(57)【要約】  本発明は、組織および／または生体液試料を含む、生体試料中の活性化可能抗体治療薬の活性化および他の特性を定性的におよび／または定量的に分析するための方法およびキットを提供する。本発明はまた、キャピラリーベースのイムノアッセイプラットフォームを使用して、組織および／または生体液試料を含む、生体試料中の活性化のレベルを定性的におよび／または定量的に分析する方法に関する。【選択図】図１Ａ
2020530554.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性化可能抗体の活性化レベルを定量化する方法であって、
ｉ）装填されたキャピラリーまたは装填されたキャピラリーの集団を活性化可能抗体、活性化された活性化可能抗体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の成分を含む生体試料と接触させることであって、
前記装填されたキャピラリーまたは装填されたキャピラリーの集団は積層マトリックスおよび分離マトリックスが事前に装填される、接触させることと、
ｉｉ）各キャピラリー内で前記生体試料の１つ以上の高分子量（ＭＷ）成分を前記生体試料の１つ以上の低分子量（ＭＷ）成分から分離することと、
ｉｉｉ）各キャピラリー内で前記高ＭＷ成分および前記低ＭＷ成分を固定することと、
ｉｖ）各キャピラリーを少なくとも１つの活性化可能抗体に特異的である少なくとも第１の試薬で免疫プローブすることと、
ｖ）各キャピラリーまたはキャピラリーの集団における前記第１の試薬のレベルを検出し定量化することと
を含む、方法。
【請求項２】
ステップｉ）の前に、少なくとも１つのキャピラリーまたはキャピラリーの集団に積層マトリックスおよび分離マトリックスを装填して前記少なくとも１つの充填されたキャピラリーまたは充填されたキャピラリーの集団を作製することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生体試料が、活性化可能抗体を含む少なくとも１つの高分子量成分および活性化された活性化可能抗体を含む少なくとも１つの低分子量成分を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ステップｉｉ）が、キャピラリー電気泳動により各キャピラリー内で前記生体試料の高分子量成分を前記生体試料の低分子量成分から分離することを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記分離ステップが、少なくとも約３５分、または少なくとも約３６分、または少なくとも約３７分、または少なくとも約３８分の分離時間にわたって実施される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ステップｉｉｉ）が、ＵＶ光を使用して前記生体試料の前記高ＭＷ成分および前記低ＭＷ成分を固定化することを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記活性化可能抗体が、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、および結合型多重特異性活性化可能抗体からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ステップｉｖ）における前記第１の試薬が、前記少なくとも１つの活性化可能抗体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記第１の試薬が、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片が、少なくとも１つの活性化可能抗体、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体、またはそれらの組み合わせの可変軽鎖（ＶＬ）ＣＤＲに結合し、前記ＶＬ  ＣＤＲが、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１の試薬が、検出可能な試薬である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ステップｉｖ）が、各キャピラリーに前記第１の試薬に特異的に結合する第２の試薬を装填することをさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記第２の試薬が、二次抗体を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第２の試薬が、検出可能な標識を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記第２の試薬が、検出可能な標識に結合された二次抗体を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記検出可能な標識が、蛍光標識である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記検出可能な標識が、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）およびアルカリホスファターゼからなる群から選択されるレポーター酵素である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記レポーター酵素が、西洋ワサビペルオキシダーゼである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記二次抗体が、検出可能な標識に結合されない、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記二次抗体が、一組の第１の結合タグおよび第２の結合タグの第１の結合タグに結合され、前記第１の結合タグが前記第２の結合タグに結合可能である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ステップｉｖ）が、各キャピラリーに前記第２の試薬に特異的に結合する第３の試薬を装填することをさらに含む、請求項１９〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記第３の試薬が、前記第２の結合タグに結合されたレポーター酵素を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記レポーター酵素が、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼからなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１の結合タグおよび第２の結合タグが、それぞれ、ビオチンおよびストレプトアビジン、ストレプトアビジンおよびビオチン、ビオチンおよびアビジン、ならびにアビジンおよびビオチンからなる群から選択される、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記第２の試薬が、ビオチンに結合された二次抗体であり、かつ前記第３の試薬が、ストレプトアビジンに結合されたレポーター酵素である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記第２の試薬が、ストレプトアビジンに結合された二次抗体であり、かつ前記第３の試薬が、ビオチンに結合されたレポーター酵素である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記レポーター酵素が、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼからなる群から選択される、請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記第３の試薬が、検出可能な三次抗体を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
ステップｉｖ）が、各キャピラリーに化学発光基質および比色基質からなる群から選択される基質を装填することをさらに含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記基質が、化学発光基質であり、かつステップｖ）が、各キャピラリーまたはキャピラリーの集団における化学発光のレベルを検出することを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記化学発光基質が、ルミノールであり、かつステップｉｖ）が、各キャピラリーに過酸化物を装填することをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ステップｉ）が、約１〜５００ｎｇの生体試料を装填することを含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
ステップｉ）が、約５〜４０ｎｇの生体試料を装填することを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記生体試料が、分子量分離をもたらすのに十分な量で１つ以上のＳＤＳ含有緩衝液を用いて調製される、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記生体試料が、体液である、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記体液が、血液、血漿、および血清からなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記生体試料が、病変組織である、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記病変組織が、溶解物である、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
前記疾患組織が、腫瘍組織である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
ｖ）各キャピラリーまたはキャピラリーの集団における前記第１の試薬のレベルを定量化することが、直接的にまたは間接的にのいずれかで検出される、第１の試薬のレベルを、活性化可能抗体についておよび活性化された活性化可能抗体についての標準曲線と、比較することを含む、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
アミノ酸配列ＳＹＧＭＳ（配列番号４３８）を含む可変重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）；アミノ酸配列ＴＩＳＰＳＧＩＹＴＹＹＰＶＴＶＫＧ（配列番号４３９）を含む可変重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）；アミノ酸配列ＨＨＰＮＹＧＳＴＹＬＹＹＩＤＹ（配列番号４４０）を含む可変重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）；アミノ酸配列ＫＳＳＱＳＶＦＳＳＳＮＱＫＮＹＬＡ（配列番号４４１）を含む可変軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）；アミノ酸配列ＷＡＦＴＲＥＳ（配列番号４４２）を含む可変軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）；およびアミノ酸配列ＹＱＹＬＳＳＬＴ（配列番号４４３）を含む可変軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）を含む単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４２】
前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号４２９のアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む、請求項４１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４３】
抗体またはその抗原結合断片が、配列番号４３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、請求項４１または請求項４２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４４】
配列番号４２９のアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４５】
配列番号４３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む請求項４４に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４６】
配列番号４３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４７】
配列番号４２９のアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む請求項４４に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４８】
（ｉ）活性化可能抗体の標準曲線試薬；
（ｉｉ）活性化された活性化可能抗体の標準曲線試薬；および
（ｉｉｉ）前記活性化可能抗体に対する結合特異性を有する抗ｉｄ一次抗体
を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１７年７月２０日に出願の米国仮出願第６２／５３４，９３１号（３５  ＵＳＣ§１１９（ｅ））に基づく利益を主張する。その内容は、その全体が援用によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
技術分野
本発明は一般に、組織および／または生体液試料などの生体試料中の活性化可能抗体治療薬の活性化および他の特性を定性的および／または定量的に分析するための方法に関する。本発明はまた、キャピラリーベースのイムノアッセイプラットフォームを使用して、組織および／または生体液試料などの生体試料中の活性化レベルを定性的および／または定量的に分析する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
抗体ベースの治療薬は、いくつかの疾患の効果的な治療法であることが証明されているが、場合によっては、幅広い標的発現による毒性により治療効果が制限される。さらに、抗体ベースの治療薬は、投与後の循環からの急速なクリアランスなど、他の制限を呈する。小分子治療の領域では、活性化学成分のプロドラッグを提供するために、戦略が開発されている。こうしたプロドラッグは、比較的不活性な（または著しく活性が低い）形態で投与される。投与されると、プロドラッグは、活性化合物へとｉｎ  ｖｉｖｏで代謝される。こうしたプロドラッグ戦略は、その意図された標的に対する薬物の選択性を高め、有害作用の低減をもたらし得る。
【０００４】
抗体ベースの治療薬の制限を克服するために、活性化可能抗体ベースの治療法が設計されている。
【０００５】
こうした活性化可能抗体ベースの治療薬の活性化を監視し、定量的に分析できる必要がある。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、活性化可能抗体の活性化レベルを定量化する方法に関し、本方法は：
ｉ）装填されたキャピラリーまたは装填されたキャピラリーの集団を、活性化可能抗体、活性化された活性化可能抗体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の成分を含む生体試料と接触させることであって、
装填されたキャピラリーまたは装填されたキャピラリーの集団は、積層マトリックスおよび分離マトリックスが事前に装填される、接触させることと、
ｉｉ）各キャピラリー内で生体試料の１つ以上の高分子量（ＭＷ）成分を、生体試料の１つ以上の低分子量（ＭＷ）成分から分離することと、
ｉｉｉ）各キャピラリー内で高ＭＷ成分および低ＭＷ成分を固定することと、
ｉｖ）少なくとも１つの活性化可能抗体に特異的である少なくとも第１の試薬で各キャピラリーを免疫プローブすることと、
ｖ）各キャピラリーまたはキャピラリーの集団における第１の試薬のレベルを検出し、定量化することと
を含む。
【０００７】
一実施形態では、ステップｉｉ）は、キャピラリー電気泳動により各キャピラリー内の生体試料の高分子量成分を生体試料の低分子量成分から分離することを含む。
【０００８】
さらなる実施形態では、活性化可能抗体は、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、および結合型多重特異性活性化可能抗体からなる群から選択される。
【０００９】
いくつかの実施形態では、第１の試薬は、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片を含む。
【００１０】
別の実施形態では、ステップｉｖ）は、第１の試薬に特異的に結合する第２の試薬を各キャピラリーに装填することをさらに含む。いくつかの実施形態では、第２の試薬は検出可能に標識される。他の実施形態では、第２の試薬は検出可能に標識されておらず、ステップｉｖ）は、第２の試薬に特異的に結合する第３の試薬を各キャピラリーに装填することをさらに含む。
【００１１】
さらなる実施形態では、本発明は、以下を含むキットを提供する：
（ｉ）活性化可能抗体の標準曲線試薬；
（ｉｉ）活性化された活性化可能抗体の標準曲線試薬；
（ｉｉｉ）活性化可能抗体に対する結合特異性を有する抗ｉｄ一次抗体。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】１：１００でのヒト血漿中０．１１、０．３３、１μｇ／ｍｌで３７％の１つのアームの活性化された活性化可能抗体に対するＰＬ０７−２００１−Ｃ５Ｈ９ｖ２抗イディオタイプ（抗−ｉｄ）クローンのスクリーニングを示す一連のグラフである。図１Ａは１アーム活性化ＰＬ０７−２００１−Ｃ５Ｈ９ｖ２（１μｇ／ｍｌ、０．３３μｇ／ｍｌ、および０．１１μｇ／ｍｌ、図中ではＡＡ  ＭＩＸと称する）の濃度が低下している１７Ｇ１の検出を示すエレクトロフェログラムである。
【図１Ｂ】１：１００でのヒト血漿中０．１１、０．３３、１μｇ／ｍｌで３７％の１つのアームの活性化された活性化可能抗体に対するＰＬ０７−２００１−Ｃ５Ｈ９ｖ２抗イディオタイプ（抗−ｉｄ）クローンのスクリーニングを示す一連のグラフである。図１Ｂは１アームの活性化された活性化可能抗体の上位６クローンの相対活性化率を示す図である。相対活性化率は、様々な濃度で保持される。２１Ｈ１０および２７Ｃ１クローンは、低い親和性を有するため、０．１１μｇ／ｍｌ濃度に関するデータはない。
【図２Ａ】本明細書において１７Ｇ１と称される抗体が活性化可能抗体（ＡＡ）ＰＬ０７−２００１−Ｃ５Ｈ９ｖ２に対して高い特異性を有することを示す一連のグラフである。１７Ｇ１は、１６０ｎｇ／ｍｌの１アームの活性化されたＰＬ０７−２００１−Ｃ５Ｈ９ｖ２（活性化ＡＡ）をヒト血漿（図２Ｃ）または肺腫瘍溶解物（図２Ｄ）のいずれかにスパイクすることにより、Ｗｅｓで特異性を評価された。
【図２Ｂ】本明細書において１７Ｇ１と称される抗体が活性化可能抗体（ＡＡ）ＰＬ０７−２００１−Ｃ５Ｈ９ｖ２に対して高い特異性を有することを示す一連のグラフである。１７Ｇ１は、１６０ｎｇ／ｍｌの１アームの活性化されたＰＬ０７−２００１−Ｃ５Ｈ９ｖ２（活性化ＡＡ）をヒト血漿（図２Ｃ）または肺腫瘍溶解物（図２Ｄ）のいずれかにスパイクすることにより、Ｗｅｓで特異性を評価された。
【図２Ｃ】本明細書において１７Ｇ１と称される抗体が活性化可能抗体（ＡＡ）ＰＬ０７−２００１−Ｃ５Ｈ９ｖ２に対して高い特異性を有することを示す一連のグラフである。１７Ｇ１は、１６０ｎｇ／ｍｌの１アームの活性化されたＰＬ０７−２００１−Ｃ５Ｈ９ｖ２（活性化ＡＡ）をヒト血漿（図２Ｃ）または肺腫瘍溶解物（図２Ｄ）のいずれかにスパイクすることにより、Ｗｅｓで特異性を評価された。
【図２Ｄ】本明細書において１７Ｇ１と称される抗体が活性化可能抗体（ＡＡ）ＰＬ０７−２００１−Ｃ５Ｈ９ｖ２に対して高い特異性を有することを示す一連のグラフである。１７Ｇ１は、１６０ｎｇ／ｍｌの１アームの活性化されたＰＬ０７−２００１−Ｃ５Ｈ９ｖ２（活性化ＡＡ）をヒト血漿（図２Ｃ）または肺腫瘍溶解物（図２Ｄ）のいずれかにスパイクすることにより、Ｗｅｓで特異性を評価された。
【図３Ａ】選択的抗イディオタイプ抗体による活性化可能抗体（ＡＡ）治療薬の特異的検出を示す一連のグラフである。図３Ａは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｑｕａｌｅｘ（ウェブサイトａｑｓｐ．ｃｏｍ／より入手可能）の市販のＡ１１０ＵＫ（非標識サルに対して吸着させたヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ））を用いて１０ｍｇ／ｋｇのＰＬ０７−２００１−Ｃ５Ｈ９ｖ２で処置したマウスの血漿中での、抗ＰＤＬ１活性化可能抗体（本明細書においてＰＬ０７−２００１−Ｃ５Ｈ９ｖ２と称する）の検出を示している。
【図３Ｂ】選択的抗イディオタイプ抗体による活性化可能抗体（ＡＡ）治療薬の特異的検出を示す一連のグラフである。図３Ｂは、抗イディオタイプ１７Ｇ１抗体を使用して０．１ｍｇ／ｋｇのＰＬ０７−２００１−Ｃ５Ｈ９ｖ２で処置したマウスの血漿中での、ＰＬ０７−２００１−Ｃ５Ｈ９ｖ２の検出を示す図である。
【図４Ａ】異種移植片腫瘍モデルで検出された血漿対腫瘍における活性化可能抗体（ＡＡ）治療薬の優先的活性化を示す一連のグラフである。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植マウスを、１ｍｇ／ｍｌの抗ＰＤＬ１活性化可能抗体（本明細書ではＰＬ０７−２００１−Ｃ５Ｈ９ｖ２と称する）で処置した。腫瘍試料および血漿試料を、４日目に採取した。図４Ａおよび図４Ｂは、本発明のキャピラリー電気泳動イムノアッセイ法による腫瘍ホモジネート試料および血漿試料の分析を示している。
【図４Ｂ】異種移植片腫瘍モデルで検出された血漿対腫瘍における活性化可能抗体（ＡＡ）治療薬の優先的活性化を示す一連のグラフである。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植マウスを、１ｍｇ／ｍｌの抗ＰＤＬ１活性化可能抗体（本明細書ではＰＬ０７−２００１−Ｃ５Ｈ９ｖ２と称する）で処置した。腫瘍試料および血漿試料を、４日目に採取した。図４Ａおよび図４Ｂは、本発明のキャピラリー電気泳動イムノアッセイ法による腫瘍ホモジネート試料および血漿試料の分析を示している。
【図５Ａ】別の異種移植片腫瘍モデルで検出された血漿対腫瘍における活性化可能抗体治療薬の優先的活性化を示す一連のグラフである。ＳＡＳ異種移植マウスを、０．１ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤＬ１活性化可能抗体（本明細書ではＰＬ０７−２００１−Ｃ５Ｈ９ｖ２と称する）で処置した。図５Ａおよび図５Ｂは、本発明のキャピラリー電気泳動イムノアッセイ法による腫瘍ホモジネート試料および血漿試料の分析を示している。
【図５Ｂ】別の異種移植片腫瘍モデルで検出された血漿対腫瘍における活性化可能抗体治療薬の優先的活性化を示す一連のグラフである。ＳＡＳ異種移植マウスを、０．１ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤＬ１活性化可能抗体（本明細書ではＰＬ０７−２００１−Ｃ５Ｈ９ｖ２と称する）で処置した。図５Ａおよび図５Ｂは、本発明のキャピラリー電気泳動イムノアッセイ法による腫瘍ホモジネート試料および血漿試料の分析を示している。
【図６Ａ】抗ＣＤ１６６活性化可能抗体（本明細書では７６１４．６−３００１−ＨｕＣＤ１６６と称する）を用いて異種移植片腫瘍モデルにおいて検出された血漿対腫瘍における活性化可能抗体治療薬の優先的活性化を示す一連のグラフである。Ｈ２９２異種移植マウスを、５ｍｇ／ｋｇの７６１４．６−３００１−ＨｕＣＤ１６６で処置した。腫瘍試料および血漿試料を、１日目に採取した。図６Ａおよび図６Ｂは、本発明のキャピラリー電気泳動イムノアッセイ法による腫瘍ホモジネート試料および血漿試料の分析を示している。
【図６Ｂ】抗ＣＤ１６６活性化可能抗体（本明細書では７６１４．６−３００１−ＨｕＣＤ１６６と称する）を用いて異種移植片腫瘍モデルにおいて検出された血漿対腫瘍における活性化可能抗体治療薬の優先的活性化を示す一連のグラフである。Ｈ２９２異種移植マウスを、５ｍｇ／ｋｇの７６１４．６−３００１−ＨｕＣＤ１６６で処置した。腫瘍試料および血漿試料を、１日目に採取した。図６Ａおよび図６Ｂは、本発明のキャピラリー電気泳動イムノアッセイ法による腫瘍ホモジネート試料および血漿試料の分析を示している。
【図７Ａ】異なる基質を含むＥＧＦＲ活性化可能抗体を用いて異種移植片腫瘍モデルにおいて検出された血漿対腫瘍における活性化可能抗体治療薬の優先的活性化を示す一連のグラフである。Ｈ２９２異種移植マウスを２５ｍｇ／ｋｇのＣ２２５−３９５４−２００１またはＣ２２５−３９５４−３００１活性化可能抗体治療薬のいずれかにより処置した。腫瘍試料および血漿試料を、４日目に採取した。図７Ａおよび図７Ｂは、本発明のキャピラリー電気泳動イムノアッセイ法による腫瘍ホモジネート試料および血漿試料の分析を示している。
【図７Ｂ】異なる基質を含むＥＧＦＲ活性化可能抗体を用いて異種移植片腫瘍モデルにおいて検出された血漿対腫瘍における活性化可能抗体治療薬の優先的活性化を示す一連のグラフである。Ｈ２９２異種移植マウスを２５ｍｇ／ｋｇのＣ２２５−３９５４−２００１またはＣ２２５−３９５４−３００１活性化可能抗体治療薬のいずれかにより処置した。腫瘍試料および血漿試料を、４日目に採取した。図７Ａおよび図７Ｂは、本発明のキャピラリー電気泳動イムノアッセイ法による腫瘍ホモジネート試料および血漿試料の分析を示している。
【図８】生体試料中の活性化された抗ＣＤ７１活性化可能抗体（本明細書ではＴＦ０２．１３−２０１１−２１．１２と称する）と活性化されていない抗ＣＤ７１活性化可能抗体との比を評価するための本発明のキャピラリー電気泳動イムノアッセイ法から得られた結果のグラフである。この方法を用いて、ヒト血漿の存在下において活性化されていない、すなわち完全な活性化可能抗体と混合された活性化前活性化可能抗体を分離した。
【図９】生体試料中の活性化された抗ＰＤ１活性化可能抗体（本明細書ではＰＤ３４−２０１１−Ａ１．５  ｈＩｇＧ４  Ｓ２２８Ｐと称する）と活性化されていない抗ＰＤ１活性化可能抗体との比を評価するために、本開示のキャピラリー電気泳動イムノアッセイ法を使用して得られた結果を示すグラフである。この方法を用いて、ヒト血漿の存在下において活性化されていない、すなわち完全な活性化可能抗体、と混合された活性化前活性化可能抗体を分離した。
【図１０Ａ】抗ＣＤ１６６活性化可能抗体（本明細書では７６１４．６−３００１−ＨｕＣＤ１６６と称する）を用いて活性化された活性化可能抗体（ＡＡ）治療薬（ＡＡ  Ｔｘ）および完全な（すなわち、非活性化）活性化可能抗体（ＡＡ）治療薬（ＡＡ  Ｔｘ）を評価するために、本開示のキャピラリー電気泳動イムノアッセイ法を使用して得られた結果を示す一連のグラフである。本発明のキャピラリー免疫アッセイ法を使用して、マトリプターゼ（図１０Ａ）またはＭＭＰ−１４（図１０Ｂ）により部分的に活性化されている７６１４．６−３００１−ＨｕＣＤ１６６活性化可能抗体を、完全な７６１４．６−３００１−ＨｕＣＤ１６６活性化可能抗体から分離した。
【図１０Ｂ】抗ＣＤ１６６活性化可能抗体（本明細書では７６１４．６−３００１−ＨｕＣＤ１６６と称する）を用いて活性化された活性化可能抗体（ＡＡ）治療薬（ＡＡ  Ｔｘ）および完全な（すなわち、非活性化）活性化可能抗体（ＡＡ）治療薬（ＡＡ  Ｔｘ）を評価するために、本開示のキャピラリー電気泳動イムノアッセイ法を使用して得られた結果を示す一連のグラフである。本発明のキャピラリー免疫アッセイ法を使用して、マトリプターゼ（図１０Ａ）またはＭＭＰ−１４（図１０Ｂ）により部分的に活性化されている７６１４．６−３００１−ＨｕＣＤ１６６活性化可能抗体を、完全な７６１４．６−３００１−ＨｕＣＤ１６６活性化可能抗体から分離した。
【図１１Ａ】実施例１１に記載されているとおり、それぞれ２段階検出プロトコルおよび三次検出プロトコルを用いて、活性化された活性化可能抗体（７６１４．６−３００１−ＨｕＣＤ１６６の切断産物）および完全な／活性化された活性化可能抗体（完全７６１４．６−３００１−ＨｕＣＤ１６６）の化学発光シグナルを示す図である。
【図１１Ｂ】実施例１１に記載されているとおり、それぞれ２段階検出プロトコルおよび三次検出プロトコルを用いて、活性化された活性化可能抗体（７６１４．６−３００１−ＨｕＣＤ１６６の切断産物）および完全な／活性化された活性化可能抗体（完全７６１４．６−３００１−ＨｕＣＤ１６６）の化学発光シグナルを示す図である。
【図１２】抗Ｊａｇｇｅｄ（完全な）活性化可能抗体５３４２−３００１−４Ｄ１１および腫瘍組織中の対応する活性化された活性化可能抗体について検出された化学発光シグナルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本開示は、キャピラリーベースのイムノアッセイプラットフォームを使用して、組織および／または生体液試料を含む、生体試料における活性化および活性化可能抗体活性化の他の特性を定性的および／または定量的に分析するための方法およびキットを提供する。
【００１４】
活性化可能抗体は典型的には、少なくとも以下の（ｉ）標的を特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片（ＡＢ）、（ｉｉ）活性化可能抗体が切断されていない状態または完全な状態にあるときに、ＡＢのその標的への結合を阻害するように、ＡＢに連結されているマスキング部分（ＭＭ）、および（ｉｉｉ）ＡＢに連結されている切断可能部分（ＣＭ）であって、プロテアーゼの基質として機能するポリペプチドであるＣＭ、を含む。活性化可能抗体は一般に、ＣＭの基質がそれに対する基質として機能するプロテアーゼの存在下で活性化され、プロテアーゼはＣＭの基質を切断し、このため「活性化された」（または「切断された」）活性化可能抗体を生じる。活性化可能抗体はまた、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体などの形態であってもよい。活性化可能抗体は、以下により詳細に記載される。
【００１５】
生体試料中の活性化可能抗体の特性、例えば、生体試料中の活性化可能抗体の活性化レベル、生体試料中の活性化された、すなわち切断された活性化可能抗体および／または完全な、すなわち不活性化されている、活性化可能抗体の総量、またはそれらの任意の組み合わせまたは相関を定性的および／または定量的に測定できることは有用である。こうした方法は、開発および／または治療用処置の任意の段階での活性化可能抗体および活性化可能抗体ベースの治療薬の有効性を監視するのに有用である。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法およびキットは、それを必要とする対象への投与前におよび／または治療計画中に活性化可能抗体および活性化可能抗体ベースの治療薬の有効性を試験して全投与期間および／または投与期間後の活性化可能抗体および活性化可能抗体ベースの治療薬の有効性を監視するために有用である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法およびキットは、活性化可能抗体および活性化可能抗体ベースの治療薬の遡及的分析を提供するのに有用である。
【００１６】
いくつかの実施形態では、本開示は、活性化可能抗体の活性化レベルを定量化する方法を提供し、この方法は、
ｉ）装填されたキャピラリーまたは装填されたキャピラリーの集団を、活性化可能抗体、活性化された活性化可能抗体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の成分を含む生体試料と接触させることであって、
装填されたキャピラリーまたは装填されたキャピラリーの集団は、積層マトリックスおよび分離マトリックスが事前に装填される、接触させることと、
ｉｉ）各キャピラリー内で生体試料の１つ以上の高分子量（ＭＷ）成分を、生体試料の１つ以上の低分子量（ＭＷ）成分から分離することと、
ｉｉｉ）各キャピラリー内で高ＭＷ成分および低ＭＷ成分を固定することと、
ｉｖ）少なくとも１つの活性化可能抗体に特異的である少なくとも第１の（一次）試薬で各キャピラリーを免疫プローブすることと、
ｖ）各キャピラリーまたはキャピラリーの集団における第１の（一次）試薬のレベルを検出し定量化することと
を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、方法は、ステップｉ）の前に、少なくとも１つのキャピラリーまたはキャピラリーの集団に積層マトリックスおよび分離マトリックスを装填して、少なくとも１つの装填したキャピラリーまたは装填したキャピラリーの集団を生成することをさらに含む。
【００１８】
本明細書で使用される「積層マトリックス」という用語は、生体試料中に存在するタンパク質を濃縮し、タンパク質が電気泳動条件下において同じ物理的開始点からの移動を開始するように分離マトリックスとの界面にタンパク質を「積層する」ために機能する非常に多孔質である（分離マトリックスに対して）材料を指す。本発明の実施において使用される好適な積層マトリックスは、ウエスタンブロット法のための積層ゲルを調製するために使用されるのと同じ材料および組成物から調製され得る（例えば、アクリルアミド、０．５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、ＳＤＳ、水、過硫酸アンモニウム、およびＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）など）。「分離マトリックス」という用語は、本明細書では、電気泳動条件下において、分子量に基づいてタンパク質の分離を促進する材料を指す。本発明の実施に使用される好適な分離マトリックスは、ウエスタンブロット法用の分離ゲルを調製するために使用される同じ材料および組成物から調製され得る（例えば、水、アクリルアミド、トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、ＳＤＳ、ＴＭＥＤ、過硫酸アンモニウムなど）。積層マトリックスおよび分離マトリックスが事前に装填されたキャピラリーは、例えばＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ（Ｗｅｓ（商標）Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ＭｏｄｕｌｅキャピラリーカートリッジおよびＷｅｓ（商標）キャピラリー電気泳動イムノアッセイシステムで使用するための関連試薬の供給元）から市販で得ることができる。
【００１９】
次に、装填されたキャピラリーまたは装填されたキャピラリーの集団は、生体試料と接触されて、装填された各キャピラリー中への生体試料の装填を開始する。生体試料は典型的には、（完全であるか、または切断されていない）活性化可能抗体（例えば、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体を含む）である少なくとも１つの比較的高分子量の成分および（切断された）活性化された活性化可能抗体である少なくとも１つの比較的低分子量の成分を含む。多くの場合、生体試料は、（完全であるか、または切断されていない）活性化可能抗体および（切断された）活性化された活性化可能抗体種の両方を含む。いくつかの実施形態では、生体試料は、対象からの体液を含む。いくつかの実施形態では、体液は、対象の身体のいずれの場所からでも単離される。いくつかの実施形態では、体液は、血液または血漿もしくは血清などの血液成分である。いくつかの実施形態では、生体試料は、細胞培養上清を含む。いくつかの実施形態では、生体試料は、対象からの組織試料を含む。組織試料は、対象の身体のいずれの場所からでも単離され得る。いくつかの実施形態では、組織試料は、腫瘍試料である。
【００２０】
いくつかの実施形態では、生体試料は、ヒト、非ヒト霊長類、愛玩動物（例えば、ネコ、イヌ、ウマ）、農場の動物、作業動物、または動物園の動物などの哺乳動物に由来する。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。いくつかの実施形態では、対象は愛玩動物である。いくつかの実施形態では、対象は獣医の治療を受けている動物である。
【００２１】
いくつかの実施形態では、ステップｉ）は、約１〜５００ｎｇの生体試料または約１〜５００ｎｇの生体試料の任意の値および／または範囲を装填することを含む。いくつかの実施形態では、ステップｉ）は、約５〜４０ｎｇの生体試料を装填することを含む。いくつかの実施形態では、生体試料は、結果として分子量の分離をもたらすのに十分な量の１つ以上の緩衝液を使用して調製される。いくつかの実施形態では、生体試料は、結果として分子量の分離をもたらすのに十分な量の１つ以上のＳＤＳ含有緩衝液を使用して調製される。
【００２２】
各キャピラリー中で生体試料の１つ以上の低分子量成分（複数可）（例えば（切断された）活性化された活性可能化抗体）から１つ以上の高分子量成分（複数可）（例えば（完全な活性化可能抗体））を分離することは、各キャピラリーを電気泳動にかけることにより達成され得る。電気泳動により、生体試料中の化合物は、分子サイズ（分子量など）に応じて異なる速度で分離ゲル中を移動する。いくつかの実施形態では、分離は、約３５分未満の期間（すなわち、「分離時間」）にわたって実行される。多くの場合、分離時間は少なくとも約３５分、または少なくとも約３６分、または少なくとも約３７分、または少なくとも約３８分である。
【００２３】
任意の好適な固定化方法および試薬を使用して、各キャピラリー内の高分子量成分および低分子量成分を（例えば、各キャピラリーの内部表面に）固定化できる。いくつかの実施形態では、ステップｉｉｉ）は、生体試料の高ＭＷ成分（例えば（完全な）活性化可能抗体）および低ＭＷ成分（例えば（切断された）活性化された活性化可能抗体）を固定するためにＵＶ光を使用することを含む。このステップにより、生体試料中に存在する（完全な）活性化可能抗体および（切断された）活性化可能抗体が結果として固定化される。キャピラリー電気泳動および固定化ステップを実行するための好適であるシステムは、Ｗｅｓ（商標）キャピラリー電気泳動イムノアッセイシステム（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）である。
【００２４】
本発明の方法を実施する際、少なくとも１つの活性化可能抗体に対し結合特異性を有する第１の試薬を使用して、各キャピラリーを免疫プローブする。典型的には、第１の試薬は一次抗体である。多くの場合、第１の試薬は、抗イディオタイプ（ｉｄ）抗体またはその抗原結合断片を含む。活性化可能抗体のＭＭおよびＣＭが活性化可能抗体の軽鎖に結合される場合、活性化可能抗体の可変軽鎖（ＶＬ）領域に結合する抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片が典型的に使用される。多くの場合、これらの実施形態では、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片は、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３からなる群から選択されるＶＬ  ＣＤＲに対する結合特異性を有する。活性化可能抗体のＭＭおよびＣＭが活性化可能抗体の重鎖に結合される場合、活性化可能抗体の可変重鎖（ＶＨ）領域に結合する抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片が典型的に使用される。これらの実施形態では、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片は多くの場合、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３からなる群から選択されるＶＨ  ＣＤＲに対する結合特異性を有する。いくつかの実施形態では、２つ以上の抗イディオタイプ抗体種（またはその抗原結合断片）の組み合わせを使用することが望ましい場合がある。例示的な抗ｉｄ抗体および本発明の方法におけるそれらの使用は、以下の実施例に記載される。
【００２５】
第１の試薬の検出は、様々な方法で達成され得る。例えば、一実施形態では、ステップｖ）は、各キャピラリーを、第１の試薬に特異的に結合するかまたは第１の試薬を認識するさらなる第２の試薬で免疫プローブすることをさらに含む。この実施形態では、各キャピラリーに第２の試薬が装填される。典型的には、第２の試薬は、第１の試薬に特異的に結合する二次抗体を含む。
【００２６】
いくつかの実施形態では、第１および／または第２の試薬は検出可能に標識される。本明細書で使用される「検出可能な標識」という用語は、例えば、蛍光標識、レポーター酵素（例えば、化学発光基質、比色分析基質などと組み合わせて使用される）など、直接的または間接的に検出され得る部分を指す。例示的なレポーター酵素としては、例えば、ペルオキシダーゼ（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）など）、アルカリホスファターゼなどが挙げられる。本発明の実施における使用に好適である検出可能に標識される例示的な第２の試薬としては、ＨＲＰ結合抗マウス二次抗体、ＨＲＰ結合抗ヤギ二次抗体、ＨＲＰ結合抗ヒト二次抗体などが挙げられる。多くの場合、最終的に検出されるシグナルを提供するために化学発光基質が追加される。好適な化学発光基質系は、当技術分野で公知であり、例えば、ルミノール＋過酸化物などが挙げられる。
【００２７】
他の実施形態では、第２の試薬は検出可能に標識されていない（例えば、レポーター酵素などの検出可能な標識に結合されない）。この実施形態では、第２の試薬は典型的には、第１および第２の結合タグのセットの第１の結合タグに通常結合される二次抗体であり、第１の結合タグは第２の結合タグに結合できる。第２の試薬に特異的に結合する第３の（三次）試薬を各キャピラリーに装填するステップｖ）をさらに含む方法が、実行される。第３の試薬は典型的には、第２の結合タグ、および例えばレポーター酵素または蛍光標識などの検出可能な標識を含む。例示的な第１および第２の結合タグとしては、それぞれ、ビオチンおよびストレプトアビジン、ストレプトアビジンおよびビオチン、ビオチンおよびアビジン、ならびにアビジンおよびビオチンなどが挙げられる。この「三次検出法」は、活性化可能抗体および活性化可能抗体種に関連するシグナルを増強すると考えられ、このため、検出および定量化ステップを容易にする。この実施形態で使用される例示的な第２および第３の試薬としては、ストレプトアビジンに結合した二次抗体である第２の試薬、およびビオチンに結合したレポーター酵素である第３の試薬（例えば、ＨＲＰ結合ビオチン）が挙げられる。化学発光系は通常、最終的に検出されるシグナルを生成するために使用される（例えば、ルミノール＋過酸化物）。この方法は、本明細書の実施例１１に示されている。
【００２８】
いくつかの実施形態では、ステップｖ）の少なくとも１つの検出可能な試薬は、少なくとも１つの活性化可能抗体、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体、またはそれらの組み合わせに特異的な少なくとも第１の試薬、および第１の試薬に特異的に結合するか、または第１の試薬を認識する第２の試薬を含み、第２の試薬は検出可能な標識を含む。
【００２９】
いくつかの実施形態では、ステップｖ）は、各キャピラリーまたはキャピラリーの集団における検出可能な標識のレベルを定量化することを含む。
【００３０】
いくつかの実施形態では、ステップｉｖ）の第１の試薬は、少なくとも１つの活性化可能抗体、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体、またはそれらの組み合わせに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、ステップｉｖ）の第２の試薬は、第１の試薬に特異的に結合する検出可能に標識された二次抗体である。いくつかの実施形態では、ステップｉｖ）の第１の試薬は、少なくとも１つの活性化可能抗体、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体、またはそれらの組み合わせに特異的に結合する一次抗体またはその抗原結合断片であり、ステップｉｖ）の第２の試薬は、一次抗体またはその抗原結合断片に特異的に結合する検出可能に標識された二次抗体である。いくつかの実施形態では、検出可能な標識は第２の試薬に結合される。いくつかの実施形態では、検出可能な標識は西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）である。
【００３１】
いくつかの実施形態では、一次試薬、二次試薬、および／または三次試薬、または一次試薬、二次試薬、および三次試薬のそれぞれは、抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、標的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、モノクローナル抗体、ドメイン抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ、ｓｃＡｂ、ｄＡｂ、単一ドメイン重鎖抗体、または単一ドメイン軽鎖抗体である。いくつかの実施形態では、標的を結合するこうした抗体またはその抗原結合断片は、マウス、他のげっ歯類、キメラ、ヒト化または完全ヒトモノクローナル抗体である。
【００３２】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの活性化可能抗体、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体、またはそれらの組み合わせに特異的に結合する一次抗体は、本明細書の例えば実施例１に記載の方法を使用して生成される。
【００３３】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの活性化可能抗体、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体、またはそれらの組み合わせに特異的に結合する一次抗体は、アミノ酸配列ＳＹＧＭＳ（配列番号４３８）を含む可変重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）；アミノ酸配列ＴＩＳＰＳＧＩＹＴＹＹＰＶＴＶＫＧ（配列番号４３９）を含む可変重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）；アミノ酸配列ＨＨＰＮＹＧＳＴＹＬＹＹＩＤＹ（配列番号４４０）を含む可変重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）；アミノ酸配列ＫＳＳＱＳＶＦＳＳＳＮＱＫＮＹＬＡ（配列番号４４１）を含む可変軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）；アミノ酸配列ＷＡＦＴＲＥＳ（配列番号４４２）を含む可変軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）；およびアミノ酸配列ＹＱＹＬＳＳＬＴ（配列番号４４３）を含む可変軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）を含む。
【００３４】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの活性化可能抗体、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体、またはそれらの組み合わせに特異的に結合する一次抗体は、配列番号４２９のアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む。
【００３５】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの活性化可能抗体、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体、またはそれらの組み合わせに特異的に結合する一次抗体は、配列番号４３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む。
【００３６】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの活性化可能抗体、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体、またはそれらの組み合わせに特異的に結合する一次抗体は、配列番号４２９のアミノ酸配列を含む可変重鎖、および配列番号４３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む。
【００３７】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの活性化可能抗体、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体、またはそれらの組み合わせに特異的に結合する一次抗体は、配列番号４２９のアミノ酸配列を含む可変重鎖と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一であるアミノ酸配列を含む。
【００３８】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの活性化可能抗体、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体、またはそれらの組み合わせに特異的に結合する一次抗体は、配列番号４３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一であるアミノ酸配列を含む。
【００３９】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの活性化可能抗体、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体、またはそれらの組み合わせに特異的に結合する一次抗体は、配列番号４２９のアミノ酸配列を含む可変重鎖と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一であるアミノ酸配列、および配列番号４３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一であるアミノ酸配列を含む。
【００４０】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの活性化可能抗体、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体、またはそれらの組み合わせに特異的に結合する一次抗体は、配列番号４４４のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
【００４１】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの活性化可能抗体、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体、またはそれらの組み合わせに特異的に結合する一次抗体は、配列番号４４５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００４２】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの活性化可能抗体、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体、またはそれらの組み合わせに特異的に結合する一次抗体は、配列番号４４４のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号４４５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００４３】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの活性化可能抗体、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体、またはそれらの組み合わせに特異的に結合する一次抗体は、配列番号４４４のアミノ酸配列を含む重鎖と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一であるアミノ酸配列を含む。
【００４４】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの活性化可能抗体、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体、またはそれらの組み合わせに特異的に結合する一次抗体は、配列番号４４５のアミノ酸配列を含む軽鎖と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一であるアミノ酸配列を含む。
【００４５】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの活性化可能抗体、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体、またはそれらの組み合わせに特異的に結合する一次抗体は、配列番号４４４のアミノ酸配列を含む重鎖と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一であるアミノ酸配列、および配列番号４４５のアミノ酸配列を含む軽鎖と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一であるアミノ酸配列を含む。
【００４６】
いくつかの実施形態では、検出可能な標識は第２の試薬に結合される。いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、例えばＨＲＰなどの蛍光標識であり、ステップｖ）は、各キャピラリーまたはキャピラリーの集団における化学発光のレベルを検出することを含む。
【００４７】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料中の１つ以上の活性化可能抗体の活性化を定量化するために使用される。例えば、活性化は、検出された活性化可能抗体種および活性化された活性化可能抗体種の総量を基準にしたパーセンテージとして計算され得る。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料中の活性化された活性化可能抗体または活性化可能抗体ベースの治療薬、および完全な活性化可能抗体または活性化可能抗体ベースの治療薬の量を比較するために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料中のｉｎ  ｖｉｖｏでのプロテアーゼ活性をプロファイリング、層別化、または分類するために使用される。検出ステップから得られるシグナルピークの属性（すなわち、分子量に対応して検出されたシグナルに対応する）は、第１の試薬のレベルを定量化するための基礎として使用できる（すなわち、直接的に、または検出可能に標識された二次もしくは検出可能に標識された三次試薬を介して間接的に検出される）。例えば、ピーク高さまたは曲線下面積および他の同様の方法を利用してもよい。典型的には、ステップｖ）は、各キャピラリーまたはキャピラリーの集団中の第１の試薬のレベルを定量化することを含み、直接的または間接的のいずれかで検出された第１の試薬のレベルを、活性化可能抗体および活性化された活性化可能抗体の標準曲線と比較することを含む。標準曲線の作成は、以下の実施例１３に示される。
【００４８】
本明細書に記載されるとおり、いくつかの実施形態では、活性化可能抗体ベースの治療薬は、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体、またはそれらの任意の組み合わせである。
【００４９】
いくつかの実施形態では、一次試薬、二次試薬、または一次試薬と二次試薬との両方は、抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、標的を結合する抗体またはその抗原結合断片は、モノクローナル抗体、ドメイン抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ、ｓｃＡｂ、ｄＡｂ、単一ドメイン重鎖抗体、または単一ドメイン軽鎖抗体である。いくつかの実施形態では、標的を結合するこうした抗体またはその抗原結合断片は、マウス、他のげっ歯類、キメラ、ヒト化または完全ヒトモノクローナル抗体である。
【００５０】
本発明の方法を使用して、様々な構造のいずれかを有する活性化可能抗体の活性化を検出し、定量化することができる。完全な活性化可能抗体構造の構造と活性化された／切断された活性化可能抗体構造の構造との一般的な違いは、比較的小さい分子量での違いである。最も複雑な生体試料からであっても検出および定量化を実現できる。例えば、いくつかの実施形態では、本開示は、キャピラリーをベースとした免疫アッセイプラットフォームを使用して、組織試料および／または血漿試料を含む、生体試料における活性化可能抗体治療活性化を定性的および／または定量的に分析するための方法を提供する。本明細書で提供される方法は、例えば、活性化可能抗体、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体、またはそれらの任意の組み合わせを含む活性化可能抗体ベースの治療薬と共に有用である。特に別に定義されない限り、本明細書で提供される方法での使用のために好適な活性化可能抗体に関するすべての開示は、非限定的な例として、活性化可能抗体、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体、またはそれらの任意の組み合わせを含む、他の活性化可能抗体のベースの治療にも適用可能であり、かつ好適である。
【００５１】
いくつかの実施形態では、本開示は、標的を特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片（ＡＢ）、活性化可能抗体が切断されていない状態にあるときに、ＡＢの標的への結合を阻害するように、ＡＢの軽鎖に連結されるマスキング部分（ＭＭ）、および、ＡＢに連結される切断可能部分（ＣＭ）であって、プロテアーゼの基質として機能するポリペプチドであるＣＭ、を有する活性化可能抗体治療薬の活性化を定性的および／または定量的に分析するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法を使用して、少なくとも（ｉ）ＣＭが切断されかつＭＭがＡＢの軽鎖に連結されない活性化された活性化可能抗体のレベル、および（ｉｉ）ＭＭおよびＣＭがＡＢの軽鎖に連結される完全な活性化可能抗体のレベル、を定量化するか、またはさもなければ比較する。
【００５２】
いくつかの実施形態では、標的を特異的に結合する活性化可能抗体および／または結合型活性化可能抗体のＡＢは、抗体である。いくつかの実施形態では、標的を結合する抗体またはその抗原結合断片は、モノクローナル抗体、ドメイン抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ、ｓｃＡｂ、ｄＡｂ、単一ドメイン重鎖抗体、または単一ドメイン軽鎖抗体である。いくつかの実施形態では、標的を結合するこうした抗体またはその抗原結合断片は、マウス、他のげっ歯類、キメラ、ヒト化または完全ヒトモノクローナル抗体である。
【００５３】
活性化された状態にある活性化可能抗体は、標的を結合し、かつ、（ｉ）標的を特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片（ＡＢ）；（ｉｉ）活性化可能抗体が切断されていない状態にあるときに、ＡＢの標的への結合を阻害するように、ＡＢに連結されるマスキング部分（ＭＭ）、および（ｉｉｉ）ＡＢに連結される切断可能部分（ＣＭ）であって、プロテアーゼの基質として機能するポリペプチドであるＣＭ、を含む。
【００５４】
いくつかの実施形態では、切断されていない状態にある活性化可能抗体は、以下のようにＮ末端からＣ末端への構造的配置を有する：ＭＭ−ＣＭ−ＡＢまたはＡＢ−ＣＭ−ＭＭ。
【００５５】
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、ＭＭとＣＭの間に連結ペプチドを含む。
【００５６】
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、ＣＭとＡＢの間に連結ペプチドを含む。
【００５７】
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、第１の連結ペプチド（ＬＰ１）および第２の連結ペプチド（ＬＰ２）を含み、切断されていない状態にある活性化可能抗体は、以下のようにＮ末端からＣ末端への構造的配置を有する：ＭＭ−ＬＰ１−ＣＭ−ＬＰ２−ＡＢまたはＡＢ−ＬＰ２−ＣＭ−ＬＰ１−ＭＭ。いくつかの実施形態では、２つの連結ペプチドは互いに同一である必要はない。
【００５８】
いくつかの実施形態では、ＬＰ１またはＬＰ２の少なくとも一方は、（ＧＳ）ｎ、（ＧＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号３３９）および（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３４０）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ｎは少なくとも１つの整数であり、いくつかの実施形態では、２０を超えない。
【００５９】
いくつかの実施形態では、ＬＰ１またはＬＰ２の少なくとも一方は、ＧＧＳＧ（配列番号３４１）、ＧＧＳＧＧ（配列番号３４２）、ＧＳＧＳＧ（配列番号３４３）、ＧＳＧＧＧ（配列番号３４４）、ＧＧＧＳＧ（配列番号３４５）、ＳＳＳＧ（配列番号３４６）およびＧＧＧＳＳＧＧＳ（配列番号４４９）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００６０】
いくつかの実施形態では、ＬＰ１は、アミノ酸配列ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号３４７）、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧ（配列番号３４８）、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号３４９）、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３５０）、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号３５１）、またはＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＳ（配列番号３５２）を含む。
【００６１】
いくつかの実施形態では、ＬＰ２は、アミノ酸配列ＧＳＳ、ＧＧＳ、ＧＧＧＳ（配列番号３５３）、ＧＳＳＧＴ（配列番号３５４）、またはＧＳＳＧ（配列番号３５５）を含む。
【００６２】
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、標的を特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片（ＡＢ）を含む。いくつかの実施形態では、標的を結合する抗体またはその抗原結合断片は、モノクローナル抗体、ドメイン抗体、単鎖、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ、ｓｃＡｂ、ｄＡｂ、単一ドメイン重鎖抗体、または単一ドメイン軽鎖抗体である。いくつかの実施形態では、標的を結合するこうした抗体またはその抗原結合断片は、マウス、他のげっ歯類、キメラ、ヒト化または完全ヒトモノクローナル抗体である。
【００６３】
いくつかの実施形態では、ＭＭは、標的へのＡＢの解離定数よりも大きい、ＡＢへの結合についての解離定数を有する。
【００６４】
いくつかの実施形態では、ＭＭは、標的に対するＡＢの解離定数以下の、ＡＢへの結合についての解離定数を有する。
【００６５】
いくつかの実施形態では、ＭＭは、ＡＢへの結合についての解離定数を有し、これは、標的へのＡＢの解離定数と同等である。
【００６６】
いくつかの実施形態では、ＭＭは、標的へのＡＢの解離定数未満である、ＡＢへの結合についての解離定数を有する。
【００６７】
いくつかの実施形態では、ＡＢに対するＭＭの解離定数（Ｋｄ）は、標的へのＡＢの解離定数の２、３、４、５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、１，０００、２，５００、５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００倍以上、または１〜５、５〜１０、１０〜１００、１０〜１，０００、１０〜１０，０００、１０〜１００，０００、１０〜１，０００，０００、１０〜１０，０００，０００、１００〜１，０００、１００〜１０，０００、１００〜１００，０００、１００〜１，０００，０００、１００〜１０，０００，０００、１，０００〜１０，０００、１，０００〜１００，０００、１，０００〜１，０００，０００、１０００〜１０，０００，０００、１０，０００〜１００，０００、１０，０００〜１，０００，０００、１０，０００〜１０，０００，０００、１００，０００〜１，０００，０００、もしくは１００，０００〜１０，０００，０００倍程度である。
【００６８】
いくつかの実施形態では、ＭＭは、活性化可能抗体が切断された状態にある場合に、標的への結合について、ＡＢと干渉または競合しない。
【００６９】
いくつかの実施形態では、ＭＭは、約２〜４０アミノ酸長のポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＭＭは、最大約４０アミノ酸長のポリペプチドである。
【００７０】
いくつかの実施形態では、ＭＭポリペプチド配列は標的の配列とは異なる。いくつかの実施形態では、ＭＭポリペプチド配列は、ＡＢの任意の天然の結合パートナーと５０％程度の同一性である。いくつかの実施形態では、ＭＭポリペプチド配列は標的の配列とは異なり、ＡＢの天然の結合パートナーとの同一性は、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、または１０％程度である。
【００７１】
いくつかの実施形態では、ＡＢへのＭＭの連結は、標的を結合するＡＢの能力を低下させ、これにより、標的に向かってＭＭに連結されるときのＡＢの解離定数（Ｋｄ）は、標的に向かってＭＭに連結されないときのＡＢのＫｄよりも少なくとも２倍大きい。
【００７２】
いくつかの実施形態では、ＡＢへのＭＭの連結は、標的を結合するＡＢの能力を低下させ、これにより、標的に向かってＭＭに連結されるときのＡＢの解離定数（Ｋｄ）は、標的に向かってＭＭに連結されないときのＡＢのＫｄよりも少なくとも５倍大きい。
【００７３】
いくつかの実施形態では、ＡＢへのＭＭの連結は、標的を結合するＡＢの能力を低下させ、これにより、標的に向かってＭＭに連結されるときのＡＢの解離定数（Ｋｄ）は、標的に向かってＭＭに連結されないときのＡＢのＫｄよりも少なくとも１０倍大きい。
【００７４】
いくつかの実施形態では、ＡＢへのＭＭの連結は、標的を結合するＡＢの能力を低下させ、これにより、標的に向かってＭＭに連結されるときのＡＢの解離定数（Ｋｄ）は、標的に向かってＭＭに連結されないときのＡＢのＫｄよりも少なくとも２０倍大きい。
【００７５】
いくつかの実施形態では、ＡＢへのＭＭの連結は、標的を結合するＡＢの能力を低下させ、これにより、標的に向かってＭＭに連結されるときのＡＢの解離定数（Ｋｄ）は、標的に向かってＭＭに連結されないときのＡＢのＫｄよりも少なくとも４０倍大きい。
【００７６】
いくつかの実施形態では、ＡＢへのＭＭの連結は、標的を結合するＡＢの能力を低下させ、これにより、標的に向かってＭＭに連結されるときのＡＢの解離定数（Ｋｄ）は、標的に向かってＭＭに連結されないときのＡＢのＫｄよりも少なくとも１００倍大きい。
【００７７】
いくつかの実施形態では、ＡＢへのＭＭの連結は、標的を結合するＡＢの能力を低下させ、これにより、標的に向かってＭＭに連結されるときのＡＢの解離定数（Ｋｄ）は、標的に向かってＭＭに連結されないときのＡＢのＫｄよりも少なくとも１０００倍大きい。
【００７８】
いくつかの実施形態では、ＡＢへのＭＭの連結は、標的を結合するＡＢの能力を低下させ、これにより、標的に向かってＭＭに連結されるときのＡＢの解離定数（Ｋｄ）は、標的に向かってＭＭに連結されないときのＡＢのＫｄよりも少なくとも１０，０００倍大きい。
【００７９】
いくつかの実施形態では、標的の存在下で、ＭＭは、例えば、ＰＣＴ国際公開番号第２０１０／０８１１７３号（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載のアッセイなどの標的置換アッセイを使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏでアッセイされる場合に、ＣＭが切断される場合と比較して、ＣＭが切断されないときに、標的を結合するＡＢの能力を少なくとも９０％低下させる。
【００８０】
いくつかの実施形態では、ＣＭを切断するプロテアーゼは、疾患組織において活性であり、例えば上方制御されているか、そうでなければ制御されておらず、プロテアーゼは、活性化可能抗体がプロテアーゼに曝露されるときに活性化可能抗体中のＣＭを切断する。
【００８１】
いくつかの実施形態では、プロテアーゼは組織中の標的と共局在し、プロテアーゼは、活性化可能抗体がプロテアーゼに曝露されるときに、活性化可能抗体中のＣＭを切断する。
【００８２】
いくつかの実施形態では、ＣＭは、活性化可能抗体中に位置付けられ、これにより、活性化可能抗体が切断されていない状態にあるときには、標的への活性化可能抗体の結合は低減されて、標的への未修飾ＡＢ結合の解離定数よりも少なくとも２倍大きい解離定数で生じ、一方、切断された状態（すなわち、活性化可能抗体が切断された状態にある場合）では、ＡＢは標的を結合する。
【００８３】
いくつかの実施形態では、ＣＭは、活性化可能抗体中に位置付けられ、これにより、活性化可能抗体が切断されていない状態にあるときには、標的への活性化可能抗体の結合は低減されて、標的への未修飾ＡＢ結合の解離定数よりも少なくとも５倍大きい解離定数で生じ、一方、切断された状態（すなわち、活性化可能抗体が切断された状態にある場合）では、ＡＢは標的を結合する。
【００８４】
いくつかの実施形態では、ＣＭは、活性化可能抗体中に位置付けられ、これにより、活性化可能抗体が切断されていない状態にあるときには、標的への活性化可能抗体の結合は低減されて、標的への未修飾ＡＢ結合の解離定数よりも少なくとも１０倍大きい解離定数で生じ、一方、切断された状態（すなわち、活性化可能抗体が切断された状態にある場合）では、ＡＢは標的を結合する。
【００８５】
いくつかの実施形態では、ＣＭは、活性化可能抗体中に位置付けられ、これにより、活性化可能抗体が切断されていない状態にあるときには、標的への活性化可能抗体の結合は低減されて、標的への未修飾ＡＢ結合の解離定数よりも少なくとも２０倍大きい解離定数で生じ、一方、切断された状態（すなわち、活性化可能抗体が切断された状態にあるとき）では、ＡＢは標的を結合する。
【００８６】
いくつかの実施形態では、ＣＭは、活性化可能抗体中に位置付けられ、これにより、活性化可能抗体が切断されていない状態にあるときには、標的への活性化可能抗体の結合は低減されて、標的への未修飾ＡＢ結合の解離定数よりも少なくとも４０倍大きい解離定数で生じ、一方、切断された状態では、ＡＢは標的を結合する。
【００８７】
いくつかの実施形態では、ＣＭは、活性化可能抗体中に位置付けられ、これにより、活性化可能抗体が切断されていない状態にあるときには、標的への活性化可能抗体の結合は低減されて、標的への未修飾ＡＢ結合の解離定数よりも少なくとも５０倍大きい解離定数で生じ、一方、切断された状態では、ＡＢは標的を結合する。
【００８８】
いくつかの実施形態では、ＣＭは、活性化可能抗体中に位置付けられ、これにより、活性化可能抗体が切断されていない状態にあるときには、標的への活性化可能抗体の結合は低減されて、標的への未修飾ＡＢ結合の解離定数よりも少なくとも１００倍大きい解離定数で生じ、一方、切断された状態では、ＡＢは標的を結合する。
【００８９】
いくつかの実施形態では、ＣＭは、活性化可能抗体中に位置付けられ、これにより、活性化可能抗体が切断されていない状態にあるときには、標的への活性化可能抗体の結合は低減されて、標的への未修飾ＡＢ結合の解離定数よりも少なくとも２００倍大きい解離定数で生じ、一方、切断された状態では、ＡＢは標的を結合する。
【００９０】
いくつかの実施形態では、ＣＭは、最大１５アミノ酸長のポリペプチドである。
【００９１】
いくつかの実施形態では、ＣＭは、少なくとも１つのマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）の基質である第１の切断可能部分（ＣＭ１）、および少なくとも１つのセリンプロテアーゼ（ＳＰ）の基質である第２の切断可能部分（ＣＭ２）を含むポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＣＭ１−ＣＭ２基質のＣＭ１基質配列およびＣＭ２基質配列のそれぞれは独立して、最大１５アミノ酸長のポリペプチドである。
【００９２】
いくつかの実施形態では、ＣＭは、癌において上方制御されるか、そうでなければ制御されない、またはそのように考えられる少なくとも１つのプロテアーゼの基質である。
【００９３】
いくつかの実施形態では、ＣＭは、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、トロンビン、好中球エラスターゼ、システインプロテアーゼ、レグマイン、およびセリンプロテアーゼ、例えばマトリプターゼ（ＭＴ−ＳＰ１）、およびウロキナーゼ（ｕＰＡ）からなる群から選択される少なくとも１つのプロテアーゼの基質である。理論に束縛されることなく、これらのプロテアーゼは、癌の少なくとも１つで上方制御されるか、そうでなければ制御されないと考えられている。
【００９４】
例示的な基質としては、表４に列挙される以下の酵素またはプロテアーゼの１つ以上によって切断可能な基質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９５】
いくつかの実施形態では、ＣＭは、特定のプロテアーゼ、例えば、活性化可能抗体の標的と共局在することが知られているプロテアーゼと共に使用するために選択される。
【００９６】
いくつかの実施形態では、ＣＭは少なくとも１つのＭＭＰの基質である。ＭＭＰの例としては、表４に列挙されているＭＭＰが挙げられる。いくつかの実施形態では、ＣＭは、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１、ＭＭＰ３、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１７、ＭＭＰ１１、およびＭＭＰ１９からなる群から選択されるプロテアーゼの基質である。いくつかの実施形態では、ＣＭは、ＭＭＰ９の基質である。いくつかの実施形態では、ＣＭは、ＭＭＰ１４の基質である。
【００９７】
いくつかの実施形態では、ＣＭは、配列ＴＧＲＧＰＳＷＶ（配列番号３５６）；ＳＡＲＧＰＳＲＷ（配列番号３５７）；ＴＡＲＧＰＳＦＫ（配列番号３５８）；ＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号３５９）；ＧＧＷＨＴＧＲＮ（配列番号３６０）；ＨＴＧＲＳＧＡＬ（配列番号３６１）；ＰＬＴＧＲＳＧＧ（配列番号３６２）；ＡＡＲＧＰＡＩＨ（配列番号３６３）；ＲＧＰＡＦＮＰＭ（配列番号３６４）；ＳＳＲＧＰＡＹＬ（配列番号３６５）；ＲＧＰＡＴＰＩＭ（配列番号３６６）；ＲＧＰＡ（配列番号３６７）；ＧＧＱＰＳＧＭＷＧＷ（配列番号３６８）；ＦＰＲＰＬＧＩＴＧＬ（配列番号３６９）；ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ（配列番号３７０）；ＳＰＬＴＧＲＳＧ（配列番号３７１）；ＳＡＧＦＳＬＰＡ（配列番号３７２）；ＬＡＰＬＧＬＱＲＲ（配列番号３７３）；ＳＧＧＰＬＧＶＲ（配列番号３７４）；ＰＬＧＬ（配列番号３７５）；ＬＳＧＲＳＧＮＨ（配列番号７８９）；ＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号７９０）；ＬＳＧＲＳＤＤＨ（配列番号７９１）；ＬＳＧＲＳＤＩＨ（配列番号７９２）；ＬＳＧＲＳＤＱＨ（配列番号７９３）；ＬＳＧＲＳＤＴＨ（配列番号７９４）；ＬＳＧＲＳＤＹＨ（配列番号７９５）；ＬＳＧＲＳＤＮＰ（配列番号７９６）；ＬＳＧＲＳＡＮＰ（配列番号７９７）；ＬＳＧＲＳＡＮＩ（配列番号７９８）；ＬＳＧＲＳＤＮＩ（配列番号７９９）；ＭＩＡＰＶＡＹＲ（配列番号８００）；ＲＰＳＰＭＷＡＹ（配列番号８０１）；ＷＡＴＰＲＰＭＲ（配列番号８０２）；ＦＲＬＬＤＷＱＷ（配列番号８０３）；ＩＳＳＧＬ（配列番号８０４）；ＩＳＳＧＬＬＳ（配列番号８０５）；および／またはＩＳＳＧＬＬ（配列番号８０６）を含む基質である。
【００９８】
いくつかの実施形態では、ＣＭは、アミノ酸配列ＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号３５９）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、アミノ酸配列ＴＧＲＧＰＳＷＶ（配列番号３５６）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、アミノ酸配列ＰＬＴＧＲＳＧＧ（配列番号３６２）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、アミノ酸配列ＧＧＱＰＳＧＭＷＧＷ（配列番号３６８）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、アミノ酸配列ＦＰＲＰＬＧＩＴＧＬ（配列番号３６９）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、アミノ酸配列ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ（配列番号３７０）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、アミノ酸配列ＰＬＧＬ（配列番号３７５）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、アミノ酸配列ＳＡＲＧＰＳＲＷ（配列番号３５７）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、アミノ酸配列ＴＡＲＧＰＳＦＫ（配列番号３５８）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、アミノ酸配列ＧＧＷＨＴＧＲＮ（配列番号３６０）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、アミノ酸配列ＨＴＧＲＳＧＡＬ（配列番号３６１）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、アミノ酸配列ＡＡＲＧＰＡＩＨ（配列番号３６３）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、アミノ酸配列ＲＧＰＡＦＮＰＭ（配列番号３６４）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、アミノ酸配列ＳＳＲＧＰＡＹＬ（配列番号３６５）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、アミノ酸配列ＲＧＰＡＴＰＩＭ（配列番号３６６）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、アミノ酸配列ＲＧＰＡ（配列番号３６７）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、アミノ酸配列ＬＳＧＲＳＧＮＨ（配列番号７８９）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、アミノ酸配列ＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号７９０）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、アミノ酸配列ＬＳＧＲＳＤＤＨ（配列番号７９１）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、アミノ酸配列ＬＳＧＲＳＤＩＨ（配列番号７９２）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、アミノ酸配列ＬＳＧＲＳＤＱＨ（配列番号７９３）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、アミノ酸配列ＬＳＧＲＳＤＴＨ（配列番号７９４）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、アミノ酸配列ＬＳＧＲＳＤＹＨ（配列番号７９５）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、アミノ酸配列ＬＳＧＲＳＤＮＰ（配列番号７９６）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、アミノ酸配列ＬＳＧＲＳＡＮＰ（配列番号７９７）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、アミノ酸配列ＬＳＧＲＳＡＮＩ（配列番号７９８）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、アミノ酸配列ＬＳＧＲＳＤＮＩ（配列番号７９９）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、アミノ酸配列ＭＩＡＰＶＡＹＲ（配列番号８００）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、アミノ酸配列ＲＰＳＰＭＷＡＹ（配列番号８０１）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、アミノ酸配列ＷＡＴＰＲＰＭＲ（配列番号８０２）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、アミノ酸配列ＦＲＬＬＤＷＱＷ（配列番号８０３）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、アミノ酸配列ＩＳＳＧＬ（配列番号８０４）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、アミノ酸配列ＩＳＳＧＬＬＳ（配列番号８０５）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、アミノ酸配列および／またはＩＳＳＧＬＬ（配列番号８０６）を含む。
【００９９】
いくつかの実施形態では、ＣＭはＭＭＰの基質であり、配列ＩＳＳＧＬＳＳ（配列番号３７６）、ＱＮＱＡＬＲＭＡ（配列番号３７７）、ＡＱＮＬＬＧＭＶ（配列番号３７８）、ＳＴＦＰＦＧＭＦ（配列番号３７９）、ＰＶＧＹＴＳＳＬ（配列番号３８０）、ＤＷＬＹＷＰＧＩ（配列番号３８１）、ＩＳＳＧＬＬＳＳ（配列番号３８２）、ＬＫＡＡＰＲＷＡ（配列番号３８３）、ＧＰＳＨＬＶＬＴ（配列番号３８４）、ＬＰＧＧＬＳＰＷ（配列番号３８５）、ＭＧＬＦＳＥＡＧ（配列番号３８６）、ＳＰＬＰＬＲＶＰ（配列番号３８７）、ＲＭＨＬＲＳＬＧ（配列番号３８８）、ＬＡＡＰＬＧＬＬ（配列番号３８９）、ＡＶＧＬＬＡＰＰ（配列番号３９０）、ＬＬＡＰＳＨＲＡ（配列番号３９１）、および／またはＰＡＧＬＷＬＤＰ（配列番号３９２）を含む。
【０１００】
いくつかの実施形態では、ＣＭは、アミノ酸配列ＩＳＳＧＬＳＳ（配列番号３７６）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、アミノ酸配列ＱＮＱＡＬＲＭＡ（配列番号３７７）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、アミノ酸配列ＡＱＮＬＬＧＭＶ（配列番号３７８）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、アミノ酸配列ＳＴＦＰＦＧＭＦ（配列番号３７９）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、アミノ酸配列ＰＶＧＹＴＳＳＬ（配列番号３８０）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、アミノ酸配列ＤＷＬＹＷＰＧＩ（配列番号３８１）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、アミノ酸配列ＩＳＳＧＬＬＳＳ（配列番号３８２）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、アミノ酸配列ＬＫＡＡＰＲＷＡ（配列番号３８３）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、アミノ酸配列ＧＰＳＨＬＶＬＴ（配列番号３８４）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、アミノ酸配列ＬＰＧＧＬＳＰＷ（配列番号３８５）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、アミノ酸配列ＭＧＬＦＳＥＡＧ（配列番号３８６）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、アミノ酸配列ＳＰＬＰＬＲＶＰ（配列番号３８７）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、アミノ酸配列ＲＭＨＬＲＳＬＧ（配列番号３８８）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、アミノ酸配列ＬＡＡＰＬＧＬＬ（配列番号３８９）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、アミノ酸配列ＡＶＧＬＬＡＰＰ（配列番号３９０）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、アミノ酸配列ＬＬＡＰＳＨＲＡ（配列番号３９１）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、アミノ酸配列ＰＡＧＬＷＬＤＰ（配列番号３９２）を含む。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、ＣＭはトロンビンの基質である。いくつかの実施形態では、ＣＭはトロンビンの基質であり、配列ＧＰＲＳＦＧＬ（配列番号３９３）またはＧＰＲＳＦＧ（配列番号３９４）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、アミノ酸配列ＧＰＲＳＦＧＬ（配列番号３９３）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、アミノ酸配列ＧＰＲＳＦＧ（配列番号３９４）を含む。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、ＣＭは、ＮＴＬＳＧＲＳＥＮＨＳＧ（配列番号３９５）；ＮＴＬＳＧＲＳＧＮＨＧＳ（配列番号３９６）；ＴＳＴＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号３９７）；ＴＳＧＲＳＡＮＰ（配列番号３９８）；ＶＡＧＲＳＭＲＰ（配列番号３９９）；ＶＶＰＥＧＲＲＳ（配列番号４００）；ＩＬＰＲＳＰＡＦ（配列番号４０１）；ＭＶＬＧＲＳＬＬ（配列番号４０２）；ＱＧＲＡＩＴＦＩ（配列番号４０３）；ＳＰＲＳＩＭＬＡ（配列番号４０４）；およびＳＭＬＲＳＭＰＬ（配列番号４０５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、ＣＭは、アミノ酸配列ＮＴＬＳＧＲＳＥＮＨＳＧ（配列番号３９５）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、アミノ酸配列ＮＴＬＳＧＲＳＧＮＨＧＳ（配列番号３９６）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、アミノ酸配列ＴＳＴＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号３９７）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、アミノ酸配列ＴＳＧＲＳＡＮＰ（配列番号３９８）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、アミノ酸配列ＶＡＧＲＳＭＲＰ（配列番号３９９）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、アミノ酸配列ＶＶＰＥＧＲＲＳ（配列番号４００）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、アミノ酸配列ＩＬＰＲＳＰＡＦ（配列番号４０１）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、アミノ酸配列ＭＶＬＧＲＳＬＬ（配列番号４０２）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、アミノ酸配列ＱＧＲＡＩＴＦＩ（配列番号４０３）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、アミノ酸配列ＳＰＲＳＩＭＬＡ（配列番号４０４）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、アミノ酸配列ＳＭＬＲＳＭＰＬ（配列番号４０５）を含む。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、ＣＭは、好中球エラスターゼの基質である。いくつかの実施形態では、ＣＭは、セリンプロテアーゼの基質である。いくつかの実施形態では、ＣＭは、ｕＰＡの基質である。いくつかの実施形態では、ＣＭは、レグマインの基質である。いくつかの実施形態では、ＣＭは、マトリプターゼの基質である。いくつかの実施形態では、ＣＭは、システインプロテアーゼの基質である。いくつかの実施形態では、ＣＭは、カテプシンなどのシステインプロテアーゼの基質である。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、ＣＭは、ＣＭ１−ＣＭ２基質であり、配列ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号４０６）；ＩＳＳＧＬＬＳＳＧＧＳＧＧＳＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号４０７）；ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＴＳＴＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号４０８）；ＴＳＴＳＧＲＳＡＮＰＲＧＧＧＡＶＧＬＬＡＰＰ（配列番号４０９）；ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＧＧＴＳＴＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号４１０）；ＴＳＴＳＧＲＳＡＮＰＲＧＧＧＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ（配列番号４１１）；ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号４１２）；ＬＳＧＲＳＤＮＨＧＧＡＶＧＬＬＡＰＰ（配列番号４１３）；ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＧＧＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号４１４）；ＬＳＧＲＳＤＮＨＧＧＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ（配列番号４１５）；ＬＳＧＲＳＤＮＨＧＧＳＧＧＳＩＳＳＧＬＬＳＳ（配列番号４１６）；ＬＳＧＲＳＧＮＨＧＧＳＧＧＳＩＳＳＧＬＬＳＳ（配列番号４１７）；ＩＳＳＧＬＬＳＳＧＧＳＧＧＳＬＳＧＲＳＧＮＨ（配列番号４１８）；ＬＳＧＲＳＤＮＨＧＧＳＧＧＳＱＮＱＡＬＲＭＡ（配列番号４１９）；ＱＮＱＡＬＲＭＡＧＧＳＧＧＳＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号４２０）；ＬＳＧＲＳＧＮＨＧＧＳＧＧＳＱＮＱＡＬＲＭＡ（配列番号４２１）；ＱＮＱＡＬＲＭＡＧＧＳＧＧＳＬＳＧＲＳＧＮＨ（配列番号４２２）；ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＧＮＨ（配列番号４２３）；ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号６８０）；ＡＶＧＬＬＡＰＰＴＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号６８１）；ＡＶＧＬＬＡＰＰＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号６８２）；ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＤＨ（配列番号６８３）；ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＩＨ（配列番号６８４）；ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＱＨ（配列番号６８５）；ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＴＨ（配列番号６８６）；ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＹＨ（配列番号６８７）；ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＰ（配列番号６８８）；ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＡＮＰ（配列番号６８９）；ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＡＮＩ（配列番号６９０）；ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＤＨ（配列番号６９１）；ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＩＨ（配列番号６９２）；ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＱＨ（配列番号６９３）；ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＴＨ（配列番号６９４）；ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＹＨ（配列番号６９５）；ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＮＰ（配列番号６９６）；ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＡＮＰ（配列番号６９７）；ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＡＮＩ（配列番号６９８）；ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＩ（配列番号７１３）；ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＮＩ（配列番号７１４）；ＧＬＳＧＲＳＤＮＨＧＧＡＶＧＬＬＡＰＰ（配列番号８０７）；および／またはＧＬＳＧＲＳＤＮＨＧＧＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ（配列番号８０８）を含む。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、ＣＭ１−ＣＭ２基質は配列ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号４０６）を含み、これは本明細書では基質２００１とも称される。いくつかの実施形態では、ＣＭ１−ＣＭ２基質は配列ＩＳＳＧＬＬＳＳＧＧＳＧＧＳＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号４０７）を含み、これは本明細書では基質１００１／ＬＰ’／０００１とも称される。このＣＭ１−ＣＭ２基質で使用されるＬＰ’は、アミノ酸配列ＧＧＳＧＧＳ（配列番号１０３７）である。いくつかの実施形態では、ＣＭ１−ＣＭ２基質は配列ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＴＳＴＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号４０８）を含み、これは本明細書では基質２０１５および／または基質１００４／ＬＰ’／０００３とも称される。このＣＭ１−ＣＭ２基質で使用されるＬＰ’は、アミノ酸配列ＧＧである。いくつかの実施形態では、ＣＭ１−ＣＭ２基質は配列ＴＳＴＳＧＲＳＡＮＰＲＧＧＧＡＶＧＬＬＡＰＰ（配列番号４０９）を含み、これは本明細書では基質０００３／ＬＰ’／１００４とも称される。このＣＭ１−ＣＭ２基質で使用されるＬＰ’は、アミノ酸配列ＧＧである。いくつかの実施形態では、ＣＭ１−ＣＭ２基質は配列ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＧＧＴＳＴＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号４１０）を含み、これは本明細書では基質１００３／ＬＰ’／０００３とも称される。このＣＭ１−ＣＭ２基質で使用されるＬＰ’は、アミノ酸配列ＧＧである。いくつかの実施形態では、ＣＭ１−ＣＭ２基質は配列ＴＳＴＳＧＲＳＡＮＰＲＧＧＧＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ（配列番号４１１）を含み、これは本明細書では基質０００３／ＬＰ’／１００３とも称される。このＣＭ１−ＣＭ２基質で使用されるＬＰ’は、アミノ酸配列ＧＧである。いくつかの実施形態では、ＣＭ１−ＣＭ２基質は配列ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号４１２）を含み、これは本明細書では基質３００１および／または基質１００４／ＬＰ’／０００１とも称される。このＣＭ１−ＣＭ２基質で使用されるＬＰ’は、アミノ酸配列ＧＧである。いくつかの実施形態では、ＣＭ１−ＣＭ２基質は配列ＬＳＧＲＳＤＮＨＧＧＡＶＧＬＬＡＰＰ（配列番号４１３）を含み、これは本明細書では基質０００１／ＬＰ’／１００４とも称される。このＣＭ１−ＣＭ２基質で使用されるＬＰ’は、アミノ酸配列ＧＧである。いくつかの実施形態では、ＣＭ１−ＣＭ２基質は配列ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＧＧＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号４１４）を含み、これは本明細書では基質１００３／ＬＰ’／０００１とも称される。このＣＭ１−ＣＭ２基質で使用されるＬＰ’は、アミノ酸配列ＧＧである。いくつかの実施形態では、ＣＭ１−ＣＭ２基質は配列ＬＳＧＲＳＤＮＨＧＧＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ（配列番号４１５）を含み、これは本明細書では基質００１／ＬＰ’／１００３とも称される。このＣＭ１−ＣＭ２基質で使用されるＬＰ’は、アミノ酸配列ＧＧである。いくつかの実施形態では、ＣＭ１−ＣＭ２基質は配列ＬＳＧＲＳＤＮＨＧＧＳＧＧＳＩＳＳＧＬＬＳＳ（配列番号４１６）を含み、これは本明細書では基質０００１／ＬＰ’／１００１とも称される。このＣＭ１−ＣＭ２基質で使用されるＬＰ’は、アミノ酸配列ＧＧＳＧＧＳ（配列番号１０３７）である。いくつかの実施形態では、ＣＭ１−ＣＭ２基質は配列ＬＳＧＲＳＧＮＨＧＧＳＧＧＳＩＳＳＧＬＬＳＳ（配列番号４１７）を含み、これは本明細書では基質０００２／ＬＰ’／１００１とも称される。このＣＭ１−ＣＭ２基質で使用されるＬＰ’は、アミノ酸配列ＧＧＳＧＧＳ（配列番号１０３７）である。いくつかの実施形態では、ＣＭ１−ＣＭ２基質は配列ＩＳＳＧＬＬＳＳＧＧＳＧＧＳＬＳＧＲＳＧＮＨ（配列番号４１８）を含み、これは本明細書では基質１００１／ＬＰ’／０００２とも称される。このＣＭ１−ＣＭ２基質で使用されるＬＰ’は、アミノ酸配列ＧＧＳＧＧＳ（配列番号１０３７）である。いくつかの実施形態では、ＣＭ１−ＣＭ２基質は配列ＬＳＧＲＳＤＮＨＧＧＳＧＧＳＱＮＱＡＬＲＭＡ（配列番号４１９）を含み、これは本明細書では基質０００１／ＬＰ’／１００２とも称される。このＣＭ１−ＣＭ２基質で使用されるＬＰ’は、アミノ酸配列ＧＧＳＧＧＳ（配列番号１０３７）である。いくつかの実施形態では、ＣＭ１−ＣＭ２基質は配列ＱＮＱＡＬＲＭＡＧＧＳＧＧＳＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号４２０）を含み、これは本明細書では基質１００２／ＬＰ’／０００１とも称される。このＣＭ１−ＣＭ２基質で使用されるＬＰ’は、アミノ酸配列ＧＧＳＧＧＳ（配列番号１０３７）である。いくつかの実施形態では、ＣＭ１−ＣＭ２基質は配列ＬＳＧＲＳＧＮＨＧＧＳＧＧＳＱＮＱＡＬＲＭＡ（配列番号４２１）を含み、これは本明細書では基質０００２／ＬＰ’／１００２とも称される。このＣＭ１−ＣＭ２基質で使用されるＬＰ’は、アミノ酸配列ＧＧＳＧＧＳ（配列番号１０３７）である。いくつかの実施形態では、ＣＭ１−ＣＭ２基質は配列ＱＮＱＡＬＲＭＡＧＧＳＧＧＳＬＳＧＲＳＧＮＨ（配列番号４２２）を含み、これは本明細書では基質１００２／ＬＰ’／０００２とも称される。このＣＭ１−ＣＭ２基質で使用されるＬＰ’は、アミノ酸配列ＧＧＳＧＧＳ（配列番号１０３７）である。いくつかの実施形態では、ＣＭ１−ＣＭ２基質は配列ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＧＮＨ（配列番号４２３）を含み、これは本明細書では基質２００２とも称される。いくつかの実施形態では、ＣＭ１−ＣＭ２基質は配列ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号６８０）を含み、これは本明細書では基質２００３とも称される。いくつかの実施形態では、ＣＭ１−ＣＭ２基質は配列ＡＶＧＬＬＡＰＰＴＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号６８１）を含み、これは本明細書では基質２００４とも称される。いくつかの実施形態では、ＣＭ１−ＣＭ２基質は配列ＡＶＧＬＬＡＰＰＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号６８２）を含み、これは本明細書では基質２００５とも称される。いくつかの実施形態では、ＣＭ１−ＣＭ２基質は配列ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＤＨ（配列番号６８３）を含み、これは本明細書では基質２００６とも称される。いくつかの実施形態では、ＣＭ１−ＣＭ２基質は配列ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＩＨ（配列番号６８４）を含み、これは本明細書では基質２００７とも称される。いくつかの実施形態では、ＣＭ１−ＣＭ２基質は配列ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＱＨ（配列番号６８５）を含み、これは本明細書では基質２００８とも称される。いくつかの実施形態では、ＣＭ１−ＣＭ２基質は配列ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＴＨ（配列番号６８６）を含み、これは本明細書では基質２００９とも称される。いくつかの実施形態では、ＣＭ１−ＣＭ２基質は配列ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＹＨ（配列番号６８７）を含み、これは本明細書では基質２０１０とも称される。いくつかの実施形態では、ＣＭ１−ＣＭ２基質は配列ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＰ（配列番号６８８）を含み、これは本明細書では基質２０１１とも称される。いくつかの実施形態では、ＣＭ１−ＣＭ２基質は配列ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＡＮＰ（配列番号６８９）を含み、これは本明細書では基質２０１２とも称される。いくつかの実施形態では、ＣＭ１−ＣＭ２基質は配列ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＡＮＩ（配列番号６９０）を含み、これは本明細書では基質２０１３とも称される。いくつかの実施形態では、ＣＭ１−ＣＭ２基質は配列ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＤＨ（配列番号６９１）を含み、これは本明細書では基質３００６とも称される。いくつかの実施形態では、ＣＭ１−ＣＭ２基質は配列ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＩＨ（配列番号６９２）を含み、これは本明細書では基質３００７とも称される。いくつかの実施形態では、ＣＭ１−ＣＭ２基質は配列ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＱＨ（配列番号６９３）を含み、これは本明細書では基質３００８とも称される。いくつかの実施形態では、ＣＭ１−ＣＭ２基質は配列ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＴＨ（配列番号６９４）を含み、これは本明細書では基質３００９とも称される。いくつかの実施形態では、ＣＭ１−ＣＭ２基質は配列ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＹＨ（配列番号６９５）を含み、これは本明細書では基質３０１０とも称される。いくつかの実施形態では、ＣＭ１−ＣＭ２基質は配列ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＮＰ（配列番号６９６）を含み、これは本明細書では基質３０１１とも称される。いくつかの実施形態では、ＣＭ１−ＣＭ２基質は配列ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＡＮＰ（配列番号６９７）を含み、これは本明細書では基質３０１２とも称される。いくつかの実施形態では、ＣＭ１−ＣＭ２基質は配列ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＡＮＩ（配列番号６９８）を含み、これは本明細書では基質３０１３とも称される。いくつかの実施形態では、ＣＭ１−ＣＭ２基質は配列ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＩ（配列番号７１３）を含み、これは本明細書では基質２０１４とも称される。いくつかの実施形態では、ＣＭ１−ＣＭ２基質は配列ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＮＩ（配列番号７１４）を含み、これは本明細書では基質３０１４とも称される。いくつかの実施形態では、ＣＭ１−ＣＭ２基質は配列ＧＬＳＧＲＳＤＮＨＧＧＡＶＧＬＬＡＰＰ（配列番号８０７）を含み、これは本明細書では基質０００１／ＬＰ’／１００４とも称される。このＣＭ１−ＣＭ２基質で使用されるＬＰ’は、アミノ酸配列ＧＧである。いくつかの実施形態では、ＣＭ１−ＣＭ２基質は配列ＧＬＳＧＲＳＤＮＨＧＧＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ（配列番号８０８）を含み、これは本明細書では基質０００１／ＬＰ’／１００３とも称される。このＣＭ１−ＣＭ２基質で使用されるＬＰ’は、アミノ酸配列ＧＧである。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、ＣＭは少なくとも２つのプロテアーゼの基質である。いくつかの実施形態では、各プロテアーゼは、表４に示すものからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＭは少なくとも２つのプロテアーゼの基質であり、プロテアーゼの１つはＭＭＰ、トロンビン、好中球エラスターゼ、システインプロテアーゼ、ｕＰＡ、レグマインおよびマトリプターゼからなる群から選択され、他のプロテアーゼは表４に示すものからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＭは、ＭＭＰ、トロンビン、好中球エラスターゼ、システインプロテアーゼ、ｕＰＡ、レグマインおよびマトリプターゼからなる群から選択される少なくとも２つのプロテアーゼの基質である。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、少なくとも第１のＣＭおよび第２のＣＭを含む。いくつかの実施形態では、第１のＣＭおよび第２のＣＭは、それぞれ１５アミノ酸程度の長さのポリペプチドである。いくつかの実施形態では、切断されていない状態である活性化可能抗体中の第１のＣＭおよび第２のＣＭは、以下のようにＮ末端からＣ末端への構造的配置を有する：ＭＭ−ＣＭ１−ＣＭ２−ＡＢまたはＡＢ−ＣＭ２−ＣＭ１−ＭＭ。いくつかの実施形態では、第１のＣＭおよび第２のＣＭの少なくとも一方は、ＭＭＰ、トロンビン、好中球エラスターゼ、システインプロテアーゼ、ｕＰＡ、レグマイン、およびマトリプターゼからなる群から選択されるプロテアーゼの基質として機能するポリペプチドである。いくつかの実施形態では、第１のＣＭは、標的組織中のＭＭＰ、トロンビン、好中球エラスターゼ、システインプロテアーゼ、ｕＰＡ、レグマイン、およびマトリプターゼからなる群から選択される第１の切断剤によって切断され、第２のＣＭは、標的組織中の２番目の切断剤によって切断される。いくつかの実施形態では、他のプロテアーゼは、表４に示されるものからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第１の切断剤および第２の切断剤は、ＭＭＰ、トロンビン、好中球エラスターゼ、システインプロテアーゼ、ｕＰＡ、レグマイン、およびマトリプターゼからなる群から選択される同じプロテアーゼであり、第１のＣＭおよび第２のＣＭはその酵素の異なる基質である。いくつかの実施形態では、第１の切断剤および第２の切断剤は、表４に示されるものからなる群から選択される同じプロテアーゼである。いくつかの実施形態では、第１の切断剤および第２の切断剤は異なるプロテアーゼである。いくつかの実施形態では、第１の切断剤および第２の切断剤は、標的組織に共局在する。いくつかの実施形態では、第１のＣＭおよび第２のＣＭは、標的組織中の少なくとも１つの切断剤によって切断される。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、あるプロテアーゼがＣＭを切断した後に、活性化抗体が、活性化されているかまたは切断されている状態で、ＬＰ２および／またはＣＭ配列の少なくとも一部分を含む軽鎖アミノ酸配列を含むように、活性化可能抗体がそのプロテアーゼに曝露され、切断される。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、１つ以上の剤に結合される。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、剤は、毒素またはその断片である。いくつかの実施形態では、剤は、微小管阻害剤である。いくつかの実施形態では、剤は、核酸損傷剤である。いくつかの実施形態では、剤は、ドラスタチンまたはその誘導体、オーリスタチンまたはその誘導体、メイタンシノイドまたはその誘導体、デュオカルマイシンまたはその誘導体、カリケアマイシンまたはその誘導体、およびピロロベンゾジアゼピンまたはその誘導体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、剤は、オーリスタチンＥまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、剤は、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。いくつかの実施形態では、剤は、モノメチルオーリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）である。いくつかの実施形態では、剤は、ＤＭ１およびＤＭ４からなる群から選択されるメイタンシノイドである。いくつかの実施形態では、剤は、メイタンシノイドＤＭ４である。いくつかの実施形態では、剤は、デュオカルマイシンである。いくつかの実施形態では、剤は、リンカーを介してＡＢに結合される。いくつかの実施形態では、それにより剤がＡＢに結合されるリンカーは、ＳＰＤＢ部分、ｖｃ部分、またはＰＥＧ２−ｖｃ部分を含む。いくつかの実施形態では、ＡＢに結合されるリンカーおよび毒素は、ＳＰＤＢ−ＤＭ４部分、ｖｃ−ＭＭＡＤ部分、ｖｃ−ＭＭＡＥ部分、ｖｃ−デュオカルマイシン、またはＰＥＧ２−ｖｃ−ＭＭＡＤ部分を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは切断可能なリンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは切断不能リンカーである。いくつかの実施形態では、剤は、検出可能な部分である。いくつかの実施形態では、検出可能な部分は診断剤である。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、ＡＢまたは活性化可能抗体のＡＢに結合される剤は治療剤である。いくつかの実施形態では、剤は、抗腫瘍剤である。いくつかの実施形態では、剤は、毒素またはその断片である。本明細書で使用される場合、毒素の断片は、毒性活性を保持する断片である。いくつかの実施形態では、剤は、切断可能リンカーを介してＡＢに結合される。いくつかの実施形態では、剤は、少なくとも１つのＣＭ１−ＣＭ２基質配列を含むリンカーを介してＡＢに結合される。いくつかの実施形態では、剤は、切断できないリンカーを介してＡＢに結合される。いくつかの実施形態では、剤は、細胞内またはリソソーム環境で切断可能であるリンカーを介してＡＢに結合される。いくつかの実施形態では、剤は、微小管阻害剤である。いくつかの実施形態では、剤は、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡ切断剤、ＤＮＡ架橋剤、ＤＮＡインターカレーター、または他のＤＮＡ損傷剤などの核酸損傷剤である。いくつかの実施形態では、剤は、表５に列挙されている群から選択される剤である。いくつかの実施形態では、剤は、ドラスタチンである。いくつかの実施形態では、剤は、オーリスタチンまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、剤は、オーリスタチンＥまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、剤は、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。いくつかの実施形態では、剤は、モノメチルオーリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）である。いくつかの実施形態では、剤は、メイタンシノイドまたはメイタンシノイド誘導体である。いくつかの実施形態では、剤は、ＤＭ１またはＤＭ４である。いくつかの実施形態では、剤は、デュオカルマイシンまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、剤は、カリケアマイシンまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、剤は、ピロロベンゾジアゼピンである。いくつかの実施形態では、剤は、ピロロベンゾジアゼピン二量体である。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、剤の１つ以上の等価物に結合される。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、剤の１当量に結合される。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０を超える当量の剤に結合される。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、同種の同等の数の結合された剤を有する活性化可能抗体の混合物の一部分である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、不均一の同等の数の結合された剤を有する活性化可能抗体の混合物の一部分である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体の混合物は、各活性化可能抗体に結合された剤の平均数が、０〜１、１〜２、２〜３、３〜４、４〜５、５〜６、６〜７、７〜８、８〜９、９〜１０、および１０以上であるようなものである。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体の混合物は、各活性化可能抗体に結合された剤の平均数が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上であるようなものである。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、リジンおよび／またはシステイン残基の数が活性化可能抗体の元のアミノ酸配列に対して増加または減少されるように、１つ以上の部位特異的アミノ酸配列修飾を含み、このため、いくつかの実施形態では、活性化可能抗体に結合され得る剤の数を対応して増加もしくは減少させ、またはいくつかの実施形態では、部位特異的様式で活性化可能抗体への剤の結合を制限する。いくつかの実施形態では、改変された活性化可能抗体は、部位特異的な様式で１つ以上の非天然アミノ酸により改変され、このため、いくつかの実施形態では、剤の結合を非天然アミノ酸の部位のみに制限する。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、剤は、抗炎症剤である。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、検出可能な部分も含む。いくつかの実施形態では、検出可能な部分は診断剤である。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、それに治療剤が結合される活性化可能抗体である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、剤に結合されない。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は検出可能な標識を含む。いくつかの実施形態では、検出可能な標識はＡＢに位置付けられる。いくつかの実施形態では、対象または試料中の活性化可能抗体のレベルを測定することは、活性化抗体に特異的に結合する二次試薬を使用して達成され、この試薬は検出可能な標識を含む。いくつかの実施形態では、二次試薬は、検出可能な標識を含む抗体である。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、検出可能な標識としては、イメージング剤、造影剤、酵素、蛍光標識、発色団、色素、１つ以上の金属イオン、またはリガンドベースの標識が挙げられる。いくつかの実施形態では、イメージング剤は、放射性同位元素を含む。いくつかの実施形態では、放射性同位体は、インジウムまたはテクネチウムである。いくつかの実施形態では、造影剤は、ヨウ素、ガドリニウムまたは酸化鉄を含む。いくつかの実施形態では、酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはβ−ガラクトシダーゼを含む。いくつかの実施形態では、蛍光標識は、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、修飾赤色蛍光タンパク質（ｍＲＦＰ）、赤色蛍光タンパク質ｔｄｉｍｅｒ２（ＲＦＰ  ｔｄｉｍｅｒ２）、ＨＣＲＥＤ、またはユーロピウム誘導体を含む。いくつかの実施形態では、発光標識は、Ｎ−メチルアクリジウム誘導体である。これらの方法のいくつかの実施形態では、標識は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６８０またはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０などのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）標識を含む。いくつかの実施形態では、リガンドをベースにした標識は、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンまたは１つ以上のハプテンを含む。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、シグナルペプチドも含む。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、スペーサーを介して活性化可能抗体に結合される。いくつかの実施形態では、スペーサーは、シグナルペプチドの非存在下で活性化可能抗体に結合される。いくつかの実施形態では、スペーサーは、活性化可能抗体のＭＭに直接連結される。いくつかの実施形態では、スペーサーは、スペーサー−ＭＭ−ＣＭ−ＡＢのＮ末端からＣ末端への構造的配置で、活性化可能抗体のＭＭに直接連結される。活性化可能抗体のＭＭのＮ末端に直接連結されるスペーサーの例は、ＱＧＱＳＧＱ（配列番号４２４）である。活性化可能抗体のＭＭのＮ末端に直接連結されるスペーサーの他の例としては、ＱＧＱＳＧＱＧ（配列番号６４５）、ＱＧＱＳＧ（配列番号６４６）、ＱＧＱＳ（配列番号６４７）、ＱＧＱ（配列番号６４８）、ＱＧ（配列番号６４９）、およびＱが挙げられる。活性化可能抗体のＭＭのＮ末端に直接連結されるスペーサーの他の例としては、ＧＱＳＧＱＧ（配列番号６６６）、ＱＳＧＱＧ（配列番号６６７）、ＳＧＱＧ（配列番号６６８）、ＧＱＧ（配列番号６６９）、およびＧが挙げられる。いくつかの実施形態では、いずれのスペーサーも、ＭＭのＮ末端に連結されない。いくつかの実施形態では、スペーサーは、少なくともアミノ酸配列ＱＧＱＳＧＱ（配列番号４２４）を含む。いくつかの実施形態では、スペーサーとしては、少なくともアミノ酸配列ＱＧＱＳＧＱＧ（配列番号６４５）が挙げられる。いくつかの実施形態では、スペーサーは、少なくともアミノ酸配列ＱＧＱＳＧ（配列番号６４６）を含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、少なくともアミノ酸配列ＱＧＱＳ（配列番号６４７）を含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、少なくともアミノ酸配列ＱＧＱ（配列番号６４８）を含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、少なくともアミノ酸配列ＱＧ（配列番号６４９）を含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、少なくともアミノ酸残基Ｑを含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、少なくともアミノ酸配列ＧＱＳＧＱＧ（配列番号６６６）を含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、少なくともアミノ酸配列ＱＳＧＱＧ（配列番号６６７）を含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、少なくともアミノ酸配列ＳＧＱＧ（配列番号６６８）を含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、少なくともアミノ酸配列ＧＱＧ（配列番号６６９）を含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、少なくともアミノ酸配列Ｇを含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは存在しない。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体および／または結合型活性化可能抗体は、単一特異性である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体および／または結合型活性化可能抗体は、例えば非限定的な例として、二重特異性または三機能性などの多重特異性である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体および／または結合型活性化可能抗体は、プロ二重特異性Ｔ細胞エンガージャー（ＢＩＴＥ）分子の一部として配合される。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体および／または結合型活性化可能抗体は、プロキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）改変Ｔ細胞または他の操作された受容体の一部として配合される。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体またはその抗原結合断片は、多重特異性活性化可能抗体またはその抗原結合断片に組み込まれ、多重特異性活性化可能抗体の少なくとも１つのアームが標的を特異的に結合する。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体またはその抗原結合断片は、二重特異性抗体またはその抗原結合断片に組み込まれ、二重特異性活性化可能抗体の少なくとも１つのアームが標的を特異的に結合する。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、多重特異性活性化可能抗体および／または結合型多重特異性活性化可能抗体である。多重特異性活性化可能抗体および／または結合型多重特異性活性化可能抗体は、少なくとも（ｉ）第１のマスキング部分（ＭＭ１）の連結が、第１の標的を結合するＡＢ１の能力を低下させるように、ＭＭ１に連結される第１の標的を特異的に結合する第１の抗体またはその抗原結合断片（ＡＢ１）、および（ｉｉ）第２のマスキング部分（ＭＭ２）ＭＭ２の連結が、第２の標的を結合するＡＢ２の能力を低下させるように、ＭＭ２に連結される第２の標的を特異的に結合する第２の抗体またはその抗原結合断片（ＡＢ２）を含む。いくつかの実施形態では、ＭＭ１および／またはＭＭ２は、プロテアーゼ、例えば、対象の治療部位で第１の標的、第２の標的、または第１の標的と第２の標的との両方と共局在するプロテアーゼ、の基質を含む配列を介して、それぞれの抗体またはその抗原結合断片（ＡＢ１またはＡＢ２）に連結される。いくつかの実施形態では、第１の標的、第２の標的、または第１の標的と第２の標的の両方は、例えば、ヒト標的などの哺乳動物標的である。好適なＭＭ１、ＭＭ２、ＣＭ１、および／またはＣＭ２としては、本開示の組成物および方法で使用される活性化可能抗体および／または結合型活性化可能抗体に関連して上述したＭＭおよび／またはＣＭのいずれかが挙げられる。
【０１２３】
非限定的な例として、活性化可能抗体のＡＢは、表１に列挙される任意の標的の結合パートナーである。非限定的な例として、多重特異性活性化可能抗体のＡＢ１、ＡＢ２、またはＡＢ１とＡＢ２の両方は、表１に列挙される任意の標的の結合パートナーである。
【表１】
2020530554.tif 000003
2020530554.tif 000004
【０１２４】
非限定的な例として、抗体もしくは抗原結合断片、および／もしくは活性化可能抗体のＡＢは、表２に列挙される抗体であるか、またはそれらに由来する。非限定的な例として、活性化可能抗体のＡＢ、多重特異性活性化可能抗体のＡＢ１、および／または多重特異性活性化可能抗体のＡＢ２は、表２に列挙される抗体であるか、またはそれらに由来する。
【表２】
2020530554.tif 000005
2020530554.tif 000006
【０１２５】
本開示はまた、少なくとも１つの活性化可能抗体、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体、またはそれらの組み合わせに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片を提供し、抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＳＹＧＭＳ（配列番号４３８）を含む可変重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）；アミノ酸配列ＴＩＳＰＳＧＩＹＴＹＹＰＶＴＶＫＧ（配列番号４３９）を含む可変重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）；アミノ酸配列ＨＨＰＮＹＧＳＴＹＬＹＹＩＤＹ（配列番号４４０）を含む可変重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）；アミノ酸配列ＫＳＳＱＳＶＦＳＳＳＮＱＫＮＹＬＡ（配列番号４４１）を含む可変軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）；アミノ酸配列ＷＡＦＴＲＥＳ（配列番号４４２）を含む可変軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）；およびアミノ酸配列ＹＱＹＬＳＳＬＴ（配列番号４４３）を含む可変軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）を含む。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４２９のアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４２９のアミノ酸配列を含む可変重鎖、および配列番号４３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４２９のアミノ酸配列を含む可変重鎖と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４２９のアミノ酸配列を含む可変重鎖と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一であるアミノ酸配列、および配列番号４３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１３２】
本開示は、本明細書で提供される方法のいずれかを実施するためのキットも提供する。
【０１３３】
本開示は、組織および／または生体液試料を含む、生体試料中での活性化および活性化可能抗体治療活性化の他の特性を定性的および／または定量的に分析するための方法およびキットを提供する。
一実施形態では、本発明は、以下を含むキットを提供する：
（ｉ）活性化可能抗体の標準曲線試薬；
（ｉｉ）活性化された活性化可能抗体の標準曲線試薬；
（ｉｉｉ）活性化可能抗体に対する結合特異性を有する抗ｉｄ一次抗体またはその抗原結合断片。いくつかの実施形態では、抗イディオタイプ（ｉｄ）抗体またはその抗原結合断片は、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３からなる群から選択されるＶＬ  ＣＤＲに対する結合特異性を有する。他の実施形態では、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片は、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３からなる群から選択されるＶＨ  ＣＤＲに対する結合特異性を有する。いくつかの実施形態では、キットは、２つ以上の抗イディオタイプ抗体種（またはその抗原結合断片）の組み合わせを含む。標準曲線試薬は、溶液中において比較的純粋な活性化可能抗体および活性化された活性化可能抗体であり、希釈の準備ができているか、または固体の形態である。
【０１３４】
活性化可能抗体は典型的には、少なくとも（ｉ）標的を特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片（ＡＢ）；（ｉｉ）活性化可能抗体が切断されていない状態にあるときに、標的へのＡＢの結合を阻害するように、ＡＢに連結されるマスキング部分（ＭＭ）、および（ｉｉｉ）ＡＢに連結される切断可能部分（ＣＭ）であって、ＣＭはプロテアーゼの基質として機能するポリペプチドである、ＣＭ、を含む。活性化可能抗体は一般に、ＣＭの基質が、それが基質として機能するプロテアーゼの存在下で活性化され、プロテアーゼが、ＣＭの基質を切断する。生体試料中の活性化可能抗体の特性、例えば、生体試料中の活性化可能抗体の活性化レベル、生体試料中の活性化された、すなわち切断された活性化可能抗体および／または完全な、すなわち不活性化されている、活性化可能抗体の総量、またはそれらの任意の組み合わせまたは相関を、定性的および／または定量的に測定できることは有用である。こうした方法は、開発および／または治療用処置の任意の段階での活性化可能抗体および活性化可能抗体ベースの治療の有効性を監視するのに有用である。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法およびキットは、それを必要とする対象への投与前および／または治療計画中に活性化可能抗体および活性化可能抗体ベースの治療薬の有効性を試験して、投与期間全体および／または投与期間後の活性化可能抗体および活性化可能抗体ベースの治療薬の有効性を監視するのに有用である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法およびキットは、活性化可能抗体および活性化可能抗体ベースの治療薬の遡及的分析を提供するのに有用である。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、本開示は、キャピラリーをベースとした免疫アッセイプラットフォームを使用して、組織および／または血漿試料を含む、生体試料における活性化可能抗体治療活性化を定性的および／または定量的に分析するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料中の１つ以上の活性化可能抗体の活性化を定量化するために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料中のｉｎ  ｖｉｖｏでのプロテアーゼ活性をプロファイリング、層別化、または分類するために使用される。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、本開示は、標的を特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片（ＡＢ）、活性化可能抗体が切断されていない状態にあるときに、標的へのＡＢの結合を阻害するように、ＡＢの軽鎖に連結されるマスキング部分（ＭＭ）、および、ＡＢに連結される切断可能部分（ＣＭ）であって、プロテアーゼの基質として機能するポリペプチドであるＣＭ、を有する活性化可能抗体治療薬の活性化を定性的および／または定量的に分析するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法を使用して、少なくとも（ｉ）ＣＭが切断され、かつＭＭがＡＢの軽鎖に連結されない活性化された活性化可能抗体のレベル、および（ｉｉ）ＭＭおよびＣＭがＡＢの軽鎖に連結される完全な活性化可能抗体のレベルを定量化するか、またはさもなければ比較する。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、本開示は、標的を特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片（ＡＢ）、活性化可能抗体が切断されていない状態にあるときに、標的へのＡＢの結合を阻害するように、ＡＢの重鎖に連結されるマスキング部分（ＭＭ）、および、ＡＢに連結される切断可能部分（ＣＭ）であって、プロテアーゼの基質として機能するポリペプチドであるＣＭ、を有する活性化可能抗体治療薬の活性化を定性的および／または定量的に分析するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法を使用して、少なくとも（ｉ）ＣＭが切断され、かつＭＭがＡＢの重鎖に連結されない活性化された活性化可能抗体のレベル、および（ｉｉ）ＭＭおよびＣＭがＡＢの重鎖に連結される完全な活性化可能抗体のレベルを定量化するか、またはさもなければ比較する。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、本開示は、標的を特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片（ＡＢ）、活性化可能抗体が切断されていない状態にあるときに、ＭＭ１が標的へのＡＢの結合を阻害するように、ＡＢの軽鎖に連結される第１のマスキング部分（ＭＭ１）、軽鎖ＡＢに連結される第１の切断可能部分（ＣＭ１）であって、プロテアーゼの基質として機能するポリペプチドであるＣＭ１、活性化可能抗体が切断されていない状態にあるときに、ＭＭ２が標的へのＡＢの結合を阻害するように、ＡＢの重鎖に連結される第２のマスキング部分（ＭＭ２）、軽鎖ＡＢに連結される第２の切断可能部分（ＣＭ２）であって、プロテアーゼの基質として機能するポリペプチドであるＣＭ２、を有する活性化可能抗体治療薬の活性化を定性的および／または定量的に分析する方法を提供する。いくつかの実施形態では、これらの方法は、少なくとも（ｉ）ＭＭ１および／またはＭＭ２の少なくとも一方がＡＢに連結されないようにＣＭ１および／またはＣＭ２の少なくとも一方が切断されている、活性化された活性化可能抗体のレベル、ならびに（ｉｉ）ＭＭ１とＣＭ１および／またはＭＭ２とＣＭ２の少なくとも一方がＡＢに連結される完全な活性化可能抗体のレベルを定量化するか、またはそうでなければ比較するために使用される。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、本開示は、活性化可能抗体ベースの治療薬の活性化レベルを定量化する方法を提供し、この方法は、ｉ）少なくとも１つのキャピラリーまたはキャピラリーの集団に積層マトリックスおよび分離マトリックスを装填することと、ｉｉ）装填されたキャピラリーまたは装填されたキャピラリーの集団を生体試料と接触させることと、ｉｉｉ）各キャピラリー内の生体試料において、活性化された活性化可能抗体または活性化された活性化可能抗体ベースの治療薬から完全な活性化可能抗体または完全な活性化可能抗体ベースの治療薬を分離することと、ｉｖ）完全な活性化可能抗体または完全な活性化可能抗体ベースの治療薬および活性化された活性化可能抗体または完全な活性化可能抗体ベースの治療薬を各キャピラリー内に固定化することと、ｖ）少なくとも１つの活性化可能抗体、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体、またはそれらの組み合わせに特異的である少なくとも１つの検出可能な試薬で各キャピラリーを免疫プローブすることと、ｖｉ）各キャピラリーまたはキャピラリーの集団における検出可能な試薬のレベルを定量化すること、を含む。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、本開示は、活性化可能抗体ベースの治療薬の活性化レベルを定量化する方法を提供し、この方法は、ｉ）少なくとも１つのキャピラリーまたはキャピラリーの集団に積層マトリックスおよび分離マトリックスを装填することと、ｉｉ）装填されたキャピラリーまたは装填されたキャピラリーの集団を生体試料と接触させることと、ｉｉｉ）各キャピラリー内で生体試料の高分子量（ＭＷ）成分を、生体試料の低分子量（ＭＷ）成分から分離することと、ｉｖ）各キャピラリー内で高ＭＷ成分および低ＭＷ成分を固定することと、ｖ）少なくとも１つの活性化可能抗体、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体、またはそれらの組み合わせに特異的である少なくとも１つの検出可能な試薬で各キャピラリーを免疫プローブすることと、ｖｉ）各キャピラリーまたはキャピラリーの集団における検出可能な試薬のレベルを定量化すること、を含む。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、ステップｖ）の少なくとも１つの検出可能な試薬は、少なくとも１つの活性化可能抗体、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体、またはそれらの組み合わせに特異的な少なくとも第１の試薬、および第１の試薬に特異的に結合するか、または第１の試薬を認識する第２の試薬を含み、第２の試薬は検出可能な標識を含む。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、ステップｖｉ）は、各キャピラリーまたはキャピラリーの集団における検出可能な標識のレベルを定量化することを含む。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、ステップｉｉ）は、約１〜５００ｎｇの生体試料または約１〜５００ｎｇの生体試料の任意の値および／または範囲を装填することを含む。いくつかの実施形態では、ステップｉｉ）は、約５〜４０ｎｇの生体試料を装填することを含む。当業者であれば、生体試料の装填量は、本方法において使用される検出可能な試薬または第１の試薬の親和性に応じて変化する可能性があり、検出可能な試薬または第１の試薬の親和性が高いほど、生体試料の装填量は少なくなり得ることを理解するであろう。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、生体試料は、結果として分子量の分離をもたらすのに十分な量の１つ以上の緩衝液を使用して調製される。いくつかの実施形態では、生体試料は、結果として分子量の分離をもたらすのに十分な量の１つ以上のＳＤＳ含有緩衝液を使用して調製される。いくつかの実施形態では、生体試料は、生体試料中の活性化可能抗体および／または活性化可能抗体ベースの治療薬を含む、天然タンパク質の分離をもたらすのに十分な量の１つ以上の緩衝液を使用して調製される。いくつかの実施形態では、生体試料は、分離に好適な任意の試薬を使用して低減された試料の分離をもたらすのに十分な量の１つ以上の緩衝液を使用して調製される。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、ステップｉｉｉ）は、生体試料の高ＭＷ成分および低ＭＷ成分を固定化するためにＵＶ光を使用することを含む。いくつかの実施形態では、任意の好適な固定化剤は、本明細書で提供される方法のステップｉｉｉ）において用いられる。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、ステップｉｖ）の第１の試薬は、少なくとも１つの活性化可能抗体、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体、またはそれらの組み合わせに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片である。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、ステップｉｖ）の第２の試薬は、第１の試薬に特異的に結合する検出可能に標識された二次抗体である。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、ステップｉｖ）の第１の試薬は、少なくとも１つの活性化可能抗体、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体、またはそれらの組み合わせに特異的に結合する一次抗体またはその抗原結合断片であり、ステップｖ）の第２の試薬は、一次抗体またはその抗原結合断片に特異的に結合する検出可能に標識された二次抗体である。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、検出可能な標識は第２の試薬に結合される。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、検出可能な標識は蛍光標識であり、ステップｖｉ）は、各キャピラリーまたはキャピラリーの集団において化学発光のレベルを検出することを含む。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、検出可能な標識は西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）である。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、生体試料は体液である。いくつかの実施形態では、体液は、血液、血漿、または血清である。いくつかの実施形態では、生体試料は病変組織である。いくつかの実施形態では、病変組織は溶解物である。いくつかの実施形態では、疾患組織は腫瘍組織である。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、生体試料中の活性化された活性化可能抗体または活性化可能抗体ベースの治療薬、および完全な活性化可能抗体または活性化可能抗体ベースの治療薬の量を比較するために使用される。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体ベースの治療薬は、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体、またはそれらの任意の組み合わせである。
【０１５４】
本開示はまた、活性化可能抗体および／または活性化可能抗体ベースの治療薬に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を提供し、例えば、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体、またはそれらの任意の組み合わせなどである。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＳＹＧＭＳ（配列番号４３８）を含む可変重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）；アミノ酸配列ＴＩＳＰＳＧＩＹＴＹＹＰＶＴＶＫＧ（配列番号４３９）を含む可変重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）；アミノ酸配列ＨＨＰＮＹＧＳＴＹＬＹＹＩＤＹ（配列番号４４０）を含む可変重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）；アミノ酸配列ＫＳＳＱＳＶＦＳＳＳＮＱＫＮＹＬＡ（配列番号４４１）を含む可変軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）；アミノ酸配列ＷＡＦＴＲＥＳ（配列番号４４２）を含む可変軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）；およびアミノ酸配列ＹＱＹＬＳＳＬＴ（配列番号４４３）を含む可変軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）を含む。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４２９のアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４２９のアミノ酸配列を含む可変重鎖、および配列番号４３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４４４のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４４５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４４４のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号４４５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【０１６２】
本明細書で提供される方法は、活性化可能抗体、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、および／または結合型多重特異性活性化可能抗体の定量化に有用である。
【０１６３】
活性化可能抗体および／または結合型活性化可能抗体としては、マスキング部分（ＭＭ）に連結される標的を特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片（ＡＢ）が挙げられ、ＭＭの連結が標的に結合する抗体またはその抗原結合断片の能力を低下させるようにする。いくつかの実施形態では、ＭＭは、プロテアーゼ、例えば、対象の治療部位において標的と共局在するプロテアーゼ、の基質を含む配列を介して連結される。いくつかの実施形態では、標的は、例えばヒト標的などの哺乳動物標的である。
【０１６４】
多重特異性活性化可能抗体および／または結合型多重特異性活性化可能抗体は、少なくとも（ｉ）第１のマスキング部分（ＭＭ１）の連結が第１の標的を結合する第１の抗体またはその抗原結合断片（ＡＢ１）の能力を低下させるように、ＭＭ１に連結された第１の標的を特異的に結合するＡＢ１、および（ｉｉ）第２のマスキング部分（ＭＭ２）の連結が第２の標的を結合する第２の抗体またはその抗原結合断片（ＡＢ２）の能力を低下させるように、ＭＭ２に連結された第２の標的を特異的に結合するＡＢ２を含む。いくつかの実施形態では、ＭＭ１および／またはＭＭ２は、プロテアーゼ、例えば、第１の標的、第２の標的、対象の治療部位での、または第１の標的および第２の標的の両方と共局在するプロテアーゼ、の基質を含む配列を介して、それぞれの抗体またはその抗原結合断片（ＡＢ１またはＡＢ２）に連結される。いくつかの実施形態では、第１の標的、第２の標的、または第１の標的および第２の標的の両方は、例えば、ヒト標的などの、哺乳動物標的である。
【０１６５】
本明細書で提供される活性化可能抗体は、マスキング部分を含む。いくつかの実施形態では、マスキング部分は、抗体に結合または付着されるアミノ酸配列であり、かつ活性化可能抗体構築物内に位置付けられ、これにより、マスキング部分が、標的を特異的に結合する抗体の能力を低下させる。好適なマスキング部分は、様々な既知の技術のいずれかを使用して特定される。例えば、ペプチドマスキング部分は、ＤａｕｇｈｅｒｔｙらによるＰＣＴ公開番号国際公開第２００９／０２５８４６号に記載されている方法（本内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を使用して特定される。
【０１６６】
本明細書で提供される活性化可能抗体は、切断可能部分を含む。いくつかの実施形態では、切断可能部分は、プロテアーゼ、通常は細胞外プロテアーゼ、の基質であるアミノ酸配列を含む。好適な基質は、様々な既知の技術のいずれかを使用して特定される。例えば、ペプチド基質は、Ｄａｕｇｈｅｒｔｙらによる米国特許第７，６６６，８１７号、Ｓｔａｇｌｉａｎｏらによる米国特許第８，５６３，２６９号、また、Ｌａ  ＰｏｒｔｅらによるＰＣＴ公開番号国際公開第２０１４／０２６１３６号に記載されている方法を使用して特定される。これらのそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる（また、Ｂｏｕｌｗａｒｅら、「Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ  ｔｈａｔ  ｅｘｈｉｂｉｔ  ｒａｐｉｄ  ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．１０６．３（２０１０年）：３３９−４６も参照されたい）。
【０１６７】
例示的な基質としては、表４に列挙される以下の酵素またはプロテアーゼの１つ以上によって切断可能な基質が挙げられるが、これらに限定されない。
【表３】
2020530554.tif 000007
2020530554.tif 000008
【０１６８】
本明細書で提供される方法は、プロテアーゼの基質として機能する切断可能部分を含む活性化可能抗体の活性化を定量化するのに有用である。本明細書に記載の活性化可能抗体は、抗体治療、特にｉｎ  ｖｉｖｏで少なくともある程度毒性であることが知られている抗体治療の限界を克服するように設計されている。標的を介した毒性は、治療用抗体の開発にとって大きな制限となる。本明細書で提供される活性化可能抗体は、従来の治療用抗体による正常組織での標的の阻害に関連する毒性に対処するように設計されている。これらの活性化可能抗体は、疾患部位でタンパク質分解的に活性化されるまでマスクされたままである。親治療用抗体としての抗体から始めて、本発明の活性化可能抗体は、プロテアーゼ基質を組み込むリンカーを介して抗体を阻害マスクに連結することにより改変された。
【０１６９】
ＡＢがＭＭで修飾され、標的の存在下にある場合、ＡＢの標的への特異的結合は、ＭＭで修飾されていないＡＢの特異的結合または親ＡＢの標的への特異的結合と比較して、減少または阻害される。
【０１７０】
標的に対するＭＭで修飾されたＡＢのＫｄは、標的に対するＭＭで修飾されないＡＢまたは親ＡＢのＫｄの少なくとも５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、１，０００、２，５００、５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００倍以上、または５〜１０、１０〜１００、１０〜１，０００、１０〜１０，０００、１０〜１００，０００、１０〜１，０００，０００、１０〜１０，０００，０００、１００〜１，０００、１００〜１０，０００、１００〜１００，０００、１００〜１，０００，０００、１００〜１０，０００，０００、１，０００〜１０，０００、１，０００〜１００，０００、１，０００〜１，０００，０００、１０００〜１０，０００，０００、１０，０００〜１００，０００、１０，０００〜１，０００，０００、１０，０００〜１０，０００，０００、１００，０００〜１，０００，０００、もしくは１００，０００〜１０，０００，０００倍大きい。逆に、ＭＭで修飾されたＡＢの標的に対する結合親和性は、ＭＭで修飾されないＡＢまたは親ＡＢの標的に対する結合親和性よりも少なくとも２、３、４、５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、１，０００、２，５００、５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００倍以上、または５〜１０、１０〜１００、１０〜１，０００、１０〜１０，０００、１０〜１００，０００、１０〜１，０００，０００、１０〜１０，０００，０００、１００〜１，０００、１００〜１０，０００、１００〜１００，０００、１００〜１，０００，０００、１００〜１０，０００，０００、１，０００〜１０，０００、１，０００〜１００，０００、１，０００〜１，０００，０００、１０００〜１０，０００，０００、１０，０００〜１００，０００、１０，０００〜１，０００，０００、１０，０００〜１０，０００，０００、１００，０００〜１，０００，０００、もしくは１００，０００〜１０，０００，０００倍低い。
【０１７１】
ＡＢに対するＭＭの解離定数（Ｋｄ）は一般に、標的に対するＡＢのＫｄよりも大きい。ＡＢに対するＭＭのＫｄは、標的に対するＡＢのＫｄより少なくとも５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、１，０００、２，５００、５，０００、１０，０００、１００，０００、１，０００，０００、またはさらには１０，０００，０００倍大きくてよい。逆に、ＡＢに対するＭＭの結合親和性は一般に、標的に対するＡＢの結合親和性よりも低い。ＡＢに対するＭＭの結合親和性は、標的に対するＡＢの結合親和性より少なくとも５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、１，０００、２，５００、５，０００、１０，０００、１００，０００、１，０００，０００、またはさらには１０，０００，０００倍低くてよい。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、ＡＢに対するＭＭの解離定数（Ｋｄ）は、標的に対するＡＢのＫｄにほぼ等しい。いくつかの実施形態では、ＡＢに対するＭＭの解離定数（Ｋｄ）は、標的に対するＡＢの解離定数程度である。いくつかの実施形態では、ＡＢに対するＭＭの解離定数（Ｋｄ）は、標的に対するＡＢの解離定数に等しい。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、ＡＢに対するＭＭの解離定数（Ｋｄ）は、標的に対するＡＢの解離定数よりも小さい。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、ＡＢに対するＭＭの解離定数（Ｋｄ）は、標的に対するＡＢの解離定数よりも大きい。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、ＭＭは、標的へのＡＢの結合のＫｄ程度である、ＡＢへの結合のＫｄを有する。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、ＭＭは、標的へのＡＢの結合のＫｄ以上である、ＡＢへの結合のＫｄを有する。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、ＭＭは、標的へのＡＢの結合のＫｄにほぼ等しい、ＡＢへの結合のＫｄを有する。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、ＭＭは、標的へのＡＢの結合のＫｄよりも小さい、ＡＢへの結合のＫｄを有する。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、ＭＭは、標的へのＡＢの結合のＫｄより大きい、ＡＢへの結合のＫｄを有する。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、ＭＭは、標的へのＡＢの結合のＫｄの２、３、４、５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、または１，０００倍程度である、ＡＢへの結合のＫｄを有する。いくつかの実施形態では、ＭＭは、標的へのＡＢの結合のＫｄよりも１〜５、２〜５、２〜１０、５〜１０、５〜２０、５〜５０、５〜１００、１０〜１００、１０〜１，０００、２０〜１００、２０〜１０００、または１００〜１，０００倍大きい、ＡＢへの結合のＫｄを有する。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、ＭＭは、標的へのＡＢの結合の親和性よりも低い、ＡＢへの結合の親和性を有する。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、ＭＭは、標的へのＡＢの結合の親和性程度の、ＡＢへの結合の親和性を有する。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、ＭＭは、標的へのＡＢの結合の親和性にほぼ等しい、ＡＢへの結合の親和性を有する。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、ＭＭは、標的へのＡＢの結合の親和性ほどのＡＢへの結合の親和性を有する。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、ＭＭは、標的へのＡＢの結合の親和性よりも大きいＡＢへの結合の親和性を有する。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、ＭＭは、標的へのＡＢの結合の親和性よりも２、３、４、５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、または１，０００少ないＡＢへの結合の親和性を有する。いくつかの実施形態では、ＭＭは、標的へのＡＢの結合の親和性よりも１〜５、２〜５、２〜１０、５〜１０、５〜２０、５〜５０、５〜１００、１０〜１００、１０〜１，０００、２０〜１００、２０〜１０００、または１００〜１，０００倍低いＡＢへの結合の親和性を有する。いくつかの実施形態では、ＭＭは、標的へのＡＢの結合の親和性よりも２〜２０倍低いＡＢへの結合の親和性を有する。いくつかの実施形態では、ＡＢに共有結合で連結されずかつＡＢと等モル濃度であるＭＭは、標的へのＡＢの結合を阻害しない。
【０１８７】
ＡＢがＭＭで修飾され標的の存在下にある場合、その標的へのＡＢの特異的結合は、標的へのＭＭで修飾されないＡＢの特異的結合または親ＡＢの特異的結合と比較して、減少または阻害される。標的へのＭＭで修飾されないＡＢの結合または親ＡＢの結合と比較すると、ＭＭで修飾された場合の標的を結合するＡＢの能力は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイで測定した場合、少なくとも２時間、４時間、６時間、８時間、１２時間、２８時間、２４時間、３０時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、８４時間、もしくは９６時間、または５日、１０日、１５日、３０日、４５日、６０日、９０日、１２０日、１５０日、もしくは１８０日、または１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、または１２ヶ月以上の間、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらに１００％低下され得る。
【０１８８】
ＭＭは、標的へのＡＢの結合を阻害する。ＭＭは、ＡＢの抗原結合ドメインを結合し、標的へのＡＢの結合を阻害する。ＭＭは、標的へのＡＢの結合を立体的に阻害できる。ＭＭは、標的へのＡＢの結合をアロステリックに阻害できる。これらの実施形態では、ＡＢが修飾されるか、またはＭＭに連結され、かつ標的の存在下にある場合、標的へのＡＢの結合はないか実質的になく、またはｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイで測定した場合、少なくとも２時間、４時間、６時間、８時間、１２時間、２８時間、２４時間、３０時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、８４時間、もしくは９６時間、または５日、１０日、１５日、３０日、４５日、６０日、９０日、１２０日、１５０日、もしくは１８０日、または１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、もしくは１２ヶ月以上の間、標的へのＭＭにより修飾されないＡＢ、親ＡＢ、またはＭＭに連結されないＡＢの結合と比較して、０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、または５０％程度の標的へのＡＢの結合がある。
【０１８９】
ＡＢがＭＭに連結されるか、またはＭＭにより修飾される場合、ＭＭは標的へのＡＢの特異的結合を「マスク」するか、低減するか、または阻害する。ＡＢがＭＭに連結されるか、またはＭＭにより修飾される場合、こうした連結または修飾は、その標的に特異的に結合するＡＢの能力を低下させるか、または阻害する構造変化を引き起こし得る。
【０１９０】
ＭＭに連結されるか、またはＭＭにより修飾されるＡＢは、次式で表すことができる（アミノ（Ｎ）末端領域からカルボキシル（Ｃ）末端領域の順：
（ＭＭ）−（ＡＢ）
（ＡＢ）−（ＭＭ）
（ＭＭ）−Ｌ−（ＡＢ）
（ＡＢ）−Ｌ−（ＭＭ）
式中、ＭＭはマスキング部分であり、ＡＢは抗体またはその抗体断片であり、Ｌはリンカーである。多くの実施形態では、柔軟性を提供するために、１つ以上のリンカー、例えば柔軟なリンカーを組成物中に挿入することが望ましい場合がある。
【０１９１】
特定の実施形態では、ＭＭは、ＡＢの天然の結合パートナーではない。いくつかの実施形態では、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーと相同性を全く含まないか、または実質的に含まない。いくつかの実施形態では、ＭＭは、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または８０％程度、ＡＢの任意の天然の結合パートナーと類似している。いくつかの実施形態では、ＭＭは、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または８０％程度、ＡＢの任意の天然の結合パートナーと同一である。いくつかの実施形態では、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーとの同一性は、２５％程度である。いくつかの実施形態では、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーとの同一性は、５０％程度である。いくつかの実施形態では、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーとの同一性は、２０％程度である。いくつかの実施形態では、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーとの同一性は、１０％程度である。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、ＭＭにより修飾されたＡＢを含み、１つ以上の切断可能部分（ＣＭ）も含む。このような活性化可能抗体は、ＡＢの標的に対して活性化可能な／切り替え可能な結合を呈する。活性化可能抗体は、一般に、マスキング部分（ＭＭ）および修飾可能もしくは切断可能部分（ＣＭ）によって修飾されるか、またはこれらに連結される抗体もしくは抗体断片（ＡＢ）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭは、少なくとも１つのプロテアーゼの基質として機能するアミノ酸配列を含む。
【０１９３】
活性化可能抗体のエレメントは、切断された（または比較的活性である）状態でかつ標的の存在下で、ＡＢが標的を結合し、その一方で、活性化可能抗体は、標的の存在下で切断されていない（または比較的不活性な）状態にあるように、ＭＭおよびＣＭが位置付けられるよう配置され、その標的へのＡＢの特異的結合が減少されるか、または阻害される。標的へのＡＢの特異的結合は、ＭＭによるその標的を特異的に結合するＡＢの能力の阻害またはマスキングにより減少され得る。
【０１９４】
標的に対するＭＭおよびＣＭにより修飾されたＡＢのＫｄは、標的に対するＭＭおよびＣＭにより修飾されないＡＢまたは親ＡＢのＫｄの少なくとも５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、１，０００、２，５００、５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００以上、または５〜１０、１０〜１００、１０〜１，０００、１０〜１０，０００、１０〜１００，０００、１０〜１，０００，０００、１０〜１０，０００，０００、１００〜１，０００、１００〜１０，０００、１００〜１００，０００、１００〜１，０００，０００、１００〜１０，０００，０００、１，０００〜１０，０００、１，０００〜１００，０００、１，０００〜１，０００，０００、１０００〜１０，０００，０００、１０，０００〜１００，０００、１０，０００〜１，０００，０００、１０，０００〜１０，０００，０００、１００，０００〜１，０００，０００、もしくは１００，０００〜１０，０００，０００倍大きい。逆に、標的に対するＭＭおよびＣＭにより修飾されたＡＢの結合親和性は、標的に対するＭＭおよびＣＭにより修飾されないＡＢまたは親ＡＢの結合親和性の少なくとも５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、１，０００、２，５００、５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００以上、または５〜１０、１０〜１００、１０〜１，０００、１０〜１０，０００、１０〜１００，０００、１０〜１，０００，０００、１０〜１０，０００，０００、１００〜１，０００、１００〜１０，０００、１００〜１００，０００、１００〜１，０００，０００、１００〜１０，０００，０００、１，０００〜１０，０００、１，０００〜１００，０００、１，０００〜１，０００，０００、１０００〜１０，０００，０００、１０，０００〜１００，０００、１０，０００〜１，０００，０００、１０，０００〜１０，０００，０００、１００，０００〜１，０００，０００、もしくは１００，０００〜１０，０００，０００倍少ない。
【０１９５】
ＡＢがＭＭおよびＣＭにより修飾され、標的の存在下にあるが、修飾剤（例えば、少なくとも１つのプロテアーゼ）の存在下にない場合、その標的へのＡＢの特異的結合は、標的へのＭＭおよびＣＭにより修飾されないＡＢの、または親ＡＢの特異的結合と比較して、減少されるか、または阻害される。その標的への親ＡＢの結合またはＭＭおよびＣＭにより修飾されないＡＢの結合と比較したとき、ＭＭおよびＣＭにより修飾されたときの標的を結合するＡＢの能力は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイで測定した場合少なくとも２時間、４時間、６時間、８時間、１２時間、２８時間、２４時間、３０時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、８４時間、または９６時間、または５日、１０日、１５日、３０日、４５日、６０日、９０日、１２０日、１５０日、または１８０日間、または１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、または１２ヶ月以上の間、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、およびさらには１００％低下され得る。
【０１９６】
本明細書で使用する場合、切断された状態という用語は、少なくとも１つのプロテアーゼによるＣＭの修飾の後の活性化可能抗体の状態を指す。本明細書で使用する切断されていない状態という用語は、プロテアーゼによるＣＭの切断がない活性化可能抗体の状態を指す。上述のように、「活性化可能抗体」という用語は、本明細書では、その切断されていない（天然の）状態およびその切断された状態の両方の活性化可能抗体を指すために使用される。いくつかの実施形態では、切断された活性化可能抗体がプロテアーゼによるＣＭの切断によりＭＭを欠失し、その結果として少なくともＭＭの放出（例えば、ＭＭが共有結合（例えば、システイン残基間のジスルフィド結合）により活性化可能抗体に結合されない場合）がもたらされることは、当業者にとって明らかであろう。
【０１９７】
活性化可能または切り替え可能とは、活性化可能抗体が、阻害され、マスクされ、または切断されていない状態（すなわち、第１の立体構造）にある場合、活性化可能抗体が標的に対する第１のレベルの結合を呈し、阻害されない、マスクされない、かつ／または切断された状態（すなわち、第２の立体構造）では標的に対する第２のレベルの結合を呈することを意味し、このとき標的結合の第２レベルは、第１のレベルの結合より大きい。一般に、活性化可能抗体のＡＢへの標的の接近は、こうした切断剤の非存在下よりも、ＣＭを切断できる切断剤、すなわちプロテアーゼの存在下でより大きい。したがって、活性化可能抗体が切断されていない状態にある場合、ＡＢは標的結合を阻害され、標的結合からマスクされ得る（すなわち、第１の立体構造は、ＡＢが標的を結合できないようなものである）、切断された状態でＡＢは、標的結合が阻害されないか、または標的結合に対してマスクされない。
【０１９８】
活性化可能抗体のＣＭおよびＡＢは、ＡＢが所与の標的の結合部分を表し、ＣＭがプロテアーゼの基質を表すように選択される。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、対象の治療部位または診断部位において標的と共局在する。本明細書で使用される共局在化は、同じ場所にあるか、比較的近くにあることを指す。いくつかの実施形態では、プロテアーゼはＣＭを切断し、切断部位の近くに位置する標的に結合する活性化抗体を生じる。本明細書に開示される活性化可能抗体は、例えば、ＣＭ中の任意の部位を切断できるプロテアーゼ、すなわちプロテアーゼが、処置部位または診断部位の標的含有組織中に、非処置部位の組織（例えば、健康な組織）中よりも比較的高いレベルで存在する、特定の用途を見出す。いくつかの実施形態では、本開示のＣＭはまた、１つ以上の他のプロテアーゼによって切断される。いくつかの実施形態では、標的と共局在しｉｎ  ｖｉｖｏでのＣＭの切断を担うのは１つ以上の他のプロテアーゼである。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、ＡＢが標的への結合をマスクされないか、または阻害されない場合、活性化可能抗体は非処置部位でのＡＢの結合によって生じ得る毒性および／または有害な副作用の低減をもたらす。
【０２００】
一般に、活性化可能抗体は、コンフォメーション的に制約されている場合、ＭＭがＡＢのマスキングまたは標的へのＡＢの結合の減少をもたらすように、目的のＡＢを選択することおよび活性化可能抗体の残りの部分を構築することにより設計され得る。この機能的特徴をもたらすために、構造設計基準が考慮され得る。
【０２０１】
阻害された立体配座および阻害されていない立体配座における標的結合の望ましいダイナミックレンジの切り替え可能な表現型を呈する活性化可能抗体を提供する。ダイナミックレンジとは一般に、（ａ）第１の条件セットでのパラメーターの最大検出レベル対（ｂ）第２の条件セットでのパラメーターの最小検出値の比率、を指す。例えば、活性化可能抗体の文脈において、ダイナミックレンジは、（ａ）活性化可能抗体のＣＭを切断できる少なくとも１つのプロテアーゼの存在下での活性化可能抗体に結合する標的タンパク質の最大検出レベル対（ｂ）プロテアーゼ非存在下で活性化可能抗体に結合する標的タンパク質の最小検出レベル、の比率を指す。活性化可能抗体のダイナミックレンジは、活性化可能抗体切断剤処置の解離定数に対する、活性化可能抗体切断剤（例えば、酵素）処置の解離定数の比として算出できる。活性化可能抗体のダイナミックレンジが大きいほど、活性化可能抗体の切り替え可能な表現型がよりよくなる。比較的高いダイナミックレンジ値（例えば、１よりも大きい）を有する活性化可能抗体は、より望ましい切り替え表現型を呈し、これにより、活性化可能抗体による標的タンパク質の結合が、切断剤の非存在下でよりも、活性化可能抗体のＣＭを切断できる切断剤（例えば、酵素）の存在下において、より広い範囲まで発生する（例えば、主に発生する）ようになる。
【０２０２】
活性化可能抗体は、様々な構造構成で提供され得る。活性化可能抗体の例示的な式を以下に提供する。活性化可能抗体内で、Ｎ末端からＣ末端へのＡＢ、ＭＭおよびＣＭの順序を逆にし得ることが特に想定される。また、例えばＣＭがＭＭ内に含まれるように、ＣＭおよびＭＭがアミノ酸配列中で重複し得ることも特に想定される。
【０２０３】
例えば、活性化可能抗体は、次式で表すことができる（アミノ（Ｎ）末端領域からカルボキシル（Ｃ）末端領域の順：
（ＭＭ）−（ＣＭ）−（ＡＢ）
（ＡＢ）−（ＣＭ）−（ＭＭ）
式中、ＭＭはマスキング部分、ＣＭは切断可能部分、ＡＢは抗体またはその断片である。ＭＭおよびＣＭは、上記の式では別個の成分として示されているが、本明細書に開示されるすべての例示的な実施形態（式を含む）において、ＭＭおよびＣＭのアミノ酸配列は、例えば、ＣＭが、ＭＭ内に完全にまたは部分的に含まれるように、重複し得ることが想定されることに留意されたい。加えて、上記の式は、活性化可能抗体エレメントに対してＮ末端またはＣ末端に位置付けられることができる追加のアミノ酸配列をもたらす。
【０２０４】
特定の実施形態では、ＭＭは、ＡＢの天然の結合パートナーではない。いくつかの実施形態では、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーと相同性を全く含まないか、または実質的に含まない。いくつかの実施形態では、ＭＭは、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または８０％程度、ＡＢの任意の天然の結合パートナーと類似している。いくつかの実施形態では、ＭＭは、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または８０％程度、ＡＢの任意の天然の結合パートナーと同一である。いくつかの実施形態では、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーとの同一性は、５０％程度である。いくつかの実施形態では、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーとの同一性は、２５％程度である。いくつかの実施形態では、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーとの同一性は、２０％程度である。いくつかの実施形態では、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーとの同一性は、１０％程度である。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、ＭＭ−ＣＭ接合部、ＣＭ−ＡＢ接合部、またはその両方の１つ以上に柔軟性を付与するために、１つ以上のリンカー、例えば柔軟なリンカーを活性化可能抗体構築物中に含む。例えば、ＡＢ、ＭＭおよび／またはＣＭは、所望の柔軟性をもたらすための十分な数の残基（例えば、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、特にＧｌｙおよびＳｅｒ、特にＧｌｙ）を含まないかもしれない。そのため、こうした活性化可能抗体構築物の切り替え可能な表現型は、柔軟なリンカーをもたらすために１つ以上のアミノ酸を導入することから利益を得る可能性がある。加えて、以下に記載するように、活性化可能抗体が立体構造的に拘束された構築物として提供される場合、柔軟なリンカーを作動可能に挿入して、切断されていない活性化可能抗体における環状構造の形成および維持を容易にし得る。
【０２０６】
例えば、ある実施形態では、活性化可能抗体は、次式のうちの１つを含む（以下の式は、Ｎ−末端方向からＣ−末端方向またはＣ−末端方向からＮ−末端方向のいずれかのアミノ酸配列を表す）：
（ＭＭ）−Ｌ１−（ＣＭ）−（ＡＢ）
（ＭＭ）−（ＣＭ）−Ｌ２−（ＡＢ）
（ＭＭ）−Ｌ１−（ＣＭ）−Ｌ２−（ＡＢ）
式中、ＭＭ、ＣＭ、およびＡＢは、上記で定義したとおりである。式中、Ｌ１およびＬ２は、それぞれ独立してかつ任意に存在するか、または存在せず、少なくとも１つの柔軟なアミノ酸（例えばＧｌｙ）を含む同じまたは異なる柔軟なリンカーである。加えて、上記の式は、活性化可能抗体エレメントに対してＮ末端またはＣ末端に位置付けることができる追加のアミノ酸配列をもたらす。例としては、これらに限定されないが、標的化部分（例えば、標的組織に存在する細胞の受容体に対するリガンド）および血清半減期延長部分（例えば、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）または血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）などの血清タンパク質を結合するポリペプチド）が挙げられる。
【０２０７】
ＣＭは、約０．００１〜１５００ｘ１０４Ｍ−１Ｓ−１、または少なくとも０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、２．５、５、７．５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、２００、２５０、５００、７５０、１０００、１２５０、または１５００ｘ１０４Ｍ−１Ｓ−１の速度で少なくとも１つのプロテアーゼにより特異的に切断される。いくつかの実施形態では、ＣＭは約１００，０００Ｍ−１Ｓ−１の速度で特異的に切断される。いくつかの実施形態では、ＣＭは、約１ｘ１０２〜約１ｘ１０６Ｍ−１Ｓ−１（すなわち、約１ｘ１０２〜約１ｘ１０６Ｍ−１Ｓ−１）の速度で特異的に切断される。
【０２０８】
酵素による特異的切断の場合、酵素とＣＭの間で接触が生じる。ＭＭおよびＣＭに連結されるＡＢを含む活性化可能抗体が標的および十分な酵素活性の存在下にある場合、ＣＭは切断され得る。十分な酵素活性は、ＣＭと接触し切断を行う酵素の能力を指す。酵素は、ＣＭの近くにあり得るが、他の細胞因子のためまたは酵素のタンパク質修飾のために切断できないことが容易に想起され得る。
【０２０９】
本明細書に記載の組成物中での使用に好適なリンカーは一般に、標的へのＡＢの結合の阻害を容易にするために、修飾ＡＢまたは活性化可能抗体の柔軟性をもたらすものである。こうしたリンカーは一般に、柔軟なリンカーと称される。好適なリンカーは容易に選択でき、１アミノ酸（例えばＧｌｙ）〜２０アミノ酸、２アミノ酸〜１５アミノ酸、３アミノ酸〜１２アミノ酸、４アミノ酸〜１０アミノ酸、５アミノ酸〜９アミノ酸、６アミノ酸〜８アミノ酸、または７アミノ酸から８アミノ酸など、好適な異なる長さのいずれであってもよく、かつ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸の長さであってもよい。
【０２１０】
例示的な柔軟なリンカーとしては、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシンセリンポリマーが挙げられる（例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号３３９）および（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３４０）（ｎは、少なくとも１つの整数であり、いくつかの実施形態では、２０以下である）、グリシン−アラニンポリマー、アラニン−セリンポリマー、および当技術分野で公知である他の柔軟なリンカーを含む）。グリシンおよびグリシン−セリンポリマーは比較的構造化されていないため、成分間の中性のつなぎとして機能し得る。グリシンは、アラニンよりもはるかに多くのｐｈｉ−ｐｓｉスペースにアクセスし、より長い側鎖を有する残基よりもはるかに制限が少ない（Ｓｃｈｅｒａｇａ、Ｒｅｖ．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍ．１１１７３−１４２（１９９２年）を参照されたい）。例示的な柔軟なリンカーとしては、これらに限定されないが、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ（配列番号３４１）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号３４２）、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ（配列番号３４３）、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号３４４）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ（配列番号３４５）、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ（配列番号３４６）などが挙げられる。当業者であれば、活性化可能抗体の設計は、すべてまたは部分的に柔軟なリンカーを含んでよく、これにより、リンカーは、柔軟性のあるリンカーと、柔軟性の低い構造を付与して所望の活性化可能抗体構造をもたらす１つ以上の部分とを含み得ることを認識するであろう。
【０２１１】
本開示はまた、活性化可能抗体の活性（例えば、マスキング、活性化または結合活性）を損なうことなく、ＡＢ中の１つ以上のシステイン残基への１つ以上の剤の付着を可能にするように修飾された活性化可能抗体を定量化するための組成物および方法も提供する。いくつかの実施形態では、ＭＭ内の１つ以上のジスルフィド結合を還元するか、またはさもなければ妨害することなく、ＡＢ内の１つ以上のシステイン残基に１つ以上の剤を付着できるように修飾された活性化可能抗体。本明細書で提供される組成物および方法は、例えばいくつかの実施形態では、活性化可能抗体のＭＭに結合されるいずれの剤（複数可）もなく、１つ以上の剤、例えば様々な治療剤、診断剤および／または予防剤のいずれかに結合される活性化可能抗体を使用して実施できる。本明細書で提供される組成物および方法は、ＭＭが、切断されていない状態の活性化可能抗体のＡＢを効果的かつ効率的にマスクする能力を保持する、結合型活性化可能抗体と共に使用される。本明細書で提供される組成物および方法は、ＣＭを切断できるプロテアーゼの存在下で、活性化可能抗体が依然として活性化されている、すなわち、切断されている、結合型活性化可能抗体と共に使用される。
【０２１２】
活性化可能抗体は、剤に対する少なくとも１つの結合点を有するが、本明細書で提供される方法および組成物では、可能な結合点のすべてが剤への結合に利用可能ではない。いくつかの実施形態では、１つ以上の結合点は、ジスルフィド結合に関与する硫黄原子である。いくつかの実施形態では、１つ以上の結合点は、鎖間ジスルフィド結合に関与する硫黄原子である。いくつかの実施形態では、１つ以上の結合点は、鎖間スルフィド結合に関与する硫黄原子であるが、鎖内ジスルフィド結合に関与する硫黄原子ではない。いくつかの実施形態では、１つ以上の結合点は、システインまたは硫黄原子を含む他のアミノ酸残基の硫黄原子である。こうした残基は、抗体構造中に自然に存在し得るか、部位特異的変異誘発、化学変換、または非天然アミノ酸の誤取り込みにより抗体に組み込まれ得る。
【０２１３】
本明細書で提供される組成物および方法は、ＡＢに１つ以上の鎖間ジスルフィド結合およびＭＭに１つ以上の鎖内ジスルフィド結合を有する活性化可能抗体のコンジュゲートも使用でき、この場合、遊離チオールと反応する薬物が提供される。これらの実施形態では、方法は一般に、例えばＴＣＥＰなどの還元剤により活性化可能抗体の鎖間ジスルフィド結合を部分的に還元すること、および遊離チオールと反応する薬物を、部分的に還元された活性化可能抗体に結合させることを含む。本明細書で使用する場合、部分的還元という用語は、活性化可能抗体が還元剤と接触し、すべてよりも少ないジスルフィド結合、例えば、すべてよりも少ない可能な結合部位が還元される状況を指す。いくつかの実施形態では、すべての可能な結合部位の９９％未満、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％または５％未満が還元される。
【０２１４】
さらに他の実施形態では、本明細書で提供される組成物および方法は、薬物などの剤を活性化可能抗体に還元し、結合する方法と組み合わせて使用され、その結果、剤の配置の選択性が付与される。これらの実施形態では、方法は一般に、活性化可能抗体のマスキング部分または他のＡＢ以外の部分の任意の結合部位が還元されないように還元剤で活性化可能抗体を部分的に還元すること、およびＡＢ中の鎖間チオールに剤を結合することを含む。結合部位（複数可）は、剤の所望の配置を可能にして、結合が所望の部位で生じ得るように選択される。還元剤は、例えば、ＴＣＥＰである。例えば、還元剤と活性化可能抗体の比、インキュベーションの長さ、インキュベーション中の温度、還元反応溶液のｐＨなどの還元反応条件は、ＭＭが切断されていない状態の活性化可能抗体のＡＢを効果的かつ効率的にマスクする能力を保持する結合型活性化可能抗体を産生する条件を特定することによって決定される。還元剤と活性化可能抗体との比は、活性化可能抗体によって異なる。いくつかの実施形態では、還元剤と活性化可能抗体との比は、約２０：１〜１：１、約１０：１〜１：１、約９：１〜１：１、約８：１〜１：１、約７：１〜１：１、約６：１〜１：１、約５：１〜１：１、約４：１〜１：１、約３：１〜１：１、約２：１〜１：１、約２０：１〜１：１．５、約１０：１〜１：１．５、約９：１〜１：１．５、約８：１〜１：１．５、約７：１〜１：１．５、約６：１〜１：１．５、約５：１〜１：１．５、約４：１〜１：１．５、約３：１〜１：１．５、約２：１〜１：１．５、約１．５：１〜１：１．５、または約１：１〜１：１．５の範囲である。いくつかの実施形態では、比は、約５：１〜１：１の範囲である。いくつかの実施形態では、比は、約５：１〜１．５：１の範囲である。いくつかの実施形態では、比は、約４：１〜１：１の範囲である。いくつかの実施形態では、比は、約４：１〜１．５：１の範囲である。いくつかの実施形態では、比は、約８：１〜約１：１の範囲である。いくつかの実施形態では、比は、約２．５：１〜１：１の範囲である。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物および方法は、活性化可能抗体のＡＢ中の鎖間ジスルフィド結合を還元すること、および剤、例えば薬物などのチオール含有剤を、結果として生じる鎖間チオールに結合して、ＡＢ上の剤（複数可）を選択的に配置する方法と組み合わせて使用される。これらの実施形態では、この方法は一般に、ＡＢを還元剤で部分的に還元して、活性化可能抗体においてすべての可能な鎖間チオールを形成することなく、少なくとも２つの鎖間チオールを形成すること、および部分的に還元されたＡＢの鎖間チオールに剤を結合させること、を含む。例えば、活性化可能抗体のＡＢは、還元剤対活性化抗体の望ましい比にて、約３７℃で約１時間部分的に還元される。いくつかの実施形態では、還元剤と活性化可能抗体との比は、約２０：１〜１：１、約１０：１〜１：１、約９：１〜１：１、約８：１〜１：１、約７：１〜１：１、約６：１〜１：１、約５：１〜１：１、約４：１〜１：１、約３：１〜１：１、約２：１〜１：１、約２０：１〜１：１．５、約１０：１〜１：１．５、約９：１〜１：１．５、約８：１〜１：１．５、約７：１〜１：１．５、約６：１〜１：１．５、約５：１〜１：１．５、約４：１〜１：１．５、約３：１〜１：１．５、約２：１〜１：１．５、約１．５：１〜１：１．５、または約１：１〜１：１．５の範囲である。いくつかの実施形態では、比は、約５：１〜１：１の範囲である。いくつかの実施形態では、比は、約５：１〜１．５：１の範囲である。いくつかの実施形態では、比は、約４：１〜１：１の範囲である。いくつかの実施形態では、比は、約４：１〜１．５：１の範囲である。いくつかの実施形態では、比は、約８：１〜約１：１の範囲である。いくつかの実施形態では、比は、約２．５：１〜１：１の範囲である。
【０２１６】
チオール含有試薬は、例えば、システインまたはＮ−アセチルシステインであり得る。還元剤は、例えば、ＴＣＥＰであり得る。いくつかの実施形態では、還元された活性化可能抗体は、例えば、カラムクロマトグラフィー、透析、またはダイアフィルトレーションを使用して、結合の前に精製され得る。あるいは、還元された抗体は、部分的な還元の後および結合の前に精製されない。
【０２１７】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物および方法は、活性化可能抗体の鎖内ジスルフィド結合を妨害することなく、活性化可能抗体の少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合が還元剤で還元されている、部分的に還元された活性化可能抗体と共に使用され、活性化可能抗体は、標的を特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片（ＡＢ）、切断されていない状態の活性化可能抗体のＡＢの標的への結合を阻害するマスキング部分（ＭＭ）、および、ＡＢに連結される切断可能部分（ＣＭ）であって、プロテアーゼの基質として機能するポリペプチドであるＣＭ、を含む。いくつかの実施形態では、ＭＭはＣＭを介してＡＢに連結される。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体の１つ以上の鎖内ジスルフィド結合は、還元剤によって乱されない。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体内のＭＭの１つ以上の鎖内ジスルフィド結合は、還元剤によって乱されない。いくつかの実施形態では、切断されていない状態の活性化可能抗体は、以下のようなＮ末端からＣ末端への構造的配置を有する：ＭＭ−ＣＭ−ＡＢまたはＡＢ−ＣＭ−ＭＭ。いくつかの実施形態では、還元剤はＴＣＥＰである。
【０２１８】
さらに他の実施形態では、本明細書で提供される組成物および方法は、剤、例えば薬物を還元し、活性化可能抗体に結合させ、リジンおよび／またはシステイン残基の定義された数と位置を有する活性化可能抗体を提供することにより剤の配置に選択性をもたらす方法と併せて使用される。いくつかの実施形態では、リジンおよび／またはシステイン残基の定義された数は、親抗体または活性化可能抗体のアミノ酸配列における対応する残基の数より多いかまたは少ない。いくつかの実施形態では、定義された数のリジンおよび／またはシステイン残基は、抗体または活性化可能抗体に結合され得る定義された数の剤同等物をもたらし得る。いくつかの実施形態では、定義された数のリジンおよび／またはシステイン残基は、部位特異的様式で抗体または活性化可能抗体に結合され得る定義された数の剤同等物をもたらし得る。いくつかの実施形態では、修飾された活性化可能抗体は、部位特異的な様式で１つ以上の非天然アミノ酸により修飾され、このため、いくつかの実施形態では、剤の結合を非天然アミノ酸の部位のみに制限する。いくつかの実施形態では、定義された数および位置のリジンおよび／またはシステイン残基を有する抗体または活性化可能抗体は、マスキング部分または活性化可能抗体の他のＡＢ以外の部分でのいかなる結合部位も還元されないように、本明細書で論じられるように還元剤で部分的に還元されてよく、かつ剤をＡＢ中の鎖間チオールに結合する。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物および方法は、活性化可能抗体のいかなる鎖内ジスルフィド結合も乱されることなく活性化可能抗体中の少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合が還元剤で還元されている、部分的に還元された活性化可能抗体と共に使用され、活性化可能抗体は、標的に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片（ＡＢ）、切断されていない状態の活性化可能抗体のＡＢの標的への結合を阻害するマスキング部分（ＭＭ）、およびＡＢに連結される切断可能部分（ＣＭ）であって、プロテアーゼの基質として機能するポリペプチドであるＣＭ、を含む。いくつかの実施形態では、ＭＭはＣＭを介してＡＢに連結される。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体の１つ以上の鎖内ジスルフィド結合は、還元剤によって乱されない。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体内のＭＭの１つ以上の鎖内ジスルフィド結合は、還元剤によって乱されない。いくつかの実施形態では、切断されていない状態にある活性化可能抗体は、以下のようにＮ末端からＣ末端への構造的配置を有する：ＭＭ−ＣＭ−ＡＢまたはＡＢ−ＣＭ−ＭＭ。いくつかの実施形態では、還元剤はＴＣＥＰである。
【０２２０】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物および方法は、活性化可能抗体に結合された剤も含む活性化可能抗体と共に使用される。いくつかの実施形態では、結合された剤は、抗炎症剤および／または抗新生物剤などの治療剤である。こうした実施形態では、剤は、活性化可能抗体の炭水化物部分に結合される。例えば、いくつかの実施形態では、炭水化物部分は、活性化可能抗体中の抗体または抗原結合断片の抗原結合領域の外側に配置される。いくつかの実施形態では、剤は、活性化可能抗体中の抗体または抗原結合断片のスルフヒドリル基に結合される。
【０２２１】
いくつかの実施形態では、剤は、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素、またはそれらの断片）、または放射性同位体（すなわち、放射性コンジュゲート）などの細胞毒性剤である。
【０２２２】
いくつかの実施形態では、剤は、例えば標識または他のマーカーなどの検出可能な部分である。例えば、剤は、放射標識アミノ酸、マークされたアビジンによって検出可能な１つ以上のビオチニル部分（例えば、蛍光マーカーを含むストレプトアビジンまたは光学的方法もしくは熱量測定法によって検出可能な酵素活性）、または１つ以上の放射性同位体もしくは放射性核種、１つ以上の蛍光標識、１つ以上の酵素標識、および／または１つ以上の化学発光剤であるか、またはこれらを含む。いくつかの実施形態では、検出可能な部分は、スペーサー分子によって付着される。
【０２２３】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物および方法は、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、または動物起源の酵素的に活性な毒素、またはそれらの断片）などの細胞傷害剤に結合された抗体を含む免疫複合体、または放射性同位体（すなわち、放射性コンジュゲート）と共に使用される。好適な細胞毒性剤としては、例えば、ドラスタチンおよびその誘導体（例えば、オーリスタチンＥ、ＡＦＰ、ＭＭＡＦ、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＤ、ＤＭＡＦ、ＤＭＡＥ）が挙げられる。例えば、剤はモノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）またはモノメチルオーリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）である。いくつかの実施形態では、剤は、表５に列挙される群から選択される剤である。いくつかの実施形態では、剤は、ドラスタチンである。いくつかの実施形態では、剤は、オーリスタチンまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、剤は、オーリスタチンＥまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、剤は、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。いくつかの実施形態では、剤は、モノメチルオーリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）である。いくつかの実施形態では、剤は、メイタンシノイドまたはメイタンシノイド誘導体である。いくつかの実施形態では、剤は、ＤＭ１またはＤＭ４である。いくつかの実施形態では、剤は、デュオカルマイシンまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、剤は、カリケアマイシンまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、剤は、ピロロベンゾジアゼピンである。いくつかの実施形態では、剤は、ピロロベンゾジアゼピン二量体である。
【０２２４】
いくつかの実施形態では、剤は、マレイミドカプロイル−バリン−シトルリンリンカーまたはマレイミドＰＥＧ−バリン−シトルリンリンカーを使用してＡＢに連結される。いくつかの実施形態では、剤は、マレイミドカプロイル−バリン−シトルリンリンカーを使用してＡＢに連結される。いくつかの実施形態では、剤は、マレイミドＰＥＧ−バリン−シトルリンリンカーを使用してＡＢに連結される。いくつかの実施形態では、剤は、マレイミドＰＥＧ−バリン−シトルリン−パラ−アミノベンジルオキシカルボニルリンカーを使用してＡＢに連結されたモノメチルオーリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）であり、このリンカーペイロード構築物は、本明細書では「ｖｃ−ＭＭＡＤ」と称される。いくつかの実施形態では、剤は、マレイミドＰＥＧ−バリン−シトルリン−パラ−アミノベンジルオキシカルボニルリンカーを使用してＡＢに連結されたモノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）であり、このリンカーペイロード構築物は本明細書では「ｖｃ−ＭＭＡＥ」と称される。いくつかの実施形態では、剤は、マレイミドＰＥＧ−バリン−シトルリンリンカーを使用してＡＢに連結される。いくつかの実施形態では、剤は、ｂｉｓ−マレイミドＰＥＧ−バリン−シトルリン−パラ−アミノベンジルオキシカルボニルリンカーを使用してＡＢに連結されたモノメチルオーリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）であり、このリンカーペイロード構築物は、本明細書では「ＰＥＧ２−ｖｃ−ＭＭＡＤ」と称される。ｖｃ−ＭＭＡＤ、ｖｃ−ＭＭＡＥ、およびＰＥＧ２−ｖｃ−ＭＭＡＤの構造を以下に示す：
【化１】
2020530554.tif 000009
【化２】
2020530554.tif 000010
【化３】
2020530554.tif 000011
【０２２５】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物および方法は、モノメチルオーリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）ペイロードに連結された活性化可能抗体を含む結合型活性化可能抗体と共に使用され、活性化可能抗体は、標的に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片（ＡＢ）、切断されていない状態の活性化可能抗体のＡＢの標的への結合を阻害するマスキング部分（ＭＭ）、およびＡＢに結合された切断可能部分（ＣＭ）であって、少なくとも１つのＭＭＰプロテアーゼの基質として機能するポリペプチドであるＣＭ、を含む。
【０２２６】
いくつかの実施形態では、ＭＭＡＤ結合型活性化可能抗体は、剤をＡＢに付着させるためのいくつかの方法のいずれかを用いて結合されてよい：（ａ）ＡＢの炭水化物部分への付着、または（ｂ）ＡＢのスルフヒドリル基への付着、または（ｃ）ＡＢのアミノ基への付着、または（ｄ）ＡＢのカルボキシレート基への付着。
【０２２７】
いくつかの実施形態では、ＭＭＡＤペイロードは、リンカーを介してＡＢに結合される。いくつかの実施形態では、ＭＭＡＤペイロードは、リンカーを介してＡＢ中のシステインに結合される。いくつかの実施形態では、ＭＭＡＤペイロードは、リンカーを介してＡＢ中のリジンに結合される。いくつかの実施形態では、ＭＭＡＤペイロードは、リンカーを介して、本明細書に開示される残基などのＡＢの別の残基に結合される。いくつかの実施形態では、リンカーはチオール含有リンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは切断可能なリンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは切断不能リンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは、表６および表７に示されるリンカーからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体およびＭＭＡＤペイロードは、マレイミドカプロイル−バリン−シトルリンリンカーを介して連結される。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体およびＭＭＡＤペイロードは、マレイミドＰＥＧ−バリン−シトルリンリンカーを介して連結される。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体およびＭＭＡＤペイロードは、マレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−パラ−アミノベンジルオキシカルボニルリンカーを介して連結される。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体およびＭＭＡＤペイロードは、マレイミドＰＥＧ−バリン−シトルリン−パラ−アミノベンジルオキシカルボニルリンカーを介して連結される。いくつかの実施形態では、ＭＭＡＤペイロードは、本明細書で開示される部分的還元および結合技術を用いてＡＢに結合される。
【０２２８】
いくつかの実施形態では、本開示のリンカーのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）成分は、２つのエチレングリコールモノマー、３つのエチレングリコールモノマー、４つのエチレングリコールモノマー、５つのエチレングリコールモノマー、６つのエチレングリコールモノマー、７つのエチレングリコールモノマー、８つのエチレングリコールモノマー、９つのエチレングリコールモノマー、または少なくとも１０のエチレングリコールモノマーから形成される。本開示のいくつかの実施形態では、ＰＥＧ成分は分岐ポリマーである。本開示のいくつかの実施形態では、ＰＥＧ成分は非分岐ポリマーである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧポリマー成分は、アミノ基またはその誘導体、カルボキシル基またはその誘導体、またはアミノ基またはその誘導体とカルボキシル基またはその誘導体の両方で官能化される。
【０２２９】
いくつかの実施形態では、本開示のリンカーのＰＥＧ成分は、アミノテトラエチレングリコールカルボキシル基またはその誘導体である。いくつかの実施形態では、本開示のリンカーのＰＥＧ成分は、アミノトリエチレングリコールカルボキシル基またはその誘導体である。いくつかの実施形態では、本開示のリンカーのＰＥＧ成分は、アミノジエチレングリコールカルボキシル基またはその誘導体である。いくつかの実施形態では、アミノ誘導体は、アミノ基と、アミノ基が結合されるカルボキシル基との間のアミド結合の形成である。いくつかの実施形態では、カルボキシル誘導体は、カルボキシル基と、カルボキシル基が結合されるアミノ基との間のアミド結合の形成である。いくつかの実施形態では、カルボキシル誘導体は、カルボキシル基と、カルボキシル基が結合されるヒドロキシル基との間のエステル結合の形成である。
【０２３０】
使用可能な酵素活性毒素およびその断片としては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファサルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ダイアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ツルレイシ（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン、サパオナリアオフィシナリス阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、および、トリコテセンが挙げられる。放射性結合抗体の産生には、様々な放射性核種が利用可能である。例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、および１８６Ｒｅが挙げられる。
【０２３１】
抗体と細胞毒性剤のコンジュゲートは、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（アジピン酸ジメチルＨＣＬなど）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビスアジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアナート（トリエン２，６−ジイソシアナートなど）、およびビス活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）などの様々な二官能性タンパク質カップリング剤を使用して作製される。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１０９８（１９８７年）に記載のとおり作製され得る。炭素−１４標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体への結合のための例示的なキレート剤である（国際公開第９４／１１０２６号を参照されたい）。
【０２３２】
表５は、本明細書に記載の開示で使用できる例示的な医薬剤のいくつかを列挙するが、決して網羅的なリストであることを意味するものではない。
【表４】
2020530554.tif 000012
2020530554.tif 000013
【０２３３】
当業者であれば、多種多様な可能な部分が、本開示により生じる抗体に結合され得ることを認識するであろう（例えば、「Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ」、Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ  ｔｏ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊ．Ｍ．Ｃｒｕｓｅ  ａｎｄ  Ｒ．Ｅ．Ｌｅｗｉｓ、Ｊｒ（編）、Ｃａｒｇｅｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９年）（その全内容は参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。
【０２３４】
連結は、抗体および他の部分がそれぞれの活性を保持する限り、２つの分子を結合するあらゆる化学反応によって達成され得る。この連結は、共有結合、親和性結合、インターカレーション、座標結合、錯体形成など、多くの化学的メカニズムを含んでよい。しかし、いくつかの実施形態では、結合は共有結合による結合である。共有結合は、既存の側鎖の直接縮合、または外部架橋分子の取り込みのいずれかによって達成され得る。多くの二価または多価の連結剤が、本開示の抗体などのタンパク質分子を他の分子に連結するのに有用である。例えば、代表的なカップリング剤としては、チオエステル、カルボジイミド、スクシンイミドエステル、ジイソシアネート、グルタルアルデヒド、ジアゾベンゼン、およびヘキサメチレンジアミンなどの有機化合物を挙げることができる。このリストは、当技術分野で公知である様々なクラスのカップリング剤を網羅することを意図するものではなく、より一般的なカップリング剤の例示である（Ｋｉｌｌｅｎ  ａｎｄ  Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍ，Ｊｏｕｒ．Ｉｍｍｕｎ．１３３：１３３５−２５４９（１９８４年）；Ｊａｎｓｅｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ６２：１８５−２１６（１９８２年）；およびＶｉｔｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１０９８（１９８７年）を参照されたい）。
【０２３５】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物および方法は、活性化可能抗体配列に挿入されるか、さもなければそれらに含まれる修飾アミノ酸配列を介する部位特異的結合のために修飾されている結合型活性化可能抗体と共に使用される。これらの修飾アミノ酸配列は、結合型活性化可能抗体内のコンジュゲート剤の制御された配置および／または用量を可能にするように設計される。例えば、活性化可能抗体は、軽鎖および重鎖上の位置にシステイン置換を含むように操作でき、システイン置換は反応性チオール基を提供し、かつタンパク質の折り畳みおよび集合に悪影響を与えず抗原結合を変化させない。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、活性化可能抗体内に１つ以上の非天然アミノ酸残基を含めるか、さもなければ導入して、コンジュゲーションに好適な部位を提供するように操作できる。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、活性化可能抗体配列内に、酵素により活性化可能なペプチド配列を含むか、そうでなければ導入するように操作できる。
【０２３６】
好適なリンカーは文献に記載されている（例えば、Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｓ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４４：２０１−２０８（１９８４年）（（Ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）の使用について記載）を参照されたい）。オリゴペプチドリンカーを介して抗体に連結されたハロゲン化アセチルヒドラジド誘導体の使用を記載している米国特許第５，０３０，７１９号も参照されたい。いくつかの実施形態では、好適なリンカーとしては、（ｉ）ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ−プロピル）カルボジイミド塩酸塩；（ｉｉ）ＳＭＰＴ（４−スクシンイミジルオキシカルボニル−アルファ−メチル−アルファ−（２−プリジル−ジチオ）−トルエン（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｃａｔ．（２１５５８Ｇ）；（ｉｉｉ）ＳＰＤＰ（スクシンイミジル−６［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，カタログ番号２１６５１Ｇ）；（ｉｖ）スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ（スルホスクシンイミジル６［３−（２−ピリジルジチオ）−プロピアンアミド］ヘキサノエート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．カタログ番号２１６５−Ｇ）；および（ｖ）ＥＤＣに結合されたスルホ−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド：Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，カタログ番号２４５１０）が挙げられる。追加のリンカーとしては、これらに限定されないが、ＳＭＣＣ（（スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート）、スルホ−ＳＭＣＣ（スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート）、ＳＰＤＢ（Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート）、またはスルホ−ＳＰＤＢ（Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホブタノエート）が挙げられる。
【０２３７】
上記のリンカーは、異なる属性を有する成分を含むため、異なる物理化学的特性を有するコンジュゲートをもたらす。例えば、アルキルカルボキシレートのスルホ−ＮＨＳエステルは、芳香族カルボキシレートのスルホ−ＮＨＳエステルよりも安定である。ＮＨＳエステル含有リンカーは、スルホＮＨＳエステルよりも溶解性が低い。さらに、リンカーＳＭＰＴは立体障害のあるジスルフィド結合を含み、安定性が向上したコンジュゲートを形成し得る。ジスルフィド結合は一般に、ジスルフィド結合がｉｎ  ｖｉｔｒｏで切断されるため、他の結合よりも安定性が低く、その結果、利用できるコンジュゲートが少ない。スルホＮＨＳは、特に、カルボジイミドのカップリングの安定性を高めることができる。カルボジイミドのカップリング（ＥＤＣなど）は、スルホＮＨＳと組み合わせて使用される場合、カルボジイミドカップリング反応単独よりも加水分解に対してより耐性であるエステルを形成する。
【０２３８】
いくつかの実施形態では、リンカーは切断可能である。いくつかの実施形態では、リンカーは切断不能である。いくつかの実施形態では、２つ以上のリンカーが存在する。２つ以上のリンカーはすべて同じである、すなわち切断可能か切断不能であり、または２つ以上のリンカーは異なる、すなわち少なくとも１つが切断可能であり、少なくとも１つが切断不能である。
【０２３９】
剤をＡＢに付着させるいくつかの方法のいずれかを使用して、剤をＡＢに付着させ得る。（ａ）ＡＢの炭水化物部分への付着、または（ｂ）ＡＢのスルフヒドリル基への付着、または（ｃ）ＡＢのアミノ基への付着、または（ｄ）ＡＢのカルボキシレート基への付着。いくつかの実施形態では、ＡＢは、少なくとも２つの反応性基（一方はＡＢと反応し、他方は剤と反応する）を有する中間リンカーを介して、剤に共有結合により付着され得る。任意の適合性有機化合物を含み得るリンカーは、ＡＢ（または剤）との反応がＡＢの反応性および選択性に悪影響を与えないように選択され得る。さらに、剤へのリンカーの付着は、剤の活性を破壊しないであろう。酸化抗体または酸化抗体断片との反応に好適なリンカーは、一級アミン基、二級アミン基、ヒドラジン基、ヒドラジド基、ヒドロキシルアミン基、フェニルヒドラジン基、セミカルバジド基およびチオセミカルバジド基からなる群から選択されるアミンを含むものを含む。こうした反応性官能基は、リンカーの構造の一部として存在する場合があり、またはこうした基を含まないリンカーの好適な化学修飾により導入され得る。
【０２４０】
本開示によれば、還元されたＡＢへの付着に好適なリンカーとしては、還元された抗体または断片のスルフヒドリル基と反応できる特定の反応基を有するものが挙げられる。こうした反応性基は、これらに限定されないが、反応性ハロアルキル基（例えば、ハロアセチル基など）、ｐ−メルクリベンゾエート基、およびマイケル型付加反応が可能な基（例えば、マレイミドおよびＭｉｔｒａ  ａｎｄ  Ｌａｗｔｏｎ、１９７９年、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０１：３０９７−３１１０によって記載された型の基を含む）を含む。
【０２４１】
本開示によれば、酸化も還元もされていないＡｂへの付着に好適なリンカーとしては、Ａｂ中の非修飾リジン残基に存在する一級アミノ基と反応できる特定の官能基を有するリンカーが挙げられる。こうした反応基としては、これらに限定されないが、ＮＨＳカルボン酸または炭酸エステル、スルホＮＨＳカルボン酸または炭酸エステル、４−ニトロフェニルカルボン酸または炭酸エステル、ペンタフルオロフェニルカルボン酸または炭酸エステル、アシルイミダゾール、イソシアネート、およびイソチオシアネートが挙げられる。
【０２４２】
本開示によれば、酸化も還元もされていないＡｂへの付着に好適なリンカーとしては、好適な試薬で活性化されたＡｂ中のアスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基に存在するカルボン酸基と反応し得る特定の官能基を有するものが挙げられる。好適な活性化試薬としては、追加されたＮＨＳまたはスルホ−ＮＨＳの有無にかかわらず、ＥＤＣ、およびカルボキサミド形成に利用される他の脱水剤が挙げられる。これらの場合、好適なリンカーに存在する官能基としては、一級および二級アミン、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、およびヒドラジドが挙げられる。
【０２４３】
剤は、リンカーがＡＢに付着される前または後にリンカーに付着され得る。特定の用途では、そこでリンカーが関連する剤を含まない、ＡＢ−リンカー中間体を最初に生成することが望ましい場合もある。特定の用途に応じて、特定の剤を次いでリンカーに共有結合により付着させ得る。いくつかの実施形態では、ＡＢは、最初にＭＭ、ＣＭおよび関連するリンカーに付着され、次に結合の目的のためにリンカーに付着される。
【０２４４】
分岐リンカー：特定の実施形態では、剤を付着するための複数の部位を有する分岐リンカーが利用される。複数部位リンカーの場合、ＡＢへの単一の共有結合による付着により、複数の部位で剤を結合できるＡＢリンカー中間体が得られる。これらの部位は、アルデヒド基またはスルフヒドリル基、または剤が付着され得る任意の化学部位であり得る。
【０２４５】
いくつかの実施形態では、ＡＢの複数の部位での単一部位リンカーの付着により、より高い比活性（またはＡＢに対する剤のより高い比）を達成できる。この複数の部位は、２つの方法のいずれかによってＡＢに導入され得る。最初の方法では、同じＡＢ中に複数のアルデヒド基および／またはスルフヒドリル基を生成させ得る。次の方法では、ＡＢの一つのアルデヒドまたはスルフヒドリルに、リンカーへのその後の付着のための複数の官能部位を有する一つの「分岐リンカー」を付着し得る。分岐リンカーまたは複数部位リンカーの官能部位は、アルデヒド基またはスルフヒドリル基であり得るか、リンカーが付着され得る任意の化学部位であり得る。これらの２つのアプローチを組み合わせること、すなわち、ＡＢの複数の部位に複数の部位リンカーを付着させることによって、さらに高い比活性を得ることができる。
【０２４６】
切断可能リンカー：これらに限定されないが、ｕ−プラスミノーゲンアクチベーター、組織プラスミノーゲンアクチベーター、トリプシン、プラスミン、またはタンパク質分解活性を有する別の酵素などの、補体系の酵素による切断を受けやすいペプチドリンカーを、本開示の一実施形態で使用できる。本開示の一方法によれば、剤は、補体による切断を受けやすいリンカーを介して付着される。抗体は、補体を活性化できるクラスから選択される。したがって、抗体−剤コンジュゲートは、補体カスケードを活性化し、標的部位で剤を放出する。本開示の別の方法によれば、剤は、ｕ−プラスミノーゲンアクチベーター、組織プラスミノーゲンアクチベーター、プラスミン、またはトリプシンなどのタンパク質分解活性を有する酵素による切断を受けやすいリンカーを介して付着される。これらの切断可能なリンカーは、細胞外毒素、例えば、非限定的な例として、表５に示す細胞外毒素、のいずれかを含む結合型活性化可能抗体において有用である。
【０２４７】
切断可能なリンカー配列の非限定的な例を表６に示す。
【表５】
2020530554.tif 000014
【０２４８】
さらに、剤は、ジスルフィド結合（例えば、システイン分子のジスルフィド結合）を介してＡＢに付着され得る。多くの腫瘍は高レベルのグルタチオン（還元剤）を自然に放出するため、これはジスルフィド結合を還元し、送達部位においてその後の剤の放出をもたらす。いくつかの実施形態では、ＣＭを修飾する還元剤は、結合された活性化可能抗体のリンカーも修飾する。
【０２４９】
スペーサーおよび切断可能エレメント：いくつかの実施形態では、剤と活性化可能抗体のＡＢの間隔を最適化するような方法でリンカーを構築することが必要な場合がある。これは、一般構造：
Ｗ−（ＣＨ２）ｎ−Ｑ
式中、
Ｗは、−−ＮＨ−−ＣＨ２−−または−−ＣＨ２−−のいずれかであり、
Ｑは、アミノ酸、ペプチドであり、
ｎは、０〜２０の整数である、
のリンカーの使用により実現され得る。
【０２５０】
いくつかの実施形態では、リンカーは、スペーサーエレメントおよび切断可能エレメントを含み得る。スペーサーエレメントは、切断可能エレメントが切断を担う酵素により接近しやすいように、切断可能エレメントをＡＢのコアから離して位置付けるのに役立つ。上記の特定の分岐リンカーは、スペーサーエレメントとして機能し得る。
【０２５１】
この議論を通じて、リンカーの剤への付着（またはスペーサーエレメントの切断可能エレメントへの付着、または切断可能エレメントの剤への付着）は、特定の付着様式または反応様式である必要はないことを理解されたい。好適な安定性および生物学的適合性の生成物をもたらすいかなる反応もすべて許容される。
【０２５２】
血清補体およびリンカーの選択：本開示の一方法によれば、剤の放出が望まれる場合、補体を活性化できるクラスの抗体であるＡＢが使用される。得られるコンジュゲートは、抗原を結合する能力および補体カスケードを活性化する能力の両方を保持する。したがって、本開示のこの実施形態によれば、剤は、切断可能なリンカーまたは切断可能なエレメントの一端に結合され、リンカー基の他端は、ＡＢの特定の部位に付着される。例えば、剤がヒドロキシ基またはアミノ基を有する場合には、それはペプチド、アミノ酸または他の好適に選択されたリンカーのカルボキシ末端に、それぞれエステル結合またはアミド結合を介して付着され得る。例えば、こうした剤は、カルボジイミド反応を介してリンカーペプチドに付着され得る。剤がリンカーへの付着に干渉する官能基を含む場合、これらの干渉官能基は、付着前に遮断され得、生成物コンジュゲートまたは中間体が作製されると遮断が解除され得る。次いで、リンカーの反対側またはアミノ末端が、直接使用されるか、または補体を活性化させ得るＡＢへの結合のためのさらなる修飾後に使用される。
【０２５３】
リンカー（またはリンカーのスペーサーエレメント）は、任意の所望の長さであり得、その一端は、活性化可能抗体のＡＢの特定部位に共有結合により付着され得る。リンカーまたはスペーサーエレメントの他端は、アミノ酸またはペプチドリンカーに付着され得る。
【０２５４】
したがって、これらのコンジュゲートが補体の存在下で抗原に結合すると、剤をリンカーに付着させるアミドまたはエステル結合が切断され、その結果、活性型の剤が放出される。これらのコンジュゲートは、対象に投与されると、標的部位で剤の送達および放出を達成し、表５に記載のものに限定されないが、医薬剤、抗生物質、代謝拮抗剤、抗増殖剤などのｉｎ  ｖｉｖｏ送達に特に有効である。
【０２５５】
補体活性化を有しない放出用リンカー：標的化送達のさらに別の用途では、補体カスケードの活性化が最終的に標的細胞を溶解するため、補体活性化を有しない剤の放出が望ましい。したがって、このアプローチは、標的細胞を死滅させることなく剤の送達および放出を達成する必要がある場合に有用である。これは、標的細胞へのホルモン、酵素、コルチコステロイド、神経伝達物質、遺伝子または酵素などの細胞メディエーターの送達が望まれる場合の目標である。これらのコンジュゲートは、血清プロテアーゼによる切断を軽度に受けやすいリンカーを介して、補体を活性化できないＡＢに剤を付着することにより調製され得る。このコンジュゲートが個体に投与されると、抗原抗体複合体が急速に形成されるのに対し、剤の切断はゆっくりと生じ、その結果、標的部位で化合物が放出される。
【０２５６】
生化学的架橋剤：いくつかの実施形態では、特定の生化学的架橋剤を使用して、活性化可能抗体を１つ以上の治療剤に結合できる。架橋試薬は、２つの異なる分子の官能基を結び付ける分子架橋を形成する。２つの異なるタンパク質を段階的様式で連結するには、望ましくないホモポリマー形成を排除するヘテロ二官能性架橋剤を使用できる。
【０２５７】
リソソームプロテアーゼにより切断可能なペプチジルリンカー、例えばＶａｌ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ａｌａまたは他のジペプチドも有用である。さらに、リソソームの低ｐＨ環境で切断可能な、酸に不安定なリンカー、例えば、ビス−シアリルエーテルを使用できる。他の好適なリンカーとしては、カテプシンに不安定な基質、特に酸性ｐＨで最適な機能を示す基質が挙げられる。
【０２５８】
例示的なヘテロ二官能性架橋剤は、表７で参照される。
【表６】
2020530554.tif 000015
【０２５９】
切断不能リンカーまたは直接的付着：本開示のいくつかの実施形態では、コンジュゲートは、剤が標的に送達されるが放出されないように設計され得る。これは、剤を直接、または切断不能リンカーを介してＡＢに付着することにより達成され得る。
【０２６０】
これらの切断不能リンカーとしては、アミノ酸、ペプチド、Ｄ−アミノ酸、または本明細書に記載の方法によりＡＢへの付着にその後利用できる官能基を含むように修飾され得る他の有機化合物を挙げることができる。こうした有機リンカーの一般式は、
Ｗ−（ＣＨ２）ｎ−Ｑであり、
式中、
Ｗは、−−ＮＨ−−ＣＨ２−−または−−ＣＨ２−−のいずれかであり、
Ｑは、アミノ酸、ペプチドであり、
ｎは、０〜２０の整数である。
【０２６１】
切断不能コンジュゲート：いくつかの実施形態では、化合物は、補体を活性化しないＡＢに付着され得る。補体を活性化できないＡＢを使用する場合、この付着は、活性化された補体による切断を受けやすいリンカーを用いて、または活性化された補体による切断を受けにくいリンカーを使用して達成され得る。
【０２６２】
本明細書に開示される抗体は、免疫リポソームとしても配合され得る。抗体を含むリポソームは、Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８（１９８５年）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４０３０（１９８０年）；および米国特許第４，４８５，０４５および同第４，５４４，５４５号に記載のものなど、当該分野で公知の方法により調製される。循環時間が延長されたリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
【０２６３】
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いる逆相蒸発法によって生成され得る。リポソームは、定義された孔径のフィルターを通して押し出されて、所望の直径のリポソームを生じる。本開示の抗体のＦａｂ’断片は、ジスルフィド交換反応によりＭａｒｔｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７：２８６−２８８（１９８２年）に記載されるリポソームに結合され得る。
【０２６４】
定義：
特に定義されない限り、本開示に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。「ある（ａ）」エンティティまたは「ある（ａｎ）」エンティティという用語は、そのエンティティの１つ以上を指す。例えば、ある化合物は、１つ以上の化合物を指す。したがって、「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」、「１つ以上」、および「少なくとも１つの」という用語は同義的に使用され得る。さらに、文脈で特に必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。一般に、本明細書に記載の細胞および組織培養、分子生物学、ならびにタンパク質およびオリゴまたはポリヌクレオチドの化学およびハイブリダイゼーションに関連して利用される命名法、および技術は、当技術分野で周知であり、一般的に使用されるものである。組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、組織培養および形質転換（エレクトロポレーション、リポフェクションなど）には標準的な手法が用いられる。酵素反応および精製技術は、製造業者の仕様に従って、または当技術分野で一般的に達成されるように、または本明細書に記載されるように実施される。前述の技術および手順は一般に、当技術分野で周知の従来の方法に従って、本明細書全体を通して引用され、かつ論じられている様々な一般的およびより具体的な参考文献に記載されているとおりに実施される。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９年））を参照されたい。本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、および医薬品化学（ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）に関連して利用される命名法、ならびにこれらの実験室の手順および技術は、当技術分野で周知であり一般的に使用されるものである。標準的な手法が、化学合成、化学分析、医薬品の調製、配合、送達、および患者の治療に使用される。
【０２６５】
本開示に従って利用される場合、以下の用語は、特に明記しない限り、以下の意味を有すると理解されるものとする：
【０２６６】
本明細書で使用する「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的な活性部分、すなわち、抗原を特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含む分子を指す。「特異的に結合する」または「免疫反応する」または「免疫特異的に結合する」とは、抗体が所望の抗原の１つ以上の抗原決定基と反応し、他のポリペプチドと反応しないか、またははるかに低い親和性（Ｋｄ＞１０−６）で結合することを意味する。抗体としては、これらに限定されないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ドメイン抗体、単鎖、Ｆａｂ、およびＦ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ、およびＦａｂ発現ライブラリーが挙げられる。
【０２６７】
基本的な抗体構造単位は、四量体を含むことが公知である。各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一の対で構成され、各対は１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識を担う約１００〜１１０またはそれより多いアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能を主に担う定常領域を画定する。一般に、ヒトから得られる抗体分子は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤのクラスのいずれかに関連し、これらは、分子中に存在する重鎖の性質によって互いに異なる。特定のクラスは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２などのサブクラスも有する。さらに、ヒトでは、軽鎖はカッパ鎖またはラムダ鎖であり得る。
【０２６８】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、固有の軽鎖遺伝子産物および固有の重鎖遺伝子産物からなる、１つの分子種のみの抗体分子を含む抗体分子の集団を指す。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、集団のすべての分子において同一である。ＭＡｂは、それに対する固有の結合親和性により特徴付けられる抗原の特定のエピトープと免疫反応できる抗原結合部位を含む。
【０２６９】
「抗原結合部位」または「結合部分」という用語は、抗原結合に関与する免疫グロブリン分子の部分を指す。抗原結合部位は、重（「Ｈ」）および軽（「Ｌ」）鎖のＮ末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基によって形成される。「超可変領域」と称される重鎖および軽鎖のＶ領域内の３つの高度に異なる一続きの範囲は、「フレームワーク領域」または「ＦＲ」として公知である、より保存された隣接する一続きの範囲の間に挿入される。したがって、用語「ＦＲ」は、免疫グロブリンで超可変領域間に、およびそれに隣接して自然に見られるアミノ酸配列を指す。抗体分子において、軽鎖の３つの超可変領域および重鎖の３つの超可変領域は、３次元空間で互いに対して配置されて抗原結合表面を形成する。抗原結合表面は、結合された抗原の三次元表面に相補的であり、重鎖および軽鎖のそれぞれの３つの超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と称される。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Ｋａｂａｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９８７年および１９９１年））、またはＣｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７年）、Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３（１９８９年）の定義に従う。
【０２７０】
本明細書で使用される「エピトープ」という用語は、免疫グロブリン、ｓｃＦｖ、またはＴ細胞受容体に特異的に結合できるあらゆるタンパク質決定基を含む。「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合できるあらゆるタンパク質決定基を含む。エピトープ決定基は、通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基で構成され、通常、特定の三次元構造特性、ならびに特定の電荷特性を有する。例えば、抗体は、ポリペプチドのＮ末端ペプチドまたはＣ末端ペプチドに対して生成され得る。抗体は、解離定数が１μＭ以下の場合、いくつかの実施形態では、１００ｎＭ以下の場合、いくつかの実施形態では、１０ｎＭ以下の場合、抗原を特異的に結合すると言われる。
【０２７１】
本明細書で使用される「特異的結合」、「免疫学的結合」、および「免疫学的結合特性」という用語は、免疫グロブリン分子と、それに対し免疫グロブリンが特異的である抗原との間に生じるタイプの非共有相互作用を指す。免疫学的結合相互作用の強度または親和性は、相互作用の解離定数（Ｋｄ）で表すことができ、より小さいＫｄはより高い親和性を表す。選択されたポリペプチドの免疫学的結合特性は、当該分野で周知の方法を使用して定量化され得る。こうした方法の１つは、抗原結合部位／抗原複合体の形成および解離の速度を測定することを伴い、これらの速度は、複合体パートナーの濃度、相互作用の親和性、および両方向の速度に等しく影響を与える幾何学的パラメーターに依存する。したがって、「オン速度定数」（Ｋｏｎ）および「オフ速度定数」（Ｋｏｆｆ）の両方は、濃度、ならびに会合および解離の実際の速度を計算することによって決定され得る（Ｎａｔｕｒｅ  ３６１：１８５−８７（１９９３年）を参照されたい）。Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎの比率は、親和性に関係のないすべてのパラメーターをキャンセルでき、また、解離定数Ｋｄと等しい（一般に、Ｄａｖｉｅｓら（１９９０年）Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ５９：４３９−４７３を参照されたい）。本開示の抗体は、放射性リガンド結合アッセイまたは当業者に公知である同様のアッセイなどのアッセイによって測定した場合、結合定数（Ｋｄ）が１μＭ以下、いくつかの実施形態では１００ｎＭ以下、いくつかの実施形態では１０ｎＭ以下、いくつかの実施形態では１００ｐＭ以下〜約１ｐＭである場合、標的に特異的に結合すると言われる。
【０２７２】
本明細書で使用される「単離されたポリヌクレオチド」という用語は、ゲノム、ｃＤＮＡ、または合成起源のポリヌクレオチド、またはそれらのいくつかの組み合わせを意味し、その起源により「単離されたポリヌクレオチド」は、（１）「単離されたポリヌクレオチド」が天然に見られるポリヌクレオチドのすべてまたは一部と関連していない、（２）天然にはそれに連結されないポリヌクレオチドに作動可能に連結される、または（３）天然には、より大きい配列の一部としては発生しない。本開示によるポリヌクレオチドは、本明細書に示される重鎖免疫グロブリン分子をコードする核酸分子、および本明細書に示される軽鎖免疫グロブリン分子をコードする核酸分子を含む。
【０２７３】
本明細書で言及される「単離されたタンパク質」という用語は、ｃＤＮＡ、組換えＲＮＡ、または合成起源またはそれらのいくつかの組み合わせのタンパク質を意味し、その起源または誘導源により、「単離されたタンパク質」は、（１）天然に見られるタンパク質とは関連しないか、（２）同じ供給源の他のタンパク質を含まない、例えばマウスタンパク質を含まないか、（３）異なる種からの細胞によって発現されるか、または（４）天然に発生しない。
【０２７４】
「ポリペプチド」という用語は、本明細書では、ポリペプチド配列の天然のタンパク質、断片、または類似体を指す総称として使用される。したがって、天然のタンパク質断片および類似体は、ポリペプチド属の種である。本開示によるポリペプチドは、本明細書に示される重鎖免疫グロブリン分子、および本明細書に示される軽鎖免疫グロブリン分子、ならびに重鎖免疫グロブリン分子と軽鎖免疫グロブリン分子、例えばカッパ軽鎖免疫グロブリン分子およびその逆を含む組み合わせによって形成される抗体分子、ならびにそれらの断片および類似体を含む。
【０２７５】
本明細書において物体に適用される「天然に存在する」という用語は、物体が天然に見出すことができることを指す。例えば、自然界の供給源から単離できる生物（ウイルスなど）中に存在し、かつ実験室においてヒトによってまたは別の方法で意図的に修飾されていないポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。
【０２７６】
本明細書で使用される「作動可能に連結された」という用語は、そのように説明された構成要素の位置を指し、それらを意図された様式で機能させることができる関係にあることを指す。コード配列に「作動可能に連結された」制御配列は、コード配列の発現が、制御配列に適合する条件下で達成されるように連結される。
【０２７７】
本明細書で使用される「制御配列」という用語は、それらがライゲートされるコード配列の発現およびプロセシングを行うのに必要なポリヌクレオチド配列を指す。こうした制御配列の性質は、原核生物における宿主生物によって異なり、こうした制御配列は一般に、真核生物中のプロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列を含み、一般にこうした制御配列は、プロモーターおよび転写終結配列を含む。「制御配列」という用語は、少なくとも、その存在が発現およびプロセッシングに必須であるすべての成分を含むことを意図し、その存在が有益である追加の成分、例えばリーダー配列および融合パートナー配列も含んでよい。本明細書で言及される「ポリヌクレオチド」という用語は、少なくとも１０塩基長のヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチド、またはいずれかのタイプのヌクレオチドの修飾された型を意味する。この用語は、一本鎖および二本鎖の形態のＤＮＡを含む。
【０２７８】
本明細書で言及されるオリゴヌクレオチドという用語は、天然に存在するヌクレオチド、および天然に存在するオリゴヌクレオチドの連結および天然に存在しないオリゴヌクレオチドの連結によって共に連結される修飾型ヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、２００塩基以下の長さを一般に含むポリヌクレオチドサブセットである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さが１０〜６０塩基であり、いくつかの実施形態では、長さが１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０〜４０塩基である。オリゴヌクレオチドは通常、例えばプローブ用には一本鎖であるが、オリゴヌクレオチドは、例えば遺伝子変異体の構築での使用のために、二本鎖であってもよい。本開示のオリゴヌクレオチドは、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれかである。
【０２７９】
本明細書で言及される「天然に存在するヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含む。本明細書で言及される「修飾型ヌクレオチド」という用語は、修飾または置換された糖基などを有するヌクレオチドを含む。本明細書で言及される用語「オリゴヌクレオチド連結」は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレルロエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニラデート、ホスホロンミデートなどのオリゴヌクレオチド連結を含む。例えば、ＬａＰｌａｎｃｈｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：９０８１（１９８６年）；ＳｔｅｃらＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０６：６０７７（１９８４年）、Ｓｔｅｉｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：３２０９（１９８８年）、Ｚｏｎら、Ａｎｔｉ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ６：５３９（１９９１年）；Ｚｏｎら、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、８７〜１０８頁（Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９１年））；Ｓｔｅｃら米国特許第５，１５１，５１０号；Ｕｈｌｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｐｅｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ９０：５４３（１９９０年）を参照されたい。オリゴヌクレオチドは、必要に応じて、検出のための標識を含み得る。
【０２８０】
本明細書で使用する場合、２０個の従来のアミノ酸およびそれらの略語は従来の用法に従う。Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（第２版、Ｅ．Ｓ．Ｇｏｌｕｂ  ａｎｄ  Ｄ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎ、編、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、Ｍａｓｓ（１９９１年））を参照されたい。２０個の従来のアミノ酸、α−、α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、および他の従来のものではないアミノ酸などの非天然アミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）も、本開示のポリペプチドの好適な成分であり得る。従来のものではないアミノ酸の例として、以下が挙げられる：４ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、σ−Ｎ−メチルアルギニン、および他の類似のアミノ酸およびイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）。本明細書で使用されるポリペプチド表記では、標準の使用法および慣例に従って、左手方向がアミノ末端方向であり、右手方向がカルボキシ末端方向である。
【０２８１】
同様に、特に明記しない限り、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左端は５’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左方向は５’方向と称される。新生ＲＮＡ転写産物の５’から３’への付加の方向は、転写方向と称され、ＲＮＡと同じ配列を有し、かつＲＮＡ転写産物の５’末端に対し５’であるＤＮＡ鎖上の配列領域は、「上流配列」と称され、ＲＮＡと同じ配列を有し、かつＲＮＡ転写産物の３’末端に対し３’であるＤＮＡ鎖上の配列領域は、「下流配列」と称される。
【０２８２】
ポリペプチドに適用される場合、「実質的に同一である」という用語は、２つのペプチド配列が、デフォルトのギャップウェイトを使用するプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどにより最適に整列された場合、少なくとも８０％の配列同一性、いくつかの実施形態では、少なくとも９０％の配列同一性、いくつかの実施形態では、少なくとも９５％の配列同一性、いくつかの実施形態では、少なくとも９９％の配列同一性を共有することを意味する。
【０２８３】
いくつかの実施形態では、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。
【０２８４】
本明細書で論じられるように、抗体または免疫グロブリン分子のアミノ酸配列のわずかな変化は、本開示に包含されると考えられ、アミノ酸配列での変化は、少なくとも７５％、いくつかの実施形態では少なくとも８０％、９０％、９５％、およびいくつかの実施形態では９９％を維持することを条件とする。特に、保存的アミノ酸置換が考えられる。保存的置換は、側鎖に関連するアミノ酸のファミリー内で行われる置換である。遺伝的にコードされたアミノ酸は一般的に、次のファミリーに分類される：（１）酸性アミノ酸はアスパラギン酸、グルタミン酸である、（２）塩基性アミノ酸はリジン、アルギニン、ヒスチジンである、（３）非極性アミノ酸は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンである、および（４）非荷電極性アミノ酸は、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシンである。親水性アミノ酸としては、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸塩、グルタミン、グルタミン酸塩、ヒスチジン、リジン、セリン、およびトレオニンが挙げられる。疎水性アミノ酸としては、アラニン、システイン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン、およびバリンが挙げられる。アミノ酸の他のファミリーとしては、（ｉ）脂肪族ヒドロキシファミリーであるセリンおよびスレオニン、（ｉｉ）アミド含有ファミリーであるアスパラギンおよびグルタミン、（ｉｉｉ）脂肪族ファミリーであるアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、および（ｉｖ）芳香族ファミリーであるフェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンが挙げられる。例えば、イソロイシンまたはバリンによるロイシン、グルタミン酸塩によるアスパラギン酸塩、セリンによるトレオニンの単離された置換、または構造的に関連したアミノ酸によるあるアミノ酸の同様の置換は、特に置換がフレームワーク部位内のアミノ酸を含まない場合、得られる分子の結合または特性に大きな影響を有しないと予測することは合理的である。アミノ酸の変化が機能性ペプチドをもたらすかどうかは、ポリペプチド誘導体の比活性をアッセイすることにより容易に決定され得る。アッセイは、本明細書において詳細に記載される。抗体または免疫グロブリン分子の断片または類似体は、当業者によって容易に調製され得る。断片または類似体の好適なアミノ末端およびカルボキシ末端は、機能的ドメインの境界付近に生じる。構造的ドメインおよび機能的ドメインは、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列データを公開配列データベースまたは独自の配列データベースと比較することにより同定され得る。いくつかの実施形態では、コンピューター化された比較方法を使用して、既知の構造および／または機能の他のタンパク質において生じる配列モチーフまたは予測されるタンパク質立体構造ドメインを同定する。既知の三次元構造に折り畳まれるタンパク質配列を同定する方法は、公知である。Ｂｏｗｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：１６４（１９９１年）。したがって、前述の例は、当業者が、本開示に従って構造的ドメインおよび機能的ドメインを画定するために使用で���る配列モチーフおよび構造コンフォメーションを認識できることを実証する。
【０２８５】
好適なアミノ酸置換は、以下のものである：（１）タンパク質分解に対する感受性を低下させる、（２）酸化に対する感受性を低下させる、（３）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を変化させる、（４）結合親和性を変化させる、および（５）こうした類似体の他の物理化学的特性または機能的特性を付与するか、または変更する。類似体は、天然に存在するペプチド配列以外の配列の様々なムテインを含んでよい。例えば、単一または複数のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）は、天然に存在する配列（例えば、分子間接触を形成するドメイン（複数可）外のポリペプチドの部分）中で行われ得る。保存的アミノ酸置換は、親配列の構造的特徴を実質的に変化させてはならない（例えば、置換アミノ酸は、親配列に生じるらせんを破壊する傾向がないか、または親配列を特徴とする他のタイプの二次構造を破損させる傾向がないものでなければならない）。技術的に認められたポリペプチドの二次および三次構造の例は、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、編、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４年））；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃ．Ｂｒａｎｄｅｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｔｏｏｚｅ、編、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９９１年））；およびＴｈｏｒｎｔｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ３５４：１０５（１９９１年）に記載されている。
【０２８６】
本明細書で使用される用語「ポリペプチド断片」は、アミノ末端および／またはカルボキシ末端の欠失かつ／または１つ以上の内部欠失を有するが、残りのアミノ酸配列が、例えば、完全長のｃＤＮＡ配列から推定される天然に存在する配列における対応する位置と同一である、ポリペプチドを指す。断片は典型的には、少なくとも５、６、８または１０アミノ酸長であり、いくつかの実施形態では少なくとも１４アミノ酸長であり、いくつかの実施形態では少なくとも２０アミノ酸長であり、通常少なくとも５０アミノ酸長であり、いくつかの実施形態では、少なくとも７０アミノ酸長である。本明細書で使用される用語「類似体」は、推定されるアミノ酸配列の一部分に対する実質的な同一性を有し、かつ好適な結合条件下で標的に対する特異的結合を有する少なくとも２５個のアミノ酸のセグメントから構成されるポリペプチドを指す。典型的には、ポリペプチド類似体は、天然に存在する配列に関して保存的アミノ酸置換（または付加または欠失）を含む。類似体は典型的には、少なくとも２０アミノ酸長であり、いくつかの実施形態では、少なくとも５０アミノ酸長以上であり、多くの場合、完全長の天然に存在するポリペプチドと同じ長さであり得る。
【０２８７】
用語「剤」は、本明細書では、化学化合物、化学化合物の混合物、生体巨大分子、または生体材料からの抽出物を示すために使用される。
【０２８８】
本明細書で使用する「標識」または「標識された」という用語は、例えば放射標識されたアミノ酸の組み込みまたはマークされたアビジン（例えば、光学的方法または熱量測定法によって検出できる蛍光マーカーまたは酵素活性を含むストレプトアビジン）により検出できるビオチニル部分のポリペプチドへの付着による、検出可能なマーカーの組み込みを指す。特定の状況では、標識またはマーカーも治療用であり得る。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識する様々な方法が当技術分野において公知であり、使用できる。ポリペプチドの標識の例は、これらに限定されないが、以下の：放射性同位元素または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ｐ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光、ビオチン基、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパーペア配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）を含む。いくつかの実施形態では、標識は、潜在的な立体障害を減少させるために、様々な長さのスペーサーアームによって付着される。本明細書で使用される用語「医薬剤または薬物」は、患者に適切に投与されたときに所望の治療効果を誘導できる化学化合物または組成物を指す。
【０２８９】
本明細書の他の化学用語は、Ｔｈｅ  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｒｍｓ（Ｐａｒｋｅｒ，Ｓ．編、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（１９８５年））に例示される当技術分野における従来の用法に従って使用される。
【０２９０】
本明細書で使用される「実質的に純粋な」は、対象種が、存在する優勢な種であることを意味し（すなわち、それがモル基準で、組成物中の他の個々のいかなる種よりも豊富である）、いくつかの実施形態では、実質的に精製された画分は、対象種が、存在するすべての巨大分子種の少なくとも約５０パーセント（モル基準）を構成する、組成物である。
【０２９１】
一般に、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在するすべての巨大分子種の約８０パーセント超、いくつかの実施形態では約８５％、９０％、９５％、および９９％超を構成する。いくつかの実施形態では、対象種は、組成物が本質的に単一の高分子種からなる、本質的に均一（混入種が従来の検出方法では、組成物中に検出され得ない）へと精製される。
【０２９２】
患者という用語は、ヒトおよび獣医学の対象を含む。
【０２９３】
本開示の抗体および／または活性化可能抗体は、所与の標的、例えばヒト標的タンパク質を特異的に結合する。本開示には、本明細書に記載の抗体および／または活性化可能抗体と同じエピトープに結合する抗体および／または活性化可能抗体も含まれる。また、本開示には、標的への結合について本明細書に記載の抗体および／または活性化可能抗体と競合する抗体および／または抗体活性化可能抗体も含まれる。また、本開示には、標的への結合について本明細書に記載の抗体および／または活性化可能抗体と交差競合する抗体および／または抗体活性化可能抗体も含まれる。
【０２９４】
当業者は、あるモノクローナル抗体（例えば、マウスモノクローナル抗体またはヒト化抗体）が、本明細書に記載の方法で使用されるモノクローナル抗体と同じ特異性を有するか否かを、前者が後者の標的への結合を防ぐか否かを確認することによって、過度の実験をすることなく、決定できることを認識するであろう。試験されるモノクローナル抗体が本開示のモノクローナル抗体と競合する場合、本開示のモノクローナル抗体による結合が減少することによって示されるように、２つのモノクローナル抗体は同じエピトープか、または密接に関連するエピトープに結合する。モノクローナル抗体が本開示のモノクローナル抗体の特異性を有するか否かを決定するための代替的方法は、本開示のモノクローナル抗体を標的とプレインキュベートし、その後、試験されるモノクローナル抗体を追加して、試験されるモノクローナル抗体が、標的を結合する能力を阻害されるかを決定することである。試験されるモノクローナル抗体が阻害される場合、おそらく、それは本開示のモノクローナル抗体と同じか、または機能的に同等のエピトープ特異性を有する。
【０２９５】
多重特異性活性化可能抗体
本開示は、多重特異性活性化可能抗体を使用する方法および組成物も提供する。本明細書で提供される多重特異性活性化可能抗体は、標的および少なくとも１つ以上の異なる抗原またはエピトープを認識し、かつ多重特異性抗体の少なくとも１つの抗原またはエピトープ結合ドメインに連結された少なくとも１つのマスキング部分（ＭＭ）を含む多重特異性抗体であり、ＭＭの連結が、抗原またはエピトープ結合ドメインがその標的を結合する能力を低下させるようにする。いくつかの実施形態では、ＭＭは、少なくとも１つのプロテアーゼの基質として機能する切断可能部分（ＣＭ）を介して多重特異性抗体の抗原結合ドメインまたはエピトープ結合ドメインに連結される。本明細書で提供される活性化可能な多重特異性抗体は、循環において安定であり、意図された治療部位および／または診断部位で活性化されるが、正常な、すなわち健康な組織では活性化されず、活性化された場合には、対応する未修飾の多重特異性抗体に少なくとも匹敵する標的への結合を呈する。
【０２９６】
いくつかの実施形態では、多重特異性活性化可能抗体は、免疫エフェクター細胞と係合するように設計され、本明細書では、免疫エフェクター細胞係合多重特異性活性化可能抗体とも称される。いくつかの実施形態では、多重特異性活性化可能抗体は、白血球に係合するように設計され、本明細書では、白血球係合多重特異性活性化可能抗体とも称される。いくつかの実施形態では、多重特異性活性化可能抗体は、Ｔ細胞に係合するように設計され、本明細書では、Ｔ細胞係合多重特異性活性化可能抗体とも称される。いくつかの実施形態では、多重特異性活性化可能抗体は、Ｔ細胞上、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上、骨髄単核細胞上、マクロファージ上、および／または別の免疫エフェクター細胞上などの白血球上の表面抗原に係合する。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は白血球である。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞はＮＫ細胞である。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、骨髄単核細胞などの単核細胞である。いくつかの実施形態では、多重特異性活性化可能抗体は、複数の標的および／または複数のエピトープと結合するか、または相互作用するように設計され、本明細書では多重抗原標的化可能抗体とも呼ばれる。本明細書で使用される場合、用語「標的」および「抗原」は同義的に使用される。
【０２９７】
いくつかの実施形態では、本開示の免疫エフェクター細胞係合多重特異性活性化可能抗体は、標的を結合する標的化抗体またはその抗原結合断片、および免疫エフェクター細胞係合抗体またはその抗原結合部分を含み、標的化抗体またはその抗原結合断片および／または免疫エフェクター細胞係合抗体またはその抗原結合部分の少なくとも１つがマスクされる。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞係合抗体またはその抗原結合断片は、第１の免疫エフェクター細胞係合標的を結合する第１の抗体またはその抗原結合断片（ＡＢ１）を含み、ＡＢ１は、マスキング部分（ＭＭ１）に付着され、ＭＭ１の連結が、ＡＢ１が第１の標的を結合する能力を低下させるようにする。いくつかの実施形態では、標的化抗体またはその抗原結合断片は、標的を結合する二次抗体またはその抗原結合断片を含む、二次抗体またはその抗原結合断片（ＡＢ２）を含み、ＡＢ２は、マスキング部分（ＭＭ２）に付着され、ＭＭ２の連結が、ＡＢ２が標的を結合する能力を低下させるようにする。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞係合抗体またはその抗原結合断片は、第１の免疫エフェクター細胞係合標的を結合する第１の抗体またはその抗原結合断片（ＡＢ１）を含み、ＡＢ１は、マスキング部分（ＭＭ１）に付着され、ＭＭ１の連結が、ＡＢ１が第１の標的を結合する能力を低下させ、標的化抗体またはその抗原結合断片は、標的を結合する二次抗体またはその抗原結合断片（ＡＢ２）を含む二次抗体またはその断片を含み、ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ２）に付着され、ＭＭ２の連結が、ＡＢ２が標的を結合する能力を低下させるようにする。いくつかの実施形態では、非免疫エフェクター細胞係合抗体は、癌標的化抗体である。いくつかの実施形態では、非免疫細胞エフェクター抗体はＩｇＧである。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞係合抗体は、ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、標的化抗体（例えば、非免疫細胞エフェクター抗体）はＩｇＧであり、免疫エフェクター細胞係合抗体はｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は白血球である。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞はＮＫ細胞である。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は骨髄単核細胞である。
【０２９８】
いくつかの実施形態では、本開示のＴ細胞係合多重特異性活性化可能抗体は、標的化抗体またはその抗原結合断片、およびＴ細胞係合抗体またはその抗原結合部分を含み、ここでは、標的化抗体またはその抗原結合断片および／またはＴ細胞係合抗体またはその抗原結合部分の少なくとも１つがマスクされる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞係合抗体またはその抗原結合断片は、第１のＴ細胞係合標的に結合する第１の抗体またはその抗原結合断片（ＡＢ１）を含み、ＡＢ１は、マスキング部分（ＭＭ１）に付着され、ＭＭ１の連結が、ＡＢ１が第１の標的を結合する能力を低下させるようにする。いくつかの実施形態では、標的化抗体またはその抗原結合断片は、標的を結合する二次抗体またはその抗原結合断片を含む、二次抗体またはその抗原結合断片（ＡＢ２）を含み、ＡＢ２は、マスキング部分（ＭＭ２）に付着され、ＭＭ２の連結が、ＡＢ２が標的を結合する能力を低下させるようにする。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞係合抗体またはその抗原結合断片は、第１のＴ細胞係合標的を結合する第１の抗体またはその抗原結合断片（ＡＢ１）を含み、ＡＢ１は、マスキング部分（ＭＭ１）に付着され、ＭＭ１の連結が、ＡＢ１が第１の標的を結合する能力を低下させ、標的化抗体またはその抗原結合断片は、標的を結合する二次抗体またはその抗原結合断片（ＡＢ２）を含む二次抗体またはその断片を含み、ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ２）に付着され、ＭＭ２の連結が、ＡＢ２が標的を結合する能力を低下させるようにする。
【０２９９】
免疫エフェクター細胞係合多重特異性活性化可能抗体のいくつかの実施形態では、１つの抗原が標的であり、別の抗原は典型的には、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、骨髄単核細胞、マクロファージ、および／または他の免疫エフェクター細胞の表面に存在する刺激性または抑制性受容体であり、これらに限定されないが、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６ａ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３２、ＣＤ５６、ＣＤ１３７、ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、ＬＡＧ３、ＮＫＧ２Ｄ、ＯＸ４０、ＰＤ−１、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、またはＶＩＳＴＡなどが挙げられる。いくつかの実施形態では、抗原は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の表面に存在する刺激性受容体であり、こうした刺激性受容体の例としては、ＣＤ３、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４−１ＢＢとも称される）、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、ＮＫＧ２Ｄ、およびＯＸ４０が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、抗原はＴ細胞の表面に存在する阻害性受容体であり、こうした阻害性受容体の例としては、これらに限定されないが、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、およびＮＫ発現ＫＩＲが挙げられる。Ｔ細胞表面抗原に特異性を付与する抗体ドメインは、これらに限定されないが、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７Ｈ３、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、またはＴＮＦＳＦ９などの、Ｔ細胞受容体、ＮＫ細胞受容体、マクロファージ受容体、および／または他の免疫エフェクター細胞受容体に結合するリガンドまたはリガンドドメインによって置換されてもよい。
【０３００】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞係合多重特異性活性化可能抗体は、抗ＣＤ３イプシロン（ＣＤ３ε、本明細書ではＣＤ３ｅおよびＣＤ３とも称する）、ｓｃＦｖおよび標的化抗体またはその抗原結合断片を含み、ここでは、抗ＣＤ３εｓｃＦｖおよび／または標的化抗体またはその抗原結合部分の少なくとも１つがマスクされる。いくつかの実施形態では、ＣＤ３εｓｃＦｖは、ＣＤ３εを結合する第１の抗体またはその抗原結合断片（ＡＢ１）を含み、ＡＢ１は、マスキング部分（ＭＭ１）に付着され、ＭＭ１の連結が、ＡＢ１がＣＤ３εを結合する能力を低下させるようにする。いくつかの実施形態では、標的化抗体またはその抗原結合断片は、標的を結合する二次抗体またはその抗原結合断片を含む、二次抗体またはその抗原結合断片（ＡＢ２）を含み、ＡＢ２は、マスキング部分（ＭＭ２）に付着し、ＭＭ２が連結することにより、ＡＢ２が標的に結合する能力を低下させるようになる。いくつかの実施形態では、ＣＤ３εｓｃＦｖは、ＣＤ３εに結合する第１の抗体またはその抗原結合断片（ＡＢ１）を含み、ＡＢ１は、マスキング部分（ＭＭ１）に付着され、ＭＭ１の連結が、ＡＢ１のＣＤ３εを結合する能力を低下させ、標的化抗体またはその抗原結合断片は、標的を結合する第２の抗体またはその抗原結合断片（ＡＢ２）を含む第２の抗体またはその抗原結合断片を含み、ＡＢ２は、マスキング部分（ＭＭ２）に付着され、このため、ＭＭ２の連結が、ＡＢ２の標的を結合する能力を低下させる。
【０３０１】
いくつかの実施形態では、多抗原標的化抗体および／または多抗原標的化活性化可能抗体は、第１の標的および／または第１のエピトープを結合する少なくとも第１の抗体またはその抗原結合断片、ならびに第２の標的および／または第２のエピトープを結合する第２の抗体またはその抗原結合断片を含む。いくつかの実施形態では、多抗原標的化抗体および／または多抗原標的化活性化可能抗体は、２つ以上の異なる標的を結合する。いくつかの実施形態では、多抗原標的化抗体および／または多抗原標的化活性化可能抗体は、同じ標的上の２つ以上の異なるエピトープを結合する。いくつかの実施形態では、多抗原標的化抗体および／または多抗原標的化活性化可能抗体は、２つ以上の異なる標的および同じ標的上の２つ以上の異なるエピトープの組み合わせを結合する。
【０３０２】
いくつかの実施形態では、ＩｇＧを含む多重特異性活性化可能抗体は、マスクされたＩｇＧ可変ドメインを有する。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖを含む多重特異性活性化可能抗体は、マスクされたｓｃＦｖドメインを有する。いくつかの実施形態では、多重特異性活性化可能抗体は、ＩｇＧ可変ドメインおよびｓｃＦｖドメインの両方を有し、ＩｇＧ可変ドメインの少なくとも１つはマスキング部分に連結される。いくつかの実施形態では、多重特異性活性化可能抗体は、ＩｇＧ可変ドメインおよびｓｃＦｖドメインの両方を有し、ｓｃＦｖドメインの少なくとも１つはマスキング部分に連結される。いくつかの実施形態では、多重特異性活性化可能抗体は、ＩｇＧ可変ドメインおよびｓｃＦｖドメインの両方を有し、ＩｇＧ可変ドメインの少なくとも１つはマスキング部分に連結され、ｓｃＦｖドメインの少なくとも１つはマスキング部分に連結される。いくつかの実施形態では、多重特異性活性化可能抗体は、ＩｇＧ可変ドメインおよびｓｃＦｖドメインの両方を有し、ＩｇＧ可変ドメインおよびｓｃＦｖドメインの各々は、それ自体のマスキング部分に連結される。いくつかの実施形態では、多重特異性活性化可能抗体の１つの抗体ドメインは、標的抗原に対して特異性を有し、別の抗体ドメインは、Ｔ細胞表面抗原に対して特異性を有する。いくつかの実施形態では、多重特異性活性化可能抗体の１つの抗体ドメインは、標的抗原に対して特異性を有し、別の抗体ドメインは、別の標的抗原に対して特異性を有する。いくつかの実施形態では、多重特異性活性化可能抗体の１つの抗体ドメインは、標的抗原のエピトープに対して特異性を有し、別の抗体ドメインは、その標的抗原の別のエピトープに対して特異性を有する。
【０３０３】
多重特異性活性化可能抗体では、ｓｃＦｖは、ＩｇＧ活性化可能抗体の重鎖のカルボキシル末端に、ＩｇＧ活性化可能抗体の軽鎖のカルボキシル末端に、またはＩｇＧ活性化可能抗体の重鎖および軽鎖の両方のカルボキシル末端に融合され得る。多重特異性活性化可能抗体では、ｓｃＦｖは、ＩｇＧ活性化可能抗体の重鎖のアミノ末端に、ＩｇＧ活性化可能抗体の軽鎖のアミノ末端に、またはＩｇＧ活性化可能抗体の重鎖および軽鎖の両方のアミノ末端に融合され得る。多重特異性活性化可能抗体では、ｓｃＦｖは、ＩｇＧ活性化可能抗体の１つ以上のカルボキシル末端および１つ以上のアミノ末端の任意の組み合わせに融合され得る。いくつかの実施形態では、切断可能部分（ＣＭ）に連結されるマスキング部分（ＭＭ）は、ＩｇＧの抗原結合ドメインに付着され、そのドメインをマスクする。いくつかの実施形態では、切断可能部分（ＣＭ）に連結されるマスキング部分（ＭＭ）は、少なくとも１つのｓｃＦｖの抗原結合ドメインに付着され、そのドメインをマスクする。いくつかの実施形態では、切断可能部分（ＣＭ）に連結されるマスキング部分（ＭＭ）は、ＩｇＧの抗原結合ドメインに付着され、そのドメインをマスクし、切断可能部分（ＣＭ）に連結されるマスキング部分（ＭＭ）は、少なくとも１つのｓｃＦｖの抗原結合ドメインに付着され、そのドメインをマスクする。
【０３０４】
本開示は、以下を含むがこれらに限定されない多重特異性活性化可能抗体構造の例を提供する：（ＶＬ−ＣＬ）２：（ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−Ｌ４−ＶＨ＊−Ｌ３−ＶＬ＊−Ｌ２−ＣＭ−Ｌ１−ＭＭ）２；（ＶＬ−ＣＬ）２：（ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−Ｌ４−ＶＬ＊−Ｌ３−ＶＨ＊−Ｌ２−ＣＭ−Ｌ１−ＭＭ）２；（ＭＭ−Ｌ１−ＣＭ−Ｌ２−ＶＬ−ＣＬ）２：（ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−Ｌ４−ＶＨ＊−Ｌ３−ＶＬ＊）２；（ＭＭ−Ｌ１−ＣＭ−Ｌ２−ＶＬ−ＣＬ）２：（ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−Ｌ４−ＶＬ＊−Ｌ３−ＶＨ＊）２；（ＶＬ−ＣＬ）２：（ＭＭ−Ｌ１−ＣＭ−Ｌ２−ＶＬ＊−Ｌ３−ＶＨ＊−Ｌ４−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）２；（ＶＬ−ＣＬ）２：（ＭＭ−Ｌ１−ＣＭ−Ｌ２−ＶＨ＊−Ｌ３−ＶＬ＊−Ｌ４−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）２；（ＭＭ−Ｌ１−ＣＭ−Ｌ２−ＶＬ−ＣＬ）２：（ＶＬ＊−Ｌ３−ＶＨ＊−Ｌ４−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）２；（ＭＭ−Ｌ１−ＣＭ−Ｌ２−ＶＬ−ＣＬ）２：（ＶＨ＊−Ｌ３−ＶＬ＊−Ｌ４−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）２；（ＶＬ−ＣＬ−Ｌ４−ＶＨ＊−Ｌ３−ＶＬ＊−Ｌ２−ＣＭ−Ｌ１−ＭＭ）２：（ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）２；（ＶＬ−ＣＬ−Ｌ４−ＶＬ＊−Ｌ３−ＶＨ＊−Ｌ２−ＣＭ−Ｌ１−ＭＭ）２：（ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）２；（ＭＭ−Ｌ１−ＣＭ−Ｌ２−ＶＬ＊−Ｌ３−ＶＨ＊−Ｌ４−ＶＬ−ＣＬ）２：（ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）２；（ＭＭ−Ｌ１−ＣＭ−Ｌ２−ＶＨ＊−Ｌ３−ＶＬ＊−Ｌ４−ＶＬ−ＣＬ）２：（ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）２；（ＶＬ−ＣＬ−Ｌ４−ＶＨ＊−Ｌ３−ＶＬ＊−Ｌ２−ＣＭ−Ｌ１−ＭＭ）２：（ＭＭ−Ｌ１−ＣＭ−Ｌ２−ＶＬ＊−Ｌ３−ＶＨ＊−Ｌ４−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）２；（ＶＬ−ＣＬ−Ｌ４−ＶＨ＊−Ｌ３−ＶＬ＊−Ｌ２−ＣＭ−Ｌ１−ＭＭ）２：（ＭＭ−Ｌ１−ＣＭ−Ｌ２−ＶＨ＊−Ｌ３−ＶＬ＊−Ｌ４−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）２；（ＶＬ−ＣＬ−Ｌ４−ＶＬ＊−Ｌ３−ＶＨ＊−Ｌ２−ＣＭ−Ｌ１−ＭＭ）２：（ＭＭ−Ｌ１−ＣＭ−Ｌ２−ＶＬ＊−Ｌ３−ＶＨ＊−Ｌ４−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）２；（ＶＬ−ＣＬ−Ｌ４−ＶＬ＊−Ｌ３−ＶＨ＊−Ｌ２−ＣＭ−Ｌ１−ＭＭ）２：（ＭＭ−Ｌ１−ＣＭ−Ｌ２−ＶＨ＊−Ｌ３−ＶＬ＊−Ｌ４−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）２；（ＶＬ−ＣＬ−Ｌ４−ＶＨ＊−Ｌ３−ＶＬ＊）２：（ＭＭ−Ｌ１−ＣＭ−Ｌ２−ＶＬ＊−Ｌ３−ＶＨ＊−Ｌ４−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）２；（ＶＬ−ＣＬ−Ｌ４−ＶＨ＊−Ｌ３−ＶＬ＊）２：（ＭＭ−Ｌ１−ＣＭ−Ｌ２−ＶＨ＊−Ｌ３−ＶＬ＊−Ｌ４−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）２；（ＶＬ−ＣＬ−Ｌ４−ＶＬ＊−Ｌ３−ＶＨ＊）２：（ＭＭ−Ｌ１−ＣＭ−Ｌ２−ＶＬ＊−Ｌ３−ＶＨ＊−Ｌ４−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）２；（ＶＬ−ＣＬ−Ｌ４−ＶＬ＊−Ｌ３−ＶＨ＊）２：（ＭＭ−Ｌ１−ＣＭ−Ｌ２−ＶＨ＊−Ｌ３−ＶＬ＊−Ｌ４−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）２；（ＶＬ−ＣＬ−Ｌ４−ＶＨ＊−Ｌ３−ＶＬ＊−Ｌ２−ＣＭ−Ｌ１−ＭＭ）２：（ＶＬ＊−Ｌ３−ＶＨ＊−Ｌ４−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）２；（ＶＬ−ＣＬ−Ｌ４−ＶＨ＊−Ｌ３−ＶＬ＊−Ｌ２−ＣＭ−Ｌ１−ＭＭ）２：（ＶＨ＊−Ｌ３−ＶＬ＊−Ｌ４−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）２；（ＶＬ−ＣＬ−Ｌ４−ＶＬ＊−Ｌ３−ＶＨ＊−Ｌ２−ＣＭ−Ｌ１−ＭＭ）２：（ＶＬ＊−Ｌ３−ＶＨ＊−Ｌ４−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）２；または（ＶＬ−ＣＬ−Ｌ４−ＶＬ＊−Ｌ３−ＶＨ＊−Ｌ２−ＣＭ−Ｌ１−ＭＭ）２：（ＶＨ＊−Ｌ３−ＶＬ＊−Ｌ４−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）２。ＶＬおよびＶＨは、ＩｇＧに含まれる第１の特異性の軽可変ドメインおよび重可変ドメインを表し、ＶＬ＊およびＶＨ＊は、ｓｃＦｖに含まれる第２の特異性の可変ドメインを表し、Ｌ１は、マスキング部分（ＭＭ）と切断可能部分（ＣＭ）を接続するリンカーペプチドであり、Ｌ２は、切断可能部分（ＣＭ）と抗体とを接続するリンカーペプチドであり、Ｌ３は、ｓｃＦｖの可変ドメインを接続するリンカーペプチドであり、Ｌ４は、第１の特異性の抗体を第２の特異性の抗体に接続するリンカーペプチドであり、ＣＬは、軽鎖定常ドメインであり、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３は、重鎖定常ドメインである。第１および第２の特異性は、任意の抗原またはエピトープに対するものであり得る。
【０３０５】
Ｔ細胞係合多重特異性活性化可能抗体のいくつかの実施形態では、１つの抗原が標的であり、別の抗原は典型的には、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、骨髄単核細胞、マクロファージ、および／または他の免疫エフェクター細胞の表面に存在する刺激性受容体（本明細書では活性化とも称する）または阻害性受容体であり、これらに限定されないが、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６ａ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３２、ＣＤ５６、ＣＤ１３７（ＴＮＦＲＳＦ９とも称される）、ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、ＬＡＧ３、ＮＫＧ２Ｄ、ＯＸ４０、ＰＤ−１、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、またはＶＩＳＴＡなどである。Ｔ細胞表面抗原に特異性を付与する抗体ドメインは、Ｔ細胞受容体、ＮＫ細胞受容体、マクロファージ受容体、および／または他の免疫エフェクター細胞受容体に結合するリガンドまたはリガンドドメインによって置換されてもよい。
【０３０６】
いくつかの実施形態では、標的化抗体は、本明細書に開示される抗体である。いくつかの実施形態では、標的化抗体は、活性化可能抗体の形態であり得る。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、Ｐｒｏ−ｓｃＦｖの形態であり得る（例えば、国際公開第２００９／０２５８４６号、国際公開第２０１０／０８１１７３号を参照されたい）。
【０３０７】
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖはＣＤ３εへの結合に特異的であり、ＣＤ３εを結合する抗体またはその断片、例えばＣＨ２５２７、ＦＮ１８、Ｈ２Ｃ、ＯＫＴ３、２Ｃ１１、ＵＣＨＴ１、またはＶ９を含むか、またはそれらに由来する。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、ＣＴＬＡ−４（本明細書ではＣＴＬＡおよびＣＴＬＡ４とも称される）の結合に特異的である。
【０３０８】
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｃＦｖは、アミノ酸配列：
GGGSGGGGSGSGGGSGGGGSGGGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPLTFGGGTKVEIKRSGGSTITSYNVYYTKLSSSGTQVQLVQTGGGVVQPGRSLRLSCAASGSTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATNSLYWYFDLWGRGTLVTVSSAS（配列番号６４３）
を含む。
【０３０９】
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｃＦｖは、配列番号６４３のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一であるアミノ酸配列を含む。
【０３１０】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３εｓｃＦｖは、アミノ酸配列：
GGGSGGGGSGSGGGSGGGGSGGGQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINR（配列番号６４４）
を含む。
【０３１１】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３εｓｃＦｖは、配列番号６４４のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一であるアミノ酸配列を含む。
【０３１２】
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、１つ以上のＴ細胞、１つ以上のＮＫ細胞、および／または１つ以上のマクロファージの結合に特異的である。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６ａ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３２、ＣＤ５６、ＣＤ１３７、ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、ＬＡＧ３、ＮＫＧ２Ｄ、ＯＸ４０、ＰＤ−１、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、またはＶＩＳＴＡからなる群から選択される標的の結合に特異的である。
【０３１３】
いくつかの実施形態では、多重特異性活性化可能抗体は、ＡＢに結合された剤も含む。いくつかの実施形態では、剤は治療剤である。いくつかの実施形態では、剤は抗腫瘍剤である。いくつかの実施形態では、剤は、毒素またはその断片である。いくつかの実施形態では、剤は、リンカーを介して多重特異性活性化可能抗体に結合される。いくつかの実施形態では、剤は切断可能リンカーを介してＡＢに結合される。いくつかの実施形態では、リンカーは切断不能リンカーである。いくつかの実施形態では、剤は微小管阻害剤である。いくつかの実施形態では、剤は、ＤＮＡアルキル化剤またはＤＮＡ挿入剤などの核酸損傷剤、または他のＤＮＡ損傷剤である。いくつかの実施形態では、リンカーは切断可能なリンカーである。いくつかの実施形態では、剤は、表５に列挙される群から選択される剤である。いくつかの実施形態では、剤は、ドラスタチンである。いくつかの実施形態では、剤は、オーリスタチンまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、剤は、オーリスタチンＥまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、剤は、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。いくつかの実施形態では、剤は、モノメチルオーリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）である。いくつかの実施形態では、剤は、メイタンシノイドまたはメイタンシノイド誘導体である。いくつかの実施形態では、剤は、ＤＭ１またはＤＭ４である。いくつかの実施形態では、剤は、デュオカルマイシンまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、剤は、カリケアマイシンまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、剤は、ピロロベンゾジアゼピンである。いくつかの実施形態では、剤は、ピロロベンゾジアゼピン二量体である。
【０３１４】
いくつかの実施形態では、多重特異性活性化可能抗体は検出可能な部分も含む。いくつかの実施形態では、検出可能な部分は診断剤である。
【０３１５】
いくつかの実施形態では、多重特異性活性化可能抗体は、１つ以上のジスルフィド結合を自然に含む。いくつかの実施形態では、多重特異性活性化可能抗体は、１つ以上のジスルフィド結合を含むように遺伝子操作され得る。
【０３１６】
本開示はまた、本明細書に記載の多重特異性活性化可能抗体をコードする単離された核酸分子、ならびにこれらの単離された核酸配列を含むベクターを提供する。本開示は、活性化可能抗体の発現をもたらす条件下で細胞を培養することにより多重特異性活性化可能抗体を産生する方法を提供し、この場合、細胞はこうした核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、こうしたベクターを含む。
【０３１７】
本開示はまた、（ａ）多重特異性活性化可能の発現をもたらす条件下で、多重特異性活性化可能抗体をコードする核酸構築物を含む細胞を培養すること、および（ｂ）多重特異性活性化可能抗体を回収すること、により本開示の多重特異性活性化可能抗体を製造する方法を提供する。好適なＡＢ、ＭＭ、および／またはＣＭは、本明細書で開示されるＡＢ、ＭＭ、および／またはＣＭのいずれかを含む。
【０３１８】
本開示はまた、第１の標的または第１のエピトープを特異的に結合する少なくとも第１の抗体またはその抗原結合断片（ＡＢ１）および第２の標的または第２のエピトープを結合する第２の抗体またはその抗原結合断片（ＡＢ２）を含む多重特異性活性化可能抗体および／または多重特異性活性化可能抗体組成物を提供し、少なくともＡＢ１がマスキング部分（ＭＭ１）に連結されるか、または付着され、ＭＭ１の連結が、ＡＢ１がその標的を結合する能力を低下するようにする。いくつかの実施形態では、ＭＭ１は、プロテアーゼ、例えば、対象における治療部位または診断部位でＡＢ１の標的と共局在するプロテアーゼ、の基質を含む第１の切断可能部分（ＣＭ１）配列を介してＡＢ１に連結される。本明細書で提供される多重特異性活性化可能抗体は、循環において安定であり、意図された治療部位および／または診断部位で活性化されるが、正常な、すなわち健康な組織では活性化されず、活性化されると、対応する未修飾の多重特異性抗体に少なくとも匹敵するＡＢ１の標的結合を呈する。好適なＡＢ、ＭＭ、および／またはＣＭは、本明細書で開示されるＡＢ、ＭＭ、および／またはＣＭのいずれかを含む。
【０３１９】
本開示は、標的を特異的に結合する少なくとも第１の抗体または抗体断片（ＡＢ１）および第２の抗体または抗体断片（ＡＢ２）を含む多重特異性活性化可能抗体を含む組成物および方法も提供し、多重特異性活性化可能抗体の少なくとも第１のＡＢは、その標的を結合するＡＢ１の能力を低下させるマスキング部分（ＭＭ１）に連結される。いくつかの実施形態では、各ＡＢは、各標的に対するその対応するＡＢの能力を低下させるＭＭに連結される。例えば、二重特異性活性化可能抗体の実施形態では、ＡＢ１は、ＡＢ１の標的を結合する能力を低下させる第１のマスキング部分（ＭＭ１）に連結され、ＡＢ２は、ＡＢ２の標的を結合する能力を低下させる第２のマスキング部分（ＭＭ２）に連結される。いくつかの実施形態では、多重特異性活性化可能抗体は、３つ以上のＡＢ領域を含み、こうした実施形態では、多重特異性活性化可能抗体中の各ＡＢについて、ＡＢ１は、ＡＢ１のその標的を結合する能力を低下させる第１のマスキング部分（ＭＭ１）に連結され、ＡＢ２は、ＡＢ２のその標的を結合する能力を低下させる第２のマスキング部分（ＭＭ２）に連結され、ＡＢ３は、ＡＢ３のその標的を結合する能力を低下させる第３のマスキング部分（ＭＭ３）に連結される、などである。好適なＡＢ、ＭＭ、および／またはＣＭは、本明細書で開示されるＡＢ、ＭＭ、および／またはＣＭのいずれかを含む。
【０３２０】
いくつかの実施形態では、多重特異性活性化可能抗体は、プロテアーゼの基質である少なくとも１つの切断可能部分（ＣＭ）をさらに含み、ＣＭはＭＭをＡＢに連結する。例えば、いくつかの実施形態では、多重特異性活性化可能抗体は、標的を特異的に結合する少なくとも第１の抗体または抗体断片（ＡＢ１）、および第２の抗体または抗体断片（ＡＢ２）を含み、多重特異性活性化可能抗体中の少なくとも第１のＡＢは、第１の切断可能部分（ＣＭ１）を介して、ＡＢ１のその標的を結合する能力を低下させるマスキング部分（ＭＭ１）に連結される。いくつかの二重特異性活性化可能抗体の実施形態では、ＡＢ１は、ＣＭ１を介してＭＭ１に連結され、ＡＢ２は、第２の切断可能部分（ＣＭ２）を介して、ＡＢ２のその標的を結合する能力を低下させる第２のマスキング部分（ＭＭ２）に連結される。いくつかの実施形態では、多重特異性活性化可能抗体は、３つ以上のＡＢ領域を含み、これらの実施形態のいくつかでは、多重特異性活性化可能抗体中の各ＡＢについて、ＡＢ１はＣＭ１を介してＭＭ１に連結され、ＡＢ２はＣＭ２を介してＭＭ２に連結され、ＡＢ３は第３の切断可能部分（ＣＭ３）を介してＡＢ３のその標的を結合する能力を低下させる第３のマスキング部分（ＭＭ３）に連結される、などである。好適なＡＢ、ＭＭ、および／またはＣＭとしては、本明細書で開示されるＡＢ、ＭＭ、および／またはＣＭのいずれかを含む。
【０３２１】
非結合立体部分または非結合立体部分の結合パートナーを有する活性化可能抗体
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物および方法は、非結合立体部分（ＮＢ）または非結合立体部分の結合パートナー（ＢＰ）を含む活性化可能抗体と共に使用され、ＢＰは、ＮＢを活性化可能抗体に動員するか、または引き付ける。本明細書で提供される活性化可能抗体は、例えば、非結合立体部分（ＮＢ）、切断可能リンカー（ＣＬ）、および標的を結合する抗体または抗体断片（ＡＢ）を含む活性化可能抗体、非結合立体部分（ＢＰ）の結合パートナー、ＣＬ、およびＡＢを含む活性化可能抗体、ならびにそこへＮＢが動員されたＢＰ、標的を結合するＣＬおよびＡＢを含む活性化可能抗体を含む。ＮＢが活性化可能抗体のＣＬおよびＡＢに共有結合により連結されるか、または活性化可能抗体のＣＬおよびＡＢに共有結合により連結されるＢＰとの相互作用により会合している活性化可能抗体を、本明細書では「ＮＢ含有活性化可能抗体」と称する。活性化可能または切り替え可能とは、活性化可能抗体が、活性化可能抗体が阻害されず、マスクされず、または切断されない状態にある（すなわち、第１の立体構造）場合の標的への第１の結合レベル、および活性化可能抗体が阻害されず、マスクされず、および／または切断された状態にある（すなわち、第２の立体構造、すなわち活性化抗体）場合の標的への第２の結合レベルを呈することを意味し、ここで、第２の標的結合レベルは、第１の標的結合レベルよりも大きい。活性化可能抗体組成物は、従来の抗体治療薬と比較して、向上された生物学的利用能およびより好ましい生体内分布を呈し得る。
【０３２２】
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、ＡＢがマスクされていないか、またはそうでなければ非治療部位および／または非診断部位への結合を阻害されていない場合にこうした部位での結合から生じ得る毒性および／または有害な副作用の低減をもたらす。
【０３２３】
非結合立体部分（ＮＢ）を含む活性化可能抗体は、その内容が全体として参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開国際公開第２０１３／１９２５４６号に記載の方法を使用して作製され得る。
【０３２４】
本発明の実施形態は以下を含む：
１．活性化可能抗体ベースの治療薬の活性化レベルを定量化する方法であって、本方法は、
ｉ）少なくとも１つのキャピラリーまたはキャピラリーの集団に積層マトリックスおよび分離マトリックスを装填することと、
ｉｉ）装填されたキャピラリーまたは装填されたキャピラリーの集団を生体試料と接触させることと、
ｉｉｉ）各キャピラリー内で生体試料の高分子量（ＭＷ）成分を、生体試料の低分子量（ＭＷ）成分から分離することと、
ｉｖ）各キャピラリー内で高ＭＷ成分および低ＭＷ成分を固定することと、
ｖ）少なくとも１つの活性化可能抗体、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体、またはそれらの組み合わせに特異的である少なくとも１つの検出可能な試薬で各キャピラリーを免疫プローブすることと、
ｖｉ）各キャピラリーまたはキャピラリーの集団における検出可能な試薬のレベルを定量化することと
を含む。
２．ステップｖ）の少なくとも１つの検出可能な試薬は、少なくとも１つの活性化可能抗体、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体、またはそれらの組み合わせに特異的な少なくとも第１の試薬、および第１の試薬に特異的に結合するか、または第１の試薬を認識する第２の試薬を含み、第２の試薬は検出可能な標識を含む、実施形態１に記載の方法。
３．ステップｖｉ）は、各キャピラリーまたはキャピラリーの集団における検出可能な標識のレベルを定量化することを含む、実施形態２に記載の方法。
４．ステップｉｉ）が約１〜５００ｎｇの生体試料を装填することを含む、実施形態１〜３のいずれか１つに記載の方法。
５．ステップｉｉ）が約５〜４０ｎｇの生体試料を装填することを含む、実施形態１〜４のいずれか１つに記載の方法。
６．生体試料が、分子量分離をもたらすのに十分な量の１つ以上のＳＤＳ含有緩衝液を用いて調製される、実施形態１〜５のいずれか１つに記載の方法。
７．ステップｉｖ）が、生体試料の高ＭＷ成分および低ＭＷ成分を固定化するためにＵＶ光を使用することを含む、実施形態１〜６のいずれか１つに記載の方法。
８．ステップｖ）の第１の試薬が、少なくとも１つの活性化可能抗体、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体、またはそれらの組み合わせに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片である、実施形態１〜７のいずれか１つに記載の方法。
９．ステップｉｖ）の第２の試薬が、第１の試薬に特異的に結合する検出可能に標識された二次抗体である、実施形態１〜８のいずれか１つに記載の方法。
１０．ステップｖ）の第１の試薬が、少なくとも１つの活性化可能抗体、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体、またはそれらの組み合わせに特異的に結合する一次抗体またはその抗原結合断片であり、ステップｖ）の第２の試薬が、一次抗体またはその抗原結合断片に特異的に結合する検出可能に標識された二次抗体である、実施形態１〜７のいずれか１つに記載の方法。
１１．検出可能な標識が第２の試薬に結合される、実施形態１〜１０のいずれか１つに記載の方法。
１２．検出可能な標識が蛍光標識であり、ステップｖｉ）が各キャピラリーまたはキャピラリーの集団における化学発光のレベルを検出することを含む、実施形態１１に記載の方法。
１３．検出可能な標識が西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）である、実施形態１２に記載の方法。
１４．生体試料が体液である、実施形態１〜１３のいずれか１つに記載の方法。
１５．体液が、血液、血漿、または血清である、実施形態１４に記載の方法。
１６．生体試料が病変組織である、実施形態１〜１３のいずれか１つに記載の方法。
１７．病変組織が溶解物である、実施形態１６に記載の方法。
１８．疾患組織が腫瘍組織である、実施形態１６または実施形態１７に記載の方法。
１９．活性化された活性化可能抗体または活性化可能抗体ベースの治療薬または完全な活性化可能抗体または活性化可能抗体ベースの治療薬の量を比較する、実施形態１〜１８のいずれか１つに記載の方法。
２０．活性化可能抗体ベースの治療薬が、結合型活性化可能抗体、多重特異性活性化可能抗体、結合型多重特異性活性化可能抗体、またはそれらの任意の組み合わせである、実施形態１９に記載の方法。
２１．アミノ酸配列ＳＹＧＭＳ（配列番号４３８）を含む可変重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）；アミノ酸配列ＴＩＳＰＳＧＩＹＴＹＹＰＶＴＶＫＧ（配列番号４３９）を含む可変重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）；アミノ酸配列ＨＨＰＮＹＧＳＴＹＬＹＹＩＤＹ（配列番号４４０）を含む可変重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）；アミノ酸配列ＫＳＳＱＳＶＦＳＳＳＮＱＫＮＹＬＡ（配列番号４４１）を含む可変軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）；アミノ酸配列ＷＡＦＴＲＥＳ（配列番号４４２）を含む可変軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）；およびアミノ酸配列ＹＱＹＬＳＳＬＴ（配列番号４４３）を含む可変軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）を含む、単離された抗体またはその抗原結合断片。
２２．抗体またはその抗原結合断片が、配列番号４２９のアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む、実施形態２１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
２３．抗体またはその抗原結合断片が、配列番号４３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、実施形態２１または実施形態２２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
２４．配列番号４２９のアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む単離された抗体またはその抗原結合断片。
２５．配列番号４３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、実施形態２４に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
２６．配列番号４３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む単離された抗体またはその抗原結合断片。
２７．配列番号４２９のアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む、実施形態２６に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
【０３２５】
本発明は、以下の実施例でさらに説明される。これらは、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
【０３２６】
実施例
実施例１．活性化された抗ＰＤＬ１活性化可能抗体および完全な抗ＰＤＬ１活性化可能抗体を結合する抗体の生成
本明細書で提供される研究は、本開示の抗ＰＤＬ１活性化可能抗体を結合する抗体を生成し、評価するために設計された。
【０３２７】
本明細書に提示される研究は、以下に示すように、配列番号４２５の重鎖配列および配列番号４２６の軽鎖配列を含む、本明細書においてＰＬ０７−２００１−Ｃ５Ｈ９ｖ２と称される抗ＰＤＬ１活性化可能抗体を使用した。
ＰＬ０７−２００１−Ｃ５Ｈ９ｖ２重鎖アミノ酸配列（配列番号４２５）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIWRNGIVTVYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKWSAAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
ＰＬ０７−２００１−Ｃ５Ｈ９ｖ２軽鎖アミノ酸配列（配列番号４２６）
QGQSGSGIALCPSHFCQLPQTGGGSSGGSGGSGGISSGLLSGRSDNHGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDNGYPSTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【０３２８】
マウスを、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより以下の表３に示す手順を用いて、キャリアタンパク質キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合された抗ＰＤＬ１活性化可能抗体ＰＬ０７−２００１−Ｃ５Ｈ９ｖ２のＶＬ  ＣＤＲ３を含むペプチド抗原ＣＱＱＤＮＧＹＰＳＴＦＧＧＧＴ（配列番号４２７）で免疫化した。３ヶ月齢の６匹の（Ｂａｌｂ／ｃ３匹およびＣ５６  ３匹）マウスを以下のプロトコルに従って免疫した。各注射の時点で、抗原アリコートを解凍し、最初の注射では完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）と、その後の注射では不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）と組み合わせた。
【表７】
2020530554.tif 000016
【０３２９】
遊離ペプチドおよびカウンタースクリーニング抗原（ヒトＩｇＧ）に対する血清力価を、標準的なＥＬＩＳＡ手順を使用して、試験ブリードで評価した。リードを、ウエスタンブロットにより、ヒト血漿中の完全長の活性化可能抗体に対して評価した。これらの結果は、すべてのマウスがそれぞれの免疫原に対して同等の力価を有することを示した。抗血清を、Ｗｅｓ（商標）システム（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）において活性化可能抗体ＰＬ０７−２００１−Ｃ５Ｈ９ｖ２に対して試験し、２匹のマウスを細胞融合のために選択した。
【０３３０】
マウスモノクローナル抗体を以下のとおり産生した：２匹のマウス由来のリンパ球をハイブリドーマの融合に使用し、９６ウェルプレート４０枚に播種した（４億個のリンパ球／マウス）。プレートを、標準的条件下において組織培養インキュベーターで保管した。
【０３３１】
実施例２．ハイブリドーマクローンのスクリーニングおよび抗体の特徴付け
本実施例は、ハイブリドーマクローンのスクリーニングおよび特徴付け、ならびに抗ＰＤＬ１活性化可能抗体ＰＬ０７−２００１−Ｃ５Ｈ９ｖ２に対して生成された、得られた抗体について記載する。
【０３３２】
親クローンからのハイブリドーマ上清をＧｅｎＳｃｒｉｐｔにより、間接ＥＬＩＳＡにより、活性化可能抗体ＰＬ０７−２００１−Ｃ５Ｈ９ｖ２のＶＬ  ＣＤＲ３を含む短いペプチドに対してスクリーニングした。簡潔に言えば、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ高結合プレートを、濃度１μｇ／ｍＬ、１００μＬ／ウェルのペプチドＢＳＡでコートした。上清を、希釈せずに使用した。１：１０００希釈の抗血清を陽性対照として使用した。ペルオキシダーゼ−ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃγ断片特異的（ヒト、ウシ、またはウマ血清アルブミンとの最小交差反応性、これらは、ｍｉｎ  Ｘ  Ｈｕ、Ｂｏｖ、Ｈｒｓ  Ｓｒ  Ｐｒｏｔとも呼ばれる）を二次として使用した。陽性シグナルを有する２０個のクローンを、抗ＰＤＬ１抗体Ｃ５Ｈ９ｖ２、活性化可能抗体ＰＬ０７−２００１−Ｃ５Ｈ９ｖ２の親抗体、および５μｇ／ｍＬのヒトＩｇＧに対してさらにスクリーニングした。抗ＰＤＬ１抗体Ｃ５Ｈ９ｖ２を濃度１μｇ／ｍＬ、１００μＬ／ウェルで高結合プレートにコートした。ヒトＩｇＧを、濃度５μｇ／ｍＬ、１００μＬ／ウェルで高結合プレートにコートした。２００ｎｇの変性され、還元された抗ＰＤＬ１抗体Ｃ５Ｈ９ｖ２を標的として用いて、これらの２０個のクローンについてウエスタンブロット分析も実施した。最終スクリーニングとして、２０個のクローンの上清もＷｅｓ（商標）システム（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）で評価した。簡潔に言えば、２０個のクローンすべてを、０．１ｘサンプル緩衝液中の１μｇ／ｍＬの１つのアームが活性化された活性化可能抗体ＰＬ０７−２００１−Ｃ５Ｈ９ｖ２、および１：１００ヒト血漿中の１μｇ／ｍＬの一方のアームが活性化された活性化可能抗体ＰＬ０７−２００１−Ｃ５Ｈ９ｖ２に対して試験した。活性化可能抗体ＰＬ０７−２００１−Ｃ５Ｈ９ｖ２への結合の強度および特異性により評価された、１７Ｇ１、１８Ｆ１、１９Ｈ１２、および２３Ｈ６、２１Ｈ１０および２７Ｃ１と称される上位６個のクローンを、１：１００ヒト血漿中濃度０．１１および０．３３μｇ／ｍＬで、１つのアームが活性化された活性化可能抗体ＰＬ０７−２００１−Ｃ５Ｈ９ｖ２に対してさらにスクリーニングした。結果を図１Ａおよび図１Ｂに示し、これは、１：１００でのヒト血漿中の０．１１、０．３３および１μｇ／ｍｌでの３７％の１つのアームが活性化された活性化抗体ＰＬ０７−２００１−Ｃ５Ｈ９ｖ２に対する活性化可能抗体ＰＬ０７−２００１−Ｃ５Ｈ９ｖ２抗イディオタイプ（抗ｉｄ）クローンのスクリーニングを示す。図１Ａは、１つのアームが活性化された活性化可能抗体ＰＬ０７−２００１−Ｃ５Ｈ９ｖ２（１、０．３３、および０．１１μｇ／ｍｌ）の濃度が低下する１７Ｇ１検出を示すエレクトロフェログラムである。図１Ｂは、１つのアームが活性化された活性化可能抗体ＰＬ０７−２００１−Ｃ５Ｈ９ｖ２の上位６個のクローンの相対活性化率を示す。相対活性化率は、様々な濃度で保持される。クローン２１Ｈ１０および２７Ｃ１は、低い親和性を有することから、濃度０．１１μｇ／ｍｌのデータはない。
【０３３３】
クローン１７Ｇ１、１８Ｆ１、１９Ｈ１２、および２３Ｈ６をサブクローニングおよび特徴付けのために選択した。分子クローニングを、以下の方法を使用して実行した。総ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ技術マニュアル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に記載される手法に従って、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔにより回収された新鮮なハイブリドーマ細胞から単離した。総ＲＮＡを次に、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標）１ｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に記載される手法に従って、アイソタイプ特異的アンチセンスプライマーまたはユニバーサルプライマーのいずれかを使用して、ｃＤＮＡへと逆転写した。可変重（ＶＨ）、可変軽（ＶＬ）、重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）抗体断片を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔのｃＤＮＡ末端の迅速な増幅（ＲＡＣＥ）プロトコルに従って増幅した。増幅された抗体断片の各々を、別々の標準的なクローニングベクター中にクローニングした。コロニーＰＣＲを実施して、正確なサイズのインサートを有するクローンをスクリーニングした。正確なサイズのインサートを有する５個以上のコロニーを、各断片について、配列決定した。異なるクローンの配列を整列し、コンセンサス配列を決定した。
【０３３４】
抗体１７Ｇ１の核酸およびアミノ酸配列を以下に示す。１７Ｇ１抗体は、アミノ酸配列ＳＹＧＭＳ（配列番号４３８）を含む可変重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）；アミノ酸配列ＴＩＳＰＳＧＩＹＴＹＹＰＶＴＶＫＧ（配列番号４３９）を含む可変重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）；アミノ酸配列ＨＨＰＮＹＧＳＴＹＬＹＹＩＤＹ（配列番号４４０）を含む可変重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）；アミノ酸配列ＫＳＳＱＳＶＦＳＳＳＮＱＫＮＹＬＡ（配列番号４４１）を含む可変軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）；アミノ酸配列ＷＡＦＴＲＥＳ（配列番号４４２）を含む可変軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）；およびアミノ酸配列ＹＱＹＬＳＳＬＴ（配列番号４４３）を含む可変軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）を含む。
成熟可変重領域：ＤＮＡ配列
[FR1]-[CDR1]-[FR2]-[CDR2]-[FR3]-[CDR3]-[FR4]
[GAGGTGCAGTTGGTGGAGTCTGGGGGAGACTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAAGTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGT][AGTTATGGCATGTCT][TGGGTTCGCCAGACTCCAGACAAAAGGCTGGAGTGGGTCGCA][ACCATTAGTCCTAGTGGTATATACACCTACTATCCAGTCACTGTGAAGGGG][CGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTTCTGTGCAAGA][CACCATCCAAACTATGGTAGTACGTACCTGTATTATATTGATTAC][TGGGGCCAAGGCACCGCTCTCACAGTCTCCTCA]（配列番号４２８）
成熟可変重領域：アミノ酸配列
[FR1]-[CDR1]-[FR2]-[CDR2]-[FR3]-[CDR3]-[FR4]
[EVQLVESGGDLVKPGGSLKVSCAASGFTFS][SYGMS][WVRQTPDKRLEWVA][TISPSGIYTYYPVTVKG][RFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYFCAR][HHPNYGSTYLYYIDY][WGQGTALTVSS]（配列番号４２９）
成熟重鎖：アミノ酸配列：１７Ｇ１＿Ｈｃ  ｍＩｇＧ２ａ
EVQLVESGGDLVKPGGSLKVSCAASGFTFSSYGMSWVRQTPDKRLEWVATISPSGIYTYYPVTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYFCARHHPNYGSTYLYYIDYWGQGTALTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK（配列番号４４４）
成熟可変軽領域：ＤＮＡ配列
[FR1]-[CDR1]-[FR2]-[CDR2]-[FR3]-[CDR3]-[FR4]
[AACATTATGATGACACAGTCGCCATCATCTCTGGCTGTGTCTGCAGGAGAAAAGGTCACTATGGCCTGT][AAGTCCAGTCAAAGTGTTTTTTCCAGTTCAAATCAGAAGAACTACTTGGCC][TGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAAATACTGATCTAC][TGGGCTTTCACTAGGGAATCT][GGTGTCCCTGACCGCTTCTCAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTTACTCTTACCATCAGCAGTGTGCAAGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGT][TATCAATACCTCTCCTCACTCACG][TTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGGTGAAA]（配列番号４３０）
成熟可変軽領域：アミノ酸配列
[FR1]-[CDR1]-[FR2]-[CDR2]-[FR3]-[CDR3]-[FR4]
[NIMMTQSPSSLAVSAGEKVTMAC][KSSQSVFSSSNQKNYLA][WYQQKPGQSPKILIY][WAFTRES][GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYC][YQYLSSLT][FGAGTKLEVK]（配列番号４３１）
成熟軽鎖：アミノ酸配列：１７Ｇ１＿Ｌｃ  ｍｋ
NIMMTQSPSSLAVSAGEKVTMACKSSQSVFSSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKILIYWAFTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCYQYLSSLTFGAGTKLEVKADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC（配列番号４４５）
【０３３５】
実施例３．抗ＰＤＬ１活性化可能抗体を結合する抗体の結合特異性
本実施例は、本開示の抗体が抗ＰＤＬ１活性化可能抗体ＰＬ０７−２００１−Ｃ５Ｈ９ｖ２を結合する能力について記載する。
【０３３６】
抗体１７Ｇ１の抗ＰＤＬ１活性化可能抗体ＰＬ０７−２００１−Ｃ５Ｈ９ｖ２への結合の特異性を試験するために、１６０ｎｇ／ｍＬの１つのアームが活性化された抗ＰＤＬ１活性化可能抗体ＰＬ０７−２００１−Ｃ５Ｈ９ｖ２をヒト血漿（ＰＢＳ中で１：１００希釈））または肺腫瘍溶解物のいずれかにスパイクした。簡潔に述べると、腫瘍ホモジネートを、バロサイクラー（Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｈａｌｔ（商標）プロテアーゼ阻害剤シングルユニットユースカクテルキット（カタログ番号７８４３０）を追加してＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＩＰ溶解緩衝液（カタログ番号８７７８８）中で調製した。抗ｉｄ抗体１７Ｇ１を、１つのアームが活性化された抗ＰＤＬ１活性化可能抗体ＰＬ０７−２００１−Ｃ５Ｈ９ｖ２でスパイクされない同じ血漿および腫瘍に対しても試験した。ＨＲＰ結合抗マウス二次抗体をルミノールおよび過酸化物と組み合わせて使用し、化学発光を測定した。試験試料を次に、Ｗｅｓ（商標）キャピラリー電気泳動イムノアッセイシステム（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）で分析し、ここでは分離を、Ｗｅｓ（商標）システムとも称されるＳＤＳベースの電気泳動によって行った。図２Ａ〜図２Ｄは、ヒト血漿（図２Ｃ）および肺腫瘍溶解物試料（図２Ｄ）にスパイクされた抗ＰＤＬ１活性化可能抗体ＰＬ０７−２００１−Ｃ５Ｈ９ｖ２に対する抗体１７Ｇ１の高い結合特異性を示す。図２Ａおよび図２Ｂは、抗ＰＤＬ１活性化可能抗体ＰＬ０７−２００１−Ｃ５Ｈ９ｖ２の非存在下で、それぞれヒト血漿および肺腫瘍溶解物試料中の抗体１７Ｇ１のバックグラウンド結合を示す。
【０３３７】
実施例４．生体試料中の活性化された抗ＰＤＬ１活性化可能抗体および完全な抗ＰＤＬ１活性化可能抗体の定量化
本実施例では、抗ＰＤＬ１活性化可能抗体ＰＬ０７−２００１−Ｃ５Ｈ９ｖ２を投与されたマウスの血漿および異種移植腫瘍試料中の活性化された抗ＰＤＬ１活性化可能抗体ＰＬ０７−２００１−Ｃ５Ｈ９ｖ２、および完全抗ＰＤＬ１活性化可能抗体ＰＬ０７−２００１−Ｃ５Ｈ９ｖ２を検出する抗ｉｄ抗体１７Ｇ１の能力を記載する。
【０３３８】
抗ＰＤＬ１活性化可能抗体ＰＬ０７−２００１−Ｃ５Ｈ９ｖ２を、一般にヒト腫瘍に関連する複数のセリンプロテアーゼおよびマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）によって切断（活性化）され（ＬｅＢｅａｕら、Ｉｍａｇｉｎｇ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ２０１３年；
１１０：９３−９８；Ｏｖｅｒａｌｌ＆Ｋｌｅｉｆｅｌｄ、２００６年、Ｖａｌｉｄａｔｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ  ａｓ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ａｎｄ  Ａｎｔｉ−Ｔａｒｇｅｔｓ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｃａｎｃｅｒ、６、２２７−２３９）、かつ血液または正常組織において低い活性を有するように設計する。腫瘍試料および血漿試料中の活性化可能抗体の活性化を評価し測定するために、試料を、本明細書に記載の方法で完全抗ＰＤＬ１活性化可能抗体ＰＬ０７−２００１−Ｃ５Ｈ９ｖ２、および活性化された抗ＰＤＬ１活性化可能抗体ＰＬ０７−２００１−Ｃ５Ｈ９ｖ２の検出を可能にするＷｅｓ（商標）システムにより分析した。このシステムを使用して、活性化可能抗体は、循環においてほとんど完全なままである（すなわち、不活性化である）が、マウス異種移植腫瘍では活性化されることが示された。
【０３３９】
一般に、次のプロトコルを使用した：マウス異種移植片腫瘍モデルを、７〜８週齢の雌のヌードマウスにマトリゲル（１：１）を含む３０μＬ無血清培地中の３ｘ１０６  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ２−４Ｄ３ＬＮ細胞をＳＣ移植することにより、開発した。体重および腫瘍の測定値を、研究期間中、週に２回測定し記録した。腫瘍体積が２００〜５００ｍｍ３に達した後、マウスを同等の平均腫瘍体積の３つの群に無作為化し、抗ＰＤＬ１活性化可能抗体ＰＬ０７−２００１−Ｃ５Ｈ９ｖ２を投与した。処置の４日後、腫瘍および血漿（ヘパリン）を収集し、分析前に−８０℃で保存した。腫瘍ホモジネート（すなわち、溶解物）を、バロサイクラー（Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｈａｌｔ（商標）プロテアーゼ阻害剤シングルユースカクテルキット（カタログ番号７８４３０）を追加してＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＩＰ溶解物緩衝液（カタログ番号８７７８８）中で調製した。ＨＡＬＴプロテアーゼ阻害剤／ＥＤＴＡを含むＩＰ溶解緩衝液中の約０．８ｍｇ／ｍＬのタンパク質溶解物およびＰＢＳ中１：１００に希釈した血漿試料を、本明細書に記載のＷｅｓ（商標）システムにより分析した。
【０３４０】
試料分析を、Ｗｅｓ（商標）キャピラリー電気泳動プラットフォーム（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）を使用して本明細書に記載の方法に従って行った。Ｓｉｍｐｌｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｓｉｚｅ  Ａｓｓａｙ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｇｕｉｄｅ（ウェブサイトｐｒｏｔｅｉｎｓｉｍｐｌｅ．ｃｏｍ／ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／０４２−８８９＿Ｒｅｖ１＿Ｓｉｚｅ＿Ａｓｓａｙ＿Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ＿Ｇｕｉｄｅ．ｐｄｆを参照されたい。いくつかの実施形態では、方法を使用して以下のいずれか１つ以上を変更することを用いて、完全種と活性化種との分離を容易にできる：スタッキング時間を変更する（例えば、延長する、または短縮する）、サンプル時間を変更する（例えば、延長する、または短縮する）、および／または分離時間を変更する（例えば、延長する、または短縮する）。
【０３４１】
一般に、１部（例えば、１μＬ）の５Ｘ蛍光マスターミックス（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）を４部（例えば、４μＬ）の溶解物と組み合わせて、微量遠心管で試験した。１ｎｇ〜５μｇの範囲の抗ＰＤＬ１活性化可能抗体ＰＬ０７−２００１−Ｃ５Ｈ９ｖ２を、抗体のスクリーニングおよび特徴付けのために使用した。腫瘍組織を含む生体試料について、ＨＡＬＴプロテアーゼ阻害剤／ＥＤＴＡを含むＩＰ溶解緩衝液中のタンパク質溶解物０．８ｍｇ／ｍＬを使用した。血漿試料を、ＰＢＳで１：１００に希釈した。一次抗体を濃度１．７ｎｇ／ｍＬで使用した（抗体希釈液２（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅカタログ番号０４２−２０３）で希釈）。ＨＲＰ結合マウス二次抗体（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）をそのままで、ルミノールおよび過酸化物と組み合わせて使用し、化学発光を測定した。Ｓｉｍｐｌｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｓｉｚｅ  Ａｓｓａｙ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｇｕｉｄｅに従って調製した試料を含むプレートを、室温、２５００ｒｐｍ（〜１０００ｘｇ）で５分間遠心分離し、その後、Ｗｅｓ（商標）システム（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）で分析した。
【０３４２】
図３Ａおよび図３Ｂは、本開示の抗イディオタイプ抗体１７Ｇ１およびＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｑｕａｌｅｘからの市販の抗ヒトＩｇＧ  Ａ１１０ＵＫ（カニクイザル吸着ヤギ抗ヒトＩｇＧ）による完全抗ＰＤＬ１活性化可能抗体ＰＬ０７−２００１−Ｃ５Ｈ９ｖ２、および活性化された抗ＰＤＬ１活性化可能抗体ＰＬ０７−２００１−Ｃ５Ｈ９ｖ２の特異的検出を比較する。本開示の抗ｉｄ抗体１７Ｇ１は、１０ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤＬ１活性化可能抗体ＰＬ０７−２００１−Ｃ５Ｈ９ｖ２で処置したマウスの血漿中で抗ＰＤＬ１活性化可能抗体ＰＬ０７−２００１−Ｃ５Ｈ９ｖ２を最小限検出できるのみである市販のヒトＩｇＧ抗体（図３Ａ）と比較して、わずか０．１ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤＬ１活性化可能抗体ＰＬ０７−２００１−Ｃ５Ｈ９ｖ２で処置したマウスの血漿中で抗ＰＤＬ１活性化可能抗体ＰＬ０７−２００１−Ｃ５Ｈ９ｖ２を検出できた（図３Ｂ）。
【０３４３】
図４Ａおよび図４Ｂは、腫瘍試料対血漿試料における抗ＰＤＬ１活性化可能抗体ＰＬ０７−２００１−Ｃ５Ｈ９ｖ２の優先的活性化を示す。この研究では、ＭＤＡ−ＭＤ−２３１異種移植マウスを１ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤＬ１活性化可能抗体ＰＬ０７−２００１−Ｃ５Ｈ９ｖ２で処置した。腫瘍試料および血漿試料を、４日目（９６時間）に収集した。腫瘍ホモジネート試料および血漿試料を、検出のために抗ｉｄ  １７Ｇ１抗体を使用してＷｅｓ（商標）システムで分析した。血漿試料は、完全抗ＰＤＬ１活性化可能抗体ＰＬ０７−２００１−Ｃ５Ｈ９ｖ２（図４Ｂ）を呈したが、腫瘍微小環境は、抗ＰＤＬ１活性化可能抗体ＰＬ０７−２００１−Ｃ５Ｈ９ｖ２（図４Ａ）の少なくとも一部分を活性化した。
【０３４４】
実施例５．生体試料中の活性化された抗ＰＤＬ１活性化可能抗体および完全な抗ＰＤＬ１活性化可能抗体の定量化
本実施例は、本発明の方法を、異なる異種腫瘍タイプおよび異なる投与濃度に適用できることを実証する。
【０３４５】
簡潔に述べると、マウス異種移植片腫瘍モデルを、７〜８週齢の雌ヌードマウスに対して、１００μＬ無血清培地中の５ｘ１０６ＳＡＳ細胞をＳＣ移植することにより開発した。体重および腫瘍の測定値を、研究期間中、週に２回測定し記録した。腫瘍体積が４５０〜５５０ｍｍ３に達した後、マウスを同等の平均腫瘍体積の３つの群に無作為化し、０．１ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤＬ１活性化可能抗体ＰＬ０７−２００１−Ｃ５Ｈ９ｖ２を投与した。処置の４日後、腫瘍および血漿（ヘパリン）試料を収集し、分析前に−８０℃で保存した。腫瘍ホモジネート（すなわち、溶解物）を、バロサイクラー（Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｈａｌｔ（商標）プロテアーゼ阻害剤シングルユースカクテルキット（カタログ番号７８４３０）を追加してＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＩＰ溶解物緩衝液（カタログ番号８７７８８）中で調製した。ＨＡＬＴプロテアーゼ阻害剤／ＥＤＴＡを含むＩＰ溶解緩衝液中の約０．８ｍｇ／ｍＬのタンパク質溶解物、およびＰＢＳ中１：２５０で希釈された血漿試料を、Ｗｅｓ（商標）システムおよび検出用の１７Ｇ１抗体を用いて本発明の方法に従って分析した。ＨＲＰ結合抗マウス二次抗体をルミノールおよび過酸化物と組み合わせて使用し、化学発光を測定した。図５Ａおよび図５Ｂは、血漿試料に対する腫瘍における活性化可能抗体治療薬の優先的活性化を示す。
【０３４６】
実施例６．生体試料中の活性化された抗ＣＤ１６６活性化可能抗体および完全抗ＣＤ１６６活性化可能抗体の定量化
本実施例は、７６１４．６−３００１−ＨｕＣＤ１６６を投与されたマウスの血漿試料および異種移植片腫瘍試料中の活性化された抗ＣＤ１６６活性化可能抗体７６１４．６−３００１−ＨｕＣＤ１６６および完全抗ＣＤ１６６活性化可能抗体７６１４．６−３００１−ＨｕＣＤ１６６を検出する能力について記載する。
【０３４７】
本明細書に提示される研究は、本明細書において７６１４．６−３００１−ＨｕＣＤ１６６とも称される抗ＣＤ１６６活性化可能抗体を使用し、これはＨｕＣＤ１６６−７６１４．６−３００１とも称され、以下に示す配列番号４３２の重鎖配列および配列番号４３３の軽鎖配列を含む。
抗ＣＤ１６６活性化可能抗体配列：
重鎖アミノ酸配列
QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTYGMGVGWIRQPPGKALEWLANIWWSEDKHYSPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTITNVDPVDTATYYCVQIDYGNDYAFTYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号４３２）
軽鎖アミノ酸配列
LCHPAVLSAWESCSSGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSDNHGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号４３３）
【０３４８】
活性化された抗ＣＤ１６６活性化可能抗体７６１４．６−３００１−ＨｕＣＤ１６６および完全抗ＣＤ１６６活性化可能抗体７６１４．６−３００１−ＨｕＣＤ１６６の定量化を、抗ヒトＩｇＧ抗体（抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｑｕａｌｅｘカタログ番号Ａ１１０ＵＫ）を用いて、Ｗｅｓ（商標）システムによって評価した。ヌードマウスに、マトリゲル（商標）と１：１で混合した無血清培地中の５ｘ１０ｅ６Ｈ２９２細胞を皮下移植した。２００〜５００ｍｍ２のＨ２９２異種移植片（ｘｅｎｏｇｒａｐｈ）を保有するマウスに、５ｍｐｋの抗ＣＤ１６６活性化可能抗体７６１４．６−３００１−ＨｕＣＤ１６６を投与した。処置の１日後、腫瘍および血漿（ヘパリン）を収集し、分析前に−８０℃で保存した。腫瘍ホモジネートを、バロサイクラー（Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｈａｌｔ（商標）プロテアーゼ阻害剤シングルユースカクテルキット（カタログ番号７８４３０）を追加してＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＩＰ溶解緩衝液（カタログ番号８７７８８）中で調製した。ＨＡＬＴプロテアーゼ阻害剤／ＥＤＴＡを含むＩＰ溶解緩衝液中のタンパク質溶解物１ｍｇ／ｍＬおよびＰＢＳ中１：２０に希釈した血漿試料を、本明細書に記載のとおり、Ｗｅｓ（商標）により分析した。ＨＲＰ結合抗マウス二次抗体をルミノールおよび過酸化物と組み合わせて使用し、化学発光を測定した。図６Ａおよび図６Ｂは、血漿（図６Ａ）と比較して腫瘍（図６Ｂ）での優先的活性化を実証する。
【０３４９】
実施例７．生体試料中の活性化された抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体および完全抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体の定量化
本実施例は、抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体３９５４−２００１−Ｃ２２５ｖ５または３９５４−３００１−Ｃ２２５ｖ５を投与されたマウスの血漿試料および異種移植腫瘍試料中の活性化された抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体３９５４−２００１−Ｃ２２５ｖ５および３９５４−３００１−Ｃ２２５ｖ５、ならびに完全抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体３９５４−２００１−Ｃ２２５ｖ５および３９５４−３００１−Ｃ２２５ｖ５を検出する能力について記載する。
【０３５０】
本明細書で提示される研究は、本明細書において３９５４−２００１−Ｃ２２５ｖ５および３９５４−３００１−Ｃ２２５ｖ５と称される抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体を使用した。抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体３９５４−２００１−Ｃ２２５ｖ５は、以下に示す配列番号４４６のＣ２２５ｖ５重鎖アミノ酸配列、およびアミノ酸配列ＣＩＳＰＲＧＣＰＤＧＰＹＶＭＹ（配列番号４４８）を含むマスキング部分を含む軽鎖、アミノ酸配列ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号４０６）を含む切断可能部分、および以下に示す配列番号４４７を含むＣ２２５ｖ５軽鎖抗体配列を含む。抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体３９５４−３００１−Ｃ２２５ｖ５は、以下に示す配列番号４４６の重鎖配列、およびアミノ酸配列ＣＩＳＰＲＧＣＰＤＧＰＹＶＭＹ（配列番号４４８）を含むマスキング部分を含む軽鎖、アミノ酸配列ＡＶＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号４１２）を含む切断可能部分、および以下に示す配列番号４４７の軽鎖配列を含む。
Ｃ２２５ｖ５重鎖抗体のアミノ酸配列：
【化４】
2020530554.tif 000017
Ｃ２２５ｖ５軽鎖抗体のアミノ酸配列：
QILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号４４７）
【０３５１】
活性化された抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体３９５４−２００１−Ｃ２２５ｖ５および３９５４−３００１−Ｃ２２５ｖ５ならびに完全抗ＥＧＦＲ活性化可能抗体３９５４−２００１−Ｃ２２５ｖ５および３９５４−３００１−Ｃ２２５ｖ５の定量化を、抗ヒトＩｇＧ抗体（抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｑｕａｌｅｘカタログ番号Ａ１１０ＵＫ）を使用するＷｅｓ（商標）システムによって評価した。ヌードマウスに、マトリゲル（商標）と１：１で混合した無血清培地中の５ｘ１０ｅ６Ｈ２９２細胞を皮下移植した。２００〜５００ｍｍ２のＨ２９２異種移植片（ｘｅｎｏｇｒａｐｈ）を保有するマウスに、２５ｍｇ／ｋｇの３９５４−２００１−Ｃ２２５ｖ５または３９５４−３００１−Ｃ２２５ｖ５を投与した。腫瘍および血漿（ヘパリン）を、処置の４日後に収集し、分析まで−８０℃で保存した。腫瘍ホモジネートを、バロサイクラー（Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｈａｌｔ（商標）プロテアーゼ阻害剤シングルユースカクテルキット（カタログ番号７８４３０）を追加してＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＩＰ溶解物緩衝液（カタログ番号８７７８８）中で調製した。ＨＡＬＴプロテアーゼ阻害剤／ＥＤＴＡを含むＩＰ溶解緩衝液中の約０．４ｍｇ／ｍＬのタンパク質溶解物、およびＰＢＳ中１：５００に希釈した血漿試料を、本明細書に記載のＷｅｓ（商標）システムにより分析した。ＨＲＰ結合抗ヤギ二次抗体をルミノールおよび過酸化物と組み合わせて使用し、化学発光を測定した。図７Ａおよび図７Ｂは、血漿（図７Ａ）と比較して腫瘍（図７Ｂ）での優先的活性化を実証する。
【０３５２】
実施例８．生体試料中の活性化された抗ＣＤ７１活性化可能抗体および完全抗ＣＤ７１活性化可能抗体の定量化
本実施例は、活性化された抗ＣＤ７１活性化可能抗体ＴＦ０２．１３−２０１１−２１．１２および完全抗ＣＤ７１活性化可能抗体ＴＦ０２．１３−２０１１−２１．１２を検出する能力について記載する。
【０３５３】
本明細書で提示される研究は、本明細書においてＴＦ０２．１３−２０１１−２１．１２と称される（２１．１２−ＴＦ０２．１３−２０１１およびｈｕＣＤ７１−ＴＦ０２．１３−２０１１とも称される）抗ＣＤ７１活性化可能抗体を使用し、これは、以下に示す、配列番号４３４の重鎖配列および配列番号４３５の軽鎖配列を含む。
抗ＣＤ７１活性化可能抗体配列：
重鎖アミノ酸配列
QVQLVQSGAEVKKPGASVKMSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGAIYPGNSETGYAQKFQGRATLTADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRENWDPGFAFWGQGTLITVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号４３４）
軽鎖アミノ酸配列
NLCTEHSAALDCRSYGGGSSGGSISSGLLSGRSDNPGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFATYYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号４３５）
【０３５４】
抗ＣＤ７１活性化可能抗体ＴＦ０２．１３−２０１１−２１．１２を、２００ｎＭマトリプターゼ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号３９４６−ＳＥ）により３７℃で一晩活性化し、ヒト血漿中の完全抗ＣＤ７１活性化可能抗体ＴＦ０２．１３−２０１１−２１．１２と混合した（Ｂｉｏｒｅｃｌａｉｍａｔｉｏｎ）。混合物を次に、抗ＣＤ７１活性化可能抗体ＴＦ０２．１３−２０１１−２１．１２の軽鎖のＣＤＲ１およびＣＤＲ３を含むペプチドで免疫化したマウス由来のハイブリドーマクローンからの上清を使用して、本明細書に記載のＷｅｓ（商標）システムによって分析し、その上清は、抗ＣＤ７１活性化可能抗体ＴＦ０２．１３−２０１１−２１．１２を特異的に認識する。ＨＲＰ結合抗マウス二次抗体をルミノールおよび過酸化物と組み合わせて使用し、化学発光を測定した。図８は、血漿中の完全な抗ＣＤ７１活性化可能抗体ＴＦ０２．１３−２０１１−２１．１２から事前に活性化されたものを分離する能力を示す。
【０３５５】
実施例９．活性化された抗ＰＤ１活性化可能抗体および完全抗ＰＤ１活性化可能抗体の定量化
本実施例は、活性化された抗ＰＤ１活性化可能抗体ＰＤ３４−２０１１−Ａ１．５  ｈＩｇＧ４  Ｓ２２８Ｐおよび完全な抗ＰＤ１活性化可能抗体ＰＤ３４−２０１１−Ａ１．５  ｈＩｇＧ４  Ｓ２２８Ｐを検出する能力について記載する。
【０３５６】
本明細書に提示される研究は、本明細書においてＰＤ３４−２０１１−Ａ１．５  ｈＩｇＧ４  Ｓ２２８Ｐと称される（Ａ１．５−ＰＤ３４−２０１１および１．５−ＰＤ３４−２０１１とも称される）抗ＰＤ１活性化可能抗体を使用し、これは、以下に示す配列番号４３６の重鎖配列および配列番号４３７の軽鎖配列を含む。
抗ＣＤ７１活性化可能抗体配列：
重鎖アミノ酸配列
evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfsgyamswvrqapgkglewvayisnsggnahyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyyctredygtspfvywgqgtlvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcppcpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgK（配列番号４３６）
軽鎖アミノ酸配列
tsycsiehypcnthhgggssggsissgllsgrsdnPgggsdiqltqspsslsasvgdrvtitcrasesvdaygisfmnwfqqkpgkapklliyaasnqgsgvpsrfsgsgsgtdftltissmqpedfatyycqqskdvpwtfgqgtkleikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec（配列番号４３７）
【０３５７】
抗ＰＤ１活性化可能抗体ＰＤ３４−２０１１−Ａ１．５  ｈＩｇＧ４  Ｓ２２８Ｐを２００ｎＭ  ＭＭＰ１４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号９１８−ＭＰ）により３７℃で一晩活性化し、完全な抗ＰＤ１活性化可能抗体ＰＤ３４−２０１１−Ａ１．５  ｈＩｇＧ４  Ｓ２２８Ｐと混合した。混合物を次いで、抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｑｕａｌｅｘカタログ番号Ａ１１０ＵＫ）を使用して、本明細書に記載のＷｅｓ（商標）システム（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）により分析した。ＨＲＰ結合抗ヤギ二次抗体をルミノールおよび過酸化物と組み合わせて使用し、化学発光を測定した。図９は、完全な抗ＰＤ１活性化可能抗体ＰＤ３４−２０１１−Ａ１．５  ｈＩｇＧ４  Ｓ２２８Ｐを、対応する活性化（切断）された活性化可能抗体から分離する能力を示す。
【０３５８】
実施例１０．活性化された抗ＣＤ１６６結合型活性化可能抗体および完全な抗ＣＤ１６６結合型活性化可能抗体の定量化
本実施例は、ＳＰＤＢリンカーを介してメイタンシノイド毒素ＤＭ４に結合された活性化された抗ＣＤ１６６活性化可能抗体７６１４．６−３００１−ＨｕＣＤ１６６および完全な抗ＣＤ１６６活性化可能抗体７６１４．６−３００１−ＨｕＣＤ１６６を検出する能力について記載する。
【０３５９】
本明細書に提示される研究は、本明細書において７６１４．６−３００１−ＨｕＣＤ１６６と称される（ＨｕＣＤ１６６−７６１４．６−３００１とも称される）抗ＣＤ１６６活性化可能抗体のＤＭ４結合型活性化可能抗体を使用し、これは、以下に示す、配列番号４３２の重鎖配列および配列番号４３３の軽鎖配列を含む。
抗ＣＤ１６６活性化可能抗体配列：
重鎖アミノ酸配列
QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTYGMGVGWIRQPPGKALEWLANIWWSEDKHYSPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTITNVDPVDTATYYCVQIDYGNDYAFTYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号４３２）
軽鎖アミノ酸配列
LCHPAVLSAWESCSSGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSDNHGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号４３３）
【０３６０】
抗ＣＤ１６６結合型活性化抗体を、８０μｇ／ｍｌのマトリプターゼ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号３９４６−ＳＥ）または８０μｇ／ｍｌのＭＭＰ１４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号９１８−ＭＰ）により、３７℃で２時間活性化し、完全な結合型活性化可能抗体と混合した。混合物を次に、抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｑｕａｌｅｘカタログ番号Ａ１１０ＵＫ）を使用して、上記のＷｅｓ（商標）システムで分析した。ＨＲＰ結合抗ヤギ二次抗体をルミノールおよび過酸化物と組み合わせて使用し、化学発光を測定した。図１０Ａおよび図１０Ｂは、マトリプターゼ活性化（図１０Ａ）またはＭＭＰ１４活性化（図１０Ｂ）結合型活性化抗体を完全な結合型活性化可能抗体から分離する能力を示す。
【０３６１】
実施例１１．三次検出プロトコル
（完全な）活性化可能抗体および／または活性化（切断）された活性化可能抗体に関連するシグナルは、追加の抗体検出ステップを用いて増幅され得る。このプロトコルでは、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合されていない二次抗体を使用して一次抗体を検出し、ＨＲＰに結合された三次検出抗体を使用してシグナルを増幅する。この例では、活性化可能な抗ＣＤ１６６、７６１４．６−３００１−ＨｕＣＤ１６６を、抗ｉｄ抗体クローン２２Ｂ８（ＨＲＰに結合していない）でプローブし、その後ビオチン化抗ラットＩｇＧ  ＦＣγ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １１２−０３５−００８）、次に、ストレプトアビジンＨＲＰ（０４３−４５９−２）（すなわち、三次検出プロトコルの例）またはクローン２２Ｂ８に続いてＨＲＰ結合抗ラットＩｇＧ  ＦＣγ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １１２−０６５−００８）（すなわち、２段階プロトコルの例）によって検出した。ルミノールおよび過酸化物試薬を使用し、化学発光を測定した。ヌードマウスに、マトリゲル（商標）と１：１で混合した無血清培地中のＨ２９２細胞を皮下移植した。Ｈ２９２異種移植片を保有するマウスを、５ｍｇ／ｋｇの７６１４．６−３００１−ＨｕＣＤ１６６で処置した。組織を、投与後４日目に収集した。腫瘍ホモジネートを、バロサイクラー（Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｈａｌｔ（商標）プロテアーゼ阻害剤シングルユースカクテルキット（カタログ番号７８４３０）を追加してＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＩＰ溶解緩衝液（カタログ番号８７７８８）中で調整した。１．５ｍｇ／ｍＬのタンパク質を、本明細書に記載されるように、Ｗｅｓ（商標）キャピラリー電気泳動イムノアッセイシステムで分析した。
【０３６２】
図１１Ａは、２段階検出プロトコルを使用して生体試料中の異なる分子量を有する分子種に関連する化学発光シグナルの大きさを示す。このプロットは、活性化された活性化可能抗体（７６１４．６−３００１−ＨｕＣＤ１６６の切断産物）についておよび完全な／活性化された活性化可能抗体（完全な７６１４．６−３００１−ＨｕＣＤ１６６）について検出されたピークを示す。図１１Ｂは、三次検出プロトコルを使用して、生体試料中の異なる分子量を有する分子種に関連する化学発光シグナルの大きさを示す。三次検出プロトコルの使用は、７６１４．６−３００１−ＨｕＣＤ１６６（完全な活性化可能抗体）およびその切断産物（活性化された活性化可能抗体）の両方についてはるかに大きなシグナルをもたらした。これらの結果は、２段階プロトコルを用いて得られたシグナルと比較して、三次プロトコルを用いて得られたシグナルの増幅を示しており、これにより、各種の検出が容易になる。
【０３６３】
実施例１２．生体試料中の活性化された抗Ｊａｇｇｅｄ活性化可能抗体および完全な抗Ｊａｇｇｅｄ活性化可能抗体の定量化
本実施例は、抗Ｊａｇｇｅｄ活性化可能抗体５３４２−３００１−４Ｄ１１を投与されたマウスの腫瘍試料中の活性化された抗Ｊａｇｇｅｄ活性化可能抗体５３４２−３００１−４Ｄ１１および完全な抗Ｊａｇｇｅｄ活性化可能抗体５３４２−３００１−４Ｄ１１を検出する能力について記載する。
【０３６４】
本明細書で提示される研究は、本明細書で５３４２−３００１−４Ｄ１１と称される抗−Ｊａｇｇｅｄ活性化可能抗体を使用した。抗−Ｊａｇｇｅｄ活性化可能抗体５３４２−３００１−４Ｄ１１は、配列番号９５０の重鎖配列および配列番号９５１の軽鎖配列を含む。両方の配列セットを以下に示す：
４Ｄ１１−重鎖：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIDPEGRQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDIGGRSAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*
（配列番号ＮＯ９５０）
４Ｄ１１−５３４２−８５０４−軽鎖
QGQSGQCNIWLVGGDCRGWQGGSSGGSGGSGGAVGLLAPPGGLSGRSDNHGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTVVAPPLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*（配列番号９５１）
【０３６５】
活性化された抗Ｊａｇｇｅｄ活性化可能抗体５３４２−３００１−４Ｄ１１および完全な抗Ｊａｇｇｅｄ活性化可能抗体５３４２−３００１−４Ｄ１１の定量化を、Ｗｅｓ（商標）システム（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｉｍｐｌｅ、および抗ヒトＩｇＧ抗体（抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｑｕａｌｅｘカタログ番号Ａ１１０ＵＫ）を用いて、本発明の方法に従って評価した。ヌードマウスに、マトリゲル（商標）と１：１で混合した無血清培地中のＢｘＰＣ３細胞を皮下移植した。２００〜５００ｍｍ２のＢｘＰＣ３異種移植片を保有するマウスに、１０ｍｇ／ｋｇの５３４２−３００１−４Ｄ１１を投与した。腫瘍組織を処置の４日後に収集し、分析まで−８０℃で保存した。腫瘍ホモジネートを、バロサイクラー（Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｈａｌｔ（商標）プロテアーゼ阻害剤シングルユースカクテルキット（カタログ番号７８４３０）を追加してＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＩＰ溶解緩衝液（カタログ番号８７７８８）中で調製した。ＨＡＬＴプロテアーゼ阻害剤／ＥＤＴＡを含むＩＰ溶解緩衝液中の１．５ｍｇ／ｍＬのタンパク質溶解物とＰＢＳ中の１：１００に希釈した血漿試料を、Ｗｅｓ（商標）システムで分析した。ＨＲＰ結合抗ヤギ二次抗体をルミノールおよび過酸化物と組み合わせて使用し、化学発光を測定した。図１２は、各種について検出された化学発光シグナルを示し、したがって、腫瘍組織における５３４２−３００１−４Ｄ１１抗Ｊａｇｇｅｄ活性化可能抗体の活性化の検出を実証する。
【０３６６】
実施例１３．標準曲線を使用する、生体試料中の活性化された抗ＰＤＬ１活性化可能抗体および完全な抗ＰＤＬ１活性化可能抗体の定量化
この例は、標準曲線を作成し使用することによる、生体試料中の完全な活性化可能抗体および活性化された活性化可能抗体を定量化するためのプロトコルを示す。
【０３６７】
活性化可能抗体および／または活性化された活性化可能抗体を含むと考えられる腫瘍溶解物試料または血漿試料を調製する。これらの試料を、本明細書に記載のとおり、Ｗｅｓ（商標）システム（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）で評価し、それらの結果を精製された組換え型完全活性化抗体ＰＬ０７−２００１−Ｃ５Ｈ９ｖ２および対応する活性化された抗体の標準曲線と比較する。活性化可能抗体および活性化された活性化可能抗体の濃度を、標準曲線を用いて決定する。
【０３６８】
血漿を１：１０〜１：１００の範囲に希釈し、腫瘍溶解物を１：１〜１：１０の範囲に希釈する。キャピラリーは、標準曲線材料用に用意され、生体試料が装填されている試料と並行して電気泳動および免疫ブロットを行う。標準曲線用の試料を、（１）血漿試料用のプールされた通常のＫ２−ＥＤＴＡ血漿（下記参照）または（２）Ｐｉｅｒｃｅ  ＩＰ溶解緩衝液（下記参照）、を使用して調製する。標準曲線に使用されるキャピラリーのセットは、試料を試験するために用いられるのと同じ希釈度で、完全な活性化可能抗体および活性化された活性化可能抗体を含む。正常ドナーＫ２−ＥＤＴＡ血漿（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ）のプールを、血漿試料の標準曲線の作成に使用する。
【０３６９】
７名のヒトドナーからのＫ２−ＥＤＴＡ血漿を収集し、等量で組み合わせて正常ドナープールを作成した。１名の対象からの試料は、血漿の外観が乳白色であったためにプールに含めなかった。腫瘍溶解物を調製した。
【０３７０】
材料：１０．７ｍｇ／ｍｌ完全な活性化可能抗体ＰＬ０７−２００１−Ｃ５Ｈ９ｖ２、緩衝液：８％スクロース、３０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ８０、２５ｍＭコハク酸塩ｐＨ６；対応する活性化された活性化可能抗体１１．３５ｍｇ／ｍｌ、ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．２。
【０３７１】
希釈シリーズを、曲線１つに１つのゼロ／ブランク試料を含み、１７，５００ｎｇ／ｍｌから始めて８ｎｇ／ｍｌまで（３倍増分で）、容量に応じて、フルスカートＰＣＲプレート（Ａｘｙｇｅｎ  ＰＣＲ９６ＦＳＣ；約１００μｌウェル）または４５０μｌ  Ｖ−ｂｏｔｔｏｍプレート（Ａｘｙｇｅｎ  Ｐ−９６−４５０Ｖ−ＣＳ；約５００μｌウェル）で調製した。希釈液を、Ｗｅｓ（商標）システムキャピラリカートリッジ（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）に装填する前に氷上で保存した。抗ｉｄ抗体１７Ｇ１（１．３ｍｇ／ｍｌ）（実施例２を参照されたい）を、１：１２００の希釈で一次抗体として使用した。抗マウス二次抗体−ＨＲＰ（未処置、ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）、１０μｌ／ウェル、ベンダーのプレートレイアウトで指定される（部品番号０４２−２０５）。
【０３７２】
一旦試料を調製し、Ｗｅｓ（商標）カートリッジ（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）にアッセイに必要な試薬を装填すると、試料（生体試料（４つの繰り返し）および標準曲線用の試料（２つの繰り返し、２つのゼロ／ブランクを含む）、ならびにＷｅｓ（商標）キット（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）のビオチン化分子量標準試薬を、Ｗｅｓ（商標）カートリッジ（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）に装填した。
【０３７３】
Ｗｅｓ（商標）システムの操作を、製造業者の指示に従って実施した。これらの結果は、試料がＷｅｓ（商標）プラットフォームで完全（約３８ｋＤ）または「活性化」（約３５ｋＤ）ピークに分離したことを示した。完全ピークおよび活性ピークを次に、完全な活性化可能抗体ＰＬ０７−２００１−Ｃ５Ｈ９ｖ２および対応する活性化された抗体について調製された標準曲線に対して定量化し、それぞれの濃度をｎｇ／ｍｌで決定した。
【０３７４】
他の実施形態
本発明をその詳細な説明と共に記載しているが、上記説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を例示するものであり、限定するものではない。他の態様、利点、および変形は、以下の範囲内である。
【図１Ａ】
2020530554.tif 000018
【図１Ｂ】
2020530554.tif 000019
【図２Ａ】
2020530554.tif 000020
【図２Ｂ】
2020530554.tif 000021
【図２Ｃ】
2020530554.tif 000022
【図２Ｄ】
2020530554.tif 000023
【図３Ａ】
2020530554.tif 000024
【図３Ｂ】
2020530554.tif 000025
【図４Ａ】
2020530554.tif 000026
【図４Ｂ】
2020530554.tif 000027
【図５Ａ】
2020530554.tif 000028
【図５Ｂ】
2020530554.tif 000029
【図６Ａ】
2020530554.tif 000030
【図６Ｂ】
2020530554.tif 000031
【図７Ａ】
2020530554.tif 000032
【図７Ｂ】
2020530554.tif 000033
【図８】
2020530554.tif 000034
【図９】
2020530554.tif 000035
【図１０Ａ】
2020530554.tif 000036
【図１０Ｂ】
2020530554.tif 000037
【図１１Ａ】
2020530554.tif 000038
【図１１Ｂ】
2020530554.tif 000039
【図１２】
2020530554.tif 000040
【国際調査報告】
2020530554.tif 000041
2020530554.tif 000042
2020530554.tif 000043
2020530554.tif 000044
2020530554.tif 000045