(57)【要約】２つの別々の成分を含む組み合わせたシステムであって、第一成分が、可変および定常(Ｖ-Ｃ)Ｔ細胞受容体(TCR)遺伝子セグメントを有するベクターであり、第二成分が、連結(Ｊ)TCR遺伝子セグメントを有するベクターである、組み合わせたシステム。組み合わせたシステムは、前記第一成分が、第一TCR鎖をコードする改変Ｖ-Ｃエントリーベクターであり、システムが、第四および第五成分をさらに含み、第四成分が、二方向ターミネータ(BiT)ドナーベクターを含み、第五成分が、前記第一TCR鎖に相補的な第二TCR鎖をコードする改変Ｖ-Ｃエントリーベクターを含むように改変できる。【選択図】図１
2020530769.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つの別々の成分を含む組み合わせたシステムであって、第一成分が、可変および定常(Ｖ-Ｃ)Ｔ細胞受容体(TCR)遺伝子セグメントを有するベクターであり、第二成分が、連結(Ｊ)TCR遺伝子セグメントを有するベクターである、組み合わせたシステム。
【請求項２】
第一成分が、
ａ.複製起点、
ｂ.第一ポジティブ選択マーカー、
ｃ.１つ以上の５'遺伝子エレメント、
ｄ.コザック配列、
ｅ.TCR可変遺伝子セグメント、
ｆ.第一IIS型制限酵素による部位特異的認識および切断のための第一IIS型配列であって、前記認識配列の５'側でTCR可変遺伝子セグメントの３'末端にて酵素が切断するような向きである配列、
ｇ.ネガティブ選択マーカー、
ｈ.第二IIS型制限酵素による部位特異的認識および切断のための第二IIS型配列であって、酵素が切断して、前記認識配列の３'側でTCR定常遺伝子セグメントの５'末端にて切断を駆動するような向きである配列、
ｉ.TCR定常遺伝子セグメント、ならびに
ｊ.１つ以上の３'遺伝子エレメント
を含むＶ-Ｃエントリーベクターである、請求項１に記載の組み合わせたシステム。
【請求項３】
第二成分が、
ａ.複製起点、
ｂ.第二ポジティブ選択マーカー、
ｃ.第三IIS型制限酵素による部位特異的認識および切断のための第三IIS型配列であって、前記認識配列の３'側でTCR連結遺伝子セグメントの５'末端にて酵素が切断するような向きである配列、
ｄ.TCR連結遺伝子セグメント、
ｅ.定常遺伝子セグメントの小さい５'部分に相当するＣ部、および
ｆ. 第四IIS型制限酵素による部位特異的認識および切断のための第四IIS型配列であって、配列が、前記認識配列の５'側で構築物の３'末端 TCR Ｃ部部分にて酵素が切断するような向きであり、作製される一本鎖突出配列が、請求項２ｈで規定される第二IIS型配列により作製されるものに相補的である配列
を含む１つ以上のＪドナーベクターである、請求項１または２に記載の組み合わせたシステム。
【請求項４】
５'遺伝子エレメントが：
ａ.遺伝子シスエレメント、
ｂ.リコンビナーゼ酵素のための異種特異的認識部位、
ｃ.興味対象のゲノム部位についての５'相同組換えアーム、
ｄ.mRNAスプライスアクセプター部位、
ｅ.配列内リボソーム進入部位、および
ｆ.エピジェネティックインスレータ配列
から選択される１つ以上のエレメントを含む、請求項２または３に記載の組み合わせたシステム。
【請求項５】
ネガティブ選択マーカーが：
ａ.第一成分の他の場所にもTCR連結遺伝子セグメント内に含まれない制限酵素認識部位、
ｂ.細菌性自殺遺伝子および
ｃ.レポーターエレメント
から選択される、請求項２〜４のいずれか１項に記載の組み合わせたシステム。
【請求項６】
３'遺伝子エレメントが：
ａ.ターミネータエレメント、
ｂ.リコンビナーゼ酵素のための異種特異的認識部位、
ｃ.興味対象のゲノム部位についての３'相同組換えアーム、
ｄ.mRNAスプライスドナー部位、
ｅ.配列内リボソーム進入部位、および
ｆ.エピジェネティックインスレータ配列
から選択される１つ以上のエレメントを含む、請求項２〜５のいずれか１項に記載の組み合わせたシステム。
【請求項７】
両成分が、上で規定するもの以外のいずれのIIS型配列も含まず、請求項５で規定するネガティブ選択マーカーだけを含む、請求項２〜６のいずれか１項に記載の組み合わせたシステム。
【請求項８】
CDR3をコードするオリゴヌクレオチド二重鎖(odeCDR3)を含む第三成分をさらに含み、odeCDR3が：
ａ.TCR可変遺伝子セグメントの３'末端にて第一IIS型制限部位の切断により作製されるものに相補的な第一一本鎖突出配列、
ｂ.TCR CDR3領域をコードし、請求項３で規定されるネガティブ選択マーカーを含まない二本鎖セグメントであって、第一および第二成分のいずれのIIS型制限配列も含まない二本鎖セグメント、ならびに
ｃ.TCR連結遺伝子セグメントの５'末端にて第三IIS型制限酵素部位の切断により作製されるものに相補的な第二一本鎖突出配列
を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組み合わせたシステム。
【請求項９】
CDR3をコードするオリゴヌクレオチド二重鎖(odeCDR3)を含む第三成分をさらに含み、odeCDR3が、２つのIIS型認識および切断部位に挟まれたCDR3をコードするdsDNA分子またはプラスミドDNAであり、それにより、前記酵素による切断が、Ｖ-Ｃエントリーベクターにおいて第一IIS型切断により５'末端にて作製される一本鎖突出及びＪドナーベクターの第三IIS型切断により3'末端に作製される一本鎖突出に相補的な一本鎖突出をもたらして、請求項８に記載されるａ、ｂおよびｃを含む前記odeCDR3の消化生成物を得る、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組み合わせたシステム。
【請求項１０】
第一から第四IIS型配列が、同じまたは異なる、請求項２〜９のいずれか１項に記載の組み合わせたシステム。
【請求項１１】
請求項１〜10のいずれか１項で規定されるＶ-ＣエントリーベクターライブラリとＪドナーベクターライブラリとの二部分ベクターライブラリであって、Ｖ-Ｃエントリーベクターライブラリが：
TCRを有する生物の全ての生殖系列TCR可変および定常遺伝子セグメントを表す１つ以上のベクターの収集物、または
コードされるタンパク質の翻訳されたアミノ酸配列が、生殖系列遺伝子セグメントによりコードされるタンパク質配列に関して改変されないような、TCRを有する生物のバリアント生殖系列TCR可変および定常遺伝子セグメントの収集物を表す１つ以上のベクターの収集物、または
コードされるタンパク質の翻訳されたアミノ酸配列が、生殖系列遺伝子セグメントによりコードされるタンパク質配列に関して改変されるような、TCRを有する生物のバリアント生殖系列TCR可変および定常遺伝子セグメントの収集物を表す１つ以上のベクターの収集物
であり、
Ｊドナーベクターライブラリが、TCRを有する生物の生殖系列TCR連結遺伝子セグメントを表す１つ以上のベクターの収集物、または
コードされるタンパク質の翻訳されたアミノ酸配列が、生殖系列遺伝子セグメントによりコードされるタンパク質配列に関して改変されないような、TCRを有する生物のバリアント生殖系列TCR連結遺伝子セグメントを表す１つ以上のベクターの収集物、または
コードされるタンパク質の翻訳されたアミノ酸配列が、生殖系列遺伝子セグメントによりコードされるタンパク質配列に関して改変されるような、TCRを有する生物のバリアント生殖系列TCR連結遺伝子セグメントを表す１つ以上のベクターの収集物
である、二部分ベクターライブラリ。
【請求項１２】
全長TCRオープンリーディングフレーム(ORF)のインビトロ再構成の方法であって：
ａ.Ｖ-Ｃエントリーベクターを選択する工程と、
ｂ.Ｊドナーベクターを選択する工程と、
ｃ.odeCDR3を選択する工程と、
ｄ.ａ、ｂおよびｃを、ｉ)Ｖ-ＣエントリーベクターおよびＪドナーベクターに存在する全てのIIS型制限酵素認識および切断部位を切断するIIS型制限酵素ならびにii)DNAリガーゼ酵素と、組み合わせたミックスを熱サイクル反応に供する工程と、
ｅ.工程ｄから得られる反応生成物で、DNAベクター増殖能力を持つ宿主生物を形質転換する工程と、
ｆ.前記宿主生物を増殖させて、得られるＶ-Ｃエントリーベクター主鎖内の全長の再構成されたTCRオープンリーディングフレームを得る工程
とを含む、方法。
【請求項１３】
全長TCR ORFを再構成するためにＪドナーベクターおよびodeCDR3と組み合わせて用いるためのＶ-Ｃエントリーベクターであって、Ｖ-Ｃベクターが：
哺乳動物宿主細胞における一過性発現または再構成された全長TCRオープンリーディングフレームのために適切な配列SEQ0692、
マッチする異種特異的リコンビナーゼ配列を有する遺伝子標的とのリコンビナーゼ媒介カセット交換のために適切な配列SEQ0693、および
マッチする異種特異的リコンビナーゼ配列を有する遺伝子標的とのリコンビナーゼ媒介カセット交換のために適切な配列SEQ0694
から選択される、Ｖ-Ｃエントリーベクター。
【請求項１４】
配列SEQ0700により表されるＪドナーベクター。
【請求項１５】
全長TCR ORFを再構成するためにＪドナーベクターおよびodeCDR3と組み合わせて用いるための請求項１〜10のいずれか１項で規定されるＶ-Ｃエントリーベクターのライブラリであって、Ｖ-Ｃエントリーベクターが、配列SEQ0049〜SEQ0094により表されるヒトTRA遺伝子座の遺伝子セグメント使用を再現するための可変および定常遺伝子セグメントを含み、かつ/またはＶ-Ｃエントリーベクターが、配列SEQ0484〜SEQ0577により表されるヒトTRB遺伝子座の遺伝子セグメント使用を再現するための可変および定常遺伝子セグメントを含み、
ベクターが、再構成された全長TCRオープンリーディングフレームの一過性発現に適切である、ライブラリ。
【請求項１６】
配列SEQ0323〜SEQ0378により表されるヒトTRA遺伝子座の遺伝子セグメント使用を再現するための連結遺伝子セグメントを含み、ベクターが、CDR3領域全体にわたるodeCDR3とともに用いられ、かつ/または
配列SEQ0379〜SEQ0434により表されるヒトTRA遺伝子座の遺伝子セグメント使用を再現するための連結遺伝子セグメントを含み、ベクターが、３〜４コドン長さが短くなったodeCDR3とともに用いられる、
請求項１および３〜10のいずれか１項で規定されるＪドナーベクターのライブラリ。
【請求項１７】
配列SEQ0636〜SEQ0661で表されるヒトTRB遺伝子座の遺伝子セグメント使用を再現するための連結遺伝子セグメントを含み、ベクターが、CDR3領域全体にわたるodeCDR3とともに用いられ、かつ/または
配列SEQ0662〜SEQ0687により表されるヒトTRB遺伝子座の遺伝子セグメント使用を再現するための連結遺伝子セグメントを含み、ベクターが、３〜４コドン長さが短くなったodeCDR3とともに用いられる、
請求項１および３〜10のいずれか１項で規定されるＪドナーベクターのライブラリ。
【請求項１８】
全長TCR ORFを再構成するためにＶ-ＣエントリーベクターおよびodeCDR3と組み合わせて用いるための請求項16または17に記載のライブラリ。
【請求項１９】
前記第一成分が、第一TCR鎖をコードする改変Ｖ-Ｃエントリーベクターであり、システムが、第四および第五成分をさらに含み、第四成分が、二方向ターミネータ(BiT)ドナーベクターを含み、第五成分が、前記第一TCR鎖に相補的な第二TCR鎖をコードする改変Ｖ-Ｃエントリーベクターを含む、請求項１〜10のいずれか１項に記載の組み合わせたシステム。
【請求項２０】
前記第一成分の前記改変Ｖ-Ｃエントリーベクターが、請求項２で規定するエレメントを含み：
ａ.第五IIS型制限酵素による特異的認識および切断のための第五IIS型配列であって、前記認識配列の５'側で定常遺伝子セグメントの３'末端にて酵素が切断するような向きである配列、
ｂ.第五IIS型配列の３'側にあるネガティブ選択マーカー、
ｃ.ｂ.のネガティブ選択マーカーの３'側にある第六IIS型制限酵素による部位特異的認識および切断のための第六IIS型配列であって、前記認識配列の３'側で３'遺伝子エレメントの５'側で酵素が切断するような向きである配列
をさらに含む、請求項19に記載の組み合わせたシステム。
【請求項２１】
前記第五成分の前記改変Ｖ-Ｃエントリーベクターが、請求項２で規定するエレメントを含み：
ａ.第七IIS型制限酵素による部位特異的認識および切断のための第七IIS型配列であって、前記認識配列の３'側でコザック配列の５'にて酵素が切断するような向きである配列、
ｂ.第八IIS型制限酵素による部位特異的認識および切断のための第八IIS型配列であって、前記認識配列の５'側で定常遺伝子セグメントの３'末端にて酵素が切断するような向きである配列、
ｃ.第八IIS型配列の３'側にあるネガティブ選択マーカー
をさらに含む、請求項19または20に記載の組み合わせたシステム。
【請求項２２】
前記第四成分の前記BiTドナーベクターが：
a. 複製起点、
b. ポジティブ選択マーカー、
c. 第九IIS型制限酵素による部位特異的認識および切断のための第九IIS型配列であって、前記認識配列の３'側で二方向ターミネータエレメントｄの５'末端で酵素が切断するような向きである配列、
d. アンチセンス配置で２つの転写ターミネータをコードする二方向ターミネータエレメント、
e. 第十IIS型制限酵素による部位特異的認識および切断のための第十IIS型配列であって、前記認識配列の５'側でかつ二方向ターミネータエレメントｄの３'側で酵素が切断するような向きである配列
を含む、請求項19〜21のいずれか１項に記載の組み合わせたシステム。
【請求項２３】
第一から第四IIS型配列が、同じまたは異なる、請求項19〜22のいずれか１項に記載の組み合わせたシステム。
【請求項２４】
第五から第十IIS型配列が、同じまたは異なり、第一から第四IIS型配列のものとは異なる、請求項19〜22のいずれか１項に記載の組み合わせたシステム。
【請求項２５】
ネガティブ選択マーカーが：
ａ.第一成分の他の場所にもTCR連結遺伝子セグメント内に含まれない制限酵素認識部位、
ｂ.細菌性自殺遺伝子、および
ｃ.レポーターエレメント
から選択され、請求項20のｂ.および請求項21のｃ.で規定されるネガティブ選択マーカーが、請求項２のｇ.で規定されるネガティブ選択マーカーとは異なり、請求項２のｇ.で規定されるネガティブ選択マーカーが、第一および第五成分の改変Ｖ-Ｃエントリーベクターについて異なる、請求項19〜24のいずれか１項に記載の組み合わせたシステム。
【請求項２６】
請求項19〜25のいずれか１項で規定されるＶ-Ｃエントリーベクターのライブラリであって、ライブラリが、第一および第二Ｖ-Ｃエントリーベクターライブラリを含み、これらがそれぞれ：
TCRを有する生物の全ての生殖系列TCR可変および定常遺伝子セグメントを表す１つ以上のベクターの収集物、または
コードされるタンパク質の翻訳されたアミノ酸配列が、生殖系列遺伝子セグメントによりコードされるタンパク質配列に関して改変されないような、TCRを有する生物のバリアント生殖系列TCR可変および定常遺伝子セグメントの収集物を表す１つ以上のベクターの収集物、または
コードされるタンパク質の翻訳されたアミノ酸配列が、生殖系列遺伝子セグメントによりコードされるタンパク質配列に関して改変されるような、TCRを有する生物のバリアント生殖系列TCR可変および定常遺伝子セグメントの収集物を表す１つ以上のベクターの収集物
を含み、
第一および第二Ｖ-Ｃエントリーライブラリが、相互性TCR鎖をコードする、ライブラリ。
【請求項２７】
単一生成物構築物中の逆平行配置でコードされる全長TCRオープンリーディングフレーム(ORF)の対を提供するために用いるための、請求項26に記載のＶ-Ｃエントリーベクターのライブラリ。
【請求項２８】
単一生成構築物中の逆平行配置でコードされる全長TCRオープンリーディングフレーム(ORF)の対のインビトロ再構成の方法であって：
ａ.各TCR鎖についてＶ-Ｃエントリーベクターを選択する工程と、
ｂ.各TCR鎖についてＪドナーベクターを選択する工程と、
ｃ.各TCR鎖についてodeCDR3を選択する工程と、
ｄ.各TCRについて独立した反応においてｉ)Ｖ-ＣエントリーベクターおよびＪドナーベクターに存在する第一から第四IIS型制限酵素認識および切断部位を切断するIIS型制限酵素ならびにii)DNAリガーゼ酵素と反応させるためにａ、ｂおよびｃを組み合わせて、組み合わせたミックスを熱サイクル反応に供して第一および第二反応生成物を得る工程と、
ｅ.工程ｄからの両方の反応生成物を、請求項21で規定するBiTドナーベクターと、ｉ)第五から第十IIS型制限酵素認識および切断部位を切断するIIS型制限酵素ならびにii)DNAリガーゼ酵素と組み合わせ、組み合わせた反応生成物を熱サイクル反応に供して、第三反応生成物を得る工程と、
ｆ.工程ｅ.からの第三反応生成物で、DNAベクター増殖能力を持つ宿主細胞を形質転換する工程と、
ｇ.前記宿主生物を増殖させて、得られたＶ-Ｃエントリーベクター主鎖内の全長の再構成されたTCRオープンリーディングフレームを得る工程と
を含む、方法。
【請求項２９】
配列番号0756および0764により表されるＶ-Ｃエントリーベクターの対。
【請求項３０】
マッチする異種特異的リコンビナーゼ配列を有する遺伝子標的とのリコンビナーゼ媒介カセット交換において用いるための、配列番号0756および0764により表されるＶ-Ｃエントリーベクターの対。
【請求項３１】
配列SEQ0777により表される、請求項21に記載の二方向ターミネータエレメント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ヘテロ二量体Ｔ細胞受容体(TCR)は、適応免疫の中心である。ユニークTCRは、Ｔ細胞発生の間に継続的に生成され、これにより、一連の遺伝子セグメントが単一の連続TCRオープンリーディングフレーム(ORF)に組み換えられる。組換えのこのプロセスにおいて生じる多様性の程度が大きいので、単細胞において発現されるTCR対からの配列データを把握することは困難である。さらに、この多様性は、TCR機能の試験および操作のためにハイスループットベースで遺伝子構築物内でこれらのTCRオープンリーディングフレーム(ORF)を提供することも困難にする。本発明は、第一の態様において、TCR遺伝子セグメントの部分を含む可変-定常エントリーベクター(Ｖ-Ｃエントリー)および連結ドナー(Ｊドナー)ベクターからなる予め組立てられた二成分ベクターライブラリシステムを提供する。二成分システムは、制限酵素消化/リガーゼサイクル反応においてTCR相補性決定領域３をコードする合成DNAオリゴヌクレオチド二重鎖(odeCDR3)とともに、Ｖ-Ｃエントリーベクターライブラリから選択されたＶ-ＣエントリーベクターがＪドナーベクターライブラリから選択されたＪドナーベクターと組み合わされた場合に、単一ベクターが創出されて全長TCR ORFを再構築するような様式で設計されている。このようなベクターライブラリシステムにより、選択されたベクターの状況においてTCR ORFを迅速かつ費用効果的に作製するためのPCRに依存しない方法が可能になる。さらに、このシステムは、親和性および/または機能成熟ワークフローのために合成TCR配列を作成するための新規なワークフローを可能にする。このTCR ORF再構成およびエンジニアリングシステム(TCR ORF Reconstitution and Engineering System ;TORES)は、よって、TCR機能解析およびエンジニアリングのための強力なツールである。第二の態様において、逆平行コーディングセンスにおける２つのTCR ORF鎖対を単一生成物ベクターに接続する第二工程を可能にする、第三成分二方向ターミネータドナーベクター(BiTドナー)とともに改変Ｖ-Ｃエントリーベクターを含むTORESが提供される。この二方向TORES2システムは、TCR操作および特徴決定のための対形成したTCR ORF構築物を送達するための代替のワークフローを可能にする。
【背景技術】
【０００２】
Ｔリンパ球(Ｔ細胞)による免疫監視機構は、全ての有顎脊椎動物の適応免疫における中心的な機能である。Ｔ細胞による免疫監視機構は、Ｔ細胞サブタイプ全体にわたる豊富な機能多様性を介して達成され、該Ｔ細胞サブタイプは、病原体感染および腫瘍性細胞の排除に貢献し、侵入病原体、共生微生物、食物の分子成分のような共生非自己因子に対する適応免疫応答を組織化し、さらには自己の免疫寛容を維持する。様々な外来および自己因子に応答するために、Ｔ細胞は、これらの外来および自己因子の分子構成成分を特異的に検出できなければならない。よって、Ｔ細胞は、個体が遭遇する自己および非自己分子の大きな断面を、病原性生物および病的な自己に対する有効な応答を開始するために十分な特異性を持って、健常な自己に対するそのような応答の開始を回避しながら検出できなければならない。この任務の非常に複雑な性質は、外来および自己の分子の両方の実際的に無限の多様性を考慮した場合に明らかになり、病原性生物は、Ｔ細胞による検出を逃れるための進化圧力の下にある。
【０００３】
Ｔ細胞受容体(TCR)
Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体(TCR)の発現により第一に規定される。TCRは、Ｔ細胞適応免疫の標的と相互作用しそれを感知する役割を担うＴ細胞の成分である。一般的に言えば、TCRは、細胞表面上で提示されるヘテロ二量体タンパク質複合体で構成される。２つのTCR鎖のそれぞれは、ともに免疫グロブリンスーパーファミリー(IgSF)ドメインに属し、逆並行βシートを形成する可変(Ｖ)領域と定常(Ｃ)領域である２つの細胞外ドメインで構成される。これらは、短い細胞質尾部につながるＩ型膜貫通ドメインにより細胞膜に係留されている。多様な分子構成成分に適応してそれを検出するＴ細胞の素質は、Ｔ細胞発生中に生じるTCR鎖における変動から生じる。この変動は、Ｂ細胞における抗体発生に類似の様式で体細胞組換えにより生じる。
【０００４】
TCR鎖多様性
Ｔ細胞プールは、いくつかの機能および表現型が不均質な下位集団からなる。しかし、Ｔ細胞は、それらの表面で発現される体性再編成されたTCRの形に従ってαβまたはγδに大きく分類できる。２つのTCR鎖対の形、すなわちTCRアルファ(TRA)およびTCRベータ(TRB)対と、TCRガンマ(TRG)およびTCRデルタ(TRD)対が存在する。TRA:TRB対を発現するＴ細胞はαβＴ細胞と呼ばれ、TRG:TRD対を発現するＴ細胞は、しばしばγδＴ細胞と呼ばれる。
αβおよびγδ形のTCRはともに多様なリガンドまたは抗原の認識を担い、各Ｔ細胞は、Ｔ細胞成熟中にαβまたはγδ受容体鎖を新たに生じる。これらの新たなTCR鎖対は、体細胞V(D)J組換えと呼ばれるプロセスにおいて受容体配列多様性を生じることにより認識の多様性を達成した後に、各Ｔ細胞は、別個に再編成された単一TCRのコピーを発現する。TRAおよびTRG遺伝子座では、いくつかの分離した可変(Ｖ)および機能(Ｊ)遺伝子セグメントが組換えのために利用可能であり、定常(Ｃ)遺伝子セグメントに並置されるので、VJ組換えと呼ばれる。TRBおよびTRD遺伝子座での組換えは、さらに、多様性(Ｄ)遺伝子セグメントを含むので、VDJ組換えと呼ばれる。
組換えられたTCRのそれぞれは、αβＴ細胞の場合にαおよびβ鎖、またはγδＴ細胞の場合にγおよびδ鎖により形成されるリガンド結合部位の構造により決定される、ユニークなリガンド特異性の能力を有する。TCRの構造多様性は、相補性決定領域(CDR)と呼ばれる、それぞれの鎖上の３つの短いヘアピンループに主に限定される。３つのCDRは、受容体鎖対のそれぞれの鎖からもたらされ、これらの６つのCDRループはまとめてTCR細胞外ドメインの膜から遠い末端に存在して、抗原結合部位を形成する。
各TCR鎖における配列多様性は、２つの形態で達成される。第一に、組換えのための遺伝子セグメントの無作為選択は、基本的な配列多様性をもたらす。例えば、TRB組換えは、47のユニークＶ、２のユニークＤおよび13のユニークＪ生殖系列遺伝子セグメントの間で起こる。通常、Ｖ遺伝子セグメントは、CDR1およびCDR2ループの両方に貢献し、よって生殖系列にコードされている。配列多様性を生じるための第二の形態は、組み換えられるＶ、(Ｄ)およびＪ遺伝子セグメントの間の接合部にて鋳型ヌクレオチドの無作為欠失および非鋳型ヌクレオチドの付加により生じる超可変CDR3ループ内で起こる。
【０００５】
TCR:CD3複合体
成熟αβおよびγδTCR鎖対は、ε、γ、δおよびζと呼ばれるいくつかのアクセサリーCD3サブユニットと一緒に複合体として細胞表面にて提示される。これらのサブユニットは、αβまたはγδTCRと一緒に３つの二量体(εγ、εδ、ζζ)として会合する。このTCR:CD3複合体は、αβまたはγδTCRと同族抗原との結合の際に細胞シグナル伝達応答を開始するためのユニットを形成する。TCR:CD3複合体として会合したCD3アクセサリーは、免疫受容体活性化チロシンモチーフ(ITAM)と呼ばれるシグナル伝達モチーフに貢献する。
CD3ε、CD3γおよびCD3δはそれぞれ、単一のITAMに貢献するが、CD3ζホモ二量体は３つのITAMを含む。TCRとともに組み立てられる３つのCD3二量体(εγ、εδ、ζζ)は、よって、10のITAMに貢献する。同族抗原とのTCRライゲーションの際に、直列型チロシン残基のリン酸化は、重要な70kDaのζ鎖関連タンパク質(ζ-chain-associated protein of 70 kDa; ZAP-70)のようなSrcホモロジー２(Scr homology 2; SH2)ドメインを含むタンパク質のための対形成したドッキング部位を創出する。このようなタンパク質の動員は、Ｔ細胞活性化および分化を最終的に担うTCR:CD3シグナル伝達複合体の形成を開始する。
【０００６】
αβＴ細胞
αβＴ細胞は、通常、ヒトにおいて、対応するγδＴ細胞よりも豊富に存在する。αβＴ細胞のほとんどは、細胞表面上でHLA複合体により提示されるペプチド抗原と相互作用する。これらのペプチド-HLA(pHLA)認識Ｔ細胞は、最初に記述され、最もよく特徴決定されている。αβＴ細胞のより稀な形も記述されている。粘膜関連インバリアントＴ(MAIT)細胞は、比較的限定されたαおよびβ鎖多様性を有するとみられ、タンパク質断片よりもむしろ細菌代謝産物を認識する。インバリアントナチュラルキラーＴ細胞(invariant natural killer T-cells; iNK Ｔ細胞)および生殖系列によりコードされるミコリル反応性Ｔ細胞(germline-encoded mycolyl-reactive T-cells; GEM Ｔ細胞)は、非HLA分子により交差提示される糖脂質の認識に限定される。iNK Ｔ細胞は、大部分が、CD1dにより提示される糖脂質と相互作用すると考えられるが、GEM Ｔ細胞細胞は、CD1bにより提示される糖脂質と相互作用する。さらに別の形のＴ細胞は、CD1aおよびCD1cの状況において糖脂質と相互作用すると考えられるが、このような細胞は、まだ詳細に特徴決定されていない。
【０００７】
通常型αβＴ細胞
ほとんどのαβＴ細胞の重要な特徴は、HLA分子の状況におけるペプチド抗原の認識である。これらは、しばしば、「通常型」αβＴ細胞と呼ばれる。個体内で自己HLA分子は、自己および外来タンパク質からのペプチドをＴ細胞に提示し、悪性病変および外来病原体に対する適応免疫、共生生物、食物および自己に向けての適応寛容のための必須の基礎を提供する。HLAタンパク質をコードするHLA遺伝子座は、ヒトゲノムのうちで最も遺伝子密度が高く、多型性の領域であり、ヒトにおいて12,000を超えるアレルが記載されている。HLA遺伝子座における多型の程度が高いことにより、個体間のペプチド抗原提示の多様性が確実になり、このことは、集団レベルでの免疫のために重要である。
【０００８】
HLAクラスＩおよびII
２つの形の古典的HLA複合体、すなわちHLAクラスＩ(HLAI)およびHLAクラスII(HLAII)が存在する。３つの古典的HLAI遺伝子、すなわちHLA-A、HLA-BおよびHLA-Cが存在する。これらの遺伝子は、インバリアントβ2ミクログロブリン(β2Μ)鎖と会合する膜貫通型α鎖をコードする。HLAIα鎖は、免疫グロブリンフォールド型の３つのドメイン、すなわちα1、α2およびα3で構成される。α3ドメインは、膜の近くにあり、大部分がインバリアントであるが、α1およびα2ドメインは一緒になって、多型で膜から遠くにある抗原結合窩を形成する。６つの古典的HLAII遺伝子、すなわちHLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DRAおよびHLA-DRB1が存在する。これらの遺伝子は、α鎖およびβ鎖を含む、対形成したDP、DQおよびDRヘテロ二量体HLA複合体をコードする。それぞれの鎖は、免疫グロブリンフォールド型の２つの主要な構造ドメインを有し、ここで、α2およびβ2ドメインは、HLAIα3ドメインのものに類似の、膜に近く大部分がインバリアントのモジュールを含む。HLAIIα2およびβ2ドメインは一緒になって、膜から遠くにある抗原結合窩を形成し、多型性が高い領域である。
HLAIおよびHLAIIの抗原結合窩は、８つの逆平行βシートのプラットフォーム上に２つの逆平行αヘリックスを含む。この窩において、ペプチド抗原が結合し、延ばされた立体構造で提示される。HLAIおよびHLAIIにおけるペプチド接触残基は、ほとんどの配列多型の場所であり、これは、異なるHLAアレルにより提示される多様なペプチドレパートリの分子的基礎を構成する。ペプチドは、抗原結合窩と広範囲で接触し、その結果、各HLAアレルは、提示されたペプチドに対する別個の配列制約および優先性を課す。所定のペプチドは、よって、限定された数のHLAとだけ結合し、相互的に、各アレルは、所定のタンパク質からのペプチド収集物の特定の画分だけを受け入れる。各個体に存在するHLAIおよびHLAIIアレルのセットは、HLAハプロタイプと呼ばれる。HLAIおよびHLAII遺伝子の多型ならびに遺伝性のアレルの相互優性発現は、ヒト集団全体にわたるHLAハプロタイプの非常に大きい多様性を駆動し、これは、αβTCRの莫大な配列多様性と組み合わせた場合に、これらのHLA-抗原-TCR相互作用の分析の標準化への大きな障害となる。
【０００９】
HLAIおよびHLAIIのαβTCR結合
αβTCRは、HLAおよびペプチド抗原(変化した自己)の両方の残基により形成される混合pHLA結合界面の一部としてペプチドを認識する。HLAI複合体は、ほぼすべての有核細胞の表面に提示され、内因性タンパク質に由来するペプチドを提示すると一般的に考えられている。Ｔ細胞は、よって、相互作用細胞のpHLAI 複合体をサンプリングすることにより、HLAI提示細胞の内因性細胞性プロテオームを調べることができる。HLAIの結合は、相互作用Ｔ細胞によるTCR共受容体CD8の発現を必要とするので、HLAIサンプリングは、CD8+αβＴ細胞に制限される。これとは対照的に、HLAII複合体の表面提示は、プロフェッショナルAPCにほぼ制限され、提示細胞にとって外因性のタンパク質に由来するペプチドを提示すると一般的に考えられている。相互作用Ｔ細胞は、よって、提示細胞が存在する細胞外微小環境のプロテオームを調べることができる。HLAIIの結合は、相互作用Ｔ細胞によるTCR共受容体CD4の発現を必要とするので、HLAIIサンプリングは、CD4+αβＴ細胞に制限される。
【００１０】
αβTCRの胸腺選択
上記のαβTCRの役割は、pHLA複合体の検出であり、それにより、TCR提示Ｔ細胞は、確立された免疫におけるそのＴ細胞の役割と密接な関係がある応答を高めることができる。個体において生じたαβTCRレパートリは、特定のハプロタイプの状況においてかつそれが実際に起こる前に遭遇する可能性が高い全ての外来抗原の巨大で予測できない多様性の理由であるはずである。この結果は、自己pHLAとの強い相互作用を回避するように特異的に教授されただけで特定されていないpHLA複合体を認識する能力を有して非常に多様で多数のαβTCRがある程度無作為化された様式で生じる背景に対して達成される。これは、胸腺選択と呼ばれるプロセスにおいてＴ細胞成熟中に注意深く調整される。
胸腺におけるＴ細胞成熟の第一工程中に、十分な親和性をもって自己pHLA複合体と相互作用できないαβTCRを有するＴ細胞は、生存シグナルを奪われ、排除される。ポジティブ選択と呼ばれるこの工程により、正しいHLAの状況において提示される外来または変化したペプチドを少なくとも認識できる可能性があるTCRレパートリを生存Ｔ細胞が確実に有することになる。その後、自己pHLAと強く相互作用し、よって自己免疫を駆動する能力を有するαβTCRは、ネガティブ選択のプロセスにより能動的に除去される。ポジティブおよびネガティブ選択のこの組み合わせは、末梢にある自己pHLAに対する低い親和性を有するαβTCRを有するＴ細胞だけをもたらす。これは、自己に制限されるが自己反応性ではないαβＴ細胞レパートリを確立する。HLAハプロタイプに対するＴ細胞発生のこの高度に個別化された性質は、αβTCR-抗原-HLA相互作用の標準化された分析における困難を強調する。さらに、これは、移植片拒絶および移植片対宿主病の両方の基礎、ならびに一個体において同定されるαβTCRが第二の個体において完全に異なる影響を有し得るという一般的な原理の基礎を形成し、このことは、実際の臨床において現れるTCRベースおよびＴ細胞ベースの治療および診断方策について明確な意味を有する。
【００１１】
非通常型αβＴ細胞
αβＴ細胞の非HLA拘束または「非通常型」の形は、非常に異なる分子抗原標的を有する。これらの非通常型αβＴ細胞は、古典的HLA複合体を結合させないが、CD1ファミリーまたはMR1のような保存されたHLA様タンパク質を結合させる。CD1ファミリーは、抗原交差提示に関与する４つの形(CD1a、ｂ、ｃおよびｄ)を含む。これらの細胞表面複合体は、HLAIによく似たα鎖を有し、これがβ2Μとヘテロ二量体を形成する。α鎖の膜から遠い表面で提示される小さい疎水性ポケットは、病原体由来の脂質ベースの抗原のための結合部位を形成する。自然様NK Ｔ細胞(innate like NK T-cells; iNK Ｔ細胞)は、脂質/CD1ファミリー認識の最もよく理解された例であり、GEM Ｔ細胞は、別の顕著な例を表す。「Ｉ型」iNK Ｔ細胞は、CD1dの状況において脂質α-GalCerと強く相互作用することが知られている。これらのiNK Ｔ細胞は、固定されたTCRα鎖(Vα10/Jα18)および限定された数のβ鎖(制限されたvβ使用を有する)を有する非常に限定されたTCR多様性を示し、これらは、Toll様およびNod様受容体のような自然の病原体関連分子パターン(PAMPS)認識受容体になぞらえられている。これとは対照的に、「II型」NK Ｔ細胞は、より多様なTCRレパートリを示し、より多様な形態のCD1d-脂質複合体結合を有するとみられる。GEM Ｔ細胞は、CD1bにより提示されるマイコバクテリア由来糖脂質を認識するが、CD1a、ｂおよびｃによる抗原提示ならびにそれらのＴ細胞認識の分子的な詳細は、理解され始めたばかりである。
MAIT細胞は、インバリアントTCRα鎖(TRAJ33、TRAJ20またはTRAJ12とライゲーションされたTRAV1-2)を主に発現し、該鎖は、一連のTCRβ鎖と対形成できる。ペプチドまたは脂質の代わりに、MAIT TCRは、HLAI様分子であるMR1により提示される病原体由来葉酸およびリボフラビンベースの代謝産物と結合できる。MAIT TCR上で観察されるTCR における限定されているが著しい多様性は、保存されたMR1の状況における多様であるが関連する代謝産物の認識を可能にするとみられる。
非古典的HLA拘束αβＴ細胞TCRがどのようにして成熟中に胸腺において選択されるのか、よく理解されていない。しかし、上で概説したネガティブおよびポジティブ選択の基本的なプロセスが当てはまるようであり、胸腺内で特殊化した適所においてこのことが生じることを示唆するいくらかの証拠がある。
【００１２】
γδＴ細胞
αβTCR発生およびpHLA結合の詳細な機械論的理解とは対照的に、抗原標的およびそれらのγδＴ細胞対応物の状況については比較的ほとんど知られていない。このことは、循環Ｔ細胞区画中のそれらの量が比較的低いことが理由の一つである。しかし、 γδＴ細胞は、厳密にHLA拘束されないと広く考えられており、抗体と同様に、より自由に表面抗原を認識するとみられる。さらに、より最近では、γδＴ細胞は、外来抗原との免疫系の主な相互作用部位である上皮組織の常在型Ｔ細胞区画を支配できることが認識されるようになってきている。さらに、γδＴ細胞腫瘍免疫監視および調節不全になった自己のその他の形の監視機構についての様々な機序が文献において明らかにされ始めている。自然様および適応γδＴ細胞の両方の特異的抗原標的は、まだほとんど定義されていないが、PAMPの組織分布および迅速な認識は、外来抗原に対する応答の初期および適応免疫系がまだ成熟中の生命の初期の両方におけるγδＴ細胞の基本的な役割を示唆する。
γδＴ細胞の多様な機能は、異なるVγVδ遺伝子セグメント使用に基づくとみられ、γδＴ細胞がほとんどインバリアントのTCRと一緒に、感染中の非常に初期にPAMPの自然様認識を媒介する２つの主なカテゴリーにおいて広く理解できる。PAMP以外に、これらのタイプのγδＴ細胞は、さらに、細胞ストレス、感染およびおそらく腫瘍発生の非常に初期のサインを与え得るリン酸抗原を含む自己分子を認識すると考えられている。PAMPおよびこのようないわゆる損傷関連分子パターン(danger associated molecular patterns; DAMPS)ならびに多数の組織拘束自然様γδＴ細胞の認識は、これらの細胞が、予め活性化、ホーミングおよびクローン増殖を必要とせず抗原負荷に対して迅速に応答するのに適していることを強く示唆する。
【００１３】
γδＴ細胞の第二の形は、実際はより適応性があり、非常に多様性のγδTCRレパートリおよび末梢を循環してリンパ系組織に直接アクセスする能力を有すると考えられている。このような抗原特異的γδＴ細胞は、CMVのような一般的なヒト病原体について記載されており、メモリー応答を形成するとみられる。しかし、γδＴ細胞は、活性化の後に比較的限定されたクローン性増殖のみを示し、末梢循環または組織におけるTCR多様性およびγδＴ細胞の特異的応答の程度についてはほとんど利用可能なデータはない。さらに、γδTCRはpHLA複合体と相互作用せず、よって、この状況においてペプチド抗原と結合しないと一般的に考えらえているが、γδＴ細胞のいくつかの抗原標的だけが特徴決定されており、根底にある分子フレームワークはわずかに理解されているだけである。
【００１４】
末梢γδＴ細胞の頻度が低いことおよびヒトにおける組織常在性Ｔ細胞を研究することが困難であることのために、この重要で多様なタイプのＴ細胞がどのようにして適応免疫応答に参加するのかについての我々の知識が限定されてきた。この台頭してきた研究領域は、稀なγδＴ細胞を捕捉して特徴決定し、それらのTCR対を単離し、それらの同族抗原を同定する、より信頼できる技術を必要とする。
【００１５】
抗原および抗原提示細胞
Ｔ細胞およびTCRの状況において、抗原は、TCRと結合でき、Ｔ細胞内のシグナル伝達をもたらす任意の分子と定義できる。最もよく特徴決定されているＴ細胞抗原は、HLAIおよびHLAII複合体において提示され、通常型αβＴ細胞と結合するペプチドである。しかし、近年、非通常型αβＴ細胞およびγδＴ細胞が抗原として広範囲の生体分子、例えば脂質、リポペプチド、糖ペプチド、糖脂質ならびに一連の代謝産物および異化産物を結合できることが明らかになってきた。さらに、γδＴ細胞が、抗体様の様式で完全にフォールドされたタンパク質と直接結合できることが明らかになってきた。よって、Ｔ細胞抗原がHLAにより提示されるペプチドに主に拘束されるという視点は、過去20年間で、ほぼ全ての生体分子を含むように拡大されている。この概念を念頭に置いて、何を抗原提示細胞(APC)と考えることができるかを定義することが適切である。
【００１６】
前出のセクションで定義したように、HLAIおよびHLAIIは、細胞型全体にわたって共通点のない発現プロファイルを有する。ほぼ全ての有核細胞が細胞表面上でHLAI複合体を提示し、よって、Ｔ細胞サンプリングのためにペプチド抗原を提示する能力があることが広く受け入れられている。これとは対照的に、HLAIIは制限された発現プロファイルを有し、少なくとも定常状態条件において、樹状細胞(DC)、マクロファージおよびＢ細胞を含む抗原提示の専門的な役割を有する細胞の表面でだけ発現される。これらの専門細胞型は、しばしばプロフェッショナルAPCと呼ばれる。この文書の目的のために、用語「APC」は、αβまたはγδＴ細胞によるサンプリングのために抗原を提示できる任意の有核細胞を表すために用いる。このような抗原は、特異的抗原提示複合体、例えばHLAおよびHLA様分子において「カーゴ」として提示されるものに制限されないが、αβまたはγδTCR保有細胞と結合できる任意の細胞表面提示部分も含むことができる。
【００１７】
TCRの治療への使用
初代Ｔ細胞の養子移入は、免疫不全患者にウイルス免疫を与えるために、ウイルス抗原に向かう、エクスビボで増殖させたＴ細胞をまず用いて、1990年代初期に臨床背景において初めて試験された。特定の癌抗原に対してエクスビボで増殖させた初代Ｔ細胞を用いる同様のアプローチが、そのすぐ後に悪性腫瘍の処置において試験された。現在でも課題であり続けるこれらの初期のアプローチにおけるある限界は、治療製品において組成を精細に最適化する必要性と対立する、Ｔ細胞の性質および多様性についての理解の欠如である。現在、エクスビボで増殖させた初代Ｔ細胞の使用は、ウイルス抗原に対する特異性を有する初代Ｔ細胞を用いる一握りのイニシアティブ以外は、製薬業界においてほぼあきらめられている。
【００１８】
近年、遺伝物質を初代ヒト細胞に安定して導入する能力により、様々な実験的遺伝子改変Ｔ細胞治療剤が出現している。このような治療用細胞製品は、Ｔ細胞応答の力を利用し、Ｔ細胞特異性を疾患関連抗原標的、例えば悪性細胞によってのみ発現される抗原に向けなおすことを目的とする。これらは、実際のTCR鎖対ではなく、キメラ抗原受容体(CAR)をレシピエントＴ細胞に移入することに主に頼っている。CARは、CD3-TCR機能を模倣する合成キメラ受容体を生成するための、シグナル受容体エレメント、例えばCD3複合体のζ鎖にグラフトされた標的化部分(多くの場合、悪性細胞の表面発現タンパク質を標的にする一本鎖抗体エレメント)である。これらのいわゆるCAR Ｔ細胞(CAR-T)製品は、現在までに臨床試験においてまちまちの成功度を示しており、その可能性にもかかわらず、固有のユニークな分子標的を有する腫瘍、例えばＢ細胞悪性病変を超えて解釈することは容易ではない。代わりに、全長TCR鎖対ORFをＴ細胞に移入することについての興味が増えてきている。このようなTCRエンジニアリングされたＴ細胞治療剤は、困難な製造プロセスや、CAR-T製品と同様に、確認された抗原標的及び標的化構築物の欠如により現在限定されている。現在までに、悪性細胞上のHLAIにより提示されるペプチド抗原の認識のためのαβTCRの使用に焦点が当てられており、このアプローチの基本的な困難は、悪性細胞に特異的な抗原が必要であるということである。
【００１９】
TCR-pHLA相互作用が比較的低親和性のものであるので、天然TCRは、TCRエンジニアリングされたＴ細胞療法のために最適ではないようであると考えられている。いくつかのアプローチが、一本鎖抗体親和性成熟と同じ方法で、インビトロでTCRを親和性成熟させるために考案されている。これらのTCR親和性成熟アプローチも、通常、一方の鎖のＶ領域を別の鎖のＶ領域に融合させて単一ポリペプチド構築物を作製する一本鎖フォーマットを用いる。このような単一ポリペプチドを、次いで、抗体エンジニアリングワークフローから適応させたファージまたは酵母ディスプレイシステムにおいて用いることができ、標的結合に基づく何回かの選択を経ることができる。このような一本鎖TCRアプローチにおいて、機能的TCR鎖対を得る点において２つの固有の限界が存在する。第一に、選択が標的との結合親和性に基づくことである。しかし、TCR親和性がTCRシグナル伝達アウトプットの強さまたは能力と常に相関するわけではないことが十分に文書化されている。第二に、親和性に基づく一本鎖構築物の選択が、それらが全長受容体として一旦再構成されると、等価な親和性であると常に解釈されるわけではない。
【００２０】
治療の状況において、親和性成熟化TCR対においてさらなる限界が存在する。つまり、それらの配列が変更されたことを考慮すると、得られた構築物は、定義によれば、もはや胸腺選択に供されず、ここで、自己抗原と強く反応するTCRは、レパートリから削除される。よって、これらの改変TCRは、自己反応性である固有の危険性を有し、この危険性を、現在の方法を用いてインビトロで除くことは非常に難しい。同じ理由により、治療用途のために選択されたかまたはエンジニアリングされたTCRはいずれも、個別化される必要がある。もしTCRが人工的にエンジニアリングされるかまたは天然TCRが個体にまたがって用いられるならば、破滅的な可能性がある自己免疫を回避するために、それぞれの特定の個体のHLAハプロタイプおよび提示されるペプチドレパートリに基づいて交差反応性を除かなければならない。このことは、胸腺選択が、その所定の個体にのみ特異的なすべての利用可能なHLA分子の背景において行われるという事実のためである。このような交差反応性の可能性は不明である。しかし、我々のTCRレパートリが、同じ種の他の個体のpHLA複合体を外来であると認識する能力は、適応免疫の基本的な特性であり、移植片拒絶および移植片対宿主病を支持する。癌特異的黒色腫関連抗原(MAGE)に対する成熟TCR鎖対を用いる最近の臨床試験は、胸腺選択を迂回することの潜在的な問題に光を当てた。成熟TCRを有する自家Ｔ細胞を２名の癌患者に注入して戻したとき、これらの患者は、致命的な心臓疾患を迅速に発症した。その後の研究により、MAGE特異的成熟化TCRは、心臓タンパク質であるタイチンからのHLAIにより提示されるペプチドと交差反応性であったことがわかった。このことは、交差反応性が、TCRの治療への使用において別個の可能性であることを強く示唆する。
【００２１】
TCRを治療目的のために利用するための別の達成手段は、抗体治療用物質とほぼ同じ方法でそれらを親和性試薬として用いることにある。一本鎖TCR分子は、コンジュゲート薬物物質を特定のHLA-抗原発現細胞集団に送達するために試験されている。このようなアプローチは、通常、CAR-TまたはTCRエンジニアリングされたＴ細胞療法より安全であると考えられている。なぜなら、薬物物質の投与を単純に撤回することができるからである。しかし、交差反応性の可能性および予測困難なオフターゲット効果により、この背景における可能性のある限界がまだ存在する。
【００２２】
臨床診断におけるTCRレパートリ検出
関連する観点において、臨床診断目的のために特定のTCR配列の量の検出を用いることに対する興味が増加している。特にディープシーケンシング法の台頭につれて、ある個体内の全体の、そして特定の状況におけるマッチするαβ対についての完全なTCR多様性を把握することが可能である。このことは、患者における疾患関連抗原に対する免疫応答の確立のための代理の読み出しとして、増殖したＴ細胞クローンの量を単に検出することにより特定の状態および疾患状態を診断するための手段になる可能性がある。しかし、このような包括的なアプローチは、確立された臨床タイムポイントを有する非常に強い免疫応答に現在のところ限定されており、シーケンシングにより同定された任意の特定のTCRの特異的抗原標的を同定することの根底にある困難に苦しんでいる。
【００２３】
Ｔ細胞抗原の治療および診断のための使用
適応免疫応答を活用する基本的な強みは、TCR-抗原相互作用の精巧な特異性が、それぞれの病原体、癌細胞または自己免疫疾患に特異的に関連する抗原についての詳細な知識を必要とするという中心的な技術的困難と言い換えられる。さらに、各抗原は、特異的抗原提示複合体またはそのアレルにより提示され得るので、抗原の発見は、それぞれの関連するHLA遺伝子およびアレルについて行わなければならない。強い適応免疫応答と関連し、保存されたエピトープ応答階層を一般的に示すHIV、インフルエンザおよびCMVのようないくつかの感染性疾患について、最も重要なエピトープが、いくつかの一般的なHLAの状況においてマッピングされている。同様に、癌、アレルギーおよび自己免疫の分野において、関連Ｔ細胞抗原をマッピングする系統的な努力が増えてきている。しかし、これらは、困難な手順であり、異なる臨床状況と関連するＴ細胞抗原を系統的に表す努力は、効率的で確固とした迅速で適応性のあるプロトコールが存在しないことにより妨げられている。
特に、癌細胞は、困難で重要な態様である。なぜなら、悪性細胞の表面上で提示されるペプチドのほとんどは自己抗原であるかまたは自己抗原に非常に類似しているからである。よって、胸腺選択は、これらのペプチドを強く認識しうるTCRを削除するであろう。それと同時に、腫瘍は免疫認識を逃れるように発展する。このことは、確立された腫瘍に対する有力な免疫応答が比較的稀であり、標的を予測または発見することが難しいことを意味する。しかし、これらの応答は存在し、そして重要なことには、通常、よりよい結果と関連している。このような応答の標的、腫瘍関連抗原(TAA)は、ほとんどの場合、自己からの区別可能な特徴を有し、癌発展中に過剰発現されるか、発展のこの段階では細胞型に存在しないか、または遺伝子変異もしくは翻訳後改変、例えばリン酸化により特異的に変更されたタンパク質に由来する。
【００２４】
利用可能な場合、このようなエピトープの知識により、基礎的な発見、診断目的のためおよび例えばワクチン効力の試験として関連するＴ細胞応答を調べることが可能になる。重要なことに、これらは、アレルギーおよび自己免疫におけるＴ細胞寛容化のための高度に特異的な標的と、重大なことに、特異的免疫療法のためおよび悪性細胞に対抗する価値のある標的に向かう点とを提供する。悪性病変は、細胞免疫療法の有望性として特に価値のある標的であり、Ｔ細胞操作における進展は、癌のタイプについての特異的マーカーがたまたま利用可能であるいくつかの場合を超える確認された標的TAAの欠如により遅くなる。
細胞療法の可能性および確認された標的の欠如に鑑みて、見込のあるTCR抗原の同定は、いまだに、特に癌を処置するための努力におけるTCRに基づく免疫療法の最も急を要する障害の一つである。
【００２５】
全長TCR ORFの取得
主に自然に存在するTCRにおけるＶ遺伝子セグメントの使用の多様性により、Ｔ細胞のプールから対形成したTCR鎖の配列データを把握することは困難である。全般的に、高い確実性で配列を確実に把握するために、標的プールの完全Ｖ領域多様性をカバーするプライマーのプールを用いて、逆転写および/またはPCR法を用いてTCRを増幅する必要がある。このプロセスは、そこから配列データを得ることができるが、全長TCR ORFを容易にクローニングするために適切でない出発材料を作るORF断片を作製する。よって、Ｔ細胞のプールから対形成した配列データを引き出すための効率の高い方策は、下流の用途のための全長TCR ORFのクローニングとは通常相容れない。TCR ORFの時間がかかり高価な合成が、よって、これらの配列決定されたTCR対の機能試験または応用のために要求される。
【００２６】
全長TCR ORFの多様化
TCRの治療的使用の台頭は、TCR配列を親和性および/または機能成熟ワークフロー内で多様化して、規定された特異性および機能の合成TCR対を導くことへの興味の増加を見ている。通常、このことは、TCR鎖対をファージディスプレイ法のための単一鎖構築物に連結し、これらの単一鎖構築物に配列多様性を導入することにより達成されている。現在、単一TCR ORFを系統的な方法で迅速に多様化でき、これらの全長TCR ORFを生存哺乳動物細胞上での表面発現の状況において直接試験および/または選択するために用いることができる技術が欠如している。このような技術は、治療的使用のための高度に規定された特異性およびシグナル伝達能力を有するTCR対の成熟において、非常に価値があるだろう。
【００２７】
TCRおよびＴ細胞抗原分析の技術的観点
概して、TCRベースの療法の開発は、まだ初期段階であり、成功は限定されている。計り知れない可能性があるが、診断アプローチは、療法に対する患者の疾患状態または応答を評価することを狙いとする比較対照臨床研究にほとんど展開されていない。天然TCR鎖対を確実に把握するための技術、ならびにハイスループットで細胞間コミュニケーションの機能的状況におけるTCR-抗原相互作用の系統的分析のための技術が開発されていないことは、TCRベースの療法および診断の開発のための主な障害となっている。
ディープシーケンシングアプローチにより、健康および疾患状態におけるＴ細胞受容体多様性のよりよい理解が導かれた。しかし、これらのアプローチは、通常、主にTCRβ鎖のCDR3領域にわたる短い一続きに焦点を当てている。ほとんどの研究は、TCRα鎖の寄与を無視しており、対形成したαβ鎖の分析およびTCRの抗原特異性を決定することに興味を示したものはほとんどない。単細胞カプセル化および遺伝子バーコード化を用いる最近のワークフローにより、天然TCRαβまたはγδ鎖対の対形成、および全長配列の分析が可能になったが、このようなワークフローは、まだ実験段階である。
【００２８】
単離TCR鎖対は、生物物理学的または機能的形態のいずれかにおいて、抗原特異性の点で分析できる。生物物理学的分析は、可溶形のTCRおよび分析物抗原の両方の組換え生成を必要とする。HLA拘束TCRの場合、このことは、全ての個別のTCRおよび同族pHLA複合体の作製を必要とする。このことは、技術的に非常に困難で、遅く、スループットが非常に低い。さらに、このような分析は、相互作用の親和性だけを提供し、これは、予想可能な様式で機能的特徴とうまく相関しない。
最近まで、細胞の状況における単離TCR配列の詳細な機能解析は、分析物TCR鎖対の初代Ｔ細胞もしくは不死化Ｔ株化細胞へのトランスフェクションと、細胞活性化の伝統的なフローサイトメトリー分析による細胞応答の検出または抗原での攻撃の際のトランスフェクションされた細胞からの分泌因子の検出の面倒なプロトコールに限定されている。Guoらによる最近の発表において、単細胞からの対形成したTCR鎖の迅速クローニング、発現および機能特徴決定が報告された(Molecular Therapy - Methods and clinical development (2016) 3:15054)。この研究では、分析物ヒトαβTCR対を、αβTCR発現を欠くレポーター株化細胞で発現させたが、これは、TCR刺激により活性化されるNur77プロモータに連結された緑色蛍光タンパク質(GFP)レポーターシステムを含んでいた。このシステムは、レポーター株化細胞ゲノムへの標準化されたTCR組込みの欠如により、非効率のままであり、APCエレメントによる細胞結合抗原攻撃のための系統的な方法を提供しない。
【００２９】
既知のＴ細胞抗原に対するTCRの同定のためのワークフローと同様に、健康および疾患状態における新規なＴ細胞抗原の新規な発見は、非常に困難なままである。多くのアプローチは、本質的にまだ生物物理学的であり、免疫化プロトコールにおいて試験し得るかまたは上で対処するように同族TCRを同定することによる候補抗原を生成することを狙いとする。Ｔ細胞抗原発見の分野において標準化は全くまたはほとんど存在せず、この分野は、学術研究にほぼ制限されている。
治療的および診断的使用の両方におけるTCRおよびそれらの同族抗原に対する興味が蓄積し、著しい数の天然TCRαβおよびγδ鎖対を捕捉する手段が出現する中で、TCR-抗原相互作用の系統的分析のための確実なハイスループットおよび標準化技術が欠如したままである。重要なことに、全長TCR ORFを天然の状況において生存細胞の表面上で提示された分析物TCRの天然の状況におけるTCR鎖対の機能解析に直接用いることができるようにこれらのORFを迅速に再構成および/または系統的に多様化するための標準化されたシステムが欠如している。このような能力は、治療的および診断的使用のための天然TCR鎖対のハイスループット分析だけでなく、TCR鎖対の親和性および/または機能成熟を達成するために重要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３０】
ハイスループット法でのTCR診断薬をインフォーマティクスおよび試薬ベースで用いること、および個別化TCRベースの免疫療法の個別化を可能にするTCR鎖再構成およびそれらの系統的多様化のための迅速で系統化された方法に対する明確な必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００３１】
本発明は、上記の必要性に対処する。本発明は、第一の態様において、TCR鎖についての可変(Ｖ)、連結(Ｊ)および定常(Ｃ)配列を有するベクターからなる予め組立てられたライブラリを含む二成分ベクターシステムを提供する。このようなシステムの第一成分は、ＶおよびＣ配列を含むＶ-Ｃエントリーベクターを含む。システムの第二成分は、Ｊ配列を含むＪドナーベクターを含む。二成分ベクターシステムは、それぞれ全ての望ましいＶ-Ｃ配列組み合わせおよびＪ配列を有するＶ-ＣエントリーベクターおよびＪドナーベクターのライブラリに予め組立てられる。二成分ベクターシステムは、所望の配列を有する単一Ｖ-Ｃエントリーベクターおよび単一Ｊドナーベクターが、CDR3をコードする短いDNAオリゴヌクレオチド二重鎖(odeCDR3)配列と組み合わされて、制限酵素およびリガーゼ依存性かつPCR非依存性の様式で単一チューブ反応においてインビトロで全長TCR ORFを再構成できるような様式で設計されている。さらに、モジュールの二成分システムは、親和性または機能成熟ワークフローのための合成または変異全長TCR ORFの大きいライブラリを迅速に作製するために理想的に適切である。第二の態様において、TCR鎖の相互性対(すなわち、TRA/TRBまたはTRD/TRG)のための改変Ｖ-Ｃエントリーベクターは、５成分ベクターシステムに編纂されて、再構成されたTCR鎖対が単一ベクター内でつながれ得るシステムを提供する。この第二システムは、改変Ｖ-Ｃエントリーベクターおよび第一システムと同じＪドナーベクターの両方と、二方向ターミネータドナーベクター(BiTドナー)とを用いて、最終構築物において逆平行センス方向でコードされるつながれたTCR鎖対であって、各TCR鎖が「二方向ターミネータ」エレメントを間に挟むTCR鎖対を達成する。
【００３２】
TCR ORF再構成およびエンジニアリングシステム(TORES)
本発明は、まず、上記の使用に適したユニークな特徴を有する二成分ベクターシステムを提供する。このTCR ORF再構成およびエンジニアリングシステム(TORES)は、第三成分、CDR3をコードするオリゴヌクレオチド二重鎖(odeCDR3)と一緒に用いて、規定されたベクターの状況内で全長TCR ORFを新規に組立て、かつ/または所定のTCR ORF内で公式的な配列多様性を作製する。
本発明を、図1Aにまとめる。標的全長TCR ORFのために必要なＶおよびＣ TCR遺伝子セグメントを含む選択されたＶ-Ｃエントリーベクターを、必要なＪ TCR遺伝子セグメントを含むＪドナーベクターと組み合わせる。全長TCR ORFは、V(D)J組換え中に生じる非固定化非生殖系列配列の原因となるCDR3をコードするオリゴヌクレオチド二重鎖(odeCDR3)の付加により完成し、Ｖ-ＣエントリーベクターおよびＪドナーベクターによりそれぞれコードされる固定化生殖系列をコードするＶおよびＪ配列が間に挿入されている。二成分ベクターシステムおよび第三odeCDR3成分は、制限酵素およびリガーゼサイクル反応に組み合わされた場合に、完全V-CDR3-J-C TCR ORFが再構成されるように設計されている。このことは、標準化された様式で遺伝子エレメントの「傷のない」組立てを行うために用いられるIIS型制限酵素により達成される。
【００３３】
二成分ベクターシステムは、標的全長TCR ORFの再構成のための必要なＶ、ＣおよびＪ遺伝子セグメントを全て含むライブラリに組立てられる(図1B)。例えば、ライブラリは、実施例１および２に記載するようなヒトTRAレパートリおよび実施例３に記載するようなヒトTRBレパートリの天然タンパク質配列をコードする全ての遺伝子セグメントを含むように構築できる。
固定化ＶおよびＪセグメントが間に挿入されている非固定化CDR3配列とともにＶ、ＪおよびＣ遺伝子セグメント使用を定義するのに十分な配列情報から全長TCR ORFを再構成するために、標的TCR ORFのＶ/ＣおよびＪ使用に相当するＶ-ＣエントリーベクターおよびＪドナーベクターをまず選択する。全長TCR ORFを完成するために必要な非固定化CDR3配列に相当するodeCDR3も作製する。これらの３つの成分を、IIS型制限酵素およびDNAリガーゼ酵素とサイクル反応において組み合わせて、図４および実施例７に記載するように標的全長TCR ORFを作製する。得られる再構成された全長TCRは、Ｖ-Ｃエントリーベクター主鎖に含まれ、よってこの親の構築物に含まれる全てのベクターの特徴を含む。
【００３４】
制限酵素/リガーゼサイクル反応内の３つの組み合わせた構成成分(図4a、b、c)のIIS型制限酵素の作用により、２つの反応副産物および２つの反応中間体が得られる。Ｖ-Ｃエントリーベクター由来の反応副産物は、切り取られた天然選択マーカーおよびIIS型結合部位である(図4d)。Ｊセグメント部がそこから切り取られたＪドナーベクター主鎖は、第二反応副産物である(図4e)。Ｊドナーベクターから切り取られたＪセグメント部は、反応中間体であり、Ｊセグメント部、Ｃセグメントからの小さいＣ部およびライゲーションのために必要な一本鎖突出を両方含む(図4f)。第二反応中間体は、ＶおよびＣセグメントならびにライゲーションのために必要な一本鎖突出を含む親のＶ-Ｃエントリー主鎖である(図4g)。反応の最終生成物は、親のＶ-Ｃエントリーベクター主鎖内で再構築され、odeCDR3(図4c)、切り取られたＪセグメント部(図4f)ならびにＶおよびＣ遺伝子セグメントを有するＶ-Ｃエントリー主鎖(図4g)のライゲーションで構成される全長TCR ORFである。
【００３５】
Ｖ-ＣエントリーベクターおよびＪドナーベクター成分
本発明の状況において、組み合わせた二成分システムは、
ａ.複製起点、
ｂ.第一ポジティブ選択マーカー、
ｃ.１つ以上の５'遺伝子エレメント、
ｄ.コザック配列、
ｅ.TCR可変遺伝子セグメント、
ｆ.IIS型制限酵素による部位特異的認識および切断のための第一IIS型配列、
ｇ.ネガティブ選択マーカー、
ｈ.第二IIS型配列、
ｉ.TCR定常遺伝子セグメント、ならびに
ｊ.１つ以上の３'遺伝子エレメント
を含む１つ以上のＶ-Ｃエントリーベクターを含み、ここで、ａ)およびｂ)は、細菌宿主内での親のＶ-Ｃエントリーベクターおよび再構成されたTCR含有ベクターの両方の増幅および選択のために用いられ、ｃ)およびｊ)は、再構成された全長TCR ORFの下流の用途を規定するために用いられ、ｄ)は、真核細胞での効率的な翻訳開始を確実にし、これは、代わりに、原核生物および古細菌における移行制御のためのShine-Dalgarno配列であり得、ｅ)は、開始コドンから、所定の二成分ベクターシステムにおける全てのＶセグメントにわたって保存されるCDR3領域の５'端でのモチーフまでの可変(Ｖ)遺伝子セグメントであり、ｆ)は、IIS型制限酵素を駆動して、５'方向に切断してＶ遺伝子セグメントの３'末端にて標準化された一本鎖突出を創出するIIS型認識配列であり、ｇ)は、システムの運転中に親のＶ-Ｃエントリーベクターを排除して全長TCR ORFを再構成するネガティブ選択マーカーであり、ｈ)は、IIS型制限酵素を駆動して、３'方向に切断してＣ遺伝子セグメントの５'末端にて標準化された一本鎖突出を創出するIIS型認識配列であり、ｉ)は、所定の二成分ベクターシステムにおける全てのＣセグメントにわたって保存されるＣ遺伝子セグメントの５'末端でのモチーフからの定常(Ｃ)遺伝子セグメントであり、これは、Ｊセグメントとの境界を定める(図２および４を参照されたい)。
【００３６】
下流の生物学的用途を必要としない、例えば分子生物学ワークフローのために用いられる全長TCR ORFの遺伝的再構成のために用いられるＶ-Ｃエントリーベクター、すなわち最小限Ｖ-Ｃエントリーベクターは、制御エレメントを欠くエレメントａ)、ｂ)、ｅ)、ｆ)、ｈ)およびｉ)を含むであろう。
Ｖ-Ｃエントリーベクターは、下流の用途のために適切なさらなるORF、例えば哺乳動物抗生物質耐性遺伝子またはレポーター構築物の発現のための１つ以上の転写ユニットも含むことができる。
【００３７】
組み合わせた二成分システムは、
ａ.複製起点、
ｂ.第二ポジティブ選択マーカー、
ｃ.第三IIS型配列、
ｄ.TCR連結遺伝子セグメント、
ｅ.定常遺伝子セグメントの小さい５'部分に相当するＣ部、および
ｆ.第四IIS型配列
を含む１つ以上のＪドナーベクターを含み、ここで、ａ)およびｂ)は、Ｊドナーベクターの増殖および選択のために用いられ、ｃ)は、IIS型制限酵素を駆動して、３'方向に切断してＪ遺伝子セグメントの５'末端にて標準化された一本鎖突出を創出するIIS型認識配列であり、ｄ)は、所定の二成分ベクターシステムにおける全てのＪセグメントにわたって保存されるCDR3領域の３'端を定義するモチーフからの５'側から始まって、二成分システムに含まれるＶ-ＣエントリーベクターによりコードされるＣセグメントの５'部分である、Ｃ部を組み込む３'配列までの連結(Ｊ)遺伝子セグメントであり、は、IIS型制限酵素が５'方向に切断して、Ｊ遺伝子セグメントの３'末端にて標準化された一本鎖突出を創出するようにし、配列のＣ部部分に含まれるIIS型認識配列である(図３および４を参照されたい)。
【００３８】
Ｊドナーベクターは、Ｃ遺伝子セグメントの小さい５'部分をコードするＣ部配列を厳密に有する必要はない。このＣ部は、TORESの運転中に再構成反応のために突出を最適化して標準化するために用いられる。これは、Ｊ遺伝子セグメントの３'末端で見いだされる配列の変動がより高く、よって、Ｃ部を含むことにより、多様性がより低いＣ遺伝子セグメント内の突出を作製することにより標準化が可能になるからである。３'Ｊセグメント多様性を有さない他の生物からのTCR遺伝子座についてTORESを構築する場合、または合成Ｊ遺伝子セグメントを用いる場合、前記Ｊセグメント内の突出の標準化のために、このＣ部は省略してもよい。このことにより、Ｊドナーライブラリ構築の複雑さが低くなる。
第一、第二、第三および第四IIS型配列のそれぞれは、同じであっても異なっていてもよい。好ましくは、これらは同じである。このことにより、二成分ベクターシステム内の制限部位のそれぞれが、同じIIS型酵素に適合し、システムを用いる全長TCR ORFの再構成中の制限酵素/リガーゼサイクル反応のために単一の酵素だけが必要となる。IIS型酵素は、それらの認識配列内で切断しないので、認識配列に対して外来の一本鎖突出が作製される。よって、IIS型制限酵素の作用により作製される突出の性質は、認識配列の向きと、実際の隣接配列との両方に依存する(実施例１〜４を参照されたい)。
代わりに、IIS型制限配列のそれぞれは、互いに異なっていてよい。しかし、ユニークな認識配列を加えるたびに、制限酵素/リガーゼサイクル反応にさらなるIIS型酵素を組み込まなければならない。このことにより、全長TCR ORFを組立てるための再構成反応の複雑さおよび費用が増加する。
【００３９】
Ｖ-ＣエントリーベクターおよびＪドナーベクターそれぞれに含まれる第一および第二ポジティブ選択マーカーは、通常は異なる。このことにより、最終全長TCR ORF生成物の主鎖を提供するＶ-ＣエントリーベクターがＪドナーベクターから独立して選択され、よって、再構成反応に対するバックグラウンドに寄与する未消化または再環形成したＪドナーベクターを有する形質転換体を排除できる(図２および３ならびに実施例７を参照されたい)。
ポジティブ選択マーカーは：
ａ.抗生物質耐性遺伝子、
ｂ.栄養要求性補完遺伝子、
ｃ.レポーター遺伝子
から選択でき、ここで、このようなポジティブ選択マーカーの選択、フォーマッティングおよび使用は、当業者に公知である。
【００４０】
Ｖ-Ｃエントリーベクターに組み込まれる５'遺伝子エレメントは：
ａ.遺伝子シスエレメント、
ｂ.リコンビナーゼ酵素のための異種特異的認識部位、
ｃ.興味対象のゲノム部位についての５'相同組換えアーム、
ｄ.mRNAスプライスアクセプター部位、
ｅ.配列内リボソーム進入部位、および
ｆ.エピジェネティックインスレータ配列
から選択される１つ以上のエレメントを含み、ここで、ａ)は、Ｖ-Ｃエントリーベクター主鎖内で再構成された全長TCR ORF生成物によりコードされる転写産物の発現を駆動し、ｂ)は、リコンビナーゼ酵素の存在下で部位特異的組換えを駆動して、Ｖ-Ｃエントリーベクター主鎖内で特異的な遺伝子状況に全長TCR ORF生成物再構築物を挿入する配列であり、ｃ)は、部位特異的相同組換えを駆動して、Ｖ-Ｃエントリーベクター主鎖内で再構築された全長TCR ORF生成物を特異的な遺伝子状況に挿入する配列であり、ｄ)は、エンジニアリングされたドメイン融合アプローチを可能にして、Ｖ-Ｃエントリーベクター主鎖内で再構成された全長TCR ORFから発現されるタンパク質の形を操作し、ｅ)は、Ｖ-Ｃエントリーベクター主鎖内で再構成された全長TCR ORF から発現されるmRNAのキャップ非依存性の翻訳開始を許容し、ｆ)は、Ｖ-Ｃエントリーベクター主鎖内で再構成された全長TCR ORFを挿入し得るゲノムの状況においてエンハンサエレメントにより影響される転写活性の遮蔽を許容する。
【００４１】
シスエレメントは、実施例１および３に示すＶ-Ｃエントリーベクター主鎖に再構成されたTCRの一過性発現を、再構成されたTCR ORFを含む前記ベクターが哺乳動物細胞にトランスフェクションされる場合に、駆動するために用いることができる。
リコンビナーゼ酵素の異種特異的認識部位は、実施例４に示すＶ-Ｃエントリーベクター主鎖に再構成されたTCRのリコンビナーゼ媒介カセット交換を、再構成されたTCR ORFを含む前記ベクターを適切なリコンビナーゼ酵素の存在下で哺乳動物にトランスフェクションする場合に、許容するために用いることができる。
【００４２】
Ｖ-Ｃエントリーベクターに含まれる第一IIS型認識配列は、前記認識配列の５'側をTCR可変遺伝子セグメント(図4a)内で切断して、合成されたodeCDR3(図4c)の５'末端でのものに相補的な一本鎖DNA突出を可変遺伝子セグメント(図4g)の３'末端にて生成する向きである。この第一IIS型認識配列をどのように設計するかについての詳細は、実施例１、３、５および６を参照されたい。
Ｖ-Ｃエントリーベクターは、第一IIS型認識配列と第二IIS型認識配列との間にネガティブ選択マーカーを含む(下記参照、図２)。このネガティブ選択マーカーは：
ａ.第一成分の他の場所にもはTCR連結遺伝子セグメント内にも含まれない制限酵素認識部位、
ｂ.細菌性自殺遺伝子および
ｃ.レポーターエレメント
から選択され、ここで、ネガティブ選択マーカーは、親のＶ-Ｃエントリーベクターで形質転換された宿主細胞を排除して、第一ポジティブ選択マーカーを用いてＶ-Ｃエントリーベクター主鎖内に標的TCR ORFを含む形質転換体を選択する場合に、再構成反応のバックグラウンドを低減するために用いられる(実施例７を参照されたい)。
ネガティブ選択マーカー自体を除いて、二部分システム内の全てのその他の配列は、システムの他の場所にこの配列を含むことに基づく不当なネガティブ選択を与えないために、前記配列を含んではならない。
この関係において、Ｖ-Ｃエントリーベクターに含まれる第二IIS型認識配列は、前記認識配列の３'をTCR定常遺伝子セグメント(図4a)内で切断して、Ｊドナー断片反応中間体(図4f)の３'末端でのものに相補的な一本鎖DNA突出を定常遺伝子セグメント(図4g)の５'末端で生成する向きである。この第二IIS型認識配列をどのように設計するかについての詳細は、実施例１、２、３および５を参照されたい。
【００４３】
Ｖ-Ｃエントリーベクターに組み込まれる３'遺伝子エレメントは：
ａ.ターミネータエレメント、
ｂ.リコンビナーゼ酵素のための異種特異的認識部位、
ｃ.興味対象のゲノム部位についての３'相同組換えアーム、
ｄ.mRNAスプライスドナー部位、
ｅ.配列内リボソーム進入部位、および
ｆ.エピジェネティックインスレータ配列
から選択される１つ以上のエレメントを含み、ここで、ａ)は、インサイチュでのTCR ORFの効率的なmRNA生成のための転写終結を駆動し、ポリＡシグナルをコードしていてもよい配列であり、ｂ)は、部位特異相同組換えを駆動して、Ｖ-Ｃエントリーベクター主鎖内で再構成された全長TCR ORF生成物を特異的な遺伝子状況に挿入する配列であり、ｃ)は、下流のmRNAスプライスアクセプター部位をコードするゲノム遺伝子座への組込みの後に転写ユニットへのTCR ORFの融合を許容して、TCR発現レベルの強度またはＶ-Ｃエントリーベクター主鎖内で再構成された全長TCR ORFから発現されるタンパク質の形を操作し、ｅ)は、Ｖ-Ｃエントリーベクター主鎖内で再構成された全長TCR ORFから発現されるmRNAのキャップ非依存性の翻訳開始を許容し、ｆ)は、隣接クロマチンドメイン間の不適切な相互作用を妨げて、Ｖ-Ｃエントリーベクター主鎖内の再構成されたTCR ORFが挿入され得るゲノムの状況において、隣接転写調節またはヘテロクロマチンの広がりから全長TCR ORFを遮蔽する。
【００４４】
ターミネータエレメントは、実施例１および３に示すＶ-Ｃエントリーベクター主鎖に再構成されたTCRの発現中の転写終結を、再構成されたTCR ORFを含む前記ベクターを哺乳動物細胞にトランスフェクションする場合に、確実にするために用いられる。
リコンビナーゼ酵素のための異種特異的認識部位は、実施例４に示すＶ-Ｃエントリーベクター主鎖に再構成されたTCRのリコンビナーゼ媒介カセット交換を、再構成されたTCR ORFを含む前記ベクターを適切なリコンビナーゼ酵素の存在下で哺乳動物細胞にトランスフェクションする場合に、許容するために用いられる。
Ｊドナーベクターは、Ｊ遺伝子セグメントの３'側に、Ｃ遺伝子セグメントの５'側の断片であるＣ部配列を有するＪ遺伝子セグメントを含む(図３)。
Ｃ部配列は、Ｊドナーベクター由来Ｊ断片反応中間体(図4f)の３'末端にての中に、そしてIIS型消化開環Ｖ-Ｃエントリーベクター反応中間体(図4g)の中のＣ遺伝子セグメントの５'末端にて、IIS型酵素の作用により作製される一本鎖突出を標準化するように設計される。
【００４５】
Ｊドナーベクターに含まれる第三IIS型認識配列は、前記認識配列の３'側をTCR連結遺伝子セグメント内(図4b)で切断して、合成されたodeCDR3(図4c)の５'末端のものに相補的な一本鎖DNA突出を連結遺伝子セグメント(図4f)の５'末端にて生成する向きである。この第三IIS型認識配列をどのように設計するかについての詳細は、実施例２、３、５および６を参照されたい。
Ｊドナーベクターに含まれる第四IIS型認識配列は、前記認識配列の５'側をTCR Ｃ部(図4b)内で切断して、５'IIS型消化開環Ｖ-Ｃエントリーベクター反応中間体(図4g)のものに相補的な一本鎖DNA突出をＣ部(図4f)の３'末端にて生成するような向きである。この第三IIS型認識配列をどのように設計するかについての詳細は、実施例１、２、３、５および６を参照されたい。
【００４６】
二部分ベクターシステム内で、全てのコードされるTCR遺伝子セグメントおよび部分は、Ｖ-ＣエントリーベクターまたはＪドナーベクターの操作または組立てに用いられるIIS型認識配列を含まない。このような配列を含むことは、コードされる遺伝子セグメントまたは部分内でのIIS型制限酵素の作用をもたらし、TCR再構成プロセスの混乱をもたらす。同様に、IIS型認識配列は、ベクター主鎖またはこれらのベクター内の５'および３'遺伝子エレメントのいずれにも、あるいは二部分ベクターシステムを組立てるために用いるクローニング断片にも、あるいは第三システム成分であるodeCDR3にも含まれない(下記参照)。
TORESの二成分ベクターシステムは、TCR鎖の任意の収集物についても構築できる。以下の実施例１〜４では、二成分ベクターシステムを、ヒトTCRアルファおよびベータ鎖をそれぞれコードするヒトTRAおよびTRB遺伝子座について構築する。このようなTORESの構築は、TCRデルタおよびガンマ鎖対をそれぞれコードするTRDおよびTRG遺伝子座、または実際に、有顎脊椎動物で見いだされる任意のTRA/TRB、TRD/TRGもしくはバリアントTCR鎖対システムの状況において等しく当てはめることができる。
【００４７】
第三odeCDR3成分
任意の所定のTORESを用いて全長TCR ORFを再構成するために、二成分Ｖ-ＣエントリーベクターおよびＪドナーベクターシステムによりコードされない小さいORF断片が第三成分として必要である。この第三成分は、CDR3をコードするオリゴヌクレオチド二重鎖(odeCDR3)の形をとる。
このような第三成分odeCDR3は：
ａ.認識配列の５'側でＶ-ＣエントリーベクターのTCR可変遺伝子セグメント内を切断する向きの、第一IIS型制限酵素認識および切断部位に相補的な第一一本鎖突出配列、
ｂ.TCR CDR3領域をコードし、ネガティブ選択エレメントを含まず(ネガティブ選択エレメントは、項目10で規定されるとおりである)、第一および第二部分のいずれのIIS型制限配列も含まない二本鎖セグメント、ならびに
ｃ.認識配列の３'側でＪドナーベクターのTCR連結遺伝子セグメント内を切断する向きの、第三IIS型制限酵素認識および切断部位に相補的な第二一本鎖突出配列
を含む。
あるいは、odeCDR3は、第一(Ｖ-Ｃエントリーベクター)または第二(Ｊドナーベクター)成分と矛盾しない２つのIIS型酵素に挟まれ、消化した場合に前記のａ、ｂおよびｃを含む生成物と、IIS型部位に挟まれた短いdsDNA断片をコードする２つの副産物とを生じるような向きである、CDR3をコードするdsDNA分子および/またはプラスミドDNAで構成され得る。この代替のdsDNA odeCDR3は、予めの消化または処理を必ずしも必要とすることなく、制限酵素/リガーゼ反応に適合する。
TORESにおけるＶ-ＣエントリーベクターおよびＪドナーベクターの構成を使用する代わりに、同じ概念のフレームワークを用いることにより、Ｊ-ＣエントリーベクターおよびＶドナーベクターの構成を用いてもよい。
【００４８】
全長TCR ORFを再構成するためにTORESを用いる方法
TORESは、ヒト TRA/TRB鎖対について実施例７において示すように、遺伝子ベクターの状況において、配列情報から全長TCR ORFを再構成するために用いることができる。
配列情報から全長TCR ORFを再構成するためにTORESを運転するために、所定のTCR鎖について二成分ベクターシステムのリソースに鑑みて、方法は：
ａ.Ｖ-Ｃエントリーベクターを選択する工程と、
ｂ.Ｊドナーベクターを選択する工程と、
ｃ.odeCDR3を選択する工程と、
ｄ.ｉ)Ｖ-ＣエントリーベクターおよびＪドナーベクターに存在する全てのIIS型制限酵素認識および切断部位を切断するIIS型制限酵素ならびにii)DNAリガーゼ酵素と反応させるためにａ、ｂおよびｃを組み合わせて、iii)組み合わせたミックスを熱サイクル反応に供する工程と、
ｅ.工程ｄから得られる反応生成物で、DNAベクター増殖能力を持つ選択可能な宿主生物を形質転換する工程と、
ｆ.宿主生物の選択を行って、Ｖ-Ｃエントリーベクター主鎖内の全長の再構成されたTCRオープンリーディングフレームを得る工程と
を含み、ａ)およびｂ)は、標的全長TCR ORF内のＶ、ＪおよびＣ遺伝子セグメントをコードする選択されたベクターに基づいて選択され、ｃ)は、ａ)およびｂにおいて選択されるＶ-ＣエントリーまたはＪドナーベクターによりコードされず、その中にコードされる可変および連結セグメントと結合する全長TCR ORF配列を完成することに基づいて選択され、ｄ)３つの選択された成分を、反応混合物に、Ｖ-ＣエントリーおよびＪドナーベクター内の第一、第二、第三および第四IIS型制限酵素認識配列を切断する制限酵素とともに組み合わせること、ｅ)は、通常、形質転換能力を持つ細菌であり、ｆ)宿主の選択は、Ｖ-Ｃエントリーベクター主鎖によりもたらされる第一ポジティブ選択マーカーに基づく。
【００４９】
通常、再構成のための全長TCR ORFの遺伝子エレメントを選択および定義するためのワークフローは、標的生物組織からのTCR鎖のデノボシーケンシングを必然的に伴う。以下の実施例８は、HLA-B*07:02拘束の状況においてHCMV抗原に特異的なTRA/TRB鎖対のセットのデノボ同定を示す。図13に示すワークフローは、選別した単細胞からのTCR鎖対の逆転写およびPCRベースの増幅と、その後のサンガーシーケンシングを組み込む。TCR ORFのＶ、CDR3、ＪおよびＣセグメントにわたる高品質の配列情報が必要とされ、このことにより、特定のシーケンシングアプローチをとることが要求される。
【００５０】
よって、TCRオープンリーディングフレームを選択および再構成する方法は：
ａ.TCRオープンリーディングフレーム配列を得る工程であって、前記配列情報が、ｉ)可変遺伝子セグメント使用、ii)定常遺伝子セグメント使用、iii)連結遺伝子セグメント使用、iv)可変遺伝子セグメント境界から連結遺伝子セグメント境界にわたる全長CDR3配列を同定するために十分である工程と、
ｂ.工程ａ．ｉ)およびａ．ii)でそれぞれ同定される可変および定常遺伝子セグメントに対応するＶ-Ｃエントリーベクターを選択する工程と、
ｃ.工程ａ.iii)で同定される連結遺伝子セグメントに対応するＪドナーベクターを選択する工程と、
ｄ.工程ａ.iv)で同定されるCDR3配列に対応するodeCDR3を作製する工程と、
ｅ.ｉ)Ｖ-ＣエントリーベクターおよびＪドナーベクターに存在する全てのIIS型制限酵素認識および切断部位を切断するIIS型制限酵素ならびにii)DNAリガーゼ酵素と反応させるためにｂ、ｃおよびｄを組み合わせて、iii)組み合わせたミックスを熱サイクル反応に供する工程と、
ｆ.工程ｅ.で得られる反応生成物で、プラスミド複製能力を持つ選択可能な宿主生物を形質転換する工程と、
ｇ.宿主生物の選択を行って、Ｖ-Ｃエントリーベクター主鎖内の全長の再構成されたTCRオープンリーディングフレームを得る工程と
を含み、ａ)は、当業者に公知のシーケンシング方法により行われ、４つ全ての必要な遺伝子エレメントを同定するために十分な配列の長さおよび質を得ることができ、ｂ)およびｃ)は、必要なベクターを含むTORESライブラリから選択され、ｄ)は、新規に合成されるか、またはodeCDR3ライブラリから選択され、ｅ)は、単一反応槽で行われる。
【００５１】
適切なＶ-Ｃエントリーベクター、ＪドナーベクターおよびodeCDR3を選択するために、標的TCR配列を、対応するTCR鎖についてのＶ、ＣおよびＪ遺伝子セグメントのライブラリに対して整列させて、標的鎖のＶ、ＣおよびＪセグメント使用を決定した。この配列アラインメントおよび解析工程は、CDR3コーディング配列の規定、よって、odeCDR3配列の定義も許容する。よって、全体として、このような配列解析は、TCR鎖再構成のためのＶ-ＣエントリーベクターおよびＪドナーベクターの選択を許容する。この解析は、各鎖再構成反応のためのodeCDR3の合成も許容する。このプロセスは、実施例８に詳細に記載し、図13の一部にまとめる。
IIS型消化およびDNAリガーゼ依存性ライゲーション(工程ｅ)を単一サイクル反応で行うことが望ましい。このことは、処理工程を最小限にし、いくつかのユニーク突出が単一酵素を用いて作製され、よってＪドナーベクター反応中間体およびodeCDR3の、Ｖ-Ｃエントリーベクター主鎖への効率的な定方向クローニングを維持するような認識配列の外側を切断するIIS型制限酵素を用いる、システムの設計により可能になる。
あるいは、IIS型制限消化およびDNAライゲーションは、逐次的な手順で行ってよい。
【００５２】
実施例８に、ヒト末梢血液からの抗原特異的CD8 Ｔ細胞の単細胞蛍光標示式細胞選択(FACS)の状況において、逆転写およびTRA/TRB TCR鎖対のPCRベースの増幅と、その後のサンガーシーケンシングのためのTORESの使用を例示する。これは、一般的に適用可能なワークフローであり、ここで、任意の組織を任意の有顎脊椎動物からのＴ細胞の供給源とすることができ、細胞を表現型の特徴に基づいて選別できる。重要なことに、単一選別された細胞は、HLA多量体試薬を用いて抗原特異性について染色される必要がない。
用いられるTCRシーケンシングアプローチは、TCR ORFの上記のように規定する遺伝子特徴が配列情報に基づいて規定できるように十分に高品質の配列情報が得られる限り、いずれの特定の方法または技術にも限定されない。
【００５３】
天然TCR鎖対をシーケンシングおよび同定できるように単細胞を分けるためのFACSの使用は、多重特異性抗体パネルを用いて収集できる正確で豊富な表現型情報のために、強力な方法である。しかし、エマルジョンPCR、微小流体細胞カプセル化を用いるデジタルPCRアプローチ、物理的分配基板を用いるデジタルPCRを含む他の方法が、細胞を分配するために存在する。
供給源材料から天然TCR対を得ることが一般的に望ましい。なぜなら、TCR対の両方の鎖が、HLA-抗原結合および認識に寄与するからである。しかし、設定された特異性に対する単一鎖のハイスループットスクリーニングのように、単一の鎖だけの回収が望まれる場合がある。このような場合、TCRは、非分配細胞から増幅および/またはシーケンシングしてよい。
【００５４】
多様化配列を有する全長TCR ORFを作製するためにTORESを使用する方法
TORESシステムは、いくつかの系統的な形態で多様化された全長TCR ORFを作製するために理想的に適する。このような系統的多様化は、TCR鎖についての親和性および/または機能成熟ワークフローに適用できる。標的TCR鎖配列のこのような多様化は、実施例９および10に詳しく記載する。
このようなTCR ORF配列多様化方法は、再構成反応と同じ全般的なスキームに従う。多様化は、単一のバリアントTCR ORFが反応当たり作製される多重並列再構成反応で行うことができる。しかし、ほとんどのシナリオでは、単一反応でバリアントTCR ORFのプールを作製することが望ましい。これらのアプローチのそれぞれは、各遺伝子成分(Ｖ-Ｃエントリーベクター、Ｊドナーベクター、odeCDR3)の１つ以上の多重バリアントを再構成反応に提供することにより達成される。
実施例９に記載するように、TCR ORFは、規定された位置的配列多様性を有するodeCDR3のプールを加えることにより、CDR3領域にて系統的に多様化できる。
【００５５】
よって、CDR3領域におけるTCR ORF多様性を達成するためにTCRオープンリーディングフレームを選択および再構成する方法は：
ａ.TCRオープンリーディングフレーム配列を得る工程であって、前記配列情報が、ｉ)可変遺伝子セグメント使用、ii)定常遺伝子セグメント使用、iii)連結遺伝子セグメント使用、iv)可変遺伝子セグメント境界から連結遺伝子セグメント境界にわたる全長CDR3配列を同定するために十分である工程と、
ｂ.工程ａ．ｉ)およびａ．ii)でそれぞれ同定される可変および定常遺伝子セグメントに対応するＶ-Ｃエントリーベクターを選択する工程と、
ｃ.工程ａ.iii)で同定される連結遺伝子セグメントに対応するＪドナーベクターを選択する工程と、
ｄ.バリアント配列組成を有する工程ａ.iv)で同定されるCDR3配列に対応する２つ以上のodeCDR3を作製する工程と、
ｅ.ｉ)Ｖ-ＣエントリーベクターおよびＪドナーベクターに存在する全てのIIS型制限酵素認識および切断部位を切断するIIS型制限酵素ならびにii)DNAリガーゼ酵素と反応させるためにｂ、ｃおよびｄを組み合わせて、iii)組み合わせたミックスを熱サイクル反応に供する工程と、
ｆ.工程ｅ.で得られる反応生成物で、プラスミド複製能力を持つ選択可能な宿主生物を形質転換する工程と、
ｇ.宿主生物の選択を行って、Ｖ-Ｃエントリーベクター主鎖内の全長の再構成されたTCRオープンリーディングフレームを得る工程と
を含み、ａ)は、当業者に公知のシーケンシング方法により行われ、４つ全ての必要な遺伝子エレメントを同定するために十分な配列の長さおよび質を得ることができ、ｂ)およびｃ)は、必要なベクターを含むTORESライブラリから選択され、ｄ)は、新規に合成されるか、またはodeCDR3ライブラリから選択され、ｅ)は、単一反応槽で行われる。
【００５６】
このような方法は、全てのodeCDR3バリアントを単一反応にプールして、配列多様化プールを作製することにより達成できるが、各odeCDR3バリアントを並行反応に供することによっても等しく達成され得る。
バリアントodeCDR3は、当業者に公知の様々な方法により作製できる。odeCDR3縮重/多様性の位置および程度の選択は、単一の位置での単一残基の変化から、odeCDR3の長さでの完全縮重配列までの範囲であり得る。
実施例10に記載するように、TCR ORFは、odeCDR3の提供によりCDR3領域を維持するが、２つ以上のＶ-Ｃエントリーベクターおよび/またはＪドナーベクターを再構成反応に提供することによりＶ、ＣおよびＪセグメント使用を多様化することにより、系統的に多様化できる。
【００５７】
よって、多様化Ｖ、Ｃおよび/またはＪセグメント使用を有するTCRオープンリーディングフレームを選択および再構成する方法は：
ａ.TCRオープンリーディングフレーム配列を得る工程であって、前記配列情報が、ｉ)可変遺伝子セグメント使用、ii)定常遺伝子セグメント使用、iii)連結遺伝子セグメント使用、iv)可変遺伝子セグメント境界から連結遺伝子セグメント境界にわたる全長CDR3配列を同定するために十分である工程と、
ｂ.工程ａ．ｉ)およびａ．ii)でそれぞれ同定される可変および定常遺伝子セグメントに対応しない２つ以上のＶ-Ｃエントリーベクターを選択する工程と、
ｃ.工程ａ.iii)で同定される連結遺伝子セグメントに対応しない２つ以上のＪドナーベクターを選択する工程と、
ｄ.工程ａ. iv)で同定されるCDR3配列に対応するodeCDR3を作製する工程と、
ｅ.ｉ)Ｖ-ＣエントリーベクターおよびＪドナーベクターに存在する全てのIIS型制限酵素認識および切断部位を切断するIIS型制限酵素ならびにii)DNAリガーゼ酵素と反応させるためにｂ、ｃおよびｄを組み合わせて、iii)組み合わせたミックスを熱サイクル反応に供する工程と、
ｆ.工程ｅ.で得られる反応生成物で、プラスミド複製能力を持つ選択可能な宿主生物を形質転換する工程と、
ｇ.宿主生物の選択を行って、Ｖ-Ｃエントリーベクター主鎖内の全長の再構成されたTCRオープンリーディングフレームを得る工程と
を含み、ａ)は、当業者に公知のシーケンシング方法により行われ、４つ全ての必要な遺伝子エレメントを同定するために十分な配列の長さおよび質を得ることができ、ｂ)およびｃ)は、必要なベクターを含むTORESライブラリから選択され、ｄ)は、新規に合成されるか、またはodeCDR3ライブラリから選択され、ｅ)は、単一反応槽で行われる。
【００５８】
このような方法は、全てのＶ-Ｃエントリーベクターおよび/またはＪドナーベクターバリアントを単一反応にプールして、配列多様化プールを作製することにより達成できるが、各ベクターバリアントを並行反応に供することによっても等しく達成され得る。
所定のライブラリからの各Ｖ-ＣエントリーおよびＪドナーベクターを選択して、Ｖ、ＣおよびＪ遺伝子セグメントを完全にカバーできる。
上記のCDR3ならびにＶ、ＣおよびＪ多様化のいずれの組み合わせを用いても、多様化TCR ORFのプールまたはライブラリを作製できる。
このシステムを用いて、天然Ｖ、ＣおよびＪ遺伝子セグメント使用を完全にカバーし、規定されたCDR3特徴を有するTCR ORFの完全合成ライブラリを作製できる。
【００５９】
再構成/多様化方法に関するTORESの特徴
上記のように、単一IIS型制限酵素を用いる組立てサイクル反応を行うことが望ましい。このことは、制限酵素の使用を節約し、IIS型作用の性質、ならびに二成分ベクターシステムにおけるユニーク一本鎖突出およびodeCDR3の設計により可能になる。
あるいは、４つまでのIIS型制限酵素認識配列が、Ｖ-ＣエントリーベクターおよびＪドナーベクターの４つのIIS型認識部位にわたる。
TCR ORF生成物の効率的なクローニングのために：
ａ.反応生成物の制限酵素消化を行って、親のＶ-Ｃエントリーベクターを消去すること、
ｂ.自殺遺伝子選択を行って、親のＶ-Ｃエントリーベクターで形質転換されたコンピテントな宿主を排除すること、および/または
ｃ.レポーター同定により、親のＶ-Ｃエントリーベクターで形質転換された宿主細胞の選択を行うこと
から選択される少なくとも一工程のネガティブ選択を、TORESを用いる全長TCR ORFの組立て中に行い、ここで、ネガティブ選択を用いて、IIS型酵素により未消化のまま残ったかまたは消化の後に親の形に再びライゲーションされた親のＶ-Ｃエントリーベクターを排除する。
Ｖ-Ｃエントリーベクター主鎖、よってこの主鎖が有するポジティブ選択マーカーを、全長TCR ORF反応生成物を含むベクターのポジティブ選択に用いることを考えると、親のＶ-Ｃエントリーベクターの排除は重要である。
【００６０】
この関係において、ネガティブ選択を、Ｖ-Ｃエントリーベクターから切り取られた反応副産物内で設計された制限酵素部位を用いて行う(図4d)。このネガティブ選択手順は、実施例７および８に記載する。
上記のネガティブ選択方法のいずれか１つまたは組み合わせを用いて、最終のクローニングされた生成物から親のＶ-Ｃエントリーベクターを排除できる。クローニングされた反応生成物の効率的な回収のためにクローニング効率が十分に高いとみられるならば、このようなネガティブ選択手順は省略してよい。
形質転換宿主生物におけるクローニングされた全長TCR ORF含有ベクターの選択が、最終のクローニングされた生成物を得るために必要である。このような選択は、当業者に公知である。
【００６１】
宿主生物は、形質転換能力を持つ細菌であり、Ｖ-Ｃエントリーベクター主鎖内に含まれる全長TCR ORFを含む形質転換体の選択は、抗生物質選択を含む。このことは、形質転換された細胞が存在する培養系に抗生物質を加えることを必然的に伴い、この抗生物質に対する耐性は、Ｖ-Ｃエントリーベクター主鎖内の第一ポジティブ選択マーカーである遺伝子によりコードされる。
あるいは、形質転換体が存在する培養系の栄養要求性因子の除去がポジティブ選択の形であってよく、ここで、栄養要求性補完は、Ｖ-Ｃエントリーベクター主鎖内でコードされる遺伝子生成物により与えられる。上記のポジティブ選択の組み合わせを用いてよい。
【００６２】
TORESを含むＶ-ＣエントリーベクターおよびＪドナーベクターライブラリ
選択されたTCR ORFの再構成または多様化を行うためのTORESの効率的な運転のために、Ｖ-ＣエントリーベクターおよびＪドナーベクターライブラリの予備構築が必要である。各TCR鎖の形について特異的なこのライブラリから、odeCDR3配列を補完した場合に、標的TCR ORF配列のＶ/Ｊ/Ｃ使用を満足する選択が行われるのである。
Ｖ-ＣエントリーおよびＪドナーベクターライブラリは、TCRを有する生物の全ての生殖系列TCR可変、定常および連結遺伝子セグメントを含むように構築してよい。このようなライブラリは、実施例３に示すTRB遺伝子座特異的TORESのように、Ｖ-Ｃエントリーベクター内に全てのＶ-Ｃ組み合わせを含んでもよく、このライブラリは、各可変セグメントに対する両方の定常遺伝子セグメントを有して複製される。
【００６３】
Ｖ-ＣエントリーおよびＪドナーベクターのライブラリは、コードされるタンパク質の翻訳されたアミノ酸配列が、生殖系列遺伝子セグメントによりコードされるタンパク質配列に対して改変されないように、Ｖ/Ｊ/Ｃ遺伝子セグメントを含んでよい。
このようなライブラリは、望ましくないIIS型認識配列、またはポジティブおよびネガティブ選択エレメントを有さないライブラリを作製するような、基礎の核酸配列における変化を許容する。基礎の核酸配列における変化は、異なる宿主生物からの細胞における再構成されたTCR鎖の発現のためのコドン最適化のために用いることもできる。
あるいは、Ｖ-ＣエントリーおよびＪドナーベクターのライブラリは、コードされるタンパク質の翻訳されたアミノ酸配列が、生殖系列遺伝子セグメントによりコードされるタンパク質配列に対して改変されるように、Ｖ/Ｊ/Ｃ遺伝子セグメントを含んでよい。
このようなライブラリは、異なる診断または治療のための使用について最適化された特徴を有するTCRを構築するために用いることができる。Ｖ/Ｊ/Ｃ遺伝子セグメント内のフレームワーク残基または領域における変化は、可溶性試薬としてのTCRの発現のような様々なシナリオにおける発現または安定性を増すために用いることができる。同様に、直接のHLA-抗原接触に関与しないフレームワーク領域における変更は、TORESにより生成される再構成されたTCRのシグナル伝達能力を変更するために用いることができる。親和性タグまたは免疫原性配列も、下流の用途における再構成されたTCRの精製および/または検出を助けるように、フレームワーク領域内にコードされることができる。
【００６４】
Ｖ-ＣエントリーおよびＪドナーベクターライブラリは：
ａ.可変および定常遺伝子セグメントの組み合わせをコードする１つ以上のＶ-Ｃエントリーベクターと、
ｂ.Ｊ遺伝子セグメントをコードする1つ以上のＪドナーベクターと、
所望により、
ｃ. 陽性対照odeCDR3として、Ｖ-ＣエントリーベクターおよびＪドナーベクター一本鎖突出とマッチする一本鎖突出を有する１つ以上の標準化odeCDR3と、
所望により、
ｄ. 参照としての予め組立てられた全長TCR ORFと
の組み合わせを含むキットに組立てることができ、ここで、ａ)およびｂ)は、意図する用途のために適切な未改変または改変アミノ酸配列を有して、標的生物からの遺伝子セグメントの要求される遺伝的多様性をカバーし、ｃ)は、再構成反応における陽性対照として用いられ、ｄ)は、該キットで提供されるＶ-ＣエントリーベクターおよびＪドナーベクターライブラリを用いて再構成された全長TCR ORFの下流の用途において陽性対照として用いられる。
【００６５】
Ｖ-Ｃエントリーベクターを構築する方法
Ｖ-ＣエントリーおよびＪドナーベクターライブラリの組立ては、必要なベクターの直接DNA合成を含む当業者に公知の様々な分子生物学の方法により達成できる。しかし、小遺伝子セグメント含有断片を用いる迅速で費用効果的な組み合わせアプローチが望ましい。このような方法により、TCRエンジニアリングワークフローのために重要なＶ-ＣエントリーおよびＪドナーベクター形の迅速サイクリングが可能になる。同様に、偽同種間治療の状況においてTCR配列の免疫原性に対して機能的重要性または影響を有し得る、一ヌクレオチド多型および所定の集団の個体間のTCR遺伝子セグメントの他のアレルの差の原因となるように、所定のＶ-Ｃエントリーベクターおよび/またはＪドナーベクターライブラリの迅速拡大を用いることができる。Ｖ-ＣエントリーベクターおよびＪドナーベクターライブラリを組立てるための系統的な方法は、実施例１、２および３に詳しく記載する。
【００６６】
Ｖ-Ｃエントリーを構築する方法は：
ａ.可変遺伝子セグメントクローニング断片、
ｂ.定常遺伝子セグメントクローニング断片、
ｃ.Ｖ-Ｃエントリーベクター主鎖
から選択される３つのDNA成分を組み合わせることを含み、ここで、ａ)は、可変遺伝子セグメントを含み、ｂ)は、定常遺伝子セグメントを含み、ｃ)は、可変および定常遺伝子断片がその中に組立てられるＶ-Ｃエントリーベクター主鎖である。
この状況において、可変遺伝子セグメントクローニング断片は：
ａ.断片のポリメラーゼ連鎖反応依存性増幅のための５'プライマーバインド配列、
ｂ.３'方向に切断する向きの第五IIS型配列、
ｃ.ｂ.における第五IIS型配列に対するIIS型酵素反応の際の規定された一本鎖突出をコードする第一突出配列、
ｄ.コザック配列、
ｅ.TCR可変遺伝子セグメント、
ｆ.第一IIS型配列、
ｇ.ネガティブ選択マーカーの５'配列セグメント
ｈ.ｇ.におけるネガティブ選択マーカーの５'配列セグメント内で一本鎖突出が生じるように５'方向に切断する向きの第六IIS型配列、
ｉ.断片のポリメラーゼ連鎖反応依存性増幅のための３'プライマーバインド配列
を含み、ｂ)およびｈ)は、Ｖ-Ｃエントリーベクターの組立てに用いられたIIS型配列をコードし、ｆ)は、再構成反応の運転に用いられたIIS型配列をコードし、ｇ)は、定常遺伝子セグメントクローニング断片で提供される相補断片により完成されるネガティブ選択マーカー配列の断片である。
【００６７】
可変遺伝子セグメントクローニング断片の模式図を、図５に示す。実施例１および３は、それぞれヒトTRAおよびTRB遺伝子座についてのＶ-Ｃエントリーベクターを組立てるためのこれらのクローニング断片のフォーマットおよび使用について記載する。
これらの実施例は、ヒトTRA可変遺伝子セグメントクローニング断片をSEQ0001〜SEQ0046、およびヒトTRB可変遺伝子セグメントクローニング断片をSEQ0435〜SEQ0481と規定する。
Ｖ-Ｃエントリーベクターを組立てるために、可変遺伝子セグメントクローニング断片を定常遺伝子セグメントクローニング断片と組み合わせなければならない。
定常遺伝子セグメントクローニング断片は：
ａ.断片のポリメラーゼ連鎖反応依存性増幅のための５'プライマーバインド配列、
ｂ.ｃ.におけるネガティブ選択マーカーの３'配列セグメント内で一本鎖突出が生じるように３'方向に切断する向きの第七IIS型配列、
ｃ.ネガティブ選択マーカーの３'配列セグメント、
ｄ.第二IIS型配列
ｅ.TCR定常遺伝子セグメント
ｆ.ｇ.における第八IIS型配列に対するIIS型酵素作用の際に規定された一本鎖突出をコードする第二突出配列、
ｇ.ｆ.の突出配列内で一本鎖突出が生じるように５'方向に切断する向きの第八IIS型配列、
ｈ.断片のポリメラーゼ連鎖反応依存性増幅のための３'プライマーバインド配列
を含み、ｂ)およびｇ)は、Ｖ-Ｃエントリーベクターの組立てに用いられたIIS型配列をコードし、ｇ)は、再構成反応の運転に用いられたIIS型配列をコードし、ｃ)は、可変遺伝子セグメントクローニング断片で提供される相補断片により完成されるネガティブ選択マーカー配列の断片である。
【００６８】
可変遺伝子セグメントクローニング断片の模式図を、図６に示す。実施例１および３は、それぞれヒトTRAおよびTRB遺伝子座についてのＶ-Ｃエントリーベクターを組立てるためのこれらのクローニング断片のフォーマットおよび使用について記載する。
これらの実施例は、ヒトTRB定常遺伝子セグメントクローニング断片をSEQ0047として、およびヒトTRB定常遺伝子セグメントクローニング断片をSEQ0482およびSEQ0483と規定する。
Ｖ-Ｃエントリーベクターを組立てるために、可変および定常遺伝子セグメントクローニング断片を、Ｖ-Ｃエントリーベクター主鎖に組み合わせる。
Ｖ-Ｃエントリーベクター主鎖は：
ａ.複製起点、
ｂ.第一ポジティブ選択マーカー、
ｃ.５'遺伝子エレメント、
ｄ.主鎖の消化を許容して、組立て反応中にIIS型作用により可変遺伝子セグメントクローニング断片内で創出される突出に相補的な一本鎖突出を創出する第一制限酵素認識配列、
ｅ.主鎖の消化を許容して、組立て反応中にIIS型作用により定常遺伝子セグメントクローニング断片を創出する第二制限酵素認識配列 、
ｆ.３'遺伝子エレメント
を含み、ｃ)およびｆ)は、上記のように生物学的システムの区別における再構成されたTCR ORFの用途のために用いるための遺伝子エレメントである。
【００６９】
Ｖ-Ｃエントリーベクター主鎖の模式図を、図７に示す。実施例１、３および４は、それぞれTRAおよびTRB遺伝子座のためのＶ-Ｃエントリーベクターを組立てるための異なるＶ-Ｃエントリーベクター主鎖の形のフォーマットおよび使用について記載する。
哺乳動物細胞において再構成されたTCR ORFの下流の一過性発現のために用いるＶ-Ｃエントリーベクター主鎖を、SEQ0048と規定し、再構成されたTCR ORFのリコンビナーゼ媒介カセット交換のために用いるＶ-Ｃエントリーベクター主鎖の対を、SEQ0688およびSEQ0689と規定する。
【００７０】
異なるＶ-Ｃエントリーベクター主鎖への可変および定常遺伝子クローニング断片の迅速サイクリングは、与えられたＶ/Ｊ/Ｃ組み合わせから再構成されたTCR ORFのベクターの状況の特徴を変更するために費用効果的なアプローチである。このことにより、天然または合成TCR遺伝子セグメントライブラリを異なる生物学的用途に再割り当てすることの迅速な繰り返しが可能になる。
本明細書に記載する可変および定常遺伝子セグメントクローニング断片ならびにＶ-Ｃエントリーベクター主鎖の例のうちで、ベクター組立てのために用いるIIS型酵素は、BbsIであり、TCR ORF再構成のために用いるIIS型酵素は、BsaIである。Ｖ-Ｃエントリーベクター主鎖は、Acc65IおよびXbaIのための制限酵素認識部位を含んで、BbsI作用によりそれぞれ可変および定常遺伝子クローニング断片に作製される５'突出および３'突出に適合する突出を創出する。
制限酵素の任意の他の組み合わせは、上記の基準を満たす限り、組立ておよび再構成反応に用いることができる。
【００７１】
好ましくは、上で第五、第六、第七および第八IIS型配列と示したＶ-Ｃエントリーベクターの組立てのために用いるIIS型配列は、同じである。
あるいは、４つまでの異なるIIS型認識配列をこの手順のために用いることができる。
上で第五、第六、第七および第八IIS型配列と示したＶ-Ｃエントリーベクターの組立てのために用いるIIS型配列は、上で第一、第二、第三および第四IIS型配列と示した再構成反応のために用いるものとは異ならなければならない。
【００７２】
可変および定常遺伝子セグメントクローニング断片をＶ-Ｃエントリーベクター主鎖と組み合わせてＶ-Ｃエントリーベクターを組立てる方法は、実施例1および３に詳しく記載する。
Ｖ-Ｃエントリーベクターを組立てる方法は、
ａ.Ｖ-Ｃエントリーベクター主鎖内に含まれる認識配列に特異的な２つの制限酵素でのＶ-Ｃエントリーベクター主鎖の消化と、
ｂ.消化したＶ-Ｃエントリーベクター主鎖を、DNAリガーゼ酵素ならびに第五、第六、第七および第八IIS型配列を認識する１つ以上のIIS型制限酵素とともに、Ｖクローニング断片およびＣクローニング断片と組み合わせ、組み合わせたミックスを熱サイクル反応に供することと、
ｃ.得られた反応生成物でのコンピテント宿主生物の形質転換および前記第一ポジティブ選択マーカーを用いるポジティブ選択により、完全Ｖ-Ｃエントリーベクターを得ることと
を含み、ａ)は、ｂ)におけるIIS型酵素作用により可変および定常クローニング断片中に生じたものに相補的な一本鎖突出を創出し、ｂ)は、ａ)において生じる突出とライゲーションされる突出を生じるための可変および定常断片の消化であり、可変および定常断片をライゲーションするためのネガティブ選択マーカー断片内で生じた相補性突出のライゲーションを許容し、ｃ)は、Ｖ-Ｃエントリーベクター生成物の選択および増幅である。
【００７３】
Ｖ-Ｃエントリーベクターおよび構築エレメントの一般的な特徴
上記の記載は、実施例1〜４にも概説するように、ヒトHLA TRAおよびTRB遺伝子座をTORESシステムの規定のための鋳型として用いる。しかし、任意のTCR遺伝子座からの遺伝子セグメントファミリーをTORESに組立てることができる。上記の記載では、ヒトTRA/TRB遺伝子座の両方についてTORESシステムの設計のどこに自由度があるかについての手引きを与えるが、任意の生物からの任意の他の遺伝子座にも用いることができることについての手引きも与える。このセクションでは、システムの一般的な特徴を、実施例１〜４に鋳型として示すTRA/TRB設計を用いて記載する。
任意の所定のTCR遺伝子座についてTORESを達成するために、前記TCR遺伝子座によりコードされるTCR鎖に特異的な４つの配列エレメントが必要である：
Ｘ - 可変(Ｖ)遺伝子セグメント断片
Ｙ - 定常(Ｃ)遺伝子セグメント断片
Ｙ' - 定常(Ｃ)遺伝子セグメント部
Ｚ - 連結(Ｊ)遺伝子セグメント断片。
【００７４】
上記の記載および以下の実施例によると、これらの４つの形のTCR配列エレメントは、様々なベクターの状況に組立てて、任意の所定のTCR鎖についての任意の所定のＶ-Ｊ-Ｃ組み合わせについてTORESを構築および展開できる。例えば、天然ヒトTRGおよびTRD遺伝子座、バリアントおよび/または合成TCR鎖形あるいはヒト以外の生物の天然TCR鎖形についてのシステム。
ＶおよびＣ遺伝子セグメント断片は、それぞれＶクローニング断片およびＣクローニング断片によりＶ-Ｃエントリーベクターに組立てられるものである。このプロセスは、実施例１および３に詳しく記載する。
第一IIS型配列が酵素BsaIのための認識をコードし、第五および第六IIS型配列が酵素BbsIのための認識をコードし、可変遺伝子セグメントクローニング断片が、よって、配列SEQ0690により表される、一般的な可変遺伝子セグメントクローニング断片。コードされる可変遺伝子セグメント断片は、XNnで表され、ここで、Ｘは、可変遺伝子セグメントのことであり、Ｎは、任意のヌクレオチドを表し、ｎは、前記配列内のヌクレオチドの数を表す。
【００７５】
第一IIS型配列が酵素BsaIのための認識をコードし、第七および第八IIS型配列が、酵素BbsIのための認識をコードし、定常遺伝子セグメントクローニング断片が、よって、配列SEQ0691により表される、一般的な定常遺伝子セグメントクローニング断片。コードされる定常遺伝子セグメント断片は、YNnで表され、Ｙは、定常遺伝子セグメントのことあり、Ｎは、任意のヌクレオチドを表し、ｎは、前記配列内のヌクレオチドの数を表す。
配列SEQ0048により表されるＶ-Ｃエントリーベクター主鎖は、哺乳動物宿主細胞における一過性発現または再構成された全長TCRオープンリーディングフレームのために適切なＶ-Ｃエントリーベクターを構築するために用いられ、ここで、第一および第二突出は、それぞれ主鎖のAcc65IおよびXbaI酵素作用により作製され、５'および３'遺伝子エレメントは、それぞれ構成性プロモータおよびポリアデニル化シグナルにより表される。
配列SEQ0688により表されるＶ-Ｃエントリーベクター主鎖は、適切な異種特異的リコンビナーゼ配列を有するマッチする遺伝子標的とのリコンビナーゼ媒介カセット交換のために適切なＶ-Ｃエントリーベクターを構築するために用いられ、ここで、第一および第二突出は、それぞれ主鎖のAcc65IおよびXbaI酵素作用により作製され、５'および３'遺伝子エレメントは、それぞれフリッパーゼ活性を駆動するF14およびF15異種特異的リコンビナーゼ配列により表される。
配列SEQ0689により表されるＶ-Ｃエントリーベクター主鎖は、マッチする異種特異的リコンビナーゼ配列を有する遺伝子標的とのリコンビナーゼ媒介カセット交換のために適切なＶ-Ｃエントリーベクターを構築するために用いられ、ここで、第一および第二突出は、それぞれ主鎖のAcc65IおよびXbaI酵素作用により作製され、５'および３'遺伝子エレメントは、それぞれフリッパーゼ活性を駆動するFRTおよびF3異種特異的リコンビナーゼ配列により表される。
上記の一般的なＶクローニング断片、Ｃクローニング断片を選択されたＶ-Ｃエントリーベクター主鎖と組み合わせることにより、バリアントＶ-Ｃエントリーベクターを、これらの変動するベクターの状況内で再構成されるTCR ORFの異なる下流の用途のために構築できる。
【００７６】
配列SEQ0048を有するＶ-Ｃエントリーベクター主鎖を用いて構築される一般的なＶ-Ｃエントリーベクターを、配列SEQ0692により表す。この得られるＶ-Ｃエントリーベクターは、哺乳動物宿主細胞における一過性発現または再構成された全長TCRオープンリーディングフレームのために適切であり、ここで、第一および第二IIS型配列は、酵素BsaIのための認識をコードし、可変遺伝子セグメント断片は、XNnで表され、定常遺伝子セグメント断片は、YNnで表され、ＸおよびＹは、前記配列のことであり、Ｎは、任意のヌクレオチドを表し、ｎは、各配列内のヌクレオチドの数を表す。
配列SEQ0688を有するＶ-Ｃエントリーベクター主鎖を用いて構築される一般的なＶ-Ｃエントリーベクターは、マッチする異種特異的リコンビナーゼ配列を有する遺伝子標的とのリコンビナーゼ媒介カセット交換のために適切なF14およびF15配列を含む配列SEQ0693により表され、ここで、第一および第二IIS型配列は、酵素BsaIのための認識をコードし、可変遺伝子セグメント断片は、XNnで表され、定常遺伝子セグメント断片は、YNnで表され、ＸおよびＹは、前記配列のことであり、Ｎは、任意のヌクレオチドを表し、ｎは、各配列内のヌクレオチドの数を表す。
配列SEQ0689を有するＶ-Ｃエントリーベクター主鎖を用いて構築される一般的なＶ-Ｃエントリーベクターは、マッチする異種特異的リコンビナーゼ配列を有する遺伝子標的とのリコンビナーゼ媒介カセット交換のために適切なFRTおよびF3配列を含む配列SEQ0694により表され、ここで、第一および第二IIS型配列は、酵素BsaIのための認識をコードし、可変遺伝子セグメント断片は、XNnで表され、定常遺伝子セグメント断片は、YNnで表され、ＸおよびＹは、前記配列のことであり、Ｎは、任意のヌクレオチドを表し、ｎは、各配列内のヌクレオチドの数を表す。
【００７７】
異なる異種特異的リコンビナーゼ部位を有するＶ-Ｃエントリーベクターの対の使用は、ヒトTRAおよびTRB鎖対について実施例４に示すように、TCR鎖対の各鎖について用いてよい。このことは、この対形成したTORESシステムにおいて再構成されるTCR鎖の下流の用途において、二重の異種特異的リコンビナーゼレシーバ部位を用いて遺伝子の状況においてこれを送達できることを意味する。例えば、TCR鎖対のゲノム組込みのためのこのような二重の異種特異的リコンビナーゼレシーバ部位を含む株化細胞。
Ｖ-Ｃエントリーベクターおよびそれを組立てる成分についての上の記載は、それぞれ構築および運転のためのIIS型酵素BbsIおよびBsaIの使用に基づく。上に示す手引きに基づいて、１つ以上の代わりのIIS型酵素を、これらの任務のそれぞれのために用いてよい。
【００７８】
Ｊドナーベクターを構築する方法
Ｖ-Ｃエントリーベクターの構築のための上記の組み合わせ方法について、組み合わせ方法は、Ｊドナーベクターを構築するために用いてよい。本方法において、Ｊドナーベクターは、第一工程において中間Ｊ受入カセットベクターを構築し、第二工程においてそこにＪセグメント部を挿入してＪドナーベクターを形成することを含む二工程プロセスで構築される。この状況において、Ｊドナーベクターがそこから導かれるＪ受入カセットベクターは、Ｃ部と呼ばれる定常遺伝子セグメントの小さい断片を含む。よって、迅速な組み合わせ方法または構築は、定常遺伝子セグメントの異なる仕様を必要とする異なるＪドナーベクター形を繰り返すために望ましい。この方法は、実質的に実施例２および３に詳しく記載する。
【００７９】
Ｊドナーベクターを構築する方法は：
ａ.Ｊ受入カセット断片
ｂ.Ｊドナーベクター主鎖
ｃ.Ｊ受入カセットベクター
ｄ.Ｊセグメント部
から選択される４つのDNA成分を組み合わせることを含み、ａ)は、ベクター組立ておよび再構成反応運転のための上記のＣ部および４つの異なるIIS型クローニング部位を含み、ｂ)は、１つが挿入されてｃ)を創出するベクター主鎖であり、ｄ)は、ｃ)と組み合わされてＪドナーベクターを創出するＪ遺伝子セグメント部である。
Ｊ受入カセット断片は：
ａ.Ｊドナーベクター主鎖に作製される突出配列に相補的な５'末端での第一一本鎖突出、
ｂ.ｃ.で述べる第九IIS型配列により駆動される酵素が作用した場合に一本鎖突出を形成する配列と連結される、３'方向に切断する向きの第三IIS型配列、
c.５'方向に切断する向きであり、ｂ.に述べる一本鎖突出を創出する第九IIS型配列、
ｄ.ネガティブ選択マーカー、
ｅ.３'方向に切断する向きであり、ｆ.に記載する配列の５'側にて一本鎖突出を創出する第十IIS型配列、
ｆ.第十IIS型配列により駆動される酵素作用により作製される５'末端での突出配列と、ｇ.で述べる第四IIS型配列により駆動される酵素作用により作製される３'末端での突出配列とを有する、定常遺伝子断片の５'部分を表すＣ部、
ｇ.ｇで述べるＣ部を含む５'配列内で一本鎖突出が作製されるように５'方向に切断する向きの第四IIS型配列、
ｈ.Ｊドナーベクター主鎖内に作製される突出配列に相補的(commentary)である３'末端の第二一本鎖突出
を含み、ａ)およびｈ)は、Ｊドナーベクター主鎖への定方向クローニングのために用いられ、ｂ)およびｇ)は、再構成反応の運転において用いられるIIS型配列をコードし、ｃ)およびｅ)は、Ｊドナーベクターの組立てに用いるIIS型配列をコードし、ｄ)は、Ｊドナーベクターの組立て中に親のＪ受入カセットベクターの排除のためのネガティブ選択マーカーであり、ｆ)は、Ｊドナーベクターが有する定常遺伝子セグメントの断片である。
【００８０】
Ｊ受入カセット断片の模式図を、図８に示す。実施例２および３は、それぞれヒトTRAおよびTRB遺伝子座についてのＪ受入カセットベクターを組立てるためのＪ受入カセット断片のフォーマットおよび使用について記載する。
この状況において、Ｊ受入カセット断片は、両末端に一本鎖突出を有するDNA二重鎖をもたらす部分相補的一本鎖オリゴヌクレオチドをアニールすることにより形成される。
TRA遺伝子座についてのＪ受入カセット断片を、SEQ0098およびSEQ0099として記載する。
TRB遺伝子座についてのＪ受入カセット断片を、SEQ0578およびSEQ0581として記載し、ここで、２つの形は、ヒトTRB遺伝子座にて利用される２つの定常遺伝子セグメントの原因となるように存在する。
示す例では、Ｊ受入カセット断片、Ｊドナーベクター組立てのために用いるIIS型酵素は、BbsIであるが、TCR ORF再構成のために用いるIIS型酵素は、BsaIである。
【００８１】
Ｊドナーベクター主鎖は：
ａ.複製起点、
ｂ.第二ポジティブ選択マーカー、
ｃ.主鎖の消化を許容して、Ｊ受入カセット断片内の突出に相補的な一本鎖突出を創出する第一制限酵素認識配列、
ｄ.主鎖の消化を許容して、Ｊ受入カセット断片内の突出に相補的な一本鎖突出を創出する第二制限酵素認識配列
を含み、ｃ)およびｄ)は、ユニーク相補的突出配列の使用により、Ｊ受入カセット断片の定方向クローニングを許容する。
Ｊドナーベクター主鎖は、図９に模式的に示し、実施例２および３に詳細に記載する。Ｊドナーベクター主鎖配列は、SEQ0097として表す。
【００８２】
Ｊドナーベクター主鎖は、EcoRIおよびXhoIについての制限酵素認識部位を含んで、Ｊ受入カセット遺伝子クローニング断片で提供される５'突出および３'突出に適合する突出を創出する。
制限酵素の任意の他の組み合わせは、上記の基準を満たす限り、組立ておよび再構成反応に用いることができる。
Ｊ受入カセット断片とＪドナーベクター主鎖とを組み合わせることによりＪ受入カセットベクターを作製する方法は、実施例２および３に詳しく記載する。
Ｊ受入カセットベクターは、TRAＪ受入カセット断片とTRAJ Ｊドナーベクター主鎖とを組み合わせることにより構築し、方法は：
ａ.Ｊドナーベクター主鎖内に含まれる認識配列に特異的な２つの制限酵素でのＪドナーベクター主鎖の消化と、
ｂ.消化したＪドナーベクター主鎖を、DNAリガーゼ酵素を用いて、Ｊ受入カセット断片と組み合わせることと、
ｃ.得られた反応生成物でのコンピテント宿主生物の形質転換および前記第二ポジティブ選択マーカーを用いるポジティブ選択により、完全Ｊ受入カセットベクターを得ることと、
を含み、ａ)は、Ｊ受入カセット断片内に含まれるものに相補的な一本鎖突出を創出し、ｂ)は、Ｊ受入カセットベクターを形成するための相補的突出のライゲーションであり、ｃ)は、Ｊ受入カセットベクター生成物の選択および増幅である。
【００８３】
Ｊ受入カセットベクターの模式図を、図10に示す。実施例２および３は、それぞれヒトTRAおよびTRB遺伝子座についてのＪ受入カセットベクターの構築を記載する。
TRA遺伝子座についてのＪ受入カセットベクターは、SEQ0098として記載するが、TRB遺伝子座についてのものは、SEQ0582およびSEQ0583として記載する。TRB遺伝子座は、２つの定常遺伝子セグメントを用い、よって、レプリカTRB Ｊ受入カセットベクターは、各定常遺伝子セグメントに特異的なＣ部配列を含む。
Ｊ受入カセットベクターは、Ｊセグメント部と組み合わせて、Ｊドナーベクターを創出する。Ｊセグメント部は、Ｊ遺伝子セグメントのまとまりをコードする。
【００８４】
前記Ｊセグメント部は：
ａ.第九IIS型配列により駆動される酵素が作用した場合にＪ受入カセットベクターに作製される突出に相補的である、５'末端での第一一本鎖突出配列、
ｂ.連結遺伝子セグメント部、
ｃ.第十IIS型配列により駆動される酵素が作用した場合にＪ受入カセットベクターに作製される突出に相補的である、３'末端での第二一本鎖突出配列、
を含み、ａ)およびｃ)は、組立て反応において提供されるIIS型酵素により消化されるＪ受入カセットベクターへのＪセグメント部の定方向クローニングを駆動し、ｂ)は、Ｊドナーベクター生成物が有することとなる連結遺伝子セグメントをコードする。
Ｊセグメント部の模式図を、図11に示す。実施例２および３は、それぞれヒトTRAおよびTRB遺伝子座についてのＪドナーベクターを構築するために用いるＪセグメント部を記載する。
【００８５】
ヒトTRA遺伝子座のＪ遺伝子セグメント使用にわたる短いＪセグメント部は、SEQ0099〜SEQ0210として記載し、ここで、Ｊセグメント部は、両末端に一本鎖突出を有するDNA二重鎖をもたらす部分相補的一本鎖オリゴヌクレオチドをアニールすることにより作製される。
短いＪセグメント部は、実施例２および３に示すように、最小限の長さの標準化Ｊセグメント部を有するＪドナーベクターを作製するために用いることができる。
【００８６】
長いＪセグメント部は、Ｊ遺伝子セグメントの拡張されたカバー範囲を有するＪドナーベクターを作製して、TCR 再構成反応において用いるodeCDR3のサイズを最小限にするために用いることができる。odeCDR3エレメントを短くすることは、該エレメントの合成費用を節約し、これらのオリゴヌクレオチド二重鎖内の変異負荷も最小限にする。
ヒトTRA遺伝子座のＪ遺伝子セグメント使用にわたる長いＪセグメント部は、SEQ0211〜SEQ0322として記載し、ここで、Ｊセグメント部は、両末端に一本鎖突出を有するDNA二重鎖をもたらす部分相補的一本鎖オリゴヌクレオチドをアニールすることにより作製される。
ヒトTRB遺伝子座のＪ遺伝子セグメント使用にわたる短いＪセグメント部は、SEQ0584〜SEQ0609として記載し、ここで、Ｊセグメント部は、両末端に一本鎖突出を有するDNA二重鎖をもたらす部分相補的一本鎖オリゴヌクレオチドをアニールすることにより作製される。
ヒトTRB遺伝子座のＪ遺伝子セグメント使用にわたる長いＪセグメント部は、SEQ0610〜SEQ0635として記載し、ここで、Ｊセグメント部は、両末端に一本鎖突出を有するDNA二重鎖をもたらす部分相補的一本鎖オリゴヌクレオチドをアニールすることにより作製される。
【００８７】
この状況において、上で第九および第十IIS型配列と示したＪドナーベクターの組立てのために用いるIIS型配列は、同じである。
あるいは、２つの異なるIIS型認識配列をこの手順のために用いることができる。
上で第九および第十IIS型配列と示したＪドナーベクターの組立てのために用いるIIS型配列は、上で第一、第二、第三および第四IIS型配列と示した再構成反応のために用いるものとは異ならなければならない。
上で第九および第十IIS型配列と示したＪドナーベクターの組立てのために用いるIIS型配列は、上で第五、第六、第七および第八IIS型配列と示したＶ-Ｃエントリーベクターを組立てるために用いるものと同じである。
Ｖ-ＣエントリーおよびＪドナーベクターを組立てるために用いるこれらのIIS型配列は、同じまたは異なる必要はない。なぜなら、これらは、独立して処理されるからである。
【００８８】
Ｊセグメント部は、マッチするＣ部を含むＪ受入カセットベクターと組み合わせて、Ｊドナーベクターを生じる。
Ｊドナーベクターは、Ｊドナーベクター主鎖をＪセグメント部と組み合わせることにより構築され、方法は：
ａ.DNAリガーゼ酵素ならびに第九および第十IIS型配列を認識する１つ以上のIIS型制限酵素とともに、Ｊ受入カセットベクターをＪセグメント部と組み合わせ、組み合わせたミックスを熱サイクル反応に供することと、
ｂ.得られた反応生成物でのコンピテント宿主生物の形質転換および前記第二ポジティブ選択マーカーを用いるポジティブ選択により、完全Ｊドナーベクターを得ることと
を含み、工程ａ)における第九および第十IIS型配列に対するIIS型酵素作用は、ネガティブ選択マーカー配列の切り出しにより、Ｊ受入カセットベクター内に一本鎖突出を創出する。
得られるＪドナーベクターの模式図を、図３に示す。実施例２および３は、それぞれヒトTRAおよびTRB遺伝子座についてのＪドナーベクターを構築するためのＪセグメント部およびＪ受入カセットベクターについて記載する。
【００８９】
ヒトTRA遺伝子座についての短いＪセグメントを含むＪドナーベクターは、SEQ0323〜SEQ0378として記載し、ヒトTRA遺伝子座についての長いＪセグメントを含むＪドナーベクターは、SEQ0379〜SEQ0434として記載する。
C1定常遺伝子セグメントと対形成したヒトTRB遺伝子座についての短いＪセグメントを含むＪドナーベクターは、SEQ0636〜SEQ0648として記載し、ヒトTRA遺伝子座についての長いＪセグメントを含むＪドナーベクターは、SEQ0662〜SEQ0674として記載する。
C2定常遺伝子セグメントと対形成したヒトTRB遺伝子座についての短いＪセグメントを含むＪドナーベクターは、SEQ0649〜SEQ0661として記載し、ヒトTRA遺伝子座についての長いＪセグメントを含むＪドナーベクターは、SEQ0675〜SEQ0687として記載する。
【００９０】
提供する例において、Ｊドナーベクターを組立てるために用いるIIS型酵素は、BbsIであり、TCRの再構成において用いるIIS型酵素は、BsaIである。ネガティブ選択マーカーは、NotI制限酵素配列である。
Ｊドナーベクターを構築する方法も、形質転換および選択の前に親のＪ受入カセットベクターを排除するネガティブ選択工程を必然的に伴う。
提供する例において、このネガティブ選択は、形質転換および選択の前に親のＪ受入カセットベクターを排除するNotI消化を必然的に伴う。
【００９１】
Ｊドナーベクターおよび構築エレメントの包括的な特徴
上および以下の実施例５で記載するように、Ｖ-ＣエントリーおよびＪドナーベクターライブラリのいくつかの特徴は、TCR遺伝子セグメントエレメントを一般的な状況において構築してTORESシステムを達成する程度に、一般的であり得る。
任意の所定のTCR遺伝子座についてTORESを達成するために、前記TCR遺伝子座によりコードされるTCR鎖に特異的な４つの配列エレメントが必要である：
Ｘ - 可変(Ｖ)遺伝子セグメント断片
Ｙ - 定常(Ｃ)遺伝子セグメント断片
Ｙ' - 定常(Ｃ)遺伝子セグメント部
Ｚ - 連結(Ｊ)遺伝子セグメント断片。
【００９２】
上記の記載および以下の実施例によると、これらの４つの形のTCR配列エレメントは、様々なベクターの状況に組立てて、任意の所定のTCR鎖についての任意の所定のＶ-Ｊ-Ｃ組み合わせについてTORESを構築および展開できる。例えば、天然ヒトTRGおよびTRD遺伝子座、バリアントおよび/または合成TCR鎖形あるいはヒト以外の生物の天然TCR鎖形についてのシステム。
Ｃ遺伝子セグメント部およびＪ遺伝子セグメント断片は、それぞれＪ受入カセット断片およびＪクローニング断片によりＪドナーベクターに組立てられるものである。このプロセスは、実施例２および３に詳しく記載する。
第三および第四IIS型配列が、酵素BsaIのための認識をコードし、第九および第十IIS型配列が、酵素BbsIのための認識をコードし、ネガティブ選択マーカーが、NotI制限酵素認識配列である、配列SEQ0695およびSEQ0696で表される包括的なＪ受入カセット断片。この配列内で、コードされるＣ部は、Y'Nnで表され、ここで、Y'は、Ｃ部のことであり、Ｎは、任意のヌクレオチドを表し、ｎは、前記配列内のヌクレオチドの数を表す。
【００９３】
Ｊ受入カセット断片は、部分相補的配列と配列の対で表される一本鎖オリゴヌクレオチドをアニールすることにより作製される。
上記の包括的Ｊ受入カセット断片を有するＪ受入カセットベクターを構築するためのＪドナーベクター主鎖は、SEQ0097で表され、ここで、制限酵素EcoRIおよびXhoIを用いて、Ｊ受入カセット断片配列の挿入のために必要な一本鎖DNA突出を作製する。
配列SEQ0695およびSEQ0696で表されるＪ受入カセット断片から作製されるＪ受入カセット断片と、配列SEQ0097で表されるＪドナーベクター主鎖との組み合わせにより構築されるＪ受入カセットベクターは、よって、SEQ0697で表される。この得られるＪ受入カセットベクター内で、第三および第四IIS型配列は、酵素BsaIのための認識をコードし、第九および第十IIS型配列は、酵素BbsIのための認識をコードし、ネガティブ選択マーカーは、NotI制限酵素認識配列である。Ｊ受入カセット断片から導かれるように、コードされるＣ部は、Y'Nnで表され、ここで、Y'は、Ｃ部のことであり、Ｎは、任意のヌクレオチドを表し、ｎは、前記配列内のヌクレオチドの数を表す。
【００９４】
Ｊ受入カセットベクターは、挿入されてＪドナーベクターを与えるＪセグメント部を有する。
SEQ0697で表される包括的なＪ受入カセットベクターに挿入されて用いられる包括的なＪセグメント部は、よって、相補配列SEQ0698およびSEQ0699により表され、ここで、Ｊ遺伝子セグメント部は、ZNnで表され、Ｚは、Ｊ遺伝子セグメントのことであり、Ｎは、任意のヌクレオチドを表し、ｎは、前記配列内のヌクレオチドの数を表す。
Ｊセグメント部は、SEQ0698およびSEQ0699で表される２つの一本鎖オリゴヌクレオチドをアニールすることにより作製される。
SEQ0697により表されるＪ受入カセットベクターと、相補配列SEQ0698およびSEQ0699により表されるＪセグメント部との組み合わせから組立てられる包括的なＪドナーベクターは、よって、配列SEQ0700で表される。この得られるＪドナーベクターは、よって、ZNnおよびY'Nnの２つのアノテート配列挿入断片を含み、ここで、Ｚは、Ｊ遺伝子セグメントのことであり、Y'は、Ｃセグメント部の名称であり、Ｎは、任意のヌクレオチドを表し、ｎは、前記配列内のヌクレオチドの数を表す。
Ｖ-Ｃエントリーベクターおよびそれらを組立てるための成分についての上の記載は、それぞれ構築および運転のためのIIS型酵素BbsIおよびBsaIの使用に基づく。上に示す手引きに基づいて、１つ以上の代わりのIIS型酵素を、これらの任務のそれぞれのために用いてよい。
【００９５】
診断および治療のための規定されたベクターの状況における全長TCR ORFの使用
疾患の処置のためのＴ細胞免疫の活用における重要な課題は、TCRレパートリの膨大な個体内での内容とともに、HLAおよびTCRシステムの個体間多様性である。このことは、TCRの評価および/または提供に依拠する医薬品および治療方策が、真の生物学的状況におけるTCRの確固とした評価を必要とする。
天然TCR鎖対の正確な評価を達成するために、把握したTCR ORFを規定されたベクターの状況で与えるための信頼できる費用効果的なハイスループット方法が必要である。任意の所定の鎖対のためのTORESは、そのようなTCR ORFを送達する手段である。
TCR ORFのための規定されたベクターの状況は、例えば、実施例８に記載するように、例えばヒト細胞表面上でそれによりTCRを迅速に特徴決定できる一過性発現ベクターであり得る。この例では、TCRを配列決定し、再発現させて、期待される特異性を確認できる。このことにより、確認されたTCR配列を用いて、個別化ベースでの免疫治療介入中に診断手順のために配列または増幅もしくはプローブベースのアッセイによりTCRクローン形質の量を追跡できる。同様に、TCR鎖対の迅速な把握および確認は、医薬化合物としての可溶性TCR構築物の送達または細胞治療薬としてのエフェクター細胞内のTCRの提供のような個別化医薬品において前記TCR対を提供できることを意味する。
【００９６】
同様のアプローチにおいて、TORESシステムは、実施例９および10に概説するように、特異性および/または機能を変更するためのTCR ORFのエンジニアリングに理想的に適切である。このエンジニアリングを用いて、シグナル伝達強度を増進もしくは低減し、かつ/または特異的疾患抗原に向かってTCR鎖対の特異性を変更もしくは再指向できる。このようなエンジニアリングされたTCR配列は、天然TCR鎖対の代わりに個別化した免疫療法方策で用いることができる。
【００９７】
二方向TCR ORF再構成およびエンジニアリングシステム(TORES2)
上記のTORESシステムは、独立した二部分ベクターライブラリシステム内の各TCR鎖を処理する。よって、TORES運転の生成物は、再構成されたTCR ORFをコードする別個のベクターである。別の態様では、本発明は、二工程方法を用いて相互性TCR鎖対を単一生成物ベクターに接続する代替のシステムを提供する。このことは、改変Ｖ-ＣエントリーベクターをTORESシステムのＪドナーベクターおよびodeCDR3と組み合わせて、別個の反応においてTCR鎖対の再構成を達成する五成分ベクターライブラリシステムで達成される。改変Ｖ-Ｃエントリーベクターにより、次いで、第五ベクター成分である二方向ターミネータドナーベクター(BiTドナー)を加えることにより再構成TCR ORFが第二工程においてつながって、逆平行コーディングセンスにおいて２つのTCR OFR対をコードするベクターが達成できる。
【００９８】
この二方向TORES(TORES2)は、相互性鎖対のエレメントをコードするＶ-Ｃエントリーベクターに対する改変が非対称であるので、組み合わせた五成分ベクターシステムである。Ｖ-Ｃエントリーベクターが別々の手はずを含むことを意味する。つまり、１つの鎖の再構成されたORFは、第一工程の生成物ベクターから切り出され、第一工程の相互性生成物ベクター中にアンチセンスの向きでライゲーションされる。よって、Ｖ-Ｃエントリーベクターの対形成が重要である。なぜなら、TORES2システムの元のＶ-Ｃエントリーベクターの１つが、最終生成物主鎖であり、よって、再構成され、つながれたTCR対の下流の用途のための所望の３'および５'遺伝子エレメントをコードするからである。明確さのために、以下の記載および例は、TRA鎖を最終生成物主鎖(例えばＶ-Ｃαエントリーベクター)およびTRBをこの最終生成物主鎖に組み込まれる鎖(例えばＶ-Ｃβエントリーベクター)と固定する。相互性配置は、相互性TCR鎖対の任意の他の組み合わせのように等しくあてはまる。
【００９９】
TORES2のＶ-Ｃエントリーベクター成分
上記のように、TORES2を含む五成分ベクターライブラリシステムは、改変Ｖ-Ｃエントリーベクターの状況の提供においてTORESシステムとは異なる。これらの改変は、第一工程においてTCR ORF再構成に利用されたものから別々のIIS型部位(IIS型#2とラベルを付す)およびネガティブ選択エレメント(-ve選択#2とラベルを付す)を組み込んで、第二工程において再構成されたORFを単一ベクターに接続することを駆動する。実際上、TORES2システムは、TORESシステムを新しいＶ-Ｃエントリーベクターの状況内に組み込む。以下の記載は、TRA鎖を最終生成物の主鎖として、そしてTRB鎖を再構築されたTRA鎖主鎖にアンチセンスの向きでライゲーションされるものとして取り扱う。同じフレームワークを、TCR鎖の任意の対に当てはめることができ、TCR鎖のいずれかがなぜ記載するベクターの配置の一方又は他方になければならないかについて、特定の理由はない。
【０１００】
Ｖ-Ｃαエントリーベクターは：
ａ.複製起点、
ｂ.第一ポジティブ選択マーカー、
ｃ.１つ以上の５'遺伝子エレメント、
ｄ.コザック配列、
ｅ.TCRアルファ可変遺伝子セグメント、
ｆ.IIS型制限酵素による部位特異的認識および切断のための第一IIS型配列(IIS型酵素#1について)、
ｇ.第一ネガティブ選択マーカー、
ｈ.第二IIS型配列(IIS型酵素#1について)、
ｉ.TCR定常遺伝子セグメント、
ｊ.第三IIS型配列(IIS型制限酵素#2について)、
ｋ.第二ネガティブ選択マーカー、
ｌ.第四 IIS型配列(IIS型制限酵素#2について)、ならびに
ｍ.１つ以上の３'遺伝子エレメント
を含み、ここで、ａ)およびｂ)は、細菌宿主内での親のＶ-Ｃエントリーベクターおよび再構成されたTCR含有ベクターの両方の増幅および選択のために用いられ、ｃ)およびｍ)は、再構成され、つながれた全長TCR ORFの下流の用途を規定するために用いられ、TORESについて上で記載したエレメントを含んでよく、ｄ)は、真核細胞での効率的な翻訳開始を確実にし、これは、原核生物および古細菌における移行制御のためのShine-Dalgarno配列の代わりであり得、ｅ)は、開始コドンから、所定の二成分ベクターシステムにおける全てのＶセグメントにわたって保存されるCDR3領域の５'端でのモチーフまでの可変(Ｖ)アルファ遺伝子セグメントであり、ｆ)は、IIS型制限酵素を駆動して、５'方向に切断してＶ遺伝子セグメントの３'末端にて標準化された一本鎖突出を創出するIIS型#1認識配列であり、ｇ)は、システムの運転中に親のＶ-Ｃエントリーベクターを排除して全長TCR ORFを再構成するネガティブ選択マーカー#1であり、ｈ)は、IIS型制限酵素を駆動して、３'方向に切断してＣ遺伝子セグメントの５'末端にて標準化された一本鎖突出を創出するIIS型認識配列#1であり、ｉ)は、所定の二成分ベクターシステムにおける全てのＣセグメントにわたって保存されるＣ遺伝子セグメントの５'末端でのモチーフからの定常(Ｃ)遺伝子セグメントであり、これは、Ｊセグメントとの境界を定め(図２および４を参照されたい)、ｊ)は、IIS型制限酵素を駆動して、５'方向に切断してＣ遺伝子セグメントの後に３'末端にて標準化された一本鎖突出を創出するIIS型#2認識配列であり、このIIS型酵素は、第一および第二IIS型#1酵素とは異なり、ｋ)は、二方向ベクター構築物を創出する運転中に親のTRA ORFベクターを消去するネガティブ選択マーカー#2であり、これは、第一ネガティブ選択マーカーとは別であり、ｌ)は、IIS型制限酵素を駆動して、３'方向に切断して３'遺伝子エレメントの前に標準化された一本鎖突出を創出するIIS型#2認識配列であり、このIIS型酵素は、第一および第二IIS型#1酵素とは異なり、ｍ)は、１つ以上の３'遺伝子エレメントである。
上記のＶ-Ｃαエントリーベクターの配置を、図20aに示す。
【０１０１】
通常、第一および第二IIS型酵素(IIS型#1と称する)は、同じであるが、異なっていてもよい。同様に、第三および第四IIS型酵素(IIS型#2と称する)は、一般的に同じであるが、異なっていてもよい。重要なことには、第一および第二IIS型(IIS型#1)部位に用いられるIIS型酵素は、第三および第四IIS型(IIS型#2)部位に用いられる酵素と異ならなければならない。
Ｖ-Ｃαエントリーベクター主鎖は、実施例11に示すようにSEQ0756で表される。
以下の実施例11は、ヒトTRA遺伝子座についてのTORES2のＶ-Ｃαエントリーベクター(SEQ0756)を表し、ここで、Ｖ/Ｃ配列のいくつかは、第三および第四部位において用いられるIIS型酵素がない点でTORESシステムに組み込まれるものと比較して改変されている(SEQ0757〜SEQ0763)。
【０１０２】
Ｖ-Ｃβエントリーベクターは：
ａ.複製起点、
ｂ.第一ポジティブ選択マーカー、
ｃ.１つ以上の５'遺伝子エレメント、
ｄ.IIS型#2制限酵素による部位特異的認識および切断のための第一IIS型配列
ｅ.コザック配列、
ｆ.TCRベータ可変遺伝子セグメント、
ｇ.IIS型制限酵素(IIS型#1)による部位特異的認識および切断のための第二IIS型配列、
ｈ.第一ネガティブ選択マーカー、
ｉ.第三IIS型配列(IIS型#1)、
ｊ.TCR定常遺伝子セグメント、
ｋ.第四IIS型配列(IIS型#2)、
ｌ.第二ネガティブ選択マーカー、および
ｍ.１つ以上の３'遺伝子エレメント
を含み、ここで、ａ)およびｂ)は、細菌宿主内での親のＶ-Ｃエントリーベクターおよび再構成されたTCR含有ベクターの両方の増幅および選択のために用いられ、ｃ)およびｍ)は、TORESシステムについて上記したような再構成された全長TCR ORFの下流の用途を場合によって規定し、ｄ)は、IIS型制限酵素を駆動して、３'方向に切断して５'遺伝子エレメントの後およびコザック配列の前に標準化された一本鎖突出を創出するIIS型#2認識配列であり、このIIS型酵素は、第二および第三IIS型#1酵素とは異なり、ｅ)は、真核細胞での効率的な翻訳開始を確実にし、これは、原核生物および古細菌における移行制御のためのShine-Dalgarno配列の代わりであり得、ｆ)は、開始コドンから、所定の二成分ベクターシステムにおける全てのＶセグメントにわたって保存されるCDR3領域の５'端でのモチーフまでの可変(Ｖ)遺伝子セグメントであり、ｇ)は、IIS型制限酵素を駆動して、５'方向に切断してＶ遺伝子セグメントの３'末端にて標準化された一本鎖突出を創出するIIS型#1認識配列であり、ｈ)は、システムの運転中に親のＶ-Ｃエントリーベクターを排除して全長TCR ORFを再構成するネガティブ選択マーカーであり、ｉ)は、IIS型制限酵素を駆動して、３'方向に切断してＣ遺伝子セグメントの５'末端にて標準化された一本鎖突出を創出するIIS型#1 認識配列であり、ｊ)は、所定の二成分ベクターシステムにおける全てのＣセグメントにわたって保存されるＣ遺伝子セグメントの５'末端でのモチーフからの定常(Ｃ)遺伝子セグメントであり、これは、Ｊセグメントとの境界を定め(図２および４を参照されたい)、ｋ)は、IIS型制限酵素を駆動して、５'方向に切断してＣセグメントの後であるが３'遺伝子エレメントの前に標準化された一本鎖突出を創出するIIS型#2認識配列であり、このIIS型酵素は、第二および第三IIS型#1酵素とは異なり、ｍ)は、第二ネガティブ選択マーカーであり、これは、第一ネガティブ選択マーカーとは異なり、ｌ)は、1つ以上の３'遺伝子エレメントである。
上記のＶ-Ｃβエントリーベクターの配置を図20bに示す。
【０１０３】
３'および５'遺伝子エレメントは、Ｖ-Ｃβエントリーベクターの状況において、任意選択である。なぜなら、このベクター内で再構成されたORFは、後で切り出され、Ｖ-Ｃαエントリーベクター主鎖の状況にライゲーションされるからである。これは、Ｖ-Ｃαエントリーベクター主鎖である。
通常、第二および第三IIS型酵素(IIS型#1と称する)は、同じであるが、異なっていてもよい。同様に、第一および第四IIS型酵素(IIS型#2と称する)は、一般的に同じであるが、異なっていてもよい。重要なことには、第二および第三IIS型部位(IIS型#1)に用いられるIIS型酵素は、第一および第四IIS型部位(IIS型#2)に用いられる酵素と異ならなければならない。
【０１０４】
通常、Ｖ-Ｃαエントリーベクターの第一および第二IIS型部位(IIS型#1)は、Ｖ-Ｃβエントリーベクターの第二および第三と同じであるが、その必要はない。なぜなら、これらの反応は、独立して行うことができるからである。Ｖ-Ｃαエントリーベクターの第一および第二IIS型部位が、Ｖ-Ｃβエントリーベクターの第二および第三IIS型部位のものから異なるならば、記載するシステムにおけるTRA鎖およびTRB鎖の再構成は、単一反応で行うことができる。
通常、Ｖ-Ｃαエントリーベクターの第三および第四IIS型部位(IIS型#2)は、第二反応の接続反応に単一のIIS型酵素(IIS型#2)の添加だけを必要とするために、Ｖ-Ｃβエントリーベクターの第一および第四と同じである。
通常、Ｖ-ＣαおよびＶ-Ｃβエントリーベクターのそれぞれの第二ネガティブ選択マーカー(-ve選択#2)は、TORES2運転の接続工程において親のベクターの効率的なネガティブ選択を容易にするために、同じであるが、異なっていてもよい。
Ｖ-Ｃβエントリーベクター主鎖は、実施例11に示すように、SEQ0764により表される。
以下の実施例11は、ヒトTRB遺伝子座についてのTORES2のＶ-Ｃβエントリーベクター(SEQ0764)を表す、ここで、Ｖ/Ｃ配列のいくつかは、第一および第四部位において用いられるIIS型酵素がない点で、TORESシステムに組み込まれるものと比較して改変されている(SEQ0765〜SEQ0776)。
【０１０５】
TORES2のＪドナーおよびodeCDR3成分
ＪドナーベクターおよびCDR3をコードするオリゴヌクレオチド二重鎖は、従来のTORESについて既に上で記載したものと同じである。これらはともに、第一工程反応において用いて、TORESについて上で記載したものと同一の手順において、指定したＶ-Ｃエントリーベクター主鎖の状況内で相互性TCR鎖対を再構成する。
【０１０６】
TORES2の二方向ターミネータドナーベクター(BiTドナー)
TORES2の最初の四つのベクターライブラリ成分は、TRA/TRBに焦点を当てた記載においてTRAおよびTRB鎖のそれぞれについてのＪドナーベクターとともにＶ-ＣαおよびＶ-Ｃβエントリーベクターである。ここでもまた、記載する設計原理に従ってこのシステムに任意のTCR鎖を組み込むことができ、特定のTRAおよびTRB構成に明確性のために固定することに注意されたい。
第五成分は、二方向ターミネータドナーベクター(BiTドナー)であり、これは、第一工程反応において再構成され、第二工程反応においてこの二方向ターミネータエレメントによりつながれる逆平行センスTRAおよびTRB鎖が間に入った二方向ターミネータエレメントを提供する。
二方向ターミネータは、通常、ベクターとして提供され、これもまた２つのIIS型制限酵素(IIS型#2)に包囲されている。二方向ターミネータエレメントを、これらのIIS型部位を有するか、またはIIS型部位なしで標的一本鎖DNA突出を有する直鎖状dsDNA構築物として提供することは、等しく適当である。
【０１０７】
二方向ターミネータを含むベクターは：
ａ.複製起点、
ｂ.第二ポジティブ選択マーカー、
ｃ.第一IIS型配列(IIS型#2)、
ｄ.二方向ターミネータ、および
ｅ.第二IIS型配列(IIS型#2)
を含み、ここで、ａ)およびｂ)は、細菌宿主内での二方向ターミネータを有するベクターの増幅および選択のために用いられ、ｃ)は、IIS型制限酵素(IIS型#2)を駆動して、３'方向に切断して標準化された一本鎖突出を創出するIIS型認識配列であり、ｄ)は、再構成されたTCR ORFを含む前記ベクターが、哺乳動物細胞にトランスフェクションされる場合に、TRA主鎖に再構成されるTCRの発現中にセンスおよびアンチセンスの両方のDNA鎖上での転写終結を確実にするために用いられる二方向ターミネータであり、ｅ)は、IIS型制限酵素を駆動して、５'方向に切断して標準化された一本鎖突出を創出するIIS型認識配列(IIS型#2)である。
上記のBiTドナーベクターの配置を、図21に示す。
【０１０８】
通常、BiTドナー内に含まれるポジティブ選択マーカーは、第二工程の接続反応において親のBiTドナーの持越しを最小限にするために、Ｖ-ＣαおよびＶ-Ｃβエントリーベクターが有するポジティブ選択マーカーとは異なる。
通常、BiTドナーにおける第一および第二IIS型部位(IIS型#2)は、第二の接続反応に単一のIIS型酵素(IIS型#2)の添加だけを必要とするので、Ｖ-Ｃαエントリーベクターの第三および第四IIS型部位、ならびにＶ-Ｃβエントリーベクターの第一および第四の両方と同じである。
二方向ターミネータエレメント配列は、SEQ0777により表される。
【０１０９】
全長TCR ORF対を再構成して接続するためのTORES2の運転
TORES2の運転は、第一TCR ORF再構成反応と、第二TCR ORF接続反応とを組み込む二工程プロセスである。TCR ORFの再構成の方法は、TORESについて上で記載したものと同一である(図１および４を参照されたい)。第一工程の生成物は、よって、TORESの生成物と同じであり、Ｖ-CDR3-Ｊ-Ｃエレメント配置を含む全長TCR ORFをコードするベクターを含む。しかし、TORES2システムは、TORESシステムとは異なる主鎖の状況においてこれらのTCR ORFを提供し、ここで、TORES2主鎖は、第二接続工程反応を容易にするために、さらなるクローニング部位を含む。この第二工程制限酵素およびリガーゼサイクル反応は、第一工程からの再構成されたTCR ORFを、逆平行センスにて接続してBiTドナーにより提供される二方向ターミネータを挿入することを必然的に伴う。全体的なプロセスを図22に示し、これは、上記のTRA/TRB TORES2配置を示す。
【０１１０】
再構成されたTRAコーディングベクター(図22a)、TRBコーディングベクター(図22b)およびBiTドナー(図22c)は、単一チューブ内でIIS型酵素(IIS型#2)およびリガーゼと反応させ、制限酵素およびリガーゼサイクル反応に供する。IIS型制限酵素は、３つの提供されたベクターを３つの反応副産物と、反応生成物への定方向ライゲーションのための設計された突出を有する３つの中間体とに消化する。
３つの反応副産物は、TRAベクターからの切り出された-ve選択エレメント#2およびIIS型#2部位(図22d)、再構成されたTRB ORFがそこから切り出される開環TRBコーディングベクター主鎖(図22e)、およびそこから二方向ターミネータエレメントが切り出される開環BiTドナー主鎖(図22f)である。
【０１１１】
第一の反応中間体は、開環TRAベクターであり、Ｖ-Ｃαエントリーベクター主鎖の状況において再構成されたTRA ORFをコードする(図22g)。上記の元のＶ-Ｃαエントリーベクター中の第三IIS型#2部位は、酵素を駆動して、５'方向に切断してＣ遺伝子セグメントの後に３'末端にて標準化された一本鎖突出を創出するが(図22g、突出≠1-5')、第四IIS型#2部位は、３'方向における酵素切断を駆動して、３'遺伝子エレメントの前に標準化された一本鎖突出を創出する(図22e突出≠3-3')。
第二反応中間体は、Ｖ-Ｃβエントリーベクターの状況から切り出されたTRB ORFをコードする断片である。上記のＶ-Ｃβエントリーベクター中の第一IIS型#2部位は、酵素を駆動して、３'方向に切断してコザック配列の前に突出を創出する(図22h突出≠3-5')。第四IIS型#2部位は、酵素を駆動して、５'方向に切断してＣセグメントの後に突出を創出する(図22h突出≠2-3')。図22hは、この中間体をアンチセンスの向きに示し、ここで、これは、生成物ベクターの状況にライゲーションされることに注意すべきである。
第三反応中間体は、BiTドナーから切り出される二方向ターミネータエレメントであり、ここで、第一IIS型#2部位は、酵素を駆動して、５'方向に切断して標準化された一本鎖突出を生じる(図22i突出≠1-3')。第二IIS型#2部位は、酵素を駆動して、３'方向に切断して標準化された一本鎖突出を創出する(図22i突出≠2-5')。
制限酵素およびリガーゼサイクル反応内で、一本鎖突出は、生成物ベクターへのリガーゼ媒介定方向ライゲーションを駆動し、元のＶ-Ｃαエントリーベクター主鎖の状況内でTRAおよびTRB鎖の両方を接続する(図22j)。
【０１１２】
TORES2は、TCR鎖の任意の収集物について構築できる。明確性のために、説明のためのケーススタディとしてTRAおよびTRB遺伝子座を用いる。このようなTORES2の構築は、それぞれTCRデルタおよびガンマ鎖対をコードするTRDおよびTRG遺伝子座、または実際に有顎脊椎動物で見いだされる任意のTRA/TRB、TRD/TRGもしくはバリアントTCR鎖対システムの状況において等しく適用可能である。
以下の実施例において、ヒトTRA/TRB遺伝子座についてのTORES2システムが提供され、モデルヒトTCR ORFの再構成のために適用され、その後、元のＶ-Ｃαエントリーベクター主鎖の状況の５'および３'遺伝子エレメントとマッチする、RMCE部位を有するマッチするエンジニアリング株化細胞に組み込まれる。このことは、TORES2が、出願WO2018/083318 A1に記載されるものと類似の二部分装置の構成において、再構成されたTCR ORFの組込みおよび提示のために最適化されたマッチするエンジニアリング株化細胞と組み合わせて直ちに用いられることを示す。
以下に、本明細書で言及する配列を示す表を示す。
【０１１３】
【表１−１】
2020530769.tif 000003
【表１−２】
2020530769.tif 000004
【表１−３】
2020530769.tif 000005
【０１１４】
【表２−１】
2020530769.tif 000006
【表２−２】
2020530769.tif 000007
【０１１５】
定義のリスト
相補的TCR鎖の対：２つのTCR鎖であって、翻訳されたタンパク質が、TCR提示細胞の表面上でTCRspを形成できる対。
親和性：2つ以上の分子またはタンパク質間の相互作用の動的または平衡パラメータ。
アレル：所定の遺伝子のバリアント形。
アンプリコン：PCRを含む様々な方法を用いる人工的増幅の供給源および/または生成物であるDNAまたはRNA片。
分析物：同定および/または測定および/または照会しようとする物体。
抗体：Ｂ細胞とよばれる免疫系の特化された細胞により発現され、２つの鎖を含む親和性分子。Ｂ細胞は、自己タンパク質と通常は結合しないが、宿主に脅威を与え得る病原体または毒素と結合および中和できる非常に大きく非常に多様な抗体レパートリを発現する。天然または人工的エンジニアリング抗体は、頻繁に、親和性試薬として用いられる。
APC：抗原提示細胞。通常、HLAの状況において細胞表面上で抗原を提示できる細胞。
【０１１６】
Ｃ(セグメント)：定常セグメント。定常領域ともいう。Ｔ細胞受容体を組立てるために用いられる遺伝子セグメントの１つ。ｃ領域は、TCRの多様性を駆動するよりもむしろ、免疫系におけるその全般的な機能を規定する別個のセグメントである。
Ｃクローニング断片：定常クローニング断片。Ｃ遺伝子セグメントクローニング断片ともいう。Ｖ-Ｃエントリーベクターを構築するために用いるＣ遺伝子セグメントの一部を有する構築物。
Ｃ部：定常部。Ｊ受入カセット断片、Ｊ受入カセットおよびＪドナーベクターが有する定常遺伝子セグメント配列の小さい部分であって、TCR ORFを再構成するためのTORESの運転のために突出配列を標準化する。
CDR：相補性決定領域。標的結合機能のほとんどを行う、TCRおよび抗体の抗原に面する末端にある短い配列。各抗体およびTCRは、６つのCDRを含み、これらは、多数の多様性標的分子の検出を可能にするために、通常、分子の最も変動する部分である。
シスエレメント：近傍のORFの転写を制御するノンコーディングDNAの領域。
Ｄ(セグメント)：多様性セグメント。Ｄ領域ともいう。Ｔ細胞受容体を組立てるために用いられる遺伝子セグメントの一つ。各個体は、多数の異なるバリエーションのこれらの領域を有して、各個体が非常に多種類の異なるTCRを有するＴ細胞で武装できるようにする。
多様化：配列を多様化するプロセス。
DNA：デオキシリボ核酸。遺伝子およびタンパク質をコードする遺伝物質を形成する分子の化学名称。
内因性：細胞内を起源とする物質。
【０１１７】
真核生物条件的調節エレメント：規定された条件下で誘導または抑制され得るプロモータの活性に影響し得るDNA配列。
真核生物プロモータ：RNAポリメラーゼ結合部位および応答エレメントをコードするDNA配列。プロモータ領域の配列は、RNAポリメラーゼおよび転写因子の結合を制御するので、プロモータは、興味対象の遺伝子がどこでいつ発現されるかを決定する大きな役割を演じる。
真核生物ターミネータ/シグナルターミネータ：RNAポリメラーゼIIと会合し、転写終結プロセスの引き金を引くタンパク質因子により認識されるDNA配列。これは、ポリＡシグナルもコードする。
FACS/フローサイトメトリ：蛍光標示式細胞選別。フローサイトメトリは、特定の細胞表面および細胞内マーカーの発現について個別の細胞をまとめて分析できる技術である。この技術の変法である細胞選別は、規定されたマーカーセットを有する細胞を、さらなる分析のために回収することを可能にする。
フリッパーゼ：パン酵母サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)の２μmプラスミドに由来するリコンビナーゼ(フリッパーゼ、Flp)。
異種特異的リコンビナーゼ部位：２つのDNA分子のクロスオーバーを促進するためのリコンビナーゼ酵素により認識されるDNA配列。
HLA I：ヒト白血球抗原クラスＩ。全ての有核細胞においてヒトにおいて発現され、細胞表面に輸送されてそこで内部タンパク質の短いカーゴ断片、ペプチドとしてＴ細胞受容体に提示される遺伝子。よって、これは、固有のタンパク質とともに可能性のある進行中の感染の断片を提示する。HLA Iは、培養培地に加えられるか、導入された遺伝子エレメントから発現されたタンパク質から作製されるかまたは細胞により取り込まれたタンパク質から作製されるカーゴペプチドとしてさらに提示できる。HLAクラスＩ遺伝子は多型であり、これは、異なる個体が同じ遺伝子において変動を有し、提示における変動を導く可能性があることを意味する。HLAクラスIIと関連する。
【０１１８】
HLA II：ヒト白血球抗原クラスII。例えば樹状細胞についての適応免疫応答を調和しかつ助ける特定の細胞においてヒトにおいて発現される遺伝子。HLAクラスＩと関連する。HLAクラスIIタンパク質は、細胞表面に輸送されそこでこれらは外部タンパク質の短いカーゴ断片、ペプチドとしてＴ細胞受容体に提示される。よって、これは、固有のタンパク質とともに可能性のある進行中の感染の断片を提示する。HLA IIは、培養培地に加えられるか、導入された遺伝子エレメントから発現されたタンパク質から作製されるかまたは細胞により取り込まれたタンパク質から作製されるカーゴペプチドとしてさらに提示できる。HLAクラスII遺伝子は多型であり、これは、異なる個体が同じ遺伝子において変動を有し、提示における変動を導く可能性があることを意味する。
相同アーム：相補相同アームとほぼ同一の配列同一性を有し、よって細胞性プロセスである相同性配向型修復による２つのDNA分子の交換を促進するDNAの区間。
免疫監視機構：免疫系が感染、悪性病変またはその他の病原性の可能性がある変化を検出し、それにより活性化されるプロセス。
インスレータ：近傍の遺伝子の活性化または抑制により遺伝子が影響されることを妨げるDNA配列。インスレータは、発現停止された遺伝子から活性に転写された遺伝子へのヘテロクロマチンの広がりも妨げる。
【０１１９】
組込み：細胞の染色体へのDNA配列の物理的ライゲーション。
配列内リボソーム進入部位(IRES) ：一旦転写されると、キャップ非依存様式で翻訳の開始を可能にするRNAエレメントをコードするDNA配列。
Ｊ(セグメント)：連結セグメント。Ｊ領域ともいう。Ｔ細胞受容体を組立てるために用いられる遺伝子セグメントの一つ。各個体は、これらの領域の多数の異なるバリエーションを有して、各個体が非常に多種類の異なるTCRを有するＴ細胞で武装できるようにする。
Ｊ-Ｃエントリーベクター：ＪおよびＣ TCRセグメントを有し、全長TCR ORFの再構成中に、Ｖドナーベクターからの配列およびodeCDR3を受け入れる、二成分ベクターシステムのベクター。
Ｊドナー主鎖:連結ドナー主鎖：連結ドナー主鎖。Ｊ受入カセット断片が挿入されてＪ受入カセットベクターを創出するベクター主鎖。
Ｊドナーベクター：Ｊ TCRセグメントを有し、このセグメントを、全長TCR ORFの再構成中にＶ-Ｃエントリーベクターに与える二成分ベクターシステムのベクター。
Ｊ受入カセット断片：連結受入カセット断片。Ｊ受入カセットベクターを構築するために用いられるＣ部を有するクローニング断片。
【０１２０】
Ｊ受入カセットベクター：連結受入カセットベクター。Ｊセグメント部が挿入されてＪドナーベクターを創出する、Ｃ部を有するベクター。
Ｊセグメント部：連結セグメント部。Ｊ受入カセットベクターに挿入されてＪドナーベクターを作製するＪ遺伝子セグメントの一部分を有するDNA構築物。
Ｋは、ケトを示すヌクレオチドコードである(K＝GまたはT)。
コザック配列：翻訳の効率的な開始のために必要な短い配列。
Ｍは、アミノを示すヌクレオチドコードである(M＝AまたはC)。
主要HLAクラスＩ：遺伝子HLA-A、HLA-BおよびHLA-Cで構成されるAPXのファミリー。
マッチする：2つの成分が、相補成分の間の相互作用を駆動および制限する遺伝子エレメントをコードする場合。
メガヌクレアーゼ認識部位：メガヌクレアーゼと一般的に呼ばれるエンドデオキシリボヌクレアーゼにより認識されるDNA配列。
可動遺伝子エレメント：トランスポサーゼ酵素の活性を有するDNAの組込みを許容するDNA配列。
Ｎは、任意のヌクレオチドを示すヌクレオチドコードである(N＝A、T、CまたはG)。
天然：細胞に自然に存在する物体。
ネガティブ選択マーカー：ベクターおよび/またはマーカーを有するベクターを有する宿主生物のネガティブ選択を与える選択可能なマーカー。
odeCDR3：相補性決定領域をコードするオリゴヌクレオチド二重鎖。全長TCR ORFを再構成するために二成分ベクターシステムに関連して用いられる、終末突出とともにCDR3遺伝子配列を有する合成構築物。
複製起点：そこで複製が開始する、ベクター、プラスミドまたはゲノム内の特定の配列。
【０１２１】
ORF：オープンリーディングフレーム。リボソームによるタンパク質(ポリペプチド)の合成のための翻訳フレームをコードする遺伝子材料の区間。
突出：二本鎖核酸分子の末端での一本鎖配列。しばしば粘着または付着末端と呼ばれる。
PCR：特定の標的DNA分子が指数関数的に増幅されるポリメラーゼ連鎖反応
ペプチド：６〜30の間のアミノ酸長のアミノ酸の短い一続き。
表現型分析：細胞の観察可能な特徴の分析。
プラスミド：遺伝子構築物は、染色体、典型的に、細菌または原生動物の細胞質内の小さい環状DNA鎖とは独立して複製できる。
多型：同じ遺伝子の異なるアレルの存在により、同じ種の個体において異なる形で存在する。
ポリペプチド：三次元構造を形成する、ペプチドの区間からなるタンパク質。
ポジティブ選択マーカー：ベクターおよび/またはマーカーを有するベクターを有する宿主生物のポジティブ選択を与える選択可能なマーカー。
プライマー：例えばPCR中に標的DNA配列の特異的認識を可能にする短いDNA配列。
【０１２２】
プロモータ：遺伝子発現の制御された開始のための調節DNAエレメント。
リコンビナーゼ：遺伝子組換えを媒介する酵素。
再構成：本発明の状況において、再構成は、TCR ORFを組立てるためのTORESおよびTORES2の運転のことをいう。「再構成反応」は、この運転が必然的に伴う反応ミックスおよび熱サイクル反応である。
レポーターエレメント：エレメントを有する生物またはベクターにおけるレポートされたシグナルを媒介する遺伝子エレメント。ポジティブまたはネガティブ選択マーカーとして用いることができる。
制限酵素切断配列：制限酵素の認識配列にとって固有または固有であり得る、制限酵素により切断される遺伝子配列。
制限酵素認識配列：制限酵素により認識され、制限酵素が結合する遺伝子配列。
選択可能なマーカー：人工的選択法に適切な形質を与えるDNA配列。
スライスアクセプター部位：表面上でTCRspを有する細胞との相互作用のためのイントロンAM、APX CMまたは親和性試薬、あるいはTCRspベースの試薬の３'末端でのDNA配列。
スライスドナー部位：イントロンの５'末端でのDNA配列。
自殺遺伝子：この遺伝子を有する宿主生物内で細胞死を媒介する遺伝子。ポジティブまたはネガティブ選択マーカーとして用いることができる。
合成：人工的に作製された物体。
Ｔ細胞：Ｔリンパ球。その表面上でＴ細胞受容体を発現する白血球。自己と反応しないが、感染および悪性疾患を認識し、同じ種のほとんどのメンバーからの移植片を拒絶する能力を有するように免疫系により選択される。
【０１２３】
TCR：Ｔ細胞受容体。Ｔリンパ球と呼ばれるリンパ球の下位集団により発現される親和性分子。ヒトでは、TCRは、ウイルスもしくは細菌感染または癌性細胞からの断片を含む、APX CMまたはAPX AMにより提示されるカーゴを認識する。よって、TCR認識は、適応免疫系の肝要な部分である。TCRは、細胞表面上で対形成する２つの鎖からなる。各細胞の表面上で発現されるTCRは、様々な遺伝子(ｖ、ｄ、ｊおよびｃセグメント)の大きいプールから無作為に組立てられるので、各個体は、異なるTCRの非常に大きく多様なレパートリを発現するＴ細胞のプールを有する。
TRA：TCRアルファをコードする遺伝子座。VDJ組換えTCR鎖を形成できる遺伝子をコードする４つの異なる遺伝子座のうちの一つ。翻訳されたTCRアルファ鎖タンパク質は、典型的に、TCRベータ鎖タンパク質と対形成して、アルファ/ベータTCRspを形成する。
TRB：TCRベータをコードする遺伝子座。VDJ組換えTCR鎖を形成できる遺伝子をコードする４つの異なる遺伝子座のうちの一つ。翻訳されたTCRベータ鎖タンパク質は、典型的に、翻訳されたTCRアルファ鎖タンパク質と対形成して、アルファ/ベータTCRspを形成する。
TRD：TCRデルタをコードする遺伝子座。VDJ組換えTCR鎖を形成できる遺伝子をコードする４つの異なる遺伝子座のうちの一つ。翻訳されたTCRデルタ鎖タンパク質は、典型的に、翻訳されたTCRガンマ鎖タンパク質と対形成して、ガンマ/デルタTCRspを形成する。
TRG：TCRガンマをコードする遺伝子座。VDJ組換えTCR鎖を形成できる遺伝子をコードする４つの異なる遺伝子座のうちの一つ。翻訳されたTCRガンマ鎖タンパク質は、典型的に、翻訳されたTCRデルタ鎖タンパク質と対形成して、ガンマ/デルタTCRspを形成する。
IIS型制限酵素：非対称DNA配列を認識し、その認識配列の外側で切断する制限酵素。
Ｖ(セグメント)：可変領域。Ｖ領域ともいう。Ｔ細胞受容体を組立てるために用いられる遺伝子セグメントの一つ。各個体は、これらの領域の多数の異なるバリエーションを有して、各個体が非常に多種類の異なるTCRを有するＴ細胞で武装できるようにする。
Ｖ-Ｃエントリーベクター：ＶおよびＣ TCRセグメントを有し、全長TCR ORFの再構成中にＪドナーベクターからの配列およびodeCDR3を受け入れる、二成分ベクターシステムのベクター。
Ｖクローニング断片：可変クローニング断片。Ｖ遺伝子セグメントクローニング断片とも呼ばれる。Ｖ-Ｃエントリーベクターを構築するために用いられるＶ遺伝子セグメントの一部分を有する構築物。
Ｖドナーベクター：Ｖ TCRセグメントを有し、このセグメントを、全長TCR ORFの再構成中にＪ-Ｃエントリーベクターに与える、二成分ベクターシステムのベクター。
ベクター：ベクターは、遺伝情報を有する遺伝子構築物である。本発明の状況において、ベクターは、通常、プラスミドDNAベクターを表す。ベクターは、宿主生物において増幅および選択できる任意のこのような構築物のことであり得る。
Ｗは、弱を示すヌクレオチドコードである(W＝AまたはT)。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】迅速な全長TCR ORF再構成のための二成分ベクターシステム。Ａ)  二成分ベクターシステムの核となる特徴(ボックスｉ)、必要なオリゴ二重鎖インプット(ボックスii)および得られる全長TCR ORFベクター(ボックスiii)を示す。第一成分は、選択されたTCR V (可変)遺伝子セグメントおよびTCR C (定常)遺伝子セグメントを組み込んだＶ-Ｃエントリーベクターである。このエントリーベクターは、最終全長TCR ORFを有することとなる主鎖である。よって、このベクター主鎖の任意の所望の特徴は、意図する下流の用途のために仕立てられる。通常、これは、少なくとも５'および３'遺伝子エレメントにより表される。標的全長TCR ORFの必要なＶ遺伝子セグメントおよびＣ遺伝子セグメントは、Ｖ-Ｃエントリーベクターのライブラリから選択されて、任意の所望のＶ/Ｃ組み合わせのTCR ORF を構築する(ボックスｉ)。第二成分は、選択されたＪ(連結)遺伝子セグメントを含むＪドナーベクターである。このドナーベクターは、Ｊ遺伝子セグメントを与えるように作用して、よって、このベクターの主鎖は、反応副産物である。標的TCR ORFの所望のＪ遺伝子セグメントは、ライブラリＪドナーベクターから選択される。全長TCR ORFのために必要な配列を完成するために、成熟TCR ORFのCDR3領域に大部分が対応する短いオリゴ二重鎖を合成する(ボックスii)。このオリゴ二重鎖は、Ｖ-ＣエントリーおよびＪドナーベクターの制限酵素消化により作製されるユニーク突出に適合する一本鎖突出を有して合成される。適切な制限およびリガーゼ酵素とともに単一チューブの反応に組み合わせる場合に、全長TCR ORFは、予め存在するライブラリから選択されるＶ-ＣエントリーおよびＪドナーベクター、ならびに合成されたオリゴ二重鎖により提供される配列から再構成される(ボックスiii)。Ｂ)  TCR ORF 再構成システムの全体的なライブラリ特徴の機能を示す。単一Ｖ-Ｃエントリーベクターを、様々なＶ-Ｃ組み合わせを有するＶ-Ｃエントリーベクターのライブラリから選択する(ボックスｉ)。この選択は、選択されたTCR鎖についての必要なＶ-Ｃ組み合わせ配列に基づく。単一Ｊエントリーベクターは、コードされる様々なＪ遺伝子セグメントを有するＪドナーベクターのライブラリから選択される(ボックスii)。この選択は、Ｖ-Ｃエントリーベクターのものと同じ選択されたTCR鎖についての所望のＪ組み合わせ配列に基づく。最後に、CDR3をコードするオリゴマー二重鎖(odeCDR3)を選択して、標的TCR鎖の全長ORFを完成する(ボックスiii)。これらの３成分(ボックスi、iiおよびiii)を、適当な制限およびリガーゼ酵素とともに、単一反応に組み合わせる。反応サイクルは、Ｖ-Ｃエントリーベクター主鎖の状況において単一工程で、再構成された全長TCR ORFを生成する(ボックスiv)。
【図２】一般的なＶ-Ｃエントリーベクターの遺伝子特徴のプラスミド模式図。  ラベルを付したボックスとして示す最小限に必要な遺伝子エレメントを有するＶ-Ｃエントリーベクターの環状化プラスミド模式図を示す。コザックは、翻訳の効率的な開始において役割を演じるコンセンサス配列のことをいう。Ｖセグメントは、TCR可変生殖系列ORFまたは変異体/合成ORFの一部をコードする選択された配列のことをいう。IIS型←は、酵素が５'方向に切断する向きのIIS型制限酵素結合部位のことをいう。IIS型→は、酵素が３'方向に切断する向きのIIS型制限酵素結合部位のことをいう。-ve選択は、全長TCR再構築反応またはその後の選択工程中に配列を有するプラスミドにとって有害であるように設計されたネガティブ選択エレメントのことをいう。Ｃセグメントは、TCR定常生殖系列ORFまたは変異/合成ORFの一部をコードする選択された配列のことをいう。+ve選択#1は、ベクターを有する生物に選択の利点を運ぶために用いられる二成分システムの第一ポジティブ選択マーカーのことをいい、これは、第二ベクター成分のポジティブ選択マーカーとは異なる(図３を参照されたい)。Oriは、適合する宿主内でプラスミドの増幅のために用いられる複製起点のことをいう。５'遺伝子エレメントは、再構築された全長TCRの下流の用途のために必要な性状を与え、再構築された全長TCRの５'側に位置する任意の所望の遺伝子エレメント、例えばシスエレメントのことをいう。３'遺伝子エレメントは、再構築された全長TCRの下流の用途のために必要な性状を与え、全長TCR ORFの３'に位置する任意の所望の遺伝子エレメント、例えば転写ターミネータエレメントのことをいう。
【図３】一般的なＪドナーベクターの遺伝子特徴のプラスミド模式図。  ラベルを付したボックスとして示す最小限に必要な遺伝子特徴を有するＪドナーベクターの環状化プラスミド模式図を示す。Ｊセグメント部は、TCR連結生殖系列ORFまたは変異体/合成Ｊ遺伝子セグメントの一部をコードするDNA配列のことをいう。Ｃ部は、TCR定常遺伝子セグメントの小さい５'部分のことをいう。IIS型←は、酵素が５'方向に切断する向きのIIS型制限酵素結合部位のことをいう。IIS型→は、酵素が３'方向に切断する向きのIIS型制限酵素結合部位のことをいう。+ve選択#2は、ベクターを有する生物に選択の利点を運ぶために用いられる二成分システムの第一ポジティブ選択マーカーのことをいい、これは、第一ベクター成分のポジティブ選択マーカーとは異なる(図２を参照されたい)。Oriは、適合する宿主内でプラスミドの増幅のために用いられる複製起点のことをいう。
【図４】全長TCR ORFを再構築するための二成分ベクターシステムの遺伝子インプット、副産物、中間体および生成物の一般的な説明。  ベクターシステムの二成分(ａおよびｂ)、オリゴヌクレオチド二重鎖(ｃ)を示し、これらの３成分をIIS型制限酵素およびリガーゼとともに単一反応に組み合わせた場合に、２つの反応副産物(ｄおよびｅ)、２つの反応中間体(ｆおよびｇ)および１つの反応生成物(ｈ)が生じる。二成分システムのインプットベクターおよび生成物は、ラベルを付したボックスとして示す遺伝子エレメントを有する環状化プラスミド模式図として示す。副産物または中間体である開環プラスミドベクターは、ラベルを付したボックスとして示す遺伝子エレメントを有する非環状化プラスミド模式図である。直鎖状DNAは、遺伝子エレメントを示すラベルを付した一連のボックスとして示す。  ａ)図２に示すような一般的なＶ-Ｃエントリープラスミド。  ｂ)図３に示すような一般的なＪドナープラスミド。  ｃ)２つの一本鎖DNA突出、突出≠1-5'および突出≠1-3'に挟まれたCDR3配列を含むDNAオリゴ二重鎖。突出≠1-5'は、開環Ｖ-Ｃエントリーベクター中間体(ｇ)中の突出≠1-3'と適合する。突出≠2-3'は、ドナー断片中間体(f)中の突出≠2-5'と適合する。  ｄ)IIS型制限酵素によるＶ-Ｃエントリーベクター(ａ)の消化は、-ve選択エレメントならびにIIS型←およびIIS型→エレメントを含む直鎖状DNA Ｖ-Ｃエントリーベクター反応副産物をもたらす。  ｅ)IIS型制限酵素によるＪドナーベクター(ｂ)の消化は、切り出されたＪドナー断片中間体(ｆ)が有するものを除く親のプラスミドの全ての遺伝子エレメントを含む非環状化プラスミド副産物をもたらす。  ｆ)IIS型制限酵素によるＪドナーベクター(ｂ)の消化は、一本鎖DNA突出、突出≠2-5'および突出≠3-3'に挟まれたＪセグメント部およびＣ部を含む直鎖状DNA断片をもたらす。突出≠2-5'は、CDR3 DNAオリゴヌクレオチド二重鎖(ｃ)中の突出≠2-3'と適合する。突出≠3-3'は、開環Ｖ-Ｃエントリーベクター中間体(ｇ)中の突出≠3-5'と適合する。  ｇ)IIS型制限酵素によるＶ-Ｃエントリーベクター(ａ)の消化は、切り出された直鎖状DNA Ｖ-Ｃエントリーベクター反応副産物(ｄ)が有するものを除く親のプラスミドの全ての遺伝子エレメントを含む非環状化プラスミド中間体をもたらす。消化は、２つの一本鎖DNA突出、突出≠1-3'および突出≠3-5'をさらに創出する。突出≠1-3'は、CDR3 DNAオリゴヌクレオチド二重鎖(ｃ)中の突出≠1-5'と適合する。突出≠3-5'は、Ｊドナー断片中間体(ｆ)中の突出≠3-3'と適合する。  ｈ)３つ全ての適合する一本鎖DNA突出のライゲーションは、環状化プラスミドとしての全長TCR ORF ベクターをもたらす。このプラスミドは、切り出されたＶ-Ｃエントリーベクター反応副産物(ｄ)を除く親のＶ-Ｃエントリーベクター(ａ)の全ての遺伝子エレメントを含む。さらに、全長TCR ORFベクターは、CDR3 DNAオリゴヌクレオチド二重鎖(ｃ)からのCDR3配列ならびにＪドナー断片反応中間体からのＪセグメント部およびＣ部を組み込む。矢印は、適合する一本鎖DNA突出≠1、≠2および≠3の間のライゲーションのおおよその位置を示す。ライゲーション点≠1は、それぞれＶ-Ｃエントリーベクター反応中間体(ｇ)およびCDR3 DNAオリゴヌクレオチド二重鎖(ｃ)により与えられるH1-3'およびH1-5'エレメントで構成される。ライゲーション点≠2は、それぞれCDR3 DNAオリゴヌクレオチド二重鎖(ｃ)およびＪドナー断片反応中間体(ｆ)により与えられる≠2-3'および≠2-5'エレメントで構成される。ライゲーション点≠3は、それぞれＪドナー断片反応中間体(ｆ)およびＶ-Ｃエントリーベクター反応中間体(ｇ)により与えられる≠3-3'および≠3-5'エレメントで構成される。
【図５】Ｖ-Ｃエントリーベクターの構築のためのＶクローニング断片の配置。  実施例1〜４に示すヒトTRAおよびTRB TCR鎖についてのTORESのＶ-Ｃエントリーベクターを組立てるために用いるＶクローニング断片の図を示す。  Ｖクローニング断片は、５'および３'末端にてユニークプライマーバインド配列に挟まれて、クローニング断片のPCR媒介増幅を容易にする。BbsI部位は、Ｖ-Ｃエントリーベクターの組立てにおいて用いる特異的IIS型制限酵素結合部位であり、→は、認識部位が、部位の３'方向に切断する向きであることを示し、←は、部位が、５'方向に切断する向きであることを示す。BbsI→部位は、コードされるコザック配列の５'を切断して、突出*1を創出する。BsaI←部位は、切断して、NotI５'断片内に５' NotI突出を創出する。突出*1および５' NotI突出は、Ｖ-Ｃエントリーベクターの組立てにおいて、それぞれ消化されたＶ-Ｃエントリーベクター主鎖の突出*1'、および消化されたＣクローニング断片の３' NotI突出と最終的にライゲーションされる。NotI ５'断片は、NotI 認識配列の６ヌクレオチドの５'断片であり、ここで、NotIは、ネガティブ選択マーカーとして作用して、TORESの運転において親のＶ-Ｃエントリーベクターを排除する。完全NotI認識部位は、Ｃクローニング断片により提供される３' NotI断片と再構成される。Ｖセグメントは、最終Ｖ-ＣエントリーベクターによりコードされるTCR V遺伝子セグメントであり、所定のＶセグメントのATG開始コドンから、CDR3領域の境界を規定するＶセグメントの最後のCysコドンまでをコードする。BsaI←部位は、TORESシステムの運転中に用いられて、全長TCR ORFを再構成するIIS型制限酵素認識配列である。BsaI酵素の作用(部位は、５'方向に切断する向きである)は、各Ｖセグメントの最後のCysコドンの３ヌクレオチドと、そのCysコドンに先立つコドンの第三ヌクレオチドとを含む、Ｖセグメントの３'末端に突出≠1の創出をもたらす。この突出は、与えられたTORESセットにおける全てのＶセグメントの間で標準化される。最終的に、Ｖセグメントの３'での突出≠1は、全長TCR ORFを再構成するTORESシステムの運転において、５' odeCDR3にて突出≠1とライゲーションされる。全てのspは、IIS型認識配列と標的突出配列との間の正しい間隔を創出するか、または効率的な作用のためにNotI認識および切断部位の間をあけるための１つ以上のヌクレオチドを付加を示す。
【図６】Ｖ-Ｃエントリーベクター構築のためのＣクローニング断片の配置。  実施例1〜４に示すヒトTRAおよびTRB TCR鎖についてのTORESのＶ-Ｃエントリーベクターを組立てるために用いるＣクローニング断片の図を示す。  Ｃクローニング断片は、５'および３'端にてユニークプライマーバインド配列に挟まれて、クローニング断片のPCR媒介増幅を容易にする。BbsI部位は、Ｖ-Ｃエントリーベクターの組立てのために用いる特異的IIS型制限酵素結合部位であり、→は、認識部位が、部位の３'方向に切断する向きであることを示し、←は、部位が、５'方向に切断する向きであることを示す。BbsI→部位は、切断して、NotI ３'断片内に３' NotI突出を創出する。BsaI←部位は、Ｃセグメントの停止コドンの３'を切断して、Ｃセグメントの３'末端にて突出*2を創出する。突出*2および３' NotI突出は、Ｖ-Ｃエントリーベクターの組立てにおいて、それぞれ消化されたＶ-Ｃエントリーベクター主鎖の突出*2'、および消化されたＶクローニング断片の５' NotI突出と最終的にライゲーションされる。NotI ３'断片は、NotI認識配列の６ヌクレオチドの３'断片であり、ここで、NotIは、ネガティブ選択マーカーとして作用して、TORESの運転において親のＶ-Ｃエントリーベクターを排除する。完全NotI認識部位は、Ｖクローニング断片により提供される５' NotI断片と再構成される。  Ｃセグメントは、最終Ｖ-Ｃエントリーベクターによりコードされ、Ｃ遺伝子セグメントの最初のGluコドンの５'側のシトシン残基から、停止コドンまでをコードするTCR Ｃ遺伝子セグメントである。BsaI→部位は、TORESシステムの運転中に用いられて全長TCR ORFを再構成するIIS型制限酵素認識配列である。BsaI酵素の作用(部位は、３'方向に切断する向きである)は、Ｃセグメントの５'末端にて突出≠3の創出をもたらす。この突出は、所定のTORESセットにおいて、全てのＣセグメントの間で標準化される。最終的に、Ｃセグメントの５'側での突出≠3は、全長TCR ORFを再構成するTORESシステムの運転において、Ｊドナーベクターの３'Ｃ部での突出≠3とライゲーションされる。全てのspは、IIS型認識配列と標的突出配列との間の正しい間隔を創出するか、または効率的な作用のためにNotI認識および切断部位の間をあけるための１つ以上のヌクレオチドを付加を示す。
【図７】Ｖ-Ｃエントリーベクターの構築のためのＶ-Ｃエントリーベクター主鎖の配置。  実施例1〜４に示すヒトTRAおよびTRB TCR鎖についてのTORESのＶ-Ｃエントリーベクターを組立てるために用いるＶ-Ｃエントリーベクター主鎖の図を示す。  環状プラスミドDNAは、複製起点(Ori)およびポジティブ選択マーカー#1を含む。この選択マーカーは、組立て中にＶ-Ｃエントリーベクター主鎖およびＶ-Ｃエントリーベクターのクローンを単離する場合に形質転換宿主の選択のため、およびTORESの運転中に全長TCR ORFを含むベクターの選択のために用いられる。５'および３'遺伝子エレメントは、TORES運転による作製の後の全長TCR ORFの作製の後に、最終TCR ORFを挟む標的エレメントをコードする。５'遺伝子エレメントは、TCR転写産物の発現を駆動するための哺乳動物プロモータエレメントであり得、３'遺伝子エレメントは、転写ターミネータ配列であり得る。ACC65I部位は、制限酵素認識配列であり、ここで、Acc65I酵素の作用は、突出*1'の創出をもたらす。この突出*1'は、Ｖ-Ｃエントリーベクターの組立て中に、消化されたＶクローニング断片中の突出*1とライゲーションされる。XbaI部位は、制限酵素認識配列であり、ここで、XbaI酵素の作用は、突出*2'の創出をもたらす。この突出*2'は、Ｖ-Ｃエントリーベクターの組立て中に、消化されたＣクローニング断片中の突出*2とライゲーションされる。Spは、両方の酵素の効率的な作用のためにAcc65IおよびXbaI認識部位の間をあけるためのヌクレオチドの付加を示す。
【図８】Ｊ受入カセット断片の配置。  実施例２および３に記載するヒトTRAおよびTRB TCR鎖についてのTORESのＪドナーベクターの組立てに用いられるＪ受入カセット断片の図を示す。Ｊ受入カセット断片は、Ｊドナー主鎖に挿入されて、Ｊ受入カセットベクターを生じる。  Ｊ受入カセット断片は、２つの相補オリゴヌクレオチドをアニールして、Ｊドナーベクター主鎖への断片の挿入のために用いられる５'および３'末端にて４ヌクレオチドの一本鎖突出を有する直鎖状二本鎖DNA構築物を創出することにより作製される。Ｊ受入カセット断片の５'末端の突出*3は、消化されたＪドナーベクター主鎖の突出*3'とライゲーションされるが、３'末端の突出*4は、消化されたＪドナーベクター主鎖の突出*4'とライゲーションされる。  BsaI部位は、全長TCR ORFを組立てるTORESの運転において用いられるIIS型制限認識部位である。BsaI←部位は、５'方向に切断する向きであり、Ｃ部配列に作用して、３'Ｃ部にて突出≠3を生じる。BsaI→部位は、ＪドナーベクターのＪセグメント部に最終的に作用して、Ｊセグメント部の５'末端にて突出≠2を創出する。BsaI→エレメントは、突出*5も含み、これは、Ｊドナーベクターの組立て中にBbsI←部位へのBbsIの作用により生じる。  BbsI部位は、Ｊドナーベクターを組立てるために用いられるIIS型制限認識部位である。BbsI←部位は、BsaI→エレメントを切断して突出*5を生じるが、BbsI→部位は、Ｃ部の５'末端を切断して、突出*6を生じる。突出*5および突出*6は、それぞれＪセグメント部の突出*５'および突出*6'と最終的にライゲーションされる。  Ｃ部は、TORESの運転中に非パリンドローム突出の標準化された作製を可能にする標的遺伝子セグメントの小さい部分である。このＣ部は、Ｊセグメント部の３'末端に最終的に保持され、全長TCR ORFを作製するTORESの運転において、消化されたＶ-Ｃエントリーベクターが有するＣセグメントとライゲーションされる配列の一部を形成する。  NotI部位は、Ｊドナーベクターの作製中に親のＪ受入カセットベクターを排除するために用いられるネガティブ選択マーカーである。  全てのspは、IIS型認識配列と標的突出配列との間の正しい間隔を創出するか、または効率的な作用のためにNotI認識および切断部位の間をあけるための１つ以上のヌクレオチドの付加を示す。
【図９】Ｊドナー主鎖の配置。  実施例２および３に記載するヒトTRAおよびTRB TCR鎖についてのTORESのＪドナーベクターの組立てに用いられるＪドナーベクター主鎖の図を示す。Ｊ受入カセット断片は、Ｊドナー主鎖に挿入されて、Ｊ受入カセットベクターを生じる。  環状プラスミドDNAは、複製起点(Ori)およびポジティブ選択マーカー#2を含む。この選択マーカーは、組立て中にＪドナーベクター主鎖およびＪドナーベクターのクローンを単離する場合に形質転換宿主の選択のために用いられる。重要なことに、このポジティブ選択マーカーは、Ｖ-Ｃエントリーベクター内のポジティブ選択マーカー#1とは別個であるので、Ｖ-Ｃエントリーベクター主鎖の状況において全長TCR ORFを作製するTORESの運転中に、#1に対するポジティブ選択の下で親のＪドナーベクターは排除される。  EcoRI部位は、制限酵素認識配列であり、ここで、EcoRI酵素の作用は、突出*3'の創出をもたらす。この突出*3'は、Ｊ受入カセットベクターの組立て中に、アニールされたＪ受入カセット断片中の突出*3とライゲーションされる。XboI部位は、制限酵素認識配列であり、ここで、XboI酵素の作用は、突出*4'の創出をもたらす。この突出*4'は、Ｊ受入カセットベクターの組立て中に、アニールされたＪ受入カセット断片中の突出*4とライゲーションされる。Spは、両方の酵素の効率的な作用のためにAcc65IおよびXbaI認識部位の間をあけるためのヌクレオチドの付加を示す。
【図１０】Ｊ受入カセットベクターの配置。  実施例２および３に記載するヒトTRAおよびTRB TCR鎖についてのTORESのＪドナーベクターの組立てに用いられるＪドナーベクター主鎖の図を示す。Ｊ受入カセットベクターは、Ｊドナー主鎖へのＪ受入カセット断片の挿入により創出される。  環状プラスミドDNAは、複製起点(Ori)およびポジティブ選択マーカー#2を含む。この選択マーカーは、組立て中にＪドナーベクター主鎖およびＪドナーベクターのクローンを単離する場合に形質転換宿主の選択のために用いられる。重要なことに、このポジティブ選択マーカーは、Ｖ-Ｃエントリーベクター内のポジティブ選択マーカー#1とは別個であるので、Ｖ-Ｃエントリーベクター主鎖の状況において全長TCR ORFを作製するTORESの運転中に、#1に対するポジティブ選択の下で親のＪドナーベクターは排除される。  BsaI部位は、全長TCR ORFを組立てるTORESの運転において用いられるIIS型制限認識部位である。BsaI←部位は、５'方向に切断する向きであり、Ｃ部配列に作用して、３'Ｃ部にて突出≠3を生じる。BsaI→部位は、ＪドナーベクターのＪセグメント部に最終的に作用して、Ｊセグメント部の５'末端にて突出≠2を創出する。BsaI→エレメントは、突出*5も含み、これは、Ｊドナーベクターの組立て中にBbsI←部位へのBbsIの作用により生じる。  BbsI部位は、Ｊドナーベクターを組立てるために用いられるIIS型制限認識部位である。BbsI←部位は、BsaI→エレメントを切断して突出*5を生じるが、BbsI→部位は、Ｃ部の５'末端を切断して、突出*6を生じる。突出*5および突出*6は、それぞれＪセグメント部の突出*5'および突出*6'と最終的にライゲーションされる。  Ｃ部は、TORESの運転中に非パリンドローム突出の標準化された作製を可能にする標的Ｃ遺伝子セグメントの小さい部分である。このＣ部は、Ｊセグメント部の３'末端に最終的に保持され、全長TCR ORFを作製するTORESの運転において、消化されたＶ-Ｃエントリーベクターが有するＣセグメントとライゲーションされる配列の一部を形成する。  NotI部位は、Ｊドナーベクターの作製中に親のＪ受入カセットベクターを排除するために用いられるネガティブ選択マーカーである。  全てのspは、IIS型認識配列と標的突出配列との間の正しい間隔を創出するか、または効率的な作用のためにNotI認識および切断部位の間をあけるための１つ以上のヌクレオチドを付加を示す。
【図１１】Ｊセグメント部の配置。  実施例２および３に記載するヒトTRAおよびTRB TCR鎖についてのTORESのＪドナーベクターの組立てに用いられるＪセグメント部の図を示す。Ｊセグメント部は、Ｊ受入カセットベクターに挿入されて、Ｊドナーベクターを創出する。  相補一本鎖オリゴヌクレオチドをアニールして両末端に一本鎖突出を有する直鎖状二本鎖DNA構築物を形成することにより、Ｊセグメント部が作製される。５'末端の突出*5'は、BbsIで消化されたＪ受入カセットベクター内に作製される突出*5とアニールされる。３'末端の突出*6'は、BbsIで消化されたＪ受入カセットベクター内に作製される突出*6とアニールされる。  Ｊセグメント部は、標的Ｊ遺伝子セグメント配列である。Ｊドナーベクターが構築される様式(すなわち、短いまたは長い)に依存して、Ｊセグメント部の５'境界は、異なって規定される。短いＪドナーベクターについて、Ｊセグメント部の５'境界は、全長TCR ORFのＪおよびCDR3部分の間の基準の境界を規定するために用いられるPhe-Ala/GlyまたはTrp-Glyモチーフとして規定される。長いＪドナーベクターについて、Ｊセグメント部の５'境界は、Phe-Ala/GlyまたはTrp-Glyモチーフの５'側に10〜12ヌクレオチド伸長される。このことは、ＪドナーベクターによりコードされるTCR ORF全体の部分を伸長し、逆に、TORESの運転において全長TCR ORFを構築するために必要なodeCDR3の長さを短くする。Ｊセグメント部の３'末端にて、単一アデニン残基(Ａ)がコードされ、これは、Ｃ断片の最初のヌクレオチドである。このアデニンは、Ｊ受入カセットベクターから除外される。
【図１２】再構成されたモデルTCR TRA/TRB対の特異性の確認  HLA-A2*01-拘束HCMV pp65由来抗原に対する特異性を有するモデルTRA/TRB TCR鎖対を、実施例７に記載するようにTORESシステムを用いて再構成した。２つのTRAおよびTRBプラスミド生成物を、CD3成分を構成的に発現するが、TCR TRAおよびTRB鎖の内因性発現を欠くヒト株化細胞に一過的にトランスフェクションした。トランスフェクションの48時間後に、細胞は、CD3に対する抗体、TCRアルファ/ベータおよび特異的HLA-A2*01-NLVPMVATV四量体とともにあり、フローサイトメトリにより分析した。モデルTCR対は、CD3およびTCRアルファ/ベータ抗体を用いる陽性染色により示されるように、細胞表面で提示された(左、上のパネル)。モデルTCR対は、HLA-A2*01-NLVPMVATV四量体試薬についての陽性染色も示し(左、下のパネル)、このことは、期待された結合特異性を示した。TRAおよびTRBプラスミド構築物の無関係の対(中央のパネル)および空のベクター(最も左のパネル)でも並行してトランスフェクションした。無関係のTCRは、CD3およびTCRアルファ/ベータ抗体についての陽性染色により示されるように細胞表面で提示された(中央、上のパネル)が、HLA-A2*01-NLVPMVATV四量体試薬についての結合を示さなかった(中央、下のパネル)。空のベクターをトランスフェクションした細胞は、CD3もしくはTCRアルファ/ベータ抗体またはHLA-A2*01-NLVPMVATV四量体試薬のいずれについても染色を示さなかった。
【図１３】ヒト末梢血からのTCR TRA/TRB鎖対のセットの同定および再構成のためのワークフロー。  ヒト検体から捕捉した天然TCR TRA/TRB鎖対の再構成のためのTORESシステムの使用を示すために、HLA-B*07:02拘束HCMV pp65抗原、TPRVTGGGAMに特異的なTCRのセットを、ヒトPBMC画分からの四量体陽性細胞の単細胞選別からの配列情報を把握することにより作製した。このプロセスは、実施例８に記載する。  ｉ)HLA-B*07:02アレルを有するドナーからのPBMC画分を、HLA-B*07:02-TPRV四量体試薬で染色する。FACSにより単一PCRチューブに堆積させた、四量体についての陽性染色を示す単一CD8+Ｔ細胞。  ii)単細胞含有チューブを、TRAおよびTRBの両方の鎖についての全ての発現された可変および定常遺伝子セグメントにつなぎ留められたプライマーセットを用いる逆転写に供した。  iii)独立してTRAおよびTRB鎖についての全ての発現されたＶおよびＣ遺伝子セグメントにまだつなぎ留められた内部プライマーのセットを用いて、逆転写生成物に対してネステッドPCR反応を行う。  iv)ネステッドPCR生成物を、サンガーシーケンシングに供する。  ｖ)PCR生成物の配列を、ヒト生殖系列TCR遺伝子セグメントのライブラリに対して整列させて、それぞれの増幅されたTCR鎖についてのＶおよびＪ(およびＣ)遺伝子セグメント使用を決定する。５'Cysコドンから３'Phe-Ala/GlyまたはTrp-GlyモチーフまでのCDR3配列を決定する。  vi)Ｖ-Ｃエントリーベクターを、再構成するTRAおよびTRB鎖それぞれの決定されたＶおよびＣ遺伝子セグメント使用に対応するTORESライブラリから選択する。  vii)Ｊドナーベクターを、再構成するTRAおよびTRB鎖それぞれの決定されたＪ遺伝子セグメント使用に対応するTORESライブラリから選択する。  viii)再構成するTRAおよびTRB鎖それぞれから決定されたCDR3領域に対応するodeCDR3を合成する。  ix)選択されたＶ-Ｃエントリーベクター、Ｊドナーベクターおよび合成されたodeCDR3を含む独立制限酵素(RE)/リガーゼサイクル反応を、再構成するTRAおよびTRB鎖それぞれについて組立てる。  x)RE/リガーゼサイクル反応生成物で細菌を形質転換して、第一ポジティブ選択マーカー(すなわちＶ-Ｃエントリーベクター主鎖)についての抗生物質選択の下に置く。  xi)クローンを増幅し、最終全長TCR ORFのサンガーシーケンシングにより確認する。
【図１４】ヒト末梢血から捕捉され、TORESを用いて再構成されたTCR TRA/TRB鎖対のセットについての特異性の確認。  ６つのTCR TRA/TRB鎖対のセットを、ヒト末梢血から捕捉し、図13に概説し、実施例８に記載するワークフローにより再構成した。６つのTCR対は、単一CD8+Ｔ細胞を単離するために用いたB*07:02-TPRV四量体試薬に対する期待通りの特異性を有した。６つの捕捉した対、無関係のTCR鎖対および空のベクター対照のそれぞれを、CD3成分を発現するが、TCR TRAおよびTRB鎖の内因性発現を欠くヒト細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションの48時間後に、フローサイトメトリ分析を用いて、CD3、TCRアルファおよびベータ鎖に対する抗体を用いて細胞を染色し、再構成され、発現されたTCRの特異性を、特異的HLA-B*07:02-TPRV四量体試薬により確認した。データは、等高線プロットとして表す。各パネルは、Ｘ軸上にCD3シグナル、およびＹ軸上にHLA-B*07:02-TPRV四量体を示す。各パネル中の右下の挿入部は、四量体染色の度合いの任意単位としての CD3陰性細胞に対するCD3陽性細胞のHLA-B*07:02-TPRV四量体シグナルの比率である。示した６つ全てのTCR鎖対は、無関係のTCR対の対照と比較して、ある程度の特異的四量体染色を示す。
【図１５】CDR3多様化TCR鎖を作製するためのTORESの運転。  多様化CDR3挿入断片を有する全長TCR鎖を作製するために用いる場合のTORESの模式図を示す。親のTCRは、Ｖ-Ｊ-Ｃ使用および規定されたCDR3領域配列を用いて規定する。対応する単一Ｖ-Ｃエントリーベクター(ボックスｉ)および単一Ｊドナーベクター(ボックスii)を反応チューブに入れる。コードされるアミノ酸配列を変更する規定された位置でのヌクレオチド縮重および/または点突然変異を有するodeCDR3のプールを合成する(ボックスiii)。このようなCDR3プールは、規定されたodeCDR3フレームワークの境界内での完全無作為化CDR3配列を含むことができ、それにより、生殖系列Ｖ-Ｊ-Ｃ使用を有する「合成」全長TCR ORF CDR3を創出した。これらの３成分(ボックスｉ、iiおよびiii)は、適当な制限およびリガーゼ酵素とともに単一反応に組み合わせる。反応サイクルは、Ｖ-Ｃエントリーベクター主鎖の状況において、単一工程で、含まれるバリアントodeCDR3の数に比例したいくつかのバリアントの再構成された全長TCR ORFを生成する(ボックスiv)。
【図１６】制限されたCDR3縮重を用いる単一回のTCR鎖多様化は、大きいスペクトルの標的親和性を有するTCRセットを生じる。  実施例７に記載するようなHCMV pp65由来抗原に対する特異性を有するモデルTRA/TRB TCR鎖対のTRA鎖を、図15に示し、実施例９に記載するスキームに従うCDR3多様化サイクルに供した。TRA鎖odeCDR3を、３つの分離した位置にて、コドン使用をこれらの３つの位置にて変える４重ヌクレオチド縮重を用いて合成した。得られた反応生成物は、親の配列を含む64の全長TRA鎖バリアントを含んだ。64のTRA鎖のそれぞれをクローニングし、配列を確認した。  Ａ)64のTRA鎖プラスミドのそれぞれを、親のTRBプラスミドとともに、CD3成分を構成的に発現するが、TCR TRAおよびTRB鎖の内因性発現を欠くヒト株化細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションの48時間後に、細胞を、CD3に対する抗体およびHLA-A2*01-NLVPMVATV四量体試薬で染色し、フローサイトメトリにより分析した。CD3-集団に対するCD3+集団についてのHLA-A2*01-NLVPMVATV四量体シグナルの平均蛍光強度(MFI)の比率を、各TCR鎖対バリアントの結合強度の示度としてプロットした。矢印は、親のTRAに対応するデータ点を示す。楕円は、スペクトルの両端での高結合および非結合バリアントを示す。  Ｂ)各TRA鎖バリアントを、CD3-集団に対するCD3+集団についてのHLA-A2*01-NLVPMVATV四量体シグナルのMFI比率、および一文字コードでの３つの多様化点(Pos1、2および3)のそれぞれに存在するアミノ酸とともに表に示す。矢印は、親のTRAに対応するデータ点を示す。括弧は、スペクトルの両端での高結合および非結合バリアントを示す。
【図１７】Ｖセグメント多様化TCR鎖を作製するためのTORESの運転。  多様化Ｖセグメント使用を有する全長TCRを作製するために用いる場合のTORESの模式図を示す。親のTCRは、Ｖ-Ｊ-Ｃ使用および規定されたCDR3領域配列を用いて規定する。対応する単一Ｊドナーベクター(ボックスii)を反応チューブに入れ、親のCDR3領域配列と対応するように合成した単一odeCDR3も同様である(ボックスiii)。生成物Ｖセグメント多様化全長TCR ORF生成物において所望のＶおよびＣセグメントに対応するＶ-Ｃエントリーベクターの選択も反応チューブに加える(ボックスｉ)。これらの３成分(ボックスｉ、iiおよびiii)は、適当な制限およびリガーゼ酵素とともに単一反応に組み合わせる。反応サイクルは、Ｖ-Ｃエントリーベクター主鎖の状況において、単一工程で、含まれるバリアントＶ-Ｃエントリーベクターの数に比例したいくつかのバリアントの再構成された全長TCR ORFを生成する(ボックスiv)。
【図１８】Ｊセグメント多様化TCR鎖を作製するためのTORESの運転。  多様化Ｊセグメント使用を有する全長TCR鎖を作製するために用いる場合のTORESの模式図を示す。親のTCRは、Ｖ-Ｊ-Ｃ使用および規定されたCDR3領域配列を用いて規定する。対応する単一Ｖ-Ｃエントリーベクター(ボックスｉ)を反応チューブに入れ、親のCDR3領域配列と対応するように合成した単一odeCDR3も同様である(ボックスiii)。生成物Ｊセグメント多様化全長TCR ORF生成物において所望のＪセグメントに対応するＪドナーの選択も反応チューブに加える(ボックスii)。これらの３成分(ボックスｉ、iiおよびiii)は、適当な制限およびリガーゼ酵素とともに単一反応に組み合わせる。反応サイクルは、Ｖ-Ｃエントリーベクター主鎖の状況において、単一工程で、含まれるバリアントＪドナーベクターの数に比例したいくつかのバリアントの再構成された全長TCR ORFを生成する(ボックスiv)。
【図１９】Ｖ/Ｊセグメント多様化TCR鎖を作製するためのTORESの運転。  多様化ＶおよびＪセグメント使用を有する全長TCRを作製するために用いる場合のTORESの模式図を示す。親のTCRは、Ｖ-Ｊ-Ｃ使用および規定したCDR3領域配列を用いて規定する。対応する単一odeCDR3を、親のCDR3領域配列と対応するように合成した(ボックスiii)。生成物V/Ｊセグメント多様化全長TCR ORF生成物において所望のＶ(Ｃ)およびＪセグメントの組み合わせに対応するＶ-ＣエントリーベクターおよびＪドナーベクターの選択を反応チューブに入れる(ボックスii)。これらの３成分(ボックスｉ、iiおよびiii)は、適当な制限およびリガーゼ酵素とともに単一反応に組み合わせる。反応サイクルは、Ｖ-Ｃエントリーベクター主鎖の状況において、単一工程で、含まれるものから可能なＶ-ＣおよびＪドナーベクター組み合わせの数に比例するいくつかのバリアントの再構成された全長TCR ORFを生成する(ボックスiv)。
【図２０】TORES2 Ｖ-Ｃ□およびＶ-Ｃ□エントリーベクターの遺伝子特徴の模式図。  ラベルを付したボックスとして示す最小限に必要な遺伝子エレメントを有するＶ-Ｃ□(ａ)およびＶ-Ｃ□(ｂ)エントリーベクターの環状化プラスミド模式図を示す。コザックは、翻訳の効率的な開始において役割を演じるコンセンサス配列のことをいう。Ｖセグメントは、TCR可変生殖系列ORFまたは変異体/合成ORFの一部をコードする選択された配列のことをいう。IIS型#1←は、酵素が５'方向に切断する向きの第一IIS型制限酵素結合部位のことをいう。IIS型#1→は、酵素が３'方向に切断する向きの第一IIS型制限酵素結合部位のことをいう。-ve選択#1は、全長TCR再構築反応またはその後の選択工程中に配列を有するプラスミドにとって有害であるように設計されたネガティブ選択エレメントのことをいう。Ｃセグメントは、TCR定常生殖系列ORFまたは変異/合成ORFの一部をコードする選択された配列のことをいう。IIS型#2←は、酵素が５'方向に切断する向きの第二IIS型制限酵素結合部位のことをいう。酵素は、第一IIS型とは異なる。IIS型#2→は、酵素が３'方向に切断する向きの第二IIS型制限酵素結合部位のことをいう。酵素は、第一IIS型とは異なる。-ve選択#2は、全長二方向TCR ORFベクターの組立て中に配列を有するプラスミドにとって有害であるように設計されたネガティブ選択エレメントのことをいう。-ve選択#2は、第一-ve選択とは異なる。+ve選択#1は、ベクターを有する生物に選択の利点を運ぶために用いられる二成分システムの第一ポジティブ選択マーカーのことをいい、これは、第二ポジティブ選択マーカー (Ｊドナー)ベクター成分とは異なる(図３を参照されたい)。Oriは、適合する宿主内でプラスミドの増幅のために用いられる複製起点のことをいう。５'遺伝子エレメントは、再構成された全長TCRの下流の用途のために必要な性状を与え、再構築された全長TCRの５'に位置する任意の所望の遺伝子エレメント、例えばRMCEエレメントのことをいう。３'遺伝子エレメントは、再構築された全長TCRの下流の用途のために必要な性状を与え、全長TCR ORFの３'側に位置する任意の所望の遺伝子エレメント、例えば第二RMCEエレメントのことをいう。
【図２１】二方向ターミネータドナー(BiTドナー)ベクターの遺伝子特徴のプラスミド模式図。  ラベルを付したボックスとして示す最小限に必要な遺伝子特徴を有する二方向ターミネータドナーベクターの環状化プラスミド模式図を示す。二方向ターミネータエレメント(T-T)は、二方向ターミネータをコードするDNA配列のことをいうIIS型#2→は、酵素が３'方向に切断する向きの第二IIS型制限酵素結合部位のことをいう。IIS型#2←は、酵素が５'方向に切断する向きの第二IIS型制限酵素結合部位のことをいう。+ve選択#2は、ベクターを有する生物に選択の利点を運ぶために用いられる二成分システムの第一ポジティブ選択マーカーのことをいい、これは、第一ベクター成分のポジティブ選択マーカーとは異なる(図20を参照されたい)。Oriは、適合する宿主内でプラスミドの増幅のために用いられる複製起点のことをいう。
【図２２】対形成したTRAおよびTRBベクターを再構築するための二方向二成分ベクターシステムの遺伝子インプット、副産物、中間体および生成物の一般的な説明。  TRA(ａ)、TRB(ｂ)および二方向ターミネータドナーベクター(ｃ)の３成分を示し、これらの３成分を、第二IIS型制限酵素およびリガーゼとともに単一反応に組み合わせた場合に、３つの反応副産物(ｄ、ｅおよびｆ)、３つの反応中間体(ｇ、ｈおよびｉ)ならびに１つの反応生成物(ｊ)が生じる。二成分システムのインプットベクターおよび生成物は、ラベルを付したボックスとして示す遺伝子エレメントを有する環状化プラスミド模式図として示す。副産物または中間体である開環プラスミドベクターは、ラベルを付したボックスとして示す遺伝子エレメントを有する非環状化プラスミド模式図である。直鎖状DNAは、遺伝子エレメントを示す一連のラベルを付したボックスとして示す。ａ)図20aに示すＶ-Ｃ□エントリーベクターの状況における再構成されたTRA ORF。ｂ)図20bに示すＶ-Ｃ□エントリーベクターの状況における再構成されたTRA ORF。ｃ)図21に示すBiTドナーベクター。ｄ)IIS型#2制限酵素によるTRAベクター(ａ)の消化は、-ve選択エレメント#2ならびにIIS型#2←およびIIS型#2→結合部位を含む直鎖状DNA TRAベクター反応副産物をもたらす。ｅ)IIS型#2制限酵素によるTRBベクター(ｂ)の消化は、５'および３'遺伝子エレメント、IIS型#2→およびIIS型#2←エレメント、-ve選択エレメント#2、+ve選択エレメント#1ならびに複製起点エレメントを含む直鎖状DNA TRBベクター反応副産物をもたらす。ｆ)IIS型#2制限酵素による二方向ターミネータドナーベクター(ｃ)の消化は、切り出された二方向ターミネータ断片中間体(ｉ)を除く親のプラスミドの全てのベクターエレメントを含む非環状化プラスミド副産物をもたらす。ｇ)IIS型#2制限酵素によるTRAベクター(ａ)の消化は、切り出された直鎖状DNA TRAベクター反応副産物(ｄ)が有するものを除く親のプラスミドの全ての遺伝子エレメントを含む非環状化プラスミド中間体をもたらす。消化は、２つの一本鎖DNA突出、突出≠1-5'および突出≠3-3'をさらに創出する。突出≠1-5'は、二方向ターミネータ中間体(ｉ)中の突出≠1-3'と適合する。突出≠3-3'は、TRB断片中間体(ｈ)中の突出≠3-5'と適合する。ｈ)IIS型#2制限酵素によるTRBベクター(ｂ)の消化は、Ｃセグメント、Ｃ部、Ｊセグメント、CDR3、一本鎖DNA突出に挟まれたＶ□セグメントおよびコザック配列、突出≠2-3'および突出≠3-5'を含む直鎖状DNA断片をもたらす。突出≠2-3'は、二方向ターミネータ中間体(ｉ)中の突出≠2-5'と適合する。突出≠3-5'は、開環TRA ベクター中間体(ｇ)中の突出≠3-3'と適合する。ｉ)IIS型#2制限酵素による二方向ターミネータドナーベクター(ｃ)の消化は、二方向ターミネータを含む直鎖状DNA断片中間体をもたらす。消化は、２つの一本鎖DNA突出、突出≠1-3'および突出≠2-5'をさらに創出する。突出≠1-3'は、開環TRAベクター中間体(ｇ)中の突出≠1-5'と適合する。突出≠2-5'は、TRB断片中間体(ｈ)中の突出≠2-3'と適合する。ｊ)３つ全ての適合する一本鎖DNA突出のライゲーションは、環状化プラスミドとしての二方向対形成TRAおよびTRBベクターをもたらす。このプラスミドは、切り出されたTRAベクター反応副産物(ｄ)を除く親のTRAベクター(ａ)の全ての遺伝子エレメントを含む。さらに、全長TCR ORFベクターは、TRB断片中間体(ｈ)および二方向ターミネータ中間体(ｉ)を組み込む。矢印は、適合する一本鎖DNA突出≠1、≠2および≠3の間のライゲーションのおおよその位置を示す。ライゲーション点≠1は、それぞれTRA ベクター反応中間体(ａ)および二方向ターミネータ中間体(ｉ)により与えられる≠1-5'および≠1-3'エレメントで構成される。ライゲーション点≠2は、それぞれTRB断片中間体(ｈ)および二方向ターミネータ断片(ｉ)により与えられる≠2-3'および≠2-5'エレメントで構成される。ライゲーション点≠3は、それぞれTRAベクター反応中間体(ａ)およびTRB断片反応中間体(ｈ)により与えられる≠3-3'および≠3-5'エレメントで構成される。
【図２３】TORES2を用いて再構成されたモデルTCR TRA/TRB対の特異性の確認  HLA-A*02:01拘束抗原に対する特異性を有するモデルTRA/TRB TCR鎖対を、実施例11に示すようにしてTORES2システムを用いて再構成した。二方向TRA/TRBドナーベクターを用いて、CD3成分を構成的に発現するが、TCR TRAおよびTRB鎖の内因性発現を欠き、さらに元のＶ-Ｃαエントリーベクターにより与えられた生成物ドナーベクター内に含まれるRMCE部位に適合するゲノムレシーバ部位をコードするヒト株化細胞にTCR ORFを安定的に組み込んだ。TORES2により作製された、再構成された全長対形成TRAおよびTRBドナーベクターの機能性を、CD3複合体の表面染色により決定し、再構成され、発現されたTCRの期待通りの特異性を、特異的HLA-A*02:01-SLLMWITQV四量体染色により確認した。ａ)モデルTCR対を、ドナーベクターとマッチするゲノムレシーバ部位を含むエンジニアリングTCR提示株化細胞のゲノムに組み込んだ。このゲノムレシーバ部位は、実施例11に記載するTRA/TRB TORES2の最終TRA/TRBドナーベクター生成物と同様の二方向ターミネータエレメントが間に挿入された、逆平行の配置の２つの別々の蛍光マーカー(赤色蛍光タンパク質、RFPおよび緑色蛍光タンパク質、BFP)を駆動するプロモータエレメントを含む。レシーバ細胞のトランスフェクションおよび増生の際に、フローサイトメトリ分析を行って、これらの蛍光レポータの持続性を観察した。ゲノムレシーバ部位の不在(RFP-BFP-)は、よって、細胞がTRA/TRBドナーベクターをうまく組み込んだことを示した。一方、TRA/TRBドナーベクターを組み込まなかった細胞は、ゲノムレシーバ部位の存在(RFP+BFP+)を示した。細胞の大多数は、TRA/TRBドナーベクター配列をゲノムレシーバ部位にうまく組み込んだ。ｂ)  ａ)のRFP-BFP-およびRFP+BFP+集団のそれぞれをゲーティングし、第二オーバーレイヒストグラムプロットに再表示した。二方向構築物を組み込んだ細胞は、CD3抗体での陽性染色も示し、このことは、TCRが細胞表面上で発現されたことを示した(薄いヒストグラム)。二方向構築物を組み込まなかった細胞は、CD3抗体で染色されなかった(濃いヒストグラム)。ｃ)およびｄ)  ａ)およびｂ)において分析されたRFP-BFP-細胞をゲーティングし、等高プロットとして再表示した。並行細胞試料をHLA-A*02:01-SLLMWITQV四量体試薬ありｃ)またはなしｄ)で染色し、ｃ)における四量体/CD3二重陽性は、再構成され、組み込まれたTCR ORF対の期待通りの特異性を示した。
【発明を実施するための形態】
【０１２５】
材料および方法
DNAシーケンシング
ここで示す実施例の中で言及する全てのシーケンシングは、サンガー法により行い、GATC Biotec AB、スウェーデンが行った。
DNA合成
ここで示す実施例の中で言及する全てのDNA合成は、Integrated DNA technologies BVBA、ベルギーが行った。
125 bpより大きいDNA断片は、「gBlock遺伝子断片」生成物として、直鎖状二本鎖DNA分子として合成した。
15〜60 ntのDNA断片は、「カスタムオリゴヌクレオチド断片」生成物として、一本鎖DNA分子として合成した。
61〜124 ntのDNA断片は、「Ultramer DNAオリゴヌクレオチド断片」生成物として、一本鎖DNA分子として合成した。
【０１２６】
ベクターライブラリ組立ておよびクローニング
実施例に記載するベクターの構築は、当業者に公知の様々な方法を含み、具体的な反応組成物は、実施例１〜３に詳細に概説する。以下の鍵となる材料を、記載する手順において用いた：
【０１２７】
【表３】
2020530769.tif 000008
【０１２８】
CDR3をコードするオリゴヌクレオチド二重鎖(odeCDR3)の組立て
odeCDR3は、部分相補一本鎖オリゴヌクレオチドをアニールすることにより、慣例的に組立てた。詳細な反応組成および条件は、実施例６に記載する。以下の鍵となる材料を、記載する手順において用いた：
【０１２９】
【表４】
2020530769.tif 000009
【０１３０】
TCR再構成
全長TCR ORFを再構成するためのTORESの運転は、実施例７〜９に詳細に記載する。以下の鍵となる材料を、記載する手順において用いた：
【０１３１】
【表５】
2020530769.tif 000010
【０１３２】
蛍光標示式細胞選別(FACS)
単一HLA-多量体陽性CD8+Ｔ細胞を、TCR鎖の増幅およびシーケンシングのためにFACSにより選別した。このことは、BDInflux装置を用いる標準的な細胞選別法により達成した。簡単に述べると、細胞を、氷上で10分間HLA-多量体試薬で、次いでCD8+Ｔ細胞のマーカーとしてCD3およびCD8 抗体で染色した。CD3+CD8+多量体+シグナルを有する細胞を、５μLのヌクレアーゼフリー水を予め満たしたPCRプレートに選別した。検体を、さらなる処理まで急速凍結した。以下の鍵となる材料を、記載する手順において用いた：
【０１３３】
【表６】
2020530769.tif 000011
【０１３４】
単一Ｔ細胞からのTCRアルファおよびベータ鎖のシーケンシング
単一FACS選別Ｔ細胞を、実施例８に記載するように、TRAおよびTRBのそれぞれについてＶ領域特異的プライマー収集と、続いて、配列分析のためのTRAおよびTRBアンプリコンを創出するペア型ネステッドPCR反応とを必然的に伴う二工程増幅プロセスに供した。この手順は、以前に記載されている(Hanら、Nat Biotechnol. 2014 32(7): 684〜692)。以下の材料を、記載する手順において用いた：
【０１３５】
【表７】
2020530769.tif 000012
【０１３６】
実施例１
天然ヒトTRAレパートリのためのTRA Ｖ-Ｃエントリーベクターライブラリの設計および組立て
TORESは、所定のTCR鎖についてのＶ-ＣエントリーベクターライブラリおよびＪドナーベクターライブラリからなる。選択されたＶ-Ｊ-Ｃの状況に挿入される標的odeCDR3配列と組み合わせた場合に、全長TCR ORFを再構成できる。odeCDR3配列の特徴および/またはＶ/Ｊ/Ｃ選択を変えることにより、この再構成工程は、TCR ORFエンジニアリングワークフローにおける配列多様化工程にもなり得る。本実施例では、天然ヒトTRA Ｖ-Ｃ配列レパートリを含むTRA Ｖ-Ｃエントリーベクターライブラリの設計および組立て。これは、図２に示す一般的なＶ-Ｃエントリーベクター型の例である。
【０１３７】
TRA Ｖ-Ｃ ベクターライブラリに必要なDNA成分は：
Ｉ.ヒトゲノムにおいてコードされる各機能的TRA Ｖ遺伝子セグメントについてのTRA Ｖクローニング断片
II.単一TRA Ｃクローニング断片
III.Ｖ-Ｃエントリーベクター主鎖
である。
本実施例では、TRA VおよびTRA Cクローニング断片を合成および使用して、単一制限酵素およびリガーゼ反応において標的Ｖ-Ｃエントリーベクター主鎖に組立てた。本実施例では、標的Ｖ-Ｃエントリー主鎖を設計して、哺乳動物細胞内での再構成されたTRA ORFの一過性発現を許容した。
本実施例では、IIS型制限酵素BbsIを用いてTRA Ｖ-Ｃエントリーベクターライブラリを構築する。全長TRA ORFを再構成するための完全TORESの稼働において用いるIIS型制限酵素は、BsaIである。
【０１３８】
合成TRA Ｖクローニング断片の設計
本実施例におけるTRA Ｖクローニング断片の遺伝子エレメントの配置を、図５に示す。
TRA Ｖクローニング断片の各末端は、PCRによる断片全体の増幅のための、20ヌクレオチドの標準化された５'および３'プライマーバインドDNA配列をコードする。
５'プライマーバインドに隣接して、BbsI IIS型制限酵素結合部位がコードされ、BbsI結合部位の方向は、BbsI酵素がDNAをその認識配列に対して３'側で切断するように手引きする。BbsI酵素活性により作製される突出は、突出*1によりコードされる。この突出は、Ｖ-Ｃエントリーベクター主鎖のアームを用いる定方向リガーゼ依存性クローニングを許容するように設計されている。
コンセンサスコザック配列は、最終の再構成されかつ発現されたTRA mRNAの翻訳の効率的な開始のために、TRA Ｖ遺伝子セグメント内のATG開始コドンの５'側にコードされる。本実施例では、各TRA Vセグメントは、TRA Vセグメントの最初のメチオニン残基からその最後のシステイン(Cys)まで全てのアミノ酸をコードする。このCys残基は、一般的に、TRA可変遺伝子セグメントの境界として認識され、この欠失は、天然に存在する組換えおよび機能的TRA鎖において稀である。必要であれば、天然ヒトTRA Ｖコンセンサス配列を編集して、TORESを用いる組立てまたは再構成運転において用いられる任意の制限酵素、および下流の用途において用いられる任意の酵素についての認識配列を除去する。
【０１３９】
TRA Vセグメントの３'末端に、BsaI IIS型制限酵素結合部位BsaI←がコードされる。BsaI結合部位の方向は、BsaI酵素がDNAをその認識配列に対して５'側で切断するように手引きする。得られる突出配列は、Ｖセグメントエレメントの最後のシステインコドンと、システインに先行するアミノ酸コドンの３番目のヌクレオチドとを含むように設計されている。よって、設計された配列に対するBsaIの作用は、TRA Vセグメントの３'末端にてTRA V Cys-突出≠1を創出する。本実施例では、このCys-突出≠1は、全ての含まれるTRA Vセグメントのうちで標準化されており、このことにより、クローニング方策が単純かつ一定になる。必要であれば、TRA V遺伝子エレメントをコードするヌクレオチドを変更して、翻訳されるアミノ酸配列を変化させずに、この標準化された突出をコードするようにする。このBsaI←部位は、全長TRA再構成反応中に利用する。
【０１４０】
本実施例では、Ｖ-Ｃエントリーベクターネガティブ選択マーカーは、NotI制限酵素結合部位である。NotI結合部位を構築するために、TRA Ｖクローニング断片とTRA Ｃクローニング断片とが一緒にライゲーションされるときに、部位の２つの半分を組み合わせる。TRA Ｖクローニング断片は、６ヌクレオチドのNotI ５'セグメントをコードする。
３'プライマーバインド配列の５'末端に、第二BbsI制限部位がコードされ、これは、BbsI酵素を駆動して、DNAをその認識配列に対して５'側で切断する、BbsI←。設計された配列に対するBbsIの作用は、よって、４ヌクレオチドの突出であるNotI ５'突出を創出し、これは、TRA Ｃ DNA断片上に作製される突出と相補的であり、ライゲーションによりNotI結合部位を再構成するように設計される。
Spは、IIS型制限酵素結合部位および切断部位の正しいスペーシングを、そのような部位に隣接する場合に達成するための、TRA Ｖクローニング断片の特定の点へのヌクレオチド付加を表す。NotI制限酵素結合部位配列を挟むSpブロックは、効率的な作用のために、適切にNotI結合および切断部位の間をあけるために用いられる。ヌクレオチドの選択は、BsaI結合部位のDAMメチル化の可能性のある影響を考慮した。
天然ヒトTRA鎖の本実施例におけるTRA Ｖクローニング断片についての全長DNA配列を、SEQ0001〜SEQ0046として示す。これらの配列は、５'プライマーバインドおよび３'プライマーバインド配列を含む。
【０１４１】
合成TRA Ｃクローニング断片の設計
本実施例におけるTRA Ｃクローニング断片の遺伝子エレメントの配置を、図６に示す。
TRA Ｃクローニング断片の各末端は、PCRによる断片全体の増幅のための、20ヌクレオチドの標準化された５'および３'プライマーバインドDNA配列をコードする。
５'プライマーバインドに隣接して、BbsI制限酵素認識部位がコードされるので、BbsI酵素がDNAをその認識配列に対して３'側で切断する、BbsI→。
TRA Ｃクローニング断片は、６ヌクレオチドのNotI ３'セグメントをコードし、これは、Ｖ-Ｃエントリーベクターネガティブ選択マーカーを作り上げるNotI認識部位を完成する。隣接BbsI→制限部位は、NotI ３'エレメントに作用して、４ヌクレオチドのNotI ３!突出を創出する。この突出は、TRA Ｖ DNA断片上に作製されるNotI ５'突出に相補的であり、Ｖ-Ｃエントリーベクターの組立ての際に全長NotI結合部位を再構成するように設計される。
NotI ３'エレメントの３'末端に、TRA Ｃクローニング断片は、BsaI制限酵素結合部位BsaI→をコードする。BsaI結合部位の方向は、BsaI酵素がDNAをその認識配列に対して５'で切断するように手引きする。得られる突出配列は、TRA Ｃ遺伝子断片の最初のシトシンから開始するように設計される、TRA Ｃ突出≠3。このBsaI→部位は、全長TRA再構成反応中利用される。BsaI→酵素は、Ｖ-ＣエントリーベクターにおいてコードされるTRA Ｃセグメントに対して作用して、再構成反応中に必要なTRA Ｃ突出≠3を創出する。最初のグルタミンコドンの５'のシトシン残基から停止コドンまでのコンセンサスTRA Ｃ配列が、本実施例のTRA Ｃクローニング断片に含まれる。
３'プライマーバインドの５'に、BbsI制限酵素認識配列BbsI←がコードされる。BbsI結合部位の方向は、BbsI酵素がDNAをその認識配列に対して５'で切断するように手引きする。BbsI酵素活性により作製される突出は、突出*2によりコードされる。この突出の設計は、組立て中にＶ-Ｃエントリーベクター主鎖のアームを用いる定方向リガーゼ依存クローニングを許容する。
Spは、IIS型制限酵素結合部位および切断部位の正しいスペーシングを、そのような部位に隣接する場合に達成するための、TRA Ｃクローニング断片の特定の点へのヌクレオチド付加を表す。NotI制限酵素結合部位配列を挟むSpブロックは、効率的な作用のために、適切にNotI結合および切断部位の間をあけるために用いられる。ヌクレオチドの選択は、BsaI結合部位のDAMメチル化の可能性のある影響を考慮した。
天然ヒトTRA鎖の本実施例におけるTRA Ｃクローニング断片についての全長DNA配列を、SEQ0047として示す。この配列は、５'プライマーバインドおよび３'プライマーバインド配列を含む。
【０１４２】
哺乳動物細胞における再構成されたTRA ORFの一過性発現のためのＶ-Ｃエントリーベクター主鎖の設計
本実施例では、Ｖ-Ｃエントリーベクター主鎖をpMAプラスミドから導く。これは、Col E1複製起点であるoriを、抗生物質耐性ベータ-ラクタマーゼ遺伝子、ポジティブ選択#1とともにコードする。ベータ-ラクタマーゼは、アンピシリンおよびカルベニシリンのようなベータ-ラクタム抗生物質のペニシリン群に対する耐性を付与する。
図７に示すベクター主鎖は、完全に再構成されたTRA ORFの下流の用途のための適切な機能性を付与する、必要な遺伝子エレメントをコードする。本実施例では、５'遺伝子エレメントは、CMV構成性哺乳動物プロモータをコードし、３'遺伝子エレメントは、SV40pAポリアデニル化シグナルをコードして、哺乳動物細胞における完全に再構成されたTRA ORFの一過性発現を許容する。
本実施例では、ベクター主鎖は、突出*1'および突出*2'をそれぞれ作製するAcc65IおよびXbaI制限酵素結合部位をコードする。突出 *1'は、TRA Ｖクローニング断片内の突出*1に相補的である(図５)。突出*2'は、TRA Ｃクローニング断片内の突出*2に相補的である(図６)。これらの相補突出は、Ｖ-Ｃエントリーベクター主鎖へのTRA VおよびTRA Ｃクローニング断片の定方向クローニングを許容する。
Sp特徴は、効率的な作用のためにAcc65IおよびXbaI制限酵素認識部位の距離をあけるために必要な、２つの部位の間に付加されたヌクレオチドを表す。
CMV構成性プロモータをコードする５'遺伝子エレメントから、SV40pAポリアデニル化シグナルをコードする３'遺伝子エレメントまでのベクター主鎖の配列を、SEQ0048として表す。
【０１４３】
TRA Ｖ-Ｃエントリーベクターライブラリの組立ての方法
この方法は、標準的な分子生物学的技術を利用して、選択されたTRA Ｖクローニング断片(図５)およびTRA Ｃクローニング断片(図６)を所定のＶ-Ｃエントリーベクター主鎖(図７)に組立てて、TRA Ｖ-Ｃエントリーベクター(図２)を創出する。本実施例では、方法は、制限酵素消化およびライゲーション反応を単一反応で行う。
【０１４４】
消化およびライゲーション反応について
100 ngの直鎖状ベクター主鎖(ACC65IおよびXbaI消化により直鎖化)
10 ngのTRA Ｖ遺伝子断片
20 ngのTRA Ｃ遺伝子断片
２μl 10×NEBリガーゼ緩衝液
0.5μlのBbsI
１μlのT4 DNAリガーゼ
20μlまでのH2O
【０１４５】
反応条件
工程１：37℃にて２分
工程２：16℃にて３分
工程１および２を20回反復
50℃にて５分
80℃にて５分
室温に戻す
【０１４６】
得られた生成物で、コンピテント大腸菌(E.coli)細胞を形質転換し、該細胞を、カルベニシリン耐性コロニーについて選択する。選択されたコロニーから単離されるプラスミドをシーケンシングして、正しく組立てられた構築物を決定する。この手順を、それぞれの独立したＶセグメントクローニング断片について再現する。得られた構築物は、哺乳動物細胞における再構成されたTRAの一過性発現において後で用いるための全長TRA ORFの再構成において用いるためのTRA Ｖ-Ｃエントリーベクターライブラリを作り上げる。TRA Ｖ-Ｃエントリーベクターライブラリを作り上げるクローニングされたＶ-Ｃ断片の配列を、SEQ0049〜SEQ0094として示す。示した配列は、可変セグメントの開始コドンに先行するコザック配列から、Ｃセグメントの停止コドンまで全てを含む。
【０１４７】
実施例２
天然ヒトTRAレパートリのためのTRA Ｊドナーベクターライブラリの設計および組立て
TORESは、所定のTCR鎖についてのＶ-ＣエントリーベクターライブラリおよびＪドナーベクターライブラリからなる。選択されたＶ-Ｊ-Ｃの状況に挿入される標的odeCDR3配列と組み合わされた場合に、全長TCR ORFを再構成できる。odeCDR3配列の特徴および/またはＶ/Ｊ/Ｃ選択を変えることにより、この再構成工程は、TCR ORFエンジニアリングワークフローにおける配列多様化工程にもなり得る。
本実施例では、天然ヒトTRA Ｊ配列レパートリを含むTRA Ｊドナーベクターライブラリの設計および組立て。これは、図３に示す一般的なＪドナーベクター型の例である。
本実施例では、TRA Ｊ受入カセット断片を構築してＪドナーベクター主鎖に挿入して、Ｊ受入カセットベクターを創出する。その後、合成TRA Ｊセグメント部をTRA Ｊ受入カセットベクターに組立てて、Ｊドナーベクターライブラリを創出できる。このフレキシブル多工程組立て法により、Ｊセグメント長の変動のようなＪドナーセグメント特徴の迅速で費用効果的なエンジニアリングが可能になる。
TRA Ｊドナーベクターライブラリに必要なDNA成分は：
Ｉ.TRA Ｊ受入カセット断片
II.Ｊドナーベクター主鎖
III. TRAＪ受入カセットベクター
IV. TRA Ｊセグメント部
である。
【０１４８】
合成TRA Ｊ受入カセット断片の設計
２つの一本鎖DNAオリゴヌクレオチドのアニーリングを用いて、DNA断片の各末端に４ヌクレオチド一本鎖突出である突出*3および突出*4を設計により含む受入部位カセット断片を作製する。Ｊドナーベクター主鎖への定方向リガーゼ依存性クローニングを許容して、TRAＪ受入カセットベクターを創出する４ヌクレオチド突出を、図８に示す。
IIS型制限部位の対、BsaI←およびBsaI→は、受入部位カセットDNA断片の５'および３'末端に位置する。BsaI認識部位の方向は、BsaI酵素がDNAを構築物の中央に向かって切断するように手引きする。これらの部位は、突出≠2-5'および突出≠3-3'を作製することにより、TRA ORF再構成プロトコール中に用いられる。突出≠3は、受入カセット断片にコードされるTRA Ｃ部の成分であるが、突出≠2は、TRA Ｊセグメント部がクローニングされた後に規定される(下記参照)。
IIS型認識部位のBbsI対BbsI←およびBbsI→は、カセットの中央近くにコードされ、合成されたTRA Ｊセグメント部(下記参照)に含まれる相補突出の創出において、TRA Ｊドナーベクターの組立てのために用いられる。５' BbsI部位であるBbsI←は、BsaI部位中を切断して、この機能の３'末端に突出*5を創出する。3 BbsI部位であるBbsI→は、TRA Ｃ部エレメントに切断して、このエレメントの５'末端に突出*6を創出する。これらの突出は、この構築物のBsaI およびTRA Ｃ部機能の内部にコードされて、最終の再構成されたTRA ORFに組み込まれる可能性のある非天然ヌクレオチドの付加を回避する。
【０１４９】
BbsI→酵素が作製した突出とBsaI←酵素が作製した突出との間の領域は、TRA C遺伝子断片の２番目のヌクレオチドから開始するTRA Ｃ領域の一部であるTRA Ｃ部をコードする。TRA Ｃ遺伝子断片の２番目のヌクレオチドから開始する動機は、ヒトTRA遺伝子座TORESの本実施例においては、得られる突出がTATCであって回文突出ではないからであり、これは、TRA Ｃ遺伝子断片の最初(得られる突出ATAT)を含む場合にそうである。回文突出は、２つのベクター末端が必要なTRA Ｊセグメント部挿入断片なしで連結することを許容するので、回避すべきである。BbsI→部位の向きは、全てのTRA Ｊ断片３'末端の、受入部位カセットにおけるTRA Ｃ領域の５'の始めへのインフレームリガーゼ依存性クローニングを許容する。BsaI T部位の向きは、完全TORESを用いるTRA全長ORF再構成プロトコールの最終工程において、TRA Ｃ領域の始めと残りのTRA Ｃ断片とのインフレームリガーゼ依存性クローニングを許容する。
【０１５０】
２つのBbsI結合部位の間は、酵素NotIの８ヌクレオチド認識配列である。この制限部位は、親のプラスミドコロニーのバックグラウンドを低減するためのネガティブ選択マーカーとして利用される。これは、TRA Ｊ遺伝子断片挿入を行った後にNotI酵素が加えられたときに達成される。よって、TRA Ｊ遺伝子断片を正しくクローニングしているプラスミドは、NotI酵素の存在下で環状のままであるが、そのNotI部位がTRA Ｊ遺伝子断片に交換されていない親のプラスミドは直鎖状にされ、次いで、細菌の形質転換が偏って、完全環状TRA Ｊ断片含有プラスミドを増幅させる。
Spは、IIS型制限酵素結合部位および切断部位の正しいスペーシングを、そのような部位に隣接する場合に達成するための、TRA Ｊ受入カセット断片の特定の点へのヌクレオチド付加を表す。NotI制限酵素結合部位配列を挟むSpブロックは、効率的な作用のために、適切にNotI結合および切断部位の間をあけるために用いられる。さらなるヌクレオチドを含めて、最終の再構成された全長TRA内の正しいリーディングフレームを維持する。ヌクレオチドの選択は、BsaI結合部位のDAMメチル化の可能性のある影響を考慮した。
天然ヒトTRA鎖の本実施例におけるTRA Ｊ受入カセット断片オリゴヌクレオチドのための全長DNA配列 を、SEQ0095およびSEQ0096として示す。フォワード(F1)およびリバース(R1)オリゴヌクレオチド配列をともに列挙する。
【０１５１】
Ｊドナーベクター主鎖の設計
Ｊドナーベクター主鎖を用いて、TRA Ｊ受入カセット断片を挿入して、TRA Ｊ受入カセットベクターを創出する。この主鎖は、よって、Ｊドナーベクターライブラリまで保持される。TRA全長ORFを創出するための最終反応において、この主鎖は、反応副産物であり(図4e)、よって、図９に示すように最小限の特徴を有する。
本実施例では、Ｊドナーベクター主鎖は、Col E1複製起点であるoriをコードする。抗生物質耐性は、アミノグリコシド３'-ホスホトランスフェラーゼ遺伝子であるポジティブ選択#2である。アミノグリコシド３'-ホスホトランスフェラーゼは、カナマイシン、ストレプトマイシン、ネオマイシンおよびゲンタマイシンのような抗生物質に対する耐性を付与する。この代わりのポジティブ選択は、ポジティブ選択#1で選択されるＪドナーベクターが全長TCR ORF再構成の後に選択されることが確実にないようにするために用いられる。
本実施例では、相補突出である突出*3'および突出*4'をそれぞれ作製するベクターEcoRIおよびXhoI制限酵素結合部位。突出*3'は、TRA Ｊ受入カセット断片内に含まれる突出*3に相補的である。突出*4'は、TRA Ｊ受入カセット断片内に含まれる突出*4に相補的である。これらの突出は、TRA Ｊ受入カセット断片の定方向クローニングを許容する。
Spブロックは、効率的な作用を確実にするためにEcoRIとXhoI制限酵素結合部位の距離をあけるための、２つの部位の間に付加されたヌクレオチドを表す。
本実施例では、Ｊドナー主鎖をSEQ0097として表す。
【０１５２】
TRA Ｊ受入カセットベクターを組立てる方法
この方法は、標準的な分子生物学的技術を利用して、所定のTRA Ｊ受入カセット断片(図８)を所定のＪドナーベクター主鎖(図９)に組立てて、TRA Ｊ受入カセットベクター(図10)を創出する。得られるTRA Ｊ受入カセットベクターを用いて、TRA Ｊセグメント部(図11)を挿入して、TRA Ｊドナーベクター(図３)を構築する。
まず、TRA Ｊ受入カセットDNA断片を形成する２つのオリゴヌクレオチドをリン酸化してアニールしなければならない。
【０１５３】
反応ミックス
オリゴヌクレオチド(センス鎖) (100μΜ)                １μl
オリゴヌクレオチド(アンチセンス鎖) (100μΜ)          １μl
T4リガーゼ緩衝液10×                                  １μl
T4 PNK                                                １μl
H2O                                                   ６μl
【０１５４】
反応条件
37℃にて１時間インキュベート
95℃にて５分変性
センスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドを、反応物をゆっくり１分当たり３℃にて25℃まで冷却することによりアニールする
【０１５５】
TRA Ｊ受入カセット断片とＪドナーベクター主鎖の組立てライゲーション
反応ミックス
直鎖状ベクター主鎖                                     100 ng
受入部位カセットDNA断片(0.5μΜ)                       ２μｌ
T4リガーゼ緩衝液10×                                   ２μl
T4リガーゼ                                             0.5μｌ
H2O                                                    20μｌまで
【０１５６】
反応条件
25℃にて１時間インキュベート
65℃にて10分間熱不活化
【０１５７】
得られた生成物でコンピテント大腸菌細胞を形質転換し、カナマイシン耐性コロニーを選択する。耐性コロニーを選択して、正しく組立てられた構築物を決定する。得られるプラスミドは、TRA Ｊ受入カセットベクターである。本実施例では、TRA Ｊ受入カセットベクターをSEQ0098として表し、図10に示す。
【０１５８】
合成TRA Ｊセグメント部の設計
TRA Ｊ受入カセットベクターを作製したら、合成TRA Ｊセグメント部を作製して、このベクターに挿入しなければならない。各TRA Ｊ配列は、独立したTRA Ｊ受入カセットベクターの状況に挿入して、ヒトTRA TORESの一部としてのTRA Ｊドナーベクターライブラリを作製する。
TRA Ｊドナーベクターライブラリは、長いまたは短いＪセグメント部で構成される２つの異なる形で得られる。短いTRA Ｊセグメント部は、CDR3境界コドンの最初から全てのアミノ酸をコードする。しかし、TRA Ｊセグメントの大部分はTCR再編成中に10ヌクレオチド未満刈り込まれることを考慮して、より長いTRA Ｊ生殖系列セグメントを含むTRA Ｊドナーライブラリを設計する、長いTRA Ｊセグメント部。より長いTRA Ｊ遺伝子断片ライブラリに対する動機は、CDR3をコードするより短いオリゴヌクレオチド二重鎖(odeCDR3)が、短いTRA Ｊ断片を用いる場合よりも全長TRA再構成のために必要とされるであろうことである。高可変配列が短いオリゴヌクレオチド二重鎖、odeCDR3として提供されるので、より短いCDR3オリゴヌクレオチド合成は、切断または変異されたオリゴヌクレオチド混入物を含む可能性がより低く、よって、全長TRA再構築中に配列の誤りを有するオリゴヌクレオチド二重鎖がクローニングされる可能性が低減する。さらに、より短いodeCDR3合成は、費用節減になる。
TRA Ｊセグメント部は、４ヌクレオチド一本鎖突出をDNA断片の各末端に含むように設計された２つの一本鎖DNAオリゴヌクレオチドをアニールすることにより構築する。得られるTRA Ｊセグメント部を図11に示す。
【０１５９】
突出*5'と呼ぶ５'突出は、BbsI作用によりＪドナー受入カセットベクター内に作製される突出*5に相補的である。突出*6'と呼ぶ３'突出は、BbsI作用によりＪドナー受入カセットベクター内に作製される突出*6に相補的である。相補突出のこの対は、TRA Ｊ受入カセットベクターへのTRA Ｊセグメント部の定方向クローニングを許容する。
短いTRA Ｊセグメント部は、CDR3-Ｊ境界Pheコドンの最初から全てのアミノ酸をコードする。CDR3は、Ｖ領域のＣ末端保存Cysと、Phe-Gly/Ala保存モチーフの一部であるＪ領域のPheとに挟まれた配列と規定される。この保存Phe-Gly/Alaモチーフを用いて、TRA J断片の５'突出を、下流のTRA再構成のためにTTTGに標準化する。本実施例におけるこの標準化の例外は、TrpおよびGlyがCDR3領域の境界をなすヒトTRAJ33およびTRAJ38である。５'突出は、本実施例において、TRAJ33およびTRAJ38の両方についてTGGGである。
長いTRA Ｊセグメント部は、CDR3境界アミノ酸のＮ末端のより多くのアミノ酸をコードするように設計されている。それぞれの長い遺伝子断片の開始点は、生殖系列によりコードされるTCR連結エレメントの５'末端から10〜12 ntに位置するアミノ酸コドンの１番目のヌクレオチドである。それぞれの長いTRA Ｊセグメント部の５'末端は、短いTRA Ｊセグメント部のものと同一のままである。
短いおよび長いTRA Ｊセグメント部の両方に、図11においてＡブロックと表されるアデニンを、各TRA Ｊセグメント部の３'末端に付加する。このアデニンは、TRA Ｊ受入カセットから除外されるTRA Ｃ断片の１番目のヌクレオチドである。
天然ヒトＪセグメントの本実施例の短いTRA Ｊセグメント部の配列を、SEQ0099〜SEQ0210として表し、長いTRA Ｊセグメント部をSEQ0211〜SEQ0322として表す。両方の場合において、フォワード(F1)およびリバース(R1)オリゴヌクレオチド配列の両方を列挙する。
【０１６０】
短いまたは長いＪドナーベクターライブラリを組立てる方法
この方法は、標準的な分子生物学的技術を利用して、短いTRA Ｊセグメントまたは長いTRA Ｊセグメント部部(図11)をTRA Ｊ受入カセットベクター(図10)にクローニングして、短いまたは長いTRA Ｊセグメントを含むTRA Ｊドナーベクター(図３)を創出する。本実施例では、この方法は、制限酵素消化およびライゲーション反応を単一反応で行う。
Ｊドナーベクターライブラリに必要なDNA成分は、以下のとおりである：
Ｉ.短いTRA Ｊセグメント部または長いTRA Ｊセグメント部
II.Ｊドナー受入カセットベクター
【０１６１】
TRA Ｊセグメント部DNA断片を形成するための２つのオリゴヌクレオチドのリン酸化およびアニーリング
反応ミックス
オリゴヌクレオチド(センス鎖) (100μΜ)                １μl
オリゴヌクレオチド(アンチセンス鎖) (100μΜ)          １μl
T4リガーゼ 緩衝液10×                                 １μl
T4 PNK                                                １μl
H2O                                                   ６μl
【０１６２】
反応条件
37℃にて１時間インキュベート
95℃にて５分変性
センスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドを、反応物をゆっくり１分当たり３℃にて25℃まで冷却することによりアニールする
【０１６３】
RE消化およびライゲーション反応
TRA Ｊ受入カセット主鎖                     100 ng
TRA J DNA断片 (0.5μΜ)                    ２μl
10×NEB T4リガーゼ緩衝液                   ２μl
BbsI                                      0.5μl
T4 DNAリガーゼ                            0.5μｌ
H2O                                        20μｌまで
【０１６４】
反応条件
工程1：37℃にて２分
工程２：16℃にて３分
工程１および２を20回
50℃にて５分
80℃にて５分
室温に戻す
0.5μlのNotI酵素を加え、37℃にて30分インキュベートして、親のベクターを直鎖状にする。
【０１６５】
反応生成物で、コンピテント大腸菌を形質転換し、カナマイシン耐性について選択する。選択された耐性コロニーをシーケンシングして、正しく組立てられた構築物を決定する。得られた構築物は、長いまたは短いTRA Ｊ遺伝子断片のいずれかをコードするTRA Ｊドナーベクターライブラリを作り上げる。
BsaI認識部位の外側の主鎖配列を除く、得られるライブラリの配列を、TRA短いＪドナーライブラリについてSEQ0323〜SEQ0378として、TRA長いＪドナーライブラリについてSEQ0379〜SEQ0434として示す。
【０１６６】
実施例３
天然ヒトTRBレパートリのためのTRB Ｖ-ＣエントリーベクターおよびTRB Ｊドナーベクターライブラリの設計および組立て
上の実施例では、天然ヒトTRAレパートリのためのＶ-ＣエントリーベクターおよびＪドナーベクターライブラリの設計および組立てについて詳細に記載した。TRBレパートリの配列をコードするこのようなベクターライブラリの全体的な設計および組立ては、本質的に同じである。本実施例では、TORESまたは天然ヒトTRB TCR遺伝子座を構築するためのTRB Ｖ-ＣエントリーベクターおよびTRB Ｊドナーベクターライブラリの設計および組立てを簡単に概説する。
【０１６７】
天然ヒトTRBレパートリのためのTRB Ｖ-Ｃエントリーベクターライブラリの設計および組立て
本実施例では、天然ヒトTRB Ｖ-Ｃ配列レパートリを含むTRB Ｖ-Ｃエントリーベクターライブラリの設計および組立て。これは、図２に示す一般的なＶ-Ｃエントリーベクター型の例である。
TRB Ｖ-Ｃ ベクターライブラリのために必要なDNA成分は：
Ｉ.ヒトゲノムにコードされる各機能的TRB Ｖ遺伝子セグメントについてのTRB Ｖクローニング断片
II.TRB C1またはTRB C2クローニング断片
III.Ｖ-Ｃエントリーベクター主鎖
である。
ヒトTRA遺伝子座と対照的に、ヒトTRB遺伝子座は、２つの別個の定常セグメントTRB C1およびC2をコードする。よって、両方の定常領域を捕捉するために、２つのＶ-Ｃエントリーベクターセットを構築して、ＶセグメントのそれぞれをC1およびC2セグメントのそれぞれと対形成させる。
本実施例では、TRB ＶおよびTRB Ｃクローニング断片を合成および使用して、単一制限酵素およびリガーゼ反応において標的Ｖ-Ｃエントリーベクター主鎖に組立てた。本実施例では、標的Ｖ-Ｃエントリー主鎖は、哺乳動物細胞内で再構成されたTRB ORFの一過性発現を許容するように設計された。
本実施例では、IIS型制限酵素BbsIを用いてTRB Ｖ-Ｃエントリーベクターライブラリを構築する。全長TRB ORFを再構成するためのライブラリの稼働において用いるIIS型制限酵素は、BsaIである。
【０１６８】
合成TRB Ｖクローニング断片の設計
TRB Ｖクローニング断片の遺伝子エレメントの配置は、図５に示すように、実施例１に記載するTRA Ｖクローニング断片のものと同一である。
天然ヒトTRB鎖の本実施例におけるTRB Ｖクローニング断片の全長DNA配列を、SEQ0435〜SEQ481として表す。
【０１６９】
合成TRB Ｃクローニング断片の設計
TRB Ｃクローニング断片の遺伝子エレメントの配置は、図６に示すように、実施例１で記載するTRA Ｃクローニング断片のものと同一である。
TRB遺伝子座は、２つの別個のＣセグメントをコードし、ともにTRB Ｖ-Ｃエントリーベクターライブラリの設計に含まれる。
天然ヒトTRB鎖の本実施例におけるTRB Ｃクローニング断片の全長DNA配列を、SEQ0482およびSEQ0483として表す。
【０１７０】
TRB Ｖ-Ｃエントリーベクターライブラリを組立てる方法
所定のTRB ＶおよびTRB Ｃクローニング断片を所定のＶ-Ｃエントリーベクター主鎖に組立てて、TRB Ｖ-Ｃエントリーベクターを創出する方法は、実施例１に記載したものと同一である。哺乳動物細胞における全長TRAまたはTRB ORFの一過性発現のために用いて設計したＶ-Ｃエントリーベクター主鎖を、本実施例および実施例１において用いる(SEQ0048)。
TRA Ｖ-Ｃエントリーベクターライブラリを作り上げるクローニングされたＶ-Ｃ断片の配列を、SEQ0484〜SEQ0577として表す。
【０１７１】
天然ヒトTRBレパートリについてのTRB Ｊドナーベクターライブラリの設計および組立て
本実施例では、天然ヒトTRB Ｊ配列レパートリを含むTRB Ｊドナーベクターライブラリの設計および組立て。これは、図３に示す一般的なＪドナーベクター型の例である。
本実施例では、TRB Ｊ受入カセット断片を構築して、Ｊドナーベクター主鎖に挿入して、TRB Ｊ受入カセットベクターを創出する。その後、合成TRB Ｊセグメント部をTRB Ｊ受入カセットベクターに組立てて、TRB Ｊドナーベクターライブラリを創出できる。このフレキシブル多工程組立て法により、Ｊセグメント長の変動のようなＪドナーセグメント特徴の迅速で費用効果的なエンジニアリングが可能になる。
この手順は、実施例２に記載するTRA Ｊドナーベクター組立てと同じパターンに従う。しかし、Ｊ受入カセット断片がＣセグメントの部分を含むので、TRA ＪおよびTRB Ｊ受入カセット断片は、Ｃ部配列に関して異なり、それぞれのＣ遺伝子セグメントに対応しなければならないことに注意すべきである。さらに、単一Ｊ受入カセット断片だけを必要とするTRA Ｊのシナリオとは対照的に、TRB Ｊは、交互のC1およびC2セグメントの使用を可能にするために、２つの別個のＪ受入カセット断片を必要とする。
【０１７２】
TRB Ｊドナーベクターライブラリのために必要なDNA成分は：
Ｉ.TRB Ｊ C1またはTRB Ｊ C2受入カセット断片
II.Ｊドナーベクター主鎖
III.TRB J C1またはTRB J C2受入カセットベクター
IV.TRB Ｊセグメント部
である。
【０１７３】
合成TRA Ｊ受入カセット断片の設計
２つの一本鎖DNAオリゴヌクレオチドのアニーリングを用いて、図８に示すように、４ヌクレオチド一本鎖突出をDNA断片の各末端に含む受入カセット断片を作製する。４ヌクレオチド突出により、TRB Ｊ受入カセットベクターを創出するために、Ｊドナーベクター主鎖への定方向リガーゼ依存性クローニングが可能になる。
C1およびC2セグメントの交互の使用に必要な２つの受入カセット断片を、SEQ0578およびSEQ0581として表す。各断片について、フォワード(F1)およびリバース(R1)オリゴヌクレオチド配列を示す。
【０１７４】
TRB Ｊ受入カセットベクターを組立てる方法
TRB Ｊ受入カセットベクターを組立てる方法は、実施例２に記載するTRA Ｊ受入カセットベクターを組立てる方法のものと同一である。同じＪドナーベクター主鎖(SEQ0097)を用いて、TRB遺伝子座についての交互のＣセグメントに対応する１つのC1またはC2部をそれぞれ含む２つのTRB Ｊ受入カセットベクターを作製する。
得られる２つのTRB Ｊ受入カセットベクターを用いて、TRB Ｊセグメント部を挿入して、TRB Ｊドナーベクターを構築する。
得られるTRB Ｊ受入カセットベクターを、SEQ0582およびSEQ0583として表す。
【０１７５】
合成TRB Ｊセグメント部の設計
TRB Ｊセグメント部は、４ヌクレオチド一本鎖突出をDNA断片の各末端に含むように設計された２つの一本鎖DNAオリゴヌクレオチドをアニールすることにより構築する。この部分の配置および組立ての方法は、TRA Ｊセグメント部のものと同一であり、図11に示す。
短いTRB Ｊセグメント部の場合、CDR3-Ｊ境界Pheコドンの最初から全てのアミノ酸をコードする。CDR3は、Ｖ領域のＣ末端保存Cysと全てのヒトTRB Ｊセグメントにわたって保存されているPhe-Gly モチーフの一部であるＪ領域のPheとに挟まれた配列として規定される。この保存Phe-Glyモチーフを用いて、下流のTRB再構成のためにTRA Ｊ断片の５'突出をTTTGに標準化する。TRA Ｊセグメントと異なって、本実施例におけるTRA Ｊセグメント部におけるこの標準化された突出に例外はない。
短いおよび長いTRB Ｊセグメント部の両方に、図11においてＡブロックと表されるアデニンを、各TRB Ｊセグメント部の３'末端に付加する。このアデニンは、TRB Ｊ受入カセットから除外されるTRB Ｃ断片の最初のヌクレオチドである。
天然ヒトＪセグメントの本実施例の短いTRB Ｊセグメント部の配列を、SEQ0584〜SEQ0609として、長いTRB Ｊセグメント部をSEQ0610〜SEQ0635として表す。両方の場合において、フォワード(F1)およびリバース(R1)オリゴヌクレオチド配列の両方を列挙する。
【０１７６】
TRB短いまたは長いＪドナーベクターライブラリを組立てる方法
TRB Ｊドナーライブラリを組立てる手順は、実施例２に記載するTRAライブラリのものと同一である。しかし、TRA遺伝子座セグメントについての短いおよび長いライブラリとは対照的に、TRBライブラリの場合、４つのライブラリを作製する。
TRBライブラリの場合、各短いおよび長いライブラリは、代替のC1およびC2 Ｃセグメントのそれぞれを有するように構築して、TRB Ｊドナーライブラリ内で４つの部分集合をもたらすことができる。
Ｊドナーベクターライブラリのために必要なDNA成分は、以下のとおりである：
Ｉ.短いTRB Ｊセグメント部または長いTRB Ｊセグメント部
II.TRB J C1またはTRB J C2受入カセットベクター
【０１７７】
実施例２に記載するものと同じ手順に従って、TRB Ｊドナーライブラリ内の４つの得られる部分集合を作製する。BsaI認識部位の外側の主鎖配列を除く得られるライブラリの配列を示す。
SEQ0636〜SEQ0648として表すTRB C1短いＪドナーライブラリ
SEQ0649〜SEQ0661として表すTRB C2短いＪドナーライブラリ
SEQ0662〜SEQ0674として表すTRB C1長いＪドナーライブラリ
SEQ0675〜SEQ0687として表すTRB C2長いＪドナーライブラリ
【０１７８】
実施例４
リコンビナーゼ媒介カセット交換用途のためのTRAおよびTRB Ｖ-Ｃエントリーベクターの設計
実施例１および３におけるそれぞれTRAおよびTRB Ｖ-Ｃエントリーベクターの設計は、各TCR鎖についてこれらのTORESを用いて再構成された全長TCRを、トランスフェクションにより哺乳動物細胞での一過性発現のために直接用いることができるようなものである。TORESの全体的な設計により、下流の用途のために適切な任意の主鎖、ならびにＶおよびＣクローニング断片から迅速に組立てられる必要なＶ-ＣエントリーベクターライブラリについてＶ-Ｃエントリーベクター主鎖を交換できる。
本実施例では、異種特異的FRT Ｖ-Ｃエントリーベクター主鎖の対を用いて、TRAおよびTRB Ｖ-Ｃエントリーベクターライブラリを組立てる。各TRAおよびTRB Ｖ-Ｃエントリーベクターライブラリを、別個のフリッパーゼ認識標的(FRT)配列を含むベクター主鎖を用いて構築する。このようなベクターのある下流の用途は、最終の再構成されたTRAおよびTRB対の、適切なFRT部位を有する哺乳動物細胞への迅速なゲノム組込みへの提供である。
【０１７９】
本実施例では、図７に示す設計のTRA Ｖ-Ｃエントリーベクターは、それぞれ５'および３'遺伝子エレメントとしてのF14およびF15 FRT配列を含む。このF14/F15 Ｖ-Ｃエントリーベクター主鎖配列を、SEQ0688として表す。
この主鎖を用いて、TRA Ｖクローニング断片(SEQ0001〜SEQ0046)およびTRA Ｃクローニング断片(SEQ0047)を用い、実施例１に概説する方法を用いて、図２に概説する設計のTRA Ｖ-Ｃエントリーライブラリを構築した。この構築は、一過性発現TRA Ｖ-Ｃエントリーベクターライブラリ(SEQ0049〜SEQ0094)のものと同一であるが、F14/F15 Ｖ-Ｃ エントリーベクター主鎖の状況においてFRT配列に挟まれた配列を有するTRA Ｖ-Ｃエントリーライブラリを与えた。
【０１８０】
本実施例では、図７に示す設計のTRB Ｖ-Ｃエントリーベクターは、それぞれ５'および３'遺伝子エレメントとしてFRTおよびF3 FRT配列を含む。このFRT/F3 Ｖ-Ｃエントリーベクター主鎖配列を、SEQ0689として表す。
この主鎖を用いて、TRA Ｖクローニング断片(SEQ0435〜SEQ0481)およびTRB Ｃクローニング断片(SEQ0482〜SEQ0483)を用い、実施例３に概説する方法を用いて、図２に概説する設計のTRB Ｖ-Ｃエントリーライブラリを構築した。この構築は、一過性発現TRB Ｖ-Ｃエントリーベクターライブラリ(SEQ0484〜SEQ0577)のものと同一であるが、FRT/F3 Ｖ-Ｃエントリーベクター主鎖の状況においてFRT配列に挟まれた配列を有するTRB Ｖ-Ｃエントリーライブラリを与えた。
全体として、本実施例のTRAおよびTRB Ｖ-Ｃエントリーベクターは、上記の実施例においてＶ-Ｃエントリーベクターと交換可能に用いることができる。それぞれの場合、Ｊドナーベクターは、odeCDR3の設計および提供と同様に変わらないままである(実施例６を参照されたい)。結果において、異なるＶ-Ｃエントリーベクター主鎖は、TCR再構成反応の直接の生成物として、下流の用途のための所望のベクターの状況における全長TCR ORFを提供する。
【０１８１】
実施例５
任意のＶ-Ｊ-Ｃ組み合わせの提供のために適切なＶ-ＣエントリーベクターおよびＪドナーベクターの設計
Ｖ-ＣエントリーベクターおよびＪドナーベクターの上記の実施例では、天然ヒトTRAおよびTRC TCR鎖を、TORESの実際的な証明のために用いる。しかし、必要なTCR鎖配列を、特定するベクターフォーマットに挿入する際に、TORESフォーマットにおいて、任意の天然または非天然TCR鎖を用い得ることが明らかである。
任意の所定のTCR鎖のためのTORESを達成するために、前記TCR鎖に特異的な４つの配列エレメントが必要である：
Ｘ-可変(Ｖ)遺伝子セグメント断片
Ｙ-定常(Ｃ)遺伝子セグメント断片
Ｙ'-定常(Ｃ)遺伝子セグメント部
Ｚ-連結(Ｊ)遺伝子セグメント断片
【０１８２】
上記の実施例によると、これらの４つの形の配列エレメントを様々なベクターの状況に組立てて、任意の所定のTCR鎖のための任意の所定のＶ-Ｊ-Ｃ組み合わせについてのTORESを構築して配備できる。例えば、天然ヒトTRGおよびTRD遺伝子座、バリアント合成ヒトTCR鎖の形またはヒト以外の生物の天然TCR鎖の形についてのシステム。
【０１８３】
Ｖ-Ｃエントリーベクター組立ておよび最終構築物
Ｖ-Ｃエントリーベクターの組立てを達成するために、適切なＶおよびＣ遺伝子セグメント断片を含む２つの中間体を構築できる。
図５によるＶクローニング断片は、最終Ｖ-Ｃエントリーベクター組立てのために適当なクローニング部位の状況において必要なＶ遺伝子セグメント断片を含むように設計する。本実施例では、実施例１、３および4にも示すように、Ｖ-Ｃエントリーベクターの組立てを、BbsI 制限酵素部位の使用により達成し、それぞれＶ-Ｃエントリーベクター主鎖およびＣクローニング断片における相補的突出とマッチする５'および３'末端での標的突出を創出する。例示する方策は、ネガティブ選択マーカーとしてのNotI制限酵素部位も組み込む。
【０１８４】
このようなクローニングアプローチの一般的な配列を、SEQ-0690として表し、ここで、Ｖ遺伝子セグメント断片は、５'および３'端にてBbsI 部位が境界をなし、Ｖ遺伝子セグメント断片は、XNnと示し、Ｘは、Ｖ遺伝子セグメントのことであり、Ｎは、任意のヌクレオチドを表し、ｎは、前記配列中のヌクレオチドの数を表す。Ｖ遺伝子セグメント断片は、それぞれ５'および３'末端にてコザックおよびスペーサヌクレオチドが境界をなし、翻訳開始コドンを含む。
【０１８５】
特定のTCR鎖配列についてのＶ-Ｃエントリーベクターライブラリを組立てるために構築できる第二中間体は、図６に示すＣクローニング断片である。本実施例では、実施例１、３および4にも示すように、Ｖ-Ｃエントリーベクターの組立てを、BbsI制限酵素部位の使用により達成し、それぞれＶクローニング断片および主鎖Ｖ-Ｃエントリーベクター中の相補的突出とマッチする５'および３'末端での標的突出を創出する。例示する方策は、ネガティブ選択マーカーとしてのNotI制限酵素部位も組み込む。
このようなクローニングアプローチの一般的な配列を、SEQ-0691として表し、ここで、Ｃ遺伝子セグメント断片は、５'および３'末端にてBbsI 部位が境界をなし、Ｃ遺伝子セグメント断片は、YNnと示し、Ｙは、Ｃ遺伝子セグメントのことであり、Ｎは、任意のヌクレオチドを表し、ｎは、前記配列中のヌクレオチドの数を表す。Ｃ遺伝子セグメント断片は、それぞれ５'および３'末端にてＣ遺伝子セグメントの最初のGluコドンの５'側ののシトシンまたは等価な保存部位、およびスペーサヌクレオチドが境界をなし、翻訳停止コドンを含み得る。
【０１８６】
上で定義するＶおよびＣクローニング断片を用いてＶ-Ｃエントリーベクターを組立てるために、これらの断片を、図７に示し、実施例１および3に記載するＶ-Ｃエントリーベクター主鎖と組み合わせる。この実施例および上記の実施例では、この主鎖は、それぞれ突出*1'および突出*2'を生じるAcc65IおよびXbaI制限酵素結合部位で規定される。突出*1'は、Ｖクローニング断片内の突出*1と相補的である(図５)。突出*2'は、Ｃクローニング断片内の突出*2と相補的である(図６)。これらの相補的突出により、Ｖ-Ｃエントリーベクター主鎖へのＶおよびＣクローニング断片の直接クローニングが可能になる。
Sp特徴は、効率的な作用のためにAcc65IおよびXbaI制限酵素認識部位の距離をあけるために必要な、２つの部位の間に付加されたヌクレオチドを表す。
【０１８７】
実施例４に概説するように、５'および３'遺伝子エレメントをＶ-Ｃエントリーベクターに提供することにより(図２)、Ｖ-Ｃエントリーベクター主鎖(図７)は、最終的に、全長TCR ORFがその中で再構成されるベクターの状況を提供する(図4h)。よって、ある範囲の選択をＶ-Ｃエントリーベクター主鎖/Ｖ-Ｃエントリーベクターについて作製して、再構成されたTCR ORFについてのある範囲の下流の用途を満足することができる。
【０１８８】
本実施例では、上記の実施例１、３および４と同様に、３つの異なるＶ-Ｃエントリーベクター主鎖を提供する。
CMV構成性プロモータをコードする５'遺伝子エレメントおよびSV40pAポリアデニル化シグナルをコードする３'遺伝子エレメントを有するＶ-Ｃエントリーベクター主鎖の配列を、SEQ0048として表す。このベクターの状況により、哺乳動物細胞での再構成されたTCR ORFの一過性の発現が可能になる。
本実施例においてこの一過性発現Ｖ-Ｃエントリーベクター主鎖SEQ0048を一般的なＶクローニング断片(SEQ0690)およびＣクローニング断片(SEQ0691)と組み合わせる場合、一般化されるＶ-Ｃエントリーベクターは、配列SEQ0692により規定できる。
【０１８９】
FTR部位F14配列をコードする５'遺伝子エレメントおよびFRT部位F15配列をコードする３'遺伝子エレメントを有するＶ-Ｃエントリーベクター主鎖の配列を、SEQ0688として表す。このベクターの状況により、F14およびF15異種特異的FRT部位が境界をなす遺伝子状況への再構成されたTCR ORFのフリッパーゼ媒介カセット交換が可能になる。例えば、このようなアプローチは、このような異種特異的FRTレシーバ部位を有する哺乳動物株化細胞へのTCR ORFの安定組込みのために用いることができる。
本実施例においてこのF14/F15 RCME Ｖ-Ｃエントリーベクター主鎖SEQ0688を一般的なＶクローニング断片(SEQ0690)およびＣクローニング断片(SEQ0691)と組み合わせる場合、一般化されるＶ-Ｃエントリーベクターは、配列SEQ0693により規定できる。
【０１９０】
FRT部位FRT配列をコードする５'遺伝子エレメントおよびFRT部位F3配列をコードする３'遺伝子エレメントを有する第二Ｖ-Ｃエントリーベクター主鎖の配列を、SEQ0689として表す。このベクターの状況により、FRTおよびF3異種特異的FRT部位が境界をなす遺伝子状況への再構成されたTCR ORFのフリッパーゼ媒介カセット交換が可能になる。例えば、このようなアプローチは、このような異種特異的FRTレシーバ部位を有する哺乳動物株化細胞へのTCR ORFの安定組込みのために用いることができる。
本実施例においてこのFRT/F3 RCME Ｖ-Ｃエントリーベクター主鎖SEQ0689を一般的なＶクローニング断片(SEQ0690)およびＣクローニング断片(SEQ0691)と組み合わせる場合、一般化されるＶ-Ｃエントリーベクターは、配列SEQ0694により定義できる。
【０１９１】
本実施例では、一方のTCR鎖を、２つのRCMEの状況のうちの一方において再構成でき、第二の鎖を、他方のRCMEの状況で再構成できる。例えば、TRA ORFをF14/F15の状況において再構成でき、TRB ORFをFRT/F3の状況において再構成できる。よって、対形成したTRA/TRB構築物を、F14/F15およびFRT/F3部位を有する哺乳動物株化細胞に、前記株化細胞におけるTRA/TRB対の安定的発現のために、RCMEにより組み込むことができる。
【０１９２】
Ｊドナーベクター組立ておよび最終構築物
上に、様々なＶおよびＣ TCR遺伝子セグメント組み合わせを、TORESの成分としてＶ-Ｃエントリーベクターに組立てるために用いることができる一般的な構築物を記載する。TORESを完成するために、適当なＪドナーベクターが必要である。実施例２に記載するように、Ｊドナーベクターを多重工程プロセスにおいて組立てて、Ｊセグメントの特徴を設計する柔軟性を有するＪドナーシステムを達成できる。注目すべきある重要な態様は、Ｊドナーベクターが、マッチするＶ-ＣエントリーベクターライブラリのＣセグメントに相当するＣ部に貢献することである。
【０１９３】
Ｊドナーベクターライブラリを組立てるために、４つの異なる構築物が必要である：
Ｉ.Ｊ受入カセット断片
II.Ｊドナーベクター主鎖
III.Ｊ受入カセットベクター
IV.Ｊセグメント部
本実施例では、実施例２と同様に、BbsI制限部位を用いてＪドナーベクターを組立て、得られるＪドナーベクターおよびマッチするＶ-Ｃエントリーベクターの両方が有するBsaI制限部位を使用して全体的なTORESを運転する。
図８に示すＪ受入カセット断片は、重要なことに、マッチするＶ-Ｃドナーベクターライブラリが有するＣセグメントに対応するＣ部を含む。このようなクローニングアプローチの一般的な配列を、SEQ0695〜SEQ0696として表し、ここで、Ｃセグメント上の５'部分をコードするＣ部は、５'にてBbsI認識部位および３'にてBsaI部位が境界をなす。２つの示す配列は、アニールされてＪ受入カセット断片を生じるセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドを表し、ここで、提供されるＹ'配列は、相補的である。本配列のＣ部は、Y'Nnと示し、Ｙ'は、上記のＹ ＣセグメントとマッチするＣ部のことであり、Ｎは、任意のヌクレオチドを表し、ｎは、前記配列中のヌクレオチドの数を表す。BbsI部位は、３' 方向に切断して、挿入されるＪセグメント部とマッチするクローニング突出を創出するような間隔をあけ、かつそのような向きである。BsaI部位は、５'方向に間隔をあけて切断して、TORESの運転において全長TCR ORFを作製するための最終組み立て反応においてＣ突出を創出する。３'方向に切断するＪ受入カセット断片の５'末端の第二BsaI部位も、TORESの最終運転において用いる。５'方向に切断する内部BbsI部位は、Ｊドナーベクターの組立てのための第二クローニング突出を創出する。本実施例では、間隔をあけたNotI制限部位がBbsI認識部位の間にコードされて、Ｊドナーベクター組立てプロセスから親の断片を排除するためのネガティブ選択マーカーとして作用する。Ｊ受入断片は、実施例２に記載するように、５'末端の突出*3および３'末端の突出*4とよばれる２つの４ヌクレオチド一本鎖突出を生成するように設計された２つの相補的オリゴヌクレオチドをアニールすることにより組立てられる。
【０１９４】
上記のＪ受入カセット断片を有する中間体Ｊ受入カセットベクターを組立てるために、図9に示すように、Ｊドナー主鎖を創出しなければならない。本実施例では、このベクター主鎖のクローニング特徴は、効率的な制限酵素作用のために間隔をあけたEcoRIおよびXhoI制限部位である。この主鎖を、EcoRIおよびXhoIで消化することにより、組立てられたＪ受入カセット断片中の突出*3および突出*4に相補的な突出*3'および突出*4'が生じる。このことにより、Ｊドナー主鎖へのＪ受入カセット断片の定方向クローニングが可能になり、実施例２に記載するようにＪ受入カセットベクターが創出される。上記のＶ-Ｃエントリーベクターのものとは異なるポジティブ選択マーカーを有するＪドナーベクター主鎖の例を、SEQ0097として表す。
【０１９５】
上で得られるＪ受入カセットベクターを図10に示し、これは、本質的に、Ｊドナーベクター主鎖の状況におけるＪ受入カセット断片であり、SEQ0697で表され、Ｙ'は、Ｙで示され上に記載するＣセグメントとマッチするＣ部のことであり、Ｎは、任意のヌクレオチドを表し、ｎは、前記配列中のヌクレオチドの数を表す。
このＪ受入カセットベクターに、一連のＪセグメントを挿入してＪドナーベクターライブラリを構築する。Ｊ遺伝子セグメントの設計を図11に示し、ここで、Ｊ遺伝子セグメントは、それぞれ５'および３'末端で突出*5'および突出*6'が境界をなす。Ｊセグメント部は、本実施例では、３'突出から単一アデニンヌクレオチドで間隔があいており、これにより、酵素認識配列を維持して、実施例２に記載するように、Ｊセグメント部をＪ受入カセットベクターに挿入してＪドナーベクターを創出する場合にリーディングフレームを修正する。本実施例では、Ｊセグメント部についての一般的な配列を、SEQ0698〜SEQ0699として表し、ここで、Ｊ遺伝子セグメント部は、ZNnと示し、Ｚは、Ｊ遺伝子セグメントのことであり、Ｎは、任意のヌクレオチドを表し、ｎは、前記配列中のヌクレオチドの数を表す。２つの示す配列は、アニールされてＪセグメント部を組立てるセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、ここで、Ｚ配列は、相補的である。
【０１９６】
本実施例において得られる一般的な最終Ｊドナーベクターを、SEQ0700で表し、この図を図３に示す。本実施例におけるこのＪドナーベクターは、Ｊ受入カセットベクターからの挿入されたＪセグメント部およびＣ部である。配列は、ZNnおよびY'Nnの２つのアノテーションされた配列挿入断片として表し、ここで、Ｚは、Ｊ遺伝子セグメントのことであり、Ｙ'は、Ｃセグメント部のことであり、Ｎは、任意のヌクレオチドを表し、ｎは、前記配列中のヌクレオチドの数を表す。
全ての提供する配列内で、ヌクレオチドの選択は、BsaI結合部位のDAMメチル化の可能性のある影響を考慮した。ベクター内の組立ておよび選択酵素のための全てのさらなる認識配列は、除外した。任意のそのような認識配列も、記載する断片およびベクターの状況において挿入される生殖系列または合成TCR Ｖ，ＪおよびＣエレメントから除外されるべきである。
【０１９７】
実施例６
CDR3をコードするオリゴヌクレオチド二重鎖(odeCDR3)の設計および作製
上の実施例では、様々な用途のための、マッチするＶ-ＣエントリーベクターおよびＪドナーベクターライブラリの設計および作製における、様々なフォーマットのTORESについて記載する。全長TCRオープンリーディングフレームの一工程再構成のためのこれらのＶ-ＣエントリーベクターおよびＪドナーベクターライブラリの利用は、標的全長TCR鎖配列を完成するために提供されるCDR3をコードするオリゴヌクレオチド二重鎖(odeCDR3)構築物を必要とする(図4c)。Ｖ-ＣエントリーベクターおよびＪドナーベクターライブラリが一旦作製されると、これらのベクターは、標的全長TCR鎖配列の所望のＶ-Ｊ-Ｃ組み合わせを選択するために独立して引き出すことができるストックアイテムである。対照的に、odeCDR3は、標的全長TCR ORFに特異的な短いユニーク配列である。
【０１９８】
本実施例は、天然ヒトTRAおよびTRBベクタープラットフォームで用いるためのodeCDR3の設計および作製について記載する。
TRA odeCDR3の設計
２つの一本鎖DNAオリゴヌクレオチドのアニーリングは、図4cに示すように、４ヌクレオチド一本鎖突出をDNA断片の各末端に含むodeCDR3を作製する。４ヌクレオチド突出は、エントリーベクターにコードされるTRA Ｖセグメントの３'末端(突出≠1-5')およびTRA再構成中のTRA Ｊ断片の５'末端(突出≠2-3')への定方向リガーゼ依存性クローニングを許容するように設計される。突出≠1-5'は、TRA Ｖ-ＣエントリーベクターのＶセグメントにコードされる標準化された突出≠1-5に相補的なCTGCに標準化される。突出≠2-3'の場合、２つの取り得る配列の形があり、これは、ヒトTRA遺伝子座からのＪセグメントのうちの配列分散により決定される。天然ヒトTRA ＪセグメントTRAJ33およびTRAJ38について、突出≠2-3'は、これらの２つのＪセグメントのＪドナーベクターにコードされる突出≠2-3に相補的なTGGGに標準化される。他の全てのヒトTRA Ｊセグメントについて、突出≠2-3'は、これらのＪセグメントのＪドナーベクターにコードされる突出≠2-3に相補的なTTTGに標準化される(実施例２を参照されたい)。
【０１９９】
TRB odeCDR3の設計
TRB odeCDR3について、２つの一本鎖DNAオリゴヌクレオチドのアニーリングは、図4cに示すように、DNA断片の各端にて４ヌクレオチド一本鎖突出を含むodeCDR3を作製する。４ヌクレオチド突出は、エントリーベクターにコードされるTRB Ｖセグメントの３'末端の突出≠1-5'、TRB再構成中のTRB Ｊ断片の５'末端、突出≠2-3'、への定方向リガーゼ依存性クローニングを許容するように設計される。突出≠1-5'は、TRB Ｖ-ＣエントリーベクターのＶセグメントにコードされる標準化された突出≠1-5に相補的なTTGCに標準化される。２つの代替突出≠2-3形が必要なTRA odeCDR3とは対照的に、TRB odeCDR3については、突出≠2-3は、全てのTRB ＪセグメントのＪドナーベクターにコードされる突出≠2-3に相補的なTTTGに標準化される(実施例３を参照されたい)。
【０２００】
一般的なodeCDR3設計
一般的に、odeCDR3設計は、突出にマッチしなければならず、４ヌクレオチド突出は、エントリーベクターにコードされるＶセグメントの３'末端(突出≠1-5')および再構成中のＪ断片の５'末端(突出≠2-3')への定方向リガーゼ依存性クローニングを許容するように設計される。
【０２０１】
リン酸化CDR3 DNAオリゴヌクレオチド二重鎖を作製するための方法
odeCDR3を形成するための２つのオリゴヌクレオチドのリン酸化およびアニーリング
反応ミックス
オリゴヌクレオチド(センス鎖) (100μM)                 1μl
オリゴヌクレオチド(アンチセンス鎖) (100μM)           1μl
T4リガーゼ緩衝液10x                                   1μl
T4 PNK                                                1μl
H2O                                                  ６μl
【０２０２】
反応条件
37℃で1時間インキュベート
95℃で５分間変性
センスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドを、反応物をゆっくり１分当たり３℃にて25℃まで冷却することによりアニールする
【０２０３】
実施例７
Ｖ-ＣエントリーおよびＪドナーベクターライブラリそれぞれからのTRAおよびTRB全長ORFの再構成
JG9a/b実施例
本実施例は、標的TCRの配列情報に鑑みて、TRAおよびTRB全長TCR ORFを再構成するために必要なベクターライブラリ成分およびodeCDR3を規定するために用いる工程について記載する。本実施例は、全長モデルTRAおよびTRB TCR鎖対の組立てプロセスを実証し、ヒト細胞モデルにおける一過性発現および特異的HLA-マルチマー試薬を用いる表面提示TCRの染色によるその特異性を確認する。
【０２０４】
Ｖ-Ｃエントリーベクター、ＪドナーベクターおよびodeCDR3の選択
クローニングライブラリにおいて示される全ての可能な生殖系列断片の配列を、興味対象のTRAまたはTRB配列と整列させる。TRAまたはTRB配列と最高の同一性を有する遺伝子断片は、どのＶ、ＪおよびＣ遺伝子エレメントが所望のTRAまたはTRBクローン形質配列を構成するかを決定する。TRAについて、適当なＶ-Ｃエントリーベクターを、所望のTRAのＶ使用の決定に基づいて選択する。TRBについて、配列包括度がＶおよびＣ使用を決定するために十分である場合、所望のTRBクローン形質のＶ使用に対応する適当なＶ-Ｃエントリーベクターを、前記クローン形質がTRBC1またはTRBC2を使用するかに加えて、選択する。
特異的TRAＪまたはTRB Ｊ遺伝子エレメントの短いおよび長いバージョンの両方をTRAおよびTRB配列とそれぞれ整列させる場合、より長い遺伝子エレメントをコードする対応するプラスミドを、TRA再構築のために用いる。
【０２０５】
合成するTRAのために必要なodeCDR3配列は、整列させたTRA Ｖ断片の３'末端と、整列させたTRAＪ遺伝子断片の５'末端との間の領域として決定される。オリゴヌクレオチドセンス鎖は、さらなる５'の４ヌクレオチド突出、突出≠1-5'、BsaIで消化した場合にTRA Vエントリーベクター上に作製される突出に対して普遍的なCTGC、突出≠1-3'を必要とする。相補的オリゴヌクレオチドアンチセンス鎖は、さらなる５'の４ヌクレオチド突出、特にTRA再構築反応に加えられるTRA Ｊベクターのための突出に対してユニークな突出≠2-3'、突出≠2-5'を必要とする。
合成されるTRBのために必要なCDR3配列は、整列させたTRB Ｖ遺伝子断片の３'末端と、整列させたTRB Ｊ遺伝子断片の５'末端との間の領域として決定される。オリゴヌクレオチドセンス鎖は、さらなる５'の４ヌクレオチド突出、突出≠1-5'、BsaIで消化した場合にTRB Vエントリーベクター上に作製される突出に対して普遍的なTTGC、突出≠1-3'を必要とする。相補的オリゴヌクレオチドアンチセンス鎖は、さらなる５'の４ヌクレオチド突出、特にTCR再構築反応に加えられるTRB Ｊベクターのための突出に対してユニークな突出≠2-3'、突出≠2-5を必要とする。
本実施例では、HLA-A2*01-拘束抗原に対して既知の特異性を有するモデルTCR TRA/TRB対を用いる。TRAおよびTRB鎖の配列を、それぞれSEQ701およびSEQ702として表す。
この全長配列に基づいて、TRAおよびTRBライブラリから適当なＶ-ＣエントリーおよびＪドナーベクターを選択することは単純であった。本実施例では、一過性発現タイプのＶ-Ｃエントリーベクター、つまりSEQ0048として示す主鎖を有するものを用いた。
本実施例では、TRA Ｖ-ＣエントリーベクターSEQ0088(リスト0049〜0094から)およびＪドナーベクターSEQ0371(リスト0323〜0378から)を選択した。
本実施例では、TRB Ｖ-ＣエントリーベクターSEQ0563(リスト0484〜0577から)およびＪドナーベクターSEQ0637(リスト0636〜0687から)を選択した。
TRA鎖について合成したodeCDR3を、それぞれセンスアンチセンスとしてSEQ703およびSEQ704に示す。
TRB鎖について合成したodeCDR3を、それぞれセンスアンチセンスとしてSEQ705およびSEQ706に示す。
【０２０６】
全長再構成の方法
上で選択したTRAおよびTRB成分のそれぞれについて、以下に記載するようにして制限酵素/リガーゼサイクル反応を行った。
RE消化およびライゲーション反応
Ｖ-Ｃエントリーベクター                              100 ng
Ｊドナーベクター                                      60 ng
odeCDR3オリゴヌクレオチド二重鎖(0.5μM)               ２μl
10x T4リガーゼ緩衝液                                  ２μl
BsaI                                                 0.5μl
T4 DNAリガーゼ                                       0.5μl
H2O                                                   20μlまで
【０２０７】
反応条件
工程１；37℃で２分
工程２；16℃で３分
工程１および２を20回反復
50℃にて５分
80℃にて５分
室温に戻す
0.5μlのNotI酵素を加え、37℃にて30分インキュベート。
【０２０８】
得られた反応生成物で、コンピテント大腸菌を形質転換し、カルベニシリン含有プレート上に播種した。
カルベニシリン耐性コロニーのスクリーニングおよび配列決定を行って、正しく組立てられた構築物を決定した。コロニーのスクリーニングは、単離プラスミドDNAの制限酵素診断消化により行い、期待されるDNA断片サイズをDNA電気泳動により観察した。得られた構築物は、全長TCRアルファおよびベータクローン配列をコードする。
【０２０９】
再構成されたTRAおよびTRBベクターの確認。
上記の再構成されたTCR TRA/TRB対の特異性を確認するために、両方の構築物を、CD3成分の全てを発現するが、TRAおよびTRB発現を欠く株化細胞に一過的にトランスフェクションした。この分析は、図12に示し、ここで、再構築されたTCRを、無関係のTCRおよび空のベクター対照と並行してトランスフェクションする。空のベクターは、TCRアルファ/ベータもしくはCD3のいずれについての抗体でも表面染色を示さず、これらの対照細胞もHLA-A2*01-NLVPMVATV四量体試薬で染色されなかった(図12、最右パネル)。TCR発現は、CD3複合体の表面提示のために必要である。無関係のTCRは、TCRアルファ/ベータおよびCD3についての染色が陽性であったが、HLA-A2*01-NLVPMVATV四量体試薬についての染色を示さなかった(図12、中央のパネル)。このことは、TCRが、細胞表面上で発現されるが、HLA-A2*01四量体試薬に搭載される標的抗原について特異的でないことを表す。標的TCRは、TCRアルファ/ベータおよびCD3についての染色が陽性であり、HLA-A2*01-NLVPMVATV四量体試薬についての染色も陽性を示す(最左のパネル)。このことは、再構成されたTCRが、ともに、細胞表面上に提示され、期待されるように、HLA-A2*01四量体試薬に搭載される標的抗原についても特異的であることを示す。
【０２１０】
実施例８
ヒト末梢血から同定される抗原特異的TCR TRA/TRB鎖対のセットの再構成
個別化TCRベースの診断および療法における来るべき方策の重要な要件の一つは、個体から抗原特異的TCR鎖対を迅速に捕捉して特徴決定する能力である。本実施例では、ヒト末梢血から単離された単一Ｔ細胞からTCR TRA/TRB鎖対を増幅して配列決定した後に、哺乳動物細胞における一過性発現によりこれらの対の再構成および確認を行うワークフローを行う。
【０２１１】
TRAおよびTRB鎖対の配列決定および再構成
図13は、全体的なワークフローを表す。簡単に述べると、新鮮なPBMC検体をHLA-B*07:02陽性ドナーから回収し、HLA-B*07:02-TPRV HLA-多量体試薬で染色した。HLA-多量体は、HCMV pp65遺伝子からの既知の免疫優性抗原を搭載するHLA-B*07:02アレルであり、その全長ペプチド配列は、TPRVTGGGAMである。単一HLA-B*07:02-TPRV多量体陽性細胞を、FACSにより、５μLの水を含む0.2mL PCRチューブに選別した。試料を急速凍結し、さらなる処理まで-80℃にて貯蔵した(図13工程ｉ)。
単離単細胞を、TRAおよびTRBのそれぞれについてのＶ領域特異的プライマー収集物(図13工程ii)と、配列分析(図13工程iv)のためのTRAおよびTRBアンプリコンを創出するその後のペア型ネステッドPCR反応(図13工程iii)を必然的に伴う２工程増幅プロセスに供した。この手順は、以前に記載されている(Hanら、Nat Biotechnol. 2014 32(7): 684-692)。
【０２１２】
本実施例では、６つの対形成したクローンが、下流のプロセシングの例を示す。得られた配列を、SEQ0707〜SEQ0718として表す。
これらの配列を、次いで、対応するTRAおよびTRB鎖についてのＶ、ＣおよびＪ遺伝子セグメントのライブラリに対して整列させて、各増幅鎖のＶ、ＣおよびＪセグメント使用を決定した。この配列分析工程は、CDR3コーディング配列の規定、よって、odeCDR3配列の規定も可能にする(図13工程ｖ)。この配列分析は、TCR鎖再構成のためのＶ-Ｃエントリーベクター(図13工程vi)およびＪドナーベクター(図13工程vii)の選択を許容する。この分析は、各鎖再構成反応についてのodeCDR3の合成も許容する(図13工程viii)。選択および配列を、表１にまとめる。
以下の表は、デノボ配列決定および再構成の例において同定されたTCR TRA/TRB対についての配列IDのまとめを示す。
【０２１３】
【表８】
2020530769.tif 000013
【０２１４】
これらの成分の選択により、各TRAおよびTRB鎖についての独立した制限酵素/リガーゼサイクル反応を組立てて、全長TCR ORFの再構成を行うことが可能になる(図13工程ix)。各反応は、上の実施例７に記載するようにして行い、これは、形質転換および抗生物質選択(図13工程ｘ)と、次いで、得られた再構成されたTCR ORFの増幅および配列決定確認とを含む(図13工程xi)。
【０２１５】
TRAおよびTRB鎖対の確認
上記の再構成されたTCR TRA/TRB対のセットの特異性を確認するために、実施例７に示すように、対形成した構築物を、CD3成分の全てを発現するが、TRAおよびTRB発現を欠く株化細胞に一過的にトランスフェクションした。この分析を、図14に示す。細胞を、６つのTCR ORF構築物対のそれぞれでトランスフェクションするとともに、並行して無関係のTRA/TRBクローン対および空のベクター対照でトランスフェクションした。細胞を、CD3に対する抗体およびPBMC検体から単一Ｔ細胞を単離するために最初に用いたHLA-B*07:02-TPRV四量体試薬で染色した後に、フローサイトメトリにより分析した。本実施例における対形成した構築物は、全て、標的HLA-B*07:02-TPRV四量体試薬への結合を示し、量的な差が観察される。各ボックスへの数字の挿入は、CD3陽性細胞事象に対するCD3陰性のMFI比率を表す。
【０２１６】
実施例９
odeCDR3縮重による迅速なTCR鎖多様化
TCR ORFの多様化および選択は、特異性、親和性および/またはシグナル伝達能力が変更されたTCR鎖対をエンジニアリングするために望ましい。TORESシステムは、元の標的配列から系統的に変更されたTCR鎖の収集物の迅速な作製に適している。本実施例では、選択されたコドン位置にて規定され制限されたヌクレオチド縮重とともにodeCDR3を再構成反応に含めることにより、モデルTCR鎖対を多様化するアプローチを示す。このアプローチを用いて、実施例７に示すモデルTCR TRA/TRB対のTRA鎖を多様化した。この単一反応多様化は、その天然のTRB鎖対とともに哺乳動物細胞の表面上に提示された場合に、特異的HLA-多量体試薬に対する広い範囲の親和性を有するTCRセットを生成することが示されている。このアプローチは、生存哺乳動物細胞の機能的状況において提示および選択され得る全長TCR ORFを用いる迅速TCR-エンジニアリングに理想的に適している。
【０２１７】
多様性TRA鎖収集物の作製
図15は、odeCDR3プールを用いることにより単一反応においてTCR鎖の配列多様化収集物の作製についての全体的な方策を示す。単一Ｃ-ＶエントリーベクターおよびＪドナーベクターを選択して、最終全長TCR生成物における標的Ｖ、ＪおよびＣ遺伝子セグメントを表す(図15、ボックスｉおよびボックスii)。選択された多様性を有するodeCDR3プールを作製して、odeCDR3プール中にいくつかの異なるCDR3配列があるようにする(図15、ボックスiii)。全ての成分を制限酵素/リガーゼサイクル反応に組み合わせた場合に、得られる生成物は、規定されたＶ、ＪＣ遺伝子セグメント使用と、CDR3領域における規定された多様性との全長TCR鎖を含む構築物の収集物である(図15、ボックスiv)。最終生成物における多様化された全長TCR鎖の数は、反応に加えた初期odeCDR3プール中のodeCDR3バリアントの数に正比例する。
【０２１８】
本実施例では、HLA-A2*01で提示されるヒトサイトメガロウイルス(HCMV)抗原に対する既知の特異性を有するモデルTCR TRA/TRB対を用いる(実施例７と同じ対)。この抗原性ペプチドは、HCMV pp65タンパク質に由来し、HLA-A2*01で提示されるペプチド抗原の全長アミノ酸配列は、NLVPMVATVである。TRAおよびTRB鎖の配列を、それぞれSEQ701およびSEQ702として示す。
本実施例では、TRA鎖が配列多様化の標的であり、このことは、それぞれ別々のコドンを変化させて、３つのコドンのそれぞれでの４つの異なるアミノ酸の可能性をもたらす３つの別々の位置でのヌクレオチド縮重を有するodeCDR3センスおよびアンチセンスオリゴの合成により達成した。縮重のために選択したコドンは、CDR3ループにわたって間隔をあけていた。odeCDR3オリゴをSEQ0743およびSEQ0744として示し、ここで、縮重コドンはＮとして示す。
元のコーディング配列(すなわちSEQ0701)を含む、64のユニーク配列を有するodeCDR3生成物プールをもたらす３つの別々のコドン位置にて４重アミノ酸縮重を有するodeCDR3オリゴを、実施例６に概説する方法によりアニールした。
odeCDR3を用いて、実施例７に概説する方法により全長TRA ORFを組立てて、３つの別々のコドン位置にて４重アミノ酸縮重を有する64のユニークTRA ORFを創出した。本実施例では、示す位置にて縮重ヌクレオチド使用を有するodeCDR3を合成し、よって、再構成を単一チューブ中で行って、64全ての鎖バリアント作製した。ユニークodeCDR3を並行して別々の反応に供するというアプローチが等しく有効である。期待されるクローンが全て調製され、単一反応から配列を確認した。各TRA鎖は、その後の特徴決定のための別々のプラスミドストックとして調製した。
【０２１９】
TRB鎖対と、多様化されたTRA鎖の特徴決定
特異性を特徴決定するために、上で導いた64のTCR TRA鎖のそれぞれを、TRB鎖(SEQ0702)とともに、CD3成分の全てを発現するが、TRAおよびTRB発現を欠く株化細胞に共トランスフェクションした。これらの細胞を、次いで、CD3に対する抗体およびHLA-A2*01-NLVPMVATV多量体試薬で染色し、フローサイトメトリにより分析した。この分析を、図16に示す。
各トランスフェクタント集団は、CD3陰性集団に対するCD3陽性のHLA-A2*01-NLVPMVATV多量体シグナルの平均蛍光強度(MFI)の比率として表し、上昇する比率に対して並べた散布図としてプロットした(図16a)。多様化したTRA鎖は、HLA-A2*01-NLVPMVATV多量体に対するある範囲の親和性を創出することが明らかである。元のアルファ鎖を矢印で示す。多様化したクローンの大多数は、元のものよりも乏しい結合を示した。著しい数の非結合体も観察される。著しいことに、いくつかのクローンは、相対シグナルが３倍を超えて改善されたクローンを含んで、HLA-A2*01-NLVPMVATV多量体染色の著しい増加(高結合体)を示した。列挙する１位、２位および３位を提示して多様化したアミノ酸を有するクローンは、MFI比率の上昇する順位の表としても表す(図16b)。２位のProが、HLA-A2*01-NLVPMVATV多量体結合を高度に安定化させ、３位のAspがより低い程度でそのようにすることが観察できる。逆に、３位のHisは、２位にProが存在しなければ、結合を完全に廃止する。HLA-A2*01-NLVPMVATV多量体の結合の増加および減少に対するアミノ酸置換のこの位置的な偏りは、TORESを用いてTRA鎖に創出される標的化アミノ酸縮重に対する結合親和性の本物の変化を強く示唆する。
全体として、本実施例は、TORES内でodeCDR3縮重により単一工程で導入されたCDR3ループ中の最小限の多様性が、分析物HLA-抗原複合体に対する多様化結合特徴を有するTCRの収集物を創出できることを示す。これは、TCR成熟ワークフローに直接組み込んで、天然のＶ、ＪおよびＣ遺伝子セグメント使用とともにTCR鎖の全長の天然の状況をいまだに維持しながら様々なTCRエンジニアリングシナリオ内で特徴が変更された合成TCRを作製できる。
【０２２０】
実施例10
ＶおよびＪセグメントシャッフリングによる迅速TCR鎖多様化
TCR ORFの多様化および選択は、特異性、親和性および/またはシグナル伝達能力が変更されたTCR鎖対をエンジニアリングするために望ましい。TORESシステムは、元の標的配列から系統的に変更されたTCR鎖の収集物の迅速な作製に適している。本実施例では、多重のＶ-Ｃエントリーベクター、Ｊドナーベクターまたは多重のＶ-ＣエントリーベクターおよびＪドナーベクターの両方とともに単一odeCDR3を全長TCR鎖反応に提供するTCR鎖多様化アプローチを概説する。このようなアプローチを用いて、新規なTCR鎖において同族HLA-抗原複合体を有するコアCDR3コンタクトをやり遂げる可能性を維持しながら、天然の生殖系列Ｖ、ＪおよびＣセグメントを用いて所定のTCR鎖を多様化できる。このアプローチは、生存哺乳動物細胞の機能的状況において提示および選択され得る全長TCR ORFを用いる迅速TCR-エンジニアリングに理想的に適している。
シャッフリングＶ遺伝子セグメント使用の例を図17に示す。この模式例は、いくつかのＶ-Ｃエントリーベクターを再構成反応に提供することによりＶ遺伝子セグメントの選択を提供しながら、親のTCR鎖とマッチする配列を有する単一odeCDR3およびＪドナーベクター使用を維持するアプローチを概説する。多重Ｃ遺伝子セグメント使用の機会を有するTCR鎖(例えばヒトTRB)の場合、これを多様化ワークフローに考慮することもできる。単一odeCRD3およびＪドナーベクターと、Ｖ-Ｃエントリーベクターの選択とを含む反応の生成物は、親のCDR3/J配列と、提供されたＶ(および/またはＣ)遺伝子セグメントのそれぞれとを含むいくつかの全長TCR鎖である。このようなアプローチは、図17に示すプールされた反応ではなく、いくつかの選択されたＶ-Ｃエントリーベクターを用いる別々の反応において達成するために等しく有効である。
【０２２１】
シャッフリングＪ遺伝子セグメント使用の例を図18に示す。この模式例は、再構成反応にＪドナーベクターの選択を提供することによりＪ遺伝子セグメントの選択を提供しながら、親のTCR鎖とマッチする配列を有する単一odeCDR3およびＶ-Ｃエントリーベクター使用を維持するアプローチを概説する。単一odeCRD3およびＶ-Ｃエントリーベクターと、Ｊドナーベクターの選択とを含む反応の生成物は、親のCDR3/Ｖ-Ｃ配列と、提供されたＪドナー遺伝子セグメントのそれぞれとを含むいくつかの全長TCR鎖である。このようなアプローチは、図18に示すプールされた反応ではなく、いくつかの選択されたＪドナーベクターを用いる別々の反応において達成するために等しく有効である。
【０２２２】
ＶおよびＪ遺伝子セグメント使用の両方のシャッフリングの最後の例を図19に示す。この模式例は、再構成反応にＶ-ＣおよびＪドナーベクターの両方の選択を提供することによりＶ(-Ｃ)およびＪ遺伝子セグメントの両方の選択を提供しながら、親のTCR鎖とマッチする配列を有する配列を有する単一odeCDR3を維持するアプローチを概説する。単一odeCRD3と、Ｖ-ＣエントリーおよびＪドナーベクターの両方の選択とを含む反応の生成物は、親のCDR3配列と、反応に提供したＶ(-Ｃ)およびＪドナー遺伝子セグメントの各組み合わせとを含むいくつかの全長TCR鎖である。このようなアプローチは、図19に示すプールされた反応ではなく、いくつかの選択されたＶ-ＣエントリーおよびＪドナーベクターを用いる別々の反応において達成するために等しく有効である。
【０２２３】
実施例11
TORES2を用いるTRAおよびTRBからの全長TCR ORFの再構成
本実施例は、５'および３'遺伝子エレメントとしてのRMCE部位を有するヒトTRA/TRB遺伝子座についてのTORES2について記載し、モデルヒトTCR対の再構成と、元のＶ-Ｃαエントリーベクター主鎖の状況の５'および３'遺伝子エレメントとマッチするRMCE部位を有するエンジニアリングされた株化細胞への再構成されたORFのその後の組込みとを示す。モデルTCR TRA/TRB対は、HLA-A*02:01-拘束抗原に対する既知の特異性を有する。モデルTRAおよびTRB配列を、それぞれSEQ0778およびSEQ0779により表す。抗原ペプチドは、アミノ酸配列SLLMWITQVを有する。
【０２２４】
TORES2のためのＶ-Ｃエントリーベクター、Ｊドナーベクター、odeCDR3および二方向ターミネータ
Ｖ-Ｃα、Ｖ-Ｃβ、ＪドナーベクターおよびodeCDR3をコードするオリゴヌクレオチド二重鎖は、実施例７に概説したものと同じ選択基準を用いて選択する。上記のように、TORES2は、別個のIIS型部位およびネガティブ選択エレメントを組み込むためのＶ-ＣαおよびＶ-Ｃβの適合を必要とする。Ｖ-ＣαおよびＶ-Ｃβエントリーベクター主鎖配列を、それぞれSEQ7056およびSEQ0764により表す。これらの主鎖配列に新しい制限部位を加えるので、Ｖセグメント配列のいくつかは、TCRコーディング配列からこれらの新しい制限部位を排除することについて、上記のTORESシステムについて示すものと比較して根底にあるヌクレオチド配列の改変を必要とする。改変TRA Ｖ-Ｃ配列は、SEQ0757〜SEQ0763により表し、改変TRB Ｖ-Ｃ配列は、SEQ0765〜SEQ0776により表す。用いた他の全てのTRAおよびTRB 配列は、上記のTORESシステムについて記載したとおりであった。
【０２２５】
二方向ターミネータドナー成分
二方向ターミネータドナーベクター(BiTドナー)は、第二工程反応において導入される二方向ターミネータエレメントを提供し、これは、第一工程反応において再構成された逆平行TRAおよびTRB鎖を最終的に接続する。本実施例では、二方向ターミネータエレメントは、SEQ0777により表し、適切なベクター主鎖の状況で提供する。
【０２２６】
再構成反応
標的TRAおよびTRB ORFを再構成するための第一制限酵素/リガーゼサイクル反応は、実施例７に記載するようにして行う。このことにより、それぞれそれらのＶ-Ｃエントリー主鎖の状況内での再構成されたTRAおよびTRBがもたらされる。第二反応では、これらの２つの生成物ベクターを、新しい酵素リガーゼサイクル反応においてBiTドナーベクターと組み合わせて、逆平行センスにおいて再構成され、導入した二方向ターミネータエレメントにより接続されたTRAおよびTRB ORFをコードする最終生成物ベクターを作製する。
【０２２７】
TORES2についてのRE消化およびライゲーション反応
再構成されたTRA ORFベクター                           25 ng
再構成されたTRB ORFベクター                           25 ng
BiTドナーベクター                                     25 ng
10x T4リガーゼ緩衝液                                   ２μl
Esp3I                                                 0.5μl
T4 DNAリガーゼ                                        0.5μl
H2O                                                    20μlまで
【０２２８】
反応条件
工程１；37℃で２分
工程２；16℃で３分
工程１および２を20回反復
50 lCにて５分
80 lCにて５分
室温に戻す
0.5μlのSalIおよびMluI酵素を加え、37℃にて30分インキュベート。
【０２２９】
得られた反応生成物で、コンピテント大腸菌を形質転換し、カルベニシリン含有プレート上に播種した。
カルベニシリン耐性コロニーのスクリーニングおよび配列決定を行って、正しく組立てられた構築物を決定した。コロニーのスクリーニングは、単離プラスミドDNAの制限酵素診断消化により行い、期待されるDNA断片サイズをDNA電気泳動により観察した。得られた構築物は、全長TCRアルファおよびベータクローン配列をコードする。
【０２３０】
再構成された全長TCR ORFの確認
TORES2システムにより作製された、再構成された二方向TRA/TRBドナーベクターの機能性を確認するために、構築物を、CD3成分の全てを発現するが、TRAおよびTRB発現を欠き、生成物ドナーベクターに含まれるRMCE部位に適合し、元のＶ-Ｃαエントリーベクターが寄与するゲノムレシーバ部位と、５'および３'末端にて適切な逆平行プロモータエレメントとをさらにコードする株化細胞に送達した。分析を図23に示し、ここで、再構成されたドナーベクターを、細胞にトランスフェクションする。ゲノムレシーバ部位マーカーを喪失した細胞(図23a、RFP- BFP-)は、二方向TCRORFを発現して、CD3表面発現をもたらす細胞である(図23b、淡い灰色のヒストグラム)。ゲノムレシーバ部位マーカーを喪失しなかった細胞は、二方向TCR構築物を組み込むことができなかった細胞であり(図23a) RFP+BFP+)、CD3表面発現について染色されない(図23b、濃い灰色のヒストグラム)。TCR発現は、CD3複合体の表面提示のために必要である。ゲノムレシーバマーカーを喪失した全てのRFP-BFP-細胞は、CD3表面発現について陽性である(図23b、淡い灰色のヒストグラム)。ゲノムレシーバマーカーを喪失しなかった全てのRFP+BFP+細胞は、CD3表面発現について陰性である(図23b)、濃い灰色のヒストグラム)。再構成されたTCRを発現するこれらのCD3+細胞も、HLA-A*02:01-SLLMWITQV四量体試薬(図23d)で染色されなかった細胞と比較して、前記四量体について陽性染色を示す(図23c)。一緒に、これらの結果は、再構成されたTCRがともに細胞表面上に提示され、HLA-A*02:01-SLLMWITQV四量体試薬に搭載された標的抗原に特異的であることを示す。
【０２３１】
特定の実施形態
以下に、本発明およびその様々な態様に関するさらなる詳細を示す。
１.  ２つの別々の成分を含む組み合わせたシステムであって、第一成分が、可変および定常(Ｖ-Ｃ)Ｔ細胞受容体(TCR)遺伝子セグメントを有するベクターであり、第二成分が、連結(Ｊ)TCR遺伝子セグメントを有するベクターである、組み合わせたシステム。
２.  第一成分が：
ａ.複製起点、
ｂ.第一ポジティブ選択マーカー、
ｃ.１つ以上の５'遺伝子エレメント、
ｄ.コザック配列、
ｅ.TCR可変遺伝子セグメント、
ｆ.IIS型制限酵素による部位特異的認識および切断のための第一IIS型配列、
ｇ.ネガティブ選択マーカー、
ｈ.第二IIS型配列、
ｉ.TCR定常遺伝子セグメント、ならびに
ｊ.１つ以上の３'遺伝子エレメント
を含むＶ-Ｃエントリーベクターである、項目１に記載の組み合わせたシステム。
３.  第二成分が：
ａ.複製起点、
ｂ.第二ポジティブ選択マーカー、
ｃ.第三IIS型配列、
ｄ.TCR連結遺伝子セグメント、
ｅ.定常遺伝子セグメントの小さい５'部分に相当するＣ部、および
ｆ.第四IIS型配列
を含むＪドナーベクターである、項目１または２に記載の組み合わせたシステム。
４.  前記第一、第二、第三および第四IIS型配列が、同じまたは異なる、項目２または３に記載の組み合わせたシステム。
５.  前記第一、第二、第三および第四IIS型配列が、同じである、項目２または３に記載の組み合わせたシステム。
６.  第一および第二ポジティブ選択マーカーが、異なり、抗生物質耐性遺伝子または栄養要求性補完遺伝子から選択される、項目２〜５のいずれかに記載の組み合わせたシステム。
７.  ５'遺伝子エレメントが：
ａ.遺伝子シスエレメント、
ｂ.リコンビナーゼ酵素のための異種特異的認識部位、
ｃ.興味対象のゲノム部位についての５'相同組換えアーム、
ｄ.mRNAスプライスアクセプター部位、
ｅ.配列内リボソーム進入部位、および
ｆ.エピジェネティックインスレータ配列
から選択される1つ以上のエレメントを含む、項目２〜６のいずれかに記載の組み合わせたシステム。
８.  TCR可変遺伝子セグメントが、第一および第二成分に含まれるIIS型配列を含まない、項目２〜７のいずれかに記載の組み合わせたシステム。
９.  第一IIS型配列が、前記認識配列の５'側でTCR可変遺伝子セグメント内を切断する向きである、項目２〜８のいずれかに記載の組み合わせたシステム。
【０２３２】
10.  ネガティブ選択マーカーが：
ａ.第一成分の他の場所にもTCR連結遺伝子セグメント内にも含まれない制限酵素認識部位、
ｂ.細菌性自殺遺伝子および
ｃ.レポーターエレメント
から選択される、項目２〜９のいずれかに記載の組み合わせたシステム。
11.  第二IIS型配列が、前記認識配列の３'側でTCR定常遺伝子セグメント内を切断する向きである、項目２〜10のいずれかに記載の組み合わせたシステム。
12.  TCR定常遺伝子セグメントが、第一および第二成分に含まれるいずれのIIS型配列も含まない、項目２〜11のいずれかに記載の組み合わせたシステム。
13.  ３'遺伝子エレメントが：
ａ.ターミネータエレメント、
ｂ.リコンビナーゼ酵素のための異種特異的認識部位、
ｃ.興味対象のゲノム部位についての３'相同組換えアーム、
ｄ.mRNAスプライスドナー部位、
ｅ.配列内リボソーム進入部位、および
ｆ.エピジェネティックインスレータ配列
から選択される１つ以上のエレメントを含む、項目２〜12のいずれかに記載の組み合わせたシステム。
14.  第三IIS型配列が、前記認識配列の３'側でTCR連結遺伝子セグメント内を切断する向きである、項目３〜13のいずれかに記載の組み合わせたシステム。
15.  TCR連結遺伝子セグメントが、第一および第二成分に含まれるいずれのIIS型配列も含まない、項目３〜14のいずれかに記載の組み合わせたシステム。
16.  第四 IIS型配列が、前記認識配列の５'側でTCR Ｃ部部分または構築物内を切断する向きである、項目３〜15のいずれかに記載の組み合わせたシステム。
17.   TCR Ｃ部が、第一および第二成分に含まれるいずれのIIS型配列も含まない、項目３〜16のいずれかに記載の組み合わせたシステム。
18.  全ての含まれる配列が、項目10で規定するネガティブ選択マーカー以外のいずれのネガティブ選択エレメントも含まない、前記項目のいずれかに記載の組み合わせたシステム。
19.  CDR3をコードするオリゴヌクレオチド二重鎖(odeCDR3)を含む第三成分をさらに含む、前記項目のいずれかに記載の組み合わせたシステム。
【０２３３】
20.  odeCDR3が：
ａ.認識配列の５'側でTCR可変遺伝子セグメント内を切断する向きの、第一IIS型制限酵素認識および切断部位に相補的な第一一本鎖突出配列、
ｂ.TCR CDR3領域をコードし、ネガティブ選択エレメントを含まず(ネガティブ選択エレメントは、項目10で定義されるとおりである)、第一または第二部分のいずれのIIS型制限配列も含まない二本鎖セグメント、ならびに
ｃ.認識配列の３'側でTCR連結遺伝子セグメント内を切断する向きの、第三IIS型制限酵素認識および切断部位に相補的な第二一本鎖突出配列
を有する、項目19に記載の組み合わせたシステム。
21.  TCRを有する生物の全ての生殖系列TCR可変および定常遺伝子セグメントを表す１つ以上のベクターの収集物である、項目１〜18のいずれかで規定されるＶ-Ｃエントリーベクターのライブラリ。
22.  TCRを有する生物の生殖系列TCR連結遺伝子セグメントを表す１つ以上のベクターの収集物である、項目１〜18のいずれかで規定されるＪドナーベクターのライブラリ。
23.  コードされるタンパク質の翻訳されたアミノ酸配列が、生殖系列遺伝子セグメントによりコードされるタンパク質配列に関して改変されないように、ライブラリが、TCRを有する生物のバリアント生殖系列TCR可変および定常遺伝子セグメントの収集物を表す１つ以上のベクターの収集物である、項目１〜18のいずれかで規定されるＶ-Ｃエントリーベクターのライブラリ。
24.  コードされるタンパク質の翻訳されたアミノ酸配列が、生殖系列遺伝子セグメントによりコードされるタンパク質配列に関して改変されないように、ライブラリが、TCRを有する生物のバリアント生殖系列TCR連結遺伝子セグメントを表す１つ以上のベクターの収集物である、項目1-18のいずれかで規定されるＪドナーベクターのライブラリ。
25.  コードされるタンパク質の翻訳されたアミノ酸配列が、生殖系列遺伝子セグメントによりコードされるタンパク質配列に関して改変されるように、ライブラリが、TCRを有する生物のバリアント生殖系列TCR可変および定常遺伝子セグメントの収集物を表す１つ以上のベクターの収集物である、項目１〜18のいずれかで規定されるＶ-Ｃエントリーベクターのライブラリ。
26.  コードされるタンパク質の翻訳されたアミノ酸配列が、生殖系列遺伝子セグメントによりコードされるタンパク質配列に関して改変されるように、ライブラリが、TCRを有する生物のバリアント生殖系列TCR連結遺伝子セグメントを表す１つ以上のベクターの収集物である、項目１および３〜18のいずれかで規定されるＪドナーベクターのライブラリ。
27.  項目１〜26のいずれかで規定されるＶ-ＣエントリーベクターおよびＪドナーベクターの組み合わせを含むライブラリ。
【０２３４】
28.  ａ.可変および定常遺伝子セグメントの組み合わせをコードする１つ以上のＶ-Ｃエントリーベクターと、
ｂ.Ｊ遺伝子セグメントをコードする1つ以上のＪドナーベクターと、
所望により、
ｃ. 陽性対照odeCDR3として、Ｖ-ＣエントリーベクターおよびＪドナーベクター一本鎖突出とマッチする一本鎖突出を有する１つ以上の標準化odeCDR3と、
所望により、
ｄ. 参照としての予め組立てられた全長TCR ORFと
の組み合わせを含むキット。
【０２３５】
29.  全長TCRオープンリーディングフレーム(ORF)のインビトロ再構成の方法であって：
ａ.Ｖ-Ｃエントリーベクターを選択する工程と、
ｂ.Ｊドナーベクターを選択する工程と、
ｃ.odeCDR3を選択する工程と、
ｄ.ｉ)Ｖ-ＣエントリーベクターおよびＪドナーベクターに存在する全てのIIS型制限酵素認識および切断部位を切断するIIS型制限酵素ならびにii)DNAリガーゼ酵素と反応させるためにａ、ｂおよびｃを組み合わせて、組み合わせたミックスを熱サイクル反応に供する工程と、
ｅ.工程ｄから得られる反応生成物で、DNAベクター増殖能力を持つ選択可能な宿主生物を形質転換する工程と、
ｆ.宿主生物の選択を行って、Ｖ-Ｃエントリーベクター主鎖内の全長の再構成されたTCRオープンリーディングフレームを得る工程
とを含む、方法。
【０２３６】
30.  Ｖ-Ｃエントリーベクターが、項目２で規定されるとおりであり、Ｊドナーベクターが、項目３で規定されるとおりであり、項目29の工程ｆが、形質転換宿主細胞に対して項目６で規定される第一ポジティブ選択マーカーを用いることにより行われる、項目29に記載の方法。
31.  選択されたTCRオープンリーディングフレームが、選択されたTCR配列から再構成され、前記方法が、
ａ.TCRオープンリーディングフレーム配列を得る工程であって、前記配列情報が、ｉ)可変遺伝子セグメント使用、ii)定常遺伝子セグメント使用、iii)連結遺伝子セグメント使用、iv)可変遺伝子セグメント境界から連結遺伝子セグメント境界にわたる全長CDR3配列を同定するために十分である工程と、
ｂ.工程ａ．ｉ)およびａ．ii)でそれぞれ同定される可変および定常遺伝子セグメントに対応するＶ-Ｃエントリーベクターを選択する工程と、
ｃ.工程ａ.iii)で同定される連結遺伝子セグメントに対応するＪドナーベクターを選択する工程と、
ｄ.工程ａ.iv)で同定されるCDR3配列に対応するodeCDR3を作製する工程と、
ｅ.ｂ、ｃおよびｄを組み合わせて、ｉ)Ｖ-ＣエントリーベクターおよびＪドナーベクターに存在する全てのIIS型制限酵素認識および切断部位を切断するIIS型制限酵素ならびにii)DNAリガーゼ酵素と反応させて、組み合わせたミックスを熱サイクル反応に供する工程と、
ｆ.工程ｅ.で得られる反応生成物で、ベクター複製能力を持つ選択可能な宿主生物を形質転換する工程と、
ｇ.宿主生物の選択を行って、Ｖ-Ｃエントリーベクター主鎖内の全長の再構成されたTCRオープンリーディングフレームを得る工程と
を含む、項目29または30に記載の方法。
【０２３７】
32.   工程ｄ.ｉ)が、単一IIS型制限酵素を用いて行われる、項目29〜31のいずれかに記載の方法。
33.  工程ｄ.ｉ)が、少なくとも２つのIIS型制限酵素を用いて行われる、項目29〜31のいずれかに記載の方法。
34.  ａ.項目29の工程ｅ.または項目31の工程ｆ.の宿主形質転換の前に反応生成物の制限酵素消化を行って、親のＶ-Ｃエントリーベクターを排除すること、
ｂ.自殺遺伝子選択を行って、親のＶ-Ｃエントリーベクターで形質転換されたコンピテントな宿主を排除すること、および/または
ｃ.レポーター同定により、親のＶ-Ｃエントリーベクターで形質転換された宿主細胞の選択を行うこと
を含む少なくとも一工程のネガティブ選択をさらに含む、項目29〜33のいずれかに記載の方法。
35.  宿主生物の選択が、培養系中に存在する抗生物質に対する耐性を有する宿主を選択すること、または培養系に存在しない栄養要求性因子の競合を含み、前記抗生物質耐性または栄養要求性補完が、Ｖ-Ｃエントリーベクターにコードされる遺伝子生成物により授けられる、項目29〜34のいずれかに記載の方法。
【０２３８】
36.  １つ以上の工程が、宿主生物の培養および選択のために適切な培養系で行われる、項目29〜34のいずれかに記載の方法。
37.  ２つ以上のodeCDR3形が、項目29cに従って選択され、項目29dによる単一制限酵素/リガーゼサイクル反応と組み合わされる、多様化されたCDR3領域を有する２つ以上のTCR ORFのプールを創出するために用いる項目29〜36のいずれかに記載の方法。
38.  ２つ以上のＶ-Ｃエントリーベクターが、項目29aに従って選択され、項目29dによる単一制限酵素/リガーゼサイクル反応と組み合わされる、多様化されたＶおよび/またはＣ遺伝子セグメント使用を有する２つ以上のTCR ORFのプールを創出するために用いる項目29〜36のいずれかに記載の方法。
39.  ２つ以上のＪドナーベクターが、項目29bに従って選択され、項目29dによる単一制限酵素/リガーゼサイクル反応と組み合わされる、多様化されたＪ遺伝子セグメント使用を有する２つ以上のTCR ORFのプールを創出するために用いる項目29〜36のいずれかに記載の方法。
40.  ２つ以上のＶ-ＣエントリーおよびＪドナーベクターが、項目29aおよびbに従って選択され、項目29dによる単一制限酵素/リガーゼサイクル反応と組み合わされる、多様化されたＶおよび/またはＣならびにＪ遺伝子セグメント使用を有する２つ以上のTCR ORFのプールを創出するために用いる項目29〜36のいずれかに記載の方法。
41.  ２つ以上のodeCDR3が、項目29cに従って選択され、２つ以上のＶ-ＣエントリーおよびＪドナーベクターが、項目29aおよびbに従って選択され、項目29dによる単一制限酵素/リガーゼサイクル反応と組み合わされる、多様化されたＶおよび/またはＣならびにＪ遺伝子セグメント使用に加えて多様化されたCDR3を有する２つ以上のTCR ORFのプールを創出するために用いる項目29〜36のいずれかに記載の方法。
【０２３９】
42.  項目１および２に記載のＶ-Ｃエントリーベクターを構築するための方法であって、
ａ.可変遺伝子セグメントクローニング断片、
ｂ.定常遺伝子セグメントクローニング断片、
ｃ.Ｖ-Ｃエントリーベクター主鎖
から選択される３つのDNA成分を組み合わせることを含む、方法。
43.  前記可変遺伝子セグメントクローニング断片が：
ａ.断片のポリメラーゼ連鎖反応依存性増幅のための５'プライマーバインド配列、
ｂ.３'方向に切断する向きの第五IIS型配列、
ｃ.ｂ.における第五IIS型配列に対するIIS型酵素作用の際に規定された一本鎖突出をコードする第一突出配列、
ｄ.コザック配列、
ｅ.TCR可変遺伝子セグメント、
ｆ.第一IIS型配列、
ｇ.ネガティブ選択マーカーの５'配列セグメント
ｈ.ｇ.におけるネガティブ選択マーカーの５'配列セグメント内で一本鎖突出が生じるように５'方向に切断する向きの第六IIS型配列、
ｉ.断片のポリメラーゼ連鎖反応依存性増幅のための３'プライマーバインド配列
を含む、項目42に記載の方法。
【０２４０】
44.  前記定常遺伝子セグメントクローニング断片が：
ａ.断片のポリメラーゼ連鎖反応依存性増幅のための５'プライマーバインド配列、
ｂ.ｃ.におけるネガティブ選択マーカーの３'配列セグメント内で一本鎖突出が生じるように３'方向に切断する向きの第七IIS型配列、
ｃ.ネガティブ選択マーカーの３'配列セグメント、
ｄ.第二IIS型配列
ｅ.TCR定常遺伝子セグメント
ｆ.ｇ.における第八IIS型配列に対するIIS型酵素作用の際に規定された一本鎖突出をコードする第二突出配列、
ｇ.ｆ.の突出配列内で一本鎖突出が生じるように５'方向に切断する向きの第八IIS型配列、
ｈ.断片のポリメラーゼ連鎖反応依存性増幅のための３'プライマーバインド配列
を含む、項目42または43に記載の方法。
【０２４１】
45.  前記Ｖ-Ｃエントリーベクター主鎖が：
ａ.複製起点、
ｂ.第一ポジティブ選択マーカー、
ｃ.５'遺伝子エレメント、
ｄ.主鎖の消化を許容して、項目43cで言及する前記第一突出に相補的な一本鎖突出を創出する第一制限酵素認識配列、
ｅ.主鎖の消化を許容して、項目44fで言及する前記第二突出に相補的な一本鎖突出を創出する第二制限酵素認識配列 、
ｆ.３'遺伝子エレメント
を含む、項目42〜44のいずれかに記載の方法。
46.  第五、第六、第七および第八IIS型配列が、同じまたは異なる、項目42〜45のいずれかに記載の方法。
47.  第五、第六、第七および第八IIS型配列が、同じである、項目42〜45のいずれかに記載の方法。
48.  第五、第六、第七および第八IIS型配列が、項目２〜５で規定される第一、第二、第三および第四IIS型配列とは異なる、項目42〜45のいずれかに記載の方法。
【０２４２】
49.  ａ.前記第一制限酵素および前記第二制限酵素を用いてＶ-Ｃエントリーベクター主鎖を消化して、前記第一および第二突出を創出することと、
ｂ.消化したＶ-Ｃエントリーベクター主鎖を、DNAリガーゼ酵素および第五、第六、第七および第八IIS型配列を認識する１つ以上のIIS型制限酵素とともに、Ｖクローニング断片およびＣクローニング断片と組み合わせることと、
ｃ.得られた反応生成物でのコンピテント宿主生物の形質転換および前記第一ポジティブマーカーを用いるポジティブ選択により、完全Ｖ-Ｃエントリーベクターを得ることと
を含む、項目42〜48のいずれかに記載の方法。
【０２４３】
50.  配列SEQ0690により表される可変遺伝子セグメントクローニング断片。
51.  配列SEQ0691により表される定常遺伝子セグメントクローニング断片。
52.  哺乳動物宿主細胞における一過性発現または再構成された全長TCRオープンリーディングフレームのために適切なＶ-Ｃエントリーベクターを構築するための、配列SEQ0048により表されるＶ-Ｃエントリーベクター。
53.  適切な異種特異的リコンビナーゼ配列を有するマッチする遺伝子標的とのリコンビナーゼ媒介カセット交換のために適切なＶ-Ｃエントリーベクターを構築するための、配列SEQ0688により表されるＶ-Ｃエントリーベクター。
54.  マッチする異種特異的リコンビナーゼ配列を有する遺伝子標的とのリコンビナーゼ媒介カセット交換のために適切なＶ-Ｃエントリーベクターを構築するための、配列SEQ0689により表されるＶ-Ｃエントリーベクター主鎖。
【０２４４】
Ｖ-Ｃエントリーベクターの属性
55.  哺乳動物宿主細胞における一過性発現または再構成された全長TCRオープンリーディングフレームのために適切な配列SEQ0692により表されるＶ-Ｃエントリーベクター。
56.  マッチする異種特異的リコンビナーゼ配列を有する遺伝子標的とのリコンビナーゼ媒介カセット交換のために適切な配列SEQ0693により表されるＶ-Ｃエントリー。
57.  マッチする異種特異的リコンビナーゼ配列を有する遺伝子標的とのリコンビナーゼ媒介カセット交換のために適切な配列SEQ0694により表されるＶ-Ｃエントリーベクター。
58.  項目１または３に記載のＪドナーベクターを構築する方法であって：
ａ.Ｊ受入カセット断片
ｂ.Ｊドナーベクター主鎖
ｃ.Ｊ受入カセットベクター
ｄ.Ｊセグメント部
から選択される４つのDNA成分を組み合わせることを含む、方法。
【０２４５】
59.  前記Ｊ受入カセット断片が：
ａ.60cで言及する突出配列に相補的な５'末端での第一一本鎖突出、
ｂ.ｃ.で言及する第九IIS型配列により駆動される酵素が作用した場合に一本鎖突出を形成する配列と連結される、３'方向に切断する向きの第三IIS型配列、
c.５'方向に切断する向きであり、ｂ.で言及する一本鎖突出を創出する第九IIS型配列、
ｄ.ネガティブ選択マーカー、
ｅ.３'方向に切断する向きであり、ｆ.に記載する配列の５'側にて一本鎖突出を創出する第十IIS型配列、
ｆ.第十IIS型配列により駆動される酵素作用により作製される５'末端での突出配列と、ｇで言及する第四IIS型配列により駆動される酵素作用により作製される３'末端での突出配列とを有する、定常遺伝子断片の５'部分を表すＣ部、
ｇ.ｆで言及するＣ部を含む５'配列内で一本鎖突出が作製されるように５'方向に切断する向きの第四IIS型配列、
ｈ.60dで言及する突出配列に相補的(commentary)である３'末端の第二一本鎖突出
を含む、項目58に記載の方法。
【０２４６】
60.  前記Ｊドナーベクター主鎖が：
ａ.複製起点、
ｂ.第二ポジティブ選択マーカー、
ｃ.主鎖の消化を許容して、項目59aで言及する前記第一突出に相補的な一本鎖突出を創出する第一制限酵素認識配列、
ｄ.主鎖の消化を許容して、項目59hで言及する前記第二突出に相補的な一本鎖突出を創出する第二制限酵素認識配列
を含む、項目58または59に記載の方法。
【０２４７】
61.  前記Ｊ受入カセットベクターが、項目53に記載するTRAＪ受入カセット断片と、項目54に記載するTRAJ Ｊドナーベクター主鎖とを組み合わせることにより構築され、方法が：
ａ.前記第一制限酵素と前記第二制限酵素を用いてＪドナーベクター主鎖を消化することにより、それぞれ前記第一および第二突出を創出することと、
ｂ.消化したＪドナーベクター主鎖を、Ｊ受入カセット断片と組み合わせることと、
ｃ.得られた反応生成物でのコンピテント宿主生物の形質転換および前記第二ポジティブ選択マーカーを用いるポジティブ選択により、完全Ｊ受入カセットベクターを得ることと、
を含む、項目58〜60のいずれかに記載の方法。
【０２４８】
62.  前記Ｊセグメント部が：
ａ.項目59bで言及する第九IIS型配列により駆動される酵素が作用した場合に項目59bで言及するＪ受入カセット断片に作製される突出に相補的である、５'末端での第一一本鎖突出配列、
ｂ.連結遺伝子セグメント部、
ｃ.項目59eで言及する第九IIS型配列により駆動される酵素が作用した場合に, 項目59fで言及するＪ受入カセット断片に作製される突出に相補的である、３'末端での第二一本鎖突出配列、
を含む、項目58〜61のいずれかに記載の方法。
63.  第九および第十IIS型配列が、同じまたは異なる、項目58〜62のいずれかに記載の方法。
【０２４９】
64.  第九および第十IIS型配列が、同じである、項目58〜62のいずれかに記載の方法。
65.  第九および第十IIS型配列が、項目２〜５で規定される第一、第二、第三および第四IIS型配列とは異なる、項目42〜62のいずれかに記載の方法。
66.  第九および第十IIS型配列が、項目２〜５で規定される第五、第六、第七および第八IIS型配列と同じまたは異なる、項目42〜62のいずれかに記載の方法。
67.  第九および第十IIS型配列が、項目２〜５で規定される第五、第六、第七および第八IIS型配列と同じである、項目42〜62のいずれかに記載の方法。
【０２５０】
68.  前記Ｊドナーベクターが、Ｊドナーベクター主鎖をＪセグメント部と組み合わせることにより構築され、方法が：
ａ.DNAリガーゼ酵素ならびに第九および第十IIS型配列を認識する１つ以上のIIS型制限酵素とともに、Ｊセグメント部をＪ受入カセットベクターと組み合わせ、組み合わせたミックスを熱サイクル反応に供することと、
ｂ.得られた反応生成物でのコンピテント宿主生物の形質転換および前記第二ポジティブマーカーを用いるポジティブ選択により、完全Ｊドナーベクターを得ることと
を含む、項目42〜62のいずれかに記載の方法。
69.  配列SEQ0695およびSEQ0696により表されるＪ受入カセット断片。
70.  配列SEQ0097により表されるＪドナーベクター主鎖。
71.  項目69で言及するＪ受入カセット断片と、項目70で言及するＪドナーベクター主鎖との組み合わせにより構築される、SEQ0697により表されるＪ受入カセットベクター。
72.  項目71で言及するＪ受入カセットベクターへのＪセグメント部の挿入によりＪドナーベクターを構築するための、配列SEQ0698およびSEQ0699により表されるＪセグメント部。
73.  項目71で言及するＪ受入カセットベクターと項目72で言及するＪセグメント部とから組立てられる配列SEQ0700により表されるＪドナーベクター。
【０２５１】
74.  配列SEQ0049〜SEQ0094により表されるヒトTRA遺伝子座の遺伝子セグメント使用を再現するための可変および定常遺伝子セグメントを含む、項目２〜19のいずれかで規定されるＶ-Ｃエントリーベクターのライブラリであって、ベクターが、再構成された全長TCRオープンリーディングフレームの一過性発現のために適切である、ライブラリ。
【０２５２】
75.  配列SEQ0323〜SEQ0378により表されるヒトTRA遺伝子座の遺伝子セグメント使用を再現するための連結遺伝子セグメントを含む、項目３〜19のいずれかで規定されるＪドナーベクターのライブラリであって、ベクターが、CDR3領域全体にわたるodeCDR3とともに用いられる、ライブラリ。
76.  配列SEQ0379〜SEQ0434により表されるヒトTRA遺伝子座の遺伝子セグメント使用を再現するための連結遺伝子セグメントを含む、項目３〜のいずれかで規定されるＪドナーベクターのライブラリであって、ベクターが、３〜４コドン長さが短くなったodeCDR3とともに用いられる、ライブラリ。
【０２５３】
77.  配列SEQ0484〜SEQ0577により表されるヒトTRB遺伝子座の遺伝子セグメント使用を再現するための可変および定常遺伝子セグメントを含む、項目２〜19のいずれかで規定されるＶ-Ｃエントリーベクターのライブラリであって、ベクターが、再構成された全長TCRオープンリーディングフレームの一過性発現に適切な、ライブラリ。
78.  配列SEQ0636〜SEQ0661で表されるヒトTRB遺伝子座の遺伝子セグメント使用を再現するための連結遺伝子セグメントを含む、項目３〜19のいずれかで規定されるＪドナーベクターのライブラリであって、ベクターが、CDR3領域全体にわたるodeCDR3とともに用いられる、ライブラリ。
79.  配列SEQ0662〜SEQ0687により表されるヒトTRB遺伝子座の遺伝子セグメント使用を再現するための連結遺伝子セグメントを含む、項目３〜19のいずれかで規定されるＪドナーベクターのライブラリであって、ベクターが、３〜４コドン長さが短くなったodeCDR3とともに用いられる、ライブラリ。
【０２５４】
80.   規定されたベクターの状況において天然生殖系列および/または多様化された合成TCRオープンリーディングフレームの提供において用いるための、項目１〜20に記載の組み合わせたシステム。
81.  診断または治療手順において用いるための、規定されたベクターの状況でのTCRオープンリーディングフレーム。
【図１Ａ】
2020530769.tif 000014
【図１Ｂ】
2020530769.tif 000015
【図２】
2020530769.tif 000016
【図３】
2020530769.tif 000017
【図４】
2020530769.tif 000018
【図５】
2020530769.tif 000019
【図６】
2020530769.tif 000020
【図７】
2020530769.tif 000021
【図８】
2020530769.tif 000022
【図９】
2020530769.tif 000023
【図１０】
2020530769.tif 000024
【図１１】
2020530769.tif 000025
【図１２】
2020530769.tif 000026
【図１３】
2020530769.tif 000027
【図１４】
2020530769.tif 000028
【図１５】
2020530769.tif 000029
【図１６Ａ】
2020530769.tif 000030
【図１６Ｂ】
2020530769.tif 000031
【図１７】
2020530769.tif 000032
【図１８】
2020530769.tif 000033
【図１９】
2020530769.tif 000034
【図２０】
2020530769.tif 000035
【図２１】
2020530769.tif 000036
【図２２】
2020530769.tif 000037
【図２３】
2020530769.tif 000038
【配列表】
2020530769000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年9月6日(2019.9.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つの別々の成分を含む組み合わせたシステムであって、第一成分が、可変および定常(Ｖ-Ｃ)Ｔ細胞受容体(TCR)遺伝子セグメントを有するベクターであり、第二成分が、連結(Ｊ)TCR遺伝子セグメントを有するベクターであり、
第一成分が、
ａ.複製起点、
ｂ.第一ポジティブ選択マーカー、
ｃ.１つ以上の５'遺伝子エレメント、
ｄ.コザック配列、
ｅ.TCR可変遺伝子セグメント、
ｆ.第一IIS型制限酵素による部位特異的認識および切断のための第一IIS型配列であって、前記認識配列の５'側でTCR可変遺伝子セグメントの３'末端にて酵素が切断するような向きである配列、
ｇ.ネガティブ選択マーカー、
ｈ.第二IIS型制限酵素による部位特異的認識および切断のための第二IIS型配列であって、酵素が切断して、前記認識配列の３'側でTCR定常遺伝子セグメントの５'末端にて切断を駆動するような向きである配列、
ｉ.TCR定常遺伝子セグメント、ならびに
ｊ.１つ以上の３'遺伝子エレメント
を含むＶ-Ｃエントリーベクターであり、
第二成分が、
ａ.複製起点、
ｂ.第二ポジティブ選択マーカー、
ｃ.第三IIS型制限酵素による部位特異的認識および切断のための第三IIS型配列であって、前記認識配列の３'側でTCR連結遺伝子セグメントの５'末端にて酵素が切断するような向きである配列、
ｄ.TCR連結遺伝子セグメント、
ｅ.定常遺伝子セグメントの小さい５'部分に相当するＣ部、および
ｆ. 第四IIS型制限酵素による部位特異的認識および切断のための第四IIS型配列であって、配列が、前記認識配列の５'側で構築物の３'末端 TCR Ｃ部部分にて酵素が切断するような向きであり、作製される一本鎖突出配列が、前記第二IIS型配列により作製されるものに相補的である、配列
を含む１つ以上のＪドナーベクターである、組み合わせたシステム。
【請求項２】
５'遺伝子エレメントが：
ａ.遺伝子シスエレメント、
ｂ.リコンビナーゼ酵素のための異種特異的認識部位、
ｃ.興味対象のゲノム部位についての５'相同組換えアーム、
ｄ.mRNAスプライスアクセプター部位、
ｅ.配列内リボソーム進入部位、および
ｆ.エピジェネティックインスレータ配列
から選択される１つ以上のエレメントを含む、請求項１に記載の組み合わせたシステム。
【請求項３】
ネガティブ選択マーカーが：
ａ.第一成分の他の場所にもTCR連結遺伝子セグメント内にも含まれない制限酵素認識部位、
ｂ.細菌性自殺遺伝子および
ｃ.レポーターエレメント
から選択される、請求項１または２に記載の組み合わせたシステム。
【請求項４】
３'遺伝子エレメントが：
ａ.ターミネータエレメント、
ｂ.リコンビナーゼ酵素のための異種特異的認識部位、
ｃ.興味対象のゲノム部位についての３'相同組換えアーム、
ｄ.mRNAスプライスドナー部位、
ｅ.配列内リボソーム進入部位、および
ｆ.エピジェネティックインスレータ配列
から選択される１つ以上のエレメントを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組み合わせたシステム。
【請求項５】
両成分が、上で規定するもの以外のいずれのIIS型配列も含まず、前記ネガティブ選択マーカーだけを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組み合わせたシステム。
【請求項６】
CDR3をコードするオリゴヌクレオチド二重鎖(odeCDR3)を含む第三成分をさらに含み、odeCDR3が：
ａ.TCR可変遺伝子セグメントの３'末端にて第一IIS型制限部位の切断により作製されるものに相補的な第一一本鎖突出配列、
ｂ.TCR CDR3領域をコードし、請求項３で規定されるネガティブ選択マーカーを含まない二本鎖セグメントであって、ネガティブ選択マーカーが、第一および第二成分のいずれのIIS型制限配列も含まない二本鎖セグメント、ならびに
ｃ.TCR連結遺伝子セグメントの５'末端にて第三IIS型制限酵素部位の切断により作製されるものに相補的な第二一本鎖突出配列
を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組み合わせたシステム。
【請求項７】
CDR3をコードするオリゴヌクレオチド二重鎖(odeCDR3)を含む第三成分をさらに含み、odeCDR3が、２つのIIS型認識および切断部位に挟まれたCDR3をコードするdsDNA分子またはプラスミドDNAであり、それにより、前記酵素による切断が、Ｖ-Ｃエントリーベクターにおいて第一IIS型切断により５'末端にて作製される一本鎖突出及びＪドナーベクターの第三IIS型切断により3'末端に作製される一本鎖突出に相補的な一本鎖突出をもたらして、請求項６に記載されるａ、ｂおよびｃを含む前記odeCDR3の消化生成物を得る、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組み合わせたシステム。
【請求項８】
第一から第四IIS型配列が、同じまたは異なる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組み合わせたシステム。
【請求項９】
請求項１で規定されるＶ-Ｃエントリーベクターのライブラリと請求項１で規定されるＪドナーベクターのライブラリとの二部分ベクターライブラリであって、Ｖ-Ｃエントリーベクターのライブラリが：
TCRを有する生物の全ての生殖系列TCR可変および定常遺伝子セグメントを表す１つ以上のベクターの収集物、または
コードされるタンパク質の翻訳されたアミノ酸配列が、生殖系列遺伝子セグメントによりコードされるタンパク質配列に関して改変されないような、TCRを有する生物のバリアント生殖系列TCR可変および定常遺伝子セグメントの収集物を表す１つ以上のベクターの収集物、または
コードされるタンパク質の翻訳されたアミノ酸配列が、生殖系列遺伝子セグメントによりコードされるタンパク質配列に関して改変されるような、TCRを有する生物のバリアント生殖系列TCR可変および定常遺伝子セグメントの収集物を表す１つ以上のベクターの収集物
であり、
Ｊドナーベクターライブラリが、TCRを有する生物の生殖系列TCR連結遺伝子セグメントを表す１つ以上のベクターの収集物、または
コードされるタンパク質の翻訳されたアミノ酸配列が、生殖系列遺伝子セグメントによりコードされるタンパク質配列に関して改変されないような、TCRを有する生物のバリアント生殖系列TCR連結遺伝子セグメントを表す１つ以上のベクターの収集物、または
コードされるタンパク質の翻訳されたアミノ酸配列が、生殖系列遺伝子セグメントによりコードされるタンパク質配列に関して改変されるような、TCRを有する生物のバリアント生殖系列TCR連結遺伝子セグメントを表す１つ以上のベクターの収集物
である、二部分ベクターライブラリ。
【請求項１０】
全長TCRオープンリーディングフレーム(ORF)のインビトロ再構成の方法であって：
ａ.Ｖ-Ｃエントリーベクターを選択する工程と、
ｂ.Ｊドナーベクターを選択する工程と、
ｃ.odeCDR3を選択する工程と、
ｄ.ａ、ｂおよびｃを、ｉ)Ｖ-ＣエントリーベクターおよびＪドナーベクターに存在する全てのIIS型制限酵素認識および切断部位を切断するIIS型制限酵素ならびにii)DNAリガーゼ酵素と、組み合わせたミックスを熱サイクル反応に供する工程と、
ｅ.工程ｄから得られる反応生成物で、DNAベクター増殖能力を持つ宿主生物を形質転換する工程と、
ｆ.前記宿主生物を増殖させて、得られるＶ-Ｃエントリーベクター主鎖内の全長の再構成されたTCRオープンリーディングフレームを得る工程
とを含む、方法。
【請求項１１】
配列SEQ0692、
配列SEQ0693、および
配列SEQ0694
から選択される、Ｖ-Ｃエントリーベクター。
【請求項１２】
配列SEQ0700により表されるＪドナーベクター。
【請求項１３】
全長TCR ORFを再構成するためにＪドナーベクターのライブラリおよびodeCDR3と組み合わせて用いるための請求項１〜８のいずれか１項で規定されるＶ-Ｃエントリーベクターのライブラリであって、Ｖ-Ｃエントリーベクターが、配列SEQ0049〜SEQ0094により表されるヒトTRA遺伝子座の遺伝子セグメント使用を再現するための可変および定常遺伝子セグメントを含み、かつ/またはＶ-Ｃエントリーベクターが、配列SEQ0484〜SEQ0577により表されるヒトTRB遺伝子座の遺伝子セグメント使用を再現するための可変および定常遺伝子セグメントを含む、ライブラリ。
【請求項１４】
配列SEQ0323〜SEQ0378により表されるヒトTRA遺伝子座の遺伝子セグメント使用を再現するための連結遺伝子セグメントを含み、ベクターが、CDR3領域全体にわたるodeCDR3とともに用いられ、かつ/または
配列SEQ0379〜SEQ0434により表されるヒトTRA遺伝子座の遺伝子セグメント使用を再現するための連結遺伝子セグメントを含み、ベクターが、３〜４コドン長さが短くなったodeCDR3とともに用いられる、
請求項１〜８のいずれか１項で規定されるＪドナーベクターのライブラリ。
【請求項１５】
配列SEQ0636〜SEQ0661で表されるヒトTRB遺伝子座の遺伝子セグメント使用を再現するための連結遺伝子セグメントを含み、ベクターが、CDR3領域全体にまたがるodeCDR3とともに用いられ、かつ/または
配列SEQ0662〜SEQ0687により表されるヒトTRB遺伝子座の遺伝子セグメント使用を再現するための連結遺伝子セグメントを含み、ベクターが、３〜４コドン長さが短くなったodeCDR3とともに用いられる、
請求項１〜８のいずれか１項で規定されるＪドナーベクターのライブラリ。
【請求項１６】
全長TCR ORFを再構成するためにＶ-ＣエントリーベクターおよびodeCDR3と組み合わせて用いるための請求項14または15に記載のライブラリ。
【請求項１７】
前記第一成分が、第一TCR鎖をコードするＶ-Ｃエントリーベクターであり、システムが、二方向ターミネータ(BiT)ドナーベクターを含む成分および前記第一TCR鎖に相補的な第二TCR鎖をコードするＶ-Ｃエントリーベクターを含む成分をさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組み合わせたシステム。
【請求項１８】
前記第一成分の前記Ｖ-Ｃエントリーベクターが：
ａ.第五IIS型制限酵素による特異的認識および切断のための第五IIS型配列であって、前記認識配列の５'側で定常遺伝子セグメントの３'末端にて酵素が切断するような向きである配列、
ｂ.第五IIS型配列の３'側にあるネガティブ選択マーカー、
ｃ.ｂ.のネガティブ選択マーカーの３'側にある第六IIS型制限酵素による部位特異的認識および切断のための第六IIS型配列であって、前記認識配列の３'側で３'遺伝子エレメントの５'側で酵素が切断するような向きである配列
をさらに含む、請求項17に記載の組み合わせたシステム。
【請求項１９】
前記第一鎖に相補的な第二TCR鎖をコードする前記Ｖ-Ｃエントリーベクターが：
ａ.第七IIS型制限酵素による部位特異的認識および切断のための第七IIS型配列であって、前記認識配列の３'側でコザック配列の５'にて酵素が切断するような向きである配列、
ｂ.第八IIS型制限酵素による部位特異的認識および切断のための第八IIS型配列であって、前記認識配列の５'側で定常遺伝子セグメントの３'末端にて酵素が切断するような向きである配列、
ｃ.第八IIS型配列の３'側にあるネガティブ選択マーカー
をさらに含む、請求項17または18に記載の組み合わせたシステム。
【請求項２０】
前記BiTドナーベクターが：
a. 複製起点、
b. ポジティブ選択マーカー、
c. 第九IIS型制限酵素による部位特異的認識および切断のための第九IIS型配列であって、前記認識配列の３'側で二方向ターミネータエレメントｄの５'末端で酵素が切断するような向きである配列、
d. アンチセンス配置で２つの転写ターミネータをコードする二方向ターミネータエレメント、
e. 第十IIS型制限酵素による部位特異的認識および切断のための第十IIS型配列であって、前記認識配列の５'側でかつ二方向ターミネータエレメントｄの３'側で酵素が切断するような向きである配列
を含む、請求項17〜19のいずれか１項に記載の組み合わせたシステム。
【請求項２１】
第一から第四IIS型配列が、同じまたは異なる、請求項17〜20のいずれか１項に記載の組み合わせたシステム。
【請求項２２】
第五から第十IIS型配列が、同じまたは異なり、第一から第四IIS型配列のものとは異なる、請求項17〜20のいずれか１項に記載の組み合わせたシステム。
【請求項２３】
ネガティブ選択マーカーが：
ａ.第一成分の他の場所にもTCR連結遺伝子セグメント内にも含まれない制限酵素認識部位、
ｂ.細菌性自殺遺伝子、および
ｃ.レポーターエレメント
から選択され、請求項18のｂ.および請求項19のｃ.で規定されるネガティブ選択マーカーが、請求項１のｇ.で規定されるネガティブ選択マーカーとは異なり、請求項１のｇ.で規定されるネガティブ選択マーカーが、第一成分のＶ-Ｃエントリーベクターおよび前記第一TCR鎖に相補的な前記第二TCR鎖をコードするＶ-Ｃエントリーベクター中のものとは異なる、請求項17〜22のいずれか１項に記載の組み合わせたシステム。
【請求項２４】
請求項17〜23のいずれか１項で規定されるＶ-Ｃエントリーベクターのライブラリであって、ライブラリが、第一および第二Ｖ-Ｃエントリーベクターライブラリを含み、これらがそれぞれ：
TCRを有する生物の全ての生殖系列TCR可変および定常遺伝子セグメントを表す１つ以上のベクターの収集物、または
コードされるタンパク質の翻訳されたアミノ酸配列が、生殖系列遺伝子セグメントによりコードされるタンパク質配列に関して改変されないような、TCRを有する生物のバリアント生殖系列TCR可変および定常遺伝子セグメントの収集物を表す１つ以上のベクターの収集物、または
コードされるタンパク質の翻訳されたアミノ酸配列が、生殖系列遺伝子セグメントによりコードされるタンパク質配列に関して改変されるような、TCRを有する生物のバリアント生殖系列TCR可変および定常遺伝子セグメントの収集物を表す１つ以上のベクターの収集物
を含み、
第一および第二Ｖ-Ｃエントリーライブラリが、相互性TCR鎖をコードする、ライブラリ。
【請求項２５】
単一生成構築物中の逆平行配置でコードされる全長TCRオープンリーディングフレーム(ORF)の対を提供するために用いるための、請求項24に記載のＶ-Ｃエントリーベクターのライブラリ。
【請求項２６】
単一生成構築物中の逆平行配置でコードされる全長TCRオープンリーディングフレーム(ORF)の対のインビトロ再構成の方法であって：
ａ.各TCR鎖についてＶ-Ｃエントリーベクターを選択する工程と、
ｂ.各TCR鎖についてＪドナーベクターを選択する工程と、
ｃ.各TCR鎖についてodeCDR3を選択する工程と、
ｄ.各TCRについて独立した反応においてｉ)Ｖ-ＣエントリーベクターおよびＪドナーベクターに存在する第一から第四IIS型制限酵素認識および切断部位を切断するIIS型制限酵素ならびにii)DNAリガーゼ酵素と反応させるためにａ、ｂおよびｃを組み合わせて、組み合わせたミックスを熱サイクル反応に供して第一および第二反応生成物を得る工程と、
ｅ.工程ｄからの両方の反応生成物を、請求項17で規定するBiTドナーベクターと、ｉ)第五から第十IIS型制限酵素認識および切断部位を切断するIIS型制限酵素ならびにii)DNAリガーゼ酵素と組み合わせ、組み合わせた反応生成物を熱サイクル反応に供して、第三反応生成物を得る工程と、
ｆ.工程ｅ.からの第三反応生成物で、DNAベクター増殖能力を持つ宿主細胞を形質転換する工程と、
ｇ.前記宿主生物を増殖させて、得られたＶ-Ｃエントリーベクター主鎖内の全長の再構成されたTCRオープンリーディングフレームを得る工程と
を含む、方法。
【請求項２７】
配列番号0756および0764により表されるＶ-Ｃエントリーベクターの対。
【請求項２８】
マッチする異種特異的リコンビナーゼ配列を有する遺伝子標的とのリコンビナーゼ媒介カセット交換において用いるための、請求項27に記載のＶ-Ｃエントリーベクターの対。
【請求項２９】
配列SEQ0777により表される、二方向ターミネータエレメント。
【国際調査報告】
2020530769.tif 000039
2020530769.tif 000040
2020530769.tif 000041