(57)【要約】  本発明は、分析化学及び生物学的検出の技術分野、特に固相抽出材及び核酸の濃縮・検出におけるその応用に関する。本発明は、ｒＧＯ又はＧＯで修飾された固相抽出材であって、ＧＯ又はｒＧＯ修飾材料は、静電気力、水素結合及びπ−π相互作用により核酸、特に短い１本鎖核酸を迅速かつ効率的に吸着できるため、核酸サンプルの検出限界を低減させ、検出感度を向上させている固相抽出材を提供する。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
固相支持体の表面が酸化グラフェン又は還元型酸化グラフェンで修飾された固相抽出材であって、
前記固相支持体は、ガラスビーズ又は磁気ビーズであることを特徴とする、固相抽出材。
【請求項２】
前記ガラスビーズの直径は、１００μｍ〜３００μｍであり、前記磁気ビーズの直径は、１０ｎｍ〜５μｍであることを特徴とする、請求項１に記載の固相抽出材。
【請求項３】
酸化グラフェン又は還元型酸化グラフェンの分散液を固相支持体と混合し、吸着させ、固相抽出材を調製する方法であって、前記固相支持体は、ガラスビーズ又は磁気ビーズであることを特徴とする、請求項１又は２に記載の固相抽出材の製造方法。
【請求項４】
前記酸化グラフェンの横方向サイズは、０．５μｍ〜２μｍであり、
前記還元型酸化グラフェンの横方向サイズは、０．５μｍ〜２μｍであることを特徴とする、請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
前記吸着の条件は、室温で０．５ｈ〜２ｈ振とうさせることを特徴とする、請求項３に記載の製造方法。
【請求項６】
請求項１又は２に記載の固相抽出材、或いは請求項３〜５のいずれか１項に記載の製造方法で調製された固相抽出材の、核酸の濃縮及び/又は検出における応用。
【請求項７】
請求項１又は２に記載の固相抽出材、或いは請求項３〜５のいずれか１項に記載の製造方法で調製された固相抽出材を含むことを特徴とする、核酸濃縮用キット。
【請求項８】
サンプルを請求項１又は２に記載の固相抽出材、或いは請求項３〜５のいずれか１項に記載の製造方法で調製された固相抽出材と混合し、抽出した後、固相抽出材を分離し、清洗し、溶出した後、核酸溶液を得ることを特徴とする、核酸の濃縮方法。
【請求項９】
請求項１又は２に記載の固相抽出材、或いは請求項３〜５のいずれか１項に記載の製造方法で調製された固相抽出材、特異的なプローブ、及びインサイチュ増幅用試薬を含むことを特徴とする、核酸検出用キット。
【請求項１０】
サンプルを請求項１又は２に記載の固相抽出材、或いは請求項３〜５のいずれか１項に記載の製造方法で調製された固相抽出材と混合し、抽出した後、固相抽出材を分離し、特異的なプローブ及びインサイチュ増幅用試薬と混合し、増幅させた後、電気泳動により増幅産物を検出することを特徴とする、核酸の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［相互参照］
本出願は、２０１７年７月１４日に中国特許庁へ提出された、出願番号が２０１７１０５７５３４１．５、発明の名称が「固相抽出材及び核酸の濃縮・検出におけるその応用」である中国特許出願に基づき優先権を主張し、その開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、分析化学及び生物学的検出の技術分野、特に固相抽出材及び核酸の濃縮・検出におけるその応用に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＭｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、内在性遺伝子でコードされた、塩基長が約２２個ヌクレオチドである非コード１本鎖ＲＮＡ分子であり、主に転写後遺伝子発現の調節に関与し、標的ｍＲＮＡと結合して標的遺伝子サイレンシングが生じ又は発現を低下させることができるので、生体を調節する役割を果たす。ｍｉＲＮＡは、その含有量の変化が癌の発生と密接に関連することが多いため、その検出が多くの核酸検出技術の重要なステップである。現在、一般的に使用されるｍｉＲＮＡの検出方法は、主にポリ（Ａ）尾部ＲＴ−ＰＣＲ、及びステムループプライマーＲＴ−ＰＣＲなどがある。前者は、サンプル調製中に介在するｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ又はｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを区別できないため、ｍｉＲＮＡの正確な定量を行うことができない。後者は、一般的にｐｒｅ−ｍｉＲＮＡにアニールしないが、プライマー設計が難しく、ステムループ形成の条件が比較的に厳しい。近年、科学者は、ｍｉＲＮＡ検出のためのさまざまな新しい技術を開発しており、中でも、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）がｍｉＲＮＡの検出に広く用いられている。ｍｉＲＮＡは、短い一本鎖ＲＮＡであり、ＲＣＡの検出ターゲット（短い一本鎖核酸）に一致する。環状プローブの存在下で、ｍｉＲＮＡは、その一部と相補的にペアリングされ、Ｂｓｔ酵素又はｐｈｉ２９酵素の作用下で等温増幅が完了する。しかし、通常のＲＣＡは、相同ｍｉＲＮＡ、即ち、１塩基または２塩基のみ異なるｍｉＲＮＡを区別できない。
【０００４】
グラフェンは、炭素原子がｓｐ２混成軌道でハニカム状の六方格子構造を形成する単原子層を形成する２次元結晶である。現在、関連文献により、酸化グラフェン（ＧＯ）又は還元型酸化グラフェン（ｒＧＯ）は、π電子雲及び酸素含有基が豊富であり、π−π相互作用、水素結合及び静電相互作用により短い一本鎖核酸をグラフェンの表面に速く吸着させるが、長鎖核酸及び２本鎖核酸に対する吸着能力及び吸着速度が弱く、且つｒＧＯ又はＧＯは近くの蛍光基を消光できる。固相抽出技術は、分析化学におけるサンプル前処理技術であり、サンプルを濃縮し、検出感度を大幅に向上させることができる。しかし、現在の報道により、反応系中の高濃度のｒＧＯ又はＧＯがＲＣＡ反応を阻害することが示されているが、グラフェンが短い一本鎖核酸を吸着できるという性質と固相抽出技術とを組み合わせてｍｉＲＮＡの濃縮及び増幅に適用する文献や特許報告はまだない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は上記の事情に鑑みてなされたものであり、解決すべき技術的問題は、固相抽出材及び核酸の濃縮・検出におけるその応用を提供することにあり、本発明により提供される固相抽出材は、表面に酸化グラフェン（ＧＯ）又は還元型酸化グラフェン（ｒＧＯ）を担持されたものであり、ｍｉＲＮＡを抽出、濃縮し、ＲＣＡによるｍｉＲＮＡの検出限界を低減させ、微量のｍｉＲＮＡの検出に役立つ。また、ｒＧＯの使用により、ＲＣＡが相同ｍｉＲＮＡを識別する能力は大幅に向上する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明により提供される固相抽出材は、その固相支持体の表面が酸化グラフェン又は還元型酸化グラフェンで修飾された。
【０００７】
本発明において、前記固相支持体は、ガラスビーズ又は磁気ビーズである。ガラスビーズの直径は、その比表面積に影響を与え、さらに吸着効率に影響を与え、本発明において、前記ガラスビーズの直径は、１００μｍ〜３００μｍである。幾つかの具体的な実施例において、前記ガラスビーズの直径は、２００μｍである。前記磁気ビーズの直径は、１０ｎｍ〜５μｍである。
【０００８】
本発明の実施例において、前記固相抽出材は、表面が酸化グラフェンで修飾されたガラスビーズ、表面が還元型酸化グラフェンで修飾されたガラスビーズ、表面が酸化グラフェンで修飾された磁気ビーズ、又は表面が還元型酸化グラフェンで修飾された磁気ビーズである。
【０００９】
本発明により提供される固相抽出材は、正に帯電した固相支持体が酸化グラフェン又は還元型酸化グラフェンで吸着されたものである。ＧＯ又はｒＧＯはガラスビーズの表面に薄膜を形成するか、またはＧＯ又はｒＧＯの表面は球状磁気ビーズと結合するため、作製された固相抽出材が核酸を吸着できる。ここで、磁気ビーズを固相支持体として使用される場合には、磁気ビーズはグラフェン表面における負に帯電した基の近くに結合し、グラフェンの平坦な表面に１つ又は複数の磁気ビーズを結合させる。
【００１０】
ＧＯ及びｒＧＯで修飾された固相抽出材は、静電気力、水素結合、及びπ−π相互作用により核酸を吸着し、且つ２本鎖核酸及び長い１本鎖核酸と比較して、短い１本鎖核酸（例えば、ｓｓＤＮＡ又はｍｉＲＮＡ）に対する吸着能力及び吸着速度がより高く、また、ＧＯと比較して、ｒＧＯが短い１本鎖核酸を吸着する能力はより強い。本発明により提供される固相抽出材の製造方法は、酸化グラフェン又は還元型酸化グラフェンの分散液を固相支持体と混合し、吸着させて固相抽出材を作製することであり、前記固相支持体は、ガラスビーズ又は磁気ビーズである。
【００１１】
グラフェンを吸着できるようにするために、固相支持体の表面には正に帯電した基があることにより、グラフェンの表面の負に帯電した基と静電相互作用により結合できる。
【００１２】
本発明の実施例において、固相抽出材を製造するためのガラスビーズは、表面に正電荷を帯びているガラスビーズであり、幾つかの実施例において、シラン化によって修飾されたガラスビーズが使用される。シラン化ガラスビーズは、市販されているものでもよく、自分で作製したものでもよく、これは本発明において限定されていない。シラン化ガラスビーズの製造方法は、ガラスビーズ表面を濃硫酸及び過酸化水素で活性化し、エタノール溶媒中のＡＰＴＥＳでシラン化することにより調製する。シラン化されたガラスビーズは、表面にアミノ基を有するため、正電荷を帯びている。核酸をより十分に吸着するように適当な比表面積を確保するために、ガラスビーズの直径は、２００μｍである。
【００１３】
本発明では、固相抽出材を調製するための磁気ビーズは、表面に正電荷を帯びている磁気ビーズであり、幾つかの実施例において、アミノ基磁気ビーズが使用される。
【００１４】
本発明の実施例において、前記酸化グラフェン又は還元型酸化グラフェンの分散液における溶媒は、水である。つまり、ＧＯ又はｒＧＯの水分散液を使用し、その分散液は、購入されてもよく自分で作製されてもよく、これは本発明において限定されない。本発明の実施例において、ＧＯは、横方向サイズが０．５〜２μｍであり、濃度が１ｍｇ/ｍＬである。ｒＧＯは、横方向サイズが０．５〜２μｍであり、濃度が１ｍｇ/ｍＬである。
【００１５】
本発明に係る製造方法では、吸着の条件は、室温で０．５ｈ〜２ｈ振とうする。具体的な実施例において、吸着の条件は、室温で１ｈ振とうする。
【００１６】
具体的なＧＯで修飾されたガラスビーズの製造方法は、シラン化されたガラスビーズとＧＯの分散液とを混合し、室温で１ｈ振とうして反応させた後、水洗し、乾燥し、ＧＯで修飾されたガラスビーズを得る。前記ＧＯの分散液では、ＧＯは、横方向サイズが０．５〜２μｍであり、濃度が１ｍｇ/ｍＬである。前記乾燥温度は、８０℃である。
【００１７】
具体的なｒＧＯで修飾されたガラスビーズの製造方法は、シラン化されたガラスビーズとｒＧＯの分散液とを混合し、室温で１ｈ振とうして反応させた後、水洗し、乾燥し、ｒＧＯで修飾されたガラスビーズを得る。前記ｒＧＯの分散液では、ｒＧＯは、横方向サイズが０．５〜２μｍであり、濃度が１ｍｇ/ｍＬである。前記乾燥の温度は、８０℃である。
【００１８】
シラン化ガラスビーズは、市販として購入されてもよく、自分で作製されてもよい。
【００１９】
本発明に用いられるシラン化ガラスビーズの製造方法は、以下の通りである。即ち、
ガラスビーズを濃硫酸と混合した後、それに過酸化水素をゆっくりと加え、シェーカーで１ｈ振盪して反応させ、その後、純水でガラスビーズを１０回洗浄した後、干燥させ、
干燥されたガラスビーズをシラン化試薬及び溶媒と混合し、２ｈ振とうして反応させた後、純水で１０回洗浄し、シラン化されたガラスビーズを得る。
【００２０】
前記過酸化水素と濃硫酸との体積比は、３:７である。酸洗浄済みガラスビーズ０．５ｇあたり濃硫酸７ｍＬを混合する。前記濃硫酸における硫酸の質量分率は、９８％である。
【００２１】
前記シラン化試薬は、ＡＰＴＥＳであり、前記溶媒は、エタノール、水及び氷酢酸の混合物であり、ここで、エタノールと水と氷酢酸との体積比は、９００:１００:１である。前記シラン化試薬と溶媒との体積比は、１:５０である。
【００２２】
具体的なＧＯで修飾された磁気ビーズの製造方法は、アミノ基磁気ビーズをＧＯの分散液と混合し、室温で１ｈ振とうして反応させた後、水洗して、乾燥し、ＧＯで修飾された磁気ビーズを得る。前記ＧＯの分散液では、ＧＯは、横方向サイズが０．５〜２μｍであり、濃度が１ｍｇ/ｍＬである。前記乾燥温度は、８０℃である。
【００２３】
具体的なｒＧＯで修飾された磁気ビーズの製造方法は、アミノ基磁気ビーズをｒＧＯの分散液と混合し、室温で１ｈ振とうして反応させた後、水洗し、乾燥し、ｒＧＯで修飾された磁気ビーズを得る。前記ｒＧＯの分散液では、ｒＧＯは、横方向サイズが０．５〜２μｍであり、濃度が１ｍｇ/ｍＬである。前記乾燥温度は、８０℃である。
【００２４】
前記アミノ基磁気ビーズは、ＡＰＴＥＳで修飾された磁気ビーズであり、粒径が５００ｎｍである。本発明では、海狸公司から購入された、濃度が１０ｍｇ/ｍＬのアミノ基磁気ビーズ懸濁液を採用する。ＧＯ又はｒＧＯの修飾を行う前に、純水で磁気ビーズを３回洗浄し、その後、磁気ビーズを遠心して収集し、水分を除去する。磁気ビーズ懸濁液１００μＬから收集した磁気ビーズをｒＧＯ分散液３００μＬ、又はＧＯ分散液３００μＬに加える。
【００２５】
ＧＯ又はｒＧＯで修飾されていない磁気ビーズ又はガラスビーズは、いずれも核酸を吸着する能力を持たないが、本発明で提供される方法により固相抽出材を作製し、作製されたＧＯ又はｒＧＯが修飾されたガラスビーズ又は磁気ビーズは、黒色であり、核酸を吸着する能力を持つ。
【００２６】
本発明にかかる固相抽出材の、核酸の濃縮及び/又は検出における応用。
【００２７】
幾つかの実施例において、本発明により提供される固相抽出材は、短い１本鎖核酸の抽出及び/又は検出に用いられる。幾つかの具体的な実施例において、前記短い１本鎖核酸は、ｍｉＲＮＡ又はｓｓＤＮＡである。
【００２８】
本発明の実験は、ＧＯで修飾されたガラスビーズが、ｍｉＲＮＡ又はｓｓＤＮＡを濃縮させ、特異的なプローブを介して標的核酸分子を識別することができ、標的核酸分子の定性的または定量的検出を実現することを示している。また、ＧＯで修飾されたガラスビーズは、主に静電気力、水素結合及びπ−π相互作用によるため、様々な核酸に適する。ＧＯで修飾されたガラスビーズは、ｍｉＲＮＡ又はｓｓＤＮＡを迅速に吸着できるだけでなく、ｇＤＮＡ又はｍＲＮＡなどの他の核酸も吸着できる（長鎖核酸又は２本鎖核酸の吸着には長い時間が必要である）。従って、吸着時間が短い場合には、ＧＯで修飾された固相抽出材は、短い１本鎖核酸を２本鎖核酸又は長鎖核酸から区別することもできる。本発明の実施例において、ＧＯで修飾された固相抽出材は、短い１本鎖核酸に対する吸着時間が１０ｍｉｎである。ｒＧＯで修飾された磁気ビーズは、主にπ−π相互作用を介して核酸を吸着するため、過剰なπ結合を持つ核酸、特にｍｉＲＮＡ又はｓｓＤＮＡなどの短い１本鎖核酸に対してより強い吸着能力を持つが、長い分子鎖を持つｍＲＮＡの場合には、吸着効率が低いため、短い１本鎖核酸と簡単に区別できる。
【００２９】
本発明により提供されるＧＯで修飾された固相抽出材は、核酸の濃縮及び/又は検出における応用である。
【００３０】
本発明により提供されるｒＧＯで修飾された固相抽出材は、短い１本鎖核酸の濃縮及び/又は検出における応用である。
【００３１】
本発明は、さらに、本発明に記載の固相抽出材を含む、核酸濃縮のためのキットを提供する。
【００３２】
短い１本鎖核酸を特異的に濃縮するためのキットには、ｒＧＯで修飾された固相抽出材又はＧＯで修飾された固相抽出材を含む。実験の要件に応じて、そのキットには、さらに、ＥＰチューブ、清洗バッファー、溶出バッファーを含む。
【００３３】
多種の核酸を濃縮するためのキットには、ＧＯで修飾された固相抽出材が含まれる。実験の要件に応じて、そのキットには、さらに、ＥＰチューブ、清洗バッファー、溶出バッファーを含む。前記多種の核酸は、短い１本鎖核酸又は２本鎖核酸を含む。
【００３４】
本発明は、サンプルを本発明に係る固相抽出材と混合し、抽出した後、固相抽出材を分離し、清洗し、溶出して核酸溶液を得る、核酸の濃縮方法を提供する。
【００３５】
本発明は、サンプルをｒＧＯで修飾された固相抽出材と混合し、抽出した後、固相抽出材を分離し、清洗し、溶出して核酸溶液を得る、短い１本鎖核酸の濃縮方法を提供する。前記抽出時間は、１０ｍｉｎであり、抽出温度は、室温、具体的には１８〜３０℃である。
【００３６】
或いは、ＧＯ修飾固相抽出材でのＧＯによる短い１本鎖核酸の吸着が速いという特性に基づいて、抽出時間が１０ｍｉｎとなるように制御し、ＧＯで修飾された固相抽出材を使用して短い１本鎖核酸への特異的濃縮も達成できる。
【００３７】
短い１本鎖核酸を濃縮する方法は、サンプルをＧＯで修飾された固相抽出材と混合し、室温で１０ｍｉｎ抽出した後、固相抽出材を分離し、清洗し、溶出して核酸溶液を得る。
【００３８】
多種の核酸を濃縮する方法は、サンプルをＧＯで修飾された固相抽出材と混合し、抽出した後、固相抽出材を分離し、清洗し、溶出した後、核酸溶液を得る。多種の核酸を同時に濃縮するために、その方法に係る抽出時間は、１ｈ以上である。
【００３９】
本発明により提供される方法では、固相支持体がガラスビーズである場合には、抽出際に均質機を使用して均一に混合する。固相支持体が磁気ビーズである場合には、２ｍｉｎごとに１回渦巻きし振とうする。
【００４０】
タンパク質などの不純物は、本発明に係る固相抽出材の抽出効果に影響を与える可能性があるため、本出願に係るサンプルは、核酸溶液である。例えば、核酸抽出プロセスにおいてタンパク質などの不純物を除去した後に得られた低濃度抽出液である。磁気ビーズ法又は膜濾過法は、従来技術において低濃度の核酸抽出液を濃縮するために使用されるが、微量の核酸分子を濃縮することが困難であり、主に２００ｎｔを超える核酸の抽出に適し、特にｍｉＲＮＡへの吸着効果がさらに悪化するため、磁気ビーズ法又は膜濾過法により抽出されたＲＮＡ中のｍｉＲＮＡの含有量が非常に低い。ｍｉＲＮＡに適した特別なろ過膜を使用しても、抽出された生成物には無関係なＲＮＡが大量に存在し、後の検出の精度及び感度に影響をもたらす。本出願で調製された固相抽出材は、微量の核酸分子に対しても良好な濃縮効果を有し、ＲＣＡの検出閾値を２５倍低下させる。本発明の実施例において、実験の簡便及び厳密さのために、標準的な核酸溶液をサンプルとして使用する。
【００４１】
標準溶液は、核酸とバッファーにより調製された、前記バッファーには、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ  塩化マグネシウム、５０ｍＭ  塩化ナトリウムを含み、ｐＨ  ８．０である。
【００４２】
本発明は、さらに、本発明に係る固相抽出材、特異的なプローブ及びインサイチュ増幅用試薬を含む核酸検出用キットを提供する。
【００４３】
本発明により提供される短い１本鎖核酸検出用キットでは、ｒＧＯで修飾された固相抽出材、特異的なプローブ及びインサイチュ増幅用試薬を含む。又は、ＧＯで修飾された固相抽出材、特異的なプローブ及びインサイチュ増幅用試薬を含む。前記特異的なプローブは、標的核酸を検出するために設計されている。
【００４４】
前記インサイチュ増幅用試薬には、ＲＣＡ増幅酵素を含み、本発明では、ＲＣＡマスターミックスが使用される。
【００４５】
実験の要件に応じて、そのキットには、さらにＥＰチューブ又は９６ウェルプレートを含む。
【００４６】
多種核酸検出用キットには、ＧＯで修飾された固相抽出材、特異的なプローブ及びインサイチュ増幅用試薬を含む。前記特異的なプローブは、標的核酸を検出するために設計されている。
【００４７】
前記インサイチュ増幅用試薬は、ＲＣＡ増幅酵素を含み、本発明では、ＲＣＡマスターミックスが使用される。
【００４８】
実験の要件に応じて、そのキットには、さらにＥＰチューブ又は９６ウェルプレートを含む。
【００４９】
本発明は、さらに、サンプルを本発明に記載の固相抽出材と混合し、抽出した後、固相抽出材を分離し、特異的なプローブ及びインサイチュ増幅用試薬と混合し、増幅した後、増幅産物を電気泳動で検出する、ことを含む核酸の検出方法を提供する。
【００５０】
前記固相抽出材は、短い１本鎖核酸を検出するために、ｒＧＯ又はＧＯで修飾されたものである。ＧＯ修飾固相抽出材料を使用して核酸に対する抽出時間を延長させた後、インサイチュ増幅により２本鎖核酸を検出することもできる。
【００５１】
増幅後、電気泳動バンドの出現に応じて、サンプルでは特異的なプローブの目的とする標的核酸分子が存在するか否かを判断する。
【００５２】
本発明の実施例において、サンプル溶液をＧＯで修飾されたガラスビーズと混合し、１０ｍｉｎ抽出した後、溶液を捨て、ガラスビーズを洗浄し、溶出してｓｓＤＮＡ溶液を得る、ことを含むｓｓＤＮＡの濃縮方法を提供する。
【００５３】
本発明の実施例において、さらに、サンプル溶液をＧＯで修飾されたガラスビーズと混合し、１０ｍｉｎ抽出した後、溶液を捨て、ガラスビーズ、ＲＣＡマスターミックス、環状プローブ及び水を混合し、６５℃、１．５ｈで等温増幅を行った後、電気泳動により増幅産物を検出する、ことを含むｓｓＤＮＡ（２２ｎｔ）の検出方法を提供する。
【００５４】
本発明の実施例において、サンプル溶液をｒＧＯで修飾された磁気ビーズと混合し、１０ｍｉｎ抽出した後、溶液を捨て、磁気ビーズを洗浄し、溶出してｍｉＲＮＡ溶液を得る、ことを含むｍｉＲＮＡの濃縮方法を提供する。
【００５５】
本発明により提供されるｒＧＯで修飾された固相抽出材は、ｍｉＲＮＡ又はｓｓＤＮＡを特異的に吸着できるが、ｇＤＮＡ又はｍＲＮＡを吸着できない。
【００５６】
本発明の実施例において、サンプル溶液をｒＧＯで修飾された磁気ビーズと混合し、１０ｍｉｎ抽出した後、溶液を捨て、磁気ビーズ、ＲＣＡマスターミックス、環状プローブ及び水を混合し、６５℃、１．５ｈで等温増幅を行った後、電気泳動により増幅産物を検出する、ことを含むｍｉＲＮＡの検出方法を提供する。
【発明の効果】
【００５７】
本発明で提供されるｒＧＯで修飾された固相抽出材は、ｍｉＲＮＡを効率的に吸着し、相同ｍｉＲＮＡを識別する能力を保持することができる。
【００５８】
本発明は、ｒＧＯ又はＧＯで修飾された固相抽出材を提供し、ＧＯ又はｒＧＯで修飾された固相抽出材は、静電気力、水素結合、及びπ−π相互作用により核酸、特に短い１本鎖核酸を吸着することができる。本発明で提供される固相抽出材は、核酸を濃縮することにより、サンプルの検出限界を低減させ、検出感度を向上させている。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】図１は、ＧＯで修飾されたガラスビーズによるｓｓＤＮＡの濃縮効果を示し、ＭがＤＮＡ  マーカーであり、レーン１〜４が原液増幅であり、レーン４〜８がインサイチュ増幅である。
【図２】図２は、ｒＧＯで修飾された磁気ビーズによるｍｉＲＮＡ（ｌｅｔ−７ａ）の濃縮効果を示し、ＭがＤＮＡ  マーカーであり、レーン１〜３が原液増幅であり、レーン４〜６がインサイチュ増幅である。
【図３】図３は、実施例のｒＧＯで修飾された磁気ビーズによる相同ｍｉＲＮＡへの区別能力を示し、レーン１及び２が通常のＲＣＡによるｌｅｔ−７ａ及びｌｅｔ−７ｂの増幅であり、レーン３及び４がそれぞれアミノ基磁気ビーズによる抽出後のｌｅｔ−７ａ及びｌｅｔ−７ｄのインサイチュ増幅であり、レーン５及び６がそれぞれｒＧＯで修飾された磁気ビーズによる抽出後のｌｅｔ−７ａ及びｌｅｔ−７ｄのインサイチュ増幅であり、レーン７が陰性対照実験である。
【図４】図４は、ｍｉＲＮＡ、ｇＤＮＡ及びｍＲＮＡに対するｒＧＯで修飾された磁気ビーズの選択的吸着を示し、ＰＣは、吸着されていない元のサンプルにおける核酸の含有量の測定であり、上清は、吸着された上清における核酸の含有量の測定であり、縦軸は、ＰＣＲのＣｔ値であり、中でも、図４−ａは、ｇＤＮＡへの吸着効果を示し、図４−ｂは、ｍＲＮＡへの吸着効果を示し、図４−ｃは、ｍｉＲＮＡへの吸着効果を示す。
【図５】図５は、ｒＧＯで修飾された磁気ビーズによるｍｉＲＮＡサンプルの濃縮効果を示し、図５−ａは、濃縮されていない場合に、ＲＣＡによるｍｉＲＮＡサンプルの検出限界が１．３１８ｐＭ（３σ）であることを示し、図５−ｂは、ｒＧＯで修飾された磁気ビーズによって濃縮された後、ＲＣＡによるｍｉＲＮＡサンプルの検出限界が５３．４ｆＭ（３σ）であることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
本発明は、固相抽出材及び短い１本鎖核酸の濃縮及び検出におけるその応用を提供し、当業者が本明細書に鑑みてプロセスのパラメータを適当に改良することができる。特に、全ての類似する置換および修正が当業者にとっては明らかになり、本発明に含まれるとみなされることを指摘すべきである。本発明に係る方法および応用を好ましい実施形態により説明してきたが、本発明に係る技術を実現・応用するために、本発明の内容、精神および範囲から逸脱することなく修正または適当な変更および組み合わせを加えることができることは当業者にとって明らかである。
【００６１】
本発明に係る磁気ビーズは、生物学的磁気ビーズであって、微粒子サイズの超常磁性ビーズである。
【００６２】
本発明に係るガラスビーズは、実験用ガラスビーズであって、ガラスマイクロビーズとも呼ばれる。
【００６３】
本発明に係る短い１本鎖核酸とは、短い１本鎖核酸分子、例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｓＤＮＡを指す。
【００６４】
本発明に係る多種の核酸とは、様々なタイプの核酸、例えば、ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃｐＤＮＡ、ｍｓＤＮＡ、ｍｔＤＮＡ、ｒＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔｍＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ又はａＲＮＡを意味する。
【００６５】
本発明に係る濃縮とは、サンプルから標的核酸を収集するステップを指し、抽出又は精製とも理解される。
【００６６】
本発明に係る検出とは、特異的なプローブによる標的核酸の増幅結果に基づいて、サンプル中の核酸に定量的または定性的分析を行うプロセスを意味する。
【００６７】
特に明記しない限り、本発明に係る室温は、１８〜３０℃である。
【００６８】
本発明に用いられる機器、材料は、いずれも普通の市販品であって、市場で入手可能である。
【実施例】
【００６９】
以下、実施例と組み合わせて本発明をさらに説明する。
【００７０】
実施例１
酸洗浄済みガラスビーズ（Ｓｉｇｍａ）約０．５ｇをビーカーに加え、それに濃硫酸７ｍＬを加えた後、過酸化水素３ｍＬを徐々に加え、その反応系をシェーカーで１時間振盪して、ガラスビーズの活性化を完了させた。活性化後、ガラスビーズを純水で１０回洗浄し、オーブンに入れて乾燥させた。
【００７１】
乾燥されたガラスビーズを１．５ｍＬ遠心分離管に入れ、シラン化試薬及び溶媒（溶媒１ｍＬ、エタノールと水との割合９：１、且つ氷酢酸１μＬ、シラン化試薬としてＡＰＴＥＳ、２０μＬ）を加え、振とうしながら２ｈ反応させた後、ガラスビーズを純水で１０回洗浄した。
【００７２】
ガラスビーズから余分な水を除去し、シラン化されたガラスビーズに水２００μＬ及びＧＯ分散液（先豊ナノ公司から購入、横方向サイズ０．５〜２μｍ、初期濃度いずれも１ｍｇ／ｍＬ）５０μＬを加え、振とうしながら１ｈ反応させた後、水洗し、８０℃で乾燥させて準備した。
【００７３】
実施例２
酸洗浄済みガラスビーズ（Ｓｉｇｍａ）約０．５ｇをビーカーに加え、それに濃硫酸７ｍＬを加えた後、過酸化水素３ｍＬを徐々に加え、その反応系をシェーカーで１時間振盪して、ガラスビーズの活性化を完了させた。活性化後、ガラスビーズを純水で１０回洗浄し、オーブンに入れて乾燥させた。
【００７４】
乾燥されたガラスビーズを１．５ｍＬ遠心分離管に入れ、シラン化試薬及び溶媒（溶媒１ｍＬ、エタノールと水の割合９：１、且つ１μＬ氷酢酸、シラン化試薬としてＡＰＴＥＳ、２０μＬ）を加え、振とうしながら２ｈ反応させた後、純水で１０回洗浄した。
【００７５】
ガラスビーズから余分な水を除去し、シラン化されたガラスビーズに水２００μＬ及びｒＧＯ分散液（先豊ナノ公司から購入、横方向サイズ０．５〜２μｍ、初期濃度いずれも１ｍｇ／ｍＬ）５０μＬを加え、振とうしながら１ｈ反応させた後、水洗し、８０℃で乾燥させて準備した。
【００７６】
実施例３
ＡＰＴＥＳ修飾磁気ビーズは海狸公司から購入された（粒径５００ｎｍ、初期濃度１０ｍｇ／ｍＬ）。まず、磁気ビーズ１００μＬを１．５ｍＬ遠心分離管に入れ、磁気スタンドに置いて磁気ビーズを収集し、余分な水を除去し、その後、磁気ビーズを純水で３回洗浄し、余分な水を除去した。磁気ビーズには、ＧＯ分散液３００μＬを加え（先豊ナノ公司から購入、横方向サイズ０．５〜２μｍ、初期濃度いずれも１ｍｇ／ｍＬ）、振とうしながら１ｈ反応させ、磁気ビーズと十分に結合させた後、過剰の未結合ＧＯを除去し、上清が透明になるまで磁気ビーズを水で洗浄し、得られたＧＯ修飾磁気ビーズを水２００μＬに分散させ、４℃で保存して準備した。
【００７７】
実施例４
ＡＰＴＥＳ修飾磁気ビーズは、海狸公司から購入された（粒径５００ｎｍ、初期濃度１０ｍｇ／ｍＬ）。まず、磁気ビーズ１００μＬを１．５ｍＬ遠心分離管に入れ、磁気スタンドに置いて磁気ビーズを収集し、余分な水を除去し、その後、磁気ビーズを純水で３回洗浄し、余分な水を除去した。磁気ビーズにｒＧＯ分散液３００μＬを加え（先豊ナノ公司から購入、横方向サイズ０．５〜２μｍ、初期濃度いずれも１ｍｇ／ｍＬ）、振とうしながら１ｈ反応させ、磁気ビーズと十分に結合させた後、過剰の未結合ＧＯを除去し、上清が透明になるまで磁気ビーズを水で洗浄し、得られたＧＯ修飾磁気ビーズを水２００μＬに分散させ、４℃で保存して準備した。
【００７８】
効果検証：
１．ＧＯ修飾ガラスビーズによる短い１本鎖ＤＮＡ（２２ｎｔ）の濃縮効果
まず、ｓｓＤＮＡ（配列５’−ＴＧＡＧＧＴＡＧＴＡＧＧＴＴＧＴＡＴＡＧＴＴ−３’；配列番号１）を含む最終濃度１０ｎＭのサンプル溶液２５μＬを調製し、実施例１で調製されたＧＯ修飾ガラスビーズ０．００５ｇを秤量して０．２ｍＬ遠心分離管に入れた。サンプル溶液２０μＬを抽出材料の入った遠心分離管に加え、渦巻きし振とうし抽出材料と溶液とを十分に混合し、室温で１０ｍｉｎ抽出した。抽出後、遠心分離管内の液体を吸引し、得られた抽出材料を後のＲＣＡにかけた。
【００７９】
濃縮されていないサンプル溶液をコントロールとして増幅し、ＲＣＡ反応の容量が２０μＬであり、ＲＣＡマスターミックス１０μＬ、サンプル溶液２μＬ、環状プローブ（配列ＣＡＣＧＣＧＡＴＣＣＧＣＡＡＣＴＡＴＡＣＡＡＣＣＴＡＣＴＡＣＣＴＣＡＡＣＡＣＣＣＴＣＣＡＡＣＣＡＣＣＡＡＧＧＣＡＡＴＧＴＡＣＡＣＧＡＡＴＴＣＧＣＣＧＡＡＣＧ；配列番号３）２μＬ及び水６μＬを含み、調合が完了した後、反応系を十分に混合した後、等温増幅のために６５℃でインキュベートし、反応時間が１．５ｈであり、これは、原液増幅と呼ばれる。
【００８０】
固相抽出材の場合には、抽出材料の入った遠心分離管にＲＣＡ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ  １０μＬ、環状プローブ２μＬ及び水８μＬを加え、調合が完了した後、反応系を十分に混合した後、等温増幅のために６５℃でインキュベートし、反応時間が１．５ｈであり、これは、インサイチュ増幅と呼ばれる。
【００８１】
原液増幅産物及びインサイチュ増幅産物は、それぞれ電気泳動にかけられた。結果は、図１に示した。Ｍは、ＤＮＡマーカーであり、レーン１〜４は、原液増幅の４つの複製であり、レーン５〜８は、インサイチュ増幅の４つの複製である。図１に示すように、濃縮前のサンプル溶液では、ｓｓＤＮＡの濃度は、ゲル電気泳動で明るいバンドを示すのに十分なＲＣＡ産物を生じる増幅するには不十分であるが、ＧＯ修飾ガラスビーズによる濃縮及び増幅を経て、ＲＣＡ産物の量が大幅に増加し、且つ電気泳動像に明るいバンドが見られる。この実験は、ＧＯ修飾ガラスビーズが、短い１本鎖ＤＮＡを効率的に濃縮し、且つインサイチュ増幅を行うことができることを示している。
【００８２】
２．ｒＧＯで修飾された磁気ビーズによるｍｉＲＮＡｌｅｔ−７ａ（２２ｎｔ）の濃縮効果
まず、ｌｅｔ−７ａ（配列５’−ＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＧＵＵＧＵＡＵＡＧＵＵ−３’；配列番号３）を含む最終濃度１０ｎＭのサンプル水溶液２５μＬを調製し、実施例３で調製されたｒＧＯ修飾ガラスビーズ０．５μＬを秤量して０．２ｍＬ遠心分離管に入れた。サンプル溶液２０μＬを抽出材料の入った遠心分離管に加え、渦巻きし振とうし抽出材料と溶液とを十分に混合し、室温で１０ｍｉｎ抽出した。抽出後、遠心分離管内の液体を吸引し、得られた抽出材料を後のＲＣＡにかけた。
【００８３】
濃縮されていないサンプル溶液をコントロールとして増幅し、ＲＣＡ反応の容量が２０μＬであり、ＲＣＡマスターミックス１０μＬ、サンプル溶液２μＬ、環状プローブ（配列ＣＡＣＧＣＧＡＴＣＣＧＣＡＡＣＴＡＴＡＣＡＡＣＣＴＡＣＴＡＣＣＴＣＡＡＣＡＣＣＣＴＣＣＡＡＣＣＡＣＣＡＡＧＧＣＡＡＴＧＴＡＣＡＣＧＡＡＴＴＣＧＣＣＧＡＡＣＧ；配列番号３）２μＬ及び水６μＬを含み、調合が完了した後、反応系を十分に混合した後、等温増幅のために６５℃でインキュベートし、反応時間が１．５ｈであり、これは、原液増幅と呼ばれる。
【００８４】
固相抽出材の場合には、抽出材料の入った遠心分離管にＲＣＡ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ  １０μＬ、環状プローブ２μＬ及び水８μＬを加え、調合が完了した後、反応系を十分に混合した後、等温増幅のために６５℃でインキュベートし、反応時間が１．５ｈであり、これは、インサイチュ増幅と呼ばれる。
【００８５】
原液増幅産物及びインサイチュ増幅産物は、それぞれ電気泳動を行った。結果は、図２に示した。レーン１〜３は、原液増幅であり、レーン４〜６は、インサイチュ増幅である。図２に示すように、濃縮前のサンプル溶液では、ｌｅｔ−７ａの濃度は、ゲル電気泳動で明るいバンドを示すのに十分なＲＣＡ産物を生じる増幅するに不十分であるが、ｒＧＯ修飾磁気ガラスビーズによる濃縮及び増幅を経て、ＲＣＡ産物の量が大幅に増加し、且つ電気泳動像に明るいバンドが見られる。この実験は、ｒＧＯ修飾磁気ガラスビーズが、ｍｉＲＮＡを効率的に濃縮し、且つインサイチュ増幅を行うことができることを示している。
【００８６】
３．アミノ基磁気ビーズ及びｒＧＯ修飾磁気ビーズによるＳＮＰへの区別能力
アミノ基磁気ビーズは、主に静電吸着により核酸を捕捉するが、グラフェン固相抽出材は、主にπ−π相互作用により１本鎖核酸を捕捉する。ｍｉＲＮＡへの捕捉については、両方は同様の効果があり、グラフェン修飾固相抽出材の利点を示さないが、この実験は、ｒＧＯ修飾磁気ビーズがアミノ基磁気ビーズではなく、相同ｍｉＲＮＡを効率的に区別できることを示している。
【００８７】
本実施例に用いられるｍｉＲＮＡは、ｌｅｔ−７ａ及びｌｅｔ−７ｄであり、両方に2つの塩基の違いがあり、本実施例に用いられる環状プローブは、いずれもｌｅｔ−７ａに応じて設計されたプローブである。
【００８８】
まず、ｌｅｔ−７ａ及びｌｅｔ−７ｄのサンプル溶液のそれぞれを２５μＬずつ調製し、含まれるｍｉＲＮＡの最終濃度いずれも１０ｎＭであった。実施例３で調製されたｒＧＯ修飾磁気ガラスビーズ０．５μＬを０．２ｍＬ遠心分離管に秤量した。その後、ｌｅｔ−７ａ及びｌｅｔ−７ｄのサンプル溶液を２０μＬずつ採取して抽出材料を含むそれぞれの遠心分離管に入れ、渦巻き渦巻きし振とうしたり逆転させて混合したり、抽出材料と溶液とを十分に混合させ、室温で１０ｍｉｎ抽出した。抽出後、遠心分離管内の液体を吸引し、得られた抽出材料を後のＲＣＡにかけた。濃縮されていない元のサンプル溶液は、ＲＣＡ増幅のコントロールとして増幅された。修飾されていないアミノ基磁気ビーズで濃縮されたサンプルはＲＣＡ増幅のコントロール及び陰性コントロールとしても増幅された。
【００８９】
抽出後の材料を含む遠心分離管に、１０μＬ ＲＣＡ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ、環状プローブ（配列ＣＡＣＧＣＧＡＴＣＣＧＣＡＡＣＴＡＴＡＣＡＡＣＣＴＡＣＴＡＣＣＴＣＡＡＣＡＣＣＣＴＣＣＡＡＣＣＡＣＣＡＡＧＧＣＡＡＴＧＴＡＣＡＣＧＡＡＴＴＣＧＣＣＧＡＡＣＧ）２μＬ及び水８μＬをそれぞれ加え、調合が完了した後、反応系を十分に混合した後、等温増幅のために６５℃でインキュベートし、反応時間が１．５ｈであった。それぞれの増幅産物は、電気泳動にかけた。結果は、図３に示した。
【００９０】
図３に示すように、レーン１及び２は、反応容量が２０μＬである通常のＲＣＡによるｌｅｔ−７ａ及びｌｅｔ−７ｂの増幅である。
【００９１】
レーン１的増幅系にはＲＣＡマスターミックス１０μＬ、ｌｅｔ−７ａ  ２μＬ（総量が２００ｎｍｏｌ）、環状プローブ２μＬ和水６μＬが含まれた。
【００９２】
レーン２の増幅系には、ＲＣＡマスターミックス１０μＬ、ｌｅｔ−７ｄ  ２μＬ（総量が２００ｎｍｏｌ）、環状プローブ２μＬ及び水６μＬが含まれた。
【００９３】
レーン３及び４は、それぞれｒＧＯで修飾されていないアミノ基磁気ビーズによるｌｅｔ−７ａ及びｌｅｔ−７ｄの抽出後のインサイチュ増幅（ｌｅｔ−７ａ及びｌｅｔ−７ｄの総量いずれも２００ｎｍｏｌ）であった。
【００９４】
レーン５及び６は、それぞれｒＧＯ修飾磁気ビーズによるｌｅｔ−７ａ及びｌｅｔ−７ｄの抽出後のインサイチュ増幅（ｌｅｔ−７ａ及びｌｅｔ−７ｄの総量いずれも２００ｎｍｏｌ）であった。
【００９５】
レーン７は、陰性対照実験であった。
【００９６】
図３に示すように、レーン２及び４にはバンドが現れ、これは、通常のＲＣＡ及びアミノ基磁気ビーズがいずれも相同ｍｉＲＮＡを区別できないことを示しているが、レーン６には明らかなバンドが現れなく、これは、ｒＧＯ修飾磁気ビーズは相同ｍｉＲＮＡを区別する能力を持つことを示した。
【００９７】
４．異なるタイプの核酸に対するｒＧＯ修飾磁気ビーズの吸着能力の比較
本発明は、ｒＧＯ修飾材料がｍｉＲＮＡを効率的に吸着できるが、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）及びｍＲＮＡを吸着できないため、複雑な核酸溶液からｍｉＲＮＡを抽出できるために使用できることを初めて見出・証明した。市販されているよく見られたシリコンマトリックス材料は、ｍｉＲＮＡ、ｇＤＮＡ又はｍＲＮＡを特異的に吸着することができない。
【００９８】
実験では、２０ｎＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ=８．０、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｎＭＮａＣｌ、核酸１５ｎｇ（それぞれｍｉＲＮＡ、ｇＤＮＡ、ｍＲＮＡ）を含む抽出量を２０μＬに固定し、残量が水である。サンプル２０μＬをｒＧＯ修飾磁気ビーズで１０  ｍｉｎ抽出し、ＰＣＲにより抽出前のサンプル及び抽出後の上清における核酸含有量の変化を確認した。
【００９９】
図４−ａで用いられた核酸は、ヒトｇＤＮＡであり、増幅ターゲットは、β−ａｃｔｉｎ遺伝子であり、ＰＣＲのＣｔ値により分かるように、抽出前後でサンプルの核酸含有量に変化がないため、該材料はｇＤＮＡに対して吸着効果を持たないことを示した。
【０１００】
図４−ｂで用いられた核酸は、トータルＲＮＡであり、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ含有量の変化は、ＲＴ−ｑＰＣＲによって測定され、Ｃｔ値により分かるように、抽出前後でサンプル核酸含有量に変化がないため、該材料がｍＲＮＡに対して吸着効果を持たないことを示した。
【０１０１】
図４−ｃで用いられたサンプルは、ｌｅｔ−７ａ  ｍｉＲＮＡであり、抽出前後の含有量の変化は、ＲＴ−ｑＰＣＲによって測定され、抽出前後のＣｔ値の差が７．８であることが分かり、増幅効率が２である場合、ｌｅｔ−７ａ  ｍｉＲＮＡの９９．５５％が吸着された。
【０１０２】
図４−ａ〜図４−ｃでは、陰性対照のＣｔ値は、それぞれ３８．８７、Ｎ/Ａ（未検出）及び３２．４７であった。
【０１０３】
上記の実験は、ｒＧＯ修飾磁気ビーズが、ｍｉＲＮＡを効率的に吸着できるが、ｇＤＮＡ及びｍＲＮＡを吸着できないことを示した。
【０１０４】
５．ｒＧＯ修飾磁気ビーズによるｍｉＲＮＡサンプルの濃縮
濃縮されていない低濃度核酸抽出液は、インサイチュ増幅を行い、ＲＣＡ反応系は、２０μＬで、ＲＣＡマスターミックス１０μＬ、ｍｉＲＮＡ（ｌｅｔ−７ａ）サンプル２μＬ、環状プローブ（配列ＣＡＣＧＣＧＡＴＣＣＧＣＡＡＣＴＡＴＡＣＡＡＣＣＴＡＣＴＡＣＣＴＣＡＡＣＡＣＣＣＴＣＣＡＡＣＣＡＣＣＡＡＧＧＣＡＡＴＧＴＡＣＡＣＧＡＡＴＴＣＧＣＣＧＡＡＣＧ）２μＬ及び水６μＬを含む。
【０１０５】
ｍｉＲＮＡサンプル  １００μＬは、ｒＧＯ修飾磁気的固相抽出材によって抽出された後、液体を吸出し、ｒＧＯ修飾磁気的固相抽出材をｉｎ  ｓｉｔｕ  ＲＣＡにかけ、反応系は、２０μＬで、マスターミックス１０μＬ、抽出されたｒＧＯ修飾磁気ビーズ、環状プローブ（配列ＣＡＣＧＣＧＡＴＣＣＧＣＡＡＣＴＡＴＡＣＡＡＣＣＴＡＣＴＡＣＣＴＣＡＡＣＡＣＣＣＴＣＣＡＡＣＣＡＣＣＡＡＧＧＣＡＡＴＧＴＡＣＡＣＧＡＡＴＴＣＧＣＣＧＡＡＣＧ）２μＬ及び８μＬ水を含む。
【０１０６】
図５−ａに示すように、濃縮されていない場合には、ＲＣＡによるｍｉＲＮＡサンプルの検出限界は、１．３１８ｐＭ（３σ）（図５−ａを参照）であるが、磁気的材料によって濃縮された後、ＲＣＡによるｍｉＲＮＡサンプルの検出限界は、５３．４ｆＭ（３σ）（図５−ｂを参照）に達し、検出限界は約２５倍減少した。該磁性材料は、低濃度ｍｉＲＮＡサンプルの検出に適用できることを示した。
【０１０７】
以上、本発明の好ましい実施形態に過ぎず、当業者にとっては本発明の原理から逸脱することなく、幾つかの変更及び改良を行うことができることを指摘すべきである。これらの変更及び改良も本発明の保護範囲と見なされるべきである。
【図１】
2020530764.tif 000003
【図２】
2020530764.tif 000004
【図３】
2020530764.tif 000005
【図４】
2020530764.tif 000006
【図５】
2020530764.tif 000007
【配列表】
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【国際調査報告】
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