(57)【要約】  グルコアミラーゼ活性を有するポリペプチド、このようなポリペプチドを含む組成物並びにこのようなポリペプチド及び組成物を使用する方法が記載される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号３のポリペプチドに対して少なくとも９５％、例えばさらに少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）少なくとも低ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中ストリンジェンシー条件、さらにより好ましくは少なくとも中〜高ストリンジェンシー条件、最も好ましくは少なくとも高ストリンジェンシー条件、さらに最も好ましくは少なくとも非常に高いストリンジェンシー条件下において、
（ｉ）配列番号１の成熟ポリペプチドコード配列、
（ｉｉ）配列番号１の前記成熟ポリペプチドコード配列を含むゲノムＤＮＡ配列、又は
（ｉｉｉ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）の完全長相補鎖
とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；
（ｃ）配列番号１の前記成熟ポリペプチドコード配列に対して好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、さらにより好ましくは少なくとも９３％、最も好ましくは少なくとも９４％、さらに最も好ましくは少なくとも９５％、例えばさらに少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；
（ｄ）配列番号３の前記ポリペプチドの１つ以上（例えば、いくつか）のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入を含む変異体、及び
（ｅ）グルコアミラーゼ活性を有する（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）のポリペプチドの断片
からなる群から選択される、グルコアミラーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項３】
発現宿主における前記ポリペプチドの産生を制御する１つ以上の制御配列に作動可能に連結されている、請求項２に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項４】
請求項２に記載のポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞。
【請求項５】
エタノール生産微生物である、請求項４に記載の宿主細胞。
【請求項６】
プロテアーゼ、ヘミセルラーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、脂肪分解酵素、メタロ脂肪分解酵素、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、ペルヒドロラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、マンナナーゼ、ケラチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、アルファ−アミラーゼ、プルラナーゼ、フィターゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ、ベータ−グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、トランスフェラーゼ又はこれらの組み合わせを含む群から選択される１つ以上の追加の酵素をさらに発現及び分泌する、請求項４又は５に記載の宿主細胞。
【請求項７】
デンプン含有材料を糖化する方法であって、ｉ）前記デンプン含有材料をアルファ−アミラーゼと接触させる工程と、ｉｉ）少なくとも７０℃の温度で前記デンプン含有材料をグルコアミラーゼと接触させる工程とを含み、前記デンプン含有材料（基質）から少なくとも７０％の遊離グルコースを製造する方法。
【請求項８】
前記工程（ｉｉ）は、少なくとも７５℃、好ましくは少なくとも８０℃の温度で１２〜９６時間、好ましくは１８〜６０時間にわたって行われる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記グルコアミラーゼは、少なくとも７０℃の温度及び／又は２．０〜７．０のｐＨ、好ましくはｐＨ４．０〜ｐＨ６．０、より好ましくはｐＨ４．５〜ｐＨ５．５で少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％の相対活性を維持する、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
工程（ｉ）及び工程（ｉｉ）を順次又は同時に行うことを含む、請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
糖化工程ｉｉ）前に予備糖化をさらに含む、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記グルコアミラーゼは、請求項１に記載のポリペプチドである、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記工程（ｉ）は、前記デンプン含有材料のゼラチン化温度以下で行われる、請求項７〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
追加の脱分枝酵素は、工程（ｉ）及び／又は工程（ｉｉ）中に存在しない、請求項７〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記脱分枝酵素は、プルラナーゼである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項７〜１５のいずれか一項に記載の方法によって製造される糖。
【請求項１７】
請求項１６に記載の糖から醗酵産物を製造する方法であって、前記糖は、醗酵生物によって醗酵される、方法。
【請求項１８】
醗酵プロセスは、前記工程（ｉｉ）と順次又は同時に行われる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記醗酵産物は、エタノールを含む、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記醗酵産物は、非エタノール性代謝産物を含む、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記非エタノール性代謝産物は、クエン酸、乳酸、コハク酸、グルタミン酸一ナトリウム、グルコン酸、グルコン酸ナトリウム、グルコン酸カルシウム、グルコン酸カリウム、有機酸、グルコノデルタ−ラクトン、エリソルビン酸ナトリウム、オメガ３脂肪酸、ブタノール、イソ−ブタノール、アミノ酸、リシン、チロシン、トレオニン、グリシン、イタコン酸、１，３−プロパンジオール、ビタミン、酵素、ホルモン、イソプレン又は他の生化学物質若しくは生体材料である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
醸造において請求項１に記載のポリペプチドを適用する方法。
【請求項２３】
ビール又はモルトベースの飲料の製造のために、請求項１に記載のポリペプチドを適用する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１７年３月０７日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０１３／０７６４１９号明細書の利益を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、グルコアミラーゼ活性を有するポリペプチド及びそのようなポリペプチドを含む組成物に関する。本開示は、そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、そのようなポリペプチドをコードする遺伝子を含むベクター及び宿主細胞にさらに関し、これらは、そのようなポリペプチドの産生も可能にし得る。本開示は、ポリペプチド又は組成物を使用又は適用してデンプン含有材料を糖化する方法及びこの方法によりそのようにして製造された糖類にも関する。さらに、本開示は、醗酵産物を製造する方法及びその方法によって製造される醗酵産物に関する。
【背景技術】
【０００３】
グルコアミラーゼ（１，４−アルファ−Ｄ−グルカングルコヒドロラーゼ、ＥＣ３．２．１．３）は、デンプン又は関連するオリゴ糖及び多糖分子の非還元末端からのＤ−グルコースの放出を触媒する酵素である。グルコアミラーゼは、いくつかの糸状菌及び酵母によって産生される。
【０００４】
グルコアミラーゼの主な用途は、部分的に処理されたデンプン／デキストリンのグルコースへの糖化であり、これは、多くの醗酵プロセスに必須の基質である。その後、グルコースは、醗酵生物を使用して、直接又は間接的に醗酵産物に変換され得る。市販の醗酵産物の例としては、アルコール（例えば、エタノール、メタノール、ブタノール、１，３−プロパンジオール）；有機酸（例えば、クエン酸、酢酸、イタコン酸、乳酸、グルコン酸、グルコン酸塩、乳酸、コハク酸、２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸）；ケトン（例えば、アセトン）；アミノ酸（例えば、グルタミン酸）；気体（例えば、Ｈ２及びＣＯ２）；並びに例えば抗生物質（例えば、ペニシリン及びテトラサイクリン）；酵素；ビタミン（例えば、リボフラビン、Ｂ１２、ベータ−カロテン）；ホルモン及び合成による製造が困難な他の化合物を含むより複雑な化合物が挙げられる。醗酵プロセスは、消耗アルコール（例えば、ビール及びワイン）、乳製品（例えば、ヨーグルト及びチーズの製造で）、皮革、飲料及びタバコ産業でも一般に使用される。
【０００５】
最終製造物は、シロップであり得る。例えば、最終製造物は、グルコースであり得るが、例えばグルコースイソメラーゼによってフルクトースに又はほぼ等量のグルコース及びフルクトースから構成される混合物に変換され得る。この混合物又はフルクトースをさらに濃縮した混合物は、世界中で商業化されている、最も一般的に使用されている高フルクトースコーンシロップ（ＨＦＣＳ）である。
【０００６】
多様な群の微生物がグルコアミラーゼを産生することが報告されているが、商業目的のためのグルコアミラーゼは、大量の酵素を細胞外に分泌することから、従来、糸状菌を用いて製造されてきた。しかしながら、商業的に使用されている真菌グルコアミラーゼは、中程度の熱安定性、酸性ｐＨ要件及びプロセスコストを増加させる低触媒活性などの一定の制約を有する。したがって、触媒効率の改善につながる最適温度を改善し、糖化時間を短縮するため又は最終生成物のより高い収率を得るために新しいグルコアミラーゼを探索する必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本開示の目的は、グルコアミラーゼ活性を有する特定のポリペプチド、そのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、そのようなポリペプチドを生成するために使用することができる核酸構築物、これらを含む組成物及びそのようなポリペプチドを様々な工業用途に適用する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明のポリペプチド、組成物及びこのポリペプチド又は組成物を使用又は適用してデンプン含有材料を糖化する方法である。ポリペプチド、組成物及び方法の態様及び実施形態を、独立して番号を付した以下のパラグラフに記載する。
１．一態様では、
（ａ）配列番号３のポリペプチドに対して少なくとも９５％、例えばさらに少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）少なくとも低ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中ストリンジェンシー条件、さらにより好ましくは少なくとも中〜高ストリンジェンシー条件、最も好ましくは少なくとも高ストリンジェンシー条件、さらに最も好ましくは少なくとも非常に高いストリンジェンシー条件下において、
（ｉ）配列番号１の成熟ポリペプチドコード配列、
（ｉｉ）配列番号１の成熟ポリペプチドコード配列を含むゲノムＤＮＡ配列、又は
（ｉｉｉ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）の完全長相補鎖
とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；
（ｃ）配列番号１の成熟ポリペプチドコード配列に対して好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、さらにより好ましくは少なくとも９３％、最も好ましくは少なくとも９４％、さらに最も好ましくは少なくとも９５％、例えばさらに少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；
（ｄ）配列番号２の成熟ポリペプチドの１つ以上（例えば、いくつか）のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入を含む変異体、及び
（ｅ）グルコアミラーゼ活性を有する（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）のポリペプチドの断片
からなる群から選択される、グルコアミラーゼ活性を有するポリペプチドである。
２．別の態様では、パラグラフ１のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである。
３．パラグラフ２のポリヌクレオチドのいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、発現宿主におけるポリペプチドの産生を制御する１つ以上の制御配列に作動可能に連結されている。
４．別の態様では、パラグラフ２のポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞である。
５．パラグラフ４の宿主細胞のいくつかの実施形態では、宿主細胞は、エタノール生産微生物である。
６．パラグラフ４又は５の宿主細胞のいくつかの実施形態では、宿主細胞は、プロテアーゼ、ヘミセルラーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、脂肪分解酵素、メタロ脂肪分解酵素、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、ペルヒドロラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、マンナナーゼ、ケラチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、アルファ−アミラーゼ、プルラナーゼ、フィターゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ、ベータ−グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、トランスフェラーゼ又はこれらの組み合わせを含む群から選択される１つ以上の追加の酵素をさらに発現及び分泌する。
７．別の態様では、デンプン含有材料を糖化する方法であって、ｉ）デンプン含有材料をアルファ−アミラーゼと接触させる工程と、ｉｉ）少なくとも７０℃の温度でデンプン含有材料をグルコアミラーゼと接触させる工程とを含み、デンプン含有材料（基質）から少なくとも７０％の遊離グルコースを製造する方法である。
８．パラグラフ７の方法のいくつかの実施形態では、工程（ｉｉ）は、少なくとも７５℃、好ましくは少なくとも８０℃の温度で１２〜９６時間、好ましくは１８〜６０時間にわたって行われる。
９．パラグラフ７又は８の方法のいくつかの実施形態では、グルコアミラーゼは、少なくとも７０℃の温度及び／又は２．０〜７．０のｐＨ、好ましくはｐＨ４．０〜ｐＨ６．０、より好ましくはｐＨ４．５〜ｐＨ５．５で少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％の相対活性を維持する。
１０．パラグラフ７〜９のいずれかの方法のいくつかの実施形態では、方法は、工程（ｉ）及び工程（ｉｉ）を順次又は同時に行うことを含む。
１１．パラグラフ７〜１０のいずれかの方法のいくつかの実施形態では、方法は、糖化工程ｉｉ）前に予備糖化をさらに含む。
１２．パラグラフ７〜１１のいずれかの方法のいくつかの実施形態では、グルコアミラーゼは、請求項１のポリペプチドである。
１３．パラグラフ７〜１２のいずれかの方法のいくつかの実施形態では、工程（ｉ）は、デンプン含有材料のゼラチン化温度以下で行われる。
１４．パラグラフ７〜１３のいずれかの方法のいくつかの実施形態では、追加の脱分枝酵素は、工程（ｉ）及び／又は工程（ｉｉ）中に存在しない。
１５．パラグラフ１４の方法のいくつかの実施形態では、脱分枝酵素は、プルラナーゼである。
１６．別の態様では、パラグラフ７〜１５のいずれかの方法によって製造される糖である。
１７．別の態様では、パラグラフ１６の糖から醗酵産物を製造する方法であって、糖は、醗酵生物によって醗酵される、方法である。
１８．パラグラフ１７の方法のいくつかの実施形態では、醗酵プロセスは、工程（ｉｉ）と順次又は同時に行われる。
１９．パラグラフ１７又は１８の方法のいくつかの実施形態では、醗酵産物は、エタノールを含む。
２０．パラグラフ１７又は１８の方法のいくつかの実施形態では、醗酵産物は、非エタノール性代謝産物を含む。
２１．パラグラフ２０の方法のいくつかの実施形態では、代謝産物は、クエン酸、乳酸、コハク酸、グルタミン酸一ナトリウム、グルコン酸、グルコン酸ナトリウム、グルコン酸カルシウム、グルコン酸カリウム、有機酸、グルコノデルタ−ラクトン、エリソルビン酸ナトリウム、オメガ３脂肪酸、ブタノール、イソ−ブタノール、アミノ酸、リシン、チロシン、トレオニン、グリシン、イタコン酸、１，３−プロパンジオール、ビタミン、酵素、ホルモン、イソプレン又は他の生化学物質若しくは生体材料である。
２２．別の態様では、醸造においてパラグラフ１のポリペプチドを適用する方法である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ｐＪＧ５８０のプラスミドのマップである。
【図２】９５時間にわたる醗酵におけるＰｒｕＧＡ１の産生プロファイルである。
【図３】６０、６５及び７０℃での７２時間にわたるインキュベーション後のＰｒｕＧＡ１−０．３×、ＰｒｕＧＡ１−１×、ＡｆｕＧＡ−１×及びＡｎＧＡ−１×のＤＰ１生成の比較である。
【図４】ｐＨ３．５におけるＰｒｕＧＡ１の生デンプンに対する活性のＴｒＧＡとの比較である。
【図５】ｐＨ４．５におけるＰｒｕＧＡ１の生デンプンに対する活性のＴｒＧＡとの比較である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本開示は、グルコアミラーゼ活性を有するポリペプチド及びそのようなポリペプチドを含む組成物に関する。本開示は、そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、そのようなポリペプチドをコードする遺伝子を含むベクター及び宿主細胞にさらに関し、これらは、そのようなポリペプチドの産生も可能にし得る。本開示は、ポリペプチド又は組成物を使用又は適用してデンプン含有材料を糖化する方法及びこの方法によりそのようにして製造された糖類にも関する。さらに、本開示は、醗酵産物を製造する方法及びその方法によって製造される醗酵産物に関する。
【００１１】
本組成物及び方法を詳細に説明する前に以下の用語及び略語を定義する。
【００１２】
別段の定義がされてない限り、使用される全ての技術用語及び科学用語は、関連する科学分野における通常の意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４）及びＨａｌｅ＆Ｍａｒｋｈａｍ，Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，ＮＹ（１９９１）は、本発明を説明する用語の多くの通常の意味を提供する。
【００１３】
定義
用語「グルコアミラーゼ（１，４−アルファ−Ｄ−グルカングルコヒドロラーゼ、ＥＣ３．２．１．３）の活性」は、本明細書では、デンプン又は関連するオリゴ糖及び多糖分子の非還元末端からのＤ−グルコースの放出を触媒する酵素活性として定義される。
【００１４】
本発明のポリペプチドは、配列番号２の成熟ポリペプチドのグルコアミラーゼ活性の少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、さらに最も好ましくは少なくとも１００％を有する。
【００１５】
用語「アミノ酸配列」は、用語「ポリペプチド」、「タンパク質」及び「ペプチド」と同義語であり、互換的に使用される。そのようなアミノ酸配列が活性を示す場合、それらは、「酵素」と呼ぶことができる。アミノ酸残基についての従来の１文字コード又は３文字コードが用いられ、アミノ酸配列は、標準的なアミノ末端からカルボキシ末端の向き（すなわちＮ→Ｃ）に示される。
【００１６】
用語「成熟ポリペプチド」は、本明細書では、翻訳及び任意の翻訳後修飾（例えば、Ｎ末端プロセシング、Ｃ末端切断、グリコシル化、リン酸化など）後のその最終形態ポリペプチドと定義される。一態様では、配列番号２のアミノ酸１〜２１がシグナルペプチドであると予測するＳｉｇｎａｌＰ（Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １０：１−６）プログラムに基づき、成熟ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸２２〜６１４である。
【００１７】
用語「核酸」は、ポリペプチドをコードすることができるＤＮＡ、ＲＮＡ、ヘテロ二本鎖及び合成分子を包含する。核酸は、一本鎖又は二本鎖であり得、化学的に修飾され得る。用語「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は、互換的に用いられる。遺伝子コードは、縮重しているため、特定のアミノ酸をコードするために２個以上のコドンを使用することができ、本組成物及び方法は、特定アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を包含する。他に規定しない限り、核酸配列は、５’から３’の方向に表示される。
【００１８】
用語「コード配列」は、そのタンパク質産物のアミノ酸配列を直接指定するヌクレオチド配列を意味する。コード配列の境界は、一般に、オープンリーディングフレームによって決定され、これは、通常、ＡＴＧ開始コドン又はＧＴＧ及びＴＴＧなどの代替開始コドンで始まり、ＴＡＡ、ＴＡＧ及びＴＧＡなどの終止コドンで終わる。コード配列は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成分子又は組換えヌクレオチド配列であり得る。
【００１９】
本明細書では、用語「ｃＤＮＡ」は、真核細胞から得られる成熟し、スプライシングされたｍＲＮＡ分子から逆転写によって調製することができるＤＮＡ分子として定義される。ｃＤＮＡは、対応するゲノムＤＮＡ中に存在し得るイントロン配列を欠く。初期の一次ＲＮＡ転写産物は、成熟し、スプライシングされたｍＲＮＡとして現れる前に一連の工程を通してプロセシングされているｍＲＮＡの前駆体である。これらの工程には、スプライシングと呼ばれるプロセスによるイントロン配列の除去が含まれる。したがって、ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡは、イントロン配列を欠損している。
【００２０】
用語「ハイブリダイゼーション」は、ブロットハイブリダイゼーション手法及びＰＣＲ手法中に発生するように、核酸の１本の鎖が相補鎖と二本鎖を形成する、すなわち塩基対を形成するプロセスを指す。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、以下の条件下のハイブリダイゼーションによって例示される：６５℃及び０．１×ＳＳＣ（ここで、１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５ＭのＮａ３クエン酸塩、ｐＨ７．０）。ハイブリダイズした二本鎖の核酸は、ハイブリダイズした核酸の２分の１が相補鎖と対にならない融解温度（Ｔｍ）により特徴付けられる。二本鎖内のミスマッチヌクレオチドは、Ｔｍを低下させる。
【００２１】
「合成」分子は、生物ではなく、インビトロの化学合成又は酵素合成によって生成される。
【００２２】
「宿主株」又は「宿主細胞」は、目的のポリペプチド（例えば、アミラーゼ）をコードするポリヌクレオチドを含む、発現ベクター、ファージ、ウイルス又は他のＤＮＡ構築物が導入されている生物である。例示的な宿主株は、目的のポリペプチドを発現でき、且つ／又は糖類を醗酵できる微生物細胞（例えば、細菌、糸状菌及び酵母）である。用語「宿主細胞」には、細胞から作製されたプロトプラストが含まれる。
【００２３】
用語「発現」は、核酸配列に基づいてポリペプチドが生成されるプロセスを指す。このプロセスには、転写及び翻訳の両方が含まれる。
【００２４】
用語「ベクター」は、核酸を１種以上の細胞型に導入するように設計されたポリヌクレオチド配列を指す。ベクターには、クローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、ファージ粒子、カセットなどが含まれる。
【００２５】
「発現ベクター」は、目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物を指すが、そのコード配列は、好適な宿主内のＤＮＡの発現を実施できる好適な制御配列に作動可能に連結している。このような制御配列には、転写を生じさせるプロモーター、転写を制御する任意選択的オペレーター配列、ｍＲＮＡ上の好適なリボソーム結合部位をコードする配列、エンハンサー並びに転写及び翻訳の終了を制御する配列が含まれ得る。
【００２６】
本明細書では、用語「制御配列」は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現に必要な全ての成分を含むものであると定義される。各制御配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対して天然若しくは外来であり得るか、又は互いに天然若しくは外来であり得る。このような制御配列には、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列及び転写ターミネーターが含まれるが、これらに限定されない。少なくとも、制御配列には、プロモーター並びに転写及び翻訳停止シグナルが含まれる。制御配列には、制御配列と、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のコード領域とのライゲーションを容易にする特定の制限部位を導入する目的でリンカーが提供され得る。
【００２７】
用語「作動可能に連結した」は、特定の複数の構成成分が意図された方法で機能することを許容する関係（並列を含むが、それに限定されない）にあることを意味する。例えば、調節配列は、コード配列の発現が調節配列の制御下にあるようにコード配列に作動可能に連結している。
【００２８】
「シグナル配列」は、細胞外部へのタンパク質の分泌を容易にする、タンパク質のＮ末端部分に結合しているアミノ酸の配列である。細胞外タンパク質の成熟形は、分泌プロセスで切断除去されるシグナル配列を欠く。
【００２９】
「生物学的に活性な」とは、酵素活性などの特定の生物活性を有する配列を指す。
【００３０】
用語「比活性」は、特定の条件下において、単位時間当たりで酵素又は酵素調製物によって生成物に変換させることのできる基質のモル数を指す。比活性は、一般に、単位数（Ｕ）／ｍｇ−タンパク質で表される。
【００３１】
「配列同一性パーセント」は、特定の配列を、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗアルゴリズムをデフォルトパラメーターで使用して整列させた場合、特定の参照配列内のものと同一のアミノ酸残基を少なくとも一定のパーセンテージで有することを意味する。Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４６７３−４６８０を参照されたい。ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗアルゴリズムのためのデフォルトパラメーターは、次の通りである。
ギャップ開始ペナルティ：１０．０
ギャップ伸長ペナルティ：０．０５
タンパク質重量マトリックス：ＢＬＯＳＵＭシリーズ
ＤＮＡ重量マトリックス：ＩＵＢ
ディレイ発散配列（％）：４０
ギャップ分離距離：８
ＤＮＡ遷移重量：０．５０
親水性残基のリスト：ＧＰＳＮＤＱＥＫＲ
負のマトリックスの使用：オフ
トグル残基特異的ペナルティ：オン
トグル親水性ペナルティ：オン
トグル末端ギャップ分離ペナルティ  オフ
【００３２】
本明細書では、用語「相同配列」は、配列番号３のペニシリウム・ルッセリイ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｒｕｓｓｅｌｌｉｉ）グルコアミラーゼを用いたｔｆａｓｔｙサーチ（Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．，１９９９，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｓ．Ｍｉｓｅｎｅｒ  ａｎｄ  Ｓ．Ａ．Ｋｒａｗｅｔｚ，ｅｄ．，ｐｐ．１８５−２１９）で０．００１未満のＥ値（すなわち期待スコア）を有する予測タンパク質と定義される。
【００３３】
本明細書では、用語「ポリペプチド断片」は、配列番号３のポリペプチドのアミノ末端及び／又はカルボキシル末端から１つ以上（例えば、いくつか）のアミノ酸が欠失したポリペプチド又はその相同配列として定義され、その断片は、グルコアミラーゼ活性を有する。
【００３４】
ポリペプチドに関連する「野生型」、「親」又は「参照」という用語は、アミノ酸の１つ以上の位置で人為的な置換、挿入又は欠失を含まない天然型ポリペプチドを指す。同様に、ポリヌクレオチドに関連する「野生型」、「親」又は「参照」という用語は、人為的なヌクレオシド改変を含まない天然型ポリヌクレオチドを指す。しかし、野生型、親又は参照ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、天然型ポリヌクレオチドに限定されず、野生型、親又は参照ポリペプチドをコードする任意のポリヌクレオチドを包含することに留意されたい。
【００３５】
酵素に関連する「熱安定性の」及び「熱安定性」という用語は、酵素が高温への曝露後に活性を保持する能力を指す。酵素、例えばアミラーゼ酵素の熱安定性は、その時間中に規定条件下で酵素活性の半分が失われる、分、時間又は日数で与えられるその半減期（ｔ１／２）によって測定される。半減期は、例えば、高温への曝露（すなわち高温によるチャレンジ）後の残留アルファ−アミラーゼ活性を測定することによって計算できる。
【００３６】
酵素に関連する「ｐＨ範囲」は、酵素が触媒活性を示すｐＨ値の範囲を指す。
【００３７】
酵素に関連する「ｐＨ安定性の」及び「ｐＨ安定性」という用語は、酵素が所定の時間（例えば、１５分間、３０分間、１時間）にわたって広範囲のｐＨ値で活性を保持する能力に関する。
【００３８】
本明細書では、用語「予備糖化」は、完全な糖化又は糖化と同時の醗酵（ＳＳＦ）の前プロセスとして定義される。予備糖化は、通常、３０〜６５℃、約６０℃の温度で４０〜９０分間にわたって行われる。
【００３９】
「糖化と同時の醗酵（ＳＳＦ）」という語句は、例えば、エタノール生産微生物などの微生物及びアミラーゼなどの少なくとも１種の酵素が同一のプロセス工程中に存在する生化学物質の製造におけるプロセスを指す。ＳＳＦは、同一の反応容器内において、デンプン基質（顆粒状、液化物又は可溶化物）のグルコースを含む糖類への加水分解と同時に起こる、糖類のアルコール又は他の生化学物質又は生体材料への醗酵を含む。
【００４０】
「スラリー」は、水中に不溶性デンプン顆粒を含有する水性混合物である。
【００４１】
用語「全糖含量」は、単糖類、オリゴ糖及び多糖類を含むデンプン組成物中に存在する全可溶性糖類の含有量を指す。
【００４２】
用語「乾燥固体」（ｄｓ）は、水中に溶解した乾燥固体、水中に分散した乾燥固体又は両方の組み合わせを指す。したがって、乾燥固体は、顆粒状デンプン及びグルコースを含むその加水分解生成物を含む。
【００４３】
「乾燥固体含有率」は、乾燥固体が分散及び／又は溶解している水に対する重量パーセンテージとして、溶解及び分散した両乾燥固形分のパーセンテージを指す。デンプンの初期の乾燥固体含有率は、顆粒状デンプンの重量に水の重量を加えたものに対する、水分含量を補正した顆粒状デンプンの重量である。その後の乾燥固体含有率は、加えられた又は失われた水及び化学的に得られたもので調整した初期含有率から決定することができる。その後の溶解乾燥固体含有率は、下記で８に示すように屈折率から測定することができる。
【００４４】
用語「高ＤＳ」は、３８％（ｗｔ／ｗｔ）を超える乾燥固体含有率を有する水性デンプンスラリーを指す。
【００４５】
「乾燥物質デンプン」は、デンプンスラリーなどの基質の乾燥デンプン含有量を指し、タンパク質、繊維及び水などの非デンプン成分の寄与分を基質の質量から減じることによって決定することができる。例えば、顆粒状デンプンスラリーが２０％（ｗｔ／ｗｔ）の含水率及び１％（ｗｔ／ｗｔ）のタンパク質含有率を有する場合、１００ｋｇの顆粒状デンプンは、７９ｋｇの乾燥デンプン含有量を有する。乾燥物質デンプンは、使用する酵素単位の数を決定する際に使用することができる。
【００４６】
「重合度（ＤＰ）」は、所与の糖類中のアンヒドログルコピラノースの単位数（ｎ）を指す。ＤＰ１の例は、グルコース及びフルクトースなどの単糖類である。ＤＰ２の例は、マルトース及びスクロースなどの二糖類である。ＤＰ４＋（＞ＤＰ３）は、重合度が３を超えるポリマーを意味する。
【００４７】
「接触させる」という用語は、基質に作用する酵素又は基質を醗酵させる醗酵生物などの期待される結果に影響を及ぼすよう十分に近接して、参照される成分（酵素、基質及び醗酵生物を含むが、これらに限定されない）を配置することを指す。当業者は、溶液を混合することで「接触」をもたらし得ることを認識するであろう。「エタノール生産微生物」は、糖又は他の炭水化物をエタノールに変換させる能力を備える微生物を指す。
【００４８】
「生化学物質」という用語は、クエン酸、乳酸、コハク酸、グルタミン酸一ナトリウム、グルコン酸、グルコン酸ナトリウム、グルコン酸カルシウム、グルコン酸カリウム、グルコノデルタ−ラクトン、エリソルビン酸ナトリウム、オメガ３脂肪酸、ブタノール、イソ−ブタノール、アミノ酸、リシン、イタコン酸、他の有機酸、１，３−プロパンジオール、ビタミン若しくはイソプレン又は他の生体材料などの微生物の代謝産物を指す。
【００４９】
脱分枝酵素とも呼ばれる用語「プルラナーゼ」（Ｅ．Ｃ．３．２．１．４１、プルラン６−グルカノヒドロラーゼ）は、アミロペクチン分子中のアルファ１−６グルコシド結合を加水分解することができる。
【００５０】
用語「約」は、参照値の±１５％を指す。
【００５１】
用語「含む」及びその同種の語は、それらの包括的な意味で使用され、すなわち用語「包含する」及びその対応する同種の語と均等である。
ＥＣ  酵素委員会
ＣＡＺｙ  炭水化物活性酵素
ｗ／ｖ  重量／体積
ｗ／ｗ  重量／重量
ｖ／ｖ  体積／体積
ｗｔ％  重量％
℃  摂氏温度
ｇ又はｇｍ  グラム
μｇ  マイクログラム
ｍｇ  ミリグラム
ｋｇ  キログラム
μＬ及びμｌ  マイクロリットル
ｍＬ及びｍｌ  ミリリットル
ｍｍ  ミリメートル
μｍ  マイクロメートル
ｍｏｌ  モル
ｍｍｏｌ  ミリモル
Ｍ  モル濃度
ｍＭ  ミリモル濃度
μＭ  マイクロモル濃度
ｎｍ  ナノメートル
Ｕ  単位
ｐｐｍ  百万分率
ｈｒ及びｈ  時間
ＥｔＯＨ  エタノール
ｄｓ  乾燥固体
【００５２】
グルコアミラーゼ活性を有するポリペプチド
第１の態様では、本発明は、配列番号３のポリペプチドに対して好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９２％、さらにより好ましくは少なくとも９３％、最も好ましくは少なくとも９４％、さらに最も好ましくは少なくとも９５％、例えばさらに少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、グルコアミラーゼ活性を有するポリペプチドに関する。
【００５３】
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、配列番号３のポリペプチドと１０アミノ酸だけ、好ましくは９アミノ酸だけ、好ましくは８アミノ酸だけ、好ましくは７アミノ酸だけ、好ましくは６アミノ酸だけ、好ましくは５アミノ酸だけ、より好ましくは４アミノ酸だけ、さらにより好ましくは３アミノ酸だけ、最も好ましくは２アミノ酸だけ、さらに最も好ましくは１アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む相同ポリペプチドである。
【００５４】
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、配列番号３のポリペプチドの変異体又はグルコアミラーゼ活性を有するその断片である。
【００５５】
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、熱安定性を有し、高温でグルコアミラーゼ活性を保持する。本発明のポリペプチドは、約２．５〜約８．０（例えば、約３．０〜約７．５、約３．０〜約７．０、約３．０〜約６．５など）の範囲のｐＨ値で熱安定性を示した。例えば、約３．０〜約７．０（例えば、約３．５〜約６．５など）のｐＨにおいて、本発明のポリペプチドは、高温（例えば、少なくとも５０℃、少なくとも５５℃、少なくとも６０℃、少なくとも６５℃、少なくとも７０℃、少なくとも７５℃、少なくとも８０℃、少なくとも８５℃、少なくとも９０℃以上の温度）で長時間、例えば少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも５時間又はそれよりさらに長くグルコアミラーゼ活性の大部分を保持する。例えば、本発明のポリペプチドは、高温下において、約３．５〜約６．５のｐＨで少なくとも約１時間、３時間、５時間又はそれより長くインキュベートした場合、グルコアミラーゼ活性の少なくとも約３５％（例えば、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％又はそれより高いパーセンテージ）を保持する。
【００５６】
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、本明細書に記載のアッセイにより決定されたように、温度５０℃で測定すると、ｐＨ約５で最大活性を有し、ｐＨ約３．５〜ｐＨ約６．０で最大活性の９０％超を有し、ｐＨ約２．８〜ｐＨ約７．０で最大活性の７０％超を有する。酵素を使用するための例示的なｐＨ範囲は、ｐＨ２．５〜７．０、３．０〜７．０、３．５〜７．０、２．５〜６．０、３．０〜６．０及び３．５〜６．０である。
【００５７】
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、本明細書に記載のアッセイにより決定されたように、ｐＨ５．０で測定すると、温度約７５℃で最大活性を有し、温度約６３℃〜温度約７９℃で最大活性の７０％超を有する。酵素を使用するための例示的な温度範囲は、５０〜８２℃、５０〜８０℃、５５〜８２℃、５５〜８０℃及び６０〜８０℃である。第２の態様では、本発明は、好ましくは、非常に低いストリンジェンシー条件、より好ましくは低ストリンジェンシー条件、より好ましくは中ストリンジェンシー条件、より好ましくは中〜高ストリンジェンシー条件、さらにより好ましくは高ストリンジェンシー条件、最も好ましくは非常に高いストリンジェンシー条件下において、（ｉ）配列番号１の成熟ポリペプチドコード配列、（ｉｉ）配列番号１の成熟ポリペプチドコード配列を含むゲノムＤＮＡ配列、又は（ｉｉｉ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）の完全長相補鎖とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、グルコアミラーゼ活性を有するポリペプチドに関する（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。
【００５８】
配列番号１のヌクレオチド配列又はその断片を使用し、当該技術分野でよく知られた方法に従って、異なる属又は種の株から、グルコアミラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを同定し、且つクローニングするための核酸プローブを設計し得る。特に、そのようなプローブは、その中の対応する遺伝子を同定及び単離するために、標準のサザンブロット法に従い、目的の属又は種のゲノム又はｃＤＮＡとハイブリダイゼーションするために使用することができる。そのようなプローブは、完全配列より相当に短いこともあるが、長さは、少なくとも１４個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個及び最も好ましくは少なくとも７０個のヌクレオチドであるべきである。しかし、核酸プローブは、長さが少なくとも１００個のヌクレオチドであることが好ましい。例えば、核酸プローブは、長さが少なくとも２００ヌクレオチド、好ましくは少なくとも３００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも４００ヌクレオチド又は最も好ましくは少なくとも５００ヌクレオチドであり得る。より一層長いプローブ、例えば長さが好ましくは少なくとも６００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも８００ヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも１０００ヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも１５００ヌクレオチド又は最も好ましくは少なくとも１８００ヌクレオチドである核酸プローブを使用し得る。ＤＮＡプローブ及びＲＮＡプローブの両方を使用できる。これらのプローブは、通常、対応する遺伝子を検出するために標識される（例えば、３２Ｐ、３Ｈ、３５Ｓ、ビオチン又はアビジンを用いて）。このようなプローブも本発明によって包含される。
【００５９】
このため、そのような他の株から調製されたゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーは、上述したプローブとハイブリダイズし、且つグルコアミラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡについてスクリーニングされ得る。そのような他の株からのゲノムＤＮＡ又は他のＤＮＡは、アガロース若しくはポリアクリルアミドゲル電気泳動法又は他の分離手法によって分離され得る。ライブラリー由来のＤＮＡ又は分離ＤＮＡは、ニトロセルロース又は他の好適な担体材料に移して固定化され得る。配列番号１又はそのサブ配列と相同であるクローン又はＤＮＡを同定するために、サザンブロット法において担体材料を使用することが好ましい。
【００６０】
第３の態様では、本発明は、配列番号１の成熟ポリペプチドコード配列に対して好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６３％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも６８％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７２％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも７７％、より好ましくは少なくとも７９％、より好ましくは少なくとも８１％、より好ましくは少なくとも８３％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９２％、さらにより好ましくは少なくとも９３％、最も好ましくは少なくとも９４％、さらに最も好ましくは少なくとも９５％、例えばさらに少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％程度の配列同一性を有し、グルコアミラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドによってコードされるグルコアミラーゼ活性を有するポリペプチドに関する。
【００６１】
第４の態様では、本発明のグルコアミラーゼは、配列番号３のアミノ酸配列に対して１つ又は数個のアミノ酸残基の保存的置換を含む。例示的な保存的アミノ酸置換を表１に列挙する。いくつかの保存的変異は、遺伝子操作によって作製することができるが、他の保存的変異は、他の手段によって合成アミノ酸をポリペプチドに導入することによって作製される。
【表１】
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【００６２】
いくつかの実施形態では、本発明のグルコアミラーゼは、配列番号３のアミノ酸配列又はその相同配列に対して１個又は数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入又は付加を含む。いくつかの実施形態では、本発明のグルコアミラーゼは、１個又は数個のアミノ酸残基の保存的置換により、配列番号３のアミノ酸配列から得られる。いくつかの実施形態では、本発明のグルコアミラーゼは、配列番号３のアミノ酸配列に対して１個又は数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入又は付加により、配列番号３のアミノ酸配列から得られる。全ての場合において、「１個又は数個のアミノ酸残基」という表現は、１０個以下、すなわち１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のアミノ酸残基を指す。
【００６３】
代わりに、アミノ酸の変化は、ポリペプチドの物理化学的特性が変化するような性質のものである。例えば、アミノ酸の変化は、ポリペプチドの熱安定性を改善し、基質特異性を変化させ、最適ｐＨを変化させることなどである。
【００６４】
単一又は複数のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入は、既知の変異誘発、組換え及び／又はシャッフリング法、続くＲｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：５３−５７；Ｂｏｗｉｅ  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：２１５２−２１５６；国際公開第９５／１７４１３号パンフレット；又は国際公開第９５／２２６２５号パンフレットに開示されているような関連するスクリーニング手順により実施し、試験することができる。使用することができる他の方法には、エラープローンＰＣＲ、ファージディスプレイ（例えば、Ｌｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０：１０８３２−１０８３７；米国特許第５，２２３，４０９号明細書；国際公開第９２／０６２０４号パンフレット）及び領域特異的変異誘発（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｇｅｎｅ  ４６：１４５；Ｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，ＤＮＡ  ７：１２７）が含まれる。
【００６５】
変異誘発／シャッフリング法は、宿主細胞によって発現された、クローン化され、変異誘発されたポリペプチドの活性を検出するハイスループット自動スクリーニング法と組み合わせることができる（Ｎｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：８９３−８９６）。活性ポリペプチドをコードする変異誘発ＤＮＡ分子は、宿主細胞から回収することができ、当該技術分野における標準的な方法を使用して迅速に配列決定することができる。これらの方法により、目的ポリペプチド中の個々のアミノ酸残基の重要性を迅速に決定することができ、また、これらの方法は、未知の構造のポリペプチドにも適用することができる。
【００６６】
配列番号２の成熟ポリペプチドのアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入は、最大で１０、好ましくは最大で９、より好ましくは最大で８、より好ましくは最大で７、より好ましくは最大で６、より好ましくは最大で５、より好ましくは最大で４、さらにより好ましくは最大で３、最も好ましくは最大で２、さらに最も好ましくは最大で１であり得る。
【００６７】
グルコアミラーゼは、第１のグルコアミラーゼの少なくとも一部及び第２のアミラーゼ、グルコアミラーゼ、ベータ−アミラーゼ、アルファ−グルコシダーゼ若しくは他のデンプン分解酵素又は限定されないが、セルラーゼ、ヘミセルラーゼなどの他のグリコシルヒドロラーゼ（ドメインスワップアミラーゼとして最近「再発見された」キメラアミラーゼを含む）の少なくとも一部を含む点で「キメラ」又は「ハイブリッド」ポリペプチドであり得る。本発明のグルコアミラーゼは、異種シグナル配列、トラッキング又は精製を可能にするエピトープなどをさらに含み得る。
【００６８】
グルコアミラーゼの産生
本発明のグルコアミラーゼは、宿主細胞内において、例えば分泌又は細胞内発現によって産生され得る。グルコアミラーゼを含む培養細胞材料（例えば、全細胞ブロス）は、グルコアミラーゼの細胞培地への分泌後に得ることができる。任意選択により、グルコアミラーゼは、最終グルコアミラーゼの所望の純度に応じて宿主細胞から単離することができるか、又はさらに細胞ブロスから単離することができる。グルコアミラーゼをコードする遺伝子は、当該技術分野でよく知られた方法に従ってクローニングし、発現させることができる。好適な宿主細胞としては、細菌、真菌（酵母及び糸状菌を含む）及び植物細胞（藻類を含む）が挙げられる。特に有用な宿主細胞としては、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）又はミセリオフトーラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）が挙げられる。他の宿主細胞としては、細菌細胞（例えば、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）又はＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）及びストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）が挙げられる。
【００６９】
さらに、宿主は、１つ以上のアクセサリー酵素、タンパク質、ペプチドを発現し得る。これらは、液化、糖化、醗酵、ＳＳＦ及び下流プロセスに有益であり得る。さらに、宿主細胞は、種々の原料を消化するために使用される酵素に加えて、エタノール及び他の生化学物質又は生体材料を産生し得る。このような宿主細胞は、酵素を添加する必要性を低減又は排除するために、醗酵プロセス又は糖化と同時の醗酵プロセスに有用であり得る。
【００７０】
組成物
本発明は、本発明のポリペプチドを含む組成物にも関する。いくつかの実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％が同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドも酵素組成物で使用することができる。好ましくは、組成物は、薄い色、低臭気及び許容される貯蔵安定性などの望ましい特性を提供するように製剤化される。
【００７１】
組成物は、主要酵素成分、例えば単一成分組成物として本発明のポリペプチドを含み得る。代わりに、組成物は、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、アルファ−ガラクトシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、アルファ−グルコシダーゼ、ベータ−グルコシダーゼ、ベータ−アミラーゼ、イソアミラーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペプチドグルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、プルラナーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ又はこれらの組み合わせなどの複数の酵素活性を含むことができ、これらは、当業者によく知られた有効量で添加され得る。
【００７２】
ポリペプチド組成物は、当該技術分野で知られた方法に従って調製することができ、また、それらは、液体組成物の形態又は乾燥組成物の形態であり得る。例えば、本発明のグルコアミラーゼを含む組成物は、水性又は非水性製剤、顆粒、粉末、ゲル、スラリー、ペーストなどであり得、それらは、バッファー、塩、保存料、水、共溶媒、界面活性剤などと一緒に、本明細書に列挙した追加の酵素の任意の１つ以上をさらに含み得る。そのような組成物は、スラリー、水浴、洗濯機、食品又は飲料製品などの中に既に存在する内因性酵素又は他の成分、例えば内因性植物（藻類を含む）酵素、先行する処理工程からの残留酵素などとの組み合わせで機能し得る。この組成物に含めるポリペプチドは、当該技術分野で知られた方法に従って安定化させることができる。
【００７３】
組成物は、ポリペプチドを発現する細胞、例えば醗酵で生成物を製造することができる細胞であり得る。そのような細胞は、好適な安定剤と共にクリーム又は乾燥形態で提供され得る。そのような細胞は、上記したようなさらなるポリペプチドをさらに発現し得る。
【００７４】
本発明のポリペプチド又は組成物の好ましい使用例を下記に示す。本発明のポリペプチド組成物の用量及び組成物を使用し得る他の条件は、当該技術分野で知られた方法に基づいて決定され得る。
【００７５】
上記組成物は、液化、糖化及び／又は醗酵プロセス、好ましくはデンプンの転化、特にシロップ及び醗酵産物、例えばエタノールの製造に使用するのに好適である。
【００７６】
使用
本発明は、液化、糖化及び／又は醗酵プロセスにおける本発明のポリペプチド又は組成物の使用にも関する。ポリペプチド又は組成物は、単一のプロセス、例えば液化プロセス、糖化プロセス又は醗酵プロセスで使用され得る。ポリペプチド又は組成物は、好ましくは、デンプン転化に関連して、プロセスを組み合わせて、例えば液化及び糖化プロセス、液化及び醗酵プロセス又は糖化及び醗酵プロセスを組み合わせても使用され得る。
【００７７】
１．液化
本明細書で使用される場合、用語「液化」又は「液化する」は、ゼラチン化デンプンをより短鎖の可溶性デキストリンを含有する粘性の低い液体に変換するプロセスを意味し、任意選択により液化誘導酵素及び／又は糖化酵素を添加し得る。いくつかの実施形態では、調製したデンプン基質は、水を用いてスラリー化される。デンプンスラリーは、約１０〜５５％、約２０〜４５％、約３０〜４５％、約３０〜４０％又は約３０〜３５％の重量％の乾燥固体としてデンプンを含有し得る。例えば、計量ポンプを用いて、アルファ−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１）をスラリーに添加することができる。この用途に一般に使用されるアルファ−アミラーゼは、熱安定性の細菌アルファ−アミラーゼ、例えばゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）アルファ−アミラーゼ、サイトファーガ属（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）アルファ−アミラーゼなどであり、例えばＳｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＲＳＬ（ＤｕＰｏｎｔ製品）、Ｓｐｅｚｙｍｅ  ＡＡ（ＤｕＰｏｎｔ製品）、Ｓｐｅｚｙｍｅ（登録商標）Ｆｒｅｄ（ＤｕＰｏｎｔ製品）、Ｃｌｅａｒｆｌｏｗ  ＡＡ（ＤｕＰｏｎｔ製品）、Ｓｐｅｚｙｍｅ  Ａｌｐｈａ  ＰＦ（ＤｕＰｏｎｔ製品）、Ｓｐｅｚｙｍｅ  Ｐｏｗｅｒｌｉｑ（ＤｕＰｏｎｔ製品）をここで使用することができる。
【００７８】
デンプンとアルファ−アミラーゼとのスラリーは、デンプン含有原料の供給源に応じて、８０〜１１０℃に蒸気加熱したジェットクッカーを通して連続的にポンプで送り込むことができる。ゼラチン化は、これらの条件下で迅速に進行し、有意な剪断力と組み合わされた酵素活性は、デンプン基質の加水分解を開始する。ジェットクッカー内の滞留時間は短い。その後、部分的にゼラチン化されたデンプンは、１０５〜１１０℃に維持された一連の保持管内に通され、５〜８分間保持されて、ゼラチン化プロセスが完了し得る（「一次液化」）。必要とされるＤＥへの加水分解は、保持タンク内において８５〜９５℃又はそれより高い温度において約１〜２時間で完了する（「二次液化」）。その後、スラリーは、室温まで冷却される。この冷却工程は、３０分間〜１８０分間、例えば９０分間〜１２０分間であり得る。液化デンプンは、通常、約１０〜５０％、約１０〜４５％、約１５〜４０％、約２０〜４０％、約２５〜４０％又は約２５〜３５％の乾燥固体含有率（ｗ／ｗ）を有するスラリーの形態である。
【００７９】
従来の酵素液化プロセスでは、熱安定性アルファ−アミラーゼが添加され、長鎖デンプンが分岐した線状のより短い単位（マルトデキストリン）に分解されるが、グルコアミラーゼは、添加されない。本発明のグルコアミラーゼは、熱安定性が高いため、液化プロセスでグルコアミラーゼを加えることが有利である。
【００８０】
２．糖化
液化デンプンは、任意選択により別の酵素の存在下において、アルファ−アミラーゼ及びグルコアミラーゼを使用して、低ＤＰ（例えば、ＤＰ１＋ＤＰ２）の糖類に富むシロップに糖化され得る。糖化生成物の正確な組成は、使用する酵素の組合せ及び加工処理するデンプンの種類に依存する。有利には、提供されたグルコアミラーゼを使用して得られるシロップは、糖化デンプン中の全オリゴ糖の重量パーセントが３０％を超える、例えば４５％〜６５％又は５５％〜６５％のＤＰ２を含有し得る。糖化デンプン中の（ＤＰ１＋ＤＰ２）の重量パーセントは、約７０％、例えば７５％〜８５％又は８０％〜８５％を超え得る。
【００８１】
液化は、一般に連続プロセスとして実施されるが、糖化は、バッチプロセスとして実施されることが多い。糖化条件は、液化物の性質及び利用可能な酵素の種類に依存する。場合により、糖化プロセスは、約６０〜６５℃の温度及び約４．０〜４．５のｐＨ、例えばｐＨ４．３を含み得る。糖化は、例えば、約４０℃、約５０℃又は約５５℃〜約６０℃又は約６５℃の温度で実施することができ、液化物を冷却する必要がある。必要に応じてｐＨを調整し得る。糖化は、通常、充填又は空にするのに数時間を要し得る撹拌槽中で実施される。酵素は、一般的には、タンクに充填されるに従い、乾燥固体に対して一定の割合で加えられるか、又は充填段階の開始時に単回量として加えられる。シロップを製造するための糖化反応は、通常、約２４〜７２時間、例えば２４〜４８時間にわたり実施される。しかしながら、温度３０〜６５℃、通常、約６０℃において、通常、４０〜９０分の予備糖化を行い、続いて糖化と同時の醗酵（ＳＳＦ）により完全糖化を行うことのみが一般的である。本発明のグルコアミラーゼは、熱安定性が高いため、本発明の予備糖化及び／又は糖化は、従来の予備糖化及び／又は糖化よりも高い温度で行うことができる。一実施形態では、本発明のプロセスは、糖化と同時の醗酵（ＳＳＦ）プロセス前にデンプン含有材料を予備糖化することを含む。予備糖化は、ＳＳＦに移行する前に高温（例えば、５０〜８５℃、好ましくは６０〜７５℃）で行うことができる。好ましくは、糖化は、約３０℃〜約７５℃の比較的高い温度範囲、例えば４５℃〜７５℃又は５０℃〜７５℃で最適に行われる。比較的高い温度で糖化プロセスを実施することにより、このプロセスは、比較的短い時間で実施することができるか、又は代わりに、このプロセスは、比較的低い酵素用量で実施することができる。さらに、液化及び／又は糖化プロセスを比較的高い温度で行う場合、微生物汚染の危険性が低減される。
【００８２】
本発明の好ましい態様では、液化及び／又は糖化は、順次又は同時に行われる液化及び糖化プロセスを含む。
【００８３】
３．醗酵
可溶性デンプン加水分解物、特にグルコースに富むシロップは、通常、３２℃前後、例えば３０℃〜３５℃の温度において、デンプン加水分解物を醗酵生物に接触させることによって醗酵させることができる。「醗酵生物」とは、醗酵プロセスでの使用に好適であり、所望の醗酵産物を製造することができる、細菌及び真菌生物を含む任意の生物を指す。特に好適な醗酵生物は、グルコース又はマルトースなどの糖を直接又は間接的に所望の醗酵産物に醗酵する、すなわち変換することができる。醗酵生物の例としては、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母及び細菌、例えばアルコールデヒドロゲナーゼ及びピルビン酸デカルボキシラーゼを発現するザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）が挙げられる。エタノール生産微生物は、キシロースをキシルロースに変換させるキシロースレダクターゼ及びキシリトールデヒドロゲナーゼを発現することができる。例えば、高温に抵抗できるエタノール生産微生物の改良株は、当該技術分野において知られており、使用することができる。Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｓｈｅｎｇ  Ｗｕ  Ｇｏｎｇ  Ｃｈｅｎｇ  Ｘｕｅ  Ｂａｏ２７：１０４９−５６を参照されたい。市販の酵母としては、例えば、Ｒｅｄ  Ｓｔａｒ（商標）／Ｌｅｓａｆｆｒｅ  Ｅｔｈａｎｏｌ  Ｒｅｄ（Ｒｅｄ  Ｓｔａｒ／Ｌｅｓａｆｆｒｅ，ＵＳＡから入手可能）ＦＡＬＩ（Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ’ｓ  Ｙｅａｓｔ、ａ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｕｒｎｓ  Ｐｈｉｌｐ  Ｆｏｏｄ  Ｉｎｃ，ＵＳＡから入手可能）、ＳＵＰＥＲＳＴＡＲＴ（Ａｌｌｔｅｃｈから入手可能）、ＧＥＲＴ  ＳＴＲＡＮＤ（Ｇｅｒｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎから入手可能）及びＦＥＲＭＩＯＬ（ＤＳＭ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓから入手可能）が挙げられる。醗酵の温度及びｐＨは、醗酵生物に依存するであろう。醗酵によってクエン酸及び乳酸などの他の代謝産物を生産する微生物も当該技術分野において知られている。例えば、Ｐａｐａｇｉａｎｎｉ（２００７）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．２５：２４４−６３；Ｊｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．２７：１４５−５２を参照されたい。
【００８４】
糖化及び醗酵プロセスは、ＳＳＦプロセスとして実施され得る。ＳＳＦプロセスは、ＳＳＦを通してグルコアミラーゼを連続的に発現し、分泌する真菌細胞を用いて実施することができる。グルコアミラーゼを発現する真菌細胞は、醗酵微生物、例えばエタノール生産微生物でもあり得る。したがって、エタノールの製造は、外部からの酵素の添加が比較的少量で済むか、又はその必要がないほどに十分なグルコアミラーゼを発現する真菌細胞を使用して実施することができる。真菌宿主細胞は、適切に改変された真菌株由来であり得る。グルコアミラーゼに加えて、他の酵素を発現及び分泌する真菌宿主細胞も使用できる。そのような細胞は、アミラーゼ及び／又はプルラナーゼ、フィターゼ、アルファ−グルコシダーゼ、イソアミラーゼ、ベータ−アミラーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、他のヘミセルラーゼ、プロテアーゼ、ベータ−グルコシダーゼ、ペクチナーゼ、エステラーゼ、酸化還元酵素、トランスフェラーゼ又は他の酵素を発現し得る。醗酵に続いて、その後のエタノールの回収を行い得る。
【００８５】
４．生デンプンの加水分解
本発明は、生デンプン又は顆粒状デンプンからグルコースなどを製造するための、本発明のグルコアミラーゼの使用を提供する。一般に、本発明のグルコアミラーゼは、所望の糖及び醗酵産物を製造するために、単独で又はアルファ−アミラーゼの存在下において、生デンプンの加水分解（ＲＳＨ）又は顆粒状デンプンの加水分解（ＧＳＨ）プロセスで使用することができる。顆粒状デンプンは、ゼラチン化温度未満で酵素加水分解により可溶化される。そのような「低温」システム（「ノークック」又は「コールドクック」としても知られている）は、従来のシステムよりも高濃度の乾燥固体（例えば、４５％まで）を処理できることが報告されている。
【００８６】
「生デンプン加水分解」プロセス（ＲＳＨ）は、従来のデンプン処理プロセスと異なり、通常、少なくともグルコアミラーゼ及び／又はアミラーゼの存在下において、デンプン基質のゼラチン化温度以下で顆粒状デンプンを順次又は同時に糖化及び醗酵させることを含む。水中で加熱されたデンプンは、５０℃〜７５℃でゼラチン化を開始するが、ゼラチン化の正確な温度は、特定のデンプンに依存する。例えば、ゼラチン化温度は、植物種、植物種の特定の種類及び成長条件によって変化し得る。本発明との関連では、所与のデンプンのゼラチン化温度は、ＧｏｒｉｎｓｔｅｉｎＳ．ａｎｄ  Ｌｉｉ．Ｃ．，Ｓｔａｒｃｈ／Ｓｔａｒｋｅ，Ｖｏｌ．４４（１２）ｐｐ．４６１−４６６（１９９２）で報告された方法を使用して、デンプン顆粒の５％で複屈折が失われる温度である。
【００８７】
本発明のグルコアミラーゼは、少なくとも４つのグルコシル残基を含む分子中のアルファ−（１，６）−グルコシド結合のみを加水分解する酵素と組み合わせても使用され得る。好ましくは、本発明のグルコアミラーゼは、プルラナーゼ又はイソアミラーゼと組み合わせて使用される。デンプンの脱分枝のためのイソアミラーゼ及びプルラナーゼの使用、酵素の分子特性及びグルコアミラーゼと酵素の潜在的同時使用については、Ｇ．Ｍ．Ａ．ｖａｎ  Ｂｅｙｎｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔａｒｃｈ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８５，１０１−１４２に記載されている。
【００８８】
さらなる態様では、本発明は、デンプンの、例えばシロップ飲料への変換及び／又はエタノールを含む醗酵産物への変換を含む、本発明のグルコアミラーゼの使用に関する。
【００８９】
５．醗酵産物
用語「醗酵産物」は、醗酵生物を使用する醗酵プロセスを含むプロセスによって生成される生成物を意味する。本発明により意図される醗酵産物には、アルコール（例えば、アラビニトール、ブタノール、エタノール、グリセロール、メタノール、エチレングリコール、１，３−プロパンジオール［プロピレングリコール］、ブタンジオール、グリセリン、ソルビトール及びキシリトール）；有機酸（例えば、酢酸、アセトン酸、アジピン酸、アスコルビン酸、クエン酸、２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸、ギ酸、フマル酸グルカル酸、グルコン酸、グルクロン酸、グルタル酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、イタコン酸、乳酸、リンゴ酸、マロン酸、シュウ酸、オキサロ酢酸、プロピオン酸、コハク酸及びキシロン酸）；ケトン（例えば、アセトン）；アミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、リシン、セリン及びトレオニン）；アルカン（例えば、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、デカン、ウンデカン及びドデカン）；シクロアルカン（例えば、シクロペンタン、シクロヘキサン、シクロヘプタン及びシクロオクタン）；アルケン（例えば、ペンテン、ヘキセン、ヘプテン及びオクテン）；気体（例えば、メタン、水素（Ｈ２）、二酸化炭素（ＣＯ２）及び一酸化炭素（ＣＯ））；抗生物質（例えば、ペニシリン及びテトラサイクリン）；酵素；ビタミン（例えば、リボフラビン、Ｂ１２、ベータ−カロテン）；及びホルモンが含まれる。好ましい態様では、醗酵産物は、エタノール、例えば燃料エタノール；飲用エタノール、すなわち飲用中性スピリット；又は工業用エタノール若しくは消耗アルコール産業（例えば、ビール及びワイン）、乳業（例えば、醗酵乳製品）、皮革産業及びタバコ産業で使用される製品である。好ましいビールの種類には、エール、スタウト、ポーター、ラガー、ビター、モルトリカー、高アルコールビール、低アルコールビール、低カロリービール又はライトビールが含まれる。使用される好ましい醗酵プロセスには、当該技術分野でよく知られたアルコール醗酵プロセスが含まれる。好ましい醗酵プロセスは、当該技術分野でよく知られた嫌気性醗酵プロセスである。
【００９０】
６．醸造
本発明のグルコアミラーゼは、熱安定性が高く、したがって醗酵モルト飲料を製造するための高温でのデンプンの加水分解に使用することができる。例えば、本発明のグルコアミラーゼは、ホットマッシュに添加することができ、これは、高温を活かして反応速度を増大させ、且つ酵母を添加する前に醗酵性糖の収率を増加させる。グルコアミラーゼは、アミラーゼ並びに任意選択的にプルラナーゼ及び／又はイソアミラーゼと組み合わせて、デンプンをデキストリン及び醗酵性糖に変換させ、最終ビール中の残留非醗酵性炭水化物を減少させることを支援する。本発明のグルコアミラーゼは、当業者により容易に決定され得る有効量で添加される。
【００９１】
ビールを製造するためのプロセスは、当該技術分野でよく知られている。例えば、Ｗｏｌｆｇａｎｇ  Ｋｕｎｚｅ（２００４）「Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｂｒｅｗｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｌｔｉｎｇ，」Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｅａｃｈｉｎｇ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｒｅｗｉｎｇ，Ｂｅｒｌｉｎ（ＶＬＢ），３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎを参照されたい。簡潔に記せば、このプロセスは、（ａ）マッシュを調製する工程と、（ｂ）マッシュをろ過して麦芽汁を調製する工程と、（ｃ）麦芽汁を醗酵させて醗酵飲料、例えばビールを得る工程とを含む。
【００９２】
グルコアミラーゼをアミラーゼ並びに任意選択的にプルラナーゼ及び／又はイソアミラーゼと組み合わせて含む醸造組成物を上記の工程（ａ）のマッシュに、すなわちマッシュの調製中に添加し得る。代わりに又はさらに、醸造組成物を上記の工程（ｂ）のマッシュに、すなわちマッシュのろ過中に添加し得る。代わりに又はさらに、醸造組成物を上記の工程（ｃ）の麦芽汁に、すなわち麦芽汁の醗酵中に添加し得る。
【００９３】
本明細書中で引用した全ての参考文献は、あらゆる目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。本組成物及び方法並びにそれらの利点をさらに説明するために、以下の具体的な実施例を、それらが限定的ではなくむしろ例示的であるとの理解の下に提供する。
【実施例】
【００９４】
実施例１
ペニシリウム・ルッセリイ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｒｕｓｓｅｌｌｉｉ）グルコアミラーゼ（ＰｒｕＧＡ１）の配列
ペニシリウム・ルッセリイ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｒｕｓｓｅｌｌｉｉ）株を工業用途に有用な種々の酵素の潜在的供給源として選択した。このペニシリウム・ルッセリイ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｒｕｓｓｅｌｌｉｉ）株の全ゲノムの配列を決定し、「ＰｒｕＧＡ１」と名付けた推定グルコアミラーゼのヌクレオチド配列を配列同一性によって同定した。ＰｒｕＧＡ１をコードする遺伝子を配列番号１として示す。
【化１】
2020522995.tif 000004
【００９５】
ＰｒｕＧＡ１前駆体タンパク質のアミノ酸配列を配列番号２として示す。
【化２】
2020522995.tif 000005
【００９６】
Ｎ−末端エドマン分解によって確認したＰｒｕＧＡ１の成熟形態アミノ酸配列を配列番号３として示す。
【化３】
2020522995.tif 000006
【００９７】
実施例２
ペニシリウム・ルッセリイ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｒｕｓｓｅｌｌｉｉ）グルコアミラーゼ（ＰｒｕＧＡ１）の発現及び精製
合成したペニシリウム・ルッセリイ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｒｕｓｓｅｌｌｉｉ）のＰｒｕＧＡ１遺伝子のヌクレオチドの配列を配列番号４として示す。
【化４】
2020522995.tif 000007
【００９８】
トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）中でのＰｒｕＧＡ１の発現のために、ＰｒｕＧＡ１のＤＮＡ配列を最適化し、ｐＴｒｅｘ３ｇＭ発現ベクター（米国特許出願公開第２０１１／０１３６１９７Ａ１号明細書に記載）に挿入し、ｐＪＧ５８０（図１）を得た。
【００９９】
プロトプラスト形質転換（Ｔｅ’ｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５１：３９３−９９，２００２）を使用して、プラスミドｐＪＧ５８０をトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）株中へ形質転換させた（国際公開第０５／００１０３６号パンフレットに記載）。国際公開第２０１６／１３８３１５号パンフレットに記載の方法により、形質転換体を選択し且つ醗酵させた。これらの培養物の上清を使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析及び酵素活性アッセイによってタンパク質発現を確認した。
【０１００】
続いて、上記の形質転換細胞の種培養物を既知組成培地中において２．８Ｌの醗酵槽で増殖させた。醗酵時間４２、６５及び９５時間で醗酵ブロスをサンプリングし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、乾燥細胞重量、残留グルコース及び細胞外タンパク質濃度の測定を行った。図２は、９５時間醗酵時のＰｒｕＧＡ１の生成物プロファイルを示す。醗酵後９５時間後、遠心分離、ろ過及び濃縮して、濃縮試料５００ｍＬを得た。タンパク質濃度は、ＢＣＡ法により１０．７ｇ／Ｌと測定された。
【０１０１】
２００ｍＬの清澄化培養ブロスを２０ｍＬのベータ−シクロデキストリン結合セファロース６カラム（２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０、１５０ｍＭのＮａＣｌで予め平衡化されている）にロードし、続いて３カラム容量の同じ緩衝液で洗浄した。１５０ｍＭのＮａＣｌを含有する、２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）中の１０ｍＭアルファ−シクロデキストリンを５カラム容量用いて、溶出を行った。画分を回収し、グルコアミラーゼ活性を分析し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。標的タンパク質を含有する画分をプールし、１５０ｍＭのＮａＣｌを含有する２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）を用いたＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５装置を使用し、１０ＫのＭＷＣＯで濃縮した。精製した試料は、９９％を超える純度であり、使用するまで４０％グリセロール中において−８０℃で保存する。
【０１０２】
実施例３
可溶性デンプンに対するＰｒｕＧＡ１の比活性
グルコアミラーゼ比活性を、グルコースオキシダーゼ／ペルオキシダーゼ（ＧＯＸ／ＨＲＰ）共役酵素法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０５（１９８０），３８９−３９７）を用いて、グルコアミラーゼによる可溶性デンプンからのグルコースの放出に基づいて分析した。
【０１０３】
１５ｍＬのコニカルチューブ中で９ｍＬの可溶性デンプン（水中１％、ｗｔ／ｗｔ）と１ｍＬの０．５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）とを混合することによって基質溶液を調製した。５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）中において、最終濃度がＡＢＴＳについて２．７４ｍｇ／ｍＬ、ＨＲＰについて０．１Ｕ／ｍＬ及びＧＯＸについて１Ｕ／ｍＬである、ＡＢＴＳを含む共役酵素（ＧＯＸ／ＨＲＰ）溶液を調製した。
【０１０４】
グルコアミラーゼ試料及びグルコース標準の連続希釈物を精製水で調製した。５０℃で５分間、６００ｒｐｍで予備インキュベートした基質溶液９０μＬを含む新しいマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ３６４１）に、各グルコアミラーゼ試料（１０μＬ）を移した。サーモミキサー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）内で振盪（６００ｒｐｍ）しながら５０℃で１０分間反応させ、反応混合物１０μＬ及びグルコース標準の連続希釈物１０μＬをそれぞれ新しいマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ３６４１）に迅速に移し、続いて１００μＬのＡＢＴＳ／ＧＯＸ／ＨＲＰ溶液を加えた。ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ）を用いて、直ちに１１秒間隔で５分間、４０５ｎｍの吸光度を測定した。出力は、各酵素濃度での反応速度Ｖｏであった。線形回帰を用いて、Ｖｏ対酵素用量プロットの傾きを決定した。グルコアミラーゼの比活性を、式１を用い、グルコース標準曲線に基づいて計算した：
比活性（単位／ｍ）＝傾き（酵素）／傾き（標準）×１０００  （１）
（式中、１単位＝１μｍｏｌグルコース／分である）。
【０１０５】
上記の方法を用いて、ＰｒｕＧＡ１の比活性を測定し、ベンチマークであるＡｎＧＡ（アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）のグルコアミラーゼ）と比較した。結果を表２に示す。可溶性デンプンに対するＰｒｕＧＡ１の比活性１９７Ｕ／ｍｇは、他のグルコアミラーゼＡｎＧＡよりも約２倍高かった。
【表２】
2020522995.tif 000008
【０１０６】
実施例４
グルコアミラーゼＰｒｕＧＡ１のプルラン加水分解活性
酵素を１０ｐｐｍで投与したことを除いて、可溶性デンプンに対するグルコアミラーゼＰｒｕＧＡ１の比活性について上に記載したのと同じプロトコールを用いて、プルランに対するグルコアミラーゼの活性を分析した。表３は、ＰｒｕＧＡ１及びベンチマークＡｎＧＡのプルラン加水分解活性を要約する。プルランに対するＰｒｕＧＡ１の活性は、ＡｎＧＡより約６倍高かった。
【表３】
2020522995.tif 000009
【０１０７】
実施例５
ＰｒｕＧＡ１グルコアミラーゼ活性に対するｐＨ及び温度の影響
基質として可溶性デンプン（水中１％、ｗｔ／ｗｔ）を用い、ＰｒｕＧＡ１活性に対するｐＨ（２．０〜１０．０）の影響を測定した。緩衝作業溶液は、ｐＨを２．０〜１０．０に変動させた、グリシン／酢酸ナトリウム／ＨＥＰＥＳ（２５０ｍＭ）の組み合わせから構成した。基質溶液は、可溶性デンプン（水中１％、ｗｔ／ｗｔ）と２５０ｍＭの緩衝溶液とを９：１の比で混合することによって調製した。酵素作業溶液を特定の用量（用量応答曲線の通り直線範囲内のシグナルを示す用量）で水中において調製した。全てのインキュベーションを、可溶性デンプンに対するグルコアミラーゼＰｒｕＧＡ１の比活性について上に記載したのと同じプロトコールに従って５０℃で１０分間行った。各ｐＨでの酵素活性を最適ｐＨでの酵素活性と比較した相対活性として報告した。ＰｒｕＧＡ１のｐＨプロファイルを表４に示す。ＰｒｕＧＡ１は、約５．０に最適ｐＨを有し、ｐＨ２．８〜７．０で最大活性の７０％超を保持することが分かった。
【表４】
2020522995.tif 000010
【０１０８】
基質として可溶性デンプン（水中１％、ｗｔ／ｗｔ）を用い、ＰｒｕＧＡ１活性に対する温度（４０℃〜８４℃）の影響を測定した。１５ｍＬのコニカルチューブ中で９ｍＬの可溶性デンプン（水中１％、ｗｔ／ｗｔ）と１ｍＬの０．５Ｍ緩衝液（ｐＨ５．０酢酸ナトリウム）とを混合することによって基質溶液を調製した。酵素作業溶液を特定の用量（用量応答曲線の通り直線範囲内のシグナルを示す用量）で水中において調製した。インキュベーションを、グルコアミラーゼＰｒｕＧＡ１の可溶性デンプンに対する比活性について上に記載したのと同じプロトコールに従ってそれぞれ４０℃〜８４℃の温度で１０分間行った。各温度での活性を最適温度での酵素活性と比較した相対活性として報告した。ＰｒｕＧＡ１の温度プロファイルを表５に示す。ＰｒｕＧＡ１は、７５℃で最適活性を示し、活性は、６３℃〜７９℃で最大活性の７０％超を維持した。
【表５】
2020522995.tif 000011
【０１０９】
実施例６
ｐＨ４．５での異なる温度におけるＰｒｕＧＡ１の糖化性能
ｐＨ４．５の糖化条件下において、異なるインキュベーション温度でＰｒｕＧＡ１、ＡｎＧＡ及びＡｆｕＧＡ（国際公開第２０１４０９２９６０号パンフレットに記載）の活性を評価した。ＤＰ１の評価は、等しい酵素用量を有する糖組成物を分析することによって測定した。アルファ−アミラーゼ前処理トウモロコシデンプン液化物（３４．９％ｄｓで調製、ｐＨ３．８）を出発基質として使用した。グルコアミラーゼ（１×用量として０．１２１ｍｇ／ｇｄｓで投与）及びトウモロコシデンプン液化物（３４％ｄｓ）のインキュベーションをｐＨ４．５においてそれぞれ６０℃、６５℃及び７０℃で行った。それぞれ１６、２４、４０、６４及び７２時間目に試料を回収した。１００℃で１５分間加熱することによって全てのインキュベーションの反応を停止させた。試料上清を移し、５ｍＭのＨ２ＳＯ４中で４００倍に希釈し、これを、８５℃で行われるＦａｓｔ  ｆｒｕｉｔカラム（１００ｍｍ×７．８ｍｍ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １２００シリーズシステムを使用するＨＰＬＣ分析用とした。１０μＬの試料をカラムにロードし、１．０ｍＬ／分の流量で移動相として精製水のアイソクラティック勾配で分離した。オリゴ糖生成物を、屈折率検出器を用いて検出した。試料のグルコース生成活性を表６に要約する。一例として、７２時間のインキュベーション後のＤＰ１％を選択すると（図３）、０．３×用量（４０μｇ／ｇｄｓ）のＰｒｕＧＡ１は、３つの試験温度の全てでＡｆｕＧＡ−１×用量（１２１μｇ／ｇｄｓ）及びＡｎＧＡ−１×用量（１２１μｇ／ｇｄｓ）よりも優れていた。インキュベーション温度を７０℃まで上昇させても、ＰｒｕＧＡ１は、ＤＰ１生成に関して優れた性能を維持した。試料のグルコース生成活性を表６に要約する。
【表６】
2020522995.tif 000012
【０１１０】
実施例７
ｐＨ５．５及び７０℃でのＰｒｕＧＡ１糖化の評価
高温（糖化時間の短縮を目的とする）でのＰｒｕＧＡ１のグルコース生成活性を評価した。アルファ−アミラーゼ前処理トウモロコシデンプン液化物からトウモロコシデンプン液化物（３２％ｄｓ、ｐＨ３．９）を得た。ｐＨ５．５、７０℃で異なる用量のＰｒｕＧＡ１とトウモロコシデンプン液化物（３２％ｄｓ）のインキュベーションを行った。１８、２６、４２、５０、６６及び７２時間目に試料を回収した。１００℃で１５分間加熱することによって全てのインキュベーションの反応を停止させた。試料の上清を移し、５ｍＭのＨ２ＳＯ４で４００倍に希釈し、実施例６に示したのと同じ条件を用いたＨＰＬＣ分析用とした。試料のグルコース生成活性を表７に要約する。結果は、ｐＨ５．５、７０℃での２日間のインキュベーション後、ＰｒｕＧＡ１（３０μｇ／ｇｄｓで投与）のＤＰ１産生が＞９５％に達し得ることを示した。
【表７】
2020522995.tif 000013
【０１１１】
実施例８
ＰｒｕＧＡ１の生デンプン活性
生デンプンアッセイでＰｒｕＧＡ１の活性を測定し、顆粒状デンプン加水分解酵素（ＧＳＨＥ）醗酵及びデンプンからグルコース／マルトースへの直接プロセス（ＤＳＴＧ／ＤＳＴＭ）のために使用した、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼ（ＴｒＧＡ）の活性と比較した。このアッセイでは、アルファ−アミラーゼ及びグルコアミラーゼを１：６．６の比でブレンドした。アスペルギルス・カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｋａｗａｃｈｉｉ）アミラーゼ（ＡｋＡＡ、国際公開第２０１３１６９６４５号パンフレットに記載）を使用した。糖プロファイル分析にＦａｓｔ  Ｆｒｕｉｔ  ＨＰＬＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ）を使用し、グルコース（最終生成物）を使用して酵素の生デンプン加水分解能を決定した。
【０１１２】
ワイドボアチップを用いて、１５０μＬのトウモロコシデンプン基質（ｐＨ３．５／ｐＨ４．５の５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液中１％）を０．５ｍＬのマイクロタイタープレートに分注した。ＡｋＡＡ及びグルコアミラーゼの最終投与量をそれぞれ１．５ｐｐｍ及び１０ｐｐｍに設定するために、１ウェルあたり１０μＬのアミラーゼ及び１０μＬのグルコアミラーゼを添加した。３２℃、９００ｒｐｍに設定したｉＥＭＳインキュベーターに試料を６、２０及び２８時間にわたって置いた。０．５ＭのＮａＯＨを５０μＬ添加して反応を停止させ、プレートをシェーカー上に２分間置くことによってデンプンプラグを懸濁させた。その後、プレートを密封し、２５００ｒｐｍで３分間遠心分離した。ＨＰＬＣ分析のために、０．０１ＮのＨ２ＳＯ４を用いて上清を１０倍に希釈した。屈折率検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １２００シリーズＨＰＬＣを用いて、試料中の１０μＬの試料を分析した。使用したカラムは、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｒｅｚｅｘ  ＲＯＡ有機酸ガードカラム（カタログ番号０３Ｂ−０１３８−Ｋ０）と共に用いたＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｒｅｚｅｘ−ＲＦＱ  Ｆａｓｔ  Ｆｒｕｉｔカラム（カタログ番号００Ｄ−０２２３−Ｋ０）であった。移動相は、０．０１ＮのＨ２ＳＯ４であり、流量は、８５℃で１．０ｍＬ／分であった。結果を図４及び５に示す。ＰｒｕＧＡ１は、ｐＨ３．５及びｐＨ４．５の両方で生デンプンに対してベンチマークグルコアミラーゼＴｒＧＡに匹敵する活性を示した。
【０１１３】
実施例９
低ｐＨ醗酵におけるＰｒｕＧＡ１の評価
低ｐＨ醗酵条件下でのＰｒｕＧＡ１のグルコース生成活性を評価した。０．２５ｍｇ／ｇｄｓの等タンパク質濃度でＰｒｕＧＡ１及びＴｒＧＡの性能を試験した。アミラーゼ処理トウモロコシデンプン液化物（３４．９％ｄｓ、ｐＨ３．８）を基質として使用した。トウモロコシデンプン液化物（３２％ｄｓ、アミラーゼ前処理）のｐＨをｐＨ３．０に調整し、１０ｇを５０ｍＬガラス瓶に移した。インキュベーションは、３２℃及び５５℃で行った。試料を１７、２４、４１、４８、６３、７２時間目に回収した。１００℃で１５分間加熱することによって全てのインキュベーションの反応を停止させた。試料の上清を移し、５ｍＭのＨ２ＳＯ４で４００倍に希釈し、実施例７に示したのと同じ条件を用いたＨＰＬＣ分析用とした。表７に報告する値は、各ＤＰｎのピーク面積のパーセンテージを全ＤＰ１、ＤＰ２、ＤＰ３及びＤＰ３＋の分率として反映している。表８のデータは、ＰｒｕＧＡ１が等しいタンパク質濃度で投与され、且つ３２℃、ｐＨ３でインキュベートされた場合、ＴｒＧＡよりも高いグルコース生成活性を示したことを示している。インキュベーション温度を５５℃に上昇させると、ＰｒｕＧＡ１は、高ＤＰ糖を非常に効率的に加水分解し、１７時間のインキュベーション後に５％のＤＰ３＋のみが残ったが、ＴｒＧＡのそれは、１８％であった。
【０１１４】
低ｐＨでのＰｒｕＧＡ１の性能をさらに評価するために、さらに低いｐＨ（ｐＨ２．０）でデンプン液化物に対する別の試験を行った。スクリーニング手順は、酵素を０．２ｍｇ／ｇｄｓで投与し、試料を４、２１、２９、４５、５３、７０時間目に回収したことを除いて、ｐＨ３．０のそれと同じであった。表９に示すように、ｐＨ２及び３２℃では、ＰｒｕＧＡ１によって放出されたＤＰ１は、７０時間後に７７．４％であったが、ＴｒＧＡは、５４％を放出した。５５℃でＰｒｕＧＡ１によって放出されたＤＰ１のパーセントは、２６．２％であったが、ＴｒＧＡ反応ではわずか３．２％であった。
【表８】
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【表９】
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【０１１５】
実施例１０
麦芽汁基質に対するグルコアミラーゼの高温注入マッシング
高温注入マッシングプロセスにおけるＰｒｕＧＡ１の、醸造用麦芽汁基質に対するグルコース生成活性を他のグルコアミラーゼベンチマークと比較して評価した。
【０１１６】
マッシング操作は、４．０：１の水対グリスト比を用いて、５５％のピルスナーモルト（Ｐｉｌｓｎｅｒ  ｍａｌｔ；Ｆｕｇｌｓａｎｇ  Ｄｅｎｍａｒｋ，Ｂａｔｃｈ  １３．０１．２０１６）及び４５％のコーングリスト（Ｂｅｎｎｔａｇ  Ｎｏｒｄｉｃ；Ｎｏｒｄｇｅｔｒｅｉｄｅ  ＧｍＢＨ  Ｌｕｅｂｅｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ、Ｂａｔｃｈ：０２．０５．２０１６）を用いて行った。ピルスナーモルトを、Ｂｕｈｌｅｒ  Ｍｉａｇモルトミル（０．５ｍｍ設定）で粉砕した。トウモロコシグリスト（１．３５ｇ）、モルト（粉砕ピルスナーモルト、１．６５ｇ）を、２．５Ｍ硫酸によりｐＨ５．４にｐＨ調整した１２．０ｇの水道水とｗｈｅａｔｏｎカップ（キャップ付きｗｈｅａｔｏｎガラス容器）中で混合し、予備インキュベートした。その後、得られた基質（１５％ｄｓ、ｐＨ５．４）をグルコアミラーゼの性能評価に使用した。ＰｒｕＧＡ１（１ｍｇ／ｍＬのストック１０μＬ）を、ＰＣＲマイクロタイタープレート（Ａｘｙｇｅｎ）に分注した９０μＬの基質に添加した。評価した他のグルコアミラーゼは、以下の通りであった：ＴｒＧＡ変異体Ａ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼ変異体（Ｄ４４Ｒ及びＤ５３９Ｒに置換、２ｍｇ／ｍＬストック１０μＬ）及びアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ（ＡｎＧＡ、１ｍｇ／ｍＬストック１０μＬ）。全てのインキュベーションを６４℃で４時間、又はさらに高いマッシング温度についてインキュベーションを７０℃で２時間、続いて７９℃で１５分間行った。９５℃で１０分間の反応停止を行った後、反応混合物を３７００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清試料を移し、ＨＰＬＣ分析のために５ｍＭのＨ２ＳＯ４で２０倍に希釈した。ＨＰＬＣ分離は、Ｆａｓｔ  ｆｒｕｉｔカラム（１００ｍｍ×７．８ｍｍ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １２００シリーズＨＰＬＣシステムを用いて８５℃で行った。試料（１０μＬ）をＨＰＬＣカラムにロードし、１．０ｍＬ／分の流量で移動相として精製水のアイソクラティック勾配で分離した。オリゴ糖生成物は、屈折率検出器を用いて検出した。試料のグルコース生成活性を表１０に要約する。１００ｐｐｍのＰｒｕＧＡ１試料は、２００ｐｐｍのＴｒＧＡ変異体Ａ（ＴｒＧＡ  ｖＡ）グルコアミラーゼに匹敵する性能を示した。ＰｒｕＧＡ１酵素は、インキュベーション温度を７０℃まで上昇させ、インキュベーション時間を２時間に短縮した場合、ベンチマークよりも優れた性能も示した。
【表１０】
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【０１１７】
実施例１１
モルト及びトウモロコシを用いたグルコアミラーゼによる超高温注入マッシング
４．０：１の水対グリスト比を用い、５５％のピルスナーモルト（Ｐｉｌｓｎｅｒ  ｍａｌｔ；Ｆｕｇｌｓａｎｇ  Ｄｅｎｍａｒｋ，Ｂａｔｃｈ  １３．０１．２０１６）及び４５％のコーングリスト（Ｂｅｎｎｔａｇ  Ｎｏｒｄｉｃ；Ｎｏｒｄｇｅｔｒｅｉｄｅ  ＧｍＢＨ  Ｌｕｅｂｅｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ、Ｂａｔｃｈ：０２．０５．２０１６）のマッシング操作でグルコアミラーゼＰｒｕＧＡ１を試験した。ピルスナーモルトは、Ｂｕｈｌｅｒ  Ｍｉａｇモルトミル（０．５ｍｍ設定）で粉砕した。
【０１１８】
トウモロコシグリスト（１．３５ｇ）及びモルト（粉砕ピルスナーモルト、１．６５ｇ）を、２．５Ｍ硫酸によりｐＨ５．４にｐＨ調整した１２．０ｇの水道水とｗｈｅａｔｏｎカップ（キャップ付きｗｈｅａｔｏｎガラス容器）中で混合し、予備インキュベートした。活性タンパク質のｐｐｍ（合計１．０ｍｌ）及び水に基づき、酵素対照なしでグルコアミラーゼ酵素を添加した。磁気撹拌機で撹拌しながら、ｗｈｅａｔｏｎカップをＤｒｙｂａｔｈ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｔｅｍ  ｓｔａｔｉｏｎ）に入れ、以下のマッシングプログラムを適用した。すなわち、試料を３０分間で６４℃まで加熱し、６４℃で１５分間維持し、１℃／分で温度を上昇させることにより１５分間で７９℃まで加熱し、７９℃で１５分間維持し、１℃／分で温度を上昇させることにより１１分間で９０℃まで加熱し、９０℃で１５分間維持し、１５分間で７９℃まで冷却し、最後に７９℃に１５分間加熱し、マッシングを完了した。１０ｍｌの試料をＦａｌｃｏｎチューブに移し、１００℃で２０分間煮沸して、完全な酵素不活性化を確実にした。Ｈｅｒａｅｕｓ  Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ  Ｘ３Ｒにより、４５００ｒｐｍで２０分間、１０℃で遠心分離することにより、使用済穀粒を麦芽汁から分離した。標準的な方法を用いたＨＰＬＣ糖分析のために上清を回収した。結果を表１１に示す。
【表１１】
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【０１１９】
ＰｒｕＧＡ１が用量依存的にＤＰ１の高生成を促進したことは明らかである。７５０ｐｐｍの酵素用量で８３．４４％までのＤＰ１が生成された。
【０１２０】
実施例１２
グルコアミラーゼによる高温での１００％トウモロコシの注入マッシング
この実験の目的は、トウモロコシ及びモルトを用いた高温マッシングプロセスにおけるＰｒｕＧＡ１のグルコース生成活性を工業的ベンチマークと比較して評価することであった。マッシング操作は、４．０：１の水対グリスト比を使用し、１００％トウモロコシグリスト（Ｂｅｎｎｔａｇ  Ｎｏｒｄｉｃ；Ｎｏｒｄｇｅｔｒｅｉｄｅ  ＧｍＢＨ  Ｌｕｅｂｅｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ、Ｂａｔｃｈ：０２．０５．２０１６）を用いて行った。
【０１２１】
トウモロコシグリット（３．０ｇ）を、２．５Ｍ硫酸でｐＨ５．４にｐＨ調整した１２．０ｇの水道水と共にｗｈｅａｔｏｎカップ（キャップ付きｗｈｅａｔｏｎガラス容器）に加え、予備インキュベートした。活性タンパク質のｐｐｍ（合計１．０ｍｌ）又は水に基づき、酵素対照なしでグルコアミラーゼ酵素を添加した。液化及びろ過を容易にするために、５．０ｐｐｍのアルファ−アミラーゼ（ＤｕｐｏｎｔからのＡＭＹＬＥＸ（登録商標）５Ｔ）及び０．２１ｐｐｍのベータ−グルカナーゼ（ＤｕｐｏｎｔからのＬＡＭＩＮＥＸ（登録商標）７５０）を固定濃度で全ての試料に使用した。磁気撹拌しながらｗｈｅａｔｏｎカップをＤｒｙｂａｔｈ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｔｅｍ  ｓｔａｔｉｏｎ）に入れ、３つの異なるマッシングプログラムを適用した。プロファイル１に従い、試料を６４℃まで加熱し、６４℃で８０分間維持し、１．６℃／分で温度を上昇させることによって８０℃に１０分間で加熱し、８０℃で３０分間維持してマッシングを完了した。プロファイル２に従い、試料を７０℃まで加熱し、７０℃で８０分間維持し、１．０℃／分で温度を上昇させることによって８０℃に１０分間で加熱し、８０℃で３０分間維持してマッシングを完了した。プロファイル３に従い、試料を７５℃まで加熱し、７５℃で８０分間維持し、０．５℃／分で温度を上昇させることによって８０℃に１０分間で加熱し、８０℃に３０分間維持してマッシングを完了した。１０ｍｌの試料をＦａｌｃｏｎチューブに移し、１００℃で２０分間煮沸して、完全な酵素不活性化を確実にした。Ｈｅｒａｅｕｓ  Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ  Ｘ３Ｒにより、４５００ｒｐｍで２０分間、１０℃で遠心分離することにより、使用済穀粒を麦芽汁から分離した。ＨＰＬＣによる糖分析のために上清を回収した。試料のグルコース生成活性を表１２に要約する。
【表１２】
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【０１２２】
ＰｒｕＧＡ１は、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼ由来の野生型のＴｒＧＡ（最終濃度：１８ｐｐｍ）と比較して７０℃及び７５℃マッシングプロファイル（最終濃度：１８ｐｐｍ）で性能の向上を示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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