(57)【要約】  本文書は、付加製造のためのシステム、および埋め込み印刷方法を記載する。印刷材料はサポート材に印刷される。印刷材料およびサポート材の各々は、流体相および固相を有する。印刷材料は、サポート材との流体−流体相互作用に基づいて、流体相から固相に転移する。サポート材の１以上のパラメーターを調整して、流体−流体相互作用中のサポート材への印刷材料の拡散速度が閾値未満になることを可能にできる。複数の印刷材料は、サポート材に同時に印刷することができる。
2020512944.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
応力を受けることに応じて第１の固相から第１の流体相に転移するように構成されたサポート材；および
サポート材に埋め込まれる印刷材料
を含むシステムであって、
前記印刷材料は、サポート材の第１の流体相と印刷材料の第２の流体相との間の流体−流体相互作用により、サポート材中で第２の流体相から第２の固相に転移するように構成される、前記システム。
【請求項２】
前記サポート材が塩基性であり、前記印刷材料が酸性であって、前記サポート材の転移が、印刷材料およびサポート材の流体−流体相互作用中の印刷材料の中和を含む、請求項１記載のシステム。
【請求項３】
前記印刷材料が、コラーゲン、ゼラチンおよびアルギナートの少なくとも１つを含む、請求項１記載のシステム。
【請求項４】
前記印刷材料が、約６０〜８０マイクロメートルの直径を含むストランドを含む、請求項１記載のシステム。
【請求項５】
前記印刷材料が第１の印刷材料であり、前記システムが、第１の印刷材料を包むメッシュを形成する第２の印刷材料を含み、前記メッシュが、サポート材が第１の印刷材料から除去される場合、第１の印刷材料の幾何学を支持するように構成されている、請求項１記載のシステム。
【請求項６】
前記第１の印刷材料がコラーゲンを含み、前記第２の印刷材料がアルギナートを含み、前記サポート材がカルシウムを含む、請求項５記載のシステム。
【請求項７】
前記サポート材がゲル粒子を含み、前記ゲル粒子が、サポート材の塩濃度を調整することにより形成され、前記ゲル粒子が、印刷材料と混合される、請求項１記載のシステム。
【請求項８】
前記印刷材料が、印刷材料からゲル粒子を除去することにより形成されたボイドへの細胞浸潤を可能にするように構成される、請求項７記載のシステム。
【請求項９】
前記サポート材がコアセルベート・スラリーを含む、請求項１記載のシステム。
【請求項１０】
第１の固相と第１の流体相との間で転移するように構成されたサポート材の内部にインジェクターを移動させ；
インジェクターにより、サポート材の一部分を第１の固相から第１の流体相に変化させ；
印刷材料をサポート材に注入し、
前記サポート材の第１の流体相と印刷材料の第２の流体相との間の流体−流体相互作用に基づいて、サポート材中で印刷材料を第２の流体相から第２の固相に転移させ；次いで
前記印刷材料からサポート材を除去することを含む、付加製造方法。
【請求項１１】
さらに、
前記印刷材料を酸性化すること；および
前記サポート材をアルカリ化すること、
を含み、
前記サポート材の転移は、印刷材料およびサポート材の流体−流体相互作用中の印刷材料の中和を含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
さらに、前記サポート材のｐＨの制御により第２の固相中の印刷材料のナノ構造体を制御することを含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
前記印刷材料が、コラーゲン、ゼラチンおよびアルギナートの少なくとも１つを含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
前記サポート材のパラメーターを選択し；次いで
あるタイプの印刷材料に基づいて、サポート材のパラメーターの値を調整する
ことを含み、
前記パラメーターの値は、パラメーターの値が調整されない場合の流体−流体相互作用中の第２の流体相から第２の固相への印刷材料の転移速度に比べて、流体−流体相互作用中の第２の流体相から第２の固相への印刷材料の転移速度を増加させるように構成される、請求項１０記載の方法。
【請求項１５】
前記サポート材のパラメーターが、流体相の組成、ｐＨ、イオン強度、緩衝能および酵素活性の１つを含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
さらに、
前記サポート材のパラメーターを選択し；次いで
あるタイプの印刷材料に基づいてサポート材のパラメーターの値を調整することを含み、
前記パラメーターの値は、パラメーターの値が調整されない場合の流体−流体相互作用中にサポート材中への印刷材料の拡散速度に比べて、流体−流体相互作用中のサポート材中への印刷材料の拡散速度を減少させるように構成される、請求項１０記載の方法。
【請求項１７】
前記サポート材のパラメーターが、流体相の組成、ｐＨ、イオン強度、緩衝能および酵素活性の１つを含む、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
さらに、注入中に前記サポート材を前記印刷材料に混合することを含み、
前記サポート材の除去は、印刷材料の第２の固相中の１以上のボイドを生じさせる、請求項１０記載の方法。
【請求項１９】
前記印刷材料へのサポート材の混合が、サポート材の塩濃度を制御して、ゲル粒子がサポート材に形成することを可能にすることを含み、前記ゲル粒子は、流体−流体相互作用中に印刷材料と混合する、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記印刷材料の第２の固相が、約６０〜８０マイクロメートルの平均直径を有するコラーゲン・ストランドを含む、請求項１０記載の方法。
【請求項２１】
前記印刷材料が第１の印刷材料を含み、
あるタイプの第１の印刷材料およびあるタイプの第２の印刷材料に基づいてサポート材を改変し；次いで
第１の印刷材料および第２の印刷材料をサポート材に注入する
ことを含む、請求項１０記載の方法。
【請求項２２】
前記第１の印刷材料がコラーゲンを含み、第２の印刷材料がアルギナートを含み、サポート材がカルシウムカチオンを含む、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
インジェクター；
２０ｇ／Ｌを超える塩濃度のＮａＣｌおよびアラビアゴムの双方を含むコアセルベート・ゼラチン支持浴、ここに、前記アセルベート・ゼラチン支持浴は、ｐＨ８を超え、降伏応力閾値を超えて応力を受けることに応じて第１の固相から第１の流体相に転移するように構成される；および
前記インジェクターにより、サポート材への注入のために構成されたコラーゲンおよびアルギナート、ここに、前記コラーゲンおよびアルギナートの各々は、６未満のｐＨを有し、コラーゲンおよびアルギナートの各々が、コアセルベート・ゼラチン支持浴中のゲル化のために構成され、ゼラチンおよびアルギナートの各々が、ゲル化中に支持浴へ１０％未満で拡散する、
を含むシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（優先権主張）
本願は、２０１７年４月６日付けで出願された米国特許出願第６２／６０１，９９５号、および２０１７年９月２８日付けで出願された米国特許出願第６２／６０６，５８１号に対する、米国特許法第１１９条（ｅ）下の優先権を主張し、これらの全内容をここに出典明示して本明細書の一部分とみなす。
【０００２】
（政府支援の項）
本発明は、国立衛生研究所第ＨＬ１１７７５０号下の政府支援でなされた。米国政府は本発明においてある種の権利を有する。
【０００３】
（技術分野）
本願は付加製造、特に、埋め込み印刷（embedded printing）に関する。
【背景技術】
【０００４】
付加製造を用いて、三次元の物体または構造を創成できる。材料は、組立て中に一時的に構造を支持するサポート骨格に印刷することができる。組立てが完了した場合、サポート骨格が除去される。
【発明の概要】
【０００５】
本願は、付加製造に用いるサポート材および印刷材料を記載する。自由形状可逆性懸濁性ハイドロゲル埋め込み（ＦＲＥＳＨ）と呼ばれる、流体の付加製造方法は、一時的サポート材（例えば、スラリーを含む）へ流体材料（例えば、アルギナート、コラーゲン、フィブリンなど）を埋め込むことを含む。
【０００６】
サポート材は固体および流体相を含む。いくつかの実施において、固相は、サポート材にビンガム塑性体挙動を与えるゼラチン粒子を含み、ゲル化流体の析出および支持を可能にする。流体相はゼラチン粒子を懸濁し、その体積および組成は従前にサポート材の流動特性に影響することが示されている。流体相の組成を用いて、埋め込まれた流体インクのゲル化挙動を制御することができる。従前には、アルギナートは、アルギナートのゲル化を促進するためカルシウムカチオンを含有する流体相でサポート材に印刷されてきた。アルギナートの初期の使用を越えて拡張すると、物理的および化学的改質が流体相になされて、他の流体インク、最も顕著にはコラーゲンのゲル化を調整することができる。印刷材料（print material）の流体相は、サポート材の流体相と相互作用し、流体−流体界面を形成する。インクのゲル化挙動を調整するためのサポート材と埋め込まれたヒドロゲル・インクとの間の流体−流体界面は、フィブリン、コラーゲンおよびマトリゲルのごとき有機ポリマーならびにエポキシ、ゴムおよびセメントを含む合成ポリマーの双方にまで、ＦＲＥＳＨの使用が拡張されることを可能にする。
【０００７】
後記のシステムは、応力を受けることに応じて第１の固相から第１の流体相に転移するように構成されたサポート材；およびサポート材に埋め込まれる印刷材料を含み、印刷材料は、サポート材の第１の流体相と印刷材料の第２の流体相との間の流体−流体相互作用により、サポート材中で第２の流体相から第２の固相に転移するように構成される。
【０００８】
いくつかの実施において、サポート材は塩基性であり、印刷材料は酸性であり、およびサポート材の転移が印刷材料およびサポート材の流体−流体相互作用中に印刷材料の中和を含む。いくつかの実施において、印刷材料は、コラーゲン、ゼラチンおよびアルギナートの少なくとも１つを含む。いくつかの実施において、印刷材料は、約６０〜８０マイクロメートルの直径を含むストランド（strand）を含む。いくつかの実施において、印刷材料は第１の印刷材料であり、システムが第１の印刷材料を覆うメッシュを形成する第２の印刷材料を含み、サポート材が第１の印刷材料から除去される場合に、メッシュは第１の印刷材料の幾何学を支持するように構成される。いくつかの実施において、第１の印刷材料はコラーゲンを含み、第２の印刷材料がアルギナートを含み、サポート材がカルシウムを含む。いくつかの実施において、印刷材料は、印刷材料からゲル粒子を除去することにより形成されたボイド（void）への細胞浸潤を可能にするように構成される。サポート材は、コアセルベート・スラリーを含む。
【０００９】
いくつかの実施において、サポート材は、ゲル粒子を含み、ゲル粒子は、ゲル粒子が印刷材料と混合される場合に、サポート材の塩濃度を調整することにより形成される。
【００１０】
本明細書に記載されたこのプロセスは、第１の固相と第１の流体相との間で転移するように構成されたサポート材の内部にインジェクターを移動させ、インジェクターにより、サポート材の一部分を第１の固相から第１の流体相に変化させ、印刷材料をサポート材に注入し、サポート材の第１の流体相と印刷材料の第２の流体相との間の流体−流体相互作用に基づいて、サポート材中で印刷材料を第２の流体相から第２の固相に転移させ、次いで、印刷材料からサポート材を除去することを含む。
【００１１】
いくつかの実施において、プロセスは、印刷材料を酸性化すること、およびサポート材をアルカリ化することを含み、サポート材の転移は、印刷材料およびサポート材の流体−流体相互作用中の印刷材料の中和を含む。
【００１２】
いくつかの実施において、プロセスは、サポート材のｐＨの制御により第２の固相中の印刷材料のナノ構造体を制御することを含む。
【００１３】
いくつかの実施において、印刷材料は、コラーゲン、ゼラチンおよびアルギナートの少なくとも１つを含む。いくつかの実施において、プロセスは、サポート材のパラメーターを選択し；次いで、あるタイプの印刷材料に基づいてサポート材のパラメーターの値を調整することを含み、前記パラメーターの値は、前記パラメーターの値が調整されない場合の流体−流体相互作用中の第２の流体相から第２の固相への印刷材料の転移の速度に比べて、流体−流体相互作用中の第２の流体相から第２の固相への印刷材料の転移の速度を増加させるように構成される。いくつかの実施において、サポート材のパラメーターは、流体相の組成、ｐＨ、イオン強度、緩衝能および酵素活性の１つを含む。
【００１４】
いくつかの実施において、プロセスは、サポート材のパラメーターを選択し；次いで、あるタイプの印刷材料に基づいてサポート材のパラメーターの値を調整することを含み、パラメーターの値は、パラメーターの値が調整されない場合の流体−流体相互作用中のサポート材中への印刷材料の拡散速度に比べて、流体−流体相互作用中にサポート材中への印刷材料の拡散速度を減少するように構成される。いくつかの実施において、サポート材のパラメーターは、流体相の組成、ｐＨ、イオン強度、緩衝能および酵素活性の１つを含む。
【００１５】
いくつかの実施において、プロセスは、注入中にサポート材を印刷材料に混合することを含み、サポート材の除去は、印刷材料の第２の固相中の１以上のボイドを生じさせる。いくつかの実施において、サポート材の印刷材料への混合は、サポート材の塩濃度を制御して、ゲル粒子がサポート材中で形成することを可能にし、ゲル粒子は流体−流体相互作用中に印刷材料と混合することを含む。
【００１６】
いくつかの実施において、印刷材料の第２の固相は、約６０〜８０マイクロメートルの平均直径を有するコラーゲン・ストランドを含む。いくつかの実施において、印刷材料は、第１の印刷材料を含み：その方法は、あるタイプの第１の印刷材料およびあるタイプの第２の印刷材料に基づいてサポート材を改変し；次いで、第１の印刷材料および第２の印刷材料をサポート材に注入することを含む。いくつかの実施において、第１の印刷材料がコラーゲンを含み、第２の印刷材料がアルギナートを含み、サポート材がカルシウムカチオンを含む。
【００１７】
いくつかの実施において、印刷システムは、インジェクター；２０ｇ／Ｌを超える塩濃度のＮａＣｌおよびアラビアゴムを含むコアセルベート・ゼラチン支持浴、ここに、アセルベート・ゼラチン支持浴は、ｐＨ８を超え、降伏応力閾値を超えて応力を受けることに応じて第１の固相から第１の流体相に転移するように構成される；およびインジェクターにより、サポート材への注入のために構成されたコラーゲンおよびアルギナート、ここに、コラーゲンおよびアルギナートの各々は、６未満のｐＨを有し、コラーゲンおよびアルギナートの各々が、コアセルベート・ゼラチン支持浴中のゲル化のために構成され、ゼラチンおよびアルギナートの各々が、ゲル化中に支持浴へ１０％未満で拡散する、を含む。
【００１８】
１以上の具体例の詳細は、以下の添付図面および明細書に記載されている。他の特徴、目的および有利さは、本明細書および図面、および特許請求の範囲から明らかである。種々の図面中の同様の参照シンボルは、同様の要素を示す。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は印刷システムを示す。
【図２−７】図２〜７は各々、サポート材の例における印刷されたストランドの代表を示す。
【図８】図８は、多重材料の埋め込み印刷の例を示す。
【図９】図９は、付加製造技術間の比較を示す。
【図１０−１１】図１０〜１１は、多重材料印刷の例を示す。
【図１２】図１２は、埋め込み印刷プロセスの例についての流れ図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
図１は印刷システム１００を示す。印刷システム１００は、インジェクター１２０を介してのごとく、サポート材１３０（例えば、アルギナート、ゼラチン、セルロースなど）に埋め込まれる材料１１０（例えば、コラーゲン、フィブリン、マトリゲル、エポキシ、ゴム、セメントなど）を印刷するように構成される。印刷材料１１０およびサポート材１３０は各々、固相および流体相を有する。印刷材料１１０は、流体相に印刷され、サポート材１３０との相互作用に際して固相に転移する。サポート材１３０は、降伏応力（例えば、臨界剪断応力）を超える応力がサポート材に働く場合に、固相から流体相に転移する。例えば、サポート材１３０を通してのインジェクター１２０の移動は、降伏応力閾値を超えるサポート材に対する応力を引き起こすことができる。これは、インジェクター１２０の周囲にてサポート材１３０を流体相に転移させることができる。
【００２１】
サポート材１３０は、印刷が行なわれ、印刷材料（printed material）が流体相から固相に（例えば、ゲル化が生じつつ）硬化する間に、材料１１０を支持する骨格を形成する。サポート材１３０の粘度および降伏応力が印刷材料（インクともいう）に同様である場合、印刷システム１００は、サポート材１３０の粘度および降伏応力が一致しないか、またはサポート材のものに同様でない場合より高精度で印刷することができる。さらに、より小さな粒子を含むスラリーを形成するサポート材１３０は、印刷システム１００によりサポート材中の構造の高忠実度の印刷を促す。
【００２２】
いくつかの実施において、サポート材（支持浴、支持媒体などともいう）は、ビンガム塑性体の特性の少なくともいくつかを示す。例えば、サポート材が降伏応力値を超える応力（例えば、剪断応力）を受けていない場合、サポート材は、固体材料の特性を示す。サポート材１３０の少なくとも一部分が降伏応力値を超える応力（例えば、剪断応力）を受ける場合、サポート材１３０のその一部分は粘稠液のように挙動する。いくつかの実施において、プリンター・インジェクター１２０がサポート材を介して移動すると、それはサポート材に応力を適用する。これにより、プリンターヘッドは、印刷材料１１０（インクともいう）をサポート材１３０に注入することができ、サポート材は、構造が形成されるまで適所にインクを支持する。インク１１０は、コラーゲン、フィブリン、エポキシ、セメント、ゴム、アルギナートまたは、他の材料、例えば、サポート材１３０に注入後にゲル化を受ける材料のごとき組織を含み得る。サポート材１３０は、ゲル化が完了するまで、インクを支持する。次いで、サポート材は除去する（例えば、溶解する）ことができる。
【００２３】
流体相から固相への印刷材料１１０の転移、および転移がどのように生じるかは、印刷される構造の質に影響する。転移の制御は印刷忠実度の増加に有用である。印刷材料１１０の転移は、印刷材料とサポート材１３０との間の流体−流体相互作用の制御により制御することができる。流体−流体相互作用は、印刷材料の流体相とサポート材の流体相との間の相互作用である。印刷材料がサポート材に挿入される（例えば、注入される）場合、流体−流体相互作用が生じる。サポート材は、挿入の間および印刷材料の挿入点で固相から流体相に転移する。流体として印刷された印刷材料は、流体−流体界面にてそのサポート材に会合する（例えば、印刷材料およびサポート材が会合し相互作用する）。例えば、サポート材は、印刷材料のゲル化を引き起こすか、またはそうでなければ流体から固体への印刷材料の転移を生じさせる。流体−流体相互作用は、以下に詳述されるごとく、サポート材１３０および印刷材料１１０の種々のパラメーターの選択に基づいて制御することができる。
【００２４】
サポート材１３０の流体相は予想されるようにサポート材内のＩ型コラーゲン埋め込みおよびゲル化を制御するように特に設計することができる。サポート材の流体相の制御は、高忠実度を持つ複雑な印刷幾何学を可能にする。Ｉ型コラーゲンは酸性状態で可溶である。Ｉ型コラーゲン溶液のｐＨおよび温度が中性のｐＨおよび３７℃に駆動される場合、かかる溶解度は逆転する。コラーゲンＩ酸性溶液の中和は、サポート材の流体相を高ｐＨ溶液で置換することにより達成される。中和とは、材料のｐＨが約７（例えば、６〜８）であるように、印刷材料を酸性または塩基性の状態から中性にさせることを意味する。略言すると、サポート材を遠心分離して、固体および流体相を分離する。上清は除去され、ＮａＯＨ溶液と置換され、固相と徹底的に混合される。所望のｐＨが達成されるまで、これらの工程が繰り返される。この高ｐＨのサポート材への印刷の結果、高忠実度を生じ、図２〜６に示され、後記されるごとく、重合されたＩ型コラーゲンの単一８０μｍストランドを反復可能に埋め込む。
【００２５】
サポート材のｐＨは、ゲル化材料の流体から固体への転移を制御するようにこの方法で変更することができる多数の流体相パラメーターの単に１つである。流体相の組成、化学、イオン強度、緩衝能、酵素活性は、サポート材内で容易に微調整することができ、種々のインクに特に適合することができるいくつかの変数である。また、この方法を用いて、複数のインクを各インクのゲル化を促すために改変された単一のサポート材料１３０浴に一緒に印刷することができる。例えば、個別のコラーゲンおよびアルギナート・インクは、カルシウムカチオンを含有する単一の高ｐＨのサポート材に印刷して、単一の複数材料印刷を構築することができる。ゲル化を制御するための流体−流体界面を設計するこの方法は、固体ゼラチン粒子に対して、変更された流体相が有し得る化学・物理的な効果に単に制限される。ゼラチン加水分解は極端なｐＨで生じることができ、イオンの存在はゼラチンの粒子密度、サイズおよび形態学に影響できる。サポート材１３０の流体相を改変することができる容易さ、および流体相内で調整することができる因子の大きな範囲は、サポート材のレオロジーにおける変化が、対処されることを可能にする。
【００２６】
いくつかの実施において、サポート材は、２０１８年４月５日付けで出願された、出願シリアル番号第６２／６０１，９４９号、およびに２０１７年９月２８日付けで出願された出願シリアル番号第６２／６０１，５７８号に記載されたコアセルベート・スラリーであり、その各々をここに出典明示してそのすべてを本明細書の一部とみなす。コアセルベート・スラリーはゲル微粒子を含む。粒子のサイズおよび形状を含めた粒子の幾何学は、コアセルベート・スラリーが製造されるプロセス、およびコアセルベートに用いる材料に基づいて制御することができる。粒子は、３５％未満の分散を持つ直径０．５マイクロメートル〜６０マイクロメートルであることができる。粒子はスラリー中で単分散であることができる。ゲル粒子は、印刷プロセスの間に印刷材料（例えば、コラーゲン）と混合することができる。スラリーが除去される（例えば、溶解される）場合、ボイドは印刷されたコラーゲン中に残される。かくして、ボイドは印刷材料の全体にわたり、実質的に一定のサイズおよび分布のものである。半多孔性の印刷材料は、インビボ適用に特に有用である。印刷材料のボイドは、プリント構造のインビボ適用のための細胞浸潤を促すことができる。ボイド数およびボイド分布は、本願に記載のごとき印刷材料のゲル化の制御により制御することができる。
【００２７】
図２は、種々のパラメーターを持つサポート材に印刷されたストランドの例を示す。ストランド２００、２１０は、Ｈｙｃｌｏｎｅ  １０×リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）ベースのサポート材に印刷されている。１０×ＰＢＳに印刷されたストランドは、滑らかで直径において一貫し、後記の他のサポート材中に印刷されたストランドに比較して、比較的低いストランド−対−ストランド融合を有する。ストランド２２０は、ベースラインサポート材塩濃度に比べて高い塩濃度である８０ｇ／Ｌ ＮａＣｌを含むサポート材に印刷されている。高塩濃度（８０ｇ／Ｌ）単独は、最もおそらく塩析を介して、コラーゲン組立てを誘導するのに十分である。ストランド２３０は１０×リン酸緩衝液を含むサポート材に印刷されている。ストランド２４０は、１０×リン酸緩衝液および高ＮａＣｌ濃度を持つサポート材に印刷されている。リン酸緩衝液濃度の上昇は、塩がリン酸緩衝液に戻し添加される場合ほど滑らかでないストランドを創成する。
【００２８】
図３は、種々のパラメーターを持つサポート材に印刷されたストランドの例を示す。ストランド３００は、８０ｇ／Ｌ ＮａＣｌの塩濃度をさらに含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液に印刷されている。ストランド３１０は、４０ｇ／Ｌ ＮａＣｌの塩濃度をさらに含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液に印刷されている。ストランド３２０は、０．８０ｇ／Ｌ ＮａＣｌの塩濃度をさらに含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液に印刷されている。ストランド３３０は、８０ｇ／Ｌ ＮａＣｌの塩濃度をさらに含む２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液に印刷されている。サポート材中の高ＮａＣｌ濃度は、「滑らかな」印刷コラーゲン・ストランドを促す。これらのストランドの形成に十分なサポート材の５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ溶液。典型的な細胞培養培地は１５〜２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳである。ストランド３００、３１０、３２０および３３０を示す各画像において、サポート材中への印刷材料のいくらかの拡散が存在するが、これは印刷材料の１０％未満に制限されている。いくつかの実施において、拡散は印刷材料の１％未満である。リン酸緩衝液をＨＥＰＥＳ緩衝液に置換する能力がカルシウムイオンの添加を可能にするために、これらのサポート材は二重のアルギナートおよびコラーゲン印刷に特に有用である。
【００２９】
図４は、種々の緩衝液の強度、および印刷以来の種々の量の経過時間後に印刷されたストランドの画像４００を示す。頂部の行は、１０×ＰＢＳを含む溶液を含むサポート材中で印刷されたストランドを示す。中央の行は、２０×１％緩衝液を含む溶液を含むサポート材中で印刷されたストランドを示す。底部の行は、２０×２％緩衝液を含む溶液を含むサポート材中で印刷されたストランドを示す。左カラムは、サポート材に印刷した直後のストランドの画像を示す。中央カラムは、サポート材に印刷の２４時間後のストランドを示す。右カラムは、サポート材へ印刷され、４℃にて２４時間貯蔵されたストランドを示す。各ストランドについて、印刷材料は２％ Ｆｉｓｈｅｒ  Ｇｅｌ Ｂを含む。０．２５％ Ｆ１２７  １％アラビアゴムが含まれ、ｐＨは６である。洗浄溶液は５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．１６％ ＣａＣｌ２、８０ｇ／Ｌ ＮａＣｌを含む。遠心分離は２０００ｇにて５分間であった。
【００３０】
図５Ａ〜５Ｂは、種々のサポート材中で印刷されたストランド５００〜５７０を印刷した例を示す。ストランドについての左画像は、ズームアウト画像を示し、一方、右画像は、拡大されている。ストランド５００〜５３０は、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｇｅｌ Ｂ  ｐＨ６、０％ アラビアゴムを含む。ストランド５４０〜５７０は、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｇｅｌ Ｂ  ｐＨ６、１％ アラビアゴムを含む。ストランド５００および５４０は、２１℃のＭＷ  ｐＨ７．４を含むサポート材中で印刷され、印刷された直後に示される。ストランド５１０および５５０は、２１℃のＭＷ  ｐＨ７．４を含むサポート材中で印刷され、印刷された４時間後に示されている。ストランド５２０および５６０は、２１℃のＭＷ  ｐＨ５．８５を含むサポート材中で印刷され、印刷された４時間後に示されている。ストランド５３０および５７０は、４℃のＭＷ  ｐＨ７．４を含むサポート材中で印刷され、印刷された４時間後に示されている。ＭＷ  ｐＨ７．４の印刷されたストランドは、２１℃にて４時間静置後劣化する。ＭＷ  ｐＨ５．８５は、ＭＷ  ｐＨ７．４より速く溶けて、その結果、印刷に用いることができないスラリーを生じる。ＨＥＰＥＳ／ＣａＣｌ２スラリーは室温にて劣化しない。ＨＥＰＥＳ／ＣａＣｌ２は、他のサポート材より顕著にゆっくり（第２の溶解サイクル）溶ける。印刷されたゲルおよび融点、イオン強度および溶解度が変更されるため、高ＮａＣｌ濃度はスラリー分解に寄与する。ＮａＣｌの添加は、コラーゲン・ストランド形態学にかなり影響し、スラリー・レオロジーが初期のコラーゲン・ストランド形態学を決定し、コラーゲン重合の完了が最終ストランドおよび構成物の忠実度を決定することを示す。サポート材（例えば、スラリー）レオロジー・パラメーターは、パッキング、電荷を介する粒子−粒子相互作用、スラリー・フロー、混合およびフラッキング（fracking）を含む。印刷材料（例えば、コラーゲン）重合についてのパラメーターは、ｐＨ、イオン強度、温度および時間を含む。
【００３１】
図６は、ストランド重合に対するゲルＢ−ＧＡ（Ａｃｒｏｓ）液相効果を示す。ストランド６００は、１×ＰＢＳを含むサポート材中で印刷されている。ストランド６１０は、１０×ＰＢＳを含むサポート材中で印刷されている。ストランド６２０は、２００ｎＭ  ＨＥＰＥＳを含むサポート材中で印刷されている。ストランド６３０は、エッセンシャル８媒体を含むサポート材中で印刷されている。ストランド６４０は、細胞外の緩衝液を含むサポート材中で印刷されている。
【００３２】
図７は、ストランド重合に対するｐＨの変更の効果を示す。各画像は、印刷の２４時間後のストランドを示す。ストランド７００は、ｐＨ８．５の緩衝剤を含むサポート材中で印刷されている。ストランド７１０は、ｐＨ９の緩衝剤を含むサポート材中で印刷されている。ストランド７２０は、ｐＨ９．５の緩衝剤を含むサポート材中で印刷されている。ストランド７３０は、ｐＨ１０の緩衝剤を含むサポート材中で印刷されている。ストランド７４０は、ｐＨ１０．５の緩衝剤を含むサポート材中で印刷されている。ストランド７５０は、ｐＨ１１の緩衝剤を含むサポート材中で印刷されている。
【００３３】
図８は、多重インク印刷の例を示す。前記のごとく、コラーゲンおよび他の緩ゲル化（slow-gelling）インクはスラリー中の拡散の傾向を有する。この現象は、コラーゲンＦＲＥＳＨ印刷を囲む拡散ヘイズ（diffuse haze）として可視でき、これに対する唯一の現在の解決方法は、印刷浴中のより積極的な方法のゲル化である。この拡散を抑制する努力は、ＮａＯＨ、Proton Sponge（シグマ）、およびリボフラビン、トランスグルタミナーゼおよびグルタルアルデヒドのごとき後処理架橋の化学薬品の使用を含む。
【００３４】
いくつかの実施において、周囲ゲルのごとき強化材なしで印刷されたコラーゲンのリングは取扱い易くない。大部分の未改変のコラーゲン・ヒドロゲル３Ｄ印刷は、永久変形を導入することなく溶液から引き上げることができない、これは、コラーゲン・ヒドロゲルは余りにも弱いので、溶液の外部でそれ自体を支持できないからである。コラーゲンの側のアルギナートのごとき硬直な（rigid）ヒドロゲルの含有は、融合し、溶液外のコラーゲンの幾何学を持続する強化を提供したであろう。
【００３５】
印刷されたアルギナート・メッシュに支持された、印刷されたコラーゲン・ヒドロゲル８００のリングは、２つのヒドロゲルの境界にて融合し続けただけでなく、空気中で複数回移された後にさえ、正確な寸法を維持することが示された。多重材料印刷８００は、アルシアンブルーで染色されたアルギナート・ヒドロゲルにより囲まれたコラーゲン・ヒドロゲルの内部リングを示し、スケールは米国ペニー貨である。ファイルからの最大の寸法偏差は、アルギナート・メッシュの横で判明し、それは８ｍｍであると思われたが、８．２５ｍｍに近く製造された。コラーゲンリングは、４．４ｍｍの内径および６ｍｍの外径を有すると想定された。アルギナート・メッシュの端縁およびコラーゲンの内径・外径につき、測定値８１０が示されている。測定された構成物８１０は、意図した直径と一致する寸法を示す。もう一つの例において、それらのアルギナート・メッシュ相当物８２０からマニュアルにて引き抜いたコラーゲン・セクション８３０は、それらと共に、アルギナート・メッシュの部分を解体中にもたらされた。解体された多重材料印刷８２０は、右側のコラーゲンリングおよび左側のアルギナート・メッシュを示す。これらの多重材料印刷のアルギナートおよびコラーゲン部分間の融合は、取扱い中にコラーゲン幾何学を維持することを担うと思われる。さらに、スケールアップした開発中の乳腺管上皮の多重材料コラーゲンおよびアルギナート印刷は、研究室床への落下を切り抜けた。多重材料印刷８４０は、その親ビーカーの破片と共に数フィート落ちた後に研究室の床に示されている。それは、回収および画像化された後、無傷であり、アルギナート繊維に包まれていることが示された。除去したコラーゲンリング８５０は、コラーゲンに融合され、分離することができず、アルギナート繊維を示し、ゲルの融合を提供した。印刷８４０は回収され、暗視野照明下で示され、プリント内部の内側の脆弱なコラーゲン成分８５０の維持を示している。コラーゲン成分についてのファイルが挿入されている。
【００３６】
コラーゲン単独が溶液外でその重量を担うように、微妙に印刷することができない脆弱な材料であるので、アルギナートでコラーゲンを強化するこの方法は、複雑なコラーゲン成分の操作を創成し可能にするための解決方法である。コラーゲンは、カルシウム−キレート化浴中の水浸によって損害なくアルギナートから単離することができ、その結果、アルギナート・メッシュの溶解およびコラーゲン成分８６０の完全なリリースを生じる。コラーゲンベースの３Ｄ印刷された組織８６０は、アルギナート糸から除去される。これらの構成物は、全体的な幾何学的忠実度を維持しつつ、細胞が蒔かれた場合にコラーゲン構成物の圧縮を示した。アルギナート・メッシュの存在により、これらの構成物は、コラーゲン成分にすべての接触および妨害なく、容易に扱い、播種し、培養し、固定することができることが注目される。
【００３７】
流体インクを利用する他の技術への比較において、ＦＲＥＳＨはより速く、より多数の材料を印刷することができ、埋め込み培地からの印刷の完全なリリースを可能にしつつ、そうすることができる。後記の表３．２は、相違点を要約する。
【００３８】
図９は、他の流体の印刷技術に対するＦＲＥＳＨの比較を示す。直接的書込み印刷は、流体のＦＤＭおよび多数の他の技術の代表である。
【００３９】
構造例
未変更のＥＣＭの組合せからいずれの幾何学も作製できることは、インビボ条件を模倣する構成で組織設計を可能にする。ＦＲＥＳＨ技術は、組織培養に適した１セットの複雑なバイオミメティック多重材料ヒドロゲル骨格の付加製造に用いた。
【００４０】
細胞を含有するコラーゲン・ヒドロゲルは、細胞の付着、増殖および再構築により経時的に圧縮し得る。このプロセスが無秩序ならば、多数の構成物が壊死性コアを含有する稠密な状態に圧縮するであろう。多数の設計された組織は、ゲル内部の応力に基づいた内部細胞を整列させるのが目的のマンドレルまたは一連の硬直なポストの周囲で圧縮される細胞のゲルから成る。無拘束の管状構成物において、圧縮は、内部管腔の初期の閉鎖および稠密な塊への最終的な融合として現れるであろう。したがって、壊死性領域および部分的な管腔閉鎖を持つより稠密で、機能障害の状態へ圧縮する導管上皮のごとき、設計された分岐構成物を期待することは合理的である。培養中に圧縮しないコラーゲンの細胞のヒドロゲル・インクを処方するすることは可能であり得るが、このための要件はこのプロジェクトの範囲外であるようである。代わりに、硬直なアルギナート・ヒドロゲル押出しの希薄なネット内部にコラーゲン構成物を埋め込むことはより容易であろう。
【００４１】
図１０は、印刷１０００によって示されたコラーゲン上のアルギナート骨格を用いる、多重材料プリント処理を示す。柔軟なコラーゲン・ヒドロゲル塊は、より硬直なアルギナート・ヒドロゲルの希薄なネットの側に３Ｄ印刷された。コラーゲン・ヒドロゲルを通常変形する力は、その代りに、構成物を包むアルギナート・メッシュに対して働くように強いられるであろう。アルギナートは付加押出機における個別のインクとしてプリントに含まれ、メッシュは、３Ｄ印刷の内部で通常見られる希薄な充填パターンとして生成されるであろう。コラーゲンのヒドロゲルおよびアルギナート・インクの二重押出しは、デュアル押出機１０１０に依拠する。もう一つのものの１つの印刷材料を不動化するこのアプローチのテストは、アルギナート・メッシュ１０２０に印刷されるコラーゲンゲルの垂直チューブのごとき単純化された幾何学を必要とするようである。２つの軸受け器が、コラーゲンおよびアルギナートヒドロゲル・インクを含む１組のシリンジ・ポンプ押出機を動かす。チューブの寸法測定は、較正印刷を用いる印刷精度の測定でのように遂行され−顕微鏡写真は公知のデジタル寸法で比較される。中空管は、ハンドリングまたは培養の間にその形状を保存するために、アルギナート・メッシュ内部の柔軟なヒドロゲルから印刷されている。
【００４２】
インビトロでのインビボ環境の複製は、インビボ等価物の外観を密接に模倣するための構成物の設計を意味する。画像データは、全体のマウントの組織試料の光学投影断層撮影（ＯＰＴ）から処理でき、ソフトウェア分析を通じて、３Ｄ印刷可能な固体として組織をモデル化する。画像データからモデル化された導管上皮全体の印刷は、分岐ツリー内の分岐点（bifurcation）のごとき上皮の内部特徴が本来の組織の幾何学的代表であることを保証する。
【００４３】
導管上皮は、乳癌研究において３つの最も一般的に用いるマウス系統に詳細に関係している、４つの別個の発生形態学を所有することが判明しているので、上皮の選択された幾何学を変更することができ、種々の形態学を横切って同様のレベルの正確度を得ることができることは重要である。３Ｄ印刷の前記正確度の確認は、ＯＰＴまたは共焦点顕微鏡のごとき技術を用いて、それらを画像化することを含み、かかるプロセスから得られたデータを用いて、３Ｄプリンターの出力を入力ファイルの寸法と直接的に比較することができる。上皮を培養するための導管上皮の正確なモデルの３Ｄ印刷は、研究者がＤＣＩＳのためのインビボ環境を密接にシミュレートし、宿主生物を用いることなく、インサイチュからの浸潤性移行（in situ-to-invasive transition）を潜在的に研究することさえを可能にするであろう。バイオミメティックであり、完全にカスタマイズ可能の双方である環境においてＤＣＩＳの挙動を調査する機会は、ＤＣＩＳのどの例が介入に値するかを理解について非常に貴重なツールを証明するであろう。実際に、印刷された上皮モデルは、ＤＣＩＳの特定の患者についての画像データから生成することができ、次いで、コアリング針生検を用いて、患者の上皮細胞および疑わしい病変の双方を含む構成物を播種することができた。患者の外側の病変の成長は、現在の患者間の有力な仮定である最悪の場合の前癌状態のシナリオを仮定せずに、医師が必要な治療ルーチンおよび標的治療を同定することを可能にする。
【００４４】
前記された多重印刷適用の柔軟性は、細胞を含むまたは細胞を含まず、いずれの複雑な幾何学も離れて圧縮する細胞の恐れなしで、いずれの柔軟なヒドロゲルからも微妙な分岐構造の原型を作ることを可能にするようなものである
【００４５】
その印刷は３Ｄ印刷ソフトウェアにおいてモデル化された。所与のモデルについてのコラーゲン成分は、ソフトウェアに導入され、次いで、付随的アルギナート成分は、ソフトウェアのメッシュ−編集メニューの利用によりオリジナルのコラーゲン成分の「一部分」として導入された。コラーゲン成分は、第１の押出機および第２のアルギナート成分の使用として特定された。次いで、アルギナート成分は、以下の表１に示される設定修飾因子を指定された。
【００４６】
【表１】
2020512944.tif 000003
【００４７】
２つの材料を印刷するために、デュアルプリンター中の第１および第２のレプリストラーダー（Replistruder）に、８０μｍ針を特徴とするコラーゲンの１００μＬシリンジ、および１５０μｍ針を特徴とするアルギナートの２．５ｍＬシリンジを装備した。コラーゲン・シリンジの８０μｍ針は非常に長く薄かったので、印刷中にたわみに付され、その結果、押出機による機械動作の貧弱な表現を生じた。この針によって印刷されたいずれの垂直管も融合する閉鎖（shut）で終わり、鋭角を丸くした。これに対する解決方法は、支柱（brace）として用いる大きな針をレーザー切断することであった。長さ２５０μｍの針の１／２をレーザー切断し、未硬化のエポキシを充填し、８０μｍ針上に滑らせ、６５℃にて２時間焼き固めた。
【００４８】
ＭＫ２は、少なくとも２４時間２５ｍＭ  Ｎａ−ＨＥＰＥＳを含む暖かい７０ｍＭ  ＣａＣｌ２中で徹底的に洗浄した後、２５ｍＭ  Ｎａ−ＨＥＰＥＳおよび５０％ｖ／ｖエタノールを含む７０ｍＭ  ＣａＣｌ２に浸漬した。次いで、この５０％エタノール溶液中のＭＫ２は、４℃にて２４時間静置させた。播種および培養開始の日に、構成物は、このエタノール溶液から取り出し、２５ｍＭ  Ｎａ−ＨＥＰＥＳを含む暖かい７０ｍＭ  ＣａＣｌ２に入れられた。少なくとも３０分間この流体中で静止した後に、構成物は２５ｍＭ  Ｎａ−ＨＥＰＥＳを含む新鮮な７０ｍＭ  ＣａＣｌ２で洗浄され、その後、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２を補足した細胞培地に入れた。
【００４９】
ＡＴＣＣ  ＭＣＦ７（ＨＴＢ−２２）およびＡＴＣＣ  ＭＣＦ  １０Ａ（ＣＲＬ−１０３１７）細胞は、ｐＨＩＶ−ＺＳＧｒｅｅｎレンチウイルスでトランスフェクトされ、流動選別し、トランスフェクトされた細胞を選択した。得られた細胞は、ＡＴＣＣガイドラインに従って培養された。構成物は、２５ｍＭ  Ｎａ−ＨＥＰＥＳを含む滅菌濾過した２０℃  １％ ＣａＣｌ２中で洗浄された。次いで、構成物は、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２および２００μｇ／ｍＬペニシリン・ストレプトマイシンを補足した２０℃の無菌濾過したＡＴＣＣ培地中に１０分間浸漬された。次いで、構成物は、ウェル当たり１構成物で６−ウェルプレート中に入れた。補足培地は、構成物の半分が沈むまで各ウェルに加えた（約３ｍＬ）。細胞は、１×１０６細胞／ｍＬにて補足培地中で懸濁された。５０μＬの細胞懸濁液は、各構成物の筒（funnel）部分の中心に直接的にピペッティングされた。構成物の半分について、それらを４側の１つに回転させ、３７℃にて２０分間そこで静止させた。次いで、播種を繰り返した後、各構成物が各側に播種されるまで、４回を超える静止期とした。構成物は、オリンパスＩＸ８３蛍光顕微鏡上で迅速に画像化して、細胞が構成物にあることを保証した。播種中に回転しなかった各細胞型につき３つの構成物の１つは、直立位置に２００，０００個の細胞を蒔いた。すべての構成物は、最終的にそれらの直立条件に戻し、７日間３７℃培養し、規則的に培地交換した。７日後に、培地は固定前に各ウェルから吸引した。
【００５０】
培養されたＭＫ２は、３７℃にて１×ＰＢＳ（０．６２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１０ｍＭ  ＣａＣｌ２を補足された）で濯がれ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）を含む４％ｗ／ｖホルムアルデヒドに１５分間固定され、次いで、２５ｍＭ  Ｎａ−ＨＥＰＥＳを含む１１ｍＭ  ＣａＣｌ２中で３回洗浄された。固定されたＭＫ２は、５×対物レンズ（０．４５のＮＡ）を持つニコンＡＺ−Ｃ２のマクロ共焦点顕微鏡、および１０×（ＮＡ＝０．４）対物レンズおよび２５×（ＮＡ＝０．９５）水浸対物レンズを持つライカＳＰ５の多光子顕微鏡で画像化した。３Ｄ画像スタックは、ＡｕｔｏＱｕａｎｔ  Ｘ３でデコンボリュート（deconvolve）され、Ｉｍａｒｉｓ７．５で処理された。
【００５１】
コラーゲンおよび細胞がアルギナート糸によって不明瞭にされる場合において、１００ｍＭ  クエン酸Ｎａ緩衝液中で固定されたＭＫ２を１２時間洗浄することにより、アルギナートを除去することが可能であった。次いで、構成物は、１０％ｗ／ｖゼラチンＡに埋め込まれ、薄切できた。次いで、付着した内部細胞を含む得られたコラーゲン成分は、顕微鏡によってアクセスできた。アルギナート糸の除去後、３Ｄ  ｚ−スタックは、ライカＳＰ５の多光子顕微鏡および２５×水対物レンズ（ＮＡ＝０．９５）で４３５ｎｍにて、コラーゲンIの反射率画像化を用いて得られた。断面積中のコラーゲンＩヒドロゲルの厚みが測定された。
【００５２】
コラーゲン押出機の針が強化された後、コアセルベート・スラリー中で創成されたＭＫ２構成物は、コラーゲンの完全に同心円状の押出しを所有し、可視的な押出しのゆがみまたは遅滞（lagging）は余りないし全くなかった。図１１は出力印刷１１００を示す。出力のこの品質は、単分散の微視的粒子を有するコアセルベートの極細目テクスチャーおよび、個別の押出機針プレ印刷の整列に払われた注意の双方に大きく起因する。ＭＫ１およびＭＫ２の構成物の外部は、正方形プロフィールを所有し、アルギナート・メッシュの９０°網目パターンを有した。筒（funnel）の縁は、意図した値の１％以内の直径をほとんど常に所有した。初期データは、導管の内部直径がその意図した値の約２％以内にあることを示す。同じデータは、培養後、印刷がリリースされた場合、それらは芽（bud）を所有することが判明し、これが印刷するために用いたファイルの意図した直径の２％以内に常にあることを示した。
【００５３】
図１２は、埋め込み印刷プロセスの例の流れ図１２００を示す。インジェクターは、第１の固相と第１の流体相との間で転移するように構成されたサポート材内部に移動する（１２１０）。インジェクターは、（１２２０）サポート材の一部分が第１の固相から第１の流体相に変化させる。インジェクターは（１２３０）印刷材料をサポート材に注入する。印刷材料は、（１２４０）サポート材の第１の流体相と印刷材料の第２の流体相との間の流体−流体相互作用に基づいて、サポート材中で第２の流体相から第２の固相に転移する。サポート材は、（１２５０）印刷材料から除去される。
【００５４】
多数の具体例が記載されている。しかしながら、種々の変更が特許請求の範囲の精神および範囲から逸脱することなく成され得ることが理解されるであろう。したがって、他の具体例は、以下の特許請求の範囲内にある。
【図１】
2020512944.tif 000004
【図２】
2020512944.tif 000005
【図３】
2020512944.tif 000006
【図４】
2020512944.tif 000007
【図５Ａ】
2020512944.tif 000008
【図５Ｂ】
2020512944.tif 000009
【図６】
2020512944.tif 000010
【図７】
2020512944.tif 000011
【図８Ａ】
2020512944.tif 000012
【図８Ｂ】
2020512944.tif 000013
【図８Ｃ】
2020512944.tif 000014
【図８Ｄ】
2020512944.tif 000015
【図８Ｅ】
2020512944.tif 000016
【図８Ｆ】
2020512944.tif 000017
【図８Ｇ】
2020512944.tif 000018
【図９】
2020512944.tif 000019
【図１０】
2020512944.tif 000020
【図１１】
2020512944.tif 000021
【図１２】
2020512944.tif 000022
【国際調査報告】
2020512944.tif 000023