(57)【要約】本明細書において提供されるのは、例として、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を利用した、オトフェルリンを発現させるための方法および組成物である。かかる方法および組成物は、難聴、常染色体劣性９（ＤＦＮＢ９）などの疾患の処置のために有用であり得る。
2020518268.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞においてオトフェルリンの発現を増加させる方法であって：
細胞を、第１のポリヌクレオチドを含む第１のＡＡＶ粒子に接触させること;および
細胞を、第２のポリヌクレオチドを含む第２のＡＡＶ粒子に接触させること、を含み、ここで、
（ｉ）第１のポリヌクレオチドは、５’から３’へ向かって：
（ａ）プロモーター、
（ｂ）オトフェルリンポリペプチドのＮ末端部分をコードする部分コード配列、
（ｃ）スプライスドナー部位、および
（ｄ）第２のポリヌクレオチドにおける配列と相同な配列を含有する第１の相同の領域、
を含有する発現カセットに隣接する逆方向末端反復配列を含み、および
（ｉｉ）第２のポリヌクレオチドは、５’から３’へ向かって：
（ａ）第１のポリヌクレオチドにおける配列と相同な配列を含有する第２の相同の領域、
（ｂ）スプライスアクセプター部位、
（ｃ）オトフェルリンポリペプチドのＣ末端部分をコードする部分コード配列、および
（ｄ）ポリアデニル化（ｐＡ）シグナル配列、
を含有する発現カセットに隣接する逆方向末端反復配列を含む、前記方法。
【請求項２】
第１および第２のポリヌクレオチドにおける相同の領域が、５０〜５００ヌクレオチドの間である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１および第２のポリヌクレオチドにおける相同の領域が、５０〜３００ヌクレオチドの間である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
相同の領域が、配列番号３のヌクレオチド配列を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
プロモーターが、キメラＣＭＶβアクチン（ｓｍｃＢＡ）プロモーターである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
プロモーターが、配列番号４の配列を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
オトフェルリンポリペプチドが、配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
スプライスドナー部位が、配列番号７の配列を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
スプライスアクセプター部位が、配列番号８の配列を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
逆方向末端反復配列が、ＡＡＶ２逆方向末端反復配列である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
第１および第２のＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ２血清型粒子である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
細胞が、ex vivoである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
細胞が、in vivoである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
細胞が、哺乳動物対象中にある、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
対象が、難聴、常染色体劣性９（ＤＦＮＢ９）を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
第１のポリヌクレオチドを含む第１のＡＡＶ粒子；および
第２のポリヌクレオチドを含む第２のＡＡＶ粒子
を含み、ここで、
（ｉ）第１のポリヌクレオチドは、５’から３’へ向かって：
（ａ）プロモーター、
（ｂ）オトフェルリンポリペプチドのＮ末端部分をコードする部分コード配列、
（ｃ）スプライスドナー部位、および
（ｄ）第２のポリヌクレオチドにおける配列と相同な配列を含有する第１の相同の領域、
を含有する発現カセットに隣接する、逆方向末端反復配列を含み、および
（ｉｉ）第２のポリヌクレオチドは、５’から３’へ向かって：
（ａ）第１のポリヌクレオチドにおける配列と相同な配列を含有する第２の相同の領域、
（ｂ）スプライスアクセプター部位、
（ｃ）オトフェルリンポリペプチドのＣ末端部分をコードする部分コード配列、および
（ｄ）ポリアデニル化（ｐＡ）シグナル配列、
を含有する発現カセットに隣接する、逆方向末端反復配列を含む、組成物。
【請求項１７】
第１および第２のポリヌクレオチドにおける相同の領域が、５０〜５００ヌクレオチドの間である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
第１および第２のポリヌクレオチドにおける相同の領域が、５０〜３００ヌクレオチドの間である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
相同の領域が、配列番号３のヌクレオチド配列を含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
プロモーターが、キメラＣＭＶβアクチン（ｓｍｃＢＡ）プロモーターである、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
プロモーターが、配列番号４の配列を含む、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
オトフェルリンポリペプチドが、配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列を含む、請求項１６〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
スプライスドナー部位が、配列番号7の配列を含む、請求項１６〜２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
スプライスアクセプター部位が、配列番号８の配列を含む、請求項１６〜２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
逆方向末端反復配列が、ＡＡＶ２逆方向末端反復配列である、請求項１６〜２４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
第１および第２のＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ２血清型粒子である、請求項１６〜２５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７】
薬学的に許容し得る担体をさらに含む、請求項１６〜２６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８】
請求項１６〜２７のいずれか一項に記載の組成物を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１７年５月５日に出願された米国仮特許出願番号６２／５０２，４６２への優先権を主張し、その全開示が参照により本明細書に組み込まれる。
連邦政府による資金提供を受けた研究
この発明は、国立衛生研究所によって授与された認可番号ＥＹ０００３３１、ＥＹ０２１７２１、およびＤＣ０１２１１８の下、政府の支援によりなされた。政府は発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
非症候性難聴は、一般的に内耳および／または中耳の欠陥または損傷によって引き起こされる聴力喪失の型である。タンパク質オトフェルリンをコードするＯＴＯＦ遺伝子における突然変異は、「難聴、常染色体劣性９（ＤＦＮＢ９）」と呼ばれる非症候性難聴のタイプを引き起こすと考えられる。ＤＦＮＢ９および他の類似した形の難聴の処置は、現在、重症または重度の聴力喪失のための蝸牛移植、およびより軽症型の聴力喪失のための補聴器を使用することが関与するものである。聴力を復元させるための電子デバイスに頼らないかまたは頼る度合いが少ない代替的な処置の形へのニーズが残っている。
【発明の概要】
【０００３】
本明細書において提供されるのは、オトフェルリンを、例として、細胞または対象中において、発現させるための組成物および方法である。本明細書に記載のとおり、ＯＴＯＦ ｃＤＮＡの異なる部分を含有する二重（dual）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）系を介した、ＯＴＯＦノックアウトマウスへのＯＴＯＦ ｃＤＮＡの送達は、マウスの聴力を野生型のレベル近くまでレスキューする能力があったということが見出されている。
【０００４】
いくつかの側面において、本開示は、細胞においてオトフェルリンの発現を増加させる方法に関し、方法は、細胞を、第１のポリヌクレオチドを含む第１のＡＡＶ粒子に接触させること；および、細胞を、第２のポリヌクレオチドを含む第２のＡＡＶ粒子に接触させること、を含み、ここで、第１のポリヌクレオチドは、５’から３’へ向かって：（ａ）プロモーター、（ｂ）オトフェルリンポリペプチドのＮ末端部分をコードする部分コード配列、（ｃ）スプライスドナー部位、および（ｄ）第２のポリヌクレオチドにおける配列と相同な配列を含有する第１の相同の領域、を含有する発現カセットに隣接する逆方向末端反復配列を含み、第２のポリヌクレオチドは、５’から３’へ向かって：（ａ）第１のポリヌクレオチドにおける配列と相同な配列を含有する第２の相同の領域、（ｂ）スプライスアクセプター部位、（ｃ）オトフェルリンポリペプチドのＣ末端部分をコードする部分コード配列、および（ｄ）ポリアデニル化（ｐＡ）シグナル配列、を含有する発現カセットに隣接する逆方向末端反復配列を含む。
【０００５】
いくつかの態様において、第１および第２のポリヌクレオチドにおける相同の領域は、５０〜５００ヌクレオチドの間である。いくつかの態様において、第１および第２のポリヌクレオチドにおける相同の領域は、５０〜３００ヌクレオチドの間であるいくつかの態様において、相同の領域は、配列番号３のヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、プロモーターは、キメラＣＭＶβアクチン（ｓｍｃＢＡ）プロモーターである。いくつかの態様において、プロモーターは、配列番号４の配列を含む。いくつかの態様において、オトフェルリンポリペプチドは、配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、スプライスドナー部位は、配列番号７の配列を含む。いくつかの態様において、スプライスアクセプター部位は、配列番号８の配列を含む。いくつかの態様において、逆方向末端反復配列は、ＡＡＶ２逆方向末端反復配列である。いくつかの態様において、第１および第２のＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２血清型粒子である。いくつかの態様において、細胞は、ex vivoである。いくつかの態様において、細胞は、in vivoである。いくつかの態様において、細胞は、哺乳動物対象中にある。いくつかの態様において、対象は、難聴、常染色体劣性９（ＤＦＮＢ９）を有する。
【０００６】
他の側面において、本開示は、第１のポリヌクレオチドを含む第１のＡＡＶ粒子；および第２のポリヌクレオチドを含む第２のＡＡＶ粒子、を含む組成物を提供し、ここで、第１のポリヌクレオチドは、５’から３’へ向かって：（ａ）プロモーター、（ｂ）オトフェルリンポリペプチドのＮ末端部分をコードする部分コード配列、（ｃ）スプライスドナー部位、および（ｄ）第２のポリヌクレオチドにおける配列と相同な配列を含有する第１の相同の領域、を含有する発現カセットに隣接する逆方向末端反復配列を含み、第２のポリヌクレオチドは、５’から３’へ向かって：（ａ）第１のポリヌクレオチドにおける配列と相同な配列を含有する第２の相同の領域、（ｂ）スプライスアクセプター部位、（ｃ）オトフェルリンポリペプチドのＣ末端部分をコードする部分コード配列、および（ｄ）ポリアデニル化（ｐＡ）シグナル配列、を含有する発現カセットに隣接する逆方向末端反復配列を含む。
【０００７】
いくつかの態様において、第１および第２のポリヌクレオチドにおける相同の領域は、５０〜５００ヌクレオチドの間である。いくつかの態様において、第１および第２のポリヌクレオチドにおける相同の領域は、５０〜３００ヌクレオチドの間である。いくつかの態様において、相同の領域は、配列番号３のヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、プロモーターは、キメラＣＭＶβアクチン（ｓｍｃＢＡ）プロモーターである。いくつかの態様において、プロモーターは、配列番号４の配列を含む。いくつかの態様において、オトフェルリンポリペプチドは、配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、スプライスドナー部位は、配列番号７の配列を含む。いくつかの態様において、スプライスアクセプター部位は、配列番号８の配列を含む。いくつかの態様において、逆方向末端反復配列は、ＡＡＶ２逆方向末端反復配列である。いくつかの態様において、第１および第２のＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２血清型粒子である。いくつかの態様において、組成物は、薬学的に許容し得る担体をさらに含む。
【０００８】
さらにまた他の側面において、本開示は、本明細書に記載のとおりの組成物を含むか、または本明細書に記載のとおりの第１のＡＡＶ粒子および本明細書に記載のとおりの第２のＡＡＶ粒子を含む、キットを提供する。
これらおよび他の側面は、本明細書において、より詳細に記載される。
【０００９】
図面の簡単な説明
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、および、これらの図面の１つ以上と本明細書に提示された具体的な実施形態の詳細な記載を組み合わせて参考にすることによってより良く理解されることができる、本開示のある側面を、さらに実証するために包含される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】図１Ａは、ＣＭＶエンハンサー、ニワトリベータアクチンプロモーター、マウスオトフェルリンｃＤＮＡの５’区間（オトフェルリンＮＴ）、スプライスドナー配列（ＡＰＳＤ）、および組み換えのための相同配列（ＡＰｈｅａｄ）、に隣接するＡＡＶ２逆方向末端反復（ＴＲ）を含有する、プラスミドのマップである。
【図１Ｂ】図１Ｂは、組み換えのための相同配列（ＡＰｈｅａｄ）、スプライスアクセプター配列（ＡＰＳＡ）、マウスオトフェルリンｃＤＮＡの３’区間（オトフェルリンＣＴ）、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｂＧＨポリＡ）、に隣接するＡＡＶ２逆方向末端反復（ＴＲ）を含有する、プラスミドのマップである。
【図２】図２は、図１Ａおよび１Ｂにおけるプラスミド中の２つの発現カセットの概略である。
【００１１】
【図３Ａ−１】図３Ａは、図１Ａにおけるプラスミドについての、逆方向末端反復（ＴＲ）を包含する、発現カセットのアノテーションされた配列を示す。
【図３Ａ−２】図３Ａは、図１Ａにおけるプラスミドについての、逆方向末端反復（ＴＲ）を包含する、発現カセットのアノテーションされた配列を示す。
【図３Ａ−３】図３Ａは、図１Ａにおけるプラスミドについての、逆方向末端反復（ＴＲ）を包含する、発現カセットのアノテーションされた配列を示す。
【図３Ｂ−１】図３Ｂは、図１Ｂにおけるプラスミドについての、逆方向末端反復（ＴＲ）を包含する、発現カセットのアノテーションされた配列を示す。
【図３Ｂ−２】図３Ｂは、図１Ｂにおけるプラスミドについての、逆方向末端反復（ＴＲ）を包含する、発現カセットのアノテーションされた配列を示す。
【図３Ｂ−３】図３Ｂは、図１Ｂにおけるプラスミドについての、逆方向末端反復（ＴＲ）を包含する、発現カセットのアノテーションされた配列を示す。
【００１２】
【図４】図４は、ＡＡＶ２−ＯＴＯＦ−ＮＴ（ＡＡＶ−ＮＴ）、またはＡＡＶ２−ＯＴＯＦ−ＮＴおよびＡＡＶ２−ＯＴＯＦ−ＣＴ（ＡＡＶ２−ＮＴ＋ＣＴ）で処置されたHEK 293細胞中のＯＴＯＦタンパク質の発現を示す一連の写真である。
【図５】図５は、ＡＡＶ２−ＧＦＰで処置された野生型マウスからの蝸牛のコルチ器官の表面プレパレーション（surface preparations）におけるＧＦＰの発現を示す一連の写真である。
【図６Ａ−６Ｂ】図６Ａ〜Ｄは、Ｐ１〜Ｐ３マウスの蝸牛におけるＯＴＯＦ発現を示す一連の写真およびグラフである。図６Ａは、中回転（mid-turn）におけるＯＴＯＦタンパク質の発現を示す。図６Ｂは、頂（apex）におけるＯＴＯＦタンパク質の発現を示す。
【図６Ｃ−６Ｄ】図６Ｃは、野生型マウス（ＷＴ、ｎ＝６）とＡＡＶ２−ＯＴＯＦ−ＮＴおよびＡＡＶ２−ＯＴＯＦ−ＣＴで処置されたＯＴＯＦノックアウトマウス（Res. ＫＯ ＮＴ＋ＣＴ、ｎ＝６）とにおける、基底（base）、中回転および頂におけるＯＴＯＦ発現の違いを示す。棒の各対における左の棒はＷＴであり、棒の各対における右の棒はRes. ＫＯ ＮＴ＋ＣＴである。図６Ｄは、野生型（ＷＴ）、ＯＴＯＦノックアウトマウス（ＫＯ）、ならびにＡＡＶ２−ＯＴＯＦ−ＮＴおよびＡＡＶ２−ＯＴＯＦ−ＣＴで処置されたＯＴＯＦノックアウトマウス（Res. ＫＯ）におけるＯＴＯＦ ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲを示す。
【００１３】
【図７Ａ】図７Ａ〜Ｄは、マウスにおける聴力評価を示す。図７Ａは、野生型マウス（ＷＴ）、未処置のもの（ＫＯ／ＫＯ ＮＴ）かまたはＡＡＶ２−ＯＴＯＦ−ＮＴおよびＡＡＶ２−ＯＴＯＦ−ＣＴで処置されたもの（レスキューされたＫＯ）のいずれかであるＯＴＯＦノックアウトマウスにおける、聴性刺激により誘導された聴性脳幹反応（ＡＢＲ）パターンのトレースである。
【図７Ｂ】図７Ｂは、野生型マウス（ＷＴ）、未処置のオトフェルリンノックアウトマウス（ＫＯ）、ＡＡＶ２−ＯＴＯＦ−ＮＴおよびＡＡＶ２−ＯＴＯＦ−ＣＴで処置されたオトフェルリンノックアウトマウス（Res ＫＯ ＮＴ＋ＣＴ）、ならびにＡＡＶ２−ＯＴＯＦ−ＮＴで処置されたオトフェルリンノックアウトマウス（ＫＯ ＋ＮＴ）における聴性脳幹反応（ＡＢＲ）閾値を示す。
【図７Ｃ】図７Ｃ は、野生型マウス（ＷＴ）、未処置のＯＴＯＦノックアウトマウス（ＫＯ）、ＡＡＶ２−ＯＴＯＦ−ＮＴおよびＡＡＶ２−ＯＴＯＦ−ＣＴで処置されたオトフェルリンノックアウトマウス（レスキューされたＫＯ ＮＴ＋ＣＴ）、ならびにＡＡＶ２−ＯＴＯＦ−ＮＴで処置されたオトフェルリンノックアウトマウス（ＫＯＮＴ）における聴力回復の経時変化を示す。
【図７Ｄ】図７Ｄは、野生型マウス（ＷＴ）、未処置のオトフェルリンノックアウトマウス（ＫＯ）、ＡＡＶ２−ＯＴＯＦ−ＮＴおよびＡＡＶ２−ＯＴＯＦ−ＣＴで処置されたオトフェルリンノックアウトマウス（Res. ＫＯ（ＮＴ＋ＣＴ））、ならびにＡＡＶ２−ＯＴＯＦ−ＮＴで処置されたオトフェルリンノックアウトマウス（ＫＯ＋ＮＴ）におけるクリックＡＢＲ閾値を示す。
【００１４】
【図８Ａ−８Ｂ】図８ＡおよびＢは、ＯＴＯＦレスキューされたＫＯマウス内有毛細胞におけるオトフェルリンタンパク質発現を示す。図８Ａは、Ｐ１２およびそれよりも高齢の、ＡＡＶ２−ＯＴＯＦ−ＮＴおよびＡＡＶ２−ＯＴＯＦ−ＣＴで処置されたマウスにおける、ＯＴＯＦタンパク質発現を示す。図８Ｂは、野生型マウス（ＷＴ、ｎ＝５）、ならびにＡＡＶ２−ＯＴＯＦ−ＮＴおよびＡＡＶ２−ＯＴＯＦ−ＣＴで処置されたＯＴＯＦノックアウトマウス（レスキューされたＫＯ、ｎ＝５）における、ＯＴＯＦを発現している内有毛細胞の割合を示す。棒の各対における左の棒はＷＴであり、棒の各対における右の棒はレスキューされたＫＯである。
【図９Ａ−９Ｂ】図９Ａおよび９Ｂは、聴力評価を示す一連のグラフである。図９Ａは、野生型マウス（ＷＴ）、ＯＴＯＦノックアウトマウス（ＫＯ）、ならびにＡＡＶ２−ＯＴＯＦ−ＮＴおよびＡＡＶ２−ＯＴＯＦ−ＣＴで処置されたＯＴＯＦノックアウトマウス（レスキューされたＫＯ）におけるＡＢＲ閾値の数値を示す。図９Ｂは、ＷＴ、ＫＯおよびレスキューされたＫＯマウスにおける聴力の寿命を示す。
【図１０】図１０は、ＣＭＶエンハンサー、ニワトリベータアクチンプロモーター、ヒトオトフェルリンｃＤＮＡの５’区間（オトフェルリンＮＴ）、スプライスドナー配列（ＡＰＳＤ）、および組み換えのための相同配列（ＡＰｈｅａｄ）、に隣接するＡＡＶ２逆方向末端反復（ＴＲ）を含有する、プラスミドのマップである。
【図１１】図１１は、組み換えのための相同配列（ＡＰｈｅａｄ）、スプライスアクセプター配列（ＡＰＳＡ）、オトフェルリン１のアイソフォームをコードするヒトオトフェルリンｃＤＮＡの３’区間（オトフェルリンＣＴ）、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｂＧＨポリＡ）、に隣接するＡＡＶ２逆方向末端反復（ＴＲ）を含有する、プラスミドのマップである。
【００１５】
【図１２】図１２は、組み換えのための相同配列（ＡＰｈｅａｄ）、スプライスアクセプター配列（ＡＰＳＡ）、オトフェルリン５のアイソフォームをコードするマウスオトフェルリンｃＤＮＡの３’区間（オトフェルリンＣＴ）、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｂＧＨポリＡ）、に隣接するＡＡＶ２逆方向末端反復（ＴＲ）を含有する、プラスミドのマップである。
【図１３−１】図１３は、図１０におけるプラスミドについての、逆方向末端反復（ＴＲ）を包含する、ヒトＯＴＯＦ Ｎ末端発現カセットのアノテーションされた配列を示す。
【図１３−２】図１３は、図１０におけるプラスミドについての、逆方向末端反復（ＴＲ）を包含する、ヒトＯＴＯＦ Ｎ末端発現カセットのアノテーションされた配列を示す。
【図１３−３】図１３は、図１０におけるプラスミドについての、逆方向末端反復（ＴＲ）を包含する、ヒトＯＴＯＦ Ｎ末端発現カセットのアノテーションされた配列を示す。
【００１６】
【図１４−１】図１４は、図１１におけるプラスミドについての、逆方向末端反復（ＴＲ）を包含する、アイソフォーム１のためのヒトＯＴＯＦ Ｃ末端発現カセットのアノテーションされた配列を示す。
【図１４−２】図１４は、図１１におけるプラスミドについての、逆方向末端反復（ＴＲ）を包含する、アイソフォーム１のためのヒトＯＴＯＦ Ｃ末端発現カセットのアノテーションされた配列を示す。
【図１４−３】図１４は、図１１におけるプラスミドについての、逆方向末端反復（ＴＲ）を包含する、アイソフォーム１のためのヒトＯＴＯＦ Ｃ末端発現カセットのアノテーションされた配列を示す。
【図１５−１】図１５は、図１２におけるプラスミドについての、逆方向末端反復（ＴＲ）を包含する、アイソフォーム５のためのヒトＯＴＯＦ Ｃ末端発現カセットのアノテーションされた配列を示す。
【図１５−２】図１５は、図１２におけるプラスミドについての、逆方向末端反復（ＴＲ）を包含する、アイソフォーム５のためのヒトＯＴＯＦ Ｃ末端発現カセットのアノテーションされた配列を示す。
【図１５−３】図１５は、図１２におけるプラスミドについての、逆方向末端反復（ＴＲ）を包含する、アイソフォーム５のためのヒトＯＴＯＦ Ｃ末端発現カセットのアノテーションされた配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
発明の詳細な記載
本明細書に記載のとおり、オトフェルリンノックアウトマウスにおける聴力を、１つがＯＴＯＦ ｃＤＮＡの５’部分を含み、および、１つがＯＴＯＦ ｃＤＮＡの３’部分を含み、および、各々がin vivoにおける５’部分と３’部分との間の相同的組み換えを促進するための相同の領域を含む、２つの別々のＡＡＶ粒子で、マウスを処置することによって、回復させることができるということが見出されている。この相同の領域には、ＯＴＯＦ ｃＤＮＡの５’部分内の５’側にあるスプライスドナー配列、およびＯＴＯＦ ｃＤＮＡの３’部分内の３’側にあるスプライスアクセプター配列が隣接している。したがって、組成物および方法は、オトフェルリンの発現を増加させるために提供される。
【００１８】
例示の定義
別様に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する分野の当業者により通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載の方法および材料と類似のまたは同等のあらゆる方法および材料を、本発明の実施または試験のために使用することができるが、好ましい方法および材料が本明細書に記載される。本発明の目的のために、以下の用語は、下記に定義される：
【００１９】
本明細書で使用される用語「核酸」および「ポリヌクレオチド配列」は、一本鎖型または二本鎖型のいずれかにおける、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指し、および、別様に限定されない限り、自然発生のヌクレオチドと同じように機能することができる天然のヌクレオチドの知られているアナログを網羅する。
【００２０】
用語「実質的に〜に対応する」、「実質的に相同」、または「実質的に同一」は、本明細書で使用されるとき、選択された核酸またはアミノ酸配列が、選択された参照核酸配列または参照アミノ酸配列の配列と比較すると、少なくとも約７０もしくは約７５パーセントの配列同一性を有するという、核酸またはアミノ酸配列の特徴を指し示す。より典型的には、選択された配列と参照配列とが、少なくとも約７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４または８５パーセントもの配列同一性を有し、および、より好ましくは、少なくとも約８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、または９５パーセントの配列同一性を有する。なおもより好ましくは、高度に相同な配列は、しばしば、選択された配列とそれが比較される参照配列との間で少なくとも約９６、９７、９８、または９９パーセントよりも、大きな配列同一性を共有する。
【００２１】
配列同一性の割合は、比較される配列の全体の長さにわたって算出されてもよいし、または、選ばれた参照配列の約２５パーセントくらいよりも合計が少ない小さな欠失または不可を除外することにより算出されてもよい。参照配列は、遺伝子もしくは隣接配列の部分、または染色体の反復部分などの、より大きな配列のサブセットであってもよい。しかしながら、２つ以上のポリヌクレオチド配列の配列相同性の場合、参照配列は、典型的には、少なくとも約１８〜２５ヌクレオチド、より典型的には２６〜３５ヌクレオチド、および、なおもより典型的には、少なくとも約４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００くらいものヌクレオチドを含む。
【００２２】
高度に相同なフラグメントが望ましいとき、２つの配列の間のパーセント同一性の程度は、例として、PearsonおよびLipmanによって記載されたＦＡＳＴＡプログラム分析などの、当業者に周知である１つ以上の配列比較アルゴリズムによって容易に決定されるとおり、少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、およびより好ましくは約９０％または９５％、またはそれより高いものであり得る。
【００２３】
ポリヌクレオチド
いくつかの側面において、ポリヌクレオチドは、オトフェルリンタンパク質をコードするＯＴＯＦ遺伝子のコード配列の部分を細胞へ送達するために提供される。いくつかの態様において、コード配列は、ヒトＯＴＯＦ遺伝子に由来する（例として、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：9381およびｃＤＮＡ配列 NM_001287489.1、NM_004802.3、NM_194248.2、NM_194322.2、およびNM_194323.2を参照）。いくつかの態様において、コード配列は、マウスＯＴＯＦ遺伝子に由来する（例として、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ 83762およびｃＤＮＡ配列 NM_001100395.1、NM_001286421.1、NM_001313767.1、およびNM_031875.2を参照）。いくつかの態様において、第１および第２のポリヌクレオチドが提供される。「第１」、「第２」、「第３」等は、別様に明示的に述べられていない限り、特定の順序または重要性を暗示することを意味するものではないということが理解されるべきである。
【００２４】
いくつかの態様において、第１のポリヌクレオチドは、５’から３’へ向かって、（ａ）プロモーター、（ｂ）オトフェルリンポリペプチドのＮ末端部分をコードする部分コード配列、（ｃ）スプライスドナー部位、および（ｄ）第２のポリヌクレオチドにおける配列と相同な配列を含有する第１の相同の領域、の１つ以上を含有する、発現カセットに隣接する、逆方向末端反復配列を含む。いくつかの態様において、第１のポリヌクレオチドは、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）の少なくとも２つ、少なくとも３つ、または４つ全てを含む。
【００２５】
いくつかの態様において、第２のポリヌクレオチドは、５’から３’へ向かって、（ａ）第１のポリヌクレオチドにおける配列と相同な配列を含有する第２の相同の領域 第２の相同の領域、（ｂ）スプライスアクセプター部位、（ｃ）オトフェルリンポリペプチドのＣ末端部分をコードする部分コード配列、および（ｄ）ポリアデニル化（ｐＡ）シグナル配列、の１つ以上を含有する、発現カセットに隣接する、逆方向末端反復配列を含む。いくつかの態様において、第２のポリヌクレオチドは、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）の少なくとも２つ、少なくとも３つ、または４つ全てを含む。
【００２６】
本明細書に記載のポリヌクレオチドの内に含有される部分コード配列は、ポリヌクレオチドが送達されると部分コード配列が、例として、相同的組み換えを通して、一緒になって繋ぎ合わされ、およびオトフェルリンポリペプチドをコードする完全コード配列を形成するように、設計され得る。
【００２７】
いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは、プラスミド（例として、複製の起点、選択可能なマーカー、およびレポーター遺伝子の１つ以上を含む環状核酸）である。いくつかの態様において、プラスミドなどの、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、マーカーまたはレポーター遺伝子、例として、LacZまたは蛍光タンパク質、および、複製の起点をもまた、含有してもよい。いくつかの態様において、プラスミドは、プラスミド内に含有された発現カセットを含有するＡＡＶ粒子を生産するプロデューサー細胞中へと、トランスフェクトされる。
【００２８】
いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどの核酸ベクターである。本開示による有用である例示のＡＡＶ核酸ベクターは、一本鎖（ｓｓ）または自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶ核酸ベクターを包含する。
【００２９】
いくつかの態様において、組換えＡＡＶ粒子は、一本鎖（ｓｓ）または自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶ核酸ベクターなどのポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載のとおりの発現コンストラクト、および、発現コンストラクトに隣接する逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列（例として、野生型ＩＴＲ配列または人工的に作り出されたＩＴＲ配列）を、含有する。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは、ウイルスカプシドによってカプシド化されている。
【００３０】
したがって、いくつかの態様において、ＡＡＶ粒子は、ウイルスカプシド、および、ウイルスカプシドによってカプシド化された本明細書に記載のとおりのポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、ウイルスカプシドは、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３を含む６０のカプシドタンパク質サブユニットを含む。いくつかの態様において、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３サブユニットは、それぞれ、およそ１：１：１０の比率でカプシド中に存在する。
【００３１】
いくつかの態様において、本明細書に記載のとおりのポリヌクレオチド（例として、第１および第２のポリヌクレオチド）は、相同の領域を、例として、ひとたび細胞へ送達されるとポリヌクレオチド間の相同的組み換えを促進するために、含んでいる（例として、Ghosh et al. Efficient transgene reconstitution with hybrid dual AAV vectors carrying the minimized bridging sequences.  Hum Gene Ther. 2011 Jan;22(1):77-83を参照）。いくつかの態様において、第１の相同の領域および第２の相同の領域は、相同的組み換えを促進するための互いとの配列同一性の閾値レベルを有する。いくつかの態様において、第１の相同の領域は、第２の相同の領域と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を有する。
【００３２】
別様に特定しない限り、本明細書で使用されパーセント配列同一性および／または２つの配列の類似度は、KarlinおよびAltschul (1990)のアルゴリズムの、KarlinおよびAltschul (1993)におけるとおりに改変されたものを使用して決定することができる。かかるアルゴリズムは、Altschul et al. (1990)のNBLASTおよびXBLASTプログラム中へと組み込まれている。BLASTサーチは、所望のパーセント配列同一性を有する配列を得るために、NBLASTプログラム、score＝100、wordlength＝12にて行うことができる。比較の目的のためにギャップを考慮したアラインメントを得るためには、Gapped BLASTを、記載されているとおり使用することができる（Altschul et al., 1997）。BLASTおよびGapped BLASTを利用する場合には、それぞれのプログラム（NBLASTおよびXBLAST）のデフォルトのパラメータを、公開されている方法に従って使用することができる。いくつかの態様において、各々の相同の領域は、独立して、５０〜５００、５０〜４００、５０〜３００、１００〜５００、１００〜４００、１００〜３００、２００〜５００、２００〜４００、または２００〜３００ヌクレオチドの間である。  いくつかの態様において、相同の領域は同一であり、および各々の相同の領域は、５０〜５００、５０〜４００、５０〜３００、１００〜５００、１００〜４００、１００〜３００、２００〜５００、２００〜４００、または２００〜３００ヌクレオチドの間である。
【００３３】
いくつかの態様において、相同領域（region homology）は、ヌクレオチド配列
【化１】
2020518268.tif 000003
と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００同一である配列を含む。
【００３４】
いくつかの態様において、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、１つ以上の調節要素を含んでもよい。当業者は、適切な宿主細胞、例えば、哺乳動物またはヒト宿主細胞における使用のための調節要素を選択することができる。調節要素は、例えば、プロモーター、転写終結配列、翻訳終結配列、エンハンサー、およびポリアデニル化要素である。本明細書に記載のポリヌクレオチドは、オトフェルリンなどの所望のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された、プロモーター配列を含んでもよい。主題の発明における使用のために企図されるプロモーターは、これらに限定されないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、キメラＣＭＶ／ニワトリβアクチンプロモーター（ＣＢＡ）および切断された（truncated）型のＣＢＡ（ｓｍＣＢＡ）を包含する（例として、それへの明確な参照によって本明細書中にその全体が具体的に組み込まれる、Haire et al. 2006および米国特許第8,298,818号を参照）。いくつかの態様において、プロモーターは、切断されたキメラＣＭＶβアクチン（ｓｍｃＢＡ）プロモーターである。
【００３５】
いくつかの態様において、プロモーターは、ヌクレオチド配列
【化２】
2020518268.tif 000004
と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００同一である配列を含む。
【００３６】
いくつかの態様において、本明細書に記載のとおりのポリヌクレオチドは、オトフェルリンポリペプチドのＮ末端またはＣ末端部分をコードする部分コード配列を含み、ここで、部分コード配列は、オトフェルリンポリペプチドをコードするためにin vivoでスプライシングされるかまたはそうでなければ一緒になって組み合わせられることができる。いくつかの態様において、オトフェルリンポリペプチドは、ヒトオトフェルリンポリペプチドである。いくつかの態様において、オトフェルリンポリペプチドは、ヒトオトフェルリンポリペプチドの長アイソフォームである（例として、Yasunaga et al. OTOF Encodes Multiple Long and Short Isoforms: Genetic Evidence That the Long Ones Underlie Recessive Deafness DFNB9. Am. J. Hum. Genet. 67:591-600, 2000を参照）。
【００３７】
いくつかの態様において、オトフェルリンポリペプチドは、以下のアミノ酸配列の一方または両方と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００同一である配列を含む：
【００３８】
ヒトＯＴＯＦアイソフォーム１ − Genbank番号AF183185.1
【化３−１】
2020518268.tif 000005
【化３−２】
2020518268.tif 000006
【００３９】
ヒトＯＴＯＦアイソフォーム５ − Genbank番号NP_001274418
【化４−１】
2020518268.tif 000007
【化４−２】
2020518268.tif 000008
【００４０】
いくつかの態様において、オトフェルリンポリペプチドは、マウスオトフェルリンポリペプチドである。いくつかの態様において、オトフェルリンポリペプチドは、以下のアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００同一である配列を含む：
【００４１】
マウスＯＴＯＦアイソフォーム１ − Genbank番号NP_001093865.1
【化５−１】
2020518268.tif 000009
【化５−２】
2020518268.tif 000010
【００４２】
いくつかの態様において、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、スプライスドナーまたはスプライスアクセプター部位を含む。いくつかの態様において、スプライスドナーおよび／またはスプライスアクセプター部位は、スプライスコンセンサス配列を含有する。いくつかの態様において、スプライスドナーおよび／またはスプライスアクセプター部位は、アルカリホスファターゼに由来するスプライスコンセンサス配列の配列を含有する。
【００４３】
いくつかの態様において、スプライスドナー部位は、ヌクレオチド配列
【化６】
2020518268.tif 000011
と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００同一である配列を含む。
【００４４】
いくつかの態様において、スプライスアクセプター部位は、ヌクレオチド配列
【化７】
2020518268.tif 000012
と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００同一である配列を含む。
【００４５】
いくつかの態様において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、ＩＴＲ配列を含む。本明細書に記載のポリヌクレオチドのＩＴＲ配列は、いずれかのＡＡＶ血清型（例として、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）に由来する可能性があるか、または１つより多い血清型に由来する可能性がある。本明細書で提供されるポリヌクレオチドのいくつかの態様において、ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２に由来する。ＩＴＲ配列、およびＩＴＲ配列を含有するプラスミドは、当該技術分野において知られており、商業的に利用可能である（例として、Vector Biolabs, Philadelphia, PA；Cellbiolabs, San Diego, CA；Agilent Technologies, Santa Clara, Ca；およびAddgene, Cambridge, MAから入手可能な商品およびサービス；ならびに「Gene delivery to skeletal muscle results in sustained expression and systemic delivery of a therapeutic protein.」Kessler PD, Podsakoff GM, Chen X, McQuiston SA, Colosi PC, Matelis LA, Kurtzman GJ, Byrne BJ. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996 Nov 26;93(24):14082-7；およびCurtis A. Machida. 「Methods in Molecular MedicineTM.」 「Viral Vectors for Gene Therapy Methods and Protocols.」 10.1385/1-59259-304-6:201 (C) Humana Press Inc. 2003. 第１０章「Targeted Integration by Adeno-Associated Virus.」 Matthew D. Weitzman, Samuel M. Young Jr., Toni CathomenおよびRichard Jude Samulski；米国特許第５，１３９，９４１号および５，９６２，３１３号を参照、その全てが参照により本明細書に組み込まれる。）。
【００４６】
発現コンストラクトの５’端に隣接するものについての例示のＡＡＶ２ ＩＴＲ配列は、配列：
【化８】
2020518268.tif 000013
を含む。
発現コンストラクトの３’端に隣接するものについての例示のＡＡＶ２ ＩＴＲ配列は、配列：
【化９】
2020518268.tif 000014
を含む。
【００４７】
いくつかの態様において、本明細書に記載のポリヌクレオチドはさらに、１つ以上の転写終結配列、１つ以上の翻訳終結配列、１つ以上のシグナルペプチド配列、１つ以上の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、および／または１つ以上のエンハンサー要素、またはそれらのあらゆる組み合わせを、任意に包含してもよい。転写終結領域は、典型的には、真核生物またはウイルスの遺伝子配列の３’非翻訳領域から得ることができる。転写終結配列は、効率のよい終結を可能にするために、コード配列の下流に位置することができる。シグナルペプチド配列は、１つ以上の翻訳後の細胞の行き先（例えば、具体的な細胞小器官の区画、または、タンパク質合成および／または活性の部位、およびさらには細胞外環境を包含する）に作動可能に連結されたポリペプチドの配置の責任を担う情報をコードする、アミノ末端ペプチド配列である。いくつかの態様において、本明細書に記載のとおりのポリヌクレオチドは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを含む。
【００４８】
いくつかの態様において、本明細書に記載のポリヌクレオチドの内に含有される発現コンストラクトは、サイズが５キロベース以下、４キロベース以下、または３キロベース以下である。いくつかの態様において、発現コンストラクトは、サイズが４〜５キロベースの間である。
【００４９】
いくつかの態様において、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、１つ以上の組換えＡＡＶ粒子（例として、第１および第２のＡＡＶ粒子）の内に含有される。ｒＡＡＶ粒子は、あらゆる派生型（血清型の自然発生でないバリアントを包含する）または偽型を包含する、あらゆるＡＡＶ血清型（例として、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）のものであり得る。派生型および偽型の非限定的な例は、AAV2-AAV3ハイブリッド、AAVrh.10、AAVhu.14、AAV3a/3b、AAVrh32.33、AAV-HSC15、AAV-HSC17、AAVhu.37、AAVrh.8、CHt-P6、AAV2.5、AAV6.2、AAV2i8、AAV-HSC15/17、AAVM41、AAV9.45、AAV6(Y445F/Y731F)、AAV2.5T、AAV-HAE1/2、AAVクローン32/83、AAVShH10、AAV2 (Y-＞F)、AAV8 (Y733F)、AAV2.15、AAV2.4、AAVM41、およびAAVr3.45を包含する。かかるＡＡＶ血清型および派生型／偽型、およびかかる派生型／偽型を生産する方法は、当該技術分野において知られている（例として、Mol Ther. 2012 Apr;20(4):699-708. doi: 10.1038/mt.2011.287. Epub 2012 Jan 24.「The AAV vector toolkit: poised at the clinical crossroads.」Asokan A1, Schaffer DV, Samulski RJ.を参照）。いくつかの態様において、第１および第２のＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２血清型粒子である。
【００５０】
ＡＡＶ粒子およびポリヌクレオチドを生産する方法は、当該技術分野において知られており、および商業的に利用可能である（例として、Zolotukhin et al. Production and purification of serotype 1, 2, and 5 recombinant adeno-associated viral vectors. Methods 28 (2002) 158-167；および参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開番号US20070015238およびUS20120322861；ならびにATCCおよびCell Biolabs, Inc.から入手可能なプラスミドおよびキットを参照）。例えば、ポリヌクレオチド（例として、プラスミドとしての）は、例として、rep遺伝子（例として、Rep78、Rep68、Rep52およびRep40をコードするもの）およびcap遺伝子（ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３をコードするもの）を含有する１つ以上のヘルパープラスミドと組み合わせられて、プロデューサー細胞株中へとトランスフェクトされることで、ＡＡＶ粒子がパッケージ化され、続いて精製されることができるようにしてもよい。
【００５１】
いくつかの態様において、1つ以上のヘルパープラスミドは、rep遺伝子およびcap遺伝子を含む第１のヘルパープラスミド、ならびに、Ｅ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、およびＶＡ遺伝子などのＡＡＶ生産の助けとなる他の遺伝子を含む第２のヘルパープラスミドを包含する。いくつかの態様において、rep遺伝子は、ＡＡＶ２に由来するrep遺伝子である。ヘルパープラスミド、およびかかるプラスミドを作る方法は、当該技術分野において知られており、および商業的に利用可能である（例として、pDM、pDG、pDP1rs、pDP2rs、pDP3rs、pDP4rs、pDP5rs、pDP6rs、pDG(R484E/R585E)、およびpDP8.ape プラスミド（PlasmidFactory, Bielefeld, Germanyからのもの）；Vector Biolabs, Philadelphia, PA；Cellbiolabs, San Diego, CA；Agilent Technologies, Santa Clara, Ca；およびAddgene, Cambridge, MA、から入手可能な他の製品およびサービス；pxx6；Grimm et al. (1998), Novel Tools for Production and Purification of Recombinant Adenoassociated Virus Vectors, Human Gene Therapy, Vol. 9, 2745-2760；Kern, A. et al. (2003), Identification of a Heparin-Binding Motif on Adeno-Associated Virus Type 2 Capsids, Journal of Virology, Vol. 77, 11072-11081.；Grimm et al. (2003), Helper Virus-Free, Optically Controllable, and Two-Plasmid-Based Production of Adeno-associated Virus Vectors of Serotypes 1 to 6, Molecular Therapy,Vol. 7, 839-850；Kronenberg et al. (2005), A Conformational Change in the Adeno-Associated Virus Type 2 Capsid Leads to the Exposure of Hidden VP1 N Termini, Journal of Virology, Vol. 79, 5296-5303；およびMoullier, P.およびSnyder, R.O. (2008), International efforts for recombinant adenoassociated viral vector reference standards, Molecular Therapy, Vol. 16, 1185-1188を参照）。
【００５２】
非限定的な、例示のＡＡＶ粒子生産方法は、次に記載される。所望のＡＡＶ血清型のためのrepおよびcapのＯＲＦ、および生来のプロモーターの転写制御下にあるアデノウイルスＶＡ、Ｅ２Ａ（ＤＢＰ）およびＥ４遺伝子を含む１つ以上のヘルパープラスミドが、生産または取得される。HEK293細胞（ATCC（登録商標）から入手可能）が、ＣａＰＯ４に媒介されるトランスフェクション、脂質またはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などのポリマー分子を介して、ヘルパープラスミド（単数または複数）および本明細書に記載のポリヌクレオチドを含有するプラスミドでトランスフェクトされる。代替的に、別の非限定的な例においては、Sf9系プロデューサー安定細胞株が、ポリヌクレオチドを含有する単一の組換えバキュロウイルスに感染させられる。さらなる非限定的な代替として、別の例においては、HEK293またはBHK細胞株が、ポリヌクレオチドを含有するＨＳＶに、ならびに任意に、本明細書に記載のとおりのrepおよびcapのＯＲＦ、および生来のプロモーターの転写制御下にあるアデノウイルスＶＡ、Ｅ２Ａ（ＤＢＰ）およびＥ４遺伝子を含有する１つ以上のヘルパーＨＳＶに、感染させられる。HEK293、BHK、またはSf9細胞は次に、ＡＡＶ粒子生産が可能となるように、少なくとも６０時間インキュベートされる。ＡＡＶ粒子は、次に、当該技術分野において知られているかまたは本明細書に記載されているいずれかの方法を使用して、例として、イオジキサノール段階的勾配、ＣｓＣｌ勾配、クロマトグラフィー、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿によって、精製されることができる。
【００５３】
本開示は、開示されたＡＡＶ粒子またはポリヌクレオチドの少なくとも１つを含む宿主細胞をもまた企図する。かかる宿主細胞は、哺乳動物宿主細胞を包含し、ヒト宿主細胞が好ましく、および、単離されていても、細胞もしくは組織培養の中にあっても、いずれでもよい。遺伝的に改変された動物モデル（例として、マウス）の場合、形質転換された宿主細胞は、非ヒト動物それ自体の体内にあってもよい。
【００５４】
方法および対象
いくつかの側面において、細胞におけるオトフェルリンの発現を増加させる方法が提供される。いくつかの態様において、方法は、細胞を、本明細書に記載のとおりの第１のポリヌクレオチドを含む本明細書に記載のとおりの第１のＡＡＶ粒子に接触させること；および、細胞を、本明細書に記載のとおりの第２のポリヌクレオチドを含む本明細書に記載のとおりの第２のＡＡＶ粒子に接触させることを含む。いくつかの態様において、細胞は、マウスまたはヒト細胞などの哺乳動物細胞である。いくつかの態様において、細胞は、ex vivoである。いくつかの態様において、細胞は、in vivoである。いくつかの態様において、細胞は、耳の細胞（例として、ヒトの耳の細胞）である。いくつかの態様において、細胞は、内耳の細胞（例として、ヒトの内耳の細胞）である。いくつかの態様において、細胞は、対象（例として、ヒト対象などの哺乳動物対象）中にある。
【００５５】
本開示の他の側面は、オトフェルリンの発現もしくは活性の減少または不在によって引き起こされる疾患または状態の処置に関する。いくつかの態様において、方法は、治療有効量の、本明細書に記載のとおりの第１のポリヌクレオチドを含む第１のＡＡＶ粒子、および本明細書に記載のとおりの第２のポリヌクレオチドを含む第２のＡＡＶ粒子を、対象へ投与することを含む。いくつかの態様において、対象は、ヒト対象であり、および対象は、難聴、常染色体劣性９（ＤＦＮＢ９）を有する。いくつかの態様において、対象は、損なわれた前庭機能、または前庭障害を有する、ヒト対象である（例として、Dulon et al. Otoferlin is Critical for a Highly Sensitive and Linear Calcium Dependent Exocytosis at Vestibular Hair Cell Ribbon Synapses. J Neurosci. 2009; 29(34): 10474-10487を参照）。
【００５６】
疾患を「処置する」ことは、本明細書において用語が使用されるとおり、対象が経験する疾患または障害の少なくとも１つの兆候または症状の、頻度または重症度を低減させることを意味する。上記にまたは本明細書における他の場所に記載された組成物は、典型的には、有効量で、つまり、望ましい結果を生じる能力がある量で、対象へ投与される。望ましい結果は、投与される活性な剤に依存する。例えば、ＡＡＶ粒子の有効量は、宿主器官、組織、または細胞へ発現コンストラクトを移動させる能力がある、粒子の量であり得る。治療的に許容し得る量は、疾患を、例として、ＤＦＮＢ９を、処置する能力がある量であり得る。医学および獣医学の分野において周知のとおり、ある対象に対する投薬量は、対象のサイズ、体表面積、年齢、投与される特定の組成物、組成物中の活性成分（単数または複数）、投与時間および経路、全身健康状態、および同時に投与される他の薬物を包含する多くの要因に依存する。
【００５７】
ＡＡＶ粒子またはポリヌクレオチドは、本明細書に記載のＡＡＶ粒子などの活性成分および本明細書に記載のとおりの薬学的に許容し得る担体を含む組成物などの、組成物の形態にて送達されてもよい。ＡＡＶ粒子またはポリヌクレオチドは、様々な組成物にて調製され得、および、ヒトまたは動物対象への投与のための適切な医薬ビヒクルでもまた製剤化され得る。いくつかの態様において、第１および第２のＡＡＶ粒子が利用される場合、第１および第２のＡＡＶ粒子は、同じ組成物の内に含有されてもよいし、あるいは異なる組成物の内に含有されてもよく、および、一緒にまたは別々に投与されてもよい。
【００５８】
いくつかの態様において、対象へ投与されるＡＡＶ粒子は、１０６〜１０１４粒子／ｍｌまたは１０３〜１０１５粒子／ｍｌの範囲にわたるオーダーにある濃度を有する組成物にて、または、例えば、約１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、もしくは１０１４粒子／ｍｌなどの、いずれかの範囲の間にあるあらゆる値で、提供されてもよい。一態様において、１０１３粒子／ｍｌを上回るＡＡＶ粒子が投与される。いくつかの態様において、対象へ投与されるＡＡＶ粒子の数は、１０６〜１０１４ベクターゲノム（ｖｇｓ）／ｍｌまたは１０３〜１０１５  ｖｇｓ／ｍｌの範囲にわたるオーダーにあってもよく、または、例えば、約１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、もしくは１０１４ｖｇｓ／ｍｌなどの、いずれかの範囲の間にあるあらゆる値であってもよい。一態様において、１０１３ｖｇｓ／ｍｌを上回るＡＡＶ粒子が投与される。ＡＡＶ粒子は、単回用量として投与することができ、または、処置される特定の疾患または障害の治療にを達成するために要求され得るとおり、２回以上の投与に分けることができる。いくつかの態様において、０．０００１ｍｌ〜１０ｍｌｓが、対象へ送達される。
【００５９】
いくつかの態様において、対象へ投与されるＡＡＶ粒子の数は、１０６〜１０１４  ｖｇ／ｋｇの範囲にわたるオーダーにあってもよく、または、例えば、約１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、もしくは１０１４ｖｇｓ／ｋｇなどの、いずれかの範囲の間にあるあらゆる値であってもよい。いくつかの態様において、本明細書に記載のとおりの第１のポリヌクレオチドを含む第１のＡＡＶ粒子、および本明細書に記載のとおりの第２のポリヌクレオチドを含む第２のＡＡＶ粒子が、投与される場合には、投与される量は、両方の粒子について同じである。いくつかの態様において、本明細書に記載のとおりの第１のポリヌクレオチドを含む第１のＡＡＶ粒子、および本明細書に記載のとおりの第２のポリヌクレオチドを含む第２のＡＡＶ粒子が、投与される場合には、投与される量は、各粒子について異なる。
【００６０】
望ましい場合には、ＡＡＶ粒子は、例として、タンパク質またはポリペプチドまたは様々な薬学的に活性な剤などの、他の剤または処置（治療的ポリペプチド、生物学的に活性なフラグメント、またはそれらのバリアントの１つ以上の全身または局所投与を包含する）との組み合わせでもまた同様に、投与されてもよい。実際に、また包含してもよい他の成分には、追加の剤が標的細胞または宿主組織との接触で有意な有害作用を引き起こさないことを前提とすれば、事実上は限定がない。よって、特定の場合における要求に応じて様々な他の剤または処置と共に、ＡＡＶ粒子が送達されてもよい。いくつかの態様において、AAV粒子の処置は、補聴器の使用を伴ってもよい。
【００６１】
ある状況においては、皮下で、非経口で、静脈内で、筋肉内で、腹腔内で、経口または経鼻吸入により、または直接注射により、のいずれかで、１つ以上の細胞、組織、または器官へ、好適に製剤化された本明細書に記載の医薬組成物にてＡＡＶ粒子を送達することが好ましい。いくつかの態様において、投与は、静脈注射または注入によるなどの全身送達のために好適な経路である。いくつかの態様において、投与は、耳へのものであり、例として、蝸牛内投与を介してである。注射可能な使用のために好適なＡＡＶ粒子組成物の医薬形態は、滅菌された水溶液または分散液を包含する。いくつかの態様において、形態は、滅菌されており簡単な注射可能性が存在する程度には流動性を持つ。いくつかの態様において、形態は、製造および保存の条件化において安定であり、ならびに、細菌および菌類などの微生物の汚染作用から守られる。担体は、例えば、水、生理食塩水、エタノール、ポリオール（例として、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、これらの好適な混合物、および／または植物油を含有する、溶媒または分散媒とすることができる。適正な流動性は、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には要求される粒子サイズの維持によって、および、界面活性剤の使用によって、維持され得る。
【００６２】
注射可能な水溶液の投与のためには、例えば、必要ならば溶液を好適に緩衝化し、および液体希釈剤をまず十分な生理食塩水またはグルコースで等張状態にしてもよい。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、硝子体内、網膜下、皮下および鼻腹腔内投与にとりわけ好適である。これに関連して、本開示に照らすと、採用することができる無菌水性媒体が当業者には知られる。例えば、１つの投薬量を、等張ＮａＣｌ溶液１ｍｌに溶解し、１０００ｍｌの皮下注入用流体に加えるか、または提案注入部位に注射するかのいずれかをしてもよい（例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」15th Edition、1035〜1038および1570〜1580頁を参照）。処置される対象の状態に依存して、投薬のいくらかの変動は必然的に起こる。いずれにしても、投与の責任を負う者が、個々の対象のための適切な用量を決定する。そのうえ、ヒトへの投与のためには、調製は、例として、ＦＤＡの生物系審査部の規格によって要求されるとおりの、滅菌性、発熱性、および一般的安全性および純度の規格を満たさなければならない。
【００６３】
滅菌された注射可能な溶液は、ＡＡＶを必要量で適切な溶媒中に、必要に応じて、上記に列挙した他の成分のいくつかとともに、組み込むことによって調製され、これに続いて濾過滅菌またはその他の滅菌技法がなされる。一般的に、分散液は、基本的な分散媒および上に列挙したものからの必要な他の成分を含有する滅菌された媒体に、様々な滅菌された活性成分を組み込むことによって調製される。滅菌された注射可能な溶液の調製のための滅菌された粉末の場合、好ましい調製の方法は、予め濾過滅菌したその溶液から活性成分および何らかのさらなる所望の成分の粉末を得る、真空乾燥および凍結乾燥技法である。
【００６４】
ＡＡＶ粒子またはポリヌクレオチド組成物の量およびかかる組成物の投与の時間は、本教示の利益を有する当業者の知識の範囲内である。しかしながら、開示された組成物の治療有効量の投与は、かかる治療を受けている患者に治療上の利益を提供するために、例えば、十分な数の感染性粒子の単回注射などの単回投与によって、達成され得る可能性がある。代替的に、いくつかの状況では、かかる組成物の投与を監督する医師によって決定され得るとおり、比較的短い期間または比較的長い期間のいずれかにわたって、ＡＡＶ粒子組成物の複数回の、または連続的な投与を提供することが望ましいことがあり得る。
組成物は、ＡＡＶ粒子を、単独でも、あるいは、天然もしくは組み換えソースから得られるかまたは化学的に合成され得る１つ以上の追加の活性成分との組み合わせでも、包含してよい。
【００６５】
本開示の方法において利用される組成物の毒性および有効性は、培養細胞または実験動物のいずれかを使用することでＬＤ５０（集団の５０％に対して致死性である用量）を決定する、標準的な製薬手順によって決定することができる。毒性と有効性との間の用量比は、治療指数であり、これは、比率ＬＤ５０／ＥＤ５０として表現することができる。大きな治療指標を呈する組成物が好ましい。有毒な副作用を呈するものも使用され得るが、かかる副作用による潜在的な損傷を最小限にする送達系を設計するように注意を払わなければならない。本明細書に記載のとおりの組成物の投薬量は、一般的には、ほとんどあるいは全く毒性を伴わないＥＤ５０を包含する範囲内にある。投薬量は、この範囲内で、採用される投薬形態および利用される投与経路に依存して変動し得る。
【００６６】
本開示の側面は、ヒトまたは非ヒト霊長類対象などの対象についての使用のための方法に関する。非ヒト霊長類対象の非限定的な例は、マカク（例えば、カニクイザルまたはアカゲザル）、マーモセット、タマリン、クモザル、ヨザル、ベルベットモンキー、リスザル、ヒヒ、ゴリラ、チンパンジー、およびオランウータンを包含する。いくつかの態様において、対象は、ヒト対象である。他の例示の対象は、イヌおよびネコなどの飼い慣らされた動物；ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、およびニワトリなどの家畜；ならびにマウス、ラット、モルモット、およびハムスターなどの他の動物を包含する。
【００６７】
いくつかの態様において、対象は、遺伝子治療にて処置され得る疾患を有するかまたは有する疑いがある。いくつかの態様において、対象は、難聴、常染色体劣性９（ＤＦＮＢ９）を有するかまたは有する疑いがある。ＤＦＮＢ９は、オトフェルリンタンパク質の発現、機能、または両方の減少をもたらすＯＴＯＦ遺伝子における突然変異によって引き起こされると考えられている、常染色体劣性型の難聴である。オトフェルリンタンパク質は、聴覚リボンシナプスでのエクソサイトーシスのために重要であることが示されている（例として、Roux et al. Otoferlin, defective in a human deafness form, is essential for exocytosis at the auditory ribbon synapse. (2006) Cell 127(2):277-89を参照）。ＤＦＮＢ９を有する対象は、熟練した医師が、例として、聴性脳幹反応（ＡＢＲ）の電気生理学的検査と、ＯＴＯＦ遺伝子中の突然変異（例として、ＯＭＩＭエントリー603681および601071を参照）を同定するための遺伝子検査との組み合わせを使用して、同定することができる。
【００６８】
いくつかの態様において、対象は、以下のナンセンスもしくはミスセンス突然変異の１つ以上をＯＴＯＦ遺伝子中に有するヒト対象である：ＴＹＲ７３０ＴＥＲ、ＧＬＮ８２９ＴＥＲ、ＰＲＯ１８２５ＡＬＡ、ＰＲＯ５０ＡＲＧ、ＬＥＵ１０１１ＰＲＯ、ＩＬＥ５１５ＴＨＲ、ＡＲＧ１９３９ＧＬＮ、またはＧＬＹ５４１ＳＥＲ。いくつかの態様において、対象は、イントロン８／エキソン９ジャンクションでのＡからＧへのトランジション（IVS8-2A-G）、または、エキソン５のスプライスドナー部位における最初のイントロンヌクレオチドである位置＋１でのＧからＡへのトランジション、または、イントロン３９のドナースプライス部位におけるGからCへのトランスバージョン、を有するヒト対象である。いくつかの態様において、対象は、エキソン１６における１塩基対欠失（１７７８Ｇ）、これは終止コドンへと導く、および、６１４１Ｇ−Ａの変化、これはエキソン４８におけるＡＲＧからＧＬＮへの置換をもたらす、を有するヒト対象である。
【００６９】
組成物
本開示の他の側面は、本明細書に記載のＡＡＶ粒子またはポリヌクレオチドを含む組成物に関する。いくつかの態様において、本明細書に記載のＡＡＶ粒子は、組成物に、例として、医薬組成物に、加えられる。
【００７０】
いくつかの態様において、組成物は、薬学的に許容し得る担体を含む。用語「担体」は、これとともにＡＡＶが投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを指す。かかる医薬担体は、水または油、これは鉱油などの石油、ピーナッツ油、ダイズ油およびゴマ油などの植物油、動物油、または合成起源の油を包含する、などの滅菌液体とすることができる。生理食塩水溶液および水性デキストロースおよびグリセロール溶液もまた、液体担体として採用することができる。薬学的に許容し得る担体の非限定的な例は、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、生理食塩水、シロップ、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリアクリル酸、潤滑剤（タルク、ステアリン酸マグネシウム、および鉱油など）、湿潤剤、乳化剤、懸濁化剤、防腐剤（ヒドロキシ安息香酸メチル、−エチル、および−プロピルなど）およびｐＨ調整剤（無機および有機の酸および塩基など）を包含する。
【００７１】
担体の他の例は、リン酸緩衝生理食塩水、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水、および注射のための水を包含し、これらのいずれも、塩化カルシウム二水和物、無水リン酸二ナトリウム、塩化マグネシウム六水和物、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、塩化ナトリウム、またはスクロースの１つ以上と任意に組み合わせられてもよい。使用することがあり得る他の担体の例は、生理食塩水（例として、滅菌された、発熱物質を含まない生理食塩水）、塩緩衝液（saline buffers）（例として、クエン酸塩緩衝液、リン酸塩緩衝液、酢酸塩緩衝液、および重炭酸塩緩衝液）、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質（例えば、血清アルブミン）、ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム、リポソーム、マンニトール、ソルビトール、およびグリセロールを包含する。ＵＳＰグレードの担体および賦形剤は、ヒト対象へのＡＡＶ粒子の送達のために特に有用である。かかる組成物は、さらに任意に、リポソーム、脂質、脂質複合体、ミクロスフェア、微粒子、ナノスフェア、またはナノ粒子を含んでもよく、あるいは、細胞、組織、器官、またはこれを必要とする対象の体への投与のために別様に製剤化されていてもよい。かかる組成物を作るための方法は、周知であり、および、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd edition, Pharmaceutical Press, 2012において見出すことができる。
【００７２】
典型的には、かかる組成物は、少なくとも約０．１％の治療剤（例として、ＡＡＶ粒子）またはそれ以上を含有し得るが、活性成分（単数または複数）の割合は、もちろん変動してもよく、および好都合に全製剤の重量または体積の約１または２％と約７０％または８０％との間、またはそれ以上であってもよい。当然ながら、各々の治療上有用な組成物の中の治療剤（単数または複数）（例として、ＡＡＶ粒子）の量は、化合物の何らかの所与の単位用量にて好適な用量が得られるようなやり方で調製され得る。可溶性、生物学的利用能、生物学的半減期、投与の経路、製品の有効期間などの要因、ならびに他の薬理学的配慮が、かかる医薬処方物の調製についての技術分野における当業者によって企図されることとなり、そのため、様々な用量および処置レジメンが、望ましいものとなり得る。
【００７３】
いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、ＤＦＮＢ９を有する対象などの、これを必要とする対象へ、投与されてもよい。いくつかの態様において、本明細書に記載の方法は、本明細書に記載のとおりのＡＡＶ粒子を含む１つまたは複数の組成物を、これを必要とする対象へ投与することを含んでもよい。いくつかの態様において、対象は、ヒト対象である。いくつかの態様において、対象は、ＤＦＮＢ９などの、遺伝子治療で処置され得る疾患を有するか、または有する疑いがある。いくつかの態様において、対象は、ＤＦＮＢ９と診断されている。
【００７４】
キット
本開示の他の側面は、１つ以上の容器中での本明細書に記載のとおりのＡＡＶ粒子またはポリヌクレオチドを含む、キットに関する。キットは、薬学的に許容し得る担体および／または希釈剤を、任意に包含することができる。いくつかの態様において、キットは、キットの内に含有されるＡＡＶ粒子またはポリヌクレオチドをいかにして選択された細胞またはレシピエントへ投与するかを説明する、指示または包装材料を包含する。キットの容器は、あらゆる好適な材料（例として、ガラス、プラスチック、金属等々）とすることができ、およびあらゆる好適なサイズ、形状、または構成とすることができる。いくつかの態様において、キットは、ＡＡＶ粒子またはポリヌクレオチドを好適な液体または溶液形態で含有する１つ以上のアンプルまたはシリンジを包含してもよい。
【実施例】
【００７５】
例
アデノ随伴ウイルス遺伝子治療アプローチを使用したＯＴＯＦノックアウトマウスにおける聴力のレスキュー
イントロダクション
オトフェルリンは、耳における神経伝達物質放出のための重要なカルシウムセンサーである（例として、Roux 2006を参照）。オトフェルリンは、主に蝸牛の内有毛細胞において、および、中枢神経系のごく少数の他の細胞において発現する（例として、Yasunaga et al. 1999 ＆ 2000を参照）。それは、シナプトタグミン、ＰＫＣおよびＰＬＣにも見出されるＣ２ドメインと共通のものを共有する、膜貫通タンパク質のフェルリンファミリーの一員である。
【００７６】
ヒトオトフェルリンをコードするヒトＯＴＯＦ遺伝子における突然変異は、「難聴、常染色体劣性９（ＤＦＮＢ９）」と呼ばれる非症候性難聴のタイプを引き起こす。ＯＴＯＦノックアウトマウスは、正常な内有毛細胞の発達および聴覚リボンシナプス形成にもかかわらず、重症の聴力喪失を有することもまた、示されている（例として、Roux et al. (2006) Otoferlin, defective in a human deafness form, is essential for exocytosis at the auditory ribbon synapse. Cell. 127:277-289を参照）。しかしながら、Ｏｔｏｆ−／−マウスは、シナプス開口放出の完全な無効化、および結果的にシナプス小胞からの神経伝達物質放出の無効化に起因して、聴性脳幹反応を全ての音周波数にわたって喪失する。
【００７７】
ＤＦＮＢ９は、ヒトにおいては２つの表現型として、言葉の習得の前の非症候性の両側性の聴力の喪失として、およびそれより少ない頻度で温度感受性の非症候性のオーディトリーニューロパチーとして現れる。これは、罹患したレバノン人の家族において最初に発見され（Chaib et al. 1996）、およびそれ以来世界の多数の部分で見出されている（例として、Adato et al. 2000、Rodriguez-Ballesteros et al. 2003、Choi et al. 2009、Matsunaga et al. 2012を参照）。
【００７８】
ＤＦＮＢ９を持つヒトにおける現在の処置は、蝸牛移植および補聴器を利用する。加えて、温度感受性型のＤＦＮＢ９のためには、発熱およびその他の体温の上昇を引き起こす状態の予防が重要である。本出願人らは、ＤＦＮＢ９のための処置としてＯＴＯＦを送達するのにＡＡＶを使用することについての概念実証として、ノックアウトマウスにおけるＯＴＯＦの発現を復元する手段としてアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を使用することを目指した。マウスＯＴＯＦ ｃＤＮＡは、長さが５９７９塩基対であり、他方、ほとんどのＡＡＶは、およそ４．８キロベースを超えるゲノムをパッケージ化することができない。その結果として、ひとたび送達されたときに全長ｃＤＮＡがin vivoで再組み立てされることができるように、ｃＤＮＡの５’部分とｃＤＮＡの３’部分とを別々のＡＡＶコンストラクトとして別々に送達するために二重ベクター系を使用した。
【００７９】
方法
二重ＡＡＶベクターコンストラクト
マウスＯＴＯＦ ｃＤＮＡを、２つの区間、５’および３’区間に分け、および、２つのＡＡＶ ＩＴＲ含有プラスミド中へと挿入した。プラスミド中の２つのカセットの各々の配列は、下記に示され、および、各コンストラクトのマップは、図１および２に示される。カセットの、アノテーションされたバージョンは、図３Ａおよび３Ｂに示される。各カセットは、in vivoにおいてｃＤＮＡの５’および３’端の間の相同的組み換えを促進させるための相同の領域を含有する（see Ghosh et al., 2011を参照）。ひとたびin vivoで組み換えられると、全長ｃＤＮＡは、相同の領域からのスプライシングによる切り出しを引き起こすスプライスドナー／スプライスアクセプター対を含有する。ベクターを、以前に記載されたとおりの標準的なプラスミドトランスフェクション法を使用して、ＡＡＶ２血清型粒子中へとパッケージ化した（Zolotukhin et al. Production and purification of serotype 1, 2, and 5 recombinant adeno-associated viral vectors. Methods 28 (2002) 158-167を参照）。ウイルス粒子を、以前に記載されたとおりの標準的な方法により精製した（Zolotukhin et al. Production and purification of serotype 1, 2, and 5 recombinant adeno-associated viral vectors. Methods 28 (2002) 158-167を参照）。ＯＴＯＦ ｃＤＮＡの５’部分を保有するウイルス粒子は、本明細書において「ＡＡＶ２−ＯＴＯＦ−ＮＴ」とも称される。ＯＴＯＦ ｃＤＮＡの３’部分を保有するウイルス粒子は、本明細書において「ＡＡＶ２−ＯＴＯＦ−ＣＴ」とも称される。
【００８０】
ｐＴＲ２２−ｓｍＣＢＡ−オトフェルリンＮＴ−ＡＰＳＤ−ＡＰｈｅａｄ
【化１０−１】
2020518268.tif 000015
【化１０−２】
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【化１０−３】
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【化１０−４】
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【化１０−５】
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【００８１】
ｐＴＲ２２−ＡＰｈｅａｄ−ＡＰＳＡ−オトフェルリンＣＴ
【化１１−１】
2020518268.tif 000020
【化１１−２】
2020518268.tif 000021
【化１１−３】
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【化１１−４】
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【化１１−５】
2020518268.tif 000024
【００８２】
HEK 293細胞のトランスフェクション
HEK 293細胞を、培養培地中のポリリシンコートされたカバースリップ上で育てた。１μｌの各ウイルスを、各ウェルについて以下のとおり使用した：ウイルスなしのコントロール細胞、ＡＡＶ２−ＯＴＯＦのｎ末端部分を有する細胞（ＡＡＶ２−ＯＴＯＦ−ＮＴ）、ＡＡＶ２−ＯＴＯＦのｃ末端部分を有する細胞（ＡＡＶ２−ＯＴＯＦ−ＣＴ）、および両方のウイルスを有する細胞（ＡＡＶ２−ＯＴＯＦ−ＮＴおよびＡＡＶ２−ＯＴＯＦ−ＣＴ）。細胞を、抗ＯＴＯＦ抗体で染色し、およびスライドガラス上に標本化した。
【００８３】
ＯＴＯＦノックアウトマウス
使用したＯＴＯＦノックアウトマウスは、以前の研究において作り出した（Roux et al. (2006) Otoferlin, defective in a human deafness form, is essential for exocytosis at the auditory ribbon synapse. Cell. 127:277-289を参照）。手短にいうと、Ｏｔｏｆのエキソン１４および１５までのゲノム配列５’および３’を含有する２つのフラグメントを、ＰＣＲによって増幅させた。５ｋｂのBamHI-XhoI-BssHIIおよび６ｋｂのBssHII-SfiI-BamHI-NaeI 129/SvPasフラグメントを、BamHI-XhoI-BssHII-SfiI-NaeI-HindIIIポリリンカーを挿入することによって前もって改変されているpUC19（New England BioLabs）へと挿入した。loxP-hygro-loxP（ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子［Pgk-1］プロモーターの制御下でハイグロマイシンへの耐性を付与する遺伝子）カセットを、BssHII部位へと挿入した。全てのコンストラクトについて配列決定し、および、得られた配列を、129/SvPasゲノム配列と比較した。ハイグロマイシンに対して耐性の２８２ ＣＫ３５ ＥＳ細胞を、相同的組み換えおよびモノインサーション（monoinsertion）事象について、サザンブロット分析によりスクリーニングした。
【００８４】
キメラ動物を作製するために、２つのクローンを、C57BL/6N胚盤胞中へと注射した。突然変異Otofアレルの伝播を、アグーチの仔においてＰＣＲにより検出した。Ｆ１子孫における陽性の仔を、混合C57BL/6-129/SvPasバックグラウンドにおけるPgk-1-creマウスと交配させた。ハイグロマイシンカセットが欠失したアレル（Otof tm1Ugdsアレル）を保有するＦ２動物を、５０７塩基対のＰＣＲ産物を作り出した、プライマー  ５’−ＣＡＣＴＴＧＣＴＴＴＧＴＣＴ  ＣＡＴＣＴＣＣ−３’  （配列番号１２）および  ５’−ＧＴＣＡＣＴＴＣＴＴＣＴＧＧＧＴＡＴＴＴＣ−３’  （配列番号１３）を使用したＰＣＲによって、選択した。ヘテロ接合の動物を、Ｏｔｏｆ−／−、Ｏｔｏｆ＋／−、およびＯｔｏｆ＋／＋マウスを作り出すために同系交配（interbred）させた。ノックアウトマウスを、上記のとおりのC57BL/6-129/SvPasバックグラウンドにて作り出した。このバックグラウンド株は、いくらか加齢に関連した聴力喪失を有することが知られているので、マウスを第１０世代までＦＶＢマウス株と戻し交配させることで、知られている加齢に関連した聴力喪失がないＦＶＢの同種の遺伝的バックグラウンドを得た。
【００８５】
マウスへのＡＡＶの送達
ＯＴＯＦノックアウトマウス（新生およびＰ１０より高齢）に、２つのＡＡＶコンストラクトの各々のウイルス粒子１マイクロリットルを、以前に記載されたとおりに円窓膜（ＲＷＭ）注射を使用して注射した（Akil et al. (2012) Restoration of Hearing in the VGLUT3 Knockout Mouse Using Virally-Mediated Gene Therapy. Neuron. 75(2): 283-293およびAkil et al. (2015) Surgical Method for Virally Mediated Gene Delivery to the Mouse Inner Ear through the Round Window Membrane. J. Vis. Exp. (97), e52187を参照）。ＡＡＶ２−ＯＴＯＦ−ＮＴ（６．３２×１０１２ｖｇ／ｍｌ）およびＡＡＶ２−ＯＴＯＦ−ＣＴ（４．５×１０１２ｖｇ／ｍｌ）を、ＲＷＭを通して、Ｐ１〜３マウスへ送達した。ＡＡＶ２−ＯＴＯＦ−ＮＴ（１．４３×１０１３ｖｇ／ｍｌ）およびＡＡＶ２−ＯＴＯＦ−ＣＴ（３．１２×１０１３ｖｇ／ｍｌ）を、ＲＷＭを通して、Ｐ≧１２マウスへ送達した。ＡＢＲ試験を、注射７日後に実施した。マウスにおけるＯＴＯＦタンパク質の発現を、蝸牛の全載標本中の細胞を標識するための抗ＯＴＯＦ抗体を使用して測定した。逆転写酵素（ＲＴ）−ＰＣＲを、マウスの蝸牛組織の内にあるＯＴＯＦ ｍＲＮＡの存在をスクリーニングするために使用した。野生型マウスにもまた、同じ技法でＡＡＶ２−ＧＦＰを、ＡＡＶ２での蝸牛へのウイルス送達を評価するために注射した。蝸牛を、全載標本にし、および抗ＧＦＰ抗体で染色した。
【００８６】
聴性脳幹反応（ＡＢＲ）試験
聴力試験を、以前に記載したとおりに（Akil et al. (2006) Progressive deafness and altered cochlear innervation in knockout mice lacking prosaposin. J. Neurosci. 26:13076-13088およびAkil et al. (2016) Mouse Auditory Brainstem Response Testing. Bio Protoc. 6(6)）、オトフェルリンノックアウト（ＯＴＯＦ ＫＯ）マウス、レスキューされたＯＴＯＦ ＫＯマウスおよび野生型（ＷＴ）同腹子について行った。手短にいうと、全ての聴覚試験は、防音室の中で行った。聴覚試験の前に、マウスをケタミン塩酸塩（Ketaset、１００ｍｇ／ｍｌ）とキシラジン塩酸塩（xyla-ject、１０ｍｇ／ｍｌ）との混合物の腹腔内注射によって麻酔し、および、必要に応じ、当初の用量の５分の１でブーストした。記録の間中にわたって、体温を温熱パッドで維持し、および直腸プローブでモニターした。
【００８７】
誘発された聴性脳幹反応（ＡＢＲ）閾値を、マウスの頭皮から、別個に記録した。応答は、頭頂、左耳の耳介の下（参照）、および反対側の耳の下（グランド）で皮下針電極を使用して記録した。使用した音刺激は、クリック（５ｍｓの持続時間、３１Ｈｚ）ならびに８、１６、および３２ｋＨｚでのトーンピップ（１０ｍｓの持続時間、ｃｏｓ２整形、２１Ｈｚ）を包含した。測定結果は、TDT BioSig III system（Tucker Davis Technologies）を使用して記録した。各刺激について、脳波（ＥＥＧ）活動を２０ｍｓの間（２５ｋＨｚのサンプリングレートにて）記録し、およびフィルタリングした（０．３〜３ｋＨｚ）。クリック応答について、５１２の刺激からの波形を平均した。周波数特異的なトーンバースト刺激（８、１６、および３２ｋＨｚ）を同定するために、１０００の刺激からの波形を検査した。ＡＢＲ波形を、最大振幅から５ｄＢ音圧レベル（ＳＰＬ）の間隔おきに下げたところで記録した。閾値は、目視検査で波Ｉ−Ｖについての応答ピークが明確にかつ繰り返し存在する最も低い刺激レベルとして定義した。これらの閾値判断は、保存波形の分析により確認した。各々の動物の群の比較は、一元配置ＡＮＯＶＡとBonferroniの事後検定を使用して行った。
【００８８】
結果
２つの異なるＡＡＶプラスミドコンストラクトを、マウスＯＴＯＦ ｃＤＮＡの５’側半分および３’側半分をＯＴＯＦノックアウトマウスの内耳へ送達するために作り出した（ＯＴＯＦ Ｎ末端ウイルスおよびＯＴＯＦ Ｃ末端ウイルス）。２つのコンストラクトを、ＡＡＶ２粒子中へと別々にパッケージ化した。ＡＡＶ２粒子を、つぎに、一緒にプールし、HEK 293細胞を処置するのに使用したか、またはＯＴＯＦノックアウトマウスの内耳中へと注射した。
HEK 293細胞は、両方のウイルスでトランスフェクトされたときにのみオトフェルリンタンパク質を発現したということが示された（図４）。未処置の細胞においては、またはＯＴＯＦ Ｎ末端（図４）もしくはＯＴＯＦ Ｃ末端ウイルスのみでトランスフェクトされた細胞においては、オトフェルリンタンパク質の発現は観察されなかった。
【００８９】
次に、ＡＡＶ２の、マウスの蝸牛に形質導入をする能力を、ＡＡＶ２−ＧＦＰレポーターウイルスを使用して評価した。ＡＡＶ２は、内有毛細胞（ＩＨＣ）、外有毛細胞（ＯＨＣ）、柱細胞（Ｐ）および他の指示細胞（ＳＣ）を包含する数々の細胞タイプをトランスフェクトするということが示された（図５）。よって、ＡＡＶ２は、マウスの蝸牛に、効果的に形質導入をすることができる。
【００９０】
マウスを、次に、プールされたＯＴＯＦ Ｎ末端およびＣ末端ウイルスで処置し、および様々なコントロールと比較した。オトフェルリンタンパク質は、両方のウイルスでの処置で発現することが見出された（図６）。トランスフェクトされた内有毛細胞（ＩＨＣ）の最大の数は、基底において観察され、中回転および頂においてはより少数であった（図６）。ＩＨＣの計数は、全体としてほぼ１１％のＩＨＣが標識されており、基底（ほぼ２９％）、中回転（ほぼ８％）、および頂（ほぼ２％）の間で有意な違いが見られたということを実証した（図６）。ＲＴ−ＰＣＲを使用したことで、ＯＴＯＦ ｍＲＮＡが全蝸牛抽出物中にあり、および、野生型と、両方のウイルスで処置されたＯＴＯＦノックアウトマウスとの両方において同じサイズであったということが示された（図６）。対照的に、未処置のＯＴＯＦノックアウトマウスの蝸牛では、ＯＴＯＦ ｍＲＮＡ発現が実証されなかった。逆転写酵素の非存在下でＲＴ−ＰＣＲを行ったときには、産物は検出されなかった。
【００９１】
次に、ＮおよびＣ末端ウイルスの両方の送達によって発現したオトフェルリンに聴力機能をレスキューする能力があったかどうかを決定するために、聴力試験を行った。野生型と、両方のウイルスで処置されたＯＴＯＦノックアウトマウスとからのＡＢＲ波形は類似しており、レスキューされたＫＯマウスにおける聴力回復を立証したが、他方、未処置のＯＴＯＦノックアウトマウスコントロール、およびＯＴＯＦ Ｎ末端ウイルスだけでトランスフェクトしたＯＴＯＦノックアウトマウスは、聴力回復を示さなかった（図７）。Ｐ７０では、両方のウイルスで処置されたＯＴＯＦノックアウトマウスにおいて、部分的な聴力回復（改善されたＡＢＲ閾値）がクリックに対しておよび特定の周波数８、１６および３２ｋＨｚで見られ、とはいえ８および１６ｋＨｚではＡＢＲ閾値はわずかに上昇したように見えたが、それでもなお、未処置のＯＴＯＦノックアウトマウスよりも有意に良好であった（図７）。 注目すべきことに、ＡＢＲ閾値に若干変動はあったものの、両方のウイルスで処置されたＯＴＯＦノックアウトマウス（ＫＯ ＮＴ＋ＣＴ）においては４か月を超えて聴力が維持された（図７）。トランスフェクトされていないＫＯコントロール、およびＯＴＯＦ ＮＴでトランスフェクトされたＫＯは、難聴のままであった（図７）。
【００９２】
次に、Ｐ１２よりも高齢のＯＴＯＦノックアウトマウスを、両ウイルスで処置した。二重にトランスフェクトされたＩＨＣは、ＯＴＯＦを発現し、これには基底（図示せず）と頂（図８）とで均一なトランスフェクション率が見られた。ＩＨＣの計数は、全体としてほぼ４１％のＩＨＣが標識されており、基底（ほぼ３８％）、中回転（ほぼ４２％）、および頂（ほぼ４７％）の間でわずかな違いが見られたということを実証した（図８）。
【００９３】
Ｐ６０では、両方のウイルスで処置された全てのＯＴＯＦノックアウトマウスは、クリック刺激に対する正常なＡＢＲ閾値を実証し、とはいえ特定の周波数８、１６および３２ｋＨｚでは、ＡＢＲ閾値はわずかに上昇したように見えたが、それでもなお、未処置のＯＴＯＦノックアウトマウスよりも有意に良好であった（図９）。Ｐ１２より高齢のＯＴＯＦノックアウトマウスへの両方のウイルスの注射に続く聴力回復の経時変化は、処置されたマウスにおいて聴力が３０週間以上維持され、およびＡＢＲ閾値が、ＷＴのレベルまで復元されたということを示した（図９）。
【００９４】
これらの結果は、ＯＴＯＦ ｃＤＮＡの異なる部分を送達するための１つより多いＡＡＶコンストラクトの使用が、in vivoにおける機能的なｃＤＮＡをもたらすことができるということを実証する。これらの結果はまた、ＡＡＶ送達系を使用したＯＴＯＦ ｃＤＮＡの送達によって聴力喪失を処置することができるということも実証する。
【００９５】
例２：ヒトＯＴＯＦ二重ベクターコンストラクト
下記に提供されるのは、ヒトオトフェルリンタンパク質アイソフォーム１および５を発現させるための二重ベクター配列の例である。両アイソフォーム１および５をコードするｃＤＮＡは、両アイソフォームを発現させるために同じＮ末端ベクターを使用することができるように、同じＮ末端配列を含有する。下記の配列に対応するベクターマップおよびアノテーションされた配列は、図１０〜１５に示される。
【００９６】
ｐＴＲ２２−ｓｍＣＢＡ−オトフェルリンＮＴ Ｈｓ ｖａｒ １＋５−ＡＰＳＤ−ＡＰｈｅａｄ
【化１２−１】
2020518268.tif 000025
【化１２−２】
2020518268.tif 000026
【化１２−３】
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【化１２−４】
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【００９７】
ｐＴＲ２２−ＡＰｈｅａｄ−ＡＰＳＡ−オトフェルリンＣＴ Ｈｓ ｖａｒ １
【化１３−１】
2020518268.tif 000029
【化１３−２】
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【化１３−３】
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【化１３−４】
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【化１３−５】
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【００９８】
ｐＴＲ２２−ＡＰｈｅａｄ−ＡＰＳＡ−オトフェルリンＣＴ Ｈｓ ｖａｒ ５
【化１４−１】
2020518268.tif 000034
【化１４−２】
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【化１４−３】
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【化１４−４】
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【化１４−５】
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【００９９】
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【０１０１】
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【０１０３】
他の態様
本明細書に開示されているすべての特徴は、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本明細書に開示されている各特徴は、同じ、同等、または類似の目的を果たす代替の特徴によって置き換えられてもよい。よって、別様に明示的に述べられていない限り、開示された各特徴は、包括的な一連の同等または類似の特徴の一例にすぎない。
上記の説明から、当業者は本開示の本質的な特徴を容易に確認することができ、その趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な使用および条件に適合させるために開示の様々な変更および修正をすることができる。よって、他の態様も特許請求の範囲内にある。
【０１０４】
均等物
本明細書ではいくつかの発明の態様が説明され、例示されたが、当業者は、機能を実行し、および／または結果を得るための様々な他の手段および／または構造および／または本明細書に説明した利点のうちの１つ以上を容易に想到するであろう。かかる変形および／または修正の各々は、本明細書に記載の発明の態様の範囲内にあるとみなされる。より一般的には、当業者は、本明細書に記載のすべてのパラメータ、寸法、材料、および構成が例示的であることを意味し、実際のパラメータ、寸法、材料、および／または構成は発明の教示が使用されている特定の用途（単数または複数）に依存することを容易に理解するであろう。当業者であれば、本明細書に記載の特定の発明の態様に対する多くの均等物を認識し、または日常的な実験のみを用いて確かめることができるであろう。したがって、前述の態様は例としてのみ提示され、添付の特許請求の範囲およびその均等物の範囲内で、発明の態様は具体的に説明および特許請求の範囲に記載されるもの以外の方法で実施され得ることを理解されたい。本開示の発明の態様は、本明細書に記載されている個々の特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法のそれぞれに関する。さらに、かかる特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法が互いに矛盾していない場合、かかる特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法の２つ以上の任意の組み合わせも本開示の発明の範囲内に含まれる。
【０１０５】
本明細書で定義および使用されるすべての定義は、辞書の定義、参照により組み込まれる文書中の定義、および／または定義された用語の通常の意味を支配すると理解されるべきである。
本明細書に開示されているすべての参考文献、特許および特許出願は、それぞれが引用されている主題に関して参照により組み込まれており、場合によっては文書の全体を包含し得る。
本明細書および特許請求の範囲で使用される不定冠詞「a」および「an」は、そうでないことが明確に示されていない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。
【０１０６】
本明細書および特許請求の範囲で使用される「および／または」なる句は、そのように結合された要素、すなわち場合によっては結合的に存在し、他の場合には分離的に存在する要素の「いずれかまたは両方」を意味すると理解されるべきである。「および／または」で列挙された複数の要素は、同じように、すなわち、そのように結合された要素の「１つ以上」であるものと解釈されるべきである。具体的に識別された要素に関連しているかどうかにかかわらず、「および／または」なる節によって具体的に識別された要素以外の他の要素が任意に存在してもよい。よって、非限定的な例として、「含む」などのオープンエンド言語と共に使用されるときの「Ａおよび／またはＢ」への言及は、一態様において、Ａのみ（任意にＢ以外の要素を含む）を、別の態様では、Ｂのみ（任意にＡ以外の要素を含む）を、さらに別の態様では、ＡとＢの両方（任意に他の要素を含む）等を指し得る。
【０１０７】
本明細書および特許請求の範囲で使用されるように、「または」は、上記で定義されたような「および／または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リスト内の項目を分離するとき、「または」または「および／または」は包括的、すなわち、少なくとも１つを含むが、複数の数またはリストの要素も含み、任意にリストに含まれていない追加の項目も含むものとして解釈されるものとする。「のうちの１つのみ」または「のうちの正確に１つ」、または、特許請求の範囲で使用される場合「からなる」などの反対に明確に示された用語のみが、正確に１つの数の要素または要素のリストの包含を指すであろう。一般に、本明細書で使用される「または」という用語は、「どちらか」、「の１つ（one of）」、「の１つのみ（only one of）」、または「の正確に１つ（exactly one of）」などの排他性の用語が先行するときに排他的な選択肢（すなわち「一方または他方、両方ではない」）を示すと解釈されるに過ぎない。「から本質的になる（consisting essentially of）」は、特許請求の範囲において使用されるとき、特許法の分野において使用されるその通常の意味を有するものとする。
【０１０８】
明細書および特許請求の範囲で使用されるように、１つ以上の要素のリストに関する句「少なくとも１つ」は、要素のリストにおける任意の１つ以上の要素から選択される少なくとも１つの要素を意味すると理解されるべきであるが、必ずしも要素のリスト内に具体的に列挙された各要素の少なくとも１つおよびすべての要素を含まず、要素のリストにおける要素の任意の組み合わせを除外しない。この定義はまた、「少なくとも１つ」という句が指す要素のリスト内で具体的に識別された要素以外の要素が、具体的に識別されたそれらの要素に関係するか関係しないかに関わらず、任意に存在し得ることを可能にする。よって、非限定的な例として、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」（または同等に「ＡまたはＢの少なくとも１つ」、または同等に「Ａおよび／またはＢの少なくとも１つ」）は、一態様において、少なくとも１つ（任意に１つより多いものを含む）のＡ（Ｂは存在しない（そして、任意にＢ以外の要素を含む））を、別の態様において、少なくとも１つ（任意に１つより多いものを含む）のＢ（Ａは存在しない（そして、任意にＡ以外の要素を含む））を、さらに別の態様において、少なくとも１つ（任意に１つより多いものを含む）のＡ、および、少なくとも１つ（任意に１つより多いものを含む）のＢ（そして、任意に他の要素を含む）等を指し得る。
【０１０９】
反対に明確に示されていない限り、１つより多いステップまたは行為を含む特許請求の範囲の任意の方法において、方法のステップまたは行為の順序は、必ずしも方法のステップまたは行為が列挙されている順序に限定されないことも理解されるべきである。
特許請求の範囲ならびに上記の明細書において、「含む（comprising）」、「含む（including）」、「保有する（carrying）」、「有する（having）」、「含有する（containing）」、「伴う（involving）」、「保持する（holding）」、「から構成される（composed of）などのすべての移行句は、オープンエンドである、すなわち、限定するものではないが含むことを意味すると理解されるべきである。「からなる（consisting of）」および「から本質的になる（consisting essentially of）」という移行句のみが、それぞれ、米国特許庁の特許審査手続、第2111.03節に記載されているように、クローズまたはセミクローズの移行句であるものとする。
【図１Ａ】
2020518268.tif 000039
【図１Ｂ】
2020518268.tif 000040
【図２】
2020518268.tif 000041
【図３Ａ−１】
2020518268.tif 000042
【図３Ａ−２】
2020518268.tif 000043
【図３Ａ−３】
2020518268.tif 000044
【図３Ｂ−１】
2020518268.tif 000045
【図３Ｂ−２】
2020518268.tif 000046
【図３Ｂ−３】
2020518268.tif 000047
【図４】
2020518268.tif 000048
【図５】
2020518268.tif 000049
【図６Ａ−６Ｂ】
2020518268.tif 000050
【図６Ｃ−６Ｄ】
2020518268.tif 000051
【図７Ａ】
2020518268.tif 000052
【図７Ｂ】
2020518268.tif 000053
【図７Ｃ】
2020518268.tif 000054
【図７Ｄ】
2020518268.tif 000055
【図８Ａ−８Ｂ】
2020518268.tif 000056
【図９Ａ−９Ｂ】
2020518268.tif 000057
【図１０】
2020518268.tif 000058
【図１１】
2020518268.tif 000059
【図１２】
2020518268.tif 000060
【図１３−１】
2020518268.tif 000061
【図１３−２】
2020518268.tif 000062
【図１３−３】
2020518268.tif 000063
【図１４−１】
2020518268.tif 000064
【図１４−２】
2020518268.tif 000065
【図１４−３】
2020518268.tif 000066
【図１５−１】
2020518268.tif 000067
【図１５−２】
2020518268.tif 000068
【図１５−３】
2020518268.tif 000069
【配列表】
2020518268000001.app
【国際調査報告】
2020518268.tif 000070
2020518268.tif 000071
2020518268.tif 000072