(57)【要約】方法は遺伝子ＣＡＳＰ３とＴＨＢＤの発現を高め；および、遺伝子ＣＯＬ１８Ａ１、ＣＰＢ２、ＮＰＲ１、ＯＣＬＮ、ＢＭＰ２、ＣＬＣＬ６、ＩＬ１２Ｂ、ＳＥＬＰＬＧ、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＡＳＰ３、ＴＨＢＤ、ＣＯＬ１８Ａ１、ＣＰＢ２、ＮＰＲ１、ＣＬＤＮ５、ＣＬＤ３、ＰＩＧＦ、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＶＥＧＦ−Ａ、ＣＡＭ−１、ＰＧＦ、ＦＯＸ−０１、ＦＯＸ−０４、ＰＤＧＦＢ、ＴＧＦＡ、ＨＧＦ、ＶＥ−カドヘリン、またはＰＬＡＵの発現を低下させるために提供される。その結果、これらの遺伝子の発現に関係する疾病が処置される。カスパーゼ３は、ＣＡＳＰ３（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＧＣＡ＿０００００１４０５．２２）によってコードされ、およびカスパーゼ６と７を切断して活性化し；タンパク質自体は、カスパーゼ８、９、および１０によって処理され、活性化される。カスパーゼ３は、アミロイド−ベータ４Ａ前駆体タンパク質の切断に関与する主要なカスパーゼであり、これは、アルツハイマー病と脊髄損傷後のニューロン死に関係している。カスパーゼ３はアポトーシスに関与しているため、ＣＡＳＰ３のアップレギュレーションは、機能障害細胞の排除を引き起こすために使用することができる。【選択図】図１
2020518675.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管バリアを処置する方法であって、該方法は：
ノリンに血管を暴露する工程；および
前記ノリンに十分な時間、ＢＭＰ２、ＣＬＣＬ６、ＩＬ１２Ｂ、ＳＥＬＰＬＧ、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＡＳＰ３、ＴＨＢＤ、ＣＯＬ１８Ａ１、ＣＰＢ２、ＮＰＲ１、ＢＭＰ２、ＣＬＣＬ６、ＩＬ１２Ｂ、ＳＥＬＰＬＧ、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＡＳＰ３、ＴＨＢＤ、ＣＯＬ１８Ａ１、ＣＰＢ２、ＮＰＲ１、ＣＬＤＮ５、ＣＬＤ３、ＰＩＧＦ、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＶＥＧＦ−Ａ、ＣＡＭ−１、ＰＧＦ、ＦＯＸ−０１、ＦＯＸ−０４、ＰＤＧＦＢ、ＴＧＦＡ、ＨＧＦ、ＶＥ−カドヘリン、またはＰＬＡＵの少なくとも１つの遺伝子の遺伝子発現を調節させる工程、
を含む、方法。
【請求項２】
前記遺伝子のすべてが、前記ノリンによって調節される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
血管バリアは、被験体のインビボの網膜血管である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
被験体は、加齢黄斑変性または増殖性網膜症を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
暴露する工程は、眼内注入によるものである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
暴露する工程は、全身性の投与によるものである、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記被験体はヒトである、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記被験体は、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、マウス、モルモット、ハムスター、ウサギ、ラット、または前述のものの１つに由来する細胞のうちの１つである、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記ノリンは、ＳＥＱ  ＩＤ．ＮＯ．２のポリペプチドである、請求項１−８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１０】
前記ノリンは、網膜血管細胞のｆｒｉｚｚｌｅｄ−４受容体を結合する、ＳＥＱ  ＩＤ．ＮＯ．１のフラグメントである、請求項１−８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１１】
前記ノリンは組換えである、請求項１−８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１２】
前記ノリンに十分な時間、遺伝子発現を調節させた後に、網膜血管細胞に染料を接触させる工程をさらに含む、請求項１−８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１３】
前記染料はエバンスブルー染料またはフルオレセインである、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
＜関連出願＞
本出願は、２０１７年５月５日出願の米国仮特許出願第６２／５０１，９４０号の優先権の利益を主張し、その内容は参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は概して、網膜、脳、および末梢血管等の組織において、そのような組織にノリン（ｎｏｒｒｉｎ）タンパク質を適用することによって、遺伝子発現を調節する方法を対象とし；特に、疾患の処置に有効な遺伝子調節を作り出すことを対象とする。
【背景技術】
【０００３】
網膜症は、視覚障害を引き起こし得る、眼の網膜への損傷である。網膜症はしばしば、網膜血管障害、または異常な血流によって引き起こされる網膜損傷を指す。網膜症は頻繁に、糖尿病または高血圧症で見られる、または未熟児網膜症（ＲＯＰ）として未熟児に関して見られる、全身性疾患の眼における発症である。
【０００４】
網膜症、または網膜血管障害はおおまかに、増殖性および非増殖性のタイプに分類することができる。両方のタイプの網膜症が、異なるメカニズムを通じて網膜への正常な血流を変えることにより疾患を引き起こす。網膜は、網膜中心動脈からの小さな血管分岐によって供給される。増殖性の網膜症は、異常な血管成長によって引き起こされた損傷を指す。通常は、血管新生は組織成長と形成の自然な部分であり、ここで血管新生は、既に存在する血管から形成される新たな血管を介した生理的なプロセスである。血管新生の異常に高い、または速い速度がある場合、新血管新生と呼ばれる血管の異常増殖が存在し、異常増殖した血管はしばしば脆弱で弱く、網膜の組織の潅流に効果がない。これらの弱く脆弱な血管はしばしば漏れやすく、流体、タンパク質、および他の異物を網膜へと漏れ出させる。過剰増殖した血管はまた、強度が不十分であるがゆえに出血しがちである。非増殖性では、網膜への異常な血流は、直接的な損傷、または血管自体の損傷により生じる。非増殖性の損傷の多くの一般的な原因として、高血圧網膜症、未熟児網膜症、放射線網膜症、太陽性網膜症、および鎌状赤血球病に関係した網膜症があげられる。
【０００５】
様々な網膜症に起因する虚血組織における酸素と栄養素の不足を補うために、透過性に関わるサイトカインが過度にアップレギュレートされる。
【０００６】
様々な炎症性疾患は、漏出により誘発された浮腫を特徴とする。細胞レベルでは、この浮腫は、損なわれている上皮または内皮細胞の間のジャンクションに関係している。この種の炎症に関係する１つのそのようなメカニズムは、透過性に関わる過度にアップレギュレートされたサイトカインによる、酸素と栄養素の不足を補う虚血組織である。血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）の過剰発現は、ＶＥ−カドヘリンおよびクローディン−５等の細胞間接着分子の劣化に起因する、血管の透過性の増加を引き起こす。クローン病と炎症性大腸疾患は、故障したタイトジャンクションメカニズムを通じて進行することが示されてきた。（ＪＤ  Ｓｃｈｕｌｚｋｅ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．２００９  Ｍａｙ；１１６５：２９４−３００．ｄｏｉ：１０．１１１１）。
【０００７】
内皮のタイトジャンクションは血管と脳を含む様々な組織に見られ、血管壁の内皮層は、制御された透過性バリアを形成し、これは血管と血管周囲の区画との間の界面に位置する。内皮は、２つの区画を厳密に分離する効果的なバリアとして作用するが、さらに、バリアの管腔側と反管腔側との間の溶質と水の選択的交換を可能にする透過性フィルターとして作用し得る。タイトジャンクション不全を介した平衡機能の破壊は、血管、リンパ系、および脳の様々な炎症性の疾病をもたらす。そのような疾病は、ステロイドまたは非ステロイド性の抗炎症剤で慣例的に処置されるが、そのような既存の治療は効果と副作用の点で限界を有する。
【０００８】
付加的に、多くの癌が、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）によって広められた血管新生を介してのみ進行する。付加的に、腫瘍の転移は、細胞を循環可能にするために、そのような細胞間のジャンクションをゆるめることを必ず要求する。
【０００９】
上皮層と内皮層は、組織間のイオンと分子の輸送および有機体の循環系のための、バリアだけでなく交換の場である。隣接する上皮細胞と内皮細胞との間の複合体は、タイトジャンクションとアドヘレンスジャンクションを含む。脊椎動物の上皮細胞と内皮細胞は、アドヘレンスジャンクションに対して尖っているタイトジャンクションを示す。タイトジャンクションは、上皮と内皮の極性化における組織化の役割を有し、および細胞内空間を介した溶質の拡散に対する頂端側面（ｐｉｃｏ−ｌａｔｅｒａ）バリアを確立する（ゲート機能）。タイトジャンクションはまた、舌尖音と側底膜との間の脂質と膜タンパク質の移動を制限する（フェンス機能）。タイトジャンクションは、膜原線維間のネットワークを含む、高度に整理された膜接触部位である。タイトジャンクションは、オクルディン、クローディン−５、およびジャンクション接着分子（ＪＡＭ）を含む膜貫通型タンパク質、および多くの細胞質周辺タンパク質を含む。これらは、図１の先行技術に概略的に示される。膜貫通型タンパク質は細胞間接合を媒介するが、細胞質ゾルのタイトジャンクションプラークは、タイトジャンクション膜貫通型タンパク質を、基礎を成す細胞骨格に連結する様々なタイプのタンパク質（例えばＺＯ（密着結合［Ｚｏｎａ  Ｏｃｃｌｕｄｅｎｓ］ファミリー等のＰＤＺタンパク質）を含んでいる。これらのアダプターはまた、タイトジャンクションに、プロテインキナーゼ、ホスファターゼ、小ＧＴＰａｓｅｓ、および転写因子等の、調節タンパク質を補充する。その結果、構造タンパク質（アクチンとスペクトリン）と調節タンパク質（アクチン結合タンパク質、ＧＴＰａｓｅｓ、およびキナーゼ）は、膜貫通型タンパク質と並置される。このタンパク質足場は、上皮細胞の極性と増殖と分化を調節する結合複合体またはシグナルパッチ等の、高度に整理された構造のアセンブリを促進する。この足場はまた、網膜色素上皮において効力がある。
【００１０】
眼の血管の透過性の増加は、結果として浮腫をもたらし得る。糖尿病等の浮腫の原因の臨床的な特性評価が研究されてきたが、網膜の血管における細胞間接合の低下への取り組みにはほとんど関心が払われなかった。血管漏出に関係する浮腫は、黄斑浮腫と滲出性網膜剥離等の併発症を引き起こす場合がある。
【００１１】
網膜色素上皮機能を含む上皮は、他の組織からの循環系における血液の分離のために機能する。上皮は、組織間のイオンと分子の輸送および有機体の循環系のための、バリアだけでなく交換の場である。隣接する細胞間の複合体は、タイトジャンクションとアドヘレンスジャンクションを含む。脊椎動物上皮細胞は、アドヘレンスジャンクションに対して尖っているタイトジャンクションを示す。タイトジャンクションは、上皮の極性化における組織化の役割を有し、および細胞内空間を介した溶質の拡散に対する頂端側面（ｐｉｃｏ−ｌａｔｅｒａ）バリアを確立する（ゲート機能）。タイトジャンクションはまた、舌尖音と側底膜との間の脂質と膜タンパク質の移動を制限する（フェンス機能）。タイトジャンクションは、膜原線維間のネットワークを含む、高度に整理された膜接触部位である。タイトジャンクションは、オクルディン、クローディン−５、およびジャンクション接着分子（ＪＡＭ）を含む膜貫通型タンパク質、および多くの細胞質周辺タンパク質を含む。これらは、図１の先行技術に概略的に示される。膜貫通型タンパク質は細胞間接合を媒介するが、細胞質ゾルのタイトジャンクションプラークは、タイトジャンクション膜貫通型タンパク質を、基礎を成す細胞骨格に連結する様々なタイプのタンパク質（例えばＺＯ（密着結合［Ｚｏｎａ  Ｏｃｃｌｕｄｅｎｓ］ファミリー等のＰＤＺタンパク質）を含んでいる。これらのアダプターはまた、タイトジャンクションに、プロテインキナーゼ、ホスファターゼ、小ＧＴＰａｓｅｓ、および転写因子等の調節タンパク質を補充する。その結果、構造タンパク質（アクチンとスペクトリン）と調節タンパク質（アクチン結合タンパク質、ＧＴＰａｓｅｓ、およびキナーゼ）は、膜貫通型タンパク質と並置される。このタンパク質足場は、上皮細胞の極性と増殖と分化を調節する結合複合体またはシグナルパッチ等の、高度に整理された構造のアセンブリを促進する。この足場はまた、網膜色素上皮において効力がある。
【００１２】
ＶＥＧＦは、重要な内皮細胞接着分子、ＶＥ−カドヘリンの迅速なエンドサイトーシスの誘発を介して血管透過性を誘発し、それによって内皮のバリア機能を混乱させる。このプロセスは、小ＧＴＰａｓｅ、Ｖａｖ２のＳｒｃ依存性リン酸化を介したＶＥＧＦＲによるＲａｃ（図示せず）、グアニンヌクレオチド交換因子の活性化によって開始される。Ｒａｃ活性化は次に、ＶＥ−カドヘリンの細胞内テール内の高度に保存されたモチーフの、ｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）媒介リン酸化を促進する。これは細胞間結合の分解に帰結する。（Ｇａｖａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００６  Ｎｏｖ；８（１１）：１２２３−３４．Ｅｐｕｂ  ２００６  Ｏｃｔ  ２２）。
【００１３】
無傷のタイトジャンクションを有する図１１の左パネルに示される、正常に機能する網膜色素上皮細胞では、ＶＥＧＦは、その対応する受容体ＶＥＧＦＲに結合されず、およびクローディン−５は、核においてコード化クローディン−５遺伝子から正常に発現され、かつ小胞体によって処理される。オクルディン、クローディン−５、およびＪＡＭは共に、機能性タイトジャンクションを形成し、およびＶＥ−カドヘリンは、アドヘレンスジャンクションを形成して組織化した。
【００１４】
対照的に、ＶＥＧＦＲへのＶＥＧＦ結合では、図１の右パネルに示されるように、Ｓｒｃ／Ｒａｃ／Ｐａｋ複合体は、アドヘレンスジャンクションを不安定にするためにベータ・カテニンに作用する。結果として生じるカスケードは、クローディン−５発現を混乱させ、およびアセンブリはタイトジャンクション構造の損失をもたらすと考えられる。図２は、様々な遺伝子と、各遺伝子の血液網膜関門（ＢＲＢ）の完全性への潜在的影響力に関する先行技術研究を示す表である。
【００１５】
ノリエ病タンパク質またはＸ連鎖滲出性硝子体網膜症２タンパク質（ＥＶＲ２）としても知られるノリンは、ヒトにおいてＮＤＰ遺伝子によってコードされるタンパク質である。ノリンタンパク質は、脊椎動物網膜の血管発生を調節し、および耳にある重要な血管を制御する信号を誘導する。ノリンは、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−４に高親和性で結合する（ノリンは、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体サブタイプ４（Ｆｚ４）のためのリガンドである）。ノリンはナノモル親和性でＦｚ４に結合し（Ｘｕ，ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ，２００４；１１６：８８３−８９５；Ｃｌｅｖｅｒｓ，Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ，２００４；１４：Ｒ４３６−４３７；Ｎｉｃｈｒｓ，Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ，２００４；６：４５３−４５４））、およびＦｒｉｚｚｌｅｄ−４ノックアウトマウスは、網膜の異常な血管発生を示す。
【００１６】
Ｆｚ４とのノリンの相互作用は、細胞表面受容体ＬＲＰ５に依存する（Ｘｕ，２００４）。Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体は、β−カテニン標準シグナル経路に連結される。Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体結合を介したグリコゲン合成酵素キナーゼ（ＧＳＫ）３βとＡｘｉｎの不活性化は、β−カテニンを安定させ、これはその後、細胞核に蓄積し、サイクリンＤ１またはｃ−Ｍｙｃ等のＧ１−Ｓ相転移において重要な標的遺伝子の形質導入を活性化する（Ｗｉｌｌｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  Ｄｅｖ，１９９８；８：９５−１０２）。ノリン活性の抑制は、眼疾患に関係する血管新生を妨げることが示されてきた（米国特許第２０１０／０１２９３７５号）。
【００１７】
留意されるように、増殖性網膜症の特徴は、血管透過性をもたらす過度のＶＥＧＦ発現である。ＶＥＧＦは、細胞間接合タンパク質を直接リン酸化し、ジャンクションタンパク質を分解する酵素の発現を高めることによって、および単球が血管の内側に付着することを可能にする白血球付着を引き起こすことによって、血液網膜関門（ＢＲＢ）の分解を開始する。Ｗｎｔシグナル伝達リガンドであるノリンでの実験は、ＯＩＲマウスモデルの網膜においてノリンが血管を安定させ、ＢＲＢを修復することができることを示した。リガンドは、生物学的目的に奉仕するために生体分子と複合体を形成する物質である。タンパク質リガンド結合において、リガンドは通常、標的タンパク質上の部位に結合することによって信号を生成する分子である。結合は典型的に、標的タンパク質の構造の変化をもたらす。Ｗｎｔシグナル伝達経路は、細胞表面受容体を通じて細胞内に信号を流す、タンパク質で作られた信号伝達経路の群である。３つのＷｎｔシグナル伝達経路が特徴づけられた：標準Ｗｎｔ経路、非標準平面内細胞極性経路、および非標準Ｗｎｔ／カルシウム経路。全ての３つの経路は、Ｗｎｔタンパク質リガンドをＦｒｉｚｚｌｅｄファミリー受容体に結合することにより活性化され、これは細胞内のほつれたタンパク質に生体信号を流す。
【００１８】
血液網膜関門（ＢＲＢ）の修復の証拠が、網膜内皮細胞を連結するクラウディンとＶＥ−カドヘリン等のジャンクションタンパク質の再確立によって見られる一方で、標準Ｗｎｔシグナル伝達はタイトジャンクションタンパク質発現を直接アップレギュレートすることができるが、これがバリア修復を完全に説明するとは限らない。加えて、増殖性網膜症（ＰＲ）がＢＲＢの破壊をもたらすこと、および抗ＶＥＧＦが増殖を制御することが知られているが、網膜バリアに対する抗ＶＥＧＦの効果は単に一時的である。さらに、ノリンタンパク質は眼の血管漏出に関係する浮腫の処置に関与しないが、ノリンでの血管安定化に寄与し得る経路の判定が依然として必要である。しかしながら、ノリン暴露の結果として発現が調節される他の遺伝子は、不明のままである。
【００１９】
したがって、血管漏出に関係した網膜浮腫を処置する等のための、ノリンの投与による遺伝子発現の調節、およびそれに関連する疾患の処置方法が必要とされている。付加的に、増殖性の網膜症は血液網膜関門（ＢＲＢ）の破壊をもたらし、および抗ＶＥＧＦが増殖を制御する一方で、網膜バリアに対するそれらの効果は単に一時的である。したがって、長期にわたる有効性の改善された処置が必要とされる。
【発明の概要】
【００２０】
方法は、血管バリアの処置を提供し、ノリンに血管を暴露する工程、およびＢＭＰ２、ＣＬＣＬ６、ＩＬ１２Ｂ、ＳＥＬＰＬＧ、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＡＳＰ３、ＴＨＢＤ、ＣＯＬ１８Ａ１、ＣＰＢ２、ＮＰＲ１、ＣＬＤＮ５、ＣＬＤ３、ＰＩＧＦ、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＶＥＧＦ−Ａ、ＣＡＭ−１、ＰＧＦ、ＦＯＸ−０１、ＦＯＸ−０４、ＰＤＧＦＢ、ＴＧＦＡ、ＨＧＦ、ＶＥ−カドヘリン、またはＰＬＡＵの少なくとも１つの遺伝子の遺伝子発現を調節するために十分な時間をノリンに許容する工程を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
本発明のこれらの態様と他の態様は、添付の図面と、以下の本発明の詳細な説明で解明されるだろう。
【図１】無傷の細胞ジャンクション（左パネル）と、弱められた、または破壊された細胞ジャンクション（右パネル）を有する、先行技術による細胞の概略図であり、特定の強調された細胞経路の経路を変更する際のＶＥＧＦの機能を示す。
【図２】様々な遺伝子と、各遺伝子の血液網膜関門の完全性への潜在的影響力に関する先行技術研究を示す表である。
【図３】ＶＥ−カドヘリンとクローディン−５の細胞発現を誘発する本発明の効果に関して可能性のある経路の概略図である。
【図４】本発明の効果を評価するための工程の概略図である。
【図５】「ヒト血管新生増殖因子」を試験するために設定されたアレイを例示する。
【図６】「ヒト内皮細胞生物学」を試験するために設定されたアレイを例示する。
【図７】培地のみでの２４時間後（左上パネル）、ＶＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌの培地）（右上パネル）、ノリン（２５０ｎｇ／ｍｌの培地）（左下パネル）、ＶＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌの培地）とノリン（２５０ｎｇ／ｍｌの培地）の両方（右下パネル）への暴露後の、ＶＥ−カドヘリンに関して免疫染色された（細胞周辺の境界で緑色）、ヒトの網膜毛細血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）の２０Ｘ倍率蛍光顕微鏡写真を示す。
【図８】培地のみでの２４時間後（左上パネル）、ＶＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌの培地）（右上パネル）、ノリン（２５０ｎｇ／ｍｌの培地）（左下パネル）、ＶＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌの培地）とノリン（２５０ｎｇ／ｍｌの培地）の両方（右下パネル）への暴露後の、クローディン−５に関して免疫染色された（細胞周辺の境界で緑色）、ＨＲＭＥＣの４０Ｘ倍率蛍光顕微鏡写真を示す。
【図９】添加なし、ＶＥＧＦ、ノリン、またはＶＥＧＦとノリンの組み合わせの、２４時間後のＨＲＭＥＣの単層におけるクローディン−５のｍＲＮＡ発現の標準化された棒グラフであり、ノリンがクローディン−５発現を修復することを示す。
【図１０】マウスの酸素誘発性網膜症（ＯＩＲ）モデルの眼における、エバンスブルー漏出を示す網膜顕微鏡写真であり、未注入の眼（左パネル）とノリンを注入した眼（右パネル）があり、画像はノリン注射の三日後に撮られ、明るい部分（白）は血管漏出を示し、および注射を受けた眼は毛細血管網の保存を示す。
【図１１Ａ】それぞれ異なる処置条件下での、クローディン−５とＶＥ−カドヘリンの相対的発現を示す棒グラフである。
【図１１Ｂ】それぞれ異なる処置条件下での、クローディン−５とＶＥ−カドヘリンの相対的発現を示す棒グラフである。
【図１２Ａ】それぞれ異なる治療条件下での、７時間と２４時間における骨形成タンパク質２（ＢＭＰ２）の相対的発現を示す棒グラフである。
【図１２Ｂ】それぞれ異なる治療条件下での、７時間と２４時間における骨形成タンパク質２（ＢＭＰ２）の相対的発現を示す棒グラフである。
【図１３Ａ】それぞれ異なる処置条件下での、７時間と２４時間での肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の相対的発現を示す棒グラフである。
【図１３Ｂ】それぞれ異なる処置条件下での、７時間と２４時間での肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の相対的発現を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、遺伝子ＣＡＳＰ３とＴＨＢＤの発現を高め；および、遺伝子ＣＯＬ１８Ａ１、ＣＰＢ２、ＮＰＲ１、ＯＣＬＮ、およびＰＬＡＵの発現を低下させる方法として有用性を有している。その結果、これらの遺伝子の発現に関係する疾病が処置される。
【００２３】
具体的には、カスパーゼ３はＣＡＳＰ３（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＧＣＡ＿０００００１４０５．２２）によってコードされ、かつカスパーゼ６および７を切断して活性化する；およびタンパク質自体は、カスパーゼ８と９と１０によって処理され、活性化される。カスパーゼ３は、アミロイド−ベータ４Ａ前駆体タンパク質の切断に関与する主なカスパーゼであり、これは、アルツハイマー病におけるニューロン死、かつ脊髄損傷後のニューロン死に関係している。カスパーゼ３はアポトーシスに関与しているため、ＣＡＳＰ３のアップレギュレーションは、機能障害細胞除去を誘発するために使用することができる。
【００２４】
ＴＨＢＤ遺伝子は、トロンボモジュリン（商標）、つまり内皮細胞の表面に発現される必須の膜タンパク質をコードし、かつトロンビンのための補助因子としての役割を担う。それは、前凝固剤酵素からトロンビンを抗凝固性酵素に変換することにより、血液凝固を減らす。トロンボモジュリンはまた、ヒト中皮細胞、単球、および樹状細胞のサブセットに発現される。その発現を高めることは、外科手術、遺伝子凝固亢進障害、糖尿病、または心臓病と血管疾患に関係する凝結の効果を制限するために使用される。
【００２５】
ＳＥＲＰＩＮＥ１遺伝子は、内皮プラスミノゲンアクチベータインヒビターまたはｓｅｒｐｉｎ  Ｅ１としても知られるプラスミノゲン活性化因子インヒビター−１（ＰＡＩ−１）をコードし、およびタンパク質は、組織プラスミノゲン活性化因子（ｔＰＡ）とウロキナーゼ（ｕＰＡ）の主要な阻害剤、プラスミノゲンの活性剤、したがって繊維素溶解として機能する。ノリン投与に関係した発現の増加は、したがって繊維素溶解を高めるのに臨床的に有効である。
【００２６】
ＣＯＬ１８Ａ１遺伝子はコラーゲンアルファ−１（ＸＶＩＩＩ）鎖をコードする。このコラーゲンは、非コラーゲン性領域によって中断された多数の三重螺旋領域（コラーゲン性領域）を含む、多重の細胞外マトリックスタンパク質の１つである。タイプＸＶＩＩＩコラーゲンのタンパク質に関して産生されたＣ末端フラグメントは、エンドスタチン、つまり強力な抗血管新生タンパク質であり、結果としてのノリン投与によるその発現の低下は、加齢黄斑変性と増殖性網膜症で観察されるような血管新生、過剰な血管成長を制限するのに効果がある。
【００２７】
ＣＰＢ２遺伝子は、カルボキシペプチダーゼ−２をコードし、およびトロンビン／トロンボモジュリン複合体により残基Ａｒｇ９２においてタンパク質分解によって活性化されると、カルボキシペプチダーゼ活性を示す。活性化されたカルボキシペプチダーゼ−２は繊維素溶解を減らし、したがってＣＰＢ２の発現の低下は、血管漏出と出血の減少に密接に関係する。
【００２８】
ＮＰＲ１遺伝子は、ナトリウム利尿ペプチド受容体Ａ／グアニル酸シクラーゼＡ（ナトリウム利尿ペプチド受容体Ａ）をコードし、この受容体のレベルと活性は、塩と水の恒常性の保全に主として向けられる異なる組織におけるペプチドホルモン心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）と脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）の生物学的作用を判定する。その結果、この遺伝子のダウンレギュレーションは、血管漏出の減少に密接に関係する。
【００２９】
ＰＬＡＵ遺伝子は、細胞外マトリックスの分解に関与するセリンプロテアーゼ（ＥＣ  ３．４．２１．７３）をコードし、およびプラスミノゲンにおけるＡｒｇ−Ｖａｌ結合の特定の切断によってプラスミノゲンをプラスミンに変換する際に活性である。その結果、この遺伝子のダウンレギュレーションは、内皮細胞漏出における治療に密接に関係する。
【００３０】
遺伝子ＢＭＰ２、ＣＬＣＬ６、ＩＬ１２Ｂ、ＳＥＬＰＬＧ、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＡＳＰ３、ＴＨＢＤ、ＣＯＬ１８Ａ１、ＣＰＢ２、ＮＰＲ１、ＣＬＤＮ５、ＣＬＤ３、ＰＩＧＦ、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＶＥＧＦ−Ａ、ＣＡＭ−１、ＰＧＦ、ＦＯＸ−０１、ＦＯＸ−０４、ＰＤＧＦＢ、ＴＧＦＡ、ＨＧＦ、ＶＥ−カドヘリンはすべて、網膜発現に一般的な従来の遺伝子名を表す。
【００３１】
特定の動作理論に縛られることを意図せず、網膜上皮細胞のｆｒｉｚｚｌｅｄ−４受容体へのノリンタンパク質の結合は、ベータ−カテニンの分解を制限し、これはその後、上皮細胞核に蓄積して局在化し、続いてＴＣＦ／ＬＥＦ（Ｔ細胞因子／リンパ性増強因子）側の遺伝子形質導入を介して細胞反応を引き起こす。クローディン−５とＶＥ−カドヘリン遺伝子はその後、転写され、および対応するタンパク質が小胞体を介して製造される。結果として生じるタンパク質は、損なわれた細胞結合を修復する。これは図３に概略的に示される。さらに、クローディン−５およびＶＥ−カドヘリンタンパク質はまた、本発明の特定の実施形態において、組織回収または実験的研究内での使用の対象とされる。
【００３２】
以下の定義は、本発明の理解に関して本明細書で使用される。
【００３３】
「投与する」は本明細書において、ノリンタンパク質またはノリンタンパク質を含む組成物を被験体の網膜に提供する手段として定義される。そのような投与は、限定されないが、経口で、経皮的に（例えば口腔粘膜）、注射により（例えば皮下、静脈内、非経口的、腹腔内、眼内）、吸入により（例えば、経口または鼻）、または局所（例えば点眼剤、クリーム等）を含む任意の経路によって可能である。医薬品はもちろん、各投与経路に適した形態で供給される。
【００３４】
「変性」は、本明細書に記載されるもの等の標準的技術の既知の方法によって検出される遺伝子またはポリペプチドの発現レベルまたは活性における変化（増加または減少）を意味する。本明細書で使用されるように、変性は、発現レベルにおける少なくとも１０％の変化、好ましくは２５％の変化、より好ましくは４０％の変化、および最も好ましくは発現レベルにおける５０％以上の変化を含む。
【００３５】
「類似体」は、ノリンタンパク質と同一ではないが類似の機能的または構造的特徴を有する分子を意味する。例えば、ポリペプチド類似体は、対応する天然ノリンの類似体の生物学的活性を保持し、同時に、天然ポリペプチドと比較して類似体の機能を高める特定の生化学的修飾を有する。そのような生化学的修飾は、例えばリガンド結合を修正せずに、類似体のプロテアーゼ抵抗、溶解度、膜透過性、または半減期を高め得る。類似体は、非天然のアミノ酸を含み得る。
【００３６】
本開示において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」等は、米国特許法に帰する意味を有し、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」等を意味することができる；「から実質的に成る」または「実質的に成る」は同様に、米国特許法に帰する意味を有し、および該用語は制限なく、列挙されるものの基本的または新規な特徴が、列挙されるもの以上の存在によって変更されない限り、列挙されるもの以上の存在を許容するが、先行技術の実施形態は除外する。
【００３７】
「対照」は、標準的状態または基準状態を意味する。
【００３８】
「検出する」は、検出される分析物の存在、欠如、または量を特定することを指す。
【００３９】
「検出可能な標識」は、対象の分子に連結された時に、分光学、光化学、生化学、免疫化学、または化学的な手段を通じて、後者を検出可能にする組成物を意味する。例えば、有用な標識として、放射性同位体、磁気ビーズ、金属性ビーズ、コロイド粒子、蛍光染料、電子密度の高い試薬、酵素（例えばＥＬＩＳＡで一般に使用）、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテンがあげられる。
【００４０】
「フラグメント」は、ノリンの部分を意味する。この部分は、好ましくは、天然のヒトノリンポリペプチドの全長１３３アミノ酸残基の、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％を含んでいる。フラグメントは、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、または完全な１３３のアミノ酸さえをも含み得る。
【００４１】
「トランケート」は、最大４０アミノ酸残基のノリンタンパク質のポリペプチド末端開裂を有するノリンのフラグメントを含むことを意味する。
【００４２】
「単離されたポリペプチド」は、自然にそれに付随している成分から分離されたノリンのポリペプチド類似体を意味する。典型的にポリペプチドは、少なくとも６０重量％の場合に単離され、それが当然に関係しているタンパク質および天然の有機分子を含まない。好ましくは、その調製物は、少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも９０重量％、および最も好ましくは少なくとも９９重量％の、本発明のポリペプチドである。本発明の単離されたポリペプチドは、例えば、天然のソースからの抽出によって、そのようなポリペプチドをコードする組換え核酸の発現によって；または化学的にタンパク質を合成することによって、得られる。純度は、任意の適切な方法、例えばカラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはＨＰＬＣ解析によって測定することができる。
【００４３】
ノリンは、以下に示されるように、ＮＣＢＩ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿０００２５７．１に対する少なくとも約８５％のアミノ酸同一性を有し、および網膜上皮細胞のｆｒｉｚｚｌｅｄ−４受容体を結合する能力を有するポリペプチドまたはそのフラグメントを規定することを意図する。
ｇｉｌ４５５７７８９ｌｒｅｆｌＮＰ＿０００２５７．１ｌ  ノリン前駆体［ホモサピエンス］
ＭＲＫＨＶＬＡＡＳＦＳＭＬＳＬＬＶＩＭＧＤＴＤＳＫＴＤＳＳＦＩＭＤＳＤＰＲＲＣＭＲＨＨＹＶＤＳＩＳＨＰＬＹＫＣＳＳＫＭＶＬＬＡＲＣＥＧＨＣＳＱＡＳＲＳＥＰＬＶＳＦＳＴＶＬＫＱＰＦＲＳＳＣＨＣＣＲＰＱＴＳＫＬＫＡＬＲＬＲＣＳＧＧＭＲＬＴＡＴＹＲＹＩＬＳＣＨＣＥＥＣＮＳ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１）
【００４４】
本明細書で使用されるように、「薬剤を得る」における「得る」は、合成する、購入する、またはそうでなければ薬剤を取得する、を含む。
【００４５】
用語「患者」または「被験体」は、処置、観察、または実験の対象である動物を指す。単なる例として、被験体は、限定されないが、ヒト以外の霊長類、ウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ、またはネコ等の、限定されないがヒトまたはヒト以外の哺乳動物を含む。
【００４６】
「薬学的に許容可能な」は、連邦政府または州政府の規制機関によって認可されていること、または認可可能であること、あるいはＵ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａまたはヒトを含む動物における使用のための他の一般に承認された薬局方にリストされていることを指す。
【００４７】
「薬学的に許容可能な賦形剤、担体、または希釈剤」は、薬剤と共に被験体に投与可能であり、およびその薬理学的活性を破壊せず、治療量の薬剤を送達するのに十分な用量で投与される場合に無毒である賦形剤、担体、または希釈剤を指す。
【００４８】
本明細書に提供される範囲は、その範囲内の数値のすべてに関する簡略表記であることが理解される。例えば、１〜５０の範囲は、任意の数、数の組み合わせ、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０から成る群からのサブ範囲、さらに例えば１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、および１．９等の、前述の整数間のすべての介在デシマル値を含むことが理解される。サブ範囲に関して、範囲のいずれかのエンドポイントから拡がる「入れ子のサブ範囲」が特に熟考される。例えば、１〜５０の典型的な範囲の入れ子のサブ範囲は、ある方向に１〜１０、１〜２０、１〜３０、および１〜４０、または別の方向に５０〜４０、５０〜３０、５０〜２０、および５０〜１０を含み得る。
【００４９】
「低減する（ｒｅｄｕｃｅｓ）」によって、少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、または１００％の負の変性が意味される。
【００５０】
配列同一性は配列分析ソフトウェアを使用して、典型的に測定される（例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ，１７１０  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７０５，ＢＬＡＳＴ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＧＡＰ、またはＰＩＬＥＵＰ／ＰＲＥＴＴＹＢＯＸプログラム）。そのようなソフトウェアは、様々な置換、欠失、および／または他の修飾に相同性の度合いを割り当てることにより、同一または類似する配列をマッチングさせる。同類置換は典型的に、以下の群の置換を含む：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。同一性の度合を判定するための典型的なアプローチでは、ＢＬＡＳＴプログラムが使用されてもよく、ｅ”３〜ｅ”１００の確率スコアは、密接に関連する配列を示す。
【００５１】
本明細書で使用されるように、用語「処置する」、「処置された」、「処置している」、「処置」等は、ＢＲＢ損傷に関連する障害および／または症状を低減または緩和することを指す。
【００５２】
典型的には、治療上有効な用量は、約０．１ｎｇ／ｍｌから約５０−１００μｇ／ｍｌの化合物の血清濃度を生み出す必要がある。
【００５３】
具体的に示されない限り、または文脈から明白でない限り、本明細書で使用されるように、用語「または」は包括的であると理解される。具体的に示されない限り、または文脈から明白でない限り、本明細書で使用されるように、用語「ａ」「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、単数または複数であると理解される。
【００５４】
具体的に示されない限り、または文脈から明白でない限り、本明細書で使用されるように、用語「約」は、例えば平均の２準偏差内等の、当技術における様々な正常許容範囲内として理解される。「約」は、示される値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、または０．０１％以内であると理解され得る。文脈から明白でない限り、本明細書に提供される全ての数値は、用語「約」によって修飾される。
【００５５】
ノリンは、細胞外空間に分泌される１３３アミノ酸長の長いタンパク質である。２つの一次的領域が一般的なノリンタンパク質構造を定義する：シグナルペプチドは、分子の限局化を指図する；およびシステイン−ノットモチーフは、ｆｒｉｚｚｌｅｄ−４受容体結合に必要な第３の確認を提供する。（Ｍｅｉｔｉｎｇｅｒ，Ｔ，ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ，１９９３；５：３７６−３８０；Ｂｅｒｇｅｒ，Ｗ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ，１９９６；５：５１−５９）。ｆｒｉｚｚｌｅｄ−４受容体を結合する能力を保持するノリンのトランケートおよびフラグメントが、本明細書において有効である。いくつかの創造性のある実施形態では、ノリンのトランケートまたはフラグメントは、システイン・ノットモチーフを保持する。
【００５６】
システイン・ノットモチーフの重要性は、ノリン構造の確認を行う際にシステイン残基間のジスルフィド結合の要件を実証するコンピュータモデリングによって強調される。しかしながら、システイン・ノットモチーフ以外の領域における突然変異は、不完全なタンパク質のフォールディングを生成し、結果として家族性滲出性硝子体網膜症（ＦＥＶＲ）および関連する硝子体網膜症をもたらす。
【００５７】
特定の創造性のある実施形態では、ノリンの−２４残基のＮ末端トランケートは、以下のアミノ酸配列を有する。
【００５８】
ＫＴＤＳＳＦＩＭＤＳＤＰＲＲＣＭＲＨＨＹＶＤＳＩＳＨＰＬＹＫＣＳＳＫＭＶＬＬＡＲＣＥＧＨＣＳＱＡＳＲＳＥＰＬＶＳＦＳＴＶＬＫＱＰＦＲＳＳＣＨＣＣＲＰＱＴＳＫＬＫＡＬＲＬＲＣＳＧＧＭＲＬＴＡＴＹＲＹＩＬＳＣＨＣＥＥＣＮＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２）（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃  Ｑ００６０４）
【００５９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２等のフラグメントおよびトランケーションは、ノリンと比較して可溶性が改善されていることがわかった。
【００６０】
本発明は、ノリンに実質的に相同し、選択的にｆｒｉｚｚｌｅｄ−４受容体を結合する能力を依然として保持する変異体および同等物を包含する。これらは、例えば同類置換突然変異、すなわち類似するアミノ酸による１つ以上のアミノ酸の置換を含むことができる。例えば、同類置換は、同じ一般的クラス内の他のアミノ酸とのアミノ酸の置換、例えば、ある酸性アミノ酸の別の酸性アミノ酸との、ある塩基性アミノ酸の他の塩基性アミノ酸との、またはある中性アミノ酸の他の中性アミノ酸との置換を指す。
【００６１】
本発明のノリンは組換えノリン、天然のノリン、またはＦｒｉｚｚｌｅｄ−４結合性を保持する合成ノリンであり得る。本発明のいくつかのアミノ酸配列が、タンパク質の構造または機能の重要な効果なしに変動し得ることが、当技術において認識されるだろう。したがって本発明は、実質的な活性を示すノリンの変化形体をさらに含む；そのような突然変異は、欠失、挿入、転位、反復、およびタイプ置換を含む。本明細書において操作可能なノリン突然変異は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＲ６４Ｅに関するアミノ酸置換を含む。随意に、活性ペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１：Ｔ２７Ａ、Ｓ２８Ａ、Ｓ２９Ａ；Ｐ３６Ａ、Ｒ３７Ａ、Ｒ３８Ａ；Ｙ１２０Ａ、Ｒ１２１Ａ、Ｙ１２２Ａ；またはＨ１２７Ａ、Ｅ１２９Ａ、Ｅ１３０Ａ；またはそれらの組み合わせに関する多数の突然変異である。多数の突然変異で変異したアミノ酸は、単一の突然変異として操作可能である。本明細書で実施される他の配列突然変異は、Ｓｍａｌｌｗｏｏｄ，Ｐ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２００７：２８２：４０５７−４０６８の図６ＡまたはＫｅ，Ｊ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ．２０１３：２７：２３０５−２３１９に例示される。異なるアミノ酸部位での他の突然変異が同様に操作可能であることが認識される。任意の特定部位での保存アミノ酸の突然変異が好ましくはグリシンまたはアラニンへと変化することがさらに認識される。中性電荷、電荷、疎水性、親水性、合成、非天然、ヒト以外、または他のアミノ酸への突然変異が同様に操作可能であることがさらに認識される。
【００６２】
本明細書に開示される典型的なポリペプチドと同様の特性を有する分子を結果としてもたらし得る、またはもたらさない場合もある創造性のある化合物内に包含されるノリンタンパク質の構造（一次、二次、または三次）において、修飾と変更が随意に行なわれる。保存されたアミノ酸塩基における変更が、結果として生じたタンパク質の活性に影響を与える可能性が最もありそうであることが認識される。受容体相互作用、タンパク質劣化への抵抗または促進、細胞内または細胞外輸送、分泌、タンパク質間相互作用、グリコシル化とリン酸化と硫酸化等の翻訳後修飾のために操作可能なアミノ酸における変更は、創造性のある化合物の活性の増加または減少をもたらす場合もあり、他方で生理活性を変更または維持するいくつかの能力を保持する。配列内の他のアミノ酸に対する特定のアミノ酸置換は、認識可能な活性の損失なく生じることが知られている。
【００６３】
そのような変更を行う際に、アミノ酸の水治療法指数が考慮される。本発明によれば、特定のアミノ酸は、同様の水治療法指数を有する他のアミノ酸と置き換えることができ、依然として同様の生物学的活性を有するポリペプチドを結果としてもたらすことができる。各アミノ酸は、その疎水性と電荷特性に基づいて水治療法指数を割り当てられる。それらの指数は以下のとおりである：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／システイン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸塩（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸塩（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。
【００６４】
特定の理論に限定する意図はないが、アミノ酸の相対的な水治療法特性が、結果として生じたポリペプチドの二次構造を決定し、これは次に他の分子とのポリペプチドの相互作用を規定すると考えられている。同様の水治療法指数を有する他のアミノ酸によってアミノ酸を置き換えることができ、かつ機能的に同等のポリペプチドを依然として得ることができることは、当技術において既知である。そのような変更において、その水治療法指数が．＋−．２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、．＋−．１以内であるのが特に好ましく、および．＋−．０．５以内であるのがさらに好ましい。
【００６５】
上記で概説されるように、アミノ酸置換は一般的に、アミノ酸側鎖置換基の相対的な類似性、例えばそれらの疎水性、親水性、電荷、サイズ等に基づく。先の様々な特性を考慮した典型的な置換が当業者に周知であり、および以下が含まれる（もとの残基：典型的な置換）：（Ａｌａ：Ｇｌｙ，Ｓｅｒ），（Ａｒｇ：Ｌｙｓ），（Ａｓｎ：Ｇｌｎ，Ｈｉｓ），（Ａｓｐ：Ｇｌｕ，Ｃｙｓ，Ｓｅｒ），（Ｇｌｎ：Ａｓｎ），（Ｇｌｕ：Ａｓｐ），（Ｇｌｙ：Ａｌａ），（Ｈｉｓ：Ａｓｎ，Ｇｌｎ），（Ｉｌｅ：Ｌｅｕ，Ｖａｌ），（Ｌｅｕ：Ｉｌｅ，Ｖａｌ），（Ｌｙｓ：Ａｒｇ），（Ｍｅｔ：Ｌｅｕ，Ｔｙｒ），（Ｓｅｒ：Ｔｈｒ），（Ｔｈｒ：Ｓｅｒ），（Ｔｉｐ：Ｔｙｒ），（Ｔｙｒ：Ｔｒｐ，Ｐｈｅ），および（Ｖａｌ：Ｉｌｅ，Ｌｅｕ）。
【００６６】
ノリンおよび類似体は、通常はタンパク質の部分ではない追加の化学部分を含むように、さらに修飾することができる。それらの誘導部分は、溶解度、生物学的半減期、タンパク質の吸収、または結合親和性を改善することができる。該部分はまた、タンパク質等の望ましい副作用を低減または消去することができる。それらの部分に関する概略は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（２０００）に見ることができる。
【００６７】
本明細書に記載される単離されたノリンは、当技術で既知の任意の適切な方法によって生成することができる。そのような方法は、直接タンパク質合成法から、単離されたポリペプチド配列をコードし、かつ適切な変換ホストにおいてそれらの配列を発現するＤＮＡ配列を構築することにまで及ぶ。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ配列は、対象の野生型タンパク質をコードするＤＮＡ配列を単離または合成することによって、組換え技術を使用して構築される。随意に、配列は、その官能性類似体を提供するために部位特異的な突然変異誘発により変異誘発され得る。（Ｚｏｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：５６６２−５０６６（１９８４）および米国特許第４，５８８，５８５号）。
【００６８】
本発明によれば、損なわれたジャンクションを有する網膜上皮細胞のタイトジャンクションとアドヘレンスジャンクションが、ある用量のノリン、そのトランケートまたはフラグメントに暴露される。ノリン暴露の後、結果として生じた細胞は、明らかに高レベルの細胞ジャンクションクローディン−５とＶＥ−カドヘリンを有する。本発明はしたがって、網膜と脈絡膜の上皮細胞に対する、ＶＥＧＦを含むサイトカインの効果を逆転する。損なわれた網膜または脈絡膜の上皮細胞ジャンクションに関係した網膜浮腫と網膜剥離が、結果として低減される。
【００６９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のノリントランケート２は、１０〜１０００ｎｇ／ｍｌの濃度でクローディン−５とＶＥ−カドヘリンの細胞ジャンクションレベルを高めるのに有効であることが観察されている。
【００７０】
本発明はまた、有効な量のノリンのみを含む、または薬学的に許容可能な担体、賦形剤、または添加物と組み合わせた、医薬組成物を対象とする。特に好ましい誘導体は、哺乳動物に投与されたノリンのバイオアベイラビリティを高めるもの（例えば、眼の脈絡膜に投与されたノリンが、より容易に血液に吸収されるようにする）、または天然タンパク質と比較して生体区画（例えば網膜）へのノリンの送達を増強するものである。
【００７１】
本発明に係る医薬組成物を調製するために、治療上有効な量のノリンは好ましくは、用量を生成するために従来の薬事配合技術に従い、薬学的に許容可能な担体と密に混合される。担体は、例えば、経眼、経口、局所、または非経口の投与にとって望ましい調合剤の形態に応じて広範な形態をとってもよく、とりわけゲル剤、クリーム剤、軟膏剤、ローション剤、および長期にわたり活性成分を放出する植え込み可能な調合剤があげられる。
【００７２】
ノリンはまた、抗ＶＥＧＦ剤等の補助剤を用いて投与される。本明細書において例示的に作用可能な抗ＶＥＧＦ薬剤は、ラパチニブ、スニチニブ、ソラフェニブ、アキシチニブ、パゾパニブ、またはそれらの組み合わせ等のＶＥＧＦによって刺激されたチロシンキナーゼを阻害するベバシズマブ・ラニビズマブ小分子を含む。抗ＶＥＧＦ剤とノリンを含む併用治療が提供される。驚くべきことに、同時に細胞へのＶＥＧＦ結合を抑制し、かつタイトジャンクションおよびアドヘレンスジャンクションタンパク質の発現を刺激することによって、従来の抗ＶＥＧＦ剤の効果が高まることがわかった。例えば、抗ＶＥＧＦ剤は典型的に、糖尿病に付随して起こる黄斑浮腫の徴候を有する被験体のおよそ７５％において有効である。この効果は、ノリンの同時投与により８５％より多く、ますます増加する。
【００７３】
経口、非経口、皮内、皮下、または局所の投与に使用される溶液または懸濁液は、以下の構成要素を含むことができる：注射用蒸留水、食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒等の無菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラオキシ安息香酸エステル類等の抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸ナトリウム等の酸化防止剤；エチレンジアミン４酢酸等のキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸等の緩衝液、および塩化ナトリウムまたはデキストロース等の張度の調整用薬剤。
【００７４】
液体経口調合剤の形態での投与は、懸濁液、エリキシル剤、および溶液等の形態の担体、水、グリコール、油、アルコール、香料添加剤、保存剤、および着色剤等を含む適切な担体と添加物を使用する。固形経口投与では、調合剤は、デンプン、デキストロースとマンニトールとラクトースと関連担体等の糖担体、希釈剤、造粒剤、潤滑剤、結合剤、または崩壊剤を含む、坐剤および適切な担体と添加物等の、粉末剤、錠剤、カプセル剤、および固形剤等の形態で提供される。望ましい場合、錠剤またはカプセル剤は、標準的な技術により、腸コーティングされてもよく、または徐放性であってもよい。固形用量で提供されるノリンは、凍結乾燥形態または小球化された溶液小滴である。
【００７５】
一実施形態において、活性化合物は、植込剤とマイクロカプセル化された送達システムを含む、制御放出製剤等の、化合物が身体から急速に排出されるのを防ぐ担体を用いて調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリアンハイドライド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸等の、生分解性の生物学的適合性のあるポリマーを使用することができる。そのような製剤の調製方法が当業者に明白になるだろう。
【００７６】
リポソーム懸濁液はまた、薬学的に許容可能な担体であってもよい。これらは、当業者に既知の方法に従って調製されてもよい。例えば、リポソーム製剤は、適切な脂質を無機溶媒に溶解し、次にこれを蒸発させ、容器表面上に乾燥した脂質の薄膜を残すことによって、調製されてもよい。活性化合物の水溶液はその後、容器に入れられる。次に、容器を手で旋回させて容器の側面から脂質物質を解放し、かつ脂質集団を分散させて、リポソーム懸濁液を生成する。当業者に周知の他の調製方法もまた、本発明のこの態様で使用されてもよい。
【００７７】
皮膚への局所投与に適した製剤は、薬学的に許容可能な担体中に投与される成分を含む軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、およびパスタ剤として提示されてもよい。好ましい局所用の送達システムは、投与される成分を含有する経皮パッチである。
【００７８】
直腸投与用の製剤は、例えばカカオ脂またはサリチル酸塩を含む、適切な基剤を有する坐薬として提示されてもよい。
【００７９】
非経口調合剤は、ガラスまたはプラスチックで作られたアンプル、使い捨てシリンジ、または多人数用バイアルに入れることができる。静脈内に投与される場合、好ましい担体は、例えば生理食塩水またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含む。
【００８０】
非経口製剤については、担体は通常、水性塩化ナトリウム溶液を含むが、分散を助けるものを含む他の成分が含まれてもよい。もちろん、滅菌水が使用され、無菌で保全される場合、ノリン担体もまた殺菌されなければならない。注射可能な懸濁液もまた調製されてもよく、この場合は、適切な液体担体、懸濁化剤等が使用されてもよい。
【００８１】
非経口または経口投与に適した製剤は、指定されたレシピエントの血液によって製剤を等張性にする、酸化防止剤、緩衝液、静菌剤および溶質を含み得る、水性および非水性の無菌注射溶液、および懸濁化剤と増粘剤を含み得る水性および非水性の無菌懸濁液を含む。製剤は、単一用量または複数用量の容器、例えば密閉されたアンプルおよびバイアルに提供されてもよく、使用の直前に、無菌の液体担体、例えば注入用の水の添加のみを必要とする冷凍乾燥（凍結乾燥）状態で保管されてもよい。即席の注射液および懸濁液は、上記の種類の滅菌した粉末、顆粒および錠剤から調製されてもよい。
【００８２】
活性化合物の投与は、連続的（点滴静注）から、１日あたり複数回の経口投与（例えばＱ．Ｉ．Ｄ．）に及んでもよく、および局所、経眼、非経口、筋肉内、静脈内、皮下、脈絡膜内、または経皮を含んでもよい（侵入増強剤を含んでもよい）。
【００８３】
被験体への治療の適用は、対象部位に投与されるように局所的であってもよい。注入、カテーテルの使用、トロカール、放射体、プルロニックゲル、ステント、徐放性薬物放出ポリマー、または内部アクセスを提供する他のデバイス等の様々な技術を、対象部位に対象ノリンを提供するために使用することができる。器官または組織を患者から取り出すことによってアクセス可能となる場合、そのような器官または組織は、対象ノリンを含む培地に入れられてもよく、対象ノリンは器官上に塗られてもよく、または任意の好都合な方法で適用されてもよい。
【００８４】
ノリンは、望ましい局所的または全身性の生理的効果あるいは薬学的効果を得るのに有効な組成物の制御放出と徐放性放出に適したデバイスによって投与されてもよい。該方法は、薬剤の放出が望まれる領域に徐放性薬物送達システムを配置する工程、および望ましい処置領域へとデバイスを通じて薬剤を流す工程を含む。より具体的には、ノリンは、眼のガラス体液への直接の植え込みに適した眼デバイスによって投与される。本発明のそのようなデバイスは、驚くべきことに、有害な局所的および全身性の副作用のリスクなしに、眼を処置するために様々なノリンの徐放性制御放出を提供することがわかっている。本発明の眼送達方法の目的は、植え込みの持続時間を引き延ばすために、眼内デバイスに含まれる薬剤の量を最大化し、同時にそのサイズを最小化することである。例えば、米国特許第５，３７８，４７５号；５，７７３，０１９号；６，００１，３８６号；６，２１７，８９５号、６，３７５，９７２号、および６，７５６，０５８号を参照されたい。
【００８５】
ノリンの送達の他の方法は、以下を含む：炎症または後関節不透明化を防ぐために眼内レンズに適用可能な眼送達システム、ガラス体液、網膜下、または強膜上に直接挿入可能な眼送達システムであって、挿入がシステムの注入またはシステムの外科的植え込みによって達成可能なシステム、徐放性薬剤送達システム、および望ましい位置に徐放性薬剤送達システムを外科的に植え込む工程を含む、望ましい局所的または全身性の生理的効果あるいは薬学的効果を得るのに有効な薬剤の制御徐放性投与を提供するための方法。
【００８６】
例として、限定されないが以下があげられる：ノリンを含有する内側リザーバ、薬剤の通過に対して不透過性のインナーチューブであって、第１と第２の端部を有し、かつ内側リザーバの少なくとも一部を覆い、それ自体の重量を支持できるようなサイズと物質で形成されたインナーチューブ、インナーチューブの第１の端部に配置された不透過性部材であって、リザーバを出てインナーチューブの第１の端部を通る薬剤の通過を妨げる不透過性部材、およびインナーチューブの第２の端部に配置された透過性部材であって、リザーバを出てインナーチューブの第２の端部を通る薬剤の拡散を可能にする透過性部材、を含む徐放性薬剤送達システム。眼の部分にノリンを投与する方法は、眼のガラス体液または膜質にノリンを送達するために徐放性デバイスを、または眼あるいは膜質の部分に本発明の化合物を投与するための植え込み可能な徐放性デバイスを、植え込む工程を含み；徐放性薬剤送達デバイスは、ａ）ノリンを含む薬物コア；ｂ）薬物コアを受け入れるために内部区画を取り囲み規定する薬剤の通路に対し本質的に不透過性の少なくとも１つの単一体カップであって、単一体カップの開放上端の少なくともいくつかの部分のまわりにある少なくとも１つの凹んだ溝を有する開放上端を含む、単一体カップ；ｃ）ノリンの通路に対して透過性である透過性プラグであって、透過性プラグは、単一体カップの開放上端に配置され、溝は、それを適所に保持し、かつ開放上端を閉じる透過性プラグと相互作用し、透過性プラグは、薬物コアから出て、透過性プラグを通り、単一体カップの開放上端から出る薬剤の通過を可能にする、透過性プラグ、を含む。徐放性ノリン送達デバイスは、望ましい溶解度を有する内部コアノリンとポリマーコーティング層を含み、ポリマーコーティング層はノリンに対して透過性であり、ここでポリマーコーティング層は完全に内部コアを包含する。
【００８７】
ノリンはミクロスフェアとして投与されてもよい。例えば、ノリンは、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎ．から購入されてもよく、またはＦｕ，Ｋ，ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，２００３；９２：１５８２−９１の自然乳化を使用して、Ｊｉａｎｇ，Ｃ，ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ．Ｖｉｓ．，２００７；１３：１７８３−９２に記載されるように、実質的に、クローンを作り、発現させ、浄化し、生分解性ミクロスフェアに装填されてもよい。ミクロスフェアは、カプセル化中のタンパク質凝集を最小化するために、８ｍｇの水酸化マグネシウムを補足した、４：１体積比のトリフルオロエタノール：ジクロロメタン５ｍｌに、２００ｍｇの５０：５０のポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）を溶解することによって合成され、装填される。１０μｇのノリンを、３００μｌ、７ｍｇのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）３ｍｌにおいて再構成し、１００ｍｇのドキュセートナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）を３ｍｌのＰＢＳに溶解してもよい。溶液を攪拌し、優しく撹拌しながら１％（ｗ／ｖ）のポリビニルアルコール（ＰＶＡ、８８％加水分解）２００ｍｌに注いでもよい。ミクロスフェアを３時間撹拌することによって硬化させ、遠心分離によって回収し、３回洗浄して残余のＰＶＡを除去してもよい。ミクロスフェアが直ちに注入されない場合、それらを液体窒素中で急速凍結し、７２時間凍結乾燥させ、−２０℃で乾燥器に保管する。ノリン含有ミクロスフェアは、粒子径によって規定されるように、８μιηの平均直径を示す。ノリンはまた、硝子体内注射によって投与されてもよい。例えば、溶液中のノリンは、上記のようにミクロスフェアへとパッケージングされてもよく、または細胞において発現され、あるいは溶液中の精製された形態であってもよく、Ｊｉａｎｇ，２００７によって記載されるように硝子体内注射によって網膜に実質的に暴露されてもよい。硝子体内注射は、およそ１００μｍの外径を有する斜角のガラス製マイクロ針を使用して、眼手術用顕微鏡（Ｍｏｌｌｅｒ−Ｗｅｄｅｌ  ＧｍｂＨ，Ｗｅｄｅｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用し、全身麻酔下で行なわれてもよい。ミクロスフェア懸濁液は、２％および１０％（ｗ／ｖ）のＰＢＳにおいて調製され、均一分散を確実にするために注射の直前に簡単に攪拌される。３０ゲージの皮下注射針を使用して、角膜輪部の１．５ｍｍ背後の強膜を穿孔してもよい。５マイクロリットルの試験サンプルが、５０μｌのＨａｍｉｌｔｏｎ  Ｓｙｒｉｎｇｅ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｃｏ，Ｒｅｎｏ，Ｎｅｖ．）を使用して、ガラス体液へのこの通路により随意に注入される。適切な送達を確実にし、かつショックを防ぐために、注入完了後１分間、針を適所に保持し、その後にゆっくりと引き抜く。加えて、穿刺は、圧力を緩和し、それによって還流を防ぐために、同時に行なわれてもよい。
【００８８】
ノリンはまた、制御放出送達システムによる網膜への送達によって投与されてもよい。植え込み可能な制御放出送達システムは、米国特許第２００５／０２８１８６１号に記載されており、最終的に製剤されたカプセルにつき１００μｇでシステム等としてパッケージングされる。例えば、ノリン含有薬物送達システムは、強膜を２−３ｍｍ切開した後に、鉗子またはトロカールを使用して眼に配置されてもよい。代替的に、切開は行われなくてもよく、システムは、眼を通じてトロカールまたは他の送達デバイスを直接挿入することにより眼に配置される。眼にシステムを配置した後のデバイスの除去は、自己密封される開口部を結果としてもたらし得る。眼に植込剤を挿入するために使用されるデバイスの一例は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第２００４／００５４３７４号に開示される。システムの位置は、要素を囲む治療成分または薬剤の濃度勾配に影響を及ぼし、したがって放散速度に影響を及ぼす場合もある（例えば、硝子体の端部近くに配置された要素は、より遅い放散速度を結果としてもたらす場合もある）。したがって、システムが網膜表面近く、またはガラス体液の後部に配置される場合、それは好ましい。
【００８９】
好ましい単位用量製剤は、投与される成分の、上記に列挙される１日量または単位１日サブ用量、あるいはその適切なフラクションを含むものである。
【００９０】
ノリン発明のための投与レジメンは、ＢＲＢ漏出の度合、投与経路、眼体積、黄斑分離量、および使用される特定のノリンを含む様々な因子に基づく。したがって、投与レジメンは広く変動し得るが、標準方法を使用して慣例的に決定することができる。
【００９１】
特定の実施形態では、ノリンは毎日１回投与され；他の実施形態では、ノリンは１日２回投与され；さらに他の実施形態では、ノリンは、２日に１回、３日に１回、４日に１回、５日に１回、６日に１回、７日に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、２ヶ月に１回、６ヶ月に１回、または１年に１回投与される。投与間隔は、個々の患者の必要に従って調節可能である。より長い投与間隔では、持続放出性製剤またはデポー製剤を使用することができる。
【００９２】
薬学的に許容可能な担体、賦形剤、または希釈剤は、例示的に、塩、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、無菌等張水性バッファー、およびそれらの組み合わせを含む。
【００９３】
制御放出性の非経口組成物は、水性懸濁液、ミクロスフェア、マイクロカプセル、磁気ミクロスフェア、油剤、油懸濁液、乳剤の形態であり得、または活性成分を、生物学的適合性の担体、リポソーム、ナノ粒子、植込剤、または注入用デバイスに組み込むことができる。
【００９４】
ミクロスフェアおよび／またはマイクロカプセルの調製に使用される物質は、ＰＬＧＡ等の生分解性／生体分解性ポリマー、ポリグラクチン９１０、ポリ−（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−Ｌ−グルタミン）、およびポリ（乳酸）を含む。
【００９５】
制御放出性の非経口製剤を調剤する際に使用可能な生物学的適合性の担体は、デキストラン等の炭水化物、アルブミン等のタンパク質、リポタンパク質、または抗体を含む。
【００９６】
植込剤で使用される物質は、非生物分解性の、例えばポリジメチルシロキサン、または生分解性の、例えばポリ（カプロラクトン）、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、またはポリ（オルトエステル）等であり得る。
【００９７】
保存剤の例として、限定されないが、メチルまたはｐ−オキシ安息香酸プロピルと塩化ベンザルコニウム等のパラベンがあげられる。
【００９８】
注射可能なデポー形態は、ポリラクチド−ポリグリコリド等の生分解性ポリマーにおいて本発明の化合物のマイクロカプセル化強化マトリックスを形成することによってなされる。化合物対ポリマーの比率、および利用される特定のポリマーの性質に応じて、化合物放出の速度は制御され得る。他の生分解性ポリマーの例として、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物類）があげられる。デポー注射可能製剤はまた、体組織と相溶性のあるリポソームまたはマイクロエマルジョン中に薬物を閉じ込めることによって調製される。
【００９９】
上記の制御放出性組成物、持続放出性組成物、および徐放性組成物は、約３０分から約１週間、約３０分から約７２時間、約３０分から２４時間、約３０分から１２時間、約３０分から６時間、約３０分から４時間、および約３時間から１０時間で、活性成分を放出するように調剤され得る。実施形態では、活性成分の有効濃度は、４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１６時間、２４時間、４８時間、７２時間、またはそれ以上、被験体への医薬組成物の投与後に被験体において維持される。
【０１００】
ノリンがヒトまたは動物に薬剤として投与される場合、ノリンはそれ自体として、または薬学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤と組み合わせて活性成分を含んでいる医薬組成物として与えられ得る。
【０１０１】
本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投与レベルと投与の時間的経過は、患者に毒性をもたらすことなく、特定の患者、組成物、および投与モードにとって望ましい治療効果を達成するのに有効な活性成分の量を得るように、変えることができる。概してノリンは、網膜浮腫または黄斑変性またはＦＥＶＲに関係した症状を低減または排除するのに十分な量で投与される。
【０１０２】
典型的な眼用量範囲は、１日あたり０．００００１ｍｇから２５０ｍｇ、１日あたり０．０００１ｍｇから１００ｍｇ、１日あたり１ｍｇから１００ｍｇ、１日あたり１０ｍｇから１００ｍｇ、１日あたり１ｍｇから１０ｍｇ、および１日あたり０．０１ｍｇから１０ｍｇを含む。薬剤の好ましい用量は、患者が許容でき、かつ重篤あるいは許容できない副作用をもたらすことのない最大値である。特定の創造性のある実施形態では、治療上有効な量は、約０．１ｎｇ／ｍｌから約５０−１００μｇ／ｍｌのノリンの眼濃度を生み出す。特定の創造性のある実施形態では、５０ｎＭ−１μＭの薬剤が被験体の眼に投与される。関連する実施形態では、約５０−１００ｎＭ、５０−２５０ｎＭ、１００−５００ｎＭ、２５０−５００ｎＭ、２５０−７５０ｎＭ、５００−７５０ｎＭ、５００ｎＭ−１μＭ、または７５０ｎＭ−１μＭのノリンが、被験体の眼に投与される。
【０１０３】
治療上有効な量の判定は、特に本明細書に提供される詳細な開示の観点から、十分、当業者の能力内である。概して、ノリンの効果的または有効な量は、まず低用量の薬剤を投与し、次に、最小限または許容可能な毒性の副作用で、処置される被験体において望ましい効果（例えば、網膜浮腫に関係した症状が低減または除去）が観察されるまで投与量または用量を漸増的に増やすことによって判定される。本発明の医薬組成物の投与のための適切な用量と投与スケジュールを判定するための適用可能な方法は、例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｏｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｇｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１１ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  ２００５、およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  ａｎｄ  ２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎｓ，Ｇｅｎｎａｒｏ  ａｎｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｅｄｓ．，Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ（２００３  ａｎｄ  ２００５）に記載され、これらの各々が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０４】
下記は、ノリンがどのようにして細胞間接着分子の内皮細胞劣化を克服し、かつ血管を再度安定させることができるかの、インビトロ＆インビボの実施例であり、これらは例示のためのものであり、本発明の範囲を制限することを意図しない。
【０１０５】
インビトロアッセイ
【０１０６】
実施例１：発現アレイを使用したノリンによる血管安定化
【０１０７】
増殖性網膜症（ＰＲ）の酸素誘発性網膜症（ＯＩＲ）モデルにおいてノリンが血液網膜関門（ＢＲＢ）を修復することがこれまでに示されてきたので、ノリンによる血管安定化をもたらし得る可能性のある経路を探索するために実験を行い、ヒト網膜毛細血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）におけるノリン誘発遺伝子発現の変化を検討した。
【０１０８】
実験では、ＨＲＭＥＣ（Ｐ５−Ｐ８）を、細胞接着因子コーティングプレート上に播種し、集合へと成長させた。
【０１０９】
集合に達した後に、プレート内の培地を以下と置き換えて、ｍＲＮＡ単離に先立って２４時間（または７時間）インキュベートした。
【０１１０】
培地：アレイおよびジャンクションＴａｑＭａｎ用の１０％のＦＢＳ／ＣＳＣ培地（Ｃｅｌｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、またはヒドロコルチゾン（ミリポア）無しの２．５％のＦＢＳ／ＥｎｄｏＧｒｏ。
【０１１１】
ＶＥＧＦＡ１６５−ｂ：Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（１００ｎｇ／ｍｌ）＆ノリン：ＢＭＰ２／ＨＧＦ  ＴａｑＭａｎアッセイ用のＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（２５０ｎｇ／ｍｌ）または（２００ｎｇ／ｍｌ）。
【０１１２】
Ａｇｉｌｅｎｔ  Ａｂｓｏｌｕｔｅｌｙ  ＲＮＡ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔを使用してｍＲＮＡを細胞から単離し、次にＱｉａｇｅｎ  ＲＴ２  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ａｒｒａｙｓと個々のＴａｑＭａｎアッセイのためのＡｇｉｌｅｎｔ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｓｃｒｉｐｔ  ＱＰＣＲ  ｃＤＮＡ合成キットを使用して０．５−１ｕｇをｃＤＮＡに変換した。
【０１１３】
ＦＡＭ標識Ｔａｑｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎアッセイを、標準化のために使用されるＶｉｃ標識ＴＢＰ  Ｔａｑｍａｎアッセイを用いて多重化した。
【０１１４】
ＲＴ−ＰＣＲをＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＭＸ３０００Ｐシステムで実施した。
【０１１５】
試験アレイを、図４と併せて以下のように設定した：Ｑｉａｇｅｎ  ＲＴ２  ＰＣＲ  Ｐｒｏｆｉｌｅｒアレイを使用、アレイを「血管新生増殖因子」と「ヒト内皮細胞生物学」のために設定し、アレイの各々は、８４の関連する経路遺伝子のためのＰＣＲアッセイを含む。
【０１１６】
ノリン処置および未処置（培地のみ）ＨＲＥＣにおける発現を、両方のアレイタイプを使用して比較した。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＲＴ−ＰＣＲを使用した検出の後、デルタＣＴ法によりフォールド差を算出した。
【０１１７】
図５は、「ヒト血管新生増殖因子」を試験するために設定されたアレイを例示する。
【０１１８】
図６は、「ヒト内皮細胞生物学」を試験するために設定されたアレイを例示する。
【０１１９】
実験結果は２つの一般的なパターンを明らかにした：ノリンは炎症性メディエーターの発現を減らすように作用する。ノリンはウロキナーゼ経路シグナリングをもたらす。
【０１２０】
ＴＡＱＭＡＮアッセイの結果
【０１２１】
実施例２：
【０１２２】
対照条件下で、図７の左上パネルに示されるように、これらの細胞の細胞間境界へとクローディン−５を局所化する。ＶＥＧＦの添加後（右上パネル、図７）、細胞間接着分子の減少と共に、玉石形態（ｃｏｂｂｌｅｓｔｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ）における損失を見ることができる。しかしながら、ＶＥＧＦとノリンの組み合わせを用いると（右下パネル、図７）、ジャンクションタンパク質と形態が修復された。ノリンのみの効果が留意される（左下パネル、図７）。
【０１２３】
実施例３：細胞−ＶＥＧＦチャレンジにおけるクローディン−５の免疫染色
【０１２４】
抗ヒトＶＥ−カドヘリンの代わりにマウス抗ヒトクローディン−５抗体を用いて、４℃で一晩、プロセスを繰り返した。ＰＢＳで洗浄した後、抗ヒトクローディン−５抗体に特異的な色素結合二次抗体を用いて細胞をインキュベートし、次に、蛍光顕微鏡検査法を使用した画像化に先立ってＰＢＳで洗浄した。
【０１２５】
対照条件下で、図８の左上パネルに示されるように、これらの細胞の細胞間境界へとクローディン−５を局所化する。ＶＥＧＦの添加後（右上パネル、図８）、細胞間接着分子の減少と共に、玉石形態（ｃｏｂｂｌｅｓｔｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ）における損失を見ることができる。しかしながら、ＶＥＧＦとノリンの組み合わせを用いると（右下パネル、図８）、ジャンクションタンパク質と形態が修復された。ノリンのみの効果が留意される（左下パネル、図８）。
【０１２６】
実施例４：細胞−ＶＥＧＦチャレンジにおけるクローディン−５  ｍＲＮＡ発現
【０１２７】
チャレンジ剤としてＴＧＦベータをＶＥＧＦと置き換えて実施例３のプロセスを繰り返す。検出されたクローディン−５の量が図９に示され、培地のみの対照に対して標準化される。ノリンは、培地対照のものを超えてクローディン−５発現レベルを高めることがわかる。
【０１２８】
実施例４：ＯＩＲマウスにおける血管漏出＆クローディン−５染色のインビボアッセイ
【０１２９】
血管の形態と機能における変化を評価することができるように、マウスの酸素誘発性網膜症モデル（ＯＩＲ）を使用して虚血性網膜を生成する。高酸素環境でマウスを育てることで、無血管の網膜の領域を作り出す。一旦正常な酸素環境に戻ると、血管は漏出するようになり、無秩序な様式で成長する。蛍光染料（エバンスブルーまたはフルオレセイン）を全身注入して漏出の量を視覚化することができ、次に、顕微鏡で網膜を見る。ＯＩＲマウスでは、エバンスブルー染料が網膜血管から漏出するのを見ることができ、およびクローディン−５は乱れている（図１０の左パネル）。しかしながら、無血管の網膜のＯＩＲ誘発の後にノリンを注入されたＯＩＲ眼では、エバンスブルー染料は血管内に制限されている（図１０の右パネル）。画像は、右眼へのノリン注入後４日目にとられた。
【０１３０】
図１１Ａと１１Ｂは、それぞれ異なる処置条件下での、２４時間後の、クローディン−５とＶＥ−カドヘリンの相対的発現を示す棒グラフである。ＢＭＰ２  ＴａｑＭａｎアッセイの結果が、ＢＭＰ２発現低下のアレイ結果と一致しなかったことが留意される。
【０１３１】
図１２Ａと１２Ｂは、それぞれ異なる治療条件下での、７時間と２４時間における骨形成タンパク質２（ＢＭＰ２）の相対的発現を示す棒グラフである。ＨＧＦ  ＴａｑＭａｎアッセイの結果が、アレイで見られた結果に類似することに留意されたい：ノリンはＨＧＦ発現を低下させた。
【０１３２】
図１３Ａと１３Ｂは、それぞれ異なる処置条件下での、７時間と２４時間での肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の相対的発現を示す棒グラフである。
【０１３３】
遺伝子発現アレイは、ノリン処置（２４時間）ＨＲＭＥＣにおいて差次的に発現する（最も消極的）いくつかの遺伝子を明らかにした。これらの遺伝子のいくつかは、炎症性のメディエーターである；ＢＭＰ２、ＣＬＣＬ６、ＩＬ１２Ｂ、ＳＥＬＰＬＧ＆ＣＸ３ＣＬ１。
【０１３４】
アレイとＴａｑＭａｎアッセイにおいて、ノリンは、ウロキナーゼシグナル経路（ＳＰＩＮＫ５、ＰＬＡＵ  ＰＡＩ−１）に含まれるＨＧＦおよび他のいくつかの遺伝子を調節不全にした。ウロキナーゼ経路は、ＥＣＭとジャンクションタンパク質を分解する酵素の活性化をもたらす。ＨＧＦは、ＥＣ遊走性表現型をもたらすウロキナーゼ（ｕＰＡ）活性を高める。（Ｃｏｌｏｍｂｏ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（２００７）．Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ／Ｓｃａｔｔｅｒ  Ｐｒｏｍｏｔｅｓ  Ｒｅｔｉｎａｌ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．ＩＯＶＳ，４８（４），１７９３−１８００）。さらに、従来の研究は、ウロキナーゼ受容体（ＵＰＡＲ）の阻害が、クローディン−５タンパク質発現のＶＥＧＦ−Ａ阻害に打ち勝つことができることを示してきた。（Ｍｏｔｔａ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ（２０１６）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  Ｍｅｄｉａｔｉｎｇ  Ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  Ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ＵＰＡＲＡＮＴ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｉｎａｌ  Ｅｎｏｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ．５７，５７２３−５７３５）。
【０１３５】
当業者が先の詳細な説明、および図面と特許請求の範囲から認識するように、以下の特許請求の範囲に規定される本発明の範囲から逸脱することなく本発明の好ましい実施形態への修正と変更を行うことができる
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【国際調査報告】
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