(57)【要約】  遺伝子療法を個人において実施する前に、遺伝子療法ベクターの安全性及び／又は有効性を明確にする方法は、個人から得られた人工多能性幹細胞の培養物を、遺伝子療法ベクターに感染させることを含む。理想的には、細胞は、分化可能な状態に置かれ、そして感染は、培養開始時において、並びに分化期間中、及び／又は分化後においては少なくとも１回、実施される。核酸が、感染細胞から抽出され、次にベクターに由来する核酸の組み込みの有害効果、及び／又はベクターに由来する核酸の発現効率を測定及び／又は決定するために分析される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子療法ベクターの安全性及び／又は有効性を明確にする方法であって、
人工多能性幹細胞の培養物を遺伝子療法ベクターに感染させることと、
感染細胞から核酸を抽出することと、
ベクターに由来する核酸の組み込みの有害効果、及び／又はベクターに由来する核酸の発現効率を測定及び／又は決定するために核酸を分析することと
を含む方法。
【請求項２】
人工多能性幹細胞が、分化可能な状態に置かれ、並びに細胞が、培養開始時において、並びに分化期間中、及び／又は分化後においては少なくとも１回、遺伝子療法ベクターによる感染を受ける、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
培養物が、分化期間中のいくつか異なる時点において、遺伝子療法ベクターによる感染を受ける、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
異なる量のベクターが、各感染で使用される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
感染させるステップが、少なくとも３０分間、細胞をベクターに曝露することを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
感染させるステップが、少なくとも３時間、細胞をベクターに曝露することを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
感染させるステップが、オーバーナイトで細胞をベクターに曝露することを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
核酸を分析することが、遺伝子療法の副次効果に寄与する可能性がある、ベクターに担持される因子、又はその組み込みに起因する因子を決定することを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
決定することが、宿主ゲノム内のベクター挿入部位を決定すること、遺伝子発現の変化を決定すること、新たなＲＮＡ転写物若しくはトランケートされたＲＮＡ転写物、組み込み部位若しくはその近傍における遺伝子に生じたメチル化変化を決定すること、及び／又は遺伝子の不活性化を決定することを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ベクターが、ウイルス又はプラスミドである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ベクターが、レトロウイルスである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ベクターが、レンチウイルスである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ベクターが、アデノ関連ウイルスである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
ベクターが、組み込みウイルスである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
人工多能性幹細胞が、ヒト又はマウスに由来する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
人工多能性幹細胞が、遺伝子療法を必要とする個人の細胞に由来する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ベクターが、個人が必要とする修正遺伝子を担持する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
ベクターが、修正遺伝子の発現に必要とされる核酸要素を担持する、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子療法ベクターの安全性及び／又は有効性を明確にする方法に関する。本発明は、特に、遺伝子療法の安全性、その副次効果、及び長期奏功性の遺伝子発現を特に明確にすることに関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子療法は、遺伝子を担持するベクター物質を、修正遺伝子の増強を必要とする細胞の宿主ゲノム内に恒久的に組み込むことにより、治療用遺伝子を送達する有望なアプローチである。このプロセスでは、罹患した宿主内の既存遺伝子が突然変異しており、したがって機能的タンパク質を生成しない遺伝的障害を処置又は修正するために、完全に機能的な遺伝子が使用可能である。遺伝子療法は、細胞を正常に機能させるための、ワクチン接種するための、又は標的腫瘍細胞（複数可）の死を引き起こすことにより、がんを処置するためのタンパク質を提供する遺伝子を送達することができる。核酸を標的宿主ゲノムに組み込む遺伝子療法ベクターとして、アデノ関連（ＡＡＶ）ウイルス、レトロウイルス（ＲＶ）等のウイルス、及びそのサブグループが挙げられる。これらのベクターは、それら自体をオープンクロマチンに挿入することを好む。オープンクロマチンは、遺伝子が転写に必要とされる、開いた又はほどかれたコンフィギュレーション状態にある。発現される遺伝子を代表するこのコンフィギュレーションは、挿入を目的とした遺伝子療法ベクターの進入を可能にする。高度に発現している遺伝子がベクター挿入にとって好ましい標的であることが明らかにされている（Ｋｕｓｔｉｋｏｖａら（２００９）、Ｗｕら（２００３）、Ｎｏｗｒｏｕｚｉら（２０１３））。組み込みのプロセスは、ウイルスベクターにより担持されている核酸が挿入可能なように、宿主ＤＮＡが切断されることを必要とし、次にウイルス核酸が宿主に結合した後に、このプロセスの修復が宿主ＤＮＡ修復遺伝子により実施される。
【０００３】
これまでに、遺伝子療法は、重度の複合型免疫不全症について処置された小児が白血病を発症したという挫折を経験した。これは、がん遺伝子に挿入されるレトロウイルスにより担持される治療用遺伝子と関連し、その発現変化の原因となり、そして組み込まれた遺伝子を担持するがん性細胞のクローン増殖を引き起こすことが判明した。この後、ベクターと関連した寄与因子、並びに細胞のクローン増殖及び発癌を引き起こす、宿主とベクターとの相互作用を識別するために、いくつかのｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏモデルが設計された。これらの公知の寄与因子として、ベクタープロモーター又はエンハンサーにより媒介された宿主のローカル遺伝子の活性化（挿入部位から約１００ｋｂに限定されると考えられている）、ベクター及び宿主遺伝子の間のスプライシングとこれによるその発現においてコントロールされていない可能性があるトランケートされた遺伝子の生成、ベクター内のプロモーターが、ベクター挿入近傍における宿主の遺伝子発現を継続的に駆動するベクターリードスルー、並びに宿主の自然免疫系によるベクターのメチル化及び宿主遺伝子のメチル化が挙げられる。ＤＮＡをメチル化することにより、宿主の自然免疫応答は、感染後の侵入外来ベクターの発現をコントロールしてその発現を停止しようとするが、しかしそれそのものの遺伝子のメチル化も引き起こし、これにより細胞恒常性をコントロールする多くの重要な遺伝子について、その宿主内遺伝子発現変化を引き起こす。
【０００４】
出願者は、レトロウイルスサブグループ、レンチウイルス（ＬＶ）を発現される宿主遺伝子に挿入し、これを用いて胎児マウスが処置されるｉｎ  ｖｉｖｏモデルをこれまでに開発した。この動物の出生は叶えられたが、これにより発達期間中に発現された遺伝子は、遺伝子療法ベクターの組み込みに曝露される。高度に発現している遺伝子が組み込み用として多くの場合選択され、そしてこのようなマウスは肝臓腫瘍を続いて発症することが判明した。また、出願者は、このＬＶの挿入は、発達期間中に、また出生後でさえも生じたことも見出した（感染症後の最長５日間測定された）（Ｎｏｗｒｏｕｚｉら（２０１３））。胎児マウスでは、発達遺伝子は、増殖、成長、及び分化に関与する遺伝子を含み、そしてこれらは高度に発現している。この種の遺伝子はがん遺伝子又はプロトオンコジーンであることも公知であるが、出生後には通常スイッチオフされる。したがって、このような遺伝子へのウイルス遺伝物質の組み込み及びこのような遺伝子の突然変異原性が、この動物におけるがん発症の原因であったのではないかと疑われている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、遺伝子療法ベクターの安全性及び／又は有効性を明確にする改善した方法の提供について探索する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の態様によれば、遺伝子療法ベクターの安全性及び／又は有効性を明確にする方法であって、人工多能性幹細胞の培養物を遺伝子療法ベクターに感染させることと、感染させた人工多能性幹細胞から核酸を抽出することと、ベクター組み込みの有害効果及び／又はベクターによる遺伝子の発現効率を測定及び／又は決定するために核酸を分析することとを含む、方法が提供される。
【０００７】
このモデルは、発現された遺伝子が、増殖、発達、及び分化に関与する発達プロセス期間中の状況を模倣する。この方法は、したがって、がんコントロール遺伝子に関してベクターをテストすることを可能にする。方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施され、そして遺伝子療法ベクターをテストする方法における動物の使用に対する代替法を提供する。
【０００８】
人工多能性幹細胞は、好ましくは遺伝子療法を必要とする個人の細胞に由来する（Ｋａｎｅら（２０１０））。一実施形態では、細胞は、ベクターの副次効果をテストするために、別の個人から提供され得る。ベクターは、個人が必要とする可能性がある、又は可能性のない修正遺伝子を、その発現に必要とされるあらゆる核酸要素と共に担持するのが好ましい。いくつかの実施形態では、ベクターはレポーター遺伝子を、その発現に必要とされるあらゆる核酸要素と共に担持する。
【０００９】
好ましい実施形態では、人工多能性幹細胞は、分化可能な状態に置かれ、並びに細胞は、培養開始時において、並びに分化期間中、及び／又は分化後においては少なくとも１回、遺伝子療法ベクターによる感染を受ける。
【００１０】
これは、発達又は分化の１つの段階においてのみ発現される遺伝子に限定されることなく、発達期間全体にわたり、多くの発現遺伝子、特に遺伝子療法の安全性にとって重要であるがんと関連する遺伝子にアプローチすることにより、ベクターのテストを可能にする。
【００１１】
好ましくは、培養物は、分化期間中のいくつか異なる時点において、遺伝子療法ベクターによる感染を受ける。
【００１２】
培養物は、開始時及び最終分化細胞に至る分化期間中のいくつかの異なる時点において、遺伝子療法ベクターによる感染を受け、ベクターの安全性及び／又は有効性をテストするための広範囲の遺伝子標的を提供し得る。これは、ベクターの安全性が多くの遺伝子においてテストされるのを可能にする。たった１つの時点での感染では、その時に発現された数個の遺伝子についてテストできるに過ぎない。
【００１３】
いくつかの実施形態では、異なる量のベクターが各感染で使用される。
【００１４】
感染させるステップは、少なくとも３０分間、細胞をベクターに曝露することを含み得る。例えば、感染させるステップは、少なくとも３０分間（例えば、３０分間〜１時間）、少なくとも３時間（例えば、３〜６時間）、又はオーバーナイトで細胞をベクターに曝露することを含み得る。
【００１５】
複数の実施形態では、感染させるステップのそれぞれは、サンプルが各時点において安全性について分析可能であるように、分化期間中、分離した複数の時点において、細胞をベクターに曝露することを含む。感染させるステップは、分化プロセス期間中のいくつかの後続する機会において、同一の感染細胞上で感染が繰り返されることを可能にし得る。
【００１６】
核酸を分析するステップは、遺伝子療法の副次効果に寄与する可能性がある、ベクターに担持される因子、又はその組み込みに起因する因子を決定することを含み得る。
【００１７】
決定することは、宿主ゲノム内のベクター挿入部位を決定すること、挿入されたベクターに由来する核酸を用いて遺伝子の遺伝子発現変化を決定すること、ベクター／宿主遺伝子のスプライシング、又はベクターのプロモーターリードスルーを代表する新たなＲＮＡ転写物又はトランケートされたＲＮＡ転写物、ベクター由来の核酸の組み込み部位若しくはその近傍における、又は組み込み部位の近傍にない遺伝子に生じたメチル化変化であって、発現の変化を引き起こすメチル化変化を決定すること、及び／或いは遺伝子の不活性化を決定することからなる分析を含み得る。
【００１８】
ベクターは、ウイルス又はプラスミドであり得る。例えば、ベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ関連ウイルス、及び／又は任意の組み込みウイルス（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ  ｖｉｒｕｓ）であり得る。ベクターは、非ウイルスであり得る。
【００１９】
複数の実施形態では、人工多能性幹細胞は、ヒトに由来し得る。
【００２０】
人工多能性幹細胞は、遺伝子療法を必要とする個人の細胞に由来し得る。
【００２１】
ベクターは、個人が必要とする修正遺伝子を、任意選択的に修正遺伝子の発現に必要とされる核酸要素と共に担持し得る。
【００２２】
方法の好ましい実施形態は、幹細胞の最終分化細胞への分化が生じ、その期間中に発達段階において発現された遺伝子がベクターの組み込み及び突然変異誘発に利用可能であるとき、発達期間中に標的細胞を遺伝子療法ベクターに曝露することと関係する。
【００２３】
本発明の好ましい実施形態が、添付図面を参照しながら、及びそこで例証されるように、以下に記載されている。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】成体細胞からｉＰＳｃへのリプログラミング、及び次の最終分化細胞について、一般的に例証する図である。
【図２】ｉＰＳｃから肝臓への分化期間中の複数の遺伝子発現、ベクターの組み込み、及び突然変異誘発の概略図を示す図である。
【図３】肝細胞と比較して、ｉＰＳｃにおいて発現が増加している重要な経路に関与する遺伝子を示す図である。
【図４】発現に富んだ肝細胞と対比したｉＰＳｃの遺伝子オントロジーを示す図である。
【図５】緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーター遺伝子をそれぞれ担持するＬＶベクターｐＨＶ及びｐｄＥＷによる挿入遺伝子のＩｎｇｅｎｕｉｔｙ経路分析（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：ＩＰＡ）を示す図である。
【図６】ＬＶ及びＡＡＶベクター「標準品」の例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本出願者は、ｉＰＳｃを使用して、そのこれまでのｉｎ  ｖｉｖｏモデルを模倣するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法を開発した。方法は、幹細胞、分化の過程にある細胞、及びその最終的に分化した形態の細胞を感染用として使用する。これらの各段階において、この期間中に活性であり、遺伝子療法ベクターによる組み込みに利用可能である遺伝子が提供される。ヒト細胞を使用して、この方法は、異なるコンフィギュレーションの多くの遺伝子において、及びヒトにおいてがん易罹患性遺伝子と考えられる遺伝子においても、遺伝子療法ベクターの副次効果の測定を可能にする。方法の好ましい実施形態は、組み込みと関連した遺伝子発現の変化を露見させる一連の分子アッセイを使用する。方法は、遺伝毒性に対して高感度であり、また臨床的検討に入る前に、分化期間においてベクターにより担持される遺伝子の発現に関して、遺伝子療法ベクターの有効性と共に、このようなベクターの安全性をテストするのに有用であると考えられ得る。
【００２６】
方法は、ヒトを対象とした遺伝子療法を、但し検査室において模倣する安全性テストを提供し、すなわち、テストは個人に対して非侵襲的である。方法は、ベクターの組み込みによる遺伝子移入の有害な副次効果を識別するために、発達段階において発現される遺伝子をベクター挿入に利用可能となるようにすることができる。
【００２７】
方法は、細胞が当初取得された宿主内の有害効果を明確にするために、個人に特化されたアプローチも提供する。このプロセスでは、正常細胞、例えば宿主由来の線維芽細胞等は、ｉＰＳｃに変換され、次に最終分化細胞に分化される。ここに記載される方法により、このプロセス期間中の安全性についてベクターをテストすれば、ベクターコンフィギュレーションテストと宿主の遺伝的背景とが整合し、個人に特化したテストとして、突然変異原性及びおそらくは発癌について、宿主に対して特異的にテストする。一実施形態では、方法は、ベクターの安全性についてテストするために、遺伝子療法が意図された個人以外の個人に由来する細胞から得られたｉＰＳｃ及びその分化後のカウンターパート上で実施可能である。
【００２８】
この方法は、遺伝的障害を有する患者がそれを処置するために来院する前に、ベクターが安全かどうか検査されることを可能にする。方法は、細胞の増殖及びがんを引き起こす遺伝子を見つけるのにも使用され得る。
【００２９】
ここに記載される方法は、高度に発現している遺伝子が、遺伝子療法ベクターによる挿入用として、その標的とされるという事実を使用する。方法は、ｉＰＳｃがいくつかの細胞型、例えば肝臓、心臓、神経系、及び血液等に分化するｉｎ  ｖｉｔｒｏアプローチを使用する。この期間中、及び選択された分化経路に応じて、各細胞型に発達するのに重要である遺伝子（それはがん遺伝子（ベクターにより担持される核酸の挿入によるその発現について、コントロールされない状態にされた場合）であり得る）は、高度に発現され、遺伝子療法ベクターによる組み込みに用いられる。発達プロセスのあらゆる段階にある細胞集団が存在するので、これはｅｘ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝子療法を模倣し、したがってこのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法は、各発達段階にある細胞、すなわちその発達の初期段階にある細胞、最終分化の途中にある細胞、又は遺伝子療法ベクターによる組み込みが容易な遺伝子を発現する最終的に分化した細胞を代表する。
【００３０】
この方法は、宿主ゲノムへの挿入部位が、毎回異なる可能性があり、またベクター上に担持される遺伝子の遺伝子発現の奏功に対して影響を有し得る場合に、ベクター性能についてその検査を可能にする。
【００３１】
ここに記載される方法は、ｉＰＳｃ、及び最終分化細胞に至る分化ステップ、及びこのプロセス期間中のいくつかの段階において感染を受けることとなる、最終分化後に増殖させたこれらの細胞を使用する。一般的に、異なる量のベクターが各感染期間中に使用され得る。ベクターにより担持される核酸は、発現される又は発現されない遺伝子又はゲノムＤＮＡの領域と一体化する。ＤＮＡが、遺伝子又はゲノムＤＮＡの領域が転写されるときに一般的であるオープンクロマチン構造を採るときに、ＤＮＡが高度に発現している場合には、ベクターはより多くの遺伝子又はゲノムＤＮＡの領域を標的とする。感染手順は、より多くの感染細胞又はより多くの数のベクター組み込み体を含む細胞を提供するために、感染効率を高める又は改善する薬剤を使用する場合もあれば、使用しない場合もある。感染は、短期間、一般的に３０分〜１時間、又は１日若しくはそれ超のより長期間、ベクターに曝露することと関係し得る。選択された曝露期間の後、ベクターは洗い流され、そして細胞には増殖させるための培地が提供される、又は細胞は標準プロトコール若しくは市販キットを使用してそのＤＮＡ若しくはＲＮＡを単離するために採取される。
【００３２】
本方法は、ベクターを挿入する際に、すべての段階において感染を行うために、ｉＰＳｃ及び最終分化細胞に至る途中のその派生物（ここでは、例として肝細胞が使用される）を使用する。これはベクターに曝露されるすべての遺伝子の固有の長所をもたらし、そうすることで、ベクターにより影響を受ける遺伝子の遺伝子発現変化、したがってベクターによって引き起こされた、遺伝子療法の副次効果に寄与する可能性のある変化を測定するのに、これらの細胞のサンプルが使用可能となる。これら因子に対するアッセイは、以下のうちの１つ又は複数等のように、容易に利用可能である。
（Ｉ）ライゲーションアダプター媒介式のＰＣＲによる組み込み部位分析、ターゲットエンリッチメント配列決定、及び感染細胞又はクローン化された感染細胞のプール上での逆ＰＣＲ。
（ＩＩ）遺伝子上のベクタープロモーター又はエンハンサー活性の影響を明らかにするために、感染細胞と非感染細胞におけるＲＮＡ転写物のレベル、したがって感染後に生じた遺伝子発現変化を測定する、感染細胞又はクローン化された感染細胞のプール上でのＲＮＡＳｅｑ。ＲＮＡＳｅｑは、ベクターと宿主遺伝子の間の新規ＲＮＡスプライシング転写物、並びにベクター内のベクタープロモーターから外側に向かって宿主遺伝子に至るリードスルーに起因する転写物の存在に関する情報も提供する。
（ＩＩＩ）ベクター組み込み部位が既知である遺伝子用として、当該遺伝子の発現の変化を特異的に測定するために設計されたプライマーを用いたｑ−ＲＴＰＣＲ。この方法は、この細胞のクローン細胞集団／ＩＳの単離を必要とする。
（ＩＶ）これまでに公表された研究に基づき、メチル化された遺伝子が発現変化し得るというエビデンスを提供する、ベクター及び宿主ＤＮＡのＣｐＧメチル化を測定するためのＥＬＩＳＡ又はその他の手段によるＤＮＡのメチル化。
【００３３】
これらのルーチンアッセイの場合、サンプル細胞集団は、アッセイ用として、感染後の任意の時期、例えば分化プロセスの開始及び終了の間に採取可能である。
【００３４】
この分化モデルは、ヒトにおける発達プロセスと良く一致し、そしてこのプロセスをコントロールする遺伝子、又は組み込み用として容易に入手可能なその他の遺伝子を提供する。この方法は、疾患を処置するために、クリニックにおいてベクターの使用について検討する前に、ベクターが宿主に対して効果を有さないこと又は有害効果を有すること、及び有用であることについて検査可能にすることにより、ベクター組み込みの安全性についてテストするプラットフォームを提供する。システムは分化に至るいくつかの細胞経路においてテスト可能であり、また有害な副次効果を引き起こすことが可能、又は不可能としてベクターを特徴づける、これらの細胞型を対象としたバイオインフォマティクスを使用するシステムアプローチを提供する。
【００３５】
図１は、成体細胞からｉＰＳｃへのリプログラミング、次の最終分化細胞について、一般的に例証する。成体細胞、例えば線維芽細胞１４等は、生検１２により、個人ドナー／患者１０から取得可能であり、そして転写因子プログラミング遺伝子１６、例えばＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、及びＫｌｆ４等、並びに多能性の誘発１８を使用してｉＰＳｃに変換される。得られたｉＰＳｃ２０は胚性幹細胞に類似しており、次に最終分化細胞２４、例えば肝細胞等に分化２２することができる。このプロセス期間中に、細胞は、遺伝子療法ベクターによる感染２６を受け得る。これらの細胞では、このプロセスをコントロールするいくつかの遺伝子が活発に転写され、そしてオープンクロマチン構造を採るので、これらの遺伝子は、組み込み用のウイルス侵入にとってきわめて好ましい。これは、ベクターが複数の遺伝子にアクセスすることを可能にし、そして突然変異誘発に利用することを可能にする。多くの遺伝子標的が利用可能であるので、これは、例えば、ベクター挿入部位、及びこのような挿入部位を有する、又は有さない遺伝子の発現変化を識別する上記分子的方法のうちの１つ又は複数を使用して、遺伝子療法ベクターコンフィギュレーションの効果、したがってベクターの安全性をテストするための高感度モデルを提供する。これは、分化プロセス全体を通じて、遺伝子移入の有効性、及びベクターによる遺伝子発現の寿命についてもテストする。
【００３６】
遺伝子療法の方法では、修正された細胞は、次に個人１０に移植２８して戻される。
【００３７】
本発明の好ましい実施形態では、個人に移植して戻される代わりに、修正された細胞が、ベクターの安全性を明確にするために分析される。特に、細胞由来の核酸が、ベクターに由来する核酸の組み込みの有害効果、及び／又はベクターに由来する核酸の発現効率を測定及び／又は決定するために分析される。
【００３８】
図２は、ｉＰＳｃから肝臓への分化期間中の複数の遺伝子発現、ベクターの組み込み、及び突然変異誘発の概略図である。同図は、細胞がｉＰＳｃから肝細胞に分化可能であることを示す。同図は、ｉＰＳｃから肝細胞への分化期間中に、宿主遺伝子中又はその近傍で実施されたベクターの組み込みを示す。この期間中、多くの遺伝子が活発に発現され、そしてこの状態では、遺伝子療法ベクターの組み込みが容易となる。がんと関連する遺伝子は、発達期間中にスイッチのオン／オフが生じ、そして異なるレベルで発現される。高度に発現している遺伝子は、ベクターによる挿入がより容易となる。これは、突然変異誘発を引き起こす可能性がある。このシナリオは、ｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子療法を模倣する。発達期間中、この広範囲にわたる遺伝子が、がんと関連することが公知である。そのような遺伝子は高度に発現しているので、それを組み込みに利用することができる。これは、ベクターの挿入後、これらの遺伝子は、挿入部位の遺伝子の発現に対するベクターの効果についてテスト可能であることを意味し、したがってこの方法は、いくつかの異なる遺伝子型内のベクターの安全性を、その固有のコンフィギュレーションにおいてより徹底してテストする。
【００３９】
遺伝子療法ベクターに曝露された場合に、突然変異誘発が生じやすい複数の遺伝子（がん細胞又は正常細胞の挙動をコントロールする上で重要）が一度に高度に発現している、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法（ｉｎ  ｖｉｖｏでの胎児マウスモデルにおいて実証されたような）が、これまでに存在しなかった。ここに記載されるｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルはｉｎ  ｖｉｖｏでのヒトへの遺伝子送達を模倣するが、その場合、多くの細胞が、ベクター投与後の組み込みにより中断されるおそれのあるいくつかの発達段階にある。幹細胞が最終分化細胞に変換される間、幹細胞を感染させることにより、この期間中に発現されるすべての遺伝子が、ベクターの組み込み、したがって突然変異誘発において利用可能となる。多くの発達遺伝子が、出生後に通常スイッチオフとなるがん関連遺伝子であることが公知であるので、このことは、分化期間中の感染シナリオを、ｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝子療法を代表するものとし、そのシナリオでは、組み込みが初期及び後期の発達細胞型の中に生じる可能性がある。次に、記載したように、これは、突然変異誘発が生じやすい遺伝子、したがって遺伝子療法ベクターのコンフィギュレーションがベクターの有害効果及び発癌と関連することが公知である寄与効果を引き起こす可能性があるか確認するテストを提供する。
【実施例】
【００４０】
［実施例１］
肝細胞への分化期間中のｉＰＳｃの感染
方法
下記の実施例は、多能性幹細胞の肝細胞への分化について、Ｓｚｋｏｌｎｉｃｋａら（２０１４）により記載されるプロトコールを使用する。この方法は、この分化期間中に遺伝子療法ベクターによる感染を実施するために、ここでは使用される。
【００４１】
一般的に：
１．無菌の３０ｍｌユニバーサルチューブ中で、ノックアウトＤＭＥＭ（ＫＯ−ＤＭＥＭ；Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１０８２９）を用いて作製された１０ｍｌのマトリゲルＢＤ（マトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、マトリゲル、カタログ番号３５４２３０）で、細胞培養物プレートをコーティングする。６ウェルプレートの各ウェルにおいて１ｍｌの混合物を取得するのに、１ｍｌのマトリゲルを含む１８ｍｌのＫＯ−ＤＭＥＭを使用する。
【００４２】
２．６ウェルプレートを、ヒト組み換えビトロネクチン（カタログＡ１４７００；Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でコーティングする。一定分量（６０ｍｌ）のビトロネクチンを、６ｍｌの、カルシウム及びマグネシウムを含まない無菌ＤＰＢＳ（カタログ１４１９０）を含有する１５ｍｌコニカルチューブに、室温でピペット分取し、１ｍｌの希釈したビトロネクチン溶液を各ウェルに添加し、そして使用前にプレートを室温で１時間放置する。
【００４３】
３．次に、ラミニン５２１／１１１ミックス（Ｌ１１１）を使用して、ラミン（コーティングの説明については、Ｂｉｏｌａｍｉｎａのウェブサイトを参照）でプレートをコーティングする。ラミニン５２１（１００μｇ／ｍｌ）及びラミニン１１１（１００μｇ／ｍｌ）（Ｂｉｏｌａｍｉｎａ（スウェーデン））。濃度５μｇ／ｃｍ2のラミニン１１１ミックス（１：２又は１：３の比の５２１及び１１１からなるブレンド品）を使用する。ラミニン希釈では、カルシウム及びマグネシウムを含有するＰＢＳを使用する。播種後、プレートを３７℃において２時間インキュベートする。
【００４４】
４．ｉＰＳｃは、１ウェル当たり２ｍｌのＥｓｓｅｎｔｉａｌ８培地（Ｅ８；Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）内、ビトロネクチンプレート上で維持可能である。培地は、毎日アスピレートし、そして１ウェル毎に２〜３ｍｌの新鮮な培地に交換しなければならない。細胞の継代は、１：３の比で、ＥＤＴＡ（１：１０００希釈；Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して３〜４日毎に行う。
【００４５】
５．細胞は、様々な密度において感染可能であり、例えばベクターに応じて、感染を増強するための薬剤、例えばポリブレン等（通常５μｇ／ｍｌ  ｖｏｌ）を用いて、又は用いないで、１ウェル毎に遺伝子療法ベクター（増殖培地の組成を有意に変化させないように濃縮される）１〜１０，０００個のＭＯＩにおいて感染可能である。感染は３〜６時間生ずるのが一般的であり、その後、ベクターは除去され、そして新鮮な培地内に置き換えられる。２４時間の発現時間後、細胞は、Ｇｅｎｔｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号０７１７４）及びスクレーパーを使用して各ウェルから除去可能であり、またＤＮＡ及びＲＮＡは市販キットを使用して細胞から精製可能である。理想的には、ＤＮＡについて１つのウェルを使用し、そしてＲＮＡを単離するのに別のウェルを使用する。この試料は、この方法の終了時に、記載されるような分子アッセイに付される。
【００４６】
６．細胞を分化させるには、細胞がおよそ７０％〜８０％の集密度に達したら、培地をｉＰＳｃからアスピレートする。細胞をＰＢＳで洗浄し、そして１ｍｌのＧｅｎｔｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔを用いて、細胞が解離を開始するまで、３７℃においておよそ６〜８分間処理する。
【００４７】
７．細胞懸濁物を、等しい容積（１ｍｌ）のＤＭＥＭ／Ｆ１２を含有する１５ｍｌ無菌チューブに移し、１０００ｒｐｍ、室温で５分間遠心分離し、そして上清をアスピレートした後、ＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ−２７６３２）を含有する１ｍｌのＥ８中で細胞の再懸濁を行い、最終濃度を１０μＭとする。
【００４８】
８．細胞は、血球計算機を用いてカウントし、そして肝細胞分化実験用として、Ｅ８中での密度が１ｃｍ2当たり１０5個の生存細胞となるまで希釈すべきである。細胞懸濁物を、Ｅ８含有ウェルに添加し、そして３７℃においてインキュベートし、そしてＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ−２７６３２）（ＲＯＣＫ阻害剤；Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号０７１７１）を、約３０秒間、穏やかに添加して細胞をウェル内に分布させる。細胞を３７℃及び５％のＣＯ2において２４時間維持して、細胞が好適な所与のマトリックス（マトリゲル／ビトロネクチン／ラミニンミックス）に付着可能にすべきである。
【００４９】
９．ヒト多能性幹細胞分化
プロトコールは、ｉＰＳｃを、約９０％の細胞がアルブミンを発現し、及びチトクロームＰ４５０活性を示す肝細胞に効率的に分化させる方法について記載する。集密度が８０％である６ウェルプレートのうちの１つのウェルは、約３×１０6個の生存細胞を通常含有する。
【００５０】
分化の０、１、及び２日目−胚体内胚葉
細胞を単一細胞懸濁物に分離する（上記のように）。細胞をカウントし、１ｃｍ2当たり１０5個の生存細胞で播種する。細胞は、播種後２４時間で通常分化するが、均等に分布させるべきである。初期の細胞分化における細胞密度は、２０％〜３０％（位相差顕微鏡検査により決定される）であるべきである。
【００５１】
必要とされる容積の、組み換えマウスｗｎｔ３ａ（５０ｎｇ／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ／Ｂ２７補充物を調製する（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号１３２４−ＷＮ−５００／ＣＦ；レシピーを参照）。２ｍｌ／ウェルを使用し、そして使用前に培地が室温に達していることを確実にする。使用済みのＥ８培地をｈｉＰＳＣからアスピレートする。０日目に、ＲＰＭＩ／Ｂ２７培地（ｗｎｔ３ａ及びＡＡを含まない）を用いて穏やかに細胞を洗浄した後、ｗｎｔ３ａ及びＡＡが補充された新鮮なＲＰＭＩ／Ｂ２７培地を添加する。注記：高頻度の細胞死に起因して、２日目及び３日目に、細胞を、ＲＰＭＩ／Ｂ２７培地（ｗｎｔ３ａ及びＡＡを含まない）で洗浄する必要があり得る。さもなければ、ｗｎｔ３ａ及びＡＡが補充された新鮮なＲＰＭＩ／Ｂ２７培地に交換する前に、細胞を洗浄する必要はない。０、１、及び２日目に、使用済みの培地を取り除き、そして適切な容積のＲＰＭＩ／Ｂ２７／ｗｎｔ３ａ／ＡＡを添加する。この時点で、上記のように遺伝子療法ベクターを添加することができ、そして本方法のステップ５に記載するように試料を採取する。
【００５２】
分化の３、４、及び６日目−肝芽細胞
４ｍｌ／ウェルのＳＲ／ＤＭＳＯ培地を調製する（下記の「試薬及び溶液」を参照）。
【００５３】
３、４、及び６日目にＲＰＭＩ／Ｂ２７培地を細胞からアスピレートし、ＳＲ／ＤＭＳＯ培地を添加する。４及び６日目において、除去を必要とする顕著な死細胞が認められる（この場合、細胞を、ＳＲ／ＤＭＳＯを用いて穏やかに洗浄すべきである）のでなければ、培地交換前に細胞を洗浄する必要がないといえる。この時点において、上記のように、遺伝子療法ベクターが毎日添加され、そして本方法のステップ５に記載するように試料が採取され得る。
【００５４】
分化の８、１０、１２、１４、１６、及び１８日目−肝細胞規格
１０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦ及び２０ｎｇ／ｍｌのＯＳＭが補充されたＨＺＭ培地（４ｍｌ／ウェル）を調製し（下記の「試薬及び溶液」を参照）、そして使用前に培地が室温になっていることを確実にする。培地を細胞からアスピレートして取り除き、そして８日目に、補充物を含まないＨＺＭを用いて細胞を洗浄する。ＨＧＦ及びＯＳＭが補充されたＨＺＭ培地を４８時間毎に１８日目まで添加する。細胞は、ルーチンアッセイにより又はキットを使用して、肝臓マーカーについて検査可能である。この時点において、上記のように、遺伝子療法ベクターが毎日添加され、そして本方法のステップ５に記載するように試料が採取され得る。
【００５５】
材料
６ウェルマトリゲルコーティングプレートＲＰＭＩ／Ｂ２７分化培地中のヒトｉＰＳｃ（ｈｉＰＳｃ）（レシピー；「試薬及び溶液」セクションを参照）
ＳＲ／ＤＭＳＯ分化培地（レシピー；「試薬及び溶液」セクションを参照）
ＨｅｐａｔｏＺＹＭＥ（ＨＺＭ）分化培地（レシピー；「試薬及び溶液」セクションを参照）
組み換えマウスｗｎｔ３ａ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号１３２４−ＷＮ−５００／ＣＦ；レシピーを参照）
ヒト肝細胞増殖因子（ＨＧＦ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号１００−３９；レシピー「試薬及び溶液」セクションを参照）
ヒトオンコスタチンＭ（ＯＳＭ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号３００−１０（下記の「試薬及び溶液」を参照）
【００５６】
試薬及び溶液
試薬及び機器の選択された供給業者
多能性幹細胞用の維持培地
Ｅ８及び補充物（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ａ１５１７００１）
ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ−２７６３２（ＲＯＣＫ阻害剤；Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号０７１７１）、Ｙ−２７６３２は、滅菌水中、５ｍＭのストック濃度で調製し、一定分量化し、及び使用までフリーザー中で保管すべきである。
ＲＰＭＩ１６４０／Ｂ２７分化培地、ＲＰＭＩ１６４０（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号２１８７５）１°−最終濃度のＢ２７補充物（５０°−Ｂ２７補充ストックから；Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１７５０４）
１％−ペニシリン／ストレプトマイシン（ペン／ストレプ；Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１５１４０；１００°−濃縮ストックから添加する）
最終濃度５０ｎｇ／ｍｌの組み換えマウスｗｎｔ３ａ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号１３２４−ＷＮ−５００／ＣＦ；０．２％のＢＳＡを含むＰＢＳ中で１０μｇ／ｍｌに調製されたｗｎｔ３ａストックから）
最終濃度１００ｎｇ／ｍｌのヒトアクチビンＡ（ＡＡ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号１２０−１４Ｅ；０．２％のＢＳＡを含むＰＢＳ中で１００μｇ／ｍｌに調製されたＡＡストックから）
ＳＲ／ＤＭＳＯ分化培地
ノックアウトＤＭＥＭ（ＫＯ−ＤＭＥＭ；Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１０８２９）
ノックアウトＳｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＯ−ＳＲ；Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１０８２８）
ノックアウトＳｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔが、全培地の２０％であることを確認する（ＫＯＳｅｒｕｍ：ＫＯ−ＤＭＥＭが１：５の比）
０．５％−ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号３５０５０；１００°−濃縮ストックから添加する）、１％非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ；Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１１１４０；−濃縮ストックから）
最終濃度０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール（５０ｍＭのストックから；Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号３１３５０）
１％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｄ５８７９）
１％−ペニシリン／ストレプトマイシン（ペン／ストレプ；Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１５１４０；１００°−濃縮ストックから添加する）
ＨｅｐａｔｏＺＹＭＥ分化培地
ＨｅｐａｔｏＺＹＭＥ培地（ＨＺＭ；Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１７７０５）
１％−ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号３５０５０；１００％−濃縮ストックから添加する）
最終濃度１０μＭのヒドロコルチゾン２１−ヘミスクシネートナトリウム塩（ＨＣ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｈ４８８１；ＰＢＳ中で１ｍＭに調製されたＨＣストックから）
１％−ペニシリン／ストレプトマイシン（ペン／ストレプ；Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１５１４０；１００％−濃縮ストックから添加する）
最終濃度１０ｎｇ／ｍｌのヒト肝細胞増殖因子（ＨＧＦ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号１００−３９；０．２％のＢＳＡを含むＰＢＳ中で１０μｇ／ｍｌに調製されたＨＧＦストックから）
最終濃度２０ｎｇ／ｍｌのヒトオンコスタチンＭ（ＯＳＭ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号３００−１０；０．２％のＢＳＡを含むＰＢＳ中で２０μｇ／ｍｌに調製されたＯＳＭストックから）
【００５７】
ＲＰＭＩ／Ｂ２７、ＳＲ／ＤＭＳＯ培地、及びストック因子は、使用する前に濾過されなければならない。ＨｅｐａｔｏＺＹＭＥ（ＨＺＭ）は濾過を必要としない。増殖因子の濃縮ストック溶液は、適切な細胞培養培地中で、最終作業濃度まで希釈された。
【００５８】
感染細胞は、次にベクター毒性を決定する１つ又は複数のアッセイに付すことができる。このアッセイは、ベクターが組み込まれた部位（遺伝子又は遺伝子の近傍）、遺伝子若しくはその近傍への挿入により、ベクターが遺伝子の遺伝子発現に及ぼす効果、ベクターが宿主ゲノム核酸とスプライシングして新規の遺伝子転写物を生成するか若しくはしないか、ベクターのリードスルーが近傍遺伝子の発現に変化を引き起こすか、及び／又は感染／組み込みが、ＤＮＡの損傷若しくは細胞恒常性の遺伝子発現変化を引き起こす後成的変化の原因となるか、決定することを含み得る。感染細胞は、突然変異誘発細胞又はがん性若しくは前がん性の細胞を示唆する、優勢に活動するクローンの増殖についてモニタリングされ得る。
【００５９】
［実施例２］
ベクター挿入部位、融合転写物、及びリードスルーの識別
実施例２は、ベクター挿入部位がどのように識別され得るか、その方法を示す。遺伝子又はその近傍へのベクターの組み込みが、挿入部位近傍の隣接する核酸、したがって組み込まれた核酸の遺伝子座を、どのようにベクターから識別可能にするか、その方法について記載する。要するに、方法は、挿入部位に隣接するＤＮＡを増幅するために、ＰＣＲ増幅及び富化を使用する。このＤＮＡは、次に単離、クローン化、及び配列決定される。ヒトゲノムと対比したこの配列のＢＬＡＳＴは、次にベクターの位置の識別を可能にする。これが、がんと関連した重要な遺伝子である場合には、この遺伝子は、遺伝子が、ベクターによる突然変異誘発、例えばこの遺伝子のスプライシング、リードスルー、又は遺伝子の不活性化等による突然変異誘発に利用可能であり得ることのいくつかのエビデンスを提供する。したがって、がんに関係する重要な遺伝子内への挿入は、潜在的遺伝毒性を示唆する。ベクターの位置はそのコンフィギュレーションによっても影響を受け、したがってベクターが異なれば、突然変異誘発の可能性も異なる（Ｓｃｈｏｌｚら（２０１７））。本方法の好ましい実施形態は、このプロセスが生ずるように非常に多くの遺伝子を曝露し、したがって遺伝子療法ベクターの有害効果をテストするのにより高感度である。
【００６０】
方法
ベクター−ゲノムＤＮＡ接合部の増幅
ゲノムＤＮＡを、感染細胞から抽出し、そしてＬＶベクターに対するＬＡＭ−ＰＣＲ：線形増幅を、これまでの記載に従い実施した（Ｔｈｅｍｉｓら（２００５）及びＳｃｈｍｉｄｔら（２００２））。１００ｎｇのゲノムＤＮＡ及び２．５ＵのＴａｑポリメラーゼを使用すると共に、５’ＬＴＲに見出された配列からなる２つの下記ビオチン化プライマーを最終容積５０μｌで使用して、ベクターに隣接したゲノムＤＮＡのＬＡＭ−ＰＣＲも実施した。サイクルパラメーターは、９５℃で５分間の変性（単一サイクル）、その後９５℃で６０秒間保持、６０℃で４５秒間のアニーリング、及び７２℃で９０秒間の伸長反応について５０サイクル、及び７２℃で１０分間保持からなる。２．５Ｕの追加のＴａｑポリメラーゼを添加し、そしてＰＣＲを更に５０サイクル稼働させた。ＰＣＲ産物を、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ｋｉｌｏｂａｓｅ  ｂｉｎｄｅｒ  ｋｉｔ（Ｄｙｎａｌ、Ｏｓｌｏ、ノルウェイ）を使用して捕捉し、そして第２のＤＮＡ鎖を、ランダムなヘキサヌクレオチド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐａｉｓｌｅｙ、英国）（２０μｌの反応混合物）と共に、Ｋｌｅｎｏｗ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して、３７℃で１時間合成した。規則的切断酵素、例えばＴｓｐ５０９Ｉ等を用いて二本鎖ＤＮＡを消化し、リンカーオリゴヌクレオチドを添加し、その後Ｆａｓｔ  Ｌｉｎｋ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅキット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を用いて、室温で１５分間ライゲーションした。ＤＮＡを、０．１ｍｏｌ／ｌのＮａＯＨを用いて変性した後、プライマーを用いた線形増幅と同一の条件を使用するＰＣＲを２ラウンド実施した。ＰＣＲ産物を３％アガロースゲル上で分離し、そしてＤＮＡ断片を、Ｑｕｉｅｘ  ＩＩゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃｒａｗｌｅｙ、英国）を使用して単離し、そして製造業者の指示３に従って、ＴＯＰＯ  ＴＡプラスミドクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化した。第２ラウンドＰＣＲにおいて認められた断片に対応するＤＮＡ断片を含有する細菌コロニーについて、ＬＶ特異的ネスト化プライマーを使用して配列決定した。ＬＡＭ  ＰＣＲ及び非制限的ＰＣＲ技術によりクローン化され、１００〜３００ｎｇのサンプルゲノムＤＮＡを使用して取得されたＥＩＡＶ及びＨＩＶ挿入部位について、ディープパラレルパイロシークエンシング（ＧＳ  ＦＬＸ／４５４：Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）により配列決定し、次にこれまでの記載に従い、Ｂｌａｓ２Ｓｅｑ及びＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムで処理した（Ｍｏｎｔｉｎｉら（２００６））。配列を、ＵＣＳＣ  ＢＬＡＴゲノムブラウザー（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ）、又はＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅ／ｓｅｑ／ＭｍＢｌａｓｔ．ｈｔｍｌ）を使用して、マウスゲノムにアライメントした。
【００６１】
ＲｅｆＳｅｑ遺伝子近傍又はその中（１００ｋｂのウィンドウ内）に組み込んだときに、その組み込みそれぞれの生物学的プロセスにおける分子機能及び役割を、遺伝子オントロジーデータベース（Ｇｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ  ｄａｔａｂａｓｅ）を使用して決定し、そして腫瘍形成に関与する候補遺伝子となり得るものとして識別した。
【００６２】
ランダム化データセットの生成
挿入部位が染色体にランダムに割り振られたか評価するために、ランダム化を１００回実施して、１染色体当たりのベクター挿入について１００のランダム化カウントが得られた。１染色体当たりの実測カウントが１である部位と１００カウントのランダム化された集団の間でｔ検定（９５％信頼度）を実施した。同様に、ＣＧ含有量及び遺伝子密度統計学の場合、ランダム化データを、ゲノム全体を対象に生成した。遺伝子内の転写開始部位及びいくつかの領域からのベクター挿入距離の性質を決定するために、実測データとランダムな場所に割り振られた部位から生成されたデータの間において、遺伝子内で１００回ｔ検定を実施した。
【００６３】
Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ経路分析（ＩＰＡ）による生物学的ネットワークの分析
ネットワーク分析を、差次的に発現されているものとして上記記載の、初期分析から生成された遺伝子のリスト上で実施した。ＩＰＡ（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｒｅｄｗｏｏｄ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）は、遺伝子対象物（例えば、遺伝子、ｍＲＮＡ、及びタンパク質）間の個別に精選された関連性のデータを包含するが、これを、有意に大きな比率を占め、重要な生物学的ネットワーク及び経路を形成している生物学的プロセスを識別するために使用した。特定の経路内の最低３つの遺伝子において、その相対的過剰出現に基づくフィッシャー直接検定のＰ値を使用して、遺伝子のランダムサンプルと比較しながら、生物学的過剰出現の統計的有意性を決定した（＜０．０５のＰ値カットオフ）。Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ  Ｈｏｃｈｂｅｒｇ補正後の、Ｐ＜１０〜２０又はそれ未満に対応するスコアを使用して、きわめて重要な生物学的ネットワークを選択した。
【００６４】
遺伝子発現分析
遺伝子発現分析は、市販されているいくつかの方法により実施可能である。調査の対象とされる細胞から細胞ＲＮＡを最初に単離することにより、これらのＲＮＡは逆転写酵素を使用してｃＤＮＡに変換可能であり、次にこのｃＤＮＡの存在量を測定するために、ｃＤＮＡに対してすでに調製済みのプローブを使用しながらマイクロアレイに付される。ＲＮＡＳｅｑは、やはり市販されている方法であり、ＲＮＡ転写物を直接配列決定し、そして調査の対象とされる細胞中のその相対的存在量を測定する。この方法は、遺伝子療法ベクターに感染した細胞内の遺伝子発現レベルの変化を、未感染細胞と比較して決定するのに有用である。ｉＰＳＣ細胞を肝細胞様の細胞と比較し、カットオフとして両者間でｐ値有意の２倍の上方制御を使用したときに、これらの細胞の発達期間の間のこれら遺伝子におけるその遺伝子発現の差異に基づき、ｉＰＳＣ細胞において遺伝子が上方制御されている、という分析結果が図３及び図４に示されている。
【００６５】
この分析データは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎＣｈｉｐ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  ＨＧ−Ｕ１３３  ｐｌｕｓ  ２．０チップを使用して取得され、及びＧｏｄｏｙら（２０１６）の表２（差次的に発現している遺伝子セットに関する情報を提供する）から取得されたマイクロアレイデータから取得した。データを図３及び図４に示す。
【００６６】
下記の表１及び表２は、図３及び図４に示すデータに対する手がかりを提供する。
【００６７】
【表１】
2020530284.tif 000003
【００６８】
【表２】
2020530284.tif 000004
【００６９】
図３及び図４は、ｉＰＳｃから肝細胞への分化期間中に、多くの遺伝子が活性であること（肝細胞期に限らず、むしろそれよりも）を示す。両図は、ｉＰＳｃ及び肝細胞の間に認められる遺伝子発現の差異は、組み込みに関する有用な標的とみなされ、したがってベクターの効果をテストするのに利用可能であることを示す。
【００７０】
これらのデータは、ｉＰＳｃと肝細胞（Ｈｈｅ）の比較を示す（ｐ値有意で２倍上方制御）。細胞経路、例えば細胞の増殖、成長、及びがん等にとって重要ないくつかの遺伝子が、Ｈｅｐ期と比較してｉＰＳｃ期においてより多く富化している。ベクターの副次効果についてテストするために、好ましくは、両期において感染を実施すべきである。
【００７１】
図３は、ｈｔｔｐｓ：／／ｔｏｐｐｇｅｎｅ．ｃｃｈｍｃ．ｏｒｇ／ｅｎｒｉｃｈｅｍｅｎｔ．ｊｓｐ（富化遺伝子リストを分析することによって、重要な経路における遺伝子の関与を明確にすることを可能にする）を使用したバイオインフォマティクスを示す。これらの遺伝子は、ｉＰＳｃと肝細胞を比較し、その間で発現が増加していることが判明した遺伝子であり、また感染後のベクター挿入に関する標的とみなされる。
【００７２】
図４は、図３に示す遺伝子の遺伝子オントロジーを示す。細胞プロセス、例えば細胞の増殖、成長、及びがん等にとって重要ないくつかの遺伝子が、肝細胞期と比較してｉＰＳｃ期において高度により多く発現している。ベクターの副次効果についてテストするために、好ましくは、両期において感染を実施すべきである。
【００７３】
遺伝子、サブ経路、及びネットワークの経路分析を実施し、分子相互作用を予測し、並びに遺伝子発現データに基づき、重要な生物学的プロセスが増加又は減少することを予測するために、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ経路分析（ＩＰＡ）（ｗｗｗ．ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｉｐａ／ｔｏｘｉｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ）を使用して遺伝子を分析することも可能である。図５は、ＧＦＰレポーター遺伝子をそれぞれ担持するＬＶベクターｐＨＶ及びｐｄＥＷによる挿入遺伝子のＩＰＡを示す。いくつかの毒性学的経路及びプロセスに関与する遺伝子は、複数の挿入を有する。このような遺伝子の遺伝子オントロジーは、ｉＰＳｃ期及び肝細胞（Ｈｅｐ）期の両期における感染が、ベクターをこれらの遺伝子に挿入する上で重要であること、並びに両期（ｉＰＳｃにより当てはまる）において感染した後に挿入を有する遺伝子が、がんプロセスにおいて重要であることを示す。図５もやはり、ベクターが異なれば、標的とされる組み込み用の遺伝子も異なることを示す。これらの結果はｉＰＳｃ及び肝細胞から取得されたが、同じ方法論が任意の種類の感染細胞上で実施可能である。
【００７４】
スプライシング、リードスルー、成長、及びその他の方法と関係する更なるアッセイが、当業者にとって公知であり、また代替的に／付加的に実施され得る。そのような方法は、発癌を引き起こすおそれのある、細胞ゲノムに生じたあらゆる変化を実証する。
【００７５】
融合転写物及びリードスルー
ＮｒＬＡＭ−ＰＣＲが、ベクター／宿主融合転写物、及びリードスルー転写物、並びに組み込み部位を分析するのに使用可能である。（ｎｒ）ＬＡＭ−ＰＣＲ、４５４配列決定及びバイオインフォマティクスデータ分析は、Ｓｃｈｍｉｄｔら（２００７）、Ｐａｒｕｚｙｎｓｋｉら（２０１０）、及びＡｒｅｎｓら（２０１２）により記載されている．
【００７６】
これらのプロトコールに対する修正が、Ｓｃｈｏｌｚら（２０１７）により記載されている。このデータは、発癌を引き起こすことが一般的に認められている遺伝毒性寄与因子としての、ベクターＩＳ、ベクター／宿主のスプライシング、及びリードスルー転写物の識別について記載する。分析では、遺伝毒性を引き起こし、また引き起こさないことが明らかにされているベクター「標準品」が使用される。このＬＶ及びＡＡＶベクター「標準品」の例を図６に示す。これらのＬＶ「標準品」ＬＶは、Ｓｃｈｏｌｚら（２０１７）により、及びＢｏｋｈｏｖｅｎら（２００９）により記載されている。
【００７７】
図６に示すＬＶ及びＡＡＶ標準品の例は、遺伝毒性の可能性に関して「安全」又は「非安全」とみなされる。ＰＨＲ及びＰｄＥＷベクターは、自己非活性化（ＳＩＮ）コンフィギュレーションである。これは、ＬＴＲプロモーター活性は消滅しており、したがって組み込み後、ＩＳ遺伝子はその発現において変化し得ないことを意味する。ｐＨＶベクターは、完全なＬＴＲコンフィギュレーションを有し、そしてＩＳ遺伝子に対して遺伝子発現増加を引き起こすことができる。「安全」ＡＡＶベクターは、「非安全」ベクターにおいて黒く示したプロモーター領域を有さない。この領域は、マウスにおいて肝細胞癌と関わっていることが判明しているプロモーターを含有する（Ｃｈａｎｄｌｅｒら（２０１６））。
【００７８】
遺伝毒性について「標準品」として使用されることを可能にするコンフィギュレーションを有するＬＶ及びＡＡＶベクターが、ここに記載されるモデルにとって有用である。このようなベクターは、組み込み後のそのＩＳ選択、宿主ゲノムとのスプライシング、及びリードスルーについて、調査の対象とされるベクターとアライメントするのに使用される。これらの因子は、遺伝毒性の可能性の指標として使用される。安全なベクターは、遺伝子発現を活性化も、また不活性化もすることなく、宿主ともスプライシングせず、そしてリードスルーを示さないことが好ましい。これらのパラメーターを測定すれば、遺伝毒性の可能性が示唆されるが、但しヒトにおける遺伝毒性をその生涯にわたり予測することができる絶対的且つ正確な保証とはならない。
【００７９】
当業者は、好ましい実施形態の上記説明に対して修正を加えることができるものと認識する。
【００８０】
記載されている実施形態のあらゆる任意選択的で好ましい特性、及び修正、並びに従属項は、本明細書において教示される本発明のあらゆる態様において使用可能である。更に、従属項の個々の特性、並びに記載されている実施形態のあらゆる任意選択的で好ましい特性、及び修正は、互いに組み合わせ可能、及び交換可能である。
【００８１】
本出願は英国特許出願第１７１１０６５．１号に起因して優先権を主張するが、同号における開示、及び添付の要約書における開示は、本明細書において参考として組み込まれている。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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