(57)【要約】  本発明は、対象からの試料中の、ドナー特異的無細胞ＤＮＡなどの、非対象核酸の量を査定査定するための方法およびシステムに関する。方法およびシステムは、不明なときの非対象遺伝子型のシミュレーションを包含し得る。本明細書に提供される方法およびシステムは、移植拒絶反応などの疾病のリスクを決定するために使用され得る。
2020531050.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の複数の夫々の標的にてアレルの量を分析すること、ならびに試料内の定量可能なおよび／または情報価値のある標的を同定すること；
非対象について実行可能な遺伝子型でシミュレーションを実施すること；ならびに
非対象に起因する各標的のアレルの量を決定すること
を含む方法であって、
任意に、対象が、確からしい非対象遺伝子型（単数または複数）に基づき、シミュレーションから決定され、
方法が、任意に、試料中の非対象 対 対象量のパーセントまたは比率を決定することを含む、前記方法。
【請求項２】
方法が、対象遺伝子型を決定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
方法が、アレルの量を決定するための増幅を実施することをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
増幅が、少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、またはより多くの標的について実施される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
試料中の決定されたパーセントまたは比率に対して品質測度を算出することをさらに含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
方法が、適した非対象遺伝子型空間をシミュレーションすることを含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
シミュレーション（例として、Monte Carlo）が、非対象にとって確からしい遺伝子型の範囲を決定するために実施される、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
方法が、夫々の確からしい遺伝子型に基づき、夫々の標的について測定された寄与分を調整すること（例として、非対象の確からしい遺伝子型が、ヘテロ接合であると決定することに反応して、測定された寄与値を倍にすること）をさらに含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
方法が、中央値、パーセント、または比率などの平均値を算出することをさらに含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
方法が、各標準曲線および／または試料増幅値が、信頼度閾値を満たすと決定することをさらに含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
方法が、歴史的増幅形状、アレル特異的ＰＣＲアッセイ（例として、第２アレルに関する）の特異性、試料についてのシグナル対ノイズ比率、標準曲線一式についての傾きおよびｒ二乗値、挿入された対照に対して得られた非増幅値、または陰性対照から試料に対して得られた汚染値のうち少なくとも１つの分析に基づき信頼値を決定することをさらに含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
方法が、試料から得られたデータを歴史的増幅形状へフィッティングすることをさらに含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
方法が、標準曲線一式について傾きおよびｒ二乗値が、閾値を超えないと決定することをさらに含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
方法が、試料中の定量可能なおよび／または情報価値のあるものとして同定された各標的にて非対象または対象のためののラベルを創設することをさらに含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
方法が、遺伝子型に従い夫々の標的を分類することに反応して、試料内の情報価値のある標的を決定することをさらに含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
方法が、対象および非対象が、異なる遺伝子型を有する（例として、対象が、一方のアレルにホモ接合であり、かつ非対象が、ホモ接合ではないか、または他方のアレルにホモ接合である）と決定することに反応して、情報価値のあるものとして夫々の標的を分類することをさらに含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
方法が、非対象が、ヘテロ接合であると決定することに反応して、夫々の標的について測定された寄与分を調整すること（例として、非対象が、ヘテロ接合であると決定することに反応して、測定された寄与値を倍にすること）をさらに含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
方法が、情報価値のある（例として、遺伝子型判定する構成要素によって同定された）かつ品質管理試験を合格した（例として、品質管理の構成要素によって同定された）アレル比率の中央値を算出すること、およびの中央値を比率またはパーセンテージとして保存することをさらに含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
方法が、情報価値のあるかつ定量可能な標的の分布および関連するパーセントまたは比率に基づき、正規化されたロバスト変動係数（「ｒＣＶ」）を算出することをさらに含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
方法が、少数種の割合の中央値からの絶対ダイバージェンスの中央値に基づき、ロバスト標準偏差（「ｒＳＤ」）を算出することをさらに含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
方法が、例えば、非対象ｃｆ−ＤＮＡパーセンテージでの除算によって、ｒＳＤをｒＣＶへ変換することをさらに含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
方法が、ゼロによる除算を避けるために（例として、１パーセントの４分の１を除数へ加えることによって）ｒＳＤを調整することをさらに含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
方法が、情報価値のあるかつ定量可能な標的の分布および関連するパーセントまたは比率に対して決定されたｒＣＶ閾値に基づき、定量に好適な試料を同定することをさらに含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
方法が、ホモ接合である対象と汚染閾値に対する情報価値のない標的との少数アレルの割合の平均値を評価することをさらに含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
方法が、ホモ接合である対象と情報価値のない標的との少数アレルの割合の平均値に基づき、不一致の品質チェック（「ｄＱＣ」）値を計算すること、および閾値に対してｄＱＣ値を評価することをさらに含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
方法が、．５％を下回るｄＱＣ値を同定することに基づき、定量に好適な試料を同定することをさらに含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
非対象が、ドナーである、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
試料が、移植対象からである、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
移植対象が、心臓移植対象である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
試料が、小児対象からである、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
方法が、確からしいシミュレーションの総計および／または９５％信頼区間を選択することをさらに含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
方法が、ｄＱＣおよびｒＣＶの中央値を下回る値でのシミュレーションを選択すること、および／または９５％信頼区間を決定することをさらに含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
対象からの試料を分析するためのシステムであって、システムが、以下：
メモリーへ動作可能に接続された少なくとも１つのプロセッサー；
試料中の複数の夫々の標的にてアレルの量（例として、定量的な遺伝子型判定（「ｑＧＴ」）量）を分析し、ならびに試料内の定量可能なおよび／または情報価値のある標的を同定するように構成されており、少なくとも１つのプロセッサーによって実行される、第１構成要素（例として、品質管理の構成要素）；
非対象について実行可能な遺伝子型情報をシミュレーションするように構成されている、第２構成要素（例として、モデリング構成要素）；ならびに
非対象に起因する各標的のアレルの量を決定する（任意に、対象が、確からしい非対象遺伝子型（単数または複数）に基づき、シミュレーションから決定される）ように（任意に、試料中の非対象 対 対象量のパーセントまたは比率を決定するように）構成されており、少なくとも１つのプロセッサーによって実行される、第３構成要素
を含む、前記システム。
【請求項３４】
試料中の決定されたパーセントまたは比率に対して品質測度を算出するように構成されており、少なくとも１つのプロセッサーによって実行される、第４構成要素（例として、分析的構成要素）をさらに含む、請求項３３に記載のシステム。
【請求項３５】
第３構成要素が、適した非対象遺伝子型空間をシミュレーションするように構成されている、請求項３３または３４に記載のシステム。
【請求項３６】
第３構成要素が、非対象について確からしい遺伝子型の範囲を決定するためのシミュレーション（例として、Monte Carlo）を実行するように構成されている、請求項３３〜３５のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項３７】
第３構成要素が、夫々の確からしい遺伝子型に基づき、夫々の標的について測定された寄与分を調整する（例として、非対象の確からしい遺伝子型が、ヘテロ接合であると決定することに反応して、測定された寄与値を倍にする）ように構成される、請求項３３〜３６のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項３８】
少なくとも１つのプロセッサーが、中央値、パーセント、または比率などの、平均値を算出するように構成されている、請求項３３〜３７のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項３９】
第１構成要素が、各標準曲線および／または試料増幅値が、信頼度閾値を満たすと決定するように構成されている、請求項３３〜３８のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項４０】
第１構成要素が、歴史的増幅形状、アレル特異的ＰＣＲアッセイ（例として、第２アレルに関する）の特異性、試料についてのシグナル対ノイズ比率、標準曲線一式についての傾きおよびｒ二乗値、挿入された対照に対して得られた非増幅値、または陰性対照からの試料に対して得られた汚染値のうち少なくとも１つの分析に基づき信頼値を決定するように構成される、請求項３３〜３９のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項４１】
第１構成要素が、試料から得られたデータを歴史的増幅形状へフィッティングするように構成されている、請求項４０に記載のシステム。
【請求項４２】
第１構成要素が、標準曲線一式について傾きおよびｒ二乗値が、閾値を超えないと決定するように構成されている、請求項４０に記載のシステム。
【請求項４３】
第１または第３の構成要素が、試料中の定量可能なおよび／または情報価値のあるものとして同定された各標的にて非対象または対象のためのラベルを創設するように構成されている、請求項３３〜４２のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項４４】
第１または第３の構成要素が、遺伝型に従い夫々の標的を分類することに反応して、試料内の情報価値のある標的を決定するように構成されている、請求項４３に記載のシステム。
【請求項４５】
第３構成要素が、対象および非対象が、異なる遺伝子型を有する（例として、対象が、一方のアレルにホモ接合であり、かつ非対象が、ホモ接合ではないか、または他方のアレルにホモ接合である）ことを決定することに反応して、情報価値のあるものとして夫々の標的を分類するように構成されている、請求項４３または４４に記載のシステム。
【請求項４６】
第３構成要素が、非対象が、ヘテロ接合であると決定することに反応して、夫々の標的についての測定された寄与分を調整する（例として、非対象がヘテロ接合であると決定することに反応して、測定された寄与値を倍にする）ように構成されている、請求項３３〜４５のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項４７】
第３構成要素が、情報価値のある（例として、遺伝子型判定する構成要素によって同定された）かつ品質管理試験を合格した（例として、品質管理の構成要素によって同定された）アレル比率の中央値を算出し、ならびに中央値を比率またはパーセンテージとして保存する、請求項３３〜４６のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項４８】
構成要素のいずれか１つ（例として、分析的構成要素）が、情報価値のあるかつ定量可能な標的の分布および関連するパーセントまたは比率に基づき、正規化されたロバスト変動係数（「ｒＣＶ」）を算出するように構成されている、請求項３３〜４７のいずれか一向に記載のシステム。
【請求項４９】
構成要素のいずれか１つ（例として、分析的構成要素）が、少数種の割合の中央値からの絶対ダイバージェンスの中央値に基づき、ロバスト標準偏差（「ｒＳＤ」）を算出するように構成されている、請求項３３〜４８のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項５０】
構成要素のいずれか１つ（例として、分析的構成要素）が、例えば、非対象ｃｆ−ＤＮＡパーセンテージまたは比率での除算によって、ｒＳＤをｒＣＶへ変換するように構成されている、請求項４９に記載のシステム。
【請求項５１】
構成要素が、ゼロによる除算を避けるために（例として、１パーセントの４分の１を加えることによって）、ｒＳＤを調整するように構成されている、請求項４９または５０に記載のシステム。
【請求項５２】
システムが、情報価値のあるかつ定量可能な標的の分布および関連するパーセントまたは比率に対して決定されたｒＣＶの閾値に基づき、定量に好適な試料を同定するように構成されている、請求項３３〜５１のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項５３】
システムが、ホモ接合である対象と汚染閾値に対する情報価値のない標的との少数アレルの割合の平均値を評価するように構成されている、請求項３３〜５２のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項５４】
システムが、ホモ接合である対象と情報価値のない標的との少数アレルの割合の平均値に基づき、不一致の品質チェック（「ｄＱＣ」）値を算出し、および閾値に対してｄＱＣ値を評価するように構成されている、請求項５３に記載のシステム。
【請求項５５】
システムが、．５％を下回るｄＱＣ値を同定することに基づき、定量に好適な試料を同定するように構成されている、請求項５３または５４に記載のシステム。
【請求項５６】
非対象が、ドナーである、請求項３３〜５５のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項５７】
試料が、移植対象からである、請求項３３〜５５のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項５８】
移植対象が、心臓移植対象である、請求項５７に記載のシステム。
【請求項５９】
試料が、小児対象からである、請求項５７または５８に記載のシステム。
【請求項６０】
システムが、確からしいシミュレーションの総計および／または９５％信頼区間を選択するようにさらに構成されている、請求項３９〜５５のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項６１】
システムが、ｄＱＣもしくはｒＣＶの中央値を下回る値でのシミュレーションを選択するように、および／または９５％信頼区間を決定するように、さらに構成されている、請求項３３〜６０のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項６２】
先行する方法またはシステムのいずれか１つから生じるいずれか１以上の値を含む、レポート。
【請求項６３】
対象を処置する方法であって、以下：
先行する方法またはシステムのいずれか１つから生じるいずれか１以上の値に基づき対象を評価すること、および
対象を処置すること、処置を勧めること、処置を変更すること、さらに監視すること、またはそのさらなる監視を勧めること
を含む、前記方法。
【請求項６４】
本明細書に提供されるとおりの、方法のいずれか１つ。
【請求項６５】
本明細書に提供されるとおりの、システムのいずれか１つ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、35 U.S.C.§119(e)の下で、2017年8月17日に出願された米国仮出願番号第62/547,098号の出願日の利益を主張し、その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明の分野
本発明は、対象からの試料中のドナー特異的無細胞ＤＮＡなどの、非対象核酸の量を査定するための方法およびシステムに関する。本発明は、非対象遺伝子型情報なしの対象から試料中の非対象核酸の量を分析するか、および／または査定するためのシステムを提供する。本明細書に提供される方法、組成物、およびシステムは、移植拒絶反応などの状態のリスクを決定することに使用され得る。
【発明の概要】
【０００３】
概要
本開示は、非対象遺伝子型の知識の必要なしに非対象および／または対象無細胞ＤＮＡなどの無細胞ＤＮＡの量を決定する方法の驚くべき発見に、少なくとも一部、基づく。記載されるのは、非対象遺伝子型（例として、ドナー遺伝子型）を知る必要なしに急性拒絶反応および／または臨床的に深刻な副作用などに対する非侵襲的アッセイとして使用され得る、移植対象などの対象におけるｃｆ−ＤＮＡの定量のためのそれらの方法およびシステムである。方法およびシステムはまた、拒絶反応および／または臨床的な副作用などの、低いかまたは高いリスクにある対象を決定することに使用され得る。方法およびシステムはまた、本明細書に提供されるいかなる対象をモニタリングすることにも使用され得る。いくつかの態様において、方法およびシステムは、非対象遺伝子型（例として、ドナー遺伝子型）のシミュレーション（例として、Monte Carloシミュレーション）を採用する。かかる方法およびシステムは、試料が混合の遺伝子型であり、および非対象遺伝子型が知られていない、いかなる実例においても採用され得る。移植対象のシナリオに言及する例および文章は、例示のためであり、およびアッセイがそのように限定されるべきであるという示唆を意図しない。
【０００４】
一側面において、対象からの試料中の非対象核酸の量を決定する方法が、提供される。いくつかの態様において、方法は、試料中複数の夫々の標的にてアレルの量を分析すること、および試料内の定量可能なおよび／または情報価値のある標的を同定すること、非対象について実行可能な遺伝子型によりシミュレーションを実施すること；ならびに非対象および任意に、シミュレーションから決定される実行可能な、または確からしい非対象遺伝子型（単数または複数）に基づく対象に起因する核標的のアレルの量を決定すること、ならびに任意に、対象ｃｆ−ＤＮＡ試料中の非対象 対 対象の量（例として、パーセントまたは比率）を決定することを含む。
【０００５】
本明細書に提供される、方法またはシステムのいずれか１つの一態様において、方法またはシステムは、対象の遺伝子型を決定することをさらに含む。方法またはシステムのいずれか１つの一態様において、方法またはシステムはアレルの量を決定する増幅を実施することをさらに含む。方法またはシステムのいずれか１つの一態様において、方法またはシステムは、アレルの量を決定するシークエンシングアッセイを実施することをさらに含む。
方法またはシステムのいずれか１つの一態様において、シークエンシングアッセイまたは増幅は、少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０またはより多くの標的に対して実施される。
【０００６】
本明細書に提供される方法またはシステムのいずれか１つの一態様において、方法またはシステムは、試料中、決定される量（例として、パーセントまたは比率）において品質測度を産出することをさらに含む。方法またはシステムのいずれか１つの品質測度は、本明細書に提供されるか、またはさもなければ当該技術分野において知られている品質測度であり得る。
本明細書に提供される方法またはシステムのいずれか１つの一態様において、方法またはシステムは、適しているかもしくは実行可能な非対象遺伝子型空間をシミュレーションすることを含む。
本明細書に提供される方法またはシステムのいずれか１つの一態様において、シミュレーション（例として、Monte Carloシミュレーション）は、実施され、非対象に対する実行可能な、もしくは確からしい遺伝子型をの範囲を決定する。
【０００７】
本明細書に提供される方法またはシステムのいずれか１つの一態様において、夫々の実行可能なもしくは確からしい遺伝型（例として、非対象の確からしい遺伝子型はヘテロ接合であることを決定することによく反応する測定された寄与値を二倍にすること）に基づき、方法またはシステムは、夫々の標的に測定された寄与分を調整することをさらに含む。
本明細書に提供される方法またはシステムのいずれか１つの一態様において、方法またはシステムは、平均もしくは中央値などの平均値、またはパーセントもしくは比率などの量を産出することをさらに含む。
【０００８】
本明細書に提供される方法またはシステムのいずれか１つの一態様において、方法またはシステムは、各標準曲線および／または試料増幅値が信頼度閾値を満たすと決定することをさらに含む。本明細書に提供される方法またはシステムのいずれか１つの一態様において、方法またはシステムは、信頼値に基づき、歴史的増幅形状、アレル特異的ＰＣＲアッセイ（例として、第２アレルに関する）の特異性、試料についてのシグナル対ノイズ比率、標準曲線一式についての傾きおよびｒ二乗値、挿入された対照に対して得られた非増幅値、あるいは陰性対照から試料に対して得られた汚染値のうち少なくとも１つの分析に基づき信頼値を決定することをさらに含む。
【０００９】
本明細書に提供される方法またはシステムのいずれか１つの一態様において、方法またはシステムは、試料から得られたデータを歴史的増幅形状にフィッティングすることをさらに含む。
本明細書に提供される方法またはシステムのいずれか１つの一態様において、方法またはシステムは、標準曲線一式についての傾きおよびｒ二乗値が閾値を超えないと決定することをさらに含む。
【００１０】
本明細書に提供される方法またはシステムのいずれか１つの一態様において、方法またはシステムは、試料中の定量可能なおよび／または情報価値のあるものとして同定された各標的にて非対象または対象のためのラベルを創設することをさらに含む。本明細書に提供される方法またはシステムのいずれか１つの一態様において、方法またはシステムは、遺伝子型に従い夫々の標的を分類することに反応して、試料内の定量可能なおよび／または情報価値のある標的を決定することをさらに含む。本明細書に提供される方法またはシステムのいずれか１つの一態様において、方法またはシステムは、対象および非対象が異なる遺伝子型を有する（例として、対象が一方のアレルにホモ接合であり、かつ非対象がホモ接合ではないか、または他方のアレルにホモ接合である）ことを決定することに反応して、定量可能なおよび／または情報価値のあるものとして夫々の標的を分類することをさらに含む。本明細書に提供される方法またはシステムのいずれか１つの一態様において、方法またはシステムは、非対象がヘテロ接合であると決定することに反応して、夫々の標的について測定された寄与分を調整すること（例として、非対象が、ヘテロ接合であると決定することに反応して、測定された寄与値を倍にすること）をさらに含む。
【００１１】
本明細書に提供される方法またはシステムのいずれか１つの一態様において、方法またはシステムは、情報価値のある（例として、遺伝子型判定する構成要素によって同定された）かつ品質管理試験を合格した（例として、品質管理の構成要素によって同定された）アレル量（例として、パーセントまたは比率）の平均値または中央値を、量（例として、比率またはパーセンテージ）として算出し、ならびに平均値または中央値を比率またはパーセンテージとして保存することをさらに含む。本明細書に提供される方法またはシステムのいずれか１つの一態様において、方法またはシステムは、情報価値のあるおよび／または定量可能な標的ならびに関連する量（例として、パーセントまたは比率）の分布に基づく、正規化されたロバスト変動係数（「ｒＣＶ」）を算出することをさらに含む。本明細書に提供される方法またはシステムのいずれか１つの一態様において、方法またはシステムは、少数種の割合の中央値からの絶対ダイバージェンスの中央値に基づき、ロバスト標準偏差（「ｒＳＤ」）を算出することをさらに含む。本明細書に提供される方法またはシステムのいずれか１つの一態様において、方法またはシステムは、例えば、非対象のｃｆ−ＤＮＡ量（例として、比率またはパーセンテージ）による割り算によって、ｒＳＤをｒＣＶに変換することをさらに含む。
【００１２】
本明細書に提供される方法またはシステムのいずれか１つの一態様において、方法またはシステムは、ゼロによる除算を避けるために（例として、１パーセントの４分の１を除数へ加えることによって）ｒＳＤを調整することをさらに含む。本明細書に提供される方法またはシステムのいずれか１つの一態様において、方法またはシステムは、情報価値のあるおよび／または定量可能な標的ならびに関連する量（例として、パーセントまたは比率）の分布について決定されたｒＣＶ閾値に基づき、定量に好適な試料を同定することをさらに含む。
【００１３】
本明細書に提供される方法またはシステムのいずれか１つの一態様において、方法またはシステムは、ホモ接合である対象と非定量的である、および／または汚染閾値に対して情報価値のない標的との少数アレルの割合の平均値を評価することをさらに含む。
【００１４】
本明細書に提供される方法またはシステムのいずれか１つの一態様において、方法またはシステムは、ホモ接合である対象と非定量的なおよび／または情報価値のない標的との少数アレルの割合の平均値に基づき、不一致の品質チェック（「ｄＱＣ」）値を算出すること、ならびに閾値に対してｄＱＣ値を評価することをさらに含む。本明細書に提供される方法またはシステムのいずれか１つの一態様において、方法またはシステムは、閾値、例として、．５％を下回るｄＱＣ値を同定することに基づき、定量に好適な試料を同定することをさらに含む。
【００１５】
本明細書に提供される方法またはシステムのいずれか１つの一態様において、非対象は、ドナーである。本明細書に提供される方法またはシステムのいずれか１つの一態様において、試料は、移植対象からである。本明細書に提供される方法またはシステムのいずれか１つの一態様において、移植対象は、心臓移植対象である。本明細書に提供される方法またはシステムのいずれか１つの一態様において、試料は、小児対象からである。本明細書に提供される方法またはシステムのいずれか１つの一態様において、試料は、妊娠している対象からである。
【００１６】
本明細書に提供される方法またはシステムのいずれか１つの一態様において、方法またはシステムは、確からしいシミュレーションの総計および／または９５％信頼区間を選択することをさらに含む。本明細書に提供される方法またはシステムのいずれか１つの一態様において、方法は、ｄＱＣとｒＣＶの中央値を下回る値でのシミュレーションを選択すること、および／または９５％信頼区間を決定することをさらに含む。
【００１７】
別の側面において、本明細書に提供されるのは、対象からの試料を分析するためのシステムであって、ここで、システムは、以下：メモリーへ動作可能に接続された少なくとも１つのプロセッサー；試料中の複数の夫々の標的にてアレルの量（例として、定量的な遺伝子型判定（「ｑＧＴ」）量）を分析し、ならびに試料内の定量可能なおよび／または情報価値のある標的を同定するように構成されており、少なくとも１つのプロセッサーによって実行される、第１構成要素（例として、品質管理の構成要素）；非対象について実行可能な遺伝子型情報をシミュレーションするように構成されている、第２構成要素（例として、モデリング構成要素）；および非対象に起因する各標的のアレルの量を決定し、および任意に確からしい非対象遺伝子型（単数または複数）に基づき、シミュレーションから決定された対象、および任意に、試料中の非対象 対 対象量の量（例として、パーセントまたは比率）を決定するように構成されており、少なくとも１つのプロセッサーによって実行される、第３構成要素を含む。
【００１８】
本明細書に提供される、いずれか１つのシステムの一態様において、システムは、試料中の決定されたパーセントまたは比率に対して品質測度を算出するように構成されており、少なくとも１つのプロセッサーによって実行される、第４構成要素（例として、分析的構成要素）をさらに含む。
【００１９】
本明細書に提供される、いずれか１つのシステムの一態様において、第３構成要素は、適したまたは実行可能な非対象遺伝子型空間をシミュレーションするように構成されている。本明細書に提供される、いずれか１つのシステムの一態様において、第３構成要素は、第３構成要素は、非対象について実行可能なまたは確からしい遺伝子型の範囲を決定するためのシミュレーション（例として、Monte Carloシミュレーション）を実行するように構成されている。本明細書に提供される、いずれか１つのシステムの一態様において、第３構成要素は、夫々の実行可能なまたは確からしい遺伝子型に基づき、夫々の標的について測定された寄与分を調整する（例として、非対象の実行可能なまたは確からしい遺伝子型が、ヘテロ接合であると決定することに反応して、測定された寄与値を倍にする）ように構成される。
【００２０】
本明細書に提供される、いずれか１つのシステムの一態様において、少なくとも１つのプロセッサーは、平均中央値、量（例として、パーセント、または比率）などの平均値を算出するように構成されている。
【００２１】
本明細書に提供される、いずれか１つのシステムの一態様において、第１構成要素は、各標準曲線および／または試料増幅値が、信頼度閾値を満たすと決定するように構成されている。本明細書に提供される、いずれか１つのシステムの一態様において、第１構成要素は、歴史的増幅形状、アレル特異的ＰＣＲアッセイ（例として、第２アレルに関する）の特異性、試料についてのシグナル対ノイズ比率、標準曲線一式についての傾きおよびｒ二乗値、挿入された対照に対して得られた非増幅値、または陰性対照から試料に対して得られた汚染値のうち少なくとも１つの分析に基づき信頼値を決定するように構成されている。提供される、いずれか１つのシステムの一態様において、第１構成要素は、第１構成要素が、試料から得られたデータを歴史的増幅形状へフィッティングするように構成されている。提供される、いずれか１つのシステムの一態様において、第１構成要素は、標準曲線一式について傾きおよびｒ二乗値が、閾値を超えないと決定するように構成されている。
【００２２】
本明細書に提供される、いずれか１つのシステムの一態様において、第１または第３の構成要素は、試料中の定量可能なおよび／または情報価値のあるものとして同定された各標的にて非対象または対象のためのラベルを創設するように構成されている。提供される、いずれか１つのシステムの一態様において、第１もしくは第３の構成要素は、遺伝子型に従い夫々の標的を分類することに反応して、試料内の定量可能なおよび／または情報価値のある標的を決定するように構成されている。提供される、いずれか１つのシステムの一態様において、第３構成要素は、対象および非対象が、異なる遺伝子型を有する（例として、対象が、一方のアレルにホモ接合であり、かつ非対象が、ホモ接合ではないか、あるいは他方のアレルにホモ接合である）ことを決定することに反応して、定量可能なおよびに／または情報価値のあるものとして夫々の標的を分類するように構成されている。
【００２３】
本明細書に提供される、いずれか１つのシステムの一態様において、第３構成要素は、非対象がヘテロ接合であると決定することに反応して、夫々の標的について測定された寄与分を調整する（例として、非対象が、ヘテロ接合であると決定することに反応して、測定された寄与値を倍にすること）ように構成されている。本明細書に提供される、システムのいずれか１つの一態様において、第３構成要素が、情報価値のある（例として、遺伝子型判定する構成要素によって同定された）かつ品質管理試験を合格した（例として、品質管理の構成要素によって同定された）アレル比率の中央値を算出し、ならびに中央値を量（例として、比率またはパーセンテージ）として保存する。
【００２４】
本明細書に提供される、システムのいずれか１つの一態様において、構成要素のいずれか１つ（例として、分析的構成要素）は、情報価値のあるおよび／または定量可能な標的の分布ならびに関連する量（例として、パーセントまたは比率）の分布に基づき、正規化されたロバスト変動係数（「ｒＣＶ」）を算出するように構成されている。本明細書に提供される、システムのいずれか１つの一態様において、構成要素のいずれか１つ（例として、分析的構成要素）は、少数種の割合の中央値からの絶対ダイバージェンスの中央値に基づき、ロバスト標準偏差（「ｒＳＤ」）を算出するように構成されている。本明細書に提供される、システムのいずれか１つの一態様において、構成要素のいずれか１つ（例として、分析的構成要素）は、例えば、非対象ｃｆ−ＤＮＡ量（例として、パーセンテージまたは比率)での除算によって、ｒＳＤをｒＣＶへ変換するように構成されている。
【００２５】
提供される、システムのいずれか１つの一態様において、構成要素は、ゼロによる除算を避けるために（例として、１パーセントの４分の１を加えることによって）、ｒＳＤを調整するように構成されている。本明細書に提供される、システムのいずれか１つの一態様において、システムは、情報価値のあるおよび／または定量可能な標的ならびに関連する量（例として、パーセントまたは比率）の分布および関連するパーセント、あるいは比率に対して決定されたｒＣＶの閾値に基づき、定量に好適な試料を同定するように構成されている。本明細書に提供される、システムのいずれか１つの一態様において、システムは、ホモ接合である対象と汚染閾値に対する情報価値のない標的との少数アレルの割合の平均値を評価するように構成されている。
【００２６】
本明細書に提供される、システムのいずれか１つの一態様において、システムは、ホモ接合である対象と非定量可能なおよび／または情報価値のない標的との少数アレルの割合の平均値に基づき、不一致の品質チェック（「ｄＱＣ」）値を算出し、ならびに閾値に対してｄＱＣ値を評価するように構成されている。提供される、システムのいずれか１つの一態様において、システムは、例として、．５％を下回るｄＱＣ値の閾値を同定することに基づき、定量に好適な試料を同定するように構成されている。
【００２７】
本明細書に提供される方法またはシステムのいずれか１つの一態様において、システムは、実行可能なあるいは確からしいシミュレーションの総計および／または９５％信頼区間を選択するようにさらに構成されている。
本明細書に提供される、システムのいずれか１つの一態様において、システムは、ｄＱＣとｒＣＶの中央値を下回る値でのシミュレーションを選択するように、および／または９５％信頼区間を決定するように、さらに構成されている。
一側面において、本明細書に記載の方法またはシステムのいずれか１つから結果としてもたらされるいかなる１以上の値を含むレポートが、提供される。
【００２８】
別の側面において、本明細書に提供されるのは、対象を処置する方法である。方法は、先行する方法またはシステムのいずれか１つから生じるいずれか１以上の値に基づき対象を評価すること、および対象を処置すること、処置を勧めること、処置を変更すること、さらに監視すること、またはそのさらなる監視を勧めることを含む。
一態様において、本明細書に提供される方法のいずれか１つの態様は、組成物、システム、または本明細書に提供されるレポートのいずれか１つのための態様であり得る。一態様において、本明細書に提供されるシステムのいずれか１つの態様は、本明細書に提供される組成物、方法またはレポートのいずれか１つの態様である。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
図面の簡単な記載
付随する図は、縮尺として描かれることを意図しない。図は、例証のみであり、本開示の実施可能のために要求されない。
【図１Ａ】図１Ａは、ＣＲ２についてドナー遺伝子型情報のあるものによる閾値点（「カットポイント」）の実験的な決定を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＣＲ２について、ドナー遺伝子型情報のあるものによる閾値点（「カットポイント」）の実験的な決定を示す。
【００３０】
【図２Ａ】図２Ａは、移植片脈管障害について、ドナー遺伝子型情報のあるによる閾値点（「カットポイント」）の実験的な決定を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、移植片脈管障害について、ドナー遺伝子型情報のないものによる閾値点（「カットポイント」）の実験的な決定を示す。
【００３１】
【図３】図３は、試料分析システムの態様の例の分解組立図である。
【図４】図４は、本開示の様々な側面および機能が実践される分散型のコンピュータシステムの態様の例の分解立体図である。
【図５】図５は、一態様に従う、試料分析プラットフォームの分解組立図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
詳細な記載
結果的に、様々な側面は、対象から得られた試料中の非対象核酸（例として、非対象の無細胞ＤＮＡ）などの核酸（例として、無細胞ＤＮＡ）を検出し、分析し、および／または定量化する技法を提供する。本明細書に使用されるとき、「非対象核酸」は、対象において見出される核酸（野生型配列などの、特異的な配列に関する）の変異バージョンからである核酸を指す。「対象核酸」は、したがって、別の供給源からではなく、および対象において見出される核酸の変異バージョン（野生型配列などの、特異的な配列に関する）ではない。本明細書に使用されるとき、本明細書に提供される方法またはシステムのいずれか１つは、ドナーまたはドナー特異的無細胞ＤＮＡ（例として、ドナー特異的ｃｆ−ＤＮＡ）または胎児のＤＮＡ（例として、胎児の無細胞ＤＮＡ）に特異的なＤＮＡなどの、非対象供給源からの無細胞ＤＮＡの量を決定することに使用され得る。本明細書に提供される方法またはシステムのいずれか１つは、移植を経験した対象からの試料について、使用されてもよい。いくつかの態様において、移植は、心臓移植である。いくつかの態様において、本明細書に提供される方法またはシステムは、妊娠している対象からの試料について、使用されてもよい。
【００３３】
いかなる理論によって束縛されることを望まないが、「無細胞ＤＮＡ」（ｃｆ−ＤＮＡ）は、例として、対象の血液、血漿、血清、尿等々中に、自由に循環していることが見出される、アポトーシス、溶解、ネクローシスまたは障害の間に、細胞から放出されたＤＮＡのフラグメントを一般に指す。本明細書に使用されるとき、本明細書に提供される組成物および方法は、例えば、移植レシピエント中に見出され得るドナーのなど、または妊娠している対象のなどの、例えば非対象無細胞ＤＮＡの、無細胞ＤＮＡの量を決定することに使用され得る。「対象」ｃｆ−ＤＮＡは、移植対象または妊娠中の母体の血清中の胎児のＤＮＡの場合においてなどの「非対象」ｃｆ−ＤＮＡから別個のものとして独自に定量化、および検出され得る（Norton et al., N Engl J Med 373: 2582 (2015)）。
【００３４】
本明細書に提供されるシステムおよび方法は、非対象遺伝型が知られていない場合、Monte Carloシミュレーションなどのシミュレーションの使用を採用し得る。システムおよび方法は、一般に、数多の標的にてアレルの量を分析する。「標的」は、その中に配列同一性の変化性があるか、あってもよいか、または配列同一性の変化性の期待がある核酸配列である。ある態様において、標的は、個々の集合の中におけるか、または対象において起こり得るか、および疾患または状態に関連し得る突然変異の結果としてなどの単一ヌクレオチドにおける配列変化性がある場合、１つであるか、１つであってもよいか、あるいは１つであると期待される。標的は、よって１より多くのアレルを有すると期待されていたか、または期待されており、好ましい一態様において、標的は、両アレル的である。「標的の複数」、１つより多くの標的（すなわち、複数の標的）を指す。
【００３５】
提供されるシステムまたは方法のいずれか１つのいくつかの態様において、アレルの量は、少なくとも、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５またはより多くの標的にて分析される。本明細書に提供される方法またはシステムのいずれか１つのいくつかの態様において、アレルの量は、１０５、１０４、１０３、１０２、１０１，１００、９９、９８または９７より少ない標的にて分析される。本明細書に提供される方法またはシステムのいずれか１つのいくつかの態様において、アレルの量は、４０〜１０５、４５〜１０５、５０〜１０５、５５〜１０５、６０〜１０５、６５〜１０５、７０〜１０５、７５〜１０５、８０〜１０５、８５〜１０５、９０〜１０５、９０〜１０４、９０〜１０３、９０〜１０２、９０〜１０１、９０〜１００、９０〜９９、９１〜９９、９２〜９９、９３、９９、９４〜９９、９５〜９９、または９０〜９５の間の標的について分析される。提供される方法またはシステムのいずれか１つのいくつかの態様において、４０〜９９、４５〜９９、５０〜９９、５５〜９９、６０〜９９、６５〜９９、７０〜９９、７５〜９９、８０〜９９、８５〜９９、９０〜９９、９０〜９９、９０〜９８、９０〜９７または９０〜９６の間の標的について分析される。その上、提供される方法またはシステムのいずれか１つの他の態様において、４０〜９５、４５〜９５、５０〜９５、５５〜９５、６０〜９５、６５〜９５、７０〜９５、７５〜９５、８０〜９５、８５〜９５、または９０〜９５の間の標的について分析される。その上、提供される方法またはシステムのいずれか１つの他の態様において、４０〜９０、４５〜９０、５０〜９０、５０〜９０、６０〜９０、６５〜９０、７０〜９０、７５〜９０、８０〜９０、８５〜９０の間の標的について分析される。その上、提供される方法またはシステムのいずれか１つの他の態様において、４０〜８５、４５〜８５、５０〜８５、５５〜８５、６０〜８５、６５〜８５、７０〜８５、７５〜８５、または８０〜８５の間の標的について分析される。その上、提供される方法またはシステムのいずれか１つの他の態様において、４０〜８０、４５〜８０、５０〜８０、５５〜８０、６０〜８０、６５〜８０、７０〜８０、または７５〜８０の間の標的について分析される。その上、提供される方法またはシステムのいずれか１つの他の態様において、４０〜７５、４５〜７５、５０〜７５、５５〜７５、６０〜７５、６５〜７５、または７０〜７５の間の標的について分析される。
【００３６】
標的が、定量可能な（すなわち、アレル量が測定され得るということ）および／または情報価値のあるものとして同定されてもよい。本明細書に提供される「情報価値のある標的」は、アレルの量が、対象核酸と比べてまたは対象核酸から区別される、非対象核酸の量を定量化することに使用され得るものである。一般に、情報価値のある結果は、対象核酸が特異的な標的についてヘテロ接合である場合の結果ならびに「いいえコール」または誤ったコール結果を除外し得る。提供される方法またはシステムのいずれか１つのいくつかの態様において、情報価値のある結果から、標準曲線などを使用し、アレル量（例として、比率またはパーセンテージ）が産出され得る。提供される方法またはシステムのいずれか１つのいくつかの態様において、非対象および対象核酸の量は、非対象および／または対象核酸、夫々についての情報価値のある結果にわたる平均を表す。本明細書に提供される方法またはシステムのいずれか１つのいくつかの態様において、この平均は、絶対量もしくは比率またはパーセンテージとして与えられる。好ましくは、本明細書に提供される方法またはシステムのいずれか１つのいくつかの態様において、平均は、平均値または中央値である。本明細書に提供される方法またはシステムのいずれか１つの他の態様において、平均は、トリミングされた平均値である。本明細書に使用されるとき、「トリミングされた平均値」は、最も低くレポートされる標的（最低の２つなど）とレポートされる標的の最も高いもの（最高の２つなど）の組み合わせにおける除去を指す。そのうえ、本明細書に提供される方法またはシステムのいずれか１つの他の態様において、平均は、平均値である。
【００３７】
別の側面において、より多く値のいずれか１つのレポートは、本明細書に提供される方法またはシステムのいずれか１つを使用して生産される。一態様において、レポートは、１以上の時点にて非対象無細胞ＤＮＡの量を提供する。一態様において、レポートは、本明細書に提供される方法またはシステムのいずれか１つにより生産されたいかなる１以上の他の値を包含し得、および／または、それも包含し得る。好ましくは、レポートは、値の少なくとも１つが、臨床医によって、対象を査定することおよび／または対象を処置することに使用され得るものである。本明細書に提供される方法のいかなる１以上は、レポートを生成し、および／またはレポートを提供し、および／または１以上の値に基づき対象を査定し、および／または本明細書に提供される方法またはシステムのいずれか１つによって生産されたかあるいはレポートのいずれか１つにおいて提供された１以上の値に基づき対象を処置するステップを包含し得る。
【００３８】
レポートは、口頭、記述（またはハードコピー）であるか、または画像化されるかもしくは表示し得る形式などの電子形式であってもよい。いくつかの態様において、本明細書に提供される「生の」結果は、レポートにおいて提供され、およびこのレポートからさらなるステップが、試料中の非対象核酸の量を決定するために採られ得る。他の態様において、レポートは、試料中の非対象核酸の量を提供する。量から、臨床医は、より後の時点における非対象核酸の量などの、対象に対する処置の必要または対象をモニタリングする必要を査定してもよい。結果的に、本明細書に提供される方法のいずれか１つにおいて、方法は、別の時点での対象における非対象核酸の量を査定することを包含し得る。かかる査定は、本明細書に提供される方法のいずれか１つによって実施され得る。いくつかの態様において、レポートは、時間にわたって対象からの非対象核酸の量を提供する。
【００３９】
本明細書に提供される方法またはシステムのいずれか１つのいくつかの態様において、量は、データベース中もしくはその中に入る。一側面において、かかる値を持つデータベースが提供される。臨床医は、量（単数または複数）から対象の処置またはモニタリングに対する必要を査定してもよい。結果的に、本明細書に提供される方法のいずれか１つにおいて、方法は１時点よりも多くにおいて対象における量を査定することを包含し得る。かかる査定すは、本明細書に提供される方法またはシステムのいずれか１つによって実施され得る。
【００４０】
本明細書に使用されるとき、「量」は、核酸（例として、ｃｆ−ＤＮＡ）の測定のためのいかなる定量的な値を指し、および絶対または比較量について与えられる。さらに、量は、総量、頻度、比率、パーセンテージ等々であり得る。本明細書に使用されるとき、用語「レベル」は、「量」の代わりに使用され得るが、しかし同じ種類の値を指すことが意図される。提供されない限り、本明細書に提供される量は、一般に、試料中の非対象核酸の比率またはパーセンテージを表す。
【００４１】
いくつかの態様において、本明細書に提供される方法またはシステムのいずれか１つは、量と閾値、もしくは１以上の先行の量を比較し、増大するかまたは低下するリスクにある対象を同定するように構成されている分析的構成要素を含み得る。例えば、分析的構成要素は、非対象遺伝子型が未知である場合、混合の遺伝子型試料の分析を可能にするように、ドナー遺伝子型を刺激し得る。別の例において、分析的構成要素が、試料中の得られる値（非対象（例として、ドナー）核酸（例として、ｃｆ−ＤＮＡ）の量を反映する）をリスクの増大についての標的の閾値に対して比べるように構成されている。測定もしくは値が閾値を下回る場合、対象が、低リスクまたはいくつかの実例においてリスクの増大ではないとラベル付けされ得、および値が閾値を超える場合、対象が、リスクの増大として同定され得る。分析的構成要素はまた、測定または値を低減したリスクについての閾値に対しても、比べることができる。対象が閾値を下回る場合、対象が低リスクとして同定され得る。そうでない場合、対象は、ラベルを受けられ得ないか、または対象が、高リスク閾値に対しても評価され得る。
【００４２】
本明細書に使用されるとき、「閾」または「閾値」は、いくつかのことを指し示す、いかなる予め決定されたレベルまたはレベルの範囲を指す。例えば、リスクを決定することにおいて、この閾値は、状態の有無の、またはリスクの有無のであり得る。閾値は、様々な形を採り得る。中央値または平均値などの単一のカットオフ値であり得る。１つの定義されたグループにおけるリスクは、別の定義されたグループにおけるリスクを倍する場合などの、比較グループに基づいて設けられ得る。例えば、試験された集団は、低リスクグループ、中リスクグループおよび高リスクグループなどのグループ内へ、あるいは対象が最も低いリスクをもつ最低象限および対象が最も高いリスクをもつ最高象限である象限に均等に（または不均等に）分けられた場合、範囲にあり得る。閾値は、選択された特異的な集団に、または測定されおよび閾値と比べられた値の目的に依ることができる。閾値の適切な値、範囲およびカテゴリーは、当業者による日常的な実験法によって選択され得る。
【００４３】
非対象核酸の量を決定する能力のため、低レベルにおいてさえ、本明細書に提供される方法およびシステムは、移植レシピエントまたは妊娠している対象などの対象におけるリスクを査定することに使用され得る。本明細書に提供される「リスク」は、対象（移植レシピエントなど）における所望されない状態の有無、または例として、拒絶反応などのかかる状態の有無の増大する可能性を指す。本明細書において提供されるように「リスクの増大」は、対象において、任意の所望されない状態があること、またはかかる状態があることの可能性の増大を指す。本明細書において提供されるように、「リスクの低下」は、対象において任意の所望されない状態がないこと、またはかかる状態があることへの可能性の低下（またはないことの可能性の増大）を指す。本明細書に提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、閾値、または１以上の先行の量と比べて増大した量を有する対象は、リスクの増大にあるものとして同定される。本明細書に提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、閾値、または１以上の先行の量と比べて低下したもしくは同等の量を有する対象は、リスクの低下にあるものとして同定される。
【００４４】
例として、移植（例として、心臓移植）の埋め込みに続く拒絶反応の早期検出は、処置を促進し、および臨床結果を改善し得る。移植拒絶反応は、移植失敗および遅発性死亡の主な原因として残り、および一般に一生の監視モニタリングを要求する。免疫抑制療法による移植拒絶反応の処置は、特に拒絶反応が早期に検出される場合、処置の成果を改善することが示された。臨床医は、ドナーｃｆ−ＤＮＡの量をもつ移植対象の査定（例として、リスクを査定すること）を作成し、およびかかるステップが本明細書に提供される方法のいずれか１つの一部として包含され得る。
【００４５】
結果的に、提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、対象は、移植のレシピエントであり、およびリスクは、移植に関するリスクである。提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、移植に関するリスクは、移植拒絶反応のリスク、移植への移植または障害を伴う解剖学的問題である。提供される方法またはシステムのいずれか１つのいくつかの態様において、移植片への損傷は、初期または持続する損傷である。提供される方法またはシステムのいずれか１つのいくつかの態様において、移植に関するリスクは、急性の状態または慢性の状態である。提供される方法またはシステムのいずれか１つのいくつかの態様において、急性の状態は、細胞性拒絶反応または抗体媒体拒絶反応を包含する、移植拒絶反応である。提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、慢性の状態は移植脈管障害である。提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、移植に関するリスクは、障害の重症度を指し示す。提供される方法またはシステムのいずれか１つのいくつかの態様において、移植に関連するリスクは、感染のリスクまたはステータスである。移植レシピエントにおけるリスクが、本明細書に提供される方法のいずれか1つの部分として決定され得る。
【００４６】
本明細書に使用されるとき、「移植」は、レシピエントの損傷もしくは欠落した組織もしくは器官またはその部分を交換する目的のための、ドナーからレシピエントへの組織もしくは器官またはその部分の移動を指す。移植は、１つの器官のものまたは１つより多くの器官のものであってもよい。移植され得る器官の例は、しかしこれらに限定されないが、以下：心臓、腎臓（単数または複数）、腎臓、肝臓、肺（単数または複数）、膵臓、腸、等々を包含する。本明細書において提供される方法またはシステムのいずれかの１つは、本明細書に提供されるいかなる１以上の組織もしくは器官、またはその部分の移植を受けた対象からの試料について使用されてもよい。いくつかの態様において、移植は、心臓移植である。
【００４７】
本明細書に提供される方法またはシステムのいずれか１つのいくつかの態様において、方法またはシステムは、対象または総核酸と移植拒絶反応などの状態のリスクの増大を比べて、非対象核酸の量における増大を相関することを含み得る。本明細書に提供される方法またはシステムのいずれか１つのいくつかの態様において、相関することは、状態のリスクの増大または低下にある対象を同定するように、非対象核酸の量（例として、濃度、比率またはパーセンテージ）と閾値を比べることを含む。本明細書に提供される方法またはシステムのいずれか１つのいくつかの態様において、閾値と比べて非対象核酸の増大した量を有する対象は、状態のリスクの増大にあるものとして同定される。本明細書に提供される方法またはシステムのいずれか１つのいくつかの態様において、閾値と比べて非対象核酸の低下したまたは同等の量を有する対象は、状態のリスクの低下にあるものとして同定される。
【００４８】
非対象核酸の量における変化がまた、時間にわたってモニターされ得、および本明細書に提供される方法またはシステムのいずれか１つは、そのようにするステップを包含し得る。これは、臨床ステータスにおける変動の測定を可能にし得るか、または正常な値またはベースラインレベルの計算を許容し得る。臓器移植において、これは、拒絶反応に対する個々の非侵襲的スクリーニング試験の基礎またはそれに関連する状態のリスクの基礎を形成し得る。一般に、本明細書に提供されるように、非対象核酸の、比率またはパーセントなどの量は、レシピエントにおける拒絶反応などの、移植に関連するリスクなどの状態に関連するリスクの有無を指し示し得、またはさらなる試験もしくは監視への必要を指し示し得る。本明細書に提供される方法またはシステムのいずれか１つの一態様において、方法またはシステムは、移植拒絶反応、移植傷害、等々などの状態を査定するための追加の試験（単数または複数）、あるいは対象に、かかるさらなる試験を提案する（またはかかるさらなる試験の情報を提案する）ステップをさらに包含してもよい。追加の試験（単数または複数）は、本明細書に提供される方法またはシステムのいずれか１つであってもよい。追加の試験（単数または複数）は、本明細書に提供されるか、またはさもなければ当該技術分野において適切として知られる、他の方法もしくはシステムのいずれか１つであってもよい。
【００４９】
本明細書に提供される方法またはシステムのいずれか１つは、処置対象のための作用の過程の決定を指す、「処置レジメンを決定すること」のステップを包含し得る。本明細書に提供される方法またはシステムのいずれか１つの一態様において、処置レジメンを決定することは、対象に提供するための適切な治療または適切な治療に関する情報を決定することを包含する。本明細書に提供される方法またはシステムのいずれか１つにおいて、決定することは、対象への適切な治療もしくは適切な治療に関する情報を提供することを包含し得る。いくつかの態様において、治療は、抗拒絶反応処置および／または抗感染処置の投与である。本明細書に使用されるとき、処置もしくは治療もしくはモニタリングが、記述形式または電子形式において提供されてもよい。いくつかの態様において、情報が、コンピュータ読み取り可能な指示として提供されてもよい。いくつかの態様において、情報が、口頭で提供されてもよい。
【００５０】
「投与すること」または「投与」または「投与する」または同種のものは、薬理学的に直接的にまたは間接的に有用であるやり方において、材料を対象に対して提供することを意味する。よって、用語は、処方することなど、対象または別の者に材料を投与することを指示することを包含する。処置または治療の投与は、当該技術分野において知られるいかなる方法により、成し遂げられてもよい（例えば、Harrison’s Principle of Internal Medicine, McGraw Hill Inc.を参照）。好ましくは、処置または治療の投与は、治療的に有効な量において起こる。投与は、局部または全身性であってもよい。投与は、非経口(静脈内、皮下、皮下)または経口であってもよい。異なるルートの投与ための組成物は、当該技術分野において知られる（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences by E. W. Martinを参照）。
【００５１】
いくつかの態様において、投与される抗拒絶反応処置は、免疫抑制剤である。免疫抑制剤は、これらに限定されないが、コルチコステロイド（例えば、プレドニゾロンまたはヒドロコルチゾン）、グルココルチコイド、細胞増殖抑制剤、アルキル化剤（例えば、ナイトロジェンマスタード（シクロホスファミド）、ニトロソ尿素、プラチナ化合物、シクロホスファミド（サイトキサン）、代謝拮抗薬（例えば、メトトレキサートなどの葉酸類似体、アザチオプリンやメルカプトプリンなどのプリン類似体、ピリミジン類似体、タンパク質合成阻害剤）、細胞傷害性抗生物質（例えば、ダクチノマイシン、アントラサイクリン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ミトラマイシン）、抗体（例えば、抗ＣＤ２０、抗ＩＬ−１、抗ＩＬ−２Ｒアルファ、抗Ｔ細胞または抗ＣＤ−３モノクローナル、およびウマ由来抗ヒト胸腺細胞免疫グロブリン、サイモグロブリン(Thymoglobuline)などのポリクローナル、イムノフィリンに作用する薬剤、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス、インターフェロン、オピオイド(opiod)、ＴＮＦ結合タンパク質、ミコフェノール酸、フィンゴリモドおよびミリオシンを包含する。いくつかの態様において、抗拒絶反応療法は、輸血また髄移植を含む。治療はまた、敗血症などの、全身性の状態を処置するための治療も包含する。敗血症の治療は、静脈内輸液、抗生物質、外科的ドレナージ、早期目標指向治療（ＥＧＤＴ）、バソプレッサ、ステロイド、活性化プロテインＣ、ドロトレコギンアルファ（活性化）、酸素および臓器機能不全に対する適切な支援を包含し得る。これは、腎不全における血液透析、肺機能障害における機械的換気、血液製剤の輸血、および循環不全のための薬物および輸液治療を包含してもよい。好ましくは経腸栄養によるが、しかし必要であれば腸管外栄養によって適切な栄養を確保することもまた、特に長引く疾病の間に包含され得る。他の関連する治療法はまた、インスリンおよび深部静脈血栓症および胃潰瘍を予防するための薬物療法も包含し得る。
【００５２】
感染が指し示される、いくつかの態様において、移植のレシピエントを処置するための治療はまた、バクテリアの、真菌の、および／またはウィルスの感染を処置するための治療を包含し得る。かかる治療は抗生物質を包含する。他の例は、しかしこれらに限定されないが、抗アメーバ剤、アミノグリコシド、駆虫剤、抗真菌剤、アゾール系抗真菌剤、エキノカンジン、ポリエン、ジアリールキノリン、ヒドラジド誘導体、ニコチン酸誘導体、リファマイシン誘導体、ストレプトミセス誘導体、抗ウィルス剤、ケモカイン受容体アンタゴニスト、インテグラーゼ鎖転移阻害剤、ノイラミニダーゼ阻害剤、ＮＮＲＴＩ、ＮＳ５Ａ阻害剤、ヌクレオシドリバーストランスクリプターゼ阻害剤（ＮＲＴＩ）、プロテアーゼ阻害剤、プリンヌクレオシド、カルバペネム、セファロスポリン、グリシルサイクリン、抗らい菌薬、リンコマイシン誘導体、マクロライド誘導体、ケトライド、マクロライド、オキサゾリジノン抗生物質、ペニシリン、β−ラクタミナーゼ阻害剤、キノロン系抗菌剤、スルホンアミド、およびテトラサイクリンを包含する。他のかかる治療は、当業者に知られる。本明細書において提供されるいずれか１つの方法は、対象に抗感染処置を投与することまたは提案することを包含し得る（いくつかの態様において、処置についての情報を対象に提供することを包含して）。いくつかの態様において、抗感染処置は、免疫抑制療法における量または頻度における減少であってもよく、または対象に投与される免疫抑制療法における変化であってもよい。他の治療は、当業者に知られる。
【００５３】
本明細書に提供される方法またはシステムのいずれか１つは、「モニタリングレジュメを決定すること」のステップを包含し得、それは時間にわたって対象における状態をモニターする作用の過程を決定することを指す。本明細書に提供される方法またはシステムのいずれか１つの一態様において、モニタリングレジュメを決定することは、時間にわたってもしくは後続の時点にて、対象における非対象核酸の量を決定することのための適切な作用の過程を決定すること、またはかかるモニタリングを対象へ提案することを包含する。これは、臨床ステータスにおける変動の測定を可能にし得るか、および／または正常な値もしくはベースラインレベルの計算（およびそれへの比較）を許容し得る。本明細書に提供される方法またはシステムのいずれか１つのいくつかの態様において、モニタリングのレジュメを決定することは、対象から試料を得ることのタイミングおよび／または頻度を決定することを包含する。
【００５４】
本明細書に使用されるとき、対象からの試料は、生体試料であり得る。かかる生体試料の例は、全血、血漿、血清、尿等々を包含する。本明細書に提供されるいずれか１つの方法のいくつかの態様において、さらなる核酸、例として、基準の試料への追加が実施され得る。
【００５５】
本明細書に提供される方法またはシステムのいずれか１つにおいて、次世代またはハイスループットシークエンシングおよび／または遺伝子型解析テクニックなどのシークエンシングによって、アレルの量が決定されてもよい。次世代およびハイスループットシークエンシングおよび／または遺伝子型解析テクニックの例は、限定されないが、超並列特性(massively parallel signature)シークエンシング、polonyシークエンシング、４５４パイロシークエンシング、イルミナ（Solexa）シークシング、SOLiDシークエンシング、イオン半導体シークエンシング、ＤＮＡナノボールシークエンシング、ヘリオスコープ単一分子シークエンシング、単一分子リアルタイム（ＳＭＡＲＴ）シークエンシング、MassARRAY（登録商標）、およびDigital Analysis of Selected Regions（DANSR（商標））を包含する。(例えば、Stein RA (1 September 2008)を参照。"Next-Generation Sequencing Update". Genetic Engineering & Biotechnology News 28 (15); Quail, Michael; Smith, Miriam E; Coupland, Paul; Otto, Thomas D; Harris, Simon R; Connor, Thomas R; Bertoni, Anna; Swerdlow, Harold P; Gu, Yong (1 January 2012)を参照。"A tale of three next generation platforms: Comparison of Ion torrent, pacific biosciences and illumina MiSeq Sequencers". BMC Genomics 13 (1): 341; Liu, Lin; Li, Yinhu; Li, Siliang; Hu, Ni; He, Yimin; Pong, Ray; Lin, Danni; Lu, Lihua; Law, Maggie (1 January 2012)."Comparison of Next-Generation Sequencing Systems". Journal of Biomedicine and Biotechnology 2012: 1-11;Qualitative and quantitative genotyping using single base primer extension coupled with matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MassARRAY（登録商標）). Methods Mol Biol. 2009;578:307-43;Chu T, Bunce K, Hogge WA, Peters DG.A novel approach toward the challenge of accurately quantifying fetal DNA in maternal plasma. Prenat Diagn 2010;30:1226-9; and Suzuki N, Kamataki A, Yamaki J, Homma Y. Characterization of circulating DNA in healthy human serum. Clinica chimica acta; International Journal of Clinical Chemistry 2008;387:55-8を参照）。かかる方法はまた、いくつかの態様において、遺伝型を決定することにも使用されてもよい。
【００５６】
本明細書に提供される方法またはシステムのいずれか１つにおいて、アレルの量は、増幅技術によって決定され得、かかる技法は、本明細書または米国公開番号2016/176662に記載される。かかる技法のいずれか１つは、本明細書に組み込まれる。
【００５７】
本明細書で提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、増幅が、定量的ＰＣＲなどのＰＣＲによって実施され、核酸の量が、決定され得ることを意味する。定量的ＰＣＲは、リアルタイムＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、TAQMAN（商標）等々を包含する。本明細書で提供される方法またはシステムのいずれか１つのいくつかの態様において、ＰＣＲは「リアルタイムＰＣＲ」である。かかるＰＣＲは、増幅過程がいまだ続行している一方で、反応動態が、液体相においてモニターされることがあるＰＣＲ反応を指す。従来的なＰＣＲと対照に、リアルタイムＰＣＲは、増幅反応においてリアルタイムで、連続的に検出するまたは定量する能力を差し出す。特異的な色素からの蛍光強度の増大に基づき、標的の濃度が、増幅がそのプラトーに達する前にさえ、決定され得る。提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、ＰＣＲは、デジタルＰＣＲである。
【００５８】
システムの実装
一側面に従うと、システムは、移植レシピエントなどの、対象から採られる試料について品質測度を算出することのために提供される。システムのいずれか１つの様々な態様は、対象から得られるゲノムのデータを分析することに反応してより高いか、またはより低いリスクの特性を有する試料を同定するように構成されている。図３は、かかる試料およびリスクプロファイルを同定するためのシステム３００の一例を例証する。システムのいずれか１つの一態様に従って、システムが、試料を直接的に、または「定量的遺伝子型判定」（ｑＧＴ）を提供する試料に関するデータを分析するように構成され得る。システムのいずれか１つのいくつかの態様に従って、システムは、各標的にてＡおよびＢアレルを定量化するように、ヘテロ接合のＤＮＡ供給減の標準曲線を使用する定量的遺伝子型判定を実行する。システムのいずれか１つのさらなる態様は、受容性判断基準に従って、各標準曲線および試料増幅を評価するように品質管理手順を実行する。システムのいずれか１つのいくつかの態様に従って、システムは、定量可能な標的としての品質管理手順を満たすデータを分類し、および品質管理されたデータ上のアルゴリズムの解釈を実行するように構成され得る。
【００５９】
システムのいずれか１つのいくつかの態様に従って、品質管理は、以下：歴史的増幅形状、第２のアレルに関するアレル特異的ＰＣＲアッセイの特異性、ＣｐまたはＣｔ値、ＰＣＲ効率、シグナル対ノイズ、標準曲線一式の傾きおよびｒ二乗、対照の非増幅、および陰性対照の汚染のいずれか１以上およびいかなる組み合わせの分析を包含し得る特異的な受容性判断基準に基づく。
いずれか１つのシステムの一態様に従って、システムは、定量可能な標的を同定するための分析および／または開示されたアルゴリズムを実行する品質管理構成要素３０２を包含する。
【００６０】
システムのいずれか１つのいくつかの態様に従って、システム（例として、３００）は、遺伝子型の一次分析を提供する。例えば、システムは、レシピエント（または対象）およびドナー（または非対象）ゲノムを「基礎的な遺伝子型判定」（ｂＧＴ）について第１に評価する。ｂＧＴ処理は、ドナー（または非対象）および／またはレシピエント（または対象）に、各標的にて３つの実行可能な遺伝子型（例として、ホモ接合のＡＡ、ヘテロ接合のＡＢ，およびホモ接合のＢＢ）のラベルを生産する。システムのいずれか１つの様々な態様に従って、この情報は、標的当たりのｑＧＴの解釈におけるシステムにより使用される。システムのいずれか１つの一態様に従って、システム３００は、特定された標的での試料へドナー（または非対象）および／またはレシピエント（または対象）の寄与分の遺伝型を分析するように構成されている、遺伝子型判定構成要素３０４を包含し得る。システムのいずれか１つの一態様に従って、各標的における遺伝子型の同定は、システムが完全におよび／または半分情報価値のあるものなどの情報価値のある標的を認識することを可能にする。
【００６１】
例えば、システムは、レシピエント（または対象）がホモ接合であると知られおよびドナー（または非対象）が別の遺伝子型を有する場合のものとして、情報価値のある標的を定義するように構成され得る。１つの例において、システムは、情報価値のある標的を同定し、情報価値のある夫々の標的についての情報を保存し、ならびにドナーおよび／またはレシピエントについてのラベルおよび両方の遺伝子型の分析の結果を包含する。
【００６２】
システムのいずれか１つの別の態様に従って、遺伝子型判定構成要素（例として、３０４）は、情報価値のある標的を分析するように、ドナー（または非対象）、および／またはレシピエント（または対象）の情報価値のある標的をラベル付けする。別の例において、システムは、ドナー（または非対象）が他のアレル（ホモ接合のレシピエント（または対象）から異なる）他のアレルについてホモ接合である場合、情報価値のある標的を同定するように構成されている。システムのいずれか１つのさらなる態様において、遺伝子型判定構成要素が、観察されたアレル比率の分析に反応して、完全に情報価値のあるものまたは半分情報価値のあるものとして、夫々の標的を分類するように構成され得る。
【００６３】
この例において、標的は、完全に情報価値のあると称され、および観察されたアレル比率は、およそ全体のドナーｃｆ−ＤＮＡ（または対象ｃｆ−ＤＮＡ）レベルである。さらなる例において、実例は、ドナー（または非対象）がヘテロ接合でありおよびレシピエント（または対象）がホモ接合であり、および標的が半分情報価値のある（寄与分が、ＡおよびＢアレルの両方へであるから）として定義される場合、システムにより同定される。半分情報価値のある標的のために、システムは、測定された寄与分を調整するように構成されている。例えば、標的が半分情報価値のあることを決定することに反応して、測定された寄与分が、倍にされ得る。他の態様において、より洗練された調整が、実行され得る。例えば、ドナーｃｆ−ＤＮＡに対するレシピエントｃｆ−ＤＮＡの比率が、パーセンテージとして表現され得る。パーセント値が、結果的に測定された寄与分を調整することに使用され得る。他の例において、測定された寄与分への調整は、他の選択肢の内で統計変動に基づき得る。
【００６４】
システムのいずれか１つの様々な態様に従って、システムは、情報価値のあるおよび品質管理を合格したアレル比率の中央値を生産し、およびドナー無細胞ＤＮＡ（または非対象ｃｆ−ＤＮＡ）のパーセンテージとして中央値をアウトプットする。システムが、情報価値のあるおよび品質管理を合格したアレル比率の中央値をレポートし、および産出された結果のロバストネスを改善するドナー無細胞ＤＮＡのパーセンテージとして、中央値をアウトプットするように構成され得る。システムのいずれか１つのいくつかの実装において、システムは、ドナー（または非対象）および／またはレシピエント(または対象)の標的をラベルし、ならびに随時いかなる測定された寄与分も調整するように構成されている、遺伝子型判定構成要素（例として、３０４）を包含する。
【００６５】
システムのいずれか１つの一態様に従って、システムは、少なくとも２つの品質測度（例として、値の有用性の査定）、ロバスト変動係数（ｒＣＶ）およびｄＱＣを生産するｑＧＴ処理を実行した。例えば、システムが、情報価値のあるおよび定量可能な標的の分布を使用し、正規化された（ｒＣＶ）を算出するように構成され得る。
【００６６】
１つのアプローチにおいて、ロバスト標準偏差（ｒＳＤ）が、（例として１．４８２６の）正規化係数によって縮尺された少数種の割合の中央値からの絶対ダイバージェンスの中央値として、コンピュータ処理される。ｒＳＤは、それがスタブ値（例として、１パーセントの４分の１）を加えることによって正規化された後、ドナーｃｆ−ＤＮＡ％（または非対象ｃｆ−ＤＮＡ％）で割ることによって、変動係数へ変換され得る。スタブ値は、ゼロ付近の除数の不安定性を避けるシステムにより導入され得、および様々な例において、非ゼロ除数を確実にするように小さい値を包含する。様々な態様において、システムは、ｒＣＶによって、それらの中央値付近のアッセイされた標的の広がりを測定するように構成され得る。これは、計量の正確さまたは試料の質としてｒＣＶを決定するシステムを可能にする。システムは、健常対象(health)試料を同定するように、試料の質の計量に適用するように構成され得る。いくつかの例において、有用な試料は、５０％を下回るｒＣＶを有する。改善された質の計量の結果は、従来のアプローチを超えて試料中の異常の検出の増大、および副作用の検出の改善を産生する。
【００６７】
システムのいずれか１つの一態様に従って、システム３００は、試料データ（例えば、遺伝型に基づく調整された試料データを含む）上の様々な品質測度を算出するように構成されている、分析構成要素３０６を包含し得る。１つの例において、分析構成要素は、試料の安定性を確実にし、ならびに試料の汚染が起こっていないことを確実にするように、ｒＳＤ、ｒＣＶおよびｄＱＣを算出するように構成されている。
【００６８】
システムのいずれか１つのいくつかの態様に従って、システムは、不一致な品質チェックを提供するｄＱＣ値を決定する：システムが、試料の混合および汚染に対する保護として、ホモ接合のレシピエントおよび情報価値のない標的の少数アレルの割合を評価するように構成されている。「ｄＱＣ」値は、対象 対 非特異性アレルノイズほぼゼロパーセントと理論上読み取られるはずである。採取および処理の間に試料取り換えが起こった場合、誤ったレシピエント遺伝子型が使用され、およびシステムによって実行されるｄＱＣ試験は、推定される情報価値のない標的での５０または１００％読み値まで即時に合図を出す。システムのいずれか１つのさらなる態様は、試料の汚染および試料中のゲノムの不安定性を同定するようにｄＱＣ分析を実装する。システムは、算出されるｄＱＣ値が、例えば０．５％を下回る場合、有用な試料としてデータを同定するような初期値によってセットされ得る。他の閾値が、実装され得る（例として、＜１％、２％、．３％、．４％、．６％、等々）。さらなる例の閾値は、１％、５％、１０％、または５０％を包含する。システムのいずれか１つの様々な態様において、ｄＱＣフィルターをかけることの実行は、従来のアプローチを超えて汚染の検出、およびまたはゲノムの不安定性の検出を改善する。
【００６９】
さらなる側面において（または提供される他のシステムのいずれか１つのさらなる態様において）、ドナー（または非対象）遺伝子型を刺激する、および次いでいくつかの態様において、ドナーｃｆ−ＤＮＡ（または非対象ｃｆ−ＤＮＡ）を算出する方法とともに構成されるシステムが、提供される（または、そのように構成され得る）。例えば、ドナー（または非対象）遺伝型が入手可能でない場合、システムは、ドナー（または非対象）遺伝子型データのシミュレーションに基づき、ドナーｃｆ−ＤＮＡ（または非対象ｃｆ−ＤＮＡ）をそれでも算出し得る。ドナー（または非対象）遺伝型をシミュレーションすることは、確からしいドナー（または非対象）遺伝子型および確からしいｑＧＴ成果の範囲を決定するシステムを可能にする。システムのいずれか１つの様々な態様に従って、システムは、より適した非自己遺伝子型を同定するように、全体的にランダムな遺伝子型を生産しおよび統計的な計算を実行するように構成されている。システムは、明らかに可視のアレルに適用されるバイアスによって、ランダムな遺伝子型の生成を繰り返しすことができる。
【００７０】
システムのいずれか１つの様々な態様に従って、システム（例として、３００）は、ドナー遺伝子型が入手可能でない場合、ドナーｃｆ−ＤＮＡ（または非対象ｃｆ−ＤＮＡ）をコンピュータ処理するシミュレーション方法を実行するように構成されている。レシピエントの遺伝子型およびｑＧＴの結果のみを使用し、システムは、Monte Carloシミュレーションを使用し、ドナー（または非対象）の選択肢を評価する。例えば、シミュレーションにおける予備的なランダムな選択は、与えられたｑＧＴ試料が表し得るだろう全体の結果を決定する。シミュレーションの統計的な分析は、確からしいドナー（または非対象）遺伝子型を創設するシステムによって見出される。システムはまた、適したドナー（または非対象）の遺伝子型空間を模索するおよび確からしいｑＧＴ成果の範囲を産生するための第２のMonte Carloシミュレーションを実行するようにも構成され得る。１つの例に従って、システムによって実行される５万のシミュレーションは、３次元のポイントクラウドを創造し、ドナーｃｆ−ＤＮＡ（または非対象ｃｆ−ＤＮＡ）の中央値、ｒＣＶおよびｄＱＣトリプレットをレポートする。システムについての後続する処置において、ポイントクラウドが、ｄＱＣおよびｒＣＶの下方３分の１についてスライスされ、ならびに残存する「象限」は、現実的なおよびクリーンな試料に対応するシミュレーションを表す。ドナーｃｆ−ＤＮＡの中央９５％（または非対象ｃｆ−ＤＮＡ）コールは、いくつかの態様において、ドナー（または非対象）遺伝子型を有さないｑＧＴについて、「方法２」成果を産生し得る。他の実装において、より少ないシミュレーション(例として、１万、２万、３万等々)が、実行され得るか、またはより大きな数のシミュレーション（例として、６万、７万等々）が、処理のための値を創設するように実行され得る。システムのいずれか１つのいくつかの態様に従って、追加の計算が、遺伝型シミュレーションおよび結果として生じるドナー遺伝子型を洗練するように適用され得る。
【００７１】
本明細書に記載の様々な側面および機能（例として、基礎的な遺伝子型判定アルゴリズム、特異的な遺伝子型判定アルゴリズム、ｑＧＴアルゴリズム、試料の結果を形質転換するような（例として、遺伝子型の正常化された見かけの値へ）記録された試料のデータの操作、「ドナー（または非対象）なしの」アルゴリズム、（再）シミュレーションアルゴリズム、Monte-Carloシミュレーション等々）が、１以上の特別に構成されたコンピュータシステム（例として、ネットワークアプライアンス、パーソナルコンピューター、ワークステーション、メインフレーム、ネットワーククライアント、サーバー、メディアサーバー、アプリケーションサーバー、データベースサーバー、ウェブサーバー、携帯コンピューターデバイス（例として、スマートフォン、タブレットコンピューター、およびパーソナルデジタルアシスタント）およびネットワーク機器（例として、負荷分散装置、ルーター、およびスイッチ））において実行する、特化したハードウェアまたはソフトウェア構成要素として実装されてもよい。さらに、側面は、単一のコンピュータシステムに位置されてもよく、または１以上のコミュニケーションネットワークに接続される複数のコンピュータシステムの内で分散型であってもよい。
【００７２】
例えば様々な側面、機能、システム構成要素、および処理（例として、品質管理構成要素、遺伝子型判定構成要素、および分析構成要素）は、１以上のクライアントコンピュータへサービスを提供するように特別に構成されているか、または図４において示される分散型コンピュータシステム４００などの、分散型のシステムの一部として全体の仕事を実施するように特別に構成されている、１以上のコンピュータシステム（クラウド供給源を包含する）に位置されていてもよい。その結果として、態様は、いかなる特定のシステムまたはシステムのグループ上で実行することに限られない。さらに、側面、機能、および処理が、ソフトウェア、ハードウェアまたはファームウェア、あるいはそれらのいかなる組み合わせの中に実装されてもよい。システムのいずれか１つのいくつかの態様に従って、コンピュータシステム４００は、ｃｆ−ＤＮＡ値を産生するか、または他の選択肢の間で試料の質、汚染、健康および／または生存性を決定する同じものから採られた値を分析するための組織および／または血液試料を処理するように他のシステムに接続され得る。
【００７３】
図４に言及すると、特別な目的の分散型コンピュータシステム４００の例証される分解立体図であり、それにおいて、本開示の様々な側面および機能が、実践される。示されるとおり、分散型コンピュータシステム４００は、１以上の情報を交換するコンピュータシステムを包含する。より具体的に言うと、分散型コンピュータシステム４００は、コンピュータシステム４０２、４０４、および４０６を包含する。示されるとおり、コンピュータシステム４０２、４０４および４０６は、コミニュケーションネットワーク４０８によって相互接続され、およびコミニュケーションネットワーク４０８を通してデータ交換をしてもよい。ネットワーク４０８は、それを通してコンピュータシステムがデータ交換をしてもよいいかなるコミニュケーションネットワークを包含してもよい。ネットワーク４０８を使用するデータを交換するように、コンピュータシステム４０２、４０４、および４０６ならびにネットワーク４０８は、他のものの内で、ファイバーチャネル、トークンリング、イーサネット、ワイヤレスイーサネット、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ、ＩＰ、ＩＰＶ６、ＴＣＰ／ＩＰ、ＵＤＰ、ＤＴＮ、ＨＴＴＰ、ＦＴＰ、ＳＮＭＰ、ＳＭＳ、ＭＭＳ、ＳＳ４、ＪＳＯＮ、ＳＯＡＰ、ＣＯＲＢＡ、ＲＥＳＴ、およびウェブサービスを包含する様々な方法、プロトコル、ならびに基準を使用してもよい。データ転送が、安全であることを確実にするように、コンピュータシステム４０２、４０４、および４０６は、例えば、ＳＳＬまたはＶＰＮ技術を包含する様々なセキュリティ対策を使用し、ネットワーク４０８を介してデータを伝えてもよい。 分散型コンピュータシステム４００が３つのネットワーク化コンピュータシステムを例証する一方で、分散型コンピュータシステム４００は、そう限定されず、およびいかなる数のコンピュータシステムおよびいかなる媒体及びコミニュケーションプロトコルを使用し、ネットワーク化されるコンピュータ処理デバイスを包含してもよい。
【００７４】
図４において例証されるとおり、コンピュータシステム４０２は、プロセッサー４１０、メモリー４１２、相互接続要素４１４、インターフェース４１６、およびデータ保存要素４１８を包含する。本明細書に開示の少なくともいくつかの側面は、機能および工程を実装するように、プロセッサー４１０は、操作されたデータを結果としてもたらす一連の指示を実施する。プロセッサー４１０は、いかなる種類のプロセッサー、マルチプロセッサー、またはコントローラーであってもよい。例のプロセッサーは、市販のプロセッサーを包含してもよい。プロセッサー４１０は、相互接続要素４１４によって１以上のメモリーデバイス４１２を包含する、他のシステムの構成要素に接続される。
【００７５】
メモリー４１２は、プログラム（例として、プロセッサー４１０によって実行されるようにコードされた指示の配列）およびコンピュータシステム４０２のオペレーションの間のデータを保存する。よって、メモリー４１２は、比較的高いパフォーマンス、揮発性、ダイナミック・ランダム・アクセス・メモリー（「ＤＲＡＭ」）またはスタティックメモリー（「ＳＲＡＭ」）などのランダムアクセスメモリーであってもよい。しかしながら、メモリー４１２は、ディスクドライブまたは他の不揮発性の保存デバイスなどのデータを保存するいかなるデバイスを包含してもよい。様々な例は、メモリー４１２を特定化し、およびそのいくつかのケースにおいて、本明細書に開示の機能を実施するユニークな構造へ組織化してもよい。それらのデータ構造は、特定のデータおよびデータの特定の種類に対する値を保存するようにサイズによって並べられ、そして組織化されてもよい。
【００７６】
コンピュータシステム４０２の構成要素は、相互接続要素４１４などの相互接続要素によってカップリングされる。相互接続要素４１４は、特化したまたは標準的なコンピュータ処理母線技術と適合する１以上の物理的な母線などのシステム構成要素との間のいかなるコミュニケーションカップリングを包含してもよい。相互接続要素４１４は、コンピュータシステム４０２のシステム構成要素の間で交換されるべき指示およびデータを包含するコミュニケーションを可能にする。
【００７７】
コンプライアンスはまた、インプットデバイス、アウトプットデバイス、およびインプット／アウトプットデバイスの組み合わせなどの１以上のインターフェースデバイス４１６をも包含する。インターフェースデバイスは、インプットを受け取るか、またはアウトプットを提供してもよい。より具体的に、アウトプットデバイスは、外部の発表のために情報をレンダーリングしてもよい。インプットデバイスは、外部供給源からの情報を受けてもよい。インターフェースデバイスの例は、キーボード、マウスデバイス、トラックボール、マイクロフォン、タッチスクリーン、プリントデバイス、ディスプレイスクリーン、スピーカー、ネットワークインターフェースカード等々を包含する。インターフェースデバイスは、コンピュータシステム４０２がユーザーおよび他のシステムなどの外部の存在物と情報を交換しならびに伝達することを可能にする。
【００７８】
データ保存要素４１８は、コンピュータ読み取り可能な、および書き込み可能な不揮発性の、または非一過性の指示が、プログラム、または他のプロセッサー４１０によって実行されるオブジェクト定義するようにその中に保存される、データ保存媒体を包含する。データ保存要素４１８はまた、媒体上または媒体中に記録される、およびプログラムの実行の間、プロセッサー４１０によって処理される情報を包含してもよい。指示は、コード化されたシグナルとして持続的に保存されてもよく、および支持派、プロセッサー４１０が本明細書に記載のいかなる機能を実施させてもよい。媒体は、他のもの内で、例えば光学ディスク、磁気ディスクまたはフラッシュメモリーであってもよい。オペレーションにおいて、プロセッサー４１０またはいくつかの他のコントローラーは、データがデータ保存要素４１８中に包含される保存媒体がするよりも、プロセッサー４１０による情報へより早いアクセスを可能にする、メモリー４１２などの別のメモリー不揮発性のレコーディング媒体から読み取られせる。メモリーは、データ保存要素４１８中またはメモリー４１２においてに位置されてもよいが、しかしながら、プロセッサー４１０は、メモリー内のデータを操作し、および次いで処理が完了した後、データ保存要素４１８に関連する保存媒体にデータを複製する。様々な構成要素は、保存媒体と他のメモリー要素の間のデータの移動を管理してもよく、および例は、特定のデータ管理構成要素に限定されない。さらに例は、特定のメモリーシステムまたはデータ保存システムに限定されない。
【００７９】
コンピュータシステム４０２は、そのうえで様々な側面および機能が実践されてもよい１種類のコンピュータシステムとしての例の方法で示されるものの、側面および機能は、図４において示されるようなコンピュータシステム４０２において実装されるものに限定されない。様々な側面および機能は、図４において示されるものよりも異なる構造または構成要素を有する１以上のコンピュータにおいて実践されてもよい。
【００８０】
コンピュータシステム４０２は、コンピュータシステム４０２中に包含されるハードウェアの要素の少なくとも部分を管理する作動システムを包含するコンピュータシステムであってもよい。プロセッサー４１０および作動システムは、高いレベルのプログラミング言語における適用プログラムが記述されることについて、一緒に定義され得る。加えて、様々な側面および機能が、非プログラム化環境において実装されてもよい。例えば、ＨＴＭＬ、ＸＭＬまたは他の形式において想像された書類は、ブラウザプログラムのウインドウにおいて観られた場合、画像的なユーザーインターフェースの側面をレンダーリングし得るか、または他の機能を実施し得る。さらに、様々な例は、プログラム化もしくは非プログラム化要素、またはそのいかなる組み合わせとして実装されてもよい。
【００８１】
例
成人および小児の両者８７名の固有の(unique)移植レシピエント対象から合計２９８試料が品質管理（ＱＣ）基準に合格し、かつ分析のために入手可能であった。２つの固有のドナー／レシピエントがＤＮＡミスマッチであることを考慮すると、初期移植後および再移植後の両方の研究に参加した１個体を２つの固有の対象として分析した。移植での患者の平均年齢は、７．９＋／−７．５歳であった（０．０３〜２４．２年に及ぶ）；血液試料採取における患者の平均年齢は、１２．７＋／−８．１歳であった（０．０８〜３０．２年に及ぶ）；対象の５９．６％（５１／８７）は、男性であり、および６５．５％（５７／８７）は、白人であった。移植から血液試料採取までの平均時間は、４．８＋／−４．２年であった。
【００８２】
生検関連血液試料におけるドナーフラクションと細胞性拒絶反応のグレードとの相関
合計で１５８の試料を、ＥＭＢに先立ち２４時間以内に採取し、分析のために包含させた。１つの試料のみを各生検と関連付けた。結果を表１に要約する。１３４の生検は、グレードＣＲ０であり、２１の生検は、グレードＣＲ１であり、３つの生検は、グレードＣＲ２であった。
【００８３】
分析のためにドナー遺伝型が知られていた場合、平均ドナーｃｆ−ＤＮＡフラクションを、グレードＣＲ０生検に関連する試料において０．１１％（ＩＱＲ０．０６〜０．２１％）、グレードＣＲ１生検に関連する試料において０．３７％（ＩＱＲ０．１５〜０．７２％）およびグレードＣＲ２生検（ｐ＝０．０２７）に関連する試料において０．９７％であると見出した。関連するＲＯＣ曲線に基づくグレードＣＲ２拒絶を除外するために実験上最適なカットポイントは、０．８７％［95% CI 0.78-0.97% (p=0.009)］であった。ＰＰＶは、１３．４％（７．６、２２．６）およびＮＰＶは１００％であった。データのグラフ表示を、図１Ａにおいて表示する。
【００８４】
ドナー遺伝子型が未知であった場合、平均ドナーｃｆ−ＤＮＡフラクションは、グレードＣＲ０生検に関連する試料おいて０．２５％であり、グレードＣＲ１生検に関連する試料において０．８９％（ＩＱＲ０．４４＝５．３５％）であり、およびグレードＣＲ２生検に関連する試料において、１．２２％（ｐ＜０．００１）である。関連するＲＯＣ曲線に基づくグレードＣＲ２拒絶を除外するために実験上最適なカットポイントは、０．８９％［95% CI 0.46-1.70% (p=0.725)］であった。ＰＰＶは、１５％（３．２１〜３７．９）であり、およびＮＰＶは、１００％（９７．４、１００）であった。データのグラフ表示を図１Ｂに提示する。
【００８５】
表１．ドナーフラクションおよび細胞性拒絶反応のグレード
【表１】
2020531050.tif 000003
＊ヌル仮説：中央値は拒絶反応のグレードカテゴリーにわたって同じである（ＣＲ０ vs. ＣＲ１ vs. ＣＲ２）
【００８６】
Quilty病変との相関
１３９試料を、Quilty病変の有無について報告されている生検と関連付けた（１２０ いいえ、１８ はい）。ドナーｃｆ−ＤＮＡフラクションとの相関を表２に要約した。
ドナー遺伝子型が分析のため知られていた場合、平均ドナーｃｆ−ＤＮＡフラクションは、Quilty病変について陰性である生検に関連する試料において、０．１２％（ＩＱＲ ０．０７〜０．３２％）であり、およびQuilty病変ついて陽性である生検に関連する試料において、０．１０％（ＩＱＲ ０．０６〜０．１９％）であった（ｐ＝０．７３８）。
ドナー遺伝子型が未知であった場合、平均ドナーｃｆ−ＤＮＡフラクションは、Quilty病変について陰性である生検に関連する試料において、０．２８％（ＩＱＲ ０．１８〜０．５３％）であり、およびQuilty病変ついて陽性である生検に関連する試料において、０．２１％（ＩＱＲ ０．１５〜０．２７％）であった（ｐ＝０．０３）。
【００８７】
表２．ドナーフラクションおよびQuilty病変の存在
【表２】
2020531050.tif 000004
＊ヌル仮説：中央値はQuilty病変の存在／不在にわたって等しい（いいえvs. はい）
【００８８】
移植心冠動脈病変（ＣＡＶ）との相関
選択的冠動脈造影に先立つ２４時間以内に１１６の血液試料を採取した。それらのうち、１１は、2020 ISHLTグレーディングシステム（Mehra et al.,J Heart Lung Transplant 29,717-727 (2010)）により定義されるように、移植片脈管障害を実証し、および９９は、移植片脈管障害を示さなかった。血管造影関連試料中のドナーｃｆ−ＤＮＡフラクションの比較を表３に要約した。
【００８９】
分析のためのドナー遺伝子型が知られていた場合、平均ドナーｃｆ−ＤＮＡフラクションは、ＣＡＶに関連しない試料において０．０９％（ＩＱＲ ０．０６〜０．２０％）であり、ＣＡＶに関連する試料において０．４７％（ＩＱＲ ０．２７〜０．７１％）であった（ｐ＝０．０５）。Mehra,M.R.,et al. International Society for Heart and Lung Transplantation working formulation of a standerdized nomenclature for cardiac allograft Vasculopathy-2010. J Heart Lung Transplant 29,717-727 (2010)。ＣＡＶを除外するため実験上最適なカットポイントは、０．１９％［95% CI 0.09-0.038%(p<0.001)］であった。データのグラフ表示を図２Ａに提示する。
【００９０】
分析のためのドナー遺伝子型が未知であった場合、平均ドナーｃｆ−ＤＮＡフラクションは、ＣＡＶに関連しない試料において、０．２７％（ＩＱＲ ０．１６〜０．５２％）であり、ＣＡＶに関連する試料において、０．５５％（ＩＱＲ ０．３８〜１．２２％）であった（ｐ＝０．０５７）。ＣＡＶを除外するために実験上最適なカットポイントは、０．３７％［95% CI 0.24-0.57% (p<0.001)］であった。データのグラフ表示を図２Ｂに提示する。
【００９１】
表３．ドナーフラクションおよび心冠動脈病変
【表３】
2020531050.tif 000005
＊ヌル仮説：中央値はＣＡＤなしとＧＶにわたって同じである（ＣＡＤなし vs. ＧＶ）
【００９２】
抗体媒体拒絶反応（ＡＭＲ）との相関
１４２試料を、抗体媒体拒絶反応（ＡＭＲ）について分析された生検と関連付けた。１３２試料をｐＡＭＲ０として読み、および３試料をグレードｐＡＭＲ１またはｐＡＭＲ２として読んだ。
ＡＭＲ試料の間でドナーｃｆ−ＤＮＡフラクションの比較を、表４に要約する。
分析のためのドナー遺伝子型が知られていた場合、グレードｐＡＭＲ０と関連する試料について平均ドナーフラクションは、０．１２％（ＩＱＲ ０．０７〜０．２９％）であり、およびグレードｐＡＭＲ１またはｐＡＭＲ２に関連する試料については、０．２６％（ＩＱＲ ０．０９〜０．３３％）であった（ｐ＝０．９０５）。
分析のためのドナー遺伝子型が未知であった場合、平均ドナーｃｆ−ＤＮＡフラクションは、グレードｐＡＭＲ０に関連する試料について０．２９％（ＩＱＲ ０．１８〜０．６１％）であり、およびグレード１または２に関連する試料について、０．３９（ＩＱＲ ０．１２〜０．４４％）であった（ｐ＝０．９６９）。関連するＲＯＣ曲線に基づきｐＡＭＲ１またはｐＡＭＲ２を除外するための実験上最適なカットポイントは、０．３８％［95%CI 0.19-0.74%(p=0.005)］であった。
【００９３】
表４：ドナーフラクションおよび抗体媒体性拒絶反応
【表４】
2020531050.tif 000006
＊ヌル仮説：中央値は、感染に対する処置にわたって同じである（０ vs. １または２）
【００９４】
考察
標的化された心臓移植レシピエントの拒絶反応の監視のためなどの、ドナーｃｆ−ＤＮＡの定量のためのハイスループットアッセイが鋭敏な感度を有すること、およびドナーフラクションにおける著しい高騰が、移植心冠動脈病変の形状で急性突発性拒絶反応および慢性拒絶反応を包含する、深刻な同種移植片傷害に相関されることが見出されている。具体的に言うと、０．８７％（９５％ ＣＩ０．７８−０．９７％）の実験上最適なカットポイントは、ＣＲ２グレード拒絶からＣＲ０とＣＲ１を確実に見分けた。しかしながら、総ｃｆ−ＤＮＡのドナーフラクションは、Quilty病変と識別しなかった。
【００９５】
ドナーｃｆ−ＤＮＡは、ドナーとレシピエントとの間の遺伝子的差異からして、移植の分野におけるバイオマーカーとして、独自に好適である。分野は、女性レシピエントの血清中にＹ染色体を検出した、1998年における第１のレポート以来、有意に進展している（Lo et al.,Lancet 351: 1329-1330 (1998)）。
【００９６】
ドナーｃｆ−ＤＮＡの使用は、監視生検の必要性を劇的に減少させ、およびそのため、拒絶反応に対するより頻繁なモニタリングを可能にする。早期の拒絶反応を検出することにおけるアッセイの見かけの感度と、それがＥＭＢもしくは他の生検よりも高い頻度で使用され得るという事実の両方は、臨床医に頻繁な非侵襲的なモニタリングを可能にし、それは患者への外傷の低減ならびに拒絶反応および／または他の臨床的に深刻な事象のより早期のかつより有効な検出の両方を結果としてもたらしてもよい。加えて、ドナーｃｆ−ＤＮＡは、心臓移植レシピエントの病理組織学的なパターンの理解を増してもよい。Quilty病変のありの、およびなしの患者が同等のレベルのドナーｃｆ−ＤＮＡを有したという知見は、他の人々が提案するように（Gopal et al.,Pathol Int 48: 191-198 (1998)）、この病理学的な知見がドナーの器官への障害を反映していなくてもよいという証拠を増す。際立ったことに、データは、ＣＲ０対ＣＲ1対ＣＲ２の細胞性のグレードを比較する場合、ドナーｃｆ−ＤＮＡレベルにおける段階的な、統計的に有意な違いを示した。この結果は予想外であったし、およびドナーｃｆ−ＤＮＡレベルとドナー器官への進行性の障害の間に、測定可能な直線状の関係を提案する。
【００９７】
材料および方法
測定および定義
各対象の移植の時点での、身長および体重ならびに滞在期間を記録した。拒絶反応の処置を、診療記録において文章化されるような同種移植片拒絶反応を処置する意図による、免疫抑制医薬における変更として定義し、ならびに拒絶反応に対する処置の開始を、この変更の医薬を対象にはじめて投与した日付および時間として記録した。生検により証明された細胞性拒絶反応を、ISHLTグレード２またはより高い細胞性拒絶反応として定義した。生検により証明された抗体媒体拒絶反応を、ISHLTグレード１またはより高いＡＭＲとして定義した。機械的循環補助を、一時的なもしくは耐久性のあるいずれかの心室補助デバイス、大動脈内バルーンポンプ、または体外の循環補助として定義した。もし、対象が、がんまたは移植後リンパ増殖性障害として診断されたか、または妊娠した場合、それらの状態がレシピエントの血清の中へ追加の「非自己」無細胞ＤＮＡの交絡の供給源を実装するため、診断の最初の日付を記録した。すべての生検の病的状態のレポートをレビューし、および２００４  ISHLTグレードを記録し、ならびに生検がQuilty病変を有するかどうかを判断した。冠動脈造影の結果が、血液試料の前の２４時間以内に実施される場合、2010 ISHLTグレーディングシステムに従って記録された（Mehra et al., J Heart Lung Transplant 29: 717-727 (1998)）。
【００９８】
血液試料を、以下：移植後１、４、７および２８日、いかなるＥＭＢの前の２４時間以内に、および拒絶反応に対する処置の開始の直前に、ならびに次いで、１、４、７、および２８日後の臨床シナリオにおいて、心臓移植レシピエントから得た。
【００９９】
総ｃｆ−ＤＮＡレベルの平均および四分位範囲（ＩＱＲ）を、ｎｇ／ｄＬにおいて報告し、およびドナーｃｆ−ＤＮＡレベルの平均パーセンテージおよびＩＱＲを、合計のフラクションとしてレポートした。独立試料平均試験を、試験された臨床的な変数にわたるドナーフラクション（パーセンテージドナーｃｆ−ＤＮＡ）と総ｃｆ−ＤＮＡ（ｎｇ／ｄＬ血漿）を比較するために使用した。
【０１００】
除外基準
拒絶の検出の前処置のためのバイオマーカーの感度特異性を決定することにおいて、それらの臨床シナリオは、それらが拒絶反応の早期の処置前の検出に関連するためアッセイ結果の解釈を交絡させる、総ｃｆ−ＤＮＡおよびドナーフラクションにおける変化についての生物学的な理由を提示するため、試料を心臓移植の８日以内に採取した場合、試料を拒絶反応の処置の開始後２８日以内に採った場合、試料を患者が機械的な循環補助を受ける間に採った場合、対象が選出の時点でがんもしくは移植後リンパ増殖性障害の診断を有した場合、または試料が生検手順の間、心臓内のアクセスの後に採られた場合、試料を分析から除外した。同種移植片拒絶の診断のための感度および特異性は、それらの除外基準の外側に該当する生検関連試料に基づいた。複数のドナー／レシピエント（および胎児性の）遺伝子型が分析を交絡させることから、骨髄もしくは非心臓固体臓器移植のレシピエントであった対象または心臓移植の前に妊娠していた対象をまた、この研究から除外した。
【０１０１】
加えて、それらが以下のアッセイのための品質管理（ＱＣ）基準、以下：血液体積、血漿体積、ＤＮＡ分量、スピンする時間、および温度を満たさなかった場合、試料の技術的な除外はされなかった。
【０１０２】
血液試料採取
循環するｃｆ−ＤＮＡのレベルを査定するために、抗凝固剤処置された血液の３〜１０ミリリットル（ｍｌ）を、採取した。各試料を、１０ｍｌ ＢＣＴチューブ（Streck,Omaha,NE）中に採取した。試料を即時にコードし、非同定化し、および処理するため実験室へ送達した。
【０１０３】
血漿処理およびＤＮＡ抽出
これまでに記載されたとおり、遠心分離による全血からの血漿の分離を、実行した。血漿を、ＤＮＡ抽出まで−８０℃で保存した。すべてのｃｆ−ＤＮＡ抽出を、ReliaPrep（商標） HT Circulating Nucleic Acid Kit（Promega,Madison,WI）を使用して実施した。各血漿試料からの総ｃｆ−ＤＮＡをまた、記録した。レシピエントゲノムのＤＮＡを、ReliaPrep（商標） Large Volume gDNA isolation system（Promega, Madison, WI）またはGentra Puregene Blood Kit（Qiagen, Germantown MD）を使用することにより抽出した。遺伝子型判定のためのゲノムのドナーＤＮＡを、ドナー／レシピエントマッチング処理の部分として、すべてのドナーからのＤＮＡを採取しおよび保存するBlood Centre of Southeast Wisconsinから得た。いくつかのケースにおいて、ゲノムのＤＮＡを生検試料から得、およびQIAamp DNA Micro Kit（Qiagen, Germantown MD）を使用し、抽出した。精製されたゲノムすべてのＤＮＡを、０．１×ＴＥバッファー中に再懸濁した。
【０１０４】
総ｃｆ−ＤＮＡ分析
各血漿試料中の総ｃｆ−ＤＮＡ含有量を、ヒト染色体１４、cytoband 14q11.2.上のリボヌクレアーゼＰＲＮＡ構成要素Ｈ１（Ｈ１ＲＮＡ）遺伝子（ＲＰＰＨ１）を検出する、TaqMan Quantitative real-time Polymerase Chain Reaction（ｑＲＴ−ＰＣＲ）参照アッセイを使用し、トリプリケイトにおいて評価した。アッセイは、NCBI build 37上のchr14:20811565（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA）での単一エキソンＲＰＰＨ１遺伝子内でマッピングする８７ｂｐ産物を増幅する。ＰＣＲ分析を、Applied Biosystem QuantStudio 7 Flex Real-time PCR system（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA）において実行した。各反応液に、血漿から抽出されたｃｆ−ＤＮＡの１μｌを使用した。ヒトゲノムのＤＮＡの希釈系列を、定量のための標準曲線を創造するように使用した。各試料からの総ｃｆ−ＤＮＡを得、およびｎｇ／ｍｌ血漿として表示した。
【０１０５】
パーセンテージドナーｃｆ−ＤＮＡ分析
myTAI-Heart Assayと称される、専売の、マルチプレックスの、アレル特異的定量的ＰＣＲに基づくアッセイを、ドナー無細胞ＤＮＡ（Ｄｃｆ−ＤＮＡ）のパーセンテージが総ｃｆ−ＤＮＡ（TAI Diagnostics）のフラクションとして直接的に定量化されるようにデザインした。アッセイは、両アレルのＳＮＰを各アレルに特異的なリアルタイムＰＣＲによって定量化する。これが、信頼し得る定量ならびにレシピエントおよびドナーゲノムの間の判別能力のそれらの可能性を増大したため、安定なゲノムの領域中の高頻度集団のＳＮＰが選択された。
【０１０６】
１５ｎｇのｃｆ−ＤＮＡを、各試料（４．５Ｅ＋０３コピー）中へスパイクされた外来性の標準（ＴＡＩ５）とともに、マルチプレックスのライブラリマスターミックスに加え、および０．００５ＵのＱ５（ＮＥＢ）ＤＮＡポリメラーゼ、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、９６標的の３ｕＭフォワードプライマープール、および３ｕＭの逆方向プライマープールを含有する２５ｕｌの反応液において、２ｍＭ ＭｇＣｌ２の最終濃度で３５サイクルの間、ＰＣＲによって増幅された。サイクル条件は、９８℃３０秒間、次いで９８℃１０秒間、５５℃４０秒間、および７２℃３０秒間を３５サイクルであった。これは、次いで、７２℃で２分のインキュベーションに続いた。試料を、次いで４℃で保存した。１０マイクロリットルの最終反応液を、ExoSAP-IT（Thermo Fisher Scientific）を使用し、３７℃で１５分間、および８０℃で１５分間インキュベーションすることにより、一掃した。
【０１０７】
試料を、次いでＴＡＩ保存バッファーで１：１に希釈し、および定量的遺伝子型判定のための準備ができるまで−８０℃で保存した。試料を、次いで定量的遺伝子型判定のために１：１００で希釈し、Roche LightCycler 480 System（Roche Diagnostics, Indianapolis, IN）を使用する、リアルタイムＰＣＲのための適切な対照およびキャリブレーターとともに３ｕｌの反応液として設定した。
【０１０８】
分析
定量的遺伝型判定
「定量的遺伝子型判定」（ｑＧＴ）は、各標的でのＡおよびＢアレルを定量化するように、ヘテロ接合体のＤＮＡ供給源の標準曲線を使用する。品質管理手順は、許容性判定基準を満たすように各標準曲線および試料増幅を評価する。定量可能な標的を、次いで解釈する。受容性判断基準は、歴史的増幅形状、第２のアレルに関するアレル特異的ＰＣＲアッセイの特異性、シグナル対ノイズ比率、標準曲線一式の傾きおよびｒ二乗、対照の非増幅、および陰性対照の汚染を包含する。
【０１０９】
一次分析は、「基礎的な遺伝子型判定」について、レシピエントおよびドナーのゲノムを最初に評価する。ｂＧＴ処理は、ドナーおよび／またはレシピエントを、各標的（例としてホモ接合のＡＡ、ヘテロ接合のＡＢ、およびホモ接合のＢＢ）で３つの実行可能な遺伝型によってラベル付けする。この情報を、標的当たりのｑＧＴを正確に解釈する目的において必要とする。情報価値のある標的を、レシピエントは知られるホモ接合であるところでそれらとして定義し、およびドナーは、別の遺伝子型を有する。ドナーはホモ接合であり、レシピエントから異なるところで、標的を、観察されるＢアレル比率がおよそ全体のドナーｃｆ−ＤＮＡレベルであるから、完全に情報価値のあると称する。ドナーがヘテロ接合であるところで、標的を、貢献がＡおよびＢアレルの両方に対してであることから、半分情報価値があると称し、測定された貢献を倍にしなければならないことを意味する。ロバストネスに対して、情報価値があり、および品質管理を合格したアレル比率を、ドナーｃｆ−ＤＮＡのパーセンテージとして報告する。
【０１１０】
各ｑＧＴ処理は、２つの主要な品質測度、ｒＣＶおよびｄＱＣを産生する。正規化されたロバストな変動係数（ｒＣＶ）を、情報価値のあるおよび定量可能な標的の分布を使用し、コンピュータ処理する。第１に、ロバストな標準偏差（ｒＳＤ）を、１．４８２６の正規化係数によって縮尺化された少数種の比率の中央値からの絶対ダイバージェンスの中央値としてコンピュータ処理する。ｒＳＤを、ゼロ付近の除数の不安定さを避けるために、１パーセントの４分の１を加えることによって正規化した後に、ドナーｃｆ−ＤＮＡによって割ることにより、変動係数へ変換する。ｒＣＶは、アッセイされた標的の、それらの中央値の付近の広がりを測定し、および正確さまたは試料の質の計量として働く。有用な試料は、一般に５０％を下回るｒＣＶを有するだろう。
【０１１１】
ｄＱＣは、不一致の品質チェックである：レシピエントホモ接合のおよび情報価値のない標的の平均少数アレルの割合を、試料の混合および汚染から保護するという目的で評価した。それらは、ほぼゼロパーセントの、対象対非特異性アレルノイズと理論上読めるべきである。もし仮に、採取および処理の間に試料取り換えが起こったならば、誤ったレシピエント遺伝子型を使用し、およびｄＱＣは、推定される情報価値のない標的での５０または１００％読み値まで、即時に合図を出す。ｄＱＣはまた、試料汚染およびおそらくはゲノムの不安定性をも捕える。有用な試料は、一般に０．５％を下回るｄＱＣを有する。
【０１１２】
ドナーｃｆ−ＤＮＡをコンピュータ処理する第２の方法は、ドナー遺伝子型が入手可能ではない場合、適用可能である。レシピエントの遺伝型およびｑＧＴの結果のみを使用し、ドナーの選択肢、Monte Carloシミュレーションにおいて評価する。予備的なランダムな選択は、与えられたｑＧＴ試料が表し得るだろう全体の結果を例証する。シミュレーション知見の統計学的分析は、確からしいドナー遺伝子型に対するサポートを提供する。第２のMonte Carloシミュレーションは、実行可能なまたは適したドナー遺伝子型空間を模索し、および確からしいｑＧＴ成果の範囲を産生する。５０，０００のシミュレーションの各々は、Ｄｃｆ−ＤＮＡの中央値、ｒＣＶおよびｄＱＣのトリプレットをレポートし、および３次元のポイントクラウドを構成する。ポイントクラウドを、ｄＱＣおよびＣＶの下方３分の１についてスライスし、および残存する「象限」は、現実的なおよびクリーンな試料に対応するシミュレーションを表す。その結果得られるドナーｃｆ−ＤＮＡコールの中央の９５％は、ドナー遺伝子型なしのｑＧＴについての成果となる。
【０１１３】
ドナーフラクション
ドナーフラクション（またはパーセントドナーｃｆ−ＤＮＡ）を算出し、および細胞性拒絶反応、抗体媒体拒絶反応、移植片脈管障害などの事象、ならびに死亡、心肺停止、心臓再移植、および機械的な循環補助の開始の臨床的に深刻な事象に対して比較した。対象ががんもしくは移植後リンパ増殖性障害と診断されるか、または妊娠した場合、適用可能であれば、診断の第１日を記録した。
対象からの試料の遺伝子型判定は、包含／排除判断基準を通過すること、および後続する分析に使用された。各ドナーとレシピエント対の遺伝子型判定は、試料当たりの情報価値のある遺伝子座を結果としてもたらした。
【０１１４】
統計
方法の種類（ドナー遺伝子型ありか、またはシミュレーションありドナー遺伝子型なし）によって、拒絶反応の種類（ＣＲ０、ＣＲ１、ＣＲ２）が等しい中央値を有するかどうか試験するように、独立中央値についての中央値テストを実施した。ＣＲ０およびＣＲ１を組み合わせならびにそれらの方法の中央値とＣＲ２を比較する場合、ｐ値は、０．０５より大きい。したがって、中央値が拒絶反応の種類にわたって等しいと結論付けた。しかしながら、３つの拒絶反応の種類（ＣＲ０ vs. ＣＲ１ vs. ＣＲ２）にわたって中央値を比較するとき、ｐ値は０．０５より少なく、ならびにドナー遺伝子型が知られる場合およびドナー遺伝子型が未知の場合、決定された中央値が拒絶の種類に関して等しくないことを結論付けた。
【０１１５】
受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線を、２つの分析方法の感度および特異性を認定しならびにそれらのＣＲ０対ＣＲ１対ＣＲ２を診断する能力を比較するように構築した。最適なカットオフポイントまたは決定閾値は、正しい分類を与える最大のポイントであり、およびLiu et al. (Stat Med. 31(23):2676-86 (2012））による方法を利用した。この方法は、感度および特異度の積を最大化する。テストの陰性および陽性適中度をまた、コンピュータ処理した。例えば、１３．４％の陽性適中度（ＰＰＶ）は、陽性スクリーニングテストをした人々の間で、疾患の確率が１３．４％であったことを表す。同じく、１００％の陰性適中度は、陰性スクリーニングテストをした人々の間で、疾患なしである確率が、１００％であったことを示す。
【０１１６】
例  システムの実装
システムのいかなる一態様に従って、ドナー遺伝子型が未知である場合のドナーフラクション（％）を決定するソフトウェアを実行する。１つの例において、実行は、以下のオペレーション：
１．  Monte Carloシミュレーションを、ドナー遺伝子型にわたって実行可能なドナーフラクション（他の態様において、他のモデルまたは概算を使用してもよい）を決定するために実行した；
２．  ２フェーズのアプローチ、ここで試料の初期の短いシミュレーション（例として、試料の閾値の数の（例として、他の選択肢の間で、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、５９９９）を、より大きい数の試料（例として、１００００、１５０００、２００００、２５０００、２９９９９、等々）の第２のシミュレーションを伝えることに使用する−シミュレーションにおいて、ドナーフラクションの中央値、ｒＣＶおよびｄＱＣトリプレットを算出し得る；
【０１１７】
３．  初期シミュレーションにおいて、明らかなドナー遺伝子型を、ｒＣＶおよびｄＱＣ個別における標的選択物の影響の一般化された直線状のモデル化を実施することによって、決定し得る。さらにエントロピーおよび高バックグラウンド試料の間の標的選択物の頻度の分析を、ドナー遺伝子型の可能性のオフセット項に加える；
４．  初期シミュレーションにおいて、ドナー遺伝子型を一様に選び得る（例として、２２．７％ＲＲ、４５．５％ＲＶ、２２．７％ＶＶ、１０％ＮＡとして設定される）（例として、ヘテロ接合の（ＲＶ）、ホモ接合のバリアント（ＶＶ）およびホモ接合の基準（ＲＲ）；
５．  第２のシミュレーションは、ドナー遺伝子型を２５％ＲＲ、５０％ＲＶ、および７５％ＶＶとして選び、上の証拠ベクターによる一様なランダムな可変のオフセットをもち、不偏化のための標的が２より少ない(less two targets for unbiasing)；
【０１１８】
６．  ３次元ポイントクラウドを創造し、および部分を検閲した。検閲のためにマークされる指数関数0.001/3 + (exp(3*x)-1)/2750として定義されるドナーフラクションの中央値およびｒＣＶの極端な値によるシミュレーションである。いくつかの態様において、シミュレーションの９５％超が検閲される場合、アルゴリズムを、中央値ドナーフラクションの中間点より上のものを回復するように構成し得る。
７．  残存するシミュレーションのうち、より低いバックグラウンドノイズシミュレーションを、ｄＱＣの第１四分位を下回るものとして同定する。システムまたは方法の態様のいずれか１つに従って、よりｄＱＣのより低い四分位より高いシミュレーションを捨てる；
８．  残存するシミュレーションのうち、内部的に一貫したシミュレーションを、ｒＣＶの最初の３分の１を下回るものとして同定する。システムまたは方法の態様のいずれか１つに従って、ｒＣＶの低い３分の１より高いシミュレーションを捨てることができる。他の例において、異なるカットオフを、ｒＣＶに対して実装し得る。
９．  システムまたは方法の態様のいずれか１つにおいて、ドナー分析実行中、較正を包含し得る。例えば、ドナーフラクションを、直線状の式（例として、y <- (1.166002)x + 0.0001230337）によって縮尺し得る；および
１０．  システムまたは方法の態様のいずれか１つにおいて、アルゴリズムは、情報を戻す中央値ドナーフラクションの第４８分位数を捉えるように構成されておりその情報を返す
のいかなる１以上の、またはいかなる組み合わせを包含する。
【０１１９】
図５は、一態様に従ってシステム要素および試料を分析するための関数を包含する、プラットフォーム５００の分解組立図である。様々な態様において、プラットフォーム５００は、分析されるようなデータを受け取るかまたは生産し得る。例えばシステムは、外部のデータベース（例として、５５０、５５２）からとらえ、およびとらえられたデータを分析し得る。他の例において、ユーザー(例として、５５４、５５６)は、データのプラットフォーム５００へのコミュニケーションを管理し得るかかまたは誘導し得る。さらなる例において、ユーザー（６５８、５６０）は、アッセイデバイスおよび／または増幅デバイス(例として、５８２、５８４、およびプラットフォーム５００へ直接的に提供される結果）を作動し得る。
【０１２０】
システムのいずれか１つまたは方法の様々な態様に従って、実施される分析を、以下：ｂＧＴを前処理すること、ｇＧＴを前処理すること、および定量的に遺伝型を処理すること、ならびに結果を５９２でアウトプットすること、および／または保存すること（例として、データベース５９０中に）の３つのフェーズによって記載され得る。
【０１２１】
いくつかの態様において、実行および試料情報（例として、基礎的な遺伝型判定実行情報５０２および／または定量的遺伝子判定実行情報５０４）を、画像的なユーザーインターフェースのオペレーションを通してとらえる。いくつかの例において、基礎的な遺伝子型判定の前処理は、オペレーター名、試料識別子、および試料の位置の明細を包含し得る情報によって作動し得る；定量的な遺伝子型の前処理は、実行名、オペレーター名、試料識別子、および試料の位置を包含し得る情報によって作用し得る；ならびに成果コールの処理は、ｂＧＴ前処理データファイル、ファイル指定（レシピエントまたはドナー）、ｑＧＴ前処理データファイル、実行名および試料名を包含し得る情報によって作動する。立体配置データベース５９４は、データフォーマット、制御所法、および管理機能を包含する他の機能のデータを特定する情報を包含し得る。
【０１２２】
図５において、lightcycler 480（例として、５８２および５８４）からのデータを、試料分析の部分として処理する。１つの例において、プラットフォーム５００は、ＸＭＬファイルまたは他の好適なデータフォーマットを介し、ROCHE Lighcycler 480からのデータを捉える。データを、ユーザー統御（例として、ユーザー５５８または５６０によって誘発される）と伝達し得る。
【０１２３】
図５において５１８で示されるのは、得られた実行情報（例として、５０６および５０８）、液体の取り扱い情報（例として、５１０および５１２）、およびＲＴ−ＰＣＲデータ（例として、５１４および５１６（例えば、リアルタイムＰＣＲデータを包含し得る）について作動する３つのワークフローである。３つのワークフローは、以下：基礎的な遺伝子型判定結果および品質管理書類からなるデータファイル（例として、二進法データファイル）を生産する、ゲノムのＤＮＡ試料（例えば、プレートレイアウトの立体配置の情報と合わせて）について得られたデータを読むｂＧＴの前処理５２２−それらのファイルを、別々のデータレパートリーまたはシステムにおいてアーカイブに保管し得る；定量的な遺伝子型判定結果および品質管理書類からなるデータファイル（例として、二進法データファイル）を生産する、無細胞ＤＮＡ試料（例えば、プレートレイアウトの立体配置の情報と合わせて）についてのデータを読むｑＧＴ前処理５１８−それらのファイルを、別々のデータレパートリーまたはシステムにおいて保管し得る；および基礎的な遺伝子型判定および定量的遺伝子判定データファイル（例として、５１８および５２０）の対を、成果測定および全体品質管理書類を生産する、定量的遺伝型処理５２０−それらのファイルを、例えば、データベース５９０を包含する、別々のデータ供給源またはシステムにおいて保管し得るを包含する。様々な態様において、結果５９２を、プラットフォームにおいて表示し得るか、または表示のための他のシステムへ伝達し得る。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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