(57)【要約】多能性細胞の幹細胞性および分化能を増大するための方法。本発明は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）または胚性幹細胞（ＥＳＣ）においてマイクロＲＮＡ−２０３レベルを増加させることが、細胞運命潜在能の質、およびこれらの細胞が複数の細胞系譜へと分化し、それらの自己更新特性を妨害せずに、さらなる成熟特性を達成する能力を改善するという所見に基づく。この効果は、デノボＤＮＡメチルトランスフェラーゼＤｎｍｔ３ａおよびＤｎｍｔ３ｂのｍｉＲ−２０３依存性の制御を介して媒介され、それは今度は多能性細胞のメチル化全体像を調節する。この効果は、マイクロＲＮＡ−２０３の過剰発現によって、または細胞培養培地へのマイクロＲＮＡ−２０３もしくはそのアナログの添加によって達成することができ、多様な細胞モデルおよびインビボモデルを使用して観察され得る。生成された細胞は改善された分化能力を備えたナイーブ型多能性細胞であり、それを使用して、再生医療ストラテジーに向いているより効率的に分化し成熟した細胞を得ることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性細胞の幹細胞性および／または分化能を促進するための方法であって、前記細胞が増加したレベルのマイクロＲＮＡ−２０３またはそのアナログへ曝露されるステップを含む、前記方法。
【請求項２】
前記細胞が、培養中の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）または胚性幹細胞（ＥＳＣ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が、増加したレベルのマイクロＲＮＡ−２０３またはそのアナログへ一過性に曝露される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞が増加したレベルのマイクロＲＮＡ−２０３またはそのアナログへ３〜５日間曝露される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞が、マイクロＲＮＡ−２０３を発現する発現ベクターにより形質導入される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
マイクロＲＮＡ−２０３またはそのアナログが、前記ｉＰＳＣまたはＥＳＣの培養培地へ添加される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
少なくともｈｓａ−ｍｉＲ−２０３ａ−３ｐ（配列番号：１）、ｍｍｕ−ｍｉＲ−２０３−５ｐまたはそのアナログが、前記ｉＰＳＣまたはＥＳＣの培養培地へ添加される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
マイクロＲＮＡ−２０３のアナログが前記培養培地へ添加される、請求項６に記載の方法であって、前記アナログが、
ａ．ヌクレオチドのうちの少なくとも１つが化学的に修飾されたヌクレオチドによって置き換えられる、ＲＮＡ修飾分子であって、前記化学的修飾が、
ｉ．１つもしくは複数のリン酸結合のホスホロチオエート結合による置換、
ｉｉ．２’−Ｏ−メチル修飾もしくは２’−Ｏ−メトキシエチル修飾から選択される、糖部分の２’位での１つもしくは複数の修飾；ならびに／または
ｉｉｉ．２’の酸素と４’の炭素を接続するリンクを生じ、したがって立体配座３’−ｅｎｄｏでリボースをブロックするもの（ＬＮＡ：ロック核酸）もしくは２’−Ｏ，４’−Ｃエチレン架橋核酸（ＥＮＡ）；ペプチド核酸（ＰＮＡ）におけるような、アミド含有骨格（アミノエチルグリシン骨格等）による糖骨格の置換；およびＰＭＯ（リボース部分がモルホリン基によって置換される核酸）の使用の群から選択される、リボース部分における１つもしくは複数の修飾、
の群から選択される、前記分子であり；
ｂ．１６〜３１ヌクレオチドの長さの二重らせん領域を備え、配列番号：１によって表わされるＲＮＡ分子の窒素含有塩基の配列に対してそれらの配列が少なくとも５０％同一の断片を含有する二本鎖分子であり；
ｃ．随意に、鎖のうちの少なくとも１つの少なくとも１つの端部で、コレステロール、コレスタノール、スチグマステロール、コラン酸およびエルゴステロールの１つまたは複数の単位を含むコンジュゲート部分、ならびにさらに随意に追加で鎖へのコンジュゲート部分を付加するリンカー部分を追加で含み、
ｄ．さらに随意に追加で、２つの鎖の中で１つまたは複数のミスマッチを提示すること
によって特徴づけられるＲＮＡ模倣体である、前記方法。
【請求項９】
前記細胞の分化能の促進が、心筋細胞への分化効率の改善によって特徴づけられる、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記多能性細胞が、以下のファミリー（Ｏｃｔファミリー、Ｋｌｆファミリー、ＭｙｃファミリーおよびＳｏｘファミリー）のうちの各々１つの遺伝子産物を含む核リプログラミング因子と、体細胞の分化細胞を接触させることによって得られたｉＰＳＣである、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記多能性細胞がｉＰＳＣであり、前記細胞が増加したレベルのマイクロＲＮＡ−２０３またはそのアナログへ曝露された後にナイーブ型様の状態を取得した、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法のステップを含む、分化細胞および／または成熟細胞を得るための方法。
【請求項１３】
前記分化細胞が、心筋細胞、神経またはグリア細胞、軟骨細胞および膵臓細胞（インシュリン分泌細胞等）である、請求項１２に記載の分化細胞および／または成熟細胞を得るための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）および胚性幹細胞（ＥＳＣ）の潜在能を改善するための方法に関する。より詳細には、本発明は前記細胞の分化能を増加するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多能性幹細胞は、自己更新能および複数の細胞系譜へと分化する能力に起因して、再生医療についての重要な将来性を提供する。
【０００３】
多能性は、複数の体細胞系譜に加えて生殖細胞を生成する、単一細胞レベルでの能力として定義することができる。着床前胚において、多能性は、後期内部細胞塊（ＩＣＭ）のエピブラスト（それは胎盤以外のすべての組織へと発生し得る細胞を含有する）において確立される。これらの細胞は捕捉され、胚性幹細胞（ＥＳＣ）として培養中で維持され得る。ＩＣＭ細胞およびＥＳＣの両方はキメラに寄与し、胚へ再導入したものが生殖細胞系列をコロニー形成することができ、それらのナイーブ型多能性の機能的証明を提供する。反対に、着床後のエピブラストも、この組織に由来するプライム型多能性幹細胞も、胚盤胞への組込みに続いて、キメラへ効率的に寄与する能力を有していない。したがって、マウスからの多能性細胞において、２つの別個の多能性状態：マウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）によって例示される基底状態またはナイーブ型状態、およびマウスの着床後エピブラスト幹細胞（ｍＥｐｉＳＣ）によって代表されるプライム型多能性状態、を観察できることは十分に確立されている。２つの状態の間の最も明らかな差異は、コロニーの形態（ナイーブ型細胞の事例においてコンパクトなドーム形状であり、プライム型細胞の事例において平らである）、多能性状態の維持のための増殖因子の要求性（プライム型細胞はアクチビン／ＦＧＦ２に依存するが、ナイーブ型細胞はＬＩＦに依存する）、ならびにキメラおよび生殖細胞系列伝達への寄与率（ナイーブ型細胞はキメラに寄与できるが、プライム型細胞は決してできない）である。次いでナイーブ型多能性は体細胞分化に際して胚において失われ、リプログラミングストラテジーによってのみ実験的に回復され得る。
【０００４】
リプログラミングは、成熟細胞が胚性幹細胞のような状態である細胞へと変換されるプロセスである。細胞の完全なリプログラミングは、改善された機能性およびナイーブ型多能性と密接に関するかまたはそれの同義語と判断され得る。
【０００５】
体細胞を人工多能性細胞（ｉＰＳＣ）へリプログラミングする、オリジナルのプロトコールは、Ｙａｍａｎａｋａおよび共同研究者（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ＆  Ｙａｍａｎａｋａ，２００６）によって２００６年に確立されたので、Ｙａｍａｎａｋａのオリジナルのプロトコールとして一般的に知られており、欧州特許ＥＰ１０９７０４４６中で開示されていた。それは、分化した体細胞が多能性状態へ変換することを可能にする。オリジナルの方法は、成熟細胞中に胚性幹細胞（ＥＳＣ）の必須の特性の維持のために重要なある特定の遺伝子を導入し、その結果、体細胞（最初の開示ではマウス線維芽細胞）を、以下のファミリー（Ｏｃｔファミリー、ＫｌｆファミリーおよびＭｙｃファミリー、ならびに好ましくはＳｏｘファミリーの遺伝子産物も）のうちの各々１つの遺伝子産物を含む核リプログラミング因子と接触させることに基づく。かかる方法の最も一般に使用される実施形態のうちの１つは、遺伝子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃ（それは４つのＹａｍａｎａｋａ因子としても当業者に公知である）の産物の使用を包含する。ＯＳＫＭという略語は、４つの前記因子の組み合わせについて多くの場合使用される。
【０００６】
それらの多能性および増殖能力が胚性幹細胞（ＥＳＣ）のものに類似すると判断されるので、得られた細胞は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）と呼ばれる。
【０００７】
ｉＰＳＣは、薬物開発、疾患のモデル化、および移植医学のためのツールとしてのそれらの潜在的な有用性に起因して、多くの注目を集めた。興味深いことには、ＥＳＣの産生と関連する倫理的問題は、ｉＰＳＣ（それは患者特異的幹細胞株を生成するという議論の余地がないストラテジーを提供する）へ適用されない。しかしながら、リプログラミングが臨床的ツールとしての使用のために考慮され得る前に、プロセスの効率は実質的に改善されなくてはならない。
【０００８】
したがって、リプログラミング方法の最初の開示以来、複数の取り組みはリプログラミングの改善に注目してきた。非常に重要な問題は、細胞リプログラミングの効率（それは通常低く、その結果、非常に少ない数のナイーブ型ｉＰＳＣが出発の分化した体細胞から得られる）を増加させることである。分化細胞の集団へ転写因子を単純に添加することはリプログラミングを保証しない。インビトロのリプログラミングの低効率は、追加の稀な事象がナイーブ型ｉＰＳＣを生成するのに必要であることを示唆し、リプログラミングの効率は、長期間の間培養された線維芽細胞で場合によってはさらに減少する。
【０００９】
さらに、出発細胞の分化ステージは、リプログラミング効率に直接影響を与えるように思われる。マウスの造血幹細胞および造血前駆細胞は、それらの最終分化したＢ細胞およびＴ細胞のカウンターパートがナイーブ型ｉＰＳＣを生じるよりも、最大３００倍効率的にナイーブ型ｉＰＳＣを生じる。さらに、重要な点は、報告されたリプログラミング頻度が、多くの場合、アルカリホスファターゼ活性およびレポーター遺伝子の活性化等の基準に基づくということである。ナイーブ型のｉＰＳＣおよびＥＳＣの両方は、多能性幹細胞の重要な特徴（幹細胞マーカーを発現すること、およびすべての３つの原始胚葉からの細胞タイプを含有する腫瘍を形成することを包含する）を実証する。しかしながら、ＥＳＣに比較して、生存状態で生まれる子孫の産生の効率が非常に低減されるので、ｉＰＳＣのナイーブ型多能性は完全に明らかではない。したがって、キメラ寄与率および生殖細胞系列伝達は効率的なリプログラミングのより正確な実証として供されるが、かかる質の定量化は技術的に難しく、頻繁に使用されない（Ｂｉｌｉｃ  ａｎｄ  Ｉｚｐｉｓｕａ  Ｂｅｌｍｏｎｔｅ，２０１２によって概説される）。
【００１０】
リプログラミング因子の形質転換能を減じることによってプロセスの安全性を増加させること、およびそれらの発現のために使用されたベクターも、主な懸念の要因であった。ウイルス形質導入またはゲノム組込みの使用を回避するストラテジーは、リプログラミング因子をコードする遺伝子を細胞の中へ導入するのに最初に使用される組込み型ウイルスベクターを置換するために、活発な発生下で行う。その上、分化能を様々な細胞系譜へと増大させることによって、または特異的な機能細胞タイプへの成熟特性を改善することによって、ｉＰＳＣの多能性特性を改善することに、複数の取り組みがなされてきた（Ｌｉ  ＆  Ｉｚｐｉｓｕａ  Ｂｅｌｍｏｎｔｅ，２０１６）。
【００１１】
それらのすべての理由のために、分化細胞のｉＰＳＣへのリプログラミングのオリジナルのプロトコールは多くの修飾の対象であり、それらの大部分は、オリジナルのＹａｍａｎａｋａ因子のうちの１つもしくは複数を異なる化合物で置き換えること、またはオリジナルの因子への追加のタンパク質をコードする追加のＲＮＡを使用することからなる。したがって、現在、エピジェネティック修飾物質のマイクロＲＮＡまたは小分子インヒビターを使用するものを包含する、ｉＰＳプロトコールの多くの変形がある。
【００１２】
多くの小分子インヒビターは特異的な酵素またはシグナル経路の阻害によってリプログラミング効率を改善することが見出された。この群は、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（ＧＳＫ３ｂ）、形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−ｂ）、クロマチン修飾ＨＤＡＣ（ヒストン脱アセチル化酵素）またはＤＮＭＴ（ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ）のインヒビター、およびＹａｍａｎａｋａ因子と組み合わせてリプログラミング効率を促進することができる多くのものを包含する。
【００１３】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を使用してエピジェネティック因子および腫瘍抑制因子の発現を負に調節することも、リプログラミングを増進する。複数の研究は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼインヒビター（５−アザ−シチジン；ＡＺＡ）と一緒に、分化した系譜マーカーに対するｓｉＲＮＡ（小分子干渉ＲＮＡ）を使用することが、部分的にリプログラミングされた細胞の完全なリプログラミングを達成するのを援助することを示した（Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，２００８）。ＤＮＡメチルトランスフェラーゼＤｎｍｔ１に対するＲＮＡ干渉も、部分的にリプログラミングされた状態から多能性状態への移行を援助し、実際、多能性細胞のエピジェネティックな記憶は、多能性細胞の確立におけるバリアとして作用することが公知の因子である（Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，２００８）。複数の従来の研究は、リプログラミングプロセスの間のＤＮＡメチル化の操作が、体細胞から多能性細胞へのリプログラミングの成功に影響を及ぼすことを実証する。リプログラミングの間に脱メチル化酵素を使用することは、多能性細胞へのリプログラミングを増強し得るが、得られた多能性細胞は適用のために有用ではなく、それは、なぜならば、それらの事例において使用される遺伝学的アプローチが不可逆的であり、多能性細胞が分化のためにＤＮＡを再メチル化する必要があり、そのことが得られたリプログラミングされた細胞を再生医療のために役立たなくするからである（Ｐａｐｐ  ａｎｄ  Ｐｌａｔｈ，２０１１）。
【００１４】
腫瘍抑制因子ｐ５３およびｐ２１のＲＮＡｉ媒介性ノックダウンも、細胞分裂速度を増加させることによってリプログラミングプロセスを加速する（Ｈａｎｎａ  ｅｔ  ａｌ，２００９）。
【００１５】
しかし、有効なリプログラミングを増進する能力以上に、小分子の安全性に関する複数の問題は注意深く対処する必要がある。例えば、ＡＺＡはＤＮＡ損傷および細胞死を誘導することが公知である（Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，２００８）。永続的な修飾（ゲノム性またはエピゲノム性の）は回避されるべきであり、化学的治療の投薬量または継続期間の至適化を指示して毒性を回避する研究は今日までない。したがって、上で言及された小分子についての代替物に加えて、細胞リプログラミングにおいて分化した状態を阻害する異なるストラテジー（そのストラテジーは好ましくは、体細胞のナイーブ型ｉＰＳＣへの完全なリプログラミングを改善するべきである）が求められている。
【００１６】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ、またはそれらのうちの１つの具体的な同定が付随する場合にｍｉＲと頻繁に省略される）は、タンパク質をコードするＲＮＡの発現を調整し、したがって細胞における複数の機能を行うことができる、小さな（１５〜２５ヌクレオチド、非常に多くの場合２０〜２１ｎｔ）非コーディングＲＮＡである（Ａｍｂｒｏｓ，２００４）。最近の証拠は、幹細胞性転写因子の発現、上皮−間充織分化転換、細胞周期進行、または細胞のエピジェネティック全体像を制御することによっても、ｍｉＲＮＡが多能性へ結びつけられることを示唆する（Ｓｈｅｎｏｙ  ＆  Ｂｌｅｌｌｏｃｈ，２０１４；Ｌｅｏｎａｒｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。
【００１７】
例えば、ｍｉｒ−３０２−３６７は、３つの転写因子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびＮａｎｏｇのレベルへ直接結びつけられる（Ｃａｒｄ  ｅｔ  ａｌ，２００８；Ｍａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，２００８）。１つの特定のｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−３０２、それはＥＳＣ中で多量に発現される）は、ＥＳＣに似ている細胞へヒト癌細胞株を形質転換できることが見出された（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ，２００８）。他のクラスター（ｍｉＲ−２９０−２９５またはｍｉＲ−１０６−３６３等）も、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびＮａｎｏｇのプロモーターによって共占有される（Ｍａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，２００８）。
【００１８】
多能性幹細胞を産生するいくつかの方法は、標的細胞の中への少なくとも１つのｍＲＮＡの導入を、標的細胞の中へ少なくとも１つのｍｉＲＮＡを導入することと、組み合わせることに基づく。ＵＳ２０１５０２３２８１０Ａ１として公開された米国特許出願は、例えば、ｍＲＮＡと組み合わせてｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの模倣体を使用して、多能性幹細胞を産生する可能性を開示し、この出願は、ｍｉＲＮＡ模倣体を、修飾されたヌクレオチドまたは構造的な修飾（例えば膨らみまたはループ）に起因して促進された安定性を有する、合成のｍｉＲＮＡとして、および内在性ｍｉＲＮＡを模倣し、ｍｉＲＮＡ活性のアップレギュレーションによってｍｉＲＮＡ機能分析が可能になる、小分子の化学的に修飾された二本鎖ＲＮＡとしても、定義する。ＵＳ２０１５０２３２８１０Ａ１中で開示された方法は、ｍＲＮＡ単独またはｍｉＲＮＡ単独が関与する方法に不応性の細胞株からのｉＰＳＣの生成を可能にすると述べられているので、リプログラミングの改善に具体的に関する。
【００１９】
ｍｉＲＮＡおよび幹細胞性に関する他の研究は、幹細胞性を特徴づける分子シグネチャーに注目した。したがって、例えば、ＵＳ２０１３０３４５２８９Ａ１として公開された米国特許出願は、成体幹細胞中でユニークに発現される幹細胞に特異的なｍｉＲＮＡシグネチャーの同定に基づき、生物学的サンプル中のｍｉＲ遺伝子産物のレベルを決定すること、それを解剖学的に正確な対照サンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルに比較すること、およびサンプル間で特異的遺伝子産物のレベルにおいて差異がある場合に被験体が臨床的に利用可能な成体幹細胞を持つと決定することによって、成体被験体に由来する生物学的サンプル中のかかる臨床的に利用可能な成体幹細胞の存在を同定するための方法を開示する。その目的のためのマーカーとして有用な可能なマイクロＲＮＡのうちの１つは、ｈｓａ−ｍｉｒ−２０３−ｐｒｅｃＮｏ１であり、それは幹細胞集団中でではなく分化細胞中で発現される。ｈｓａ−ｍｉｒ−２０３−ｐｒｅｃＮｏ１についてＵＳ２０１３０３４５２８９Ａ１中に含まれるアクセッション番号、および２０１７年３月１２日のｍｉＲｂａｓｅデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ／）中で利用可能な情報との比較から、それは、ｈｓａ−ｍｉＲ２０３ａ−３ｐ（配列番号：１、ｍｉＲｂａｓｅにおいてアクセッションＭＩＭＡＴ００００２６４）であり、ヒトｈｓａ−ｍｉＲ−２０３ａ遺伝子（配列番号：２、ｍｉＲｂａｓｅにおいてアクセッションＭＩ００００２８３）によって生成される主要な成熟配列であることが結論され得る。第２の成熟配列はｈｓａ−ｍｉＲ−２０３ａから生成され、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０３ａ−５ｐ＊（配列番号：５３、ｍｉＲｂａｓｅにおいてアクセッションＭＩＭＡＴ００３１８９０）であり得る。
【００２０】
したがって、他の多くのマイクロＲＮＡで起こるように、成熟した２つのマイクロＲＮＡは同じプレｍｉＲＮＡ（ｈａｓ−ｍｉＲ−２０３ａ）の反対のアームから生じることができ、それらは−３ｐまたは−５ｐの接尾語と共に表わされる。しかしながら、ヘアピンの１つのアームから見出された成熟したマイクロＲＮＡは他のアームから見出されたものよりも通常はるかに豊富であり、その事例において、名称に続く星印は、ヘアピンの反対のアームからの低レベルで見出される成熟種を表示する。ｍｉＲ−２０３の事例において、最も豊富な成熟形態はｍｉＲ−２０３ａ−３ｐである一方で、少ない量の形態はｍｉＲ−２０３ａ−５ｐ＊と呼ばれる。
【００２１】
ヒトｍｉＲ−２０３は第１９染色体から発現される。そのマウスカウンターパートのｍｍｕ−ｍｉＲ−２０３（配列番号：３、ｍｉＲｂａｓｅにおいてアクセッションＭＩ００００２４６）は、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓの第１４染色体から発現される。ｍｍｕ−ｍｉＲ−２０３の主要な成熟配列であるｍｍｕ−ｍｉＲ−２０３−３ｐ（配列番号：４（ｍｉＲｂａｓｅにおいてアクセッションＭＩＭＡＴ００００２３６）は、ｈｓａ−ｍｉＲ２０３ａ−３ｐのものに同一であると思われる。第２の成熟配列であるｍｍｕ−ｍｉＲ−２０３−５ｐ＊（配列番号：５４、ｍｉＲｂａｓｅにおいてアクセッションＭＩＭＡＴ０００４５４７）について、それは、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０３ａ−５ｐよりも短く（２５ではなく２２ヌクレオチド）、残りの配列においてヒトカウンターパートとはわずかに異なる（位置１１のＧはｈｓａ−ｍｉＲ２０３ａ−５ｐ＊においてＡで置換される）という実験的な証拠がある。
【００２２】
ｍｉＲ−２０３は、ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ．ｏｒｇ）またはＭｉＲａｎｄａ（２０１０年８月ダウンロード可能のバージョン、例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｏｒｇ／ｍｉｃｒｏｒｎａ／ｇｅｔＤｏｗｎｌｏａｄｓ．ｄｏから）等のツールを使用して見出すことができるように、何百もの潜在的な標的（それらのうちのいくつかはそれらの対応する経路において反対の方向で作用する）を持つマイクロＲＮＡである。それは皮膚特異的マイクロＲＮＡとして最初に同定され、増殖性の表皮基底前駆細胞と最終分化する基底上部細胞との間の境界を画成する発現勾配を形成し、したがって皮膚中の幹細胞性潜在能を限定する（Ｙｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。それは、乾癬においてアップレギュレートされ、いくつかのタイプの癌において差異的に発現されることも見出された。
【００２３】
細胞リプログラミングおよび／またはＥＳＣ特色の獲得と従来関連するマイクロＲＮＡとは反対に、ｍｉＲ−３０２、およびｍｉＲ−３０２−３６７、ｍｉＲ−２９０−２９５またはｍｉＲ−１０６−３６３のクラスターのもの、ｍｉＲ−２０３等は、幹細胞性リプレッサーと判断される（Ｙｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｖｏｌｉｎｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）が、初期発生の間の発現は今まで未知であった。
【００２４】
幹細胞のマイクロＲＮＡ調節についてのいくつかの総説（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）は、Ｓｏｘ２およびＫｌｆ４の調整においてｍｉＲ２００ｃおよびｍｉＲ−１８３と協同するマイクロＲＮＡとしてｍｉＲ−２０３に言及する。実際、かかる記述は、ｍｉＲ−２０３がＳｏｘ２またはＫｌｆ４のレギュレーターではなく幹細胞性インヒビターとしてみなす研究論文（Ｗｅｌｌｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）を参照してなされる。具体的には、Ｗｅｌｌｎｅｒ  ｅｌ  ａｌ．は、ＺＥＢ１が、幹細胞性を阻害するｍｉＲ−２０３の発現を抑制すること、およびさらにｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−２０３およびｍｉＲ−１８３が、ポリコームリプレッサーＢｍｉ１について実証されるように、協同して、癌細胞およびマウス胚幹（ＥＳ）細胞中の幹細胞因子の発現を抑制することを報告した。
【００２５】
多能性細胞の幹細胞性のインヒビターとしてのｍｉＲ−２０３の役割は、上皮分化と関連して（Ｎｉｓｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）、より具体的には、ｈＥＳＣの角化細胞へのインビトロの分化と関連しても示唆され、そこでは、表皮分化の間のｍｉＲ−２０３の誘導は最も初期のステージから起こるが、ＢＭＰ４による処理（すなわち、そのｈＥＳＣは一旦表皮分化へ既にコミットされている）の３日後の角化細胞分化において意義のあるようになることが観察され得る。かかる結果に従って、ｍｉＲ−２０３は、上皮分化の誘導によって多能性細胞の幹細胞性を阻止する重要な因子と判断され得る。
【００２６】
同様にそのような流れで、ｍｉＲ−２０３によるサバイビンアイソフォーム発現の選択的調節は、特異的にｈＥＳＣの多能性を抑制することによって、ヒト胚性幹細胞の多能性に関する機構に寄与することが報告された（Ｋａｐｉｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。ｈＥＳＣ（Ｈ９）がｍｉＲ−２０３インヒビターによりトランスフェクションされる実験は、核サバイビンレベルの増加を示した一方で、ｍｉＲ−２０３の過剰発現がｍｉＲ−２０３前駆体によりｈＥＳＣをトランスフェクションすることによって達成されるアッセイは、核サバイビンレベルの減少をもたらした。言及された論文中で読み取ることができるように、かかる結果から、Ｋａｐｉｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．は、ｍｉＲ−２０３が、サバイビン発現を負に調節することによって多能性を阻害し得るという仮説を立てた。
【００２７】
ｉＰＳＣ中で、ｍｉＲ−２０３は幹細胞性の反対のプロセスに寄与し、ｉＰＳＣ機能を阻止すること（老化）が報告されている。そして、かかる効果は、ｍｉＲ−２０３−サバイビン−ｐ２１経路を介して正確に発揮される（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。
【００２８】
ｍｉＲ−２０３は癌と関連し、複数の癌において腫瘍抑制機能を提示すると考えられてきた（Ｂｕｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｍｉｃｈｅｌ  ＆  Ｍａｌｕｍｂｒｅｓ，２０１３）。フィラデルフィア染色体に関連する白血病の発症についてのｍｉＲ−２０３のエピジェネティック不活性化の重要性に加えて、前記白血病に対する療法としてのｍｉＲ−２０３を注射する可能性が検討されたが、それは、なぜならば、ｍｉＲ−２０３レベルの回復が発癌性タンパク質ＢＣＲ−ＡＢＬの産生を阻止し、結果として、腫瘍細胞の分裂増殖が、他の治療アプローチに耐性のある腫瘍の事例においてでさえ停止するからである。転移の有る一次腫瘍は、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０３ａの広範囲の抑制を示し、非対称のｈｓａ−ｍｉＲ−３０２（高い）／ｈｓａ−ｍｉＲ−２０３ａ（低い）が、侵襲性腺管癌における幹細胞マーカー、転移およびより短い生存と関連することが見出された（Ｖｏｌｉｎｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。
【００２９】
ｍｉＲ−２０３は、エピジェネティック装置の構成要素の制御に関与するマイクロＲＮＡのうちの１つとであるとも判断される。細胞形質転換の間のｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２６およびｍｉＲ−２９ファミリーメンバーと遺伝子Ｄｎｍｔ３ａ、Ｄｎｍｔ３ｂ、Ｍｅｃｐ２およびＥｚｈ２との間の発現の潜在的な関連性についての研究は、前記マイクロＲＮＡおよびそれらの検証または予測された標的が逆に発現されることを示し、これらの分子がエピジェネティックリプログラミングに関与することを指摘する。例えば、ｍｉＲ−２０３がマウスメラノサイト細胞においてＤｎｍｔ３ｂをダウンレギュレートすることが報告された（Ｇａｓｑｕｅ  Ｓｃｈｏｏｆ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。
【００３０】
残念なことに、そしてリプログラミング、ならびに幹細胞性および多能性のマーカーおよびデターミナントについて取得されたすべての知識にもかかわらず、多能性細胞の分化アウトカムに関する多くの疑問およびそれらの判断はどのように行われるかということが未解決のままである。研究者は体細胞のリプログラミングに関与する多数の分子経路を同定し始めたが、このプロセスを可能にする事象の完全なスペクトルを同定するには、さらにより基礎的な研究が要求されるだろう。リプログラミングプロセスおよびその動態の詳細、特にエピジェネティックリプログラミングは、不完全な理解のままである。
【００３１】
最終的に、大部分のストラテジーはリプログラミングの効率を改善するようにデザインされてきたが、既に確立している多能性細胞の分化能を改善することを目的とした適用はほとんどない。自己更新能力と一緒に完全な分化能を維持することは発生および再生の間の幹細胞の主要な特性であるが、リプログラミングプロセス後に得られた利用可能なＥＳＣまたはｉＰＳＣは多くの場合に後続の分化プロセスを容易にする質ではない。ｉＰＳＣの低い質、および同じリプログラミングプロセスからもたらされたｉＰＳＣの中での質の差は、ヒト再生療法におけるそれらの使用のために特に重要である。ｉＰＳＣは、起源の体細胞および細胞培養条件によって影響を受ける多能性幹細胞のサブセットであり、そのサブセットは、同じリプログラミングプロセスの過程で得られたｉＰＳＣの中でさえ差異を示すと、多くの著者らによって考えられる。多くのｉＰＳＣが分化能力の低減（それは不完全なゲノムリプログラミングによって説明され得る）を示し、それはナイーブ型状態よりもプライム型状態に近いｉＰＳＣを生じさせる。Ｈｏｎｄａおよび共同研究者（Ｈｏｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）は、連続継代およびより未成熟のナイーブ型様状態への変換によって、ｉＰＳＣの限定的な分化能を改善できることを報告した。かかるナイーブ型様の状態への変換は、レンチウイルスからのＯＣＴ３／４の発現、マウス胎仔線維芽細胞へのｉＰＳＣの継代、ならびにＣＨＩＲ９９０２１（ＧＳＫインヒビター）および白血病抑制因子を含む培地中の培養を要求する。かかる細胞は、成熟したオリゴデンドロサイトへの分化能力の改善を示し、このことは、ｉＰＳＣのナイーブ型様の変換がより高い分化能を賦与することを示唆する。
【００３２】
ナイーブ型状態（ＥＳＣまたはｉＰＳＣのいずれか）への多能性細胞のインビトロでの維持は挑戦的で、多くの研究の対象でもあり、それらのうちの大部分は、可能な限り幅広い多能性潜在能の維持を達成することを目的として、培養培地への異なる化合物の添加に注目する。血清＋白血病抑制因子（ＬＩＦ）の存在下において培養された場合に、マウスＥＳＣはナイーブ型状態で長期で維持され得る（Ｎｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。注目すべきことには、ＬＩＦ単独は多くの事例においてｍＥＳＣの分化を阻止することができず、ｉＰＳＣにおいてでさえ有効ではない。この限定は、ＬＩＦと共に「２ｉ」と称される２つの小分子キナーゼインヒビターを添加することによって部分的に克服される。２ｉ構成要素は、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ１／２）／マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）シグナル伝達経路の特異的インヒビター（ＭＥＫｉ、ＰＤ０３２５９０１）、およびグリコーゲンシンターゼキナーゼ３βの特異的インヒビター（ＧＳＫ３βｉ、ＣＨＩＲ９９０２１）を含み、それは分化促進刺激から多能性細胞を保護し、細胞を分化させることに対抗して選択することができる（Ｙｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。国際出願ＷＯ２０１２０８７９６５は、細胞の潜在能を維持または増加させる類似の方法を開示し、そこで、多能性細胞は、ＴＧＦ−β、ＧＳＫ３、ＭＥＫまたはＲＯＣＫのインヒビターから選択される少なくとも１つの小分子が存在するフィーダーなしの環境において培養され、その方法は、主に生存率の増加および潜在能の増加を達成し、その潜在能の増加は、以下の特色のうちの１つまたは複数によって特徴づけられる。ａ）内在性Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｔｒａｌ８１およびＬｉｎ２８からなる群から選択される少なくとも１つの多能性幹細胞マーカーの発現；ｂ）多能性幹細胞の形態；ｃ）生殖細胞系列伝達に寄与する能力；ｄ）奇形腫の形成；ｅ）分化する能力または出発の系譜から異なる系譜へと分化転換する能力；ならびにｆ）インビトロでの三系譜分化（それは多能性幹細胞のナイーブ型状況のマーカーと判断され得る）。
【００３３】
他の研究グループは、特異的系譜への分化の効率を改善するためおよび／または所望される分化プロセスについてより適切な細胞を選択するために、ｉＰＳ細胞の培養培地の修飾に注目した。それらのうちの大部分は化合物（上記のもの等）の添加に基づく。したがって、例えば、ＷＯ２０１４２０１２５４Ａ１は、ｉＰＳＣまたはＥＳＣから心筋細胞を導き出すためにマイクロＲＮＡが関与する方法を開示し、そこで、ｌｅｔ−７ファミリーのマイクロＲＮＡはインビトロでの心臓の成熟のために重要なマイクロＲＮＡとして記載される。ＥＰ２４９０７１Ａ２は、多能性幹細胞からの心筋細胞の産生のための方法および組成物を開示し、そこで、多能性細胞はＲＯＣＫインヒビターの存在下において心筋細胞へと分化する。ＷＯ２０１４２０００３０Ａ１は、多能性幹細胞から造血幹細胞および／または造血前駆細胞を得るための方法を開示し、それは、ＩＧＦ２の存在下において多能性幹細胞を培養すること、および１つまたは複数の遺伝子の発現のレベルに基づいて造血幹細胞へと分化するための高い能力を有する人工多能性幹細胞を選択することを含む。ＥＰ２６４６５４３Ａ１は、角膜細胞を生成する方法を開示し、そこで、ヒト多能性幹細胞は、細胞外マトリックス成分を含む固体表面上の角膜線維芽細胞馴化培地中で培養される。ＫＲ２０１７０１１６７６Ａは、脱細胞された器官組織に由来する生体親和性可溶化スキャフォールド抽出物を含む培養組成物を使用して、幹細胞を肝細胞へ分化させる方法を開示する。ＷＯ２０１７０６２３７４は、生体適合性ポリマーを含む立体培養系、ならびにソニックヘッジホッグシグナル経路のアゴニスト、ｗｎｔシグナル経路アゴニスト、レチノイン酸およびデュアルＳｍａｄのインヒビターから選択されるオリゴデンドロサイトへの分化を増進する少なくとも２つの因子の組み合わせを使用して、多能性幹細胞からオリゴデンドロサイト前駆体を生成するための組成物および方法を開示する。
【００３４】
いくつかのグループは、培養培地へ単一分子を添加して、複数の系譜への多能性幹細胞分化の改善を達成したことを報告している。２０１３年にＣｈｅｔｔｙ  ｅｔ  ａｌ．は、多能性幹細胞をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で培養した後に２５を超える幹細胞株において複数の系譜への指向性分化についてのコンピテンシーの改善を記載し、そこでは、細胞周期のＧ１初期の細胞の比率が増加し、結果的に指向性分化についてのコンピテンシーが改善され、機能的誘導物への最終分化でさえ増進した。それにもかかわらず、それらのストラテジーのどれも得られた多能性細胞のナイーブ型状態を適切に達成しないが、それは、なぜならば、それらの細胞の幹細胞性能力が実証されず（ナイーブ型細胞の上記の特徴で記載される特色のどれもそれらの事例において検討されない）、分化改善は実質的ではなく、一般に以前の研究は厳格な多能性アッセイ（４ｎ相補性またはキメラ寄与率等）を欠損するからである。
【００３５】
したがって、新しい小分子（ＬＩＦ、２ｉ、ｂＦＧＦ、ＴＧＦβ、ＪＮＫｉ、ｐ３８ｉ、ＲＯＣＫｉ、アクチビンＡ等）の添加、および／または転写因子（ＫＬＦ４、ＫＬＦ２、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ等）の持続発現による、インビトロの多能性細胞の培養における最近の改善にもかかわらず、多能性細胞の分化能の改善は、リプログラミングプロトコールの間または一旦多能性細胞が確立されてからのいずれかで、未解決の問題および達成すべき重要なゴールのままである。臨床的ツールとしての使用のために培養された多能性細胞が考慮され得る前に、分化細胞の生成の効率を実質的に改善しなくてはならない。多能性細胞の臨床適用は、疾患組織を修復する探究において置換細胞を生成する潜在能を備えた、多様な細胞タイプへと分化し得る幹細胞の安全且つ高効率の生成を要求するだろう。多能性細胞の質の改善も、細胞運命決定を調節する機構を分析するための、または様々なヒト疾患が特異的な突然変異およびエピ変異の結果としてどのように生じるかを調査する疾患モデルを開発するための、およびその情報により、かかる疾患を治癒させるかもしくは場合によっては予防する新しい薬物を開発するための、有用な研究ツールにするために重要である。
【００３６】
ＤＭＳＯの添加に基づく分化能を改善する方法は、有望なアプローチを意味するが、好ましくは代替の方法が開発されるべきである。
【００３７】
したがって、幹細胞性特性および／または異なる細胞タイプへの分化能を増加させることによって、多能性細胞（特にｉＰＳＣ）の質を改善する方法の必要性がある。好ましくは、方法は、複雑なデバイスまたは非常に高価な産物を要求せずに遂行するのがたやすく、可能であるならば、可能な限り安全な分子により実践することが実現可能であるべきである。
【００３８】
本発明は、かかる問題への解決策を提供する。
【発明の概要】
【００３９】
本発明は、単一のマイクロＲＮＡ（マイクロＲＮＡ−２０３）の一過性の発現またはレベルの増加が、複数のアッセイにおいて、ｉＰＳＣまたはＥＳＣのいずれかの機能を改善することができるという、本出願において開示される意外な所見に基づく。ｍｉＲ−２０３への一過性の曝露の効果は二重である。第一に、ｉＰＳＣにおけるｍｉＲ−２０３のレベルの増加は、幹細胞性シグネチャーのアップレギュレーションを包含する、ＥＳ細胞（ナイーブ型状態またはナイーブ型様の状態）に近い転写プロファイルを誘導する。報告された２Ｃ様ステージ（２細胞胚における全能性細胞の特徴）を使用する場合にも、幹細胞性特性におけるこの増加が観察される。第二に、多能性細胞におけるｍｉＲ−２０３の一過性の発現またはレベルの増加は、インビトロで生成された胚様体において、またはマウス中へのこれらの細胞の注射後に観察された奇形腫および胚様構造において、示されるように、三胚葉を包含する複数の系譜へのインビトロおよびインビボでの分化の促進をもたらす。ｍｉＲ−２０３への曝露は、稀な分化した組織（膵臓、骨髄またはトロホブラスト等）の生成を改善し、これらの構造は、多能性細胞におけるｍｉＲ−２０３への一過性の曝露の何週間も後でさえ形成された。心筋細胞への特異的な分化は、ｍｉＲ−２０３への曝露が、分化だけでなくもたらされた細胞における成熟および機能性も支援することを示唆する。
【００４０】
したがって、本発明は、第１の態様において、多能性細胞の幹細胞性および／または分化能を促進するための方法であって、当該細胞が増加したレベルのマイクロＲＮＡ−２０３またはそのアナログへ曝露されるステップを含む、方法に言及する。好ましくは、多能性細胞は培養下の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であるが、それらは培養下の胚性幹細胞（ＥＳＣ）であってもよい。同様に好ましくは、当該細胞は、増加したレベルのマイクロＲＮＡ−２０３またはそのアナログへ一過性に（例えば３〜５日の間）曝露される。細胞が曝露されるマイクロＲＮＡ−２０３のレベルの増加は、マイクロＲＮＡ−２０３を発現する発現ベクターにより細胞を形質導入もしくは形質転換すること（および発現が誘導可能ならばかかる発現を誘導すること）によって、またはそれらが培養下であるならば、マイクロＲＮＡ−２０３もしくはそのアナログをｉＰＳＣの培養培地へ添加することによって、達成され得る。可能なアナログの中で、少なくともマイクロＲＮＡ−２０３の成熟形態の配列（配列番号：１）との高い程度の相同性を備えた断片を含有する小分子ＲＮＡ分子、および好ましくは化学的修飾によるものは、好ましい可能な実施形態であり、アナログの中には二本鎖ＲＮＡ模倣体も包含される。本発明の前記方法は、例えばオリジナルのＹａｍａｎａｋａの方法（以下のファミリー（Ｏｃｔファミリー、Ｋｌｆファミリー、ＭｙｃファミリーおよびＳｏｘファミリー）のうちの各々１つの遺伝子産物を含む核リプログラミング因子と、体細胞の分化細胞（好ましくは線維芽細胞）を接触させる）等の任意の方法、またはその変形によって、ｉＰＳＣを得ることとの適合性がある。
【００４１】
上記のように、増加レベルのマイクロＲＮＡ−２０３またはそのアナログへ曝露される細胞が、少なくとも３’アームまたはそのアナログから生じるｍｉＲ−２０３の成熟形態へ曝露されることは、他のすべての実施形態と適合性のある、本発明の方法の好ましい実施形態である。かかる成熟形態は、任意の哺乳動物種のｍｉＲ−２０３成熟形態であり得る。増加レベルのｍｉＲ−２０３へ曝露される多能性細胞は好ましくはヒトまたはマウスの起源であるので、少なくともｈｓａ−ｍｉＲ−２０３ａ−３ｐ（配列番号：１）もしくはｍｍｕ−ｍｉＲ−２０３−３ｐ（配列番号：４）またはそのアナログへの曝露が好ましく、それは、単独で、またはｍｉＲ−２０３の他の形態との組み合わせ（ｈｓａ−ｍｉＲ−２０３ａ−３ｐおよび／もしくはｍｍｕ−ｍｉＲ−２０３−３ｐのアナログ、５’アームから生じるｍｉＲ−２０３の成熟形態（ｈｓａ−ｍｉＲ−２０３ａ−５ｐ＊および／またはｍｍｕ−ｍｉＲ−２０３−５ｐ＊等）またはそのアナログの組み合わせを包含する）であり得る。添加する分子がｍｉＲ−２０３またはそのアナログのプレｍｉＲＮＡである場合でさえ、細胞は、細胞における前記プレｍｉＲＮＡのプロセシングに起因して、前記成熟形態へ曝露され得る。
【００４２】
以前にコメントされるように、ｍｉＲ−２０３はプレｍｉＲＮＡとしてインビボで発現され（それはヒト分子の事例において配列番号：２およびマウス分子の事例において配列番号：３によって提示される）、そのプレｍｉＲＮＡは２つの異なる成熟形態を生じ、１つはプレｍｉＲＮＡの５’アームから、および他の１つは３’アームから生じる。３’アームから生じる成熟形態は最も豊富なものであり、実施例１のアッセイのうちの１つによれば、より高い程度で、本発明の効果（少なくとも胚体（ｅｍｂｒｙｏ−ｂｏｄｙ）形成に関連するもの）の責任を負う形態である。図１０中で見ることができるように、ｍｉＲ−２０３の配列は、異なる哺乳類種の中で高度に保存される（特にＤｎｍｔ３ａおよびＤｎｍｔ３ｂに関連するシード領域）。したがって、本発明の目的のために、マイクロＲＮＡの特定の種または特定の形態への参照を規定しない限り、「ｍｉＲ−２０３」または「マイクロＲＮＡ−２０３」という用語は、任意の哺乳動物によって発現されるマイクロＲＮＡ−２０３およびその可能な形態のうちの任意のものを網羅し、すなわち：プレｍｉＲＮＡ、および／または５’アーム（ヒト分子（ｈｓａ−ｍｉＲ−２０３ａ−５ｐ）の事例において配列番号：５３およびマウス分子の事例において配列番号：５４によって表わされる）もしくは３’アーム（ヒト分子（ｈｓａ−ｍｉＲ−２０３ａ−３ｐ）またはマウス分子（ｍｍｕ−ｍｉＲ−２０３−３ｐ）について配列番号：１および配列番号：４（それは同一である）によって表わされる）のいずれかから生じる成熟形態である。ｍｉＲ−２０３の前記形態の２つ以上の組み合わせ、ならびに本出願の大部分の例でのように、非常に特に５’アームおよび３’アームから生じる２つの成熟形態の組み合わせも、「ｍｉＲ−２０３」または「マイクロＲＮＡ−２０３」という用語によって網羅される。「ｍｉＲ−２０３のアナログ」または、前提がそれを正当化する場合に「そのアナログ」という用語は、１つの分子または分子の混合物を網羅し、それらのうちの各々が「マイクロＲＮＡ−２０３」または「ｍｉＲ−２０３」という用語によって網羅される分子のうちの任意のもののアナログであることが想定され、好ましくは、分子または混合物の分子のうちの少なくとも１つは、プレｍｉＲＮＡ−２０３の３’アームから生じる１つの成熟形態のアナログまたは模倣体（以下に定義されるような）であり、最も好ましくは、「アナログ」という用語によって定義される分子または分子の混合物のうちの少なくとも１つは、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０３ａ−３ｐ（配列番号：１）またはｍｍｕ−ｍｉＲ−２０３−３ｐ（配列番号：４）のアナログであるだろう。
【００４３】
本発明の別の可能な態様は、本発明の方法を実行した後に（特に増加レベルのｍｉＲ−２０３への一過性の曝露後に）得られる多能性細胞であり、それは出発材料として使用されるリプログラミングされたｉＰＳＣとは異なる。当該ナイーブ型多能性細胞が分化プロトコールへかけられる場合に（インビトロまたはインビボで）、それらは拡大された細胞運命潜在能を示し、Ｎａｎｏｇ、ＯｃｔおよびＳｏｘ２発現（十分に確立されている多能性のマーカー）によって特徴づけられる細胞を生成するが、ネスチン、Ｇａｔａ４またはＣｄ３４（十分に確立されている分化のマーカー）を発現する細胞が同じ培養集団中でそれらと共存すると思われる。それらがナイーブ型様の細胞である徴候（ナイーブ型細胞の特徴的な細胞形態学、キメラに寄与する能力、および生殖細胞系列伝達等）を示すことを指摘することも重要である。
【００４４】
本発明の方法からもたらされたナイーブ型多能性細胞は、改善された分化および成熟の転帰を示し、特異的に心筋細胞へ分化させた場合に、そのことは特に観察され得る。これを考慮に入れて、本発明の別の態様は、分化細胞（心筋細胞等）を得るための、本発明の前記細胞の使用である。他の可能な実施形態は、神経系の細胞（例えばニューロンおよびグリア細胞）、軟骨細胞、または膵臓β細胞である。
【００４５】
したがって、本発明の方法は、改善された幹細胞性能力および増大された分化能を備えたナイーブ型多能性細胞、並びに分化細胞および／または成熟細胞を得るためのストラテジーと考えることができる。本発明の方法によって得られた分化細胞または成熟細胞も、本発明の範囲内に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】アッセイのために生成されたマウス対立遺伝子。ａ、本出願のためのマウスｍｕ−ｍｉＲ２０３遺伝子座で生成された異なる対立遺伝子の図解描写。ｂ、ｍｉＲ−２０３（−／−）マウスにおける発生不全の尾皮膚を示す代表的な顕微鏡写真。ヘマトキシリン−エオシン染色；スケールバー、５０μｍ。ｃ、本研究において生成されたｍｉＲ−２０３の誘導可能なノックインモデルの図解描写。ｍｉＲ−２０３  ＫＩ［ＣｏｌＡ１（ｍｉＲ−２０３／ｍｉＲ−２０３）；Ｒｏｓａ２６（ｒｔＴＡ／ｒｔＴＡ）］モデルにおいて、リバーステトラサイクリントランス活性化因子はＲｏｓａ２６遺伝子座から発現されるが、ｍｉＲ−２０３はＣｏｌＡ１遺伝子座の下流のテトラサイクリンオペレーターによって駆動される。ｄ、ｍｉＲ−２０３  ＷＴ、ＫＯおよびＫＩ（ドキシサイクリンによる誘導後；Ｄｏｘ）のＭＥＦ（左側パネル）、またはドキシサイクリンにより処理したかもしくは処理しないｍｉＲ−２０３  ＫＩのＥＳＣおよびｉＰＳＣ（右側パネル）における、定量的ＰＣＲによって決定されるようなｍｉＲ−２０３  ＲＮＡ発現。ＲＮＡ発現を対照ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−１４２）によって正規化する。＊＊＊Ｐ＜０．００１（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。
【図２】ｉＰＳＣおよびＥＳＣの多能性および分化能におけるｍｉＲ−２０３の一過性の誘導の効果。ａ、ｍｉＲ−２０３突然変異ＭＥＦの多能性ｉＰＳＣへのリプログラミングおよび胚様体への後続の分化のためのプロトコール。野生型（ＷＴ）、ノックアウト（ＫＯ）およびノックイン（ＫＩ）のＭＥＦに、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃ（ＯＳＫＭ）を発現するウイルスを、形質導入した。次いでもたらされたｉＰＳＣをドキシサイクリン（Ｄｏｘ）１μｇ／ｍｌにより５日間処理した。ｔＫＩは、ノックイン細胞における指示された５日間の一過性のｍｉＲ−２０３発現を示す。胚様体生成プロトコールの開始の前に、Ｄｏｘを１５〜３０日間除去した。ＲＮＡシーケンシングのためのサンプルをＤｏｘ中止の３０日後に採取した。ｂ、ＷＴのｉＰＳＣ（ｎ＝３クローン）、ｔＫＩのｉＰＳＣ（ｎ＝４）およびＷＴのＥＳＣ（ｎ＝３）からのＲＮＡシークエンシングデータの主成分分析。ｃ、ゲノムワイドのＲＮＡシークエンシングデータのバイアスのないクラスタリング（ｕｎｂｉａｓｅｄ  ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）（左側）、および多能性と関連する４５０遺伝子の比較発現を示すヒートマッププロット（幹細胞性シグネチャー；１サンプルあたり２クローン）。ｔＫＩのｉＰＳのプロファイルは、階層ツリーが実証するように、ＥＳ細胞において観察されたものに類似する。ｄ、１０日または１５日の分化後のＷＴ、ＫＯおよびｔＫＩのｉＰＳＣに由来する胚様体（ＥＢ）の代表的な画像。スケールバー、５００μｍ。真中のヒストグラムは、分化の１０日目の３つの遺伝子型から生成されたＥＢの数を示す。データは平均±標準偏差である（ｎ＝９の独立した実験）。ＥＢサイズ（分化の０日目に比べた）の増加を、右側パネル中で示す。データは平均±標準偏差として表わされる（ｎ＝３の独立した実験）。ｅ、ＷＴ、ＫＯおよびｔＫＩのｉＰＳＣに由来するＥＢにおけるＣｄ３４（中胚葉；緑色）、Ｇａｔａ４（内胚葉；赤色）およびＰａｘ６（外胚葉；青色）の代表的な免疫蛍光検出。スケールバー、２０μｍ。ｆ、ｔＫＩのＥＢにおけるＣｄ３４（中胚葉）、Ｇａｔａ４（内胚葉）およびネスチン（外胚葉）の免疫組織化学的検出。スケールバーは、上部画像について５００μｍ、および下部画像について１００μｍ（Ｃｄ３４、Ｇａｔａ４）または５０μｍ（ネスチン）である。ｇ、分化の間の異なるタイムポイントでベヒクル（ＫＩ）またはＤｏｘ（ｔＫＩ）により処理した、ＫＩのｉＰＳＣおよびＥＳＣに由来するＥＢの代表的な画像。スケールバー、５００μｍ。ｈ、指示された時間経過の間の、内部の長い空洞を提示するＥＢおよび拍動するＥＢのパーセンテージの定量化。データは平均±標準誤差として表わされる（ｎ＝３の独立した実験）。ｉ、２Ｃ：：ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターを安定的に発現し、そしてＧＦＰウイルスまたはｍｉＲ−２０３−ＧＦＰウイルスを一過性に形質導入した、ＥＳＣの代表的な免疫蛍光分析。スケールバー、１０μｍ。右側のプロットは、全ＧＦＰ陽性細胞のうちのｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞のパーセンテージを示す。データは平均±標準誤差として表わされる（ｎ＝３の独立した実験）。ｄ、ｈおよびｉにおいて、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０���；＊＊＊Ｐ＜０．００１（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。
【図３】ｉＰＳＣにおけるｍｉＲ−２０３の一過性の遺伝子誘導後の胚様体生成の改善。ａ、ｍｉＲ−２０３  ＫＩのｉＰＳＣから胚様体（ＥＢ）を生成する実験デザイン。細胞をドキシサイクリン（Ｄｏｘ）により５日の間処理したかまたは処理せず、次いで胚様体形成アッセイの開始に前に、続く２週間の間Ｄｏｘを除去した。ｂ、分化プロセスの異なるタイムポイントでの５つの異なるＫＩクローンに由来する、非誘導（−Ｄｏｘ）ＥＢまたは一過性誘導（＋Ｄｏｘ）ＥＢの代表的な画像。スケールバー、５００μｍ。ｃ、分化プロセスの間の、内部の長い空洞を備えたＥＢ、拍動するＥＢ、およびＥＢサイズの定量化。データは平均±標準誤差である（ｎ＝５の独立した実験）。＊＊Ｐ＜０．０１（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。ｄ、誘導対非誘導のＫＩのｉＰＳＣ（４つの独立したクローンを分析した）において、有意にアップレギュレートされた遺伝子の遺伝子オントロジー分析における上位のカテゴリー。ｅ、非誘導（ＫＩ）または一過性誘導（ｔＫＩ）のｉＰＳＣに加えて、非誘導胚様体（ＥＢ）における、ＧＯ：００４８５１３（器官の発生）中に含まれる遺伝子の発現プロファイルを示すヒートマップ。ｔＫＩおよびＫＩのＥＢについて観察されたプロファイルは、対照ＫＩのｉＰＳに比較した場合よりも、それらの間で類似する。ｆ、指示されたサンプルにおける幹細胞性シグネチャー中に含まれる遺伝子の発現プロファイルを示すヒートマップ。ｔＫＩのｉＰＳのみが、このシグネチャー中に含まれる遺伝子を高いレベルで発現する。
【図４】ｍｉＲ−２０３の一過性の外来性発現後の胚様体形成の改善。ａ、ｍｉＲ−２０３の一過性の発現のために、レトロウイルスにより形質導入されたかまたはｍｉＲＮＡ模倣体によりトランスフェクションされた、のいずれかである、野生型のｉＰＳＣまたはＥＳＣから、胚様体（ＥＢ）を生成するのに使用される実験デザインの図解描写。ｂ、ｐＭＣＳＶもしくはｐＭＣＳＶ−ｍｉＲ−２０３により形質導入されたかまたは対照模倣体もしくはｍｉＲ−２０３模倣体によりトランスフェクションした、野生型のｉＰＳＣにおけるｍｉＲ−２０３  ＲＮＡの発現。ＲＮＡ発現を対照ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−１４２）によって正規化する。＊＊＊Ｐ＜０．００１（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。ｃ、分化プロセスの間の異なるタイムポイントでの、空のｐＭＣＳＶベクター、ｐＭＣＳＶ−ｍｉＲ−２０３により形質導入されたかまたは対照模倣体もしくはｍｉＲ−２０３模倣体によりトランスフェクションした、野生型のｉＰＳＣ（左側）またはＥＳＣ（右側）のいずれかに由来するＥＢの代表的な画像。スケールバー、５００μｍ。ｄ、分化プロセスの間の、長い空洞を備えたＥＢおよび拍動するＥＢの定量化。データは平均±標準誤差である（ｎ＝３の独立した実験）。＊＊Ｐ＜０．０１（ｉＰＳ細胞およびＥＳ細胞の両方において；Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。ｅ、従来のプロトコールにおいて生成されたＥＢの代表的な顕微鏡写真。構造における複雑性および長い空洞の形成が下部パネル中で示されることに注目されたい。スケールバー、２００μｍ（上部パネル）および５００μｍ（下部パネル）または５０μｍ（挿入図）。
【図５】ｍｉＲ−２０３ａ−３ｐ対ｍｉＲ−２０３ａ−５ｐの一過性の外来性発現後の胚様体形成の改善。分化プロセスの間の異なるタイムポイントでの、対照模倣体、ｍｉＲ−２０３ａ−３ｐまたはｍｉＲ−２０３ａ−５ｐ模倣体によりトランスフェクションした、野生型のＥＳＣに由来するＥＢの代表的な画像。スケールバー、５００μｍ。
【図６】ｍｉＲ−２０３へのｉＰＳＣの一過性の曝露は、インビボで複雑な奇形腫をもたらす。ａ、ＷＴ、ＫＯおよびｔＫＩの（ＧＦＰ発現）ｉＰＳＣの皮下注射の２０〜２５日後に生成された奇形腫の代表的な画像。スケールバー、５ｍｍ。下部の像は、ＧＦＰを発現するｔＫＩのｉＰＳＣ由来胚様構造の例を示す。スケールバー、１ｍｍ。右側のプロットは、実験の終了時に測定された腫瘍体積（ｍｍ３）を示す。データは平均±標準誤差として表わされる（１遺伝子型あたりｎ＝８腫瘍）。ｂ、奇形腫における特異的な高度に分化した組織の出現率。分析において含まれる腫瘍の数はパネル中で指示される。ｃ、ヌードマウスにおける腹腔内注射後のｔＫＩのｉＰＳＣから生成された高度に分化した奇形腫の代表的な例。大部分のこれらの複雑な奇形腫は、子宮の近傍において、または宿主マウスにおける卵巣嚢腫として、検出された。パネルは、奇形腫中で観察される複数の分化した組織および細胞のより高い倍率（Ｈ＆Ｅ染色）を示す。スケールバー、１ｍｍ（中央の画像）または５０μｍ（挿入図）。ｄ、ＷＴ、ＫＯおよびｔＫＩのｉＰＳＣに由来する奇形腫における多能性マーカー（Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２）、および三胚葉への分化のマーカー（ネスチン、Ｇａｔａ４、ＣＤ３４））の免疫組織化学的検出。スケールバー、２０００μｍ、およびより高い倍率について１００μｍ。ａおよびｂ中で、＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。
【図７】ｍｉＲ−２０３  ｔＫＩのｉＰＳＣから生成された奇形腫における分化特性。ａ、ｔＫＩのｉＰＳＣ由来奇形腫中で見出される特異的な組織の組織病理学的な例（Ｈ＆Ｅ染色）。スケールバー、１００μｍ。胎盤性ラクトゲン−１（ＰＬ−１）により染色されたトロホブラストの拡大も示される（スケールバー，５０μｍ）。ｂ、野生型奇形腫に比較して、ｍｉＲ−２０３  ｔＫＩ由来奇形腫において有意に変更された遺伝子の遺伝子オントロジー分析。ｃ、野生型、ＫＯまたはｔＫＩのｉＰＳＣに由来する奇形腫の免疫組織化学的分析。増殖マーカーＫｉ６７、または平滑筋もしくは骨格筋への最終分化マーカー（アクチン）に対する抗体を使用した。スケールバー、２０００μｍ、およびより高い倍率について１００μｍ。ｄ、ｔＫＩのｉＰＳＣから生成された奇形腫におけるＣＤ３１（骨髄）、ＣＤ７３（膵臓）、Ｉ型コラゲナーゼ（軟骨）およびインスリン（産生中の細胞）の免疫検出。スケールバー、２０μｍ。
【図８】ｍｉＲ−２０３へのインビトロでの一過性の曝露は、インビボで生成されたｉＰＳＣによって誘導されたものに類似する、宿主マウス中での胚様構造をもたらす。ａ、ｔＫＩのＧＦＰ発現ｉＰＳＣの腹腔内注射後に生成されたＥ−Ｌｓの代表的な例。Ｈ＆Ｅ（ヘマトキシリン−エオシン）。以下の抗原：ＧＦＰ、Ｓｏｘ２（外胚葉）、Ｃｄ３４（中胚葉）、Ｇａｔａ４（内胚葉）、ＡＦＰおよびＣＫ８（卵黄嚢の臓側内胚葉）ならびにＴｅｒ１１９（有核赤血球系細胞）を免疫組織化学によって検出した。スケールバー、５００μｍ、およびより高い倍率について１００μｍ。ｂ、胚四倍体補完アッセイにおいてｔＫＩのｉＰＳＣから生成された、成育可能な全ｉＰＳＣマウス（黒色）の代表的な例の写真。
【図９】ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ａおよび３ｂは、多能性および分化の制御に関与するｍｉＲ−２０３の標的である。ａ、ＷＴのｉＰＳＣに対してｔＫＩにおいてダウンレギュレートされ、ＷＴのｉＰＳＣに対してＫにおいてアップレギュレートされ、ｍｉＲ−２０３の標的として予測される、共通の遺伝子を表わすベン図（共通の３５の転写物（Ｄｎｍｔ３ａおよびＤｎｍｔ３ｂを包含する）のリストについて表６に示す）。ｂ、ｃ、示された転写物からの野生型３’ＵＴＲを保有するＤＮＡコンストラクト（ｂ）、またはルシフェラーゼレポーターの下流の、Ｄｎｍｔ３ａおよびＤｎｍｔ３ｂの３’ＵＴＲの変異バージョン（ｃ）により、トランスフェクションされた２９３Ｔ細胞における相対的ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ；Ｒｅｎｉｌｌａ属ルシフェラーゼに正規化し、ＤＮＡ量に比べて）。細胞に、トランスフェクションの対照としてのＲｅｎｉｌｌａ属ルシフェラーゼ、およびＧＦＰまたはｍｉＲ−２０３−ＧＦＰを発現するプラスミドをコトランスフェクションした。データは平均±標準偏差として表わされる（ｎ＝３の独立した実験）。ｄ、Ｄｎｍｔ３ａおよびＤｎｍｔ３ｂのｃＤＮＡまたは空ベクターにより一過性に同時に形質導入され、ベヒクルまたはＤｏｘにより指示されるように処理したｔＫＩのｉＰＳＣに由来する胚様体（ＥＢ）の代表的な画像。スケールバー、５００μｍ。ヒストグラムは、異なるタイムポイントでの、長い空洞を備えたＥＢ、拍動するＥＢおよびＥＢサイズの定量化を示す。ｅ、２Ｃ：：ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターを安定的に発現し、そしてｐＭＣＳＶ−ＧＦＰ、ｐＭＣＳＶ−ｍｉＲ−２０３−ＧＦＰ、またはｐＭＣＳＶ−ｍｉＲ−２０３−ＧＦＰ＋Ｄｎｍｔ３ａ／ｂ  ｃＤＮＡのいずれかにより一過性に形質導入された、ＥＳＣにおける、ＧＦＰまたはｔｄＴｏｍａｔｏの免疫検出。スケールバー、１６μｍ。プロットは、全ＧＦＰ陽性細胞のうちのＴｏｍａｔｏ陽性細胞のパーセンテージを示す。データは平均±標準誤差として表わされる（ｎ＝３の独立した実験）。ｆ、ｔＫＩのｉＰＳＣにおいてダウンレギュレートされ、ｍｉＲ−２０３の標的として予測され、遺伝子転写のエピジェネティック調節（ＧＯ：００４００２９）にも関与する、共通の遺伝子を表わすベン図。ｇ、野生型のｉＰＳＣ、ｔＫＩのｉＰＳＣ、および対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＣ）、またはＤｎｍｔ３ａ（ｓｉＤｎｍｔ３ａ）、Ｄｎｍｔ３ｂ（ｓｉＤｎｍｔ３ｂ）もしくは両方（ｓｉＤｎｍｔ３ａ／ｂ）に対する特異的なｓｉＲＮＡのいずれかによりトランスフェクションした、野生型のｉＰＳＣからのプロファイルを包含する、ＲＮＡシークエンシングデータからの主成分分析。ｈ、Ｄｎｍｔ３ａおよびＤｎｍｔ３ｂの発現がｓｉＲＮＡによって一過性に抑制された、野生型のｉＰＳＣに由来する胚様体（ＥＢ）の代表的な画像。スケールバー、５００μｍ。ヒストグラムは、分化プロセスの間の異なるタイムポイントでの、ＥＢのサイズの定量化、および大きな空洞または拍動の有るＥＢのパーセンテージを示す。ｉ、２Ｃ：：ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターを安定的に発現し、そして対照模倣体、ｍｉＲ−２０３模倣体、ｍｉＲ−２０３模倣体＋Ｄｎｍｔ３ａおよびＤｎｍｔ３ｂ  ｃＤＮＡ、���たはＤｎｍｔ３ａおよびＤｎｍｔ３ｂ転写物の両方に対するｓｉＲＮＡのいずれかにより一過性にトランスフェクションした、ＥＳＣにおけるｔｄＴｏｍａｔｏおよびＤＡＰＩの検出。スケールバー、５０μｍ。ｊ、左側のヒストグラムは、トランスフェクションの５日後のパネルｉ）のアッセイにおけるＴｏｍａｔｏ陽性細胞のパーセンテージを示す。右側のヒストグラムは、Ｔｏｍａｔｏ陽性コロニーのパーセンテージを示し、そこで、Ｔｏｍａｔｏは、クローンの周辺部でのみ（黒色）またはコロニーを構成する大多数の細胞において（灰色）発現される。データは平均±標準誤差である（ｎ＝３の独立した実験；対照模倣体について４８６コロニー、ｍｉＲ−２０３模倣体について５０４コロニー、ｍｉＲ−２０３模倣体＋Ｄｎｍｔ３ａ／３ｂ  ｃＤＮＡについて５１５コロニー、およびＤｎｍｔ３ａ／３ｂ  ｓｉＲＮＡについて４４９コロニー）。ｋ、（ｉ）中で指示されるように一過性にトランスフェクションされた野生型のｉＰＳＣにおける、ｍｉＲ−２０３、Ｄｎｍｔ３ａおよびＤｎｍｔ３ｂの転写産物発現。ＲＮＡ発現をトランスフェクションプロトコールの２４時間後に測定し、それぞれ対照ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−１４２）またはＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡによって正規化した。ｂ〜ｅ、ｈ、ｊ、ｋ中で、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。
【図１０】ｍｉＲ−２０３とＤｎｍｔａ／ｂの３’−ＵＴＲ配列との間のアライメント。ａ、複数の代表的な種における、Ｄｎｍｔ３ａおよびＤｎｍｔ３ｂの３’ＵＴＲのアライメント（Ｈｓａ：Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ；Ｍｍｕ：Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ；Ｒｎｏ：Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ；Ｏｃｕ：Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ；Ｐｔｒ：Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ（チンパンジー）；Ｍｍｌ：Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ；Ｏｇａ：Ｏｔｏｌｅｍｕｒ  ｇａｒｎｅｔｔｉ；Ｔｂｅ：Ｔｕｐａｉａ  ｂｅｌａｎｇｅｒｉ；Ｅｅｕ：Ｅｒｉｎａｃｅｕｓ  ｅｕｒｏｐａｅｕｓ；Ｃｆａ：Ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ（イヌ）；Ｅｃａ：Ｅｑｕｕｓ  ｃａｂａｌｌｕｓ；Ｂｔａ：Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ（ウシ）；Ｅｔｅ：Ｅｃｈｉｎｏｐｓ  ｔｅｌｆａｉｒｉ；Ｆｃａ：Ｆｅｌｉｓ  ｃａｔｕｓ（イエネコ））。これらの３’−ＵＴＲ中に含有されるｍｉＲ−２０３の標的部位のシード領域を、太字フォントで強調し、対応するｍｉＲ−２０３シード配列とアライメントさせる。ｂ、野生型のＤｎｍｔ３ａ（左側）またはＤｎｍｔ３ｂ（右側）の完全な３’−ＵＴＲまたは対応する変異バージョンを、ルシフェラーゼ遺伝子の下流に保有するルシフェラーゼレポーターの図解描写。変異残基に下線を引いて示す。
【図１１】ｍｉＲ−２０３の一過性の発現は、ｉＰＳＣにおいてゲノムワイドの低メチル化を誘導する。ａ、ＷＴおよびｔＫＩのｉＰＳＣならびにそれらに由来する胚様体（ＥＢ）のゲノムワイドのＤＮＡメチル化分析のための実験デザイン。細胞（２つの独立したｔＫＩクローンおよび２つのＷＴの技術的反復物）を、Ｄｏｘにより一過性に５日間処理し、次いでＥＢ形成プロトコールの開始の前に追加の２０日間でＤｏｘ中止を行った。ＤＮＡおよびＲＮＡの分析のためのサンプルを、Ｄｏｘの前（ｔ＝０）、Ｄｏｘ中止の５日後（ｔ＝１０）、Ｄｏｘ中止の２０日後（ｔ＝２５）、またはＥＢ生成プロトコールの開始の７日後（ｔ＝３２日）の指示されたタイムポイントで収集した。ｂ、ＤＮＡメチル化バレー（ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｖａｌｌｅｙ）（ＤＭＶ）および部分的メチル化ドメイン（ＰＭＤ）の数およびサイズを示すゲノムワイドのＤＮＡメチル化データ。ｃ、１００ｋｂのブロックにわたって平滑化された、指示されたサンプルのＤＮＡメチル化分布。ｄ、指示されたサンプル（明確にするために、ｗｔおよびｔＫＩのサンプルを分離してグループ化する）において、異なるメチル化プロフィールの分布を示す主成分分析。ｅ、指示された比較における、メチル化可変単一ＣｐＧ部位（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ｓｉｎｇｌｅ  ＣｐＧ  ｓｉｔｅ）（ＤＭＰ）およびメチル化可変領域（ＤＭＲ）の数。ｆ、ｍｉＲ−２０３耐性のＤｎｍｔ３ａ／ｂ  ｃＤＮＡによるＤＮＡメチル化レスキューを試験するために従った実験的なプロトコール。Ｓｉｒｔ６およびＥｌｆ５の遺伝子座での特異的なメチル化可変領域（ＤＭＲ）を、バイサルファイト修飾ＤＮＡのＰＣＲ増幅およびシーケンシングによって分析した。メチル化されたＣｐＧ対メチル化されないＣｐＧの定量化を、ヒストグラム中で示す。
【図１２】ｍｉＲ−２０３への一過性の曝露後のｉＰＳＣまたは胚様体のゲノムワイドのメチル化。ａ、定量的ＰＣＲによって決定される、ｍｉＲ−２０３、ならびにＤＮＡメチルトランスフェラーゼＤｎｍｔ１、Ｄｎｍｔ３ａ、Ｄｎｍｔ３ｂ、Ｄｎｍｔ３ａ２およびＤｎｍｔ３ｌ、または多能性（Ｄａｚｌ）および分化（Ｇａｔａ６）のマーカーについての転写物の発現レベル。ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）により処理したかまたは処理せず、そしてＤｎｍｔ３ａ／ｂ  ｃＤＮＡまたは空ベクターにより同時に形質導入したＫＩのｉＰＳＣを、実験デザインの図解描写において示されるように、使用した。左側から開始する第１の影（淡灰色、オリジナルでは桃色）は時間経過を指示し、そこで、細胞を、Ｄｏｘにより処理したかまたは処理せず、そしてＤｎｍｔ３ａ／ｂ  ｃＤＮＡにより形質導入したかまたは形質導入しなかった。左側からの第２の影（暗灰色、オリジナルでは橙色）は、胚様体への分化プロセスを指示する。データは１実験あたり３つの技術的反復物の平均として表わされる（ｎ＝２の独立した実験）。ｂ、ｔＫＩのｉＰＳＣおよび胚様体におけるメチル化パターンを示す代表的なゲノム領域（第１０染色体のテロメア）。時間は図１１ａを参照する。ＤＭＶ、ＤＮＡメチル化バレー；ＰＭＤ、部分的メチル化ドメイン。
【図１３】ｉＰＳＣまたは胚様体における、ゲノムワイドのメチル化および遺伝子発現変化。ａ、Ｄｏｘ中止の２０日後のｔＫＩのｉＰＳＣにおいて、アップレギュレートされた（ＲＮＡシークエンシング研究からのデータ）および低メチル化の（ゲノムワイドのメチル化研究からのデータ）共通の遺伝子を表わすベン図。かかる条件において、合計で２３５の遺伝子はＤＮＡ低メチル化且つアップレギュレートされた。このリストの遺伝子オントロジー分析を右側のパネル中で提示する。ｂ、図１１ａ中で示される実験デザインに従う、誘導前（ｔ＝０、上部ライン）、一過性のｍｉＲ−２０３誘導の１０日または２５日後（下部シグナル）のＫＩのｉＰＳＣにおける、および胚様体（ＥＢ、ｔ＝３２）における、Ｅｌｆ５ゲノム領域中のメチル化データ。２つのＥｌｆ５転写物を示す。ｃ、指示されたＥｌｆ５メチル化可変領域（ＤＭＲ；ｂ中でボックス、およびｃ中でＥｌｆ５を表わす矢印の第１の部分）におけるメチル化データの検証のために使用される実験デザイン。ＤＮＡを指示されるように単離し、バイサルファイト修飾後にシーケンスした。１条件あたり独立した８〜１０のクローンをシーケンスした。ヒストグラムは、異なる条件におけるＥｌｆ５  ＤＭＲでのＤＮＡメチル化のパーセンテージを示す。
【図１４】ｍｉＲ−２０３模倣体への前駆細胞の一過性の曝露は、成熟した心筋細胞への後期分化を促進する。ａ、出生後１日目で抽出し、そして抽出の２４時間後に対照またはｍｉＲ−２０３模倣体により一過性にトランスフェクションした、初代心筋細胞のＥｄＵ（オリジナルのものでは緑色）および核（ＤＡＰＩ、オリジナルのものでは青色）の染色を示す代表的な免疫蛍光法。写真をトランスフェクションの３日後に撮った。スケールバー、６０μｍ。ヒストグラムは、トランスフェクション後の異なる日でのＥｄＵ陽性細胞のパーセンテージを示す。データは、平均±標準偏差である（ｎ＝２の独立した実験で、各々６の反復）。ｂ、ｍｉＲ−２０３（トランスフェクションの２４時間後）ならびにＣｃｎｂ１、Ｍｙｈ６およびＭｙｈ７転写物（トランスフェクションの５日後）の定量的ＰＣＲによって決定されるようなＲＮＡ発現。Ｍｙｈ６／Ｍｙｈ７の比を心筋細胞成熟の指標として計算する。データは平均±標準偏差である（ｎ＝３の独立した実験）。ｃ、ｍｉＲ−２０３模倣体およびＤｎｍｔ３ａ／ｂ  ｃＤＮＡの非存在または存在下におけるｉＰＳＣからの心筋細胞の分化のために従った実験的なプロトコール。ｄ、対照模倣体、ｍｉＲ−２０３模倣体またはｍｉＲ−２０３模倣体＋Ｄｎｍｔ３ａ／ｂ  ｃＤＮＡのいずれかにより一過性にトランスフェクションした、ＷＴのｉＰＳＣに由来する、インビトロで生成された心筋細胞の心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ、オリジナルのものでは緑色）および核（ＤＡＰＩ、オリジナルのものでは青色）の染色を示す代表的な免疫蛍光法。写真を分化の１５日目で撮った。下部パネルは、各々の条件におけるｃＴｎＴ染色の拡大の細部を示す。スケールバー、６８μｍ（挿入図、２５μｍ）。これらの心筋細胞におけるｃＴｎＴ陽性領域を右側ヒストグラム中で示す。データは、平均±標準偏差として表わされる（ｎ＝２の独立した実験で、各々６の反復）。ｅ、指示されたサンプル中の心筋細胞分化の間の異なるタイムポイントでの指示された転写物の定量的ＰＣＲによって決定される、ｍｉＲＮＡまたはｍＲＮＡのレベル。データは、平均±標準偏差として表わされる（ｎ＝２の独立した実験で、各々６の反復）。ａ、ｂ、ｄ、ｅ中で、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。
【図１５】ｍｉＲ−２０３の一過性の発現後の心筋細胞分化および成熟の改善。ａ、出生後１日目で抽出し、そして抽出の２４時間後に対照またはｍｉＲ−２０３模倣体により一過性にトランスフェクションした、初代心筋細胞における、リン酸化ヒストン３（Ｓｅｒ−１０；ｐＨ３）（オリジナルのものでは緑色）、心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ、オリジナルのものでは赤色）および核染色についてのＨｏｅｓｃｈｔ（オリジナルのものでは青色）（画像の左側に指示されるように）を示す代表的な免疫蛍光法。画像をトランスフェクションの３日後に撮った。スケールバー、６４μｍ。白色矢印はｐＨ３について陽性の心筋細胞を指摘する。真中のヒストグラムは、トランスフェクション３日後でのｃＴｎＴ陽性細胞の総数についてのｐＨ３陽性細胞のパーセンテージとして測定された分裂増殖率を示す。データは平均±標準偏差である（ｎ＝２の独立した実験）。右側のプロットは、トランスフェクション３日後での細胞の総数を示す。データは平均±標準偏差として表わされる（ｎ＝２の独立した実験）。ｂ、心筋細胞分化の前およびその間の異なるタイムポイントでの指示された転写物の定量的ＰＣＲによって決定される、ｍＲＮＡのレベル。ｉＰＳＣを対照模倣体またはｍｉＲ−２０３模倣体のいずれかによりトランスフェクションし、１５日間培養中で維持し、次いでインビトロで分化させた。ｃ、左側のパネル：心筋細胞分化の間の異なるタイムポイントでの指示された転写物のｍＲＮＡのレベル。右側のパネル：分化の１５日目でのこれらの心筋細胞の拍動頻度（５秒あたりの拍の数として測定される）も示される（ｎ＝８の異なるクローン）。ｂ〜ｃ中で、データは、平均±標準偏差として表わされる（ｎ＝２の独立した実験で、各々６の反復）。ａ〜ｃ中で、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。
【図１６】ｍｉＲ−２０３への一過性の曝露は、成熟した心筋細胞への分化を促進し、心臓再生を改善する。ａ、出生８日後の心臓の代表的な画像（凍結損傷７日後）。凍結創の領域を強調する。ｂ、シリウスレッドにより染色された、ベヒクル処理マウスおよびＤｏｘ処理マウスからの心臓切片の代表的な画像（スケールバー、５００μｍ）。拡大の詳細は、白色光（左側）および偏光（右側）で線維化領域を示す。挿入図のスケールバー、１００μｍ。ｃ、代表的なベヒクル処理マウスまたはＤｏｘ処理マウスからのシリウスレッドにより染色された心臓切片の代表的な「白黒」画像であり、凍結損傷７日後の線維化領域を白色で示す。スケールバー、２５０μｍ。ヒストグラムは、凍結損傷７日後の１条件あたりのｎ＝１５マウスにおいて、全心臓領域に比べた線維化領域のパーセンテージの定量化を示す。＊＊Ｐ＜０．０１（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。ｄ、ベヒクル処理マウスおよびＤｏｘ処理マウスからの心臓切片のＣｄ３４（中胚葉前駆細胞）の免疫組織化学的検出およびシリウスレッド染色。３匹の異なるマウスからの代表的な画像を示す。スケールバー、１００μｍ。線維化領域を強調する。ｅ、凍結創１日後の１腹仔あたりの生存仔のパーセンテージの定量化。１条件あたり５腹仔を試験した。Ｐ＝０．０５３（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）．
【図１７】ｍｉＲ−２０３は胚発生の間の２Ｃステージで誘導される。ｑＰＣＲによって決定される、正常初期発生の５つの異なるステージ：卵母細胞、２細胞胚、桑実胚、コンパクト桑実胚および胚盤胞におけるｍｉＲ−２０３発現。ＲＮＡを３０の異なる胚から抽出し、ｑＰＣＲによって分析するために２つの独立した群でプールした。ＲＮＡ発現を対照ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−１６）によって正規化する。データは６つの異なるｑＰＣＲ測定値を表わす。２Ｃ／桑実胚対コンパクト桑実胚／胚盤胞を比較して、Ｐ＝０．０５であった（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。
【図１８】ｍｉＲ−２０３への一過性の曝露は２細胞様のマーカーを誘導する。ａ、２Ｃ：：ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターを安定的に発現し、そしてＧＦＰウイルスまたはｍｉＲ−２０３−ＧＦＰウイルスにより一過性に形質導入された、ＥＳＣコロニーの代表的な免疫蛍光分析。スケールバー、１０μｍ。右側のプロットは、形質導入の２４時間後の、全ＧＦＰ陽性コロニーのうちのｔｄＴｏｍａｔｏ陽性群体のパーセンテージを示す。データは平均±標準誤差として表わされる（ｎ＝３の独立した実験）。＊＊＊Ｐ＜０．００１（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。ｂ、指示された転写物（近位上流ＭＥＲＶＬエレメント（Ｔｃｓｔｖ３、Ｚｆｐ３５２およびＣｍｌ２）またはイントロンＭＥＲＶＬエレメント（Ａｂｃｂ５およびＣｈｉｔ１）を保有することが知られている）のＲＮＡシーケンシングによって決定される、ＲＮＡ発現。データは、３の独立した野生型のｉＰＳＣクローン（青色）またはｔＫＩのｉＰＳＣクローン（赤色）を示す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。ｃ、ｔＫＩのｉＰＳＣのＤｏｘ中止の１０および２５日後の２８２の遺伝子の２細胞のシグネチャー（Ｂｉａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）のエンリッチメントプロット。ｄ、ＲＮＡシーケンシングによって決定される、２Ｃシグネチャー中に包含される指示された転写物の発現。データは平均±標準誤差である（ｎ＝３の独立した実験）。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。ｅ、ＧＦＰによってタグ付けされたＨＥＲＶＨ内在性レトロウイルスの長末端反復（ＬＴＲ７）を発現する、ヒト多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）の代表的な画像。細胞を、対照（左側）またはｍｉＲ−２０３模倣体（右側）のいずれかによりトランスフェクションした。同じコロニーについての白色視野およびＧＦＰ発現を示す。スケールバー、１０μｍ。ｆ、左側のプロットは、ｍｉＲＮＡトランスフェクション５日後の、パネル（Ｅ）中に記載されるアッセイにおけるＨＥＲＶＨ−ＧＦＰ陽性コロニーのパーセンテージを示す。右側のプロットは、ＨＥＲＶＨ−ＧＦＰ陽性コロニーのパーセンテージを示し、そこで、ＧＦＰは、クローンの周辺部でのみ（黒色）またはコロニーを構成する大多数の細胞において（灰色）発現される。データは平均±標準誤差である（ｎ＝３の独立した実験；指示されるように、対照模倣体について５０８コロニーおよびｍｉＲ−２０３模倣体について５７５コロニーをカウントした）。＊＊＊Ｐ＜０．００１（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。ｇ、分化プロセスの間の異なるタイムポイントでの、（Ｅ、Ｆ）中で指示されるように、対照（左側）またはｍｉＲ−２０３模倣体（右側）のいずれかにより一過性にトランスフェクションした、ＨＥＲＶＨ  ｈｉＰＳＣに由来するＥＢの代表的な画像。スケールバー、５００μｍ。ｈ、指示された分化の時間経過の間の、パネルｇ）からのＥＢサイズの定量化および内部の大きな空洞を提示するＥＢのパーセンテージ。データは平均±標準誤差である（ｎ＝３の独立した実験）。＊＊＊Ｐ＜０．００１（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。
【図１９】ｍｉＲ−２０３は、２ｉ／ＬＩＦ培地中で培養した細胞においてナイーブ型多能性を誘導する。ａ、ｔＫＩのｉＰＳＣ（ドキシサイクリン誘導ｉＰＳＣ）対非誘導ｉＰＳＣ（両方は２ｉ／Ｌ条件で培養した）における、有意に脱調節された遺伝子オントロジーデータベースからの経路。ｂ、分化プロセスの異なるタイムポイントでの、１０継代の間に２ｉ／Ｌ条件において培養した、非誘導ｉＰＳＣまたはドキシサイクリン誘導ｉＰＳＣ（ｔＫＩのｉＰＳＣ）に由来するＥＢの代表的な画像。顕微鏡写真は３つの異なる実験の代表である。スケールバー、５００μｍ。ｃ、パネルａ）およびｂ）中で使用される同じ細胞からの、ＥＢサイズの定量化、および内部の大きな空洞または拍動を提示するＥＢのパーセンテージ。データは平均±標準誤差である（ｎ＝３の独立した実験）。＊＊Ｐ＜０．０１（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。
【図２０】ｍｉＲ−２０３は、インプリンティング遺伝子上で軽度の低メチル化を誘導する。指示されたサンプル中の、上位のメチル化可変領域（ＤＭＲ；ｎ＝１００；左側のパネル）またはインプリンティング制御領域（ＩＣＲ；ｎ＝１０３の異なるインプリンティング遺伝子座；右側のパネル）での、メチル化レベルを表わすヒートマップ。グレースケールは両方のヒートマップへ適用可能である。左側のパネル：ｔＫＩのｉＰＳＣにおいて、ｔ＝０はメチル化１．００に近いレベルを有する一方で、ｔ＝１０では徐々に低減し、ｔ＝２５ではメチル化レベルは０．００に近づく。対照ＫＩのｉＰＳＣにおいて、メチル化レベルは指示されたすべてのタイムポイントで０．７５〜１．００の間である。右側のパネル：わずかな低メチル化がｔＫＩのｉＰＳＣのｔ＝２５でＩＣＲについて観察され、左側のパネル中で示されるＤＭＲにおいて検出されたものに匹敵しない。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
（発明の詳細な説明）
本発明は、上記のように、治療アプローチのために（非常に特に再生目的のために有用な分化細胞への分化および成熟のために）、多能性細胞（特にｉＰＳＣ）の効率を改善し、したがってより好適なナイーブ型多能性細胞を生成するための方法を提供する。
【００４８】
本発明は本出願の実施例において開示されるアッセイの結果に基づき、そのアッセイは、ｍｉＲ−２０３配列への単なる一過性の曝露が多能性細胞の幹細胞性潜在能を強化し、分化を支援することを実証する。
【００４９】
以下の実施例において、単一のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ−２０３）またはそのアナログの一過性の過剰発現が、多能性細胞（胚性幹細胞および人工多能性細胞の両方）の分化をどのように増強し、同時にそれらの幹細胞性能力を維持するかが示される。ｍｉＲ−２０３は、幹細胞マーカー発現、３つの原始胚葉からの細胞タイプを含有する奇形腫形成、および任意の系譜への分化効率を有意に改善するだけではない。いっそう重要なことには、ｉＰＳＣでのｍｉＲ−２０３の一過性の発現は、特に生存状態で生まれる子孫を産生する細胞の幹細胞性能力を支援する（ＥＳＣが行うように）。ｉＰＳＣまたはＥＳＣがマイクロＲＮＡの一過性の誘導へ曝露された場合に、キメラ寄与率（特に興味深いのは、四倍体補完アッセイにおいて）および生殖細胞系列伝達の両方は、劇的に増加する。したがって、ｉＰＳＣへの本発明の方法の適用（すなわちｉＰＳＣにｍｉＲ−２０３の増加レベルを一過性に受けさせることによって）からもたらされる多能性細胞は、もたらされた細胞がナイーブ型多能性細胞と判断され得るように、ナイーブ型状態における多能性細胞の適切な特性を可能にすると言える。これらの結果は本発明者によって実行された追加の研究と合致し、本出願において開示され、ここで、ｍｉＲ−２０３は、マウス胚中で着床前の発生の間の２Ｃ〜桑実胚のステージにおいて優先的に発現されるマイクロＲＮＡとして同定される。
【００５０】
細胞が曝露されるｍｉＲ−２０３のレベルを増加させることによって（細胞中に事前に導入されたベクターからの一過性の発現によって、または細胞の培養培地へのｍｉＲ−２０３の添加によって）、言及される効果（特に多能性細胞の分化能の増大および幹細胞性潜在能の強化）が達成されることは注目に値するが、それは、なぜならば、何名かの著者らによってｍｉＲ−２０３が幹細胞性リプレッサーとして考慮され（Ｙｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｖｏｌｉｎｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４を参照）、それは皮膚における幹細胞性潜在能を限定し、非対称のｈｓａ−ｍｉＲ−３０２（高い）／ｈａｓ−ｍｉＲ−２０３ａ（低い）が幹細胞性と関連することが見出されていたからである。同じ流れで、たとえ、当業者がＨｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．の総説の知識（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）を有し、ｍｉＲ−２０３がＳｏｘ２およびＫｌｆ４を協同して調整することを読み取ったとしても、その記述のために引用された情報源（Ｗｅｌｌｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９、そこでは、上でコメントされるように、ｍｉＲ−２０３がｍｉＲ−２００ｃおよびｍｉＲ−１８３と協同して、幹因子を抑制すると述べられる）中で実際にコメントされたものを検証せずに、その当業者は、ｍｉＲ−２０３が標的を抑制するので、ｍｉＲ−２０３の増加が不十分な幹細胞性を導くと予想していただろう。先行技術におけるすべての情報が、ｍｉＲ−２０３発現が、細胞の環境または分化状態のいずれにしても、幹細胞性潜在能を促進せずに抑制すると予測することを導くと言えるだろう。
【００５１】
したがって、真に多能性であると判断することができ、特定の分化細胞タイプまたは組織（角化細胞等）へのコミットメントのプロセスを開始していなかった、ＥＳＣまたはｉＰＳＣにおけるｍｉＲ−２０３レベルの増加が、幹細胞性の改善を導くであろうことは予想可能ではなかった。それに関連して、本出願において開示されるアッセイおよび得られた結果が、Ｎｉｓｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎｉｓｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）によって記載されたものとは異なり、それらを妨害するものではないと気づくことは重要である。それは、なぜならば、上で論じられるように、一旦ｈＥＳＣが追加の処理（特にＢＭＰ４による処理）によって（それはｍｉＲ−２０３が初期の角化細胞コミットメントに関与する重要な因子になる条件である）、表皮分化へ既にコミットされていれば、ｍｉＲ−２０３が角化細胞分化において意義のあるようになるとＮｉｓｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．が報告し、それは２００８年（Ｙｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８を参照）以来既に公知であると見なすことができるからである。そして、これは、本出願において開示されるもの（ｍｉＲ−２０３の一過性の誘導が、直近の分化コミットメントの改善に由来する多能性ナイーブ型状態の追求のために妥当であることが示される）とは異なる。これらの２つの概念に加えて、再生医療におけるそれらの意義は完全に異なる。換言すれば、ｍｉＲ−２０３の一過性の発現は、後続の分化コミットメントが何であれ、多能性細胞の幹細胞性潜在能の刺激物質として作用する。これは、例えば胚様体および奇形腫に関連する本出願のアッセイにおいて示され、そこで、それらの対照カウンターパートに比較して、ｍｉＲ−２０３へ短時間曝露された多能性細胞の三胚葉への分化能の改善が観察され得る。
【００５２】
さらに、本出願において開示されるアッセイの結果に、ｈＥＳＣ中の核サバイビンレベルにおけるｍｉＲ−２０３の影響の研究（Ｋａｐｉｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）（その研究は、サバイビン発現を負に調節することによって作用する多能性のインヒビターとしてのｍｉＲ−２０３の提案を導く）後に達した結論の知識があると考えることも難しかった。
【００５３】
ｍｉＲ−２０３の一過性の過剰発現後に観察される効果において、デノボＤＮＡメチルトランスフェラーゼがおそらく重要な役割を果たすことが重要である。キメラの生成および四倍体補完アッセイにおけるｉＰＳ細胞の効率の有意な改善（それはこれらの細胞が複雑な奇形腫および胚様構造をインビボで形成することを可能にする）は、デノボＤＮＡメチルトランスフェラーゼＤｎｍｔ３ａおよびＤｎｍｔ３ｂの直接的なｍｉＲ−２０３依存性抑制によって機構的に媒介され、多能性細胞の全体的なＤＮＡメチル化の消去を導くように思われる。
【００５４】
ＤＮＡメチル化ダイナミックスは多能性および分化プロセスの両方を制御すると、従来広く記載されていた。全体的なＤＮＡ低メチル化およびゲノムインプリントの維持は、多能性の証明として、キメラ寄与率および生殖細胞系列伝達を確実にするのに必須であることが公知である。ナイーブ型多能性状態は全体的なＤＮＡ低メチル化によって特徴づけられるが、分化状態は、より高いレベルのメチル化ならびにデノボメチルトランスフェラーゼＤｎｍｔ３ａおよびＤｎｍｔ３ｂに加えて、それらの反作用（ｃｏｕｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ）タンパク質Ｄｎｍｔ３ｌのアップレギュレーションと相関する。
【００５５】
興味深いことには、それらのデノボＤｎｍｔのダウンレギュレーションは、多能性関連遺伝子のアップレギュレーションが付随して、初期の着床前のエピブラストの細胞において観察される。それらの特色はナイーブ型状態で再現され、ある特定の条件下でインビトロで持続させることができる。インタクトなゲノムインプリントを備えた胚性幹細胞のインビトロの導出は、全体的なＤＮＡ低メチル化の情況においてでさえ、達成することはたやすくない。インプリント不安定性はいくつかのＥＳＣ株および培養において通常査定され、ＤＮＡメチル化全体像は一般的には変更され、キメラ寄与率、生殖細胞系列伝達および分化において低〜中位の効率を導く。しかしながら、本発明の系において、ｍｉＲ−２０３を一過性に過剰発現する多能性細胞において、ゲノムインプリントは不変のままであるにもかかわらず全体的なＤＮＡ低メチル化が観察された。本発明者は、ｍｉＲ−２０３がデノボメチルトランスフェラーゼＤｎｍｔ３ａおよびＤｍｔ３ｂをどのように標的とし、全体的なＤＮＡメチル化を低減し、したがってナイーブ型多能性を支援するかを詳細に記載した。Ｄｎｍｔ１はこれらの条件において影響されないままであり、おそらくゲノムインプリント上のＤＮＡメチル化消失を回避する。これは、ｍｉＲ−２０３を一過性に過剰発現するＩＰＳＣおよびＥＳＣのナイーブ型状態の概念の別の証明である。
【００５６】
ＥＳＣにおけるこれらのＤＮＡメチルトランスフェラーゼの欠如は、継代にともなってクロマチンの進行性の低メチル化を誘導することが公知である（Ｌｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。ｍｉＲ−２０３耐性のＤｎｍｔ３ａおよびＤｎｍｔ３ｂ  ｃＤＮＡの発現は、ｍｉＲ−２０３によって誘導された表現型を救済する（図９〜１５）。注目すべきことには、Ｄｎｍｔ３ａ／ｂノックアウト細胞において観察された重度で不可逆性の低メチル化は分化をブロックするが（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｏｋａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）、ｍｉＲ−２０３によって誘導された低メチル化状態は可逆的であり、分化は高度に効率的であり、強力なＤＮＡメチル化に伴って起こる（図７）。
【００５７】
したがって、本発明の方法は、培養多能性細胞の質を改善するように指令される従来公知の方法との複数の重要な違いを有し、それは以下のように要約することができる。
ｉ）本方法は既に確立している多能性クローン（ｉＰＳＣおよびＥＳＣ）において使用することができ、本方法はしたがって上で検討された方法への追加の手順であり、それらと組み合わせ可能である。これはＹａｍａｎａｋａのオリジナルのプロトコールの大部分の変形に関して重要な違いであり、変形では、方法の効率または安全性を、オリジナルのＹａｍａｎａｋａ因子のうちのいくつかを他の化合物によって置換することによって、またはリプログラミングプロセスを実行するために追加の化合物を添加することによって、増加させようとしている。本事例において、追加の化合物（ｍｉＲ−２０３）は既に確立しているｉＰＳＣまたはＥＳＣへ添加される。
ｉｉ）ｍｉＲ−２０３へ曝露された多能性細胞は、分化細胞および機能性細胞の生成において、促進された機能をインビトロおよびインビボの両方で提示する。
ｉｉｉ）増加レベルのｍｉＲ−２０３への多能性細胞の曝露の効果は、市販で入手可能なｍｉＲ−２０３のアナログ（特異的な模倣体等）である合成の小分子ＲＮＡ分子の使用によってもたやすく達成することができる。
ｉｖ）機構的に、ｍｉＲ−２０３は、多能性細胞のエピジェネティックメモリ（多能性細胞の確立においてバリアとして作用することが公知の因子）を消すことによって、その効果を発揮することが観察された。これは、例えば脱メチル化酵素が多能性細胞へのリプログラミングプロセスの間に使用される方法との別の重要な違いであるが、それは、なぜならば、その脱メチル化が不可逆的であるかまたは細胞毒性（得られた細胞を再生医療のために役立たなくするもの）を誘導するからである。既に確立しているｉＰＳＣまたはＥＳＣを増加レベルのｍｉＲ−２０３（またはそのアナログ）へ一過性に曝露する本方法は、それらの多能性を改善する一過性のゲノムワイドの低メチル化を誘発し、かかる低メチル化が一過性で可逆的であるので、それはそれらの分化能の増大も許容する。したがって、本方法は、再生医療において適用可能な金の分化細胞を得るために有用であり得るナイーブ型多能性細胞を生じさせる。
ｖ）増加レベルのｍｉＲ−２０３（またはそのアナログ）レベルへの既に得られていた多能性細胞の曝露（例えばおよび好ましくは一過性の発現によって）は、いくつかの既知の方法（ＤＮＡメチル化インヒビター（ＡＺＡ等）がリプログラミングの間の使用される方法等）に対するより安全な代替物を意味するが、それは、なぜならば、ＡＺＡが細胞死を誘導することが公知であるからである。その意味では、ｍｉＲ−２０３が他の因子とは異なって十分に確立された腫瘍抑制因子であり、その使用はリプログラミングの間の発癌性因子の使用に関連する問題を回避することも可能にすることも指摘されなくてはならない（Ｔａｐｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。
【００５８】
以下の実施例に示されるように、それらの対照カウンターパートと比較する場合に、本発明の方法の実行後に得られた多能性細胞は幹細胞性潜在能の改善を提示し、それは、以下の特色（それはナイーブ型状態における多能性細胞の特徴である）に起因して観察することができる。
（ｉ）胚様体（ＥＢ）へのインビトロの分化は、対照ｉＰＳＣに比較して有意に増加する。本発明の方法のステップを経験したｉＰＳＣから生成されたＥＢ（特にｔＫＩのｉＰＳＣ由来ＥＢ）は、より速く増殖し、より良好に分化し、より高いパーセンテージおよび効率での拍動を示し、三胚葉の完璧な構成を提示する。それらの細胞の分化および機能性も長い空洞の形成によって明らかにされ、それは対照のｉＰＳＣ由来ＥＢにおいてほとんど見出されない。
（ｉｉ）それぞれの対照と比較した場合に、本発明の方法のステップを経験したｉＰＳＣ（特にｔＫＩのｉＰＳＣ）がマウス中に注射される時の奇形腫へのインビボの分化も、劇的に改善される。三胚葉の分化のレベルは低いことで有名であるが、いくつかの非定型組織（膵臓、骨髄、軟骨または胚体外の組織（胎盤）でさえ等）は、ｔＫＩのｉＰＳＣ由来奇形腫においてたやすく見出される。これらのｔＫＩのｉＰＳＣがマウスにおいて腹腔内に注射される場合に、複雑な胚様構造（野生型のｉＰＳＣ注射では決して見出されなかった）を発生させることが可能である。それらの構造は、胚発生の複数のマーカーの発現、三胚葉、および胚体外組織によって特徴づけられる。
（ｉｉｉ）それらのＷＴカウンターパートに比較した場合に、胚の２細胞ステージマーカー（ある特定のレトロトランスポゾン等）の発現は、ｔＫＩのｉＰＳＣにおいてより高い。さらに、それらのｉＰＳＣのトランスクリプトームプロファイルは、ｔＫＩのｉＰＳＣが発生、形態形成、幹細胞性維持、クロマチン構成、および細胞運命コミットメントに関与する多くのシグナリングネットワークをどのように活性化するか説明し、それらのナイーブ型状態を証明する。興味深いことには、ＲＮＡシーケンシングサンプルの、主成分分析、階層的クラスタリング、およびヒートマップ分析は、ＷＴのｉＰＳＣに比較して、ナイーブ型ｔＫＩのｉＰＳＣとＥＳ細胞との間の有意な近接を実証した。四倍体補完アッセイはｉＰＳＣの多能性潜在能を試験する最も厳格なアッセイである。そこで、四倍体胚盤胞は２細胞ステージ胚の融合を経由して産生され、インビボで胚体外組織のみを形成することによって発生的に不完全なものである。予想されるように、完全な多能性を備えたＥＳ細胞は、四倍体胚の発生的な欠損を補償し、満期の生物体は、かかる四倍体胚に由来する胚体外の組織と一緒にＥＳＣから産生され得る。生存状態で生まれる子孫を生成する効率は、かかるアッセイにおいてＥＳＣについて約２０％であるが、ｉＰＳＣは通常この厳格な試験を失敗し、「全ｉＰＳＣ」マウスを支持しない。しかしながら、ｍｉＲ−２０３を一過性に発現するｉＰＳＣは、ＷＴのＥＳＣを使用して達成されたものに類似する程度まで、４ｎ相補性によって生存状態で生まれる仔をうまく生成する。なおさらに、ＷＴのＥＳＣに比較した場合に、一過性のｍｉＲ−２０３誘導へ曝露されたＥＳＣはこの試験において有意なより高いコンピテンシーを提示する。このデータは、ｍｉＲ−２０３がｉＰＳＣ技術の効率を改善することを明確に主張する。
（ｉｖ）キメラ寄与率は、多能性の価値（ｉＰＳまたはＥＳ細胞）を実証するのに間違いなく最も良い概念の証明である。細胞集合およびさらにより重要なことには四倍体補完アッセイの実験は、ｔＫＩのｉＰＳＣがそれぞれの対照ｉＰＳＣよりも、有意に多くのキメラ生成および生殖細胞系列伝達にどのように寄与するかを示す。
【００５９】
増加レベルのｍｉＲ−２０３へのＥＳＣのｉＰＳＣの曝露がナイーブ型多能性を増進し、本発明の方法が、他の従来記載された方法（インビトロで多能性を持続させることを目的とする）に関して有利であるという所見を強化する追加データは、以下のものである。
（ｉ）ｍｉＲ−２０３発現は２細胞ステージおよび桑実胚でピークに達し、このマイクロＲＮＡが２細胞ステージの典型的な転写物の発現を支援することを示すデータに一致する。この観察は、ｍｉＲ−２０３がインビボでナイーブ型多能性を取得するために妥当であるという事実を支持し、したがってそれはインビトロのナイーブ型多能性のブーストのための利点として使用され得る。
（ｉｉ）ＰＳＣにおけるｍｉＲ−２０３の発現は、胚の２細胞ステージにおいて典型的に発現される遺伝子の発現を誘導する。特異的な２細胞のレポーターに加えて、「２細胞トランスクリプトーム」中に含まれる転写物の発現が、詳細に分析された。ｍｉＲ−２０３が、２細胞シグネチャー中に含まれる上位２８２の遺伝子のうちの２８１を誘導するという事実は、注目すべき所見である。この場合もやはり、これらの観察は、ｍｉＲ−２０３がナイーブ型多能性を増進するという考えを補強する。
（ｉｉｉ）ｍｉＲ−２０３は、２ｉ／ＬＩＦ条件における発生能（幹細胞性潜在能の維持のための以前のスタンダード）も有意に改善する。加えて、インプリンティング制御領域の分析は、ｍｉＲ−２０３が、２ｉ／Ｌ条件に比較して、これらの領域において効果がほとんどないことを示し、したがって複数のインビボのアッセイにおけるｍｉＲ−２０３処理細胞の有意な改善について説明する。これらの結果は、インビトロの多能性を持続させることを目的とする以前の方法を超える、ｍｉＲ−２０３の好ましい使用を支持する。
（ｉｖ）ｍｉＲ−２０３の効果はヒト細胞においても試験され、２細胞マーカーの発現および分化能において類似する効果を示す。したがって、マウス多能性細胞における観察はヒト多能性細胞へ拡張される。
(ｖ）意義のある標的としてのＤｎｍｔ３ａ／ｂの妥当性は、レスキューアッセイに加えて、ＷＴのＰＳＣにおけるＤｎｍｔ３ａ／ｂノックダウン、それによるｍｉＲ−２０３の模倣によって示される。これらのデータは、記載される表現型についての原因であるｍｉＲ−２０３の標的としてのデノボＤＮＡメチルトランスフェラーゼの同定を補強する。
【００６０】
加えて、以下で見出される効果によって実証されるように、ｍｉＲ−２０３へ曝露された多能性細胞は、分化および成熟の潜在能の促進を提示した。
（ｉ）組織の数および分化のレベルは、胚様体分化アッセイ、複雑な奇形腫の形成、および胚様構造（骨髄、胎盤組織または膵臓外分泌腺等の通常は観察されない分化した組織を含む）において観察されるように、ｔＫＩ細胞（本発明の方法のステップを経験した多能性細胞）において増加する。加えて、ｔＫＩ細胞に由来する奇形腫はホルモンインスリンについて陽性細胞を含有するが、対照奇形腫は含有せず、分化した膵臓β細胞の存在を示唆し、複数の細胞系譜への分化におけるｔＫＩ細胞の能力の増大をさらに例証する。
（ｉｉ）ｉＰＳＣの心筋細胞への分化および成熟は、機能アッセイに加えて成熟マーカーの発現によって検出されるように、改善される。
（ｉｉｉ）新生仔心筋細胞の分化に加えて、それらがｍｉＲ−２０３への曝露後に到達する成熟レベルは改善される。
（ｉｖ）組織再生アッセイ（インビトロで改善された細胞でインビボの複雑な再生アッセイを適切に遂行することについての複雑さを考慮すると、典型的には多能性細胞の改善の報告中に含まれないアッセイ）は、ｍｉＲ−２０３発現が心臓損傷後の心臓再生および全生存を有意に増強することを示し、結果は、ｍｉＲ−２０３処理を受けた多能性細胞の分化能およびインビボのそれらの機能性を強化し、再生医療におけるこのマイクロＲＮＡの妥当性を示唆する。
【００６１】
国際特許出願ＷＯ２０１４２０１２５４Ａ１（その中で、ｌｅｔ−７ファミリーのマイクロＲＮＡは、多能性細胞から出発するインビトロの心臓成熟のために重要なマイクロＲＮＡとして前記国際特許出願中で言及された唯一のものであり、他のマイクロＲＮＡは言及されない）中で開示されるｉＰＳＣまたはＥＳＣから心筋細胞を導出する方法および手段とは本発明の方法が異なることは注目すべきである。次いで、本発明は心筋細胞分化のために従来示唆された方法ではなく代替案を提供し、それは、ｍｉＲ−２０３のレベルの一過性増加（細胞における一過性の発現、またはそれらの培養培地への添加によるｍｉＲ−２０３またはそのアナログへの細胞の一過性の曝露のいずれかによって）を事前に受けた多能性細胞から出発し、その多能性細胞は後に心筋細胞分化を受け、もたらされた心筋細胞が成熟し機能的であるので有効性の改善を達成するものである。
【００６２】
将来の臨床適用のためのそれらの潜在的な有用性を考慮すると、細胞の分化能の促進が、例えば心筋細胞への分化効率の改善、そして他の分化細胞、特に臨床的に興味のあるもの（神経系の細胞（例えばニューロンおよびグリア細胞）、軟骨細胞、膵臓β細胞等）への分化効率の改善によっても特徴づけられることが、本発明の方法の重要な実施形態であると判断され得る。
【００６３】
ｍｉＲ−２０３は、既に確立しているＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞が複数の細胞系譜に寄与する潜在能を改善する。したがって、本発明の方法は、既に確立している多能性細胞の幹細胞性特性／潜在能を改善する方法として（胚性幹細胞および人工多能性幹細胞で作動するので）、ならびに／または多能性細胞の分化能および／もしくは成熟能を促進する方法としても定義することができる。したがって、本発明の方法のステップを経験した多能性細胞は、ａ）胚様体へ分化させた場合に、対照細胞に比較して、より高いパーセンテージ、より速い増殖、より良好な分化、拍動のより良好な効率、および三胚葉のより良好なアーキテクチャー；ｂ）奇形腫へのインビボでの分化の改善；およびｃ）２細胞ステージマーカーのより高い発現を提示する。ここで、分化能および／または成熟能の促進に関して、本発明の方法のステップを経験した多能性細胞は、ａ）胚様体へ分化させた場合に、対照に比較して、組織の数の増加およびより高いレベルの分化；ｂ）対照条件において通常は観察されない分化した組織を含む、複雑な奇形腫および胚様構造の形成；ｃ）心筋細胞へ特異的に分化させた場合に、分化能および成熟能の改善（成熟マーカーのより速く増加した発現、およびそれらの機能性のより速い獲得を包含する）、を提示する。
【００６４】
上でコメントされるように、増加レベルのｍｉＲ−２０３またはそのアナログへの曝露（過剰発現または培養培地へ添加によって）の効果は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）および胚性幹細胞（ＥＳＣ）の両方において観察され得る。本発明の目的のために、ｉＰＳＣおよびＥＳＣの両方は任意の哺乳動物に由来する細胞であり得る。ヒトＥＳＣは随意に除外され得る。ＥＳＣがヒトＥＳＣである場合に、胚の破壊を意味しない方法（Ｃｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００８中で記載される方法等）によって本発明の方法において使用されるヒトＥＳＣが得られることが好ましい。しかし、ヒトＥＳＣの使用に関連する上述のモラルまたは法的な問題のためにおよび取り扱いの理由のために、本発明の方法がｉＰＳＣにより実行されることが好ましい。生成および取り扱いをたやすくするために、本発明の方法がそれらに適用される場合にｉＰＳＣが培養中にあることは特に好ましく、前記ｉＰＳＣの生成が培養された分化細胞（線維芽細胞等）からインビトロで起こることも好ましいが、インビボで生成されたｉＰＳＣ（Ａｂａｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）の使用は、本発明の方法と適合性があり、その範囲中に包含されることが考慮され得る。インビトロで（培養において）生成されたｉＰＳＣを得るために、公知のリプログラミング手順のうちの任意のものを使用することができ、オリジナルのＹａｍａｎａｋａの方法（以下のファミリー（Ｏｃｔファミリー、Ｋｌｆファミリー、ＭｙｃファミリーおよびＳｏｘファミリー）のうちの各々１つの遺伝子産物を含む核リプログラミング因子と、体細胞の分化細胞を接触させる）およびその変形のうちの任意のものを包含する。
【００６５】
本発明の実施例はいくつかのアッセイを含有しており、そこで、マイクロＲＮＡ−２０３の増加レベルはｉＰＳＣ細胞において遺伝子的に誘導された過剰発現のおかげで得られ、かかる細胞は、マウスモデル（ｍｉＲ−２０３発現のためのドキシサイクリン誘導カセットが含まれる）から抽出された分化細胞（線維芽細胞）からインビトロでリプログラミングされたという事実に起因する。次いで、その事例において、増加レベルはｍｉＲ−２０３の細胞内過剰発現から直接生じ、かかる増加は、ドキシサイクリンが３〜５日間のみ添加されるという事実に起因して一過性に起こる。他のアッセイ（実施例４中で記載されるアッセイのうちのいくつかのように）は培養中の野生型のｉＰＳＣにより遂行され、増加レベル／量のｍｉＲ−２０３へのｉＰＳＣの曝露は、培養培地へのｍｉＲ−２０３（特に化学的に修飾された二本鎖ｍｉＲ−２０３）の添加によって達成された。天然のｍｉＲ−２０３のこの模倣体により得られた結果は、培養培地へのｍｉＲ−２０３の添加が本出願の方法の可能な実施形態であること、および同じ技術的問題も解決することを示す。ｍｉＲ−２０３またはそのアナログもしくは模倣体は、その効果を発揮するためには細胞に侵入しなくてはならないので、内在性のｍｉＲ−２０３量（細胞中に天然に存在する）に培養培地からの添加化合物の透過からもたらされるｍｉＲ−２０３量が加わることで、類似的に、増加レベルのｍｉＲ−２０３（または同じ種類の活性を備えたアナログ化合物）へ細胞が曝露されるという結果がもたらされる。その理由のために、本発明の方法を遂行するのに必要なステップは、増加レベルのｍｉＲ−２０３へ細胞を曝露することとして定義された。たとえ出発レベルがゼロ（０）であるべきと判断されたとしても（培養培地における、または以下の実施例で使用されるモデルのうちのいくつかにおける事例のように）、それは０からある特定の量のレベルでの増加と判断され得る。
【００６６】
ｍｉＲ−２０３レベルのかかる増加は、従来技術の水準において周知の、ｍｉＲ−２０３が発現され得る発現ベクターの使用によって達成することができ、例えば、非成熟前駆体形態のコード配列（例えばヒトの事例において配列番号：２によって表わされるｈｓａ−ｍｉＲ２０３またはＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓの事例において配列番号：３によって表わされるｍｍｕ−ｍｉＲ−２０３）であり、その形態は、細胞において対応する成熟形態（ヒトについて配列番号：１によって表わされるｈｓａ−ｍｉＲ−２０３ａ−３ｐまたはＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓについて配列番号：４によって表わされるｍｍｕ−ｍｉＲ−２０３−３ｐ）を生じさせるだろう。ヒトおよびマウスの成熟形態が同一であることが観察され得、そのため、多能性細胞の起源の種とは異なるある種の前駆体形態および／または成熟形態の使用は、特にヒトの中で、マイクロＲＮＡが培養培地へ直接添加される場合、またはベクターからもしくは発現産物としてベクターから産生される場合の両方で、本発明の方法と適合性があり、その範囲中に含まれる。
【００６７】
同様に可能な実施形態は、本発明のいくつかの実施例でのようにマイクロＲＮＡまたはその前駆体が発現される発現カセットをゲノム中に挿入した変異分化細胞により出発するものである。
【００６８】
一過性の発現（例えば３〜５日）が好ましいので、マイクロＲＮＡまたはその前駆体を生じさせるコード配列が、誘導可能プロモーター（本出願の実施例において使用されるテトラサイクリン誘導可能プロモーター（例えばドキシサイクリンによって誘導可能である）として）の制御下であることが好ましく、その結果、発現の時間はたやすく制御可能であり、誘導可能な化合物を除去することによって停止可能である。発現ベクターは、プラスミドまたは非組込み型のウイルス由来ベクター（アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルス等のウイルスに由来するもの等）であることも可能であり、それは独力で追加の制御無しに一過性の発現を容易にし、別の可能な実施形態と判断され得る。
【００６９】
発現の産物は、ｍｉＲＮＡおよび例えばマーカーとして使用可能なタグまたはタンパク質のコード配列の分子へ対応する部分を提示する、ｍＲＮＡになり得る。
【００７０】
別の可能な実施形態（それは好ましいもののうちの１つである）は、ｍｉＲ−２０３またはそのアナログを既に生成された多能性細胞の培養培地へ添加すること、および、一過性の曝露が所望される場合に、所望される曝露時間（例えば以前にコメントされるように３〜５日）が完了した時に培養培地からそれを除去することである。かかるマイクロＲＮＡ模倣体の一過性のトランスフェクションは、一過性の曝露（以前にコメントされるように約３〜５日）を許容する。その事例において、ｍｉＲ−２０３の成熟分子または前駆体分子の両方が添加され得る。上で論じられるように、ｍｉＲ−２０３の事例において、最も豊富な成熟形態は、プレｍｉＲＮＡの３’アームから生じるもの（ヒトにおけるｈｓａ−ｍｉＲ−２０３ａ−３ｐおよびマウスにおけるｍｍｕ−ｍｉＲ−２０３−３ｐ）であり、それは本出願中に記載される効果について、少なくとも高いレベルで責任を負う形態である。したがって、それは本方法において優先的に使用される形態であり、それは、本出願のいくつかのアッセイにおけるように、両方の成熟形態の混合物（３’アームから生じるものおよび５’アームから生じるもの）を多能性細胞に受けさせ、その結果、細胞における内在性の状況が忠実に模倣される、本方法の可能な実施形態である。
【００７１】
本発明のいくつかの実施例において実証されるように、ｍｉＲ−２０３の天然の分子の代わりに合成化合物の使用は可能である。特に「アナログ」の使用が考慮される。ＲＮＡアナログは、天然のマイクロＲＮＡに類似するが、少なくともそれらを異なる別個のものにする修飾を含有する分子である。ＲＮＡアナログの定義中に包含されるものは、少なくとも１つのヌクレオチドが別のものによって置換されるＲＮＡ分子である。マイクロＲＮＡおよびそれらと塩基対になるｍＲＮＡの３’ＵＴＲの断片の中での相補性が、めったに完全（１００％）でないことを考慮すると、塩基対が依然として存在すれば、マイクロＲＮＡ配列中の変化は許容され、その結果、その機能が依然として達成されれば、ＲＮＡアナログは天然のマイクロＲＮＡへ少なくとも５０〜６０％で類似し得る。その目的に対して、６〜８ヌクレオチドの領域（シード領域として公知）が常に存在し、そこで、マイクロＲＮＡおよびｍＲＮＡ  ３’ＵＴＲの中での相補性が完全（１００％）またはほとんど完全であること（Ｄｎｍｔ３ａおよびＤｎｍｔ３ｂの３’ＵＴＲに関するシード領域についての図１０を参照）ことを考慮しなくてはならず、その結果、シード領域のヌクレオチドを修飾しないことが勧められる。
【００７２】
より多くの場合であるが先行する修飾と適合するものとして、ヌクレオチドのアナログを生じさせるヌクレオチド（マイクロＲＮＡの単位）中の化学的修飾がある。かかる修飾を行って、通常、ヌクレアーゼへの安定性および／もしくは耐性を増加する、細胞の中への侵入を容易にする、マイクロＲＮＡおよびｍＲＮＡの中での相互作用の強度を増加する、マイクロＲＮＡの所望される活性を増加する、ならびに／または特定の細胞経路を介するマイクロＲＮＡのプロセシング（小分子干渉ＲＮＡまたはマイクロＲＮＡの１つの鎖を取り込み、相補的なｍＲＮＡの認識のためのテンプレートとしてそれを使用し、その後は、ＲＮａｓｅを活性化し、ＲＮＡを切断する、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体）等）にバイアスをかける。かかる修飾は、通常糖部分および／またはリン酸結合中に存在し、１つまたは複数の非ヌクレオチド部分の添加を包含する。いくつかの一般的な修飾は、リン酸結合の代わりに一般的に使用されるホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｙｏａｔｅ）結合；糖部分の２’位での修飾（２’−Ｏ−メチル修飾または２’−Ｏ−メトキシエチル修飾等）；リボースが２’の酸素と４’の炭素を接続するリンクを提示し、したがって立体配座３’−ｅｎｄｏでリボースをブロックする修飾（ＬＮＡ：ロック核酸）または２’−Ｏ，４’−Ｃエチレン架橋核酸（ＥＮＡ）；アミド含有骨格（ペプチド核酸（ＰＮＡ）においてアミノエチルグリシン骨格等）による糖骨格の置換；ＰＭＯ（リボース部分がモルホリン基によって置換される核酸）の使用；および例えばＫｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）によって概説されて見出すことができる当業者に周知の他の修飾である。窒素含有塩基はヌクレオチドのアナログにおいてあまり一般的には修飾されていないエレメントであるので、天然のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの断片または全配列に関するそれらの相同性または同一性の比較は、窒素含有塩基の配列に関してより適切に行われる。鎖端部のうちの少なくとも１つでの修飾（コレステロール、コレスタノール、スチグマステロール、コラン酸およびエルゴステロール等の化合物の１つまたは複数の単位の部分、およびさらに随意に追加で鎖へのコンジュゲート部分を取り付けるリンカー部分の付加等）も、細胞の中へのマイクロＲＮＡアナログの侵入を容易にするために特に一般的である。
【００７３】
ＲＮＡ模倣体、特にマイクロＲＮＡ模倣体（ｍｉＲＮＡ模倣体）も、この用語が本出願において使用される時、マイクロＲＮＡアナログ内に包含される。ＲＮＡ模倣体（ＵＳ２０１３０３４５２８９Ａ１に関して上でコメントされるような）は、修飾されたヌクレオチドまたは構造的な修飾（例えば膨らみまたはループ）に起因して安定性が促進された合成ｍｉＲＮＡであり、内在性のｍｉＲＮＡを模倣し、ｍｉＲＮＡ活性のアップレギュレーションによってｍｉＲＮＡ機能分析を可能にする、小分子で化学的に修飾された二本鎖ＲＮＡでもある。培養培地へ添加されたマイクロＲＮＡ模倣体は、細胞によって取り込まれ、それぞれのマイクロＲＮＡ（本事例においてｍｉＲ−２０３）を忠実にまねる、二本鎖分子（細胞発現は要求されない）として直接作用する。いくつかの本発明の実施例（実施例４等）におけるように、ｍｉＲ−２０３模倣体（１つのみまたはその混合物）がｉＰＳＣの培養培地へ添加される方法は、特に模倣体が以下のものによって特徴づけられる場合に、本発明の好ましい実施形態である。
ａ．ヌクレオチドのうちの少なくとも１つが化学的に修飾されたヌクレオチドによって置換される、ＲＮＡ修飾分子であって、前記化学的修飾が、
ｉ．１つもしくは複数のリン酸結合のホスホロチオエート結合による置換、
ｉｉ．２’−Ｏ−メチル修飾もしくは２’−Ｏ−メトキシエチル修飾から選択される、糖部分の２’位での１つもしくは複数の修飾；ならびに／または
ｉｉｉ．２’の酸素と４’の炭素を接続するリンクを生じ、したがって立体配座３’−ｅｎｄｏでリボースをブロックするもの（ＬＮＡ：ロック核酸）もしくは２’−Ｏ，４’−Ｃエチレン架橋核酸（ＥＮＡ）；アミド含有骨格（ペプチド核酸（ＰＮＡ）においてアミノエチルグリシン骨格等）による糖骨格の置換；およびＰＭＯ（リボース部分がモルホリン基によって置換される核酸）の使用、ならびにその組み合わせの群から選択される、リボース部分における１つもしくは複数の修飾、
の群から選択される、
前記分子であることと；
ｂ．１６〜３１ヌクレオチドの長さの二重らせん領域を備えた二本鎖分子であり、それが配列番号：１（ｈｓａ−ｍｉＲ−２０３ａ−３ｐ）または配列番号：４（ｍｍｕ−ｍｉＲ−２０３−３ｐ）によって表わされるＲＮＡ分子の窒素含有塩基の配列に対してそれらの配列で少なくとも５０％同一の断片を含有することと、
ｃ．随意に、鎖のうちの少なくとも１つの少なくとも１つの端部でコレステロール、コレスタノール、スチグマステロール、コラン酸およびエルゴステロールの１つまたは複数の単位を含むコンジュゲート部分、ならびにさらに随意に追加で鎖へのコンジュゲート部分を付加するリンカー部分を追加で含むことと、
ｄ．さらに随意に追加で、２つの鎖の中で１つまたは複数のミスマッチを提示すること。
【００７４】
模倣体が上で記載される模倣体の具体的な事例である具体的なマイクロＲＮＡ模倣体の例は、例えば米国特許出願ＵＳ２００９／０２０９６２６およびＵＳ２０１１／０２６３６７５（それらの両方ともＤｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃ．）中でも見出すことができる。非常に好ましいものは、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓおよび他の種（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ等）のｍｉＲ−２０３の模倣体を市販化する、本出願のアッセイにおいて使用されるＤｈａｒｍａｃｏｎのｍｉＲＩＤＩＡＮシリーズのｍｉＲ−２０３模倣体（ｈｔｔｐ：／／ｄｈａｒｍａｃｏｎ．ｇｅｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ／ｒｎａｉ−ａｎｄ−ｃｕｓｔｏｍ−ｒｎａ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ／ｍｉｃｒｏｒｎａ／ｍｉｒｉｄｉａｎ−ｍｉｃｒｏｒｎａ−ｍｉｍｉｃｓ／）等のマイクロＲＮＡ模倣体である。ｍｉＲＩＤＩＡＮ模倣体はＯＮ−ＴＡＲＧＥＴ修飾パターンにより化学的に促進されて、活性のあるマイクロＲＮＡ鎖によるＲＩＳＣを優先的にプログラムする。この修飾は、各々のセンス領域の第１および第２のヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル部分を有し、アンチセンス鎖がその５’端部でリン酸化される、ＲＮＡを包含し、そこで、かかるオンターゲット修飾はＯｎ−Ｔａｒｇｅｔ（商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃ．）で造られた専用の修飾も指す。任意の事象において、オンターゲット修飾は、センス（パッセンジャー）鎖がＲＩＳＣプロセスによって取り込まれることをブロックすることによるオフターゲット効果の低減の支援に使用され得る。任意の事例において、マイクロＲＮＡ模倣体の他の例は例えばＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈにおいて見出すことができ、それはｈｓａ−ｍｉＲ−２０３ａ模倣体（ＨＭＩ０３５７）も商品化する。
【００７５】
ｉＰＳＣから出発する本発明の方法の実行からもたらされるナイーブ型多能性細胞は、表３中で見られるように、前記出発のｉＰＳＣとは異なる。得られたナイーブ型多能性細胞は、十分に確立された分化プロトコールを行った場合に、多能性マーカー（Ｎａｎｏｇ、ＯｃｔおよびＳｏｘ２等）を発現することを継続するが、それらは分化マーカー（ネスチン、Ｇａｔａ４およびＣＤ３４等）を発現する細胞と共存する。したがって、多能性マーカーおよび分化マーカーの両方の発現によって特徴づけられるもたらされた細胞の集団（特に本発明の方法によって得られたもの）も、本発明の目標である。
【００７６】
以下の実施例において開示したアッセイは、ｉＰＳＣにおいておよびＥＳＣにおいても一過性のｍｉＲ−２０３発現の制御が、これらの細胞が複数の細胞系譜へと分化し、それらの自己更新特性を妨害せずに、さらなる成熟特性を達成する能力を改善することを示す。したがって、本発明の方法およびそれから得られた多能性幹細胞は、多能性幹細胞の臨床適用について新しい可能性を開拓し、臨床的目的のためにそれらの使用を真剣に考えて計画するために、解決されなかった難点のうちのいくつかを解決する。
【００７７】
多能性幹細胞は、モデル疾患を理解する研究および臨床のツールになり、候補薬物を開発およびスクリーニングし、細胞置換療法を提供して再生医療を支持する、潜在能を有する。リプログラミング技術は、神経変性疾患、心血管性疾患、糖尿病および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を包含する多くの疾患を治療する潜在能を提供する。理論的には、たやすく接近可能な細胞タイプ（皮膚線維芽細胞等）が患者から生検されリプログラミングされ、培養ディッシュ中で患者の疾患を効果的に再現し得るだろう。次いでかかる細胞は、自己由来細胞置換療法のための基礎として供することができるだろう。源の細胞が患者内に生じるものなので、分化した誘導物の免疫拒絶が最小限にされるだろう。さらにｉＰＳＣは成体成熟細胞の源として高い潜在能を有するが、これらの細胞が分化するプロセスについて多くのことがこれから明らかにされるべきだろう。本発明の方法およびそれから得られる多能性細胞は、多能性細胞が分化するプロセスの理解のために、および、分化後の前記細胞の特に再生医療のための臨床適用を容易にしより実現可能する有用な改善のためにも使用され得る、新しい改善された研究ツールとして見なすことができる。したがって、本発明の方法を特徴づけるステップ（増加レベルのｍｉＲ−２０３への細胞の曝露）等のステップを含む、分化細胞を得るための本発明の多能性細胞の使用、出発材料として本発明の多能性細胞を使用する分化細胞を得る方法に加えて、ｉＰＳＣから分化細胞を得る方法は、本発明の範囲に含まれる。
【００７８】
本技術（本発明の方法およびそれらから得られた細胞）の可能な使用は、以下のものを含む。
心臓再生の分野。ヒトおよびマウスの線維芽細胞から生成されたｉＰＳＣは、ホールマークの心筋活動電位を提示する機能的心筋細胞を生じ得る。しかしながら、ｉＰＳＣが使用される場合、心筋細胞への成熟プロセスが損なわれる。ｉＰＳＣの心臓発生は、ＥＳＣまたは胎生組織に由来する心筋細胞で観察されたものに比較して遅れる。さらに、ＥＳＣ由来心筋細胞において観察されたものに比較して、ばらつきがｉＰＳＣ由来心臓細胞中の遺伝的マーカーの発現において存在する。したがって、ｉＰＳＣ由来心筋細胞は、正常なコミットメントであるが成熟が損なわれていることを実証し、観察された欠陥が、技術的なもの（例えばｉＰＳＣの不完全なリプログラミング）に起因するか、または生物学的バリア（例えば遺伝的因子に起因する機能欠陥）に起因するかどうかは、明らかではない。
神経再生（神経変性疾患（パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症または脊髄筋萎縮症等）のモデル化および治療を包含する）。患者由来ｉＰＳＣをインビトロの分化を経由して罹患したニューロンサブタイプへ戻すことができるか、または疾患を引き起こす突然変異を修復するために遺伝子ターゲティングを使用してｉＰＳ細胞を修復することができる。依然として、神経変性障害においてＩＰＳＣベースの再生の適用のためのプロトコールは現実から遠い。さらに、薬物および置換療法のスクリーニングの目的のための別個のニューロンおよびグリアの成熟集団を生成することにおいて、より大きな進歩が得られた。しかしながら、これらの細胞は、体が生理的レベルで有する化合物への細胞応答を忠実に反映しないかもしれない。最後に、研究者は、依然として低い効率の変換および遂行への労力の問題に直面する。かかる方法の平均変換効率は１％未満であり、それは技術の広汎な使用をさらに制限する。
軟骨再生システムにおけるリモデリング。関節軟骨は自然治癒によって回復しないので、この組織修復の質を改善する多くの試みが行われた。自己由来軟骨の移植は、軟骨欠陥の治療のパラダイムを修復から再生へと変化させ、これは、細胞療法アプローチで組織を再生する概念を証明するランダム化試験において実証された。このシナリオにおいて、本発明者は、移植の前に自己由来軟骨細胞におけるｍｉＲ−２０３治療が損傷した組織のリモデリングおよびその完全な再生を容易にし得ると推測する。
【００７９】
ｉＰＳＣにおいておよびＥＳＣにおいても一過性のｍｉＲ−２０３発現の制御が、これらの細胞が複数の細胞系譜へ（特に心筋細胞へ）と分化し、それらの自己更新特性を妨害せずに、さらなる成熟特性を達成する能力を改善するので、本発明の方法は、上で言及された分野において適用可能な分化細胞の生成のための重要な改善を意味する。したがって、上で言及された分野（心臓再生、神経再生および軟骨再生）において適用可能な分化細胞（すなわち心筋細胞、神経またはグリア細胞、軟骨細胞、インシュリン産生細胞）を得るための、本発明の方法によって得られた多能性細胞の使用は、本発明の多能性細胞の使用の好ましい実施形態である。
【００８０】
心筋細胞の分化および成熟に関連する本出願の実施例（特に実施例４）において示されるように、ｍｉＲ−２０３配列への一過性の曝露が機能的な分化および成熟の両方を改善することが指摘されなくてはならない。したがって、再生医療におけるこのマイクロＲＮＡの可能な治療使用（神経再生、軟骨再生、インシュリン分泌細胞の置換および非常に特に心臓再生等）は、本出願において開示したアッセイによって支持される。
【００８１】
総合すると、複数の機能アッセイ（再生医療において対象となる複数の細胞系譜への分化および成熟を包含する）において、小分子マイクロＲＮＡ模倣体への曝露によって多能性細胞のＤＮＡメチル化全体像を調整することが、これらの細胞の性能を促進し得ることが結論付けられるだろう。
【００８２】
本発明は、以下に説明される実施例および図の手段によってより詳細に説明されるだろう。
【実施例】
【００８３】
実験手順の要約
本発明者は、ｍｉＲ−２０３発現がドキシサイクリン（ＤＯＸ）処理によって調整することができるマウスモデルを生成した。それらのノックイン動物モデル（ＣｏｌＡ＿ｍｉＲ２０３；Ｒｏｓａ２６＿ｒｔＴＡ）は、動物または動物に由来する細胞がドキシサイクリン処理へ曝露される時はいつでも、このマイクロＲＮＡの１００倍を超える過剰発現を可能にする。第１のアプローチは、それらのマウスからマウス胎仔線維芽細胞を抽出し、Ｙａｍａｎａｋａ因子を使用してインビトロでそれらをリプログラミングし、ｍｉＲ−２０３ノックイン誘導可能多能性細胞（ｍｉＲ−２０３  ＫＩのｉＰＳＣ）を生成することであった。次いでそれらのｉＰＳＣを３〜５日間ＤＯＸにより処理し、次いで複数の継代の間ＤＯＸ中止へ曝露した。それらのｉＰＳＣを、単純化のために「一過性ＫＩ（ｔＫＩ）ｉＰＳＣ」と命名した。次いで複数のリードアウトを分析して、それらの対照カウンターパート（ベヒクルにより処理された真に同じｉＰＳＣクローン）と比較した場合に、それらのｔＫＩのｉＰＳＣが改善された幹細胞性潜在能をどのように提示するかを以下のように実証した。（ｉ）胚様体（ＥＢ）へのインビトロの分化は、対照ｉＰＳＣに比較してｔＫＩにおいて有意に増加する。ｔＫＩのｉＰＳＣ由来ＥＢは、より速く増殖し、より良好に分化し、より高いパーセンテージおよび効率での拍動を示し、三胚葉の完璧な構成を提示する。それらの細胞の分化および機能性も長い空洞の形成によって明らかにされ、それは対照のｉＰＳＣ由来ＥＢにおいてほとんど見出されない。（ｉｉ）それぞれの対照と比較した場合に、ｔＫＩのｉＰＳＣは、マウス中に注射される時の奇形腫へのインビボの分化も劇的に改善される。三胚葉の分化のレベルは低いことで有名であるが、いくつかの非定型組織（膵臓、骨髄、軟骨または胚体外の組織（胎盤）でさえ等）は、ｔＫＩのｉＰＳＣ由来奇形腫においてたやすく見出される。これらのｔＫＩのｉＰＳＣがマウスにおいて腹腔内に注射された場合に、複雑な胚様構造（ＷＴのｉＰＳＣ注射では決して見出されなかった）を発生させることが可能であった。それらの構造は、胚発生の複数のマーカーの発現、三胚葉、および胚体外組織によって特徴づけられる。（ｉｉｉ）それらのＷＴカウンターパートに比較した場合に、２細胞ステージマーカー（ある特定のレトロトランスポゾン等）の発現は、ｔＫＩのｉＰＳＣにおいてより高い。さらに、それらのｉＰＳ細胞のトランスクリプトームプロファイルは、ｔＫＩのｉＰＳＣが発生、形態形成、幹細胞性維持、クロマチン構成、および細胞運命コミットメントに関与する多くのシグナリングネットワークをどのように活性化するか説明し、それらのナイーブ型状態を証明する。興味深いことには、ＲＮＡシーケンシングサンプルの主成分分析、階層的クラスタリングおよびヒートマップ分析は、ＷＴのｉＰＳＣに比較して、ｔＫＩのｉＰＳとＥＳ細胞との間の有意な近接を実証した；（ｉｖ）キメラ寄与率は、ｉＰＳまたはＥＳ細胞の価値を実証するのに間違いなく最も良い概念の証明である。細胞集合およびさらにより重要なことには四倍体補完アッセイの提供された実験は、ｔＫＩのｉＰＳＣがそれぞれの対照ｉＰＳＣよりも、有意に���くのキメラ生成および生殖細胞系列伝達にどのように寄与するかを示した。
【００８４】
データをさらに検証する本発明者の第２のアプローチは、他のいくつかの異なるモデルにおいて、それらの概念の証明を再現することに向けられた。したがって、ｍｉＲ−２０３がＷＴのＩＰＳＣまたはＷＴのＥＳＣの多くのクローンにおいて一過性に過剰に発現された場合に、真に同じ効果が観察されたことが実証された。一過性ｍｉＲ−２０３の多能性細胞（ｉＰＳＣまたはＥＳＣのいずれか）の質は、すべての事例において、それらの対照カウンターパートよりも良好であった。形質導入から数日後に多能性細胞中でサイレンシングするレトロウイルス（ｐＭＣＳＶ）も使用して過剰発現を再現し、マイクロＲＮＡの一過性発現を可能にした。最終的に、そして非常に重要なことには、データは、マイクロＲＮＡ模倣体およびＲＮＡトランスフェクションのために通常の方法（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉ  Ｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＤｈａｒｍａｆｅｃｔ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）等）の使用によって、ｍｉＲ−２０３をトランスフェクションして、再現された。
【００８５】
以下に説明される実施例のアッセイを、以下の材料および方法論により遂行した。
【００８６】
動物モデルおよび手順。
ｍｉＲ−２０３コンディショナルノックアウトモデルを、ＥＳ細胞の中への相同組換えを使用して、ｌｏｘＰ部位によりｍｍｕ−ｍｉｒ２０３遺伝子座を隣接させること（ＥＴ組換え；Ｇｅｎｅｂｒｉｄｇｅｓ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）によって生成した（図１ａ）。ネオマイシン耐性カセットを組換えクローンの選択のために使用した。ＣＡＧ−Ｆｌｐｅ遺伝子導入体（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）を使用してｆｒｔ部位の組換えを達成し、ＥＩＩａ−Ｃｒｅ導入遺伝子（Ｓｃｈｗｅｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）を使用してｌｏｘＰ部位を組換え、ｍｉＲ−２０３（−／−）対立遺伝子をもたらした（図１ａ）。以前に報告されたストラテジー（Ｂｅａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）に従って、ＥＳ細胞中のＣｏｌＡ１遺伝子座の中への組換えのために、ｐＢＳ３１ベクターの中へゲノムのｍｍｕ−ｍｉｒ２０３配列（第１２染色体：１１２１３０８８０−１１２１３０９５５；ｍｉＲＢａｓｅデータベースリリース２１．０．）をクローン化することによって、ｍｉＲ−２０３誘導可能モデルを生成した。もたらされたノックイン対立遺伝子［ＣｏｌＡ１（ｍｉＲ−２０３）］を、以前に記載される（Ｂｅａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）ように、ドキシサイクリン依存性誘導のためにＲｏｓａ２６−Ｍ２ｒｔＴＡ対立遺伝子［Ｒｏｓａ２６（ｒｔＴＡ）］と組み合わせた（詳細については図を１ｃを参照）。これらの動物を、Ｃ５７ＢＬ６／Ｊ×１２９×ＣＤ１の混合遺伝的背景において維持した。
【００８７】
動物実験を、ＣＮＩＯ−ＩＳＣＩＩＩ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｎｉｍａｌ  Ｗｅｌｆａｒｅ（ＣＥＩｙＢＡ）によって承認されたプロトコールに従って遂行した。
【００８８】
皮下奇形腫のために、ｉＰＳＣをトリプシン処理し、２〜３００万細胞を０．１％のグルコースを補足した１００μｌのＰＢＳ中に懸濁し、無胸腺ヌードマウスＣｒｌ：ＮＵ（ＮＣｒ）−Ｆｏｘｎ１ｎｕ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒによって提供された）の両脇腹の中へ皮下注射した。奇形腫を毎日管理し、キャリパーによって測定し、最終的にそれらの直径が１．５ｃｍに到達した時に単離した。動物をその時点で安楽死させ、奇形腫を重量測定し、ＲＮＡ抽出または組織病理学分析のためにプロセシングした。
【００８９】
腹腔内投与のために、野生型無胸腺マウスに、０．１％のグルコースを補足した１００μｌのＰＢＳ中で再懸濁した４〜５×１０５のｉＰＳＣを注射した。マウスを注射の日から毎日監視した。通常、注射の３０日または４０日後に、マウスを安楽死させ、内臓の奇形腫および胚様構造を単離し、ＲＮＡ抽出または組織病理学分析のいずれかのためにプロセシングした。
【００９０】
キメラ生成のために、ｉＰＳＣまたはＥＳＣ（１胚あたり５〜７細胞、１０継代）をＣ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｔｙｒｃ−２Ｊ／Ｊ胚盤胞の中へ顕微注射し、Ｃｒｌ：ＣＤ１（ＩＣＲ）擬似妊娠メスへ移した。
【００９１】
四倍体補完の研究のために、２細胞ステージに到達するまで接合子を一晩培養するか、または２細胞ステージのＨｓｄ：ＩＣＲ（ＣＤ−１）胚をＥ１．５で妊娠メスから収穫し、電気融合させたが、その時、２５０μｍ電極チャンバーを備えたＢＬＳ  ＣＦ−１５０／Ｂ細胞融合器機を使用して、０．３Ｍのマンニトール中で電気融合させた。電気パルス条件は、３０Ｖの振幅、３１μｓの幅および１．５のＡＣ電圧だった。１時間後に、１細胞（四倍体）の胚を注意深く同定し、融合が失敗した胚から分離し、さらに１または２日間ＫＳＯＭ中で培養した。次の日に、４細胞ステージの胚を選択し、ＥＳＣまたはｉＰＳＣと共に凝集した。次いで凝集した胚を擬似妊娠メス２４時間後に注入した。
【００９２】
生殖細胞系列への寄与率を研究するために、黒色のＥＳ−ｉＰＳマウス（四倍体補完アッセイから）またはキメラ（２倍体胚ＥＳ−ｉＰＳの顕微注射から）を、アルビノＢ６またはＣ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｔｙｒｃ−２Ｊ／Ｊメスと交配し、子孫の色を試験した。
【００９３】
細胞培養および遺伝子発現。
初代マウス胎仔線維芽細胞（ＭＥＦ）をＥ１３．５の胚から得て、１０％のＦＢＳおよびペニシリン／ストレプトマイシンを補足したＤＭＥＭ中で培養した。培養をマイコプラズマについてルーチンに試験した。Ｏｃｔ４−Ｓｏｘ２−Ｋｌｆ４−ｃＭｙｃ（ＯＳＫＭ）レンチウイルス形質導入によって、これらのＭＥＦ培養でリプログラミングを誘導した（Ｔａｋａｈａｓｉ  ＆  Ｙａｍａｎａｋａ，２００６）。レンチウイルス形質導入のために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、Ｔｅｔ−Ｏ−ＦＵＷ−ＯＳＫＭ（Ａｄｄｇｅｎｅ  ＃２０３２１）およびパッケージングベクターによりトランスフェクションした。ウイルス上清を、トランスフェクションの２４時間後に開始して１日２回、２日連続で収集し、これを使用して、６ウェルプレート中で１ウェルあたり２５００００細胞の密度で事前にプレーティングしたＭＥＦを感染させた。感染に先立って、ポリブレンを２μｇ／ｍｌの濃度でウイルス上清へ添加した。次いで感染させたＭＥＦを、ＩＰＳＣ培地（ＫＯ−ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）、５０ｍＭの２−メルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、非必須アミノ酸ＭＥＭ  ＮＥＡＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ペニシリンおよびストレプトマイシン（５０００μｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＬＩＦ（白血病抑制因子、ＥＳＧＲＯ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ならびに２０％のノックアウト血清代替物（ＫＳＲ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する）中で培養した。培地を２４時間ごとに交換し、プレートをアルカリホスファターゼ活性について染色してリプログラミングの効率を確認した（ＡＰ検出キット、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）。一旦コロニーを取り上げたならば、ＩＰＳＣを、マイトマイシンＣ（Ｒｏｃｈｅ）不活性化フィーダー細胞の上でＩＰＳＣ培地中で培養した。Ｇ４  ＥＳＣを、マイトマイシンＣ不活性化フィーダーの上で、ＥＳＣ培地（ＫＯ−ＤＭＥＭ、２−メルカプトエタノール、非必須アミノ酸、Ｇｌｕｔａｍａｘ、ペニシリンおよびストレプトマイシン、ＬＩＦ、ならびに１０％のウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を含有する）の存在下において培養した。指示された場合に、以前に記載されるように（Ｙｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）、多能性細胞のための培養培地は、Ｎ２Ｂ２７培地中に２ｉ因子（１μＭのＭＥＫインヒビターＰＤ０３２５９０１、３μＭのＧｓｋ３インヒビターＣＨＩＲ９９０２１）およびマウスＬＩＦ（上記のように）を含んでいた。
【００９４】
ｍｉＲ−２０３  ＫＩ細胞における一過性ｍｉＲ−２０３過剰発現の誘導のために、ＣｏｌＡ１（ｍｉＲ−２０３／ｍｉＲ−２０３），Ｒｏｓａ２６（ｒｔＴＡ／ｒｔ／ＴＡ）のｉＰＳＣまたはＥＳＣの培養物を、ドキシサイクリン（１μｇ／ｍｌ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により５日間処理した。その後に、ドキシサイクリン中止を、その後の複数の継代の間（１５〜３０日）の培養のためにスタンダードとした。ドキシサイクリン処理を野生型のＥＳＣまたはｉＰＳＣへも適用して、処理それ自体の効果を評価した。
【００９５】
過剰発現の実験のために、ｍｉＲ−２０３ならびにＤｎｍｔ３ａおよびＤｎｍｔ３ｂの全長ｃＤＮＡを、テンプレートとしてｐＣＭＶ−Ｓｐｏｒｔ６−ｍＤｎｍｔ３ａ（ＭＧＣクローン：５６６２）およびａｔｔＢ−ｍＣｈ−ｍＤｎｍｔ３ｂ−Ｐｏｌｙ（Ａ）−ＮｅｏＲ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド６５５５３）のプラスミドをそれぞれ使用して、制限指令サブクローニングによって、レトロウイルスベクターｐＭＣＳＶ−ＰＩＧ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド２１６５４を介して利用可能：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／２１６５４／）（Ａｂａｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）の中へ、サブクローニングした。これらのレトロウイルスベクターにより形質導入した場合に、ＥＳＣおよびｉＰＳＣの細胞両方をＦＡＣＳによって選別し、ＧＦＰ陽性細胞を後続の培養および分析のために選択した。
【００９６】
レトロウイルス形質導入のために、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ＧＦＰレポーター（ＧＦＰのみ；ｍｉＲ−２０３−ＧＦＰ；Ｄｎｍｔ３ａ−ＧＦＰまたはＤｎｍｔ３ｂ−ＧＦＰのいずれかを含む）を発現する、それぞれのｐＭＣＳＶ−ＰＩＧベクター（Ａｂａｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ２０１３）、およびパッケージングベクターｐＣＬ−ＥＣＯを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした。ウイルス上清を、トランスフェクションの２４時間後に開始して１日２回、２日連続で収集し、これを使用して、６ウェルプレート中でフィーダーの上に事前にプレーティングしたＥＳＣまたはＩＰＳＣのいずれかを感染させた。感染に先行して、ポリブレンを２μｇ／ｍｌの濃度でウイルス上清へ添加した。
【００９７】
模倣体によるトランスフェクションのために、本発明者は、Ｄｈａｒｍａｃｏｎからの、ｍｉＲＩＤＩＡＮマイクロＲＮＡヒトｈｓａ−ｍｉＲ−２０３ａ−５ｐ（Ｃ−３０２８９３−００）／ｈｓａ−ｍｉＲ−２０３ａ−３ｐ（Ｃ−３００５６２−０３）模倣体、またはＤｙ５４７（ＣＰ−００４５００−０１）による模倣トランスフェクション対照を使用し、その結果、細胞はマイクロＲＮＡ−２０３の両方の成熟形態のアナログ／模倣体の混合物を受けて、細胞における内在性の状況をまさに忠実に模倣した。製造者の指示に従ってＤｈａｒｍａｆｅｃｔトランスフェクション試薬（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）またはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のいずれかを使用して、トランスフェクションを遂行した。トランスフェクション効率をトランスフェクションの２４時間後にＤｙ５４７蛍光によって評価し、次いで実験を図中で指示されるように遂行した。
【００９８】
ＲＮＡ干渉アッセイのために、Ｄｈａｒｍａｃｏｎからの非標的化対照ｓｉＲＮＡ（Ｄ−００１８１０−０１、０２、０３、０４）、Ｄｎｍｔ３ａ  ｓｉＲＮＡ（Ｊ−０６５４３３−０９、１０、１１、１２）、およびＤｎｍｔ３ｂ  ｓｉＲＮＡ（Ｊ−０４４１６４−０５、０６、０７、０８）についてのＯＮ−ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ  ＳＭＡＲＴｐｏｏｌを使用した。製造者の指示に従ってＤａｒｍａｆｅｃｔトランスフェクション試薬（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を使用して、トランスフェクションを遂行した。トランスフェクション効率を、トランスフェクションの２４時間後に、表２中で指示されたプライマーを使用してｐＰＣＲによって評価した。
【００９９】
ルシフェラーゼレポーターによるアッセイをＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で遂行した。簡潔には、１ウェルあたり２００．０００細胞を６ウェルプレート上に播種し、翌日、製造者の指示に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、細胞をトランスフェクションした。マウス遺伝子のＤｎｍｔ３ａ、Ｄｎｍｔ３ｂ、Ｄｎｍｔ３ｌおよびＤｎｍｔ１からの３’ＵＴＲ領域を、ｃＤＮＡクローン（ｐＣＭＶ−Ｓｐｏｒｔ６−ｍＤｎｍｔ３ａ、ｃＤＮＡクローンＭＧＣ：５６６２；ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ｍＤｎｍｔ３ｌ、ＲＩＫＥＮクローン：２４１０００６０２１；ｐＹＸ−Ａｓｃ−ｍＤｎｍｔ１、ＭＧＣクローン：６２３０２）またはマウスｃＤＮＡ（Ｄｎｍｔ３ｂの事例において）を使用して、特異的なプライマー（Ｄｎｍｔ３ａ＿ＥｃｏＲＩ−Ｆｗ：５’−ＧＡＡＴＴＣＡＧＧＧＡＣＡＴＧＧＧＧＧＣＡＡＡＣＴＧＡＡ−３’（配列番号：５５）；Ｄｎｍｔ３ａ＿ＮｄｅＩ−Ｒｖ：５’−ＣＡＴＡＴＧＣＴＧＡＧＧＣＡＧＴＣＡＴＴＴＴＡＧＡＴＴＣＡＴ−３’（配列番号：５６）；Ｄｎｍｔ３ｂ＿ＥｃｏＲＩ−Ｆｗ：５’−ＧＡＡＴＴＣＴＴＴＴＡＧＣＴＣＡＣＣＴＧＴＧＴＧＧＧＧ−３’（配列番号：５７）；Ｄｎｍｔ３ｂ＿ＮｄｅＩ−Ｒｖ：５’−ＣＡＴＡＴＧＣＣＡＧＡＡＡＧＧＴＡＡＡＣＴＣＴＧＧＧＣＡ−３’（配列番号：５８）；Ｄｎｍｔ３ｌ＿ＥｃｏＲＩ−Ｆｗ：５’−ＧＡＡＴＴＣＧＡＡＡＴＧＡＡＴＣＡＣＣＡＴＡＡＧＡＴＧＡＡＡＧ−３’（配列番号：５９）；Ｄｎｍｔ３ｌ＿ＮｄｅＩ−Ｒｖ：５’−ＣＡＴＡＴＧＡＡＣＡＡＴＣＣＴＡＴＧＡＴＡＴＡＴＴＴＧＡＡＡＡＡ−３’（配列番号：６０）；Ｄｎｍｔ１＿ＥｃｏＲＩ−Ｆｗ：５’−ＧＡＡＴＴＣＧＴＧＣＴＣＴＣＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＣＡ−３’（配列番号：６１）；Ｄｎｍｔ１＿ＮｄｅＩ−Ｒｖ：５’−ＣＡＴＡＴＧＧＣＴＴＧＡＣＡＧＡＡＧＣＧＣＴＴＴＡＴＴＴＴＧ−３’（配列番号：６２））によるＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物をシーケンシングによって検証し、ｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の中へ、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の下流にライゲーションした。ｍｉＲ−２０３結合部位中の突然変異（図１０）を部位特異的突然変異誘発によって生成し、後続してシーケンシングによって検証した。トランスフェクションを、ｐＧＬ３由来ベクターと組み合わせたｐＭＣＳＶ−ＧＦＰまたはｐＭＣＳＶ−ｍｉＲ−２０３−ＧＦＰベクターのいずれかおよび対照としてのＲｅｎｉｌｌａにより遂行した。ルシフェラーゼ測定を、トランスフェクションの４８時間後に、発光マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ）を使用して達成した。最終的に、２ＣステージレトロトランスポゾンＭｕＥＲＶ−Ｌの内在性の発現を検出するために２Ｃ：：ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターを発現するＥＳ細胞を、以前に報告されるように（Ｍａｃｆａｒｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）、フィーダーの上で２ｉ培地中で培養した。このレトロトランスポゾンは、全能性の２細胞割球中で特異的に誘導される。ＭＥＲＶＬ発現は培養中の多能性幹細胞においてめったに検出できないが、非常に低い比率（培養の０．５％未満）でのみ検出できる。
【０１００】
ＧＦＰレポーターと融合されたＨＥＲＶＨ内在性レトロウイルスの長末端反復（ＬＴＲ７）（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）を発現するヒトｉＰＳＣを、マトリゲル基底（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の上でｍＴｅＳＲＴＭ１培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で培養した。ヒト細胞による実験を、ＩＳＣＩＩＩ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＣＥＩ；番号ＰＩ  ６１＿２０１７）によって承認されたプロトコールに従って遂行した。
【０１０１】
胚様体生成。
簡潔には、野生型のｉＰＳＣまたはＥＳＣを使用した場合に、それらを、図４ａの図解描写において見ることができるようにｍｉＲ−２０３（ｐＭＳＣＶ−ｍｉＲ−２０３）を発現するレトロウイルスにより事前に形質導入したか、またはｍｉＲ−２０３の一過性発現のためにｍｉＲＮＡ模倣体によりトランスフェクションした。ｉＰＳＣまたはＥＳＣをトリプシン処理し、白血病抑制因子（ＬＩＦ）を欠損する完全増殖培地の存在下において２００．０００細胞／ｍｌの濃度に再懸濁した。この懸濁の小液滴（約２５μｌ）を収集し、１０ｍｍのプレートの蓋の上に播種し、１液滴あたりおよそ５０００細胞のハンギングドロップを生成した。４日後に、凝集物は液滴の底部で既に目視可能であり、それを取り、ＤＭＥＭおよび１０％のウシ胎仔血清を含有する非接着性プレートへ移した。そこで、それらを指示された時間の間懸濁で維持し、図中で記載されるように、拍動、サイズおよび空洞形成を査定した。簡潔には、胚様体は５日ごとに観察し、サイズ、拍動および空洞形成について測定した。１条件あたり２０〜３０のＥＢを分析し、「拍動するＥＢ」または「空洞を備えたＥＢ」のパーセンテージを、すべてのタイムポイントについて計算した。ＥＢのサイズはＩｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを使用して測定した。
【０１０２】
免疫蛍光法および免疫組織化学。
事前にカバーグラス中に播種した細胞を４％のパラホルムアルデヒド中で１５分間固定し、０．１％トリトンＸ−１００のＰＢＳを１５分間使用して透過性にし、室温で１時間ＢＳＡ中でブロックした。一次抗体インキュベーションをすべての事例において４℃で一晩、続いて、二次抗体インキュベーションを室温で１時間遂行した。ＨｏｅｓｃｈｔまたはＤＡＰＩを使用する核染色は、最後のＰＢＳの洗浄中に含まれていた。この研究において使用される一次抗体はＣｄ３４（Ａｂｃａｍ）、Ｇａｔａ４（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、Ｐａｘ６（Ａｂｃａｍ）、ネスチン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ｃＴｎＴ（Ａｂｃａｍ）およびリン酸化ヒストンＨ３（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に対するものであった。以下の表１は、本出願のアッセイにおいて使用される、前記抗体および他の抗体についての詳細情報を示す。白色光レーザーおよびハイブリッド検出を装備したＬｅｉｃａ  ＳＰ５顕微鏡下で、細胞を検討した。
【０１０３】
免疫組織化学のために、組織サンプルを１０％のホルマリン中で固定し、パラフィン包埋し、３μｍ切片でカットし、それをｓｕｐｅｒ−ｆｒｏｓｔ−ｐｌｕｓ  ｐｏｒｔａ−ｏｂｊｅｃｔｓ中でマウントし、再水和した。一続きの切片をヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）により染色したか、または、自動化免疫染色プラットフォーム（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＸＴ、Ｒｏｃｈｅ、またはＡｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ  Ｐｌｕｓ  Ｌｉｎｋ  ４８）を使用して、免疫組織化学を行った。一次抗体に依存して、高ｐＨまたは低ｐＨのバッファー（ＣＣ１ｍ、Ｒｏｃｈｅ、または低ｐＨ抗原性回復バッファー、Ｄａｋｏ）により抗原性回復を最初に遂行し、内在性のペルオキシダーゼをブロックし（３％の過酸化物水素）、スライドを、Ｎａｎｏｇ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、８８２２）、サイトケラチン８（ＣＫ８；ＣＮＩＯ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｃｏｒｅ  Ｕｎｉｔ、ＡＭ−ＴＲＯＭＡ  Ｉ）、ＧＦＰ（Ｒｏｃｈｅ、１１８１４４６０００１）、Ｓｏｘ２（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３７２８）、αフェトプロテイン（ＡＦＰ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＡＦ５３６９）、Ｏｃｔ４（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ−９０８１）、ＫＩ−６７（Ｍａｓｔｅｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ、０００３１１０ＱＤ）、ネスチン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＭＡＢ３５３）、Ｃｄ３１（Ａｂｃａｍ）、Ｃｄ３４（ＡＢＣＡＭ  ａｂ８１５８）、Ｃｄ７３（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ｉ型コラゲナーゼ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）、Ｇａｔａ４（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ−１２３７）、インスリン（Ｄａｋｏ  Ａ０５６４）、平滑筋アクチン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＲＢ−９０１０−ＰＯ）、骨格アクチン（Ｄａｋｏ、Ｍ０６３５）、およびＴｅｒ１１９（ＬＹ−７６；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、５５０５６５）に対する一次抗体を使用してインキュベーションした。それらについての詳細情報は、表１中でも以下に見出すことができる。次いでスライドを、対応するホースラディシュペルオキシダーゼとコンジュゲートした二次抗体（ＯｍｎｉＲａｂｂｉｔ  Ｖｅｎｔａｎａ、Ｒｏｃｈｅ）によりインキュベーションし、免疫組織化学の反応は、色原体として３，３０−ジアミノベンジジン（ｄｉａｍｉｎｏｖｅｎｚｉｄｉｎｅ）テトラヒドロクロリド（ＤＡＢ）（Ｃｈｒｏｍｏｍａｐ  ＤＡＢ、Ｖｅｎｔａｎａ、Ｒｏｃｈｅ、またはＤＡＢ溶液、Ｄａｋｏ）を使用して顕色させ、核をＣａｒａｚｚｉのヘマトキシリンにより対比染色した。最終的に、スライドを脱水し、透明化し、顕微鏡による評価のために永久封入剤によりマウントした。シリウスレッド染色のために、Ｗｅｉｇｅｒｔのヘマトキシリンで８分間およびピクロ／シリウスレッドで１時間インキュベーションし、続いて、水により洗浄（１０分間）した。画像をスライドスキャナー（ＡｘｉｏＳｃａｎ  Ｚ１、Ｚｅｉｓｓ）により取得した。シリウスレッド染色を明視野および偏光の両方を使用して測定した。画像を捕捉し、Ｚｅｎソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ）を使用して定���化した。
【表１】
2020527050.tif 000002
【０１０４】
ｍＲＮＡおよびマイクロＲＮＡのレベルの分析。
製造者の推奨に従って、トリゾール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により、またはｍｉＲＶａｎａ  ｍｉＲＮＡ単離キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）の使用によって、細胞または組織のサンプルから、ＲＮＡを抽出した。製造者のプロトコールに従って、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ｃＤＮＡへの逆転写を遂行した。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００サーモサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中でＳｙｂｅｒ  Ｇｒｅｅｎ  Ｐｏｗｅｒ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、定量的リアルタイムＰＣＲを遂行した。ハウスキーピング遺伝子Ｇａｐｄｈを正規化のために使用した。本出願のアッセイ中で使用されるオリゴヌクレオチドプライマーを、以下の表２中でリストする。
【表２−１】
2020527050.tif 000003
【表２−２】
2020527050.tif 000004
【０１０５】
マイクロＲＮＡの逆転写のために、Ｔａｑｍａｎ小分子ＲＮＡアッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、４３６６５９６）を使用し、それは、ｍｍｕ−ｍｉＲ−２０３−５ｐおよび３ｐ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、００２５８０および０００５０７）およびハウスキーピングＲＮＡ  ｓｎｏ−２０２またはｓｎｏ−１４２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）についての特異的な商業的なオリゴヌクレオチドを含んでいた。ｍｉＲＮＡ増幅のための条件は以下の通りであった。１６℃で３０分間；４２℃で３０分間および８５℃で５分間の最終的なステップ。次いでＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００サーモサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中の製造者の指示に従って、Ｔａｑｍａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（４３４４３７）を使用して、定量的リアルタイムＰＣＲを遂行した。
【０１０６】
ＲＮＡシークエンシングのために、製造者の推奨に従って、ｍｉＲＶａｎａ  ｍｉＲＮＡ単離キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、全ＲＮＡを抽出した。０．８〜１μｇの全ＲＮＡをｉＰＳＣ、ＥＳＣまたは奇形腫から抽出し、ＲＩＮ（ＲＮＡ全体性数）は範囲７〜１０の数であった（Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ）。Ｉｌｌｕｍｉｎａの「ＴｒｕＳｅｑ  Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｍＲＮＡ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｐａｒｔ  ＃  １５０３１０４７  Ｒｅｖ．Ｄ」キットを使用して、ポリＡ＋画分を精製し、ランダムに断片化し、二本鎖ｃＤＮＡに変換し、プロセシングした。アダプターにライゲーションしたライブラリーを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＰＥプライマーによるＰＣＲ（８〜１１サイクル）によって完成させ、もたらされた方向性のあるｃＤＮＡライブラリーを単一リード形式で５０塩基についてシーケンスし（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ２０００）、ｎｅｘｔｐｒｅｓｓｏ（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏ．ｃｎｉｏ．ｅｓ／ｎｅｘｔｐｒｅｓｓｏ／で利用可能）により分析した（Ｇｒａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。リードの質をＦａｓｔＱＣ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂａｂｒａｈａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｆａｓｔｑｃ）によりチェックし、Ｂｏｗｔｉｅ  １．０．０（異なるインターネット資源からダウンロード可能（ｈｔｔｐｓ：／／ｓｌａｃｋｂｕｉｌｄｓ．ｏｒｇ／ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ／１４．２／ａｃａｄｅｍｉｃ／ｂｏｗｔｉｅ／等）（Ｌａｎｇｍｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）およびＳａｍｔｏｏｌｓ  ０．１．１９（ｈｔｔｐｓ：／／ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｓａｍｔｏｏｌｓ／ｆｉｌｅｓ／ｓａｍｔｏｏｌｓ／０．１．１９／）（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００９））を使用して、ＴｏｐＨａｔ−２．０．１０（ｈｔｔｐｓ：／／ｃｃｂ．ｊｈｕ．ｅｄｕ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｔｏｐｈａｔ／で利用可能）（Ｔｒａｐｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）により、２つのミスマッチおよび５つのマルチヒットを許容して、マウスゲノム（ＧＲＣｍ３８／ｍｍ１０）へアライメントさせた。転写物アセンブリー、それらの存在量の推定、および差異的発現を、ＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／）（Ｒｏｓｅｎｂｌｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）からのマウスゲノムアノテーションデータセットＧＲＣｍ３８／ｍｍ１０を使用して、Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ  ２．２．１（ｈｔｔｐ：／／ｃｏｌｅ−ｔｒａｐｎｅｌｌ−ｌａｂ．ｇｉｔｈｕｂ．ｉｏ／ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ／ｒｅｌｅａｓｅｓ／ｖ２．２．１／で利用可能）（Ｔｒａｐｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）により計算した。０．０５の偽発見率（ＦＤＲ）を差異的発現における閾値として有意性のために使用する。ＧＥＮＥ−Ｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｃａｎｃｅｒ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＧＥＮＥ−Ｅ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）を使用して、ヒートマップを後に構築した。ＲＮＡシークエンシングデータをＧＥＯレポジトリ（アクセッション番号ＧＳＥ８１５７１）中に寄託した。
【０１０７】
バイサルファイト変換、ゲノムワイドのＤＮＡメチル化、およびＤＭＲの検証。
製造者の指示に従って、ＴｒｕｅＭｅｔｈｙｌ（登録商標）Ｗｈｏｌｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｋｉｔ（ＣＥＧＸ（登録商標））を使用して、全ゲノムバイサルファイトシーケンシングのために、ＤＮＡサンプルを調製した。簡潔には、２００ｎｇのゲノムＤＮＡを、Ｍ２２０  Ｆｏｃｕｓｅｄ−ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃａｔｏｒ（商標）（Ｃｏｖａｒｉｓ（登録商標））を使用して８００ｂｐへ剪断した。次いで断片化したＤＮＡを変性し、化学的酸化剤によって酸化して、５−ヒドロキシメチルシトシンを５−ホルミルシトシン（５ｆＣ）へ変換する。酸化の目的は、５’メチルシトシンと５’ヒドロキシメチルシトシンの識別不可能なパターンの組み合わせではなく、５’メチルシトシンのメチル化についての情報を純粋に把握することをと保証することであった。酸化に続いて、ＤＮＡに、シトシンおよび５ｆＣのウラシルへの脱アミノ化のためにバイサルファイト変換を行った。バイサルファイト変換ＤＮＡを脱スルホン化し精製して、次いでライブラリー調製へ進む。この「バイサルファイト変換後」ライブラリー調製方法において、断片化した一本鎖バイサルファイト変換ＤＮＡは、３’端部でシーケンシングアダプターを適合させ、続いて、伸長ステップおよび最終的に分子の５’端部でのアダプターのライゲーションを行った。最終的に、ライブラリーをインデックス化および増幅した。ＰＣＲを１０サイクル、続いてビーズベースの精製を遂行した。Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｃａｔ：Ａ６３８８１）を使用する追加の精製およびサイズ選択ステップを遂行して、アダプターダイマーを除去した。精製されたライブラリーを、最終体積１４μｌの純水で溶出させた。得られたライブラリーの質を、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ上でＤＮＡ高感度チップを使用してチェックした。製造者の指示に従って、ＱｕｂｉｔおよびＫＡＰＡ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（＃ＫＫ４８２４）を使用して、ライブラリーを定量化した。合計で１２ｐＭｏｌのマルチプレックスライブラリーを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ２５００上に１２５ｂｐ  ＰＥラピッドランでロードした。パラメーター「−ｍ  １５  −ｕ  ６  −Ｕ  ６」でペアエンドモードでｃｕｔａｄａｐｔバージョン１．９．１（Ｍａｒｔｉｎ，２０１１）を使用して、アダプター配列を除去した。次いでｂｗａ−ｍｅｔｈ（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）を使用して、デフォルトパラメーターを使用してｍｍ１０へリードをアライメントさせた。ＰＣＲ重複を、Ｐｉｃａｒｄ  ｖ１．９１（ｈｔｔｐ：／／ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｇｉｔｈｕｂ．ｉｏ／ｐｉｃａｒｄ）を使用して除去した。ゲノム中の各々のＣｐＧ部位でシーケンスされたメチル化塩基および非メチル化塩基の数のカウント表を、デフォルトパラメーターによりｂｗａ−ｍｅｔｈおよびＢｉｓＳＮＰ−０．８２．２（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）の「作表」モジュールを使用して構築した。すべてのライブラリーは、最小で８２．７％のユニークにアライメントするリードペアにより、基礎的な品質管理チェックを合格した。ラムダ＝１０００およびＣ＝５０のパラメーターによりＤＭＲｃａｔｅ（Ｐｅｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）のＷＧＢＳモジュールを使用してＤＭＲをコールし、ＤＳＳ（Ｆｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）を使用してＤＭＰをコールし、ＭｅｔｈｙｌＳｅｅｋＲ（Ｂｕｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）を使用してＰＭＤ、ＬＭＲおよびＵＭＲをコールし、Ｒパッケージ「ａａＲｏｎ」（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ａｓｔａｔｈａｍ／ａａＲｏｎ）を使用してＰＭＤをコールした。
【０１０８】
ＤＭＲの検証のために、クローンのバイサルファイトシーケンシングを、２つの特定の遺伝子座：Ｅｌｆ５（第２染色体：１０３、４２３、７７８−１０３、４２４、１８０）およびＳｉｒｔ６（第１０染色体：８１、６２４、５９５−８１、６２５、５４７）のプロモーター領域（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ：Ｍｏｕｓｅ  ｍｍ１０  Ｄｅｃ．２０１１．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ＧＲＣｍ３８）で遂行した。製造者の指示に従ってＥＺ  ＤＮＡ−Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−Ｌｉｇｈｔｉｎｇ（商標）キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、１００ｎｇのＤＮＡをバイサルファイト処理した。次いで、バイサルファイトに変換されたＤＮＡは、バイサルファイトＰＣＲ分析によって分析された。以前にＥｌｆ５について記載されたＰＣＲ条件（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）に従って、またはＳｉｒｔ６について以下のプロトコール：９５℃  ４分；５サイクル（９５℃  ４５秒、５４℃  １．５分、７２℃  ２分）；２５サイクル（９５℃  ４５秒、５４℃  １．５分；７２℃  １．５分）および７２℃  ４分での最終伸長を使用して、表２の最後のパート（「ＤＮＡメチル化分析（マウス遺伝子）」）中でリストしたセミネステッドのバイサルファイト変換特異的なプライマーを使用して、三重検体ＰＣＲ増幅を遂行した。ＰＣＲアンプリコンのメチル化ステータスを、プールしたＰＣＲ産物のＳａｎｇｅｒのクローンシーケンシングによって決定して、１サンプルあたり８〜１０の間のクローンを使用する代表的なクローン分析を確実にした。クローンのメチル化ステータスの分析をＢｉＱ  Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して遂行した（Ｂｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。
【０１０９】
新生仔心筋細胞の単離および分化の研究。
以前に記載されるように、新生仔のマウスおよびラットの心筋細胞を調製した（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。簡潔には、新生仔の心筋細胞を、Ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｅｌｌｕｔｒｏｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）により１日齢の新生仔のマウスまたはラットの心臓の酵素解離によって単離した。心筋細胞を２時間、前プレーティングして、線維芽細胞を除去した。次いで細胞を、１０％のウマ血清および５％のウシ胎仔血清を含有する培地中で１％のゼラチンをコーティングしたプレート上にプレーティングした。プレーティングの１８時間後に、細胞を無血清培地の中へ変え、次いで製造者の指示に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬の使用によって、５０ｎＭのｍｉＲ−２０３ａ−３ｐ模倣体およびｍｉＲ−２０３ａ−５ｐ模倣体または対照模倣体（それらのすべてはＤｈａｒｍａｃｏｎから）によりトランスフェクションした。６時間後に、トランスフェクション試薬含有培地を除去し、１％の血清を含有する培地によって置き換えた。異なるタイムポイントのもの（図１３ａ中で指示されるように：トランスフェクションの１、３または５日後）を、後続するＲＮＡ抽出およびＥｄＵ染色／免疫蛍光法のために収集した。ＥｄＵ染色のために、製造者の推奨に従ってＣｌｉｃｋ−ｉＴ  ＥｄＵ  ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。その後に、心筋細胞マーカー（トロポニンＴ）の免疫蛍光法を遂行し、最終的に核染色のためにＨｏｅｓｃｈｔを使用した。
【０１１０】
マウスｉＰＳＣから心筋細胞へのインビトロの分化のために、野生型マウスｉＰＳＣに、分化の前に対照模倣体またはｍｉＲ−２０３ａ−３ｐ／−５ｐ模倣体のいずれかをトランスフェクションした。いくつかの実験において、追加で、ｐＭＣＳＶ−Ｄｎｍｔ３ａおよび３ｂまたは空のｐＭＣＳＶベクターを、模倣体トランスフェクションの２４時間後に、一過性に形質導入した。次いで分化が開始する前に、ｉＰＳＣを、スタンダード条件下の（２ｉ／ＬＩＦ培地下の）培養において１５日間維持した。次いで細胞を、マトリゲルを前コーティングした６ウェルプレート中にプレーティングした。一旦それらがコンフルエントになったならば、培地を、５μＭのＣＨＩＲ９９０２１（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、７２０５４）含有ＲＰＭＩ  １６４０／Ｂ２７培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＲＰＭＩ  １６４０培地について６１８７０１２７およびＢ２７についてＡ１８９５６０１）へ変えた。２日後に、細胞を洗浄し、ＣＨＩＲ９９０２１無しの培地を添加した。分化の３日目で、培地に５μＭのＩＷＲ１（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、７２５６４）を補足し、これらの条件でさらに２日間維持した。分化の７日目で、培地をＲＰＭＩ  １６４０／Ｂ２７＋インスリンへ変えた。次いで９日目から１５日目に、細胞をＲＰＭＩ  １６４０／Ｂ２７中で培養し、培地を２日ごとに変えた。分化の１６日目から１８日目に、細胞を、グルコース無しで４ｍＭのラクテートを含有するＤＭＥＭ中で培養した。１８日目から２１日目に、培地をＲＰＭＩ／  １６４０／Ｂ２７へ変え、毎日変えた。最終的に、２２日目から２８日目に、単層細胞を細胞塊へと単離し、低接着でもう１週間維持する。
【０１１１】
新生仔マウスにおける心臓凍結損傷
以前に記載されるように、新生仔マウスの心臓凍結損傷実験を遂行した（Ｐｏｌｉｚｚｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。簡潔には、出生後の１日目に、新生仔を３７℃に設定した加熱ウォーターブランケット上に置き、母親の巣からの敷きわらによりカバーした。次いで仔を３分間氷水浴の中へ置くことによって麻酔をかけた。その後に、仔を滅菌ガーゼパッドを使用して乾かし、腕、脚および尾で固定された仰臥位で外科区域に置いた。胸にわたる横の皮膚切開をマイクロシザースを使用して行い、次いで側方開胸を、第４肋間腔または第５肋間腔で小さな切開を行うことによって注意深く遂行した。次いで心膜を注意深く除去し、穏やかに腹部を押すことによって心臓を体外に出した。左側心室を同定し、次いであらかじめ冷却したクリオプローブをちょうど２秒間心室表面上に適用した。胸壁を閉じるために８−０の非吸収性Ｐｒｏｌｅｎｅ縫合糸を使用し、皮膚を閉じるためにＷｅｂｇｌｕｅ縫合糸を使用した。閉鎖後に、外科区域をウェットガーゼにより洗浄して、あらゆる残血を除去した。迅速に、仔を数分間暖め、他の仔と共に加熱ブランケットへ戻し、母親のケージからの敷きわらによりカバーした。一旦すべての仔が外科手術から完全に回復したならば、母親のケージ中に入れ替えた。凍結損傷の７日後に、仔を断頭によって安楽死させ、心臓を収集し、ホルムアルデヒド中で固定した。次いでパラフィン包埋のために通常通りに上記のように、心臓をプロセシングした。
【０１１２】
統計。
正規分布および等分散をＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定（対応のない両側）の使用の前に確認して、統計的有意差を推測した。分割表のために、Ｆｉｓｈｅｒの直接検定を使用した。統計解析をＰｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を使用して遂行した。
【０１１３】
実施例１。ｍｉＲ−２０３は多能性細胞の機能をインビトロで促進する。
ｍｉＲ−２０３をインビボで研究するために、Ｃｒｅリコンビナーゼの発現後にｍｉＲ−２０３コードする遺伝子を消失させることができるコンディショナルノックアウトマウスモデルを最初に生成した（図１ａを参照）。マウスにおけるｍｉＲ−２０３の遺伝子除去は大きな異常をもたらさなかったが、ｍｉＲ−２０３−ヌルマウス［ｍｉＲ−２０３（−／−）；ＫＯ］の皮膚で軽度の発生障害を提示した（図１ｂ）。
【０１１４】
ノックイン誘導可能モデル（ＫＩ：ＣｏｌＡ＿ＭｉＲ２０３；Ｒｏｓａ  ２６＿ｒｔＴＡ）も生成し、そこでは、ｍｉＲ−２０３コード配列を、Ｒｏｓａ２６遺伝子座から発現されるテトラサイクリンリバーストランス活性化因子［Ｒｏｓａ２６（ｒｔＴＡ／ｒｔＴＡ）］存在下におけるテトラサイクリン応答性配列の制御下で、Ｉ型コラーゲン遺伝子の下流に挿入した［ＣｏｌＡ１（ｍｉＲ−２０３／ｍｉＲ−２０３）］（図１ｃ）。したがって、ＫＩモデルは、動物または動物に由来する細胞がドキシサイクリン処理へ曝露される時はいつでも、ｍｉＲ−２０３の１００倍を超える過剰発現を可能にする。
【０１１５】
第１のアプローチは、それらのマウス（ＫＯおよびＫＩ）からマウス胎仔線維芽細胞（ＭＥＦ）を抽出し、Ｙａｍａｎａｋａ因子のウイルスバージョンを使用してインビトロでそれらをリプログラミングし、ｍｉＲ−２０３ノックイン誘導可能多能性細胞（ｍｉＲ−２０３  ＫＩのｉＰＳＣ）を生成することであった。
【０１１６】
これらのマウスから単離されたマウス胎仔線維芽細胞（ＭＥＦ）のドキシサイクリンによる処理は、ｍｉＲ−２０３のレベルの１０００倍誘導を導いた（図１ｄ）。
【０１１７】
多能性細胞におけるｍｉＲ−２０３発現の効果を直接研究するために、これらのｍｉＲ−２０３のＫＯおよびＫＩモデルから単離したＭＥＦから、ｉＰＳＣを生成した。野生型、ＫＯおよび非誘導ＫＩのＭＥＦを、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびＭｙｃを発現するレンチウイルスベクターにより形質導入してｉＰＳＣを生成し、ＫＩ培養物を後に３〜５日間ドキシサイクリン（ＤＯＸ）により処理し、次いで複数の継代の間ＤＯＸ中止へ曝露し、したがって一過性に誘導されたＫＩと命名されるｉＰＳＣ（または略した形態でｔＫＩのｉＰＳＣ）を得た（使用されるプロトコールの図解描写については図２ａを参照）。
【０１１８】
ｍｉＲ−２０３が皮膚前駆細胞の幹細胞性潜在能を阻止することは以前に提案されたが（Ｙｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）、野生型ＥＳ細胞（ＥＳＣ）に加えて、これらのｉＰＳＣクローンのＲＮＡシーケンシングは、ゲノムワイドのレベルで、および以前に定義されたナイーブ型多能性シグネチャーを判断する場合（Ｃｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）の両方で（図２ｃ）、ｔＫＩ細胞がＷＴのｉＰＳＣよりもＥＳＣに転写的に近いことを予想外に明らかにした（図２ｂ）。
【０１１９】
変異体のｉＰＳＣの分化能を研究するために、野生型および変異体（ＫＯおよびｔＫＩ）のｉＰＳＣを、インビトロの胚様体形成アッセイにおいて試験した。胚様体（ＥＢ）へのインビトロの分化は、対照ｉＰＳＣに比較してｔＫＩにおいて有意に増加し、そのほかに、ｔＫＩのｉＰＳＣ由来ＥＢは、より速く増殖し、より良好に分化し、より高いパーセンテージおよび効率での拍動を示し、三胚葉の完璧な構成を提示することが観察された。したがって、ｍｉＲ−２０３の欠如は胚様体の不十分な形成をもたらしたが、このアッセイの２週間前の５日間のｍｉＲ−２０３の一過性誘導は、有意に多くの数および体積の胚様体をもたらした（図２ｄ）。ｔＫＩの胚様体は、原始内胚葉（Ｇａｔａ４）、中胚葉（Ｃｄ３４）および外胚葉（Ｐａｘ６）または神経外胚葉（ネスチン）マーカーの高い発現による複雑な構成を提示した（図２ｅ、ｆ）。無処理（ＫＩ）または一過性にドキシサイクリンにより誘導した（ｔＫＩ；図３ａ）真に同じＣｏｌＡ１（ｍｉＲ−２０３／ｍｉＲ−２０３）；Ｒｏｓａ２６（ｒｔＴＡ／ｒｔＴＡ）ｉＰＳクローンを比較する場合に、類似する結果が見出された。この事例においてさらに、ｍｉＲ−２０３の一過性誘導は、長い空洞および促進された拍動頻度を備えたより大きな胚様体のより効率的な形成をもたらした（図３ｂ、ｃ）。ドキシサイクリン中止の３０日後で、ｔＫＩクローン対非誘導ＫＩクローンにおける発現プロファイルの比較は、ｍｉＲ−２０３が一過性に誘導されたクローンにおいて、組織形態形成および胚発生に関連する遺伝子のより高い発現を示唆した（図３ｄ、ｅ）。表３は、ＫＩのｉＰＳＣ（無処理）に対して、ｔＫＩのｉＰＳＣ（ドキシサイクリンの存在下において５日およびドキシサイクリン中止後に３０日）においてアップレギュレートされた遺伝子の遺伝子オントロジー分析を示す。
【表３−１】
2020527050.tif 000005
【表３−２】
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【表３−３】
2020527050.tif 000007
【０１２０】
興味深いことには、発生および形態形成の経路のアップレギュレーションには、これらのｉＰＳＣにおけるｍｉＲ−２０３の一過性誘導後の多能性遺伝子の発現の促進が付随していた（図３ｆ）。
【０１２１】
次にｍｉＲ−２０３がＥＳ細胞中で類似する効果を有するかどうかを試験した。ＥＳ細胞をＣｏｌＡ１（ｍｉＲ−２０３／ｍｉＲ−２０３）；Ｒｏｓａ２６（ｒｔＴＡ／ｒｔＴＡ）マウスから生成し、これらの細胞を、無処理なままにしておいた（ＫＩ）か、または胚様体アッセイの遂行の２週間前に５日間ドキシサイクリンにより一過性に処理した（ｔＫＩ）。図２ｇ、ｈ中で示されるように、ＥＳＣにおけるｍｉＲ−２０３の一過性誘導は、無処理ＥＳＣよりも、初期のタイムポイントで、より高い効率による拍動を示すより大きな胚体をもたらした。興味深いことには、ＣＭＶ駆動レトロウイルスベクターまたはＲＮＡ模倣体を使用する異所性ｍｉＲ−２０３の一過性発現も、野生型のｉＰＳＣまたはＥＳＣにおいて胚様体形成の促進をもたらし（図４ａ〜ｅ）、これらの効果が誘導可能遺伝モデルにユニークなものではなかったことを示す。図４中で描写されるように、ｍｉＲ−２０３ａ−３ｐ／−５ｐの両方をこれらのアッセイにおいて使用し、両方の成熟形態が発現される内在性の状況を忠実に模倣することを目指した。しかしながら、最も豊富な形態（ｍｉＲ−２０３ａ−３ｐ）が本発明において観察される効果についての原因である（図５）。最終的に、野生型のＥＳ細胞におけるｍｉＲ−２０３−ＧＦＰの一過性発現は、ロイシンｔＲＮＡプライマーによるマウス内在性レトロウイルスの発現（ＭｕＥＲＶ−Ｌ；２Ｃ：：ｔｄＴｏｍａｔｏレポーター）（Ｍａｃｆａｒｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）によって決定されるように、２Ｃ（２細胞胚）様細胞の数を有意に増加させた（図２ｉ）。
【０１２２】
総合すると、これらの結果は、ｍｉＲ−２０３配列の一過性誘導がｉＰＳＣおよびＥＳＣにおける多能性を改善し、これらの細胞の複数の系譜への分化をインビトロで支援することを示唆する。
【０１２３】
実施例２。ｍｉＲ−２０３はｉＰＳ細胞の多能性機能をインビボで改善する。
次いでマウスにおける皮下注射後に、ｔＫＩのｉＰＳＣ（ｍｉＲ−２０３の発現を５日間のみインビトロで誘導した）の潜在能を試験した。そしてそれぞれの対照と比較した場合に、ｔＫＩのＩＰは、マウス中に注射される時の奇形腫へのインビボの分化も劇的に改善されることが見出された。
【０１２４】
奇形腫の形成はｍｉＲ−２０３  ＫＯ細胞において低減したが、ｔＫＩのｉＰＳＣはこれらのアッセイにおいて有意により大きな腫瘍を形成した（図６ａ）。興味深いことには、これらの奇形腫は大きいだけではなく、奇形種中の三胚葉の分化のレベルは低いことで有名であるが、この奇形種は、対照のｉＰＳＣ誘導奇形腫中で典型的には見出されない組織（骨髄、軟骨または膵臓等、インスリン陽性細胞（膵臓β細胞を表す）に加えて、ＰＬ−１の発現によって確認されるようなトロホブラスト（胚体外組織、胎盤を表す）等）も含有していた（図６ｂ、ｃおよび図７ａ、ｄ）。
【０１２５】
これらの奇形腫におけるトランスクリプトーム研究は、ｔＫＩのｉＰＳＣに由来する場合に、胚発生および器官形態形成に関与する遺伝子のアップレギュレーションを示唆した（図７ｂ）。免疫組織化学研究は、外胚葉、中胚葉および内胚葉を表わす複数の分化マーカーのｔＫＩの奇形腫における発現上昇を示した（図６ｄおよび図７ｃ）。興味深いことには、インビボの多能性マーカー（Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４またはＳｏｘ２等）の発現のレベルも上昇し（図６ｄ）、これらの構造が未分化細胞および分化細胞の複雑な混合物を含有することを示唆した。
【０１２６】
ＯＳＫＭ導入遺伝子からインビボで生成されたｉＰＳＣは、腹腔内に接種した場合に、小さな胚様構造（３つの胚層に由来する組織を含有する）を形成することが可能であることが最近報告された（Ａｂａｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。本発明者のグループによって実行された先行するアッセイにおいて、インビボで生成された野生型のｉＰＳＣは、注射されたマウスのうちの１１％（以前に報告された（Ａｂａｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）ものに類似する効率）で胚様構造を形成することが可能であった。しかしながら、インビトロで生成されたｔＫＩのｉＰＳＣは、注射されたマウスの８３％で胚様構造（複数のマーカーまたは胚発生の発現によって特徴づけられる、ＷＴのｉＰＳＣ注射後に見出されない複雑な胚様構造、三胚葉および胚体外の組織でさえ）を示してはるかにより効率的であった（図８ａを参照、そこで、ｔＫＩの胚様構造は、インビボで形成されたｉＰＳＣの事例でのように、三胚葉の特異的なマーカーについて陽性だったことが観察できる）。以下の表４は、４０００００〜５０００００のＷＴのｉＰＳＣまたはｉＫＩのｉＰＳＣまたはインビボ（ｉｖ）で生成されたＷＴのｉＰＳＣの腹腔内（ｉ．ｐ．）注射の２０〜３０日後の、腹腔中で胚様構造（Ｅ−Ｌｓ）を備えたヌードマウスの頻度を示す。１条件あたりの試験された独立したクローンの数をパネル中に指示する（各々の動物に異なるクローンを接種した）。
【表４】
2020527050.tif 000008
【０１２７】
ｍｉＲ−２０３が、キメラの形成における多能性細胞の潜在能にも影響を及ぼすかどうかを次に試験した。表５は、指示されるように（１条件あたり２つの独立したクローンを分析した）ベヒクル（ＫＩ）またはＤｏｘ（ｔＫＩ）により一過性にインビトロで処理した、ＫＩのｉＰＳＣおよびＥＳＣによって提示されるキメラ寄与率の頻度を示し、得られた結果を要約する。前記表５から、ｔＫＩのＥＳ細胞は１００％のキメリズムのキメラの形成において２７．５％の成功（毛色によって決定されるように）であり、それに対して対照の非誘導ＫＩのＥＳ細胞において１１．８％の成功を示したことが理解できる。さらに、ｔＫＩのｉＰＳＣは１００％のキメラの生成において５．８％の成功を示したが、対照の非誘導ｉＰＳＣはこれらのアッセイにおいて１．５％の成功を示した。これらの実験において生成されたすべてのキメラは生殖細胞系列伝達に寄与していた。
【表５】
2020527050.tif 000009
【０１２８】
最終的に、ｔＫＩのｉＰＳＣの性能を、ＷＴのｉＰＳＣまたはｔＫＩのｉＰＳＣまたはＷＴのＥＳＣ（１条件あたりｎ＝３クローン）と共に、四倍体補完アッセイにおいて試験した。四倍体胚補完は、多能性および発生能について最も厳格な試験を代表する。ｉＰＳＣはこのアッセイにおいて非常に非能率的であり、そこで、任意の成育可能な生存状態で生まれる動物は、四倍体胚盤胞中に注射された２倍体ｉＰＳ（またはＥＳ）細胞を踏み台にしてユニークに発生する。表６中で示されるように、生存可能な仔は対照ｉＰＳＣにおいて得られなかったが、ｔＫＩのｉＰＳＣは２．８％の成功率で完全キメラ（それらのうちの１つを図８ｂ中で示す）を形成することが可能であり、対照ＥＳＣにより達成された１１．９％により近い。
【表６】
2020527050.tif 000010
【０１２９】
実施例３。多能性におけるｍｉＲ−２０３効果はＤｎｍｔ３ａ／ｂ−依存性である。
多能性の対照に関与する可能性のあるｍｉＲ−２０３標的を同定するために、本発明者は、ｍｉＲ−２０３−ヌルのｉＰＳＣ中でアップレギュレートされ（野生型のｉＰＳＣに対して２倍以上の増加）、ｍｉＲ−２０３  ｔＫＩ誘導可能モデルにおいてダウンレギュレートされる（野生型状況に対して２倍以下の減少）転写物の中で、予測されるｍｉＲ−２０３標的についてサーチした。
【０１３０】
６７８の転写物がｍｉＲ−２０３−ヌルのｉＰＳＣ中でアップレギュレートされ、ｍｉＲ−２０３  ｔＫＩのｉＰＳＣ中でダウンレギュレートされることが見出され、以下の表７ａ中で示されるように、それらのうちの３５はｍｉＲ−２０３標的であることが予測された（図９ａ）（コンピュータによる予測はｍｉＲａｎｄａ、Ｔａｒｇｅｔ  ＳｃａｎおよびＭｉｃｒｏＴａｒのデータベースに基づいた）。
【０１３１】
検索を制限して、ｔＫＩのｉＰＳＣにおいてダウンレギュレートされる転写物の中で、予測されるｍｉＲ−２０３標的を同定する場合に（図９ｆ）、発現のエピジェネティック調節（ＧＯ００４００２９）に関与する遺伝子のそのリストからの選択は、ｔＫＩのｉＰＳＣにおいてダウンレギュレートされ、表７ａについて使用された同じマイクロＲＮＡ標的予測アルゴリズムに従って予測されるｍｉＲ−２０３標的である、１８のＧＯ００４００２９転写物をもたらした。前記１８の転写物のリストを表７ｂ中で以下に示す。
【表７】
2020527050.tif 000011
【表８】
2020527050.tif 000012
【０１３２】
これらの２つのスタンダードな分析において脱調節される転写物の中で、本発明者は、デノボＤＮＡメチルトランスフェラーゼＤｎｍｔ３ａ（ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３α、ＥＣ番号２．１．１．３７；ヒト遺伝子ＨＧＮＣ：２９７８、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１１９７７２、ＮＣＢＩ遺伝子：１７８８、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＭ＿０２２５５２バージョンＮＭ＿０２２５５２．４  ０７、２０１６年１０月；Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ遺伝子ＭＧＩ：１２６１８２７、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＭＵＳＧ００００００２０６６１；ＮＣＢＩ遺伝子：１３４３５、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＭ＿００１２７１７５３バージョンＮＭ＿００１２７１７５３．１、２０１５年２月１５日）およびＤｎｍｔ３ｂ（ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３β、ＥＣ番号２．１．１．３７；ヒト遺伝子ＨＧＮＣ：２９７９、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ００００００８８３０５バージョンＥＮＳＧ００００００８８３０５．１８；ＮＣＢＩ遺伝子：１７８９、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＭ＿００６８９２バージョンＮＭ＿００６８９２．３  ０３、２０１６年１１月；Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ遺伝子ＭＧＩ：１２６１８１９、Ｅｎｓｅｍｂｌ  ＥＮＳＭＵＳＧ００００００２７４７８バージョンＥＮＳＭＵＳＧ００００００２７４７８．１５、ＮＣＢＩ遺伝子１３４３６、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＭ＿００１００３９６１バージョンＮＭ＿００１００３９６１、２０１５年２月１５日）に注目することを決定した（データは以下のデータベースに基づいた：ＨＵＧＯ  Ｇｅｎｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｎａｍｅｓ．ｏｒｇ／）；ＭＧＩ  Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｊａｘ．ｏｒｇ／）２０１７年３月１３日更新；Ｅｎｓｅｍｂｌ（ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ）リリース８７、２０１６年１２月）。この決定は、多能性におけるクロマチン修飾の関連性、およびエピジェネティック変更に示唆的なｍｉＲ−２０３の一過性発現からもたらされる長期的な効果に基づいた。加えて、これらの２つの転写物は、野生型のｉＰＳＣにおけるｍｉＲ−２０３模倣体の発現後に有意にダウンレギュレートもされた（Ｄｎｍｔ３ａについてｌｏｇ２倍変化＝−０．２４、およびＤｎｍｔ３ｂ転写物について−０．２２）。ヒトｍｉＲ−２０３およびＤＮＭＴ３ａ／ｂ転写物は、癌細胞において逆の発現プロファイルを提示することが以前に示され（Ｓａｎｄｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｇａｓｑｕｅ  Ｓｃｈｏｏｆ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）、ＤＮＭＴ３ｂは、ヒト結腸癌細胞において直接的なｍｉＲ−２０３標的であることが最近示された（Ｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。
【０１３３】
Ｄｎｍｔ３ａおよびＤｎｍｔ３ｂ転写物の両方はそれらの３’−ＵＴＲ中に保存されたｍｉＲ−２０３部位を含有し（図１０ａ）（Ｄｎｍｔ３ａ：配列番号：４９；Ｄｎｍｔ３ｂ：配列番号：５１）、ｍｉＲ−２０３の外来性発現はこれらの配列へ融合させたルシフェラーゼコンストラクトのシグナルの減少を導いたが、関連する遺伝子Ｄｎｍｔ３ｌまたはＤｎｍｔ１からの３’−ＵＴＲ配列は減少させなかった（図９ｂ、ｃ）。推定上のｍｉＲ−２０３結合部位が変異され、ルシフェラーゼコンストラクトが、Ｄｎｍｔ３ａ（配列番号：５０）またはＤｎｍｔ３ｂ（配列番号：５２）の３’−ＵＴＲ変異配列（図１０ｂ）へ融合された場合に、この調節は消失し（図９ｃ）、ｍｉＲ−２０３によるこれらの転写物の直接的な制御を指摘する。顕著なことに、ｍｉＲ−２０３耐性のＤｎｍｔ３ａおよびＤｎｍｔ３ｂ  ｃＤＮＡの過剰発現と同時の一過性ドキシサイクリン処理は、対応する胚様体の過剰増殖（図９ｄ）に加えて、野生型のＥＳＣにおけるｍｉＲ−２０３のレトロウイルス発現によって誘導された２Ｃ様細胞の増加（図９ｅ）を、阻止した。
【０１３４】
Ｄｎｍｔ３ａ／ｂのダウンレギュレーションがｍｉＲ−２０３の効果をどの程度模倣することができるかどうかを試験するために、ＲＮＡ干渉手段（ｓｉＤｎｍｔ３ａ／ｂ）によってこれらのデノボＤＮＡメチルトランスフェラーゼをノックダウンした。これらのサンプルのＲＮＡシーケンシングは、ｓｉＤｎｍｔ３ａ／ｂのｉＰＳＣがｔＫＩのｉＰＳＣに近いトランスクリプトームプロファイルを提示することを明らかにした（図９ｇ）。加えて、Ｄｎｍｔ３ａ／ｂのダウンレギュレーションは、ｔＫＩのｉＰＳＣ由来ＥＢにおいて観察されるものに類似する程度で、ＥＢの増殖、長い空洞の形成および拍動の増加を誘導した（図９ｈ）が、これらの転写物の個別のノックダウンは部分的な効果を提示した（図９ｈ中で定量化される）。
【０１３５】
Ｄｎｍｔ３ａ／ｂのノックダウンは、ＭＥＲＶＬエレメントの発現によってスコアリングされるように、野生型のＥＳＣ中での２Ｃ様集団も増加させた（図９ｉ、ｊ、ｋ）が、ｍｉＲ−２０３よりも少ない程度であった。これらの違いが、追加のｍｉＲ−２０３標的の遺伝子発現の制御における可変的な効率に起因するかどうかは、現在のところ明らかではない。さらに、ｍｉＲ−２０３耐性のＤｎｍｔ３ａ／ｂ  ｃＤＮＡの発現は、有意に２Ｃ関連マーカーの発現を阻止し（図９ｉ、ｊ）、それによって、Ｄｎｍｔ３ａ／ｂデノボメチルトランスフェラーゼがナイーブ型多能性の誘導においてｍｉＲ−２０３の重要な標的であることを示唆した。
【０１３６】
Ｄｎｍｔ３ａ／ｂはＤＮＡのメチル化に関与するデノボメチルトランスフェラーゼであるので、本発明者は、次に野生型のｉＰＳＣおよびｔＫＩのｉＰＳＣ（ドキシサイクリンによる誘導の前後で）に加えて、それらに由来する胚様体のゲノムワイドのメチル化プロフィールを分析した（図１１ａ）。野生型およびｔＫＩのｉＰＳＣはＤｏｘ前に類似レベルのメチル化を提示し、野生型細胞はこの処理によって影響を受けなかった。これとは対照的に、５日間のｍｉＲ−２０３の一過性誘導はｔＫＩのｉＰＳＣにおいてゲノムワイドの低メチル化をもたらし、それは、意外にもＤｏｘの中止２０日後（ｔ＝２５；図１１ｂ〜ｅ）でさえより低減されており、これは、Ｄｎｍｔ３ａ／ｂ転写レベルが、Ｄｏｘの存在下における抑制後に既に回復していたタイムポイントである（図１２ａ）。顕著なことに、ＤＮＡメチル化バレー（ＤＭＶ；（Ｘｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３））および部分的メチル化ドメイン（ＰＭＤ；（Ｌｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９））の数は、ｔＫＩのｉＰＳＣにおいて経時的に漸増的に高かった（図１１ｂおよび図１２ｂ）。例えば、１３１のＰＭＤがｔ＝０で見出されたが、５４８および６，５５５のＰＭＤがそれぞれｔ＝１０およびｔ＝２５で見出された。群間のＤＮＡメチル化比較は、１３１の全ＤＭＲのうちの１２８のメチル化可変領域（ＤＭＲ）（９７．７％；ｔ＝１０対ｔ＝０）および１２，５４９のうち１２，５４２のＤＭＲ（９９．９％；ｔ＝２５対ｔ＝０）は、ｍｉＲ−２０３への先行する曝露の結果としてｔＫＩのｉＰＳＣにおいて低メチル化であることを示した（図１１ｅおよび図１２ｂ）。これらのサンプルの転写解析は、影響を受けたＤＭＲにより脱調節される遺伝子が、クロマチンレギュレーター、または他の経路の中でＤＮＡ複製、細胞分裂もしくは胚形態形成に関与する遺伝子において有意にエンリッチされることを示唆した（図１３ａ）。
【０１３７】
これらの観察の検証として、バイサルファイト修飾後のシーケンシングは、Ｅ７４様ＥＴＳ転写因子５（Ｅｌｆ５）（上皮細胞の分化ならびにトロホブラスト幹細胞の更新および分化に関与するタンパク質）をコードする遺伝子座のｍｉＲ−２０３依存性の低メチル化を確認した（図１３ｂ、ｃ）。興味深いことには、ｔＫＩのｉＰＳＣに由来する胚様体は、Ｄｎｍｔ３ａおよびＤｎｍｔ３ｂの転写物のアップレギュレーションに一致して（図１２ａ）、より高いゲノムワイドのＤＮＡメチル化を提示した（図１１ｂ、ｃ）。ゲノムワイドのスケールでも観察されるように、Ｅｌｆ５  ＤＭＲは、野生型由来構造に比較した場合に、ｔＫＩのｉＰＳＣから生成された胚様体において高メチル化された（図１３ｂ、ｃ）。
【０１３８】
以前のデータは、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの発現または活性を妨害することはゲノムにおける全般的な低メチル化をもたらすことを示唆する（Ｂｌａｔｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｌｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５；Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。ｔＫＩのｉＰＳＣにおけるメチル化の変化がＤｎｍｔ３ａ／ｂのｍｉＲ−２０３媒介性抑制に関連するかどうかをさらに分析するために、ｔＫＩのｉＰＳＣにおけるこれらのＤＮＡメチルトランスフェラーゼのｍｉＲ−２０３耐性の形態の過剰発現後のＤＭＲメチル化の変化を研究した。図１１ｆ中で描写されるように、外来性Ｄｎｍｔ３ａ／ｂの発現は、ヒストン脱アセチル化酵素Ｓｉｒｔ６遺伝子に近接して所在するＤＭＲに加えてＥｌｆ５  ＤＭＲの両方において、ｍｉＲ−２０３誘導後に観察される低メチル化を救済し、これらのデノボＤＮＡメチルトランスフェラーゼが、ゲノムワイドの低メチル化の誘導においてｍｉＲ−２０３の重要な標的であることを示唆した。
【０１３９】
実施例４。ｍｉＲ−２０３の一過性発現は心筋細胞への分化および成熟を改善する。
ｍｉＲ−２０３の一過性発現が複数のアッセイ（図２〜８）において多能性細胞の機能を改善するので、心筋細胞分化の間にこのｍｉＲＮＡを発現させる効果を直接試験することを決定した。インビトロで培養された場合にさらなる増大および分化を行う、新生仔（Ｐ１）ラットから単離された初代心筋細胞において、ｍｉＲ−２０３の効果を最初に試験した。ｍｉＲ−２０３模倣体は、ヌクレオチドアナログＥｄＵの取り込み（図１４ａ）および有糸分裂マーカー（サイクリンＢ１等）（図１４ｂ）によって測定されるように、細胞の分裂増殖の一過性バーストを引き起こした。重要なことには、分裂増殖のこの増加が心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）陽性細胞において起こり（図１５ａ）、Ｍｙｈ６対Ｍｙｈ７のミオシン重鎖遺伝子の比（心筋細胞成熟および心仕事量と相関する、発生的に調節されるスイッチ（Ｍｉｙａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００））の増加した細胞をもたらした（図１４ｂ）。
【０１４０】
野生型のｉＰＳＣからの心筋細胞分化プロトコールも試験した（Ｋａｔｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。マウスｉＰＳＣにｍｉＲ−２０３模倣体または対照模倣体を一過性にトランスフェクションし、１５日後に、特異的な培地および培養条件を使用して心筋細胞へと分化させた（方法を参照）。この分化には、事前にｍｉＲ−２０３模倣体により処理されたｉＰＳＣにおける、心筋細胞分化転写物（ミオシン重鎖（Ｍｙｈ）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（Ｎｐｐａ）、心筋トロポニンＴ（Ｔｎｎｔ２遺伝子によってコードされる）等）、心筋前駆細胞についてのマーカー（インスリン遺伝子エンハンサー転写因子Ｉｓｌ１およびＴｂｘ５等）の発現の増加が付随した（図１５ｂ）。重要なことには、ｍｉＲ−２０３への一過性曝露は、分化マーカーだけでなく成熟マーカー（Ｋｃｎｈ２、Ｈｃｎ１およびＫｃｎａ４遺伝子によってコードされるカリウムチャンネル構成要素（Ｏｔｓｕｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）等）のより高い発現ももたらし、それらは対照模倣体ＲＮＡにより処理された細胞において最小でのみ誘導された（図１５ｃ）。これらのデータと一致して、ｍｉＲ−２０３処理ｉＰＳＣに由来する心筋細胞における拍動頻度は有意により高く、機能性の促進を示唆する（図１５ｄ）。ｍｉＲ−２０３と平行したＤｎｍｔ３ａおよびＤｎｍｔ３ｂのｍｉＲ−２０３耐性形態の発現（図１４ｃ）は、これらの分化および成熟のマーカーのアップレギュレーションを阻止し（図１４ｄ、ｅ）、多能性細胞からの心筋細胞の機能的な分化および成熟におけるｍｉＲ−２０３−Ｄｎｍｔ３ａ／ｂ軸の妥当性を示唆する。
【０１４１】
ｍｉＲ−２０３がｉＰＳＣをよりナイーブ型にし、それらの分化の潜在能および可塑性を増加させるという事実は、損傷後の心筋再生におけるｍｉＲ−２０３の効果を試験するように本発明者を導いた。新生仔マウスの心筋凍結損傷は、小児心疾患において観察されるものに類似する特徴を備えたモデルにおいて、再生を刺激する分子介入の試験を可能にするものである（Ｐｏｌｉｚｚｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。心筋細胞死を、出生後１日目のＣｏｌＡ１（ｍｉＲ−２０３／ｍｉＲ−２０３）；Ｒｏｓａ２６（ｒｔＴＡ／ｒｔＴＡ）マウスにおける凍結損傷によって誘導し（図１６ａ）、新生仔をベヒクル（対照）またはＤｏｘ（ｍｉＲ−２０３発現の誘導）により７日間処理した。１週間の回復の後に、対照仔は心臓における有意により大きな線維化領域を提示したが、Ｄｏｘに処理された新生仔において創傷治癒は有意に改善した（図１６ｂ、ｃ）。シリウスレッドの同時染色によるＣＤ３４陽性心筋前駆細胞の同定は、対照心臓の瘢痕中の未分化前駆細胞の蓄積を明らかにした。しかしながら、ドキシサイクリンによる処理は、損傷部位中のこれらの前駆細胞の存在の低減が付随した、線維化の有意な低減および正常組織のより良好な回復を導いた（図１６ｄ）。興味深いことには、対照に比較して、Ｄｏｘ処理群において手術された腹仔中の生存仔のパーセンテージはより高く（図１６ｅ）、心筋再生の間にｍｉＲ−２０３を誘導する治療効果、および再生医療におけるこのマイクロＲＮＡの可能な妥当性を示唆する。
【０１４２】
実施例５。ｍｉＲ−２０３は基底ナイーブ型状態をインビトロで誘導する。
増加レベルのｍｉＲ−２０３への一過性曝露後に得られた多能性細胞の特性を、基底状態における自然細胞のものと適切に比較することを可能にするために、異なるステージで単離されたマウス胚において定量的ＰＣＲ分析を遂行した。結果（図１７）は、ｍｉＲ−２０３発現が卵母細胞において低く、２細胞ステージで有意に誘導され、桑実胚および胚盤胞において段階的な低減を提示することを示した。
【０１４３】
２細胞ステージでのｍｉＲ−２０３の発現は、培養されたｔＫＩのマウスＰＳＣにおける２Ｃマーカーの発現を分析するように本発明者を導いた。野生型のＥＳ細胞におけるｍｉＲ−２０３−ＧＦＰの一過性発現は、ロイシンｔＲＮＡプライマーによるマウス内在性レトロウイルスの発現（ＭｕＥＲＶ−Ｌ；２Ｃ：：ｔｄＴｏｍａｔｏレポーター）（Ｍａｃｆａｒｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）によって決定されるように、２Ｃ様細胞の数を有意に増加させた（図１８ａ）。これらの観察と一致して、ｍｉＲ−２０３への曝露は、近位上流またはイントロン性ＭＥＲＶＬエレメントを保有する遺伝子の発現を誘導した（図１８ｂ）。加えて、ｍｉＲ−２０３曝露は、かなりの数の全能性２Ｃ割球に特徴的な遺伝子（Ｂｉａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）の発現を誘導した（図１８ｃ、ｄ）。劇的なことには、２Ｃ細胞の２８２の遺伝子のシグネチャー中に含まれるほとんどすべての転写物は、Ｄｏｘ中止の１０日後でｍｉＲ−２０３によって誘導され、それらの発現は徐々に経時的に低減した（図１８ｃ）。興味深いことに、ヒトナイーブ型多能性の維持に関与するヒト内在性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）のファミリーＨＥＲＶＨの発現（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）によって測定されるように、ｍｉＲ−２０３模倣体への一過性曝露は、ヒト多能性細胞も基底ナイーブ型状態にした（図１８ｅ、ｆ）。ｍｉＲ−２０３模倣体は、周辺部だけでなくほとんどコロニーの細胞の全体での多くの事例において、かなりの数のコロニー中でＨＥＲＶＨ−ＧＦＰレポーターの発現を誘導した。これらの培養の分化能を試験した場合に、ヒトｔＫＩのｉＰＳＣは、対照カウンターパートよりも大きな内部空洞を備えた有意により大きなＥＢを生成した（図１８ｇ、ｈ）。そのような訳で、この結果は、マウス多能性細胞における観察がヒト多能性細胞へ拡張され得ることを指摘する。
【０１４４】
実施例６。ｍｉＲ−２０３は、２ｉ／ＬＩＦ培地中で培養した細胞においてナイーブ型多能性を誘導する。
ＬＩＦとＭＥＫインヒビターＰＤ０３２５９０１およびＧＳＫ３インヒビターＣＨＩＲ９９０２１の組み合わせ（２ｉ／Ｌ条件）は、ｉＰＳＣをＥＳＣへより近くすることが以前に示され（Ｙｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）、その結果、それは幹細胞性潜在能の維持のための以前のスタンダードと判断きるので、２ｉ／Ｌ条件下でｍｉＲ−２０３の効果も試験することを決定した。
【０１４５】
同じ条件において増殖させた野生型のｉＰＳＣに比較した場合に、２ｉ／Ｌ中で増殖されたｔＫＩのｉＰＳＣも幹細胞性因子および発生経路の転写のエンリッチメントを提示したことが観察された（図１９ａ）。加えて、ＥＢアッセイの２週間前に、２ｉ／Ｌ条件において培養したｔＫＩのｉＰＳＣの５日間のＤｏｘによる前処理は、ＥＢサイズの有意な増加および大きな内部空洞の形成に加えて拍動を増進し（図１９ｂ、ｃ）、２ｉ／Ｌ条件を上回るｍｉＲ−２０３の付加的作用を示唆する。
【０１４６】
実施例７。ｍｉＲ−２０３は、２ｉ／Ｌ条件に比較して、ＩＣＲ領域における効果はほとんどない。
ゲノムのインプリントの大規模な消去が付随する場合に、ＰＳＣの培養でのメチル化の広範囲の損失は有害であり得ることを示す最近の所見（Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７；Ｙａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）を考慮して、ｔＫＩのｉＰＳＣにおいて１０３の異なるインプリンティング制御領域（ＩＣＲ）でのメチル化レベルを試験することを決定した。
【０１４７】
ｔＫＩのｉＰＳＣは遺伝子の進行性の脱メチル化を提示した（より黒いシグナル、オリジナルのものでは赤色、図２０；左側パネル中で、ｔ＝１０およびｔ＝２５で）が、ＩＣＲの脱メチル化はｔ＝１０で非常に限定され、同じサンプルのｔ＝２５では中等度であった（右側パネル）。重要なことには、脱メチル化は、すべての事例において分化に際して完全に回復し（ｔＫＩのｉＰＳＣ由来ＥＢ；図２０）、ｔＫＩのｉＰＳＣの脱メチル化（ＤＭＲおよびＩＣＲの両方で）は、管理可能且つ可逆的であり、ｉＰＳＣの質も分化するコンピテンスも損なわないことを示唆する。
【０１４８】
したがって、ｍｉＲ−２０３は、２ｉ／Ｌ条件に比較して、ＩＣＲ領域における効果がほとんどないことを観察することができ、したがって、複数のインビボのアッセイにおけるｍｉＲ−２０３処理細胞の有意な改善を説明する。
【０１４９】
結論
結論として、多様な細胞モデルおよびインビボモデルの使用によって、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞または胚性幹（ＥＳ）細胞中での一過性ｍｉＲ−２０３発現の制御が、これらの細胞が複数の細胞系譜へと分化し、それらの自己更新特性を妨害せずに、さらなる成熟特性を達成する能力を改善することを、本明細書において開示および実証した。この効果は、デノボＤＮＡメチルトランスフェラーゼＤｎｍｔ３ａおよびＤｎｍｔ３ｂのｍｉＲ−２０３依存性の制御を介して媒介され、それは今度は多能性細胞のメチル化全体像を調節する。
【０１５０】
参考文献
2020527050.tif 000013
2020527050.tif 000014
2020527050.tif 000015
2020527050.tif 000016
2020527050.tif 000017
【配列表フリーテキスト】
【０１５１】
配列番号１：＜２２３＞ｈｓａ−ｍｉＲ２０３ａ−３ｐ：ｍｉＲＢａｓｅにおいてアクセッションＭＩＭＡＴ００００２６４
配列番号２：＜２２３＞ｈｓａ−ｍｉＲ２０３ａ、ｍｉＲＢａｓｅにおいてアクセッションＭＩ００００２８３
配列番号３：＜２２３＞ｍｍｕ−ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲＢａｓｅにおいてアクセッションＭＩ００００２４６
配列番号４：＜２２３＞ｍｍｕ−ｍｉＲ−２０３−３ｐ：ｍｉＲｂａｓｅにおいてアクセッションＭＩＭＡＴ００００２３６
配列番号５：＜２２３＞マウス遺伝子ＤａｚｌのＲＴ−ＰＣＲのフォワードプライマー
配列番号６：＜２２３＞マウス遺伝子ＤａｚｌのＲＴ−ＰＣＲのリバースプライマー
配列番号７：＜２２３＞マウス遺伝子Ｄｎｍｔ１のＲＴ−ＰＣＲのフォワードプライマー
配列番号８：＜２２３＞マウス遺伝子Ｄｎｍｔ１のＲＴ−ＰＣＲのリバースプライマー
配列番号９：＜２２３＞マウス遺伝子Ｄｎｍｔ３ａのＲＴ−ＰＣＲのフォワードプライマー
配列番号１０：＜２２３＞マウス遺伝子Ｄｎｍｔ３ａのＲＴ−ＰＣＲのリバースプライマー
配列番号１１：＜２２３＞マウス遺伝子Ｄｎｍｔ３ａ２のＲＴ−ＰＣＲのフォワードプライマー
配列番号１２：＜２２３＞マウス遺伝子Ｄｎｍｔ３ａ２のＲＴ−ＰＣＲのリバースプライマー
配列番号１３：＜２２３＞マウス遺伝子Ｄｎｍｔ３ｂのＲＴ−ＰＣＲのフォワードプライマー
配列番号１４：＜２２３＞マウス遺伝子Ｄｎｍｔ３ｂのＲＴ−ＰＣＲのリバースプライマー
配列番号１５：＜２２３＞マウス遺伝子Ｄｎｍｔ３ｌのＲＴ−ＰＣＲのフォワードプライマー
配列番号１６：＜２２３＞マウス遺伝子Ｄｎｍｔ３ｌのＲＴ−ＰＣＲのリバースプライマー
配列番号１７：＜２２３＞マウス遺伝子Ｅｃａｔ１のＲＴ−ＰＣＲのフォワードプライマー
配列番号１８：＜２２３＞マウス遺伝子Ｅｃａｔ１のＲＴ−ＰＣＲのリバースプライマー
配列番号１９：＜２２３＞マウス遺伝子ＥｒａｓのＲＴ−ＰＣＲのフォワードプライマー
配列番号２０：＜２２３＞マウス遺伝子ＥｒａｓのＲＴ−ＰＣＲのリバースプライマー
配列番号２１：＜２２３＞マウス遺伝子Ｅｓｇ１のＲＴ−ＰＣＲのフォワードプライマー
配列番号２２：＜２２３＞マウス遺伝子Ｅｓｇ１のＲＴ−ＰＣＲのリバースプライマー
配列番号２３：＜２２３＞マウス遺伝子Ｆｇｆ４のＲＴ−ＰＣＲのフォワードプライマー
配列番号２４：＜２２３＞マウス遺伝子Ｆｇｆ４のＲＴ−ＰＣＲのリバースプライマー
配列番号２５：＜２２３＞マウス遺伝子ＧａｐｄｈのＲＴ−ＰＣＲのフォワードプライマー
配列番号２６：＜２２３＞マウス遺伝子ＧａｐｄｈのＲＴ−ＰＣＲのリバースプライマー
配列番号２７：＜２２３＞マウス遺伝子Ｇａｔａ６のＲＴ−ＰＣＲのフォワードプライマー
配列番号２８：＜２２３＞マウス遺伝子Ｇａｔａ６のＲＴ−ＰＣＲのリバースプライマー
配列番号２９：＜２２３＞マウス遺伝子Ｇｄｆ３のＲＴ−ＰＣＲのフォワードプライマー
配列番号３０：＜２２３＞マウス遺伝子Ｇｄｆ３のＲＴ−ＰＣＲのリバースプライマー
配列番号３１：＜２２３＞マウス遺伝子Ｈｃｎ１のＲＴ−ＰＣＲのフォワードプライマー
配列番号３２：＜２２３＞マウス遺伝子Ｈｃｎ１のＲＴ−ＰＣＲのリバースプライマー
配列番号３３：＜２２３＞マウス遺伝子Ｉｓｌ１のＲＴ−ＰＣＲのフォワードプライマー
配列番号３４：＜２２３＞マウス遺伝子Ｉｓｌ１のＲＴ−ＰＣＲのリバースプライマー
配列番号３５：＜２２３＞マウス遺伝子Ｋｃｎａ４のＲＴ−ＰＣＲのフォワードプライマー
配列番号３６：＜２２３＞マウス遺伝子Ｋｃｎａ４のＲＴ−ＰＣＲのリバースプライマー
配列番号３７：＜２２３＞マウス遺伝子Ｋｃｎｈ２のＲＴ−ＰＣＲのフォワードプライマー
配列番号３８：＜２２３＞マウス遺伝子Ｋｃｎｈ２のＲＴ−ＰＣＲのリバースプライマー
配列番号３９：＜２２３＞マウス遺伝子ＭｙｈのＲＴ−ＰＣＲのフォワードプライマー
配列番号４０：＜２２３＞マウス遺伝子ＭｙｈのＲＴ−ＰＣＲのリバースプライマー
配列番号４１：＜２２３＞マウス遺伝子ＮａｎｏｇのＲＴ−ＰＣＲのフォワードプライマー
配列番号４２：＜２２３＞マウス遺伝子ＮａｎｏｇのＲＴ−ＰＣＲのリバースプライマー
配列番号４３：＜２２３＞マウス遺伝子ＮｐｐａのＲＴ−ＰＣＲのフォワードプライマー
配列番号４４：＜２２３＞マウス遺伝子ＮｐｐａのＲＴ−ＰＣＲのリバースプライマー
配列番号４５：＜２２３＞マウス遺伝子Ｔｂｘ５のＲＴ−ＰＣＲのフォワードプライマー
配列番号４６：＜２２３＞マウス遺伝子Ｔｂｘ５のＲＴ−ＰＣＲのリバースプライマー
配列番号４７：＜２２３＞マウス遺伝子Ｔｎｎｔ２のＲＴ−ＰＣＲのフォワードプライマー
配列番号４８：＜２２３＞マウス遺伝子Ｔｎｎｔ２のＲＴ−ＰＣＲのリバースプライマ
配列番号４９：＜２２３＞Ｄｎｍｔ３ａの３’ＵＴＲの断片
＜２２３＞ｍｉＲ−２０３のシード領域
配列番号５０：＜２２３＞Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓのＤｎｍｔ３ａの３’−ＵＴＲの変異バージョン
＜２２３＞Ｄｎｍｔ３ａ  ｍＲＮＡの３’ＵＴＲの天然の配列に関してＡをＣによって置換する
＜２２３＞Ｄｎｍｔ３ａ  ｍＲＮＡの３’ＵＴＲの天然の配列に関してＵをＡによって置換する
＜２２３＞Ｄｎｍｔ３ａ  ｍＲＮＡの３’ＵＴＲの天然の配列に関してＣをＡによって置換する
配列番号５１：＜２２３＞Ｄｎｍｔ３ｂの３’ＵＴＲ
＜２２３＞ｍｉＲ−２０３のシード領域
配列番号５２：＜２２３＞Ｄｎｍｔｂの３’ＵＴＲの変異バージョン
＜２２３＞Ｄｎｍｔ３ｂ  ｍＲＮＡの３’ＵＴＲの天然の配列に関してＡをＣによって置換する
＜２２３＞Ｄｎｍｔ３ｂ  ｍＲＮＡの３’ＵＴＲの天然の配列に関してＵをＡによって置換する
＜２２３＞Ｄｎｍｔ３ｂ  ｍＲＮＡの３’ＵＴＲの天然の配列に関してＣをＡによって置換する
配列番号５３：＜２２３＞ｈｓａ−ｍｉＲ２０３ａ−５ｐ：ｍｉＲＢａｓｅにおいてアクセッションＭＩＭＡＴ００３１８９０
＜２２３＞ｍｍｕ−ｍｉＲ２０３−５ｐ中でａをｇによって置換する
＜２２３＞ｍｍｕ−ｍｉ２０３−５ｐに存在しないヌクレオチド
配列番号５４：＜２２３＞ｍｍｕ−ｍｉＲ−２０３−５ｐ、ｍｉＲＢａｓｅにおいてアクセッションＭＩＭＡＴ０００４５４７
＜２２３＞ｈｓａ−ｍｉＲ２０３ａ−５ｐ中でｇをａによって置換する
配列番号５５：＜２２３＞Ｄｎｍｔ３ａのＰＣＲ増幅のためのプライマーＤｎｍｔ３ａ  ＥｃｏＲＩ−Ｆｗ
配列番号５６：＜２２３＞Ｄｎｍｔ３ａのＰＣＲ増幅のためのプライマーＤｎｍｔ３ａ  ＥｃｏＲＩ−Ｒｖ
配列番号５７：＜２２３＞Ｄｎｍｔ３ｂのＰＣＲ増幅のためのプライマーＤｎｍｔ３ｂ＿ＥｃｏＲＩ−Ｆｗ
配列番号５８：＜２２３＞Ｄｎｍｔ３ｂのＰＣＲ増幅のためのプライマーＤｎｍｔ３ｂ＿ＮｄｅＩ−Ｒｖ
配列番号５９：＜２２３＞Ｄｎｍｔ３１のＰＣＲ増幅のためのプライマーＤｎｍｔ３１＿ＥｃｏＲＩ−Ｆｗ
配列番号６０：＜２２３＞Ｄｎｍｔ３１のＰＣＲ増幅のためのプライマーＤｎｍｔ３１＿ＮｄｅＩ−Ｒｖ
配列番号６１：＜２２３＞Ｄｎｍｔ１のＰＣＲ増幅のためのプライマーＤｎｍｔ１＿ＮｄｅＩ−Ｒｖ
配列番号６２：＜２２３＞Ｄｎｍｔ１のＰＣＲ増幅のためのプライマーＤｎｍｔ１＿ＮｄｅＩ−Ｒｖ
配列番号６３：＜２２３＞マウス遺伝子Ｅｃａｔ１のＲＴ−ＰＣＲのフォワードプライマー
配列番号６４：＜２２３＞マウス遺伝子Ｅｃａｔ１のＲＴ−ＰＣＲのリバースプライマー
配列番号６５：＜２２３＞マウス遺伝子ＥｒａｓのＲＴ−ＰＣＲのフォワードプライマー
配列番号６６：＜２２３＞マウス遺伝子ＥｒａｓのＲＴ−ＰＣＲのリバースプライマー
配列番号６７：＜２２３＞マウス遺伝子Ｅｓｇ１のＲＴ−ＰＣＲのフォワードプライマー
配列番号６８：＜２２３＞マウス遺伝子Ｅｓｇ１のＲＴ−ＰＣＲのリバースプライマー
配列番号６９：＜２２３＞マウス遺伝子Ｆｇｆ４のＲＴ−ＰＣＲのフォワードプライマー
配列番号７０：＜２２３＞マウス遺伝子Ｆｇｆ４のＲＴ−ＰＣＲのリバースプライマー
配列番号７１：＜２２３＞マウス遺伝子Ｇｄｆ３のＲＴ−ＰＣＲのフォワードプライマー
配列番号７２：＜２２３＞マウス遺伝子Ｇｄｆ３のＲＴ−ＰＣＲのリバースプライマー
配列番号７３：＜２２３＞ラット遺伝子Ｃｃｎｂ１のＲＴ−ＰＣＲのフォワードプライマー
配列番号７４：＜２２３＞ラット遺伝子Ｃｃｎｂ１のＲＴ−ＰＣＲのリバースプライマー
配列番号７５：＜２２３＞ラット遺伝子ＧａｐｄｈのＲＴ−ＰＣＲのフォワードプライマー
配列番号７６：＜２２３＞ラット遺伝子ＧａｐｄｈのＲＴ−ＰＣＲのリバースプライマー
配列番号７７：＜２２３＞ラット遺伝子Ｍｙｈ６のＲＴ−ＰＣＲのフォワードプライマー
配列番号７８：＜２２３＞ラット遺伝子Ｍｙｈ６のＲＴ−ＰＣＲのリバースプライマー
配列番号７９：＜２２３＞ラット遺伝子Ｍｙｈ７のＲＴ−ＰＣＲのフォワードプライマー
配列番号８０：＜２２３＞ラット遺伝子Ｍｙｈ７のＲＴ−ＰＣＲのリバースプライマー
配列番号８１：＜２２３＞マウス遺伝子Ｅｌｆ５（ａ）のＤＮＡメチル化分析のためのフォワードプライマー
配列番号８２：＜２２３＞マウス遺伝子Ｅｌｆ５（ａ）のＤＮＡメチル化分析のためのリバースプライマー
配列番号８３：＜２２３＞マウス遺伝子Ｅｌｆ５（ｂ）のＤＮＡメチル化分析のためのフォワードプライマー
配列番号８４：＜２２３＞マウス遺伝子Ｅｌｆ５（ｂ）のＤＮＡメチル化分析のためのリバースプライマー
配列番号８５：＜２２３＞マウス遺伝子Ｓｉｒｔ６のＤＮＡメチル化分析のためのフォワードプライマー
配列番号８６：＜２２３＞マウス遺伝子Ｓｉｒｔ６のＤＮＡメチル化分析のためのリバースプライマー
【図１】
2020527050.tif 000018
【図２】
2020527050.tif 000019
【図３】
2020527050.tif 000020
【図４】
2020527050.tif 000021
【図５】
2020527050.tif 000022
【図６】
2020527050.tif 000023
【図７】
2020527050.tif 000024
【図８】
2020527050.tif 000025
【図９−１】
2020527050.tif 000026
【図９−２】
2020527050.tif 000027
【図１０】
2020527050.tif 000028
【図１１】
2020527050.tif 000029
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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