(57)【要約】  消化管シミュレーションシステムおよびそのための区画。区画は、周縁部によって囲まれた開口上部を有する容器と、周縁部上に配置されるように構成された気密蓋システムとを備える。蓋システムは、本体を通って延出し、かつ容器の内部へのアクセスを提供する複数の通路を有する本体を備え、複数の通路は、流体移送管用の通路と少なくとも１つのセンサ構成要素を取り付けるための通路とを備える。蓋システムには、複数の通路を封止するための解除可能な封止要素と、少なくともいくつかの封止要素に共通であり、各封止要素のそれぞれに圧力を加えてそれぞれの通路の封止を達成するように構成されている少なくとも１つの押圧要素とが設けられている。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
周縁部によって囲まれた開口上部を有する容器と、前記周縁部上に配置され、蓋システムと前記容器との間に気密封止を形成するように構成された気密蓋システムとを備える、消化管シミュレーションシステムの区画であって、前記蓋システムは、本体を通って延出し、かつ前記容器の内部へのアクセスを提供する複数の通路を有する本体を備え、前記複数の通路は、流体移送管を受け入れるように構成された第１の通路と、少なくとも１つのセンサ構成要素を取り付けるように構成された第２の通路とを備え、また前記蓋システムには、前記複数の通路を封止するための解除可能な封止要素と、少なくともいくつかの封止要素に共通であり、各封止要素のそれぞれに圧力を加えてそれぞれの通路の封止を達成するように構成された少なくとも１つの押圧要素とが設けられている、区画。
【請求項２】
前記解除可能な封止要素は、それぞれの通路に挿入されるそれぞれの管またはセンサ構成要素の上または周囲に圧縮されるように設けられた封止材料の封止部材と、前記圧縮のために前記封止部材に作用するばね部材とを各々備える、請求項１に記載の区画。
【請求項３】
前記押圧要素は板状部材を備え、前記板状部材は、前記通路の封止を達成するために前記板状部材が前記封止要素に圧力を加える押圧位置と、前記封止要素が解除状態にある解除位置との間で前記蓋システムの本体に移動可能に固定されている、請求項１または２に記載の区画。
【請求項４】
前記板状部材は、１つ以上のねじをねじ込むことにより、前記解除位置から前記押圧位置まで移動可能である、請求項３に記載の区画。
【請求項５】
前記板状部材が、ねじを固定するための空間を残す切り欠きを備え、それによって前記蓋システムの本体と前記容器とが互いに封止される、請求項３または４に記載の区画。
【請求項６】
前記気密蓋システムの本体は内部空洞を有する中空であり、前記解除可能な封止要素は前記空洞を囲む中空体内に配置され、前記空洞内には保持要素が設けられ、前記保持要素は前記管および前記センサ構成要素のための第１および第２の通路を含有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の区画。
【請求項７】
前記保持要素が３Ｄ印刷部品である、請求項６に記載の区画。
【請求項８】
前記蓋システムを通って前記容器内に垂直に延出するセンサプローブを備える、請求項１〜７のいずれか一項に記載の区画。
【請求項９】
前記通路は、前記蓋システムを通って垂直に延出する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の区画。
【請求項１０】
前記通路は、前記センサプローブの周りで半径方向に離間している、請求項７および８に記載の区画。
【請求項１１】
前記本体および前記押圧要素は、回転対称部品である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の区画。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の少なくとも１つの区画を備え、流体移送管が、それぞれの第１の通路と第２の通路の中または上に取り付けられたセンサ構成要素とを通って延出する、消化管シミュレーションシステム。
【請求項１３】
流体を前記区画へおよび前記区画から移送するための流体移送システムをさらに備え、前記流体移送システムは、流体を前記流体移送管を介して前記区画へおよび前記区画から圧送するための複数シリンジポンプと、ピンチ弁を有するピンチ弁システムとを備え、各ピンチ弁は、前記液体移送管の１つを開閉するように構成され、前記ピンチ弁システムは、各ピンチ弁に１つの複数のカムディスクと、前記カムディスクの回転を同期駆動する共通のスピンドルとを備える、請求項１２に記載の消化管シミュレーションシステム。
【請求項１４】
前記カムディスクは前記共通のスピンドルに組み付けられ、前記共通のスピンドルは回転ロック形状を有し、前記カムディスクは前記回転ロック形状に対応する中央開口部を有する、請求項１３に記載の消化管シミュレーションシステム。
【請求項１５】
前記ピンチ弁は、前記カムディスク上のカムによって作動するばね式フィンガを備える、請求項１３または１４に記載の消化管シミュレーションシステム。
【請求項１６】
前記消化管シミュレーションシステムは、少なくとも１つの区画の少なくとも１つの容器が配置される水浴と、少なくとも１つの容器の内容物を撹拌するための少なくとも１つの磁気撹拌システムとをさらに備え、各磁気撹拌システムは、それぞれの容器および水浴の下に取り付けられ、かつ回転磁場を生成するように設けられた磁気駆動装置と、それぞれの容器の下の水浴内に配置され、前記回転磁場によって回転し、回転磁場を増幅するように設けられた永久磁石と、前記増幅された磁場によって回転するように設けられたそれぞれの容器の底部にある第１の撹拌要素とを備える、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の消化管シミュレーションシステム。
【請求項１７】
それぞれの区画の容器は外側容器であり、前記区画は、前記外側容器の内側に取り付けられた内側容器と、前記内側容器の底部にあり、増幅された磁場によって回転されるように設けられている第２の撹拌要素とをさらに備える、請求項１６に記載の消化管シミュレーションシステム。
【請求項１８】
前記第１および／または第２の撹拌要素が永久磁石である、請求項１６または１７に記載の消化管シミュレーションシステム。
【請求項１９】
前記永久磁石および／または撹拌要素のうちの少なくとも１つが概ね三角柱形状である、請求項１６、１７または１８に記載の消化管シミュレーションシステム。
【請求項２０】
少なくとも１つの区画が、外側容器と、前記外側容器の内側に取り付けられた内側容器とを有し、前記内側容器は少なくとも一部が透析膜によって形成された壁を有する、請求項１２〜１９のいずれか一項に記載の消化管シミュレーションシステム。
【請求項２１】
前記内側容器壁は円筒形のグリッド構造を備え、前記透析膜は前記円筒形のグリッド構造の周囲に取り付けられている、請求項２０に記載の消化管シミュレーションシステム。
【請求項２２】
ヒトおよび動物の腸壁に付着して成長する可能性のある微生物種の定着を支持できる粘膜区画をシミュレートするために、少なくとも１つの区画は、腸壁の内側を覆う粘液層を代表するムチンで覆われた担体を含有する、請求項１２〜２１のいずれか一項に記載の消化管シミュレーションシステム。
【請求項２３】
少なくとも１つの区画の蓋システムには前記容器内の高すぎる液位を検出するための高液位検出手段が設けられており、前記高液位検出手段は、前記蓋システムを通るガス入口管およびガス出口管と、前記ガス入口管およびガス出口管を通り、前記容器のヘッドスペースを経由するガス流を確立する手段とを備え、前記ガス入口管およびガス出口管の少なくとも１つの口部にはフロータが取り付けられており、前記フロータは、前記液体の液位が高くなりすぎると、前記フロータが前記ガス流の障害物を形成しない自由な流れ位置から、前記フロータがガス流の障害物を形成する妨害位置まで、前記容器内の液体に浮かぶことによって上昇するように適合されている、請求項１２〜２２のいずれか一項に記載の消化管シミュレーションシステム。
【請求項２４】
請求項１２〜２３のいずれか一項で定義された消化管シミュレーションシステムの空の区画を消化管の生理学的流体をシミュレートする流体で満たすステップと、事前に決定された値、範囲または軌道に各々応じて液体流、温度、ｐＨ、イオン強度、ヘッドスペース、撹拌、圧力、液体量のパラメータの１つ以上またはすべてを各区画で制御するように前記消化管シミュレーションシステムを動作させるステップとを含む、ヒトまたは動物の消化管の機能をシミュレートする方法。
【請求項２５】
前記空の区画にＨ２Ｏ２ガスを導入することにより、および／または前記区画の内部温度を３０分の範囲内の期間に４０〜１２１℃（１５ｐｓｉ）の範囲内の値に上げることにより、前記消化管シミュレーションシステムの内部を滅菌する第１のステップを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記消化管シミュレーションシステムが所定の速度で栄養培地を第１のリザーバから第１の区画へ（５〜５０ｍｌ）、シミュレートした胃液を第２のリザーバから第１の区画へ（０〜１０ｍｌ）、膵液を第３のリザーバから第３の区画へ（０〜２０ｍｌ）、および各区画の内容物を要求された保持時間に従って連続した区画へ移送するように動作する、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記消化管シミュレーションシステムの区画に試験試料を導入するステップを含み、前記試験試料が微生物試料、薬理活性剤、医薬製剤、ミネラル、食品、飼料化合物および食物繊維からなる群より選択される、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記消化管シミュレーションシステムの複数が同時にかつ同一に動作し、前記消化管シミュレーションシステムの１つ以上が試験試料を含有し、前記消化管シミュレーションシステムの１つ以上が試験試料を含有しない、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、消化管シミュレーションシステム、そのようなシステム用の区画、およびそのようなシステムを動作させる方法に関する。消化管シミュレーションシステムは、単胃動物（ヒトを含む）のシミュレータであり得る。
【背景技術】
【０００２】
従来のＳＨＩＭＥは、胃、小腸、上行結腸、横行結腸、下行結腸をそれぞれシミュレートする５区画で構成されるヒト腸の動的モデルである。胃と小腸の区画は、ｐＨ、滞留時間、ならびに適切な栄養培地、酵素および胆汁酸塩の投与を制御することにより、酵素環境および物理化学的環境を模倣する。
【０００３】
ｐＨ、酸化還元電位および滞留時間を制御することにより、異なる結腸区画は、代謝活性と群落構成の点で生体内の状況における微生物群に対応する微生物群を各々保有する。このモデルでは、２週間の典型的な安定化期間と２週間の基礎期間の後に、治療期間とウォッシュアウト期間が続く。
【０００４】
消化管の動作をシミュレートするために、区画には様々な流体を追加する必要がある。さらに、１つの区画から別の区画に内容物を移送するために管が必要であり、センサを取り付けるために開口部が必要である。その結果、区画の気密封止は面倒である。
【０００５】
米国特許第４，４５７，３３９号からは、医療分野および生物学分野で試験を実施するための自動分析装置内でａ．ｏ（空気圧補助）で使用できるピンチ弁モジュールが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第４４５７３３９号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、気密封止を容易にすることができる消化管シミュレーションシステムの区画を提供することである。
【０００８】
本発明の別の目的は、消化管シミュレーションシステムの区画へおよび区画から流体を移送するための改良された流体移送システムを提供することである。
【０００９】
本発明の別の目的は、消化管シミュレーションシステムの区画の内容物を撹拌するための改良された撹拌システムを提供することである。
【００１０】
本発明の別の目的は、ヒトまたは動物の消化管の機能をシミュレートする方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の第１の態様は、周縁部によって囲まれた開口上部を有する容器と、周縁部上に配置され、蓋システムと容器との間に気密封止を形成するように構成された気密蓋システムとを備える消化管シミュレーションシステムの区画を提供し、ここで、蓋システムは、本体を通って延出し、かつ容器の内部へのアクセスを提供する複数の通路を有する本体を備え、この複数の通路は、流体移送管を受け入れるように構成された第１の通路と、少なくとも１つのセンサ構成要素を取り付けるように構成された第２の通路とを備え、また蓋システムには、複数の通路を封止するための解除可能な封止要素と、少なくともいくつかの封止要素に共通であり、各封止要素のそれぞれに圧力を加えてそれぞれの通路の封止を達成するように構成された少なくとも１つの押圧要素とが設けられている。
【００１２】
解除可能な封止要素を共通の押圧要素と組み合わせて提供することにより、区画の気密封止を容易および／または単純にすることができる。封止要素による通路の封止を達成または解除するためには押圧要素を操作するだけでよい。この構造のさらなる利点は、消化管シミュレーションシステムの区画を小型化できることである。
【００１３】
本発明による実施形態では、解除可能な封止要素は、それぞれの通路に挿入されるそれぞれの管またはセンサ構成要素の上または周囲に圧縮されるように設けられた封止材料の封止部材と、圧縮のために封止部材に作用する例えばコイルばねなどのばね部材とを各々備えることができる。これにより、封止要素の構造が単純になる。この実施形態は、解除可能な封止要素のための単純な構造を提供し得る。
【００１４】
本発明による実施形態では、押圧要素は板状部材を備えることができ、板状部材は、通路の封止を達成するために板状部材が封止要素に圧力を加える押圧位置と、封止要素が解除状態にある解除位置との間で蓋システムの本体に移動可能に固定されている。可動固定は、例えば１つ以上のねじによって実行されてもよく、板状部材は、１つ以上のねじをねじ込むことによって解除位置から押圧位置まで移動可能であり、その逆も可能である。この実施形態は、押圧部材の単純な構造を提供し得る。
【００１５】
本発明による実施形態では、気密蓋システムの本体は、内部空洞を有する中空であり得、解除可能な封止要素は空洞を囲む中空体に配置され、空洞内には保持要素が設けられてもよく、保持要素は、管およびセンサ構成要素のための第１および第２の通路を含有する。この実施形態は、蓋システムを通して提供する必要がある管およびセンサ構成要素の数およびサイズのような状況に蓋システムが容易に適応可能であるという利点を有する。この方法では、消化管シミュレーションシステムの異なる区画ごとに異なる保持要素を提供すれば十分であり、各区画用に完全な蓋システムを設計する必要を回避できる。さらに、この保持要素は、蓋システムの外側部分とは別に設計することができ、したがって、管を入口地点から蓋システム内へ、出口地点へ、そして容器の内部へ、例えば管のために緩やかな曲線を描く通路で誘導するように最適化することができる。この構造のさらなる利点は、消化管シミュレーションシステムの区画を小型化できることである。保持要素は、例えば３Ｄ印刷部品であってもよい。
【００１６】
本発明による実施形態では、押圧要素または板状部材は、切り欠きを備え、すなわち切り欠きのある形状を有してもよく、例えば、ねじを固定するための空間を残し、ねじを固定することによって蓋システムの本体および容器が互いに封止される。
【００１７】
本発明による実施形態では、区画は、蓋システムを通って容器内に垂直に延出するセンサプローブを備えていてもよく、「垂直に」とは容器の高さ軸に平行な方向を意味する。同様に、通路は蓋システムを通って垂直に延出してもよい。さらに、通路は、センサプローブの周りで半径方向に離間していてもよい。この構成により、プローブと通路が占有する、またはプローブと通路が必要とする全体のスペースを削減でき、コンパクトな蓋システムを実現できる。
【００１８】
センサプローブ、通路、および／または板状部材を本体に固定するおよび／または本体を容器に封止するためのねじ用の穴が開いた構造は、好ましくはすべて互いに平行に、好ましくは垂直に延出し、蓋システムの本体の製造を容易または単純化して、製造の複雑さおよび／またはコストを削減することができるという利点がある。本体は、例えば、プラスチック材料の本体から製造されてもよく、様々な穴が同じ方向から本体に開けられる。
【００１９】
本発明による実施形態では、本体および押圧要素または板状部材は、回転対称部品であってもよい。これにより、製造の複雑さがさらに軽減される。
【００２０】
本発明の第２の態様は、本明細書に記載の本発明の他の態様および実施形態と組み合わせて生じてもよく、少なくとも１つの区画を備える消化管シミュレーションシステムを提供し、各区画は、周縁部によって囲まれた開口上部を有する容器と、周縁部上に配置され、蓋システムと容器との間に気密封止を形成するように構成された気密蓋システムとを備え、ここで、蓋システムは、本体を通って延出し、かつ容器の内部へのアクセスを提供する複数の通路を有する本体を備え、この複数の通路は、流体移送管を受け入れるように構成された第１の通路と、少なくとも１つのセンサ構成要素を装着するように構成された第２の通路と、それぞれの第１の通路を通って延出する流体移送管と、第２の通路の中または上に取り付けられたセンサ構成要素とを備える。消化管シミュレーションシステムは、流体を区画へおよび区画から移送するための流体移送システムをさらに備え、この流体移送システムは、流体を流体移送管を介して区画へおよび区画から圧送するための複数のポンプ、好ましくはシリンジポンプと、ピンチ弁を有するピンチ弁システムとを備え、各ピンチ弁は、液体移送管の１つを開閉するように構成され、ここで、ピンチ弁システムは、各ピンチ弁に１つの複数のカムディスクと、カムディスクの回転を同期駆動する共通のスピンドルとを備える。
【００２１】
共通の駆動スピンドルと組み合わせて各ピンチ弁に個別のカムディスクを提供することにより、ピンチ弁の動作シーケンスの設定または「プログラミング」を単純化でき、例えばピンチ弁の開閉を所望に制御するための所望の突起またはカムを備えた、各ピンチ弁用に適切な形状のカムディスクを提供するだけでよい。例えばステッピングモータによって駆動される共通の駆動スピンドルは、個々のカムディスクの同期回転を保証できる。１つのピンチ弁の動作を変更するには、それぞれのカムディスクを取り出して別のカムディスクと交換するだけでよい。
【００２２】
本発明による実施形態では、カムディスクは共通のスピンドルに組み付けることができ、共通のスピンドルは回転ロック形状を有し、カムディスクはこの回転ロック形状に対応する中央開口部を有する。これにより、ピンチ弁システムの構造は単純化され得る。（他の実施形態では、カムディスクの回転はギアシステムによって駆動されてもよく、および／またはカムディスクは他の方法で互いに回転ロックされてもよい。）
本発明による実施形態では、ピンチ弁は、カムディスク上のカムによって作動されるばね式フィンガを備えていてもよい。他の実施形態では、ピンチ弁は、カムディスク自体のカムによって形成されてもよい。
【００２３】
本発明の第３の態様は、本明細書に記載の本発明の他の態様および実施形態と組み合わせて生じてもよく、少なくとも１つの区画を備える消化管シミュレーションシステムを提供し、各区画は、周縁部によって囲まれた開口上部を有する容器と、周縁部上に配置され、蓋システムと容器との間に気密封止を形成するように構成された気密蓋システムとを備え、ここで、消化管シミュレーションシステムは、少なくとも１つの区画の少なくとも１つの容器が配置される水浴と、少なくとも１つの容器の内容物を撹拌するための少なくとも１つの磁気撹拌システムとをさらに備え、磁気撹拌システムは、それぞれの容器および水浴の下に取り付けられ、かつ回転磁場を生成するように設けられた磁気駆動装置と、それぞれの容器の下の水浴内に配置され、回転磁場によって回転し回転磁場を増幅するように設けられた永久磁石と、増幅された磁場によって回転するように設けられたそれぞれの容器の底部にある第１の撹拌要素とを備える。
【００２４】
この磁気駆動撹拌要素を設けることにより、容器の壁または蓋を通る撹拌要素の機械的結合の必要性を回避することができ、その結果、区画の内部の気密封止をより確実にすることができる。生成された磁場に沿って回転し増幅する永久磁石を水浴内に設けることにより、容器内の撹拌要素の良好な動作を確保できる。さらに、水浴内の永久磁石の回転は、この水浴の内容物も撹拌し、より均一な温度に導くことができる。
【００２５】
好ましい実施形態では、各区画の容器は外側容器であってもよく、区画は、外側容器の内側に取り付けられた内側容器と、内側容器の底部にあり、増幅された磁場によって回転されるようにも設けられている第２の撹拌要素とをさらに備えていてもよい。
【００２６】
好ましい実施形態では、第１および／または第２の撹拌要素は永久磁石であってもよい。
【００２７】
好ましい実施形態では、水浴内の永久磁石、第１の撹拌要素および／または第２の撹拌要素は、概ね三角柱形状であってもよい。
【００２８】
本発明の第４の態様は、本明細書に記載の本発明の他の態様および実施形態と組み合わせて生じてもよく、周縁部によって囲まれた開口上部を有する外側容器と、周縁部上に配置され、蓋システムと容器との間に気密封止を形成するように構成された気密蓋システムとを有する少なくとも１つの区画を備える消化管シミュレーションシステムを提供し、ここで、消化管シミュレーションシステムは、外側容器の内側に取り付けられた内側容器をさらに備え、内側容器は、少なくとも一部が透析膜によって形成されている壁を有する。このように、内側容器を使用して、腸内の消化された小さな化合物の吸着を模倣することができ、膜は血液−腸バリアを模倣する。
【００２９】
好ましい実施形態では、内側容器壁は、透析膜に囲まれた円筒形のグリッド構造を備える。
【００３０】
本発明の第５の態様は、本明細書に記載の本発明の他の態様および実施形態と組み合わせて生じてもよく、ヒトおよび動物の腸壁に付着して成長する可能性のある微生物種の定着を支持できる粘膜区画をシミュレートするために、腸壁の内側を覆う粘液層を代表するムチンで覆われた担体を含有する少なくとも１つの区画を備える消化管シミュレーションシステムを提供する。
【００３１】
本発明の第６の態様は、本明細書に記載の本発明の他の態様および実施形態と組み合わせて生じてもよく、周縁部に囲まれた開口上部を有する容器と、周縁部上に配置され、蓋システムと容器との間に気密封止を形成するように構成された気密蓋システムとを備える消化管シミュレーションシステム用の区画を提供し、蓋システムには、容器内の高すぎる液位を検出するための高液位検出手段が設けられており、高液位検出手段は、蓋システムを通るガス入口管およびガス出口管と、ガス入口管およびガス出口管を通るガス流を確立する手段とを備え、ガス入口管およびガス出口管の少なくとも１つの口部にはフロータが取り付けられており、フロータは、液位が高くなりすぎると、フロータがガス流の障害物を形成しない自由な流れ位置から、フロータがガス流の障害物を形成する妨害位置まで、容器内の液体に浮かぶことによって上昇するように適合されている。
【００３２】
本発明の第７の態様は、本明細書に記載の本発明の他の態様および実施形態と組み合わせて生じてもよく、ヒトまたは動物の消化管の機能をシミュレートする方法を提供し、本明細書で定義される消化管シミュレーションシステムの空の区画を消化管の生理学的流体をシミュレートする流体で満たすステップと、事前に決定された値、範囲または軌道に各々応じて液体流、温度、ｐＨ、イオン強度、ヘッドスペース、撹拌、圧力、液体量のパラメータの１つ以上またはすべてを各区画で制御するように消化管シミュレーションシステムを動作させるステップとを含む。
【００３３】
本明細書に記載の実施形態による消化管シミュレーションシステムを使用することにより、従来のＳＨＩＭＥ装置と比較して１０倍少ない量の試験製品を試験することができる。さらに、本発明は、従来のＳＨＩＭＥ装置の限られたスループット、すなわち２つの完全な腸または４つの限られたセットアップを克服し、例えば６つの完全な腸、３ステップ構成の１２の限られたセットアップを研究することを可能にし、または３０の個々の反応器を実行する可能性を可能にする。
【００３４】
添付の図面を参照して、以下に本発明をより詳細に論じる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】本発明の実施形態による消化管シミュレーションシステムの区画の断面図である。
【図２】解除可能な封止要素を備える図１の区画の一部の断面を示す分解図である。
【図３】本発明の実施形態による消化管シミュレーションシステム用の流体移送システムの概略図である。
【図４】図３の流体移送システム用のピンチ弁システムの斜視図である。
【図５】図４のピンチ弁システムの詳細を示す図である。
【図６】磁気撹拌システムを備える本発明の一実施形態による消化管シミュレーションシステムの断面図である。
【図７】図６の磁気撹拌システムの詳細を示す図である。
【図８】内側容器と外側容器を備える本発明の別の実施形態による消化管シミュレーションシステム用の区画の断面図である。
【図９】本発明の一実施形態による消化管シミュレーションシステムの区画用の高液位検出システムの概略図である。
【図１０】本発明の一実施形態による消化管シミュレーションシステム用の区画の別の実施形態の図である。
【図１１】本発明の一実施形態による消化管シミュレーションシステム用の区画の別の実施形態の図である。
【図１２】本発明の一実施形態による消化管シミュレーションシステム用の区画の別の実施形態の図である。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明を特定の実施形態に関して特定の図面を参照して説明するが、本発明はそれらに限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。記載されている図面は概略図に過ぎず、非限定的である。図面において、例示の目的でいくつかの要素のサイズは誇張されており、縮尺通りに描かれていない場合がある。寸法および相対寸法は、本発明の実施に対する実際の縮小に必ずしも対応するものではない。
【００３７】
さらに、説明および特許請求の範囲における第１、第２、第３などの用語は、類似の要素を区別するために使用され、必ずしも連続的または時間的順序を説明するために使用されるものではない。これらの用語は適切な状況下で交換可能であり、本発明の実施形態は、本明細書で説明または図示された以外のシーケンスで動作することができる。
【００３８】
さらに、説明および特許請求の範囲における上部、底部、上、下などの用語は説明目的で使用されており、必ずしも相対的な位置を説明するために使用されるものではない。そのように使用される用語は、適切な状況下で交換可能であり、本明細書で説明される本発明の実施形態は、本明細書で説明または図示される以外の向きで動作することができる。
【００３９】
さらに、様々な実施形態は、「好ましい」と呼ばれるが、本発明の範囲を限定するものとしてではなく、本発明が実施され得る例示的な方法として解釈されるべきである。
【００４０】
請求項で使用される「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、その後に挙げられる要素またはステップに限定されると解釈されるべきではなく、他の要素やステップを除外するものではない。これは言及された機能、整数、ステップ、または構成要素の存在を特定するものと解釈する必要があるが、１つ以上の他の機能、整数、ステップ、構成要素、またはそれらのグループの存在または追加を排除するものではない。したがって、表現「ＡおよびＢを備えるデバイス」の範囲は、構成要素ＡおよびＢのみからなるデバイスに限定されるべきではなく、むしろ本発明に関して、デバイスの列挙された構成要素のみがＡおよびＢであり、さらに、特許請求の範囲はそれらの構成要素の均等物を含むと解釈されるべきである。
【００４１】
図１〜図２に示す実施形態は、周縁部１０２によって囲まれた開口上部を有する容器１０１と、周縁部に配置され、蓋システムと容器との間に気密封止を形成するように構成された気密蓋システム１１０とを備える消化管シミュレーションシステムの区画１００（反応器とも呼ばれる）を提供する。これは、蓋システム１１０が周縁部１０２に嵌合するように構成され、蓋システムを縁部に固定するステップに続いて気密封止が得られるように構成されていることを意味する。これは多くの方法で達成することができ、例えば１つ以上の封止リング１０３を含み、それ自体は当業者に知られているため本明細書でさらに説明する必要はない。
【００４２】
蓋システムは、本体を通って延出し、かつ容器の内部１０４へのアクセスを提供する複数の通路１１２、１１３を有する本体１１１を備え、複数の通路は、流体移送管１１３を受け入れるように構成された第１の通路１１２と、少なくとも１つのセンサ構成要素１１５（これは管を備えていてもよい）を取り付けるように構成された第２の通路１１４とを備える。これは、第１の通路が、流体移送管（液体および／または気体の移送用）を受け入れるサイズと形状になっており、好ましくは、管の周りにきつく嵌合し、好ましくは閉塞を避けるために緩やかな角を得るように蓋システムへの入口地点と容器の内部に向かう出口地点との間に管を誘導すること、および第２の通路がセンサまたはセンサの少なくとも一構成要素を収容するように構成され、容器の内部のパラメータを検知するように設けられていることを意味する。
【００４３】
蓋システム１１０には、少なくとも第１の通路を封止するための解除可能な封止要素１１６と、少なくともいくつかの封止要素に共通であり、各封止要素に圧力を加えて複数の通路の封止を達成するように構成されている１つ以上の押圧要素１１７とが設けられていることが好ましい。図２に示される実施形態では、封止要素１１６はコイルばね、円筒状部材および弾性封止リングを各々備え、使用時に管を取り囲み、封止リングは管上および管周囲で圧縮される。この構造により、区画の気密封止を容易および／または単純にすることができる。封止要素１１６のそばの通路全数、または少なくとも共通の押圧要素１１７によって動作する封止要素を有する通路の封止を達成または解除するためには、押圧要素１１７を操作するだけでよい。この構造のさらなる利点は、消化管シミュレーションシステムの区画を小型化できることである。
【００４４】
実施形態では、解除可能な封止要素１１６は、それぞれの通路に挿入されるそれぞれの管またはセンサ構成要素の上または周囲に圧縮されるように設けられた封止材料の封止部材１１８と、圧縮を達成するために封止部材に作用する例えばコイルばねなどのばね部材１１９とを各々備えていてもよい。これにより、封止要素の構造が単純になる。
【００４５】
実施形態では、押圧要素は板状部材１１７を備えていてもよく、板状部材は、通路の封止を達成するために板状部材が封止要素に圧力を加える押圧位置と、封止要素が解除状態にある解除位置との間で蓋システムの本体に移動可能に固定されている。可動固定は、例えば１つ以上のねじによって実行されてもよく、板状部材は、１つ以上のねじをねじ込むことによって解除位置から押圧位置まで移動可能であり、その逆も可能である。この実施形態は、押圧部材の単純な構造を提供し得る。
【００４６】
実施形態では、気密蓋システムの本体１１１は、内部空洞１２０を有する中空であり得、解除可能な封止要素は空洞を囲む中空体内に配置され、空洞内には保持要素（図示せず）が設けられてもよく、保持要素は、管およびセンサ構成要素のための第１および第２の通路の一部を含有する。この実施形態では、蓋システムの本体は、２つの部分、すなわち、容器に固定するために設けられた底部１２２と上部１２３とで実施されてもよく、２つの間に空洞がある。この実施形態では、解除可能な封止要素１１６は、空洞を囲む中空体の底部および／または上部の壁に配置され、好ましくは一体化されてもよく、内部空洞は、通路のすべて、特にそれぞれの封止要素の位置から容器の内部までの所望の形状を画定する保持要素を含有してもよい。本体の上部１２３は、内部空洞１２０を閉じるように配置され、そのために、上部および底部には、噛み合うねじ山と、空洞を密封するための封止リングとを設けることができる。この実施形態は、蓋システムを通して提供する必要がある管１１３およびセンサ構成要素１１５の数およびサイズのような状況に蓋システムが容易に適応可能であるという利点を有する。この方法では、消化管シミュレーションシステムの異なる区画ごとに異なる保持要素１２１を提供すれば十分であり、各区画用に完全な蓋システムを設計する必要を回避できる。言い換えれば、各区画の蓋システムは、保持要素を除いて同じであってもよい。さらに、この保持要素１２１は、蓋システムの外側部分とは別に設計することができ、したがって、管を入口地点から蓋システム内へ、出口地点へ、そして容器の内部へ、例えば管のために緩やかな曲線を描く通路で誘導するように最適化することができる。この構造のさらなる利点は、消化管シミュレーションシステムの区画を小型化できることである。
【００４７】
保持要素（図示せず）は、例えば、ポリアミドまたは３Ｄ印刷に適した別の材料などの３Ｄ印刷部品であってもよい。蓋システムの本体１１１、特に上部および底部は、例えばプラスチック材料、例えば３Ｄ印刷に適した材料で製造されてもよい。容器１０１は、好ましくは透明な材料で製造され、区画の内容物の視覚的検査を可能にする。
【００４８】
区画１００には、図示のようにｐＨプローブ１２５を装備することができ、ｐＨプローブ１２５は中心に配置され、空洞１２０に設けられた保持要素を通して設けることができる。したがって、保持要素は、ｐＨプローブの中央開口部の周りのすべての管に全通路を提供し、それによってすべての管を容器１０１内の正しい場所に導くことができる。
【００４９】
実施形態では、上記の構造の結果として、消化管シミュレーションシステムの区画は、容器が例えば５ｍｌから１００ｍｌの範囲の内容積を有するように小型化され得る。
【００５０】
図３〜図５に示す実施形態は、例えば上記のような少なくとも１つの区画１００を備える消化管シミュレーションシステムを提供する。消化管シミュレーションシステムは、流体を区画へおよび区画から移送するための流体移送システムをさらに備える。
【００５１】
流体移送システムは、好ましくは、流体を流体移送管１３１を介して区画１００へおよび区画１００から圧送するための複数のポンプ、好ましくはシリンジポンプ１３２と、ピンチ弁１３４を有するピンチ弁システム１３３とを備え、各ピンチ弁は、流体移送管１３１の１つを開閉するように構成され、ここで、ピンチ弁システムは、各ピンチ弁に１つの複数のカムディスク１３５と、カムディスクの回転を同期駆動する共通のスピンドル１３６とを備える。この構成により、ピンチ弁の動作シーケンスの設定または「プログラミング」を単純化でき、例えばピンチ弁の開閉を所望に制御するための所望の突起またはカムを備えた、各ピンチ弁用に適切な形状のカムディスクを提供するだけでよい。例えばステッピングモータ１３７によって駆動される共通の駆動スピンドルは、個々のカムディスクの同期回転を保証できる。１つのピンチ弁の動作を変更するには、それぞれのカムディスクを取り出して別のカムディスクと交換するだけでよい。
【００５２】
本発明による実施形態では、カムディスクは共通のスピンドルに組み付けることができ、共通のスピンドルは回転ロック形状を有し、カムディスクはこの回転ロック形状に対応する中央開口部を有する。これにより、ピンチ弁システムの構造は単純化され得る。
【００５３】
他の実施形態では、カムディスクの回転はギアシステムによって駆動されてもよく、および／またはカムディスクは他の方法で互いに回転ロックされてもよい。
【００５４】
実施形態では、ピンチ弁は、カムディスク上のカム１３９によって作動されるばね式フィンガ１３８を備えていてもよい。カムディスクは、フィンガ１３８を３つの位置、すなわち、フィンガ１３８が管１３１を閉じている完全に閉じた位置、管は開いているがフィンガ１３８でまだクランプされている８０％開いた位置、および管をピンチ弁システムから取り外して交換できるようにフィンガ１３８が管を解放する完全に開いた位置の間で移動させるように構成されていてもよい。
【００５５】
他の実施形態では、ピンチ弁は、カムディスク自体のカムによって形成されてもよい。
【００５６】
実施形態では、消化管シミュレーションシステム内に連続配置された多数の区画、例えば、２〜１０個の連続配置された区画、典型的には５個の連続配置された区画があってもよい。
【００５７】
実施形態では、図５〜図６に示すように、例えば上記のような少なくとも１つの区画１００を備える消化管シミュレーションシステムが提供され、消化管シミュレーションシステムは、少なくとも１つの区画の少なくとも１つの容器が配置される水浴１４０と、少なくとも１つの容器の内容物を撹拌するための少なくとも１つの磁気撹拌システム１４１とをさらに備え、磁気撹拌システムは、それぞれの容器１０１および水浴１４０の下に取り付けられ、かつ回転磁場を生成するために提供される例えば回転電磁石などの磁気駆動装置１４２と、それぞれの容器の下の水浴内に配置され、回転磁場によって回転し回転磁場を増幅するように設けられた永久磁石１４３と、増幅された磁場によって回転するように設けられたそれぞれの容器１０１の底部にある第１の撹拌要素１４４とを備える。
【００５８】
この磁気駆動撹拌要素を設けることにより、容器の壁または蓋を通る撹拌要素の機械的結合の必要性を回避することができ、その結果、区画の内部の気密封止をより確実にすることができる。生成された磁場に沿って回転し増幅する永久磁石１４３を水浴内に設けることにより、容器内の撹拌要素の良好な動作を確保できる。さらに、水浴内の永久磁石１４３の回転は、この水浴の内容物も撹拌し、より均一な温度に導くことができる。
【００５９】
好ましい実施形態では、各区画の容器は外側容器であってもよく、区画は、外側容器の内側に取り付けられた内側容器１５１と、内側容器の底部にあり、増幅された磁場によって回転されるようにも設けられている第２の撹拌要素１４５とをさらに備えていてもよい。そのような実施形態の例を図８に示し、以下でさらに説明する。
【００６０】
好ましい実施形態では、第１および／または第２の撹拌要素１４４、１４５は永久磁石であってもよい。
【００６１】
好ましい実施形態では、水浴内の永久磁石１４３、第１の撹拌要素１４４および／または第２の撹拌要素１４５は、概ね三角柱形状であってもよい。それらは、それぞれの水浴／容器内で自由に動く要素であってもよく、または追加の位置決め要素（図示せず）によって所定の位置に保持されてもよい。図５に示す実施形態では、ｐＨセンサプローブ１２５を支持し、プローブと撹拌要素１４４との接触を回避するために、容器１０１の底部にさらにプローブ支持要素１４６が設けられている。
【００６２】
実施形態では、図８に示すように、周縁部１０２によって囲まれた開口上部を有する外側容器１０１と、周縁部上に配置され、蓋システムと容器との間に気密封止を形成するように構成された気密蓋システム１１０と、外側容器の内側に取り付けられた内側容器１５１とを有する少なくとも１つの区画を備える消化管シミュレーションシステムが提供され、内側容器は、少なくとも一部が透析膜１５０によって形成されている壁を有する。このように、内側容器を使用して、腸内の化合物の吸着を模倣することができ、膜は血液−腸バリアを模倣する。
【００６３】
好ましい実施形態では、内側容器壁は、透析膜に囲まれた円筒形のグリッド構造１５２を備える。
【００６４】
反応器容器において、ガス入口管とガス出口管が容器の液体に届かないようにすることが好ましい。液体が容器に供給され、ガス管に到達する可能性がある場合、高液位検出を使用して緊急停止を発生させる。本明細書に記載され、大気圧とは異なる圧力下で表現され、滅菌できるような小さな反応器（例えば直径２５ｍｍ）では、高液位検出のための従来技術の解決策は適切ではないか嵩張り、高価である。それに対して、図９に示す本発明による実施形態は、周縁部によって囲まれた開口上部を有する容器２００と、周縁部上に配置され、蓋システムと容器との間に気密封止を形成するように構成された気密蓋システム２０１とを備える消化管シミュレーションシステムの区画を提供し、蓋システムには、容器内の高すぎる液位を検出するための高液位検出手段２０２〜２０５が設けられており、高液位検出手段は、蓋システム２０１を通るガス入口管２０３およびガス出口管２０２と、ガス入口管およびガス出口管を通るガス流を確立するための手段（図示せず、例えば小型ポンプまたは換気装置など）とを備える。フロータ２０４は、入口管２０３の口部（出口管の口部またはその両方にもあり得る）に取り付けられ、液位が高くなりすぎた場合に、フロータがガス流の障害物を形成しない自由な流れ位置（図９上に示す）からフロータがガス流の障害物を形成する妨害位置（図９下に示す）まで、容器内の液体２０６に浮かぶことによって上昇するように適合されている。
【００６５】
図示の実施形態では、フロータ２０４は、正方形の断面を有するホルダ２０５に配置された中空シリンダの形態をとっており、その結果シリンダの周りにガス流が起こり得る。これが多くの方法で実行できることは明らかである。通常、重力の影響下で、フロータ２０４は、管２０３の口部からわずかな距離で下向きの位置に配置されるため、ガスの自由な流れが可能になる。液位が高くなりすぎると、フロータ２０４はその上面が入口管２０３の口部に到達するまで上方に移動し、例えば流量計によって検出可能な方法でガス流を妨害する。妨害は口部を完全に閉じる必要はなく、自由な流れと妨害された流れの違い（例えば５倍少ない）を検出できれば十分である。
【００６６】
そのような高液位検出手段２０２〜２０５は、容器内の液位が高くなりすぎたときを検出するための単純な構造を提供する。第一に、入口管の口部を完全に閉じる必要がないという事実は、完全な封止が必要ないことを意味する。消化管シミュレーションシステムの状況では、連続的な測定を行う必要はないため、液位を検出するためのガス流は断続的であってもよく、実際には短い時間間隔でのみ必要になり得る。ガス流はフロータを下げた状態で１Ｎｌ／分、フロータを上げた状態で０．１Ｎｌ／分と少ないため、液体の上のヘッドスペースの圧力は実質的に安定している。蓋の天井にあるこれらの検出手段のサイズ／フットプリントは、５×５ｍｍほどに小さくなり得る。ホルダ２０５の構造は、本明細書の他の箇所で説明されている３Ｄ印刷された保持要素に完全に統合することができる。ガス供給および流量計には、システムにすでに存在するデバイスを使用できる。
【００６７】
実施形態では、本明細書に記載の消化管シミュレーションシステムの区画は、栄養培地、胃液、膵液、胆汁、小腸培地および結腸懸濁液の流体を移送するための管を備えていてもよい。さらに、区画には、ｐＨプローブ、レドックスプローブ、温度センサ、レベルセンサ、溶存酸素センサ、圧力センサなどのセンサが装備されていてもよい。
【００６８】
本発明の実施形態は、ヒトまたは動物の消化管の機能をシミュレートする方法を提供し、本明細書に記載される消化管シミュレーションシステムの空の区画を消化管の生理学的流体をシミュレートする流体で満たすステップと、事前に決定された値、範囲または軌道に各々応じて、液体流（例：０〜１０ｍｌ／分）、温度（例：２０〜５０℃）、ｐＨ（例：１〜９の範囲）、イオン強度（例：０〜１０Ｍの範囲）、ヘッドスペース（例：０〜１００ｍｌ）、撹拌（例：０〜６００ｒｐｍ）、圧力（例：０〜２ｂａｒ）、液量（例：０〜１００ｍｌ）のパラメータの１つ以上またはすべてを各区画で制御するように消化管シミュレーションシステムを動作させるステップとを含む。好ましい範囲は、液体流０．１〜６ｍｌ／分、温度３５〜４０℃、ｐＨ１．５〜８の範囲、イオン強度０．０１〜５Ｍの範囲、ヘッドスペース１〜５０ｍｌ、撹拌１〜５００ｒｐｍ、圧力０．１〜１．５ｂａｒ、液量５〜５０ｍｌである。
【００６９】
実施形態では、方法は、空の区画にＨ２Ｏ２ガスを導入することにより、および／または区画の内部温度を３０分の範囲内の期間に４０〜１２１℃（１５ｐｓｉ）の範囲内の値に上げることにより、消化管シミュレーションシステムの内部を滅菌する第１のステップを含む。
【００７０】
実施形態では、消化管シミュレーションシステムは、所定の速度で栄養培地を第１のリザーバから第１の区画へ（５〜５０ｍｌ）、シミュレートした胃液を第２のリザーバから第１の区画へ（０〜１０ｍｌ）、膵液を第３のリザーバから第３の区画へ（０〜２０ｍｌ）、および各区画の内容物を要求された保持時間に従って連続した区画へ移送するように動作する。
【００７１】
実施形態では、方法は、消化管シミュレーションシステムの区画に試験試料を導入するステップを含み、この試験試料は、微生物試料、薬理活性剤、医薬製剤、ミネラル、食品、飼料化合物および食物繊維からなる群より選択される。
【００７２】
実施形態では、複数の消化管シミュレーションシステムが同時にかつ同一に動作し、１つ以上の消化管シミュレーションシステムは試験試料を含有し、１つ以上の消化管シミュレーションシステムは試験試料を含有しない。
【００７３】
図１０〜図１２は、本発明による消化管シミュレーションシステムの別の実施形態の断面図および斜視図を示し、周縁部またはフランジ３０２によって囲まれた開口上部を有する容器３０１と、周縁部に配置され、蓋システムと容器との間に気密封止を形成するように構成された気密蓋システム３１０とを有する区画３００（反応器とも呼ばれる）を備える。これは、蓋システム３１０が周縁部３０２に嵌合するように構成され、蓋システムを縁部に固定するステップに続いて気密封止が得られるように構成されていることを意味する。これは多くの方法で達成することができ、例えば１つ以上の封止リング３０３を含み、それ自体は当業者に知られているため本明細書でさらに説明する必要はない。
【００７４】
蓋システムは、本体を通って延出し、かつ容器の内部３０４へのアクセスを提供する複数の通路３１２、３１４を有する本体３１１を備え、複数の通路は、流体移送管３１３を受け入れるように構成された第１の通路３１２と、蓋システムを通って垂直に延出する少なくとも１つのセンサ構成要素３１５（これは管を備えていてもよい）を取り付けるように構成された第２の通路３１４とを備える。第１および／または第２の通路３１２、３１４は、（液体および／または気体を移送するための）流体移送管（それぞれセンサ構成要素またはセンサ管）を受け入れるためのサイズおよび形態であり、通路は管の周囲にぴったりと嵌合し、蓋システムへの入口地点（上面）と出口地点（底面）との間で容器の内部に向かって管を誘導するようになっていることが好ましい。
【００７５】
蓋システム３１０には、少なくとも第１の通路を封止するための解除可能な封止要素３１６と、少なくともいくつかの封止要素に共通であり、各封止要素に圧力を加えて複数の通路の封止を達成するように構成されている１つ以上の押圧要素３１７とが設けられていることが好ましい。原理は図２に示すものと同じであり、封止要素３１６はコイルばね、円筒形部材および弾性封止リングを各々備え、使用時に管を取り囲み、封止リングは管上および管周囲で圧縮される。この構造により、区画の気密封止を容易および／または単純にすることができる。封止要素３１６のそばの通路全数、または少なくとも共通の押圧要素３１７によって動作する封止要素を有する通路の封止を達成または解除するためには、押圧要素３１７を操作するだけでよい。この構造のさらなる利点は、消化管シミュレーションシステムの区画を小型化できることである。
【００７６】
実施形態では、解除可能な封止要素３１６は、それぞれの通路に挿入されるそれぞれの管またはセンサ構成要素の上または周囲に圧縮されるように設けられた封止材料の封止部材と、圧縮を達成するために封止部材に作用する例えばコイルばねなどのばね部材とを各々備えていてもよい。これにより、封止要素の構造が単純になる。
【００７７】
実施形態では、押圧要素は板状部材３１７を備えていてもよく、板状部材は、通路の封止を達成するために板状部材が封止要素に圧力を加える押圧位置と、封止要素が解除状態にある解除位置との間で蓋システムの本体に移動可能に固定されている。可動固定は、例えば１つ以上のねじ３１８によって実行されてもよく、板状部材は、１つ以上のねじをねじ込むことによって解除位置から押圧位置まで移動可能であり、その逆も可能である。この実施形態は、押圧部材の単純な構造を提供し得る。
【００７８】
図１０〜図１２の実施形態に示すように、通路３１２、３１４、板状部材３１７を固定するための固定ねじ３１８を受け入れるための穴またはボア３１９、容器上に蓋システムを（容器のフランジを収容する板３２２を使用して）固定および封止するための固定ねじまたはボルト３２０を受け入れるための穴またはボア３２１、ならびに他の穴またはボアも蓋システムを通って垂直に延出し得る。これらのすべての穴は、例えばドリルによって、同じ方向で本体に開けることができるため、これは蓋システムの本体３１１の製造を容易にする。蓋システムの本体３１１は、図示のように、例えばプラスチック材料で製造された円筒形の本体であってもよい。容器３０１は、好ましくは透明な材料で製造され、区画の内容物の視覚的検査を可能にする。
【００７９】
区画３００は、図示のようにｐＨプローブ３２５を装備することができ、ｐＨプローブ３２５は中央に配置され、本体３１１を通して提供される。通路３１４、３１５は、通路によって占有される空間を最小にし、かつ蓋システムのサイズを縮小するために、ｐＨプローブの中央開口部の周りに半径方向に離間していてもよい。
【００８０】
図示のように、板状部材３１７は星形であってもよく、各先端はボア３１９内に保持されたねじ３１８によって本体に固定され、各先端がばね３２３を圧縮する。星形はボルト３２０を動作させるための空間を残すため有利であり、ボルト３２０によって本体３１１は板３２２に固定され、容器３０１のフランジ３０２は本体３１１と板３２２との間に封止される。あるいは、板状部材は、これらの固定ねじまたは他の固定手段３２０のための空間を提供する切り欠きのある任意の形状を有してもよい（例えば三角形、プラス形状、切り欠きのある円形など）。
【００８１】
図示のように、板状部材３１７および本体３１１は、回転対称部品であり、このことは製造の複雑さの低減および／または蓋システムの小型化に寄与し得る。
【００８２】
実施形態では、上記の構造の結果として、消化管シミュレーションシステムの区画は、容器が例えば５ｍｌから１００ｍｌの範囲の内容積を有するように小型化され得る。
【図１】
2020522273.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
2020522273.tif 000015
2020522273.tif 000016
2020522273.tif 000017