(57)【要約】  本発明は、細胞外小胞体の分離方法に関するもので、より詳細には、本発明は、細胞外小胞体の疎水性を利用して、細胞外小胞体を分離する方法、前記方法を利用して分離された細胞外小胞体等に関するものである。本発明の細胞外小胞体分離方法を利用することは、血液及び尿を含む様々な動物の体液又は癌組織を含む様々な組織から、従来の方法では難しかった、脂質タンパク質の汚染が除去された細胞外小胞体を分離でき、従来の脂質タンパク質汚染によって引き起こされた問題を解決し、動物の様々な体液又は組織から分離した細胞外小胞体を利用して、特性と機能の研究、マルチオミクス研究、新規バイオマーカーの発掘、診断と治療など、様々な研究に波及効果が大きい必須の技術になると期待される。
2020530780.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）固定相に疎水性官能基を固定させる段階;
（b）前記固定相に、細胞外小胞体が含まれた試料をローディングして、前記疎水性官能基に細胞外小胞体を結合させる段階；
（c）前記固定相において疎水性官能基に結合していない試料の残余物を洗浄する段階；及び
（d）前記固定相から疎水性官能基と結合した細胞外小胞体を溶出させる段階、
を含む、細胞外小胞体分離方法。
【請求項２】
前記（b）段階以前に、前記疎水性官能基を有する固定相を、塩析イオンを含む溶液で洗浄する段階をさらに含むことを特徴とする、請求項１記載の細胞外小胞体分離方法。
【請求項３】
前記塩析イオンの濃度は、前記固定相に細胞外小胞体が結合できるように、固定相の疎水性を調節する濃度であることを特徴とする、請求項２記載の細胞外小胞体分離方法。
【請求項４】
前記塩析イオンの濃度は、０Ｍ〜１０Ｍであることを特徴とする、請求項３記載の細胞外小胞体分離方法。
【請求項５】
前記（b）段階において、細胞外小胞体が含まれた試料を固定相にローディングする前に、試料に塩析イオンを含む溶液を添加して、試料に含まれた塩析イオンの濃度又は種類を変化させる段階をさらに含むことを特徴とする、請求項１記載の細胞外小胞体分離方法。
【請求項６】
前記（d）段階において、細胞外小胞体を溶出させる前に、塩析イオンの種類又は濃度を調節して、細胞外小胞体より疎水性相互作用の強度が小さい物質を除去する段階をさらに含むことを特徴とする、請求項１記載の細胞外小胞体分離方法。
【請求項７】
前記細胞外小胞体より疎水性相互作用の強度が小さい物質を除去するための塩析イオンの濃度は、０Ｍ〜１０Ｍに調節されることを特徴とする、請求項６記載の細胞外小胞体分離方法。
【請求項８】
前記塩析イオンは、硫酸塩、リン酸塩、水酸化物、フッ素化物、ギ酸塩、酢酸塩、塩化物、臭化物、硝酸塩、ヨウ化物、チオシアン酸塩、クエン酸塩及び酒石酸塩からなる群から選択される１以上であることを特徴とする、請求項１記載の細胞外小胞体分離方法。
【請求項９】
前記固定相は、アガロースビーズ、セファロースビーズ、セファデックスビーズ、シリカビーズ、磁気ビーズ、金ナノ粒子、銀ナノ粒子、酸化鉄ナノ粒子、ナイロン膜、ニトロセルロース膜、ＰＶＤＦ膜、紙、プラスチック、ガラス及び金属センサーチップからなる群から選択される１以上であることを特徴とする請求項１記載の細胞外小胞体分離方法。
【請求項１０】
前記疎水性官能基は、ブチル基、シアノブチル基、オクチル基、フェニル基及びジフェニル基からなる群から選択される１以上であることを特徴とする請求項１記載の細胞外小胞体分離方法。
【請求項１１】
前記試料は、哺乳動物細胞培養培地、バクテリア細胞培養培地、酵母培養培地、組織抽出物、癌組織、血清、血漿、唾液、涙、鼻水、汗、尿、糞便、脳脊髄液、腹水、羊水、気管支洗浄液、胸水、精液、乳、ほこり、淡水、海水、土壌及び発酵食品からなる群から選択される１以上であることを特徴とする請求項１記載の細胞外小胞体分離方法。
【請求項１２】
前記細胞外小胞体分離方法は、前記（b）段階において、細胞外小胞体が含まれた試料を、前記固定相にローディングする前に、前処理する段階をさらに含むことを特徴とする、請求項１記載の細胞外小胞体分離方法。
【請求項１３】
前記試料の前処理段階は、遠心分離法、超遠心分離法、ろ過法、限外ろ過法、透析法、脱塩カラムクロマトグラフィー法、音波処理法、密度勾配法、サイズ排除法、イオン交換クロマトグラフィー法、親和性クロマトグラフィー法、沈殿法及び水溶液二相系法からなる群から選択される１以上の方法であることを特徴とする、請求項１２記載の細胞外小胞体分離方法。
【請求項１４】
前記細胞外小胞体分離方法は、前記（d）段階において溶出された試料中の細胞外小胞体を後処理する段階をさらに含むことを特徴とする、請求項１記載の細胞外小胞体分離方法。
【請求項１５】
前記細胞外小胞体の後処理段階は、遠心分離法、超遠心分離法、ろ過法、限外ろ過法、透析法、脱塩カラムクロマトグラフィー法、音波処理法、密度勾配法、サイズ排除法、イオン交換クロマトグラフィー法、親和性クロマトグラフィー法、沈殿法及び水溶液二相系法からなる群から選択される１以上の方法であることを特徴とする、請求項１４記載の細胞外小胞体分離方法。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれかに記載の方法で分離された、細胞外小胞体。
【請求項１７】
（a）固定相に疎水性官能基を固定させる段階；
（b）前記疎水性官能基が固定された固定相に、細胞外小胞体が含まれた試料をローディングする段階；及び
（c）前記固定相において疎水性官能基に結合していない細胞外小胞体を含む試料を回収する段階を含む、細胞外小胞体分離方法。
【請求項１８】
前記（b）段階の以前に、前記疎水性官能基を有する固定相を、塩析イオンを含む溶液で洗浄する段階をさらに含む、請求項１７記載の細胞外小胞体分離方法。
【請求項１９】
前記塩析イオンの濃度は、０Ｍ〜１０Ｍであることを特徴とする、請求項１８記載の細胞外小胞体分離方法。
【請求項２０】
前記（b）段階において、細胞外小胞体が含まれた試料を固定相にローディングする前に、試料に塩析イオンを含んだ溶液、又は塩析イオンを含まない溶液を添加して、試料に含まれた塩析イオンの濃度又は種類を変化させる段階をさらに含むことを特徴とする、請求項１７記載の細胞外小胞体分離方法。
【請求項２１】
前記塩析イオンの濃度は、０Ｍ〜１０Ｍであることを特徴とする、請求項２０記載の細胞外小胞体分離方法。
【請求項２２】
前記塩析イオンは、硫酸塩、リン酸塩、水酸化物、フッ素化物、ギ酸塩、酢酸塩、塩化物、臭化物、硝酸塩、ヨウ化物、チオシアン酸塩、クエン酸塩及び酒石酸塩からなる群から選択される１以上であることを特徴とする、請求項１７記載の細胞外小胞体分離方法。
【請求項２３】
前記固定相は、アガロースビーズ、セファロースビーズ、セファデックスビーズ、シリカビーズ、磁気ビーズ、金ナノ粒子、銀ナノ粒子、酸化鉄ナノ粒子、ナイロン膜、ニトロセルロース膜、ＰＶＤＦ膜、紙、プラスチック、ガラス及び金属センサーチップからなる群から選択される１以上であることを特徴とする、請求項１７記載の細胞外小胞体分離方法。
【請求項２４】
前記疎水性官能基は、ブチル基、シアノブチル基、オクチル基、フェニル基及びジフェニル基からなる群から選択される１以上であることを特徴とする、請求項１７記載の細胞外小胞体分離方法。
【請求項２５】
前記試料は、哺乳動物細胞培養培地、細菌細胞培養培地、酵母培養培地、組織抽出物、癌組織、血清、血漿、唾液、涙、鼻水、汗、尿、糞便、脳脊髄液、腹水、羊水、気管支洗浄液、胸水、精液、乳、ほこり、淡水、海水、土壌及び発酵食品からなる群から選択される１以上であることを特徴とする、請求項１７記載の細胞外小胞体分離方法。
【請求項２６】
前記細胞外小胞体の分離方法は、前記（b）段階において細胞外小胞体が含まれた試料を、前記固定相にローディングする前に、前処理する段階をさらに含むことを特徴とする、請求項１７記載の細胞外小胞体分離方法。
【請求項２７】
前記試料の前処理段階は、遠心分離法、超遠心分離法、ろ過法、限外ろ過法、透析法、脱塩カラムクロマトグラフィー法、音波処理法、密度勾配法、サイズ排除法、イオン交換クロマトグラフィー法、親和性クロマトグラフィー法、沈殿法及び水溶液二相系法からなる群から選択される１以上の方法であることを特徴とする、請求項２６記載の細胞外小胞体分離方法。
【請求項２８】
前記細胞外小胞体の分離方法は、前記（c）段階において、回収された試料中の細胞外小胞体を後処理する段階をさらに含むことを特徴とする、請求項１７記載の細胞外小胞体分離方法。
【請求項２９】
前記細胞外小胞体の後処理段階は、遠心分離法、超遠心分離法、ろ過法、限外ろ過法、透析法、脱塩カラムクロマトグラフィー法、音波処理法、密度勾配法、サイズ排除法、イオン交換クロマトグラフィー法、親和性クロマトグラフィー法、沈殿法及び水溶液二相系法からなる群から選択される１以上の方法であることを特徴とする、請求項２８記載の細胞外小胞体分離方法。
【請求項３０】
請求項１７〜２９のいずれかに記載の方法で分離された細胞外小胞体。
【請求項３１】
（a）固定相に疎水性官能基を固定させる段階；
（b）前記疎水性官能基が固定された固定相に、細胞外小胞体が含まれた試料をローディングする段階；及び
（c）前記固定相から疎水性官能基に結合していない試料を回収する段階、
を含む、細胞外小胞体が含まれた試料から細胞外小胞体より疎水性相互作用の強度が高い物質を除去する方法。
【請求項３２】
細胞外小胞体より疎水性相互作用の強度が高い物質を除去する方法であって、
前記（b）段階の前に、前記疎水性官能基が固定された固定相を、塩析イオンを含む溶液で洗浄する段階をさらに含むことを特徴とする、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
細胞外小胞体より疎水性相互作用の強度が高い物質を除去する方法であって、
前記塩析イオンの濃度は、０Ｍ〜１０Ｍであることを特徴とする、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
細胞外小胞体が含まれた試料から細胞外小胞体より疎水性相互作用の強度が高い物質を除去する方法であって、
前記（b）段階において細胞外小胞体が含まれた試料を固定相にローディングする前に、試料に塩析イオンが含まれた溶液を添加して、試料に含まれた塩析イオンの濃度又は種類を変化させる段階をさらに含むことを特徴とする、請求項３０記載の方法。
【請求項３５】
細胞外小胞体より疎水性相互作用の強度が高い物質を除去する方法であって、
前記塩析イオンの濃度は、０Ｍ〜１０Ｍであることを特徴とする、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
細胞外小胞体より疎水性相互作用の強度が高い物質を除去する方法であって、
前記細胞外小胞体より疎水性相互作用の強度が高い物質は、脂質タンパク質であることを特徴とする、請求項３１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞外小胞体の分離方法に関するものであり、より詳細には本発明は、細胞外小胞体の疎水性を利用して、細胞外小胞体を分離する方法、及び前記方法を利用した、脂質タンパク質を含む異物が除去された細胞外小胞体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
細胞外小胞体（extracellular vesicles）は、地球上に生息している全ての細胞から天然に分泌されるナノサイズ（20〜100,000 nm）の小胞体で、細胞由来の脂質二重膜構造を有していて、動物の場合、血液（blood）、唾液（saliva）、涙（tear）、鼻水（nasal mucus）、汗（sweat）、尿（urine）、糞便（feces）、脳脊髄液（CSF, cerebrospinal fluid）、腹水（ascite）、羊水（amniotic fluid）、気管支洗浄液（bronchoalveolar lavage fluid）、胸水（pleural effusion）、精液（semen）、乳（milk）などのような体液だけでなく、様々な癌又は正常組織にも存在している。
【０００３】
これらの細胞外小胞体は、分泌した細胞（母細胞）のタンパク質、脂質、アミノ酸、RNAなどの様々な生理活性物質で構成されて、母細胞の生理的、病理的特性を代弁するだけでなく、他の細胞及び組織に結合して、母細胞由来の生理活性物質を受容細胞及び組織に伝達する運送体として様々な生理的、病理的機能を遂行することが究明されており、細胞外小胞体の構成成分及び機能に対する研究を通じて、生命現象の本質を究明して、様々な疾患・疾病を診断して治療する新たな方法で活用する可能性が期待されている。
【０００４】
従来の細胞外小胞体の分離技術には、超高速遠心分離法（ultra-centrifugation）、密度勾配法（density gradient）、音波処理法、サイズ排除法（size exclusion）、ポリマーを利用した沈殿法（polymer-based precipitation）、塩析法（salt-based precipitation）、有機溶媒沈殿法（organic solvent-based precipitation）、イオン交換クロマトグラフィー法（ion exchange chromatography）、親和性クロマトグラフィー法（affinity chromatography）、及び水溶液二相系法（aqueous two phase system）などがあり、このうちで、超高速遠心分離法が最も広く使用されている。前記技術は、ナノ粒子を、相対的に小さい物質から分離するのに効果的であり、従って、試料内の細胞外小胞体を、溶解性タンパク質を含む様々な物質から分離するのに適用されている。
【０００５】
細胞外小胞体の活用において、試験管で培養した細胞由来の細胞外小胞体を分離してそれらの構成物質を分析することにより、新規バイオマーカー発掘に挑む研究だけでなく、血液をはじめとする動物の体液又は癌組織を含む様々な組織から細胞外小胞体を分離して、タンパク質、核酸などの構成物質の定量的比較を通じて、疾病の診断、予後予測、又は治療のための手段として、多角的に活用に挑む研究が進行中である。
【０００６】
特に、血液（血清及び血漿）と尿を含む様々な動物の体液、又は癌組織を含む様々な組織由来の細胞外小胞体を利用した診断及び治療に対する需要が大きいものの、動物の体液又は組織に存在するナノ粒子は、細胞外小胞体だけでなく、様々な形態の脂質タンパク質（lipoprotein）も含んでいるため、従来の細胞外小胞体の分離方法では、細胞外小胞体だけを特異的に分離し難い問題点がある。
【０００７】
脂質タンパク質又はリポタンパク質は、細胞の構成に必須的な細胞膜の生成において基本となるコレステロール（cholesterol）及びトリグリセリド（triglyceride）を伝達する重要な因子である。また、脂質タンパク質は、血液内の細胞外核酸（extracellular nucleic acids）を運搬する運搬体として作用することが知られており（非特許文献１）、血液内の細胞外核酸を運搬する細胞外小胞体の機能と極めて類似した特性を有する。脂質タンパク質には、高密度脂質タンパク質（HDL; 5〜15 nm、1.063 g/mL）、低密度脂質タンパク質（LDL; 18〜28 nm、1.019〜1.063 g/mL）、中密度脂質タンパク質（IDL; 25〜50 nm、1.006〜1.019 g/mL）、超低密度脂質タンパク質（VLDL; 30〜80 nm、0.950〜1.006 g/mL）、カイロミクロン（chylomicron; 100〜1000 nm、0.95 g/mL程度）などがあるが、これらはサイズ（nm）と密度（g/mL）が様々なナノ粒子である。
【０００８】
前記血液内の細胞外小胞体と脂質タンパク質は、細胞外核酸を運搬しながら、サイズ及び密度が多くの面で類似したナノ粒子であり、前記の通常の細胞外小胞体の分離方法では、両者を選択的に分離することは難しい（非特許文献２〜４）。
【０００９】
従って、血液や尿を含む様々な動物の体液や、癌組織を含む様々な組織から細胞外小胞体を分離する場合、精製された細胞外小胞体は、脂質タンパク質で汚染されていて、誘電体及びタンパク体の分析、機能研究、診断及び治療に活用する際に、いくつかの問題点を引き起こす。これらの問題点について、細胞外小胞体と脂質タンパク質の密度差を利用した密度勾配法を利用しても、脂質タンパク質の効果的な除去が行われないことが報告された。
【００１０】
従って、様々な動物の体液又は組織由来の細胞外小胞体の分析及び機能の研究だけでなく、細胞外小胞体の診断及び治療に活用するためには、細胞外小胞体を精製する際の、脂質タンパク質の効果的な除去技術の開発が至急な実情である。これらの技術は、細胞外小胞体の分離技術と共にその分野の発展において最も核心的な技術となるであろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Vicker et al., Nat Cell Biol, 2011, ISSN: 1476-4679
【非特許文献２】Looze et al., Biochem Biophys Res Commun, 2009, ISSN:1090-2104
【非特許文献３】Yuana et al., J Extracell Vesicles, 2014, ISSN:2001-3078
【非特許文献４】Sodar et al., Sci Rep, 2016, ISSN:2045-2322
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
［発明の詳細な説明］
［技術的課題］
本発明の目的は、（a）固定相（stationary phase）に疎水性（hydrophobic）官能基を固定させる段階、（b）前記固定相に、細胞外小胞体が含まれた試料をローディングする段階、（c）前記固定相において疎水性官能基に結合していない試料の残余物を洗浄する段階、及び（d）前記固定相から疎水性官能基と結合した細胞外小胞体を溶出させる段階、を含む、細胞外小胞体分離方法を提供することである。
【００１３】
本発明のさらに他の目的は、（a）固定相に疎水性官能基を固定させる段階、（b）前記疎水性官能基が固定された固定相に、細胞外小胞体が含まれた試料をローディングする段階、及び（c）前記固定相から疎水性官能基に結合していない細胞外小胞体を含む試料を回収する段階、を含む、細胞外小胞体分離方法を提供することである。
【００１４】
本発明のさらに他の目的は、前記方法により分離された細胞外小胞体を提供することである。
【００１５】
本発明のさらに他の目的は、前記方法により、細胞外小胞体が含まれた試料から脂質タンパク質を除去する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
［技術的解決方法］
本発明は、上述した問題点を解決するためのものであって、細胞外小胞体の疎水性相互作用（hydrophobic interaction）を利用して、細胞外小胞体より疎水性が大きいか又は小さい物質から、細胞外小胞体を特異的に分離する方法を提供する。本発明で、細胞外小胞体を含む様々な試料を、疎水性官能基が付着した固定相に通過させながら、塩析イオンの濃度を調節すると、疎水性相互作用の強度によって、物理的、化学的変化なしに、迅速かつ容易に、細胞外小胞体を分離することができる。
【００１７】
本発明の用語“細胞外小胞体”とは、古細菌（Archaea）、原核生物（Prokarya）又は真核生物（Eukarya）の細胞から由来した生体ナノ粒子の通称であり、アグロソーム（argosomes）、デキソソーム（dexosomes）、細胞外小胞体、エキソソーム（exosome）、エクトソーム（ectosomes）、エキソベジクル（exovesicle）、オンコソーム（oncosome）、プロミノソーム（prominosome）、プロスタソーム（prostasome）、トレロソーム（tolerosome）、微粒子（microparticle）、微細小胞（microvesicle）、ナノ小胞（nanovesicle）、水疱性小胞（blebbing vesicle）、出芽性小胞（budding vesicle）、エキソソーム様小胞（exosome-like vesicle）、マトリックス小胞（matrix vesicle）、膜小胞（membrane vesicle）、脱粒小胞（shedding vesicle）、膜粒子（membrane particle）、脱粒微細小胞（shedding microvesicle）、膜水泡（membrane bleb）、エピディディモソーム（epididimosome）、プロミニノソーム（promininosome）、テキソソーム（texosome）又はアキオソーム（archeosome）を含むことができるが、これらに限定されるものではない。また、様々な膜タンパク質を含む様々な種類の細胞外小胞体の模写体も含む。
【００１８】
具体的に、本発明の第１の細胞外小胞体分離方法は、（a）固定相に疎水性官能基を固定させる段階、（b）前記固定相に細胞外小胞体が含まれた試料をローディングして、前記疎水性官能基に細胞外小胞体を結合させる段階、（c）前記固定において疎水性官能基に結合していない試料残余物を洗浄する段階及び、（d）前記固定相から疎水性官能基と結合した細胞外小胞体を溶出させる段階を含む、細胞外小胞体分離方法を含む。
【００１９】
本発明による前記細胞外小胞体の分離方法を、図１（a）に模式的に示した。
【００２０】
また、本発明の第２の細胞外小胞体分離方法は、（a）固定相に疎水性官能基を固定させる段階、（b）前記疎水性官能基が固定された固定相に、細胞外小胞体が含まれた試料をローディングする段階、及び（c）前記固定相から疎水性官能基に結合していない細胞外小胞体を含む試料を回収する段階を含む。
【００２１】
本発明による前記細胞外小胞体の分離方法を、図１（b）に模式的に示した。
【００２２】
本発明の用語「固定相（stationary phase）」とは、親和性クロマトグラフィーにおいて、物理的、化学的又は生物学的に親和性を示す２種類の物質のうち、いずれかの物質を固定するための基質を意味する。具体的には、本発明で固定相は、アガロースビーズ、セファロースビーズ、セファデックスビーズ、シリカビーズ、磁気ビーズ、金ナノ粒子、銀ナノ粒子、酸化鉄ナノ粒子、ナイロン膜、ニトロセルロース膜、ＰＶＤＦ膜、紙、プラスチック、ガラス及び金属センサーチップからなる群から選択される１以上であるが、これらに限定されるものではない。
【００２３】
本発明の用語「疎水性官能基」とは、疎水性作用基又は非極性官能基とも呼ばれており、水分子に対する親和力がないか、もしくはほとんどないか、又は、分子及び表面が水に溶けないか、もしくはその表面から水を押し出す性質を有する作用基を意味し、アルキル基（alkyl-）、フェニル基（phenyl-）などがある。好ましくは、本発明の疎水性官能基は、ブチル基（butyl）、シアノブチル基（cyanobutyl）、オクチル基（octyl）、フェニル基及びジフェニル基（diphenyl）からなる群から選択されるが、これらに限定されるものではない。
【００２４】
本発明の用語「試料」とは、細胞外小胞体を含む生体試料又は細胞培養液、組織試料などを含むもので、具体的には、哺乳動物細胞培養培地、バクテリア細胞培養培地、酵母培養培地、組織抽出物、癌組織、血液（血清及び血漿）、唾液、涙、鼻水、汗、尿、糞便、脳脊髄液、腹水、羊水、気管支洗浄液、胸水、精液、乳、ほこり、淡水、海水、土壌及び発酵食品からなる群から選択される１以上であるが、これらに限定されない。
【００２５】
本発明の用語「溶液」とは、細胞外小胞体が含まれるか又は含まれていない液体を意味し、試料ローディング前後に固定相を洗浄したり、細胞外小胞体が含まれている試料に添加したり、固定相に結合された試料を溶出する用途に使用することができる。具体的には、本発明の溶液は、水、有機溶媒及び緩衝溶液からなる群から選択されるが、これらに限定されるものではない。
【００２６】
本発明の用語「塩析イオン（salting-out ion）」とは、溶液中で水への可溶性を減少させ、疎水性相互反応の強度を増加させるためのものであり、水の構造を安定化させるコスモトロピック塩（kosmotropic salt）を指す。これらのコスモトロピック塩は、溶液から溶解性物質の溶解度に影響を与える能力の程度によってホフマイスター系列（Hofmeister series）で表し、陰イオン系列は以下の通りである：ＳＯ４２−＜ＨＰＯ４２−＜ＯＨ−＜Ｆ−＜ＨＣＯＯ−＜ＣＨ３ＣＯＯ−＜Ｃｌ−＜Ｂｒ−＜ＮＯ３−＜Ｉ−＜ＳＣＮ−＜ＣｌＯ４−。陽イオン系列は、以下の通りである：ＮＨ４＋、Ｒｂ＋、Ｋ＋、Ｎａ＋、Ｃｓ＋、Ｌｉ＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、及びＢａ２＋。コスモトロピック塩は、ホフマイスター系列に沿って、疎水性粒子に対する塩析イオンとして作用する。本発明の前記塩析イオンは、ホフマイスター系列で水の構造を安定化させる陰イオンとそのカウンター陽イオンとからなるコスモトロピック塩でもある。
【００２７】
試料内の細胞外小胞体と、疎水性官能基を有する固定相とが結合するか否かは、前記塩析イオンの種類及び濃度を調節することにより決定することができる。
【００２８】
具体的には、試料内の細胞外小胞体より疎水性相互作用の強度が弱い物質から細胞外小胞体を分離しようとする場合、高濃度の塩析イオンを含む溶液で疎水性官能基を有する固定相を洗浄し、高濃度の塩析イオンが添加された細胞外小胞体試料を前記固定相に流すことにより、細胞外小胞体は疎水性官能基を有する固定相に吸着されて、相対的に疎水性相互作用の強度が弱い粒子は吸着されないままカラムを通過して出てくる。その後、前記固定相の洗浄溶液及び試料に混合された塩析イオンの濃度よりも低い濃度の塩析イオンを含む溶液で洗浄すると、追加して細胞外小胞体よりも疎水性相互作用が低い物質を溶出して除去することができる。この後、前記吸着された細胞外小胞体は、水又は塩析イオンを含まない溶液又は低濃度の塩析イオンが含まれた溶液等の通常の方法で溶出させることにより、分離することができる。
【００２９】
一方、試料内の細胞外小胞体より疎水性相互作用の強度が強い物質から細胞外小胞体を分離しようとする場合には、水又は低濃度の塩析イオンで疎水性の官能基を有する固定相を洗浄すると、相対的に疎水性相互作用の強度が強い物質は疎水性官能基を有する固定相に吸着され、細胞外小胞体は疎水性官能基を有する固定相に吸着されないまま、カラムを通過して分離することができる。必要な場合、細胞外小胞体が含まれた試料の塩析イオン濃度を下げることにより、効率的に疎水性官能基を有する固定相に吸着されていない細胞外小胞体を分離することができる。
【００３０】
本発明で塩析イオンは、前記コスモトロピック塩からなる群から選択されるが、硫酸塩（sulphate）、リン酸塩（phosphate）、水酸化物（hydroxide）、フッ素化物（fluoride）、ギ酸塩（formate）、酢酸塩（acetate）、塩化物（chloride）、臭化物（bromide）、硝酸塩（nitrate）、ヨウ化物（iodide）、チオシアン酸塩（thiocyanate）、クエン酸塩（citrate）及び酒石酸塩（tartrate）などと陽イオンとからなる群から選択される１以上でもあるが、これらに限定されない。好ましくは、本発明の塩析イオンは、塩化ナトリウム、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム及び塩化アンモニウムからなる群から選択される１以上であるが、これらに限定されない。
【００３１】
本発明では、細胞外小胞体を含む様々な試料から、塩析イオン濃度の調節を通じて、１）疎水性官能基を有する固定相に細胞外小胞体を結合させて、疎水性相互作用の強度が低い物質を除去した後、結合された細胞外小胞体を溶出させることにより、疎水性相互作用の強度が異なる物質から細胞外小胞体を分離したり、２）疎水性官能基を有する固定相に疎水性相互作用の強度が高い物質を吸着させ、細胞外小胞体は結合させずに溶出させることにより、分離する方法を提供する。これらを通じて、様々な試料から迅速かつ容易に細胞外小胞体を分離することができ、このように分離された細胞外小胞体は、診断と治療及びマルチオミクス（multi-omics）、特性と機能の研究などに活用が容易である。
【００３２】
本発明は、前記疎水性相互作用を利用して、細胞外小胞体を分離する方法において二つの方法を提供する。
【００３３】
最初に、本発明は、細胞外小胞体より相対的に疎水性相互作用の強度が小さい物質から細胞外小胞体を分離するために、（a）固定相に疎水性官能基を固定させる段階、（b）前記固定相に細胞外小胞体が含まれた試料をローディングして、前記疎水性官能基に細胞外小胞体を結合させる段階、（c）前記固定相において疎水性官能基に結合しない試料の残余物を洗浄する段階、及び（d）前記固定相において疎水性官能基と結合した細胞外小胞体を溶出させる段階、を含む細胞外小胞体分離方法を提供する。
【００３４】
本発明の一実施例において、前記（b）段階の前に、前記疎水性官能基を有する固定相を、塩析イオンを含む溶液で洗浄する段階をさらに含むことができる。
【００３５】
このとき、前記固定相の洗浄段階で、塩析イオンの濃度は、固定相に細胞外小胞体が結合することができるように固定相の疎水性を強く調節する濃度であり、これは洗浄溶液中の塩析イオンの種類、洗浄前固定相の疎水性の強度などによって異なる場合がある。前記固定相の洗浄段階を通じて、細胞外小胞体は固定相に結合し、塩析イオンの濃度によって、細胞外小胞体より疎水性の強度が低いナノ粒子は、固定相をそのまま通過することができる。好ましくは、本発明の前記塩析イオンの濃度は、０Ｍ〜１０Ｍで調節することができる。
【００３６】
本発明の一実施例において、前記（b）段階の細胞外小胞体が含まれた試料を固定相にローディングする前に、試料に塩析イオンを含む溶液を添加して、試料に含まれた塩析イオンの濃度又は種類を変化させる段階をさらに含むことができる。
【００３７】
前記試料に塩析イオンが含まれた溶液を添加することにより、試料中に含まれた塩析イオンの濃度を高めたり、希釈したり、塩析イオンの種類を置換したり、追加することができる。このように、試料に含まれている塩析イオンの種類又は濃度を調節することにより、試料の疎水性相互作用の強度を調節することができ、細胞外小胞体と前記固定相との疎水性相互作用を調節することができる。好ましくは、本発明の前記塩析イオンの濃度は、０Ｍ〜１０Ｍで調節することができる。
【００３８】
本発明の一実施例において、前記（d）段階は、疎水性官能基を有する固定相に吸着された物質から、細胞外小胞体を特異的に分離するためのものであって、前記（d）段階の細胞外小胞体を溶出する前に、塩析イオンの種類又は濃度を調節して、細胞外小胞体より疎水性相互作用の強度が小さい物質を除去する段階をさらに含むことができる。
【００３９】
前記塩析イオンの濃度は、細胞外小胞体を固定相に付着させた状態で、細胞外小胞体より疎水性の強度が小さい物質だけを溶出させることができる濃度であって、塩析イオンの種類、溶液のｐＨ又は温度によって異なるように調節することができる。好ましくは本発明の前記塩析イオンの濃度は、０Ｍ〜１０Ｍで調節することができる。
【００４０】
本発明の一実施例において、前記（d）段階は、疎水性の官能基を有する固定相に吸着された物質から細胞外小胞体を特異的に分離するためのものであって、塩析イオンの種類又は濃度を調節して、細胞外小胞体より疎水性の強度が大きい物質はカラムに付着させた状態で、細胞外小胞体のみを溶出させることができる。
【００４１】
前記塩析イオンの濃度は、細胞外小胞体より疎水性の強度が強い固定相に付着させた状態で、細胞外小胞体のみを溶出させることができる濃度であって、塩析イオンの種類、溶液のｐＨ又は温度によって異なるように調節することができる。好ましくは、本発明の前記塩析イオンの濃度は、０Ｍ〜１０Ｍで調節することができる。
【００４２】
本発明の前記塩析イオンは、固定相又は細胞外小胞体が含まれた試料の疎水性を調節するためのものであって、本発明で前記固定相に細胞外小胞体を結合させたり、前記固定相に結合された細胞外小胞体を溶出させたりするためには、この技術分野の当業者が理解できる様々な条件を適用することができる。具体的には、塩析イオンの種類、塩析イオンの濃度、緩衝液のｐＨ、温度などによって調節することができる。好ましくは、本発明の塩析イオンを含む溶液において、塩析イオンは、硫酸塩、リン酸塩、水酸化物、フッ素化物、ギ酸塩、酢酸塩、塩化物、臭化物、硝酸塩、ヨウ化物、チオシアン酸塩、クエン酸塩、及び酒石酸塩からなる群から選択される１以上でもあって、溶液の条件として、０Ｍ〜１０Ｍの塩析イオン、ｐＨ３〜ｐＨ１２の溶液、４℃〜５０℃の温度、又は前記条件の組合せを適用することができるが、これらに限定されない。
【００４３】
本発明において、前記固定相に疎水性官能基又は試料をローディングする方法は、重力式、ポンプ式（液体クロマトグラフィーシステム）、注射式、回転式又は真空式の中から選択することができるが、これに限定されない。
【００４４】
本発明の細胞外小胞体分離方法は、前記細胞外小胞体が含まれた試料を、前記固定相にローディングする前に、試料を前処理する段階をさらに含むことができる。
【００４５】
本発明の前記前処理段階は、非精製試料の部分精製段階であって、遠心分離（centrifugation）、超遠心分離（ultracentrifugation）、ろ過（filtration）、限外ろ過（ultrafiltration）、透析（dialysis）、脱塩カラムクロマトグラフィー（desalting column chromatography）、音波処理（sonication）、密度勾配超遠心分離（density gradient ultracentrifugation）、サイズ排除クロマトグラフィー（size exclusion chromatography）、イオン交換クロマトグラフィー（ion exchange chromatography）、親和性クロマトグラフィー（affinity chromatography）、ポリマーを利用した沈殿（polymer-based precipatation）、塩析（salt-based precipitation）、有機溶媒沈殿（organic solvent precipitation）及び水溶液二相系（aqueous two phase system）から選択される１以上であるが、これらに限定されない。
【００４６】
また、本発明の細胞外小胞体分離方法によって、前記疎水性官能基が固定された固定相から溶出された細胞外小胞体を後処理する段階をさらに含むことができる。
【００４７】
本発明の前記後処理段階は、分離された細胞外小胞体の精製段階であって、遠心分離、超遠心分離、ろ過、限外ろ過、透析、脱塩カラムクロマトグラフィー、音波処理、密度勾配超遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ポリマーを利用した沈殿、塩析、有機溶媒沈殿及び水溶液二相系から選択される１以上であるが、これらに限定されない。
【００４８】
本発明の第二の分離方法は、細胞外小胞体より相対的に疎水性相互作用の強度が強い物質から細胞外小胞体を分離するために、（a）固定相に疎水性官能基を固定させる段階、（b）前記疎水性官能基が固定された固定相に細胞外小胞体が含まれた試料をローディングする段階、及び（c）前記固定相から疎水性官能基に結合していない細胞外小胞体を含む試料を回収する段階、を含む細胞外小胞体分離方法を提供する。
【００４９】
本発明の一実施例において、前記（b）段階の以前に、前記疎水性官能基を有する固定相を、塩析イオンを含む溶液で洗浄する段階をさらに含むことができる。
【００５０】
このとき、前記固定相の洗浄段階で、塩析イオンの濃度は、固定相に細胞外小胞体より疎水性の強度が強い物質のみを結合させ、細胞外小胞体は結合しないように固定相の疎水性を弱く調節する濃度であって、これは洗浄溶液中の塩析イオンの種類、洗浄前固定相の疎水性強度などによって異なることがある。前記固定相の洗浄段階を通じて細胞外小胞体より疎水性の強度が強い物質は固定相に結合し、細胞外小胞体及びこれより疎水性の強度が低いナノ粒子は、固定相をそのまま通過することができる。好ましくは、本発明の前記塩析イオンの濃度は、０Ｍ〜１０Ｍで調節することができる。
【００５１】
本発明の一実施例において、前記（b）段階の細胞外小胞体が含まれている試料を固定相にローディングする前に、試料に塩析イオンを含む溶液又は塩析イオンを含まない溶液を添加して、試料に含まれている塩析イオンの濃度又は種類を変化させる段階をさらに含むことができる。
【００５２】
前記試料に塩析イオンを含む溶液又は塩析イオンを含まない溶液を添加することにより、試料中に含まれた塩析イオンの濃度を高めたり、希釈したり、塩析イオンの種類を置換したり、追加することができる。このように試料に含まれている塩析イオンの種類又は濃度を調節することにより、試料の疎水性相互作用の強度を調節することができ、細胞外小胞体と前記固定相との疎水性相互作用を調節することができる。好ましくは、本発明の前記塩析イオンの濃度は、０Ｍ〜１０Ｍで調節することができる。
【００５３】
本発明の前記塩析イオンを含む溶液又は塩析イオンを含まない溶液は、固定相又は細胞外小胞体が含まれている試料の疎水性を調節するためのもので、本発明において比較的に疎水性相互作用の強度が弱い細胞外小胞体は、疎水性官能基を有する固定相に吸着されずにそのまま通過するが、細胞外小胞体より疎水性が強い脂質タンパク質のような物質のみを選択的に疎水性官能基を有する固定相に吸着できるようにするためには、この技術分野の当業者が理解できる様々な条件を適用することができる。具体的には、塩析イオンの種類、塩析イオンの濃度、緩衝液のｐＨ、及び温度などによって調節することができる。好ましくは、本発明の塩析イオンを含む溶液において、塩析イオンは、硫酸塩、リン酸塩、水酸化物、フッ素化物、ギ酸塩、酢酸塩、塩化物、臭化物、硝酸塩、ヨウ化物、チオシアン酸塩、クエン酸塩及び酒石酸塩からなる群から選択される１以上でもあって、溶液の条件として０Ｍ〜１０Ｍの塩析イオン、ｐＨ３〜ｐＨ１２の溶液，４℃〜５０℃の温度又は前記条件の組合せを適用することができるが、これらに限定されない。
【００５４】
血液を含めた生体試料内の脂質タンパク質は、疎水性相互作用強度が強い物質として、塩析イオン濃度が低い環境でも、疎水性官能基に強く吸着されることがよく知られている。これにより前記のような本発明の方法で、生体試料から脂質タンパク質と細胞外小胞体とを効率的に分離することができる。
【００５５】
本発明では、前記固定相に疎水性官能基又は試料をローディングする方法は、重力式、ポンプ式（液体クロマトグラフィーシステム）、注射式、回転式又は真空式から選択されるが、これらに限定されない。
【００５６】
本発明の細胞外小胞体の分離方法は、前記細胞外小胞体が含まれている試料を、前記固定相にローディングする前に、試料を前処理する段階をさらに含むことができる。
【００５７】
本発明の前記前処理段階は、非精製試料の部分精製段階として、遠心分離、超遠心分離、ろ過、限外ろ過、透析、脱塩カラムクロマトグラフィー、音波処理、密度勾配超遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ポリマーを利用した沈殿、塩析、有機溶媒沈殿及び水溶液二相系から選択される１以上であるが、これらに限定されない。
【００５８】
また、本発明の細胞外小胞体分離方法によって、前記疎水性官能基が固定された固定相から溶出された細胞外小胞体を後処理する段階をさらに含むことができる。
【００５９】
本発明の前記後処理段階は、分離された細胞外小胞体の精製段階として、遠心分離、超遠心分離、ろ過、限外ろ過、透析、脱塩カラムクロマトグラフィー、音波処理、密度勾配超遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ポリマーを利用した沈殿、塩析、有機溶媒沈殿及び水溶液二相系の中から一つ以上の方法が選ばれるが、これに限定されない。
【００６０】
本発明は、また、前記分離方法により分離された細胞外小胞体を提供する。
【００６１】
本発明は、また、前記分離方法により、細胞外小胞体を含む試料から、細胞外小胞体より疎水性相互作用の強度が強い脂質タンパク質や、細胞外小胞体より疎水性相互作用の強度が低い物質を効果的に除去する方法を提供する。
【発明の効果】
【００６２】
本発明に係る細胞外小胞体の分離方法は、遠心分離器のような高価な装置を必要とせず、分離過程で試料が極限環境に晒されないため、細胞外小胞体の形態や性質を維持しながら、効率的に分離することができるというメリットがある。また、本発明の方法は、従来の細胞外小胞体分離方法と結合して適用することができ、従来方法の実行前の段階又は後の段階に適用することにより、分離効率を最大化することができる。
【００６３】
また、本発明の細胞外小胞体分離方法は、試料量の制限なしに、迅速かつ効果的に、細胞外小胞体を分離することができ、細胞外小胞体の大量生産に重要な要素として活用することができるだけでなく、少量の体液試料の前処理及び後処理段階に適用することにより、臨床診断に活用することができる。
【００６４】
また、本発明の細胞外小胞体分離方法を利用すると、血液や尿を含む様々な動物の体液又は癌組織を含む様々な組織から、従来の方法では難しかった、脂質タンパク質の汚染が除去された細胞外小胞体の分離が可能となり、従来の脂質タンパク質の汚染によって引き起こされた問題を解決し、動物の様々な体液又は組織から分離した細胞外小胞体の特性と機能の研究、マルチオミクス研究、新規バイオマーカーの発掘、診断と治療など、様々な研究に波及効果が大きい必須の技術になると期待される。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】図１は、本発明の一実施例に係る方法で、細胞外小胞体分離方法に対する模式図である。
【図２】図２は、本発明の一実施例に係る、大腸癌細胞株SW480から標本細胞外小胞体を分離する方法の概念図である。
【図３】図３は、本発明の一実施例に基づいて分離された標本細胞外小胞体を、サイズ排除クロマトグラフィー（a）、透過型電子顕微鏡（b）、DLS分析（c）及びウエスタンブロット（d）で確認した結果である。
【図４】図４は、本発明の一実施例に基づいて疎水性官能基を有する固定相に標本細胞外小胞体が結合する様相を確認するために、ナノ粒子の濃度分析（a）及びサンドイッチELISA分析（b）を遂行した結果である。
【図５】図５は、本発明の一実施例に基づいて、様々な濃度の塩化ナトリウム環境で、疎水性官能基を有する固定相への標本細胞外小胞体の結合様相を確認するために、ナノ粒子の濃度分析（a）及びウエスタンブロット（b）を遂行した結果である。
【図６】図６は、本発明の一実施例に基づいて疎水性相互作用を利用した方法を含む細胞外小胞体分離法を通じて、脂質タンパク質が除去されたヒトの血漿から由来した細胞外小胞体の精製を、ウエスタンブロット（a）、コレステロール分析（b）、ナノ粒子の濃度分析（c）及びタンパク質の濃度分析（d）を通じて確認した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００６６】
［発明の実施のための最善の形態］
以下、実施例を通じて、本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されるものと解釈されないことは、当業界で通常の知識を有する者にとって自明なことである。
【００６７】
実施例１．標本細胞外小胞体の精製及び分析
新鮮に得られた大腸癌細胞株SW480培養液を500×ｇで10分間遠心分離（計２回繰り返し）して、残存する細胞及び沈殿物を除去した。前記上澄み液を、再び2,000×ｇで20分間遠心分離（計２回繰り返し）して、沈殿物を除去した。
【００６８】
前記上澄み液に存在する細胞外小胞体を一次精製及び沈殿するために、細胞外小胞体沈殿誘導液（8.4％ Polyethylene Glycol 6000, 250 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7.4）を添加して16時間冷蔵保管した後、12,000×ｇで30分間遠心分離して沈殿した細胞外小胞体を回収し、HEPES緩衝溶液（HEPES-buffered saline, 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.4）に溶かした。
【００６９】
密度及び浮力を利用して細胞外小胞体を二次精製するために、前記試料をオプティプレップと混合（最終濃度30％）して超遠心分離容器の最下層に位置させた後、20％オプティプレップ、5％オプティプレップ順で重層させた。200,000×ｇで2時間、オプティプレップ浮力密度勾配超遠心分離（30％、20％、5％オプティプレップ三重層）を行い、超遠心分離後、細胞外小胞体と高密度分画（1.08〜1.12 g/ml）を回収した。
【００７０】
前記精製された細胞外小胞体を三次精製するために、HPLC装置を利用して、セファクリル（Sephacryl）S500で充填されたカラム（10 x 100 mm）にローディングした後、サイズ排除クロマトグラフィー法を通じて、最終精製された細胞外小胞体分画を回収し、この標本細胞外小胞体分離過程を図２に示した。
【００７１】
前記の方法に基づいて、大腸癌細胞株SW480から最終精製された細胞外小胞体をサイズ排除クロマトグラフィー、電子顕微鏡及び動的光散乱（Dynamic Light Scattering, DLS）を通じて確認した。その結果、図３（a）に示した通り、サイズ排除クロマトグラフィーでは、精製した大腸癌細胞株由来の細胞外小胞体の高い純度を確認することができ、図３（b）に示した通り、透過型電子顕微鏡を用いて大腸癌細胞株由来の細胞外小胞体の形状を確認し、図３（c）に示した通り、DLS分析を通じて大腸癌細胞株由来の細胞外小胞体の大きさが直径約164 nmであることを確認した。
【００７２】
また、図３（d）に示した通り、ウエスタンブロットを通じて、細胞外小胞体マーカーであるAlix、CD63、及び、CD9タンパク質が、細胞株に比べて選択的に高く発現されたが、同時に、細胞質内に存在するタンパク質であるCalnexin及びヒストンH2Bタンパク質は、精製した大腸癌細胞株由来の細胞外小胞体からは検出されなかった。
【００７３】
実施例２．標本細胞外小胞体の疎水性官能基を有する固定相に対する結合様相
疎水性官能基に対する細胞外小胞体の結合を確認するために、HPLCシステムを利用して、前記実施例から分離した標本細胞外小胞体の結合様相を確認した。
【００７４】
まず、疎水性官能基を有する固定相（Phenyl-Sepharose）が充填されたカラム（1 ml）を1 ml/minの圧力で、20カラム嵩の結合緩衝溶液（Binding buffer; 1M NaCl, 20 mM HEPES, pH 7.2）を利用して洗浄した。前記実施例１で分離した標本細胞外小胞体は、前記と同じ結合緩衝液に、4x1010個ほどを溶解させて準備した。
【００７５】
前記洗浄した疎水性官能基を有する固定相に、標本細胞外小胞体溶液を、同じ結合緩衝溶液を使用して５分間ローディングした後、追加して５分間、同じ緩衝液で洗浄して、結合されていない残余物を除去した。次に20カラム嵩の1 M〜0 M塩化ナトリウム（NaCl）濃度勾配の後、10カラム嵩の0 M塩化ナトリウム緩衝溶液で洗浄した。
【００７６】
前記細胞外小胞体の結合、洗浄、塩化ナトリウム濃度勾配及び最終洗浄工程で出た溶出液を、1 mlずつ分画して、分画された全ての溶出液に対して、ナノ粒子濃度の分析及び抗-細胞外小胞体マーカー抗体（anti-CD9, anti-SW480EV antibody）を利用したサンドイッチELISAを行うことにより、細胞外小胞体の固定相結合様相を分析した。
【００７７】
その結果、図４に示した通り、1 M塩化ナトリウム緩衝溶液の環境では、ほとんどの標本細胞外小胞体が、疎水性官能基を有する固定相に結合して溶出液中に検出されず、移動相の塩化ナトリウムの濃度が0 Mに達すると、細胞外小胞体が溶出されることを確認した。従って、高濃度の塩化ナトリウム環境で、細胞外小胞体は疎水性官能基に結合して、低濃度の塩化ナトリウム環境において疎水性官能基から分離されることが分かった。また前記研究結果から、疎水性官能基を有する固定相を使用すると、精製された標本細胞外小胞体に存在する不純物又は保管中に生じた不活性化された細胞外小胞体や相対的にサイズが大きい不純物の滓の複合体を、効率的に除去することができることを知った。
【００７８】
実施例３．塩濃度による標本細胞外小胞体の疎水性官能基を有する固定相結合様相
塩化ナトリウム濃度によって、疎水性官能基を有する固定相に標本細胞外小胞体が結合する様相を確認するために、下記のような実験を行った。
【００７９】
精製した試料の細胞外小胞体を、ポリエチレングリコールを利用して沈殿し、沈殿した標本細胞外小胞体を、様々な濃度の塩化ナトリウムを含む緩衝溶液（0 M, 50 mM, 150 mM, 500 mM NaCl in 20 mM HEPES, pH 7.2）で置換した。
【００８０】
疎水性官能基を有する固定相（Phenyl-Sepharose）0.4 mlを空カラムに充填して、水で各0.5 mlずつ、合計３回の遠心分離（700×ｇ、1 min）で洗浄し、疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムを準備した。このような疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムを４個用意し、各カラムを前記濃度別緩衝溶液（0 M, 50 mM, 150 mM, 500 mM NaCl in 20 mM HEPES, pH 7.2）で各0.5 mlずつ、合計３回追加洗浄した。用意された各カラムに、標本細胞外小胞体0.2 mlずつをローディングした後、10分間反応させて、700×ｇで１分間遠心分離して、非結合溶液を回収した。回収した溶液内の標本細胞外小胞体を定量するために、ナノ粒子の濃度を測定し、細胞外小胞体マーカーであるCD9に対するウエスタンブロット分析を行い、その結果を図５に示した。
【００８１】
図５に示した通り、ナノ粒子の分析結果（a）とウエスタンブロット（b）の結果、塩化ナトリウムの濃度が0 Mの緩衝溶液において最も高いナノ粒子濃度及びCD9信号が検出され、細胞外小胞体は高濃度の塩化ナトリウム条件で疎水性官能基に結合し、低濃度の塩化ナトリウム環境では、疎水性官能基に結合せずにカラムを抜け出すことが分かった。
【００８２】
実施例４．疎水性相互作用クロマトグラフィーを利用した脂質タンパク質が除去された血液由来細胞外小胞体の分離
本発明の方法を利用して、下記のようにヒトの血漿から細胞外小胞体を分離して、脂質タンパク質除去効果を確認した。
【００８３】
空のカラムに疎水性官能基を有する固定相（Phenyl-Sepharose）2 mlを充填し、遠心分離（700×ｇ, 1 min）を利用して、水で2 mlずつ、計３回洗浄した。その後、EDTAが処理された1 mlのヒトの血漿試料を、前記固定相が充填されたカラムにローディングし、再び700×ｇで１分間遠心分離を行い、カラムに結合していない血漿試料を回収した。その後、回収した血漿試料を、再び同じカラムにローディングして、同じ条件で遠心分離する方式で、血漿試料を合計３回、前記固定相が充填されたカラムを通過させて回収した。
【００８４】
前記疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムを通じて溶出された血漿試料と、対照群として疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムを通過させていない血漿試料とを、それぞれHEPES緩衝溶液（150 mM NaCl, HEPES, pH 7.2）で8倍に希釈した後、ポリエチレングリコールを利用して、試料内の細胞外小胞体を沈殿させ、遠心分離（12,000×ｇ, 10 min）を利用して、沈殿された細胞外小胞体を回収した。次に、回収した沈殿物をHEPES緩衝溶液に溶解させた後、HPLCシステムを利用したS500サイズ排除クロマトグラフィーを通じて、細胞外小胞体を追加精製した。
【００８５】
前記にて精製した血液由来の細胞外小胞体から、細胞外小胞体マーカータンパク質であるCD81及び高密度脂質タンパク質の特異タンパク質であるApoA1と低密度脂質タンパク質の特異タンパク質であるApoBの信号を、ウエスタンブロットを通じて分析して、図６（a）に示した。その結果、疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムを通過した試料と、カラムを通過していない試料とから、CD81の信号が類似して示された反面、疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムを通過した試料では、脂質タンパク質のマーカーであるApoB及びApoA1信号が検出されなかった。従って、疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムを使用すると、血液由来の細胞外小胞体の収率はそのまま維持しながら、脂質タンパク質のみを選択的に除去することができることを確認した。
【００８６】
また、前記にて精製した血液由来の細胞外小胞体のコレステロール濃度分析を行った結果、疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムを通過させた細胞外小胞体試料の場合、コレステロール濃度が著しく低くなることを確認し（図６（b））、ナノ粒子の分析（図６（c））及びタンパク質濃度の分析（図６（d））を通じても、脂質タンパク質ナノ粒子が除去されることにより、疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムを通過した試料からナノ粒子の濃度と脂質タンパク質濃度が低くなることが確認できた。
【００８７】
従って、本実施例を通じて、疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムを利用して、血液由来の細胞外小胞体の収率を維持しながら、通常の方法では除去が困難であった脂質タンパク質の汚染を効率的に除去できることが分かった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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