(57)【要約】  チュウゴクオオサンショウウオ軟骨製剤を開示する。本発明のチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物は、チュウゴクオオサンショウウオから軟骨を取得して、取得した軟骨にプロテアーゼにより加水分解を行うことと、プロテアーゼにより加水分解した後の上澄みを得て、それを乾燥させることを含む方法によって得られる。本発明のチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物及びそのアルコール可溶性成分は、軟骨ポリペプチドを含み、尿酸を低下させる、又は高尿酸血症又は痛風を治療する作用を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
チュウゴクオオサンショウウオコンドロイチン硫酸、及び軟骨ポリペプチド粗抽出物を含む、チュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物。
【請求項２】
前記チュウゴクオオサンショウウオコンドロイチン硫酸は、非硫酸化二糖（ＣＳ−Ｏ）、Ｃ６位硫酸化二糖（ＣＳ−Ｃ）、及びＣ４位硫酸化二糖（ＣＳ−Ａ）を含有する、請求項１に記載のチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物。
【請求項３】
前記チュウゴクオオサンショウウオコンドロイチン硫酸は、非硫酸化二糖（ＣＳ−Ｏ）、Ｃ６位硫酸化二糖（ＣＳ−Ｃ）、及びＣ４位硫酸化二糖（ＣＳ−Ａ）からなる、請求項１又は２に記載のチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物。
【請求項４】
前記チュウゴクオオサンショウウオコンドロイチン硫酸の重量平均分子量（Ｍｗ）が、４０ｋＤａ以上、好ましくは４５ｋＤａ以上、より好ましくは４８ｋＤａ以上、最も好ましくは４９．２ｋＤａである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物。
【請求項５】
前記軟骨ポリペプチド粗抽出物は、ＴＧＰＬＧＰＳＰＧＰ、ＨＤＬＰＬＰＬＰＥ、ＤＮＬＰＰＬＰＫ及びＶＰＳＧＰＬＧＰＥＧＰＲのうちの１種類又は複数種類を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物。
【請求項６】
前記チュウゴクオオサンショウウオコンドロイチン硫酸は、チュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物の全量の１５質量％〜３０質量％を占め、前記軟骨ポリペプチド粗抽出物は、チュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物の全量の７０質量％〜８５質量％を占める、請求項１〜５のいずれか１項に記載のチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物。
【請求項７】
チュウゴクオオサンショウウオから軟骨を取得することと、
取得した軟骨にプロテアーゼにより加水分解を行うことと、
プロテアーゼにより加水分解した後の上澄みを得て、それを乾燥させることと、を含む方法によって得られる、請求項１〜６のいずれか１項に記載のチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物。
【請求項８】
軟骨ポリペプチド粗抽出物であり、且つＴＧＰＬＧＰＳＰＧＰ、ＨＤＬＰＬＰＬＰＥ、ＤＮＬＰＰＬＰＫ及びＶＰＳＧＰＬＧＰＥＧＰＲのうちの１種類又は複数種類を含む、チュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物のアルコール可溶性成分。
【請求項９】
チュウゴクオオサンショウウオから軟骨を取得することと、
取得した軟骨にプロテアーゼにより加水分解を行うことと、
プロテアーゼにより加水分解した後の上澄みを得て、それを乾燥させることと、
プロテアーゼにより加水分解した後の上澄み又はその乾燥物をアルコール沈殿することと、
上澄みを得ることと、を含む方法によって得られる、請求項８に記載のアルコール可溶性成分。
【請求項１０】
尿酸低下活性を有する、請求項８又は９に記載のアルコール可溶性成分。
【請求項１１】
ＴＧＰＬＧＰＳＰＧＰ、ＨＤＬＰＬＰＬＰＥ、ＤＮＬＰＰＬＰＫ及びＶＰＳＧＰＬＧＰＥＧＰＲのうちの１種類又は複数種類である、ことを特徴とする軟骨ポリペプチド。
【請求項１２】
ＸＯＤ酵素阻害活性を有する、請求項１１に記載の軟骨ポリペプチド。
【請求項１３】
尿酸低下活性を有する、請求項１１に記載の軟骨ポリペプチド。
【請求項１４】
非硫酸化二糖（ＣＳ−Ｏ）、Ｃ６位硫酸化二糖（ＣＳ−Ｃ）、及びＣ４位硫酸化二糖（ＣＳ−Ａ）を含有するチュウゴクオオサンショウウオコンドロイチン硫酸を含む、チュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物のアルコール沈殿成分。
【請求項１５】
前記チュウゴクオオサンショウウオコンドロイチン硫酸は、非硫酸化二糖（ＣＳ−Ｏ）、Ｃ６位硫酸化二糖（ＣＳ−Ｃ）、及びＣ４位硫酸化二糖（ＣＳ−Ａ）からなる、請求項１４に記載のチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物のアルコール沈殿成分。
【請求項１６】
前記チュウゴクオオサンショウウオコンドロイチン硫酸の重量平均分子量（Ｍｗ）が、４０ｋＤａ以上、好ましくは４５ｋＤａ以上、より好ましくは４８ｋＤａ以上、最も好ましくは４９．２ｋＤａである、請求項１４又は１５に記載のチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物のアルコール沈殿成分。
【請求項１７】
チュウゴクオオサンショウウオから軟骨を取得することと、
取得した軟骨にプロテアーゼにより加水分解を行うことと、
プロテアーゼにより加水分解した後の上澄みを得て、それを乾燥させることと、
プロテアーゼにより加水分解した後の上澄み又はその乾燥物をアルコール沈殿することと、
沈殿画分を得ることと、を含む方法によって得られる、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載のチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物のアルコール沈殿成分。
【請求項１８】
尿酸を低下させる、又は高尿酸血症又は痛風を治療する医薬品を調製するための、請求項１〜７のいずれか１項に記載のチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物、請求項８〜１０のいずれか１項に記載のチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物のアルコール可溶性成分、又は請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の軟骨ポリペプチドの使用。
【請求項１９】
尿酸低減、又は高尿酸血症又は痛風の治療のための、請求項１〜７のいずれか１項に記載のチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物、請求項８〜１０のいずれか１項に記載のチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物のアルコール可溶性成分、又は請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の軟骨ポリペプチドの使用。
【請求項２０】
チュウゴクオオサンショウウオから軟骨を取得することと、
取得した軟骨にプロテアーゼにより加水分解を行うことと、
プロテアーゼにより加水分解した後の上澄みを得て、それを乾燥させることと、を含むチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物を取得する方法。
【請求項２１】
前記プロテアーゼはアルカリプロテアーゼであり、ｐＨ  ９〜１１の条件下でプロテアーゼにより加水分解を行う、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
チュウゴクオオサンショウウオから軟骨を取得することと、
取得した軟骨にプロテアーゼにより加水分解を行うことと、
プロテアーゼにより加水分解した後の上澄みを得て、それを乾燥させることと、
プロテアーゼにより加水分解した後の上澄み又はその乾燥物をアルコール沈殿することと、
上澄みを得ることと、を含むチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物のアルコール可溶性成分を取得する方法。
【請求項２３】
前記プロテアーゼはアルカリプロテアーゼであり、ｐＨ  ９〜１１の条件下でプロテアーゼにより加水分解を行う、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
チュウゴクオオサンショウウオから軟骨を取得することと、
取得した軟骨にプロテアーゼにより加水分解を行うことと、
プロテアーゼにより加水分解した後の上澄みを得て、それを乾燥させることと、
プロテアーゼにより加水分解した後の上澄み又はその乾燥物をアルコール沈殿することと、
沈殿画分を取得することと、を含むチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物のアルコール沈殿成分を取得する方法。
【請求項２５】
前記プロテアーゼはアルカリプロテアーゼであり、ｐＨ  ９〜１１の条件下でプロテアーゼにより加水分解を行う、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記アルカリプロテアーゼは２７０９プロテアーゼである、請求項２１、２３又は２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
アルコール沈殿の操作では、エタノールの質量濃度が５０％−９０％である、請求項２２〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
アルコール沈殿の操作では、エタノールの質量濃度が７０％である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物、請求項８〜１０のいずれか１項に記載のチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物のアルコール可溶性成分、又は請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の軟骨ポリペプチドを、それを必要とする被験者に投与することを含む、尿酸を低下させる、又は高尿酸血症又は痛風を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チュウゴクオオサンショウウオ軟骨製剤及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
軟骨には、糖タンパク質、ポリペプチド、低分子タンパク質、多糖が豊富に含まれており、研究によれば、特定の動物由来の軟骨抽出物には、優れた抗腫瘍、抗血管新生、免疫調節、抗関節炎などの活性がある。その中でも、サメ軟骨製剤（Ｓｈａｒｋ  ＣａｒｔｉｌａｇｅＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎ、ＳＣＰ）は、関連研究が特に多く、栄養補助食品として世界中非常に人気がある。しかし、サメ軟骨市場の発展に伴い、サメの漁獲量が増加し、最近数十年で自然界のサメの個体数が急激に減少し、いくつかの種類のサメが絶滅危惧種になっている。したがって、サメ軟骨の使用は持続不可能である。
現在市販されている軟骨製剤は、主にサメの軟骨に由来するものである。サメ軟骨市場の発展に伴い、サメの漁獲量が増加し、最近数十年で自然界のサメの個体数が激減し、いくつかの種類のサメが絶滅危惧種になっている。したがって、サメ軟骨の使用は持続不可能である。
【発明の概要】
【０００３】
中国固有の希少動物であるチュウゴクチュウゴクオオサンショウウオ（Ａｎｄｒｉａｓ  ｄａｖｉｄｉａｎｕｓ）は、食用及び薬用としての価値が高く、開発と利用の潜在力が大きい。野生チュウゴクオオサンショウウオは国の二級保護水生動物であるが、過去２０年でチュウゴクオオサンショウウオの人工飼育及び繁殖技術は徐々に成熟し、チュウゴクオオサンショウウオ産業は急速に発展し、陝西省、湖南省、河南省、四川省などの複数の省や地域では、大規模なチュウゴクオオサンショウウオ養殖産業と市場が形成されており、それは、チュウゴクオオサンショウウオ軟骨を使用して医薬品及びヘルスケアの価値を有する製品を抽出するために持続可能な生物学的資源を提供し、また、チュウゴクオオサンショウウオ軟骨製剤の開発は、チュウゴクオオサンショウウオ産業の高価値化への発展にも寄与する。
【０００４】
具体的には、本発明は以下に関する。
１．チュウゴクオオサンショウウオコンドロイチン硫酸、及び軟骨ポリペプチド粗抽出物を含むチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物。
２．前記チュウゴクオオサンショウウオコンドロイチン硫酸は非硫酸化二糖（ＣＳ−Ｏ）、Ｃ６位硫酸化二糖（ＣＳ−Ｃ）、及びＣ４位硫酸化二糖（ＣＳ−Ａ）を含有する項１に記載のチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物。
３．前記チュウゴクオオサンショウウオコンドロイチン硫酸は非硫酸化二糖（ＣＳ−Ｏ）、Ｃ６位硫酸化二糖（ＣＳ−Ｃ）、及びＣ４位硫酸化二糖（ＣＳ−Ａ）からなる項１又は２に記載のチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物。
４．前記チュウゴクオオサンショウウオコンドロイチン硫酸の重量平均分子量（Ｍｗ）が、４０ｋＤａ以上、好ましくは４５ｋＤａ以上、より好ましくは４８ｋＤａ以上、最も好ましくは４９．２ｋＤａである項１〜３のいずれか１項に記載のチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物。
５．前記軟骨ポリペプチド粗抽出物はＴＧＰＬＧＰＳＰＧＰ、ＨＤＬＰＬＰＬＰＥ、ＤＮＬＰＰＬＰＫ及びＶＰＳＧＰＬＧＰＥＧＰＲのうちの１種類又は複数種類を含む項１〜４のいずれか１項に記載のチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物。
６．前記チュウゴクオオサンショウウオコンドロイチン硫酸は、チュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物の全量の１５質量％〜３０質量％を占め、前記軟骨ポリペプチド粗抽出物は、チュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物の全量の７０質量％〜８５質量％を占める項１〜５のいずれか１項に記載のチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物。
７．チュウゴクオオサンショウウオから軟骨を取得することと、
取得した軟骨にプロテアーゼにより加水分解を行うことと、
プロテアーゼにより加水分解した後の上澄みを得て、それを乾燥させることと、を含む方法によって得られる項１〜６のいずれか１項に記載のチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物。
８．軟骨ポリペプチド粗抽出物であり、且つＴＧＰＬＧＰＳＰＧＰ、ＨＤＬＰＬＰＬＰＥ、ＤＮＬＰＰＬＰＫ及びＶＰＳＧＰＬＧＰＥＧＰＲのうちの１種類又は複数種類を含むチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物のアルコール可溶性成分。
９．チュウゴクオオサンショウウオから軟骨を取得することと、
取得した軟骨にプロテアーゼにより加水分解を行うことと、
プロテアーゼにより加水分解した後の上澄みを得て、それを乾燥させることと、
プロテアーゼにより加水分解した後の上澄み又はその乾燥物をアルコール沈殿することと、
上澄みを得ることと、を含む方法によって得られる項８に記載のアルコール可溶性成分。
１０．尿酸低下活性を有する項８又は９に記載のアルコール可溶性成分。
１１．ＴＧＰＬＧＰＳＰＧＰ、ＨＤＬＰＬＰＬＰＥ、ＤＮＬＰＰＬＰＫ及びＶＰＳＧＰＬＧＰＥＧＰＲのうちの１種類又は複数種類である、ことを特徴とする軟骨ポリペプチド。
１２．ＸＯＤ酵素阻害活性を有する項１１に記載の軟骨ポリペプチド。
１３．尿酸低下活性を有する項１１に記載の軟骨ポリペプチド。
１４．非硫酸化二糖（ＣＳ−Ｏ）、Ｃ６位硫酸化二糖（ＣＳ−Ｃ）、及びＣ４位硫酸化二糖（ＣＳ−Ａ）を含有するチュウゴクオオサンショウウオコンドロイチン硫酸を含むチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物のアルコール沈殿成分。
１５．前記チュウゴクオオサンショウウオコンドロイチン硫酸は非硫酸化二糖（ＣＳ−Ｏ）、Ｃ６位硫酸化二糖（ＣＳ−Ｃ）、及びＣ４位硫酸化二糖（ＣＳ−Ａ）からなる項１４に記載のチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物のアルコール沈殿成分。
１６．前記チュウゴクオオサンショウウオコンドロイチン硫酸の重量平均分子量（Ｍｗ）が、４０ｋＤａ以上、好ましくは４５ｋＤａ以上、より好ましくは４８ｋＤａ以上、最も好ましくは４９．２ｋＤａである項１４又は１５に記載のチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物のアルコール沈殿成分。
１７．チュウゴクオオサンショウウオから軟骨を取得することと、
取得した軟骨にプロテアーゼにより加水分解を行うことと、
プロテアーゼにより加水分解した後の上澄みを得て、それを乾燥させることと、
プロテアーゼにより加水分解した後の上澄み又はその乾燥物をアルコール沈殿することと、
沈殿画分を得ることと、を含む方法によって得られる項１４〜１６のいずれか１項に記載のチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物のアルコール沈殿成分。
１８．尿酸を低下させる、又は高尿酸血症又は痛風を治療する医薬品を調製するための、項１〜７のいずれか１項に記載のチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物、項８〜１０のいずれか１項に記載のチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物のアルコール可溶性成分、又は項１１〜１３のいずれか１項に記載の軟骨ポリペプチドの使用。
１９．尿酸低減、又は高尿酸血症又は痛風の治療のための、項１〜７のいずれか１項に記載のチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物、項８〜１０のいずれか１項に記載のチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物のアルコール可溶性成分、又は項１１〜１３のいずれか１項に記載の軟骨ポリペプチドの使用。
２０．チュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物の取得方法であって、
チュウゴクオオサンショウウオから軟骨を取得することと、
取得した軟骨にプロテアーゼにより加水分解を行うことと、
プロテアーゼにより加水分解した後の上澄みを得て、それを乾燥させることと、を含む取得方法。
２１．前記プロテアーゼはアルカリプロテアーゼであり、ｐＨ  ９〜１１の条件下でプロテアーゼ加水分解を行う項２０に記載の方法。
２２．チュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物のアルコール可溶性成分の取得方法であって、
チュウゴクオオサンショウウオから軟骨を取得することと、
取得した軟骨にプロテアーゼにより加水分解を行うことと、
プロテアーゼにより加水分解した後の上澄みを得て、それを乾燥させることと、
プロテアーゼにより加水分解した後の上澄み又はその乾燥物をアルコール沈殿することと、
上澄みを得ることと、を含む取得方法。
２３．前記プロテアーゼはアルカリプロテアーゼであり、ｐＨ  ９〜１１の条件下でプロテアーゼにより加水分解を行う項２２に記載の方法。
２４．チュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物のアルコール沈殿成分の取得方法であって、
チュウゴクオオサンショウウオから軟骨を取得することと、
取得した軟骨にプロテアーゼにより加水分解を行うことと、
プロテアーゼにより加水分解した後の上澄みを得て、それを乾燥させることと、
プロテアーゼにより加水分解した後の上澄み又はその乾燥物をアルコール沈殿することと、
沈殿画分を取得することと、を含む取得方法。
２５．前記プロテアーゼはアルカリプロテアーゼであり、ｐＨ  ９〜１１の条件下でプロテアーゼにより加水分解を行う項２４に記載の方法。
２６．前記アルカリプロテアーゼは２７０９プロテアーゼである項２１、２３又は２５のいずれか１項に記載の方法。
２７．アルコール沈殿の操作では、エタノールの質量濃度が５０％−９０％である項２２〜２６のいずれか１項に記載の方法。
２８．アルコール沈殿の操作では、エタノールの質量濃度が７０％である項２７に記載の方法。
２９．尿酸を低下させる、又は高尿酸血症又は痛風を治療する方法であって、
項１〜７のいずれか１項に記載のチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物、項８〜１０のいずれか１項に記載のチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物のアルコール可溶性成分、又は項１１〜１３のいずれか１項に記載の軟骨ポリペプチドを、それを必要とする被験者に投与することを含む方法。
【発明の効果】
【０００５】
本発明に係るチュウゴクオオサンショウウオ軟骨製剤は、チュウゴクオオサンショウウオ軟骨のプロテアーゼによる加水分解などの方法により得られるポリペプチド系物質又はチュウゴクオオサンショウウオコンドロイチン硫酸とポリペプチドの組成物であり、抗腫瘍、抗血管新生、抗炎症、抗酸化、免疫力強化、抗骨粗鬆症、抗リウマチ、尿酸低減、抗痛風などの活性を有する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１はＧＳＣＰ成分のセルロースアセテート膜電気泳動（ＨＡ：ヒアルロン酸；ＣＳ：コンドロイチン硫酸；ＨＰ：ヘパリン）を示す。
【図２】図２はＡＤＣＳ、サメコンドロイチン硫酸（ＳＣＳ）及び牛コンドロイチン硫酸（ＢＣＳ）のＨＰＧＰＣスペクトルを示す。
【図３】図３はＳＡＸ−ＨＰＬＣスペクトル及び二糖組成を示す。（ａ）  ＡＤＣＳ；（ｂ）  ＢＣＳ；（ｃ）  ＳＣＳ。
【図４】図４はＡＤＣＳの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図５】図５はトータルイオンクロマトグラムを示す。
【図６】図６はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析結果を示す。
【図７】図７はＸＯＤ酵素活性検出結果を示す。
【図８】図８は高性能高尿酸血症動物モデルを用いた尿酸低減の評価効果を示す。（ａ）血中尿酸含有量；（ｂ）肝臓ＸＯＤ酵素活性。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明に係るチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物は、チュウゴクオオサンショウウオコンドロイチン硫酸、及び軟骨ポリペプチド粗抽出物を含む。
前記チュウゴクオオサンショウウオコンドロイチン硫酸は、チュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物の全量の１５質量％〜３０質量％、好ましくは１８質量％〜２６質量％を占め、前記軟骨ポリペプチド粗抽出物は、チュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物の全量の７０質量％〜８５質量％、好ましくは７４質量％〜８２質量％を占める。
【０００８】
なお、チュウゴクオオサンショウウオコンドロイチン硫酸は、非硫酸化二糖（ＣＳ−Ｏ）、Ｃ６位硫酸化二糖（ＣＳ−Ｃ）、及びＣ４位硫酸化二糖（ＣＳ−Ａ）を含有し、好ましくは非硫酸化二糖（ＣＳ−Ｏ）、Ｃ６位硫酸化二糖（ＣＳ−Ｃ）、及びＣ４位硫酸化二糖（ＣＳ−Ａ）からなる。
【０００９】
本発明に係るチュウゴクオオサンショウウオ軟骨製剤の調製過程は、以下のとおりである。
チュウゴクオオサンショウウオから軟骨を取得する。
プロテアーゼによる加水分解：１種類又は複数種類のプロテアーゼ、たとえば、コラゲナーゼ、アルカリプロテアーゼ、プロナーゼ、トリプシン又はパパインなど、好ましくはアルカリプロテアーゼを用いて、適切な条件下で、チュウゴクオオサンショウウオ軟骨を加水分解させ、所定時間後、加熱して昇温してプロテアーゼを不活性化させる。
分離：反応させた溶液を静置して沈殿（又は遠心分離、ろ過など）させて、上澄みを得る。
乾燥：自然乾燥（又は凍結乾燥、回転蒸発など）させて上澄み中の水分を除去させると、所望のチュウゴクオオサンショウウオコンドロイチン硫酸と軟骨ポリペプチドの組成物を得て、本発明ではこの組成物をＧＳＣＰと略することもある。
分離ステップで得られた上澄み液又は乾燥ステップで得られた組成物にエタノール又はエタノール溶液を加えてアルコール沈殿（最終溶液中のエタノール含有量が５０％〜９０％である）を行い、上澄みを得て乾燥させ、ポリペプチドを主成分とする所望のアルコール可溶性成分を得て、本発明ではこのアルコール可溶性成分をＧＳＣＰ２ということもある。
さらに分析したところ、アルコール可溶性成分は、尿酸低下活性を有するポリペプチドＴＧＰＬＧＰＳＰＧＰ、ＨＤＬＰＬＰＬＰＥ、ＤＮＬＰＰＬＰＫ及びＶＰＳＧＰＬＧＰＥＧＰＲを含む。アルコール沈殿成分の組成は、チュウゴクオオサンショウウオコンドロイチン硫酸（ＡＤＣＳ）を主とする。
【００１０】
本発明は、
チュウゴクオオサンショウウオから軟骨を取得することと、
取得した軟骨にプロテアーゼにより加水分解を行うことと、
プロテアーゼにより加水分解した後の上澄みを得て、それを乾燥させることと、を含む方法によって得られることを特徴とするチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物に関する。
【００１１】
さらに、本発明は、チュウゴクオオサンショウウオコンドロイチン硫酸、及び軟骨ポリペプチド粗抽出物を含むことを特徴とするチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物に関する。
【００１２】
本発明のプロテアーゼは、好ましくはアルカリプロテアーゼ、さらに好ましくは２７０９プロテアーゼである。
【００１３】
さらに、本発明は、チュウゴクオオサンショウウオコンドロイチン硫酸の重量平均分子量（Ｍｗ）が４９．２ｋＤａであることを特徴とするチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物に関する。
【００１４】
さらに、本発明は、軟骨ポリペプチド粗抽出物がＴＧＰＬＧＰＳＰＧＰ、ＨＤＬＰＬＰＬＰＥ、ＤＮＬＰＰＬＰＫ及びＶＰＳＧＰＬＧＰＥＧＰＲのうちの１種類又は複数種類を含むことを特徴とするチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物に関する。
【００１５】
本発明は、
チュウゴクオオサンショウウオから軟骨を取得することと、
取得した軟骨にプロテアーゼにより加水分解を行うことと、
プロテアーゼにより加水分解した後の上澄みを得て、それを乾燥させることと、を含むことを特徴とするチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物の調製方法に関する。
【００１６】
本発明は、
チュウゴクオオサンショウウオから軟骨を取得することと、
取得した軟骨にプロテアーゼにより加水分解を行うことと、
プロテアーゼにより加水分解した後の上澄みを得て、それを乾燥させることと、
プロテアーゼにより加水分解した後の上澄み又はその乾燥物をアルコール沈殿することと、
上澄みを得ることと、を含む方法によって得られることを特徴とするチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物のアルコール可溶性成分に関する。
【００１７】
さらに、本発明は、軟骨ポリペプチド粗抽出物であることを特徴とするチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物のアルコール可溶性成分に関する。
【００１８】
さらに、本発明は、ＴＧＰＬＧＰＳＰＧＰ、ＨＤＬＰＬＰＬＰＥ、ＤＮＬＰＰＬＰＫ及びＶＰＳＧＰＬＧＰＥＧＰＲのうちの１種類又は複数種類を含むことを特徴とするチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物のアルコール可溶性成分に関する。
【００１９】
本発明は、
チュウゴクオオサンショウウオから軟骨を取得することと、
取得した軟骨にプロテアーゼにより加水分解を行うことと、
プロテアーゼにより加水分解した後の上澄みを得て、それを乾燥させることと、
プロテアーゼにより加水分解した後の上澄み又はその乾燥物をアルコール沈殿することと、
上澄みを得ることと、を含む、ことを特徴とするチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物のアルコール可溶性成分の調製方法に関する。
【００２０】
本発明は、ＴＧＰＬＧＰＳＰＧＰ、ＨＤＬＰＬＰＬＰＥ、ＤＮＬＰＰＬＰＫ及びＶＰＳＧＰＬＧＰＥＧＰＲのうちの１種類又は複数種類であることを特徴とする軟骨ポリペプチドに関する。
【００２１】
即ち、本発明の軟骨ポリペプチドは、ＴＧＰＬＧＰＳＰＧＰ、ＨＤＬＰＬＰＬＰＥ、ＤＮＬＰＰＬＰＫ、ＶＰＳＧＰＬＧＰＥＧＰＲ、及びこれらの任意の混合物、たとえば、ＴＧＰＬＧＰＳＰＧＰとＨＤＬＰＬＰＬＰＥの混合物、ＴＧＰＬＧＰＳＰＧＰとＤＮＬＰＰＬＰＫの混合物、ＴＧＰＬＧＰＳＰＧＰとＶＰＳＧＰＬＧＰＥＧＰＲの混合物、ＨＤＬＰＬＰＬＰＥとＤＮＬＰＰＬＰＫの混合物、ＨＤＬＰＬＰＬＰＥとＶＰＳＧＰＬＧＰＥＧＰＲの混合物、ＤＮＬＰＰＬＰＫとＶＰＳＧＰＬＧＰＥＧＰＲの混合物、ＴＧＰＬＧＰＳＰＧＰ、ＨＤＬＰＬＰＬＰＥ及びＤＮＬＰＰＬＰＫの混合物、ＨＤＬＰＬＰＬＰＥ、ＤＮＬＰＰＬＰＫ及びＶＰＳＧＰＬＧＰＥＧＰＲの混合物、ＴＧＰＬＧＰＳＰＧＰ、ＨＤＬＰＬＰＬＰＥ及びＶＰＳＧＰＬＧＰＥＧＰＲの混合物、ＨＤＬＰＬＰＬＰＥ、ＤＮＬＰＰＬＰＫ及びＶＰＳＧＰＬＧＰＥＧＰＲの混合物、ＴＧＰＬＧＰＳＰＧＰ、ＨＤＬＰＬＰＬＰＥ、ＤＮＬＰＰＬＰＫ及びＶＰＳＧＰＬＧＰＥＧＰＲの混合物であってもよい。
【００２２】
さらに、本発明は、ＸＯＤ酵素阻害活性を有することを特徴とする軟骨ポリペプチドに関する。
【００２３】
さらに、本発明は、尿酸低下活性を有することを特徴とする軟骨ポリペプチドに関する。
【００２４】
本発明は、
チュウゴクオオサンショウウオから軟骨を取得することと、
取得した軟骨にプロテアーゼにより加水分解を行うことと、
プロテアーゼにより加水分解した後の上澄みを得て、それを乾燥させることと、
プロテアーゼにより加水分解した後の上澄み又はその乾燥物をアルコール沈殿することと、
沈殿画分を得ることと、を含む方法によって得られる、ことを特徴とするチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物のアルコール沈殿成分に関する。
【００２５】
さらに、本発明は、チュウゴクオオサンショウウオコンドロイチン硫酸を含むことを特徴とするチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物のアルコール沈殿成分に関する。
【００２６】
さらに、本発明は、チュウゴクオオサンショウウオコンドロイチン硫酸の重量平均分子量（Ｍｗ）が４９．２ｋＤａであることを特徴とするチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物のアルコール沈殿成分に関する。
【００２７】
本発明は、
チュウゴクオオサンショウウオから軟骨を取得することと、
取得した軟骨にプロテアーゼにより加水分解を行うことと、
プロテアーゼにより加水分解した後の上澄みを得て、それを乾燥させることと、
プロテアーゼにより加水分解した後の上澄み又はその乾燥物をアルコール沈殿することと、
沈殿画分を得ることと、を含む、ことを特徴とするチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物のアルコール沈殿成分の調製方法に関する。
【００２８】
本発明に係るチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物又はチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物のアルコール可溶性成分又は軟骨ポリペプチド、たとえばＴＧＰＬＧＰＳＰＧＰ、ＨＤＬＰＬＰＬＰＥ、ＤＮＬＰＰＬＰＫ又はＶＰＳＧＰＬＧＰＥＧＰＲは、ＸＯＤ酵素阻害活性を有する。
【００２９】
さらに、本発明は、尿酸を低下させる、又は高尿酸血症を治療する医薬品の調製における、チュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物の使用に関する。
【００３０】
さらに、本発明は、尿酸低減又は高尿酸血症の治療における、チュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物の使用に関する。
【００３１】
さらに、本発明は、痛風を治療する医薬品の調製における、チュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物の使用に関する。
【００３２】
さらに、本発明は、痛風治療におけるチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物の使用に関する。
【００３３】
さらに、本発明は、尿酸を低下させる、又は高尿酸血症を治療する医薬品の調製における、チュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物のアルコール可溶性成分の使用に関する。
【００３４】
さらに、本発明は、尿酸低減又は高尿酸血症治療における、チュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物のアルコール可溶性成分の使用に関する。
【００３５】
さらに、本発明は、痛風を治療する医薬品の調製における、チュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物のアルコール可溶性成分の使用に関する。
【００３６】
さらに、本発明は、痛風治療におけるチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物のアルコール可溶性成分の使用に関する。
【００３７】
さらに、本発明は、尿酸を低下させる、又は高尿酸血症を治療する医薬品の調製における、軟骨ポリペプチド、たとえばＴＧＰＬＧＰＳＰＧＰ、ＨＤＬＰＬＰＬＰＥ、ＤＮＬＰＰＬＰＫ又はＶＰＳＧＰＬＧＰＥＧＰＲの使用に関する。
【００３８】
さらに、本発明は、尿酸低減又は高尿酸血症治療における、軟骨ポリペプチド、たとえばＴＧＰＬＧＰＳＰＧＰ、ＨＤＬＰＬＰＬＰＥ、ＤＮＬＰＰＬＰＫ又はＶＰＳＧＰＬＧＰＥＧＰＲの使用に関する。
【００３９】
さらに、本発明は、痛風を治療する医薬品の調製における、軟骨ポリペプチド、たとえばＴＧＰＬＧＰＳＰＧＰ、ＨＤＬＰＬＰＬＰＥ、ＤＮＬＰＰＬＰＫ又はＶＰＳＧＰＬＧＰＥＧＰＲの使用に関する。
【００４０】
さらに、本発明は、治療痛風における、軟骨ポリペプチド、たとえばＴＧＰＬＧＰＳＰＧＰ、ＨＤＬＰＬＰＬＰＥ、ＤＮＬＰＰＬＰＫ又はＶＰＳＧＰＬＧＰＥＧＰＲの使用に関する。
【００４１】
したがって、本発明のチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物及びそのアルコール可溶性成分は、尿酸を低下させる、又は高尿酸血症又は痛風を治療する作用を有する軟骨ポリペプチドを含む。
実施例
【００４２】
実施例１  チュウゴクオオサンショウウオ軟骨製剤の調製
切断された軟骨付きのチュウゴクオオサンショウウオ肉を浄水に入れて、加熱して１ｈ沸騰させ、チュウゴクオオサンショウウオ軟骨２０ｇを分離し、軟骨を５００ｍｌビーカーに入れて、水２００ｍｌ、２７０９プロテアーゼ（北京東華強盛生物公司製、バチルス・リケニフォルミス由来）２ｇを加え、ｐＨ９．５、５０℃で８ｈ加水分解し、９０℃で１０分間加熱して、プロテアーゼを不活性化させ、１００００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離して上澄みを取り、４８ｈ真空凍結乾燥して、固体粉末１０．６ｇとして、チュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物（即ちＧＳＣＰ）を得た。チュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物５ｇを、７５％エタノール２０ｍｌに加えて十分に混合し、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離して上澄みを取り、６０℃オーブンに入れて６ｈかけてアルコールを除去した後、４８ｈ凍結乾燥させ、アルコール可溶性成分３．５ｇ（即ちＧＳＣＰ２）を得た。沈殿画分を乾燥させて、チュウゴクオオサンショウウオコンドロイチン硫酸１．２ｇ（即ちＡＤＣＳ）を得た。アルコール沈殿画分は、質量分率として２５．５％、アルコール可溶性画分は質量分率として７４．５％を占めた。
【００４３】
実施例２  チュウゴクオオサンショウウオ軟骨製剤の調製
軟骨を調製するためのチュウゴクオオサンショウウオ（３．２ｋｇ）を分離して、きれいに洗浄して、湿重量１００ｇのチュウゴクオオサンショウウオ軟骨を得て、軟骨を小さく切ってホモジナイザーを用いてホモジネートし、ホモジネートした軟骨を２％の酢酸ナトリウムを含有する溶液５００ｍＬに懸濁させ、１ＭのＮａＯＨでｐＨを１０．０±０．５の範囲に調整し、次に、２７０９アルカリプロテアーゼ６ｇを加えて加熱しながら撹拌し、３０ｍｉｎおきに１ＭのＮａＯＨを用いてｐＨを１０．０±０．５の範囲に調整し、軟骨組織が完全に消化されるまで、約６ｈかけて５０℃で反応させ、次に、反応液を１００℃に加熱して１０ｍｉｎ保温してプロテアーゼを不活性化させた。反応液を室温に冷却した後、５，０００×ｇで１５ｍｉｎ遠心分離して上澄みを得て、チュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物（ＧＳＣＰ）溶液を得た。上澄みにその体積に対して３倍の無水エタノールを加えて、４℃で一晩静置し、５,０００×ｇで１５ｍｉｎ遠心分離して沈殿を収集し、沈殿を脱イオン水１００ｍＬに溶解した後、アルコール沈殿の操作を繰り返して沈殿を得て、その後、沈殿を脱イオン水１００ｍＬに溶解して、カットオフ分子量７ｋＤａの透析バッグを使用して２４ｈ透析し、その後、凍結乾燥させて精製済みのチュウゴクオオサンショウウオコンドロイチン硫酸４．４ｇを得た。２回のアルコール沈殿の操作による上澄み液を収集して、回転蒸発して濃縮させた後、凍結乾燥させてチュウゴクオオサンショウウオ軟骨ポリペプチドを主な組成としたアルコール可溶性成分１９．０ｇを得た。アルコール沈殿画分は質量分率として１８．８％、アルコール可溶性画分は質量分率として８１．２％を占めた。
【００４４】
実施例３  セルロースアセテート膜電気泳動による実施例１で得られたＧＳＣＰ成分のグリコサミノグリカンの組成の分析
セルロースアセテート薄膜（７ｃｍ＊９ｃｍ）を電極バッファー（０．１ｍｏｌ／Ｌピリジン、０．４７ｍｏｌ／Ｌギ酸、ｐＨ３．０）にて十分に３０分間浸透し、取り出して余分なバッファーを吸い捨てて、ピペットを用いてセルロースアセテート薄膜の一端に試料を加え（１０ｍｇ／ｍｌ  ＧＳＣＰ）、２ｍｇ／ｍｌヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリンのサンプルを対照として、ＤＹＣＰ−３８Ｃ型横型電気泳動装置において定電流６ｍＡで３０分間電気泳動し、染色液（０．５％アルシアンブルー、２％酢酸）にて３０分間染色し、次に、リンス液（２％酢酸）で、１回に２０分間、３〜５回繰り返してリンスし、リンスしたセルロースアセテート薄膜を可視光で観察し、結果を図１に示した。図１は、ＧＳＣＰサンプルにコンドロイチン硫酸が多く含まれていることを示す。
【００４５】
実施例４  チュウゴクオオサンショウウオコンドロイチン硫酸のキャラクタリゼーション
前記と同様に、湿重量３．２ｋｇの飼育チュウゴクオオサンショウウオから湿重量１００ｇの軟骨を分離し、その乾湿比（Ｗ／Ｄ、５．３４）で、ＣＳ抽出により乾重量１８．７ｇの軟骨を得た。抽出、分離、精製して凍結乾燥させ、実験にＡＤＣＳサンプル４．４ｇを得た。ＨＰＧＰＣ、ＳＡＸ−ＨＰＬＣによりＡＤＣＳ及び市販品として入手したＢＣＳ、ＳＣＳの純度、分子量分布、二糖組成、電荷密度を分析し、結果を表１に示した。ＡＤＣＳの純度は９８．７％であり、チュウゴクオオサンショウウオ軟骨から抽出されたＡＤＣＳの収率は２３．２％（乾重量／乾重量）であった。
【００４６】
【表１】
2020531627.tif 000002
【００４７】
ＨＰＧＰＣによりＣＳの分子量分布を分析したところ、図２に示されるクロマトグラムのように、３種類のＣＳサンプルは、分散係数がすべて１．５よりも小さく、分子量分布が集中している。ＡＤＣＳの重量平均分子量（Ｍｗ）は、４９．２ｋＤａであり、水生動物であるサメ由来のＳＣＳの７５．８ｋＤａよりも低く、陸生動物である牛由来のＢＣＳの３４．４ｋＤａよりも高かった。
【００４８】
ＣｈｏｎＡＢＣで完全に分解した後、ＳＡＸ−ＨＰＬＣによってＣＳの二糖組成を分析し、結果を図３に示した。ＡＤＣＳには、１４．６％の非硫酸化二糖ＣＳ−Ｏ、６０．９％のＣ６位硫酸化二糖ＣＳ−Ｃ、及び２４．５％のＣ４位硫酸化二糖ＣＳ−Ａが含まれているが、二重硫酸化二糖ＣＳ−Ｄが含まなかった。さらに、表１から明らかなように、ＡＤＣＳの二糖組成は、ＢＣＳ、ＳＣＳとは明らかな差異があった。サメ由来のＣＳは、ＣＳ−Ｃの含有量が高いため、通常、ＳＣＳをＣＳＣと呼び、実験結果から明らかなように、ＡＤＣＳ中のＣＳ−Ｃの含有量は６０％以上と高く、サメ由来のＳＣＳよりも高かった。さらに、ＡＤＣＳでは、非硫酸化二糖単位ＣＳ−Ｏの含有量もＢＣＳ及びＳＣＳ中のＣＳ−Ｏの含有量よりも高く、且つ、ＳＣＳに比べて、ＡＤＣＳには、二重硫酸化二糖単位が含まれておらず、このため、ＡＤＣＳの電荷密度（０．８５）もＢＣＳ（０．９５）及びＳＣＳ（１．１７）よりも低かった。さらに、同様に両生動物の軟骨から抽出されたＣＳ、ＡＤＣＳの二糖組成も従来の文献(Ｍａｔｈｅｗｓ  Ｍ  Ｂ，  Ｈｉｎｄｓ  Ｌ  Ｄ．  Ａｃｉｄ  ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ｏｆ  ｆｒｏｇ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｉｎ  ｔｈｙｒｏｘｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｅｔａｍｏｒｐｈｏｓｉｓ［Ｊ］．  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  Ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，  １９６３，  ７４（２）：  １９８)により報告されたカエル由来のＣＳ（４０％  ＣＳ−Ｏ、４０％  ＣＳ−Ａ、２０％  ＣＳ−Ｃ）とは明らかな差異があった。
【００４９】
ＡＤＣＳの１Ｈ−ＮＭＲスペクトル分析結果を図４に示した。ＣＳ核磁気分析の文献報告(Ｍｕｃｃｉ  Ａ，  Ｓｃｈｅｎｅｔｔｉ  Ｌ，  Ｖｏｌｐｉ  Ｎ．  Ｈａｎｄ  １３  Ｃ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｏｆ  ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅｓ  ｏｆ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｏｒｉｇｉｎ［Ｊ］．  ２０００，  ４１：  ３７−４５)と組み合わせて核磁気気共鳴スペクトルを分析したところ、１．９−２．１ｐｐｍでの１組の重なり合うピークが、未硫酸化及び硫酸化のＧａｌＮＡｃ構造メチル中のＨ原子の信号ピークに帰属し、４．１８ｐｐｍ及び４．７０ｐｐｍでの信号ピークが、それぞれＣＳ−Ｃ中のＧａｌＮＡｃ６ＳのＣ６位Ｈ原子及びＣＳ−Ａ中のＧａｌＮＡｃ４ＳのＣ４位のＨ原子に帰属し、４．４６ｐｐｍでの信号ピークが、ＧｌｃＵＡ及びＧａｌＮＡｃ中のＣ１位のＨ原子に帰属し、３．３２ｐｐｍ、３．５４ｐｐｍ及び３．６９ｐｐｍでの信号ピークが、それぞれＧｌｃＵＡのＣ２、Ｃ３及びＣ４／Ｃ５位のＨ原子に帰属した。
【００５０】
分析した結果、チュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物に対してアルコール沈殿の操作及び透析精製を行って、純度９８％以上のＡＤＣＳを得た。ＨＰＧＰＣで分析したところ、ＡＤＣＳの分子量が４９．２ｋＤａであった。ＣｈｏｎＡＢＣ酵素で完全に分解した後、ＳＡＸ−ＨＰＬＣにより分析した結果、ＡＤＣＳ二糖の組成は、１４．６％  ＣＳ−Ｏ、６０．９％  ＣＳ−Ｃ及び２４．５％  ＣＳ−Ａであり、牛由来のＢＣＳ及びサメ由来のＳＣＳとは明らかな差異があった。
【００５１】
実施例５  チュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物ＧＳＣＰ及びアルコール可溶性成分ＧＳＣＰ２のアミノ酸組成、ポリペプチド分子量分布、タンパク質シーケンシング
分析１：ＧＳＣＰのアミノ酸組成の分析は、北京農業生物検測センターに依頼した。
【００５２】
一、試料情報
試料タイプ：生物試料
保管条件：−２０℃
試料の数：７個
検出内容：５０種類の加水分解アミノ酸含有量の検出
【００５３】
二、器械及び試薬の情報
使用される技術：質量分析−同位体内部標準
使用器械：液体クロマトグラフィー−四重極イオントラップ型タンデム質量分析計ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ  Ｑ−ＴＲＡＰ
器械型番：ＨＰＬＣ−  ＭＳ／ＭＳ（Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００  −  ＡＰＩ  ３２００  Ｑ  ＴＲＡＰ）
アミノ酸キット：ＡＰＩ  ４５ＡＡキット；メタノール、ヘキサンニトリルはすべてｆｉｓｈｅｒから購入した。
【００５４】
三、試料前処理
酸加水分解処理（固体試料：浸漬−ホモジネート−遠心分離）
（１）試料１００ｕｌに水４００ｕｌ、濃塩酸５００ｕｌを加えて、均一に混合して窒素ガスを導入して保護し、１１０℃でシールして、高温で２１時間消化した。
（２）消化液を取り出して、遠心分離して上澄みを取り、窒素ガス５０ｕｌで吹いて乾燥させ、水１ｍｌを加えて再溶解した。
誘導化処理
（１）再溶解液４０μＬを試験管内に入れて、スルホサリチル酸１０μＬを加え、３０秒ボルテックスさせ、１３２００ｒｐｍで４分間遠心分離した。
（２）上層液体１０μＬを別の試験管に入れた。標識バッファー４０μＬを加えて、ボルテックスさせて均一に混合して、回転遠心を行った。
（３）上層液体１０μＬを別の試験管に入れた。各々のサンプル管に希釈したａＴＲＡＱ試薬５μＬを加えて、ボルテックスさせて均一に混合して、回転遠心を行った。
（４）室温で少なくとも３０分間インキュベートした。サンプル管にヒドロキシルアミン５μＬを加えて、ボルテックスさせて均一に混合して、回転遠心を行った。
（５）それぞれのサンプル管に内部標準物質３２μＬを加えて、ボルテックスさせて均一に混合して、回転遠心を行った。検出時まで保存した。
【００５５】
四、実験パラメータ
（１）液相条件：
クロマトグラフィーカラム：ＭＳＬａｂ  ＨＰ−Ｃ１８（１５０＊４．６ｍｍ  ５ｕｍ）
移動相：Ａ：水＋０．１％ギ酸     Ｂ：アセトニトリル＋０．１％ギ酸
流速：０．８ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：５０℃ 
注入量：３ｕｌ
液相分析勾配：
【表Ａ】
2020531627.tif 000003
（２）質量分析条件：
イオン源：  ＋ＥＳＩエレクトロスプレーイオン源、陽イオンモード
走査方式：ＭＲＭ多重反応モニタリング
ＣＵＲ：２０（カーテンガス）
ＣＡＤ：  Ｍｅｄｉｕｍ（衝突ガス）
ＩＳ：  ＋５５００Ｖ（スプレー電圧）
ＴＥＭ：５００℃（霧化温度）
ＧＳ１：５５  ｐｓｉ（霧化ガス）
ＧＳ２：  ６０  ｐｓｉ（補助ガス）
ＤＰ：  ３５ｖ（デクラスタリング電圧）
ＥＰ：１０  （注入電圧）
ＣＥ：３０  （衝突エネルギー）
ＣＸＰ：５．０  （衝撃室注入電圧）
【００５６】
五、実験データ
（１）トータルイオンクロマトグラム
トータルイオンクロマトグラムは図５に示された。
（２）検出結果は、表２に示された。
【００５７】
【表２】
2020531627.tif 000004
2020531627.tif 000005
2020531627.tif 000006
2020531627.tif 000007
【００５８】
分析２：アルコール可溶性画分ＧＳＣＰ２ポリペプチドの分子量分布、タンパク質のシーケンシング
アルコール可溶性画分は、明らかな尿酸低下活性を有し、ゲルサイズ排除クロマトグラフィー及び逆相分取クロマトグラフィーによりさらに精製されて、ＸＯＤ酵素の活性に対して明らかな阻害作用を有する成分となり、それについてポリペプチド分子量及び配列を分析し、その方法及び結果を以下に示した。
【００５９】
ポリペプチドサンプルの分子量及び配列分析は、清華大学生物医学試験センターに依頼し、分子量の分析には、マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析計ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦ  ４８００Ｐｌｕｓ（米国ＡＢＩ社製）が使用され、ポリペプチド配列の分析には、ＯｒｂｉＴｒａｐ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＬＵＭＯＳ液体クロマトグラフィー質量分析計（米国Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社製）が使用された。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析結果を図６に示した。分析結果から明らかなように、サンプルポリペプチド質量電荷比（ｍ／ｚ）は１００−３０００の範囲であり、且つ、２つのサンプルはすべてｍ／ｚが７３９及び１１６２の位置では強いピークを有した。
【００６０】
高速液体クロマトグラフィー−エレクトロスプレーイオン化／質量分析計（ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ）によってサンプルを分析し、データ非依存性解析（ＤＩＡ）手段を用いてポリペプチドのアミノ酸配列を分析し、得られた４つの主なポリペプチド配列を表３に示し、それぞれＳ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４と命名して人工合成した。
【００６１】
【表３】
2020531627.tif 000008
【００６２】
実施例６  酵素分解抽出物ＧＳＣＰ及びアルコール可溶性成分ＧＳＣＰ２の尿酸低下活性
【００６３】
分析１：
ＸＯＤは、キサンチンの酸化を触媒して尿酸とスーパーオキシドアニオンを生成し、活性酸素の主な由来の１種でありながら、ヌクレオチド代謝の重要な酵素の１つであり、主に哺乳動物の心臓、肺、肝臓などの組織に分布しており、ＸＯＤ酵素活性阻害モデルにより、潜在的な尿酸低減用医薬品をスクリーニングして評価することができた。
試薬：ＸＯＤ酵素（Ｓｉｇｍａ社製、牛乳由来）、ＸＯＤ酵素活性検出キット（南京建成社から購入う）。
【００６４】
キサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）は、キサンチンの酸化を触媒して、生成した尿酸は、２９５ｎｍに特異的吸収を有し、分光光度法により生成物を測定すると、酵素活性をキャラクタリゼーションすることができた。ＸＯＤ酵素活性検出キットの取扱書に従ってＸＯＤ酵素活性検出を行い、結果を図７に示した。図７の結果から明らかなように、ＧＳＣＰは、ＸＯＤ阻害活性を有し、且つ用量依存性を有し、ＧＳＣＰの濃度が４０ｍｇ／ｍｌであるときの阻害活性が最大であり、１／２又は１／５濃度に希釈された後の阻害活性もその分減少した。
【００６５】
また、図７から明らかなように、ＧＳＣＰ中の含有量が高いＡＤＣＳはＸＯＤ阻害活性を有さなかった。このことから、ＸＯＤ阻害酵素活性を有する成分がＧＳＣＰ中のポリペプチド成分、即ちＧＳＣＰ２成分であることが推定された。
【００６６】
阻害剤がない場合のＸＯＤ酵素活性を１００％とし、人工合成した尿酸低下活性を有するペプチド及び陽性医薬品であるアロプリノールのＸＯＤ酵素活性阻害の効果を比較し、結果を表４に示した（表中の濃度は反応系でのサンプルの最終濃度である）。
【００６７】
【表４】
2020531627.tif 000009
【００６８】
ＸＯＤ酵素活性阻害実験によって半数阻害濃度（ＩＣ５０）を算出して比較し、表５に示した。
【００６９】
【表５】
2020531627.tif 000010
【００７０】
合成ポリペプチドＳ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４は、それぞれ３．２ｍｇ／ｍＬ、１１０μｇ／ｍＬ、６０μｇ／ｍＬ、６０μｇ／ｍＬでは、ＸＯＤに対する半数阻害濃度に達した。実験した結果、同様な反応系では、ＧＳＣＰ２は、５．２ｍｇ／ｍＬでは、ＸＯＤに対する半数阻害濃度に達し、さらに、アロプリノールは、０．２６μｇ／ｍＬでは、ＸＯＤに対する半数阻害濃度に達し、濃度３０μｇ／ｍＬであっても、ＸＯＤはまだ約１０％の酵素活性を維持し、一方、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４濃度が半数阻害濃度の３倍である場合、ＸＯＤ酵素活性は完全に阻害され、このことから、人工合成した活性ポリペプチドは、アロプリノールと異なるＸＯＤ酵素活性阻害メカニズムを有することが推定された。
【００７１】
分析２：
急性高尿酸血症マウスモデル：実験では、正常群、モデル群、陽性医薬品群（アロプリノール、百霊威、２ｍｇ／ｍｌ）、ＡＤＣＳ群（２０ｍｇ／ｍｌ）、ＧＳＣＰ群（４０ｍｇ／ｍｌ）に分けて、１群あたりマウス１０匹とし、連続的に７日間強制経口投与し（２０ｍｌ／ｋｇ、正常群及びモデル群には超純水を投与）、強制経口投与してから７日後、１５ｍｇ／ｍｌオテラシルカリウム（生工生物社製）及び１０ｍｇ／ｍｌヒポキサンチン（ｓｉｇｍａ）懸濁液０．５ｍｌを１ｈかけて腹腔内注射してモデリングし、モデリング１ｈ後、血液及び肝臓を取り、血中尿酸レベル及び肝臓のキサンチンオキシダーゼ活性を測定し、結果を図８に示した。
【００７２】
ヒポキサンチンは、尿酸を生成するための前駆体物質であり、オテラシルカリウムはウリカーゼの阻害剤である。オテラシルカリウム及びヒポキサンチンを腹腔内注射すると、マウスの血中尿酸レベルが明らかに上昇し、それは、高尿酸血症マウスモデルの作成に成功したことを示した。モデル群に比べて、陽性医薬品であるアロプリノール群のマウスの血中尿酸レベルが０に近く、ＧＳＣＰ群の血中尿酸レベルも低レベルであり、ＧＳＣＰは、経口投与されると、優れた尿酸低下活性を示した。肝臓ＸＯＤ酵素活性の検出結果には、アロプリノール群及びＧＳＣＰ群のＸＯＤ活性がモデル群のそれよりも低く、それは、ＧＳＣＰが肝臓ＸＯＤ活性を阻害することで尿酸低減作用を発揮できることを示した。２群のデータの結果から明らかなように、ＡＤＣＳでは尿酸低減作用を発揮し得る有効成分は、コンドロイチン硫酸であはなく、尿酸低下活性を有する成分がＧＳＣＰ中のポリペプチド成分、即ちＧＳＣＰ２成分であることが推定された。
【００７３】
以上は、本発明の原理だけを示したが、本発明の範囲は、本明細書に記載の例示的なものに制限されず、既知の等同物及び将来開発される等同物を含むことを意図する。また、なお、本発明の技術的原理を逸脱することなく、いくつかの改良及び修正を行うことができ、これら改良及び修正も本発明の範囲であるとみなされるべきである。
【図１】
2020531627.tif 000011
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年5月22日(2020.5.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チュウゴクオオサンショウウオ軟骨製剤及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
軟骨には、糖タンパク質、ポリペプチド、低分子タンパク質、多糖が豊富に含まれており、研究によれば、特定の動物由来の軟骨抽出物には、優れた抗腫瘍、抗血管新生、免疫調節、抗関節炎などの活性がある。その中でも、サメ軟骨製剤（Ｓｈａｒｋ  ＣａｒｔｉｌａｇｅＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎ、ＳＣＰ）は、関連研究が特に多く、栄養補助食品として世界中非常に人気がある。しかし、サメ軟骨市場の発展に伴い、サメの漁獲量が増加し、最近数十年で自然界のサメの個体数が急激に減少し、いくつかの種類のサメが絶滅危惧種になっている。したがって、サメ軟骨の使用は持続不可能である。
現在市販されている軟骨製剤は、主にサメの軟骨に由来するものである。サメ軟骨市場の発展に伴い、サメの漁獲量が増加し、最近数十年で自然界のサメの個体数が激減し、いくつかの種類のサメが絶滅危惧種になっている。したがって、サメ軟骨の使用は持続不可能である。
【発明の概要】
【０００３】
中国固有の希少動物であるチュウゴクチュウゴクオオサンショウウオ（Ａｎｄｒｉａｓ  ｄａｖｉｄｉａｎｕｓ）は、食用及び薬用としての価値が高く、開発と利用の潜在力が大きい。野生チュウゴクオオサンショウウオは国の二級保護水生動物であるが、過去２０年でチュウゴクオオサンショウウオの人工飼育及び繁殖技術は徐々に成熟し、チュウゴクオオサンショウウオ産業は急速に発展し、陝西省、湖南省、河南省、四川省などの複数の省や地域では、大規模なチュウゴクオオサンショウウオ養殖産業と市場が形成されており、それは、チュウゴクオオサンショウウオ軟骨を使用して医薬品及びヘルスケアの価値を有する製品を抽出するために持続可能な生物学的資源を提供し、また、チュウゴクオオサンショウウオ軟骨製剤の開発は、チュウゴクオオサンショウウオ産業の高価値化への発展にも寄与する。
【０００４】
具体的には、本発明は以下に関する。
１．チュウゴクオオサンショウウオコンドロイチン硫酸、及び軟骨ポリペプチド粗抽出物を含むチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物。
２．前記チュウゴクオオサンショウウオコンドロイチン硫酸は非硫酸化二糖（ＣＳ−Ｏ）、Ｃ６位硫酸化二糖（ＣＳ−Ｃ）、及びＣ４位硫酸化二糖（ＣＳ−Ａ）を含有する項１に記載のチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物。
３．前記チュウゴクオオサンショウウオコンドロイチン硫酸は非硫酸化二糖（ＣＳ−Ｏ）、Ｃ６位硫酸化二糖（ＣＳ−Ｃ）、及びＣ４位硫酸化二糖（ＣＳ−Ａ）からなる項１又は２に記載のチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物。
４．前記チュウゴクオオサンショウウオコンドロイチン硫酸の重量平均分子量（Ｍｗ）が、４０ｋＤａ以上、好ましくは４５ｋＤａ以上、より好ましくは４８ｋＤａ以上、最も好ましくは４９．２ｋＤａである項１〜３のいずれか１項に記載のチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物。
５．前記軟骨ポリペプチド粗抽出物はＴＧＰＬＧＰＳＰＧＰ(配列番号 1)、ＨＤＬＰＬＰＬＰＥ(配列番号 2)、ＤＮＬＰＰＬＰＫ(配列番号 3)及びＶＰＳＧＰＬＧＰＥＧＰＲ(配列番号4)のうちの１種類又は複数種類を含む項１〜４のいずれか１項に記載のチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物。
６．前記チュウゴクオオサンショウウオコンドロイチン硫酸は、チュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物の全量の１５質量％〜３０質量％を占め、前記軟骨ポリペプチド粗抽出物は、チュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物の全量の７０質量％〜８５質量％を占める項１〜５のいずれか１項に記載のチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物。
７．チュウゴクオオサンショウウオから軟骨を取得することと、
取得した軟骨にプロテアーゼにより加水分解を行うことと、
プロテアーゼにより加水分解した後の上澄みを得て、それを乾燥させることと、を含む方法によって得られる項１〜６のいずれか１項に記載のチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物。
８．軟骨ポリペプチド粗抽出物であり、且つＴＧＰＬＧＰＳＰＧＰ(配列番号 1)、ＨＤＬＰＬＰＬＰＥ(配列番号 2)、ＤＮＬＰＰＬＰＫ(配列番号 3)及びＶＰＳＧＰＬＧＰＥＧＰＲ(配列番号4)のうちの１種類又は複数種類を含むチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物のアルコール可溶性成分。
９．チュウゴクオオサンショウウオから軟骨を取得することと、
取得した軟骨にプロテアーゼにより加水分解を行うことと、
プロテアーゼにより加水分解した後の上澄みを得て、それを乾燥させることと、
プロテアーゼにより加水分解した後の上澄み又はその乾燥物をアルコール沈殿することと、
上澄みを得ることと、を含む方法によって得られる項８に記載のアルコール可溶性成分。
１０．尿酸低下活性を有する項８又は９に記載のアルコール可溶性成分。
１１．ＴＧＰＬＧＰＳＰＧＰ(配列番号 1)、ＨＤＬＰＬＰＬＰＥ(配列番号 2)、ＤＮＬＰＰＬＰＫ(配列番号3)及びＶＰＳＧＰＬＧＰＥＧＰＲ(配列番号 4)のうちの１種類又は複数種類である、ことを特徴とする軟骨ポリペプチド。
１２．ＸＯＤ酵素阻害活性を有する項１１に記載の軟骨ポリペプチド。
１３．尿酸低下活性を有する項１１に記載の軟骨ポリペプチド。
１４．非硫酸化二糖（ＣＳ−Ｏ）、Ｃ６位硫酸化二糖（ＣＳ−Ｃ）、及びＣ４位硫酸化二糖（ＣＳ−Ａ）を含有するチュウゴクオオサンショウウオコンドロイチン硫酸を含むチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物のアルコール沈殿成分。
１５．前記チュウゴクオオサンショウウオコンドロイチン硫酸は非硫酸化二糖（ＣＳ−Ｏ）、Ｃ６位硫酸化二糖（ＣＳ−Ｃ）、及びＣ４位硫酸化二糖（ＣＳ−Ａ）からなる項１４に記載のチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物のアルコール沈殿成分。
１６．前記チュウゴクオオサンショウウオコンドロイチン硫酸の重量平均分子量（Ｍｗ）が、４０ｋＤａ以上、好ましくは４５ｋＤａ以上、より好ましくは４８ｋＤａ以上、最も好ましくは４９．２ｋＤａである項１４又は１５に記載のチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物のアルコール沈殿成分。
１７．チュウゴクオオサンショウウオから軟骨を取得することと、
取得した軟骨にプロテアーゼにより加水分解を行うことと、
プロテアーゼにより加水分解した後の上澄みを得て、それを乾燥させることと、
プロテアーゼにより加水分解した後の上澄み又はその乾燥物をアルコール沈殿することと、
沈殿画分を得ることと、を含む方法によって得られる項１４〜１６のいずれか１項に記載のチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物のアルコール沈殿成分。
１８．尿酸を低下させる、又は高尿酸血症又は痛風を治療する医薬品を調製するための、項１〜７のいずれか１項に記載のチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物、項８〜１０のいずれか１項に記載のチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物のアルコール可溶性成分、又は項１１〜１３のいずれか１項に記載の軟骨ポリペプチドの使用。
１９．尿酸低減、又は高尿酸血症又は痛風の治療のための、項１〜７のいずれか１項に記載のチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物、項８〜１０のいずれか１項に記載のチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物のアルコール可溶性成分、又は項１１〜１３のいずれか１項に記載の軟骨ポリペプチドの使用。
２０．チュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物の取得方法であって、
チュウゴクオオサンショウウオから軟骨を取得することと、
取得した軟骨にプロテアーゼにより加水分解を行うことと、
プロテアーゼにより加水分解した後の上澄みを得て、それを乾燥させることと、を含む取得方法。
２１．前記プロテアーゼはアルカリプロテアーゼであり、ｐＨ  ９〜１１の条件下でプロテアーゼ加水分解を行う項２０に記載の方法。
２２．チュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物のアルコール可溶性成分の取得方法であって、
チュウゴクオオサンショウウオから軟骨を取得することと、
取得した軟骨にプロテアーゼにより加水分解を行うことと、
プロテアーゼにより加水分解した後の上澄みを得て、それを乾燥させることと、
プロテアーゼにより加水分解した後の上澄み又はその乾燥物をアルコール沈殿することと、
上澄みを得ることと、を含む取得方法。
２３．前記プロテアーゼはアルカリプロテアーゼであり、ｐＨ  ９〜１１の条件下でプロテアーゼにより加水分解を行う項２２に記載の方法。
２４．チュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物のアルコール沈殿成分の取得方法であって、
チュウゴクオオサンショウウオから軟骨を取得することと、
取得した軟骨にプロテアーゼにより加水分解を行うことと、
プロテアーゼにより加水分解した後の上澄みを得て、それを乾燥させることと、
プロテアーゼにより加水分解した後の上澄み又はその乾燥物をアルコール沈殿することと、
沈殿画分を取得することと、を含む取得方法。
２５．前記プロテアーゼはアルカリプロテアーゼであり、ｐＨ  ９〜１１の条件下でプロテアーゼにより加水分解を行う項２４に記載の方法。
２６．前記アルカリプロテアーゼは２７０９プロテアーゼである項２１、２３又は２５のいずれか１項に記載の方法。
２７．アルコール沈殿の操作では、エタノールの質量濃度が５０％−９０％である項２２〜２６のいずれか１項に記載の方法。
２８．アルコール沈殿の操作では、エタノールの質量濃度が７０％である項２７に記載の方法。
２９．尿酸を低下させる、又は高尿酸血症又は痛風を治療する方法であって、
項１〜７のいずれか１項に記載のチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物、項８〜１０のいずれか１項に記載のチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物のアルコール可溶性成分、又は項１１〜１３のいずれか１項に記載の軟骨ポリペプチドを、それを必要とする被験者に投与することを含む方法。
【発明の効果】
【０００５】
本発明に係るチュウゴクオオサンショウウオ軟骨製剤は、チュウゴクオオサンショウウオ軟骨のプロテアーゼによる加水分解などの方法により得られるポリペプチド系物質又はチュウゴクオオサンショウウオコンドロイチン硫酸とポリペプチドの組成物であり、抗腫瘍、抗血管新生、抗炎症、抗酸化、免疫力強化、抗骨粗鬆症、抗リウマチ、尿酸低減、抗痛風などの活性を有する。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
本発明に係るチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物は、チュウゴクオオサンショウウオコンドロイチン硫酸、及び軟骨ポリペプチド粗抽出物を含む。
【０００７】
前記チュウゴクオオサンショウウオコンドロイチン硫酸は、チュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物の全量の１５質量％〜３０質量％、好ましくは１８質量％〜２６質量％を占め、前記軟骨ポリペプチド粗抽出物は、チュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物の全量の７０質量％〜８５質量％、好ましくは７４質量％〜８２質量％を占める。
【０００８】
なお、チュウゴクオオサンショウウオコンドロイチン硫酸は、非硫酸化二糖（ＣＳ−Ｏ）、Ｃ６位硫酸化二糖（ＣＳ−Ｃ）、及びＣ４位硫酸化二糖（ＣＳ−Ａ）を含有し、好ましくは非硫酸化二糖（ＣＳ−Ｏ）、Ｃ６位硫酸化二糖（ＣＳ−Ｃ）、及びＣ４位硫酸化二糖（ＣＳ−Ａ）からなる。
【０００９】
本発明に係るチュウゴクオオサンショウウオ軟骨製剤の調製過程は、以下のとおりである。
チュウゴクオオサンショウウオから軟骨を取得する。
プロテアーゼによる加水分解：１種類又は複数種類のプロテアーゼ、たとえば、コラゲナーゼ、アルカリプロテアーゼ、プロナーゼ、トリプシン又はパパインなど、好ましくはアルカリプロテアーゼを用いて、適切な条件下で、チュウゴクオオサンショウウオ軟骨を加水分解させ、所定時間後、加熱して昇温してプロテアーゼを不活性化させる。
分離：反応させた溶液を静置して沈殿（又は遠心分離、ろ過など）させて、上澄みを得る。
乾燥：自然乾燥（又は凍結乾燥、回転蒸発など）させて上澄み中の水分を除去させると、所望のチュウゴクオオサンショウウオコンドロイチン硫酸と軟骨ポリペプチドの組成物を得て、本発明ではこの組成物をＧＳＣＰと略することもある。
分離ステップで得られた上澄み液又は乾燥ステップで得られた組成物にエタノール又はエタノール溶液を加えてアルコール沈殿（最終溶液中のエタノール含有量が５０％〜９０％である）を行い、上澄みを得て乾燥させ、ポリペプチドを主成分とする所望のアルコール可溶性成分を得て、本発明ではこのアルコール可溶性成分をＧＳＣＰ２ということもある。
さらに分析したところ、アルコール可溶性成分は、尿酸低下活性を有するポリペプチドＴＧＰＬＧＰＳＰＧＰ(配列番号 1)、ＨＤＬＰＬＰＬＰＥ(配列番号 2)、ＤＮＬＰＰＬＰＫ(配列番号 3)及びＶＰＳＧＰＬＧＰＥＧＰＲ(配列番号4)を含む。アルコール沈殿成分の組成は、チュウゴクオオサンショウウオコンドロイチン硫酸（ＡＤＣＳ）を主とする。
【００１０】
本発明は、
チュウゴクオオサンショウウオから軟骨を取得することと、
取得した軟骨にプロテアーゼにより加水分解を行うことと、
プロテアーゼにより加水分解した後の上澄みを得て、それを乾燥させることと、を含む方法によって得られることを特徴とするチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物に関する。
【００１１】
さらに、本発明は、チュウゴクオオサンショウウオコンドロイチン硫酸、及び軟骨ポリペプチド粗抽出物を含むことを特徴とするチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物に関する。
【００１２】
本発明のプロテアーゼは、好ましくはアルカリプロテアーゼ、さらに好ましくは２７０９プロテアーゼである。
【００１３】
さらに、本発明は、チュウゴクオオサンショウウオコンドロイチン硫酸の重量平均分子量（Ｍｗ）が４９．２ｋＤａであることを特徴とするチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物に関する。
【００１４】
さらに、本発明は、軟骨ポリペプチド粗抽出物がＴＧＰＬＧＰＳＰＧＰ(配列番号 1)、ＨＤＬＰＬＰＬＰＥ(配列番号 2)、ＤＮＬＰＰＬＰＫ(配列番号 3)及びＶＰＳＧＰＬＧＰＥＧＰＲ(配列番号4)のうちの１種類又は複数種類を含むことを特徴とするチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物に関する。
【００１５】
本発明は、
チュウゴクオオサンショウウオから軟骨を取得することと、
取得した軟骨にプロテアーゼにより加水分解を行うことと、
プロテアーゼにより加水分解した後の上澄みを得て、それを乾燥させることと、を含むことを特徴とするチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物の調製方法に関する。
【００１６】
本発明は、
チュウゴクオオサンショウウオから軟骨を取得することと、
取得した軟骨にプロテアーゼにより加水分解を行うことと、
プロテアーゼにより加水分解した後の上澄みを得て、それを乾燥させることと、
プロテアーゼにより加水分解した後の上澄み又はその乾燥物をアルコール沈殿することと、
上澄みを得ることと、を含む方法によって得られることを特徴とするチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物のアルコール可溶性成分に関する。
【００１７】
さらに、本発明は、軟骨ポリペプチド粗抽出物であることを特徴とするチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物のアルコール可溶性成分に関する。
【００１８】
さらに、本発明は、ＴＧＰＬＧＰＳＰＧＰ(配列番号 1)、ＨＤＬＰＬＰＬＰＥ(配列番号 2)、ＤＮＬＰＰＬＰＫ(配列番号 3)及びＶＰＳＧＰＬＧＰＥＧＰＲ(配列番号4)のうちの１種類又は複数種類を含むことを特徴とするチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物のアルコール可溶性成分に関する。
【００１９】
本発明は、
チュウゴクオオサンショウウオから軟骨を取得することと、
取得した軟骨にプロテアーゼにより加水分解を行うことと、
プロテアーゼにより加水分解した後の上澄みを得て、それを乾燥させることと、
プロテアーゼにより加水分解した後の上澄み又はその乾燥物をアルコール沈殿することと、
上澄みを得ることと、を含む、ことを特徴とするチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物のアルコール可溶性成分の調製方法に関する。
【００２０】
本発明は、ＴＧＰＬＧＰＳＰＧＰ(配列番号 1)、ＨＤＬＰＬＰＬＰＥ(配列番号 2)、ＤＮＬＰＰＬＰＫ(配列番号 3)及びＶＰＳＧＰＬＧＰＥＧＰＲ(配列番号4)のうちの１種類又は複数種類であることを特徴とする軟骨ポリペプチドに関する。
【００２１】
即ち、本発明の軟骨ポリペプチドは、ＴＧＰＬＧＰＳＰＧＰ(配列番号 1)、ＨＤＬＰＬＰＬＰＥ(配列番号 2)、ＤＮＬＰＰＬＰＫ(配列番号 3)、ＶＰＳＧＰＬＧＰＥＧＰＲ(配列番号 4)、及びこれらの任意の混合物、たとえば、ＴＧＰＬＧＰＳＰＧＰ(配列番号 1)とＨＤＬＰＬＰＬＰＥ(配列番号 2)の混合物、ＴＧＰＬＧＰＳＰＧＰ(配列番号 1)とＤＮＬＰＰＬＰＫ(配列番号 3)の混合物、ＴＧＰＬＧＰＳＰＧＰ(配列番号 1)とＶＰＳＧＰＬＧＰＥＧＰＲ(配列番号4)の混合物、ＨＤＬＰＬＰＬＰＥ(配列番号 2)とＤＮＬＰＰＬＰＫ(配列番号 3)の混合物、ＨＤＬＰＬＰＬＰＥ(配列番号 2)とＶＰＳＧＰＬＧＰＥＧＰＲ(配列番号4)の混合物、ＤＮＬＰＰＬＰＫ(配列番号 3)とＶＰＳＧＰＬＧＰＥＧＰＲ(配列番号 4)の混合物、ＴＧＰＬＧＰＳＰＧＰ(配列番号 1)、ＨＤＬＰＬＰＬＰＥ(配列番号 2)及びＤＮＬＰＰＬＰＫ(配列番号 3)の混合物、ＨＤＬＰＬＰＬＰＥ(配列番号 2)、ＤＮＬＰＰＬＰＫ(配列番号 3)及びＶＰＳＧＰＬＧＰＥＧＰＲ(配列番号4)の混合物、ＴＧＰＬＧＰＳＰＧＰ(配列番号 1)、ＨＤＬＰＬＰＬＰＥ(配列番号 2)及びＶＰＳＧＰＬＧＰＥＧＰＲ(配列番号 4)の混合物、ＨＤＬＰＬＰＬＰＥ(配列番号2)、ＤＮＬＰＰＬＰＫ(配列番号 3)及びＶＰＳＧＰＬＧＰＥＧＰＲ(配列番号 4)の混合物、ＴＧＰＬＧＰＳＰＧＰ(配列番号 1)、ＨＤＬＰＬＰＬＰＥ(配列番号 2)、ＤＮＬＰＰＬＰＫ(配列番号 3)及びＶＰＳＧＰＬＧＰＥＧＰＲ(配列番号 4)の混合物であってもよい。
【００２２】
さらに、本発明は、ＸＯＤ酵素阻害活性を有することを特徴とする軟骨ポリペプチドに関する。
【００２３】
さらに、本発明は、尿酸低下活性を有することを特徴とする軟骨ポリペプチドに関する。
【００２４】
本発明は、
チュウゴクオオサンショウウオから軟骨を取得することと、
取得した軟骨にプロテアーゼにより加水分解を行うことと、
プロテアーゼにより加水分解した後の上澄みを得て、それを乾燥させることと、
プロテアーゼにより加水分解した後の上澄み又はその乾燥物をアルコール沈殿することと、
沈殿画分を得ることと、を含む方法によって得られる、ことを特徴とするチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物のアルコール沈殿成分に関する。
【００２５】
さらに、本発明は、チュウゴクオオサンショウウオコンドロイチン硫酸を含むことを特徴とするチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物のアルコール沈殿成分に関する。
【００２６】
さらに、本発明は、チュウゴクオオサンショウウオコンドロイチン硫酸の重量平均分子量（Ｍｗ）が４９．２ｋＤａであることを特徴とするチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物のアルコール沈殿成分に関する。
【００２７】
本発明は、
チュウゴクオオサンショウウオから軟骨を取得することと、
取得した軟骨にプロテアーゼにより加水分解を行うことと、
プロテアーゼにより加水分解した後の上澄みを得て、それを乾燥させることと、
プロテアーゼにより加水分解した後の上澄み又はその乾燥物をアルコール沈殿することと、
沈殿画分を得ることと、を含む、ことを特徴とするチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物のアルコール沈殿成分の調製方法に関する。
【００２８】
本発明に係るチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物又はチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物のアルコール可溶性成分又は軟骨ポリペプチド、たとえばＴＧＰＬＧＰＳＰＧＰ(配列番号 1)、ＨＤＬＰＬＰＬＰＥ(配列番号 2)、ＤＮＬＰＰＬＰＫ(配列番号 3)又はｚＶＰＳＧＰＬＧＰＥＧＰＲ(配列番号 4)は、ＸＯＤ酵素阻害活性を有する。
【００２９】
さらに、本発明は、尿酸を低下させる、又は高尿酸血症を治療する医薬品の調製における、チュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物の使用に関する。
【００３０】
さらに、本発明は、尿酸低減又は高尿酸血症の治療における、チュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物の使用に関する。
【００３１】
さらに、本発明は、痛風を治療する医薬品の調製における、チュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物の使用に関する。
【００３２】
さらに、本発明は、痛風治療におけるチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物の使用に関する。
【００３３】
さらに、本発明は、尿酸を低下させる、又は高尿酸血症を治療する医薬品の調製における、チュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物のアルコール可溶性成分の使用に関する。
【００３４】
さらに、本発明は、尿酸低減又は高尿酸血症治療における、チュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物のアルコール可溶性成分の使用に関する。
【００３５】
さらに、本発明は、痛風を治療する医薬品の調製における、チュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物のアルコール可溶性成分の使用に関する。
【００３６】
さらに、本発明は、痛風治療におけるチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物のアルコール可溶性成分の使用に関する。
【００３７】
さらに、本発明は、尿酸を低下させる、又は高尿酸血症を治療する医薬品の調製における、軟骨ポリペプチド、たとえばＴＧＰＬＧＰＳＰＧＰ(配列番号 1)、ＨＤＬＰＬＰＬＰＥ(配列番号 2)、ＤＮＬＰＰＬＰＫ(配列番号 3)又はＶＰＳＧＰＬＧＰＥＧＰＲ(配列番号 4)の使用に関する。
【００３８】
さらに、本発明は、尿酸低減又は高尿酸血症治療における、軟骨ポリペプチド、たとえばＴＧＰＬＧＰＳＰＧＰ(配列番号 1)、ＨＤＬＰＬＰＬＰＥ(配列番号 2)、ＤＮＬＰＰＬＰＫ(配列番号 3)又はＶＰＳＧＰＬＧＰＥＧＰＲ(配列番号 4)の使用に関する。
【００３９】
さらに、本発明は、痛風を治療する医薬品の調製における、軟骨ポリペプチド、たとえばＴＧＰＬＧＰＳＰＧＰ(配列番号 1)、ＨＤＬＰＬＰＬＰＥ(配列番号 2)、ＤＮＬＰＰＬＰＫ(配列番号 3)又はＶＰＳＧＰＬＧＰＥＧＰＲ(配列番号 4)の使用に関する。
【００４０】
さらに、本発明は、治療痛風における、軟骨ポリペプチド、たとえばＴＧＰＬＧＰＳＰＧＰ(配列番号 1)、ＨＤＬＰＬＰＬＰＥ(配列番号 2)、ＤＮＬＰＰＬＰＫ(配列番号 3)又はＶＰＳＧＰＬＧＰＥＧＰＲ(配列番号 4)の使用に関する。
【００４１】
したがって、本発明のチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物及びそのアルコール可溶性成分は、尿酸を低下させる、又は高尿酸血症又は痛風を治療する作用を有する軟骨ポリペプチドを含む。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１はＧＳＣＰ成分のセルロースアセテート膜電気泳動（ＨＡ：ヒアルロン酸；ＣＳ：コンドロイチン硫酸；ＨＰ：ヘパリン）を示す。
【図２】図２はＡＤＣＳ、サメコンドロイチン硫酸（ＳＣＳ）及び牛コンドロイチン硫酸（ＢＣＳ）のＨＰＧＰＣスペクトルを示す。
【図３】図３はＳＡＸ−ＨＰＬＣスペクトル及び二糖組成を示す。（ａ）  ＡＤＣＳ；（ｂ）  ＢＣＳ；（ｃ）  ＳＣＳ。
【図４】図４はＡＤＣＳの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図５】図５はトータルイオンクロマトグラムを示す。
【図６】図６はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析結果を示す。
【図７】図７はＸＯＤ酵素活性検出結果を示す。
【図８】図８は高性能高尿酸血症動物モデルを用いた尿酸低減の評価効果を示す。（ａ）血中尿酸含有量；（ｂ）肝臓ＸＯＤ酵素活性。
【００４３】
実施例
実施例１  チュウゴクオオサンショウウオ軟骨製剤の調製
切断された軟骨付きのチュウゴクオオサンショウウオ肉を浄水に入れて、加熱して１ｈ沸騰させ、チュウゴクオオサンショウウオ軟骨２０ｇを分離し、軟骨を５００ｍｌビーカーに入れて、水２００ｍｌ、２７０９プロテアーゼ（北京東華強盛生物公司製、バチルス・リケニフォルミス由来）２ｇを加え、ｐＨ９．５、５０℃で８ｈ加水分解し、９０℃で１０分間加熱して、プロテアーゼを不活性化させ、１００００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離して上澄みを取り、４８ｈ真空凍結乾燥して、固体粉末１０．６ｇとして、チュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物（即ちＧＳＣＰ）を得た。チュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物５ｇを、７５％エタノール２０ｍｌに加えて十分に混合し、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離して上澄みを取り、６０℃オーブンに入れて６ｈかけてアルコールを除去した後、４８ｈ凍結乾燥させ、アルコール可溶性成分３．５ｇ（即ちＧＳＣＰ２）を得た。沈殿画分を乾燥させて、チュウゴクオオサンショウウオコンドロイチン硫酸１．２ｇ（即ちＡＤＣＳ）を得た。アルコール沈殿画分は、質量分率として２５．５％、アルコール可溶性画分は質量分率として７４．５％を占めた。
【００４４】
実施例２  チュウゴクオオサンショウウオ軟骨製剤の調製
軟骨を調製するためのチュウゴクオオサンショウウオ（３．２ｋｇ）を分離して、きれいに洗浄して、湿重量１００ｇのチュウゴクオオサンショウウオ軟骨を得て、軟骨を小さく切ってホモジナイザーを用いてホモジネートし、ホモジネートした軟骨を２％の酢酸ナトリウムを含有する溶液５００ｍＬに懸濁させ、１ＭのＮａＯＨでｐＨを１０．０±０．５の範囲に調整し、次に、２７０９アルカリプロテアーゼ６ｇを加えて加熱しながら撹拌し、３０ｍｉｎおきに１ＭのＮａＯＨを用いてｐＨを１０．０±０．５の範囲に調整し、軟骨組織が完全に消化されるまで、約６ｈかけて５０℃で反応させ、次に、反応液を１００℃に加熱して１０ｍｉｎ保温してプロテアーゼを不活性化させた。反応液を室温に冷却した後、５，０００×ｇで１５ｍｉｎ遠心分離して上澄みを得て、チュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物（ＧＳＣＰ）溶液を得た。上澄みにその体積に対して３倍の無水エタノールを加えて、４℃で一晩静置し、５,０００×ｇで１５ｍｉｎ遠心分離して沈殿を収集し、沈殿を脱イオン水１００ｍＬに溶解した後、アルコール沈殿の操作を繰り返して沈殿を得て、その後、沈殿を脱イオン水１００ｍＬに溶解して、カットオフ分子量７ｋＤａの透析バッグを使用して２４ｈ透析し、その後、凍結乾燥させて精製済みのチュウゴクオオサンショウウオコンドロイチン硫酸４．４ｇを得た。２回のアルコール沈殿の操作による上澄み液を収集して、回転蒸発して濃縮させた後、凍結乾燥させてチュウゴクオオサンショウウオ軟骨ポリペプチドを主な組成としたアルコール可溶性成分１９．０ｇを得た。アルコール沈殿画分は質量分率として１８．８％、アルコール可溶性画分は質量分率として８１．２％を占めた。
【００４５】
実施例３  セルロースアセテート膜電気泳動による実施例１で得られたＧＳＣＰ成分のグリコサミノグリカンの組成の分析
セルロースアセテート薄膜（７ｃｍ＊９ｃｍ）を電極バッファー（０．１ｍｏｌ／Ｌピリジン、０．４７ｍｏｌ／Ｌギ酸、ｐＨ３．０）にて十分に３０分間浸透し、取り出して余分なバッファーを吸い捨てて、ピペットを用いてセルロースアセテート薄膜の一端に試料を加え（１０ｍｇ／ｍｌ  ＧＳＣＰ）、２ｍｇ／ｍｌヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリンのサンプルを対照として、ＤＹＣＰ−３８Ｃ型横型電気泳動装置において定電流６ｍＡで３０分間電気泳動し、染色液（０．５％アルシアンブルー、２％酢酸）にて３０分間染色し、次に、リンス液（２％酢酸）で、１回に２０分間、３〜５回繰り返してリンスし、リンスしたセルロースアセテート薄膜を可視光で観察し、結果を図１に示した。図１は、ＧＳＣＰサンプルにコンドロイチン硫酸が多く含まれていることを示す。
【００４６】
実施例４  チュウゴクオオサンショウウオコンドロイチン硫酸のキャラクタリゼーション
前記と同様に、湿重量３．２ｋｇの飼育チュウゴクオオサンショウウオから湿重量１００ｇの軟骨を分離し、その乾湿比（Ｗ／Ｄ、５．３４）で、ＣＳ抽出により乾重量１８．７ｇの軟骨を得た。抽出、分離、精製して凍結乾燥させ、実験にＡＤＣＳサンプル４．４ｇを得た。ＨＰＧＰＣ、ＳＡＸ−ＨＰＬＣによりＡＤＣＳ及び市販品として入手したＢＣＳ、ＳＣＳの純度、分子量分布、二糖組成、電荷密度を分析し、結果を表１に示した。ＡＤＣＳの純度は９８．７％であり、チュウゴクオオサンショウウオ軟骨から抽出されたＡＤＣＳの収率は２３．２％（乾重量／乾重量）であった。
【００４７】
【表１】
2020531627.tif 000019
【００４８】
ＨＰＧＰＣによりＣＳの分子量分布を分析したところ、図２に示されるクロマトグラムのように、３種類のＣＳサンプルは、分散係数がすべて１．５よりも小さく、分子量分布が集中している。ＡＤＣＳの重量平均分子量（Ｍｗ）は、４９．２ｋＤａであり、水生動物であるサメ由来のＳＣＳの７５．８ｋＤａよりも低く、陸生動物である牛由来のＢＣＳの３４．４ｋＤａよりも高かった。
【００４９】
ＣｈｏｎＡＢＣで完全に分解した後、ＳＡＸ−ＨＰＬＣによってＣＳの二糖組成を分析し、結果を図３に示した。ＡＤＣＳには、１４．６％の非硫酸化二糖ＣＳ−Ｏ、６０．９％のＣ６位硫酸化二糖ＣＳ−Ｃ、及び２４．５％のＣ４位硫酸化二糖ＣＳ−Ａが含まれているが、二重硫酸化二糖ＣＳ−Ｄが含まなかった。さらに、表１から明らかなように、ＡＤＣＳの二糖組成は、ＢＣＳ、ＳＣＳとは明らかな差異があった。サメ由来のＣＳは、ＣＳ−Ｃの含有量が高いため、通常、ＳＣＳをＣＳＣと呼び、実験結果から明らかなように、ＡＤＣＳ中のＣＳ−Ｃの含有量は６０％以上と高く、サメ由来のＳＣＳよりも高かった。さらに、ＡＤＣＳでは、非硫酸化二糖単位ＣＳ−Ｏの含有量もＢＣＳ及びＳＣＳ中のＣＳ−Ｏの含有量よりも高く、且つ、ＳＣＳに比べて、ＡＤＣＳには、二重硫酸化二糖単位が含まれておらず、このため、ＡＤＣＳの電荷密度（０．８５）もＢＣＳ（０．９５）及びＳＣＳ（１．１７）よりも低かった。さらに、同様に両生動物の軟骨から抽出されたＣＳ、ＡＤＣＳの二糖組成も従来の文献(Ｍａｔｈｅｗｓ  Ｍ  Ｂ，  Ｈｉｎｄｓ  Ｌ  Ｄ．  Ａｃｉｄ  ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ｏｆ  ｆｒｏｇ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｉｎ  ｔｈｙｒｏｘｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｅｔａｍｏｒｐｈｏｓｉｓ［Ｊ］．  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  Ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，  １９６３，  ７４（２）：  １９８)により報告されたカエル由来のＣＳ（４０％  ＣＳ−Ｏ、４０％  ＣＳ−Ａ、２０％  ＣＳ−Ｃ）とは明らかな差異があった。
【００５０】
ＡＤＣＳの１Ｈ−ＮＭＲスペクトル分析結果を図４に示した。ＣＳ核磁気分析の文献報告(Ｍｕｃｃｉ  Ａ，  Ｓｃｈｅｎｅｔｔｉ  Ｌ，  Ｖｏｌｐｉ  Ｎ．  Ｈａｎｄ  １３  Ｃ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｏｆ  ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅｓ  ｏｆ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｏｒｉｇｉｎ［Ｊ］．  ２０００，  ４１：  ３７−４５)と組み合わせて核磁気気共鳴スペクトルを分析したところ、１．９−２．１ｐｐｍでの１組の重なり合うピークが、未硫酸化及び硫酸化のＧａｌＮＡｃ構造メチル中のＨ原子の信号ピークに帰属し、４．１８ｐｐｍ及び４．７０ｐｐｍでの信号ピークが、それぞれＣＳ−Ｃ中のＧａｌＮＡｃ６ＳのＣ６位Ｈ原子及びＣＳ−Ａ中のＧａｌＮＡｃ４ＳのＣ４位のＨ原子に帰属し、４．４６ｐｐｍでの信号ピークが、ＧｌｃＵＡ及びＧａｌＮＡｃ中のＣ１位のＨ原子に帰属し、３．３２ｐｐｍ、３．５４ｐｐｍ及び３．６９ｐｐｍでの信号ピークが、それぞれＧｌｃＵＡのＣ２、Ｃ３及びＣ４／Ｃ５位のＨ原子に帰属した。
【００５１】
分析した結果、チュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物に対してアルコール沈殿の操作及び透析精製を行って、純度９８％以上のＡＤＣＳを得た。ＨＰＧＰＣで分析したところ、ＡＤＣＳの分子量が４９．２ｋＤａであった。ＣｈｏｎＡＢＣ酵素で完全に分解した後、ＳＡＸ−ＨＰＬＣにより分析した結果、ＡＤＣＳ二糖の組成は、１４．６％  ＣＳ−Ｏ、６０．９％  ＣＳ−Ｃ及び２４．５％  ＣＳ−Ａであり、牛由来のＢＣＳ及びサメ由来のＳＣＳとは明らかな差異があった。
【００５２】
実施例５  チュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物ＧＳＣＰ及びアルコール可溶性成分ＧＳＣＰ２のアミノ酸組成、ポリペプチド分子量分布、タンパク質シーケンシング
分析１：ＧＳＣＰのアミノ酸組成の分析は、北京農業生物検測センターに依頼した。
【００５３】
一、試料情報
試料タイプ：生物試料
保管条件：−２０℃
試料の数：７個
検出内容：５０種類の加水分解アミノ酸含有量の検出
【００５４】
二、器械及び試薬の情報
使用される技術：質量分析−同位体内部標準
使用器械：液体クロマトグラフィー−四重極イオントラップ型タンデム質量分析計ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ  Ｑ−ＴＲＡＰ
器械型番：ＨＰＬＣ−  ＭＳ／ＭＳ（Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００  −  ＡＰＩ  ３２００  Ｑ  ＴＲＡＰ）
アミノ酸キット：ＡＰＩ  ４５ＡＡキット；メタノール、ヘキサンニトリルはすべてｆｉｓｈｅｒから購入した。
【００５５】
三、試料前処理
酸加水分解処理（固体試料：浸漬−ホモジネート−遠心分離）
（１）試料１００ｕｌに水４００ｕｌ、濃塩酸５００ｕｌを加えて、均一に混合して窒素ガスを導入して保護し、１１０℃でシールして、高温で２１時間消化した。
（２）消化液を取り出して、遠心分離して上澄みを取り、窒素ガス５０ｕｌで吹いて乾燥させ、水１ｍｌを加えて再溶解した。
誘導化処理
（１）再溶解液４０μＬを試験管内に入れて、スルホサリチル酸１０μＬを加え、３０秒ボルテックスさせ、１３２００ｒｐｍで４分間遠心分離した。
（２）上層液体１０μＬを別の試験管に入れた。標識バッファー４０μＬを加えて、ボルテックスさせて均一に混合して、回転遠心を行った。
（３）上層液体１０μＬを別の試験管に入れた。各々のサンプル管に希釈したａＴＲＡＱ試薬５μＬを加えて、ボルテックスさせて均一に混合して、回転遠心を行った。
（４）室温で少なくとも３０分間インキュベートした。サンプル管にヒドロキシルアミン５μＬを加えて、ボルテックスさせて均一に混合して、回転遠心を行った。
（５）それぞれのサンプル管に内部標準物質３２μＬを加えて、ボルテックスさせて均一に混合して、回転遠心を行った。検出時まで保存した。
【００５６】
四、実験パラメータ
（１）液相条件：
クロマトグラフィーカラム：ＭＳＬａｂ  ＨＰ−Ｃ１８（１５０＊４．６ｍｍ  ５ｕｍ）
移動相：Ａ：水＋０．１％ギ酸     Ｂ：アセトニトリル＋０．１％ギ酸
流速：０．８ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：５０℃ 
注入量：３ｕｌ
液相分析勾配：
【表Ａ】
2020531627.tif 000020
（２）質量分析条件：
イオン源：  ＋ＥＳＩエレクトロスプレーイオン源、陽イオンモード
走査方式：ＭＲＭ多重反応モニタリング
ＣＵＲ：２０（カーテンガス）
ＣＡＤ：  Ｍｅｄｉｕｍ（衝突ガス）
ＩＳ：  ＋５５００Ｖ（スプレー電圧）
ＴＥＭ：５００℃（霧化温度）
ＧＳ１：５５  ｐｓｉ（霧化ガス）
ＧＳ２：  ６０  ｐｓｉ（補助ガス）
ＤＰ：  ３５ｖ（デクラスタリング電圧）
ＥＰ：１０  （注入電圧）
ＣＥ：３０  （衝突エネルギー）
ＣＸＰ：５．０  （衝撃室注入電圧）
【００５７】
五、実験データ
（１）トータルイオンクロマトグラム
トータルイオンクロマトグラムは図５に示された。
（２）検出結果は、表２に示された。
【００５８】
【表２】
2020531627.tif 000021
2020531627.tif 000022
2020531627.tif 000023
【００５９】
分析２：アルコール可溶性画分ＧＳＣＰ２ポリペプチドの分子量分布、タンパク質のシーケンシング
アルコール可溶性画分は、明らかな尿酸低下活性を有し、ゲルサイズ排除クロマトグラフィー及び逆相分取クロマトグラフィーによりさらに精製されて、ＸＯＤ酵素の活性に対して明らかな阻害作用を有する成分となり、それについてポリペプチド分子量及び配列を分析し、その方法及び結果を以下に示した。
【００６０】
ポリペプチドサンプルの分子量及び配列分析は、清華大学生物医学試験センターに依頼し、分子量の分析には、マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析計ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦ  ４８００Ｐｌｕｓ（米国ＡＢＩ社製）が使用され、ポリペプチド配列の分析には、ＯｒｂｉＴｒａｐ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＬＵＭＯＳ液体クロマトグラフィー質量分析計（米国Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社製）が使用された。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析結果を図６に示した。分析結果から明らかなように、サンプルポリペプチド質量電荷比（ｍ／ｚ）は１００−３０００の範囲であり、且つ、２つのサンプルはすべてｍ／ｚが７３９及び１１６２の位置では強いピークを有した。
【００６１】
高速液体クロマトグラフィー−エレクトロスプレーイオン化／質量分析計（ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ）によってサンプルを分析し、データ非依存性解析（ＤＩＡ）手段を用いてポリペプチドのアミノ酸配列を分析し、得られた４つの主なポリペプチド配列を表３に示し、それぞれＳ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４と命名して人工合成した。
【００６２】
【表３】
2020531627.tif 000024
【００６３】
実施例６  酵素分解抽出物ＧＳＣＰ及びアルコール可溶性成分ＧＳＣＰ２の尿酸低下活性
【００６４】
分析１：
ＸＯＤは、キサンチンの酸化を触媒して尿酸とスーパーオキシドアニオンを生成し、活性酸素の主な由来の１種でありながら、ヌクレオチド代謝の重要な酵素の１つであり、主に哺乳動物の心臓、肺、肝臓などの組織に分布しており、ＸＯＤ酵素活性阻害モデルにより、潜在的な尿酸低減用医薬品をスクリーニングして評価することができた。
試薬：ＸＯＤ酵素（Ｓｉｇｍａ社製、牛乳由来）、ＸＯＤ酵素活性検出キット（南京建成社から購入う）。
【００６５】
キサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）は、キサンチンの酸化を触媒して、生成した尿酸は、２９５ｎｍに特異的吸収を有し、分光光度法により生成物を測定すると、酵素活性をキャラクタリゼーションすることができた。ＸＯＤ酵素活性検出キットの取扱書に従ってＸＯＤ酵素活性検出を行い、結果を図７に示した。図７の結果から明らかなように、ＧＳＣＰは、ＸＯＤ阻害活性を有し、且つ用量依存性を有し、ＧＳＣＰの濃度が４０ｍｇ／ｍｌであるときの阻害活性が最大であり、１／２又は１／５濃度に希釈された後の阻害活性もその分減少した。
【００６６】
また、図７から明らかなように、ＧＳＣＰ中の含有量が高いＡＤＣＳはＸＯＤ阻害活性を有さなかった。このことから、ＸＯＤ阻害酵素活性を有する成分がＧＳＣＰ中のポリペプチド成分、即ちＧＳＣＰ２成分であることが推定された。
【００６７】
阻害剤がない場合のＸＯＤ酵素活性を１００％とし、人工合成した尿酸低下活性を有するペプチド及び陽性医薬品であるアロプリノールのＸＯＤ酵素活性阻害の効果を比較し、結果を表４に示した（表中の濃度は反応系でのサンプルの最終濃度である）。
【００６８】
【表４】
2020531627.tif 000025
【００６９】
ＸＯＤ酵素活性阻害実験によって半数阻害濃度（ＩＣ５０）を算出して比較し、表５に示した。
【００７０】
【表５】
2020531627.tif 000026
【００７１】
合成ポリペプチドＳ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４は、それぞれ３．２ｍｇ／ｍＬ、１１０μｇ／ｍＬ、６０μｇ／ｍＬ、６０μｇ／ｍＬでは、ＸＯＤに対する半数阻害濃度に達した。実験した結果、同様な反応系では、ＧＳＣＰ２は、５．２ｍｇ／ｍＬでは、ＸＯＤに対する半数阻害濃度に達し、さらに、アロプリノールは、０．２６μｇ／ｍＬでは、ＸＯＤに対する半数阻害濃度に達し、濃度３０μｇ／ｍＬであっても、ＸＯＤはまだ約１０％の酵素活性を維持し、一方、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４濃度が半数阻害濃度の３倍である場合、ＸＯＤ酵素活性は完全に阻害され、このことから、人工合成した活性ポリペプチドは、アロプリノールと異なるＸＯＤ酵素活性阻害メカニズムを有することが推定された。
【００７２】
分析２：
急性高尿酸血症マウスモデル：実験では、正常群、モデル群、陽性医薬品群（アロプリノール、百霊威、２ｍｇ／ｍｌ）、ＡＤＣＳ群（２０ｍｇ／ｍｌ）、ＧＳＣＰ群（４０ｍｇ／ｍｌ）に分けて、１群あたりマウス１０匹とし、連続的に７日間強制経口投与し（２０ｍｌ／ｋｇ、正常群及びモデル群には超純水を投与）、強制経口投与してから７日後、１５ｍｇ／ｍｌオテラシルカリウム（生工生物社製）及び１０ｍｇ／ｍｌヒポキサンチン（ｓｉｇｍａ）懸濁液０．５ｍｌを１ｈかけて腹腔内注射してモデリングし、モデリング１ｈ後、血液及び肝臓を取り、血中尿酸レベル及び肝臓のキサンチンオキシダーゼ活性を測定し、結果を図８に示した。
【００７３】
ヒポキサンチンは、尿酸を生成するための前駆体物質であり、オテラシルカリウムはウリカーゼの阻害剤である。オテラシルカリウム及びヒポキサンチンを腹腔内注射すると、マウスの血中尿酸レベルが明らかに上昇し、それは、高尿酸血症マウスモデルの作成に成功したことを示した。モデル群に比べて、陽性医薬品であるアロプリノール群のマウスの血中尿酸レベルが０に近く、ＧＳＣＰ群の血中尿酸レベルも低レベルであり、ＧＳＣＰは、経口投与されると、優れた尿酸低下活性を示した。肝臓ＸＯＤ酵素活性の検出結果には、アロプリノール群及びＧＳＣＰ群のＸＯＤ活性がモデル群のそれよりも低く、それは、ＧＳＣＰが肝臓ＸＯＤ活性を阻害することで尿酸低減作用を発揮できることを示した。２群のデータの結果から明らかなように、ＡＤＣＳでは尿酸低減作用を発揮し得る有効成分は、コンドロイチン硫酸であはなく、尿酸低下活性を有する成分がＧＳＣＰ中のポリペプチド成分、即ちＧＳＣＰ２成分であることが推定された。
【００７４】
以上は、本発明の原理だけを示したが、本発明の範囲は、本明細書に記載の例示的なものに制限されず、既知の等同物及び将来開発される等同物を含むことを意図する。また、なお、本発明の技術的原理を逸脱することなく、いくつかの改良及び修正を行うことができ、これら改良及び修正も本発明の範囲であるとみなされるべきである。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
チュウゴクオオサンショウウオコンドロイチン硫酸、及び軟骨ポリペプチド粗抽出物を含む、チュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物。
【請求項２】
前記チュウゴクオオサンショウウオコンドロイチン硫酸は、非硫酸化二糖（ＣＳ−Ｏ）、Ｃ６位硫酸化二糖（ＣＳ−Ｃ）、及びＣ４位硫酸化二糖（ＣＳ−Ａ）を含有する、請求項１に記載のチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物。
【請求項３】
前記チュウゴクオオサンショウウオコンドロイチン硫酸は、非硫酸化二糖（ＣＳ−Ｏ）、Ｃ６位硫酸化二糖（ＣＳ−Ｃ）、及びＣ４位硫酸化二糖（ＣＳ−Ａ）からなる、請求項１に記載のチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物。
【請求項４】
前記チュウゴクオオサンショウウオコンドロイチン硫酸の重量平均分子量（Ｍｗ）が、４０ｋＤａ以上、好ましくは４５ｋＤａ以上、より好ましくは４８ｋＤａ以上、最も好ましくは４９．２ｋＤａである、請求項１に記載のチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物。
【請求項５】
前記軟骨ポリペプチド粗抽出物は、ＴＧＰＬＧＰＳＰＧＰ(配列番号 1)、ＨＤＬＰＬＰＬＰＥ(配列番号 2)、ＤＮＬＰＰＬＰＫ(配列番号 3)及びＶＰＳＧＰＬＧＰＥＧＰＲ(配列番号4)のうちの１種類又は複数種類を含む、請求項１に記載のチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物。
【請求項６】
前記チュウゴクオオサンショウウオコンドロイチン硫酸は、チュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物の全量の１５質量％〜３０質量％を占め、前記軟骨ポリペプチド粗抽出物は、チュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物の全量の７０質量％〜８５質量％を占める、請求項１に記載のチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物。
【請求項７】
チュウゴクオオサンショウウオから軟骨を取得することと、
取得した軟骨にプロテアーゼにより加水分解を行うことと、
プロテアーゼにより加水分解した後の上澄みを得て、それを乾燥させることと、を含む方法によって得られる、請求項１に記載のチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物。
【請求項８】
ＴＧＰＬＧＰＳＰＧＰ(配列番号 1)、ＨＤＬＰＬＰＬＰＥ(配列番号 2)、ＤＮＬＰＰＬＰＫ(配列番号 3)及びＶＰＳＧＰＬＧＰＥＧＰＲ(配列番号4)のうちの１種類又は複数種類である、ことを特徴とする軟骨ポリペプチド。
【請求項９】
ＸＯＤ酵素阻害活性を有する、請求項８に記載の軟骨ポリペプチド。
【請求項１０】
尿酸低下活性を有する、請求項８に記載の軟骨ポリペプチド。
【請求項１１】
非硫酸化二糖（ＣＳ−Ｏ）、Ｃ６位硫酸化二糖（ＣＳ−Ｃ）、及びＣ４位硫酸化二糖（ＣＳ−Ａ）を含有するチュウゴクオオサンショウウオコンドロイチン硫酸を含む、チュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物のアルコール沈殿成分。
【請求項１２】
前記チュウゴクオオサンショウウオコンドロイチン硫酸は、非硫酸化二糖（ＣＳ−Ｏ）、Ｃ６位硫酸化二糖（ＣＳ−Ｃ）、及びＣ４位硫酸化二糖（ＣＳ−Ａ）からなる、請求項１１に記載のチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物のアルコール沈殿成分。
【請求項１３】
前記チュウゴクオオサンショウウオコンドロイチン硫酸の重量平均分子量（Ｍｗ）が、４０ｋＤａ以上、好ましくは４５ｋＤａ以上、より好ましくは４８ｋＤａ以上、最も好ましくは４９．２ｋＤａである、請求項１１に記載のチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物のアルコール沈殿成分。
【請求項１４】
チュウゴクオオサンショウウオから軟骨を取得することと、
取得した軟骨にプロテアーゼにより加水分解を行うことと、
プロテアーゼにより加水分解した後の上澄みを得て、それを乾燥させることと、
プロテアーゼにより加水分解した後の上澄み又はその乾燥物をアルコール沈殿することと、
沈殿画分を得ることと、を含む方法によって得られる、請求項１３に記載のチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物のアルコール沈殿成分。
【請求項１５】
チュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物のアルコール可溶性成分である、ことを特徴とする請求項８に記載の軟骨ポリペプチド。
【請求項１６】
前記可溶性成分はチュウゴクオオサンショウウオから軟骨を取得することと、
取得した軟骨にプロテアーゼにより加水分解を行うことと、
プロテアーゼにより加水分解した後の上澄みを得て、それを乾燥させることと、
プロテアーゼにより加水分解した後の上澄み又はその乾燥物をアルコール沈殿することと、
上澄みを得ることと、を含む方法によって得られる、
請求項１５に記載の軟骨ポリペプチド。
【請求項１７】
前記プロテアーゼはアルカリプロテアーゼであり、好ましく前記アルカリプロテアーゼは２７０９プロテアーゼであり、
ｐＨ  ９〜１１の条件下でプロテアーゼにより加水分解を行う、請求項７に記載のチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物。
【請求項１８】
前記プロテアーゼはアルカリプロテアーゼであり、好ましく前記アルカリプロテアーゼは２７０９プロテアーゼであり、
ｐＨ  ９〜１１の条件下でプロテアーゼにより加水分解を行う、請求項１６に記載の軟骨ポリペプチド。
【請求項１９】
前記プロテアーゼはアルカリプロテアーゼであり、好ましく前記アルカリプロテアーゼは２７０９プロテアーゼであり、
ｐＨ  ９〜１１の条件下でプロテアーゼにより加水分解を行う、請求項１４に記載のチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物のアルコール沈殿成分。
【請求項２０】
アルコール沈殿の操作では、エタノールの質量濃度が５０％−９０％であり、好ましくは、エタノールの質量濃度が７０％である、請求項１４に記載のチュウゴクオオサンショウウオ軟骨酵素分解抽出物のアルコール沈殿成分。
【国際調査報告】
2020531627.tif 000027
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