(57)【要約】例示的な実施形態において、１つ又は複数の細胞の内部の核酸配列への複数の編集を自動化する自動マルチモジュール細胞編集機器が提供される。
2020530979.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
自動マルチモジュール細胞編集機器において、
モジュールの幾つかの全てを収容する筐体と、
細胞を受容するレセプタクルと、
核酸を受容する１つ又は複数のレセプタクルと、
前記核酸を前記細胞に導入する形質転換モジュールと、
前記形質転換モジュールにおける細胞の形質転換後、前記細胞が回復することを可能にする回復モジュールと、
前記導入された核酸が前記細胞内の核酸を編集することを可能にする編集モジュールと、
ユーザ入力及び予めプログラムされたスクリプトの選択のうちの少なくとも一方に基づいて、前記自動マルチモジュール細胞編集機器を動作させるプロセッサと
を備える、自動マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項２】
前記１つ又は複数のレセプタクル内の前記核酸は、骨格及び編集カセットを有し、及び前記自動マルチモジュール細胞編集機器は、核酸アセンブリモジュールを更に備える、請求項１に記載の自動マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項３】
前記核酸アセンブリモジュールは、磁石を有する、請求項２に記載の自動マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項４】
前記核酸アセンブリモジュールは等温核酸アセンブリを実行するように構成される、請求項３に記載の自動マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項５】
前記編集モジュール及び前記回復モジュールは結合される、請求項１に記載の自動マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項６】
前記細胞を成長させる成長モジュールを更に備える、請求項１に記載の自動マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項７】
前記成長モジュールは前記成長する細胞の光学濃度を測定する、請求項６に記載の自動マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項８】
光学濃度は連続して測定される、請求項７に記載の自動マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項９】
前記プロセッサは、前記細胞がユーザによって要求される時間に標的光学濃度に達するように、前記成長モジュール内の成長条件を調整するように構成される、請求項６に記載の自動マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項１０】
前記細胞を受容するレセプタクル及び前記核酸を受容する１つ又は複数のレセプタクルは、試薬カートリッジ内に収容される、請求項１に記載の自動マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項１１】
細胞編集に必要な幾つか又は全ての試薬は、前記試薬カートリッジ内に収容される、請求項１０に記載の自動マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項１２】
前記試薬カートリッジ内に収容される前記試薬は、前記プロセッサによって読み出されるスクリプトによって位置特定可能である、請求項１１に記載の自動マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項１３】
前記試薬カートリッジは試薬を含み、且つキットにおいて提供される、請求項１２に記載の自動マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項１４】
前記形質転換モジュールは電気穿孔デバイスを含む、請求項１に記載の自動マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項１５】
前記電気穿孔デバイスはフロースルー電気穿孔デバイスである、請求項１４に記載の自動マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項１６】
前記細胞を濃縮させ、且つ前記細胞をエレクトロコンピテントにさせるように構成された濾過モジュールを更に備える、請求項１に記載の自動マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項１７】
自動マルチモジュール細胞編集機器において、
モジュールの幾つか又は全てを収容する筐体と、
細胞を受容するレセプタクルと、
核酸を受容する少なくとも１つのレセプタクルと、
骨格及び編集カセットをアセンブルする核酸アセンブリモジュールと、
前記細胞を成長させる成長モジュールと、
アセンブルされた核酸を前記細胞に導入するためのエレクトロポレータを含む形質転換モジュールと、
前記アセンブルされた核酸が前記細胞内の核酸を編集することを可能にする編集モジュールと、
ユーザ入力及び予めプログラムされたスクリプトの選択のうちの少なくとも一方に基づいて、前記自動マルチモジュール細胞編集機器を動作させるプロセッサと
を備える、自動マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項１８】
前記自動マルチモジュール細胞編集機器において細胞編集を実行するための試薬を収容する少なくとも１つの試薬カートリッジを更に備える、請求項１７に記載の自動マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項１９】
前記細胞及び前記核酸のための前記レセプタクルは、前記試薬カートリッジ内に配置される、請求項１８に記載の自動マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項２０】
自動マルチモジュール細胞編集機器において、
モジュールの幾つか又は全てを収容する筐体と、
細胞を受容するレセプタクルと、
核酸を受容する少なくとも１つのレセプタクルと、
ａ）骨格及び編集カセットをアセンブルし、且つｂ）アセンブリ後、アセンブルされた核酸を脱塩する核酸アセンブリモジュールと、
前記細胞を成長させる成長モジュールと、
前記細胞を濃縮させ、且つ前記細胞をエレクトロコンピテントにさせる濾過モジュールと、
前記アセンブルされた核酸を前記細胞に導入するためのフロースルーエレクトロポレータを含む形質転換モジュールと、
前記形質転換モジュールにおける電気穿孔後、前記細胞が回復することを可能にし、且つ前記核酸が前記細胞を編集することを可能にする、回復及び編集結合モジュールと、
ユーザ入力に基づいて前記自動マルチモジュール細胞編集機器を動作させるプロセッサと
を備える、自動マルチモジュール細胞編集機器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
以下の考察において、背景及び紹介目的で特定の物品及び方法について説明する。ここに含まれるものは、先行技術であることを「認める」ものとして解釈されるべきではない。適切な場合、本出願人は、適切な法律規定下において、ここで参照される物品及び方法が先行技術をなさないことを示す権利を明示的に留保する。
【背景技術】
【０００２】
人工ヌクレアーゼを用いたゲノム編集は、核酸への変更が生体のゲノムにおいて行われる方法である。特定のヌクレアーゼは、ゲノムの標的領域において部位特異的二本鎖切断を生じさせ、この切断は、非相同末端結合又は相同組換えによって修復することができ、標的編集を生じさせる。しかしながら、これらの方法は、低効率性及び細胞形質転換に伴う問題、成長測定及び細胞選択に起因して自動化に対応していなかった。更に、従来のベンチトップデバイスは、必ずしも自動化されたモジュールシステムに良好にスケーリング及び統合されるわけではない。したがって、編集された細胞集団を作成する方法及びシステムは、厄介なままであり、再帰的技法を用いて複数ラウンドの編集を導入するという問題により、作成することができる細胞集団の性質及び複雑性が制限される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
したがって、編集された細胞が、自動化された機器外部での更なる実験に使用可能なである、アセンブルされた核酸及び他の生体分子を生体細胞に自動的に導入するための自動化機器、システム及び方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
特定の実施形態では、複数の細胞内の１つ又は複数の標的ゲノム領域のヌクレアーゼ特異的なゲノム編集の自動方法が使用され、方法は、自動マルチモジュール細胞編集機器において実行される。これらの方法は、所望のゲノム変更で関心がある生体細胞のライブラリの生成に使用することができる。本明細書に記載される自動マルチモジュール細胞編集機器を用いて実行される自動方法は、多様なヌクレアーゼ特異的ゲノム編集技法と併用することができ、１つ又は複数の選択可能なマーカの使用あり又はなしで使用することができる。
【０００５】
したがって、本開示は、選択された実施形態において、ヌクレアーゼ特異的ゲノム編集を含む自動マルチモジュール細胞編集のためのモジュール、機器及びシステムを提供する。本開示の自動マルチモジュール細胞編集機器の他の特定の実施形態は、再帰的ゲノム編集に向けて、例えば機器内の２つ以上の編集動作を通して細胞集団の１つ又は複数の細胞内部のゲノムに複数の編集を順次導入するように設計される。
【０００６】
したがって、本明細書において、自動マルチモジュール細胞編集機器であって、モジュールの幾つか又は全てを収容するように構成された筐体と、細胞を受けるように構成されたレセプタクルと、核酸を受けるように構成された１つ又は複数のレセプタクルと、核酸を細胞に導入するように構成された形質転換モジュールと、形質転換モジュールにおける細胞の形質転換後、細胞が回復することを可能にするように構成された回復モジュールと、細胞に形質転換された核酸が細胞内の核酸を編集することを可能にするように構成された編集モジュールと、ユーザ入力及び／又は適切なコントローラスクリプトの選択に基づいて、自動マルチモジュール細胞編集機器を動作させるように構成されたプロセッサとを含む自動マルチモジュール細胞編集機器の実施形態が提供される。
【０００７】
幾つかの態様では、１つ又は複数のレセプタクル内の核酸は、骨格及び編集カセットを含み、及び自動マルチモジュール細胞編集機器は、核酸アセンブリモジュールを更に含む。幾つかの態様では、核酸アセンブリモジュールは、磁石を含み、幾つかの態様では、核酸アセンブリモジュールは、１つの等温反応を用いてアセンブリを実行するように構成される。他の態様では、核酸アセンブリモジュールは、増幅及び／又はライゲーションを実行するように構成される。
【０００８】
自動マルチモジュール細胞編集機器の幾つかの態様では、編集モジュール及び回復モジュールは、結合される。
幾つかの態様では、自動マルチモジュール細胞編集機器は、細胞を成長させるように構成された成長モジュールを更に含み得、幾つかの実装形態では、成長モジュールは、成長する細胞の光学濃度を連続して又は間隔を置いて測定する。幾つかの実装形態では、プロセッサは、細胞が、ユーザによって要求される時間に標的光学濃度に達するように、成長モジュール内の成長条件を調整するように構成される。更に、幾つかの実施形態では、ユーザは、成長プロセスに関して更新情報を提供され得る。
【０００９】
幾つかの態様では、自動マルチモジュール細胞編集機器は、試薬カートリッジであって、細胞を受けるように構成されたレセプタクル及び核酸を受けるように構成された１つ又は複数のレセプタクルが試薬カートリッジ内に含まれる、試薬カートリッジを含む。更に、試薬カートリッジは、細胞編集に必要な幾つか又は全ての試薬を含むこともできる。幾つかの実装形態では、試薬カートリッジ内に含まれる試薬は、プロセッサによって読み出されるスクリプトによって位置特定可能であり、幾つかの実装形態では、試薬カートリッジは、試薬を含み、且つキットにおいて提供される。
【００１０】
幾つかの態様では、自動マルチモジュール細胞編集機器の形質転換モジュールは、電気穿孔デバイスを含み、幾つかの実装形態では、電気穿孔デバイスは、フロースルー電気穿孔デバイスである。
【００１１】
自動マルチモジュール細胞編集機器の幾つかの態様は、液体を交換し、且つ／又は細胞を濃縮させるように構成された濾過モジュールを更に含む。特定の態様では、濾過システムは、細胞をエレクトロコンピテントにさせるのにも使用され得る。
【００１２】
他の実施形態では、自動マルチモジュール細胞編集機器であって、モジュールの幾つか又は全てを収容するように構成された筐体と、細胞を受けるように構成されたレセプタクルと、核酸骨格及び編集カセットを受けるように構成された少なくとも１つのレセプタクルと、ａ）骨格及び編集カセットをアセンブルし、且つｂ）アセンブリ後、アセンブルされた核酸を脱塩するように構成された核酸アセンブリモジュールと、細胞を成長させ、且つ細胞の光学濃度（ＯＤ：ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ）を測定するように構成された成長モジュールと、細胞を濃縮させ、且つ細胞をエレクトロコンピテントにさせるように構成された濾過モジュールと、アセンブルされた核酸を細胞に導入するためのフロースルーエレクトロポレータを含む形質転換モジュールと、形質転換モジュールにおける電気穿孔後、細胞が回復することを可能にし、且つアセンブルされた核酸が細胞内の核酸を編集することを可能にするように構成された回復及び編集結合モジュールと、ユーザ入力及び／又は適切なコントローラスクリプトの選択に基づいて自動マルチモジュール細胞編集機器を動作させるように構成されたプロセッサとを含む自動マルチモジュール細胞編集機器が提供される。
【００１３】
幾つかの実装形態では、自動マルチモジュール細胞編集機器は、複数の試薬リザーバと、フロースルー電気穿孔デバイスと、複数の試薬リザーバに配置された試薬を分注し、且つフロースルー電気穿孔デバイスを制御するためのプロセッサ可読のスクリプトとを含む試薬カートリッジを提供する。
【００１４】
幾つかの態様では、成長モジュールは、温度被制御回転成長バイアルと、バイアルをスピンさせるモータアセンブリと、バイアル内の例えばＯＤを測定する分光光度計と、ユーザから入力を受け入れ、且つ細胞の成長速度を制御するためのプロセッサとを含む。成長モジュールは、回転成長バイアル内の成長する細胞のＯＤを連続して又は設定された間隔で自動的に測定し、且つユーザによって指定された標的ＯＤ及び標的時間に細胞の成長を制御し得る。すなわち、本明細書に記載される方法及びデバイスは、細胞の成長をリアルタイムでモニタし、ユーザによって指定された標的時間に標的ＯＤに達するように回転成長バイアルの温度をリアルタイムで調整するフィードバックループを提供する。
【００１５】
自動マルチモジュール細胞編集機器の幾つかの態様では、形質転換モジュールは、フロースルー電気穿孔デバイスを含み、フロースルー電気穿孔デバイスは、細胞試料及びアセンブルされた核酸をフロースルー電気穿孔デバイス内に導入する入口及び入口チャネルと、電気穿孔された細胞試料がフロースルー電気穿孔デバイスから出るための出口及び出口チャネルと、入口チャネルと出口チャネルとの間を横切り、且つ入口チャネルと出口チャネルとの間に位置するフローチャネルと、２つ以上の電極であって、第１の入口チャネルとのフローチャネルの交点と出口チャネルとのフローチャネルの交点との間に位置し、フローチャネル内の細胞試料と流体連通し、且つ細胞試料に１つ又は複数の電気パルスを印加するように構成された２つ以上の電極とを含む。特定の態様では、フロースルー電気穿孔デバイスは、平行な２つ以上のフローチャネルを含むことができる。
【００１６】
自動マルチモジュール細胞編集機器を用いて、細胞内でゲノム編集動作を実行するシステムも提供される。これらのシステムは、任意選択的に、機器と、細胞準備、核酸準備、編集された細胞集団の選択、編集された細胞集団の機能分析、編集された細胞集団の貯蔵等の他のデバイス又はレセプタクルとの間の１つ又は複数の境界部分を含み得る。
【００１７】
加えて、自動マルチモジュール細胞編集機器を用いる方法が提供される。幾つかの方法では、エレクトロコンピテント細胞は、好適には、所望の光学濃度で機器に直接提供され、且つ形質転換モジュールに移される。幾つかの方法では、細胞は、成長モジュールに移され、成長モジュールにおいて所望の光学濃度まで成長する。次に、細胞は、成長バイアルから濾過モジュールに移され、濾過モジュールにおいて、細胞は、濃縮され、任意選択的にエレクトロコンピテントにされる。次に、細胞は、形質転換モジュールに移される。
【００１８】
幾つかの態様では、アセンブルされた核酸カセットは、本機器に直接提供され、且つ形質転換モジュールに移される。幾つかの態様では、ベクター骨格及び１つ又は複数のオリゴヌクレオチド編集カセット等の核酸は、細胞の導入若しくは準備と同時に又は細胞の導入若しくは準備に続けて核酸アセンブリモジュールに移される。この態様では、核酸は、アセンブルされ、脱塩され（例えば、液体交換又は浸透を通して）、且つ形質転換モジュールに移されて、電気穿孔されてエレクトロコンピテント細胞になる。形質転換モジュールにおいて電気穿孔又はトランスフェクションが行われ、次に、細胞は、任意選択的に１つ又は複数のゲノム編集を含む細胞の選択を含む回復／編集モジュールに移される。回復／編集／選択後、細胞は、回収され、研究に直接使用されるか若しくは更なる研究に向けて貯蔵され得るか、又は機器内で編集ステップを繰り返すことにより、ゲノム編集の更なる１つのラウンド（又は複数のラウンド）を実行することができる。
【００１９】
ヌクレアーゼ特異的ゲノム編集のための、自動マルチモジュール細胞編集機器を用いて作成される細胞ライブラリも提供され、機器は、筐体と、細胞及び細胞内でのヌクレアーゼ特異的ゲノム編集イベントを促進する配列を含む１つ又は複数の合理的に設計された核酸を受けるように構成されたレセプタクルと、核酸を細胞に導入する形質転換モジュールと、ヌクレアーゼ特異的ゲノム編集イベントを細胞内で発生させる編集モジュールと、ユーザ入力に基づいて自動マルチモジュール細胞編集機器を動作させるように構成されたプロセッサとを含み、自動機器によって作成されたヌクレアーゼ特異的ゲノム編集イベントは、合理的に設計された編集を有する個々の細胞を含む細胞ライブラリを作成させる。
【００２０】
幾つかの態様では、細胞ライブラリは、飽和突然変異誘発細胞ライブラリを含む。幾つかの態様では、細胞ライブラリは、プロモータスワップ細胞ライブラリを含む。他の態様では、細胞ライブラリは、ターミネータスワップ細胞ライブラリを含む。更に他の態様では、細胞ライブラリは、一塩基多型（ＳＮＰ：ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）スワップ細胞ライブラリを含む。更に他の態様では、細胞ライブラリは、プロモータスワップ細胞ライブラリを含む。
【００２１】
幾つかの実装形態では、ライブラリは、少なくとも１００，０００個の編集された細胞を含み、更に他の実装形態では、ライブラリは、少なくとも１，０００，０００個の編集された細胞を含む。
【００２２】
幾つかの実装形態では、ヌクレアーゼ特異的ゲノム編集は、ＲＧＮ特異的ゲノム編集である。好適な態様では、機器は、誘導型ヌクレアーゼの使用に向けて構成される。ヌクレアーゼは、例えば、化学誘導、ウィルス誘導、光誘導、温度誘導又は熱誘導され得る。
【００２３】
幾つかの実装形態では、本機器は、単一のサイクルでの複数の細胞の多重化ゲノム編集を提供する。幾つかの態様では、本機器は、少なくとも５つの細胞のゲノムを単一のサイクルで編集する能力を有する。他の態様では、本機器は、少なくとも１００個の細胞のゲノムを単一のサイクルで編集する能力を有する。更に他の態様では、本機器は、少なくとも１０００個の細胞のゲノムを単一のサイクルで編集する能力を有する。更に他の態様では、本機器は、少なくとも１０，０００個の細胞のゲノムを単一のサイクルで編集する能力を有する。特定の態様では、自動マルチモジュール細胞編集機器は、少なくとも１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、１０９個、１０１０個、１０１１個、１０１２個、１０１３個、１０１４個又はそれを超える細胞のゲノムを単一のサイクルで編集する能力を有する。
【００２４】
単一のサイクルでの編集で標的とすることができる細胞集団内のゲノム部位の数は、２〜１０，０００，０００個であり得る。
再帰的編集が関わる幾つかの実施形態では、自動マルチモジュール細胞編集機器は、２つ以上のゲノム編集を細胞に導入することを提供し、１つのゲノム編集が各サイクルで細胞集団のゲノムに追加される。したがって、幾つかの態様では、本開示の自動マルチモジュール細胞編集機器は、１サイクル当たり細胞集団中の細胞ごとに２つ以上の編集、細胞集団中の１細胞当たり３つ以上の編集、集団中の細胞ごとに５つ以上の編集又は単一のサイクルで細胞集団の細胞ごとに１０以上の編集を順次提供するのに有用である。
【００２５】
特定の実施形態では、自動マルチモジュール細胞編集機器は、１サイクル当たり編集モジュールに導入される細胞の少なくとも１０％という編集効率、好適には１サイクル当たり編集モジュールに導入される細胞の少なくとも２０％という編集効率、より好適には１サイクル当たり編集モジュールに導入される細胞の少なくとも２５％という編集効率、更に好適には１サイクル当たり自動マルチモジュール細胞編集機器の編集モジュールに導入される細胞の少なくとも３０％という編集効率、更に好適には１サイクル当たり編集モジュールに導入される細胞の少なくとも４０％という編集効率、更に好適には１サイクル当たり編集モジュールに導入される細胞の５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれを超える編集効率を提供することが可能である。
【００２６】
他の特徴、利点及び態様について以下により詳細に説明する。
添付図面は、本明細書に組み込まれ、本明細書の一部をなし、１つ又は複数の実施形態を示し、説明と一緒にこれらの実施形態を説明する。添付図面は、必ずしも一定の縮尺で描かれているわけではない。添付のグラフ及び図に示されている任意の値、寸法は、単に例示を目的とし、実際の又は好適な値又は寸法を表すこともあれば表さないこともある。妥当な場合、土台となる特徴の説明を支援するために、幾つか又は全ての特徴は、示されないことがある。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１Ａ】機器の一部として交換式カートリッジを用いて複数の細胞の多重化ゲノム編集を行う自動マルチモジュール細胞処理機器の一例の実施形態を示す平面図。
【図１Ｂ】機器の一部として交換式カートリッジを用いて複数の細胞の多重化ゲノム編集を行う自動マルチモジュール細胞処理機器の一例の実施形態を示す斜視図。
【図２Ａ】図１Ａ及び図１Ｂの自動マルチモジュール細胞処理機器の側面図。
【図２Ｂ】図１Ａ及び図１Ｂの自動マルチモジュール細胞処理機器の正面図。
【図２Ｃ】自動マルチモジュール細胞処理機器の第２の例のシャーシを示す斜視図。
【図２Ｄ】自動マルチモジュール細胞処理機器の第２の例のシャーシを示す斜視図。
【図３Ａ】自動マルチモジュール細胞処理機器において使用する一例の細胞洗浄又は濃縮モジュールの側面図。
【図３Ｂ】自動マルチモジュール細胞処理機器において使用する一例の細胞洗浄又は濃縮モジュールの斜視図。
【図３Ｃ】自動マルチモジュール細胞処理機器において使用する一例の細胞洗浄又は濃縮モジュールの切り欠き断面図。
【図４】自動マルチモジュール細胞処理機器において使用する核酸アセンブリモジュール及び精製モジュールの一例の組合せを示す斜視図。
【図５Ａ】自動マルチモジュール細胞処理機器において使用する一例のインライン電子専攻モジュールを示す模式図。
【図５Ｂ】自動マルチモジュール細胞処理機器において使用する一例の使い捨てのフロースロー電気穿孔モジュールを示す斜視図。
【図５Ｃ】自動マルチモジュール細胞処理機器において使用する一例の使い捨てのフロースロー電気穿孔モジュールを示す斜視図。
【図６Ａ】自動マルチモジュール細胞処理機器において使用する一例の洗浄カートリッジを示す。
【図６Ｂ】自動マルチモジュール細胞処理機器において使用する一例の洗浄カートリッジを示す。
【図６Ｃ】自動マルチモジュール細胞処理機器において使用する一例の試薬カートリッジを示す。
【図６Ｄ】自動マルチモジュール細胞処理機器において使用する一例の試薬カートリッジを示す。
【図６Ｅ】自動マルチモジュール細胞処理機器において使用する一例の試薬カートリッジを示す。
【図７Ａ】自動マルチモジュール細胞処理機器において使用する一例の濾過モジュールの機能ブロック図。
【図７Ｂ】自動マルチモジュール細胞処理機器において使用する一例の濾過モジュールの斜視図。
【図７Ｃ】自動マルチモジュール細胞処理機器において使用する一例の濾過モジュールの斜視図。
【図７Ｄ】自動マルチモジュール細胞処理機器において使用する一例のフィルタカートリッジの斜視図。
【図８Ａ】自動マルチモジュール細胞処理機器において使用する例としての細胞成長モジュールを示す。
【図８Ｂ】自動マルチモジュール細胞処理機器において使用する例としての細胞成長モジュールを示す。
【図８Ｃ】自動マルチモジュール細胞処理機器において使用する例としての細胞成長モジュールを示す。
【図８Ｄ】自動マルチモジュール細胞処理機器において使用する例としての細胞成長モジュールを示す。
【図８Ｅ】自動マルチモジュール細胞処理機器において使用する例としての細胞成長モジュールを示す。
【図８Ｆ】自動マルチモジュール細胞処理機器において使用する例としての細胞成長モジュールを示す。
【図９】自動マルチモジュール細胞処理機器の一例の方法のフローチャート。
【図１０Ａ】自動マルチモジュール細胞処理機器による細菌細胞の自動処理の第１の例の作業フローの流れ図。
【図１０Ｂ】自動マルチモジュール細胞処理機器による細菌細胞の自動処理の第２の例の作業フローの流れ図。
【図１０Ｃ】自動マルチモジュール細胞処理機器による酵母細胞の自動細胞処理の一例の作業フローの流れ図。
【図１１】自動マルチモジュール細胞処理機器に命令を提供し、自動マルチモジュール細胞処理機器からフィードバックを受信する一例のグラフィカルユーザインターフェースを示す模式図。
【図１２Ａ】複数の細胞の多重化ゲノム編集の自動マルチモジュール細胞処理機器の別の例の実施形態の機能ブロックシステム図。
【図１２Ｂ】複数の細胞の再帰的多重化ゲノム編集の自動マルチモジュール細胞処理機器の更に別の例の実施形態の機能ブロックシステム図。
【図１３】自動マルチモジュール細胞処理機器において使用する一例の制御システムを示すブロック図。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
添付図面と併せて以下に記載される説明は、開示される主題の種々の例示的な実施形態の説明であることが意図される。特定の特徴及び機能が例示的な各実施形態と併せて説明されるが、それらの特定の特徴及び機能のそれぞれなしに、開示される実施形態が実施可能であることが当業者に明白になるであろう。
【００２９】
本明細書に記載される技法の実施は、グリーン（Ｇｒｅｅｎ）ら編、（１９９９年）、ゲノム解析：ラボラトリーマニュアルシリーズ（Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ）（第Ｉ−ＩＶ巻）；ウィーナー（Ｗｅｉｎｅｒ）、ガブリエル（Ｇａｂｒｉｅｌ）、ステファン（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ）編、（２００７年）、遺伝的変異：ラボラトリーマニュアル（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）；ディーフェンバハ（Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ）、ドベクスラー（Ｄｖｅｋｓｌｅｒ）編、（２００３年）、ＰＣＲプライマー：ラボラトリーマニュアル（ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）；ボーテル（Ｂｏｗｔｅｌｌ）及びサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）著、（２００３年）、バイオインフォマティクス：配列及びゲノム解析（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）；サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）及びラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ）著、（２００６年）、分子クローニングからの濃縮プロトコール：ラボラトリーマニュアル（Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）；並びにグリーン（Ｇｒｅｅｎ）及びサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）著、（分子クローニング：ラボラトリーマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、第４版、コールドスプリングハーバ研究所プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州コールドスプリングハーバ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）、２０１４年）；ストライヤー，Ｌ（Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ）、（１９９５年）、生化学（第４版）、Ｗ．Ｈ．フリーマン（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ）、ニューヨーク州ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｎ．Ｙ．）；ゲイト（Ｇａｉｔ）著、「オリゴヌクレオチド合成：実用手法（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）」、１９８４年、ＩＲＬプレス（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）、ロンドン（Ｌｏｎｄｏｎ）；ネルソン（Ｎｅｌｓｏｎ）及びコックス（Ｃｏｘ）著、（２０００年）、レーニンジャ（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ）、生化学の原理（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第３版、Ｗ．Ｈ．フリーマン出版（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｕｂ．）、ニューヨーク州ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）；並びにバーグ（Ｂｅｒｇ）ら著、（２００２年）、生化学、第５版、Ｗ．Ｈ．フリーマン出版（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｕｂ．）、ニューヨーク州ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ）に記載の技法を利用し得、これらの全ては、あらゆる目的のために全体的に参照により本明細書に援用される。
【００３０】
なお、本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈により明らかに別段のことが示される場合を除き、複数の対象物を含む。したがって、例えば、「オリゴ」への言及は、同じ機能を果たす１つ又は複数のオリゴを指し、「方法」への言及は、当業者に既知の同等のステップ及び方法への言及を含む等である。すなわち、別段のことが明示的に指示されない限り、本明細書で使用される場合、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」という言葉は、「１つ又は複数」の意味を有する。更に、本明細書で使用し得る「左」、「右」、「上」、「下」、「前」、「後」、「横」、「高さ」、「長さ」、「幅」、「上方」、「下方」、「内部」、「外部」、「内側」、「外側」等の用語は、単に視点を記述し、本開示の実施形態を任意の特定の向き又は構成に必ずしも限定するわけではないことを理解されたい。更に、「第１の」、「第２の」、「第３の」等の用語は、単に本明細書に開示される幾つかの部分、構成要素、ステップ、動作、機能及び／又は評価基準の１つを識別し、同様に本開示の実施形態を任意の特定の構成又は向きに必ずしも限定するわけではない。
【００３１】
更に、「概ね」、「近く」、「少ない」という用語及び同様の用語は、一般に、特定の実施形態では、２０％、１０％又は好適には５％のマージン内の識別された値を含む範囲及びそれらの間の任意の値を指す。
【００３２】
別段のことが定義される場合を除き、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。
【００３３】
本明細書において言及された全ての公開物（特許、公開出願及び非特許文献を含む）は、限定ではなく、本明細書に記載される方法、モジュール、機器及びシステムと併せて使用又は変更され得るデバイス、システム及び方法を説明及び開示する目的を含め、あらゆる目的のために参照により援用される。
【００３４】
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限との間にある各介在値及びその言及された範囲内の任意の他の言及された値又は介在値が本開示内に包含されることが理解される。これらの小範囲の上限及び下限は、小範囲に独立して含まれ得、また言及された範囲内の任意の特に除外された限度を受けて、本開示内にも包含される。言及された範囲が限度の一方又は両方を含む場合、それらの包含される限度の両方のいずれかを除外した範囲も本開示に含まれる。
【００３５】
本明細書全体を通した「一実施形態」又は「実施形態」への言及は、実施形態と併せて説明された特定の特徴、構造又は特性が、開示される主題の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体を通して種々の箇所での句「一実施形態では」又は「実施形態では」の出現は、必ずしも同じ実施形態を指すわけではない。
【００３６】
更に、特定の特徴、構造又は特性は、１つ又は複数の実施形態において任意の適した様式で組み合わされ得る。更に、開示された主題の実施形態は、その変更形態及び変形形態を包含することが意図される。
前置き及び概説
選択された実施形態では、本明細書に記載される自動マルチモジュール細胞編集機器、システム及び方法は、生体細胞における多重化ゲノム編集及び編集された細胞集団のライブラリを構築する方法において使用することができる。本明細書に開示される自動マルチモジュール細胞編集機器は、多様なゲノム編集技法、特にヌクレアーゼ特異的ゲノム編集と併用することができる。本開示の自動マルチモジュール細胞編集機器は、コード領域、非コード領域又は両方への種々のクラスのゲノム編集を含むライブラリを構築する方法を含め、生体細胞のゲノムを編集するゲノム部位をターゲティングする核酸配列を導入する新規の方法を提供する。自動マルチモジュール細胞編集機器は、複数の細胞にゲノム編集を単一のサイクルで導入し、それにより１つ又は複数のゲノム編集を有する細胞のライブラリを自動的に多重化して生成するのに特に適する。自動マルチモジュール細胞編集機器は、２つ以上の編集、例えば細胞集団の個々の細胞内の異なる標的ゲノム部位への編集を導入するのにも適する。１つであれ多数であれ関係なく、これらのゲノム編集は、好適には、合理的に設計された編集、すなわち特定の編集を細胞のゲノム内の標的領域に導入するように設計及び作成された核酸である。ゲノム編集イベントの促進に使用される配列は、ヌクレアーゼ切断のガイド、関心領域へのゲノム編集の導入及び／又は両方を支援する配列を含む。これらの配列は、細胞のゲノム内の特定の合理的に設計された編集を追跡できるようにする細胞のゲノムの領域への編集を含むこともできる。編集を細胞に導入するそのような方法は、例えば、「ＣＲＩＳＰＲ可能な多重化ゲノム工学（ＣＲＩＳＰＲ  ｅｎａｂｌｅｄ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」という名称のギル（Ｇｉｌｌ）らによる米国特許第９，９８２，２７８号明細書、「バーコード付きコンビナトリアルライブラリを生成する方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｂａｒｃｏｄｅｄ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）」という名称のギル（Ｇｉｌｌ）らによる米国特許第１０，０１７，７６０号明細書、米国特許出願第１５／６３２，２２２号明細書に教示されている。
【００３７】
そのような核酸及びオリゴヌクレオチド（又は「オリゴ」）は、限定ではなく、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド又はそれらの類似体のいずれかを含め、種々の長さを有し得るヌクレオチドの重合形態を含むことが意図される。例示的な実施形態で使用される核酸及びオリゴヌクレオチドは、化学合成又は続く酵素的修飾又はポリメラーゼ複製中に導入される安定性を強化するように１つ又は複数の位置において修飾することができる。これらの修飾は、限定ではなく、オリゴマーへの１つ又は複数のアルキル化核酸、ロックド核酸（ＬＮＡ：ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ：ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、ホスホン酸、ホスホチオエートの包含を含む。修飾ヌクレオチドの例には、限定ではなく、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｄ４６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ及び２，６−ジアミノプリンがある。核酸分子は、塩基部分、糖部分又はリン酸骨格において修飾することもできる。
ヌクレアーゼ特異的ゲノム編集
選択された実施形態では、本明細書に記載される自動マルチモジュール細胞編集機器は、ヌクレアーゼ特異的ゲノム編集システムを利用する。編集を有機体のゲノムに提供する多数の異なるヌクレアーゼベースのシステムが存在し、それぞれは、単一編集システム、順次編集システム（例えば、異なるヌクレアーゼ特異的システムを順次使用して、２つ以上のゲノム編集を細胞内に提供する）及び／又は再帰的編集システム（例えば、１つのヌクレアーゼ特異的システムを使用して、２つ以上のゲノム編集を細胞内に導入する）のいずれかで使用することができる。例示的なヌクレアーゼ特異的ゲノム編集システムが本明細書に記載されるが、本開示を読んだ上で、例示的な実施形態の自動マルチモジュール細胞編集機器において他の酵素特異的編集システムも有用であることを当業者は認識するであろう。
【００３８】
本明細書に記載される自動システムは、本開示の機器を用いたゲノムの切断及び標的ゲノム領域への編集の導入にヌクレアーゼを使用できることに留意されたい。
例示的な実施形態の特定の態様では、ヌクレアーゼ編集システムは、編集のタイミングの制御が可能な誘導性システムである。誘導性システムは、ヌクレアーゼの誘導性発現、編集核酸の誘導性発現又は両方を含み得る。ヌクレアーゼ活性を調節する能力は、オフターゲット切断を低減し、精密なゲノム組換えを促進することができる。本開示を読んだ上で当業者に明かになるように、本開示の自動マルチモジュール細胞編集機器と併せて多くの異なる誘導性システムを使用することができる。
【００３９】
特定の態様では、ヌクレアーゼによる切断は、標的領域におけるゲノム編集を用いる細胞を選択するために、例示的な実施形態の自動マルチモジュール細胞編集機器と併用することもできる。例えば、特定のヌクレアーゼ認識部位を除去する（例えば、相同組換えを介する）ゲノム編集を受けた細胞は、そのような編集に続き、細胞をヌクレアーゼに暴露することにより、例示的な実施形態の自動マルチモジュール細胞編集機器及びシステムを用いて選択することができる。ゲノム編集のない細胞内のＤＮＡは、切断され、続けて限られた成長を有し、且つ／又は死ぬ一方、ヌクレアーゼ認識部位を除去するゲノム編集を受けた細胞は、続くヌクレアーゼへの暴露により影響を受けない。
【００４０】
細胞又は細胞の集団が、インデューサ分子により誘導される核酸誘導ヌクレアーゼコードＤＮＡを含む場合、ヌクレアーゼは、インデューサ分子の存在下でのみ発現する。代替的に、細胞又は細胞の集団が、リプレッサー分子により抑制される核酸誘導性ヌクレアーゼコードＤＮＡを含む場合、ヌクレアーゼは、リプレッサー分子が不在のときのみ発現する。
【００４１】
例えば、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼを用いて編集する誘導性システムが記載されており、これは、化学誘導を用いて、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼへの細胞の一時的な暴露を制限する。（２０１５年１月２３日付けで出願された「誘導性ＤＮＡ結合タンパク質、ゲノム摂動ツール及びその適用（Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ＤＮＡ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ  Ｔｏｏｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ）」という名称のジャン（Ｚｈａｎｇ）らに付与された米国特許出願公開第２０１５／０２９１９６６  Ａ１号明細書、コロラド州ラファイエット（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）所在のホライゾン／ダーマコン（Ｈｏｒｉｚｏｎ／Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）において入手可能な誘導性レンチウィルス発現ベクターも参照されたい）。更なる技法については、例えば、キャンベル（Ｃａｍｐｂｅｌｌ）著、ターゲティングタンパク質機能：条件付き破壊のための拡張ツールキット（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ：ｔｈｅ  ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｏｏｌｋｉｔ  ｆｏｒ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）、生化学ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．）、第４７３（１７）巻、ｐ．２５７３〜２５８９、（２０１６年）を参照されたい。
【００４２】
他の例では、ウィルス誘導ヌクレアーゼを使用して、細胞内の遺伝子編集を誘導することができる。例えば、ドン（Ｄｏｎｇ）著、昆虫細胞における高効率ウィルス誘導ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの確立（Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｖｉｒｕｓ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｉｎｓｅｃｔ  ｃｅｌｌｓ）、アンチウィルスリサーチ（Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．）、第１３０巻：ｐ．５０〜７、（２０１６年）を参照されたい。別の例では、核酸特異的ヌクレアーゼの誘導性発現の場合、バリアントは、ヌクレアーゼをエストロゲン受容体（ＥＲＴ２）のホルモン結合ドメインと融合させることにより、４−ヒドロキシタモキシフェン（４−ＨＴ）を用いて哺乳類細胞においてオンオフを切り替えることができる。（リウ（Ｌｉｕ）ら著、ネイチャーケミカルバイオロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、第１２巻、ｐ．９８０〜９８７、（２０１６年）及び２０１６年１１月７日付けで出願された「化学誘導性ゲノム組換え技術（Ｃｈｅｍｉｃａｌ−Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」という名称のタン（Ｔａｎ）に付与された国際公開第２０１７／０７８６３１  Ａ１号パンフレットを参照されたい）。
【００４３】
加えて、原核生物及び真核生物の両方で細胞内の遺伝子の被制御発現のための幾つかの遺伝子調節制御システムが開発されている。これらのシステムは、テトラサイクリン制御性トランス活性化システム（テトオン／テトオフ（Ｔｅｔ−Ｏｎ／Ｔｅｔ−Ｏｆｆ）、クローンテク社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）（カリフォルニア州パロアルト（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ））、Ｌａｃスイッチ（Ｌａｃ  Ｓｗｉｔｃｈ）誘導性システム（「真核遺伝子発現の調節（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｕｃａｒｙｏｔｉｃ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」という名称のブレント（Ｂｒｅｎｔ）らに付与された米国特許第４，８３３，０８０号明細書）、エクジソン誘導性遺伝子発現システム（ノー（Ｎｏ）ら著、哺乳罹災坊及びトランスジェニックマウスにおけるエクジソン誘導性遺伝子発現（Ｅｃｄｙｓｏｎｅ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ）、米国科学アカデミー紀要（ＰＮＡＳ）、第９３（８）巻、ｐ．３３４６〜３３５１、（１９９６年））及びクメート（ｃｕｍａｔｅ）遺伝子スイッチシステム（ムリック（Ｍｕｌｌｉｃｋ）ら著、クメート遺伝子スイッチ：哺乳類細胞における発現調節システム（Ｔｈｅ  ｃｕｍａｔｅ  ｇｅｎｅ−ｓｗｉｔｃｈ：ａ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ）、ＢＭＣバイオテクノロジー（ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、第６巻、ｐ．４３、（２００６年））を含む。
【００４４】
例示的な実施形態の自動マルチモジュール細胞編集機器を用いて編集することができる細胞は、任意の原核細胞、古細菌細胞又は真核細胞を含む。例えば、本発明の例示的な実施形態と併用される原核細胞は、グラム陽性細菌細胞、例えば枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）又はグラム陰性細菌細胞、例えば大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）細胞であり得る。例示的な実施形態の自動マルチモジュール細胞編集機器と併用される真核細胞は、任意の植物細胞及び任意の動物細胞、例えば真菌細胞、昆虫細胞、両生類細胞、線虫細胞又は哺乳類細胞を含む。
亜鉛フィンガーヌクレアーゼゲノム編集
選択された実施形態では、本明細書に記載される自動マルチモジュール細胞編集機器は、亜鉛フィンガーヌクレアーゼゲノム編集を実行する。亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ：Ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅ）は、亜鉛フィンガーＤＮＡ切断ドメインをＤＮＡ結合ドメインに融合することにより生成される人工制限酵素である。亜鉛フィンガードメインは、有機体のゲノム内の標的特異的領域に対して組み換えることができる。（ウルノフ（Ｕｒｎｏｖ）ら著、ネイチャーレビュージェネティクス（Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、第１１巻、ｐ．６３６〜６４６、（２０１０年）；２００３年１月２２日付けで出願された「亜鉛フィンガーヌクレアーゼを用いる、標的化された染色体変異誘発（Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｚｉｎｃ  Ｆｉｎｇｅｒ  Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ）」という名称のキャロル（Ｃａｒｒｏｌｌ）らに付与された国際公開第２００３／０８７３４１  Ａ２号パンフレット）。有機体の内因性ＤＮＡ修復過程を用いて、ＺＦＮを用いてゲノムの標的領域を精密に変更することができる。ＺＦＮは、突然変異アレル内のＤＮＡにおいて二本鎖切断（「ＤＳＢ：ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋ」）を生成することにより、ヘテロ接合性個人での顕性突然変異をディセーブルするのに使用することができ、ＤＳＢは、相同鋳型が不在の場合、非相同末端結合（ＮＨＥＪ：ｎｏｎ−ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｎｄ−ｊｏｉｎｉｎｇ）により修復される。ＮＨＥＪは、２つの末端を一緒に結合することによりＤＳＢを修復し、通常、カットがクリーンであり、複雑ではない場合、突然変異を生じない。（デュライ（Ｄｕｒａｉ）ら著、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ：植物細胞及び哺乳類細胞のゲノム組換えのためのカスタム設計分子バサミ（Ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ：ｃｕｓｔｏｍ−ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｃｉｓｓｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｐｌａｎｔ  ａｎｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ）、ヌクレイックアシッズリサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）、第３３（１８）巻、ｐ．５９７８〜９０、（２００５年））。この修復メカニズムは、インデル又は染色体再編を介して、そのロケーションにおいてコードされる遺伝子産物を非機能化させることが多いエラーをゲノムに誘導するのに使用することができる。
【００４５】
代替的に、ＤＮＡは、相同依存性修復（ＨＤＲ：ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｒｅｐａｉｒ）を用いて外因性二本鎖ＤＮＡ断片の存在下でゲノムに導入することができる。ＤＳＢ修復での相同配列へのＨＤＲの依存性は、ＤＳＢの隣接配列と相同の配列内に所望の配列を挿入することにより利用することができ、これにより、ＨＤＲシステムにより鋳型として用いられる際、ゲノム関心領域内に所望の変更を生み出す。
【００４６】
複数対のＺＦＮを使用して、ゲノム配列の大きいセグメント全体を完全に除去することもできる。（リー（Ｌｅｅ）ら著、ゲノムリサーチ（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．）、第２０（１）巻、ｐ．８１〜９、（２００９年）；及び２０１０年７月２８日付けで出願された「トリヌクレオチドリピート病を治療する方法及び組成物（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｔｒｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｒｅｐｅａｔ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）」という名称のグレゴリー（Ｇｒｅｇｏｒｙ）らに付与された米国特許出願公開第２０１１／００８２０９３  Ａ１号明細書）。伸長ＣＡＧ／ＣＴＧ反復トラクトは、ハンチントン舞踏病、筋緊張性ジストロフィーを含む、１２を超える遺伝性神経疾患及び幾つかの脊髄小脳失調症の遺伝学的根拠である。ＺＦＮがＤＳＢをＣＡＧ反復に特異的にさせ、反復を長い病理的長さから、短く毒性のより低い長さに収縮させ得ることがヒト細胞で実証されている。（ミッテルマン（Ｍｉｔｔｅｌｍａｎ）ら著、ＣＡＧ反復トラクト内の亜鉛フィンガー特異的二本鎖切断は、ヒト細胞での反復不安定性を促進する（Ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ＣＡＧ  ｒｅｐｅａｔ  ｔｒａｃｔｓ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｒｅｐｅａｔ  ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ）、米国科学アカデミー紀要（ＰＮＡＳ  ＵＳＡ）、第１０６（２４）巻、ｐ．９６０７〜１２、（２００９年）；及び２０１３年２月２８日付けで出願された「ハンチントン舞踏病を治療する方法及び組成物（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ）」という名称のミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）らに付与された米国特許出願公開第２０１３／０２５３０４０  Ａ１号明細書）。
メガヌクレアーゼゲノム編集
選択された実施形態では、本明細書に記載される自動マルチモジュール細胞編集モジュール、機器及びシステムは、メガヌクレアーゼゲノム編集を実行する。メガヌクレアーゼは、１９９０年代に発見され、続く研究により、効率的に相同組換えを誘導し、ゲノムのコード領域又は非コード領域に突然変異を生成し、ゲノムのコード領域の読み枠を変更することが可能であるため、ゲノム編集に特に有望なツールであることが示された。（例えば、エピナット（Ｅｐｉｎａｔ）ら著、新規の組換えメガヌクレアーゼは、真核細胞、例えば、酵母細胞及び哺乳類細胞において相同組換えを誘導する（Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｍｅｇａｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ，ｅ．ｇ．，ｙｅａｓｔ  ａｎｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ）、ヌクレイックアシッズリサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第３１（１１）巻、ｐ．２９５２〜２９６２；及び２０１４年１２月３０日付けで出願された「二本鎖ＤＮＡ切断及び切断部位における相同組換えの誘導に関わる染色体修飾（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｎｄ  Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｓｉｔｅ）」という名称のチュリカ（Ｃｈｏｕｌｉｋａ）らに付与された米国特許第８，９２１，３３２号明細書を参照されたい）。メガヌクレアーゼの高特異性により、高精度及び他の天然発生の制限酵素よりもはるかに低い細胞毒性が与えられる。
転写アクチベータ様エフェクターヌクレアーゼ編集
選択された実施形態では、本明細書に記載される自動マルチモジュール細胞編集モジュール、機器及びシステムは、転写アクチベータ様エフェクターヌクレアーゼ編集を実行する。転写アクチベータ様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ：ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅ）は、ＤＮＡの特定の配列をカットするように組み換えることができる制限酵素である。ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメイン（ＤＮＡ鎖をカットするヌクレアーゼ）に融合させることにより作られる。転写アクチベータ様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、略あらゆる所望のＤＮＡ配列に結合するように組み換えることができ、したがってヌクレアーゼと結合するとＤＮＡを特定のロケーションでカットすることができる。（例えば、ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）ら著、効率的なゲノム編集のためのＴＡＬＥヌクレアーゼアーキテクチャ（Ａ  ＴＡＬＥ  ｎｕｃｌｅａｓｅ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ）、ネイチャーバイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、第２９（２）巻、ｐ．１４３〜８、（２０１１年）；ボッホ（Ｂｏｃｈ）著、ネイチャーバイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．）、ゲノムターゲティングのＴＡＬＥ（ＴＡＬＥｓ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）、第２９（２）巻、ｐ．１３５〜６、（２０１１年）；２０１０年１月１２日付けで出願された「モジュールＤＮＡ結合ドメイン及び使用方法（Ｍｏｄｕｌａｒ  ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｕｓｅ）」という名称のボナス（Ｂｏｎａｓ）らに付与された国際公開第２０１０／０７９４３０  Ａ１号パンフレット；２０１０年１２月１０日付けで出願された「ＴＡＬエフェクター媒介ＤＮＡ修飾（ＴＡＬ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」という名称のヴォイタス（Ｖｏｙｔａｓ）らに付与された国際公開第２０１１／０７２２４６  Ａ２号パンフレットを参照されたい）。
【００４７】
ＺＦＮのように、ＴＡＬＥＮはＤＳＢを誘導することによりゲノムを編集することができる。標的領域におけるＴＡＬＥＮ作成部位特異的ＤＳＢは、ＮＨＥＪ又はＨＤＲを通して修復され、標的化ゲノム編集を生じさせる。ＴＡＬＥＮは、インデル、再編成の導入又は外因性二本鎖ＤＮＡ断片の存在下でのＮＨＥＪを通したゲノムへのＤＮＡの導入に用いることができる。
ＲＮＡガイドヌクレアーゼ（ＲＧＮ：ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ）編集
特定の態様では、例示的な実施形態の自動マルチモジュール細胞編集機器のゲノム編集は、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ：ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ）技法を利用し、この技法では、ＲＮＡガイドヌクレアーゼ（ＲＧＮ）を使用して、有機体のゲノム内の特定の標的領域を編集する。合成ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ：ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡ）が複合化されたＲＧＮを細胞に送達することにより、細胞のゲノムを所望のロケーションにおいてカットすることができ、それによりゲノムの標的領域への編集を可能にする。ガイドＲＮＡは、ＲＧＮタンパク質が標的ゲノム領域のＤＮＡを認識しカットすることを促進する。ガイドＲＮＡのヌクレオチド配列を操作することにより、ＲＧＮシステムは、切断に向けて任意のＤＮＡ配列を標的化するようにプログラムすることができる。
【００４８】
例示的な実施形態の自動マルチモジュール細胞編集機器と併用されるＲＧＮシステムは、所望の標的ゲノム領域においてカット及びペーストの両方を行う能力を有する任意のＲＮＡガイドヌクレアーゼシステムを用いてゲノム編集を実行することができる。特定の態様では、ＲＮＡガイドヌクレアーゼシステムは、２つの別個のＲＮＡ分子、例えばＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をｇＲＮＡとして用い得る。他の態様では、ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ配列及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列の両方を含む１つのｇＲＮＡであり得る。
【００４９】
特定の態様では、ゲノム編集は、所望のＤＮＡ変更を標的領域に導入すると共に、標的領域からプロトスペーサモチーフ（ＰＡＭ：ｐｒｏｔｏ−ｓｐａｃｅｒ  ｍｏｔｉｆ）領域を除去し、したがって例えば標的領域と相補的な合成ｇＲＮＡが複合化されたＲＮＡガイドヌクレアーゼに暴露したとき、その標的領域におけるいかなる追加編集も行われないようにする。この態様では、第１の編集イベントは、例えば、ＲＧＮ特異的編集イベント又は相同組換えイベントであり得、所望の編集を有する細胞は、標的領域と相補的な合成ｇＲＮＡが複合化されたＲＧＮを用いて選択することができる。第１の編集イベントを受けなかった細胞は、カットされ、したがって適切な選択基準下で生存し続けない。所望の突然変異を含む細胞は、もはや必要なＰＡＭ部位を含まないため、カットされず、自動マルチモジュール細胞編集機器において成長し繁殖し続ける。
【００５０】
ＲＧＮタンパク質システムが選択に用いられる場合、必要とされるのは主にカット活性であり、したがって、ＲＮＡガイドヌクレアーゼタンパク質システムは、編集に用いられるものと同じであり得るか、又は特定のＰＡＭ部位を用いたカットに有効であるが、必ずしもその部位における編集に有効であるわけではないＲＧＮタンパク質システムであり得る。選択に用いられるヌクレアーゼの重要な一態様は、前のゲノム編集動作の編集手法を用いて置換されたＰＡＭ部位の認識である。
相同組換えによるゲノム編集
他の態様では、例示的な実施形態の自動マルチモジュール細胞編集機器のゲノム編集は、ｃｒｅ−ｌｏｘ技法及びＦＲＥＴ技法を含む相同組換え法を利用することができる。部位特異的な相同組換えは、リコンビナーゼの認識に必要とされる短い特異的ＤＮＡ配列のみが、組換えが行われる部位であるという点で一般的な相同組換えと異なる。部位特異的組換えは、部位を認識し、これらの部位における組換えを触媒するために専用のリコンビナーゼを必要とする。それぞれがリコンビナーゼ及び特定のコグネイト部位を含む幾つかのバクテリオファージ及び酵母由来部位特異的組換えシステムは、ＤＮＡ組込み目的で真核細胞において機能することを示しており、したがって本発明での使用に適用可能であり、これらには、バクテリオファージＰ１  Ｃｒｅ／ｌｏｘ、酵母ＦＬＰ−ＦＲＴシステム及び部位特異的リコンビナーゼのチロシンファミリのＤｒｅシステムがある。有用なそのようなシステム及び方法は、例えば、米国特許第７，４２２，８８９号明細書、同第７，１１２，７１５号明細書、同第６，９５６，１４６号明細書、同第６，７７４，２７９号明細書、同第５，６７７，１７７号明細書、同第５，８８５，８３６号明細書、同第５，６５４，１８２号明細書及び同第４，９５９，３１７号明細書に記載されており、これらは、そのような組換えを用いる方法を教示するために参照により本明細書に援用される。バクテリオファージλＩｎｔインテグラーゼ、ＨＫ２０２２インテグラーゼ等のチロシンファミリの他のシステム、加えてバクテリオファージｐｈｉＣ３１、Ｒ４Ｔｐ９０１インテグラーゼ等の別個のセリンファミリの組換えに属するシステムも、各組換え部位を用いて哺乳類細胞で機能することが分かっており、これらも本発明での使用に適用可能である。相同組換えの例示的な方法論は、米国特許第６，６８９，６１０号明細書、同第６，２０４，０６１号明細書、同第５，６３１，１５３号明細書、同第５，６２７，０５９号明細書、同第５，４８７，９９２号明細書及び同第５，４６４，７６４号明細書に記載されており、これらは、全体的に参照により本明細書に援用される。
機器アーキテクチャ
図１Ａ及び図１Ｂは、カートリッジベースの原料物質（例えば、試薬、酵素、核酸、洗浄液等）を利用する一例の自動マルチモジュール細胞処理機器１００を示す。機器１００は、例えば、実験環境内で使用される卓上機器として設計され得る。機器１００は、細胞における自動ゲノム切断及び／又は編集を行うに当たり、種々の段階的動作を実行する再使用可能要素及び使い捨て要素が混合したものを組み込み得る。カートリッジベースの原料物質は、例えば、ロボットハンドリング機器１０８によるアクセスのために機器１００のデック１０２上の指定エリアに位置し得る。図１Ｂに示されるように、デック１０２は、機器１００の任意のモジュールからの汚染物のこぼれ、滴り又は溢れが保護シンクの蓋内に含まれるような保護シンクを含み得る。
【００５１】
図１Ａを参照すると、機器１００は、幾つかの実装形態では、ＤＮＡ試料及び他の原料物質を機器１００に導入する試薬カートリッジ１０４と、溶離剤及び他の原料物質を機器１００に導入する洗浄カートリッジ１０６と、材料を機器１００のモジュール（例えば、モジュール１１０ａ、１１０ｂ及び１１０ｃ）、カートリッジレセプタクル（例えば、カートリッジ１０４及び１０６のレセプタクル）及び貯蔵ユニット（例えば、ユニット１１２、１１４、１１６及び１１８）間で移動させて、自動ゲノム切断及び／又は編集を実行するロボットハンドリングシステム１０８とを含む。細胞供給源１０６の処理が完了すると、幾つかの実施形態では、細胞出力は、一時的に貯蔵し、後に回収するために、ロボットハンドリング機器１０８により、例えば試薬カートリッジ１０４又は洗浄カートリッジ１０６に配置された貯蔵ユニット又はレセプタクルに移送され得る。
【００５２】
ロボットハンドリングシステム１０８は、例えば、液体をカートリッジ１０４、１０６の種々の材料ソースから、試薬カートリッジ１０４又は洗浄カートリッジ１０６内のレセプタクルであり得る種々のモジュール１１０及び貯蔵ユニットに移送する空気容積型ポンプ１２０を含み得る。他の実施形態では、ロボットハンドリングシステム１０８は、原料物質の容器（例えば、管又はバイアル）を試薬カートリッジ１０４及び／又は洗浄カートリッジ１０６から種々のモジュール１１０に移送するピックアンドプレースヘッド（図示せず）を含み得る。幾つかの実施形態では、１つ又は複数のカメラ又は他の光学センサ（図示せず）は、ガントリ１２２に沿ったロボットハンドリング装置の適切な移動及び位置を確認する。
【００５３】
幾つかの実施形態では、ロボットハンドリングシステム１０８は、移送先端部供給源１１６（例えば、ピペット先端部ラック）に提供される使い捨て移送先端部を用いて、機器１００内で原料物質、試薬（例えば、核酸アセンブリ）及び細胞を移送する。例えば、使用済みの移送先端部１１６は、固体廃棄物ユニット１１２内に破棄され得る。幾つかの実装形態では、固体廃棄物ユニット１１２は、ロボットハンドリングシステム１０８のピックアンドプレースヘッドから管、先端部、バイアル及び／又はフィルタを除去するキッカーを含む。例えば、示されるように、ロボットハンドリングシステム１０８は、フィルタピックアップヘッド１２４を含む。
【００５４】
幾つかの実施形態では、機器１００は、空気容積型ポンプ１２０に接続するシッパーを有するエレクトロポレータキュベットを含む。幾つかの実装形態では、細胞及び試薬は、シッパーを通して電気穿孔キュベットに吸引され、キュベットは、機器１００の１つ又は複数のモジュール１１０に移動される。
【００５５】
幾つかの実装形態では、機器１００は、図１３の処理システム１３１０等の処理システム１２６により制御される。処理システム１２６は、ユーザ入力に基づいて機器１００を動作させるように構成され得る。例えば、ユーザ入力は、タッチスクリーン制御ディスプレイ１２８を通して機器１００により受信され得る。処理システム１２６は、機器１００の種々のモジュール１１０のタイミング、持続時間、温度及び他の動作を制御し得る。図１Ｂを参照すると、処理システム１２６は、機器１００の動作のために電源１５０に接続され得る。
【００５６】
図１Ａに戻ると、示されるように、試薬カートリッジ１０４は、１６個のリザーバ（５×３つのリザーバの行列に１つの追加リザーバを加えたもの）及びフロースルー形質転換モジュール（電気穿孔デバイス）１１０ｃを含む。洗浄カートリッジ１０６は、例えば、洗浄液又は反復プロセスを通して使用されることが多い溶液を貯蔵する大きい管又はリザーバを収容するように構成され得る。更に、幾つかの実施形態では、洗浄カートリッジ１０６は、例えば、より小量のソース培地を保持する幾つかのより小さい管、バイアル又はリザーバ及び編集済みの細胞のためのレセプタクル又はリポジトリを含み得る。例えば、洗浄カートリッジ１０６は、２つ以上の試薬カートリッジ１０４が順次使用され、交換される場合、定位置に留まるように構成され得る。試薬カートリッジ１０４及び洗浄カートリッジ１０６は、図１Ａにおいて別個のカートリッジとして示されているが、他の実施形態では、洗浄カートリッジ１０６の内容物は、試薬カートリッジ１０４に組み込まれ得る。更なる実施形態では、３つ以上のカートリッジを自動マルチモジュール細胞処理機器１００に装填し得る。特定の実施形態では、試薬カートリッジ１０４、洗浄カートリッジ１０６及び自動マルチモジュール細胞処理機器１００のモジュール１１０の他の構成要素は、一緒にキットにパッケージングされる。
【００５７】
幾つかの実装形態では、洗浄カートリッジ１０６及び試薬カートリッジ１０４は、自動マルチモジュール細胞処理機器１００で使用するために提供される使い捨てキットである。例えば、ユーザは、細胞処理を作動させる前、試薬カートリッジ１０４及び洗浄カートリッジ１０６のそれぞれを開封し、自動マルチモジュール細胞処理機器のシャーシ内に位置決めし得る。シャーシの例について、図２Ａ〜図２Ｄに関連して以下に更に詳細に考察する。
【００５８】
幾つかの実装形態では、カートリッジ１０４、１０６の構成要素には、ロボットハンドリングシステム１０８による認識のためにバーコード等の機械可読印が記される。例えば、ロボットハンドリングシステム１０８は、カートリッジ１０４、１０６のそれぞれ内の容器をスキャンして、内容物を確認し得る。他の実装形態では、機械可読印は、各カートリッジ１０４、１０６に記され得、自動マルチモジュール細胞処理機器１００の処理システムは、機械可読印に基づいて貯蔵材料マップを識別し得る。
【００５９】
図６Ａ及び図６Ｂを参照すると、幾つかの実施形態では、洗浄カートリッジ１０６は、カートリッジ本体６０８に保持された一対の大型ボトル６０２、４本１組の小管６０４及び大管６０６を含む洗浄カートリッジ６００である。ボトル６０２及び管６０４、６０６のそれぞれは、幾つかの実施形態では、シッパー又はピペッター等の自動液体ハンドリングシステムによるアクセスのために穿孔可能なフォイルで封止される。他の実施形態では、ボトル６０２及び管６０４、６０６のそれぞれは、封止可能なアクセスガスケットを含む。幾つかの実施形態では、ボトル６０２及び管６０４、６０６のそれぞれの上部には、内容物を自動的に識別するための機械可読印（図示せず）が記される。
【００６０】
幾つかの実施形態では、大型ボトル６０２は、それぞれ洗浄液を含む。洗浄液は、同じ又は異なる洗浄液であり得る。幾つかの例では、洗浄液は、例えば、緩衝剤、緩衝剤及び１０％グリセリン、８０％エタノールを含み得る。
【００６１】
幾つかの実装形態では、カバー６１０は、ボトル６０２及び管６０４、６０６をカートリッジ本体６０８内に固定する。図６Ｂを参照すると、カバー６１０は、ボトル６０２及び管６０４、６０６のそれぞれにアクセスするための開口部を含み得る。更に、カバー６１０は、カートリッジのタイプを識別する（例えば、カートリッジ内容物のマップにアクセスする）機械可読印６１２を含み得る。代替的に、各開口部に個々の内容物を別個に記し得る。
【００６２】
図６Ｃ〜図６Ｅを参照すると、幾つかの実装形態では、試薬カートリッジ１０４は、１６個１組の小管又はバイアル６２６と、カートリッジ本体６２２に保持されるフロースルー電気穿孔モジュール６２４とを含む試薬カートリッジ６２０である。小管又はバイアル６２６のそれぞれは、幾つかの実施形態では、シッパー又はピペッター等の自動液体ハンドリングシステムによりアクセスするために穿孔可能なフォイルで封止される。他の実施形態では、小管又はバイアル６２６のそれぞれは、封止可能なアクセスガスケットを含む。小管又はバイアル６２６のそれぞれの上部には、幾つかの実施形態では、内容物を自動的に識別するための機械可読印（図示せず）が記される。機械可読印は、バーコード、ＱＲコード（登録商標）又は他の機械可読符号化を含み得る。特定の容器を識別する他の自動手段は、配色、シンボル認識（例えば、テキスト、画像、アイコン等）及び／又は形状認識（例えば、容器の相対形状）を含むことができる。容器自体に記されるのではなく、幾つかの実施形態では、カートリッジ本体及び／又はカートリッジカバーの上面は、内容物を識別する機械可読印を含み得る。小管又はバイアルは、それぞれ同じサイズであり得る。代替的に、複数の容積の管又はバイアルを試薬カートリッジ６２０に提供し得る。例示のための例では、各管又はバイアルは、２ｍＬ〜２０ｍＬ、４ｍＬ〜１０ｍＬ又は約５ｍＬを保持するように設計され得る。
【００６３】
例示のための例では、小管又はバイアル６２６は、それぞれ以下の材料の１つを保持し得る：ベクター骨格、オリゴヌクレオチド、等温核酸アセンブリの試薬、ユーザ供給の細胞試料、誘導剤、緩衝剤中の磁性ビーズ、エタノール、細胞選択のための抗生剤、細胞及び核酸を溶離する試薬、オイルオーバーレイ、他の試薬及び細胞成長及び／又は回復培地。
【００６４】
幾つかの実装形態では、カバー６２８は、小管又はバイアル６２６をカートリッジ本体６２２内で固定する。図６Ｄを参照すると、カバー６２８は、小管又はバイアル６２６のそれぞれにアクセスするために開口部を含み得る。３つの大きい開口部６３２は、太字（例えば、青色）帯で輪郭が示されて、ユーザ供給材料を追加する。ユーザ供給材料は、例えば、ベクター骨格、オリゴヌクレオチド及び細胞試料を含み得る。更に、カバー６１０は、カートリッジのタイプを識別する（例えば、カートリッジ内容物のマップにアクセスする）機械可読印６３０を含み得る。代替的に、各開口部に個々の内容物を別個に記し得る。幾つかの実装形態では、ユーザ供給材料の位置を保証するために、実験環境での充填に提供されるバイアル又は管は、細胞試料バイアル又は管が細胞試料開口部のみに嵌まり、オリゴヌクレオチドバイアル又は管がオリゴヌクレオチド開口部のみに嵌まる等のような一意の形状又はサイズを有し得る。
【００６５】
図１Ａを再び参照すると、ガントリ１２２を含むロボットハンドリングシステム１０８も示されている。幾つかの例では、ロボットハンドリングシステム１０８は、スイスのメンネドルフ（Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ）所在のテカングループ社（Ｔｅｃａｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ．）、ネバダ州リノ（Ｒｅｎｏ，ＮＶ）所在のハミルトン社（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ）製（例えば、「流体処理システムを動作させるピペットデバイス、流体処理システム及び方法（Ｐｉｐｅｔｔｉｎｇ  ｄｅｖｉｃｅ，ｆｌｕｉｄ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  ａ  ｆｌｕｉｄ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）」という名称のオット（Ｏｔｔ）に付与された国際公開第２０１８０１５５４４Ａ１号パンフレットを参照されたい）又はコロラド州フォートコリンズ（Ｆｏｒｔ  Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＣＯ）所在のベックマンコールター社（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）（例えば、「管検査及び液体レベル検出の方法及びシステム（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｔｕｂｅ  ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｌｉｑｕｉｄ  ｌｅｖｅｌ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）」という名称のストリーベル（Ｓｔｒｉｅｂｌ）らに付与された米国特許出願公開第２０１６００１８４２７Ａ１号明細書を参照されたい）等の自動液体ハンドリングシステムを含み得る。ロボットハンドリングシステム１０８は、空気容積型ピペッター１２０を含み得る。試薬カートリッジ１０４、１０６は、空気容積型ピペッター１２０等のロボットハンドリングシステム１０８の液体ハンドリング機器との特に容易な統合を可能にする。幾つかの実施形態では、空気容積型ピペッター１２０のみがガントリ１２２により移動され、種々のモジュール１１０及びカートリッジ１０４、１０６が静止したままである。ピペット先端部１１６は、空気容積型ピペッター１２０との併用に提供し得る。
【００６６】
幾つかの実施形態では、自動機械的運動システム（アクチュエータ）（図示せず）は、ＸＹ軸運動制御又はＸＹＺ軸運動制御を自動マルチモジュール細胞処理システム１００の１つ又は複数のモジュール１１０及び／又はカートリッジ１０４、１０６に更に供給する。例えば、使用済みのピペット先端部１１６は、ロボットハンドリングシステムにより廃棄物リポジトリ１１２に配置され得る。例えば、アクティブモジュールは、ロボットハンドリングシステムと接触アクセス可能な位置まで上昇し得るか、又は逆に、ロボットハンドリングシステムが材料を自動マルチモジュール細胞処理機器１００内の他のモジュール１１０に移動させているとき、ロボットハンドリングシステムとの衝突を回避するために使用後に降下し得る。
【００６７】
自動マルチモジュール細胞処理機器１００は、幾つかの実装形態では、試薬カートリッジ１０４に含まれるフロースルー電気穿孔モジュール１１０ｃを含む。例えば、フロースルー電気穿孔接続ブリッジ１３２は、細胞及び核酸が入力チャネルを介してデバイスに移送された後、フロースルー電気穿孔デバイスと係合する。ブリッジ１３２は、液密封止及び電気接続の両方を電極及び電気穿孔モジュール１１０ｃ内で電気穿孔を行う制御機構に提供する。例えば、電気穿孔接続ブリッジ１３２は、自動マルチモジュール細胞処理機器１００の電子回路ラック１３６内のフロースルー電気穿孔制御機構１３４に接続され得る。
【００６８】
幾つかの実装形態では、自動マルチモジュール細胞処理機器１００は、デュアル細胞成長モジュール１１０ａ、１１０ｂを含む。細胞成長モジュール１１０ａ、１１０ｂは、示されるように、回転細胞成長バイアル１３０ａ、１３０ｂをそれぞれ含む。細胞声調モジュール１１０ａ、１１０ｂの少なくとも一方は、統合された濾過モジュール（図示せず）を更に含み得る。代替の実施形態では、濾過モジュール又は細胞洗浄及び濃縮モジュールは、代わりに、細胞成長モジュール１１０ａ、１１０ｂとは別個であり得る（例えば、図１２Ａ及び図１２Ｂの細胞成長モジュール１２１０ａ及び濾過モジュール１２１０ｂに関連して説明するように）。細胞成長モジュール１１０ａ、１１０ｂは、例えば、図８Ａ〜図８Ｆの細胞成長モジュール８００に関連して考察する特徴及び機能をそれぞれ含み得る。
【００６９】
細胞成長モジュール１１０ａ、１１０ｂの一方又は両方の濾過部は、幾つかの実施形態では、フィルタカセット１１８に格納される交換式フィルタを用いる。例えば、ロボットハンドリングシステムは、細胞成長モジュール１１０ａ、１１０ｂの一方又は両方と併用するフィルタをピックアップして係合するフィルタピックアップヘッド１２４を含み得る。フィルタピックアップヘッドは、フィルタを成長モジュールに移送し、成長モジュールから細胞を吸い上げ、次に細胞を洗浄してエレクトロコンピテントにする。細胞からの培地及び洗浄流体は、廃棄物モジュール１１４に配置される。
【００７０】
幾つかの実装形態では、自動マルチモジュール細胞処理機器１００は、細胞編集に向けてアセンブルされた核酸に対し、試薬カートリッジ１０４内に提供された材料を結合する核酸アセンブリ及び精製機能（例えば、核酸アセンブリモジュール）を含む。更に、脱塩又は精製動作は、核酸が細胞内により効率的に電気穿孔されるように、アセンブルされた核酸を精製し、緩衝剤を脱塩する。核酸アセンブリ及び精製特徴は、反応チャンバ又は管レセプタクル（図示せず）及び磁石（図示せず）を含み得る。
【００７１】
一例の機器１００は、特定の配置のモジュール１１０を含むものとして示されているが、この実装形態は、単に例示を目的とする。例えば、他の実施形態では、より多数又はより少数のモジュール１１０が機器１００内に含まれ得、例えば細胞を融合して、ハイブリドーマを生成するモジュール及び／又はタンパク質生成モジュール等の異なるモジュールが含まれ得る。更に、図１Ａの複製細胞成長モジュール１１０ａ、１１０ｂ等の特定のモジュールは、特定の実施形態内で複製され得る。
【００７２】
幾つかの実施形態では、細胞は、自動マルチモジュール細胞編集機器に導入される前に修飾される。例えば、細胞は、λレッドシステムを用いて、通常、カナマイシン又はクロラムフェニコールへの抗生物質耐性遺伝子で標的遺伝子を置換する（ダトセンコ（Ｄａｔｓｅｎｋｏ）及びワーナ（Ｗａｎｎｅｒ）著、ＰＣＲ産物を用いた大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ−１２における染色体遺伝子の１ステップ非活性化（Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  ｕｓｉｎｇ  ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、米国科学アカデミー紀要（ＰＮＡＳ  ＵＳＡ）、第９７（１２）巻、ｐ．６６４０〜５、（２０００年）；２００３年１月２１日付けで出願された「大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ｒｅｃＥ／ｒｅｃＴ組換えシステムに依拠したＤＮＡクローニング法（ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｒｅｌｙｉｎｇ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ｒｅｃＥ／ｒｅｃＴ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）」という名称のステュアート（Ｓｔｅｗａｒｔ）らに付与された米国特許第６，５０９，１５６Ｂ１号明細書を参照されたい）。幾つかの実施形態では、細胞は、ヌクレアーゼの発現カセットを含むベクターを用いて既に形質転換又はトランスフェクトされていることがある。別の例では、所望の遺伝子編集は、自動マルチモジュール細胞編集機器（例えば、相同組換え修復を用いて）及びヌクレアーゼを用いてこれらの編集を選択し、且つ／又は追加の編集を細胞集団に追加するのに使用されるシステムに導入される前に細胞集団に導入され得る。
【００７３】
図２Ａ〜図２Ｄは、自動マルチモジュール細胞処理機器の卓上版で使用される一例のシャーシ２００及び２３０を示す。例えば、シャーシ２００及び２３０は、幅約６１ｃｍ〜約１２２ｃｍ（約２４インチ〜約４８インチ）、高さ約６１ｃｍ〜約１２２ｃｍ（２４インチ〜約４８インチ）及び奥行き約６１ｃｍ〜約１２２ｃｍ（約２４インチ〜約４８インチ）を有し得る。シャーシ２００及び２３０は、自動細胞処理で使用される複数のモジュール及び使い捨て供給品を保持するように設計され得る。更に、各シャーシ２００及び２５０は、材料をモジュール間で移動させるようにロボットハンドリングシステムを搭載し得る。
【００７４】
図２Ａ及び図２Ｂは、自動マルチモジュール細胞処理機器の第１の例のシャーシ２００を示す。示されるように、シャーシ２００は、カバー２０２を持ち上げ、シャーシ２００の内部にアクセスするためのハンドル２０４及びヒンジ２０６を有するカバー２０２を含む。冷却格子２１４は、内部ファン（図示せず）を介して空気を流せるようにし得る。更に、シャーシ２００は、調節可能な脚部２２０により持ち上げられる。脚部２２０は、例えば、シャーシ２００の下に追加の空気流を提供し得る。幾つかの実施形態では、制御ボタン２１６により、シャーシ２００内の細胞処理の単一ボタン自動開始及び停止が可能である。
【００７５】
シャーシ２００の内部には、幾つかの実装形態では、ロボットハンドリングシステム２０８が材料カートリッジ２１２ａ、２１２ｂ及びモジュールの上にガントリ２１０に沿って配置される。制御回路、液体ハンドリング管、空気ポンプ制御機構、弁、熱ユニット（例えば、加熱ユニット及び冷却ユニット）並びに他の制御機構は、幾つかの実施形態では、制御ボックス領域２１８内のシャーシ２００のデック下に配置される。
【００７６】
示されていないが、幾つかの実施形態では、表示画面をシャーシ２００の正面に位置決めして、例えばカバー２０２の一部を覆い得る。表示画面は、自動マルチモジュール細胞処理機器の処理ステータスに関する情報をユーザに提供し得る。別の例では、表示画面は、細胞処理の実行についてのユーザからの入力を受け入れ得る。
【００７７】
図２Ｃ及び図２Ｄは、自動マルチモジュール細胞処理機器の第２の例のシャーシ２３０を示す。シャーシ２３０は、示されるように、ヒンジ２３４を有する透明ドア２３２を含む。例えば、ドアは、ページの左側にスイングして、シャーシの作業エリアへのアクセスを提供し得る。ユーザは、例えば、透明ドア２３２を開けて、試薬カートリッジ及び洗浄カートリッジ等の供給品をシャーシ２３０に装填し得る。
【００７８】
幾つかの実施形態では、シャーシ２３０の正面は、ドア２３２の右側に示されるディスプレイ（例えば、タッチスクリーンディスプレイデバイス）２３６を更に含む。ディスプレイ２３６は、自動マルチモジュール細胞処理機器の処理ステータスに関する情報をユーザに提供し得る。別の例では、ディスプレイ２３６は、細胞処理の実行に関するユーザからの入力を受け入れ得る。
【００７９】
シャーシ２３０の右面の空気格子２３８は、シャーシ２３０の作業エリア（例えば、デックの上）内に空気流を提供し得る。シャーシ２３０の左にある第２の空気格子２４０は、シャーシ２３０の制御ボックス領域２４２内（例えば、デックの下）に空気流を提供し得る。示されていないが、幾つかの実施形態では、シャーシ２００の脚部２２０等の脚部は、シャーシ２３０を作業面の上に上昇させ、更なる空気流を提供し得る。
【００８０】
シャーシ２３０の内部において、幾つかの実装形態では、ロボットハンドリングシステム２４８は、カートリッジ２５２ａ、２５２ｂ、材料供給品２５４ａ、２５４ｂ（例えば、ピペット先端部及びフィルタ）及びモジュール２５６（例えば、デュアル成長バイアル）の上にガントリ２５０に沿って配置される。制御回路、液体ハンドリング管、空気ポンプ制御機構、弁及び他の制御機構は、幾つかの実施形態では、制御ボックス領域２４２内のシャーシ２３０のデック下に配置される。
【００８１】
幾つかの実施形態では、液体廃棄物ユニット２４６は、シャーシ２３０の左外壁に搭載される。液体廃棄物ユニット２４６は、例えば、シャーシ２３０の外側に搭載して、潜在的な汚染を回避し、液体廃棄物ユニット２４６を迅速に空にし、交換することを保証し得る。
核酸アセンブリモジュール
本開示の自動マルチモジュール細胞編集機器の特定の実施形態は、機器内に核酸アセンブリモジュールを含む。核酸アセンブリモジュールは、所望のゲノム編集イベントの促進に必要な核酸を受け入れるように構成される。核酸アセンブリモジュールは、ベクターアセンブリ及び関心細胞への続く形質転換に適切なベクター骨格を受け入れるように構成することもできる。
【００８２】
一般に、「ベクター」という用語は、連結された別の核酸を輸送可能な核酸分子を指す。ベクターは、限定ではなく、１本鎖、２本鎖又は部分的に２本鎖である核酸分子；１つ又は複数の自由末端を含むか又は自由末端を含まない（例えば、環状）核酸分子；ＤＮＡ、ＲＮＡ又は両方を含む核酸分子；及び当技術分野で既知の他の多様なポリヌクレオチドを含む。１つのタイプのベクターは、「プラスミド」であり、これは、標準分子クローニング技法等により追加のＤＮＡセグメントを挿入することができる環状２本鎖ＤＮＡループを指す。別のタイプのベクターは、ウィルスベクターであり、このベクターでは、ウィルス（例えば、レトロウィルス、複製欠損レトロウィルス、アデノウィルス、複製欠損アデノウィルス及びアデノ随伴ウィルス）にパッケージングするためのウィルス特異的ＤＮＡ又はＲＮＡ配列がベクターに存在する。ウィルスベクターは、宿主細胞にトランスフェクトする、ウィルスにより担持されるポリヌクレオチドも含む。特定のベクターは、導入された宿主細胞内で自律複製が可能である（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより宿主ゲノムと共に複製される。更に、特定のベクターは、操作可能に連結された遺伝子の発現を支配することが可能である。本明細書では、そのようなベクターは、「発現ベクター」と呼ばれる。組換えＤＮＡ技法において有用な共発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。本明細書において、ベクターについての更なる考察が提供される。
【００８３】
組換え発現ベクターは、形質転換及び幾つかの核酸配列について、宿主細胞における核酸の翻訳及び発現に適した形態の核酸を含むことができ、これは、組換え発現ベクターが、発現する核酸配列に操作可能に連結された１つ又は複数の調節エレメント  −  発現に使用する宿主細胞に基づいて選択され得る  −  を含むことを意味する。組換え発現ベクター内では、「操作可能に連結される」は、関心のあるヌクレオチド配列が、転写並びに幾つかの核酸配列について、ヌクレオチド配列の翻訳及び発現が可能なように（例えば、インビトロ転写／翻訳システム内又はベクターが宿主細胞内に導入される場合には宿主細胞内において）調節エレメントに連結されることを意味することが意図される。適切な組換え及びクローニング法は、米国特許出願公開第２００４−０１７１１５６  Ａ１号明細書として２００４年９月２日付けで公開された「組換え部位を有する核酸を用いた組換えクローニング（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｕｓｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｈａｖｉｎｇ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｓｉｔｅｓ）」という名称の米国特許出願第１０／８１５，７３０号明細書に開示されており、この内容は、全体的に参照により本明細書に援用される。
【００８４】
幾つかの実施形態では、調節エレメントは、標的化可能なヌクレアーゼシステムの１つ又は複数の要素に操作可能に連結されて、転写を誘導し、幾つかの核酸配列について、標的化可能なヌクレアーゼシステムの１つ又は複数の構成要素の翻訳及び発現を誘導する。
【００８５】
幾つかの実施形態では、ベクターは、核酸ガイドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列に操作可能に連結された調節エレメントを含み得る。核酸ガイドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、原核細胞又は真核細胞等の特定の細胞における発現に向けて最適化されたコドンであり得る。真核細胞は、酵母細胞、菌類細胞、藻類細胞、植物細胞、動物細胞又はヒト細胞であり得る。原核細胞は、限定ではなく、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ又は非ヒト霊長類を含む非ヒト哺乳類を含め、哺乳類等の特定の有機体のもの又は由来のものであり得る。追加又は代替として、ベクターは、転写されると、ガイドＲＮＡを形成するポリヌクレオチド配列に操作可能に連結された調節エレメントを含み得る。
【００８６】
核酸アセンブリモジュールは、多様な異なる核酸アセンブリ技法を自動的に実行するように構成することができる。開示される自動マルチモジュール細胞編集機器の核酸アセンブリモジュールにおいて実行することができる核酸アセンブリ技法には、限定ではなく、ＰＣＲ、バイオブリック（ＢｉｏＢｒｉｃｋ）アセンブリ（２０１６年６月７日付けで出願された「スカーレスマルチパートＤＮＡアセンブリ設計（Ｓｃａｒ−ｌｅｓｓ  Ｍｕｌｔｉ−ｐａｒｔ  ＤＮＡ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｄｅｓｉｇｎ）」という名称のヒルソン（Ｈｉｌｌｓｏｎ）に付与された米国特許第９，３６１，４２７号明細書）、タイプＩＩＳクローニング（例えば、ゴールデンゲート（ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅ）アセンブリ；２０１０年７月６日付けで出願された「モジュールクローニングのシステム及び方法（Ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｍｏｄｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）」という名称のウェーバ（Ｗｅｂｅｒ）らに付与された欧州特許出願公開第２  ３９５  ０８７  Ａ１号明細書）及びリガーゼサイクル反応（ドゥコックＳ（ｄｅ  Ｋｏｋ  Ｓ）著、リガーゼサイクル反応を介した高速且つ高信頼性のＤＮＡアセンブリ（Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  Ｒｅｌｉａｂｌｅ  ＤＮＡ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｖｉａ  Ｌｉｇａｓｅ  Ｃｙｃｌｉｎｇ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＡＣＳ合成生物学（ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈ  Ｂｉｏｌ．）、第３（２）巻、ｐ．９７〜１０６、（２０１４年）；エングラー（Ｅｎｇｌｅｒ）ら著、プロスワン（ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ）、高スループット性能を有する１ポット１ステップ精密クローニング法（Ａ  Ｏｎｅ  Ｐｏｔ，Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ，Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ）、第３（１１）巻、ｐ．ｅ３６４７、（２００８年）；２０００年１１月７日付けで発行された「ブリッジオリゴヌクレオチド及びＤＮＡリガーゼを用いた連鎖反応クローニング（Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｂｒｉｄｇｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｎｄ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ）」という名称のパチュク（Ｐａｃｈｕｋ）らに付与された米国特許第６，１４３，５２７号明細書）を含め、制限エンドヌクレアーゼを用いるアセンブリ方法がある。他の実施形態では、開示される自動マルチモジュール細胞編集機器により実行される核酸アセンブリ技法は、ギブソンアセンブリ（Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ）（登録商標）、ＣＰＥＣ、ＳＬＩＣ、リガーゼサイクル等の核酸の隣接部分間の重複に基づく。追加のアセンブリ法は、酵母でのギャップ修復（ベッサ（Ｂｅｓｓａ）著、酵母における改善されたギャップ修復：ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いたギャップベクターの処理は、ベクターセルフライゲーションを回避する（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｇａｐ  ｒｅｐａｉｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ：ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇａｐｐｅｄ  ｖｅｃｔｏｒ  ｗｉｔｈ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ａｖｏｉｄｓ  ｖｅｃｔｏｒ  ｓｅｌｆ−ｌｉｇａｔｉｏｎ）、イースト（Ｙｅａｓｔ）、第２９（１０）巻、ｐ．４１９〜２３、（２０１２年））、ゲートウェイクローニング（オオツカ（Ｏｈｔｓｕｋａ）著、ランチビオティクス：作用機序、生合成及び生体工学（Ｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ：ｍｏｄｅ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ，ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、カレントファーマシューティカルバイオテクノロジー（Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ）、第１０（２）巻、ｐ．２４４〜５１、（２００９年）；１９９９年３月３０日付けで発行された「操作された組換え部位を使用する組換えクローニング（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｕｓｉｎｇ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｓｉｔｅｓ）」という名称のハートレイ（Ｈａｒｔｌｅｙ）らに付与された米国特許第５，８８８，７３２号明細書；２００１年８月２１日付けで発行された「組換え部位を有する核酸を使用する組換えクローニング（Ｒｅｃｏｍｉｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｕｓｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｈａｖｉｎｇ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｓｉｔｅｓ）」という名称のハートレイ（Ｈａｒｔｌｅｙ）らに付与された米国特許第６，２７７，６０８号明細書及びトポイソメラーゼ媒介クローニング（ウド（Ｕｄｏ）著、ワクシニアトポイソメラーゼＩ媒介組換えへのポジティブブルーホワイトセレクションの導入による哺乳動物細胞での発現研究についてｃＤＮＡクローニングを促進する代替方法（Ａｎ  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｔｏ  Ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ  ｃＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｂｌｕｅ  Ｗｈｉｔｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｉａ  Ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ  Ｉ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）、プロスワン（ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ）、第１０（９）巻、ｐ．ｅ０１３９３４９（２０１５年）；２００５年７月１２日付けで発行された「分子クローニングの方法及び試薬（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）」という名称のチェストナット（Ｃｈｅｓｔｎｕｔ）らに付与された米国特許第６，９１６，６３２  Ｂ２号明細書）を含む。これら及び他の核酸アセンブリ技法は、例えば、サンズ（Ｓａｎｄｓ）及びブレント（Ｂｒｅｎｔ）著、シングルセグメントクローニング及びマルチセグメントＤＮＡアセンブリのコーヘン−ボイヤー後の方法の概説（Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｐｏｓｔ  Ｃｏｈｅｎ‐Ｂｏｙｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｓｅｇｍｅｎｔ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｆｏｒ  Ｍｕｌｔｉｓｅｇｍｅｎｔ  ＤＮＡ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ）、カレントプロトコールインモレキュラーバイオロジー（Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．）、第１１３巻、ｐ．３．２６．１〜３．２６．２０、（２０１６年）；カジーニ（Ｃａｓｉｎｉ）ら著、基本及びブループリント：ＤＮＡアセンブリの方法及び基準（Ｂｒｉｃｋｓ  ａｎｄ  ｂｌｕｅｐｒｉｎｔｓ：ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ａｓｓｅｍｂｌｙ）、ネーチャレビューモレキュラーセルバイオロジー（Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．）、第（９）巻、ｐ．５６８〜７６、（２０１５年）；パトロン（Ｐａｔｒｏｎ）著、植物生物学のＤＮＡアセンブリ：技法及びツール（ＤＮＡ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｆｏｒ  ｐｌａｎｔ  ｂｉｏｌｏｇｙ：ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  ｔｏｏｌｓ）、カレントオピニオンインプラントバイオロジー（Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．）、第１９巻、ｐ．１４〜９、（２０１４年）に記載されている。
【００８７】
核酸アセンブリは、自動マルチモジュール細胞編集機器において使用される核酸アセンブリのタイプに応じて温度制御される。例えば、ＰＣＲが核酸アセンブリモジュールで利用される場合、モジュールは、温度を変性、アニーリング及び伸長間で循環させる熱サイクル機能を有する。単一温度アセンブリ方法が核酸アセンブリモジュールで使用される場合、モジュールは、実行中の特定のアセンブリプロセスを最適化する温度に達し、その温度を維持する能力を有する。これらの温度及びこれらの温度を維持する持続時間は、スクリプトにより実行される予めプログラムされるパラメータの組によって決定され得るか、又は自動マルチモジュール細胞処理機器の処理システムを使用してユーザにより手動で制御され得る。
【００８８】
一実施形態では、核酸アセンブリモジュールは、図４に示される等の１つの等温反応を使用してアセンブリを実行するモジュールである。等温アセンブリモジュールは、１つの等温反応を使用して分子クローニング法を実行するように構成される。特定の等温アセンブリ方法は、配列同一性に基づいて最高で１５個までの核酸断片を同時に結合することができる。アセンブリ方法は、幾つかの実施形態では、隣接する核酸断片と約２０〜４０個の塩基重複を含む、アセンブルされる核酸を提供する。断片は、緩衝成分と共に３つの酵素  −  エキソヌクレアーゼ、ポリメラーゼ及びリガーゼ  −  の混合物と混合される。プロセスは、等温であり、１つの反応容器を用いて１ステップ又は２ステップ方法で実行することができるため、等温アセンブリ反応は、自動マルチモジュール細胞処理機器での使用に理想的である。１ステップ方法により、１ステップ等温プロセスを用いて５つまでの異なる断片のアセンブリが可能である。断片及び酵素のマスターミックスは、結合され、５０℃において最長で１時間にわたり培養される。最高で１５個までの断片を有するより複雑な構造物を作成する場合又は１００ｂｐ〜１０ｋｂまでの断片を組み込む場合、通常、２ステップが用いられ、２ステップ反応には、マスターミックスの２つの別個の添加が必要とされる：一方は、エキソヌクレアーゼ及びアニーリングステップのためのものであり、２番目は、ポリメラーゼ及びライゲーションステップのためのものである。
【００８９】
図４は、精製が統合された一例の等温核酸アセンブリモジュール４００を示す。等温核酸アセンブリモジュール４００は、液体を等温核酸アセンブリモジュール４００内外に移送する（例えば、ピペット又はシッパーを介して）ためのアクセスガスケット４０４を有するチャンバ４０２を含む。幾つかの実施形態では、アクセスガスケット４０４は、交換式バイアルに接続され、交換式バイアルは、チャンバ４０２内に位置決めされる。例えば、ユーザ又はロボット操作システムは、処理のためにバイアルを等温核酸アセンブリモジュール４００内に配置され得る。
【００９０】
チャンバ４０２は、抵抗性ヒータ４０８と筐体４０６を共有する。試料が等温核酸アセンブリモジュール４００のチャンバ４０２に導入されると、抵抗性ヒータ４０８を用いて、チャンバ４０２の内容物を所望の温度まで加熱し得る。温度上昇は、チャンバ４０２の内容物（例えば、ロボット操作システムのピペッター又はシッパーを介してアクセスガスケット４０４を通して供給される材料）に基づいて設定され得る。自動マルチモジュール細胞処理システムの処理システムは、目標温度及び熱上昇プランを決定し得る。熱上昇及び目標温度は、筐体４０６内に含まれるサーミスタ４１０等の熱センサをモニタすることを通して制御され得る。特定の実施形態では、抵抗性ヒータ４０８は、筐体４０６内の温度を２０o〜８０oＣ、２５o〜７５oＣ、３７o〜６５oＣ、４０o〜６０oＣ、４５o〜５５oＣ又は好適には約５０oＣに維持するように設計される。
精製モジュール
幾つかの実施形態では、核酸アセンブリモジュールが自動マルチモジュール細胞編集機器に含まれる場合、機器は、核酸アセンブリ混合物の不要成分（例えば、塩、鉱物）を除去し、特定の実施形態では、アセンブルされた核酸を濃縮する精製モジュールを含むこともできる。核酸アセンブリに続き液体を交換する方法の例には、磁性ビーズ（例えば、ＳＰＲＩ又はカリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）所在のインビトロゲン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）によるダイナル（Ｄｙｎａｌ）（ダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄ））、シリカビーズ、シリカスピンカラム、ガラスビーズ、沈殿（例えば、エタノール又はイソプロパノールを用いる）、アルカリ溶解、浸透精製、ブタノールを用いた抽出、膜ベースの分離技法、濾過等がある。
【００９１】
一態様では、精製モジュールは、濾過、例えば限外濾過を提供する。例えば、多孔性が様々な異方性の親水性生成セルロース膜が装着された種々のマイクロ濃縮器が利用可能である。（例えば、ジュアン（Ｊｕａｎ）、リ−ジュン（Ｌｉ−Ｊｕｎｇ）ら著、「ヒストンデアセチラーゼは、ｐ５３依存性遺伝子活性を特異的にダウンレギュレートする（Ｈｉｓｔｏｎｅ  ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｐ５３−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）」、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２７５．２７巻（２０００年）：ｐ．２０４３６〜２０４４３において用いられるミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）ＳＣＸマイクロ濃縮器を参照されたい）。別の例では、精製及び濃縮は、不溶性リン酸塩を含むイオン交換器を用いて、アセンブルされた核酸及びイオン性塩を含む液体試料に接触し、液体を除去し、イオン交換基から核酸を溶出させることを含む。
【００９２】
精製モジュールの特定の態様では、ＳＰＲＩビーズが使用可能であり、０．６ｘ〜２．０ｘの容積のＳＰＲＩビーズを核酸アセンブリに追加することができる。核酸アセンブリ産物は、ＳＰＲＩビーズに結合し、ＳＰＲＩビーズは、小粒をハーバリングする管、容器又はチャンバの近くに磁石を自動的に位置決めすることにより小粒化される。例えば、０．６ｘ〜２．０ｘの容積のＳＰＲＩビーズを核酸アセンブリに追加することができる。ＳＰＲＩビーズは、例えば、エタノールで洗浄され得、結合した核酸アセンブリ産物は、例えば、水、トリス（Ｔｒｉｓ）緩衝剤又は１０％グリセリン中に溶出する。
【００９３】
特定の態様では、磁石は、磁石を位置決めする線形アクチュエータに結合される。幾つかの実装形態では、核酸アセンブリモジュールは、アセンブリ及び精製を統合するように設計されたアセンブリ及び精製結合モジュールである。例えば、等温核酸アセンブリモジュールに関連して上述したように、等温核酸アセンブリ反応が行われるのに十分な時間が経過すると、幾つかの実施形態では、チャンバ４０２の内容物（例えば、等温核酸アセンブリ試薬及び核酸）は、磁性ビーズ（図示せず）と結合されて、精製プロセスを活性化する。緩衝剤中のＳＰＲＩビーズは、例えば、ロボットハンドリングシステムにより等温核酸アセンブリモジュールの内容物に送られる。その後、幾つかの実施形態では、ソレノイド４１２は、磁石により作動して、チャンバ４０２内に含まれる磁性ビーズを励起させる。特定の例では、ソレノイドは、チャンバ４０２内の磁性ビーズに約０．９ｋｇ（２ポンド）磁気引張力〜約２．２６ｋｇ（５ポンド）磁気引張力又は約１．８ｋｇ（約４ポンド）磁気引張力を付与し得る。チャンバ４０２の内容物は、アセンブルされたベクター及びオリゴヌクレオチドが磁性ビーズに結合するのに十分な時間にわたり培養され得る。
【００９４】
幾つかの実装形態では、結合後、結合した等温核酸アセンブリ混合物（例えば、等温核酸アセンブリ試薬＋アセンブルされたベクター及びオリゴヌクレオチド）は、等温核酸アセンブリモジュールから取り出され、ビーズに付着した核酸は、８０％エタノールで１回〜数回洗浄される。洗浄されると、ビーズに付着した核酸は、緩衝剤中に溶出し、形質転換モジュールに移送される。
【００９５】
幾つかの実装形態では、バイアルは、処理のためにチャンバ４０２内の定位置にロックされる。例えば、ユーザは、ピペッター又はシッパーとの係合時、バイアルを保持するように設計された、チャンバ４０２内の戻り止めを超えてバイアルを押し得る。別の例では、ユーザは、バイアルを定位置に捻り得、それにより突起部を対応するチャネルに係合させ、上向きの運動を阻止する。位置センサ（図示せず）は、バイアルの退避を保証し得る。特定の実施形態では、位置センサは、チャンバ４０２の一部とバイアルとの係合を検出する磁気センサである。他の実施形態では、位置センサは、退避位置におけるバイアルの存在を検出する光学センサである。チャネル及び突起部を使用する実施形態では、突起物により押下された機械的スイッチはバイアルの係合を検出し得る。
成長モジュール
核酸がアセンブルされているとき、編集への準備として細胞を成長させ得る。細胞成長は、成長モジュールにおいて測定される光学濃度（例えば、ＯＤ６００ｎｍ）によりモニタすることができ、フィードバックループを用いて、標的時間に目標ＯＤに達するように細胞成長を調節する。測定することができる細胞濃度及び生理学的状態の他の尺度には、限定ではなく、ｐＨ、溶解酸素、放出酵素、音響特性及び電気特性がある。
【００９６】
幾つかの態様では、成長モジュールは、分光光度計又は蛍光光度計により問い合わせられるシェーカ又はボルテクサ内に培養管を含む。シェーカ又はボルテクサは、細胞を加熱又は冷却することができ、細胞成長は、リアルタイム吸光度又は蛍光測定によりモニタされる。一態様では、細胞は、２５℃〜４０℃で１ＯＤ〜１０ＯＤのＯＤ６００吸光度まで成長する。細胞は、２５℃〜３５℃、２５℃〜３０℃、３０℃〜４０℃、３０℃〜３５℃、３５℃〜４０℃、４０℃〜５０℃、４０℃〜４５℃又は４４℃〜５０℃の温度範囲で成長することもできる。別の態様では、細胞は、４２℃〜５０℃に加熱されることにより又は誘導剤を添加することにより誘導される。細胞は、４２℃〜４６℃、４２℃〜４４℃、４４℃〜４６℃、４４℃〜４８℃、４６℃〜４８℃、４６℃〜５０℃又は４８℃〜５０℃の範囲で加熱することにより誘導することもできる。幾つかの態様では、細胞は、誘導後、０℃〜１０℃に冷却される。細胞は、誘導後、０℃〜５℃、０℃〜２℃、２℃〜４℃、４℃〜６℃、６℃〜８℃、８℃〜１０℃又は５℃〜１０℃の温度範囲まで冷却することもできる。
【００９７】
図８Ａは、図８Ｂ及び図８Ｃに示される細胞成長デバイス８５０等の細胞成長デバイスと併用する回転成長バイアル８００の一実施形態を示す。幾つかの実装形態では、回転成長バイアル８００は、液体培地及び細胞を受け取る開放端部８０４と、細胞を成長させる主容器を画定する中央バイアル領域８０６と、少なくとも１つの光路８０８、８１０を画定するテーパ−狭窄領域８１８と、閉鎖端部８１６と、駆動係合機構８１２とを有する透明容器である。回転成長バイアル８００は、長手方向中心軸８２０を有し得、バイアル８００は、長手方向中心軸８２０の周りを回転し、光路８０８、８１０は、概してバイアルの長手軸に直交し得る。幾つかの例では、第１の光路８１０は、テーパ−狭窄領域８１８の下狭窄部に位置し得る。幾つかの実装形態では、駆動係合機構８１２は、駆動機構（例えば、アクチュエータ、モータ（図示せず））と係合して、バイアル８００を回転させる。アクチュエータは、駆動モータ８６４（図８Ｄ）のための駆動シャフト８７４を含み得る。
【００９８】
幾つかの実施形態では、回転成長バイアル８００は、例えば、テーパ−狭窄領域８１８の上部テーパ領域に第２の光路８０８を含む。幾つかの例では、第２の光路８０８のためにテーパ−狭窄領域８１８の上部テーパ領域を画定する壁は、第１の光路８１０のためのテーパ−狭窄領域８１０の下部狭窄部を画定する壁よりも長手軸８２０に対してより広い角度で配置され得る。例えば、光路８０８、８１０の両方は、細胞培養物（細胞＋成長培地）が常に充填される回転成長バイアル８００の領域に位置し得、成長バイアル８００の回転速度による影響を受けない。示されるように、第２の光路８０８は、第１の光路８１０よりも短く、バイアル内の細胞培養物のＯＤ値が高レベル（例えば、細胞成長プロセスの後期）である場合、光学濃度（ＯＤ）値の高感度測定を可能にする一方、第１の光路８１０は、バイアル内の細胞培養物のＯＤ値がより低レベル（例えば、細胞成長プロセスの初期）である場合、ＯＤ値の高感度測定を可能にする。
【００９９】
回転成長バイアル８００は、再使用可能であり得るか、又は好適には、回転成長バイアルは、消耗品である。幾つかの実施形態では、回転成長バイアル８００は、消耗品であり、成長培地が予め充填されてユーザに提示することができ、バイアル８００は、フォイルシールで開放端部８０４において封止される。そのようにパッケージされた培地充填回転成長バイアルは、スタンドアロン細胞成長デバイスと併用するか、又は自動マルチモジュール細胞処理システムの一部である細胞成長モジュールと併用するキットの一部であり得る。細胞をバイアル内に導入するために、ユーザは、所望の容積の細胞をピペットで採取し、ピペット先端部を用いてバイアル８００のフォイルシールを突き破るのみでよい。代替的に、当然ながら、自動機器は、例えば、試薬カートリッジから成長バイアルに細胞を移送し得る。成長培地は、成長バイアル内に提供され得るか、又は細胞の添加前、試薬カートリッジから成長バイアルに移送され得る。開放端部８０４は、細胞成長デバイス８５０（図８Ｂ及び図８Ｃ）と重なり係合する延長リップ８０２を含み得る。自動機器では、回転成長バイアル８００には、図１３に示される処理システム１３１０の一部であるスキャナ又はカメラにより読み取り可能なバーコード又は他の識別手段をタグ付けし得る。
【０１００】
幾つかの実装形態では、回転成長バイアル８００の容積及び細胞培養物（成長培地を含む）の容積は、広く様々であり得るが、回転成長バイアル８００の容積は、バイアル８００が回転している間、成長バイアル８００内の細胞培養物が適切なエアレーションを受けるのに十分に大きいものであるべきである。実際には、回転成長バイアル８００の容積は、１ｍｌ〜２５０ｍｌ、２ｍｌ〜１００ｍｌ、５ｍｌ〜８０ｍｌ、１０ｍｌ〜５０ｍｌ又は１２ｍｌ〜３５ｍｌの範囲であり得る。同様に、細胞培養物（細胞＋成長培地）の容積は、回転成長バイアル８００内で適切にエアレーションできるようにするのに適切であるべきである。したがって、細胞培養物の容積は、成長バイアル８００の容積の約１０％〜８５％、成長バイアルの容積の１５％〜８０％、成長バイアルの容積の２０％〜７０％、３０％〜６０％又は４０％〜５０％であるべきである。一例では、３５ｍｌの成長バイアル８００の場合、細胞培養物の容積は、約４ｍｌ〜約２７ｍｌである。
【０１０１】
幾つかの実施形態では、回転成長バイアル８００は、生体適合性透明材料から製作されるか、又はバイアル８００の少なくとも光路を含む部分は、透明である。更に、回転成長バイアル８００が製作される材料は、温度ベースの細胞アッセイ及び低温での長期貯蔵の両方に対応するために、約０℃以下まで冷却可能であり、約７５℃以上まで加熱可能であるべきであり、例えば約２℃まで冷却若しくは約７０℃まで加熱、約４℃まで冷却若しくは約６０℃まで加熱又は約４℃まで冷却若しくは約５５℃まで加熱可能であるべきである。更に、バイアルの製作に用いられる材料は、好適には、スピン中、変形なしで５５℃までの温度に耐えることが可能である。適した材料には、ガラス、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリアミド、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリ（メタクリル酸メチル）（ＰＭＭＡ）、ポリスルホン、ポリウレタン及びこれら及び他のポリマーのコポリマーがある。好適な材料には、ポリプロピレン、ポリカーボネート又はポリスチレンがある。幾つかの実施形態では、回転成長バイアル８００は、例えば、射出成形又は押し出しにより安価に製作される。
【０１０２】
図８Ｂは、回転成長バイアル８００の代替の実装形態である回転成長バイアル８００ｂの上面図を示す。幾つかの例では、バイアル８００ｂは、バイアル８００ｂの中心に向かって突出する、内面に固定された１つ又は複数のパドル８２２を含み得る。図８Ｂに示されるバイアル８００ｂは、バイアル８００ｂの周囲で略等間隔に離間される３つのパドル８２２を含むが、他の例では、バイアル８００ｂは、２つ、４つ又はそれを超えるパドル８２２を含み得る。幾つかの実装形態では、パドルは、細胞成長デバイス内で回転するバイアル８００ｂ内で高度の混合及びエアレーションを提供し、微生物の成長を促進する。
【０１０３】
図８Ｃ及び図８Ｄは、回転成長バイアル８００を受ける一例の細胞成長デバイス８５０の図を示す。幾つかの実施形態では、細胞成長デバイス８５０は、回転して、バイアル内の細胞又は細胞成長を所定の温度範囲に加熱又は冷却する。幾つかの実装形態では、回転成長バイアル８００は、バイアル８００の延長リップ８０２が主筐体８５２の上面を超えて延びた状態で主筐体８５２内部に位置することができる。幾つかの態様では、延長リップ８０２は、ユーザがバイアル８００を挿入又はデバイス８５０の主筐体８５２からバイアル８００を退避させるための把持表面を提供する。更に、主筐体８５２内に完全に挿入された場合、延長リップ８０２の下面は、主筐体８５２の上面に当接する。幾つかの例では、細胞成長デバイス８５０の主筐体８５２は、回転成長バイアル８００の外面が主筐体８５２の内面に当接し、それによりバイアル８００を主筐体８５２内に固定するようなサイズである。幾つかの実装形態では、細胞成長デバイス８５０は、主筐体８５４及び主筐体８５２の下端部に配置された下部筐体８５６の各側に配置された端部筐体８５４を含むことができる。幾つかの例では、下部筐体８５６は、細胞成長デバイス８５０を温度制御（例えば、加熱／冷却）機構又は自動細胞処理システムのシャーシ等の他の構造体に取り付けるのに使用することができるフランジ８５８を含み得る。
【０１０４】
図８Ｄに示されるように、幾つかの実装形態では、細胞成長デバイス８５０は、主筐体８５２内に挿入された回転成長バイアル８００の垂直負荷を支持する、主筐体８５２内に位置する上部軸受８６０及び下部軸受８６２を含むことができる。幾つかの例では、細胞成長デバイス８５０は、主筐体８５２に挿入されたとき、バイアル８００の第１の光路８１０及び第２の光路８０８と位置合わせされる主光学ポート８６６及び補助光学ポート８６８を含むこともできる。幾つかの例では、主光学ポート８６６及び補助光学ポート８６８は、主筐体のギャップ、開口部又は光をバイアル８００に通して、細胞成長ＯＤ測定を実行できるようにする透明材料から構築された主筐体の部分である。光学ポート８６６、８６８に加えて、細胞成長デバイス８５０は、光路の１つ又は複数の照明源を提供する発光ボード８７０と、光が回転成長バイアル８００内の細胞培養液を通った後、光を検出する検出器ボード８７２とを含み得る。一例では、発光ボード８７０に配置された照明源は、細胞培養物（例えば、哺乳動物細胞であるか、細菌細胞であるか、動物細胞であるか、酵母細胞であるか）で通常使用される成長培地に見合った１つ又は複数の標的波長の照明を提供する発光ダイオード（ＬＥＤ：ｌｉｇｈｔ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｄｉｏｄｅ）又はフォトダイオードを含み得る。
【０１０５】
幾つかの実装形態では、発光ボード８７０及び／又は検出器ボード８７２は、有線又は無線接続を通して、発光ボード８７０により出力された光の波長を制御し、検出器ボード８７２において検知された照明を受信して処理する処理システム（例えば、処理システム１２６、１２２０、１３１０）に通信可能に結合される。幾つかの態様では、遠隔制御可能な発光ボード８７０及び検出器ボード８７２は、細胞成長の過程中、自動ＯＤ測定の実行を提供する。例えば、処理システム１２６、１２２０は、ＯＤ測定が実行される周期を制御し得、これは、所定の間隔であり得るか又はユーザ要求に応答し得る。更に、処理システム１２６、１２２０は、検出器ボード８７２から受信したセンサデータを用いて、リアルタイムＯＤ測定を実行し、細胞成長条件（例えば、温度、回転の速度／方向）を調節することができる。
【０１０６】
幾つかの実施形態では、下部筐体８５６は、回転成長バイアル８００を細胞成長デバイス８５０内で回転させる回転運動を生成する駆動モータ８６４を含み得る。幾つかの実装形態では、モータ８６４は、回転成長バイアル８００の下端部に結合する駆動シャフト８７４を含み得る。幾つかの実施形態では、回転成長バイアル８００の回転運動を生成するモータ８６４は、０〜約３０００ＲＰＭで一定の毎分回転数（ＲＰＭ：ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｐｅｒ  ｍｉｎｕｔｅ）を維持するように構成することができる内蔵駆動制御を有するブラシレスＤＣ型駆動モータである。代替的に、ステッパ、サーボ又はブラシＤＣモータ等の他のモータタイプを用いることができる。任意選択的に、モータ８６４は、回転方向を逆にできるようにする方向制御と、実際のＲＰＭを検知し報告するタコメータとを有することもできる。他の例では、モータ８６４は、所定の頻度で回転方向を逆にすることにより振動運動を生成することができる。一例では、バイアル８００は、３５０ＲＰＭの速度で１秒間、各方向に回転する。幾つかの実装形態では、モータ８６４は、有線又は無線通信ネットワークを通して、モータ８６４の動作を制御するように構成された処理システム（例えば、処理システム１２６、１２２０）に通信可能に結合され、これは、例えば、図１３のモジュールコントローラ１３３０に関連して説明するように、プロセッサにプログラムされ、且つ／又はユーザ入力により提供されるプロトコールを実行することを含むことができる。例えば、及びモータ８６４は、バイアル８００の速度及び／又は回転方向を変えて、細胞培養物の軸方向歳差運動を生じさせ、それにより細胞の凝集を回避し、エアレーションを上げるために混合を強化するように構成することができる。幾つかの例では、モータ８６４の速度又は方向は、検出器ボード８７２から受信される光学濃度センサデータに基づいて変更され得る。
【０１０７】
幾つかの実施形態では、細胞成長デバイス８５０の主筐体８５２、端部筐体８５４及び下部筐体８５６は、アルミニウム、ステンレス鋼及びプラスチックを含む他の熱伝導性材料を含め、頑丈な材料から製作し得る。これらの構造体又はその部分は、種々の技法、例えば金属製作、射出成形、融合される構造層の作成等を通して作成することができる。幾つかの例では、回転成長バイアル８００は、再使用可能であるが、他の実施形態では、バイアル８００は、好適には、消耗品である。幾つかの態様では、細胞成長デバイス８５０の他の構成要素は、好適には、再使用可能であり、スタンドアロンベンチトップデバイス又は自動マルチモジュール細胞処理システム内のモジュールとして機能することができる。
【０１０８】
幾つかの実装形態では、細胞成長モジュールに通信可能に結合される処理システムは、成長細胞培養物の「ブランク」又は制御として用いられる情報をプログラムされ得る。幾つかの例では、「ブランク」又は制御は、細胞成長培地のみを含む容器であり、これは、１００％透過率及び０ＯＤを生じる一方、細胞試料は、光線を偏向させ、低い割合の透過率及び高いＯＤを有する。細胞が培地で成長し、濃度が高くになるにつれて、透過率が下がり、ＯＤが上がる。幾つかの実装形態では、細胞成長モジュールのプロセッサは、細胞培養物（例えば、哺乳動物細胞であるか、細菌細胞であるか、動物細胞であるか、酵母細胞であるか）で通常使用される成長培地に見合った波長値をブランクに用いるようにプログラムされ得る。代替的に、第２の分光光度計及び容器を細胞成長モジュールに含めることができ、その場合、第２の分光光度計は、指定された間隔でブランクを読み取るのに用いられる。
【０１０９】
図８Ｅは、回転ではなく振動を用いて温度を制御し、細胞成長バイアル８９０（図８Ｆ）内で混合及びエアレーションを促進する別のタイプの細胞成長デバイス８８０を示す。幾つかの例では、細胞成長デバイス８８０のサイズは、自動マルチモジュール細胞処理システムに統合するために従来のベンチトップシェーカよりも小さい。幾つかの実装形態では、細胞成長デバイス８８０は、細胞成長バイアル８９０を受ける筐体８８４を含む。幾つかの例では、細胞成長デバイス８８０は、モータの速度に基づいてバイアル８９０の軌道運動を生成する、バイアル８９０の下に位置するモータアセンブリを含むことができる。一例では、バイアル８９０は、約２５０ＲＰＭで軌道を回るより大きいベンチトップシェーカよりもはるかに高速である、７５０ＲＰＭ等の６００ＲＰＭ〜９００ＲＰＭで水平面において軌道を移動する。幾つかの態様では、振動運動は、少なくとも１つの水平面において生成される。幾つかの例では、振動細胞成長デバイス８８０と併用される細胞成長バイアル８９０は、従来のベンチシェーカで用いられるフラスコと略同様の形状の円錐形下部管である。回転細胞成長デバイス８５０と同様に、細胞成長デバイス８８０は、細胞成長の過程にわたり自動ＯＤ測定を行うために照明ボード８７０及び検出器ボード８７２を含み得る。幾つかの例では、光源８８２を細胞成長デバイス８８０に結合し得、光源８８２は、検出器ボードにより測定される照明を生成し、幾つかの例では、検出器ボードは、バイアル８９０の下又は光源８８２からバイアル８９０の逆側に配置される。
【０１１０】
ゲノム編集を受けなかった細胞の背景を低減するために、成長モジュールは、選択プロセスにより編集細胞を富化することもできる。例えば、誘導された核酸は、抗生物質耐性又は別の選択可能なマーカを付与する遺伝子を含むことができる。編集の続くラウンドで選択可能なマーカの導入を交互にすることで、非編集細胞の背景をなくし、自動マルチモジュール細胞編集機器の複数のサイクルを可能にして、一連のゲノム編集を有する細胞を選択できるようにすることもできる。
【０１１１】
適した抗生物質耐性遺伝子には、限定ではなく、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナバニン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ピュロマイシン耐性遺伝子又はクロラムフェニコール耐性遺伝子等の遺伝子がある。幾つかの実施形態では、死んだ細胞背景の除去は、洗浄剤、浸透ストレス、温度、酵素、プロテアーゼ、バクテリオファージ、還元剤又はカオトロープ等の溶解性エンハンサーを用いて支援される。他の実施形態では、細胞除去及び／又は培地交換は、死んだ細胞背景の低減に用いられる。
細胞洗浄及び／又は濃縮モジュール
細胞洗浄及び／又は濃縮モジュールは、細胞環境において液体を交換する任意の方法を利用することができ、細胞を濃縮し得るか、又は核酸アセンブリモジュールにおいて用いられるものと基本的に同じ容積の液体若しくはより大きい容積の液体のままにさせることができる。更に、幾つかの態様では、細胞洗浄モジュールで実行されるプロセスは、例えば、洗浄にグリセリンを用いることにより細胞をエレクトロコンピテントにもする。
【０１１２】
密度勾配精製、透析、イオン交換カラム、濾過、遠心分離、希釈及び精製へのビーズの使用を含め、細胞の洗浄に多くの異なる方法が使用可能である。
幾つかの態様では、細胞洗浄及び／又は濃縮モジュールは、遠心分離デバイスを利用する。他の態様では、細胞洗浄及び／又は濃縮モジュールは濾過モジュールを利用する。更に他の態様では、細胞表面に結合する部分にビーズが結合される。これらの部分は、限定ではなく、抗体、レクチン、小麦胚芽凝集素、突然変異リゾチーム及びリガンドを含む。
【０１１３】
他の態様では、細胞は、磁化するように組み換えられ、洗浄ステップ後、磁石が細胞を小粒状にできるようにする。細胞磁化のメカニズムは、限定ではなく、フェリチンタンパク質発現を含むことができる。
【０１１４】
幾つかの実装形態では、細胞洗浄及び／又は濃縮モジュールは、遠心分離アセンブリモジュールである。幾つかの実装形態では、図３Ａ〜図３Ｃを参照すると、遠心分離アセンブリモジュール３００は、ロボットハンドリングシステム（図示せず）により作動して、核酸アセンブリ材料（例えば、オリゴ、ベクター骨格、酵素等）を、ロータ３０８に接続されたバイアルバケツ３０６ａ、ｂ内に配置された１つ又は複数のバイアル３０４ａ、ｂに送るように設計された上部ドア３０２を含む。幾つかの実施形態では、ロボットハンドリングシステムは、バイアル３０４ａ、ｂを遠心分離アセンブリモジュール３００に送る。他の実施形態では、ユーザは、バイアル３０４ａ、ｂをバイアルバケツ３０６、ｂ内に配置する。幾つかの実施形態では、バイアルバケツ３０６ａ、ｂは、回転中、バイアルバケツ３０６ａ、ｂが外側に振れ得るように、ヒンジ接続を介してロータ３０８に接続される。他の実施形態では、バケツ３０６ａ、ｂの位置は、固定される。
【０１１５】
幾つかの実施形態では、遠心分離アセンブリモジュール３００は、気象制御される。例えば、内部温度は、冷却コイル３１０及び断熱材３１２により管理され得る。冷却材供給及びリターンライン３１４は、冷却材を冷却コイル３１０にポンピングし得、それにより遠心分離アセンブルモジュール３００のチャンバ３１６を冷却し得る。幾つかの例では、遠心分離アセンブリモジュール３００は、０℃〜１０℃、２℃〜８℃、最適には約４℃にチャンバ３１６を冷却するように設計され得る。更に、濃縮制御を提供して、チャンバ３１６内の湿度を制限し得る。幾つかの実施形態では、気象制御は、自動マルチモジュール細胞処理機器の処理システムを通して設定される。例えば、処理システムは、信号を回路３２０のインターフェースに向け得る。
【０１１６】
幾つかの実施形態では、モータ３１８は、ロータ３０８を回転駆動する。モータ３１８、したがってロータ３０８の加減速は、自動マルチモジュール細胞処理機器の処理システムにより制御され得る。示されるように、運動センサ３２２（例えば、加速度計又はジャイロスコープ）は、モータ３１８のベースに位置決めされて、回転パラメータをモニタする。代替的に、加速度計又はジャイロスコープ等の運動センサ（図示せず）は、チャンバ３１６内に配置されて、回転パラメータをモニタし得る。例えば、処理システムは、運動センサからの信号をモニタし、状況を分析して、回転が外部パラメータである場合、安全遮断を行い得る。説明のための実施形態では、ロータアームは、最高で１００００毎分回転数（ＲＰＭ）、最高で８０００ＲＰＭ又は最高で約６５００ＲＰＭで回転するように設計され得る。処理システムは、遠心分離アセンブリモジュール３００に供給される材料に基づいて回転速度を変更し得る。
【０１１７】
幾つかの実装形態では、細胞洗浄及び／又は濃縮モジュールは、濾過モジュールである。図７Ａを参照すると、ブロック図は、濾過モジュール７００の一例の機能ユニットを示す。幾つかの実装形態では、濾過モジュール７００の主制御機構７０２は、洗浄流体７０６を取り込むための第１の液体ポンプ７０４ａと、液体廃棄物を液体廃棄物ユニット７０８（例えば、図１Ａの液体廃棄物ユニット１１４又は図１２Ａ及び図１２Ｂの液体廃棄物ユニット１２２８等）に除去するための第２の液体ポンプ７０４ｂとを含む。フローセンサ７１２を液体廃棄物ユニット７０８へのコネクタ７１４に配置されて、濾過モジュールからの液体廃棄物のリリースをモニタし得る。弁７１６（示されるような三方弁）を洗浄流体７１６へのコネクタ７１８に配置して、洗浄流体７１６及び濾過モジュール７００を選択的に接続し得る。
【０１１８】
幾つかの実装形態では、濾過モジュール７００は、細胞試料を濾過及び濃縮するフィルタマニホルド７２０を含む。フィルタマニホルド７２０は、１つ又は複数の温度センサ７２２及び圧力センサ７２４を含み、洗浄流体及び／又は液体廃棄物のフロー及び温度をモニタし得る。幾つかの実施形態では、センサ７２２、７２４は、図１３の処理システム１３１０等の自動マルチモード細胞処理システムの処理システムによりモニタ及び分析される。フィルタマニホルド７２０は、洗浄流体及び／又は液体廃棄物のフローを向ける１つ又は複数の弁７２６を含み得る。例えば、自動マルチモード細胞処理機器の処理システムは、濾過モジュール７００により濾過を指示する命令の組に従って弁を作動させ得る。
【０１１９】
濾過モジュール７００は、少なくとも１つのフィルタ７３０を含む。濾過モジュール７００での使用に適したフィルタの例には、メンブレンフィルタ、セラミックフィルタ及び金属フィルタがある。フィルタは、任意の形状で使用され得、例えば、フィルタは、円筒形又は基本的に平坦であり得る。幾つかの実施形態では、所与の動作又は所与の作業フローに選択されるフィルタは、作業フローのタイプ（例えば、細菌、酵母、ウィルス等）又は処理中の材料の容積に依存する。例えば、平坦フィルタは、比較的低コストであり、一般的に使用されるが、円筒形フィルタ等の表面積が大きいフィルタほど、より高い流量を受け入れ得る。別の例では、中空フィルタは、小量の試料（例えば、約１０ｍｌ未満）を処理する場合、より低い回収率を示し得る。例えば、細菌と併用する場合、使用されるフィルタがメンブレンフィルタ、特に中空繊維フィルタであることが好適なことがある。「中空繊維」という用語は、管状膜を意味する。幾つかの例では、管の内径は、少なくとも０．１ｍｍ、より好適には少なくとも０．５ｍｍ、最適には少なくとも０．７５ｍｍであり、好適には、管の内径は、最大で１０ｍｍ、より好適には最大で６ｍｍ、最適には最大で１ｍｍである。中空繊維を有するフィルタモジュールは、Ｇ．Ｅ．ライフサイエンス（Ｇ．Ｅ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）（マサチューセッツ州マールボロ（Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ））及びイノバプレップ（ＩｎｎｏｖａＰｒｅｐ）（ミズーリ州ドレクセル（Ｄｒｅｘｅｌ，ＭＯ））（例えば、ページ（Ｐａｇｅ）らに付与された「使い捨て流路を用いた液体−液体生物学的粒子濃縮器（Ｌｉｑｕｉｄ  ｔｏ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ  ｗｉｔｈ  Ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ  Ｆｌｕｉｄ  Ｐａｔｈ）」という名称の米国特許出願公開第２０１１００６１４７４Ａ１号明細書を参照されたい）を含め、種々の企業から市販されている。
【０１２０】
幾つかの実装形態では、濾過モジュール７００は、使用後、フィルタ７３０を排出するフィルタ排出手段７２８（例えば、アクチュエータ）を含む。例えば、ユーザ又はロボットハンドリングシステムは、使用するために、濾過中、フィルタがフィルタマニホルド７２０により保持されるような位置にフィルタ７３０を押し得る。濾過後、使用済みフィルタ７３０を取り外すために、フィルタ排出アクチュエータ７２８は、フィルタ７３０を排出し、ユーザ又はロボットハンドリングシステムが使用済みフィルタ７３０を濾過モジュール７００から取り外され得るようにフィルタ７３０をリリースし得る。幾つかの例では、使用済みフィルタ７３０は、図１Ａ及び図１Ｂの固体廃棄物ユニット１１２、図１２Ａ及び図１２Ｂの固体廃棄物ユニット１２１８内に配置され得るか、又は図７Ｄに示されるようにフィルタカートリッジ７４０に返され得る。
【０１２１】
幾つかの実装形態では、図７Ｄを参照すると、自動マルチモジュール細胞処理機器のシャーシ内に配置されるフィルタカートリッジ７４０に提供されるフィルタ７３０は、使用前、ロボットハンドリングシステム（例えば、図１Ａ及び図１Ｂに関連して説明したロボットハンドリングシステム１０８又は図１２Ａ及び図１２Ｂのロボットハンドリングシステム１２１８）により濾過モジュール７００に輸送され、濾過モジュール７００内に位置決めされる。
【０１２２】
幾つかの実装形態では、濾過モジュール７００は、定期的な清掃を必要とする。例えば、処理システムは、清掃が必要である場合、自動マルチモジュール細胞処理機器のユーザインターフェースを通して及び／又は無線メッセージング手段（例えば、テキストメッセージ、電子メール及び／又は個人計算デバイスアプリケーション）を通してユーザに警告し得る。例えば、汚染除去フィルタは、濾過モジュール７００に装填され得、濾過モジュール７００は、洗浄液及び／又はアルコール混合物を用いて清掃され得る。
【０１２３】
幾つかの実装形態では、濾過モジュール７００は、コネクタ７１８を介して、洗浄流体７１６を含む洗浄カートリッジ７１０（図６Ａの洗浄カートリッジ６００等）と流体接続される。例えば、ユーザが洗浄カートリッジ７１０を自動マルチモジュール細胞処理機器のシャーシ内に位置決めされると、コネクタ７１８は、洗浄カートリッジ７１０の下部流入口と嵌合して、洗浄流体７１６と濾過モジュール７００との間に液体通路を作り得る。
【０１２４】
幾つかの実装形態では、図７Ｂ及び図７Ｃを参照すると、デュアルフィルタ濾過モジュール７５０は、デュアル洗浄リザーバ７５４上に配置されるデュアルフィルタ７５２、７５４を含む。一例では、各フィルタは、０．４５μｍの孔を有し、８５ｃｍ２よりも大きい面積を有する中空芯繊維フィルタであり得る。幾つかの例では、洗浄リザーバ７５４の容積は、５０ｍＬ、１００ｍＬ又は２００ｍＬ超であり得る。幾つかの実施形態では、洗浄リザーバ７５４は、図６Ａの洗浄又は試薬カートリッジ６００等の洗浄カートリッジ７５６に配置される。
【０１２５】
幾つかの実装形態では、自動マルチモジュール細胞処理機器の処理システムは、Ｘ（水平）及びＺ（垂直）方向においてデュアルフィルタ７５２の作動を制御して、フィルタ７５２ａ、７５２ｂを洗浄リザーバ７５４に位置決めする。特定の例では、デュアルフィルタ７５２は、Ｘ軸に沿って協調して移動し得るが、独立したｚ軸移動範囲を有し得る。
【０１２６】
示されるように、濾過モジュール７５０のデュアルフィルタ７５２は、細アーム本体７５８に接続される。幾つかの実施形態では、濾過モジュール７５０の任意のポンプ及び弁は、本体７５８から離れて（例えば、自動マルチモジュール細胞処理機器のシャーシのフロア内）配置され得る。このようにして、濾過モジュール７５０は、はるかに嵩張る従来の市販の濾過モジュールを置換し得る。
【０１２７】
更に、幾つかの実施形態では、濾過モジュール７５０は、図７Ａの貯蔵ユニット７０８又は図１Ａの液体廃棄物格納ユニット１１４若しくは図１２Ａ及び図１２Ｂの１２２８等の液体廃棄物格納ユニットに液体廃棄物をリリースするように設計された破棄物パージシステムと液体連通する。
形質転換モジュール
形質転換モジュールは、トランスフェクション、形質転換及び微少流体技術の分野の当業者により日常的に用いられる任意の細胞形質転換又はトランスフェクション技法を実施し得る。形質転換は、マイクロ管、試験管、キュベット、マルチウェルプレート、微小繊維及びフロー機器で行うことができる。形質転換モジュールの温度及び制御は、ユーザにより及び／又は処理システムに提供されるスクリプトを通して設定される制御を用いて、図１３の処理システム１３１０等の処理システムを用いて制御することができる。
【０１２８】
形質転換は、外因性核酸配列（例えば、ＤＮＡ）を標的細胞に導入する、分野で認識されている種々の技法の包含が意図され、本明細書で使用される場合、「形質転換」という用語は、全ての形質転換技法及びトランスフェクション技法を包含する。そのような方法には、限定ではなく、電気穿孔、リポフェクション、光穿孔、注入、マイクロ沈殿、マイクロ注入、リポソーム、微粒子銃、ソノポレーション、レーザ誘起穿孔、ビーズトランスフェクション、リン酸カルシステム又は塩化カルシウム共沈又はＤＥＡＥ−デキストラン−媒介トランスフェクションがある。細胞は、例えば、スクロース又はグリセリン洗浄を用いてベクター取り込みに向けて準備することもできる。更に、化学的トランスフェクションを機械的方法と組み合わせるトランスフェクション方法論であるマグネトフェクション等の機械的及び化学的トランスフェクション方法の機能を利用するハイブリッド技法を用いることができる。別の例では、陽イオン脂質を遺伝子銃又はエレクトロポレータと組み合わせて展開し得る。標的細胞の形質転換又はトランスフェクションに適した材料及び方法は、例えば、グリーン（Ｇｒｅｅｎ）及びサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）著、（分子クローニング：ラボラトリーマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、第４版、コールドスプリングハーバ研究所プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州コールドスプリングハーバ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）、２０１４年）において見出すことができる。
【０１２９】
細胞及び電気穿孔プロセスに向けて細胞中に電気穿孔される材料（試薬）の懸濁に用いられる培地又は緩衝剤は、限定ではなく、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ、ハンクス、ＰＢＳ又はリンガー液を含めた培地又は緩衝剤であり得、培地は、キットの一部として試薬カートリッジで提供され得る。大半の真核細胞の電気穿孔では、培地又は緩衝剤は、通常、適切な浸透圧を維持するために塩を含む。培地又は緩衝剤中の塩は、培地を導電性にもする。細菌等の非常に小さい真核細胞の電気穿孔では、水又は１０％グリセリンは、低導電培地として用いられて、非常に高い電場強度を可能にすることがある。その場合、送られる荷電分子は、なおも水系培地の導電性を脂質系細胞膜より高くし、培地は、なおも特に細胞膜と比較して導電性として大まかに見なされ得る。
【０１３０】
選択した細胞中に電気穿孔する化合物は、核酸、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、ホルモンのような小分子、サイトカイン、ケモカイン、薬剤又は薬剤前駆体等の電気穿孔に有用であることが当技術分野で既知の任意の化合物であり得る。
【０１３１】
細胞への材料の電気穿孔を達成するのに十分であるが、大きすぎない電圧を使用することが重要であり、その理由は、大きすぎる電圧は、細胞生存能力を下げるためである。例えば、ヒト細胞株の懸濁液を電気穿孔するために、２００ボルトが、約１０００μＦのキャパシタからの指数的放電を用いた４ｍｍギャップキュベットでの０．２ｍｌ試料に必要である。しかしながら、同じ０．２ｍｌ細胞懸濁液が、２ｃｍ電極距離（キュベットギャップ距離の５倍）を有するより長い容器内に配置される場合、必要とされる電圧は、１０００ボルトであるが、キャパシタからの電気エネルギーは、
Ｅ＝０．５Ｕ２Ｃ
の式に従うため、４０μＦ（１０００μＦの１／２５）のみのキャパシタが必要であり、式中、Ｅは、電気エネルギーであり、Ｕは、電圧であり、Ｃは、キャパシタンスである。したがって、高電圧パルス生成器は、同様の量のエネルギーの貯蔵に必要なキャパシタがはるかに小さいため、実際に製造が容易である。同様に、高電圧の他の波形を生成することは難しくない。
【０１３２】
本開示の電気穿孔デバイスは、高率の細胞形質転換を比較的短い時間量で可能にすることができる。細胞形質転換率は、形質転換されている細胞のタイプ及び数に依存する。例えば、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）の場合、電気穿孔デバイスは、毎秒１〜１０１０細胞、毎秒１０４〜１０７細胞、毎秒１０５〜１０８細胞又は毎秒１０６〜１０９細胞という細胞形質転換率を提供することができる。電気穿孔デバイスは、デバイスを用いて１つの形質転換手順で１細胞〜１０１０細胞の範囲の細胞のバッチの形質転換を可能にすることもできる。
【０１３３】
本開示の電気穿孔デバイスを用いた形質転換の効率は、細胞の少なくとも１０％を生体分子の送達を可能にするのに十分に穿孔させることができる。好適には、本開示の電気穿孔デバイスを使用する形質転換の効率は、細胞の少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９５％超を生体分子の送達を可能にするのに十分に穿孔させることができる。
【０１３４】
幾つかの実施形態では、電気穿孔は、キュベット、ウェル、管、チャンバ、フローセル、チャネル又はピペット先端部において実行される。他の実施形態では、キュベット、ウェル、管又はチャンバは、下部から充填され、空にされる。幾つかの実施形態では、キュベットは、下部に接続されたシッパーを含む。
【０１３５】
図５Ａは、上から下に、自動空気容積型ピペット（図示せず）等のピペットと係合するように構成された係合部材５０４及びフィルタ５０６を囲む筐体５０２を含む一例の単一ユニット電気穿孔デバイス５００（電気穿孔モジュール）を示す。筐体５０２に加えて、電気穿孔チャンバ５１６の電極５１２及び壁５１４を含む電気穿孔デバイス５００の電気穿孔キュベット５１０部分がある。幾つかの例では、チャンバは、幅０．０１ｍｍ〜１００ｍｍ、高さ１ｍｍ〜５，０００ｍｍ及び容積１μｌ〜２０，０００μｌの範囲；幅０．０３ｍｍ〜５０ｍｍ、高さ５０ｍｍ〜２，０００ｍｍ及び容積５００μｌ〜１０，０００μｌの範囲；又は幅０．０５ｍｍ〜３０ｍｍ、高さ２ｍｍ〜５００ｍｍ及び容積２５μｌ〜４，５００μｌの範囲であり得る。
【０１３６】
幾つかの実施形態では、第１のリザーバ５０８は、フィルタ５０６と電気穿孔チャンバ５１６との間に配置され得、第１のリザーバは、電気穿孔チャンバ５１６と流体連通し、電気穿孔チャンバ５１６を超えて取り込まれ得る任意の細胞試料の空のリポジトリを提供する。幾つかの例では、第１のリザーバ５０８は、幅０．１ｍｍ〜１５０ｍｍ、高さ０．１ｍｍ〜２５０ｍｍ及び容積０．５μｌ〜１０，０００μｌの範囲；幅０．３ｍｍ〜１００ｍｍ、高さ３０ｍｍ〜１５０ｍｍ及び容積２０μｌ〜４，０００μｌの範囲；又は幅０．５ｍｍ〜１００ｍｍ、高さ０．５ｍｍ〜１００ｍｍ及び容積５μｌ〜２，０００μｌの範囲であり得る。
【０１３７】
幾つかの実装形態では、電気穿孔デバイス５００は、第１のリザーバ５０８と流体連通する（フィルタ５０６を通して）別のリザーバ５２４を更に含み得る。第２のリザーバ５２４は、フィルタ５０６と係合部材５０４との間に配置されて、フィルタ５０６を超えさせ得る任意の液体による汚染からピペットを保護し得る。幾つかの例では、第２のリザーバ５２４は、幅０．１ｍｍ〜２５０ｍｍ、高さ０．２ｍｍ〜１０００ｍｍ及び容積０．１μｌ〜２，５００μｌの範囲；幅０．１ｍｍ〜１５０ｍｍ、高さ５０ｍｍ〜４００ｍｍ及び容積１μｌ〜１，０００μｌの範囲；又は幅０．２ｍｍ〜１００ｍｍ、高さ０．５ｍｍ〜２００ｍｍ及び容積２μｌ〜６００μｌの範囲であり得る。
【０１３８】
幾つかの実施形態では、シッパー５１８は、電気穿孔チャンバ５１６と流体連通し、電気穿孔チャンバ５１６に結合され、シッパー５１８は、電気穿孔チャンバ５１６に近い端部５２０と、電気穿孔チャンバ５１６から遠い端部５２２とを有する。シッパー５１８の先端部５２２は、電気穿孔デバイス５００からの細胞試料の取り込み及び分注を可能にし得る。幾つかの実施形態では、シッパー５１８は、ロボット操作システムの一部である。幾つかの例では、シッパー５１８は、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリアミド、ポリエチレン、ポリプロピレン、アクリロニトリルーブタジエン、ポリカーボネート、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリスルホン及びポリウレタン、これら及び他のポリマーのコポリマー等のプラスチック、ガラス（ガラス毛管等）及びアルミニウム、ステンレス鋼又は銅等の金属管から作られ得る。例示的な材料には、結晶スチレン及び環状オレフィンコポリマーがある。ＰＥＥＫは、低価格及び製造が容易であるため、好適なプラスチックである。幾つかの例では、シッパー５１８は、幅０．０２ｍｍ〜２，０００ｍｍ、高さ０．２５ｍｍ〜２，０００ｍｍ及び容積１μｌ〜２，０００μｌの範囲；幅０．０２ｍｍ〜１，２５０ｍｍ、高さ２５０ｍｍ〜１，５００ｍｍ及び容積１．５μｌ〜１，５００μｌの範囲；又は幅０．０２ｍｍ〜１０ｍｍ、高さ４．０ｍｍ〜１，０００ｍｍ及び容積２．５μｌ〜１，０００μｌの範囲であり得る。
【０１３９】
幾つかの例では、電気穿孔デバイス５００の筐体５０２及び係合部材５０４は、シリコーン、樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリアミド、ポリエチレン、ポリプロピレン、アクリロニトリルーブタジエン、ポリカーボネート、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリスルホン及びポリウレタン、これら及び他のポリマーのコポリマーから作ることができる。同様に、幾つかの例では、電気穿孔チャンバの壁５１２は、シリコーン、樹脂、ガラス繊維、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリアミド、ポリエチレン、ポリプロピレン、アクリロニトリルーブタジエン、ポリカーボネート、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリスルホン及びポリウレタン、これら及び他のポリマーのコポリマーで作り得る。例示的な材料には、結晶スチレン及び環状オレフィンコポリマーがある。これらの構造体又はそれらの部分は、種々の技法、例えば射出成形、融合される構造層の作成等を通して作成することができる。ポリカーボネート及び環状オレフィンポリマーが好適な材料である。
【０１４０】
幾つかの実施形態では、電気穿孔チャンバ５１６は、概して円筒形の形状である。他の実施形態では、電気穿孔チャンバ５１６は、矩形、円錐形又は正方形であり得る。
フィルタ５０６は、幾つかの例では、多孔性プラスチック、疎水性ポリエチレン、綿又はガラス繊維から作ることができる。好適には、フィルタ５０６は、多孔性プラスチック等の低コスト材料で構成される。フィルタは、幅０．２ｍｍ〜５００ｍｍ、高さ０．２ｍｍ〜５００ｍｍ及び容積１μｌ〜３，０００μｌの範囲；幅０．３ｍｍ〜２５０ｍｍ、高さ２０ｍｍ〜２００ｍｍ及び容積５０μｌ〜２，５００μｌの範囲；又は幅０．５ｍｍ〜１５０ｍｍ、高さ０．２ｍｍ〜８０ｍｍ及び容積１０μｌ〜２，０００μｌの範囲であり得る。
【０１４１】
係合部材５０４は、電気穿孔機器で用いられる液体ハンドリングデバイスに対応する寸法を有するように構成される。
電気穿孔デバイスの構成要素は、別個に製造され、次にアセンブルされ得るか、又は電気穿孔デバイスの特定の構成要素は、一体として製造又は成形され得、他の構成要素は、成形後に追加される。例えば、シッパー、電気穿孔壁及び筐体は、一体として製造又は成形され得、電極、フィルタ、係合部材は、後に一体に追加されて、電気穿孔モジュールを形成する。同様に、電気穿孔壁及び筐体は、一体として製造され得、シッパー、電極、フィルタ、係合部材は、成形後、電気穿孔モジュールに追加される。統合される構成要素及び統合されない構成要素の他の組合せも可能である。
【０１４２】
電極５１２は、電場の印加に耐えることが可能な銅、チタン、アルミニウム、真鍮、銀、ロジウム、金又は白金等の金属又はグラファイトから形成することができる。例えば、印加された電場は、アルミニウムのような金属から作られた電極を破壊することができる。複数回使用される電気穿孔デバイスが望ましい場合、電極板は、電気化学的腐食に耐性がある金属で被覆することができる。貴金属、例えば、金のような電導性被覆材を用いて電極板を保護することができる。特定の例では、電気穿孔キュベットは、金の層で覆われたチタンから作られる第１の金属電極及び第２の金属電極を含み得る。逆に、電気穿孔デバイス５００が１回の使用（例えば、使い捨て）に向けて設計される場合、アルミニウム等のより安価な金属を用い得る。
【０１４３】
一実施形態では、電極間の距離は、０．３ｍｍ〜１０ｍｍであり得る。別の実施形態では、電極間の距離は、１ｍｍ〜２０ｍｍ、１ｍｍ〜１０ｍｍ又は２ｍｍ〜５ｍｍであり得る。電気穿孔チャンバの内径は、０．１ｍｍ〜１０ｍｍであり得る。電極間で異なる場強度を回避するため、電極は、電極の全面にわたり互いに対して一定の距離を有して平行に配置されるべきである。好適には、第１の金属電極及び第２の金属電極は、＋／−２０μｍ未満の距離変動で平行構成において２ｍｍ〜４ｍｍの距離で隔てられる。更に、電極の表面は、ピン穴又はピークなしで可能な限り平滑であるべきである。１μｍ〜１０μｍの粗さＲｚを有する電極が好適である。他の実施形態では、電気穿孔デバイスは、例えば、電気穿孔デバイスのシッパー部分に接地電位を印加する少なくとも１つの追加の電極を含む。
【０１４４】
単一ユニットデバイス５００として示されているが、他の実施形態では、電気穿孔モジュールは、複数の電気穿孔ユニットを含む。各電気穿孔ユニットは、１μｌ〜２０ｍｌの細胞試料容積を電気穿孔するように構成され得る。例えば、マルチユニット電気穿孔デバイスにおいて、異なる容積容量の電気穿孔ユニットが利用可能であり得る。
【０１４５】
幾つかの実施形態において、マルチユニット電気穿孔モジュールでは、電極は、独立したスタンドアロン要素である。他の実施形態では、マルチユニット電気穿孔デバイスは、隣接する電気穿孔ユニット内の電気穿孔キュベットが電極を共有するように構成された電極を含み得る。そのようなマルチユニット電気穿孔デバイスは、好適には、自動デバイスにおいて、例えば２つ以上の電気穿孔ユニット、４つ以上の電気穿孔ユニット、８つ以上の電気穿孔ユニット、１６以上の電気穿孔ユニット、３２以上の電気穿孔ユニット、４８以上の電気穿孔ユニット、６４以上の電気穿孔ユニット又は更に９６以上の電気穿孔ユニットを含み得る。複数の平行デバイスが利用される場合、通常、同様の容積が各ユニットに用いられる。
【０１４６】
寸法例が提供されるが、当然ながら、寸法は、細胞試料及び電気穿孔する細胞及び／又は材料を含むのに用いられる容器の容積に応じて様々である。
好適な実施形態では、形質転換モジュールは、電気穿孔チャンバを有する筐体、電気パルス生成器と係合するように構成された第１の電極及び第２の電極を有する少なくとも１つのフロースルー電気穿孔デバイスを含む。幾つかの実装形態では、フロースルー電気穿孔デバイスは、図１Ａのカートリッジ１０４、１０６等の置換可能なカートリッジ（例えば、形質転換モジュール１１０ｃ）と嵌合するように構成され、それにより、電気接点は、電気穿孔デバイスの電極と係合する。特定の実施形態では、電気穿孔デバイスは、オートクレーブ可能及び／又は使い捨てであり、試薬カートリッジ内の試薬と共にパッケージされ、且つ／又は試薬カートリッジから取り外し可能であり得る。電気穿孔デバイスは、１μｌ〜２ｍｌ、１０μｌ〜１ｍｌ、２５μｌ〜７５０μｌ又は５０μｌ〜５００μｌの細胞試料容積を電気穿孔するように構成され得る。開示される電気穿孔デバイスを用いて電気穿孔し得る細胞には、哺乳動物細胞（ヒト細胞を含む）、植物細胞、酵母、他の真核細胞、細菌、古細菌及び他の細胞タイプがある。
【０１４７】
自動マルチモジュール細胞処理システムで使用される試薬カートリッジ（例えば、図１Ａのカートリッジ１０４）は、幾つかの実施形態では、１つ又は複数の電気穿孔デバイス（例えば、図１Ａの電気穿孔モジュール１１０ｃ）、好適にはフロースルー電気穿孔デバイスを含む。図５Ｂは、試薬カートリッジの一部であり得る６つ１組５３０のフロースルー電気穿孔デバイス（例えば、ユニット又はモジュール）５３２ａ〜ｆの下部斜視図であり、図５Ｃは、同じフロースルー電気穿孔デバイスの上部斜視図である。カートリッジは、１つの基板５３４に配置された１〜６つ又はそれを超えるフロースルー電気穿孔ユニット５３２ａ〜ｆを含み得る。６つの結合されたフロースルー電気穿孔ユニット５３２ａ〜ｆのそれぞれは、細胞試料入口を画定する対応するウェル５３６ａ〜ｆ及び細胞試料出口を画定するウェル５３８ａ〜ｆ（図５Ｃを参照されたい）を有する。更に、図５Ｂに見られるように、各電気穿孔ユニット５３２ａ〜ｆは、各入口５４０ａ〜ｆ、各出口５４２ａ〜ｆ、各フローチャネル５４４ａ〜ｆ及び各フロースルー電気穿孔ユニット５３２ａ〜ｆの各フローチャネル５４４ａ〜ｆ内の構築物の両側に２つの電極５４６ａ〜ｆを含む。
【０１４８】
６つのフロースルー電気穿孔ユニット５３２ａ〜ｆが製作されると、幾つかの実施形態では、隣接するユニットから各ユニットを分離する（すなわち「折って切り離す」）スコア線に沿って互いから分離し、一度に１つずつ用いることができるか、又は代替的に、他の実施形態では、２つ以上のフロースルー電気穿孔ユニット５３２ａ〜ｆを並行して用いることができ、その場合、それらの２つ以上のユニットは、好適には、スコア線に沿って接続されたままである。
【０１４９】
一般的に言えば、マイクロ流体電気穿孔  −  約１０ｍｌ未満且つ１μｌまで下がる細胞懸濁容積を用いる  −  は、トランスフェクション又は形質転換プロセスに対してより精密な制御可能であり、ベンチスケール電気穿孔デバイスと比較して、他の細胞処理ツールとの柔軟な統合を可能にする。したがって、マイクロ流体電気穿孔は、例えば、単一細胞形質転換、処理及び解析；マルチユニット電気穿孔デバイス構成；及び統合された自動マルチモジュール細胞処理及び解析という独自の利点を提供する。
【０１５０】
試薬カートリッジに含まれるフロースルー電気穿孔デバイスは、低毒性で高効率の細胞電気穿孔を達成することができる。本開示のフロースルー電気穿孔デバイスの特定の実施形態では、形質転換の毒性レベルは、電気穿孔後、１０％よりも高い生存細胞になり、好適には細胞タイプ及び細胞に導入されている核酸に応じて形質転換に続いて１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は更に９５％超の生存細胞になる。
【０１５１】
形質転換後、細胞は、細胞に導入された核酸の形質転換及び発現の結果として行われるゲノム編集プロセスを促進する条件下で回復される。
自動マルチモジュール細胞処理の方法
図９は、図１Ａ、図１Ｂ、図１２Ａ及び図１２Ｂに示されるシステム等の自動マルチモジュール細胞処理システムを用いる一例の方法９００のフローチャートである。図１３の処理システムは、例えば、方法９００の処理段階を指示し得る。例えば、ソフトウェアスクリプトは、各処理段階の設定及びロボットハンドリングシステムを移動させて、方法９００の動作を実行する命令を識別し得る。幾つかの実施形態では、ソフトウェア命令スクリプトは、自動マルチモジュール細胞処理機器に供給されるカートリッジにより識別され得る。例えば、カートリッジは、自動マルチモジュール細胞処理機器のメモリ（例えば、図１３のメモリ１３０２等）に記憶されたスクリプトの識別情報を含む、バーコード又はＱＲコード（登録商標）等の機械可読印を含み得る。別の例では、カートリッジは、無線周波数（ＲＦ）タグ等の機械可読印に埋め込まれたダウンロード可能なスクリプトを含み得る。他の実施形態では、ユーザは、例えば、自動マルチモジュール細胞処理機器の処理システムへの有線若しくは無線接続を介したスクリプトのダウンロードを通して又は自動マルチモジュール細胞処理機器のユーザインターフェースを通した、記憶されたスクリプトの選択を通してスクリプトを識別し得る。特定の例では、自動マルチモジュール細胞処理機器は、ユーザ設定を提出し、細胞処理をアクティブ化するタッチスクリーンインターフェースを含み得る。
【０１５２】
幾つかの実装形態では、方法９００は、細胞を成長モジュールに移送すること（９０２）で開始される。成長モジュールは、例えば、図８Ａ〜図８Ｆに関連して説明した成長モジュール８００であり得る。特定の例では、処理システム１２０は、図１２Ａ及び図１２Ｂに関連して説明するように、細胞１０６を成長モジュール１１０ａに移送するようにロボットハンドリングシステム１０８に指示し得る。別の例では、図１Ａに関連して説明したように、細胞は、ロボットハンドリングシステム１０８によりカートリッジ１０４、１０６の一方から成長モジュール１１０ａ、１１０ｂに移送され得る。幾つかの実施形態では、成長バイアルは、成長培地を含み得、例えばキットの一部として供給され得る。他の実施形態では、例えば、液体ハンドリングデバイスを介して、試薬容器から移送された培地を成長バイアルに充填し得る。
【０１５３】
幾つかの実施形態では、細胞を移送する（例えば、試薬カートリッジ１０４から又は機器に追加されたバイアルから）前、細胞に指定された位置に配置されたバイアル又は他の容器の機械可読印をスキャンして、バイアル又は容器が細胞を含むものとして記されていることを確認し得る。更に、機械可読印は、機器に提供された細胞のタイプを示し得る。幾つかの実施形態では、細胞のタイプは、機器に特定の処理スクリプト（例えば、ロボットハンドリングシステムの一連の命令並びに種々のモジュールの設定及びアクティブ化）を選択させ得る。
【０１５４】
幾つかの実装形態では、細胞は、所望の光学濃度まで成長モジュール内で成長する（９０４）。例えば、図１Ａ及び図１Ｂの処理システム１２６又は図１２Ａ及び図１２Ｂの処理システム１２２０は、成長サイクル中、細胞を培養する成長モジュール１１０ａの温度設定を管理し得る。処理システム１２６、１２２０は、成長モジュール１１０ａ、１１０ｂから光学濃度を示すセンサ信号を更に受信し、センサ信号を解析して、細胞の成長をモニタし得る。幾つかの実施形態では、ユーザは、細胞の成長を管理する成長パラメータを設定し得る。例えば、温度及び細胞の攪拌の程度である。更に、幾つかの実施形態では、ユーザは、成長プロセスに関して更新情報を提供され得る。幾つかの例では、更新は、自動マルチモジュール細胞処理システムのユーザインターフェースに提示されるメッセージ、ユーザの携帯電話番号へのテキストメッセージ、電子メールアカウントへの電子メールメッセージ又はポータブル電子デバイス（例えば、携帯電話、タブレット等）で実行中のアプリに送信されるメッセージを含み得る。幾つかの実施形態では、メッセージに応答して、ユーザは、温度等のパラメータを変更して、細胞成長を調整し得る。例えば、ユーザは、自動マルチモジュール細胞処理システムのユーザインターフェースを通して又は図１１のユーザインターフェース１１００等の自動マルチモジュール細胞処理システムと通信するポータブル計算デバイスアプリケーションを通して、更新されたパラメータを提出し得る。
【０１５５】
光学濃度に関連して説明するが、他の実装形態では、成長モジュール内の細胞成長は、幾つかの例では、ｐＨ、溶解酸素、放出酵素、音響特性及び電気特性等の異なる細胞濃度尺度及び生理学的状態を用いてモニタされ得る。
【０１５６】
幾つかの実装形態では、所望の光学濃度に達する（９０４）と、細胞は、成長モジュールから濾過モジュール又は細胞洗浄及び濃縮モジュールに移送される（９０６）。図１Ａ及び図１Ｂのロボットハンドリングシステム１０８又は図１２Ａ及び図１２Ｂのロボットハンドリングシステム１２０８は、例えば、細胞を成長モジュール１２１０ａから濾過モジュール１２１０ｂに移送し得る。濾過モジュールは、例えば、細胞をエレクトロコンピテントにさせるように設計され得る。更に、濾過モジュールは、電気穿孔に適切な容積に細胞試料の容積を低減するように構成され得る。別の例では、濾過モジュールは、塩等の不要成分を細胞試料から除去するように構成され得る。幾つかの実施形態では、ロボットハンドリングシステム１０８は、細胞を洗浄するために、洗浄液を濾過モジュール１２１０ｂに移送する。
【０１５７】
幾つかの実装形態では、細胞は、濾過モジュール又は細胞洗浄及び濃縮モジュールにおいてエレクトロコンピテントにされ、溶出される（９０８）。細胞は、洗浄液を用いて溶出し得る。例えば、細胞は、試薬供給源からの試薬を用いて溶出し得る。濾過モジュール又は細胞洗浄及び濃縮モジュールは、例えば、図７Ａ及び図７Ｂに示される濾過モジュール７００と同様であり得る。上述したように、密度勾配精製、透析、イオン交換カラム、濾過、遠心分離、希釈及び精製へのビーズの使用を含めた多くの異なる方法を用いて細胞を洗浄することができる。幾つかの態様では、細胞洗浄及び濃縮モジュールは、遠心分離デバイスを利用する。他の態様では、濾過モジュールは、濾過機器を利用する。更に他の態様では、ビーズは、細胞表面に結合する部分に結合する。これらの部分は、限定ではなく、抗体、レクチン、小麦胚芽凝集素、突然変異リゾチーム及びリガンドを含む。他の態様では、細胞は、磁化するように組み換えられ、洗浄ステップ後、磁石が細胞を小粒状にできるようにする。細胞磁化のメカニズムは、限定ではなく、フェリチンタンパク質発現を含むことができる。
【０１５８】
幾つかの実施形態では、洗浄液は、溶出前、濾過モジュールに移送される。図１２Ａ及び図１２Ｂのロボットハンドリングシステム１０８は、例えば、洗浄液に指定された位置に配置されたバイアル又は容器から洗浄液を移送し得る。洗浄液を移送する前、洗浄液に指定された位置に配置されたバイアル又は他の容器若しくはリザーバの機械可読印をスキャンして、バイアル、容器、リザーバの内容物を確認し得る。更に、機械可読印は、機器に提供された洗浄液のタイプを示し得る。幾つかの実施形態では、洗浄液のタイプは、システムに特定の処理スクリプト（例えば、特定の洗浄液に適切な濾過モジュールの設定及びアクティブ化）を選択させ得る。
【０１５９】
他の実施形態では、細胞は、洗浄カートリッジの細胞洗浄モジュールにおいて溶出される。例えば、溶出した細胞は、図１Ａに示される洗浄カートリッジ１０６の空容器に集められ得、ロボットハンドリングシステム１０８は、培地を試薬カートリッジ１０４（又は洗浄カートリッジ１０６の試薬ウェル）から溶出細胞に移送し得る。
【０１６０】
細胞がエレクトロコンピテントにされ、５０μＬ〜１０ｍＬ、又は１００μＬ〜８０ｍＬ、又は１５０μＬ〜８ｍＬ、又は２５０μＬ〜７ｍＬ、又は５００μＬ〜６ｍＬ、又は７５０μＬ〜５ｍＬ等の濾過モジュールによる形質転換（９０６）に適切な容積中に懸濁されると、幾つかの実装形態では、細胞は、形質転換モジュールに移送される（９１８）。例えば、図１Ａ及び図１Ｂのロボットハンドリングシステム１０８は、細胞を濾過モジュールから形質転換モジュール１１０ｃに移送し得る。濾過モジュールは、形質転換モジュールに物理的に結合され得るか、又はこれらのモジュールは、別個であり得る。カートリッジベースの供給品を有する図１Ａの機器１００等の実施形態では、細胞は、形質転換モジュールに移送される前、試薬カートリッジ１０４等のカートリッジ内のリザーバに溶出し得る。
【０１６１】
幾つかの実装形態では、核酸は、自動マルチモジュール細胞処理機器外部で準備される。例えば、アセンブルされたベクター又は他の核酸アセンブリは、方法９００における形質転換プロセス及び他のプロセスを実行する前、ユーザにより試薬として含め得る。
【０１６２】
しかしながら、他の実装形態では、核酸は、自動マルチモジュール細胞処理機器により準備される。続くステップ９１０〜９１６の一部は、幾つかの実施形態では、ステップ９０２〜９０８の一部と平行して実行される。幾つかの実施形態では、続くステップの少なくとも一部は、ステップ９０２〜９０８前及び／又は後に実行される。
【０１６３】
幾つかの実装形態では、編集オリゴヌクレオチド及びベクター骨格等の核酸並びに幾つかの例では酵素及び他の反応成分は、核酸アセンブリモジュールに移送される（９１０）。核酸アセンブリモジュールは、多様な異なる核酸アセンブリ技法の１つ又は複数を自動的に実行するように構成され得る。核酸アセンブリモジュールにおいて実行することができる核酸アセンブリ技法には、限定ではなく、ＰＣＲ、バイオブリック（ＢｉｏＢｒｉｃｋ）アセンブリ、タイプＩＩＳクローニング（例えば、ゴールデンゲート（ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅ）アセンブリ）及びリガーゼサイクル反応を含めた、制限エンドヌクレアーゼを用いるアセンブリ方法があり得る。他の例では、核酸アセンブリモジュールは、ギブソンアセンブリ（Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ）（登録商標）、ＣＰＥＣ、ＳＬＩＣ、リガーゼサイクル等の核酸の隣接部分間の重複に基づくアセンブリ技法を実行し得る。核酸アセンブリモジュールにより実行し得る追加の例としてのアセンブリ方法には、酵母でのギャップ修復、ゲートウェイクローニング及びトポイソメラーゼ媒介クローニングがある。核酸アセンブリモジュールは、例えば、図４に関連して説明した核酸アセンブリモジュール４００であり得る。特定の例では、処理システム１２０は、図１２Ｂに関連して説明するように、核酸１２０６を核酸アセンブリモジュール１２１０ｅに移送するようにロボットハンドリングシステム１２０８に指示し得る。別の例では、図１Ａに関連して説明したように、核酸は、ロボットハンドリングシステム１０８によりカートリッジ１０４、１０６の一方から核酸アセンブリモジュールに移送され得る。
【０１６４】
幾つかの実施形態では、−  核酸試料、酵素及び他の反応成分のそれぞれの移送前に  −  これらの材料に指定された位置に配置されたバイアル又は他の容器の機械可読印をスキャンして、バイアル又は容器が予期される材料を含むものとして記されていることを確認し得る。更に、機械可読印は、機器に提供された核酸試料、酵素及び他の反応成分の１つ又は複数のタイプを示し得る。幾つかの実施形態では、材料のタイプは、機器に特定の処理スクリプト（例えば、更なる材料を識別させるロボットハンドリングシステムへの一連の命令及び／又は核酸アセンブリモジュールの設定及びアクティブ化）を選択させ得る。
【０１６５】
幾つかの実施形態では、核酸アセンブリモジュールは、用いられる核酸アセンブリのタイプに応じて温度制御される。例えば、ＰＣＲが核酸アセンブリモジュールで利用される場合、モジュールは、温度を変性、アニーリング及び伸長間で循環させる熱サイクル機能を有することができる。単一温度アセンブリ方法が核酸アセンブリモジュールで使用される場合、モジュールは、実行中の特定のアセンブリプロセスを最適化する温度に達し、その温度を維持する能力を有することができる。
【０１６６】
幾つかの実施形態では、温度制御は、図１３の処理システム１３１０等の自動マルチモジュール細胞処理機器の処理システムにより管理される。これらの温度及び温度を維持する持続時間は、予めプログラムされるパラメータの組（例えば、処理スクリプト内で識別されるか、若しくは処理システムがアクセス可能な別のメモリ空間内で識別される）によって決定され得るか、又は処理システムとのインターフェースを通してユーザにより手動で制御され得る。
【０１６７】
アセンブリ反応が行われるのに十分な時間が経過すると、幾つかの実装形態では、核酸アセンブリは、精製モジュールに移送される（９１４）。例えば、処理システムは、反応のタイプ、材料のタイプ及び自動マルチモジュール細胞処理機器に提供されるユーザ設定の１つ又は複数に基づいてアセンブリ反応のタイミングをモニタし得る。例えば、図１Ａ及び図１Ｂ又は図１２Ａ及び図１２Ｂのロボットハンドリングシステム１０８は、シッパー又はピペッター境界物を通して核酸アセンブリを精製モジュールに移送し得る。別の例では、図１Ａ及び図１Ｂ又は図１２Ａ及び図１２Ｂのロボットハンドリングシステム１０８は、核酸アセンブリを含むバイアルを核酸アセンブリモジュールのチャンバから脱塩／精製モジュールのチャンバに移送し得る。
【０１６８】
幾つかの実装形態では、核酸アセンブリは、精製モジュールにおいて脱塩され溶出する（９１６）。例えば、精製モジュールは、核酸アセンブリ混合物の不要成分（例えば、塩、鉱物等）を除去し得る。幾つかの実施形態では、精製モジュールは、核酸アセンブリ容積より小さい容積にアセンブルされた核酸を濃縮する。核酸アセンブリ後に続く液体交換の方法例には、磁性ビーズ（例えば、ＳＰＲＩ又はカリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）所在のインビトロゲン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）によるダイナル（Ｄｙｎａｌ）（ダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ））、シリカビーズ、シリカスピンカラム、ガラスビーズ、沈殿（例えば、エタノール又はイソプロパノールを用いる）、アルカリ溶解、浸透精製、ブタノールを用いた抽出、膜ベースの分離技法、濾過等がある。例えば、多孔性が様々な異方性の親水性生成セルロース膜が装着された１つ又は複数のマイクロ濃縮器が使用可能である。別の例では、脱塩／生成モジュールは、不溶性リン酸塩を含むイオン交換器で混合物に接触し、液体を除去し、核酸をイオン交換器から溶出させることにより、核酸及びイオン性塩を含む液体試料を処理し得る。
【０１６９】
例示的な実施形態では、核酸アセンブリは、精製モジュールのチャンバにおいてＳＰＲＩビーズ等の磁性ビーズと結合し得る。核酸アセンブリは、核酸アセンブリが磁性ビーズに結合するのに十分な時間にわたり、設定された温度で培養され得る。培養後、核酸アセンブリを洗浄し溶出させることができるように、磁石をチャンバの近傍に係合させ得る。このプロセスの説明のための例は、図４の等温核酸アセンブリ及び精製結合モジュールに関連して考察されている。
【０１７０】
核酸アセンブリが溶出すると、幾つかの実装形態では、核酸アセンブリは、形質転換モジュールに移送される（９１８）。例えば、図１Ａ及び図１Ｂ又は図１２Ａ及び図１２Ｂのロボットハンドリングシステム１０８は、例えば、上述したように、キュベットベースのエレクトロポレータモジュール又はフロースルーエレクトロポレータモジュールへのシッパー又はピペッター境界物を通して核酸アセンブリを形質転換モジュールに移送し得る。例えば、アセンブルされた脱塩された核酸は、移送中、ステップ９０８からのエレクトロコンピテント細胞と結合し得る。他の実施形態では、形質転換モジュールは、エレクトロコンピテント細胞及び核酸アセンブリのそれぞれを別個に受け入れ、混合を可能にし得る（例えば、１つ又は複数のチャネルを開き、共有チャンバ内で材料を結合する）。
【０１７１】
細胞は、形質転換モジュールに移送され得る（９２０）。形質転換は、幾つかの例では、電気穿孔、リポフェクション、光穿孔、注入、マイクロ沈殿、マイクロ注入、リポソーム、微粒子銃、ソノポレーション、レーザ誘起穿孔、ビーズトランスフェクション、リン酸カルシウム又は塩化カルシウム共沈又はＤＥＡＥ−デキストラン−媒介トランスフェクションを含め、外因性核酸配列（例えば、ＤＮＡ）を標的細胞に導入する（形質転換又はトランスフェクション）任意の分野で認識された技法を含み得る。幾つかの実施形態では、化学的トランスフェクションを機械的方法と組み合わせるトランスフェクション方法論であるマグネトフェクション等の機械的及び化学的トランスフェクション方法の機能を利用するハイブリッド技法を用いることができる。別の例では、陽イオン脂質を遺伝子銃又はエレクトロポレータと組み合わせて展開し得る。
【０１７２】
幾つかの実装形態では、形質転換モジュールは、電気穿孔を用いて、ＤＮＡ材料の取り込みをトリガーする。電気穿孔中、細胞の生き残りに有利な緩衝剤又は培地中に細胞を懸濁し得るように、緩衝剤又は培地を形質転換モジュールに移送し、細胞に添加する。緩衝剤又は培地を移送する前、緩衝剤又は培地に指定された位置に配置されたバイアル、他の容器又はリザーバの機械可読印をスキャンして、バイアル、容器又はリザーバの内容物を確認し得る。更に、機械可読印は、機器に提供された緩衝剤又は培地のタイプを示し得る。幾つかの実施形態では、緩衝剤又は培地のタイプは、機器に特定の処理スクリプト（例えば、特定の緩衝剤又は培地に適切な形質転換モジュールの設定及びアクティブ化）を選択させ得る。細菌細胞電気穿孔の場合、水溶液又はグリセリン溶液等の低濃度培地を用いて、過渡的な高電流による熱生成を低減し得る。酵母細胞の場合、ソルビトール溶液を用い得る。哺乳動物細胞の電気穿孔の場合、細胞は、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ、ハンクス、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、ＨｅＢＳ及びリンガー溶液等の高濃度培地又は緩衝剤中に懸濁し得る。特定の例では、ロボットハンドリングシステム１０８は、カートリッジ１０４、１０６の一方から形質転換モジュール１１０ｃに緩衝液を移送し得る。例えば、形質転換モジュールは、図５Ａ及び図５Ｂに関連して説明した電気穿孔モジュール等のフロースルー電気穿孔モジュールであり得る。図１Ａ及び図５Ｂに関連して説明したように、形質転換モジュールは、図１Ａのカートリッジ１０４と共に提供される使い捨てフロースルー電気穿孔モジュール１１０ｃであり得る。
【０１７３】
幾つかの実装形態では、形質転換モジュールは、核酸取り込みに向けて細胞を更に準備する。例えば、細菌細胞は、核酸の添加前、スクロース又はグリセリン洗浄を用いて処理され得、酵母細胞は、酢酸リチウム、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）及びＴＥ緩衝剤の溶液を用いて処理され得る。核酸取り込みに向けた細胞の準備を含む他の実装形態では、濾過モジュール又は他の別個のモジュール（例えば、細胞洗浄モジュール）は、核酸取り込みに向けて細胞を準備し得る。
【０１７４】
形質転換されると、細胞は、第２の成長／回復／編集モジュールに移送される（９２２）。例えば、図１Ａ及び図１Ｂ又は図１２Ａ及び図１２Ｂのロボットハンドリングシステム１０８は、シッパー又はピペッター境界物を通して、形質転換された細胞を第２の成長モジュールに移送し得る。別の例では、図１Ａ及び図１Ｂ又は図１２Ａ及び図１２Ｂのロボットハンドリングシステム１０８は、形質転換された細胞を含むバイアルを形質転換モジュールのチャンバから第２の成長モジュールのチャンバに移送し得る。
【０１７５】
幾つかの実施形態では、第２の成長モジュールは、回復モジュールとして機能し、細胞が形質転換プロセスから回復できるようにする。他の実施形態では、細胞は、第２の成長モジュールに輸送される前、別個の回復モジュールに提供し得る。回復中、第２の成長モジュールは、形質転換された細胞に、導入された核酸を取り込ませ、特定の態様では、導入された核酸を細胞のゲノムに統合させる。第２の成長モジュールは、細胞成長に最適な任意のユーザ定義温度、好適には２５℃、３０℃又は３７℃で細胞を培養するように構成され得る。
【０１７６】
幾つかの実施形態では、第２の成長モジュールは、選択モジュールとして挙動し、抗生物質又は他の試薬に基づいて、形質転換された細胞を選択する。一例では、ＲＮＡガイドヌクレアーゼ（ＲＧＮ）タンパク質システムは、所望の編集を受け取らなかった細胞のゲノムを切断するための選択に用いられる。選択に用いられるＲＧＮタンパク質システムは、編集に用いられるＲＧＮと同じであるか又は異なり得る。抗生物質選択剤の例では、抗生物質を第２の成長モジュールに添加して、選択を実行し得る。適する抗生物質耐性遺伝子には、限定ではなく、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナバニン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ピュロマイシン耐性遺伝子又はクロラムフェニコール耐性遺伝子等の遺伝子がある。例えば、図１Ａ及び図１Ｂ又は図１２Ａ及び図１２Ｂのロボットハンドリングシステム１０８は、シッパー又はピペッター境界物を通して第２の成長モジュールに抗生物質を移送し得る。幾つかの実施形態では、死んだ細胞背景の除去は、洗浄剤、ヒプノティックウォッシュ（ｈｙｐｎｏｔｉｃ  ｗａｓｈ）による浸透ストレス、温度、酵素、プロテアーゼ、バクテリオファージ、還元剤又はカオトロープ等の溶解性エンハンサーを用いて支援される。図１３の処理システム１３１０は、図１Ａ及び図１Ｂ又は図１２Ａ及び図１２Ｂのロボットハンドリングシステム１０８が追加の材料（例えば、洗浄剤、酵素、還元剤等）を送達し得る間、例えば、選択を誘導するように温度等の環境変数を変更し得る。他の実施形態では、濾過による細胞の除去及び／又は培地の交換は、死んだ細胞背景の低減に用いられる。
【０１７７】
更なる実施形態では、選択の適用に加えて又は代えて、第２の成長モジュールは、編集モジュールとして機能し、形質転換された細胞でのゲノム編集を可能にする。代替的に、他の実施形態では、回復及び選択（実行される場合）後の細胞は、別個の編集モジュールに移送される。編集モジュールとして、第２の成長モジュールは、例えば、導入された核酸の発現を通した細胞のゲノムの編集を誘導する。ヌクレアーゼの発現には、化学的、光、ウィルス又は温度誘導の１つ又は複数が関わり得る。例えば、第２の成長モジュールは、温度誘導プロセス中、細胞を加熱又は冷却するように構成され得る。特定の例示では、細胞は、４２℃〜５０℃での加熱により誘導し得る。例示に付け加えて、誘導後、細胞は、次に、０℃〜１０℃に冷却され得る。化学的誘導又はウィルス誘導の例では、誘導剤を第２の成長モジュールに移送して、編集を誘導し得る。誘導性ヌクレアーゼが細胞に導入された場合、編集中、誘導性ヌクレアーゼは、図１２Ａに関連して説明されるインデューサ分子１２２４等のインデューサ分子の導入を通して誘導される。幾つかの実装形態では、誘導剤又はインデューサ分子は、図１Ａ及び図１Ｂ又は図１２Ａ及び図１２Ｂのロボットハンドリングシステム１０８により（例えば、ピペッター又はシッパー境界物を通して）第２の成長モジュールに移送される。
【０１７８】
幾つかの実装形態では、追加の細胞編集が望まれない場合（９２４）、細胞は、後に自動マルチモジュール細胞処理システムから取り出すために、細胞成長モジュールから貯蔵ユニットに移送され得る（９２６）。貯蔵ユニットは、例えば、図１２Ａ及び図１２Ｂの貯蔵ユニット１１４を含み得る。図１Ａ及び図１Ｂ又は図１２Ａ及び図１２Ｂのロボットハンドリングシステム１０８は、例えば、シッパー又はピペッター境界物を通して細胞を貯蔵ユニット１１４に移送し得る。別の例では、図１Ａ及び図１Ｂ又は図１２Ａ及び図１２Ｂのロボットハンドリングシステム１０８は、細胞を含むバイアルを第２の成長モジュールのチャンバから貯蔵ユニット内のバイアル又は管に移送し得る。
【０１７９】
幾つかの実装形態では、追加の細胞編集が望まれる場合（９２４）、細胞は、同じ又は異なる濾過モジュールに移送され、エレクトロコンピテントにされ得る（９０８）。更に、幾つかの実施形態では、新しくアセンブルされた核酸試料は、このとき、核酸アセンブリモジュールにより準備され得る。再帰的編集前、幾つかの実施形態では、自動マルチモジュール細胞処理機器は、追加の材料（例えば、置換カートリッジ）をユーザにより供給する必要があり得る。
【０１８０】
ステップは、編集の第２ラウンド中、同じであるか又は異なり得る。例えば、幾つかの実施形態では、ステップ９０４の続く実行時、選択的成長培地は、成長モジュールに移送されて、編集の第１ラウンドから編集された細胞を選択できるようにする。図１Ａ及び図１Ｂ又は図１２Ａ及び図１２Ｂのロボットハンドリングシステム１０８は、例えば、選択的成長培地に指定された位置に配置された試薬カートリッジ内のバイアル又は容器から選択的成長培地を移送し得る。選択的成長培地の移送前、選択的成長培地に指定された位置に配置されたバイアル、他の容器又はリザーバの機械可読印をスキャンして、バイアル、容器又はリザーバの内容物を確認し得る。更に、機械可読印は、機器に提供された選択的成長培地のタイプを示し得る。幾つかの実施形態では、選択的成長培地のタイプは、機器に特定の処理スクリプト（例えば、特定の選択的成長培地に適切な成長モジュールの設定及びアクティブ化）を選択させ得る。再帰的編集作業フローの特定の例について、図１０Ａ〜図１０Ｃに関連して説明する。
【０１８１】
幾つかの実装形態では、方法９００は、ユーザのスケジュールと連携して材料を要求し、且つ／又は編集サイクルを完了するタイミングをとることができる。例えば、自動マルチモジュール細胞処理機器は、方法９００がユーザの好適な時間で完了する目標で行われるように、１つ又は複数の細胞処理サイクル（例えば、１つ又は複数の再帰的編集）の完了をスケジュールする能力をユーザに提供し得る。例えば、時間スケジューリングは、図１３のユーザインターフェース１３１６等のユーザインターフェースを通して設定され得る。特定の例示では、ユーザは、追加の材料カートリッジを自動マルチモジュール細胞処理機器に供給して、細胞編集の別のラウンドの一晩での処理を可能にするように、最初のサイクルの完了を午後４：００に設定し得る。
【０１８２】
幾つかの実装形態では、方法９００全体を通して、自動マルチモジュール細胞処理機器は、現在のステータスをユーザに警告し得る。例えば、図１３のユーザインターフェース１３１６は、処理の現在段階のグラフィカル指示を提示し得る。特定の例では、自動マルチモジュール細胞処理機器の正面に、細胞処理の現在ステータスを示すアニメ化グラフィックを提示するユーザインターフェース（例えば、タッチスクリーン）を重ね得る。ユーザインターフェースは、現在の処理段階に関連付けられた任意のユーザ設定及び／又はデフォルト設定（例えば、温度設定、時間設定等）を更に提示し得る。
【０１８３】
特定の一連の動作として示されているが、他の実施形態では、より多数又はより少数のステップが方法９００に含まれ得る。例えば、幾つかの実施形態では、編集の各ラウンドに従事する前、リザーバ、カートリッジ及び／又はバイアルの内容物を画面表示して、処理の進行に適切な材料が利用可能であることを確認し得る。例えば、幾つかの実施形態では、１つ又は複数の撮像センサ（例えば、バーコードスキャナ、カメラ等）は、自動マルチモジュール細胞処理機器の筐体内の種々のロケーションにおける内容物を確認し得る。一例では、複数の撮像センサを自動マルチモジュール細胞処理機器の筐体内に配置し得、各撮像センサは、１つ又は複数の材料（例えば、バーコード又はＱＲコード（登録商標）等の機械可読印、材料の形状／サイズ等）を検出するように構成される。別の例では、少なくとも１つの撮像センサは、ロボットハンドリングシステムにより複数のロケーションに移動されて、１つ又は複数の材料を検出し得る。更なる実施形態では、１つ又は複数の重量センサは、使い捨て又は交換式材料の有無を検出し得る。説明のための例では、移送先端部供給ホルダ１１６は、先端部が領域に装填されたか否かを検出するための重量センサを含み得る。別の説明のための例では、光学センサは、液体廃棄物のレベルが閾値レベルに達し、細胞処理を継続する前に廃棄する必要があることを検出し得る。材料追加、廃棄物供給物の除去又は他のユーザ介入（例えば、１つ又は複数の要素の手動清掃等）の要求は、幾つかの実装形態では、自動マルチモジュール細胞処理機器のグラフィカルユーザインターフェースに提示される。幾つかの実装形態では、自動マルチモジュール細胞処理機器は、例えば、ソフトウェアアプリ、電子メール又はテキストメッセージを通して新しい材料又は他の手動介入の要求をユーザに交信する。
自動マルチモジュール細胞処理機器での細胞処理の作業フロー
自動マルチモジュール細胞処理機器は、同じモジュールを用いて多様な細胞処理作業フローを実行するように設計される。例えば、個々の容器内又はカートリッジ形態の原料物質は、異なり得、対応する命令（例えば、ソフトウェアスクリプト）は、それに従って同じ基本機器及びロボットハンドリングシステムを用いて選択され得、すなわち、マルチモジュール細胞処理システムは、細胞試料及び異なるタイプの細胞試料の処理に幾つかの異なる作業フローを実行するように構成することができる。実施形態では、同じ作業フローを繰り返し実行して、細胞試料を再帰的に編集し得る。他の実施形態では、細胞試料は、再帰的に編集されるが、作業フローは、反復ごとに変更し得る。
【０１８４】
図１０Ａ〜図１０Ｃは、２つの細胞成長モジュール１００２、１００８、２つの濾過モジュール１００４及び１０１０並びにフロースルー電気穿孔モジュール１００６を含む自動マルチモジュール細胞処理機器を用いて実行され得る例としての作業フローを示す。別個の成長モジュール１００２、１００８及び濾過モジュール１００４、１０１０として説明されるが、それぞれは、代わりに、デュアルモジュールとして設計することもできる。例えば、成長モジュール１００２及び１００８を含むデュアル成長モジュールは、幾つかの回路、制御機構及び電源を共有し、同じ筐体内に配置されるデュアル回転成長バイアルを含み得る。同様に、デュアル濾過モジュールは、別個であるが、回路、制御機構、電源及び筐体を共有する２つのフィルタ及び液体供給管を含む濾過モジュール１００４及び１０１０を含み得る。モジュール１００２、１００４、１００６、１００８及び１０１０は、例えば、図１Ａ及び図１Ｂに関連して説明した機器１００の一部であり得る。
【０１８５】
図１０Ａを参照すると、流れ図は、細胞ストック１０１２への２つの編集を生成する、同一の処理ステップを有する２つの処理段階を含む第１の細菌ゲノム編集作業フロー１０００を示す。各段階は、原料物質の異なるカートリッジに基づいて動作し得る。例えば、第１のカートリッジは、第１のオリゴライブラリ１０１４ａ及び第１のｓｇＲＮＡ骨格１０１６ａを含み得る。第２のカートリッジは、処理段階間又は処理前に自動マルチモジュール細胞処理機器内であるが、第１のカートリッジと異なる位置に導入され、第２のオリゴライブラリ１０１４ｂ及び第２のｓｇＲＮＡ骨格１０１６ｂを含み得る。各カートリッジは、編集細胞のライブラリを構築するための「ライブラリカートリッジ」として見なされ得る。幾つかの実施形態では、細胞ストック１０１２は、第１のライブラリカートリッジに含まれる。細胞ストック１０１２は、２つのカートリッジを含むキット内で供給され得る。代替的に、ユーザは、細胞ストック１０１２の容器（例えば、バイアル又は管）を購入されたカートリッジに追加し得る。
【０１８６】
幾つかの実施形態では、作業フロー１０００は、図１３の処理システム１３１０等の自動マルチモジュール細胞処理機器の処理システムにより実行されるスクリプトに基づいて実行される。第１の例では、スクリプトは、第１のカートリッジに追加された機械可読マーカ又はタグを介してアクセスされ得る。幾つかの実施形態では、各処理段階は、別個のスクリプトを用いて実行される。例えば、各カートリッジは、カートリッジの内容物を処理するスクリプトの指示又はスクリプト自体を含み得る。
【０１８７】
幾つかの実装形態では、第１の段階は、植菌、成長及びモニタリングのために細胞ストック１０１２を第１の成長モジュール１００２に導入する（１０１８ａ）ことで開始される。一例では、ロボットハンドリングシステムは、第１の成長モジュール１００２の回転成長バイアルに含まれる培地に細胞ストック１０１２のバイアルを追加する。別の例では、ロボットハンドリングシステムは、第１のカートリッジから細胞ストック１０１２をピペットで移送し、回転成長バイアルに含まれる培地に細胞ストック１０１２を追加する。細胞は、この時点で４℃の温度に維持されていることがある。特定の例では、２０ｍｌの細胞ストックを３０℃の温度で第１の成長モジュール１００２の回転成長バイアル内で０．５０のＯＤまで成長させ得る。第１の成長モジュール１００２に追加された細胞ストック１０１２は、０．５０のＯＤが成長バイアルの自動モニタリングを介して検知されるまで、時間の経過に伴ってモニタされ得る。モニタリングは、定期的であるか又は連続であり得る。これには、例えば、約９００分（推定）かかり得るが、厳密な時間は、所望のＯＤの検出に依存する。
【０１８８】
幾つかの実装形態では、細胞を所望のＯＤまで成長させた後、細胞を誘導するために、インデューサを第１の成長モジュール１００２に追加する。特定の例では、１００μｌのインデューサを追加し得、成長モジュール１００２は、混合物の温度を４２℃にし、１５分間維持され得る。
【０１８９】
細胞ストック１０１２は、成長及び誘導後、幾つかの実装形態では、細胞をエレクトロコンピテントにさせ（１０２０ａ）、形質転換に向けて細胞の容積を低減するために、第１の濾過モジュール１００４に移送される。一例では、ロボットハンドリングシステムは、細胞ストック１０１２のバイアルを第１の成長モジュール１００２の回転成長バイアルから第１の濾過モジュール１００４のバイアルホルダに移動させる。別の例では、ロボットハンドリングシステムは、第１の成長モジュール１００２の回転成長バイアルから細胞ストック１０１２をピペットで移送し、第１の濾過モジュール１００４に送る。例えば、細胞ストック１０１２を第１の成長モジュール１００２に移送するのに用いられた使い捨てピペット先端部を用いて、細胞ストック１０１２を第１の成長モジュール１００２から第１の濾過モジュール１００４に移送し得る。幾つかの実施形態では、細胞ストック１０１２を第１の成長モジュール１００２から第１の濾過モジュール１００４に移送する前、第１の成長モジュール１００２は、４℃に冷却され、それにより、細胞ストック１０１２も同様にこの温度に冷却される。特定の例では、第１の成長モジュール１００２の温度は、約８分のスパンで約４℃に冷却され得、成長モジュール１００２は、温度を４℃に約１５分間維持して、細胞ストック１０１２の温度低減を保証し得る。
【０１９０】
細胞ストックを移送する前、幾つかの実装形態では、第１の濾過モジュール１００４のフィルタは、洗浄液を用いて予め洗浄される。洗浄液は、例えば、図１Ａに関連して説明したカートリッジ１００６等の洗浄カートリッジで供給され得る。第１の濾過モジュール１００４は、例えば、図７Ａに関連して説明したように、洗浄カートリッジの洗浄液に流体接続され得る。
【０１９１】
第１の濾過モジュール１００４は、例えば、図７Ｂ及び図７Ｃに関連して説明した濾過モジュール７５０等のデュアル濾過モジュールの一部であり得る。特定の例では、第１の濾過モジュール１００４は、溶出バイアルと第１の濾過モジュール１００４との間で細胞材料を移送している間、洗浄及び溶出プロセス中に４℃に維持され得る。
【０１９２】
幾つかの実装形態では、濾過モジュール１００４において細胞をエレクトロコンピテントにすると、細胞ストック１０１２は、形質転換のために形質転換モジュール１００６（例えば、フロースルー電気穿孔モジュール）に移送される。一例では、ロボットハンドリングシステムは、細胞ストック１０１２のバイアルを第１の濾過モジュール１００４のバイアルホルダからフロースルー電気穿孔モジュール１００６のリザーバに移動させる。別の例では、ロボットハンドリングシステムは、細胞ストック１０１２を第１の濾過モジュール１００２又は一時的なリザーバからピペットで移送し、第１の濾過モジュール１００４に送る。特定の例では、第１の濾過モジュール１００４からの４００μｌの濃縮細胞ストック１０１２は、形質転換モジュール１００６に移送される前、混合リザーバに移送される。例えば、細胞ストック１０１２は、アセンブルされた核酸と混合するためにカートリッジ内のリザーバに移送され、次にピペット先端部を用いてロボットハンドリングシステムにより移送され得る。特定の例では、形質転換モジュールは、４℃に維持される。細胞ストック１０１２は、説明のための例では、約４分で移送され得る。
【０１９３】
幾つかの実装形態では、細胞が成長中及び／又はエレクトロコンピテントになっている間、第１のオリゴライブラリ１０１４ａ及びｓｇＲＮＡ骨格１０１６ａは、等温核酸アセンブリプロセスを用いてアセンブルされ、等温核酸アセンブリマスターミックス（１０２２ａ）においてアセンブルされた核酸を作成する。アセンブルされた核酸は、作業フロー１０００の第１の段階の第１の処理ステップ１０１８ａ、１０２０ａ中、幾つかのポイントで作成され得る。代替的に、アセンブルされた核酸は、第１の処理ステップ１０１８の開始前に作成され得る。
【０１９４】
幾つかの実施形態では、核酸は、自動マルチモジュール細胞処理機器の等温核酸アセンブリモジュールを用いてアセンブルされる。例えば、ロボットハンドリングシステムは、第１のオリゴライブラリ１０１４ａ及びｓｇＲＮＡ骨格１０１６ａを、自動マルチモジュール細胞処理機器の試薬カートリッジ内のライブラリ容器から、図１２Ｂに関連して説明する核酸アセンブリモジュール１２１０ｇ等の等温核酸アセンブリモジュール（図示せず）に追加し得る。核酸アセンブリ混合物は、例えば、特定の例では、５０μｌのギブソンアセンブリ（Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ）（登録商標）マスターミックス（Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ）、２５μｌのベクター骨格１０１６ａ及び２５μｌのオリゴ１０１４ａを含み得る。等温核酸アセンブリモジュールは、室温に維持され得る。アセンブリプロセスは、約３０分かかり得る。
【０１９５】
他の実施形態では、核酸は、マルチモジュール細胞処理機器外部でアセンブルされ、原料物質として追加される。例えば、細胞処理の第１のステップ１０１８ａをアクティブ化する前、アセンブルされた核酸のバイアル又は管は、試薬カートリッジに追加され得る。特定の例では、１００μｌのアセンブルされた核酸が提供される。
【０１９６】
幾つかの実装形態では、アセンブルされた核酸は、精製される（１０２４ａ）。アセンブルされた核酸は、例えば、ロボットハンドリングシステムにより等温核酸アセンブリモジュールから図１２Ｂの精製モジュール１２１０ｈ等の精製モジュール（図示せず）に移送され得る。他の実施形態では、等温核酸アセンブリモジュールは、精製特徴（例えば、等温核酸アセンブリ及び精製結合モジュール）を含み得る。更なる実施形態では、アセンブルされた核酸は、マルチモジュール細胞処理機器外部で精製され、原料物質として追加される。例えば、アセンブルされ精製された核酸のバイアル又は管は、細胞処理の第１のステップ１０１８ａのアクティブ化前、細胞ストック１０１２と共に試薬カートリッジに追加され得る。
【０１９７】
特定の例では、等温核酸アセンブリ混合物中の１００μｌのアセンブルされた核酸は、精製される。幾つかの実施形態では、磁性ビーズを等温核酸アセンブリモジュールに追加し、例えば、ロボットハンドリングシステムにより、１８０μｌの液体懸濁磁性ビーズを等温核酸アセンブリモジュールに追加し得る。等温核酸アセンブリモジュールに機能的に結合された磁石は、活性化され得、試料は、２００μｌエタノール中で洗浄され得る（例えば、ロボットハンドリングシステムはエタノールを等温核酸アセンブリモジュールに移送し得る）。幾つかの実施形態では、この動作からの液体廃棄物は、カートリッジの廃棄物レセプタクルに移送される（例えば、エタノール移送に用いられるものと同じピペット先端部を用いてロボットハンドリングシステムにより）。この時点で、アセンブルされた脱塩された核酸は、カートリッジのリザーバ等の保持容器に移送され得る。アセンブルされた脱塩された核酸は、細胞が形質転換可能な状態になるまで例えば４℃の温度に維持され得る。特定の例では、１００μｌのアセンブルされた核酸は、形質転換モジュール１００６に移送される前、混合リザーバにおいて４００μｌの濃縮細胞ストック１０１２に追加され得る。幾つかの実施形態では、生成プロセスには約１６分かかり得る。
【０１９８】
幾つかの実装形態では、アセンブルされた核酸及び細胞ストック１０１２は、フロースルー電気穿孔モジュール１００６に追加され、細胞ストック１０１２は、形質転換される（１０２６ａ）。例えば、ロボットハンドリングシステムは、例えば、ピペット先端部を用いて又はバイアル若しくは管の移動を通して、細胞ストック１０１２とアセンブルされた核酸との混合物を混合物リザーバからフロースルー電気穿孔モジュール１００６に移送し得る。幾つかの実施形態では、図５Ａのフロースルー電気穿孔モジュール５００等の内蔵フロースロー電気穿孔モジュールは、細胞ストック１０１２の移送に用いられる。他の実施形態では、図５Ｂのフロースルー電気穿孔モジュール５３０等のカートリッジベースの電気穿孔モジュールは、細胞ストック１０１２の移送に用いられる。例えば、電気穿孔モジュール１００６は、４℃の温度に保持され得る。説明のための例では、電気穿孔プロセスには約４分かかり得る。
【０１９９】
幾つかの実装形態では、形質転換された細胞ストック１０１２は、回復のために第２の成長モジュール１００８に移送される（１０２８ａ）。特定の例では、形質転換された細胞は、温度３０℃で第２の成長モジュール１００８において回復プロセスを経る。例えば、形質転換された細胞は、回復のために、第２の成長モジュール１００８内に約１時間維持され得る。
【０２００】
幾つかの実装形態では、選択的培地は、第２の成長バイアル（図示せず）に移送され、細胞は、残されて、選択プロセスにおいて更なる時間期間にわたり培養される。説明のための例では、抗生物質は、第２の成長バイアルに移送され得、細胞は、温度３０℃で更に２時間にわたり培養され得る。
【０２０１】
回復後、細胞は、編集の別のラウンド又は例えば自動細胞処理環境外部で行われる更なる実験のための容器内での貯蔵への準備ができ得る。代替的に、細胞の一部は、細胞ライブラリ出力として貯蔵ユニットに移送され得る一方、細胞の別の一部は、編集の第２のラウンドに向けて準備され得る。
【０２０２】
幾つかの実装形態では、編集の第２のラウンドへの準備において、形質転換された細胞は、培地交換及び濾過のために、第２の濾過モジュール１０１０に移送される（１０３０ａ）。幾つかの実装形態では、形質転換された細胞ストックを移送する前、第２の濾過モジュール１００４のフィルタは、洗浄液を用いて予め洗浄される。洗浄液は、例えば、図１Ａに関連して説明したカートリッジ１００６等の洗浄カートリッジで供給され得る。第２の濾過モジュール１０１０は、例えば、図７Ａに関連して説明したように、洗浄カートリッジの洗浄液に流体接続され得る。
【０２０３】
第２の濾過モジュール１０１０は、例えば、図７Ｂ及び図７Ｃに関連して説明した濾過モジュール７５０等のデュアル濾過モジュールの一部であり得る。特定の例では、第２の濾過モジュール１０１０は、溶出バイアルと第２の濾過モジュール１０１０との間で細胞材料を移送している間、洗浄及び溶出プロセス中に４℃に維持され得る。特定の例では、この濾過プロセスの出力は、バイアル又は管に配置され、更なる処理、例えば形質転換モジュールへの移送を待つ。バイアル又は管は、温度４℃に貯蔵ユニットを維持され得る。
【０２０４】
処理の第１の段階は、１日で行われ得る。例示的な実施形態では、処理の第１の段階は、完了までに１９時間未満（例えば、約１８．７時間）かかると推定される。幾つかの実装形態では、作業フロー１０００のこの時点で、新しい材料は、自動マルチモジュール細胞処理機器に手動で追加される。例えば、新しい試薬カートリッジを追加し得る。更に、この時点で、新しい洗浄カートリッジ、置換用フィルタ及び／又は置換用ピペット先端部を自動マルチモジュール細胞処理機器に追加し得る。更に、幾つかの実施形態では、フィルタモジュールは、清掃プロセスを受け得、且つ／又は固体及び液体廃棄物ユニットは、処理の次のラウンドへの準備として空にされ得る。更に他の実施形態では、試薬カートリッジは、編集の２つ以上のサイクルに試薬を提供し得る。
【０２０５】
幾つかの実装形態では、編集の第２のラウンドは、上述した第１の処理段階と同じモジュール１００２、１００４、１００６、１００８及び１０１０、同じ処理ステップ１０１８、１０２０、１０２２、１０２４、１０２６、１０２８及び１０３０並びに同じ温度及び時間範囲を含む。例えば、第２のオリゴライブラリ１０１４ｂ及び第２のｓｇＲＮＡ骨格１０１６ｂは、上述したのと略同じように、形質転換された細胞の編集に用いられ得る。２段階プロセスとして示されているが、他の実施形態では、２つまで、４つまで、６つまで、８つまで又はそれを超える再帰を行い、同じ細胞ストック１０１２の編集を続け得る。
【０２０６】
他の実装形態では、図１０Ｂを参照すると、作業フロー１０４０は、プロセスの第１の段階と同じモジュール１００２、１００４、１００６、１００８及び１０１０並びに同じ処理ステップ１０１８、１０２０、１０２２、１０２４、１０２６、１０２８及び１０３０を含む。しかしながら、図１０Ａの作業フロー１０００と異なり、図１０Ｂの作業フロー１０４０の第２の段階は、キュアリングステップを含む。「キュアリング」とは、ベクター  −  例えば、編集前のラウンドで使用された編集ベクター、ヌクレアーゼの発現配列を含む「エンジン」ベクター又は両方  −  が、形質転換した細胞から除去されるプロセスである。キュアリングは、例えば、キュアリングプラスミドを用いて編集ベクターを切断し、それにより編集及び／又はエンジンベクターを非機能化させる（図１０ｂの作業フローにおいて例示される）ことにより；細胞成長を介して細胞集団中のベクターを希釈する（すなわち細胞が経験する成長サイクルが多くなるほど、編集若しくはエンジンベクターを保持する娘細胞が少なくなる）（図示せず）ことにより；又は例えば、編集若しくはエンジンベクター上で熱の影響を受けやすい複製起点を利用する（図示せず）ことにより達成することができる。一例では、「キュアリングプラスミド」は、自動機器の試薬カートリッジ内に含まれ得るか、又は処理の第２の段階前に機器に手動で追加され得る。作業フロー１０００と同様に、幾つかの実施形態では、作業フロー１０４０は、図１３の処理システム１３１０等の自動マルチモジュール細胞処理機器の処理システムにより実行されるスクリプトに基づいて実行される。第１の例では、スクリプトは、第１のカートリッジに追加された機械可読マーカ又はタグを介してアクセスされ得る。幾つかの実施形態では、各処理段階は、別個のスクリプトを用いて実行される。例えば、各カートリッジは、カートリッジの内容物を処理するスクリプトの指示又はスクリプト自体を含み得る。このようにして、例えば、キュアリングカートリッジが関わる第２の段階は、キュアリングに適切な設定（例えば、温度、時間、材料数量等）に向けて設計されたスクリプトを用いて実行され得る。キュアリングの条件は、キュアリングに用いられるメカニズム、すなわちこの例ではキュアリングプラスミドが編集及び／又はエンジンプラスミドを切断する方法に依存する。
【０２０７】
幾つかの実装形態では、作業フロー１０４０の第２の段階は、第１の編集細胞を第１の成長モジュール１００２における作業フロー１０４０の第１の段階から受け取ることにより開始される。例えば、第１の編集細胞は、図１０Ａの作業フロー１０００に関連して説明したように、ステップ１０１８、１０２０、１０２２、１０２４、１０２６、１０２８及び１０３０の適用を通して、細胞ストック１０４２、オリゴライブラリ１０４４及びｓｇＲＮＡ骨格１０４６を用いて編集されていることがある。例えば、第１の編集細胞ストック１０４２は、ロボットハンドリングシステムにより第１の成長モジュール１００２に移送され得る。一例では、ロボットハンドリングシステムは、第１の編集細胞ストック１０４２のバイアルを第１の成長モジュール１００２の回転成長バイアルに追加する。別の例では、ロボットハンドリングシステムは、第１の編集細胞ストック１０４２を貯蔵ユニットのレセプタクルからピペットで移送し、細胞ストック１０４２を回転成長バイアルに追加する。細胞は、この時点で４℃の温度に維持されていることがある。
【０２０８】
幾つかの実装形態では、第１の編集細胞は、第１の成長モジュール１００２において培養され、成長し、モニタされる（１０１８ｄ）。特定の例では、第１の編集細胞ストック１０４２のアリコートは、例えば、２０ｍＬの成長培地を含む回転成長バイアルに温度３０℃で０．５０のＯＤまで移送され得る。第１の成長モジュール１００２に追加された細胞ストック１０４２は、０．５０のＯＤが自動モニタリングを介して検知されるまで経時モニタされ得る。モニタリングは、定期的であるか又は連続であり得る。これには、例えば、約９００分（推定）かかり得るが、厳密な時間は、所望のＯＤの検出に依存する。
【０２０９】
幾つかの実装形態では、所望のＯＤまで成長した後、インデューサは、細胞を誘導するために第１の成長モジュール１００２に追加される。特定の例では、１００μｌのインデューサを追加し得、成長モジュール１００２は、混合物の温度を最高４２℃にし、１５分間維持され得る。
【０２１０】
第１の編集細胞ストック１０４２は、成長及び誘導後、幾つかの実装形態では、第１の編集細胞をエレクトロコンピテントにするために第１の濾過モジュール１００４に移送される（１０２０ｄ）。一例では、ロボットハンドリングシステムは、第１の編集細胞ストック１０４２のバイアルを第１の成長モジュール１００２の回転成長バイアルから第１の濾過モジュール１００４のバイアルホルダに移動させる。別の例では、ロボットハンドリングシステムは、第１の編集細胞ストック１０４２を第１の成長モジュール１００２の回転成長バイアルからピペット移送し、第１の濾過モジュール１００４に送る。例えば、第１の編集細胞ストック１０４２を第１の成長モジュール１００２に移送するのに用いられた使い捨てピペット先端部は、細胞ストック１０４２を第１の成長モジュール１００２から第１の濾過モジュール１００４に移送するのに用いられ得る。幾つかの実施形態では、細胞ストック１０４２を第１の成長モジュール１００２から第１の濾過モジュール１００４に移送する前、第１の成長モジュール１００２は、４℃に冷却され、それにより、細胞ストック１０４２も同様にこの温度まで下がる。特定の例では、第１の成長モジュール１００２の温度は、約８分のスパンで約４℃に冷却され得、成長モジュール１００２は、温度を４℃に約１５分間維持して、細胞ストック１０１２の温度低減を保証し得る。
【０２１１】
第１の編集細胞ストック１０４２を濾過モジュールに移送する前、幾つかの実装形態では、第１の濾過モジュール１００４のフィルタは、洗浄液を用いて予め洗浄される。洗浄液は、例えば、図１Ａに関連して説明したカートリッジ１００６等の洗浄カートリッジで供給され得る。第１の濾過モジュール１００４は、例えば、図７Ａに関連して説明したように、洗浄カートリッジの洗浄液に流体接続され得る。
【０２１２】
第１の濾過モジュール１００４は、例えば、図７Ｂ及び図７Ｃに関連して説明した濾過モジュール７５０等のデュアル濾過モジュールの一部であり得る。特定の例では、第１の濾過モジュール１００４は、溶出バイアルと第１の濾過モジュール１００４との間で細胞材料を移送している間、洗浄及び溶出プロセス中に４℃に維持され得る。
【０２１３】
幾つかの実装形態では、濾過モジュール１００４において第１の編集細胞をエレクトロコンピテントにすると（１０２０ｄ）、第１の編集細胞ストック１０４２は、形質転換のために形質転換モジュール１００６（例えば、フロースルー電気穿孔モジュール）に移送される。一例では、ロボットハンドリングシステムは、細胞ストック１０４２のバイアルを第１の濾過モジュール１００４のバイアルホルダからフロースルー電気穿孔モジュール１００６のリザーバに移動させる。別の例では、ロボットハンドリングシステムは、細胞ストック１０４２を第１の濾過モジュール１００２又は一時的なリザーバからピペットで移送し、第１の濾過モジュール１００４に送る。特定の例では、第１の濾過モジュール１００４からの４００μｌの濃縮細胞ストック１０４２は、形質転換モジュール１００６に移送される前、混合リザーバに移送される。例えば、細胞ストック１０４２は、キュアリングプラスミド１０５０と混合するためにカートリッジ内のリザーバに移送され、次に混合され、ピペット先端部を用いてロボットハンドリングシステムにより移送され得る。特定の例では、形質転換モジュール１００６は、４℃に維持される。細胞ストック１０４２は、説明のための例では、約４分で形質転換され得る。
【０２１４】
幾つかの実装形態では、形質転換された細胞ストック１０４２は、回復／キュアリングのために第２の成長モジュール１００８に移送される（１０２８ｄ）。特定の例では、２０ｍｌの形質転換された細胞は、温度３０℃で第２の成長モジュール１００８において回復プロセスを経る。例えば、形質転換された細胞は、回復のために、第２の成長モジュール１００８内に約１時間維持され得る。編集の別のラウンドが望まれる場合、第１の編集プラスミド又はベクターは、キュアリングされる。編集の別のラウンドが望まれない場合、第１の編集プラスミド及びエンジンプラスミドは、キュアリングされ得る。
【０２１５】
回復及びキュアリング後、細胞は、編集の別のラウンドに向けて準備ができ得るか、又は自動細胞処理機器外部での更なる研究で用いるために貯蔵する準備ができ得る。例えば、細胞の一部は、細胞ライブラリ出力として貯蔵ユニットに移送され得る一方、細胞の別の部分は、編集の第２のラウンドに向けて準備され得る。
【０２１６】
幾つかの実装形態では、編集の第２のラウンドに向けての準備において、形質転換された細胞は、細胞をエレクトロコンピテントにするためのグリセリンを含む培地交換及び濾過（１０３０ｄ）のために第２の濾過モジュール１０１０に移送される。幾つかの実装形態では、形質転換された細胞ストックを移送する前、第２の濾過モジュール１００４のフィルタは、洗浄液を用いて予め洗浄される。洗浄液は、例えば、図１Ａに関連して説明したカートリッジ１００６等の洗浄カートリッジで供給され得る。第２の濾過モジュール１０１０は、例えば、図７Ａに関連して説明したように、洗浄カートリッジの洗浄液に流体接続され得る。
【０２１７】
第２の濾過モジュール１０１０は、例えば、図７Ｂ及び図７Ｃに関連して説明した濾過モジュール７５０等のデュアル濾過モジュールの一部であり得る。特定の例では、第２の濾過モジュール１０１０は、溶出バイアルと第２の濾過モジュール１０１０との間で細胞材料を移送している間、洗浄及び溶出プロセス中に４℃に維持され得る。特定の例では、この濾過プロセスの出力は、バイアル又は管に配置され、更なる処理を待つエレクトロコンピテント細胞である。バイアル又は管は、温度４℃に貯蔵ユニットを維持し得る。
【０２１８】
図１０Ｃを参照すると、流れ図は、細胞ストック１０６２の２つの編集をもたらす、同一の処理ステップを有する処理の２つの段階を含む酵母作業フロー１０６０を示す。各段階は、原料物質の異なるカートリッジに基づいて動作し得る。例えば、第１のカートリッジは、第１のオリゴライブラリ１０７０ａ及び第１のｓｇＲＮＡ骨格１０７２ａを含み得る。第２のカートリッジは、処理段階間又は処理前であるが、第１のカートリッジと異なる位置において自動マルチモジュール細胞処理機器に導入され、第２のオリゴライブラリ１０７０ｂ及び第２のｓｇＲＮＡ骨格１０７２ｂを含み得る。各カートリッジは、編集細胞のライブラリを構築するための「ライブラリカートリッジ」として見なされ得る。代替的に、ユーザは、細胞ストック１０６２ａの容器（例えば、バイアル又は管）を酵母細胞キットに含まれる購入されたカートリッジのそれぞれに追加し得る。
【０２１９】
幾つかの実施形態では、作業フロー１０６０は、図１３の処理システム１３１０等の自動マルチモジュール細胞処理システムの処理システムにより実行されるスクリプトに基づいて実行される。第１の例では、スクリプトは、第１のカートリッジに追加された機械可読マーカ又はタグを介してアクセスされ得る。幾つかの実施形態では、各処理段階は、別個のスクリプトを用いて実行される。例えば、各カートリッジは、カートリッジの内容物を処理するスクリプトの指示又はスクリプト自体を含み得る。
【０２２０】
幾つかの実装形態では、第１の段階は、植菌、成長及びモニタリングのために細胞ストック１０６２を第１の成長モジュール１００２に導入する（１０１８ｅ）ことで開始される。一例では、ロボットハンドリングシステムは、第１の成長モジュール１００２の回転成長バイアルに細胞ストック１０６２のバイアルを追加する。別の例では、ロボットハンドリングシステムは、第１のカートリッジから細胞ストック１０６２をピペットで移送し、細胞ストック１０６２を回転成長バイアルに追加する。細胞は、この時点で４℃の温度に維持されていることがある。特定の例では、２０ｍｌの細胞ストックを３０℃の温度で第１の成長モジュール１００２の回転成長バイアル内で０．７５のＯＤまで成長させ得る。第１の成長モジュール１００２に追加された細胞ストック１０６２は、０．７５のＯＤが自動モニタリングを介して検知されるまで、成長モジュール１００２内において時間の経過に伴って自動的にモニタされ得る。モニタリングは、定期的であるか又は連続であり得る。
【０２２１】
幾つかの実装形態では、誘導性発現システムを用い得る。したがって、所望のＯＤまで成長させた後、細胞を誘導するために、インデューサを第１の成長モジュール１００２に追加する。インデューサは、小分子又はガラクトースのような異なる糖を有する培地への培地交換であり得る。
【０２２２】
幾つかの実装形態では、細胞ストック１０６２は、成長及び誘導後、培地を交換するために、第１の濾過モジュール１００４に移送される（１０６４ａ）。一例では、ロボットハンドリングシステムは、細胞ストック１０６２のバイアルを第１の成長モジュール１００２の回転成長バイアルから第１の濾過モジュール１００４のバイアルホルダに移動させる。別の例では、ロボットハンドリングシステムは、第１の成長モジュール１００２の回転成長バイアルから細胞ストック１０６２をピペットで移送し、第１の濾過モジュール１００４に送る。例えば、細胞ストック１０６２ａを第１の成長モジュール１００２に移送するのに用いられた使い捨てピペット先端部を用いて、細胞ストック１０６２を第１の成長モジュール１００２から第１の濾過モジュール１００４に移送し得る。幾つかの実施形態では、細胞ストック１０６２を第１の成長モジュール１００２から第１の濾過モジュール１００４に移送する前、第１の成長モジュール１００２は、４℃に冷却され、それにより、細胞ストック１０６２も同様にこの温度に冷却される。特定の例では、第１の成長モジュール１００２の温度は、約８分のスパンで約４℃に冷却され得、成長モジュール１００２は、温度を４℃に約１５分間維持して、細胞ストック１０６２の温度低減を保証し得る。培地交換中、説明のための例では、０．４ｍｌの１Ｍソルビトールを細胞ストック１０６２に追加し得る。
【０２２３】
細胞ストック１０６２を移送する前、幾つかの実装形態では、第１の濾過モジュール１００４のフィルタは、洗浄液を用いて予め洗浄される。洗浄液は、例えば、図１Ａに関連して説明したカートリッジ１００６等の洗浄カートリッジで供給され得る。第１の濾過モジュール１００４は、例えば、図７Ａに関連して説明したように、洗浄カートリッジの洗浄液に流体接続され得る。
【０２２４】
第１の濾過モジュール１００４は、例えば、図７Ｂ及び図７Ｃに関連して説明した濾過モジュール７５０等のデュアル濾過モジュールの一部であり得る。特定の例では、第１の濾過モジュール１００４は、溶出バイアルと第１の濾過モジュール１００４との間で細胞材料を移送している間、洗浄及び溶出プロセス中に４℃に維持され得る。
【０２２５】
培地交換動作後、幾つかの実装形態では、細胞ストック１０６２は、調整のために再び第１の成長モジュール１００２に移送される（１０６６ａ）。一例では、ロボットハンドリングシステムは、細胞ストック１０６２のバイアルを第１の濾過モジュール１００４から第１の成長モジュール１００２に移動させる。別の例では、ロボットハンドリングシステムは、細胞ストック１０６２を第１の濾過モジュール１００４からピペットで移送し、第１の成長モジュール１００２の回転成長バイアルに送る。調整中、例えば、５ｍｌのＤＴＴ／ＬＩＡｃ及び８０ｍＭのソルビトールを細胞ストック１０６２に追加し得る。例えば、ロボットハンドリングシステムは、ＤＴＴ／ＬＩＡｃ及びソルビトールを第１の成長モジュール１００２に個々に又は同時に移送し得る。細胞ストック１０６２は、例えば、第１の成長モジュール１００２の回転成長バイアルの回転を介してＤＴＴ／ＬＩＡｃ及びソルビトールを混合し得る。調整中、細胞ストック１０６２は、４℃の温度に維持され得る。
【０２２６】
幾つかの実装形態では、調整後、細胞ストック１０６２は、細胞の洗浄及び準備のために第１の濾過モジュール１００４に移送される（１０６８）。例えば、細胞は、このステップにおいてエレクトロコンピテントにされ得る。一例では、ロボットハンドリングシステムは、細胞ストック１０６２のバイアルを第１の成長モジュール１００２の回転成長バイアルから第１の濾過モジュール１００４のバイアルホルダに移動させる。別の例では、ロボットハンドリングシステムは、細胞ストック１０６２を第１の成長モジュール１００２の回転成長バイアルからピペットで移送し、第１の濾過モジュール１００４に送る。
【０２２７】
細胞ストックを移送する前、幾つかの実装形態では、第１の濾過モジュール１００４のフィルタは、洗浄液を用いて予め洗浄される。洗浄液は、例えば、図１Ａに関連して説明したカートリッジ１００６等の洗浄カートリッジで供給され得る。第１の濾過モジュール１００４は、例えば、図７Ａに関連して説明したように、洗浄カートリッジの洗浄液に流体接続され得る。他の実施形態では、ステップ１０６４ａにおける培地交換に用いられたフィルタと同じフィルタがエレクトロコンピテントにするのに用いられる。幾つかの実施形態では、１Ｍソルビトールを用いて、酵母細胞をエレクトロコンピテントにする。
【０２２８】
幾つかの実装形態では、濾過モジュール１００４においてエレクトロコンピテントになると、細胞ストック１０６２は、形質転換のために形質転換モジュール１００６（例えば、フロースルー電気穿孔モジュール）に移送される。一例では、ロボットハンドリングシステムは、細胞ストック１０６２のバイアルを第１の濾過モジュール１００４のバイアルホルダからフロースルー電気穿孔モジュール１００６のリザーバに移動させる。別の例では、ロボットハンドリングシステムは、細胞ストック１０６２を濾過モジュール１００４又は一時的なリザーバからピペットで移送し、第１の濾過モジュール１００４に送る。特定の例では、第１の濾過モジュール１００４からの４００μｌの濃縮細胞ストック１０６２は、形質転換モジュール１００６に移送される前、混合リザーバに移送される。例えば、細胞ストック１０６２は、核酸成分（骨格及び編集オリゴヌクレオチド）と混合するためにカートリッジ内のリザーバに移送され、次に混合され、ロボットハンドリングシステムによりピペット先端部を用いて移送され得る。骨格（ベクター）及び編集オリゴヌクレオチドは細胞にアセンブルされている（インビボ）ため、核酸アセンブリモジュールは、酵母編集に必要な構成要素ではない。特定の例では、形質転換モジュールは、４℃に維持される。
【０２２９】
幾つかの実装形態では、アセンブルされる核酸及び細胞ストック１０６２は、フロースルー電気穿孔モジュール１００６に追加され、細胞ストック１０６２は、形質転換される（１０２６ｅ）。例えば、ロボットハンドリングシステムは、例えば、ピペット先端部を用いて又はバイアル若しくは管に移動を通して、細胞ストック１０６２ｅと核酸アセンブリとの混合物を混合リザーバからフロースルー電気穿孔モジュール１００６に移送し得る。幾つかの実施形態では、図５Ａのフロースルー電気穿孔モジュール５００等の内蔵フロースルー電気穿孔モジュールを用いて、細胞ストック１０６２ｅを形質転換する。他の実施形態では、図５Ｂのフロースルー電気穿孔モジュール５３０等のカートリッジベースの電気穿孔モジュールを用いて、細胞ストック１０６２ｅを形質転換する。電気穿孔モジュール１００６は、例えば、４℃の温度に維持され得る。
【０２３０】
幾つかの実装形態では、形質転換された細胞ストック１０６２ｅは、回復のために第２の成長モジュール１００８に移送される（１０２８ａ）。特定の例では、２０ｍｌの形質転換された細胞は、第２の成長モジュール１００８において回復プロセスを受ける。
【０２３１】
幾つかの実装形態では、選択的培地、例えば栄養要求性成長培地又は薬剤を含む培地が第２の成長バイアル（図示せず）に移送され、細胞は、残され、選択プロセスにおいて更なる時間期間にわたり培養される。説明のための例では、抗生物質を第２の成長バイアルに移送し得、細胞は、温度３０°で更に２時間にわたり培養され得る。
【０２３２】
回復後、細胞は、編集の別のラウンド又は細胞ライブラリへの貯蔵に使用可能な状態になり得る。例えば、細胞の一部は、細胞ライブラリ出力として貯蔵ユニットに移送され得る（１０７６ａ）一方、細胞の別の部分は、編集の第２のラウンドに向けて準備され得る（１０７８ａ）。細胞は、例えば、温度４℃で貯蔵し得る。
【０２３３】
幾つかの実装形態では、編集の第２のラウンドへの準備において、形質転換された細胞は、培地交換のために第２の濾過モジュール１０１０に移送される（１０７８ａ）。形質転換された細胞ストック１０６２ａを移送する前、幾つかの実装形態では、第２の濾過モジュール１００４のフィルタは、洗浄液を用いて予め洗浄される。洗浄液は、例えば、図１Ａに関連して説明したカートリッジ１００６等の洗浄カートリッジで供給され得る。第２の濾過モジュール１０１０は、例えば、図７Ａに関連して説明したように、洗浄カートリッジの洗浄液に流体接続され得る。
【０２３４】
例えば、第２の濾過モジュール１０１０は、図７Ｂ及び図７Ｃに関連して説明した濾過モジュール７５０等のデュアル濾過モジュールの一部であり得る。特定の例では、第２の濾過モジュール１０１０は、溶出バイアルと第２の濾過モジュール１０１０との間で細胞材料を移送している間、洗浄及び溶出プロセス中に４℃に維持され得る。
【０２３５】
濾過プロセス中、幾つかの実装形態では、細胞ストック１０６２ａの細胞壁を溶解させるために、酵素製剤が追加される。例えば、ザイロマース（Ｚｙｌｏｍａｓｅ）（登録商標）等の酵母溶解酵素を追加して、細胞壁を溶解し得る。酵母溶解酵素は、特定の例では、細胞ストック１０２６ａ中において温度３０℃で５分〜６０分にわたり培養され得る。特定の例では、この濾過プロセスの出力は、バイアル又は管内に配置されて、更なる処理を待つ。バイアル又は管は、温度４℃に貯蔵ユニットを維持し得る。
【０２３６】
処理の第１の段階は、１日で行われ得る。作業フロー１０６０のこの時点で、幾つかの実装形態では、新しい材料が自動マルチモジュール細胞処理機器に手動で追加される。例えば、新しい細胞ストック１０６２ｂ及び新しい試薬カートリッジを追加し得る。更に、この時点で、新しい洗浄カートリッジ、置換フィルタ及び／又は置換ピペット先端部を自動マルチモジュール細胞処理システムに追加し得る。更に、幾つかの実施形態では、フィルタモジュールは、清掃プロセスを受け得、且つ／又は固体及び液体廃棄物ユニットは、処理の次のラウンドへの準備として空にされ得る。
【０２３７】
幾つかの実装形態では、編集の第２のラウンドは、上述した第１の処理段階と同じモジュール１００２、１００４、１００６、１００８及び１０１０、同じ処理ステップ１０１８、１０６４、１０６６、１０２６、１０２８及び１０７６及び／又は１０７８並びに同じ条件（例えば、温度、時間範囲等）を含む。例えば、第２のオリゴライブラリ１０７０ｂ及び第２のｓｇＲＮＡ骨格１０７２ｂは、上述したのと略同じように、形質転換された細胞の組合せの編集に用い得る。２段階プロセスとして示されているが、他の実施形態では、２つまで、３つまで、４つまで、６つまで、８つまで又はそれを超える再帰を行い、細胞ストック１０６２の編集を続け得る。
【実施例】
【０２３８】
実施例Ｉ：完全自動シングルプレックスＲＧＮ特異的編集実行
本開示の自動マルチモジュール機器を用いて、ＭＡＤ７ヌクレアーゼを用いたシングルプレックス自動ゲノム編集が問題なく実行された。米国特許第９，９８２，２７９号明細書を参照されたい。
【０２３９】
ギブソンアセンブリ（Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ）（登録商標）を介してａｍｐＲプラスミド骨格及びｌａｃＺ＿Ｆ１７２＊編集カセットを自動機器に含まれる等温核酸アセンブリモジュール内の「編集ベクター」中にアセンブルした。ｌａｃＺ＿Ｆ１７２は、機能的にｌａｃＺ遺伝子をノックアウトする。「ｌａｃＺ＿Ｆ１７２＊」は、編集がｌａｃＺアミノ酸配列の１７２番目の残基で行われることを示す。アセンブリに続き、アンピュア（ＡＭＰｕｒｅ）ビーズを用いて等温核酸アセンブリモジュールにおいて産物を脱塩し、８０％エタノールを用いて洗浄し、緩衝剤中に溶出した。アセンブルされた編集ベクター及びリコンビニアリング可能状態のエレクトロコンピテント大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）細胞を電気穿孔のために形質転換モジュールに移送した。形質転換モジュールは、ＡＤＰ−ＥＰＣキュベットを含んだ。例えば、米国特許出願第６２／５５１０６９号明細書を参照されたい。細胞及び核酸を結合し、１分間混合し、電気穿孔を３０秒間、実行した。穿孔パルスのパラメータは、電圧２４００Ｖ、長さ５ｍｓ、間隔５０ｍｓ、パルス数１、極性＋であった。移送パルスのパラメータは、電圧１５０Ｖ、長さ５０ｍｓ、間隔５０ｍｓ、パルス数２０、極性＋／−であった。電気穿孔に続き、細胞を回復モジュール（もう一つの成長モジュール）に移送し、クロラムフェニコールを含むＳＯＣ培地において回復させた。１時間後、カルベニシリンを培地に追加し、細胞を更に２時間、回復させた。回復後、ユーザによる回収まで細胞を４℃に維持した。
【０２４０】
自動プロセス及び回復後、ラクトース（糖基材として）、クロラムフェニコール及びカルベニシリンが補足されたマッコンキー（ＭａｃＣｏｎｋｅｙ）寒天ベースに細胞のアリコートを配置し、コロニーが現れるまで成長させた。白色コロニーは、機能編集された細胞を表し、紫色コロニーは、非編集細胞を表した。全ての液体移送は、自動マルチモジュール細胞処理機器の自動液体ハンドリングデバイスにより実行した。
【０２４１】
自動処理の結果は、合計で約１．０Ｅ−０３の細胞が形質転換し（従来のベンチトップ結果に匹敵する）、編集効率は、８３．５％であった。白色コロニーにおけるｌａｃＺ＿１７２編集は、細胞のゲノムの編集領域のシーケンシングにより確認された。更に、自動細胞処理のステップをウェブカムにより遠隔から観測し、テキストメッセージを送信して、自動処理手順のステータスを更新した。
実施例ＩＩ：完全自動再帰的編集実行
自動マルチモジュール細胞処理システムを用いて再帰的編集が問題なく達成された。ギブソンアセンブリ（Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ）（登録商標）を介してａｍｐＲプラスミド骨格及びｌａｃＺ＿Ｖ１０＊編集カセットを自動システムに含まれる等温核酸アセンブリモジュール内の「編集ベクター」中にアセンブルした。ｌａｃＺ＿Ｆ１７２編集と同様に、ｌａｃＺ＿Ｖ１０編集も機能的にｌａｃＺ遺伝子をノックアウトする。「ｌａｃＺ＿Ｖ１０」は、編集がｌａｃＺアミノ酸配列のアミノ酸位置１０で行われることを示す。アセンブリに続き、産物は、アンピュア（ＡＭＰｕｒｅ）ビーズを用いて等温核酸アセンブリモジュールにおいて脱塩され、８０％エタノールを用いて洗浄され、緩衝剤中に溶出した。第１のアセンブルされた編集ベクター及びリコンビニアリング可能状態のエレクトロコンピテント大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）細胞を電気穿孔のために形質転換モジュールに移送した。形質転換モジュールは、ＡＤＰ−ＥＰＣキュベットを含んだ。細胞及び核酸を結合し、１分間混合し、電気穿孔を３０秒間、実行した。穿孔パルスのパラメータは、電圧２４００Ｖ、長さ５ｍｓ、間隔５０ｍｓ、パルス数１、極性＋であった。移送パルスのパラメータは、電圧１５０Ｖ、長さ５０ｍｓ、間隔５０ｍｓ、パルス数２０、極性＋／−であった。電気穿孔に続き、細胞を回復モジュール（もう一つの成長モジュール）に移送し、クロラムフェニコールを含むＳＯＣ培地において回復させた。１時間後、カルベニシリンを培地に追加し、細胞を更に２時間、成長させた。次に、細胞を遠心分離モジュールに移送し、次に培地交換を実行した。クロラムフェニコール及びカルベニシリンを含むＴＢ中に細胞を再懸濁させ、ＴＢ中で細胞を２．７のＯＤ６００まで成長させ、次に濃縮し且つエレクトロコンピテントにさせた。
【０２４２】
細胞成長中、等温核酸アセンブリモジュールにおいて第２の編集ベクターを準備した。第２の編集ベクターは、カナマイシン耐性遺伝子を含み、編集カセットは、ｇａｌＫ  Ｙ１４５＊編集を含んだ。成功の場合、ｇａｌＫ  Ｙ１４５＊編集は、ガラクトースを取り込み代謝する能力を細胞に付与する。ｇａｌＫ  Ｙ１５４＊カセットにより生成された編集は、１５４番目のアミノ酸残基に停止コドンを導入し、チロシンアミノ酸を停止コドンに変える。この編集は、ｇａｌＫ遺伝子産物を非機能的にし、細胞がガラクトースを代謝できないようにする。アセンブリに続き、アンピュア（ＡＭＰｕｒｅ）ビーズを用いて等温核酸アセンブリモジュールにおいて第２の編集ベクター産物を脱塩し、８０％エタノールを用いて洗浄し、緩衝剤中に溶出した。上記において詳述したものと同じパラメータを用いて、アセンブルされた第２の編集ベクター及びエレクトロコンピテント大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）細胞（形質転換され、第１の編集ベクターに選択された）を電気穿孔のために形質転換モジュールに移送した。電気穿孔に続き、細胞を回復モジュール（もう一つの成長モジュール）に移送し、カルベニシリンを含むＳＯＣ培地において回復させた。回復後、回収されるまで細胞を４℃に維持し、回収後、クロラムフェニコール及びカナマイシンが補足されたＬＢ寒天に細胞のアリコートを配置した。ｌａｃＺ編集及びｇａｌＫ編集の両方を定量化するために、２つの培地タイプ上にレプリカパッチプレートを生成した：１）ラクトース（糖基材として）、クロラムフェニコール及びカナマイシンが補足されたマッコンキー（ＭａｃＣｏｎｋｅｙ）寒天ベース、並びに２）ガラクトース（糖基材として）、クロラムフェニコール及びカナマイシンが補足されたマッコンキー（ＭａｃＣｏｎｋｅｙ）寒天ベース。全ての液体移送は、自動マルチモジュール細胞処理システムの自動液体ハンドリングデバイスにより実行した。
【０２４３】
この再帰的編集実験では、スクリーニングされたコロニーの４１％は、ｌａｃＺ編集及びｇａｌＫ編集の両方を有し、その結果は、「ベンチトップ」又は手動手法を用いて得られた編集効率の２倍に匹敵した。
機器アーキテクチャの代替の実施形態
図１２Ａ及び図１２Ｂは、自動細胞処理、例えば複数の細胞における編集を単一のサイクルで実行する自動マルチモジュール細胞編集機器の例の代替の実施形態を示す。自動マルチモジュール細胞編集機器は、例えば、研究所環境内で使用するように設計されたデスクトップ機器であり得る。自動マルチモジュール細胞編集機器は、自動ゲノム切断及び／又は編集を細胞で行うに当たり種々の段階的動作を実行するために、再使用可能な要素と使い捨て要素とを混合したものを組み込み得る。
【０２４４】
図１２Ａは、本開示の一実施形態による、複数の細胞における自動細胞処理、例えば編集を単一のサイクルで実行する第１の例の機器１２００のブロック図である。幾つかの実装形態では、機器１２００は、デック１２０２、ＤＮＡ試料成分を機器１２００に導入する試薬供給レセプタクル１２０４、細胞を機器１２００に導入する細胞供給レセプタクル１２０６並びに自動細胞処理を実行するために、材料を機器１２００のモジュール（例えば、モジュール１２１０ａ、１２１０ｂ、１２１０ｃ、１２１０ｄ）、レセプタクル（例えば、レセプタクル１２０４、１２０６、１２１２、１２２２、１２２４及び１２２６）並びに貯蔵ユニット（例えば、ユニット１２１６、１２１８、１２２８及び１２１４）間で移動させるロボットハンドリングシステム１２０８を含む。幾つかの実施形態では、細胞供給１２０６の処理が完了すると、細胞出力１２１２は、一時的に貯蔵し、後に回収するために、ロボットハンドリングシステム１２０８により貯蔵ユニット１２１４に移送され得る。
【０２４５】
ロボットハンドリングシステム１２０８は、例えば、液体を種々の材料源から種々のモジュール１２１０及び貯蔵ユニット１２１４に移送する空気容積型ポンプを含み得る。他の実施形態では、ロボットハンドリングシステム１２０８は、原料物質の容器（例えば、管）を供給カートリッジ（図示せず、図１Ａに関連して考察された）から種々のモジュール１２１０に移送するピックアンドプレースヘッドを含み得る。幾つかの実施形態では、１つ又は複数のカメラ又は他の光学センサ（図示せず）は、適切なガントリの移動及び位置を確認する。
【０２４６】
幾つかの実施形態では、ロボットハンドリングシステム１２０８は、移送先端部供給源１２１６に提供される使い捨て移送先端部を用いて、機器１２００内で原料物質、試薬１２０４（例えば、核酸アセンブリ）及び細胞１２０６を移送する。例えば、使用済みの移送先端部１２１６は、固体廃棄物ユニット１２１８内に破棄され得る。幾つかの実装形態では、固体廃棄物ユニット１２１８は、ロボットハンドリングシステム１２０８のピックアンドプレースヘッドから管を除去するキッカーを含む。
【０２４７】
幾つかの実施形態では、機器１２００は、空気容積型ポンプに接続するシッパーを有するエレクトロポレータキュベットを含む。幾つかの実装形態では、細胞１２０６及び試薬１２０４は、シッパーを通して電気穿孔キュベットに吸引され、キュベットは、機器１２００の１つ又は複数のモジュール１２１０に移される。
【０２４８】
幾つかの実装形態では、機器１２００は、図１３の処理システム１３１０等の処理システム１２２０により制御される。処理システム１２２０は、ユーザ入力に基づいて機器１２００を動作させるように構成され得る。処理システム１２２０は、機器１２００の種々のモジュール１２１０のタイミング、持続時間、温度及び他の動作を制御し得る。処理システム１２２０は、機器１２００の動作のために電源（図示せず）に接続され得る。
【０２４９】
幾つかの実施形態では、機器１２００は、例えば、編集に関連して、核酸を細胞１２０６に導入する形質転換モジュール１２１０ｃを含む。例えば、ロボットハンドリングシステム１２０８は、試薬１２０４及び細胞１２０６を形質転換モジュール１２１０ｃに移送し得る。形質転換モジュール１２１０は、トランスフェクション、形質転換及びマイクロ流体の当業者により慣習的に用いられる任意の細胞形質転換又はトランスフェクション技法を行い得る。形質転換は、それらの形質転換技法及びトランスフェクション技法を含めた、外因性核酸配列（例えば、ＤＮＡ）を標的細胞に導入する種々の当技術分野で認識されている技法の包含を意図する。そのような方法には、限定ではなく、電気穿孔、リポフェクション、光穿孔、注入、マイクロ沈殿、マイクロ注入、リポソーム、微粒子銃、ソノポレーション、レーザ誘起穿孔、ビーズトランスフェクション、リン酸カルシウム若しくは塩化カルシウム共沈又はＤＥＡＥ−デキストラン−媒介トランスフェクションがある。形質転換は、マイクロ管、試験管、キュベット、マルチウェルプレート、微小繊維又はフロー機器において行うことができる。処理システム１２２０は、形質転換モジュール１２１０ｃの温度及び動作を制御し得る。幾つかの実装形態では、処理システム１２００は、ユーザにより設定された１つ又は複数の様々な制御に従って形質転換モジュール１２１０ｃの動作に影響を及ぼす。
【０２５０】
幾つかの実装形態では、形質転換モジュール１２１０ｃは、前処理液１２２２を用いて細胞コンピテンスを上げること、例えばスクロース又はグリセリン洗浄により、ベクター取り込みに向けて細胞を準備するように構成される。更に、機械的及び化学的トランスフェクション方法、例えば化学的トランスフェクションを機械的方法と組み合わせるトランスフェクション方法論であるマグネトフェクションの機能を利用するハイブリッド技法を用いることができる。別の例では、陽イオン脂質を遺伝子銃又はエレクトロポレータと組み合わせて展開し得る。標的細胞の形質転換又はトランスフェクションに適した材料及び方法は、例えば、グリーン（Ｇｒｅｅｎ）及びサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）著、「分子クローニング：ラボラトリーマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第４版、コールドスプリングハーバ研究所プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州コールドスプリングハーバ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）、２０１４年及び他のラボラトリーマニュアルに見出すことができる。
【０２５１】
形質転換に続き、幾つかの実装形態では、細胞は、回復モジュール１２１０ｄに移送され得る。幾つかの実施形態では、回復モジュール１２１０ｄは、回復及び編集モジュールの誘導の組合せである。回復モジュール１２１０ｄにおいて、細胞は、回復し、核酸を発現し得、誘導性ヌクレアーゼシステムでは、ヌクレアーゼが、例えば、幾つかの例ではヌクレアーゼ発現のための化学的、光、ウィルス若しくは温度誘導又はインデューサ分子１２２４の導入等の一時的に制御される誘導により細胞に導入される。
【０２５２】
編集に続き、幾つかの実装形態では、細胞は、貯蔵ユニット１２１４に移送され、貯蔵ユニット１２１４において、細胞は、細胞が更なる研究又は編集細胞集団、例えば編集細胞ライブラリの回収のために取り出されるまで細胞出力１２１２として貯蔵することができる。
【０２５３】
幾つかの実装形態では、機器１２００は、再帰的ゲノム編集に向けて設計され、再帰的ゲノム編集では、複数の編集が細胞集団の細胞内部のゲノムに順次導入される。幾つかの実装形態では、試薬供給源１２０４は、再帰的処理のために貯蔵ユニットから細胞出力１２１２にアクセスする前に補充される。他の実装形態では、続く処理サイクル前にユーザ介入が必ずしも必要ないように、複数の試薬供給源１２０４及び／又は大容積の試薬供給源１２０４を機器１２００に導入し得る。
【０２５４】
幾つかの実施形態では、細胞出力１２１２ａの一部は、自動細胞成長モジュール１２１０ａに移送される。例えば、細胞出力１２１２ａの全てを移送し得るか、又は機器が増分的に変更された試料を保持するようにアリコートのみを移送し得る。細胞成長モジュール１２１０ａは、幾つかの実装形態では、成長中、細胞のＯＤを測定して、編集の誘導前に細胞が所望の濃度であることを保証する。使用することができる細胞濃度及び生理学的状態の他の尺度には、限定ではなく、ｐＨ、溶解酸素、放出酵素、音響特性及び電気特性がある。
【０２５５】
幾つかの実施形態では、ゲノム編集を受けない細胞の背景を低減するために、成長モジュール１２１０ａは、選択的成長培地１２２６を用いて選択プロセスを実行して、編集細胞を富化する。例えば、導入された核酸は、抗生物質耐性又は別の選択可能なマーカを授ける遺伝子を含むことができる。幾つかの実装形態では、複数の選択的遺伝子又はマーカ１２２６は、再帰的編集中、細胞に導入され得る。例えば、編集の順次ラウンドで選択可能なマーカの導入を交互にすることにより、非編集細胞の背景をなくし、機器１２００の複数のサイクルが順次ゲノム編集を有する細胞を選択できるようにし得る。適した抗生物質耐性遺伝子には、限定ではなく、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナバニン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ピュロマイシン耐性遺伝子及びクロラムフェニコール耐性遺伝子等の遺伝子がある。
【０２５６】
成長モジュール１２１０ａから、細胞は、濾過モジュール１１０ｂに移送され得る。濾過モジュール１２１０ｂ又は代替的に細胞洗浄及び濃縮モジュールは、培地交換を可能にし得る。幾つかの実施形態では、死んだ細胞背景の除去は、洗浄剤、浸透ストレス、温度、酵素、プロテアーゼ、バクテリオファージ、還元剤又はカオトロープ等の溶解性エンハンサーを用いて支援される。他の実施形態では、細胞除去及び／又は培地交換を用いて、死んだ細胞背景を除去する。幾つかの実施形態では、濾過モジュール１２１０ｂからの廃棄産物は、液体廃棄物ユニット１２２８に集められる。
【０２５７】
濾過後、詳細に上述したように、細胞は、形質転換モジュール１２１０ｃに提示され得、次に回復モジュール１２１０ｄ及び最後に貯蔵ユニット１２１４に提示され得る。
図１２Ｂを参照すると、図１２Ａと同様に、複数の細胞において自動ゲノム切断及び／又は編集を単一のサイクルで実行する第２の例の機器１２４０は、デック１２０２と、１つ又は複数の核酸成分を機器１２４０に導入する試薬供給レセプタクル１２０４と、細胞を機器１２４０に導入する細胞供給レセプタクル１２０６と、自動細胞処理を実行するために、材料を機器１２４０のモジュール（例えば、モジュール１２１０ａ、１２１０ｂ、１２１０ｃ、１２１０ｆ、１２１０ｇ、１２１０ｍ及び１２１０ｈ）、レセプタクル（例えば、レセプタクル１２０４、１２０６、１２１２、１２１４、１２２４、１２４２、１２４４及び１２４６）並びに貯蔵ユニット（例えば、ユニット１２１４、１２１６、１２１８及び１２２８）間で移動させるロボットハンドリングシステム１２０８とを含む。細胞供給１２０６の処理が完了すると、幾つかの実施形態では、細胞出力１２１２は、一時的に貯蔵し、後に回収するために、ロボットハンドリングシステム１２０８により貯蔵ユニット１２１４に移送され得る。
【０２５８】
幾つかの実施形態では、ロボットハンドリングシステム１２０８は、図１２Ａに関連して説明したように、移送先端部供給源１２１６に提供される使い捨て移送先端部を用いて、機器１２４０内で原料物質、ベクター骨格１２４２、編集オリゴ１２４４、試薬１２０４（例えば、核酸アセンブリ、核酸精製のため、細胞をエレクトロコンピテントにするため等）及び細胞１２０６を移送する。
【０２５９】
他の実施形態では、機器１２４０は、空気容積型ポンプに接続するシッパーを有するエレクトロポレータキュベットを含む。幾つかの実装形態では、細胞１２０６及び試薬１２０４は、シッパーを通して電気穿孔キュベットに吸引され、キュベットは、機器１２４０の１つ又は複数のモジュール１２１０に移される。
【０２６０】
図１２Ａに関連して説明したように、幾つかの実装形態では、機器１２４０は、図１３の処理システム１３１０等の処理システム１２２０により制御される。
幾つかの実施形態では、機器１２４０は、核酸アセンブリモジュール１２１０ｇ、特定の例では自動マルチモジュール細胞処理機器を含み、核酸アセンブリモジュール１２１０ｇは、幾つかの実施形態では、等温核酸アセンブリを含み得る。上述したように、等温核酸アセンブリモジュールは、ギブソンアセンブリ（Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ）（登録商標）分子クローニング法を実行するように構成される。
【０２６１】
幾つかの実施形態では、核酸をアセンブルした後、核酸（例えば、等温核酸アセンブリの例では等温核酸アセンブリ混合物（核酸＋等温核酸アセンブリ試薬））は、精製モジュール１２１０ｈに移送される。ここで、核酸アセンブリ混合物の不要成分は、除去され（例えば、塩、鉱物）、特定の実施形態では、アセンブルされた核酸は、濃縮される。例えば、例示的な実施形態では、精製モジュール１２１０ｈにおいて、等温核酸アセンブリ混合物は、無塩緩衝剤及び固相可逆的固定化（ＳＰＲＩ：Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）磁性ビーズ又はアンピュア（ＡＭＰｕｒｅ）ビーズ等の磁性ビーズと組み合わされ得る。等温核酸アセンブリ混合物は、アセンブルされた核酸を磁性ビーズに結合するのに十分な時間（例えば、３０秒〜１０分）にわたり培養され得る。幾つかの実施形態では、精製モジュールは、磁性ビーズと係合するように構成された磁石を含む。磁石は、アセンブルされ結合した核酸から上澄みを除去し、例えば８０％エタノールでアセンブルされ結合した核酸を洗浄することができるように係合し得る。ここでも、磁石は、係合し得、８０％エタノール洗浄液を除去し得る。磁性ビーズ／アセンブルされた核酸は、乾燥され得、次にアセンブルされた核酸を溶出させ得、磁石を再び係合して、それにより今回はビーズを隔離し、溶出した、アセンブルされた核酸を含む上澄みを除去し得る。次に、アセンブルされた核酸は、形質転換モジュール（例えば、好適な実施形態ではエレクトロポレータ）に移送され得る。形質転換モジュールは、移送時、エレクトロコンピテント細胞を既に含み得る。
【０２６２】
幾つかの実施形態では、機器１２４０は、図１２Ａに関連して説明したように、核酸を細胞１２０６に導入する形質転換モジュール１２１０ｃを含む。しかしながら、これに関連して、精製モジュール１２１０ｈから出力されたアセンブルされた核酸１２０４は、細胞１２０６との結合のために形質転換モジュール１２１０ｃに移送される。
【０２６３】
形質転換モジュール１２１０ｃにおける形質転換に続き、幾つかの実装形態では、細胞は、回復モジュール１２１０ｍに移送され得る。回復モジュール１２１０ｅにおいて、細胞は、回復され、核酸を発現し得、誘導性ヌクレアーゼシステムでは、ヌクレアーゼが、例えば、幾つかの例ではヌクレアーゼ発現のための化学的、光、ウィルス若しくは温度誘導又はインデューサ分子の導入等の一時的に制御される誘導により導入される。
【０２６４】
回復に続き、幾つかの実装形態では、細胞は、編集モジュール１２１０ｆに移送される。編集モジュール１２１０ｆは、例えば、誘導された核酸の発現及び誘導性ヌクレアーゼの誘導を通して細胞のゲノムの編集を誘導するのに適切な状況を供給する。細胞は、誘導性ヌクレアーゼを含み得る。幾つかの例では、ヌクレアーゼは、編集モジュール１２１０ｆ内で化学的に誘導、生物学的に誘導（例えば、誘導性プロモータを介する）、ウィルス的に誘導、光誘導、温度誘導及び／又は熱誘導され得る。
【０２６５】
幾つかの実装形態では、図１２Ａに関連して説明したように、編集に続き、細胞は、貯蔵ユニット１２１４に移送される。
幾つかの実装形態では、機器１２４０は、再帰的ゲノム編集に向けて設計され、再帰的ゲノム編集では、複数の編集は、細胞集団の細胞内部のゲノムに順次導入される。幾つかの実装形態では、試薬供給源１２０４は、再帰的処理のために貯蔵ユニットから細胞出力１２１２にアクセスする前に補充される。例えば、核酸アセンブリモジュール１２１０ｇ及び精製モジュール１２１０ｈを介したアセンブリ及び準備のために、追加のベクター骨格１２４２及び／又は編集オリゴ１２４４を機器１２４０に導入し得る。他の実装形態では、続く処理サイクル前にユーザ介入が必ずしも必要ないように、複数のベクター骨格容積１２４２及び／又は編集オリゴ１２４４を機器２１４０に導入し得る。各後続サイクルにおいて、ベクター骨格１２４２及び／又は編集オリゴ１２４４は、変更し得る。核酸アセンブリが準備されるとき、核酸アセンブリは、試薬供給源１２０４又は別の貯蔵領域に提供され得る。
【０２６６】
幾つかの実施形態では、図１２Ａに関連して考察したように、細胞出力１２１２ａの一部は、自動細胞成長モジュール１２１０ａに移送される。
幾つかの実施形態では、ゲノム編集を受けない細胞の背景を低減するために、図１２Ａに関連して考察したように、成長モジュール１２１０ａは、選択的成長培地１２２６を用いて選択プロセスを実行して、編集細胞を富化する。
【０２６７】
図１２Ａに関連して考察したように、成長モジュール１２１０ａから、細胞は、濾過モジュール１２１０ｂに移送され得る。示されるように、溶離剤供給源１２４６からの溶離剤（例えば、緩衝剤、グリセリン）は、培地交換のために濾過モジュール１２１０ｂに移送され得る。
【０２６８】
濾過後、上述したように、細胞は、形質転換のために形質転換モジュール１２１０ｃに提示され得、次に回復モジュール１２１０ｍ及び編集モジュール１２１０ｆ及び最後に貯蔵ユニット１２１４に提示され得る。
【０２６９】
幾つかの実施形態では、図１２Ａ及び／又は図１２Ｂの自動マルチモジュール細胞処理機器は、図１Ａ及び図１Ｂに関連して考察したように、１つ又は複数の交換式供給カートリッジ及びロボットハンドリングシステムを含む。各カートリッジは、核酸アセンブリ混合物、オリゴヌクレオチド、ベクター、成長培地、選択剤（例えば、抗生物質）、誘導剤、固相可逆的固定化（ＳＰＲＩ）ビーズ等の核酸精製試薬、エタノール及び１０％グリセリンの１つ又は複数を含み得る。
【０２７０】
一例の機器１２００、１２４０は、特定の構成のモジュール１２１０を含むものとして示されているが、これらの構成は、単なる例示を目的とする。例えば、他の実施形態では、より多数又はより少数のモジュール１２１０を各機器１２００、１２４０内に含め得る。また、例えば、例としてハイブリドーマを提供する細胞融合を促進するモジュール、アセンブリ前に核酸を増幅するモジュール並びに／又はタンパク質発現及び／若しくは分泌を促進するモジュール等の異なるモジュールを機器に含めることもできる。更に、図１Ａの複製細胞成長モジュール１１０ａ、１１０ｂ等の特定のモジュール１２１０は、特定の実施形態内で複製され得る。各機器１２００及び１２４０は、別の例では、図１Ａのカートリッジ１０４及び１０６等の培地カートリッジを受け入れるように設計され得る。更なる変更も可能である。
自動マルチモジュール細胞処理機器の制御システム
図１１を参照すると、スクリーンショットは、自動マルチモジュール細胞処理機器とインターフェースする一例のグラフィカルユーザインターフェース（ＧＵＩ：ｇｒａｐｈｉｃａｌ  ｕｓｅｒ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）１１００を示す。インターフェースは、例えば、図１Ｃ及び図２Ｄのディスプレイ２３６に提示され得る。一例では、ＧＵＩ１１００は、図１３の処理システム１３１０によりタッチスクリーン１３１６に提示され得る。
【０２７１】
幾つかの実装形態では、ＧＵＩ１１００は、プロトコールペイン１１０２、温度ペイン１１０６、電気穿孔ペイン１１０８及び細胞成長ペイン１１１０等の幾つかの情報ペイン及びデータ入力ペインに分けられる。更なるペインも可能である。例えば、幾つかの実施形態では、ＧＵＩ１１００は、幾つかの例では、核酸アセンブリモジュール、精製モジュール、細胞成長モジュール、濾過モジュール、形質転換モジュール、編集モジュール及び回復モジュールのそれぞれの１つ又は複数等、各モジュールにペインを含む。ＧＵＩ１１００の下部ペインは、幾つかの実施形態では、現在の作業フローに適用可能なモジュール（例えば、プロトコールペイン１１０２において選択されるか、又はスクリプトインターフェース（図示せず）を通してロードされたスクリプト内で指定される）を表す。幾つかの実施形態では、スクロール又はページング特徴により、ユーザは、図１１のスクリーンショット内に示されていない追加のペインにアクセスすることができ得る。
【０２７２】
ＧＵＩ１１００は、幾つかの実施形態では、示されるスクリーンショット等の種々の画面にアクセスする（例えば、ホーム制御機構１１２０ａの使用を通して）ための一連の制御機構１１２０を含む。例えば、編集制御機構１１２０ｂの選択を通して、ユーザに、１つ、２つ又は一連の細胞処理ステップを提供する選択肢を提供し得る。スクリプト制御機構１１２０ｃの選択を通して、ユーザに、新しい処理スクリプトを追加する機会又は既存の処理スクリプトを変更する機会を提供し得る。ユーザは、幾つかの実施形態では、ヘルプ制御機構１１２０ｄを選択して、ＧＵＩ１１００及び自動マルチモジュール細胞処理機器の特徴に関する更なる情報を取得し得る。幾つかの実装形態では、ユーザは、設定制御機構１１２０ｅを選択して、幾つかの例では、タイムゾーン、言語、単位、ネットワークアクセス選択肢等の所望のプロセス及び／又はＧＵＩ１１００の設定選択肢にアクセスする。電力制御機構１１２０ｆは、選択されると、ユーザが自動マルチモジュール細胞処理機器の電源を切れるようにする。
【０２７３】
プロトコールペイン１１０２を参照すると、幾つかの実装形態では、ユーザは、プロトコールをプロトコール入力フィールド１１１２に入力すること（又は代替的にドロップダウンメニュー）により、自動マルチモジュール細胞処理機器によって実行されるプロトコール（例えば、スクリプト又は作業フロー）を選択する。他の実施形態では、プロトコールは、例えば、スクリプト制御機構１１２０ｂを選択することによりアクセスされる別個のユーザインターフェース画面を通して選択され得る。別の例では、自動マルチモジュール細胞処理機器は、プロトコールを選択し、それをプロトコール入力フィールド１１１２に提示し得る。例えば、自動マルチモジュール細胞処理機器の処理システムは、自動マルチモジュール細胞処理機器に装填された１つ又は複数のカートリッジに位置決めされた機械可読印をスキャンして、適切なプロトコールを決定し得る。示されるように、「Ｍｉｃｒｏｂｅ＿Ｋｉｔ１（１．０．２）」プロトコールが選択されており、これは、自動マルチモジュール細胞処理機器と併用するために購入されたカートリッジのキット及び他の使い捨て供給品に対応し得る。
【０２７４】
幾つかの実装形態では、プロトコールペイン１１０２は、プロトコール入力フィールド１１１２に提示されたプロトコールの実行を制御する開始制御機構１１１４ａ及び停止制御機構１１１４ｂを更に含む。ＧＵＩ１１００は、タッチスクリーンインターフェース上に提供し得、例えば開始制御機構１１１４ａをタッチ選択すると、細胞処理が開始され、停止制御機構１１１４ｂを選択すると、細胞処理が停止する。
【０２７５】
実行ステータスペイン１１０４を参照すると、幾つかの実装形態では、チャート１１１６は、プロトコールペイン１１０２において識別されたプロトコールの処理の段階を示す。例えば、実行完了１１１８ａの部分は、青色で示される一方、現在段階１１１８ｂの部分は、緑色で示され、任意のエラー１１１８ｃは、エラーが生じた実行完了１１１８ａの部分の過程に沿った時点から延びるマーカでフラグされる。メッセージ領域１１１８ｄは、完了した実行の割合、完了した段階の割合及びエラー総数を提示する。幾つかの実施形態では、チャート１１１６が選択されると、ユーザに、幾つかの例ではエラーのタイプの識別、現在の処理段階の名称（例えば、核酸アセンブリ、精製、細胞成長、濾過、形質転換、回復、編集等）及び実行内の処理段階のリスト等の実行ステータスに関する更なる詳細を提示し得る。更に、幾つかの実施形態では、実行完了時間メッセージは、実行が完了すると推定される日時を示す。幾つかの例では、実行は、１つの細胞編集プロセス又はユーザ介入なしで実行がスケジュールされた一連の再帰的細胞編集プロセスを示し得る。幾つかの実施形態（図示せず）では、実行ステータスペイン１１０４は、ユーザ介入（例えば、カートリッジ交換、固体廃棄物の廃棄、液体廃棄物の廃棄等）が必要とされる推定時間を更に示す。
【０２７６】
幾つかの実装形態では、実行ステータスペイン１１０４は、細胞処理を一時停止する一時停止制御機構１１２４を含む。ユーザは、例えば、識別されたエラーを修正するため又は廃棄物除去等の手動介入を行うために現在の実行の一時停止を選択し得る。
【０２７７】
温度ペイン１１０６は、幾つかの実施形態では、自動マルチモジュール細胞処理機器の種々の装置の温度設定を示す対応するメッセージ１１２８を有する一連のアイコン１１２６を示す。アイコンは、左から右に、形質転換モジュール１１２６ａ（例えば、図１Ａの試薬カートリッジ１１０ｃに関連付けられたフロースルー電気穿孔カートリッジ又は図５Ｂのフロースルー電気穿孔デバイス５３４）、精製モジュール１１２６ｂ、第１の成長モジュール１１２６ｃ、第２の成長モジュール１１２６ｄ及び濾過モジュール１１２６ｅを表し得る。対応するメッセージ１１２８ａ〜ｅは、対応するモジュール（例えば、この段階又はこの実行での）現在の温度、低温及び高温を識別する。アイコン１１２６の１つを選択するに当たり、幾つかの実施形態では、時間の温度のグラフィック表示をレビューし得る。
【０２７８】
温度ペインの下において、幾つかの実装形態では、一連のペインは、幾つかのモジュールの現在ステータスを識別する。例えば、電気穿孔ペイン１１０８は、形質転換モジュールのステータスを表す一方、細胞成長ペイン１１１０は、成長モジュールのステータスを表す。幾つかの実施形態では、ここで提示されるペインは、現在動作可能なモジュール（例えば、現在の段階で細胞処理に関わるモジュール）のステータス及び現在の実行（示されるように、例えば実行ステータスペイン１１０４における）中に既に利用した任意のモジュールのステータスを識別する。過去のステータス情報は、例えば、細胞処理前の段階において用いられたパラメータに関する情報をユーザに提示し得る。
【０２７９】
電気穿孔ペイン１１０８を参照すると、幾つかの実装形態では、ボルト、ミリアンペア及びジュール単位の動作パラメータ１１３０ａが提示される。更に、ステータスメッセージ１１３２ａは、幾つかの例では、エラーステータス、処理の残り時間又はモジュールの内容物（例えば、モジュールに追加された材料）等の形質転換モジュールの機能に関する追加情報を識別し得る。幾つかの実装形態では、ステータスメッセージ１１３２ａの上のアイコン１１３４ａは、対応するモジュールが活発に処理中であるとき、アクティブモード（例えば、有色、「点灯」、太字等）で提示される。幾つかの実施形態では、アイコン１１３４ａを選択すると、動作パラメータ１１３０ａに関する詳細情報のグラフィック表示が提示される。
【０２８０】
幾つかの実装形態では、細胞成長ペイン１１１０を参照すると、成長のＯＤ及び時間の動作パラメータ１１３０ｂが提示される。更に、ステータスメッセージ１１３２ｂは、幾つかの例では、エラーステータス、処理の残り時間又はモジュールの内容物（例えば、モジュールに追加された材料）等の成長モジュールの機能に関する追加情報を識別し得る。幾つかの実装形態では、ステータスメッセージ１１３２ｂの上のアイコン１１３４ｂは、対応するモジュールが活発に処理中であるとき、アクティブモード（例えば、有色、「点灯」、太字等）で提示される。幾つかの実施形態では、アイコン１１３４ｂを選択すると、動作パラメータ１１３０ｂに関する詳細情報のグラフィック表示が提示される。
【０２８１】
次に、図１３を参照して、例示的な実施形態による一例の処理システム及び処理環境のハードウェア説明について説明する。図１３において、処理システム１３１０は、上述した処理の一部を実行するＣＰＵ１３０８を含む。例えば、ＣＰＵ１３０８は、図９の方法９００及び／又は図１０Ａ〜図１０Ｃの作業フローの処理段階を管理し得る。プロセスデータ及びスクリプト、命令及び／又はユーザ設定は、メモリ１３０２に記憶され得る。これらのプロセスデータ及びスクリプト、命令及び／又はユーザ設定は、ポータブル記憶培地（例えば、ＵＳＢドライブ、光ディスクドライブ等）等の記憶培地ディスク１３０４に記憶され得るか、又は遠隔に記憶され得る。例えば、プロセスデータ及びスクリプト、命令及び／又はユーザ設定は、ネットワーク１３２８を介して処理システム１３１０がアクセス可能なロケーションに記憶され得る。更に、請求項に記載される進歩は、本発明のプロセスの命令が記憶されるコンピュータ可読培地の形態によって限定されない。例えば、命令は、フラッシュメモリ、ＲＡＭ、ＲＯＭ又はサーバ、コンピュータ、スマートフォン若しくは他のハンドヘルド計算デバイス等、処理システム１３１０が通信する任意の他の情報処理デバイスに記憶され得る。
【０２８２】
更に、請求項に記載される進歩の構成要素は、当業者に既知の他の計算システム等のＣＰＵ１３０８及びオペレーティングシステムと併せて実行される実用アプリケーション、バックグラウンドデーモン、オペレーティングシステムの構成要素又はそれらの組合せとして提供され得る。
【０２８３】
ＣＰＵ１３０８は、ＡＲＭプロセッサ、システムオンチップ（ＳＯＣ：ｓｙｓｔｅｍ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ）マイクロプロセッサ、マイクロコントローラ、デジタル信号プロセッサ（ＤＳＰ：ｄｉｇｉｔａｌ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ）であり得るか、又は当業者により認識される他のプロセッサタイプであり得る。更に、ＣＰＵ１３０８は、並列に協働的に機能して、上述した本発明によるプロセスの命令を実行する複数のプロセッサとして実施され得る。
【０２８４】
処理システム１３１０は、処理環境１３００の一部である。図１３における処理システム１３１０は、ネットワーク１３２８とインターフェースして、処理環境１３００内の追加の要素にアクセスするためのネットワークコントローラ１３０６も含む。理解することができるように、ネットワーク１３２８は、インターネット等の公衆ネットワーク、ＬＡＮ若しくはＷＡＮネットワーク等の私設ネットワーク又はそれらの任意の組合せであり得、ＰＳＴＮ又はＩＳＤＮサブネットワークを含むこともできる。ネットワーク１３２８は、ＥＤＧＥ、３Ｇ及び４Ｇ無線セルラシステムを含むセルラネットワーク等の無線であり得る。無線ネットワークは、Ｗｉ−Ｆｉ、ブルートゥース（Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ（登録商標））又は既知の任意の他の無線形態の通信でもあり得る。
【０２８５】
処理システム１３１０は、ユーザインターフェース（例えば、タッチスクリーン）１３１６、１つ又は複数のセンサ１３１４及び１つ又は複数の周辺デバイス１３１８とインターフェースする汎用Ｉ／Ｏインターフェース１３１２を更に含む。周辺Ｉ／Ｏデバイス１３１８は、幾つかの例では、ビデオ録画システム、オーディオ録音システム、マイクロホン、外付け記憶装置及び／又は外部スピーカシステムを含み得る。１つ又は複数のセンサ１３１４は、ジャイロスコープ、加速度計、重力センサ、線形加速度計、全地球測位システム、バーコードスキャナ、ＱＲコード（登録商標）スキャナ、ＲＦＩＤスキャナ、温度モニタ及び照明システム又は照明要素の１つ又は複数を含み得る。
【０２８６】
汎用記憶装置コントローラ１３２４は、処理システムの全ての構成要素を相互接続する、パラレルバス又はユニバーサルシリアルバス（ＵＳＢ：Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｓｅｒｉａｌ  Ｂｕｓ）等のシリアルバス等の通信バス１３４０又は同様のものに記憶培地ディスク１３０４を接続する。記憶装置コントローラ１３２４、ネットワークコントローラ１３０６及び汎用Ｉ／Ｏインターフェース１３１２の一般的な特徴及び機能の説明は、これらの特徴が既知であるため、簡潔にするために本明細書において省略される。
【０２８７】
幾つかの実施形態では、処理システム１３１０は、１つ又は複数のオンボードセンサ及び／又は周辺センサ１３１４を含む。センサ１３１４は、例えば、自動マルチモジュール処理機器の内部電子回路に直接及び／又は筐体に組み込むことができる。センサ１３１４の一部は、例えば、ワイヤを介してＩ／Ｏインターフェース１３１２と直接、物理的に交信することができるか、又は例えばブルートゥース（Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ（登録商標））、Ｗｉ−Ｆｉ若しくはＮＦＣ接続を介して無線交信することができる。例えば、無線通信コントローラ１３２６は、１つ又は複数の無線センサ１３１４とＩ／Ｏインターフェース１３１２との間の通信を可能にし得る。更に、１つ又は複数のセンサ１３１４は、例えば、ネットワーク１３２８を拠点とする中間サーバ又は記憶装置を介して間接的に交信し得るか、又は自動マルチモジュール細胞処理機器内のいずれかの箇所にある１つの累積器と交信（有線、無線又は間接的）し得、累積器は、次に、Ｉ／Ｏインターフェース１３１２と交信（有線、無線又は間接的）する。
【０２８８】
Ｉ／Ｏインターフェース１３１２と通信するセンサ１３１４の群を組み合わせて用いて、複数の場所から所与の信号タイプを収集し、信号のより完全なマップを生成し得る。Ｉ／Ｏインターフェース１３１２と通信する１つ又は複数のセンサ１３１４は、例えば、他の信号を濾波、相殺又は拒絶するコンパレータ又は検証要素として使用することができる。
【０２８９】
幾つかの実施形態では、処理環境１３００は、無線通信コントローラ１３２６を介して処理システム１３１０と通信する計算デバイス１３３８を含む。例えば、無線通信コントローラ１３２６は、ユーザのスマートフォン又は他の個人計算デバイスを宛先とした電子メールメッセージ、テキストメッセージ及び／又はソフトウェアアプリケーションアラートの交換を可能にし得る。
【０２９０】
処理環境１３００は、幾つかの実装形態では、ロボット材料ハンドリングシステム１３２２を含む。処理システム１３１０は、自動マルチモジュール細胞処理機器におけるガントリの位置操作、シッパー又はピペッター要素の昇降及び／又はシッパー／ピペッターと種々の容器（例えば、チャンバ、バイアル等）との間で液体を移送させるポンプ及び弁の作動等のロボット材料ハンドリングシステムの要素を作動させる制御信号を発行するロボットコントローラ１３２０を含み得る。ロボットコントローラ１３２０は、幾つかの例では、処理システム１３１０をロボット材料ハンドリングシステム１３２２とインターフェースさせるハードウェアドライバ、ファームウェア要素及び／又は１つ又は複数のアルゴリズム又はソフトウェアパッケージを含み得る。
【０２９１】
幾つかの実装形態では、処理環境１３１０は、幾つかの例では、１つ又は複数のセンサインターフェース、電力制御インターフェース、弁及びポンプインターフェース及び／又は自動マルチモジュール処理システムの各モジュールの処理をアクティブ化し制御するアクチュエータインターフェース等の１つ又は複数のモジュールインターフェース１３３２を含む。例えば、モジュールインターフェース１３３２は、回転細胞成長デバイス８５０（図８Ｄ）の駆動装置モータ８６４のアクチュエータインターフェース及び回転成長バイアル８００内の細胞成長の光学濃度を検知する検出器ボード８７２のセンサインターフェースを含み得る。モジュールコントローラ１３３０は、幾つかの実施形態では、モジュールインターフェース１３３２とインターフェースするように構成される。モジュールコントローラ１３３０は、１つ又は多くのコントローラを含み得る（例えば、可能な場合にはモジュールにつき１つのコントローラであるが、幾つかのモジュールは、１つのコントローラを共有し得る）。幾つかの例では、モジュールコントローラ１３３０は、処理システム１３１０をモジュールインターフェース１３３２とインターフェースさせるハードウェアドライバ、ファームウェア要素及び／又は１つ又は複数のアルゴリズム又はソフトウェアパッケージを含み得る。
【０２９２】
幾つかの実装形態では、処理環境１３１０は、自動マルチモジュール処理システムの筐体内の気候条件を制御する熱管理システム１３３６を含む。熱管理システム１３３６は、自動マルチモジュール細胞処理機器の１つ又は複数のモジュール内の気候条件を更に制御し得る。幾つかの実施形態では、処理システム１３１０は、熱管理システム１３３６とインターフェースする温度コントローラ１３３４を含む。幾つかの例では、温度コントローラ１３３４は、処理システム１３１０を熱管理システム１３３６とインターフェースさせるハードウェアドライバ、ファームウェア要素及び／又は１つ又は複数のアルゴリズム又はソフトウェアパッケージを含み得る。
自動編集方法、モジュール、機器及びシステムを用いた細胞ライブラリの生成
一態様では、本開示は、本明細書により詳細に説明されるように、種々の編集戦略を用いた種々の細胞タイプでの関心のあるＲＮＡ及び／又はタンパク質の発現、レベル及び／又は活性が様々な細胞のライブラリを作成する自動編集方法、モジュール、機器及び自動マルチモジュール細胞編集機器を提供する。したがって、本開示は、本開示の自動編集方法、自動マルチモジュール細胞編集機器により作成された編集細胞ライブラリの包含を意図する。これらの細胞ライブラリは、限定ではなく、種々の有機体の細胞における遺伝子ノックアウト、遺伝子ノックイン、挿入、欠失、シングルヌクレオチド編集、縦列型反復配列編集、フレームシフト、トリプレットコドン拡張等を含め、異なる標的化編集を有し得る。これらの編集は、ゲノムのコード領域又は非コード領域に向けられ得、好適には合理的に設計される。
【０２９３】
他の態様では、本開示は、ＤＮＡ連結プロセスが様々な細胞のライブラリを作成する自動編集方法、自動マルチモジュール細胞編集機器を提供する。例えば、細胞ライブラリは、選択された遺伝子の発現を変調する調節エレメントのＤＮＡ結合を妨げる編集をＤＮＡ結合部位に有する個々の細胞を含み得る。加えて、細胞ライブラリは、ヘテロクロマチン形成、クラススイッチ組換え及びＶＤＪ組換え等の細胞プロセスに影響する編集をゲノムＤＮＡに含み得る。
【０２９４】
特定の態様では、細胞ライブラリは、細胞集団内の個々の細胞の多重化編集を用いて作成され、細胞集団内の複数の細胞を用いて１ラウンドの編集で編集され、すなわち、細胞ライブラリ内の細胞内の複数の変更は、１つの自動動作におけるものである。１つの多重化自動動作で作成することができるライブラリは、５００個の編集細胞、１０００個の編集細胞、２０００個の編集細胞、５０００個の編集細胞、１０，０００個の編集細胞、５０，０００個の編集細胞、１００，０００個の編集細胞、２００，０００個の編集細胞、３００，０００個の編集細胞、４００，０００個の編集細胞、５００，０００個の編集細胞、６００，０００個の編集細胞、７００，０００個の編集細胞、８００，０００個の編集細胞、９００，０００個の編集細胞、１，０００，０００個の編集細胞、２，０００，０００個の編集細胞、３，０００，０００個の編集細胞、４，０００，０００個の編集細胞、５，０００，０００個の編集細胞、６，０００，０００個の編集細胞、７，０００，０００個の編集細胞、８，０００，０００個の編集細胞、９，０００，０００個の編集細胞、１０，０００，０００個の編集細胞又はそれを超える編集細胞という多くの編集細胞を含むことができる。
【０２９５】
他の特定の態様では、細胞ライブラリは、細胞集団内の個々の細胞の再帰的編集を用いて作成され、編集は、編集の２つ以上のラウンドで個々の細胞に追加される。再帰的編集の使用により、ライブラリの個々の細胞のゲノム内の２つ以上の部位を標的化した２つ以上の編集が融合する。自動再帰的動作において作成することができるライブラリは、５００個の編集細胞、１０００個の編集細胞、２０００個の編集細胞、５０００個の編集細胞、１０，０００個の編集細胞、５０，０００個の編集細胞、１００，０００個の編集細胞、２００，０００個の編集細胞、３００，０００個の編集細胞、４００，０００個の編集細胞、５００，０００個の編集細胞、６００，０００個の編集細胞、７００，０００個の編集細胞、８００，０００個の編集細胞、９００，０００個の編集細胞、１，０００，０００個の編集細胞、２，０００，０００個の編集細胞、３，０００，０００個の編集細胞、４，０００，０００個の編集細胞、５，０００，０００個の編集細胞、６，０００，０００個の編集細胞、７，０００，０００個の編集細胞、８，０００，０００個の編集細胞、９，０００，０００個の編集細胞、１０，０００，０００個の編集細胞又はそれを超える編集細胞という多くの編集細胞を含むことができる。
【０２９６】
本明細書に基づいて、自動システムを利用するように変更することができる非自動編集戦略の例は、例えば、米国特許第８，１１０，３６０号明細書、同第８，３３２，１６０号明細書、同第９，９８８，６２４号明細書、米国特許出願公開第２０１７０３１６３５３号明細書及び同第２０１２０２７７１２０号明細書に見出すことができる。
【０２９７】
特定の態様では、まず、細胞表現型を作成するのに再帰型編集を用い、表現型を逆にし、且つ／又は他の細胞特性を加速化させるために、次の編集後のラウンドを用いることができる。
【０２９８】
幾つかの態様では、細胞ライブラリは、細胞内で非天然アミノ酸を作成する編集を含む。
特定の態様では、本開示は、本開示の自動編集方法、自動マルチモジュール細胞編集機器を用いて作成された１つ又は複数の調節エレメントにおける編集を有する編集細胞ライブラリを提供する。「調節エレメント」という用語は、特定の環境及び／又は状況において操作可能に連結されたコード配列の転写及び／又は翻訳に影響を及ぼすことができる核酸分子を指す。この用語は、転写と、プロモータ、ＲＮＡポリメラーゼ及び転写因子の基本相互作用に必要なコアエレメント、上流エレメント、エンハンサー及び応答エレメントを含むＲＮＡ安定性とを促進又は調節する全てのエレメントの包含を意図する。（例えば、ルーウィン（Ｌｅｗｉｎ）著、「遺伝子Ｖ（Ｇｅｎｅｓ  Ｖ）」、（オックスフォード大学プレス（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）、オックスフォード（Ｏｘｆｏｒｄ））、ｐ．８４７〜８７３を参照されたい）。原核生物における例示的な調節エレメントには、限定ではなく、プロモータ、オペレータ配列及びリボゾーム結合部位がある。真核細胞において用いられる調節エレメントには、限定ではなく、プロモータ、エンハンサー、インスレータ、スプライシングシグナル及びポリアデニレーションシグナルがあり得る。
【０２９９】
好適には、編集細胞ライブラリは、特定の細胞タイプでのタンパク質構造、発現及び／又は活性の予測に基づいて設計される、合理的に設計された編集を含む。例えば、合理的な設計は、ヌクレアーゼ発現及び／又は結合を含む異なる編集パラメータ、成長条件及び他の実験条件が集合的にヌクレアーゼ編集のダイナミクスをどのように制御するかを予測するために、特定のヌクレアーゼ及び遺伝子調節を有するゲノム編集のシステム全体生物物理学モデルに基づき得る。例えば、ファラサット（Ｆａｒａｓａｔ）及びサリス（Ｓａｌｉｓ）、プロスコンピュテーショナルバイオロジー（ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ．）、第２９：１２（１）巻、ｐ．ｅ１００４７２４、（２０１６年）を参照されたい。
【０３００】
一態様では、本開示は、本発明の自動編集機器、システム及び方法を用いて作成された種々の合理的に設計された調節配列を有する編集細胞のライブラリの作成を提供する。例えば、編集細胞ライブラリは、構成及び／又は誘導プロモータ、エンハンサー配列、オペレータ配列及び／又はリボゾーム結合部位の組を用いて作成された原核細胞集団を含むことができる。別の例では、編集細胞ライブラリは、構成及び／又は誘導プロモータ、エンハンサー配列、オペレータ配列及び／又は関心のあるタンパク質の発現の異なるコザック配列の組を用いて作成された真核配列を含むことができる。
【０３０１】
幾つかの態様では、本開示は、有機体のゲノムにわたり関心のある配列内に１つ又は複数のクラスの編集を含む合理的に設計された編集を有する細胞を含む細胞ライブラリを提供する。特定の態様では、本開示は、ゲノムのサブセットにわたり関心のある配列に１つ又は複数のクラスの編集を含む合理的に設計された編集を有する細胞を含む細胞ライブラリを提供する。例えば、細胞ライブラリは、エクソーム、例えばゲノムのあらゆる又は大半のオープン読み枠にわたり関心のある配列に１つ又は複数のクラスの編集を含む合理的に設計された編集を有する細胞を含み得る。例えば、細胞ライブラリは、カイノームにわたり関心のある配列に１つ又は複数のクラスの編集を含む合理的に設計された編集を有する細胞を含み得る。更に別の例では、細胞ライブラリは、セクレトームにわたり関心のある配列に１つ又は複数のクラスの編集を含む合理的に設計された編集を有する細胞を含み得る。更に別の態様では、細胞ライブラリは、エクソーム内でコードされたタンパク質の種々のアイソフォームを解析するために作成された合理的に設計された編集を有する細胞を含み得、細胞ライブラリは、例えば、トランスクリプトーム解析で１つ又は複数の特定のアイソフォームの発現を制御するように設計することができる。
【０３０２】
重要なことに、特定の態様では、細胞ライブラリは、ランダム化配列、例えばランダム化プロモータ配列を用いて、ライブラリ内の個々の細胞内の１つ又は複数のタンパク質の発現間の類似性を低減する編集を含み得る。更に、細胞ライブラリ内のプロモータは、強力及び／又は滴定可能な発現を可能にするように構成、誘導又は両方であり得る。
【０３０３】
他の態様では、本開示は、選択された遺伝子標的の最適な発現を識別する編集を含む細胞のライブラリを作成する自動編集方法、自動マルチモジュール細胞編集機器を提供する。例えば、代謝工学を通した生化学物質の製造では、多くの場合、経路酵素の発現が必要であり、細胞内の最高量の標的経路酵素により最良の製造歩留まりが常に達成されるわけではなく、むしろ、最良の製造歩留まりは、個々の酵素及び関連する調節タンパク質及び／又は経路の発現レベルの微調整により達成される。同様に、異種タンパク質の発現レベルも最適な歩留まりに向けて実験的に調整されることもあり得る。
【０３０４】
転写が遺伝子発現レベルに影響を与える最も明白な方法は、Ｐｏｌ  ＩＩ開始の速度によるものであり、これは、プロモータ又はエンハンサーの強度と、トランス活性化因子との組合せにより変調することができる（カドナガ（Ｋａｄｏｎａｇａ）ら著、セル（Ｃｅｌｌ）、第１１６（２）巻、ｐ．２４７〜５７、（２００４年））。真核生物では、伸長率も、オルタナティブスプライシングに影響することにより遺伝子発現パターンを決め得る（クラマー（Ｃｒａｍｅｒ）ら著、米国科学アカデミー紀要（ＰＮＡＳ  ＵＳＡ）、第９４（２１）巻、ｐ．１１４５６〜６０、（１９９７年））。遺伝子での終結失敗は、Ｐｏｌ  ＩＩへのプロモータのアクセス可能性を低減することにより、下流遺伝子の発現を損ない得る（グレガー（Ｇｒｅｇｅｒ）ら著、２０００年米国科学アカデミー紀要（２０００  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ）、第９７（１５）巻、ｐ．８４１５〜２０、（２０００年））。このプロセスは、転写干渉として知られ、下等真核生物において特に関連し、その理由は、下等真核生物が密集した遺伝子を有することが多いためである。
【０３０５】
幾つかの実施形態では、本開示は、細胞遺伝子転写を最適化する方法を提供する。遺伝子転写は、転写開始（ＲＮＡｐ動員及び転写複合体形成）、伸長（鎖合成／拡張）並びに転写終結（ＲＮＡｐ脱離及び終結）を含めた幾つかの別個の生物学的現象の結果である。
部位特異的突然変異誘発
細胞ライブラリは、部位特異的突然変異誘発を利用する自動編集方法、モジュール、機器及びシステムを用いて、すなわちタンパク質又はゲノム特徴を意図的且つ精密に突然変異させることによりタンパク質又は他のゲノム特徴のアミノ酸配列を変更し得る場合に作成することができる。これらの細胞株は、種々の目的で、例えば細胞内のタンパク質機能の特定、細胞内の酵素活性部位の識別及び新規タンパク質の設計に有用であり得る。例えば、部位特異的突然変異誘発は、多重化様式で用いて、タンパク質配列内の１つのアミノ酸を異なる化学特性を有する別のアミノ酸と交換することができる。これにより、細胞集団内の個々の細胞における合理的に設計又はランダムに生成された突然変異の効果を特定することができる。例えば、バーグ（Ｂｅｒｇ）ら著、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第６版、（ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）：Ｗ．Ｈ．フリーマンアンドカンパニー（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ））（２００７年）を参照されたい。
【０３０６】
別の例では、編集は、細胞ライブラリ内の個々の細胞に対して行い、タンパク質複合体内で相互作用するためのタンパク質結合部位における１つ又は複数のアミノ酸の置換又は補助因子若しくはリガンドを収容することができる酵素ポケットにおける１つ又は複数のアミノ酸の置換等、結合部位におけるアミノ酸を置換することができる。このクラスの編集は、タンパク質複合体内の他の補助因子、リガンド等との相互作用を含め、１つ又は複数のタンパク質の特定の特性を測定する、タンパク質への特定の操作の作成を可能にする。
【０３０７】
更に別の例では、発現定量的形質遺伝子座（ｅＱＴＬ：ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｔｒａｉｔ  ｌｏｃｉ）を研究する部位特異的突然変異誘発を用いて細胞ライブラリ内の個々の細胞に対して種々の編集タイプを作成することができる。ｅＱＴＬは、遺伝子発現表現型の遺伝的分散の割合を説明する遺伝子座である。本発明のライブラリは、ｅＱＴＬを評価し、ｅＱＴＬを実際の病的状態にリンクするのに有用である。
【０３０８】
特定の態様では、本開示の細胞ライブラリに導入される編集は、タンパク質の既知又は予測される構造に基づく合理的な設計を用いて作成され得る。例えば、クロノプロスＥＧ（Ｃｈｒｏｎｏｐｏｕｌｏｕ  ＥＧ）及びラブロー（Ｌａｂｒｏｕ）著、カレントプロトコールインプロテインサイエンス（Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．）、第２６章、ユニット２６．６、（２０１１年）を参照されたい。そのような部位特異的突然変異誘発は、ライブラリ内の細胞集団内の個々の細胞に１つ又は複数の部位特異的編集、好適には２つ以上の部位特異的編集（例えば、結合編集）を提供することができる。
【０３０９】
他の態様では、本開示の細胞ライブラリは、遺伝子のコード領域内のコドンの全て又は略全ての部位特異的コドン突然変異「スキャン」を用いて作成される。このようにして、遺伝子の１つ又は複数のコドンにおける特定の多型に基づいて、機能喪失又は機能獲得について特定のコドンの個々の編集を調べることができる。これらのライブラリは、細胞又は細胞集団内の特定の表現型のどの遺伝的変更が沈黙又は原因であるかの特定に強力なツールであり得る。コドンの編集は、ランダムに生成され得るか、又は解析する遺伝子において識別されている既知の多型及び／又は突然変異に基づいて合理的に設計され得る。更に、これらの技法を細胞内の経路内の１つにおける２つ以上の遺伝子に対して用いることで、潜在的なタンパク質：タンパク質相互作用又は細胞の機能若しくは経路における重複を特定し得る。
【０３１０】
例えば、アラニンスキャンを用いて、所与のタンパク質の安定性又は機能への特定の残基の寄与を特定することができる。例えば、ルフェーブル（Ｌｅｆｅｖｒｅ）ら著、ヌクレイックアシッズリサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第２５（２）巻、ｐ．４４７〜４４８、（１９９７年）を参照されたい。アラニンは、他のアミノ酸の多くが保有する二次構造プリファレンス（ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）を模倣することができる、嵩張らず、化学的に不活性なメチル官能基であるため、このコドン走査技法で用いられることが多い。コドン走査は、特定の残基の側鎖が細胞の機能及び／又は活性における有意な役割を果たすか否かの特定に使用することもできる。ときに、突然変異した残基のサイズの保存が必要である場合、コドン走査細胞ライブラリの作成にバリン又はロイシン等の他のアミノ酸を使用することができる。
【０３１１】
他の特定の態様では、本発明の自動編集方法、自動マルチモジュール細胞編集機器を用いて、酵素又はホルモン等のタンパク質の活性部位を特定し、細胞ライブラリ内でのこれらのタンパク質の１つ又は複数の動作のメカニズムを明らかにする細胞ライブラリを作成することができる。分子モデリング研究に関連付けられた部位特異的突然変異誘発を用いて、酵素の活性部位構造、したがってその動作のメカニズムを解明することができる。これらの細胞ライブラリの解析は、タンパク質の活性部位における特定のアミノ酸残基により及ぼされる役割、タンパク質複合体のサブユニット間の接触、種々の遺伝的背景での細胞内トラフィック及びタンパク質安定性／半減期についての理解を提供することができる。
飽和突然変異誘発
幾つかの態様では、本開示の自動編集方法、自動マルチモジュール細胞編集機器を用いて作成された細胞ライブラリは、１つのコドン又はコドンの組がランダム化されて、関心のある特定の１つ又は複数の遺伝子の位置において可能な全てのアミノ酸を生成する飽和突然変異誘発ライブラリであり得る。これらの細胞ライブラリは、バリアントの生成、例えば定方向進化に特に有用であり得る。例えば、チカ（Ｃｈｉｃａ）ら著、カレントオピニオンインバイオテクノロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、第１６（４）巻、ｐ．３７８〜３８４、（２００５年）；及びシバンジ（Ｓｈｉｖａｎｇｅ）、カレントオピニオンインケミカルバイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、第１３（１）巻、ｐ．１９〜２５を参照されたい。
【０３１２】
幾つかの態様では、異なる縮重コドンを含む編集は、ライブラリ内の個々の細胞内の複数の組のアミノ酸のコードに用いることができる。アミノ酸によっては、他のアミノ酸よりも多くのコドンによりコードされるものがあるため、アミノ酸の厳密な比率は、同じであることができない。特定の態様では、より制限された縮重コドンが用いられる。「ＮＮＫ」及び「ＮＮＳ」は、２０個全てのアミノ酸をコードするという利点があるが、それでもなお３％の確率で停止コドンをコードする。「ＮＤＴ」、「ＤＢＫ」等の代替のコドンは、停止コドンを全体的に回避し、主要な全ての生物物理学的タイプ（アニオン、カチオン、脂肪族疎水性、芳香族疎水性、親水性、小型）をなお含む最小の組のアミノ酸をコードする。
【０３１３】
特定の態様では、特定の有機体に最も一般的に用いられるコドンが飽和突然変異誘発編集プロセスで用いられる非重複飽和突然変異誘発である。
プロモータスワップ及びラダー
関心のある１つ又は複数の遺伝子の発現を解析及び／又は最適化する一メカニズムは、細胞が、関心のある１つ又は複数の遺伝子に連結された特定のプロモータを有する遺伝的編集を含む「プロモータスワップ」細胞ライブラリの作成によるものである。したがって、本開示の方法、自動マルチモジュール細胞編集機器を用いて作成される細胞ライブラリは、プロモータスワップ細胞ライブラリであり得、例えば代謝経路又は遺伝経路を最適化するように関心のある遺伝子の発現を増減させるのに用いることができる。幾つかの態様では、プロモータスワップ細胞ライブラリは、細胞の生命力又は生存能力に影響を及ぼす遺伝子、例えば細胞の成長速度又は全体的な健康に影響するタンパク質をコードする遺伝子の発現の増減を識別するのに用いることができる。幾つかの態様では、プロモータスワップ細胞ライブラリは、プロモータ間に依存性及び論理を有する細胞を作成して、合成遺伝子ネットワークを作成するのに用いることができる。幾つかの態様では、プロモータスワップは、同種の性質の集団及び異種の性質（複合組織）の集団の両方の細胞間の細胞間伝達を制御するのに用いることができる。
【０３１４】
細胞ライブラリは、ある範囲の発現強度の発揮及び任意の所与の数の標的遺伝子に基づいて一緒に群化された任意の所与の数のプロモータを利用することができる。プロモータ配列のラダーは、少なくとも１つの条件下で少なくとも１つの遺伝子座の発現を変える。次に、このラダーは、本開示の自動編集方法、自動マルチモジュール細胞編集機器を用いて有機体内の遺伝子群に系統的に適用される。
【０３１５】
特定の態様では、本開示の自動編集プロセス、モジュール及びシステムを用いて形成される細胞ライブラリは、他の場合には同一の遺伝的背景において関心のある１つ又は複数の標的遺伝子に操作可能に連結された所与のプロモータを表す個々の細胞を含む。自動システムを利用するように変更することができる非自動編集戦略の例は、例えば、米国特許第９，９８８，６２４号明細書に見出すことができる。
【０３１６】
特定の態様では、プロモータスワップ細胞ライブラリは、関心のある遺伝子の発現の「プロモータラダー」として機能する予め選択されたプロモータの組に操作可能に連結されるように標的遺伝子の組を編集することにより生成される。例えば、細胞は、関心のある１つ又は複数の個々の遺伝子がプロモータラダー内の異なるプロモータに操作可能に連結されるよう編集されるように編集される。内因性プロモータが存在しない場合、その配列は、未知であるか、又は何らかの様式で前に変更されており、プロモータラダーの個々のプロモータは、関心のある遺伝子の前に挿入することができる。生成されたこれらの細胞ライブラリは、他の場合には同一の遺伝状況にある１つ又は複数の標的遺伝子に操作可能に連結されたラダーの個々のプロモータを有する個々の細胞を有する。
【０３１７】
プロモータは、一般に、異なる遺伝子座にわたり可変発現が生じるように選択され、誘導プロモータ、構成プロモータ又は両方を含み得る。
プロモータラダーを用いて編集された標的遺伝子の組は、ゲノム内の全て若しくは多くのオープン読み枠（ＯＲＦ：ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ）又はゲノムの選択されたサブセット、例えばカイノーム若しくはセクレトームのＯＲＦを含むことができる。幾つかの態様では、標的遺伝子は、遺伝子の種々のアイソフォームのコード領域を含むことができ、細胞ライブラリは、１つ又は複数の特定のアイソフォームの発現に向けて、例えば種々のプロモータを用いたトランスクリプトーム解析に向けて設計することができる。
【０３１８】
標的遺伝子の組は、特定の細胞経路、例えば調節経路又はシグナリング経路に関わることが既知又は疑われる遺伝子でもあり得る。標的遺伝子の組は、以前に実証された有利な編集（前のプロモータスワップ若しくは前のＳＮＰスワップ）への関連により、以前に生成された編集間のエピスタティック相互作用に基づくアルゴリズム的選択により、標的化に有利なＯＲＦに関する仮説に基づく他の選択基準により又はランダム選択を通して、機能に関連するＯＲＦであり得る。特定の実施形態では、標的遺伝子は、非コードＲＮＡを含む非タンパク質コード遺伝子を含むことができる。
【０３１９】
インスレータエレメント及び他のゲノム編成エレメントを含めた他の機能的遺伝エレメントの編集は、標的遺伝子の組の発現レベルを系統的に変えるのに用いることもでき、本開示の方法、自動マルチモジュール細胞編集機器を用いて導入することができる。一態様では、細胞の集団は、エンハンサー配列のラダーを単独で又は選択されたプロモータ若しくはプロモータラダーと組み合わせて用いて編集されて、これらのエンハンサーエレメントに種々の編集を有する細胞ライブラリを作成する。別の態様では、細胞の集団は、リボゾーム結合配列のラダーを単独で又は選択されたプロモータ若しくはプロモータラダーと組み合わせて用いて編集されて、これらのリボゾーム結合配列に種々の編集を有する細胞ライブラリを作成する。
【０３２０】
別の態様では、細胞の集団は、転写産物又はタンパク質の５’若しくは３’末端に又は任意の他のロケーションにおいて、配列を安定化又は不安定化する種々のｍＲＮＡ及び／又はタンパク質を結合できるように編集される。
【０３２１】
特定の態様では、以前に確立された細胞株の細胞の集団は、本開示の自動編集方法、モジュール、機器及びシステムを用いて編集されて、細胞ライブラリを作成し、細胞の機能、健康及び／又は生存能力を改善し得る。例えば、大規模製造に現在用いられている多くの工業菌株は、ときに数十年という多年の期間にわたり、ランダム突然変異誘発プロセスを繰り返し用いて開発されてきた。不要な中立及び障害突然変異が有利な変更と共に菌株に導入され、時間の経過に伴い、全体のロバスト性及び成長速度等の主要特性に欠陥を有する菌株になった。別の例では、哺乳動物細胞株は、時間期間にわたる細胞の通過を通して突然変異し続け、同様に、これらの細胞株は、不安定になり、望ましくない特性を取得する恐れがある。本開示の自動編集方法、自動マルチモジュール細胞編集機器は、ＳＮＰ及び／又はＳＴＲスワップ、インデル作成又は他の技法等の編集戦略を用いて、望ましくないゲノム配列を除去又は変更し、且つ／又は細胞の望ましい特性を保持しながら、欠陥に対処する新しいゲノム配列を導入することができる。
【０３２２】
再帰的編集が用いられる場合、編集細胞ライブラリ内の個々の細胞における編集は、ゲノムにおける異所（例えば、ＣａｒＴ遺伝子座）での「ランディングパッド」の包含を組み込み、発現、安定性及び／又は制御を最適化することができる。
【０３２３】
幾つかの実施形態では、１つ又は複数の編集（導入又は除去）を含む個々の細胞を有する、生成された各ライブラリは、１つ又は複数の基準（例えば、関心のある化学製品の生成）下で培養し解析される。次に、特定の基準を保有する細胞に、細胞内の１つ又は複数の特定の編集が関連付けられるか又は相関付けられる。このようにして、関心のある任意の数の遺伝的特性又は表現型特性への所与の編集の効果を特定することができる。特定の基準又は機能性／ロバスト性の強化が関連付けられた複数の編集の識別は、高度に望ましい特性を有する細胞に繋がり得る。
ノックアウト又はノックインライブラリ
特定の態様では、本開示は、関心のある種々の遺伝子の「ノックアウト」（ＫＯ：ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ）又は「ノックイン」（ＫＩ：ｋｎｏｃｋ−ｉｎ）編集を有する細胞のライブラリを作成する自動編集方法、モジュール、機器及びシステムを提供する。したがって、本開示は、関心のある選択された遺伝子の発現を除去又は低減する１つ又は複数の突然変異を有し、細胞ライブラリ内の個々の細胞での遺伝子機能へのこれらの編集の効果を調べる、本開示の自動編集方法、自動マルチモジュール細胞編集機器により作成された編集細胞ライブラリの包含を意図する。
【０３２４】
細胞ライブラリは、標的化遺伝子ＫＯ（例えば、挿入／削除を介する）又はＫＯ（例えば、相同特異的修復を介する）を用いて作成することができる。例えば、２本鎖切断は、多くの場合、非相同末端結合ＤＮＡ修復経路を介して修復される。修復は、エラーが生じやすいことが知られており、したがって遺伝子機能を妨げる恐れがある挿入及び削除が導入されることがある。好適には、編集は、関心のある遺伝子に特に影響を及ぼすように合理的に設計され、関心のある１つ又は複数の遺伝子座にＫＩ又はＫＩを有する個々の細胞を作成することができる。関心のある２つ以上の遺伝子座のＫＯ又はＫＩを有する細胞は、本開示の自動再帰的編集を用いて作成することができる。
【０３２５】
特定の態様では、ＫＯ又はＫＩ細胞ライブラリは、細胞集団内の細胞の同時多重化編集を用いて作成され、細胞集団内の複数の細胞は、編集の１つのラウンドで編集され、すなわち、細胞ライブラリの細胞内の複数の変更は、１つの自動動作におけるものである。他の特定の態様では、細胞ライブラリは、細胞集団内の個々の細胞の再帰的編集を用いて作成され、ゲノムの２つ以上の部位の複数の編集を１つの細胞に融合する。
ＳＮＰ又は縦列型反復配列スワップ
一態様では、細胞ライブラリは、シングルヌクレオチド多型（「ＳＮＰ」）を個々の細胞のゲノムに系統的に導入又は置換して、「ＳＮＰスワップ」細胞ライブラリを作成することにより、本開示の自動編集方法、自動マルチモジュール細胞編集機器を用いて作成される。幾つかの実施形態では、本開示のＳＮＰスワップ方法は、有利なＳＮＰの追加及び有害及び／又は中立ＳＮＰの除去の両方を含む。ＳＮＰスワップは、コード配列、非コード配列又は両方を標的化し得る。
【０３２６】
別の態様では、細胞ライブラリは、縦列型反復配列（「ＳＴＲ」）を個々の細胞のゲノムに系統的に導入又は置換して、「ＳＴＲスワップ」細胞ライブラリを作成することにより、本開示の自動編集方法、モジュール、機器及びシステムを用いて作成される。幾つかの実施形態では、本開示のＳＴＲスワップ方法は、有利なＳＴＲの追加及び有害及び／又は中立ＳＴＲの除去の両方を含む。ＳＴＲスワップは、コード配列、非コード配列又は両方を標的化し得る。
【０３２７】
幾つかの実施形態では、細胞ライブラリの作成に用いられるＳＮＰ及び／又はＳＴＲスワップは、多重化され、細胞集団内の複数の細胞は、編集の１つのラウンドで編集され、すなわち、細胞ライブラリの細胞内の複数の変更は、１つの自動動作におけるものである。他の実施形態では、細胞ライブラリの作成に用いられるＳＮＰ及び／又はＳＴＲスワップは、再帰的であり、複数の有利な配列及び／又は有害な配列の除去を１つの細胞に融合させる。複数の変更は、特定の組の定義された変更でもあり得るか、又は突然変異の部分的にランダム化された結合ライブラリでもあり得る。有害な突然変異の除去及び有利な突然変異の統合は、種々の細胞プロセスにおける即時改善を提供することができる。遺伝的荷重の除去又は遺伝的荷重のない菌株への有利な変更の統合は、更なる改善を可能にし得る追加のランダム突然変異誘発の新しくロバストな開始点も提供する。
【０３２８】
ＳＮＰスワップは、ランダム手法ではなく、むしろ細胞にわたる個々の突然変異の系統的な導入又は除去であるため、ランダム突然変異誘発手法の基本的な制限を解消する。
スプライス部位編集
ＲＮＡスプライシングは、イントロンが切除され、エクソンが一緒にスプライスされて、タンパク質に翻訳されるｍＲＮＡを作成するプロセスである。細胞機構によるスプライシングシグナルの精密な認識は、このプロセスにとって極めて重要である。したがって、幾つかの態様では、細胞の集団は、種々の遺伝子座における既知及び／又は予測されたスプライスドナー及び／又はアクセプターへの系統的編集を用いて編集されて、種々の遺伝子のスプライス部位バリアントのライブラリを作成する。そのような編集は、細胞状況における遺伝子の種々のアイソフォームの生物学的関連を明らかにするのに役立つことができる。種々の哺乳動物疾患に関連付けられた実際又は予測された突然変異を含めた種々のコード領域のスプライス部位の合理的な設計の配列は、ナッラ（Ｎａｌｌａ）及びローガン（Ｒｏｇａｎ）著、ヒューマンミューテーション（Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ）、第２５巻、ｐ．３３４〜３４２、（２００５年）；ディヴィーナ（Ｄｉｖｉｎａ）ら著、ヨーロピアンジャーナルオブヒューマンジェネティクス（Ｅｕｒ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ）、第１７巻、ｐ．７５９〜７６５、（２００９年）；デスメ（Ｄｅｓｍｅｔ）ら著、ヌクレイックアシッズリサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ）、第３７巻、ｐ．ｅ６７、（２００９年）；ファーバ（Ｆａｂｅｒ）ら著、ＢＭＣバイオイフォマティクス（ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）、第１２巻（付録４）：Ｓ２、（２０１１年）に見られる等の解析技法を用いて予想することができる。
開始／停止コドン交換及び核酸類似体の組込み
幾つかの態様では、本開示は、ライブラリが、有機体のゲノム全体を通して又はゲノム内のコード領域の選択されたサブセット、例えばカイノーム又はセクレトームの開始及び停止コドンバリアントのスワップにより作成される、本開示の自動編集方法、モジュール、機器及びシステムを用いた細胞ライブラリの作成を提供する。細胞ライブラリでは、個々の細胞は、関心のある１つ又は複数の遺伝子の元々の開始又は停止コドンを置換する１つ又は複数の開始又は停止コドンを有する。
【０３２９】
例えば、真核生物により使用される典型的な開始コドンはＡＴＧ（ＡＵＧ）であり、原核生物は、ＡＴＧ（ＡＵＧ）を最も用い、その後にＧＴＧ（ＧＵＧ）及びＴＴＧ（ＵＵＧ）が続く。細胞ライブラリは、関心のある１つ又は複数の遺伝子の元々の開始コドンへの置換を有する個々の細胞を含み得る。
【０３３０】
幾つかの態様では、本開示は、関心のある選択された遺伝子の前においてＡＴＧ開始コドンをＴＴＧで置換することによる細胞ライブラリの自動作成を提供する。他の態様では、本開示は、ＡＴＧ開始コドンをＧＴＧで置換することによる細胞ライブラリの自動作成を提供する。他の態様では、本開示は、ＧＴＧ開始コドンをＡＴＧで置換することによる細胞ライブラリの自動作成を提供する。他の態様では、本開示は、ＧＴＧ開始コドンをＴＴＧで置換することによる細胞ライブラリの自動作成を提供する。他の態様では、本開示は、ＴＴＧ開始コドンをＡＴＧで置換することによる細胞ライブラリの自動作成を提供する。他の態様では、本開示は、ＴＴＧ開始コドンをＧＴＧで置換することによる細胞ライブラリの自動作成を提供する。
【０３３１】
他の例では、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及び哺乳動物に典型的な停止コドンは、それぞれＴＡＡ（ＵＡＡ）及びＴＧＡ（ＵＧＡ）である。単子葉植物に典型的な停止コドンは、ＴＧＡ（ＵＧＡ）である一方、昆虫及び大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）は、一般に、停止コドンとしてＴＡＡ（ＵＡＡ）を用いる（ダルフィン（Ｄａｌｐｈｉｎ）ら著、ヌクレイックアシッズリサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）、第２４巻、ｐ．２１６〜２１８、（１９９６年））。細胞ライブラリは、関心のある１つ又は複数の遺伝子の元々の停止コドンの置換を有する個々の細胞を含み得る。
【０３３２】
幾つかの態様では、本開示は、ＴＡＡ停止コドンをＴＡＧで置換することによる細胞ライブラリの自動作成を提供する。他の態様では、本開示は、ＴＡＡ停止コドンをＴＧＡで置換することによる細胞ライブラリの自動作成を提供する。他の態様では、本開示は、ＴＧＡ停止コドンをＴＡＡで置換することによる細胞ライブラリの自動作成を提供する。他の態様では、本開示は、ＴＧＡ停止コドンをＴＡＧで置換することによる細胞ライブラリの自動作成を提供する。他の態様では、本開示は、ＴＡＧ停止コドンをＴＡＡで置換することによる細胞ライブラリの自動作成を提供する。他の態様では、本開示は、ＴＡＧ停止コドンをＴＧＡで置換することによる細胞ライブラリの自動作成を教示する。
ターミネータスワップ及びラダー
関心のある１つ又は複数の遺伝子の予めスプライスされたｍＲＮＡの最適な終結を識別する一メカニズムは、細胞が、関心のある１つ又は複数の遺伝子に連結された特定のターミネータ配列を有する遺伝的編集を含む「ターミネータスワップ」細胞ライブラリの作成によるものである。したがって、本開示の方法、モジュール、機器及びシステムを用いて作成された細胞ライブラリは、ターミネータスワップ細胞ライブラリであり得、ターミネータスワップ細胞ライブラリは、例えば、合成部位から転写産物を解放することによりｍＲＮＡ安定性に影響を及ぼすために用いることができる。他の実施形態では、ターミネータスワップ細胞ライブラリは、転写終結の効率の増減、したがって非スプライスプレｍＲＮＡの蓄積（例えば、ウェスト（Ｗｅｓｔ）及びプラウドフット（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ）著、モレキュラーセル（Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．）、第３３（３〜９）巻、ｐ．３５４〜３６４、（２００９年））及び／又は３’末端処理を識別するのに用いることができる（例えば、ウェスト（Ｗｅｓｔ）ら著、モレキュラーセル（Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．）、第２９（５）巻、ｐ．６００〜１０、（２００８年））。遺伝子が複数の終結部位に連結される場合、編集は、遺伝子に関連付けられた複数のターミネータへの編集の組合せを編集し得る。追加のアミノ酸をタンパク質の末尾に追加して、ターミネータ上のタンパク質長に効果を特定することもできる。
【０３３３】
細胞ライブラリは、ある範囲の活性の発揮及び任意の所与の数の標的遺伝子に基づいてターミネータラダーに選択されたターミネータの任意の所与の数のターミネータ編集を利用することができる。ターミネータ配列のラダーは、少なくとも１つの条件下で少なくとも１つの遺伝子座の発現を変える。次に、このラダーは、本開示の自動編集方法、機器及びシステムを用いて有機体内の遺伝子群に系統的に適用される。
【０３３４】
幾つかの態様では、本開示は、ライブラリの個々の細胞内のゲノムの１つ又は複数の領域におけるターミネータシグナルを編集するライブラリが作成される、本開示の自動編集方法、モジュール、機器及びシステムを用いた細胞ライブラリの作成を提供する。真核生物での転写終結は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩに関連付けられたタンパク質因子により認識されるターミネータシグナルを通して機能する。例えば、細胞ライブラリは、ポリアデニル化特異性因子（ＣＰＳＦ）及び切断刺激因子（ＣｓｔＦ）をコードする遺伝子及び／又は部位を終結するためにＣＰＳＦ及びＣｓｔＦ因子により動員されるタンパク質をコードする遺伝子において編集を有する個々の真核細胞を含み得る。原核生物では、ρ非依存性終結及びρ依存性終結と呼ばれる２つの主要メカニズムが転写終結を媒介する。例えば、細胞ライブラリは、これらの終結経路の結合、効率及び／又は活性に影響を及ぼすタンパク質をコードする遺伝子に編集を有する個々の原核細胞を含み得る。
【０３３５】
特定の態様では、本開示は、最適な特性を有する終結配列（「ターミネータ」）を選択する方法を提供する。例えば、幾つかの実施形態では、本開示は、１つ又は複数のターミネータを導入及び／又は編集し、且つ／又は宿主細胞内の１つ又は複数のターミネータの、ある範囲の活性を示すバリアントを生成する方法を教示し、提供する。ターミネータの特定の組合せは、ターミネータラダーとして一緒に群化することができ、本開示の細胞ライブラリは、他の場合には同一の遺伝的背景において関心のある１つ又は複数の標的遺伝子に操作可能に連結されたターミネータを表す個々の細胞を含む。自動機器を利用するように変更することができる非自動編集戦略の例は、例えば、「ＨＴＰゲノム操作プラットフォームによる微生物株の改良（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｓｔｒａｉｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｂｙ  ａ  ＨＴＰ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｐｌａｔｆｏｒｍ）」という名称のサーバ（Ｓｅｒｂｅｒ）らに付与された米国特許第９，９８８，６２４号明細書に見出すことができる。
【０３３６】
特定の態様では、ターミネータスワップ細胞ライブラリは、関心のある遺伝子の発現のために「ターミネータラダー」として機能する予め選択されたターミネータの組に操作可能に連結されるように標的遺伝子の組を編集することにより生成される。例えば、細胞は、内因性プロモータが関心のある個々の遺伝子に操作可能に連結されるように編集され、プロモータラダー内の異なるプロモータで編集される。内因性プロモータが存在しない場合、その配列が未知である場合又は何らかの様式で前に変更されていた場合、プロモータラダーの個々のプロモータは、関心のある遺伝子の前に挿入することができる。これらの生成された細胞ライブラリは、他の場合には同一の遺伝的背景において１つ又は複数の標的遺伝子に操作可能に連結されたラダーの個々のプロモータを有する個々の細胞を有する。次に、問題となっているターミネータラダーは、関心のある所与の遺伝子に関連付けられる。
【０３３７】
ターミネータラダーは、ゲノム又はゲノムの選択されたサブセット内の全て若しくは大半のＯＲＦ、例えばカイノーム又はセクレトームのＯＲＦの終結により一般的に影響を及ぼすのに用いることができる。標的遺伝子の組は、特定の細胞経路、例えば調節経路又はシグナリング経路に関わることが既知又は疑われる遺伝子でもあり得る。標的遺伝子の組は、以前に実証された有利な編集（前のプロモータスワップ若しくは前のＳＮＰスワップ）への関連により、以前に生成された編集間のエピスタティック相互作用に基づくアルゴリズム的選択により、標的化に有利なＯＲＦに関する仮説に基づく他の選択基準により又はランダム選択を通して、機能に関連するＯＲＦであり得る。特定の実施形態では、標的遺伝子は、非コードＲＮＡを含む非タンパク質コード遺伝子を含むことができる。
【０３３８】
特定の実施形態について説明したが、これらの実施形態は、単なる例として提示され、本開示の範囲の限定を意図しない。実際に、本明細書に記載される新規の方法、装置、モジュール、機器及びシステムは、多様な他の形態で実施することが可能であり、更に、本開示の趣旨から逸脱せずに、本明細書に記載される方法、装置、モジュール、機器及びシステムの形態に対する種々の省略形態、置換形態及び変更形態がなされ得る。添付の特許請求の範囲及びそれらの均等物は、本開示の範囲及び趣旨内にあるそのような形態又は変更形態の包含を意図する。
【図１Ａ】
2020530979.tif 000003
【図１Ｂ】
2020530979.tif 000004
【図２Ａ】
2020530979.tif 000005
【図２Ｂ】
2020530979.tif 000006
【図２Ｃ】
2020530979.tif 000007
【図２Ｄ】
2020530979.tif 000008
【図３Ａ】
2020530979.tif 000009
【図３Ｂ】
2020530979.tif 000010
【図３Ｃ】
2020530979.tif 000011
【図４】
2020530979.tif 000012
【図５Ａ】
2020530979.tif 000013
【図５Ｂ】
2020530979.tif 000014
【図５Ｃ】
2020530979.tif 000015
【図６Ａ】
2020530979.tif 000016
【図６Ｂ】
2020530979.tif 000017
【図６Ｃ】
2020530979.tif 000018
【図６Ｄ】
2020530979.tif 000019
【図６Ｅ】
2020530979.tif 000020
【図７Ａ】
2020530979.tif 000021
【図７Ｂ】
2020530979.tif 000022
【図７Ｃ】
2020530979.tif 000023
【図７Ｄ】
2020530979.tif 000024
【図８Ａ】
2020530979.tif 000025
【図８Ｂ】
2020530979.tif 000026
【図８Ｃ】
2020530979.tif 000027
【図８Ｄ】
2020530979.tif 000028
【図８Ｅ】
2020530979.tif 000029
【図８Ｆ】
2020530979.tif 000030
【図９】
2020530979.tif 000031
【図１０Ａ】
2020530979.tif 000032
【図１０Ｂ】
2020530979.tif 000033
【図１０Ｃ】
2020530979.tif 000034
【図１１】
2020530979.tif 000035
【図１２Ａ】
2020530979.tif 000036
【図１２Ｂ】
2020530979.tif 000037
【図１３】
2020530979.tif 000038
【手続補正書】
【提出日】平成30年11月26日(2018.11.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
自動マルチモジュール細胞編集機器において、
モジュールの幾つかの全てを収容する筐体と、
細胞を受容するレセプタクルと、
核酸を受容する１つ又は複数のレセプタクルと、
前記核酸を前記細胞に導入する形質転換モジュールと、
前記形質転換モジュールにおける細胞の形質転換後、前記細胞が回復することを可能にする回復モジュールと、
前記導入された核酸が前記細胞内の核酸を編集することを可能にする、ヌクレアーゼ特異的編集モジュールと、
ユーザ入力及び予めプログラムされたスクリプトの選択のうちの少なくとも一方に基づいて、前記自動マルチモジュール細胞編集機器を動作させるプロセッサと、
成長モジュール、形質転換モジュール、又はヌクレアーゼ特異的編集モジュールのうちの１つから、前記成長モジュール、形質転換モジュール、又はヌクレアーゼ特異的編集モジュールのうちのさらなる１つまでユーザの介入なしに液体を直接に移動させる、自動液体ハンドリングシステムと
を備える、自動マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項２】
前記１つ又は複数のレセプタクル内の前記核酸は、骨格及び編集カセットを有し、及び前記自動マルチモジュール細胞編集機器は、核酸アセンブリモジュールを更に備える、請求項１に記載の自動マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項３】
自動液体ハンドリングシステムはシッパー又はピペッターを備える、請求項２に記載の自動マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項４】
前記核酸アセンブリモジュールは等温核酸アセンブリを実行するように構成される、請求項２に記載の自動マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項５】
前記編集モジュール及び前記回復モジュールは単一のモジュールとして結合される、請求項１に記載の自動マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項６】
前記細胞を成長させる成長モジュールを更に備える、請求項１に記載の自動マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項７】
前記成長モジュールは前記成長する細胞の光学濃度を測定する、請求項６に記載の自動マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項８】
前記成長モジュールは光学濃度を連続して測定する、請求項７に記載の自動マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項９】
前記プロセッサは、前記細胞がユーザによって要求される時間に標的光学濃度に達するように、前記成長モジュール内の成長条件を調整するように構成される、請求項６に記載の自動マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項１０】
前記細胞を受容するレセプタクル及び前記核酸を受容する１つ又は複数のレセプタクルは、試薬カートリッジ内に収容される、請求項１に記載の自動マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項１１】
細胞編集に必要な幾つか又は全ての試薬は、前記試薬カートリッジ内に受容される、請求項１０に記載の自動マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項１２】
前記試薬カートリッジ内に収容される前記試薬は、前記プロセッサによって読み出されるスクリプトによって位置特定可能である、請求項１１に記載の自動マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項１３】
前記試薬カートリッジは試薬を含み、且つキットにおいて提供される、請求項１２に記載の自動マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項１４】
前記形質転換モジュールは電気穿孔デバイスを含む、請求項１に記載の自動マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項１５】
前記電気穿孔デバイスはフロースルー電気穿孔デバイスである、請求項１４に記載の自動マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項１６】
前記細胞を濃縮させ、且つ前記細胞をエレクトロコンピテントにさせるように構成された濾過モジュールを更に備える、請求項１に記載の自動マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項１７】
自動マルチモジュール細胞編集機器において、
モジュールの幾つか又は全てを収容する筐体と、
細胞を受容するレセプタクルと、
核酸を受容する少なくとも１つのレセプタクルと、
ベクター骨格及び編集カセットをアセンブルする核酸アセンブリモジュールであって、前記細胞内での所望のゲノム編集イベントを促進するために核酸を受容し、アセンブリを行う、核酸アセンブリモジュールと、
前記細胞を成長させる成長モジュールと、
アセンブルされた核酸を前記細胞に導入するためのエレクトロポレータを含む形質転換モジュールと、
前記アセンブルされた核酸が前記細胞内の核酸を編集することを可能にする、ヌクレアーゼ特異的編集モジュールと、
ユーザ入力及び予めプログラムされたスクリプトの選択のうちの少なくとも一方に基づいて、前記自動マルチモジュール細胞編集機器を動作させるプロセッサと、
核酸アセンブリモジュール、形質転換モジュール、又はヌクレアーゼ特異的編集モジュールのうちの１つから、前記核酸アセンブリモジュール、形質転換モジュール、又はヌクレアーゼ特異的編集モジュールのうちのさらなる１つまでユーザの介入なしに液体を直接に移動させる、自動液体ハンドリングシステムと
を備える、自動マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項１８】
前記自動マルチモジュール細胞編集機器において細胞編集を実行するための試薬を収容する少なくとも１つの試薬カートリッジを更に備える、請求項１７に記載の自動マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項１９】
前記細胞及び前記核酸のための前記レセプタクルは、前記試薬カートリッジ内に配置される、請求項１８に記載の自動マルチモジュール細胞編集機器。
【請求項２０】
自動マルチモジュール細胞編集機器において、
モジュールの幾つか又は全てを収容する筐体と、
細胞を受容するレセプタクルと、
核酸を受容する少なくとも１つのレセプタクルと、
ａ）骨格及び編集カセットをアセンブルし、且つｂ）アセンブリ後、アセンブルされた核酸を脱塩する核酸アセンブリモジュールと、
前記細胞を成長させる成長モジュールと、
前記細胞を濃縮させ、且つ前記細胞をエレクトロコンピテントにさせる濾過モジュールと、
前記アセンブルされた核酸を前記細胞に導入するためのフロースルーエレクトロポレータを含む形質転換モジュールと、
前記形質転換モジュールにおける電気穿孔後、前記細胞が回復することを可能にし、且つ前記核酸が前記細胞を編集することを可能にする、回復及びヌクレアーゼ特異的編集結合モジュールと、
ユーザ入力に基づいて前記自動マルチモジュール細胞編集機器を動作させるプロセッサと、
成長モジュール、濾過モジュール、形質転換モジュール、又は回復及びヌクレアーゼ特異的編集結合モジュールのうちの１つから、前記成長モジュール、濾過モジュール、形質転換モジュール、又は回復及びヌクレアーゼ特異的編集結合モジュールのうちのさらなる１つまでユーザの介入なしに液体を直接に移動させる、自動液体ハンドリングシステムと
を備える、自動マルチモジュール細胞編集機器。
【国際調査報告】
2020530979.tif 000039