(57)【要約】  本発明において、生物活性細胞集団などの活性作用物質を含有する治療用製剤、ならびに同製剤を作製および使用する方法が与えられる。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
a) 温度感受性の細胞安定化バイオマテリアル、および
b) 生物活性腎細胞（BRC）集団、
を含んでなる注射可能製剤であって、
該温度感受性の細胞安定化バイオマテリアルが、ハイドロゲルであって、
(i)約8℃以下では、実質的に固体の状態を維持しており、該実質的に固体の状態はゲル状態であり、
(ii)ほぼ外気温又はそれより高い温度では、実質的に液体の状態を維持し、ならびに
(iii)約8℃から、ほぼ外気温又はそれより高い温度、の間において、固体から液体への遷移状態を有する、ハイドロゲルであり、
該ハイドロゲルは、組換え起源の細胞外マトリックスタンパク質を含んでいるか、腎臓または別の組織もしくは臓器から得られる細胞外マトリックスに由来するか、またはゼラチンを含んでいる、
前記注射可能製剤。
【請求項２】
ゼラチンがI型αIコラーゲンに由来する、請求項1に記載の注射可能製剤。
【請求項３】
BRC集団がバイオマテリアルで被覆され、バイオマテリアル上に堆積され、バイオマテリアル中に包埋され、バイオマテリアルに付着し、バイオマテリアルの中にシードされ、またはバイオマテリアルの中に捕捉されている、請求項1に記載の注射可能製剤。
【請求項４】
バイオマテリアルが多孔質発泡体、ゲル、液体、ビーズ、または固体として構成される、請求項1に記載の注射可能製剤。
【請求項５】
ゼラチンがブタI型αIコラーゲンまたは組換えヒトI型αIコラーゲンに由来する、請求項2に記載の注射可能製剤。
【請求項６】
BRCが選択された腎細胞（SRC）集団である、請求項1に記載の注射可能製剤。
【請求項７】
BRCまたはSRC集団が、出発の腎細胞集団と比べて、1つもしくは複数の細胞集団を高い割合で含有し、かつ、他の1つもしくは複数の細胞集団を欠くか、またはそれが欠けている、請求項6に記載の注射可能製剤。
【請求項８】
BRCまたはSRC集団が、尿細管腎細胞について富化されている、請求項7に記載の注射可能製剤。
【請求項９】
BRCまたはSRC集団が、尿細管腎細胞を示唆する細胞形態を示す、請求項8に記載の注射可能製剤。
【請求項１０】
BRCまたはSRC集団が、1つもしくは複数の尿細管上皮細胞マーカーの表現型発現を特徴とする、請求項8に記載の注射可能製剤。
【請求項１１】
1つもしくは複数の尿細管上皮細胞マーカーが、CK18および/またはGGT1を含む、請求項10に記載の注射可能製剤。
【請求項１２】
BRCまたはSRC集団が、生きた代謝活性のある腎細胞を示唆する細胞増殖速度を示す、請求項8に記載の注射可能製剤。
【請求項１３】
BRCまたはSRC集団が、1つもしくは複数のバイアビリティマーカーおよび/または機能性マーカーの表現型発現を特徴とする、請求項12に記載の注射可能製剤。
【請求項１４】
1つもしくは複数のバイアビリティマーカーおよび/または機能性マーカーが、VEGFおよび/またはKIM-Iを含む、請求項13に記載の注射可能製剤。
【請求項１５】
BRCまたはSRC集団が、LAPおよび/またはGGT酵素活性を特徴とする、請求項12に記載の注射可能製剤。
【請求項１６】
ゼラチンが約0.5%から約1% (w/v)の割合で製剤中に含まれる、請求項1に記載の注射可能製剤。
【請求項１７】
ゼラチンが約0.8%から約0.9% (w/v)の割合で製剤中に含まれる、請求項1に記載の注射可能製剤。
【請求項１８】
細胞生存作用物質をさらに含有する、請求項1に記載の注射可能製剤。
【請求項１９】
細胞生存作用物質が、抗酸化物質、酸素運搬体、増殖因子、細胞安定化因子、免疫調節因子、細胞動員因子、細胞接着因子、抗炎症薬、免疫抑制薬、血管新生因子、および創傷治癒因子からなる1群から選択される作用物質を含む、請求項18に記載の注射可能製剤。
【請求項２０】
細胞生存作用物質が、ヒト血漿、ヒト血小板溶解物、ウシ胎仔血漿、またはウシ下垂体抽出物からなる1群から選択される、請求項18に記載の注射可能製剤。
【請求項２１】
a)ヒトもしくは動物起源の脱細胞化された腎臓、または3次元バイオプリンティングによって構造的に作製された細胞安定化バイオマテリアル、および
b) 生物活性腎細胞（BRC）集団、
を含む、移植可能な製剤。
【請求項２２】
腎細胞集団により分泌される産物をさらに含有する、請求項1〜21のいずれか1つに記載の製剤。
【請求項２３】
a)約0.88% (w/v)ゼラチンを含有するバイオマテリアルであって、該ゼラチンがI型αIコラーゲンに由来する前記バイオマテリアル、および
b)SRC集団を含有する組成物であって、該SRC集団が尿細管腎細胞の富化された集団を含み、かつ約1.04 g/mLより高い密度を有する、前記組成物、
を含む注射可能製剤。
【請求項２４】
温度感受性の細胞安定化バイオマテリアルおよび生物活性腎細胞混合物を含有する、注射可能製剤を調製するための方法であって、方法が、
i) ドナー/レシピエントから腎皮質組織を採取するステップ；
ii) 酵素消化により腎組織から腎細胞を単離し、標準的な細胞培養技術によって腎細胞を増殖させるステップ；
iii) 収集された該腎細胞を、密度境界または密度界面または単一段階不連続勾配を超える分離に供し、SRC集団を得るステップ；ならびに
iv) ゼラチンベースのハイドロゲルバイオマテリアルを用いて生物活性細胞を再構成するステップを含み、該ゼラチンはI型αIコラーゲンに由来する、
前記方法。
【請求項２５】
選択された腎細胞が、尿細管腎細胞の富化された集団を含有し、約1.04 g/mlより高い密度を有する、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
収集された腎細胞が、密度境界、または密度界面、または連続もしくは不連続の単一段階もしくは多段階密度勾配を超える分離の前に、低酸素培養条件に曝される、請求項24に記載の方法。
【請求項２７】
腎細胞が尿細管腎細胞について富化されている、請求項24に記載の方法。
【請求項２８】
細胞増殖中に腎細胞の細胞形態をモニターすることをさらに含む、請求項24に記載の方法。
【請求項２９】
腎細胞が尿細管腎細胞を示唆する細胞形態を示す、請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
細胞継代ごとに腎細胞の細胞増殖速度をモニターすることをさらに含む、請求項24に記載の方法。
【請求項３１】
代謝活性を評価するための試薬を用いて腎細胞数および生存率をモニターすることをさらに含む、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
1つもしくは複数のバイアビリティマーカーおよび/または機能性マーカーの表現型発現について腎細胞をモニターすることをさらに含む、請求項24に記載の方法。
【請求項３３】
1つもしくは複数のバイアビリティマーカーおよび/または機能性マーカーが、VEGFおよび/またはKIM-1を含む、請求項32に記載の方法。
【請求項３４】
1つもしくは複数の尿細管上皮細胞マーカーの表現型発現について腎細胞をモニターすることをさらに含む、請求項24に記載の方法。
【請求項３５】
1つもしくは複数の尿細管上皮細胞マーカーがCK18および/またはGGT1を含む、請求項34に記載の方法。
【請求項３６】
腎細胞機能を遺伝子発現プロファイリングまたは酵素活性の測定によってモニターすることをさらに含む、請求項24に記載の方法。
【請求項３７】
測定される酵素活性が、LAPおよび/またはGGTの活性である、請求項36に記載の方法。
【請求項３８】
腎細胞が、自己または同種の腎臓サンプルから得られる、請求項24に記載の方法。
【請求項３９】
腎細胞が、非自己腎臓サンプルから得られる、請求項24に記載の方法。
【請求項４０】
サンプルが腎生検によって得られる、請求項38に記載の方法。
【請求項４１】
SRCが、26-30℃において、液化したゼラチン溶液中に再懸濁される、請求項24に記載の方法。
【請求項４２】
SRCが、100x106 細胞/mlのSRC濃度を達成するのに十分なゼラチン溶液中に再懸濁される、請求項41に記載の方法。
【請求項４３】
保存中にSRCがゲル内に懸濁したままとなるように、バイオマテリアルを安定化するためにSRC/ゼラチン溶液を急冷することをさらに含む、請求項24に記載の方法。
【請求項４４】
製剤が2-8℃の温度範囲で保存される、請求項43に記載の方法。
【請求項４５】
細胞生存作用物質の添加をさらに含む、請求項42に記載の方法。
【請求項４６】
細胞生存作用物質が、抗酸化物質、酸素運搬体、増殖因子、細胞安定化因子、免疫調節因子、細胞動員因子、細胞接着因子、抗炎症薬、免疫抑制薬、血管新生因子、および創傷治癒因子からなる1群から選択される作用物質を含む、請求項45に記載の方法。
【請求項４７】
細胞生存作用物質が、ヒト血漿、ヒト血小板溶解物、ウシ胎仔血漿、またはウシ下垂体抽出物からなる1群から選択される、請求項45に記載の方法。
【請求項４８】
被験者において腎臓病を治療する方法であって、方法が、請求項1に記載の製剤を被験者に注入することを含み、製剤が18〜30ゲージ針を通して注入される、前記方法。
【請求項４９】
針の直径が、約27ゲージ、約26ゲージ、約25ゲージ、約24ゲージ、約23ゲージ、約22ゲージ、約21ゲージ、または約20ゲージである、請求項48に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2017年3月31日出願の米国仮出願第62/480,166号の優先権の利益を主張し、その内容はすべてそのまま参照により本明細書に組み入れられる。
技術分野
本発明は、腎疾患を治療するための細胞、組成物、および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
米国では1900万人以上が慢性腎臓病に冒されているが、慢性腎臓病は多くの場合、世界中でも増加している3つの疾患 - 肥満、糖尿病、および高血圧などの代謝異常の結果である(United States Renal Data System: Costs of CKD and ESRD. ed. Bethesda, MD, National Institutes of Health, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, 2007 pp 223-238)。肥満、高血圧、および血糖コントロール不良はすべて、腎臓損傷の独立危険因子であることが判明しており、糸球体および尿細管の病変を引き起こして、タンパク尿およびその他の全身性に検出可能な腎臓の濾過機能の変化をもたらす。 (Aboushwareb, et al., World J Urol, 26: 295-300, 2008; Amann, K. et al., Nephrol Dial Transplant, 13: 1958-66, 1998)。
【０００３】
従来、慢性腎不全の治療のための臨床的アプローチは、腎臓濾過および尿産生の回復のために透析および腎移植を必要とし、赤血球量を回復させるために組換えEPOまたはEPOアナログの全身性投与が不可欠である。透析は中期から末期の腎不全患者に生存の利益を提供するが、重大なクオリティ・オブ・ライフの問題を引き起こす。腎移植は、末期腎不全の患者にとってたいへん望ましい（そして多くの場合唯一の）選択肢であるが、質の高い提供腎の供給は、腎不全人口の需要を満たさない。貧血治療のための組換えEPOのボーラス投与は現在、重篤な下流の健康上のリスクと関連付けられて、医薬品に関するFDAからの黒枠警告に至っており、この集団において赤血球恒常性を回復させるための代替治療についてさらなる研究が必要である。
【０００４】
ごく最近になって、組織工学を応用した新たな治療パラダイムが報告されたが、それはこうした患者集団において、腎機能の実質的かつ永続的な増強をもたらし、病気の進行を遅らせ、さらにクオリティ・オブ・ライフを改善するものである。単離された、生物活性のある腎細胞は、慢性腎臓病治療のための細胞ベースの再生治療の候補となる(Presnell et al. WO/2010/056328; Ilagan et al. PCT/US2011/036347)。しかしながら、このような細胞ベースの治療法は、生体外で、しかも標準的な細胞培養環境のない状態で維持されるように、長期間持続する生理学的に適切な生物活性を必要とする。製品の効力は、生物活性細胞を細胞ベースの治療用製品としてパッキングする際に、生物学的に支援する製剤もしくは担体なしでは失われる可能性がある。したがって、たとえば、生物活性細胞などの、組織工学および再生医療の応用のための生物活性作用物質を、それを必要とする患者に送達するのに適した治療用製剤が必要である。単離された生物活性腎細胞および/または非腎性細胞をNeo-Kidney Augment (NKA)へと製剤することによって、細胞の安定性を高めることが可能となり、したがって製品の保存可能期間を延長し、臨床応用のためのコンストラクトの、輸送中および標的臓器への送達中の安定性を改善することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】WO/2010/056328;
【特許文献２】PCT/US2011/036347
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】United States Renal Data System: Costs of CKD and ESRD. ed. Bethesda, MD, National Institutes of Health, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, 2007 pp 223-238
【非特許文献２】Aboushwareb, et al., World J Urol, 26: 295-300, 2008;
【非特許文献３】Amann, K. et al., Nephrol Dial Transplant, 13: 1958-66, 1998
【発明の概要】
【０００７】
概要
本明細書は概して、特に、腎臓の構造および/または機能の再生、修復および/またはレスキューのための複合再生コンストラクトに関するものであるが、このコンストラクトは、生物活性のある細胞集団のために支えとなる3次元環境を提供するマトリックス、ゲル、または足場と複合体化した、生物活性のある腎細胞および/または非腎性細胞組成物からなるものであって、腎臓病改善のための治療薬として、その細胞画分の広範な生物学的効力を高める。
【０００８】
ある態様において、提供されるのは注射可能製剤（注射用製剤）である。特定の実施形態において、製剤は、a) 温度感受性細胞安定化バイオマテリアル、およびb) 生物活性腎細胞(BRC)細胞集団を含む。ある実施形態において、温度感受性細胞安定化バイオマテリアルはハイドロゲルであって、このハイドロゲルは、(i)約8℃以下において実質的に固体の状態を維持しており、実質的に固体の状態とはゲル状態である、(ii)ほぼ外気温かそれ以上では、実質的に液体の状態を維持する、さらに(iii)約8℃からほぼ外気温の間またはそれより高い温度で固体から液体への遷移状態をとる。ある実施形態において、ハイドロゲルは、組換え起源の細胞外マトリックスタンパク質を含むか、腎臓または別の組織もしくは臓器から得られる細胞外マトリックスに由来するか、あるいはゼラチンを含んでなる。
【０００９】
ある実施形態において、ゼラチンはI型αIコラーゲンに由来する。ある実施形態において、BRC（たとえば、選択された腎細胞集団）は、バイオマテリアルに被覆され、バイオマテリアル上に堆積され、バイオマテリアルに包埋され、バイオマテリアルに付着し、バイオマテリアルの中にシードされ（埋め込まれ）、またはバイオマテリアルの中に捕捉されている。ある実施形態において、バイオマテリアルは、多孔質発泡体、ゲル、液体、ビーズ、または固体として形作られる（構成される）。
【００１０】
ある実施形態において、ゼラチンはブタI型αIコラーゲンまたは組換えヒトI型αIコラーゲンに由来する。
【００１１】
ある実施形態において、BRCは選択された腎細胞（SRC）集団である。ある実施形態において、BRCまたはSRC集団は、出発の腎細胞集団と比べて、1つもしくは複数の細胞集団を高い割合で含有し、他の1つもしくは複数の細胞集団を欠くか、またはそれが不足している。ある実施形態において、BRCまたはSRC集団は、尿細管腎細胞が富化されている。ある実施形態において、BRCまたはSRC集団は、尿細管腎細胞を示唆する細胞形態を示す。ある実施形態において、BRCまたはSRC集団は、1つもしくは複数の尿細管上皮細胞マーカーの表現型発現を特徴とする。ある実施形態において、1つもしくは複数の尿細管上皮細胞マーカーは、CK18および/またはGGT1を含む。ある実施形態において、BRCまたはSRC集団は、生きた代謝活性のある腎細胞を示唆する細胞増殖速度を示す。ある実施形態において、BRCまたはSRC集団は、1つもしくは複数のバイアビリティマーカー（生存能マーカー）および/または機能性マーカーの表現型発現を特徴とする。ある実施形態において、1つもしくは複数のバイアビリティマーカーおよび/または機能性マーカーは、VEGFおよび/またはKIM-Iを含む。ある実施形態において、BRCまたはSRC集団は、LAPおよび/またはGGT酵素活性を特徴とする。
【００１２】
ある実施形態において、ゼラチンは約0.5%から約1% (w/v)の割合で製剤中に含まれる。ある実施形態において、ゼラチンは約0.8%から約0.9% (w/v)の割合で製剤中に含まれる。ある実施形態において、製剤はさらに、細胞生存作用物質を含有する。ある実施形態において、細胞生存作用物質は、抗酸化物質、酸素運搬体、増殖因子、細胞安定化因子、免疫調節因子、細胞動員因子、細胞接着因子、抗炎症薬、免疫抑制薬、血管新生因子、および創傷治癒因子からなる1群から選択される作用物質を含む。ある実施形態において、細胞生存作用物質は、ヒト血漿、ヒト血小板溶解物、ウシ胎仔血漿、またはウシ下垂体抽出物からなる1群から選択される。
【００１３】
ある実施形態において、本明細書に記載される製剤は、腎細胞集団により分泌される産物を含有する。
【００１４】
ある態様において、提供されるのは移植可能な製剤である。特定の実施形態において、製剤は、a)ヒトもしくは動物起源の脱細胞化された腎臓、または3次元バイオプリンティングによって構造的に作製された細胞安定化バイオマテリアル、およびb) BRC集団を含む。
【００１５】
ある態様において、提供されるのは注射可能製剤である。特定の実施形態において、製剤は、a)約0.88% (w/v)ゼラチンを含有するバイオマテリアルであって、そのゼラチンがI型αIコラーゲンに由来する前記バイオマテリアル、およびb)SRC集団を含有する組成物を含む。ある実施形態において、SRC集団は尿細管腎細胞の富化された集団を含み、約1.04 g/mLより高い密度を有する。
【００１６】
ある態様において、提供されるのは、温度感受性細胞安定化バイオマテリアルおよび生物活性腎細胞混合物を含有する、注射可能製剤を調製するための方法であって、その方法は、i) ドナー/レシピエントから腎皮質組織を採取するステップ；ii) 酵素消化により腎組織から腎細胞を単離し、標準的な細胞培養技術によって腎細胞を増殖させるステップ；iii) 収集された腎細胞を、密度境界または密度界面または単一段階不連続勾配を超える分離に供し、SRC集団を得るステップ；ならびにiv) ゼラチンベースのハイドロゲルバイオマテリアルを用いて生物活性細胞を再構成するステップを含むが、このゼラチンはI型αIコラーゲンに由来する。
【００１７】
ある実施形態において、選択された腎細胞は、尿細管腎細胞の富化された集団を含有し、その密度は約1.04 g/mlより高い。
【００１８】
ある実施形態において、収集された腎細胞は、密度境界、または密度界面、または連続もしくは不連続の単一段階もしくは多段階密度勾配を超える分離の前に、低酸素培養条件に曝される。
【００１９】
ある実施形態において、腎細胞は尿細管腎細胞について富化される。
【００２０】
ある実施形態において、方法はさらに、細胞増殖中に腎細胞の細胞形態をモニターする（モニタリングする）ことを含む。
【００２１】
ある実施形態において、腎細胞は尿細管腎細胞を示唆する細胞形態を示す。
【００２２】
ある実施形態において、方法はさらに、細胞継代ごとに腎細胞の細胞増殖速度をモニターすることを含む。ある実施形態において、方法はさらに、代謝活性を評価するための試薬を用いて腎細胞数および生存率をモニターすることを含む。ある実施形態において、方法はさらに、1つもしくは複数のバイアビリティマーカーおよび/または機能性マーカーの表現型発現について腎細胞をモニターすることを含む。
【００２３】
ある実施形態において、1つもしくは複数のバイアビリティマーカーおよび/または機能性マーカーは、VEGFおよび/またはKIM-1を含む。
【００２４】
ある実施形態において、方法はさらに、1つもしくは複数の尿細管上皮細胞マーカーの表現型発現について腎細胞をモニターすることを含む。ある実施形態において、1つもしくは複数の尿細管上皮細胞マーカーはCK18および/またはGGT1を含む。
【００２５】
ある実施形態において、方法はさらに、腎細胞機能を遺伝子発現プロファイリングまたは酵素活性の測定によってモニターすることを含む。ある実施形態において、測定される酵素活性は、LAPおよび/またはGGTの活性である。
【００２６】
ある実施形態において、腎細胞は自己または同種の腎臓サンプルから得られる。ある実施形態において、腎細胞は非自己腎臓サンプルから得られる。ある実施形態において、サンプルは腎生検によって得られる。
【００２７】
ある実施形態において、SRCは、26-30℃において液化したゼラチン溶液中に再懸濁される。ある実施形態において、SRCは、100x106 細胞/mlのSRC濃度を達成するのに十分なゼラチン溶液中に再懸濁される。
【００２８】
ある実施形態において、方法はさらに、保存中にSRCがゲル内に懸濁したままとなるように、バイオマテリアルを安定化するためにSRC/ゼラチン溶液を急冷することを含む。
【００２９】
ある実施形態において、製剤は2-8℃の温度範囲で保存される。
【００３０】
ある実施形態において、方法はさらに、細胞生存作用物質の添加を含む。ある実施形態において、細胞生存作用物質は、抗酸化物質、酸素運搬体、増殖因子、細胞安定化因子、免疫調節因子、細胞動員因子、細胞接着因子、抗炎症薬、免疫抑制薬、血管新生因子、および創傷治癒因子からなる1群から選択される作用物質を含む。
【００３１】
ある実施形態において、細胞生存作用物質は、ヒト血漿、ヒト血小板溶解物、ウシ胎仔血漿、またはウシ下垂体抽出物からなる1群から選択される。
【００３２】
ある態様において、提供されるのは、被験者において腎臓病を治療する方法であって、その方法は、本明細書に記載の製剤、組成物、または細胞集団を被験者に注入することを含む。ある実施形態において、製剤、組成物、または細胞集団は、18〜30ゲージ針を通して注入される。ある実施形態において、製剤、組成物、または細胞集団は、20ゲージより小さい針を通して注入される。ある実施形態において、製剤、組成物、または細胞集団は、21ゲージより小さい針を通して注入される。ある実施形態において、製剤、組成物、または細胞集団は、22ゲージより小さい針を通して注入される。ある実施形態において、製剤、組成物、または細胞集団は、23ゲージより小さい針を通して注入される。ある実施形態において、製剤、組成物、または細胞集団は、24ゲージより小さい針を通して注入される。ある実施形態において、製剤、組成物、または細胞集団は、25ゲージより小さい針を通して注入される。ある実施形態において、製剤、組成物、または細胞集団は、26ゲージより小さい針を通して注入される。ある実施形態において、製剤、組成物、または細胞集団は、27ゲージより小さい針を通して注入される。ある実施形態において、製剤、組成物、または細胞集団は、28ゲージより小さい針を通して注入される。ある実施形態において、製剤、組成物、または細胞集団は、29ゲージより小さい針を通して注入される。ある実施形態において、製剤、組成物、または細胞集団は、約20ゲージの針を通して注入される。ある実施形態において、製剤、組成物、または細胞集団は、約21ゲージの針を通して注入される。ある実施形態において、製剤、組成物、または細胞集団は、約22ゲージの針を通して注入される。ある実施形態において、製剤、組成物、または細胞集団は、約23ゲージの針を通して注入される。ある実施形態において、製剤、組成物、または細胞集団は、約24ゲージの針を通して注入される。ある実施形態において、製剤、組成物、または細胞集団は、約25ゲージの針を通して注入される。ある実施形態において、製剤、組成物、または細胞集団は、約26ゲージの針を通して注入される。ある実施形態において、製剤、組成物、または細胞集団は、約27ゲージの針を通して注入される。ある実施形態において、製剤、組成物、または細胞集団は、約28ゲージの針を通して注入される。ある実施形態において、製剤、組成物、または細胞集団は、約29ゲージの針を通して注入される。
【００３３】
ある態様において、本明細書は、温度感受性細胞安定化バイオマテリアル、ならびに生物活性腎細胞集団(BRC)を含む組成物を含有する注射可能製剤に関する。ある実施形態において、注射可能製剤の生物活性腎細胞集団は、密度境界、バリアーまたは界面を越える、増殖させた腎細胞の分離（たとえば、単一段階不連続密度勾配分離）後に得られる、選択された腎細胞(SRC)集団である。実施形態において、SRCは約1.04 g/mLより高い浮遊密度を示す可能性がある。実施形態において、SRCは約1.0419 g/mLより高い浮遊密度を示すことがある。実施形態において、SRCは約1.045 g/mLより高い浮遊密度を示すことがある。ある実施形態において、注射可能製剤のBRCまたはSRCは、出発の腎細胞集団と比べて、1つもしくは複数の細胞集団をより高い割合で含有し、他の1つもしくは複数の細胞集団を欠いているかまたはそれらが不足している。ある実施形態において、BRCまたはSRCは尿細管腎細胞を豊富に含み得る。BRCまたはSRCは、尿細管腎細胞を表す細胞形態を示すことがあり、ならびに/または、1つもしくは複数の尿細管上皮細胞マーカーの表現型発現を特徴とすることもある。特定の実施形態において、1つもしくは複数の尿細管上皮細胞マーカーはCK18および/またはGGT1を含む。
【００３４】
ある実施形態において、注射可能製剤のBRCまたはSRCは、生存し代謝活性のある腎細胞であることを示唆する細胞増殖速度を示すと考えられる。ある実施形態において、BRCまたはSRCは、1つもしくは複数のバイアビリティマーカーおよび/または機能性マーカーの表現型発現を特徴とする。特定の実施形態において、1つもしくは複数のバイアビリティマーカーおよび/または機能性マーカーは、VEGFおよび/またはKIM-1を含む。ある注射可能製剤の実施形態において、BRCまたはSRCの機能性は、遺伝子発現プロファイリングまたは酵素活性の測定によってさらに確定される。測定される酵素活性は、LAPおよび/またはGGTの酵素活性とすることができる。一部の実施形態において、注射可能製剤のBRCまたはSRCは、自己または同種の腎臓サンプルから得られる。また他の実施形態において、BRCまたはSRCは、非自己腎臓サンプルから得られる。サンプルは腎生検から得ることができる。
【００３５】
一部の実施形態において、注射可能製剤の温度感受性細胞安定化バイオマテリアルは、約8℃以下では実質的に固体の状態を維持するが、ほぼ外気温以上では実質的に液体状態を保つ。ある実施形態において、バイオマテリアルは、約8℃からほぼ外気温の間、またはそれ以上では固体から液体への遷移状態を含み得る。実質的に固体の状態はゲル状であるといえる。ある実施形態において、バイオマテリアルはゼラチンベースのハイドロゲルを含む。ゼラチンは約0.5%から約1% (w/v)の割合で製剤中に含まれる可能性がある。個別の実施形態において、ゼラチンは約0.8%から約0.9% (w/v)の割合で製剤中に含まれる。
【００３６】
1つもしくは複数の実施形態において、注射可能製剤の生物活性細胞は、細胞安定化バイオマテリアルの体積全体にわたって実質的に均一に分散している。一部の実施形態において、注射可能製剤はさらに、細胞生存作用物質を含有する。細胞生存作用物質は、抗酸化物質、酸素運搬体、増殖因子、細胞安定化因子、免疫調節因子、細胞動員因子、細胞接着因子、抗炎症薬、免疫抑制薬、血管新生因子、および創傷治癒因子からなる1群から選択される作用物質を含んでいる可能性がある。個別の実施形態において、細胞生存作用物質は、ヒト血漿、ヒト血小板溶解物、ウシ胎仔血漿、またはウシ下垂体抽出物からなる1群から選択することができる。ある実施形態において、注射可能製剤は、約0.88% (w/v)ゼラチンを含有するバイオマテリアル、ならびに生物活性腎細胞集団（BRC）を含有する組成物を含んでなるが、このBRCは尿細管腎細胞の富化集団を含んでおり、その密度は約1.04 g/mLより高い。ある実施形態において、注射可能製剤は、約0.88% (w/v)ゼラチンを含有するバイオマテリアル、ならびに生物活性腎細胞集団（BRC）を含有する組成物を含んでなるが、このBRCは尿細管腎細胞の富化集団を含んでおり、その密度は約1.0419 g/mLまたは約1.045 g/mLより高い。
【００３７】
別の態様において、本明細書は、温度感受性細胞安定化バイオマテリアルおよび生物活性腎細胞混合物を含有する、注射可能製剤を調製するための方法であって、その方法は、i) ドナー/レシピエントから腎皮質組織を採取するステップ；ii) 酵素消化により腎組織から腎細胞を単離し、標準的な細胞培養技術によって腎細胞を増殖（拡張）させるステップ；iii) 収集された腎細胞を、密度境界、バリアーまたは界面を超えて遠心分離することによる分離に供し、選択された腎細胞（Selected Renal Cells）(SRC)を得るステップ；ならびにiv) ゼラチンベースのハイドロゲルバイオマテリアルを用いて生物活性細胞を再構成するステップを含む。実施形態において、選択された腎細胞は、尿細管腎細胞の富化集団を含んでもよく、その密度は約1.04 g/mLより高い。選択された腎細胞は、尿細管腎細胞の富化集団を含んでもよく、その密度は約1.0419 g/mLまたは約1.045 g/mLより高い。ある実施形態において、集められた腎細胞は、密度境界、バリアー、または界面を超えて遠心分離することによって分離する前に、低酸素培養条件に曝される。ある実施形態において、腎細胞は尿細管腎細胞について富化される。
【００３８】
ある実施形態において、注射可能製剤を調製するための方法はさらに、細胞増殖中の腎細胞の細胞形態をモニターすることを含む。選択された腎細胞は、尿細管腎細胞であることを示唆する細胞形態を示す。ある実施形態において、方法は、細胞継代ごとの腎細胞の細胞増殖速度をモニターすることを含む。また別の実施形態において、方法は、代謝活性を評価するための試薬を用いて腎細胞数および生存率をモニターすることを含む。一部の実施形態において、方法は、1つもしくは複数のバイアビリティマーカーおよび/または機能性マーカーの表現型発現について腎細胞をモニターすることを含む。1つもしくは複数のバイアビリティマーカーおよび/または機能性マーカーは、VEGFおよび/またはKIM-1を含み得る。さらに他の実施形態において、方法は、1つもしくは複数の尿細管上皮細胞マーカーの表現型発現について腎細胞をモニターすることを含む。1つもしくは複数の尿細管上皮細胞マーカーはCK18および/またはGGT1を含み得る。方法はまた、腎細胞機能を遺伝子発現プロファイリングまたは酵素活性の測定によってモニターすることも含んでいることがある。測定される酵素活性は、LAPおよび/またはGGT活性を含めることができる。
【００３９】
一部の実施形態において、注射可能製剤を調製するための方法に使用される腎細胞は、自己または同種の腎臓サンプルから得られる。ある実施形態において、腎細胞は非自己腎臓サンプルから得られる。腎臓サンプルは腎生検によって得ることができる。
【００４０】
ある実施形態において、注射可能製剤を調製するための方法に使用されるSRCは、26-30℃において液化ゼラチン溶液中に再懸濁される。SRCは、100x106 細胞/mlのSRC濃度を達成するのに十分なゼラチン溶液中に再懸濁することができる。ある実施形態において、方法は、保存中にSRCがゲル内に懸濁したままとなるように、バイオマテリアルを安定化するためにSRC/ゼラチン溶液を急冷することを含む。製剤は2-8℃の温度範囲で保存することができる。
【００４１】
また別の実施形態において、注射可能製剤を調製するための方法は、細胞生存作用物質の添加を含む。細胞生存作用物質は、抗酸化物質、酸素運搬体、増殖因子、細胞安定化因子、免疫調節因子、細胞動員因子、細胞接着因子、抗炎症薬、免疫抑制薬、血管新生因子、および創傷治癒因子からなる1群から選択される作用物質とすることができる。ある実施形態において、細胞生存作用物質は、ヒト血漿、ヒト血小板溶解物、ウシ胎仔血漿、またはウシ下垂体抽出物からなる1群から選択される。
【００４２】
態様および実施形態をさらに以下に記載する。本明細書に記載の実施形態はいずれも、他に記載の実施形態のそれぞれに当てはまると考えられる。したがって、本明細書に記載のさまざまな要素の組み合わせはすべて、本明細書の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】培養中のヒト腎細胞の形態
【図２】密度境界を超える遠心分離によるSRCバンド形成
【図３】ゼラチン溶液のゲル化に関する温度プロファイル
【図４】NKAゲル化中の回転時間
【図５】ヒトSRC集団における腎細胞マーカーの発現
【図６】ヒトSRCの酵素活性
【図７】低温で3日の保持時間中のSRCの沈降
【図８】共焦点顕微鏡法によるNKA中のSRCの分布
【図９】シリンジ全域にわたるNKAサンプリング
【図１０】シリンジの全域にわたるNKA中の全生細胞分布
【図１１】製剤後のNKAにおけるSRC分布
【図１２】3日保持後のシリンジ全域にわたるNKA中のSRC分布
【図１３】トリパンブルーによる冷蔵時のNKA生存率の安定性
【図１４】冷蔵におけるCK18によるNKA表現型の安定性
【図１５】冷蔵におけるGGT1によるNKA表現型の安定性
【図１６】冷蔵におけるPrestoBlueの代謝によるNKAの安定性
【図１７】冷蔵におけるVEGFによるNKA機能の安定性
【図１８】NKAとデリバリーカニューレの適合性
【図１９】NKAデリバリーおよび移植の図解
【図２０】NKA製造プロセス全体の限定的でない例のフロー図
【図２１Ａ】図20に示す非限定例をさらに詳細に示すフロー図
【図２１Ｂ】図20に示す非限定例をさらに詳細に示すフロー図
【図２１Ｃ】図20に示す非限定例をさらに詳細に示すフロー図
【図２１Ｄ】図20に示す非限定例をさらに詳細に示すフロー図
【発明を実施するための形態】
【００４４】
詳細な説明
ここでは本発明の特定の実施形態について詳細に記載することとする。本明細書の態様は実施形態と関連して説明されるが、当然のことながらそれらは本発明をそれらの実施形態に限定するものではない。それどころか、本発明は、請求の範囲に記載される本発明の範囲に含まれうるあらゆる代替物、変更、および同等物を含めるものとする。当業者は、本明細書に記載の方法および材料と類似した、または同等の多くの方法および材料を認識することが可能であり、それらを本発明の実践に使用することができるであろう。本発明は、けっして記載された方法および材料に限定されない。
【００４５】
本明細書を通じて引用されるすべての参考文献は、そのまま参照により、明確に本明細書に組み入れられる。万一、組み入れられた文献、特許、および同種材料の1つもしくはいくつかが、それに限らないが定義された用語、用語法、記載の技法などを含む本出願と異なるか、または矛盾する場合には、本出願が優先される。
【００４６】
1.定義
他に記載のない限り、本明細書に使用される科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者に通常理解されるのと同じ意味を有する。Principles of Tissue Engineering, 3rd Ed. (Edited by R Lanza, R Langer, & J Vacanti), 2007 は、当業者に、本出願に使用される用語の多くに対する一般的な指針を与える。当業者は、本明細書に記載の方法および材料と類似した、または同等の多くの方法および材料を認識すること可能であって、それらを本発明の実践に使用することができる。確かに本発明は記載された方法および材料にけっして限定されない。
【００４７】
「含む」（"comprise," "comprising," "include," "including," および "includes"）という用語は、本明細書および請求の範囲に使用される場合、言明された特徴、整数、構成成分、またはステップの存在を明記するものであるが、1つもしくは複数の他の特徴、整数、構成成分、ステップ、またはそれらの一群が存在すること、または追加されることを排除しない。
【００４８】
本明細書で使用される「細胞集団」という用語は、適当な組織起源、通常は哺乳動物から、直接単離することによって得られる多数の細胞を指す。たとえば、細胞集団は腎細胞の集団、およびその混合物を含み得る。単離された細胞集団は、その後in vitroで培養することができる。本明細書で使用するための細胞集団を単離および培養するためのさまざまな方法、ならびに本明細書で使用するのに適した細胞集団中のさまざまな細胞数が、当業者に理解されるであろう。細胞集団は、たとえば腎臓などの臓器もしくは組織に由来する、未分画の不均一な細胞集団、または富化された均一な細胞集団とすることができる。たとえば、不均一な細胞集団は、組織生検または全臓器組織から単離することができる。あるいはまた、不均一な細胞集団は、組織生検または全臓器組織から確立された哺乳動物細胞のin vitro培養物から得ることができる。未分画不均一細胞集団は、非富化細胞集団と呼ぶこともできる。ある実施形態において、細胞集団は生物活性細胞を含有する。均一細胞集団は、共通の表現型を共有するか、または類似した物理的特性を有する同一細胞型の細胞を、未分画不均一細胞集団より多くの割合で含んでいる。たとえば、均一細胞集団は、不均一腎細胞集団から単離し、取り出し、または富化することができる。ある実施形態において、均一細胞集団は、不均一な細胞懸濁物の密度境界、バリアー、または界面を超える遠心分離による分離によって、細胞画分として得られる。ある実施形態において、均一細胞集団は、不均一細胞懸濁物の連続または不連続（単一段階または多段階）密度勾配分離によって、細胞画分として得られる。ある実施形態において、腎臓起源の均一もしくは不均一細胞集団は、腎臓以外の組織もしくは臓器を起源とする均一もしくは不均一細胞集団と混合されるが、それに限定されない。
【００４９】
本明細書で使用される、「生物活性のある」という用語は、薬理学的もしくは治療的活性のような「生物学的活性を有する」ことを意味する。ある実施形態において、生物活性は、腎機能の強化および/または腎臓の恒常性への効果である。ある実施形態において、生物学的活性は、鎮痛性；抗ウイルス性；抗炎症性；抗腫瘍性；免疫刺激性；免疫調節性；細胞生存能力の強化、抗酸化性、酸素運搬体、細胞動員、細胞接着、免疫抑制、血管新生、創傷治癒活性、宿主幹細胞もしくは前駆細胞の動員、細胞増殖、損傷部位への細胞遊走の刺激、細胞および組織線維症の改善、上皮間葉シグナル伝達カスケードの妨害、サイトカイン、増殖因子、タンパク質、核酸、エキソソーム、マイクロベシクルの分泌、またはそれらの任意の組み合わせであるが、それに限定されない。
【００５０】
本明細書で使用される「生物活性腎細胞」または「BRC」という用語は、被験者の腎臓に投与されたときに以下の性質：慢性腎臓病もしくはその症状の悪化もしくは進行を軽減する（たとえば遅らせる、または止める）能力、腎機能を強化する能力、腎臓の恒常性に影響を及ぼす（改善する）能力、ならびに腎組織もしくは腎臓の治癒、修復および/または再生を促す能力、のうち1つもしくはいくつかを有する腎細胞を指す。実施形態において、こうした細胞は、機能的な尿細管細胞（たとえばクレアチニン排出およびタンパク質保持の改善に基づく）、糸球体細胞（たとえば、タンパク質保持の改善に基づく）、血管細胞、ならびに皮髄境界部の他の細胞を含み得る。実施形態において、BRCは、腎組織からの腎細胞の単離および増殖から得られる。実施形態において、BRCは、生物活性細胞を選択する方法を用いて、腎組織からの腎細胞の単離および増殖から得られる。実施形態において、BRCは腎臓への再生効果を有する。実施形態において、BRCは、選択された腎細胞（SRC）を含み、主としてSRCからなり、またはSRCからなる。実施形態において、BRCはSRCである。
【００５１】
実施形態において、SRCは、適当な腎組織起源に由来する腎細胞の単離および増殖から得られる細胞であって、このSRCは、出発の腎細胞集団と比べて、1つもしくは複数の細胞型をより高い割合で含有し、他の1つもしくは複数の細胞型を欠いているか、またはより少ない割合で含有する。実施形態において、SRCは、出発の腎細胞集団より高い割合のBRCを含有する。実施形態において、SRC集団は、腎臓病の治療に使用するための単離された腎細胞の集団であって、その腎細胞集団は、特定の生物活性成分および/もしくは細胞型を豊富に含む腎細胞集団、ならびに/または、特定の不活性な、および/もしくは望ましくない成分または細胞型を減少させた腎細胞集団であり、すなわち、腎機能の安定化および/または改善および/または再生をもたらす腎細胞集団である。SRCは、出発集団と比べて、すぐれた治療および再生の成果を提供する。実施形態において、SRCは、腎生検によって患者の腎皮質組織から得られる。実施形態において、SRCは、1つもしくは複数のマーカーの発現に基づいて、（たとえば、蛍光励起セルソーター、すなわちFACSによって）選択される。実施形態において、SRCは、細胞型における1つもしくは複数のマーカーの発現に基づいて、1つもしくは複数の細胞型が（たとえば、蛍光励起セルソーター、すなわちFACSによって）激減（枯渇）している。実施形態において、SRCは生物活性腎細胞の集団から選択される。実施形態において、SRCは、増殖させた腎細胞の密度勾配分離によって選択される。実施形態において、SRCは、密度境界、バリアーもしくは界面を超える遠心分離によって、または単一段階不連続ステップ勾配分離によって、増殖させた腎細胞を分離することによって選択される。実施形態において、SRCは、低酸素条件下で培養された、増殖腎細胞の連続もしくは不連続密度勾配分離によって選択される。実施形態において、SRCは、低酸素条件下で少なくとも約8、12、16、20、または24時間培養された、増殖腎細胞の密度勾配分離によって選択される。実施形態において、SRCは、低酸素条件下で培養された増殖腎細胞の、密度境界、バリアー、もしくは界面を超える遠心による分離によって選択される。実施形態において、SRCは、低酸素条件下で少なくとも約8、12、16、20、または24時間培養された増殖腎細胞の、密度境界、バリアーもしくは界面を超える遠心による分離（たとえば、単一段階不連続密度勾配分離）によって選択される。実施形態において、SRCは主として尿細管腎細胞からなる。実施形態において、他の実質（たとえば血管）および間質（たとえば集合管）細胞がSRC中に含まれる可能性がある。実施形態において、SRC集団において約10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、または1%未満の細胞は、血管細胞である。実施形態において、SRC集団において約10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、または1%未満の細胞は、集合管細胞である。実施形態において、SRC集団において約10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、または1%未満の細胞は、血管細胞または集合管細胞である。
【００５２】
「自然臓器」という用語は、生きた被験者の臓器を意味するものである。被験者は健康であっても、健康でなくてもよい。健康でない被験者は、その特定臓器に関わる疾患を有することもある。
【００５３】
「自然腎」という用語は、生きた被験者の腎臓を意味するものである。被験者は健康であっても、健康でなくてもよい。健康でない被験者は、腎疾患を有することもある。
【００５４】
「再生効果」という用語は、腎臓などの自然臓器にたいして利益をもたらす効果を意味するものである。その効果には、自然臓器損傷程度の低減、または自然臓器機能の改善、回復もしくは安定化を含めることができるがそれらに限定されない。腎損傷は、線維症、炎症、糸球体肥大などの形をとることがあり、被験者の自然臓器に関連する疾患に関わる可能性がある。
【００５５】
本明細書で使用される「混合物」という用語は、未分画不均一細胞集団から得られた2つ以上の単離富化された細胞集団を組み合わせたものを指す。ある実施形態によれば、本明細書の細胞集団は腎細胞集団である。他の実施形態において、細胞集団は、腎細胞集団と非腎細胞集団との混合物であってもよく、非腎細胞集団は間葉系幹細胞および内皮前駆細胞を含むがこれに限定されない。
【００５６】
「富化された」細胞集団もしくは標品は、出発臓器細胞集団（たとえば、未分画不均一細胞集団）から得られる細胞集団であって、特定の細胞型を、出発集団におけるその細胞型の割合より高い割合で含有する、前記細胞集団を指す。たとえば、出発腎細胞集団を、目的とする第1、第2、第3、第4、第5の細胞集団などについて富化することができる。本明細書で使用される場合、「細胞集団」、「細胞標品」、および「細胞表現型」は区別なく使用される。
【００５７】
本明細書で使用される「低酸素」培養条件という用語は、細胞が、大気中酸素レベル（約21%）で培養される標準培養条件と比べて、培養系における有効酸素レベルの低下にさらされる培養条件を指す。低酸素でない条件は、本明細書では、正常条件または正常酸素条件と呼ぶ。
【００５８】
本明細書で使用される「酸素調整可能な」という用語は、細胞に有効な酸素量に基づいて遺伝子発現を（上下に）調整することができる細胞の能力を指す。
【００５９】
本明細書で使用される「バイオマテリアル」という用語は、選択された生物活性細胞を生存可能な状態で維持する、生体組織への導入に適した、天然または合成の生体適合性材料を指す。天然バイオマテリアルは、生体系によって作られる、または生体系を起源とする材料である。合成バイオマテリアルは、生体系によって作られない、または生体系を直接の起源としない材料であるが、その代わりに、当業者によく知られた特定の化学的方法およびプロトコルによって合成または構成される。本明細書に記載のバイオマテリアルは、天然および合成の生体適合性材料の組み合わせであってもよい。本明細書で使用されるバイオマテリアルには、たとえばポリマーマトリックスおよび足場が含まれる。当業者に理解されるように、バイオマテリアルはさまざまな形、たとえば多孔質発泡体、ゲル、液体、ビーズ、固体などとして構成される可能性があり、1つもしくは複数の天然または合成の生体適合性材料を含有することができる。ある実施形態において、バイオマテリアルは、ハイドロゲルとなることができる溶液の液体状態である。
【００６０】
本明細書で使用されるバイオマテリアルは、たとえば、ヒトまたは動物起源の既存の腎臓から得られる細胞外マトリックスを含むが、その天然細胞集団は、当業者に知られている界面活性剤および/または他の化学薬品を適用することによって除去されている。ある実施形態において、バイオマテリアルは、ハイドロゲルとなりうる溶液の液体状態であり、当業者に知られている3次元バイオプリンティング法を適用することにより、特定の細胞集団とともに、または特定の細胞集団なしで、積層される。ある実施形態において、バイオマテリアルは、脱細胞化された腎臓の3次元フラクタル組織構造を模して構成される。
【００６１】
「放出調節」という用語、または「放出制御」、「遅延放出」もしくは「持続放出」という同等の用語は、生物活性細胞などの活性作用物質を、長時間にわたって、または個体への投与後いっときより長い時間、放出する製剤を意味する。活性作用物質の放出調節は、製剤に応じて、望ましい時間範囲、たとえば数分間、数時間、数日間、数週間、またはそれより長期間にわたって起こりうるものであって、投与単位のほぼ全体が投与直後に利用できる標準製剤とは対照的である。組織工学および再生医療の応用に向けて、好ましい放出調節製剤は、局所投与（たとえば、活性作用物質の固形臓器への直接投与）後多くの時点で活性作用物質の放出をもたらす。たとえば、生物活性細胞の放出調節製剤は、投与した時すぐに細胞の初回放出を与え、その後の時点で後の2回目の放出をもたらす。活性作用物質の2回目の放出の遅延時間は、初回投与後数分、数時間、または数日とすることができる。概して、放出の遅延時間は、活性作用物質のバイオマテリアル担体がその構造的完全性を失うのにかかる時間に相当する。活性作用物質の遅延放出は、そうした完全性が劣化し始めるとすぐに始まり、完全性が完全になくなる時点までに終了する。当業者は、他の適当な放出メカニズムを正しく評価することができる。
【００６２】
「コンストラクト」または「製剤」という用語は、1つもしくは複数の合成もしくは天然由来の生体適合性材料で構成される、足場またはマトリックスの表面上または内部に配置された1つもしくは複数の細胞集団のことをいう。1つもしくは複数の細胞集団は、1つもしくは複数の合成もしくは天然由来の生体適合性バイオマテリアル、ポリマー、タンパク質またはペプチドで構成されるバイオマテリアルで被覆され、その上に配置され、その中に包埋され、それに付着し、またはその中にシードされ（埋め込まれ）、または捕捉されている可能性がある。ある実施形態において、天然由来バイオマテリアルは、ヒトもしくは動物起源の脱細胞化された腎臓である。ある実施形態において、バイオマテリアルは、3次元バイオプリンティングによって構造的に作製された。1つもしくは複数の細胞集団は、in vitroまたはin vivoで、バイオマテリアルまたは足場またはマトリックスと組み合わせることができる。コンストラクトまたは製剤を作製するために使用される1つもしくは複数のバイオマテリアルは、コンストラクトの細胞成分の分散および/または内在組織との一体化を方向付け、促進し、または許容するように選択することができるが、コンストラクトまたは製剤の細胞成分の生存、生着、寛容、または機能的パフォーマンスを方向付け、促進し、または許容するように選択してもよい。ある実施形態において、足場/バイオマテリアルを形成するために使用される1つもしくは複数の生体適合性材料は、その上に配置される細胞集団のうち少なくとも1つの、多細胞性3次元組織の形成を方向付け、促進し、または許容するように選択される。ある実施形態において、バイオマテリアルは、組織化の方向性を含むがそれに限定されない、自然腎組織の様相を再現する特定の三次元細胞集合体もしくはオルガノイドの構築を方向付ける。ある実施形態において、バイオマテリアルは、管腔を含めた自然腎組織の様相を再現する、特定の尿細管構造の構築を方向付ける。ある実施形態において、バイオマテリアルは、そこに配置された細胞集団からのタンパク質、核酸および膜結合小胞の分泌を増進または促進する。概して、コンストラクトの作製に使用される1つもしくは複数のバイオマテリアルは、これらの細胞集団の起源である本来の生物環境に対応する、自然腎もしくは腎実質内部の特定の3次元組織または環境ニッチの様相を模倣または再現するように選択することもできる。こうした細胞集団の起源であった本来の生物学的ニッチを再創造することは、細胞の生存能力および効力をさらに増進または促進すると考えられる。
【００６３】
「細胞集合体」または「スフェロイド」という用語は、単層での増殖とは対照的に3D増殖を可能にするように培養された細胞の凝集体または集合体を指す。「スフェロイド」という用語が、その集合体が幾何学的に球体であることを意味しないことは、特筆される。集合体は、明確に定義された形態および方向性をもって高度に組織化されることがあるが、組織化されない塊となることもある；それは単一の細胞型を含むことがあるが、2つ以上の細胞型を含むこともある。細胞は一次単離物とすることができるが、永久細胞株であっても、その2つの組み合わせであってもよい。この定義に含まれるのは、オルガノイドおよび器官型培養である。ある実施形態において、スフェロイド（たとえば細胞集合体またはオルガノイド）は、スピナーフラスコ内で形成される、ある実施形態において、スフェロイド（たとえば細胞集合体またはオルガノイド）は、3次元マトリックス中で形成される。
【００６４】
「外気温」という用語は、本明細書の製剤が被験者に投与されることになる温度を指す。概して、外気温は、温度調節された環境の温度である。外気温は約18℃から約30℃までの範囲に及ぶ。ある実施形態において、外気温は、約18℃、約19℃、約20℃、約21℃、約22℃、約23℃、約24℃、約25℃、約26℃、約27℃、約28℃、約29℃、または約30℃である。
【００６５】
「ハイドロゲル」という用語は、有機ポリマー（天然もしくは合成）が共有結合、イオン結合または水素結合を介して架橋されて、水分子を捕捉してゲルを形成する3次元開放格子構造を生じるときに形成される物質を指して、本明細書で使用される。ハイドロゲルを形成するために使用することができる材料の例には、イオンで架橋された、アルギン酸などの多糖類、ポリホスファジンおよびポリアクリレート、またはそれぞれ温度もしくはpHにより架橋された、プルロニック（Pluronic）（商標名）もしくはTetronic（商標名）などのブロックコポリマー、ポリエチレンオキシド-ポリプロピレングリコールブロックコポリマーがある。本明細書で使用されるハイドロゲルは、生分解性のゼラチンベースのハイドロゲルであることが好ましい。
【００６６】
「Neo-Kidney Augment (NKA)」という用語は、ゼラチンベースのハイドロゲルからなるバイオマテリアル中で製剤された、自己の選択された腎細胞（SRC）からなる注射可能製剤である、生物活性細胞製剤を指す。
【００６７】
本明細書で使用される「腎疾患」という用語は、血液を濾過し、血液から余分な水分、電解質、および老廃物を除去する機能を果たす、腎臓の能力の喪失をもたらす、あらゆる病期もしくは程度の急性もしくは慢性腎不全を伴う疾患を表す。腎疾患は、貧血などの内分泌機能不全（エリスロポエチン欠乏）、および無機質不均衡（ビタミンD欠乏）も含むことがある。腎疾患は腎臓で起こることもあるが、さまざまな疾患に続発することもあり、そうした疾患には心不全、高血圧、糖尿病、自己免疫疾患、または肝疾患が含まれる（が、それに限定されない）。腎疾患は、急性腎損傷後に発症する慢性腎不全の状態であることもある。たとえば、虚血および/または中毒物質への暴露による腎損傷は急性腎不全を引き起こす可能性がある；急性腎損傷後の不完全な回復は慢性腎不全の発症につながることがある。
【００６８】
「治療」という用語は、腎疾患、尿細管輸送不全、または糸球体濾過不全に対する治療的処置および予防対策の両方を表すが、その目的は、標的疾患を回復に向かわせ、防止し、進行を遅くする（減少させる）ことである。治療を必要とする人は、すでに腎疾患、尿細管輸送不全、または糸球体濾過不全を有する人、または腎疾患、尿細管輸送不全、または糸球体濾過不全を予防すべき人を含む。本明細書で使用される「治療」という用語は、腎機能の安定化および/または改善を含む。
【００６９】
本明細書で使用される「in vivo接触」という用語は、富化された細胞集団による分泌産物と自然臓器とのin vivo直接接触を意味する。たとえば、富化された腎細胞集団（または腎細胞/腎細胞画分を含有する混合物もしくはコンストラクト）による分泌産物は、自然腎とin vivoで接触しうる。in vivo直接接触は、本来、パラ分泌、内分泌、または接触分泌とすることができる。分泌される産物は、本明細書に記載のさまざまな産物の不均一集団とすることができる。
【００７０】
「被験者」という用語は、治療を受けるのにふさわしい、患者を含めた、任意の一人のヒト被験者を意味するものとするが、この被験者は腎疾患の、1つもしくは複数の徴候、症状または他の指標を経験しているかまたは、経験したことがある。このような被験者には、新規に診断されたか、または以前に診断されて再発もしくは再燃を現在経験している被験者、または理由に関わらず腎疾患のリスクがある被験者が含まれるが、それらに限定されない。被験者は、すでに腎疾患の治療を受けた可能性があるが、そうでない可能性もある。
【００７１】
「患者（患畜）」という用語は、治療が望まれる任意の一個体の動物、より好ましくは哺乳動物（たとえば、イヌ、ネコ、ウマ、ウサギ、動物園の動物、ウシ、ブタ、ヒツジ、および非ヒト霊長類などの非ヒト動物を含む）を指す。もっとも好ましくは、本明細書において患者はヒトである。
【００７２】
「サンプル」または「患者サンプル」または「生体サンプル」という用語は、総じて、被験者もしくは患者、体液、体組織、細胞株、組織培養または他の起源から得られる任意の生物学的サンプルを意味するものとする。その用語は、たとえば、腎生検などの組織生検を含む。その用語は、たとえば、培養された哺乳動物腎細胞などの培養細胞を含む。組織生検および培養細胞を哺乳動物から得るための方法は当技術分野でよく知られている。「サンプル」という用語が単独で使用される場合、それはやはり、「サンプル」が「生体サンプル」または「患者サンプル」であること、すなわちそれらの用語が区別せずに使用されることを意味するものとする。「テストサンプル」という用語は、本明細書の方法によって治療された被験者に由来するサンプルを指す。テストサンプルは、哺乳動物被験体のさまざまな起源に由来する可能性があり、血液、精液、血清、尿、骨髄、粘膜、組織などが含まれるが、それに限定されない。
【００７３】
「対照」または「対照サンプル」という用語は、陰性もしくは陽性対照を表し、この陰性もしくは陽性の結果がテストサンプルでの結果を相互に関連付けるのに役立つことが期待される。本明細書に適した対照としては、正常な腎機能に特徴的な指標を示すことが判明しているサンプル、腎疾患のないことが判明している被験者から得られたサンプル、ならびに腎疾患を有することが判明している被験者から得られたサンプルがあるが、それに限定されない。それに加えて、対照は、本明細書の方法で治療される前に被験者から得られたサンプルとすることができる。さらに適当な対照は、任意のタイプまたは病期の腎疾患を有することが判明している被験者から得られるテストサンプル、および、いかなるタイプまたは病期の腎疾患も有していないことが判明している被験者から得られたサンプルとすることができる。対照は、正常で健康な対応対照とすることができる。当業者は、本明細書において使用するのに適した他の対照を正しく認識することができる。
【００７４】
「再生予後（regeneration prognosis）」、「再生的予後（regenerative prognosis）」または「再生の予後」は総じて、本明細書に記載の細胞集団、混合物またはコンストラクトの投与または移植に関する、可能性の高い再生経過または結果の予想もしくは予測を意味する。再生予後について、予想もしくは予測は、下記のうち1つもしくはいくつかによって特徴付けられると考えられる：移植もしくは投与後の機能的臓器（たとえば腎臓）の改善、移植もしくは投与後の機能的腎臓の発生、移植もしくは投与後の改善された腎機能もしくは能力の出現、ならびに移植もしくは投与後の自然腎による特定マーカーの発現。
【００７５】
「再生臓器」は、本明細書に記載の細胞集団、混合物またはコンストラクトの移植もしくは投与後の自然臓器を表す。再生臓器は、さまざまな指標によって特徴づけられ、それには、自然臓器における機能もしくは能力の出現、自然臓器における機能もしくは能力の改善、疾患に関連する特定のマーカーおよび生理学的指標の改善、ならびに自然臓器における特定のマーカーの発現が含まれるがそれらに限定されない。当業者は、他の指標が再生臓器を特徴づけるのに適している可能性があることを理解することができる。
【００７６】
「再生腎臓」は、本明細書に記載の細胞集団、混合物、またはコンストラクトの移植もしくは投与後の自然腎を指す。再生腎臓は、さまざまな指標によって特徴づけられ、それには、自然腎における機能もしくは能力の出現、自然腎における機能もしくは能力の改善、腎疾患に関連する特定のマーカーおよび生理学的指標の改善、ならびに自然腎における特定のマーカーの発現があるがそれに限定されない。当業者は、他の指標が再生腎臓を特徴づけるのに適している可能性があることを理解することができる。
【００７７】
2. 細胞集団
ある実施形態において、本明細書の製剤は、腎疾患の治療用に、特定の生物活性成分または細胞型について富化され、ならびに/または、特定の不活性な、もしくは望ましくない成分または細胞型を欠く、単離された腎細胞の不均一集団、および/もしくはその混合物を含有することができるが、それはすなわち、腎機能の安定化および/または改善および/または再生をもたらすものであり、たとえばPresnell et al. U.S. 8,318,484 およびIlagan et al. PCT/US2011/036347に既に記載されており、その内容はすべて参照により本明細書に組み入れられる。製剤は、単離された腎細胞画分を含有することができる。製剤は、健康な個体と比べて細胞成分を欠いているが治療的性質は保持している、すなわち、腎機能の安定化および/または改善および/または再生をもたらす、単離された腎細胞を含有することができる。本明細書に記載の、細胞集団、細胞画分、および/または細胞混合物は、健康な個体、腎疾患を有する個体、または本明細書に記載の被験者から得ることができる。
【００７８】
本明細書は、単離された細胞集団、細胞画分、混合物、富化された細胞集団、細胞集合体、オルガノイド、尿細管およびその他の3次元組織様構造体、ならびにそれらの任意の組み合わせを含むがそれに限定されない、さまざまな生物活性細胞集団とともに使用するのに適した、本項に記載の製剤を提供する。ある実施形態において、生物活性細胞集団は生物活性腎細胞である。ある実施形態において、生物活性細胞集団は、内皮細胞を添加した生物活性腎細胞である。ある実施形態において、ある実施形態において、生物活性細胞集団は、間葉系、内皮細胞系もしくは上皮細胞系の幹細胞または前駆細胞を添加した生物活性腎細胞である。ある実施形態において、生物活性細胞集団は、脂肪組織の間質血管細胞群に由来する細胞を添加した生物活性腎細胞である。ある実施形態において、生物活性細胞集団から得られる分泌産物のみが最終コンストラクトに組み入れられる。このような分泌産物には、エキソソーム、miRNA、分泌型サイトカインおよび増殖因子、細胞外小胞、脂質および馴化培地を含めることができるがそれに限らない。
【００７９】
生物活性細胞集団
実施形態において、本項で与えられる治療用組成物または製剤は、特定の生物活性成分もしくは細胞型について富化された、および/または、特定の不活性な、もしくは不要な、成分または細胞型を欠いた、単離された不均一な腎細胞集団を含有する。実施形態において、このような組成物および製剤は、腎疾患の治療に使用され、たとえば腎臓の機能および/または構造の、安定化および/または改善および/または再生をもたらす。実施形態において、組成物は、健康な個体と比べて細胞成分を欠いているが、治療的性質は保持している、単離された腎細胞画分を含有し、たとえば腎機能の安定化および/または改善および/または再生をもたらす。実施形態において、本項に記載の細胞集団は、健康な個体、腎疾患を有する個体、または本項に記載の被験者から得ることができる。
【００８０】
被験体の標的臓器もしくは組織に投与されることになる、選択された腎細胞集団の治療用組成物は、本明細書に含まれる。実施形態において、生物活性のある選択された腎細胞集団は、概して、被験者への投与で治療的特性を有する可能性のある細胞集団を指す。実施形態において、生物活性腎細胞集団は、必要のある被験者への投与で、被験体の腎機能の安定化および/または改善および/または修復および/または再生をもたらすことができる。実施形態において、治療的特性は修復または再生効果を含み得る。
【００８１】
実施形態において、腎細胞集団は、腎臓に由来する未分画不均一細胞集団または富化均一細胞集団である。実施形態において、不均一細胞集団は、組織生検から、または全臓器組織から単離される。実施形態において、腎細胞集団は、組織生検または全臓器組織から確立された哺乳動物細胞のin vitro培養から得られる。実施形態において、腎細胞集団は、生物活性成分（たとえば生物活性腎細胞）を富化し、不活性な、または不必要な、成分もしくは細胞をなくした、腎細胞不均一集団の亜分画もしくは亜集団を含む。
【００８２】
実施形態において、腎細胞集団は、GGTおよびサイトケラチンを発現する。実施形態において、GGTは、約10%、約15%、約18%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、または約60%より高い発現レベルを有する。実施形態において、GGTはGGT-1である。実施形態において、腎細胞集団の細胞は、GGT-1、サイトケラチン、VEGF、およびKIM-1を発現する。実施形態において、腎細胞集団の18%より多くの細胞が、GGT-1を発現する。実施形態において、腎細胞集団の80%より多くの細胞が、サイトケラチンを発現する。実施形態において、サイトケラチンは、CK8、CK18、CK19およびそれらの組み合わせから選択される。実施形態において、サイトケラチンは、CK8、CK18、CK19、CK8/CK18、CK8/CK19、CK18/CK19またはCK8/CK18/CK19であって、この“/”はそれに隣り合うサイトケラチンの組み合わせを意味する。実施形態において、サイトケラチンは、約80%、約85%、約90%、または約95%より高い発現レベルを有する。腎細胞集団の80%より多くの細胞が、サイトケラチンを発現する。実施形態において、腎細胞集団はAQP2を発現する。実施形態において、40%未満の細胞がAQP2を発現する。実施形態において、腎細胞集団の少なくとも3%の細胞がAQP2を発現する。
【００８３】
実施形態において、細胞集団内の18%より多くの細胞がGGT-1を発現し、細胞集団内の80%より多くの細胞がサイトケラチンを発現する。実施形態において、サイトケラチンはCK18である。実施形態において、細胞集団内の4.5%〜81.2％の細胞がGGT-1を発現し、細胞集団内の3.0%〜53.7%の細胞がAQP2を発現し、細胞集団内の81.1%〜99.7%の細胞がCK18を発現する。
【００８４】
実施形態において、腎細胞集団は、AQP1、AQP2、AQP4、カルビンディン、カルポニン、CD117、CD133、CD146、CD24、CD31 (PECAM-1)、CD54 (ICAM-1)、CD73、CK18、CK19、CK7、CK8、CK8、CK18、CK19、CK8およびCK18およびCK19の組み合わせ、コネキシン43、キュビリン、CXCR4 (フーシン)、DBA、E-カドヘリン (CD324)、EPO (エリスロポエチン)、GGT1、GLEPP1 (糸球体上皮タンパク質1)、ハプトグロビン、Itgbl (インテグリンβ1)、KIM-1 (腎障害分子-1)、T1M-1 (T細胞免疫グロブリンおよびムチン含有分子)、MAP-2(微小管結合タンパク質2)、メガリン、N-カドヘリン、ネフリン、NKCC (Na-K-Cl-コトランスポーター)、OAT-1 (有機アニオントランスポーター1)、オステオポンチン、Pan-カドヘリン、PCLP1 (ポドカリキシン様1分子)、ポドシン、SMA (平滑筋αアクチン)、シナプトポジン、THP (タム・ホースフォールタンパク質)、ビメンチン、およびαGST-1 (αグルタチオンS-トランスフェラーゼ)から選択されるバイオマーカーの任意の組み合わせのうち1つもしくはいくつかを発現する細胞を含有する。
【００８５】
実施形態において、腎細胞集団は、腎組織生検における細胞の集団またはその初代培養物などの、出発集団と比べて上皮細胞が富化されている（たとえば、腎細胞集団は、出発集団より少なくとも約5%、10%、15%、20%、または25%多い上皮細胞を含む）。実施形態において、腎細胞集団は、腎組織生検における細胞の集団またはその初代培養物などの、出発集団と比べて尿細管細胞が富化されている（たとえば、腎細胞集団は、出発集団より少なくとも約5%、10%、15%、20%、または25%多い尿細管細胞を含む）。実施形態において、尿細管細胞は近位尿細管細胞を含む。実施形態において、腎細胞集団は、出発集団と比べて少ない割合の遠位尿細管細胞、集合尿細管細胞、内分泌細胞、血管細胞、または前駆細胞様細胞を含有する。実施形態において、腎細胞集団は、出発集団より少ない割合の遠位尿細管細胞を含有する。実施形態において、腎細胞集団は、出発集団より少ない割合の集合尿細管細胞を含有する。実施形態において、腎細胞集団は、出発集団より少ない割合の内分泌細胞を含有する。実施形態において、腎細胞集団は、出発集団より少ない割合の血管細胞を含有する。実施形態において、腎細胞集団は、出発集団より少ない割合の前駆細胞様細胞を含有する。実施形態において、腎細胞集団は、非富化集団（たとえば、出発腎細胞集団）より高い割合の尿細管細胞、ならびに低い割合のEPO産生細胞、糸球体細胞、および血管細胞を含有する。実施形態において、腎細胞集団は、非富化集団より高い割合の尿細管細胞、ならびに低い割合のEPO産生細胞および血管細胞を含有する。実施形態において、腎細胞集団は、非富化集団よび高い割合の尿細管細胞、ならびに低い割合の糸球体細胞および血管細胞を含有する。
【００８６】
実施形態において、腎細胞集団の細胞は、ヒアルロン酸（HA）を発現する。実施形態において、HAの分子量範囲は約5 kDaから約20000 kDaまでである。実施形態において、HAは、5 kDa、60 kDa、800 kDa、および/または3000 kDaの分子量を有する。実施形態において、腎細胞集団は、特に腎臓内移植後に、ヒアルロン酸合成酵素2（HAS-2）の発現によって高分子量HAを合成し、および/または高分子量HAの合成を刺激する。実施形態において、腎細胞集団の細胞は、HAS-2の作用によって、in vitroおよび/またはin vivoで比較的高分子量のHAを発現する。実施形態において、腎細胞集団の細胞は、HAS-2の作用によって、in vitroでもin vivoでも比較的高分子量のHAを発現する。実施形態において、比較的高分子量のHA分子種は、少なくとも100 kDaの分子量を有するHAである。実施形態において、比較的高分子量のHA分子種は、約800 kDaから約3500 kDaまでの分子量を有するHAである。実施形態において、比較的高分子量のHA分子種は、約800 kDaから約3000 kDaまでの分子量を有するHAである。実施形態において、比較的高分子量のHA分子種は、少なくとも800 kDaの分子量を有するHAである。実施形態において、比較的高分子量のHA分子種は、少なくとも3000 kDaの分子量を有するHAである。実施形態において、比較的高分子量のHA分子種は、約800 kDaの分子量を有するHAである。実施形態において、比較的高分子量のHA分子種は、約3000 kDaの分子量を有するHAである。実施形態において、HAS-2は2x105から2x106 Daまでの分子量を有するHAを合成する。実施形態において、比較的小さいHA分子種が、分解性ヒアルロニダーゼの作用によって生成される。実施形態において、比較的高分子量のHA分子種は、約200 kDaから約2000 kDaまでの分子量を有するHAである。実施形態において、比較的高分子量のHA分子種は、約200 kDaの分子量を有するHAである。実施形態において、比較的高分子量のHA分子種は、約2000 kDaの分子量を有するHAである。実施形態において、比較的高分子量のHA分子種は、少なくとも200 kDaの分子量を有するHAである。実施形態において、比較的高分子量のHA分子種は、少なくとも2000 kDaの分子量を有するHAである。実施形態において、比較的高分子量のHA分子種は、少なくとも5000 kDaの分子量を有するHAである。実施形態において、比較的高分子量のHA分子種は、少なくとも10000 kDaの分子量を有するHAである。実施形態において、比較的高分子量のHA分子種は、少なくとも15000 kDaの分子量を有するHAである。実施形態において、比較的高分子量のHA分子種は、約20000 kDaの分子量を有するHAである。
【００８７】
実施形態において、集団は、受容体を介したアルブミン輸送の能力を有する細胞を含有する。
【００８８】
実施形態において、腎細胞集団の細胞は低酸素抵抗性である。
【００８９】
実施形態において、腎細胞集団は、メガリン、キュビリン、N-カドヘリン、E-カドヘリン、アクアポリン-1、およびアクアポリン-2の任意の組み合わせの1つもしくはいくつかを発現する、1つもしくは複数の細胞型を含有する。
【００９０】
実施形態において、腎細胞集団は、メガリン、キュビリン、ヒアルロン酸合成酵素2 (HAS2)、ビタミンD3 25-ヒドロキシラーゼ (CYP2D25)、N-カドヘリン (Ncad)、E-カドヘリン (Ecad)、アクアポリン-1 (Aqp1)、アクアポリン-2 (Aqp2)、RAB17、RASがん遺伝子ファミリーメンバー(Rab17)、GATA結合タンパク質3 (Gata3)、FXYDドメイン含有イオン輸送制御因子4 (Fxyd4)、溶質輸送体ファミリー9 (ナトリウム水素交換輸送体)・メンバー4 (Slc9a4)、アルデヒドデヒドロゲナーゼ3ファミリー・メンバーB1 (Aldh3b1)、アルデヒドデヒドロゲナーゼ1ファミリー・メンバーA3 (Aldh1a3)、およびカルパイン8 (Capn8)の任意の組み合わせの1つもしくはいくつかを発現する、1つもしくは複数の細胞型を含有する。
【００９１】
実施形態において、腎細胞集団は、メガリン、キュビリン、ヒアルロン酸合成酵素2 (HAS2)、ビタミンD3 25-ヒドロキシラーゼ (CYP2D25)、N-カドヘリン (Ncad)、E-カドヘリン (Ecad)、アクアポリン-1 (Aqp1)、アクアポリン-2 (Aqp2)、RAB17、RASがん遺伝子ファミリーメンバー(Rab17)、GATA結合タンパク質3 (Gata3)、FXYDドメイン含有イオン輸送制御因子4 (Fxyd4)、溶質輸送体ファミリー9 (ナトリウム水素交換輸送体)・メンバー4 (Slc9a4)、アルデヒドデヒドロゲナーゼ3ファミリー・メンバーB1 (Aldh3b1)、アルデヒドデヒドロゲナーゼ1ファミリー・メンバーA3 (Aldh1a3)、およびカルパイン8 (Capn8)、およびアクアポリン-4 (Aqp4)の任意の組み合わせの1つもしくはいくつかを発現する、1つもしくは複数の細胞型を含有する。
【００９２】
実施形態において、腎細胞集団は、アクアポリン7 (Aqp7)、FXYDドメイン含有イオン輸送制御因子2 (Fxyd2)、溶質輸送体ファミリー17 (リン酸ナトリウム)・メンバー3 (Slc17a3)、溶質輸送体ファミリー3・メンバー1 (Slc3a1)、クローディン2 (Cldn2)、Napsin Aアスパラギン酸ペプチダーゼ(Napsa)、溶質輸送体ファミリー2 (グルコース促進輸送体（facilitated glucose transporter）)・メンバー2 (Slc2a2)、アラニン(膜)アミノペプチダーゼ(Anpep)、膜貫通タンパク質27 (Tmem27)、アシル-CoA合成酵素中鎖ファミリーメンバー2 (Acsm2)、グルタチオンペルオキシダーゼ3 (Gpx3)、フルクトース-1,6-ビスホスファターゼ1 (Fbp1)、アラニン-グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ2 (Agxt2)、血小板内皮細胞接着分子(Pecam)、およびポドシン(Podn)の任意の組み合わせの1つもしくはいくつかを発現する、1つもしくは複数の細胞型を含有する。
【００９３】
実施形態において、腎細胞集団は、PECAM、VEGF、KDR、HIF1a、CD31、CD146、ポドシン(Podn)、およびネフリン(Neph)、ケモカイン(C-X-Cモチーフ)受容体4 (Cxcr4)、エンドセリン受容体B型(Ednrb)、V型コラーゲンα2 (Col5a2)、カドヘリン5 (Cdh5)、組織プラスミノゲン活性化因子(Plat)、アンジオポエチン2 (Angpt2)、キナーゼ挿入ドメインタンパク質受容体(Kdr)、分泌型システインリッチ酸性タンパク質(オステオネクチン) (Sparc)、セルグリシン(Srgn)、TIMPメタロペプチダーゼインヒビター3 (Timp3)、ウィルムス腫瘍1 (Wt1)、ウイングレス型MMTV統合部位ファミリー（wingless-type MMTV integration site family）・メンバー4 (Wnt4)、Gタンパク質シグナル伝達制御因子4 (Rgs4)、エリスロポエチン(EPO)の任意の組み合わせの1つもしくはいくつかを発現する、1つもしくは複数の細胞型を含有する。
【００９４】
実施形態において、腎細胞集団は、PECAM、vEGF、KDR、HIF1a、ポドシン、ネフリン、EPO、CK7、CK8/18/19の任意の組み合わせの1つもしくはいくつかを発現する、1つもしくは複数の細胞型を含有する。
【００９５】
実施形態において、腎細胞集団は、PECAM、vEGF、KDR、HIF1a、CD31、CD146の任意の組み合わせの1つもしくはいくつかを発現する、1つもしくは複数の細胞型を含有する。
【００９６】
実施形態において、腎細胞集団は、ポドシン(Podn)およびネフリン(Neph)の任意の組み合わせの1つもしくはいくつかを発現する、1つもしくは複数の細胞型を含有する。
【００９７】
実施形態において、腎細胞集団は、PECAM、vEGF、KDR、HIF1a、およびEPOの任意の組み合わせの1つもしくはいくつかを発現する、1つもしくは複数の細胞型を含有する。
【００９８】
実施形態において、サンプルまたは細胞集団中のさまざまなバイオマーカーの存在（たとえば発現）および/またはレベル/量は、数多くの方法によって分析することができるが、その方法の多くは当技術分野で周知であって、当業者に理解されており、そうした方法には、免疫組織化学 (“IHC”)、ウェスタンブロット分析、免疫沈降法、分子結合アッセイ、ELISA、ELIFA、蛍光活性化セルソーティング(“FACS”)、MassARRAY、プロテオミクス、生化学的酵素活性アッセイ、in situハイブリダイゼーション、サザン解析、ノーザン解析、全ゲノム配列解析、定量的リアルタイムPCR (“qRT-PCR”)および他の増幅型検出法 (たとえば、分岐DNA法、SISBA、TMAなど)を含むポリメラーゼ連鎖反応(“PCR”)、RNA-Seq、FISH、マイクロアレイ解析、遺伝子発現プロファイリング、および/または遺伝子発現プロファイリング技術 (“SAGE”)、ならびにタンパク質、遺伝子、および/または組織アレイ解析によって実施されるさまざまなアッセイのいずれか1つ、などがあるがそれらに限定されない。遺伝子および遺伝子産物の状態を評価するためのプロトコルに関する限定的でない例としては、ノーザンブロット法、サザンブロット法、免疫ブロット法、およびPCR分析が挙げられる。実施形態において、Rules Based MedicineまたはMeso Scale Discoveryから入手できるマルチプレックスイムノアッセイも使用することができる。実施形態において、サンプルもしくは細胞集団中のさまざまなバイオマーカーの存在（たとえば発現）および/またはレベル/量は、数多くの方法によって分析することが可能であって、その方法の多くは当技術分野で周知であり、当業者に理解されているが、そうした方法には、ゲノムワイドなトランスクリプトミクス、プロテオミクス、セクレトミクス（secretomics）、リピドミクス、ホスファトミックス(phospatomics)、エキソソミクス（exosomics）などといった「-オミクス」（“-omics”）プラットフォームがあり、これに限らないが、このハイスループットな方法は、計算生物学およびバイオインフォマティクス技術と連動して、検討中の細胞集団によって発現される、ならびに発現されない、遺伝子、miRNA、タンパク質、分泌型タンパク質、脂質などの完全な生物学的シグネチャーを明らかにする。
【００９９】
実施形態において、腎細胞集団中の2つ以上のバイオマーカーの存在を検出する方法は、抗体とその関連リガンド（すなわちバイオマーカー）との結合を可能にする条件下で、バイオマーカーに対する抗体とサンプルを接触させること、ならびに、たとえば、抗体とバイオマーカーとの間で複合体が形成されているかを見分けることによって、結合した抗体の存在を検出することを含む。実施形態において、1つもしくは複数のバイオマーカーの存在は、免疫組織化学的方法によって検出される。本明細書で使用される「検出する」という用語は、定量的検出および/または定性的検出を含む。
【０１００】
実施形態において、腎細胞集団は、本明細書に記載のバイオマーカーの検出を可能にする1つもしくは複数の試薬、たとえば、AQP1、AQP2、AQP4、カルビンディン、カルポニン、CD117、CD133、CD146、CD24、CD31 (PECAM-1)、CD54 (ICAM-1)、CD73、CK18、CK19、CK7、CK8、CK8/18、CK8/18/19、コネキシン43、キュビリン、CXCR4 (フーシン)、DBA、E-カドヘリン(CD324)、EPO (エリスロポエチン)、GGT1、GLEPP1 (糸球体上皮タンパク質1)、ハプトグロビン、Itgbl (インテグリンp)、KIM-1 (腎障害分子-1)、T1M-1 (T細胞免疫グロブリンおよびムチン含有分子)、MAP-2 (微小管結合タンパク質2)、メガリン、N-カドヘリン、ネフリン、NKCC (Na-K-Cl-コトランスポーター)、OAT-1 (有機アニオントランスポーター1)、オステオポンチン、Pan-カドヘリン、PCLP1 (ポドカリキシン様1分子)、ポドシン、SMA (平滑筋αアクチン)、シナプトポジン、THP (タム・ホースフォールタンパク質)、ビメンチン、およびαGST-1 (αグルタチオンS-トランスフェラーゼ)などを用いて同定される。実施形態において、バイオマーカーはモノクローナルまたはポリクローナル抗体によって検出される。
【０１０１】
実施形態において、細胞の起源は、対象とする標的臓器もしくは組織と同一である。実施形態において、BRCおよびSRCは、腎臓に投与される製剤に使用するために、腎臓から得ることができる。実施形態において、細胞集団は、腎生検から得られる。実施形態において、細胞集団は、全腎臓組織から得られる。実施形態において、細胞集団は、腎生検もしくは全腎臓組織から確立された、哺乳動物腎細胞のin vitro培養から得られる。
【０１０２】
実施形態において、BRCおよびSRCは、生物活性腎細胞の不均一な混合物もしくは画分を含む。実施形態において、BRCおよびSRCは、健康な個体から得ることができるが、あるいは、健康な個体からの本人の腎細胞画分である。実施形態において、（たとえば腎臓もしくは腎生検において）健康な個体の腎細胞集団と比べて特定の細胞型を欠いている可能性がある、健康でない個体から得られた腎細胞集団もしくは画分が、本明細書に含まれる。実施形態において、健康な個体と比べて細胞型を欠いた、治療的活性のある細胞集団が与えられる。実施形態において、細胞集団は自己細胞集団から単離して増殖させる。
【０１０３】
実施形態において、SRCは、腎生検によって患者の腎皮質組織から得られる腎細胞を単離して増殖させることによって得られる。実施形態において、腎細胞は酵素消化によって腎組織から単離され、標準的な細胞培養技術によって増殖させて、その増殖腎細胞から密度境界、バリアーもしくは界面を超える遠心分離によって選択される。実施形態において、腎細胞は酵素消化によって腎組織から単離され、標準的な細胞培養技術によって増殖させて、その増殖腎細胞から、連続もしくは不連続の単一段階または多段階密度勾配遠心分離によって選択される。実施形態において、SRCは主として腎上皮細胞からなり、それは再生能のあることで知られている。実施形態において、他の実質（血管）細胞および間質細胞が、自己SRC集団に含まれていることもある。
【０１０４】
実施形態において、生物活性腎細胞は、腎組織から酵素消化によって単離され、標準的な細胞培養技術によって増殖させた腎細胞から得られる。実施形態において、細胞培養培地は、再生能力のある生物活性腎細胞を増殖させるように作製される。実施形態において、細胞培養培地は、組換え分化因子もしくは精製分化因子を含有しない。実施形態において、増殖させた腎細胞の不均一混合物は、再生能力のある細胞の組成をさらに増やすために、低酸素条件下で培養される。理論に縛られるつもりはないが、これは、以下の現象のうち1つもしくはいくつかに起因する可能性がある：1) 低酸素培養期間中の特定の細胞成分の選択的な生存、死、または増殖；2) 低酸素培養に反応して細胞の粒度および／または大きさが変化し、それによって浮遊密度、ならびにその後の、密度勾配分離、または密度境界、バリアーもしくは界面を超える遠心分離の際の局在性に変化をもたらすこと；ならびに3) 低酸素培養に反応して細胞遺伝子/タンパク質発現が変化し、その結果として単離増殖集団において細胞の性質の差異をもたらすこと。
【０１０５】
実施形態において、生物活性腎細胞集団は、腎臓再生能を有する細胞を富化する培養条件下での腎組織（生検で得られる組織など）由来の腎細胞の単離および増殖から得られる。
【０１０６】
実施形態において、腎組織（生検で得られる組織など）から得られる腎細胞は、増殖させた生物活性腎細胞（腎臓再生能力を有する細胞を富化した細胞集団など）を生じるために、1、2、3、4、5、または6回以上継代される。実施形態において、腎組織（生検で得られる組織など）から得られる腎細胞は、増殖させた生物活性腎細胞を生じるために、1回継代される。実施形態において、腎組織（生検で得られる組織など）から得られる腎細胞は、増殖させた生物活性腎細胞を生じるために、2回継代される。実施形態において、腎組織（生検で得られる組織など）から得られる腎細胞は、増殖させた生物活性腎細胞を生じるために、3回継代される。実施形態において、腎組織（生検で得られる組織など）から得られる腎細胞は、増殖させた生物活性腎細胞を生じるために、4回継代される。実施形態において、腎組織（生検で得られる組織など）から得られる腎細胞は、増殖させた生物活性腎細胞を生じるために、5回継代される。実施形態において、細胞の継代は生物活性のない腎細胞の細胞集団を激減（枯渇）させる。実施形態において、細胞の継代は、少なくとも1つの細胞型の細胞集団を激減させる。実施形態において、細胞の継代は、1.095 g/mlより密度の高い細胞の細胞集団を激減させる。実施形態において、細胞の継代は、粒度の低い小さな細胞の細胞集団を激減させる。実施形態において、細胞の継代は、赤血球より小さい細胞の細胞集団を激減させる。実施形態において、細胞の継代は、直径が6μm未満の細胞の細胞集団を激減させる。実施形態において、細胞の継代は、直径が2μm未満の細胞の細胞集団を激減させる。実施形態において、細胞の継代は、赤血球より粒度の低い細胞の細胞集団を激減させる。実施形態において、細胞集団の生存率は、1回または2回以上の継代後に増加する。実施形態において、小さい細胞および低い粒度という記述は、蛍光活性化セルソーティング（FACS）によって、たとえば細胞の出現箇所の散布図のX-Y軸を用いて細胞を分析したときに使用される。
【０１０７】
実施形態において、増殖させた生物活性腎細胞は、低酸素条件下で、少なくとも約6、9、10、12、もしくは24時間で48時間未満の間、または6から9時間までの間、または6から48時間までの間、または12から15時間までの間、または約8時間、または約12時間、または約24時間、または約36時間、または約48時間の間、培養される。実施形態において、低酸素条件で培養された細胞は、密度に基づいて選択される。実施形態において、生物活性腎細胞集団は、（たとえば、継代および/または低酸素条件下で培養後の）増殖させた腎細胞の、連続もしくは不連続の（単一段階もしくは多段階）密度勾配分離後に得られた、選択された腎細胞（SRC）集団である。実施形態において、生物活性腎細胞集団は、（たとえば、継代および/または低酸素条件下での培養後の）増殖させた腎細胞の、密度境界、バリアー、または界面を超える遠心分離による分離後に得られた、選択された腎細胞（SRC）集団である。実施形態において、低酸素培養条件は、細胞が、細胞が大気中の酸素レベル（約21%）で培養される標準培養条件と比べて、培養系において利用できる酸素レベルの低下にさらされる培養条件である。実施形態において、低酸素培養条件下で培養される細胞は、約5%から約15%、または約5%から約10%、または約2%から約5%、または約2%から約7%、または約2%、または約3%、または約4%、または約5%の酸素レベルで培養される。実施形態において、SRCは、約1.0419 g/mLより高い浮遊密度を示す。実施形態において、SRCは、約1.04 g/mLより高い浮遊密度を示す。実施形態において、SRCは、約1.045 g/mLより高い浮遊密度を示す。実施形態において、BRCまたはSRCは、出発腎細胞集団と比べて、1つもしくは複数の細胞集団をより高い割合で含有し、他の1つもしくは複数の細胞集団を欠いているか、またはそれらが不足している。
【０１０８】
実施形態において、増殖させた腎細胞は、SRCを得るために密度勾配分離を受けることができる。実施形態において、連続もしくは不連続の、単一段階もしくは多段階密度勾配遠心分離は、細胞浮遊密度に基づいて、収集された腎細胞集団を分離するために使用される。実施形態において、増殖させた生物活性腎細胞は、SRCを得るために、密度境界、バリアーまたは界面を超える遠心分離によって分離することができる。実施形態において、密度境界または界面を超える遠心分離は、細胞浮遊密度に基づいて、収集された腎細胞集団を分離するために使用される。実施形態において、SRCは、一つにはOPTIPREP (Axis-Shield)培地を使用することによって作製されるが、この培地は非イオン性ヨウ素化合物イオジキサノールの60% (w/v)水溶液を含有する。しかしながら、生物活性腎細胞を得るために、他の培地、密度勾配（連続もしくは不連続）、密度境界、バリアー、界面、または他の手段、たとえば、本明細書に記載の細胞集団の単離に必要な特徴を有する、当技術分野で公知の細胞表面マーカーを用いた免疫学的分離、を使用することができることは、当業者に理解されるであろう。実施形態において、約1.04 g/mLより高い浮遊密度を示す細胞画分が、遠心分離後に別個のペレットとして集められる。実施形態において、1.04 g/mLより低い浮遊密度を維持する細胞は除外され、廃棄される。実施形態において、約1.0419 g/mLより高い浮遊密度を示す細胞画分が、遠心分離後に別個のペレットとして集められる。実施形態において、1.0419 g/mLより低い浮遊密度を維持する細胞は除外され、廃棄される。実施形態において、約1.045 g/mLより高い浮遊密度を示す細胞画分が、遠心分離後に別個のペレットとして集められる。実施形態において、1.045 g/mLより低い浮遊密度を維持する細胞は除外され、廃棄される。
【０１０９】
実施形態において、細胞浮遊密度は、SRC集団を得るために、および/または、腎細胞集団が生物活性腎細胞であるかを判断するために使用される。実施形態において、細胞浮遊密度は、生物活性腎細胞を単離するために用いられる。実施形態において、細胞浮遊密度は、単一段階OptiPrep (7%イオジキサノール；60% (w/v)、OptiMEM中)密度界面を超える（単一段階不連続密度勾配）遠心分離によって測定される。OptiPrepは、60% w/vイオジキサノール水溶液である。典型的な密度界面または単一段階不連続密度勾配に使用される場合、OptiPrepは、OptiMEM (細胞培養基本培地)により7%イオジキサノール（水およびOptiMEM中）の終濃度となるように希釈される。OptiMEMの調製は、HEPESおよび炭酸水素ナトリウムで緩衝化し、ヒポキサンチン、チミジン、ピルビン酸ナトリウム、L-グルタミンまたはGLUTAMAX、微量元素、および増殖因子を添加する、イーグル最小必須培地の改変である。タンパク質レベルは最小（15 μg/mL）であり、インスリンおよびトランスフェリンが、わずかにタンパク質添加物である。フェノールレッドがpH指示薬として低濃度で含まれる。実施形態において、OptiMEMは使用前に2-メルカプトエタノールを添加することができる。
【０１１０】
実施形態において、OptiPrep溶液が調製され、望ましい密度を示す屈折率が使用前に測定される（R.I. 1.3456 +/- 0.0004）。実施形態において、腎細胞は、溶液の上部に層をなす。実施形態において、密度界面または単一段階不連続密度勾配は、遠心管（50mlコニカルチューブ）または細胞処理装置（たとえばCOBE 2991）の中で、室温にて20分間800gで（ブレーキなしで）遠心される。実施形態において、約1.04 g/mLより高い浮遊密度を示す細胞画分は、遠心分離後に別個のペレットとして集められる。実施形態において、1.04 g/mLより低い浮遊密度を維持する細胞は除外され、廃棄される。実施形態において、約1.0419 g/mLより高い浮遊密度を示す細胞画分は、遠心分離後に別個のペレットとして集められる。実施形態において、1.0419 g/mLより低い浮遊密度を維持する細胞は除外され、廃棄される。実施形態において、約1.045 g/mLより高い浮遊密度を示す細胞画分は、遠心分離後に別個のペレットとして集められる。実施形態において、1.045 g/mLより低い浮遊密度を維持する細胞は除外され、廃棄される。実施形態において、細胞密度の評価または密度に基づく選択の前に、細胞は、それが少なくとも50%コンフルエントとなるまで培養され、一晩（たとえば少なくとも約8時間から12時間）、37℃にて5% CO2雰囲気下で2%酸素に設定された低酸素インキュベーターの中でインキュベートされる。
【０１１１】
実施形態において、腎臓サンプルから得られる細胞を増殖させた後、処理し（たとえば、低酸素および遠心分離）、SRC集団を作製する。実施形態において、SRC集団は、本明細書に記載の試薬および方法を用いて作製される。実施形態において、SRC集団の細胞を被験者に投与する前に、その集団由来の細胞サンプルの生存能力を調べる。実施形態において、SRC集団の細胞を被験者に投与する前に、その集団由来の細胞サンプルの、本明細書に記載のマーカーのうち1つもしくはいくつかの発現を調べる。
【０１１２】
SRCを調製するための組成物および方法の限定的でない例が、U.S. Patent Application Publication No. 2017/0281684 A1に記載されており、その全体は参照により本明細書に組み入れられる。
【０１１３】
実施形態において、BRCまたはSRCは、天然の自己もしくは同種の腎臓サンプルから得られる。実施形態において、BRCまたはSRCは、非自己腎臓サンプルから得られる。実施形態において、サンプルは腎生検で得ることができる。
【０１１４】
実施形態において、腎細胞の単離および増殖は、腎上皮細胞および間質細胞を含む、腎細胞型の混合物をもたらす。実施形態において、SRCは、増殖させた腎細胞の、連続もしくは不連続密度勾配分離によって得られる。実施形態において、密度勾配分離されたSRC集団中の主要な細胞型は尿細管上皮表現型の細胞型である。実施形態において、SRCは、密度境界、バリアーまたは界面を超える遠心分離により、増殖させた腎細胞を分離することによって得られる。実施形態において、密度境界/バリアー/界面を超えて分離されるSRC集団中の主要な細胞型は、尿細管上皮表現型の細胞型である。実施形態において、増殖させた腎細胞から得られるSRCの特性は、多方面からのアプローチで評価される。実施形態において、腎細胞増殖過程の間、細胞の形態、増殖速度、および細胞生存率がモニターされる。実施形態において、SRC浮遊密度および生存率は、密度勾配媒体上または密度勾配媒体を通した遠心分離およびトリパンブルー色素排除によって特徴づけられる。実施形態において、SRC表現型はフローサイトメトリーによって特徴づけられ、SRC機能はVEGFおよびKIM-1の発現によって実証される。実施形態において、プレフォーミュレーションであるSRCの細胞機能は、近位尿細管に存在する2つの特異的酵素；GGT (γ-グルタミルトランスペプチダーゼ) およびLAP (ロイシンアミノペプチダーゼ)の活性を測定することによっても評価することができる。
【０１１５】
実施形態において、密度媒体を介した細胞亜集団の分離に寄与する細胞の特徴（サイズおよび粒度）を利用して、細胞亜集団をフローサイトメトリーで分離することができる（前方散乱 = フローサイトメトリーによるサイズの反映、ならびに側方散乱 = 粒度の反映）。実施形態において、密度勾配または分離媒体は、対象とする特定の細胞に対して毒性が低くなければならない。実施形態において、密度媒体は、対象とする特定の細胞に対して低い毒性を有するべきであるが、本明細書は、対象とする細胞の選択プロセスに役割を果たす媒体の使用を考慮する。実施形態において、理論に拘束されることを望むものではないが、ローディングステップと回収ステップの間に細胞の相当な損失があるので、イオジキサノール含有媒体によって回収される本明細書に記載の細胞集団は、イオジキサノール抵抗性であるようであり、密度勾配、または密度境界、密度バリアーもしくは密度界面の条件下でのイオジキサノールへの暴露が、特定の細胞の排除をもたらすことを示唆する。実施形態において、イオジキサノール密度勾配または密度界面分離後に現れる細胞は、イオジキサノールおよび/または密度勾配または界面暴露のあらゆる悪影響に対して抵抗性である。実施形態において、軽度から中程度までの腎毒素を含有する造影剤が、たとえばSRC集団などの細胞集団の単離および/または選択に使用される。実施形態において、SRCはイオジキサノール抵抗性である。実施形態において、密度媒体は、ヒト血漿中のタンパク質と結合してはならず、対象とする細胞の重要な機能に悪影響を及ぼしてはならない。
【０１１６】
実施形態において、細胞集団は、蛍光活性化セルソーティング（FACS）を用いて1つもしくは複数の腎細胞型を富化および/または減少させた。実施形態において、BD FACSAria（商標名）または同等の製品を用いて腎細胞型を富化および/または減少させることができる。実施形態において、FACSAria III（商標名）または同等の製品を用いて腎細胞型を富化および/または減少させることができる。
【０１１７】
実施形態において、細胞集団は、磁気細胞分離を用いて、1つもしくは複数の腎細胞型を富化および/または減少させた。実施形態において、Miltenyi autoMACS（登録商標）システムまたは同等の製品を用いて1つもしくは複数の腎細胞型を富化および/または減少させることができる。
【０１１８】
実施形態において、腎細胞集団は3次元培養に供された。実施形態において、細胞集団を培養する方法は、連続灌流による。実施形態において、3次元培養および連続灌流によって培養された細胞集団は、静置培養された細胞集団と比べて、高い細胞充実性および相互結合性を示す。実施形態において、3次元培養および連続灌流によって培養された細胞集団は、そうした細胞集団の静置培養物と比べて、EPOの高い発現、ならびにE-カドヘリンなどの尿細管関連遺伝子の発現強化を示す。実施形態において、連続灌流によって培養された細胞集団は、静置培養された細胞集団より高レベルのグルコースおよびグルタミン消費を示す。
【０１１９】
実施形態において、本明細書に提供される細胞集団を調製する方法で低酸素条件を使用することができる。実施形態において、細胞集団を調製する方法は、低酸素を条件付けるステップなしで使用することができる。実施形態において、正常酸素圧条件を使用することができる。
【０１２０】
実施形態において、腎細胞集団は、腎組織から単離および/または培養した。腎細胞成分、たとえば治療用の製剤に使用される富化細胞集団、を分離および単離するための方法の限定的でない例を本明細書に記載するが、これには腎疾患、貧血、EPO欠損、尿細管輸送欠損、および糸球体濾過欠損の治療を含む。実施形態において、細胞集団は、新たに消化された、すなわち機械的もしくは酵素的に消化された腎臓組織から、または哺乳動物腎細胞の不均一なin vitro培養物から単離される。
【０１２１】
実施形態において、腎細胞集団は、EPO産生腎細胞を含有する。実施形態において、被験者は貧血および/またはEPO欠損を有する。実施形態において、EPO産生腎細胞集団は、EPOの発現、および酸素に対する生物学的応答を特徴としており、培養系の酸素圧の低下は、結果としてEPO発現の誘導をもたらす。実施形態において、EPO産生細胞集団は、EPO産生細胞が富化されている。実施形態において、EPO発現は、細胞集団が、標準大気中レベル（約21%）の有効酸素で培養される細胞集団と比べて、細胞が培養系の有効酸素レベルの低下にさらされる条件下で培養されたときに、誘導される。実施形態において、低酸素条件で培養されたEPO産生細胞は、標準酸素条件で培養されたEPO産生細胞より高レベルのEPOを発現する。概して、低下したレベルの有効酸素（低酸素培養条件ともいわれる）における細胞の培養とは、低下した酸素のレベルが、標準大気中レベルの有効酸素（正常培養条件もしくは正常酸素圧培養条件ともいわれる）における細胞培養と比較して、低下していることを意味する。実施形態において、低酸素細胞培養条件は、約1%未満の酸素、約2%未満の酸素、約3%未満の酸素、約4%未満の酸素、または約5%未満の酸素で細胞を培養することを含む。実施形態において、正常培養条件もしくは正常酸素圧培養条件は、約10%酸素、約12%酸素、約13%酸素、約14%酸素、約15%酸素、約16%酸素、約17%酸素、約18%酸素、約19%酸素、約20%酸素、または約21%酸素で細胞を培養することを含む。
【０１２２】
実施形態において、約5%未満の有効酸素で細胞を培養し、EPO発現レベルを大気中（約21%）酸素で培養された細胞と比較することによって、EPOの誘導もしくは発現の増加が得られ、これを観察することができる。実施形態において、EPOを発現する能力を有する細胞の培養物において、細胞培養物がある程度の期間、大気中酸素（約21%）で培養される第1培養期、および、有効酸素レベルを低下させ、同じ細胞が約5%未満の有効酸素で培養される第2培養期を含む方法によって、EPOの誘導が得られる。実施形態において、低酸素条件に反応するEPO発現は、HIF1αによって制御される。実施形態において、当技術分野で知られている他の酸素操作培養条件を、本明細書に記載の細胞のために使用することができる。
【０１２３】
実施形態において、製剤は、灌流条件に対する生物学的反応性（たとえばEPO発現）を特徴とするEPO産生哺乳動物細胞の富化集団を含有する。実施形態において、灌流条件には、一過性、間欠性、または連続性の流体流動（灌流）が含まれる。実施形態において、細胞を培養する培地を間欠的または連続的に循環させて、流れを介して動的な力が細胞に伝えられるように攪拌した場合、EPO発現は機械的に誘導される。実施形態において、一過性、間欠性、または連続性流体流動にさらされる細胞は、それらの細胞が、フレームワーク、および/またはそうした3次元構造が形を成すスペースを提供する材料の中で、またはその表面上に、3次元構造として存在するように培養される。実施形態において、細胞は多孔質ビーズ上で培養され、揺動プラットフォーム、軌道周回プラットフォーム、またはスピナーフラスコを用いて、間欠的または連続的な流体流動にさらされる。実施形態において、細胞は3次元足場材料上で培養され、デバイスの中にセットされるが、その足場は、そのデバイスによって固定されており、流体がその足場を通過して、または横切って流れる。当業者には当然のことながら、当技術分野で知られている他の灌流培養条件を、本明細書に記載の細胞のために使用することができる。
【０１２４】
実施形態において、細胞集団は腎生検から得られる。実施形態において、細胞集団は全腎臓組織から得られる。実施形態において、細胞集団は、腎生検または全腎臓組織から樹立された哺乳動物腎細胞のin vitro培養から得られる。実施形態において、腎細胞集団は、SRC集団である。実施形態において、細胞集団は未分画細胞集団であって、本明細書では非富化細胞集団とも称される。
【０１２５】
さまざまな活性作用物質（たとえば腎細胞以外）を含有する組成物は本明細書に含まれる。適当な活性作用物質の非限定的な例としては、細胞凝集体、無細胞バイオマテリアル、生物活性細胞からの分泌産物、高分子および低分子治療薬、ならびにそれらの組み合わせがあるがそれに限定されない。たとえば、ある生物活性細胞型は、治療用分子または別の生物活性細胞型とともに、またはそれらなしで、バイオマテリアルベースのマイクロキャリアと組み合わせることができる。実施形態において、非付着性細胞を無細胞粒子と組み合わせることができる。
【０１２６】
実施形態において、腎細胞集団の細胞はスフェロイドの中に存在する。実施形態において、腎細胞集団は、スフェロイドの形をとる。実施形態において、生物活性腎細胞を含有するスフェロイドは被験者に投与される。実施形態において、スフェロイドは、少なくとも1つの非腎細胞型または細胞集団を含有する。実施形態において、スフェロイドは、(i)生物活性腎細胞集団および非腎細胞集団を組み合わせること、ならびに(ii)その生物活性腎細胞集団および非腎細胞集団を、スフェロイドが形成されるまで、スピナーフラスコを含む3次元培養系で培養すること、を含む方法で作製される。
【０１２７】
実施形態において、非腎細胞集団は、内皮細胞集団および内皮前駆細胞集団を含む。実施形態において、生物活性細胞集団は内皮細胞集団である。実施形態において、内皮細胞集団は細胞株である。実施形態において、内皮細胞集団はヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を含む。実施形態において、非腎細胞集団は、間葉系幹細胞集団である。実施形態において、非腎細胞集団は、造血系、乳房、腸、胎盤、肺、骨髄、血液、臍帯、内皮、歯髄、脂肪、神経、嗅神経、神経堤、または精巣起源の幹細胞集団である。実施形態において、非腎細胞集団は、脂肪由来前駆細胞集団である。実施形態において、細胞集団は、異種、同系、同種、自己の集団、またはその組み合わせである。実施形態において、生物活性腎細胞集団および非腎細胞集団は、0.1:9.9から9.9:0.1までの割合で培養される。実施形態において、生物活性腎細胞集団および非腎細胞集団は、約1:1の割合で培養される。実施形態において、腎細胞集団および生物活性細胞集団は増殖培地中に懸濁される。
【０１２８】
増殖させた生物活性腎細胞はさらに、連続もしくは不連続密度媒体分離に供し、SRCを得ることができる。具体的には、連続もしくは不連続の、単一段階もしくは多段階の密度勾配遠心分離を用いて、収集された腎細胞集団を細胞浮遊密度に基づいて分離する。ある実施形態において、増殖させた生物活性腎細胞はさらに、密度境界、バリアー、または界面を超える遠心による分離に供し、SRCを得ることができる。具体的には、密度境界、バリアー、または界面を超える遠心分離を用いて、収集された腎細胞集団を細胞浮遊密度に基づいて分離する。ある実施形態において、SRCは、一つには、非イオン性ヨウ素化合物イオジキサノールの60%水溶液を含有するOPTIPREP (Axis-Shield)媒体を用いて作製される。しかしながら、当業者には、たとえば、本明細書の細胞集団の分離に必要な特徴を有する当技術分野で公知の細胞表面マーカーを用いた免疫学的分離など、特定の媒体もしくは他の手段に限らず、任意の密度勾配媒体を、本明細書にしたがって使用することができることが認識されるであろう。たとえば、パーコール（Percoll）またはショ糖を用いて、密度勾配もしくは密度境界を形成することができる。ある実施形態において、約1.04 g/mLより高い浮遊密度を示す細胞画分は、遠心分離後に別個のペレットとして集められる。ある実施形態において、1.04 g/mLより低い浮遊密度を維持する細胞は排除され廃棄される。ある実施形態において、約1.0419 g/mLより高い浮遊密度を示す細胞画分は、遠心分離後に別個のペレットとして集められる。ある実施形態において、1.0419 g/mLより低い浮遊密度を維持する細胞は排除され廃棄される。ある実施形態において、約1.045 g/mLより高い浮遊密度を示す細胞画分は、遠心分離後に別個のペレットとして集められる。ある実施形態において、1.045 g/mLより低い浮遊密度を維持する細胞は排除され廃棄される。
【０１２９】
本明細書の治療用組成物およびその製剤は、腎疾患の治療に使用するために、特定の生物活性成分もしくは細胞型を富化し、および/または、特定の不活性もしくは不要な成分もしくは細胞型を減少させた、すなわち、腎臓の機能および/または構造の安定化および/または改善および/または再生をもたらす、単離された腎細胞の不均一集団および/またはその混合物を含有することができるが、これは、たとえば、Presnell et al. U.S. 8,318,484およびIlagan et al. PCT/US2011/036347に既に記載されており、その全体を参照により本明細書に含めるものとする。組成物は、健康な個体と比べて細胞成分を欠いているが治療的特性は保持している、すなわち腎機能の安定化および/または改善および/または再生をもたらす、単離された腎細胞画分を含有することができる。本明細書に記載の細胞集団、細胞画分、および/または細胞混合物は、健康な個体、腎臓病の個体、または本明細書に記載の被験者から得ることができる。
【０１３０】
本明細書は、必要のある被験者の標的臓器もしくは組織に投与されることになる、選択された腎細胞集団の治療用組成物を考慮する。生物活性のある選択された腎細胞集団は総じて、被験者への投与において治療的特性を有する可能性のある細胞集団を指す。たとえば、必要のある被験者への投与によって、生物活性腎細胞集団は、被験者の腎機能の安定化および/または改善および/または修復および/または再生をもたらすことができる。治療的特性には再生効果を含めることができる。
【０１３１】
ある実施形態において、細胞の起源は対象とする標的臓器もしくは組織と同じである。たとえば、BRCおよび/またはSRCは腎臓から得られ、腎臓に投与される製剤に使用することができる。ある実施形態において、細胞集団は腎生検から得られる。ある実施形態において、細胞集団は全腎臓組織から得られる。他の実施形態において、細胞集団は、腎生検もしくは全腎臓組織から樹立された、哺乳動物腎細胞のin vitro培養から得られる。ある実施形態において、BRCおよび/またはSRCは、生物活性腎細胞の不均一混合物もしくは画分を含有する。BRCおよび/またはSRCは、健康な個体から得ることが可能であって、すなわち健康な個体から得られるそれ自身の腎細胞画分である。それに加えて、本明細書は、健康でない個体から得られる腎細胞画分であって、健康な個体の対応する腎細胞画分と比べて、特定の細胞成分を欠く可能性があるが、それでも治療的特性は依然として保持している前記腎細胞画分を提供する。本明細書はまた、健康な個体と比べて細胞成分を欠いた、治療活性のある細胞集団を提供するが、その細胞集団は、ある実施形態において、さまざまな病期の自己の起源から単離して増殖させることができる。
【０１３２】
ある実施形態において、SRCは、患者の腎生検による腎皮質組織から腎細胞を単離して増殖させることから得られる。腎細胞は、酵素消化によって腎組織から単離され、標準的な細胞培養技術によって増殖させて、密度境界、バリアー、または界面を超える増殖腎細胞の遠心分離によって選択される。この実施形態において、SRCは、主として尿細管上皮細胞からなり、これはその再生能力で知られている（Bonventre JV. Dedifferentiation and proliferation of surviving epithelial cells in acute renal failure. J Am Soc Nephrol. 2003;14(Suppl. 1):S55-61; Humphreys BD, Czerniak S, DiRocco DP, et al. Repair of injured proximal tubule does not involve specialized progenitors. PNAS. 2011;108:9226-31; Humphreys BD, Valerius MT, Kobayashi A, et al. Intrinsic epithelial cells repair the kidney after injury. Cell Stem Cell. 2008;2:284-91）他の実質（血管）細胞および間質細胞が自己SRC集団に存在していてもよい。ある実施形態において、腎細胞は、連続もしくは不連続の単一段階もしくは多段階勾配による遠心分離によって選択される。
【０１３３】
本項に記載のように、本明細書は、一つには、生物活性成分を富化し、不活性もしくは不要な成分を減少させた、腎細胞の不均一集団の特定の亜分画が、出発集団より優れた治療および再生の成果をもたらすという驚くべき知見に基づいている。
【０１３４】
腎細胞の単離および増殖は、尿細管上皮細胞および間質細胞を含めた腎細胞型の混合物を与える。上記のように、SRCは、密度境界、バリアー、または界面を超える遠心分離によって、増殖させた腎細胞を分離することにより得られる。分離されたSRC集団の主要な細胞型は、尿細管上皮表現型の細胞型である。増殖させた腎細胞から得られるSRCの特徴は、多方面からのアプローチによって評価される。腎細胞増殖過程の間、細胞の形態、増殖速度、および細胞生存率をモニターする。SRC浮遊密度および生存率は、密度境界面およびトリパンブルー色素排除によって、特徴づけられる。SRC表現型はフローサイトメトリーによって特徴づけられ、SRC機能はVEGFおよびKIM-1の発現によって実証される。
【０１３５】
当業者には当然のことながら、当技術分野で知られている分離および培養の他の方法を本明細書に記載の細胞に使用することができる。やはり当業者には当然のことながら、具体的に上記に挙げられる以外の起源、たとえば、限定はしないが、腎臓、体液および脂肪以外の組織および臓器から生物活性細胞集団を得ることができる。
【０１３６】
SRC表現型
ある実施形態において、細胞表現型はフローサイトメトリーを用いた腎細胞マーカーの発現解析によってモニターされる。細胞の表現型分析は、分析しようとする細胞型に特異的な抗原マーカーの利用に基づく。フローサイトメトリー分析は、分析しようとする抗原マーカーを発現するサンプル集団中の細胞について定量的指標を与える。
【０１３７】
腎細胞の表現型を特徴づけるために有用な、さまざまなマーカーが文献に報告されている：(i) サイトケラチン；(ii) 輸送に関する膜タンパク質（アクアポリンおよびキュビリン）；(iii) 細胞結合分子（adherin（アドヘリン）およびレクチン、およびその他のタンパク質）；ならびに(iv) 代謝酵素（グルタチオンおよびγグルタミルトランスペプチダーゼ（GGT））。（表１）全腎臓消化物から得られる培養物中の細胞の大部分は、上皮および内皮細胞であるので、調べられるマーカーは、これら2群に通常関連しているタンパク質の発現に重点を置く。
【０１３８】
【表１】
2020512406.tif 000003
表2は、選択されたマーカー、SRC集団における表現型の範囲およびパーセント平均値、ならびにそれらの選択の論理的根拠を提供する。
【０１３９】
【表２】
2020512406.tif 000004
【０１４０】
細胞機能
SRCは馴化培地の分析によって検出することができるタンパク質を活発に分泌する。細胞機能は、細胞がPrestoBlueを代謝する能力、ならびにVEGF（血管内皮増殖因子）およびKIM-1（腎障害分子1）を分泌する能力によって評価される。
【０１４１】
表3は、腎細胞およびSRC培養物から得られた馴化培地中に存在するVEGFおよびKIM-1の量を示す。腎細胞はほぼコンフルエンスとなるまで培養された。その腎細胞培養物への一晩の暴露から得られた馴化培地のVEGFおよびKIM-1を調べた。
【０１４２】
【表３】
2020512406.tif 000005
【０１４３】
SRC酵素活性
プレフォーミュレーションであるSRCの細胞機能は、腎臓近位尿細管に存在する2つの特異的酵素；GGT（γグルタミルトランスペプチダーゼ）およびLAP（ロイシンアミノペプチダーゼ）の活性を測定することによっても評価することができる。
【０１４４】
選択された腎細胞組成物が本明細書に記載されているが、本明細書は、腎臓以外の組織および臓器から得られる細胞および細胞混合物を含めた、さまざまな他の活性作用物質を含有する組成物を考慮する。他の適当な活性作用物質としては、細胞凝集体およびオルガノイド、無細胞バイオマテリアル、生物活性細胞からの分泌産物、高分子および低分子治療薬、ならびにそれらの組み合わせがあるがそれらに限定されない。たとえば、ある生物活性細胞型を、治療用分子または別の生物活性細胞型を有する、または有さないバイオマテリアルベースのマイクロキャリアと組み合わせることができる。ある実施形態において、非付着性細胞を無細胞粒子と組み合わせることができる。
【０１４５】
細胞凝集体
他の態様において、本明細書の製剤は、細胞凝集体またはスフェロイドを含有する。ある実施形態において、細胞凝集体は、本明細書に記載の生物活性細胞集団を含む。ある実施形態において、細胞凝集体は、たとえば、腎細胞混合物、富化された腎細胞集団などの生物活性腎細胞、ならびに、腎細胞画分および腎細胞混合物と、間葉系幹細胞、内皮前駆細胞、脂肪の間質血管細胞群に由来する細胞、または無制限にその他の任意の非腎細胞集団との組み合わせを含む。
【０１４６】
ある実施形態において、本明細書の生物活性腎細胞は、本項でさらに説明される3Dフォーマットで培養することができる。一部の実施形態において、「オルガノイド」という用語は、自然腎の様相を再現する表現型および/または機能を有する細胞の集積を意味する。一部の実施形態において、オルガノイドは、さまざまな系譜の細胞の混合集団を含んでおり、それらは典型的には所与の組織内にin vivoで見られるものである。一部の実施形態において、本明細書のオルガノイドは、in vitroで任意の方法によって形成されるが、本明細書の細胞はその方法によって集合体を形成し、それが次にスフェロイド、オルガノイド、またはそれらの組み合わせを形成することができる。このような集合体、スフェロイド、またはオルガノイドは、一部の実施形態において、特定の臓器と合致する構造を呈する。一部の実施形態において、このような集合体、スフェロイド、またはオルガノイドは、典型的には特定の臓器の細胞によって発現される表面マーカーを発現する。一部の実施形態において、このような集合体、スフェロイド、またはオルガノイドは、典型的には特定の臓器の細胞によって発現される、化合物もしくは材料を産生する。ある実施形態において、本明細書の細胞は、たとえばゼラチンなどの天然基質上で培養することができる。ある実施形態において、本明細書の細胞は、たとえばPLGAなどの合成基質上で培養することができる。
【０１４７】
3. バイオマテリアル
さまざまなバイオマテリアルを活性作用物質と組み合わせて、本明細書の治療用製剤を提供することができる。バイオマテリアルは、適当な任意の形態（たとえばビーズ）もしくは形状（たとえば液体、ゲルなど）をとることができる。Bertram et al. U.S. Published Application 20070276507 (参照によりそのまま本明細書に含められる)に記載されるように、ポリマーマトリックスもしくは足場はいくつもの望ましい形態に形作ることができ、総合的なシステム、形状もしくはスペースの制限をいくらでも満足させることができる。一部の実施形態において、バイオマテリアルは、液体懸濁物の形をとる。ある実施形態において、本明細書のマトリックスもしくは足場は3次元であって、臓器もしくは組織構造の寸法および形状に適合するように形作ることができる。たとえば、腎疾患、尿細管輸送欠損もしくは糸球体濾過欠損を治療するための高分子足場の使用において、自然腎組織構造および組織化の様相もしくはその全体、ならびに腎実質のそれを再現する3次元（3-D）マトリックスを使用することができる。
【０１４８】
さまざまに形の異なる3-D足場を使用することができる。当然、ポリマーマトリックスは、大きさの異なる患者に合わせて、さまざまなサイズと形状に形作ることができる。ポリマーマトリックスは、患者の特別なニーズに応えるために他の方法で形作られることもある。ある実施形態において、ポリマーマトリックスまたは足場は、生体適合性の多孔質高分子足場とすることができる。足場は、さまざまな合成もしくは天然由来の材料から形成され、そうした材料には、オープンセルポリ乳酸（OPLA(登録商標)）、セルロースエーテル、セルロース、セルロースエステル、フッ素化ポリエチレン、フェノール類、ポリ-4-メチルペンテン、ポリアクリロニトリル、ポリアミド、ポリアミドイミド、ポリアクリル酸塩、ポリベンゾオキサゾール、ポリカーボネート、ポリシアノアリールエーテル、ポリエステル、ポリエステルカーボネート、ポリエーテル、ポリエーテルエーテルケトン、ポリエーテルイミド、ポリエーテルケトン、ポリエーテルスルホン、ポリエチレン、ポリフルオロオレフィン、ポリイミド、ポリオレフィン、ポリオキサジアゾール、ポリフェニレンオキサイド、ポリフェニレンスルファイド、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリスルファイド、ポリスルホン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリチオエーテル、ポリトリアゾール、ポリウレタン、ポリビニル、フッ化ポリビニリデン、再生セルロース、シリコーン、尿素ホルムアルデヒド、コラーゲン類、ゼラチン、アルギン酸塩、ラミニン、フィブロネクチン、絹、エラスチン、アルギン酸塩、ヒアルロン酸、アガロース、またはそれらのコポリマーもしくは物理的ブレンドがあるがそれらに限定されない。足場材料の形態は、柔らかい多孔質の足場から、形を保持できる硬い多孔質の足場まで多岐にわたる可能性がある。ある実施形態において、足場は、たとえば融点を上回っているハイドロゲルなどの、ハイドロゲルとなりうる液体溶液として構成される。
【０１４９】
ある実施形態において、足場はヒトもしくは動物起源の実在する腎臓もしくは他の臓器から得られるが、その場合、天然の細胞集団は、当業者に公知の界面活性剤および/または他の化学薬品および/または他の酵素的および/または物理的方法の適用によって除去されている。この実施形態において、供給源となる臓器の天然の3次元構造は、関連するすべての細胞外マトリックス成分とともに、それらの天然の生物活性のある状況で保持される。ある実施形態において、足場は、ヒトもしくは動物の腎臓または他の臓器から得られる細胞外マトリックスである。ある実施形態において、配置構成は、3次元バイオプリンティング法を適用することによって、組織様構造となるように構築される。ある実施形態において、配置構成はハイドロゲルとなりうる溶液の液体形態をとる。
【０１５０】
ハイドロゲルはさまざまなポリマー材料から形成され、さまざまな生物医学的応用に有用である。ハイドロゲルは、親水性ポリマーの3次元ネットワークとして物理的に説明することができる。ハイドロゲルの種類に応じて、さまざまな割合の水を含有するが、水にまったく溶解しない。含水量が高いにもかかわらず、ハイドロゲルは、親水性残基が存在するため、大量の液体とさらに結合することができる。ハイドロゲルはそのゼラチン状の構造を変化させることなく、大幅に膨潤する。ハイドロゲルの基本的な物理的特性は、使用されるポリマーの性質およびハイドロゲルを投与するために使用されるデバイスに応じて、個別に変更することができる。
【０１５１】
ハイドロゲル材料は炎症反応を引き起こさないことが好ましい。ハイドロゲルを形成するために使用することができる他の材料の例には、(a) 修飾アルギン酸、(b) 1価カチオンへの暴露によりゲル化する多糖類（たとえばジェランガムおよびカラギーナン）、(c) 非常に粘性のある液体であるか、または揺変性であって、構造のゆっくりとした進化によって徐々にゲルを形成する多糖類（たとえばヒアルロン酸）、(d) ゼラチンもしくはコラーゲン、ならびに(e) ハイドロゲルポリマー前駆物質（たとえば、ポリエチレンオキサイド-ポリプロピレングリコールブロックコポリマーおよびタンパク質）が挙げられる。U.S. Pat. No. 6,224,893 B1は、本明細書にしたがってハイドロゲルを作製するのに適した、さまざまなポリマー、およびそうしたポリマーの化学的性質について詳細な説明を提供する。
【０１５２】
特定の実施形態において、本明細書のバイオマテリアルを調製するために使用されるハイドロゲルは、ゼラチンベースである。ゼラチンは、コラーゲンから得られる、毒性のない生分解性の水溶性タンパク質であって、間葉組織細胞外マトリックス（ECM）の主要な構成成分である。コラーゲンは、動物体のさまざまな結合組織内の細胞外空間における主要な構造タンパク質である。結合組織の主成分として、哺乳類ではもっとも大量に存在するタンパク質であって、全身タンパク質含量の25%から35%を構成している。石灰化の程度に応じて、コラーゲン組織は、硬く（骨）、伸展性があり（腱）、または硬いものから伸展性のあるものまで変化の度合いがある（軟骨）。細長い小線維の形をとるコラーゲンは、腱、靭帯、および皮膚などの線維組織におもに存在する。コラーゲンは、角膜、軟骨、骨、血管、消化管、椎間板、および歯の象牙質にも多く存在する。筋肉組織において、コラーゲンは筋内膜の主成分として機能を果たす。コラーゲンは筋肉組織の1〜2%を構成し、強い腱質の筋肉の重量の6%を占める。コラーゲンは体中の多くの場所に存在する。しかしながら、人体のコラーゲンの90%より多くを占めるのはI型である。
【０１５３】
これまでに、28種類のコラーゲンが同定され、報告されている。そうしたコラーゲンは、それらが形成する構造にしたがっていくつかのグループに分けることができる：線維性（I、II、III、V、XI型）、非線維性FACIT（断続性三重らせんを有する線維付随性コラーゲン）（IX、XII、XIV、XVI、XIX型）、短鎖（VIII、X型）、基底膜（IV型）、マルチプレキシン（複数の中断を有する多数の三重らせんドメイン）（XV、XVIII型）、MACIT（断続性三重らせんを有する膜結合型コラーゲン）（XIII、XVII型）、その他（VI、VII型）。もっとも一般的な5つの型は：I型：皮膚、腱、血管、靭帯、臓器、骨（骨の有機部分の主成分）；II型：軟骨（軟骨の主要コラーゲン成分）；III型：網状（細網線維の主成分）で、通常I型と併存する；IV型：基底層、上皮により分泌される基底膜の層を形成する；V型：細胞表面、毛髪および胎盤である。
【０１５４】
ゼラチンはアルギニン-グリシン-アスパラギン酸（RGD）配列を含む情報シグナルを保持しており、それは細胞接着、増殖および幹細胞分化を促進する。ゼラチンの特徴的な性質は、それが上部臨界共溶温度挙動（UCST）を示すことである。40℃の特定温度閾値を超えると、フレキシブルなランダム一重コイルを形成することによって水に溶解することができる。冷却すると、水素結合およびファンデルワールス相互作用が生じ、その結果、三重らせんの形成をもたらす。こうしたコラーゲン様三重らせんはジャンクションゾーンとして機能するので、ゾル-ゲル転移を引き起こす。ゼラチンは薬学および医学的応用に広く使用されている。
【０１５５】
ある実施形態において、本明細書において注射用細胞組成物を製剤するために使用されるハイドロゲルは、ブタのゼラチンに基づくものであり、これはブタの皮膚から供給可能であって、たとえばNitta Gelatin NA Inc (NC, USA)またはGelita USA Inc. (IA, USA)から市販されている。ゼラチンは、たとえば、ダルベッコのリン酸緩衝食塩水（DPBS）に溶解して、熱反応性ハイドロゲルを形成することができるが、それはさまざまな温度でゲル化および液化する可能性がある。ある実施形態において、本明細書の注射用細胞組成物を製剤するために使用されるハイドロゲルは、当業者に公知の方法によって発現され、精製された、組換えヒトもしくは動物ゼラチンに基づくものである。ある実施形態において、ヒトI型、αIコラーゲンのcDNAのすべて、または一部を含有する発現ベクターが、酵母ピキア・パストリス（Pichia pastoris）において発現される。他の発現ベクター系および生物が当業者に知られている。特定の実施形態において、本明細書のゼラチンベースのハイドロゲルは室温（22-28℃）以上で液体であり、冷蔵温度（2-8℃）に冷却するとゲル化する。
【０１５６】
当業者には当然のことながら、本明細書に記載の足場を形成するために、当技術分野で知られている他の種類の合成材料または天然由来材料を使用することができる。
【０１５７】
ある実施形態において、本明細書にしたがって使用されるバイオマテリアルは、ハイドロゲルの形をとるヒアルロン酸（HA）からなり、これは分子量5.1 kDAから>2 x 105 kDaに及ぶHA分子を含む。HAは、関連する生物活性細胞集団の、分岐形態形成および3次元自己組織化を促進することができる。ある実施形態において、本明細書にしたがって使用されるバイオマテリアルは、多孔質発泡体の形をとるヒアルロン酸からなり、やはり分子量5.1 kDAから>2 x 105 kDaに及ぶHA分子を含む。ある実施形態において、ハイドロゲルは、それに限らないが腎臓またはその他の任意の組織もしくは臓器から供給される細胞外マトリックスから得られるか、またはその細胞外マトリックスを含有する。さらに別の実施形態において、本明細書にしたがって使用されるバイオマテリアルは、ポリ乳酸（PLA）ベースの発泡体からなるが、これはオープンセル構造を有し、孔径は約50ミクロンから約300ミクロンである。
【０１５８】
温度感受性バイオマテリアル
本明細書に記載のバイオマテリアルは、たとえば、in vitroもしくはin vivoで一定の外部状況に対応するように、設計または構成することもできる。ある実施形態において、バイオマテリアルは温度感受性である（たとえば、in vitroでもin vivoでも）。ある実施形態において、バイオマテリアルは、（たとえば、in vitroでもin vivoでも）酵素分解への暴露に反応するように構成される。バイオマテリアルの外部状況への反応は、本明細書に記載のように微調整することができる。記載の製剤の温度感受性は、製剤中のバイオマテリアルの割合を調整することによって変化させることができる。たとえば、溶液中のゼラチンの割合を調整して、最終製剤中のゼラチンの温度感受性を調節することができる（たとえば液体、ゲル、ビーズなど）。あるいはまた、バイオマテリアルを化学的に架橋して、酵素分解に対する抵抗性を高めることができる。たとえば、カルボジイミドクロスリンカーを使用して、ゼラチンビーズを化学的に架橋することによって、内在性酵素に対する感受性を低下させることができる。
【０１５９】
ある態様において、本明細書に記載の製剤は、生物活性腎細胞などの活性作用物質を被験者に投与するために好ましい環境を作り出す特性を有するバイオマテリアルを組み込んでいる。ある実施形態において、製剤は、活性作用物質をバイオマテリアルとともに製剤した時から被験者に投与する時点まで、好ましい環境をもたらす第1のバイオマテリアルを含有する。他の実施形態において、好ましい環境は、被験者に投与する前の（本明細書に記載の）液体中の細胞に対して、生物活性細胞をほぼ固体状態で懸濁させることの優位性に関する。ある実施形態において、第1のバイオマテリアルは、温度感受性バイオマテリアルである。温度感受性バイオマテリアルは、(i) 8℃以下で実質的に固体状態、ならびに(ii) 外気温以上では実質的に液体状態を有する可能性がある。ある実施形態において、外気温はほぼ室温である。
【０１６０】
ある実施形態において、バイオマテリアルは、少なくとも2つの異なる相または状態を温度に応じて維持することができる、温度感受性バイオマテリアルである。バイオマテリアルは、第1の温度において第1の状態を維持し、第2の温度において第2の状態を、ならびに/または第3の温度において第3の状態を維持することができる。第1、第2または第3の状態は、実質的に固体、実質的に液体、または実質的に半固体もしくは半液体状態とすることができる。ある実施形態において、バイオマテリアルは、第1の温度において第1の状態をとり、第2の温度において第2の状態をとるが、この第1の温度は第2の温度より低い。
【０１６１】
他の実施形態において、温度感受性バイオマテリアルの状態は、8℃以下の温度において実質的に固体状態である。ある実施形態において、実質的に固体の状態は、約1℃、約2℃、約3℃、約4℃、約5℃、約6℃、約7℃、または約8℃において維持される。ある実施形態において、実質的に固体の状態はゲルの形をとる。ある実施形態において、温度感受性バイオマテリアルの状態は、外気温以上では実質的に液体状態である。ある実施形態において、実質的に液体の状態は、約25℃、約25.5℃、約26℃、約26.5℃、約27℃、約27.5℃、約28℃、約28.5℃、約29℃、約29.5℃、約30℃、約31℃、約32℃、約33℃、約34℃、約35℃、約36℃、または約37℃において維持される。ある実施形態において、外気温はほぼ室温である。
【０１６２】
ある実施形態において、温度感受性バイオマテリアルの状態は、ほぼ外気温以下の温度において実質的に固体状態である。ある実施形態において、外気温はほぼ室温である。ある実施形態において、実質的に固体の状態は、約17℃、約16℃、約15℃、約14℃、約13℃、約12℃、約11℃、約10℃、約9℃、約8℃、約7℃、約6℃、約5℃、約4℃、約3℃、約2℃、または約1℃において維持される。ある実施形態において、実質的に固体の状態はビーズの形をとる。ある実施形態において、温度感受性バイオマテリアルの状態は、約37℃以上の温度において実質的に液体の状態である。他の実施形態において、実質的に固体の状態は、約37℃、約38℃、約39℃、または約40℃において維持される。
【０１６３】
温度感受性バイオマテリアルは、溶液の形で、固体の形で、ビーズの形で、または本明細書に記載の、および/もしくは当業者に公知の、他の適当な形で、与えられる可能性がある。本明細書に記載の細胞集団および標品は、温度感受性バイオマテリアルで被覆され、その上に堆積され、それに包埋され、それに付着し、その中にシードされ（埋め込まれ）、その中に懸濁され、またはその中に捕捉される可能性がある。ある実施形態において、本明細書に記載の細胞集団は、温度感受性バイオマテリアルとともに複合体を形成する前に、3次元細胞集合体もしくはオルガノイド、または3次元管状構造として構築されていてもよいが、温度感受性バイオマテリアルとともに複合体を形成する際に上記のように構築されてもよい。あるいはまた、温度感受性バイオマテリアルは、細胞なしで、たとえばスペーサービーズの形で提供されることもある。この実施形態において、温度感受性バイオマテリアルは、再生生物活性、たとえば、血管新生、または宿主細胞集団の浸潤および遊走のために標的臓器の内部にスペースを作り出すために、純粋に消極的な役割として機能する。
【０１６４】
ある実施形態において、温度感受性バイオマテリアルは、第1の状態と第2の状態の間の遷移状態をとる。ある実施形態において、遷移状態は、温度が約8℃からほぼ外気温までの間の固体から液体への遷移状態である。ある実施形態において、外気温はほぼ室温である。他の実施形態において、固体から液体への遷移状態は、約8℃、約9℃、約10℃、約11℃、約12℃、約13℃、約14℃、約15℃、約16℃、約17℃、および約18℃のうち1つもしくは複数の温度において生じる。
【０１６５】
温度感受性バイオマテリアルは、所定の温度で、センチポアズ（cP）単位で測定される一定の粘度を有する。ある実施形態において、バイオマテリアルは、25℃において、約1 cPから約5 cP、約1.1 cPから約4.5 cP、約1.2 cPから約4 cP、約1.3 cPから約3.5 cP、約1.4 cPから約3.5 cP、約1.5 cPから約3 cP、約1.55 cPから約2.5 cP、または約1.6 cPから約2 cPの粘度を有する。ある実施形態において、バイオマテリアルは、37℃において、約1.0 cPから約1.15 cPの粘度を有する。37℃における粘度は、約1.0 cP、約1.01 cP、約1.02 cP、約1.03 cP、約1.04 cP、約1.05 cP、約1.06 cP、約1.07 cP、約1.08 cP、約1.09 cP、約1.10 cP、約1.11 cP、約1.12 cP、約1.13 cP、約1.14 cP、または約1.15 cPとすることができる。他の実施形態において、バイオマテリアルはゼラチン溶液である。ゼラチンは、溶液中に約0.5%、約0.55%、約0.6%、約0.65%、約0.7%、約0.75%、約0.8%、約0.85%、約0.9%、約0.95%、または約1% (w/v)存在する。一例を挙げると、バイオマテリアルは、PBS中0.75% (w/v)ゼラチン溶液である。ある実施形態において、この0.75% (w/v)溶液は、25℃において約1.6 cPから約2 cPの粘度を有する。ある実施形態において、その0.75% (w/v)溶液は、37℃において約1.07 cPから約1.08 cPの粘度を有する。ゼラチン溶液は、PBS、DMEM、または他の適当な溶媒中で与えられる。
【０１６６】
別の態様において、製剤は生物活性細胞を第2のバイオマテリアルと組み合わせて含有するが、このバイオマテリアルは、製剤時点から被験者への投与後の時点まで、組み合わされた細胞にとって好ましい環境を提供するものである。ある実施形態において、第2のバイオマテリアルによって提供される好ましい環境は、被験者への投与時点まで、ならびに投与後しばらくの間、構造的完全性を保持するバイオマテリアル中の細胞を投与することの優位性に関する。ある実施形態において、移植後の第2のバイオマテリアルの構造的完全性は、数分、数時間、数日、または数週間である。ある実施形態において、構造的完全性は1月未満、1週間未満、1日未満、または1時間未満である。比較的短期間の構造的完全性は、取り込まれたエレメントと、それが留置された組織もしくは臓器との相互作用に対する妨害もしくは障害となることなしに、制御された処理、配置、または分散によって、活性作用物質およびバイオマテリアルを、組織もしくは臓器内の標的部位に送達することができる製剤をもたらす。
【０１６７】
ある実施形態において、第2のバイオマテリアルは、第1のバイオマテリアルとは異なる感受性を有する温度感受性バイオマテリアルである。第2のバイオマテリアルは、(i) ほぼ外気温以下で実質的に固体の状態、ならびに(ii) 約37℃以上で実質的に液体の状態をとる可能性がある。ある実施形態において、外気温はほぼ室温である。
【０１６８】
ある実施形態において、第2のバイオマテリアルは、架橋されたビーズである。架橋ビーズは、本明細書に記載のように、架橋の程度に応じて、細かく調整可能なin vivo滞留時間を有することができる。ある実施形態において、架橋ビーズは、生物活性細胞を含有し、本明細書に記載の酵素分解に抵抗性である。本明細書の製剤は、活性作用物質、たとえば生物活性細胞と組み合わせた第2のバイオマテリアルとともに、またはそうしたバイオマテリアルなしに、第1のバイオマテリアルを活性作用物質、たとえば生物活性細胞と組み合わせて含有することができる。製剤が第2のバイオマテリアルを含有する場合、それは温度感受性ビーズおよび/または架橋ビーズとすることができる。
【０１６９】
もう1つの態様において、本明細書は、およそ数分、数時間、または数日という一定期間で分解するバイオマテリアルを含有する製剤を提供する。これは、数日、数週間、または数か月にわたってゆっくりと分解する固形物の移植に焦点を当てた多数の一連の研究とは対照的である。ある実施形態において、バイオマテリアルは以下の特徴のうち1つもしくはいくつかを有する：生体適合性、生分解性/生体吸収性、被験者への移植の前およびその間に実質的に固体の状態であること、移植後の構造的完全性（実質的に固体の状態）の喪失、ならびに細胞生存能力および増殖を支える細胞適合性のある環境。移植中に移植された粒子の間に一定の間隔をあけておくことができるバイオマテリアルの能力は、天然の組織の内部成長を増進する。バイオマテリアルはまた、固体製剤の移植を促進する。固体ユニットの挿入は、送達された材料が移植中に組織内部で分散しないようにするのに役立つので、バイオマテリアルは本明細書に記載の製剤の局在化をもたらす。細胞製剤について、固体バイオマテリアルはまた、液体中に懸濁された細胞と比較して、足場依存性細胞の安定性および生存能力を改善する。しかしながら、構造的完全性の短い持続時間は、バイオマテリアルが、移植直後に、組織の内部成長または送達された細胞/材料の宿主組織との統合に対して有意な障害をもたらさないことを意味する。
【０１７０】
ある態様において、本明細書は、実質的に固体の形で移植され、その後液化/融解され、またはそうでなくても、体内への移植後に構造的完全性を失うようなバイオマテリアルを含有する製剤を提供する。これは、液体として注入され、その後体内で固化する材料の使用に焦点を当てた、重要な一連の研究とは対照的である。
【０１７１】
生体適合性ビーズ
他の態様において、製剤は、本明細書に記載の温度感受性バイオマテリアル、ならびにバイオマテリアルを含有する生体適合性ビーズ群を含有する。ある実施形態において、ビーズは架橋されている。架橋は、当業者に公知の任意の適当な架橋剤を用いてなされるが、その架橋剤はたとえば、カルボジイミド；アルデヒド（たとえば、フルフラール、アクロレイン、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、グリセリルアルデヒド）、スクシンイミド架橋剤｛スベリン酸ビス(スルホスクシンイミジル) (BS3)、グルタル酸ジスクシンイミジル(DSG)、スベリン酸ジスクシンイミジル(DSS)、ジチオビス(プロピオン酸スクシンイミジル)、エチレン グリコールビス(スルホスクシンイミジルスクシナート)、エチレン グリコールビス(スクシンイミジルスクシナート) (EGS)、グルタル酸ビス(スルホスクシンイミジル) (BS2G)、酒石酸ジスクシンイミジル (DST)｝；エポキシド（エチレングリコール ジグリシジル エーテル、1,4-ブタンジオール ジグリシジル エーテル）；糖類（グルコースおよびアルドース糖）；スルホン酸およびp-トルエンスルホン酸；カルボニルジイミダゾール；ゲニピン；イミン；ケトン；ジフェニルホスホリルアジド (DDPA)；塩化テレフタロイル；硝酸セリウム(III)六水和物；微生物トランスグルタミナーゼ；および過酸化水素などである。当業者は、本明細書にしたがって使用される、他の適当な架橋剤および架橋法を正しく認識することができる。
【０１７２】
ある実施形態において、ビーズはカルボジイミド架橋ビーズである。カルボジイミド架橋ビーズは、1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル] カルボジイミド 塩酸塩 (EDC)、DCC - N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド (DCC)、およびN,N'-ジイソプロピルカルボジイミド (DIPC)からなる一群から選択されるカルボジイミドで架橋されている。低濃度のEDCで処理されたビーズは、多数の遊離一級アミンを有することが予想されたが、高濃度の架橋剤で処理された試料は、一級アミンの大半がアミド結合に関与していると考えられる。一級アミンとピクリルスルホン酸との共有結合によって発色するオレンジ色の強度は、分光光度法で335 nmにおいて検出可能であって、試料中に存在する一級アミンの数と比例する。サンプル中に存在するタンパク質ミリグラムに対して基準化すると、含まれる遊離アミン数と架橋に使用されるEDCの初濃度との間に逆相関を観察することができる。この結果はビーズ架橋の差異を示しており、これは反応に使用されるカルボジイミドの量によって決定される。概して、架橋ビーズは、非架橋ビーズと比べて遊離の一級アミン数の減少を示す。
【０１７３】
架橋ビーズは、架橋されていない生体適合性ビーズと比べて、酵素分解を受けにくくなっており、それによって、in vivoでの滞留時間を微調整できるビーズをもたらす。たとえば、架橋ビーズは、コラゲナーゼなどの内在性酵素に抵抗性である。架橋ビーズの提供は、下記のうち1つもしくはいくつかを促進するデリバリーシステムの一部である：(a) 付着した細胞を望ましい部位に送達し、天然組織の再生および内部成長ならびに血管供給のための空間を作り出すこと；(b) 細胞がその微小環境を確立し、機能し、再構築し、その細胞自身の細胞外マトリックス（ECM）を分泌することを可能にするほど十分に長く、その部位において存続できる能力；(c) 移植された細胞と周囲の組織との統合の促進；(d) 細胞を実質的に固体の形で移植することができる能力；(e) 組織の内部成長、新生血管形成、または送達された細胞/材料と宿主組織との統合に対して有意な障害をもたらさない短期構造的完全性；(f) 実質的に固体の形で局所的にin vivo送達することによって、移植中の組織内での細胞の分散を防止すること；(g) 液体中に懸濁された細胞と比較して、足場依存性細胞の安定性および生存能力の改善；ならびに(h) 細胞が1) 実質的に固体の形で（たとえばビーズに付着して）、ならびに2) 実質的に液体の状態で（たとえば液体中に懸濁されて）、送達される場合の二相性放出；(i) これらの生物活性細胞集団の起源である、3次元生物学的ニッチもしくは腎実質の発生反復および模倣。
【０１７４】
ある実施形態において、本明細書はゼラチンを含有する架橋ビーズを提供する。架橋されていないゼラチンビーズが生物活性細胞製剤に適していないのは、それらが速やかに完全性を失い、細胞が注入部位から消失するからである。それに対して、高度に架橋されたゼラチンビーズは、あまりにも長く注入部位に存続することが可能であって、新規のECM分泌、細胞集積、血管新生および組織再生を妨げる可能性がある。本明細書は、架橋ビーズのin vivo滞留時間を微調整することを可能にする。バイオマテリアルの生分解性を調整するために、全サンプルについてあらゆる反応条件を一定に保った一方で、さまざまな架橋剤濃度のカルボジイミドを使用する。たとえば、カルボジイミド架橋ビーズの酵素感受性は、架橋剤の濃度を約0から約1Mまで変化させることによって微調整することができる。一部の実施形態において、濃度は、約5 mM、約6 mM、約7 mM、約8 mM、約9 mM、約10 mM、約11 mM、約12 mM、約13 mM、約14 mM、約15 mM、約16 mM、約17 mM、約18 mM、約19 mM、約20 mM、約21 mM、約22 mM、約23 mM、約24 mM、約25 mM、約26 mM、約27 mM、約28 mM、約29 mM、約30 mM、約31 mM、約32 mM、約33 mM、約34 mM、約35 mM、約36 mM、約37 mM、約38 mM、約39 mM、約40 mM、約41 mM、約42 mM、約43 mM、約44 mM、約45 mM、約46 mM、約47 mM、約48 mM、約49 mM、約50 mM、約55 mM、約60 mM、約65 mM、約70 mM、約75 mM、約80 mM、約85 mM、約90 mM、約95 mM、または約100 mMである。架橋剤濃度は、約0.15 M、約0.2 M、約0.25 M、約0.3 M、約0.35 M、約0.4 M、約0.45 M、約0.5 M、約0.55 M、約0.6 M、約0.65 M、約0.7 M、約0.75 M、約0.8 M、約0.85 M、約0.9 M、約0.95 M、または約1 Mとすることもできる。ある実施形態において、架橋剤は、1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル] カルボジイミド 塩酸塩（EDC）である。ある実施形態において、EDC架橋ビーズはゼラチンビーズである。ビーズの分解％は、架橋剤の濃度に応じて微調整することができる。ある実施形態において、ゼラチンビーズは、ゼラチン以外（たとえば、それに限らないが、アルギン酸もしくはHA）のビーズもしくは微小粒子と混合されて、生物活性細胞集団を送達する効力を促すことができる。
【０１７５】
架橋ビーズは、生物活性細胞集団の播種、付着またはカプセル化に有利な一定の性質を有する可能性がある。たとえば、ビーズは多孔質表面を有し、ならびに/または、実質的に中空である可能性がある。孔の存在は、孔のないすなわち平滑な表面より多数の細胞の付着を可能にする、細胞付着表面の増加をもたらす。それに加えて、細孔構造は、新たな組織の形成を支える多孔質ビーズと宿主組織の統合をサポートすることができる。ビーズは、一般的な粒子分布パターンに対応するワイブル（Weibull）プロットに当てはめることができる粒度分布を有する。ある実施形態において、架橋ビーズは、約120μm、約115μm、約110μm、約109μm、約108μm、約107μm、約106μm、約105μm、約104μm、約103μm、約102μm、約101μm、約100μm、約99μm、約98μm、約97μm、約96μm、約95μm、約94μm、約93μm、約92μm、約91μm、または約90μm未満の平均直径を有する。架橋ビーズの特性は、キャスティング法次第でさまざまである。たとえば、気流を用いて液体ゼラチン溶液をエアロゾル化し、それを薄層クロマトグラフィー試薬噴霧器（ACE Glassware）により液体窒素中に噴霧する方法を用いて、前記の性質を有するビーズが与えられる。当業者には当然のことながら、キャスティング法のパラメーターを調整することは、ビーズのさまざまな特性、たとえばさまざまな粒度分布を目的に合わせる機会をもたらす。ある実施形態において、ビーズの微小起伏、表面および内部の特性をさらに改変して細胞付着を容易にすることができる。
【０１７６】
架橋ビーズの細胞適合性は、最終的な生物活性細胞製剤に対応する細胞とともにビーズを培養するという細胞培養技術を用いて、製剤前にin vitroで評価される。たとえば、生物活性腎細胞製剤の調製前に、ビーズを初代腎細胞とともに培養し、生細胞/死細胞アッセイを用いて細胞適合性を確認する。細胞の生存能力に加えて、細胞の代謝能力、特定の重要なサイトカインおよび増殖因子およびエキソソームの分泌、ならびに、機能的生物活性腎細胞集団と関連するmiRNAなどの、特定の重要なタンパク質および核酸マーカーの発現を測定する、特異的な機能テストが当業者によく知られており、それらをさらに使用して、架橋ビーズを有する製剤における細胞の効力を確認する。
【０１７７】
ある実施形態において、生体適合性架橋ビーズは、溶液中の温度感受性バイオマテリアルと、溶液量の約5% (w/w)から約15% (w/w)で組み合わせられる。架橋ビーズは、溶液量の約5% (w/w)、約5.5% (w/w)、約6% (w/w)、約6.5% (w/w)、約7% (w/w)、約7.5% (w/w)、約8% (w/w)、約8.5% (w/w)、約9% (w/w)、約9.5% (w/w)、約10% (w/w)、約10.5% (w/w)、約11% (w/w)、約11.5% (w/w)、約12% (w/w)、約12.5% (w/w)、約13% (w/w)、約13.5% (w/w)、約14% (w/w)、約14.5% (w/w)、または約15% (w/w)で存在しうる。
【０１７８】
別の態様において、本明細書は、およそ数分、数時間、または数日という一定期間で分解するバイオマテリアルを含有する製剤を提供する。これは、数日、数週間、または数か月にわたってゆっくりと分解する固形物の移植に焦点を当てた多数の一連の研究とは対照的である。
【０１７９】
別の態様において、本明細書は、生体適合性架橋ビーズにデリバリーマトリックスとともに生物活性細胞を入れた製剤を提供する。ある実施形態において、デリバリーマトリックスは、以下の特性のうち1つもしくはいくつかを有する：生体適合性、生分解性/生体吸収性、被験者への移植の前およびその間に実質的に固体の状態であること、移植後の構造的完全性（実質的に固体の状態）の喪失、ならびに細胞生存能力を支える細胞適合性のある環境。移植中に移植された粒子の間に一定の間隔をあけておくことができるデリバリーマトリックスの能力は、天然の組織の内部成長を増進する。デリバリーマトリックスがない場合、移植中の細胞化ビーズの圧縮は、十分な組織の内部成長のためには不十分な空間をもたらす可能性がある。デリバリーマトリックスは、固体製剤の移植を促進する。それに加えて、短期間の構造的完全性は、マトリックスが、移植直後に、組織の内部成長、新生血管形成、または送達された細胞/材料の宿主組織との統合に対して有意な障害をもたらさないことを意味する。固体ユニットの挿入は、移植中に送達された材料が組織内部で分散しないようにするのに役立つので、デリバリーマトリックスは、本明細書に記載の製剤の局在化をもたらす。ある実施形態において、本明細書に記載のデリバリーマトリックスの適用は、腎実質への送達後に排尿によって移植細胞が急速に失われることを防止するのに役立つ。細胞製剤のために、固体デリバリーマトリックスは、液体中に懸濁された細胞と比較して、足場依存性細胞の安定性および生存能力を改善する。
【０１８０】
ある実施形態において、デリバリーマトリックスは、細胞を入れられていない生体適合性ビーズの集団である。ある実施形態において、細胞の入っていないビーズは、個々の細胞入りビーズの間に、その全体にわたって分散する。細胞の入っていないビーズは、移植の前と直後に、細胞入りビーズの間で「スペーサービーズ」として機能する。スペーサービーズは、第1の温度では実質的に固体の状態をとり、第2の温度では実質的に液体の状態をとる温度感受性バイオマテリアルを含有するが、この第1の温度は第2の温度より低い。たとえば、スペーサービーズは、本明細書に記載のように、ほぼ外気温以下では実質的に固体の状態をとり、約37℃では実質的に液体の状態をとるバイオマテリアルを含有する。ある実施形態において、外気温はほぼ室温である。ある実施形態において、バイオマテリアルはゼラチン溶液である。ゼラチン溶液は、約4%、約4.5%、約5%、約5.5%、約6%、約6.5%、約7%、約7.5%、約8%、約8.5%、約9%、約9.5%、約10%、約10.5%、または約11% (w/v)で存在する。ゼラチン溶液は、PBS、細胞培養培地（DMEM）、または別の適当な溶媒中で与えられる。ある実施形態において、バイオマテリアルはヒアルロン酸である。ある実施形態において、バイオマテリアルは、ハイドロゲルとしてさらに再構成される可能性のある、ヒトもしくは動物の腎臓から供給される脱細胞化された細胞外マトリックスである。
【０１８１】
ある態様において、本明細書は、実質的に固体の形で移植され（たとえばスペーサービーズ）、その後液化/融解され、そうでなくても、体内への移植後に構造的完全性を失うようなバイオマテリアルを含有する製剤を提供する。これは、液体として注入され、その後体内で固化する材料の使用に焦点を当てた、重要な一連の研究とは対照的である。
【０１８２】
スペーサービーズの温度感受性は、製剤前にin vitroで評価することができる。スペーサービーズは標識し、標識されていない温度非感受性ビーズと混合することができる。次にその混合物を37℃でインキュベートし、物理的遷移における変化を観察する。標識された温度感受性ビーズの高温での形の崩壊を経時的に観察する。たとえば、温度感受性ゼラチンビーズは、物理的遷移のマーカーとして機能するように、アルシアンブルー色素とともに作製することができる。青いゼラチンビーズは、架橋ビーズ（白色）と混合され、カテーテル内に入れてから、押し出して、1X PBS, pH 7.4中で37℃においてインキュベートする。青いゼラチンビーズの形がなくなるのを、さまざまな時点で顕微鏡により追跡する。青いゼラチンビーズの物理的状態の変化は、30分後に目に見えるようになり、インキュベーション時間の延長によりもっと顕著になる。ビーズは、材料の粘性のため、完全には消散しない。
【０１８３】
放出調節製剤
ある態様において、本明細書の製剤は、放出調節製剤として提供される。概して、放出調節は、投与直後に第1の活性作用物質の最初の放出があり、その後少なくとも1つの追加の、第2の活性作用物質の放出が続くことを特徴とする。第1および第2の活性作用物質は、同一であっても異なっていてもよい。ある実施形態において、製剤は、同一製剤において複数の成分によって放出調節をもたらす。ある実施形態において、放出調節製剤は、第1の成分の一部として活性作用物質を含有するが、この第1の成分は、活性作用物質が製剤の体積の全体にわたって自由に移動することを可能にするものであって、それによって投与後すぐに標的部位における即時放出を可能にする。第1の成分は、実質的に液相および実質的に固相をとる温度感受性バイオマテリアルとすることができるが、この第1の成分は、投与時点では実質的に液相である。ある実施形態において、活性作用物質は、製剤の体積の全体にわたって実質的に自由に移動できるように実質的に液相となっており、したがって、投与直後に標的部位でただちに放出される。
【０１８４】
ある実施形態において、放出調節製剤は、第2の成分の一部として活性作用物質を有するが、この活性作用物質は、投与前後に標的部位に存在し続ける第2の成分に付着し、配置され（堆積され）、覆われ、包埋され、シードされ（埋め込まれ）、または捕捉されている。第2の成分は、活性作用物質を結び付けることができる構造的要素を含んでおり、それによって投与の時点で第2の成分から活性作用物質が即時放出されるのを防止する。たとえば、第2の成分は、実質的に固体の形で、たとえば、生体適合性ビーズとして与えられるが、それは架橋されてin vivo酵素分解を防止し、もしくは遅らせることができる。ある実施形態において、実質的に固相状態の活性作用物質は、投与の前後で製剤内部においてその構造的完全性を保持しており、したがって、投与直後すぐには活性作用物質を標的部位に放出しない。放出調節製剤に適したキャリアは本明細書に記載したが、当業者は本明細書での使用に適した他のキャリアを正しく識別することができる。
【０１８５】
ある実施形態において、製剤は、細胞、ナノ粒子、治療用分子などを含めた、送達される要素の、最初の迅速な送達/放出をもたらし、続いてその後の遅延放出をもたらす。ある実施形態において、製剤は、エキソソーム、miRNAおよび他の生物活性核酸もしくはタンパク質分子の最初の迅速な送達/放出をもたらすが、これらは可溶性であって、腎細胞もしくは他の細胞集団から供給された分泌型生物活性産物である。再生の生物活性を伴う他の分子もしくは治療用作用物質を、当業者は正しく認識することができる。本明細書の製剤は、送達されるべき作用物質が非付着型（たとえば溶液中の細胞）および付着型（たとえばビーズもしくは別の適当な担体と一緒になった細胞）として与えられるような、二相性放出特性を得るためにデザインすることができる。最初の投与後すぐに、妨害のない作用物質は送達部位にただちに供給される一方で、動きをふさがれた作用物質の放出は、キャリア（たとえばビーズ）の構造的完全性が破綻するまで遅れ、その時点であらかじめ付着していた作用物質が放出される。以下に検討されるように、他の適当な放出メカニズムが当業者に理解されるであろう。
【０１８６】
放出の遅延時間は、活性作用物質の性質に基づいて調整することができる。たとえば、生物活性細胞製剤における放出の遅延時間は、おおよそ数秒、数分、数時間、または数日とすることができる。状況によって、おおよそ数週間の遅延が適当である。低分子もしくは高分子などの他の活性作用物質については、製剤における放出の遅延時間は、おおよそ数秒、数分、数時間、数日、数週間、または数か月とすることができる。製剤が、異なる時間遅延放出プロファイルを与える、異なるバイオマテリアルを含有することも可能である。たとえば、第1の活性作用物質を有する第1のバイオマテリアルは、第1の放出時間を示し、第2の活性作用物質を有する第2のバイオマテリアルは、第2の放出時間を示すことがある。第1と第2の活性作用物質は同一であっても、異なっていてもよい。
【０１８７】
本明細書に記載のように、遅延放出時間は、概して、バイオマテリアルが構造的完全性を失う時間に対応することになる。しかしながら、当業者は、他の遅延放出メカニズムを理解するであろう。たとえば、活性作用物質は、たとえばポリマーマトリックスからの薬物の拡散のように、特定のバイオマテリアルの分解時間と無関係に経時的に、連続して放出されてもよい。さらに、生物活性細胞は、バイオマテリアルを含有する製剤から離れて遊走し、その生物活性細胞は天然組織に遊走することができる。ある実施形態において、生物活性細胞はバイオマテリアル、たとえばビーズから天然組織へと遊走する。ある実施形態において、生物活性細胞はバイオマテリアルから天然組織へと遊走し、増殖因子、サイトカイン、エキソソーム、miRNA、ならびに再生させる生物活性に関わる他の核酸およびタンパク質の分泌を引き起こす。ある実施形態において、エキソソームおよび他の細胞外小胞、ならびにmiRNA、他の生物活性のある核酸およびタンパク質は、バイオマテリアルから移動する。さらに別の実施形態において、生物活性細胞はバイオマテリアルから天然組織へと遊走し、その後損傷部位もしくは病変部位に向かって遊走または回遊する宿主の幹細胞および前駆細胞の動員に関与する。
【０１８８】
エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。製剤中に、吸収を遅延させる作用物質、たとえばモノステアリン酸塩およびゼラチン、を含めることによって、注射用製剤（注射可能製剤）の持続的吸収がもたらされる。そのような製剤を調製するための多くの方法が特許を受け、または当業者に広く知られている。たとえば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照されたい。ポリペプチド薬の制御放出または持続放出に適用できる他の方法が、たとえば、U.S. Pat. Nos. 6,306,406および6,346,274、ならびに、たとえばU.S. Patent Application Nos. US20020182254およびUS20020051808に記載されており、これらはすべて参照により本明細書に組み入れられる。
【０１８９】
4. 生物活性細胞製剤
本明細書に記載の生物活性細胞製剤は、必要のある被験者の腎疾患を治療するための、本明細書に記載の生物活性腎細胞を有する上記バイオマテリアルから作製される移植可能なコンストラクト（構築物）を含有する。ある実施形態において、コンストラクトは、生体適合性材料もしくはバイオマテリアル、1つもしくは複数の合成もしくは天然由来の生体適合性材料からなる足場またはマトリックス、ならびに、付着および/または捕捉によって足場の表面上に配置され（堆積され）、もしくは包埋された、本明細書に記載の1つもしくは複数の細胞集団もしくは細胞混合物で構成される。ある実施形態において、コンストラクトは、バイオマテリアル、ならびに、バイオマテリアル成分（1つもしくは複数）の表面または内部に配置され、それに付着し、捕捉され、包埋され、シードされ（埋め込まれ）、または組み合わせられた、本明細書に記載の1つもしくは複数の細胞集団または細胞混合物で構成される。富化された細胞集団またはその混合物を含めて、本明細書に記載の細胞集団はいずれも、コンストラクトを形成するためにマトリックスと組み合わせて使用することができる。ある実施形態において、生物活性細胞製剤は、生体適合性材料もしくはバイオマテリアル、および本明細書に記載のSRC集団で構成される。ある実施形態において、生物活性細胞製剤は、生体適合性材料もしくはバイオマテリアル、ならびに本明細書に記載のSRC細胞集団と別の細胞集団との混合物から構成されるが、この別の細胞集団には、限定はしないが、内皮前駆細胞、間葉系幹細胞、および脂肪の間質血管画分から得られる細胞を含めることができる。
【０１９０】
Neo-Kidney Augmentの説明および組成
ある実施形態において、生物活性細胞製剤は、Neo-Kidney Augment（KNA）であって、これは、バイオマテリアル（ゼラチンベースのハイドロゲル）中で製剤された、自己の選択された腎細胞（SRC）からなる注射可能製剤である。ある態様において、自己SRCは、腎生検によって患者の腎皮質組織から得られた腎細胞の単離および増殖、ならびに、増殖させた腎細胞を、密度境界、バリアー、または界面を超えて遠心分離することによる選択によって得られる。ある実施形態において、自己SRCは、腎生検によって患者の腎皮質組織から得られた腎細胞の単離および増殖、ならびに連続もしくは不連続の単一段階もしくは多段階密度勾配を超える、増殖させた腎細胞の選択によって得られる。SRCは、主として尿細管上皮細胞からなるが、これはその再生能力でよく知られている（Humphreys et al. (2008) Intrinsic epithelial cells repair the kidney after injury. Cell Stem Cell. 2(3):284-91）。他の実質（血管）および間質（集合管）細胞は、自己SRC集団にわずかに存在する可能性がある。SRCのレシピエント腎臓内への注入は、前臨床試験において、動物の生存、尿濃縮および濾過機能に顕著な改善をもたらした。しかしながら、SRCは保存可能期間および安定性が限られている。ゼラチンベースのハイドロゲルバイオマテリアル中のSRC製剤は、細胞の安定性を高めるので、製品の保存可能期間の延長し、臨床的有用性のために、腎皮質へのNKAの輸送および送達中のNKAの安定性の改善をもたらす。
【０１９１】
別の態様において、NKAは、最初に標準治療の腎生検法を用いてドナー/レシピエントから腎皮質組織を得ることによって製造される。腎細胞を酵素消化によって腎組織から単離し、標準的な細胞培養技術を用いて増殖させる。細胞培養培地は、初代腎細胞を増殖させるようにデザインされ、分化因子は含有しない。収集された腎細胞は、SRCを得るために、密度境界もしくは界面もしくは密度勾配を超える分離に供される。
【０１９２】
温度感受性製剤
本明細書のある態様はさらに、本明細書に記載の外部状況に対応するようにデザインされ、または適合させたバイオマテリアルで構成される製剤を提供する。その結果、コンストラクト中での生物活性細胞集団とバイオマテリアルとの会合の性質は、外部状況に応じて変化させることができる。たとえば、細胞集団の、温度感受性バイオマテリアルとの会合は温度によって変化する。ある実施形態において、コンストラクトは、生物活性腎細胞集団、および約8℃以下では実質的に固体の状態をとり、ほぼ外気温以上では実質的に液体の状態をとるバイオマテリアルを含有し、その細胞集団は約8℃以下でバイオマテリアル中に懸濁されている。しかしながら、細胞集団は、およそ外気温以上の温度において、バイオマテリアルの体積の全体にわたって実質的に自由に移動する。細胞集団をより低い温度で実質的に固相中に懸濁することは、液体中の細胞と比較して、足場依存性細胞のような細胞にとって安定性の利点をもたらす。その上、細胞を実質的に固体状態に懸濁することは、以下の利点のうち1つもしくはいくつかを提供する：i) 細胞の定着を防ぐ；ii) 細胞が懸濁状態でバイオマテリアルに固定されたままにしておく；iii) 細胞がバイオマテリアルの体積の全体にわたってより均一に分散したままにしておく；iv) 細胞集合体の形成を防ぐ；ならびにv) 製剤の保管および輸送中に細胞をよりよく保護する。被験者への投与までこのような特徴を保持しうる製剤は、少なくとも、製剤中の細胞の全般的な健全性がすぐれており、より均一で一貫した投与量の細胞が投与されるので、有利である。
【０１９３】
好ましい実施形態において、SRCを調剤してNKAとするために使用されるゼラチンベースのハイドロゲルバイオマテリアルは、熱反応性ハイドロゲルを形成する、バッファーに溶解したブタゼラチンである。このハイドロゲルは、室温では液体であるが、冷蔵温度（2-8℃）に冷却されるとゲルとなる。SRCは、ハイドロゲルとともに調剤されてNKAが得られる。NKAは冷却によってゲル化し、冷蔵温度条件下（2-8℃）でクリニックに輸送される。NKAの保存可能期間は3日間である。臨床現場において、製品は患者の腎臓に注入される前に室温に温められる。NKAは、経皮的または腹腔鏡下の方法でNKAを送達するのに適した針とシリンジを用いて腎皮質内に移植される。ある実施形態において、ハイドロゲルは、ゼラチンまたは他の組換え起源の細胞外マトリックスタンパク質から得られる。ある実施形態において、ハイドロゲルは、腎臓または別の組織もしくは臓器を起源とする細胞外マトリックスから得られる。ある実施形態において、ハイドロゲルは、組換え細胞外マトリックスタンパク質から得られる。ある実施形態において、ハイドロゲルは、組換えコラーゲンに由来するゼラチン（すなわち組換えゼラチン）を含んでいる。
【０１９４】
製造工程
ある実施形態において、生物活性細胞製剤の製造工程は、患者の生検から製品の移植まで約4週間のうちに製品が送達されるようにデザインされる。患者間の固有の組織のばらつきが、決まった移植スケジュールで製品を送達するために難題をもたらす。こうした患者によって異なる細胞増殖の変動に合わせるために、細胞増殖中にルーチンとして、増殖させた腎細胞を凍結保存する。凍結保存された腎細胞は、万一別の処理が必要となった場合に（たとえば、患者の病気による遅れ、予期しない経過事象など）、必要に応じて再移植のための複数回投与分を製造するために、引き続き存在する細胞の供給源をもたらす。
【０１９５】
生物活性細胞製剤が、バイオマテリアル（ゼラチンベースのハイドロゲル）中で製剤された自己の均一な細胞で構成されるような実施形態に関して、最終的な組成は、ダルベッコのリン酸緩衝食塩水（DPBS）を有するゼラチン溶液中、約20x106 細胞/mLから約200x106 細胞/mLとすることができる。一部の実施形態において、製品mL当たりの細胞数は、約20 x106 細胞/mL、約40 x106 細胞/mL、約60x106 細胞/mL、約100 x106 細胞/mL、約120 x106 細胞/mL、約140 x106 細胞/mL、約160 x106 細胞/mL、約180 x106 細胞/mL、または約200 x106 細胞/mLである。一部の実施形態において、ゼラチンは溶液中に約0.5%、約0.55%、約0.6%、約0.65%、約0.7%、約0.75%、約0.8%、約0.85%、約0.9%、約0.95%、または約1% (w/v)存在する。ある実施形態において、バイオマテリアルはDPBS中0.88% (w/v)ゼラチン溶液である。
【０１９６】
好ましい実施形態において、NKAは、滅菌済み使い捨て10 mLシリンジとして与えられる。最終的な容積は、NKAの濃度100x106 SRC/mLおよび標的用量3.0x106 SRC/g腎臓重量（MRIによる推定）から計算される。投与量はまた、患者の腎臓重量に基づいて注入時点で、外科医によって決定されることもある。
【０１９７】
NKAを作り出すためのこうしたアプローチは、活性のある生物学的構成成分、SRCの広範な化学的評価を基本とした（Bruce et al. (2011) Exposure of Cultured Human Renal Cells Induces Mediators of cell migration and attachment and facilitates the repair of tubular cell monolayers in vitro. Experimental Biology, Washington, DC, www.regenmedtx.com/wp-content/uploads/2015/06/Bruce-EB2011-podium_compressed_Final-AB.pdf; Ilagan et al. (2010a) Exosomes derived from primary renal cells contain microRNAs that can potentially drive therapeutically-relevant outcomes in models of chronic kidney disease. TERMIS Conference, Orlando, FL; Ilagan et al. (2010b) Secreted Factors from Bioactive Kidney Cells Attenuate NF-kappa-B. TERMIS Conference, Orlando, FL, www.regenmedtx.com/wp-content/uploads/2015/06/Ilagan-2010-TERMIS-poster-FINAL.pdf; Ilagan et al. (2009) Characterization of primary adult canine renal cells (CRC) in a three-dimensional (3D) culture system permissive for ex vivo nephrogenesis. KIDSTEM Conference, Liverpool, England, UK; Kelley et al. (2012) A Population of Selected Renal Cells Augments Renal Function and Extends Survival in the ZSF1 model of Progressive Diabetic Nephropathy. Cell Transplant 22(6), 1023-1039; Kelley et al. (2011) Intra-renal Transplantation of Bioactive Renal Cells Preserves Renal Functions and Extends Survival in the ZSF1 model of Progressive Diabetic Nephropathy. ADA Conference, San Diego, CA, available at www.regenmedtx.com/wp-content/uploads/2015/06/ADA-2011-rwk_Tengion-FINAL.pdf; Kelley et al. (2010a) A tubular cell-enriched subpopulation of primary renal cells improves survival and augments kidney function in a rodent model of chronic kidney disease. Am J Physiol Renal Physiol. 299(5), F1026-1039; Kelley et al. (2010b) Bioactive Renal Cells Augment Kidney Function In a Rodent Model Of Chronic Kidney Disease. ISCT Conference, Philadelphia, PA, www.regenmedtx.com/wp-content/uploads/2015/06/Kelley-2010-ISCT-podium-FINAL.pdf; Kelley et al. (2008) Enhanced renal cell function in dynamic 3D culture system. KIDSTEM Conference, Liverpool, England, UK, www.regenmedtx.com/wp-content/uploads/2015/06/Kelley-2008-KIDSTEM-poster-SEP2008_v1.pdf; Kelley et al. (2010c) Bioactive Renal Cells Augment Renal Function in the ZSF1 model of Diabetic Nephropathy. TERMIS Conference, Orlando, FL, www.regenmedtx.com/wp-content/uploads/2015/06/Kelley-2010-TERMIS-FINAL.pdf; Presnell et al. (2010) Isolation, Characterization, and Expansion (ICE) methods for Defined Primary Renal Cell Populations from Rodent, Canine, and Human Normal and Diseased Kidneys. Tissue Engineering Part C Methods. 17(3):261-273; Presnell et al. (2009) Isolation and characterization of bioresponsive renal cells from human and large mammal with chronic renal failure. Experimental Biology, New Orleans, LA, www.regenmedtx.com/wp-content/uploads/2015/06/Presnell-EB-poster-APR2009.pdf; Wallace et al. (2010) Quantitative Ex Vivo Characterization of Human Renal Cell Population Dynamics via High-Content Image-Based Analysis (HCA). ISCT Conference, Philadelphia, PA, www.regenmedtx.com/wp-content/uploads/2015/06/Wallace-2010-ISCT-podium-FINAL.pdf; Yamaleyeva et al. (2010) Primary Human Kidney Cell Cultures Containing Erythropoietin-Producing Cells Improve Renal Injury. TERMIS Conference, Orlando, FL）。ある実施形態において、SRCは、腎臓の修復および再生に生来的に関与する、自己の均一な細胞集団である。一連の非臨床薬理学、生理学、および機構的生物学研究において、SRCの特性は明らかにされ、腎臓の構造および機能を増強することによってCKDの進行を遅らせる能力が実証されている（Presnell et al. WO/2010/056328、およびIlagan et al. PCT/US2011/036347）。
【０１９８】
製剤のために総細胞数を選択し、適正な投与量に到達するように製剤の量を調整することができる。一部の実施形態において、製剤は、1回投与量または1回投与量プラス追加投与量となる、被験者への細胞投与量を含有することができる。ある実施形態において、投与量は、本明細書に記載のコンストラクトとして与えられる。本明細書に記載の生物活性腎細胞集団または腎細胞集団混合物の治療上有効な量は、被験者に安全に投与される最大細胞数から、腎疾患の治療に必要な最小細胞数にまで及ぶ可能性があり、この腎疾患の治療とは、たとえば、1つもしくは複数の腎機能の安定化、腎機能低下速度の減少、または腎機能の改善である。
【０１９９】
治療上有効な量の本明細書に記載の生物活性腎細胞集団またはその混合物は、製薬上許容されるキャリアまたは添加剤中に懸濁されていてもよい。こうしたキャリアには、培地プラス1%血清アルブミン、生理食塩水、緩衝生理食塩水、ブドウ糖、水、コラーゲン、アルギン酸塩、ヒアルロン酸、フィブリン糊、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、およびそれらの組み合わせなどがあるが、それに限定されない。製剤は投与方法に合っていなくてはならない。
【０２００】
生物活性腎細胞製剤（1つまたは複数）、もしくはその混合物、または組成物は、ヒトへの投与に適した医薬組成物として、通常の手順にしたがって製剤される。典型的には、静脈内投与、動脈内投与、または腎被膜内投与用の組成物は、たとえば、滅菌等張水性緩衝液中の溶液である。必要に応じて、組成物は、注入部位における痛みを和らげるために局所麻酔薬を含んでいてもよい。概して、成分は、別々に供給されるか、または、たとえば活性作用物質の量を表示したアンプルなどの密封された容器内の凍結保存濃縮物として、単位剤形の中にまとめて混合される。組成物が点滴によって投与されることになる場合、組成物は滅菌医薬品グレードの水または生理食塩水を含有する点滴ボトルで分散させることができる。組成物が注射で投与される場合、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルが提供され、投与前に成分を混合することができる。
【０２０１】
製薬上許容されるキャリアは、一つには、投与されることになる個別の組成物によって、ならびに組成物を投与する個別の方法によって、決定される。したがって、非常にさまざまな適当な医薬組成物の製剤がある（たとえば、Alfonso R Gennaro (ed), Remington: The Science and Practice of Pharmacy, formerly Remington's Pharmaceutical Sciences 20th ed., Lippincott, Williams & Wilkins, 2003を参照されたいが、これは参照によりそのまま本明細書に組み入れられる）。医薬組成物は、総じて、滅菌され、実質的に等張として、米国食品医薬品局のすべての製造管理および品質管理に関する基準(GMP)規則に則って製剤される。
【０２０２】
細胞生存作用物質
ある態様において、生物活性細胞製剤には、細胞生存作用物質も含まれる。ある実施形態において、細胞生存作用物質は、抗酸化物質、酸素運搬体、免疫調節因子、細胞動員因子、細胞付着因子、抗炎症薬、血管新生因子、マトリックスメタロプロテアーゼ、創傷治癒因子、および生物活性細胞からの分泌産物からなる一群から選択される。
【０２０３】
抗酸化物質は、他の分子の酸化を阻害することができるといつ特徴を有する。抗酸化物質には、6-ヒドロキシ-2,5,7,8-テトラメチルクロマン-2-カルボン酸（Trolox（登録商標））、カロテノイド、フラボノイド、イソフラボン、ユビキノン、グルタチオン、リポ酸、スーパーオキシドジスムターゼ、アスコルビン酸、ビタミンE、ビタミンA、混合カロテノイド（たとえば、βカロテン、αカロテン、γカロテン、ルテイン、リコピン、フィトエン、フィトフルエン、およびアスタキサンチン）、セレン、コエンザイムQ10、インドール-3-カルビノール、プロアントシアニジン、レスベラトロール、ケルセチン、カテキン、サリチル酸、クルクミン、ビリルビン、シュウ酸、フィチン酸、リポ酸、バニリン酸、ポリフェノール、フェルラ酸、テアフラビン、およびそれらの誘導体のうち1つもしくはいくつかが挙げられるがそれに限定されない。当業者には当然のことながら、他の適当な抗酸化物質を本明細書の特定の実施形態に使用することができる。
【０２０４】
酸素運搬体は、酸素を運び放出する能力を特徴とする作用物質である。それには、パーフルオロカーボン、およびパーフルオロカーボン含有医薬品などがあるがこれらに限定されない。適当なパーフルオロカーボンに基づく酸素運搬体には、パーフルオロオクチルブロミド（C8F17Br）；パーフルオロジクロロタン（perfluorodichorotane）（C8F16C12）；パーフルオロデシルブロミド；パーフルブロン（perflubron）；パーフルオロデカリン； パーフルオロトリプロピルアミン；パーフルオロメチルシクロピペリジン；Fluosol（登録商標）（パーフルオロデカリンおよびパーフルオロトリプロピルアミン）；Perftoran（登録商標）（パーフルオロデカリンおよびパーフルオロメチルシクロピペリジン）；Oxygent（登録商標）（パーフルオロデシルブロミドおよびパーフルブロン）；Ocycyte（商標名）（パーフルオロ(tert-ブチルシクロヘキサン)）などがあるがそれらに限定されない。当業者には当然のことであるが、他の適当なパーフルオロカーボンに基づく酸素運搬体を、本明細書の特定の実施形態に使用することができる。
【０２０５】
免疫調節因子は、オステオポンチン、FASリガンド因子、インターロイキン、トランスフォーミング増殖因子β、血小板由来増殖因子、クラスタリン、トランスフェリン、RANTES（regulated upon activation, normal T cell expressed and secreted）、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター1（Pai-1）、腫瘍壊死因子α（TNF-α）、インターロイキン6（IL-6）、α1ミクログロブリン、およびβ2ミクログロブリンなどがあるが、それに限定されない。当業者には当然のことながら、他の適当な免疫調節因子を、本明細書の特定の実施形態に使用することができる。
【０２０６】
抗炎症薬もしくは免疫抑制薬（下記）も製剤の一部とすることができる。当業者には当然のことながら、他の適当な抗酸化物質を本明細書の特定の実施形態に使用することができる。
【０２０７】
細胞動員因子には、単球走化性タンパク質1（MCP-1）およびCXCL-1があるがそれに限定されない。当業者には当然のことながら、他の適当な細胞動員因子を本明細書の特定の実施形態に使用することができる。
【０２０８】
細胞接着因子には、フィブロネクチン、プロコラーゲン、コラーゲン、ICAM-1、結合組織増殖因子、ラミニン、プロテオグリカン、RGDおよびYSIGRなどの特異的細胞接着ペプチドがあるがそれに限定されない。当業者には当然のことながら、他の適当な細胞接着因子を本明細書の特定の実施形態に使用することができる。
【０２０９】
血管新生因子には、血管内皮増殖因子F（VEGF）およびアンジオポエチン-2（ANG-2）があるがそれに限定されない。当業者には当然のことながら、他の適当な血管新生因子を本明細書の特定の実施形態に使用することができる。
【０２１０】
マトリックスメタロプロテアーゼには、マトリックスメタロプロテアーゼ1 (MMP1)、マトリックスメタロプロテアーゼ2 (MMP2)、マトリックスメタロプロテアーゼ9 (MMP-9)、および組織メタロプロテアーゼ阻害物質1 (TIMP-1)があるがそれに限定されない。
【０２１１】
創傷治癒因子には、ケラチノサイト増殖因子（KGF-1）、組織プラスミノーゲンアクチベーター（tPA）、カルビンジン、クラスタリン、シスタチンC、トレフォイル因子3があるがそれに限定されない。当業者には当然のことながら、他の適当な創傷治癒因子を本明細書の特定の実施形態に使用することができる。
【０２１２】
本明細書に記載の生物活性細胞からの分泌産物も、細胞生存作用物質として生物活性細胞製剤に添加することができる。
【０２１３】
ヒトまたは動物起源の体液、組織または臓器、たとえば、限定はしないが、ヒト血漿、ヒト血小板溶解物、ウシ胎仔血漿またはウシ下垂体抽出物などから得られる組成物を、細胞生存作用物質として生物活性細胞製剤に添加してもよい。
【０２１４】
当業者には当然のことながら、コンストラクトを形成するために、バイオマテリアルで細胞集団を配置し、または他の方法で細胞集団とバイオマテリアルとを組み合わせる、いくつかの適当な方法がある。
【０２１５】
5. 使用方法
ある態様において、本明細書のコンストラクトおよび製剤は、本明細書に記載の使用法における使用に適している。ある実施形態において、本明細書の製剤は、疾患の治療のために投与することができる。たとえば、生物活性細胞は、本明細書に記載の製剤の一部として自然臓器に投与することができる。ある実施形態において、生物活性細胞は、投与の対象である自然臓器から供給されることがあるが、標的の自然臓器ではない供給源から得られることもある。
【０２１６】
ある実施形態において、本明細書は、本明細書に記載の生物活性腎細胞集団を含有する製剤を用いて、必要のある被験者において腎疾患を治療するための方法を提供する。ある実施形態において、治療用製剤は、選択された腎細胞集団、またはその混合物を含有する。実施形態において、製剤は腎機能の改善を必要とする被験者への投与に適している。
【０２１７】
別の態様において、本明細書の方法による被験者の腎疾患の有効な治療を、腎機能に関するさまざまな指標によって観察することができる。ある実施形態において、腎機能の指標としては、血清アルブミン、アルブミン/グロブリン比（A/G比）、血清リン、血清ナトリウム、腎サイズ（超音波により測定）、血清カルシウム、リン：カルシウム比、血清カリウム、タンパク尿、尿クレアチニン、血清クレアチニン、血中尿素窒素（BUN）、コレステロール値、トリグリセリド値、および糸球体濾過率（GFR）があるが、それに限定されない。さらに、全般的な健康および幸福に関する重要な指標には、体重の増減、生存率、血圧、（平均全身血圧、拡張期血圧、または収縮期血圧）および身体持久運動能力があるがそれに限定されない。
【０２１８】
別の態様において、生物活性腎細胞集団による有効な治療は、腎機能に関する1つもしくは複数の指標の安定化によって証明される。腎機能の安定化は、本明細書の方法によって治療されていない被験者の指標と比較して、本明細書の方法によって治療された被験者における同じ指標の変化を観察することによって実証される。あるいはまた、腎機能の安定化は、治療前の被験者の指標と比較して、本明細書の方法で治療されたが同被験者における同じ指標の変化を観察することによって実証することができる。第1の指標の変化は、値の増加であることも減少であることもある。ある実施形態において、本明細書で与えられる治療は、被験者における血中尿素窒素（BUN）値の安定化を含むことがあり、この被験者で観察されるBUN値は、本明細書の方法で治療されていない同様の病態を有する被験者と比べて低い。他の実施形態において、治療は、被験者における血清クレアチニン値の安定化を含むことがあり、この被験者で観察される血清クレアチニン値は、本明細書の方法で治療されていない同様の病態を有する被験者と比べて低い。ある実施形態において、腎機能に関する上記指標の1つもしくはいくつかの安定化は、選択された腎細胞製剤による治療の結果である。
【０２１９】
当業者には当然のことながら、本明細書に記載の、または当技術分野で公知の1つもしくは複数の追加の指標を測定して、被験者における腎疾患の有効な治療を判定することができる。
【０２２０】
別の態様において、生物活性腎細胞製剤による有効な治療は、腎機能に関する1つもしくは複数の指標の改善によって実証される。ある実施形態において、生物活性腎細胞集団は、血清血中尿素窒素（BUN）値の改善をもたらす。ある実施形態において、生物活性腎細胞集団は、血清中のタンパク質保持の改善をもたらす。ある実施形態において、生物活性腎細胞集団は、非富化細胞集団と比べて、血清アルブミン濃度の改善をもたらす。ある実施形態において、生物活性腎細胞集団は、非富化細胞集団と比べて、A:G比の改善をもたらす。ある実施形態において、生物活性腎細胞集団は、血清コレステロール値および/またはトリグリセリド値の改善をもたらす。ある実施形態において、生物活性腎細胞集団は、ビタミンD値の改善をもたらす。ある実施形態において、生物活性腎細胞集団は、非富化細胞集団と比べて、リン：カルシウム比の改善をもたらす。ある実施形態において、生物活性腎細胞集団は、非富化細胞集団と比べて、ヘモグロビン値の改善をもたらす。さらに他の実施形態において、生物活性腎細胞集団は、非富化細胞集団と比べて、血清クレアチニン値の改善をもたらす。また別の実施形態において、生物活性腎細胞集団は、非富化細胞集団と比べて、ヘマトクリット値の改善をもたらす。ある実施形態において、腎機能に関する上記指標のうちの1つもしくはいくつかの改善は、選択された腎細胞製剤による治療の結果である。
【０２２１】
別の態様において、本明細書は、それを必要とする被験者の自然腎を再生するための方法に用いる製剤を提供する。ある実施形態において、その方法は、本明細書に記載の生物活性細胞集団、混合物、またはコンストラクトを投与または移植するステップを含む。再生された自然腎は、多くの指標によって特徴づけることが可能であって、その指標には、自然腎の機能もしくは能力の発達、自然腎の機能もしくは能力の改善、ならびに自然腎の特定のマーカーの発現があるがそれに限定されない。ある実施形態において、機能もしくは能力の発達または改善は、上記の、腎機能に関するさまざまな指標に基づいて観察することができる。ある実施形態において、再生された腎臓は、1つもしくはいくつかの幹細胞マーカーの発現の差異によって特徴づけられる。幹細胞マーカーは、以下のうち1つもしくはいくつかとすることができる：SRY（性決定領域Y）-ボックス2 (Sox2)；未分化胚性細胞転写因子 (UTF1)；マウス由来Nodalホモログ（NODAL）；プロミニン1 (PROM1)もしくはCD133 (CD133)；CD24；およびそれらの任意の組み合わせ（参照により本明細書にそのまま編入されるIlagan et al. PCT/US2011/036347を参照されたい、また、やはり参照によりそのまま本明細書に編入されるGenheimer et al., 2012. Molecular characterization of the regenerative response induced by intrarenal transplantation of selected renal cells in a rodent model of chronic kidney disease. Cells Tissue Organs 196: 374-384も参照されたい）。ある実施形態において、1つもしくは複数の幹細胞マーカーの発現は、対照と比べてアップレギュレートされている。
【０２２２】
ある態様において、本明細書に与えられるのは、被験者の腎疾患を治療する方法であって、その方法は、本明細書に記載の製剤、組成物、または細胞集団を被験者に注入することを含む。ある実施形態において、製剤、組成物、または細胞集団は、18〜30ゲージの針で注入される。ある実施形態において、製剤、組成物、または細胞集団は、20ゲージより小さい針で注入される。ある実施形態において、製剤、組成物、または細胞集団は、21ゲージより小さい針で注入される。ある実施形態において、製剤、組成物、または細胞集団は、22ゲージより小さい針で注入される。ある実施形態において、製剤、組成物、または細胞集団は、23ゲージより小さい針で注入される。ある実施形態において、製剤、組成物、または細胞集団は、24ゲージより小さい針で注入される。ある実施形態において、製剤、組成物、または細胞集団は、25ゲージより小さい針で注入される。ある実施形態において、製剤、組成物、または細胞集団は、26ゲージより小さい針で注入される。ある実施形態において、製剤、組成物、または細胞集団は、27ゲージより小さい針で注入される。ある実施形態において、製剤、組成物、または細胞集団は、28ゲージより小さい針で注入される。ある実施形態において、製剤、組成物、または細胞集団は、29ゲージより小さい針で注入される。ある実施形態において、製剤、組成物、または細胞集団は、約20ゲージである針で注入される。ある実施形態において、製剤、組成物、または細胞集団は、約21ゲージである針で注入される。
【０２２３】
ある実施形態において、製剤、組成物、または細胞集団は、約22ゲージである針で注入される。ある実施形態において、製剤、組成物、または細胞集団は、約23ゲージである針で注入される。ある実施形態において、製剤、組成物、または細胞集団は、約24ゲージである針で注入される。ある実施形態において、製剤、組成物、または細胞集団は、約25ゲージである針で注入される。ある実施形態において、製剤、組成物、または細胞集団は、約26ゲージである針で注入される。ある実施形態において、製剤、組成物、または細胞集団は、約27ゲージである針で注入される。ある実施形態において、製剤、組成物、または細胞集団は、約28ゲージである針で注入される。ある実施形態において、製剤、組成物、または細胞集団は、約29ゲージである針で注入される。
【０２２４】
ある実施形態において、針の内径は0.84 mm未満である。ある実施形態において、針の内径は0.61 mm未満である。ある実施形態において、針の内径は0.51 mm未満である。ある実施形態において、針の内径は0.41 mm未満である。ある実施形態において、針の内径は0.33 mm未満である。ある実施形態において、針の内径は0.25 mm未満である。ある実施形態において、針の内径は0.20 mm未満である。ある実施形態において、針の内径は0.15 mm未満である。ある実施形態において、針の外径は1.27 mm未満である。ある実施形態において、針の外径は0.91 mm未満である。ある実施形態において、針の外径は0.81 mm未満である。ある実施形態において、針の外径は0.71 mm未満である。ある実施形態において、針の外径は0.64 mm未満である。ある実施形態において、針の外径は0.51 mm未満である。ある実施形態において、針の外径は0.41 mm未満である。ある実施形態において、針の外径は0.30 mm未満である。ある実施形態において、針は以下の表中のサイズの1つを有する：
2020512406.tif 000006
【０２２５】
分泌産物
ある実施形態において、効果は細胞自体によって、および/または細胞からの分泌産物によってもたらされる。再生効果は、以下のうち1つもしくはいくつかによって特徴づけることができる：上皮間葉転換の減少（TGFβシグナル伝達の減弱によると考えられる）；腎線維症の減少；腎臓の炎症の減少；自然腎における幹細胞マーカーの発現の差異；移植された細胞および/または体内に生じた細胞の腎損傷部位、たとえば尿細管損傷部位への遊走、移植された細胞の腎損傷部位、たとえば尿細管損傷部位における生着；（本明細書に記載の）腎機能に関する1つもしくは複数の指標の安定化；腎発生と関連したS-shaped body/comma-shaped bodyのde novo形成、尿細管またはネフロンのde novo形成、（本明細書に記載の）赤血球ホメオスタシスの修復；ならびにこれらの任意の組み合わせ（Basu et al., 2011. Functional evaluation of primary renal cell/biomaterial neo-kidney augment prototypes for renal tissue engineering. Cell Transplantation 20: 1771-90; Bruce et al., 2015. Selected renal cells modulate disease progression in rodent models of chronic kidney disease via NF-κB and TGF-β1 pathways. Regenerative Medicine 10: 815-839を参照されたいが、これらのそれぞれの全体は参照により本明細書に組み入れる）。
【０２２６】
組織生検の代わりに、治療を受けた被験者における再生の結果を、たとえば尿などの体液の検査から評価することができる。被験者の尿から得られる微小胞は、下記に限らないが、特定のタンパク質およびmiRNAなどの一定の成分を含有することが判明しており、これらの成分は、本明細書の細胞集団による治療の影響を受けた腎細胞集団から最終的に由来するものである。これらの成分には、幹細胞の複製および分化、アポトーシス、炎症および免疫修飾、線維症、上皮間葉転換、TGF-βシグナリングおよびPAI-1シグナリングに関与する因子を含めることができるがそれらに限定されない。微小胞関連miRNA/タンパク質発現パターンの経時的分析によって、本明細書の細胞集団、混合物、もしくはコンストラクトの投与を受けた被験者の腎臓内での再生の結果を連続的にモニターすることができる。
【０２２７】
ある実施形態において、本発明は、腎疾患（KD）患者が治療用製剤による治療に反応するかどうかを評価する方法を提供する。その方法には、上記治療薬で治療されたKD患者由来のテストサンプル中の小胞もしくはその管腔内容物の量を、その治療薬による治療前の同じ患者由来の対象サンプル中の小胞の量と比較もしくは対比して、測定もしくは検出するステップを含めることができるが、このテストサンプル中の小胞もしくはその管腔内容物の量が対象サンプル中の小胞もしくはその管腔内容物の量と比較して増減していることは、その治療薬による治療に対して、治療を受けた患者が反応性を有することを示している。
【０２２８】
これらの腎臓由来小胞および/または腎臓由来小胞の管腔内容物はまた、被験者の尿中に流れ出て、再生の結果または治療有効性を示すバイオマーカーとして分析することができる。非侵襲的予後判定法には、本明細書に記載の細胞集団、混合物もしくはコンストラクトの投与もしくは移植の前、および/または後に、被験者から尿サンプルを得るステップを含めることができる。小胞およびその他の分泌産物は、標準的方法を用いて尿サンプルから単離することが可能であって、この標準的方法には、不要なデブリを除去するための遠心分離（Zhou et al. 2008. Kidney Int. 74(5):613-621; Skog et al. U.S.特許出願公開第 20110053157号、これらのそれぞれの全体は参照により本明細書に組み入れる）、尿からエキソソームを分離するための沈澱、特定の核酸を同定するためのポリメラーゼ連鎖反応および核酸配列決定、ならびに再生成果と結びつく特定のタンパク質を同定するための質量分析および/または2Dゲル電気泳動があるがそれに限定されない。
【０２２９】
前記の説明は、当業者が本発明を実施するのを可能にするために十分であるとみなされる。当然のことながら、本発明は好ましい実施形態およびオプションの特徴によって具体的に開示されてはいるが、当業者は、本明細書に記載のコンセプトの修正および変更に依拠してもよく、そのような修正および変更は、添付の請求の範囲によって規定される本発明の範囲内に含まれるものとみなされる。以下の実施例は、説明目的でのみ提供されるものであって、けっして本発明の範囲を限定することを意図するものではない。実際、前記の説明から、本明細書で提示され説明されたことのほかに、本発明のさまざまな修正が当業者に明白となるであろうが、それは添付の請求の範囲に含まれる。
【０２３０】
本明細書に引用された特許、特許出願、および文献はすべて、参照によりそのまま本明細書に組み入れられる。
（実施例）
【実施例１】
【０２３１】
NKA製剤成分
１．細胞成分及び材料
SRCはNKAの生物活性成分を構成している。SRCは主として、その再生能力でよく知られている尿細管上皮細胞からなる。他の実質（血管）細胞、間葉細胞、内皮細胞および間質（集合管）細胞が自己SRC集団に存在する可能性がある。
【０２３２】
SRCは、腎組織のコアを採取するための標準治療腎生検法を用いて得られた腎皮質組織から調製される。腎細胞は酵素消化により腎組織から単離され、標準的な細胞培養技術を用いて増殖させる。顕微鏡下で培養物を目視観察することによって、細胞を評価して腎細胞の形態を検証する。培養物は、細胞同士の集合に起因して、きっちりした敷石状の外観を特徴的に示す（図1）。SRCは、単離し増殖させた細胞を、密度境界もしくは密度界面もしくは単一段階不連続密度勾配を超えて分離することによって得られる。
【０２３３】
密度境界もしくは界面を超える遠心分離を用いて、細胞浮遊密度に基づいて収集された腎細胞集団を分離する。腎細胞懸濁物は、オプティプレップ（OptiPrep）（OptiMEM中7%イオジキサノール；60% (w/v)）媒体の溶液を通じて分離される。約1.0419 g/mLより高い浮遊密度を示す細胞画分を、個別のペレットとして遠心後に収集する（図2）。1.0419 g/mL未満の浮遊密度を維持する細胞は除外して廃棄される。
【０２３４】
SRCペレットをDPBS中に再懸濁する。最終産物中の、残存するオプティプレップ、FBS、培地および補助材料のキャリーオーバーは、洗浄ステップによって最小限にする。
【０２３５】
2. バイオマテリアル成分および補助材料
以下のバイオマテリアル成分および補助材料が、SRCのNKAへの製剤のために使用される：
1. ブタゼラチン - 熱に反応するハイドロゲルを作製するために使用される。   
2. ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS） - ブタゼラチンを溶解するために使用される。このバッファーはヒト血漿またはヒト血小板溶解物に置き換える、またはそれらと混合することができる。
【０２３６】
バイオマテリアル標品
バイオマテリアルは、DPBS中でブタゼラチンからなるゼラチン溶液である。ゼラチンはDPBS中、またはヒト血漿/人血小板溶解物中、または両者の混合物中に指定の濃度となるように溶解して、熱反応性ハイドロゲルのゼラチン溶液を形成する。ゼラチン溶液を、0.1μmフィルターに通して濾過滅菌し、そのまま調剤できる1回使用分に分けて冷蔵もしくは凍結保存する。
【０２３７】
バイオマテリアルの重要な性質は、それが熱に反応するハイドロゲルであって、異なる温度でゲル化し、液化することができることである。NKA製剤中に用いられるゼラチン溶液は、室温以上（22-28℃）で液体であり、冷蔵温度（2-8℃）に冷却するとゲル化する。
【０２３８】
ゼラチン溶液濃度
ゲル化の特性 - 冷蔵温度においてゲルを形成する能力（逆さにしたときに流れない）、および室温において液体となる能力（逆さにしたときに自由に流動する）について、0.5-1.0%の範囲のゼラチン濃度を評価した。表4は、さまざまなゼラチン溶液のゲル化の特性を示す。
【０２３９】
【表４】
2020512406.tif 000007
【０２４０】
0.63%以上のゼラチン溶液を用いて製剤されたNKAは判定基準を矛盾なく満たすことができたので、NKA製剤のためのゼラチン濃度に、0.88 ± 0.12%の範囲を選択した。しかしながら、約0.63%から約1%までの濃度範囲でゼラチンを含有する製剤も好適であることに言及しておく。
【０２４１】
3. NKA製剤
SRCは、ゼラチンベースの熱反応性ハイドロゲルであるゼラチン溶液を用いてNKAへと製剤される。ゼラチンベースの熱反応性ハイドロゲルは、細胞の安定性の改善をもたらし、したがって、製品の保存可能期間の延長、臨床的有用性のための腎皮質内へのSRCの輸送および送達中の安定性をもたらす。製剤の開発はゼラチン溶液の組成、濃度および安定性を評価した。
【０２４２】
トリパンブルー色素排除法によって、洗浄したSRCを計数する。ゼラチン溶液を冷蔵保存から取り出し、26-30℃に加温して液化する。必要数の細胞を含有するある容積のSRC懸濁物を遠心分離し、最終洗浄ステップのために液化したゼラチン溶液中に再懸濁した。この懸濁物を遠心分離し、結果として得られるSRC濃度が製剤されたNKA中で100x106 細胞/mLとなるように、SRCペレットを再懸濁する。
【０２４３】
NKA充填およびゲル化
NKA製品はシリンジ内に無菌充填される。充填工程の持続期間中、生菌サンプリングおよび非生菌サンプリングを含めた、ダイナミックエアーサンプリングを実施する。最終的なゲル化NKAを形成するために、2-8℃に冷却している間、NKAパッケージを最低2時間回転させて細胞を懸濁状態に保つ。細胞がゼラチン溶液中で定着しないようにゲル化が行われるために、迅速な冷却が必要である。冷蔵条件に置いたらすぐに、シリンジ内のゼラチン溶液の温度をモニターした。図3に示すように、急速な温度低下が観察される。1時間後、温度は典型的には最終温度4.4℃の±0.3℃の範囲に低下する。
【０２４４】
ゼラチン溶液の冷却はゲル化のプロセスを開始させるが、SRCが保存中にゲル内で懸濁状態を保持するように、形成されたゲルが安定化するために、一定の時間を必要とする。製剤されたNKAを含有するシリンジは、一晩または1.25時間回転させた後、一晩立たせておく。その後、内容物を取り出し、製品の異なる4区分において細胞濃度を測定した。分析から、4区分の間に差異はないので、最低限1.25時間低温で回転させたら、測定可能な細胞の定着は起こらないことが示されている（図4）。
【実施例２】
【０２４５】
NKAおよび成分の性質検討
NKAおよびその成分、SRCおよびバイオマテリアルは、本項に記載の分析技術を用いて性質検討した。
【０２４６】
SRCの性質検討
SRCは、出荷試験を目的として、ならびに格付けする目的で延長された培養において性質検討した。それに加えて、情報および開発目的で使用することが可能で、今後力価アッセイを確立するのに有用となりうる、SRCの他の特性についても調べた。
【０２４７】
SRCの特性
腎細胞の単離および増殖は、尿細管上皮細胞および間質細胞を含めた腎細胞型の混合物をもたらす。SRCは、増殖させた腎細胞の単一段階不連続密度勾配分離によって、または密度境界/密度界面を超える遠心分離によって得られる。密度分離されたSRC集団における主要な細胞型は、上皮表現型である。増殖させた腎細胞から得られたSRCの特性を確証するために多方面からのアプローチを取った。細胞形態、増殖速度、および細胞生存率は、腎細胞増殖プロセスの間モニターされる。SRC浮遊密度は密度界面を超える遠心分離の使用により確認される。細胞数および生存率はトリパンブルー色素排除法によって測定される。SRCの表現型はフローサイトメトリーによって特徴づけられる。生存細胞の存在およびSRCの機能は、PrestoBlueの代謝、ならびにVEGFおよびKIM-1の産生によって実証される。
【０２４８】
臨床研究のためのNKAの製造に使用されるSRCは、以下の重要な特性について調べることとする：
・SRC細胞数および生存率
・SRC表現型
・SRC機能
【０２４９】
SRC細胞数および生存率
細胞数および生存率はトリパンブルー色素排除法によって測定される。
【０２５０】
SRC表現型
細胞表現型は、フローサイトメトリーを用いて腎細胞マーカーの発現解析によりモニターされる。細胞の表現型分析は、分析しようとする細胞型に特異的な抗原マーカーの利用に基づく。フローサイトメトリー分析は、分析しようとする抗原マーカーを発現するサンプル集団中の細胞について定量的指標を提供する。
【０２５１】
腎細胞の表現型を特徴づけるために有用な、さまざまなマーカーが文献に報告されている：(i) サイトケラチン；(ii) 輸送に関する膜タンパク質（アクアポリンおよびキュビリン）；(iii) 細胞結合分子（adherin（アドヘリン）およびレクチン、およびその他のタンパク質）；ならびに(iv) 代謝酵素（グルタチオン）。全腎臓消化物から得られる培養物中の細胞の大部分は、上皮および内皮細胞であるので、調べられるマーカーは、これら2群に特異的なタンパク質の発現に重点を置く。
【０２５２】
サイトケラチンは、多くのタイプの上皮細胞によってさまざまな程度に発現される、中間径フィラメントタンパク質のファミリーである。上皮細胞によって発現されるサイトケラチンのサブセットは、上皮のタイプによって決まる。たとえば、サイトケラチン7、8、18および19はいずれも、腎臓および残りの泌尿生殖器ならびに消化管および気道の正常な単層上皮によって発現される。これらのサイトケラチンの組み合わせは上皮細胞の構造的完全性に関与する。これらの組み合わせは、酸性（I型）および塩基性（II型）ケラチンファミリーの両者に相当し、腎細胞において大量に見いだされる（Oosterwijk et al. (1990) Expression of intermediate-sized filaments in developing and adult human kidney and in renal cell carcinoma. J Histochem Cytochem, 38(3), 385-392）。
【０２５３】
アクアポリンは、細胞内および細胞外への水の通過を可能にする一方で、イオンおよび他の溶質の通過を妨げることができる、輸送に関わる膜タンパク質である。13種類のアクアポリンが文献に記載されており、このうち6種類は腎臓に存在する（Nielsen et al. (2002) Aquaporins in the kidney: from molecules to medicine. Physiol Rev, 82(1), 205-244）。アクアポリン2は、水流の制御において厳格なコントロールを行うことによって、水に対して高い透過性を有し、浸透圧勾配の方向に水が流れるようにする腎集合管上皮細胞の細胞膜の原因となる（Bedford et al. (2003) Aquaporin expression in normal human kidney and in renal disease. J Am Soc Nephrol, 14(10), 2581-2587; Takata et al. (2008) Localization and trafficking of aquaporin 2 in the kidney. Histochem Cell Biol, 130(2), 197-209; Tamma et al. (2007) Hypotonicity induces aquaporin-2 internalization and cytosol-to-membrane translocation of ICln in renal cells. Endocrinology, 148(3), 1118-1130）。アクアポリン1は近位尿細管に特徴的である（Baer et al. (2006) Differentiation status of human renal proximal and distal tubular epithelial cells in vitro: Differential expression of characteristic markers. Cells Tissues Organs, 184(1), 16-22; Nielsen et al. (2002) Aquaporins in the kidney: from molecules t
o medicine. Physiol Rev, 82(1), 205-244）。
【０２５４】
キュビリンは輸送に関する膜受容体タンパク質である。キュビリンがタンパク質メガリンと共存する場合、それらはともにアルブミンなどのキュビリン結合リガンドの内在化を促進する。キュビリンは腸管および腎臓の上皮内にある（Christensen & Birn (2001) Megalin and cubilin: synergistic endocytic receptors in renal proximal tubule. Am J Physiol Renal Physiol, 280(4), F562-573）。
【０２５５】
CXCR4は、SDF1のケモカイン受容体として機能する、輸送に関わる膜タンパク質である。リガンドが結合すると、細胞内カルシウムレベルが上昇し、MAPK1/MAPK3活性化が増強される。CXCR4は、腎臓において構成的に発現され、腎臓の発生および管形成に重要な役割を果たす（Ueland et al. (2009). A novel role for the chemokine receptor Cxcr4 in kidney morphogenesis: an in vitro study. Dev Dyn, 238(5), 1083-1091）。さらに、CXCR4は、SDF1のリガンド結合のための受容体である。SDF1/CXCR4軸は、内皮前駆細胞および間葉幹細胞の損傷部位への遊走およびホーミングにきわめて重要な役割を果たす（Sagrinati et al. (2008) Stem-cell approaches for kidney repair: choosing the right cells. Trends Mol Med, 14(7), 277-85）。
【０２５６】
カドヘリンは、カルシウム依存性細胞接着タンパク質である。カドヘリンは4群に分類され、Eカドヘリンは上皮組織中に存在するが、移動性および増殖の制御に関与する。Eカドヘリンは、腎臓において遠位尿細管を構成する上皮細胞の接着結合の中に局在することが判明している膜貫通糖タンパク質である（Prozialeck et al. (2004) Differential expression of E-cadherin, N-cadherin and beta-catenin in proximal and distal segments of the rat nephron. BMC Physiol, 4, 10; Shen et al. (2005) Kidney-specific cadherin, a specific marker for the distal portion of the nephron and related renal neoplasms. Mod Pathol, 18(7), 933-940）。
【０２５７】
DBA（Dolichos biflorus凝集素）は、腎臓集合管構造の表面上にあるα-N-アセチルガラクトサミン結合レクチン（細胞結合タンパク質）であり、発生中の腎臓集合管および遠位尿細管の一般的なマーカーとみなされて使用されている（Michael et al. (2007) The lectin Dolichos biflorus agglutinin is a sensitive indicator of branching morphogenetic activity in the developing mouse metanephric collecting duct system. J Anat 210(1), 89-97; Lazzeri et al. (2007) Regenerative potential of embryonic renal multipotent progenitors in acute renal failure. J Am Soc Nephrol 18 (12), 3128-3138）。
【０２５８】
CD31（血小板内皮細胞接着分子、PECAM-1としても知られる）は、免疫細胞ならびに内皮細胞の選抜集団によって発現される細胞接着タンパク質である。内皮細胞において、このたんぱく質は細胞境界に集中している（DeLisser et al. (1997) Involvement of endothelial PECAM-1/CD31 in angiogenesis. Am J Pathol, 151(3), 671-677）。CD146は、アクチン細胞骨格に関連した細胞間結合において、内皮細胞の細胞接着および粘着に関与する。血管内皮および平滑筋によって強く発現されるCD146は、現在、内皮細胞系統のマーカーとして使用されており（Malyszko et al. (2004) Adiponectin is related to CD146, a novel marker of endothelial cell activation/injury in chronic renal failure and peritoneally dialyzed patients. J Clin Endocrinol Metab, 89(9), 4620-4627）、イヌ科においてCD31に相当するものである。
【０２５９】
γ-グルタミルトランスペプチダーゼ（GGT）は、グルタチオンのγ-グルタミル部分のアクセプターへの転移を触媒する代謝酵素であって、このアクセプターはアミノ酸、ペプチドまたは水であってよく、グルタミン酸を生成することができる。この酵素も、グルタチオンの合成および分解、ならびに細胞膜を介したアミノ酸の移行に機能を果たす。GGTは、腎臓の近位尿細管細胞を含めて、多くの組織の細胞膜に存在する（Horiuchi et al. (1978) Gamma-glutamyl transpeptidase: sidedness of its active site on renal brush-border membrane. Eur J Biochem, 87(3), 429-437; Pretlow et al. (1987). Enzymatic histochemistry of mouse kidney in plastic. J Histochem Cytochem, 35(4), 483-487; Welbourne & Matthews (1999) Glutamate transport and renal function. Am J Physiol, 277(4 Pt 2), F501-505）。表5は、フローサイトメトリーで検出された、上記マーカーを発現する腎細胞の特定の型の一覧を提供する。
【０２６０】
【表５】
2020512406.tif 000008
【０２６１】
図5は、集団におけるそれぞれの表現型のパーセンテージ値としてプロットされた、SRC集団中の上記マーカーの数量化された発現を示す。CK8/18/19は、種を超えて検出される、もっとも一貫して発現される腎細胞タンパク質である。GGT1およびアクアポリン1（AQP1）は、一貫して発現されるがレベルはさまざまである。DBA、アクアポリン2（AQP2）、E-カドヘリン（CAD）、CK7、およびCXCR4も中程度のレベルで観察されるが、ばらつきはもっと大きく、CD31/146およびキュビリンの発現は最低であった。既報のデータ（Kelley et al. (2012) A Population of Selected Renal Cells Augments Renal Function and Extends Survival in the ZSF1 model of Progressive Diabetic Nephropathy. Cell Transplant 22(6), 1023-1039; Kelley et al. (2010a) A tubular cell-enriched subpopulation of primary renal cells improves survival and augments kidney function in a rodent model of chronic kidney disease. Am J Physiol Renal Physiol. 299(5), F1026-1039）および本発明者らの未発表の研究（図5）に基づいて、NKAの製造中にSRCの慣用的な表現型分析に使用されるマーカーとしてCK18およびGGT1を選択した。AQP2発現も表現型分析の有用なマーカーであるが、発現が変動しやすく、したがってAQP2発現は情報目的でモニターすることとする。表6は、選択されたマーカー、SRCにおける表現型発現の範囲および平均パーセント値、ならびにそれらの選択理由を提供する。
【０２６２】
【表６】
2020512406.tif 000009
【０２６３】
細胞の機能
SRCは、馴化培地の分析によって検出可能なタンパク質を盛んに分泌する。細胞の機能は、細胞がPrestoBlueを代謝する能力、ならびにVEGF（血管内皮増殖因子）およびKIM-1（腎障害分子-1）を分泌する能力によって評価される。
【０２６４】
細胞がPrestoBlueを代謝する能力によって、NKAにおいて機能する生存細胞をモニターすることができる。PrestoBlue細胞生存試薬は、細胞透過性非蛍光性青色色素である、修飾されたレサズリンに基づくアッセイ試薬である。この色素は、増殖できるほど十分に生存能力のある細胞内に入ると、脱水素酵素を伴う自然の細胞プロセスによって還元されて、蛍光もしくは吸光度で測定可能な鮮やかな赤色のフルオロフォアとなる。
【０２６５】
生体分子VEGFおよびKIM-1は、高感度で特異的な、腎障害および腎機能の分析的な非臨床バイオマーカーとして提案されたものから選抜された分子である（Sistare et al. (2010) Towards consensus practices to qualify safety biomarkers for use in early drug development. Nat Biotechnol, 28(5), 446-454; Warnock & Peck (2010) A roadmap for biomarker qualification. Nat Biotechnol, 28(5), 444-445）。これら2つのマーカーは、in vivoで尿細管の機能、損傷および/または修復を示し、尿細管上皮細胞培養物の特徴がin vivoで認められる。KIM-1は、損傷および細胞の代謝回転中に脱落するアポトーシス細胞を認識して貪食するのに役立つ、腎臓近位尿細管細胞の膜に固定された細胞外タンパク質である。腎細胞により構成的に発現されるVEGFは、きわめて重要な血管由来の生存促進因子であって、これは細胞分裂、遊走、内皮細胞生存および血管の出芽を促進するものである。SRCは、VEGF mRNAを構成的に発現すると特徴づけられ（表8）、活発にタンパク質を産生する（表7）こうしたタンパク質は、腎細胞およびSRCに曝された培地中で検出することができる。表7は、腎細胞およびSRC培養物から得られる馴化培地中に存在するVEGFおよびKIM-1の量を示す。腎細胞は、ほぼコンフルエンスまで培養された。腎細胞培養物およびSRCへの一晩の暴露から得られる馴化培地を、VEGFおよびKIM-1について調べた。
【０２６６】
【表７】
2020512406.tif 000010
【０２６７】
他のSRC特性の解明
遺伝子発現プロファイリング、および細胞の酵素活性の測定によってさらにSRCの特性を明らかにした。
【０２６８】
遺伝子発現プロファイル
定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）によって、ヒト腎細胞培養物から単離されたSRCの遺伝子発現プロファイルを調べたが、これには、アクアポリン2、E-カドヘリン、キュビリン、VEGFおよびCD31が含まれており、これらはタンパク質発現についても調べた。表14の遺伝子型マーカーは、腎細胞培養物中に存在することが予想される細胞集団を代表する。NCAD、キュビリンおよびCYP2R1は、尿細管上皮細胞のマーカーであり、AQP2およびECADは集合管および遠位尿細管のマーカーである。ポドシンおよびネフリンはポドサイト（糸球体上皮細胞、）のマーカーである。VEGFおよびCD31は内皮マーカーである。VEGFおよびEPOは酸素応答遺伝子であり、関連mRNAはさまざまに異なる組織および細胞型に存在する。
【０２６９】
使用される遺伝子プローブはTaqManから得られた。継代2のヒト腎細胞を70-90%コンフルエンスで収集した。RNAは、Qiagen社のRNeasy Plus Mini Kitを用いて、動物細胞由来の全RNAの精製のためのプロトコルにしたがって精製された。cDNAは、Invitrogen社のSuperScript（登録商標）VILO（商標名）cDNA Synthesis Kitを用いて、メーカーの説明書にしたがって、1.4μgに相当する量のRNAから作製された。SRC集団（n=3）に関する平均qPCRデータを、未分画腎細胞と対比して表8に示す。
【０２７０】
結果から、NCAD、キュビリンおよびCYP2R1の相対的に高い発現レベルによって実証されるように、尿細管上皮細胞の集団が存在することが示唆される。集合管および遠位尿細管マーカーであるAQP2およびECADは比較的低く、内皮マーカであるCD31はさらに低い（表8）。
【０２７１】
【表８】
2020512406.tif 000011
【０２７２】
初期の遺伝子型評価に基づいて、表現型および機能性マーカーを選択した。VEGF遺伝子発現レベルは高く、アクアポリン2遺伝子発現レベルは低いが、これはタンパク質の分析データと一致する（表6および表7）。
【０２７３】
SRC酵素活性
プレフォーミュレーションであるSRCの細胞機能は、腎臓近位尿細管に存在する2つの特異的酵素；GGT（γグルタミルトランスペプチダーゼ）およびLAP（ロイシンアミノペプチダーゼ）（Chung et al. (1982) Characterization of primary rabbit kidney cultures that express proximal tubule functions in a hormonally defined medium. J Cell Biol, 95(1), 118-126）の活性を測定することによっても評価することができる。細胞内のこれらの酵素の活性を測定する方法は、活性酵素を発現する細胞に加えた時に切断されて発色産物を遊離する、溶液中の酵素特異的基質を利用する（Nachlas et al. (1960) Improvement in the histochemical localization of leucine aminopeptidase with a new substrate, L-leucyl-4-methoxy-2-naphthylamide. J Biophys Biochem Cytol, 7( ), 261-264; Tate & Meister (1974) Stimulation of the hydrolytic activity and decrease of the transpeptidase activity of gamma-glutamyl transpeptidase by maleate; identity of a rat kidney maleate-stimulated glutaminase and gamma-glutamyl transpeptidase. Proc Natl Acad Sci U S A, 71(9), 3329-3333）。細胞に暴露された溶液の吸光度を測定し、活性酵素に起因する切断産物の量と関係づける。GGTのために利用される基質はL-グルタミン酸 γ-p-ニトロアニリド 塩酸塩であり、LAP用にはL-ロイシン p-ニトロアニリドである。図6は、ヒトドナーから作製された6つのSRCサンプル中のLAPおよびGGT活性を示す。LAPおよびGGTアッセイは情報提供のためにのみ行われる。アッセイは長期の細胞培養期間を必要とするため、製品リリースのために行うことができない。
【０２７４】
SRC性質検討（特徴付け）のまとめ
・細胞形態はImage Libraryの画像による培養観察の比較によって、細胞増殖の間モニターされる。    
・細胞増殖速度はそれぞれの細胞継代においてモニターされる。細胞増殖は患者ごとにさまざまであると予想される。   
・SRCの細胞数および生存率はトリパンブルー色素排除およびPresroBlueの代謝によりモニターされる。   
・SRCはCK18、GGT1の表現型発現を特徴とする。AQP2発現は情報提供の目的でモニターされることになる。   
・PrestoBlueの代謝ならびにVEGFおよびKIM-1の産生は、生存し機能するSRCの存在に関するマーカーとして使用される。   
・SRC機能はさらに、遺伝子発現プロファイルならびにLAPおよびGGTによる酵素活性の測定によって明らかにすることができる。
【０２７５】
バイオマテリアルの性質検討
NKA（ゼラチン溶液）中で使用されるバイオマテリアルは、2つの重要なパラメーターにより特性を明らかにする：
濃度 - ゼラチン溶液の濃度は分光光度計を用いて280nmの吸光度によって測定される。ゼラチン溶液濃度は、吸光度対濃度の検量線から求められる。
転移試験 - 転移試験は、2-8℃においてゲルを形成して維持し、室温ではゲルが液化（流動化）する、ゼラチン溶液の能力について視覚的評価をもたらす。
【０２７６】
他のバイオマテリアルの特性の解明
NKAに使用されるバイオマテリアルの特性を、レオロジー特性および粘性についてさらに明らかにすることができる。
【０２７７】
レオロジー特性
バイオマテリアルのレオロジー特性は、Couette Cell型レオメータの使用により、最初に4℃で測定し、次に25℃で測定することができる。サンプルは各温度において少なくとも30分間平衡化する。低いほうの温度における許容貯蔵弾性率（G’ >10）は、NKAの出荷および輸送温度である2-8℃において、溶液がゲルを形成して維持できることを反映する。高いほうの温度における許容損失弾性率（G’ <10）は、NKAの送達および移植のために必要とされる室温において、ゲルが液化しうることを反映する。
【０２７８】
粘性
バイオマテリアルの粘性は、37℃において、せん断速度200-300 s-1で、コーンプレート粘度計を用いて測定される。1.05-1.35 cPの範囲内の粘性を有する溶液は、18-27ゲージ針を通して効率的に投与することができる。
【０２７９】
NKAの性質検討
NKAはバイオマテリアル（ゼラチンベースのハイドロゲル）中で製剤された自己のSRCからなる。ゼラチンベースのハイドロゲルバイオマテリアル中のSRCの製剤は、細胞の安定性を高め、したがって製品の保存可能期間の延長をもたらし、臨床的有用性のためにSRCの輸送および腎皮質内への送達中の、NKAの安定性の改善をもたらす。
【０２８０】
NKAは、生存細胞の存在、SRC表現型および細胞機能について、PrestoBlueの代謝、CK18、GGT1およびAQP2の表現型発現、ならびにVEGFおよびKIM-1の産生によって特徴づけられる。詳細は上記のSRCの性質検討の項で与えられる。
【０２８１】
ヒト腎臓ドナーから得られたSRCを用いて作製され、ゼラチンとともに製剤されたNKAが、貯蔵および輸送の間シリンジ内で凝集することなく均一な細胞の分布を維持しており、それによって、リリース後および注入時の最終的なNKA製品における細胞の安定性の向上を保証することを実証するために実験を行った。NKAにおけるSRC分布および凝集に関する結果は以下の項で与えられる。冷蔵時のNKAの安定性に関する詳細は以下に与えられる。
【０２８２】
NKAにおけるSRCの分布
NKAにおけるSRCの分布は、細胞定着の定性的観察、共焦点顕微鏡を用いたLive/Dead Viabilityのイメージング、およびトリパンブルー色素排除による生細胞分布の測定によって確認された。
【０２８３】
細胞定着の定性的観察
製剤されたNKA中のSRCは、定着について視覚的に観察し、DPBAのみの中に懸濁されたSRCと比較した。DPBS中に懸濁されたSRCは、保持期間中に懸濁物から沈降する。DPBS中0.88%ゼラチンによるSRCのNKA製剤は、低温において3日間の貯蔵を通して、シリンジ内に細胞が定着しないようにすることができる（図7）。
【０２８４】
共焦点顕微鏡を用いたLive/Dead Viabilityのイメージング
製剤化NKAにおけるSRCの分布を、共焦点顕微鏡（BD Pathway 855）を用いて画像化した。NKA（ゼラチン中で製剤されたSRC）をスライドガラス上に放出し、蛍光Live (緑色)/Dead(赤色)色素で染色した。図8はゼラチン中に分散した生存SRC（緑色）の代表的な画像を示す。
【０２８５】
NKAシリンジの全域にわたるSRC分布
製剤化NKAシリンジ全域にわたるSRC分布は、トリパンブルー染色によって測定した。NKAは、標準的な方法によってシリンジ内で調製した。3日間低温に保持してから室温に温めた後、図9に示すようにNKAをシリンジから4分割して押し出した。各画分について計数を行って、全生細胞分布および平均生存率を求めた。
【０２８６】
シリンジ内のSRC分布の測定
SRCは、押し出された画分においてトリパンブルー色素排除によって計数された。図10は選択された画分における全生細胞数を示し、配置時のシリンジの外筒に沿った分布パターンを示している。SRCはシリンジの全域にわたって均一に分布している。
【０２８７】
NKAにおけるSRC凝集
NKAにおけるSRC凝集は、位相差顕微鏡下でLeica LASイメージソフトウェアを用いて評価した。細胞凝集は、製剤時、ならびに低温にて3日間保持した後にも評価した。図11は、製剤直後のSRCのLeicaイメージを示す（10X）。0.88%ゼラチン中に懸濁されたSRCのNKA製剤において細胞の凝集は認められなかった。図12は、NKAから採取されたサンプル（画分1-4）の位相差像（10X）を示す。3日間の保持期間後に、シリンジの全域にわたって細胞凝集は見られなかった。
【０２８８】
NKA性質検討（特徴付け）のまとめ
・SRCのゼラチン製剤は、NKAの貯蔵および輸送の間、細胞をNKAの中で懸濁したままにして、分散した状態にしておくことができる。ゼラチン製剤は注入時のNKAの均一な送達も保証する。   
・DPBAのみの中に懸濁されたSRCは3日間低温で保存する間に沈降する。    
・SRCは、製剤後も、製品の保存可能期間である3日間の貯蔵後にも凝集しない。
【実施例３】
【０２８９】
安定性試験
ゼラチン溶液安定性
調製されたゼラチン溶液は、冷蔵庫内（2-8℃）で、または冷凍庫内（-20℃より低い）で保存される。NAK製剤に使用されるゼラチン溶液の安定性は、材料を低温（2-8℃）で8週間までの間、または凍結して（-20℃より下）24週間までの間、保持した後に評価された。
【０２９０】
濾過滅菌後、ゼラチン溶液を15 mLチューブに分注し、冷蔵庫（2-8℃）または冷凍庫（-20℃より低い）内で保存した。評価するときに、ゼラチン溶液の1つのチューブを低温貯蔵から取り出し、26-30℃の水浴中に置いた。水浴中で2時間の後、チューブを逆さにするとゼラチン溶液が「流れる」ことが観察されたら、その溶液は液化する能力について許容できるとみなされた。そのチューブは2-8℃の冷蔵に戻され、その翌日に観察した。ゼラチン溶液が逆さにしたときに流れなければ、その溶液はゲル化する能力を満たすとみなされた。ゲル化または液化においてテストした期間中に有意な傾向は観察されなかった。
【０２９１】
さらに、凍結サンプルについて、液化したゼラチン溶液の粘性は、37℃にて150-250 s-1のせん断速度でコーンプレート粘度計を用いて測定した。テストした期間中にゼラチン粘度に有意な傾向は観察されなかった。
【０２９２】
冷蔵および凍結保存安定性検討の一環として、サンプルは、無菌性についてテストした（BacT/Alert）。テストは、8週間冷蔵後、ならびに24週間冷凍後、陰性（5日間で増殖なし）であった。
【０２９３】
NKA安定性
ヒト腎臓ドナーにより作製されたNKAを低温（2-8℃）で保存することができることを実証するために実験を行った。NKA安定性は、生存率の測定、表現型の特徴、および製品中の細胞の機能によって確認された。
【０２９４】
SRCは、4つの腎組織サンプルに由来する腎組織生検検体から得られ、NKAは標準的な方法で調製された。製造終了後、NKAは最長7日間低温で保持され、保存可能期間を評価した。分析のために1、2、3、4および7日目にサンプルを採取した。
【０２９５】
NKA中のSRC生存能力の安定性
NKA中のSRCの生存率はトリパンブルー色素排除によって測定された。図13は、製品を製造後最長7日間低温で保存した後のSRC生存率の安定性を示す。SRC生存率は、低温貯蔵で少なくとも4日間70%超えを維持する（業界標準）。
【０２９６】
NKA中のSRC表現型の安定性
NKAにおけるSRC表現型は、CK18およびGGT1の発現によって測定した。図14および15は、製品を製造後最長7日間冷蔵しておいた後のSRC表現型の安定性を示す。SRC表現型は、CK18およびGGT1によって、冷蔵で少なくとも4日間は上記のリリース基準にとどまる。
【０２９７】
NKA中のSRC機能の安定性
PrestoBlue代謝およびVEGF産生を、製品中のSRC機能の指標として使用した。図16は、製造後最長7日間冷蔵後のPrestoBlue代謝を示す。NKA中のSRCがPrestoBlueを代謝する能力は、栄養なしで貯蔵される細胞について予想されるように、貯蔵時間につれて着実に減少する。冷蔵3日の時点で、NKA代謝は、最初のPrestoBlue値の50%を上回っていたので、リリース基準案に合致する。3日の保存可能期間は、NKAの冷蔵中のSRC機能に基づいて見積もられる。
【０２９８】
図17は、製品を製造後最長7日間冷蔵した後のVEGF産生を示す。NKA中のSRCがVEGFを発現する能力は3日目まで安定しているが（0日から統計学的差異はない）、それ以上保存すると、栄養なしで貯蔵される細胞について予想されるように減少する。冷蔵3日の時点でVEGF産生はリリース基準案に合致する。3日の保存可能期間は、NKAの冷蔵中のSRC機能の評価に基づいて見積もられる。
【０２９９】
貯蔵3日の時点で≧70%のSRC生存率を維持していることに基づいて、NKAについて3日の保存可能期間が提起される。3日の時点でPrestoBlue代謝は細胞機能の目安として、0日における初期値の50%を上回っている。栄養なしで貯蔵された細胞ではPrestoBlue代謝の減少が予想される。
【０３００】
NKAは、目標レベルの70%のSRC生存率を維持していることに基づいて、製造後3日間、低温で保存することが可能であって、リリース仕様に合致する細胞表現型および機能を維持する。
【実施例４】
【０３０１】
NKA送達および移植
NKAはセルデリバリーシステムを用いて患者の腎皮質内に注入することを目標としている。このデリバリーシステムおよび注入法で使用される成分は以下の項で扱う。
【０３０２】
NKAデリバリーシステム
NKAデリバリーシステムは、セルデリバリーに適合するカニューレ（針）およびシリンジからなる。異なる供給業者はカニューレもしくは針という用語をセルデリバリー製品を説明するために使用する。この説明のために、トロカール、カニューレ、および針という用語は、意味の区別なく使用される。
【０３０３】
NKAデリバリーシステムの主要な構成要素は、デリバリー針/カニューレである。臨床におけるNKAの効果的なデリバリー（送達）のために望ましいデリバリーカニューレの特徴を表9に記載する。さらに本発明者らはNKAに適合するカニューレを使用する。
【０３０４】
【表９】
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【０３０５】
シリンジ材料はUSP Class VIガイドラインに準拠しており、生体適合性を評価するためにISO 10993法にしたがってテストした。シリンジはMerit Medical、Becton Dickinsonまたは同様の供給業者から供給されるが、これらは生体適合性分類および製品適合性試験を満たすものである。デリバリー針/カニューレはCook Medical, Bloomington, IN、International Medical Development, Huntsville, UT、Innovative Med Inc., Irvine CAなどから調達されるが、これらは生体適合性要件および製品適合性試験を満たすものである。NKAを用いた18-32ゲージのデリバリーカニューレの製品適合性試験を図18に示す。カニューレを通過した時のSRC生存率は、18-26ゲージのカニューレについてはシリンジ単独と同様であり、これらのカニューレがSRCに適合していることを実証する。26ゲージより小さい針サイズについては、SRC生存率は落ちるようである。
【０３０６】
NAK移植
移植に備えて、腎臓への注入の直前にNKAを室温に温めて製品を液化する。
【０３０７】
NKAは、セルデリバリーに適合した針/カニューレおよびシリンジによって腎皮質内に移植することを目標とする。目的は、腎臓被膜の貫通によってNKAを導入し、腎皮質の複数部位に配置することである。初めに、15-20ゲージのアクセストロカール/カニューレを用いて腎皮質内に約1 cm挿入し、腎臓被膜に穴をあけることとなる（しかしそれ以上腎臓内に前進させない）。NKAは、先端の丸い内部細胞デリバリー針またはフレキシブルカニューレ（18-26ゲージ、アクセスカニューレに適している）に接続されるシリンジ内に入っていることとなる。第I相臨床試験において、18Gデリバリー針を通してNKAを送達した。提案される第II相試験はセルデリバリー用に18ゲージかそれより小さい針を利用することとなる。デリバリー針はアクセスカニューレの内側に差し込まれて腎臓内に進められ、腎臓内にNKAが投与されることになる。NKAの注入は1-2 mL/分の速度とする。それぞれ1-2分の注入後に、内針を皮質内の針の進路に沿って第二の注入部位へと後退させることとなる；針の先端がアクセスカニューレの末端に至るまで、または細胞の全量が注入されてしまうまで、そのようにする。このシステムは、腹腔鏡下デリバリーおよび経皮的デリバリーをいずれも可能にする。経皮的デリバリーの下で、アクセスカニューレ/トロカールおよびデリバリー針の配置は、直接、リアルタイムイメージガイダンスを用いて行われる。NKAの注入は、NKAを配置したマイクロバブルフットプリントを可視化する、超音波イメージガイダンスによってモニターされる。
【０３０８】
図19の模式図は、セルデリバリーに適合した針を用いた腎臓内へのNKA注入のコンセプト、および実質臓器における分布を示す。NKAは、直接腎皮質内に送達される。患者におけるNKAデリバリーは、最初に、標準の経皮的方法または内視鏡下の方法を使用することとなる。
【実施例５】
【０３０９】
SRCを作製するための方法および組成物の非限定的な例
（実施例５．１）
溶液の調製
【０３１０】
本項の実施例は、不均一腎細胞集団の単離および性質検討、ならびに再生治療製品の製造のために使用される、さまざまな培地製品および溶液の組成を、この実施例において提供する。
【０３１１】
【表１０】
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すべての細胞洗浄にはダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）を使用した。
【０３１２】
（実施例５．２）
不均一未分画腎細胞集団の単離
本項の実施例は、ヒトからの未分画の（UNFX）不均一腎細胞集団の単離を示す。最初に組織の解離を行って、ヒト腎組織から不均一細胞懸濁物を作製した。
【０３１３】
腎生検による腎組織は、不均一腎細胞集団のための原料をもたらした。皮質、皮髄境界部または髄質組織のうち1つもしくはいくつかを含む腎組織を使用することができる。皮髄境界部組織を使用することが好ましい。瘢痕組織を避けて、CKD腎臓からの複数の生検コア（最低2個）が必要であった。腎組織は、最終NKAの計画された移植の約4週間前に、臨床現場において患者から、臨床研究者によって得られた。その組織は、実施例5.1の組織輸送培地中で輸送された。
【０３１４】
その組織は次に、細胞を取り出すために組織を処理する前に、侵入するバイオバーデンを減少させるために、実施例5.1の組織洗浄溶液で洗浄した。
【０３１５】
腎組織を細分して計量し、実施例5.1の消化溶液中で解離させた。得られた細胞懸濁物をダルベッコの改変イーグル培地（D-MEM）+ 10%ウシ胎仔血清（FBS）（Invitrogen, Carlsbad Calif.）中で中和し、洗浄し、無血清、無添加の、ケラチノサイト培地（KSFM）（Invitrogen）中に再懸濁した。次に細胞懸濁物を、15% (w/v)イオジキサノール (OptiPrep（商標名）、Sigma)密度境界を越えて遠心分離し、組織培養処理されたポリスチレンフラスコもしくはディッシュ上で、実施例5.1の腎細胞増殖培地中25,000細胞/cm2の細胞密度で培養を開始する前に、赤血球およびデブリを取り除いた。たとえば、細胞は、150 mlの50:50培地中、25x106 細胞/フラスコで、T500 Nuncフラスコの表面上で培養することができる。
【０３１６】
（実施例５．３）
単離された腎細胞集団の細胞増殖
腎細胞の増殖は、受け取った組織の量、および受け入れた組織からの腎細胞の単離の成功に左右される。単離された細胞は必要に応じて凍結保存することができる（上記を参照されたい）。腎細胞の増殖速度は、個々の患者から単離された細胞に固有の多様性に起因して、サンプルごとに変動する可能性がある。
【０３１７】
表11に記載の、受け入れた組織の多様性に起因する細胞回収率の範囲に適合した、細胞増殖プロセスを開発した。腎細胞の増殖は、指定の細胞培養法を用いて、表10の腎細胞増殖培地の中で、閉鎖培養容器（たとえば、Tフラスコ、Cell Factories、 HyperStacks（登録商標））内での連続継代を必要とする。
【０３１８】
ヒト臨床試験のため、BPEの使用に伴う固有のリスクを排除するために、BPEフリー培地を開発した。細胞の増殖、表現型（K18）、および細胞機能（GGTおよびLAP酵素活性）をBPEフリー培地中で評価し、動物実験で使用されたBPE含有培地と比較した。腎細胞増殖、表現型および機能は2つの培地において同等であった（データは示さない）。
【表１１】
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【０３１９】
最初のTフラスコ内で細胞増殖が観察され（継代0）、目に見えるコンタミネーションの徴候がなければ、培地を置き換えて、その後2-4日ごとに交換した（図21B）。顕微鏡下で培養物を目視観察することによって、細胞を評価して腎細胞の形態を検証した。培養物は、細胞同士の集合に起因して、きっちりした敷石状の外観を特徴的に示した。これらの形態学的特徴は増殖中に変化し、すべての継代において存在しているわけではない可能性がある。細胞培養コンフルエンスは、細胞増殖の期間中ずっと使用される培養容器内でさまざまなコンフルエンスレベルにおいて、細胞のイメージライブラリを用いて推定された。
【０３２０】
腎細胞は、培養容器が少なくとも50%コンフルエントとなった時に、トリプシン処理によって継代された（図21B）。脱離された細胞を、腎細胞増殖培地を入れた容器内に集め、計数し、細胞生存率を計算した。細胞継代ごとに、NKAを製剤するために必要な数まで細胞数を増やすために、十分な数の培養容器内に500-4000 細胞/cm2の細胞をシード（播種）した（図21B）。培養容器は37℃のインキュベーター内で5% CO2の環境に置いた。上記のように、細胞形態およびコンフルエンスをモニターし、組織培養培地を2-4日ごとに交換した。表12は、ヒトドナー由来の6つの腎生検検体の細胞を単離して増殖させる間に観察された、ヒト腎細胞の生存率を記載する。
【０３２１】
【表１２】
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【０３２２】
異なる患者から得られる組織の固有の（内在の）多様性は、培養中の細胞収率の差異をもたらした。したがって、細胞継代のタイミング、または目標細胞数を達成するために継代ごとに必要とされる培養容器の数およびタイプを厳密に定めることは現実的でない。典型的には、腎細胞は2もしくは3回の継代を受ける；しかしながら、培養期間および細胞収率は、細胞増殖速度によって変動しうる。
【０３２３】
細胞は収集または継代のために、EDTAを有する0.25%トリプシン(Invitrogen)によって脱離される。生存率はトリパンブルー色素排除によって評価され、血球計を用いて手作業で、または自動化Cellometer（登録商標）計数システム（Nexcelom Bioscience, Lawrence Mass.）を用いて計数が行われた。
【０３２４】
（実施例５．４）
培養細胞の凍結保存
増殖させた腎細胞は、個別の患者からの細胞増殖の固有のばらつきを調整するために、そして事前に決められた臨床投与スケジュールで製品を投与するために、慣用的に凍結保存した。凍結保存された細胞は、万一もう1つのNKAが必要となった場合には（たとえば、患者の病気による遅れ、予期せぬ経過事象など）、予備の細胞供給源を提供する。細胞を凍結保存し、融解すると生きた機能的な細胞を回復することができるように用いられる条件を確立した。
【０３２５】
凍結保存のために、細胞は、凍結保存溶液（実施例5.1を参照されたい）中で約50x106 細胞/mLの終濃度となるように懸濁され、バイアル中に分注された。約50x106 細胞/mLの入った1 mlバイアルをコントロールレートフリーザーの冷凍室に入れ、あらかじめプログラムされた速度で凍結した。凍結した後、細胞を中間貯蔵のために液体窒素フリーザーに移した。
【０３２６】
（実施例５．５）
SRC細胞集団の調製
選択された腎細胞（SRC）は、スケジューリングに応じて、凍結保存細胞から増殖させた最終培養容器から、または増殖培養物から直接、調製することができる（図21B）。
【０３２７】
凍結保存された細胞を使用する場合には、細胞を融解し、最後の1段階の増殖ステップのために組織培養容器の表面上で培養した。最終培養容器が約50-100%コンフルエントとなったら、細胞はSRC分離のために処理を行う準備が整った。NKAの培地交換および最終洗浄は、最終製品中に残存する凍結保存溶液を薄める。
【０３２８】
最後の細胞培養容器が、少なくとも50%コンフルエンスに達したら、その培養容器を、37℃にて5% CO2の環境で2%酸素に設定された低酸素インキュベーターに移し（図21C）、一晩培養した。細胞は48時間もの間、2%酸素にセットされた酸素コントロールインキュベーター内に保持することができる。より生理学的に適している低酸素（2%）環境に暴露することは、細胞分離効率を向上させ、VEGFなどの低酸素誘導マーカーのよりよい検出を可能にした。
【０３２９】
細胞を十分な時間（たとえば一晩から48時間）低酸素条件に暴露した後、EDTA含有0.25%トリプシン（Invitrogen）を用いて細胞を脱離した。生存率はトリパンブルー色素排除によって評価され、血球計を用いて手作業で、または自動化Cellometer（登録商標）計数システム（Nexcelom Bioscience, Lawrence Mass.）を用いて計数が行われた。細胞はDPBSで1回洗浄し、DPBS中に約850x106 細胞/mLとなるように再懸濁した。
【０３３０】
密度境界/界面を超える遠心分離を用いて、細胞浮遊密度に基づいて、収集した細胞集団を分離した。腎細胞懸濁物は、7%イオジキサノール溶液を超える遠心分離によって分離された（OptiMEM中OptiPrep; 60% (w/v)；実施例5.1を参照されたい）。
【０３３１】
7% OptiPrep密度界面溶液を調製し、望ましい密度を示す屈折率を使用前に測定した（R.I. 1.3456+/-0.0004）。収集した腎細胞の層を溶液の上に重ねた。この密度界面を遠心管または細胞処理装置（たとえばCOBE 2991）の中で室温にて800gで20分間遠心分離した。約1.045 g/mLより高い浮遊密度を示す細胞画分が、遠心分離後、個別のペレットとして集められた。1.045 g/mL未満の浮遊密度を維持する細胞は、除外して廃棄された。
【０３３２】
SRCペレットをDPBS中に再懸濁した（図21C）。残存するOptiPrep、FBS、培地、および補助材料のキャリーオーバーは、4回のDPBS洗浄および1回のゼラチン溶液ステップによって最小限に抑えられた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【国際調査報告】
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