(57)【要約】  本発明は、ＣＤ６リガンドである活性化白血球細胞接着分子（ＡＬＣＡＭ）とのＣＤ６の相互作用を遮断することなくＣＤ６のＳＲＣＲドメイン１（Ｄ１）に結合するヒト化ＩｇＧ１抗ＣＤ６モノクローナル抗体（Ｔ１ｈ）を使用する、狼瘡の処置のために有用な組成物および方法に関する。【選択図】図１
2020503251.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において狼瘡を処置するための組成物であって、ＣＤ６へのＡＬＣＡＭの結合を妨げることなくＣＤ６のドメイン１（Ｄ１）に結合する抗ＣＤ６モノクローナル抗体（Ｔ１ｈ）を含み、ここで、抗ＣＤ６モノクローナル抗体は、配列番号１および配列番号２のアミノ酸配列を含み、およびここで、抗ＣＤ６モノクローナル抗体は、対象における狼瘡の症候を低減させるための治療有効量である、前記組成物。
【請求項２】
狼瘡が、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、皮膚エリテマトーデス、中枢神経系（ＣＮＳ）狼瘡、新生児エリテマトーデス、小児期全身性エリテマトーデス、薬剤誘発性エリテマトーデス、または結果として狼瘡症状をもたらす補体欠損症候群を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
狼瘡の症候が、心血管症状、肺症状、肝臓症状、血液学的症状、胃腸症状および／または筋骨格症状を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
抗ＣＤ６モノクローナル抗体が、Ｔ細胞の活性化を低減させるかまたは防止する、Ｔ細胞増殖を阻害する、および／または補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）の誘導を低減させる、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
抗ＣＤ６モノクローナル抗体が、配列番号３および配列番号４を含むヌクレオチド配列、またはそれらと少なくとも９０％同一性を有し、配列番号１および配列番号２をコードするヌクレオチド配列、によってコードされる、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
非経口投与による送達のために製剤化された、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
薬学的に許容し得る担体をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
抗ＣＤ６モノクローナル抗体が、化学療法剤、免疫抑制性剤、抗マラリア薬、細胞毒性剤、インテグリン拮抗薬、サイトカイン拮抗薬、またはホルモンと組み合わせられる、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
免疫抑制剤が、プレドニゾン、メトトレキサート、アザチオプリンまたはシクロホスファミドである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
治療有効量が、対象の体重あたり約０．０１〜約１００ｍｇ／ｋｇである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
抗ＣＤ６モノクローナル抗体が、炎症促進性サイトカインの低減を引き起こす、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
対象において狼瘡を処置するための方法であって、ＣＤ６へのＡＬＣＡＭの結合を妨げることなくＣＤ６のドメイン１（Ｄ１）に結合する抗ＣＤ６モノクローナル抗体（Ｔ１ｈ）を投与することを含み、ここで、抗ＣＤ６モノクローナル抗体は、配列番号１および配列番号２のアミノ酸配列を含み、およびここで、抗ＣＤ６モノクローナル抗体は、処置される対象における狼瘡の症候を低減させるための治療有効量である、前記方法。
【請求項１３】
狼瘡が、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、皮膚エリテマトーデス、中枢神経系（ＣＮＳ）狼瘡、新生児エリテマトーデス、小児期全身性エリテマトーデス、薬剤誘発性エリテマトーデス、または結果として狼瘡症状をもたらす補体欠損症候群を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
狼瘡の症候が、心血管症状、肺症状、肝臓症状、血液学的症状、胃腸症状および／または筋骨格症状を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
抗ＣＤ６モノクローナル抗体が、Ｔ細胞の活性化を低減させるかまたは防止する、Ｔ細胞増殖を阻害する、および／または補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）の誘導を低減させる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
抗ＣＤ６モノクローナル抗体が、配列番号３および配列番号４を含むヌクレオチド配列、またはそれらと少なくとも９０％同一性を有し、配列番号１および配列番号２をコードするヌクレオチド配列、によってコードされる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
抗ＣＤ６モノクローナル抗体が、非経口送達により投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
抗ＣＤ６モノクローナル抗体を薬学的に許容し得る担体と組み合わせることをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
抗ＣＤ６モノクローナル抗体が、化学療法剤、免疫抑制性剤、抗マラリア薬、細胞毒性剤、インテグリン拮抗薬、サイトカイン拮抗薬、またはホルモンと組み合わせられる、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
治療有効量が、対象の体重あたり約０．０１〜約１００ｍｇ／ｋｇである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項２１】
抗ＣＤ６モノクローナル抗体が、炎症促進性サイトカインの低減を引き起こす、請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
対象が、狼瘡以外の自己免疫疾患を有しない、請求項１２に記載の方法。
【請求項２３】
抗ＣＤ６モノクローナル抗体の治療有効量を対象に投与することを含む、抗核抗体（ＡＮＡ）および／または抗二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）抗体のレベルが上昇した対象患者においてＴ細胞の活性化を低減する方法であって、抗ＣＤ６モノクローナル抗体が、配列番号１および配列番号２のアミノ酸配列を含む、前記方法。
【請求項２４】
治療有効量が、対象の体重あたり約０．０１〜約１００ｍｇ／ｋｇである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
抗ＣＤ６モノクローナル抗体が配列番号１および配列番号２のアミノ酸配列を含む、狼瘡の処置のために有用な医薬の製造における抗ＣＤ６モノクローナル抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胸腺上皮細胞、単球、活性化Ｔ細胞および種々の他の細胞種の表面に存在するＣＤ６のスカベンジャー受容体システインリッチ（ＳＲＣＲ）ドメイン１（Ｄ１）に結合するヒト化ＩｇＧ１アイソタイプ抗ＣＤ６モノクローナル抗体（Ｔ１ｈ）に関する。本発明はさらに、ＣＤ６リガンドである活性化白血球細胞接着分子（ＡＬＣＡＭ）とのＣＤ６の相互作用を遮断することなくＴ細胞の増殖を阻害する方法に関する。それはまた、ＣＤ６のＳＲＣＲドメイン１（Ｄ１）に結合する抗ＣＤ６モノクローナル抗体を使用した狼瘡の処置のために有用な組成物および方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト全身性自己免疫疾患の原型である狼瘡は、種々広範な多臓器損傷によって特徴づけられる。それは、結合組織を攻撃する抗体が関与している自己免疫疾患である。この疾患には、１００万人近くの米国人、主として２０〜４０歳の間の女性が、罹患していると推計される。狼瘡の主な形は、全身性のもの（全身性エリテマトーデス；ＳＬＥ）であり、抗核抗体の生産、循環免疫複合体、および補体系の活性化と関連している。
【０００３】
ＳＬＥの発病機序は依然としてよく理解されていないが、一方、Ｂ細胞、Ｔ細胞および単球は、疾患の進行において不可欠な役割を担うことに関係しているということが、知られている。具体的には、ポリクローナルＢ細胞およびＴ細胞活性化の著しい増大があり、かかる増大は、種々の自己抗原に対するＴ細胞および抗体応答の発生によって特徴づけることができる。Ｔ細胞の活性化は、ある特定のエピトープに対する自己反応性Ｂ細胞の生産を刺激して、次に他のエピトープへ広がることができるということが理論立てられている。かかる抗体応答は、上で述べたとおり、抗核抗体（ＡＮＡ）および抗二本鎖ＤＮＡ抗体などの自己抗原に対する自己抗体の生産を包含し得る。
【０００４】
ＳＬＥは、不利益なプロセス／経路への拮抗または有益なプロセス／経路への刺激のいずれかにより免疫応答を調整することによって処置することができる。免疫刺激活性を有する分子を阻害する中和抗体を使用すること、または免疫応答を直接的に阻害することは、免疫関連疾患を改善するための有効な手だてである。
【０００５】
ＣＤ６は、ヒトＴ細胞、およびＢ細胞のサブセットにより主に発現し、ならびにいくらかのＢ細胞性慢性リンパ性白血病およびニューロンにより主に発現する、重要な細胞表面タンパク質である。ＣＤ６は、Ｉ型マクロファージのスカベンジャー受容体システインリッチドメイン（ＳＲＣＲ）に相同である少なくとも１つのドメインを有することによって特徴づけられるタンパク質の大規模なファミリーのメンバーである。抗ＣＤ６モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を使用した遮断研究は、ＣＤ６が、胸腺上皮（ＴＥ）細胞とのＴ細胞接着相互作用を調節することによって、Ｔ細胞発生において重要な役割を担うということを提案する。
【０００６】
追加の研究は、ＣＤ６が、Ｔ細胞活性化において重要なアクセサリー分子（accessory molecule）として機能することができることを示している。例えば、特定の抗ＣＤ６ｍＡｂは、Ｔ細胞に対して直接的にマイトジェニックであり［１，２］、これに対して、他のものは、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２またはホルボール１２ミリスタート１３アセタート（ＰＭＡ）と連動してＴ細胞増殖を共刺激することが可能である［１，３，４］。Ｔ細胞活性化におけるＣＤ６の役割の、なおも追加の証拠は、Ｔ細胞活性化に続いて、ＣＤ６がＳｅｒおよびＴｈｒ残基で過剰なリン酸化を生じ［５，６，７］、およびＴｙｒ残基でリン酸化を生じる［８］ということを示す研究から来る。これらおよびその他の研究は、Ｔ細胞活性化およびシグナル変換の両方に影響を及ぼす、in vivoでの未熟および成熟Ｔ細胞機能の両方の重要なモジュレーターとして、ＣＤ６を関係させている。
【０００７】
成熟ＣＤ６タンパク質の細胞外ドメインは、３つのＳＲＣＲドメイン（これ以降において、Ｄ１、Ｄ２、およびＤ３と称する）から構成される。Ｄ３が対応するのは、膜近位ＳＲＣＲドメインであり、短い３３アミノ酸のストーク領域（stalk region）がこれに続く。これらの細胞外ドメインは、短い膜貫通ドメインを介して細胞膜にアンカリングされており、可変の長さの細胞質ドメインがこれに続く［１９］。
【０００８】
ヒトＩｇＧ１定常ドメインと融合したＣＤ６の選択された細胞外ドメインを含有するＣＤ６−免疫グロブリン融合タンパク質（ＣＤ６−Ｒｇｓ）を使用した研究は、「活性化白血球細胞接着分子」（ＡＬＣＡＭ）と称されるＣＤ６リガンドの同定およびクローニングに導いた［１１，１２］。ＡＬＣＡＭは、膜近位ＳＲＣＲドメインに対応するＣＤ６のドメイン３と結合する［１３］。
【０００９】
Ｔ細胞調節におけるＣＤ６／ＡＬＣＡＭ相互作用の役割の研究は、この受容体−リガンド対が、ＣＤ６を発現する細胞の胸腺上皮細胞への接着を媒介することが可能であることを示している［１２］。これおよびその他の証拠は、ＣＤ６／ＡＬＣＡＭ相互作用がＴ細胞の発生および活性化を調整するために重要であるということを提案する。
【００１０】
ＣＤ６の機能的特性評価は不完全なままであるにも関わらず、抗ＣＤ６ｍＡｂは、骨髄からＴ細胞およびＴ細胞前駆体を除去するために首尾よく臨床の場に適用されている。これらの知見は、ＣＤ６が、Ｔ細胞の機能をin vivoで調整することにおける重要な役割を担うという仮説を、さらに支持する。ＣＤ６はまた、初期または後期のＴ細胞−抗原提示細胞（ＡＰＣ）相互作用を媒介する免疫学的シナプスの一部であることも報告されている。［１４］
【００１１】
米国特許第６，３７２，２１５号は、ヒトＣＤ６（ｈＣＤ６）のＳＲＣＲドメイン３（Ｄ３）またはヒトＣＤ６ストークドメイン（ＣＤ６Ｓ）に特異的に結合し、ＣＤ６への活性化した白血球細胞接着分子（ＡＬＣＡＭ）の結合を阻害する、抗体およびその他の結合剤を開示する。
【００１２】
先行する刊行物および特許は、マウス抗ＣＤ６（ＩＯＲ−Ｔ１）モノクローナル抗体の配列、および、ＩＯＲ−Ｔ１をＴ１ｈ（ヒト化ＩＯＲ−Ｔ１）へヒト化するために実施したアミノ酸改変を開示した。米国特許第５，７１２，１２０号およびそれに対応する欧州特許第０６９９７５５号は、マウスモノクローナル抗体をヒト化するための具体的な方法、ならびにＩＯＲ−Ｔ１およびＴ１ｈの配列を開示する。米国特許第６，５７２，８５７号およびそれに対応する欧州特許第０８０７１２５号は、ＩＯＲ−Ｔ１およびＴ１ｈ（ヒト化ＩＯＲ−Ｔ１）の配列を開示している。Roque-Navarro文献［１５］は、マウスモノクローナル抗体をヒト化するための具体的な方法、ならびにＩＯＲ−Ｔ１およびＴ１ｈの配列について論じている。「A Monoclonal Antibody and a Method Thereof」と題されたＰＣＴ／ＩＮ２００８／００５６２は、多発性硬化症、移植拒絶反応および移植片対宿主病などの自己免疫疾患の処置としてＣＤ６の標的化について論じている。
【００１３】
狼瘡の処置のための改良された治療方法および組成物の、差し迫った必要性がある。現在のところ、狼瘡は、典型的には、コルチコステロイドおよび免疫抑制剤を用いて処置されている。いくつかの態様においては、リンパ球を有意に枯渇させる抗体が使用され、他の態様においては、リンパ球は枯渇させられない。ＣＤ６へのＡＬＣＡＭの結合を妨げることなくＣＤ６、Ｄ１ドメインに結合することによりＴ細胞活性化を阻害する抗ＣＤ６モノクローナル抗体であって、狼瘡を処置し、狼瘡型疾患において通常起こるＴ細胞の増殖を阻害する能力を有する、抗ＣＤ６モノクローナル抗体を提供することが、有益となる。
【発明の概要】
【００１４】
本発明は、Ｔ細胞の活性化を低減または防止し、Ｔ細胞増殖を阻害し、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）の誘導を低減させ、および、ＣＤ６に活性化白血球細胞接着分子（ＡＬＣＡＭ）が結合することを妨げることなくＣＤ６のドメイン１（Ｄ１）に結合する、抗ＣＤ６モノクローナル抗体（Ｔ１ｈ）に関し、ここで、抗ＣＤ６モノクローナル抗体は、配列番号１および配列番号２のアミノ酸配列またはそれらと少なくとも９７％同一性を有する配列を含む。
【００１５】
１つの側面において、本発明は、狼瘡を処置する方法を提供し、方法は、配列番号１および配列番号２のアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる抗ＣＤ６モノクローナル抗体の治療有効量を、狼瘡による影響を患っている対象へ投与することを含む。
【００１６】
本発明の方法は、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、皮膚エリテマトーデス、中枢神経系（ＣＮＳ）狼瘡、心血管症状、肺症状、肝臓症状、血液学的症状、胃腸症状、筋骨格症状、新生児エリテマトーデス、小児期全身性エリテマトーデス、薬剤誘発性エリテマトーデス、抗リン脂質抗体症候群、または、結果として狼瘡症状をもたらす補体欠損症候群を、限定することなく包含する、狼瘡の症状または系の１つ以上を有する対象を処置するために使用することができる。
【００１７】
別の側面において、本発明は、配列番号１および配列番号２のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ６モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチド、アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを包含するベクター、およびベクターを包含する宿主細胞を提供する。細胞は、真核細胞（例として、ヒト、マウス、サルまたはウサギの細胞などの哺乳動物性）であってもよく、または原核細胞（例として、E. coli細胞などの細菌細胞）であってもよい。
【００１８】
なおも別の側面において、本発明は、対象において狼瘡を処置する方法を提供し、方法は、配列番号１および配列番号２のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ６モノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントを対象へ投与することを含み、ここで、抗ＣＤ６モノクローナル抗体の使用は、炎症促進性サイトカインの低減を示す。
【００１９】
本発明の別の側面は、配列番号１および配列番号２のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ６モノクローナル抗体を使用する、炎症状態を調整するための方法を提供する。モノクローナル抗体は、化学療法剤、免疫抑制性剤、抗マラリア薬、細胞毒性剤、インテグリン拮抗薬、サイトカイン拮抗薬、またはホルモンと組み合わせられてもよい。
【００２０】
免疫抑制剤は、プレドニゾン、メトトレキサート、アザチオプリンまたはシクロホスファミドを包含し得る。重要なことに、本件の抗ＣＤ６モノクローナル抗体の投与は、免疫抑制剤の量の低減を提供し、それによって、他の潜在的病因に対する体の防御を弱める可能性があり、これにより対象が感染およびその他の潜在的に致死性の疾患、例えばがんなどに極めて罹りやすくなるという免疫抑制剤の悪影響を回避する。
【００２１】
別の側面において、本発明は、本発明の抗ＣＤ６モノクローナル抗体の治療有効量を患者へ投与することを含む、抗核抗体（ＡＮＡ）および／または抗二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）抗体のレベルが上昇した対象においてＴ細胞の活性化を低減する方法もまた提供する。
【００２２】
なおもさらなる側面において、本発明は、抗ＣＤ６抗体の治療有効量を、少なくとも第２の化合物と組み合わせて、患者へ投与することを含む、それを必要とする狼瘡の患者を処置する方法もまた提供する。第２の化合物は、典型的には、狼瘡を処置するのに使用される治療剤、例えば、標準治療または実験的な処置である。この発明の併用療法において、抗ＣＤ６抗体および追加の治療剤は、患者にとって適当であれば、あらゆる順序で投与することができる。抗ＣＤ６抗体および追加の剤（単数または複数）は、同時にまたは連続的に投与することができる。例えば、追加の剤（単数または複数）は、抗ＣＤ６治療の前または後に投与することができる。この発明においては、かかる併用療法のために有用なキットもまた提供される。
【００２３】
本発明の別の側面は、配列番号３に記述されたヌクレオチド配列またはその相補体；および（ｂ）配列番号４に記述されたヌクレオチド配列またはその相補体を含む核酸分子、によってコードされる重鎖および軽鎖を含む、ＣＤ６のスカベンジャー受容体システインリッチ（ＳＲＣＲ）ドメイン１（Ｄ１）に特異的に結合するモノクローナル抗体を提供する。
【００２４】
本発明のさらに別の側面は、狼瘡の処置のために有用な医薬の製造における上記の抗ＣＤ６抗体の使用を提供する。
本発明の別の側面は、狼瘡以外の自己免疫疾患を有しない対象に対する処置方法を提供する。
【００２５】
さらなる側面において、本発明は、（ａ）本発明の抗ＣＤ６モノクローナル抗体を含む容器；および（ｂ）対象において狼瘡を処置するための指示を伴う添付文書、を含む製造物を提供し、ここで、指示は、狼瘡の悪影響を低減させることを提供するのに有効である量の抗体が対象へ投与されることを示唆する。
本発明の上記およびその他の目的および側面は、本明細書における図面および下記に記述される仕様において、詳細に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、正常およびＳＬＥのマウスのリンパ節の外観検査を示す：ＳＬＥのマウス（右のパネル）は、腫れたリンパ節（矢印でマークした）および肥大した唾液腺を示す。
【図２】図２は、臓器重量およびリンパ節腫脹の比較を示す：動物（ｎ＝６）を、６０もしくは６００μｇのα−ｍＣＤ６または６０μｇのラットＩｇＧ（アイソタイプ対照）を用いて腹腔内（ｉ．ｐ．）にて１０日間（用量あたり３週間、１日おきに）処置した。研究の最後に、リンパ節腫脹（ａ）を測定し（スケール０〜３；リンパ節の腫れが低程度／なし〜重度）、および臓器重量を測定した（ｂ〜ｄ）。リンパ節腫脹スコア（ａ）、ならびに脾臓（ｃ）および唾液腺（ｄ）のサイズにおいて、有意な低減が観察された（ｐ＜０．０５、一元配置ＡＮＯＶＡに続いて多重比較検定）。
【００２７】
【図３】図３は、細胞増殖アッセイの結果を示す：各群からのリンパ細胞の単一細胞懸濁液を、抗ｍＣＤ３に媒介される増殖に供した。α−ｍＣＤ６処置群は、抗ＣＤ３に媒介される増殖への有意な（ｐ＜０．０５、一元配置ＡＮＯＶＡに続いて多重比較検定）反応性低下を示した。
【図４】図４は、サイトカイン分析の結果を示す：Cytokine Bead Array（ＣＢＡ）分析によってサイトカイン放出を測定するために、増殖アッセイからの上清を使用する。α−ｍＣＤ６は、処置群（群は両方とも、分析の目的のために組み合わせられた）において、アイソタイプ群と比較してＩＦＮ−γの放出の有意な減少（ｐ＜０．０５；Mann-Whitney検定）を示した。ＴＮＦ−αもまた、アイソタイプ処置群と比較して処置群においてより低かったが、その差は統計的に有意ではなかった（ｐ＜０．０９）。
【００２８】
【図５】図５は、血清ＡＮＡおよび抗ｄｓ−ＤＮＡ抗体分析の結果を示す：ELISAを使用してＡＮＡおよび抗ｄｓ−ＤＮＡ抗体（１：１００希釈）を分析するために、アイソタイプおよびα−ｍＣＤ６処置マウスからの血清を使用する。
【図６】図６は、マウスの処置のための投薬レジメンを示す。
【図７Ａ】図７（Ａ）ＶＨ（配列番号３）およびＶｋ（配列番号４）の、プラスミドおよびゲノムＤＮＡに由来するＴ１ｈのヌクレオチド配列、
【図７Ｂ】（Ｂ）ＶＨ（配列番号１）およびＶｋ（配列番号２）のアミノ酸配列、
【図７Ｃ】（Ｃ）以前の刊行物に開示されているＶｋアミノ酸配列（配列番号５）の、この特許に開示されている配列（配列番号２）と比較して配列の違いを強調した比較。
【００２９】
【図８】図８は、Ｔ１ｈおよびＡＬＣＡＭ、またはＴ１ｈ単独の存在下におけるＣＤ６−Ｆｃが拘束されたプレートのＥＬＩＳＡの読取り値を示す。
【図９】図９は、リンパ球に対するＴ１ｈの用量依存性を棒グラフとして示す。図は、各種の濃度（５０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、１２.５μｇ／ｍｌ、６．２５μｇ／ｍｌ）での、ＰＨＡで活性化した（PHA activate）リンパ球に対するＴ１ｈの阻害の％を表す。ｈＲ３（非特異的抗体）を同じ濃度で使用した。
【図１０】図１０は、アラマーブルー（Alamar Blue）を使用したＣＤＣアッセイにおける、RituxanとＴ１ｈとの間の細胞毒性の倍数差（fold difference）を示す。
【００３０】
【図１１】図１１は、Ｔ１ｈ抗体（５μｇ／ｍｌ）、ｈＲ３抗体（５μｇ／ｍｌ）、およびラパマイシン（１．２μｇ／ｍｌ）または抗体なし（対照として）で処置したＨＵＴ７８細胞であって、ＣＯ２インキュベーター中で３７℃にて終夜インキュベートしたものについての、結果を示す。細胞を、次にアネキシンＶ（Annexin V）標識化溶液で処置し、これに続いてフローサイトメトリー分析を行った。アネキシンＶ ＦＩＴＣ対数値を横軸とし、ＰＩ／ＰＥテキサスレッドを縦軸とする。
【図１２】図１２は、Ｔ１ｈ抗体（１０μｇ／ｍｌ）、ｈＲ３（アイソタイプ対照）または抗体なし（対照として）でＰＢＭＣを処置し、ＣＯ２インキュベーター中で３７℃にて５日間インキュベートした結果を示す。インキュベーションの前に、細胞を破傷風トキソイドで刺激した。アラマーブルー色素を用いて増殖を測定した。Ｔ１ｈの存在下では、増殖の阻害は観察されなかった。
【００３１】
【図１３】図１３は、免疫蛍光により、Raji細胞が真のＢ細胞であり、およびＭＨＣ ＩＩ抗原も発現することを示す。
【図１４】図１４は、マイトマイシン処置されたRaji細胞の存在下でのＰＢＭＣの増殖性を示す。陽性対照は、ＰＨＡの存在下でＰＢＭＣが成長するということを示す。ｓＴ１ｈは、抗体なしまたはｈＲ３対照と比較してＴ細胞増殖を阻害する（ｔ検定により有意）。各実験結果は、６つの異なるウェルから得られた平均および標準偏差である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明の詳細な記載
本発明は、ＣＤ６のドメイン1（Ｄ１）に結合することを可能とし、ＡＬＣＡＭの結合を妨げることなくＴ細胞増殖を阻害する、抗ＣＤ６モノクローナル抗体を提供し、ここで、抗ＣＤ６モノクローナル抗体は、全身性の狼瘡に起因する炎症状態を低減させる。さらに、抗ＣＤ６モノクローナル抗体は、in vitroで補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を誘導しないことが見出されている。
【００３３】
本発明の実施は、他に指示しない限り、当分野の技術の範囲内である免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学および組み換えＤＮＡの、従来技術を採用する。例として、Sambrook, et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 第２版 (1989)；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, et al. eds., (1987))；METHODS IN ENZYMOLOGYのシリーズ (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson、B. D. HamesおよびG. R. Taylor eds. (1995)), HarlowおよびLane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, および ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1987))を参照。
【００３４】
定義
本明細書中において他に定義しない限り、本発明に関して使用する科学および技術用語は、当業者に普通に理解されている意味を有するものとする。さらに、別様に文脈から要求されない限り、単数形の用語は複数形を包含するものとし、複数形の用語は単数形を包含するものとする。
本発明を記載およびクレームすることにおいては、以下の専門用語を、本明細書中に定めた定義に従って使用する。
【００３５】
本明細書中において使用する「狼瘡」は、結合組織を攻撃する抗体が関与している自己免疫疾患または障害である。狼瘡の主な形は、全身性のもの、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）（皮膚ＳＬＥおよび亜急性皮膚ＳＬＥを包含する）、ならびに、他の狼瘡の型（腎炎、腎外（exfrarenal）、脳炎、小児、腎外性（non-renal）、円板状、および脱毛を包含する）である。
【００３６】
本明細書中において使用する「抗ＣＤ６抗体」は、一般的に、ヒトＣＤ６（ｈＣＤ６）のＳＲＣＲドメイン１（Ｄ１）に特異的に結合する抗体である。本発明の好ましい側面において、ネイティブおよび人工的に改変された抗体および抗体フラグメントを包含する、抗体およびその他の免疫グロブリンであって、ＣＤ６のヒトＳＲＣＲドメイン１に特異的に結合するが、ＣＤ６に活性化白血球細胞接着分子（ＡＬＣＡＭ）が結合することを妨げないものが提供される。
【００３７】
本明細書中において使用する「対象」は、ヒト対象である。一般的に、かかる対象は、狼瘡のための処置に適格である。本明細書中における目的のために、かかる適格な対象は、狼瘡の１つ以上の兆候、症候またはその他の指標を経験しているか経験した者、または、例えば、新たなフレアがあると新たに診断されたか、以前に診断されたか、または慢性ステロイド依存で新たなフレアがあるかを問わず、狼瘡と診断されている者、または、狼瘡を発生させるリスクを有する者である。
【００３８】
本明細書中において使用する、狼瘡を診断するために使用される「症候」またはその他の指標は、頬の紅斑、円板状紅斑、または赤い隆起した斑；日光に対する反応などの光過敏性；鼻内や口内における潰瘍などの口腔潰瘍；２つ以上の末梢関節が関与する非びらん性関節炎などの、関節炎；過剰な尿中タンパク質などの腎障害；癲癇（けいれん）などの神経学的兆候；および、溶血性貧血、白血球減少症、リンパ球減少症または血小板減少症などの血液学的症候を包含し得る。
【００３９】
本明細書中において使用する「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）は、実質的に同質である抗体の集団の抗体を指し；つまり、その集団中における個々の抗体は、少量存在し得る自然発生突然変異以外では同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原決定基「エピトープ」に対して向けられている。したがって、修飾語句「モノクローナル」は、同一のエピトープに向けられた実質的に同質である抗体の集団を意味するが、いかなる特定の方法による抗体の生産を要求すると解されるものでもない。当技術分野において知られているあらゆる手法または方法論によってモノクローナル抗体を作ることができることが理解されるべきであり；例として、当技術分野において知られている組み換えＤＮＡ法、またはファージ抗体ライブラリーを使用して組み換え技術により生産されたモノクローナルの単離の方法が包含される。
【００４０】
本明細書中において使用する「補体依存性細胞毒性」または「ＣＤＣ」は、補体の存在下で標的を溶解させる分子の能力を指す。補体活性化経路は、補体系の第１の構成成分の、同種抗原と複合体化した分子（例として、抗体）への結合によって開始する。
【００４１】
本明細書中において使用する「サイトカイン」は、別の細胞に対して細胞間メディエーター（intercellular mediators）として作用する１つの細胞集団から放出されるタンパク質の総称である。かかるサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン；ＩＬ−１、ＩＬ−ｌα、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５などのインターロイキン（ＩＬ）；ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−βなどの腫瘍壊死因子である。
本明細書中において使用する「成長阻害」抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞の増殖を、防止または低減させるものである。例えば、抗体は、in vitroおよび／またはin vivoにおいてＴ細胞の増殖を防止または低減させ得る。
【００４２】
本明細書中において使用する「治療有効量」は、所望の治療結果を達成するための、必要な投薬量および期間での、有効な量を指す。
本明細書中において使用する「自己免疫疾患」は、個体の自身の組織または臓器から生じ、およびそれらに対して向けられ、ならびに、自己抗原（例として、核抗原）からのエピトープに対して特異的である自己抗体の分泌などの、正常な体内組織および抗原と反応する抗体のＢ細胞による生産によってもたらされるか、またはそれらによって増悪する、疾患または障害である。
【００４３】
本明細書中において使用する、ある特定の抗体によるアポトーシス（プログラム細胞死）の決定であって、それらがアポトーシス（例として、Ｔ細胞の）を誘導するか誘導しないかは、アネキシンＶの結合、ＤＮＡの断片化、細胞萎縮、小胞体の拡張、細胞断片化、および／または膜ベシクル（アポトーシス体と呼ばれる）の形成などの標準アポトーシスアッセイにより決定することができる。
本明細書中において記載された本発明の側面は、「からなる」および「から本質的になる」という側面もまた包含することが理解される。
【００４４】
本発明の第１の側面によると、配列番号１および配列番号２を含む、ＣＤ６へのＡＬＣＡＭの結合を妨げることなくＣＤ６のＤ１ドメインに特異的に結合することを可能とする抗ＣＤ６モノクローナル抗体が提供される。抗ＣＤ６モノクローナル抗体をコードするヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号３および配列番号４を包含するか、または、ヌクレオチド配列は、それらと少なくとも９０％同一性を有し、配列番号１および配列番号２をコードする。
【００４５】
本発明の抗ＣＤ６モノクローナル抗体を生産するための方法
本発明はさらに、開示されている抗ＣＤ６抗体を生産するための方法を提供する。これらの方法は、本発明の抗体をコードする単離された核酸（単数または複数）を含有する宿主細胞を培養することを網羅する。当業者には当然認識される通り、これは、抗体の性質に応じて種々のやり方によって行うことができる。
【００４６】
一般に、本発明の抗体をコードする、核酸が提供される。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡの形とすることができる。ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、核酸類似体、および合成ＤＮＡの形でのポリヌクレオチドは、本発明の範囲内にある。ＤＮＡは、二重鎖または一重鎖であり得、一重鎖であれば、コード（センス）鎖または非コード(アンチセンス)鎖であり得る。抗ＣＤ６モノクローナル抗体をコードするコード配列は、本明細書中において提供されるコード配列と同一であり得、または、その配列が、遺伝子コードの重複もしくは縮退の結果として、本明細書中において提供されるＤＮＡと同じポリペプチドをコードする、異なるコード配列であり得る。
【００４７】
いくつかの態様において、本発明の抗ＣＤ６モノクローナル抗体をコードする核酸（単数または複数）は、染色体外であるかまたはそれが導入される宿主細胞のゲノム中へと組み入れられるように設計されたものであり得る、発現ベクター中へと組み込まれている。発現ベクターは、いくつもの適切な調節配列（転写および翻訳制御配列、プロモーター、リボソーム結合部位、エンハンサー、複製の起点等を包含するが、これに限られない）または他の構成成分（選択遺伝子等）を含有することができ、それらの全てが、当技術分野においてよく知られているとおりに作動可能に（operably）連結している。
【００４８】
いくつかの場合において、２つの核酸が使用され、および各々が異なる発現ベクター中に（例として、重鎖が第１の発現ベクター中に、軽鎖が第２の発現ベクター中に）入れられるか、またはこれに代えて、それらが同じ発現ベクター中に入れられることができる。調節配列の選択を包含する、発現ベクター（単数または複数）の設計は、宿主細胞の選定、所望のタンパク質の発現のレベル等の、かかる因子に依存し得ることが、当業者には当然認識される。
【００４９】
一般に、核酸および／または発現は、選択された宿主細胞に適切なあらゆる方法（例として、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、感染）を使用して組み換え宿主細胞を作り出すために、核酸分子（単数または複数）が１つ以上の発現制御エレメントに（例として、ベクター中において、細胞中のプロセスによって作り出されるコンストラクト中、宿主細胞ゲノム中へと組み入れられて）作動可能に連結するように、適切な宿主細胞中へと導入されることができる。結果として生じる組み換え宿主細胞は、発現に適切である環境下（例として、インデューサーの存在下で、適切な非ヒト動物中において、適当な塩、増殖因子、抗生物質、栄養補助剤等を補充された適切な培地中において）で維持されることができ、これにより、コードされているポリペプチド（単数または複数）が生産される。いくつかの場合において、１つの細胞中で重鎖が生産され、別の１つの中で軽鎖が生産される。
【００５０】
組み換え宿主細胞中においてモノクローナル抗体の合成が得られるように、発現ベクターを、E. coli細胞、シミアンＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または、他のやり方では免疫グロブリンタンパク質を生産しない骨髄腫細胞などの宿主細胞中へとトランスフェクトすることができる。酵母、昆虫、および植物細胞もまた、組み換え抗体を発現するために使用することができる。いくつかの態様において、抗体は、ウシまたはニワトリなどのトランスジェニック動物において生産することができる。
【００５１】
抗体分子生物学、発現、精製、およびスクリーニングについての、一般的な方法は、例えば、Antibody Engineering、Kontermann & Dubel, Springer, Heidelbergによって編集、2001および2010年、において記載されている。
【００５２】
投与方法
以下に記載される使用の方法における投与のために、抗ＣＤ６モノクローナル抗体は、投与の前に、非毒性の薬学的に許容し得る担体物質（例として、生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水）と混合されてもよく、あらゆる医学上適当な手順、例として、非経口投与（例として、注入）、例えば静脈内または動脈内注入などによって投与されることとなる。
【００５３】
本発明に従って使用される抗ＣＤ６モノクローナル抗体の処方物は、所望の純度を有する抗体を、任意に、凍結乾燥製剤または水溶液のいずれかの形での薬学的に許容し得る担体、賦形剤または安定化剤とともに、混合することによって調製し得る。
【００５４】
許容し得る担体、賦形剤または安定化剤は、採用される投薬量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンなどを包含する抗酸化物質；塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムなどの保存料；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノールおよびｍ−クレゾール；低分子（約１０よりも少ない残基の）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノースまたはデキストリンを包含する単糖類、二糖類、およびその他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例として、Ｚｎ−タンパク質錯体）；および／またはTWEEN（商標）、PLURONICS（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤、を包含する。
【００５５】
抗ＣＤ６モノクローナル抗体はまた、コアセルベーション手法により、または界面重合により、例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ（メチルメタクリラート）マイクロカプセルで、それぞれ、コロイド薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）中においてまたはマイクロエマルジョン中において、調製されたマイクロカプセル中に封入されてもよい。かかる手法は、当技術分野においてよく知られている。
【００５６】
徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の適切な例は、抗ＣＤ６モノクローナル抗体を含有する固体の疎水性ポリマーの半透過性のマトリックスであって、そのマトリックスが、成形品、例として、フィルムまたはマイクロカプセルの形であるものを包含する。徐放性マトリックスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル、Ｌ−グルタミン酸のコポリマー、非分解性酢酸エチレンビニルおよび分解性乳酸−グリコール酸コポリマーを包含する。
【００５７】
抗ＣＤ６モノクローナル抗体は、対象に、ボーラスでまたはある期間にわたる持続注入によっての静脈内投与、筋肉内、腹腔内、脳髄腔内、皮下、関節内、滑液内、クモ膜下腔内、または経口経路などの知られている方法に沿って投与され得る。抗ＣＤ６モノクローナル抗体の静脈内または皮下投与が、好ましい。
【００５８】
本発明による狼瘡関連疾患の処置は、使用される抗ＣＤ６モノクローナル抗体の「治療有効量」を包含する。注目すべきことに、治療有効量は、個体の病状、年齢、性別、および体重、ならびに個体において所望の応答を引き出すための抗ＣＤ６モノクローナル抗体の能力などの因子によって変動し得る。
【００５９】
投薬レジメンは、最適な所望の応答（例として、治療反応）を提供するように加減される。例えば、単回のボーラスが投与されてもよく、複数の分割用量が時間をかけて投与されてもよく、または用量が、治療状況の緊急事態により示唆されるとおりに比例的に低減させられるかもしくは増大させられてもよい。本発明において使用される抗ＣＤ６モノクローナル抗体のための効率的な投薬量および投薬レジメンは、狼瘡型疾患の重症度に依存し、および当業者によって決定され得る。
【００６０】
本発明において使用する抗ＣＤ６モノクローナル抗体の治療有効量の、例示の、限定されない範囲は、対象の体重あたり約０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．０１〜５０ｍｇ／ｋｇなど、例えば、約０．０１〜２５ｍｇ／ｋｇである。当技術分野における通常の技術を有する医療専門家は、要求される医薬組成物の有効量を容易に決定し、処方し得る。例えば、医師は、抗ＣＤ６モノクローナル抗体の用量を、所望の治療効果を達成するために必要なそれよりも低いレベルで始めて、所望の効果が達成されるまで投薬量を徐々に増大させることができる。
【００６１】
１つの態様において、抗ＣＤ６モノクローナル抗体は、対象の体重あたり１〜５００ｍｇ／ｋｇ、例えば２０〜２００ｍｇ／ｋｇなどの週間投薬量で、注入により投与される。かかる投与は、繰り返されてもよく、例として、１〜８回、例えば３〜５回などである。代替において、投与は、２〜２４時間の、例えば２〜１２時間などの期間にわたる、持続注入により行われてもよい。
【００６２】
１つの態様において、抗ＣＤ６モノクローナル抗体は、１０ｍｇ〜２００ｍｇの週間投薬量で、７回まで、例えば４〜６回など、投与される。投与は、２〜２４時間の、例えば２〜１２時間などの期間にわたる、持続注入により行われてもよい。かかるレジメンは、例えば６か月または１２か月後に、必要に応じて１回以上繰り返されてもよい。
【００６３】
以下の例は、本発明の理解を補助するために記述されているが、いかなるやり方でもその範囲を限定するものと意図するものではなく、またそのように解されてはならない。例は、アッセイ手順において採用されている従来型の方法についての詳細な記載を含んでいない。かかる方法は、当業者によく知られており、ほんの例として包含する多数の刊行物において記載されている。
【実施例】
【００６４】
例１
ＣＤ６は、リンパ球上に主に発現する共刺激分子であり、数多くの自己免疫疾患［１６，１７］と関連する。抗マウスＣＤ６（α−ｍＣＤ６）は、ＣＤ６のドメイン１に特異的に結合し、イトリズマブに対するサロゲート抗体である。この抗体を使用した以前の研究は、マウスにおける多発性硬化症についてのモデルであるＥＡＥ（実験的自己免疫性脳脊髄炎）の有意な改善を実証した。本研究において、抗体は、ヒトにおける狼瘡様疾患と関係のあるマウスモデルであるＭＲＬＦａｓ／ｌｐｒマウスにおいて評価される。
【００６５】
α−ｍＣＤ６処置は、アイソタイプ対照と比較して、リンパ節腫脹、脾臓および唾液腺の重量の有意な低減を示した（ｐ＜０．０５）。α−ｍＣＤ６処置された動物は、抗ＣＤ３に媒介されるＴ細胞増殖アッセイに対して、有意な低増殖（hypo proliferation）を、ＩＦＮ−γ（ｐ＜０．０４）およびＴＮＦ−α（ｐ＜０．０９）のような炎症促進性サイトカインの放出の同時の低減とともに示した。
【００６６】
ＭＲＬＦａｓ／ｌｐｒは、狼瘡様自己免疫疾患において使用される、よく知られた動物モデルである［１８〜２１］。このモデルは、Fas遺伝子に、主にＢおよびＴ細胞の増殖に影響を及ぼす自然発生突然変異を有する。この突然変異は、リンパ球の増殖を制御せずにアポトーシスを防止し、それによって、図１に示すとおり、リンパ節（リンパ節腫脹）、唾液腺および脾臓の大幅な肥大化を結果としてもたらす。このモデルはまた、ヒトにおけるループス腎炎に似た糸球体腎炎も示す［２２］。マウスにおいて、疾患発症は、第８週以降、第１６〜１８週の間の死亡に至るまでである［２０、２１］。
【００６７】
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）は、その大部分は中年女性が罹患する（女性と男性の比率９：１）自己免疫性炎症性疾患である。ＳＬＥの特徴は、皮膚発疹、関節痛、再発性の胸膜炎、および腎疾患を包含する。
【００６８】
この研究は、この狼瘡モデルにおけるα−ｍＣＤ６の使用を記載している。動物（群あたりｎ＝６、齢：１２週）を、６０および６００μｇ／用量のα−ｍＣＤ６または６０μｇのラットＩｇＧ（アイソタイプ対照）で、腹腔内経由にて（ｉ．ｐ．）１０日間（用量あたり３週間）処置した。動物を、１６週齢でサクリファイスした。試験方式は、図６に示されている。研究の最後に、以下のパラメーターを評価した：
・リンパ節腫脹の測定とこれに続く臓器の回収および研究の最後の評価
・研究の期間の間中に測定した蛋白尿
・研究終了時の採血
・リンパ節および脾臓を用いた増殖アッセイ。
・マウス血清からの抗核抗体および抗ｄｓＤＮＡ抗体測定。
・増殖アッセイからのサイトカイン分析。
【００６９】
結果：
α−ｍＣＤ６でのリンパ節腫脹の減少と、それに伴う関連する特定のリンパ器官の縮小。
図２に示すとおり、α−ｍＣＤ６抗体で処置した狼瘡マウスは、アイソタイプ対照と比較して、リンパ節腫脹スコアおよび臓器すなわち脾臓、唾液腺の重量の有意な低減を示した。群の間で、測定された蛋白尿、腎臓および胸腺のサイズには、差がなかった（データ示さず）。
【００７０】
α−ｍＣＤ６処置されたものは抗ＣＤ３に媒介される増殖への低応答性と、それに伴う関連する炎症促進性サイトカインの低減を示す
図３に示すとおり、α−ｍＣＤ６で処置した動物からのリンパ節由来細胞は、アイソタイプ処置群と比較して、抗ＣＤ３に媒介されるＴ細胞の増殖（ｐ＜０．０５）への低応答性を示しており、これは、おそらく疾患抑制と関連するであろうＴ細胞活性化の抑制を示唆している。
【００７１】
サイトカインは、ＳＬＥの発病機序においてメジャーな役割を担う［２３〜２６］。Ｔｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７サイトカインを、増殖アッセイからの上清から測定した。図４に示すとおり、α−ｍＣＤ６処置群は、対照群と比較して、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αのような炎症促進性サイトカインのより低い放出を示した。しかしながら、群間で評価した他のサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＩＬ−１７）における差はなかった。
【００７２】
α−ｍＣＤ６処置された動物は、Ｂ細胞応答に影響を与える可能性がある
抗核抗体（ＡＮＡ）および抗ｄｓ−ＤＮＡは、狼瘡疾患において一般的に観察される主要な自己抗体である。これもまた、この動物モデルにおいて観察される［１８、２０、２１、２７］。図５に示すとおり、α−ｍＣＤ６での処置は、アイソタイプ処置群と比較してマウス血清中におけるより少ないＡＮＡおよび抗ｄｓ−ＤＮＡ抗体を示した。低減は、しかしながら、統計的に有意ではなかった。
【００７３】
この初期用量設定研究において、６０および６００μｇ／用量の両方が、測定した物理的および生物学的エンドポイントにおいて、同等の有効性を示した。ゆえに、α−ｍＣＤ６抗体の使用は、このマウスモデルにおいて狼瘡様の症候を軽減することが可能であるということが示されている。
【００７４】
例２
ＥＬＩＳＡによると、Ｔ１ｈとＡＬＣＡＭはＣＤ６上の同じドメインに結合しない
ＣＤ６−Ｆｃで被覆されたＥＬＩＳＡプレート中で、様々な濃度のＡＬＣＡＭ−Ｆｃを、固定された濃度のＴ１ｈと一緒にインキュベートしたとき、Ｔ１ｈは全ての濃度のＡＬＣＡＭ−Ｆｃで検出された。この実験から、Ｔｈ１が、ＡＬＣＡＭ結合ドメイン（ドメイン３）とは異なるドメインに結合するということが提案された。
【００７５】
ｒｈＣＤ６ＦＣ／キメラ（R and D systems）（１００μｇ／ｍｌ）をコーティング緩衝液中で希釈し、１００μｌを９６ウェルNunc-Maxisorpプレートの各ウェルに加えた。プレートを、次に、４℃にて終夜インキュベートした。プレートをＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。その後、２００μｌのブロッキング溶液（１×ＰＢＳ中の２％ＢＳＡ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）を加え、３７℃にて１時間インキュベートした。インキュベーション後に、プレートを再びＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄し、これに続いてＴ１ｈモノクローナル抗体（０．２ｍｇ／ｍｌ）および.ｒｈＡＬＣＡＭＦｃ（R and D systems）の様々な濃度での添加を行った。これを、次に、３７℃にて１時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ２０でその後３回洗浄した。
【００７６】
ウェルに、２００μｌの、ブロッキング緩衝液中で希釈した抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ）２ＡＬＰ（１：２００００）を加え、３７℃にて１時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄し、２００μｌのｐ−ニトロフェニルリン酸（ＰＮＰＰ）基質を各ウェルに加え、３７℃にて、およそ１５分で発色するまでインキュベートした。BIOTEK Micro Plate Readerを使用して、４０５ｎｍで読取り値を取った。実験は、様々な濃度のＡＬＣＡＭの存在は、ＣＤ６受容体へのＴ１ｈの結合を防止しないということを示唆する。図８に示すとおり、ＡＬＣＡＭとＴ１ｈとの競合がないことは、両者についての結合ドメインが異なるということを提案する。
【００７７】
例３
ＣＦＳＥを使用したフローサイトメトリーによるリンパ球増殖阻害 
ＰＢＭＣを採取し、ＰＢＳ中で洗浄した。細胞（７．５×１０６）を、１ｍｌの、ＰＢＳ中における濃度２μＭのカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）中に再懸濁させた。細胞を、厳密に３７℃で１０分間インキュベートした。１０ｍｌのRoswell Park Memorial Institute培地（ＲＰＭＩ）、１０％ＦＢＳを加えることで反応を止めた。細胞を、１０ｍｌのＰＢＳで２回洗浄した。細胞調製物を、次に、１．５×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で、５ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁させ、２００μｌを各ＢＤ ＦＡＣＳチューブに加えた。２００μｌの所要および非特異的抗体を各種の濃度（それぞれ５０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、１２．５μｇ／ｍｌおよび６．２５μｇ／ｍｌ）で加え、３７℃で３０分間インキュベートした。
【００７８】
２ｍｌのＰＢＳを各チューブに加え、未結合の抗体を洗い落とすために、ＲＴにて５分間、１２００ＲＰＭで遠心分離した。各チューブ中のペレットに、１ｍｌのＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳを加えた。各チューブに、増殖を刺激するために、１ｍｌのＲＰＭＩ １０％ＦＢＳ中におけるＰＨＡ ２０μｇ／ｍｌを加えた。チューブ中の合計体積は２ｍｌであり、ＰＨＡの最終濃度は１０μｇ／ｍｌであった。チューブをボルテックスし、ＣＯ２インキュベーター中で３７℃にて３日間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、５分間、４℃にて１２００ＲＰＭでスピンダウンした。上清を捨て、５００μｌの１×ＰＢＳ中に再懸濁させた。およそ２００事象／秒で合計２００００の事象を取得し、ＦＩＴＣチャネルで見た。
【００７９】
阻害の％＝｛［ＰＨＡ−（Ｔ１ｈ＋ＰＨＡ）］／ＰＨＡ｝＊１００
（ここで、ＰＨＡ＝ＰＨＡ−細胞単独
ＰＨＡ＋Ｔ１ｈ＝（ＰＨＡ＋Ｔ１ｈ）−細胞単独
ＰＨＡ＋ｈＲ３＝（ＰＨＡ＋ｈＲ３）−細胞単独）
細胞単独は、ＣＦＳＥ＋細胞 である。
【００８０】
これらのデータは、Ｔ１ｈ抗体が、ＰＨＡで刺激されたリンパ球の増殖の阻害を用量依存的な様式で媒介するということを提案する。阻害率は、正常な個体間の生来の変動に起因して、個体間で変動し得る。しかしながら、全体として、図９に示すとおり、ＰＨＡで刺激されたリンパ球の用量依存的な阻害は、Ｔ１ｈで観察されたが、非特異的抗体ｈＲ３では観察されなかった。
【００８１】
例４
Ｔ１ｈは補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を媒介しない
アラマーブルー(レサズリン)に基づいたアッセイは、抗体の、細胞殺滅を促進する能力を測定するために使用される。これは、それによって補体を固定および活性化させて標的細胞溶解を結果としてもたらす細胞表面抗原への抗体の結合によって誘導される。レサズリンは、還元されると色が青色からピンク色へ変化する酸化還元活性色素である。
【００８２】
全血からのプールしたヒト血清（最小３（minimum three））を滅菌チューブ中に回収し、血液を室温で少なくとも４時間凝固させ、およびこれを２０分間、９００ｇで遠心分離する。血清を採取し；分注して−８０℃で保管した。標的細胞（Wil-2S／ＨＵＴ−７８）を希釈緩衝液中で洗浄し、２×１０５細胞／ｍｌまで再懸濁させた。抗体を希釈緩衝液中で、最終的な所望の濃度の４×として希釈した。補体を、所望の最終濃度の４×として希釈した（すなわち、１：１０の最終濃度に対しては、１：２．５希釈）。各５０μＬの希釈した抗体、希釈した補体、および５０μＬの細胞懸濁液（１０，０００細胞／ウェル）を、９６ウェル平底プレートの各ウェルに加えた。
【００８３】
以下の対照ウェルを含めた：標的細胞＋Ａｂ単独（自発的細胞死）、標的細胞＋血清単独（バックグラウンドの溶解）、および標的細胞＋１０％ＳＤＳ（細胞死の最大値のため）。陽性対照は、異なる濃度でのRituxanで処置したWil-2S細胞とした。９６ウェルプレートを、３７℃にて２時間インキュベートした。５０μＬ／ウェルのアラマーブルーを各ウェルに加え、プレートを３７℃にて終夜インキュベートした。蛍光を、分光光度計Biotek Synergy（商標）ＨＴで５３０ｎｍ励起、５９０ｎｍ発光、および感度＝３５にて測定した。結果は、図１０に示すとおり、Ｔ１ｈがRituxanと比較してＣＤＣを誘導しないということを提案する。ゆえに、この実験からの結果は、抗ＣＤ６モノクローナル抗体は、ＣＤ６を発現する細胞株、つまりＨＵＴ７８において、ＣＤＣを誘導しないということを決定的に証明する。
【００８４】
例５
Ｔ１ｈはＨＵＴ７８細胞においてアポトーシスを誘導しない
アポトーシスの特質の１つは、原形質膜の内部から外部へのホスファチジルセリン（ＰＳ）の移行である。アポトーシス細胞と壊死細胞との区別のために、アネキシンＶフルオレセインおよびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を使用することにより、アポトーシス細胞膜の外葉についてのホスファチジルセリンの分析が行われる。
【００８５】
アネキシンＶは、ホスファチジルセリンに対して高い親和性を持つ、Ｃａ２＋依存性のリン脂質結合タンパク質である。ＰＩは、明確な壊死細胞に結合し、一方、アネキシンＶフルオレセインは、アポトーシス細胞に結合する。この方法は、アポトーシスおよび壊死の細胞集団を区別するのに役立つ。早期アポトーシスの集団は、アネキシンＶのみ陽性であり、一方、後期アポトーシスは、アネキシンＶおよびＰＩの両方が陽性である。
【００８６】
細胞を採取し、１．５ｍｌの３．３×１０５細胞／ｍｌ（最終的な細胞：５×１０５細胞）を、各３５ｍｍディッシュ中に播種した。それぞれのディッシュに、要求される量の抗体を加え、（５μｇ／ｍｌ）の最終濃度にした。対照ディッシュ中には、抗体を加えなかった。陽性対照として、細胞を、１．２μｇ／ｍｌのラパマイシンとともにインキュベートした。細胞を、５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃にて終夜インキュベートした。細胞を、次に、ＦＡＣＳチューブＢＤ Falcon カタログ番号：352054へと移し、室温（ＲＴ）にて５分間、１２００ＲＰＭで遠心分離した。上清を捨て、２ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁させ、ＲＴにて５分間、１２００ＲＰＭで遠心分離した。
【００８７】
上清を捨て、１００μｌのアネキシンＶフルオレセイン標識化溶液を加え、ＲＴにて１０〜１５分間インキュベートした。細胞を、２ｍｌのＰＢＳで洗浄し、５分間、１２００ＲＰＭで遠心分離した。次に、上清を捨てた。細胞を、０．５ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁させ、励起４８８ｎｍでフローサイトメーター（３０００個の細胞をゲーティングした）により取得した。試料は、アネキシンＶに関してＦＩＴＣチャネルで、ＰＩに関してＰＥテキサスレッドチャネルで、読み取った。ラパマイシン処置アームにおけるアネキシンＶ単独およびＰＩ単独の試料に、補償が可能となるようにランを行った。
【００８８】
Ｔ１ｈで処置したＨＵＴ７８細胞は、アネキシンＶ ＦＩＴＣチャネルにおける未処置対照とほぼ等しい４０％のアポトーシスを示した。未処置および非特異的抗体（ｈＲ３抗体）処置細胞は、３５．３％および３６．５％のアポトーシスをそれぞれ示し、一方、陽性対照のラパマイシンは、５４．３％のアポトーシスを示した。図１１に示すとおり、このデータは、Ｔ１ｈがＨＵＴ７８細胞においてアポトーシスを媒介しないということを提案する。
【００８９】
例６
破傷風トキソイド媒介性Ｔ細胞増殖アッセイにおいてはＴ１ｈによるメモリーＴ細胞の阻害はない
ＰＢＭＣを、Ficoll-Paque（Amersham、カタログ番号：17-14403-03)、密度勾配遠心分離により単離した。軟膜を、健常ドナーから取得し、常に新鮮な状態で採取した。ＰＢＭＣを、次に、ＰＢＳ（Invitrogen）中で洗浄した。ＰＢＭＣを、次に、０．３×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で、５％ＦＢＳを補充した２ｍｌのＲＰＭＩ培地中に再懸濁させた。細胞を、次に、Ｔ１ｈ １０μｇ／ｍｌおよび非特異的対照として使用するｈＲ３とともにまたはそれなしで、滅菌ＢＤ ＦＡＣＳ ５ｍｌチューブ中で３０分間インキュベートした。
【００９０】
インキュベーション後に、細胞をボルテックスし、１００μｌの細胞懸濁液をそれぞれのウェルに加えた。１００μｌの破傷風トキソイド（カタログ番号582231、CALBIOCHEM）（１０μｇ／ｍｌ）希釈標準溶液（５％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ培地）をそれぞれのウェルに加えることで、メモリーＴ細胞増殖を刺激した。プレートを、ＣＯ２インキュベーター中で３７℃にて５日間インキュベートした。６５μｌのアラマーブルーを各ウェルに加え、ＣＯ２インキュベーター中で３７℃にて終夜インキュベートした。蛍光を、分光光度計Biotek Synergy（商標）ＨＴで５３０ｎｍ励起、５９０ｎｍ発光、および感度＝３５にて測定した。
【００９１】
図１２に記述されたとおりの実験結果は、破傷風トキソイドはＴ細胞の増殖を用量依存的な様式で刺激するが、Ｔ１ｈはこれらの細胞の増殖の阻害を全く示さない、ということを示す。これは、Ｔ１ｈがメモリーＴ細胞増殖を阻害しないことを強く提案している。循環メモリーＴ細胞増殖が影響されず、Ｔ１ｈ療法を受けている患者が感染に罹りやすくならないため、これはＴ１ｈ療法にとって好都合である。
【００９２】
例７
Ｔ１ｈは、ＰＢＭＣおよびRaji細胞により媒介される混合リンパ球反応においてＴ細胞増殖を阻害する
Raji／ＰＢＭＣ細胞を採取して、１×ＰＢＳ中に再懸濁させた。８×１０５細胞／ｍｌのRaji細胞／ＰＢＭＣを、１ｍｌのマイトマイシン（２５μｇ／ｍｌ）中に再懸濁させた。細胞を、ＣＯ２インキュベーター中で３７℃にて３０分間インキュベートした。インキュベーション後に、２ｍｌの５％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩを各チューブに加え、マイトマイシンを取り除くために、ＲＴにて５分間、１２００ＲＰＭで遠心分離した。上清を捨て、再度、２ｍｌの５ＦＢＳ添加ＲＰＭＩを加えて遠心分離した。上清を捨て、細胞をＲＰＭＩ培地中に再懸濁する。
【００９３】
５０μｌのＰＢＭＣ（４×１０５細胞／ｍｌ）を、９６ウェル丸底プレートのそれぞれのウェルに加えた。１００μｌの抗体希釈物Ｔ１またはｈＲ３（１０μｇ／ｍｌ）をそれぞれのウェルに加え、ＣＯ２インキュベーター中で３７℃にて３０分間インキュベートした。５０μｌのマイトマイシン処置されたRaji細胞（４×１０５細胞／ｍｌ）を、それぞれのウェル中へと加えた。アッセイとともに、包含された対照は、マイトマイシン処置されたRaji細胞単独、ＰＢＭＣ単独、マイトマイシン処置されたRaji細胞＋ＰＨＡ、ＰＢＭＣ＋ＰＨＡ、マイトマイシン処置されたRajiおよびＰＢＭＣであった。
【００９４】
プレートを、ＣＯ２インキュベーター中で３７℃にて５日間インキュベートした。６５μｌのアラマーブルーを各ウェルに加え、ＣＯ２インキュベーター中で３７℃にて終夜インキュベートした。蛍光を、分光光度計Biotek Synergy（商標）ＨＴで５３０ｎｍ励起、５９０ｎｍ発光、および感度＝３５にて測定した。結論として、図１３および１４の結果を参照して、Ｔ１ｈは、Raji細胞が抗原提示細胞およびＰＢＭＣである一方向ＭＬＲを特異的に阻害することができることが観察された。
【００９５】
参考
本明細書中において引用されている全ての参考文献の内容は、ここに全ての目的のために参照により本明細書中に組み込まれる。
【００９６】
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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