(57)【要約】  合成ＰＤ−１ペプチド、キメラＰＤ−１ペプチド、抗ＰＤ−１抗体、並びに当該ペプチド又は抗体を使用して癌、自己免疫疾患、及びアルツハイマー病を治療する方法が開示される。【選択図】図１８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＤ−１タンパク質に対する免疫応答を刺激するためのＰＤ−１キメラペプチドであって、前記ＰＤ−１キメラペプチドが、
１つ以上のＰＤ−１Ｂ細胞エピトープと、
Ｔヘルパー（Ｔｈ）エピトープと、
前記ＰＤ−１  Ｂ細胞エピトープを前記Ｔｈエピトープに接合するリンカーと、を含み、
前記１つ以上のＰＤ−１Ｂ細胞エピトープが、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５からなる群から選択される配列からなる、ＰＤ−１キメラペプチド。
【請求項２】
前記Ｔｈエピトープが、麻疹ウイルス融合タンパク質ペプチドを含む、請求項１に記載のキメラペプチド。
【請求項３】
前記Ｔｈエピトープが、配列番号６を含む、請求項１に記載のキメラペプチド。
【請求項４】
前記リンカーが、配列番号７を含む、請求項１に記載のキメラペプチド。
【請求項５】
前記ペプチドが、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、又は配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のキメラペプチド。
【請求項６】
配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、又は配列番号１５に記載の配列のうちの１つ以上を含む、ＰＤ−１タンパク質に対する免疫応答を刺激するための合成ＰＤ−１ペプチド。
【請求項７】
前記合成ＰＤ−１ペプチドを含むアミノ酸が、Ｄ体の鏡像異性体である、請求項６に記載の合成ペプチド。
【請求項８】
請求項６又は７に記載の１種以上の合成ペプチドを含むキメラペプチドであって、
Ｔｈエピトープと、
前記合成ＰＤ−１ペプチドを前記Ｔｈエピトープに接合するリンカーと、を更に含む、キメラペプチド。
【請求項９】
前記Ｔｈエピトープが、麻疹ウイルス融合タンパク質ペプチドを含む、請求項８に記載のキメラペプチド。
【請求項１０】
前記Ｔｈエピトープが、配列番号６を含む、請求項８に記載のキメラペプチド。
【請求項１１】
前記リンカーが、配列番号７を含む、請求項８に記載のキメラペプチド。
【請求項１２】
前記ペプチドが、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、又は配列番号１９に記載のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載のキメラペプチド。
【請求項１３】
前記ペプチドがアセチル化されている、請求項６又は７に記載の合成ペプチド。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の、１つ以上のキメラペプチド又は合成ペプチドと、
薬学的に許容されるビヒクルとを含む、医薬組成物。
【請求項１５】
１つ以上のＨＥＲ−２  Ｂ細胞エピトープを更に含む、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記ＨＥＲ−２  Ｂ細胞エピトープが、配列番号２７又は２９に記載の配列のうちの１つ以上を含む、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記ＨＥＲ−２  Ｂ細胞エピトープが、配列番号２８又は３０に記載される１つ以上の合成ＨＥＲ−２  Ｂ細胞エピトープを含む、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記ビヒクルが生分解性であり、かつ、
前記ビヒクルが、
製薬上許容できる油／水エマルションを含むエマルションと、
ポリラクチド−ポリグリコール酸ポリマーを含む生分解性ミクロスフェア又はナノスフィアと、からなる群から選択される、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載のキメラ又は合成ペプチドのいずれかに特異的に結合する抗体。
【請求項２０】
被検体における癌、アルツハイマー病、又は自己免疫疾患を治療する方法であって、
前記被検体に、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のペプチド又は組成物のいずれかを投与することを含む、方法。
【請求項２１】
被検体における癌、アルツハイマー病、又は自己免疫疾患を治療する方法であって、前記方法が、
前記被検体に、ＰＤ−１キメラペプチドを投与することを含み、
前記キメラペプチドが、
１つ以上のＰＤ−１  Ｂ細胞エピトープと、
Ｔヘルパー（Ｔｈ）エピトープと、
前記ＰＤ−１  Ｂ細胞エピトープを前記Ｔｈエピトープに接合させるリンカーとを含み、かつ
前記１つ以上のＰＤ−１  Ｂ細胞エピトープが、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５からなる群から選択される配列からなる、方法。
【請求項２２】
被検体における癌、アルツハイマー病、又は自己免疫疾患を治療する方法であって、前記方法が、
前記被検体に、ＰＤ−１合成ペプチドを投与することを含み、
前記ＰＤ−１合成ペプチドが、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、又は配列番号１５に記載の配列のうちの１つ以上を含む、方法。
【請求項２３】
前記癌が、リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉腫、ホジキン病、骨髄性白血病、膀胱癌、脳腫瘍、神経系癌、頭頚部癌、頭頚部扁平上皮癌、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経芽細胞腫、神経膠芽腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、肝臓癌、黒色癌、口腔、咽喉、喉頭、及び肺の扁平上皮癌、結腸癌、子宮頸癌、子宮頸癌種、乳癌、上皮癌、腎臓癌、泌尿生殖器癌、肺癌、食道癌、頭頚部癌種、大腸癌、造血性癌、精巣癌、前立腺癌、及び膵臓癌からなる癌群から選択される請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記癌が乳癌である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記被検体に、１つ以上のＨＥＲ−２  Ｂ細胞エピトープを投与することを更に含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＨＥＲ−２  Ｂ細胞エピトープが、配列番号２７又は２９に記載の配列のうちの１つ以上を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＨＥＲ−２  Ｂ細胞エピトープが、配列番号２８又は３０に記載の１つ以上の合成ＨＥＲ−２  Ｂ細胞エピトープを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＨＥＲ−２  Ｂ細胞エピトープが、前記ＰＤ−１エピトープと同じ組成物内で投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記自己免疫疾患が、乾癬、円形脱毛症、原発性胆汁性肝硬変、多腺性自己免疫症候群、劇症１型糖尿病、自己免疫甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、グレーブス病、シェーグレン症候群、潰瘍性大腸炎、自己免疫溶血性貧血、悪性貧血症、乾癬性関節炎、リウマチ性関節炎、再発性ポリコンドチン炎、筋腱炎、急性有害性脳脊髄炎、及び多発性血管炎を伴う肉芽腫症からなる群から選択される、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
今、癌は、先進国における、また世界全体における主要な死亡原因となっている。この疾患の財務的負担、より重要なことには、それが引き起こす苦しみはあまりにも大きいものがある。新たな、より有効な抗癌療法の開発及び適用を速める明白かつ緊急な必要性がある。腫瘍学の分野は膨大であり、いくつかの希少／希用薬を含むいくつかの指示薬を含む。腫瘍学は、薬物開発の観点から最も活性な領域のうちの１つであり続けているが、未だ満たされていない必要性が依然として存在する。
【０００２】
癌免疫学における最近の進歩は、ヒト癌に対するＴ細胞媒介抗腫瘍免疫の重要性を実証しており、Ｔ細胞によって発現される阻害受容体は、癌免疫療法の重要な標的となっている。免疫チェックポイントプログラム細胞死タンパク質−１（ＰＤ−１）を介してシグナル伝達することにより、抗腫瘍免疫応答を緩衝することによる腫瘍の進行を可能にする。ＰＤ−１とそのリガンド、すなわちプログラムされた細胞死リガンド−１（ＰＤ−Ｌ１）との間のシグナル伝達軸を、モノクローナル抗体を用いて治療的に遮断することは、癌の治療において顕著な臨床的成功を示し、疾患が進行した段階及び転移した段階であっても、癌サブタイプの広範なセットにわたって、印象的な活躍を示している。この経路を標的とする治療法は、現在臨床治験中である。ペンブロリズマブ及びニボルマブは、イピリムマブ不応性黒色腫の治療のための米国食品医薬品局（ＦＤＡ）からの迅速承認を得るための、チェックポイント阻害剤のこの抗ＰＤ−１経路ファミリーの第１のものである。
【０００３】
免疫学的チェックポイントを標的とするモノクローナル抗体、特にＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１軸は、近年、癌治療に目覚ましい成果をもたらしている。それらの証明された有用性にもかかわらず、抗体は、ＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達経路を標的化する際に特に関連し得る、不十分な組織／腫瘍浸透性を含めて、治療薬として特有の欠点を有する。例えば、ＰＤ−１発現エフェクターＴ細胞は、ＰＤ−Ｌ１発現腫瘍の固形組織内に浸潤したことが見出される。これは、それらの大きなサイズのために腫瘍内に入ることが妨げられる抗体にとっては問題である。したがって、抗体は、腫瘍内の意図された治療部位における、ＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達に完全には拮抗することができず、その効き目は最適とは言えないものとなる。
【０００４】
チェックポイントブロックは、癌に対する免疫療法における新たなパラダイムシフトを開始させるものである。しかしながら、多くの癌患者は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１チェックポイント遮断に応答しなかった。癌、ウイルス感染症、自己免疫疾患、及びアルツハイマー病の治療のための新たなＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１チェックポイント阻害剤が必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
合成ＰＤ−１ペプチドに関連する方法及び組成物が開示される。
【０００６】
一態様では、本明細書では、ＰＤ−１タンパク質に対する免疫応答を刺激するためのＰＤ−１キメラペプチドが開示され、そのＰＤ−１キメラペプチドは、１つ以上のＰＤ−１のＢ細胞エピトープと、Ｔヘルパー（Ｔｈ）エピトープ（例えば、配列番号６などの麻疹ウイルス融合タンパク質ペプチド）と、ＰＤ−１のＢ細胞エピトープをＴｈエピトープに接合するリンカー（例えば、配列番号７など）とを含み、１つ以上のＰＤ−１のＢ細胞エピトープが、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５からなる群から選択される配列からなるものである。
【０００７】
また、本明細書では、ペプチドが、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、又は配列番号１１に記載されるアミノ酸配列を含む、前述の態様のいずれかのキメラペプチドも開示される。
【０００８】
一態様では、本明細書に開示されるのは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、又は配列番号１５に記載される配列のうちの１つ以上を含む、ＰＤ−１タンパク質に対する免疫応答を刺激するための合成ＰＤ−１ペプチドである。一態様では、合成ペプチドは、アセチル化されているものであり得る。
【０００９】
また、本明細書では、Ｔｈエピトープ（例えば、配列番号６などの麻疹ウイルス融合タンパク質ペプチド）と、合成ＰＤ−１ペプチドをＴｈエピトープに接合するリンカー（例えば、配列番号７など）とを更に含む、前述の態様のいずれかに記載の合成ペプチドを含むキメラペプチドも開示される。
【００１０】
また、本明細書では、ペプチドが、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、又は配列番号１９に記載のアミノ酸配列を含む、前述の態様のいずれかに記載のキメラペプチドも開示される。
【００１１】
一態様では、前述の態様のいずれかの、１つ以上のキメラペプチド又は合成ペプチドと、薬学的に許容されるビヒクルとを含む医薬組成物が本明細書に開示される。
【００１２】
また、１つ以上のＨＥＲ−２のＢ細胞エピトープ（例えば、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、又は配列番号３０）及び／又は１つ以上の抗ＨＥＲ−２抗体を更に含む、前述の態様のいずれかの医薬組成物も開示される。
【００１３】
一態様では、本明細書に開示されるのは、被検体の癌、アルツハイマー病、又は自己免疫疾患を治療する方法であって、前述の態様のいずれかのペプチド又は組成物のいずれかを被検体に投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
本明細書に組み込まれ、また本明細書の一部を構成する添付の図面は、いくつかの実施形態を例証し、説明と共に、開示される組成物及び方法を例証する。
【００１５】
【図１Ａ】ｈＰＤ−１／ｈＰＤ−Ｌ１インタフェースの拡大図を示し、ｈＰＤ−１及びｈＰＤ−Ｌ１をそれぞれ青色及び緑色リボンによって表している図である。相互作用に重要な全ての残基は、スティックとして強調されている。疎水性コアを形成する残基は、黄色に着色されている。水分子は、赤色球体として示されている。水素結合は、黒色の破線で示されている。正面図（出典：Ｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２３，２３４１−２３４８）。
【図１Ｂ】ｈＰＤ−１／ｈＰＤ−Ｌ１インタフェースの拡大図を示し、ｈＰＤ−１及びｈＰＤ−Ｌ１をそれぞれ青色及び緑色リボンによって表している図である。相互作用に重要な全ての残基は、スティックとして強調されている。疎水性コアを形成する残基は、黄色に着色されている。水分子は、赤色球体として示されている。水素結合は、黒色の破線で示されている。ＰＤ−１ペプチドをモデル化したもの。
【００１６】
【図２Ａ】立体構造エピトープとしてのＰＤ−１ペプチドをモデリングしたものを示す図である。ＰＤ−１（３２−５０）（配列番号２）を示す図である。
【図２Ｂ】立体構造エピトープとしてのＰＤ−１ペプチドをモデリングしたものを示す図である。ＰＤ−１（７３−９０）（配列番号４）を示す図である。
【図２Ｃ】立体構造エピトープとしてのＰＤ−１ペプチドをモデリングしたものを示す図である。ＰＤ−１（９２−１１０）（配列番号５）を示す図である。
【００１７】
【図３Ａ】ヒトｈＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインに対する結合実験のための表面プラズモン共鳴分光法による図を示す。ｒｈＰＤ−Ｌ１に対して得られた固定化レベルは、２３４５ＲＵである。
【図３Ｂ】ヒトｈＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインに対する結合実験のための表面プラズモン共鳴分光法による図を示す。ニボルマブに対して得られた固定化レベルは、１２２６４ＲＵである。
【図３Ｃ】ヒトｈＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインに対する結合実験のための表面プラズモン共鳴分光法による図を示す。ヒトＩｇＧに対して得られた固定化レベルは、１１６５１ＲＵである。
【図３Ｄ】ヒトｈＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインに対する結合実験のための表面プラズモン共鳴分光法による図を示す。センサチップの妥当性検証は、ｆｈＰＤ−１及びニボルマブ結合の特異性を測定することによって示された。１μＭ（１７．３μｇ／ｍｌ）のｒｈＰＤ−１を１０μＬ／分で３分間、チップ上に導入した。１μＭのＢＳＡが、陰性対照として用いられた。
【図３Ｅ】ヒトｈＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインに対する結合実験のための表面プラズモン共鳴分光法による図を示す。センサチップの妥当性検証は、ｆｈＰＤ−１及びニボルマブ結合の特異性を測定することによって示された。１μＭ（１７．３μｇ／ｍｌ）のｒｈＰＤ−１を１０μＬ／分で３分間、チップ上に導入した（図３Ｄ）。１μＭのＢＳＡが、陰性対照として用いられた。チップを、１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．５によって再生した。
【００１８】
【図４Ａ】ＭＶＦペプチド及びアセチル化ペプチドが、ｒｈＰＤ−Ｌ１及びニボルマブに結合するのを示している図である。ＭＶＦ−ＰＤ−１（４５−６４）、ＭＶＦ−ＰＤ−１（７３−９０）、及びＭＶＦ−ＰＤ−１（９２−１１０）は固定化されたｒｈＰＤ−Ｌ１に結合する。
【図４Ｂ】ＭＶＦペプチド及びアセチル化ペプチドが、ｒｈＰＤ−Ｌ１及びニボルマブに結合するのを示している図である。ＭＶＦ−ＰＤ−１（４５−６４）、ＭＶＦ−ＰＤ−１（７３−９０）、及びＭＶＦ−ＰＤ−１（９２−１１０）は固定化されたニボルマブに結合する。
【図４Ｃ】ＭＶＦペプチド及びアセチル化ペプチドが、ｒｈＰＤ−Ｌ１及びニボルマブに結合するのを示している図である。Ａｃ−ＰＤ−１（４５−６４）、Ａｃ−ＰＤ−１（７３−９０）、及びＡｃ−ＰＤ−１（９２−１１０）は、固定化ｒｈＰＤ−Ｌ１に結合する。
【図４Ｄ】ＭＶＦペプチド及びアセチル化ペプチドが、ｒｈＰＤ−Ｌ１及びニボルマブに結合するのを示している図である。Ａｃ−ＰＤ−１（４５−６４）、Ａｃ−ＰＤ−１（７３−９０）、及びＡｃ−ＰＤ−１（９２−１１０）は、固定化ｒｈＰＤ−Ｌ１に結合する。
【図４Ｅ】ＭＶＦペプチド及びアセチル化ペプチドが、ｒｈＰＤ−Ｌ１及びニボルマブに結合するのを示している図である。Ａｃ−ＰＤ−１（４５−６４）、Ａｃ−ＰＤ−１（７３−９０）、及びＡｃ−ＰＤ−１（９２−１１０）は、固定化ニボルマブに結合する。
【図４Ｆ】ＭＶＦペプチド及びアセチル化ペプチドが、ｒｈＰＤ−Ｌ１及びニボルマブに結合するのを示している図である。Ａｃ−ＰＤ−１（４５−６４）、Ａｃ−ＰＤ−１（７３−９０）、及びＡｃ−ＰＤ−１（９２−１１０）は、固定化ニボルマブに結合する。
【００１９】
【図５Ａ】ＭＶＦペプチドの２００ｎｇ／ウェル上で、１番目（１Ｙ＋３）、３番目（２Ｙ＋３）、及び６番目（３Ｙ＋３）の試験出血を、ＥＬＩＳＡで試験した結果を示す図である。血清を最初に１：２０００に希釈し、次いでプレートを最大１：２５０，０００まで連続的に希釈した。アッセイにおいて、ＡＢＴＳを基質として使用した。力価は、４１５λで読み取ったときに０．２００を超える吸光度を有した最後の希釈物として定義した。
【００２０】
【図５Ｂ】様々なペプチド構築体（ＭＶＦペプチド、アセチル化ペプチド、遊離ペプチド、及び組換えヒトＰＤ−１タンパク質）の２００ｎｇ／ウェルに対して、終末血清をＥＬＩＳＡにより試験した結果を示す図である。血清を最初に１：２０００に希釈し、次いでプレートを最大１：２５０，０００まで連続的に希釈した。アッセイにおいて、ＡＢＴＳを基質として使用した。力価は、４１５λで読み取ったときに０．２００を超える吸光度を有した最後の希釈物として定義した。
【００２１】
【図５Ｃ】２００ｎｇ／ウェルのペプチドに対して、末端血清から精製された抗体を、ＥＬＩＳＡによって試験した結果を示す図である。抗体を最初に２０μｇ／ｍｌに希釈し、次いでプレートを最大６２５ｎｇ／ｍｌまで連続的に希釈した。アッセイにおいて、ＡＢＴＳを基質として使用した。力価は、４１５λで読み取ったときに０．２００を超える吸光度を有した最後の希釈物として定義した。
【００２２】
【図６】ナイーブＴＣＲ遺伝子導入マウスからの脾細胞を、ＭＢＰ  Ａｃ１−１１で３日間、活性化した結果を示す図である。ＰＤ−１発現は、フローサイトメトリーによって決定した。細胞を、標識されたα−ｍＰＤ−１又はα−ｈＰＤ−１抗体で染色した。細胞をＣＤ４＋Ｔ細胞上でゲーティングした。
【００２３】
【図７】精製されたα−ｈＰＤ−１ポリクローナル抗体が、ミエリン特異的ＣＤ４Ｔ細胞の、抗原特異的増殖を変化させるのを示す図である。（Ａ）ナイーブＴＣＲ遺伝子導入マウスからの脾細胞をＣＦＳＥで標識し、５０ｍｇ／ｍｌのαｈＰＤ−１抗体又は対照例としてのウサギＩｇＧの存在下で、ＭＢＰ  Ａｃ１−１１を用いて４日間活性化した。細胞をＣＤ４＋細胞上でゲーティングした。（Ｂ）特異性αｈＰＤ−１抗体（青色）で処理した細胞のＣＦＳＥヒストグラムを、（Ａ）の対照ウサギＩｇＧ（赤色）で処理したものと重ね合わせた。
【００２４】
【図８】マウスのワクチン接種及び腫瘍移植のスキームを示す図である。マウスは、３週間間隔で、合計３回のワクチン接種を受けた。３回目のワクチン接種の１０日後に、マウスに、１×１０５マウス結腸癌ＣＴ２６腫瘍細胞を、右脇腹皮下に抗原として投与した。対照例のマウスにＣＴ２６細胞株を接種し、マウスｐＤ−１モノクローナル抗体で３日毎に処理した。
【００２５】
【図９】ＰＤ−１ワクチンの免疫原性を示す図である。血清プールを、２００ｎｇ／ウェルのＭＶＦペプチド上で、ＥＬＩＳＡにより試験した。１：１００〜１：２５０，０００の血清濃度を試験した。アッセイにおいて、ＡＢＴＳを基質として使用した。力価は、４１５λで読み取ったときに０．２００を超える吸光度を有した最後の希釈物として定義した。
【００２６】
【図１０】脾細胞（Ａ）及び腫瘍浸潤細胞（Ｂ）を、処置されたマウスの全ての５つのグループから単離したことを示す図である。ＣＤ４及びＣＤ８細胞を、フローサイトメトリー（ＣＤ４５＋ＣＤ３＋細胞でゲーティング）により決定した。Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ２５＋ＣＤ４の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、細胞内染色によって決定された。全てのＣＤ４及びＣＤ８のＴ細胞を、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋細胞上でゲーティングした。Ｔｒｅｇを、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋の細胞でゲーティングした。グループＡ＝対照ペプチド、グループＢ＝３２−５０；グループＣ＝４５−６４；グループＤ＝７３−９０；グループＥ＝９２−１１０；グループＦ＝α−マウスＰＤ−１（陽性対照）。
【００２７】
【図１１Ａ】４つのＰＤ−１構築体（Ａ：ＰＤ−１（３２−５０）、Ｂ：ＰＤ−１（４５−６４）、Ｃ：ＰＤ−１（７３−９０）、及びＤ：ＰＤ−１（９２−１１０）、対照ペプチド（Ｅ：無関係ペプチド）のそれぞれで免疫化したＢａｌｂ／ｃマウス（５／グループ）、及び抗マウスＰＤ−１モノクローナル抗体で処理した陽性対照グループ（Ｆ）における腫瘍増殖を、個々にプロットしたものを示す図である。Ｇ及びＨは、同一遺伝子のＢａｌｂ／ｃマウスにおいて、ＰＤ−１ワクチン構築体で免疫化し、３回目のワクチン接種の１０日後に、ＣＴ２６癌腫細胞（１×１０５）を投与した結果を、個々にプロットしたものを示す図である。腫瘍マウスをモニタリングし、触知可能な腫瘍のスコア化を週２回行い、１９日目に屠殺した。
【図１１Ｂ】４つのＰＤ−１構築体（Ａ：ＰＤ−１（３２−５０）、Ｂ：ＰＤ−１（４５−６４）、Ｃ：ＰＤ−１（７３−９０）、及びＤ：ＰＤ−１（９２−１１０）、対照ペプチド（Ｅ：無関係ペプチド）のそれぞれで免疫化したＢａｌｂ／ｃマウス（５／グループ）、及び抗マウスＰＤ−１モノクローナル抗体で処理した陽性対照グループ（Ｆ）における腫瘍増殖を、個々にプロットしたものを示す図である。Ｇ及びＨは、同一遺伝子のＢａｌｂ／ｃマウスにおいて、ＰＤ−１ワクチン構築体で免疫化し、３回目のワクチン接種の１０日後に、ＣＴ２６癌腫細胞（１×１０５）を投与した結果を、個々にプロットしたものを示す図である。腫瘍マウスをモニタリングし、触知可能な腫瘍のスコア化を週２回行い、１９日目に屠殺した。
【図１１Ｃ】４つのＰＤ−１構築体（Ａ：ＰＤ−１（３２−５０）、Ｂ：ＰＤ−１（４５−６４）、Ｃ：ＰＤ−１（７３−９０）、及びＤ：ＰＤ−１（９２−１１０）、対照ペプチド（Ｅ：無関係ペプチド）のそれぞれで免疫化したＢａｌｂ／ｃマウス（５／グループ）、及び抗マウスＰＤ−１モノクローナル抗体で処理した陽性対照グループ（Ｆ）における腫瘍増殖を、個々にプロットしたものを示す図である。Ｇ及びＨは、同一遺伝子のＢａｌｂ／ｃマウスにおいて、ＰＤ−１ワクチン構築体で免疫化し、３回目のワクチン接種の１０日後に、ＣＴ２６癌腫細胞（１×１０５）を投与した結果を、個々にプロットしたものを示す図である。腫瘍マウスをモニタリングし、触知可能な腫瘍のスコア化を週２回行い、１９日目に屠殺した。
【図１１Ｄ】４つのＰＤ−１構築体（Ａ：ＰＤ−１（３２−５０）、Ｂ：ＰＤ−１（４５−６４）、Ｃ：ＰＤ−１（７３−９０）、及びＤ：ＰＤ−１（９２−１１０）、対照ペプチド（Ｅ：無関係ペプチド）のそれぞれで免疫化したＢａｌｂ／ｃマウス（５／グループ）、及び抗マウスＰＤ−１モノクローナル抗体で処理した陽性対照グループ（Ｆ）における腫瘍増殖を、個々にプロットしたものを示す図である。Ｇ及びＨは、同一遺伝子のＢａｌｂ／ｃマウスにおいて、ＰＤ−１ワクチン構築体で免疫化し、３回目のワクチン接種の１０日後に、ＣＴ２６癌腫細胞（１×１０５）を投与した結果を、個々にプロットしたものを示す図である。腫瘍マウスをモニタリングし、触知可能な腫瘍のスコア化を週２回行い、１９日目に屠殺した。
【図１１Ｅ】４つのＰＤ−１構築体（Ａ：ＰＤ−１（３２−５０）、Ｂ：ＰＤ−１（４５−６４）、Ｃ：ＰＤ−１（７３−９０）、及びＤ：ＰＤ−１（９２−１１０）、対照ペプチド（Ｅ：無関係ペプチド）のそれぞれで免疫化したＢａｌｂ／ｃマウス（５／グループ）、及び抗マウスＰＤ−１モノクローナル抗体で処理した陽性対照グループ（Ｆ）における腫瘍増殖を、個々にプロットしたものを示す図である。Ｇ及びＨは、同一遺伝子のＢａｌｂ／ｃマウスにおいて、ＰＤ−１ワクチン構築体で免疫化し、３回目のワクチン接種の１０日後に、ＣＴ２６癌腫細胞（１×１０５）を投与した結果を、個々にプロットしたものを示す図である。腫瘍マウスをモニタリングし、触知可能な腫瘍のスコア化を週２回行い、１９日目に屠殺した。
【図１１Ｆ】４つのＰＤ−１構築体（Ａ：ＰＤ−１（３２−５０）、Ｂ：ＰＤ−１（４５−６４）、Ｃ：ＰＤ−１（７３−９０）、及びＤ：ＰＤ−１（９２−１１０）、対照ペプチド（Ｅ：無関係ペプチド）のそれぞれで免疫化したＢａｌｂ／ｃマウス（５／グループ）、及び抗マウスＰＤ−１モノクローナル抗体で処理した陽性対照グループ（Ｆ）における腫瘍増殖を、個々にプロットしたものを示す図である。Ｇ及びＨは、同一遺伝子のＢａｌｂ／ｃマウスにおいて、ＰＤ−１ワクチン構築体で免疫化し、３回目のワクチン接種の１０日後に、ＣＴ２６癌腫細胞（１×１０５）を投与した結果を、個々にプロットしたものを示す図である。腫瘍マウスをモニタリングし、触知可能な腫瘍のスコア化を週２回行い、１９日目に屠殺した。
【図１１Ｇ】４つのＰＤ−１構築体（Ａ：ＰＤ−１（３２−５０）、Ｂ：ＰＤ−１（４５−６４）、Ｃ：ＰＤ−１（７３−９０）、及びＤ：ＰＤ−１（９２−１１０）、対照ペプチド（Ｅ：無関係ペプチド）のそれぞれで免疫化したＢａｌｂ／ｃマウス（５／グループ）、及び抗マウスＰＤ−１モノクローナル抗体で処理した陽性対照グループ（Ｆ）における腫瘍増殖を、個々にプロットしたものを示す図である。Ｇ及びＨは、同一遺伝子のＢａｌｂ／ｃマウスにおいて、ＰＤ−１ワクチン構築体で免疫化し、３回目のワクチン接種の１０日後に、ＣＴ２６癌腫細胞（１×１０５）を投与した結果を、個々にプロットしたものを示す図である。腫瘍マウスをモニタリングし、触知可能な腫瘍のスコア化を週２回行い、１９日目に屠殺した。
【図１１Ｈ】４つのＰＤ−１構築体（Ａ：ＰＤ−１（３２−５０）、Ｂ：ＰＤ−１（４５−６４）、Ｃ：ＰＤ−１（７３−９０）、及びＤ：ＰＤ−１（９２−１１０）、対照ペプチド（Ｅ：無関係ペプチド）のそれぞれで免疫化したＢａｌｂ／ｃマウス（５／グループ）、及び抗マウスＰＤ−１モノクローナル抗体で処理した陽性対照グループ（Ｆ）における腫瘍増殖を、個々にプロットしたものを示す図である。Ｇ及びＨは、同一遺伝子のＢａｌｂ／ｃマウスにおいて、ＰＤ−１ワクチン構築体で免疫化し、３回目のワクチン接種の１０日後に、ＣＴ２６癌腫細胞（１×１０５）を投与した結果を、個々にプロットしたものを示す図である。腫瘍マウスをモニタリングし、触知可能な腫瘍のスコア化を週２回行い、１９日目に屠殺した。
【００２８】
【図１２Ａ】ＭＶＦ−ＰＤ−１（３２−５０）、ＭＶＦ−ＰＤ−１（４５−６４）、ＭＶＦ−ＰＤ−１（７３−９０）、及びＭＶＦ−ＰＤ−１（９２−１１０）について、ＬＷＷ及びＬＷＨの分布を１４日目に測定した結果を示す図である。ＭＶＦ−ＰＤ−１（９２−１１０）のＬＷＷが示されている。
【図１２Ｂ】ＭＶＦ−ＰＤ−１（３２−５０）、ＭＶＦ−ＰＤ−１（４５−６４）、ＭＶＦ−ＰＤ−１（７３−９０）、及びＭＶＦ−ＰＤ−１（９２−１１０）について、ＬＷＷ及びＬＷＨの分布を１４日目に測定した結果を示す図である。ＭＶＦ−ＰＤ−１（９２−１１０）のＬＷＨが示されている。
【図１２Ｃ】ＭＶＦ−ＰＤ−１（３２−５０）、ＭＶＦ−ＰＤ−１（４５−６４）、ＭＶＦ−ＰＤ−１（７３−９０）、及びＭＶＦ−ＰＤ−１（９２−１１０）について、ＬＷＷ及びＬＷＨの分布を１４日目に測定した結果を示す図である。ＭＶＦ−ＰＤ−１（３２−５０）、ＭＶＦ−ＰＤ−１（４５−６４）、ＭＶＦ−ＰＤ−１（７３−９０）、及びＭＶＦ−ＰＤ−１（９２−１１０）のそれぞれによるＬＷＷ１４の分布を示す図である。
【図１２Ｄ】ＭＶＦ−ＰＤ−１（３２−５０）、ＭＶＦ−ＰＤ−１（４５−６４）、ＭＶＦ−ＰＤ−１（７３−９０）、及びＭＶＦ−ＰＤ−１（９２−１１０）について、ＬＷＷ及びＬＷＨの分布を１４日目に測定した結果を示す図である。ＭＶＦ−ＰＤ−１（３２−５０）、ＭＶＦ−ＰＤ−１（４５−６４）、ＭＶＦ−ＰＤ−１（７３−９０）、及びＭＶＦ−ＰＤ−１（９２−１１０）のそれぞれによるＬＷＨ１４の分布を示す図である。
【００２９】
【図１３Ａ】αｈＰＤ１−４５及びαｈＰＤ１−７３が、ミエリン特異的増殖を抑制するのを示す図である。ＭＢＰ  Ａｃ１−１１に特異的な、ナイーブＶα２．３／Ｖβ８．２のＴＣＲ遺伝子導入マウスからのＣＦＳＥ標識脾細胞を、５０μｇ／ｍｌのαｈＰＤ−１抗体又は対照ウサギＩｇＧの存在下でＭＢＰ  Ａｃ１−１１で活性化した。ＣＦＳＥをフローサイトメトリーにより分析した。
【図１３Ｂ】αｈＰＤ１−４５及びαｈＰＤ１−７３が、ミエリン特異的増殖を抑制するのを示す図である。ＭＢＰ  Ａｃ１−１１に特異的な、ナイーブＶα２．３／Ｖβ８．２のＴＣＲ遺伝子導入マウスからのＣＦＳＥ標識脾細胞を、５０μｇ／ｍｌのαｈＰＤ−１抗体又は対照ウサギＩｇＧの存在下でＭＢＰ  Ａｃ１−１１で活性化した。細胞をＣＤ４＋細胞上でゲーティングした。増殖の生成あたりの細胞の量をまとめた。
【００３０】
【図１４】ＰＤ−１ワクチンの免疫原性を示す。プールした血清を、２００ｎｇ／ウェルのＭＶＦペプチド上で、ＥＬＩＳＡにより試験した。１：１００〜１：２５０，０００の血清濃度を試験した。力価は、
【数１】
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で読み取った値が、０．２００を超える吸光度を有した最後の希釈物として定義した。
【００３１】
【図１５】４つのＰＤ−１  ＭＶＦワクチン構築体、Ａ：ＰＤ−１（３２−５０）、Ｂ：ＰＤ−１（４５−６４）、Ｃ：ＰＤ−１（７３−９０）、及びＤ：ＰＤ−１（９２−１１０）と、Ｅ：−ｖｅ対照例（無関係のペプチド）、及びＦ：＋ｖｅ対照例抗マウスＰＤ−１モノクローナル抗体（２９Ｆ．１Ａ１２）で免疫化した、同一遺伝子のＢａｌｂ／ｃマウス（５／ｇｐｓ）の腫瘍成長の平均をプロットしたものを示す図である。３回目のワクチン接種の１５日後に、ＣＴ２６癌細胞（１×１０５）をマウスに抗原として投与した。マウスをモニタリングし、触知可能な腫瘍の形成についてスコア化し、週に２回、腫瘍を、キャリパーを使用して測定した。１９日目に動物を屠殺した。
【００３２】
【図１６】ＢＡＬＢ／ｃにおけるワクチン接種と、その後のＣＴ２６／ＨＥＲ−２癌細胞の抗原投与との組み合わせのスケジュールを示す図である。Ｂａｌｂ／ｃにおけるＣＴ−２６−ＨＥＲ−２腫瘍モデルを使用して、抗ＨＥＲ２免疫療法と組み合わせた抗ＰＤ１免疫療法の相乗効果を試験した。ペプチドワクチンは、注記されているように、単独で、又は組み合わせて与えられた。ワクチンは、水に溶解させ、ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（商標）ＩＳＡ  ７２０（１：１）及び５０μｇのノル−ＭＤＰ（Ｎ−アセチルグルコサミン−３イル−アセチル−ｌ−アラニル−ｄ−イソグルタミン）で乳化させた。マウスは、３週間間隔で、合計３回のワクチン接種を受けた。５〜６週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓより入手）を、各ペプチドワクチンを１００μｇの各ペプチドワクチンで３週間間隔で３回免疫化し、３回目の免疫化の２週間後に、マウスに対して、ＣＴ−２６−ＨＥＲ−２のｎｅｕ腫瘍細胞（マウス１個体あたり、１×１０５個の細胞）を皮下（ｓ．ｃ）で、抗原として投与した。抗マウスＰＤ−１  ＭＡｂ  ２９Ｆ．１Ａ１２（Ｂｉｏ  Ｘ  Ｃｅｌｌ，Ｗｅｓｔ  Ｌｅｂａｎｏｎ，ＮＨより入手）を１回あたり２００μｇ用いて、週２回処置したＢａｌｂ／ｃマウスを陽性対照として使用し、また、リン酸緩衝塩類溶液（ｐｂｓ）を使用して処置したＢａｌｂ／ｃマウスを陰性対照として使用した。マウスをモニタリングし、週に２回、２１日目まで、触知可能な腫瘍の形成についてスコア化した。腫瘍が壊死したか、又は所定の大きさ２，０００ｍｍ３を超えた場合には、マウスを屠殺した。腫瘍体積をキャリパーで立方ミリメートル単位で測定し、式Ａ×Ｂ２×０．５（式中、Ａは最大直径であり、Ｂは最小直径である）で計算した。  Ｖ＝［（長さ×幅２）／２］。  免疫化中、血液を隔週で採取し、ＥＬＩＳＡで使用して、Ａｂ力価をモニタリングした。処置終了時にマウスを安楽死させ、腫瘍を摘出し、腫瘍の試料を計量の上で、更なる試験及び組織学的検査のために保存した。また、更なる検査のために脾臓も回収した。全ての実験は、米国公衆衛生局の実験動物の人道的な取り扱いに関する政策（U.S.Public Health Service Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animals）に準拠して行われ、かつオハイオ州立大学の施設内における動物の取り扱いに関する委員会（Ohio State University Institutional Animals Care and Use Committee）により承認され、その詳細は、受理されたプロトコルに記載されている。
【００３３】
【図１７】３種ワクチン投与処置されたマウスにおける、個々の抗原の免疫原性を示す図である。３種類のペプチド（ＨＥＲ−２（２６６−２９６）、ＨＥＲ−２（５９７−６２６）、及びＰＤ−１（９２−１１０））で免疫したマウスからの血清プールを、２００ｎｇ／ウェルのＭＶＦペプチド上で、ＥＬＩＳＡにより試験した。１：１００〜１：５１２，０００の血清濃度を試験した。アッセイにおいて、ＡＢＴＳを基質として使用し、０．１％のＳＤＳ溶液を用いて、１０分後に酵素反応を停止させた。力価は、４１５ｎｍで読み取ったときに０．２００を超える吸光度を有した最後の希釈物として定義した。血清サンプル１Ｙ＋３、２Ｙ＋１、２Ｙ＋３、及び３Ｙ＋２を、ＣＴ−２６  ＨＥＲ−２のｎｅｕ腫瘍の抗原投与前に採取した。試料３Ｙ＋３及び３Ｙ＋５を、それぞれ抗原投与の１週間後及び３週間後にそれぞれ採取した。
【００３４】
【図１８】ＨＥＲ−２（２６６）＋ＨＥＲ−２（５９７）＋ＰＤ−１（９２）の３種ワクチン接種が、陽性対照α−マウスＰＤ−１ｍＡｂ（２９Ｆ．１Ａ１２）、ＭＶＦ−ＰＤ−１（９２−１１０）、及び陰性対照ＰＢＳ又は無関係のペプチドと比較して、結腸癌細胞株ＣＴ２６／ＨＥＲ−２を抗原として投与したＢＡＬＢ／ｃにおいて、腫瘍成長を有意に（ｐ＜０．００１）阻害していることを示す図である。
【００３５】
【図１９Ａ】ＨＥＲ−２及びＰＤ−１ワクチンの組み合わせが、免疫原性の強化及び腫瘍成長の阻害性強化を示すことを示す図である。３週間間隔で３回、同一遺伝子のＢａｌｂ／ｃマウス（１０／ｇｐｓ）を、ＰＤ−１（９２−１１０）のみで免疫化したもの、２種類のＨＥＲ−２ペプチド免疫原と組み合わせて免疫化したもの、又はＨＥＲ−２免疫原のみで免疫化したものを用意し、それらの同一遺伝子のＢａｌｂ／ｃマウス（１０／ｇｐｓ）における腫瘍成長をプロットしている。３回目のワクチン接種の１５〜１８日後に、ＣＴ−２６  ＨＥＲ−２癌細胞（１×１０５）を、マウスに抗原として投与した。ＰＢＳ（陰性対照）に、腫瘍を抗原として投与し、週に２回ＰＢＳの腹腔内投与で処置した。マウスをモニタリングし、触知可能な腫瘍の形成についてスコア化した後、キャリパーを使用して定期的に測定した。エラーバーは、マウスのグループの標準誤差を表現したものであり、ｐ値は、陰性対照であるＰＢＳ処置マウスに対して、様々なグループを比較するものである。
【図１９Ｂ】ＨＥＲ−２及びＰＤ−１ワクチンの組み合わせが、免疫原性の強化及び腫瘍成長の阻害性強化を示すことを示す図である。３週間間隔で３回、同一遺伝子のＢａｌｂ／ｃマウス（１０／ｇｐｓ）を、ＰＤ−１（９２−１１０）のみで免疫化したもの、２種類のＨＥＲ−２ペプチド免疫原と組み合わせて免疫化したもの、又はＨＥＲ−２免疫原のみで免疫化したものを用意し、それらの同一遺伝子のＢａｌｂ／ｃマウス（１０／ｇｐｓ）における腫瘍成長をプロットしている。３回目のワクチン接種の１５〜１８日後に、ＣＴ−２６  ＨＥＲ−２癌細胞（１×１０５）を、マウスに抗原として投与した。ＰＢＳ（陰性対照）に、腫瘍を抗原として投与し、週に２回ＰＢＳの腹腔内投与で処置した。マウスをモニタリングし、触知可能な腫瘍の形成についてスコア化した後、キャリパーを使用して定期的に測定した。エラーバーは、マウスのグループの標準誤差を表現したものであり、ｐ値は、陰性対照であるＰＢＳ処置マウスに対して、様々なグループを比較するものである。
【００３６】
【図２０】Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤは、４つのグループにおいて、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬｓ）が各マウスから単離されたことを示す図である。ＣＤ４（Ａ）及びＣＤ８（Ｂ）のＴ細胞を、フローサイトメトリー（ＣＤ４５＋細胞でゲーティング）によって決定した。Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ２５＋ＣＤ４のＴｒｅｇ（０Ｃ）を、細胞内染色（ＣＤ４５＋ＣＤ４＋細胞でゲーティング）により決定した。Ｄは、Ｔｒｅｇグループ平均値に対するＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を計算し、分散分析で比較したものを示す図である。
【００３７】
【図２１Ａ】ペプチドワクチン接種マウスから採取した腫瘍浸潤リンパ球の分析を示す図である。第１の生体内実験並びにグループ５及び６からのデータと、第２の生体内実験からのデータとを組み合わせたデータを示す図である。第１の生体内実験において処置されたマウスの５つのグループ（グループＡ〜Ｆ）から組み合わせた腫瘍組織から、腫瘍浸潤細胞を単離した。第２の生体内実験からのグループ５及びグループ６の各マウスから、腫瘍浸潤細胞を単離した。ＣＤ４及びＣＤ８細胞は、フローサイトメトリー（ＣＤ４５＋浸潤細胞でゲーティング）によって決定された。ＣＤ２５＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞上のＦｏｘＰ３発現は、組織内染色（ＣＤ４５＋ＣＤ４＋細胞でゲーティング）により決定した。
【図２１Ｂ】ペプチドワクチン接種マウスから採取した腫瘍浸潤リンパ球の分析を示す図である。第２の生体内実験からのグループ１〜４の各マウスから、腫瘍浸潤細胞を単離したことを示す図である。ＣＤ４及びＣＤ８細胞は、フローサイトメトリー（ＣＤ４５＋浸潤細胞でゲーティング）によって決定された。ＣＤ２５＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞上のＦｏｘＰ３発現は、組織内染色（ＣＤ４５＋ＣＤ４＋細胞でゲーティング）により決定した。グループ平均を計算し、分散分析で比較した。エラーバーは、平均値の標準誤差を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明の化合物、組成物、物品、デバイス及び／又は方法を開示及び説明する前に、特に指定されない限り、これらが特定の合成法又は特定の組換えバイオテクノロジー方法に限定されないこと、又は、特に指定されない限り、特定の試薬に限定されず、当然ながらそれ自体が変化してもよいことを理解されたい。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明するための目的のものにすぎず、限定することを意図しないことも理解するべきである。
Ａ．定義
【００３９】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、その内容について別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を包含する。したがって、例えば、「医薬担体」への言及は、２つ以上のこのような担体の混合物などを含む。
【００４０】
範囲は、「約」１つの特定の値から、かつ／又は「約」別の特定の値までとして表され得る。このような範囲が表されるとき、別の実施形態は、１つの特定の値から、かつ／又は他の特定の値までを含む。同様に、値が、先行詞「約」の使用によって近似として表されるとき、特定の値は、別の実施形態を形成することが理解されるであろう。範囲のそれぞれの端点は、他の端点に関しても、他の端点とは独立しても、この両方において、有意であると更に理解されるであろう。本明細書で多くの値が開示され、それぞれの値がその値自体に加えて「約」その特定の値として本明細書でもまた開示されることもまた理解される。例えば、値「１０」が開示されている場合、「約１０」もまた開示されている。当業者によって適切に理解されるように、ある値が開示される場合、その値「以下」、「その値以上」及び値間の可能な範囲もまた開示されていることもまた理解される。例えば、値「１０」が開示されている場合、「１０以下」と同様に「１０以上」もまた開示されている。本願全体にわたってデータが多数の異なるフォーマットで提供され、このデータが、端点及び開始点並びにデータ点の任意の組み合わせに対する範囲を表すこともまた理解される。例えば、特定のデータポイント「１０」及び特定のデータポイント１５が開示されている場合、１０と１５との間と同様に、１０及び１５よりも大きい、１０及び１５以上、１０及び１５未満、１０及び１５以下、並びに１０及び１５に等しいデータポイントが開示されていると見なされることが理解される。特定の２つの単位間のそれぞれの単位もまた開示されていることもまた理解される。例えば、１０及び１５が開示されている場合、１１、１２、１３、及び１４もまた開示されている。
【００４１】
本明細書及び以下の「特許請求の範囲」において、多数の用語に言及し、それらは以下の意味を有すると定義されるものとする。
【００４２】
「任意選択的な」又は「任意選択的に」は、引き続いて記載された事象又は状況が起こってもよいかあるいは起こらなくてもよいこと、及び説明が、当該事象又は状況が起こる場合の例及びそれが起こらない場合の例を含むことを意味する。
【００４３】
用語「投与」は、経口、局所、静脈内、皮下、経皮（transcutaneous）、経皮（transdermal）、筋肉内、関節内、非経口、細動脈内、皮内、心室内、頭蓋内、腹腔内、病巣内、経鼻、直腸、経膣、吸入による、又は埋め込みリザーバによる投与を指す。用語「非経口」は、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液内、胸骨内、くも膜下腔内、肝内、病巣内、及び頭蓋内注射又は注入を含む。
【００４４】
本明細書において使用されるとき、用語「含む」は、組成物及び方法が示される要素を含むが、他のものを除外しないことを意味することを意図する。組成物及び方法の定義に使用されるとき、「から本質的になる」は、組み合わせにとって何らかの本質的に意義のある別の要素を除外することを意味するものとする。したがって、本明細書に定義される要素から本質的になる組成物は、単離及び精製法からの微量の混入物質、並びに、リン酸緩衝生理食塩液などの医薬的に許容される担体、防腐剤、及びその他同種のものを除外しない。これらの各移行用語（transition term）によって定義される実施形態は、本発明の範囲内にある。
【００４５】
「有効量」は、有益な又は所望の結果をもたらすのに十分な量である。有効量は、１回以上の投与、塗布、又は服用で投与することができる。
【００４６】
本明細書で使用するとき、用語「治療する（treat）」、「治療すること（treating）」、「治療（treatment）」、及びそれらの文法的な変化形は、疾患若しくは身体の異常の１つ以上の付随する症状の強度を部分的に若しくは完全に遅延させる、緩和する、軽減する、若しくは低減すること、及び／又は障害若しくは状態の１つ以上の原因を緩和、軽減、若しくは妨害することを含む。本発明による治療は、防止的に、予防的に、対症的に、又は矯正的に適用されてもよい。いくつかの例では、用語「治療する（treat）」、「治療すること（treating）」、「治療（treatment）」、及びその文法的な変化形は、対象の治療前と比較して、あるいは一般集団又は研究対象集団におけるかかる症状の発生率と比較して、腫瘍の重症度／転移性を低減することを含む。
【００４７】
「阻害する」という用語は、活性、応答、状態、疾病、又は他の生物学的指標における減少を指す。これには、活性、応答、状態又は疾病の完全除去を含むことができるが、これらに限定されない。これには、例えば、天然又は対照レベルと比較して、活性、応答、状態、又は疾病における１０％の低減も含むことができる。したがって、低減は、天然レベル又は対照レベルと比較して、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％又は中間の任意の量の低減であり得る。
【００４８】
本明細書で使用するとき、「被検体」とは、個体を意味する。したがって、「被検体」には、愛玩動物（例えば、ネコ、イヌなど）、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）、実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモットなど）、及び鳥を含むことができる。「被検体」にはまた、霊長類又はヒトなどの哺乳類も含むことができる。
【００４９】
「低減させる」、又は「低減させること」若しくは「低減」など単語の他の形態は、事象又は特性（例えば、腫瘍成長）の低下を意味する。これは、通常、いくつかの標準値又は期待値と関連している、換言すれば、相対的であること、しかし標準値又は相対値が必ずしも参照される必要はないことが理解される。例えば、「腫瘍成長を低減させる」は、標準又は対照と比較して腫瘍の成長の速度を低減させることを意味する。
【００５０】
「防止する」、又は「防止すること」若しくは「防止」など単語の他の形態は、特定の事象若しくは特性を停止すること、特定の事象若しくは特性の、発症若しくは進行を安定化させる又は遅延させること、又は特定の事象若しくは特性が発生する機会を最小にすることを意味する。防止する、は、例えば、低減させる、よりも通常絶対的であるため対照との比較を必要としない。本明細書で使用するとき、何かが低減するが防止されない場合があるが、低減する何かは、また防止されることもある。同様に、何かが防止されるが低減しない場合があるが、防止される何かは、また低減することもある。低減させる又は防止する、が使用される場合、特に明確に指示されない限り、他の単語の使用もまた明示的に開示されることが理解される。
【００５１】
本明細書及び特許請求の範囲における組成物中の特定の要素又は成分の重量部への言及は、その要素又は成分と、組成物又は物品中の任意の他の要素又は成分の間との重量関係を意味する。したがって、２重量部の成分Ｘ及び５重量部の成分Ｙを含有する化合物において、Ｘ及びＹは２：５の重量比で存在し、かつその化合物において他の成分が含有されているかどうかに関係なくそのような割合で存在する。本明細書で使用するとき、成分の「重量％」又は「重量パーセント」又は「重量によるパーセント」といった表現は、特にそうではないと明記されない限り、ある成分が含まれる組成物の総重量に対する、その成分の重量の比率を指す。
【００５２】
本明細書全体において、様々な出版物が参照される。これらの出版物の開示全体が、開示内容が関連する技術分野の状態をより十分に説明するためにここに参照により本出願に組み込まれる。開示される参照文献も、その参照文献が依拠される文において考察されるそれらに含まれる資料について、参照により本明細書に個々に、かつ具体的に組み込まれる。
Ｂ．組成物
【００５３】
開示される組成物を調製するために使用される成分と、本明細書で開示される方法の範囲内で使用される組成物それ自体が開示される。これら及び他の物質が本明細書で開示されており、これらの物質の組み合わせ、サブセット、相互作用、群などが開示されている場合、これらの化合物のそれぞれの様々な個々及び集合的な組み合わせ及び順列の具体的な言及は、明示的に開示されていない場合があるが、それぞれが具体的に企図され、本明細書に記載されることが理解される。例えば、ある特定の合成又はキメラＰＤ−１ペプチドが開示されかつ論じられ、また、その合成又はキメラＰＤ−１ペプチドを含む多くの分子に対して行うことができる多くの修飾が論じられている場合、そうではないということが具体的に示されていない限り、その合成又はキメラＰＤ−１ペプチド及び可能な修飾のあらゆる組み合わせ及び置換が、具体的に可能であると考えられる。したがって、分子Ａ、Ｂ及びＣの種類が開示されており、同様に分子Ｄ、Ｅ及びＦの種類及び分子Ａ〜Ｄの組み合わせの例が開示されている場合、それぞれが個々に列挙されていない場合であっても、それぞれが個々にかつ集合的に企図され、組み合わせＡ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−Ｅ及びＣ−Ｆが開示されると見なされる。同様に、これらの任意のサブセット又は組み合わせもまた開示される。したがって、例えば、Ａ−Ｅ、Ｂ−Ｆ及びＣ−Ｅのサブグループが開示されていると見なされるであろう。この概念は、本出願の全ての態様に適用され、開示される組成物の作製及び使用方法における工程を含むが、これに限定されない。このように、実施することができる多様な更なる工程が存在する場合、これらの更なる工程のそれぞれは、任意の特定の実施形態又は開示される方法の実施形態の組み合わせにより実施することができることが理解される。
【００５４】
免疫グロブリンスーパーファミリーに属するＰＤ−１遺伝子は、５５ｋＤａのＩ型膜貫通タンパク質をエンコードする。マウスＰＤ−１及びヒトＰＤ−１は両方とも２８８個のアミノ酸からなり、Ｎ末端（２０アミノ酸）と、膜貫通領域である胴部の疎水性領域とにシグナルペプチドを有する。ヒト及びマウスＰＤ−１タンパク質は、４つの潜在的なＮ−グリコシル化部位の保存を含めて約６０〜８０％のアミノ酸同一性を共有し、かつＩｇ−Ｖドメインを定義する残基をも共有する。ＰＤ−１は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、及びマクロファージ上に発現される。ＰＤ−１のリガンドは、Ｂ７ファミリーメンバーのＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１）及びＰＤ−Ｌ２（Ｂ７−ＤＣ）である。免疫チェックポイントプログラム細胞死タンパク質−１（ＰＤ−１）を介してシグナル伝達することにより、抗腫瘍免疫応答を緩衝することによる腫瘍の進行を可能にする。ＰＤ−１とそのリガンド、すなわちプログラムされた細胞死リガンド−１（ＰＤ−Ｌ１）との間の、シグナル伝達軸を、モノクローナル抗体を用いて治療的に遮断することは、癌の治療において顕著な臨床的成功を示し、癌サブタイプの広範なセットにわたって、印象的な活躍を示している。本明細書に開示されるのは、ＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１の相互作用を直接遮断する、又はＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用を遮断する、ＰＤ−１に対する抗体を生成するために、宿主免疫応答を刺激することができる非抗体ペプチド治療薬及びペプチドワクチンを使用する、従来のＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断法を改善することである。
【００５５】
ＰＤ−１のＢ細胞エピトープのコンピュータ支援分析を使用して、ＰＤ−１（配列番号１）の残基３２−５０、４５−６４、７３−９０、及び９２−１１０に対応する配列を誘導した。したがって、一態様では、ＰＤ−１の残基３２−５０、４５−６４、７３−９０、及び／又は９２−１００を含むＰＤ−１タンパク質に対する免疫応答を刺激するための合成ＰＤ−１ペプチドが、本明細書に開示される。例えば、本明細書では、ＶＬＮＷＹＲＭＳＰＳＮＱＴＤＫＬＡＡＦ（配列番号２）、ＫＬＡＡＦＰＥＤＲＳＱＰＧＱＤＣＲＦＲ（配列番号３）、ＤＦＨＭＳＶＶＲＡＲＲＮＤＳＧＴＹＬ（配列番号４）、及び／又はＧＡＩＳＬＡＰＫＡＱＩＫＥＳＬＲＡＥＬ（配列番号５）を含む、ＰＤ−１タンパク質に対する免疫応答を刺激するための合成ＰＤ−１ペプチドが開示される。一態様では、ペプチドは、アシル化及び／又はアミド化され得る。したがって、（配列番号２）、（配列番号３）、（配列番号４）、及び／又は（配列番号５）を含む、ＰＤ−１タンパク質に対する免疫応答を刺激するための合成ＰＤ−１ペプチドであって、アシル化及び／又はアミド化されている合成ペプチドが、本明細書には開示される。
【００５６】
場合によっては、Ｌ−アミノ配列の類似体の使用は、分解耐性、安定性、合成の容易さ、又はより高い有効性など、ベース配列に勝る利点を有し得る。一態様では、本開示の合成配列は、アミノ末端からカルボキシ末端まで逆順にＬ−アミノ配列を含み得るということが理解され、本明細書において企図される。例えば、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５のレトロ配列は、それぞれ、ＦＡＡＬＫＤＴＱＮＳＰＳＭＲＹＷＮＬＶ（配列番号１２）、ＲＦＲＣＤＱＧＰＱＳＲＤＥＰＦＡＡＬＫ（配列番号１３）、ＬＹＴＧＳＤＮＲＲＡＲＶＶＳＭＨＦＤ（配列番号１４）、及びＬＥＡＲＬＳＥＫＩＱＡＫＰＡＬＳＩＡＧ（配列番号１５）である。これらのレトロ配列はまた、ベース配列の鏡立体構造を有することもできる。したがって、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、及び／又は配列番号１５に記載の配列のうちの１つ以上を含む合成ＰＤ−１ペプチドが、本明細書に開示される。配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５に対してと同様、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、及び／又は配列番号１５を含む合成ペプチドは、アセチル化及び／又はアミド化され得る。
【００５７】
配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５に記載されるＬ−アミノ酸配列の、レトロ類似体は、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、及び配列番号１５に記載されているが、そのようなレトロ類似体に加えて、前方Ｌ−アミノ（配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５）のＤ体の鏡像異性体類似体、及びレトロアミノ配列（配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、及び配列番号１５）のＤ体の鏡像異性体類似体が存在し、これらは、より良好な経口投与、より長期の有効性、及び合成の容易さを可能にする、劣化及びタンパク質分解に対する耐性を増加させることができる。したがって、一態様では、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、及び配列番号１５のうちの１つ以上を含み、その配列を含むアミノ酸がＤアミノ酸である、合成ＰＤ−１ペプチドが、本明細書において開示されている。
【００５８】
一態様では、本開示の合成ＰＤ−１ペプチドは、合成ＰＤ−１ペプチドを、ＭＨＣ制限（すなわち、無差別Ｔｈ細胞エピトープ）を迂回させてキメラＰＤ−１ペプチドを形成するのを支援するサイトカインの放出を促進するヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞エピトープに連結することによって、Ｂ細胞刺激を増加させることができるということが理解され、本明細書で企図される。例えば、一態様では、Ｔヘルパー（Ｔｈ）エピトープ（例えば、配列番号６のような、麻疹ウイルス融合タンパク質ペプチド）を更に含む１種類以上のＰＤ−１  Ｂ細胞エピトープを含むＰＤ−１タンパク質に対する免疫応答を刺激するためのＰＤ−１キメラペプチドであって、その１種類以上のＰＤ−１  Ｂ細胞エピトープが、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、及び／又は配列番号１５からなる群から選択される配列からなるＰＤ−１キメラペプチドが、本明細書に開示されている。本明細書では、Ｂ細胞エピトープ（すなわち、ＰＤ−１合成ペプチド）は、Ｄアミノ酸を含み得るということが、理解され、本明細書において企図される。
【００５９】
Ｔｈエピトープは、長さが約１４〜約２２個、より好ましくは約１５〜２１個、最も好ましくは１６個のアミノ酸であり得る。好ましくは、Ｔｈ細胞エピトープは、表１に提供される以下のアミノ酸配列のうちの１つを有する。
【表１】
2020512375.tif 000004
【００６０】
合成ＰＤ−１ペプチド及びＴｈ細胞エピトープを接合するために、アミノ酸リンカーを使用することができる。好ましくは、リンカーは、その長さが約２〜約１５個のアミノ酸、より好ましくは約２〜約１０個のアミノ酸、最も好ましくは約２〜約６個のアミノ酸のペプチドである。最も好ましいリンカーは、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ（配列番号７）を含む。したがって、一態様では、Ｔｈエピトープ（例えば、配列番号６などの麻疹ウイルス融合タンパク質ペプチド）と、合成ＰＤ−１ペプチドをＴｈエピトープに接合するリンカー（例えば、配列番号７など）とを更に含む、前述の態様のいずれかに記載の合成ペプチドを含むキメラペプチドも、本明細書で開示される。例えば、一態様では、１種類以上のＰＤ−１  Ｂ細胞エピトープと、Ｔヘルパー（Ｔｈ）エピトープ（例えば、配列番号６などの麻疹ウイルス融合タンパク質ペプチド）と、ＰＤ−１を発言したＢ細胞エピトープをＴｈエピトープに接合するリンカー（例えば、配列番号７など）とを含む、ＰＤ−１タンパク質に対する免疫応答を刺激するためのキメラＰＤ−１ペプチドであって、
ＫＬＬＳＬＩＫＧＶＩＶＨＲＬＥＧＶＥＧＰＳＬＶＬＮＷＹＲＭＳＰＳＮＱＴＤＫＬＡＡＦ（配列番号８）、
ＫＬＬＳＬＩＫＧＶＩＶＨＲＬＥＧＶＥＧＰＳＬＫＬＡＡＦＰＥＤＲＳＱＰＧＱＤＣＲＦＲ（配列番号９）、
ＫＬＬＳＬＩＫＧＶＩＶＨＲＬＥＧＶＥＧＰＳＬＤＦＨＭＳＶＶＲＡＲＲＮＤＳＧＴＹＬ（配列番号１０）、
ＫＬＬＳＬＩＫＧＶＩＶＨＲＬＥＧＶＥＧＰＳＬＧＡＩＳＬＡＰＫＡＱＩＫＥＳＬＲＡＥＬ（配列番号１１）、
ＫＬＬＳＬＩＫＧＶＩＶＨＲＬＥＧＶＥＧＰＳＬＦＡＡＬＫＤＴＱＮＳＰＳＭＲＹＷＮＬＶ（配列番号１６）、
ＫＬＬＳＬＩＫＧＶＩＶＨＲＬＥＧＶＥＧＰＳＬＲＦＲＣＤＱＧＰＱＳＲＤＥＰＦＡＡＬＫ（配列番号１７）、
ＫＬＬＳＬＩＫＧＶＩＶＨＲＬＥＧＶＥＧＰＳＬＬＹＴＧＳＤＮＲＲＡＲＶＶＳＭＨＦＤ（配列番号１８）、及び／又は
ＫＬＬＳＬＩＫＧＶＩＶＨＲＬＥＧＶＥＧＰＳＬＬＥＡＲＬＳＥＫＩＱＡＫＰＡＬＳＩＡＧ（配列番号１９）に記載されるアミノ酸配列を含むキメラＰＤ−１ペプチドが、本明細書で開示される。
【００６１】
合成ペプチドと同様に、本明細書では、キメラＰＤ−１ペプチド内に含まれる合成ＰＤ−１ペプチドのアミノ酸は、配列中のＬ−アミノ酸のＤアミノ酸類似体であり得ることが理解され、本明細書において企図される。したがって、一態様では、本明細書に開示される合成ＰＤ−１ペプチドのいずれかを含むキメラペプチドであって、Ｔｈエピトープ（例えば、配列番号６などの麻疹ウイルス融合タンパク質ペプチド）と、合成ＰＤ−１ペプチドをＴｈエピトープに接合するリンカー（例えば、配列番号７など）を更に含む、キメラペプチドが、本明細書に開示される。例えば、本明細書に開示されるのは、一態様では、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、及び／又は配列番号１９に記載のアミノ酸配列を含むキメラＰＤ−１ペプチドであり、合成ＰＤ−１ペプチド配列（すなわち、Ｂ細胞エピトープ）は、Ｄアミノ酸を含む。
１．配列類似性
【００６２】
本明細書で論じられる場合、相同性及び同一性という語句の使用は、類似性と同じことを意味すると理解される。したがって、例えば、相同性という語の使用が２つの非天然配列間で使用される場合、これが必ずしもこれらの２つ配列間の進化的関係を示さないが、むしろそれらの核酸配列間の類似度又は関連性に注目していると理解される。進化的に関連する２つの分子間の相同性を決定するための方法の多くは、任意の２つ以上の核酸又はタンパク質に、それらが進化的に関連するか否かに関わらず、配列類似性を測定する目的で規定どおりに適用される。
【００６３】
一般的に、本明細書で開示される遺伝子及びタンパク質のうちの任意の既知の変異体及び誘導体又は起こり得るものを決定するための１つの方法は、特定の既知の配列に対する相同性に関して変異体及び誘導体を定義することによるものであることが理解される。本明細書で開示される特定の配列の同一性もまた、本明細書の他の個所で論じられる。一般的には、本明細書で開示される遺伝子及びタンパク質の変異体は、典型的には、記載された配列又は天然配列に対して、少なくとも約７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの相同性を有する。当業者は、２つのタンパク質又は遺伝子などの２つの核酸の相同性を決定する方法を容易に理解する。例えば、相同性は、相同性が最も高いレベルになるように２つの配列をアライメントした後に算出することができる。
【００６４】
相同性を算出する他の方法は、公開されたアルゴリズムによって行うことができる。比較のための配列の最適なアライメントは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ  Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．ＭｏＬ  Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アライメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４（１９８８）の類似性に関する検索法によって、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータ化された実施によって、又はインスペクションによって行われてもよい。
【００６５】
方法のうちの任意を一般的に使用することができること、特定の場合には、これらの様々な方法の結果が異なってもよいことが理解されるが、当業者は、同一性がこれらの方法のうちの少なくとも１つにより見出される場合、配列が記載された同一性を有すると言えるであろうこと、及び本明細書で開示されているであろうことが理解される。
【００６６】
例えば、本明細書で使用するとき、他の配列と特定のパーセントの相同性を有していると記載された配列は、上述の計算法のうちの任意の１つ以上によって計算されたとして記載された相同性を有する配列を指す。例えば、第１の配列がＺｕｋｅｒ計算法を用いて第２の配列と８０パーセントの相同性を有するように計算される場合、第１の配列が他の計算法のいずれかによって計算されたように第２の配列と８０パーセントの相同性を有さない場合であっても、第１の配列は、本明細書で定義されたように、第２の配列と８０パーセントの相同性を有する。別の例として、第１の配列がＺｕｋｅｒ計算法及びＰｅａｒｓｏｎ−Ｌｉｐｍａｎ計算法の両方を用いて第２の配列と８０パーセントの相同性を有するように計算される場合、第１の配列がＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ計算法、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ計算法、Ｊａｅｇｅｒ計算法又は他の計算法のうちのいずれかによって計算されたように第２の配列と８０パーセントの相同性を有さない場合であっても、第１の配列は、本明細書で定義されたように、第２の配列と８０パーセントの相同性を有する。更に別の例として、第１の配列が計算法のそれぞれを用いて第２の配列と８０パーセントの相同性を有するように計算される場合、第１の配列は、本明細書で定義されたように、第２の配列と８０パーセントの相同性を有する（ただし、実際には、異なる計算法は、多くの場合、異なる計算相同性百分率をもたらすこととなる）。
２．ペプチド
ａ）タンパク質及びペプチド変異体
【００６７】
本明細書で論じるように、合成ＰＤ−１ペプチド及びキメラＰＤ−１ペプチドには、既に知られており、本明細書で企図される多数の変異体が存在する。加えて、既知の機能性ＰＤ−１株変異体には、開示される方法及び組成物においても機能する合成ＰＤ−１ペプチド及びキメラＰＤ−１ペプチドの誘導体が存在する。タンパク質変異体及び誘導体は、当業者により十分に理解され、アミノ酸配列修飾を含むことができる。例えば、アミノ酸配列修飾は、一般的に、３種類の分類、置換変異体、挿入変異体又は欠失変異体のうちの１つ以上に該当する。挿入は、アミノ末端及び／又はカルボキシル末端融合並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。挿入は、通常、アミノ末端又はカルボキシル末端融合よりも少ない挿入、例えば、１〜４残基程度となる。実施例に記載されたものなどの免疫原性融合タンパク質誘導体は、インビトロでの架橋によって標的配列に免疫原性を付与するほど十分に大きいポリペプチドを融合することによって、又は融合をコードするＤＮＡによって形質転換された組換え細胞培養によって作製される。欠失は、１つ以上のアミノ酸残基をタンパク質配列から除去することを特徴とする。一般的に、わずか約２〜６個の残基のみが、タンパク質分子内の任意の１つの部位で欠失される。これらの変異体は、通常、タンパク質をコードするＤＮＡにおけるヌクレオチドの部位特異的変異誘発によって調製され、それにより、変異体をコードするＤＮＡを作製し、その後、組換え細胞培養においてＤＮＡを発現させる。既知の配列を有するＤＮＡの所定の部位で置換変異を行う技術は周知であり、例えば、Ｍ１３プライマー変異誘発及びＰＣＲ変異誘発がある。アミノ酸置換は、一般的には単一の残基についてであるが、一度に多数の異なる位置で起こることができ、挿入は、通常、約１〜１０個のアミノ酸残基程度となり、欠失は、約１〜３０個の残基の範囲となる。欠失又は挿入は、好ましくは、隣接する対において行われ、すなわち、２個の残基の欠失又は２個の残基の挿入である。置換、欠失、挿入又はこれらの任意の組合せは、最終構築物に到達するように組み合わせてもよい。突然変異は、配列を読み枠の外に配置する必要がなく、好ましくは、二次ｍＲＮＡ構造を産生することができると考えられる相補領域を生成しないこととなる。置換変異体は、少なくとも１つの残基が除去され、異なる残基がその場所に挿入された変異体である。そのような置換は、一般的に、以下の表２及び表３に従って行われ、保存的置換と称される。
【表２】
2020512375.tif 000005
【表３】
2020512375.tif 000006
【００６８】
機能又は免疫的同一性における実質的な変化は、表３の置換よりも保守的ではない置換を選択すること、すなわち、（ａ）例えば、シート又はヘリカル立体配座としての、置換の領域におけるポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷若しくは疎水性、又は（ｃ）側鎖のかさ高さを維持するその効果において顕著に異なる残基を選択することによって行われる。タンパク質特性において最大変化を生じることが概ね期待される置換は、（ａ）親水性残基、例えば、セリル若しくはトレオニルが、疎水性残基、例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル若しくはアラニルに（又はこれらによって）置換されるか、（ｂ）システイン若しくはプロリンが、任意の他の残基に（又はこれらによって）置換されるか、（ｃ）正電荷側鎖を有する残基、例えば、リシル、アルギニル若しくはヒスチジルが、負電荷残基、例えば、グルタミル若しくはアスパルチルに（又はこれらによって）置換されるか、又は、（ｄ）かさ高い側鎖を有する残基、例えば、フェニルアラニンが、側鎖を有さないアミノ酸、例えば、グリシンに（又はこれによって）置換され、この場合は、（ｅ）硫酸化及び／又はグリコシル化のための部位の数を増加させることによる置換となる。
【００６９】
例えば、１つのアミノ酸残基を生物学的及び／又は化学的に類似する別のアミノ酸残基と置換することは、保存的置換として当業者に既知である。例えば、保守的置換は、１つの疎水性残基を別の疎水性残基に、又は１つの極性残基を別の極性残基に置換することであると考えられる。置換には、例えば、Ｇｌｙ，Ａｌａ；Ｖａｌ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ；Ａｓｐ，Ｇｌｕ；Ａｓｎ，Ｇｌｎ；Ｓｅｒ，Ｔｈｒ；Ｌｙｓ，Ａｒｇ及びＰｈｅ，Ｔｙｒなどの組み合わせが挙げられる。それぞれ明示的に開示された配列のそのような保守的に置換された変異体は、本明細書で提供されるモザイクポリペプチドの範囲内に含まれる。
【００７０】
置換又は欠失の変異誘発は、Ｎ−グリコシル化（Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ）又はＯ−グリコシル化（Ｓｅｒ又はＴｈｒ）のための挿入部位に対して使用することができる。システイン又は他の不安定な残基の欠失もまた、望ましい場合がある。潜在的なタンパク質分解部位、例えば、Ａｒｇの欠失又は置換は、例えば、塩基性残基の１つを欠失させるか、又はグルタミニル残基若しくはヒスチジン残基により塩基性残基を置換することによって達成される。
【００７１】
特定の翻訳後誘導体化は、発現されたポリペプチドへの組換え宿主細胞の作用の結果である。グルタミニル残基及びアスパラギニル残基は、対応するグルタミル残基及びアスパリル残基に頻繁に翻訳後脱アミド化される。あるいは、これらの残基は、温和な酸性条件下で脱アミド化される。他の翻訳後修飾には、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル残基又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン及びヒスチジンの側鎖のｏ−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  ｐｐ  ７９−８６［１９８３］）、Ｎ−末端アミンのアセチル化並びに、いくつかの例では、Ｃ末端カルボキシルのアミド化が挙げられる。
【００７２】
本明細書で開示されるタンパク質の変異体及び誘導体を定義する１つの方法は、特定の既知配列と相同性／同一性の点で変異体及び誘導体を定義することによることを理解されたい。本明細書で開示されるこれらのタンパク質及び他のタンパク質が、記載された配列に対して少なくとも７０％又は７５％又は８０％又は８５％又は９０％又は９５％の同一性を有することが、具体的に開示されている。当業者は、２つのタンパク質の相同性を判定する方法を容易に理解する。例えば、相同性は、相同性が最も高いレベルになるように２つの配列をアライメントした後に算出することができる。
【００７３】
相同性を算出する他の方法は、公開されたアルゴリズムによって行うことができる。比較のための配列の最適なアライメントは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ  Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．ＭｏＬ  Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アライメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４（１９８８）の類似性に関する検索法によって、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータ化された実施によって、又はインスペクションによって行われてもよい。
【００７４】
同じ種類の相同性は、例えば、Ｚｕｋｅｒ，Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：４８−５２，１９８９，Ｊａｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：７７０６−７７１０，１９８９，Ｊａｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：２８１−３０６，１９８９に開示されたアルゴリズムにより核酸について得ることができる。
【００７５】
保守的変異及び相同性の記述が、特定の配列と少なくとも７０％の相同性を有し、変異体が保守的変異体である実施形態などの、任意の組み合わせで一緒に組み合わせることができることを理解されたい。
【００７６】
本明細書が様々なタンパク質及びタンパク質配列を論じるとき、それらのタンパク質配列をコードすることができる核酸もまた開示されることを理解されたい。この核酸は、特定のタンパク質配列に関連する全変性配列、すなわち、１つの特定のタンパク質配列をコードする配列を有する全ての核酸、並びに、開示されたタンパク質配列の変異体及び誘導体をコードする変性核酸を含む全ての核酸を含むと考えられる。したがって、それぞれの特定の核酸配列が本明細書に完全に記載されなくてもよい一方で、あらゆる配列が、開示されたタンパク質配列を介して実際に開示され、本明細書に記載されていることを理解されたい。いかなるアミノ酸配列も、どのような特定のＤＮＡ配列が生物内の、そのタンパク質をエンコードするものであるかを示すものではないが、開示されるタンパク質の特定の変異体が本明細書に開示されている場合には、そのペプチド又はタンパク質をエンコードする既知の核酸配列もまた既知であり、本明細書に開示及び記載されているということも理解される。
【００７７】
開示される組成物に組み込むことができるアミノ酸及びペプチド類似体が多数あることを理解されたい。例えば、異なる機能的置換基、ひいては、表２及び表３に示されるアミノ酸を有するＤアミノ酸又はアミノ酸が多数ある。天然型ペプチドの反対の立体異性体及びペプチド類似体の立体異性体もまた開示される。これらのアミノ酸は、例えば、最適なアミノ酸を伴うｔＲＮＡ分子を投入することによって、またアンバーコドンを利用して類似体アミノ酸を部位特異的な方法でペプチド鎖に挿入する遺伝子構築物を操作することによって、ポリペプチド鎖に容易に組み込むことができる。
【００７８】
ペプチドに類似しているが、天然型ペプチド結合を介して接続されていない分子を作製することができる。例えば、アミノ酸又はアミノ酸類似体の結合には、ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（ｃｉｓ及びｔｒａｎｓ）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−及び−ＣＨＨ２ＳＯ−を挙げることができる（これらの結合及び他の結合は、Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，ｅｄｓ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐ．２６７（１９８３）；Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．，Ｖｅｇａ  Ｄａｔａ（Ｍａｒｃｈ  １９８３），Ｖｏｌ．１，Ｉｓｓｕｅ  ３，Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂａｃｋｂｏｎｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ（一般的レビュー）；Ｍｏｒｌｅｙ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ（１９８０）ｐｐ．４６３−４６８；Ｈｕｄｓｏｎ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｐｒｏｔ  Ｒｅｓ  １４：１７７−１８５（１９７９）（−ＣＨ２ＮＨ−，−ＣＨ２ＣＨ２−）；Ｓｐａｔｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ３８：１２４３−１２４９（１９８６）（−ＣＨ  Ｈ２−Ｓ）；Ｈａｎｎ  Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．Ｉ  ３０７−３１４（１９８２）（−ＣＨ−ＣＨ−，ｃｉｓ及びｔｒａｎｓ）；Ａｌｍｑｕｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２３：１３９２−１３９８（１９８０）（−ＣＯＣＨ２−）；Ｊｅｎｎｉｎｇｓ−Ｗｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ２３：２５３３（１９８２）（−ＣＯＣＨ２−）；Ｓｚｅｌｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ａｐｐｌｎ，ＥＰ  ４５６６５  ＣＡ（１９８２）：９７：３９４０５（１９８２）（−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−）；Ｈｏｌｌａｄａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２４：４４０１−４４０４（１９８３）（−Ｃ（ＯＨ）ＣＨ２−）；及びＨｒｕｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ３１：１８９−１９９（１９８２）（−ＣＨ２−Ｓ−）に見出すことができ、これらのそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる。特に好ましい非ペプチド結合は、−ＣＨ２ＮＨ−である。ペプチド類似体は、β−アラニン、γ−アミノ酪酸などの、結合原子間に２個以上の原子を有することできることを理解されたい。
【００７９】
アミノ酸類似体及び類似体及びペプチド類似体は、より経済的な生産、より高い化学的安定性、向上した薬理学的性質（半減期、吸収、力価、有効性など）、変化した特異性（例えば、生物活性の広域スペクトル）、低減した抗原性などの、増強された又は所望の特性を多くの場合有する。
【００８０】
Ｄ−アミノ酸は、ペプチダーゼなどにより認識されないため、Ｄ−アミノ酸は、より安定なペプチドを生成するために使用することができる。コンセンサス配列の１つ以上のアミノ酸の同じ種類のＤ−アミノ酸（例えば、Ｌ−リシンの代わりにＤ−リシン）による系統的置換は、より安定なペプチドを生成するために使用することができる。換言すれば、本明細書では、任意の開示される配列の逆（すなわち、Ｄ−アミノ酸置換）が企図される。システイン残基は、環化するため又は２つ以上のペプチドを一緒に接続するために使用することができる。これは、ペプチドを特定の立体配座に拘束するために有益であり得る。一態様では、配列番号２、配列番号３、配列番号４、又は配列番号５に記載される配列のうちの１つ以上を含む合成ＰＤ−１ペプチドであって、そのペプチドのアミノ酸が、Ｄ体の鏡像異性体である合成ＰＤ−１ペプチドが、本明細書に開示される。
【００８１】
一態様では、開示される合成ペプチドは、ペプチドのアミノ末端とカルボキシ末端とが逆になるように、逆順（すなわち、レトロ配列）であり得る。一態様では、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５のレトロ配列が本明細書に開示され、それらは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、及び配列番号１５をそれぞれ含むものである。これらのレトロ配列はまた、ベース配列の鏡立体構造を有することができる。一態様では、レトロ配列はまた、Ｄアミノ酸置換（すなわち、レトロ−インベルソ）配列を含み得る。したがって、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、及び配列番号１５に記載の配列のうちの１つ以上を含む合成ＰＤ−１ペプチドであって、そのペプチドのアミノ酸が、Ｄ体の鏡像異性体である合成ＰＤ−１ペプチドが、本明細書に開示される。
【００８２】
本明細書に開示されるＤアミノ酸置換合成ペプチドのいずれも、開示されるＰＤ−１キメラペプチドにおけるＰＤ−１エピトープとして使用することができることが理解される。例えば、１つ以上のＰＤ−１  Ｂ細胞エピトープ、Ｔヘルパー（Ｔｈ）エピトープ、及びＰＤ−１  Ｂ細胞エピトープをＴｈエピトープに接合するリンカーとを含むキメラＰＤ−１ペプチドであって、その１つ以上のＰＤ−１  Ｂ細胞エピトープが、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、及び配列番号１５からなる群から選択される配列からなり、そのペプチドのアミノ酸がＤ体の鏡像異性体であるキメラＰＤ−１ペプチドが、本明細書で開示される。一態様では、キメラＰＤ−１ペプチドであり、そのペプチドが、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、又は配列番号１９に記載されるアミノ酸配列を含み、合成ＰＤ−１ペプチドのアミノ酸がＤ体の鏡像異性体であるキメラＰＤ−１ペプチドが、本明細書に開示される。
３．医薬担体／医薬品の送達
【００８３】
上記のように、本明細書に開示される合成ＰＤ−１ペプチド及びキメラＰＤ−１ペプチドは、薬学的に許容される担体中でインビボで投与することもできる。したがって、一態様では、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、及び／又は配列番号１９に記載のＰＤ−１ペプチドのうちの、任意の１つ以上を含む医薬組成物が、本明細書に開示される。
【００８４】
「薬学的に許容される」とは、生物学的に又はその他の点で望ましい物質を意味し、すなわち、その物質は、望ましくない生物学的効果をいずれも引き起こすことなく、又は物質が含まれる医薬組成物の他の成分のいずれかと有害な様式で相互作用することなく、核酸又はベクターと共に被検体に投与されてもよい。担体は、当業者に公知であるように、活性成分の分解を最小限にするように、かつ被検体における任意の有害な副作用を最小限にするように、当然選択されるであろう。
【００８５】
開示されるＰＤ−１ペプチドを含む医薬組成物は、ＰＤ−１媒介性免疫抑制が生じる疾患又は身体の異常の治療に特に有用であることが理解され、本明細書において企図される。したがって、一態様では、本明細書に開示されるＰＤ−１ペプチドのうちの１つ以上を含む開示される医薬組成物は、疾患特異的治療法又はワクチンと組み合わせて、ＰＤ−１ペプチドの有効性を更に増加させることができる。例えば、１つ以上のＰＤ−１ペプチドを含む医薬組成物は、乳癌の治療、阻害、及び／又は予防に使用するため、抗ＨＥＲ２抗体又はＨＥＲ−２のＢ細胞エピトープと組み合わせることができる。したがって、一態様では、本明細書に開示される、ＰＤ−１ペプチド、合成ペプチド、又はキメラペプチド（例えば、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号：１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、及び／又は配列番号１９）のうちの１つ以上を含む医薬組成物であって、１つ以上のＨＥＲ−２のＢ細胞エピトープ（例えば、配列番号２７若しくは２９、又はキメラエピトープ配列番号２８又は３０）、及び／又は抗ＨＥＲ−２抗体を更に含む、医薬組成物が、本明細書に開示される。一態様では、配列番号１１に記載のＭＶＦ−ＰＤ１（９２−１１０）、ＭＶＦ−ＨＥＲ−２（２６６−２９６）ペプチド（例えば、配列番号２８に記載されるもの）、及びＭＶＦ−ＨＥＲ−２（５９７−６２６）ペプチド（例えば、配列番号３０に記載されるもの）を含む医薬組成物が、本明細書で具体的に開示される。
【００８６】
組成物は、局所鼻腔内投与又は吸入による投与を含んで、経口的に、非経口的に（例えば、静脈内に）、筋肉内注射によって、腹腔内注射によって、経皮的に、体外に、局所的になどで投与されてもよい。本明細書で使用するとき、「局所鼻腔内投与」は、鼻孔の一方又は両方を通る鼻及び鼻腔への組成物の送達を意味し、噴霧機構若しくは液滴機構による送達又は核酸若しくはベクターのエアロゾル化を介した送達を含むことができる。吸入による組成物の投与は、噴霧機構又は液滴機構による送達を介して鼻又は口を通して行うことができる。送達はまた、挿管を介して呼吸器系（例えば、肺）の任意の領域に対して直接行うことができる。必要とされる組成物の正確な量は、被検体の人種、年齢、体重及び全身状態、治療されるアレルギー性疾患の重症度、使用される特定の核酸又はベクター、組成物の投与様式などに依存して、被検体によって異なるであろう。したがって、全ての組成物の正確な量を指定することは不可能である。しかし、適量は、本明細書の教示に鑑みて、通常の実験のみを使用して、当業者によって決定され得る。
【００８７】
組成物の非経口投与は、使用される場合、一般に注射を特徴とする。注射剤は、溶液若しくは懸濁液、注射前における液体での溶解又は懸濁に好適な固形、又は乳剤のいずれかとして、従来の形態で調製されてよい。非経口投与についてごく最近改良された方法は、一定用量が維持されるように徐放系又は持続放出系の使用を伴う。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第３，６１０，７９５号を参照されたい。
【００８８】
材料は、溶液、（例えば、微小粒子、リポソーム又は細胞に組み込まれた）懸濁液であってもよい。これらは、抗体、受容体又は受容体リガンドを介して特定の細胞型を標的としてもよい。以下の参照文献は、特定のタンパク質を腫瘍組織へ標的化するためにこの技術を使用する例である（Ｓｅｎｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，２：４４７−４５１，（１９９１）；Ｂａｇｓｈａｗｅ，Ｋ．Ｄ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６０：２７５−２８１，（１９８９）；Ｂａｇｓｈａｗｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５８：７００−７０３，（１９８８）；Ｓｅｎｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，４：３−９，（１９９３）；Ｂａｔｔｅｌｌｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３５：４２１−４２５，（１９９２）；Ｐｉｅｔｅｒｓｚ  ａｎｄ  ＭｃＫｅｎｚｉｅ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．Ｒｅｖｉｅｗｓ，１２９：５７−８０，（１９９２）；及びＲｏｆｆｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，４２：２０６２−２０６５，（１９９１））。「ステルス」などのビヒクル及び（結腸癌を標的とする脂質介在性薬物を含む）他の抗体共役リポソーム、細胞特異的リガンドを介するＤＮＡの受容体介在性標的化、リンパ球指向性腫瘍標的化、並びにインビボでのマウス神経膠腫細胞の高特異的治療的レトロウイルス標的化。以下の参照文献は、特定のタンパク質を腫瘍組織へ標的化するためにこの技術を使用する例である（Ｈｕｇｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４９：６２１４−６２２０，（１９８９）；及びＬｉｔｚｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１１０４：１７９−１８７，（１９９２））。全般的に、受容体は、構成的誘発性又はリガンド誘発性のいずれかで、エンドサイトーシスの経路に関与する。クラスリン被覆ピット中のこれらの受容体クラスターは、クラスリン被覆小胞を介して細胞に入り、受容体が分別される酸性化エンドソームを通過し、次いで、細胞表面へ再循環するか、細胞内に保存されるか又はリポソーム内で分解されるかのいずれかである。内在化経路は、栄養取り込み、活性化タンパク質の除去、巨大分子のクリアランス、ウイルス及び毒素の日和見侵入、リガンドの解離及び分解、並びに受容体レベル調節などの多様な機能を果たす。多数の受容体は、細胞型、受容体濃度、リガンドの種類、リガンドの価数及びリガンド濃度に応じて、２つ以上の細胞内経路に従う。受容体介在性エンドサイトーシスの分子機構及び細胞機構がレビューされている（Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎｅ，ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０：６，３９９−４０９（１９９１））。
ａ）薬学的に許容される担体
【００８９】
抗体を含む組成物は、薬学的に許容される担体と組み合わせて治療する上で使用することができる。
【００９０】
好適な担体及びこれらの製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（１９ｔｈ  ｅｄ．）ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ  １９９５に記載されている。一般的には、適量の薬学的に許容される塩を製剤に使用して、製剤等張性（formulation isotonic）を与える。薬学的に許容される担体の例には、生理食塩水、リンゲル溶液及びデキストロース溶液が挙げられるが、これらに限定されない。溶液のｐＨは、好ましくは、約５〜約８、より好ましくは、約７〜約７．５である。更に、担体は、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスなどの徐放性製剤を含み、マトリックスは、成形品の形態、例えば、フィルム、リポソーム又は微粒子である。例えば、投与経路及び投与される組成物の濃度に応じて、特定の担体が更に好ましい場合があることは、当業者には明白であろう。
【００９１】
医薬担体は、当業者に既知である。これらは、最も一般的には、滅菌水、生理食塩水及び生理的ｐＨの緩衝液などの溶液を含む、ヒトへの薬剤投与のための標準的な担体であると考えられる。組成物は、筋肉内又は皮下に投与することができる。他の化合物は、当業者によって使用される標準的な手順に従って投与されることとなる。
【００９２】
医薬組成物は、選択した分子に加えて、担体、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、防腐剤、界面活性剤などを含んでもよい。医薬組成物はまた、抗菌剤、抗炎症剤、麻酔薬などの、１種以上の有効成分を含んでもよい。
【００９３】
医薬組成物は、局所治療又は全身治療が望まれているかどうか、及び治療すべき領域に応じて、多数の方法で投与されてもよい。投与は、（眼科的、経腟的、経直腸的、鼻腔内を含んで）局所的に、経口的に、吸入により又は、例えば、静脈内点滴、皮下注射、腹腔内注射若しくは筋肉内注射による非経口的にでもよい。開示される抗体は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内又は経皮的に投与することができる。
【００９４】
非経口的投与の製剤には、滅菌した水溶液又は非水溶液、懸濁液及びエマルションが挙げられる。非水溶液の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物油及びオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。水性担体には、生理食塩水及び緩衝媒体を含む、水、アルコール性／水性溶液、エマルション又は懸濁液が挙げられる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル又は不揮発性油が挙げられる。静脈内ビヒクルには、流体及び栄養補充剤、電解質補充剤（リンゲルデキストロースに基づく電解質補充剤など）などが挙げられる。防腐剤及び他の添加剤はまた、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤及び不活性ガスなどとして存在してもよい。
【００９５】
局所投与のための製剤は、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、液滴、坐剤、スプレー、液体及び粉末を含んでもよい。従来の医薬担体、水性基剤、粉末基剤又は油性基剤、増粘剤などが、必要となるか又は望ましい場合がある。
【００９６】
経口投与のための組成物には、粉末若しくは顆粒、水中又は非水性媒体中の懸濁液若しくは溶液、カプセル、小袋又はタブレットが挙げられる。増粘剤、香味料、希釈剤、乳化剤、分散助剤又は結合剤が望ましい場合がある。
【００９７】
組成物のうちのいくつかは、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸及びリン酸などの無機酸並びにギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸及びフマル酸などの有機酸との反応によって、又は、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムなどの無機塩基並びにモノ、ジ、トリアルキルアミン及びアリールアミン及び置換エタノールアミンなどの有機塩基類との反応によって形成される、薬学的に許容される酸付加塩又は塩基付加塩として、投与される可能性がある場合がある。
ｂ）治療的使用
【００９８】
組成物を投与するための有効量及びスケジュールは、経験的に決定されてもよく、そのような決定を行うことは、当業者の技能の範囲内である。組成物の投与の用量範囲は、疾患の症状に影響する所望の効果を生じるほど大きい用量である。用量は、望ましくない交差反応、アナフィラキシー反応などの有害な副作用を引き起こすほど大きくあるべきではない。一般に、用量は、年齢、状態、性別及び患者の疾患の程度、投与経路又は他の薬物がレジメンに含まれているかどうかにより変動することとなり、当業者によって決定することができる。用量は、いずれかの禁忌がある場合には、個々の医師によって調整することができる。用量は、変更することができ、毎日、１日又は数日間、１つ以上の用量の投与において投与することができる。指針は、所与のクラスの医薬製品に対する適切な用量に関する文献において見出すことができる。例えば、抗体について適切な用量を選択する際の指針は、抗体の治療用途に関する文献、例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｆｅｒｒｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｎｏｇｅｓ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐａｒｋ  Ｒｉｄｇｅ，Ｎ．Ｊ．，（１９８５）ｃｈ．２２  ａｎｄ  ｐｐ．３０３−３５７；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｈａｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７７）ｐｐ．３６５−３８９に見出すことができる。単独使用の抗体の一般的な１日用量は、上記の因子に基づいて、１日につき体重１ｋｇ当たり約１μｇ〜最大１００ｍｇ又はそれ以上の範囲である場合がある。
【００９９】
ＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１の相互作用を阻害する、本明細書に開示される合成ＰＤ−１ペプチド、キメラ、及び抗体は、癌、自己免疫疾患、又はアルツハイマー病を発症するリスクがある患者又は被検体に予防的に投与することができ、あるいは癌、自己免疫疾患、又はアルツハイマー病の治療のために、治療的に（すなわち、疾患の診断後又は症状の発症後に）投与することができる。
【０１００】
ＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１と相互作用して、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用を阻害する他の分子又は抗体（例えば、ペンブロリズマブ及びニボルマブ）を、開示される合成ＰＤ−１ペプチド、キメラＰＤ−１ペプチド、又は抗ＰＤ−１抗体と組み合わせて使用して、被検体における癌、自己免疫疾患、又はアルツハイマー病を治療することができる。
４．抗体１
（１）一般的な抗体
【０１０１】
用語「抗体」は、広義で本明細書で使用され、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の両方を含む。無傷免疫グロブリン分子に加えて、用語「抗体」にはまた、これらの免疫グロブリン分子のフラグメント又はポリマー、及びヒト型若しくはヒト化型の免疫グロブリン分子又はこれらのフラグメントが含まれるが、ただしそれは、ＰＤ−１がＰＤ−Ｌ１と相互作用しないように阻害されるように、これらがＰＤ−１と相互作用する能力によって選択される場合に限る。ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の間の相互作用に関与する、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、及び／又は配列番号１９に結合する抗体も開示される。抗体は、本明細書に記載される生体外でのアッセイを使用して、又は類似の方法によって、それらの所望の活性について試験することができるが、その後、それらの生体内での治療的及び／又は予防的活性を、既知の臨床試験方法に従って試験する。ヒト免疫グロブリンには５つの主要なクラスＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、及びＩｇＧ−４、並びにＩｇＡ−１及びＩｇＡ−２に更に分類してもよい。当業者は、マウスに対して同等なクラスを理解すると考えられる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ及びミューと呼ばれる。
【０１０２】
用語「モノクローナル抗体」は、本明細書で使用するとき、実質的に均一な抗体の集団、すなわち、集団に含まれる個々の抗体は、抗体分子の小さいサブセットとして存在する場合がある天然に生じ得る突然変異を除いて同一であるという集団から得られる抗体を指す。本明細書におけるモノクローナル抗体は、具体的には、「キメラ」抗体を含み、そのキメラ抗体では、抗体が所望の拮抗活性を発揮する限り、重鎖及び／又は軽鎖の一部分は、特定の種に由来する又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の、対応する配列と同一若しくは相同である一方、鎖の残部は、他の種に由来するか又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体、及びそのような抗体のフラグメントの対応する配列と同一若しくは相同である。
【０１０３】
開示されるモノクローナル抗体は、モノクローナル抗体を産生する任意の手順を用いて作製することができる。例えば、開示されたモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）に記載されているものなどのハイブリドーマ法を使用して調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス又は他の適切な宿主動物は、免疫剤に特異的に結合することとなる抗体を産生するか又は産生する能力があるリンパ球を誘発する免疫剤により、一般的には免疫化される。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫化されてもよい。
【０１０４】
モノクローナル抗体はまた、組換えＤＮＡ法によって作製されてもよい。開示されるモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手法を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に対して特異的に結合することが可能なオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）容易に単離され、配列決定することができる。抗体又は活性抗体フラグメントのライブラリは、例えば、バートン（Burton）らへ付与された米国特許第５，８０４，４４０号及びＢａｒｂａｓらに付与された米国特許第６，０９６，４４１号に記載されているように、ファージディスプレイ技術を用いて生成及びスクリーニングすることもできる。
【０１０５】
インビトロ法はまた、一価抗体を調製するために好適である。抗体を消化してそのフラグメント、特に、Ｆａｂフラグメントを作製することは、当該技術分野で既知の所定の技術を使用して達成することができる。例えば、消化は、パパインを用いて行うことができる。パパイン消化の例は、１９９４年１２月２２日に公開された国際特許公開第９４／２９３４８号、及び米国特許第４，３４２，５６６号に記載されている。抗体のパパイン消化は、それぞれ単一の抗原結合部位を有する、Ｆａｂフラグメントと呼ばれる同一の２つの抗原結合フラグメント及び残存Ｆｃフラグメントを一般的に産生する。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位を有し、依然として抗原とクロスリンクすることができる、フラグメントをもたらす。
【０１０６】
本明細書で使用するとき、用語「抗体又はそのフラグメント」は、二重又は多数の抗原又はエピトープ特異性を有するキメラ抗体及びハイブリッド抗体、並びにハイブリッドフラグメントを含む、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖなどのフラグメントを包含する。したがって、抗体の特定の抗原に結合する能力を保持する抗体のフラグメントが提供される。例えば、ＰＤ−１結合活性を維持するか、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、及び／又は配列番号１９に結合する抗体のフラグメントは、用語「抗体又はそのフラグメント」の意味に含まれる。このような抗体及びフラグメントは、当該技術分野で既知の技術によって製造することができ、「実施例」に記載した方法に従って、かつ、全般的には、抗体を生成し、特異性及び活性について抗体をスクリーニングする方法に従って、その特異性及び活性についてスクリーニングすることができる（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８８）を参照されたい）。
【０１０７】
抗体フラグメントと抗原結合タンパク質（単鎖抗体）との結合体もまた「抗体又は抗体のフラグメント」の意味の中に含まれる。
【０１０８】
フラグメントはまた、他の配列に付随しているかどうかにかかわらず、抗体又は抗体フラグメントの活性が非修飾の抗体又は抗体フラグメントと比較して、顕著に変化していないか又は弱められていない限り、特定の領域又は特定のアミノ酸残基の挿入、欠失、置換又は他の選択された修飾もまた含むことができる。これらの修飾は、ジスルフィド結合が可能なアミノ酸を除去／付加するため、その生体寿命（bio-longevity）を増大させるため、その分泌特性を変化させるためなどの、いくつかの付加的性質をもたらすことができる。いかなる場合でも、抗体又は抗体フラグメントは、その同種抗原に対する特異的結合などの生物活性特性を保有する必要がある。抗体又は抗体フラグメントの機能性領域又は活性領域は、タンパク質の特定の領域の変異誘発、それに続く発現及び発現されたポリペプチドの試験により特定することができる。このような方法は、当業者に対して容易に明らかであり、抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸の部位特異的変異誘発を含むことができる。（Ｚｏｌｌｅｒ  Ｍ．Ｊ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：３４８−３５４，１９９２）。
【０１０９】
本明細書で使用するとき、用語「抗体（単数）」又は「抗体（複数）」はまた、ヒト抗体及び／又はヒト化抗体を指すことができる。多くの非ヒト抗体（例えば、マウス、ラット、又はウサギ由来のもの）は、ヒトにおいては自然に抗原性であり、したがって、ヒトに投与されたときに、望ましくない免疫応答を生じさせる可能性がある。したがって、本方法におけるヒト抗体又はヒト化抗体の使用は、ヒトに投与される抗体が望ましくない免疫応答を引き起こす可能性を低減する役割を果たす。
（２）ヒト抗体
【０１１０】
開示されるヒト抗体は、任意の技術を用いて調製することができる。開示されたヒト抗体はまた、遺伝子導入動物から得ることもできる。例えば、免疫化に応答してヒト抗体の完全なレパートリーを産生できる遺伝子導入マウスが記載されている（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１−２５５（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３（１９９３）を参照されたい）。具体的には、これらのキメラ及び生殖系列突然変異マウスにおける抗体重鎖結合領域（Ｊ（Ｈ））遺伝子のホモ接合型欠失は、内因性抗体産生の完全な阻害をもたらし、ヒト生殖系列抗体遺伝子配列をこのような生殖系列突然変異マウスに移転させることにより、抗原投与に対するヒト抗体の産生がもたらされる。所望の活性を有する抗体は、本明細書に記載されるようなＥｎｖ−ＣＤ４−共受容体複合体を使用して選択される。
（３）ヒト化抗体
【０１１１】
抗体ヒト化技術は、一般に、抗体分子の１つ以上のポリペプチド鎖をエンコードするＤＮＡ配列を操作するための、組換えＤＮＡ技術の使用を含む。したがって、非ヒト抗体（又はそのフラグメント）のヒト化形態は、ヒト（レシピエント）抗体のフレームワークに組み込まれた非ヒト（ドナー）抗体から抗原結合部位の一部を含有する、キメラ抗体又は抗体鎖（又はそのフラグメント、例えば、ｓＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、又は抗体の他の抗原結合部分）である。
【０１１２】
ヒト化抗体を生成するために、レシピエント（ヒト）抗体分子の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基は、所望の抗原結合特性（例えば、標的抗原に対する、特定のレベルの特異性及び親和性）を有することが知られているドナー（非ヒト）抗体分子の１つ以上のＣＤＲからの残基で置換される。いくつかの例では、ヒト抗体のＦｖフレームワーク（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体にも、インポートされたＣＤＲ又はフレームワーク配列にも見出されない残基を含有してもよい。一般に、ヒト化抗体は、非ヒト源からヒト化抗体に導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。実際には、ヒト化抗体は、一般的には、いくつかのＣＤＲ残基及び場合によりいくつかのＦＲ残基が、げっ歯類抗体における類似部位由来の残基によって置換されたヒト抗体である。ヒト化抗体は、一般に、抗体定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト抗体のそれを少なくとも含有する。
（４）抗体の投与
【０１１３】
抗体の投与は、本明細書に開示されるように行うことができる。抗体送達のための核酸アプローチも存在する。広域中和抗ＰＤ１抗体及び抗体フラグメント（配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、及び／又は配列番号１９に結合する任意の抗体を含む）はまた、抗体又は抗体フラグメントをエンコードする核酸調製物（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）として患者又は被検体に投与されてもよく、それにより、患者又は被検体のそれ自体の細胞が核酸を取り込み、エンコードされた抗体又は抗体フラグメントを産生及び分泌する。核酸の送達は、例えば、本明細書に開示される任意の手段によってもよい。
Ｃ．疾患を治療する方法
【０１１４】
本開示の組成物、合成ＰＤ−１ペプチド、及びキメラＰＤ−１ペプチドは、例えばアルツハイマー病、自己免疫疾患などの、免疫の抑制及びプログラムされた細胞死の防止がその疾病にとって有利となるあらゆる疾病を治療するため、又は癌などの、制御されていない細胞増殖が生じるあらゆる疾病を治療するために使用され得ることが理解され、本明細書において企図される。
【０１１５】
本明細書に開示されるキメラ若しくは合成ペプチド又は医薬組成物を使用して治療することができる異なる種類の自己免疫疾患の非限定的リストとしては、乾癬、円形脱毛症、原発性胆汁性肝硬変、多腺性自己免疫症候群、劇症１型糖尿病、自己免疫甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、グレーブス病、シェーグレン症候群、潰瘍性大腸炎、自己免疫溶血性貧血、悪性貧血症、乾癬性関節炎、リウマチ性関節炎、再発性ポリコンドチン炎、筋腱炎、急性有害性脳脊髄炎、及び多発性血管炎を伴う肉芽腫症が挙げられるが、それらには限られない。
【０１１６】
開示するキメラペプチド若しくは合成ペプチド、又は医薬組成物を用いて治療できることのできる種々の型の癌の非限定的なリストは以下のようなものである：リンパ腫（ホジキン及び非ホジキン）、白血病、癌、固形組織の癌、扁平上皮癌、腺癌、肉腫、神経膠腫、高悪性度神経膠腫、芽細胞腫、神経芽細胞腫、形質細胞腫、組織球腫、黒色腫、腺腫、酸素欠乏腫瘍、骨髄腫、エイズ関連リンパ腫若しくは肉腫、転移性癌、又は一般的な癌。
【０１１７】
開示する組成物、キメラペプチド、及び合成ペプチドを治療に使用することができる癌の代表的な、しかし非限定的リストには、以下のものがある。リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉腫、ホジキン病、骨髄性白血病、膀胱癌、脳腫瘍、神経系癌、頭頚部癌、頭頚部扁平上皮癌、腎臓癌、小細胞肺癌及び非小細胞肺癌などの肺癌、神経芽細胞腫／膠芽腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、肝臓癌、黒色癌、口腔、咽喉、喉頭及び肺の扁平上皮癌、結腸癌、子宮頸癌、子宮頸癌種、乳癌、並びに上皮癌、腎癌、泌尿生殖器癌、肺癌、食道癌、頭頚部癌腫、大腸癌、造血性癌、精巣癌、結腸癌及び直腸癌、前立腺癌、イピリムマブ不応性黒色腫、又は膵臓癌。
【０１１８】
したがって、一態様では、本明細書に開示されるのは、被検体における癌、アルツハイマー病、又は自己免疫疾患を治療する方法であって、被検体に、ＰＤ−１合成ペプチドを投与することを含み、そのＰＤ−１合成ペプチドが、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、又は配列番号１５に記載の配列のうちの１つ以上を含むという方法である。合成ペプチドは、アセチル化された、アミド化された、かつ／又はＤ体の鏡像異性体を含み得ることが理解され、本明細書において企図される。したがって、一態様では、本明細書に開示されるのは、被検体における癌、アルツハイマー病、又は自己免疫疾患を治療する方法であって、被検体に、ＰＤ−１合成ペプチドを投与することを含み、そのＰＤ−１合成ペプチドが、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号１８、配列番号９、配列番号１０、又は配列番号１１のＤ体鏡像異性体及び／又はレトロインベルソＤ体鏡像異性体である、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、及び配列番号１９にそれぞれ記載されるものを含むという方法である。
【０１１９】
一態様では、開示される組成物は、所与の疾患又は身体の異常に対する他の治療法と組み合わせることができることが理解される。例えば、一態様では、本明細書に開示されるのは、被検体にＰＤ−１ペプチド、ＰＤ−１合成ペプチド、又はＰＤ−１キメラペプチドを投与することを含む、癌を治療する方法であって、その疾患又は身体の異常が乳癌であり、その方法が、被検体に、１種以上のＨＥＲ−２のＢ細胞エピトープ（例えば、配列番号２７又は２９に記載されるような１種以上のＨＥＲ−２ペプチド、又は配列番号２８若しくは３０に記載のキメラＭＶＦ−ＨＥＲ−２ペプチド）及び／又は１種以上の抗ＨＥＲ−２抗体を投与することを更に含むという方法である。被検体にＨＥＲ−２のＢ細胞エピトープ又は抗ＨＥＲ−２抗体が投与される場合、その投与は、両者を別々にしかし同時に投与するものであっても、先にＨＥＲ−２のＢ細胞エピトープ又は抗ＨＥＲ−２抗体を投与するものであっても、後でＨＥＲ−２のＢ細胞エピトープ又は抗ＨＥＲ−２抗体を投与するものであっても、あるいは、ＨＥＲ−２のＢ細胞エピトープ又は抗ＨＥＲ−２抗体が、ＰＤ−１ペプチド、ＰＤ−１合成ペプチド、又はＰＤ−１キメラペプチドと同じ医薬製剤中の成分であるものであってもよいと理解される。例えば、乳癌を治療する方法は、被検体に、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５に記載されるＰＤ−１ペプチド、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、及び配列番号１１に記載のキメラＰＤ−１ペプチド、及び／又は配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、及び配列番号１９に記載のレトロインベルソＰＤ−１ペプチドのうちの１種以上を含む医薬組成物を投与することを含み得るが、その方法は、被検体に、１種以上のＨＥＲ−２のＢ細胞エピトープ（例えば、配列番号２７に記載のＨＥＲ−２（２６６−２９６）、及び／又は配列番号２９に記載のＨＥＲ−２（５９７−６２６））、並びに／又はキメラエピトープＭＶＦ−ＨＥＲ−２（２６６−２９６）ペプチド（例えば、配列番号２８に記載のもの）及びＭＶＦ−ＨＥＲ−２（５９７−６２６）ペプチド（例えば、配列番号３０に記載のもの）を投与することを更に含む。したがって、一態様では、本明細書に開示されるのは、乳癌の治療方法であって、乳癌に罹患した被検体に、配列番号１１に記載のＭＶＦ−ＰＤ１（９２−１１０）、ＭＶＦ−ＨＥＲ−２（２６６−２９６）ペプチド（例えば、配列番号２８に記載のもの）、及びＭＶＦ−ＨＥＲ−２（５９７−６２６）ペプチド（例えば、配列番号３０に記載のもの）を含む医薬組成物を投与することを含む方法である。
【０１２０】
癌、自己免疫疾患、又はアルツハイマー病の治療に使用するための合成ペプチドは、キメラペプチドの成分であり得ることが更に理解され、本明細書において企図される。したがって、一態様では、本明細書に開示されるのは、被検体にＰＤ−１キメラペプチドを投与することを含む、被検体における癌、アルツハイマー病、又は自己免疫疾患を治療する方法であって、そのキメラペプチドが、１種以上のＰＤ−１のＢ細胞エピトープと、Ｔヘルパー（Ｔｈ）エピトープと、そのＰＤ−１のＢ細胞エピトープをそのＴｈエピトープに接合させるリンカーとを含み、その１種以上のＰＤ−１のＢ細胞エピトープが、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、及び配列番号１５からなる群から選択される配列からなるという方法である。キメラペプチドに使用される合成ＰＤ−１ペプチド（すなわち、ＰＤ−１のＢ細胞エピトープ）は、アセチル化された、アミド化された、及び／又はＤ体の鏡像異性体を含み得ることが理解され、本明細書において企図される。一態様では、例えば、本明細書に開示されるのは、被検体に、ＰＤ−１キメラペプチドを投与することを含む、被検体における癌、アルツハイマー病、又は自己免疫疾患を治療する方法であって、キメラペプチドが、配列番号８、配列番号９、配列番号１０，の配列番号１１、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、又は配列番号１９の配列を含むという方法である。
【実施例】
【０１２１】
以下の実施例は、本明細書において特許請求の範囲に記載された化合物、組成物、物品、デバイス及び／又は方法をどのように製造及び評価するかの完全な開示及び記載を当業者に提供するために示され、純粋に例示的であることが意図され、開示を制限することを意図しない。数字（例えば、量、温度など）に関して精度を保証する努力がなされたが、ある程度の誤差及び偏差を考慮するものとする。特に記載のない限り、部分は、重量部であり、温度は、℃単位又は周囲温度であり、圧力は、大気圧又はほぼ大気圧である。
１．実施例１：ＰＤ−１に対するペプチドエピトープの選択、設計、及びモデリング
【０１２２】
ＰＤ−１の表面に発現した候補となるＢ細胞エピトープの選択は、社内（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（商標），５ｘ．ｃｏｍ）での、抗原性についての６つの相関物をコンピュータを使用して分析すること（Ｋａｕｍａｙａらがその分析をレビューした）によって実現された：（ａ）個々の配列の鎖の可撓性及び移動度のプロファイルを、Ｋａｒｐｌｕｓ及びＳｃｈｕｌｔｚに従って計算した；（ｂ）７つの残基スパン設定にわたって、疎水性親水性のプロファイルを生成し、次いで、Ｋｙｔｅ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅのスケールを使用して、３残基スパンで平滑化した；（ｃ）Ｈｏｐｐ及びＷｏｏｄｓのプログラムを使用して、６残基ウィンドウにわたる親水性プロファイルを生成した；（ｄ）アミノ酸残基の水への曝露の分析（１．４Ａプローブ）を、Ｒｏｓｅらの溶媒曝露アルゴリズムによって行った；（ｅ）伸出係数を、アクセス可能なタンパク質の部分であり、溶媒中に突出する部分を予測する、Ｔｈｏｒｎｔｏｎらの方法によって計算した；（ｆ）５残基配列が抗原性である確率が、Ｗｅｌｌｉｎｇらの方法によって決定された；配列は、それぞれの指数値に基づいて１〜６のスコアが与えられ、ランク付けされた：最も高いランクを付けられた配列は、検討された分析に対して最も高い個々のスコアを有し（６／６）、それ以上の候補となる配列は、順次、次に高いスコア（５／６）を与えられた。最も良いスコアのエピトープが、それらの二次構造属性との相関によって更にランク付けされた；例えば、両親媒性のα−螺旋配列又はβターンループ領域が、ランダムコイルフラグメントよりも好ましい。Ｃｈｏｕ及びＦａｓｍａｎ、並びにＮｏｖｏｔｎｙらによるコンピュータプログラムを使用して、二次構造（α−螺旋、β−ストランド／シート、β−ターン／ループ、ランダムコイル）及びα−螺旋状両親媒性モーメントを予測した。最後に、個々のアミノ酸配列を考慮した。静電イオン対、及び螺旋セグメントにおけるヘリックス双極子の相互作用も考慮された（例えば、疎水性／親水性のバランス）。最も高いスコアを与えられた配列を表４に示す。この方法を使用して、ヒトＰＤ−１の、最も高いスコアを得た１２個のＢ細胞エピトープ配列のうちの４つを優先度の高いものとした。アミノ酸３２−５０、４５−６４、７３−９０、及び９２−１１０を、ＰＤ−１：ＰＤＬ１（２０）の結晶構造からの情報と組み合わせて評価するために選択した。ヒトＰＤ−１（ＰＤＢ  ３ＲＲＱ）及びヒトＰＤ−Ｌ１（ＰＤＢ  ３ＢＩＳ、３ＦＮ３、４Ｚ１８、５Ｃ３Ｔ）の構造が既に決定されているが、それらは、複合体形成時のヒトＰＤ−１内での有意な可塑性を説明できなかった。なお、それは、完全ヒトＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１複合体（２０）の構造によって、ごく最近になってようやく実証された。上記の構造は相互作用の完全な説明を提供したものの、タンパク質−タンパク質界面の平坦な表面は、合理的な薬物開発を更に導くために、ＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１のいずれかと複合した小分子阻害剤に関する構造情報が存在しないという下では、薬剤設計の努力をなおも複雑にしている。結晶構造は、受容体−リガンド相互作用が、ＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１の両方の中のＣ０ＣＦＧストランドの残基によって大部分媒介されることを示している（図１）。タンパク質−タンパク質の接触部は、疎水性相互作用及び極性相互作用の両方を伴い、１，９７０Å２の総表面積を覆っている。相互作用が、両方のパートナーによって寄与され、ＰＤ−１の前側シートの非極性残基（Ｖａｌ６４、Ｉｌｅ１２６、Ｌｅｕ１２８、Ａｌａ１３２、Ｉｌｅ１３４）と、ＰＤ−Ｌ１の前側シートの非極性残基（ＬＩｌｅ５４、ＬＴｙｒ５６、ＬＭｅｔ１１５、ＬＡｌａ１２１、ＬＴｙｒ１２３）によって構成される、中央の疎水性コアの周りに構築されるが、それにはＩｌｅ１３４及びＬＴｙｒ１２３ａの側鎖の、特徴的アルキル−Ｐ相互作用を含む。この疎水性領域は、抗原結合部位となる予定の部位上の溶媒に対して開放しており、分子の反対側にある、極性／非極性相互作用の埋込み領域によって隣接されている。これらの領域は両方とも、受容体とリガンドとの間に更なる水素結合介在性相互作用を提供する、極性残基の周辺ネットワーク（ＣＤＲループ側で安全）によって囲まれている。その構造は、成熟ポリペプチドの残基１６−１２７を含むｈＰＤ−１が、ＩｇＳＦドメインのトポロジーがジスルフィド結合（Ｃｙｓ３４−Ｃｙｓ１０３）によって安定化された２層サンドイッチ（すなわち、２つのβシート（ＧＦＣＣ及びＡＢＥＤ）からなることを示す。図２Ａ、２Ｂ、及び２Ｃは、立体構造エピトープとしてのＰＤ−１ペプチドのモデリングを示す。
【表４】
2020512375.tif 000007
２．実施例２：ＰＤ−１ペプチド及びＭＶＦ−ＰＤ−１ペプチドの合成、精製、及び特性決定
【０１２３】
Ｆｍｏｃ／Ｂｏｃの化学的性質を用いる、９６００  Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ固相ペプチド合成装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用して、ペプチド合成を実施した。全てのペプチドの合成には、透明アミド樹脂（０．５０ミリモル／グラム）（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社（Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，ＫＹ）製）及びＦｍｏｃ保護アミノ酸（Ｐ３ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ（Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，ＫＹ）社製）を使用した。キメラペプチドの場合、Ｂ細胞エピトープは、位置選択的側鎖保護及びＧＰＳＬリンカーを使用して、無差別なＴｈのＭＶＦ（残基２８８−３０２）エピトープと共直線的に合成された。一部のＢ細胞エピトープは、ＤＭＦ中でアセチルイミダゾール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）社製）を使用してアセチル化した。ペプチドを一晩反応させ、次いで、切断前にＤＭＦで洗浄した。試薬Ｒ（トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）：チアソール：ＥＤＴ：アニソール、９０：５：３：２）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用して、ペプチドを切断した。粗ペプチドを、Ｗａｔｅｒｓシステム上の水／アセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸）中の、Ｃ−４  ｖｙｄａｃカラムを使用して、勾配系で逆相ＨＰＬＣによって精製した。精製終了時に、純粋画分を分析ＨＰＬＣで分析し、目的の画分を一緒にプールし、１０％酢酸溶液中で凍結乾燥した。次に、表５に列挙した最終精製ペプチドを、質量分析法（Ｃａｍｐｕｓ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｔｈｅ  Ｏｈｉｏ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，ＯＨ）を使用して同定した。
【表５】
2020512375.tif 000008
３．実施例３：ＢＩＡＣＯＲＥによるＰＤ−１ペプチドの結合特異性
ａ）Ｂｉａｃｏｒｅ固定化
【０１２４】
全ての選択されたペプチドの活性を試験するために、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分光法（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００、２５８Ｃにて）を使用して、ヒトＰＤ−Ｌ１（ｈＰＤ−Ｌ１）の細胞外ドメインに対する結合親和性を測定した。組換えｈＰＤ−Ｌ１外部ドメインを、直接のアミンカップリングによって、ＣＭ５センサチップの金表面上に固定化した。固定化したｈＰＤ−Ｌ１外部ドメインが官能性であることを確認するために、その組換えヒトＰＤ−１（ｈＰＤ−１）外部ドメインに対する親和性を確認した。
【０１２５】
ペプチド結合に対する理論上の最大応答を得るために必要な、ｒｈＰＤ−Ｌ１、ニボルマブ、及びヒトＩｇＧの計算された固定化量は、それぞれ９７９０ＲＵ、１４２８６ＲＵ、及び１４２８６ＲＵである。１０ｍＭのＮａＡｃ中の２０μｇ／ｍｌのｒｈＰＤ−Ｌ１（ｐＨ５．５）と、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ中のニボルマブ（ｐＨ７．５）と、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ中のヒトＩｇＧ（ｐＨ７．０）とを、ＥＤＣ／ＮＨＳで活性化した後のチップ上に７分間、１０μｌ／分で注入した。得られたｒｈＰＤ−Ｌ１（図３Ａ）、ニボルマブ（図３Ｂ）、ヒトＩｇＧ（図３Ｃ）は、それぞれ２３４５ＲＵ、１２２６４ＲＵ、及び１１６５１ＲＵである。
ｂ）ｒｈＰＤ−１及びニボルマブ結合の特異性試験
【０１２６】
調製したセンサチップを検証するために、１μＭ（１７．３μｇ／ｍｌ）のｒｈＰＤ−１を、３分間、１０μｌ／分でチップ上に注入した（図３Ｄ）。１μＭのＢＳＡを陰性対照として使用した。チップを、１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．５）によって再生した（図３Ｅ）。ｒｈＰＤ−１インジェクションニボルマブが、応答（３７４０ＲＵ）を伴う強いシグナルを生成し、ｒｈＰＤ−Ｌ１は弱いシグナル（４６１ＲＵ）を引き起こしたが、一方、ヒトＩｇＧは何の結合シグナルも示さなかった。ＢＳＡは、何の結合にもつながらず、ニボルマブ及びｒｈＰＤ−Ｌ１へのＰＤ−１の結合が特異的であるということを示した。
ｃ）Ｂｉａｃｏｒｅによる、ＰＤ−１ペプチドのｒＰＤ−Ｌ１及びニボルマブへの結合の特異性
【０１２７】
１μＭの様々なＰＤ−１ペプチドを、１０μｌ／分で１分間、チップ上に注入し、続いて１分間解離させ、次いで、各実施のために、１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．５）で１分間の再生を行った。図４Ａは、ＭＶＦ−ＰＤ−１（４５−６４）、ＭＶＦ−ＰＤ−１（７３−９０）、ＭＶＦ−ＰＤ−１（９２−１１０）が固定化ｒｈＰＤ−Ｌ１に結合して、約１１０ＲＵをもたらすことを示す。対照的に、ＭＶＦ−ＰＤ−１（３２−５０）は、陰性対照、ＭＶＦ−ＨＥＲ−２（２６６−２９６）（２０ＲＵ）と同様である、非常に弱い結合（１１ＲＵ）を示す。同じ３つの陽性ＭＶＦペプチドはそれぞれ、１０３０ＲＵ、１０００ＲＵ、及び９７０ＲＵと、ニボルマブに対するより強い結合を示した（図４Ｂ）。ここでも、ＭＶＦ−ＰＤ−１（３２−５０）は、無視できるほどのごく小さい結合能力（２０ＲＵ）しか示さず、そのことは、この配列が生存可能なエピトープを表していないことを示している。ＭＶＦ−ＰＤ−１（４５−６４、７３−９０及び９２−１１０）は、ｒｈＰＤ−Ｌ１及びニボルマブの両方を認識することができるが、ＭＶＦ−ＰＤ−１（３１−４９）はそれができないと結論付けられた。加えて、アセチル化ペプチドはまた、キメラＭＶＦペプチドよりも弱くではあるものの、ｒｈＰＤ−Ｌ１及びニボルマブにも結合する（図４Ｃ〜４Ｄ）。遊離ペプチドはまた、ＰＤ−Ｌ１及びニボルマブの両方に結合し、ＰＤ−１（７３−９０）は、ＰＤ−１（４５−６４）及びＰＤ−１（９２−１１０）よりもｒｈＰＤ−Ｌ１及びニボルマブに対する結合力がはるかに強いことを示す（図４Ｅ及び４Ｆ）。ＰＤ−１（４５−６４）は、２番目に強力な結合剤である。したがって、遊離ペプチドの結合効率は、以下のようにランク付けすることができる：７３−９０＞４６−６４＞９２−１１０。これらの結合に関する研究から、ＰＤ−１ペプチド４６−６４、７３−９０、及び９２−１１０は、ｒＰＤ−Ｌ１を認識することができ、ＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ１相互作用の低分子ペプチド阻害剤として作用し得ると結論付けることができる。
４．実施例４：ウサギにおけるＰＤ−１ペプチドの免疫原性試験
ａ）高力価の抗ペプチド抗体を誘発するＭＶＦ−ＰＤ−１ペプチド。
【０１２８】
４つのＰＤ−１配列を、麻疹ウイルス融合タンパク質（ＭＶＦ、アミノ酸２８８−３０２）から誘導された、無差別なＴヘルパーエピトープを有するキメラ構築物として合成した。ペプチドのワクチン構築物１ｍｇを、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ７２０（Ｓｅｐｐｉｃ（Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）社製）及びノル−ＭＤＰ免疫増強剤（Ｎ−アセチル−グルコサミン−３イル−アセチルＬ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン）内で乳化させ、ニュージーランド白色ウサギに免疫をもたせるために用いた。なお、これらのニュージーランド白色ウサギは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）から購入し、オハイオ州立大学の大学研究所動物リソース（ＵＬＡＲ）の施設に収容されていたものである。ウサギには、３週間間隔で合計３回、ワクチン接種した。動物から週１回採血し、９週目に屠殺し、最後の試験出血時に心穿刺により終末血を採取した。全ての実験は、米国公衆衛生局の実験動物の人道的な取り扱いに関する政策（U.S.Public Health Service Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animals）に準拠して行われ、かつオハイオ州立大学の施設内における動物の取り扱いに関する委員会（Ohio State University Institutional Animals Care and Use Committee）により承認され、その詳細は、受理されたプロトコルに記載されている。ペプチドワクチン抗体を、タンパク質Ａ／Ｇカラムを使用してアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、その濃度をクーマシータンパク質アッセイにより測定した。
【０１２９】
全ての４つのエピトープは、図５Ａの免疫ワクチンに対する高力価（＞２５０，０００）抗体を誘導した。終末血の抗体はまた、組換えヒトＰＤ−１タンパク質、並びに免疫化ペプチドＭＶＦ−ＰＤ−１、アセチル化ペプチド、及び遊離ペプチドを認識した（図５Ｂ）。
ｂ）（ｉｉ）選択されたエピトープの、ヒトＰＤ−１配列及びマウスＰＤ−１配列間のホモロジー。
【０１３０】
ヒトＰＤ−１配列及びマウスＰＤ−１配列間には、６５％の全体相同性が存在する。選択されたエピトープは、ヒト配列とマウス配列との間で、６７％〜７４％の相同性を示す。したがって、選択されたヒトエピトープがマウスＰＤ−１に結合してマウスの研究を検証できるかどうかを見ることが重要であった。
ｃ）（ｉｉｉ）マウスＰＤ−１に結合するα−ｈＰＤ−１ウサギポリクローナル抗体
【０１３１】
α−ｈＰＤ−１ウサギポリクローナル抗体がマウスＰＤ−１を認識しているかどうかを判定するために、ナイーブミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）特異的ＴＣＲ遺伝子導入マウスからの脾細胞を、ＭＢＰ  Ａｃ１−１１で７２時間活性化した。ＰＤ−１発現をフローサイトメトリーによって分析した。図６に示すように、４つのポリクローナルα−ｈＰＤ−１抗体は全て、マウスＰＤ−１に結合し、腫瘍マウス研究におけるヒトＰＤ−１の使用の妥当性を確認した。
Ｄ）（ｉｖ）α−ヒトＰＤ−１抗体によるＴ細胞増殖の調節
【０１３２】
抗原特異的Ｔ細胞増殖は、Ｔエフェクター細胞の重要なエフェクター機能を反映している。４つのα−ヒトＰＤ−１抗体が、ＰＤ−１シグナル伝達経路を活性化又は阻害することによって、Ｔエフェクター機能を変化させるかどうかを判定するために、ＣＦＳＥ系増殖アッセイを実施した（図７）。簡潔に述べると、ナイーブＭＢＰ−特異的ＴＣＲ遺伝子導入マウスからの脾細胞をＣＦＳＥで標識し、５０ｍｇ／ｍｌのα−ヒトＰＤ−１抗体又は対照例としてのウサギＩｇＧの存在下で、ＭＢＰ  Ａｃ１−１１を用いて、４日間活性化した。ＣＦＳＥ発現をフローサイトメトリーにより分析した。データは、ＩｇＧで処理された対照グループにおいては７０％しか高度に増殖していないのに比べ、α−ヒトＰＤ−１−９２−１１０で処理されたＣＤ４のＴ細胞の８１％が高度に増殖していることを示しており、このことは、α−ヒトＰＤ−１−９２−１１０が、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用をブロックし、ミエリン特異的ＣＤ４のＴ細胞の抗原特異的増殖の増加によって表される、亢進したＴエフェクター機能をもたらすことを示す。対照的に、α−ヒトＰＤ−１（４５−６４）又はα−ヒトＰＤ−１（７３−９０）で処理したＴ細胞は、その増殖が減少し、そのことは、それらがＰＤ−１シグナル伝達を活性化し、ミエリン特異的ＣＤ４のＴ細胞のエフェクター機能を阻害していることを示す。更に、α−ヒトＰＤ−１（３２−５０）で処理された細胞は、対照例の、ＩｇＧで処理した細胞と同じレベルで増殖しているため、α−ヒトＰＤ−１（３２−５０）は、Ｔエフェクター機能に影響を及ぼしていない。まとめると、これらのデータは共に、α−ヒトＰＤ−１（９２−１１０）がＴエフェクター機能を強化し、生体内での腫瘍成長を阻害する治療能力を有することを示す。ＰＤ−１シグナル伝達を活性化する特性により、エピトープ４５−６４及びエピトープ７３−９０は、自己免疫疾患の場合の標的として機能することができる。
５．実施例５：免疫応答性マウスと腫瘍負荷とによる実験における、ＰＤ−１ペプチドの免疫原性試験
ａ）マウスワクチン接種及び抗原としての腫瘍投与のプロトコル。
【０１３３】
６−８週齢の免疫応答性Ｂａｌｂ／ｃマウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）から購入し、オハイオ州大学大学研究所動物リソース（ＵＬＡＲ）の施設に収容した。動物に細胞を注射し及び死に至らしめる前に、イソフルランを使用して麻酔した。免疫前の血清サンプルをマウスから採取した後、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ７２０（Ｓｅｐｐｉｃ（Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）社製）及びノル−ＭＤＰ免疫増強剤（Ｎ−アセチル−グルコサミン−３イル−アセチルＬ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン）内で乳化させた１００μｇのペプチドで免疫を与えた。マウスは、最初の免疫付与から３週間後及び６週間後に、追加免疫化を受けた。マウスからいくつかの試験血清サンプルを採取した（図８）。
ｂ）抗原としての腫瘍の投与：
【０１３４】
２回目のブーストから１０日後、マウスに、１×１０５個のマウス結腸癌ＣＴ２６腫瘍細胞を、右脇腹の皮下に接種した。腫瘍の成長を週３回モニタリングし、血清サンプルを毎週、更には動物を屠殺した際に採取した。０日目の対照マウスに、１×１０５個のＣＴ２６腫瘍細胞を皮下移植した。動物は、ＰＤ−１に対する抗マウス抗体の１５０μｇの注射を受けた。マウスをモニタリングし、週２回、触知可能な腫瘍の形成についてスコア化した。腫瘍が壊死したか、又は２，０００ｍｍ３の所定のサイズを超えた際にマウスを屠殺した。腫瘍直径を週２回測定した。腫瘍サイズは、式：Ｖ＝［（長さ×幅２）／２］に従って計算した。腫瘍体積をキャリパーで立方ミリメートル単位で測定し、式Ａ×Ｂ２×０．５（式中、Ａは最大直径であり、Ｂは最小直径である）で計算した。全ての実験は、米国公衆衛生局の実験動物の人道的な取り扱いに関する政策（U.S.Public Health Service Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animals）に準拠して行われ、かつオハイオ州立大学の施設内における動物の取り扱いに関する委員会（Ohio State University Institutional Animals Care and Use Committee）により承認され、その詳細は、受理されたプロトコルに記載されている。
ｃ）マウスにおけるＰＤ−１ワクチン構築物の免疫原性。
【０１３５】
全ての個々のマウスは、全ての４つのワクチンに対して、強い抗体応答開始した。プールした血清に対する免疫応答（図９及び表６）を、ワクチン構築物に対して、様々な間隔（２Ｙ＋１、２Ｙ＋３、３Ｙ＋１、３Ｙ＋２、３Ｙ＋３）でモニタリングした。
【表６】
2020512375.tif 000009
ｄ）マウス組織における免疫細胞の検出
【０１３６】
腫瘍及び腫瘍排出リンパ節を、マウスにおける免疫応答を研究するために、後でＦＡＣＳ分析する目的で収集した。細胞懸濁液を、組織を機械的に解離させることによって、又は酵素により消化させることによって調製した。染色された細胞を、波長４０５、４８８、及び６３３ｎｍの３種類の励起レーザーを備えたＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）で分析した。腫瘍白血球からのＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を、ＭＡＣＳカラム又はＦＡＣＳＡｒｉａのいずれかで精製した。
ｅ）処置マウスにおけるＴ細胞応答の免疫プロファイリング
【０１３７】
フローサイトメトリー分析を行って、脾細胞及び腫瘍浸潤Ｔ細胞における表面マーカー（ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＣＤ２５）及び転写因子ＦｏｘＰ３の発現を評価した。簡潔に述べると、脾臓をマウスから取り出し、細胞ストレーナーを通してプレスし、続いて赤血球溶解緩衝液と短時間インキュベートして赤血球を溶解させた。次いで、細胞を回収し、洗浄し、染色緩衝液（ＰＢＳ中１％  ＢＳＡ）中に再懸濁させた。同様に、腫瘍をマウスから取り出し、細胞ストレーナーを介してプレスし、続いて３７％のパーコールで１回洗浄した。次いで、腫瘍細胞をＰＢＳで洗浄し、染色緩衝液中に再懸濁させた。脾細胞及び腫瘍細胞を、細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体とともに、４℃で３０分間インキュベートした。染色緩衝液で２回洗浄した後、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ溶液を用いて、４℃で６０分間、細胞固定及び透過処理した。細胞を、４℃で３０分間、ＦｏｘＰ３用に染色した。８０，０００〜１００，０００の生細胞イベントをＦＡＣＳＣａｎｔｏ（ＢＤ社製）上で取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．製）を使用して分析した。腫瘍細胞から浸潤細胞を区別するために、腫瘍細胞を最初にＣＤ４５＋細胞でゲーティングした。次いで、ＣＤ３＋ＣＤ４＋及びＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞を分析した。Ｔｒｅｇは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋細胞によって表された。図１０Ａに示すように、ＣＤ４及びＣＤ８のサブセットは、脾臓において同様のレベルであり、一方、Ｃ群、Ｅ群、及びＦ群は、Ａ群（陰性対照）と比較して、脾臓におけるＴｒｅｇ集団の増加を示した。腫瘍において、Ｃ群は、他の４つの群と比較して、最も高いＴｒｅｇを有する（図１０Ｂ）。これが示すのは、ペプチドＰＤ１−４５−６４ワクチン接種は、腫瘍微小環境におけるＴｒｅｇの成長の増加をもたらしたということである。Ｅ群は、最も低いＴｒｅｇレベルを有した。
ｆｆ）ＰＤ−１構築物で免疫され、１ｘ１０５個のマウス結腸癌ＣＴ２６腫瘍細胞を抗原として投与された同一遺伝子のＢａｌｂ／ｃマウスにおける有効性研究
【０１３８】
図１１は、４つのＰＤ−１構築物（Ａ：（ＰＤ−１（３２−５０）、Ｂ：ＰＤ−１（４５−６４）、Ｃ：ＰＤ−１（７３−９０）、及びＤ：ＰＤ−１（９２−１１０））、対照ペプチド（Ｅ：無関係なペプチド）、及び抗マウスＰＤ−１モノクローナル抗体で処理した陽性対照群（Ｆ）のそれぞれについて、マウス（５個体／群）における腫瘍成長の個々のプロットを示す。
ｇ）マウス腫瘍増殖データの予備的な統計分析
【０１３９】
腫瘍増殖に対する４つの異なるワクチン処置の性能を評価するために、腫瘍サイズをマウスで定期的に測定し、結果を陽性対照及び陰性対照のものと比較した。各治療群には５匹のマウスが存在し、それぞれ割り当てられたＭＶＦペプチドを受容し、次いで、治療の最後のブーストの１０日後に、１ｅ５  ＣＴ２６（結腸）腫瘍細胞を接種した。１４日目は、最も重要な注目時点であると考えられた。それは、治験者は、１９日目まで待っても、腫瘍が成長するのには時間が長すぎて、１９日目でも１４日目でも得られるサイズが同様であると考えていたためである。腫瘍サイズは、以下の３つの方法で測定した：全ての時点で、ＬＷＷ（１／２＊長さ＊幅＊幅）；全ての時点で、ＬＷＨ（１／２＊長さ＊幅＊高さ）；及び試験の終了時の腫瘍量の最終重量。ＭＶＦ−ＰＤ−ａ（４５）で処置したマウス、Ｃ群は、１匹のマウスが死亡したため１９日目に屠殺された。そのため、比較は、１４日目の腫瘍サイズ間でのみ行うことができる。腫瘍サイズは、ＬＷＷ及びＬＷＨについてはｍｍ３単位で、最終腫瘍重量については、ｇ単位である。
【０１４０】
各群のサンプルサイズが小さく、正規性を想定できないため、正確なウィルコクソン順位和検定を使用して、腫瘍サイズの分布間の系統的差を１４日目及び１９日目時点についてチェックした（図１２Ａ〜Ｄ及び表７〜１０）。所与のｐ値は、そのカラムの対照をそれぞれの処置と比較する試験のためのものであり、腫瘍サイズが治療と対照との間で体系的に大きいか又はより小さい可能性を考慮するために、両側に取る。これは予備データであるため、複数の比較のためにｐ値を調整することはしない。全体として、対照の分布と治療したものの分布との間に有意な差がある事例はほとんど存在しなかった。
【表７】
2020512375.tif 000010
ＭＶＦ−ＰＤ−ａ（３２）については、治療したものと、陽性対照又は陰性対照のいずれかとの間の腫瘍サイズの分布には、有意差はなかった。
【表８】
2020512375.tif 000011
ＭＶＦ−ＰＤ−１（４５−６４）については、上記のように、比較を１４日目のデータに対してのみ行うことができる。ここで、腫瘍サイズ分布について、この治療したものと対照のいずれかとの間には、有意差は見出せなかった。
【表９】
2020512375.tif 000012
ＭＶＦ−ＰＤ−１（７３−９０）については、１４日目時点で、腫瘍サイズ分布について、この治療例と対照例のいずれかとの間に有意差はなかった。治療例を陽性対照例と比較したとき、１９日目時点では、ＬＷＨについて、顕著に小さいｐ値（＜０．１）が存在し、腫瘍サイズ分布に、差がある可能性を示していた。
【表１０】
2020512375.tif 000013
ＭＶＦ−ＰＤ−１（９２−１１０）の場合も、ＬＷＷ測定値及びＬＷＨ測定値の両方を使用して、この治療例を陽性対照例と比較すると、顕著に小さいｐ値が存在した。治療は、陽性対照よりも、体系的により小さい腫瘍サイズの分布を有するように見えた。
６．実施例６：ＰＤ−１ペプチド抗体の阻害性又は賦活性
【０１４１】
抗原特異的Ｔ細胞の増殖は、Ｔエフェクター細胞の重要なエフェクター機能を反映する。ＰＤ−１シグナル伝達経路を活性化又は阻害することによって、４つのα−ヒトＰＤ−１抗体がＴエフェクター機能を変化させるかどうかを判定するために、ＣＦＳＥ系増殖アッセイを実施した。増殖アッセイにおいて、ナイーブＭＢＰ−特異的ＴＣＲ遺伝子導入マウスからの脾細胞をＣＦＳＥで標識し、５０ｍｇ／ｍｌのα−ヒトＰＤ−１抗体又は対照例としてのウサギＩｇＧの存在下で、ＭＢＰ  Ａｃ１−１１を用いて、４日間活性化した。ＣＦＳＥ発現を、フローサイトメトリーにより分析した（図１３）。データは、ＩｇＧで処理された対照グループにおいては７０％しか高度に増殖していないのに比べ、α−ヒトＰＤ−１−９２−１１０で処理されたＣＤ４のＴ細胞の８１％が高度に増殖していることを示しており、このことは、α−ヒトＰＤ−１−９２−１１０が、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用をブロックし、ミエリン特異的ＣＤ４のＴ細胞の抗原特異的増殖の増加によって表される、亢進したＴエフェクター機能をもたらすことを示す。対照的に、α−ヒトＰＤ−１（４５−６４）又はα−ヒトＰＤ−１（７３−９０）で処理したＴ細胞は、その増殖が減少し、そのことは、それらがＰＤ−１シグナル伝達を活性化し、ミエリン特異的ＣＤ４のＴ細胞のエフェクター機能を阻害していることを示す。まとめると、これらのデータは共に、α−ヒトＰＤ−１（９２−１１０）がＴエフェクター機能を強化し、生体内での腫瘍成長を阻害する潜在的治療能力を有し得ることを示す。ＰＤ−１シグナル伝達を活性化する特性により、エピトープ４５−６４及びエピトープ７３−９０は、自己免疫疾患の場合の標的として機能することができる。
７．実施例７：異なるＰＤ−１構築物で免疫化され、１×１０５個のマウス結腸癌ＣＴ２６腫瘍細胞を抗原として投与された同一遺伝子のＢａｌｂ／ｃマウスにおける予備的スクリーニング有効性試験
【０１４２】
６−８週齢の免疫応答性Ｂａｌｂ／ｃマウス（５マウス／群）を、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ７２０（Ｓｅｐｐｉｃ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）及びノルＭＤＰ免疫増強剤（Ｎ−アセチル−グルコサミン−３イル−アセチルＬアラニル−イソグルタミン）に乳化させた１００μｇのペプチドで免疫化した。マウスは、３週目及び６週目に追加の免疫化を受け、２回目の追加免疫化から１０日後に、腫瘍を抗原として投与された。具体的には、１×１０５個のマウス結腸癌ＣＴ２６腫瘍細胞を、マウスに皮下接種して、腫瘍増殖を週３回モニタリングした。対照例のマウスには、０日目に、１×１０５  ＣＴ２６腫瘍細胞を皮下に移植し、ＰＤ−１に対して向けられた抗マウス抗体を１５０μｇ、注射した。プールした血清に対する免疫応答（図１４）を、ワクチン構築体及び組換えＰＤ−１タンパク質に対して、様々な間隔（２Ｙ＋１、２Ｙ＋３、３Ｙ＋１、３Ｙ＋２、３Ｙ＋３）でモニタリングした（表１１）。全ての個々のマウスは、全ての４つのワクチンに対して、強い抗体応答開始した。
【表１１】
2020512375.tif 000014
マウス及びウサギの終末血清を、組換えヒトＰＤ１タンパク質６００ｎｇ／ウェルに対する反応性について試験した。血清を１：１００及び１：２００希釈で試験した。アッセイにおいて、ＡＢＴＳを基質として使用した。サンプルを
【数２】
2020512375.tif 000015
で読み取り、スコア化した。
８．実施例８：ワクチン候補としてのＰＤ−１（９２−１１０）エピトープの検証
【０１４３】
全てのワクチン接種マウスは、それぞれの免疫原に高い抗体価を発現する高い免疫原性を示した。ＭＶＦ−ＰＤ−１（９２−１１０）をワクチン接種したマウスのみが、１４日目において腫瘍成長を有意に阻害していたことを示しており（図１５）、このエピトープが有用な阻害性ワクチンであることを示している。この結論は、エピトープ４５−６４及び７３−９０が阻害性ではなく、したがって腫瘍成長を強化していることを示した研究によって更に確認されている。一方、陽性対照であるマウスＰＤ１  ｍＡｂ（２９Ｆ．１Ａ１２）は、腫瘍成長を阻害したはずである。ＰＤ−１（９２−１１０）エピトープのみが、ニボルマブへの結合特性に基づいてエピトープが設計されているため、ワクチンの最有力な候補であると結論付けられた。
９．実施例９：１×１０５個のマウス結腸癌ＣＴ２６／ＨＥＲ−２腫瘍細胞を抗原として投与された、同一遺伝子のＢａｌｂ／ｃマウスにおける併用ＰＤ−１及びＨＥＲ−２ワクチン構築物の有効性（スキーム図１６）。
【０１４４】
この研究の理論的解釈は、ＰＤ−１（９２−１１０）ワクチンと組み合わせた十分に確立されたＨＥＲ−２ワクチンが、免疫原性を増強／増加させることができ、抗腫瘍応答を強化し、同一遺伝子の癌モデルにおける腫瘍成長の阻害に相乗的な利益を提供することができるかどうかである。ＭＶＦ−ＰＤ−１（９２−１１０）、ＭＶＦ−ＨＥＲ−２（２６６−２９６）、及びＭＶＦ−ＨＥＲ−２（５９７−６２６）ペプチドワクチン構築物の組み合わせを、ノルＭＤＰとＩＳＡ７２０とで乳化させた上で、それを用いて、Ｂａｌｂ／ｃマウス（１０マウス／群）に免疫をもたせた。動物には、３週間間隔で２回、追加の免疫化を行った。２００ｎｇ／ウェルのＭＶＦペプチド上で、抗体力価を、ＥＬＩＳＡによって決定した。
【０１４５】
最後の追加免疫化から２週間後、ＣＴ２６／ＨＥＲ−２腫瘍株からの１×１０５個の腫瘍細胞を、皮下に移植した。対照マウスは、１×１０５個の腫瘍細胞を抗原として投与され、実験期間の間、抗ＰＤ−１抗体（２９Ｆ．１Ａ１２）で週２回、処置をされた。腫瘍量は、腫瘍が触知可能な大きさに到達した時点で、キャリパーを使用して腫瘍を測定することによって決定した。ＣＴ−２６／ＨＥＲ−２腫瘍を有する担癌マウスは、移植から２１日後に屠殺された。屠殺時にこれらのマウスから、血液及び組織サンプルを採取し、切除した腫瘍塊の最終重量を測定した。１：１００−１：５１２，０００の血清濃度を試験した。アッセイにおいては、ＡＢＴＳを基質として使用し、０．１％のＳＤＳ溶液を用いて、１０分後に酵素反応を停止させた。力価は、４１５ｎｍで読み取ったときにまだ、０．２００超の吸光度を有した最後の希釈物として定義した。血清サンプル１Ｙ＋３、２Ｙ＋１、２Ｙ＋３、及び３Ｙ＋２を、ＣＴ−２６ＨＥＲ−２のｎｅｕ腫瘍を抗原として投与する前に採取した。試料３Ｙ＋３及び３Ｙ＋５をそれぞれ、抗原投与の１週間後及び３週間後に採取した。強いＨＥＲ−２及びＰＤ−１抗体応答が、全てのワクチン接種マウスにおいて誘発された（図１７）。
【０１４６】
３週間間隔で３回、同一遺伝子のＢａｌｂ／ｃマウス（１０／群）を、ＰＤ−１（９２−１１０）のみで免疫化したもの、又は２種類のＨＥＲ−２ペプチド免疫原と組み合わせて免疫化したものを用意して、それらのＢａｌｂ／ｃマウスにおける腫瘍成長をプロットしている。なお、無関係なペプチドで免疫化された免疫対照群も、テストした。３回目のワクチン接種の１５日後に、ＣＴ−２６のＨｅｒ２のｎｅｕ癌腫細胞（１×１０５個）をマウスに抗原として投与した。対照マウスにも、ＣＴ−２６のＨｅｒ２のｎｅｕ癌腫細胞を投与した。対照マウスを、抗マウスＰＤ−１  ＭＡｂ（ポジティブコントロール）又はＰＢＳ（ネガティブコントロール）で週２回、処置した。マウスをモニタリングし、触知可能な腫瘍の形成についてスコア化した後、キャリパーを使用して、腫瘍寸法を定期的に測定した。腫瘍細胞の移植後２１日目に、動物を屠殺した。エラーバーは、マウス群の標準誤差の表現であり、ｐ値は、様々な群を３種ワクチン接種したマウスと比較するものである。結果は、３種のワクチン接種が、ＰＤ−１ワクチン接種群、又はより重要なことに、ゴールドスタンダードとされる陽性対照、抗マウスＰＤ−１モノクローナル抗体（２９Ｆ．１Ａ１２）接種群のいずれと比較しても、結腸癌のＢａｌｂ／ｃ同系モデルにおける腫瘍成長を減少させるのに有効であることを示している（図１８）。
【０１４７】
データは、３種のワクチン接種群（ＭＶＦ−ＰＤ−１（９２−１１０）＋ＭＶＦ−ＨＥＲ−２（２６６＋２９６）＋ＭＶＦ−ＨＥＲ−２（５９７−６２６））は、陽性対照である抗マウスＰＤ−１  Ｍａｂ（２９Ｆ．１Ａ１２）接種群、又はＭＶＦ−ＰＤ−１単独によるワクチン接種群のいずれと比べても、腫瘍成長の防止においてより効果的であったことを示している（図１９Ａ及び図１９Ｂ）。したがって、ＨＥＲ−２とＰＤ−１のコンボペプチドによる３種ワクチンの接種という戦略は、免疫原性の強化及び腫瘍成長の阻害強化に到達させる相乗性／付加性を実証している、実行可能な提案である。
１０．実施例１０：安全で、毒性も自己免疫性も示さないＰＤ−１ワクチン
【０１４８】
９週間の期間にわたってワクチン接種された全てのマウスは、体調の乱れ、病害、及び活力喪失の兆候を何も示さなかった。組み合わせペプチド（ＨＥＲ−２及びＰＤ−１）をワクチン接種したＢａｌｂ／ｃマウスから、器官類（脾臓、肝臓、心臓、肺、腎臓、及び腫瘍）を回収し、Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ＆  Ｍｏｕｓｅ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ｃｏｒｅ  ｆａｃｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｎｔｅｒ  ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（病理学者：Ｋｒｉｓｔａ  Ｍ．Ｄ．Ｌａ  Ｐｅｒｌｅ，ＤＶＭ，ＰｈＤ，Ｄｉｐｌ．ＡＣＶＰ）での分析のために提出した。組織学的評価のために提出された器官のいずれにも、有意な病変は認められなかった。また、顕在的な生化学的異常は認められなかった。全てのマウスには、糖原病の症状と一致する、肝細胞における空胞形成が見られた。肝臓におけるグリコーゲン蓄積は、正常な所見であると解釈され、動物の生理学的状態に応じて変化するものである。またグリコーゲン蓄積は、毒性の発現又は糖原貯蔵障害の兆候としても観察され得るものである。
１１．実施例１１：腫瘍浸潤細胞（ＴＩＬｓ）におけるＣＤ８／Ｔｒｅｇ比を有意に増加させる組み合わせペプチドワクチン
【０１４９】
ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋  ＣＤ４の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、免疫抑制性の腫瘍微小環境（ＴＭＥ）の発達に有意に寄与する、腫瘍微小環境における主要抑制集団のうちの１つである。一方、Ｔ細胞、特にＣＤ８  Ｔ細胞が多数、腫瘍部位に存在することは、癌患者における全生存（ＯＳ）のキーとなる共通因子である。高いＣＤ８／Ｔｒｅｇ比率は、癌においては、好ましい予後と関連するものである。したがって、組み合わせペプチド又は対照ペプチド（上述）を用いてワクチン接種した担腫瘍マウスにおけるＴＩＣ中のＣＤ８／Ｔｒｅｇ比率を決定した。腫瘍を４群のマウス（上述）から取り出し、細胞ストレーナーを介してプレスし、続いて３７％のパーコールで２回洗浄した。次いで、その細胞をｍＡｂと共に細胞表面マーカーに対してインキュベートした（ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５その後、細胞を固定化し、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ溶液（ｅｂＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて、４℃で６０分間透過処理した後、４℃で３０分間ＦｏｘＰ３用に染色した。８０，０００〜１００，０００の生細胞イベントをＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ社製）上で取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．製）を使用して分析した。腫瘍細胞から腫瘍浸潤細胞（ＴＩＬｓ）を区別するために、細胞を最初にＣＤ４５＋細胞でゲーティングした。次に、ＣＤ４＋（図２０Ａ）及びＣＤ８＋（図２０Ｂ）細胞を分析した。Ｔｒｅｇは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋細胞によって表された（図２０Ｃ）。ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）製）を、統計分析のために利用した。グループ平均を計算し、分散分析で比較した。ＣＤ８＋のＴ細胞は、対照ペプチドワクチン接種群と比較して、組み合わせワクチン群（ＨＥＲ−２／ＰＤ１−９２ワクチン接種群）において、有意に高かった（図２０Ｂ）。全ての群どうしの間で、ＣＤ４のＴ細胞又はＴｒｅｇ細胞については、有意な差はない（図２０Ａ及び２０Ｂ）。しかしながら、ＣＤ８／Ｔｒｅｇ比率は、対照ペプチドワクチン接種群と比較して、組み合わせワクチン接種群において、有意に高くなっている（図２０Ｂ）。したがって、これらのデータは、対照ペプチドワクチン接種群と比較して、ＨＥＲ−２／ＰＤ−１ワクチン接種群における高いＣＤ８／Ｔｒｅｇ比率を示している）４で３０分
１２．実施例１２：ペプチドワクチン接種マウスからの腫瘍浸潤リンパ球の分析
【０１５０】
高いＣＤ８／Ｔｒｅｇ比率は、癌において好ましい予後に関連しているとされてきた。ペプチドワクチンがＣＤ８／Ｔｒｅｇ比率を高めるかどうかを判定するため、ＣＤ８＋、ＣＤ４＋、及びＴ制御性（ＦｏｘＰ３＋  ＣＤ２５＋  ＣＤ４＋）腫瘍浸潤リンパ球を、ペプチドワクチン接種マウスで分析した。フローサイトメトリー分析を実施して、表面マーカー（ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＣＤ２５）の発現を評価し、転写因子ＦｏｘＰ３の発現を細胞内染色によって判定した（図２１Ａ）。簡潔に述べると、腫瘍をマウスから取り出し、細胞ストレーナーを介してプレスし、続いて３７％のパーコールで２回洗浄した。次いで、細胞を染色緩衝液中に再懸濁し、ｍＡｂと共に細胞表面マーカーに対して４℃で３０分間インキュベートした。染色緩衝液で２回洗浄した後、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ溶液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて、４℃で６０分間、細胞固定及び透過処理した。次いで、細胞を、４℃で３０分間ＦｏｘＰ３用に染色した。８０，０００〜１００，０００の生細胞イベントをＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ社製）上で取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．製）を使用して分析した。腫瘍細胞（ＣＤ４５−）から浸潤細胞（ＣＤ４５＋）を区別するために、全細胞を最初にＣＤ４５＋細胞でゲーティングした。次いで、ＣＤ４５＋腫瘍浸潤集団におけるＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞の割合を分析した。Ｔｒｅｇは、ＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋細胞によって表された。ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）製）を、統計分析のために利用した。グループ平均を計算し、分散分析で比較した。図２１Ｂに示すように、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、対照ペプチドワクチン接種群（群３）と比較して、ＰＤ−１ペプチドワクチン接種群（群１）又はＰＤ−１／Ｈｅｒ−２ワクチン接種群（群２）において、有意に高かった。しかしながら、ＰＤ−１ペプチドワクチン接種群、ＰＤ−１／Ｈｅｒ−２ワクチン接種群、及び対照ペプチドワクチン接種群間で、Ｔｒｅｇ細胞に、有意な差はなかった。これらのデータは、対照ペプチドワクチン接種群と比較して、ＰＤ−１ペプチドワクチン接種群又はＰＤ−１／Ｈｅｒ−２ワクチン接種群において、ＣＤ８／Ｔｒｅｇ比率が増加していることを示している。
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Ｈｏｕｃｋ  ＫＡ，Ｆｅｒｒａｒａ  Ｎ，Ｗｉｎｅｒ  Ｊ，Ｃａｃｈｉａｎｅｓ  Ｇ，Ｌｉ  Ｂ，Ｌｅｕｎｇ  ＤＷ．Ｔｈｅ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｆａｍｉｌｙ：ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｆｏｕｒｔｈ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｏｆ  ＲＮＡ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．１９９１；５（１２）：１８０６−１４．Ｅｐｕｂ  １９９１／１２／０１．
Ｈｙｎｅｓ  ＮＥ，Ｌａｎｅ  ＨＡ．ＥＲＢＢ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ：ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ．２００５；５（５）：３４１−５４．
Ｉｓｈｉｄａ  Ｙ，Ａｇａｔａ  Ｙ，Ｓｈｉｂａｈａｒａ  Ｋ，Ｈｏｎｊｏ  Ｔ．Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＰＤ−１，ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｇｅｎｅ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，ｕｐｏｎ  ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ．Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  ｊｏｕｒｎａｌ．１９９２；１１（１１）：３８８７−９５．Ｉｗａｉ  Ｙ，Ｉｓｈｉｄａ  Ｍ，Ｔａｎａｋａ  Ｙ，Ｏｋａｚａｋｉ  Ｔ，Ｈｏｎｊｏ  Ｔ，Ｍｉｎａｔｏ  Ｎ．Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ＰＤ−Ｌ１  ｏｎ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｓｃａｐｅ  ｆｒｏｍ  ｈｏｓｔ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｂｙ  ＰＤ−Ｌ１  ｂｌｏｃｋａｄｅ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ．２００２；９９（１９）：１２２９３−７．
Ｊａｉｎ  ＲＫ，Ｄｕｄａ  ＤＧ，Ｃｌａｒｋ  ＪＷ，Ｌｏｅｆｆｌｅｒ  ＪＳ．Ｌｅｓｓｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｐｈａｓｅ  ＩＩＩ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ  ｏｎ  ａｎｔｉ−ＶＥＧＦ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒａｃｔ  Ｏｎｃｏｌ．２００６；３（１）：２４−４０．
Ｋａｒｐｌｕｓ  ＰＡ，Ｓｃｈｕｌｚ  ＧＥ．Ｒｅｆｉｎｅｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ａｔ  １．５４  Ａ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ．１９８７；１９５（３）：７０１−２９．
Ｋａｕｍａｙａ  ＰＴ，Ｆｏｙ  ＫＣ，Ｇａｒｒｅｔｔ  Ｊ，Ｒａｗａｌｅ  ＳＶ，Ｖｉｃａｒｉ  Ｄ，Ｔｈｕｒｍｏｎｄ  ＪＭ，Ｌａｍｂ  Ｔ，Ｍａｎｉ  Ａ，Ｋａｎｅ  Ｙ，Ｂａｌｉｎｔ  ＣＲ，Ｃｈａｌｕｐａ  Ｄ，Ｏｔｔｅｒｓｏｎ  ＧＡ，Ｓｈａｐｉｒｏ  ＣＬ，Ｆｏｗｌｅｒ  ＪＭ，Ｇｒｅｖｅｒ  ＭＲ，Ｂｅｋａｉｉ−Ｓａａｂ  ＴＳ，Ｃａｒｓｏｎ  ＷＥ，３ｒｄ．Ｐｈａｓｅ  Ｉ  ａｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ，ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２，Ｂ−ｃｅｌｌ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｆｕｓｅｄ  ｔｏ  ａ  ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ａｎｄ／ｏｒ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２００９；２７（３１）：５２７０−７．
Ｋａｕｍａｙａ  ＰＴ．Ａ  ｐａｒａｄｉｇｍ  ｓｈｉｆｔ：Ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ｂａｓｅｄ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ａｎｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒ  ｔｙｐｅｓ：Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ａｎｄ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｈｕｍａｎ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ＆  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．２０１５；１１（６）：１３６８−８６．
Ｋａｕｍａｙａ  ＰＴ．Ｃｏｕｌｄ  ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ／ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｂｅ  ｔｈｅ  ｋｅｙ  ｔｏ  ａ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｕｒｅ？Ｆｕｔｕｒｅ  Ｏｎｃｏｌ．２０１１；７（７）：８０７−１０．
Ｋａｕｍａｙａ  ＰＴＰ，Ｋｏｂｓ−Ｃｏｎｒａｄ  Ｓ，ＤｉＧｅｏｒｇｅ  ＡＭ，Ｓｔｅｖｅｎｓ  Ｖ．Ｄｅｎｏｖｏ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ＆  Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ．Ｉｎ：Ａｎａｎｔｈａｒａｍａｉａｈ  ＧＭＢ，Ｃ．，ｅｄｉｔｏｒ．ＰＥＰＴＩＤＥＳ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ．；１９９４．ｐ．１３３−６４．
Ｋａｕｍａｙａ  ＰＴＰ．ＨＥＲ−２／ｎｅｕ  ｃａｎｃｅｒ  ｖａｃｃｉｎｅｓ：Ｐｒｅｓｅｎｔ  ｓｔａｔｕｓ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．２００６；１２（１）：６５−７７．
Ｋｙｔｅ  Ｊ，Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ  ＲＦ．Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ．１９８２；１５７（１）：１０５−３２．
Ｌｉ  Ｂ，Ｏｇａｓａｗａｒａ  ＡＫ，Ｙａｎｇ  Ｒ，Ｗｅｉ  Ｗ，Ｈｅ  ＧＷ，Ｚｉｏｎｃｈｅｃｋ  ＴＦ，Ｂｕｎｔｉｎｇ  Ｓ，ｄｅ  Ｖｏｓ  ＡＭ，Ｊｉｎ  Ｈ．ＫＤＲ（ＶＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２）ｉｓ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｍｅｄｉａｔｏｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｈｙｐｏｔｅｎｓｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ＶＥＧＦ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．２００２；３９（６）：１０９５−１００．Ｅｐｕｂ  ２００２／０６／０８．
Ｌｙｎｃｈ  ＭＰ，Ｋａｕｍａｙａ  ＰＴＰ．Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ＨＴＬＶ−１  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００６；７（２）：１３７−４５．
Ｍｉｌｌｅｒ  ＭＪ，Ｆｏｙ  ＫＣ，Ｋａｕｍａｙａ  ＰＴ．Ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：ｐｒｅｓｅｎｔ  ｓｔａｔｕｓ，ｆｕｔｕｒｅ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ，ａｎｄ  ａ  ｎｅｗ  ｐａｒａｄｉｇｍ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１３；１５（８２）：１６６−７６．Ｅｐｕｂ  ２０１３／０４／０３．
Ｍｉｌｌｅｒ  ＭＪ，Ｆｏｙ  ＫＣ，Ｋａｕｍａｙａ  ＰＴＰ．Ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：Ｐｒｅｓｅｎｔ  ｓｔａｔｕｓ，ｆｕｔｕｒｅ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ，ａｎｄ  ａ  ｎｅｗ  ｐａｒａｄｉｇｍ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１３；１５（８２）：１６６−７６．
Ｍｏｔｚｅｒ  ＲＪ，Ｒｉｎｉ  ＢＩ，ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ  ＤＦ，Ｒｅｄｍａｎ  ＢＧ，Ｋｕｚｅｌ  ＴＭ，Ｈａｒｒｉｓｏｎ  ＭＲ，Ｖａｉｓｈａｍｐａｙａｎ  ＵＮ，Ｄｒａｂｋｉｎ  ＨＡ，Ｇｅｏｒｇｅ  Ｓ，Ｌｏｇａｎ  ＴＦ，Ｍａｒｇｏｌｉｎ  ＫＡ，Ｐｌｉｍａｃｋ  ＥＲ，Ｌａｍｂｅｒｔ  ＡＭ，Ｗａｘｍａｎ  ＩＭ，Ｈａｍｍｅｒｓ  ＨＪ．ニボルマブｆｏｒ  Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  Ｒｅｎａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ：Ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ａ  Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  Ｐｈａｓｅ  ＩＩ  Ｔｒｉａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ：ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．２０１５；３３（１３）：１４３０−７．
Ｎｅｌｓｏｎ  ＡＬ，Ｄｈｉｍｏｌｅａ  Ｅ，Ｒｅｉｃｈｅｒｔ  ＪＭ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｔｒｅｎｄｓ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．２０１０；９（１０）：７６７−７４．
Ｎｏｖｏｔｎｙ  Ｊ，Ｈａｎｄｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ  Ｍ，Ｈａｂｅｒ  Ｅ，Ｂｒｕｃｃｏｌｅｒｉ  ＲＥ，Ｃａｒｌｓｏｎ  ＷＢ，Ｆａｎｎｉｎｇ  ＤＷ，Ｓｍｉｔｈ  ＪＡ，Ｒｏｓｅ  ＧＤ．Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｃｏｉｎｃｉｄｅ  ｗｉｔｈ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ  ｔｏ  ｌａｒｇｅ  ｐｒｏｂｅｓ（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｏｍａｉｎｓ）．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ．１９８６；８３（２）：２２６−３０．
Ｏｓｈｉｍａ  ＲＧ，Ｌｅｓｐｅｒａｎｃｅ  Ｊ，Ｍｕｎｏｚ  Ｖ，Ｈｅｂｂａｒｄ  Ｌ，Ｒａｎｓｃｈｔ  Ｂ，Ｓｈａｒａｎ  Ｎ，Ｍｕｌｌｅｒ  ＷＪ，Ｈａｕｓｅｒ  ＣＡ，Ｃａｒｄｉｆｆ  ＲＤ．Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｅｕ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍａｍｍａｒｙ  ｔｕｍｏｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００４；６４（１）：１６９−７９．Ｅｐｕｂ  ２００４／０１／２０．
Ｐｒｅｓｔｏｎ，Ｃ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｒａｔｉｏｓ  ｏｆ  ＣＤ８＋Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ＣＤ４＋ＣＤ２５＋  ＦＯＸＰ３＋ａｎｄ  ＦＯＸＰ３−Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅ  ｗｉｔｈ  ｐｏｏｒ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｏｕｓ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２０１３．８（１１）：ｐ．ｅ８００６３．
Ｒｉｚｖｉ  ＮＡ，Ｍａｚｉｅｒｅｓ  Ｊ，Ｐｌａｎｃｈａｒｄ  Ｄ，Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂｅ  ＴＥ，Ｄｙ  ＧＫ，Ａｎｔｏｎｉａ  ＳＪ，Ｈｏｒｎ  Ｌ，Ｌｅｎａ  Ｈ，Ｍｉｎｅｎｚａ  Ｅ，Ｍｅｎｎｅｃｉｅｒ  Ｂ，Ｏｔｔｅｒｓｏｎ  ＧＡ，Ｃａｍｐｏｓ  ＬＴ，Ｇａｎｄａｒａ  ＤＲ，Ｌｅｖｙ  ＢＰ，Ｎａｉｒ  ＳＧ，Ｚａｌｃｍａｎ  Ｇ，Ｗｏｌｆ  Ｊ，Ｓｏｕｑｕｅｔ  ＰＪ，Ｂａｌｄｉｎｉ  Ｅ，Ｃａｐｐｕｚｚｏ  Ｆ，Ｃｈｏｕａｉｄ  Ｃ，Ｄｏｗｌａｔｉ  Ａ，Ｓａｎｂｏｒｎ  Ｒ，Ｌｏｐｅｚ−Ｃｈａｖｅｚ  Ａ，Ｇｒｏｈｅ  Ｃ，Ｈｕｂｅｒ  ＲＭ，Ｈａｒｂｉｓｏｎ  ＣＴ，Ｂａｕｄｅｌｅｔ  Ｃ，Ｌｅｓｔｉｎｉ  ＢＪ，Ｒａｍａｌｉｎｇａｍ  ＳＳ．Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  ｎｉｖｏｌｕｍａｂ，ａｎ  ａｎｔｉ−ＰＤ−１  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ｆｏｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｄｖａｎｃｅｄ，ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ（ＣｈｅｃｋＭａｔｅ  ０６３）：ａ  ｐｈａｓｅ  ２，ｓｉｎｇｌｅ−ａｒｍ  ｔｒｉａｌ．Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．２０１５；１６（３）：２５７−６５．
Ｒｏｓｅ  ＧＤ，Ｇｅｓｅｌｏｗｉｔｚ  ＡＲ，Ｌｅｓｓｅｒ  ＧＪ，Ｌｅｅ  ＲＨ，Ｚｅｈｆｕｓ  ＭＨ．Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｉｎ  ｇｌｏｂｕｌａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９８５；２２９（４７１６）：８３４−８．
Ｒｏｓｋｏｓｋｉ  Ｒ，Ｊｒ．Ｔｈｅ  ＥｒｂＢ／ＨＥＲ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅｓ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ：ｔｈｅ  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｔａｌｉａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ．２０１４；７９：３４−７４．Ｅｐｕｂ  ２０１３／１１／２６．
Ｓｈａｒｍａ  Ｐ，Ａｌｌｉｓｏｎ  ＪＰ．Ｔｈｅ  ｆｕｔｕｒｅ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１５；３４８（６２３０）：５６−６１．
Ｓｈｉｎｏｈａｒａ  Ｔ，Ｔａｎｉｗａｋｉ  Ｍ，Ｉｓｈｉｄａ  Ｙ，Ｋａｗａｉｃｈｉ  Ｍ，Ｈｏｎｊｏ  Ｔ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＰＤ−１  ｇｅｎｅ（ＰＤＣＤ１）．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．１９９４；２３（３）：７０４−６．
Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ  Ｍ，Ｇｉｅｎａｐｐ  ＩＥ，Ｓｔｕｃｋｍａｎ  ＳＳ，Ｒｏｇｅｒｓ  ＣＪ，Ｊｅｗｅｌｌ  ＳＤ，Ｋａｕｍａｙａ  ＰＴ，Ｗｈｉｔａｃｒｅ  ＣＣ．Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｍｉｃｓ  ｏｆ  ＣＤ２８．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２；１６９（４）：２１８０−８．Ｅｐｕｂ  ２００２／０８／０８．
Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ  Ｍ，Ｗａｒｄｒｏｐ  ＲＭ，Ｇｉｅｎａｐｐ  ＩＥ，Ｓｔｕｃｋｍａｎ  ＳＳ，Ｗｈｉｔａｃｒｅ  ＣＣ，Ｋａｕｍａｙａ  ＰＴ．Ａ  ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｍｉｃ  ｏｆ  ＣＤ２８  ｅｎｃｏｍｐａｓｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＭＹＰＰＰＹ  ｍｏｔｉｆ  ａｄｏｐｔｓ  ａ  ｐｏｌｙｐｒｏｌｉｎｅ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｈｅｌｉｘ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｏｇｅｎｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１；１６７（１）：５７８−８５．
Ｓｔｅｅｌｅ  ＪＴ，Ａｌｌｅｎ  ＳＤ，Ｋａｕｍａｙａ  ＰＴＰ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  Ｒａｔｉｏｎａｌｌｙ  Ｄｅｓｉｇｎｅｄ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ２００６．ｐ．４９１−８．
Ｓｕｎｄａｒａｍ  Ｒ，Ｄａｋａｐｐａｇａｒｉ  ＮＫ，Ｋａｕｍａｙａ  ＰＴＰ．Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｓ  ｃａｎｃｅｒ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ−Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｓｅｃｔｉｏｎ．２００２；６６（３）：２００−１６．
Ｔｈｏｒｎｔｏｎ  ＪＭ，Ｅｄｗａｒｄｓ  ＭＳ，Ｔａｙｌｏｒ  ＷＲ，Ｂａｒｌｏｗ  ＤＪ．Ｌｏｃａｔｉｏｎ  ｏｆ「ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ」ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｒｕｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  ｊｏｕｒｎａｌ．１９８６；５（２）：４０９−１３．
Ｔｏｐａｌｉａｎ  ＳＬ，Ｄｒａｋｅ  ＣＧ，Ｐａｒｄｏｌｌ  ＤＭ．Ｉｍｍｕｎｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｂｌｏｃｋａｄｅ：ａ  ｃｏｍｍｏｎ  ｄｅｎｏｍｉｎａｔｏｒ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ．２０１５；２７（４）：４５０−６１．
Ｔｏｐａｌｉａｎ  ＳＬ，Ｈｏｄｉ  ＦＳ，Ｂｒａｈｍｅｒ  ＪＲ，Ｇｅｔｔｉｎｇｅｒ  ＳＮ，Ｓｍｉｔｈ  ＤＣ，ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ  ＤＦ，Ｐｏｗｄｅｒｌｙ  ＪＤ，Ｃａｒｖａｊａｌ  ＲＤ，Ｓｏｓｍａｎ  ＪＡ，Ａｔｋｉｎｓ  ＭＢ，Ｌｅｍｉｎｇ  ＰＤ，Ｓｐｉｇｅｌ  ＤＲ，Ａｎｔｏｎｉａ  ＳＪ，Ｈｏｒｎ  Ｌ，Ｄｒａｋｅ  ＣＧ，Ｐａｒｄｏｌｌ  ＤＭ，Ｃｈｅｎ  Ｌ，Ｓｈａｒｆｍａｎ  ＷＨ，Ａｎｄｅｒｓ  ＲＡ，Ｔａｕｂｅ  ＪＭ，ＭｃＭｉｌｌｅｒ  ＴＬ，Ｘｕ  Ｈ，Ｋｏｒｍａｎ  ＡＪ，Ｊｕｒｅ−Ｋｕｎｋｅｌ  Ｍ，Ａｇｒａｗａｌ  Ｓ，ＭｃＤｏｎａｌｄ  Ｄ，Ｋｏｌｌｉａ  ＧＤ，Ｇｕｐｔａ  Ａ，Ｗｉｇｇｉｎｔｏｎ  ＪＭ，Ｓｚｎｏｌ  Ｍ．Ｓａｆｅｔｙ，ａｃｔｉｖｉｔｙ，ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ＰＤ−１  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１２；３６６（２６）：２４４３−５４．
Ｖｉｃａｒｉ  Ｄ，Ｆｏｙ  ＫＣ，Ｌｉｏｔｔａ  ＥＭ，Ｋａｕｍａｙａ  ＰＴ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＶＥＧＦ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｍｉｍｉｃｓ  Ａｒｅ  Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｉｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ＶＥＧＦ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８６（１５）：１３６１２−２５．Ｅｐｕｂ  ２０１１／０２／１６．
Ｗａｎｇ  Ｂ，Ｋａｕｍａｙａ  ＰＴ，Ｃｏｈｎ  ＤＥ．Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ＶＥＧＦ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｇｙｎｅｃｏｌ  Ｏｎｃｏｌ．２０１０；１１９（３）：５６４−７０．
Ｗｅｌｌｉｎｇ  ＧＷ，Ｗｅｉｊｅｒ  ＷＪ，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｚｅｅ  Ｒ，Ｗｅｌｌｉｎｇ−Ｗｅｓｔｅｒ  Ｓ．Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．ＦＥＢＳ  ｌｅｔｔｅｒｓ．１９８５；１８８（２）：２１５−８．
Ｙａｒｄｅｎ  Ｙ，Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ  ＭＸ．Ｕｎｔａｎｇｌｉｎｇ  ｔｈｅ  ＥｒｂＢ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｎｅｔｗｏｒｋ．Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ．２００１；２（２）：１２７−３７．Ｅｐｕｂ  ２００１／０３／１７．
Ｚａｋ  ＫＭ，Ｋｉｔｅｌ  Ｒ，Ｐｒｚｅｔｏｃｋａ  Ｓ，Ｇｏｌｉｋ  Ｐ，Ｇｕｚｉｋ  Ｋ，Ｍｕｓｉｅｌａｋ  Ｂ，Ｄｏｍｌｉｎｇ  Ａ，Ｄｕｂｉｎ  Ｇ，Ｈｏｌａｋ  ＴＡ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｄｅａｔｈ  １，ＰＤ−１，ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ｌｉｇａｎｄ  ＰＤ−Ｌ１．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．２０１５；２３（１２）：２３４１−８．
Ｚｈｕ  Ｚ，Ｗｉｔｔｅ  Ｌ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｂｙ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｗｉｔｈ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  ｎｅｗ  ｄｒｕｇｓ．１９９９；１７（３）：１９５−２１２．Ｅｐｕｂ  ２０００／０２／０９．
Ｆ．配列
配列番号１：ヒトＰＤ１残基１−１２８
ＰＰＴＦＳＰＡＬＬＶＶＴＥＧＤＮＡＴＦＴＣＳＦＳＮＴＳＥＳＦＶＬＮＷＹＲＭＳＰＳＮＱＴＤＫＬＡＡＦＰＥＤＲＳＱＰＧＱＤＣＲＦＲＶＴＱＬＰＮＧＲＤＦＨＭＳＶＶＲＡＲＲＮＤＳＧＴＹＬＣＧＡＩＳＬＡＰＫＬＱＩＫＥＳＬＲＡＥＲＶＴＥＲＲＡＥＶＰＴＡＨＰＳＰＳＰ
配列番号２：ＰＤ１（３２−５０）
ＶＬＮＷＹＲＭＳＰＳＮＱＴＤＫＬＡＡＦ
配列番号３：ＰＤ１（４５−６４）
ＫＬＡＡＦＰＥＤＲＳＱＰＧＱＤＣＲＦＲ
配列番号４：ＰＤ１（７３−９０）
ＤＦＨＭＳＶＶＲＡＲＲＮＤＳＧＴＹＬ
配列番号５：ＰＤ１（９２−１１０）
ＧＡＩＳＬＡＰＫＡＱＩＫＥＳＬＲＡＥＬ
配列番号６：麻疹ウイルス融合タンパク質（ＭＶＦ）
ＫＬＬＳＬＩＫＧＶＩＶＨＲＬＥＧＶＥ
配列番号７：リンカー
ＧＰＳＬ
配列番号８：ＭＶＦ−ＰＤ１（３２−５０）
ＫＬＬＳＬＩＫＧＶＩＶＨＲＬＥＧＶＥＧＰＳＬＶＬＮＷＹＲＭＳＰＳＮＱＴＤＫＬＡＡＦ
配列番号９：ＭＶＦ−ＰＤ１（４５−６４）
ＫＬＬＳＬＩＫＧＶＩＶＨＲＬＥＧＶＥＧＰＳＬＫＬＡＡＦＰＥＤＲＳＱＰＧＱＤＣＲＦＲ
配列番号１０：ＭＶＦ−ＰＤ１（７３−９０）
ＫＬＬＳＬＩＫＧＶＩＶＨＲＬＥＧＶＥＧＰＳＬＤＦＨＭＳＶＶＲＡＲＲＮＤＳＧＴＹＬ
配列番号１１：ＭＶＦ−ＰＤ１（９２−１１０）
ＫＬＬＳＬＩＫＧＶＩＶＨＲＬＥＧＶＥＧＰＳＬＧＡＩＳＬＡＰＫＡＱＩＫＥＳＬＲＡＥＬ
配列番号１２：ＰＤ１（３２−５０）レトロインベルソＤペプチド
ＦＡＡＬＫＤＴＱＮＳＰＳＭＲＹＷＮＬＶ
配列番号１３：ＰＤ１（４５−６４）レトロインベルソＤペプチド
ＲＦＲＣＤＱＧＰＱＳＲＤＥＰＦＡＡＬＫ
配列番号１４：ＰＤ１（７３−９０）レトロインベルソＤペプチド
ＬＹＴＧＳＤＮＲＲＡＲＶＶＳＭＨＦＤ
配列番号１５：ＰＤ１（９２−１１０）レトロインベルソＤペプチド
ＬＥＡＲＬＳＥＫＩＱＡＫＰＡＬＳＩＡＧ
配列番号１６：ＭＶＦ  ＰＤ１（３２−５０）レトロインベルソＤペプチド
ＫＬＬＳＬＩＫＧＶＩＶＨＲＬＥＧＶＥＧＰＳＬＦＡＡＬＫＤＴＱＮＳＰＳＭＲＹＷＮＬＶ
配列番号１７：ＭＶＦ  ＰＤ１（４５−６４）レトロインベルソＤペプチド
ＫＬＬＳＬＩＫＧＶＩＶＨＲＬＥＧＶＥＧＰＳＬＲＦＲＣＤＱＧＰＱＳＲＤＥＰＦＡＡＬＫ
配列番号１８：ＭＶＦ  ＰＤ１（７３−９０）レトロインベルソＤペプチド
ＫＬＬＳＬＩＫＧＶＩＶＨＲＬＥＧＶＥＧＰＳＬＬＹＴＧＳＤＮＲＲＡＲＶＶＳＭＨＦＤ
配列番号１９：ＭＶＦ  ＰＤ１（９２−１１０）レトロインベルソＤペプチド
ＫＬＬＳＬＩＫＧＶＩＶＨＲＬＥＧＶＥＧＰＳＬＬＥＡＲＬＳＥＫＩＱＡＫＰＡＬＳＩＡＧ
配列番号２０：ＴＴ
ＮＳＶＤＤＡＬＩＮＳＴＩＹＳＹＦＰＳＶ
配列番号２１：ＴＴ１
ＰＧＩＮＧＫＡＩＨＬＶＮＮＱＳＳＥ
配列番号２２：Ｐ２
ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ
配列番号２３：Ｐ３０
ＦＮＮＦＴＶＳＦＷＬＲＶＰＫＶＳＡＳＨＬＥ
配列番号２４：ＭＶＦ（天然）
ＬＳＥＩＫＧＶＩＶＨＲＬＥＧＶ
配列番号２５：ＨＢＶ
ＦＦＬＬＴＲＩＬＴＩＰＱＳＬＮ
配列番号２６：ＣＳＰ
ＴＣＧＶＧＶＲＶＲＳＲＶＮＡＡＮＫＫＰＥ
配列番号２７：ＨＥＲ−２（２６６−２９６）
ＬＨＣＰＡＬＶＴＹＮＴＤＴＦＥＳＭＰＮＰＥＧＲＹＴＦＧＡＳＣＶ
配列番号２８：ＭＶＦ  ＨＥＲ−２（２６６−２９６）
ＫＬＬＳＬＩＫＧＶＩＶＨＲＬＥＧＶＥＧＰＳＬＬＨＣＰＡＬＶＴＹＮＴＤＴＦＥＳＭＰＮＰＥＧＲＹＴＦＧＡＳＣＶ
配列番号２９：ＨＥＲ−２（５９７−６２６）
ＶＡＲＣＰＳＧＶＫＰＤＬＳＹＭＰＩＷＫＦＰＤＥＥＧＡＣＱＰＬ
配列番号３０：ＭＶＦ  ＨＥＲ−２（５９７−６２６）
ＫＬＬＳＬＩＫＧＶＩＶＨＲＬＥＧＶＥＧＰＳＬＶＡＲＣＰＳＧＶＫＰＤＬＳＹＭＰＩＷＫＦＰＤＥＥＧＡＣＱＰＬ
【図１Ａ】
2020512375.tif 000016
【図１Ｂ】
2020512375.tif 000017
【図２Ａ】
2020512375.tif 000018
【図２Ｂ】
2020512375.tif 000019
【図２Ｃ】
2020512375.tif 000020
【図３Ａ】
2020512375.tif 000021
【図３Ｂ】
2020512375.tif 000022
【図３Ｃ】
2020512375.tif 000023
【図３Ｄ】
2020512375.tif 000024
【図３Ｅ】
2020512375.tif 000025
【図４Ａ】
2020512375.tif 000026
【図４Ｂ】
2020512375.tif 000027
【図４Ｃ】
2020512375.tif 000028
【図４Ｄ】
2020512375.tif 000029
【図４Ｅ】
2020512375.tif 000030
【図４Ｆ】
2020512375.tif 000031
【図５Ａ】
2020512375.tif 000032
【図５Ｂ】
2020512375.tif 000033
【図５Ｃ】
2020512375.tif 000034
【図６】
2020512375.tif 000035
【図７】
2020512375.tif 000036
【図８】
2020512375.tif 000037
【図９】
2020512375.tif 000038
【図１０】
2020512375.tif 000039
【図１１Ａ】
2020512375.tif 000040
【図１１Ｂ】
2020512375.tif 000041
【図１１Ｃ】
2020512375.tif 000042
【図１１Ｄ】
2020512375.tif 000043
【図１１Ｅ】
2020512375.tif 000044
【図１１Ｆ】
2020512375.tif 000045
【図１１Ｇ】
2020512375.tif 000046
【図１１Ｈ】
2020512375.tif 000047
【図１２Ａ】
2020512375.tif 000048
【図１２Ｂ】
2020512375.tif 000049
【図１２Ｃ】
2020512375.tif 000050
【図１２Ｄ】
2020512375.tif 000051
【図１３Ａ】
2020512375.tif 000052
【図１３Ｂ】
2020512375.tif 000053
【図１４】
2020512375.tif 000054
【図１５】
2020512375.tif 000055
【図１６】
2020512375.tif 000056
【図１７】
2020512375.tif 000057
【図１８】
2020512375.tif 000058
【図１９Ａ】
2020512375.tif 000059
【図１９Ｂ】
2020512375.tif 000060
【図２０】
2020512375.tif 000061
【図２１Ａ】
2020512375.tif 000062
【図２１Ｂ】
2020512375.tif 000063
【配列表】
2020512375000001.app
【国際調査報告】
2020512375.tif 000064
2020512375.tif 000065
2020512375.tif 000066