(57)【要約】  本発明は、虚血組織における血流もしくは灌流の増加；血管新生、新血管新生、もしくは血管再建の誘導；骨格筋の生存率の増加；虚血性皮膚創傷治癒の促進；壊疽の治療もしくは予防；および／またはＣＬＩの治療の方法を提供する。様々な態様において、本方法は、Ｅ−セレクチンをコードするヌクレオチド配列、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、および血清型２以外のＡＡＶからのカプシドを含むハイブリッドアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を対象に投与することを含む。様々な態様において、本方法は、Ｅ−セレクチンをコードするヌクレオチド配列、ＡＡＶ２  ＩＴＲ、およびＡＡＶ２カプシドを含むＡＡＶを含む細胞を対象に投与することを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における虚血組織の血流または灌流を増加させる方法であって、Ｅ−セレクチンをコードするヌクレオチド配列、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、および血清型２以外のＡＡＶからのカプシドを含むハイブリッドアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を、前記虚血組織の前記血流または灌流を増加させるために有効な量で前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項２】
対象における虚血組織に血管新生、新血管新生、または血管再建を誘導する方法であって、Ｅ−セレクチンをコードするヌクレオチド配列、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、および血清型２以外のＡＡＶからのカプシドを含むハイブリッドアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を、前記虚血組織に血管新生、新血管新生、または血管再建を誘導するために有効な量で前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項３】
対象における骨格筋の生存率を増加させる方法であって、Ｅ−セレクチンをコードするヌクレオチド配列、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、および血清型２以外のＡＡＶからのカプシドを含むハイブリッドアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を、前記骨格筋の生存率を増加させるために有効な量で前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項４】
対象における虚血性皮膚創傷治癒を促進する方法であって、Ｅ−セレクチンをコードするヌクレオチド配列、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、および血清型２以外のＡＡＶからのカプシドを含むハイブリッドアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を、虚血性皮膚創傷治癒を促進するために有効な量で前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項５】
対象における壊疽を治療または予防する方法であって、Ｅ−セレクチンをコードするヌクレオチド配列、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、および血清型２以外のＡＡＶからのカプシドを含むハイブリッドアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を、前記対象における壊疽を治療または予防するために有効な量で前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項６】
前記対象が、重症肢虚血（ＣＬＩ）を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
対象における重症肢虚血（ＣＬＩ）を治療する方法であって、Ｅ−セレクチンをコードするヌクレオチド配列、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、および血清型２以外のＡＡＶからのカプシドを含むハイブリッドアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を、ＣＬＩを治療するために有効な量で前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項８】
前記対象が、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記カプシドが、ＡＡＶ血清型８カプシドであり、前記ハイブリッドＡＡＶが、ＡＡＶ２／８である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記カプシドが、ＡＡＶ血清型９カプシドであり、前記ハイブリッドＡＡＶが、ＡＡＶ２／９である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＡＡＶが、前記骨格筋の前記虚血組織に筋肉内投与される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
対象における虚血組織の血流または灌流を増加させる方法であって、前記虚血組織の前記血流または灌流を増加させるために有効な量で、Ｅ−セレクチンをコードするヌクレオチド配列、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、およびＡＡＶ２カプシドを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を含む細胞を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項１３】
対象における虚血組織に血管新生、新血管新生、または血管再建を誘導する方法であって、前記虚血組織に血管新生、新血管新生、または血管再建を誘導するために有効な量で、Ｅ−セレクチンをコードするヌクレオチド配列、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、およびＡＡＶ２カプシドを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を含む細胞を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項１４】
対象における虚血性皮膚創傷治癒を促進する方法であって、虚血性皮膚創傷治癒を促進するために有効な量で、Ｅ−セレクチンをコードするヌクレオチド配列、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、およびＡＡＶ２カプシドを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を含む細胞を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項１５】
対象における壊疽を治療または予防する方法であって、前記対象における壊疽を治療または予防するために有効な量で、Ｅ−セレクチンをコードするヌクレオチド配列、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、およびＡＡＶ２カプシドを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を含む細胞を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項１６】
前記対象が、重症肢虚血（ＣＬＩ）を有する、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
対象における重症肢虚血（ＣＬＩ）を治療する方法であって、前記対象における前記ＣＬＩを治療するために有効な量で、Ｅ−セレクチンをコードするヌクレオチド配列、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、およびＡＡＶ２カプシドを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を含む細胞を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項１８】
前記対象が、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）を有する、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞が、幹細胞である、請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞が、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、骨髄（ＢＭ）由来前駆細胞、または内皮前駆細胞（ＥＰＣ）である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞が、対象の自己細胞である、請求項１２〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、虚血組織を治療するための材料および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
重症肢虚血（ＣＬＩ）は、全身性アテローム性動脈硬化症によって引き起こされる、肢に供給する動脈の重篤な閉塞であり、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）の進行期を表す。アテローム性動脈硬化症では、動脈壁に脂肪沈着物（プラーク）が蓄積し、動脈を通る血液の流れを困難にする。アテローム性動脈硬化症に関連した動脈の障害は、四肢（脚、足、および手）への血流を著しく低減させ、激しい痛み、皮膚潰瘍、ただれ、壊疽、および／または組織喪失を引き起こす可能性がある。多くの患者は、大規模な切断手術のリスクが非常に高く、身体機能が低下し、生活の質が著しく落ちる。特に、糖尿病患者のＣＬＩは、高い罹患率および死亡率に関連している。
【０００３】
毎年、米国でＣＬＩを罹患する約１６０，０００人の新しい患者が存在する。薬理学的治療は、この疾患がＣＬＩの状態に進行する場合、ＰＡＤの結果に限定的な影響しか与えなかった。患四肢への血流を改善することを目的としたＣＬＩのための現在の標準療法は、詰まった血管の外科的バイパス、または経皮経管血管形成（ＰＴＡ）およびステント留置を含む血管内血行再建（詰まった血管の再開）のいずれかである。しかしながら、患者の約２０％〜４０％は、特に膝下の領域で、手術リスクの高さ、血管閉塞の再発および移植片不成功率の高さ、または好ましくない血管内解剖学に起因して、そのような介入には好適でない。これらの患者は、しばしば切断以外の「選択肢がない」。
【０００４】
虚血を罹患する患者に実行可能な療法的選択肢を提供するには、新しい効果的な戦略が必要とされる。
【発明の概要】
【０００５】
助成金の開示
本発明は、国立衛生研究所／国立心肺血液研究所によって授与された、助成金番号ＨＨＳＮ２６８２０１７００００８Ｃの下で政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明におけるある特定の権利を有する。
【０００６】
電子的に提出された資料の参照による組み込み
参照によってその全体が組み込まれるのは、本明細書と同時に提出されたコンピューター読み取り可能なヌクレオチド／アミノ酸配列リストであり、以下のとおり、２０１８年５月１日に作成された“５１６００Ａ＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ”と名前が付けられた、３８，５０３バイトのＡＣＩＩ（テキスト）ファイルとして識別される。
【０００７】
本開示は、対象における虚血組織の血流または灌流を増加させる方法を提供する。本方法は、Ｅ−セレクチンをコードするヌクレオチド配列、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、および血清型２以外のＡＡＶからのカプシドを含むハイブリッドアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を、虚血組織の血流または灌流を増加させるために有効な量で対象に投与することを含む。
【０００８】
また、対象における虚血組織に血管新生、新血管新生、または血管再建を誘導する方法が提供され、本方法は、Ｅ−セレクチンをコードするヌクレオチド配列、ＡＡＶ２ＩＴＲ、および血清型２以外のＡＡＶからのカプシドを含むハイブリッドＡＡＶを、虚血組織に血管新生、新血管新生、または血管再建を誘導するために有効な量で対象に投与することを含む。
【０００９】
本開示は、対象における骨格筋の生存率を増加させる方法をさらに提供する。本方法は、Ｅ−セレクチンをコードするヌクレオチド配列、ＡＡＶ２ＩＴＲ、および血清型２以外のＡＡＶからのカプシドを含むハイブリッドＡＡＶを、骨格筋の生存率を高めるために有効な量で対象に投与することを含む。
【００１０】
さらに、対象における虚血性皮膚創傷治癒を促進する方法が提供される。本方法は、Ｅ−セレクチンをコードするヌクレオチド配列、ＡＡＶ２ＩＴＲ、および血清型２以外のＡＡＶからのカプシドを含むハイブリッドＡＡＶを、虚血性皮膚創傷治癒を促進するために有効な量で対象に投与することを含む。
【００１１】
本開示はまた、対象における壊疽を治療または予防する方法にも関し、本方法は、Ｅ−セレクチンをコードするヌクレオチド配列、ＡＡＶ２ＩＴＲ、および血清型２以外のＡＡＶからのカプシドを含むハイブリッドＡＡＶを、対象における壊疽を治療または予防するために有効な量で対象に投与することを含む。対象における重症肢虚血（ＣＬＩ）を治療する方法が提供される。本方法は、Ｅ−セレクチンをコードするヌクレオチド配列、ＡＡＶ２ＩＴＲ、および血清型２以外のＡＡＶからのカプシドを含むハイブリッドＡＡＶを、ＣＬＩを治療するために有効な量で対象に投与することを含む。
【００１２】
本開示は、対象における虚血組織の血流または灌流を増加させる方法をさらに提供し、本方法は、虚血組織の血流または灌流を増加させるために有効な量で、Ｅ−セレクチンをコードするヌクレオチド配列、ＡＡＶ２  ＩＴＲ、およびＡＡＶ２カプシドを含むＡＡＶを含む細胞を対象に投与することを含む。
【００１３】
対象における虚血組織に血管新生、新血管新生、または血管再建を誘導する方法も提供される。本方法は、虚血組織に血管新生、新血管新生、または血管再建を誘導するために有効な量で、Ｅ−セレクチンをコードするヌクレオチド配列、ＡＡＶ２  ＩＴＲ、およびＡＡＶ２カプシドを含むＡＡＶを含む細胞を対象に投与することを含む。
【００１４】
対象における虚血性皮膚創傷治癒を促進する方法が提供され、ここで、虚血性皮膚創傷治癒を促進するために有効な量で、Ｅ−セレクチンをコードするヌクレオチド配列、ＡＡＶ２  ＩＴＲ、およびＡＡＶ２カプシドを含むＡＡＶを含む細胞を対象に投与することを含む。本開示はまた、対象における壊疽を治療または予防する方法にも関し、対象における壊疽を治療または予防するために有効な量で、Ｅ−セレクチンをコードするヌクレオチド配列、ＡＡＶ２  ＩＴＲ、およびＡＡＶ２カプシドを含むＡＡＶを含む細胞を対象に投与することを含む。対象における重症肢虚血（ＣＬＩ）を治療する方法も提供され、ここで、本方法は、対象におけるＣＬＩを治療するために有効な量で、Ｅ−セレクチンをコードするヌクレオチド配列、ＡＡＶ２  ＩＴＲ、およびＡＡＶ２カプシドを含むＡＡＶを含む細胞を対象に投与することを含む。
【００１５】
前述の概要は、本発明の全ての態様を定義することを意図したものではなく、追加の態様は、発明を実施するための形態などの他のセクションで記載される。文書全体は統一された開示として関連することを意図しており、この文書の同じ文、または段落、またはセクションで特徴の組み合わせが合わせて見られない場合でも、本明細書に記載される特徴の全ての組み合わせが企図されることを理解されたい。さらに、本発明は、追加の態様として、上記で具体的に言及される変形例よりも範囲が狭い本発明の全ての実施形態を含む。「ａ」または「ａｎ」で説明または請求される本発明の態様に関して、文脈がより限定された意味を明確に要求しない限り、これらの用語は「１つ以上」を意味することを理解されたい。セット内の１つ以上として記載される要素に関して、セット内の全ての組み合わせが企図されることを理解されたい。本発明の態様が特徴を「含む」として記載される場合、実施形態も特徴「からなる」または「から本質的になる」と企図される。
【００１６】
出願人（複数可）は、本明細書に添付された特許請求の範囲の全範囲を発明したが、本明細書に添付された特許請求の範囲は、他者の先行技術を範囲内に包含することを意図しない。したがって、特許請求の範囲内の法定の先行技術が特許庁、またはその他の団体もしくは個人によって出願人に通知された場合、出願人（複数可）は、適用される特許法に基づいて修正権を行使して、そのような特許請求の範囲の主題を再定義して、そのような法定の先行技術または法定の先行技術の明らかな変形例をそのような特許請求の範囲から明確に除外する権利を留保する。そのような修正された特許請求の範囲によって定義される本発明の変形例も、本発明の態様として意図される。本出願の全体から、本発明の追加の特徴および変形例が当業者には明らかであり、そのような特徴の全ては、本発明の態様として意図される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】マウス虚血肢組織の組織細胞の感染における様々なハイブリッドＡＡＶの効率。１ｘ１０９ｖｇのＧＦＰ／ＡＡＶ２／２、ＧＦＰ／ＡＡＶ２／５、ＧＦＰ／ＡＡＶ２／８、およびＧＦＰ／ＡＡＶ２／９を、大腿動脈結紮を受けたＦＶＢマウスの内側半膜性大腿屈筋に筋肉内注射した（ｎ＝３）。肢組織は、ＡＡＶ注射後７日以内に採取し、免疫蛍光染色を行った。高出力フィールドあたりのＧＦＰ＋細胞の数（ＨＰＦ、Ｘ４０、ｙ軸）をカウントした。ＡＡＶ２／８およびＡＡＶ２／９は、組織細胞の感染において高い効率を示した。
【図２】Ｅ−セレクチン／ＡＡＶ遺伝子療法は、虚血肢の骨格筋の生存率を改善する。ＬａｃＺ／ＡＡＶ（左側のバー、ｘ軸）対Ｅ−セレクチン／ＡＡＶ（右側のバー、ｘ軸）、術後のＦａｂｅｒ虚血スコア（ｙ軸）。ＬａｃＺ／ＡＡＶ  ｎ＝７、Ｅ−セレクチン／ＡＡＶ  ｎ＝１０。術後（ＰＯＤ）１日目（ＬａｃＺ／ＡＡＶ＝２．５７、Ｅ−セレクチン／ＡＡＶ＝１．１）：ｐ＝０．２１３、ＰＯＤ２（ＬａｃＺ／ＡＡＶ＝２．７１、Ｅ−セレクチン／ＡＡＶ＝１．４）：ｐ＝０．２５３、ＰＯＤ３（ＬａｃＺ／ＡＡＶ＝３、Ｅ−セレクチン／ＡＡＶ＝１．５）：ｐ＝０．１６８、ＰＯＤ７（ＬａｃＺ／ＡＡＶ＝３．８６、Ｅ−セレクチン／ＡＡＶ＝１．９）：＊ｐ＝０．０４１、ＰＯＤ１４（ＬａｃＺ／ＡＡＶ＝５．２９、Ｅ−セレクチン／ＡＡＶ＝２．４）：＊＊ｐ＝０．００９。
【図３】Ｅ−セレクチン／ＡＡＶ遺伝子療法は、虚血肢の灌流を改善する。ＬａｃＺ／ＡＡＶ対Ｅ−セレクチン／ＡＡＶレーザードップラー画像法（ＬＤＩ）の灌流比。ＬａｃＺ／ＡＡＶ  ｎ＝７、Ｅ−セレクチン／ＡＡＶ  ｎ＝１０。手術前：ｐ＝０．６５９、術後（ＰＯＤ）７日目：ｐ＝０．０６６、ＰＯＤ１４：＊ｐ＝０．００８。
【図４】Ｅ−セレクチン／ＡＡＶ遺伝子療法は、壊疽足の新血管新生および足の灌流を改善する。結紮および非結紮肢（ｘ軸）に対するＬａｃＺ／ＡＡＶ対Ｅ−セレクチン／ＡＡＶの生動物のディル灌流平均強度スコア（ｙ軸）。ＬａｃＺ／ＡＡＶ：ｎ＝５、Ｅ−セレクチン／ＡＡＶ：ｎ＝５、結紮肢（ＬａｃＺ／ＡＡＶ＝２２．１、Ｅ−セレクチン／ＡＡＶ＝４３．８６）：＊ｐ＜０．０２７、非結紮肢（ＬａｃＺ／ＡＡＶ＝２６．７、Ｅ−セレクチン／ＡＡＶ＝４９．４８）：＊＊ｐ＜０．００５。
【図５】Ｅ−セレクチン結紮肢に対してＬａｃＺ／ＡＡＶ結紮肢（ｘ軸）における筋原線維／ｈｐｆ（ｙ軸）の数が多い（＊ｐ＜０．０００１）。高出力フィールド（ＨＰＦ）あたりの筋原線維の平均数の定量データは、ＬａｃＺ結紮肢と比較して、Ｅ−セレクチン／ＡＡＶ結紮肢の筋原線維の数が大幅に多いことを示す。
【図６】ＰＯＤ０〜１０（ｘ軸）からの創傷治癒の面積率（ｙ軸）を示す定量データ。ＬａｃＺ／ＡＡＶ（下のライン）：ｎ＝１０、Ｅ−セレクチン／ＡＡＶ（上のライン）：ｎ＝１１。ＰＯＤ０：ｐ＜０．０００１２７、ＰＯＤ１：０．０００４４１、ＰＯＤ２：ｐ＜０．０００１８９、ＰＯＤ３〜１０：ｐ＜０．０００１。
【図７】ＡＡＶ２レプリカーゼおよびＡＡＶ９カプシドを含むハイブリッドＡＡＶの模式図。
【図８】本開示の細胞の形質導入に使用されるＡＡＶの概略図。
【図９】Ｌ−ＮＡＭＥ処理したＦＶＢマウスの高肢壊疽の代表的な画像。壊疽を伴う虚血肢が箱で囲まれ、ＰＯＤ１およびＰＯＤ３で壊疽が発達したつま先は赤い矢印で示される。
【図１０】示された時点（術前、術後、ＰＯＤ７、およびＰＯＤ１４）でＥ−セレクチン／ＡＡＶ２（上の列）またはＬａｃＺ／ＡＡＶ２（下の列）で処理されたマウスのレーザードップラー画像。
【図１１】ＬａｃＺ／ＡＡＶで処理されたマウスまたはＥ−セレクチン／ＡＡＶで処理されたマウスの、非結紮または結紮肢の画像。
【図１２Ａ】Ｅ−セレクチン／ＡＡＶ結紮対ＬａｃＺ結紮肢のヘマトキシリンおよびエオシン染色の倍率１０倍での顕微鏡画像。
【図１２Ｂ】Ｅ−セレクチン／ＡＡＶ結紮対ＬａｃＺ結紮肢のヘマトキシリンおよびエオシン染色の倍率１０倍での顕微鏡画像。
【図１３】Ｅ−セレクチン／ＡＡＶまたはＬａｃＺ／ＡＡＶで処理したマウスの示された時点での創傷の画像。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
様々な態様において、本開示は、対象における虚血組織の血流もしくは灌流の増加；血管新生、新血管新生、もしくは血管再建の誘導；対象（任意に、重症肢虚血（ＣＬＩ）などの虚血を罹患しているか、または罹患するリスクがある対象）における骨格筋の生存率の増加；対象における虚血性皮膚創傷治癒の促進；対象における壊疽の治療もしくは予防；および／または対象におけるＣＬＩの治療のための材料および方法に関する。様々な態様において、本方法は、有効量のＥ−セレクチンをコードするヌクレオチド配列、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、および血清型２以外のＡＡＶからのカプシドを含むハイブリッドアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を対象に投与することを含む。様々な態様において、本方法は、所望の生物学的応答（すなわち、虚血組織に血管新生、新血管新生、または血管再建を誘導するなど）を達成するために有効な量で、Ｅ−セレクチンをコードするヌクレオチド配列、ＡＡＶ２  ＩＴＲ、およびＡＡＶ２カプシドを含むＡＡＶを含む細胞を対象に投与することを含む。本開示は、ウイルス媒介Ｅ−セレクチンの産生がインビボで壊疽の症状を寛解することを示す最初のものである。
【００１９】
本発明の態様を以下でさらに記載する。セクションの見出しの使用は、単に読みやすくするためのものであり、それ自体を制限することを意図したものではない。文書全体は、統一された開示と見なされることを意図しており、本明細書に記載される特徴の全ての組み合わせが企図されていることを理解されたい。
【００２０】
Ｅ−セレクチン
Ｅ−セレクチンは、典型的には内皮細胞に発現する細胞接着分子である。Ｅ選択は、ＣＤ６２抗原様ファミリーメンバーＥ（ＣＤ６２Ｅ）、内皮白血球接着分子１（ＥＬＡＭ−１）、および白血球内皮細胞接着分子２（ＬＥＣＡＭ２）としても知られている。様々な態様において、Ｅ−セレクチンは、ネイティブヒトＥ−セレクションである。これに関して、Ｅ−セレクチンをコードする核酸配列は、任意に、ヒトＥ−セレクチンタンパク質（すなわち、アクセッション番号ＡＡＱ６７７０２、ＮＰ＿０００４４１．２に対応する配列番号１のＥ−セレクチンタンパク質）をコードする核酸配列である。例示的な態様において、核酸配列は、成熟形態のヒトＥ−セレクチンをコードし、シグナルペプチドＭＩＡＳＱＦＬＳＡＬＴＬＶＬＬＩＫＥＳＧＡ（配列番号７）を含まない。例示的な態様において、核酸配列は、配列番号８のヒトＥ−セレクチンの成熟形態をコードする。様々な実施形態において、核酸配列は、配列番号１と少なくとも６５％（例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または９９％）のアミノ酸配列同一性を共有し、炎症部位でのＥＣ−ＥＰＣ接着の媒介または血液白血球の蓄積の促進などネイティブＥ−セレクチンに関連する少なくとも１つの活性を示すタンパク質をコードする。様々な態様において、Ｅ−セレクチンをコードする核酸配列は、配列番号２に記載されており、これは、アクセッション番号ＮＭ＿０００４５０に対応する。ヒトＥ−セレクチンの対立遺伝子バリアントおよび相同体をコードする核酸も企図されることが理解されよう。様々な実施形態において、核酸配列は、配列番号２と少なくとも６５％（例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または９９％）同一である。必要に応じて、非ヒト哺乳類のＥ−セレクチンも使用され得、マウスＥ−セレクチン（ジェンバンクアクセッション番号ＡＡＡ３７５７７．１）、ラットＥ−セレクチン（ジェンバンクアクセッション番号ＡＡＡ４１１１３．１）、イヌＥ−セレクチン（ジェンバンクアクセッション番号ＡＡＡ３０８４３．１）、およびヒツジＥ−セレクチン（ジェンバンクアクセッション番号ＮＰ＿００１００９７４９．１）のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３〜６として提供される。
【００２１】
本明細書で使用される場合、「少なくとも９０％の同一性」および同様の用語は、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％などの９０％〜１００％の任意の整数を包含する。また、「少なくとも［パーセンテージ］の同一性」という用語は、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸の数をヌクレオチドまたはアミノ酸の総数で除算した数以上である任意のパーセンテージを包含する（［少なくともパーセンテージの同一性］ｘ［同一のヌクレオチドまたはアミノ酸の数］／［ヌクレオチドまたはアミノ酸の総数］）。２つ以上の配列の整列されたアミノ酸（またはヌクレオチド）の同一性パーセントの計算は、当技術分野でよく理解されており、既知のコンピュータープログラムを使用して従来どおり決定される。例えば、２つ以上の配列を整列させて配列同一性パーセントを決定する整列は、国立バイオテクノロジー情報センターのウェブサイトで入手可能な、ＢＬＡＳＴ（基本的なローカル整列検索ツール）プログラムに組み込まれているＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９−４０２（１９９７））によって記載されているアルゴリズムを使用して任意に実行される。
【００２２】
配列番号１と異なるバリアントＥ−セレクチンタンパク質は、コードされたポリペプチドに変化を引き起こすヌクレオチド置換を行うことにより生成され得る。置換の例は、（ａ）ポリペプチド骨格の構造、（ｂ）ポリペプチドの電荷もしくは疎水性、または（ｃ）アミノ酸側鎖の大部分に変化を引き起こすものである。様々な態様において、バリアントＥ−セレクチンは、１つ以上の保存的置換を含み、すなわち、タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸が同様の特性を有する別のアミノ酸で置換されている。
【００２３】
アデノ随伴ウイルス
様々な実施形態において、本方法は、Ｅ−セレクチンをコードするヌクレオチド配列を含むハイブリッドアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の有効量を対象に投与することを含む。「ハイブリッドＡＡＶ」は、少なくとも２つのＡＡＶ血清型の部分を含むＡＡＶを意味する。例示的な態様において、ハイブリッドＡＡＶは自然発生せず、２つの異なるＡＡＶ血清型に由来するＡＡＶの部分を含むように操作される。「ハイブリッドＡＡＶ」は、Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ５（３）：２９９−３１０（２００５）およびＷｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．１４（３）：３１６−２７（２００６）に記載されているようなＡＡＶハイブリッド血清型と同義語である。例示的な態様において、ハイブリッドＡＡＶは、ウイルスゲノムにＡＡＶ２  ＩＴＲを含み、これは、血清型２以外のＡＡＶからのカプシドにパッケージ化される。ＡＡＶは、標的細胞におけるＥ−セレクチン産生を媒介する。様々な態様において、本方法は、ＡＡＶ２カプシドにパッケージ化されている、Ｅ−セレクチンおよびＡＡＶ２  ＩＴＲをコードするヌクレオチド配列を含むウイルスゲノムを含むＡＡＶを含む細胞を対象に投与することを含む。
【００２４】
ＡＡＶは、人間の疾患を引き起こすことが知られていないＤＮＡウイルスであり、これによって、それが望ましい遺伝子療法の選択肢となる。ＡＡＶゲノムは、ｒｅｐおよびｃａｐの２つの遺伝子で構成されており、ＤＮＡ複製およびウイルスパッケージングのための認識シグナルを含む逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接している。ＡＡＶは、効率的な複製のために、ヘルパーウイルス（すなわち、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）との同時感染、またはヘルパー遺伝子の発現を必要とする。療法用核酸の投与に使用されるＡＡＶベクターは、典型的には、親ゲノムの大部分が削除されているため、ＩＴＲのみが残存するが、これは必須ではない。ＡＡＶ  ｒｅｐタンパク質を送達すると、必要に応じて、ＡＡＶ  ＩＴＲを含むＡＡＶベクターをゲノムの特定の領域に組み込むことができる。統合されたＡＡＶゲノムを含む宿主細胞は、細胞の成長または形態の変化を示さない。したがって、ＡＡＶベクターからの療法因子の長期発現は、持続性および慢性疾患の治療に有用であり得る。本開示の文脈で使用するためのＡＡＶは、ＡＡＶタイプ２に基づいており、対象または細胞に送達されるウイルスゲノムは、ＡＡＶ２  ＩＴＲを含む。他のＡＡＶ血清型には、ＡＡＶタイプ１、ＡＡＶタイプ３（タイプ３Ａおよび３Ｂを含む）、ＡＡＶタイプ４、ＡＡＶタイプ５、ＡＡＶタイプ６、ＡＡＶタイプ７、ＡＡＶタイプ８、ＡＡＶタイプ９、ＡＡＶタイプ１０、またはＡＡＶタイプ１１が含まれる。ＡＡＶのゲノム配列、ならびにＩＴＲ、Ｒｅｐタンパク質、およびカプシドサブユニットの配列は、当技術分野で知られている。例えば、国際特許公開第ＷＯ００／２８０６１号、同第ＷＯ９９／６１６０１号、同第ＷＯ９８／１１２４４号、ならびに米国特許第６，１５６，３０３号、Ｓｒｉｖｉｓｔａｖａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ４５：５５５、Ｃｈｉｏｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ（１９９８）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７１：６８２３、Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ（１９９９）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７３：３９９４、Ｓｈａｄｅ  ｅｔ  ａｌ（１９８６）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．５８：９２１、およびＧａｏ  ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９９：１１８５４を参照されたい。
【００２５】
様々な態様において、ＡＡＶは、ネイティブＡＡＶゲノムの全てまたは一部を欠くウイルスゲノムを含む。例えば、ＡＡＶゲノムは、全てのネイティブＡＡＶタンパク質コード配列を欠いているが、ＡＡＶ  ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２  ＩＴＲ）を保持し、Ｅ−セレクチンをコードする核酸配列をさらに含む。
【００２６】
核酸配列およびＡＡＶ２  ＩＴＲを含むウイルスゲノムをビリオンに組み込んで（すなわち、ウイルスカプシドにパッケージ化して）、細胞へのゲノムの導入を促進することができる。ＡＡＶカプシドタンパク質は、ビリオンの外部の非核酸部分を構成し、ＡＡＶ  ｃａｐ遺伝子によってコードされる。ｃａｐ遺伝子は、ビリオンのアセンブリに必要な３つのウイルスコートタンパク質、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３をコードする。ＡＡＶビリオンの構築は、例えば、米国特許第５，１７３，４１４号、同第５，１３９，９４１号、同第５，８６３，５４１号、同第５，８６９，３０５号、同第６，０５７，１５２号、および同第６，３７６，２３７号、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：７９１−８０１，２００２、ならびにＢｏｗｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：４２３−４３２，２００３に記載されている。
【００２７】
様々な実施形態において、ＡＡＶ２  ＩＴＲを含むＡＡＶゲノムは、他の血清型ＡＡＶ２に由来するカプシドにパッケージ化される。そのようなＡＡＶベクターは、「疑似化」ＡＡＶまたは「ハイブリッド」ＡＡＶと呼ばれる。ＡＡＶ２ウイルスゲノム（Ｅ−セレクチンおよびＡＡＶ２  ＩＴＲをコードする核酸配列を含む）は、任意に、ＡＡＶタイプ１、ＡＡＶタイプ３（タイプ３Ａおよび３Ｂを含む）、ＡＡＶタイプ４、ＡＡＶタイプ５、ＡＡＶタイプ６、ＡＡＶタイプ７、ＡＡＶタイプ８、ＡＡＶタイプ９、ＡＡＶタイプ１０、またはＡＡＶタイプ１１のカプシドにパッケージ化される。様々な態様において、ＡＡＶ２ウイルスゲノムは、ＡＡＶ８カプシド（ＡＡＶ２／８）またはＡＡＶ９カプシド（ＡＡＶ２／９）にパッケージ化される。疑似化ＡＡＶの構築および使用を伴う技法は、例えば、Ｄｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７５：７６６２−７６７１，２００１、Ｈａｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７４：１５２４−１５３２，２０００、Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ，２８：１５８−１６７，２００２、およびＡｕｒｉｃｃｈｉｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３０７５−３０８１，２００１にさらに記載されている。例示的な態様において、本開示のハイブリッドＡＡＶは、図７に示される要素を含む。例示的な態様において、本開示のハイブリッドＡＡＶは、図７に示される構造を含む。
【００２８】
任意に、ウイルスのカプシド（すなわち、粒子表面）は、ウイルスの向性を調整するために修正される。例えば、カプシドの成分は、例えば、結果として生じるベクターによって形質導入される細胞型を拡大するか、望ましくない細胞型の形質導入を（全体的にまたは部分的に）回避するか、または所望の細胞型の形質導入効率を改善する（例えば、所望の細胞型の細胞表面受容体に対するリガンドを組み込むことによって）ために修正され得る。形質導入効率は、一般に、対照（すなわち、未修正の適合ウイルスベクター）を参照することによって決定される。形質導入効率の改善は、例えば、所定の細胞型の形質導入率の少なくとも約２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％の改善をもたらし得る。必要に応じて、カプシドは、肝臓や生殖細胞などの非標的組織を効率的に形質導入しないように修正され得る（例えば、所望の標的組織（複数可）の形質導入の５０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下のレベル）。挿入変異体、アラニンスクリーニング変異体、およびエピトープタグ変異体を含むＡＡＶカプシド変異体の構築および特徴付けは、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：８６３５−４５，２０００に記載されている。本明細書に記載される方法で使用され得る他のＡＡＶには、ウイルスの分子育種によって、ならびにエクソンシャッフリングによって生成されるカプシドハイブリッドが含まれる。Ｓｏｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ２５：４３６−４３９，２０００、およびＫｏｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｔｅｍｍｅｒ  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １９：４２３−４２８，２００１を参照されたい。
【００２９】
異なる血清型のＡＡＶベクターおよびＡＡＶタンパク質の構築および使用は、Ｃｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２：６１９−６２３，２０００、Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９７：３４２８−３４３２，２０００、Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：２２２４−２２３２，１９９８、Ｈａｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１５２４−１５３２，２０００、Ｈａｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：６６１５−６６２４，２００１、およびＡｕｒｉｃｃｈｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３０７５−３０８１，２００１で議論されており、これらの全ては、特にＡＡＶ産生の議論に関して、参照によって本明細書に組み込まれる。ＡＡＶベクターを使用するための方法も、例えば、Ｔａｌ，Ｊ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．７：２７９−２９１，２０００、およびＭｏｎａｈａｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ７：２４−３０，２０００で議論されている。
【００３０】
ＡＡＶベクターなどの発現ベクターは、典型的には、作動可能に連結されたコード配列の転写および翻訳に必要な様々な核酸配列を含む。例えば、発現ベクターは、複製起点、ポリアデニル化シグナル、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、プロモーター、エンハンサーなどを含み得る。本開示のＡＡＶベクターは、好ましくは、Ｅ−セレクチンコード配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む。「作動可能に連結された」は、プロモーターなどの制御配列が別の核酸配列に対して正しい位置および向きにあり、核酸配列にその効果（例えば、転写の開始）を及ぼすことを意味する。プロモーターは、それが作動可能に連結される核酸配列に対してネイティブまたは非ネイティブであり得、かつ特定の標的細胞型に対してネイティブまたは非ネイティブであり得、プロモーターは、様々な態様において、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、または誘導性プロモーターであり得る。構成的プロモーターの例には、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、Ａｄ  Ｅ１Ａ、およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターが含まれる。構成的哺乳類プロモーターの例には、β−アクチンプロモーターによって例示されるような様々なハウスキーピング遺伝子プロモーターが含まれる。本明細書に記載される方法で使用するための誘導性プロモーターおよび／または調節要素も企図される。誘導性プロモーターの例には、サイトクロムＰ４５０遺伝子、熱ショックタンパク質遺伝子、メタロチオネイン遺伝子、およびエストロゲン遺伝子プロモーターなどのホルモン誘導性遺伝子などの遺伝子由来のものが含まれるが、これらに限定されない。誘導性プロモーターの別の例は、テトラサイクリンに応答するｔｅｔプロモーターである。組織特異的プロモーターおよび／または調節要素は、本明細書に記載される方法のある特定の実施形態において有用である。そのようなプロモーターの例には、Ｔｉｅ−２またはＫＤＲプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。
【００３１】
Ｅ−セレクチンを産生する細胞の投与
いくつかの実施形態において、本方法は、Ｅ−セレクチンをコードするヌクレオチド配列およびＡＡＶ２  ＩＴＲを含むＡＡＶを含む細胞を対象に投与することを含む。ＡＡＶは、細胞内でＥ−セレクチンを産生する。様々な態様において、ＡＡＶ２ゲノムはＡＡＶ２カプシドにパッケージ化されるが、本明細書でさらに記載されるように、ＡＡＶ２  ＩＴＲを含むＡＡＶゲノムは、様々な実施形態において非ＡＡＶ２カプシドにパッケージ化され得る。細胞は、様々な実施形態において、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、骨髄（ＢＭ）由来前駆細胞、または内皮前駆細胞（ＥＰＣ）などの幹細胞である。細胞は、対象から単離され得るか（すなわち、自己細胞）、または異なるドナーから収集され（すなわち、同種異系細胞）得る。「骨髄由来前駆細胞」および「ＢＭ由来前駆細胞」は、骨髄幹細胞系統に由来する前駆細胞を意味する。細胞はまた、骨形成、筋原性、脂肪生成、および軟骨形成分化が可能である骨髄に見られる胚様細胞である間葉系幹細胞（ＭＳＣ）であり得る。
【００３２】
様々な態様において、細胞は、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）である。「前駆細胞」または「内皮前駆細胞」または「ＥＰＣ」は、分化および増殖によって完全に分化した機能的な子孫を生成する能力を有する任意の体細胞を意味する。別の実施形態において、前駆細胞は、血液、神経、筋肉、皮膚、腸、骨、腎臓、肝臓、膵臓、胸腺などを含むがこれらに限定されない任意の組織または器官系からの前駆細胞を含む。前駆細胞は、「分化細胞」とは区別され、「分化細胞」は、増殖する能力、すなわち、自己複製する能力を有する場合とそうでない場合があるが、通常の生理学的条件下では異なる細胞型にさらに分化することはできない。前駆細胞は、増殖（自己複製）する癌細胞、特に、白血病細胞などの異常細胞とはさらに区別されるが、これは、未成熟または未分化のように見えても、一般にはさらに分化しない。
【００３３】
「全能性」細胞は、胚性幹細胞などの未拘束の前駆細胞、すなわち、全ての成熟細胞型を生成するのに必要かつ十分なものである。全ての膵臓細胞系統を生成する能力を保持するが、自己再生できない前駆細胞は、「多能性」と呼ばれる。別の実施形態において、全てではないがいくつかの内皮系統を産生することができ、自己再生できない細胞は、「多分化能性」と呼ばれる。
【００３４】
ドナー幹細胞を単離し、そのような単離された細胞を移植するための技法は、当技術分野で知られている。例えば、標的組織または細胞（例えば、ＢＭ由来ＥＰＣ）を宿主から採取し、感染を促進する条件下で本明細書に記載されるＡＡＶビリオンに曝露し、それによって、Ｅ−セレクチンをコードする核酸を細胞に導入する。次いで、これらの遺伝子組み換え細胞を対象に移植する。対象への細胞の導入には、静脈内注射、腹腔内注射、または標的組織へのインサイツ注射など、いくつかの手法が使用され得る。ＡＡＶを形質導入または感染させた細胞のマイクロカプセル化も企図される。本開示の方法の文脈において、自家細胞および同種異系細胞の両方の細胞移植が企図される。
【００３５】
治療方法、用途
様々な態様において、本開示は、対象における虚血組織の血流または灌流を増加させるための材料および方法に関する。「虚血」は、典型的には動脈血液供給の障害または不十分な血流の結果として、低酸素になった（すなわち、十分な酸素を欠く）組織を指す。様々な態様において、虚血組織は、筋肉組織（骨格筋または心筋）であるが、網膜、脂肪、肝臓、腎臓、肺、胃腸、膵臓、胆嚢、膀胱、中枢神経組織、および皮膚などの他の組織も企図される。
【００３６】
ＡＡＶまたは細胞は、虚血組織の血流または灌流を増加させるために有効な量で投与される。灌流または血流の増加は、対象に利点をもたらすことが理解されよう。組織内の血流または灌流は、例えば、ドップラー画像法、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）、単一光子放出コンピューター断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、または造影コンピューター断層撮影（ＣＴ）を使用して検査され得る。例えば、９９ｍＴｃ−セスタミビＳＰＥＣＴを使用して、合計ストレススコアを決定でき、これは、ポストストレス画像によって得られた２０セグメントの低灌流の重篤度スコアを合計することによって得られる灌流の半定量的測定値である。重篤度スコアリングは次のように定義される：０＝正常、１  ＝軽度に低減または疑わしい、２＝中程度に低減、３＝大幅に低減、４＝取り込みなし。あるいは、灌流は、測定される組織の体積内の赤血球の平均速度および濃度の積として特徴付けられ得る。
【００３７】
本明細書で使用される場合、「増加する」という用語およびそれから派生する語は、１００％または完全な増加ではない場合がある。むしろ、様々な程度の増加があり、当業者は、潜在的な利点または療法的効果を有すると認識している。この点で、本開示のハイブリッドＡＡＶまたは細胞は、血流または灌流を任意の量またはレベルに増加し得る。例示的な実施形態において、本開示の方法によって提供される増加は、少なくともまたは約１０％の増加（例えば、少なくともまたは約２０％の増加、少なくともまたは約３０％の増加、少なくともまたは約４０％の増加、少なくともまたは約５０％の増加、少なくともまたは約６０％の増加、少なくともまたは約７０％の増加、少なくともまたは約８０％の増加、少なくともまたは約９０％の増加、少なくともまたは約９５％の増加、少なくともまたは約９８％の増加））である。
【００３８】
血流または灌流を測定する方法は、当技術分野で知られている。虚血肢灌流は、例えば、本明細書の実施例に記載されるＬＤＩなどのレーザードップラー画像法（ＬＤＩ）によって測定され得る。血流または灌流を測定するための他のアッセイには、プレチスモグラフィ、染色または熱拡散、コントラスト超音波、ＰＥＴ画像法、電磁流量プローブ、ビデオ顕微鏡、近赤外分光法、標識微小球、微小透析、拡散相関分光法（ＤＣＳ）、動脈スピン標識ＭＲＩ、キセノン−ＣＴ、およびドップラー超音波が含まれ、Ｍｅｓｑｕｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｉｌｏｓ  Ｔｒａｎｓ  Ａ  Ｍａｔｈ  Ｐｈｙｓ  Ｅｎｇ  Ｓｃｉ．３６９（１９５５）：４３９０−４４０６（２０１１）およびＢａｒｒｅｔｔ  ａｎｄ  Ｒａｔｔｉｇａｎ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ．６１（１１）：２６６１−２６６８（２０１２）に記載されている。
【００３９】
様々な態様において、本開示は、虚血組織に血管新生、新血管新生、または血管再建を誘導するための材料および方法に関する。新血管新生は、新しい血管の形成である。「血管再建」は、虚血を罹患している身体部分または臓器への灌流の回復である。血管新生は、既存の血管に由来する新しい血管の成長である（すなわち、既存の血管からの毛細血管芽の成長）。血管新生は、少なくとも１つの実施形態において、創傷の隣接する成熟血管ネットワークの常駐内皮細胞が増殖し、他の実施形態において、移動し、最初の無血管創傷組織に成長する新血管にリモデリングすることによるプロセスを指す。血管新生、新血管新生、または血管再建の「誘導」には、新しい血管の形成および／または質の支援が含まれる。血管新生、新血管新生、または血管再建が発生していない場合、血管新生、新血管新生、または血管再建が開始され得、血管新生、新血管新生、または血管再建が既に発生している場合、血管新生、新血管新生、または血管再建は、強化または高められ得る。この態様において、ＡＡＶまたは細胞は、血管新生、新血管新生、または血管再建を誘導するために有効な量で投与される。血管新生または新血管新生は、非分岐血管セグメントの数（単位面積あたりのセグメント数）、機能的血管密度（単位面積あたりの灌流血管の全長）、および／または血管容積密度（単位面積あたりの各セグメントの長さおよび直径に基づいて計算された血管容積の合計）を測定することによって検出および／または特徴付けされ得る。
【００４０】
本方法の様々な態様を使用して、例えば、骨格筋および心臓組織を含む様々な組織にＥ−セレクチンを送達することができる。この方法は、多くの疾患や病気の研究または治療に使用され得る。例えば、虚血組織の新血管新生または血管新生を促進する方法を使用して、末梢血管疾患、腸間膜虚血、脳血管虚血、虚血を起因とする筋肉消耗、または外科的処理（例えば、皮膚および／または筋肉の皮弁の治癒または再付着）に関連する合併症を（療法的または予防的に）研究または治療することができる。
【００４１】
様々な態様において、本開示は、対象（例えば、任意に、重症肢虚血（ＣＬＩ）などの虚血を罹患しているか、または罹患するリスクがある対象）における骨格筋の生存率を増加させるための材料および方法に関する。本開示のハイブリッドＡＡＶまたは細胞は、骨格筋の生存率を任意の量またはレベルまで増加し得る。例示的な実施形態において、本開示の方法によって提供される増加は、少なくともまたは約１０％の増加（例えば、少なくともまたは約２０％の増加、少なくともまたは約３０％の増加、少なくともまたは約４０％の増加、少なくともまたは約５０％の増加、少なくともまたは約６０％の増加、少なくともまたは約７０％の増加、少なくともまたは約８０％の増加、少なくともまたは約９０％の増加、少なくともまたは約９５％の増加、少なくともまたは約９８％の増加）である。骨格筋の生存率を測定する方法は当技術分野で知られており、それには、ヘモトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色スライド（高倍率視野あたり）の筋肉細胞の数をカウントすることが含まれる。以下の実施例を参照されたい。
【００４２】
様々な態様において、本開示は、対象における虚血性皮膚創傷治癒を促進するための材料および方法に関する。「虚血性皮膚創傷治癒の促進」は、本開示の様々な態様において、創傷のサイズの低減、炎症の消散、壊死組織の形成の阻害、皮下マトリックスの修復、および再上皮化を包含する。創傷および創傷治癒の進行は、顕微鏡検査および一定期間撮影された写真の検査によって判断され得る。ＬＤＩは、虚血性創傷治癒を測定する例示的な方法である。創傷の研究に有用な画像分析装置を利用することができる（例えば、ＡｌｐｈａＥａｓｅ  ＦＣバージョン４．１．０、Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）。様々な態様において、本方法は、創傷の再上皮化を促進する。
【００４３】
様々な態様において、本開示は、対象における壊疽を治療または予防するための材料および方法に関する。壊疽は、血液の供給不足によって引き起こされる壊死の一種である。壊疽は、怪我、感染、または血液循環に悪影響を与える慢性疾患の結果として発生し得る。壊疽のリスクがある対象には、感染症、糖尿病、循環器／血管疾患、または重傷を罹患している対象が含まれるが、これらに限定されない。異なるタイプの壊疽は、症状に基づいて分類され、これには、例えば、乾燥性壊疽（乾燥した、しわが寄った、変色した皮膚によって特徴付けられる）、湿潤性壊疽（細菌感染に関連し、しばしば腫れまたは水疱を伴う）、ガス壊疽（典型的には、深層筋組織に影響を及ぼし、ガス水疱をもたらす）、内部壊疽（１つ以上の臓器に影響を及ぼす）、および壊死性筋膜炎（肉を食べる微生物によって引き起こされる）が含まれる。様々な態様において、壊疽は、四肢（例えば、つま先、足、脚、指、または腕）に存在する。壊疽の発生と進行は、目視検査、写真、Ｘ線、コンピューター断層撮影（ＣＴ）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、動脈造影（または、血管を視覚化するために使用される他の画像化アッセイ）、および／または組織培養もしくは生検によって評価され得る。壊疽は、修正タルロフ虚血スケールを使用して特徴付けられ得、ここで、レーザードップラー画像法（ＬＤＩ）が任意に用いられる。
【００４４】
様々な態様において、本開示は、対象におけるＣＬＩを治療するための材料および方法に関する。重症肢虚血は、例えば、動脈が下肢、足首、およびつま先に十分な血流を導くことができないことから生じる。ＣＬＩは、持続性かつ再発性の安静時の痛み（例えば、母指球とつま先の灼熱痛）、潰瘍、および壊疽を引き起こし得る。ＣＬＩは、例えば、足の脈拍の低さもしくは欠如、足首上腕血圧指数の低下（ＡＢＩ、足首の血圧＜０．４）、つま先の血圧の低減（＜３０ｍｍ  Ｈｇ）、経皮酸素の低減、および／または筋肉消耗によって示される。ＣＬＩは、ドップラー画像法、血圧カフ、フルオレセイン血管造影、ＴＣＯＭ（経皮酸素測定）、および／または機能評価（筋力、歩行試験、疼痛評価）を含む（ただし、これらに限定されない）多くの方法のいずれかを使用して評価される。本方法は、様々な実施形態において、本明細書に記載されるＣＬＩパラメータのいずれか１つ以上を改善する。
【００４５】
治療または予防を必要とする対象における障害または状態の治療（すなわち、低減、軽減、抑制、または緩和）または予防における有効性は、上記の方法を含む任意の好適な方法を使用して決定される。「治療」は、対象における障害の１００％の消滅を必要としない。症状の任意の減少は、対象における有益な生物学的効果を構成する。様々な態様において、本方法は、重篤度（これらの状態に一般的に使用される他の薬物および／または療法の必要性および／または量（例えば、曝露）を低減することを含み得る）、持続時間、および／または痛みの頻度を低減する。「予防」では、障害または状態の発症を完全に排除する必要はなく、障害または関連する症状の発症の抑制または遅延が企図される。
【００４６】
本明細書に記載されるパラメーターのいずれについても、例えば、ベースライン値をフォローアップ値と比較することによって、本方法から生じる療法的効果を確認することができる。「ベースライン値」は、本方法による治療の前に記録されたベースライン研究で実行された各パラメーターについて決定された値を意味する。「フォローアップ値」は、治療後の適切な時間に記録されたベースライン研究と同じパラメーター（複数可）について決定された値を意味する（例えば、治療後１週間、６週間、１２週間、２６週間、３６週間、４８週間、または５２週間）。典型的には、複数のフォローアップ評価が実行されるため、同じパラメーターの複数のフォローアップ値が治療後の異なる時点で確認される。
【００４７】
本開示は、対象における虚血組織の血流もしくは灌流の増加；血管新生、新血管新生、もしくは血管再建の誘導；対象（任意に、重症肢虚血（ＣＬＩ）などの虚血を罹患しているか、または罹患するリスクがある対象）における骨格筋の生存率の増加；対象における虚血性皮膚創傷治癒の促進；対象における壊疽の治療もしくは予防；および／または対象におけるＣＬＩの治療において、ＡＡＶ２  ＩＴＲおよびＥ−セレクチンをコードする核酸配列を含むＡＡＶベクターの使用をさらに提供する。対象における虚血組織の血流もしくは灌流の増加；血管新生、新血管新生、もしくは血管再建の誘導；対象（任意に、重症肢虚血（ＣＬＩ）などの虚血を罹患しているか、または罹患するリスクがある対象）における骨格筋の生存率の増加；対象における虚血性皮膚創傷治癒の促進；対象における壊疽の治療もしくは予防；および／または対象におけるＣＬＩの治療のための薬剤の調製において、ＡＡＶ２  ＩＴＲおよびＥ−セレクチンをコードする核酸配列を含むＡＡＶベクターの使用も提供される。
【００４８】
対象における虚血組織の血流もしくは灌流の増加；血管新生、新血管新生、もしくは血管再建の誘導；対象（任意に、重症肢虚血（ＣＬＩ）などの虚血を罹患しているか、または罹患するリスクがある対象）における骨格筋の生存率の増加；対象における虚血性皮膚創傷治癒の促進；対象における壊疽の治療もしくは予防；および／または対象におけるＣＬＩの治療における、ＡＡＶ２カプシドにパッケージ化（または、疑似化）された、ＡＡＶ２  ＩＴＲおよびＥ−セレクチンをコードする核酸配列を含むＡＡＶを含む細胞の使用も提供される。対象における虚血組織の血流もしくは灌流の増加；血管新生、新血管新生、もしくは血管再建の誘導；対象（任意に、重症肢虚血（ＣＬＩ）などの虚血を罹患しているか、または罹患するリスクがある対象）における骨格筋の生存率の増加；対象における虚血性皮膚創傷治癒の促進；対象における壊疽の治療もしくは予防；および／または対象におけるＣＬＩの治療のための薬剤の調製において、ＡＡＶ２カプシドにパッケージ化（または、疑似化）された、ＡＡＶ２  ＩＴＲおよびＥ−セレクチンをコードする核酸配列を含むＡＡＶを含む細胞の使用も提供される。
【００４９】
本開示の方法の対象は、ヒト、ラット、マウス、ネコ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、サル、類人猿、ウサギ、ウシなどの哺乳類であり得る。対象（例えば、哺乳類）は、成人または若齢を含む発達のあらゆる段階にあり得る。好ましくは、対象は、ヒトである。本明細書に記載される方法は、一般に、本明細書に記載される療法的に有効な量の組成物を、それを必要とする対象（例えば、動物、ヒト）に投与することを含む。そのような治療は、疾患、障害、またはその症状を罹患しているか、有しているか、その影響を受けやすいか、またはそのリスクがある対象、特にヒトに好適に投与されるであろう。「リスクのある」対象の決定は、対象または医療提供者の診断試験または意見によって任意の客観的または主観的な決定によって行われ得る。様々な態様において、対象は、重症肢虚血（ＣＬＩ）を有する（または、そのリスクがある）。様々な態様において、対象は、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）を有する（または、そのリスクがある）。ＰＡＤは、例えば、脂肪、コレステロール、線維組織、カルシウム、および他の血液成分からなるプラークによってしばしば引き起こされる、末梢動脈の脚、胃、腕、および頭への狭窄によって特徴付けられる。ＰＡＤの一般的な症状には、跛行（歩行時の脚の痛み）、四肢の脱力、四肢の冷感、および変色が含まれるが、これらに限定されない。ＰＡＤは、例えば、ドップラー超音波および血管造影を使用して評価される。
【００５０】
製剤、用量、投与レジメン
様々な態様において、ＡＡＶまたは細胞は、生理学的に許容される（すなわち、薬理学的に許容される）担体、緩衝剤、賦形剤、または希釈剤を含む組成物（例えば、医薬組成物）で提供される。任意の好適な生理学的に許容可能な（例えば、薬学的に許容可能な）担体を本開示の文脈内で使用することができ、そのような担体は当技術分野で周知されている。担体の選択は、部分的に、本組成物が投与される特定の部位、および本組成物を投与するために使用される特定の方法によって決定されるだろう。本組成物はまた、例えば、宿主細胞へのＡＡＶの取り込みを促進する薬剤も含み得る。好適な組成物製剤には、水性および非水性溶液、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を血液と等張にする溶質を含有し得る等張無菌溶液、ならびに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、および防腐剤を含み得る水性および非水性無菌懸濁液が含まれる。
【００５１】
本組成物は、局所投与用に製剤化され得る（例えば、エアロゾル、クリーム、泡、ゲル、液体、軟膏、ペースト、粉末、シャンプー、スプレー、パッチ、ディスク、またはドレッシングの形態）。「パッチ」は、典型的には、少なくとも本明細書で提供される組成物および被覆層を含み、治療する皮膚の領域上にパッチを配置できるようにする。パッチは、本明細書で提供される組成物の角質層を通る表皮または真皮への送達を最大化し、遅延時間を低減し、均一な吸収を促進し、機械的摩擦を低減するように設計され得る。
【００５２】
本組成物は、アンプルおよびバイアルなどの単位用量または複数用量の密封容器で提供でき、例えば、使用する直前に水などの無菌液体担体を追加することのみを必要とする凍結乾燥された（凍結乾燥）状態で保存され得る。ＡＡＶを含む組成物またはＡＡＶを含む細胞は、一態様において、本組成物の使用に関する指示を提供する包装材料とともに容器内に（すなわち、キットで）配置される。一般に、そのような指示には、試薬濃度、ならびにある特定の実施形態において、本組成物を再構成するのに必要になり得る賦形剤成分または希釈剤（例えば、水、生理食塩水、またはＰＢＳ）の相対量を説明する具体的な表現が含まれる。
【００５３】
ＡＡＶまたは細胞は、例えば、虚血組織の血流もしくは灌流の増加；血管新生、新血管新生、もしくは血管再建の誘導；骨格筋の生存率の増加；虚血性皮膚創傷治癒の促進；壊疽の治療もしくは予防；および／またはＣＬＩの治療など、対象にいくらかの改善または利点を提供するのに十分な量および位置で投与される。状況に応じて、ＡＡＶまたは細胞を含む組成物は、体腔に適用もしくは注入され、標的組織に直接適用され、かつ／または循環系に導入される。例えば、様々な状況において、静脈内、腹腔内、脳内（実質内）、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内、病巣内、髄内、髄腔内、脳室内、皮内、関節内、神経内、神経節内、神経節周囲、経皮、皮下、鼻腔内、吸入（例えば、上気道および／または下気道）、経腸、硬膜外、尿道、膣、または直腸手段によって本組成物を送達することが望ましいだろう。必要に応じて、ＡＡＶまたは細胞は、筋肉内、経皮、もしくは皮下投与を介して局所的に投与されるか、または目的の領域に供給する動脈内もしくは静脈内投与が行われる。好ましい実施形態において、ＡＡＶまたは細胞は、骨格筋の虚血組織に筋肉内投与される。
【００５４】
あるいは、本組成物は、膜、スポンジ、カプセル、または本組成物が吸収もしくはカプセル化された別の適切な材料の移植を介して局所的に投与される。移植デバイスが使用される場合、一態様において、デバイスは、好適な組織に移植され、人工細胞によって産生されるＡＡＶまたはＥ−セレクチンの送達は、例えば、拡散、徐放性ボーラス、または連続投与を介する。
【００５５】
特定の対象に対する特定の投与レジメンは、投与される療法薬の量、投与経路、ならびに任意の副作用の原因および程度に部分的に依存するであろう。本開示に従って対象（例えば、ヒトなどの哺乳類）に投与される量は、合理的な時間枠にわたって所望の応答に影響を及ぼすのに十分でなければならない。
【００５６】
１０４〜１０１５の形質導入単位（例えば、１０７〜１０１２の形質導入単位）、または少なくとも約１０５、少なくとも約１０６、少なくとも約１０７、約１０８、少なくとも約１０９、少なくとも約１０１０、少なくとも約１０１１、少なくとも約１０１２、少なくとも約１０１３、少なくとも約１０１４、もしくは少なくとも約１０１５の形質導入単位（例えば、少なくとも約１０７、少なくとも約１０８、少なくとも約１０９、少なくとも約１０１０、少なくとも約１０１１、少なくとも約１０１２、少なくとも約１０１３、または少なくとも約１０１４の形質導入単位、例えば、約１０１０もしくは１０１２の形質導入単位）のゲノム等価力価のウイルス粒子の典型的な用量。例示的な態様において、インビトロ形質導入細胞あたりのウイルス粒子（ＶＰ）の用量は、約１０３〜約１０１２以内である。いくつかの態様において、インビトロ形質導入細胞あたりのウイルス粒子の用量は、約１０４〜約１０８または約１０４〜約１０６以内である。例えば、インビトロ形質導入細胞あたりのウイルス粒子の用量は、１０５ＶＰ／細胞である。一部の状態では、長期にわたる治療が必要であり、長期にわたる複数回の投与を伴う場合と伴わない場合がある。
【００５７】
例示的な態様において、対象に（例えば、筋肉内注射を介して）投与されるハイブリッドＡＡＶの用量は、約５０〜約５０００μｌのハイブリッドＡＡＶであり、ここで、ハイブリッドＡＡＶの濃度は、約１０８または１０１６ＶＰ／ｍｌ以内である。例示的な態様において、対象に（例えば、筋肉内注射を介して）投与されるハイブリッドＡＡＶの用量は、約５０〜約５００μｌのハイブリッドＡＡＶであり、ここで、ハイブリッドＡＡＶの濃度は、約１０１０または１０１４ＶＰ／ｍｌ以内である。例示的な態様において、対象に投与される（例えば、筋肉内注射を介して）ハイブリッドＡＡＶの用量は、約７５〜約２００μｌのハイブリッドＡＡＶであり、ここで、ハイブリッドＡＡＶの濃度は、約１０１２ＶＰ／ｍｌである。
【００５８】
適切な場合、ＡＡＶまたは細胞は、追加の（または、増強された）生物学的効果を達成するために、他の物質（例えば、療法薬）および／または他の療法と組み合わせて投与される。この態様には、ＡＡＶまたは細胞および１つ以上の追加の好適な薬剤（複数可）の同時投与（すなわち、実質的に同時投与）および非同時投与（すなわち、重複するかどうかにかかわらず、任意の順序での異なる時間での投与）が含まれる。ある特定の態様において、異なる成分は、同じかまたは別々の組成物で、かつ同じかまたは異なる投与経路で投与されることが理解されよう。
【００５９】
本開示のさらなる態様によれば、ＡＡＶまたは細胞は、任意に、虚血の症状または原因を治療するのに有用な１つ以上の薬剤と組み合わせて、別々に、連続的に、または同時に投与される。代表的な薬剤には、アスピリン、硝酸塩、ベータ遮断薬、カルシウムチャネル遮断薬、コレステロール低下薬、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害薬、ラノラジン、抗凝固薬、血栓溶解薬（組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ストレプトキナーゼ、またはウロキナーゼ）、抗生物質）が含まれるが、これらに限定されない。
【００６０】
本開示のさらなる態様によれば、ＡＡＶまたは細胞は、任意に、疼痛管理に有用な１つ以上の薬剤と組み合わせて、別々に、連続的に、または同時に投与される。さらなる薬剤の例には、オピオイド鎮痛薬（例えば、モルヒネ、ヒドロモルホン、オキシモルホン、フェンタニル、コデイン、ジヒドロコデイン、オキシコドン、またはヒドロコドン）、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）（例えば、アスピリン、ジクロフェナク、イブプロフェン、ナプロキセン、オキサプロジン、またはシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）阻害剤）、鎮静剤（例えば、バルビツール酸系鎮静剤）、麻酔薬、およびコルチコステロイド（例えば、デキサメタゾン）が含まれるが、これらに限定されない。
【００６１】
ＢＭから非ＢＭコンパートメント（例えば、標的組織）へのＢＭ由来幹細胞の動員を促進することが所望される場合、ＢＭ由来前駆細胞の動員を促進することができる薬剤も、本組成物の一部として、または治療レジメンの別の一部として対象に提供される。多くのこのような薬剤が知られており、これらには、例えば、インテグリン、接着分子のセレクチンファミリー、ＶＣＡＭ−Ｉ、およびコロニー刺激因子が含まれる。好適な薬剤は、例えば、国際特許公開第ＷＯ００／５００４８号にさらに記載されている。
【００６２】
本開示の方法は、任意に、高圧酸素療法（ＨＢＯ２）、微小血管系が減弱した状況で創傷治癒を刺激するために使用される補助療法を含む治療レジメンの一部である。ＨＢＯ２が関与する治療方法は、例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００３７６０号に記載されており、これは、高圧酸素療法の議論に関して参照によって本明細書に組み込まれる。任意に、患者は、１日１回または２回、加圧室内で絶対気圧（ＡＴＡ）約２．０〜約３．２気圧で１００％のＯ２を呼吸する治療を２０回以上受ける。治療時間の範囲は、一般に、約１０分〜約２４０分（例えば、約１０、１５、３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２１０、２４０分など）である。
【００６３】
治療レジメンはまた、血管内治療（例えば、血管形成術またはステント留置術）、バイパス手術もしくは動脈手術、または壊死組織切除も含み得る。
【００６４】
このように一般的に記載される本発明は、例示として提供され、本発明を限定することを意図しない以下の実施例を参照することによって、より容易に理解されるであろう。
【実施例】
【００６５】
実施例１
肢および軟組織への血流の障害は、通常、大血管（動脈）および微小血管（毛細血管）の両方のプロセスを介して起こり、ＰＡＤおよびＣＬＩを罹患する患者の中心的な共通の病因である。虚血組織への十分な血流の回復は、修復応答の成功を可能にする。療法的血管新生は、虚血組織で血管形成を誘導するための薬物、遺伝子、細胞、または機械的装置の使用を指す。主な利点は、新しい血管の成長を誘導し、側副血管の形成を促進して、血液が枯渇した組織への血流を増加させることである。血管新生は、最終的に、ＣＬＩ患者、特に外科的介入の資格がない患者における有害な心血管事象のリスクの低減、虚血性疼痛の緩和、潰瘍の治癒、大規模な切断の予防、ならびに生活の質および生存の改善につながる。
【００６６】
細胞表面の接着分子は、細胞間相互作用およびホーミングを媒介する。接着受容体／リガンドペア（特に、Ｅ−セレクチン／リガンド）を介した幹細胞／前駆細胞と傷害組織のＥＣとの間の細胞間相互作用は、幹細胞誘導血管産生の不可欠な事象である。ＰＡＤ／ＣＬＩを治療するための新規の戦略は、遺伝子療法（Ｅ−セレクチン／ＡＡＶ）を使用して、Ｅ−セレクチンで創傷血管系および組織細胞のＥＣを刺激することによって、支持組織の微小環境を作成することによって試験した。Ｅ−セレクチンは、内因性または外因性の骨髄（ＢＭ）由来の修復能力のある幹／前駆組織修復細胞（ＴＲＣ）（Ｅ−セレクチンのリガンドを発現する）がアンカーにドッキングする部位として機能し、これによって、ＴＲＣの虚血組織への正確な相互作用／ホーミングが増加し得る。マウス肢虚血および壊疽モデルにおける接着分子ベースの細胞外および細胞成分の実現可能性および有効性が試験され、Ｅ−セレクチン／ＡＡＶ遺伝子療法がマウスモデルのＰＡＤ／ＣＬＩの効果的な治療法であることが実証された。本明細書に記載される方法は、組織微小環境のホスピタビリティを改善して、骨髄（ＢＭ）由来の修復能力のある幹細胞／前駆細胞（ＴＲＣ）の正確な標的化を強化する。
【００６７】
壊疽は特定の種類の組織壊死であるが、その基礎となる分子メカニズムは、ほとんど知られていない。信頼できる再現可能な壊疽の動物モデルの欠如によって、この疾患の過程を研究することは困難になった。一酸化窒素（ＮＯ）は、虚血の特徴である酸化状態における細胞応答の調節因子として作用することが知られているため、壊疽の発症および進行におけるＮＯ／ＮＯＳ経路の潜在的な関与が調査され、肢の壊疽のマウスモデルを、虚血誘導性肢壊疽の病態生理学的プロセスに関与する分子メカニズムを描写するために開発した。８〜１２週齢の雄ＦＶＢマウスを、それぞれ非選択的ＮＯＳ阻害剤であるＮ−ニトロ−Ｌ−アルギニンメチルエステル（Ｌ−ＮＡＭＥ）および媒体（ｎ＝１８／群）で処理した。鼠径靭帯および膝窩の大腿動脈の結紮によって後肢虚血を生成し、その後、右肢の動脈および全ての分枝を切除した。マウスは、術前１〜２時間にＬ−ＮＡＭＥの単回投与を（４０ｍｇ／ｋｇの腹腔内）受け、その後、術後１、２、および３日目に１日量を（４０ｍｇ／ｋｇの腹腔内）受けた。対照マウスは、薬物媒体のみを受けた。壊疽の発生および進行を目視検査および写真によって毎日評価した。修正タルロフ虚血スケールを使用して、壊疽を評価した。術後（ＰＯＤ）１〜３日目にレーザードップラー画像法（ＬＤＩ）を使用して、虚血を毎日監視した。Ｌ−ＮＡＭＥで処理したマウスは、ＰＯＤ３までに遠位肢壊疽を均一に発症した。それに比べて、対照群のマウスは、いずれも壊疽を発症しなかった（図９）。これは、最初の信頼性が高く再現性の高いマウスの虚血誘導性後肢壊疽モデルである。
【００６８】
組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターは、非病原性の野生型ウイルスＡＡＶに由来する。ヒトの大半がこのウイルスに曝露されているにもかかわらず、ＡＡＶに関連する明らかな悪影響はない。任意に、本明細書に記載される方法で使用される組換えベクターは、全てのＡＡＶ遺伝子を欠いており、つまり、野生型ウイルスのレップおよびキャップ遺伝子が除去されている。逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）は、組換えベクターゲノムに保持されている唯一のウイルスＤＮＡ配列である。その安全性プロファイル（病原性および毒性の欠如）に加えて、組換えＡＡＶベクターは、以下の顕著な特徴を有する；様々な組織起源の分裂細胞および非分裂細胞に感染する能力、非常に低い宿主免疫応答、ならびに長期発現。
【００６９】
ＡＡＶのライフサイクルは、宿主因子、ヘルパーウイルス、ＡＡＶゲノムにコードされている遺伝子、およびシス要素ＩＴＲを伴う複雑なシステムを通じて調節される。ＩＴＲは、Ｔ字型のヘアピン構造を想定できるパリンドローム配列である。この特別な構成は、ウイルスＤＮＡ複製の起点として機能する。さらに、ＩＴＲは、ウイルスのパッケージ化、統合、およびレスキューを成功させるために不可欠である。組換えｒＡＡＶゲノムは、通常、野生型ＡＡＶのゲノムとしての一本鎖ＤＮＡからなる。プロウイルスプラスミドのＩＴＲのうちの１つのＤ領域の欠失は、通常、「自己相補的」ｒＡＡＶと呼ばれる二本鎖ｒＡＡＶの効率的なパッケージ化をもたらす。ｒＡＡＶの自己相補的ゲノムは、ある特定のカプシドにパッケージ化して、それらの向性を決定できる。ＡＡＶは、多くの異なる血清型のカプシドに「パッケージ化」されて、ＡＡＶベクターを「疑似化」し得、これによって、ＡＡＶのゲノム（つまり、ＩＴＲの起源）に基づく発現カセットが、ＡＡＶの別の血清型に由来するカプシドを有する組換えウイルス粒子にパッケージ化される。疑似化組換えＡＡＶベクターは、しばしばｒＡＡＶ２／１またはｒＡＡＶ２／９などと呼ばれ、それらのハイブリッド起源（ＡＡＶ１またはＡＡＶ９カプシドにパッケージ化されたＡＡＶ２に基づくゲノム）を指す。疑似化ＡＡＶベクターは、導入遺伝子発現の異なるパターンおよび動態を媒介し、ＡＡＶベクターの利用可能なレパートリーを大幅に拡大する。
【００７０】
ＧＦＰをコードする異なるＡＡＶベクターの効率が試験されおり、これには、マウスモデルの肢虚血のためのＡＡＶ２／２、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／８、およびＡＡＶ２／９が含まれる。ＡＡＶ２／９は、より高い形質導入効率を示した（図１）。基本的なＡＡＶ２シスプラスミドは、ｐＺａｃベースである。  ｐＺａｃは、２つの末端に２つのＡＡＶ  ＩＴＲ、ＣＭＶプロモーター、複数のクローニング部位（ＭＣＳ）、および目的の遺伝子に簡単にクローニングできるＳＶ４０ポリＡを含有する。マウスＥ−セレクチン／ＡＡＶ２／９（対照としてＬａｃＺ／ＡＡＶ２／９）を使用して、虚血肢組織を形質導入して、マウス後肢壊疽モデルの虚血組織微小環境を刺激した。Ｅ−セレクチン／ＡＡＶ２／９およびＬａｃＺ／ＡＡＶ２／９ウイルスを筋肉内注射した（それぞれ、１．８ｘ１０１２ｖｇおよび１．２ｘ１０１３ｖｇ）。各々２０μＬの５箇所の注射部位をそれぞれ、壊疽マウスの虚血肢への半膜性大腿屈筋に沿って実行した。導入遺伝子（Ｅ−セレクチン）の組織細胞発現を免疫組織化学によって調べた。壊疽の治療におけるＥ−セレクチン／ＡＡＶ２／９遺伝子療法の療法的効果を、レーザードップラー画像法（ＬＤＩ）を使用して後肢の血流を監視し、血管画像法技術を使用して新血管新生および血管再建を測定することによって評価した。
【００７１】
８〜１２週齢のＦＶＢ／ＮＪ雄マウスを使用して、５箇所の内側半膜性大腿屈筋に沿って２０μＬ刻みで筋肉内の１．８ｘ１０１２ｖｇのＥ−セレクチン／ＡＡＶ（治療群）または１．２ｘ１０１３ｖｇのＬａｃＺ／ＡＡＶ２／９（対照群）で両側後肢組織微小環境を刺激した。後肢手術の４、２、および０日前に刺激した。ＦＶＢマウスは、手術の３０分前、ならびに術後１、２、および３日目に、大腿動脈の結紮／切除と、一酸化窒素合成酵素阻害剤であるＮＧ−ニトロ−Ｌ−アルギニンメチルエステル（Ｌ−ＮＡＭＥ）の投与とを組み合わせて受け、それは、後肢の灌流をさらに低減する。壊疽の重篤度のファーバースケールに基づく虚血スコアを術後１、２、３、７、および１４日目に記録したのに対し、レーザードップラー画像法を術後７および１４日目に実行した。新血管新生を定量化するためのレーザー走査共焦点顕微鏡を用いた生動物のディル灌流を術後１４日目に実行し、その時点で動物を屠殺し、Ｅ−セレクチン導入遺伝子発現を検証するために大腿組織を免疫蛍光のために採取した。
【００７２】
全てのマウスは、Ｌ−ＮＡＭＥ投与に加えて、大腿動脈結紮を受けた。組織を、フェーバー虚血スコアリングシステム（０（壊疽なし）〜１１（重篤な前足壊疽）のスケール）に基づいてスコアを割り当てた。Ｆａｂｅｒ虚血スコアリングは、Ｆａｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，ａｎｄ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ３１（８）：１７４８−１７５６（２０１１）に記載されている。０（壊疽なし）〜１１（重篤な前足壊疽）のフェーバー虚血スコアスケールに基づいて、術後７日目までに全てのマウスが壊疽の存在を有することが見出された。壊疽の重篤度は、Ｅ−セレクチン／ＡＡＶを受けた治療群と比較して、術後７日目までにＬａｃＺ／ＡＡＶを受けた対照群で著しく悪化した。この有意性は、術後１４までにさらにより深刻になり、ここで、前述の両方の群の虚血スコアはそれぞれ、５．３および２．４であった（ｐ＜０．０５、図２）。これらのデータは、ＬａｃＺ／ＡＡＶの投与に対して、Ｅ−セレクチン／ＡＡＶが壊疽を弱める可能性を示唆する。
【００７３】
術後、全てのマウスは、７日目および１４日目にレーザードップラー画像法を受けた。術後１４日までに、結紮肢と非結紮肢との比率として計算された虚血指数に、群間で著しい差があった。比率１が正常な灌流を示す場合、対照群および治療群の虚血指数は、１４日目までにそれぞれ０．２８対０．５２であった（ｐ＜０．０５）（図３および図１０）。これらのデータは、Ｅ−セレクチン／ＡＡＶ群が優れた灌流で経時的に回復し、したがって、肉眼検査での壊疽の重篤度が軽減されたことを裏付けている。図１１を参照されたい。
【００７４】
さらに、全てのマウスは、屠殺される前の術後１４日目に全身ディル灌流を受けた。走査共焦点顕微鏡によって足の灌流を検出した。術後１４日までに、結紮肢対非結紮肢の壊疽足のディル染色血管の強度として計算された結紮足の血管密度に、群間で著しい差があった。Ｅ−セレクチン／ＡＡＶ遺伝子療法は、壊疽足の新血管新生および足灌流を改善する。（図４）。これらのデータは、Ｅ−セレクチン／ＡＡＶ遺伝子療法が壊疽足の新血管新生および足灌流を改善することを裏付けている。
【００７５】
術後１４日目に、内側大腿筋を採取し、パラフィン処理および包埋の前にホルマリンで固定した。ヘマトキシリンおよびエオシン染色に基づいて、Ｅ−セレクチン群では、そのような特徴がより一般的に見られるＬａｃＺ結紮肢に対して、結紮肢筋細胞は、より少ない虚血性であり、より少ない集中型核で収縮したように見えた。１０倍の倍率でのＥ−セレクチン／ＡＡＶ結紮肢およびＬａｃＺ結紮肢のヘマトキシリンおよびエオシン染色の顕微鏡画像を、それぞれ図１２Ａおよび１２Ｂに示す。ｅ−セレクチン結紮肢に対して、ＬａｃＺ／ＡＡＶ結紮肢の筋原線維／ｈｐｆの数が多い（＊ｐ＜０．０００１）。同様に、ＬａｃＺ／ＡＡＶ群では、筋細胞は、結紮肢に集密的であり、集中型核の中で炎症細胞が豊富であった。最後に、ＬａｃＺ／ＡＡＶ結紮群は、Ｅ−セレクチン／ＡＡＶ群と比較して、定量データに基づいて最も多くの筋原線維／ｈｐｆを示した（図５）。これらのデータは、Ｅ−セレクチン／ＡＡＶ遺伝子療法が虚血誘導性骨格筋萎縮を改善することを示す。
【００７６】
Ｅ−セレクチン／ＡＡＶ遺伝子療法が虚血性創傷治癒を促進することも決定された。図６は、Ｅ−セレクチン／ＡＡＶ群とＬａｃＺ／ＡＡＶ群との間のＰＯＤ０〜１０の治癒進行を示す。術後（ＰＯＤ）０、１、３、５、６、７、１０日目の内側左後肢大腿部の創傷治癒の全体像を図１３に示す。画像の上の列は、Ｅ−セレクチン／ＡＡＶで処理したマウスからの画像を表し、画像の下の列は、ＬａｃＺ／ＡＡＶで処理したマウスからの画像を表す。Ｅ−セレクチン／ＡＡＶ群では、創傷は、手術後最初の２４時間以内に最も著しい収縮を受けるようであり、ＰＯＤ１までの治癒進行率は０〜５４％であった。比較すると、ＬａｃＺ／ＡＡＶマウスは、ＰＯＤ１までに２０％の治癒率になった（ｐ＜０００１）。マウスがＰＯＤ０〜１０に進行するにつれて、Ｅ−セレクチン／ＡＡＶマウスは、創傷において著しく多くの炎症および収縮に遭遇し、それらは、全体像に基づくとＬａｃＺ／ＡＡＶマウスではさらに遅延される。毎日、いずれの群の創傷治癒率の不一致率も減少したが、統計的には異なったままであった。ＰＯＤ１０までに、Ｅ−セレクチン／ＡＡＶマウスは、ＬａｃＺ／ＡＡＶ群の８４％と比較して９７％の治癒率に到達する（ｐ＜０．０００１）。
【００７７】
実施例２
この実施例は、本方法の文脈における新規の幹細胞療法の送達を記載する。一態様において、操作されたＢＭ由来組織修復細胞（ＴＲＣ）が投与され、ここで、Ｅ−セレクチンは、細胞表面に事前に導入されている。虚血肢組織に投与されたこれらの操作されたＴＲＣは、虚血組織の血管系、特に、発芽血管新生でシャッフリングしている出芽先端の細胞で、活性化内皮細胞（ＥＣ）（Ｅ−セレクチンを引き付けて相互作用する上昇した対応リガンドを発現する）と選択的に接着および相互作用して、新しい血管の形成を促進し得る。あるいは、支持組織の微小環境は、ウイルスベクターを使用してＥ−セレクチンで創傷血管系および組織細胞のＥＣを刺激することによって生成される。Ｅ−セレクチンは、内因性または外因性ＴＲＣ（Ｅ−セレクチンのリガンドを発現する）がアンカーにドッキングする部位として機能し、ＴＲＣの虚血組織への正確な相互作用／ホーミングを増加する。
【００７８】
マウスモデルでの肢虚血の回復のために、Ａｄｈ／ＶＶを事前に形質導入した自己組織修復細胞（ＴＲＣ）の筋肉内注射。現在、ＰＡＤ／ＣＬＩ患者における非操作ＴＲＣの投与に最も広く使用されている経路は、動脈内（ｉ．ａ．）および筋肉内（ｉ．ｍ．）注射であり、これらは重大な制限を提起する。筋肉内注射されたＴＲＣは、組織細胞との「ブラインドデート」を受ける。ＴＲＣの性能は主に、パラクリンメカニズムに依存し、これは、ＴＲＣが虚血組織、特に、発芽血管新生でシャッフリングしている発芽先端の活性化ＥＣとほとんどまたは滅多に特異的に相互作用しないためである。動脈内注射の手法は優れていることが示されておらず、出血のリスクを伴う。虚血誘導低酸素センサーＨＩＦ−１αは、血管新生を誘導するだけでなく、虚血組織の内皮細胞の接着分子パネルの発現を上方調節するＶＥＧＦおよびＳＤＦ−１αを含むある特定のケモサイトカインの発現の増加を引き起こす。先端細胞の移動および出芽は、血管新生の第１のステップである。血管新生の発芽における動的先端細胞シャッフリングは、療法的血管新生の標的となる「ホットスポット」である。特定の理論に拘束されることを望まないが、ＴＲＣと多細胞の出芽先端との特定の相互作用は、血管新生を促進するであろう。Ｅ−セレクチン／リガンドは、活性化内皮上で上昇した接着分子のペアであり、新血管新生が起こる部位への幹細胞／前駆細胞、例えば、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）の相互作用および動員を担う。Ｅ−セレクチンリガンドの発現は、ＳＤＦ−１αおよび他のサイトカイン（すなわち、ＩＬ−１およびＴＮＦ−α）によって上方調節される可能性が高い創傷組織の内皮で上昇していることが判明した。出芽先端でのＴＲＣとＥＣとの特異的相互作用を増加するために、細胞表面に高レベルの「Ａｄｈ」を発現するようにＡｄｈ／ＶＶで事前に形質導入される自己ＬａｃＺ＋ＢＭ由来ＴＲＣが、肢虚血を誘導するために大腿動脈結紮を受けたレシピエントＣ５７ＢＬ６マウスの虚血肢に投与される（ｉ．ｍ．）。ＬａｃＺ＋ＢＭ由来ＴＲＣを利用する目的は、移植後の虚血組織でこれらの細胞を容易に追跡するためである。細胞表面にＥ−セレクチンを運搬するように操作された自家ＴＲＣの創傷組織注射によって、創傷血管新生が５倍増加することが観察された。生着したＴＲＣは、出芽先端でより積極的かつ特異的にＥＣと相互作用し、それらのパラクリン効果に加えて血管新生を促進する（かつ、ＴＲＣと標的細胞との正確な付着（クローズアップ）に起因して、パラクリン効果がより効果的になり得る可能性がある）。
【００７９】
マウス後肢壊疽モデルで新血管新生／血管再建を促進するためのＥ−セレクチン／ＡＡＶを用いた「刺激」虚血肢組織微小環境。四肢の壊疽は、足／つま先の組織の死であり、ＰＡＤの最も重篤な症状の１つを表す。マウスにおける後肢壊疽の新規で信頼性が高く再現性の高いモデルは、上記のとおりである。虚血組織血管および組織細胞は、マウス虚血後肢壊疽モデルにおけるウイルスベクター媒介遺伝子療法によってＥ−セレクチンで刺激されて、内因性ＴＲＣの相互作用／ホーミングのための非常にアクセスしやすい組織微小環境が作成される。パイロット研究によって、Ｅ−セレクチン／ＡＡＶの創傷組織注射が、マウスモデルの創傷血管系および組織細胞におけるＥ−セレクチンの発現の著しい増加をもたらしたことが示された。血管系および組織細胞に発現するＥ−セレクチンは、Ｅ−セレクチンの対応リガンドを発現する内因性ＴＲＣのアンカーへの「ドッキング」部位として機能し、相互作用して、より堅牢な血管再建および／または新血管新生応答を引き起こす。
【００８０】
方法
Ｅ−セレクチン／ＶＶおよび対照ベクター（プラスミド）の構築：ウイルスベクター（ＶＶ）は、効率的で安全な遺伝子導入システムである。裸のｐＤＮＡ手法は、導入遺伝子発現のレベルおよび期間に制限があることを示す。Ｅ−セレクチン／ＶＶおよびＥＧＦＰ／ＶＶプラスミドを構築し、組換えウイルスを産生した。ウイルスベクターには選択マーカーが含まれる。このため、基本的なウイルスベクターは、ＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ（約１．４ｋｂ）を複数のクローニング部位に挿入することによって修正される。これらのベクター自体は、対照として使用され得る。マウスＥ−セレクチン遺伝子を、複数のクローニング部位の残りの部位を使用して、ＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰの上流に挿入する。ＩＲＥＳ（内部リボソーム進入部位）により、Ｅ−セレクチンおよびマーカーおよび制御遺伝子（ＥＧＦＰ）の両方をＴＲＣで同時に発現させることができる。したがって、Ｅ−セレクチン過剰発現ＴＲＣ（Ｅ−セレクチン／ＴＲＣ）の純粋な集団を選択して増幅することが可能になる。
【００８１】
組換えＶＶ（ウイルス）の産生：組換えＶＶの生成には、標準的な方法を利用する。勾配遠心分離によって、組換えＶＶを精製する。組換えＶＶを含む画分を収集し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に対して透析し、保存する。
【００８２】
マウスＢＭ由来ＴＲＣの生成：マウスＴＲＣを、ＲＯＳＡ２６（ＬａｃＺ＋）マウスから採取したＢＭ由来単核細胞から生成する。
【００８３】
ＦＶＢマウスにおける虚血誘導肢壊疽の作成：ＦＶＢマウスを使用して、虚血誘導肢壊疽を作成する。マウスは、片側大腿動脈結紮を受け、酸化還元経路を阻害する化合物で処理される。目視検査および写真によって、壊疽の発生および進行を毎日評価する。修正されたタルロフ虚血スケールを使用して、壊疽をスケーリングする。術後（ＰＯＤ）１日目〜３日目にＬＤＩを使用して、虚血を毎日監視する。通常、マウスは、術後３日目までに遠位肢壊疽を均一に発症する。
【００８４】
Ｃ５７  ＢＬ６マウスでの虚血肢マウスモデルの作成：一般的な虚血肢を作成するために、Ｃ５７  ＢＬ６マウスは片側大腿動脈および静脈結紮を受ける。鼠径靭帯および膝窩の大腿動脈および静脈束の結紮によって後肢虚血を生成し、その後、動脈／静脈および全ての分枝を切除する。術後１日目〜７日目（実験終了予定）にＬＤＩを使用して、虚血および再灌流を毎日監視する。ＬＤＩを、温度変動および鎮静レベルに起因するアーチファクトを最小限に抑えるために、重量ベースの鎮静機能を備えた温度管理施設で実行する。相対的な灌流データを虚血（右）対正常（左）肢血流の比率として表す。
【００８５】
組換えＶＶによる培養ＴＲＣの形質導入：Ｅ−セレクチン／ＴＲＣをインビトロで生成するために、ＲＯＳＡ２６（ＬａｃＺ  ＋）マウスから単離されたＢＭ由来ＴＲＣにＥ−セレクチン／ＶＶまたはＥＧＦＰ／ＶＶ（対照として）を形質導入する。導入遺伝子（Ｅ−セレクチン）発現を検出するために、形質導入後３日目に、ＴＲＣをトリプシン−ＥＤＴＡで分離し、洗浄し、ＦＡＣスキャンフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用してＦＡＣＳ分類を行って、ＥＧＦＰ＋細胞を単離する（Ｅ−セレクチン／ＴＲＣおよびＥＧＦＰを発現する対照／ＴＲＣの両方）。細胞増殖のために分離されたＥＧＦＰ＋細胞を再培養する。さらに、Ｅ−セレクチン発現は、ウエスタンブロットによって検証できる。ＴＲＣを氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ですすぎ、溶解緩衝剤で再懸濁した（１％のＮｏｎｉｄｉｔ  Ｐ−４０、５０ｍｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ、２００Ｕ／ｍｌのアプロチニン、１ｍｍｏｌ／ｌのＰＭＳＦ）。細胞溶解物（１０μｇのタンパク質）を１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、ポリフッ化ビニリデン膜にブロットした。イムノブロッティングを抗マウスＥ−セレクチン抗体で実行し、ＥＣＬ検出システムで視覚化する。
【００８６】
レシピエントＣ５７ＢＬ６マウスの虚血肢へのＥ−セレクチン／ＴＲＣの筋肉内注射。ドナーＲＯＳＡ２６（ＬａｃＺ＋）マウスから調製した操作されたＴＲＣを採取して洗浄し、ＰＢＳに再懸濁する。１００μｌの細胞懸濁液（ＡＡＶ／ＴＲＣ対対照／ＴＲＣ：８匹のマウス／群）を虚血肢に注射（ｉ．ｍ．）する。
【００８７】
組換えＶＶによる虚血肢組織の形質導入：ＦＶＢマウスをジエチルエーテルで麻酔する。Ｅ−セレクチン／ＶＶおよびＥＧＦＰ／ＶＶを生理食塩水で希釈する。ウイルス懸濁液を同側の半膜様筋に注射する。導入遺伝子（Ｅ−セレクチン）の発現を免疫蛍光（ＩＦ）によって検査する。
【００８８】
後肢虚血または壊疽の監視：温度制御された施設で、術後１日目から７日目に肢虚血および虚血性後肢への血流の回復を、ＬＤＩを使用して毎日監視する。相対的な灌流データを虚血（右）対正常（左）肢血流の比率として表す。
【００８９】
新血管新生および血管再建の評価：肢組織の血管密度をディル灌流およびレーザー走査共焦点顕微鏡によって測定する。マウス血管（新血管新生）は、ディル（Ｄ−２８２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を含む特別に調合された水溶液を使用した生灌流によって、麻酔されたマウスのインビトロで直接標識する。レーザー走査共焦点顕微鏡を使用して、虚血肢を２００μｍの厚さまたは深さまで走査することによって、肢組織の血管ネットワークを視覚化する。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、走査された領域全体に正規化された赤いディル標識血管の総数を評価して、血管密度を定量化する。さらに、採取された肢組織を使用して、抗ＫＤＲまたは抗ＣＤ３１抗体による内皮細胞マーカーＫＤＲまたはＣＤ３１の免疫染色でも、毛細血管密度の定量化によって血管新生を評価する。血管再建をディル灌流後のＬＤＩ（毎日）、およびレーザー走査共焦点顕微鏡（結紮された大腿骨領域付近の大きな血管に焦点を当てる）による外側大腿動脈形成の視覚化の両方によって測定する。
【００９０】
マイクロＣＴ：血管新生はマイクロＣＴでも探索することができる。マイクロコンピューター断層撮影（マイクロＣＴ）は、血管画像法の分析、定量、検証、視覚化に好適な高解像度の３Ｄボリュームデータを提供する。実験マウスの血管探索の代替方法として提供される。
【００９１】
組織内皮への自己Ｅ−セレクチン／ＴＲＣの組み込みの検出：投与されたＴＲＣがＲＯＳＡ２６（ＬａｃＺ＋）ドナーマウスからのものであるため、Ｅ−セレクチン／ＴＲＣおよび対照ＥＧＦＰ／ＴＲＣは、Ｘ−ｇａｌ染色によって検出でき、これによって、ＬａｃＺ＋ＴＲＣの数および組織位置を調べることができる（細胞追跡）。あるいは、ＴＲＣがＥＧＦＰ＋であるため、ＩＦ（抗ＥＧＦＰ染色）によって検出できる。Ｘ−ｇａｌは、免疫蛍光（ＩＦ）よりも少ないバックグラウンドでより安定した結果をもたらすため、使用できる。
【００９２】
ＢＭ由来ＴＲＣおよびそれらの運命の組織レベルの検出のためのβ−ガラクトシダーゼアッセイ（Ｘ−ｇａｌ）およびＩＦ：採取された肢組織は二つの部分に分離され、１つは冷凍用、およびもう１つは固定用（４％パラホルムアルデヒド）である。次いで、凍結組織切片を、Ｘ−ｇａｌ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ，Ｃａｎａｄａ）を用いて室温で２時間インキュベートする。切片を核高速赤で対比染色した（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）。少なくとも３つの連続切片において切片あたり５つのランダムな高倍率視野（ＨＰＦ、４０Ｘ）で術後７日目に肢組織の連続切片中のβ−ガラクトシダーゼ＋細胞をカウントすることによって、ＴＲＣの数を定量化する。生殖されたＴＲＣをＩＦによって検出し、標準プロトコルを使用してＥＧＦＰを染色することもできる。細胞運命を検出するために、凍結切片をＸ−ｇａｌでインキュベートする際に、分化マーカー用のＨＲＰ結合抗体、例えば、ＥＣ系統用のＫＤＲおよび線維芽細胞用のＦＳＰ−１を追加する。陽性染色を、ＨＲＰ／ＤＡＢまたはＡＥＣ検出ＩＨＣキット（ａｂ９３７０２，Ａｂｃａｍ）を使用して検出する。固定組織切片には、ＧＦＰ、ＫＤＲ、またはＦＳＰ−１に対する蛍光色素結合Ａｂを使用することができる。不明な場合、ＤＡＰＩで対比染色される。
【００９３】
虚血肢に組み込まれたＥ−セレクチン／ＴＲＣの位置および運命の調査：注射されたＴＲＣの位置および運命を検出するために、ＩＨＣを使用して、細胞系統マーカー、例えば、ＥＣ用のＫＤＲおよび線維芽細胞用のＦＳＰ−１をＸ−ｇａｌで共染色する。
【００９４】
回復した虚血肢におけるサイトカイン／ケモカインのプロファイリング：療法的血管新生に対する注射されたＥ−セレクチン／ＴＲＣの潜在的なパラクリン効果を調べるために、２７−サイトカイン、アンジオポエチン−２、Ｇ−ＣＳＦ、ｓＦａｓＬ、ｓＡｌｋ−１、アンフィレグリン、レプチン、ＩＬ−１β、ベータセルリン、ＥＧＦ、ＩＬ−６、エンドグリン、エンドセリン−１、ＦＧＦ−２、フォリスタチン、ＨＧＦ、ＰＥＣＡＭ−１、ＩＬ−１７、ＰＬＧＦ−２、ＫＣ、ＭＣＰ−１、プロラクチン、ＭＩＰ−１α、ＳＤＦ−１α、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ａ、およびＴＮＦαを検出するＭＩＬＬＩＰＬＥＸＭＡＰマウス血管新生／成長因子磁気ビーズパネル（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、試験細胞および組織溶解物を試験する。
【００９５】
データ分析：２群比較の場合は両側スチューデントｔ検定を使用し、多重比較の場合は双方向ＡＮＯＶＡ検定を使用して、差異の統計分析を実行する。Ｐ値は、Ｐ＜０．０５で統計的に有意とみなされる。ＳＰＳＳ２２．０ソフトウェアパッケージ（ＳＰＳＳ，Ｉｎｃ．，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ，ＵＳＡ）を用いて、統計分析を実行する。
【００９６】
実施例３
信頼できる動物の後肢壊疽モデルの欠如によって、重症肢虚血の分子調査および前臨床治療が制限される。この実施例は、遺伝子療法の有効性を評価するためのマウス後肢壊疽モデルの開発および使用について記載する。
【００９７】
Ｅ−セレクチン／アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）で虚血性後肢組織を刺激すると、療法的血管新生が強化され、壊疽が減弱すると仮定した。
【００９８】
後肢壊疽を誘導するための２つの方法を試験した。第１の方法では、ＦＶＢマウスは、重症肢虚血を達成のするために大腿動脈結紮（ＦＡＬ）を受けた。第２の方法では、ＦＶＢマウスは、ＦＡＬと、一酸化窒素合成酵素阻害剤であるＮＧ−ニトロ−Ｌ−アルギニンメチルエステル（Ｌ−ＮＡＭＥ）との組み合わせを受けて、後肢灌流をさらに低減する。ＦＡＬおよびＬ−ＮＡＭＥを使用する前に、壊疽誘導マウスにＥ−セレクチン／ＡＡＶ（治療）またはＬａｃＺ／ＡＡＶ（対照）を後肢に筋肉内投与した。術後（ＰＯＤ）の２、７、１４日目に記録した０（壊疽なし）〜１１（前足壊疽）の範囲の標準化された虚血スコアを使用して、壊疽を評価した。レーザードップラー画像法を使用した後肢の再灌流を、同じＰＯＤでの結紮：非結紮肢の平均灌流によって定量化した。生動物のディル灌流およびレーザー走査共焦点顕微鏡を使用して、肢の新血管新生を定量化した。
【００９９】
ほとんどのＦＶＢは、ＦＡＬのみの方法では壊疽を発症しなかった（ｎ＝２／８、壊疽の発生率２５％）。ＦＡＬとＬ−ＮＡＭＥとを組み合わせた方法は、一貫して後肢壊疽を誘導した（ｎ＝１４／１４、壊疽の発生率１００％）。Ｅ−セレクチン／ＡＡＶ（ｎ＝７）およびＬａｃＺ／ＡＡＶ（ｎ＝７）のＰＯＤ７のレーザードップラー画像法スコアは０．４１対０．２７（Ｐ＝０．０７１）であり、ＰＯＤ１４では０．５４対０．２９（Ｐ＝０．０１７）であった。Ｅ−セレクチン／ＡＡＶおよびＬａｃＺ／ＡＡＶでディル灌流した結紮後肢は、４４対２１の著しく異なる平均新血管新生強度スコアを明らかにした（Ｐ＝０．０３７）。それぞれのマウスのディル灌流非結紮肢は、５０対２５の平均強度スコアを示した（Ｐ＝０．００６）。Ｅ−セレクチン／ＡＡＶおよびＬａｃＺ／ＡＡＶのＰＯＤ２、７、１４の平均肢虚血スコアは、１．９、２．９、および３．７対２．７、３．９、および５．３であった（Ｐ＝０．１０４）。
【０１００】
非常に信頼性の高いマウスの後肢壊疽モデルの開発に成功し、翻訳研究に役立つことが示された。このモデルを使用して、Ｅ−セレクチンベースの新規の遺伝子療法は、肢の再灌流を改善し、重症肢虚血の新血管新生を増加した。この新規の後肢壊疽モデルは、壊疽に寄与するレドックス経路をさらに理解し、将来の翻訳研究を促進するために利用できる。
【０１０１】
本明細書で言及される全ての出版物、特許、および特許出願は、各々の個別の出版物または特許出願が参照によって組み込まれることが具体的かつ個別に示されるように、参照によって本明細書に組み込まれる。前述の発明は、理解を明確にするために、例示および実施例によってある程度詳細に記載されているが、添付の特許請求の範囲の意図または範囲から逸脱することなく、本発明の教示に照らして、それらに対するある特定の変更および修正が可能であることは当業者には容易に明らかである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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