(57)【要約】  本発明は、細胞外小胞、例えば、ヒトカーディオスフェア又はカーディオスフェア由来の細胞（ＣＤＣ）から得られるエクソソームで急性又は慢性の全身移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を治療する方法に関し、全身ＧＶＨＤは、例えば、皮膚、粘膜、胃腸管、肝臓、肺、関節及び筋膜、生殖器、及び眼からなる群から選択される少なくとも２つの器官に関与する。本発明はまた、全身ＧＶＨＤの治療を必要とするヒト対象に、全身投与、例えば、静脈内注入するための、細胞外小胞、例えば、ヒトカーディオスフェア又はＣＤＣから得られるエクソソームを含む医薬製剤を提供する。【選択図】図７Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要とする対象における全身移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を治療する方法であって、前記対象に治療有効量の細胞外小胞を全身投与することを含む方法。
【請求項２】
前記全身ＧＶＨＤが急性又は慢性である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
治療有効量の細胞外小胞の前記投与が、皮膚、粘膜、胃腸管、肝臓、及び肺からなる群から選択される少なくとも１つの器官に対する全身ＧＶＨＤの治療をもたらす、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
治療有効量の細胞外小胞の前記投与が、皮膚、粘膜、胃腸管、肝臓、及び肺からなる群から選択される少なくとも２つの器官に対する全身ＧＶＨＤの治療をもたらす、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
治療有効量の細胞外小胞の前記投与が、皮膚、粘膜、胃腸管、肝臓、肺、関節及び筋膜、及び生殖器からなる群から選択される少なくとも１つの器官に対する全身ＧＶＨＤの治療をもたらす、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
治療有効量の細胞外小胞の前記投与が、皮膚、粘膜、胃腸管、肝臓、肺、関節及び筋膜、及び生殖器からなる群から選択される少なくとも２つの器官に対する全身ＧＶＨＤの治療をもたらす、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
治療有効量の細胞外小胞の前記投与が、皮膚、粘膜、胃腸管、肝臓、肺、関節及び筋膜、及び生殖器、及び眼からなる群から選択される少なくとも１つの器官に対する全身ＧＶＨＤの治療をもたらす、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
治療有効量の細胞外小胞の前記投与が、眼に対する全身ＧＶＨＤの治療をもたらす、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
治療有効量の細胞外小胞が、前記対象が造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）を受けた後に１回又は複数回投与される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
治療有効量の細胞外小胞が、ＨＳＣＴ後１、２、３、４、５、６、７、及び／又は８週間投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
複数回投与が、連続投与の間に７日間あけて行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記全身投与が、血管内投与、脳室内投与、髄腔内投与、皮下投与、皮内投与又は腹腔内投与を介するものである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記血管内投与が、静脈内投与、動脈内投与、又は冠動脈内投与である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞外小胞が、胚性幹細胞、多能性幹細胞、複能性幹細胞、人工多能性幹細胞、出生後の幹細胞、成体幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、内皮幹細胞、上皮幹細胞、神経幹細胞、心臓前駆細胞を含む心臓幹細胞、骨髄由来幹細胞、脂肪由来幹細胞、肝幹細胞、末梢血由来幹細胞、臍帯血由来の幹細胞、又は胎盤幹細胞などの再生幹細胞に由来する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞外小胞が、エクソソーム、微小胞、膜粒子、膜小胞、エクソソーム様小胞、エクトソーム、エクトソーム様小胞、又はエクソ小胞である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞外小胞が、カーディオスフェア、カーディオスフェア由来細胞（ＣＤＣ）、又はｎｅｗｔ  Ａ１細胞株から得られる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記対象が哺乳動物である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記哺乳動物がヒトである、請求項に記載の方法。
【請求項１９】
それを必要とする対象における全身ＧＶＨＤを治療する方法であって、ＣＤＣに由来する治療有効量の細胞外小胞を前記対象に全身投与することを含む方法。
【請求項２０】
ＣＤＣに由来する治療有効量の細胞外小胞の前記投与が、皮膚、粘膜、胃腸管、肝臓、及び肺からなる群から選択される少なくとも１つの器官に対する全身ＧＶＨＤの治療をもたらす、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ＣＤＣに由来する治療有効量の細胞外小胞の前記投与が、皮膚、粘膜、胃腸管、肝臓、及び肺からなる群から選択される少なくとも２つの器官に対する全身ＧＶＨＤの治療をもたらす、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
ＣＤＣに由来する治療有効量の細胞外小胞の前記投与が、皮膚、粘膜、胃腸管、肝臓、肺、関節及び筋膜、及び生殖器からなる群から選択される少なくとも１つの器官に対する全身ＧＶＨＤの治療をもたらす、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
ＣＤＣに由来する治療有効量の細胞外小胞の前記投与が、皮膚、粘膜、胃腸管、肝臓、肺、関節及び筋膜、及び生殖器からなる群から選択される少なくとも２つの器官に対する全身ＧＶＨＤの治療をもたらす、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
ＣＤＣに由来する治療有効量の細胞外小胞の前記投与が、皮膚、粘膜、胃腸管、肝臓、肺、関節及び筋膜、及び生殖器、及び眼からなる群から選択される少なくとも１つの器官に対する全身ＧＶＨＤの治療をもたらす、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
ＣＤＣに由来する治療有効量の細胞外小胞の前記投与が、眼に対する全身ＧＶＨＤの治療をもたらす、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）は、非同一ドナーから移植された細胞（典型的には、骨髄、Ｔ細胞、及び／又は造血幹細胞のドナー；移植片）が、移植レシピエント（宿主）に見られる抗原に対する有害な免疫応答を認識して、免疫応答を開始するときに生じる。例えば、Ｂｉｌｌｉｎｇｈａｍ，「移植片対宿主反応の生物学（Ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｇｒａｆｔ−Ｖｅｒｓｕｓ−Ｈｏｓｔ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ）」，Ｈａｒｖｅｙ Ｌｅｃｔ.  ６２：２１−７８（１９６６−１９６７）を参照されたい。この疾患は、複数の器官、最も一般的に、皮膚、粘膜、胃腸管、肝臓及び肺に関与する異種病態として存在する。同種造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）を受けた患者の場合、ＧＶＨＤは、罹患率及び死亡率の重大な原因である。疾患リスクに影響を与える要因が多いため、急性ＧＶＨＤと慢性ＧＶＨＤの両方について報告された症例の範囲は広い。患者の最大８０％が、ＨＳＣＴ（急性）後約１４〜２１日でＧＶＨＤを発症し、１００日を超えて生き残ったもののうち、３０〜７０％が慢性ＧＶＨＤを発症する。当然のことながら、慢性ＧＶＨＤは、ＨＳＣＴの生存者における死亡の単独主要原因を表す。例えば、Ｐａｓｑｕｉｎｉら、「２０１０  国際血液骨髄移植研究センターからの報告書（２０１０  Ｒｅｐｏｒｔ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＣＩＢＭＴＲ））：血液及び骨髄障害の造血細胞移植片の現在の使用と結果（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｕｓｅｓ ａｎｄ Ｏｕｔｃｏｍｅｓ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ ｆｏｒ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）」，Ｃｌｉｎ Ｔｒａｎｓｐｌ．，８７−１０５  （２０１０）を参照されたい。
【０００２】
ＧＶＨＤの発症は、宿主組織を標的とする特異的免疫応答を開始することができる抗原特異的ドナーＴ細胞の活性化に依存する。この事象は、免疫系を抑制し、効果的な生着を保証するために、ＨＳＣＴ前の宿主のコンディショニングによって増強される。宿主組織の損傷は、直接細胞接触及び可溶性炎症促進性メディエーターの産生を含む様々なメカニズムを伴う細胞傷害性Ｔ細胞によって媒介される。例えば、Ｆｅｒｒａｒａら、「移植片対宿主病（Ｇｒａｆｔ−Ｖｅｒｓｕｓ−Ｈｏｓｔ Ｄｉｓｅａｓｅ）」，Ｌａｎｃｅｔ，３７３：１５５０−１５６１（２００９）；Ｓａｋｏｄａら、「ドナー由来の胸腺依存性Ｔ細胞は慢性移植片対宿主病を引き起こす（Ｄｏｎｏｒ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｔｈｙｍｉｃ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｃａｕｓｅ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｇｒａｆｔ−Ｖｅｒｓｕｓ−Ｈｏｓｔ Ｄｉｓｅａｓｅ）」，Ｂｌｏｏｄ，１０９：１７５６−１７６４（２０１０）を参照されたい。Ｔｈ１、Ｔｈ２、及びＴｈ１７を含む複数のＴヘルパー細胞のサブセットが関与することが示されている。例えば、Ｂｒｏａｄｙら、「皮膚ＧＶＨＤは、Ｔｈ１７細胞ではなく、組織局在化Ｔｈ１の増大に関連している（Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ＧＶＨＤ ｉｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ Ｔｉｓｓｕｅ−Ｌｏｃａｌｉｚｅｄ Ｔｈ１ ａｎｄ ｎｏｔ Ｔｈ１７  Ｃｅｌｌｓ）」，Ｂｌｏｏｄ，１１６：５７４９−５７５１（２０１０）；Ｍｕｒｐｈｙら、「マウスの同種骨髄移植後の急性移植片対宿主病におけるインターフェロンガンマ及びＩＬ−４の不在の差動効果（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−Ｇａｍｍａ  ａｎｄ ＩＬ−４ ｉｎ Ａｃｕｔｅ Ｇｒａｆｔ−Ｖｅｒｓｕｓ−Ｈｏｓｔ Ｄｉｓｅａｓｅ Ａｆｔｅｒ Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ Ｍｉｃｅ）」，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．，１０２：１７４２−１７４８（１９９８）；Ｎｉｋｏｌｉｃら、「Ｔｈ１及びＴｈ２は、急性移植片対宿主病を媒介し、それぞれ別々の末端器官を標的化する（Ｔｈ１ ａｎｄ Ｔｈ２  Ｍｅｄｉａｔｅ Ａｃｕｔｅ Ｇｒａｆｔ−Ｖｅｒｓｕｓ−Ｈｏｓｔ Ｄｉｓｅａｓｅ, ｅａｃｈ ｗｉｔｈ Ｄｉｓｔｉｎｃｔ Ｅｎｄ−Ｏｒｇａｎ Ｔａｒｇｅｔｓ）」，Ｊ Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．，１０５：１２８９−１２９８（２０００）を参照されたい。それらの特定の役割の現在の理解は複雑である。一部のモデルでは、Ｔｈ１７細胞は、ＧＶＨＤの誘導に十分であることが示されているが、他のモデルでは、それらがないと、疾患が悪化することが示されている。例えば、Ｙｉら、「ドナーＴｈ１７が存在しないと、Ｔｈ１分化が増強し、急性移植片対宿主病が悪化する（Ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ Ｄｏｎｏｒ Ｔｈ１７ Ｌｅａｄｓ ｔｏ Ａｕｇｍｅｎｔｅｄ Ｔｈ１ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｘａｃｅｒｂａｔｅｄ Ａｃｕｔｅ−Ｇｒａｆｔ−Ｖｅｒｓｕｓ−Ｈｏｓｔ Ｄｉｓｅａｓｅ）」，Ｂｌｏｏｄ，１１２：２１０１−２１１０（２００８）；Ｋａｐｐｅｌら、「ＩＬ−１７がＣＤ４媒介性移植片対宿主病に寄与する（ＩＬ−１７ Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ ＣＤ４−Ｍ���ｄｉａｔｅｄ  Ｇｒａｆｔ−Ｖｅｒｓｕｓ−Ｈｏｓｔ Ｄｉｓｅａｓｅ）」，Ｂｌｏｏｄ，１１３：９４５−９５２（２００９）を参照されたい。
【０００３】
疾患及び関連危険因子の免疫病理学的基礎、並びにより効果的なＭＨＣマッチングの開発及び免疫コンディショニングの理解における進歩にもかかわらず、最近の移植関連死亡率の減少はほとんど進展していない。現在の治療の焦点は、あいまいな効力を有するコルチコステロイドを用いた一般的な免疫抑制である。疾患症状の持続的な改善は、患者の約５０％にのみ見られる。例えば、Ｂｉｌｌｉｎｇｈａｍ，「移植片対宿主反応の生物学（Ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｇｒａｆｔ−Ｖｅｒｓｕｓ−Ｈｏｓｔ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ）」，Ｈａｒｖｅｙ Ｌｅｃｔ.,６２：２１−７８（１９６６−１９６７）を参照されたい。より有望な治療法は、ＧＶＨＤの予防的防止に基づき、メトトレキサート及びタクロリムスなどのＴ細胞標的剤を使用する。成功しないのは、主に、慢性ＧＶＨＤの発症率及び重症度の軽減に失敗しているからである。
【０００４】
細胞は、それぞれ、エクソソーム及び微小胞と呼ばれるエンドソーム並びに細胞膜起源の多様な種類の膜小胞を細胞外環境に放出する。これらの細胞外小胞は、膜タンパク質及び細胞質タンパク質、脂質、及びＲＮＡの細胞間移動のためのビヒクルとして作用することによって、細胞間コミュニケーションの重要な様式を表す。例えば、Ｇｒａｓａ  Ｒａｐｏｓｏ  ａｎｄ  Ｗｉｌｌｅｍ  Ｓｔｏｏｒｖｏｇｅｌ，「細胞外小胞：エクソソーム、微小胞、及びフレンド（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｖｅｓｉｃｌｅ：Ｅｘｏｓｏｍｅｓ，Ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅｓ，ａｎｄ Ｆｒｉｅｎｄｓ）」，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＶｏＬ．２００，  Ｎｏ．４，  ３７３−３８３  （２０１３）を参照されたい。国際公開２０１４／０２８４９３は、カーディオスフェア（Ｃａｒｄｉｏｓｐｈｅｒｅ）由来細胞（ＣＤＣ）に由来するエクソソーム及び損傷した若しくは疾患のある細胞又は組織、例えば、損傷した心臓組織の修復又は再生のためのそれらの治療的有用性について記載している。米国特許公開第２０１２／０３１５２５２号は、哺乳動物の損傷した又は疾患のある心臓の機能を増大させるためのＣＤＣ、カーディオスフェアからのそれらの派生物、及びそれらの治療的有用性について記載している。国際公開２００５／０１２５１０は、カーディオスフェア、ヒト又は動物の心臓組織の生検試料からのそれらの派生物、心筋若しくは他の器官の細胞移植及び機能的修復におけるそれらの治療的有用性について記載している。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、全身ＧＶＨＤの関連するマウスモデルで初めて実証されたように、細胞外小胞、特に、カーディオスフェア由来の細胞（ＣＤＣ）に由来するエクソソームが、Ｔ細胞上で免疫調節能を有し、全身移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を治療するのに有効であるという本発明者らの驚くべき発見に基づいている。本明細書に記載されるように、本発明の方法の利点は、免疫応答を調節し、炎症及び線維症を減少させることにより、ＧＶＨＤにおける生存と末端器官損傷（例えば、胃腸管及び眼）の両方を改善することができる安全な全身投与生物療法であることである。これは、とりわけ、眼のＧＶＨＤ及び胃腸管における乏しい栄養吸収に起因する体重減少などの末端器官合併症を低下させ、生存の改善及びおそらく生活の質の向上につながる。
【０００６】
本発明の目的のために、用語「全身ＧＶＨＤ」は、「ＧＶＨＤ」と同義的に使用され、細胞外小胞、例えば、ＣＤＣ由来のエクソソーム及び／又は微小胞の全身投与による治療を必要とするか、若しくはその影響を受けやすい急性又は慢性のＧＶＨＤを指す。
【０００７】
一般に、本発明は、それを必要とする対象において全身ＧＶＨＤを安全に治療する方法であって、治療有効量の細胞外小胞、例えば、ＣＤＣ由来のエクソソーム及び／又は微小胞を該対象に全身投与することを含む方法を提供し、全身ＧＶＨＤは、複数の器官、最も一般的には、皮膚、粘膜、胃腸管、肝臓、及び肺に関与する症候群であり、ドナー由来の細胞（典型的には、骨髄、Ｔ細胞、及び／又は造血幹細胞ドナー）は、免疫不全レシピエントに見られる抗原に対する有害な免疫応答を認識し、免疫応答を開始する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の一態様によれば、治療有効量の細胞外小胞、例えば、ＣＤＣ由来のエクソソーム及び／又は微小胞の全身投与は、皮膚、粘膜、胃腸管、肝臓、及び肺からなる群から選択される少なくとも１つの器官に対する全身ＧＶＨＤの治療をもたらす。あるいは、本発明によれば、治療有効量の細胞外小胞の前記投与は、皮膚、粘膜、胃腸管、肝臓、及び肺からなる群から選択される少なくとも２つの器官に対する全身ＧＶＨＤの治療をもたらす。
【０００９】
本発明の別の態様によれば、治療有効量の細胞外小胞、例えば、ＣＤＣ由来のエクソソーム及び／又は微小胞の全身投与は、皮膚、粘膜、胃腸管、肝臓、肺、関節及び筋膜、及び生殖器からなる群から選択される少なくとも１つの器官に対する全身ＧＶＨＤの治療をもたらす。あるいは、本発明によれば、治療有効量の細胞外小胞の前記投与は、皮膚、粘膜、胃腸管、肝臓、肺、関節及び筋膜、及び生殖器からなる群から選択される少なくとも２つの器官に対する全身ＧＶＨＤの治療をもたらす。
【００１０】
本発明の別の態様によれば、治療有効量の細胞外小胞、例えば、ＣＤＣ由来のエクソソーム及び／又は微小胞の全身投与は、皮膚、粘膜、胃腸管、肝臓、肺、関節及び筋膜、及び生殖器、及び眼からなる群から選択される少なくとも１つの器官に対する全身ＧＶＨＤの治療をもたらす。
【００１１】
本発明の別の態様によれば、治療有効量の細胞外小胞、例えば、ＣＤＣ由来のエクソソーム及び／又は微小胞の全身投与は、眼に対する全身ＧＶＨＤの治療をもたらす。
【００１２】
本発明によれば、治療有効量の細胞外小胞、例えば、ＣＤＣ由来のエクソソーム及び／又は微小胞は、対象がＨＳＣＴを受けた後に、一回以上全身に投与される。いくつかの実施形態において、治療有効量の細胞外小胞は、例えば、ＨＳＣＴ後１時間以内に対象に全身投与される。いくつかの実施形態において、治療有効量の細胞外小胞は、例えば、ＨＳＣＴ後１〜２４時間以内に対象に全身投与される。いくつかの実施形態において、治療有効量の細胞外小胞は、例えば、ＨＳＣＴ後２４〜４８時間以内に対象に全身投与される。いくつかの実施形態において、治療有効量の細胞外小胞は、例えば、ＨＳＣＴ後１〜２週の時点で対象に全身投与される。いくつかの実施形態において、治療有効量の細胞外小胞は、例えば、ＨＳＣＴ後２〜３週の時点で対象に全身投与される。いくつかの実施形態において、治療有効量の細胞外小胞は、例えば、ＨＳＣＴ後４〜８週の時点で対象に全身投与される。いくつかの実施形態において、治療有効量の細胞外小胞は、例えば、連続投与の間に７日あけて１回以上、例えば、ＨＳＣＴ後１、２、３、４、５、６、７、及び／又は８週の時点で対象に全身投与される。
【００１３】
本発明によれば、前記対象は哺乳動物、例えば、ヒトである。前記全身投与は、例えば、血管内投与、脳室内投与、髄腔内投与、又は腹腔内投与を介するものであり、前記血管内投与は、例えば、静脈内、動脈内、若しくは冠動脈内注入又は注射である。
【００１４】
本発明によれば、前記細胞外小胞は、エクソソーム、微小胞、膜粒子、膜小胞、エクソソーム様小胞、エクトソーム、エクトソーム様小胞、エクソ小胞（ｅｘｏｖｅｓｉｃｌｅｓ）、エピジモソーム（ｅｐｉｄｉｄｉｍｏｓｏｍｅ）、アルゴソーム（ａｒｇｏｓｏｍｅ）、プロミニノソーム（ｐｒｏｍｉｎｉｎｏｓｏｍｅ）、プロスタソーム、デキソソーム、テキソソーム、アーケオソーム（ａｒｃｈｅｏｓｏｍｅ）、又はオンコソーム（ｏｎｃｏｓｏｍｅ）などである。
【００１５】
本発明の実施形態によれば、前記細胞外小胞は、無血清培地（例えば、ＩＭＤＭ）中で培養し、約１５日間、約５％のＯ２でインキュベートしたＣＤＣに由来し、前記細胞外小胞は、細胞外小胞を含有するＣＤＣ馴化培地を、１０００ｋＤａの細孔サイズフィルターを通して濾過した後に得られる。より一般的には、本発明によれば、前記細胞外小胞は、血清含有培地又は無血清培地中で培養し、１〜１５日間、２〜２０％のＯ２でインキュベートしたＣＤＣに由来し、前記細胞外小胞は、細胞外小胞を含有するＣＤＣ順化培地を、３〜１０００ｋＤａ（例えば、１０ｋＤａ）の細孔サイズフィルターを通して濾過した後に得られる。あるいは、細胞外小胞は、ポリエチレングリコール（例えば、２５％ＰＥＧ）を用いて沈殿させることにより得られる。
【００１６】
本発明によれば、細胞外小胞、例えば、エクソソームは、薬物送達デバイス、挿入物、又はパッチなどの一部として、晶質液（例えば、プラズマライト（Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ）、生理食塩水）、水溶液、ゲル、軟膏、クリーム、局所又は移植可能なヒドロゲル、粉末、徐放性ポリマー（例えば、ＰＬＧＡ及びＰＬＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）含有溶液、懸濁液、乳濁液で製剤化される。いくつかの実施形態において、使用前に、細胞外小胞、例えば、エクソソームは、ヒト血清アルブミンの有無にかかわらず、適切な緩衝液、例えば、無菌のＰＢＳに再懸濁される。いくつかの実施形態において、エクソソームは、将来の使用のために保存する、例えば、−８０℃で凍結することができる。
【００１７】
いくつかの実施形態において、細胞外小胞、例えば、エクソソームは、ヒト又は動物細胞に由来する。いくつかの実施形態において、細胞外小胞、例えば、エクソソームは、カーディオスフェア又はＣＤＣから調製される。いくつかの実施形態において、細胞外小胞は、例えば、エクソソームは、胚性幹細胞、多能性幹細胞、複能性幹細胞、人工多能性幹細胞、出生後の幹細胞、成体幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、内皮幹細胞、上皮幹細胞、神経幹細胞、心臓前駆細胞を含む心臓幹細胞、骨髄由来幹細胞、脂肪由来幹細胞、肝幹細胞、末梢血由来幹細胞、臍帯血由来の幹細胞、又は胎盤幹細胞などの再生幹細胞から調製される。
【００１８】
いくつかの実施形態において、細胞外小胞、例えば、エクソソームは、特定の標的部位にそれらを移動させるように（例えば、遺伝学的に又は別の方法で）改変される。例えば、改変は、いくつかの実施形態において、所望の標的組織上の受容体との特異的相互作用をもたらす、エクソソーム上の特異的細胞表面マーカーの発現誘導を含み得る。一実施形態において、エクソソームの天然含有物は除去され、所望の外因性タンパク質及び／又は核酸で置き換えられるか、又は補充される。
【００１９】
いくつかの実施形態において、細胞外小胞、例えば、エクソソームは、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１４８ａ、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−２７ｂ、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−２７ａ、ｍｉＲ−３７６ｃ、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−３２０ａ、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１８５、及びｍｉＲ−２３ａから選択される１以上のマイクロＲＮＡを含む。好ましい実施形態において、細胞外小胞、例えば、エクソソームは、ｍｉＲ−１４６ａ及びｍｉＲ−２１０を含む。いくつかの実施形態において、細胞外小胞、例えば、エクソソームは、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１６、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９０、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ｅ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２−３ｐ（ｍｉＲ−２２１−３ｐとしても知られる）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１５−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２５−３ｐ（ｍｉＲ−９２ａ−３ｐとしても知られる）から選択される１以上のマイクロＲＮＡを含む。
【００２０】
いくつかの実施形態において、細胞外小胞、例えば、エクソソームは、生物タンパク質、例えば、転写因子、サイトカイン、成長因子、及び標的細胞内においてシグナル伝達経路を調節することができる類似のタンパク質を含有する。いくつかの実施形態において、生物タンパク質は、組織の再生及び／又は機能改善を促進することが可能である。いくつかの実施形態において、生物タンパク質は、Ｉｒａｋ１、Ｔｒａｆ６、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）シグナル伝達経路、ＮＯＸ−４、ＳＭＡＤ−４、及び／又はＴＧＦ−βに関連する経路を調節することができる。いくつかの実施形態において、生物タンパク質は、エクソソーム形成又はＨｓｐ７０、Ｈｓｐ９０、１４−３−３イプシロン、ＰＫＭ２、ＧＷ１８２及びＡＧ０２などのサイトゾルタンパク質のパッケージングに関連している。いくつかの実施形態において、細胞外小胞、例えば、エクソソームは、シグナル伝達脂質、例えば、セラミド及び誘導体を含有する。
【００２１】
いくつかの実施形態において、細胞外小胞、例えば、エクソソームは、テトラスパニン、例えば、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ５３、及び／又はＣＤ３７を発現する。いくつかの実施形態において、細胞外小胞、例えば、エクソソームは、１以上の脂質ラフト関連タンパク質（例えば、グリコシルホスファチジルイノシトールアンカー型タンパク質及びフロチリン）、コレステロール、スフィンゴミエリン及び／又はヘキソシルセラミドを発現する。
【００２２】
いくつかの実施形態において、細胞外小胞、例えば、エクソソームは、例えば、約１５〜２５０ｎｍ、約１５〜２０５ｎｍ、約９０〜２２０ｎｍ、約３０〜２００ｎｍ、約２０〜１５０ｎｍ、約７０〜１５０ｎｍ、又は約４０〜１００ｎｍの直径を有する。いくつかの実施形態において、細胞外小胞、例えば、微小胞は、例えば、約１００〜１０００ｎｍの直径を有する。
【００２３】
いくつかの実施形態において、細胞外小胞、例えば、エクソソームは、汚染物質又は望ましくない化合物がエクソソームから除去されるように精製される。いくつかの実施形態において、約５０％〜９０％、又は最大１００％の汚染物質がエクソソームから除去されるように実質的に精製されたエクソソームが患者に投与される。いくつかの実施形態において、エクソソームの調製は、非エクソソーム成分を本質的に含まない。
【００２４】
いくつかの実施形態において、細胞外小胞、例えば、エクソソームは、１以上の追加の薬剤と組み合わせて投与される。例えば、いくつかの実施形態において、エクソソームは、エクソソームに由来する１以上のタンパク質又は核酸と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態において、エクソソームが単離される細胞は、エクソソームと組み合わせて投与される。いくつかの実施形態において、そのようなアプローチは、有利に、エクソソーム送達の急性期間及びより長い期間を提供する（例えば、実際のエクソソーム送達に基づく急性期間及び細胞送達に基づく長い期間、細胞は送達後にエクソソームを分泌し続ける）。
【００２５】
いくつかの実施形態において、細胞外小胞、例えば、エクソソームの用量は、約１.０×１０５〜約１.０×１０１０エクソソームの範囲である。特定の実施形態において、エクソソームの用量は、キログラムあたり、例えば、約１.０×１０５エクソソーム／ｋｇ〜約１.０×１０９エクソソーム／ｋｇで投与される。さらなる実施形態において、エクソソームは、標的組織の塊に基づく量、例えば、約１.０×１０５エクソソーム／標的組織１グラム〜約１.０×１０９エクソソーム／標的組織１グラムで送達される。いくつかの実施形態において、エクソソームは、特定の標的組織中の細胞の数に対するエクソソームの数の比に基づいて投与される。エクソソームが併用療法（例えば、除去されたエクソソームの動きを止めることができる細胞、薬物療法、及び核酸療法など）と組み合わせて投与される場合に、投与されるエクソソームの用量は、それに応じて、調節する（例えば、所望の治療効果を達成するのに必要に応じて増加又は減少させる）ことができる。
【００２６】
本発明は、さらに、上述の方法に従って、全身ＧＶＨＤの治療に使用するための細胞外小胞を含む製剤を提供する。
【００２７】
本発明は、さらに、上述の方法に従って、全身ＧＶＨＤを治療するための上述の製剤の使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】全身ＧＶＨＤがＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて誘導される方法を示す図である。
【図２Ａ】ＧＶＨＤスコアの姿勢基準のグレード０の一例を示す写真である。
【図２Ｂ】ＧＶＨＤスコアの姿勢基準のグレード１の一例を示す写真である。
【図２Ｃ】ＧＶＨＤスコアの姿勢基準のグレード２の一例を示す写真である
【図３Ａ】ＧＶＨＤスコアの毛の質感基準のグレード０の一例を示す写真である。
【図３Ｂ】ＧＶＨＤスコアの毛の質感基準のグレード１の一例を示す写真である。
【図３Ｃ】ＧＶＨＤスコアの毛の質感基準のグレード２の一例を示す写真である。
【図４Ａ】ＧＶＨＤスコアの皮膚完全性基準のグレード０の一例を示す写真である。
【図４Ｂ】ＧＶＨＤスコアの皮膚完全性基準のグレード１の一例を示す写真である。
【図４Ｃ】ＧＶＨＤスコアの皮膚完全性基準のグレード２の一例を示す写真である。
【図５】全身ＧＶＨＤを治療するための細胞外小胞の有効性を評価するための研究設計を模式的に示す。
【図６Ａ】全身ＧＶＨＤのマウスモデルの重量に対する細胞外小胞の静脈内投与の効果をグラフで示す。
【図６Ｂ】統計的検定によるグループの効果的な比較を可能にするためのＡＵＣと同じ図６Ａのデータを示す。
【図７Ａ】ＧＶＨＤスコア全体に対する細胞外小胞の静脈内投与の効果をグラフで示す。
【図７Ｂ】統計的検定によるグループの効果的な比較を可能にするためのＡＵＣと同じ図７Ａのデータを示す。
【図８Ａ】ＧＶＨＤスコアの姿勢基準に対する細胞外小胞の静脈内投与の効果をグラフで示す。
【図８Ｂ】ＧＶＨＤスコアの活性基準に対する細胞外小胞の静脈内投与の効果をグラフで示す
【図８Ｃ】ＧＶＨＤスコアの毛の活動基準に対する細胞外小胞の静脈内投与の効果をグラフで示す。
【図８Ｄ】ＧＶＨＤスコアの皮膚完全性基準に対する細胞外小胞の静脈内投与の効果をグラフで示す。
【図９】全身ＧＶＨＤのマウスモデルの生存に対する細胞外小胞の静脈内投与の効果をグラフで示す。
【図１０】図１０Ａ−図１０Ｂ。全身ＧＶＨＤのマウスモデルの下痢の発生に対する細胞外小胞の静脈内投与の効果をグラフで示す。
【図１１】図１１Ａ−図１１Ｃ。全身ＧＶＨＤのマウスモデルの眼の炎症に対する細胞外小胞の静脈内投与の効果をグラフで示す。
【図１２】全身ＧＶＨＤのマウスモデルの大腸炎スコアに対する細胞外小胞の静脈内投与の効果をグラフで示す。
【図１３】合計大腸炎スコアとして図１２と同じデータをグラフで示す。
【図１４】全身ＧＶＨＤのマウスモデルの大腸組織病理学的重症度スコアに対する細胞外小胞の静脈内投与の効果をグラフで示す。
【図１５】全身ＧＶＨＤのマウスモデルの眼平均組織病理学的スコアに対する細胞外小胞の静脈内投与の効果をグラフで示す。
【図１６】認識されたエクソソームマーカーのＣＤＣ−ＥＶ内容物を示すウェスタンブロットである。
【図１７】ＣＤＣ−ＥＶに対するＴ免疫応答及びナチュラルキラー（ＮＫ）免疫応答に関与する免疫分子の発現をグラフで示す。
【図１８】Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞におけるＣＤＣ−ＥＶのインビトロ最新情報を示す。
【図１９】ＣＤＣ−ＥＶによるＰＨＡ誘導性Ｔ細胞増殖の免疫調節を示す。
【図２０】ＣＤＣ及びＣＤＣ−ＥＶによるＰＨＡ誘導性ＣＤ６９及び／又はＨＬＡ−ＤＲ発現の下方制御をグラフで示す。
【図２１】ＣＤＣ−ＥＶがＰＨＡ誘導性Ｔ細胞増殖を下方制御することをグラフで示す。
【図２２】ＣＤＣ−ＥＶによるＰＨＡ誘導性ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞増殖の免疫調節をグラフで示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
Ａ）臨床症状
ＧＶＨＤは、１００日のカットオフを使用して開始時間に基づいて、急性バリアント及び慢性バリアントに古典的に分類される。慢性ＧＶＨＤの臨床症状には、扁平苔癬に似た皮膚の合併症、又は強皮症の皮膚症状、胃腸管の潰瘍及び硬化を伴うドライ口腔粘膜、並びに血清ビリルビン濃度の上昇が含まれる。これとは対照的に、急性ＧＶＨＤの患者は、一般的に、古典的な斑点状丘疹、下痢を伴う腹部疝痛、及び血清ビリルビン濃度の上昇を示す。しかしながら、この従来の分類は、急性及び慢性ＧＶＨＤの兆候がこれらの指定された期間外で起こり得ることを認識することによって検証されてきた。この観察は、急性ＧＶＨＤと慢性ＧＶＨＤを区別するために、設定時間よりもむしろ、臨床所見の使用の増加につながった。ＧＶＨＤの診断に広く受け入れられている米国立衛生研究所（ＮＩＨ）のコンセンサス基準は、慢性ＧＶＨＤ及び急性ＧＶＨＤの診断的又は典型的特徴が共に出現する重複症候群を含む。例えば、Ｆｉｌｉｐｏｖｉｃｈら、「慢性移植片対宿主病における臨床試験のための基準についての米国立衛生研究所のコンセンサス開発プロジェクト：Ｉ．診断及びステージングの作業部会報告書（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ  Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｐｒｏｊｅｃｔ  ｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌｓ ｉｎ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｇｒａｆｔ−Ｖｅｒｓｕｓ−Ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ：Ｉ.Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｓｔａｇｉｎｇ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ  Ｒｅｐｏｒｔ）」、Ｂｉｏｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，１１（１２）：９４５（２００５）を参照されたい。
【００３０】
慢性ＧＶＨＤの徴候及び症状を識別するためのＮＩＨコンセンサス基準を、表１にまとめる。例えば、Ｊａｇａｓｉａら、「慢性移植片対宿主病における臨床試験のための基準についての米国立衛生研究所のコンセンサス開発プロジェクト：Ｉ．２０１４診断及びステージングの作業部会報告書（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｐｒｏｊｅｃｔ  ｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌｓ ｉｎ Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−Ｈｏｓｔ Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｉ．Ｔｈｅ２０１４ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｓｔａｇｉｎｇ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ  Ｒｅｐｏｒｔ）」、Ｂｉｏｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，２１：３８９（２０１５）を参照されたい。
【００３１】
表１
【表１】
2020518564.tif 000003
2020518564.tif 000004
【００３２】
慢性ＧＶＨＤと診断された患者は、その後、急性ＧＶＨＤの特徴の存在又は非存在に基づいて、２つのカテゴリのうちの一方に細分類される：
・古典的慢性ＧＶＨＤ：慢性ＧＶＨＤの特徴は、急性ＧＶＨＤの兆候又は症状なく存在する。
・オーバーラップ症候群：慢性ＧＶＨＤと急性ＧＶＨＤの両方の特徴が存在する。
【００３３】
オーバーラップ症候群に見られる急性ＧＶＨＤの特徴には、皮膚の変化（皮膚紅斑、斑点状丘疹、掻痒）、口（歯肉炎、粘膜炎、口腔紅斑、口腔内痛）、消化器症状（食欲不振、吐き気、嘔吐、下痢、体重減少、成長障害）、肝機能障害（ビリルビン、アルカリホスファターゼ、ＡＬＴ、又はＡＳＴの上昇）、及び器質化肺炎（器質化肺炎を伴う閉塞性細気管支炎とも呼ばれる）が含まれる。
【００３４】
本発明の目的のために、本明細書で使用する「治療する」及び「治療」などの用語は、診断された病的状態又は障害を治癒するか、その進行を遅くするか、その症状を軽減するか、かつ／又はその進行を停止させる治療措置を指す。例えば、対象が、慢性ＧＶＨＤの徴候及び症状を特定するためのＮＩＨコンセンサス基準に従って臨床的改善を示す場合に、対象は、本発明の方法に従ってうまく「治療」される。
【００３５】
Ｂ）カーディオスフェア
カーディオスフェアは、国際公開２００５／０１２５１０、及びＭｅｓｓｉｎａら、「ヒト及びマウスの心臓からの成人心臓幹細胞の単離及び増殖（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ Ａｄｕｌｔ Ｃａｒｄｉａｃ  Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ ａｎｄ Ｍｕｒｉｎｅ Ｈｅａｒｔ）」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９５：９１１−９２１（２００４）に記載されているように、自己接着性クラスターとして成長する未分化心臓細胞であり、これらの開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００３６】
簡単に説明すると、心臓組織は、手術又は心臓の生検中に患者から摘出することができる。心臓組織は、左心室、右心室、中隔、左心房、右心房、分界稜、右心室心内膜、中隔壁又は心室壁、心耳、又はそれらの組み合わせから摘出することができる。生検は、例えば、米国特許出願公開第２００９／０１２４２２号及び同第２０１２／００３９８５７号に記載されているように、例えば、経皮的生検鉗子を使用することによって取得することができ、この開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。その後、該組織を直接培養することができるか、あるいは、心臓組織を凍結し、融解し、その後、培養することができる。該組織をコラゲナーゼ、及びトリプシンなどのプロテアーゼ酵素で消化することができる。心臓組織は、線維芽細胞様細胞及びカーディオスフェア形成細胞を含む細胞が外植片から成長するように、外植片として培養することができる。場合によって、外植片は、細胞外マトリックスの１以上の成分（例えば、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、エラスチン、又は他の細胞外マトリックスタンパク質）でコーティングされた培養容器で培養される。組織外植片は、カーディオスフェア形成細胞の収集前に約１、２、３、４週間、又はそれ以上の間培養することができる。線維芽細胞様細胞の層は、カーディオスフェア形成細胞が現れる外植片から成長することができる。カーディオスフェア形成細胞は、位相差顕微鏡下で小さく、丸い、位相差で明るい細胞として出現し得る。カーディオスフェア形成細胞を含む外植片の周囲の細胞は、手動の方法によって、又は酵素消化によって収集することができる。収集したカーディオスフェア形成細胞は、カーディオスフェアの形成を促進する条件下で培養することができる。いくつかの態様において、細胞は、緩衝培地、アミノ酸、栄養素、血清又は血清代替物、ＥＧＦ及びｂＦＧＦを含むがこれらに限定されない成長因子、カーディオトロフィンを含むがこれに限定されないサイトカイン、限定されないがトロンビンなどの他のカーディオスフェア促進因子を含むカーディオスフェア成長培地中で培養される。カーディオスフェア形成細胞は、約２０,０００〜１００,０００細胞／ｍＬなどのカーディオスフェア形成に必要な適切な密度で播種することができる。細胞を、ポリ−Ｄ−リジン、又は細胞が皿の表面に付着するのを妨げる他の天然若しくは合成の分子でコーティングされた滅菌皿上で培養することができる。カーディオスフェアは、カーディオスフェア形成細胞が播種された約２〜７日又はそれ以後に、自然に出現し得る。
【００３７】
Ｃ）カーディオスフェア由来細胞（ＣＤＣ）
ＣＤＣは、例えば、米国特許出願公開第２０１２／０３１５２５２号に記載されるような方法でカーディオスフェアを操作することによって作製された細胞の集団であり、この開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。例えば、ＣＤＣは、培養容器の固体表面への細胞の付着を促進する物質、例えば、フィブロネクチン、ヒドロゲル、ポリマー、ラミニン、血清、コラーゲン、ゼラチン、又はポリ−Ｄ−リジンでコーティングされた固体表面上にカーディオスフェアを播種し、付着単層培養としてそれらを増殖させることによって作製することができる。ＣＤＣは、標準的な細胞培養方法に応じて、繰り返し継代、例えば、２回以上継代することができる。
【００３８】
Ｄ）エクソソーム
エクソソームは、多胞体又は細胞の原形質膜のエンドソーム関連領域を含む特定の細胞内経路を介して形成される小胞である。エクソソームは、直径約２０〜１５０ｎｍのサイズの範囲であり得る。場合によって、それらは、約１.１〜１.２ｇ／ｍＬの特徴的浮遊密度、及び特徴的脂質組成を有する。それらの脂質膜は、典型的には、コレステロールに富み、スフィンゴミエリン、セラミド、脂質ラフト及び露出ホスファチジルセリンを含有する。エクソソームは、インテグリン及び細胞接着分子などの特定のマーカータンパク質を発現するが、一般的に、リソソーム、ミトコンドリア、又はカベオラのマーカーを欠いている。いくつかの実施形態において、エクソソームは、限定されないが、タンパク質、ＤＮＡ及びＲＮＡ（例えば、マイクロＲＮＡ及び非コードＲＮＡ）などの細胞由来の成分を含有する。いくつかの実施形態において、エクソソームは、エクソソームのレシピエントに対して同種、自己、異種、又は同系である供給源から得られる細胞から得ることができる。
【００３９】
特定の種類のＲＮＡ、例えば、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、エクソソームによって運ばれることが知られている。ｍｉＲＮＡは、多くの場合、標的メッセンジャーＲＮＡ転写物（ｍＲＮＡ）上の相補的な配列へ結合し、それによって、翻訳抑制、標的ｍＲＮＡの分解及び／又は遺伝子サイレンシングをもたらすことにより転写後調節因子として機能する。例えば、国際公開２０１４／０２８４９３に記載されているように、ｍｉＲ１４６ａは、ＣＤＣにおいて２５０倍を上回る発現増加を示し、ｍｉＲ２１０は、正常ヒト皮膚線維芽細胞から単離したエクソソームと比較して、約３０倍上方制御される。
【００４０】
カーディオスフェア及びＣＤＣに由来するエクソソームは、例えば、国際公開２０１４／０２８４９３に記載されており、この開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。エクソソームを調製する方法は、馴化培地中でカーディオスフェア又はＣＤＣを培養する工程、馴化培地から細胞を単離する工程、例えば、逐次遠心分離によってエクソソームを精製する工程、及び必要に応じて、密度勾配、例えば、スクロース密度勾配でエクソソームを清澄化する工程を含むことができる。場合によって、単離及び精製されたエクソソームは、カーディオスフェア又はＣＤＣの成分などの非エクソソーム成分を本質的に含まない。エクソソームは、０.０１〜１％のヒト血清アルブミンを含有する無菌ＰＢＳ緩衝液などの緩衝液に再懸濁することができる。エクソソームは、将来の使用のために凍結及び保存され得る。
【００４１】
エクソソームは、限定されないが、ＥｘｏＳｐｉｎ（商標）エクソソーム精製キット、インビトロゲン（登録商標）トータルエクソソーム精製キット、ＰｕｒｅＥｘｏ（登録商標）エクソソーム単離キット、及びＥｘｏＣａｐ（商標）エクソソーム単離キットなどの市販のキットを用いて調製することができる。幹細胞からエクソソームを単離する方法は、例えば、Ｔａｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ，２：２２６１４（２０１３）；Ｏｎｏら、Ｓｃｉ Ｓｉｇｎａｌ，７（３３２）：ｒａ６３（２０１４）及び米国出願公開第２０１２／００９３８８５号及び同第２０１４／０００４６０１号の中で見られる。カーディオスフェア由来細胞からエクソソームを単離する方法は、例えば、Ｉｂｒａｈｉｍら、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２：６０６−６１９（２０１４）の中で見られる。収集されたエクソソームは、当技術分野で公知の方法を用いて濃縮及び／又は精製することができる。具体的な方法は、超遠心分離、密度勾配、ＨＰＬＣ、親和性に基づく基質への付着、又はサイズ排除に基づく濾過を含む。
【００４２】
例えば、差動超遠心分離は、分泌されたエクソソームが培養細胞の上清から単離される主要技術となっている。このアプローチは、それらの比較的低い浮遊密度を利用することによって、非膜粒子からのエクソソームの分離を可能にする。サイズ排除は、生化学的に類似するが、生物物理学的に異なり、最大１０００ｎｍのより大きな直径を有する微小胞からのそれらの分離を可能にする。浮遊速度の違いは、さらに、異なるサイズのエクソソームの分離を可能にする。一般的に、エクソソームサイズは、４０〜１００ｎｍのサイズを含む、３０〜２００ｎｍの範囲の直径を有する。さらなる精製は、関心のある特定のエクソソームの特定の性質に依存し得る。これは、例えば、外細胞質方向又は外側の方向で特定の小胞を選択するために、目的のタンパク質との免疫吸着の使用を含む。
【００４３】
現在の方法、例えば、分画遠心法、不連続密度勾配、免疫親和性、限外濾過及び高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のうち、差分超遠心分離は、エクソソームの単離に最も一般的に使用される。この技術は、１００,０００×ｇでエクソソームペレットから中サイズの粒子及び大サイズの粒子と細胞デブリを分離するために、２０００×ｇ〜１０,０００×ｇへ遠心力を増加させることを利用する。一般的な夾雑物である様々なタンパク質凝集体、遺伝物質、培地からの微粒子及び細胞デブリを除去するには不十分であるが、遠心分離だけで、馴化培地からのエクソソームの顕著な分離／収集が可能になる。エクソソーム精製の強化された特異性は、限外濾過、又はショ糖密度勾配における平衡密度勾配遠心分離と組み合わせた逐次遠心分離を用いて、エクソソーム調製物のより高い純度（浮遊密度１．１〜１．２ｇ／ｍＬ）又は調製における別々の糖クッションの適用を提供し得る。
【００４４】
重要なことには、限外濾過を用いて、生物学的活性を損なうことなくエクソソームを精製することができる。より小さな粒子を除去するために、１００ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）などの異なる孔径を有する膜及びゲル濾過は、非中性ｐＨ又は非生理学的塩濃度の使用を回避するために使用されてきた。現在利用可能なタンジェンシャル流濾過（ＴＦＦ）システムは、スケーラブル（１０,０００Ｌ超）で、エクソソーム画分を精製するだけでなく、濃縮が可能であり、そのようなアプローチは、分画遠心法よりも時間がかからない。ＨＰＬＣはまた、エクソソームを均質にサイズ分類された粒子に精製し、調製物が生理的なｐＨ及び塩濃度で維持されるように、それらの生物学的活性を保つために使用することができる。
【００４５】
他の化学的方法は、沈殿技術のためのエクソソームの異なる溶解性、体積排除ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））への添加、おそらく、遠心分離又は濾過の組み合わせた追加ラウンドを利用する。この技術により調製されたペレットの再懸濁は困難であるかもしれないが、例えば、沈殿試薬、ＥｘｏＱｕｉｃｋ（登録商標）を馴化細胞培地に添加し、エクソソームの集団を素早く、迅速に沈殿させることができる。フローフィールドフローフラクショネーション（ＦｌＦＦＦ）は、巨大分子（例えば、タンパク質）とナノサイズからミクロサイズの粒子（例えば、細胞小器官及び細胞）を分離し、特徴づけるために使用され、培地からエクソソームを分画するためにうまく適用されてきた溶出ベースの技術である。
【００４６】
一般的な生化学的及び生物物理学的な特徴に依存するこれらの技術を上回って注目される技術は、関心のある特異的エクソソームを単離するために適用され得る。これには、特定のエクソソーム関連抗原の認識に対する抗体免疫親和性への依存が含まれる。説明したように、エクソソームはさらに、膜の表面で膜結合型受容体の細胞外ドメインを発現する。これは、共有抗原プロファイルに基づいて、それらの親細胞起源と関連してエクソソームを単離及び分離するための熟した機会を提供する。磁気ビーズ、クロマトグラフィーマトリックス、プレート又はマイクロ流体デバイスへの結合は、関心のある親細胞からのそれらの生成又は関連する細胞の調節状態に関連し得るので、関心のある特異的エクソソーム集団の単離を可能にする。他の親和性捕捉法は、エクソソームの表面上の特異的糖残基に結合するレクチンを使用する。
【００４７】
Ｅ）実施例
本発明を、さらに、以下の非限定的な実施例を参照して説明する。
【００４８】
実施例１：ＣＤＣ培養
ＣＤＣを、その開示が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１２／０３１５２５２号に記載されるように調製した。
【００４９】
簡単に説明すると、心臓生検を小さな断片に切り刻み、コラゲナーゼで、短時間で消化した。次いで、外植片を２０ｍｇ／ｍＬのフィブロネクチンコーティングディッシュ上で培養した。間質様扁平細胞及び位相差で明るい細胞が、組織断片から自然に成長し、２〜３週間でコンフルエントに達した。これらの細胞を、０.２５％トリプシンを用いて回収し、自己凝集カーディオスフェアを形成するために、２０ｍｇ／ｍＬのポリ−ｄ−リジンの懸濁液で培養した。ＣＤＣを、接着単層培養としてフィブロネクチンコーティングフラスコに播種し、カーディオスフェアを増殖させることによって得た。全ての培養物を、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、及び０.１ｍＬの２−メルカプトエタノールで補充したＩＭＤＭ基本培地を用いて、５％Ｏ２、５％ＣＯ２で、３７℃で維持した。ＣＤＣを、フィブロネクチンコーティングフラスコで１００％コンフルエンシーまで５継代増殖させた。
【００５０】
実施例２：ＣＤＣからのエクソソームの単離
ＣＤＣが所望のコンフルエンシーに達したとき、フラスコをＰＢＳで３回洗浄した。ＣＤＣを、無血清培地（ＩＭＤＭ）で処理し、１５日間、５％Ｏ２、５％ＣＯ２で、３７℃でインキュベートした。１５日後、２２５ｍＬのＢＤファルコンポリプロピレンコニカルチューブ（ＢＤ ３５２０７５−ブルートップ）に馴化培地を収集し、細胞及びデブリを除去するために（ペレットを乱さないように注意して）、４℃で２０分間、２，０００ｒｐｍで遠心分離した。馴化培地を、０.４５μｍの膜フィルターに通した。馴化培地を、遠心フィルターを用いて濃縮した。３ＫＤａのセントリコンプラス７０遠心フィルターを、１０〜２５ｍＬの分子グレードの水で予備洗浄し、１８℃で、５分間、３２２０ｇで遠心分離した。フィルターを洗浄した後、全ての残りの水を、フィルターに触れることなく注意深く除去した。１５ｍＬの馴化培地をフィルターに添加し、１８℃で４５分間、３２２０ｇで遠心分離した。最初のスピン後、残りの培地をピペッティングにより混合し、次いで、所望の濃度に達するまで再度遠心した。次いで、最終試料を０.２２μｍのシリンジフィルターに通した。Ｎａｎｏｓｉｇｈｔを用いた粒子計数のために、２５μＬの濃縮馴化培地を９７５μＬのＰＢＳで希釈した。濃縮馴化培地の別の１００μＬを用いて、タンパク質濃度を測定した。タンパク質を、ＤＣタンパク質アッセイを用いて定量した。場合によって、履歴データを用いて、遠心分離（ＵＦＣ）試料による限外濾過中のタンパク質の濃度を計算した。濃縮馴化培地を、直ちに用いるか、又は−８０℃で保存した。
【００５１】
実施例３：２５％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でのエクソソーム沈殿
２５％ＰＥＧの適切な量を、濾過した濃縮馴化培地に添加した。試料をオービタルシェーカー上で、１２〜１６時間、４℃でインキュベートした。インキュベーションが完了したら、試料を４℃で３０分間、１５００ｇで遠心分離した。ペレットを乱すことなく、上清を慎重に除去した。ペレットを、所望の量の無血清培地に再懸濁し、粒子計数のために採取した。
【００５２】
実施例４：ＣＤＣ−ＥＶ：１０ｋＤａ＆１０００ＫＤａの方法；ＭＳＣ−ＥＶ；Ｎｅｗｔ−ＥＶ
Ａ）１０ｋＤａ＆１０００ＫＤａの方法
１０ｋＤａ又は１０００ｋＤａの細孔サイズのフィルターを介して、ＥＶを含有するＣＤＣ馴化培地（ＣＭ）を濾過した後に、ＣＤＣ−ＥＶ（１０ｋＤａ又は１０００ｋＤａ）薬物物質を得る。分泌されたＥＶ及び濃縮ＣＭで構成される最終生成物をＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａで製剤化し、凍結保存する。
【００５３】
Ｂ）ＭＳＣ−ＥＶ
ヒト骨髄間葉系幹細胞（ＭＳＣ−ＥＶ）に由来する細胞外小胞を、ＣＤＣ−ＥＶ生成のための同様のプロセスに従って、１０ｋＤａの細孔サイズのフィルターを通してＥＶを含有するＭＳＣ ＣＭを濾過した後に得る。ＭＳＣ−ＥＶは、定義された無血清条件下で培養したヒトＭＳＣから得られる細胞を含まない濾過滅菌生成物である。分泌ＥＶ及び濃縮ＣＭで構成される最終生成物を、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａで製剤化し、凍結保存する。凍結された最終生成物は、解凍後に、直接結膜下注射に「すぐに使用できる」。
【００５４】
Ｃ）Ｎｅｗｔ−ＥＶ
ＣＤＣ−ＥＶ生成のための同様のプロセスに従って１０ｋＤａの細孔サイズのフィルターを通して、ＥＶを含有するＡ１細胞株ＣＭを濾過した後に、ｎｅｗｔ  Ａ１細胞株（Ｎｅｗｔ−ＥＶ）に由来する細胞外小胞を得る。Ｎｅｗｔ−ＥＶは、定義された無血清条件下で培養したＮｅｗｔ  Ａ１細胞から得られる細胞を含まない濾過滅菌生成物である。分泌ＥＶ及び濃縮ＣＭで構成される最終生成物を、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａで製剤化し、凍結保存する。凍結した最終生成物は、解凍後に、直接結膜下注射にすぐに使用できる。
【００５５】
実施例５：試験品及び対照品
試験品は、定義された無血清条件下で培養し、実施例１〜４に例示されるように調製したヒトＣＤＣから得られる細胞を含まない濾過滅菌生成物である。試験品の一般的な特徴を表２にまとめる。
【００５６】
表２
【表２】
2020518564.tif 000005
【００５７】
個々のエクソソームバイアルを４℃又は氷上で解凍した。各アリコートを完全に解凍した後、最初の投与前にマイクロピペット又は統合された針を有するインスリン／ハミルトン型注射器を用いて穏やかに（過剰な泡立ち／発泡を避け、６〜８回）混合した。
【００５８】
試験品及び対照品を、一晩又は投与日に投与のために解凍し、投与手順中、湿った氷上で維持した。
【００５９】
実施例６：全身ＧＶＨＤ動物モデル；研究設計；ＧＶＨＤの評価
レシピエントＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝４５、雄、６〜８週齢）及びドナーＣ５７ＢＬ／６（ｎ＝３０、雄、６〜１０週齢）を、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）から入手した。動物を、研究開始前に順応させた。この期間中、不良な状態を示した全てのものを除去するために、動物を毎日観察した。
【００６０】
研究を、７０±５°Ｆの温度及び５０％±２０％の相対湿度で、ＨＥＰＡフィルター済み空気を備えた動物室で行った。動物をケージ当たり１５匹のグループで収容した。動物室を、最低毎時１２〜１５回の空気交換を維持するように設定した。部屋に、１２時間のオン及び薄明りのない１２時間のオフの明／暗サイクルのための自動タイマーを設置した。無菌Ａｌｐｈａ−ｄｒｉ（登録商標）寝床を使用した。動物にＬａｂＤｉｅｔ ５０５３無菌齧歯類用の食事を与え、水を自由に摂取させた。
【００６１】
図１及び図５は、例えば、いくつかの変更を加えたＳｃｈｒｏｅｄｅｒ及びＤｉＰｅｒｓｉｏ，「移植片対宿主病のマウスモデル：進歩及び制限（Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｇｒａｆｔ−Ｖｅｒｓｕｓ−Ｈｏｓｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ：Ａｄｖａｎｃｅｓ ａｎｄ Ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ）」、Ｄｉｓｅａｓｅ Ｍｏｄｅｌｓ ＆ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，４：３１８−３３３（２０１１）；ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎら、「マウスにおける移植片対宿主病の二相病因（Ｔｗｏ−Ｐｈａｓｅ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ Ｇｒａｆｔ−Ｖｅｒｓｕｓ−Ｈｏｓｔ Ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ Ｍｉｃｅ）」、Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ２９：１５１−１５８（２００２）に基づいて、全身ＧＶＨＤの動物モデルを作製する方法を示している。１日目に、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、単一急性用量８グレイの全身照射（ＴＢＩ）に供した。０日目に、ＢＡＬＢ／ｃレシピエントに、３０ゲージ針を有する注射器を用いて、滅菌１×ＰＢＳ中２×１０６個の脾細胞と５×１０６個のＴ細胞除去（ＣＤ３−）骨髄細胞の組み合わせの静脈注射を尾静脈に施した。骨髄（ＢＭ）及び脾臓細胞（ＳＣ）を、ドナー雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスから得た。骨髄細胞を、標準的なフラッシング法を使用して単離し、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ（１３０−０９３−０２１）のＣＤ３−ビオチンキットと共に細胞表面のＴ細胞抗原ＣＤ３を用いてＴ細胞を除去した。レシピエント動物を、それぞれ１５匹ずつの３つのグループに無作為化した。
【００６２】
１日目から８日目までのＴＢＩに続いて、全ての動物に、ケージの床上の皿の中に補足用の高カロリーで、非常に好ましい食べ物を与えた。０日目に移した後、次いで再び、必要に応じて、全ての動物に、皮下注射による補足流体（加温したリンゲル液）を１ｍＬ／動物／日で与えた。追加の１ｍＬの流体を、必要に応じて、午後に与えてもよい。−１５％を超えて体重が減少した全ての動物を、非常に好ましい、柔らかい食物及び皮下注射による１ｍＬの補足流体（加温したリンゲル溶液）を与えた。
【００６３】
表３に詳述され、かつ図５に示すように、動物にビヒクル又は試験品を投与した。
【００６４】
表３
【表３】
2020518564.tif 000006
【００６５】
試験期間中毎日、処置群間の可能性のある差異並びにＧＶＨＤの重症度及び／又は治療に起因する毒性の可能性の指標として評価するために、各動物を秤量し、その生存を毎日記録した。出発重量の３０％超を失った全ての動物を安楽死させた。
【００６６】
ＧＶＨＤの臨床スコアを、表４に詳述した標準的なスコアリングシステムによって評価されるように、全研究期間中に週２回取得し、全体的なＧＶＨＤスコアは、５つの基準：最大指数＝１０の重量変化の割合、図２Ａ〜Ｃに例示したような姿勢（ハンチング）、図３Ａ〜Ｃに例示したような毛の質感、及び図４Ａ〜Ｃに例示したような皮膚の完全性に基づいていた。
【００６７】
表４
【表４】
2020518564.tif 000007
【００６８】
全ての動物を、少なくとも５４日間経過観察した。研究の終わりに、全ての生存動物を、ＣＯ２の過剰投与により屠殺し、表４に詳述した器官を摘出した。屠殺時に、Ｋ２ＥＤＴＡチューブへの後眼窩採血により採取した。血液を遠心分離し、血漿を収集し、瞬間凍結し、さらにその後の分析のために−８０℃で保存した。屠殺時に、肝臓を摘出し、長期保存のために７０％エタノールに移す前に、尾状葉を２４時間ホルマリン中に直接入れた。屠殺時に、肺及び心臓を一括除去し、肺を心臓の右心室を通じてホルマリンで灌流した。左（非小葉）肺を除去し、長期保存のために７０％エタノールに移す前に、２４時間ホルマリン中に直接入れた。
【００６９】
実施例７：結果の評価＆生存中の監視
Ａ）統計分析
パラメトリックデータ（体重変化、生着）を、ビヒクル対照群と全てのグループを比較するために、Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ多重比較検定と共に一方向ＡＮＯＶＡを用いて評価した。ノンパラメトリックデータ（ＧＶＨＤスコア）を、Ｄｕｎｎの事後検定と共にクラスカル・ウォリスで分析した。全ての統計分析を、グラフパッドプリズム６．０１ソフトウェア（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて行った。統計的有意性は、ｐ＜０.０５の場合に達成された。
【００７０】
Ｂ）ＧＶＨＤスコア
表４及び図７Ａに示すマルチパラメータＧＶＨＤスコアリングシステムを使用して評価した場合、脾細胞及び骨髄細胞の静脈内注射は全ての動物においてＧＶＨＤを誘発した。図７Ａに示すように、全体的なＧＶＨＤスコアの減少が、ＣＤＣ−ＥＶを投与した両方のグループで観察され、個々のＧＶＨＤパラメータ（姿勢、活動、毛の質感、皮膚の完全性）を図８Ａ〜Ｄにまとめる。
【００７１】
あまりにも多くの体重（ＩＡＣＵＣプロトコルあたり３０％以上）を失っていたので、動物を安楽死させることを余儀なくされた場合は、死んだ動物のデータが含まれるように、最後の観察をその後のデータポイントへと進めた。
【００７２】
図７Ｂを参照して、統計的検定によりグループの効果的な比較を可能にするために、ＡＵＣを計算した。
【００７３】
Ｃ）体重変化
図６Ａに示すように、脾細胞及び骨髄細胞の静脈内注射は、全ての動物において体重減少を誘導し、研究の終わりまで、増減の変化が観察された。２１日目の投与の開始後、全ての動物は体重の減少を示し続け、３３日目ごろにピークに達し、４０日目くらいまでに部分的に回復した。ＣＤＣ−ＥＶの低用量又は高用量のいずれかを投与した動物は、５４日目の研究終了時まで一般的な体重増加を経験し続けたが、ビヒクル単独で処置した動物は、体重を減らし続けた。実際、ビヒクル処置動物は、それらの多くが死亡すると予想された研究の終わりに向かって非常に多くの体重を失っていった。
【００７４】
あまりにも多くの体重（ＩＡＣＵＣプロトコルあたり３０％以上）を失っていたので、動物を安楽死させることを余儀なくされた場合は、死んだ動物のデータが含まれるように、最後の観察をその後のデータポイントへと進めた。
【００７５】
図６Ｂを参照して、統計的検定によりグループの効果的な比較を可能にするために、ＡＵＣを計算した。
【００７６】
Ｄ）生存
図９に示すように、研究期間中、全ての動物について生存を追跡し、生存率をプロットし、低用量及び高用量の両方のＣＤＣ−ＥＶで処置すると、生存に有益な効果をもたらすように思われた。
【００７７】
Ｅ）血便＆下痢の発症
血便及び下痢の発症を試験の全期間追跡した。研究中のいかなる時点でも、血便の発症はなかった（データは示さず）。図１０Ａ〜Ｂに示すように、高用量のＣＤＣ−ＥＶでの処置は下痢の発症を減少させるように思われたが、ＣＤＣ−ＥＶでの処置の結果として、下痢の発症における劇的な効果は観察されなかった。
【００７８】
Ｆ）眼の炎症
５４日目に屠殺する直前に、眼の炎症を評価し、スコア化し、１％フルオレセインナトリウムの滴を各眼に適用し、次いで、眼を生理食塩水で洗い流し、拡大下で、コバルト青色光で角膜の蛍光を見た。マスクされた／盲検の観察者に、目に見られる角膜フルオレセイン染色の程度に基づいて、各動物の各眼に、次のような０〜４のスコア：０＝染色なし；０.５＝微量の点状染色；１＝点状染色；２＝角膜表面積の２５％までの染色；３＝角膜表面積の５０％までの染色；４＝５０％超の角膜表面染色を割り当てた。各眼のスコアを平均化して、各グループの「眼スコア」を得た。図１１Ａ〜Ｃは、ＣＤＣ−ＥＶ処置群において眼のスコアがより低い傾向（したがって、より少ない角膜染色、眼の炎症が減少した兆候）があったが、高用量で処置した動物は、さらにより良好であったことを示す。
【００７９】
実施例８：組織病理学的検査
表３に記載したグループ１〜３の動物からの１４種のマウス結腸試料及び１４種のマウスの眼を、病理組織学的検査のために日常的な方法で処理した。ブロックごとに１つのスライドを切断し、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色するか、又は組織構造及び炎症性浸潤の顕微鏡分析をした。ガラススライドを、委員会認定の獣医病理学者が光顕微鏡を用いて評価した。結腸を定性的に評価し、表５〜８に列挙した組織病理学的基準に従って、炎症、浮腫、粘膜びらん、及び杯細胞枯渇についてスコア化した。所定のスライド上の長手方向セクションの各々をスコア化した。平均スコアを計算し、各パラメータについて報告した。また、平均合計スコアを、炎症、浮腫、粘膜壊死、及び杯細胞枯渇の合計として計算した。
【００８０】
表５
【表５】
2020518564.tif 000008
表６
【表６】
2020518564.tif 000009
表７
【表７】
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表８
【表８】
2020518564.tif 000011
【００８１】
各特徴のスコアを合計して、合計大腸炎スコア（範囲０〜１６）を得た。この採点方式で扱われていない結腸の組織学的病変及び眼部における病変を、０＝存在しない、１＝最小、２＝軽度、３＝中程度、４＝顕著、５＝重度の０〜５に半定量的にスコア化した。例えば、Ｃｒｉｓｓｍａｎら、「最良の実施のガイドライン：毒性病理（Ｂｅｓｔ Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ：Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）」、Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｐａｔｈｏｌ，３２：１２６−３１（２００４）を参照されたい。
【００８２】
Ａ）結腸
マウスにおけるＧＶＨＤ性大腸炎の予想される組織学的病変には、主に大腸粘膜における単核炎症；浮腫による粘膜下層及びリンパ管の拡張；浸食及び好中球の浸潤の有無にかかわらず、上皮損傷又は粘膜壊死；並びに杯細胞の枯渇が含まれた。例えば、Ｅｉｇｅｎｂｒｏｄｔら、「ヒト大腸ＧＶＨＤ及び炎症性腸疾患とのマウス結腸移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の組織学的類似性（Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃ  Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｏｆ Ｍｕｒｉｎｅ Ｃｏｌｏｎｉｃ Ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ Ｄｉｓｅａｓｅ （ＧＶＨＤ） ｔｏ Ｈｕｍaｎ Ｃｏｌｏｎｉｃ ＧＶＨＤ ａｎｄ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｂｏｗｅｌ Ｄｉｓｅａｓｅ）」、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ，１３７：１０６５−７６（１９９０）を参照されたい。さらに予想される病変には、リンパ神経膠細胞集合、上皮細胞アポトーシスを有する結腸腺へのリンパ球の浸潤；腺伸長、好塩基球増加症及び有糸分裂指数の増加によって特徴付けられる上皮過形成；並びに亜急性炎症を伴う腸間膜脂肪壊死、結腸隣接腸間膜への好中球、マクロファージ及びより少ないリンパ球及び形質細胞の浸潤が含まれた。
【００８３】
図１２〜１３に示すように、試験品の低用量グループ（グループ２）における粘膜壊死及び杯細胞枯渇のスコアの減少は、未処置グループ（グループ１）と比較して減少した合計スコアをもたらした。
【００８４】
Ｂ）眼
ＧＶＨＤを有するマウスからの眼における予想される組織学的病変には、上皮細胞の空胞化及び／又はアポトーシスを同時に伴う角膜上皮への少数のリンパ球の浸潤によって特徴付けられるリンパ神経膠細胞集合が含まれ、潰瘍に進行する角膜上皮の壊死が１つの試料中に存在していた。例えば、Ｐｅｒｅｚら、「眼の移植片対宿主病における角膜縁損傷（Ｌｉｍｂｕｓ Ｄａｍａｇｅ ｉｎ Ｏｃｕｌａｒ Ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−Ｈｏｓｔ−Ｄｉｓｅａｓｅ）」、Ｂｉｏｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，１７：２７０−２７３（２０１１）を参照されたい。角膜の亜急性炎症は、間質浮腫又は不定期の間質壊死病巣を伴う、角膜間質及び／又は上皮への好中球、リンパ球又は組織球の浸潤によって特徴付けられた。新生血管形成は、角膜間質への血管の内部成長によって特徴づけられた。亜急性炎症はまた、角膜縁、結膜（存在する場合）及び虹彩又は前房を含む前部ブドウ膜に観察された。石灰化は、角膜間質内又は角膜上皮（上皮下）のすぐそばのサブ基底ゾーンに見られた。レンズ上皮の後方移動及び崩壊並びに気泡細胞形成によって特徴付けられるレンズ繊維変性（白内障形成）が同様に観察された。
【００８５】
図１５に示すように、リンパ球神経膠細胞集合、角膜及び前ブドウ膜亜急性炎症及び血管新生スコアは、グループ１（未処理）において最も重篤であった。試験品処置動物（グループ２及び３）においてこれらの病変はより低いスコアか、又は全くなかった。
【００８６】
実施例９：ＣＤＣ由来細胞外小胞（ＣＤＣ−ＥＶ）のＴ細胞との相互作用
本研究の目的は、Ｔ細胞の調節と関連するＣＤＣ−ＥＶの免疫学的活性を決定することであった。
【００８７】
ＣＤＣ−ＥＶ＆免疫表現型の特徴付け
図１６については、有益なエクソソームマーカー発現を、ウェスタンブロット法を用いるＣＤＣ−ＥＶによって分析した。ＣＤＣ−ＥＶ（２０μｌ＝１０μｇ）を、ＲＩＰＡ緩衝液を用いて溶解し、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードし、次いで、ニトロセルロース膜に移した。膜を５％のＢＳＡでブロッキングし、次いで、ＨＳＰ７０、ＣＤ８１、ＣＤ６３、ＡＬＩＸ、ＨＬＡ ＩＩ及びβアクチンに特異的な抗体とハイブリダイズした。ＣＤＣ及び樹状細胞（ＤＣ）溶解物並びにエクソソームを含まない上清（ＳＮ）を対照として使用した。ＣＤＣ−ＥＶは、予想されるエクソソームマーカーＣＤ８１、ＣＤ６３及びＡＬＩＸを発現したが、ＳＮが完全に陰性であった。
【００８８】
ＣＤＣ−ＥＶを、次に、免疫関連マーカーの表面発現について分析した。ＣＤＣ−ＥＶ（３０μｌ＝１５μｇ）を、５μＬのラテックスビーズ（４μｍ）に連結した。抗体又はビーズとこれらのＥＶ／ビーズの最終的な非特異的結合を阻止するために、ＣＤＣ−ＥＶ／ビーズを１００ｍＭのグリシン及び２％ＢＳＡ緩衝液で連続的に処理した。洗浄後、ＥＶ／ビーズを関連する免疫分子に対する特異的抗体で染色し、Ｃａｎｔｏ ＩＩ ＢＤ Ｆａｃｓにてデータ取得し、フロージョー（ＦｌｏｗＪｏ）ソフトウェアによって分析した。同量のそれぞれの抗体とインキュベートしたビーズを対照として使用した。
【００８９】
ビーズ−抗体対照と比較して、ＣＤＣ−ＥＶは、ＨＬＡクラスＩ分子及びＣＤ８６を発現するが、ＨＬＡ ＩＩ及びＣＤ８０分子について陰性であった。ＣＤＣ−ＥＶは、ＩＣＯＳ−Ｌではなく、共刺激ＰＤ−Ｌ１分子を発現するように思われる。ＮＫ活性化受容体リガンドは、ＣＤＣ−ＥＶ上で著しく発現した。図１７については、ＥＶマーカーのＣＤ８１とＣＤ６３の両方の有意な発現が検出された。
【００９０】
同種ＥＶに応答する間接的なＴ細胞の活性化及び増殖
単球を、２つの異なる健康なドナーから取得した血液試料から単離した。単離した単球をＧＭ−ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ４（２０ｎｇ／ｍｌ）の組み合わせで６日間刺激し、ＤＣに分化させた。ＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ４での単球の分化は、ＨＬＡ ＩＩ、ＣＤ８０、及びＣＤ８６の分子の適度な発現、ＣＤ１６（単球／マクロファージのマーカー）の欠如、及びＴＬＲ−２の低発現によって特徴付けられる未成熟ＤＣ（ｉＤＣ）を生成する。次いで、これらの単球由来のｉＤＣをＨＬＡミスマッチＣＤＣ−ＥＶと一晩インキュベートした。
【００９１】
ＥＶと培養したｉＤＣは、成熟ＤＣ（ｍＤＣ）の特徴を示した。それらは、それらのＨＬＡ ＩＩ、ＣＤ８０及びＣＤ８６分子を上方制御し、図２８に示すように、ｍＤＣ特性として認識される。次いで、１×１０４個のｉＤＣ又はＥＶと接触したｉＤＣ（ｉＤＣ−ＥＶ）を、さらに６日間、Ｕ底９６ウェルプレート中で自己Ｔ細胞（１×１０５）と共培養した。自己Ｔ細胞をｉＤＣ又はｉＤＣ−ＥＶと共培養し、ＣＤ６９及びＨＬＡ−ＤＲの発現について、並びにそれらの増殖について分析した。図２９に示すように、２つの異なるドナーからのＴ細胞の応答は様々であったが、全体として、ｉＤＣ−ＥＶは、ｉＤＣ単独よりもＴ細胞を活性化し、その増殖を誘導するのにより強力であった。
【００９２】
直接的なＣＤＣ−ＥＶ誘導性Ｔ細胞増殖と比較して、間接的なＣＤＣ−ＥＶ誘導性Ｔ細胞の増殖の程度はかなりより高い。
【００９３】
成熟ＤＣ（ｍＤＣ）によって提示されたときの、Ｔ細胞を刺激するＣＤＣ−ＥＶの能力を評価した。ｍＤＣは非常に低い貪食活性を有することを考慮すると、ＥＶの適切な摂取を保証するために、アポトーシス小体を貪食した以前の経験に基づいて、ＤＣの成熟は、認められたＤＣ成熟の誘導物質であるＩＦＮγ（５００ＩＵ／ｍｌ）でｉＤＣ及びｉＤＣ−ＥＶを一晩処理することによって誘導された。ｉＤＣと比較して、これらのｍＤＣは、ＨＬＡ ＩＩ、ＣＤ８０及びＣＤ８６のより高い発現、並びにＴＬＲ−２のより高い発現を示し、これらはｍＤＣの既知の特徴である。図３０に示すように、ｉＤＣがｍＤＣに成熟する間、ＣＤＣ−ＥＶが存在すると、さらに、ＨＬＡ ＩＩ、ＣＤ８６、ＣＤ８０、及びＴＬＲ−２分子は上方制御された。
【００９４】
次いで、ｍＤＣ又はｍＤＣ−ＥＶを、Ｕ底９６ウェルプレート中、又は６日間、自己Ｔ細胞（１×１０５）と共培養し、それらの活性化（ＣＤ６９及びＨＬＡ−ＤＲの発現）並びに増殖を分析した。
【００９５】
再び２つのドナーからの応答は様々であったが、全体として、ｍＤＣ−ＥＶは、ｍＤＣ単独よりもＴ細胞を活性化し、その増殖を誘導するのにより強力であった。ｉＤＣ−ＥＶ誘導性応答と比較して、同一のドナーについてのｍＤＣ−ＥＶ誘導性Ｔ細胞活性化及び増殖はより高かった。
【００９６】
Ｔ細胞の活性化及び増殖の点で発明者らの結果をまとめると、弱い直接的な活性化が観察されたので、直接経路を展開することなく、主に間接的な経路を介して、ＣＤＣ−ＥＶはＴ細胞を活性化し、その増殖を誘導することができることが示唆される。
【００９７】
Ｔ細胞によるＣＤＣ−ＥＶのインビトロ取り込み
ＣＤＣ−ＥＶの取り込みについてのＴ細胞の能力をインビトロで評価した。ヒトＣＤＣ−ＥＶを、膜色素ＤｉＤを用いて蛍光標識し、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ、クローンＥ６−；ＡＴＴＣ（登録商標）ＴＩＮ−１５２（商標））に添加した。取り込みを、ＥＶを添加した１時間後、４時間後、又は一晩フローサイトメトリーによって測定した。試験したＪｕｒｋａｔＴ細胞は、試験した異なる時点でＤｉＤ蛍光について陽性であり、それらがＣＤＣ−ＥＶを取り込むことが示された（図１８）。
【００９８】
ＣＤＣ−ＥＶによる免疫調節
次いで、同種設定で進行中の免疫応答を調節するＣＤＣ−ＥＶの能力を調査した。この目的のために、図１９に示すように、Ｕ底９６ウェルプレート中で、ＨＬＡミスマッチ非分画ＣＦＳＥ標識ＰＢＭＣ（１×１０５）を様々な用量のＣＤＣ−ＥＶの非存在下又は存在下で、ＰＨＡ（１μｇ／ｍｌ）で刺激し（上のパネル）、同種のＴ細胞増殖を、ＣＦＳＥを監視することによって評価した。ＣＤＣ−ＥＶは、ＰＨＡ誘導性ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を下方制御することができた。図１９に示すように、Ｔ細胞増殖のＣＤＣ−ＥＶ誘導性下方制御は用量依存的であり、使用した最高用量（２０×１０９粒子）で、ＣＤＣ−ＥＶは、それらの親細胞よりも、進行中の応答を下方制御するのにより強力であった。
【００９９】
同じ実験設定で、ＰＢＭＣの代わりに、精製したＣＤ３＋ Ｔ細胞を使用した場合に、同様の結果が得られたので、ＣＤＣ−ＥＶ誘導性免疫調節は直接的な効果を介する可能性がある。図２０に示すように、実際に、ＣＤＣ−ＥＶは、２つの異なるドナーから得られたＴ細胞上でＣＤＣ６９及び／又はＨＬＡ−ＤＲのＰＨＡ誘導性発現を下方制御することができた。
【０１００】
図２１については、ＣＤＣ−ＥＶによるＴ細胞活性化マーカーの下方調節が、ＰＨＡ誘導性ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞増殖の顕著な下方制御をもたらした。
【０１０１】
図２２については、ドナー間の変動にもかかわらず、２つだけのドナーを用いて得られた結果の範囲内で、ＣＤＣ−ＥＶは強力な免疫調節因子である。
【０１０２】
免疫調節を誘導するＣＤＣ−ＥＶの能力のこれらの研究から、それらが強力な免疫調節因子であることが実証された。
【図１】
2020518564.tif 000012
【図２Ａ】
2020518564.tif 000013
【図２Ｂ】
2020518564.tif 000014
【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2020518564.tif 000017
【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
2020518564.tif 000019
【図４Ｂ】
2020518564.tif 000020
【図４Ｃ】
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【図５】
2020518564.tif 000022
【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
2020518564.tif 000026
【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
2020518564.tif 000028
【図８Ｃ】
2020518564.tif 000029
【図８Ｄ】
2020518564.tif 000030
【図９】
2020518564.tif 000031
【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
2020518564.tif 000033
【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
2020518564.tif 000037
【図１３】
2020518564.tif 000038
【図１４】
2020518564.tif 000039
【図１５】
2020518564.tif 000040
【図１６】
2020518564.tif 000041
【図１７】
2020518564.tif 000042
【図１８】
2020518564.tif 000043
【図１９】
2020518564.tif 000044
【図２０】
2020518564.tif 000045
【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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2020518564.tif 000049