抗体１２Ａ０７は免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、図１に示されるように、前記免疫グロブリン重鎖可変領域はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ３を含む。図３に示されるように、前記免疫グロブリン軽鎖可変領域はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ３を含む。例示的な実施形態において、抗体１２Ａ０７は免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、図２に示されるように、前記免疫グロブリン重鎖可変領域はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３のアミノ酸配列を含む。図４に示されるように、前記免疫グロブリン軽鎖可変領域はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４のアミノ酸配列を含む。別の例示的な実施形態において、図９に示されるように、抗体１２Ａ０７はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５の免疫グロブリン重鎖アミノ酸配列、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６の免疫グロブリン軽鎖アミノ酸配列を含む。
【００４２】
抗ＥＲＢＢ３抗体１８Ｈ０２は免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、図１に示されるように、前記免疫グロブリン重鎖可変領域はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ３を含む。図３に示されるように、前記免疫グロブリン軽鎖可変領域はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ３を含む。例示的な実施形態において、抗体１８Ｈ０２は免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、図２に示されるように、前記免疫グロブリン重鎖可変領域はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３のアミノ酸配列を含む。図４に示されるように、前記免疫グロブリン軽鎖可変領域はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４のアミノ酸配列を含む。別の例示的な実施形態において、図１０に示されるように、抗体１８Ｈ０２はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５の免疫グロブリン重鎖アミノ酸配列、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６の免疫グロブリン軽鎖アミノ酸配列を含む。
【００４３】
抗ＥＲＢＢ３抗体２２Ａ０２は免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、図１に示されるように、前記免疫グロブリン重鎖可変領域はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＨ３を含む。図３に示されるように、前記免疫グロブリン軽鎖可変領域はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６のアミノ酸配列で表されるＣＤＲＬ３を含む。例示的な実施形態において、抗体２２Ａ０２は免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、図２に示されるように、前記免疫グロブリン重鎖可変領域はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９のアミノ酸配列を含む。図４に示されるように、前記免疫グロブリン軽鎖可変領域はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０のアミノ酸配列を含む。別の例示的な実施形態において、図１１に示されるように、抗体２２Ａ０２はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１の免疫グロブリン重鎖アミノ酸配列、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２の免疫グロブリン軽鎖アミノ酸配列を含む。
【００４４】
当業者であれば、上記可変領域を各定常領域配列に繋げることにより、完全な重鎖またはｋａｐｐａ軽鎖抗体配列を構築し、活性的な全長免疫グロブリン重鎖および軽鎖を形成できることを理解できると考えられる。例えば、完全な重鎖は重鎖可変領域、およびその後のマウスまたはヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ２ｂ重鎖定常配列（本分野では既知である）を含み、完全なｋａｐｐａ鎖はｋａｐｐａ可変配列、およびその後のマウスまたはヒトｋａｐｐａ軽鎖定常配列（本分野では既知である）を含む。さらに、免疫グロブリン重鎖および軽鎖から得られるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列をヒトまたはヒト化された免疫グロブリンフレームワーク領域に配置することができると考えられる。
【００４５】
サンプル
食道癌から得られる組織サンプル（例えばヒト患者から得られるヒト食道癌組織サンプルであって、前記ヒト患者は例えばＥＲＢＢ３阻害薬による処理が検討されているヒト患者である）はＲＮＡ源、タンパク質源または免疫組織化学（ＩＨＣ）用の薄切片源として使用でき、こうすれば実施で開示される方法においてサンプル中の本発明のバイオマーカーのレベルを測定することができる。従来の腫瘍組織生検機器およびプロセスにより組織サンプルを得ることができる。内視鏡組織生検、切除組織生検、切開組織生検、細針生検、パンチ組織生検、掻爬組織生検および皮膚組織生検は当業者が腫瘍サンプルを得るために使用できる公認されている医学プロセスの実例である。腫瘍組織のサンプルはバイオマーカーの遺伝子発現を測るために、十分なＲＮＡ、タンパク質または薄切片を提供できるくらい十分に大きいものでなければならない。
【００４６】
腫瘍組織のサンプルは、バイオマーカーの発現または含有量を測ることを許容する如何なる形式でもよい。要するに、組織サンプルはＲＮＡ抽出、タンパク質抽出または薄切片の調製に十分でなければならない。従って、組織サンプルは新鮮で、適切な低温学技術により保存されたまたは非低温学技術で保存されたものとすることができる。臨床組織生検サンプルを処理する標準的な方法は組織サンプルをホルマリン内に固定し、それからパラフィンに埋め込む。この種の形式のサンプルは通常、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織と称される。その後に分析する組織の調製の適切な技術は当業者に周知のものである。
【００４７】
バイオマーカーの発現
本明細書に記載されるように、任意の適切な方法により腫瘍から得られた組織サンプル中のバイオマーカーの発現レベルを測定または測ることができる。複数のこの種の方法は当分野では既知のものである。例えば、サンプル中のバイオマーカーのタンパク質のレベルまたは量を測る、あるいはサンプル中のバイオマーカーのＲＮＡのレベルまたは量を測ることによりバイオマーカーの発現レベルを測定できる。
【００４８】
幾つかの実施形態において、食道癌は、ＥＲＢＢ３阻害薬による処理に対して、感受性であるかまたは耐性であるかに分類され、完全に食道癌から得られた組織サンプル中のバイオマーカーの発現状況に基づく。別の実施形態において、本発明のバイオマーカーの発現以外、さらに一種または複数種の他の遺伝子の発現を測り、腫瘍を、ＥＲＢＢ３阻害薬による処理に対して感受性であるかまたは耐性であるかに分類する。本発明は、幾つかの実施形態において、本発明のバイオマーカー以外に一種または複数種の他の遺伝子の発現を測るとき、一種または複数種の他の遺伝子はＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２およびＥＲＢＢ３（例えばＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２およびＥＲＢＢ３の如何なる単量体、ヘテロダイマーおよび／またはホモダイマー、および／または単量体またはダイマー形式のリン酸化ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２およびＥＲＢＢ３）を含まない。本発明ではさらに、本発明のバイオマーカー以外、一種または複数種の他の遺伝子の発現を測ることは、例えばデータの標準化などのための、対照または標準品として役割を果たす遺伝子を測ることを含むことができると考えられる。
【００４９】
ＲＮＡ分析
本発明のバイオマーカーのｍＲＮＡ発現レベルを測定する方法は、従来のマイクロアレイ分析、デジタルＰＣＲ、ＲＮＡｓｅｑおよび定量ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が含まれるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、標準プロトコルを使用して標的細胞、腫瘍または組織からＲＮＡを抽出する。他の実施形態において、ＲＮＡの分離を必要としない技術を使用してＲＮＡ分析を行う。
【００５０】
組織サンプルから真核生物ｍＲＮＡを迅速かつ効果的に抽出する方法は当業者には周知のものである。例えばＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、１９９７、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓを参照されたい。組織サンプルは、例えば臨床研究の食道癌患者のサンプルなど、新鮮で凍結されたまたは固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）のサンプルとすることができる。通常、新鮮なまたは凍結された組織サンプルから分解して得られたＲＮＡは往々にして、ＦＦＰＥサンプルから得られるＲＮＡよりも形成される断片が少ない。しかし、腫瘍材料のＦＦＰＥサンプルはより簡単に入手でき、ＦＦＰＥサンプルは本発明の方法において使用される適切なＲＮＡ源である。ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現プロファイリングのために、ＦＦＰＥサンプルをＲＮＡ源とする議論については、例えばＣｌａｒｋ−Ｌａｎｇｏｎｅ等、２００７、ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ８：２７９を参照されたい。また、Ｄｅ  Ａｎｄｒｅｓら、１９９５、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１８：４２０４４、およびＢａｋｅｒら、米国特許出願公開番号２００５／００９５６３４を参照されたい。市販のキット（供給者が提供したＲＮＡ抽出および製造用の説明書付き）を使用できる。複数種のＲＮＡ分離産物および完全なキットの販売供給者としてはＱｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、Ａｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）およびＥｘｉｑｏｎ（Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）がある。
【００５１】
通常、ＲＮＡの分離は組織／細胞の破壊から始まる。組織／細胞の破壊プロセスでは、ＲＮＡに対するＲｎａｓｅの分解を減らすのが望ましい。ＲＮＡ分離中にＲｎａｓｅ活性を制限する一種の方法は、細胞が破壊されたら変性剤を細胞内容物と接触させることを確保する。別の慣例としてはＲＮＡ分離中に一種または複数種のプロテアーゼを含める。任意的に、新鮮な組織サンプルを収集したら、室温でＲＮＡ安定溶液に浸漬する。安定溶液が細胞に急速に浸透し、４℃で保存できるようＲＮＡを安定させて、その後の分離に備える。この種の安定溶液は市販で入手可能なＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）である。
【００５２】
幾つかの形態において、トータルＲＮＡは塩化セシウム密度勾配遠心分離により破壊された腫瘍材料から分離して得られる。通常、ｍＲＮＡは細胞のトータルＲＮＡの約１％〜５％を占める。固定化Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）（例えばＯｌｉｇｏ（ｄＴ）セルロース）は、通常、ｍＲＮＡをリボソームＲＮＡおよび転移ＲＮＡと分離するのに用いる。分離後に保存する場合、必ずＲＮＡはＲＮａｓｅを含まない条件で保存する。分離したＲＮＡを安定保存する方法は当分野では既知のものである。ＲＮＡを安定保存するための複数種の市販製品は入手可能である。
【００５３】
マイクロアレイ
従来のＤＮＡマイクロアレイ発現プロファイリング技術によりバイオマーカーのｍＲＮＡ発現レベルを測ることができる。ＤＮＡマイクロアレイは、例えばガラス、プラスチックまたはシリコンなどの固体表面または基質に固定された特定のＤＮＡセグメントまたはプローブの集合である。そして各特定のＤＮＡセグメントはアレイ内の既知の位置を占有する。標識ＲＮＡサンプルとのハイブリダイゼーションは通常、アレイ内の各プローブに対応するＲＮＡ分子を検出および定量化を許容する厳密なハイブリダイゼーション条件下で行われる。非特異的に結合したサンプル材料を除去できるよう厳密に洗浄した後、共焦点レーザー顕微鏡または他の適切な検出方法によりマイクロアレイをスキャンする。現在、市販されているＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡチップとも称される）には、通常、数万個のプローブが含まれているため、数万個の遺伝子の発現を同時に測ることができる。この種のマイクロアレイは本発明の実施に用いることができる。若しくは、ＮＲＧ１を測るのに必要な少数の数種類のプローブに加え、必須とされる対照または標準品（例えばデータの標準化に用いる）を含むカスタムチップは公開された方法の実施に用いることができる。
【００５４】
データの標準化に有利なように、２色マイクロアレイリーダーを使用できる。２色（２チャンネル）システムでは、第一波長を発する第一蛍光色素によりサンプルを標識化すると同時に異なる波長を発する第二蛍光色素によりＲＮＡまたはｃＤＮＡ標準品を標識化する。例えば、Ｃｙ３（５７０ｎｍ）およびＣｙ５（６７０ｎｍ）は通常、２色マイクロアレイシステムにおいて一緒に使用する。
【００５５】
ＤＮＡマイクロアレイ技術は良好に発展しており、市販で入手でき、広く使用されている。従って、公開された方法を実施するとき、当業者は過度な実験なしに、マイクロアレイ技術によりバイオマーカータンパク質をコード化した遺伝子の発現レベルを測ることができる。ＤＮＡマイクロアレイチップ、試薬（例えばＲＮＡまたはｃＤＮＡ調製、ＲＮＡまたはｃＤＮＡ標識化、ハイブリダイゼーションおよび洗浄溶液に用いられるもの）、機器（例えばマイクロアレイリーダー）およびプロトコルは、当分野では周知であり、複数種の市販のものが入手可能である。マイクロアレイシステムの市販供給者としてはＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）およびＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）があるが、他のＰＣＲシステムも使用可能である。
【００５６】
定量ＰＣＲ
従来の定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）技術により本発明のバイオマーカーのｍＲＮＡレベルを測ることができる。ｑＲＴ−ＰＣＲの長所として、感受性、柔軟性、定量精度および密接に関連するｍＲＮＡを識別できる能力が含まれる。定量ＰＣＲのための組織サンプルの処理に関するガイダンスは複数種のソースから入手でき、ｑＲＴ−ＰＣＲに用いる市販の機器および試薬メーカーおよび供給者（例えばＱｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）およびＡｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ））を含む。ｑＲＴ−ＰＣＲの自動化実施に用いる機器およびシステムは市販で入手でき、多くの実験室においてよく使用されている。周知の市販システムの実例はｔｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ７９００ＨＴ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）である。
【００５７】
ｍＲＮＡが分離されると、ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現を測る第一のステップはｍＲＮＡテンプレートをｃＤＮＡに逆転写し、続いてＰＣＲ反応で指数的増幅を呈する。２種類のよく用いられる逆転写酵素は、トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）およびモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ）である。逆転写反応は、通常、プライマーとして、特定のプライマー、ランダムなヘキサマーまたはｏｌｉｇｏ（ｄＴ）プライマーを使用する。適切なプライマーは市販で入手でき、例えばＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）  ＲＮＡ  ＰＣＲ  ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）である。得られたｃＤＮＡ産物はその後のポリメラーゼ連鎖反応においてテンプレートとして用いられる。
【００５８】
耐熱性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲステップを実施する。ＰＣＲシステムでよく用いられるポリメラーゼの大部分はテルムス・アクウァーティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｔａｑ）ポリメラーゼである。ＰＣＲの選択性はプライマーの使用に由来し、前記プライマーは増幅の標的となるＤＮＡ領域、即ち標的タンパク質をコード化した遺伝子から逆転写されるｃＤＮＡの領域と相補的である。従って、本発明はｑＲＴ−ＰＣＲを使用するとき、各マーカー遺伝子に対して特異的なプライマーは当該遺伝子のｃＤＮＡ配列に基づく。供給者が提供する説明書に基づき、ＳＹＢＲ（登録商標）  ｇｒｅｅｎまたはＴａｑＭａｎ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）というような市販の技術を使用できる。ハウスキーピング遺伝子（例えばβアクチンまたはＧＡＰＤＨ）のレベルを比較することにより、ロードサンプル中の差異に対して伝令ＲＮＡのレベルを標準化できる。ｍＲＮＡの発現レベルは、如何なる単一の対照サンプル、例えば正常な非腫瘍組織または細胞などから得られるｍＲＮＡに対するものとして表される。若しくは、セットの腫瘍サンプルまたは腫瘍細胞株から得られるｍＲＮＡ、または市販の一組の対照ｍＲＮＡから得られるｍＲＮＡに対するものとして表される。
【００５９】
ＮＲＧ１および／または本発明のバイオマーカーの発現状況をＰＣＲ分析するための複数の適切なプライマーセットを設計でき、かつ、過度な実験なしに、当業者により合成できる。若しくは、本発明を実施するための複数のＰＣＲプライマーセットは例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓなどの複数の市販のものを購入できる。ＰＣＲプライマーは好ましくは長さ約１７〜２５個のヌクレオチドである。融解温度（Ｔｍ）を推定する従来のアルゴリズムによりプライマーを特定のＴｍを持つように設計できる。プライマー設計およびＴｍ推定ソフトウエアは例えばＰｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）など、市販で入手でき、さらに例えばＰｒｉｍｅｒ３（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）など、インターネットからも入手できる。確立されたＰＣＲプライマー設計の原理を応用することにより、大量の異なるプライマーにより、ＮＲＧ１および本発明のバイオマーカーを含む、任意の既定の遺伝子の発現レベルを測ることができる。
【００６０】
ＲＮＡｓｅｑ
さらに、ＲＮＡｓｅｑ技術により本発明のバイオマーカーのｍＲＮＡ発現レベルを測ることができる。ＲＮＡｓｅｑは全ゲノムレベルの遺伝子発現差異研究を行うことができ、以下の長所を持つ：（１）各転写断片配列の直接測定、単一ヌクレオチド分解能の精度、同時に従来のマイクロアレイハイブリダイゼーションの蛍光アナログ信号による交差反応および背景ノイズ問題（即ちデジタル化信号付き）が存在しない、（２）細胞中の数個という少数のコピーされた稀な転写物を検出できる（即ち、感度が非常に高い）、（３）全ゲノム解析が可能である、（４）稀な転写物および正常な転写物を同時に鑑定および定量化できる６桁を超える動的検出範囲（即ち、検出範囲が広い）。以上の長所により、ＲＮＡｓｅｑは既にＲＮＡ発現レベルを正確に測るための強力なツールになっている。
【００６１】
ＲＮＡｓｅｑの原理は次のとおりである：ＲＮＡを抽出した後で精製し、ｃＤＮＡに逆転写し、それからシーケンシングしてショートリード（ｓｈｏｒｔ  ｒｅａｄｓ）を取得する。ショートリードをゲノムの対応する位置で照合し、その後、照合結果に対して、遺伝子レベル、エクソンレベルおよび転写レベルのスプライシングを行い、最後にスプライシング結果をデータ統計し、標準化した後にｍＲＮＡレベル上の遺伝子の発現レベルを得る。ここで、照合ステップ、スプライシングおよび統計ステップならびに標準化ステップはいずれも当業者に既知の各種ソフトウエアにより実行できる。例えば照合ステップはＢＦＡＳＴ、ＢＯＷＴＩＥ、ＧＮＵｍａｐ、ＣｌｏｕｄＢｕｒｓｔ、ＧＭＡＰ／ＧＳＮＡＰ、ＲｚａｅｒＳ、ＳｐｌｉｃｅＭａｐ、ＴｏｐＨａｔ、ＭＩＲＡ、Ｓｏａｐ等のソフトウエアにより実行できる。スプライシングおよび統計ステップはＣｕｆｆｌｉｎｋｓ、ＡＬＥＸＡ−ｓｅｑ等のソフトウエアにより実行できる。標準化ステップはＥＲＡＮＧＥ、Ｍｙｒｎａ等のソフトウエアにより実行できる。比較的よく用いられるＲＮＡｓｅｑデータの標準化方法としては、ＲＰＫＭ（ｒｅａｄｓ  ｐｅｒ  ｋｉｌｏｂａｓｅ  ｏｆ  ｅｘｏｎ  ｍｏｄｅｌ  ｐｅｒ  ｍｉｌｌｉｏｎ  ｍａｐｐｅｄ  ｒｅａｄｓ）、ＦＰＫＭ（ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｐｅｒ  ｋｉｌｏｂａｓｅ  ｏｆ  ｅｘｏｎ  ｍｏｄｅｌ  ｐｅｒ  ｍｉｌｌｉｏｎ  ｍａｐｐｅｄ  ｒｅａｄｓ）およびＴＰＭ（ｔａｇ  ｐｅｒ  ｍｉｌｌｉｏｎ）がある。
【００６２】
よく用いられるＲＮＡｓｅｑプラットフォームとしてはＩｌｌｕｍｉｎａ  ＧＡ／ＨｉＳｅｑ、ＳＯＬｉＤおよびＲｏｃｈｅ４５４がある。
【００６３】
ｑＮＰＡ（商標）
幾つかの実施形態においては、ＲＮＡ抽出または分離に係らない技術によりＲＮＡ分析を行う。この種の技術は定量的ヌクレアーゼ保護アッセイであり、これは市販で入手でき、商品名はｑＮＰＡ（商標）（Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｉｎｃ．、Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ）である。分析される腫瘍組織のサンプルがＦＦＰＥ材料の形式である場合、前記技術は有利である。例えばＲｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．、２００７、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ８７：９７９−９９７を参照されたい。
【００６４】
タンパク質分析
他の実施形態において、タンパク質レベルで本発明のバイオマーカーの発現を検出できる。本発明のバイオマーカーのタンパク質発現レベルを測る方法としては、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）  、ＩＨＣ分析、ウエスタンブロッティング、免疫蛍光法等がある。
【００６５】
ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡの実施には本発明のバイオマーカーに対する少なくとも一種の抗体、即ち検出抗体が必要である。以下にＮＲＧ１を例に説明する。分析対象のサンプルから得られるＮＲＧ１タンパク質を、例えばポリスチレン製マイクロタイタープレートなどの固体支持体に固定する。この種の固定は表面に吸着することによる非特異的な結合である。あるいは、「サンドイッチ」ＥＬＩＳＡにおいてサンプルから得られるＮＲＧ１が捕捉抗体（検出抗体とは異なる抗ＮＲＧ１抗体）に結合するという、特異的な結合により固定できる。ＮＲＧ１が固定された後、検出抗体を加え、検出抗体は結合したＮＲＧ１と複合体を形成する。検出抗体は直接または間接的  （例えば特異的に検出抗体を見分ける第二抗体）に酵素に結合する。通常、各ステップ間では、穏やかな洗浄溶液により結合したＮＲＧ１を有するマイクロタイタープレートを洗浄する。典型的なＥＬＩＳＡプロトコルはさらに一つまたは複数のブロッキングステップを含み、これは前記タイタープレートに非特異的に結合する不要なタンパク質試薬をブロッキングするウシ血清アルブミンのような非特異的な結合タンパク質の使用に関する。最後の洗浄ステップの後、適切な酵素基質を加えてタイタープレートを着色してサンプル中のＮＲＧ１の量を示す視覚信号を生成する。前記基質は例えば発色基質または蛍光基質とすることができる。ＥＬＩＳＡ法、試薬および装置は当分野で周知のものであり、市販で入手可能である。
【００６６】
免疫組織化学（ＩＨＣ）
免疫組織化学（ＩＨＣ）または免疫蛍光法（ＩＦ）により（例えば可視化）腫瘍組織サンプルまたは臨床サンプル中のＮＲＧ１の存在およびレベルを測定できる。臨床サンプルは通常、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）ブロック形式で保存されるため、ＩＨＣおよびＩＦは特に臨床サンプル中のＮＲＧ１タンパク質を測るのに用いられる。ＩＨＣまたはＩＦによりＮＲＧ１を測定するには少なくとも一種のＮＲＧ１に対する抗体が必要である。ＩＨＣおよびＩＦに適する抗ＮＲＧ１抗体は市販で入手可能である。例えば、適切な抗体はＲ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、ａｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）またはＮｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、ＣＯ）から購入できる。標準技術を用いて、抗ＮＲＧ１抗体は腫瘍から得られた薄切片（例えばＦＦＰＥ切片および凍結腫瘍切片を含む５ミクロン切片）中のＮＲＧ１タンパク質の存在状況を検出できる。通常、腫瘍材料を収集および保存する最初のプロセスにおいて固定したタンパク質の抗原構造を回復できるように腫瘍切片に対して最初の処理を行う。その後、スライドをブロッキングして抗ＮＲＧ１検出抗体の非特異的な結合を防ぐ。次に、抗ＮＲＧ１抗体（一次抗体）とＮＲＧ１タンパク質の結合によりＮＲＧ１タンパク質の存在状況を検出する。一次抗体を見分け、一次抗体と結合した検出抗体（二次抗体）を検出可能な酵素または蛍光色素と結合させる。通常、ステップ間では非特異的なタンパク質（例えばウシ血清アルブミン）により腫瘍切片を洗浄およびブロッキングする。検出抗体が検出可能な酵素と結合されていれば、適切な酵素基質により、視覚信号を生成できるようスライドを着色する。検出抗体が蛍光色素と結合されていれば、蛍光顕微鏡によりスライドを観察する。サンプルはヘマトキシリンを使用して再染色できる。
【００６７】
データ解釈
閾値発現レベルは本発明のバイオマーカーの発現レベルを説明するのに用いることができる。例えば、食道癌のサンプルにおいて、ＳＤＣ２および／またはＧＮＡＺの発現レベルがその対応する閾値発現レベル以下である場合、当該食道癌はＥＲＢＢ３阻害薬（例えばＥＲＢＢ３抗体）による処理に対して感受性である（反応性である）。あるいは、ＳＤＣ２および／またはＧＮＡＺの発現レベルがその対応する閾値発現レベルより高い場合、当該食道癌はＥＲＢＢ３阻害薬（例えばＥＲＢＢ３抗体）による処理に対して耐性である（反応性でない）と表される。ＮＲＧ１、ＮＣＦ２、ＮＯＸＡ１、ＰＴＧＥＳおよびＣＡＲＤ６について言えば、これらのうち一つまたは複数の発現レベルがその相応する閾値発現レベル以上である場合、当該食道癌はＥＲＢＢ３阻害薬（例えばＥＲＢＢ３抗体）による処理に対して感受性である（反応性である）。逆に、これらのうち一つまたは複数の発現レベルがその対応する閾値発現レベルより低い場合、当該食道癌はＥＲＢＢ３阻害薬（例えばＥＲＢＢ３抗体）による処理に対して耐性である（反応性でない）と表される。
【００６８】
閾値測定分析
各バイオマーカーの閾値発現レベルは、閾値測定分析により確定できる。好ましくは、閾値測定分析は受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線分析を含む。ＲＯＣ曲線分析は既に確立された統計学技術であり、当該技術の応用は当業者の知識範囲内である。ＲＯＣ曲線分析の議論については通常、Ｚｗｅｉｇ等、１９９３、「Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ（ＲＯＣ）ｐｌｏｔｓ：ａ  ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｔｏｏｌ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ」、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３９：５６１−５７７、およびＰｅｐｅ、２００３、Ｔｈｅ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｔｅｓｔｓ  ｆｏｒ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照できる。
【００６９】
閾値測定分析のデータセットには以下が含まれる：（ａ）急性応答データ（応答性または非応答性）、および（ｂ）一組の腫瘍から得られた各腫瘍サンプルの本発明のバイオマーカーの発現レベル。特定の実施形態において、腫瘍の組織サンプル中のバイオマーカーの発現レベルを測ることにより閾値発現レベルを測定でき、前記腫瘍は以下のヒト患者から得られる：前に抗ＥＲＢＢ３阻害薬による処理を受けており、且つ抗ＥＲＢＢ３阻害薬に対して感受性であると示された食道癌患者、および前に抗ＥＲＢＢ３阻害薬による処理を受けており、且つ抗ＥＲＢＢ３阻害薬に対して耐性であると示された食道癌患者。
【００７０】
以下の方式でＲＯＣ曲線分析を実行できる（ＮＲＧ１を例とする）。ＮＲＧ１発現レベルが閾値以上のサンプルは全てレスポンダー（感受性である）に分類され、ＮＲＧ１発現レベルが閾値より低いサンプルは全て非レスポンダー（耐性である）に分類される。テストグループのサンプルから得られた各ＮＲＧ１発現レベルについて言えば、当該発現レベルを閾値として使用し、サンプルを「レスポンダー」と「非レスポンダー」（仮想呼び出し）に分類する。当該方法は仮想呼び出しをデータセットの実際の応答データと比較することで各潜在閾値のＴＰＲ（ｙ値）およびＦＰＲ（ｘ値）を計算できる。それからＴＰＲおよびＦＰＲを用いてドットプロットを作成してＲＯＣ曲線を構築する。ＲＯＣ曲線が（０、０）点から（１．０、０．５）点までの斜線よりも高い場合、ＮＲＧ１テスト結果がランダムよりも良いテスト結果であることを示す。
【００７１】
ＲＯＣ曲線は最適な閾値点を識別するのに用いることができる。最適な閾値点は、偽陽性コストと偽陰性コストの間で最適なバランスが生じる点である。これらコストは等しくある必要はない。ＲＯＣ空間において、点ｘ、ｙでの分類の平均予想コスト（Ｃ）は以下の式で測定できる：
Ｃ＝（１−ｐ）α＊ｘ＋ｐ＊β（１−ｙ）
但し：α＝偽陽性コスト、β＝陽性過誤（偽陰性）コスト、およびｐ＝陽性状況の比率。
【００７２】
αおよびβに異なる値を割り当てることにより偽陽性および偽陰性の重みを変えることができる。例えば、応答グループに、より多くの患者（代償はより多くの非レスポンダーの患者を治療すること）を含むと決めた場合、より高い重みをαに与えることができる。このような場合において、偽陽性コストおよび偽陰性コストは同じである（αはβに等しい）と仮定される。従って、ＲＯＣ空間では、点ｘ、ｙでの分類の平均予想コストは以下のとおりである：
Ｃ’＝（１−ｐ）＊ｘ＋ｐ＊（１−ｙ）。
【００７３】
全ての対になった偽陽性および偽陰性（ｘ、ｙ）により最小のＣ’を計算できる。最適な閾値はＣ’における（ｘ、ｙ）値として計算される。
【００７４】
通常、ＮＲＧ１発現レベルが高いほど、腫瘍はＥＲＢＢ３阻害薬に対して感受性を持つ可能性がある。そして、ＮＲＧ１発現レベルが低いほど、腫瘍はＥＲＢＢ３阻害薬に対して耐性である可能性がある。上記閾値測定分析は本発明の他のバイオマーカーの閾値発現レベルも測定できる。
【００７５】
テストキット
また、本発明はさらに、本発明の方法の実施に用いられる特定の成分を含む診断テストキットを提供する。診断測定の実施において、診断テストキットは便利さ、速さ、および再現性が増加した。例えば、例示的なｑＲＴ−ＰＣＲに基づく実施形態において、基本的な診断テストキットは本発明のバイオマーカーの発現を分析するためのＰＣＲプライマーを含む。他の実施形態において、より複雑なテストキットは、ＰＣＲプライマーだけでなく、ＰＣＲ技術によりバイオマーカー発現レベルを測る緩衝液、反応物および詳細な説明書をさらに含む。幾つかの実施形態において、前記キットはＲＮＡサンプル以外に、テストプロトコルおよびテストに必要な全ての消耗構成要素もさらに含む。
【００７６】
例示的なＤＮＡマイクロアレイに基づく実施形態において、テストキットは、特定の機器と一緒に使用するように設計されたマイクロ流体カード（アレイ）を含む。任意的に、マイクロ流体カードは本発明のバイオマーカーを測るために特別に設計された、カスタマイズされた装置である。この種のカスタマイズマイクロ流体カードは市販で入手可能である。例えば、ＴａｑＭａｎは３８４ウェルマイクロ流体カード（アレイ）であり、ｔｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ７９００ＨＴ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）と一緒に使用するよう設計されている。マイクロ流体カードは、一種または複数種の他の遺伝子の発現を測れるよう、他のプローブを任意的に含むことができると理解すべきである。対照または標準品としての役割を果たせる（例えばデータの標準化に用いる）、あるいは上記以外の、さらには情報を提供するような他の遺伝子を含むことができる。
【００７７】
幾つかの実施形態において、テストキットはＩＨＣにより本発明のバイオマーカーの含有量を測定する材料を含む。例えば、ＩＨＣキットは本発明のバイオマーカーに対する一次抗体、およびレポーター酵素（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ）と共役する二次抗体を含むことができる。幾つかの実施形態において、二次抗体は共役ポリマーで置き換えられ、前記ポリマーは一次抗体を特異的に見分ける。
【実施例】
【００７８】
以下の実例により本発明をさらに説明する。以下の実例は説明するためのものであり、如何なる方式においても本発明の範囲または内容を限定するものと理解されるべきではない。
【００７９】
実施例１  ＣＡＮ０１７に対する食道癌の異種移植成長の応答
以下の方式によりＣＡＮ０１７に対する食道癌の応答を評価した。
【００８０】
食道癌患者の手術後に得られた新鮮な腫瘍組織を小さな腫瘍塊に分け、免疫不全マウス（ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス）に皮下接種し、腫瘍の成長状態を定期的に観察した。腫瘍が一定の体積に達した後、人道的な方法でマウスを屠殺し、腫瘍を新しいＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに皮下接種した。腫瘍の成長状態に基づいて成長曲線をプロットするとともに腫瘍サンプルを収集し、凍結し、腫瘍組織を観察し、その後、次世代の接種が必要な時に蘇生させた。数世代を経て最適化させた後、食道癌の異種移植モデルの確立に成功した。当該モデルを９〜１１週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの右側に皮下接種し、接種モデルの直径は２〜３ｍｍである。
【００８１】
毎週２回、ノギスを用いて腫瘍を測った。下記式で腫瘍体積を計算した：幅ｘ幅ｘ長さ／２。腫瘍が約１５８ｍｍ３に達したとき、これらマウスをランダムに３組に分け、各組ともマウス１０匹とした。一組は生理食塩水を投与し、一組はｈＩｇＧ対照（２０ｍｇ／ｋｇ体重）を投与し、別の一組はＣＡＮ０１７（２０ｍｇ／ｋｇ体重）を投与した。３日毎に一回投与し、３週間腹腔内注射した。腫瘍体積およびマウス体重を毎週２回記録した。腫瘍成長は、生理食塩水対照と比較した阻害百分比として表される。
【００８２】
要するに、ＣＡＮ０１７により２０個の食道癌の異種移植モデル（各モデルともマウス１０匹）を処理し、その統計結果は図１２に示すとおりである。全２０個の異種移植モデルに対するＣＡＮ０１７の平均阻害百分比は４３．６％程度で、全２０個の異種移植モデルに対する対照ｈＩｇＧの平均阻害百分比は−５．５％であった。統計学分析結果は、ｈＩｇＧと比べ、食道癌の異種移植モデルに対するＣＡＮ０１７の阻害百分比が有意レベル（Ｐ＜０．０１）に達したことを示した。これらの結果は、ＣＡＮ０１７が食道癌腫瘍の成長を効果的に阻害できることを示した。
【００８３】
ＣＡＮ０１７に対する単一の食道癌の異種移植モデルの応答をさらに分析し、前記応答は−４０％の腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）から腫瘍退縮までの範囲で変化したことが分かった。「腫瘍退縮」とは処理前の、評価期間の開始時の腫瘍のサイズに比べ、評価期間終了時に、腫瘍がさらに小さくなっていることを指す。達した腫瘍成長阻害に基づき、レスポンダー（ＴＧＩ＞７０％と定義されるもの）および非レスポンダー（ＴＧＩ＜７０％と定義されるもの）を識別した。評価された２０個のモデルにおいて、９個はレスポンダー、１１個は非レスポンダーであることが分かった（［表１］）。これらの組はＣＡＮ０１７応答の分子マーカーを識別できる。
【００８４】
表１．２０個の食道癌の異種移植モデルに対するＣＡＮ０１７の腫瘍成長阻害の結果およびそのＮＲＧ１の平均ｍＲＮＡ発現レベル
【表１】
2020524808.tif 000003
【００８５】
実施例２  バイオマーカーＮＲＧ１の発現レベルおよび閾値測定
以下の形態に基づき、ＲＮＡｓｅｑによりＮＲＧ１の発現レベルを測定した：腫瘍組織を急速凍結した後、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ  （Ｑｉａｇｅｎ、番号７４１０６）でＲＮＡを抽出、精製し、その後、ＴｒｕＳｅｑ（商標）ＲＮＡ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｇｕｉｄｅ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、番号ＲＳ−９３０−２００１）に基づき、精製した後のＲＮＡを前処理し、それからメーカーの説明に基づき、ＨｉＳｅｑ  Ｘ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）上でシーケンシングし、得られたデータをＦＰＫＭで標準化し（ｌｏｇ２（ＦＰＫＭ＋１）値で表示）、ＮＲＧ１の発現レベルを取得した。
【００８６】
ＣＡＮ０１７で処理する前に２０個の食道癌の異種移植モデル（平均各モデルともマウス１０匹）中のＮＲＧ１発現レベル値を測定し、各モデルの平均ＮＲＧ１発現レベルは［表１］に示されるとおりである。得られたＮＲＧ１発現レベル値に基づいて、受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線を生成し、ＣＡＮ０１７腫瘍応答を予測するためのＮＲＧ１の閾値発現レベルを測定した。ＲＯＣ分析結果は、ＮＲＧ１の閾値発現レベルは２．０５であることを示した。つまり、当該閾値発現レベルより高い場合、ＣＡＮ０１７の腫瘍応答を予測する。実際、ＮＲＧ１の発現レベルは、テストした大多数の異種移植モデルにおいてＣＡＮ０１７の応答結果と一致した（即ち、閾値発現レベル２．０５以上はＣＡＮ０１７に対して応答があることを示す。閾値発現レベル２．０５より低いのはＣＡＮ０１７に対して応答がないことを示す）。しかし食道癌の異種移植モデルＥＳ００２６、ＥＳ２３５６およびＥＳ０２１５において、ＮＲＧ１の発現レベルはいずれも閾値発現レベルより高いが、この３つの異種移植モデルは実際には、ＣＡＮ０１７に対して応答しなかった。このように、ＮＲＧ１はバイオマーカーとして、食道癌がＥＲＢＢ３抗体による処理に対して応答があるか否かをある程度予測するが、ＮＲＧ１を単独で使用して予測する有効性は限定的であった。
【００８７】
実施例３  本発明のバイオマーカーの発現レベルとＣＡＮ０１７応答との関係
実施例２に記載のＲＮＡｓｅｑ方法に基づき、２０個の食道癌の異種移植モデル（平均各モデルともマウス１０匹）中のＳＤＣ２、ＧＮＡＺ、ＰＴＧＥＳ、ＮＣＦ２、ＮＯＸ１およびＣＡＲＤ６の発現レベルをそれぞれ測定し、ＲＯＣ曲線により各バイオマーカーの閾値発現レベルを測定した。各バイオマーカーの閾値発現レベルの結果は以下のとおりである：ＳＤＣ２の閾値発現レベルは４．９、ＧＮＡＺの閾値発現レベルは１．１、ＰＴＧＥＳの閾値発現レベルは２．７５、ＮＣＦ２の閾値発現レベルは２．６、ＮＯＸ１の閾値発現レベルは２．７、ＣＡＲＤ６の閾値発現レベルは１．０であった。
【００８８】
各モデル中の各バイオマーカーの平均発現レベルに基づき、これらモデル中のＣＡＮ０１７腫瘍成長阻害をプロットし、回帰分析により各バイオマーカーの発現レベルと腫瘍成長阻害との相関性の有意性を検出した。結果は図１３〜図１８に示すとおりである。
【００８９】
具体的には、図１３に示されるように、腫瘍成長阻害およびＳＤＣ２発現の間に負の相関が観察された。より具体的に言えば、ＣＡＮ０１７による処理後の腫瘍成長阻害の増加はＳＤＣ２発現の減少に関連する。回帰分析により、この種の相関には高度な統計学的意義（有意性Ｆ＜０．０５）があると分かった。図１４は腫瘍成長阻害およびＧＮＡＺ発現の間に負の相関があることを示している。即ち、腫瘍成長阻害はＧＮＡＺ発現レベルの増加に伴い減少し、この種の相関性は統計学上も有意である（有意性Ｆ＜０．０５）。
【００９０】
図１５〜図１８はそれぞれ、腫瘍成長阻害およびＮＣＦ２、ＮＯＸＡ１、ＰＴＧＥＳ、ＣＡＲＤ６発現の間に全て正の相関があることを示している。即ち、腫瘍成長阻害はこれらのバイオマーカー発現レベルの増加に伴い増加し、この種の相関性は統計学上も有意である（有意性Ｆ＜０．０５）。
【００９１】
以上の結果は、本発明のバイオマーカーＳＤＣ２、ＧＮＡＺ、ＰＴＧＥＳ、ＮＣＦ２、ＮＯＸ１およびＣＡＲＤ６中のそれぞれの発現レベルが腫瘍成長阻害と有意に相関することを示している。従って、これらバイオマーカーは全て、腫瘍がＣＡＮ０１７処理に対して応答があるか否かを予測するのに使用できる。
【００９２】
実施例４  抗ＥＲＢＢ３の抗体ＣＡＮ０１７に対する食道癌の異種移植モデルの応答
実施例３で得られた各バイオマーカーの閾値発現レベルに基づき、ＣＡＮ０１７に対して応答があることを予測する異種移植モデルを選択するとともに、ＣＡＮ０１７に対して応答がないことを予測する異種移植モデルを選択する。具体的には、閾値発現レベルが４．９であるＳＤＣ２に関して、高発現の異種移植モデルＥＳ０１９５およびＥＳ０２０４（ＳＤＣ２発現レベルはそれぞれ５．８および５．２）を選択し、前記モデルはＣＡＮ０１７に対して応答がないと予測した。同時に、低発現の異種移植モデルＥＳ００４２およびＥＳ０１９０（ＳＤＣ２発現レベルはそれぞれ０．６および４．３）を選択し、前記モデルがＣＡＮ０１７に対して応答があると予測した。同様に、閾値発現レベルが１．１であるＧＮＡＺに関しては、高発現の異種移植モデルＥＳ０２０１およびＥＳ２４１１（ＧＮＡＺ発現レベルはそれぞれ１．３および１．９）を選択し、前記モデルがＣＡＮ０１７に対して応答がないと予測した。同時に、低発現の異種移植モデルＥＳ０１８４およびＥＳ０１９９（ＧＮＡＺ発現レベルはそれぞれ０．２および０．５）を選択し、前記モデルがＣＡＮ０１７に対して応答があると予測した。閾値発現レベルが２．６であるＮＣＦ２に関しては、高発現の異種移植モデルＥＳ０１９１およびＥＳ０１７６（ＮＣＦ２発現レベルはそれぞれ５．１および３．２）を選択し、前記モデルはＣＡＮ０１７に対して応答があると予測した。同時に、低発現の異種移植モデルＥＳ０２０４およびＥＳ００２６（ＮＣＦ２発現レベルはそれぞれ０．１および０．９）を選択し、前記モデルはＣＡＮ０１７に対して応答がないと予測した。閾値発現レベルが２．７であるＮＯＸＡ１に関して、高発現の異種移植モデルＥＳ２３１１およびＥＳ０２１４（ＮＯＸＡ１発現レベルはそれぞれ２．９８および３．９）を選択し、前記モデルはＣＡＮ０１７に対して応答があると予測した。同時に、低発現の異種移植モデルＥＳ１１０８７およびＥＳ０１４８（ＮＯＸＡ１発現レベルはそれぞれ２．１４および１．６）を選択し、前記モデルはＣＡＮ０１７に対して応答がないと予測した。閾値発現レベルが２．７５であるＰＴＧＥＳに関して、高発現の異種移植モデルＥＳ０１５９およびＥＳ０１４１（ＰＴＧＥＳ発現レベルはそれぞれ５．６９および３．９）を選択し、前記モデルはＣＡＮ０１７に対して応答があると予測した。同時に、低発現の異種移植モデルＥＳ１００８４およびＥＳ０１７２（ＰＴＧＥＳ発現レベルはそれぞれ０．５５および１．７）を選択し、前記モデルはＣＡＮ０１７に対して応答がないと予測した。閾値発現レベルが１．０であるＣＡＲＤ６に関して、高発現の異種移植モデルＥＳ１１０６９およびＥＳ０１４７（ＣＡＲＤ６発現レベルはそれぞれ４．０１および１．１）を選択し、前記モデルはＣＡＮ０１７に対して応答があると予測した。同時に、低発現の異種移植モデルＥＳ０２１２およびＥＳ０１３６（ＣＡＲＤ６発現レベルはそれぞれ０．０９および０．１）を選択し、前記モデルはＣＡＮ０１７に対して応答がないと予測した。
【００９３】
実施例１に記載の方法に基づき、２０ｍｇ／ｋｇの抗体ＣＡＮ０１７で上記選択した異種移植モデル（各モデルともマウス５匹）を処理し、３週間後、各モデルの腫瘍成長阻害状況を統計した。結果は［表３］に示すとおりである。
【００９４】
表３．抗体ＣＡＮ０１７で処理した異種移植モデルの結果統計。
【表２】
2020524808.tif 000004
【００９５】
以上のデータは、ＳＤＣ２、ＧＮＡＺ、ＰＴＧＥＳ、ＮＣＦ２、ＮＯＸ１およびＣＡＲＤ６の発現レベルを測ることによりＣＡＮ０１７による処理に対する腫瘍の応答を効果的に予測できることを示している。
【００９６】
実施例５  本発明のバイオマーカーとＮＲＧ１の併用
本発明者はさらに、本発明のバイオマーカーとＮＲＧ１を併用すると、ＣＡＮ０１７処理に対して腫瘍は応答があるかどうかを予測する正確性をさらに高められることを発見した。上記のように、単独のＮＲＧ１をマーカーとすると、食道癌の異種移植モデルＥＳ００２６、ＥＳ２３５６およびＥＳ０２１５の応答（即ち、ＮＲＧ１の発現レベルは閾値より高いが、ＣＡＮ０１７で処理した後は応答がない（ＴＧＩ＜７０％））を正確に予測できない。本発明者はこの３つのモデル中の本発明のバイオマーカーの発現レベルを測定した。結果は［表４］に示すとおりである。
【００９７】
表４．異種移植モデルＥＳ００２６、ＥＳ２３５６およびＥＳ０２１５中のバイオマーカーの発現レベル。
【表３】
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【００９８】
以上のデータはこの３つのモデルのうち、ＳＤＣ２およびＧＮＡＺの発現レベルはいずれもその対応する閾値発現レベルより高く、ＮＣＦ２およびＮＯＸＡ１の発現レベルはいずれもその対応する閾値発現レベルより低いことを示している。これは、これらバイオマーカーにより予測するとき、異種移植モデルＥＳ００２６、ＥＳ２３５６およびＥＳ０２１５はＣＡＮ０１７処理に対して応答がないと予測されたことを表す。言い換えれば、ＮＲＧ１がその閾値発現レベルよりも高いとき、本発明のバイオマーカーの発現レベルを測ることは、ＣＡＮ０１７処理に対して腫瘍は応答があるかどうかを予測する正確性をさらに高めることができることを表す（例えば、異種移植モデルＥＳ００２６、ＥＳ２３５６およびＥＳ０２１５の場合に、本発明のバイオマーカーはＣＡＮ０１７処理に対して応答がないと正確に予測できると考えられる）。
【００９９】
本発明者はさらに、ＴＧＩと正の相関を有する少なくとも一つのバイオマーカーおよびＴＧＩと負の相関を有する一つのバイオマーカーを同時に用いると、正確率がさらに高くなることを発見した。２０個の食道癌の異種移植モデルにおいてＮＲＧ１をマーカーとして単独使用した場合の予測の正確率は８５％であり、ＧＮＡＺをマーカーとして単独使用した場合の予測の正確率は９０％であった。しかしＮＲＧ１およびＧＮＡＺをマーカーとして同時に使用した場合の予測の正確率は９５％に達した（図１９）。
【０１００】
実施例６  抗ＥＲＢＢ３の抗体１１Ｇ０１に対する食道癌の異種移植モデルの応答
他の抗ＥＲＢＢ３抗体に対する応答の予測方法を証明するために、作用メカニズムがＣＡＮ０１７と異なる抗ＥＲＢＢ３抗体（抗体１１Ｇ０１）により実施例４で選択された１２個の食道癌の異種移植モデルを処理した。具体的には、２０ｍｇ／ｋｇの抗体１１Ｇ０１を用いて、選択した１２個の食道癌の異種移植モデルを実施例１に記載の方式で処理し、３週間後に各モデルの腫瘍成長阻害百分比を統計した。結果は実施例４と同様であった（即ち、各バイオマーカーに基づいて予測した腫瘍の抗体に対する応答状況は実際に観察された腫瘍の抗体に対する応答状況と一致した。データは未表示）。これは、本発明のバイオマーカーは作用メカニズムがＣＡＮ０１７と異なる他の抗ＥＲＢＢ３抗体による処理に対する食道癌の応答を効果的に予測できることを示している。
【０１０１】
引用による結合
全ての目的から発し、本明細書で言及される特許文献および科学論文におけるそれぞれの完全な開示内容はいずれも引用により本明細書中に組み込まれる。
【０１０２】
均等物
本発明の精神または本質的特徴を逸脱することなく、他の具体的な形式で本発明を実施することができる。従って、上記の実施形態は全ての面において、本明細書で説明される本発明を限定するものとしてではなく、説明するものとして理解されるべきである。従って、本発明の範囲は、上記説明ではなく、附属の特許請求の範囲により指定されるものである。また、当該特許請求の範囲の均等的な意味および範囲内の全ての変更はこの中に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５（Ａ）】
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【図５（Ｂ）】
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【図６（Ａ）】
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【図６（Ｂ）】
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【図７（Ａ）】
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【図７（Ｂ）】
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【図８（Ａ）】
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【図８（Ｂ）】
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【図９（Ａ）】
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【図９（Ｂ）】
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【図１０（Ａ）】
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【図１０（Ｂ）】
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【図１１（Ａ）】
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【図１１（Ｂ）】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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