(57)【要約】  本発明は、リポソームおよびリポペプチドを含む組み換え帯状疱疹ワクチン、ならびにこれを調製するための方法に関する。ことさらには、本発明によるワクチン組成物は、リポソームおよび多様な種類のリポペプチド、ならびに水痘帯状疱疹ウイルスｇＥ抗原、日本脳炎ウイルスｇＥ抗原または季節性不活性型インフルエンザウイルス抗原を含む複合アジュバントであるＬｉｐｏ−Ｐａｍを用いて調製され、細胞媒介性免疫応答ならびに体液性免疫応答を高度に誘導し、したがって、本発明の組成物は、商業的に有用であり得る。
2020531579.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性成分としてリポペプチド挿入リポソームを含む、ワクチンアジュバント。
【請求項２】
リポペプチドが、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫ、Ｐａｍ３−ＣＳＫＫＫＫ、ＰＨＣ−ＳＫＫＫＫ、Ｏｌｅ２ＰａｍＣｙｓ−ＳＫＫＫＫ、Ｐａｍ２Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫ、ＰａｍＣｙｓ（Ｐａｍ）−ＳＫＫＫＫ、Ｏｌｅ２Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫ、Ｍｙｒ２Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫ、ＰａｍＤｈｃ−ＳＫＫＫＫ、Ｐａｍ−ＣＳＫＫＫＫ、Ｄｈｃ−ＳＫＫＫＫおよびＦＳＬ−１からなる群より選択されるいずれか１つ以上である、請求項１に記載のワクチンアジュバント。
【請求項３】
免疫活性物質をさらに含む、請求項１に記載のワクチンアジュバント。
【請求項４】
免疫活性物質が、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、ＱＳ２１、ＭＰＬＡ（モノホスホリルリピドＡ）、ＣｐＧおよびフラゲリンからなる群より選択されるいずれか１つ以上である、請求項３に記載のワクチンアジュバント。
【請求項５】
Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）が、５０〜５，０００ｂｐの長さである、請求項４に記載のワクチンアジュバント。
【請求項６】
請求項１に記載のアジュバントおよび抗原を含む、ワクチン組成物。
【請求項７】
抗原が、病原体のタンパク質、組み換えタンパク質、糖タンパク質、ペプチド、多糖、リポ多糖またはポリヌクレオチドである、請求項６に記載のワクチン組成物。
【請求項８】
抗原が、細胞またはウイルス由来のものである、請求項６に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
抗原が、水痘帯状疱疹ウイルスｇＥ（糖タンパク質Ｅ）抗原、日本脳炎ウイルスｇＥ（糖タンパク質Ｅ）抗原および季節性不活性型インフルエンザウイルス抗原からなる群より選択されるいずれか１つ以上である、請求項６に記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
ワクチンが、細胞媒介性免疫応答を誘導する、請求項６に記載のワクチン組成物。
【請求項１１】
ワクチンが、Ｔｈ１免疫応答を誘導する、請求項６に記載のワクチン組成物。
【請求項１２】
活性成分として請求項６に記載のワクチン組成物を含む、ウイルス感染のための予防または治療剤。
【請求項１３】
活性成分として請求項６に記載のワクチン組成物を含む、がんのための予防または治療剤。
【請求項１４】
請求項６に記載のワクチン組成物を対象に投与するステップを含む、ウイルス感染のための予防または治療方法。
【請求項１５】
請求項６に記載のワクチン組成物を対象に投与するステップを含む、がんのための予防または治療方法。
【請求項１６】
ウイルス感染のための予防または治療剤を調製するために使用するための、請求項６に記載のワクチン組成物の使用。
【請求項１７】
がんのための予防または治療剤を調製するために使用するための、請求項６に記載のワクチン組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
１．発明の分野
本発明は、活性成分としてリポペプチド挿入リポソームを含むワクチンアジュバント、およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
２．関連技術の説明
水疱または帯状疱疹は、ＶＺＶ（水痘帯状疱疹ウイルス）により引き起こされ、単一の脊髄または脳神経の感覚神経において分布して皮膚上で発症する疾患である。ＶＺＶ感染の初期段階においては、ウイルスは、皮膚の表皮および真皮において増殖し、次いで周囲の神経細胞中に浸透し、潜伏し続ける。増殖のプロセスにおいて、潜伏期の前に水疱が発生して発疹が生じ、その後、ウイルスは神経節において潜伏し続ける。身体の耐性が低下すると、ＶＺＶは再活性化し、帯状疱疹の形態において現われる。ＶＺＶの再活性化および帯状疱疹の発症は、特に高齢者および免疫抑制剤処置を受けている者において、Ｔ細胞を中心とする細胞性免疫応答の低下と関連する。帯状疱疹が発症すると、水泡性病変が現れ、病変が回復した場合であっても、神経痛が後効果として残る。神経痛は、いったん発症すると、治癒させることが困難であり、重篤な疼痛に起因する低いクオリティ・オブ・ライフを引き起こす。
【０００３】
ＶＺＶに感染し、初期応答が無視される場合、それは潜伏し続け、最終的にＶＺＡが再活性化されて、重篤な疼痛を伴う帯状疱疹を引き起こす。この場合、抗ウイルス剤を一般に投与するが、身体において潜伏期の間に耐性を有している可能性が高いＶＺＶの死滅または不活化を誘導することは困難である。
【０００４】
ＶＺＶのための抗ウイルス剤として、アシクロビル、germinated cyclofam、ファムシクロビルなどが挙げられ、そのうち、アシクロビルが最も商品化されている。しかし、アシクロビルは、水疱発疹の２４時間以内に投与される場合にのみ、有効である。言い換えれば、アシクロビルは、ウイルス感染または水疱発疹の２４時間後、またはＶＺＶの再活性化により引き起こされる帯状疱疹の発症の後に投与された場合には、抗ウイルス剤として有効ではない。
【０００５】
高齢者および免疫抑制剤の患者の数が増加するにつれて、韓国において、帯状疱疹の発生率は、迅速に増大する。しかし、根本的な処置が存在しないので、それを予防するためにワクチンを開発することが必要である。
【０００６】
市販の帯状疱疹ワクチンは、臨床治験においてその効率について証明されているが、帯状疱疹発生率は、ワクチンの投与により５０％しか低下しておらず、このことは、それがあまり効力を有さないことを示している。加えて、市販の帯状疱疹ワクチンは、弱毒化生ワクチンであるため、ワクチンは、帯状疱疹の高い発生率により、免疫抑制剤の患者、妊婦、および妊娠する可能性があるものへの投与において限定要因を有する。帯状疱疹ウイルスは、神経節において潜伏し続け、帯状疱疹は、身体の耐性が低下した場合にＶＺＶの再活性化により発症するので、体液性免疫応答よりも細胞媒介性免疫応答を誘導することがより重要である。したがって、有効かつ安全であって、細胞媒介性免疫応答を誘導することができる、帯状疱疹ワクチンを開発することが必要である。
【０００７】
抗原の分子パターンは、免疫応答の結果に影響を及ぼす。このことは、いくつかの型の病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）リガンド（リポ多糖、核酸、リポタンパク質またはタンパク質など）の混合物である病原性微生物全体が抗原として用いられる場合に、特に重要である。抗原提示細胞の表面上の病原体認識受容体（ＰＲＲ）は、ＰＡＭＰを認識して多様な共刺激分子およびサイトカインを誘導するためのシグナルを促進することにより誘導される型の免疫応答に関与する。例えば、インターフェロンガンマおよびＩＬ−１２は、ウイルス感染に対する免疫応答のために重要なＴｈ１細胞応答を誘導する。Ｔｈ１型免疫応答は、より多くのＩｇＧ２ａまたはＩｇＧ２ｂ産生および強力な細胞媒介性免疫応答を誘導する。
【０００８】
このことに関して、韓国特許第１０−１７２３６０５号は、ＶＺＶのタンパク質をコードするＶＺＶ由来遺伝子の挿入部位を含むプラスミドを含む、帯状疱疹を予防および処置するためのＤＮＡワクチン組成物を記載し、韓国特許出願番号１０−２０１４−００２２７９９は、韓国人患者から単離されたＶＺＶ  ＭＶＡ０６のゲノムＤＮＡおよびそのオープンリーディングフレームによりコードされるタンパク質を含む、水疱および帯状疱疹のワクチン組成物を記載する。
【０００９】
したがって、本発明者らは、安全であり、かつ、体液性免疫応答のみならず細胞媒介性免疫応答をも誘導する帯状疱疹ワクチンを開発するために研究してきた。研究の過程において、本発明者らは、Ｐａｍ３−ＣＳＫＫＫＫ（Ｐａｍ３ＣＳＫ４）リポペプチドおよび脂質を含むリポソーム型複合アジュバントであるＬｉｐｏ−ｐａｍを調製し、調製されたアジュバント中にＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）および抗原を含むワクチン組成物は、低分子組み換えタンパク質抗原に対して、体液性免疫応答のみならず細胞媒介性免疫応答をも高度に誘導することを確認した。本発明者らはまた、Ｐａｍ３−ＣＳＫＫＫＫ、Ｄｈｃ−ＳＫＫＫＫ、ＰａｍＤｈｃ−ＳＫＫＫＫなどの多様なリポペプチド、または水痘帯状疱疹ウイルスのｇＥ（糖タンパク質Ｅ）抗原、ならびに日本脳炎ウイルスまたは季節性不活性型インフルエンザウイルス抗原のｇＥ（糖タンパク質Ｅ）抗原を用いて調製された本発明のワクチン組成物は、顕著な効果を示すことを確認した。したがって、本発明のアジュバントを含むワクチン組成物が、リポペプチドの型および抗原を限定することなく、商業的に有効に用いることができることを確認することにより、本発明を完成した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】韓国特許第１０−１７２３６０５号
【特許文献２】韓国特許出願番号１０−２０１４−００２２７９９
【発明の概要】
【００１１】
発明の要旨
活性成分としてリポペプチド挿入リポソームを含む、ワクチンアジュバント、これを含むワクチン組成物、およびその使用を提供することが、本発明の目的である。
【００１２】
上の目的を達成するために、本発明は、活性成分としてリポペプチド挿入リポソームを含む、ワクチンアジュバントを提供する。
本発明はまた、本発明のアジュバントおよび抗原を含む、ワクチン組成物を提供する。
本発明はまた、活性成分として本発明のワクチン組成物を含む、ウイルス感染のための予防または治療剤を提供する。
【００１３】
加えて、本発明は、活性成分として本発明のワクチン組成物を含む、がんのための予防または治療剤を提供する。
加えて、本発明は、本発明のワクチン組成物を対象に投与するステップを含む、ウイルス感染のための予防または治療方法を提供する。
加えて、本発明は、本発明のワクチン組成物を対象に投与するステップを含む、がんのための予防または治療方法を提供する。
【００１４】
加えて、本発明は、ウイルス感染のための予防または治療剤を調製するために使用するための、本発明のワクチン組成物の使用を提供する。
加えて、本発明は、がんのための予防または治療剤を調製するために使用するための、本発明のワクチン組成物の使用を提供する。
【００１５】
有利な効果
本発明の脂質およびリポペプチドを含む複合アジュバントであるＬｉｐｏ−Ｐａｍを含むワクチン組成物は、細胞媒介性免疫応答のみならず体液性免疫応答をも高度に誘導し、水痘帯状疱疹ウイルスのｇＥ抗原ならびに日本脳炎ウイルスまたは季節性不活性型インフルエンザウイルス抗原のｇＥ抗原を用いることにより調製されたワクチン組成物は、顕著な効果を示した。したがって、本発明の組成物は、商業的に有効に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、ＶＺＶのｇＥ遺伝子がｐＰＧＸＩＩベクター中に導入されたｐＰＧＸＩＩ−ＶＺＶｇＥプラスミドの生成を説明する模式図である。
【図２】図２は、組み換えＶＺＶｇＥ抗原の精製ステップ（Ａ）および最終的な精製された組み換えＶＺＶｇＥ抗原（Ｂ）により行われたＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を説明する図のセットである。Ｍは、サイズをチェックするためのマーカーであり、１は細胞培養培地であり、２は、ブチル−セファロースクロマトグラフィー溶離液であり、３は、ＤＥＡＥ−セファロースクロマトグラフィー溶離液であり、４は、ＣＨＴクロマトグラフィー溶離液であり、５は、ＳＰ−セファロースクロマトグラフィー溶離液であり、６は、濃縮−脱塩ろ過後を意味する。
【図３】図３は、ＶＺＶｇＥ抗体価（Ａ）および抗体アイソタイプ（Ｂ）を、リポソームの調製方法およびリポソーム中に含まれる構成成分の比率により比較するグラフのセットである。
【図４Ａ】図４は、組み換えワクチンのＶＺＶ組み換えｇＥ抗原について、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４のＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果（Ａ）ならびにＩＦＮ−γ、ＩＬ−４およびＴＮＦ−αのＥＬＩＳＡアッセイの結果（Ｂ）を、リポソームの調製方法およびリポソーム中に含まれる構成成分の比率により比較するグラフのセットである。
【図４Ｂ】図４は、組み換えワクチンのＶＺＶ組み換えｇＥ抗原について、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４のＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果（Ａ）ならびにＩＦＮ−γ、ＩＬ−４およびＴＮＦ−αのＥＬＩＳＡアッセイの結果（Ｂ）を、リポソームの調製方法およびリポソーム中に含まれる構成成分の比率により比較するグラフのセットである。
【図５】図５は、Ｌｉｐｏ−ｐａｍを用いて調製されたワクチンの、共焦点顕微鏡により観察された構造を確認する図である。
【００１７】
【図６】図６は、脂質およびＰａｍ３−ＣＳＫＫＫＫの組成ならびにＬｉｐｏ−ｐａｍ中に含まれるＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の用量を変更することにより調製されたＶＺＶ組み換えｇＥ抗原およびアジュバントを含むワクチン組成物についての、全ＩｇＧ抗体価を比較するグラフである。
【図７Ａ】図７は、Ｌｉｐｏ−ｐａｍ中に含まれる脂質およびＰａｍ３−ＣＳＫＫＫＫの組成ならびにＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の用量を変更することにより調製されたＶＺＶ組み換えｇＥ抗原およびアジュバントを含むワクチン組成物についての、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４のＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果（Ａ）ならびにＩＦＮ−γ、ＩＬ−４およびＴＮＦ−αのＥＬＩＳＡアッセイの結果（Ｂ）を比較するグラフのセットである。
【図７Ｂ】図７は、Ｌｉｐｏ−ｐａｍ中に含まれる脂質およびＰａｍ３−ＣＳＫＫＫＫの組成ならびにＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の用量を変更することにより調製されたＶＺＶ組み換えｇＥ抗原およびアジュバントを含むワクチン組成物についての、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４のＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果（Ａ）ならびにＩＦＮ−γ、ＩＬ−４およびＴＮＦ−αのＥＬＩＳＡアッセイの結果（Ｂ）を比較するグラフのセットである。
【図８】図８は、Ｌｉｐｏ−ｐａｍ中に含まれる脂質の用量を変更することにより調製されたアジュバント、および様々な用量の組み換えＶＺＶｇＥ抗原を含む、ワクチン組成物についての全ＩｇＧ抗体価を比較するグラフである。
【図９Ａ】図９は、Ｌｉｐｏ−ｐａｍ中に含まれる脂質の用量を変更することにより調製されたアジュバント、および様々な用量の組み換えＶＺＶｇＥ抗原を含む、ワクチン組成物についての、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４のＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果（Ａ）ならびにＩＦＮ−γ、ＩＬ−４およびＴＮＦ−αのＥＬＩＳＡアッセイの結果（Ｂ）を比較するグラフのセットである。
【図９Ｂ】図９は、Ｌｉｐｏ−ｐａｍ中に含まれる脂質の用量を変更することにより調製されたアジュバント、および様々な用量の組み換えＶＺＶｇＥ抗原を含む、ワクチン組成物についての、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４のＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果（Ａ）ならびにＩＦＮ−γ、ＩＬ−４およびＴＮＦ−αのＥＬＩＳＡアッセイの結果（Ｂ）を比較するグラフのセットである。
【図１０】図１０は、Ｌｉｐｏ−ｐａｍ中に含まれる脂質およびＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の用量を変更することにより調製されたアジュバント、および様々な用量の組み換えＶＺＶｇＥ抗原を含む、ワクチン組成物についての全ＩｇＧ抗体価を比較するグラフである。
【００１８】
【図１１Ａ】図１１は、Ｌｉｐｏ−ｐａｍ中に含まれる脂質およびＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の用量を変更することにより調製されたアジュバント、および様々な用量の組み換えＶＺＶｇＥ抗原を含む、ワクチン組成物についての、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４のＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果（Ａ）ならびにＩＦＮ−γ、ＩＬ−４およびＴＮＦ−αのＥＬＩＳＡアッセイの結果（Ｂ）を比較するグラフのセットである。
【図１１Ｂ】図１１は、Ｌｉｐｏ−ｐａｍ中に含まれる脂質およびＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の用量を変更することにより調製されたアジュバント、および様々な用量の組み換えＶＺＶｇＥ抗原を含む、ワクチン組成物についての、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４のＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果（Ａ）ならびにＩＦＮ−γ、ＩＬ−４およびＴＮＦ−αのＥＬＩＳＡアッセイの結果（Ｂ）を比較するグラフのセットである。
【図１２】図１２は、弱毒化帯状疱疹ワクチンおよび組み換えワクチンの組み換えＶＺＶｇＥ抗原に対する全ＩｇＧ抗体価を、アジュバントの処方により比較するグラフである。
【図１３】図１３は、弱毒化帯状疱疹ワクチンおよび組み換えワクチンのＶＺＶ組み換えｇＥ抗原について、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４のＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果（Ａ）ならびにＩＦＮ−γ、ＩＬ−４およびＴＮＦ−αのＥＬＩＳＡアッセイの結果（Ｂ）を、アジュバントの処方により比較するグラフのセットである。
【図１４】図１４は、弱毒化帯状疱疹ワクチンおよび組み換えワクチンについての、サイトカインを分泌するＣＤ４＋Ｔ細胞の出現頻度を、アジュバントの処方により比較するグラフである。
【図１５】図１５は、弱毒化帯状疱疹ワクチンおよび組み換えワクチンについての、ＣＤ４＋Ｔ細胞の多機能性を、アジュバントの処方により比較するグラフである。
【００１９】
【図１６】図１６は、弱毒化帯状疱疹ワクチンおよび組み換えワクチンの組み換えＶＺＶｇＥ抗原に対する全ＩｇＧ抗体価を、アジュバントの組成および処方により比較するグラフである。
【図１７Ａ】図１７は、弱毒化帯状疱疹ワクチンおよび組み換えワクチンの組み換えＶＺＶｇＥ抗原についての、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４のＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果（Ａ）ならびにＩＦＮ−γ、ＩＬ−４およびＴＮＦ−αのＥＬＩＳＡアッセイの結果（Ｂ）を、アジュバントの組成および処方により比較するグラフのセットである。
【図１７Ｂ】図１７は、弱毒化帯状疱疹ワクチンおよび組み換えワクチンの組み換えＶＺＶｇＥ抗原についての、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４のＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果（Ａ）ならびにＩＦＮ−γ、ＩＬ−４およびＴＮＦ−αのＥＬＩＳＡアッセイの結果（Ｂ）を、アジュバントの組成および処方により比較するグラフのセットである。
【図１８】図１８は、組み換えワクチンの組み換えＶＺＶｇＥ抗原に対する全ＩｇＧ抗体価を、Ｌｉｐｏ−ｐａｍの組成および調製方法により比較するグラフである。
【図１９Ａ】図１９は、組み換えワクチンの組み換えＶＺＶｇＥ抗原について、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４のＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果（Ａ）と、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４およびＴＮＦ−αのＥＬＩＳＡアッセイの結果（Ｂ）とを、Ｌｉｐｏ−ｐａｍの組成および調製方法により比較するグラフのセットである。
【図１９Ｂ】図１９は、組み換えワクチンの組み換えＶＺＶｇＥ抗原について、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４のＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果（Ａ）と、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４およびＴＮＦ−αのＥＬＩＳＡアッセイの結果（Ｂ）とを、Ｌｉｐｏ−ｐａｍの組成および調製方法により比較するグラフのセットである。
【図２０】図２０は、組み換えワクチンの組み換えＶＺＶｇＥ抗原に対する全ＩｇＧ抗体価を、脂質の型および用量、免疫活性物質の型、および組み換えＶＺＶｇＥ抗原の用量により比較するグラフである。
【００２０】
【図２１Ａ】図２１は、組み換えワクチンの組み換えＶＺＶｇＥ抗原について、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４のＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果（Ａ）ならびにＩＦＮ−γ、ＩＬ−４およびＴＮＦ−αのＥＬＩＳＡアッセイの結果（Ｂ）を、脂質の型および用量、免疫活性物質の型、および組み換えＶＺＶｇＥ抗原の用量により、比較するグラフのセットである。
【図２１Ｂ】図２１は、組み換えワクチンの組み換えＶＺＶｇＥ抗原について、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４のＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果（Ａ）ならびにＩＦＮ−γ、ＩＬ−４およびＴＮＦ−αのＥＬＩＳＡアッセイの結果（Ｂ）を、脂質の型および用量、免疫活性物質の型、および組み換えＶＺＶｇＥ抗原の用量により、比較するグラフのセットである。
【図２２】図２２は、組み換えワクチンの組み換えＶＺＶｇＥ抗原に対する全ＩｇＧ抗体価を、Ｌｉｐｏ−ｐａｍを構成するリポペプチドの型により比較するグラフである。
【図２３Ａ】図２３は、組み換えワクチンの組み換えＶＺＶｇＥ抗原について、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４のＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果（Ａ）、ならびにＩＦＮ−γ、ＩＬ−４およびＴＮＦ−αのＥＬＩＳＡアッセイの結果（Ｂ）を、Ｌｉｐｏ−ｐａｍを構成するリポペプチドの型により比較するグラフのセットである。
【図２３Ｂ】図２３は、組み換えワクチンの組み換えＶＺＶｇＥ抗原について、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４のＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果（Ａ）、ならびにＩＦＮ−γ、ＩＬ−４およびＴＮＦ−αのＥＬＩＳＡアッセイの結果（Ｂ）を、Ｌｉｐｏ−ｐａｍを構成するリポペプチドの型により比較するグラフのセットである。
【図２４】図２４は、組み換えＪＥＶｇＥ抗原に対する全ＩｇＧ抗体価（Ａ）、および不活化ＪＥＶ抗原に対する全ＩｇＧ抗体価（Ｂ）を比較するグラフのセットである。
【図２５Ａ】図２５は、組み換えワクチンの日本脳炎ウイルスｇＥ抗原について、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４のＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果（Ａ）、ならびにＩＦＮ−γ、ＩＬ−４およびＴＮＦ−αのＥＬＩＳＡアッセイの結果（Ｂ）を、アジュバントの処方により比較するグラフのセットである。
【図２５Ｂ】図２５は、組み換えワクチンの日本脳炎ウイルスｇＥ抗原について、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４のＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果（Ａ）、ならびにＩＦＮ−γ、ＩＬ−４およびＴＮＦ−αのＥＬＩＳＡアッセイの結果（Ｂ）を、アジュバントの処方により比較するグラフのセットである。
【００２１】
【図２６】図２６は、４株の季節性不活性型インフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｂ−ＹまたはＢ−Ｖ）に対する全ＩｇＧ抗体価を、アジュバントの処方により比較するグラフのセットである。
【図２７】図２７は、４株の季節性不活性型インフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｂ−ＹまたはＢ−Ｖ）のＩＦＮ−γのＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を、アジュバントの処方により説明するグラフのセットである。
【図２８】図２８は、４株の季節性不活性型インフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｂ−ＹまたはＢ−Ｖ）のＩＬ−４のＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を、アジュバントの処方により説明するグラフのセットである。
【００２２】
【図２９】図２９は、４株の季節性不活性型インフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｂ−ＹまたはＢ−Ｖ）のＩＦＮ−γのＥＬＩＳＡアッセイの結果を説明するグラフのセットである。
【図３０】図３０は、４株の季節性不活性型インフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｂ−ＹまたはＢ−Ｖ）のＴＮＦ−αのＥＬＩＳＡアッセイの結果を説明するグラフのセットである。
【図３１】図３１は、４株の季節性不活性型インフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｂ−ＹまたはＢ−Ｖ）のＩＬ−４のＥＬＩＳＡアッセイの結果を説明するグラフのセットである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
好ましい態様の記載
本明細書において以後、本発明を詳細に記載する。
本発明は、活性成分としてリポペプチド挿入リポソームを含む、ワクチンアジュバントを提供する。
【００２４】
リポペプチドは、いくつかのアミノ酸およびグリセロール分子に結合した脂肪酸からなり得る。リポペプチドを構成するアミノ酸またはグリセロール分子中の脂肪酸の数は、１つ以上であってよい。この時点において、脂肪酸およびアミノ酸は、化学修飾されていてよい。リポペプチドは、グラム陽性もしくはグラム陰性細菌またはマイコプラズマに由来する分子の一部であっても、分子全体の形態におけるリポタンパク質であってもよい。例えば、リポペプチドは、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫ、Ｐａｍ３−ＣＳＫＫＫＫ、ＰＨＣ−ＳＫＫＫＫ、Ｏｌｅ２ＰａｍＣｙｓ−ＳＫＫＫＫ、Ｐａｍ２Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫ、ＰａｍＣｙｓ（Ｐａｍ）−ＳＫＫＫＫ、Ｏｌｅ２Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫ、Ｍｙｒ２Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫ、ＰａｍＤｈｃ−ＳＫＫＫＫ、Ｐａｍ−ＣＳＫＫＫＫ、Ｄｈｃ−ＳＫＫＫＫおよびＦＳＬ−１からなる群より選択されるいずれか１つ以上であってよい。リポペプチドは、リポソーム中で、２０〜２５０、２０〜５０、５０〜２５０、１５０〜２５０、５０〜１５０、２０〜２５００、２０〜５００、５０〜２５００、１５０〜２５００または５０〜１５００μｇ／用量の濃度で含まれていてよい。
【００２５】
リポソームは、脂質からなっていてもよい。脂質は、カチオン性、アニオン性または中性の脂質であってよい。例えば、脂質は、ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン）、ＤＯＰＥ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＤＡ（ジメチルジオクタデシルアンモニウム）、ＤＣ−ｃｈｏｌ（３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール）、ＤＯＰＧ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）］）、ＤＰＰＣ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＯＰＣ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）およびコレステロールからなる群より選択されるいずれか１つ以上であってよい。脂質は、リポソーム中で、１５〜３００、１５〜１５０、１５〜９０、１５〜５０、１５〜４０、２０〜３０、１５〜３０００、１５〜１５００、１５〜９００、１５〜５００、１５〜４００または２０〜３００μｇ／用量の濃度で含まれていてよい。
【００２６】
本発明によるワクチンアジュバントは、免疫活性物質をさらに含んでもよい。免疫活性物質は、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、ＱＳ２１、ＭＰＬＡ（モノホスホリルリピドＡ）、ＣｐＧおよびフラゲリンからなる群より選択されるいずれか１つ以上であってよい。Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）は、１型インターフェロンの強力な誘導因子として、in vitroおよびin vivoでの研究において、用いられてきた。さらに、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）は、哺乳動物における最も強力な抗原提示細胞である樹状細胞を、安定に、かつ成熟して形成させることが知られている（Rous, R. et al 2004, International Immunol, 16:767-773）。先の報告によれば、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）は、強力なＩＬ−１２誘導因子である。前記のＩＬ−１２は、Ｔｈ１の発達を促進することにより細胞媒介性免疫応答およびＩｇＧ２ａまたはＩｇＧ２ｂ抗体形成を誘導する、重要な免疫活性物質である。Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の長さは、５０〜５，０００ｂｐであってよい。Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）は、アジュバント中で、１０〜１５０、１０〜９０、１０〜５０、１０〜３０、３０〜６０、３０〜９０、３０〜１５０、３０〜５０、１０〜１５００、１０〜９００、１０〜５００、１０〜３００、３０〜６００、３０〜９００、３０〜１５００または３０〜５００μｇ／用量の濃度で含まれていてよい。
【００２７】
ＱＳ２１は、南アメリカにおいてQuillaja saponaria Molinaの樹皮から抽出される１９９０．１４Ｄａの分子量を有するトリテルペングルコシドと称されるサポニン物質の部分である。ＭＰＬＡおよびコレステロールなどの脂質と組み合わされた場合、ＱＳ２１は、マクロファージおよび樹状細胞などの抗原提示細胞からＴｈ１型サイトカインを分泌させることにより、体液性および細胞媒介性免疫応答を誘導することが知られている。ＱＳ２１は、アジュバント中に、１〜１５０、１〜９０、１〜５０、１〜３０、３〜６０、３〜９０、３〜１５０、３〜５０、１〜１５００、１〜９００、１〜５００、１〜３００、３〜６００、３〜９００、３〜１５００または３〜５００μｇ／用量の濃度で含まれていてよい。
【００２８】
本発明はまた、本発明のアジュバントおよび抗原を含む、ワクチン組成物を提供する。
アジュバントは、上記のような特徴を有していてもよい。例えば、アジュバントは、リポペプチド挿入リポソームを含んでもよく、免疫活性物質をさらに含んでもよい。
【００２９】
抗原は、それらが宿主の身体に侵入した場合に、宿主の免疫系により認識されて免疫応答を引き起こすことができる、全ての物質を含み、病原体のタンパク質、組み換えタンパク質、糖タンパク質、ペプチド、多糖、リポ多糖またはポリヌクレオチドであってよい。例えば、抗原は、水痘帯状疱疹ウイルスのｇＥ（糖タンパク質Ｅ）；日本脳炎ウイルスのｇＥ（糖タンパク質Ｅ）抗原；季節性不活性型インフルエンザウイルス抗原；インフルエンザウイルスの赤血球凝集素抗原およびノイラミニダーゼ抗原；百日咳菌の百日咳毒素抗原、糸状赤血球凝集素抗原およびパータクチン抗原；ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原、ヘリコバクター・ピロリＡ、Ｂ、Ｃ、ＹおよびＷ−１３５群の莢膜多糖抗原；破傷風菌の破傷風トキソイド抗原；ジフテリアのジフテリアトキソイド抗原；肺炎球菌３型莢膜多糖抗原；結核抗原；ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のＧＰ−１２０およびＧＰ−１６０抗原；コレラ毒素Ｂサブユニット抗原；ブドウ球菌エンテロトキシンＢ抗原；赤痢菌多糖抗原；水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質抗原；サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）抗原、肝炎Ａ（ＨＡＶ）、Ｂ（ＨＢＶ）、Ｃ（ＨＣＶ）、Ｄ（ＨＤＶ）およびＧ（ＨＧＶ）抗原；呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）抗原または単純ヘルペス抗原により例示され得る。
【００３０】
ワクチン組成物は、加えて、バッファー、等張化剤、保存剤、安定化剤および可溶化剤を含んでもよい。バッファーとして、リン酸、酢酸、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、クエン酸などを用いることができる。
ワクチンは、抗原特異的体液性免疫応答のみならず、細胞媒介性免疫応答をも高度に誘導することができる。
【００３１】
ワクチンは、Ｔｈ１免疫応答を増強することができる。抗ウイルスおよび抗がん免疫応答のために有効なＴｈ１免疫応答を増強するＩｇＧ２ａまたはＩｇＧ２ｂ抗体は、ヘルパーＴ細胞１（Ｔｈ１）により生成されるサイトカインにより誘導される。したがって、本発明のワクチン組成物は、ウイルス感染またはがんのための予防または治療剤として用いることができる。
【００３２】
本発明の特定の態様において、本発明者らは、第１に、組み換え水痘帯状疱疹ウイルスｇＥ抗原（図１および２を参照）を調製し、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＯＰＥまたはＤＰＰＣ脂質をＰａｍ３−ＣＳＫＫＫＫと混合することによりＬｉｐｏ−Ｐａｍを調製して、これにＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）またはＱＳ２１を免疫活性物質として添加した。次いで、それに調製された組み換え水痘帯状疱疹ウイルスｇＥ抗原を添加することにより、水痘帯状疱疹ウイルスに対する組み換えワクチンを調製した。
【００３３】
組み換えワクチンにおいて、Ｐａｍ３−ＣＳＫＫＫＫは、脂質と共にリポソームを形成し、組み換えＶＺＶｇＥ抗原を、リポソームの表面上に結合させた（図５）。
組み換えワクチンは、体液性免疫応答のみならず、細胞媒介性免疫応答をも高度に誘導した（図３、４および６〜２１を参照）。
【００３４】
多様な型のリポペプチドをＤＣ−ＣｈｏｌおよびＤＰＰＣと混合することによりＬｉｐｏ−ｐａｍを調製し、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）および組み換えＶＺＶｇＥ抗原をＬｉｐｏ−ｐａｍに添加することにより、組み換えワクチンを調製した。調製された組み換えワクチンは、体液性免疫応答のみならず、細胞媒介性免疫応答をも高度に誘導した（図２２および２３を参照）。
【００３５】
また、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）および組み換え日本脳炎ウイルスｇＥ抗原を、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＰＰＣおよびＰａｍ３−ＣＳＫＫＫＫを混合することにより調製されたＬｉｐｏ−Ｐａｍに添加することにより、日本脳炎ウイルスに対する組み換えワクチンを調製した。調製された組み換えワクチンは、体液性免疫応答のみならず、細胞媒介性免疫応答をも高度に誘導した（図２４および２５を参照）。
【００３６】
加えて、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）および４株の季節性不活性型インフルエンザウイルス抗原を、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＯＰＥまたはＤＰＰＣおよびＰａｍ３−ＣＳＫＫＫＫを混合することにより調製されたＬｉｐｏ−Ｐａｍに添加することにより、季節性不活性型インフルエンザウイルスに対する組み換えワクチンを調製した。調製された組み換えワクチンは、体液性免疫応答のみならず、細胞媒介性免疫応答をも高度に誘導した（図２６および３１を参照）。
【００３７】
したがって、リポペプチド挿入Ｌｉｐｏ−Ｐａｍをアジュバントとして含む本発明のワクチン組成物は、抗原の型を限定することなく免疫増強効果を有するので、商業的に有効に用いることができる。
【００３８】
本発明はまた、活性成分として本発明のワクチン組成物を含む、ウイルス感染またはがんのための予防または治療剤を提供する。
ワクチン組成物は、上記のような特徴を有していてもよい。例えば、ワクチン組成物は、アジュバントおよび抗原を含んでもよい。アジュバントは、リポペプチド挿入リポソームを含んでもよく、免疫活性物質をさらに含んでもよい。
【００３９】
本発明の予防または治療剤は、薬学的に受入可能なキャリアを含んでもよく、ヒトまたは動物のために処方することができる。それは、多様な経路により投与することができる。投与の経路は、経口、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮下および皮内投与を含む。好ましくは、処方物は、注射として投与される。注射は、生理食塩水およびリンガー溶液などの水性溶媒、ならびに植物油、高級脂肪酸エステル（例えばオレイン酸エチルなど）およびアルコール（例えば、エタノール、ベンジルアルコール、プロピレングリコール、グリセリンなど）などの非水性溶媒を用いることにより調製することができる。それは、劣化を防止するための安定化剤（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸水素ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＢＨＡ、トコフェロール、ＥＤＴＡなど）、乳化剤、ｐＨ制御のためのバッファー、微生物の増殖を防止するための保存剤（例えば、硝酸フェニル水銀、チメロサール、塩化ベンザルコニウム、フェノール、クレゾール、ベンジルアルコールなど）の医薬用キャリアを含んでもよい。
【００４０】
本発明の予防または治療剤は、薬学的に有効な量により投与することができる。「薬学的に有効な量」という用語は、ワクチン効果を示すことができ、かつ同時に副作用または重篤もしくは過剰な免疫応答を引き起こさない量を意味し、正確な用量は、ワクチン中に含まれるべき抗原に依存して変化するであろう。本発明の予防または治療剤の有効な用量は、年齢、体重、健康状態、性別および薬物感受性、投与経路および投与方法にしたがって、当業者が容易に決定することができる。投与頻度は、１日に１回、または１日に数回である。
【００４１】
本明細書において以後、以下の例により、本発明を詳細に記載する。
しかし、以下の例は、単に本発明を説明するためのものであり、本発明の内容は、それらに限定されない。
【００４２】
例１．組み換え水痘帯状疱疹ウイルスｇＥ抗原の調製
＜１−１＞プラスミドの構築
第１に、遺伝子（配列番号１）を、ＶＺＶのｇＥ（糖タンパク質Ｅ）遺伝子発現領域の外側の領域において制限酵素認識配列（５’におけるＮｈｅＩ部位および３’におけるＸｈｏＩ部位）ならびにコザック配列を含むように合成した。この時点において、ヒトヘルペスウイルス３型（ＨＨＶ−３）ゲノム全体のＯＲＦ６８（糖タンパク質Ｅ）からＣ末端アンカードメインを取り除く形態におけるＣＨＯ細胞についてのコドン最適化配列を、鋳型として用いた。配列番号１により表されるＶＺＶの１．６ｋｂのｇＥ遺伝子を、ＮｈｅＩおよびＸｈｏＩ制限酵素で消化し、ｐＰＧＸＩＩベクター中にサブクローニングした。結果として、ＶＺＶｇＥ発現プラスミドであるｐＰＧＸＩＩ−ＶＺＶｇＥを調製した（図１）。
【００４３】
＜１−２＞細胞株の選択
例＜１−１＞において調製したｐＰＧＸＩＩ−ＶＺＶｇＥプラスミドのＤＮＡを、ＡｈｄＩ制限酵素で自由化し、これを、ＨＴ（ヒポキサンチン−チミジン）を含む培地中で６回継代したＣＨＯ  ＤＧ４４（Ｓ）−ＥＸ細胞中に、ｐＤＣＨ１Ｐ（ｄｈｆｒ）プラスミドＤＮＡと一緒に、エレクトロポレーションによりトランスフェクトした。次いで、形質転換した細胞を、ＨＴを含む培地中に播種した。細胞が十分に増殖したら、細胞を選択培地中でＨＴなしで培養した。約２週間後、最初に順応させた細胞群を得た。得られた細胞群を用いて、ドットブロットおよびウェスタンブロットを行って、最初に順応させた細胞群から４つの高生産株を選択した。選択された株を、限界希釈法により希釈し、各々の株を、１細胞／ウェルとなるように、１０プレートの９６ウェルプレート中に播種し、単一細胞株を単離した。単離された単一細胞株のコロニーを２４ウェルのプレートに移し、培養し、次いで、十分な細胞数を確保してから、エルレンマイヤーフラスコ中で懸濁培養した。６回の継代の後、細胞が一定の速度で増殖しつつ９５％以上の生存率が保たれている場合、流加培養を行って、生産性および安定性を確認した。最終的な細胞株は、高い生産性を有し、かつ８０％以上の安定性を保つ、５つの候補細胞株の中から、細胞増殖および生産性を考慮して選択した。
【００４４】
＜１−３＞細胞株の培養
例＜１−２＞において最終的に選択された細胞株を、EfficientFeed C+（Invitrogen）を添加した後、
HyCell CHO（GE Healthcare）培地を含む７．５リットルの広口瓶の発酵槽中に、６．５×１０６細胞／ｍｌの密度で播種し、培養した。この時点において、発酵槽は、３２℃、ＤＯ３０％、１００ｒｐｍで操作し、培地のｐＨを６．８より高く維持した。発酵槽中のグルコースおよび乳酸の含有量を、毎日分析し、グルコース含有量が２０ｍｍｏｌ／ｌより下に低下した場合、４５％のＤ−グルコースを１ｖ／ｖ％の濃度で添加し、１０日間にわたり培養した。
【００４５】
＜１−４＞抗原精製
例＜１−３＞において培養された細胞から、デプスフィルターを用いて培養培地を回収し、それからＶＺＶの組み換えｇＥ抗原を精製した。特に、組み換えＶＺＶｇＥ抗原を、４ステップのカラムクロマトグラフィーにより、ブチル−セファロース、ＤＥＡＥ−セファロース、ＣＨＴヒドロキシアパタイトおよびＳＰ−セファロースを連続して、ならびにワンタイムＵＦ／ＤＦをバッファー交換のために用いて、精製した。
結果として、図２において示されるとおり、精製された組み換えＶＺＶｇＥ抗原は、約７０ｋＤａの分子量を示した（図２）。
【００４６】
例２．リポペプチドおよびＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の用量による組み換えワクチンの免疫原性の比較
＜２−１＞試験ワクチンの調製および投与
第１に、ＤＣ−Ｃｈｏｌ：ＤＯＰＥリポソームを調製するために、ＤＣ−ＣｈｏｌおよびＤＯＰＥを、それぞれクロロホルム中に溶解し、次いで、窒素ガスにより有機溶媒を蒸発させつつ、混合溶液が容器の底壁上に均一に分布するように、ガラス容器を回転させた。この時点において、底壁上に薄いフィルムが形成された。形成されたフィルム中に残留している有機溶媒を、真空乾燥機中で１時間にわたり保管することにより取り除いた。完全に乾燥した脂質フィルムに蒸留水を添加し、その後、超音波浴を用いて１０分間かけて十分に再水和した。多重膜ベジクル（ＭＬＶ）懸濁液が生成されたら、２０ｍＭのリン酸ナトリウム中に３００ｍＭのＮａＣｌを含む２×のバッファー溶液（ｐＨ７．０）を、蒸留水と同じ量で添加した。生じたＭＬＶを、３秒／３秒（パルスオン／オフ）の条件下において５サイクルの超音波処理（５分／サイクル）に供し、ＤＣ−Ｃｈｏｌ：ＤＯＰＥリポソームを小単層ベジクル（ＳＵＶ）の形態において調製した。
【００４７】
加えて、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＯＰＥおよびＰａｍ３−ＣＳＫＫＫＫをそれぞれ有機溶媒中に溶解し、ＤＣ−ＣｈｏｌとＤＯＰＥとを３：７の比で混合し、Ｐａｍ３−ＣＳＫＫＫＫを２５μｇ／用量または１００μｇ／用量の濃度でそれに添加したことを除いて、ＤＣ−Ｃｈｏｌ：ＤＯＰＥリポソームと同じ様式において、Ｌｉｐｏ−Ｐａｍを調製した。
【００４８】
この時点において、２５μｇのＰａｍ３−ＣＳＫＫＫＫ（これはリポペプチドである）を、２０μｇまたは２００μｇのＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）と混合することにより、対照となるＬ−ｐａｍｐｏを調製した。
その後、アジュバントを、以下の表１において示される組成物と混合し、ＶＺＶｇＥ抗原を、５μｇ／用量の濃度で混合物に添加して、試験ワクチンを調製した。Ｇ２、Ｇ５およびＧ９群の場合、混合物を超音波処理し、抗原を添加して、試験ワクチンを調製した。調製されたワクチンを、６週齢のＣ５７ＢＬ／６メスマウス（Orient Bio Inc., Korea）に、２週間の間隔で２回、筋肉内注射した。
【００４９】
各々の試験群についての試験ワクチンの調製条件
【表１】
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【００５０】
＜２−２＞体液性免疫応答の分析
例＜２−１＞において投与された試験ワクチンにより誘導された体液性免疫応答を分析するために、免疫の前である第０週において、第１のワクチン接種の２週間後である第２週において、および第２のワクチン接種の２週間後である第４週において、マウスの血清を分離することにより、抗原特異的抗体形成をＥＬＩＳＡで分析することにより、抗体価を決定した。
【００５１】
第１に、組み換えＶＺＶｇＥ抗原に対する全ＩｇＧ抗体価を、以下の方法により確認した。特に、精製された組み換えＶＺＶｇＥ抗原を、１００ｎｇ／ウェルの濃度で、９６ウェルのマイクロプレート上にコーティングし、次いで、非特異的結合を防止するために、１％のウシ血清アルブミンを添加することにより１時間にわたり反応させた。マイクロプレートを洗浄した。連続希釈した血清を、プレートの各ウェルに添加し、その後、３７℃で２時間にわたり反応させた。抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（セイヨウワサビペルオキシダーゼ、ＫＰＬ、ＵＳＡ）を、二次抗体として１時間にわたりプレートに添加し、その後、同じ条件下において反応させた。反応させたマイクロプレートを洗浄し、呈色試薬ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）ペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ、ＵＳＡ）をそれに添加し、その後、室温で１０分間にわたり反応させた。停止溶液を用いて呈色反応を停止させ、次いで、ＥＬＩＳＡリーダーを用いて、４５０ｎｍでＯＤを測定した。抗体価を、陰性対照のＯＤ値の２倍に相当するＯＤ値を示す抗体希釈倍率の逆数として定義した。
【００５２】
一方、組み換えＶＺＶｇＥ抗原に対する抗体アイソタイプの力価を、一次抗体としてヤギ抗マウスＩｇＧ１、ヤギ抗マウスＩｇＧ２ａ、ヤギ抗マウスＩｇＧ２ｂまたはヤギ抗マウスＩｇＧ２ｃを用い、二次抗体としてウサギ抗ヤギＩｇＧ−ＨＲＰを用いたことを除き、組み換えＶＺＶｇＥ抗原に対する全抗体価と同じ方法により分析した。
【００５３】
結果として、図３Ａにおいて示されるとおり、組み換えＶＺＶｇＥ抗原に対する全ＩｇＧ抗体価は、ＤＣ−Ｃｈｏｌ：ＤＯＰＥリポソームとＬ−ｐａｍｐｏ（Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）２００μｇ＋Ｐａｍ３−ＣＳＫＫＫＫ  ２５μｇ）を混合することにより調製されたワクチンを投与されたＧ３群において、最も高かった。Ｌｉｐｏ−ｐａｍおよびＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を混合したか否かにより体液性免疫応答を比較した場合、全ＩｇＧは、Ｌｉｐｏ−ｐａｍおよびＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を混合することにより調製されたワクチンを投与されたＧ６群において、抗原およびＬｉｐｏ−ｐａｍのみを混合することにより調製されたワクチンを投与されたＧ５群と比較して、より高かった（図３Ａ）。
【００５４】
図３Ｂにおいて示されるとおり、組み換えＶＺＶｇＥ抗原に対する抗体アイソタイプの分析は、全試験群において、ＩｇＧ１と比較して、より高いＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ２ｃ型の抗体価を示した。特に、ＩｇＧ２型の抗体価は、Ｌ−ｐａｍｐｏをリポソームと混合したＧ３群、およびＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）をＬｉｐｏ−ｐａｍと混合したＧ６群において高かった（図３Ｂ）。
【００５５】
＜２−３＞細胞媒介性免疫応答の分析
例＜２−１＞において投与された試験ワクチンにより誘導された細胞媒介性免疫応答を、第２のワクチン接種の２週間後である第４週においてマウスから脾臓を抽出することにより全脾細胞を単離した後で行ったＥＬＩＳＰＯＴおよびサイトカインＥＬＩＳＡにより分析した。
【００５６】
特に、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行うために、抗ＩＦＮ−γまたは抗ＩＬ−４を結合させたＥＬＩＳＰＯＴプレートをＰＢＳで洗浄し、次いで、完全培地を添加することによりプレートを活性化した。マウス脾細胞を５×１０５細胞／ウェルの密度でＥＬＩＳＰＯＴプレート中に分配した後、例１において調製された組み換えＶＺＶｇＥ抗原をそれに添加し、その後、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター中で、２４時間または４８時間にわたり反応させた。次いで、脾細胞を取り除き、プレートをＰＢＳで洗浄した。マウスIFN-γELISpotPLUSキット（Mabtech、Sweden）およびマウスIL-4 ELISpotPLUSキット（Mabtech、Sweden）中のビオチン化抗体を、０．５％のＦＢＳを含むＰＢＳ中で希釈し、それぞれ、プレートの各ウェルに添加し、その後、室温で２時間にわたり反応させた。プレートを洗浄した後、プレートの各ウェルにＨＲＰ共役ストレプトアビジンを添加し、その後、室温で１時間にわたり反応させた。プレートを洗浄し、それに、呈色試薬ＴＭＢを添加し、その後、明瞭なスポットが現れるまで反応させた。反応が完了した後、三次蒸留水を添加して、反応を停止させた。プレートを蒸留水で数回洗浄し、室温で乾燥させ、ＥＬＩＳＰＯＴリーダーを用いてスポットを計算した。
【００５７】
一方で、サイトカインＥＬＩＳＡを行うために、マウス脾細胞を、１．５×１０６細胞／ウェルの密度で９６ウェルのプレート中に分配し、それに、例１において調製された組み換えＶＺＶｇＥ抗原を添加し、その後、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター中で４８時間にわたり反応させた。培養溶液を、各々の試験群について、試験管に移し、４℃において３０００ｒｐｍでの５分間にわたる遠心分離により得られた上清を、サイトカインＥＬＩＳＡを行うための試料として用いた。マウスＩＦＮ−γＥＬＩＳＡキット（ＢＤ、ＵＳＡ）マウスＩＬ−４  ＥＬＩＳＡキット（ＢＤ、ＵＳＡ）およびマウスＴＮＦ−αＥＬＩＳＡキット（ＢＤ、ＵＳＡ）中に含まれるコーティングのための抗体を、コーティングバッファー中で希釈し、９６ウェルのプレート中に分配して、３７℃で２時間にわたりプレートをコーティングした。プレートをＰＢＳＴで洗浄し、これに１０％のＦＢＳを添加し、その後、３７℃で１時間にわたりブロッキングした。プレートを洗浄した後、標準溶液および上で得られた脾細胞培養溶液を、プレート中に分配し（１００μｌ／ウェル）、その後、室温で２時間にわたり反応させた。プレートを洗浄し、これに、ビオチン化抗体とＨＲＰ共役ストレプトアビジンとを混合することにより調製された機能検出剤（working detector）を１００μｌ／ウェルの濃度で添加し、その後、室温で１時間にわたり反応させた。プレートを洗浄した後、呈色試薬ＴＭＢをそれに添加し、その後、室温で５〜１０分間にわたり反応させた。停止溶液を用いて呈色反応を停止させ、ＥＬＩＳＡリーダーを用いて４５０ｎｍでＯＤを測定した。
【００５８】
結果として、図４Ａにおいて示されるとおり、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴの分析により、Ｌｉｐｏ−ＰａｍおよびＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を混合することにより調製されたワクチンは、リポソームおよびＬ−ｐａｍｐｏを混合することにより調製されたワクチン（Ｇ２およびＧ３群）と比較して、全体的により高いＩＦＮ−γの産生を誘導した。特に、Ｇ６群は、他の試験群よりも著しくより高いＩＦＮ−γを産生し、Ｇ８およびＧ９群もまた、比較的高いＩＦＮ−γを産生した。加えて、抗原Ｇ９群の添加の前の超音波処理プロセスの追加を除いてはＧ７群と同じ処方物は、Ｇ７群よりも著しくより多くのＩＦＮ−γを産生した。加えて、抗原の添加の前に超音波処理を用いたことを除きＧ７群と同じ処方物であるＧ９群は、Ｇ７群よりも著しくより高いＩＦＮ−γを産生した。ＩＬ−４のＥＬＩＳＰＯＴ分析もまた、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴの結果と類似の傾向を示し、ＩＬ−４産生は、Ｇ６群において高かった。Ｌｉｐｏ−ｐａｍおよびＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）が混合されたか否かにより細胞媒介性免疫応答を比較した場合、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４の産生は、Ｌｉｐｏ−ｐａｍおよびＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を混合することにより調製されたワクチンを投与されたＧ６群において、抗原をＬｉｐｏ−ｐａｍのみと混合することにより調製されたワクチンを投与されたＧ５群と比較して、より高かった（図４Ａ）。
【００５９】
図４Ｂにおいて示されるとおり、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＡの結果により、Ｌｉｐｏ−ＰａｍおよびＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を混合することにより調製されたワクチンは、リポソームおよびＬ−ｐａｍｐｏを混合することにより調製されたワクチンと比較して、大量のＩＦＮ−γ分泌を誘導した。特に、最も高いＩＦＮ−γの分泌は、Ｇ６およびＧ８群において誘導された。ＩＬ−４およびＴＮＦ−αＥＬＩＳＡの結果もまた、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＡの結果と類似の傾向を示し、Ｇ６群において、大量のＩＬ−４およびＴＮＦ−αの分泌が誘導された。Ｌｉｐｏ−ｐａｍおよびＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）が混合されたか否かにより細胞媒介性免疫応答を比較した場合、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４およびＴＮＦ−αの分泌は、Ｌｉｐｏ−ＰａｍおよびＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を混合することにより調製されたワクチンを投与されたＧ６群において、抗原をＬｉｐｏ−ｐａｍのみと混合することにより調製されたワクチンを投与されたＧ５群と比較して、より高かった（図４Ｂ）。
【００６０】
したがって、上記のとおり、帯状疱疹ワクチンが体液性免疫応答よりも細胞媒介性免疫応答を誘導することは、より重要である。Ｌ−ｐａｍｐｏリポソームを混合することにより調製されたワクチンは、混合物の粒子サイズを均一に分散させ、これを安定化させるために、さらなる超音波処理、微流体化剤（microfluidizer）または押出成形機を受ける必要があった。しかし、Ｌｉｐｏ−ＰａｍおよびＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を混合することにより調製されたワクチンは、さらなる処理なしで、より安定であり、より長期にわたり粒子サイズを維持した。したがって、細胞媒介性免疫応答をより良好に誘導し、処方物の安定性において優れたＬｉｐｏ−Ｐａｍに基づくワクチン処方物を開発することは、有効であった。
【００６１】
例３．Ｌｉｐｏ−ｐａｍを用いることにより調製された組み換えワクチンの構造の確認
第１に、Ｌｉｐｏ−ｐａｍを用いることにより調製されたワクチンの構造を確認するために、ＤＣ−Ｃｈｏｌ（ジメチルエタンカルバモイルコレステロール）およびＤＯＰＥ（ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン）脂質を、Marina Blueで染色し、Ｐａｍ３−ＣＳＫＫＫＫを、６−ＴＡＭＲＡおよびＳＥ（６−カルボキシテトラメチルローダミン、サクシニミジルエステル）で染色し、組み換えＶＺＶｇＥ抗原を、フルオレセインでそれぞれ染色した。Ｌｉｐｏ−Ｐａｍは、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＯＰＥおよびＰａｍ３−ＣＳＫＫＫＫを溶解し、ＤＣ−ＣｈｏｌとＤＯＰＥとを混合し（３：７）、Ｐａｍ３−ＣＳＫＫＫＫを２５μｇ／用量の濃度でそれに添加したことを除いて、例＜２−１＞において記載されるものと同じ様式により調製した。次いで、Ｌｉｐｏ−ＰａｍおよびＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を４０μｇ／用量の濃度で混合し、抗原を５μｇ／用量の濃度でそれに添加することにより、試験ワクチンを調製した。共焦点顕微鏡を用いて、ワクチンの構造を確認した。
【００６２】
結果として、図５において示されるとおり、リポソーム脂質を染色した色素により生じた半径は、Ｐａｍ３ＣＳＫを染色した色素により生じた半径とほぼ同じであったが、組み換えＶＺＶｇＥ抗原を染色した色素により生じた半径は、それらよりも大きかった。このことにもかかわらず、調製されたワクチンが、Ｐａｍ３−ＣＳＫＫＫＫおよび脂質がリポソームを形成し（Ｌｉｐｏ−ｐａｍ）、組み換えＶＺＶｇＥ抗原がリポソームの表面に結合した構造を有することを確認した（図５）。
【００６３】
例４．リポペプチドおよびＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の用量による組み換えワクチンの免疫原性の比較
脂質の比、Ｐａｍ３−ＣＳＫＫＫＫの用量、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の用量、およびリポソームへの組み換えＶＺＶｇＥ抗原の結合の程度により、組み換えワクチンの免疫原性を比較した。
【００６４】
＜４−１＞試験ワクチンの調製および投与
Ｌｉｐｏ−Ｐａｍは、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＯＰＥおよびＰａｍ３−ＣＳＫＫＫＫを溶解し、ＤＣ−ＣｈｏｌとＤＯＰＥとを混合し（１：１〜３：７）、Ｐａｍ３−ＣＳＫＫＫＫを２５または１００μｇ／用量の濃度でそれに添加したことを除いて、例＜２−１＞において記載されるものと同じ様式により調製した。次いで、Ｌｉｐｏ−ＰａｍおよびＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を、２０、４０、６０、８０または１６０μｇ／用量の濃度で混合し、組み換えＶＺＶｇＥ抗原を５μｇ／用量の濃度でそれに添加することにより、試験ワクチンを調製した。調製されたワクチンを、６週齢のＣ５７ＢＬ／６メスマウス（Orient Bio Inc., Korea）に、２週間の間隔で２回、筋肉内注射した。
【００６５】
各々の試験群についての試験ワクチンの調製条件
【表２】
2020531579.tif 000004
【００６６】
＜４−２＞組み換えＶＺＶｇＥ抗原とＬｉｐｏ−ｐａｍとの間の結合の確認
例＜４−１＞において調製されたＬｉｐｏ−ｐａｍと、例１において調製された組み換えＶＺＶｇＥ抗原との間の結合力を、分子ふるいクロマトグラフィーを用いて、常法により確認した。
結果として、高Ｐａｍ３−ＣＳＫＫＫＫ処方物中においては（Ｇ５〜Ｇ７、Ｇ１１およびＧ１２群）、組み換えＶＺＶｇＥ抗原の大部分が、Ｌｉｐｏ−ｐａｍに組み合わされた。加えて、ｇＥ抗原に競合的に結合する低用量のＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を有するＧ２群においては、組み換えＶＺＶｇＥ抗原の大部分が、Ｌｉｐｏ−ｐａｍに結合した。
【００６７】
＜４−３＞体液性免疫応答の分析
例＜４−１＞において投与された試験ワクチンにより誘導された体液性免疫応答を分析するために、免疫の前である第０週において、第１のワクチン接種の２週間後である第２週において、および第２のワクチン接種の２週間後である第４週において、マウスの血清を分離することにより、試料を調製した。組み換えＶＺＶｇＥ抗原に対する全ＩｇＧ抗体価を、調製された試料を用いて、例＜２−２＞において記載されるものと同じ様式により分析した。
【００６８】
結果として、図６において示されるとおり、全ＩｇＧ抗体価は、ＤＣ−ＣｈｏｌとＤＯＰＥとを３：７の比で混合することにより調製されたＬｉｐｏ−ｐａｍを用いる場合（Ｇ２〜Ｇ７）において、ＤＣ−ＣｈｏｌとＤＯＰＥとを１：１の比で混合することにより調製されたＬｉｐｏ−ｐａｍを用いる場合（Ｇ８〜Ｇ１２）よりも、一般に高かった。加えて、全ＩｇＧ抗体価は、Ｐａｍ３−ＣＳＫＫＫＫ（リポペプチド）およびＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の用量に比例して高く誘導された（図６）。特に、全ＩｇＧ抗体価は、Ｇ２、Ｇ５、Ｇ６およびＧ７群の中でも、Ｇ２、Ｇ６およびＧ７群において高く、ここで、組み換え抗原の大部分がＬｉｐｏ−ｐａｍに結合した。
【００６９】
一方、Ｐａｍ３−ＣＳＫＫＫＫおよびＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を２５μｇおよび２０μｇ／用量の濃度で用いるＧ２群と、Ｐａｍ３−ＣＳＫＫＫＫおよびＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を１００μｇおよび８０μｇ／用量の濃度で用いるＧ６群との全ＩｇＧ抗体価は、同様であった。したがって、Ｐａｍ３−ＣＳＫＫＫＫおよびＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の最適用量は、Ｌｉｐｏ−ｐａｍを構成する脂質、またはワクチン中で用いられる組み換えＶＺＶｇＥ抗原により決定されたことを確認した。
【００７０】
＜４−４＞細胞媒介性免疫応答の分析
例＜４−１＞において投与された試験ワクチンにより誘導された細胞媒介性免疫応答を分析するために、第２のワクチン接種の２週間後である第４週において、マウスから脾臓を抽出することにより、全脾細胞を単離した。次いで、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイおよびサイトカインＥＬＩＳＡにより、例＜２−３＞において記載されるものと同じ様式により、細胞媒介性免疫応答を分析した。
【００７１】
結果として、図７Ａにおいて示されるとおり、ＤＣ−ＣｈｏｌとＤＯＰＥとを３：７の比で混合することにより調製されたワクチンは、ＤＣ−ＣｈｏｌとＤＯＰＥとを１：１の比で混合することにより調製されたワクチンよりも多くのＩＦＮ−γおよびＩＬ−４を産生した。２５μｇ／用量のＰａｍ３−ＣＳＫＫＫＫを用いた場合において、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４は、ＤＣ−ＣｈｏｌおよびＤＯＰＥが３：７の比において用いられ、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）が４０μｇ／用量の濃度で用いられた場合に、最も多く産生された。１００μｇ／用量または２００μｇ／用量のＰａｍ３−ＣＳＫＫＫＫを用いる場合において、より高い濃度のＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）において、より多くのＩＦＮ−γおよびＩＬ−４が産生されたが、２５μｇ／用量のＰａｍ３−ＣＳＫＫＫＫを用いては、試験群と比較して著しく低いＩＦＮ−γおよびＩＬ−４が産生された（図７Ａ）。
【００７２】
図７Ｂにおいて示されるとおり、サイトカインＥＬＩＳＡの結果により、ＤＣ−ＣｈｏｌとＤＯＰＥとを３：７の比で混合することにより調製されたワクチンは、ＤＣ−ＣｈｏｌとＤＯＰＥとを１：１の比で混合することにより調製されたワクチンと比較して、より多くのＩＦＮ−γおよびＩＬ−４の分泌を誘導したが、一方、ＴＮＦ−αの分泌は、いずれの場合においても同様であった。ＥＬＩＳＰＯＴの結果と同様に、２５μｇ／用量のＰａｍ３−ＣＳＫＫＫＫによるワクチンは、１００または２００μｇ／用量のＰａｍ３−ＣＳＫＫＫＫによるワクチンと比較して、より多くのＩＦＮ−γ、ＩＬ−４およびＴＮＦ−αの分泌を誘導した。特に、ＤＣ−ＣｈｏｌとＤＯＰＥとを３：７の比で混合することにより調製されたワクチンの中では、４０μｇ／用量のＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を用いるＧ３群、およびＤＣ−ＣｈｏｌとＤＯＰＥとを１：１の比で混合することにより調製されたワクチンの中では、２０μｇ／用量のＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を用いるＧ８群が、３種のサイトカインの最も多い分泌を誘導した（図７Ｂ）。
【００７３】
例５．脂質の用量および組み換えＶＺＶｇＥ抗原による組み換えワクチンの免疫原性の比較
３：７の比で混合されたＤＣ−Ｃｈｏｌ：ＤＯＰＥ、２５μｇ／用量のＰａｍ３−ＣＳＫＫＫＫ、および２０μｇ／用量のＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を用い、脂質の用量および組み換えＶＺＶｇＥ抗原によるワクチンの免疫原性を比較した。
【００７４】
＜５−１＞試験ワクチンの調製および投与
Ｌｉｐｏ−Ｐａｍは、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＯＰＥおよびＰａｍ３−ＣＳＫＫＫＫを溶解し、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＯＰＥおよびＰａｍ３−ＣＳＫＫＫＫを、脂質の濃度（ＤＣ−Ｃｈｏｌ：ＤＯＰＥ＝３：７）が３１．２５、６２．５または１２５μｇ／用量となり、Ｐａｍ３−ＣＳＫＫＫＫの濃度が２５μｇ／用量となるように混合したことを除いて、例＜２−１＞において記載されるものと同じ様式により調製した。次いで、以下の表３において示されるとおり、Ｌｉｐｏ−Ｐａｍを２０μｇ／用量の濃度でＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）と混合し、組み換えＶＺＶｇＥ抗原を２、５または１０μｇ／用量の濃度でそれに添加することにより、試験ワクチンを調製した。調製されたワクチンを、６週齢のＣ５７ＢＬ／６メスマウス（Orient Bio Inc., Korea）に、２週間の間隔で２回、筋肉内注射した。
【００７５】
各々の試験群についての試験ワクチンの調製条件
【表３】
2020531579.tif 000005
【００７６】
＜５−２＞体液性免疫応答の分析
例＜５−１＞において投与された試験ワクチンにより誘導された体液性免疫応答を分析するために、免疫の前である第０週において、第１のワクチン接種の２週間後である第２週において、および第２のワクチン接種の２週間後である第４週において、マウスの血清を分離することにより、試料を調製した。組み換えＶＺＶｇＥ抗原に対する全ＩｇＧ抗体価を、調製された試料を用いて、例＜２−２＞において記載されるものと同じ様式により分析した。
【００７７】
結果として、図８において示されるとおり、抗原の増加と共に脂質の用量を増加させることは、抗体の誘導を補助することを確認した。加えて、ＤＣ−ＣｈｏｌおよびＤＯＰＣを用いるＧ１１群の全ＩｇＧ抗体価は、他の試験群のものよりも低かった（図８）。
【００７８】
＜５−３＞細胞媒介性免疫応答の分析
例＜５−１＞において投与された試験ワクチンにより誘導された細胞媒介性免疫応答を分析するために、第２のワクチン接種の２週間後である第４週において、マウスから脾臓を抽出することにより、全脾細胞を単離した。次いで、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイおよびサイトカインＥＬＩＳＡにより、例＜２−３＞において記載されるものと同じ様式により、細胞媒介性免疫応答を分析した。
【００７９】
結果として、図９Ａにおいて示されるとおり、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４のＥＬＩＳＰＯＴの結果により、２μｇ／用量の組み換えＶＺＶｇＥ抗原および１２５μｇ／用量のＤＣ−Ｃｈｏｌ：ＤＯＰＥ脂質を用いることにより調製されたＧ８群において、最も多いＩＦＮ−γおよびＩＬ−４が産生された（図９Ａ）。
図９Ｂにおいて示されるとおり、サイトカインＥＬＩＳＡの結果により、２μｇ／用量の組み換えＶＺＶｇＥ抗原および１２５μｇ／用量のＤＣ−Ｃｈｏｌ：ＤＯＰＥ脂質を用いることにより調製されたＧ８群は、３種のサイトカインの最も多い分泌を誘導し、これは、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果と同様であった。しかし、ＤＣ−ＣｈｏｌおよびＤＯＰＣを用いることにより調製されたＧ１１群は、他の試験群より少ないサイトカイン分泌を誘導した（図９Ｂ）。
【００８０】
例６．脂質の用量、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）および組み換えＶＺＶｇＥ抗原による組み換えワクチンの免疫原性の比較
３：７の比で混合されたＤＣ−Ｃｈｏｌ：ＤＯＰＥ、および２５μｇ／用量のＰａｍ３−ＣＳＫＫＫＫを用い、脂質の用量、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）および組み換えＶＺＶｇＥ抗原によるワクチンの免疫原性を比較した。
【００８１】
＜６−１＞試験ワクチンの調製および投与
Ｌｉｐｏ−Ｐａｍは、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＯＰＥおよびＰａｍ３−ＣＳＫＫＫＫを溶解し、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＯＰＥおよびＰａｍ３−ＣＳＫＫＫＫを、脂質の濃度（ＤＣ−Ｃｈｏｌ：ＤＯＰＥ＝３：７）が６２．５、１２５または２５０μｇ／用量となり、Ｐａｍ３−ＣＳＫＫＫＫの濃度が２５μｇ／用量となるように混合したことを除いて、例＜２−１＞において記載されるものと同じ様式により調製した。次いで、以下の表４において示されるとおり、Ｌｉｐｏ−Ｐａｍを２０、４０、８０または１００μｇ／用量の濃度でＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）と混合し、組み換えＶＺＶｇＥ抗原を２、５または１０μｇ／用量の濃度でそれに添加することにより、試験ワクチンを調製した。調製されたワクチンを、６週齢のＣ５７ＢＬ／６メスマウス（Orient Bio Inc., Korea）に、２週間の間隔で２回、筋肉内注射した。
【００８２】
各々の試験群についての試験ワクチンの調製条件
【表４】
2020531579.tif 000006
【００８３】
＜６−２＞体液性免疫応答の分析
例＜６−１＞において投与された試験ワクチンにより誘導された体液性免疫応答を分析するために、免疫化の前である第０週において、第１のワクチン接種の２週間後である第２週において、および第２のワクチン接種の２週間後である第４週において、マウスの血清を分離することにより、試料を調製した。組み換えＶＺＶｇＥ抗原に対する全ＩｇＧ抗体価を、調製された試料を用いて、例＜２−２＞において記載されるものと同じ様式により分析した。
【００８４】
結果として、図１０において示されるとおり、６２．５μｇ／用量の脂質および２０μｇ／用量のＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を用いることによりＬｉｐｏ−ｐａｍを調製した場合、２μｇ／用量の組み換えＶＺＶｇＥ抗原を用いることにより調製されたＧ２群と、５μｇ／用量の組み換えＶＺＶｇＥ抗原を用いることにより調製されたＧ３群との間で、全ＩｇＧ抗体価は同様であった。２５０μｇ／用量の脂質および８０μｇ／用量のＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を用いることによりＬｉｐｏ−ｐａｍを調製した場合、２μｇ／用量の組み換えＶＺＶｇＥ抗原を用いることにより調製されたＧ８群、５μｇ／用量の組み換えＶＺＶｇＥ抗原を用いることにより調製されたＧ９群および１０μｇ／用量の組み換えＶＺＶｇＥ抗原を用いることにより調製されたＧ１０群の間で、全ＩｇＧ抗体価は同様であった（図１０）。アイソタイプ分析において、ＩｇＧ２ｂ／ＩｇＧ１の比は、Ｇ８、Ｇ９、Ｇ２，およびＧ６群において他の試験群より高く、ＩｇＧ２ｃ／ＩｇＧ１の比は、Ｇ８、Ｇ６，およびＧ９群において他の試験群より高かった。
【００８５】
＜６−３＞細胞媒介性免疫応答の分析
例＜６−１＞において投与された試験ワクチンにより誘導された細胞媒介性免疫応答を分析するために、第２のワクチン接種の２週間後である第４週において、マウスから脾臓を抽出することにより、全脾細胞を単離した。次いで、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイおよびサイトカインＥＬＩＳＡにより、例＜２−３＞において記載されるものと同じ様式により、細胞媒介性免疫応答を分析した。
【００８６】
結果として、図１１Ａにおいて示されるとおり、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４のＥＬＩＳＰＯＴの結果により、２μｇ／用量の組み換えＶＺＶｇＥ抗原と１２５μｇ／用量の脂質および４０μｇ／用量のＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を用いることにより調製されたＬｉｐｏ−ｐａｍとを用いたＧ６群において、最も多いＩＦＮ−γおよびＩＬ−４が産生された（図１１Ａ）。
【００８７】
図１１Ｂにおいて示されるとおり、サイトカインＥＬＩＳＡの結果により、２μｇ／用量の組み換えＶＺＶｇＥ抗原と１２５μｇ／用量の脂質および４０μｇ／用量のＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を用いることにより調製されたＬｉｐｏ−ｐａｍとを用いるＧ６群が、最も多いＩＦＮ−γ、ＩＬ−４およびＴＮＦ−αの分泌を誘導した（図１１Ｂ）。
【００８８】
例７．抗原の用量による弱毒化帯状疱疹ワクチンおよび組み換えワクチンの免疫原性の比較
組み換えワクチン中に含まれる抗原の用量による、Zostavax、市販の弱毒化生ワクチン、および組み換えＶＺＶｇＥ抗原を用いることにより調製された組み換えワクチンの免疫原性を比較した。
【００８９】
＜７−１＞試験ワクチンの調製および投与
Ｌｉｐｏ−Ｐａｍは、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＯＰＥおよびＰａｍ３−ＣＳＫＫＫＫを溶解し、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＯＰＥおよびＰａｍ３−ＣＳＫＫＫＫを、脂質の濃度（ＤＣ−Ｃｈｏｌ：ＤＯＰＥ＝３：７）が１２５μｇ／用量となり、Ｐａｍ３−ＣＳＫＫＫＫの濃度が２５μｇ／用量となるように混合したことを除いて、例＜２−１＞において記載されるものと同じ様式により調製した。加えて、２５μｇ／用量のＰａｍ３−ＣＳＫＫＫＫ、２００μｇ／用量のＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）および５μｇ／用量の抗原を混合することによりＬ−ｐａｍｐｏを調製し、これを対照として用いた。その後、以下の表５において記載されるとおりの組成を有する試験ワクチンを、調製した。Zostavaxまたは調製されたワクチンを、６週齢のＣ５７ＢＬ／６メスマウス（Orient Bio Inc., Korea）に、２週間の間隔で２回、筋肉内注射した。
【００９０】
各々の試験群についての試験ワクチンの調製条件
【表５】
2020531579.tif 000007
【００９１】
＜７−２＞体液性免疫応答の分析
例＜７−１＞において投与された試験ワクチンにより誘導された体液性免疫応答を分析するために、免疫の前である第０週において、第１のワクチン接種の２週間後である第２週において、および第２のワクチン接種の２週間後である第４週において、マウスの血清を分離することにより、試料を調製した。組み換えＶＺＶｇＥ抗原およびそのアイソタイプに対する全ＩｇＧ抗体価を、調製された試料を用いて、例＜２−２＞において記載されるものと同じ様式により分析した。
【００９２】
結果として、図１２において示されるとおり、Zostavaxで処置されたＧ２群および水酸化アルミニウムを用いたＧ３群は、Ｌ−ｐａｍｐｏまたはＬｉｐｏ−Ｐａｍを用いたＧ４、Ｇ５およびＧ６群より低い全ＩｇＧ抗体レベルを示した（図１２）。アイソタイプ分析において、多くのＩｇＧ１型抗体は、水酸化アルミニウムを用いたＧ３群において形成され、ＩｇＧ２ｂ／ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃ／ＩｇＧ１の比は、Ｌｉｐｏ−ｐａｍを用いたＧ５およびＧ６群において、Ｌ−ｐａｍｐｏを用いたＧ４群におけるものより高かった。
【００９３】
＜７−３＞細胞媒介性免疫応答の分析
例＜７−１＞において投与された試験ワクチンにより誘導された細胞媒介性免疫応答を分析するために、第２のワクチン接種の２週間後である第４週において、マウスから脾臓を抽出することにより、全脾細胞を単離した。次いで、脾細胞を用いて、例＜２−３＞において記載されるものと同じ様式により、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイおよびサイトカインＥＬＩＳＡを行った。フローサイトメーターを用いてＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−２についての細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）分析を行うことにより、各処方物中の組み換えＶＺＶｇＥ抗原に対して特異的なサイトカインを分泌するＣＤ４＋Ｔ細胞のレベルを比較することにより、細胞媒介性免疫応答を分析した。
【００９４】
結果として、図１３Ａにおいて示されるとおり、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４のＥＬＩＳＰＯＴの結果により、Zostavaxを投与されたＧ２群においては、著しく低いＩＦＮ−γおよびＩＬ−４が産生され、一方、Ｌｉｐｏ−ｐａｍを用いたＧ５およびＧ６群においては、最も多いＩＦＮ−γおよびＩＬ−４が産生された（図１３Ａ）。
図１１Ｂにおいて示されるとおり、サイトカインＥＬＩＳＡの結果により、Zostavaxを投与されたＧ２群においては、最も少ないＩＦＮ−γ、ＩＬ−４およびＴＮＦ−αの分泌が誘導され、一方、Ｌｉｐｏ−ｐａｍを用いたＧ５およびＧ６群においては、最も多いＩＦＮ−γ、ＩＬ−４およびＴＮＦ−αの分泌が誘導された（図１３Ｂ）。
【００９５】
図１４において示されるとおり、各々の試験群において分泌されたサイトカインの傾向は、Ｌｉｐｏ−ｐａｍを用いたＧ５およびＧ６群における、各々のサイトカインを分泌するＣＤ４＋Ｔ細胞の高い出現頻度を示した（図１４）。
加えて、図１５において示されるとおり、ｇＥ抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の多機能性を比較した結果により、各々の試験群において１００％の細胞がサイトカインのうちの１つ以上の型を分泌すると仮定すると、１つ以上のサイトカインを分泌するＣＤ４＋Ｔ細胞のうち、３つ全てのサイトカインを分泌するＴ細胞が高い試験群は、Ｌｉｐｏ−ｐａｍを有したＧ５およびＧ６群であった。一方、Zostavaxを投与されたＧ２群および水酸化アルミニウムを用いたＧ３群は、１つのみのサイトカインを分泌するＣＤ４＋Ｔ細胞の比率が高いことを示し、このことは、低い多機能性を確認する（図１５）。
【００９６】
例８．脂質の用量およびＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）による弱毒化帯状疱疹ワクチンおよび組み換えワクチンの免疫原性の比較
Zostavax、市販の弱毒化生ワクチン、および組み換えＶＺＶｇＥ抗原を用いることにより調製された組み換えワクチンの免疫原性を、組み換えワクチン中に含まれる脂質およびＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の用量により比較した。
【００９７】
＜８−１＞試験ワクチンの調製および投与
Ｌｉｐｏ−Ｐａｍは、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＯＰＥおよびＰａｍ３−ＣＳＫＫＫＫを溶解し、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＯＰＥおよびＰａｍ３−ＣＳＫＫＫＫを、脂質の濃度（ＤＣ−Ｃｈｏｌ：ＤＯＰＥ＝３：７）が１２５μｇ／用量となり、Ｐａｍ３−ＣＳＫＫＫＫの濃度が２５μｇ／用量となるか、脂質の濃度（ＤＣ−Ｃｈｏｌ：ＤＯＰＥ＝１：１）が１２５μｇ／用量となり、Ｐａｍ３−ＣＳＫＫＫＫの濃度が２５μｇ／用量となるように混合したことを除いて、例＜２−１＞において記載されるものと同じ様式により調製した。加えて、２５μｇ／用量のＰａｍ３−ＣＳＫＫＫＫ、２００μｇ／用量のＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）および５μｇ／用量の抗原を混合することにより、Ｌ−ｐａｍｐｏを調製した。ＤＣ−Ｃｈｏｌ：ＤＯＰＥリポソームは、例＜２−１＞において記載されるものと同じ様式により調製した。次いで、Ｌｉｐｏ−Ｐａｍを２０、４０または８０μｇ／用量の濃度のＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）と混合し、組み換えＶＺＶｇＥ抗原を５μｇ／用量の濃度ででそれに添加すること（Ｇ６〜Ｇ９群）により、同時に、Ｌｉｐｏ−Ｐａｍを４０μｇ／用量の濃度のＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）および５μｇ／用量の濃度の組み換えＶＺＶｇＥ抗原と混合することにより（Ｇ１０およびＧ１１）、Ｌｉｐｏ−ＰａｍをＤＣ−Ｃｈｏｌ：ＤＯＰＥリポソームと混合することにより（Ｇ５群）、または１００μｇ／用量の水酸化アルミニウムと５μｇ／用量の組み換えＶＺＶｇＥ抗原とを混合することにより、試験ワクチンを調製した。Zostavaxまたは調製されたワクチンを、６週齢のＣ５７ＢＬ／６メスマウス（Orient Bio Inc., Korea）に、２週間の間隔で２回、筋肉内注射した。
【００９８】
各々の試験群についての試験ワクチンの調製条件
【表６】
2020531579.tif 000008
【００９９】
＜８−２＞体液性免疫応答の分析
例＜８−１＞において投与された試験ワクチンにより誘導された体液性免疫応答を分析するために、免疫化の前である第０週において、第１のワクチン接種の２週間後である第２週において、および第２のワクチン接種の２週間後である第４週において、マウスの血清を分離することにより、試料を調製した。調製された試料を用いるＥＬＩＳＡによる抗原特異的抗体形成の分析により、抗体価を決定した。組み換えＶＺＶｇＥ抗原に対する全ＩｇＧ抗体価を、例＜２−２＞において記載されるものと同じ様式により分析した。
【０１００】
結果として、図１６において示されるとおり、Zostavaxで処置されたＧ３群、および水酸化アルミニウムを用いるＧ２群は、Ｌ−ｐａｍｐｏまたはＬｉｐｏ−Ｐａｍを用いるＧ４〜Ｇ１１群より低い全ＩｇＧ抗体価を示した（図１６）。
【０１０１】
＜８−３＞細胞媒介性免疫応答の分析
例＜８−１＞において投与された試験ワクチンにより誘導された細胞媒介性免疫応答を分析するために、第２のワクチン接種の２週間後である第４週において、マウスから脾臓を抽出することにより、全脾細胞を単離した。次いで、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイおよびサイトカインＥＬＩＳＡにより、例＜２−３＞において記載されるものと同じ様式により、細胞媒介性免疫応答を分析した。
【０１０２】
結果として、図１７Ａにおいて示されるとおり、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４のＥＬＩＳＰＯＴの結果により、Zostavaxを投与されたＧ３群においては著しく低いＩＦＮ−γおよびＩＬ−４が産生され、一方、４０μｇ／用量のＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）とＤＣ−Ｃｈｏｌ：ＤＰＰＣ（１：１）を用いることにより調製されたＬｉｐｏ−ｐａｍとを用いたＧ７群、ならびにＬｉｐｏ−Ｐａｍ、４０μｇ／用量のＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）および５μｇ／用量の組み換えＶＺＶｇＥ抗原を用いたＧ１１群においては、多くのＩＦＮ−γおよびＩＬ−４が産生された（図１７Ａ）。
【０１０３】
図１７Ｂにおいて示されるとおり、サイトカインＥＬＩＳＡの結果により、４０μｇ／用量のＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）とＤＣ−Ｃｈｏｌ：ＤＰＰＣ（１：１）を用いることにより調製されたＬｉｐｏ−ｐａｍとを用いるＧ７群、ならびにＤＣ−Ｃｈｏｌ：ＤＯＰＥリポソームおよびＬ−ｐａｍｐｏを用いるＧ５群において、最も多いＩＦＮ−γの分泌が誘導された。加えて、ＩＬ−４の分泌は、処方物の間で著しくは異ならなかったが、ＤＣ−Ｃｈｏｌ：ＤＰＰＣ（１：１）を用いることにより調製されたＬｉｐｏ−ｐａｍを用いたＧ７〜Ｇ９およびＧ１１群において、多くの分泌が誘導された。ＴＮＦ−αは、Ｇ５、Ｇ７、Ｇ９およびＧ１１群において多く誘導された（図１７Ｂ）。
【０１０４】
例９．脂質の型、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の用量および組み換えＶＺＶｇＥ抗原混合の方法による、組み換えワクチンの免疫原性の比較
脂質の型、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の用量、およびＬｉｐｏ−ｐａｍの調製において組み換えＶＺＶｇＥ抗原を混合する方法による、ワクチンの免疫原性を比較した。
【０１０５】
＜９−１＞試験ワクチンの調製および投与
Ｌｉｐｏ−Ｐａｍは、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＯＰＥおよびＰａｍ３−ＣＳＫＫＫＫを溶解し、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＯＰＥおよびＰａｍ３−ＣＳＫＫＫＫを、脂質の濃度（ＤＣ−Ｃｈｏｌ：ＤＯＰＥ＝３：７）が１２５μｇ／用量となり、Ｐａｍ３−ＣＳＫＫＫＫの濃度が２５μｇ／用量となるか、脂質の濃度（ＤＣ−Ｃｈｏｌ：ＤＰＰＣ＝１：１または３：７）が１２５μｇ／用量となり、Ｐａｍ３−ＣＳＫＫＫＫの濃度が２５μｇ／用量となるように混合したことを除いて、例＜２−１＞において記載されるものと同じ様式により調製した。加えて、２５μｇ／用量のＰａｍ３−ＣＳＫＫＫＫ、２００μｇ／用量のＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）および５μｇ／用量の組み換えＶＺＶｇＥ抗原を混合することにより、Ｌ−ｐａｍｐｏを調製した。次いで、Ｌｉｐｏ−Ｐａｍを４０または２００μｇ／用量の濃度のＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）と混合し、組み換えＶＺＶｇＥ抗原を５μｇ／用量の濃度でそれに添加することにより、（Ｇ３〜Ｇ６群）、または、Ｌｉｐｏ−Ｐａｍを４０または２００μｇ／用量の濃度のＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）および５μｇ／用量の濃度の組み換えＶＺＶｇＥ抗原と同時に混合することにより、試験ワクチンを調製した（Ｇ７〜Ｇ１０群）。調製されたワクチンを、６週齢のＣ５７ＢＬ／６メスマウス（Orient Bio Inc., Korea）に、２週間の間隔で２回、筋肉内注射した。
【０１０６】
各々の試験群についての試験ワクチンの調製条件
【表７】
2020531579.tif 000009
【０１０７】
＜９−２＞体液性免疫応答の分析
例＜９−１＞において投与された試験ワクチンにより誘導された体液性免疫応答を分析するために、免疫化の前である第０週において、第１のワクチン接種の２週間後である第２週において、および第２のワクチン接種の２週間後である第４週において、マウスの血清を分離することにより、試料を調製した。組み換えＶＺＶｇＥ抗原に対する全ＩｇＧ抗体価を、調製された試料を用いて、例＜２−２＞において記載されるものと同じ様式により分析した。
【０１０８】
結果として、図１８において示されるとおり、脂質の型およびＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）と抗原とを混合する方法によっては、全ＩｇＧ抗体価には何らの差異も存在しなかった（図１８）。アイソタイプ分析において、ＩｇＧ２ｂ／ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃ／ＩｇＧ１の比は、ＤＣ−Ｃｈｏｌ：ＤＰＰＣを３：７または１：１の比において用いるＧ４〜Ｇ６群において、他の群におけるものより高かった。
【０１０９】
＜９−３＞細胞媒介性免疫応答の分析
例＜９−１＞において投与された試験ワクチンにより誘導された細胞媒介性免疫応答を分析するために、第２のワクチン接種の２週間後である第４週において、マウスから脾臓を抽出することにより、全脾細胞を単離した。次いで、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイおよびサイトカインＥＬＩＳＡにより、例＜２−３＞において記載されるものと同じ様式により、細胞媒介性免疫応答を分析した。
【０１１０】
結果として、図１９Ａにおいて示されるとおり、ＩＦＮ−γのＥＬＩＳＰＯＴの結果により、ＤＣ−Ｃｈｏｌ：ＤＰＰＣを用いることにより調製されたＬｉｐｏ−ｐａｍを用いるＧ４〜Ｇ６およびＧ８〜Ｇ１０群において、Ｌ−ｐａｍｐｏを用いるＧ２群ならびにＤＣ−Ｃｈｏｌ：ＤＯＰＥを用いるＧ３およびＧ７群におけるものよりも、より多くのＩＦＮ−γが産生された。ＩＬ−４のＥＬＩＳＰＯＴの結果により、全試験群において同様のレベルにおいてＩＬ−４が産生された（図１９Ａ）。
【０１１１】
図１９Ｂにおいて示されるとおり、サイトカインＥＬＩＳＡの結果により、ＤＣ−Ｃｈｏｌ：ＤＯＰＥを用いる処方物よりも、ＤＣ−Ｃｈｏｌ：ＤＰＰＣを用いる処方物により、最も多いＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの分泌が、誘導された。ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの分泌は、ＤＣ−Ｃｈｏｌ：ＤＰＰＣを１：１の比で用いるＧ６およびＧ１０群において、最も多く誘導された。ＩＬ−４は、Ｌ−ｐａｍｐｏを用いるＧ２群において、ＤＣ−Ｃｈｏｌ：ＤＰＰＣを１：１の比で用いるＧ６およびＧ１０群におけるものよりも、より多く分泌された。ＤＣ−Ｃｈｏｌ：ＤＯＰＥを用いるＧ３およびＧ７群において、ＤＣ−Ｃｈｏｌ：ＤＰＰＣを用いる群と同様のレベルのＩＬ−４が誘導された（図１９Ｂ）。
【０１１２】
例１０．脂質の型および用量、免疫活性物質の種類および組み換えＶＺＶｇＥ抗原の用量による、組み換えワクチンの免疫原性の比較
脂質の型および用量、免疫活性物質の種類および組み換えＶＺＶｇＥ抗原の用量により、ワクチンの免疫原性を比較した。免疫活性物質として、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）またはＱＳ２１を用いた。
【０１１３】
＜１０−１＞試験ワクチンの調製および投与
Ｌｉｐｏ−Ｐａｍは、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＯＰＥ、ＤＰＰＣおよびＰａｍ３−ＣＳＫＫＫＫを溶解し、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＰＰＣおよびＰａｍ３−ＣＳＫＫＫＫを、脂質の濃度（ＤＣ−Ｃｈｏｌ：ＤＯＰＥ＝３：７）が１２５μｇ／用量となり、Ｐａｍ３−ＣＳＫＫＫＫの濃度が２５μｇ／用量となるか、脂質の濃度（ＤＣ−Ｃｈｏｌ：ＤＰＰＣ＝１：１）が、６２．５、１２５または２５０μｇ／用量となり、Ｐａｍ３−ＣＳＫＫＫＫの濃度が２５μｇ／用量となるように混合したことを除き、例＜２−１＞において記載されるものと同じ様式により調製した。加えて、２５μｇ／用量のＰａｍ３−ＣＳＫＫＫＫ、２００μｇ／用量のＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）および５μｇ／用量の組み換えＶＺＶｇＥ抗原を混合することにより、Ｌ−ｐａｍｐｏを調製した。次いで、Ｌｉｐｏ−Ｐａｍを４０μｇ／用量の濃度でＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）と混合することにより（Ｇ２〜Ｇ８群）、または、Ｌｉｐｏ−Ｐａｍを、５μｇ／用量の濃度のＱＳ２１と混合すること（Ｇ９）および組み換えＶＺＶｇＥ抗原を５μｇ／用量の濃度でそれに添加することにより、試験ワクチンを調製した。調製されたワクチンを、６週齢のＣ５７ＢＬ／６メスマウス（Orient Bio Inc., Korea）に、２週間の間隔で２回、筋肉内注射した。
【０１１４】
各々の試験群についての試験ワクチンの調製条件
【表８】
2020531579.tif 000010
【０１１５】
＜１０−２＞体液性免疫応答の分析
例＜１０−１＞において投与された試験ワクチンにより誘導された体液性免疫応答を分析するために、免疫化の前である第０週において、第１のワクチン接種の２週間後である第２週において、および第２のワクチン接種の２週間後である第４週において、マウスの血清を分離することにより、試料を調製した。組み換えＶＺＶｇＥ抗原に対する全ＩｇＧ抗体価を、調製された試料を用いて、例＜２−２＞において記載されるものと同じ様式により分析した。
【０１１６】
結果として、図２０において示されるとおり、脂質の型による全抗体価は、ＤＣ−ＣｈｏｌおよびＤＯＰＥを用いることにより調製されたＬｉｐｏ−ｐａｍを用いたＧ２群において最も高く、免疫活性物質としてＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の代わりにＱＳ２１を用いたＧ９群においては、高い抗体形成が誘導された（図２０）。
【０１１７】
＜１０−３＞細胞媒介性免疫応答の分析
例＜１０−１＞において投与された試験ワクチンにより誘導された細胞媒介性免疫応答を分析するために、第２のワクチン接種の２週間後である第４週において、マウスから脾臓を抽出することにより、全脾細胞を単離した。次いで、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイおよびサイトカインＥＬＩＳＡにより、例＜２−３＞において記載されるものと同じ様式により、細胞媒介性免疫応答を分析した。
【０１１８】
結果として、図２１Ａにおいて示されるとおり、ＩＦＮ−γのＥＬＩＳＰＯＴの結果により、脂質としてＤＣ−ＣｈｏｌおよびＤＰＰＣを用いた群において、脂質としてＤＣ−ＣｈｏｌおよびＤＯＰＥを用いたＧ２群におけるものよりも、より多くのＩＦＮ−γが産生された。ＩＦＮ−γは、脂質としてＤＣ−ＣｈｏｌおよびＤＰＰＣを用い、免疫活性物質としてＱＳ２１を用いることにより調製されたＬｉｐｏ−ｐａｍを用いたＧ９群において、最も多く産生された。加えて、ＩＬ−４のＥＬＩＳＰＯＴの結果により、脂質としてＤＣ−ＣｈｏｌおよびＤＰＰＣを用いた群において、脂質としてＤＣ−ＣｈｏｌおよびＤＯＰＥを用いたＧ２群におけるものよりも、より多くのＩＬ−４が産生された。ＩＬ−４は、４０μｇ／用量のＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）および５μｇ／用量の組み換えＶＺＶｇＥ抗原を用いたＧ６群と、５μｇ／用量のＱＳ２１および５μｇ／用量の組み換えＶＺＶｇＥ抗原を用いたＧ９群とにおいて、同様のレベルで産生された（図２１Ａ）。
【０１１９】
図２１Ｂにおいて示されるとおり、サイトカインＥＬＩＳＡの結果により、ＤＣ−Ｃｈｏｌ：ＤＰＰＣを用いたＧ３〜Ｇ８群において、脂質としてＤＣ−Ｃｈｏｌ：ＤＯＰＥを用いたＧ２群におけるものよりも、より多くのＩＦＮ−γ、ＩＬ−４およびＴＮＦ−αの分泌が誘導された。５μｇ／用量のＱＳ２１および５μｇ／用量の組み換えＶＺＶｇＥ抗原を用いたＧ９群において、４０μｇ／用量のＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）および５μｇ／用量の組み換えＶＺＶｇＥ抗原を用いたＧ６群におけるものよりも、より多くのＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの分泌が誘導された。ＩＬ−４の分泌は、いずれの群においても同様のレベルで誘導された（図２１Ｂ）。
【０１２０】
したがって、＜例１０＞の結果から、Ｌｉｐｏ−ｐａｍの調製における免疫活性物質として、ＱＳ２１のみならずＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の使用が、体液性および細胞媒介性免疫応答を誘導し、したがって、ワクチンの効力が改善されたことを確認した。
【０１２１】
例１１．リポペプチドの種類による組み換えワクチンの免疫原性の比較
組み換えＶＺＶｇＥ抗原を用いることにより調製された組み換えワクチン中に含まれるリポペプチドの型によるワクチンの免疫原性を比較した。
【０１２２】
＜１１−１＞試験ワクチンの調製および投与
Ｌｉｐｏ−Ｐａｍは、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＰＰＣおよびリポペプチドを溶解し、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＰＰＣおよびリポペプチドを、脂質の濃度（ＤＣ−Ｃｈｏｌ：ＤＰＰＣ＝１：１）が１２５μｇ／用量となり、リポペプチドの濃度が２５μｇ／用量となるように混合したことを除いて、例＜２−１＞において記載されるものと同じ様式により調製した。粒子サイズ分析計（Malvern, Nono-ZS）を用いて、Ｌｉｐｏ−Ｐａｍのサイズおよびゼータ電位を測定した。この時点において、リポペプチドとして、Ｐａｍ３−ＣＳＫＫＫＫ、Ｄｈｃ−ＳＫＫＫＫ、ＰａｍＤｈｃ−ＳＫＫＫＫ、Ｐａｍ−ＣＳＫＫＫＫ、Ｐａｍ２Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫ、ＰＨＣ−ＳＫＫＫＫまたはＦＳＬ−１を用いた。
【０１２３】
次いで、Ｌｉｐｏ−Ｐａｍを４０μｇ／用量の濃度でＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）と混合すること、および組み換えＶＺＶｇＥ抗原を５μｇ／用量の濃度でそれに添加することにより、試験ワクチンを調製した。粒子サイズ分析計（Malvern, Nono-ZS）を用いて、試験ワクチン組成物のサイズおよびゼータ電位を測定した。
【０１２４】
リポペプチドの型によるＬｉｐｏ−Ｐａｍのサイズおよびゼータ電位
【表９】
2020531579.tif 000011
【０１２５】
リポペプチドの型による組み換えワクチンのサイズおよびゼータ電位
【表１０】
2020531579.tif 000012
【０１２６】
結果として、表９において示されるとおり、Ｌｉｐｏ−Ｐａｍは、組み換えワクチンを、沈殿物を伴わずに、適切に生成し、これは、９０〜１３０ｎｍのサイズであった（表９）。加えて、表１０において示されるとおり、リポペプチド、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）および抗原を含むワクチン組成物は、１２０〜３００ｎｍのサイズを有する組み換えワクチンを形成した（表１０）。
次いで、以下の表１１において示されるとおり、調製されたワクチンを、６週齢のＣ５７ＢＬ／６メスマウス（Orient Bio Inc., Korea）に、２週間の間隔で２回、筋肉内注射した。
【０１２７】
各々の試験群についての試験ワクチンの調製条件
【表１１】
2020531579.tif 000013
【０１２８】
＜１１−２＞体液性免疫応答の分析
例＜１１−１＞において投与された試験ワクチンにより誘導された体液性免疫応答を分析するために、免疫化の前である第０週において、第１のワクチン接種の２週間後である第２週において、および第２のワクチン接種の２週間後である第４週において、マウスの血清を分離することにより、試料を調製した。組み換えＶＺＶｇＥ抗原に対する全ＩｇＧ抗体価を、調製された試料を用いて、例＜２−２＞において記載されるものと同じ様式により分析した。
結果として、図２２において示されるとおり、抗体は全試験群において生成され、特に、より高い抗体価は、他の試験群と比較して、Ｇ３、Ｇ７、ならびにリポペプチドとしてＰａｍ３−ＣＳＫＫＫＫ、Ｐａｍ２Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫおよびＦＳＬ−１を用いることにより調製されたＬｉｐｏ−ｐａｍを用いたＧ９群において誘導された（図２２）。
【０１２９】
＜１１−３＞細胞媒介性免疫応答の分析
例＜１１−１＞において投与された試験ワクチンにより誘導された細胞媒介性免疫応答を分析するために、第２のワクチン接種の２週間後である第４週において、マウスから脾臓を抽出することにより、全脾細胞を単離した。次いで、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイおよびサイトカインＥＬＩＳＡにより、例＜２−３＞において記載されるものと同じ様式により、細胞媒介性免疫応答を分析した。
【０１３０】
結果として、図２３Ａにおいて示されるとおり、ＩＦＮ−γのＥＬＩＳＰＯＴの結果により、抗体は全試験群において生成され、特に、ＩＦＮ−γは、リポペプチドとしてＰａｍ３−ＣＳＫＫＫＫ、Ｄｈｃ−ＳＫＫＫＫ、Ｐａｍ−ＣＳＫＫＫＫまたはＰＨＣ−ＳＫＫＫＫを用いることにより調製されたＬｉｐｏ−ｐａｍを用いたＧ３、Ｇ４、Ｇ６およびＧ８群において、良好に生成された。加えて、ＩＬ−４のＥＬＩＳＰＯＴの結果により、ＩＬ−４は、リポペプチドとしてＰａｍ３−ＣＳＫＫＫＫ、Ｄｈｃ−ＳＫＫＫＫ、Ｐａｍ２Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫまたはＰＨＣ−ＳＫＫＫＫを用いたＧ３、Ｇ４、Ｇ７およびＧ８群において、良好に産生された（図２３Ａ）。
【０１３１】
図２３Ｂにおいて示されるとおり、サイトカインＥＬＩＳＡの結果により、リポペプチドとしてＰａｍ３−ＣＳＫＫＫＫまたはＤｈｃ−ＳＫＫＫＫを用いたＧ３およびＧ４群において、より多くのＩＦＮ−γ、ＩＬ−４およびＴＮＦ−αの分泌が誘導された。
したがって、＜例１１＞の結果から、Ｌｉｐｏ−ｐａｍの調製において用いられた任意の型のリポペプチドが、体液性および細胞媒介性免疫応答を誘導し、したがって、本発明によるＬｉｐｏ−ｐａｍは、抗原と多様な型のリポペプチドとの組み合わせを用いたワクチンの調製のために用いることができることを確認した。特に、組み換え帯状疱疹ワクチンの調製において、体液性および細胞媒介性の両方の免疫応答を誘導するＰａｍ３−ＣＳＫＫＫＫは、ワクチンの効力を改善するためのリポペプチドとして用いることができる。
【０１３２】
例１２．Ｌ−ｐａｍｐｏまたはＬｉｐｏ−ｐａｍを用いて処方された日本脳炎ウイルスｇＥ抗原に対する組み換えワクチンの免疫原性の比較
組み換え日本脳炎ウイルスｇＥ抗原を用いて、Ｌ−ｐａｍｐｏまたはＬｉｐｏ−ｐａｍを用いて処方された組み換えワクチンの免疫原性を比較した。
【０１３３】
＜１２−１＞試験ワクチンの調製および投与
Ｌｉｐｏ−Ｐａｍは、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＯＰＥおよびＰａｍ３−ＣＳＫＫＫＫを溶解し、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＯＰＥおよびＰａｍ３−ＣＳＫＫＫＫを、脂質の濃度（ＤＣ−Ｃｈｏｌ：ＤＯＰＥ＝３：７）が１２５μｇ／用量となり、Ｐａｍ３−ＣＳＫＫＫＫの濃度が２５μｇ／用量となるように混合したことを除いて、例＜２−１＞において記載されるものと同じ様式により調製した。２５μｇ／用量のＰａｍ３−ＣＳＫＫＫＫ、２０μｇ／用量のＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）および０．１または０．５μｇ／用量の組み換えＪＥＶｇＥ抗原を混合することにより、Ｌ−ｐａｍｐｏを調製した。組み換えＪＥＶｇＥ抗原を、バキュロウイルス−昆虫細胞系において発現させ、精製した。次いで、Ｌｉｐｏ−Ｐａｍを４０μｇ／用量の濃度でＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）と混合し、組み換えＪＥＶｇＥ抗原を０．１または０．５μｇ／用量の濃度でそれに添加することにより、試験ワクチンを調製した。調製されたワクチンを、６週齢のＣ５７ＢＬ／６メスマウス（Orient Bio Inc., Korea）に、２週間の間隔で２回、筋肉内注射した。
【０１３４】
各々の試験群についての試験ワクチンの調製条件
【表１２】
2020531579.tif 000014
【０１３５】
＜１２−２＞体液性免疫応答の分析
例＜１２−１＞において投与された試験ワクチンにより誘導された体液性免疫応答を分析するために、免疫化の前である第０週において、第１のワクチン接種の２週間後である第２週において、および第２のワクチン接種の２週間後である第４週において、マウスの血清を分離することにより、試料を調製した。組み換えＪＥＶｇＥ抗原または不活化ＪＥＶ抗原を、９６ウェルのマイクロプレート上に１００ｎｇ／ウェルの濃度でコーティングしたことを除いて、例＜２−２＞において記載されるものと同じ様式により調製された試料を用いて、ＪＥＶｇＥ抗原に対する全ＩｇＧ抗体価を分析した。
【０１３６】
結果として、図２４Ａおよび２４Ｂにおいて示されるとおり、組み換えＪＥＶｇＥ抗原に対する全ＩｇＧ抗体価（図２４Ａ）および不活化ＪＥＶ抗原に対する全ＩｇＧ抗体価（図２４Ｂ）は、０．５μｇ／用量の抗原と共にＬｉｐｏ−ｐａｍ処方物を用いたＧ７群（Ｇ７群）において、最も高かった。組み換えＪＥＶｇＥ抗原に対する抗体のアイソタイプ分析の結果として、ＩｇＧ１型の抗体価は、Ｌ−ｐａｍｐｏを用いたＧ５群において最も高く、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ型の抗体価は、Ｌｉｐｏ−ｐａｍを用いたＧ７群において最も高かった。
【０１３７】
＜１２−３＞細胞媒介性免疫応答の分析
例＜１２−１＞において投与された試験ワクチンにより誘導された細胞媒介性免疫応答を分析するために、第２のワクチン接種の２週間後である第４週において、マウスから脾臓を抽出することにより、全脾細胞を単離した。次いで、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイおよびサイトカインＥＬＩＳＡにより、組み換えＪＥＶｇＥ抗原または不活化ＪＥＶ抗原を用いたことを除いて、例＜２−３＞において記載されるものと同じ様式により、細胞媒介性免疫応答を分析した。
【０１３８】
結果として、図２５Ａにおいて示されるとおり、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４のＥＬＩＳＰＯＴの結果により、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４は、Ｌｉｐｏ−ｐａｍを用いたＧ６およびＧ７群において最も多く産生された（図２５Ａ）。
図２５Ｂにおいて示されるとおり、サイトカインＥＬＩＳＡの結果により、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４およびＴＮＦ−αは、Ｌｉｐｏ−ｐａｍ処方物（Ｇ６およびＧ７群）、Ｌ−ｐａｍｐｏ処方物（Ｇ４およびＧ５群）および不活化ワクチン（Ｇ２およびＧ３群）の順で分泌された（図２５Ｂ）。
【０１３９】
したがって、＜例１２＞の結果より、組み換え日本脳炎ワクチンの調製においてＬｉｐｏ−ｐａｍと共に免疫活性物質を使用することにより、体液性および細胞媒介性免疫応答を誘導することにより、ワクチンの効力が改善されたことを確認した。このことは、Ｌｉｐｏ−ｐａｍが、多様な抗原に対する免疫増強効果を有することを示唆する。
【０１４０】
例１３．ミョウバン、Ｌ−ｐａｍｐｏまたはＬｉｐｏ−ｐａｍを用いて処方された、季節性不活性型インフルエンザウイルス抗原に対するワクチンの免疫原性の比較
季節性不活性型インフルエンザウイルス抗原を用いて、ミョウバン、Ｌ−ｐａｍｐｏまたはＬｉｐｏ−ｐａｍを用いて処方されたワクチンの免疫原性を比較した。
【０１４１】
＜１３−１＞試験ワクチンの調製および投与
Ｌｉｐｏ−Ｐａｍは、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＯＰＥ、ＤＰＰＣおよびＰａｍ３−ＣＳＫＫＫＫを溶解し、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＯＰＥ、ＤＰＰＣおよびＰａｍ３−ＣＳＫＫＫＫを、脂質の濃度（ＤＣ−Ｃｈｏｌ：ＤＯＰＥ＝３：７またはＤＣ−Ｃｈｏｌ：ＤＯＰＥ＝１：１）が１２５μｇ／用量となり、Ｐａｍ３−ＣＳＫＫＫＫの濃度が２５μｇ／用量となるように混合したことを除いて、例＜２−１＞において記載されるものと同じ様式により調製した。２５μｇ／用量のＰａｍ３−ＣＳＫＫＫＫ、２０μｇ／用量のＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、および０．５μｇ／用量の４株の季節性不活性型インフルエンザウイルス抗原を混合することにより、Ｌ−ｐａｍｐｏを調製した。４株の季節性不活性型インフルエンザウイルス抗原は、A/California/07/2009（Ｈ１Ｎ１）、A/Hong Kong/4801/2014（Ｈ３Ｎ２）、B/Phuket/3073/2013（ＢＹ）およびB/Brisbane/60/2008（ＢＶ）から得られた。これらの抗原を、卵中で増幅させ、産生させ、精製した。次いで、Ｌｉｐｏ−Ｐａｍを４０μｇ／用量の濃度でＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）と混合し、季節性不活性型インフルエンザウイルス抗原を０．５μｇ／用量の濃度でそれに添加することにより、試験ワクチンを調製した。調製されたワクチンを、６週齢のＣ５７ＢＬ／６メスマウス（Orient Bio Inc., Korea）に、２週間の間隔で２回、筋肉内注射した。
【０１４２】
各々の試験群についての試験ワクチンの調製条件
【表１３】
2020531579.tif 000015
【０１４３】
＜１３−２＞体液性免疫応答の分析
例＜１３−１＞において投与された試験ワクチンにより誘導された体液性免疫応答を分析するために、免疫化の前である第０週において、第１のワクチン接種の２週間後である第２週において、および第２のワクチン接種の２週間後である第４週において、マウスの血清を分離することにより、試料を調製した。調製された試料を用いて、４株の季節性不活性型インフルエンザウイルス抗原を、９６ウェルのマイクロプレート中に、それぞれ２５ｎｇ／ウェルの濃度でコーティングしたことを除いて、例＜２−２＞において記載されるものと同じ様式により、季節性不活性型インフルエンザウイルス抗原に対する全ＩｇＧ抗体価を分析した。
【０１４４】
結果として、図２６において示されるとおり、季節性不活性型インフルエンザウイルス抗原に対する全ＩｇＧ抗体価は、４株全てにおいて、Ｇ４群（Ｌ−ｐａｍｐｏ処方物）において最も高く、また、Ｇ５およびＧ６群（Ｌｉｐｏ−ｐａｍ処方物）においても優れていた。特に、Ｇ６群（ＤＣ−Ｃｈｏｌ：ＤＰＰＣ＝１：１）において、高いＩｇＧ抗体価が観察された。一方、抗原のみを投与されたＧ２群および免疫増強剤としてミョウバンを用いたＧ３群における全ＩｇＧ抗体価は、Ｌｉｐｏ−ｐａｍ処方物を用いた試験群におけるものよりも、著しく低かった（図２６）。
【０１４５】
＜１３−３＞細胞媒介性免疫応答の分析
例＜１３−１＞において投与された試験ワクチンにより誘導された細胞媒介性免疫応答を分析するために、第２のワクチン接種の２週間後である第４週において、マウスから脾臓を抽出することにより、全脾細胞を単離した。次いで、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイおよびサイトカインＥＬＩＳＡにより、４株の季節性不活性型インフルエンザウイルス抗原を用いたことを除いて、例＜２−３＞において記載されるものと同じ様式により、細胞媒介性免疫応答を分析した。
【０１４６】
結果として、図２７において示されるとおり、ＩＦＮ−γのＥＬＩＳＰＯＴの結果により、ＩＦＮ−γは、４株の季節性不活性型インフルエンザウイルス抗原に対して、Ｇ５およびＧ６群（Ｌｉｐｏ−ｐａｍ処方物）において、最も多く産生された（図２７）。図２８において示されるとおりＩＬ−４のＥＬＩＳＰＯＴの結果により、ＩＬ−４はまた、Ｇ５およびＧ６群（Ｌｉｐｏ−ｐａｍ処方物）においても分泌され、これはまた、抗原のみを投与されたＧ２群およびミョウバンを添加されたＧ３群よりも低かった（図２８）。
【０１４７】
図２９〜３１において示されるとおり、サイトカインＥＬＩＳＡの結果により、Ｇ５およびＧ６群（Ｌｉｐｏ−ｐａｍ処方物）において、多くのＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αが産生された（図２９および３０）。ＩＬ−４はまた、Ｇ５およびＧ６群においても分泌され、これは、抗原のみを投与されたＧ２群およびミョウバンを添加されたＧ３群におけるものよりも低かった（図３１）。
【０１４８】
したがって、＜例１３＞の結果から、季節性不活性型インフルエンザウイルスワクチンの調製におけるアジュバントとしてのＬｉｐｏ−ｐａｍの使用が、体液性および細胞媒介性免疫応答を誘導することにより、ワクチンの効力を改善したことを確認した。上から、また、本発明によるワクチンアジュバントＬｉｐｏ−ｐａｍは、多様な種類の抗原と共に、抗原の型を限定することなく、用いることができることを確認した。
【図１】
2020531579.tif 000016
【図２】
2020531579.tif 000017
【図３】
2020531579.tif 000018
【図４Ａ】
2020531579.tif 000019
【図４Ｂ】
2020531579.tif 000020
【図５】
2020531579.tif 000021
【図６】
2020531579.tif 000022
【図７Ａ】
2020531579.tif 000023
【図７Ｂ】
2020531579.tif 000024
【図８】
2020531579.tif 000025
【図９Ａ】
2020531579.tif 000026
【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年4月3日(2020.4.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2020531579000001.app
【国際調査報告】
2020531579.tif 000056
2020531579.tif 000057
2020531579.tif 000058
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