(57)【要約】  本発明は、特に診断および／または治療に有用な超小型シリカナノ粒子の合成方法に関する。より具体的には、シリカナノ粒子を合成するための方法であり、当該方法は、生理学的ｐＨで負に帯電している少なくとも１つのシランと、生理学的ｐＨで中性である少なくとも１つのシランおよび／または生理学的ｐＨで正に帯電している少なくとも１つのシランと、を混合することを含み、負に帯電しているシランに対する中性シランのモル比Ａは０≦Ａ≦６として規定され、負に帯電しているシランに対する正に帯電しているシランのモル比Ｂは０≦Ｂ≦５として規定され、負に帯電しているシランに対する中性シランおよび正に帯電しているシランのモル比Ｃは０＜Ｃ≦８として規定される。本発明はまた、得られた超小型シリカナノ粒子に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理学的ｐＨで負に帯電している少なくとも１つのシランと、生理学的ｐＨで中性である少なくとも１つのシランおよび／または生理学的ｐＨで正に帯電している少なくとも１つのシランと、を混合する混合工程を含み、
負に帯電しているシランに対する中性シランのモル比Ａは、０≦Ａ≦６、好ましくは０．５≦Ａ≦２として規定され、
負に帯電しているシランに対する正に帯電しているシランのモル比Ｂは、０≦Ｂ≦５、好ましくは０．２５≦Ｂ≦３として規定され、
負に帯電しているシランに対する中性シランおよび正に帯電しているシランのモル比Ｃは、０＜Ｃ≦８、好ましくは１≦Ｃ≦４として規定される、シリカナノ粒子を合成するための方法。
【請求項２】
前記ナノ粒子は、０．５ｎｍ〜１５ｎｍ、好ましくは０．５ｎｍ〜１０ｎｍの平均流体力学的直径を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記シランは、アルコキシシラン、ヒドロキシシラン、およびそれらの混合物の中から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記シランは、試薬の全重量の少なくとも８０重量％、８５重量％または９０重量％に相当する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記混合工程は、プロトン性溶媒中で行われる、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記方法は、中間生成物の単離工程または精製工程を伴わないワンポット合成である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記シリカナノ粒子は結晶性コアを含まない、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記負に帯電しているシランは、少なくとも１個、２個、またはそれ以上の負に帯電しているカルボン酸官能基を含むシランを含むか、または本質的にそれからなる、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記負に帯電しているシランは、少なくとも１つのキレート剤を含むシランを含むか、または本質的にそれからなる、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記キレート剤は、制限なく、以下を含んでいるポリアミノポリカルボン酸から選択される、請求項９に記載の方法：
−  ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸）、ＤＯＴＡＧＡ（２−（４，７，１０−トリス（カルボキシメチル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１−イル）ペンタン二酸）、下記式（ＩＩＩ）のＤＯ３Ａ−ピリジン；
【化１】
2020527538.tif 000022
−  ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）、ＣＨＸ−ＤＴＰＡ（トランス−シクロヘキシル−ジエチレントリアミン五酢酸）、オキソ−Ｄｏ３Ａ（１−オキサ−４，７，１０−トリアザシクロドデカン−４，７，１０−三酢酸）、ＳＣＮ−Ｂｚ−ＤＴＰＡ（ｐ−イソチオシアナトベンジル−ＤＴＰＡ）、１  Ｂ３Ｍ（１（ｐ−イソチオシアナトベンジル）−３−メチル−ＤＴＰＡ）、ＭＸ−ＤＴＰＡ（１−（２）−メチル−４−イソシアナトベンジル−ＤＴＰＡ）；
−  ＥＤＴＡ（２，２’，２’’，２’’’−（エタン−１，２−ジイルジニトリロ）四酢酸）；
−  ＥＧＴＡ（エチレングリコール−ビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸）、ＢＡＰＴＡ（１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’四酢酸）；
−  ＮＯＴＡ（１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−三酢酸）；
−  ＰＣＴＡ（３，６，９，１５−テトラアザビシクロ［９．３．１．］ペンタデカ−１（１５），１１，１３−トリエン−３，６，９−三酢酸）；
下記式（ＩＶ）のＴＭＰＡＣ；
【化２】
2020527538.tif 000023
−  および、それらの混合物。
【請求項１１】
前記キレート剤は金属イオンを含まない、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記キレート剤は、アルカリ金属イオンおよびそれらの放射性同位体、遷移金属イオンおよびそれらの放射性同位体、ポスト遷移金属イオンおよびそれらの放射性同位体、希土類金属イオンおよびそれらの放射性同位体ならびにそれらの混合物を含む金属イオンをキレート化する、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記正に帯電しているシランは、１つの正に帯電したアミノ官能基を有する少なくとも１つのシランを含む、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記混合工程は、少なくとも１つのフルオロフォアを含む少なくとも１つのシランをさらに含み、
中性シランに対するフルオロフォアを含むシランのモル比Ｄは、０．００１≦Ｄ≦０．２として規定される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記混合工程は、少なくとも１つの薬物部分を含む少なくとも１つのシランをさらに含み、
中性シランに対する薬物を含むシランのモル比Ｅは、０．１≦Ｅ≦５として規定される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ナノ粒子は、当該ナノ粒子の総重量と比較して０．５重量％〜５０重量％の薬物部分、例えば２重量％〜１０重量％の薬物部分を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれかに記載の方法によって得ることができる、シリカナノ粒子。
【請求項１８】
０．５ｎｍ〜１５ｎｍの平均流体力学的直径を有し、
キレート剤でグラフトされたポリオルガノシロキサンマトリックスを含み、
前記キレート剤は、（ｉ）金属イオンを含まず、且つ（ｉｉ）ナノ粒子当たり少なくとも０．１μｍｏｌ／ｍｇの含有量、好ましくはナノ粒子当たり０．５μｍｏｌ／ｍｇ〜２μｍｏｌ／ｍｇの含有量で存在する、シリカナノ粒子。
【請求項１９】
ヒトの診断および／または治療に使用するための、請求項１７または１８に記載のシリカナノ粒子。
【請求項２０】
放射線療法と組み合わせて使用するための、請求項１７または１８に記載のシリカナノ粒子。
【請求項２１】
イメージングにおける造影剤として使用するための、請求項１７または１８に記載のシリカナノ粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に診断および／または治療に有用な超小シリカナノ粒子の合成方法に関する。本発明はまた、得られた超小型シリカナノ粒子に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、世界の多くの国において主要な死因である。今日、癌を治療するための３つの主要な方法が存在し、それらは、外科手術、化学療法および放射線療法である。放射線療法は、腫瘍中の癌性細胞を破壊するための電離放射線の使用を意味する。しかしながら、放射線療法の重要な副作用は、照射が腫瘍の周囲の正常組織にも損傷を与え得ることである。ビーム形状の設計及び治療計画において多くの技術的進歩がなされてきたが、この副作用は依然として放射線治療の治療濃度域を制限している。この副作用を克服するために、従来の光子の代わりに、陽子、中性子、または重イオンなどの様々な粒子を使用すること、および／または腫瘍内に送達される線量を局所的に増強するために放射線増感剤を使用することの２つの主な戦略が導入されている。後者は、効果的な増感剤として作用することができる新しい材料の研究のためのドアを開く。
【０００３】
癌との戦いにおける別の前提条件は、腫瘍の位置を正確に突き止めることである。現在、ＭＲＩ、Ｘ線ＣＴ、単一光子放出コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）および陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）からなるシンチグラフィ、光学画像化および超音波画像化を含む、この目的のために使用することができるいくつかの画像化技術がある。これらの技術はまた、画像の品質を改善するために、プローブまたはコントラスト増強剤として新しい材料を必要とする。さらに、各技術はそれ自体の利点および欠点を有する。したがって、高解像度および高感度の両方を達成するための、いわゆるマルチモーダルイメージングと呼ばれる相補的な技術の組み合わせは、活発な研究分野である。
【０００４】
近年、ナノテクノロジーの出現は、現代医学、特に癌治療のための新しい解決策を開発するための大きな機会を提供した。これはナノ医療と呼ばれる急速に出現する分野を作り出し、最も有望な研究方向の１つは、新しいタイプの治療薬または画像化のための新しいタイプのプローブまたは造影剤としてのナノ材料の開発である。これは、ナノ粒子が提供することができる以下の多くの新規な利点によるものである:
・ナノ粒子の化学設計に基づいて、大量の活性分子を、いくつかの特定の部位で、保護し、送達し、放出する能力;
・たった１つのナノ粒子中に、活性分子、官能基、またはイメージングプローブのような異なる要素を組み合わせる可能性;
・ＥＰＲ（Enhanced Permeability and Retention：増強された透過性および保持）効果のおかげで、癌性腫瘍を特異的に標的化する能力。ＥＰＲ効果とは、ナノ粒子が正常組織ではなく、腫瘍に蓄積する傾向である;
・ナノ材料の有するナノメートルサイズによって誘導される、光学的、熱的、磁気的および電子的性質。
【０００５】
様々なタイプのナノ粒子の中で、金属を含有するものは、多くの関心を引く。このタイプのナノ粒子は、金属のいくつかの価値ある特性を利用することを可能にする。この特性には、例えばＡｕ（Ｚ＝７９）、Ｐｔ（Ｚ＝７８）、Ｈｆ（Ｚ＝７２）、Ｇｄ（Ｚ＝６４）等の高Ｚ金属が有する放射線増感能力、例えばガドリニウム（Ｇｄ）が有するＭＲＩ撮影のための常磁性、例えば、64Ｃｕ、68Ｇａ、99Ｔｃ、89Ｚｒ、111Ｉｎが有するシンチグラフィ撮像のための、あるいは、90Ｙまたは177Ｌｕなどが有するキュリー治療のための核粒子放射能力が挙げられる。これらのいくつかの例が、文献に記載されている。特に、シリカナノ粒子は、様々な金属のためのナノキャリアとして集中的に研究されてきた。それらは、安全で容易に合成および官能化することができる。さらに、多くの場合、それらは、金属と外部刺激、例えば、放射粒子、光学ビームなどとの間の相互作用を妨害しない。
【０００６】
国際公開第２００７１２４１３１号パンフレットには、キレート剤、すなわちＤＴＴＡ、ＤＴＰＡで官能化され、造影剤としてＧｄ３＋をキレート化するための臨床で使用されるシリカナノ粒子が記載されている。これらのナノ粒子の流体力学的直径（ＤＨ）は、４０ｎｍのオーダーである。しかしながら、最近、多くの研究により、１０ｎｍ未満のＤＨを有する超小型サイズのナノ粒子が、尿を通して体から迅速かつ完全に排泄されるため、推奨されている。これは、よく知られている、Ｇｄ３＋の腎性全身性線維症に対する重篤な副作用のような、金属の長期毒性を予防するのであろう。さらに、粒子のサイズを最小限にすることは、より大きな表面を作り出し、したがって、Ｇｄキレートの積載率がより高くなる。
【０００７】
それにもかかわらず、このサイズの、すなわち、例えば１５ｎｍ未満、好ましくは１０ｎｍ未満の超小型ＤＨを有するナノ粒子を合成することは依然として困難である。
【０００８】
特許出願ＷＯ２０１１１３５１０１Ａ２には、セラノスティック剤として使用されるための有望な結果を示す、ＡＧｕＩＸ（登録商標）としても知られるＧｄベースのシリカナノ粒子が記載されている。このナノ粒子はＤＯＴＡＧＡのようなキレート剤で官能化されたポリシロキサンネットワークを含み、５ｎｍ未満のＤＨを有する。微粒子上のキレート剤の大部分（通常５０％以上）は、Ｇｄ３＋と錯体を形成する。このナノ粒子は、ＭＲＩを用いた腫瘍検出のための非常に有効な造影剤である。また、その成分の全て、すなわち、ＤＯＴＡＧＡのＧｄ３＋錯体であるポリオルガノシロキサンは、ヒトにとって安全であることが知られている。ＡＧｕＩＸ（登録商標）は、腎臓の排出作用によってヒトの身体から迅速に排除され、Ｇｄ３＋の臓器への沈着を予防し、したがって、腎性全身性線維症として知られる重篤な長期合併症を予防するのに役立つ。
【０００９】
それにもかかわらず、このナノ粒子の合成は、図1に示されるような多段階合成を介して行われるので、単純ではない。まず、小さな１〜３ｎｍの酸化物ガドリニウムコアがジエチレングリコール（ＤＥＧ）中で合成される。次に、このコアを、アルコキシシランの加水分解及び縮合反応によってポリオルガノシロキサンの層で被覆する。次に、この層をＤＯＴＡＧＡ無水物で官能化する。その後、ナノ粒子を水中に移し、コアを溶解し、ＤＯＴＡＧＡによってキレート化されたＧｄ３＋イオンを放出する。ポリシロキサン層が断片化された後、ナノ粒子が得られる。このトップダウン法は十分に研究されてきたが、時間がかかり、大量の溶媒、原料を要する。さらに、これは、低い収率および合成後に異なる金属を変更または添加することの困難さを意味する。
【００１０】
したがって、現在の合成の限界を克服することができる、このナノ粒子を合成するためのより容易な方法を開発することが望ましいであろう。特に、超小型で安定なシリカナノ粒子の製造を可能にするワンポット合成方法を開発することも望ましいであろう。さらに、この新しい方法は、用途に応じて異なる金属によってキレート化され得る空のキレート剤の内、高い積載率を有するナノ粒子の合成を可能にすることも望ましいであろう。
【００１１】
本開示の第１の態様は、シリカナノ粒子を合成するための方法に関し、前記方法は、生理学的ｐＨで負に荷電した少なくとも１つのシランと、生理学的ｐＨで中性である少なくとも１つのシラン、および／または生理学的ｐＨで正に荷電した少なくとも１つのシランとを混合することを含む：
中性シランに対する負に荷電したシランのモル比Ａは、以下のように規定される：０≦Ａ≦６、好ましくは０．５≦Ａ≦２；
正に荷電したシランに対する負に荷電したシランのモル比Ｂは、以下のように規定される：０≦Ｂ≦５、好ましくは０．２５≦Ｂ≦３；
中性シランおよび正に荷電したシランに対する負に荷電したシランのモル比Ｃは、以下のように規定される：０＜Ｃ≦８、好ましくは１≦Ｃ≦４。
【００１２】
本開示の別の態様は０．５〜１５ｎｍ、例えば０．５〜１０ｎｍの間の平均流体力学的直径を有するシリカナノ粒子であって、キレート剤でグラフトされたポリオルガノシロキサンマトリックスを含み、前記キレート剤が金属イオンを含まず、ナノ粒子の少なくとも０．１μｍｏｌ／ｍｇ、好ましくは０．５〜２μｍｏｌ／ｍｇの含有量で存在するシリカナノ粒子に関する。例えば、１つの特定の実施形態では、キレート剤はＤＯＴＡＧＡであり、キレート剤の含有量は０．５〜２μｍｏｌ／ｍｇである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
〔シリカナノ粒子の合成方法〕
第１の態様において、本開示はシリカナノ粒子を合成するための方法に関し、前記方法は、生理学的ｐＨで負に荷電した少なくとも１つのシランと、生理学的ｐＨで中性である少なくとも1つのシラン、および／または生理学的ｐＨで正に荷電した少なくとも１つのシランと混合することを含む:
中性シランに対する負に荷電したシランのモル比Ａは、以下のように規定される：０≦Ａ≦６、好ましくは０．５≦Ａ≦２；
正に荷電したシランに対する負に荷電したシランのモル比Ｂは、以下のように規定される：０≦Ｂ≦５、好ましくは０．２５≦Ｂ≦３；
中性シランおよび正に荷電したシランに対する負に荷電したシランのモル比Ｃは、以下のように規定される：０＜Ｃ≦８、好ましくは１≦Ｃ≦４。
【００１４】
本明細書で使用される「シリカナノ粒子」という用語は、シラン前駆体の重合から誘導されるナノ粒子を指す。好ましくは、前記ナノ粒子がポリオルガノシロキサンを含む。前記ナノ粒子は、有機分子を含む追加の化合物をさらに含んでもよい。本方法によって得られるシリカナノ粒子の、具体的な実施形態を以下に記載する。
【００１５】
本明細書中で使用される場合、用語「生理学的ｐＨ」は、７．４であると考えられる。
【００１６】
本明細書中で使用される場合、用語「シラン」は、ケイ素原子に４個の置換基を有する化合物をいう。好ましい実施形態では、シランがアルコキシシラン、ヒドロキシシラン、およびそれらの混合物の中から選択される。該方法で使用することができるシランの例は、テトラエチルオルトシリケート（Ｓｉ（ＯＣ２Ｈ）５）４、ＴＥＯＳとしても知られている）、テトラメチルオルトシリケート（Ｓｉ（ＯＣＨ３）４、ＴＭＯＳとしても知られている）、アミノプロピルトリエトキシシラン（Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）３−Ｓｉ（ＯＣ２Ｈ５）３、ＡＰＴＥＳとしても知られている）、ＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡ、Ｎ−（トリメトキシシリルプロピル）エチレンジアミン三酢酸、トリナトリウム塩（（ＣＨ３Ｏ）３Ｓｉ−（ＣＨ）２）３Ｎ（ＣＨ２ＣＯＯＮａ）（ＣＨ２）２Ｎ（ＣＨ２ＣＯＯＮａ）２、ＴＡＮＥＤとしても知られている）、およびカルボキシエチルシラントリオール、ナトリウム塩（（ＨＯ）３Ｓｉ−（ＣＨ２）２ＣＯＯＮａ、ＣＥＳＴとしても知られている）が挙げられる。本明細書で使用されるように、シランという用語は、キレート化金属カチオンを含有する任意のシラン化合物も含む。本明細書中で使用されるように、シランという用語はまた、シラン前駆体への以下に記載されるような任意の官能化剤の共有結合グラフト化から生じる任意のシラン化合物を含む。例えば、官能化剤には、フルオロフォア、薬物、有機ポリマーまたは標的化リガンドが含まれる。
【００１７】
本明細書中で使用される場合、用語「アルコキシシラン」は、式（Ｉ）の化合物をいう:
ＲｎＳｉ（ＯＲｉ）４−ｎ        （Ｉ）
ここで、
Ｒはオルガニル基である;
Ｒｉは、Ｃ１−Ｃ１２のアルキル基、好ましくはＣ１−Ｃ６のアルキル基である;
ｎは、０、１、２または３である。
一実施形態によれば、ｎは０または１である。
【００１８】
本明細書中で使用される場合、用語「ヒドロキシシラン」は、式（ＩＩ）の化合物をいう：
ＲｎＳｉ（ＯＨ）４−ｎ        （ＩＩ）
ここで、
Ｒはオルガニル基である;
ｎは、０、１、２または３である。
一実施形態によれば、ｎは０または１である。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、用語「オルガニル基」は、官能基のタイプにかかわらず、Ｓｉ−Ｃ結合を介してケイ素原子に連結された有機置換基をいう。有機置換基の例としては、アルキルアミンが挙げられるが、これに限定されない。
【００２０】
本明細書で使用される「Ｃ１−Ｃ１２アルキル」という語は、１〜１２個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖アルキル官能基を指す。適切なアルキル基としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、i−ブチル、ｓ−ブチルおよびt−ブチル、ペンチルおよびその異性体（例えば、ｎ−ペンチル、イソペンチル）、ならびにヘキシルおよびその異性体（例えば、ｎ−ヘキシル、イソヘキシル）が挙げられる。
【００２１】
本方法の特定の実施形態によれば、ナノ粒子は、０．５〜１５ｎｍ、好ましくは０．５〜１０ｎｍの平均流体力学的直径を有する。
【００２２】
本方法の特定の実施形態では、シラン（例えば、アルコキシシラン、ヒドロキシシラン、およびそれらの混合物の中から選択される）は、試薬の総重量の少なくとも８０％、８５％または９０重量％を占めてもよく、試薬はナノ粒子の合成のための反応で使用される出発化合物である。
【００２３】
反応は、アルコールまたは水溶液のようなプロトン性溶媒中で行うことができる。１つの特定の実施形態においては、水のみが反応のための溶媒として使用される。他の実施形態では、反応がアルコールまたはアルコールの混合物中で行われる。この方法で使用できるアルコールには、エタノール、ｎ−プロパノール、イソ−プロパノール、ｎ−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、ｎ−ペンタノール、エチレングリコールおよびジエチレングリコールが含まれる。
【００２４】
反応は、好ましくはコロイド溶液中で行われる。これは、ナノ粒子の直径のより良好な制御を可能にする。典型的には、反応が３つの相互連結したゲル形成を回避するために、古典的なゾルゲル法を介して行われない。
【００２５】
従来技術の方法とは対照的に、本発明の方法の１つの利点はワンポット合成として、すなわち、中間生成物の単離または精製工程なしに、実施することができることである。
【００２６】
別の利点は、特定の比率Ａ、ＢおよびＣの設計が、特に、０．５〜１５ｎｍの間に含まれる平均流体力学的直径を有する安定なナノ粒子の製造のために、シリカナノ粒子の表面電荷およびサイズの制御を可能にすることである。特に、ナノ粒子のサイズを１０ｎｍ未満に減少させるためには、比率Ａを例えば２未満、より好ましくは１．５未満にすることが好ましい。
【００２７】
本方法の実施形態によれば、前記負に荷電したシランは、少なくとも1つ、２つ、またはそれ以上の負に荷電したカルボン酸官能基を含むシランを含むか、または本質的にそれからなる。カルボン酸官能基を有する負に荷電したシランの例には、Ｎ−（トリメトキシシリルプロピル）エチレンジアミン三酢酸、トリナトリウム塩（（ＣＨ３Ｏ）３Ｓｉ−（ＣＨ２）３Ｎ（ＣＨ２ＣＯＯＮａ）（ＣＨ２）２Ｎ（ＣＨ２ＣＯＯＮａ）２、TＡＮＥＤとしても知られている）、およびカルボキシエチルシラントリオール、ナトリウム塩（（（ＨＯ）３Ｓｉ−（ＣＨ２）２ＣＯＯＮａ、ＣＥＳＴとしても知られている）が含まれるが、これらに限定されない。
【００２８】
本方法の別の実施形態によれば、前記負に帯電したシランは、少なくとも1つのキレート剤を含むシランを含むか、または本質的にそれからなる。キレート剤は、負電荷、例えばカルボン酸官能基を有することができる。
【００２９】
キレート剤は、いくつかのキレート化金属カチオンを含有してもよい。
【００３０】
キレート剤はポリアミノポリカルボン酸から選択することができる。ポリアミノポリカルボン酸には以下が含まれるが、これらに限定されない:
ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−四酢酸）、ＤＯＴＡＧＡ（２−（４，７，１０−トリス（カルボキシメチル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−1−イル）ペンタン二酢酸）、下記式（ＩＩＩ）のＤＯ３Ａ−ピリジン:
【００３１】
【化１】
2020527538.tif 000002
【００３２】
ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）、ＣＨＸ−ＤＴＰＡ(トランス−シクロヘキシル−ジエチレントリアミン五酢酸）、オキソ−Ｄｏ３Ａ（1−オキサ−４，７，１０−トリアザシクロドデカン−４，７，１０−三酢酸）、ＳＣＮ−Ｂｚ−ＤＴＰＡ（ｐ−イソチオシアナトベンジル−ＤＴＰＡ）、１  Ｂ３Ｍ（1（ｐ−イソチオシアナトベンジル）−３−メチル−ＤＴＰＡ）、ＭＸ−ＤＴＰＡ（1−（２）−メチル−４−イソシアナトベンジル−ＤＴＰＡ）；
ＥＤＴＡ (２，２’，２’’，２’’’−（エタン−１，２−ジイルジニトリロ）四酢酸）；
ＥＧＴＡ(エチレングリコール−ビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸）、ＢＡＰＴＡ（１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’四酢酸）；
ＮＯＴＡ  （１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−三酢酸）；
ＰＣＴＡ（３，６，９，１５−テトラアザビシクロ［９．３．１．］ペンタデカ−1（１５），１１，１３−トリエン−３，６，９−三酢酸）；
以下の式（ＩＶ）のＴＭＰＡＣ：
【００３３】
【化２】
2020527538.tif 000003
【００３４】
およびその混合物。
【００３５】
本方法の一実施形態によれば、混合工程は、生理学的ｐＨで中性であるシランをさらに含んでもよく、前記中性シランはキレート剤を含んでもよい。中性シランに含まれるキレート剤は、例えば、ポルフィリン、塩素、１，１０−フェナントロリン、ビピリジンおよびテルピリジンの中から選択してもよい。
【００３６】
本方法の一実施形態によれば、本方法によって得られるナノ粒子は、０．１μｍｏｌ／ｍｇを超えるキレート剤を含む。例えば、本方法によって得られるナノ粒子は、０．５μｍｏｌ／ｍｇを超えるキレート剤、または０．１〜５μｍｏｌ／ｍｇのキレート剤、または０．５〜２μｍｏｌ／ｍｇのキレート剤を含んでもよい。
【００３７】
本方法の特定の実施形態によれば、本方法は、金属イオンを含まないキレート剤と共にシランを使用することを含む。例えば、試薬の総キレート剤の５モル％未満、1モル％未満、または０．１モル％未満が、金属イオンと錯体を形成する。この場合、本方法によって得られるような遊離キレート剤を有するナノ粒子は、所望の用途に応じて、第２の工程において、目的の金属イオンによってキレート化することができる。
【００３８】
あるいは、この方法が金属イオンをキレート化するキレート剤と共にシランを使用することを含む。例えば、試薬の総キレート剤の５０モル％、７０モル％または９０モル％を超える量が、金属イオンと錯体を形成する。この場合、本方法によって得られるナノ粒子は、キレート化した金属イオンを有し、金属イオンをさらに添加することなく直接使用することができる。
【００３９】
キレート剤によってキレート化することができる金属イオンには、アルカリ金属イオンおよびそれらの放射性同位体、遷移金属イオンおよびそれらの放射性同位体、ポスト遷移金属イオンおよびそれらの放射性同位体、希土類金属イオンおよびそれらの放射性同位体、ならびにそれらの混合物が含まれる。
【００４０】
遷移金属としては、Ｈｆ、Ｃｕ、Ｐｔ、Ａｕ、Ｔｃ、Ｙ、Ｍｎ、Ｒｕ、Ｆｅ、Ｚｒ、およびこれらの混合物が挙げられる。
【００４１】
ポスト遷移金属には、Ｂｉ、Ｇａ、Ｉｎおよびそれらの混合物が含まれる。
【００４２】
希土類金属には、ランタニド、例えば、Ｇｄ、Ｄｙ、Ｅｕ、Ｔｂ、Ｎｄ、Ｙｂ、Ｅｒ、Ｈｏ、Ｌｕ、またはそれらの混合物が含まれ、より好ましくはＧｄである。放射性核種は、例えば、Ａｃ、Ｔｈ、Ｐａ、Ｎｐ、Ｕ、およびＰｕから選択される。
【００４３】
Ｇｄ、Ｄｙ、ＭｎおよびＦｅは、例えば、ＭＲＩにおいて造影剤として使用されるナノ粒子を製造するのに適している。
【００４４】
Ｅｕ、Ｔｂ、Ｎｄ、ＹｂおよびＥｒは、例えば、蛍光剤として使用されるナノ粒子に適している。
【００４５】
Ｈｏ、Ｂｉ、ＹおよびＬｕは、例えば、キュリー療法剤として使用されるナノ粒子に適している。
【００４６】
Ｌｕ、Ｙｂ、Ｇｄ、Ｂｉ、ＨｆおよびＨｏは、例えば、放射線増感剤として使用されるナノ粒子に適している。
【００４７】
Ｃｕ、Ｇａ、Ｔｃ、Ｙ、ＩｎおよびＺｒは、例えば、シンチグラフィ用のプローブとして使用されるナノ粒子に適している。
【００４８】
本方法の特定の実施形態によれば、本方法によって得られるナノ粒子は、ナノ粒子の総重量と比較して１０重量％を超える、例えば１５％を超える、または１０〜２０％の間の金属イオンを含む。この含量は、凍結乾燥粉末の元素分析によって決定することができる。
【００４９】
本方法の特定の実施形態によれば、本方法によって得られるナノ粒子は、０．１μｍｏｌ／ｍｇを超える、例えば０．２５μｍｏｌ／ｍｇを超える、または０．１〜１．５μｍｏｌ／ｍｇの間の金属イオンを含む。
【００５０】
一実施形態によれば、混合工程は、少なくとも1つの正に荷電したシランを含み、前記正に荷電したシランは、少なくとも1つの正に荷電したアミノ基を含む。アミノ基を有する正に荷電したシランの例としてはＡＰＴＥＳが挙げられるが、これに限定されない。
【００５１】
本方法の特定の実施形態では、ナノ粒子の合成がシロキサン架橋Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉの形成を介して、ポリオルガノシロキサンネットワークの生成をもたらす。これらのシロキサン架橋は、ヒドロキシシランの縮合および水の損失によって得られる。アルコキシシランが本開示の方法において使用される場合、反応は、最初にアルコキシシランをヒドロキシシランに加水分解するために水溶液中で行われる。この場合、ナノ粒子は、ポリオルガノシロキサンマトリックスを有する。
【００５２】
特定の実施形態によれば、本開示による方法は、生理学的ｐＨで負に荷電し、ポリアミノポリカルボン酸から選択される少なくとも１つのキレート剤を含む、少なくとも１つのヒドロキシシランまたはアルコキシシランと、生理学的ｐＨで中性である少なくとも１つのヒドロキシシランまたはアルコキシシランと、および／または生理学的ｐＨで正に荷電し、アミノ基を含む少なくとも１つのヒドロキシシランまたはアルコキシシランとの混合する工程を含む:
中性シランに対する負に荷電したシランのモル比Ａは、以下のように規定される：０≦Ａ≦６、好ましくは０．５≦Ａ≦２；
正に荷電したシランに対する負に荷電したシランのモル比Ｂは、以下のように規定される：０≦Ｂ≦５、好ましくは０．２５≦Ｂ≦３；
中性シランおよび正に荷電したシランに対する負に荷電したシランのモル比Ｃは、以下のように規定される：０＜Ｃ≦８、好ましくは１≦Ｃ≦４。
【００５３】
特定の実施形態によれば、本開示による方法は、生理学的ｐＨで負に帯電している少なくとも1つのアルコキシシラン（前記アルコキシシランがＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡ、ＴＡＮＥＤ、ＣＥＳＴ、およびそれらの混合物の中から選択される）と、
少なくとも、生理学的ｐＨで中性であるアルコキシシラン（前記アルコキシシランは、ＴＭＯＳ、ＴＥＯＳおよびそれらの混合物の中から選択される）と、
生理学的ｐＨで正に荷電したＡＰＴＥＳ：
を混合する工程を含む。
【００５４】
中性シランに対する負に荷電したシランのモル比Ａは、以下のように規定される：０≦Ａ≦６、好ましくは０．５≦Ａ≦２；
正に荷電したシランに対する負に荷電したシランのモル比Ｂは、以下のように規定される：０≦Ｂ≦５、好ましくは０．２５≦Ｂ≦３；
中性シランおよび正に荷電したシランに対する負に荷電したシランのモル比Ｃは、以下のように規定される：０＜Ｃ≦８、好ましくは１≦Ｃ≦４。
【００５５】
特定の実施形態によれば、本開示による方法は、生理学的ｐＨで負に帯電しているＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡを以下のものと混合する工程を含む。
【００５６】
生理学的ｐＨで中性である少なくとも１つのアルコキシシランであって、前記アルコキシシランは、ＴＭＯＳ、ＴＥＯＳ、およびそれらの混合物の中から選択される、アルコキシシラン：および
生理学的ｐＨで正に荷電したＡＰＴＥＳ。
【００５７】
中性シランに対する負に荷電したシランのモル比Ａは、以下のように規定される：０≦Ａ≦６、好ましくは０．５≦Ａ≦２；
正に荷電したシランに対する負に荷電したシランのモル比Ｂは、以下のように規定される：０≦Ｂ≦５、好ましくは０．２５≦Ｂ≦３；
中性シランおよび正に荷電したシランに対する負に荷電したシランのモル比Ｃは、以下のように規定される：０＜Ｃ≦８、好ましくは１≦Ｃ≦４。
【００５８】
〔官能化剤〕
本方法によって得られるナノ粒子は、例えば、治療または画像化における特定の医学的用途のために、特定の有機分子で有利に官能化され得る。
【００５９】
したがって、本方法の特定の実施形態では、混合工程が少なくとも１つの官能化剤を含む少なくとも１つのシランを用いて実施することができる。
【００６０】
本明細書中で使用される場合、用語「官能化剤」は、得られたナノ粒子の特定の官能化のための共有結合を介してシランに結合した有機分子をいう。このような官能化剤にはフルオロフォア、薬物、有機ポリマーまたは標的化リガンドが含まれるが、これらに限定されない。
【００６１】
したがって、本方法の特定の実施形態では、混合工程が少なくとも１つのフルオロフォアを含む少なくとも1つのシランを用いて実施することができる。好ましくは、フルオロフォアを含むシランの中性シランに対するモル比Ｄが、以下のように規定される：０．００１≦Ｄ≦０．２。
【００６２】
フルオロフォアを含むこのようなシランは、蛍光化合物を反応性部分と共有結合させてシリカ前駆体を得、次いで、蛍光シリカ前駆体を、テトラアルコキシシランなどのシランと反応させ、頂部が少なくとも１つのフルオロフォアを含むシランを形成することによって得ることができる。使用することができる蛍光化合物には、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルトダミンイソチオシネート、Ｘ−ローダミン、アレクサ、ボディピ蛍光色素、ＣＷ８００およびインドシアニングリーン（ＩＣＧ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００６３】
別の実施形態によれば、混合工程は、少なくとも１つの薬物部分を含む少なくとも１つのシランを含む。好ましくは、薬物を含むシランの中性シランに対するモル比Ｅが以下のように規定される：０．１≦Ｅ≦５。特定の実施形態によれば、ナノ粒子は、ナノ粒子の総重量と比較して０．５〜５０重量％、例えば２〜１０重量％の薬物部分を含む。
【００６４】
このような薬物部分を含むシランはまた、例えば、抗体−薬物−共役についての文献に記載されるように、最初にリンカー薬物部分を調製し、次いで、リンカー薬物部分を少なくとも１つのシランに共有結合させることによって反応させて、少なくとも1つの薬物部分を含む前記シランを形成することによって、得られてもよい。リンカーの例には、開裂可能なリンカー、例えばパラアミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢＣ）基が含まれる。
【００６５】
薬物部分を含むシランを調製するために使用することができる薬物の例には、小分子薬物、および、例えば、アルキル化剤、アントラサイクリン、タキサン、ＨＤＡＣ阻害剤、トポイソメラーゼＩまたはＩＩの阻害剤、キナーゼ阻害剤、ヌクレオイチド類似体および前駆体類似体などの化学療法薬が含まれるが、これらに限定されない。薬物部分を含むシランを調製するために使用することができる薬物の具体例としては、アクチノマイシン、アシドレチノイクオールトランス、アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、カルボプラチン、カペシタビン、シスプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、シタラビン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エポチロン、エトポシド、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、ダルビシン、イマチニブ、イリノテカン、メクロレタミン、メカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、テニポシド、チオグアニン、トポテカン、バルルビシン、ベムラフェニブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、レナリドミド、イブルチニブ、アビラテロン、エルロチニブ、エベロリムス、ニロチニブ、スニチニブ、ソラフェニブ、ゴセレリン、ネダプラチン、ラボプラチン、ヘプタプラチン、およびそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６６】
別の実施形態によれば、混合工程は、少なくとも１つの標的化リガンドを含む少なくとも１つのシランを含む。
【００６７】
本明細書中で使用される場合、標的化リガンドは、インビボでナノ粒子を特定の細胞成分に標的化することに寄与する、シランに結合した分子である。このようなリガンドは、例えば、特定の医学的または診断的用途のために、インビボで特定の臓器、組織または細胞のタイプを標的とすることができる。
【００６８】
このような標的化リガンドは、例えば、ペプチド、タンパク質、糖（例えばレクチン）、生体ポリマー、合成ポリマー、抗原、抗体、アプタマーおよびナノボディであり得る。標的化リガンドの例としては、ハーセプチン（トラスツズマブ）、リツキサン（リツキシマブ）、ＣＤ１９抗体、ペパプタニブ、Ａ１０アプタマー、ｃＲＧＤペプチド、ＡＴＷＬＰＰＲペプチド、ＶＡＰ、Lｙｐ−１、トランスフェリン、ＬＦＲＨ、葉酸、ガラクトース、またはＡＳＧＰＲ標的化リガンド、ビオチン、マンノースが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
別の実施形態によれば、混合工程は、少なくとも1つの有機ポリマーを含む少なくとも1つのシランを含む。
【００７０】
そのような有機ポリマーは、例えば、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、ポリ乳酸、糖、脂質、ポリグルマチック酸（ＰＧＡ）、ポリグリコール酸、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ酢酸ビニル（ＰＶＡ）、およびそれらの組み合わせであってもよい。
【００７１】
従来技術の方法とは対照的に、本発明の方法は、安定化有機ポリマーを使用する必要なしに、超小型で安定なナノ粒子を製造することを可能にすることが示されている。したがって、１つの特定の実施形態では、本開示の方法がシランにグラフトされたいかなる有機ポリマーも含まない。
【００７２】
〔シリカナノ粒子〕
本発明はまた、上記の方法によって得られるシリカナノ粒子に関する。
【００７３】
典型的には、本方法によって得られるシリカナノ粒子は、有利には０．５〜１５ｎｍ、例えば１〜１０ｎｍ、または１〜５ｎｍ、または２〜７ｎｍの平均流体力学的直径を有する。当業者は、本開示の教示によれば、シリカナノ粒子の所望のサイズを得るために、本方法において規定される特定の比率Ａ、ＢおよびＣを適合させることができる。
【００７４】
本明細書中で使用される場合、用語「平均流体力学的直径」は、粒子の流体力学的直径の調和平均を意味することが意図される。このパラメータを測定する方法は光子相関分光法によるものであり、この方法は、標準ＩＳＯ１３３２１：１９９６にも記載されている。
【００７５】
本方法によって得られるシリカナノ粒子は、蛍光化合物、キレート剤（金属有りまたは無し）、薬物部分、標的化リガンド、または共有結合した有機ポリマーをさらに含んでもよい。特定の実施形態では、この方法によって得られるようなシリカナノ粒子は、キレート剤によってキレート化された金属イオンとして、Ｅｕ、Ｃｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｈｏ、Ｂｉ、またはそれらの混合物のいずれかを有する。特定の実施形態では、この方法によって得られるようなシリカナノ粒子は、キレート剤によってキレート化された金属イオンとしてＧｄを有する。特定の実施形態では、この方法によって得られるようなシリカナノ粒子は、キレート剤によってキレート化された金属イオンとして、Ｂｉ、Ｈｆ、またはそれらの混合物を有する。特定の実施形態では、本方法によって得られるようなシリカナノ粒子がキレート剤によってキレート化された金属イオンとして、Ｌｕ、Ｙ、Ｃｕ、Ｚｒ、Ｉｎ、Ｇａ、またはそれらの混合物を有する。特定の実施形態では、この方法によって得られるようなシリカナノ粒子は、キレート剤によってキレート化された金属イオンとして、希土類金属イオンを有する。
【００７６】
特定の実施形態では、本方法によって得られるナノ粒子が、例えばコア−シェル構造を有するナノ粒子に見出すことができるように、結晶性コアを含まない。例えば、本方法によって得られるナノ粒子は、金属、酸化物、硫化物、フッ化物または炭化物の結晶性コアを含まない。
【００７７】
本発明の一実施形態では、ナノ粒子が結晶性であろうとなかろうと、Ｇｄ酸化物コアなどの金属コアを含まない。一実施形態によれば、シリカナノ粒子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）シェルを含まない。
【００７８】
本開示はまた、キレート剤でグラフトされたポリオルガノシロキサンマトリックスを含む、０．５〜１５ｎｍの間の平均流体力学的直径を有するシリカナノ粒子に関し、前記キレート剤は、金属イオンを含まず、ナノ粒子の少なくとも０．１μｍｏｌ／ｍｇ、好ましくは０．５〜２μｍｏｌ／ｍｇの含有量で存在する。例えば、1つの特定の実施形態では、キレート剤はＤＯＴＡＧＡであり、キレート剤の含有量は０．５〜２μｍｏｌ／ｍｇである。
【００７９】
金属イオンを含まないキレート剤の含有量は、ＨＰＬＣによって、または、例えば、キシレノールオレンジと組み合わせたユーロピウムまたはガドリニウムで直接滴定することによって決定することができる。
【００８０】
〔シリカナノ粒子の使用〕
本開示によるナノ粒子は、好ましくは、治療もしくは診断方法において、またはセラノスティック剤として使用することができる。
【００８１】
例えば、ナノ粒子は、放射線療法または中性子療法のための増感剤または放射性源、光力学療法（ＰＤＴ）のための薬剤、または治療分子のための送達剤（化学療法剤など）などの治療剤として使用してもよい。
【００８２】
ナノ粒子はまた、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）において、または単一光子放出コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）もしくは陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）を用いたシンチグラフィにおいて、または蛍光による光学イメージングにおいて、またはＸ線コンピュータ断層撮影法（Ｘ線ＣＴ）において、またはこれらの技術の少なくとも２つを組み合わせたマルチモーダルイメージングにおいて、造影剤として作用し得るマルチモーダルイメージング剤として有利に使用されてもよい。
【００８３】
遊離キレート剤を有するナノ粒子は、体内の有毒金属のキレート剤、例えば、Ｈｇ、Ｐｂ、Ａｌ、ＣｄまたはＣｒのキレート剤としてさらに使用されてもよい。
【００８４】
遊離キレート剤を有するナノ粒子は金属ホメオスタシスを調節するために、特に、Ｆｅ、Ｃｕ、Ｚｎ、またはＭｎなどの内因性金属を調節するために、またはＨｇ、Ｐｂ、Ａｌ、Ｃｄ、またはＣｒなどの外因性の金属を調節するために、さらに使用してもよい。
【００８５】
したがって、本開示は、薬学的に許容される媒体と組み合わせて、上記で規定された方法によって得られるような治療的に有効な量のシリカナノ粒子を含む医薬組成物に関する。
【００８６】
本開示はさらに、以下のステップを含む、ヒトまたは動物における画像化の方法に関する:
本開示によって得られたナノ粒子をＴ１ＭＲＩ造影剤として投与するステップ、および適切なＭＲＩシーケンスを使用して画像を捕捉するステップ。
【００８７】
本開示はさらに、以下のステップを含む、放射線療法によってそれを必要とする患者を治療する方法に関する:
放射線療法のための増感剤として、放射線療法のために患者を照射するステップ、および本開示によって得られたナノ粒子を投与するステップ。
【００８８】
このような特定の用途のために、本開示のナノ粒子は、好ましくはキレート剤にキレート化された放射線増感剤としてGdを含む。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】ＷＯ２０１１１３５１０１Ａ２に報告されているようなナノ粒子の合成の反応スキームを示す。
【図２】２Ａは実施例１によるナノ粒子のＤＬＳ図を示し、２Ｂはゼータ電位を示す。
【図３】ＣＥＳＴ、ＴＡＮＥＤ、およびＤ２Ｏ中の実施例１によるナノ粒子の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図４】実施例1によるナノ粒子のＤ２Ｏにおける２Ｄ−ＮＭＲ（ＤＯＳＹ）スペクトルを示す。
【図５】実施例１によるナノ粒子の固相２９Ｓｉ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図６】実施例２の工程１．ａによるＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡの合成の反応スキームを示す。
【図７】実施例２の工程１．ｂによるＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡの合成の反応スキームを示す。
【図８】Ａは３９５ｎｍで励起された４０μＭのＥｕＣｌ３と１００μＭのＤＯＴＡＧＡとの混合物の発光スペクトルを示す。Ｂは実施例２の工程１．ｂによる５９４ｎｍ（円）および６１６ｎｍ（正方形）でのＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡ合成混合物の滴定曲線を示す。Ｃは、実施例２、工程１ｂによるＤＯＴＡＧＡのＩＲスペクトルを示す。Ｄは、実施例２の工程１ｂによるＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡの反応混合物のＩＲスペクトルを示す。
【図９】ナノ粒子のボトムアップ合成の反応スキームを示す：実施例２、工程２によるストラテジーａ（実線矢印）およびストラテジーｂ（破線矢印）。
【図１０】Ｇｄ３＋によるキレート化の前の、実施例２、工程２．aによるＵＣＨＳＮＰ−１ナノ粒子のＤＬＳ図を示す。
【図１１】実施例２、工程２．ａに従って３９５ｎｍで励起された５９４ｎｍ(円）および６１６ｎｍ（方形）でのＵＣＨＳＮＰ試料の滴定曲線を示す。
【図１２】ＡはＵＣＨＳＮＰ−１のＮＭＲスペクトル: ＮＭＲ−ＤＯＳＹスペクトル；Ｂは１２７ｇ／ｌでのＵＣＨＳＮＰ−１の１ＨＮＭＲスペクトル;ＣはＮＭＲ−ＤＯＳＹスペクトル；Ｄは１２７ｇ／lでのＵＣＨＳＮＰ−１＠Ｌｕの１ＨＮＭＲスペクトル；ならびにＥは実施例２、工程２．aによる、粒子上のＡＰＴＥＳおよびＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡ官能基上のＨ１、Ｈ２およびＨ３の位置を示す。
【図１３】Ｇｄ３＋によるキレート化後に凍結乾燥粉末から再分散された、実施例２、工程２．ａによるＵＣＨＳＮＰ＠Ｇｄ−１のＤＬＳ図およびゼータ電位を示す。
【図１４】実施例２の工程２．ｂに従って濃縮される前のＵＣＨＳＮＰ＠Ｇｄ−２ナノ粒子のＤＬＳ図を示す。
【図１５】実施例２の工程２．ｂによる精製後の凍結乾燥粉末から再分散されたＵＣＨＳＮＰ＠Ｇｄ−２ナノ粒子のＤＬＳ図およびゼータ電位を示す。
【図１６】実施例２の工程２．ｂに従って３９５ｎｍで励起された５９４ｎｍ（円）および６１６ｎｍ（正方形）でのＵＣＨＳＮＰ＠Ｇｄ−２試料の滴定カーブを示す。
【図１７】実施例３によるシランの比率を調整することによるナノ粒子のワンポット合成およびサイズ制御の反応スキームを示す。
【図１８】ＡＰＴＥＳとＤＯＴＡＧＡ無水物との間の反応（図３２Ａ）および実施例３に従ってｐＨ９で一晩暴露した同じ混合物（図３２Ｂ）後の混合物のＥｕ滴定曲線を示す。
【図１９】実施例３による、異なる比率の出発シランを有するナノ粒子のDLS図を示す。
【図２０】実施例３によるＵＣＨＳＮＰ−３（図２０Ａ）、ＵＣＨＳＮＰ−４（図２０Ｂ）、ＵＣＨＳＮＰ−５（図２０Ｃ）およびＵＣＨＳＮＰ−６（図２０Ｄ）のＥｕ滴定曲線を示す。
【図２１】合成中の種々の段階におけるＵＣＨＳＮＰ−７のＤＬＳ図を示す：ＤＥＧ中のＡＰＴＥＳ＋ＤＯＴＡＧＡ無水物（点線、正方形）、ＤＥＧ中のＡＰＴＥＳ＋ＤＯＴＡＧＡ無水物＋ＴＥＯＳ（点線、上三角形）、Ｈ２Ｏ中のＡＰＴＥＳ＋ＤＯＴＡＧＡ＋ＴＥＯＳ(点線、下三角形）、０．２μｍ膜を通して濾過したＨ２Ｏ中のＡＰＴＥＳ＋ＤＯＴＡＧＡ＋ＴＥＯＳ(直線、円）（図２１Ａ）；実施例４による精製後（図２１Ｂ）。
【図２２】実施例４によるＵＣＨＳＮＰ−７ナノ粒子のＥｕ滴定曲線を示す。
【図２３】実施例４に係るＵＣＨＳＮＰ−７＠Ｍ（Ｍ：Ｇｄ（正方形）、Ｔｂ（円）、Ｈｏ(上三角形）、Ｂｉ(下三角形））のＤＬＳ図を示す。
【図２４】Ａは、実施例４によるＵＣＨＳＮＰ−７の異なるｐＨでのゼータ電位の完全な曲線を示す。Ｂは、実施例４によるｐＨ６．６でのＵＣＨＳＮＰ−７＠Ｇｄ、ＵＣＨＳＮＰ−７＠Ｔｂ、ＵＣＨＳＮＰ−７＠ＨｏおよびＵＣＨＳＮＰ-７＠Ｂｉのゼータ電位を示す。
【図２５】Ａは実施例４によるＵＣＨＳＮＰ−７、ＵＣＨＳＮＰ−７＠Gｄ、ＵＣＨＳＮＰ−７＠Ｔｂ、ＵＣＨＳＮＰ−７＠ＨｏおよびＵＣＨＳＮＰ−７＠ＢｉのＵＶ−可視吸光スペクトルを示す。Ｂは、実施例４による、ＵＣＨＳＮＰ−７、ＵＣＨＳＮＰ−７＠ＨｏおよびＨｏＣｌ３（５０ｍＭ／ＨＣｌ  ０．１ｍＭ）のＵＶ−可視吸光スペクトルを示す。Ｃは、実施例４によるＵＣＨＳＮＰ−７＠ＧｄのＵＶ−可視励起および発光スペクトルを示す。Ｄは、実施例４によるＵＣＨＳＮＰ−７＠ＴｂのＵＶ−可視励起および発光スペクトルを示す。
【図２６】実施例４によるＵＣＨＳＮＰ−７、ＵＣＨＳＮＰ−７＠Ｇｄ、ＵＣＨＳＮＰ−７＠Ｔｂ、ＵＣＨＳＮＰ−７＠ＨｏおよびＵＣＨＳＮＰ−７＠Ｂｉの赤外スペクトルを示す。
【図２７】Ａは、実施例５によるＵＣＨＳＮＰ＠Ｇｄ−２の注入前（左側）および注入後（右側、６時間まで）の腫瘍組織（白い矢印）のＭＲＩ断面図を示す。Ｂは、実施例５によるＵＣＨＳＮＰ＠Ｇｄ−２注入後の腫瘍組織におけるダイナミックＭＲＩシグナル増強を示す。Ｃは、実施例５によるＵＣＨＳＮＰ＠Ｇｄ−２注入後の肝臓におけるダイナミックＭＲＩシグナル増強を示す。
【実施例】
【００９０】
〔材料及び方法〕
〔材料〕
塩酸（ＨＣｌ、３７％）は、ＶＷＲ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＢＤＨ  Ｐｒｏｌａｂｏ(フランス）から購入した。水酸化ナトリウムペレット（ＮａＯＨ、≧９８％）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ(フランス）から購入した。２Ｍから１０−４Ｍまでの異なった濃度の塩酸と水酸化ナトリウムの水溶液を調製し、水溶液のｐＨを調整した。塩化ユーロピウム六水和物（ＥｕＣｌ５・６Ｈ２Ｏ、９９．９％）、塩化ルテチウム六水和物（ＬｕＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、９９．９％）、塩化テルビウム六水和物（ＴｂＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、９９．９％）、塩化ホルミウム六水和物（ＨｏＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、９９．９％）、オルトケイ酸テトラエチル（Ｓｉ（ＯＣ２Ｈ５）４、ＴＥＯＳ、９８％）、アミノプロピルトリエトキシシラン（Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）３−Ｓｉ（ＯＣ２Ｈ５）３、ＡＰＴＥＳ、９９％）、シラン前駆体の合成のための無水ＤＭＳＯ、ＮＭＲ実験のための重水素酸化物Ｄ２Ｏ、ｐＨ５の緩衝液を調製するための氷酢酸、錯体測定のためのＥｒｉｏｃｈｒｏｍｅ（登録商標)Ｂｌａｃｋ  Ｔ（ＥＢＴ）およびｐＨ１０でのアンモニア緩衝液をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ(フランス）から購入した。Ｎ−（トリメトキシシリルプロピル）エチレンジアミン三酢酸、トリナトリウム塩（（ＣＨ３Ｏ）３Ｓｉ−（ＣＨ）２）３Ｎ（ＣＨ２ＣＯＯＮａ）（ＣＨ）２）２Ｎ（ＣＨ２ＣＯＯＮａ）２、ＴＡＮＥＤ、４５％水溶液）およびカルボキシエチルシラントリオール、ナトリウム塩（（ＨＯ）３Ｓｉ−（ＣＨ２）２ＣＯＯＮａ、ＣＥＳＴ、２５％水溶液）をＡＢＣＲ  ＧｍｂＨ(ドイツ）から購入した。１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１−グルタル酸無水物−４，７，１０−トリ酢酸（ＤＯＴＡＧＡ無水物）は、Ｃｈｅｍａｔｅｃｈ（フランス）によって提供された。塩化ガドリニウム六水和物（ＧｄＣｌ３・６Ｈ２O、９９．９９９％）をメタルレアアース社（中国）から購入した。水は、ミリＱ水（ρ＞１８ＭΩ）を使用した。Ｖｉｖａｓｐｉｎ（登録商標）濃縮器およびＶｉｖａｆｌｏｗ（登録商標）２００カセット(ＭＷＣＯ＝３ｋＤａまたは５ｋＤａ）は、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ(フランス）から購入した。
【００９１】
〔方法〕
〔動的光散乱（ＤＬＳ）およびゼータ電位〕
ナノ粒子の流体力学的直径分布を、Ｍａｌｖｅｒｎ  ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓからのＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ−Ｓ（６３３ｎｍ  Ｈｅ−Ｎｅレーザー）を用いてＤＬＳによって測定した。測定は、１回使用のＰＭＭＡキュベット（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ  ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて０．５〜１ｍｌの水溶液について行った。減衰器および位置は、装置によって最適化された。ゼータ電位を測定するために、凍結乾燥粉末を水中に再分散させて１００ｍｇ／ｍｌ溶液を得、５ｍＭのＮａＣｌを含有する水溶液中で１０〜１８ｍｇ／ｍｌに希釈し、各測定の直前に所望のｐＨに調整した。ゼータ電位測定は、ＤＴＳ  １０６１折り畳みキャピラリーセル（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ、ＵＳＡ）内で２０℃で記録した。ゼータ電位（ζ）は、Ｓｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉ、ν＝（εε0ζ／η）ζ式に基づく電気泳動移動度から自動的に計算された。ここで、ηは粘度、εは電解液の誘電率、ε0≒８．８５４×１０−１２Ｃ２Ｎ−１ｍ−２は真空誘電率である。凍結乾燥粉末を水中に再分散させて１００ｍｇ／ｍＬ溶液を得、５ｍＭのＮａＣｌを含有する水溶液中で１０ｍｇ／ｍＬに希釈し、各測定の直前に所望のｐＨに調整した。
【００９２】
〔クロマトグラフィー〕
〔方法1：ナノ粒子の純度の測定およびナノ粒子上の遊離ＤＯＴＡＧＡの定量〕
ＣＢＭ−２０Ａコントローラバスモジュール、ＬＣ‐２０ＡＤポンプ、ＣＴＯ‐２０Ａカラムオーブン、ＳＰＤ−２０ＡＵＶ−ｖｉｓ検出器を備えた島津プロミネンスシリーズＵＦＬＣ装置を用いてグラジエントＨＰＬＣ分析を行った。検出波長は、空のナノ粒子を特徴付けるために有機キレート剤のみが高度に吸収することができる２９５ｎｍ、または銅が組み込まれたナノ粒子を特徴付けるためにＤＯＴＡＧＡの銅錯体が特異的に吸収する７００ｎｍに設定した。ガドリニウムが組み込まれたナノ粒子を特徴付ける場合に、Ｇｄ複合体からの蛍光シグナルを検出するためにＦＲ−２０Ａ蛍光検出器（λｅｘ＝２７４ｎｍ、λｅｍ＝３１２ｎｍ）を加えた。カラム温度を３０℃に維持した。グラジエントＬＣ溶出を、２つの移動相:(Ａ）Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水／ＴＦＡ９９．９：０．１ｖ／ｖおよび（Ｂ）アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）／ＴＦＡ９９．９：０．１ｖ／ｖで行った。毎回、２０μLの量の試料を注入弁に装填し、１ｍＬ／分の流速でＪｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４コラム（１５０ｍｍ×４．６０ｍｍ、５μm、３００Å、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）に注入した。次いで、溶出を以下のようにプログラムした：反応性断片および断片を溶出するために７分間で１％の溶媒Ｂ、次いでナノ粒子を溶出するために１５分間で１％〜９０％の勾配。Ｂの濃度を７分間にわたって維持した。次に、溶媒Ｂの濃度を１分間かけて１％に低下させ、８分間維持して、新しい分析のために系を再平衡化した。各試料の測定前に、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水を注入することにより、同じ条件下でベースラインを得た。純度は、粒子のピーク下での面積を、粒子および反応物のピーク下での総面積で割ることによって計算される。この方法はＣｕ２＋をプルーブとして用いてナノ粒子上の遊離ＤＯＴＡＧＡ含有量を定量するために用いた。余分なＣｕＳＯ4を、ｐＨを３以下に調整済の超小型ハイブリッドキレートシリカナノ粒子（ＵＣＨＳＮＰ）の溶液に、加えた。錯化はおそらく水溶液のｐＨを低下させることができた。従って、８０℃で少なくとも２時間インキュベートする前に、ｐＨを３で安定するように再調整すべきである。７００ｎｍでの可視検出器を使用して、ナノ粒子上に遊離またはグラフトされた銅錯体の吸収を特異的に検出した。Ｃｕ２＋およびＤＯＴＡＧＡ（Ｃｕ２＋）の濃度は、ピーク面積を種々の濃度（Ｃｕ２＋ついては４ｍＭ〜３２ｍＭ、ＤＯＴＡＧＡ（Ｃｕ２＋）については０．１ｍＭ〜１５ｍＭ）でのそれらの検量線と比較することによって決定した。遊離Ｃｕ２＋およびＤＯＴＡＧＡ（Ｃｕ２＋）の総濃度を合計して、導入量と検証することができる。遊離ＤＯＴＡＧＡの含有量（ｍｏｌ／ｇ）は、分析した試料のモル濃度（ｍｏｌ／Ｌ）および質量濃度（ｍｇ／Ｌ）から計算することができる。
【００９３】
〔方法２：ＤＯＴＡＧＡ無水物からの合成後のＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡの同定〕
アイソクラティックＨＰＬＣ分析は、方法1に記載したのと同じシステムを使用して行った。蛍光検出器（λｅｘ＝２７４ｎｍ、λｅｍ＝３１２ｎｍ）は、この場合のＧｄ錯体からのシグナルを検出するための主な検出器であった。移動相を１００％（Ａ）および０％（Ｂ）に固定して、Ｇｄ３＋、ＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡ（Ｇｄ３＋）およびＤＯＴＡＧＡ（Ｇｄ３＋）の溶離を遅くし、それらを明確に分離する。試料の導入は、方法１と同様に行った。フローを１０分間維持して、全ての予想されるピークを溶出した。その後、溶媒Ｂを１００％まで徐々に上昇させ、カラムからの試料中または溶媒中に蓄積した不純物を洗浄した。次に、溶媒Ｂの濃度を１分間かけて０％に低下させ、１５分間維持して、新しい分析のために系を再平衡化した。各試料の測定前に、前者の方法と同様にしてベースラインを求めた。合成の生成物を水中に溶解し、ＧｄＣｌ３と混合して、合成混合物およびＧｄ３＋についてそれぞれｐＨ約６で５ｇ／ｌおよび１０ｍＭの最終濃度を達成し、３７℃で１５時間インキュベートして、錯化を可能にした。分析後、質量分析（ＭＳ）による解析のために溶出液を収集した。溶出した水溶液を凍結乾燥して、溶媒および過剰のＴＦＡを除去した。凍結乾燥した粉末を、凍結乾燥前の２倍高い濃度で水中に再分散させて、試料がＭＳ分析のために十分に濃縮されていることを確認した。ｐＨ６で１０ｍＭのＧｄＣｌ３の試料、およびｐＨ５で２ｍＭのＤＯＴＡＧＡ（Ｇｄ３＋）と１ｍＭのＧｄＣｌ３の混合物を、ＨＰＬＣを用いて同じ条件で分析し、Ｇｄ３＋およびＤＯＴＡＧＡ（Ｇｄ３＋）の保持時間（ｔＲ）を通してのピーク値を同定した。
【００９４】
〔方法３：ＤＯＴＡＧＡ無水物からの合成後のシラン前駆体ＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡの量の定量〕
アイソクラティックＨＰＬＣ分析は、方法２と同じシステムを使用し、蛍光検出器を設定することによって行った。試料も同様に導入した。しかしながら、ＢＤＳ−ＨＹＰＥＲＳＩＬ−Ｃ１８カラム（２５０ｍｍ×４．６０ｍｍ、５μｍ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＣ４カラムの代わりに使用して、小分子の分離能力を増加させた。また、（Ａ）の１００％の代わりに、移動相を９９％（Ａ）および１％（Ｂ）に固定して、ピークｔＲのわずかな揺らぎを防いだ。後者は、溶媒が静止相の表面を濡らすのに十分なほど疎水性ではないため、「疎水性崩壊」によるものである。フローを２５分間維持して、全ての予想されるピークを溶出した。その後、上記と同様の目的で、溶媒Ｂを徐々に１００％に上昇させた。次に、新しい分析の前に系を再平衡化した。各試料の測定前に、同様にしてベースラインを求めた。合成の生成物を酢酸緩衝液ｐＨ５に溶解した。この水溶液に、５０ｍＭのＧｄＣｌ３の水溶液（ｐＨ４）を添加して、合成混合物およびＧｄ３＋についてそれぞれ５７．８ｍｇ／Ｌおよび０．２ｍＭの最終濃度を達成した。この液を８０℃で４８時間インキュベートし、錯体形成を完了させた。最終溶液は透明であったが、ダストの大きな粒子がＨＰＬＣカラムを塞がないように、０．２μｍ膜で濾過を行った。ｐＨ４で１ｍＭのＧｄＣｌ３試料およびｐＨ５．７で０．０５ｍＭのＤＯＴＡＧＡ（Ｇｄ３＋）の混合物を同じ状態で分析し、ｔＲを通してのＧｄ３＋およびＤＯＴＡＧＡ（Ｇｄ３＋）の最高値を同定した。ＤＯＴＡＧＡ（Ｇｄ３＋）の濃度は、そのピーク面積を種々の濃度（０．０１ｍＭ〜０．１５ｍＭ）でのその検量線と比較することによって決定した。ＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡ（Ｇｄ３＋）の濃度は、Ｅｕりん光を用いた滴定によって決定したＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡおよびＤＯＴＡＧＡの総濃度からＤＯＴＡＧＡ（Ｇｄ３＋）の濃度を差し引くことによって間接的に決定した。未反応ＤＯＴＡＧＡおよびＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡの含有量（ｍｏｌ／ｇ）は、分析した合成混合物のモル濃度（ｍｏｌ／Ｌ）および質量濃度（ｍｇ／Ｌ）から計算することができる。
【００９５】
〔質量分析（ＭＳ）〕
質量分析（ＭＳ）を用いて、ＨＰＬＣクロマトグラムにおけるＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡ（Ｇｄ３＋）およびＤＯＴＡＧＡ（Ｇｄ３＋）のピークを同定した。質量スペクトルは、飛行時間型質量分析計ｍｉｃｒＯＴＯＦ−Ｑ  ＩＩ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）にネガティブモードで記録した。
【００９６】
〔１Ｈ核磁気共鳴（ＮＭＲ）とディフュージョンオーダードスペクトロスコピー（ＤＯＳＹ）〕
全ての実験は、５ｍｍＢＢＦＯおよびＢＢＩプローブを装備したＢｒｕｋｅｒ  ＡｖａｎｃｅＩＩＩ  ５００ＭＨｚ分光計上で、回転させずに２９８Ｋで行った。凍結乾燥シリカナノ粒子をＤ２Ｏ中に分散させた。
【００９７】
１Ｈ  ＮＭＲ拡散実験のために、通常のｌｅｄｂｐｇｐ２ｓシリーズを使用した。拡散遅延ｄ２０は１００ｍｓに設定され、バイポーラパルスｐ３０は、典型的には２〜４ｍｓの範囲の全強度で９５％減衰を得るように調整された。拡散寸法では３２または６４点が得られた。標準的なｄｏｓｙ２ｄ指令、ＤｙｎａｍｉｃＣｅｎｔｅｒおよびＮＭＲｎｏｔｅｂｏｏｋプログラムで得られた処理データを比較すると、ＮＭＲｎｏｔｅｂｏｏｋで最良の結果が得られ、これは、いくつかのシグナルが同じ化学シフトで混合される場合でさえ、データによく適合した。
【００９８】
報告された流体力学的直径（ＤＨ）は周知のストークス−アインシュタイン公式: ＤＨ＝ｋＢＴ／３πηＤ（ここで、ｋＢはボルツマン定数であり、Ｔは絶対温度であり、ηは溶媒の粘性（２９８ＫにおけるＤ２Ｏでは１．１３ｃＰ）である）を有する拡散係数（Ｄ）から簡単に導出される。
【００９９】
〔固体２９Ｓｉ  ＮＭＲ分光法〕
Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ５００  ＷＢ分光計で、ＭＡＳ  ４ｍｍ  ｄｏｕｂｌｅ  Ｈ／Ｘプローブを用いて、ＭＡＳ速度１０ｋＨｚ、スペクトル周波数９９．３４ＭＨｚで、固体２９ＳｉＮＭＲ実験を行った。高電力デカップリングＭＡＳパルスシーケンスを使用して、１２００回の捕捉スキャン中に２４０秒の繰り返し遅延で、４μｓのパルス長（９０°パルスに対応する）を有する定量的スペクトルを得る。スペクトル分解は、ＤＭＦｉｔソフトウェアによって行った。シグナルは、６つの異なるＳｉ環境に対応する６つの寄与に逆畳み込みすることができる。それらは、２つの主要なタイプ: ＣＳｉ（ＯＳｉ）ｎＯ３−ｎおよびＳｉ（ＯＳｉ）ｍＯ４−ｍであり、一般に、それぞれ、Ｔｎ（第３級）およびＱｍ（第４級）と標識される。Ｔｎ種は、ＣＥＳＴ、ＡＰＴＥＳ、ＴＡＮＥＤまたはＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡのようなオルガノトリアルコキシシラン、およびＴＥＯＳのようなテトラアルコキシシランからのＱｍから形成される。
【０１００】
〔Ｅｕりん光による滴定〕
Ｅｕりん光による滴定は、ＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡの合成混合物中および凍結乾燥した最終粉末中のキレート剤の含有量（ｍｏｌ／ｇ）を正確に定量するための主な方法である。合成混合物または凍結乾燥粉末を水に再分散させた。一定量のこの溶液と異なる量のＥｕＣｌ３を含む一連の試料を、酢酸緩衝液（ｐＨ５）中で調製した。これらの一連の試料を８０℃で４８時間インキュベートした後、計測した。りん光測定は、Ｖａｒｉａｎ  Ｃａｒｙ  Ｅｃｌｉｐｓｅ蛍光分光光度計を用いて、分解時間モードで行った。単一読み取り測定のために、パラメータを以下のように設定した：３９５ｎｍでの励起波長、５９４ｎｍおよび６１６ｎｍでの発光波長（これは、Ｅｕ３＋イオンについての特徴的な励起および発光である）、励起スリット１０ｎｍ、発光スリット１０ｎｍ、遅延時間０．２ｍｓ、総減衰時間０．０２ｓ、平均時間５ｓ、ゲート時間５ｍｓ、フラッシュ１の数、励起フィルター３３５〜６２０ｎｍ、発光フィルター５５０〜１１００ｎｍ、高電圧。発光スペクトルを走査するために、平均化時間を１秒からスピードアップして測定したことを除いて、解像度１ｎｍの同様のパラメータを使用した。Ｅｕ３＋の添加量に伴って、発光強度がもはや直線的に増加しなくなったときを、終点に決定した。
【０１０１】
〔緩和度測定〕
緩和性測定は、Ｂｒｕｋｅｒ（登録商標）ｍｉｎｉｓｐｅｃ  ｍｑ６０ＮＭＲ分析器（Ｂｒｕｃｋｅｒ、ＵＳＡ）を用いて３７℃、１．４Ｔ（６０ＭＨｚ）で行った。試料は、ＩＣＰ−ＯＥＳまたは元素分析のいずれかから測定した特異的Ｇｄ３＋濃度（ｍＭ）で測定した。縦緩和時間Ｔ１および横緩和時間Ｔ２（ｓ）を測定した。次に、緩和率ｒｉ（ｓ−１・ｍＭ−１）（ｉ＝１，２）を次式に従って得られた:
【０１０２】
【数１】
2020527538.tif 000004
【０１０３】
〔元素分析〕
元素分析は、ＦＩＬＡＢ  ＳＡＳ（Ｄｉｊｏｎ、フランス）によって行われ、粉末試料のＧｄ、Ｃ、ＮおよびＳｉ含有量の測定を可能にした。
【０１０４】
誘導結合プラズマ‐発光分光法（ＩＣＰ−ＯＥＳ）
ナノ粒子中の金属の正確な濃度の決定は、誘導結合プラズマ発光分光法（ＩＣＰ−ＯＥＳ）（Ｖａｒｉａｎ ７１０−ＥＳ分光計、米国）によって行った。この測定には、DLS測定後の溶液を再利用した。１０ｐｐｍの金属（Ｇｄ、Ｔｂ、ＨｏまたはＢｉ）中の推定濃度の粒子を、王水（６７％のＨＮＯ３３７％と３７％のＨＣＬを（１／２；ｖ／ｖ）の割合で混合した）４〜５ｍｌ中で３時間、分解させた。その後、５％（ｖ／ｖ)のＨＮＯ３を用いて、正確に５０ｍｌで１００、２００および４００ｐｐｂと推定されるまで希釈した。これらの溶液を０．２μｍの膜を通して濾過した後、分析した。５％（ｗ／ｗ）のＨＮＯ３で連続希釈することにより、１０００ｐｐｍのＧｄ、Ｔｂ、ＨｏおよびＢｉ基準溶液から較正試料を調製した。測定のために選択された波長は、Ｇｄ試料については３４２．２４６、３３５．０４８、３３６．２２４ｎｍ、Ｔｂ試料については３５０．９１４、３６７．６３６、３８７．４１７ｎｍ、Ｈｏ試料については３４５．６００、３３９．８９５、３４１．６４４ｎｍ、Ｂｉ試料については２２３．０６１ｎｍであった。結果は、おそらく、異なる選択された波長１００、２００および４００ｐｐｂでの３つの試料の平均であった。
【０１０５】
〔紫外可視分光法〕
ＵＶ−可視スペクトルは、Ｖａｒｉａｎ  Ｃａｒｙ  ５０分光光度計（ＵＳＡ）で記録した。ＵＣＨＳＮＰ−７およびＵＣＨＳＮＰ−７＠Ｈｏの溶液を５ｇ／Ｌで測定し、ＵＣＨＳＮＰ−７、ＵＣＨＳＮＰ−７＠Ｍ（Ｍ：Ｇｄ、Ｔｂ、Ｈｏ、Ｂｉ）を０．０６ｇ／Ｌで測定した。
【０１０６】
〔赤外分光法（ＩＲ）〕
赤外スペクトルは、ＩＲＡｆｆｉｎｉｔｙ−１  Ｓｈｉｍａｄｚｕを用いて測定した。透過モードは、ハップ−ゲンゼルアポダイゼーション機能、３０スキャン、４００〜４０００ｃｍ−１の領域で４ｃｍ−１の分解能で使用した。水溶液のｐＨを２に調整した後、凍結乾燥した。得られた粉体についてスペクトルを記録した。
【０１０７】
〔実施例１：TＡＮＥＤ、ＣＥＳＴおよびＴＥＯＳを用いた水中での超小型シリカナノ粒子の合成〕
ＴＡＮＥＤ（８．２２ｍｌ、８ｍｍｏｌ）およびＣＥＳＴ（５．５７ｍｌ、８ｍｍｏｌ）を水（６３ｍｌ）中に加え、室温で１５分間撹拌した。次いで、ＴＥＯＳ（５．５７ｍｌ、１６ｍｍｏｌ）を上記溶液に添加した。それを室温で一晩撹拌して、水溶液を均一にした。その後、適切な濃度の数滴のＨＣｌを添加することによって、水溶液のｐＨを１０．５から７．４に低下させた。この水溶液を２４時間撹拌した後、ｐＨ７．４からｐＨ４．５に再調整した。該溶液を６時間撹拌した後、炉に入れ、８０℃で一晩静置した。少量の溶液を０．２μｍ膜を通して濾過し、動的光散乱（ＤＬＳ）法および高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって分析した。次いで、全溶液を、１０−４のＨＣＬ溶液を溶媒として、Ｖｉｖａｓｐｉｎ（商標）（ＭＷＣＯ＝３ｋＤａ）を通したろ過によって精製した。該溶液を２０ｍｌのビバスピンチューブに導入し、容量の半分が残るまで遠心分離した（浄化率２１＝２）。この工程を、１０−３Ｍの塩酸溶液でチューブを満たし、再度遠心分離することによって、ＨＰＬＣクロマトグラムから計算される純度が９０％（通常、浄化率２８＝２５６）以上に達するまで、数回繰り返した。次に、溶液を０．２μｍの膜を通して濾過し、最大の不純物を除去した。最後に、水溶液を長期間保存するために凍結乾燥した。
【０１０８】
得られた粒子を、流体力学的サイズ、ゼータ電位および組成に関して特性決定した。図２Ａは、ＤＬＳによって測定された最終粒子のサイズ分布を示す。平均サイズは約４．６ｎｍであり、標準偏差は１．１ｎｍである。図２Ｂは、同じ機器に組み込まれたレーザードップラー速度測定によって測定されたゼータ電位とｐＨとの関係を示す。アルカリ性ｐＨでのポリシロキサンの安定性が低下したため、ｐＨ８で測定を停止した。最終粒子は、予想通り負の表面電荷を有する。ｐＨ７におけるゼータ電位は−２５．８ｍＶである。
【０１０９】
方法１に従ってＨＰＬＣ分析を行った。２９５ｎｍでの吸収に基づく最終的なナノ粒子の純度は９２．４％である。
【０１１０】
図３は、Ｄ２Ｏ中のＣＥＳＴ、ＴＡＮＥＤおよび最終ナノ粒子の１Ｈ核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルを示す。この結果は、ＣＥＳＴおよびＴＡＮＥＤが最終ナノ粒子に組み込まれていることを示している。図４はＤ２Ｏ中の最終ナノ粒子の試料にディフュージョンオーダードスペクトロスコピー（ＤＯＳＹ）を適用して作成した２次元ＮＭＲスペクトルである。この技術により、１Ｈシグナルのそれぞれに相関する拡散係数（ＤＨ）を測定することができる。図４において、ｘ軸は、１Ｄ１Ｈスペクトルにおいて以前に観察された１Ｈピークの全てが見出された化学シフト（ｐｐｍ）を示す。y軸は、ＤＨの値を示す。次に、拡散係数から、これらの１Ｈピークを与える種の流体力学的直径を計算することができる。ナノ粒子および２つのタイプの遊離加水分解シランからの１つに割り当てることができるＤＨの３つの値がある。したがって、スペクトルからいくつかの結論を下すことができる。第１に、２つの予想される官能基が粒子上に十分にグラフトされている。第２に、精製された粒子は、遊離の加水分解シランをほとんど含まない安定なグラフト化官能基を有する。最後に、粒子の流体力学的直径は約５．０ｎｍであり、これはＤＬＳから測定された結果に一致する。
【０１１１】
ＣＥＳＴのみに由来する１Ｈピークの面積を、ＣＥＳＴおよびＴＡＮＥＤの両方に由来する全ての１Ｈピークの総面積と比較することによって、試料中のＣＥＳＴの量とＴＡＮＥＤの量との間の比率を計算することができる。この例では、結果はＣＥＳＴ／ＴＡＮＥＤ＝１．３０であった。表１および図５は、固体２９シリコンＮＭＲ分光法からの結果を示す。第一に、Ｓｉ（Ｔ２およびＴ３）の４５％は、オルガノシラン、すなわちＴＡＮＥＤおよびＣＥＳＴからのものである。１Ｈピークの面積を比較して得られた結果と組み合わせることにより、２５．４５％がＣＥＳＴから、１９．５５％がＴＡＮＥＤからであると計算できる。その後、残りの５５％のＳｉ（Ｑ２、Ｑ３およびＱ４）はＴＥＯＳから来る。
【０１１２】
【表１】
2020527538.tif 000005
【０１１３】
以上の結果から、全ての組成物のモル比を、以下のように確立することができる：ＴＡＮＥＤ：ＣＥＳＴ：ＴＥＯＳ＝１．００：１．３０：２．８１。さらに、この比率からＴＡＮＥＤの含有量が約０．７８４μｍｏｌ／ｍｇであると計算することもできる。
【０１１４】
ＴＡＮＥＤの含有量は、色インジケータとしてＥＢＴ(またはＮＥＴ）を用いた比色分析によって定量することもできる。凍結乾燥粉末を水中に再分散させて、４８ｍｇ／ｍｌ水溶液（Ａ）を得た。１００μｌのＡ、１０μｌの色彩指示薬としてのＥＢＴ、および１０ｍｌのアンモニア緩衝液の溶液を、５ｍＭのＣａＣｌ２の溶液で滴定した。この実施例では、結果は約０．８５５μｍｏｌ／ｍｇであった。
【０１１５】
〔実施例２：大環状キレート剤官能化シラン（ＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡ）およびアミノシラン（ＡＰＴＥＳ）を用いた水中での超小型ハイブリッドキレートシリカナノ粒子（ＵＣＨＳＮＰ）の合成〕
この例では、合成は２つのステップに分割される。まず、市販されていないシラン前駆体ＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡを合成する。次いで、大環状キレート剤ＤＯＴＡＧＡで官能化された超小型ハイブリッドキレート化シリカナノ粒子（ＵＣＨＳＮＰ）を、実施例1に示す方法に従って合成する。
【０１１６】
工程１：大環状キレート剤官能化シラン（ＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡ）の合成
ＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡは、２つの異なる方法から合成することができる：ＨＢＴＵ（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）を用いて、ＡＰＴＥＳとブチル保護ＤＯＴＡＧＡの活性化カルボキシル基との間の反応を通して合成（工程１ａ）、またはＤＯＴＡＧＡ無水物（工程１ｂ）。
【０１１７】
工程１ａ：ブチル保護ＤＯＴＡＧＡからの大環状キレート剤官能化シラン（ＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡ）の合成
ＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡは、ペプチドカップリングを介して、ＡＰＴＥＳにカップリングされたｔ−ブチル保護ＤＯＴＡＧＡから合成することができる。これに続いて、中間体を脱保護して、最終化合物を得た。反応スキームを図６に示す。
【０１１８】
１ｇの（ｔ−Ｂｕ）４ＤＯＴＡＧＡ、０．６ｇのＨＢＴＵおよび０．２ｇのＨＯＢｔを、２８ｍＬのＤＣＭ（ジクロロメタン）を添加した１００ｍｌ丸底フラスコ中に秤量し、続いて１．３ｍＬのＤＩＰＥＡを添加した。混合物を１５分間撹拌し、その後、０．３ｇのＡＰＴＥＳを反応混合物に注入した。水溶液を室温で一晩撹拌した。
【０１１９】
ＤＣＭを用いて反応混合物を９０ｍｌに３回希釈し、続いて分液漏斗中で８０〜９０ｍｌのクエン酸溶液（ｐＨ３）で反応溶液を抽出した。分離した有機相を、８０〜９０ｍｌの５％ ｗ／ｖ ＮａＨＣＯ３、続いて最後に蒸留水でさらに抽出した。上記抽出は、カップリング試薬／未反応ＡＰＴＥＳ／外来水溶性成分を除去することを可能にした。単離した有機相をＭｇＳＯ４（５ｇ）で５分間乾燥させ、連続的に濾過して透明なろ液を得た。ろ液を、ＲＯＴＡＶＡＰＯＲを用いて３０℃で蒸発させて、淡褐色がかった粘稠な残渣（中間体）を得た。中間体の形成は、ＨＲＭＳを用いて確認した。Ｃ４４Ｈ８５Ｎ５Ｏ１２Ｓｉのｍ／ｚ値：計算値： ９２６．５８５６、得られた値： ９２６．５８４９（Ｍ＋Ｎａ）＋。
【０１２０】
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ  ０．４−０．７（ｍ、２Ｈ）、０．７−０．８（ｍ、１Ｈ）、１．０（ｄｄ、Ｊ＝９．０、６．７Ｈｚ、１Ｈ）、１．１−１．２（ｍ、９Ｈ）、１．３−１．５（ｍ、３２Ｈ）、１．５（ｐ、Ｊ＝７．８Ｈｚ、２Ｈ）、１．７（ｄ、１Ｈ）、１．９−１．９（ｍ、１Ｈ）、２．１−２．１（ｍ、１Ｈ）、２．４−３．４（ｍ、２９Ｈ）、３．５−３．７（ｍ、１Ｈ）、３．７−３．８（ｍ、４Ｈ）
１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ  7．５、７．８、１８．３、２０．４、２３．５、２５．９、２６．８、２７．８、２７．８、２７．９、２７．９、２７．９、２８．２、２８．３、２９．７、３３．０、３８．６、４２．１、４７．６、４９．８、５８．４、６３．６、８０．８、８２．３、１７１．１、１７３．２
上記残渣を２０ｍｌの濃縮ＨＣｌと混合し、４０分間撹拌した後、ロータリーエバポレーターを用いて３５℃で過剰の酸を除去し、固体の残渣を得た。残渣をさらに約１０ｍｌの水に溶解し、ロータリーエバポレーションにかけて遊離酸を除去した。得られた濃縮物を水１０ｍｌに溶解し、直ちに窒素中で凍結し、凍結乾燥して淡褐色粉末１．１１ｇを得た。Ｃ２２Ｈ４１Ｎ５Ｏ１２Ｓｉのｍ／ｚ値Ｏ１２  計算値：６１８．２４１３、得られた値： ６１８．２４２５（Ｍ＋Ｎａ）＋。
【０１２１】
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、酸化重水素）δ  ０．５〜０．８（ｍ、２Ｈ）、１．２〜１．３（ｍ、１Ｈ）、１．４〜１．６（ｍ、１Ｈ）、１．６〜１．８（ｍ、１Ｈ）、１．８〜２．２（ｍ、１Ｈ）、２．３〜４．５（ｍ、２６Ｈ）。
【０１２２】
〔工程１ｂ：ＤＯＴＡＧＡ無水物からの大環状キレート剤官能化シラン（ＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡ）の合成〕
シラン前駆体ＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡは、ＤＯＴＡＧＡ無水物からも合成することができる。反応スキームを図７に示す。
【０１２３】
典型的な例では、９．３７５ｇ（１６．３６ｍｍｏｌ）のＤＯＴＡＧＡ無水物を１Ｌの丸フラスコに入れた。次いで、４９４ｍＬの無水ＤＭＳＯおよび１．９３３ｍＬ（８．１６ｍｍｏｌ）のＡＰＴＥＳを迅速に添加した。すべてのＡＰＴＥＳを確実に反応させるために、ＤＯＴＡＧＡ無水物を過剰に使用した。これは、次の工程における最終粒子の組成物の正確な制御を可能にする。反応は、アルゴン雰囲気下で行い、１５〜２０時間、７５℃に加熱した。生成物は白色沈殿として形成された。生成物を５Ｌのアセトンに移すことによって完全に沈殿させ、４℃で４８時間保持した。沈殿物を濾紙グレード４２を通して濾過した。約２〜３Ｌのアセトンを用いて沈殿物を洗浄し、ＤＭＳＯを除去した。３７℃で一晩蒸発させることにより残ったアセトンを除去した。
【０１２４】
精製後、沈殿物を水に溶解し、方法２に従ってＨＰＬＣにより分析した。ＧｄＣｌ３およびＧｄＣｌ３とＤＯＴＡＧＡ（Ｇｄ３＋）の混合物と合成混合物のクロマトグラムを重ね合わせることにより、ピークを同定することができる。反応生成物の構造を確認するために、ＭＳ分析も行った。ＭＳスペクトルは５９４、４７５、２９６．５および２３７ｍ／ｚに４つの主要ピークを示し、これは、提案された生成物のシミュレートされたスペクトルと一致し、一価イオンおよび二価イオンの共存を示す。
【０１２５】
合成混合物中のＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡの含有量（ｍｏｌ／ｇ）を、総ＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡおよび未反応ＤＯＴＡＧＡの含有量を介して間接的に決定した。未反応ＤＯＴＡＧＡの含有量は、クロマトグラフィーの方法３に従って、Ｅｕによる比色およびりん光滴定によって、決定した。
【０１２６】
比色分析のために、８．８１５ｍｇ／Ｌの合成混合物２００μＬおよび２５μＬのＥＢＴ（ＮＥＴ）を１０ｍＬのアンモニア緩衝液ｐＨ１０に添加した。この液を５ｍＭのＣａＣｌ２で滴定した。終点体積は６００μｌであり、これは全ＤＯＴＡＧＡの含量を１．７０μｍｏｌ／ｍｇとした。この結果を用いて、４４．０７５ｍｇ／Ｌの合成混合物に、少しずつＥｕ３＋（０μＭ〜１４０μＭ）を滴下した一連の試料を酢酸緩衝液（ｐＨ５）中で調製し、全ＤＯＴＡＧＡ含量をより正確に測定した。これらの試料を８０℃で４８時間インキュベートした後、りん光を計測した。図８Ａは、４０μＭにおけるＤＯＴＡＧＡ（Ｅｕ３＋）の発光スペクトルを示す。５９４ｎｍおよび６１６ｎｍに２つの発光ピークが見出された。図８Ｂは、それぞれ５９４ｎｍ(円）および６１６ｎｍ（正方形）での滴定曲線を示す。全ＤＯＴＡＧＡの含有量は、１．４７５μｍｏｌ／ｍｇと決定された。比色分析では色が変化し始めた時点を認識することが困難であるため、結果を過大評価する傾向があるので、この結果はより正確である。
【０１２７】
ＤＯＴＡＧＡ（Ｇｄ３＋）の濃度は、ＨＰＬＣ分析と検量線を用いて計算した。この結果から、未反応ＤＯＴＡＧＡの含有量を推定した。未反応ＤＯＴＡＧＡの計算された含有量は０．７４５μｍｏｌ／ｍｇであった。
【０１２８】
以上の結果から、期待生成物ＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡの含有量は、０．７３０μｍｏｌ／ｍｇであると推測することができる。これは、ほとんどすべてのＡＰＴＥＳが過剰のＤＯＴＡＧＡと反応してＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡを形成し、混合物中にＡＰＴＥＳが残っていないことを示唆する。計算は反応の収率が９９％であり、全プロセス、すなわち反応および濾過の単離収率が７９％であったことを示す。
【０１２９】
赤外（ＩＲ）分光法もまた、ＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡを特徴付けるために使用した。ＤＯＴＡＧＡおよびＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡの反応混合物を水に溶解し、ｐＨ２に調整してカルボキシル基をプロトン化した。これは、Ｃ＝Ｏアミドの１６７７ｃｍ−１におけるピークを、Ｃ＝Ｏカルボキシルの１７１３ｃｍ−１におけるピークと区別可能にする。２つの溶液を８０℃で４日間乾燥させた。乾燥粉末を用いてＩＲスペクトルを得た。
【０１３０】
図８Ｃは、ＤＯＴＡＧＡ粉末およびＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡ反応混合物のＩＲスペクトルを示す。いくつかの重要なピークの帰属を以下の表２に示す。１６７７．０ｃｍ−１にピークが出現し、１７１２．７ｃｍ−１に逆ピークの出現したことは、アミド結合の形成を示している。
【０１３１】
【表２】
2020527538.tif 000006
【０１３２】
ステップ２：ＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡからのＵＣＨＳＮＰの合成
ＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡからＵＣＨＳＮＰを合成するために、２つのストラテジーを用いることができる：
ａ）ＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡシランを最初から直接的に使用して、表面上に遊離キレート剤を有する粒子（ＵＣＨＳＮＰ）を合成することができ、次いで、これらのＵＣＨＳＮＰをＧｄ３＋と複合体化させて最終生成物（ＵＣＨＳＮＰ＠Ｇｄ−１）を形成する、または、
ｂ）ＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡシランをＧｄ３＋と錯化させてから、加水分解−縮合工程を行って、錯化キレートを有する最終粒子（ＵＣＨＳＮＰ＠Ｇｄ−２）を生成することができる。
【０１３３】
両方のストラテジーを図９に要約する。
【０１３４】
〔工程２ａ：空のＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡからのＵＣＨＳＮＰ＠Ｇｄ−１の合成〕
工程１ａまたは１ｂから合成された生成物に、２００ｍｌの水を添加した。いずれの場合も、生成物は２．２２８ｍｍｏｌのＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡを含有する。適切な濃度のＮａＯＨ溶液を添加することによって、溶液のｐＨを約３から９に調整した。水溶液を１〜２時間撹拌して、ＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡを溶解し、遊離させてモノマー形態にした。次いで、ＴＥＯＳ(１０１５．４μＬ、４．４５７ｍｍｏｌ）およびＡＰＴＥＳ（５２６．７μＬ、２．２２８ｍｍｏｌ）を上記溶液に1つずつ添加した。ＡＰＴＥＳの添加はｐＨをわずかに上昇させるので、必要であれば、ｐＨを９に戻すべきである。水を添加して、ＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡ、ＴＥＯＳ、およびＡＰＴＥＳの最終濃度を、それぞれ１０ｍＭ、２０ｍＭおよび１０ｍＭとした。溶液が均質になるように、反応混合物を２５℃で一晩撹拌した。これは、全エトキシシランが加水分解されたことを意味する。次いで、適切な濃度のＨＣｌを数滴、添加することによって、ｐＨを９から７に低下させた。該溶液を２５℃で２時間攪拌した後、ｐＨ７からｐＨ４．５に再調整した。該溶液を２５℃でさらに１〜２時間撹拌した後、８０℃で加熱し、オイルバス中で一晩（１５〜２０時間）穏やかに撹拌した。少量の溶液（１ｍＬ）を０．２μｍ膜を通して濾過し、ＤＬＳおよびＨＰＬＣ（水溶液１に従って）によって分析した。ＨＰＬＣ分析のために、２つのタイプの試料を調製した。最初に、濾過した溶液を、ＨＰＬＣシステムに注入する直前に、迅速に２倍に希釈して、理論濃度５ｇ／Ｌとした。シグナルは、ＡＧｕＩＸ粒子が典型的に吸光する２９５ｎｍで追跡した。次に、濾過した溶液２００μＬを、溶液中のキレート剤の理論濃度と比較して過度の量である５０６ｍＭのＣｕＳＯ４、５μＬと混合した。この液を８０℃で２時間インキュベートした。インキュベーション後のｐＨを確認し、３．２３に維持したが、これはＣｕ（ＯＨ）２生成を回避するのに十分な低さであった。その後、溶液を、ＨＰＬＣシステムに注入する直前に、理論濃度である５ｇ／Ｌに迅速に希釈した。シグナルは、銅およびそのＤＯＴＡＧＡ錯体の特異的吸収ピークである７００ｎｍで追跡した。
【０１３５】
水溶液を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ（商標)（ＭＷＣＯ＝３ｋＤａ）による限外濾過によって１０ｍＬに濃縮した。再び、ＨＰＬＣ分析を繰り返した。銅および銅錯体を含まない２つの試料を、ＨＰＬＣシステムに注入する直前に、５ｇ／Ｌの理論濃度に希釈し、以前の結果と比較した。
【０１３６】
次いで、溶液を限外濾過でさらに精製した。前駆体が未反応のＤＯＴＡＧＡとの混合物である場合、溶液は、精製前にＨＣｌ溶液を添加することによってｐＨ２に調整されるべきである。このステップで、ＤＯＴＡＧＡは脱プロトン化し、新たに形成された粒子の表面上のアミノ基に静電的に付着せずに遊離する。容量の半分が残るまで遠心分離した（浄化率２１＝２）。この操作を数回繰り返し、１０Ｍ−４の塩酸（ＨＣｌ）溶液（または、ｐＨ２でろ過している場合には、１０Ｍ−２のＨＣｌ溶液）でチューブを満たし、再度遠心分離を行い、ＨＰＬＣクロマトグラムから算出した純度が９０％（通常は、浄化率  ２１０＝１０２４）以上に到達した。次に、水溶液を０．２μｍの膜を通して濾過し、ダストを除去した。最後に、水溶液を長期間保存するために凍結乾燥した。凍結乾燥粉末７０６ｍｇを得た。
【０１３７】
図１０は、形成されたＵＣＨＳＮＰ−１のＤＨ分布を示す。粒子は、約４．６±１．６ナノメートルのＤＨを有する。ＨＰＬＣ分析により、精製後、ナノ粒子が純粋であり、表面上にＤＯＴＡＧＡで十分にグラフトされていることが確認される。表面上にＤＯＴＡＧＡで十分にグラフトされていることは、７００ｎｍでのクロマトグラムによって示された。
【０１３８】
最終ナノ粒子（ＵＣＨＳＮＰ−１）中のＤＯＴＡＧＡの含有量を、２つの方法：１）銅によるＨＰＬＣ分析（方法１を使用）および２）Ｅｕ燐光による滴定によって定量した。
【０１３９】
第１の方法では、１４２．８ｇ／ＬのＵＣＨＳＮＰ−１と２００ｍＭのＣｕＳＯ４を含む混合物をｐＨ３で調製し、８０℃で２時間インキュベートした。溶液を１０−３ＭのＨＣｌ溶液で２０倍に希釈した直後に、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）系に注入した。ＨＰＬＣクロマトグラムは、金属が組み込まれたナノ粒子および遊離銅錯体化ＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡの存在を示す。金属が取り込まれたナノ粒子のＲｔは、最初の空のナノ粒子よりも長い。これは、錯化によって誘起される表面電荷の変化またはイオン化状態によって説明することができる。より重要なことに、ナノ粒子ピークの形状は、錯化後に均一な分布を示す。全ての銅種の総濃度は１０．０３ｍＭであり、これは理論的に導かれた量に正確に等しい。この結果から、試料中のＤＯＴＡＧＡの総濃度が分かり、ＤＯＴＡＧＡの含有量は約０．７２μｍｏｌ／ｍｇであったと導き出すことができる。
【０１４０】
Ｅｕによる滴定のために、４４．０８ｍｇ／ＬのＵＣＨＳＮＰ−１と０μＭ〜１４０μＭのＥｕＣｌ３ の一連の試料を、酢酸緩衝液（ｐＨ５）中で調製した。これらの試料を８０℃で４８時間インキュベートした後、計測した。図１１は、ＤＯＴＡＧＡ（Ｅｕ３＋）錯体の、２つの特定の発光波長における滴定曲線を示す。結果は０．７９μｍｏｌ／ｍｇであった。
【０１４１】
〔ＵＣＨＳＮＰ＠Ｌｕ−１〕
ＵＣＨＳＮＰ−１の径を評価するために、その表面上のＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡとＡＰＴＥＳの存在と比率、１Ｈ  ＮＭＲおよびＮＭＲ  ＤＯＳＹスペクトルを、空のＵＣＨＳＮＰ−１と例えばＬｕ３＋（ＵＣＨＳＮＰ＠Ｌｕ−１）等の反磁性ランタニドイオンと複合体を形成したＵＣＨＳＮＰ−１から収集した。
【０１４２】
空のＵＣＨＳＮＰ−１試料については、凍結乾燥粉末を水中に再分散させた。水溶液のｐＨを７．４に調整した後、水を添加して、最終的に、ＤＯＴＡＧＡ中で１２７ｇ／Ｌまたは１００ｍＭの濃度を得た。該溶液を凍結乾燥し、Ｄ２Ｏ中に同濃度で再分散させた。次に、４７０〜５００μｌの試料をＮＭＲ管に加えて測定した。
【０１４３】
ＵＣＨＳＮＰ＠Ｌｕ−１試料については、凍結乾燥粉末を水中に再分散させた。Ｅｕ滴定から算出したＤＯＴＡＧＡの含有量を用いて、１．９８ＭのＬｕＣｌ３液３２．５μＬ（モル比  ＤＯＴＡＧＡ:Ｌｕ＝１：０．９）を４回ゆっくりと添加した。各添加の間に、ＮａＯＨ溶液を適切な濃度で添加することによってｐＨを注意深く４〜５に上昇させた後、次のものを添加した。４回の添加後、ｐＨは５であった。この水溶液を８０℃で４８時間インキュベートした。最後に、ｐＨを７．４に上昇させ、最終的にＤＯＴＡＧＡ中１２７ｇ／Ｌまたは１００ｍＭの濃度を有するように水を添加した。該溶液を凍結乾燥し、Ｄ２Ｏ中に同濃度で再分散させた。次に、４７０〜５００μｌの試料をＮＭＲ管に加えて測定した。
【０１４４】
図１２は、ＵＣＨＳＮＰ−１のＮＭＲスペクトルを示す。まず、図１２ＡはＤ２Ｏにおける２Ｄ  ＮＭＲ  ｄｏｓｙスペクトルを示しており、陽子の大部分は、５４．４μｍ２／sで同じ拡散係数（Ｄ）を有するように思われる。結果は、予想される官能基、すなわちＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡおよびＡＰＴＥＳが同じ粒子上に良好にグラフトされたことを示す。第２に、かなり速い係数（１９４．５μｍ２／ｓ）を有するいくつかの遊離加水分解シランがある。同様のスペクトルがＵＣＨＳＮＰ−１＠Ｌｕで見出された（図１２Ｃ）。主な生成物は、５６μｍ／ｓ程度のＤを有した。それらは、より速いＤ（４１０および２１４μｍ２／s）を有するいくつかの他のより小さい種と共存した。主な粒子の流体力学的直径はアインシュタイン方程式から計算することができ、ＵＣＨＳＮＰ−１およびＵＣＨＳＮＰ−１＠Ｌｕについてそれぞれ約７．０ｎｍおよび６．８ｎｍである。その粘度は未知であり、純粋なＤ２Ｏよりもかなり高かった。したがって、計算されたＤＨは、少し過大評価されるかもしれない。いずれの場合も、１０ｎｍ未満のままであり、ＤＬＳから測定した結果と一致した。図１２Ｂおよび１２Ｄは、ＵＣＨＳＮＰ−１およびＵＣＨＳＮＰ−１＠Ｌｕの１Ｄ１Ｈスペクトルのピークインテグレーションを示す。１Ｈピークの大部分は、他の場所で確認することができたＤＯＴＡＧＡの複素１Ｈスペクトルのために、互いに重なり合った。幸いなことに、ＤＯＴＡＧＡは、ＡＰＴＥＳおよびＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡのＳｉに最も近い位置１の炭素の１Ｈピークを見出すことができる１ｐｐmより小さい範囲に１Ｈピークを有していない（図１２Ｅ）。従って、これらの炭素１に由来する１Ｈピークの面積を、全ての１Ｈピークの総面積と比較することにより、試料中のＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡの量に対するＡＰＴＥＳの量の間の比率を見出すことができる。これらの２つの試料において、結果は、それぞれ１．３５および１．１２であった。
【０１４５】
〔ＵＣＨＳＮＰ＠Ｇｄ−１〕
ＵＣＨＳＮＰ−１がＭＲＩ造影増強および放射線増感特性を有することを可能にするために、Ｇｄ３＋を粒子上に錯体化した。典型的な例では、３３３ｍｇのＵＣＨＳＮＰ−１の凍結乾燥粉末を水中に再分散させた。３６  ２．1８８  ＭのＧｄＣｌ３水溶液（モル比ＤＯＴＡＧＡ：Ｇｄ＝１：０．９）μＬを３回ゆっくり添加した。各時間の間に、ＮａＯＨ溶液を適切な濃度で添加することによってｐＨを注意深く４〜５に上昇させた後、次のものを添加した。３回の添加後、ｐＨは５であった。この水溶液を８０℃で４８時間インキュベートした。インキュベーション後、pＨを維持した。この水溶液を浄化率５でタンジェンシャル濾過(ＭＷＣＯ＝３ｋＤａ）によって精製し、遊離Ｇｄ３＋を除去した。溶液の純度をＨＰＬＣ（方法１）によって評価した。精製溶液（〜１ｍＬ）を１０−２ＭのＨＣｌ溶液で５２倍に希釈し、理論濃度であるＤＯＴＡＧＡ中５ｍＭにした直後、ＨＰＬＣシステムに注入した。
【０１４６】
Ｇｄ３＋が組み込まれたナノ粒子のＲｔは、Ｃｕ２＋が組み込まれたナノ粒子および最初の空のナノ粒子よりも長い。これもまた、錯化によって誘起される表面電荷の変化またはイオン化状態によって説明することができる。なぜなら、ＤＯＴＡＧＡ（Ｇｄ３＋）は、金属と配位した４つのカルボキシレート基全てを有し、一方、ＤＯＴＡＧＡ（Ｃｕ２＋）は２つの遊離カルボキシレート基を有するからである。より重要なことは、銅が組み込まれたナノ粒子の場合のように、ナノ粒子のピークの形状は、錯化後の均一な分布を示していることである。
【０１４７】
ＨＰＬＣクロマトグラムは、ナノ粒子が純粋であることを示す。この水溶液の純度を、２９５ｎｍでのクロマトグラムから評価したところ、ほぼ１００％であった。
【０１４８】
次に、水溶液のｐＨを７．４に上昇させ、水溶液を０．２μｍの膜を通して濾過し、塵埃を除去した後、凍結乾燥した。本実施例では、ＵＣＨＳＮＰ＠Ｇｄ−１の粉末２５０ｍｇを得た。
【０１４９】
凍結乾燥粉末の試料を水中に再分散させて、流体力学的直径（ＤＨ）、表面電荷および緩和度（ｒ１およびｒ２）を検証した。図１３は、ＵＣＨＳＮＰ＠Ｇｄ−１のＤＨの分布ヒストグラムを示し、その値は５．７±１．３ナノメートルであった。表面電荷は、ゼータ電位値によって反映され、その値はｐＨ６．６５で−５．８ｍＶおよびｐＨ７．３４で−８．２ｍＶであった。次に、元素分析を行って、粒子の化学組成を明らかにした。この結果から、Ｇｄの含有量は０．６０μｍｏｌ／ｍｇであった（表３）。次に、１００ｇ／ｌ（Ｇｄ中６０．４ｍＭ）のＵＣＨＳＮＰ＠Ｇｄ−１の溶液の緩和時間（Ｔ１およびＴ２）を測定して、３７℃および１．４Ｔでｒ１＝２１．４（ｓ−１ ．ｍＭ−１）およびｒ２＝３４．１（ｓ−１ ．ｍＭ−１）を得た。
【０１５０】
工程２ｂ：錯体化ＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡ（Ｇｄ３＋）からのＵＣＨＳＮＰ＠Ｇｄ−２の合成
２００ｍｌの水を、工程１ａまたは１ｂから合成された２．３３３ｍｍｏｌのＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡに添加した。適切な濃度のＮａＯＨ溶液を添加することによって、溶液のｐＨを４に調整した。２．１８８ＭのＧｄＣｌ３溶液１．９３８ｍｌ（モル比（ＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡ＋ＤＯＴＡＧＡ)：Ｇｄ＝１：０．９）を３回添加した。各時間の間に、適切な濃度のＮａＯＨ溶液を添加することによってｐＨを注意深く４〜５に上昇させた後、次のものを添加した。３回の添加後、ｐＨは５であった。この水溶液を８０℃でインキュベートし、ｐＨを確認し、それぞれ２４時間後にｐＨ５に再調整した。４８時間のインキュベーション後、ｐＨを５に一定に維持した。
【０１５１】
次いで、この水溶液のｐＨを９に調整し、水溶液を１〜２時間撹拌して、ＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡ（Ｇｄ３＋）を溶解し、遊離させてモノマー形態にした。次いで、ＴＥＯＳ(１０１５．４μＬ、４．４５７ｍｍｏｌ）およびＡＰＴＥＳ（５２６．７μＬ、２．２２８ｍｍｏｌ）を上記溶液に１つずつ添加した。ＡＰＴＥＳの添加はｐＨをわずかに上昇させるので、必要であればｐＨを９に戻すべきである。ＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡ（Ｇｄ３＋）、ＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡ、ＴＥＯＳおよびＡＰＴＥＳの最終の理論濃度をそれぞれ９ｍＭ、２０ｍＭおよび１０ｍＭにするために、水を添加した。溶液が均質になるように、反応混合物を２５℃で一晩撹拌した。これは全てのエトキシシランが加水分解されたことを意味する。次いで、適切な濃度で数滴のＨＣｌを添加することによって、ｐＨを９から７に低下させた。該溶液を２５℃で２時間攪拌した後、ｐＨ７からｐＨ４．５に再調整した。該溶液を２５℃でさらに１〜２時間撹拌した後、８０℃で加熱し、オイルバス中で一晩（１５〜２０時間）穏やかに撹拌した。少量の溶液を０．２μｍ膜を通して濾過し、ＤＬＳおよびＨＰＬＣ(方法１による）によって分析した。ＨＰＬＣ分析のために、濾過された溶液はＨＰＬＣシステムに注入される直前に、５ｇ／Ｌの理論濃度を有するように２倍に迅速に希釈された。シグナルは２９５ｎｍで追跡した。さらに、蛍光検出器（λｅｘ＝２７４ｎｍ、λｅｍ＝３１２ｎｍ）を用いて、Ｇｄ錯体の存在を定性的に検出した。
【０１５２】
次に、水溶液をＶｉｖａｓｐｉｎ（商標）（ＭＷＣＯ＝３ｋＤａ）によって１０ｍｌに濃縮した。再び、ＨＰＬＣ分析を繰り返した。試料は以前の結果と比較するためにＨＰＬＣシステムに注入される直前に、理論濃度５ｇ／Ｌに希釈された。
【０１５３】
次いで、水溶液を限外濾過でさらに精製した。前駆体が未反応のＤＯＴＡＧＡとの混合物である場合、精製前にＨＣｌ溶液を添加することによって、溶液のｐＨを２に調整するべきである。ＨＰＬＣクロマトグラムから計算した純度が≧９０％（浄化率１０）に達するまで精製を行った。次に、水溶液のｐＨを７．４に上昇させた後、凍結乾燥した。それを０．２μｍの膜を通して濾過し、ダストおよび大きな粒子を除去した後、長期間保存のために凍結乾燥した。本実施例では、７１６ｍｇのＵＣＨＳＮＰ＠Ｇｄ−２粉末が得られた。
【０１５４】
図１４は、形成されたＵＣＨＳＮＰ＠Ｇｄ−２のＤＨ分布を示す。粒子は、約３．９±１．３ナノメートルのＤＨを有する。
【０１５５】
ＨＰＬＣクロマトグラムは、精製後、ナノ粒子が純粋であり、表面上にＤＯＴＡＧＡで十分にグラフト化されていることを示す。ピークの形状は、錯化後に均一な分布を示す。溶液の純度を、２９５ｎｍでのクロマトグラムから評価したところ、９６．８％であった。
【０１５６】
凍結乾燥粉末の試料を水中に再分散させて、凍結乾燥後のＤＨ、表面電荷および緩和度（ｒ１およびｒ２）を確認した。図１５は、ＵＣＨＳＮＰ＠Ｇｄ−２のＤＨの分布ヒストグラムを示し、この値は２．８±０．７ナノメートルであった。表面電荷は、ゼータ電位値によって反映され、その値はｐＨ７．４で−３５．６ｍＶであった。次に、元素分析も行って、粒子の化学組成を明らかにした。この結果から、Ｇｄの含有量は０．６３μｍｏｌ／ｍｇであった（表３）。この結果から推測される構成比率によれば、ＵＣＨＳＮＰ＠Ｇｄ−２はその構成においてＡＰＴＥＳが少なく、遊離ＤＯＴＡＧＡが多いことから、これらのナノ粒子を用いて測定したゼータ電位がより負であることが説明される。
【０１５７】
ＵＣＨＳＮＰ＠Ｇｄ−２上の遊離＠の含有量は、Ｅｕを用いた別の滴定によって確認した（図１６）。結果はＤＯＴＡＧＡの０．９４μｍｏｌ／ｍｇの総含有量のうち、少なくとも０．２０μｍｏｌ／ｍｇすなわち２４．１％が金属と効果的に反応し得ることを示した。これは、ＵＣＨＳＮＰ＠Ｇｄ−１（１０％）よりも高い。元素分析によって示唆された合計ＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡの含有量は、滴定によって推定された値よりも常に１０％高く、両方のナノ粒子中のいくつかのＤＯＴＡＧＡが金属に接近できないことを示している。
【０１５８】
ＵＣＨＳＮＰ＠Ｇｄ−２中の遊離ＤＯＴＡＧＡの量が多いのは、ＴＥＯＳを加水分解するためにｐＨ９で反応混合物を一晩撹拌した場合に促進された脱錯化に起因すると考えられる。ＵＣＨＳＮＰ＠Ｇｄ−２中のＡＰＴＥＳ量がＵＣＨＳＮＰ＠Ｇｄ−１に比べて少ないことは、ＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡとＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡ（Ｇｄ３＋）の電荷が異なることで説明できる。ｐＨ４．５では、ＤＯＴＡＧＡの錯体化形態の（電荷が）常に−１である場合、遊離形態の（電荷が）が−２または−３である。おそらく、錯体化形態は遊離形態よりも、電荷反発が弱く、ＴＥＯＳによって生成されるポリシロキサン表面上の位置を占めるために容易にアミノシランと競合する。
【０１５９】
次に、１００ｇ／ｌの水溶液（Ｇｄ中６３．０ｍＭ）中のＵＣＨＳＮＰ＠Ｇｄ−２の緩和時間（Ｔ１およびＴ２）を測定し、３７℃および１．４Ｔでｒ１＝１８．５（ｓ−１ ．ｍＭ−１）およびｒ２＝２８．７（ｓ−１ ．ｍＭ−１）の値を得た。
【０１６０】
表４に、ＵＣＨＳＮＰ、ＵＣＨＳＮＰ＠Ｇｄ−１およびＵＣＨＳＮＰ＠Ｇｄ−２の特徴および特性を要約する。
【０１６１】
【表３】
2020527538.tif 000007
【０１６２】
【表４】
2020527538.tif 000008
【０１６３】
〔実施例３：異なるサイズのＵＣＨＳＮＰの合成〕
合成は、ＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡの合成とポリシロキサン粒子の合成とをワンポットプロトコルに組み合わせることによって、さらに単純化することができる。さらに、粒子のサイズは、配合物中のシラン前駆体の比率を変えることによって制御することができる（図１７）。
【０１６４】
８ｇのＤＯＴＡＧＡ無水物（１３．９６ミリモル）を１００ｍＬの丸形フラスコに入れ、これに３１．６ｍＬのＤＭＳＯ無水物および３．３００ｍＬのＡＰＴＥＳ（１３．９６ミリモル）を迅速に加えた。アルゴン雰囲気下で撹拌し、１５時間〜２０時間、７５℃に加熱した。第２の実施例とは異なり、ＤＯＴＡＧＡのカルボキシル基をイオン化する過剰のＡＰＴＥＳの存在に起因して、生成物は可溶性である。混合物を室温まで冷却した後、６６３ｍＬの超純水を添加した。溶媒中のＤＭＳＯの最終パーセンテージは、次の工程で使用されるタンジェンシャル濾過膜を溶解しないように５％未満であるべきである。少量の試料を採取し、Ｅｕ滴定と、先に導入したＧｄ３＋によりプローブしたＨＰＬＣとの組合せにより、産生されたＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡの量を定量した。
【０１６５】
ＮａＯＨ溶液を添加することによって溶液のｐＨを９に調整し、混合物を１時間撹拌して、モノマー形態のＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡを十分に遊離させた。次に、水溶液を４体積に分離した。総ての試料中の総シラン濃度が２０ｍＭであることを確認するために、表５に示すように、ＴＥＯＳおよび水の量を増加させて各体積に添加した。最終溶液のｐＨを確認し、必要に応じて９に再調整した。これらの溶液を２５℃で一晩撹拌した。表６は、使用した異なるシラン間の比率Ａ、ＢおよびＣを示す。
【０１６６】
【表５】
2020527538.tif 000009
【０１６７】
【表６】
2020527538.tif 000010
【０１６８】
ＵＣＨＳＮＰ−３（ＴＥＯＳを添加しなかった試料）を用いて、少量の試料を採取して、塩基性ｐＨに一晩暴露した後のＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡの量を確認した。図１８は、２つのサンプル（塩基性ｐＨに一晩曝露する前（Ａ）および後（Ｂ））についてのＥｕ滴定の結果を示す。ＨＰＬＣ分析も行った。表７は、これらの試験の結果をまとめる。
【０１６９】
【表７】
2020527538.tif 000011
【０１７０】
ｐＨ９への暴露は、ＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡのＤＯＴＡＧＡ構造にもアミド結合にも影響しないことが明らかである。ＤＯＴＡＧＡピーク間のわずかな変動は、室温の差に起因し得た。最後に、結果によれば、約７０％のＤＯＴＡＧＡ無水物が反応した。これにより、表５に示すように、ナノ粒子の４つのサンプル中の組成物の正確な量を再計算することができる。
【０１７１】
翌日、４つの水溶液のｐＨを７に再調整した。それらのｐＨを４．５に再調整する前に、それらを１時間撹拌した。４０℃で一晩加熱する前に、溶液をさらに１時間攪拌した。これらの溶液１ｍｌをＤＬＳ測定のために採取した（図１９Ａ）。ＵＣＨＳＮＰ−３からのシグナルは、非常に小さいナノ粒子および／または希釈された濃度のナノ粒子の生成を意味する信頼できる値を有するには弱すぎた。他の３つのサンプルは、ＴＥＯＳの添加量に対するナノ粒子サイズの明らかな依存性を示した。ＵＣＨＳＮＰ−４、ＵＣＨＳＮＰ−５およびＵＣＨＳＮＰ−６のＤＨは、それぞれ５．２ｎｍ、７．５ｎｍおよび１３．６ｎｍである。
【０１７２】
これらの溶液を、ＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡの理論濃度が２００ｍＭに達する適切な体積まで、Ｖｉｖａｓｐｉｎ（ＭＷＣＯ＝３ｋＤａ）によって濃縮した。次に、水溶液のｐＨを２に調節して、新たに形成されたナノ粒子の表面上のアミンとの静電相互作用から未反応のＤＯＴＡＧＡおよびＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡを解放させた。洗浄溶媒として塩酸１０−２Ｍを使用して、６４の精製速度のＶｉｖａｓｐｉｎにより、溶液をこのｐＨで精製した。２９５ｎｍでの紫外線吸収による分析のためにＨＰＬＣに注入する直前に、それぞれの精製液の少量の試料を１０−２ＭのＨＣｌで４０倍に希釈した。配合物中に添加されるＴＥＯＳが多いほど、ナノ粒子の保持時間は遅くなる。より高いｔＲが、通常は、より大きいナノ粒子を意味するので、これは、ナノ粒子の大きさがＴＥＯＳの量に依存することを間接的に示している。データを表８にまとめた。
【０１７３】
【表８】
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【０１７４】
精製後、水溶液を０．２μｍの膜を通して濾過し、ダストおよび他の大きな粒子を除去した後、長期間保存のために凍結乾燥した。
【０１７５】
少量の４つのサンプルを１００ｇ／Ｌの水中に再分散させた。凍結乾燥前に溶液のｐＨを調整しなかったので、再分散後、それらのｐＨは約２のままであった。ＵＣＨＳＮＰ−６の粉末は、このｐＨでは水中に再び分散することができなかった。これらの母液を１０−２ＭのＨＣｌで１０ｇ／Ｌに迅速に希釈した後、ＤＬＳ中で測定した。
【０１７６】
別の一連のサンプルを１５０ｇ／Ｌで再分散させた。ＮａＯＨ溶液を添加してサンプルをｐＨ７に中和した。この状態では、ＵＣＨＳＮＰ−６を再分散させることが可能であった。試料に応じて、約８０ｇ／Ｌ〜１００ｇ／Ｌの最終濃度を得るために、水を添加したか、または添加しなかった。同様に、これらの母液を、ＤＬＳ中で測定する前に、水で１０ｇ／Ｌに迅速に希釈した。
【０１７７】
図１９−Ｂは、ｐＨ２における３つのサンプル、ＵＣＨＳＮＰ−３、ＵＣＨＳＮＰ−４およびＵＣＨＳＮＰ−５の流体力学的な直径分布を示す。一方、図１９Ｃは、ｐＨ７で得られた４つのサンプルについての結果を示す。同時に、それらは、ＴＥＯＳが配合物中で増加した一方で、ＮＰサイズが増加することを明確に示す。データを表９にまとめる。
【０１７８】
【表９】
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【０１７９】
ＵＣＨＳＮＰ−６がｐＨ２で再分散できなかったという事実は、より大きなサイズ、より高いＴＥＯＳ比率、およびその周囲のＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡおよびＡＰＴＥＳの保護層のより低い密度によって説明される、そのより低いコロイド安定性に起因し得る。このｐＨでは、ＤＯＴＡＧＡの４個のカルボキシル基がプロトン化されたことに言及する価値がある。したがって、粒子間の反発はＡＰＴＥＳのアミノ基の正電荷のみに依存するが、これは非常に短く、ＤＯＴＡＧＡの妨害作用である。これは、ｐＨ７において、ＵＣＨＳＮＰ−６がなぜ問題なく再分散され得るかを説明する。この場合、ＤＯＴＡＧＡの２つのカルボキシル基が脱プロトン化され、総反発力を増加させる。ｐＨ７での結果は精製前の値と非常に類似しており（図１９Ａ）、これは、ほとんどの粒子が手順の間、無傷のままであることを意味する。ｐＨ７での直径は、ｐＨ２での直径よりもわずかに大きかった。おそらく、これは各粒子上の脱プロトン化ＤＯＴＡＧＡ間の反発によるものであり、これはそれらをより広げたものにする。要するに、この結果は、シロキサンネットワーク生成剤、ＴＥＯＳ、およびオルガノシラン、ＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡおよびＡＰＴＥＳの比率を変化させることによって、ＮＰのサイズを制御することができることを示す。この例では、比率ＴＥＯＳ：（ＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡ＋ＡＰＴＥＳ）１：１で、ナノ粒子サイズは、迅速な腎クリアランスの推奨限界である６ｎｍを超える。比率１．５：１では、そのサイズは１０ｎｍを超え、より具体的には１４ｎｍに達する。
【０１８０】
各試料のＤＯＴＡＧＡ含有量は、図２０に示すようにＥｕ滴定により測定した。ＴＥＯＳが予想通りに配合物中で増加したときに、ＤＯＴＡＧＡ含有量の低下が明らかに見られた。興味深いことに、加えたＴＥＯＳが多ければ多いほど、最終的なＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡの収率はより高くなる。おそらく、ケイ酸とオルガノシラノールとの間のシロキサン結合は、オルガノシラノール自体の間のシロキサン結合よりも強い。さらに、アミノシラン、特にＡＰＴＥＳのような短い炭素鎖を有するアミノシランは、非常に低い加水分解安定性を有することが知られている。
【０１８１】
ナノ粒子ＵＣＨＳＮＰ−３、ＵＣＨＳＮＰ−４、ＵＣＨＳＮＰ−５およびＵＣＨＳＮＰ−６も緩和時間測定法および元素分析により特徴付けた。表１０は、ＵＣＨＳＮＰ−３、ＵＣＨＳＮＰ−４、ＵＣＨＳＮＰ−５およびＵＣＨＳＮＰ−６の特性および特徴をまとめる。
【０１８２】
【表１０】
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【０１８３】
〔実施例４：ジエチレングリコール（ＵＣＨＳＮＰ−７）中のＵＣＨＳＮＰの１ポット中規模合成およびジエチレングリコールの異なる金属の錯化〕
６．１８７ｍｌのＡＰＴＥＳ（２６．１７ｍｍｏｌ）を、９０ｍｌのジエチレングリコール（ＤＥＧ）を含有する２００ｍｌのガラス瓶に添加した。水溶液を室温で１時間撹拌した後、１０ｇのＤＯＴＡＧＡ無水物（１７．４５ミリモル）を添加した。混合物を室温で６日間撹拌し、反応を完了させた。生成物は微細な懸濁液であった。少量の試料を採取し、水中で１０倍に希釈して、ＤＬＳ中のＤＨを測定した。
【０１８４】
７．９５２ｍｌのＴＥＯＳ（３４．９０ｍｍｏｌ）を懸濁液に添加した。この混合物を１時間撹拌した。少量の試料を採取し、水中で１０倍に希釈して、ＤＬＳ中のＤＨを測定した。次いで、９００ｍｌの超純水を添加した。溶媒中のＤＥＧの最終パーセンテージは、次の工程で使用されるタンジェンシャル濾過膜を溶解しないように１０％未満であるべきである。混合物を５０℃に加熱し、１８時間攪拌し続け、ＴＥＯＳの完全な加水分解を可能にした。少量のサンプルを採取して、ＤＬＳおよびＨＰＬＣによって、それぞれ、新しく形成された粒子の流体力学的サイズおよびクロマトグラムを分析した。
【０１８５】
溶液をＶｉｖａｆｌｏｗカセット（ＭＷＣＯ＝５ｋＤａ）により２００ｍｌに濃縮した。次いで、溶液のｐＨを２に調整して、未反応のＤＯＴＡＧＡおよびＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡと新たに形成されたナノ粒子の表面上のアミンとの間のイオン相互作用を切断した。溶液を、洗浄溶媒としての水（２００ｍｌ−１Ｌ〜２００ｍｌ−１Ｌ−１００ｍｌ）を用いて、５０の精製速度のＶｉｖａｆｌｏｗによってこのｐＨで精製した。精製後、１ＭのＮａＯＨ水溶液を滴下することによって水溶液をｐＨ７．４に中和し、０．２μｍ膜を通して濾過して、ダストおよび他の大きな粒子を除去した後、長期間保存のために凍結乾燥した。精製溶液の少量のサンプルを、ＤＬＳによって分析する直前に水中で１０倍に希釈するか、または２９５ｎｍでの紫外線吸収を使用するＨＰＬＣによって分析する前に０．１％のＴＦＡ水溶液中で１０倍に希釈した。
【０１８６】
図２１Ａは、合成中の異なる工程におけるＤＬＳの図を示す：ＤＥＧ中のＡＰＴＥＳおよびＤＯＴＡＧＡ無水物の混合物（点線、正方形）、ＴＥＯＳを添加した後の同混合物（点線、上向き三角形）、水中で希釈し、一晩加熱した後の前記混合物（点線、下向き三角形）、０．２μｍ膜を通して濾過した後の同混合物（実線、円）。図２１Ｂは、Ｖｉｖａｆｌｏｗによって精製した後の粒子のＤＬＳの図を示す。ＤＥＧ中のサンプルを最初に水中で１０倍希釈し、濾過して、最初の懸濁液の代わりに均一な溶液を得た。表１１にまとめられるように、ＵＣＨＳＮＰ−７のＤＨは、合成過程の間に変化した。テオスを添加する前に、粒子が生成されなかったことは、２つの第１のサンプルのＤＨの小さな値（０．９ｎｍおよび１．１ｎｍ）によって示される。ＴＥＯＳを導入し、加水分解した後、他のオルガノシラン、すなわちＡＰＴＥＳおよびＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡをより安定に移植することができる超小型コアを作製し始めた。最終粒子は、約４ナノメートルのＤＨを有する。
【０１８７】
【表１１】
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【０１８８】
精製後、粒子はほぼ同じｔＲおよびわずかに低いピーク幅を有し、これは、物理的に吸収されたシランを取り除くことによって簡単に説明することができる。純度は、９８％に達した。また、精製後の粒子のピーク面積と、精製前の粒子および反応物の総ピーク面積との比率から、反応の収率および精製の収率を大まかに推定することができ、約４０％を与えた。より定量的な洞察のために、データを表１２にまとめた。
【０１８９】
【表１２】
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【０１９０】
ＵＣＨＳＮＰ−７のＤＯＴＡＧＡ含有量は、図２２に示すように、Ｅｕ滴定によって測定され、その結果（〜０．８μｍｏｌ／ｍｇ）は、先の実施例において同様のＤＨを有する粒子において見出された結果と一致した。この結果を製造された粒子の総重量（５．３８８ｇ）と組み合わせると、ＤＯＴＡＧＡの導入された量と比較して約２４．７％であるプロセスの収率を見出すことができる。ナノ粒子ＵＣＨＳＮＰ−７はまた、ＮＭＲ、ゼータ電位差測定法、緩和時間測定法および元素分析によって特徴付けられた。表１３は、ＵＣＨＳＮＰ−７の特性および特徴をまとめ、表１４は、異なるｐＨでのＵＣＨＳＮＰ−７のゼータ電位を示す。ＵＣＨＳＮＰ−７の異なるｐＨでのゼータ電位の完全な曲線を図２４Ａに示す。
【０１９１】
【表１３】
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【０１９２】
【表１４】
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【０１９３】
異なる金属（Ｇｄ、Ｈｏ、ＴｂおよびＢｉ）とのＵＣＨＳＮＰ−７の錯化
２２７μｍｏｌのＤＯＴＡＧＡを含有するＵＣＨＳＮＰ−７の凍結乾燥粉末２８３ｍｇを、約２００ｍＭの濃度のＤＯＴＡＧＡを有するように水中に再分散させた。適切な濃度のＮａＯＨ溶液を添加することによって、溶液のｐＨを５．５に調整した。溶液を７０℃にて加熱板上で加熱および撹拌して錯化を促進しながら、２．１８８ＭのＧｄＣｌ３溶液（モル比ＤＯＴＡＧＡ：Ｇｄ＝１：０．９５）９８．５μＬを３回ゆっくり添加した。各時間の間に、ＮａＯＨ溶液をゆっくり添加することによってｐＨを注意深く５〜５．５に上昇させた後、次の溶液を添加した。３回の添加後、水を添加して、１００ｍＭの濃度のＤＯＴＡＧＡおよび約５〜５．５のｐＨを得た。この水溶液を８０℃にてオイルバス中で１８時間撹拌した。インキュベーション後、ｐＨを約５．５に維持した。この水溶液を、１６の精製速度でのタンジェンシャル濾過（ＭＷＣＯ＝３ｋＤａ）により、溶媒としての水で精製して、遊離Ｇｄ３＋を除去した。最後に、数滴のＮａＯＨ溶液を添加することによって溶液をｐＨ７に中和し、０．２μｍの膜を通して濾過して、ダストおよび他の大きな粒子を除去した後、長期間保存のために凍結乾燥した。ＤＬＳによって分析する直前に、精製溶液の少量のサンプルを水中で１０倍に希釈した。
【０１９４】
代わりに、５００ｍＭのＨｏＣｌ３水溶液または５００ｍＭのＴｂＣｌ３水溶液を、４３１μＬ使用して、同様のプロトコルを適用した。
【０１９５】
Ｂｉ粒子については、水酸化ビスマスの溶解度が非常に限られているため、６Ｍ塩酸中の２５０ｍＭのＢｉＣｌ３水溶液を８１７μｌ使用した。ナノ粒子溶液を７０℃で加熱した後、Ｂｉ３＋の溶解度および錯化の速さを増大させるために、追加を行わなければならなかった。この条件を維持できないと、水酸化ビスマス沈殿物の形成が誘発される可能性がある。溶液をｐＨ５〜５．５に中和するために、１０ＭのＮａＯＨ溶液が必要であり、溶液を、それぞれの添加工程の間に、８０℃のオイルバス中で１時間加熱した。残りのプロトコルは同様であった。
【０１９６】
図２３は、ＵＣＨＳＮＰ−７＠Ｍ（Ｍ：Ｇｄ、Ｔｂ、ＨｏまたはＢｉ）のＤＬＳの図を示す。結果を表１５に定量的に示した。４つの粒子の全ては、約６ｎｍの流体力学的直径を有する。結果は実施例１によるものであり、ここで、ＵＣＨＳＮＰ＠Ｇｄ−１はまた、約６ナノメートルのＤＨを有していた。
【０１９７】
【表１５】
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【０１９８】
精製したＢｉ粒子（ＵＣＨＳＮＰ−７＠Ｂｉ）溶液を０．１％ＴＦＡ水溶液で１５倍希釈した後、ＨＰＬＣ（方法１）で分析した。
【０１９９】
ナノ粒子のピークは、ｔＲ＝１５．７分で見出され、これはＵＣＨＳＮＰ＠Ｇｄ−１に非常に類似している。ピークの形状はまた、錯化後に均一な分布を示す。粒子の純度は非常に高かった（９７．４％）。このクロマトグラムをＵＣＨＳＮＰ−７と同じ高さに正規化し、保持時間（ｔＲ）とピーク幅（ＦＷＨＭ）とを比較した。複合粒子の２つの値は、両方とも空の粒子の値よりも高かった。結果を表１６にまとめた。
【０２００】
【表１６】
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【０２０１】
ナノ粒子ＵＣＨＳＮＰ−７＠Ｇｄ、ＵＣＨＳＮＰ−７＠Ｔｂ、ＵＣＨＳＮＰ−７＠ＨｏおよびＵＣＨＳＮＰ−７＠Ｂｉはまた、ゼータ電位差測定、緩和時間測定法、ＩＣＰ−ＥＯＳ、ＵＶ−可視分光法および赤外分光法によって特徴付けられた。表１７は、ＵＣＨＳＮＰ−７の特性および特徴をまとめる。ｐＨ６．６におけるナノ粒子のゼータ電位を図２４Ｂに示す。ナノ粒子のＵＶ−可視スペクトルを図２５に示す。ＵＣＨＳＮＰ−７＠Ｂの試料は３０９ｎｍに強いピークを示し、これはＤＯＴＡ（Ｂｉ３＋）錯体に典型的である。ＵＣＨＳＮＰ−７＠ＨｏのＵＶ−可視スペクトルは、Ｈｏ３＋のいくつかの吸光ピークを示す。ＩＲスペクトルを図２６に示し、金属の存在を確認した。
【０２０２】
【表１７】
2020527538.tif 000021
【０２０３】
〔実施例５：Ｉｎ  ｖｉｖｏ磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）実験〕
３匹のＢＡＬＢ／ｃマウスに、両側腹に結腸癌腫（ＣＴ２６）細胞を皮下接種した。
【０２０４】
ＵＣＨＳＮＰ＠Ｇｄ−２凍結乾燥粉末を１００ｍＭ（Ｇｄにおける）で生理学的血清中に分散させた。この濃縮溶液を血清中で２０ｍＭに希釈した後、１ｋｇ当たり２００μｍｏｌ（Ｇｄにおける）の投与でマウスに静脈内注射した。
【０２０５】
画像は、１Ｈ  ４０ｍｍコイル、Ｐａｒａｖｉｓｉｏｎ５．１１ソフトウェア（Ｂｒｕｋｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を有する７Ｔ  ＭＲＩシステム３００ＷＢマイクロイメージング分光計を使用して、注射前（造影前）および注射後（造影後）に取得した。イソフルラン濃度（１．５％）を調整することによって呼吸速度を連続的にモニターし、ＴＲ＝１００ミリ秒、ＴＥ＝４ミリ秒、フリップ角＝８０°のモーションフリーアーチファクトについて、イントラゲート・フラッシュ・マルチスライスを用いてダイナミック造影（ＤＣＥ）シーケンスを記録した。繰り返し回数は１５回とし、再構成する時間フレーム数は１回とした。３ｃｍ×３ｃｍの視野（ＦＯＶ）および２５６×２５６のマトリックス、１ｍｍの厚さを有する４枚のスライスを選択し、平面内で１１７μｍ×１１７μｍの空間分解能を与えた。総走査時間は、３分１４秒のオーダーであった。最後に、イントラゲート・フラッシュ・マルチスライス・シーケンスの伸長バージョンをダイナミックフォローアップに使用して、４０分間の走査時間で同じ時間分解能を得るために、造影の３〜６時間後に、２〜３分の走査をフォローアップとして行った。
【０２０６】
腫瘍および肝臓におけるいくつかの関心領域（ＲＯＩ）をモニターし、ＲＯＩのＭＲＩ強度を粒子の注射前および注射後にプロットした。各組織領域における信号の組織増強レベルを（Ｓｔ−Ｓ０）／Ｓ０として計算した（ここで、Ｓｔは注射後の各時点で測定した信号強度であり、Ｓ０は注射前の信号強度であった。）。
【０２０７】
図２７Ａは、予想通りに腫瘍領域が強調されているＭＲＩ断面を示す。造影前画像と造影後画像の比較は、粒子によって引き起こされる腫瘍領域でのより高い輝度を明確に示す。コントラスト増強は、造影前画像と比較した増強の割合として表した。腫瘍組織では、ＵＣＨＳＮＰ＠Ｇｄ−２は注射３０分後に最大増強（シグナル増加の３５％）を伴う摂取位相および３時間の半減期を伴う延長したクリアランス位相を示し、ＥＰＲ（増強された透過性および保持）効果を実証した（図２７Ｂ参照のこと）。肝臓において、増強のピーク（信号の９０％増加）が、粒子の注射後６分で観察され、続いてクリアランス位相が観察された（図２７Ｃを参照のこと）。注射４０分後に、シグナルは最大強度の半分であり、約３０分の肝臓半減期を示した。肝臓の血管網を介した相補的な一過性の可視化を伴う血流循環の後、超小型ナノ粒子で先に示されたように、粒子は腎臓の皮質から膀胱に排泄された。
【０２０８】
この撮像研究は、ＵＣＨＳＮＰ＠Ｇｄ−２が高分子薬剤について観察される典型的な肝臓への蓄積なしに、全観察期間にわたって腫瘍および肝臓組織の両方においてコントラスト増強を示すことを証明する。従って、それらは、望ましくない肝臓の取込みを伴わずに、撮像特性を改善する。一方、腫瘍における比較的長い保持時間は、腫瘍組織へのベクトル化の展望を開く。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2020527538.tif 000034
【図１２Ａ）】
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【図１２Ｂ）】
2020527538.tif 000036
【図１２Ｃ）】
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【図１２Ｄ）】
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【図１２Ｅ）】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【国際調査報告】
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2020527538.tif 000056
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