(57)【要約】  本発明は、12〜18個のヌクレオチドを含み、ヌクレオチドの少なくとも1つが修飾されているオリゴヌクレオチドであって、配列番号1(NM_003873.5)のニューロピリン1(NRP1、CD304)の核酸配列とハイブリダイズし、NRP1発現の少なくとも50%を阻害する、オリゴヌクレオチドに関する。本発明は更に、このようなオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を対象とする。
2020503872.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
12〜18個のヌクレオチドを含み、該ヌクレオチドの少なくとも1つが修飾されているアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、配列番号1(NM_003873.5)のヒトニューロピリン1(NRP1、CD304)の核酸配列とハイブリダイズし、NRP1発現の少なくとも50%を阻害する、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
修飾されたヌクレオチドが、LNA、cET、ENA、2'フルオロ修飾ヌクレオチド、2'O-メチル修飾ヌクレオチド、及びそれらの組合せ等の架橋型核酸からなる群から選択される、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、及びそれらの組合せからなる群から選択される配列を含む配列番号1のNRP1とハイブリダイズする、請求項1又は2に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
+G*+T*+C*T*C*A*A*G*T*C*G*C*+C*+T*+G(A15005HMR),
+A*+A*G*T*C*G*C*C*T*G*C*+A*+T*+C(A15001HMR),
+G*G*A*C*T*T*T*A*T*C*A*C*+T*C*+C(A15006HMR),
+A*+T*+C*C*T*G*T*C*A*T*T*T*A*+G*+C*+T(A15008HMR),
+T*+C*+G*G*A*C*A*A*A*T*C*G*A*+G*+T*+T(A15011HMR),
+A*+T*+C*G*A*G*T*T*A*T*C*A*+G*+T(A15002HMR),
+G*T*T*G*G*C*C*T*G*G*T*+C*G*+T(A15003HMR),
+G*+T*T*A*A*G*G*C*T*T*C*+G*C*+T(A15004HMR),
+T*C*+G*G*A*C*A*A*A*T*C*G*+A*+G*+T(A15007HMR),
+C*+G*+C*C*T*G*C*A*T*C*C*T*G*+T*+C*+A(A15009HMR),
+A*+G*+T*C*G*C*C*T*G*C*A*T*C*+C*+T*+G(A15010HMR),
+T*+T*+C*G*G*A*C*A*A*A*T*C*G*+A*G*+T(A15012HMR),
+A*+A*+T*A*A*G*T*C*C*A*G*A*C*+A*+C*+C(A15013HMR),
+T*+A*+C*T*G*T*C*A*C*T*T*T*A*+A*+C*+C(A15014HMR),
+G*+A*+A*G*C*A*A*T*A*A*T*A*T*+A*+C*+C(A15015HMR),
+G*+G*+C*T*T*C*G*C*T*G*T*T*C*+A*+T*+T(A15016HMR),
+T*+A*+A*G*G*C*T*T*C*G*C*T*G*+T*+T*+C(A15017HMR),
+T*+T*+A*A*G*G*C*T*T*C*G*C*T*+G*+T*+T(A15018HMR),
+C*+G*+C*C*T*G*C*A*T*C*C*T*G*T*+C*+A*+T(A15019HMR),
+T*+C*+G*C*C*T*G*C*A*T*C*C*T*G*T*+C*+A(A15020HMR),
+T*+C*G*C*C*T*G*C*A*T*C*C*T*G*T*C*+A(A15021HMR),
+G*+T*+C*T*C*A*A*G*T*C*G*C*C*T*+G*+C*+A(A15022HMR),
+T*+T*+C*G*G*A*C*A*A*A*T*C*G*A*+G*+T*+T(A15023HMR),
+C*+G*+A*T*C*T*T*G*A*A*C*T*T*C*+C*+T*+C(A15024HMR),
+T*+G*+G*C*A*G*T*T*G*G*C*C*T*G*G*+T*+C(A15025HMR),
（式中、+がLNAヌクレオチドを示し、*がヌクレオチド間のホスホロチオエート(PTO)結合を示す）及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項1から3のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
NRP1の発現をナノモル濃度で阻害する、請求項1から4のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
請求項1から5のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、及び薬学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤、又はそれらの組合せを含む、医薬組成物。
【請求項７】
腫瘍又は眼疾患の治療に有効な、化学療法剤、別のオリゴヌクレオチド、拮抗タンパク質、抗体、及び/又は低分子を更に含む、請求項6に記載の医薬組成物。
【請求項８】
TGF-ベータ受容体I(TβRI)、TGF-ベータ受容体II(TβRII)、VEGF、HGF、PDGF、及びSEMA3(プレキシン)からなる群から選択される増殖受容体等の受容体又はそれらの組合せの活性を更に阻害する、請求項6若しくは7に記載の医薬組成物又は請求項1から5のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
p38MAPK、ERK1、ERK2、PI3K、Akt、NF-κB、pSMAD2、pSMAD3、Src、Pyk2、FAK、p-p130Cas、又はそれらの組合せ等のシグナル伝達因子の活性を更に阻害する、請求項6若しくは7に記載の医薬組成物又は請求項1から5のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
Treg細胞の腫瘍への移行を阻害する、請求項6から9のいずれか一項に記載の医薬組成物又は請求項1から5のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
別のオリゴヌクレオチド、拮抗タンパク質、抗体、及び/又は低分子が、請求項1から5のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドと同一又は異なる増殖受容体又はシグナル伝達因子を阻害する、請求項6から9のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
がん、眼疾患、自己免疫性障害、及び/又は免疫障害の予防及び/又は治療で使用するための、請求項6から11のいずれか一項に記載の医薬組成物又は請求項1から5のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
眼疾患が、加齢黄斑疾患(AMD)、糖尿病性網膜症(DME)、未熟児網膜症(未熟児網膜症)、又は角膜血管新生等の血管新生眼疾患である、請求項12に記載の使用のための医薬組成物又はアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
がんが、膀胱癌、乳がん、大腸癌、肺がん、悪性黒色腫、中皮腫、リンパ腫、皮膚がん、骨がん、前立腺がん、肝臓癌、脳がん、喉頭、肝臓、胆のう、膵臓、精巣、直腸、副甲状腺、甲状腺、副腎、神経組織、頭頸部、結腸、胃、気管支、腎臓のがん、基底細胞癌、神経芽細胞腫、扁平上皮癌、転移性皮膚癌、骨肉腫、ユーイング肉腫、細網肉腫、脂肪肉腫、白血病、骨髄腫、巨細胞腫、小細胞肺腫瘍、膵島細胞腫瘍、原発性脳腫瘍、髄膜腫、急性及び慢性リンパ球性及び顆粒球性腫瘍、急性及び慢性骨髄性白血病、ヘアリー細胞腫瘍、腺腫、肥厚、髄様癌、腸管神経節細胞腫、ウィルムス腫瘍、精上皮腫、卵巣腫瘍、平滑筋腫、子宮頚部形成異常、網膜芽細胞腫、軟部組織肉腫、悪性カルチノイド、局所皮膚病変、横紋筋肉腫、カポジ肉腫、骨原性肉腫、悪性高カルシウム血症、腎細胞腫瘍、真性赤血球増加症、腺癌、退形成性星細胞腫、多形膠芽細胞種、白血病、又は類表皮癌である、請求項12に記載の使用のための医薬組成物又はアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
局所的に又は全身的に投与できる、請求項12から14のいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物又はアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、NRP1(CD304)等のニューロピリン(NRP)の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、並びにこのようなオリゴヌクレオチド並びに薬学的に許容される担体、賦形剤、及び/又は希釈剤を含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ニューロピリン1(NRP1)は、細胞遊走、血管新生、細胞生存、転移、及び細胞増殖を制御する広範なシグナル伝達経路に関与するマルチドメイン受容体である。したがって、NRP1は、広域スペクトルの増殖因子受容体の共同受容体として働くことが示されている(Prud'homme等、Oncotarget、2012年、3(9):921〜939頁)。NRP1の一般的な結合相手は、例えば、TGF-ベータ受容体I及びII;血管内皮増殖因受容体(VEGFR)、血小板由来増殖因子受容体(PDGFR)、並びにプレキシン(セマフォリン受容体)である(Prud'homme等、Oncotarget、2012年、3(9):921〜939頁)。NRP1発現は、制御性T細胞(Treg)等の免疫系の細胞を含む幅広い細胞において報告されている(Prud'homme等、Oncotarget、2012年、3(9):921〜939頁)。一般的に、ニューロピリンは、癌、黒色腫、神経膠芽細胞種、白血病、及びリンパ腫を含む幾つかのヒト腫瘍タイプにおいて過剰発現する。NRP1の過剰発現は、より高い悪性度の臨床的な腫瘍挙動と相関する(Prud'homme等、Oncotarget、2012年、3(9):921〜939頁)。
【０００３】
NRP1はまた、血管の成熟化に関与することも示されている。先の研究によって、未成熟血管が、NRP1の一般的なリガンドである血管内皮増殖因子(VEGF)に依存し、応答することが示されている(Pan等、Cancer Cell、2007年、11(1)、53〜67頁)。したがって、NRP1発現を阻害することは、異常な血管成熟化を防ぎ、血管を未成熟なVEGF依存状態へと強いると考えられる。したがって、抗NRP1と抗VEGFを組み合わせた治療法が、血管新生関連眼科疾患及び腫瘍の治療に有益である。
【０００４】
機能的には、NRP1は、免疫阻害に関連付けられている。幾つかの研究は、制御性T細胞(Treg)がその表面上でNRP1を発現することを示している(Hansen, W.、Oncoimmunology、2013年、2(2)、e230399)。VEGFを産生する腫瘍細胞は、NRP1とVEGFとの相互作用によって、NRP1を発現するTregを誘引する。VEGFが腫瘍血管新生を促進するのに対し、Tregは、例えば免疫抑制性サイトカインを分泌することによって、抗腫瘍免疫応答を妨害する(Hansen等、Oncoimmunology、2013年、2(2)、e230399)。NRP1の阻害は、腫瘍微小環境におけるTregの浸潤を防ぎ、したがって、抗腫瘍免疫応答を改善すると考えられる。
【０００５】
NRP1の活性を阻害するために開発された抗体は少ない。抗ヒトNRP1モノクローナル抗体MNRP1685A(Genentech社)は、NRP1のVEGF結合ドメインを特異的に阻害する。この抗体は、進行固形腫瘍を患う患者の治療のための第I相臨床試験に使用された(Weekes等、Investigational New Drug、2014年、32(4)、653〜660頁)。しかしながら、NRP1をうまく阻害するためには、抗体を比較的高濃度で反復投与することが必要とされる。
【０００６】
更に、抗VEGF抗体アフリベルセプト(Sanofi社)が、病的網膜血管新生を伴う疾患、例えば血管新生(滲出型)加齢黄斑変性(AMD)、糖尿病性網膜症、及び未熟児網膜症を治療する一般的な治療法として用いられる。しかしながら、アフリベルセプトの適用は、アフリベルセプトが、血管新生促進増殖因子として作用する非古典的リガンド(例えば、TGF-ベータ、PDGF、セマフォリン、HGF)のNRP1への結合を阻害することができず、アフリベルセプトが、成熟血管に対し低い活性しか示さないため、限定されている。NRP1活性をうまくブロックするためには、比較的高い濃度での、月1回の硝子体内注入による反復投与が必要とされる。これらの治療法は、患者には非常に不都合であるため、より低い頻度での適用が可能な、改善された治療法を開発する必要性がある。
【０００７】
更に、1つの低分子、EG00229(Tocris社)は、NRP1の受容体アンタゴニストとして作用する。EG00229は、NRP1のb1ドメインへのVEGF-Aの結合を、少なくともインビトロで阻害することが示されている。EG00229は、A549細胞の化学感受性を増強する(Jarvis等、Journal of Medicinal Chemistry、2010年、53(5)、2215〜2226頁)が、その臨床的有効性は、今のところ、インビボでは確定されていない。
【０００８】
US7,087,580は、第一世代修飾、並びに置換、挿入、及び欠失等の変異を含むヒトニューロピリン1とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドに関する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第7,087,580号
【特許文献２】WO2014154843 A1
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Prud'homme等、Oncotarget、2012年、3(9):921〜939頁
【非特許文献２】Pan等、Cancer Cell、2007年、11(1)、53〜67頁
【非特許文献３】Hansen, W.、Oncoimmunology、2013年、2(2)、e230399
【非特許文献４】Weekes等、Investigational New Drug、2014年、32(4)、653〜660頁
【非特許文献５】Jarvis等、Journal of Medicinal Chemistry、2010年、53(5)、2215〜2226頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
NRP1は、部分的に重なった、様々なリガンド及び共同受容体の結合部位を幾つか含んでいる。1つの抗体、第一世代オリゴヌクレオチド、及び/又は低分子を使用する一般的な手法は、このようなマルチドメイン受容体の全ての相互作用部位をブロックすることができないか、ほとんどブロックしない。抗体をベースとした治療法では、複数の抗体を投与することが必要であると考えられる。したがって、NRP1等の受容体が媒介する機能全体を、同時に阻害するのに安全且つ有効な薬剤を、例えばNRP1及びその血管新生促進リガンドの活性によって影響を受けた疾患又は状態を患う患者の治療に加えることが重要であると考えられる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明のオリゴヌクレオチドは、NRP1の発現及び活性を、それぞれ、非常にうまく阻害する。オリゴヌクレオチドの作用の様式は、抗体又は低分子の作用の様式とは異なり、オリゴヌクレオチドは、例えば、
(i)標的の複数の機能及び活性を、それぞれ遮断する、
(ii)その分子サイズが小さいため、固形腫瘍中の腫瘍組織へ浸透する、
(iii)オリゴヌクレオチドと、オリゴヌクレオチド同士、又は抗体若しくは低分子との組合せ、及び
(iv)抗体が接近できない又は低分子を介して阻害できない、細胞内作用の阻害
という点で、非常に好都合である。
【００１３】
本発明のオリゴヌクレオチドは、そのより高い安定性、より強力な標的親和性及び効力のため、並びに、それらが送達試薬に依存することなく細胞での標的抑制を達成するため、第一世代オリゴヌクレオチドと比較して好都合である。
【００１４】
本発明は、約12〜18個のヌクレオチドを含み、ヌクレオチドの少なくとも1つが修飾されているオリゴヌクレオチドに関する。このオリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号1(NM_003873.5)のヒトニューロピリン1(NRP1、CD304)の核酸配列とハイブリダイズする。更に、このオリゴヌクレオチドは、対応するマウス及びラット配列と交差反応性である。修飾されたヌクレオチドは、例えば、架橋型核酸(例えば、LNA、cET、ENA、2'フルオロ修飾ヌクレオチド、2'O-メチル修飾ヌクレオチド、又はそれらの組合せ)からなる群から選択される。本発明のオリゴヌクレオチドは、NRP1発現の、例えば少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、又は少なくとも99%、例えば50〜99%、55〜95%、60%〜90%、又は65〜85%を阻害する。本発明のオリゴヌクレオチドは、例えばNRP1の発現をナノモル濃度で阻害する。
【００１５】
本発明は、本発明のオリゴヌクレオチド、及び任意選択で薬学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤、又はそれらの組合せを含む医薬組成物を更に対象とする。一部の実施形態において、この医薬組成物は、例えば腫瘍治療において又は眼疾患の治療に有効な、化学療法剤、別のオリゴヌクレオチド、融合タンパク質等の拮抗タンパク質、抗体、及び/又は低分子を追加的に含む。
【００１６】
一部の実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、医薬組成物中で、別のオリゴヌクレオチド、融合タンパク質等の拮抗タンパク質、抗体、及び/又は低分子の各化合物の個々又は組合せのいずれかと組み合わされており、ここで、本発明のオリゴヌクレオチドは、TGF-ベータ受容体I(TβRI)、TGF-ベータ受容体II(TβRII)、VEGF、HGF、PDGF、及びSEMA3(プレキシン)の受容体からなる群から選択される増殖受容体等の受容体又はそれらの組合せの活性を阻害する。
【００１７】
一部の実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、医薬組成物の中で、別のオリゴヌクレオチド、融合タンパク質等の拮抗タンパク質、抗体、及び/又は低分子の各化合物の個々又は組合せのいずれかと組み合わされており、ここで、本発明のオリゴヌクレオチドは、p38MAPK、ERK1、ERK2、PI3K、Akt、NF-κB、pSMAD2、pSMAD3、Src、Pyk2、FAK、p-p130Cas、又はそれらの組合せ等のシグナル伝達因子の活性を阻害する。
【００１８】
一部の実施形態において、本発明は、別のオリゴヌクレオチド、融合タンパク質等の拮抗タンパク質、抗体、及び/又は低分子が、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドと同一又は異なる増殖受容体又はシグナル伝達因子を阻害する、本発明の医薬組成物に関する。
【００１９】
更に、本発明は、Treg細胞の腫瘍への移行を阻害する、本発明のオリゴヌクレオチド又は医薬組成物に関する。
【００２０】
更に、本発明は、がん、眼疾患、自己免疫性障害、及び/又は免疫障害を予防及び/又は治療する方法における、本発明のオリゴヌクレオチド又は医薬組成物の使用に関する。一部の実施形態において、障害は、例えば、加齢黄斑疾患(AMD)、糖尿病性網膜症(DME)、未熟児網膜症(Retinopathia praematurorum)、又は角膜血管新生(nv)、例えばヘルペス性及び梅毒性実質角膜炎にみられるデスメ膜を覆う深いnv;例えば(ほとんどの)形態の実質角膜炎に関連した角膜実質nv;並びに例えば表層角膜周辺で増殖する結合組織から構成され、例えば眼表面疾患に関連する血管パンヌス、等の血管新生眼疾患である。一部の実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチド又は医薬組成物は、例えば、局所的又は全身的に投与される。
【００２１】
本明細書において引用又は参照された全ての文書(「本明細書で引用された文書」)、及び本明細書で引用された文書おいて引用又は参照された全ての文書、並びに本明細書で又は本明細書に参照により組み込まれる任意の文書で言及された任意の製品のためのあらゆる製造業者の指示書、説明書、製品仕様書、及びプロダクトシートは、これによって参照により本明細書に組み込まれ、本発明の実施に際して用いてもよい。より具体的には、参照された文書は全て、個々の文書がそれぞれに参照により組み込まれることが具体的且つ個々に示された場合と同程度に参照により組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１Ａ】ヒト(h)NRP1(配列番号1;参照NM_003873.5)のmRNA配列を示す図である。
【図１Ｂ】図１Ａの続きである。
【図２】配列番号1(NM_003873.5)のhNRP1 mRNA上のhmr(ヒト、マウス、及びラット交差反応性)NRP1アンチセンスオリゴヌクレオチド結合部位の分布、並びにその修飾及び長さを示す図である。hmrNRP1アンチセンスオリゴヌクレオチドを、配列番号1のhNRP1 mRNA配列に整列させた。異なる灰色のスケールは異なるLNA修飾を示し、記号はアンチセンスオリゴヌクレオチドの異なる長さを示す。
【図３Ａ】ヒトがん細胞株SKOV-3(ヒト卵巣腺癌)における、hmrNRP1アンチセンスオリゴヌクレオチドのhmrNRP1 mRNAノックダウン有効性示す図である。SKOV-3細胞は、10μMの各アンチセンスオリゴヌクレオチドで3日間処理した。陰性対照として、細胞を、配列CGTTTAGGCTATGTACTTを有するアンチセンスオリゴヌクレオチドneg1(WO2014154843A1に記載される)のいずれかで処理した。無処理細胞と比較した残存するヒトNRP1 mRNA発現を示す。発現値は、ハウスキーピング遺伝子HPRT1の発現に対して正規化した。
【図３Ｂ】マウスがん細胞株Renca(腎細胞癌)における、hmrNRP1アンチセンスオリゴヌクレオチドのhmrNRP1 mRNAノックダウン有効性示す図である。Renca細胞は、10μMの各アンチセンスオリゴヌクレオチドで3日間処理した。陰性対照として、細胞を、配列CGTTTAGGCTATGTACTTを有するアンチセンスオリゴヌクレオチドneg1(WO2014154843 A1に記載される)のいずれかで処理した。無処理細胞と比較した残存するマウスNRP1 mRNA発現を示す。発現値は、ハウスキーピング遺伝子HPRT1の発現に対して正規化した。
【図３Ｃ】セルタイターブルーアッセイによって決定した場合の、マウスRenca細胞の、hmrNRP1アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理後の生存率を示す図である。
【図４】SKOV-3及びRenca細胞におけるNRP1アンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性の相関分析を示す図である。
【図５】Renca細胞における、A15001HMR(配列番号3)及びA15005HMR(配列番号2)である選択されたhmrNRP1アンチセンスオリゴヌクレオチドによる濃度依存性mNRP1 mRNAノックダウンを示す図である。Renca細胞は、示した濃度の各アンチセンスオリゴヌクレオチドで3日間処理した。無処理の対照細胞と比較した残存mNRP1発現を示す。mNRP1 mRNA発現値は、ハウスキーピング遺伝子HPRT1の発現に対して正規化した。濃度依存性標的ノックダウンは、Table 4(表4)に示したIC50値の算出に使用した。
【図６Ａ】A15001HMR(配列番号3)、A15005HMR(配列番号2)A15006HMR(配列番号4)、A15008HMR(配列番号5)、A15011HMR(配列番号6)による濃度依存性hNRP1タンパク質ノックダウンを示す図である。SKOV-3細胞において、示したアンチセンスオリゴヌクレオチドで3+3日間処理した後、フローサイトメトリーによるNRP1タンパク質発現の分析を実施した。対照として、細胞を、示した濃度のスクランブル6(S6;配列番号28)で3+3日間処理した。無処理細胞(1と設定した)と比較した相対発現を示す。
【図６Ｂ】フローサイトメトリーを使用する7-AAD染色によって決定した場合の、無処理細胞と比較した、生存率に対するオリゴヌクレオチド処理の影響を示す図である。
【図７】図7A：A15005HMR(配列番号2)による濃度依存性mNRP1タンパク質ノックダウンを示す図である。Renca細胞において、示したアンチセンスオリゴヌクレオチドで3日間処理した後、フローサイトメトリーによるmNRP1タンパク質発現の分析を実施した。処理対照として、細胞を、示した濃度のスクランブル6(S6;配列番号28)で3日間処理した。無処理細胞(1と設定した)と比較した相対発現を示す。図7B：フローサイトメトリーを使用する7-AAD染色によって決定した場合の、無処理細胞と比較した、生存率に対するオリゴヌクレオチド処理の影響を示す図である。
【図８】図8A：一般的なニューロピリンのドメイン構造を示す図である(Prud'homme G及びGlinka Y、Oncotarget、2012年、3:921〜939頁を参照されたい)。図8B：複数の増殖因子との相互作用の仮説モデルを示す図である(Prud'homme G及びGlinka Y、Oncotarget、2012年、3:921〜939頁を参照されたい)。
【図９】A15005HMR(配列番号2)又は陰性対照オリゴヌクレオチドS5(配列番号29)のいずれかを硝子体内に単回注入した3日後又は10日後の、C57BL/6マウス由来網膜におけるNRP1 mRNA発現レベルを示す図である。発現値は、ハウスキーピング遺伝子HPRT1の発現値に対して正規化した。
【図１０】A15005HMR(配列番号2)又は陰性対照オリゴヌクレオチドS5(配列番号29、16〜18個の眼／群)のいずれかを硝子体内に単回注入して処理した24日後の、C57BL/6マウス由来網膜におけるNRP1 mRNA発現レベルを示す図である(16〜18個の眼/群)。発現値は、ハウスキーピング遺伝子HPRT1の発現値に対して正規化した。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明はヒト、マウス、及び/又はラットのNRP1等のニューロピリンのmRNA配列とハイブリダイズし、NRP1の発現及び活性をそれぞれ阻害する、ヒト、マウス及びラット特異的オリゴヌクレオチドを提供する。マルチドメイン受容体としてのNRP1は、幾つかの異なるタイプのリガンド、並びに細胞遊走、血管新生、細胞生存、転移、及び細胞増殖に関連する受容体に結合する(図8を参照されたい)。NRP1の多くのリガンドは、血管新生促進増殖因子として作用する。したがって、NRP1の発現を阻害することによって、NRP1の広域スペクトルの様々な活性を同時に標的とすることが可能となり、これによって、治療法成功の実現可能性が著しく高まる。したがって、本発明は、NRP1発現の少なくとも50%を阻害するオリゴヌクレオチドに関する。これらは、がん、眼疾患、自己免疫性障害、及び/又は免疫障害を、予防及び/又は治療する方法で使用する興味深く、非常に効率的なツールである。
【００２４】
以下に、本発明の要素を更に詳しく説明する。これらの要素を特定の実施形態と共に列記するが、これらは、更なる実施形態を創出するあらゆる方法及びあらゆる数で組み合わせてよいことを理解されたい。様々に記載された実施例及び実施形態は、明確に記載された実施形態だけに本発明を限定すると解釈されるべきではない。この説明は、明確に記載された実施形態を、任意の数の開示された要素と組み合わせる実施形態を支持し包含すると理解されるべきである。更に、本出願に記載された全ての要素の任意の順列及び組合せは、別段の指示がない限り、本出願の記載により開示されたとみなされるべきである。
【００２５】
本明細書及び特許請求の範囲を通して、別段の断りがない限り、「含む(comprise)」という単語、並びに「含む(comprises)」及び「含むこと(comprising)」等の変形は、明記された部材、完全体、若しくは工程、又は部材、完全体、若しくは工程の群を含むことであるが、任意の他の部材、完全体、若しくは工程、又は部材、完全体、若しくは工程の群を除外しないことを意味することが理解されると予想される。「1つの(a)」及び「1つの(an)」並びに「その(the)」という用語、並びに本発明の記載の関連において(特に特許請求の範囲の関連において)使用される同様の言及は、本明細書において別段の指示がない限り又は文脈による明確な否定がない限り、単数及び複数の両方を包含すると解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、範囲内に入る個々の各値に個別に言及する簡潔な方法として役立つことを意図しているにすぎない。本明細書において別段の指示がない限り、個別の各値は、それが本明細書で個々に列挙されたかのように、本明細書に組み込まれる。本明細書に記載の全ての方法は、本明細書において別段の指示がない限り又は文脈による明確な否定がない限り、任意の好適な順序で実施することができる。本明細書において提供された、任意及び全ての例、又は例示的な言葉(例えば、「等の」、「例えば」)の使用は、本発明をより良く例証することを意図しているにすぎず、別段の主張がない限り、本発明の範囲に限定をもたらすものではない。本明細書中のいずれの言葉も、特許請求されていない要素が本発明の実施に必須であることを示すものとして解釈されるべきではない。
【００２６】
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、10〜25個のヌクレオチド、10〜15個のヌクレオチド、15〜20個のヌクレオチド、12〜18個のヌクレオチド、若しくは14〜17個のヌクレオチドからなる、又は該ヌクレオチドを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは、例えば、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、若しくは25個のヌクレオチドからなる、又は該ヌクレオチドを含む。本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、少なくとも1つの修飾されたヌクレオチドを含む。修飾されたヌクレオチドは、例えば、ロックド核酸(LNA、例えば、2',4'-LNA)、cET、ENA、2'フルオロ修飾ヌクレオチド、2'O-メチル修飾ヌクレオチド、又はそれらの組合せ等の架橋型ヌクレオチドである。一部の実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、同じ又は様々な修飾を有するヌクレオチドを含む。本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、リン酸が例えばホスホロチオエートである、修飾されたリン酸骨格を更に含む。
【００２７】
本発明のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの3'及び/若しくは5'末端に、並びに/又はオリゴヌクレオチド内の任意の位置に1つ又は複数の修飾されたヌクレオチドを含み、修飾されたヌクレオチドは1、2、3、4、5、又は6個の修飾されたヌクレオチドの列で続いている、又は1つの修飾されたヌクレオチドが1つ又は複数の未修飾のヌクレオチドと組み合わさっている。以下のTable 1(表1)は、修飾されたヌクレオチド、例えば(+)で示したLNA及び(*)で示したホスホロチオエート(PTO)を含むオリゴヌクレオチドの実施形態を示す。Table 1(表1)の配列からなる又はTable 1(表1)の配列を含むオリゴヌクレオチドは、任意の他の修飾されたヌクレオチド、及び修飾されたヌクレオチドと未修飾のヌクレオチドの任意の他の組合せを含んでもよい。Table 1(表1)のオリゴヌクレオチドは、ヒト、マウス、及びラットNRP1のmRNAとハイブリダイズする。
【００２８】
【表１】
2020503872.tif 000003
【００２９】
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号1のヒト、マウス、又はラットNRPのmRNAとハイブリダイズする。このようなオリゴヌクレオチドを、NRPアンチセンスオリゴヌクレオチドと呼ぶ。オリゴヌクレオチドは、例えば配列番号1のNRP1 mRNAの303位から5730位の範囲内でハイブリダイズする。
【００３０】
一部の実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、ヒト、ラット、又はマウスNRP1等のNRP発現の、少なくとも約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%を阻害する。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば細胞、組織、器官、又は対象における、NRP1の発現及び活性を阻害するオリゴヌクレオチドである。本発明のオリゴヌクレオチドは、NRP1等のNRPの発現を、ナノモル又はマイクロモル濃度で、例えば、0.1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、若しくは950nM、又は1、10、若しくは100μMの濃度で阻害する。
【００３１】
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、1、3、5、9、10、15、27、30、40、50、75、82、100、250、300、500、若しくは740nM、又は1、2.2、3、5、6.6、若しくは10μMの濃度で使用される。
【００３２】
一部の実施形態において、本発明は、本発明のオリゴヌクレオチド、並びに薬学的に許容される担体、賦形剤、及び/又は希釈剤を含む、医薬組成物に関する。医薬組成物は、例えば、化学療法剤、本発明由来又は本発明とは異なるいずれかの別のオリゴヌクレオチド、融合タンパク質等の拮抗タンパク質、抗体、及び/又は低分子を更に含む。
【００３３】
一部の実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチド又は医薬組成物は、障害を予防及び/又は治療する方法において使用される。一部の実施形態において、障害を予防及び/又は治療する方法における本発明のオリゴヌクレオチド又は医薬組成物の使用は、放射線療法及び/又はレーザー治療と組み合わされる。放射線療法は、化学療法(例えば、白金、ゲムシタビン)と更に組み合わせてもよい。障害は、例えば、NRP不均衡、すなわちNRPレベルが正常な健康細胞、組織、器官、又は対象におけるレベルと比較して上昇していることを特徴とする。NRPレベルは、例えば、NRP1等のNRP発現及び活性がそれぞれ上昇することによって上昇する。NRPレベルは、当業者に公知の免疫組織化学的検査、ウェスタンブロット、フローサイトメトリー、定量的リアルタイムPCR、又はQuantiGeneアッセイ等の任意の標準方法によって測定することができる。
【００３４】
本発明のオリゴヌクレオチド、及び本発明のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物は、例えば、1、2、3、4、5、若しくは6日間、1、2、若しくは3週間、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11カ月、又は1若しくは2年間、NRP1発現に対する阻害効果を有する。本発明のオリゴヌクレオチドの治療効果は、例えば、阻害効果の持続期間と対応する。
【００３５】
本発明のオリゴヌクレオチド又は医薬組成物は、局所的又は全身的に、例えば、硝子体内、前房内、又は結膜下への例えば点眼剤による局所的な注入、経口的、舌下、経鼻的、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、腫瘍内、髄腔内、経皮的、及び/又は直腸に投与される。別法として、又は併せて、生体外で処理した免疫細胞が投与される。オリゴヌクレオチドは、単独で、又は、本発明の別のオリゴヌクレオチドと組み合わせて、任意選択で別のオリゴヌクレオチド、融合タンパク質等の拮抗タンパク質、抗体、低分子、及び/若しくは化学療法剤(例えば、白金、ゲムシタビン)等の別の化合物と組み合わせて投与される。一部の実施形態において、別のオリゴヌクレオチド(すなわち、本発明の一部ではない)、融合タンパク質等の拮抗タンパク質、抗体、及び/又は低分子は、がん、眼疾患、自己免疫性障害、及び/又は免疫障害の予防及び/又は治療に有効である。本発明のオリゴヌクレオチド又は医薬組成物は、例えば、固形腫瘍又は血液腫瘍を予防及び/又は治療する方法において使用される。本発明のオリゴヌクレオチド又は医薬組成物の使用によって予防及び/又は治療できるがんの例は、膀胱癌、乳がん、大腸癌、肺がん、悪性黒色腫、中皮腫、リンパ腫、皮膚がん、骨がん、前立腺がん、肝臓癌、脳がん、喉頭、肝臓、胆のう、膵臓、精巣、直腸、副甲状腺、甲状腺、副腎、神経組織、頭頸部、結腸、胃、気管支、腎臓のがん、基底細胞癌、神経芽細胞腫、扁平上皮癌、転移性皮膚癌、骨肉腫、ユーイング肉腫、細網肉腫、脂肪肉腫、白血病、骨髄腫、巨細胞腫、小細胞肺腫瘍、膵島細胞腫瘍、原発性脳腫瘍、髄膜腫、急性及び慢性リンパ球性及び顆粒球性腫瘍、急性及び慢性骨髄性白血病、ヘアリー細胞腫瘍、腺腫、肥厚、髄様癌、腸管神経節細胞腫、ウィルムス腫瘍、精上皮腫、卵巣腫瘍、平滑筋腫、子宮頚部形成異常、網膜芽細胞腫、軟部組織肉腫、悪性カルチノイド、局所皮膚病変、横紋筋肉腫、カポジ肉腫、骨原性肉腫、悪性高カルシウム血症、腎細胞腫瘍、真性赤血球増加症、腺癌、退形成性星細胞腫、多形膠芽細胞種、白血病、又は類表皮癌である。
【００３６】
一部の実施形態において、2つ以上の発明のオリゴヌクレオチドが、例えば医薬組成物中で同時に、若しくは別々に、又は間隔をずらして、一緒に投与される。他の実施形態において、1つ又は複数の本発明のオリゴヌクレオチドが、別のオリゴヌクレオチド(すなわち、本発明の一部ではない)、融合タンパク質等の拮抗タンパク質、抗体、低分子、及び/又は化学療法剤等の別の化合物と、例えば医薬組成物中で同時に、若しくは別々に、又は間隔をずらして、一緒に投与される。これらの組合せの一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、増殖受容体等の受容体の発現及び活性をそれぞれ阻害し、別のオリゴヌクレオチド(すなわち、本発明の一部ではない)、融合タンパク質等の拮抗タンパク質、抗体、及び/又は低分子は、(アンタゴニストである)同一の又は異なる増殖受容体を阻害し、又はそれは、(アンタゴニストである)シグナル伝達因子を阻害する。増殖受容体は、例えば、TGF-ベータ受容体I(TβRI)、TGF-ベータ受容体II(TβRII)、又はVEGF、HGF、PDGF、及び/若しくはSEMA3(プレキシン)の受容体である。シグナル伝達因子は、例えば、p38MAPK、ERK1、ERK2、PI3K、Akt、NF-κB、pSMAD2、pSMAD3、Src、Pyk2、FAK、及び/又はp-p130Casである。
【００３７】
本発明のオリゴヌクレオチド又は医薬組成物と組み合わされる抗体は、例えば、MNRP1685A(Genentech社)等の抗NRP1抗体、アフリベルセプト等のVEGF融合タンパク質、及び/又は二重特異性抗体である。本発明のオリゴヌクレオチド又は医薬組成物と組み合わされる低分子は、例えばEG00229(Tocris社)である。AMD又はDME等の眼疾患の場合、本発明のオリゴヌクレオチドは、抗VEGF抗体若しくは融合タンパク質等の拮抗タンパク質、レーザー療法、並びに/又はコルチゾール(C21H30O5)、コルチコステロン(C21H30O4)、コルチゾン(C21H28O5)、及び/若しくはアルドステロン(C21H28O5)等の副腎皮質ステロイドと組み合わせてもよい。
【００３８】
本発明の対象は、例えば、哺乳動物、トリ、又は魚である。
【実施例】
【００３９】
以下の実施例は、本発明の様々な実施形態を例証するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【００４０】
(実施例1)
ヒト、マウス、及びラットNRP1アンチセンスオリゴヌクレオチドの設計
ヒト(h)、マウス(m)、ラット(r)NRP1に対する特異性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計のために、配列番号1を含むhNRP1 mRNA配列(配列参照番号NM_003873.5;図1)を使用した。14、15、16、及び17merを、インハウスの基準に従って設計し、neg1(WO2014154843 A1に記載)、スクランブル6(S6)又はスクランブル5(S5)(Table 1(表1))を、各実験において指示した対照アンチセンスオリゴヌクレオチドとして使用した。hNRP1 mRNA上のアンチセンスオリゴヌクレオチド結合部位の分布を図2に示す。
【００４１】
(実施例2)
ヒト及びマウスがん細胞株におけるhmrNRP1アンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性のスクリーニング
がん細胞株におけるヒト及びマウスNRP1 mRNA発現のノックダウンに関して、本発明のhmrNRP1アンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性を分析するために、SKOV-3(ヒト卵巣腺癌)及びRenca(マウス腎細胞癌)細胞を、図3A及び図3Bに示すように、10μMの1種類の濃度の各アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した(遺伝子導入試薬は何も添加しない。この方法はジムノティック送達という)。3日後、ヒト及びマウスNRP1並びにHPRT1 mRNA発現を、QuantiGene Singleplexアッセイ(Affymetrix社)を使用して分析し、hmNRP1発現値を、HPRT1値に対して正規化した。際立ったことに、図3A(SKOV-3細胞)及び図3B(Renca細胞)に示されるように、80%超のノックダウン効率が、それぞれ、2個及び13個のアンチセンスオリゴヌクレオチドで観察された。以下に、SKOV-3(Table 2(表2))及びRenca細胞(Table 3(表3))の、無処理細胞と比較した、hmNRP1のmRNA発現を正規化した平均の値を列記する。
【００４２】
【表２】
2020503872.tif 000004
【００４３】
【表３】
2020503872.tif 000005
【００４４】
(実施例3)
ヒトSKOV-3及びマウスRenca細胞におけるアンチセンスオリゴヌクレオチド有効性の相関分析
SKOV-3及びRenca細胞の両被験細胞株において、最も高い活性を有する候補を更に選択するために、相関分析を実施した(データは図3A及び図3Bから得た)。図4に示したように、5つの強力なアンチセンスオリゴヌクレオチド、すなわち、A15001HMR(配列番号3)、A15005HMR(配列番号2)、A15006HMR(配列番号4)、A15008HMR(配列番号5)、及びA15011HMR(配列番号6)を、更なる調査のために選択した。重要なことには、対照アンチセンスオリゴヌクレオチドneg1は、両細胞株においてhmrNRP1の発現に対して負の効果をもっていなかった。
【００４５】
(実施例4)
Renca細胞における選択したhmrNRP1アンチセンスオリゴヌクレオチドのIC50決定(mRNAレベル)
hmrNRP1アンチセンスオリゴヌクレオチドA15005HMR(配列番号2)及びA15001HMR(配列番号3)のIC50を決定するために、Renca細胞を、10μM、5μM、1μM、500nM、及び100nMの各濃度の各アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した。マウス(m)NRP1 mRNA発現は、オリゴヌクレオチド処理の開始3日後に分析した。図5及び以下のTable 4(表4)に示されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドA15001HMR(配列番号3)及びA15005HMR(配列番号2)は、無処理細胞と比較して、mNRP1 mRNAの下方調節に関してRenca細胞において高い効力を有し、それぞれ、90.2%及び92.8%の最大標的阻害率であった。Table 4(表4)に、Renca細胞における、上記で言及した選択したアンチセンスオリゴヌクレオチドのIC50値及び標的阻害率を示す。
【００４６】
【表４】
2020503872.tif 000006
【００４７】
(実施例5)
A15001HMR(配列番号3)、A15005HMR(配列番号2)、A15006HMR(配列番号4)、A15008HMR(配列番号5)、及びA15011HMR(配列番号6)による濃度依存性hNRP1タンパク質ノックダウン
非常に強力なhmrNRP1アンチセンスオリゴヌクレオチド、A15001HMR(配列番号3)、A15005HMR(配列番号2)、A15006HMR(配列番号4)、A15008HMR(配列番号5)、A15011HMR(配列番号6)を、ヒトSKOV-3細胞において、hNRP1タンパク質発現に対するそれらのノックダウン有効性、及び細胞生存率に対する様々な濃度でのそれらの効果に関して、詳細に特徴付けた。したがって、SKOV-3細胞を、様々な濃度の各アンチセンスオリゴヌクレオチドで3日間処理し、次いで、培地を変え、更に3日間にわたり新鮮なオリゴヌクレオチドを各濃度で添加した。6日間の全処理期間の後、タンパク質発現を、抗ヒトNRP1抗体(クローン12C2)を使用してフローサイトメトリーによって分析し、細胞生存率を7-AAD染色を使用して分析した。図6Aに示されるように、3+3日後、A15001HMR(配列番号3)、A15005HMR(配列番号2)、及びA15011HMR(配列番号6)アンチセンスオリゴヌクレオチドが、SKOV-3細胞においてhNRP1タンパク質の強力で濃度依存性阻害を示しているのに対し、S6での処理は阻害効果をもたなかった。図6Bは、オリゴヌクレオチド処理が細胞生存率に対して大きな影響を及ぼさなかったことを示している。図6及び以下のTable 5(表5)に示されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドA15001HMR(配列番号3)、A15005HMR(配列番号2)、及びA15011HMR(配列番号6)は、無処理細胞と比較して、hNRP1タンパク質の下方調節に関して、SKOV-3細胞において最も高い効力を有し、それぞれ、71.99%、58.44%、及び65.78%の最大標的阻害率であった。Table 5(表5)に、SKOV-3細胞における、選択したヒトNRP1アンチセンスオリゴヌクレオチドA15001HMR(配列番号3)、A15005HMR(配列番号2)、A15006HMR(配列番号4)、A15008HMR(配列番号5)、及びA15011HMR(配列番号6)のタンパク質ノックダウン効率をまとめる。
【００４８】
【表５】
2020503872.tif 000007
【００４９】
更に、マウス細胞におけるA15005HMR(配列番号2)のタンパク質ノックダウン有効性を検討した。したがって、マウスRenca細胞を様々な濃度のA15005HMR(配列番号2)で処理し、3日後、タンパク質発現を、抗マウスNRP1抗体(クローン3DS304M)、を使用してフローサイトメトリーによって分析し、生存率を7-AADを使用して検討した。3日後、A15005HMR(配列番号2)は、図7Bに示されるように、いずれの試験条件でもRenca細胞の生存率に影響を及ぼすことなく、図7Aに示されるように、Renca細胞においてmNRP1タンパク質発現の強力な濃度依存性阻害を示している。
【００５０】
(実施例6)
処理3日後及び10日後のC57BL/6マウスの網膜におけるアンチセンスオリゴヌクレオチド媒介NRP1 mRNAノックダウン
インビボでのC57BL/6マウスの網膜におけるNRP1 mRNAノックダウンを、ヒト-マウス交差反応性アンチセンスオリゴヌクレオチドA15005HMR(配列番号2)の100μM溶液1μlを硝子体内に単回注入して3日後及び10日後に分析した。対照として、ヒト又はマウスのどのmRNAに対しても配列相補的性を有さないオリゴヌクレオチドS5(配列番号29)を、対側の眼へ注入した。図9に示した結果から、対照オリゴヌクレオチドS5で処理したマウスの網膜と比較して、A15005HMRで処理したマウスの網膜におけるNRP1 mRNAの有意なノックダウン(p=0.0172)が明らかとなった。発現値は、ハウスキーピング遺伝子HPRT1の発現値に対して正規化した。この阻害効果は、3日後より10日後のほうが顕著であった。
【００５１】
(実施例7)
処理24日後のC57BL/6マウスの網膜におけるアンチセンスオリゴヌクレオチド媒介NRP1 mRNAノックダウン
図9に示した結果から、硝子体内に単回注入して10日後のインビボでのA15005HMRによるNRP1 mRNAの効率的なノックダウンが明らかとなった。これより後の時点での標的ノックダウンを検討するために、C57BL/6マウスを、100μMオリゴヌクレオチド溶液1μlの硝子体内への単回注入によって、A15005HMR(配列番号2)又は対照アンチセンスオリゴヌクレオチドS5(配列番号29)で処理した。24日後、網膜を単離した。図10に示した結果から、対照オリゴヌクレオチドS5と比較して中央値が約40%低減した、A15005HMRによる網膜NRP1 mRNAレベルの有意なノックダウン(p=0.0057)が明らかとなった。発現値は、ハウスキーピング遺伝子HPRT1の発現値に対して正規化した。したがって、これらの結果は、A15005HMRが、インビボでの硝子体内への単回注入後、少なくとも24日間持続して網膜におけるNRP1 mRNA発現を有意に阻害することを示している。
【図１Ａ】
2020503872.tif 000008
【図１Ｂ】
2020503872.tif 000009
【図２】
2020503872.tif 000010
【図３Ａ】
2020503872.tif 000011
【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
2020503872.tif 000015
【図６Ａ】
2020503872.tif 000016
【図６Ｂ】
2020503872.tif 000017
【図７】
2020503872.tif 000018
【図８】
2020503872.tif 000019
【図９】
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【図１０】
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【配列表】
2020503872000001.app
【国際調査報告】
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