(57)【要約】  免疫療法のための医薬組成物および方法を提供する。本医薬組成物は、ヒトの疾患に関連する抗原、好ましくはポリトープとしての２つ以上の患者に特異的な腫瘍抗原を発現する遺伝子操作した細菌を含む。この細菌は、ＣＤ１４介在型敗血症を誘導するには不十分である低いレベルでエンドトキシンを発現するように、遺伝子操作されたリポ多糖または患者自身の内共生細菌を有する。遺伝子操作した細菌は、腫瘍に特異的な免疫応答を誘導するために、全身的または局所的に患者に投与され得る。【選択図】図９Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
疾患に関連する抗原を組み換え型核酸から発現する遺伝子操作した細菌であって、前記細菌が、リポ多糖の生合成に必要であるタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１つの改変または欠失を有し、
前記遺伝子操作した細菌が、前記組み換え型核酸から、ＴＬＲおよび／またはＮＯＤのリガンドをさらに発現する、
遺伝子操作した細菌を含む医薬組成物。
【請求項２】
前記疾患に関連する抗原が、患者に特異的である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記疾患に関連する抗原が、腫瘍抗原である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記疾患に関連する抗原が、腫瘍関連抗原である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記疾患に関連する抗原が、腫瘍に特異的な抗原である、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
前記疾患に関連する抗原が、腫瘍および患者に特異的なネオアンチゲンである、請求項３に記載の組成物。
【請求項７】
前記遺伝子操作した細菌が、少なくとも１つの他の疾患に関連する抗原を発現する、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記疾患に関連する抗原が、ポリトープとして発現する、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記ポリトープが、抗原の間にペプチドスペーサーを含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記抗原が、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩのサブタイプまたは少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩのサブタイプによる提示を目的とする抗原に関する輸送シグナルをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記疾患に関連する抗原が、前記患者のＨＬＡ種の少なくとも１つのＭＨＣクラスＩのサブタイプまたは少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩのサブタイプに対して高親和性のバインダーである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記細菌が、大腸菌である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記遺伝子操作した細菌が、ＣＤ１４介在型敗血症を誘導するには不十分であるレベルで、エンドトキシンを発現する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記組み換え型核酸が、共刺激分子をコードする配列およびチェックポイント阻害剤をコードする配列のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
患者の処置のための医薬組成物であって、
組み換え型核酸からの前記患者の疾患に関連する抗原を発現するように遺伝子操作された、前記患者の内共生細菌
を含む、医薬組成物。
【請求項１６】
前記内共生細菌が、リポ多糖の生合成に必要であるタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１つの改変または欠失を有するようにさらに遺伝子改変されている、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記疾患に関連する抗原が、腫瘍抗原である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
前記疾患に関連する抗原が、腫瘍関連抗原である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記疾患に関連する抗原が、腫瘍に特異的な抗原である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２０】
前記疾患に関連する抗原が、腫瘍および患者に特異的なネオアンチゲンである、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２１】
前記遺伝子操作した細菌が、少なくとも１つの他の疾患に関連する抗原を発現する、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２２】
前記疾患に関連する抗原が、ポリトープとして発現する、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記ポリトープが、抗原の間にペプチドスペーサーを含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記抗原が、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩのサブタイプまたは少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩのサブタイプによる提示を目的とする抗原に関する輸送シグナルをさらに含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２５】
前記疾患に関連する抗原が、前記患者のＨＬＡ種の少なくとも１つのＭＨＣクラスＩのサブタイプまたは少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩのサブタイプに対して高親和性のバインダーである、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２６】
前記内共生細菌が、大腸菌である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記組み換え型核酸が、共刺激分子をコードする配列およびチェックポイント阻害剤をコードする配列のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２８】
免疫療法のための遺伝子操作した細菌を作製する方法であって、
疾患に関連する抗原を同定するステップと、
前記抗原と、ＴＬＲおよび／またはＮＯＤのリガンドとをコードする核酸配列を含むように組み換え型核酸を作製するステップと、
細菌を前記組み換え型核酸で形質転換して、前記抗原を発現する遺伝子操作した細菌を作製するステップであって、前記細菌が、リポ多糖の生合成に必要であるタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１つの改変または欠失を有する、ステップと
を含む、
方法。
【請求項２９】
前記疾患に関連する抗原が、患者に特異的である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記疾患に関連する抗原が、腫瘍抗原である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記疾患に関連する抗原が、腫瘍関連抗原である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記疾患に関連する抗原が、腫瘍に特異的な抗原である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記疾患に関連する抗原が、腫瘍および患者に特異的なネオアンチゲンである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記遺伝子操作した細菌が、少なくとも１つの他の疾患に関連する抗原を発現する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
前記疾患に関連する抗原が、ポリトープとして発現される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ポリトープが、抗原の間にペプチドスペーサーを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記抗原が、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩのサブタイプまたは少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩのサブタイプによる提示を目的とする抗原に関する輸送シグナルをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３８】
前記疾患に関連する抗原が、前記患者のＨＬＡ種の少なくとも１つのＭＨＣクラスＩのサブタイプまたは少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩのサブタイプに対して高親和性のバインダーである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３９】
前記細菌が大腸菌である、請求項２８に記載の方法。
【請求項４０】
前記遺伝子操作した細菌が、ＣＤ１４介在型敗血症を誘導するには不十分であるレベルで、エンドトキシンを発現する、請求項２８に記載の方法。
【請求項４１】
前記組み換え型核酸が、共刺激分子をコードする配列およびチェックポイント阻害剤をコードする配列のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項４２】
前記組み換え型核酸が、誘導可能なプロモーターを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項４３】
前記遺伝子操作した細菌に放射線照射するステップをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項４４】
患者の免疫療法のための遺伝子操作した細菌を作製する方法であって、
疾患に関連する抗原を同定するステップと、
前記抗原とＴＬＲおよび／またはＮＯＤのリガンドとをコードする核酸配列を含むように組み換え型核酸を作製するステップと、
前記患者の内共生細菌を前記組み換え型核酸で形質転換して、前記抗原とＴＬＲおよび／またはＮＯＤのリガンドとを発現する遺伝子操作した細菌を作製するステップと、
を含む、方法。
【請求項４５】
前記疾患に関連する抗原が、患者に特異的である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記疾患に関連する抗原が、腫瘍抗原である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記疾患に関連する抗原が、腫瘍関連抗原である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記疾患に関連する抗原が、腫瘍に特異的な抗原である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記疾患に関連する抗原が、腫瘍および患者に特異的なネオアンチゲンである、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
前記遺伝子操作した細菌が、少なくとも１つの他の疾患に関連する抗原を発現する、請求項４６に記載の方法。
【請求項５１】
前記疾患に関連する抗原が、ポリトープとして発現される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記ポリトープが、抗原の間にペプチドスペーサーを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記抗原が、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩのサブタイプまたは少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩのサブタイプによる提示を目的とする抗原に関する輸送シグナルをさらに含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項５４】
前記疾患に関連する抗原が、前記患者のＨＬＡ種の少なくとも１つのＭＨＣクラスＩのサブタイプまたは少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩのサブタイプに対して高親和性のバインダーである、請求項４４に記載の方法。
【請求項５５】
前記内共生細菌が、大腸菌である、請求項４４に記載の方法。
【請求項５６】
前記組み換え型核酸が、共刺激分子をコードする配列およびチェックポイント阻害剤をコードする配列のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項５７】
前記組み換え型核酸が、誘導可能なプロモーターを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項５８】
前記遺伝子操作した細菌に放射線照射するステップをさらに含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項５９】
免疫療法を使用して患者を処置する方法であって、
疾患に関連する抗原を同定するステップと、
前記疾患に関連する抗原をコードする核酸配列を含むように組み換え型核酸を作製するステップと、
前記組み換え型核酸を含むように、遺伝子操作した細菌、遺伝子操作した酵母、および遺伝子操作したウイルスからなる群から選択される少なくとも２つの異なる遺伝子操作した実体を作製するステップと、
前記遺伝子操作した細菌を投与することにより、前記患者に第１の免疫応答を誘導するステップと、
前記遺伝子操作した酵母または前記遺伝子操作した実体を投与することにより、前記患者に第２の免疫応答を誘導するステップと
を含む、方法。
【請求項６０】
前記疾患に関連する抗原が、患者に特異的である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記疾患に関連する抗原が、腫瘍抗原である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
前記疾患に関連する抗原が、腫瘍関連抗原である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記疾患に関連する抗原が、腫瘍に特異的な抗原である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
前記疾患に関連する抗原が、腫瘍および患者に特異的なネオアンチゲンである、請求項６１に記載の方法。
【請求項６５】
前記組み換え型核酸が、別の疾患に関連する抗原をコードする別の核酸配列を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６６】
前記疾患に関連する抗原が、ポリトープとして発現される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記ポリトープが、抗原の間にペプチドスペーサーを含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記抗原が、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩのサブタイプまたは少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩのサブタイプによる提示を目的とする抗原に関する輸送シグナルをさらに含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６９】
前記疾患に関連する抗原が、前記患者のＨＬＡ種の少なくとも１つのＭＨＣクラスＩのサブタイプまたは少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩのサブタイプに対して高親和性のバインダーである、請求項５９に記載の方法。
【請求項７０】
前記細菌が、大腸菌である、請求項５９に記載の方法。
【請求項７１】
前記遺伝子操作した細菌が、ＣＤ１４介在型敗血症を誘導するには不十分であるレベルで、エンドトキシンを発現する、請求項５９に記載の方法。
【請求項７２】
前記組み換え型核酸が、共刺激分子をコードする配列およびチェックポイント阻害剤をコードする配列のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項７３】
前記組み換え型核酸が、誘導可能なプロモーターを含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項７４】
投与の前に、前記遺伝子操作した細菌に放射線照射するステップをさらに含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項７５】
共刺激分子およびチェックポイント阻害剤を同時投与するステップをさらに含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項７６】
前記第１の遺伝子操作した実体が、前記遺伝子操作した細菌であり、前記第２の遺伝子操作した実体が、前記遺伝子操作した酵母である、請求項５９に記載の方法。
【請求項７７】
前記第２の遺伝子操作した実体が、前記遺伝子操作した酵母である、請求項５９に記載の方法。
【請求項７８】
前記第２の遺伝子操作した実体が、前記遺伝子操作したウイルスである、請求項５９に記載の方法。
【請求項７９】
前記第１の遺伝子操作した実体および前記第２の遺伝子操作した実体の投与が、２つの異なる経路にあり、前記２つの異なる経路が、皮下注射、静脈内注射、腫瘍内注射、筋肉内注射、皮内注射、脳内注射、脳室内注射、経口投与、局所的適用、吸入、舌下投与、および経粘膜投与からなる群から選択される、請求項５９に記載の方法。
【請求項８０】
前記第１の遺伝子操作した実体の投与が、プライム投与であり、前記第２の遺伝子操作した実体の投与が、ブースト投与である、請求項５９に記載の方法。
【請求項８１】
免疫療法を使用して患者を処置する方法であって、
疾患に関連する抗原を同定するステップと、
前記抗原とＴＬＲおよび／またはＮＯＤのリガンドとをコードする核酸配列を含むように組み換え型核酸を作製するステップと、
前記組み換え型核酸で細菌を形質転換して、前記抗原を発現する遺伝子操作した細菌を作製するステップと、
前記遺伝子操作した細菌を前記患者に投与するステップであって、前記細菌が、リポ多糖の生合成に必要であるタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１つの改変または欠失を含む、ステップと
を含む、方法。
【請求項８２】
前記疾患に関連する抗原が、患者に特異的である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記疾患に関連する抗原が、腫瘍抗原である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８４】
前記疾患に関連する抗原が、腫瘍関連抗原である、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記疾患に関連する抗原が、腫瘍に特異的な抗原である、請求項８３に記載の方法。
【請求項８６】
前記疾患に関連する抗原が、腫瘍および患者に特異的なネオアンチゲンである、請求項８３に記載の方法。
【請求項８７】
前記遺伝子操作した細菌が、少なくとも１つの他の疾患に関連する抗原を発現する、請求項８１に記載の方法。
【請求項８８】
前記疾患に関連する抗原が、ポリトープとして発現される、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記ポリトープが、抗原の間にペプチドスペーサーを含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記抗原が、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩのサブタイプまたは少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩのサブタイプによる提示を目的とする抗原に関する輸送シグナルをさらに含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項９１】
前記疾患に関連する抗原が、前記患者のＨＬＡ種の少なくとも１つのＭＨＣクラスＩのサブタイプまたは少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩのサブタイプに対して高親和性のバインダーである、請求項８１に記載の方法。
【請求項９２】
前記細菌が大腸菌である、請求項８１に記載の方法。
【請求項９３】
前記遺伝子操作した細菌が、ＣＤ１４介在型敗血症を誘導するには不十分であるレベルで、エンドトキシンを発現する、請求項８１に記載の方法。
【請求項９４】
前記組み換え型核酸が、共刺激分子をコードする配列およびチェックポイント阻害剤をコードする配列のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項９５】
前記組み換え型核酸が、誘導可能なプロモーターを含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項９６】
投与前に、前記遺伝子操作した細菌に放射線照射するステップをさらに含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項９７】
共刺激分子およびチェックポイント阻害剤を同時投与するステップをさらに含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項９８】
免疫療法を使用して患者を処置する方法であって、
疾患に関連する抗原を同定するステップと、
前記抗原をコードする核酸配列を含むように組み換え型核酸を作製するステップと、
前記組み換え型核酸で前記患者の内共生細菌を形質転換して、前記抗原を発現する遺伝子操作した細菌を作製するステップと、
前記遺伝子操作した細菌を前記患者に投与するステップと
を含む、方法。
【請求項９９】
前記疾患に関連する抗原が、患者に特異的である、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記疾患に関連する抗原が、腫瘍抗原である、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０１】
前記疾患に関連する抗原が、腫瘍関連抗原である、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記疾患に関連する抗原が、腫瘍に特異的な抗原である、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０３】
前記疾患に関連する抗原が、腫瘍および患者に特異的なネオアンチゲンである、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０４】
前記遺伝子操作した細菌が、少なくとも１つの他の疾患に関連する抗原を発現する、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０５】
前記疾患に関連する抗原が、ポリトープとして発現される、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記ポリトープが、抗原の間にペプチドスペーサーを含む、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記抗原が、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩのサブタイプまたは少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩのサブタイプによる提示を目的とする抗原に関する輸送シグナルをさらに含む、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０８】
前記疾患に関連する抗原が、前記患者のＨＬＡ種の少なくとも１つのＭＨＣクラスＩのサブタイプまたは少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩのサブタイプに対して高親和性のバインダーである、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０９】
前記細菌が、大腸菌である、請求項９８に記載の方法。
【請求項１１０】
前記組み換え型核酸が、共刺激分子をコードする配列およびチェックポイント阻害剤をコードする配列のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項９８に記載の方法。
【請求項１１１】
前記組み換え型核酸が、誘導可能なプロモーターを含む、請求項９８に記載の方法。
【請求項１１２】
投与前に、前記遺伝子操作した細菌に放射線照射するステップをさらに含む、請求項９８に記載の方法。
【請求項１１３】
共刺激分子およびチェックポイント阻害剤を同時投与するステップをさらに含む、請求項９８に記載の方法。
【請求項１１４】
免疫療法を使用して患者を処置するための請求項１〜２７に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１１５】
細菌性ワクチンを製造するための請求項１〜２７に記載の医薬組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、本出願人の係属中である、２０１７年６月１６日に出願の米国特許仮出願第６２／５２１，１５３号、および２０１８年２月６日に出願の米国特許仮出願第６２／６２７，１２２号の優先権を主張するものである。
【０００２】
技術分野
本発明の分野は、免疫療法のための遺伝子改変細菌を作製および／または使用するための組成物および方法である。
【背景技術】
【０００３】
背景の説明は、本発明の理解に有用であり得る情報を含む。本明細書中提供される情報のいずれもが従来技術であるかもしくはここで請求される発明に関連するものであること、または明確にもしくは暗示的に参照されるいずれの刊行物もが従来技術であることを認めるものではない。
【０００４】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて癌細胞に対する免疫応答を誘発する抗原を使用する免疫療法は、カスタマイズ可能なワクチンおよび他の治療用作用物質を含む患者および／または癌に特異的な処置を提供するための道を開くため、癌にとって魅力的な治療選択肢である。この種類の治療方法では、患者の癌細胞由来の抗原（たとえば単一または複数の変異を含む短いペプチドなど）が、免疫細胞に送達され、患者自身の免疫応答を誘発またはブーストするために主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）と複合体形成し、またその上に提示される。抗原の同定および特定のＭＨＣ種と結合するための抗原の標的化に関する例は、全体が本明細書中に組み込まれている国際特許出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ１６／５６５５０号に教示されている。
【０００５】
本明細書中の全ての刊行物および特許出願は、それぞれ個々の刊行物または特許出願が具体的かつ個別に参照により組み込まれていることを表す場合と同じ度合で、参照により組み込まれている。組み込まれた参照文献における用語の定義または使用が本明細書中提供される当該用語の定義と食い違っているかまたは矛盾する場合、本明細書中提供される当該用語の定義を適用し、参照文献における当該用語の定義を適用しない。
【０００６】
遺伝子改変ウイルス（たとえばアデノウイルス、遺伝子改変ＨＳＶを含む他の非病原性ウイルスなど）は、その比較的高い遺伝子送達の効率（たとえば高い感染速度）により特に好ましいｉｎ  ｖｉｖｏにおける免疫細胞への抗原送達ビヒクルである。しかしながら、送達ビヒクルとしてウイルスを使用することは、免疫療法にいくつかの限定を課すこととなる。第１に、アデノウイルスを含む多くのウイルスは、パッケージング能において限定されており、よって複数の抗原を大規模に産生させるために当該ウイルスを使用することは非効率である。さらに、免疫応答を誘発するために十分な量の遺伝子改変ウイルスを作製することは、比較的長い時間（たとえば１ケ月以上）がかかるため、免疫療法を使用した腫瘍成長の早期介入または緊急の処置は、実現可能ではない場合がある。
【０００７】
癌抗原の送達ビヒクルの候補として、酵母または細菌などの他の微生物が示唆されている。たとえば米国特許第８７３４７７８号は、癌胎児性抗原を発現する酵母、および当該酵母の甲状腺癌を有する患者への投与を開示している。
【０００８】
米国特許公開公報第２０１６／０３１７６３４号は、メソテリンをコードする組み換えＤＮＡ分子を送達するための弱毒化した変異型のサルモネラ菌株の使用を開示している。しかしながら、遺伝子改変細菌の使用は、このような生物により産生される様々なエンドトキシンにより、患者による重篤な免疫応答をもたらし得る。
【０００９】
よって、様々な癌に関する免疫療法の様々なシステムおよび方法が当該分野で知られているにも関わらず、これらの全てまたはほぼ全てが、いくつかの欠点を有している。特に、多くの癌における比較的多数のネオアンチゲンおよび免疫療法を使用した癌成長の早期介入の必要性の観点から、患者が良好に耐えられる方法で、患者に特異的および／または癌に特異的な抗原をｉｎ  ｖｉｖｏで発現および送達する遺伝子改変生物に関する組成物および方法が、依然として必要とされている。
【発明の概要】
【００１０】
本発明の主題は、エンドトキシン含有量の低減または患者自身の内共生細菌を伴う遺伝子操作した細菌を使用して、エンドトキシンショック応答を誘発せずに、癌細胞に対する患者の免疫応答を誘発またはブーストするように患者に特異的および／または癌に特異的な抗原を発現および送達することができる、免疫療法の様々な組成物および方法を目的とする。
【００１１】
よって、本発明の主題の一態様では、本発明者らは、ヒトまたは哺乳類の疾患に関連する抗原を発現する遺伝子操作した細菌を含む医薬組成物を企図している。多くの種類の細菌が使用され得るが、遺伝子操作される細菌は大腸菌株であることが好ましい。また遺伝子操作した細菌は、通常、患者においてＣＤ１４介在型敗血症を誘導するには不十分であるレベルでエンドトキシンを発現するように遺伝子操作されている。本発明の主題の別の態様では、本発明者らはさらに、患者の疾患に関連する抗原を発現するように遺伝子操作された患者の内共生細菌を含む、患者の処置のための医薬組成物を企図している。
【００１２】
最も典型的には、両方の遺伝子操作した細菌において、ヒトまたは哺乳類の疾患に関連する抗原は、腫瘍抗原または腫瘍関連抗原であり、好ましくは患者に特異的な抗原でもある。よって好ましい実施形態では、ヒトまたは哺乳類の疾患に関連する抗原は、患者のオミクスデータの解析を介して同定された、患者に特異的なネオアンチゲン（「ネオエピトープ」）である。ネオアンチゲンは、患者のＨＬＡ種の少なくとも１つのＭＨＣクラスＩのサブタイプまたは少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩのサブタイプに対して高親和性のバインダーであることが企図されている。この場合、抗原がさらに、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩのサブタイプまたは少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩのサブタイプによる提示を目的とする抗原に関する輸送シグナルを含むことも企図されている。
【００１３】
他の実施形態では、遺伝子操作した細菌は、２つ以上のヒトまたは哺乳類の疾患に関連する抗原を発現する。これらの実施形態では、２つ以上の抗原が、ポリトープとして、好ましくは間にペプチドスペーサーを伴い、発現されることが企図されている。さらに、組み換え型細菌は同様に、共刺激分子およびチェックポイント阻害剤のうちの少なくとも１つを発現し得る。
【００１４】
本発明の主題のさらなる別の態様では、本発明者らは、ヒトまたは哺乳類の疾患に関連する抗原を同定するステップを含む、免疫療法のための遺伝子操作した細菌を作製する方法を企図している。同定したヒトまたは哺乳類の疾患に関連する抗原を用いて、当該抗原をコードする核酸配列を含むように、組み換え型核酸が構築される。次に、この組み換え型核酸を用いて細菌を形質転換して、当該抗原を発現する遺伝子操作した細菌を作製する。多くの種類の細菌が使用され得るが、遺伝子操作される細菌は大腸菌株であることが好ましい。この実施形態では、遺伝子操作した細菌はまた、低レベル、好ましくは患者においてＣＤ１４介在型敗血症応答を誘導するには不十分である低レベルでエンドトキシンを発現するように、遺伝子操作されたリポ多糖を発現し得る。あるいは、遺伝子操作した細菌は、患者のミクロフローラから選択される患者の内共生細菌に由来する。
【００１５】
最も典型的には、両方の遺伝子操作した細菌において、ヒトまたは哺乳類の疾患に関連する抗原は、腫瘍抗原または腫瘍関連抗原であり、好ましくは患者に特異的な抗原でもある。好ましい実施形態では、ヒトまたは哺乳類の疾患に関連する抗原は、患者のオミクスデータの解析を介して同定された患者に特異的なネオアンチゲンである。ネオアンチゲンは、患者のＨＬＡ種の少なくとも１つのＭＨＣクラスＩのサブタイプまたは少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩのサブタイプに対して高親和性のバインダーであることが企図されている。またこの場合、抗原はさらに、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩのサブタイプまたは少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩのサブタイプによる提示を目的とする抗原に関する輸送シグナルを含むことも企図されている。
【００１６】
さらなる実施形態では、遺伝子操作した細菌は、２つ以上のヒトまたは哺乳類の疾患に関連する抗原を発現する。これら実施形態では、２つ以上の抗原が、間にペプチドスペーサーを伴いポリトープとして発現されることが企図されている。さらに、組み換え型ヌクレオチド配列はまた、共刺激分子をコードする配列およびチェックポイント阻害剤をコードする配列のうちの少なくとも１つを含み得る。さらに、組み換え型ヌクレオチド配列は、抗原および／または共刺激分子もしくはチェックポイント阻害剤の発現が最適な時点で制御され得るように、タンパク質発現に関して誘導可能なプロモーターを含むことが好ましい。
【００１７】
さらに、本発明者らは、遺伝子操作した細菌が、当該細菌を殺滅かつ不活性化するように放射線照射（たとえば電子線照射、ガンマ線照射、ＵＶ照射など）され得ることを企図している。
【００１８】
本発明の主題のさらなる別の態様では、本発明者らは、ヒトまたは哺乳類の疾患に関連する抗原を同定するステップを含む、免疫療法を使用して患者を処置する方法を企図している。同定した疾患に関連する抗原を用いて、当該抗原をコードする核酸配列を含むように、組み換え型核酸が構築される。最も典型的には、ヒトまたは哺乳類の疾患に関連する抗原は、腫瘍抗原または腫瘍関連抗原であり、好ましくは、患者に特異的な抗原でもある。好ましい実施形態では、疾患に関連する抗原は、患者のオミクスデータの解析を介して同定された患者に特異的なネオアンチゲンである。ネオアンチゲンは、患者のＨＬＡ種の少なくとも１つのＭＨＣクラスＩのサブタイプまたは少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩのサブタイプに対して高親和性のバインダーであることが企図されている。またこの場合、抗原はさらに、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩのサブタイプまたは少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩのサブタイプによる提示を目的とする抗原に関する輸送シグナルを含むことも企図されている。
【００１９】
また企図した方法は、少なくとも２つの異なる時点で、２つの別々の免疫応答を誘発するためのツールを提供する。よって、遺伝子操作した細菌、遺伝子操作した酵母、および遺伝子操作したウイルスからなる群から選択される少なくとも２つの異なる遺伝子操作した実体が、組み換え型核酸を含むように作製される。よって、患者の第１の免疫応答が、第１の時点で、第１の遺伝子操作した実体を投与することにより誘導され、患者の第２の免疫応答が、第２の時点で、第２の遺伝子操作した実体を投与することにより誘導される。
【００２０】
第１および第２の遺伝子操作した実体は、第１の実体が第２の実体よりも速く抗原を発現および／または産生するように選択されることが企図されている。よって一部の実施形態では、第１の遺伝子操作した実体は細菌であり、第２の実体は酵母である。他の実施形態では、第１の実体は細菌であり、第２の実体はウイルスである。さらなる他の実施形態では、第１の実体は酵母であり、第２の実体はウイルスである。
【００２１】
また、第１および第２の遺伝子操作した実体は、同じ経路または２つの異なる経路を介して患者に投与され得ることが企図されている。２つの異なる経路が選択される場合、これら２つの異なる経路は、異なる速度、比率、効率、および／または送達の関連する（副）作用を有し得る。よって、本発明者らは、第１の遺伝子操作した実体の投与が、プライム投与として作用し得、第２の遺伝子操作した実体の投与が、ブースト投与として作用し得ることを企図している。
【００２２】
最も典型的には、この方法では、疾患に関連する抗原は、腫瘍抗原または腫瘍関連抗原であり、好ましくは患者に特異的な抗原でもある。好ましい実施形態では、疾患に関連する抗原は、患者のオミクスデータの解析を介して同定された患者に特異的なネオアンチゲンである。ネオアンチゲンは、患者のＨＬＡ種の少なくとも１つのＭＨＣクラスＩのサブタイプまたは少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩのサブタイプに対して高親和性のバインダーであることが企図されている。またこの場合、抗原はさらに、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩのサブタイプまたは少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩのサブタイプによる提示を目的とする抗原に関する輸送シグナルを含むことも企図されている。
【００２３】
一部の実施形態では、遺伝子操作した実体は、２つ以上のヒトまたは哺乳類の疾患に関連する抗原を発現する。これら実施形態では、２つ以上の抗原は、間にペプチドスペーサーを伴いポリトープとして発現されることが企図されている。さらに、組み換え型の実体はまた、共刺激分子およびチェックポイント阻害剤のうちの少なくとも１つを発現し得る。
【００２４】
さらに、本発明者らは、遺伝子操作した実体が細菌または酵母である場合、遺伝子操作した細菌または酵母が、当該細菌または酵母を殺滅かつ不活性化するように放射線照射（たとえば電子線照射、ガンマ線照射、ＵＶ照射など）され得ることを企図している。この実施形態では、遺伝子操作した細菌はまた、患者においてＣＤ１４介在型敗血症を誘導するには不十分である低いレベルでエンドトキシンを発現するように、遺伝子操作されたリポ多糖を発現する。あるいは、遺伝子操作した細菌はまた、患者のミクロフローラから選択される患者の内共生細菌に由来し得る。
【００２５】
本発明の主題のさらなる別の態様では、本発明者らは、ヒトまたは哺乳類の疾患に関連する抗原を同定するステップを含む、免疫療法を使用して患者を処置する方法を企図している。同定した疾患に関連する抗原を用いて、当該抗原をコードする核酸配列を含むように、組み換え型核酸が構築される。次に、この組み換え型核酸を用いて細菌を形質転換して、当該抗原を発現する遺伝子操作した細菌を作製する。多くの種類の細菌が使用され得るが、遺伝子操作される細菌は大腸菌株であることが好ましい。この実施形態では、遺伝子操作した細菌は、低レベル、好ましくは患者においてＣＤ１４介在型敗血症を誘導するには不十分であるレベルで、エンドトキシンを発現する。あるいは遺伝子操作した細菌は、患者の正常なミクロフローラから選択される患者の内共生細菌に由来する。
【００２６】
最も典型的には、両方の遺伝子操作した細菌において、疾患に関連する抗原は、腫瘍抗原または腫瘍関連抗原であり、好ましくは患者に特異的な抗原でもある。好ましい実施形態では、疾患に関連する抗原は、患者のオミクスデータの解析を介して同定された患者に特異的なネオアンチゲンである。ネオアンチゲンは、患者のＨＬＡ種の少なくとも１つのＭＨＣクラスＩのサブタイプまたは少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩのサブタイプに対して高親和性のバインダーであることが企図されている。またこの場合、抗原はさらに、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩのサブタイプまたは少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩのサブタイプによる提示を目的とする抗原に関する輸送シグナルを含むことも企図されている。
【００２７】
さらなる実施形態では、遺伝子操作した細菌は、２つ以上の疾患に関連する抗原を発現する。これらの実施形態では、２つ以上の抗原は、間にペプチドスペーサーを伴いポリトープとして発現されることが企図されている。さらに、組み換え型細菌はまた、共刺激分子およびチェックポイント阻害剤のうちの少なくとも１つを発現し得る。さらに、組み換え型ヌクレオチド配列は、抗原および／または共刺激分子もしくはチェックポイント阻害剤の発現が最適な時点で制御され得るように、タンパク質発現に関して誘導可能なプロモーターを含むことが好ましい。さらに本発明者らは、遺伝子操作した細菌が、当該細菌を殺滅および／または不活性化するように放射線照射（たとえば電子線照射、ガンマ線照射、ＵＶ照射など）され得ることを企図している。
【００２８】
本発明の主題のさらなる別の態様では、本発明者らは、免疫療法を使用して患者を処置するための、上述の医薬組成物の使用を企図している。また本発明者らは、細菌性ワクチンを製造するための、上述の医薬組成物の使用を企図していた。
【００２９】
本発明の主題の様々な目的、特性、態様、および利点は、以下の、同様の数字が同様の構成要素を表す添付の図面と併せて好ましい実施形態の詳細な説明から、さらに明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１−１】図１は、免疫応答カスケード、および免疫応答の各ステップにおけるサイトカインの種類を示す。
【図１−２】同上。
【図２】図２は、ゲート型ビーズ（ｇａｔｅｄ  ｂｅａｄ）のシステムおよび方法によるサイトカイン放出の検出の特異度を表すチャートである。
【図３】図３は、遺伝子改変細菌におけるＰＰ６５の発現の誘導を示す代表的なデータである。
【図４】図４は、ＬＰＳ欠失ＢＬ２１細胞株におけるＰＰ６５の発現の誘導を示す代表的なデータである。
【図５Ａ】図５Ａは、樹状細胞を伴うかまたは伴わない状態のＴ細胞におけるサイトカイン放出の正規化したヒートマップを示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、樹状細胞単独での条件におけるサイトカイン放出の正規化したヒートマップを示す。
【図６−１】図６は、放射線照射した細菌および生きた細菌への曝露によるＩＬ−４およびＩＬ−５の放出を表す正規化していないＴ細胞アッセイのグラフを示す。
【図６−２】同上。
【図７−１】図７は、放射線照射した細菌および生きた細菌への曝露によるＩＬ−１３およびＴＮＦ−αの放出を表す正規化していないＴ細胞アッセイのグラフを示す。
【図７−２】同上。
【図８】図８は、放射線照射した細菌および生きた細菌への曝露によるＩＬ−６、ＩＬ−８、およびＴＮＦ−αの放出を表す正規化していないＴ細胞アッセイのグラフを示す。
【図９Ａ】図９Ａ〜９Ｂは、遺伝子改変細菌におけるＰＰ６５発現レベルと、スポット形成細胞（ＳＦＣ）の数との間の関係を表すグラフおよびデータ表を示す。星印は、ＰＰ６５タンパク質の添加（３μｇ／ｍｌ）を表す。図９Ｂは、未処置の形態または凍結形態におけるｐｐ６５に関する結果を表す。
【図９Ｂ】同上。
【図１０Ａ】図１０Ａ〜１０Ｅは、ＬＰＳ＋およびＬＰＳ−のＢＬ２１細胞に曝露した選択した細胞集団における選択したサイトカインのレベルを比較したグラフである。
【図１０Ｂ】同上。
【図１０Ｃ】同上。
【図１０Ｄ】同上。
【図１０Ｅ】同上。
【図１１】図１１は、組み換え発現したフラゲリンに対するＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＴＬＲ５細胞におけるＴＬＲ５応答を表すグラフである。
【図１２】図１２は、様々なＥＬＩＳＰＯＴアッセイからの例示的な結果を表す。
【図１３】図１３は、メラノーマに対して細菌性ワクチンを使用したｉｎ  ｖｉｖｏでのモデル系の例示である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明者らは、遺伝子操作した細菌またはその一部を、遺伝子操作した細菌に対する急性炎症性エンドトキシン応答またはＣＤ１４介在型敗血症性ショックなどの有害作用を誘発することなく抗原に対する治療効果をもたらすように、好ましくは患者および癌に特異的な、１つ以上の抗原を宿主へ送達するための担体として使用できる免疫療法の様々な組成物および方法を発見した。最も典型的には、望ましい治療効果は、組み換え型抗原に対する防御免疫応答である。
【００３２】
よって本発明者らは特に、ヒトまたは哺乳類の疾患に関連する抗原を恒常的または誘導的に発現する遺伝子操作した細菌を含む医薬組成物を企図している。最も典型的には、遺伝子操作した細菌は、遺伝子操作した細菌の投与の際に急性炎症性エンドトキシン応答またはＣＤ１４介在型敗血症性ショックをもはや誘発しないような度合で、ＬＰＳ（リポ多糖、エンドトキシン）合成に影響する１つ以上の変異を有する。あるいは、適切な遺伝子操作した細菌はまた、様々なヒトの内共生細菌を含んでもよく、これは上述のように遺伝子改変されていてもよくまたは遺伝子改変されていなくてもよい。好ましくは、ヒトの内共生細菌を使用する場合、これらは、単に、１つ以上の望ましい抗原を発現するように改変され、通常、内共生細菌を単離した身体の区画（たとえば歯周ポケット、喉、胃、結腸など）へ再導入される。
【００３３】
よって、本発明者らはまた、本医薬組成物が、免疫療法としてのワクチンの形態で（患者の癌治療の完了の前、間、または後などに）利用できることを企図している。当然、免疫療法は、同じ抗原および／またはさらなる抗原を標的とする酵母またはウイルスのワクチン組成物などの追加的なワクチン組成物によってさらに支援され得ることを認識されたい。発現の方法に関わらず、遺伝子操作した細菌は、放射線照射されてもよく、または他の方法で複製を不十分な状態にするかもしくは殺滅されてもよい（たとえば熱により不活性化、超音波処理など）。
【００３４】
好ましい実施形態では、ヒトまたは哺乳類の疾患に関連する抗原は、腫瘍抗原である。本明細書中使用される場合、腫瘍抗原は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかで腫瘍細胞により産生されるいずれかの抗原性物質である。腫瘍抗原として、特定の腫瘍細胞でのみ特異的に発現する腫瘍に特異的な抗原、および多くの異なる腫瘍細胞で発現する腫瘍関連抗原が挙げられる。これら腫瘍抗原の多くは、タンパク質の構造の異常（たとえばナンセンス、ミスセンス、フレームシフトなど）をもたらし得る遺伝子の変異（たとえば欠失、挿入、トランスバージョン、移行、転位など）、または、タンパク質のエピジェネティックな変化（たとえば過剰発現、不活性化など）から生じることが企図されている。
【００３５】
より好ましくは、ヒトまたは哺乳類の疾患に関連する抗原は、患者の疾患状態の組織および健常な組織からのオミクスデータの解析および比較を介して（たとえば、全ゲノムシーケンシングおよび／またはエキソームシーケンシングなどを介して）同定される、患者および腫瘍に特異的なネオアンチゲンである。全般的に、同定された変異において、患者に特異的なネオアンチゲンを、変異の種類、転写の強度、翻訳の強度、および先験的に知られている分子のバリエーションのうちの少なくとも１つによってフィルタリングすることによりさらに選択することが好ましい。患者に特異的なネオアンチゲンおよび／または癌に特異的であり患者に特異的なネオアンチゲンの同定に関するさらなる詳細は、全体が本明細書中に組み込まれている国際特許出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ１６／５６５５０号に詳細に記載されている。
【００３６】
さらに、疾患に関連する抗原は、たとえば国際特許公開公報第２０１７／０３５３９２号に記載されているようにｄｅ  Ｂｒｕｉｊｎ  ｇｒａｐｈによる手法を使用するかまたは当該分野で知られている従来の方法（たとえば抗体ベースの方法）を使用してｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで決定され得る、患者のＨＬＡ種の少なくとも１つのＭＨＣクラスＩのサブタイプまたは少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩのサブタイプに対して高親和性のバインダーであることが特に企図されている。疾患に関連する抗原の結合親和性は、決定したＨＬＡ種に対してｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで試験される。好ましい結合親和性は、たとえばＮｅｔＭＨＣを使用して、たとえば５００ｎＭ未満、または２５０ｎＭ未満、または１５０ｎＭ未満、または５０ｎＭ未満といった、最小のＫＤにより測定することができる。最も典型的には、ＨＬＡ種の決定は、少なくとも３種のＭＨＣ−Ｉのサブタイプ（たとえばＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃなど）および少なくとも３種のＭＨＣ−ＩＩのサブタイプ（たとえばＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＲなど）を含み、ここで好ましくはそれぞれのサブタイプは、少なくとも４桁のｄｅｐｔｈに決定される。このような手法は、患者および腫瘍に対して真である特定のネオアンチゲンを同定するだけでなく、細胞に提示され得る可能性が最も高く、よって治療効果を伴う免疫応答を誘発する可能性が最も高いネオアンチゲンをも同定することを理解されたい。
【００３７】
当然、患者および癌に特異的なネオアンチゲンに対する患者のＨＬＡ種のマッチングは、ＮｅｔＭＨＣ以外のシステムを使用して行うことができることを理解すべきであり、適切なシステムとして、ＮｅｔＭＨＣ  ＩＩ、ＮｅｔＭＨＣｐａｎ、ＩＥＤＢ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（ＵＲＬ  ｉｍｍｕｎｅｅｐｉｔｏｐｅ．ｏｒｇ）、ＲａｎｋＰｅｐ、ＰＲＥＤＥＰ、ＳＶＭＨＣ、Ｅｐｉｐｒｅｄｉｃｔ、ＨＬＡＢｉｎｄｉｎｇ、およびその他（たとえばＪ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１１；３７４：１−４を参照）が挙げられる。最も高い親和性を計算する際に、変更されたアミノ酸の位置が移動しているネオアンチゲン配列の集合（上記を参照）を使用できることにも留意されたい。あるいはまたはさらに、発現したネオアンチゲンの患者のＨＬＡ種に対する結合をさらに増大させるためにＮ末端および／またはＣ末端の修飾を付加することにより、ネオアンチゲンに対する修飾が、実施され得る。よってネオアンチゲンは、同定された際の天然のものであるか、または特定のＨＬＡ種とより良好に一致するようにさらに修飾されたものであってもよい。
【００３８】
さらに、望ましい場合、対応する野生型の配列（すなわちアミノ酸の変化を有さないネオアンチゲン配列）の結合性を、著しく差次的な親和性を確保するために計算することができる。たとえば、ネオアンチゲンとその対応する野生型の配列との間のＭＨＣの結合において特に好ましい著しく差次的な親和性は、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍などである。
【００３９】
次に、同定した疾患に関連する抗原をコードするヌクレオチド配列を、微生物（たとえば細菌、酵母など）またはウイルスで発現できるように、カセットに挿入し、特異的なプロモーター（たとえば細菌に特異的なプロモーター、酵母に特異的なプロモーター、ウイルスに特異的なプロモーターなど）を有するベクターにクローニングすることができる。タンパク質を発現するための任意の適切なベクターが使用できるが、少なくとも１ｋ、好ましくは２ｋ、より好ましくは５ｋの塩基対の大きさのカセットを有し得るベクターが好ましい。最も好ましくは、同じカセットを有する、異なる組み換え型の実体の作製を容易にするために、異なるベクターにサブクローニングできるカセットが企図されている。たとえば、患者のオミクス解析が、一定数の適切な（ネオ）アンチゲンを明らかにした場合、適切な調節エレメント（たとえばプロモーター、５’−ＵＴＲ、３’−ＵＴＥ、ｐｏｌｙＡ）が各発現系（たとえば細菌、酵母、ウイルス）の個々の発現ベクターにより供給され得るため、この調節エレメントを伴わない（ネオ）アンチゲンをコードする組み換え型配列カセットが、構築され得る。
【００４０】
一部の実施形態では、ヌクレオチドカセットは、ポリトープ抗原をコードするように、同じプロモーターの下流に２つ以上の疾患に関連する抗原のヌクレオチド配列を含む。本明細書中使用される場合、ポリトープは、１つのポリペプチドとして発現する２つ以上の抗原のタンデムアレイを表す。好ましくは、２つ以上の疾患に関連する抗原は、リンカーまたはスペーサーのペプチドにより分けられている。リンカーまたはスペーサーに関して、任意の適切な長さおよび順序のペプチド配列が使用され得る。しかしながら、リンカーペプチドの長さは、３〜３０アミノ酸、好ましくは５〜２０アミノ酸、より好ましくは５〜１５アミノ酸であることが好ましい。また本発明者らは、グリシンリッチ配列（たとえばｇｌｙ−ｇｌｙ−ｓｅｒ−ｇｌｙ−ｇｌｙなど）が、２つの抗原の間にポリトープの可動性を提供するために好ましいことを企図している。
【００４１】
２つ以上の疾患に関連する抗原は、同じＭＨＣサブタイプ（たとえばＭＨＣクラスＩのサブタイプまたはＭＨＣクラスＩＩのサブタイプ）に対して高親和性のバインダーであることが好ましい。よってこれら実施形態では、カセットは、ＭＨＣクラスＩのサブタイプまたはＭＨＣクラスＩＩのサブタイプによる提示を目的とする抗原に関する輸送シグナルのヌクレオチド配列を含み得る。最も好ましい態様では、シグナルペプチドが、エンドソームおよびリソソームの区画へネオアンチゲンを輸送する（およびＭＨＣ−ＩＩに向けてネオアンチゲンの提示を方向づけることを伴う）ため、または細胞質の空間に保持する（およびＭＨＣ−Ｉに向けてネオアンチゲンの提示を方向づけることを伴う）ために、使用され得る。たとえば、このペプチドがエンドソームおよびリソソームの区画に運ばれる場合、標的化プレ配列および内部の標的化したペプチドを使用することができる。
【００４２】
標的化したペプチドのプレ配列は、好ましくはＮ末端に付加されており、塩基性および疎水性の６〜１３６アミノ酸を含む。ペルオキシソームの標的化の場合、標的化配列は、Ｃ末端にあり得る。他のシグナル（たとえばシグナルパッチ）が、使用されてもよく、ペプチド配列において別々にある配列エレメントを含み得、適切なペプチドのフォールディングの後に機能的となり得る。さらに、グリコシル化のようなタンパク質の修飾が、標的化を誘導し得る。他の適切な標的化シグナルのうち、本発明者らは、ＰＴＳ１（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌ  １）、Ｃ末端のトリペプチド、およびＮ末端の近くに位置するノナペプチドであるＰＴＳ２（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌ  ２）を企図している。さらに、エンドソームおよびリソソームに対するタンパク質の選別はまた、通常短い直鎖状の配列を含む、タンパク質の細胞質ドメインの中のシグナルにより媒介され得る。一部のシグナルは、チロシンベースの選別シグナル（ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ｓｏｒｔｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌ）と呼ばれており、ＮＰＸＹまたはＹＸＸＯのコンセンサスなモチーフに即している。ジロイシンベースのシグナルとして知られている他のシグナルは、［ＤＥ］ＸＸＸＬ［ＬＩ］またはＤＸＸＬＬのコンセンサスなモチーフに適合している。これらシグナルの全ては、膜の細胞質側の面と末梢で結合しているタンパク質のコートの構成要素により、認識される。ＹＸＸＯおよび［ＤＥ］ＸＸＸＬ［ＬＩ］のシグナルは、アダプタータンパク質（ＡＰ）複合体ＡＰ−１、ＡＰ−２、ＡＰ−３、およびＡＰ−４により特徴的な細かな特異性で認識され、対してＤＸＸＬＬシグナルは、ＧＧＡとして知られている別のアダプターのファミリーにより認識される。また、液胞タンパク質の選別およびエンドソームの機能に関連している、ＦＹＶＥドメインが付加され得る。さらなる態様では、エンドソームの区画はまた、ヒトのＣＤ１のｔａｉｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ（たとえばＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  １２２，  ５２２−５３１参照）を使用して標的化され得る。
【００４３】
細胞質の区画への輸送または保持は、必ずしも１つ以上の特定の配列エレメントを必要としなくてもよい。しかしながら、少なくとも一部の態様では、膜にアンカリングされたタンパク質または膜にアンカリングされたタンパク質の膜アンカードメインを含む、Ｎ末端またはＣ末端の細胞質の保持シグナルが付加され得る。たとえば、膜にアンカリングされたタンパク質として、ＳＮＡＰ−２５、シンタキシン、シナプトプレビン（ｓｙｎａｐｔｏｐｒｅｖｉｎ）、シナプトタグミン、ＶＡＭＰ（ｖｅｓｉｃｌｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、シナプス小胞糖タンパク質（ＳＶ２）、高親和性コリン輸送体、ニューレキシン、電位開口型カルシウムチャネル、アセチルコリンエステラーゼ、およびＮＯＴＣＨが挙げられる。
【００４４】
さらに企図した本発明の主題の態様では、本発明者らはまた、組み換え型核酸が、免疫応答をさらにブーストするための非患者の抗原をさらにコードし得ることを企図している。あるいは、非患者の抗原はまた、細菌のゲノムにコードされ得る。最も好ましくは、さらなるタンパク質は、様々なＴＬＲリガンドおよび／またはＮＯＤリガンドを含む。たとえば、様々なペプチドグリカンおよびＴＬＲ２受容体に関するリポタンパク質、ＴＬＲ５受容体に関するフラゲリンなどがある。
【００４５】
本発明者らは、局所的または全身的に免疫応答を誘発するために、ｉｎ  ｖｉｖｏで疾患に関連する抗原を発現するための迅速かつ簡便なビヒクルとして細菌を使用できることを見出した。その迅速な増殖（たとえば１回の完全な細胞周期が２０分以内である）および誘導（たとえばＩＰＴＧでのｌａｃプロモーター誘導など）後のタンパク質の過剰発現に関して最適化された多くの菌株の利用可能性のため、好ましい細菌の１つは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。さらに、細菌のほぼ全ては、全般的に、命に関わる可能性のある敗血症（たとえばＣＤ１４介在型敗血症）を患者にもたらし得る、有意な免疫応答を誘発し内毒素応答を引き起こすリポ多糖を発現するため、ほとんどの細菌株は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの投与（たとえば注射、血流への導入、または臓器もしくは組織への移植）に適切ではないとみなされてきた。よって、特に好ましい細菌株は、ヒトの身体に導入する際に、急性炎症性エンドトキシン応答またはＣＤ１４介在型敗血症性ショックを引き起こすには十分ではない低いレベルでエンドトキシンを発現する遺伝子改変細菌に基づいている。たとえば、急性炎症性エンドトキシン応答は、悪寒、筋痛、頭痛、吐き気、および／または光感受性を含む主観的な応答、ならびに心拍数の増加、体温の上昇、収縮期血圧の低下などの様々な定量可能なデータにより、同定され得る。しかしながら、最も典型的には、急性炎症性エンドトキシン応答またはＣＤ１４介在型敗血症性ショックの病態は、特にＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、ＧＲＯ−α、ＭＩＰ−２、およびＣＸＣＬ１を含む様々なサイトカインおよびケモカインを決定する、ＥＬＩＳＡまたは他の試験により、測定され得る（また、Ｂｌｏｏｄ．  １９９６  Ｊｕｎ  １５；８７（１２）：５０５１−６０；またはＣｌｉｎ  Ｄｉａｇｎ  Ｌａｂ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００５  Ｊａｎ；  １２（１）：  ６０−６７をも参照されたい）。
【００４６】
異なる観点からみると、好ましい遺伝子改変細菌は、リポ多糖またはその前駆体の生合成に必要であるタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１つの改変または欠失を有する。特に、欠失または改変に適した遺伝子は、当該分野で報告されているものを含む（たとえばＰＬｏＳ  ＯＮＥ  １０（４）：ｅ０１２１２１６；またはＡｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２０１４，  Ｖｏｌ．  ８３：９９−１２８；またはＡｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２００２；  ７１：  ６３５−７００）。
【００４７】
たとえば、改変したリポ多糖を伴う１つの例示的な細菌株は、市販の菌株のＣｌｅａｒＣｏｌｉ（登録商標）ＢＬ２１（ＤＥ３）のエレクトロコンピテントセル（ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ）である。この細菌株は、遺伝子型Ｆ−ｏｍｐＴ  ｈｓｄＳＢ（ｒＢ−  ｍＢ−）ｇａｌ  ｄｃｍ  ｌｏｎ  λ（ＤＥ３［ｌａｃＩ  ｌａｃＵＶ５−Ｔ７  ｇｅｎｅ  １  ｉｎｄ１  ｓａｍ７  ｎｉｎ５］）ｍｓｂＡ１４８  ΔｇｕｔＱΔｋｄｓＤ  ΔｌｐｘＬΔｌｐｘＭΔｐａｇＰΔｌｐｘＰ  ΔｅｐｔＡを有するＢＬ２１である。ここで、いくつかの特定の欠失変異（ΔｇｕｔＱ  ΔｋｄｓＤ  ΔｌｐｘＬ  ΔｌｐｘＭΔｐａｇＰΔｌｐｘＰΔｅｐｔＡ）が、ＬＰＳのＬｉｐｉｄ  ＩＶＡへの修正に必要なタンパク質をコードしており、１つのさらなる代償変異（ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｎｇ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）（ｍｓｂＡ１４８）が、ＬＰＳ前駆体のｌｉｐｉｄ  ＩＶＡの存在下で細胞にバイアビリティを維持させることができることを理解されたい。これら変異は、ＬＰＳ由来のオリゴ糖鎖の欠失をもたらす。より具体的には、６個のアシル鎖のうちの２つが欠失する。ＬＰＳの６個のアシル鎖は、ミエロイド系分化因子２（ＭＤ−２）と複合体形成したＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）により認識されるトリガーであり、ＮＦ−κＢの活性化および炎症誘発性サイトカインの産生を引き起こす。Ｌｉｐｉｄ  ＩＶＡは、４個のアシル鎖のみを含み、ＴＬＲ４により認識されず、よって内毒素応答を引き起こさない。エレクトロコンピテントであるＢＬ２１細菌が例として提供されているが、本発明者らは、遺伝子改変細菌が化学的にコンピテントな細菌でもあり得ることを企図している。
【００４８】
さらなる別の例では、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株はまた、ｌｐｘＬ遺伝子の変異（および他の場合では欠失）を介して改変され、これにより、上述の市販のＬＰＳ欠失菌株の炎症性プロファイルを著しく欠いた有意に単純化されたＥ．ｃｏｌｉ菌株がもたらされた。当然、この改変は、アンチセンスＲＮＡの点変異、欠失、挿入、発現などによってもたらされ得ることを理解されたい。よって、他の選択肢の中でも、リポ多糖の生合成に必要とされる１つ以上のタンパク質をコードする、改変または欠失される遺伝子として、特に、ｇｕｔＱ遺伝子、ｋｄｓＤ遺伝子、ｌｐｘＡ遺伝子、ｌｐｘＬ遺伝子、ｌｐｘＭ遺伝子、ｐａｇＰ遺伝子、ｌｐｘＰ遺伝子、およびｅｐｔＡ遺伝子が挙げられる。ＬＰＳが低減しているかまたはＬＰＳフリーなグラム陰性細菌を産生させるためのさらなる適切なプロトコルおよび方法は、国際特許公開公報第９８／５３８５１号、米国特許第８３０３９６４号、同７０１１８３６号、および米国特許公開公報第２００５／０１０６１８４号に記載されている。
【００４９】
あるいは、本発明者らはまた、患者自身の内共生細菌を、少なくとも局所的に免疫応答を誘発するようにｉｎ  ｖｉｖｏにおいて疾患に関連する抗原を発現させるためのビヒクルとして使用できることを企図している。本明細書中使用される場合、患者の内共生細菌は、患者の健康状態にかかわらず、実質的な免疫応答を全く引き起こすことなく患者の身体に存在する細菌を表す。よって、患者の内共生細菌は、患者の正常なフローラであることが企図されている。たとえば、患者の内共生細菌は、一般にヒトの皮膚、歯周ポケット、腸、または胃で見出され得る大腸菌、乳酸桿菌、プロピオン酸菌、およびレンサ球菌を含み得る。これら実施形態では、患者自身の内共生細菌は、腸、胃、口腔粘膜、もしくは結膜の一部由来の患者の生検サンプルから、または糞便サンプルで得ることができる。次に、患者の内共生細菌を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養し、疾患に関連する抗原をコードするヌクレオチドを用いて形質転換させることができる。
【００５０】
よって、本明細書中提示される方法で使用される細菌は、ＬＰＳを産生する菌株由来であり得ること、またはＴＬＲ、特にＴＬＲ４により認識されるＬＰＳの形成をもたらす１つ以上の酵素の発現を低減もしくは抑制させるように遺伝子操作されていることを理解されたい。最も典型的には、このような細菌は、免疫療法のために少なくとも１つの疾患に関連する抗原を誘導可能な方法で発現するように遺伝子改変される。選択肢の中でも特に、発現の誘導は、通常哺乳類では見いだされない合成化合物（たとえばＩＰＴＧ、置換型ベンゼン、シクロヘキサノン関連化合物）もしくは哺乳類に天然に存在する化合物（たとえば糖（１−アラビノース、１−ラムノース、キシロース、およびスクロースを含む）、ε−カプロラクタム、プロピオン酸塩、もしくはペプチド）を用いて行われてもよく、または誘導は、１つ以上の環境上の要因（たとえば温度または酸素感受性プロモーター）の制御下にあってもよい。
【００５１】
さらなる別の態様では、本発明の主題は、免疫療法のための疾患に関連する抗原を発現する遺伝子操作した細菌を作製する方法を含む。概して、本方法は、上述の疾患に関連する抗原を同定するステップで開始する。好ましくは、疾患に関連する抗原は、腫瘍抗原（腫瘍に特異的な抗原、または腫瘍関連抗原）であり、より好ましくは、患者に特異的な腫瘍のネオアンチゲンである。疾患に関連する抗原が同定された後、次に、同定した疾患に関連する抗原をコードするヌクレオチド配列を、カセットに挿入し、特異的なプロモーター（たとえば誘導可能なプロモーターなど）を有するベクターにクローニングして、細菌で発現させることができる。次に、このヌクレオチド配列は、遺伝子改変細菌（たとえば、ＣｌｅａｒＣｏｌｉ（登録商標）ＢＬ２１（ＤＥ３）のエレクトロコンピテントセルもしくはヒトの身体に導入する際にＣＤ１４介在型敗血症を誘導するには不十分なエンドトキシンレベルを発現する他のいずれかの種類のコンピテントな細菌）、または、任意選択で上述のように形質転換する前にｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養した患者自身の内共生細菌にトランスフェクトされる。
【００５２】
さらに、抗原を発現する細菌細胞全体が全般的に好ましいが、分解した細菌またはその一部も適切とみなされることを理解されたい。たとえば、組み換え型細菌の培養後に、細菌が、細胞を断片化する分解プロトコルに供される場合があることが企図されている。たとえば、適切なプロトコルは、超音波処理、浸透圧ショック、フレンチプレスによる溶解、溶媒ベースの溶解などの、浸透圧による分解、酵素による分解、化学的な分解、および／または物理的な分解などを含む。一部の実施形態では、ライセートの全体がワクチン製剤に使用されるが、同様に、ライセートが、１つ以上の成分を除去するためにさらに処理され得ることが企図されている。たとえば、ライセートは、１つ以上の親油性の成分を除去するために有機溶媒で抽出されてもよく、分子量の閾値を超えるかまたは閾値未満である成分を除去または単離するために分子ふるいに通すなどしてもよい。望ましい場合、（処理された）ライセートはまた、たとえば凍結乾燥、噴霧乾燥などにより、水を除去するように処理されてもよい。
【００５３】
また容易に理解されるように、組み換え型細菌またはその一部は、細胞で発現されるものと同じであり得るかまたは異なるものであり得る、さらなる抗原と組み合わされてもよい。同様に、追加的なＴＬＲおよび／またはＮＯＤのリガンド、ならびに免疫刺激性サイトカインまたは類縁体（たとえばＡＬＴ−８０３）が、免疫刺激作用をさらに増大させるために、組み換え型細菌またはその一部に添加され得る。
【００５４】
よって、本発明者らは、１つ以上の疾患に関連する抗原を発現する遺伝子操作した細菌（またはその一部）が、当該遺伝子操作した細菌をヒトの身体に投与することにより免疫療法に使用できることを企図している。まとめると、遺伝子操作した細菌は、１）改変したリポ多糖を発現する遺伝子操作した細菌（ヒトの身体に導入する際に、ヒトの細胞で内毒素応答を引き起こさないために十分に低いレベルまたはＣＤ１４介在型敗血症を誘導するには不十分なレベルで、エンドトキシンを発現する）、および２）上述の患者自身の内共生細菌の両方を表す。よって、さらなる別の本発明の主題は、１つ以上の疾患に関連する抗原を発現する遺伝子操作した細菌を使用する免疫療法を使用して患者を処置する方法を含む。この方法は、上述の疾患に関連する抗原を同定するステップで開始する。好ましくは、ヒトの疾患に関連する抗原は、腫瘍抗原（腫瘍に特異的な抗原または腫瘍関連抗原）であり、より好ましくは患者に特異的な腫瘍のネオアンチゲンである。疾患に関連する抗原が同定された後、次に、同定した疾患に関連する抗原をコードするヌクレオチド配列を、カセットに挿入し、特異的なプロモーター（たとえば誘導可能なプロモーターなど）を有するベクターにクローニングして、細菌で発現させることができる。次に、このヌクレオチド配列は、遺伝子改変細菌（たとえばＣｌｅａｒＣｏｌｉ（登録商標）ＢＬ２１（ＤＥ３）のエレクトロコンピテントセル、ヒトの身体に導入する際にＣＤ１４介在型敗血症を誘導するには不十分な低いエンドトキシンレベルを発現する他の種類のコンピテントな細菌）、または、任意選択で上述のように形質転換する前にｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養した患者自身の内共生細菌に形質転換される。
【００５５】
次に、遺伝子操作した細菌を患者に投与することができる。投与の目的に応じて、適切な投与方法のいずれかが使用され得る。たとえば、遺伝子操作した細菌は、局所的に免疫応答を誘導するために、患者に投与され得る。よって、細菌は、限定するものではないが、腫瘍内注射、筋肉内注射、皮内注射、脳内（ｉｎｔｒａｃｅｌｅｂｒａｌ）注射、および脳室内注射を含む局所注射を介して、投与され得る。また細菌は、局所的適用、吸入、舌下投与、または経粘膜投与を含む局所的適用を介して、投与され得る。他の例では、遺伝子操作した細菌は、全身的に免疫応答を誘導するために、患者に投与され得る。このシナリオでは、細菌は、皮下注射または静脈内注射を介して投与され得る。
【００５６】
一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌は、微生物の過剰増殖および／または細菌自体からもたらされる潜在的な副作用もしくは毒性を予防するために、患者への投与の前に放射線照射され得る。たとえば、ガンマ線、Ｘ線、および電子線を使用した照射といった、任意の適切な放射線照射の方法が使用され得る。任意選択で、患者への投与の前に遺伝子操作した細菌のバイタリティを確認するために、細胞培養試験を放射線照射後に行うことができる。
【００５７】
さらに本発明者らは、遺伝子操作した細菌が、他の遺伝子操作した微生物または実体と組み合わせて使用され得ることを企図している。よって、本発明の主題のさらなる別の態様は、疾患に関連する抗原（通常は同物質または抗原の重複するセット）を発現する２つ以上の異なる遺伝子操作した実体（たとえば細菌、酵母、およびウイルスから選択される）を使用する免疫療法を使用して患者を処置する方法を含む。この方法は、上述の疾患に関連する抗原を同定するステップで開示する。好ましくは、疾患に関連する抗原は、腫瘍抗原（腫瘍に特異的な抗原または腫瘍関連抗原）であり、より好ましくは患者に特異的な腫瘍のネオアンチゲンである。疾患に関連する抗原が同定された後、次に、同定した疾患に関連する抗原をコードするヌクレオチド配列を、カセットに挿入し、特異的なプロモーター（たとえば細菌に特異的なプロモーター、酵母に特異的なプロモーター、ウイルスに特異的なプロモーターなど）を有するベクターにクローニングすることにより、微生物（たとえば細菌、酵母など）またはウイルスで発現させることができる。タンパク質を発現するために任意の適切なベクターが使用され得るが、少なくとも１ｋ、好ましくは２ｋ、より好ましくは５ｋの塩基対の大きさのカセットを有し得るベクターが好ましい。
【００５８】
２つの異なる遺伝子改変した実体は、免疫療法の緊急性および２つ以上の免疫療法処置の間に必要とされる時間に基づき、選択され得る。遺伝子改変細菌を作製し疾患に関連する抗原を発現させるように誘導するためには全般的に数日間かかり、遺伝子改変酵母を作製し疾患に関連する抗原を発現させるように誘導するためには全般的に１〜２週間以上かかることが企図されている。ウイルスの種類に応じて変動し得るが、必要量の遺伝子改変ウイルスを作製させるためには、全般的に１ケ月以上かかる。よって、免疫療法が火急に必要とされている場合、２つの異なる遺伝子改変した実体は、好ましくは、遺伝子改変細菌および遺伝子改変ウイルスである。しかしながら、２つの異なる遺伝子改変した実体は、遺伝子改変細菌および遺伝子改変酵母、または遺伝子改変酵母および遺伝子改変ウイルスであり得ることが企図されている。ここで繰り返しになるが、まとめると、遺伝子操作した細菌は、１）ヒトの身体に導入する際に、ヒトの細胞で内毒素応答を引き起こさないために十分に低いレベルまたはＣＤ１４介在型敗血症を誘導するには不十分なレベルでエンドトキシンを発現する、改変したリポ多糖を発現する遺伝子操作した細菌、および２）上述の患者自身の内共生細菌の両方を表す。
【００５９】
２つの異なる遺伝子改変した実体が選択され作製される場合、遺伝子改変した実体は、２つの異なる別々の免疫応答を誘導するために、異なる時点で別々に患者に投与される。たとえば、２つの異なる遺伝子改変した実体が遺伝子改変細菌および遺伝子改変ウイルスである場合、まず、遺伝子改変細菌（第１の実体）が、第１の免疫応答を誘導するために患者に投与され、第２に（ｆｉｒｓｔ）、遺伝子改変ウイルス（第２の実体）が、第２の免疫応答を誘導するように患者に投与されることが好ましい。第２の実体の投与は、第１の実体の投与の少なくとも１週間後、好ましくは少なくとも２週間後、より好ましくは少なくとも４週間後に投与されることが企図されている。
【００６０】
一部の実施形態では、第１の実体および第２の実体の投与は、２つの異なる投与経路を介して行われる。任意の適切な経路が、各実体に対して選択され得る。例示的な投与経路として、限定するものではないが、皮下注射、静脈内注射、腫瘍内注射、筋肉内注射、皮内注射、脳内（ｉｎｔｒａｃｅｌｅｂｒａｌ）注射、脳室内注射、経口投与、局所的適用、吸入、舌下投与、および経粘膜投与が挙げられる。たとえば、２つの異なる遺伝子改変した実体が遺伝子改変細菌および遺伝子改変ウイルスである場合、遺伝子改変細菌は、全身的な注射（たとえば皮下注射、静脈内注射など）を介して投与され得、遺伝子改変ウイルスは、吸入を介して投与され得る。他の例では、２つの異なる遺伝子改変した実体が遺伝子改変細菌および遺伝子改変酵母である場合、遺伝子改変細菌は、局所注射（たとえば腫瘍内注射、筋肉内注射、皮内注射、脳内注射、脳室内注射など）を介して投与され得、遺伝子改変酵母は、経口投与を介して投与され得る。
【００６１】
第１の実体および第２の実体の投与が２つの別々であり独立した免疫応答を誘導し得る場合、２つの免疫応答はまた、免疫系により大きな効果を提供するように関連していることが企図されている。よってこの実施形態では、第１の遺伝子操作した実体の投与は、患者にプライム免疫応答を誘導するプライム投与であり、第２の遺伝子操作した実体の投与は、ブースト投与である。ここで、ブースト投与は、第１の実体のプライム投与後に、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも５０％免疫応答を増大させることが好ましい。さらに、本明細書中企図される細菌性ワクチン組成物は、潜在的に残存する急性炎症性エンドトキシン応答を低減するために、国際特許公開公報第１９９３０１６７２０号に記載されるように、フルオロカーボンエマルジョンで投与され得ることに留意されたい。
【００６２】
さらに企図した態様では、ネオエピトープを発現する大腸菌または他の適切な遺伝子改変細菌は、発現したネオエピトープに対する既存の免疫性を患者が有するかどうかを決定するためのスクリーンとして、使用され得る。このようなスクリーンは、単純に、遺伝子改変細菌を患者の樹状細胞（ＡＰＣ）に添加することにより行うことができる。次に、これら細胞を、同患者由来のＴ細胞（たとえば末梢血または腫瘍浸潤リンパ細胞から単離したＴ細胞）とさらに組み合わせた後、Ｔ細胞による免疫応答を、ｐ６５モデルシステムに関する以下でさらに記載されるような方法で測定する。応答性Ｔ細胞が検出可能な場合、この応答を誘導するネオエピトープが、ワクチンで優先される（ＤＮＡ、細菌、酵母、および／またはウイルスのワクチンであり得る）。当然、エンドトキシンの発現または提示が低減している遺伝子操作した細菌が特に好ましいが、組み換え型細菌は、必ずしもエンドトキシンの発現または提示を低減する必要がないことを理解されたい。
【００６３】
最後に、本明細書中企図されている抗原は、特にヒトおよび哺乳類の抗原を含むことに留意されたい。しかしながら、細菌の抗原およびウイルスの抗原などの他の多くの抗原も、本明細書中での使用に適切であるとみなされる。よって、感染症、寄生、または癌性疾患に関連するすべての抗原が、特に企図されている。
【００６４】
実施例
遺伝子操作した細菌は、患者へ投与する前に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて免疫応答を誘発する効率を決定するために試験され得る。任意の適切な試験が使用され得るが、本発明者らは、遺伝子操作した細菌への曝露後の、患者由来の免疫細胞によるかまたは患者のＨＬＡが一致した樹状細胞、マクロファージ、末梢血単核球（ＰＢＭＣ；Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）を含む）によるサイトカイン放出を検出するｉｎ  ｖｉｔｒｏでのアッセイを企図している。図１に示すように、異なる種類のサイトカインが、さらなる免疫応答を誘発するように、Ｔ細胞、樹状細胞、または他の種類の抗原提示細胞などの様々な免疫細胞から放出される。よって、培養したＴ細胞または樹状細胞は、所定の時間（たとえば少なくとも５分間、少なくとも１０分間、少なくとも３０分間など）の間、生きているかまたは放射線照射された所定の量の遺伝子操作した細菌に曝露され得ることが企図されている。よって、放出されるサイトカインの種類、濃度、または絶対量を、培養したＴ細胞または樹状細胞の容器から上清を回収することにより、決定および定量化することができる。図２は、免疫細胞からのサイトカインの放出を定量的および定性的に検出するために使用できる検出方法（細胞毒素結合ビーズ）の特異度の例を描いている。さらに、遺伝子操作した細菌の毒性は、免疫細胞の死亡率を評価するかまたは免疫細胞の何等かの形態の変化を決定することにより、測定することができる。
【００６５】
本明細書中提示される組成物および方法の適合性を証明するために、本発明者らは、ｐｐ６５タンパク質を、当該抗原が、通常ヒトのサイトメガロウイルス（通常先進工業国の人々の６０〜７０％に感染する）に以前に感染した多数の個体で見いだされるため、モデル抗原として使用した。
【００６６】
この目的のために、本発明者らは、ｌａｃプロモーターと、抗原としての切断可能または切断不能なユニキチン（ｕｎｉｑｕｉｔｉｎ）−ＰＰ６５融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含むプラスミド構築物を作製した。ｐｐ６５タンパク質（６５ｋＤａのｌｏｗｅｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ、糖タンパク質６４またはＵＬ８３としても知られている）は、サイトメガロウイルスに対するＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の応答の免疫優性標的である。曝露後に、ｐｐ６５に特異的なＴ細胞は、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、およびＴＮＦ−αなどのサイトカインを優先的に産生する。このプラスミド構築物で、ＢＬ−２１細菌を形質転換し、タンパク質発現を、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加により誘導した。特段記載がない限り、ＢＬ２１細胞は、遺伝子改変した市販のＣｌｅａｒＣｏｌｉ  ＢＬ２１細胞（Ｌｕｃｉｇｅｎ，  ２９０５  Ｐａｒｍｅｎｔｅｒ  Ｓｔ，  Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ，  ＷＩ  ５３５６２）であった。図３および図４に示すように、本発明者らは、天然のタンパク質（図３）または切断可能もしくは切断不能なユビキチン化したバージョン（図４）の際に、約７８Ｋｄａの大きさのバンドで示されるＢＬ−２１細胞のｐｐ６５抗原の発現の誘導に成功することができた（グリコシル化による分子量の明らかなアップシフト）。
【００６７】
さらなる実験では、本発明者らは、モデル抗原（ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のリンタンパク質ｐｐ６５（ｐｐ６５））を発現する遺伝子操作した細菌を使用し、この細菌を、ｐｐ６５応答性Ｔ細胞の活性化のために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてヒトの樹状細胞に添加できることを示した。このＴ細胞は、ＣＭＶに対して免疫を有することが知られているヒトの対象に由来している。特に、細菌によりコードされたタンパク質に対する応答は、外来のｐｐ６５タンパク質を単に添加した場合の応答よりも実質的に強く、細菌がより効率的に抗原処理機構へ抗原を送達することおよび／または細菌が自然免疫を刺激することにより抗原提示細胞をより強力にすることを表した。
【００６８】
より具体的には、ＣｌｅａｒＣｏｌｉ  ＢＬ−２１細菌により産生される抗原としてのｐｐ６５タンパク質を使用して、本発明者らは、ベクター単独への応答（すなわちｐｐ６５発現がない）または精製した可溶性のｐｐ６５タンパク質への応答と、ｐｐ６５を発現するＣｌｅａｒＣｏｌｉ  ＢＬ−２１細菌への曝露の後の免疫細胞の応答を比較した。図５Ａは、ｐｐ６５発現細菌への曝露後のＴ細胞による免疫応答の強度を表すヒートマップを示し、図５Ｂは、ｐｐ６５発現細菌への曝露後の樹状細胞単独による免疫応答の強度を表すヒートマップを示す。図５Ａに示されるように、樹状細胞と同時培養したＴ細胞に対する可溶性ｐｐ６５への曝露は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、およびＩＦＮ−ｇの放出をもたらす強力な免疫応答を誘導した。このような強力な免疫応答は、樹状細胞を伴わない場合であっても、共刺激分子（ＣＤ３／ＣＤ２８）の同時発現で観察することができた。同様の強力な免疫応答はまた、ｐｐ−６５を発現するＢＬ−２１細菌（曝露前に放射線照射した細菌または生きた細菌）へＴ細胞を曝露することにより誘導することができた。このような強力な免疫応答は、図５Ｂに示されるように、樹状細胞のみでは観察できず、ｐｐ−６５を発現するＣｌｅａｒＣｏｌｉ  ＢＬ−２１細菌により誘導される免疫応答が、Ｔ細胞介在型応答であることを表している。これらの実験の結果を、図６および図７（図５Ａに対応）ならびに図８（図５Ｂに対応）において、定量的な解析の棒グラフとして再度示す。これら結果は、疾患に関連する抗原を発現するＣｌｅａｒＣｏｌｉ  ＢＬ−２１細菌が、免疫細胞へ曝露する抗原を送達するためおよび免疫細胞による抗原特異的な免疫応答を誘発するための有効なツールであり得ることを強く表している。
【００６９】
次に、本発明者らはさらに、所定の量の可溶性ｐｐ−６５タンパク質に相当する量でｐｐ−６５を発現するＣｌｅａｒＣｏｌｉ  ＢＬ−２１細菌による免疫応答の強度（サイトカインの放出により定量化される）を解析した。図９Ａおよび９Ｂは、放射線照射したかまたは生きている、ｐｐ−６５を発現するＣｌｅａｒＣｏｌｉ  ＢＬ−２１細菌が、Ｔ細胞介在型免疫応答を誘導し、免疫応答の強度は、ＣｌｅａｒＣｏｌｉ  ＢＬ−２１によるｐｐ−６５の発現の量とほぼ線形に相関していることを示している。さらに本発明者らは、ｐｐ−６５を発現するＣｌｅａｒＣｏｌｉ  ＢＬ−２１細菌への曝露が、同等の量の可溶性ｐｐ−６５単独への曝露（アスタリスクにより示される）よりも実質的に強い免疫応答を誘導することを見出した。よって、ヒトの疾患に関連する抗原を発現する遺伝子操作した細菌は、免疫の認識に関する様々な抗原を送達するための迅速かつ調節可能な系とすることができる。
【００７０】
さらに、この細菌は、様々なｔｏｌｌ様受容体リガンド（ＴＬＲ）、細菌のフラゲリン（ＴＬＲ５に関するリガンド）、および、ＭＨＣクラスＩペプチドの抗原提示を促進するリステリア由来のタンパク質である、リステリオリジンＯ（ｌｌｏ）を含む１つ以上の追加的な免疫調節性の刺激を発現するように、さらに遺伝子改変され得ることを理解されたい。様々な細胞（Ｔ細胞、ＰＢＭＣ）のｐ６５および／またはフラゲリンへの組みあわせた曝露および個別の曝露からの結果を、図１２に示す。
【００７１】
さらに本発明者らは、遺伝子改変細胞（ここではＣｌｅａｒＣｏｌｉ）におけるＬＰＳの欠如が、細菌のＬＰＳ成分に対する有害な免疫応答を実際に防止するかどうかを試験した。この目的のため、本発明者らは、ＬＰＳ＋およびＬＰＳ−のＢＬ２１−ＰＰ６５産生細胞へ曝露した免疫コンピテントセル（Ｈｅｔ、ＣＤ４、ＣＤ８）の様々な細胞集団で選択したサイトカインを測定した。図１０Ａ〜１０Ｅは、ＬＰＳ＋およびＬＰＳ−のＢＬ２１−ＰＰ６５細胞へ曝露した細胞集団における選択したサイトカインのレベルを比較した例示的な結果を示している。ここでは、上記と同じ抗原送達ベクターを使用し、選択したサイトカインに関する結果は、細菌培養物（μｌ）および細菌の細胞タンパク質（ｍｇ／ｍｌ）の関数として示されている。容易にわかるように、ＬＰＳ＋細胞は、ほとんどの場合で、有意なサイトカイン反応を誘発したのに対し、ＬＰＳ−細胞は、サイトカイン応答を誘発しないか、または控えめにのみ誘発した。たとえば、ＩＬ−６（炎症誘発性）反応は、図１０Ｄから明らかであるように、有意にそれほど顕著ではなかった。しかしながら、ＬＰＳ−細胞が全般的に好ましいが、ＬＰＳ＋細胞もまた、本明細書中の使用に適切であるとみなされる（たとえば、ＬＰＳ産生が低減している場合および／または炎症誘発性サイトカイン応答を低減もしくは無効にする医薬（たとえば、ノボビオシン）が同時に提供される場合）ことに留意されたい。
【００７２】
遺伝子改変細胞におけるさらなる免疫の刺激の発現が実行可能であるかを調査するために、本発明者らは、ＴＬＲ５リガンドに関するモデルとして、組み換え発現したフラゲリンを使用した。組み換え発現したフラゲリンまたは純正のフラゲリンに対するＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＴＬＲ５細胞の反応を、図１１に表す。容易に明らかであるように、組み換え発現したフラゲリンは、レポーター細胞において強力かつ有意な反応を誘発した。ＰＭＢＣおよびＴ細胞におけるフラゲリンおよびｐ６５の同時発現および個別の発現に対する反応を行わせ、この反応を、インターフェロンγの分泌を測定してモニタリングした。結果を図１２に示す。
【００７３】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける実施例：ｉｎ  ｖｉｖｏでのモデル系として、本発明者らは、ポリトープとして配置された複数の既知のメラノーマネオエピトープをコードする核酸でトランスフェクトした、組み換え型であり弱毒化したＢＬ２１  Ｅ．Ｃｏｌｉ（ＣｌｅａｒＣｏｌｉ）を使用する。このように産生した組み換え型細胞を、皮下ワクチンとして使用して、当該分野でよく知られているＸｅｎｏｇｒａｆｔマウスモデルにおいてＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞の増殖に対するワクチンの防御作用を確認する。播種の前に、Ｂ１６／Ｆ１０細胞は、１０％のＦＢＳ、１％のＰｅｎＳｔｒｅｐ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  １５１４０１２２）、１％のＬ−グルタミン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ２５０３００８１）を補充したＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  １０３１３０３９）で増殖させる。
【００７４】
組み換え型細菌性ワクチンの投与は、図１３に概略的に表すように、腫瘍移植の６週間前、４週間前、および２週間前である。処置は、上述のタイムラインでの処置および注射を行わないことを含む適切な対照を伴う。ワクチン投与は皮下投与であり、以下の表により詳細に示されるように、様々な用量を使用する。
【表１】
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【００７５】
４１日目（図１３参照）に、血液を、各処置グループから回収し、Ｆｉｃｏｌｌによる分離に供し、ＰＢＭＣを、後述のようにｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激する。４２日目に、マウスに、表に示す細胞数を使用して１００マイクロリットルのＰＢＳに懸濁したメラノーマ細胞を注射した。腫瘍移植の７日後から、腫瘍および体重の測定を、１週間に２回、１日おきに、電子マイクロカリパスを用いて行う。体重の減少が２０％を超える場合および／または腫瘍が潰瘍を生じるかもしくは２５００ｍｍ３より大きい場合に、マウスを屠殺する。エンドポイントは、腫瘍の成長／生存、体重、および血液中の免疫応答である。
【００７６】
抗原検証アッセイは、標準的なプロトコルに従う。簡潔に述べると、単離したＰＢＭＣを、１００μｌのＲＰＭＩ培地中２００Ｋ細胞／ウェルで、９６ウェルのｕ底型プレートに載置する。細胞を、１ｍＭの保存液由来の適切な抗原ペプチドと共に、５％のＣＯ２下、３７℃で２４時間インキュベートする。次に細胞に回転をかけ、解析のため上清を回収する。
【００７７】
さらなる実施形態
実施形態１．ヒトの疾患に関連する抗原を発現する遺伝子操作した細菌を含む医薬組成物であって、前記細菌が、リポ多糖の生合成に必要であるタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１つの改変または欠失を有する、医薬組成物。
【００７８】
実施形態２．前記ヒトの疾患に関連する抗原が、患者に特異的である、実施形態１に記載の組成物。
【００７９】
実施形態３．前記ヒトの疾患に関連する抗原が、腫瘍抗原である、実施形態１または２に記載の組成物。
【００８０】
実施形態４．前記ヒトの疾患に関連する抗原が、腫瘍関連抗原、腫瘍に特異的な抗原、ならびに腫瘍および患者に特異的なネオアンチゲンから選択される、実施形態３に記載の組成物。
【００８１】
実施形態５．前記遺伝子操作した細菌が、少なくとも１つの他のヒトの疾患に関連する抗原を発現し、好ましくは前記ヒトの疾患に関連する抗原が、ポリトープとして発現し、任意選択で前記ポリトープが、抗原の間にペプチドスペーサーを含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の組成物。
【００８２】
実施形態６．前記抗原が、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩのサブタイプまたは少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩのサブタイプによる提示を目的とする抗原に関する輸送シグナルをさらに含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の組成物。
【００８３】
実施形態７．前記ヒトの疾患に関連する抗原が、前記患者のＨＬＡ種の少なくとも１つのＭＨＣクラスＩのサブタイプまたは少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩのサブタイプに対して高親和性のバインダーである、先行する実施形態のいずれか１つに記載の組成物。
【００８４】
実施形態８．前記細菌が大腸菌である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の組成物。
【００８５】
実施形態９．前記遺伝子操作した細菌が、ＣＤ１４介在型敗血症を誘導するには不十分であるレベルでエンドトキシンを発現する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の組成物。
【００８６】
実施形態１０．前記組み換え型核酸が、共刺激分子をコードする配列およびチェックポイント阻害剤をコードする配列のうちの少なくとも１つをさらに含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の組成物。
【００８７】
実施形態１１．患者を処置するための医薬組成物であって、前記患者の内共生細菌を含み、前記細菌が、前記患者の疾患に関連する抗原を発現するように遺伝子操作されている、医薬組成物。
【００８８】
実施形態１２．前記内共生細菌が、リポ多糖の生合成に必要であるタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１つの改変または欠失を有するようにさらに遺伝子改変されている、実施形態１１に記載の組成物。
【００８９】
実施形態１３．前記疾患に関連する抗原が、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、腫瘍に特異的な抗原、ならびに腫瘍および患者に特異的なネオアンチゲンから選択される、実施形態１１または１２に記載の組成物。
【００９０】
実施形態１４．前記遺伝子操作した細菌が、少なくとも１つの他の疾患に関連する抗原を発現し、好ましくは前記疾患に関連する抗原がポリトープとして発現し、任意選択で、前記ポリトープが、抗原の間にペプチドスペーサーを含む、実施形態１１〜１３のいずれか１つに記載の組成物。
【００９１】
実施形態１５．（ａ）〜（ｄ）のうちのいずれか１つ以上が真である、実施形態１１〜１４のいずれか１つに記載の組成物：（ａ）前記抗原が、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩのサブタイプまたは少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩのサブタイプによる提示を目的とする抗原に関する輸送シグナルをさらに含む；（ｂ）前記疾患に関連する抗原が、前記患者のＨＬＡ種の少なくとも１つのＭＨＣクラスＩのサブタイプまたは少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩのサブタイプに対して高親和性のバインダーである；（ｃ）前記内共生細菌が大腸菌である；および（ｄ）前記組み換え型核酸が、共刺激分子をコードする配列およびチェックポイント阻害剤をコードする配列のうちの少なくとも１つをさらに含む。
【００９２】
実施形態１６．免疫療法を使用して患者を処置するため、または細菌性ワクチンを製造するための、先行する実施形態のいずれか１つに記載の組成物の使用。
【００９３】
全ての実施形態は、ヒトの疾患に関連する抗原を記載しているが、これらの実施形態は同様に、非ヒト、特に哺乳類の疾患に関連する抗原にも適用することに留意されたい。
【００９４】
一部の実施形態では、本発明の特定の実施形態を説明および請求するために使用される、成分、濃度などの特性、反応条件などの量を表現する数は、場合により用語「約」によって修飾されることを理解されたい。よって、一部の実施形態では、記載された説明および添付の特許請求の範囲に記載される数値パラメータは、特定の実施形態により得られると考えられる望ましい特性に応じて変動し得る近似値である。本明細書中の値の範囲の記載は、単に、当該範囲内にある各別々の値を個別に表す省略方法として作用することが意図されている。本明細書中他の記載がない限り、各個々の値は、本明細書中個別に記載されているかのように、本明細書に組み込まれている。本明細書中記載される全ての方法は、本明細書中他が記載されていないかまたは文脈と明らかに矛盾していない限り、任意の適切な順序で行われ得る。本明細書中の特定の実施形態に関して提供されるあらゆる例の使用または例示的な言語（たとえば「など（ｓｕｃｈ  ａｓ）」）は、単に、本発明を良好に明らかにするように意図されており、他で請求される発明の範囲に限定を課してはいない。本明細書中の言語は、本発明の実務に必須であるいずれかの請求されていない構成要素を表すと解釈されるべきではない。
【００９５】
本明細書中の記載および続く特許請求の範囲にわたり使用される場合、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」の意味は、文脈が他の意味を明記しない限り、複数形の言及を含む。また本明細書中の記載に使用される場合、「ｉｎ」の意味は、文脈が他の意味を明記しない限り、「ｉｎ」および「ｏｎ」を含む。また本明細書中使用される場合、文脈が他の意味を記載しない限り、用語「〜に結合する（ｃｏｕｐｌｅｄ  ｔｏ）」は、直接的なカップリング（互いに結合する２つの要素が互いに接触する）および間接的なカップリング（少なくとも１つの追加的な要素が２つの要素の間に位置している）の両方を含むように意図されている。よって、用語「ｃｏｕｐｌｅｄ  ｔｏ」および「ｃｏｕｐｌｅｄ  ｗｉｔｈ」は、同意語として使用される。
【００９６】
前述の記載に加えより多くの修正が、本明細書中の発明の概念から逸脱することなく可能であることは、当業者に明らかである。よって本発明の主題は、添付の特許請求の範囲を除き、限定されるべきではない。さらに、本明細書および特許請求の範囲の両方を解釈する際に、全ての用語は、文脈と一致する可能な限り最も広い方法で解釈されるべきである。特に、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、言及される要素、構成要素、またはステップが存在するかもしくは利用することができるか、または、明らかに言及されていない他の要素、構成要素、もしくはステップと組み合わせることができることを表す非排他的な方法で、要素、構成要素、またはステップを表すと解釈すべきである。本明細書、特許請求の範囲が、Ａ、Ｂ、Ｃ、．．．およびＮからなる群から選択される何等かのうちの少なくとも１つを表す場合、このテキストは、Ａ＋ＮまたはＢ＋Ｎなどではなく、この群から選択される１つのみの要素を必要とすると解釈すべきである。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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