(57)【要約】  本発明は、患者の急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の処置に関する。具体的には、本発明は、キナーゼ経路阻害剤により効果的に処置され得るＡＭＬ患者を特定するための改善された方法と、キナーゼ経路阻害剤が個々の患者のＡＭＬの処置に有効であり得るかどうかを予測するための改善された方法とに関する。本発明はまた、急性骨髄性白血病を患っている複数例の患者をスクリーニングして、これらの患者の内のいずれか１例または複数例の急性骨髄性白血病がキナーゼ経路阻害剤により効果的に処置され得るかどうかを決定する方法も含む。本発明はさらに、キナーゼ経路阻害剤によるそのような患者の処置の方法と、そのような方法での使用のためのキナーゼ経路阻害剤とを提供する。
2020524802.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個々の患者の急性骨髄性白血病の処置におけるキナーゼ経路阻害剤の有効性を予測する方法であって、このキナーゼ経路阻害剤は、細胞増殖または細胞生存に関与するシグナル伝達経路を阻害し、前記方法は、下記の工程：
（ａ）以下により、前記患者の白血病の分化状態を決定する工程；
（１）ＦＥＳ、ＰＫＳおよびプロテインキナーゼＣアイソフォーム（たとえば、ＰＫＣδ（ＫＰＣＤ）、ＰＲＫＣＡ、ＰＲＫＣＢ、およびＰＲＫＣＤ）、ＰＫＡ、ＰＡＫ（たとえば、ＰＡＫ１およびＰＡＫ２）、ＳＴＫ１０、ＧＳＫ３Ａ、ＲＳＫ２、ＲＡＳ、ＲＡＦ、ＭＥＫ（たとえば、ＭＥＫ１（ＭＡＰ２Ｋ１））、ＥＲＫ（たとえば、ＭＡＰＫ３（ＥＲＫ１）およびＭＡＰＫ１（ＥＲＫ２））、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ（たとえば、ＡＫＴ１）、ＭＴＯＲ、Ｓ６キナーゼ、ＳＴＡＴ５、ＣＡＭＫＫ、ＳＹＫ（ＫＳＹＫ）、ＬＹＮ、Ｐ３８Ａ、ＣＤＫ１、ＣＫ２Ａ１、ＰＫＡＣＡ、ＩＲＡＫ４、ＰＫＣＢ  ｉｓｏ２、Ｃｏｔ、ＰＫＣＤ、ＰＫＣＡ、ＰＫＣＢ、ＰＫＣＧ、ＰＫＣＨ、ＢＲＡＦ、ＭＥＫ２、ＰＤＫ１、ＣＤＫ２、ＰＴＮ６、Ｄ３（ＰＬＤ３）、ＩＱＧＡＰ１、ＧＲＢ２、ＲＨＯＡ、ＲＨＯＧ、並びにＳ１０ＡＢの内のいずれか１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、若しくはより多くにおける１箇所若しくは複数箇所のリン酸化部位の、前記患者から得られた白血病細胞におけるリン酸化に関するデータを分析することにより；並びに／または
（２）ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ（インテグリンα−Ｘ、ＩＴＡＸ）、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８（インテグリンβ、ＩＴＢ２）、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５（ＣＲ１）、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ９７、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１８０、ＣＤ１８４、ＨＬＡ−Ｃ（１Ｃ０２）、ＡＰＯＢＲ、血小板膜レセプターＧｉ２４（ＶＳＩＲ）およびＨＬＡ−ＤＲの内の、１つ若しくは複数を含む細胞表面マーカータンパク質のパネル、並びに／または前記１つ若しくは複数の細胞表面マーカータンパク質と併せて発現されるあらゆる細胞表面タンパク質について、前記患者から得られた白血病細胞上での表面発現に関するデータを分析することにより；
ここで、前記１箇所若しくは複数箇所のリン酸化部位のリン酸化若しくは高レベルでのリン酸化、および／または前記白血病細胞上における高レベルでの前記細胞表面マーカータンパク質のパネルの発現は、進行した分化状態を示す；並びに
（ｂ）前記白血病の分化状態が進行している場合には、前記患者の急性骨髄性白血病が前記キナーゼ経路阻害剤で効果的に処置され得ると予測する工程；
を含む、方法。
【請求項２】
急性骨髄性白血病を有する複数例の患者をスクリーニングして、前記複数例の患者の内のいずれか１例または複数例の急性骨髄性白血病がキナーゼ経路阻害剤により効果的に処置され得るかどうかを決定する方法であって、このキナーゼ経路阻害剤は、細胞増殖または細胞生存に関与するシグナル伝達経路を阻害し、前記方法は、下記の工程を含む：
（ａ）各患者に関して、下記により、前記患者の白血病の分化状態を決定する工程：
（１）ＦＥＳ、ＰＫＣ並びにプロテインキナーゼＣアイソフォーム（たとえば、ＰＫＣδ（ＫＰＣＤ）、ＰＲＫＣＡ、ＰＲＫＣＢおよびＰＲＫＣＤ）、ＰＫＡ、ＰＡＫ（たとえば、ＰＡＫ１およびＰＡＫ２）、ＳＴＫ１０、ＧＳＫ３Ａ、ＲＳＫ２、ＲＡＳ、ＲＡＦ、ＭＥＫ（たとえば、ＭＥＫ１（ＭＡＰ２Ｋ１）、ＥＲＫ（たとえば、ＭＡＰＫ３（ＥＲＫ１）およびＭＡＰＫ１（ＥＲＫ２）、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ（たとえば、ＡＫＴ１）、ＭＴＯＲ、Ｓ６キナーゼ、ＳＴＡＴ５、ＣＡＭＫＫ、ＳＹＫ（ＫＳＹＫ）、ＬＹＮ、Ｐ３８Ａ、ＣＤＫ１、ＣＫ２Ａ１、ＰＫＡＣＡ、ＩＲＡＫ４、ＰＫＣＢ  ｉｓｏ２、Ｃｏｔ、ＰＫＣＤ、ＰＫＣＡ、ＰＫＣＢ、ＰＫＣＧ、ＰＫＣＨ、ＢＲＡＦ、ＭＥＫ２、ＰＤＫ１、ＣＤＫ２、ＰＴＮ６、Ｄ３（ＰＬＤ３）、ＩＱＧＡＰ１、ＧＲＢ２、ＲＨＯＡ、ＲＨＯＧ、並びにＳ１０ＡＢの内のいずれか１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、若しくはより多くにおける１箇所若しくは複数箇所のリン酸化部位の、前記患者から得られた白血病細胞におけるリン酸化に関するデータを分析すること；並びに／または
（２）ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ（インテグリンα−Ｘ、ＩＴＡＸ）、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８（インテグリンβ、ＩＴＢ２）、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５（ＣＲ１）、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ９７、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１８０、ＣＤ１８４、ＨＬＡ−Ｃ（１Ｃ０２）、ＡＰＯＢＲ、血小板膜レセプターＧｉ２４（ＶＳＩＲ）、およびＨＬＡ−ＤＲの内の１つ若しくは複数を含む細胞表面マーカータンパク質、並びに／または前記１つ若しくは複数の細胞表面マーカータンパク質と併せて発現されるあらゆる細胞表面タンパク質のパネルの、前記患者から得られた白血病細胞上での表面発現に関するデータを分析すること；
前記１箇所若しくは複数箇所のリン酸化部位のリン酸化若しくは高レベルでのリン酸化、および／または前記白血病細胞上における高レベルでの前記細胞表面マーカータンパク質のパネルの発現は、進行した分化状態を示す；並びに
（ｂ）前記キナーゼ経路阻害剤による効果的な処置に適した白血病を有するとして、分化状態が進行している白血病を有するいずれか１例または複数例の患者を特定する工程
を含む、方法。
【請求項３】
前記細胞表面マーカータンパク質のパネルが以下を含む、請求項１または２に記載の方法：
（ｉ）ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ（インテグリンα−Ｘ、ＩＴＡＸ）、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８（インテグリンβ、ＩＴＢ２）、ＣＤ３３、ＣＤ３５（ＣＲ１）、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ９７、ＣＤ１２３、ＣＤ１８０、ＨＬＡ−Ｃ（１Ｃ０２）、ＡＰＯＢＲ、血小板膜レセプターＧｉ２４（ＶＳＩＲ）、およびＨＬＡ−ＤＲの内のいずれか１個、２個、若しくは３個、若しくは４個、若しくは５個、若しくは６個、若しくは７個、若しくは８個、若しくは９個、若しくは１０個、若しくは１１個、若しくは１２個、若しくは１３個、若しくは１４個、若しくは１５個、若しくは１６個、若しくは１７個、若しくは１８個、若しくは全て；または
（ｉｉ）ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ１２３、およびＨＬＡ−ＤＲの内のいずれか１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、若しくは全て；または
（ｉｉｉ）ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１８４、およびＨＬＡ−ＤＲの内のいずれか１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、若しくは全て。
【請求項４】
前記細胞表面マーカータンパク質のパネルが、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ１２３、およびＨＬＡ−ＤＲを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記リン酸化部位が、以下におけるリン酸化部位である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法：
（ｉ）ＰＫＣ、ＥＲＫ、ＰＡＫ１、およびＰ３８αの内のいずか１個、２個、３個、若しくは４個；または
（ｉｉ）ＰＫＣＤ、ＰＫＣＡ、ＰＫＡＣＡ、ＩＲＡＫ４、およびＣＫ２Ａ１の内のいずれか１個、２個、３個、４個、若しくは５個；または
（ｉｉｉ）ＭＡＰＫ１、ＭＡＰＫ２、ＡＫＴ、ＡＫＴ１Ｓ１、ＭＡＰ２Ｋ１、およびＭＡＰ２Ｋ２の内のいずれか１個、２個、３個、４個、５個、若しくは６個；または
（ｉｖ）ＧＳＫ３Ａ、ＰＲＫＣＡ、ＰＲＫＣＢ、ＰＲＫＣＤ、ＳＴＫ１０、ＰＡＫ１、ＰＡＫ２、ＭＡＰＫ１、およびＭＡＰＫ３の内のいずれか１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、若しくは９個。
【請求項６】
前記リン酸化部位が、以下である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法：
（ｉ）表１に記載のリン酸化部位の内のいずれか１箇所、２箇所、３箇所、４箇所、５箇所、６箇所、７箇所、８箇所、９箇所、１０箇所、若しくは１０箇所超；または
（ｉｉ）表２に記載のリン酸化部位の内のいずれか１箇所、２箇所、３箇所、４箇所、５箇所、６箇所、７箇所、８箇所、９個、１０箇所、若しくは１０箇所超；または
（ｉｉｉ）Ｓ１４４でのＰＡＫ１、Ｓ１４１でのＰＡＫ２、Ｙ１８７でのＭＡＰＫ１、Ｔ１８５でのＭＡＰＫ１、Ｓ３８０でのＲＰＳ６ＫＡ１、Ｔ２０２でのＭＡＰＫ３、Ｙ２０４でのＭＡＰＫ３、Ｓ１６６でのＭＡＰ３Ｋ３、Ｓ２９５およびＳ２９７でのＳＹＫ、Ｓ１１０でのＩＲＡＫ３、ＰＫＮ１（３７９〜３９６＋ホスホＳＴ）、ＳＴＫ１０（４４７〜４６４＋ホスホＳＴ）、Ｓ４１０でのＲＩＰＫ３、Ｔ２１８でのＰＲＫＣＤ、Ｔ２９５でのＰＲＫＣＤ、Ｙ３１３でのＰＲＫＣＤ、Ｔ５０７でのＰＲＫＣＤ、Ｔ６４５でのＰＲＫＣＤ、Ｓ６６４でのＰＲＫＣＤ、Ｔ２６３８でのＰＲＫＣＤ、Ｓ５３５でのＭＡＲＫ２、Ｓ５３５でのＭＡＰ３Ｋ２、ＰＲＫＤ２（７１０〜７３０＋ホスホＹ）、ｓ８０５でのＮＲＫ、Ｓ５８でのＰＲＫＡＲ２Ａ、ＺＡＫ（５９１〜６１６＋ホスホＳＴ）、Ｓ９００でのＭＡＰ４Ｋ４、Ｓ３４７でのＣＤＫ９、ＲＰＳ６ＫＡ４（６８１〜６９９＋２ホスホＳＴ）、ＭＡＳＴ３（１２５４〜１２７４＋ホスホＳＴ）、ＮＥＫ９（１０〜３９＋ホスホＳＴ）、ＧＳＫ３Ａ（１９〜５０＋ホスホＳＴ）、Ｓ３６９でのＲＰＳ６ＫＡ３、Ｓ５３１でのＲＩＰＫ２、Ｔ６０６でのＡＡＫ１、Ｙ２９２でのＴＹＫ２、Ｓ２１４でのＰＤＰＫ２、ＰＲＫＡＡ１（３〜８＋ホスホＳＴ）、Ｓ７７２でのＳＴＫ１１Ｐ、Ｓ１４６８でのＢＡＺ１Ｂ、Ｓ１４０でのＣＬＫ１、Ｓ３２８でのＭＡＰ４Ｋ２、ＷＮＫ１（１９９６〜２０２１＋ホスホＳＴ）、Ｓ２７１でのＣＤＫ１１Ａ、Ｙ７１３でのＦＥＳ、および／若しくはＳ７６９でのＴＮＩＫの内のいずれか１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、若しくは１０個超；または
（ｉｖ）Ｓ１４４でのＰＡＫ１、Ｓ１４１でのＰＡＫ２、Ｙ１８７および／若しくはＴ１８５でのＭＡＰＫ１、並びにＳ３８０でのＲＰＳ６ＫＡ１；または
（ｖ）Ｙ１８７でのＭＡＰＫ１、Ｓ１４１でのＰＡＫ２、およびＹ３１３でのＰＲＫＣＤ；または
（ｖｉ）Ｙ７１３でのＦＥＳ、Ｔ２０２／Ｙ２０４でのＭＡＰＫ３、Ｔ１８５／Ｙ１８７でのＭＡＰＫ１、Ｓ１４４でのＰＡＫ１、Ｓ２２２でのＭＥＫ１、Ｓ１４１でのＰＡＫ２、およびＳ６４５でのＰＲＫＣＤ；または
（ｖｉｉ）Ｓ２１でのＧＳＫ３Ａ、並びに／またはＴ５０７、Ｔ２９５、Ｔ２１８、Ｙ３１３、Ｔ５０７および／若しくはＳ６６４でのＰＲＫＣＤ、並びに／またはＳ２０および／若しくはＳ１３でのＳＴＫ１０、並びに／またはＳ１４４でのＰＡＫ１、並びに／またはＳ１４１でのＰＡＫ２；
（ｖｉｉｉ）ＭＡＰＫ１、たとえばＹ１８７および／若しくはＴ１８５でのＭＡＰＫ１、並びにＴ２０２および／若しくはＹ２０４でのＭＡＰＫ３、並びにＳ２１でのＧＳＫ３Ａでの１箇所若しくは複数箇所のリン酸化部位。
【請求項７】
工程（ａ）が、以下を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法：
（ｉ）前記患者から得られた白血病細胞でのＭＡＰＫ１および／若しくはＭＡＰＫ３における１箇所若しくは複数箇所のリン酸化部位のリン酸化に関するデータを分析することにより、前記患者の白血病の分化状態を決定すること；並びに／または
（ｉｉ）ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ１２３、およびＨＬＡ−ＤＲからなるＣＤマーカーの群の、前記患者から得られた白血病細胞上での表面発現に関するデータを分析することにより、前記患者の白血病の分化状態を決定すること；
ここで、前記１箇所若しくは複数箇所のリン酸化部位での、リン酸化若しくは高レベルでのリン酸化、および／または前記白血病細胞上における高レベルでの前記ＣＤマーカーの群の発現は、進行した分化状態を示す。
【請求項８】
前記キナーゼ経路阻害剤は、ＭＥＫ阻害剤、ＦＬＴ３／ＰＫＣ阻害剤、およびＰＡＫ阻害剤から選択されるキナーゼ阻害剤である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記キナーゼ経路阻害剤は、トラメチニブ等のＭＥＫ阻害剤であり、
工程（ａ）は、白血病細胞の遺伝子型に関するデータを分析することにより、前記患者から得られた白血病細胞におけるＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、またはＢＲＡＦの変異状態を決定することをさらに含み；そして、
工程（ｂ）は、前記白血病の分化状態が進行している場合、または前記白血病細胞におけるＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、若しくはＢＲＡＦの内のいずれか１つが活性化変異を有する場合には、前記患者の急性骨髄性白血病を前記キナーゼ経路阻害剤で効果的に処置し得ると予測することを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記キナーゼ経路阻害剤は、トラメチニブ等のＭＥＫ阻害剤であり、工程（ａ）は、
（ｉ）前記白血病細胞の遺伝子型に関するデータを分析することにより、前記患者から得られた白血病細胞におけるＦＬＴ３の変異状態を決定すること；並びに／または
（ｉｉ）前記白血病細胞におけるＦＬＴ３駆動型キナーゼシグナル伝達経路の活性マーカーに関するデータを分析することにより、ＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路以外の細胞増殖若しくは細胞生存に関与するＦＬＴ−３駆動型シグナル伝達経路（たとえば、ＰＫＣ経路、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ＭＴＯＲ−Ｓ６Ｋ経路、ＰＡＫ経路、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路、若しくはＣＡＭＫＫ経路）の前記白血病細胞における活性化を決定すること；並びに／または
（ｉｉｉ）前記白血病細胞におけるＴＯＰ２Ａおよび／若しくはＫＤＭ５Ｃのリン酸化に関するデータを分析することにより、前記白血病細胞におけるＴＯＰ２Ａおよび／若しくはＫＤＭ５Ｃの内の一方若しくは両方のリン酸化のレベルを決定すること；
をさらに含み、
工程（ｂ）は、
（１）前記白血病の分化状態が進行している；且つ
（２）前記白血病細胞においてＦＬＴ３が活性化変異を有しないか、または前記ＦＬＴ３駆動型キナーゼシグナル伝達経路が前記白血病細胞において活性化されていないか、またはＴＯＰ２Ａおよび／若しくはＫＤＭ５Ｃが前記白血病細胞においてリン酸化されていないか若しくは低レベルでリン酸化されている場合には、
前記患者の急性骨髄性白血病を前記ＭＥＫ阻害剤で効果的に処置し得ると予測することを含む、
請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記キナーゼ経路阻害剤は、トラメチニブ等のＭＥＫ阻害剤であり、
工程（ａ）は、
（ｉ）前記白血病細胞の遺伝子型に関するデータを分析することにより、前記患者の白血病の分化状態を決定すること、および／または前記患者から得られた白血病細胞におけるＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、またはＢＲＡＦの変異状態を決定すること；並びに
（ｉｉ）前記白血病細胞の遺伝子型に関するデータを分析することにより、前記患者から得られた白血病細胞におけるＦＬＴ３の変異状態を決定すること、
並びに／または前記白血病細胞におけるＦＬＴ３駆動型キナーゼシグナル伝達経路の活性マーカーに関するデータを分析することにより、前記ＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路以外の細胞増殖若しくは細胞生存に関与するＦＬＴ−３駆動型キナーゼシグナル伝達経路の前記白血病細胞における活性化を決定すること；
並びに／または前記白血病細胞におけるＴＯＰ２Ａおよび／若しくはＫＤＭ５Ｃのリン酸化に関するデータを分析することにより、前記白血病細胞におけるＴＯＰ２Ａおよび／若しくはＫＤＭ５Ｃの内の一方若しくは両方のリン酸化のレベルを決定すること；
を含み；
工程（ｂ）は、前記患者の急性骨髄性白血病を前記ＭＥＫ阻害剤で効果的に処置し得ると予測することを含み、ここで、
（１）前記白血病の分化状態は進行しているか、または前記白血病細胞においてＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、またはＢＲＡＦの内のいずれか１つが活性化変異を有し、且つ
（２）前記白血病細胞において、ＦＬＴ３は活性化変異を有しないか、または前記ＦＬＴ３駆動型キナーゼシグナル伝達経路は活性化されていないか、またはＴＯＰ２Ａおよび／若しくはＫＤＭ５Ｃは前記白血病細胞においてリン酸化されていないか若しくは低レベルでリン酸化されている、
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＦＬＴ３駆動型キナーゼシグナル伝達経路の前記活性マーカーは、前記ＦＬＴ３駆動型キナーゼシグナル伝達経路により選択的にリン酸化される１箇所または複数箇所のリン酸化部位を含み、前記活性マーカーに関するデータは、前記１箇所または複数箇所のリン酸化部位のリン酸化に関するデータを含み、前記１箇所または複数箇所のリン酸化部位のリン酸化または高レベルのリン酸化は、前記ＦＬＴ３駆動型キナーゼシグナル伝達経路が活性化されていることを示す、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記１箇所または複数箇所のリン酸化部位が、ＳＴＡＴ５ＡおよびＣＡＭＫＫ１の内の一方または両方におけるリン酸化部位を含み、たとえば、Ｓ７８０および／若しくはＳ１２８でのＳＴＡＴ５Ａ、並びに／またはＳ５４８でのＣＡＭＫＫ１を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記白血病細胞におけるＴＯＰ２Ａおよび／またはＫＤＭ５Ｃのリン酸化に関する前記データは、ＴＯＰ２Ａおよび／またはＫＤＭ５Ｃのリン酸化に関するデータ（たとえば、Ｓ１２１３でのＴＯＰ２Ａのリン酸化および／またはＳ３１７でのＫＤＭ５Ｃのリン酸化に関するデータ）を含む、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記キナーゼ経路阻害剤は、ミドスタウリン等のＦＬＴ３／ＰＫＣ経路阻害剤であり、工程（ａ）は、以下によって、前記患者の白血病の分化状態を決定することを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法：
（ｉ）前記患者から得られた白血病細胞でのＧＳＫ３Ａ、ＰＲＫＣＡ、ＰＲＫＣＢ、ＰＲＫＣＤ、ＳＴＫ１０、ＰＡＫ１、ＰＡＫ２ＭＡＰＫ１、および／若しくはＭＡＰＫ３の内の１つ若しくは複数におけるリン酸化部位のリン酸化に関するデータを分析すること；並びに／または
（ｉｉ）ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４ＰＫＣ５、ＣＤ６４、ＣＤ１２３、およびＨＬＡ−ＤＲからなるＣＤマーカーの群の、前記患者から得られた白血病細胞上での表面発現に関するデータを分析すること；
ここで、ＧＳＫ３Ａ、ＰＲＫＣＡ、ＰＲＫＣＢ、ＰＲＫＣＤ、ＳＴＫ１０、ＰＡＫ１、ＰＡＫ２、ＭＡＰＫ１、および／若しくはＭＡＰＫ３の内のいずれか１つ若しくは複数の前記白血病細胞におけるリン酸化若しくは高レベルのリン酸化；または高レベルでの前記ＣＤマーカーの群の前記白血病細胞による発現のいずれかは、進行した分化状態を示す、
【請求項１６】
個々の患者の急性骨髄性白血病の処置におけるミドスタウリンの有効性を予測する方法であって、以下の工程を含む方法：
（ａ）（ｉ）ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ１２３、およびＨＬＡ−ＤＲからなるＣＤマーカーの群の、前記患者の白血病細胞の表面上における発現に関するデータを分析して、前記ＣＤマーカーの群が前記患者の白血病細胞の表面上において高レベルで発現されているかどうかを決定する工程；並びに／または
（ｉｉ）ｐＳ２１でのＧＳＫ３Ａ；ＰＲＫＣＤのＹ３１３、ｐＴ５０７、ｐＴ２９５、ｐＴ２１８、および／若しくはｐＳ６６４でのＰＲＫＣＤ；ＳＴＫ１０のｐＳ２０および／若しくはｐＳ１３でのＳＴＫ１０；ＰＡＫ１のｐＳ１４４でのＰＡＫ１；ＰＡＫ２のｐＳ１４１でのＰＡＫ２；Ｙ１８７および／若しくはＴ１８５でのＭＡＰＫ１；並びにＴ２０２および／若しくはＹ２０４でのＭＡＰＫ３から選択される１箇所若しくは複数箇所のリン酸化部位での前記白血病細胞におけるリン酸化に関するデータを分析して、前記リン酸化部位の内の１箇所若しくは複数箇所が前記患者の白血病細胞においてリン酸化されているか若しくは高レベルでリン酸化されているかを決定する工程；並びに
（ｂ）前記ＣＤマーカーの群が前記患者の白血病細胞の表面上において高レベル発現されており、および／または前記白血病細胞における前記リン酸化部位の内の１箇所若しくは複数箇所がリン酸化されているか若しくは高レベルでリン酸化されている場合には、前記患者の急性骨髄性白血病をミドスタウリンで効果的に処置し得ると予測する工程。
【請求項１７】
個々の患者の急性骨髄性白血病の処置におけるトラメチニブの有効性を予測する方法であって、以下の工程を含む方法：
（ａ）（ｉ）ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ１２３、およびＨＬＡ−ＤＲからなるＣＤマーカーの群の、前記患者の白血病細胞の表面上における発現に関するデータを分析して、前記ＣＤマーカーの群が前記患者の白血病細胞の表面上において高レベルで発現されているかどうかを決定する工程；並びに／または
（ｉｉ）Ｙ１８７および／若しくはＴ１８５でのＭＡＰＫ１、並びにＴ２０２および／若しくはＹ２０４でのＭＡＰＫ３から選択される、１箇所若しくは複数箇所のＭＥＫ関連リン酸化部位での前記白血病細胞におけるリン酸化に関するデータを分析して、前記ＭＥＫ関連リン酸化部位の内の１箇所若しくは複数箇所が、前記患者の白血病細胞においてリン酸化されているか若しくは高レベルでリン酸化されているかを決定する工程；並びに／または
（ｉｉｉ）前記患者の前記白血病細胞での、ＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、若しくはＢＲＡＦの内のいずれか１つ若しくは複数におけるあらゆる活性化変異の有無に関するデータを分析して、前記患者の白血病細胞での、ＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、若しくはＢＲＡＦの内のいずれか１つ若しくは複数において、活性化変異が存在しているかどうかを決定する工程；
並びに
（ｂ）（ｉ）ｐＳ７８０および／若しくはｐＳ１２８でのＳＴＡＴ５Ａ、ｐＳ５４８でのＣＡＭＫＫ１、ｐＳ１２１３でのＴＯＰ２Ａ、並びにＫＤＭ５ＣのｐＳ３１７でのＫＤＭ５Ｃから選択される１箇所若しくは複数箇所のマーカー部位での、前記白血病細胞におけるリン酸化に関するデータを分析して、前記マーカー部位が前記患者の白血病細胞においてリン酸化されているか若しくは高レベルでリン酸化されているかを決定する工程；並びに／または
（ｉｉ）前記患者の前記白血病細胞でのＦＬＴ３におけるあらゆる活性化変異の有無に関するデータを分析して、前記患者の白血病細胞でのＦＬＴ３において活性化変異が存在しているかどうかを決定する工程；
並びに
（ｃ）（Ａ）前記ＣＤマーカーの群が、前記患者の白血病細胞の前記表面上において高レベルで発現され、および／または前記白血病細胞における前記ＭＥＫ関連リン酸化部位の内の１箇所若しくは複数箇所がリン酸化されているか若しくは高レベルでリン酸化され、および／または前記患者の前記白血病細胞での、ＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、若しくはＢＲＡＦの内のいずれか１つ若しくは複数において活性化変異が存在し；並びに
（Ｂ）前記マーカー部位が前記患者の白血病細胞においてリン酸化されていないか若しくは高レベルでリン酸化されておらず、および／または前記患者の白血病細胞でのＦＬＴ３において活性化変異が存在しない場合には、
前記患者の急性骨髄性白血病をトラメチニブで効果的に処置し得ると予測する工程。
【請求項１８】
急性骨髄性白血病を有する複数例の患者をスクリーニングして、前記複数例の患者の内のいずれか１例または複数例の急性骨髄性白血病がミドスタウリンにより効果的に処置され得るかどうかを決定する方法であって、以下の工程を含む方法：
（ａ）各患者に関して、
（ｉ）ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ１２３、およびＨＬＡ−ＤＲからなるＣＤマーカーの群の、前記患者の白血病細胞の表面上における発現に関するデータを分析して、前記ＣＤマーカーの群が、前記患者の白血病細胞の表面上において高レベルで発現されているかどうかを決定する工程；並びに／または
（ｉｉ）ｐＳ２１でのＧＳＫ３Ａ；ＰＲＫＣＤのＹ３１３、ｐＴ５０７、ｐＴ２９５、ｐＴ２１８、および／若しくはｐＳ６６４でのＰＲＫＣＤ；ＳＴＫ１０のｐＳ２０および／若しくはｐＳ１３でのＳＴＫ１０；ＰＡＫ１のｐＳ１４４でのＰＡＫ１；ＰＡＫ２のｐＳ１４１でのＰＡＫ２；Ｙ１８７および／若しくはＴ１８５でのＭＡＰＫ１；並びにＴ２０２および／若しくはＹ２０４でのＭＡＰＫ３から選択される１箇所若しくは複数箇所のリン酸化部位での前記白血病細胞におけるリン酸化に関するデータを分析して、前記リン酸化部位の内の１箇所若しくは複数箇所が前記患者の白血病細胞においてリン酸化されているか若しくは高レベルでリン酸化されているかを決定する工程；並びに
（ｂ）ミドスタウリンによる効果的な処置に適した白血病を有するとして、前記ＣＤマーカーの群を発現し、および／または前記白血病細胞における前記リン酸化部位の内の１箇所若しくは複数箇所でのリン酸化若しくは高レベルでのリン酸化を示す白血病細胞を有するいずれか１例のまたは複数例の患者を特定する工程。
【請求項１９】
急性骨髄性白血病を有する複数例の患者をスクリーニングして、前記複数例の患者の内のいずれか１例または複数例の急性骨髄性白血病がトラメチニブにより効果的に処置され得るかどうかを決定する方法であって、以下の工程を含む方法：
（ａ）各患者に関して、
（ｉ）ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ１２３、およびＨＬＡ−ＤＲからなるＣＤマーカーの群の、前記患者の白血病細胞の表面上における発現に関するデータを分析して、前記ＣＤマーカーの群が前記患者の白血病細胞の表面上において高レベルで発現されているかどうかを決定する工程；並びに／または
（ｉｉ）Ｙ１８７および／若しくはＴ１８５でのＭＡＰＫ１、並びにＴ２０２および／若しくはＹ２０４でのＭＡＰＫ３から選択される１箇所若しくは複数箇所のＭＥＫ関連リン酸化部位での前記白血病細胞におけるリン酸化に関するデータを分析して、前記ＭＥＫ関連リン酸化部位の内の１箇所若しくは複数箇所が前記患者の白血病細胞においてリン酸化されているか若しくは高レベルでリン酸化されているかを決定する工程；並びに／または
（ｉｉｉ）前記患者の前記白血病細胞での、ＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、若しくはＢＲＡＦの内のいずれか１つ若しくは複数におけるあらゆる活性化変異の有無に関するデータを分析して、前記患者の白血病細胞での、ＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、若しくはＢＲＡＦの内のいずれか１つ若しくは複数において活性化変異が存在しているかどうかを決定する工程；
並びに
（ｂ）各患者に関して、
（ｉ）ｐＳ７８０および／若しくはｐＳ１２８でのＳＴＡＴ５Ａ、ｐＳ５４８でのＣＡＭＫＫ１、ｐＳ１２１３でのＴＯＰ２Ａ、並びにＫＤＭ５ＣのｐＳ３１７でのＫＤＭ５Ｃから選択される１箇所若しくは複数箇所のマーカー部位での前記白血病細胞におけるリン酸化に関するデータを分析して、前記マーカー部位が前記患者の白血病細胞においてリン酸化されているか若しくは高レベルでリン酸化されているかを決定する工程；並びに／または
（ｉｉ）前記患者の前記白血病細胞でのＦＬＴ３におけるあらゆる活性化変異の有無に関するデータを分析して、前記患者の白血病細胞でのＦＬＴ３において活性化変異が存在しているかどうかを決定する工程；
並びに
（ｃ）以下の場合に、トラメチニブによる効果的な処置に適した白血病を有するとして、いずれか１例または複数例の患者を特定する工程；
（Ａ）前記ＣＤマーカーの群が、前記患者の白血病細胞の前記表面上において高レベルで発現され、および／または前記白血病細胞における前記ＭＥＫ関連リン酸化部位の内の１箇所若しくは複数箇所がリン酸化されているか若しくは高レベルでリン酸化され、および／または、前記患者の前記白血病細胞での、ＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、若しくはＢＲＡＦの内のいずれか１つ若しくは複数において活性化変異が存在し；並びに
（Ｂ）前記マーカー部位が、前記患者の白血病細胞においてリン酸化されていないか若しくは高レベルでリン酸化されておらず、および／または前記患者の白血病細胞でのＦＬＴ３において活性化変異が存在しない場合。
【請求項２０】
請求項１または請求項１に従属するいずれかの請求項に記載の個々の患者の急性骨髄性白血病の処置におけるキナーゼ経路阻害剤の有効性を予測する、コンピュータにより実行される方法であって、
（ａ）急性骨髄性白血病を患っている個々の患者を特定するデータと、前記個々の患者の白血病の分化状態を表すデータとをコンピュータで受信して、前記患者の白血病の分化状態が進行しているかどうかを決定する工程；
（ｂ）前記白血病の分化状態が進行している場合には、前記患者の急性骨髄性白血病が前記キナーゼ経路阻害剤により効果的に処置され得ることを示すために、前記個々の患者と関連している出力データを生成する工程
を含む方法。
【請求項２１】
請求項２または請求項２に従属するいずれかの請求項に記載の急性骨髄性白血病を有する複数例の患者をスクリーニングして、前記複数例の患者の内のいずれか１例または複数例の急性骨髄性白血病がキナーゼ経路阻害剤により効果的に処置され得るかどうかを決定する、コンピュータにより実行される方法であって、
（ａ）前記複数例の患者のそれぞれを特定するデータと、各患者の白血病の分化状態を表すデータとをコンピュータで受信して、各患者の白血病の分化状態が進行しているかどうかを決定する工程；および
（ｂ）患者の白血病の分化状態が進行している場合には、キナーゼ経路阻害剤による効果的な処置に適している患者を特定する出力データを生成する工程
を含む方法。
【請求項２２】
請求項２０または２１に記載の方法を実施するためのソフトウェア。
【請求項２３】
個々の患者の急性骨髄性白血病を処置する方法での使用のためのキナーゼ経路阻害剤であって、このキナーゼ経路阻害剤は、細胞増殖または細胞生存に関与するシグナル伝達経路を阻害し、前記処置は、
（ａ）下記により、前記患者の白血病の分化状態を決定すること：
（１）ＦＥＳ、ＰＫＳおよびプロテインキナーゼＣアイソフォーム（たとえば、ＰＫＣδ（ＫＰＣＤ）、ＰＲＫＣＡ、ＰＲＫＣＢ、およびＰＲＫＣＤ）、ＰＫＡ、ＰＡＫ（たとえば、ＰＡＫ１およびＰＡＫ２）、ＳＴＫ１０、ＧＳＫ３Ａ、ＲＳＫ２、ＲＡＳ、ＲＡＦ、ＭＥＫ（たとえば、ＭＥＫ１（ＭＡＰ２Ｋ１）、ＥＲＫ（たとえば、ＭＡＰＫ３（ＥＲＫ１）およびＭＡＰＫ１（ＥＲＫ２））、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ（たとえば、ＡＫＴ１）、ＭＴＯＲ、Ｓ６キナーゼ、ＳＴＡＴ５、ＣＡＭＫＫ、ＳＹＫ（ＫＳＹＫ）、ＬＹＮ、Ｐ３８Ａ、ＣＤＫ１、ＣＫ２Ａ１、ＰＫＡＣＡ、ＩＲＡＫ４、ＰＫＣＢ  ｉｓｏ２、Ｃｏｔ、ＰＫＣＤ、ＰＫＣＡ、ＰＫＣＢ、ＰＫＣＧ、ＰＫＣＨ、ＢＲＡＦ、ＭＥＫ２、ＰＤＫ１、ＣＤＫ２、ＰＴＮ６、Ｄ３（ＰＬＤ３）、ＩＱＧＡＰ１、ＧＲＢ２、ＲＨＯＡ、ＲＨＯＧ、並びにＳ１０ＡＢの内のいずれか１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、若しくはより多くにおける１箇所若しくは複数箇所のリン酸化部位の、前記患者から得られた白血病細胞におけるリン酸化に関するデータを分析すること；並びに／または
（２）ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ（インテグリンα−Ｘ、ＩＴＡＸ）、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８（インテグリンβ、ＩＴＢ２）、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５（ＣＲ１）、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ９７、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１８０、ＣＤ１８４、ＨＬＡ−Ｃ（１Ｃ０２）、ＡＰＯＢＲ、血小板膜レセプターＧｉ２４（ＶＳＩＲ）、およびＨＬＡ−ＤＲの内の１つ若しくは複数を含む細胞表面マーカータンパク質並びに／または前記１つ若しくは複数の細胞表面マーカータンパク質と併せて発現されるあらゆる細胞表面タンパク質のパネルの、前記患者から得られた白血病細胞上での表面発現に関するデータを分析すること；
ここで、前記１箇所若しくは複数箇所のリン酸化部位のリン酸化若しくは高レベルでのリン酸化、および／または前記白血病細胞上における高レベルでの前記細胞表面マーカータンパク質のパネルの発現は、進行した分化状態を示す；
並びに
（ｂ）前記白血病細胞の分化状態が進行している場合には、急性骨髄性白血病の処置のために前記患者に前記キナーゼ経路阻害剤を投与すること
を含む、キナーゼ経路阻害剤。
【請求項２４】
患者の急性骨髄性白血病を処置する方法での使用のためのキナーゼ経路阻害剤であって、このキナーゼ経路阻害剤は、細胞増殖または細胞生存に関与するシグナル伝達経路を阻害し、前記患者は、分化状態が進行している白血病細胞を有し、
（ａ）ＦＥＳ、ＰＫＳ並びにプロテインキナーゼＣアイソフォーム（たとえば、ＰＫＣδ（ＫＰＣＤ）、ＰＲＫＣＡ、ＰＲＫＣＢ、およびＰＲＫＣＤ）、ＰＫＡ、ＰＡＫ（たとえば、ＰＡＫ１およびＰＡＫ２）、ＳＴＫ１０、ＧＳＫ３Ａ、ＲＳＫ２、ＲＡＳ、ＲＡＦ、ＭＥＫ（たとえば、ＭＥＫ１（ＭＡＰ２Ｋ１））、ＥＲＫ（たとえば、ＭＡＰＫ３（ＥＲＫ１）およびＭＡＰＫ１（ＥＲＫ２））、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ（たとえば、ＡＫＴ１）、ＭＴＯＲ、Ｓ６キナーゼ、ＳＴＡＴ５、ＣＡＭＫＫ、ＳＹＫ（ＫＳＹＫ）、ＬＹＮ、Ｐ３８Ａ、ＣＤＫ１、ＣＫ２Ａ１、ＰＫＡＣＡ、ＩＲＡＫ４、ＰＫＣＢ  ｉｓｏ２、Ｃｏｔ、ＰＫＣＤ、ＰＫＣＡ、ＰＫＣＢ、ＰＫＣＧ、ＰＫＣＨ、ＢＲＡＦ、ＭＥＫ２、ＰＤＫ１、ＣＤＫ２、ＰＴＮ６、Ｄ３（ＰＬＤ３）、ＩＱＧＡＰ１、ＧＲＢ２、ＲＨＯＡ、ＲＨＯＧ、並びにＳ１０ＡＢの内のいずれか１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、若しくはより多くにおける１箇所若しくは複数箇所のリン酸化部位のリン酸化若しくは高レベルでのリン酸化；並びに／または
ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ（インテグリンα−Ｘ、ＩＴＡＸ）、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８（インテグリンβ、ＩＴＢ２）、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５（ＣＲ１）、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ９７、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１８０、ＣＤ１８４、ＨＬＡ−Ｃ（１Ｃ０２）、ＡＰＯＢＲ、血小板膜レセプターＧｉ２４（ＶＳＩＲ）、およびＨＬＡ−ＤＲの内の１つ若しくは複数を含む細胞表面マーカータンパク質並びに／または前記１つ若しくは複数の細胞表面マーカータンパク質と併せて発現されるあらゆる細胞表面タンパク質のパネルの高レベルでの表面発現、
を特徴とするキナーゼ経路阻害剤。
【請求項２５】
患者の急性骨髄性白血病を処置する方法での使用のためのミドスタウリンであって、前記患者は、以下により定義される、進行した分化状態を有する白血病を有する：
（ｉ）ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ１２３、およびＨＬＡ−ＤＲからなるＣＤマーカーの群の、前記患者の白血病細胞上における高レベルでの表面発現；並びに／または
（ｉｉ）下記：
ＧＳＫ３ＡのｐＳ２１；
ＰＲＫＣＤのｐＹ３１３、ｐＴ５０７、ｐＴ２９５、ｐＴ２１８、および／若しくはｐＳ６６４；
ＳＴＫ１０のｐＳ２０および／若しくはｐＳ１３；
ＰＡＫ１のｐＳ１４４；
ＰＡＫ２のｐＳ１４１；
ＭＡＰＫ１のＹ１８７および／若しくはＴ１８５；並びに
ＭＡＰＫ３のＴ２０２および／若しくはＹ２０４
の内のいずれか１つまたは複数の、前記患者の前記白血病細胞におけるリン酸化若しくは高レベルのリン酸化。
【請求項２６】
患者の急性骨髄性白血病を処置する方法での使用のためのトラメチニブであって、前記患者は、以下により定義される、進行した分化状態を有する白血病を有する：
（ａ）（ｉ）ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ１２３、およびＨＬＡ−ＤＲからなるＣＤマーカーの群の、前記患者の白血病細胞上における高レベルでの表面発現；並びに／または
（ｉｉ）ＭＡＰＫ１のＹ１８７および／若しくはＴ１８５；並びにＭＡＰＫのＴ２０２および／若しくはＹ２０４の内のいずれか１つ若しくは複数の、前記患者の前記白血病細胞におけるリン酸化若しくは高レベルのリン酸化；
（ｉｉｉ）前記患者の前記白血病細胞における，ＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、若しくはＢＲＡＦの内のいずれか１つ若しくは複数の活性化変異；および
（ｂ）（ｉ）ＳＴＡＴ５ＡのｐＳ７８０およびｐＳ１２８、ＣＡＭＫＫ１のｐＳ５４８、ＴＯＰ２ＡのｐＳ１２１３、およびＫＤＭ５ＣのｐＳ３１７の内の１つまたは複数でのリン酸化若しくは高レベルのリン酸化；並びに／または
（ｉｉ）前記患者の前記白血病細胞でのＦＬＴ３におけるあらゆる活性化変異の非存在。
【請求項２７】
個々の患者の急性骨髄性白血病を処置する方法であって、
（ａ）前記患者の白血病の分化状態を決定する工程；および
（ｂ）前記白血病の分化状態が進行している場合には、前記患者の急性骨髄性白血病の処置のために、細胞増殖または細胞生存に関与するシグナル伝達経路を阻害するキナーゼ経路阻害剤を前記患者に投与する工程
を含む方法。
【請求項２８】
急性骨髄性白血病を患っている個々の患者の急性骨髄性白血病を処置する方法であって、
（ａ）前記患者から、白血病細胞を含む生体サンプルを得る工程；
（ｂ）（ａ）で得られた前記サンプル中の前記白血病細胞の分化状態が進行していることを、インビトロでの臨床検査により決定する工程；および
（ｃ）前記白血病細胞の分化状態が進行している場合には、前記患者にキナーゼ経路阻害剤（このキナーゼ経路阻害剤は、細胞増殖または細胞生存に関与するシグナル伝達経路を阻害する）、を投与する工程
を含む方法。
【請求項２９】
前記生体サンプルは、末梢血サンプルまたは骨髄サンプルである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記キナーゼ経路阻害剤は、ＭＥＫ経路阻害剤、ＦＬＴ３／ＰＫＣ経路阻害剤、およびＰＡＫ経路阻害剤から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
工程（ｂ）は、前記患者から得られた前記サンプル中の前記白血病細胞の形態学的なおよび／または細胞化学的な特徴を検出することを含む、請求項２８に記載の急性骨髄性白血病を処置する方法であって、フランス系−アメリカ系−イギリス系（ＦＡＢ）分類システム下でのＭ４分類は、進行した分化状態を示す。
【請求項３２】
前記白血病細胞の形態学的なおよび／または細胞化学的な特徴を検出する前記工程は、顕微鏡による分析のために前記細胞を調製し、光学顕微鏡下で前記細胞を視覚的に観察して、分化の形態学的徴候を検出すること；並びに／または特定の条件または試験試薬（たとえば、スダンブラックＢ、および／またはペルオキシダーゼ、および／または特異的な若しくは非特異的なエステラーゼ）に対する前記細胞の挙動、活性、または反応をアッセイすることを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
工程（ｂ）は、インビトロでのアッセイを実施して、前記患者から得られた前記サンプル中の前記白血病細胞の表面上での１種または複数種の細胞表面分化マーカーの発現レベルを検出することを含み、この細胞表面分化マーカーは概して、健康な骨髄単球細胞で発現されるかまたは過剰発現され、且つこの細胞表面分化マーカーは概して、未分化の骨髄芽球では発現されないかまたは過剰発現されず、前記白血病細胞の表面上における高レベルでの前記１種または複数種の細胞表面分化マーカーの発現は、進行した分化状態を示す、請求項２８に記載の急性骨髄性白血病を処置する方法。
【請求項３４】
前記アッセイはＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイまたは免疫化学アッセイ（たとえば、ウエスタンブロットアッセイ、ＥＬＩＳＡアッセイ、または逆相タンパク質アッセイである）である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞表面分化マーカーは、ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ（インテグリンα−Ｘ、ＩＴＡＸ）、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８（インテグリンβ、ＩＴＢ２）、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５（ＣＲ１）、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ９７、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１８０、ＣＤ１８４、ＨＬＡ−Ｃ（１Ｃ０２）、ＡＰＯＢＲ、血小板膜レセプターＧｉ２４（ＶＳＩＲ）、およびＨＬＡ−ＤＲの内の１つ若しくは複数を含む細胞表面マーカータンパク質のパネル；並びに／または前記１つ若しくは複数の細胞表面マーカータンパク質と併せて発現されるあらゆる細胞表面タンパク質を含む、請求項３３に記載の急性骨髄性白血病を処置する方法。
【請求項３６】
前記細胞表面マーカータンパク質のパネルは、
（ｉ）ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ（インテグリンα−Ｘ、ＩＴＡＸ）、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８（インテグリンβ、ＩＴＢ２）、ＣＤ３３、ＣＤ３５（ＣＲ１）、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ９７、ＣＤ１２３、ＣＤ１８０、ＨＬＡ−Ｃ（１Ｃ０２）、ＡＰＯＢＲ、血小板膜レセプターＧｉ２４（ＶＳＩＲ）、およびＨＬＡ−ＤＲの内のいずれか１個、２個、若しくは３個、若しくは４個、若しくは５個、若しくは６個、若しくは７個、若しくは８個、若しくは９個、若しくは１０個、若しくは１１個、若しくは１２個、若しくは１３個、若しくは１４個、若しくは１５個、若しくは１６個、若しくは１７個、若しくは１８個、若しくは全て；または
（ｉｉ）ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ１２３、およびＨＬＡ−ＤＲの内のいずれか１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、若しくは全て；または
（ｉｉｉ）ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１８４、およびＨＬＡ−ＤＲの内のいずれか１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、若しくは全て
を含む、請求項３５に記載の急性骨髄性白血病を処置する方法。
【請求項３７】
工程（ｂ）は、インビトロでのアッセイを実施して、前記患者から得られた前記サンプル中の前記白血病細胞における１種または複数種の機能分化マーカーの発現、および／または活性化、および／またはリン酸化を検出することを含み、この機能分化マーカーは概して、健康な骨髄単球細胞で発現され、過剰発現され、活性化され、および／またはリン酸化され、且つこの機能分化マーカーは概して、未分化の骨髄芽球では発現されず、過剰発現されず、活性化されず、および／またはリン酸化されず、前記白血病細胞における前記１種または複数種の機能分化マーカーの発現、活性化、および／またはリン酸化は、進行した分化状態を示す、請求項２８に記載の急性骨髄性白血病を処置する方法。
【請求項３８】
前記アッセイは、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイまたは免疫化学アッセイ（たとえば、ウエスタンブロットアッセイ、ＥＬＩＳＡアッセイ、または逆相タンパク質アッセイ）である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記１種または複数種の機能分化マーカーは、１種または複数種の酵素、インテグリン、キナーゼ、ホスファターゼ、シグナル伝達調節因子、細胞質タンパク質および細胞質リンタンパク質、膜タンパク質および膜リンタンパク質（たとえば、ＧＴＰアーゼまたは細胞シグナル伝達の他の形態に関与する細胞質リンタンパク質および膜リンタンパク質）を含む、タンパク質マーカーのパネルを含み、このタンパク質マーカーは概して、健康な骨髄単球細胞では，発現され、過剰発現され、および／または活性化され、且つ未分化の骨髄芽球では、概して、発現されず、過剰発現されず、および／または活性化されず、前記白血病細胞における前記タンパク質マーカーのパネルの発現および／または活性化は、進行した分化状態を示す、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記タンパク質マーカーのパネルは、リゾチームＣ（ＬＹＺ）、好中球サイトゾル因子２（ＮＣＦ２）、骨髄細胞核分化抗原（ＭＮＤＡ）、ＡＫ１Ｃ４、およびＥＲＧの内のいずれか１個、２個、３個、４個、または５個を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記１種または複数種の機能分化マーカーは、１種または複数種のキナーゼ、ホスファターゼ、ホスホリポアーゼ、インテグリン、シグナル伝達調節因子、Ｇタンパク質、膜貫通レセプター、ホスホペプチド、並びに／または健康な骨髄単球細胞においてキナーゼシグナル伝達経路で概して発現され、および／若しくは活性化され、および／若しくはリン酸化されるが、未分化の骨髄芽球では概して発現されず、および／若しくは活性化されず、および／若しくはリン酸化されない他のキナーゼシグナル伝達分子を含むキナーゼ経路活性マーカーのパネルを含み、そして、前記白血病細胞における前記キナーゼ経路活性マーカーのパネルの発現、および／または活性化、および／またはリン酸化は、進行した分化状態を示す、請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
前記キナーゼ経路活性マーカーのパネルは、前記キナーゼ経路活性剤により阻害されるキナーゼシグナル伝達経路のマーカーを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記キナーゼ経路活性マーカーのパネルは、ＦＥＳ、ＰＫＣおよびプロテインキナーゼＣアイソフォーム（たとえば、ＰＫＣδ（ＫＰＣＤ）、ＰＲＫＣＡ、ＰＲＫＣＢ、およびＰＲＫＣＤ）、ＰＫＡ、ＰＡＫ（たとえば、ＰＡＫ１およびＰＡＫ２）、ＳＴＫ１０、ＧＳＫ３Ａ、ＲＳＫ２、ＲＡＳ、ＲＡＦ、ＭＥＫ（たとえば、ＭＥＫ１（ＭＡＰ２Ｋ１））、ＥＲＫ（たとえば、ＭＡＰＫ３（ＥＲＫ１）およびＭＡＰＫ１（ＥＲＫ２））、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ（たとえば、ＡＫＴ１）、ＭＴＯＲ、Ｓ６キナーゼ、ＳＴＡＴ５、ＣＡＭＫＫ、ＳＹＫ（ＫＳＹＫ）、ＬＹＮ、Ｐ３８Ａ、ＣＤＫ１、ＣＫ２Ａ１、ＰＫＡＣＡ、ＩＲＡＫ４、ＰＫＣＢ  ｉｓｏ２、Ｃｏｔ、ＰＫＣＤ、ＰＫＣＡ、ＰＫＣＢ、ＰＫＣＧ、ＰＫＣＨ、ＢＲＡＦ、ＭＥＫ２、ＰＤＫ１、ＣＤＫ２、ＰＴＮ６、Ｄ３（ＰＬＤ３）、ＩＱＧＡＰ１、ＧＲＢ２、ＲＨＯＡ、ＲＨＯＧ、並びにＳ１０ＡＢ、並びにあらゆるキナーゼ、ホスファターゼ、ホスホリポアーゼ、インテグリン、シグナル伝達調節因子、Ｇタンパク質、膜貫通レセプター、および／または、これらと共に選択的に発現されるかまたは活性化される他のキナーゼシグナル伝達分子の内のいずれか１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはより多くを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記キナーゼ経路活性マーカーのパネルは、
（ｉ）ＰＫＣ、ＥＲＫ、ＰＡＫ１、およびＰ３８αの内のいずか１個、２個、３個、若しくは４個；
（ｉｉ）ＰＫＣＤ、ＰＫＣＡ、ＰＫＡＣＡ、ＩＲＡＫ４、およびＣＫ２Ａ１の内のいずれか１個、２個、３個、４個、若しくは５個；または
（ｉｉｉ）ＭＡＰＫ１、ＭＡＰＫ２、ＡＫＴ、ＡＫＴ１Ｓ１、ＭＡＰ２Ｋ１、およびＭＡＰ２Ｋ２の内のいずれか１個、２個、３個、４個、５個、若しくは６個
を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記キナーゼ経路活性マーカーのパネルは、健康な骨髄単球細胞でのキナーゼシグナル伝達経路において概してリン酸化されるかまたは概して高レベルでリン酸化されるが、未分化の骨髄芽球では概してリン酸化されないかまたは概して高レベルでリン酸化されない１箇所または複数箇所のリン酸化部位のパネルを含み、前記白血病細胞における前記リン酸化部位のパネルでのリン酸化または高レベルのリン酸化は、進行した分化状態を示す、請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
前記リン酸化部位のパネルは、
（ｉ）表１に記載のリン酸化部位の内のいずれか１箇所、２箇所、３箇所、４箇所、５箇所、６箇所、７箇所、８箇所、９箇所、１０箇所、若しくは１０箇所超；または
（ｉｉ）表２に記載のリン酸化部位の内のいずれか１箇所、２箇所、３箇所、４箇所、５箇所、６箇所、７箇所、８箇所、９個、１０箇所、若しくは１０箇所超；または
（ｉｉｉ）Ｓ１４４でのＰＡＫ１、Ｓ１４１でのＰＡＫ２、Ｙ１８７でのＭＡＰＫ１、Ｔ１８５でのＭＡＰＫ１、Ｓ３８０でのＲＰＳ６ＫＡ１、Ｔ２０２でのＭＡＰＫ３、Ｙ２０４でのＭＡＰＫ３、Ｓ１６６でのＭＡＰ３Ｋ３、Ｓ２９５およびＳ２９７でのＳＹＫ、Ｓ１１０でのＩＲＡＫ３、ＰＫＮ１（３７９〜３９６＋ホスホＳＴ）、ＳＴＫ１０（４４７〜４６４＋ホスホＳＴ）、Ｓ４１０でのＲＩＰＫ３、Ｔ２１８でのＰＲＫＣＤ、Ｔ２９５でのＰＲＫＣＤ、Ｙ３１３でのＰＲＫＣＤ、Ｔ５０７でのＰＲＫＣＤ、Ｔ６４５でのＰＲＫＣＤ、Ｓ６６４でのＰＲＫＣＤ、Ｔ２６３８でのＰＲＫＣＤ、Ｓ５３５でのＭＡＲＫ２、Ｓ５３５でのＭＡＰ３Ｋ２、ＰＲＫＤ２（７１０〜７３０＋ホスホＹ）、ｓ８０５でのＮＲＫ、Ｓ５８でのＰＲＫＡＲ２Ａ、ＺＡＫ（５９１〜６１６＋ホスホＳＴ）、Ｓ９００でのＭＡＰ４Ｋ４、Ｓ３４７でのＣＤＫ９、ＲＰＳ６ＫＡ４（６８１〜６９９＋２ホスホＳＴ）、ＭＡＳＴ３（１２５４〜１２７４＋ホスホＳＴ）、ＮＥＫ９（１０〜３９＋ホスホＳＴ）、ＧＳＫ３Ａ（１９〜５０＋ホスホＳＴ）、Ｓ３６９でのＲＰＳ６ＫＡ３、Ｓ５３１でのＲＩＰＫ２、Ｔ６０６でのＡＡＫ１、Ｙ２９２でのＴＹＫ２、Ｓ２１４でのＰＤＰＫ２、ＰＲＫＡＡ１（３〜８＋ホスホＳＴ）、Ｓ７７２でのＳＴＫ１１Ｐ、Ｓ１４６８でのＢＡＺ１Ｂ、Ｓ１４０でのＣＬＫ１、Ｓ３２８でのＭＡＰ４Ｋ２、ＷＮＫ１（１９９６〜２０２１＋ホスホＳＴ）、Ｓ２７１でのＣＤＫ１１Ａ、Ｙ７１３でのＦＥＳ、および／若しくはＳ７６９でのＴＮＩＫの内のいずれか１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、若しくは１０個超；または
（ｉｖ）Ｓ１４４でのＰＡＫ１、Ｓ１４１でのＰＡＫ２、Ｙ１８７および／若しくはＴ１８５でのＭＡＰＫ１、並びにＳ３８０でのＲＰＳ６ＫＡ１；または
（ｖ）Ｙ１８７でのＭＡＰＫ１、Ｓ１４１でのＰＡＫ２、およびＹ３１３でのＰＲＫＣＤ；または
（ｖｉ）Ｙ７１３でのＦＥＳ、Ｔ２０２／Ｙ２０４でのＭＡＰＫ３、Ｔ１８５／Ｙ１８７でのＭＡＰＫ１、Ｓ１４４でのＰＡＫ１、Ｓ２２２でのＭＥＫ１、Ｓ１４１でのＰＡＫ２、およびＳ６４５でのＰＲＫＣＤ；または
（ｖｉｉ）Ｓ２１でのＧＳＫ３Ａ、並びに／またはＴ５０７、Ｔ２９５、Ｔ２１８、Ｙ３１３、Ｔ５０７および／若しくはＳ６６４でのＰＲＫＣＤ、並びに／またはＳ２０および／若しくはＳ１３でのＳＴＫ１０、並びに／またはＳ１４４でのＰＡＫ１、並びに／またはＳ１４１でのＰＡＫ２；
（ｖｉｉｉ）ＭＡＰＫ１（たとえば、Ｙ１８７および／若しくはＴ１８５でのＭＡＰＫ１）、並びにＴ２０２および／若しくはＹ２０４でのＭＡＰＫ３、並びにＳ２１でのＧＳＫ３Ａでの１箇所若しくは複数箇所のリン酸化部位；
を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記キナーゼ経路阻害剤は、ＦＬＴ３経路、ＰＫＣ経路、ＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ＭＴＯＲ−Ｓ６Ｋ経路、ＰＡＫ経路、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路、ＣＡＭＫＫ経路、またはこれらに並行のあらゆるキナーゼシグナル伝達経路の内のいずれか１つまたは複数を阻害する、請求項２８に記載の急性骨髄性白血病を処置する方法。
【請求項４８】
前記キナーゼ経路阻害剤は、ＭＥＫ阻害剤、またはＦＬＴ３／ＰＫＣ阻害剤、またはＰＡＫ阻害剤である、請求項２８に記載の急性骨髄性白血病を処置する方法。
【請求項４９】
工程（ｂ）が、以下を含む、請求項４８に記載の急性骨髄性白血病を処置する方法：
（ｉ）インビトロでのアッセイを実施して、前記患者から得られた前記サンプル中の前記白血病細胞でのＭＡＰＫ１および／若しくはＭＡＰＫ３における１箇所若しくは複数箇所のリン酸化部位のリン酸化を検出し、および／若しくは定量すること；並びに／または
（ｉｉ）インビトロでのアッセイを実施して、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ１２３、およびＨＬＡ−ＤＲからなるＣＤマーカーの群の、前記患者から得られた前記サンプル中の前記白血病細胞上での表面発現を検出し、および／若しくは定量すること。
ここで、前記１箇所若しくは複数箇所のリン酸化部位のリン酸化若しくは高レベルでのリン酸化、および／または前記白血病細胞上における高レベルでの前記ＣＤマーカーの群の発現は、進行した分化状態を示す。
【請求項５０】
前記キナーゼ経路阻害剤は、ミドスタウリン等のＦＬＴ３／ＰＫＣ経路阻害剤であり、工程（ｂ）は、
（ｉ）インビトロでのアッセイを実施して、前記患者から得られた前記サンプル中の前記白血病細胞でのＧＳＫ３Ａ、ＰＲＫＣＡ、ＰＲＫＣＢ、ＰＲＫＣＤ、ＳＴＫ１０、ＰＡＫ１、ＰＡＫ２ＭＡＰＫ１、および／若しくはＭＡＰＫ３の内の１つ若しくは複数におけるリン酸化部位のリン酸化を検出し、および／若しくは定量すること；並びに／または
（ｉｉ）インビトロでのアッセイを実施して、前記患者から得られた前記サンプル中の前記白血病細胞の表面上における、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４ＰＫＣ５、ＣＤ６４、ＣＤ１２３、およびＨＬＡ−ＤＲからなるＣＤマーカーの群の表面発現を検出し、および／若しくは定量すること
を含む。
ここで、ＧＳＫ３Ａ、ＰＲＫＣＡ、ＰＲＫＣＢ、ＰＲＫＣＤ、ＳＴＫ１０、ＰＡＫ１、ＰＡＫ２、ＭＡＰＫ１、および／若しくはＭＡＰＫ３の内のいずれか１つ若しくは複数の前記白血病細胞におけるリン酸化若しくは高レベルのリン酸化；または前記ＣＤマーカーの群の前記白血病細胞による高レベルでの発現のいずれかは、進行した分化状態を示す、
請求項２８に記載の急性骨髄性白血病を処置する方法。
【請求項５１】
前記キナーゼ経路阻害剤は、トラメチニブ等のＭＥＫ阻害剤であり、工程（ｂ）は、インビトロでのアッセイを実施して、前記患者から得られた前記白血病細胞の遺伝子型を検出し、前記患者から得られた前記サンプル中の前記白血病細胞における、ＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、またはＢＲＡＦの内のいずれか１つが活性化変異を有することを決定することをさらに含む、請求項２８に記載の急性骨髄性白血病を処置する方法。
【請求項５２】
前記アッセイは、前記患者から得られた前記サンプル中の前記白血病細胞における、ＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、またはＢＲＡＦを配列決定し、それにより得られた配列データにおける活性化変異を特定することを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
工程（ｂ）は、
（ｉ）インビトロでのアッセイを実施して、前記患者から得られた前記サンプル中の前記白血病細胞でのＭＡＰＫ１若しくはＭＡＰＫ３における１箇所若しくは複数箇所のリン酸化部位のリン酸化を検出すること；並びに／または
（ｉｉ）インビトロでのアッセイを実施して、前記患者から得られた前記サンプル中の前記白血病細胞上での、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ１２３、およびＨＬＡ−ＤＲからなるＣＤマーカーの群の表面発現を検出すること；
を含む；請求項５１に記載の方法。
ここで、前記１箇所若しくは複数箇所のリン酸化部位のリン酸化若しくは高レベルのリン酸化および／または前記白血病細胞上における高レベルでの前記ＣＤマーカーの群の発現は、進行した分化状態を示す。
【請求項５４】
前記キナーゼ経路阻害剤は、トラメチニブ等のＭＥＫ阻害剤であり、工程（ｂ）は、さらに、
（ｉ）インビトロでのアッセイを実施して、前記患者から得られた前記サンプル中の前記白血病細胞の遺伝子型を検出し、且つ、前記白血病細胞におけるＦＬＴ３が活性化変異を有しないことを決定すること；並びに／または
（ｉｉ）インビトロでのアッセイを実施して、ＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路以外の細胞増殖若しくは細胞生存に関与するＦＬＴ−３駆動型シグナル伝達経路（たとえば、ＰＫＣ経路、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ＭＴＯＲ−Ｓ６Ｋ経路、ＰＡＫ経路、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路、若しくはＣＡＭＫＫ経路の１種若しくは複数種の活性マーカーの、前記患者から得られた前記サンプル中の前記白血病細胞における発現若しくは活性化を検出し、前記ＦＬＴ３駆動型キナーゼシグナル伝達経路が前記白血病細胞において活性化されていないことを決定すること；並びに／または
（ｉｉｉ）インビトロでのアッセイを実施して、前記患者から得られた前記サンプル中の前記白血病細胞におけるＴＯＰ２Ａおよび／若しくはＫＤＭ５Ｃの内の一方若しくは両方のリン酸化のレベルを検出し、ＴＯＰ２Ａおよび／若しくはＫＤＭ５Ｃは、前記白血病細胞おいて、リン酸化されていないか若しくは低レベルでリン酸化されていることを決定すること、
を含む、請求項２８に記載の急性骨髄性白血病を処置する方法。
【請求項５５】
前記キナーゼ経路阻害剤は、トラメチニブ等のＭＥＫ阻害剤であり、工程（ｂ）は、
（ｉ）インビトロでのアッセイを実施して、前記患者から得られた前記サンプル中の前記白血病細胞の遺伝子型を検出し、前記白血病細胞における、ＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、若しくはＢＲＡＦの内のいずれか１つが活性化変異を有することを決定し；および／または前記患者から得られた前記サンプル中の前記白血病細胞の分化状態が進行していることを決定すること、並びに
（ｉｉ）インビトロでのアッセイを実施して、前記患者から得られた前記サンプル中の前記白血病細胞の遺伝子型を検出し；前記白血病細胞におけるＦＫＴ３は活性化変異を有しないことを決定し；および／またはアッセイを実施して、ＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路以外の細胞増殖若しくは細胞生存に関与するＦＬＴ−３駆動型シグナル伝達経路（たとえば、ＰＫＣ経路、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ＭＴＯＲ−Ｓ６Ｋ経路、ＰＡＫ経路、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路、若しくはＣＡＭＫＫ経路）の１種若しくは複数種の活性マーカーの、前記患者から得られた前記サンプル中の前記白血病における発現若しくは活性を検出し、前記ＦＬＴ３駆動型キナーゼシグナル伝達経路が前記白血病細胞において活性化されていないことを決定すること；および／またはアッセイを実施して、前記患者から得られた前記サンプル中の前記白血病細胞におけるＴＯＰ２Ａおよび／若しくはＫＤＭ５Ｃの内の一方若しくは両方のリン酸化のレベルを検出し、ＴＯＰ２Ａおよび／若しくはＫＤＭ５Ｃは前記白血病細胞おいてリン酸化されていないか若しくは低レベルでリン酸化されていることを決定すること；
を含む、請求項２８に記載の急性骨髄性白血病を処置する方法。
【請求項５６】
前記ＦＬＴ３駆動型シグナル伝達経路の前記活性マーカーは、前記ＦＬＴ３駆動型キナーゼシグナル伝達経路により選択的にリン酸化される１箇所または複数箇所のリン酸化部位を含み、前記１箇所または複数箇所のリン酸化部位のリン酸化または高レベルのリン酸化は、前記ＦＬＴ３駆動型キナーゼシグナル伝達経路が活性化されていることを示す、請求項５４または５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記１箇所または複数箇所のリン酸化部位は、ＳＴＡＴ５ＡおよびＣＡＭＫＫ１（たとえば、Ｓ７８０および／若しくはＳ１２８でのＳＴＡＴ５Ａ、並びに／またはＳ５４８でのＣＡＭＫＫ１を含む）の内の一方または両方におけるリン酸化部位を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記白血病細胞における、ＴＯＰ２Ａおよび／またはＫＣＭ５Ｃの内の一方または両方のリン酸化のレベルを検出する前記工程は、Ｓ１２１３でのＴＯＰ２Ａのリン酸化、および／またはＳ３１７でのＫＤＭ５Ｃのリン酸化を検出することを含む、請求項５４または５５に記載の方法。
【請求項５９】
急性骨髄性白血病を患っている個々の患者の急性骨髄性白血病を処置する方法であって、
（ａ）前記患者から、白血病細胞を含む生体サンプルを得る工程；
（ｂ）（ｉ）インビトロでのアッセイを実施して、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ１２３、およびＨＬＡ−ＤＲからなるＣＤマーカーの群の、前記患者から得られた前記サンプル中の前記白血病細胞の表面上での発現を検出する工程；並びに／または
（ｉｉ）インビトロでのアッセイを実施して、ｐＳ２１でのＧＳＫ３Ａ；ＰＲＫＣＤのＹ３１３、ｐＴ５０７、ｐＴ２９５、ｐＴ２１８、および／若しくはｐＳ６６４でのＰＲＫＣＤ；ＳＴＫ１０のｐＳ２０および／若しくはｐＳ１３でのＳＴＫ１０；ＰＡＫ１のｐＳ１４４でのＰＡＫ１；ＰＡＫ２のｐＳ１４１でのＰＡＫ２；Ｙ１８７および／若しくはＴ１８５でのＭＡＰＫ１；並びにＴ２０２および／若しくはＹ２０４でのＭＡＰＫ３から選択される１箇所若しくは複数箇所のリン酸化部位の前記白血病細胞におけるリン酸化を検出する工程；並びに
（ｃ）前記ＣＤマーカーの群が、前記患者の白血病細胞の表面上において高レベル発現されており、および／または前記白血病細胞における前記リン酸化部位の内の１箇所若しくは複数箇所がリン酸化されているか若しくは高レベルでリン酸化されている場合には、急性骨髄性白血病の処置のために、前記患者にミドスタウリンを投与する工程、
を含む方法。
【請求項６０】
急性骨髄性白血病を患っている個々の患者の急性骨髄性白血病を処置する方法であって、
（ａ）前記患者から、白血病細胞を含む生体サンプルを得る工程；
（ｂ）（ｉ）インビトロでのアッセイを実施して、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ１２３、およびＨＬＡ−ＤＲからなるＣＤマーカーの群の、前記患者から得られた前記サンプル中の前記白血病細胞の表面上での発現を検出する工程；並びに／または
（ｉｉ）インビトロでのアッセイを実施して、Ｙ１８７および／若しくはＴ１８５でのＭＡＰＫ１、並びにＴ２０２および／若しくはＹ２０４でのＭＡＰＫ３から選択される１箇所若しくは複数箇所のＭＥＫ関連リン酸化部位の前記白血病細胞におけるリン酸化を検出する工程；並びに／または
（ｉｉｉ）インビトロでのアッセイを実施して、前記患者の白血病細胞での、ＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、またはＢＲＡＦの内のいずれか１つ若しくは複数において活性化変異が存在しているかどうかを決定するために、前記白血病細胞の遺伝子型を検出する工程；
（ｃ）（ｉ）インビトロでのアッセイを実施して、ｐＳ７８０および／若しくはｐＳ１２８でのＳＴＡＴ５Ａ、ｐＳ５４８でのＣＡＭＫＫ１、ｐＳ１２１３でのＴＯＰ２Ａ、並びにＫＤＭ５ＣのｐＳ３１７でのＫＤＭ５Ｃから選択される１箇所若しくは複数箇所のマーカー部位での前記白血病細胞におけるリン酸化を検出する工程；並びに／または
（ｉｉ）インビトロでのアッセイを実施して、前記患者の白血病細胞でのＦＬＴ３において活性化変異が存在しているかどうかを決定するために、前記白血病細胞の遺伝子型を検出する工程；並びに
（ｄ）（Ａ）前記ＣＤマーカーの群が、前記患者の白血病細胞の表面上において高レベルで発現され、および／または前記白血病細胞における前記ＭＥＫ関連リン酸化部位の内の１箇所若しくは複数箇所がリン酸化されているか若しくは高レベルでリン酸化され、および／または前記患者の前記白血病細胞での、ＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、若しくはＢＲＡＦの内のいずれか１つ若しくは複数において活性化変異が存在し；並びに
（Ｂ）前記マーカー部位が前記患者の白血病細胞においてリン酸化されていないか若しくは高レベルでリン酸化されておらず、および／または前記患者の白血病細胞でのＦＬＴ３において活性化変異が存在しない場合には、
急性骨髄性白血病の処置のために、前記患者にトラメチニブを投与する工程
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、患者の急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の処置に関する。
具体的には、本発明は、キナーゼ経路阻害剤により効果的に処置され得るＡＭＬ患者を特定するための改善された方法、およびキナーゼ経路阻害剤が個々の患者のＡＭＬの処置に有効であり得るかどうかを予測するための改善された方法に関する。本発明はまた、急性骨髄性白血病を患っている複数例の患者をスクリーニングして、これらの患者の内のいずれか１例または複数例の急性骨髄性白血病がキナーゼ経路阻害剤により、効果的に処置され得るかどうかを決定する方法も包含する。本発明は、そのような患者のキナーゼ経路阻害剤による処置の方法、およびそのような方法での使用のためのキナーゼ経路阻害剤をさらに提供する。
【背景技術】
【０００２】
急性骨髄性白血病−疾患の特徴および分類
急性骨髄性白血病（ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋａｅｍｉａ）（ＡＭＬ）（急性骨髄芽球性白血病、急性顆粒球白血病、または急性非リンパ急性白血病としても既知である）は、血液および骨髄の侵攻性癌である。ＡＭＬは、骨髄による未熟な白血球（骨髄芽球として既知である）の過剰な産生を特徴とする。健康な個体では、芽球は通常、成熟した白血球へと発達する。しかしながら、ＡＭＬでは、芽球は正常に分化せず、発達の早期静止状態のままである。
【０００３】
ＡＭＬでは、骨髄はまた、異常な赤血球および血小板を産生する場合もある。これらの異常な細胞の数は急速に増加して、身体が必要とする正常な白血球、赤血球、および血小板を押し出し始める。処置をしないまま放置すると、急性骨髄性白血病は急速に死に至る。
【０００４】
疾患の進行のより正確な予後診断と処置の最適な形態の特定とを可能にすることを目的として、ＡＭＬを疾患サブタイプに分類するための様々な分類システムが考案されている。最初期のシステムはフランス系−アメリカ系−イギリス系（Ｆｒｅｎｃｈ−Ａｍｅｒｉｃａｎ−Ｂｒｉｔｉｓｈ）（ＦＡＢ）分類であり、フランス、アメリカ、およびイギリスの白血病専門家のグループにより１９７０年代に最初に考案された。このシステムは、白血病が発症している細胞のタイプと静止の時点で骨髄芽球細胞が到達している成熟の段階とに応じて、ＡＭＬをサブタイプに分類する。サブタイプＭ０〜Ｍ５は白血球の前駆体に由来し、未分化型骨髄芽球性白血病（Ｍ０）から単球白血病（Ｍ５）まで及ぶ。サブタイプＭ６は、赤血球の非常に初期の形態に由来し（赤血球白血病）、サブタイプＭ７  ＡＭＬは、血小板を形成する細胞の初期の形態で始まる（巨核芽球白血病）。
【０００５】
ＦＡＢシステム下では、ＡＭＬは、顕微鏡下での細胞形態学的特徴の目視検査と様々な染色体異常の特定とにより分類される。ＦＡＢ分類の更新版が１９８５年に公開されている−Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｐｒｏｐｏｓｅｄ  ｒｅｖｉｓｅｄ  ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋａｅｍｉａ，Ａｎｎ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ  １９８５；１０３（４）：６２０−６２５を参照されたい。
【０００６】
ＦＡＢシステムが１９７０年代に最初に考案されてから、この分野の知識のレベルは相当に進んでいる。この知識の一部を組み込むために、このシステムは更新されているが、予後診断に影響を及ぼし且つ効果的な処置の最適化に決定的であることが現在知られている追加の要因を考慮して、新規の分類システムを作成する必要があると思われていた。
【０００７】
従って、国際保健機構（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）（ＷＨＯ）分類システムは、ＡＭＬをいくつかの広範なグループに分類する。これらには下記が含まれる：
・  再発性の遺伝子異常（特定の染色体変化）を伴うＡＭＬ
・  多系列異形成を伴うＡＭＬ
・  細胞に損傷を与える過去の治療（たとえば、化学療法および放射線療法）に関連  
し、治療関連の骨髄新生物とも称されるＡＭＬ
・  他の方法では分類されないＡＭＬ−たとえば、
・  未分化型ＡＭＬ（Ｍ０）
・  最低限の成熟を伴うＡＭＬ（Ｍ１）
・  成熟を伴うＡＭＬ（Ｍ２）
・  急性骨髄単球性白血病（Ｍ４）
・  急性単球性白血病（Ｍ５）
・  急性赤血球白血病（Ｍ６）
・  急性巨核芽球性白血病（Ｍ７）
・  急性好塩基球性白血病
・  線維化を伴う急性汎骨髄症
・  骨髄肉腫（顆粒球肉腫または緑色腫としても既知である）。
【０００８】
これら２種の主要な分類システムに加えて、ＡＭＬは、特定の表現型および転帰と相関することが分かっている特定の分子マーカーを参照することにより、さらに分類されてサブタイプ化される。たとえば、ＮＰＭ１遺伝子およびＣＥＢＰＡ遺伝子に変異を有する患者は、より良好な長期転帰を有することが知られており、ＦＬＴ３に特定の変異を有する患者は予後がより悪いことが分かっている−Ｙｏｈｅら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｅｄ．２０１５  Ｍａｒ  ４（３）：４６０−４７８を参照されたい。
【０００９】
現在の処置体制
ＡＭＬの従来の処置には、化学療法および放射線療法だけでなく幹細胞移植および骨髄移植も含まれる。ほとんどの患者は、そのような治療に最初はよく反応するが、再発率が高く、且つ患者は概して一次処置に対して抵抗性になる。全体として、従来の治療を受けているＡＭＬ患者の５年生存率は約２６％である。
【００１０】
歴史的に見て、急性前骨髄球性白血病を除いて、ＡＭＬの治療は疾患のサブタイプを標的とはしていない。むしろ、上述したシステムに従うＡＭＬの分類は、処置の適切な強度に関する臨床的決定を知らせるのに主に役立っている。しかしながら、最近では、特定の疾患タイプおよび患者のサブグループに適した処置の標的とされる形態を特定しようとする努力が払われている。キナーゼ経路阻害剤は、ＡＭＬの新規の個別化治療の可能性として特に関心の対象となっている。近年では、ＦＬＴ３遺伝子中に特定の活性化変異を有すると新たに診断されたＡＭＬを有する成人患者の処置のために、ＦＤＡによりＦＬＴ３阻害剤ミドスタウリンが承認されている。発癌性ＮＲＡＳ変異を伴うＡＭＬの処置に関するＭＥＫ阻害剤の前臨床有効性も調査されている（Ｂｕｒｇｅｓｓら、Ｂｌｏｏｄ  ２０１４；１２４（２６）：３９４７−３９５５）。
しかしながら、キナーゼ経路阻害剤はＡＭＬの処置に日常的には未だ使用されておらず、キナーゼ経路阻害剤処置に対して感受性である患者を確実に特定するためのこれらのスクリーニングプロトコルの感受性は、完全には試験されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って、ＡＭＬの標的処置のための改善された方法が依然として必要とされており、具体的には、キナーゼ経路阻害剤による処置に反応する患者およびそのような処置に反応しない患者を特定するための改善された方法が依然として必要とされている。
特定の処置に反応する患者をそのように特定して適切に処置し得ることを確実にするだけでなく、反応しない患者が不必要に処置されないことを確実にするためにも、正確で敏感な層別化が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、プロテオミクスプロファイリング、カイノミクス（ｋｉｎｏｍｉｃ）プロファイリング、およびゲノムプロファイリングを統合して、原発性ＡＭＬ細胞をキナーゼ経路阻害剤に対して感作させるメカニズムを調べ、それにより、感受性細胞を正確に特定するバイオマーカーパネルの特定を可能にした。本発明者らは、分化状態が進行した白血病細胞が、低分化型白血病細胞と比べてキナーゼ経路阻害剤に対する高い感受性を示すことを発見した。
そのため、本明細書で説明されたプロトコルおよび基準に従って評価され得る白血病細胞の分化状態は、キナーゼ経路阻害剤に対して感受性を示す白血病細胞および患者の特定に効果的なバイオマーカーをもたらす。これにより、キナーゼ阻害剤療法のための患者の新規で効果的な層別化が可能になる。
本発明者らは、特定の遺伝子変異とキナーゼ経路阻害剤感受性との間の相関関係をさらに特定した。これは、とりわけ、キナーゼ阻害剤療法との併用での使用のための効果的なコンパニオン診断試験をもたらす可能性を有する。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
従って、第１の態様では、本発明は、個々の患者の急性骨髄性白血病の処置におけるキナーゼ経路阻害剤の有効性を予測する方法であって、このキナーゼ経路阻害剤は、細胞増殖または細胞生存に関与するキナーゼシグナル伝達経路を阻害し、この方法は、
（ａ）この患者の白血病の分化状態を決定する工程、および
（ｂ）この白血病の分化状態が進行している場合には、この患者の急性骨髄性白血病は、前記キナーゼ経路阻害剤で効果的に処置され得ると予測する工程
を含む、方法を提供する。
【００１４】
第２の態様では、本発明は、個々の患者の急性骨髄性白血病を処置する方法であって、
（ａ）この患者の白血病の分化状態を決定する工程、および
（ｂ）この白血病の分化状態が進行している場合には、この患者を、細胞増殖または細胞生存に関与するキナーゼシグナル伝達経路を阻害するキナーゼ経路阻害剤で処置する工程、
を含む方法を提供する。
【００１５】
第３の態様では、本発明は、急性骨髄性白血病を有する複数例の患者をスクリーニングして、前記複数例の患者の内のいずれか１例または複数例の急性骨髄性白血病がキナーゼ経路阻害剤により効果的に処置され得るかどうかを決定する方法であって、このキナーゼ経路阻害剤は、細胞増殖または細胞生存に関与するキナーゼシグナル伝達経路を阻害し、この方法は、
（ａ）各患者に関して、この患者の白血病の分化状態を決定する工程、および
（ｂ）このキナーゼ経路阻害剤による効果的な処置に適した白血病を有するとして、分化状態が進行した白血病を有するいずれか１例または複数例の患者を特定する工程、
を含む、方法を提供する。
【００１６】
第４の態様では、本発明は、個々の患者の急性骨髄性白血病を処置する方法での使用のためのキナーゼ経路阻害剤であって、このキナーゼ経路阻害剤は、細胞増殖または細胞生存に関与するキナーゼ経路を阻害し、この処置は、
（ａ）この患者の白血病の分化状態を決定すること、および
（ｂ）白血病細胞の分化状態が進行している場合には、この患者を前記キナーゼ経路阻害剤で処置すること、
を含む、キナーゼ経路阻害剤を提供する。
【００１７】
本発明は、本発明の第３の態様に係るスクリーニングの方法と本発明の第１の態様に係るキナーゼ経路阻害剤療法の有効性を予測する方法とのコンピュータによる実施をさらに提供する。
本発明はまた、これらのコンピュータにより実施される方法の内のいずれかまたは両方を実施するためのソフトウェアも提供する。
【００１８】
本発明のこれらの態様はそれぞれ、患者の白血病の分化状態を決定する工程（ａ）を含む。上記で説明されたように、ＡＭＬは、異常な、部分的に分化した骨髄芽球の増殖を伴う。そのため、用語「患者の白血病の分化状態」は、患者の白血病細胞の分化状態を指す。従って、適切には、工程（ａ）は、患者から既に得られている白血病細胞の分化状態を決定することを含み得る。或いは、工程（ａ）は、前記白血病細胞の分化状態を決定する前に、患者から白血病細胞を得ることをさらに含み得る。前記白血病細胞を、たとえば、末梢血サンプルまたは骨髄サンプルから得ることができる。本発明は、全てのＡＭＬ患者（たとえば、新たに診断された（処置されていない）ＡＭＬ患者、処置の他の形態を受けたかまたは受けているＡＭＬ患者、および再発したＡＭＬ患者）に適用可能である。
【００１９】
適切には、白血病細胞の分化状態を、下記で説明するように、この白血病細胞に関するデータを分析することにより決定し得る。いくつかの実施形態では、前記データは既に収集されて記録されており、工程（ａ）は、分析のために前記データを取得するかまたは受信することを含む。他の実施形態では、工程（ａ）は、下記で説明するように分析のために前記データを収集して記録することをさらに含む。いくつかの実施形態では、患者の白血病の分化状態を決定する前記工程は、患者の白血病が進行しているかどうかを決定すること（二元（はい／いいえ）決定）からなり得る。
【００２０】
患者の白血病の分化状態を、白血病細胞の形態学的特徴および／若しくは細胞化学的特徴に関するデータを分析することにより、並びに／または細胞表面分化マーカー等の１種若しくは複数種の分化マーカーおよび／またはキナーゼ経路活性マーカー等の機能分化マーカーの白血病細胞における発現、活性化、および／またはリン酸化に関するデータを分析することにより、並びに／またはＢｅｎｎｅｔｔら、Ｐｒｏｐｏｓｅｄ  ｒｅｖｉｓｅｄ  ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋａｅｍｉａ，Ａｎｎ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ  １９８５；１０３（４）：６２０−６２５で説明されているようなフランス系−アメリカ系−イギリス系（ＦＡＢ）分類下で白血病細胞の分類を記録しているデータの参照により、決定し得る。
このデータには、細胞に関するあらゆるタイプの情報（たとえば、限定されないが、細胞の外観、性質、特性、遺伝子型、表現型、活性、分類、および機能に関する情報、並びに、たとえば、限定されないが、細胞の画像、細胞の書面による説明、および細胞から得られた全てのタイプの測定値）が含まれ得る。
【００２１】
白血病細胞の形態学的特徴に関する前記データには、任意選択によりロマノフスキー染色等の染色を使用して光学顕微鏡下で細胞の外観を記録するデータが含まれ得る。前記データには、たとえば、細胞の視覚像、および／または細胞の書面による説明が含まれ得る。工程（ａ）は、データを分析して、細胞が、既出Ｂｅｎｎｅｔｔら、で定義されているようなＭ４細胞の特定のためのＦＡＢ基準を満たすかどうかを決定することを含み得る。
具体的には、白血病細胞の少なくとも２０％が顆粒球−単球細胞の外観特性を有することをデータが示す場合には、並びに／または白血病細胞の中で、骨髄芽球、単芽球、および前単球が非赤血球細胞の２０％以上を構成し、且つ骨髄芽球および顆粒球が非赤血球細胞の８０％以下を構成することをデータが示す場合には、分化状態が進行していると決定し得る。
たとえば、細胞の少なくとも２０％が、顆粒球−単球細胞の特徴である（Ｍ４  ＦＡＢ）わずかに顆粒化した灰色がかった細胞質および折り畳まれた核を有することをデータが示す場合には、分化状態が進行していると決定し得る。骨髄から得られたサンプル中において、芽細胞（骨髄芽球、前骨髄球、骨髄細胞、および後の顆粒）が非赤血球細胞の３０％超８０％未満を構成する場合には、および好ましくは、本質的ではないが、末梢血から得られたサンプル中において単球数（単芽球、前単球、および単球）が５×１０9個／Ｌ以上である場合には、分化状態が進行していると決定し得る。既出Ｂｅｎｎｅｔｔら、第６２２頁を参照されたい。
【００２２】
いくつかの実施形態では、白血病細胞の形態学的特徴に関する前記データは既に記録されており、工程（ａ）は、分析のために前記データを取得することを含む。他の実施形態では、工程（ａ）は、分析のために、白血病細胞の形態学的特徴に関する前記データを収集して記録することをさらに含む。細胞の形態学的特徴に関する前記データを収集して記録する方法は従来のものであり、且つ当分野で公知であり、Ｂｅｎｎｅｔｔ他（既出）および他で説明されている。
【００２３】
白血病細胞の細胞化学的特徴に関する前記データには、試薬（たとえば、スダンブラックＢ、および／またはペルオキシダーゼ、および／または特異的な若しくは非特異的なエステラーゼ）に対するこの細胞の反応を記録しているデータが含まれ得る。
前記データには、たとえば、細胞の視覚像、細胞の書面による説明、フローサイトメトリーデータ、および他の種類の細胞化学データが含まれ得る。工程（ａ）は、このデータを分析して、この細胞が、既出Ｂｅｎｎｅｔｔらで定義されているようなＭ４細胞の特定のためのＦＡＢ基準を満たしているかどうかを決定することを含み得る。具体的には、この細胞の少なくとも２０％が、スダンブラックＢ、および／またはペルオキシダーゼ、および／または特異的な若しくは非特異的なエステラーゼに反応することをデータが示す場合には、分化状態が進行していると決定し得る（Ｍ４  ＦＡＢ）。
【００２４】
いくつかの実施形態では、白血球細胞の細胞化学的特徴に関する前記データは既に記録されており、工程（ａ）は、分析のために前記データを取得することを含む。
他の実施形態では、工程（ａ）は、分析のために、白血病細胞の細胞化学的特徴に関する前記データを収集して記録することをさらに含む。細胞の細胞化学的特徴に関するデータを収集して記録する方法は従来のものであり、且つ当分野で公知であり、Ｂｅｎｎｅｔｔ他（既出）および他で説明されている。
【００２５】
細胞表面分化マーカー等の１種若しくは複数種の分化マーカーおよび／または機能分化マーカーの白血病細胞における発現、活性化、および／またはリン酸化に関する前記データには、シグナル伝達分子等の１種または複数種の細胞表面分化マーカーの白血病細胞の表面上での有無または発現レベルを記録しているデータが含まれ得、この細胞表面分化マーカーは概して、健康な骨髄単球細胞で発現されるかまたは過剰発現され、且つこの細胞表面分化マーカーは概して、未分化の骨髄芽球では発現されないかまたは過剰発現されず、白血病細胞上での前記１種若しくは複数種の細胞表面分化マーカーの存在、または白血病細胞上における高レベルでの前記１種若しくは複数種の細胞表面分化マーカーの発現は、進行した分化状態を示す。
前記データには、たとえば、細胞の書面による説明、または細胞表面タンパク質発現を測定するアッセイ（たとえば、マスサイトメトリー、または当分野で既知の任意の他の技術若しくはアッセイ）から取得されたあらゆるタイプのデータが含まれ得る。いくつかの実施形態では、前記データは既に記録されており、工程（ａ）は、分析のために前記データを取得することを含む。他の実施形態では、工程（ａ）は、当分野で既知の標準的な従来の方法およびプロトコルに従って（たとえばマスサイトメトリーにより）、分析のために前記データを収集して記録することをさらに含む。
【００２６】
前記細胞表面分化マーカーは、ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ（インテグリンα−Ｘ、ＩＴＡＸ）、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８（インテグリンβ、ＩＴＢ２）、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５（ＣＲ１）、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ９７、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１８０、ＣＤ１８４、ＨＬＡ−Ｃ（１Ｃ０２）、ＡＰＯＢＲ、血小板膜レセプターＧｉ２４（ＶＳＩＲ）、およびＨＬＡ−ＤＲ；並びに／または前記１つ若しくは複数の細胞表面マーカータンパク質と併せて発現されるあらゆる細胞表面タンパク質の１つ若しくは複数を含む細胞表面マーカータンパク質のパネルを含み得る。
ＣＤマーカー（分化マーカーのクラスターとしても既知である）は、細胞タイプおよび分化段階に関して特異的であり且つ抗体により認識される、細胞表面レセプター（エピトープ）の明確に定義されたサブセットである。
上記で列挙された細胞表面マーカータンパク質は全て当分野で既知であり、且つ十分に特徴付けられている−たとえば、Ｚｏｌａら、Ｈ，（２００７）．”ＣＤ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２００６−ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．”、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．３１９（１−２）：１−５を参照されたい。
これらの細胞表面マーカータンパク質は、キナーゼ経路阻害剤に対して感受性を示す進行した分化状態を有する白血病細胞の表面上において概して高レベルで概して発現されるが、未分化の骨髄芽球では概して発現されないことが分かっている。
従って、工程（ａ）は、データを分析して、細胞表面マーカータンパク質のパネルが前記白血球細胞により発現されているかまたは高レベルで発現されているかを決定することを含み得、この細胞表面マーカータンパク質のパネルが発現されているかまたは高レベルで発現されている場合には、分化状態が進行していると決定する。
好ましくは、この細胞表面マーカータンパク質のパネルは、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ（インテグリンα−Ｘ、ＩＴＡＸ）、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８（インテグリンβ、ＩＴＢ２）、ＣＤ３３、ＣＤ３５（ＣＲ１）、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ９７、ＣＤ１２３、ＣＤ１８０、ＨＬＡ−Ｃ（１Ｃ０２）、ＡＰＯＢＲ、血小板膜レセプターＧｉ２４（ＶＳＩＲ）、およびＨＬＡ−ＤＲの内のいずれか２個、または３個、または４個、または５個、または６個、または７個、または８個、または９個、または１０個、または１１個、または１２個、または１３個、または１４個、または１５個、または１６個、または１７個、または１８個、または全てを含む。
【００２７】
「高レベル」での１種または複数種の細胞表面タンパク質（たとえば、細胞表面マーカータンパク質）の発現への言及は、ここでおよび本明細書の他の箇所で使用される場合、関連する細胞表面タンパク質の発現の平均レベルと比べて高い発現のレベルを示す。
発現の「低レベル」への言及も同様に、細胞表面タンパク質の発現の平均レベル以下である発現のレベルを示す。
細胞表面タンパク質の発現の平均レベルは標準化された値であり、この値を、複数のサンプル全体にわたって算出された平均への参照により決定し得るか、または当分野で周知の方法（たとえば、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）に従う実験室分析によるか若しくは当分野で利用可能な情報への参照により確立され得る、未分化の骨髄芽球または他の健康な細胞タイプにおける細胞表面タンパク質の発現のレベルへの参照により決定し得る。そのため、たとえば、細胞表面タンパク質の発現の平均レベルを、多数のＡＭＬ患者から得られた細胞サンプルにおける細胞表面タンパク質の発現レベルの範囲を確立し、これらのサンプル全体にわたる発現の平均レベルを算出することにより決定し得る。細胞表面タンパク質の発現の「高レベル」とは、この算出された平均と比べて高い発現のレベルのことである。
【００２８】
任意選択により、細胞表面マーカータンパク質のパネルは、ＣＤ１９、ＣＤ１１７、ＣＤ７、ＣＤ３４、ＣＤ３、およびＣＤ１８４の内の１つまたは複数をさらに含み得る。
細胞表面マーカータンパク質のパネルは有利には、ＣＤ４５、および／またはＣＤ１１ｂ、および／またはＣＤ４４、および／またはＣＤ１４、および／またはＣＤ１６、および／またはＣＤ６４、および／またはＣＤ１５を含み得る。
具体的には、細胞表面マーカータンパク質のパネルは、ＣＤ４５、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ４４、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ６４、およびＣＤ１５の内のいずれか１つを含み得るか、またはＣＤ４５、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ４４、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ６４、およびＣＤ１５の内のいずれか２個、３個、４個、５個、または６個を含み得る。
適切には、細胞表面マーカータンパク質のパネルは、ＣＤ４５、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ４４、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ６４、およびＣＤ１５からなり得る。
いくつかの好ましい実施形態では、細胞表面マーカーのパネルは、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ１２３、およびＨＬＡ−ＤＲの内のいずれか１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、または全てからなる。
他の好ましい実施形態では、細胞表面マーカータンパク質のパネルは、ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１８４、およびＨＬＡ−ＤＲの内のいずれか１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、または全てからなる。
【００２９】
細胞表面分化マーカーおよび／または機能分化マーカー等の１種若しくは複数種の分化マーカーの白血病細胞における発現、活性化、および／またはリン酸化に関する前記データには、追加でまたは代替で、１種または複数種の機能分化マーカーの発現、および／または活性化、および／またはリン酸化を記録しているデータが含まれ得、この機能分化マーカーは概して、健康な骨髄単球（ｍｏｎｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ）細胞で発現され、過剰発現され、活性化され、および／またはリン酸化され、且つこの機能分化マーカーは概して、未分化の骨髄芽球では発現されないか、過剰発現されないか、活性化されないか、および／またはリン酸化されず、前記１種または複数種の機能分化マーカーの発現、活性化、および／またはリン酸化は、進行した分化状態を示す。
前記データには、たとえば、細胞の書面による説明、または当分野で既知の任意の技術（たとえば、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析、若しくは免疫化学技術、たとえば、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、および逆相タンパク質アッセイ）に従って細胞タンパク質の発現、活性化、またはリン酸化を測定するアッセイから取得されるあらゆるタイプのデータが含まれ得る。
いくつかの実施形態では、前記データは既に記録されており、工程（ａ）は、分析のために前記データを取得することを含む。
他の実施形態では、工程（ａ）は、当分野で既知の標準的な従来の方法に従って（たとえば、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより）、分析のために前記データを収集して記録することをさらに含む。
【００３０】
前記１種または複数種の機能分化マーカーは、１種または複数種の酵素、インテグリン、キナーゼ、ホスファターゼ、シグナル伝達調節因子、細胞質タンパク質および細胞質リンタンパク質、膜タンパク質および膜リンタンパク質、たとえばＧＴＰアーゼまたは細胞シグナル伝達の他の形態に関与する細胞質リンタンパク質および膜リンタンパク質を含むタンパク質マーカーのパネルを含み得、このタンパク質マーカーは概して、健康な骨髄単球細胞で発現され、過剰発現され、および／または活性化され、且つ未分化の骨髄芽球では概して、発現されず、過剰発現されず、および／または活性化されない。
【００３１】
タンパク質マーカーのパネルは、下記の内のいずれか１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはより多くを含み得る：
リゾチームＣ（ＬＹＺ）、好中球サイトゾル因子２（ＮＣＦ２）、骨髄細胞核分化抗原（ＭＮＤＡ）、ＡＫ１Ｃ４、ＥＲＧ、ネスプリン３、電位開口型水素チャネル１（Ｖｏｌｔａｇｅ−ｇａｔｅｄ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｃｈａｎｎｅｌ  １）、フルクトース−１，６−ビスホスファターゼ１、単球分化抗原ＣＤ１４、チミジンホスホリラーゼ、ＣＤ１８０抗原、推定上のアネキシンＡ２様タンパク質、レチノイド誘導性のセリンカルボキシペプチダーゼ、アネキシンＡ２、ゴルジが関連した植物病因関連タンパク質１（Ｇｏｌｇｉ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｌａｎｔ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １）、インテグリンベータ−２、ＢＴＢ／ＰＯＺドメイン含有タンパク質ＫＣＴＤ１２、細胞骨格関連タンパク質４、インテグリンアルファ−Ｘ、１型補体レセプター、アネキシンＡ５、特徴付けられていないタンパク質ＦＬＪ４５２５２、ガレクチン−３、アデニル酸キナーゼイソ酵素１（Ａｄｅｎｙｌａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｓｏｅｎｚｙｍｅ  １）、プロテインＳ１００−Ａ１０、チアミン−トリホスファターゼ、デオキシヌクレオシドトリホスフェートトリホスホヒドロラーゼＳＡＭＨＤ１、ミトコンドリアのアミドキシム還元成分１、コロニン−１Ｂ、Ｒｈｏ−ＧＡＰドメインを有するＡｒｆ−ＧＡＰ、ＡＮＫリピートおよびＰＨドメイン含有タンパク質１、グラニュリン、リボヌクレアーゼ阻害因子、長鎖脂肪酸ＣｏＡリガーゼ１、プロテインＳ１００−Ａ１１、プロカテプシンＨ、カテプシンＳ、ガレクチン−１、輸送およびゴルジ組織化タンパク質２相同体（Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ａｎｄ  Ｇｏｌｇｉ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２  ｈｏｍｏｌｏｇ）、Ａｒｆ−ＧＡＰドメインおよびＦＧリピート含有タンパク質１、長鎖脂肪酸ＣｏＡリガーゼ３、Ｒａｓ  ＧＴＰアーゼ活性化様タンパク質ＩＱＧＡＰ１、同種移植炎症因子１、転写仲介因子１−ベータ、ベータ−アレスチン−２、ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ［ＮＡＤＰ（＋）］、アルファ−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、カテプシンＢ、アミノペプチダーゼＢ、リソソーム保護タンパク質、ホスホグリセリン酸ムターゼ１、ポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ２、サイトカインレセプター様因子３、カルパスタチン、ＥＦ−ハンドドメイン含有タンパク質Ｄ２、二重特異性のマイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼ１（Ｄｕａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ  １）、主要ヴォールトタンパク質、アルファ−ガラクトシダーゼＡ、チロシンプロテインキナーゼＳＹＫ、姉妹染色分体接着タンパク質ＰＤＳ５相同体Ｂ、カルパイン−２触媒サブユニット、ＦＫ５０６結合タンパク質１５、プロテインジスルフィドイソメラーゼ、テンシン−３、アポリポタンパク質Ｂレセプター、形質転換タンパク質ＲｈｏＡ、プラスチン−２、アクチン関連タンパク質２／３複合体サブユニット２、ＣＤ９７抗原、カテプシンＺ、神経芽細胞分化関連タンパク質ＡＨＮＡＫ、非従来型ミオシン−Ｉｆ、ピルビン酸キナーゼＰＫＭ、プロテインＴＨＥＭＩＳ２、プラスチン−３、６型チロシン−プロテ��ンホスファターゼ非レセプター、エズリン、ロイシンリッチリピート含有タンパク質５９、グアニンヌクレオチド結合タンパク質Ｇ（Ｉ）／Ｇ（Ｓ）／Ｇ（Ｔ）サブユニットベータ−２、コロニン−１Ａ、ラディキシン、トランスケトラーゼ、成長因子レセプター結合タンパク質２、Ｖ型タンパク質ＡＴＰアーゼサブユニットＢ（腎臓アイソフォーム）、コートマーサブユニットイプシロン、アルファ−可溶性ＮＳＦ付着タンパク質、Ｒｈｏ  ＧＤＰ−解離抑制因子２、並びに／またはグアニンヌクレオチド結合タンパク質サブユニットベータ−４、並びに／またはこれらと共に選択的に発現されるおよび／若しくは活性化されるあらゆるタンパク質。
これらのタンパク質マーカーは、キナーゼ経路阻害剤に対して感受性を示す進行した分化状態を有する白血病細胞において概して発現されるおよび／または活性化されることが分かっているが、未分化の骨髄芽球では概して発現されず、および／または活性化されない。従って、工程（ａ）は、データを分析して、タンパク質マーカーのパネルが前記白血病細胞で発現されているかどうかおよび／または活性化されているかどうかを決定することを含み得、このタンパク質マーカーのパネルがこの細胞で発現されているおよび／または活性化されている場合には、進行した分化状態を決定する。
【００３２】
有利には、タンパク質マーカーのパネルは、リゾチームＣ（ＬＹＺ）、好中球サイトゾル因子２（ＮＣＦ２）、骨髄細胞核分化抗原（ＭＮＤＡ）、ＡＫ１Ｃ４、およびＥＲＧの内のいずれか１個、２個、３個、４個、または５個を含み得、工程（ａ）は、テータを分析して、このタンパク質マーカーのパネルが白血病細胞で発現されているかどうかを決定することを含み得、このタンパク質マーカーのパネルがこの細胞で発現されている場合には、進行した分化状態であると決定する。
【００３３】
前記１種または複数種の機能分化マーカーは、追加でまたは代替で、１種または複数種のキナーゼ、ホスファターゼ、ホスホリポアーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｏａｓｅ）、インテグリン、シグナル伝達調節因子、Ｇタンパク質、膜貫通レセプター、ホスホペプチド、並びに／または健康な骨髄単球細胞においてキナーゼシグナル伝達経路で概して発現され、および／若しくは活性化され、および／若しくはリン酸化されるが、未分化の骨髄芽球では概して発現されず、および／若しくは活性化されず、および／若しくはリン酸化されない他のキナーゼシグナル伝達分子を含むキナーゼ経路活性マーカーのパネルを含み得る。
有利には、このキナーゼシグナル伝達経路は、キナーゼ経路阻害剤により阻害される経路であり得る。そのため、たとえば、このキナーゼ経路阻害剤がトラメチニブ等のＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路阻害剤である場合には、このキナーゼ経路活性マーカーのパネルはＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫシグナル伝達経路のマーカーを含み得る。
【００３４】
具体的には、キナーゼ経路活性マーカーのパネルは、１種または複数種のキナーゼ、ホスファターゼ、ホスホリポアーゼ、インテグリン、シグナル伝達調節因子、Ｇタンパク質、膜貫通レセプター、並びに／または細胞増殖若しくは細胞生存に関与するキナーゼシグナル伝達経路で発現され、および／若しくは活性化される他のキナーゼシグナル伝達分子を含み得る。
いくつかの実施形態では、前記キナーゼ、ホスファターゼ、ホスホリポアーゼ、インテグリン、シグナル伝達調節因子、Ｇタンパク質、膜貫通レセプター、および／または他のキナーゼシグナル伝達分子の１つまたは複数は、前記キナーゼ経路阻害剤により阻害されるキナーゼシグナル伝達経路で発現され得、および／若しくは活性化され得る。
いくつかの実施形態では、前記キナーゼ、ホスファターゼ、ホスホリポアーゼ、インテグリン、シグナル伝達調節因子、Ｇタンパク質、膜貫通レセプター、および／または他のキナーゼシグナル伝達分子の内の１つまたは複数は、前記キナーゼ経路阻害剤により阻害され得る。
【００３５】
キナーゼ経路活性マーカーのパネルは、ＦＥＳ、ＰＫＣ、並びにプロテインキナーゼＣアイソフォーム、たとえば、ＰＫＣδ（ＫＰＣＤ）、ＰＲＫＣＡ、ＰＲＫＣＢ、およびＰＲＫＣＤ、ＰＫＡ、ＰＡＫ、たとえばＰＡＫ１およびＰＡＫ２、ＳＴＫ１０、ＧＳＫ３Ａ、ＲＳＫ２、ＲＡＳ、ＲＡＦ、ＭＥＫ、たとえばＭＥＫ１（ＭＡＰ２Ｋ１）、ＥＲＫ、たとえばＭＡＰＫ３（ＥＲＫ１）およびＭＡＰＫ１（ＥＲＫ２）、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、たとえばＡＫＴ１、ＭＴＯＲ、Ｓ６キナーゼ、ＳＴＡＴ５、ＣＡＭＫＫ、ＳＹＫ（ＫＳＹＫ）、ＬＹＮ、Ｐ３８Ａ、ＣＤＫ１、ＣＫ２Ａ１、ＰＫＡＣＡ、ＩＲＡＫ４、ＰＫＣＢ  ｉｓｏ２、Ｃｏｔ、ＰＫＣＤ、ＰＫＣＡ、ＰＫＣＢ、ＰＫＣＧ、ＰＫＣＨ、ＢＲＡＦ、ＭＥＫ２、ＰＤＫ１、ＣＤＫ２、ＰＴＮ６、Ｄ３（ＰＬＤ３）、ＩＱＧＡＰ１、ＧＲＢ２、ＲＨＯＡ、ＲＨＯＧ、並びにＳ１０ＡＢ、並びにこれらと共に選択的に発現されるかまたは活性化されるあらゆるキナーゼ、ホスファターゼ、ホスホリポアーゼ、インテグリン、シグナル伝達調節因子、Ｇタンパク質、膜貫通レセプター、および／または他のキナーゼシグナル伝達分子の内のいずれか１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはより多くを含み得る。
これらのキナーゼ経路活性マーカーは、キナーゼ経路阻害剤に対して感受性を示す進行した分化状態を有する白血病細胞で概して発現され、および／または活性化され、および／またはリン酸化されることが分かっているが、未分化の骨髄芽球では概して発現されず、および／または活性化されず、および／またはリン酸化されない。
従って、工程（ａ）は、データを分析して、このキナーゼ経路活性マーカーのパネルが前記白血病細胞で発現されているかどうかおよび／または活性化されているかどうかおよび／またはリン酸化されているかどうかを決定することを含み得、このキナーゼ経路活性マーカーのパネルがこの細胞で発現され、および／または活性化され、および／またはリン酸化されている場合には、進行した分化状態を決定する。
【００３６】
有利には、キナーゼ経路活性マーカーのパネルは、ＰＫＣ、ＥＲＫ、ＰＡＫ１、およびＰ３８αの内のいずれか１個、２個、３個、または４個を含み得、工程（ａ）は、データを分析して、このキナーゼ経路活性マーカーのパネルが白血病細胞で発現され且つ活性化されているかどうかを決定することを含み得、このキナーゼ経路活性マーカーのパネルがこの細胞で発現され且つ活性化されている場合には、進行した分化状態であると決定する。
【００３７】
適切には、キナーゼ経路活性マーカーのパネルは、ＰＫＣＤ、ＰＫＣＡ、ＰＫＡＣＡ、ＩＲＡＫ４、およびＣＫ２Ａ１の内のいずれか１個、２個、３個、４個、または５個を含み得、工程（ａ）は、データを分析して、このキナーゼ経路活性マーカーのパネルが白血病細胞で発現され且つ活性化されているかどうかを決定することを含み得、このキナーゼ経路活性マーカーのパネルがこの細胞で発現され且つ活性化されている場合には、進行した分化状態であると決定する。
或いは、このキナーゼ経路活性マーカーのパネルは、ＭＡＰＫ１、ＭＡＰＫ２、ＡＫＴ、ＡＫＴ１Ｓ１、ＭＡＰ２Ｋ１、およびＭＡＰ２Ｋ２の内のいずれか１個、２個、３個、４個、５個、または６個を含み得、工程（ａ）は、データを分析して、このキナーゼ経路活性マーカーのパネルが白血病細胞で発現され且つ活性化されているかどうかを決定することを含み得、このキナーゼ経路活性マーカーのパネルがこの細胞で発現され且つ活性化されている場合には、進行した分化状態であると決定する。
【００３８】
キナーゼ経路活性マーカーのパネルは、追加でまたは代替で、１箇所または複数箇所のリン酸化部位のパネル（健康な骨髄単球細胞でのキナーゼシグナル伝達経路において概してリン酸化されるかまたは高レベルで概してリン酸化されるが、未分化の骨髄芽球で概してリン酸化されないかまたは高レベルで概してリン酸化されない）を含む。
工程（ａ）は、データを分析して、上記リン酸化部位のパネルが前記白血病細胞において、高レベルでリン酸化されているどうかを決定することを含んでもよい。ここで、リン酸化部位のパネルが、白血病細胞において高レベルでリン酸化されている場合には、進行した分化状態であると決定する。
【００３９】
「高レベル」でのリン酸化への参照は、ここでおよび本明細書の他の箇所で使用される場合、参照タンパク質のまたは参照リン酸化部位での平均リン酸化と比べて高いリン酸化のレベルを示す。
リン酸化の「低レベル」への言及も同様に、参照タンパク質のまたは参照リン酸化部位での平均リン酸化以下であるリン酸化のレベルを示す。
参照タンパク質または参照リン酸化部位の平均リン酸化は標準化された値であり、この値を、複数のサンプル全体にわたって算出された平均への参照により決定し得るか、または当分野で周知の方法（たとえばＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）に従う実験室分析によるか若しくは当分野で利用可能な情報への参照により確立され得る、未分化の骨髄芽球または他の健康な細胞タイプにおける参照タンパク質または参照リン酸化部位のリン酸化状態への参照により決定し得る。
そのため、たとえば、特定のリン酸化部位でのリン酸化の平均レベルを、多数のＡＭＬ患者から得られた細胞サンプルにおけるこの部位でのリン酸化の範囲を確立し、これらのサンプル全体にわたる平均リン酸化を算出することにより決定し得る。
この部位でのリン酸化の「高レベル」とは、この算出された平均と比べて高いリン酸化のレベルのことである。
【００４０】
具体的には、リン酸化部位のパネルは、細胞増殖または細胞生存に関与するキナーゼシグナル伝達経路において高レベルでリン酸化される１箇所または複数箇所のリン酸化部位を含み得る。
いくつかの実施形態では、前記リン酸化部位の内の１箇所または複数箇所は、前記キナーゼ経路阻害剤により阻害されるキナーゼシグナル伝達経路において高レベルでリン酸化され得る。
【００４１】
リン酸化部位のパネルは、下記の表１に記載されたリン酸化部位の内のいずれか１箇所、２箇所、３箇所、４箇所、５箇所、６箇所、７箇所、８箇所、９箇所、１０箇所、または１０箇所超を含み得る。
【表１】
2020524802.tif 000003
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【００４２】
リン酸化部位のパネルは、下記の表２に記載されたリン酸化部位の内のいずれか１箇所、２箇所、３箇所、４箇所、５箇所、６箇所、７箇所、８箇所、９箇所、１０箇所、または１０箇所超を含み得る。
【表２】
2020524802.tif 000053
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【００４３】
有利には、リン酸化部位のパネルは、キナーゼ中に１箇所または複数箇所のリン酸化部位を含み得、たとえば、
Ｓ１４４でのＰＡＫ１、
Ｓ１４１でのＰＡＫ２、
Ｙ１８７でのＭＡＰＫ１、
Ｔ１８５でのＭＡＰＫ１、
Ｓ３８０でのＲＰＳ６ＫＡ１、
Ｔ２０２でのＭＡＰＫ３、
Ｙ２０４でのＭＡＰＫ３、
Ｓ１６６でのＭＡＰ３Ｋ３、
Ｓ２９５およびＳ２９７でのＳＹＫ、
Ｓ１１０でのＩＲＡＫ３、
ＰＫＮ１（３７９〜３９６＋ホスホＳＴ）、
ＳＴＫ１０（４４７〜４６４＋ホスホＳＴ）、
Ｓ４１０でのＲＩＰＫ３、
Ｔ２１８でのＰＲＫＣＤ、
Ｔ２９５でのＰＲＫＣＤ、
Ｙ３１３でのＰＲＫＣＤ、
Ｔ５０７でのＰＲＫＣＤ、
Ｔ６４５でのＰＲＫＣＤ、
Ｓ６６４でのＰＲＫＣＤ、
Ｔ２６３８でのＰＲＫＣＤ、
Ｓ５３５でのＭＡＲＫ２、
Ｓ５３５でのＭＡＰ３Ｋ２、
ＰＲＫＤ２（７１０〜７３０＋ホスホＹ）、
ｓ８０５でのＮＲＫ、
Ｓ５８でのＰＲＫＡＲ２Ａ、ＺＡＫ
（５９１〜６１６＋ホスホＳＴ）、
Ｓ９００でのＭＡＰ４Ｋ４、
Ｓ３４７でのＣＤＫ９、
ＲＰＳ６ＫＡ４（６８１〜６９９＋２ホスホＳＴ）、
ＭＡＳＴ３（１２５４〜１２７４＋ホスホＳＴ）、
ＮＥＫ９（１０〜３９＋ホスホＳＴ）、
ＧＳＫ３Ａ（１９〜５０＋ホスホＳＴ）、
Ｓ３６９でのＲＰＳ６ＫＡ３、
Ｓ５３１でのＲＩＰＫ２、
Ｔ６０６でのＡＡＫ１、
Ｙ２９２でのＴＹＫ２、
Ｓ２１４でのＰＤＰＫ２、
ＰＲＫＡＡ１（３〜８＋ホスホＳＴ）、
Ｓ７７２でのＳＴＫ１１Ｐ、
Ｓ１４６８でのＢＡＺ１Ｂ、
Ｓ１４０でのＣＬＫ１、
Ｓ３２８でのＭＡＰ４Ｋ２、
ＷＮＫ１（１９９６〜２０２１＋ホスホＳＴ）、
Ｓ２７１でのＣＤＫ１１Ａ、
Ｙ７１３でのＦＥＳ、並びに／または
Ｓ７６９でのＴＮＩＫの内の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、または１０個超を含み得、
工程（ａ）は、データを分析して、ホスホペプチドのパネルが白血病細胞において高レベルでリン酸化されているかどうかを決定することを含み得、ここで、ホスホペプチドのパネルがこの細胞において高レベルでリン酸化されている場合には、進行した分化状態であると決定する。
【００４４】
好ましくは、リン酸化部位のパネルは、キナーゼ中に調節リン酸化部位を含み得、たとえば、Ｓ１４４でのＰＡＫ１、Ｓ１４１でのＰＡＫ２、Ｙ１８７および／またはＴ１８５でのＭＡＰＫ１、並びにＳ３８０でのＲＰＳ６ＫＡ１を含み得、
工程（ａ）は、データを分析して、ホスホペプチドのパネルが白血病細胞において高レベルでリン酸化されているかどうかを決定することを含み得、このホスホペプチドのパネルがこの細胞において高レベルでリン酸化されている場合には、進行した分化状態であると決定する。
【００４５】
適切には、リン酸化部位のパネルは、Ｙ１８７でのＭＡＰＫ１、Ｓ１４１でのＰＡＫ２、およびＹ３１３でのＰＲＫＣＤを含み得、工程（ａ）は、データを分析して、ホスホペプチドのパネルが白血病細胞においてリン酸化されているかどうかを決定することを含み得、このホスホペプチドのパネルがこの細胞においてリン酸化されている場合には、進行した分化状態であると決定する。
【００４６】
任意選択により、リン酸化部位のパネルは、Ｙ７１３でのＦＥＳ、Ｔ２０２／Ｙ２０４でのＭＡＰＫ３、Ｔ１８５／Ｙ１８７でのＭＡＰＫ１、Ｓ１４４でのＰＡＫ１、Ｓ２２２でのＭＥＫ１、Ｓ１４１でのＰＡＫ２、およびＳ６４５でのＰＲＫＣＤを含み得、工程（ａ）は、データを分析して、ホスホペプチドのパネルが白血病細胞においてリン酸化されているかどうかを決定することを含み得、このホスホペプチドのパネルがこの細胞においてリン酸化されている場合には、進行した分化状態であると決定する。
【００４７】
リン酸化部位のパネルは、たとえば、表１で示されているように、ＰＲＫＣＡ、ＰＲＫＣＢ、および／若しくはＰＲＫＣＤ）等の１種若しくは複数種のＰＫＣアイソフォーム上の１箇所若しくは複数箇所のリン酸化部位、並びに／またはＳＴＫ１０、ＧＳＫ３Ａ、ＰＡＫ１、ＰＡＫ２、およびＧｉ２４（ＶＳＩＲ）の１つ若しくは複数上の１箇所若しくは複数箇所のリン酸化部位を含み得る。
たとえば、このリン酸化部位のパネルは、ＧＳＫ３ＡのＳ２１、並びに／またはＰＲＫＣＤのＴ５０７、Ｔ２９５、Ｔ２１８、Ｙ３１３、Ｔ５０７、および／若しくはＳ６６４、並びに／またはＳＴＫ１０のＳ２０、並びに／またはＳＴＫ１０のＳ１３、並びに／またはＰＡＫ１のＳ１４４、並びに／またはＰＡＫ２のＳ１４１を含み得る。
【００４８】
適切には、リン酸化部位のパネルは、ＭＡＰＫ１上の（たとえば、ＭＡＰＫ１のＹ１８７および／若しくはＴ１８５での、並びに／またはＭＡＰＫ３のＴ２０２若しくはＹ２０４での、並びに／またはＧＳＫ３ＡのＳ２１での）リン酸化部位からなり得、
工程（ａ）は、データを分析して、ホスホペプチドのパネルが白血病細胞においてリン酸化されているかどうかを決定することを含み得、このホスホペプチドのパネルがこの細胞においてリン酸化されている場合には、進行した分化状態であると決定する。
【００４９】
フランス系−アメリカ系−イギリス系（ＦＡＢ）分類システム下で、白血病細胞の分類を記録している前記データは、白血病細胞のＦＡＢ分類を示すあらゆる種類のデータを含み得る。
白血病細胞がＭ４、Ｍ４ｅｏｓ、またはＭ５と分類される場合には（好ましくは、白血病細胞がＭ４と分類される場合には）、進行した分化状態であると決定し得る。
【００５０】
本発明の方法は、患者の白血病の分化状態に基づいて、キナーゼ阻害剤療法に適しているＡＭＬ患者の効果的な特定を可能にする。
様々な種類のキナーゼ阻害剤が、ＡＭＬ療法での使用のための候補として既に提案されているが、患者の白血病の分化状態がキナーゼ阻害剤療法に対する適性を多少とも示し得るという開示または示唆はこれまで存在していない。
従って、本発明は、キナーゼ阻害剤療法に適しているＡＭＬ患者の新規で非自明のグループ化を提供する。
具体例により証明されるように、このグループ化は、キナーゼ阻害剤療法に反応するＡＭＬ患者に関して高度に選択的である。
【００５１】
従って、さらに別の態様によれば、本発明は、患者の急性骨髄性白血病を処置する方法での使用のためのキナーゼ経路阻害剤であって、このキナーゼ経路阻害剤は、細胞増殖または細胞生存に関与するキナーゼシグナル伝達経路を阻害し、この患者は、分化状態が進行している白血病細胞を有する、キナーゼ経路阻害剤を提供する。
好ましくは、この白血病細胞の分化状態を、本明細書で説明されている本発明の方法に従って決定し得る。
【００５２】
キナーゼ経路阻害剤とは、キナーゼ経路の活性を遮断する小分子または抗体等の薬剤のことである。
キナーゼ経路阻害剤として、酵素およびキナーゼ経路シグナル伝達分子（たとえば、キナーゼ、ホスファターゼ、およびＧタンパク質）の阻害剤が挙げられ得る。
適切には、このキナーゼ経路阻害剤はキナーゼ阻害剤であり得る。キナーゼ阻害剤とは、タンパク質キナーゼのキナーゼ活性を遮断する薬剤のことである。
そのような薬剤は公知であり、且つ当分野で広く利用可能である。キナーゼ阻害剤の阻害能力を、候補化合物とのインキュベーションの前後にキナーゼの活性を決定することにより評価し得る。キナーゼ阻害剤を特定するためのキナーゼプロファイリング方法も当分野で広く利用可能であり、そのため、当業者は、本発明での使用のために広範囲のキナーゼ阻害剤を自由に使用し得る。
特定のキナーゼを阻害し得る薬剤の特定のために使用され得る１つのアッセイは、Ｈａｓｔｉｅ，ら、２００６．Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．２００６；１（２）：９６８−７１；Ｂａｉｎ，ら、２００７．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２００７  Ｄｅｃ  １５；４０８（３）：２９７−３１５で説明されている、３３Ｐ  ＡＴＰを使用する放射性フィルタ結合アッセイである。
この方法は、高感度であり、正確であり、且つ活性の直接測定をもたらす。そのため、結果をサンプル間で直接比較可能である。
【００５３】
好ましくは、キナーゼ経路阻害剤は、ＦＬＴ３経路、ＰＫＣ経路、ＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ＭＴＯＲ−Ｓ６Ｋ経路、ＰＡＫ経路、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路、ＣＡＭＫＫ経路、またはこれらに並行のあらゆるキナーゼシグナル伝達経路の内のいずれか１つまたは複数を阻害し得る。たとえば、このキナーゼ経路阻害剤は、たとえば、ＰＫＣ、ＰＡＫ、ＲＡＦ、ＭＥＫ、ＥＲＫ、Ｐ１３Ｋ、ＡＫＴ、ＭＴＯＲ、Ｓ６Ｋ、ＳＴＡＴ５、ＣＡＭＫＫ、ＳＹＫ、ＬＹＮ、ＪＡＫ、ＲＴＫ、ＡＬＫ、ＣＤＫ、およびＢＴＫの内の１つまたは複数を阻害するキナーゼ阻害剤であり得る。
【００５４】
いくつかの実施形態では、キナーゼ経路阻害剤は、
（ａ）ＡＰＳ−２−７９、ＡＺ  ６２８、ＡＺＤ８３３０、ＢＩ−８４７３２５、ビニメチニブ、ＢＩＸ  ０２１８８、ＣＥＰ−３２４９６、コビメチニブ、ダブラフェニブ、ＤＥＬ−２２３７９、ＥＲＫ５−ＩＮ−１、ＦＲ  １８０２０４、ＧＤＣ−０６２３、ＧＤＣ−０９９４、ＨＡ１５、ホノキオール、ＰＤ０３２５９０１、ＰＤ１８４３５２、ＰＤ３１８０８８、ＰＤ９８０５９、ピマセルチブ（Ｐｉｍａｓｅｒｔｉｂ）、ＰＬＸ７９０４、レファメチニブ（Ｒｅｆａｍｅｔｉｎｉｂ）、ＲＯ５１２６７６６、ＳＣ１、ＳＣＨ７７２９８４、ＳＣＨ７７２９８４、セルメチニブ、ＳＧＸ−５２３、ＳＬ−３２７、ソラフェニブ、ＴＡＫ７３３、トラメチニブ、Ｕ０１２６、Ｕ０１２６、ウリキセルチニブ（Ｕｌｉｘｅｒｔｉｎｉｂ）、バンデタニブ、ベムラフェニブ、ＶＸ−１１ｅ、およびＸＭＤ８−９２から選択されるＭＥＫ阻害剤；または
（ｂ）ＡＭＧ  ９２５、アムバチニブ（Ａｍｕｖａｔｉｎｉｂ）、ＡＺＤ２９３２、カボザンチニブ、ドビチニブ（Ｄｏｖｉｔｉｎｉｂ）、ＥＮＭＤ−２０７６、ＥＮＭＤ−２０７６  Ｌ−（＋）−酒石酸、Ｇ−７４９、ＫＷ−２４４９、ミドスタウリン、パクリチニブ、キザルチニブ（Ｑｕｉｚａｒｔｉｎｉｂ）、Ｒ４０６、タンデュチニブ、ＴＣＳ  ３５９、ＴＧ１０１２０９、およびＵＮＣ２０２５から選択されるＦＬＴ３阻害剤；若しくは、イマチニブ、レンバチニブ、ルシタニブ（Ｌｕｃｉｔａｎｉｂ）、スニチニブ、オシメルチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ダサチニブ、ニロチニブ、ラパチニブ、パゾパニブ、ルキソリチニブ、ポナチニブ、カボザンチニブ、レゴラフェニブ、ボスチニブ、アキシチニブ、アファチニブ、およびニンテダニブから選択されるＲＴＫ阻害剤；または
（ｃ）エンザスタウリン、ビスインドリルマレイミド  Ｉ、ダフネチン（Ｄａｐｈｎｅｔｉｎ）、デカリニウム塩化物、Ｇｏ６９８３、Ｇｏ６９７６、ＬＹ３３３５３１  ＨＣｌ、Ｒｏ  ３１−８２２０メシレート、ソトラスタウリン、およびスタウロスポリンから選択されるＰＫＣ阻害剤；または
（ｄ）ＦＲＡＸ１０１３、ＦＲＡＸ４８６、ＦＲＡＸ５９７、ＩＰＡ−３、およびＰＦ３７５８３０９から選択されるＰＡＫ阻害剤；または
（ｅ）３−メチルアデニン、Ａ６６、Ａ−６７４５６３、アフレセルチブ（Ａｆｕｒｅｓｅｒｔｉｂ）、Ａｋｔｉ−１／２、アルペリシブ（Ａｌｐｅｌｉｓｉｂ）、ＡＭＧ３１９、アピトリシブ（Ａｐｉｔｏｌｉｓｉｂ）、ＡＳ−２５２４２４、ＡＳ−６０４８５０、ＡＳ−６０５２４０、ＡＴ１３１４８、ＡＴ７８６７、ＡＺＤ１２０８、ＡＺＤ５３６３、ＡＺＤ６４８２、ＡＺＤ８０５５、ＡＺＤ８１８６、ＡＺＤ８８３５、ＢＧＴ２２６、ＢＩ−７８Ｄ３、ブパルリシブ、ＣＡＹ１０５０５、ＣＣ−２２３、ＣＣＴ１２８９３０、ＣＨ５１３２７９９、コパンリシブ（Ｃｏｐａｎｌｉｓｉｂ）、ＣＰ−４６６７２２、ＣＰＩ−３６０、ＣＵＤＣ−９０７、ＣＸ−６２５８  ＨＣｌ、ＣＺ４１５、ＣＺＣ２４８３２、ダクトリシブ（Ｄａｃｔｏｌｉｓｉｂ）、デュベリシブ（Ｄｕｖｅｌｉｓｉｂ）、ＥＴＰ−４６４６４、エベロリムス、ＧＤＣ−００８４、ＧＤＣ−０３４９、ゲダトリシブ（Ｇｅｄａｔｏｌｉｓｉｂ）、ＧＮＥ−３１７、ＧＳＫ１０５９６１５、ＧＳＫ２２６９５５７、ＧＳＫ２２９２７６７、ＧＳＫ２６３６７７１、ＧＳＫ６９０６９３、ＨＳ−１７３、ＩＣ−８７１１４、イデラリシブ、ＩＮＫ  １２８、イパタセルチブ（Ｉｐａｔａｓｅｒｔｉｂ）、ＫＵ−００６０６４８、ＫＵ−００６３７９４、ＫＵ−５５９３３、ＬＴＵＲＭ３４、ＬＹ２９４００２、ＬＹ３０２３４１４、ＭＨＹ１４８５、ミルテホシン、ミランセルチブ（Ｍｉｒａｎｓｅｒｔｉｂ）、ＭＫ−２２０６、ＮＵ７０２６、ＮＵ７４４１、オミパリシブ（Ｏｍｉｐａｌｉｓｉｂ）、ＯＳＩ−０２７、パロミド（Ｐａｌｏｍｉｄ）５２９、ペリホシン、ＰＦ−０４６９１５０２、ＰＦ−４９８９２１６、ＰＨＴ−４２７、ＰＩ−１０３、ＰＩ−３０６５、ピクチリシブ（Ｐｉｃｔｉｌｉｓｉｂ）、ＰＩＫ−２９３、ＰＩＫ−２９４、ＰＩＫ−９０、ＰＩＫ−９３、ピララリシブ（Ｐｉｌａｒａｌｉｓｉｂ）、ＰＩＭ４４７、ピペルロングミン（Ｐｉｐｅｒｌｏｎｇｕｍｉｎｅ）、ＰＫＩ−４０２、ＰＰ１２１、ラパマイシン、リダフォロリムス、ＳＡＲ４０５、ＳＣ７９、ＳＧＩ−１７７６、ＳＩＳ３、ＳＫＩ  ＩＩ、ＳＲＰＩＮ３４０、タクロリムス、タセリシブ（Ｔａｓｅｌｉｓｉｂ）、テムシロリムス、ＴＧ１００−１１５、ＴＧ１００７１３、ＴＧＲ−１２０２、ＴＩＣ１０、ＴＩＣ１０類似体、トリン（Ｔｏｒｉｎ）１、トリン２、トルキニブ（Ｔｏｒｋｉｎｉｂ）、トリシリビン（Ｔｒｉｃｉｒｉｂｉｎｅ）、ウプロセルチブ（Ｕｐｒｏｓｅｒｔｉｂ）、ＶＥ−８２１、ビスツセルチブ（Ｖｉｓｔｕｓｅｒｔｉｂ）、ボキシタリシブ（Ｖｏｘｔａｌｉｓｉｂ）、ＶＰＳ３４−ＩＮ１、ＶＳ−５５８４、ＷＡＹ−６００、ワートマニン、ＷＹＥ−１２５１３２、ＷＹＥ−３５４、ＷＹＥ−６８７、ＸＬ１４７類似体、ＸＬ３８８、ゾタロリムス、およびＺＳＴＫ４７４から選択されるＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ＭＴＯＲ阻害剤；または
（ｆ）セリチニブ、ブリガチニブ（Ｂｒｉｇａｔｉｎｉｂ）、クリゾチニブ、およびアレシチニブ（Ａｌｅｃｉｔｉｎｉｂ）から選択されるＡＬＫ阻害剤；または
（ｇ）パルボシクリブおよびリボシクリブ（Ｒｉｂｏｃｉｃｌｉｂ）から選択されるＣＤＫ阻害剤；または
（ｈ）トファシチニブ等のＪＡＫ阻害剤；または
（ｉ）イブルチニブ等のＢＴＫ阻害剤
であるキナーゼ阻害剤であり得る。
【００５５】
キナーゼ経路阻害剤は、たとえば、アファチニブ、アレシチニブ、アルペリシブ、アキシチニブ、ボスチニブ、ブリガチニブ、ブパルリシブ、カボザンチニブ、セリチニブ、コビメチニブ、コパンリシブ、クリゾチニブ、ダブラフェニブ、ダサチニブ、デカリニウム塩化物、デュベリシブ、エルロチニブ、エベロリムス、ゲフィチニブ、イブルチニブ、イデラリシブ、イマチニブ、ラパチニブ、レンバチニブ、ミルテホシン、ニロチニブ、ニンテダニブ、オシメルチニブ、パクリチニブ、パルボシクリブ、パゾパニブ、ポナチニブ、キザルチニブ、ラダホロリムス（ｒａｄａｆｏｒｏｌｉｍｕｓ）、ラパマイシン、レゴラフェニブ、リボシクリブ、ルキソリチニブ、セルメチニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、テムシロリムス、トファシチニブ、バンデタニブ、ベムラフェニブ、およびゾタロリムスの内の１つであり得る。
【００５６】
いくつかの好ましい実施形態では、キナーゼ経路阻害剤は、
ＭＥＫ阻害剤、たとえば、ＡＰＳ−２−７９、ＡＺ  ６２８、ＡＺＤ８３３０、ＢＩ−８４７３２５、ビニメチニブ、ＢＩＸ  ０２１８８、ＣＥＰ−３２４９６、コビメチニブ、ダブラフェニブ、ＤＥＬ−２２３７９、ＥＲＫ５−ＩＮ−１、ＦＲ  １８０２０４、ＧＤＣ−０６２３、ＧＤＣ−０９９４、ＨＡ１５、ホノキオール、ＰＤ０３２５９０１、ＰＤ１８４３５２、ＰＤ３１８０８８、ＰＤ９８０５９、ピマセルチブ、ＰＬＸ７９０４、レファメチニブ、ＲＯ５１２６７６６、ＳＣ１、ＳＣＨ７７２９８４、ＳＣＨ７７２９８４、セルメチニブ、ＳＧＸ−５２３、ＳＬ−３２７、ソラフェニブ、ＴＡＫ７３３、トラメチニブ、Ｕ０１２６、Ｕ０１２６、ウリキセルチニブ、バンデタニブ、ベムラフェニブ、ＶＸ−１１ｅ、若しくはＸＭＤ８−９２；または
ＦＬＴ３／ＰＫＣ阻害剤、たとえばミドスタウリン；または
ＰＡＫ阻害剤、たとえば、ＦＲＡＸ１０１３、ＦＲＡＸ４８６、ＦＲＡＸ５９７、ＩＰＡ−３、およびＰＦ３７５８３０９；または、Ｐ１３Ｋ／ＡＫＴ／ＭＴＯＲ、たとえば、３−メチルアデニン、Ａ６６、Ａ−６７４５６３、アフレセルチブ、Ａｋｔｉ−１／２、アルペリシブ、ＡＭＧ３１９、アピトリシブ、ＡＳ−２５２４２４、ＡＳ−６０４８５０、ＡＳ−６０５２４０、ＡＴ１３１４８、ＡＴ７８６７、ＡＺＤ１２０８、ＡＺＤ５３６３、ＡＺＤ６４８２、ＡＺＤ８０５５、ＡＺＤ８１８６、ＡＺＤ８８３５、ＢＧＴ２２６、ＢＩ−７８Ｄ３、ブパルリシブ、ＣＡＹ１０５０５、ＣＣ−２２３、ＣＣＴ１２８９３０、ＣＨ５１３２７９９、コパンリシブ、ＣＰ−４６６７２２、ＣＰＩ−３６０、ＣＵＤＣ−９０７、ＣＸ−６２５８  ＨＣｌ、ＣＺ４１５、ＣＺＣ２４８３２、ダクトリシブ、デュベリシブ、ＥＴＰ−４６４６４、エベロリムス、ＧＤＣ−００８４、ＧＤＣ−０３４９、ゲダトリシブ、ＧＮＥ−３１７、ＧＳＫ１０５９６１５、ＧＳＫ２２６９５５７、ＧＳＫ２２９２７６７、ＧＳＫ２６３６７７１、ＧＳＫ６９０６９３、ＨＳ−１７３、ＩＣ−８７１１４、イデラリシブ、ＩＮＫ  １２８、イパタセルチブ、ＫＵ−００６０６４８、ＫＵ−００６３７９４、ＫＵ−５５９３３、ＬＴＵＲＭ３４、ＬＹ２９４００２、ＬＹ３０２３４１４、ＭＨＹ１４８５、ミルテホシン、ミランセルチブ、ＭＫ−２２０６、ＮＵ７０２６、ＮＵ７４４１、オミパリシブ、ＯＳＩ−０２７、パロミド５２９、ペリホシン、ＰＦ−０４６９１５０２、ＰＦ−４９８９２１６、ＰＨＴ−４２７、ＰＩ−１０３、ＰＩ−３０６５、ピクチリシブ、ＰＩＫ−２９３、ＰＩＫ−２９４、ＰＩＫ−９０、ＰＩＫ−９３、ピララリシブ、ＰＩＭ４４７、ピペルロングミン、ＰＫＩ−４０２、ＰＰ１２１、ラパマイシン、リダフォロリムス、ＳＡＲ４０５、ＳＣ７９、ＳＧＩ−１７７６、ＳＩＳ３、ＳＫＩ  ＩＩ、ＳＲＰＩＮ３４０、タクロリムス、タセリシブ、テムシロリムス、ＴＧ１００−１１５、ＴＧ１００７１３、ＴＧＲ−１２０２、ＴＩＣ１０、ＴＩＣ１０類似体、トリン１、トリン２、トルキニブ、トリシリビン、ウプロセルチブ、ＶＥ−８２１、ビスツセルチブ、ボキシタリシブ、ＶＰＳ３４−ＩＮ１、ＶＳ−５５８４、ＷＡＹ−６００、ワートマニン、ＷＹＥ−１２５１３２、ＷＹＥ−３５４、ＷＹＥ−６８７、ＸＬ１４７類似体、ＸＬ３８８、ゾタロリムス、若しくはＺＳＴＫ４７４から選択される。適切には、このキナーゼ経路阻害剤は、トラメチニブ、またはミドスタウリン、またはＰＦ  ３７５８３０９であり得る。
【００５７】
本発明の特に好ましい実施形態では、キナーゼ経路阻害剤は、ＭＥＫ阻害剤、ＦＬＴ３／ＰＫＣ阻害剤、またはＰＡＫ阻害剤であり、工程（ａ）は、
（ｉ）患者から得られた白血病細胞でのＭＡＰＫ１および／若しくはＭＡＰＫ３における１箇所若しくは複数箇所のリン酸化部位のリン酸化に関するデータを分析することにより、この患者の白血病の分化状態を決定すること；並びに／または
（ｉｉ）ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ１２３、およびＨＬＡ−ＤＲからなるＣＤマーカーの群の、前記患者から得られた白血病細胞上での表面発現に関するデータを分析することにより、この患者の白血病の分化状態を決定することを含み、
１箇所若しくは複数箇所のリン酸化部位の高レベルのリン酸化、および／または前記白血病細胞上での前記ＣＤマーカーの群の存在は、進行した分化状態を示す。
【００５８】
ＭＡＰＫ１における前記１箇所または複数箇所のリン酸化部位は、Ｙ１８７および／またはＴ１８５を含み得る。ＭＡＰＫ３における前記１箇所または複数箇所のリン酸化部位は、Ｔ２０２および／またはＹ２０４を含み得る。
【００５９】
本明細書に記載されている実験データにより実証されているように、本発明者らは、本発明が、ミドスタウリン等のＦＬＴ３／ＰＫＣ経路阻害剤による処置に反応するＡＭＬ患者を特定するための正確な試験を提供するということを発見している。
【００６０】
従って、好ましい実施形態では、キナーゼ経路阻害剤は、ミドスタウリン等のＦＬＴ３／ＰＫＣ経路阻害剤であり、工程（ａ）は、
（ｉ）患者から得られた白血病細胞でのＧＳＫ３Ａ、ＰＲＫＣＡ、ＰＲＫＣＢ、ＰＲＫＣＤ、ＳＴＫ１０、ＰＡＫ１、ＰＡＫ２ＭＡＰＫ１、および／若しくはＭＡＰＫ３の内の１つ若しくは複数におけるリン酸化部位のリン酸化に関するデータを分析することにより；並びに／または
（ｉｉ）ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４ＰＫＣ５、ＣＤ６４、ＣＤ１２３、およびＨＬＡ−ＤＲからなるＣＤマーカーの群の、前記患者から得られた白血病細胞上での表面発現に関するデータを分析することにより；
患者の白血病の分化状態を決定することを含み、
ＧＳＫ３Ａ、ＰＲＫＣＡ、ＰＲＫＣＢ、ＰＲＫＣＤ、ＳＴＫ１０、ＰＡＫ１、ＰＡＫ２ＭＡＰＫ１、および／若しくはＭＡＰＫ３の白血病細胞における高レベルのリン酸化；または前記ＣＤマーカーの群の白血病細胞による発現のいずれかは、進行した分化状態を示す。
【００６１】
これらの実施形態では、ＧＳＫ３Ａ、ＰＲＫＣＡ、ＰＲＫＣＢ、ＰＲＫＣＤ、ＳＴＫ１０、ＰＡＫ１、ＰＡＫ２ＭＡＰＫ１、および／またはＭＡＰＫ３における１箇所または複数箇所のリン酸化部位のリン酸化に関する前記データは、ｐＳ２１でのＧＳＫ３Ａのリン酸化、並びに／またはＹ３１３、ｐＴ５０７、ｐＴ２９５、ｐＴ２１８、および／若しくはｐＳ６６４でのＰＲＫＣＤのリン酸化、並びに／またはｐＳ２０および／若しくはｐＳ１３でのＳＴＫ１０のリン酸化、並びに／またはｐＳ１４４でのＰＡＫ１のリン酸化、並びに／またはｐＳ１４１でのＰＡＫ２のリン酸化、並びに／またはＹ１８７および／若しくはＴ１８５でのＭＡＰＫ１のリン酸化、並びに／またはＴ２０２および／若しくはＹ２０４でのＭＡＰＫ３のリン酸化に関するデータを含み得る。
【００６２】
本発明はまた、トラメチニブ等のＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路阻害剤による処置に反応するＡＭＬ患者を特定するための非常に正確なプロトコルも提供する。
本発明者らは、分化状態が進行している白血病細胞が、そのような阻害剤による処置に対して高度に敏感であることを発見している。そのような細胞は、ＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、および／またはＢＲＡＦにおいて活性化変異を有することが多い。従って、そのような活性化変異の存在に関する試験は、本発明のプロトコルを補足する。
【００６３】
従って、本発明の第１の態様のいくつかの好ましい実施形態では、キナーゼ経路阻害剤は、トラメチニブ等のＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ阻害剤であり、
工程（ａ）は、白血病細胞の遺伝子型に関するデータを分析することにより、患者から得られた白血病細胞におけるＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、またはＢＲＡＦの変異状態を決定することをさらに含み、
工程（ｂ）は、白血病の分化状態が進行している場合には、または白血病細胞におけるＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、若しくはＢＲＡＦの内のいずれか１つが活性化変異を有する場合には、この患者の急性骨髄性白血病をこのキナーゼ経路阻害剤で効果的に処置し得ると予測することを含む。
【００６４】
本発明の第２の態様のいくつかの好ましい実施形態では、キナーゼ経路阻害剤は、トラメチニブ等のＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ阻害剤であり；工程（ａ）は、白血病細胞の遺伝子型に関するデータを分析することにより、患者から得られた白血病細胞におけるＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、またはＢＲＡＦの変異状態を決定することをさらに含み、工程（ｂ）は、白血病の分化状態が進行している場合、または白血病細胞におけるＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、若しくはＢＲＡＦの内のいずれか１つが活性化変異を有する場合には、この患者をこのキナーゼ経路阻害剤で処置することを含む。
【００６５】
本発明の第３の態様のいくつかの好ましい実施形態では、キナーゼ経路阻害剤は、トラメチニブ等のＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ阻害剤であり、
工程（ａ）は、白血病細胞の遺伝子型に関するデータを分析することにより、患者から得られた白血病細胞におけるＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、またはＢＲＡＦの変異状態を決定することをさらに含み、
工程（ｂ）は、分化状態が進行している白血病を有し、および／またはＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、若しくはＢＲＡＦのいずれか１つで活性化変異を有する白血病を有するいずれか１例または複数例の患者を特定し、前記１例または複数例の患者が、このキナーゼ経路阻害剤による効果的な処置に適し得ることを決定することを含む。
【００６６】
本発明の第４の態様のいくつかの好ましい実施形態では、キナーゼ経路阻害剤は、トラメチニブ等のＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ阻害剤であり；
工程（ａ）は、白血病細胞の遺伝子型に関するデータを分析することにより、患者から得られた白血病細胞におけるＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、またはＢＲＡＦの変異状態を決定することをさらに含み、
工程（ｂ）は、白血病の分化状態が進行している場合には、または白血病細胞におけるＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、若しくはＢＲＡＦのいずれか１つが活性化変異を有する場合には、この患者をこのキナーゼ経路阻害剤で処置することを含む。
【００６７】
これらの好ましい実施形態では、ＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、またはＢＲＡＦの活性化変異は、タンパク質を「オン」に構成的に切り替える効果を有する変異である。そのような変異として、たとえば下記が挙げられ得る。
ＮＲＡＳ：
Ｇ１２Ｓ（ｃ．３４Ｇ＞Ａ）      Ｇ１２Ｃ（ｃ．３４Ｇ＞Ｔ）      Ｇ１２Ｒ（ｃ．３４Ｇ＞Ｃ）
Ｇ１２Ｖ（ｃ．３５Ｇ＞Ａ）      Ｇ１２Ａ（ｃ．３５Ｇ＞Ｃ）      Ｇ１２Ｄ（ｃ．３５Ｇ＞Ａ）
Ｇ１３Ａ（ｃ．３８Ｇ＞Ｃ）      Ｇ１３Ｖ（ｃ．３８Ｇ＞Ｔ）      Ｇ１３Ｒ（ｃ．３７Ｇ＞Ｃ）
Ｇ１３Ｃ（ｃ．３７Ｇ＞Ｔ）      Ｇ１３Ｓ（ｃ．３７Ｇ＞Ａ）      Ｇ１３Ｄ（ｃ．３８Ｇ＞Ａ）
Ｑ６１Ｅ（ｃ．１８１Ｃ＞Ｇ）    Ｑ６１Ｈ（ｃ．１８３Ａ＞Ｔ）    Ｑ６１Ｈ（ｃ．１８３Ａ＞Ｃ）
Ｑ６１Ｌ（ｃ．１８２Ａ＞Ｔ）    Ｑ６１Ｌ（ｃ．１８２＿１８３ＡＡ＞ＴＧ）
Ｑ６１Ｋ（ｃ．１８１Ｃ＞Ａ）    Ｑ６１Ｐ（ｃ．１８２Ａ＞Ｃ）    Ｑ６１Ｒ（ｃ．１８２Ａ＞Ｇ）
Ｑ６１Ｒ（ｃ．１８２＿１８３ＡＡ＞ＧＧ）                        Ｑ６１Ｑ（ｃ．１８３Ａ＞Ｇ）
ＢＲＡＦ：
Ｖ６００Ｅ（ｃ．１７９９Ｔ＞Ａ）                Ｖ６００Ｋ（ｃ．１７９８＿１７９９ＧＴ＞ＡＡ）
Ｖ６００Ｍ（ｃ．１７９８Ｇ＞Ａ）                Ｖ６００Ｄ（ｃ．１７９９＿１８００ＴＧ＞ＡＴ）
Ｖ６００Ｒ（ｃ．１７９８＿１７９９ＧＴ＞ＡＧ）  Ｖ６００Ｇ（ｃ．１７９９Ｔ＞Ｇ）
Ｖ６００Ｅ’（ｃ．１７９９＿１８００ＴＧ＞ＡＡ）Ｖ６００Ａ（ｃ．１７９９＿Ｔ＞Ｃ）
Ｇ４６９Ａ（ｃ．１４０６Ｇ＞Ａ）                Ｇ４６９Ｖ（ｃ．１４０６Ｇ＞Ｔ）
Ｄ５９４Ｇ（ｃ．１７８１Ａ＞Ｇ）                Ｄ５９４Ｖ（ｃ．３４Ｇ＞Ａ）
Ｌ５９７（ｃ．１７８９Ｃ）                      Ｌ５９７（ｃ．１７９０Ｔ）
ＫＲＡＳ：
Ｇ１２Ｄ（ｃ．３４Ｇ）  Ｇ１２（ｃ．３５Ｇ）            Ｇ１３（ｃ．３７Ｇ）
Ｇ１２（ｃ．３８Ｇ）    Ｑ６１（ｃ．１８１Ｃ）          Ｑ６１（ｃ．１８２Ａ）  
Ｑ６１（ｃ．１８３Ａ）  Ａ１４６（ｃ．４３６Ｇ）        Ａ１４６（ｃ．４３７Ｃ）
ＨＲＡＳ：
Ｇ１２Ｖ（ｃ．３４Ｇ）  Ｇ１２（ｃ．３５Ｇ）            Ｇ１３（ｃ．３７Ｇ）
Ｇ１３（ｃ．３８Ｇ）    Ｑ６１（ｃ．１８１Ｃ）          Ｑ６１（ｃ．１８２Ａ）
Ｑ６１（ｃ．１８３Ｇ）
【００６８】
これらの実施形態では、白血病細胞の遺伝子型に関する前記データは、ＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、および／またはＢＲＡＦでの活性化変異の有無を当業者が推測することが可能であるあらゆる情報を含み得る。
このデータとして、下記が挙げられ得るがこれらに限定されない：
白血病細胞におけるＮＲＡＳ遺伝子、ＫＲＡＳ遺伝子、ＨＲＡＳ遺伝子、および／若しくはＢＲＡＦ遺伝子の配列、白血病細胞により発現される、コードされているタンパク質若しくは各コードされているタンパク質の配列、または白血病細胞でのＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、および／若しくはＢＲＡＦにおける活性化変異の有無を記録しているデータ。
いくつかの実施形態では、前記データは既に収集されて記録されており、工程（ａ）は、分析のために前記データを取得することを含む。他の実施形態では、工程（ａ）は、分析のために前記データを収集して記録することをさらに含む。前記データを、当分野で公知であり且つ本明細書で例示されているような技術およびプロトコルに従って、容易に収集して記録し得る。
【００６９】
これらの実施形態では、工程（ａ）は、
（ｉ）患者から得られた白血病細胞でのＭＡＰＫ１若しくはＭＡＰＫ３における１箇所若しくは複数箇所のリン酸化部位のリン酸化に関するデータを分析することにより、この患者の白血病の分化状態を決定すること；および／または
（ｉｉ）ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ１２３、およびＨＬＡ−ＤＲからなるＣＤマーカーの群の、前記患者から得られた白血病細胞上での表面発現に関するデータを分析することにより、この患者の白血病の分化状態を決定すること
を含み得、
１箇所若しくは複数箇所のリン酸化部位の高レベルのリン酸化、および／または前記白血病細胞上での前記ＣＤマーカーの群の存在は、進行した分化状態を示す。
【００７０】
本発明者らはまた、ＦＬＴ３において活性化変異を有するか、またはＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路と並行して作用するＦＬＴ３駆動型生存促進性キナーゼシグナル伝達経路（ＦＬＴ３−ｄｒｉｖｅｎ  ｐｒｏ−ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｋｉｎａｓｅ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ）の活性化を示すか、または下記で特定されるようなある特定のホスホマーカー上での高レベルのリン酸化を有する白血病細胞は、ＭＥＫ経路阻害剤による処置に対する耐性を示し得ることも発見している。ＦＬＴ３の変異および／または並行するＦＬＴ３駆動型生存促進性シグナル伝達経路の活性化は、ＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路の阻害にもかかわらず、代替的な生存メカニズムを有する細胞を提供し得ると考えられる。
【００７１】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、キナーゼ経路阻害剤は、ＭＥＫ阻害剤等のＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路阻害剤（たとえばトラメチニブ）であり、工程（ａ）は、
（ｉ）患者から得られた白血病細胞の遺伝子型に関するデータを分析することにより、前記白血病細胞におけるＦＬＴ３の変異状態を決定すること、並びに／または
（ｉｉ）前記白血病細胞におけるキナーゼ経路活性マーカーに関するデータを分析することにより、ＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路以外の細胞増殖若しくは細胞生存に関与するＦＬＴ３駆動型キナーゼシグナル伝達経路、たとえば、ＰＫＣ経路、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ＭＴＯＲ−Ｓ６Ｋ経路、ＰＡＫ経路、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路、若しくはＣＡＭＫＫ経路のこの白血病細胞における活性化を決定すること；並びに／または
（ｉｉｉ）白血病細胞におけるＴＯＰ２Ａおよび／若しくはＫＤＭ５Ｃのリン酸化に関するデータを分析することにより、この白血病細胞におけるＴＯＰ２Ａおよび／若しくはＫＤＭ５Ｃの内の一方若しくは両方のリン酸化のレベルを決定すること
をさらに含む。
【００７２】
本発明の第１の態様に係るそのような実施形態では、工程（ｂ）は、もし、
（ｉ）白血病の分化状態が進行しており、且つ
（ｉｉ）もし、白血病細胞におけるＦＬＴ３が活性化変異を有しないか、またはＦＬＴ３駆動型キナーゼシグナル伝達経路が白血病細胞で活性化されていないか、またはＴＯＰ２Ａおよび／若しくはＫＤＭ５Ｃが白血病細胞において低レベルでリン酸化されている場合には、患者の急性骨髄性白血病がＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路阻害剤により効果的に処置され得ると予測することを含み得る。
本発明の第２の態様に係るそのような実施形態では、工程（ｂ）は、
（ｉ）白血病の分化状態が進行しており、且つ
（ｉｉ）白血病細胞におけるＦＬＴ３が活性化変異を有しないか、またはＦＬＴ３駆動型キナーゼシグナル伝達経路が白血病細胞で活性化されていないか、またはＴＯＰ２Ａおよび／若しくはＫＤＭ５Ｃが白血病細胞において低レベルでリン酸化されている場合には、ＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路阻害剤で患者を処置することを含み得る。
本発明の第３の態様に係るそのような実施形態では、工程（ｂ）は、
（ｉ）白血病細胞が、進行した分化状態を有し、且つ
（ｉｉ）白血病細胞がＦＬＴ３中に活性化変異を有しないか、またはＦＬＴ３駆動型キナーゼシグナル伝達経路が白血病細胞で活性化されていないか、またはＴＯＰ２Ａおよび／若しくはＫＤＭ５Ｃが白血病細胞において低レベルでリン酸化されているいずれか１例または複数例の患者を、ＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ阻害剤による効果的な処置に適していると特定することを含み得る。
本発明の第４の態様に係るそのような実施形態では、工程（ｂ）は、
（ｉ）白血病の分化状態が進行しており、且つ
（ｉｉ）白血病細胞におけるＦＬＴ３が活性化変異を有しないか、またはＦＬＴ３駆動型キナーゼシグナル伝達経路が白血病細胞で活性化されていないか、またはＴＯＰ２Ａおよび／若しくはＫＤＭ５Ｃが白血病細胞において低レベルでリン酸化されている場合には、ＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ阻害剤で患者を処置することを含み得る。
【００７３】
従って、本発明の第１の態様のいくつかの好ましい関連実施形態は、
（ａ）（ｉ）白血病細胞の遺伝子型に関するデータを分析することにより、患者の白血病の分化状態を決定すること、および／またはこの患者から得られた白血病細胞におけるＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、若しくはＢＲＡＦの変異状態を決定すること；並びに
（ｉｉ）前記白血病細胞の遺伝子型に関するデータを分析することにより、患者から得られた白血病細胞におけるＦＬＴ３の変異状態を決定すること、並びに／または前記白血病細胞におけるＦＬＴ３駆動型キナーゼシグナル伝達経路の活性マーカーに関するデータを分析することにより、ＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路以外の細胞増殖若しくは細胞生存に関与するＦＬＴ−３駆動型キナーゼシグナル伝達経路の白血病細胞における活性化を決定すること；並びに／または白血病細胞におけるＴＯＰ２Ａおよび／若しくはＫＤＭ５Ｃのリン酸化に関するデータを分析することにより、この白血病細胞におけるＴＯＰ２Ａおよび／若しくはＫＤＭ５Ｃの内の一方若しくは両方のリン酸化のレベルを決定すること、並びに
（ｂ）（ｉ）白血病の分化状態は進行しており、または白血病細胞においてＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、若しくはＢＲＡＦの内のいずれか１つは活性化変異を有し、且つ
（ｉｉ）白血病細胞におけるＦＬＴ３は活性化変異を有さず、またはＦＬＴ３駆動型キナーゼシグナル伝達経路は活性化されておらず、またはＴＯＰ２Ａおよび／若しくはＫＤＭ５Ｃは白血病細胞において低レベルでリン酸化されている場合には、
この患者の急性骨髄性白血病は前記ＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路阻害剤で効果的に処置され得ると予測すること
を含み得る。
【００７４】
従って、本発明の第２の態様のいくつかの好ましい実施形態は、
（ａ）（ｉ）白血病細胞の遺伝子型に関するデータを分析することにより、患者の白血病の分化状態を決定すること、および／またはこの患者から得られた白血病細胞におけるＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、若しくはＢＲＡＦの変異状態を決定すること；並びに
（ｉｉ）前記白血病細胞の遺伝子型に関するデータを分析することにより、患者から得られた白血病細胞におけるＦＬＴ３の変異状態を決定すること、並びに／または前記白血病細胞におけるＦＬＴ３駆動型キナーゼシグナル伝達経路の活性マーカーに関するデータを分析することにより、ＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路以外の細胞増殖若しくは細胞生存に関与するＦＬＴ−３駆動型キナーゼシグナル伝達経路の白血病細胞における活性化を決定すること；並びに／または白血病細胞におけるＴＯＰ２Ａおよび／若しくはＫＤＭ５Ｃのリン酸化に関するデータを分析することにより、この白血病細胞におけるＴＯＰ２Ａおよび／若しくはＫＤＭ５Ｃの内の一方若しくは両方のリン酸化のレベルを決定すること、並びに
（ｂ）（ｉ）白血病の分化状態は進行しており、または白血病細胞においてＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、若しくはＢＲＡＦの内のいずれか１つは活性化変異を有し、且つ
（ｉｉ）白血病細胞におけるＦＬＴ３は活性化変異を有さず、またはＦＬＴ３駆動型キナーゼシグナル伝達経路は活性化されておらず、またはＴＯＰ２Ａおよび／若しくはＫＤＭ５Ｃは白血病細胞において低レベルでリン酸化されている場合には、
この患者を前記ＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路阻害剤で処置すること
を含み得る。
【００７５】
従って、本発明の第３の態様のいくつかの好ましい実施形態は、
（ａ）各患者に関して、
（ｉ）白血病細胞の遺伝子型に関するデータを分析することにより、患者の白血病の分化状態を決定すること、および／またはこの患者から得られた白血病細胞におけるＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、若しくはＢＲＡＦの変異状態を決定すること；並びに
（ｉｉ）前記白血病細胞の遺伝子型に関するデータを分析することにより、患者から得られた白血病細胞におけるＦＬＴ３の変異状態を決定すること、並びに／または前記白血病細胞におけるＦＬＴ３駆動型キナーゼシグナル伝達経路の活性マーカーに関するデータを分析することにより、ＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路以外の細胞増殖若しくは細胞生存に関与するＦＬＴ−３駆動型キナーゼシグナル伝達経路の白血病細胞における活性化を決定すること；並びに／または白血病細胞におけるＴＯＰ２Ａおよび／若しくはＫＤＭ５Ｃのリン酸化に関するデータを分析することにより、この白血病細胞におけるＴＯＰ２Ａおよび／若しくはＫＤＭ５Ｃの内の一方若しくは両方のリン酸化のレベルを決定すること；並びに
（ｂ）いずれか１例または複数例の患者に関して：
（ｉ）白血病の分化状態は進行しており、または白血病細胞においてＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、若しくはＢＲＡＦの内のいずれか１つは活性化変異を有し、且つ
（ｉｉ）白血病細胞におけるＦＬＴ３は活性化変異を有さず、またはＦＬＴ３駆動型キナーゼシグナル伝達経路は活性化されておらず、またはＴＯＰ２Ａおよび／若しくはＫＤＭ５Ｃは白血病細胞において低レベルでリン酸化されている場合には、
前記ＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路阻害剤による効果的な処置に適した白血病を有するとして１例または複数例の患者を特定すること
を含み得る。
【００７６】
従って、本発明の第４の態様のいくつかの好ましい実施形態は、
（ａ）（ｉ）白血病細胞の遺伝子型に関するデータを分析することにより、患者の白血病の分化状態を決定すること、および／またはこの患者から得られた白血病細胞におけるＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、若しくはＢＲＡＦの変異状態を決定すること；並びに
（ｉｉ）前記白血病細胞の遺伝子型に関するデータを分析することにより、患者から得られた白血病細胞におけるＦＬＴ３の変異状態を決定すること、並びに／または前記白血病細胞におけるＦＬＴ３駆動型キナーゼシグナル伝達経路の活性マーカーに関するデータを分析することにより、ＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路以外の細胞増殖若しくは細胞生存に関与するＦＬＴ−３駆動型キナーゼシグナル伝達経路の白血病細胞における活性化を決定すること；並びに／または白血病細胞におけるＴＯＰ２Ａおよび／若しくはＫＤＭ５Ｃのリン酸化に関するデータを分析することにより、この白血病細胞におけるＴＯＰ２Ａおよび／若しくはＫＤＭ５Ｃの内の一方若しくは両方における１箇所若しくは複数箇所のリン酸化部位でのリン酸化を決定すること；並びに
（ｂ）（ｉ）白血病の分化状態は進行しており、または白血病細胞においてＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、若しくはＢＲＡＦの内のいずれか１つは活性化変異を有し、且つ
（ｉｉ）白血病細胞におけるＦＬＴ３は活性化変異を有さず、またはＦＬＴ３駆動型キナーゼシグナル伝達経路は活性化されておらず、またはＴＯＰ２Ａおよび／若しくはＫＤＭ５Ｃが白血病細胞において低レベルでリン酸化されている場合には、
この患者を前記ＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路阻害剤で処置すること
を含み得る。
【００７７】
これらの好ましい実施形態では、ＦＬＴ３の活性化変異は、ＦＬＴ３タンパク質を「オン」に構成的に切り替える効果を有する変異である。たとえば、そのような変異として、膜近傍ドメインの遺伝子内縦列重複（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｔａｎｄｅｍ  ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＩＴＤ）、またはチロシンキナーゼドメインが通常関与する（たとえばＤ８３５での）点変異が挙げられ得る。
白血病細胞の遺伝子型に関する前記データは、ＦＬＴ３での活性化変異の有無を当業者が推測することが可能なあるあらゆる情報を含み得る。このデータとして、下記が挙げられ得るがこれらに限定されない：白血病細胞におけるＦＬＴ３遺伝子の配列、白血病細胞により発現されるＦＬＴ３タンパク質の配列、または白血病細胞でのＦＬＴ３における活性化変異の有無を記録しているデータ。当業者は、前記データを、当分野で周知の技術およびプロトコルに従って、困難なく収集して解釈し得る。
【００７８】
これらの好ましい実施形態では、ＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路以外の細胞増殖または細胞生存に関与するＦＬＴ３駆動型キナーゼシグナル伝達経路の白血病細胞における活性化を決定する前記工程は、複数種のＦＬＴ３駆動型キナーゼシグナル伝達経路の活性化を決定することを含み得る。
好ましくは、ＦＬＴ３駆動型キナーゼシグナル伝達経路または各ＦＬＴ３駆動型キナーゼシグナル伝達経路は、ＰＫＣ経路、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ＭＴＯＲ−Ｓ６Ｋ経路、ＰＡＫ経路、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路、またはＣＡＭＫＫ経路から選択され得る。
好ましくは、ＦＬＴ３駆動型キナーゼシグナル伝達経路は、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ＭＴＯＲ−Ｓ６Ｋ経路、またはＣＡＭＫＫ経路であり得る。適切には、ＦＬＴ３駆動型キナーゼシグナル伝達経路はＪＡＫ−ＳＴＡＴ（ＳＴＡＴ５）経路であり得る。
【００７９】
ＦＬＴ３駆動型キナーゼシグナル伝達経路の前記活性マーカーとして、ＦＬＴ３駆動型キナーゼシグナル伝達経路の活性化を特定するために使用され得るあらゆるマーカーが挙げられ得る。
これらとして下記が挙げられ得る：ＦＬＴ３駆動型キナーゼシグナル伝達経路で選択的に活性化されるあらゆるキナーゼ、ホスファターゼ、ホスホリポアーゼ、インテグリン、シグナル伝達調節因子、Ｇタンパク質、膜貫通レセプター、ホスホペプチド、および／若しくは他のキナーゼシグナル伝達分子、またはＦＬＴ３駆動型キナーゼシグナル伝達経路において選択的にリン酸化されるあらゆる分子（ホスホマーカー）。好都合には、ＦＬＴ３駆動型キナーゼシグナル伝達経路の活性マーカーは１種または複数種のホスホマーカーを含み得、この活性マーカーに関するデータは、この１種または複数種のホスホマーカーのリン酸化に関するデータを含み得、この１種または複数種のホスホマーカーの高レベルのリン酸化は、ＦＬＴ３駆動型キナーゼシグナル伝達経路が活性化されていることを示す。
【００８０】
前記１種または複数種のホスホマーカーとして、たとえば、タンパク質ＳＴＡＴ５Ａおよび／またはＣＡＭＫＫ１の１つまたは複数でのリン酸化部位が挙げられ得、たとえば、ＳＴＡＴ５ＡのＳ７８０および／またはＳ１２８でのリン酸化部位、並びにＣＡＭＫＫ１のＳ５４８でのリン酸化部位が挙げられ得る。
これらのリン酸化部位は、ＦＬＴ３駆動型キナーゼシグナル伝達経路において選択的にリン酸化される。
そのため、活性マーカーに関するデータは、ＳＴＡＴ５ＡおよびＣＡＭＫＫ１の内のいずれかまたは両方のリン酸化のレベル（たとえば、Ｓ７８０および／若しくはＳ１２８でのＳＴＡＴ５Ａのリン酸化、並びに／またはＳ５４８でのＣＡＭＫＫ１のリン酸化のレベル）に関するデータを含み得、高レベルのリン酸化は、ＦＬＴ３駆動型キナーゼシグナル伝達経路の活性化を示す。
【００８１】
これらの好ましい実施形態では、白血病細胞におけるＴＯＰ２Ａおよび／またはＫＤＭ５Ｃのリン酸化に関する前記データは、ＴＯＰ２Ａおよび／またはＫＤＭ５Ｃのリン酸化に関するデータ（たとえば、Ｓ１２１３でのＴＯＰ２Ａのリン酸化および／またはＳ３１７でのＫＤＭ５Ｃのリン酸化に関するデータ）を含み得る。
【００８２】
本発明はまた、ＦＬＴ３駆動型キナーゼシグナル伝達経路の活性化を決定するために同様に使用され得る、ＦＬＴ３駆動型キナーゼシグナル伝達経路（たとえば、ＳＴＡＴ５経路および／またはＣＡＭＫＫ経路）の代替ホスホマーカーの使用も想定する。
【００８３】
活性マーカーに関するデータは、この活性マーカーの活性化を当業者が推測することが可能であるあらゆる情報（たとえば、この活性マーカーの発現または活性化、たとえば、この活性マーカーのリン酸化のレベル）を含み得る。そのようなデータとして、たとえばＬＣ−ＭＳ／ＭＳデータが挙げられ得る。いくつかの実施形態では、前記データは既に収集されて記録されており、工程（ａ）（ｉｉ）は、分析のために前記データを取得することを含む。他の実施形態では、工程（ａ）（ｉｉ）は、分析のために前記データを収集して記録することをさらに含む。前記データを、当分野で公知であり且つ本明細書で例示されているような技術およびプロトコルに従って（たとえば、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより、または免疫化学技術により）、困難なく収集して記録し得る。
【００８４】
これらの実施形態では、本明細書で説明されている方法の工程の内のいずれかに従って、白血病細胞の分化状態を決定し得る。しかしながら、好ましくは、白血病細胞の分化状態を決定する前記工程は、
（ｉ）患者から得られた白血病細胞でのＭＡＰＫ１若しくはＭＡＰＫ３における１箇所若しくは複数箇所のリン酸化部位のリン酸化に関するデータを分析すること；および／または
（ｉｉ）ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ１２３、およびＨＬＡ−ＤＲからなるＣＤマーカーの群の、前記患者から得られた白血病細胞上での表面発現に関するデータを分析することにより、この患者の白血病の分化状態を決定すること
を含み得、
１箇所若しくは複数箇所のリン酸化部位の高レベルのリン酸化、および／または前記白血病細胞上での前記ＣＤマーカーの群の存在は、進行した分化状態を示す。
【００８５】
本発明は、ＡＭＬの処置に承認されているかまたはＡＭＬの処置にまもなく承認される可能性があるキナーゼ経路阻害剤に関して特に興味深い。これらとして、ＦＬＴ３／ＰＫＣ経路阻害剤ミドスタウリン、およびＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路阻害剤トラメチニブが挙げられる。本明細書で実証されているように、本発明は、これらのキナーゼ経路阻害剤による処置に反応する患者を特定するための著しく改善されたプロトコルを提供する。潜在的に反応する患者を特定するための正確なコンパニオン診断試験の利用可能性は、処置に反応する患者がそのように特定され且つこの処置から利益を受け得、さらには反応しない患者は処置を不必要に受けないことの保証に役立つことから、重要な治療上のおよび臨床上の利点がある。
【００８６】
従って、本発明は、患者の急性骨髄性白血病を処置する方法での使用のためのミドスタウリンを提供し、この患者は、
（ｉ）ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ１２３、およびＨＬＡ−ＤＲからなるＣＤマーカーの群の、患者の白血病細胞上での表面発現；並びに／または
（ｉｉ）この患者の白血病細胞におけるＧＳＫ３Ａ、ＰＲＫＣＡ、ＰＲＫＣＢ、ＰＲＫＣＤ、ＳＴＫ１０、ＰＡＫ１、ＰＡＫ２、ＭＡＰＫ１、および／またはＭＡＰＫ３の内のいずれか１つまたは複数上でのリン酸化部位の高レベルのリン酸化
により定義される進行した分化状態を有する白血病を有する。
【００８７】
具体的には、本発明は、患者の急性骨髄性白血病を処置する方法での使用のためのミドスタウリンの提供であって、この患者は、
（ｉ）ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ１２３、およびＨＬＡ−ＤＲからなるＣＤマーカーの群の、患者の白血病細胞上での表面発現；並びに／または
（ｉｉ）下記：
ＧＳＫ３ＡのｐＳ２１；
ＰＲＫＣＤのｐＹ３１３、ｐＴ５０７、ｐＴ２９５、ｐＴ２１８、および／若しくはｐＳ６６４；
ＳＴＫ１０のｐＳ２０および／若しくはｐＳ１３；
ＰＡＫ１のｐＳ１４４；
ＰＡＫ２のｐＳ１４１；
ＭＡＰＫ１のＹ１８７および／若しくはＴ１８５；並びに
ＭＡＰＫ３のＴ２０２および／若しくはＹ２０４
の内のいずれか１つまたは複数の、この患者の白血病細胞における高レベルのリン酸化
により定義される進行した分化状態を有する白血病を有する。
【００８８】
本発明は、患者の急性骨髄性白血病を処置する方法での使用のためのトラメチニブをさらに提供するものであって、この患者は、
（ａ）（ｉ）この患者の白血病細胞でのＭＡＰＫ１および／若しくはＭＡＰＫ３における１箇所若しくは複数箇所のリン酸化部位の高レベルのリン酸化；並びに／または
（ｉｉ）ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ１２３、およびＨＬＡ−ＤＲからなるＣＤマーカーの群の、この患者の白血病細胞上での表面発現；並びに／または
（ｉｉｉ）この患者の白血病細胞におけるＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、若しくはＢＲＡＦの内のいずれか１つの活性化変異と、
（ｂ）（ｉ）この白血病細胞におけるＳＴＡＴ５Ａ、ＴＯＰ２Ａ、ＫＤＭ５Ｃ、およびＣＡＭＫＫ１の内の１つ若しくは複数の高レベルのリン酸化：並びに／または
（ｉｉ）この患者の白血病細胞でのＦＬＴ３におけるあらゆる活性化変異の非存在と
により定義される進行した分化状態およびＦＬＴ３駆動型生存経路の低活性化を有する白血病を有する。
【００８９】
具体的には、本発明は、患者の急性骨髄性白血病を処置する方法での使用のためのトラメチニブを提供し、この患者は、
（ａ）（ｉ）ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ１２３、およびＨＬＡ−ＤＲからなるＣＤマーカーの群の、この患者の白血病細胞上での表面発現；並びに／または
（ｉｉ）ＭＡＰＫ１のＹ１８７および／若しくはＴ１８５；並びにＭＡＰＫ３のＴ２０２および／若しくはＹ２０４の内のいずれか１つ若しくは複数の、この患者の白血病細胞における高レベルのリン酸化；
（ｉｉｉ）この患者の白血病細胞における、ＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、若しくはＢＲＡＦの内のいずれか１つ若しくは複数の活性化変異と、
（ｂ）（ｉ）ＳＴＡＴ５ＡのｐＳ７８０およびｐＳ１２８、ＣＡＭＫＫ１のｐＳ５４８、ＴＯＰ２ＡのｐＳ１２１３、およびＫＤＭ５ＣのｐＳ３１７の内の１つまたは複数での高レベルのリン酸化；並びに／または
（ｉｉ）この患者の白血病細胞でのＦＬＴ３におけるあらゆる活性化変異の非存在と
により定義される進行した分化状態を有する白血病を有する。
【００９０】
本発明は、急性骨髄性白血病を患っている個々の患者の急性骨髄性白血病を処置する方法であって、
（ａ）この患者から、白血病細胞を含む生体サンプルを得る工程；
（ｂ）（ａ）で得られたサンプル中の白血病細胞の分化状態が進行していることを、インビトロでの臨床検査により決定する工程；および
（ｃ）この白血病細胞の分化状態が進行している場合には、この患者にキナーゼ経路阻害剤を投与する工程であって、このキナーゼ経路阻害剤は、細胞増殖または細胞生存に関与するシグナル伝達経路を阻害する、
を含む方法をさらに提供する。
【００９１】
この生体サンプルは末梢血サンプルまたは骨髄サンプルであり得る。このキナーゼ経路阻害剤は、ＭＥＫ経路阻害剤、ＦＬＴ３／ＰＫＣ経路阻害剤、およびＰＡＫ経路阻害剤から選択され得る。
【００９２】
本発明のこの態様では、工程（ｂ）は、患者から得られたサンプル中の白血病細胞の形態学的なおよび／または細胞化学的な特徴を検出することであって、フランス系−アメリカ系−イギリス系（ＦＡＢ）分類システム下でのＭ４分類は、進行した分化状態を示す、検出することを含み得る。
【００９３】
白血病細胞の形態学的なおよび／または細胞化学的な特徴を検出する前記工程は、顕微鏡による分析のために細胞を調製し、光学顕微鏡下でこの細胞を視覚的に観察して分化の形態学的徴候を検出すること；並びに／または特定の条件または試験試薬（たとえば、スダンブラックＢ、および／またはペルオキシダーゼ、および／または特異的な若しくは非特異的なエステラーゼ）に対する細胞の挙動、活性、または反応をアッセイすることを含み得る。
【００９４】
任意選択により、工程（ｂ）は、インビトロでのアッセイを実施して、患者から得られたサンプル中の白血病細胞の表面上での１種または複数種の細胞表面分化マーカーの発現レベルを検出することを含んでもよく、この細胞表面分化マーカーは概して、健康な骨髄単球細胞で発現されるかまたは過剰発現され、且つこの細胞表面分化マーカーは概して、未分化の骨髄芽球では発現されないかまたは過剰発現されず、白血病細胞の表面上における高レベルでの前記１種または複数種の細胞表面分化マーカーの発現は、進行した分化状態を示す。
前記アッセイは、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイまたは免疫化学アッセイであり得、たとえば、ウエスタンブロットアッセイ、ＥＬＩＳＡアッセイ、または逆相タンパク質アッセイであり得る。
【００９５】
この細胞表面分化マーカーは、ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ（インテグリンα−Ｘ、ＩＴＡＸ）、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８（インテグリンβ、ＩＴＢ２）、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５（ＣＲ１）、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ９７、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１８０、ＣＤ１８４、ＨＬＡ−Ｃ（１Ｃ０２）、ＡＰＯＢＲ、血小板膜レセプターＧｉ２４（ＶＳＩＲ）、およびＨＬＡ−ＤＲの内の１つ若しくは複数を含む細胞表面マーカータンパク質のパネル；並びに／または前記１つ若しくは複数の細胞表面マーカータンパク質と併せて発現されるあらゆる細胞表面タンパク質を含み得る。
【００９６】
適切には、この細胞表面マーカータンパク質のパネルは、
（ｉ）ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ（インテグリンα−Ｘ、ＩＴＡＸ）、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８（インテグリンβ、ＩＴＢ２）、ＣＤ３３、ＣＤ３５（ＣＲ１）、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ９７、ＣＤ１２３、ＣＤ１８０、ＨＬＡ−Ｃ（１Ｃ０２）、ＡＰＯＢＲ、血小板膜レセプターＧｉ２４（ＶＳＩＲ）、およびＨＬＡ−ＤＲの内のいずれか１個、２個、若しくは３個、若しくは４個、若しくは５個、若しくは６個、若しくは７個、若しくは８個、若しくは９個、若しくは１０個、若しくは１１個、若しくは１２個、若しくは１３個、若しくは１４個、若しくは１５個、若しくは１６個、若しくは１７個、若しくは１８個、若しくは全て；または
（ｉｉ）ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ１２３、およびＨＬＡ−ＤＲの内のいずれか１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、若しくは全て；または
（ｉｉｉ）ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１８４、およびＨＬＡ−ＤＲの内のいずれか１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、若しくは全て
を含み得る。
【００９７】
本発明のこの態様に係る処置の方法においては、工程（ｂ）は、インビトロでのアッセイを実施して、患者から得られたサンプル中の白血病細胞における１種または複数種の機能分化マーカーの発現、および／または活性化、および／またはリン酸化を検出することを含み、この機能分化マーカーは概して、健康な骨髄単球細胞で発現され、過剰発現され、活性化され、および／またはリン酸化され、且つこの機能分化マーカーは概して、未分化の骨髄芽球では発現されず、過剰発現されず、活性化されず、および／またはリン酸化されず、白血病細胞における前記１種または複数種の機能分化マーカーの発現、活性化、および／またはリン酸化は、進行した分化状態を示す。
前記アッセイは、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイまたは免疫化学アッセイであり得、たとえば、ウエスタンブロットアッセイ、ＥＬＩＳＡアッセイ、または逆相タンパク質アッセイであり得る。
この１種または複数種の機能分化マーカーは、１種または複数種の、酵素、インテグリン、キナーゼ、ホスファターゼ、シグナル伝達調節因子、細胞質タンパク質および細胞質リンタンパク質、膜タンパク質および膜リンタンパク質、たとえば、ＧＴＰアーゼまたは細胞シグナル伝達の他の形態に関与する細胞質リンタンパク質および膜リンタンパク質を含むタンパク質マーカーのパネルを含んでもよく、このタンパク質マーカーは概して、健康な骨髄単球細胞で発現され、過剰発現され、および／または活性化され、且つ未分化の骨髄芽球では概して、発現されず、過剰発現されず、および／または活性化されず、そして、白血病細胞における前記タンパク質マーカーのパネルの発現および／または活性化は、進行した分化状態を示す。
【００９８】
任意選択により、タンパク質マーカーのパネルは、リゾチームＣ（ＬＹＺ）、好中球サイトゾル因子２（ＮＣＦ２）、骨髄細胞核分化抗原（ＭＮＤＡ）、ＡＫ１Ｃ４、およびＥＲＧの内のいずれか１個、２個、３個、４個、または５個を含み得る。
【００９９】
適切には、１種または複数種の機能分化マーカーは、１種または複数種のキナーゼ、ホスファターゼ、ホスホリポアーゼ、インテグリン、シグナル伝達調節因子、Ｇタンパク質、膜貫通レセプター、ホスホペプチド、並びに／または健康な骨髄単球細胞においてキナーゼシグナル伝達経路で概して発現され、および／若しくは活性化され、および／若しくはリン酸化されるが、未分化の骨髄芽球では概して発現されず、および／若しくは活性化されず、および／若しくはリン酸化されない他のキナーゼシグナル伝達分子を含むキナーゼ経路活性マーカーのパネルを含んでもよく、そして、白血病細胞におけるこのキナーゼ経路活性マーカーのパネルの発現、および／または活性化、および／またはリン酸化は、進行した分化状態を示す。
具体的には、このキナーゼ経路活性マーカーのパネルは、キナーゼ経路阻害剤により阻害されるキナーゼシグナル伝達経路のマーカーを含み得る。
【０１００】
キナーゼ経路活性マーカーのパネルは、たとえば、ＦＥＳ、ＰＫＣ並びにプロテインキナーゼＣアイソフォーム（たとえば、ＰＫＣδ（ＫＰＣＤ）、ＰＲＫＣＡ、ＰＲＫＣＢ、およびＰＲＫＣＤ）、ＰＫＡ、ＰＡＫ（たとえば、ＰＡＫ１およびＰＡＫ２）、ＳＴＫ１０、ＧＳＫ３Ａ、ＲＳＫ２、ＲＡＳ、ＲＡＦ、ＭＥＫ（たとえば、ＭＥＫ１（ＭＡＰ２Ｋ１））、ＥＲＫ（たとえば、ＭＡＰＫ３（ＥＲＫ１）およびＭＡＰＫ１（ＥＲＫ２））、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ（たとえば、ＡＫＴ１）、ＭＴＯＲ、Ｓ６キナーゼ、ＳＴＡＴ５、ＣＡＭＫＫ、ＳＹＫ（ＫＳＹＫ）、ＬＹＮ、Ｐ３８Ａ、ＣＤＫ１、ＣＫ２Ａ１、ＰＫＡＣＡ、ＩＲＡＫ４、ＰＫＣＢ  ｉｓｏ２、Ｃｏｔ、ＰＫＣＤ、ＰＫＣＡ、ＰＫＣＢ、ＰＫＣＧ、ＰＫＣＨ、ＢＲＡＦ、ＭＥＫ２、ＰＤＫ１、ＣＤＫ２、ＰＴＮ６、Ｄ３（ＰＬＤ３）、ＩＱＧＡＰ１、ＧＲＢ２、ＲＨＯＡ、ＲＨＯＧ、並びにＳ１０ＡＢ、並びにこれらと共に選択的に発現されるかまたは活性化される、あらゆるキナーゼ、ホスファターゼ、ホスホリポアーゼ、インテグリン、シグナル伝達調節因子、Ｇタンパク質、膜貫通レセプター、および／または他のキナーゼシグナル伝達分子の内のいずれか１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはより多くを含み得る。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、キナーゼ経路活性マーカーのパネルは、
（ｉ）ＰＫＣ、ＥＲＫ、ＰＡＫ１、およびＰ３８αの内のいずか１個、２個、３個、若しくは４個；
（ｉｉ）ＰＫＣＤ、ＰＫＣＡ、ＰＫＡＣＡ、ＩＲＡＫ４、およびＣＫ２Ａ１の内のいずれか１個、２個、３個、４個、若しくは５個；または
（ｉｉｉ）ＭＡＰＫ１、ＭＡＰＫ２、ＡＫＴ、ＡＫＴ１Ｓ１、ＭＡＰ２Ｋ１、およびＭＡＰ２Ｋ２の内のいずれか１個、２個、３個、４個、５個、若しくは６個
を含み得る。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、キナーゼ経路活性マーカーのパネルは、健康な骨髄単球細胞でのキナーゼシグナル伝達経路において概してリン酸化されるかまたは概して高レベルでリン酸化されるが、未分化の骨髄芽球では概してリン酸化されないかまたは概して高レベルでリン酸化されない１箇所または複数箇所のリン酸化部位のパネルを含み得、白血病細胞におけるこのリン酸化部位のパネルでのリン酸化または高レベルのリン酸化は、進行した分化状態を示す。
【０１０３】
そのような実施形態では、リン酸化部位のパネルは、
（ｉ）表１に記載のリン酸化部位の内のいずれか１箇所、２箇所、３箇所、４箇所、５箇所、６箇所、７箇所、８箇所、９箇所、１０箇所、若しくは１０箇所超；または
（ｉｉ）表２に記載のリン酸化部位の内のいずれか１箇所、２箇所、３箇所、４箇所、５箇所、６箇所、７箇所、８箇所、９個、１０箇所、若しくは１０箇所超；または
（ｉｉｉ）Ｓ１４４でのＰＡＫ１、Ｓ１４１でのＰＡＫ２、Ｙ１８７でのＭＡＰＫ１、Ｔ１８５でのＭＡＰＫ１、Ｓ３８０でのＲＰＳ６ＫＡ１、Ｔ２０２でのＭＡＰＫ３、Ｙ２０４でのＭＡＰＫ３、Ｓ１６６でのＭＡＰ３Ｋ３、Ｓ２９５およびＳ２９７でのＳＹＫ、Ｓ１１０でのＩＲＡＫ３、ＰＫＮ１（３７９〜３９６＋ホスホＳＴ）、ＳＴＫ１０（４４７〜４６４＋ホスホＳＴ）、Ｓ４１０でのＲＩＰＫ３、Ｔ２１８でのＰＲＫＣＤ、Ｔ２９５でのＰＲＫＣＤ、Ｙ３１３でのＰＲＫＣＤ、Ｔ５０７でのＰＲＫＣＤ、Ｔ６４５でのＰＲＫＣＤ、Ｓ６６４でのＰＲＫＣＤ、Ｔ２６３８でのＰＲＫＣＤ、Ｓ５３５でのＭＡＲＫ２、Ｓ５３５でのＭＡＰ３Ｋ２、ＰＲＫＤ２（７１０〜７３０＋ホスホＹ）、ｓ８０５でのＮＲＫ、Ｓ５８でのＰＲＫＡＲ２Ａ、ＺＡＫ（５９１〜６１６＋ホスホＳＴ）、Ｓ９００でのＭＡＰ４Ｋ４、Ｓ３４７でのＣＤＫ９、ＲＰＳ６ＫＡ４（６８１〜６９９＋２ホスホＳＴ）、ＭＡＳＴ３（１２５４〜１２７４＋ホスホＳＴ）、ＮＥＫ９（１０〜３９＋ホスホＳＴ）、ＧＳＫ３Ａ（１９〜５０＋ホスホＳＴ）、Ｓ３６９でのＲＰＳ６ＫＡ３、Ｓ５３１でのＲＩＰＫ２、Ｔ６０６でのＡＡＫ１、Ｙ２９２でのＴＹＫ２、Ｓ２１４でのＰＤＰＫ２、ＰＲＫＡＡ１（３〜８＋ホスホＳＴ）、Ｓ７７２でのＳＴＫ１１Ｐ、Ｓ１４６８でのＢＡＺ１Ｂ、Ｓ１４０でのＣＬＫ１、Ｓ３２８でのＭＡＰ４Ｋ２、ＷＮＫ１（１９９６〜２０２１＋ホスホＳＴ）、Ｓ２７１でのＣＤＫ１１Ａ、Ｙ７１３でのＦＥＳ、および／若しくはＳ７６９でのＴＮＩＫの内のいずれか１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、若しくは１０個超；または
（ｉｖ）Ｓ１４４でのＰＡＫ１、Ｓ１４１でのＰＡＫ２、Ｙ１８７および／若しくはＴ１８５でのＭＡＰＫ１、並びにＳ３８０でのＲＰＳ６ＫＡ１；または
（ｖ）Ｙ１８７でのＭＡＰＫ１、Ｓ１４１でのＰＡＫ２、およびＹ３１３でのＰＲＫＣＤ；または
（ｖｉ）Ｙ７１３でのＦＥＳ、Ｔ２０２／Ｙ２０４でのＭＡＰＫ３、Ｔ１８５／Ｙ１８７でのＭＡＰＫ１、Ｓ１４４でのＰＡＫ１、Ｓ２２２でのＭＥＫ１、Ｓ１４１でのＰＡＫ２、およびＳ６４５でのＰＲＫＣＤ；または
（ｖｉｉ）Ｓ２１でのＧＳＫ３Ａ、並びに／またはＴ５０７、Ｔ２９５、Ｔ２１８、Ｙ３１３、Ｔ５０７および／若しくはＳ６６４でのＰＲＫＣＤ、並びに／またはＳ２０および／若しくはＳ１３でのＳＴＫ１０、並びに／またはＳ１４４でのＰＡＫ１、並びに／またはＳ１４１でのＰＡＫ２。
（ｖｉｉｉ）ＭＡＰＫ１（たとえば、Ｙ１８７および／若しくはＴ１８５でのＭＡＰＫ１）、並びにＴ２０２および／若しくはＹ２０４でのＭＡＰＫ３、並びにＳ２１でのＧＳＫ３Ａでの１箇所若しくは複数箇所のリン酸化部位
を含み得る。
【０１０４】
本発明に係る急性骨髄性白血病を処置する方法では、キナーゼ経路阻害剤は、ＦＬＴ３経路、ＰＫＣ経路、ＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ＭＴＯＲ−Ｓ６Ｋ経路、ＰＡＫ経路、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路、ＣＡＭＫＫ経路、またはこれらに並行のあらゆるキナーゼシグナル伝達経路の内のいずれか１つまたは複数を阻害し得る。
適切には、このキナーゼ経路阻害剤は、ＭＥＫ阻害剤、またはＦＬＴ３／ＰＫＣ阻害剤、またはＰＡＫ阻害剤であり得る。
【０１０５】
そのような実施形態では、工程（ｂ）は、
（ｉ）インビトロでのアッセイを実施して、患者から得られたサンプル中の白血病細胞でのＭＡＰＫ１および／若しくはＭＡＰＫ３における１箇所若しくは複数箇所のリン酸化部位のリン酸化を検出し、および／若しくは定量すること；並びに／または
（ｉｉ）インビトロでのアッセイを実施して、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ１２３、およびＨＬＡ−ＤＲからなるＣＤマーカーの群の、前記患者から得られたサンプル中の白血病細胞上での表面発現を検出し、および／若しくは定量すること
を含み得、
この１箇所若しくは複数箇所のリン酸化部位のリン酸化若しくは高レベルでのリン酸化、および／または前記白血病細胞上における高レベルでの前記ＣＤマーカーの群の発現は、進行した分化状態を示す。
【０１０６】
本発明に係る急性骨髄性白血病を処置する方法において、キナーゼ経路阻害剤は、ミドスタウリン等のＦＬＴ３／ＰＫＣ経路阻害剤であり、工程（ｂ）は、
（ｉ）インビトロでのアッセイを実施して、患者から得られたサンプル中の白血病細胞でのＧＳＫ３Ａ、ＰＲＫＣＡ、ＰＲＫＣＢ、ＰＲＫＣＤ、ＳＴＫ１０、ＰＡＫ１、ＰＡＫ２ＭＡＰＫ１、および／若しくはＭＡＰＫ３の内の１つ若しくは複数におけるリン酸化部位のリン酸化を検出し、および／若しくは定量すること；並びに／または
（ｉｉ）インビトロでのアッセイを実施して、患者から得られたサンプル中の白血病細胞の表面上における、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４ＰＫＣ５、ＣＤ６４、ＣＤ１２３、およびＨＬＡ−ＤＲからなるＣＤマーカーの群の表面発現を検出し、および／若しくは定量すること
を含み得、
ＧＳＫ３Ａ、ＰＲＫＣＡ、ＰＲＫＣＢ、ＰＲＫＣＤ、ＳＴＫ１０、ＰＡＫ１、ＰＡＫ２、ＭＡＰＫ１、および／若しくはＭＡＰＫ３の内のいずれか１つ若しくは複数の白血病細胞におけるリン酸化若しくは高レベルのリン酸化；または前記ＣＤマーカーの群の白血病細胞による高レベルでの発現のいずれかは、進行した分化状態を示す。
【０１０７】
本発明に係る急性骨髄性白血病を処置する方法において、キナーゼ経路阻害剤は、トラメチニブ等のＭＥＫ阻害剤であり、工程（ｂ）は、インビトロでのアッセイを実施して、患者から得られた白血病細胞の遺伝子型を検出し、患者から得られたサンプル中の白血病細胞におけるＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、またはＢＲＡＦの内のいずれか１つが活性化変異を有することを決定することをさらに含み得る。適切には、前記アッセイは、患者から得られたサンプル中の白血病細胞におけるＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、またはＢＲＡＦを配列決定し、それにより得られた配列データにおける活性化変異を特定することを含み得る。
【０１０８】
これらの実施形態では、工程（ｂ）は、
（ｉ）インビトロでのアッセイを実施して、患者から得られたサンプル中の白血病細胞でのＭＡＰＫ１若しくはＭＡＰＫ３における１箇所若しくは複数箇所のリン酸化部位のリン酸化を検出すること；並びに／または
（ｉｉ）インビトロでのアッセイを実施して、患者から得られたサンプル中の白血病細胞上での、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ１２３、およびＨＬＡ−ＤＲからなるＣＤマーカーの群の表面発現を検出すること
を含み得、
この１箇所若しくは複数箇所のリン酸化部位のリン酸化若しくは高レベルのリン酸化、および／または前記白血病細胞上における高レベルでの前記ＣＤマーカーの群の発現は、進行した分化状態を示す。
【０１０９】
本発明に係る急性骨髄性白血病を処置する方法において、キナーゼ経路阻害剤は、トラメチニブ等のＭＥＫ阻害剤であり、工程（ｂ）は、
（ｉ）インビトロでのアッセイを実施して、患者から得られたサンプル中の白血病細胞の遺伝子型を検出し、この白血病細胞におけるＦＬＴ３が活性化変異を有しないことを決定すること；並びに／または
（ｉｉ）インビトロでのアッセイを実施して、ＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路以外の細胞増殖若しくは細胞生存に関与するＦＬＴ−３駆動型シグナル伝達経路（たとえば、ＰＫＣ経路、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ＭＴＯＲ−Ｓ６Ｋ経路、ＰＡＫ経路、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路、若しくはＣＡＭＫＫ経路）の１種若しくは複数種の活性マーカーの、患者から得られたサンプル中の白血病細胞における発現若しくは活性化を検出し、このＦＬＴ３駆動型キナーゼシグナル伝達経路が白血病細胞において活性化されていないことを決定すること；並びに／または
（ｉｉｉ）インビトロでのアッセイを実施して、患者から得られたサンプル中の白血病細胞における、ＴＯＰ２Ａおよび／若しくはＫＤＭ５Ｃの内の一方若しくは両方のリン酸化のレベルを検出し、ＴＯＰ２Ａおよび／若しくはＫＤＭ５Ｃが白血病細胞おいてリン酸化されていないか若しくは低レベルでリン酸化されていることを決定すること
をさらに含み得る。
【０１１０】
キナーゼ経路阻害剤が、トラメチニブ等のＭＥＫ阻害剤である、本発明に係る急性骨髄性白血病を処置する方法において、、工程（ｂ）は、
（ｉ）インビトロでのアッセイを実施して、患者から得られたサンプル中の白血病細胞の遺伝子型を検出し、この白血病細胞におけるＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、若しくはＢＲＡＦの内のいずれか１つが活性化変異を有することを決定し；および／またはこの患者から得られたサンプル中の白血病細胞の分化状態が進行していることを決定すること、並びに
（ｉｉ）インビトロでのアッセイを実施して、この患者から得られたサンプル中の白血病細胞の遺伝子型を検出し、この白血病細胞におけるＦＬＴ３は活性化変異を有しないことを決定し；
および／またはアッセイを実施して、ＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路以外の細胞増殖若しくは細胞生存に関与するＦＬＴ−３駆動型シグナル伝達経路（たとえば、ＰＫＣ経路、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ＭＴＯＲ−Ｓ６Ｋ経路、ＰＡＫ経路、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路、若しくはＣＡＭＫＫ経路）の１種若しくは複数種の活性マーカーの、患者から得られたサンプル中の白血病細胞における発現若しくは活性を検出し、そして、このＦＬＴ３駆動型キナーゼシグナル伝達経路が白血病細胞において活性化されていないことを決定すること；および／またはアッセイを実施して、この患者から得られたサンプル中の白血病細胞におけるＴＯＰ２Ａおよび／若しくはＫＤＭ５Ｃの内の一方若しくは両方のリン酸化のレベルを検出し、ＴＯＰ２Ａおよび／若しくはＫＤＭ５Ｃは白血病細胞においてリン酸化されていないか若しくは低レベルでリン酸化されていることを決定すること
を含み得る。
【０１１１】
適切には、ＦＬＴ３駆動型シグナル伝達経路の前記活性マーカーは、ＦＬＴ３駆動型キナーゼシグナル伝達経路により選択的にリン酸化される１箇所または複数箇所のリン酸化部位を含み得る。
これらの実施形態では、この１箇所または複数箇所のリン酸化部位のリン酸化または高レベルのリン酸化は、ＦＬＴ３駆動型キナーゼシグナル伝達経路が活性化されていることを示す。
前記１箇所または複数箇所のリン酸化部位は、ＳＴＡＴ５ＡおよびＣＡＭＫＫ１の内の一方または両方におけるリン酸化部位を含み得、たとえば、Ｓ７８０および／若しくはＳ１２８でのＳＴＡＴ５Ａ、並びに／またはＳ５４８でのＣＡＭＫＫ１を含み得る。
【０１１２】
任意選択により、白血病細胞におけるＴＯＰ２Ａおよび／またはＫＣＭ５Ｃの内の一方または両方のリン酸化のレベルを検出する前記工程は、Ｓ１２１３でのＴＯＰ２Ａのリン酸化、および／またはＳ３１７でのＫＤＭ５Ｃのリン酸化を検出することを含み得る。
【０１１３】
特定の態様では、本発明は、急性骨髄性白血病を患っている個々の患者の急性骨髄性白血病を処置する方法を提供する。
（ａ）この患者から、白血病細胞を含む生体サンプルを得る工程；
（ｂ）（ｉ）インビトロでのアッセイを実施して、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ１２３、およびＨＬＡ−ＤＲからなるＣＤマーカーの群の、この患者から得られたサンプル中の白血病細胞の表面上での発現を検出する工程；並び／または
（ｉｉ）インビトロでのアッセイを実施して、ｐＳ２１でのＧＳＫ３Ａ；ＰＲＫＣＤのＹ３１３、ｐＴ５０７、ｐＴ２９５、ｐＴ２１８、および／若しくはｐＳ６６４でのＰＲＫＣＤ；ＳＴＫ１０のｐＳ２０および／若しくはｐＳ１３でのＳＴＫ１０；ＰＡＫ１のｐＳ１４４でのＰＡＫ１；ＰＡＫ２のｐＳ１４１でのＰＡＫ２；Ｙ１８７および／若しくはＴ１８５でのＭＡＰＫ１；並びにＴ２０２および／若しくはＹ２０４でのＭＡＰＫ３から選択される１箇所若しくは複数箇所のリン酸化部位の白血病細胞におけるリン酸化を検出する工程；並びに
（ｃ）前記ＣＤマーカーの群が患者の白血病細胞の表面上において高レベルで発現されており、および／または白血病細胞における前記リン酸化部位の内の１箇所若しくは複数箇所がリン酸化されているか若しくは高レベルでリン酸化されている場合には、急性骨髄性白血病の処置のために、この患者にミドスタウリンを投与する工程
を含む方法を提供する。
【０１１４】
別の特定の態様では、本発明は、急性骨髄性白血病を患っている個々の患者の急性骨髄性白血病を処置する方法の提供であって、
（ａ）この患者から、白血病細胞を含む生体サンプルを得る工程；
（ｂ）（ｉ）インビトロでのアッセイを実施して、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ１２３、およびＨＬＡ−ＤＲからなるＣＤマーカーの群の、この患者から得られたサンプル中の白血病細胞の表面上での発現を検出する工程；並びに／または
（ｉｉ）インビトロでのアッセイを実施して、Ｙ１８７および／若しくはＴ１８５でのＭＡＰＫ１、並びにＴ２０２および／若しくはＹ２０４でのＭＡＰＫ３から選択される１箇所若しくは複数箇所のＭＥＫ関連リン酸化部位の白血病細胞におけるリン酸化を検出する工程；並びに／または
（ｉｉｉ）インビトロでのアッセイを実施して、この患者の白血病細胞でのＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、またはＢＲＡＦの内のいずれか１つ若しくは複数において活性化変異が存在しているかどうかを決定するために、この白血病細胞の遺伝子型を検出する工程；
（ｃ）（ｉ）インビトロでのアッセイを実施して、ｐＳ７８０および／若しくはｐＳ１２８でのＳＴＡＴ５Ａ、ｐＳ５４８でのＣＡＭＫＫ１、ｐＳ１２１３でのＴＯＰ２Ａ、並びにＫＤＭ５ＣのｐＳ３１７でのＫＤＭ５Ｃから選択される１箇所若しくは複数箇所のマーカー部位での白血病細胞におけるリン酸化を検出する工程；並びに／または
（ｉｉ）インビトロでのアッセイを実施して、この患者の白血病細胞でのＦＬＴ３において活性化変異が存在しているかどうかを決定するために、この白血病細胞の遺伝子型を検出する工程；並びに
（ｄ）（Ａ）前記ＣＤマーカーの群が患者の白血病細胞の表面上において高レベルで発現され、および／または白血病細胞における前記ＭＥＫ関連リン酸化部位の内の１箇所若しくは複数箇所がリン酸化されているか若しくは高レベルでリン酸化され、および／または患者の白血病細胞でのＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、若しくはＢＲＡＦの内のいずれか１つ若しくは複数において活性化変異が存在し；並びに
（Ｂ）前記マーカー部位が患者の白血病細胞においてリン酸化されていないか若しくは高レベルでリン酸化されておらず、および／または患者の白血病細胞でのＦＬＴ３において活性化変異が存在しない場合には、
急性骨髄性白血病の処置のために、この患者にトラメチニブを投与する工程
を含む方法を提供する。
【０１１５】
本発明を、下記に記載されている具体例および図面を参照して説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】は、キナーゼ阻害剤に対するＡＭＬ初代細胞の不均一な感受性を示す。（Ａ）示された濃度での示されたキナーゼ阻害剤によるエクスビボでの処置の関数としての、３６例のＡＭＬ症例の細胞生存率。（Ｂ）示された化合物による１μＭ処置に対する感受性に基づく、ＡＭＬ初代細胞のクラスタリング分析。（Ｃ）処置に対するＡＭＬ初代細胞の感受性に関する相関分析。（Ｄ）ＦＡＢサブタイプの関数としての、ＡＭＬ初代細胞の１μＭ  ＭＥＫｉ処置に対する感受性。  不対の両側Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定（Ｕｎｐａｉｒｅｄ，ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）を使用してｐ値を評価した。（Ｃ）では、両側検定における有意な相関関係の臨界値は、ｐ＜０．０５（*）の場合にはｒ＞０．３２９であり、ｐ＜０．０１（**）の場合にはｒ＞０．４２８であり、ｐ＜０．００１（***）の場合にはｒ＞０．５２６であった。全ての実験を、ｎ＝３６のＡＭＬ症例で行なった。
【０１１７】
【図２】は、ＦＡＢ−Ｍ１およびＦＡＢ−Ｍ４のホスホプロテオームは、ＡＭＬ初代細胞を、タンパク質リン酸化およびキナーゼ活性の特定のパターンを有する群に分類することを示す。（Ａ）ＦＡＢ−Ｍ１症例とＦＡＢ−Ｍ４症例との間でより大きな有意差を示す１５０種のホスホペプチドの階層的クラスター分析。（Ｂ）ホスホペプチドの全体像が、Ｍ１様群およびＭ４様群で有意に増加した。（Ｃ）ＫＳＥＡにより、（Ｂ）で示されるリン酸化部位を使用して、示されたキナーゼに関する活性を推測した（ｉｎｆｅｒｒｅｄ）。 全ての実験において、ｎ＝３６の初代ＡＭＬサンプル。（Ｂ）では、不対の両側Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用して、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ手順（ＦＤＲ）を使用して調整するｐ値を算出した。（Ｃ）では、超幾何分布検定（ｈｙｐｅｒｇｅｏｍｅｔｒｉｃｓ  ｔｅｓｔ）を使用して、富化（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）の有意性を評価した。
【０１１８】
【図３】は、分化マーカーの表面発現が、ＡＭＬ患者を層別化し且つタンパク質リン酸化の特定のパターンと相関することを示す。（Ａ）Ｍ１様群およびＭ４様群に関する、示された分化マーカーの平均表面発現。（Ｂ）分化マーカーの発現とホスホペプチドの存在量との間の相関の頻度。（Ｃ〜Ｅ）Ｙ１８７でのＭＡＰＫ１、Ｓ１４１でのＰＡＫ２、およびＹ３１３でのＰＲＫＣＤのリン酸化と、示された分化マーカーの表面発現との間の相関。（Ｆ）各分化マーカーの発現に関するピアソン相関係数。全ての実験において、ｎ＝３０の初代ＡＭＬサンプル。（Ａ）では、不対の両側Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用してｐ値を評価した。（Ｆ）では、両側検定における有意な相関関係の臨界値は、ｐ＜０．０５（*）の場合にはｒ＞０．３６１であり、ｐ＜０．０１（**）の場合にはｒ＞０．４６３であり、ｐ＜０．００１（***）の場合にはｒ＞０．５７１であった。
【０１１９】
【図４】は、分化段階が異なるＡＭＬ症例が、タンパク質発現、タンパク質リン酸化、およびキナーゼ活性の特定のパターンを提示することを示す。（Ａ）示された分化マーカーに基づく、３０例のＡＭＬ症例の階層的クラスタリング分析。（Ｂ）ＣＤ群全体にわたるタンパク質過剰発現の概要。（Ｃ）ＣＤ群全体にわたるホスホペプチドの存在量の概要。（Ｄ）ＣＤｓ＋群およびＣＤｓ−群の全体にわたる、差次的にリン酸化されたタンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ）に関連している遺伝子オントロジー（Ｇｅｎｅ  ｏｎｔｏｌｏｇｉｅｓ）。（Ｅ）ＣＤｓ＋群およびＣＤｓ−群における平均キナーゼ活性のＫＳＥＡ推定。（Ｂ）および（Ｃ）では、ｐ値を、不対の両側Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定分析を使用して算出し、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ補正を使用して調整した。（Ｄ）および（Ｅ）では、ｐ値を、超幾何分布検定を使用して評価した。
【０１２０】
【図５】は、ＡＭＬ芽球分化の関数としてのキナーゼ阻害剤に対する感受性を示す。（Ａ）示された阻害剤による７２時間の処置後に、Ｍ４様またはＭ１様（ｎ＝３６）と分類された初代ＡＭＬサンプルの生存率。（Ｂ）示された阻害剤による７２時間の処置後に、ＣＤｓ＋またはＣＤｓ−（ｎ＝３０）と分類された初代ＡＭＬサンプルの生存率。 両側Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を使用して統計的有意性を評価した。
【０１２１】
【図６】は、キナーゼシグナル伝達に関係している遺伝子の変異が分化段階および特定のリン酸化パターンに関連していることを示す。（Ａ）分析したＡＭＬ初代サンプル全体にわたる、示された遺伝子の変異。Ｋｉｎａｓｅ  ｓｉｇ．は、ＦＬＴ３、ＮＲＡＳ、またはＢＲＡＦのいずれかにおけるあらゆる活性化変異を表す。（Ｂ〜Ｇ）示された遺伝子型または表現型の関数としての、ＭＥＫｉによる１μＭ処置後のＭＡＰＫ１のリン酸化および細胞生存率。 不対の両側Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定および一元ＡＮＯＶＡに続いて、Ｔｕｋｅｙ検定を使用して、（Ｂ）〜（Ｃ）および（Ｄ）〜（Ｅ）それぞれにおけるｐ値を算出した。
【０１２２】
【図７】は、キナーゼ阻害剤の感受性を説明するためのゲノムデータ、ホスホプロテオミクスデータ、およびマスサイトメトリーデータの統合を示す。（Ａ）遺伝子型および表現型の示された組み合わせの関数としての、ＭＥＫｉによる１μＭ処置後のＡＭＬ初代細胞の生存率。 ＭＡＰＫ１リン酸化を、それぞれ全ての症例にわたりリン酸化の中央値を比べて、高いまたは低いリン酸化を有することに基づいて、高（ｈｉ）および低（ｌｏ）として示す。（Ｂ）（Ａ）で実施した比較に関して得られたＭａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙのｐ値。（Ｃ）ＮＲＡＳ／ＢＲＡＦ／ＣＤｓ＋遺伝子型／表現型と、ＭＥＫｉによる１μＭ処置の関数としての示された因子とを有するＡＭＬ細胞の生存率。（Ｄ）遺伝子型および表現型の示された組み合わせの関数としての、ＭＥＫｉによる１μＭ処置後のＡＭＬ初代細胞の生存率。（Ｅ）示された遺伝子型／表現型の存在／非存在の関数としての、１μＭの示された阻害剤によるＡＭＬ細胞の処置後の生存率に関するＭａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙのｐ値。（Ｆ）ＦＬＴ３／ＰＫＣｉ処置の関数としての、示された表現型／遺伝子型を有するＡＭＬ細胞の生存率。 両側Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を使用して、（Ｃ〜Ｄ、Ｆ）における統計的有意性を評価した。 ｐ値の数値が提示されていない場合には、*ｐ＜０．０５；**ｐ＜０．０１；***ｐ＜０．００１。
【０１２３】
【図８】は、キナーゼ阻害剤のパネルで処置された、初代ＡＭＬ細胞の細胞生存率に関する用量反応曲線を示す。（Ａ）各ＡＭＬ初代サンプルに関するキナーゼ阻害剤に対する用量反応曲線。（Ｂ）ＦＡＢサブタイプに基づいてクラスター化されたＡＭＬ初代サンプルに関する、キナーゼ阻害剤に対する用量反応曲線。 データポイントは、平均±ＳＤ（ｎ＝３）である。患者生検を、倫理的同意と共にＢａｒｔｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅバイオバンクにより得た。
【０１２４】
【図９】は、ペプチドリン酸化に基づく分化シグネチャ（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）が、ＡＭＬ患者をリン酸化のパターンが異なる群へと層別化することを示す。（Ａ）ＦＡＢ分類クラスターに基づいて選別された３６例のＡＭＬ初代サンプル全体にわたり、Ｍ４様群およびＭ１様群を定義するために使用される１５０種のペプチドのリン酸化を示すヒートマップ。（Ｂ）Ｍ４様と分類されたサンプルは、ＧＴＰアーゼシグナル伝達を好む膜タンパク質および細胞質タンパク質を過剰リン酸化するが、Ｍ１様サンプルは、ＤＮＡ結合特性およびＲＮＡ結合特性により核タンパク質を過剰リン酸化する。 超幾何分布検定を使用してｐ値を評価した。
【０１２５】
【図１０】は、キナーゼリン酸化と分化マーカーの表面発現との定義されたパターンを提示する群における、分化ホスホプロテオミクスシグネチャにより分類されたＡＭＬ初代細胞を示す。 Ｍ１  ＦＡＢサブタイプまたはＭ４  ＦＡＢサブタイプとして分類されたＡＭＬ症例の間でより特異的に（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ）発現された１５０種のホスホペプチドに基づく階層的クラスター分類を使用して、Ｍ１様群およびＭ４様群を定義した。（Ａ）Ｍ１様群とＭ４様群との間で有意に調節された（ｐ値＜０．０５）、キナーゼにおけるリン酸化部位（ｎ＝３６）。（Ｂ）マスサイトメトリーにより定量された表面マーカーのリスト。（Ｃ）Ｍ１様群とＭ４様群との間で異なるように発現された分化マーカー（ｎ＝３０）。 不対の両側Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用してｐ値を評価した。
【０１２６】
【図１１】は、３０例のＡＭＬ症例全体にわたるホスホマーカーとＣＤマーカーの表面発現との間の関連の有意性を示す。
【０１２７】
【図１２】は、特異的な（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）タンパク質発現とＣＤｓ＋群およびＣＤｓ−群で特異的に（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ）リン酸化されたキナーゼとを示す。 発現またはリン酸化が、ＣＤｓ群の内のいずれかで有意に増加している（ｐ値＜０．０５）タンパク質（Ａ）またはキナーゼ（Ｂ）に含まれるペプチドを示すヒートマップ。 不対の両側Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用してｐ値を評価した。
【０１２８】
【図１３】は、ＣＤｓ群にクラスター化されたＡＭＬ初代サンプルに関するキナーゼ阻害剤に対する用量反応曲線を示す。示された阻害剤による７２時間の処置後にＣＤｓ＋（ｎ＝１２）またはＣＤｓ−（ｎ＝１８）として分類された初代ＡＭＬサンプルの生存率。不対の両側Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用してｐ値を評価した：*ｐ＜０．０５；**ｐ＜０．０１；***ｐ＜０．００１。
【０１２９】
【図１４】は、ＭＥＫｉ処置の関数としての、示された遺伝子型／表現型を有するＡＭＬ細胞の生存率を示す。（Ａ）ＭＥＫｉによる処置後のＡＭＬ初代細胞の生存率。（Ｂ）ＦＬＴ３／ＰＫＣｉによる処置後のＡＭＬ細胞の生存率。（Ｃ）ＣＫ２ｉによる処置後のＡＭＬ初代細胞の生存率。両側Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を使用してｐ値を評価した。*ｐ＜０．０５；**ｐ＜０．０１；***ｐ＜０．００１。
【実施例】
【０１３０】
研究の概要
この研究を、診断時にＡＭＬ患者の末梢血から抽出した単核細胞の３６例の無作為に選択した一次（ｐｒｉｍａｒｙ）サンプルで実施した。実験を下記で説明するように実施して、キナーゼＦＬＴ３／ＰＫＣ（ミドスタウリン、ＦＬＴ３／ＰＫＣｉ）、ＰＡＫ（ＰＦ−３７５８３０９  ＰＡＫｉ）、ＣＫ２（シルミタセルチブ（ｓｉｌｍｉｔａｓｅｒｔｉｂ）ＣＫ２ｉ）、およびＭＥＫ（トラメチニブ、ＭＥＫｉ）の阻害剤による処置に反応する細胞のインビトロでの生存率を決定した。
Ｐ３８阻害剤（Ｐ３８ｉ）ＴＡＫ−７１５を、陰性コントロールとして含めた。十分な注釈付きの臨床データと共に３６例のＡＭＬ患者から得られた細胞を、７２時間にわたりこれらの化合物で処置した。
【０１３１】
用量反応曲線は、予想したように、３６例の試験したサンプルが全ての化合物に対して異種反応を示すことを示した（図１Ａ〜Ｂ、および図８Ａ）。
処置により生存率が５０％以上低下しない場合には、薬物反応曲線を解釈することは困難であることから、本発明者らは、１μＭ用量（化合物の報告されたインビトロでのＩＣ５０に基づいて、対象のキナーゼを阻害すると予想される）を使用して、処置に対する感受性を定義した。
１μＭ用量では、試験した全ての化合物の中でＰＡＫｉが最も強力であり、このＰＡＫｉは、ＤＭＳＯコントロールと比較して、１８例／３６例（５０％）のＡＭＬ症例の生存率を＞５０％低下させ、続いて、ＦＬＴ３／ＰＫＣｉ（９例／３６例、２５％）、ＭＥＫｉ（８例／３６例、２２％）、およびＣＫ２ｉ（８例／３６例、２２％）であった。
同一の閾値で、Ｐ３８ｉ処置のみが、３例のＡＭＬ症例の生存率を低下させた（８％）。
【０１３２】
細胞感受性データのクラスタリング分析により、ＰＡＫｉ感受性細胞はまた、ＭＥＫｉおよびＦＬＴ３／ＰＫＣｉに対しても感受性を示す傾向があることが示された（図１Ｂ〜Ｃ）。
対照的に、ＭＥＫｉ、ＰＡＫｉ、またはＦＬＴ３／ＰＫＣｉに対する反応率は、ＣＫ２ｉおよびＰ３８ｉに対するものとは非常に異なっており、このことは、ＰＡＫｉ、ＭＥＫｉ、およびＦＬＡＴ３／ＰＫＣｉは、同一ではないものの非常に類似した作用機序を有し、この作用機序はＣＫ２ｉおよびＰ３８ｉのものとは異なることを示唆する。
【０１３３】
実施例１
分化状態がより進行しているＡＭＬ細胞は、低分化細胞と比べてキナーゼ阻害剤処置に対してより反応する。
本発明者らは、Ｍ４細胞が、Ｍ１細胞と比較してＭＥＫｉに対して有意に反応することを発見しており（図１Ｄ）、このことは、Ｍ４サブタイプのＡＭＬ症例が、Ｍ１分類されたものと比べてＭＥＫｉに対して高い感受性を示したことを示唆する。このことは、白血病細胞の分化状態がキナーゼ阻害剤療法に対する感受性のマーカーであり得ることを示す。
【０１３４】
実施例２
分化細胞の特徴であるホスホプロテオミクスシグネチャの特定
本発明者らは、これらのＡＭＬサブタイプの間でのキナーゼシグナル伝達の差異を調べた。下記で説明する質量分析法を使用して、本発明者らは、これらの実験で９，５３４種のホスホペプチドイオンを特定して定量した。
これらの内、本発明者らは、Ｍ１  ＡＭＬサブタイプからＭ４を区別するホスホプロテオミクスシグネチャとして、群の間で最も有意な差違（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定のｐ値に基づく）を示す１５０箇所のリン酸化部位を選択した（図９Ａ）。Ｍ４細胞は、Ｍ１と比べてより分化していることから、本発明者らは、このシグネチャが、分析した芽球の分化段階と関連している可能性があると仮定した。
階層的クラスタリング分析では、このホスホプロテオミクスシグネチャにより、３６例の患者の本発明者らのコホートを、２つの定義された群へと細分化した（図２Ａ）。本発明者らは、Ｍ１サブタイプの１２例の症例の内の１０例を含む群を「Ｍ１様」と命名し、全てのＭ４症例を含む群を「Ｍ４様」と命名した（図２Ａおよび図２Ｂ）。
Ｍ１様群およびＭ４様群はそれぞれ、１６例の症例および２０例の症例からなった。
【０１３５】
本発明者らは、オントロジー・エンリッチメント解析（Ｏｎｔｏｌｏｇｙ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ）およびキナーゼ基質エンリッチメント分析（ｋｉｎａｓｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＫＳＥＡ）を使用して、様々な群で強化された（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）生物学的プロセスおよびシグナル伝達経路を調べた。
症例間のホスホプロテオミクス差異の分析（図２Ｂ）により、Ｍ４様症例では、ＧＴＰアーゼシグナル伝達に関与する細胞質リンタンパク質および膜リンタンパク質が増加し、Ｍ１様では、ＤＮＡ結合特性およびＲＮＡ結合特性を有する核リンタンパク質が増加することが示された。
既知の基質のリン酸化に基づいて、個々のキナーゼ活性を推定する計算手順であるＫＳＥＡにより、ＰＫＣ、ＥＲＫ、ＰＡＫ１、およびＰ３８αの活性がＭ４様群の細胞において強化され（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）、一方、ＣＤＫ７、ＣＫ１Ａ、およびＡｕｒＢの活性がＭ１様細胞で強化されることが示された（図２Ｃ）。
Ｍ４様群におけるいくつかの増加したリン酸化部位は、調節部位（たとえば、Ｓ１４４でのＰＡＫ１、Ｓ１４１でのＰＡＫ２、Ｙ１８７でのＭＡＰＫ１、およびＳ３８０でのＲＰＳ６ＫＡ１）にてキナーゼ中に存在した（図１０Ａ）。
これらのデータは、Ｍ４様細胞が、細胞表面レセプターの下流で作用することが知られているキナーゼシグナル伝達経路（たとえば、ＰＫＣ、ＭＡＰＫ、およびＰＡＫキナーゼ）を、Ｍ１様細胞と比べて大幅に活性化することを示す。
【０１３６】
実施例３
分化細胞の特徴であり且つホスホプロテオミクスシグネチャと相関する細胞表面マーカータンパク質シグネチャの特定
正確に分化状態を測定するために、本発明者らは、１７種の分化マーカーの表面発現を測定することにより、３６個のＡＭＬコホート（このコホートに関して、本発明者らは入手可能なマテリアルを有した）の３０例の症例の免疫表現型に対してマスサイトメトリーを使用した（図１０Ｂ）。
本発明者らは、Ｍ４様の症例がＭ１様の症例と比べて、骨髄単球性分化マーカーの発現が高いことを発見した（図３Ａおよび図１０Ｃ）。
次に、本発明者らは、特定の分化マーカーの存在が、キナーゼシグナル伝達経路の活性化に関連しているかどうかを調べた。
本発明者らは、ＣＤ４５、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ４４、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ６４、およびＣＤ１５の表面発現が、マーカー当たり８０〜２１９箇所の部位のリン酸化パターンと統計的に関連している（ｒ＞０．７、ｐ＜０．００１）ことを発見した（図３Ｂ）。
例として、Ｙ１８７でのＥＲＫ２（ＭＡＰＫ１遺伝子）のリン酸化、Ｓ１４１でのＰＡＫ２のリン酸化、およびＹ３１３でのＰＫＣδ（遺伝子ＰＲＫＣＤ）のリン酸化が挙げられ、これらは、いくつかの分化マーカーの発現と統計的に関連していた（ＭＡＰＫ１リン酸化部位、ＰＡＫ２リン酸化部位、およびＰＫＣδリン酸化部位に関する散布図を図３Ｃ〜Ｅに示し、関連のｐ値を図１１に示す）。
本発明者らは、ＣＤマーカーが共発現されることを発見した（図３Ｆ）。
階層的クラスタリングにより、３０例の患者の本発明者らのコホートを２つの群に細分化し、本発明者らはこれらをＣＤｓ＋およびＣＤｓ−と命名し（図４Ａ）、これらはそれぞれ、１２例の症例および１８例の症例で構成され、Ｍ４様群およびＭ１様群と重複した。この実施例および下記の実施例では、ＣＤｓ+細胞は、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４４、ＣＤ３８、ＣＤ１５、ＣＤ４５、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ１１ｂ、およびＣＤ１４からなる細胞表面マーカーのパネルの表面発現を特徴とした。
【０１３７】
実施例４
分化細胞の特徴であるタンパク質マーカーシグネチャの特定
細胞の分化状態の関数として、ＡＭＬ芽球の生化学的差異をより詳細に調べるために、本発明者らは、ＣＤｓ＋ＡＭＬ症例およびＣＤｓ−ＡＭＬ症例のプロテオーム活性、ホスホプロテオーム活性、およびキナーゼ活性の差異を比較した。
このプロテオミクス分析により、２，３９１種のタンパク質を特定し（図４Ｂ）、ＣＤｓ−と比較して、ＣＤｓ＋群において高い発現を示すタンパク質のセット（既に分化に関連している）を明らかにした。このタンパク質には、インテグリン、リゾチームＣ、および骨髄の分化に関連する他のタンパク質が含まれる（図１２Ａ）。
興味深いことに、いくつかのキナーゼ、ホスファターゼ、およびシグナル伝達調節因子もまた、ＣＤｓ−症例と比較してＣＤｓ＋において高レベルで発現された（図１２Ａ）。
【０１３８】
ホスホプロテオミクス分析の結果に関しては、ＣＤｓ＋症例は、ＣＤｓ−症例と比べて、リン酸化部位が約３倍増加した（図４Ｃ）。
オントロジー・エンリッチメント解析（Ｏｎｔｏｌｏｇｙ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ）により、ＣＳｓ＋における免疫、ＧＴＰアーゼ、およびキナーゼシグナル伝達に関連するリンタンパク質の発現が強調され、ＣＤ−症例は、核リンタンパク質と転写の調節に関連するものとの量の増加を示した（図４Ｄ）。
ＣＤｓ−症例と比較して、ＣＤｓ＋群でのリン酸化の増加を有するキナーゼは、Ｙ７１３でのＦＥＳ、Ｔ２０２／Ｙ２０４でのＥＲＫ１（ＭＡＰＫ３）、Ｔ１８５／Ｙ１８７でのＥＲＫ２（ＭＡＰＫ１）、Ｓ１４４でのＰＡＫ１、Ｓ２２２でのＭＥＫ１（ＭＡＰ２Ｋ１）、Ｓ１４１でのＰＡＫ２、およびＳ６４５でのＰＫＣ−δ（ＰＲＫＣＤ）を含んだ（図１２Ｂ）。
これらの観察と一致して、ＣＤｓ＋群は、ＣＤｓ−細胞と比較して、いくつかのキナーゼ（たとえば、ＰＫＡ、ＰＫＣのいくつかのアイソフォーム、ＢＲＡＦ、ＭＥＫ、およびＥＲＫ）の活性を強化した（図４Ｅ）。ＣＤｓ−細胞と比較した、ＣＤｓ＋細胞におけるインテグリン、サバイバルキナーゼ（ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｋｉｎａｓｅｓ）、および他のシグナル伝達調節因子の発現の増加（図１２Ａ）は、より分化した細胞でのキナーゼ経路の活性化の増加（図４Ｅ）が、これらのシグナル伝達分子のより高い発現に少なくとも部分的に起因していることを示唆する。
【０１３９】
実施例５
Ｍ４様細胞およびＣＤｓ＋細胞は、キナーゼ阻害剤療法に対して高い感受性を示す
Ｍ４様症例およびＣＤｓ＋症例は、それぞれ、Ｍ１様症例およびＣＤｓ−症例と比べて、キナーゼ生存経路を大幅に活性化したことから、本発明者らは、これらの患者群由来の細胞がキナーゼ阻害剤に反応し得る方法に差異が存在し得ると仮定した。
一貫して、キナーゼ阻害剤による処置の関数としての細胞生存率分析は、Ｍ４様症例およびＣＤｓ＋症例が１μＭ  ＰＡＫｉ、１μＭ  ＭＥＫｉ、および１０μＭ  ＦＬＴ３／ＰＫＣｉ（本発明者らのアッセイにおいて非常に活性であることが分かった（図２Ｃ、３Ｅ，４Ｅ）キナーゼであるＰＫＣδを阻害し得る濃度である）に対して、Ｍ１様およびＣＤｓ−と比べて高い感受性を示すことを示した（図５Ａ〜Ｂ）。
他の化合物濃度による処置後、同一の傾向の反応を観察した（図１３）。
群の間にＣＫ２ｉまたはＰ３８ｉへの反応の差異はなかった（図５Ａ〜Ｂ）。
まとめると、ホスホプロテオミクスおよび分化マーカー発現により、ＡＭＬ患者は、キナーゼ活性とＦＬＴ３／ＰＫＣ阻害剤、ＰＡＫ阻害剤、およびＭＥＫ阻害剤に対する感受性との著しく異なるパターンを有する群へと層別化された。
従って、これらの結果は、分化、キナーゼ駆動型生存経路の活性、およびキナーゼ阻害剤に対するＡＭＬ細胞の感受性の間でのリンクの存在を示唆する。
【０１４０】
実施例６
キナーゼ阻害剤感受性のマーカーとしての変異状態
分化表現型が異なるＡＭＬで観察される薬理学的な差異および生化学的な差異の一因となる可能性があるメカニズムを調べるために、本発明者らは、ＡＭＬにおいて２５種の最も頻繁に変異する遺伝子を本発明者らのサンプルコホートで配列決定した。
本発明者らは、これらの遺伝子の内の１５種が、この分析に含まれる２７例の症例の内の少なくとも１例で変異していることを発見した（図６Ａ）。興味深いことに、キナーゼシグナル伝達において役割を有する遺伝子（たとえば、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、およびＦＬＴ３）は、ＣＤｓ＋群の細胞において、より頻繁に変異していた（図６Ａ、超幾何分布検定によりｐ＝０．００８）。
【０１４１】
本発明者らは、ＮＲＡＳまたはＢＲＡＦが変異した細胞は、ＲＡＳ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路の活性マーカーであるＴ１８５およびＹ１８７でのＭＡＰＫ１（ＥＲＫ２）のリン酸化を増加させることを発見した（図６Ｂ）。公開されている研究と一致して、本発明者らは、これらの遺伝子上での変異はＭＥＫｉに対する細胞の感受性とも有意に関連していることを発見した（図６Ｃ）。
（ＮＲＡＳ／ＢＲＡＦ  ＷＴバックグラウンドにおいて）、ＦＬＴ３変異を有する細胞も比較的高いＲＡＳ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路活性を示していた（ＭＡＰＫ１リン酸化により評価した場合、図６Ｄ）、但し、これは、ＦＴＬ３、ＮＲＡＳ、およびＢＲＡＦに関する細胞ＷＴと比べてＭＥＫｉに対して高い感受性を示しておらず（図６Ｅ）、このことは、経路活性化に関連する遺伝子のバックグラウンドが経路阻害に対する反応に影響を及ぼすことを示唆する。
同様に興味深いことに、ＮＲＡＳ／ＢＲＡＦ変異に対して陰性のＣＤｓ＋症例は、ＣＤｓ−サンプルと比較して、高いＲＡＳ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路活性化を示しており（図６Ｆ）、同一のＮＲＡＳ／ＢＲＡＦ遺伝子型の未分化症例と比べて、ＭＥＫｉに対して、より高い感受性を示した（図６Ｇ）。
【０１４２】
実施例７
キナーゼ阻害剤感受性の複合マーカーとしての変異状態および分化状態
反応をさらに合理的に説明するために、本発明者らは、細胞の変異プロファイルを質量分析およびマスサイトメトリーのデータと統合する系統的な分析を実施した。変異したＮＲＡＳ、高いＭＡＰＫ１リン酸化、またはＣＤｓ＋に対する陽性を有する細胞はそれぞれ、ＮＲＡＳに関する細胞ＷＴと比べてＭＥＫｉに対して高い感受性を示すか、ＭＡＰＫ１リン酸化に関して低いか、またはＣＤｓ表現型に対して陰性であった（図７Ａ（ｉ〜ｉｖ））。
ＮＲＡＳ／ＢＲＡＦ／ＦＬＴ３−ＩＴＤ遺伝子型を有する細胞は、ＮＲＡＳ変異またはＢＲＡＦ変異のいずれかのみを有する細胞と比べて、ＭＥＫｉに対してより高い感受性を示さなかった（図７Ａ（ｖ））。対照的に、ＮＲＡＳ／ＢＲＡＦ／ＣＤｓ＋のいずれかに対して陽性の１５例の症例は、この分子シグネチャがない細胞と比べてＭＥＫｉに対して平均して高い感受性を示した（図７Ａ（ｖｉ〜ｉｘ））。
【０１４３】
様々な分子マーカーの関数としての、ＭＥＫｉ感受性の差異の有意性を評価するために、本発明者らは、図７Ａに示す比較のｐ値をプロットした。ＮＲＡＳ／ＢＲＡＦ／ＣＤｓ＋シグネチャを組み合わせることにより、−５．７のｌｏｇ10  ｐ値で最も有意な差異が生じ、ｌｏｇ10  ｐ値が−５．０であるＮＲＡＳ／ＢＲＡＦ／ＭＡＰＫ１ｈｉ／ＣＤｓ＋シグネチャが続いた（図７Ｂ）。これらの結果は、ＡＭＬ細胞が、ＮＲＡＳ／ＢＲＡＦ上の変異またはＣＤマーカーの表面発現のいずれかによりＭＥＫ／ＥＲＫ経路を活性化し得、その結果として、このＡＭＬ細胞は、ＷＴ遺伝子を有するかまたは分化状態が低い細胞と比べてＭＥＫｉ処置に対して高い感受性を示すようになることを示唆する。
【０１４４】
ＮＲＡＳ／ＢＲＡＦ変異またはＣＤｓ＋表現型のいずれかを有する症例（ＮＲＡＳ／ＢＲＡＦ／ＣＤｓ＋症例）は、ＭＥＫｉに対する高い感受性を示したが、このシグネチャを有する１５例の症例の内の８例は、処置後に＞５０％の生存率を示した（図７（ｖｉｉｉ））。
ＮＲＡＳ／ＢＲＡＦ／ＣＤｓ＋症例内の反応のこれらの差異の理由を調べるために、本発明者らは、ＮＲＡＳ／ＢＲＡＦ／ＣＤｓ＋に対して陽性の１５例の症例において変異状態およびホスホプロテオームを比較した。
これらの１５例の症例の内、本発明者らは、ＦＬＴ３−ＩＴＤ陽性細胞が、この変異を有しない細胞と比べてＭＥＫｉに対して有意に高い耐性を示すことを発見した（ｐ＝０．０１２、図７Ｃ）。
いくつかのリン酸化マーカー（たとえば、ＳＴＡＴ５Ａ  Ｓ７８０、ＳＴＡＴ５Ａ  Ｓ１２８、ＴＯＰ２Ａ  Ｓ１２１３、ＫＤＭ５Ｃ  Ｓ３１７、およびＣＡＭＫＫ１  Ｓ４５８でのもの）もまた、ＮＲＡＳ／ＢＲＡＦ／ＣＤｓ＋症例内でＭＥＫｉに対する反応に関連していることも発見しており（図７Ｃ）、このことは、ＮＲＡＳ／ＢＲＡＦ／ＣＤｓ＋シグネチャを有するが、ＭＥＫｉに対して比較的耐性を示す細胞は、増殖するためにＦＬＴ３駆動型経路（たとえば、ＳＴＡＴ５29）を使用することを示唆する。
従って、ＮＲＡＳ／ＢＲＡＦ／ＣＤｓ＋に対して陽性であり且つＦＬＴ３−ＩＴＤに対して陰性であるか、またはＳＴＡＴ５Ａ若しくはＫＤＭ５Ｃのリン酸化が低いサンプルは、他の細胞と比べて１μＭ  ＭＥＫｉに対して、より高い感受性を示しており（図７Ｄ）、低いＫＤＭ５Ｃリン酸化を示す本質的に全てのＮＲＡＳ／ＢＲＡＦ／ＣＤｓ＋症例は、ＭＥＫｉ処置に対して感受性を示した（生存率＜５０％）（図７Ｄ、中央のパネル）。
加えて、本発明者らは、ＦＬＴ３−ＩＴＤに対して陰性であるかまたはＫＤＭ５Ｃリン酸化が低いＮＲＡＳ／ＢＲＡＦ／ＣＤｓ＋症例は、ＭＥＫｉの他の濃度に対してもより感受性を示し、この差異は、ＣＤｓ状態のみのＮＲＡＳ／ＢＲＡＦを考慮する場合と比べて、より大きいことを発見した（図１４Ａ）。
【０１４５】
ＭＥＫｉ以外の阻害剤に対する感受性の決定因子を特定するために、本発明者らは、変異状態、リン酸化マーカーの発現、またはこれら２つの組み合わせの関数として、化合物に対する感受性を比較した（図７Ｅ）。本発明者らは、ＮＲＡＳ変異が、ＭＥＫｉに対する感受性の唯一の強力なゲノム決定因子であり、ＩＤＨ２変異は、ＣＫ２ｉに対する反応への小さい（ｐ約０．０３）効果を示すことを発見した（図７Ｅ、左側のパネル）。
驚くべきことに、ＦＬＴ３−ＩＴＤ状態は、ＦＬＴ３／ＰＫＣｉに対する細胞の反応への効果を有しなかった（図７Ｆ、および図１４Ｂ）。対照的に、いくつかのリン酸化マーカー（たとえば、プロテインキナーゼＣアイソフォーム（遺伝子名ＰＲＫＣＡ、ＰＲＫＣＢ、およびＰＲＫＣＤ）、ＳＴＫ１０、ＧＳＫ３Ａ、並びにＰＡＫ１／２上のもの、並びに血小板膜レセプターＧｉ２４上のもの（Ｃ１０ｏｒｆ５４））が、ＰＡＫｉ、ＦＬＴ３／ＰＫＣｉ、およびＭＥＫｉに対する反応と関連することを発見した（図７Ｅの中央のパネル）。
ゲノムマーカーまたはＣＤｓマーカーとリン酸化データとの統合により、関連性の有意性が増加した（ｐ値が減少した）（図７の右側のパネル）。たとえば、ＣＤｓまたはＧＳＫ３Ａ若しくはＰＣＫδ上でのリン酸化のいずれかに対して陽性のサンプルは、他の症例と比べてＦＬＴ３／ＰＫＣｉに対して、より高い感受性を示した（図７Ｆおよび図１４Ｂ）。
ＣＫ２ｉに関しては、ＣＤ３４発現またはＩＤＨ２変異と、この化合物に対する感受性との間に小さい関連性があったが、この効果はわずかであった（図１４Ｃ）。
まとめると、本発明者らの結果は、分化状態（ＣＤマーカーの発現により定義される）と、ゲノムシグネチャおよびホスホプロテオミクスシグネチャとの統合により、ＭＥＫｉおよびＦＬＴ３／ＰＫＣｉに対する感受性の程度により特徴付けられたＡＭＬ症例の群が生じることを示唆する。
【０１４６】
実施例８
ミドスタウリンによる処置に対するＡＭＬ患者の適合性を評価するためのコンパニオン診断試験
急性骨髄性白血病を患っている患者から、末梢血サンプルまたは骨髄サンプルを得た。これらのサンプルから単核白血病細胞を抽出し、本明細書で説明されているように、この細胞に対してアッセイを実施して、下記を検出した：
（ｉ）ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ１２３、およびＨＬＡ−ＤＲからなるＣＤマーカーの群の表面発現；並びに／または
（ｉｉ）ＧＳＫ３ＡのｐＳ２１；ＰＲＫＣＤのｐＹ３１３、ｐＴ５０７、ｐＴ２９５、ｐＴ２１８、および／若しくはｐＳ６６４；ＳＴＫ１０のｐＳ２０および／若しくはｐＳ１３；ＰＡＫ１のｐＳ１４４；ＰＡＫ２のｐＳ１４１；ＭＡＰＫ１のＹ１８７および／若しくはＴ１８５；並びにＭＡＰＫ３のＴ２０２および／若しくはＹ２０４の内のいずれか１つ若しくは複数での患者の白血病細胞における高レベルのリン酸化。
工程（ｉｉ）では、参照部位でのリン酸化が、複数例の患者サンプル全体にわたり算出した、その部位での平均リン酸化と比べてより高かった場合、高レベルのリン酸化と特定した。細胞が（ｉ）または（ｉｉ）のいずれかに対して陽性である患者を、ミドスタウリンによる処置に適しているとして特定した。
【０１４７】
実施例９
トラメチニブによる処置に対するＡＭＬ患者の適合性を評価するためのコンパニオン診断試験
急性骨髄性白血病を患っている患者から、末梢血サンプルまたは骨髄サンプルを得た。これらのサンプルから単核白血病細胞を抽出し、本明細書で説明されているように、この細胞に対してアッセイを実施して、下記を検出した：
（ａ）（ｉ）ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ１２３、およびＨＬＡ−ＤＲからなるＣＤマーカーの群の患者の白血病細胞上での表面発現；並びに／または
（ｉｉ）ＭＡＰＫ１のＹ１８７および／若しくはＴ１８５；並びにＭＡＰＫ３のＴ２０２および／若しくはＹ２０４のいずれか１つ若しくは複数での、この患者の白血病細胞における高レベルのリン酸化；
（ｉｉｉ）この患者の白血病細胞にける、ＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、若しくはＢＲＡＦの内のいずれか１つ若しくは複数における活性化変異；並びに
（ｂ）（ｉ）ＳＴＡＴ５ＡのｐＳ７８０およびｐＳ１２８、ＣＡＭＫＫ１のｐＳ５４８、ＴＯＰ２ＡのｐＳ１２１３、並びにＫＤＭ５ＣのｐＳ３１７の内の１つ若しくは複数での高レベルのリン酸化；並びに／または
（ｉｉ）この患者の白血病細胞でのＦＬＴ３におけるあらゆる活性化変異の非存在。
ここで、工程（ａ）（ｉｉ）および（ｂ）（ｉ）では、参照部位でのリン酸化が、複数例の患者サンプル全体にわたり算出した、その部位での平均リン酸化と比べてより高かった場合、高レベルのリン酸化と特定した。細胞が（ａ）および（ｂ）の両方に対して陽性である患者を、トラメチニブによる処置に適しているとして特定した。
【０１４８】
考察
標的療法の中心的な目標は、効果的な個別化処置を指示し得る、実施可能な患者特異的経路を特定することである。この研究では、本発明者らは、ＡＭＬサンプル全体にわたり、分化状態によりキナーゼ経路活性化の程度および／または性質が決定されることを発見した。
表面分化マーカーの一部（たとえば、ＣＤ４５およびＣＤ１２３）は、膜レセプターであるか、または細胞外シグナルの認識において役割を果たし、この細胞外シグナルは、タンパク質キナーゼカスケードにより、細胞内に伝達されて伝播される。
これらのＣＤマーカーに対して陽性の細胞は、ＣＤｓ−細胞と比較して、骨髄単球性分化およびキナーゼシグナル伝達と関連するタンパク質の発現がより高く、その結果として、生存促進性キナーゼのリン酸化および活性化の増加を示しており（図２〜４）、このことにより、これらの細胞がＰＡＫｉ、ミドスタウリン、およびトラメチニブによる処置に反応する方法での感受性の増加が説明された（図５）。
【０１４９】
質量分析およびサイトメトリーのデータと再発性変異との統合により、ＡＭＬは、他の研究14と一致して、ＮＲＡＳでの活性化変異がより高いＥＲＫ（ＭＡＰＫ）活性と関連しており且つＭＥＫｉに感受性を齎すことを示した（図６Ｃ〜Ｄ）。
本発明者らの患者のコホートでは、ＮＲＡＳ変異は、単独で考慮される場合には、反応の唯一の明確なゲノム決定因子であると思われ、驚くべきことに、ＦＬＴ３−ＩＴＤ変異もＦＬＴ３−ＴＫＤ変異もミドスタウリンに対する反応と関連していなかった（図７Ｆ）。
本発明者らのデータは、ＲＡＳ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路が、ＮＲＡＳ／ＢＲＡＦ活性化変異の存在により、または上流の細胞表面ＣＤマーカー若しくは関連のレセプターから生じるシグナルによりＡＭＬで活性化され得ることを示唆する。
そのため、ＭＥＫｉ処置は、これらのマーカーの内の少なくとも１つに対して陽性の場合にＡＭＬ細胞の生存率を低下させる可能性が高かった（図７Ｂ）。
【０１５０】
しかしながら、ＭＥＫｉに対する反応の程度へのＲＡＳ／ＭＥＫ／ＥＲＫ活性化の明らかな寄与にもかかわらず、ＲＡＳ／ＭＥＫ／ＥＲＫ活性化に対する陽性の症例の約５０％（７例／１５例）のみが、ＭＥＫｉに対する高い反応を示した。
本発明者らは、ＭＥＫｉに対して比較的耐性である症例は、ＲＡＳ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路の活性化にもかかわらず、ＦＬＴ３−ＩＴＤ遺伝子型を持ち、且つ高レベルのリン酸化調節タンパク質（たとえば、ＳＴＡＴ５Ａ、ＫＤＭ５Ｃ、および酵素の活性を調節する部位であるＳ１２１３でのトモイソメラーゼ２Ａ）を有することを発見した（図７）。
そのため、ＭＥＫｉに対して良好に反応するＡＭＬ細胞集団は、ＦＬＴ３／ＳＴＡＴ経路の低い活性と共に、標的経路（ＲＡＳ／ＭＥＫ／ＥＲＫ）の高い活性を示しており（図７Ｄ）、ＦＬＴ３／ＳＴＡＴ経路は、ＲＡＳ／ＭＥＫ／ＥＲＫシグナル伝達と並行して作用することにより初代ＡＭＬ細胞の生存率および増殖を維持することが知られている。
【０１５１】
従って、本発明者らの結果は、ＭＥＫ阻害に対する内因性の耐性の２種の異なるメカニズムを示唆する。
第１のものは、ＭＥＫの生存促進性作用に依存していない細胞で起こり、なぜならば、この細胞は、ＲＡＳ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路活性が低いからである。
第２のメカニズムは、非常に活性のＲＡＳ／ＭＥＫ／ＥＲＫを有するにもかかわらずＭＥＫ阻害をバイパスする細胞で起こり、なぜならば、ＦＬＴ３／ＳＴＡＴ５軸が代償メカニズムとして作用するからである。
【０１５２】
Ｐｅｍｏｖｓｋａらは、ＡＭＬ患者のサンプルの３６％が、健康なドナー由来の単核細胞と比べてトラメチニブに対する高い感受性を示すことを観察しており、本発明者らは、この薬物による処置の結果として、本発明者らの症例の２２％が生存率の５０％超の低下を示すことを発見した（図１）。
そのため、黒色腫の処置にＦＤＡにより既に承認されている薬物であるトラメチニブを、そのような処置に反応すると予想されるＡＭＬ症例の２０〜３５％を処置するために転用することを検討する価値がある。
【０１５３】
ＰＡＫｉおよびＦＬＴ３／ＰＫＣｉに関しては、本発明者らは、遺伝子変化とこれらの化合物に対する反応との間に関連性を見出さなかった（図７）。
しかしながら、本発明者らは、より分化した表現型を有する細胞と、ＧＳＫ３ＡおよびＰＫＣδの高いリン酸化を有するものとが、これらのマーカー上でのリン酸化が低い細胞と比べてミドスタウリンに対して良好に反応することを観察した（ＰＫＣδはＧＳＫ３Ａの上流であることに留意されたい［Ｒｅｆ38］）。
従って、本発明者らの結果は、臨床開発39、40の後期にあるミドスタウリン（この研究で試用されるＦＬＴ３／ＰＫＣｉ）の作用機序が、この薬物の既知の標的である、ＰＫＣδの阻害を伴うことを示唆する。
【０１５４】
結論として、本発明者らは、ＡＭＬ細胞が、分化の最中にレセプターチロシンキナーゼシグナル伝達ネットワークを活性化し、その結果、ＭＥＫおよびＰＫＣのアイソフォームにより調節される生存促進性経路の活性が著しく増加することを発見した。
標的および並行のキナーゼ経路の活性化（遺伝的なおよび非遺伝的な事象により引き起こされる）の組み合わせにより、ＡＭＬ細胞がトラメチニブまたはミドスタウリンによる処置に反応する程度が決定された。
【０１５５】
方法
研究デザイン
この研究を、診断時にＡＭＬ患者の末梢血から抽出した単核細胞の３６例の初代サンプルで実施した。サンプルを、ＢＣＩ組織バンクコレクションから無作為に選択した。最初は、この研究には４５例のサンプルが含まれていたが、９例を、エクスビボでの実験で生存可能でなかったことから後に除外した。
材料の入手可能性により、３０例のサンプルのプロテオミクス分析およびマスサイトメトリー分析と、２７例のサンプルのＤＮＡ配列決定とが可能であった。エクスビボでの薬物試験を４重のサンプリングの繰り返しで実施し、生存率の値を平均化し、ビヒクルコントロールと比較して表した。
【０１５６】
患者から、研究目的のためのこの患者の血液細胞の保管および使用に関するインフォームド・コンセントを得た。実験を、Ｌｏｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅに従って実施した。
【０１５７】
質量分析
Ｗｉｌｋｅｓ  ＥＨ，Ｔｅｒｆｖｅ  Ｃ，Ｇｒｉｂｂｅｎ  ＪＧ，Ｓａｅｚ−Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  Ｊ，Ｃｕｔｉｌｌａｓ  ＰＲ．Ｅｍｐｉｒｉｃａｌ  ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｆ  ｃｉｒｃｕｉｔｒｙ  ａｎｄ  ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ  ｉｎ  ａ  ｋｉｎａｓｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｎｅｔｗｏｒｋ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２０１５；１１２（２５）：７７１９−７７２４で既に説明されているように、細胞を溶解させ、トリプシンを使用してタンパク質を消化した。
【０１５８】
ペプチドおよびホスホペプチドのＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる特定および定量を、ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計（Ｑ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ  Ｐｌｕｓ）で実施した。正規化された定量データを使用して、群間の倍率変化と統計的有意性（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定により評価した）とを算出した。質量分析のプロテオミクスデータを、データセット識別子ＰＸＤ００５９７８およびＤＯＩ  １０．６０１９／ＰＸＤ００５９７８を有するＰＲＩＤＥパートナーリポジトリを介してＰｒｏｔｅｏｍｅＸｃｈａｎｇｅ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍに寄託している。Ｖｉｚｃａｉｎｏ  ＪＡ，Ｃｓｏｒｄａｓ  Ａ，Ｄｅｌ−Ｔｏｒｏ  Ｎら、２０１６  ｕｐｄａｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＰＲＩＤＥ  ｄａｔａｂａｓｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏｏｌｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１６；４４（２２）：１１０３３を参照されたい。
【０１５９】
バイオインフォマティクス
Ｃａｓａｄｏ  Ｐ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｐｒａｄｏｓ  ＪＣ，Ｃｏｓｕｌｉｃｈ  ＳＣら、Ｋｉｎａｓｅ−ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｏｆ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉ  Ｓｉｇｎａｌ．２０１３；６（２６８）：ｒｓ６で説明されているように、ホスホプロテオミクスデータからのキナーゼ活性の推定を、キナーゼ基質富化分析（ＫＳＥＡ）を使用して実施した。
【０１６０】
ＤＡＶＩＤソフトウェア（ｈｔｔｐｓ：／／ｄａｖｉｄ．ｎｃｉｆｃｒｆ．ｇｏｖ／）を使用して、遺伝子オントロジー（ＧＯ）の強化を決定し、この遺伝子オントロジーを、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉの補正ｐ値が＜０．０５であった場合に強化されていると見なした。
Ｈｅａｔｍａｐ２関数でＥｕｃｌｉｄｅａｎ距離計量を使用して、Ｒ統計的計算環境（３．２．３）内で階層クラスターを構築した。
【０１６１】
マスサイトメトリー
製造業者に指示されたように、初代細胞を金属結合抗体でコーティングし、ＣｙＴＯＦ２マスサイトロメーター（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）で分析した。ＤＶＳ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＣｙＴＯＦ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖ６．０．６２６）内のノーマライザーを使用して、データを正規化した。
【０１６２】
生存率アッセイ
ＡＭＬ初代細胞のエクスビボでの薬物試験は、Ｃａｓａｄｏ  Ｐ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｐｒａｄｏｓ  ＪＣ，Ｃｏｓｕｌｉｃｈ  ＳＣら、Ｋｉｎａｓｅ−ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｏｆ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉ  Ｓｉｇｎａｌ．２０１３；６（２６８）：ｒｓ６で既に説明されている通りであった。
簡潔に説明すると、細胞をＭＳ−５馴化ＩＭＤＭ培地に再懸濁させ、９６ウェルプレートに播種し、７２時間にわたり、ビヒクルまたは１〜１００００ｎＭの示された阻害剤で処置した。細胞をＧｕａｖａ  ＶｉａＣｏｕｎｔ試薬で染色し、細胞数および生存率を測定した。
ＣｙｔｏＳｏｆｔ  （ｖ２．５．７）を使用して、フローサイトメトリーのデータを分析した。
【０１６３】
パネル配列決定
インハウスでのＴｒｕｅ  ＳｅｑＣｕｓｔｏｍ  Ａｍｐｌｉｃｏｎ（ＴＳＣＡ）デザイン（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）を使用して、２５種の遺伝子骨髄パネルの標的富化（Ｔａｒｇｅｔ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）を達成した。
【０１６４】
統計分析
統計分析を、Ｒ（バージョン３．２．３）、Ｍｉｃｏｒｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２０１３またはＰｒｉｓｍ（バージョン５．４）で実施した。Ｍａｎｎ  Ｗｉｔｎｅｙ、Ａｎｏｖａ、またはＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定から返されたｐ値（図で示されている）を、必要に応じてＴｕｋｅｙまたはＢｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇの手順を使用して、多重検定用に調整した。
【０１６５】
質量分析、プロテオミクス、およびホスホプロテオミクス
細胞を、５分にわたる、４℃における、５００×ｇでの遠心分離により回収し、１ｍＭ  Ｎａ3ＶＯ4および１ｍＭ  ＮａＦが補充された冷ＰＢＳで２回洗浄し、スナップ凍結させ、さらなる処置まで−８０℃で保存した。
細胞ペレットを、３０分にわたり尿素緩衝液（１ｍＭ  Ｎａ3ＶＯ4、１ｍＭ  ＮａＦ、１ｍＭ  Ｎａ4Ｐ2Ｏ7、および１ｍＭ  β−グリセロリン酸ナトリウムが補充されたＨＥＰＥＳ  ｐＨ８．０中の２０ｍＭ中の８Ｍ尿素）に溶解させ（ｌｙｓｅｄ）、超音波処置（３０秒オン４０秒オフの６０サイクル；Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ  Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ（登録商標）Ｐｌｕｓ，Ｌｉｅｇｅ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）によりさらにホモジナイズした。
５℃において、１０分にわたる、２０．０００×ｇでの遠心分離により不溶性物質を除去し、細胞抽出物中のタンパク質をビシンコニン酸（ＢＣＡ）分析により定量した。
【０１６６】
ホスホプロテオーム分析のために、本発明者らは、公開されている方法を、いくつかの変更を加えて使用した。下記を参照されたい：
Ｇｒｕｈｌｅｒ  Ａ，Ｏｌｓｅｎ  ＪＶ，Ｍｏｈａｍｍｅｄ  Ｓ，Ｍｏｒｔｅｎｓｅｎ  Ｐ，Ｆａｅｒｇｅｍａｎ  ＮＪ，Ｍａｎｎ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ａｐｐｌｉｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｙｅａｓｔ  ｐｈｅｒｏｍｏｎｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：ＭＣＰ  ２００５；４（３）：３１０−２７  ｄｏｉ  １０．１０７４／ｍｃｐ．Ｍ４００２１９−ＭＣＰ２００．
Ｌａｒｓｅｎ  ＭＲ，Ｔｈｉｎｇｈｏｌｍ  ＴＥ，Ｊｅｎｓｅｎ  ＯＮ，Ｒｏｅｐｓｔｏｒｆｆ  Ｐ，Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ  ＴＪ．Ｈｉｇｈｌｙ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｉｔａｎｉｕｍ  ｄｉｏｘｉｄｅ  ｍｉｃｒｏｃｏｌｕｍｎｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：ＭＣＰ  ２００５；４（７）：８７３−８６  ｄｏｉ  １０．１０７４／ｍｃｐ．Ｔ５００００７−ＭＣＰ２００．
Ｍｏｎｔｏｙａ  Ａ，Ｂｅｌｔｒａｎ  Ｌ，Ｃａｓａｄｏ  Ｐ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｐｒａｄｏｓ  ＪＣ，Ｃｕｔｉｌｌａｓ  ＰＲ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ＴｉＯ（２）ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｌａｂｅｌ−ｆｒｅｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１１；５４（４）：３７０−８  ｄｏｉ  １０．１０１６／ｊ．ｙｍｅｔｈ．２０１１．０２．００４
【０１６７】
簡潔に説明すると、タンパク質２５０μｇを、１時間にわたる１０ｍＭ  ＤＴＴおよび１６．６ｍＭ  ヨードアセトアミド（ｉｏｄｏａｃｅｔａｍｙｄｅ）との連続的なインキュベーションにより、還元させてアルキル化した。
尿素濃度を２０ｍＭ  ＨＥＰＥ（ｐＨ８．０）により２Ｍまで希釈し、調節済みトリプシンビーズ（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）による３回の洗浄で調節された［ＴＬＣＫ−トリプシンの５０％スラリー（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｃａｔ．＃２０２３０）］）８０μＬを添加し、このサンプルを、撹拌しつつ３７℃で１６時間にわたりインキュベートした。
５℃における５分にわたる２，０００×ｇでの遠心分離により、トリプシンビーズを取り出した。ホスホプロテオミクス分析のために、タンパク質１００μｇを使用した。
【０１６８】
トリプシン消化後、１０ｍｇ  ＯＡＳＩＳ−ＨＬＢカートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ）を使用して、ペプチド溶液を脱塩した。簡潔に説明すると、ＯＡＳＩＳカートリッジを真空マニホールド（−５ｍｍＨｇ）に収容し、ＡＣＮ  １ｍＬで活性化し、洗浄溶液（１％  ＡＣＮ、０．１％  ＴＦＡ）１．５ｍＬで平衡化した。
サンプルを充填した後、カートリッジを洗浄溶液１ｍＬで洗浄した。ホスホプロテオミクス分析のために、グリコール酸緩衝液１（１Ｍグリコール酸、５０％  ＡＣＮ、５％  ＴＦＡ）５００μＬで溶出させ、ホスホ富化（ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）にかけた。
プロテオミクス分析のために、ペプチドをＡＣＮ溶液（３０％  ＡＣＮ、０．１％  ＴＦＡ）５００μＬで溶出させ、ｓｐｅｅｄ  ｖａｃ（ＲＶＣ  ２−２５，Ｍａｒｔｉｎ  Ｃｈｒｉｓｔ  Ｇｅｆｒｉｅｒｔｒｏｃｋｎｕｎｇｓａｎｌａｇｅｎ  ＧｍｂＨ，Ｏｓｔｅｒｏｄｅ  ａｍ  Ｈａｒｚ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で乾燥させ、−８０℃で保存した。
【０１６９】
ホスホペプチドを、いくつかの変更を加えて既に説明されているように（４）、ＴｉＯ2（ＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して富化させた。サンプル量を、グリコール酸緩衝液２（１Ｍ  グリコール酸、８０％  ＡＣＮ、５％  ＴＦＡ）を使用して１ｍＬに正規化し、このペプチド混合物に、ＴｉＯ2ビーズ（１％  ＴＦＡ中の５０％スラリー）５０μＬを添加し、撹拌しつつ室温で５分にわたりインキュベートし、１５００×ｇにて３０秒にわたり遠心分離した。
各サンプルに関して、上清の８０％を未使用のチューブに移して氷中で保存し、残余２０％を使用して、空の事前洗浄済みＰＥ−ｆｉｌｔｅｒｅｄスピンチップ（Ｇｌｙｇｅｎ，ＭＤ，ＵＳＡ）に充填したビーズペレットを再懸濁し、３分にわたる１５００×ｇでの遠心分離によりまとめた。
３分にわたる１５００×ｇでの遠心分離による上清の残余体積のローディング後、スピンチップを、１５００×ｇでの３分にわたるＲＴ遠心分離により、グリコール酸緩衝液２  １００μＬ、酢酸アンモニウム緩衝液（２５％  ＡＣＮ中の１００ｍＭ  酢酸アンモニウム）、１０％  ＡＣＮで順次洗浄した。
ホスホペプチドの回収のために、５％  アンモニア水５０μＬの添加およびその後の１５００×ｇでの５分にわたる遠心分離を４回繰り返した。溶出物をドライアイス中でスナップ凍結させ、ｓｐｅｅｄ  ｖａｃで乾燥させ、ペプチドペレットを−８０℃で保存した。
【０１７０】
ホスホプロテオミクスのために、ペプチドペレットを再構成緩衝液（３％  ＡＣＮ、０．１％  ＴＦＡ中の２０ｆｍｏｌ／μＬエノラーゼ）１２μＬに再懸濁させ、５．０μＬを、Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｑ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ  Ｐｌｕｓ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に直接接続されたＤｉｏｎｅｘ  ＵｌｔｉＭａｔｅ  ３０００  ＲＳＬＣからなるＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムに負荷した。
プロテオミクスのために、ペレットを再構成緩衝液（０．５μｇ／μＬ）に再懸濁させ、２μＬを注入した。このＬＣシステムは、移動相Ａ（３％  ＡＣＮ；０．１％  ＦＡ）およびＢ（１００％  ＡＣＮ；０．１％ＦＡ）を使用した。ペプチドを、μ−プレ−カラム（カタログ番号１６０４５４）で補足し、分析カラム（Ａｃｃｌａｉｍ  ＰｅｐＭａｐ  １００；カタログ番号１６４５６９）で分離した。下記のパラメータを使用した：１２０分にわたる３％から２３％Ｂへの勾配、および０．３μＬ／分の流速。
【０１７１】
このｎａｎｏ−ＬＣシステムから溶出した場合、ペプチドを、２．１秒のデューティサイクルで動作するオンライン接続型Ｑ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ  Ｐｌｕｓシステムに注入した。
７０，０００  ＦＷＨＭ解像度によるフルスキャン調査スペクトル（ｍ／ｚ  ３７５〜１，５００）の取得の後、２０種の最も著しいイオンをＨＣＤ（高エネルギー衝突解離）および１７，５００  ＦＷＨＭの解像度によるＭＳ／ＭＳスキャニング（２００〜２，０００ｍ／ｚ）のために選択したデータ依存性取得が続いた。３０秒の動的除外期間（ｄｙｎａｍｉｃ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｐｅｒｉｏｄ）を、１０ｐｐｍのマスウィンドウ（ｍａｓｓ  ｗｉｎｄｏｗ）を有する除外リストにより可能にした。全体のデューティサイクルは、ベースで約３０秒のクロマトグラフィーピークを生じ、これは、少なくとも１０のデータポイントを有する抽出イオンクロマトグラム（ＸＩＣ）の構築を可能にした。
余分なサンプルの生ファイルもＰＲＩＤＥにアップロードした。
【０１７２】
ペプチドの特定および定量
Ｍａｓｃｏｔ  Ｄａｅｍｏｎ  ２．５．０を使用して、ＭＳデータからのペプチドの特定を自動化した。ＲＡＷデータからのピークリストファイル（ＭＧＦ）を、Ｍａｓｃｏｔ  Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒ  ｖ２．５．１．０で生成し、Ｍａｓｃｏｔサーチエンジン（ｖ２．５）にロードして、ＭＳ／ＭＳデータをペプチドに一致させた（Ｐｅｒｋｉｎｓ  ＤＮ，Ｐａｐｐｉｎ  ＤＪ，Ｃｒｅａｓｙ  ＤＭ，Ｃｏｔｔｒｅｌｌ  ＪＳ．Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ−ｂａｓｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｓｅａｒｃｈｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａｂａｓｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｄａｔａ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  １９９９；２０（１８）：３５５１−６７）。
検索を、約１％のＦＤＲおよび下記のパラメータ：２個のトリプシン欠損開裂、ＭＳスキャンの場合の±１０ｐｐｍおよびＭＳ／ＭＳスキャンの場合の±２５ｍｍｕの質量許容範囲、固定修飾としてのカルバミドメチルＣｙｓ、可変修飾としてのＮ末端Ｇｌｎ上のＰｙｒｏＧｌｕおよびＭｅｔの酸化を有するＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  Ｄａｔａｂａｓｅ（プロテオミクスの場合のＳｗｉｓｓＰｒｏｔ＿２０１２Ｏｃｔ．ｆａｓｔａ、またはホスホプロテオミクス分析の場合のｕｎｉｐｒｏｔ＿ｓｐｒｏｔ＿２０１４＿０８．ｆａｓｔａ）に対して実施した。
ホスホプロテオミクス実験の場合、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、およびＴｙｒのリン酸化も可変修飾として含めた。インハウスで開発されたＰｅｓｃａｌソフトウェアを、標識フリーのペプチドの定量に使用し（６）、全てのサンプルにわたり特定された全てのペプチドに関するＸＩＣをそれぞれ、±７ｐｐｍおよび±２分の質量および保持時間ウィンドウで構築した。
全てのＸＩＣからのピーク面積を算出した。検出不能なペプチドに０の強度値を付与した。サンプル毎の２つの技術的複製の値を平均化し、各ペプチドの強度値を総サンプル強度へと正規化した。
【０１７３】
マスサイトメトリー
マスサイトメトリーを使用して、ＡＭＬ細胞におけるＣＤマーカーを特徴付けた（Ｂａｎｄｕｒａ  ＤＲ，Ｂａｒａｎｏｖ  Ｉ，Ｏｒｎａｔｓｋｙ  ＯＩ，Ａｎｔｏｎｏｖ  Ａ，Ｋｉｎａｃｈ  Ｒ，Ｌｏｕ  Ｘら、Ｍａｓｓ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ：ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｆｏｒ  ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌ  ｍｕｌｔｉｔａｒｇｅｔ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｐｌａｓｍａ  ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００９；８１（１６）：６８１３−２２）。細胞（４×１０6個）を未使用のチューブに移し、ＰＢＳで２回洗浄し、ＲＴで、５分にわたり、１×Ｃｅｌｌ−ＩＤ（商標）Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ溶液（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ；Ｃａｔ．２０１０６４）と共にインキュベートした。
細胞を、Ｍａｘｐａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ緩衝液で洗浄し、ペレットを再懸濁させ、ＲＴで、２０分にわたり、２０μｇ／ｍＬ  ＨＡＧ（ヒトγ−グロブリン、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｃａｔ．Ｇ４３８６−１Ｇ）５０μＬと共にインキュベートした。
抗体ミックス（各抗体の１／５０希釈；補足表１）５０μＬの添加後、サンプルを、ＲＴで、３０分にわたりインキュベートした。
次いで、細胞を、Ｍａｘｐａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ緩衝液で２回洗浄し、ペレットをＦｉｘ  ａｎｄ  Ｐｅｒｍ  Ｂｕｆｆｅｒに再懸濁させ、４℃で一晩放置した。翌日、Ｉｒ挿入剤を、１×の最終濃度まで添加し、サンプルを、ＲＴで、２０分にわたり、インキュベートした。透過処置した細胞をＭａｘｐａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ緩衝液で２回洗浄し、次いでＭａｘｐａｒ水で２回洗浄した。
【０１７４】
下記で説明するように、マスサイトメトリーアッセイでは下記の抗体を使用した。
(表３)
抗原           決定因子                            クローン        金属
ＣＤ１９       ＣＤ２１のコレセプター              ＨＩＢ１９      １４２Ｎｄ
ＣＤ１１７     レセプターチロシンキナーゼ／ＳＣＦ  １０４Ｄ２      １４３Ｎｄ
ＣＤ１１ｂ     フィブリノーゲンレセプター          ＩＣＲＦ４４    １４４Ｎｄ
ＣＤ６４       Ｆｃレセプター                      １０．１        １４６Ｎｄ
ＣＤ７         ＣＤ７−６Ｂ７                                      １４７Ｓｍ
ＣＤ１２３     インターロイキン３レセプター        ６Ｈ６          １５１Ｅｕ
ＣＤ４５       レセプターチロシンホスファターゼ    ＨＩ３０        １５４Ｓｍ
ＣＤ３３       シアル酸レセプター                  ＷＭ５３        １５８Ｇｄ
ＣＤ１５       炭水化物                            Ｗ６Ｄ３        １６４Ｄｙ
ＣＤ３４       細胞間接着因子                      ５８１          １６６Ｅｒ
ＣＤ３         ＴＣＲコレセプター                  ＵＣＨＴ１      １７０Ｅｒ
ＣＤ４４       ヒアルロン酸レセプター              ＩＭ７          １７１Ｙｂ
ＣＤ３８       環状ＡＤＰの合成                    ＨＩＴ２        １７２Ｙｂ
ＨＬＡ−ＤＲ   抗原提示                            Ｌ２４３        １７４Ｙｂ
ＣＤ１８４     ケモカインレセプター／ＰＳＤ−１    １２Ｇ５        １７５Ｌｕ
ＣＤ１４       ＴＬＲ４のコアクチベーター          Ｍ５Ｅ２        １６０Ｇｄ
ＣＤ１６       Ｆｃレセプター                      ３Ｇ８          １４８Ｎｄ
【０１７５】
サンガー配列決定
ＢＲＡＦ  Ｖ６００  ＰＣＲ用のプライマーは、フォワード  ５’−ＴＣＴＴＣＡＴＧＡＡＧＡＣＣＴＣＡＣＡＧＴ−３’、およびリバース  ５’−ＣＣＡＧＡＣＡＡＣＴＧＴＴＣＡＡＡＣＴＧＡ−３’であった。
ＤＮＡ  ２０〜５０ｎｇをテンプレートして使用し、熱条件は下記の通りであった：
９５℃での１５分にわたる最初の加熱期間、
１分にわたる９５℃、１分にわたる５５℃、および１分にわたる７２℃での３６サイクル、並びに
７２℃での最後の１０分。
増幅産物を、フォワードプライマーを使用してＧＡＴＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｃｏｎｓｔａｎｚａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により配列決定した。陽性の症例を、リバースプライマーを使用して検証した。
【０１７６】
マスサイトメトリー
マスサイトメトリーを使用して、３０例のＡＭＬ患者の末梢血から抽出された単核細胞における１７種の分化マーカー（ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１８４、ＨＬＡ−ＤＲ）の表面発現を同時に測定した。
ＴｉＯ2ホスホ富化に基づく標識フリーの定量的ホスホプロテオミクスを使用して、同一のＡＭＬ初代サンプルにおいて５，０００箇所超のリン酸化部位を定量し、ＫＳＥＡ技術を適用して、ホスホプロテオミクスデータからキナーゼ活性を推測した。
ＤＡＶＩＤソフトウェアを使用してリン酸化部位を検出したタンパク質をコードする遺伝子に基づいて、遺伝子オントロジー強化を算出した。
Ｇｕａｖａ  ＥａｓｙＣｙｔｅ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙを使用して、５種のキナーゼ阻害剤（それぞれ、ＰＦ−３７５８３０９、ミドスタウリン、シルミタセルチブ、キナーゼＰＡＫ、Ｆｌｔ−３、カゼインキナーゼ２、ＭＥＫおよびＰ３８を標的とすることを目的とするトラメチニブおよびＴＡＫ７１５）による同一の患者サンプルの処置後の細胞生存率を決定した。
【図１】
2020524802.tif 000059
【図２】
2020524802.tif 000060
【図３】
2020524802.tif 000061
【図４】
2020524802.tif 000062
【図５】
2020524802.tif 000063
【図６】
2020524802.tif 000064
【図７】
2020524802.tif 000065
【図８】
2020524802.tif 000066
【図９】
2020524802.tif 000067
【図１０】
2020524802.tif 000068
【図１１】
2020524802.tif 000069
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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