(57)【要約】  本発明は、癌及び感染性疾患を有する対象を効果的に処置するために、ＩＬ−１５ベースのスーパーアゴニスト複合体と、抗体とを用いる併用治療を特徴とする。
2020512361.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において新生物又は自己免疫疾患又は炎症性疾患を処置するための方法であって、
前記対象に、１）有効量の抗ＣＤ３８抗体（又は抗体様分子）と、２）有効量のＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα複合体とを投与することを含み、
それにより、前記新生物又は自己免疫疾患又は炎症性疾患を処置する方法。
【請求項２】
前記ＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα複合体が、二量体ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ分子と、２つのＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ分子との間の複合体（ＡＬＴ−８０３）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗ＣＤ３８抗体（又は抗体様分子）及び前記ＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα複合体が互いに併用して投与される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα複合体を含む医薬組成物が投与される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記抗体（又は抗体様分子）又は前記ＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα複合体の投与の前、投与中又は投与の後に、前記対象にステロイドを投与することをさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ステロイドが、副腎皮質ステロイド、解熱薬及び抗ヒスタミン薬を含む群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ分子が配列番号３を含む、請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃが配列番号６を含む、請求項２〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記新生物が、血液癌、Ｂ細胞新生物、多発性骨髄腫（ＭＭ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ及びＴ急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、ヘアリー細胞白血病、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、原発性全身性アミロイドーシス、マントル細胞リンパ腫、ＮＫ細胞性白血病、ＮＫ又はＴ細胞リンパ腫、形質細胞白血病、Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、及び固形腫瘍からなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
有効量の前記ＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα複合体が毎日、１週間に１回若しくは２回、又は１か月に１回若しくは２回投与される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα複合体の有効量が０．１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの間である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記医薬組成物が全身的、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、膀胱内に、又は点滴によって投与される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗ＣＤ３８抗体が、ダラツムマブ、イサツキシマブ（ＳＡＲ６５０９８４）、又はＭＯＲ２０２である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記対象において腫瘍又は自己免疫／炎症関連免疫細胞に対して前記抗体により媒介される抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）又は抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）が、前記投与の後に少なくとも５％増強される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体（又は抗体様分子）及びＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα複合体が、血中のＮＫ細胞、Ｔ細胞、好中球、マクロファージ、樹状細胞又は単球の数値又は活性のレベルを増大させる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体（又は抗体様分子）及び前記ＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα複合体がＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激して、腫瘍又は自己免疫／炎症関連免疫細胞を死滅させる、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗体（又は抗体様分子）及び前記ＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα複合体がＮＫ細胞を刺激して、腫瘍又は自己免疫／炎症関連免疫細胞を死滅させる、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗体（又は抗体様分子）及び前記ＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα複合体が好中球又は単球細胞を刺激して、腫瘍又は自己免疫／炎症関連免疫細胞を死滅させる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗体（又は抗体様分子）及び前記ＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα複合体の投与が腫瘍又は自己免疫／炎症関連免疫細胞の数の減少をもたらす、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗体（又は抗体様分子）及び前記ＡＬＴ−８０３の投与が前記新生物又は自己免疫疾患又は炎症性疾患の疾患進行の低減をもたらす、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗体（又は抗体様分子）及び前記ＡＬＴ−８０３の投与が、未処置の対象と比較して、前記対象の生存期間の延長をもたらす、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記対象がヒトである、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗体（又は抗体様分子）及び前記ＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα複合体が同時又は逐次的に投与される、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記投与が、前記新生物又は自己免疫疾患又は炎症性疾患の将来的な再発を防止又は低減する、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
新生物の処置のためのキットであって、
１）抗ＣＤ３８抗体（又は抗体様分子）と、
２）ＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα複合体と、
３）自己免疫疾患又は炎症性疾患の処置のための前記キットの使用説明書と
を含むキット。
【請求項２６】
自己免疫疾患又は炎症性疾患の処置のためのキットであって、
１）１）抗ＣＤ３８抗体（又は抗体様分子）と、
２）ＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα複合体と、
３）自己免疫疾患又は炎症性疾患の処置のための前記キットの使用説明書と
を含むキット。
【請求項２７】
１）抗ＣＤ３８抗体（又は抗体様分子）と、２）ＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα複合体とを含む医薬組成物。
【請求項２８】
前記ＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα複合体が、二量体ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ分子と、２つのＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ分子との間の複合体（ＡＬＴ−８０３）を含む、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載のキット又は医薬組成物。
【請求項２９】
ＣＤ３８抗原を発現する罹患細胞又は疾患関連細胞を処置するための方法であって、
免疫細胞を有効量のＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα複合体で処置することと、
前記ＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα複合体で処置した免疫細胞を、抗ＣＤ３８抗体、及びＣＤ３８抗原を発現する罹患細胞又は疾患関連細胞と混合することと
を含む方法。
【請求項３０】
前記処置及び混合が前記罹患細胞又は疾患関連細胞の死滅をもたらす、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα複合体が、二量体ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ分子と、２つのＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ分子との間の複合体（ＡＬＴ−８０３）を含む、請求項２９又は３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記罹患細胞又は疾患関連細胞の死滅のレベルが、ＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα複合体で処置しなかった免疫細胞により媒介されるレベルと比較して、少なくとも５％増大される、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
ＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα複合体で処置した免疫細胞が、前記罹患細胞又は疾患関連細胞を直接死滅させる、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
ＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα複合体で処置した免疫細胞が他の免疫細胞を刺激して、前記罹患細胞又は疾患関連細胞を死滅させる、請求項２９〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記罹患細胞又は疾患関連細胞の死滅が、前記ＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα複合体で処置した免疫細胞及び前記抗ＣＤ３８抗体によるＡＤＣＣ又はＡＤＣＰによって媒介される、請求項２９〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記罹患細胞が腫瘍細胞である、請求項２９〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記疾患関連細胞が自己免疫疾患又は炎症性疾患に関連する、請求項２９〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年３月３１日に出願された米国仮特許出願第６２／４８０，３３９号、及び２０１８年３月２７日に出願された米国特許出願第１５／９３７，４９３号の利益を主張するものであり、これらの全内容は、参照によってその全体が本明細書中に援用される。
【０００２】
本発明は、一般に、癌及び自己免疫疾患及び炎症性疾患の処置のための治療法の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
本明細書に記載される発明の前は、癌に対する免疫活性を増強及び／又は方向付けするため、並びに自己免疫疾患及び炎症性疾患を改善するために、新しい戦略の開発が差し迫って必要とされていた。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、少なくとも一部分において、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）スーパーアゴニスト突然変異体と、二量体ＩＬ−１５受容体α／Ｆｃ融合タンパク質との複合体であるＡＬＴ−８０３と併用した抗ＣＤ３８抗体が、新生物（例えば、血液癌、Ｂ細胞新生物、多発性骨髄腫（ＭＭ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ及びＴ急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、ヘアリー細胞白血病、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、原発性全身性アミロイドーシス、マントル細胞リンパ腫、ＮＫ細胞性白血病、ＮＫ又はＴ細胞リンパ腫、形質細胞白血病、Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、及び固形腫瘍）に対する免疫応答を強化するため、又は抗体関連自己免疫疾患及び炎症性疾患（例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、血管炎、自己免疫性血球減少、関節リウマチ、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、移植片対宿主病及びアレルギー反応）に関連する免疫応答を抑制するために有用であるという驚くべき発見に基づく。
【０００５】
対象において新生物又は自己免疫疾患又は炎症性疾患を処置するための方法は、有効量の抗ＣＤ３８抗体（又は抗体様分子）と、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ複合体（ＡＬＴ−８０３）を含む有効量の医薬組成物とを対象に投与することによって実行され、ここで、ＡＬＴ−８０３は、二量体ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ及び２つのＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ分子を含む。１つの態様では、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ分子は配列番号３を含む。例示的なＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃは配列番号６を含む。
【０００６】
対象は、好ましくは、このような処置を必要としている哺乳類、例えば、新生物若しくは自己免疫疾患若しくは炎症性疾患又はこれらの素因を有すると診断された対象である。哺乳類は、任意の哺乳類、例えば、ヒト、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、並びに家畜又は食糧消費のために飼育される動物、例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ニワトリ、及びヤギである。好ましい実施形態では、哺乳類はヒトである。
【０００７】
本明細書に記載される方法で処置するのに適した新生物には、血液癌、Ｂ細胞新生物、多発性骨髄腫（ＭＭ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ及びＴ急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、ヘアリー細胞白血病、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、原発性全身性アミロイドーシス、マントル細胞リンパ腫、ＮＫ細胞性白血病、ＮＫ又はＴ細胞リンパ腫、形質細胞白血病、Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、及び固形腫瘍が含まれる。本明細書に記載される方法を用いて処置するための例示的な自己免疫疾患／炎症性疾患には、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、血管炎、自己免疫性血球減少、関節リウマチ、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、移植片対宿主病、重症のアレルギー反応及び喘息が含まれる（ｖａｎ  ｄｅ  Ｄｏｎｋ，ｅｔ  ａｌ．２０１６．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ．２７０：９５−１１２）。
【０００８】
好ましくは、本明細書に記載される組成物の投与は、疾患の処置後の新生物又は自己免疫疾患／炎症性疾患の将来的な再発も防止する。本明細書に記載される治療的アプローチは、デキサメタゾン、ボルテゾミブ、レナリドミド、サリドマイド、ボルテゾミブ／ドキシル、カルフィルゾミブ、ポマリドミド、パノビノスタット、エロツズマブ、イキサゾミブ、及びグリコシル化メルファランを含むがこれらに限定されない、ＭＭを処置するのに有効であることが示されている他の薬剤と併用されることもあり得る。本発明の処置アプローチは、以下の治療法：放射線、化学療法、手術、治療抗体、免疫調節薬、プロテアソーム阻害薬、ｐａｎ−ＤＡＣ阻害薬、Ｈ−ＤＡＣ阻害薬、チェックポイント阻害薬、養子細胞療法（ＣＡＲ  Ｔ及びＮＫ細胞療法を含む）、及びワクチンのいずれかと併用されることもあり得る。さらに、これらの治療法は、処置未経験の患者又は再発性若しくは難治性疾患を有する患者において使用され得る。
【０００９】
さらに、ＡＬＴ−８０３と抗ＣＤ３８Ａｂとの併用治療と共に、通常、ステロイド（すなわち、副腎皮質ステロイド、解熱薬及び抗ヒスタミン薬）による前投薬及び後投薬戦略が使用される。抗ＣＤ３８Ａｂの投与は著しい注入反応をもたらすことが多く、これは、処置を遅延又は終了させ、痛みを引き起こし、そして患者を不快にし得る。ステロイドはこれらの効果を低減するために使用されるが、治療効果のために必要な免疫応答を抑制する可能性もある。驚くことに、ＡＬＴ−８０３と抗ＣＤ３８Ａｂとの併用治療は、ステロイドによる前処置の存在下及び非存在下において、動物腫瘍モデルで同様に効果的であることが見出された。
【００１０】
ＡＬＴ−８０３の例示的な有効用量は、０．１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の間、例えば、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、若しくは９００μｇ／ｋｇ体重、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、若しくは１００ｍｇ／ｋｇ体重を含む。
【００１１】
一部の場合には、ＡＬＴ−８０３は、毎日、例えば、２４時間毎に投与される。又は、ＡＬＴ−８０３は、連続的又は１日数回、例えば、１時間毎、２時間毎、３時間毎、４時間毎、５時間毎、６時間毎、７時間毎、８時間毎、９時間毎、１０時間毎、１１時間毎、又は１２時間毎に投与される。
【００１２】
ＡＬＴ−８０３の例示的な有効１日用量は、０．１μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇ体重の間、例えば、０．１、０．３、０．５、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は９９μｇ／ｋｇ体重を含む。
【００１３】
或いは、ＡＬＴ−８０３は、１週間に約１回、例えば、７日に約１回投与される。又は、ＡＬＴ−８０３は、１週間に２回、１週間に３回、１週間に４回、１週間に５回、１週間に６回、又は１週間に７回投与される。ＡＬＴ−８０３の例示的な有効週用量は、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜４ｍｇ／ｋｇ体重の間、例えば、０．００１、０．００３、０．００５、０．０１．０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、又は４ｍｇ／ｋｇ体重を含む。例えば、ＡＬＴ−８０３の有効週用量は、０．１μｇ／ｋｇ体重〜４００μｇ／ｋｇ体重の間である。或いは、ＡＬＴ−８０３は、固定用量で、又は体表面積に基づいて（すなわち、１ｍ２当たりで）投与される。
【００１４】
一部の場合には、対象は、４週間のＡＬＴ−８０３静脈内投与と、その後の２週間の休薬期間とからなる６週間のサイクルを２回受ける。最終的に、担当医師又は獣医が適切な量及び投与計画を決定する。
【００１５】
本明細書に記載される組成物は、全身的、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、膀胱内に、又は点滴によって投与される。抗体及びＡＬＴ−８０３は、同時又は逐次的に投与され得る。
【００１６】
好ましくは、本発明の抗体（Ａｂ）は、ＣＤ３８タンパク質（サイクリックＡＤＰリボースヒドロラーゼ）上の１つ又は複数のエピトープに特異的に結合する。好ましい抗体は、齧歯類型、ヒト型、キメラ型及びヒト化型を含み得る重鎖及び軽鎖免疫グロブリン（Ｉｇ）タンパク質から構成される。さらに、本明細書に記載される方法は、抗体様分子、例えば、抗原結合ドメイン（例えば、単鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｔ細胞受容体結合ドメイン、リガンド結合ドメイン又は受容体結合ドメイン）を含む分子を利用し得る。一部の場合には、これらのドメインは、好ましくは、Ｆｃドメインに連結される。Ｉｇは、既知のアイソタイプ（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、及びＩｇＭ）のいずれかであり得る。抗ＣＤ３８Ａｂ（又は抗体様分子）を用いる本明細書に記載されるいくつかの用途では、Ａｂ（又は抗体様分子）は、Ｆｃ受容体と相互作用して抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び／又は抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）を媒介することができる重鎖又はＦｃドメインを含有する。他の場合には、エフェクター分子にコンジュゲートされた抗体が使用され得る。他の用途では、好ましいＡｂ（又は抗体様分子）は、ＡＤＣＣ又はＡＤＣＰを効果的に媒介することができない重鎖又はＦｃドメイン（例えば、ＩｇＧ４  Ｆｃ）を含有する。抗ＣＤ３８抗体は、ダラツムマブ（ＤＡＲＺＡＬＥＸ（登録商標））、イサツキシマブ（ＳＡＲ６５０９８４）、ＭＯＲ２０２、Ａｂ７９、ＡＢ１９、及びＭＴ−４０１９を含むが、これらに限定されない。
【００１７】
１つの態様では、インビトロ又はインビボで抗ＣＤ３８抗体処置にＡＬＴ−８０３を加えると、罹患細胞又は疾患関連細胞に対する免疫細胞の細胞傷害性が増大される。一部の場合には、ＡＬＴ−８０３は免疫細胞を刺激して、ＣＤ３８特異的抗体（又は抗体様分子）により媒介される腫瘍又は自己免疫疾患関連細胞に対するＡＤＣＣ又はＡＤＣＰ活性を増強することができる。一実施形態では、ＡＬＴ−８０３による免疫細胞の処置は、抗ＣＤ３８抗体により媒介される罹患細胞又は疾患関連細胞に対するＡＤＣＣ又はＡＤＣＰ活性を、少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも１００％増大させる。好ましい実施形態では、免疫細胞はＡＬＴ−８０３で処置され、抗ＣＤ３８抗体により媒介されるＡＤＣＣ又はＡＤＣＰによって腫瘍細胞を死滅させるために使用されるが、ここで、腫瘍細胞死のレベルは、ＡＬＴ−８０３で処置しなかった免疫細胞で見られるレベルよりも少なくとも５％高く、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも１００％高い。好ましい実施形態では、対象における腫瘍特異的ＡＤＣＣ又はＡＤＣＰは、ＡＬＴ−８０３及び抗体の投与後に、少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも１００％増強される。特定の実施形態では、ＮＫ細胞に基づくＡＤＣＣ活性は、ＡＬＴ−８０３処置によって増強される。
【００１８】
他の場合には、ＡＬＴ−８０３はＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激して、罹患細胞又は疾患関連細胞、例えば、腫瘍細胞又は感染細胞を死滅させる。好ましくは、ＡＬＴ−８０３処置は免疫細胞の細胞溶解活性を刺激し、抗ＣＤ３８抗体は疾患細胞を標的とし、従って、併用によりこれらの処置は、腫瘍又は自己免疫関連の免疫細胞に対して非常に有効及び／又は永続的な活性を提供する。いくつかの実施形態では、ＡＬＴ−８０３はインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）及び／又はＩＬ−６の血清レベルを増大させ、ＮＫ及びＴ細胞の増殖を刺激し、ＣＤ２５、ＣＤ６９、パーフォリン及びグランザイムを含む活性化マーカーのＮＫ及びＴ細胞発現を上方制御する。これらのマーカーの誘導は、罹患細胞に対する免疫細胞の応答性又は細胞溶解活性を強化し得る。例えば、本明細書に記載される方法はＮＫ細胞を刺激して、腫瘍又は自己免疫関連の免疫細胞を死滅させる。
【００１９】
他の実施形態では、ＡＬＴ−８０３は、好中球又は単球細胞を含む他の自然免疫細胞の活性及び／又はレベルを直接又は間接的に誘導する。このような細胞は、罹患細胞、例えば、腫瘍細胞に対する治療抗体のＡＤＣＣ及びＡＤＣＰを媒介することが知られている（Ｇｏｌａｙ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２０１３  １２２：３４８２−９１、Ｒｉｃｈａｒｄｓ，ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ２００８  ７：２５１７−２７）。好ましくは、ＡＬＴ−８０３及び抗ＣＤ３８抗体の併用治療は、少なくとも一部分において自然免疫細胞により媒介される機構によって、癌又は自己免疫疾患／炎症性疾患を有する患者において改善された臨床反応を提供する。例えば、本明細書に記載される方法は好中球又は単球細胞を刺激して、腫瘍又は自己免疫／炎症関連免疫細胞を死滅させる。一例では、ＡＬＴ−８０３は、サイトカイン、又はＡＤＣＰを含むマクロファージ応答を活性化する他の薬剤を産生するＮＫ細胞を刺激することができ、それにより、抗ＣＤ３８Ａｂにより媒介されるより有効な腫瘍細胞の死滅が提供される。
【００２０】
好ましくは、本明細書に記載される方法は、本明細書中の組成物の投与前の腫瘍又は自己免疫／炎症関連免疫細胞の数と比べて、腫瘍又は自己免疫／炎症関連免疫細胞の数の減少／低下をもたらす。或いは、本明細書に記載される方法は、新生物又は自己免疫疾患／炎症性疾患の疾患進行の低減をもたらす。好ましくは、本明細書に記載される方法は、未処置の対象と比較して、対象の生存期間の延長をもたらす。
【００２１】
また、新生物の処置のためのキットも提供され、本キットは、有効量のＡＬＴ−８０３と、抗体と、新生物の処置のためのキットの使用説明書とを含む。
【００２２】
自己免疫疾患又は炎症性疾患の処置のためのキットは、有効量のＡＬＴ−８０３と、抗体と、自己免疫疾患又は炎症性疾患の処置のためのキットの使用説明書とを含む。
【００２３】
本発明の可溶性融合タンパク質複合体の特定の態様では、ＩＬ−１５ポリペプチドは、天然ＩＬ−１５ポリペプチドとは異なるアミノ酸配列を有するＩＬ−１５変異体である。ヒトＩＬ−１５ポリペプチドは、本明細書では、ｈｕＩＬ−１５、ｈＩＬ−１５、ｈｕＩＬ１５、ｈＩＬ１５、ＩＬ−１５野生型（ｗｔ）及と呼ばれ、これらの変異体は、天然アミノ酸、成熟配列中のその位置及び変異体アミノ酸を用いて呼ばれる。例えば、ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄは、７２位におけるＮからＤへの置換を含むヒトＩＬ−１５を指す。１つの態様では、例えば、天然ＩＬ−１５ポリペプチドと比較して増大された、ＩＬ−１５ＲβγＣ受容体の結合活性によって実証されるように、ＩＬ−１５変異体はＩＬ−１５アゴニストとして機能する。或いは、例えば、天然ＩＬ−１５ポリペプチドと比較して低減されたＩＬ−１５ＲβγＣ受容体の結合活性によって実証されるように、ＩＬ−１５変異体はＩＬ−１５アンタゴニストとして機能する。
【００２４】
標的細胞を死滅させるための方法は、複数の細胞を抗体及びＡＬＴ−８０３と接触させ（ここで、複数の細胞は、さらに、ＩＬ−１５ドメインにより認識されるＩＬ−１５Ｒ鎖を有する免疫細胞か、又はＦｃドメインにより認識されるＦｃ受容体鎖を有する免疫細胞と、抗ＣＤ３８抗体により認識されるＣＤ３８抗原を有する標的細胞とを含む）、そして標的細胞を死滅させることによって実行される。例えば、標的細胞は、腫瘍細胞又は自己免疫疾患又は炎症性疾患に関連する免疫細胞である。
【００２５】
ＣＤ３８抗原を発現する罹患細胞を死滅させるための方法は、免疫細胞を有効量のＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ複合体（ＡＬＴ−８０３）で処置し、ＡＬＴ−８０３で処置した免疫細胞を、抗ＣＤ３８抗体、及びＣＤ３８抗原を発現する罹患細胞と混合し、ＡＬＴ−８０３で処置した免疫細胞及びＣＤ３８特異的抗体により媒介されるＡＤＣＣ又はＡＤＣＰによって罹患細胞を死滅させることによって実行される。本方法の１つの態様では、ＡＬＴ−８０３で処置した免疫細胞（すなわち、ＮＫ細胞）はマクロファージ活性化して、抗ＣＤ３８Ａｂによる腫瘍細胞に対するＡＤＣＰを媒介することができる。１つの態様では、罹患細胞の死滅のレベルは、ＡＬＴ−８０３で処置しなかった免疫細胞により媒介されるレベルと比較して、少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも１００％増大される。
【００２６】
また本発明は、患者の疾患を予防又は処置するための方法も提供し、ここで、罹患細胞はＣＤ３８抗原を発現し、本方法は、複数の細胞を抗ＣＤ３８抗体及びＡＬＴ−８０３と接触させるステップと、患者の疾患を予防又は処置するために十分な疾患細胞を損傷又は死滅させるステップとを含む。好ましい実施形態では、ＡＬＴ−８０３及び抗ＣＤ３８抗体による併用治療は疾患進行を低減する、及び／又は患者の生存期間を延長することができる。
【００２７】
本発明は、哺乳類に有効量の抗ＣＤ３８抗体及び有効量のＡＬＴ−８０３を投与することによって、哺乳類における免疫応答を刺激する方法を提供する。
【００２８】
特に、対象において新生物又は自己免疫疾患又は炎症性疾患を処置するための方法は、有効量の抗ＣＤ３８抗体（又は抗体様分子）と、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ複合体（ＡＬＴ−８０３）を含む有効量の医薬組成物とを対象に投与することによって実行され、ここで、ＡＬＴ−８０３は、二量体ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ及び２つのＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ分子を含み、それにより、新生物又は自己免疫疾患又は炎症性疾患が処置される。一部の場合には、本方法はさらに、前記抗体又は前記ＡＬＴ−８０３の投与の前、投与中又は投与の後にステロイドによる処置を含み、ここで、ステロイドは、副腎皮質ステロイド、解熱薬及び抗ヒスタミン薬を含む群から選択される。１つの態様では、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ分子は配列番号３を含む。別の態様では、ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃは配列番号６を含む。例えば、新生物は、血液癌、Ｂ細胞新生物、多発性骨髄腫（ＭＭ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ及びＴ急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、ヘアリー細胞白血病、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、原発性全身性アミロイドーシス、マントル細胞リンパ腫、ＮＫ細胞性白血病、ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、形質細胞白血病、Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、及び固形腫瘍からなる群から選択される。
【００２９】
好ましくは、有効量のＡＬＴ−８０３は、毎日又は１週間に１回若しくは２回投与される。任意選択的に、前記ＡＬＴ−８０３の有効量は、０．１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの間である。例えば、医薬組成物は、全身的、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、膀胱内に、又は点滴によって投与される。例示的な抗ＣＤ３８抗体は、ダラツムマブ、イサツキシマブ（ＳＡＲ６５０９８４）、及びＭＯＲ２０２を含む。
【００３０】
対象において腫瘍又は自己免疫／炎症関連免疫細胞に対して抗体により媒介される抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）又は抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）は、投与の後に少なくとも５％、例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも１００％増強される。
【００３１】
好ましくは、抗体及びＡＬＴ−８０３は、血液ＮＫ細胞、Ｔ細胞、好中球、マクロファージ、樹状細胞又は単球の数値又は活性のレベルを増大させる。一部の場合には、抗体及びＡＬＴ−８０３はＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激して、腫瘍又は自己免疫／炎症関連免疫細胞を死滅させる。別の場合には、抗体及びＡＬＴ−８０３はＮＫ細胞を刺激して、腫瘍又は自己免疫／炎症関連免疫細胞を死滅させる。抗体及びＡＬＴ−８０３は好中球又は単球細胞を刺激して、腫瘍又は自己免疫／炎症関連免疫細胞を死滅させる。抗体及びＡＬＴ−８０３の投与は、腫瘍又は自己免疫／炎症関連免疫細胞の数の減少をもたらす。或いは又は加えて、抗体及びＡＬＴ−８０３の投与は、新生物又は自己免疫疾患又は炎症性疾患の疾患進行の低減をもたらす。抗体及びＡＬＴ−８０３の投与は、未処置の対象と比較して、対象の生存期間の延長をもたらす。好ましくは、対象はヒトである。
【００３２】
１つの態様では、抗体及びＡＬＴ−８０３は同時に投与される。別の態様では、抗体及びＡＬＴ−８０３は逐次的に投与される。好ましくは、投与は、新生物又は自己免疫疾患又は炎症性疾患の将来的な再発を防止する。
【００３３】
また、新生物の処置のためのキットも提供され、本キットは、有効量のＡＬＴ−８０３と、抗ＣＤ３８抗体と、新生物の処置のためのキットの使用説明書とを含む。同様に、自己免疫疾患又は炎症性疾患の処置のためのキットが提供され、本キットは、有効量のＡＬＴ−８０３と、抗ＣＤ３８抗体と、自己免疫疾患又は炎症性疾患の処置のためのキットの使用説明書とを含む。
【００３４】
ＣＤ３８抗原を発現する罹患細胞又は疾患関連細胞を死滅させるための方法は、免疫細胞を有効量のＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ複合体（ＡＬＴ−８０３）で処置し、ＡＬＴ−８０３で処置した免疫細胞を、抗ＣＤ３８抗体、及びＣＤ３８抗原を発現する罹患細胞又は疾患関連細胞と混合し、罹患細胞又は疾患関連細胞を死滅させることによって実行される。例えば、罹患細胞の死滅のレベルは、ＡＬＴ−８０３で処置しなかった免疫細胞により媒介されるレベルと比較して、少なくとも５％、例えば、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％増大される。ＡＬＴ−８０３で処置した免疫細胞は、罹患細胞又は疾患関連細胞を直接死滅させる。１つの態様では、ＡＬＴ−８０３で処置した免疫細胞は他の免疫細胞を刺激して、罹患細胞又は疾患関連細胞を死滅させた。例えば、罹患細胞又は疾患関連細胞の死滅は、ＡＬＴ−８０３で処置した免疫細胞及び抗ＣＤ３８抗体によるＡＤＣＣ又はＡＤＣＰによって媒介される。例示的な疾患関連細胞は腫瘍細胞を含む。一部の場合には、疾患関連細胞は、自己免疫疾患又は炎症性疾患に関連する。
【００３５】
他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解される意味を有する。以下の参考文献は、本発明で使用される用語の多くの一般的な定義を当業者に提供する：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（第２版  １９９４）；Ｔｈｅ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ編、１９８８）；Ｔｈｅ  Ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，第５版，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（編），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）；及びＨａｌｅ  ＆  Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）。本明細書で使用される場合、他に指定されない限り、以下の用語は、以下においてその用語のものであるとされる意味を有する。
【００３６】
「薬剤」とは、ペプチド、核酸分子、又は小化合物を意味する。例示的な治療薬はＡＬＴ−８０３である。
【００３７】
「ＡＬＴ−８０３」とは、二量体ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質と非共有結合的に結合したＩＬ−１５Ｎ７２Ｄを含み、且つ免疫刺激活性を有する複合体を意味する。一実施形態では、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ及び／又はＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質は、参照配列に対して１つ、２つ、３つ、４つ又はそれ以上のアミノ酸変異を含む。例示的なＩＬ−１５Ｎ７２Ｄアミノ酸配列は以下に提供される。
【００３８】
「改善する」とは、疾患の発症又は進行を低減、抑制、減弱、減少、又は安定化することを意味する。
【００３９】
「類似体」とは、同一ではないが類似の機能的又は構造的特徴を有する分子を意味する。例えば、ポリペプチド類似体は天然に存在する対応するポリペプチドの生物活性を保持するが、天然に存在するポリペプチドに対して類似体の機能を強化する特定の生化学的修飾を有する。このような生化学的修飾は、例えばリガンド結合を変更することなく、類似体のプロテアーゼ耐性、膜透過性、又は半減期を増大させ得る。類似体は非天然アミノ酸を含んでいてもよい。
【００４０】
本発明は、所望の生物活性を示す限り、抗体又はこのような抗体の断片を含む。また、ヒト化抗体などのキメラ抗体も本発明に含まれる。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から導入された１つ又は複数のアミノ酸残基を有する。ヒト化は、例えば、当該技術分野において記載される方法を用いて、齧歯類の相補性決定領域の少なくとも一部で、対応するヒト抗体の領域を置換することによって実施することができる。
【００４１】
本明細書で使用される「抗体」（Ａｂ）という用語は、所望の生物活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片を含む。「免疫グロブリン」（Ｉｇ）という用語は、本明細書では「抗体」と互換的に使用される。
【００４２】
「抗体様」分子とは、抗体と比べて同様の構造及び／又は同様の機能を有する分子を意味する。例示的な抗体様分子は、抗原結合ドメイン（例えば、単鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｔ細胞受容体結合ドメイン、リガンド結合ドメイン又は受容体結合ドメイン）を含む分子を含む。
【００４３】
「単離抗体」は、その天然環境の成分から分離及び／又は回収されたものである。その天然環境の汚染物質成分は抗体の診断又は治療的使用を妨げ得る物質であり、これには、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性又は非タンパク質性の溶質が含まれ得る。好ましい実施形態では、抗体は、（１）ローリー法で決定したときに、９５重量％超、最も好ましくは９９重量％超の抗体になるまで、（２）スピニングカップシークエネーターの使用により、少なくとも１５のＮ末端又は内部アミノ酸配列の残基を得るのに十分な程度まで、又は（３）クーマシーブルー又は好ましくは銀染色を用いて、還元又は非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均一になるまで精製される。単離抗体は、抗体の天然環境の少なくとも１つの成分が存在しないことになるので、組換え細胞内のインサイツの抗体を含む。しかしながら任意選択的に、単離抗体は、少なくとも１つの精製ステップによって調製されるであろう。
【００４４】
基本４鎖抗体単位は、２本の同一の軽（Ｌ）鎖及び２本の同一の重（Ｈ）鎖から構成されるヘテロ四量体糖タンパク質である。ＩｇＭ抗体は、Ｊ鎖と呼ばれる付加的なポリペプチドと共に５つの基本ヘテロ四量体単位からなり、従って１０の抗原結合部位を含有し、分泌型ＩｇＡ抗体は重合してＪ鎖と共に２〜５の基本４鎖単位を含む多価集合体を形成することができる。ＩｇＧの場合、４鎖単位は、通常、約１５０，０００ダルトンである。各Ｌ鎖は１つの共有ジスルフィド結合によってＨ鎖に連結され、２本のＨ鎖は、Ｈ鎖のアイソタイプに応じて１つ又は複数のジスルフィド結合によって互いに連結される。また各Ｈ鎖及びＬ鎖は、規則的な間隔の鎖内ジスルフィド架橋も有する。各Ｈ鎖は、Ｎ末端に、可変ドメイン（ＶＨ）と、それに続いて、α鎖及びγ鎖のそれぞれについては３つの定常ドメイン（ＣＨ）と、μ及びεアイソタイプについては４つのＣＨドメインとを有する。各Ｌ鎖は、Ｎ末端の可変ドメイン（ＶＬ）と、それに続いてその他方の端部の定常ドメイン（ＣＬ）とを有する。ＶＬはＶＨとアラインされ、ＣＬは、重鎖の最初の定常ドメイン（ＣＨ１）とアラインされる。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間の界面を形成すると考えられる。ＶＨ及びＶＬが互いに対形成すると、単一の抗原結合部位が形成される。異なるクラスの抗体の構造及び特性については、例えば、Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第８版，Ｄａｎｉｅｌ  Ｐ．Ｓｔｉｔｅｓ，Ａｂｂａ  Ｉ．Ｔｅｒｒ  ａｎｄ  Ｔｒｉｓｔｒａｍ  Ｇ．Ｐａｒｓｌｏｗ（編），Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎ．，１９９４、７１頁及び第６章が参照される。
【００４５】
任意の脊椎動物種に由来するＬ鎖は、その定常ドメイン（ＣＬ）のアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの明確に異なるタイプの１つに割り当てることができる。その重鎖の定常ドメイン（ＣＨ）のアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは、異なるクラス又はアイソタイプに割り当てることができる。５つのクラスの免疫グロブリン：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭが存在し、それぞれ、アルファ（α）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ガンマ（γ）及びミュー（μ）と呼ばれる重鎖を有する。γ及びαクラスは、ＣＨ配列及び機能の比較的小さい差異に基づいて、さらにサブクラスに分けられ、例えば、ヒトは、以下のサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２を発現する。
【００４６】
「可変」という用語は、Ｖドメインの特定のセグメントの配列が抗体間で広範に異なるという事実を指す。Ｖドメインは抗原結合を媒介し、その特定の抗原に対する特定の抗体の特異性を定義する。しかしながら、可変性は、可変ドメインの１１０のアミノ酸スパンにわたって均等に分配されない。代わりに、Ｖ領域は、それぞれ９〜１２アミノ酸長の「超可変領域」と呼ばれる極めて可変性であるより短い領域によって分離された、１５〜３０アミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的不変の区間からなる。天然重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、主にβシート配置を取る４つのＦＲを含み、これらは、βシート構造に接続するループを形成する（場合により、βシート構造の一部を形成する）３つの超可変領域によって接続される。各鎖の超可変領域はＦＲにより互いに極めて近接して保持され、他方の鎖からの超可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）を参照）。定常ドメインは抗体の抗原への結合に直接関与しないが、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）への抗体の関与などの種々のエフェクター機能を示す。
【００４７】
本明細書で使用する場合の「超可変領域」という用語は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、一般に、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けシステム；Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）に従って番号付けする場合に、ＶＬ中のおよそ残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）及び８９〜９７（Ｌ３）付近、並びにＶＨ中のおよそ３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）及び９５〜１０２（Ｈ３）付近）、及び／又は「超可変ループ」からの残基（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けシステム；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）に従って番号付けする場合に、ＶＬ中の残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）及び８９〜９７（Ｌ３）、並びにＶＨ中の２６〜３２（Ｈ１）、５２〜５６（Ｈ２）及び９５〜１０１（Ｈ３））、及び／又は「超可変ループ」／ＣＤＲからの残基（例えば、ＩＭＧＴ番号付けシステム；Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７：２０９−２１２（１９９９）、Ｒｕｉｚ，Ｍ．ｅ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：２１９−２２１（２０００）に従って番号付けする場合に、ＶＬ中の残基２７〜３８（Ｌ１）、５６〜６５（Ｌ２）及び１０５〜１２０（Ｌ３）、並びにＶＨ中の２７〜３８（Ｈ１）、５６〜６５（Ｈ２）及び１０５〜１２０（Ｈ３））を含む。任意選択的に、抗体は、ＡＨｏ；Ｈｏｎｎｅｇｅｒ，Ａ．ａｎｄ  Ｐｌｕｎｋｔｈｕｎ，Ａ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９：６５７−６７０（２００１）に従って番号付けする場合に、以下の位置、ＶＬ中の２８、３６（Ｌ１）、６３、７４〜７５（Ｌ２）及び１２３（Ｌ３）、並びにＶＨ中の２８、３６（Ｈ１）、６３、７４〜７５（Ｈ２）及び１２３（Ｈ３）のうちの１つ又は複数における対称的な挿入を有する。
【００４８】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、天然に存在する可能性のある少量で存在し得る突然変異を除いて、集団を構成する個々の抗体は同一である。モノクローナル抗体は非常に特異的であり、単一の抗原部位に対して方向付けられる。さらに、異なる決定因子（エピトープ）に対して方向付けられた様々な抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定因子に対して方向付けられる。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の抗体により汚染されずに合成され得るという点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、任意の特定の方法による抗体の生成が必要とされると解釈されてはならない。例えば、本発明において有用なモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）により最初に記載されたハイブリドーマ法によって調製されてもよく、又は細菌、真核動物又は植物細胞において組換えＤＮＡ法を用いて製造されてもよい（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書を参照）。また「モノクローナル抗体」は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載される技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離されてもよい。
【００４９】
モノクローナル抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種に由来するか又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一又は相同であるが、鎖の残りの部分は、別の種に由来するか又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一又は相同である「キメラ」抗体、並びに所望の生物活性を示す限りはこのような抗体の断片を含む（米国特許第４，８１６，５６７号明細書、及びＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４）を参照）。また、ヒト抗体に由来する可変ドメイン抗原結合配列も提供される。従って、本明細書における主な目的のキメラ抗体は、１つ又は複数のヒト抗原結合配列（例えば、ＣＤＲ）を有し、且つ非ヒト抗体に由来する１つ又は複数の配列、例えば、ＦＲ又はＣ領域配列を含有する抗体を含む。加えて、本明細書における主な目的のキメラ抗体は、１つの抗体クラス又はサブクラスのヒト可変ドメイン抗原結合配列と、別の抗体クラス又はサブクラスに由来する別の配列、例えば、ＦＲ又はＣ領域配列とを含むものを含む。また本明細書における目的のキメラ抗体は、本明細書に記載されるもの、又は非ヒト霊長類（例えば、旧世界ザル、類人猿など）などの異なる種に由来するものに関連する可変ドメイン抗原結合配列を含有するものも含む。またキメラ抗体は、霊長類化抗体及びヒト化抗体も含む。
【００５０】
さらに、キメラ抗体は、レシピエント抗体又はドナー抗体中に見出されない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体の性能をさらに精密化するために行われる。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照されたい。
【００５１】
「ヒト化抗体」は、一般に、非ヒトである供給源から導入された１つ又は複数のアミノ酸残基を有するヒト抗体であると考えられる。これらの非ヒトアミノ酸残基は「移入」残基と呼ばれることが多く、通常、「移入」可変ドメインから取られる。ヒト化は、伝統的に、Ｗｉｎｔｅｒ及び共同研究者らの方法（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））に従って、移入超可変領域配列で、ヒト抗体の対応する配列を置換することによって実施される。従って、このような「ヒト化」抗体はキメラ抗体であり（米国特許第４，８１６，５６７号明細書）、ここで、インタクトなヒト可変ドメインよりも実質的に少ない分が、非ヒト種由来の対応する配列によって置換されている。
【００５２】
「ヒト抗体」は、ヒトが天然に産生する抗体中に存在する配列のみを含有する抗体である。しかしながら、本明細書で使用される場合、ヒト抗体は、本明細書に記載される修飾及び変異配列を含む、天然に存在するヒト抗体では見出されない残基又は修飾を含み得る。これらは、通常、抗体の性能をさらに精密化又は強化するために行われる。
【００５３】
「インタクトな」抗体は、抗原結合部位、並びにＣＬ及び少なくとも重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含むものである。定常ドメインは、天然配列定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列定常ドメイン）又はそのアミノ酸配列変異体であり得る。好ましくは、インタクトな抗体は１つ又は複数のエフェクター機能を有する。
【００５４】
「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部、好ましくは、インタクトな抗体の抗原結合領域又は可変領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；ダイアボディ；直鎖抗体（米国特許第５，６４１，８７０号明細書；Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２［１９９５］を参照）；単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成される多特異性抗体が挙げられる。
【００５５】
抗体の「機能性断片又は類似体」という語句は、全長抗体と共通する定性的な生物活性を有する化合物である。例えば、抗ＩｇＥ抗体の機能性断片又は類似体は、このような分子の能力が高親和性受容体、ＦｃεＲＩに結合する能力を有することを防止又は実質的に低減するような方法で、ＩｇＥ免疫グロブリンに結合することができるものである。
【００５６】
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片と、容易に結晶化する能力を反映する名称である、その残りの「Ｆｃ」断片とを生成する。Ｆａｂ断片は、Ｈ鎖の可変領域ドメイン（ＶＨ）及び１つの重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を伴って、Ｌ鎖全体からなる。各Ｆａｂ断片は抗原結合に関して一価であり、すなわち、単一の抗原結合部位を有する。抗体のペプシン処理により、二価の抗原結合活性を有するジスルフィド結合した２つのＦａｂ断片にほぼ対応し、且つ依然として抗原を架橋することができる、単一の大きいＦ（ａｂ’）２断片がもたらされる。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１つ又は複数のシステインを含むＣＨ１ドメインのカルボキシ末端において付加的な数個の残基を有することにより、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書では、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有する、Ｆａｂ’に対する名称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、初めは、Ｆａｂ’断片間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として生成されたものである。抗体断片の他の化学的カップリングも知られている。
【００５７】
「Ｆｃ」断片は、ジスルフィドにより互いに保持された両Ｈ鎖のカルボキシ末端部分を含む。抗体のエフェクター機能はＦｃ領域の配列によって決定され、この領域は、特定のタイプの細胞上に見出されるＦｃ受容体（ＦｃＲ）により認識される部分でもある。
【００５８】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含有する最小の抗体断片である。この断片は、非共有結合的に堅固に結合した１つの重鎖可変領域ドメイン及び１つの軽鎖可変領域ドメインの二量体からなる。これらの２つのドメインの折畳みから、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、且つ抗原結合特異性を抗体に付与する６つの超可変ループ（Ｈ鎖及びＬ鎖からそれぞれ３つのループ）が突出される。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でも、結合部位全体よりも低い親和性ではあるが、抗原を認識及び結合する能力を有する。
【００５９】
「ｓＦｖ」又は「ｓｃＦｖ」とも省略される「単鎖Ｆｖ」は、単一のポリペプチド鎖に接続されたＶＨ及びＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片である。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に、ｓＦｖが抗原結合のために所望の構造を形成することを可能にするポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）；Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ  １９９５（下記）を参照されたい。
【００６０】
「ダイアボディ」という用語は、Ｖドメインの鎖内対合ではなく鎖間対合が達成されるようにＶＨドメインとＶＬドメインとの間に短いリンカー（約５〜１０残基）を有するｓＦｖ断片（前の段落を参照）を構築し、二価断片、すなわち、２つの抗原結合部位を有する断片をもたらすことによって調製された小さい抗体断片を指す。二重特異性のダイアボディは、２つの抗体のＶＨ及びＶＬドメインが異なるポリペプチド鎖上に存在する、２つの「クロスオーバー」ｓＦｖ断片のヘテロ二量体である。ダイアボディは、例えば、欧州特許第４０４，０９７号明細書；国際公開第９３／１１１６１号パンフレット；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）においてより十分に記載される。
【００６１】
本明細書で使用される場合、「内部移行する」抗体は、哺乳類細胞上の抗原（例えば、細胞表面ポリペプチド又は受容体）に結合する際に、細胞により取り込まれる（すなわち、細胞に入る）ものである。内部移行する抗体は、当然ながら、抗体断片、ヒト又はキメラ抗体、及び抗体コンジュゲートを含み得る。特定の治療用途のために、インビボでの内部移行が企図される。内部移行された抗体分子の数は、細胞、特に感染細胞を死滅させる、又はその成長を阻害するのに十分又は適切であろう。抗体又は抗体コンジュゲートの効力に応じて、場合により、単一の抗体分子の細胞への取り込みは、抗体が結合する標的細胞を死滅させるのに十分である。例えば、特定の毒素は死滅において非常に強力であり、従って、抗体にコンジュゲートした毒素の１つの分子の内部移行は、感染細胞を死滅させるのに十分である。
【００６２】
本明細書で使用される場合、抗体は、検出可能なレベルで、好ましくは、約１０４Ｍ−１以上、又は約１０５Ｍ−１以上、約１０６Ｍ−１以上、約１０７Ｍ−１以上、又は１０８Ｍ−１以上の親和性定数Ｋａで抗原と反応すれば、「免疫特異的」である、抗原「に対して特異的」である、又は抗原「に特異的に結合する」と言われる。また、その同種抗原に対する抗体の親和性は一般に解離定数ＫＤで表され、特定の実施形態では、ＨｕＭ２ｅ抗体は、１０−４Ｍ以下、約１０−５Ｍ以下、約１０−６Ｍ以下、１０−７Ｍ以下、又は１０−８Ｍ以下のＫＤで結合すれば、Ｍ２ｅに特異的に結合する。抗体の親和性は、従来の技術、例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ５１：６６０（１９４９））によって記載されるものを用いて容易に決定することができる。
【００６３】
その抗原、細胞又は組織への抗体の結合特性は、一般に、例えば、免疫組織化学（ＩＨＣ）及び／又は蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）などの免疫蛍光ベースのアッセイを含む免疫検出法を用いて決定及び評価され得る。
【００６４】
指定された抗体の「生物学的特徴」を有する抗体は、その抗体を他の抗体と区別するその生物学的特徴の１つ又は複数を有するものである。例えば、特定の実施形態では、指定された抗体の生物学的特徴を有する抗体は、指定された抗体が結合するものと同じエピトープに結合し得る、及び／又は指定された抗体と共通のエフェクター機能を有し得る。「アンタゴニスト」抗体という用語は最も広い意味で使用され、それが特異的に結合するエピトープ、ポリペプチド、又は細胞の生物活性を部分的又は完全に遮断、阻害、又は中和する抗体を含む。アンタゴニスト抗体を同定するための方法は、候補アンタゴニスト抗体が特異的に結合するポリペプチド又は細胞を、候補アンタゴニスト抗体と接触させることと、ポリペプチド又は細胞に通常関連する１つ又は複数の生物活性の検出可能な変化を測定することとを含み得る。
【００６５】
抗体の「エフェクター機能」は抗体のＦｃ領域（天然配列のＦｃ領域又はアミノ酸配列変異体のＦｃ領域）に起因する生物活性を指し、抗体アイソタイプによって異なる。抗体のエフェクター機能の例としては、Ｃｌｑ結合及び補体依存性細胞傷害；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御；及びＢ細胞活性化が挙げられる。
【００６６】
分子「に結合する」とは、その分子に対して物理化学的な親和性を有することを意味する。
【００６７】
「対照」又は「参照」とは、比較の基準を意味する。１つの態様では、本明細書で使用される場合、「対照と比べて変化した」サンプル又は対象は、正常、未処置、又は対照のサンプルからのサンプルとは統計的に異なるレベルを有すると理解される。対照サンプルは、例えば、培養細胞、１匹若しくは複数の実験室試験動物、又は１人若しくは複数のヒト対象を含む。対照サンプルを選択及び試験するための方法は、当業者の能力の範囲内である。分析物は、細胞若しくは生物により特徴的に発現若しくは産生される天然に存在する物質（例えば、抗体、タンパク質）、又はレポーター構築物により産生される物質（例えば、β−ガラクトシダーゼ又はルシフェラーゼ）であり得る。検出に使用される方法に応じて、変化の量及び測定値は異なり得る。例えば、良い結果を生じる平均からの標準偏差の数など、統計的有意性の決定は当業者の能力の範囲内である。
【００６８】
「検出」は、検出すべき分析物の存在、不在又は量を特定することを指す。
【００６９】
「疾患」とは、細胞、組織、又は臓器の正常な機能を損傷又は妨害する任意の状態又は障害を意味する。疾患の例としては、新生物及び自己免疫疾患及び炎症性疾患が挙げられる。
【００７０】
製剤又は製剤成分の「有効量」及び「治療的に有効な量」という用語は、単独又は組み合わせて、所望の効果を提供するのに十分な製剤又は成分の量を意味する。例えば、「有効量」は、単独又は組み合わせて、未処置患者に対して、疾患の症状を改善するために必要とされる化合物の量を意味する。疾患の治療的処置のために本発明を実施するのに使用される活性化合物の有効量は、投与方法、対象の年齢、体重、及び全体的な健康に応じて異なる。最終的に、担当医師又は獣医が適切な量及び投与計画を決定することになる。このような量は「有効」量と呼ばれる。
【００７１】
「断片」とは、ポリペプチド又は核酸分子の一部を意味する。この部分は、好ましくは、参照核酸分子又はポリペプチドの全長の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％を含有する。例えば、断片は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００のヌクレオチド又はアミノ酸を含有し得る。しかしながら、本発明はまた、全長のポリペプチド及び核酸の所望の生物活性をそれぞれ示す限り、ポリペプチド及び核酸断片を含む。ほとんどあらゆる長さの核酸断片が使用される。例えば、全長が約１０，０００、約５０００、約３０００、約２，０００、約１，０００、約５００、約２００、約１００、約５０の塩基対長（全ての中間長さを含む）である説明的なポリヌクレオチドセグメントが、本発明の多数の実行において含まれる。同様に、ほとんどあらゆる長さのポリペプチド断片が使用される。例えば、全長が、約１０，０００、約５，０００、約３，０００、約２，０００、約１，０００、約５，０００、約１，０００、約５００、約２００、約１００、又は約５０のアミノ酸長（全ての中間長さを含む）である説明的なポリペプチドセグメントが、本発明の多数の実行において含まれる。
【００７２】
「単離された」、「精製された」、又は「生物学的に純粋な」という用語は、その天然状態で見出されたときに通常それに付随する成分を、程度の差はあるが含まない物質を指す。「単離する」は、元の供給源又は環境からのある程度の分離を示す。「精製する」は、単離よりも高い程度の分離を示す。
【００７３】
「精製された」又は「生物学的に純粋な」タンパク質は十分に他の物質を含まないので、どの不純物も実質的にタンパク質の生物学的特性に影響を与えない、又は他の悪影響を引き起こさない。すなわち、組換えＤＮＡ技術により生成される場合には、細胞物質、ウイルス物質、若しくは培地を実質的に含まなければ、又は化学的に合成される場合には、化学的前駆体若しくは他の化学物質を実質的に含まなければ、本発明の核酸又はペプチドは精製されている。純度及び均一性は、通常、分析化学技術、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又は高速液体クロマトグラフィーを用いて決定される。「精製された」という用語は、核酸又はタンパク質が電気泳動ゲルにおいて本質的に１本のバンドを生じさせることを示し得る。修飾、例えば、リン酸化又はグリコシル化を受けることができるタンパク質については、異なる修飾により異なる単離タンパク質が生じる可能性があり、これは、別々に精製され得る。
【００７４】
同様に、「実質的に純粋な」は、天然においてそれに付随する成分から分離されたヌクレオチド又はポリペプチドを意味する。通常、ヌクレオチド及びポリペプチドは、天然において関連されるタンパク質及び天然に存在する有機分子の少なくとも６０重量％、７０重量％、８０重量％、９０重量％、９５重量％、又はさらに９９重量％を含まない場合に、実質的に純粋である。
【００７５】
「単離核酸」とは、その核酸が由来する生物の天然に存在するゲノム中で、その核酸に隣接する遺伝子を含まない核酸を意味する。この用語は、例えば、（ａ）天然に存在するゲノムＤＮＡ分子の一部分であるが、それが天然に存在する生物のゲノム中で分子のその部分に隣接する核酸配列が両方とも隣接していないＤＮＡ；（ｂ）ベクター又は原核生物若しくは真核生物のゲノムＤＮＡ内に、得られる分子が天然に存在する任意のベクター又はゲノムＤＮＡと同一でないような様式で組み込まれた核酸；（ｃ）別の分子、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノム断片、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により生成された断片、又は制限断片；並びに（ｄ）ハイブリッド遺伝子、すなわち融合タンパク質をコードする遺伝子の一部である組換えヌクレオチド配列を包含する。本発明に従う単離核酸分子はさらに、合成により生成された分子、並びに化学的に改変されている、及び／又は修飾された骨格を有する任意の核酸を含む。例えば、単離核酸は、精製されたｃＤＮＡ又はＲＮＡポリヌクレオチドである。また単離核酸分子は、メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）分子も含む。
【００７６】
「単離ポリペプチド」とは、天然においてそれに付随する成分から分離された本発明のポリペプチドを意味する。通常、ポリペプチドは、それが天然において関連するタンパク質及び天然に存在する有機分子の少なくとも６０重量％を含まない場合に単離されている。好ましくは、調製物は、少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも９０重量％、最も好ましくは少なくとも９９重量％が本発明のポリペプチドである。本発明の単離ポリペプチドは、例えば、天然の供給源からの抽出により、このようなポリペプチドをコードする組換え核酸の発現により、又はタンパク質の化学合成により得ることができる。純度は、任意の適切な方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、又はＨＰＬＣ分析によって測定することができる。
【００７７】
「マーカー」とは、疾患又は障害に関連する発現レベル又は活性の改変を有する任意のタンパク質又はポリヌクレオチドを意味する。
【００７８】
「新生物」とは、過剰な増殖又はアポトーシスの低減を特徴とする疾患又は障害を意味する。本発明が使用され得る説明的な新生物としては、白血病（例えば、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、急性赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病）、真性赤血球増加症、リンパ腫（ホジキン病、非ホジキン病）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、並びに肉腫及び癌腫などの固形腫瘍（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫（ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、胃及び食道の癌、頭頸部癌、直腸癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性肺癌、腎細胞癌、肝細胞腫、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、子宮癌、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、多形神経膠芽腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫（ｏｌｉｇｏｄｅｎｒｏｇｌｉｏｍａ）、神経鞘腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽細胞腫、及び網膜芽細胞腫）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、新生物は、多発性骨髄腫、β細胞リンパ腫、尿路上皮／膀胱癌又はメラノーマである。本明細書で使用される場合、「薬剤を得る」などの場合の「得る」は、薬剤を合成すること、購入すること、又は他の方法で獲得することを含む。
【００７９】
「低減する」とは、少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、７５％、又は１００％のマイナスの変化を意味する。
【００８０】
「参照配列」は、配列比較の基礎として使用される定義された配列である。参照配列は特定の配列のサブセットでもその全体でもよく、例えば、全長ｃＤＮＡ若しくは遺伝子配列のセグメント、又は完全なｃＤＮＡ若しくは遺伝子配列であり得る。ポリペプチドについては、参照ポリペプチド配列の長さは、通常、少なくとも約１６アミノ酸、好ましくは少なくとも約２０アミノ酸、より好ましくは少なくとも約２５アミノ酸、さらにより好ましくは約３５アミノ酸、約５０アミノ酸、又は約１００アミノ酸となる。核酸については、参照核酸配列の長さは、通常、少なくとも約５０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約６０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約７５ヌクレオチド、さらにより好ましくは約１００ヌクレオチド若しくは約３００ヌクレオチド、又はこれらの付近若しくはこれらの間の任意の整数となる。
【００８１】
「特異的に結合する」とは、本発明のポリペプチドを認識及び結合するが、サンプル中、例えば、天然において本発明のポリペプチドを含む生体サンプル中の他の分子を実質的に認識及び結合しない化合物又は抗体を意味する。
【００８２】
本発明の方法において有用な核酸分子は、本発明のポリペプチド又はその断片をコードする任意の核酸分子を含む。このような核酸分子は内在性核酸配列と１００％同一である必要はないが、通常、実質的な同一性を示すであろう。内在性配列と「実質的な同一性」を有するポリヌクレオチドは、通常、二本鎖核酸分子の少なくとも一方の鎖とハイブリダイズすることができる。本発明の方法において有用な核酸分子は、本発明のポリペプチド又はその断片をコードする任意の核酸分子を含む。このような核酸分子は内在性核酸配列と１００％同一である必要はないが、通常、実質的な同一性を示すであろう。内在性配列と「実質的な同一性」を有するポリヌクレオチドは、通常、二本鎖核酸分子の少なくとも一方の鎖とハイブリダイズすることができる。「ハイブリダイズする」とは、種々のストリンジェンシー条件下で、相補的なポリヌクレオチド配列間の二本鎖分子（例えば、本明細書に記載される遺伝子）又はその部分を形成するための対を意味する（例えば、Ｗａｈｌ，Ｇ．Ｍ．ａｎｄ  Ｓ．Ｌ．Ｂｅｒｇｅｒ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：３９９；Ｋｉｍｍｅｌ，Ａ．Ｒ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：５０７を参照）。
【００８３】
例えば、ストリンジェントな塩濃度は、通常、約７５０ｍＭのＮａＣｌ及び７５ｍＭのクエン酸三ナトリウムよりも低く、好ましくは約５００ｍＭのＮａＣｌ及び５０ｍＭのクエン酸三ナトリウムよりも低く、より好ましくは約２５０ｍＭのＮａＣｌ及び２５ｍＭのクエン酸三ナトリウムよりも低いであろう。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、有機溶媒、例えばホルムアミドの非存在下で得ることができるが、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、少なくとも約３５％のホルムアミド、より好ましくは少なくとも約５０％のホルムアミドの存在下で得ることができる。ストリンジェントな温度条件は、通常、少なくとも約３０℃、より好ましくは少なくとも約３７℃、最も好ましくは少なくとも約４２℃の温度を含み得る。ハイブリダイゼーション時間、洗浄剤、例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の濃度、及び担体ＤＮＡの包含又は排除などの様々な付加的なパラメータは当業者によく知られている。ストリンジェンシーの種々のレベルは、これらの種々の条件を必要に応じて組み合わせることによって達成される。好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションは、７５０ｍＭのＮａＣｌ、７５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、及び１％のＳＤＳ中、３０℃で起こり得る。より好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションは、５００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１％のＳＤＳ、３５％のホルムアミド、及び１００．ｍｕ．ｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）中、３７℃で起こり得る。最も好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションは、２５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１％のＳＤＳ、５０％のホルムアミド、及び２００μｇ／ｍｌのｓｓＤＮＡ中、４２℃で起こり得る。これらの条件における有用な変化形は、当業者には容易に明らかであろう。
【００８４】
ほとんどの用途では、ハイブリダイゼーションに続く洗浄ステップもストリンジェンシーが様々であり得る。洗浄ストリンジェンシー条件は、塩濃度及び温度によって定義することができる。上記のように、洗浄ストリンジェンシーは、塩濃度を低下させるか、又は温度を上昇させることによって高めることができる。例えば、洗浄ステップのためのストリンジェントな塩濃度は、好ましくは、約３０ｍＭのＮａＣｌ及び３ｍＭのクエン酸三ナトリウムよりも低く、最も好ましくは約１５ｍＭのＮａＣｌ及び１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウムよりも低いであろう。洗浄ステップのためのストリンジェントな温度条件は、通常、少なくとも約２５℃、より好ましくは少なくとも約４２℃、さらにより好ましくは少なくとも約６８℃の温度を含み得る。好ましい実施形態では、洗浄ステップは、３０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのクエン酸三ナトリウム、及び０．１％のＳＤＳ中、２５℃で起こり得る。より好ましい実施形態では、洗浄ステップは、１５ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、及び０．１％のＳＤＳ中、４２℃で起こり得る。より好ましい実施形態では、洗浄ステップは、１５ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、及び０．１％のＳＤＳ中、６８℃で起こり得る。これらの条件における付加的な変化形は、当業者には容易に明らかであろう。ハイブリダイゼーション技術は当業者によく知られており、例えば、Ｂｅｎｔｏｎ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９６：１８０，１９７７）；Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｈｏｇｎｅｓｓ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ７２：３９６１，１９７５）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１）；Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ（Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９８７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；及びＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている。
【００８５】
「実質的に同一」とは、ポリペプチド又は核酸分子が、参照アミノ酸配列（例えば、本明細書に記載されるアミノ酸配列のいずれか１つ）又は核酸配列（例えば、本明細書に記載される核酸配列のいずれか１つ）に対して少なくとも５０％の同一性を示すことを意味する。好ましくは、このような配列は、アミノ酸レベル又は核酸において、比較に使用される配列と少なくとも６０％、より好ましくは８０％又は８５％、より好ましくは９０％、９５％又はさらに９９％同一である。
【００８６】
配列同一性は、通常、配列分析ソフトウェア（例えば、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ，１７１０  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７０５のＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、ＢＬＡＳＴ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＧＡＰ、又はＰＩＬＥＵＰ／ＰＲＥＴＴＹＢＯＸプログラム）を用いて測定される。このようなソフトウェアは、種々の置換、欠失、及び／又は他の修飾に対して相同性の程度を割り当てることにより同一又は類似の配列をマッチさせる。保存的置換は、通常、以下のグループ：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；及びフェニルアラニン、チロシン内の置換を含む。同一性の程度を決定するための例示的なアプローチでは、ＢＬＡＳＴプログラムを使用することができ、ｅ−３とｅ−１００との間の確率スコアが密接に関連する配列を示す。
【００８７】
「対象」とは、ウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ、又はネコなどのヒト又は非ヒト哺乳類を含むが、これらに限定されない哺乳類を意味する。対象は、好ましくは、このような処置を必要としている哺乳類、例えば、Ｂ細胞リンパ腫又はその素因を有すると診断された対象である。哺乳類は、任意の哺乳類、例えば、ヒト、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、並びに家畜、又は食糧消費のために飼育される動物、例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ニワトリ、及びヤギである。好ましい実施形態では、哺乳類はヒトである。
【００８８】
本明細書で提供される範囲は、その範囲内の値の全てに対する省略表現であることが理解される。例えば、１〜５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０からなる群からの任意の数、数の組合せ、又は部分範囲を含むと理解される。
【００８９】
本明細書で使用される「処置する」及び「処置」という用語は、有害な状態、障害、又は疾患を患っている臨床的症状を示す個体に対して、症状の重症度及び／又は頻度の低減をもたらし、症状及び／又はその根本的な原因を除去し、及び／又は損傷の改善若しくは修復を容易にするように、薬剤又は製剤を投与することを指す。障害又は状態の処置は、その障害、状態又はそれに関連する症状が完全に除去されることを必要としない（排除はされない）ことが認識されるであろう。
【００９０】
新生物を有する患者の処置は、以下の：既知の腫瘍が初期治療（例えば、手術）により除去された後に存在し得る残存腫瘍細胞を破壊し、それにより可能性のある癌の再発を防止するための、アジュバント療法（ａｄｊｕｖａｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ）（補助療法（ａｄｊｕｎｃｔ  ｔｈｅｒａｐｙ）又は補助的療法（ａｄｊｕｎｃｔｉｖｅ  ｔｈｅｒａｐｙ）とも呼ばれる）；癌を縮小させるために外科手術の前に行われるネオアジュバント療法；通常は急性白血病の寛解を引き起こすための導入療法；寛解が達成されたら寛解を維持するために行われる地固め療法（強化療法とも呼ばれる）；寛解の延長を補助するためにより少量又はより低頻度の投与で行われる維持療法；一次治療（標準的治療とも呼ばれる）；二次治療（又は三次治療、四次治療など）（救援治療とも呼ばれる）は、一次治療の後に疾患が応答又は再発しない場合に行われる；及び癌の大幅な縮小を期待することなく症状管理に取り組むための対症療法（支持療法とも呼ばれる）のうちのいずれかを含み得る。
【００９１】
「予防する」及び「予防」という用語は、特定の有害な状態、障害、又は疾患に対して感染し易いか、又は素因を有する臨床的に無症状の個体に、薬剤又は組成物を投与することを指し、従って、症状の発生及び／又はその根本的な原因を防止することに関する。
【００９２】
具体的に言及されない限り、又は文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される場合、「又は（ｏｒ）」という用語は包含的であると理解される。具体的に言及されない限り、又は文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という用語は、単数又は複数であると理解される。
【００９３】
具体的に言及されない限り、又は文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される場合、「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、当該技術分野における通常の許容度の範囲内、例えば、平均の２標準偏差以内であると理解される。約は、規定の値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、又は０．０１％以内であると理解され得る。文脈から他に明らかでない限り、本明細書で提供される全ての数値は、約という用語によって修飾される。
【００９４】
本明細書中の変数の任意の定義における化学基のリストの詳述は、任意の単一の基又は列挙される基の組合せとしてのその変数の定義を含む。本明細書中の変数又は態様についての実施形態の詳述は、その実施形態を、任意の単一の実施形態として、又は任意の他の実施形態若しくはその一部分と組み合わせて含む。
【００９５】
本明細書で提供される任意の組成物又は方法は、本明細書で提供される他の組成物及び方法のいずれかの１つ又は複数と組み合わせることができる。
【００９６】
「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、又は「特徴とする（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  ｂｙ）」と同義である、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という移行句は包括的又は非限定的であり、記載されていない付加的な要素又は方法ステップを排除しない。対照的に、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ」という移行句は、請求項において明記されていない任意の要素、ステップ、又は成分を排除する。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という移行句は、請求項の範囲を、特許請求される本発明の明記された物質又はステップ、「及び基本的な新規の特徴に実質的に影響しないもの」に限定する。
【００９７】
本発明の他の特徴及び利点は、その好ましい実施形態の以下の説明から、及び特許請求の範囲から明らかであろう。他に定義されない限り、本明細書中で使用される科学技術用語は全て、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本発明の実施又は試験において、本明細書に記載されるものと同様又は同等の方法及び物質が使用され得るが、適切な方法及び物質は以下に記載される。本明細書で引用される公開された外国特許及び特許出願は全て、参照によって本明細書中に援用される。本明細書で引用される受託番号で示されるＧｅｎＢａｎｋ及びＮＣＢＩの提出は、参照によって本明細書中に援用される。本明細書で引用される他の公開された参考文献、文書、原稿及び科学文献は全て、参照によって本明細書中に援用される。矛盾する場合は、定義を含む本明細書が優先される。さらに、物質、方法、及び実施例は単なる実例であり、限定を意図するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】血液腫瘍細胞に対する抗ＣＤ３８Ａｂに向けられたヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）における、ＡＬＴ−８０３の効果を実証する棒グラフである。刺激なし（未処置）、ＡＬＴ−８０３（１０ｎＭ）、抗ＣＤ３８Ａｂ（１０ｎＭ）、又はＡＬＴ−８０３（１０ｎＭ）と抗ＣＤ３８Ａｂ（１０ｎＭ）との併用を用いて、ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用し、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔで標識したＤａｕｄｉ細胞を標的とした（Ｅ：Ｔ比  ５：１）。２日後に、Ｄａｕｄｉ細胞死（ヨウ化プロピジウムによるポジティブ染色）をフローサイトメトリーで決定した。棒は、４つの独立したドナーからのＰＭＢＣについての平均±ＳＥＭを表す。
【図２Ａ】血液腫瘍細胞に対する抗ＣＤ３８Ａｂに向けられたヒトＰＢＭＣ  ＡＤＣＣにおける、ＡＬＴ−８０３の濃度依存性効果を実証する棒グラフである。１０ｎＭの抗ＣＤ３８Ａｂを用いて、そして抗ＣＤ３８Ａｂを用いずに、新たに単離されたＰＢＭＣを異なる濃度のＡＬＴ−８０３と共にインキュベートした。２日後に、Ｄａｕｄｉ腫瘍標的細胞に対するＡＤＣＣ活性（Ｅ：Ｔ比  ２：１）を図１に記載されるように決定した。棒は、４つの独立したドナーからのＰＭＢＣについての平均±ＳＥＭを表す。
【図２Ｂ】図２Ａに記載される方法を使用し、１０ｎＭのＡＬＴ−８０３を用いて、又はＡＬＴ−８０３を用いずに、Ｄａｕｄｉ細胞に対して向けられたヒトＰＢＭＣ  ＡＤＣＣにおける、抗ＣＤ３８Ａｂの濃度依存性効果を実証する線グラフを示す。２つの異なるドナーからの結果が示される。
【図２Ｃ】１０ｎＭ抗ＣＤ３８Ａｂを用いて、そして抗ＣＤ３８Ａｂを用いずに、血液腫瘍細胞に対する抗ＣＤ３８Ａｂに向けられたヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞ＡＤＣＣにおける、ＡＬＴ−８０３の濃度依存性効果を実証する棒グラフである。新たに精製されたヒトＮＫ細胞（＞９０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−）を異なる濃度のＡＬＴ−８０３と共にインキュベートした。２日後に、Ｄａｕｄｉ腫瘍標的細胞に対するＡＤＣＣ活性（Ｅ：Ｔ比  ２：１）を図１に記載されるように決定した。棒は、４つの独立したドナーからのＮＫ細胞についての平均±ＳＥＭを表す。
【図３】Ｄａｕｄｉ細胞腫瘍を担持するマウスの骨髄中の腫瘍量を低減することにおける、ＡＬＴ−８０３と抗ＣＤ３８抗体との併用処置の効力を示す棒グラフである。０日目に重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスに１ｘ１０７のＤａｕｄｉ細胞を注射（静脈内）した。腫瘍担持マウス（各群につき６匹のマウス）を、ＰＢＳ（媒体、静脈内）、抗ＣＤ３８Ａｂ（１０ｍｇ／ｋｇ、静脈内）、ＡＬＴ−８０３（０．２ｍｇ／ｋｇ、皮下）、又は抗ＣＤ３８Ａｂ（１０ｍｇ／ｋｇ）とＡＬＴ−８０３（０．２ｍｇ／ｋｇ、皮下）との併用により静脈内で処置した。腫瘍細胞の接種後５日目に抗ＣＤ３８Ａｂ（Ｄａｒａ）を投与し、腫瘍細胞の接種後１７日目にＡＬＴ−８０３を投与した。また一部のマウスは、図示されるように、１５日目にステロイド（０．２μｇのヒドロコルチゾン／投与  腹腔内）で処置した。注射後２２日目の骨髄（ＢＭ）中のＤａｕｄｉ細胞（ヒトＨＬＡ−ＤＲ＋）の割合をフローサイトメーターで定量化した。＊，Ｐ＜０．０５；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図４】ＡＬＴ−８０３及び抗ＣＤ３８Ａｂの組合せが、Ｄａｕｄｉ細胞腫瘍を担持するマウスの生存期間を延長できることを実証する線グラフである。０日目にＳＣＩＤマウスに１ｘ１０７のＤａｕｄｉ細胞を注射（静脈内）した。腫瘍担持マウス（各群につき６匹のマウス）を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（媒体、静脈内）、抗ＣＤ３８Ａｂ（１０ｍｇ／ｋｇ、静脈内）、ＡＬＴ−８０３（０．２ｍｇ／ｋｇ、皮下）、又は抗ＣＤ３８Ａｂ（１０ｍｇ／ｋｇ）とＡＬＴ−８０３（０．２ｍｇ／ｋｇ、皮下）との併用により静脈内で処置した。ＰＢＳ群マウスを除いて全ての群のマウスは、注入前（ｐｒｅ−ｉｎｆｕｓｉｏｎ）反応を低減するためにステロイド（０．２ｍｇ／マウス、腹腔内）を受けた。腫瘍細胞の接種後５日目に抗ＣＤ３８Ａｂ（ＤＡＲＡ）を投与し、腫瘍細胞の接種後１７日目にＡＬＴ−８０３を投与した。２２日目に、ＰＢＳ（媒体、静脈内）、抗ＣＤ３８Ａｂ（１０ｍｇ／ｋｇ、静脈内）、ＡＬＴ−８０３（０．２ｍｇ／ｋｇ、皮下）、又は抗ＣＤ３８Ａｂ（１０ｍｇ／ｋｇ）とＡＬＴ−８０３（０．２ｍｇ／ｋｇ、皮下）との併用による２回目の処置を各群に与えた。２２日目には、マウスをステロイドで処置しなかった。マウスの生存をモニターし、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ分析が示される。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図５】インビボでのＤａｕｄｉ腫瘍細胞のマクロファージ媒介性食作用における、抗ＣＤ３８Ａｂと併用したＡＬＴ−８０３の効果を実証する一連のフローサイトメトリープロットを示す。ＰＫＨ６７で標識したヒトＴＨＰ−１マクロファージ細胞及びＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔで標識したＤａｕｄｉ細胞を、ＰＢＳ（ＵＳ）、１０ｎＭの抗ＣＤ３８Ａｂ及び／又は１０ｎＭのＡＬＴ−８０３と共に、ＮＫ−９２細胞（ａＮＫ細胞）の存在下又は非存在下で共培養した（Ｅ：Ｔ比  １：１）。２４時間後、貪食されたＤａｕｄｉ腫瘍細胞（右上腹部におけるＰＫＨ６７＋ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ＋ＴＨＰ−１細胞で表される）の割合をフローサイトメトリーで測定した。
【発明を実施するための形態】
【００９９】
本発明は、少なくとも一部分において、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）スーパーアゴニスト突然変異体と、二量体ＩＬ−１５受容体α／Ｆｃ融合タンパク質との複合体であるＡＬＴ−８０３と併用した抗体が、新生物（例えば、神経膠芽腫、前立腺癌、血液癌、Ｂ細胞新生物、多発性骨髄腫、Ｂ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、固形腫瘍、尿路上皮／膀胱癌、メラノーマ、肺癌、腎細胞癌、乳癌、頭頸部癌、結腸直腸癌、及び卵巣癌）、又は自己免疫疾患若しくは炎症性疾患に対する免疫応答を強化するのに有用であるという驚くべき発見に基づく。
【０１００】
ＡＬＴ−８０３
ＡＬＴ−８０３は、ＩＬ−２Ｒβγへの結合能力が増大され、且つ生物活性が強化されたＩＬ−１５突然変異体を含む（参照によって本明細書中に援用される米国特許第８，５０７，２２２号明細書）。このＩＬ−１５のスーパーアゴニスト突然変異体は刊行物（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００９  １８３：３５９８）に記載され、このスーパーアゴニストに対する特許が米国特許商標庁により発行されており、いくつかの特許出願が係属中である（例えば、米国特許出願第１２／１５１，９８０号明細書及び同第１３／２３８，９２５号明細書）。このＩＬ−１５スーパーアゴニストは、可溶性ＩＬ−１５α受容体融合タンパク質（ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ）と組み合わせると、インビトロ及びインビボで非常に強力なＩＬ−１５活性を有するタンパク質複合体をもたらす（Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，５６：８０４−８１０；Ｘｕ，ｅｔ  ａｌ．，２０１３  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７３：３０７５−８６，Ｗｏｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｏｎｃｏｌｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２：ｅ２６４４２）。このＩＬ−１５スーパーアゴニスト複合体（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ）は、ＡＬＴ−８０３と呼ばれる。薬物動態分析により、複合体は、マウスにおいて、静脈内投与後に２５時間の半減期を有することが示された。ＡＬＴ−８０３は、免疫適格マウスにおける侵襲性固体腫瘍及び血液腫瘍モデルに対して優れた抗腫瘍活性を示す。ＡＬＴ−８０３は、週２回又は毎週の静脈内の用法を用いる単独療法として、又は抗体との併用治療として投与することができる。またＡＬＴ−８０３の抗腫瘍応答は永続的でもある。ＡＬＴ−８０３処置の後に治癒した腫瘍担持マウスは同じ腫瘍細胞による再負荷に対しても非常に耐性があり、ＡＬＴ−８０３は、再導入された腫瘍細胞に対して有効な免疫記憶応答を誘導することが示された。
【０１０１】
インターロイキン−１５
インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）は、エフェクターＮＫ細胞及びＣＤ８＋記憶Ｔ細胞の発生、増殖、及び活性化のための重要なサイトカインである。ＩＬ−１５はＩＬ−１５受容体α（ＩＬ−１５Ｒα）に結合し、エフェクター細胞上のＩＬ−２／ＩＬ−１５受容体β−共通γ鎖（ＩＬ−１５Ｒβγｃ）複合体に対してトランスで提示される。ＩＬ−１５及びＩＬ−２はＩＬ−１５Ｒβγｃに対する結合を共有しており、ＳＴＡＴ３及びＳＴＡＴ５経路を介してシグナル伝達する。しかしながら、ＩＬ−２はＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の維持も支援し、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞死を誘導する。これらの効果は、腫瘍に対するＩＬ−２の治療活性を制限し得る。ＩＬ−１５は、これらの免疫抑制活性をＩＬ−２と共有しない。さらに、ＩＬ−１５は、エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞に抗アポトーシス性シグナル伝達を提供することが知られている唯一のサイトカインである。単独で、又はＩＬ−１５Ｒαとの複合体としてのいずれかで投与されるＩＬ−１５は、実験動物モデルにおける十分に確立された固形腫瘍に対して強力な抗腫瘍活性を示し、従って、潜在的に癌を治療し得る最も有望な免疫治療薬の１つとして特定されている。
【０１０２】
ＩＬ−１５に基づく癌治療薬の臨床開発を促進するために、ＩＬ−１５と比べて増大された生物活性を有するＩＬ−１５突然変異体（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）が同定された（Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１８３：３５９８−３６０７，２００９）。このＩＬ−１５スーパーアゴニスト（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）の薬物動態及び生物活性は、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合複合体（ＡＬＴ−８０３）作製によって、スーパーアゴニスト複合体がインビボで天然サイトカインの少なくとも２５倍の活性を有するようにさらに改善された（Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，５６：８０４−８１０，２０１１）。
【０１０３】
ＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒαタンパク質複合体
上記のように、ＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質複合体は、天然ＩＬ−１５Ｒαの可溶性ＩＬ−１５Ｒαドメインに非共有結合的に結合されたＩＬ−１５を有する複合体を指すことができる。一部の場合には、可溶性ＩＬ−１５Ｒαは、生物学的に活性なポリペプチド及び／又はＩｇＧ  Ｆｃドメインに対して共有結合される。ＩＬ−１５は、ＩＬ−１５か、又は第２の生物学的に活性なポリペプチドに共有結合したＩＬ−１５のいずれかであり得る。ＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒαタンパク質複合体の結晶構造は、参照によって本明細書中に援用されるＣｈｉｒｉｆｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００７  Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ８，１００１−１００７において示される。
【０１０４】
上記の態様又は本明細書中に描写される本発明の任意の他の態様の種々の実施形態において、ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質は、可溶性ＩＬ−１５Ｒα、例えば、生物学的に活性なポリペプチド（例えば、ＩｇＧの重鎖定常ドメイン、ＩｇＧの重鎖定常ドメインのＦｃドメイン、又はサイトカイン）に共有結合したＩＬ−１５Ｒαを含む。上記の態様の本発明の他の実施形態では、ＩＬ−１５は、ＩＬ−１５、例えば、第２の生物学的に活性なポリペプチド（例えば、サイトカイン）に共有結合したＩＬ−１５を含む。他の実施形態では、宿主細胞又は培地からＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質複合体を精製することは、ＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質複合体を特異的に結合する親和性試薬上にＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質複合体を捕獲することを含む。他の実施形態では、ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質はＩＬ−１５Ｒα／Ｆｃ融合タンパク質を含有し、親和性試薬はＦｃドメインに特異的に結合する。他の実施形態では、親和性試薬は、タンパク質Ａ又はタンパク質Ｇである。他の実施形態では、親和性試薬は抗体である。他の実施形態では、宿主細胞又は培地からのＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質複合体の精製は、イオン交換クロマトグラフィーを含む。他の実施形態では、宿主細胞又は培地からのＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質複合体の精製は、サイズ排除クロマトグラフィーを含む。
【０１０５】
他の実施形態では、ＩＬ−１５Ｒαは、ＩＬ−１５ＲαＳｕｓｈｉ（ＩＬ−１５ＲαＳｕ）を含む。他の実施形態では、ＩＬ−１５は、変異体ＩＬ−１５（例えば、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）である。他の実施形態では、ＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質複合体のＩＬ−１５結合部位は完全に占有されている。他の実施形態では、ＩＬ−１５：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質複合体の両方のＩＬ−１５結合部位が完全に占有されている。他の実施形態では、ＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質複合体は、融合タンパク質複合体の電荷又はサイズ特性に基づいて精製される。他の実施形態では、完全に占有されたＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質複合体は、融合タンパク質複合体の電荷特性に基づいてアニオン交換クロマトグラフィーにより精製される。他の実施形態では、完全に占有されたＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質複合体は第４級アミンベースの樹脂を用いて精製され、結合条件は低イオン強度の中性ｐＨ緩衝液を使用し、溶離条件はイオン強度を増大させる緩衝液を使用する。
【０１０６】
本発明の可溶性融合タンパク質複合体の特定の実施形態では、ＩＬ−１５ポリペプチドは、天然ＩＬ−１５ポリペプチドとは異なるアミノ酸配列を有するＩＬ−１５変異体である。ヒトＩＬ−１５ポリペプチドは、本明細書中では、ｈｕＩＬ−１５、ｈＩＬ−１５、ｈｕＩＬ１５、ｈＩＬ１５、ＩＬ−１５野生型（ｗｔ）とも呼ばれ、その変異体は、天然アミノ酸、成熟配列中のその位置、及び変異アミノ酸を用いて呼ばれる。例えば、ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄは、７２位におけるＮからＤへの置換を含むヒトＩＬ−１５を指す。特定の実施形態では、ＩＬ−１５変異体は、例えば、天然ＩＬ−１５ポリペプチドと比べて増大されたＩＬ−１５ＲβγＣ受容体の結合活性によって実証されるように、ＩＬ−１５アゴニストとして機能する。特定の実施形態では、ＩＬ−１５変異体は、例えば、天然ＩＬ−１５ポリペプチドと比べて低下したＩＬ−１５ＲβγＣ受容体の結合活性によって実証されるように、ＩＬ−１５アンタゴニストとして機能する。特定の実施形態では、ＩＬ−１５変異体は、天然ＩＬ−１５ポリペプチドと比べて、ＩＬ−１５ＲβγＣ受容体に対する結合親和性の増大又は結合活性の低下を有する。特定の実施形態では、ＩＬ−１５変異体の配列は、天然ＩＬ−１５配列と比べて、少なくとも１つ（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上）のアミノ酸変化を有する。アミノ酸変化は、ＩＬ−１５Ｒβ及び／又はＩＬ−１５ＲγＣと相互作用をするＩＬ−１５のドメイン内に１つ又は複数のアミノ酸置換又は欠失を含むことができる。特定の実施形態では、アミノ酸変化は、成熟ヒトＩＬ−１５配列の８位、６１位、６５位、７２位、９２位、１０１位、１０８位、又は１１１位における１つ又は複数のアミノ酸置換又は欠失である。例えば、アミノ酸変化は、成熟ヒトＩＬ−１５配列の８位におけるＤからＮ若しくはＡ、６１位におけるＤからＡ、６５位におけるＮからＡ、７２位におけるＮからＲ、又は１０８位におけるＱからＡの置換、又はこれらの置換の任意の組合せである。特定の実施形態では、アミノ酸変化は、成熟ヒトＩＬ−１５配列の７２位におけるＮからＤへの置換である。
【０１０７】
Ｆｃドメイン
ＡＬＴ−８０３は、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合複合体を含む。ＩｇＧのＦｃ領域と、種々のサイトカイン及び可溶性受容体などの別のタンパク質のドメインとを結合する融合タンパク質が報告されている（例えば、Ｃａｐｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３７：５２５−５３１，１９８９；Ｃｈａｍｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１４：５２−６０、１９９６）；米国特許第５，１１６，９６４号明細書及び同第５，５４１，０８７号明細書を参照）。プロトタイプ融合タンパク質は、ＩｇＧ  Ｆｃのヒンジ領域においてシステイン残基を介して連結されたホモ二量体タンパク質であり、重鎖可変ドメイン及びＣＨ１ドメイン及び軽鎖のないＩｇＧ分子に類似した分子がもたらされる。Ｆｃドメインを含む融合タンパク質の二量体性は、他の分子とのより高次の相互作用（すなわち、二価結合又は二重特異性結合）を提供するのに有利であり得る。構造的相同性のために、Ｆｃ融合タンパク質は、同様のアイソタイプを有するヒトＩｇＧと同等のインビボ薬物動態プロファイルを示す。ＩｇＧクラスの免疫グロブリンはヒト血液中で最も多いタンパク質の１つであり、その循環半減期は２１日という長さに達することができる。ＩＬ−１５又はＩＬ−１５融合タンパク質の循環半減期を延長するため、及び／又はその生物活性を増大させるために、ヒト重鎖ＩｇＧタンパク質のＦｃ部分に共有結合されたＩＬ−１５ＲαＳｕに非共有結合的に結合したＩＬ−１５ドメインを含有する融合タンパク質複合体が作製されている（例えば、ＡＬＴ−８０３）。
【０１０８】
「Ｆｃ」という用語は、抗体の非抗原結合断片を指す。このような「Ｆｃ」は、単量体又は多量体形態であり得る。天然Ｆｃの元の免疫グロブリン源は、好ましくは、ヒト起源であり、免疫グロブリンのいずれであってもよいが、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２が好ましい。天然Ｆｃは、共有結合（すなわち、ジスルフィド結合）及び非共有結合により二量体又は多量体形態に連結され得る単量体ポリペプチドで構成される。天然Ｆｃ分子の単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）又はサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１、ＩｇＧＡ２）に応じて、１〜４個の範囲である。天然Ｆｃの一例は、ＩｇＧのパパイン消化から得られる、ジスルフィド結合された二量体である（Ｅｌｌｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：４０７１−９を参照）。本明細書で使用される「天然Ｆｃ」という用語は、単量体、二量体、及び多量体形態に対して包括的である。Ｆｃドメインは、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、種々のＦｃ受容体及び補体タンパク質に対する結合部位を含有している。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、「Ｆｃ変異体」という用語は、天然Ｆｃから修飾されているが、依然としてサルベージ受容体ＦｃＲｎに対する結合部位含む分子又は配列を指す。国際公開第９７／３４６３１号パンフレット（１９９７年９月２５日に公開）及び国際公開第９６／３２４７８号パンフレットには、例示的なＦｃ変異体、及びサルベージ受容体との相互作用が記載されており、これらは参照によって本明細書に援用される。従って、「Ｆｃ変異体」という用語は、非ヒト天然Ｆｃからヒト化された分子又は配列を含む。さらに、天然Ｆｃは、本発明の融合分子に必要とされない構造的特徴又は生物活性を提供するために除去され得る部位を含む。従って、特定の実施形態では、「Ｆｃ変異体」という用語は、（１）ジスルフィド結合の形成、（２）選択された宿主細胞との不適合性（３）選択された宿主細胞内での発現におけるＮ末端不均一性、（４）グリコシル化、（５）補体との相互作用、（６）サルベージ受容体以外のＦｃ受容体への結合、（７）抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、又は（８）抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）に影響を与えるか、又はこれらに関与する１つ又は複数の天然Ｆｃ部位又は残基を欠いている分子又は配列を含む。Ｆｃ変異体は、以下においてさらに詳細に記載される。
【０１１０】
「Ｆｃドメイン」という用語は、上記で定義されるように、天然Ｆｃ及びＦｃ変異体の分子及び配列を包含する。Ｆｃ変異体及び天然Ｆｃと同様に、「Ｆｃドメイン」という用語は、完全抗体から消化されるか、又は組換え遺伝子発現若しくは他の手段で精製されるかに関わらず、単量体又は多量体形態の分子を含む。
【０１１１】
リンカー
一部の場合には、本発明の融合タンパク質複合体は、ＩＬ−１５又はＩＬ−１５Ｒαドメイン間に挿入された可動性リンカー配列も含む。リンカー配列は、ＩＬ−１５又はＩＬ−１５Ｒαドメインに関してポリペプチドを効果的に配置させ、両ドメインの機能活性を可能にするべきである。
【０１１２】
特定の場合には、可溶性融合タンパク質複合体はリンカーを有し、ここで、第１のポリペプチドは、ポリペプチドリンカー配列によってＩＬ−１５（又はその機能性断片）に共有結合されている。他の態様では、本明細書に記載される可溶性融合タンパク質複合体はリンカーを有し、ここで、第２のポリペプチドは、ポリペプチドリンカー配列によってＩＬ−１５Ｒαポリペプチド（又はその機能性断片）に共有結合されている。
【０１１３】
リンカー配列は、好ましくは、提示抗原の認識のためのＴＣＲ分子の結合溝、又は抗原の認識のための抗体分子の結合ドメインを効果的に配置することができるペプチドをもたらすヌクレオチド配列によってコードされる。本明細書で使用される場合、「ＩＬ−１５又はＩＬ−１５Ｒαドメインに関して、生物学的に活性なポリペプチドを効果的に配置する」という語句、又は他の同様の語句は、ＩＬ−１５又はＩＬ−１５Ｒαドメインが互いに相互作用をしてタンパク質複合体を形成できるように、ＩＬ−１５又はＩＬ−１５Ｒαドメインに連結された生物学的に活性なポリペプチドが配置されることを意味することが意図される。例えば、ＩＬ−１５又はＩＬ−１５Ｒαドメインは、免疫細胞との相互作用により免疫反応を開始若しくは阻害するか、又は細胞発生を阻害若しくは刺激するように、効果的に配置される。
【０１１４】
本発明の融合タンパク質複合体は、好ましくは、ＩＬ−１５又はＩＬ−１５Ｒαドメインと免疫グロブリンＦｃドメインとの間に挿入された可動性リンカー配列も含む。リンカー配列は、Ｆｃドメイン、生物学的に活性なポリペプチド及びＩＬ−１５又はＩＬ−１５Ｒαドメインを効果的に配置させ、各ドメインの機能活性を可能にするべきである。例えば、Ｆｃドメインは、適正な融合タンパク質複合体の形成及び／又は免疫細胞若しくは補体系のタンパク質上のＦｃ受容体との相互作用を可能にして、オプソニン化、細胞溶解、マスト細胞、好塩基球、及び好酸球の脱顆粒、並びに他のＦｃ受容体依存性プロセスを含むＦｃ媒介性効果；補体経路の活性化；並びに融合タンパク質複合体のインビボ半減期の向上を刺激するように効果的に配置される。
【０１１５】
またリンカー配列は、生物学的に活性なポリペプチドの２つ以上のポリペプチドを連結して、所望の機能活性を有する単鎖分子を生成させるためにも使用され得る。
【０１１６】
好ましくは、リンカー配列は、約７〜２０のアミノ酸、より好ましくは約１０〜２０のアミノ酸を含む。リンカー配列は、好ましくは、生物学的に活性なポリペプチド又はエフェクター分子を単一の望ましくない構造に保持しないように可動性である。リンカー配列は、例えば、認識部位を融合分子から離間させるために使用することができる。具体的には、ペプチドリンカー配列は、生物学的に活性なポリペプチドと、エフェクター分子との間に配置されて、例えば、これらを化学的に架橋させて、分子の可動性を提供することができる。リンカーは、好ましくは、可動性を提供するために、主に、グリシン、アラニン及びセリンなどの小さい側鎖を有するアミノ酸を含む。好ましくは、約８０又は９０パーセント以上のリンカー配列は、グリシン、アラニン又はセリン残基、特にグリシン及びセリン残基を含む。
【０１１７】
抗体可変領域を互いにうまく結合するために使用されているいくつかの可動性リンカー設計のいずれかを含む、様々なリンカー配列が使用され得る（Ｗｈｉｔｌｏｗ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２：９７−１０５を参照）。
【０１１８】
融合タンパク質複合体
本発明は、ＩＬ−１５Ｎ７２ＤとＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃとの間のタンパク質複合体であるＡＬＴ−８０３を提供する。特定の実施形態では、ＡＬＴ−８０３ポリペプチドは、他のタンパク質ドメインへの融合のための足場としての役割を果たし得る。このような融合タンパク質複合体では、第１の融合タンパク質はインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）又はその機能性断片に共有結合された第１の生物学的に活性なポリペプチドを含み、そして第２の融合タンパク質は、可溶性インターロイキン−１５受容体アルファ（ＩＬ−１５Ｒα）ポリペプチド又はその機能性断片に共有結合された第２の生物学的に活性なポリペプチドを含み、ここで、第１の融合タンパク質のＩＬ−１５ドメインは第２の融合タンパク質の可溶性ＩＬ−１５Ｒαドメインと結合して、可溶性融合タンパク質複合体を形成する。また本発明の融合タンパク質複合体は、第１及び第２の融合タンパク質の一方又は両方に連結された免疫グロブリンＦｃドメイン又はその機能性断片も含む。好ましくは、第１及び第２の融合タンパク質に連結されたＦｃドメインは相互作用をして、融合タンパク質複合体を形成する。このような複合体は、免疫グロブリンＦｃドメイン間のジスルフィド結合の形成によって安定化され得る。特定の実施形態では、本発明の可溶性融合タンパク質複合体は、ＩＬ−１５ポリペプチド、ＩＬ−１５変異体又はその機能性断片、及び可溶性ＩＬ−１５Ｒαポリペプチド又はその機能性断片を含み、ここで、ＩＬ−１５及びＩＬ−１５Ｒαポリペプチドの一方又は両方はさらに、免疫グロブリンＦｃドメイン又はその機能性断片を含む。
【０１１９】
さらなる実施形態では、第１及び第２の生物学的に活性なポリペプチドの一方又は両方は、抗体又はその機能性断片を含む。
【０１２０】
別の実施形態では、抗体ドメインに対する抗原は、細胞表面受容体又はリガンドを含む。
【０１２１】
さらなる実施形態では、抗原は、ＣＤ抗原、サイトカイン若しくはケモカイン受容体若しくはリガンド、成長因子受容体若しくはリガンド、組織因子、細胞接着分子、ＭＨＣ／ＭＨＣ様分子、Ｆｃ受容体、Ｔｏｌｌ様受容体、ＮＫ受容体、ＴＣＲ、ＢＣＲ、ポジティブ／ネガティブ共刺激受容体若しくはリガンド、細胞死受容体若しくはリガンド、腫瘍関連抗原、又はウイルスコード抗原を含む。
【０１２２】
本明細書で使用される場合、「生物学的に活性なポリペプチド」又は「エフェクター分子」という用語は、本明細書で議論されるような所望の効果を生じることができるアミノ酸配列、例えば、タンパク質、ポリペプチド又はペプチド；糖又は多糖；脂質又は糖脂質、糖タンパク質、又はリポタンパク質を意味する。またエフェクター分子は、化学薬品も含む。また、生物学的に活性な又はエフェクターのタンパク質、ポリペプチド、又はペプチドをコードするエフェクター分子核酸も企図される。従って、適切な分子は、制御因子、酵素、抗体、又は薬物、並びにＤＮＡ、ＲＮＡ、及びオリゴヌクレオチドを含む。生物学的に活性なポリペプチド又はエフェクター分子は天然に存在することもできるし、又は例えば、組換え若しくは化学合成によって既知の成分から合成することもでき、異種成分を含むことができる。生物学的に活性なポリペプチド又はエフェクター分子は、遠心分離又はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動などの標準的な分子サイズ分類技術で判断したときに、一般に、約０．１〜１００ＫＤ、又はそれよりも大きく約１０００ＫＤまでであり、好ましくは、約０．１、０．２、０．５、１、２、５、１０、２０、３０〜５０ＫＤである。本発明の所望の効果としては、例えば、結合活性が増大された本発明の融合タンパク質複合体を形成し、標的細胞を死滅させて、例えば、細胞増殖又は細胞死のいずれかを誘導すること、疾患の予防又は処置において免疫応答を開始させること、又は診断目的のために検出分子の役割を果たすことが挙げられるが、これらに限定されない。このような検出のために、アッセイ、例えば、細胞を培養して増殖させる逐次的なステップを含むアッセイが使用され得る。
【０１２３】
本発明に従ってエフェクター分子を本発明の融合タンパク質複合体に共有結合させると、いくつかの大きな利点が提供される。既知の構造を有するようなペプチドを含む、単一のエフェクター分子を含有する本発明の融合タンパク質複合体が作製され得る。さらに、様々な種類のエフェクター分子が同様のＤＮＡベクターにおいて作製され得る。すなわち、種々のエフェクター分子のライブラリーが感染細胞又は罹患細胞の認識のために融合タンパク質複合体に連結され得る。さらに、治療用途では、本発明の融合タンパク質複合体を対象に投与するのではなく、融合タンパク質複合体のインビボ発現のために融合タンパク質複合体をコードするＤＮＡ発現ベクターを投与することができる。このようなアプローチにより、組換えタンパク質の調製に通常関連する高価な精製ステップが回避され、従来のアプローチに関連する、抗原取り込み及びプロセッシングの複雑さが回避される。
【０１２４】
記載されるように、本明細書に開示される融合タンパク質及び抗体の成分、例えば、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、タンパク質毒素、免疫グロブリンドメイン又は他の生物活性分子などのエフェクター分子コンジュゲート、及び任意のペプチドリンカーは、融合タンパク質又は抗体が意図された機能を有することを条件として、ほとんどあらゆる方法で組織化され得る。特に、融合タンパク質の各成分は、所望により、少なくとも１つの適切なペプチドリンカー配列によって別の成分から離間され得る。さらに、融合タンパク質は、例えば、融合タンパク質の修飾、同定及び／又は精製を容易にするためにタグを含んでいてもよい。
【０１２５】
医薬品治療
本発明は、治療薬として使用するためのＡＬＴ−８０３を含む医薬組成物を提供する。１つの態様では、ＡＬＴ−８０３は、例えば、生理食塩水などの薬学的に許容できる緩衝液中で処方されて全身に投与される。好ましい投与経路には、例えば、連続的な持続レベルの組成物を患者に提供する、膀胱内への点滴、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、又は皮内注射が含まれる。ヒト患者又は他の動物の処置は、生理学的に許容できる担体中の、本明細書で同定される治療的に有効な量の治療薬を用いて実行される。適切な担体及びその製剤は、例えば、Ｅ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓに記載されている。投与すべき治療薬の量は、投与様式、患者の年齢及び体重、並びに新生物又は自己免疫疾患又は炎症性疾患の臨床症状に応じて異なる。一般に、量は、新生物又は自己免疫疾患又は炎症性疾患に関連する他の疾患の処置で使用される他の薬剤に対して使用される量の範囲内であり得るが、特定の場合には、化合物の特異性の増大のためにより低い量が必要とされるであろう。化合物は、当業者に知られている方法で決定したときに、対象の免疫応答を強化するか、又は新生物細胞の増殖、生存、若しくは侵襲性を低減する投薬量で投与される。或いは、化合物は、疾患に関連する免疫応答によって引き起こされる自己免疫疾患又は炎症性疾患を低減する投薬量で投与される。
【０１２６】
医薬組成物の処方
新生物又は自己免疫疾患又は炎症性疾患の処置のためのＡＬＴ−８０３の投与は、他の成分と組み合わせて、新生物又は自己免疫疾患又は炎症性疾患を改善、低減、又は安定化するのに有効である濃度の治療薬をもたらす任意の適切な手段によるものでよい。ＡＬＴ−８０３は、任意の適切な担体物質中に任意の適切な量で含有させることができ、一般に、組成物の総重量の１〜９５重量％の量で存在する。組成物は、非経口（例えば、皮下、静脈内、筋肉内、小胞内（ｉｎｔｒａｖｅｓｉｃｕｌａｒｌｙ）又は腹腔内）投与経路に適した剤形で提供され得る。医薬組成物は従来の薬務に従って処方され得る（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（第２０版），Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，２０００、並びにＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｓｗａｒｂｒｉｃｋ及びＪ．Ｃ．Ｂｏｙｌａｎ編，１９８８−１９９９，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照）。
【０１２７】
ヒトの投薬量を動物モデルと比べて修正することは当該技術分野において日常的であると当業者により認識されるので、ヒト投薬量は、初めに、マウス又は非ヒト霊長類で使用される化合物の量から外挿することによって決定することができる。特定の実施形態では、投薬量は、約０．１μｇの化合物／ｋｇ体重〜約５０００μｇの化合物／ｋｇ体重、又は約１μｇ／ｋｇ体重〜約４０００μｇ／ｋｇ体重、又は約１０μｇ／ｋｇ体重〜約３０００μｇ／ｋｇ体重で異なり得ることが想定される。他の実施形態では、この用量は、約０．１、０．３、０．５、１、３、５、１０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、又は５０００μｇ／ｋｇ体重であり得る。他の実施形態では、用量は、約０．５μｇの化合物／ｋｇ体重〜約２０μｇの化合物／ｋｇ体重の範囲であり得ることが想定される。他の実施形態では、用量は、約０．５、１、３、６、１０、又は２０ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。当然ながら、このような処置プロトコルにおいて日常的に行われるように、この投薬量は、最初の臨床試験の結果及び特定の患者の必要性に応じて上方又は下方に調整され得る。
【０１２８】
特定の実施形態では、ＡＬＴ−８０３は、非経口投与に適した賦形剤中に処方される。特定の実施形態では、ＡＬＴ−８０３は、０．５μｇ／ｋｇ〜約１５μｇ／ｋｇ（例えば、０．５、１、３、５、１０、又は１５μｇ／ｋｇ）で投与される。
【０１２９】
膀胱癌の処置の場合、ＡＬＴ−８０３は、膀胱内への点滴によって投与される。点滴の方法は知られている。例えば、Ｌａｗｒｅｎｃｉａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ８，７６０−８（２００１）；Ｎｏｇａｗａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１５，９７８−８５（２００５）；Ｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ３９１，３０４−１３  ２００５；Ｔｙａｇｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｕｒｏｌ  １７１，４８３−９（２００４）；Ｔｒｅｖｉｓａｎｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ３０９，１１６７−７３（２００４）；Ｔｒｅｖｉｓａｎｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ５，５４６−５１（２００２））；（Ｓｅｇａｌ，ｅｔ  ａｌ．，１９７５）．（Ｄｙｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，２００５）．（Ｂａｔｉｓｔａ，ｅｔ  ａｌ，２００５；Ｄｙｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，２００５）を参照されたい。特定の実施形態では、点滴のためのＡＬＴ−８０３の投薬量は、約５〜１０００μｇ／投与の間で異なり得ることが想定される。
【０１３０】
医薬組成物は適切な賦形剤を用いて医薬組成物に処方され、これは投与されると、制御された形で治療薬を放出する。例としては、単一又は複数の単位錠剤又はカプセル組成物、油溶液、懸濁液、エマルション、マイクロカプセル、ミクロスフェア、分子複合体、ナノ粒子、パッチ、及びリポソームが挙げられる。
【０１３１】
非経口組成物
ＡＬＴ−８０３を含む医薬組成物は、剤形、製剤中で、注射、注入若しくは移植（皮下、静脈内、筋肉内、小胞内（ｉｎｔｒａｖｅｓｉｃｕｌａｒｌｙ）、腹腔内など）によって、又は従来の非毒性の薬学的に許容可能な担体及び補助剤を含有する適切な送達デバイス若しくはインプラントによって、非経口的に投与され得る。このような組成物の処方及び調製は、医薬製剤分野の当業者によく知られている。処方は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（上記）において見出すことができる。
【０１３２】
非経口使用のためのＡＬＴ−８０３を含む組成物は、単位剤形（例えば、単回用量のアンプル、シリンジ又はバッグ）において、又は数回の用量を含有し、且つ適切な防腐剤が添加され得るバイアルにおいて提供され得る（以下を参照）。組成物は、溶液、懸濁液、エマルション、注入デバイス、又は移植のための送達デバイスの形態であってもよいし、或いは使用の前に水又は別の適切な媒体で再構成される乾燥粉末として提供され得る。新生物又は自己免疫疾患又は炎症性疾患を低減又は改善する活性剤とは別に、組成物は、適切な非経口的に許容できる担体及び／又は賦形剤を含んでいてもよい。活性治療薬は、制御放出のために、ミクロスフェア、マイクロカプセル、ナノ粒子、リポソームなどに取り込まれてもよい。さらに、組成物は、懸濁剤、可溶化剤、安定剤、ｐＨ調整剤、浸透圧調整剤、及び／又は分散剤を含んでいてもよい。
【０１３３】
上記のように、ＡＬＴ−８０３を含む医薬組成物は、無菌注射に適した形態であってもよい。このような組成物を調製するために、適切な活性の抗新生物薬／抗感染薬は、非経口的に許容できる液体媒体中に溶解又は懸濁される。使用され得る許容できる媒体及び溶媒としては、水、適切な量の塩酸、水酸化ナトリウム又は適切な緩衝液の添加により適切なｐＨに調整された水、１，３−ブタンジオール、リンゲル溶液、並びに等張の塩化ナトリウム溶液及びデキストロース溶液がある。また水性製剤は、１つ又は複数の防腐剤（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル、エチル又はｎ−プロピル）も含有し得る。化合物の１つが水中にかろうじて又はわずかにしか可溶性でない場合、溶解増強剤又は可溶化剤を添加することもできるし、或いは溶媒が１０〜６０％ｗ／ｗのプロピレングリコールなどを含んでいてもよい。
【０１３４】
本発明は、新生物又は感染性の疾患及び／又は障害又はその症状を処置する方法であって、本明細書中の処方の化合物を含む治療的に有効な量の医薬組成物を対象（例えば、ヒトなどの哺乳類）に投与することを含む方法を提供する。従って、一実施形態は、新生物又は感染性の疾患及び／又は障害又はその症状を患っているか又はこれらにかかりやすい対象を処置する方法である。本方法は、疾患又は障害が処置されるような条件下で、疾患又は障害又はその症状を処置するのに十分な治療量の量の本明細書中の化合物を哺乳類に投与するステップを含む。
【０１３５】
本明細書中の方法は、このような効果をもたらすために、有効量の本明細書に記載される化合物、又は本明細書に記載される組成物を、対象（このような処置を必要としていると特定された対象を含む）に投与することを含む。このような処置を必要としている対象の特定は対象又は医療従事者の判断でよく、主観的（例えば、意見）又は客観的（例えば、試験又は診断方法により測定可能）であり得る。
【０１３６】
本発明の治療方法（予防的治療を含む）は、一般に、治療的に有効な量の本明細書中の化合物、例えば、本明細書中の処方の化合物を、哺乳類、特にヒトを含む、それを必要としている対象（例えば、動物、ヒト）に投与することを含む。このような処置は、新生物又は感染性の疾患、障害、又はその症状を患っている、それを有している、それにかかりやすい、又はそのリスクがある対象、特にヒトに適切に投与されるであろう。「リスクのある」対象の決定は、診断テスト又は対象若しくは医療提供者の意見（例えば、遺伝子検査、酵素又はタンパク質マーカー、マーカー（本明細書中で定義される）、家族歴など）による任意の客観的又は主観的決定によって行うことができる。ＡＬＴ−８０３は、免疫応答の増大が所望される任意の他の障害の処置において使用され得る。
【０１３７】
一実施形態では、本発明は、処置の進行をモニターする方法を提供する。本方法は、新生物又は自己免疫疾患又は炎症性疾患に関連する障害又はその症状を患っているか又はそれにかかりやすい対象において、診断マーカー（マーカー）（例えば、本明細書中の化合物によって調節される本明細書中で描写される任意の標的、タンパク質又はその指標など）又は診断的測定（例えば、スクリーン、アッセイ）のレベルを決定するステップを含み、ここで、対象は、疾患又はその症状を処置するのに十分な治療量の本明細書中の化合物が投与されている。本方法において決定されるマーカーのレベルは、対象の疾患状態を確立するために、健康な正常対照又は他の悩まされている患者のいずれかのマーカーの既知のレベルと比較することができる。好ましい実施形態では、第１のレベルの決定よりも後の時点で、対象のマーカーの第２のレベルが決定され、２つのレベルを比較して、疾患の経過又は治療の効力をモニターする。特定の好ましい実施形態では、本発明に従って処置を開始する前に、対象におけるマーカーの処置前レベルが決定され、次に、マーカーのこの処置前レベルを、処置が開始した後の対象のマーカーのレベルと比較して、処置の効力を決定することができる。
【０１３８】
併用治療
好ましくは、ＡＬＴ−８０３は、抗体、例えば、腫瘍特異的抗体又は免疫チェックポイント阻害薬などの抗新生物治療薬又は抗炎症治療薬と併用して投与される。抗体及びＡＬＴ−８０３は、同時又は逐次的に投与され得る。いくつかの実施形態では、抗体処置は、疾患の徴候のために確立された治療法であり、抗体レジメンにＡＬＴ−８０３処置を加えると、患者への治療効果が改善される。このような改善は、個々の患者に基づいた応答の増大又は患者集団における応答の増大として測定され得る。また併用治療は、より少量又はより低頻度の抗体の投与で改善された応答を提供し、より良好な耐容性の処置レジメンをもたらし得る。記載されるように、ＡＬＴ−８０３及び抗体の併用治療は、増強されたＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及び／又はＮＫ細胞、Ｔ細胞、好中球又は単球細胞レベル又は免疫応答を含む、種々のメカニズムによる臨床活性の強化を提供し得る。
【０１３９】
所望により、ＡＬＴ−８０３は、手術、放射線療法、化学療法、タンパク質ベースの療法又は生物学的療法を含むがこれらに限定されない、任意の従来の治療法と組み合わせて投与される。化学療法薬には、アルキル化剤（例えば、白金系薬物、テトラジン、アジリジン、ニトロソ尿素、ナイトロジェンマスタード）、代謝拮抗薬（例えば、葉酸代謝拮抗薬、フルオロピリミジン、デオキシヌクレオシド類似体、チオプリン）、微小管阻害剤（例えば、ビンカアルカロイド、タキサン）、トポイソメラーゼ阻害薬（例えば、トポイソメラーゼＩ及びＩＩ阻害薬）、細胞傷害性抗生物質（例えば、アントラサイクリン）及び免疫調節薬（例えば、サリドマイド及び類似体）が含まれる。
【０１４０】
キット又は医薬品システム
ＡＬＴ−８０３を含む医薬組成物は、新生物又は自己免疫疾患又は炎症性疾患の処置で使用するためにキット又は医薬品システムに構築されてもよい。本発明のこの態様に従うキット又は医薬品システムは、バイアル、チューブ、アンプル、ボトル、シリンジ、又はバッグなどの１つ又は複数の容器手段がその中に厳重に閉じ込められた、ボックス、カートン、チューブなどのキャリア手段を含む。本発明のキット又は医薬品システムは、ＡＬＴ−８０３の使用についての関連の説明書も含み得る。
【０１４１】
組換えタンパク質発現
一般に、本発明の融合タンパク質複合体（例えば、ＡＬＴ−８０３の成分）の調製は、本明細書に開示される手順及び認識された組換えＤＮＡ技術によって達成することができる。
【０１４２】
一般に、組換えポリペプチドは、適切な発現媒体においてポリペプチドをコードする核酸分子又はその断片の全て又は一部を用いて、適切な宿主細胞の形質転換により産生される。分子生物学の分野の当業者は、組換えタンパク質を提供するために様々な種類の発現系のいずれかが使用され得ることを理解するであろう。使用される正確な宿主細胞は、本発明には重要ではない。組換えポリペプチドは、事実上あらゆる真核生物宿主（例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、昆虫細胞、例えば、Ｓｆ２１細胞、又は哺乳類細胞、例えば、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨｅＬａ、ＣＯＳ若しくは好ましくはＣＨＯ細胞）において産生され得る。このような細胞は、広範な供給源から入手可能である（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，Ｍｄ．；また例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９７も参照される）。トランスフェクションの方法及び発現媒体の選択は、選択される宿主系に依存するであろう。形質転換方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（上記）に記載されており、発現媒体は、例えば、Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｐ．Ｈ．Ｐｏｕｗｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｓｕｐｐ．１９８７）において提供されるものから選択することができる。
【０１４３】
組換えポリペプチドの産生のために様々な発現系が存在する。このようなポリペプチドを産生するのに有用な発現ベクターには、染色体、エピソーム、及びウイルス由来のベクター、例えば、細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入因子由来、酵母染色体要素由来、ウイルス（例えば、バキュロウイルス、ＳＶ４０などのパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス及びレトロウイルス）由来のベクター、並びにこれらの組合せに由来するベクターが含まれるが、これらに限定されない。
【０１４４】
組換えポリペプチドが発現されたら、これは、例えば、親和性クロマトグラフィーを用いて単離される。一例では、ポリペプチドに対して生じた抗体（例えば、本明細書に記載されるように産生される）はカラムに付着され、組換えポリペプチドを単離するために使用され得る。親和性クロマトグラフィーの前に、標準的な方法により、ポリペプチドを保有する細胞の溶解及び分画が実施され得る（例えば、上記のＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．を参照）。単離されたら、組換えタンパク質は、所望により、例えば、高速液体クロマトグラフィーによってさらに精製され得る（例えば、Ｆｉｓｈｅｒ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｏｒｋ及びＢｕｒｄｏｎ編，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８０を参照）。
【０１４５】
本明細書で使用される場合、本発明の生物学的に活性なポリペプチド又はエフェクター分子は、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、タンパク質毒素、免疫グロブリンドメイン、又は例えば酵素などの他の生物活性タンパク質などの因子を含み得る。また生物学的に活性なポリペプチドは、非タンパク質毒素、細胞傷害薬、化学療法剤、検出可能な標識、放射性物質など他の化合物とのコンジュゲートを含み得る。
【０１４６】
本発明のサイトカインは、他の細胞に影響を及ぼし、且つ細胞性免疫のいくつかの多重効果のいずれかの原因となる、細胞によって産生される任意の因子によって定義される。サイトカインの例としては、ＩＬ−２ファミリー、インターフェロン（ＩＦＮ）、ＩＬ−１０、ＩＬ−１、ＩＬ−１７、ＴＧＦ及びＴＮＦサイトカインファミリー、並びにＩＬ−１〜ＩＬ−３５、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮγ、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α、及びＴＮＦβが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４７】
本発明の態様では、第１の融合タンパク質は、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）ドメイン又はその機能性断片に共有結合された第１の生物学的に活性なポリペプチドを含む。ＩＬ−１５は、Ｔ細胞の活性化及び増殖に影響を及ぼすサイトカインである。免疫細胞の活性化及び増殖への影響におけるＩＬ−１５活性はいくつかの点でＩＬ−２に類似しているが、基本的な違いは十分に特徴付けられている（Ｗａｌｄｍａｎｎ，ＴＡ，２００６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５９５−６０１）。
【０１４８】
本発明の別の態様では、第１の融合タンパク質は、ＩＬ−１５変異体（本明細書では、ＩＬ−１５突然変異体とも呼ばれる）であるインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）ドメインを含む。ＩＬ−１５変異体は、好ましくは、天然（又は野生型）ＩＬ−１５タンパク質とは異なるアミノ酸配列を含む。ＩＬ−１５変異体は、好ましくは、ＩＬ−１５Ｒαポリペプチドに結合し、ＩＬ−１５アゴニスト又はアンタゴニストとして機能する。好ましくは、アゴニスト活性を有するＩＬ−１５変異体は、スーパーアゴニスト活性を有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５変異体は、ＩＬ−１５Ｒαとの関連とは無関係に、ＩＬ−１５アゴニスト又はアンタゴニストとして機能することができる。ＩＬ−１５アゴニストは、野生型ＩＬ−１５と比べて、同等又は増大した生物活性によって例示される。ＩＬ−１５アンタゴニストは、野生型ＩＬ−１５と比べて低下した生物活性によって、又はＩＬ−１５媒介性の応答を阻害する能力によって例示される。いくつかの例では、ＩＬ−１５変異体は、増大又は低下した活性によりＩＬ−１５ＲβγＣ受容体に結合する。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５変異体の配列は、天然ＩＬ−１５配列と比べて、少なくとも１つのアミノ酸変化、例えば、置換又は欠失を有しており、このような変化は、ＩＬ−１５アゴニスト又はアンタゴニスト活性をもたらす。好ましくは、アミノ酸置換／欠失は、ＩＬ−１５Ｒβ及び／又はγＣと相互作用をするＩＬ−１５のドメイン内にある。より好ましくは、アミノ酸置換／欠失は、ＩＬ−１５Ｒαポリペプチドへの結合又はＩＬ−１５変異体を産生する能力に影響を与えない。ＩＬ−１５変異体を生成するための適切なアミノ酸置換／欠失は、推定上又は既知のＩＬ−１５構造、既知の構造を有するＩＬ−２などのＩＬ−１５と相同の分子との比較に基づいて、本明細書で提供されるように、合理的若しくはランダムな変異誘発及び機能性アッセイ、又は他の経験的な方法によって特定され得る。さらに、適切なアミノ酸置換は、保存的又は非保存的な変化、及び付加的なアミノ酸の挿入であり得る。好ましくは、本発明のＩＬ−１５変異体は、成熟ヒトＩＬ−１５配列の６位、８位、１０位、６１位、６５位、７２位、９２位、１０１位、１０４位、１０５位、１０８位、１０９位、１１１位、又は１１２位において１つ又は２つ以上のアミノ酸置換／欠失を含有する；特に、Ｄ８Ｎ（「Ｄ８」は天然成熟ヒトＩＬ−１５配列におけるアミノ酸及び残基の位置を指し、「Ｎ」はＩＬ−１５変異体においてその位置で置換されたアミノ酸残基を指す）、Ｉ６Ｓ、Ｄ８Ａ、Ｄ６１Ａ、Ｎ６５Ａ、Ｎ７２Ｒ、Ｖ１０４Ｐ又はＱ１０８Ａ置換はアンタゴニスト活性を有するＩＬ−１５変異体をもたらし、Ｎ７２Ｄ置換はアゴニスト活性を有するＩＬ−１５変異体をもたらす。
【０１４９】
ケモカインは、サイトカインと同様に、他の細胞に曝露されたときに細胞性免疫のいくつかの多重効果のいずれかの原因となる任意の化学的因子又は分子として定義される。適切なケモカインは、ＣＸＣ、ＣＣ、Ｃ、及びＣＸ．ｓｕｂ．３Ｃケモカインファミリー、並びにＣＣＬ−１〜ＣＣＬ−２８、ＣＸＣ−１〜ＣＸＣ−１７、ＸＣＬ−１、ＸＣＬ−２、ＣＸ３ＣＬ１、ＭＩＰ−ｌｂ、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１、及びＲａｎｔｅｓを含み得るが、これらに限定されない。
【０１５０】
成長因子は、特定の細胞に曝露されたときに影響を受ける細胞の増殖及び／又は分化を誘導する任意の分子を含む。成長因子はタンパク質及び化学分子を含み、そのうちの一部は、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ヒト成長因子及び幹細胞成長因子を含む。付加的な成長因子も本明細書に記載される使用に適し得る。
【０１５１】
毒素又は細胞傷害薬は、細胞に曝露されたときに致死的効果又は成長阻害効果を有する任意の物質を含む。より具体的には、エフェクター分子は、例えば、植物又は細菌起源の細胞毒素、例えば、ジフテリア毒素（ＤＴ）、志賀毒素、アブリン、コレラ毒素、リシン、サポリン、シュードモナス外毒素（ＰＥ）、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、又はゲロニンであり得る。このような毒素の生物学的に活性な断片は当該技術分野においてよく知られており、例えば、ＤＴ  Ａ鎖及びリシンＡ鎖が含まれる。さらに、毒素は、細胞表面で活性な薬剤、例えば、ホスホリパーゼ酵素（例えば、ホスホリパーゼＣ）などであり得る。
【０１５２】
さらに、エフェクター分子は、例えば、ビンデシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メトトレキサート、アドリアマイシン、ブレオマイシン、又はシスプラチンなどの化学療法薬であり得る。
【０１５３】
さらに、エフェクター分子は、診断又はイメージング研究に適した、検出可能に標識された分子であり得る。このような標識には、ビオチン若しくはストレプトアビジン／アビジン、検出可能なナノ粒子若しくは結晶、酵素若しくはその触媒活性断片、蛍光標識、例えば、緑色蛍光タンパク質、ＦＩＴＣ、フィコエリトリン、ｃｙｃｈｏｍｅ、テキサスレッド若しくは量子ドット；放射性核種、例えば、ヨウ素−１３１、イットリウム−９０、レニウム−１８８若しくはビスマス−２１２；リン光若しくは化学発光の分子、又はＰＥＴ、超音波若しくはＭＲＩによって検出可能な標識、例えば、Ｇｄ若しくは常磁性金属イオンベースの造影剤が含まれる。エフェクター又はタグを含むタンパク質の作製及び使用に関する開示については、例えば、Ｍｏｓｋａｕｇ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４，１５７０９（１９８９）；Ｐａｓｔａｎ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ４７，６４１，１９８６；Ｐａｓｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｔｏｘｉｎｓ  ａｓ  Ｎｏｖｅｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１，３３１，（１９９２）；”Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｔｏｘｉｎｓ”Ｏｌｓｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｈｉｌ，Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．，２５，３５５（１９８２）；ＰＣＴ国際公開第９４／２９３５０号パンフレット；ＰＣＴ国際公開第９４／０４６８９号パンフレット；ＰＣＴ国際公開第２００５０４６４４９号パンフレット及び米国特許第５，６２０，９３９号明細書を参照されたい。
【０１５４】
共有結合したＩＬ−１５ドメイン及びＩＬ−１５Ｒαドメインを含むタンパク質融合又はコンジュゲート複合体は、いくつかの重要な用途を有する。損傷又は死滅を受けやすい細胞又は組織は、本明細書に開示される方法によって容易にアッセイすることができる。
【０１５５】
本発明のＩＬ−１５及びＩＬ−１５Ｒαポリペプチドは、アミノ酸配列において、天然に存在するＩＬ−１５及びＩＬ−１５Ｒα分子、例えば、ヒト、マウス若しくは齧歯類、又は他の哺乳類のＩＬ−１５及びＩＬ−１５Ｒα分子に適切に対応する。これらのポリペプチド及びコード核酸の配列は文献において知られており、ヒトインターロイキン１５（ＩＬ１５）ｍＲＮＡ−−ＧｅｎＢａｎｋ：Ｕ１４４０７．１、ハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）インターロイキン１５（ＩＬ１５）ｍＲＮＡ−−ＧｅｎＢａｎｋ：Ｕ１４３３２．１、ヒトインターロイキン−１５受容体アルファ鎖前駆体（ＩＬ１５ＲＡ）ｍＲＮＡ−−ＧｅｎＢａｎｋ：Ｕ３１６２８．１、ハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）インターロイキン１５受容体，アルファ鎖−−ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＣ０９５９８２．１が含まれる。
【０１５６】
いくつかの設定では、例えば、ｓｃ−ＴＣＲ又はｓｃ−抗体の原子価を増大させるために、本発明のタンパク質融合又はコンジュゲート複合体を多価にすることが有用であり得る。特に、融合タンパク質複合体のＩＬ−１５ドメインとＩＬ−１５Ｒαドメインとの間の相互作用は、多価値複合体を生成する手段を提供する。さらに、多価融合タンパク質は、例えば、標準ビオチン−ストレプトアビジン標識技術を用いることによる、１〜４個のタンパク質（同じ又は異なる）の間の共有結合的又は非共有結合的な接続によって、又はラテックスビーズなどの適切な固体支持体へのコンジュゲーションによって作製され得る。化学架橋されたタンパク質（例えば、ナノ粒子に架橋）も適切な多価種である。例えば、タンパク質は、ビオチン化ＢｉｒＡタグなどの修飾され得るタグ配列、又はＣｙｓ又はＨｉｓなどの化学反応性側鎖を有するアミノ酸残基をコードする配列を含むことによって修飾され得る。このようなアミノ酸タグ又は化学反応性アミノ酸は、融合タンパク質又は抗体内の様々な位置、好ましくは、生物学的に活性なポリペプチド又はエフェクター分子の活性部位から離れた位置に配置され得る。例えば、可溶性融合タンパク質のＣ末端は、タグ、又はこのような反応性アミノ酸を含む他の融合タンパク質に共有結合され得る。２つ以上の融合タンパク質を適切なナノ粒子に化学的に結合させて多価分子を得るために、適切な側鎖が包含され得る。例示的なナノ粒子は、デンドリマー、リポソーム、コア−シェル粒子又はＰＬＧＡ系粒子を含む。
【０１５７】
本発明の別の実施形態では、融合タンパク質複合体のポリペプチドの一方又は両方は、免疫グロブリンドメインを含む。或いは、タンパク質結合ドメインＩＬ−１５融合タンパク質はさらに免疫グロブリンドメインに連結され得る。好ましい免疫グロブリンドメインは、上記で提供されるような多重鎖タンパク質を形成するために、他の免疫グロブリンドメインとの相互作用を可能にする領域を含む。例えば、ＩｇＧ１  ＣＨ２〜ＣＨ３などの免疫グロブリン重鎖領域は安定して相互作用して、Ｆｃ領域を作り出すことができる。Ｆｃドメインを含む好ましい免疫グロブリンドメインは、Ｆｃ受容体若しくは補体タンパク質結合活性を含むエフェクター機能、及び／又はグリコシル化部位を有する領域も含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質複合体の免疫グロブリンドメインは、Ｆｃ受容体若しくは補体結合活性又はグリコシル化を低減又は増強する突然変異を含有し、それにより、得られるタンパク質の生物活性に影響を及ぼす。例えば、Ｆｃ受容体への結合を低減する突然変異を含有する免疫グロブリンドメインは、Ｆｃ受容体を有する細胞に対してより低い結合活性を有する本発明の融合タンパク質複合体を生成するために使用することができ、これは、特定の抗原を認識又は検出するように設計された試薬に有利であり得る。
【０１５８】
核酸及びベクター
本発明はさらに、本発明のタンパク質（例えば、ＡＬＴ−８０３の成分）をコードする核酸配列、特にＤＮＡ配列を提供する。好ましくは、ＤＮＡ配列は、染色体外複製に適したベクター、例えば、ファージ、ウイルス、プラスミド、ファージミド、コスミド、ＹＡＣ、又はエピソームによって担持される。特に、所望の融合タンパク質をコードするＤＮＡベクターは、本明細書に記載される調製方法を容易にするため、及び有意量の融合タンパク質を得るために使用することができる。ＤＮＡ配列は、適切な発現ベクター、すなわち、挿入されたタンパク質コード配列の転写及び翻訳に必要な要素を含有するベクターに挿入され得る。様々な宿主−ベクター系を利用して、タンパク質コード配列を発現させることができる。これらは、ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなど）に感染した哺乳類細胞系；ウイルス（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；微生物、例えば、酵母ベクターを含有する酵母、又はバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ若しくはコスミドＤＮＡで形質転換された細菌を含む。利用される宿主−ベクター系に応じて、いくつかの適切な転写及び翻訳要素のいずれか１つが使用され得る。Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（上記）及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（上記）を参照されたい。
【０１５９】
本発明には、可溶性融合タンパク質複合体を作製するための方法が含まれ、本方法は、第１及び第２の融合タンパク質をコードする本明細書に記載されるＤＮＡベクターを宿主細胞に導入することと、融合タンパク質を細胞又は培地中で発現させ、且つ第１の融合タンパク質のＩＬ−１５ドメインと、第２の融合タンパク質の可溶性ＩＬ−１５Ｒαドメインとの間の結合を可能にして、可溶性融合タンパク質複合体を形成するのに十分な条件下で、宿主細胞を培地中で培養することと、可溶性融合タンパク質複合体を宿主細胞又は培地から精製することとを含む。
【０１６０】
一般に、本発明に従う好ましいＤＮＡベクターは、５’から３’の方向に、エフェクター分子をコードする配列に作動可能に連結された、生物学的に活性なポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列の導入のための第１のクローニング部位を含む、リン酸ジエステル結合により連結されたヌクレオチド配列を含む。
【０１６１】
ＤＮＡベクターによってコードされる融合タンパク質成分は、カセット形式で提供することができる。「カセット」という用語は、標準的な組換え方法によって、各成分が別の成分を容易に置換できることを意味する。特に、カセット形式に構成されたＤＮＡベクターは、コードされた融合複合体が血清型を発生する能力を有し得るか、又は有する病原体に対して使用される場合に特に望ましい。
【０１６２】
融合タンパク質複合体をコードするベクターを作製するために、生物学的に活性なポリペプチドをコードする配列は、適切なリガーゼによって、エフェクターペプチドをコードする配列に連結される。提示ペプチドをコードするＤＮＡは、適切な細胞株などの天然の供給源からＤＮＡを単離することによって、又は既知の合成方法、例えば、リン酸トリエステル法によって得ることができる。例えば、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編，１９８４）を参照されたい。合成オリゴヌクレオチドは、市販の自動オリゴヌクレオチド合成装置を用いて調製されてもよい。単離されたら、生物学的に活性なポリペプチドをコードする遺伝子は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は当該技術分野で知られている他の手段によって増幅させることができる。生物学的に活性なポリペプチド遺伝子を増幅させるために適切なＰＣＲプライマーは、ＰＣＲ生成物に制限部位を付加し得る。ＰＣＲ生成物は、好ましくは、エフェクターペプチドのスプライス部位と、生物学的に活性なポリペプチド−エフェクター融合複合体の適正な発現及び分泌に必要なリーダー配列とを含む。またＰＣＲ生成物は、好ましくは、リンカー配列をコードする配列、又はこのような配列のライゲーションのための制限酵素部位も含む。
【０１６３】
本明細書に記載される融合タンパク質は、好ましくは、標準的な組換えＤＮＡ技術によって作製される。例えば、生物学的に活性なポリペプチドをコードするＤＮＡ分子が単離されたら、配列は、エフェクターポリペプチドをコードする別のＤＮＡ分子にライゲートされ得る。生物学的に活性なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、エフェクターペプチドをコードするＤＮＡ配列に直接接合されてもよく、より典型的には、生物学的に活性なポリペプチドをコードする配列とエフェクターペプチドをコードする配列との間に、本明細書で議論されるようなリンカー配列をコードするＤＮＡ配列が挿入され、適切なリガーゼを用いて接合されてもよい。得られたハイブリッドＤＮＡ分子は適切な宿主細胞において発現されて、融合タンパク質複合体を産生することができる。ＤＮＡ分子は、ライゲーションの後に、コードされたポリペプチドの翻訳フレームが改変されない（すなわち、ＤＮＡ分子がインフレームで互いにライゲートされる）ように、５’から３’の方向に互いにライゲートされる。得られるＤＮＡ分子は、インフレーム融合タンパク質をコードする。
【０１６４】
また他のヌクレオチド配列も遺伝子構築物に含まれ得る。例えば、エフェクターペプチドに融合された生物学的に活性なポリペプチドをコードする配列の発現を制御するプロモーター配列、又は融合タンパク質を細胞表面又は培地に方向付けるリーダー配列は、構築物内に包含されるか、又は構築物が挿入される発現ベクター内に存在し得る。免疫グロブリン又はＣＭＶプロモーターが特に好ましい。
【０１６５】
生物学的に活性な変異ポリペプチド、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα又はＦｃドメインのコード配列を得る際に、当業者は、ポリペプチドが、特定のアミノ酸置換、付加、欠失、及び翻訳後修飾によって、生物活性が損失又は低減することなく修飾され得ることを認識するであろう。特に、保存的なアミノ酸置換、すなわち同様のサイズ、電荷、極性及び構造の別のアミノ酸に対する１つのアミノ酸の置換が、タンパク質機能を著しく改変する可能性が低いことはよく知られている。タンパク質を構成する２０個の標準的なアミノ酸は、以下のような４つの保存的アミノ酸の群に大まかに分類することができる：非極性（疎水性）群はアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン及びバリンを含み；極性（非荷電、中性）群はアスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、セリン、スレオニン及びチロシンを含み；正に帯電した（塩基性）群はアルギニン、ヒスチジン及びリジンを含有し；そして負に帯電した（酸性）群はアスパラギン酸及びグルタミン酸を含有する。タンパク質において同じ群内の別のアミノ酸に対する１つのアミノ酸の置換は、タンパク質の生物活性に悪影響を有する可能性が低い。他の例では、アミノ酸位置への修飾は、タンパク質の生物活性を低減又は増強するために行うことができる。このような変化はランダムに導入されるか、又は標的残基の既知又は推定の構造又は機能特性に基づいて部位特異的突然変異により導入され得る。変異体タンパク質の発現に続いて、修飾による生物活性の変化は、結合又は機能性アッセイを用いて容易に評価することができる。
【０１６６】
ヌクレオチド配列間の相同性はＤＮＡハイブリダイゼーション分析によって決定することができ、ここで、二本鎖ＤＮＡハイブリッドの安定性は、生じる塩基対合の程度に依存する。高温及び／又は低塩含有量の条件はハイブリッドの安定性を低減し、選択される程度よりも低い程度の相同性を有する配列のアニーリングを防止するように変更され得る。例えば、約５５％のＧ−Ｃ含有量を有する配列では、４０〜５０℃、６ｘＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム緩衝液）及び０．１％のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）のハイブリダイゼーション及び洗浄条件は約６０〜７０％の相同性を示し、５０〜６５℃、１ｘＳＳＣ及び０．１％のＳＤＳのハイブリダイゼーション及び洗浄条件は約８２〜９７％の相同性を示し、５２℃、０．１ｘＳＳＣ及び０．１％のＳＤＳのハイブリダイゼーション及び洗浄条件は約９９〜１００％の相同性を示す。またヌクレオチド及びアミノ酸配列を比較するため（及び相同性の程度を測定するため）の広範なコンピュータプログラムも利用可能であり、市販のソフトウェア及び無料のソフトウェアの両方の供給源を提供するリストは、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）において見出される。容易に入手可能な配列比較及び多重配列アライメントアルゴリズムはそれぞれ、Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）及びＣｌｕｓｔａｌＷプログラムである。ＢＬＡＳＴは、ワールドワイドウェブ上のｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにおいて入手可能であり、ＣｌｕｓｔａｌＷのバージョンは、２．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋにおいて入手可能である。
【０１６７】
融合タンパク質の成分は、それぞれがその意図される機能を実施できることを条件として、ほぼ任意の順序で組織化され得る。例えば、一実施形態では、生物学的に活性なポリペプチドはエフェクター分子のＣ末端又はＮ末端に位置する。
【０１６８】
本発明の好ましいエフェクター分子は、それらのドメインの意図される機能をもたらすサイズを有し得る。本発明のエフェクター分子は、周知の化学架橋法を含む様々な方法によって作製され、生物学的に活性なポリペプチドに融合され得る。例えば、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｈｏｌｄｅｎ−ＤａｙのＭｅａｎｓ，Ｇ．Ｅ．ａｎｄ  Ｆｅｅｎｅｙ，Ｒ．Ｅ．（１９７４）を参照されたい。また、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ，ＣＲＣ  ＰｒｅｓｓのＳ．Ｓ．Ｗｏｎｇ（１９９１）も参照されたい。しかしながら、一般に、組換え操作を使用して、インフレーム融合タンパク質を作製することが好ましい。
【０１６９】
記載されるように、本発明に従う融合分子又はコンジュゲート分子は、いくつかの方法で組織化され得る。例示的な配置では、生物学的に活性なポリペプチドのＣ末端は、エフェクター分子のＮ末端に作動可能に連結される。その連結は、所望により、組換え法によって達成され得る。しかしながら、別の配置では、生物学的に活性なポリペプチドのＮ末端がエフェクター分子のＣ末端に連結される。
【０１７０】
代替的又は付加的に、１つ又は複数の付加的なエフェクター分子が、必要に応じて、生物学的に活性なポリペプチド又はコンジュゲート複合体に挿入され得る。
【０１７１】
ベクター及び発現
いくつかの戦略を用いてＡＬＴ−８０３を発現させることができる。例えば、ＡＬＴ−８０３をコードする構築物は、制限酵素を用いて構築物の挿入のためにベクターに切断部を作り、その後にライゲーションを行うことで、適切なベクターに組み込むことができる。次に、遺伝子構築物を含有するベクターは、融合タンパク質の発現のために適切な宿主に導入される。一般的には、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．を参照されたい。適切なベクターの選択は、クローニングプロトコルに関連する因子に基づいて経験的に行うことができる。例えば、ベクターは使用される宿主と適合性であり、適正なレプリコンを有さなければならい。ベクターは、発現すべき融合タンパク質複合体をコードするＤＮＡ配列を収容することができなければならない。適切な宿主細胞は、真核細胞及び原核細胞、好ましくは、容易に形質転換され、且つ培地中で急速な成長を示すことができる細胞を含む。特に好ましい宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バチルス・スブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｕｓ）などの原核生物と、動物細胞及び酵母株、例えば、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの真核生物とを含む。哺乳類細胞、特に、Ｊ５５８、ＮＳＯ、ＳＰ２−Ｏ又はＣＨＯは一般に好ましい。他の適切な宿主には、例えば、Ｓｆ９などの昆虫細胞が含まれる。従来の培養条件が使用される。上記のＳａｍｂｒｏｏｋを参照されたい。次に、安定な形質転換又はトランスフェクト細胞株が選択され得る。本発明の融合タンパク質複合体を発現する細胞は、既知の手順により決定することができる。例えば、免疫グロブリンに連結された融合タンパク質複合体の発現は、連結された免疫グロブリンに特異的なＥＬＩＳＡ、及び／又はイムノブロッティングによって決定することができる。ＩＬ−１５又はＩＬ−１５Ｒαドメインに連結された生物学的に活性なポリペプチドを含む融合タンパク質の発現を検出するための他の方法は、実施例において開示されている。
【０１７２】
上記で一般的に言及されるように、宿主細胞は、所望の融合タンパク質をコードする核酸を増殖させるために調製目的で使用され得る。従って、宿主細胞は、融合タンパク質の産生が特に意図される原核細胞又は真核細胞を含むことができる。従って、宿主細胞は、特に、融合体をコードする核酸を増殖させることができる、酵母、ハエ、虫、植物、カエル、哺乳類の細胞及び臓器を含む。使用可能な哺乳類細胞株の非限定的な例としては、ＣＨＯ  ｄｈｆｒ細胞（Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｍ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６（１９８０））、２９３細胞（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９（１９７７））、又はＳＰ２若しくはＮＳＯのような骨髄腫細胞（Ｇａｌｆｒｅ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７３（Ｂ）：３（１９８１））が挙げられる。
【０１７３】
所望の融合タンパク質複合体をコードする核酸を増殖させることができる宿主細胞は、昆虫（例えば、Ｓｐ．フルギペルダ（Ｓｐ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、酵母（例えば、Ｆｌｅｅｒ，Ｒ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３（５）：４８６４９６（１９９２）によって一般的に概説されるように、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｓ．ポンべ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｈ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ））、真菌、及び植物細胞を含む非哺乳類真核細胞も同様に包含する。また、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及びバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）などの特定の原核生物も企図される。
【０１７４】
所望の融合タンパク質をコードする核酸は、細胞をトランスフェクトするための標準的な技術によって宿主細胞に導入され得る。「トランスフェクトする」又は「トランスフェクション」という用語は、リン酸カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、ウイルス形質導入、及び／又は組込みを含む、核酸を宿主細胞に導入するための全ての従来の技術を包含することが意図される。宿主細胞をトランスフェクトするための適切な方法は、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．及び他の実験室用教科書において見出すことができる。
【０１７５】
種々のプロモーター（転写開始制御領域）が本発明に従って使用され得る。適切なプロモーターの選択は、提唱される発現宿主に依存する。異種供給源からのプロモーターは、選択される宿主において機能性である限りは使用され得る。
【０１７６】
プロモーターの選択は、ペプチド又はタンパク質産生の所望の効率及びレベルにも依存する。ｔａｃなどの誘導性プロモーターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるタンパク質発現のレベルを劇的に増大させるために使用されることが多い。タンパク質の過剰発現は、宿主細胞にとって有害であり得る。結果的に、宿主細胞の成長は制限され得る。誘導性プロモーター系の使用は、遺伝子発現の誘導前に、宿主細胞が許容できる密度まで培養さされることを可能にし、それにより、より高い生産物収量が促進される。
【０１７７】
種々のシグナル配列が本発明に従って使用され得る。生物学的に活性なポリペプチドコード配列に相同のシグナル配列が使用され得る。或いは、発現宿主における効率的な分泌及びプロセッシングのために選択又は設計されたシグナル配列も使用され得る。例えば、適切なシグナル配列／宿主細胞対は、Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）における分泌のためのＢ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｓａｃＢシグナル配列、及びＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）分泌のためのサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α−接合因子又はＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）酸性ホスファターゼｐｈｏＩシグナル配列を含む。シグナル配列は、シグナルペプチダーゼ切断部位をコードする配列によって、又は通常１０個よりも少ないコドンからなる短いヌクレオチドブリッジによってタンパク質コード配列に直接接合させることができ、ここで、ブリッジは、下流のタンパク質配列の正しいリーディングフレームを保証する。
【０１７８】
転写及び翻訳を増強するための要素は、真核生物のタンパク質発現系について同定されている。例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）プロモーター１０００ｂｐを異種プロモーターのいずれかの側に配置すると、植物細胞において転写レベルが１０倍〜４００倍上昇され得る。また発現構築物は、適切な翻訳開始配列も含むべきである。適正な翻訳開始のためのＫｏｚａｋコンセンサス配列を含むような発現構築物の修飾は、翻訳のレベルを１０倍増大させ得る。
【０１７９】
選択的マーカーが使用されることが多いが、これは、マーカーが目的の遺伝子とは異なる部位に組み込まれるように、発現構築物の一部であるか、又は発現構築物から分離され（例えば、発現ベクターにより支持され）得る。例としては、抗生物質への耐性を付与するマーカー（例えば、ｂｌａは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞にアンピシリン耐性を付与し、ｎｐｔＩＩは、様々な種類の原核細胞及び真核細胞にカナマイシン耐性を付与する）、又は最少培地において宿主が成長できるようにするマーカー（例えば、ＨＩＳ４は、ヒスチジンの非存在下でＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）又はＨｉｓ−Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が成長できるようにする）が挙げられる。選択可能なマーカーは、マーカーの独立した発現を可能にするように、その独自の転写及び翻訳の開始及び終結の制御領域を有する。抗生物質耐性がマーカーとして使用される場合、選択のための抗生物質の濃度は抗生物質によって異なることになり、通常、培地１ｍＬ当たり抗生物質１０〜６００μｇの範囲である。
【０１８０】
発現構築物は、既知の組換えＤＮＡ技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）を用いることによって構築される。制限酵素消化及びライゲーションは、２つのＤＮＡ断片を接合するために使用される基本的な工程である。ＤＮＡ断片の末端はライゲーションの前に修飾を必要とすることがあり、これは、オーバーハングを埋めることによって、ヌクレアーゼ（例えば、ＥｘｏＩＩＩ）により断片の末端部分を欠失させることによって、部位特異的変異誘発によって、或いはＰＣＲにより新しい塩基対を付加することによって達成され得る。ポリリンカー及びアダプターは、選択された断片の接合を促進するために使用され得る。発現構築物は、通常、制限、ライゲーション、及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の形質転換の繰返しを用いて段階的に構築される。発現構築物の構築に適した多数のクローニングベクターは当該技術分野で知られており（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９において引用される、λＺＡＰ及びｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ  ＳＫ−１，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ、ｐＥＴ，Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、特定の選択は本発明にとって重要ではない。クローニングベクターの選択は、宿主細胞への発現構築物の導入のために選択される遺伝子導入系によって影響され得る。各段階の最後に、得られた構築物は、制限、ＤＮＡ配列、ハイブリダイゼーション及びＰＣＲ分析によって分析され得る。
【０１８１】
発現構築物は、線状若しくは環状のいずれかのクローニングベクター構築物として宿主に形質転換されてもよいし、或いは、クローニングベクターから除去されて、そのままで使用されるか、又は送達ベクターに導入されてもよい。送達ベクターは、選択された宿主細胞型において発現構築物の導入及び維持を促進する。発現構築物は、いくつかの既知の遺伝子導入系（例えば、天然受容能、化学的に媒介される形質転換、プロトプラスト形質転換、エレクトロポレーション、微粒子銃形質転換、トランスフェクション、又はコンジュゲーション）のいずれかによって宿主細胞に導入される（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）。選択される遺伝子導入系は、使用される宿主細胞及びベクター系に依存する。
【０１８２】
例えば、発現構築物は、プロトプラスト形質転換又はエレクトロポレーションによってＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞に導入することができる。Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のエレクトロポレーションは容易に達成され、スフェロプラスト形質転換と同等の形質転換効率が得られる。
【０１８３】
本発明はさらに、目的の融合タンパク質を単離するための生産プロセスを提供する。このプロセスでは、制御配列に作動可能に連結された目的のタンパク質をコードする核酸が導入されている宿主細胞（例えば、酵母、真菌、昆虫、細菌又は動物細胞）は培地において生産規模で成長されて、目的の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列の転写を刺激する。続いて、目的の融合タンパク質は、回収された宿主細胞又は培地から単離される。標準的なタンパク質精製技術を使用して、目的のタンパク質を培地又は回収細胞から単離することができる。特に、精製技術を使用して、ローラーボトル、スピナーフラスコ、組織培養プレート、バイオリアクター、又は発酵槽を含む様々な実施から所望の融合タンパク質を大規模（すなわち、少なくともミリグラム量）で発現させ、精製することができる。
【０１８４】
発現したタンパク質融合複合体は、既知の方法によって単離及び精製され得る。通常、培地は遠心分離又はろ過され、次に上清が、親和性若しくは免疫親和性クロマトグラフィー、例えば、タンパク質Ａ若しくはタンパク質Ｇ親和性クロマトグラフィー、又は発現した融合複合体に結合するモノクローナル抗体の使用を含む免疫親和性プロトコルによって精製される。本発明の融合タンパク質は、既知の技術の適切な組み合わせによって分離及び精製され得る。これらの方法には、例えば、塩沈殿及び溶媒沈殿などの溶解度を利用する方法、透析、限外ろ過、ゲルろ過、及びＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動などの分子量の差を利用する方法、イオン交換カラムクロマトグラフィーなどの電荷の差を利用する方法、親和性クロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、並びに等電点電気泳動などの等電点の差を利用する方法、Ｎｉ−ＮＴＡなどの金属親和性カラムが含まれる。これらの方法に関する開示については、一般に、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．を参照されたい。
【０１８５】
本発明の融合タンパク質は実質的に純粋であることが好ましい。すなわち、融合タンパク質は、融合タンパク質が好ましくは少なくとも８０％又は９０％〜９５％の均一性（ｗ／ｗ）で存在するように、天然においてそれに付随する細胞置換基（ｃｅｌｌ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔ）から単離されている。少なくとも９８〜９９％の均一性（ｗ／ｗ）を有する融合タンパク質は、多数の医薬品、臨床及び研究用途のために最も好ましい。実質的に精製されたら、融合タンパク質は、治療用途のために実質的に汚染物質を含まないはずである。部分的又は実質的に純粋になるまで精製されたら、可溶性融合タンパク質は、治療的に、又は本明細書中に開示されるようなインビトロ若しくはインビボアッセイの実施において使用され得る。実質的な純度は、クロマトグラフィー及びゲル電気泳動などの様々な標準的な技術によって決定することができる。
【０１８６】
本発明の融合タンパク質複合体は、癌性であるか若しくは感染した、又は１つ若しくは複数の疾患に感染する可能性のある、様々な細胞とのインビトロ又はインビボの使用に適している。
【０１８７】
ヒトインターロイキン−１５（ｈＩＬ−１５）は、抗原提示細胞上に発現されたヒトＩＬ−１５受容体α鎖（ｈＩＬ−１５Ｒα）によって、免疫エフェクター細胞に対してトランス提示される。ＩＬ−１５Ｒαは、主に細胞外ｓｕｓｈｉドメイン（ＩＬ−１５ＲαＳｕ）によって、ｈＩＬ−１５に高親和性（３８ｐＭ）で結合する。本明細書に記載されるように、ＩＬ−１５及びＩＬ−１５ＲαＳｕドメインは、可溶性複合体（例えば、ＡＬＴ−８０３）を作製するために、又はマルチドメイン融合複合体を構築するための足場として使用することができる。
【０１８８】
ＩｇＧドメイン、特にＦｃ断片は、承認された生物学的薬物を含むいくつかの治療用分子のための二量体足場としてうまく使用されている。例えば、エタネルセプトは、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインに連結された可溶性ヒトｐ７５腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）受容体（ｓＴＮＦＲ）の二量体である。この二量体化により、エタネルセプトは、ＴＮＦ−α活性の阻害において単量体ｓＴＮＦＲよりも最大１，０００倍強力であることが可能になり、単量体形態よりも５倍長い血清半減期を有する融合体が提供される。結果として、エタネルセプトは、インビボでのＴＮＦ−αの炎症誘発性活性の中和と、いくつかの異なる自己免疫徴候についての患者の予後の改善とにおいて有効である。
【０１８９】
その二量体化活性に加えて、Ｆｃ断片は、補体の活性化、並びにナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、単球細胞、貪食細胞及び樹状細胞上に提示されるＦｃγ受容体との相互作用によって、細胞傷害性エフェクター機能も提供する。抗癌治療抗体及び他の抗体ドメイン−Ｆｃ融合タンパク質との関連で、これらの活性は、動物腫瘍モデル及び癌患者において観察される効力において重要な役割を果たす可能性がある。しかしながら、これらの細胞傷害性エフェクター応答は、いくつかの治療用途では十分でないことがある。従って、Ｆｃドメインのエフェクター活性における改善及び拡大と、免疫治療分子による疾患部位での細胞溶解性免疫応答（ＮＫ細胞及びＴ細胞を含む）の活性又は補充を増大させる他の手段の開発とにかなりの関心が持たれている。
【０１９０】
ヒト由来の免疫刺激治療薬を開発することを目的として、ヒトＩＬ−１５（ｈＩＬ−１５）及びＩＬ−１５受容体ドメインを使用した。ｈＩＬ−１５は、高い結合親和性（平衡解離定数（ＫＤ）約１０−１１Ｍ）でｈＩＬ−１５受容体α鎖（ｈＩＬ−１５Ｒα）と結合する、サイトカインの小さい４αヘリックスバンドルファミリーのメンバーである。得られた複合体は、次に、Ｔ細胞及びＮＫ細胞の表面に提示されたヒトＩＬ−２／１５受容体β／共通γ鎖（ｈＩＬ−１５ＲβγＣ）複合体に対してトランス提示される。このサイトカイン／受容体相互作用はエフェクターＴ細胞及びＮＫ細胞の拡大及び活性化をもたらし、これは、ウイルス感染細胞及び悪性細胞を根絶するのに重要な役割を果たす。通常、ｈＩＬ−１５及びｈＩＬ−１５Ｒαは樹状細胞において同時産生されて細胞内に複合体を形成し、これは続いて分泌され、細胞表面にヘテロ二量体分子として提示される。従って、ｈＩＬ−１５及びｈＩＬ−１５Ｒαの相互作用の特徴により、これらの鎖間結合ドメインがヒト由来免疫刺激複合体として、そして標的特異的結合が可能な可溶性二量体分子を作製するため足場としての役割を果たし得ることが示唆される。
【０１９１】
本発明の実施は、他に記載されない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の従来の技術を使用し、これらは、十分に当業者の技能の範囲内である。このような技術は、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９８９）；”Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｇａｉｔ，１９８４）；”Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，１９８７）；”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ””Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（Ｗｅｉｒ，１９９６）；”Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ”（Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｃａｌｏｓ，１９８７）；”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ａｕｓｕｂｅｌ，１９８７）；”ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ”，（Ｍｕｌｌｉｓ，１９９４）；”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（Ｃｏｌｉｇａｎ，１９９１）などの文献において十分に説明されている。これらの技術は本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドの作製に適用可能であり、従って、本発明の作製及び実施において考慮され得る。特定の実施形態のために特に有用な技術は、以下のセクションで議論されるであろう。
【０１９２】
本明細書には、インビトロ及び実験動物腫瘍モデルにおいてＩＬ−１５スーパーアゴニストのＡＬＴ−８０３を用いた、抗ＣＤ３８抗体の抗腫瘍活性の強化が記載される。ダラツムマブは、再発性又は難治性多発性骨髄腫を有する患者の処置のためにＦＤＡにより最近承認された抗ＣＤ３８抗体である。ダラツムマブは、ＣＤ３８発現腫瘍細胞を標的とすることによって、腫瘍量を低減することが示されている。同様に、イサツキシマブ（ＳＡＲ６５０９８４）、ＭＯＲ２０２、Ａｂ７９、ＡＢ１９、及びＭＴ−４０１９などの他の抗ＣＤ３８Ａｂは、ＣＤ３８発現腫瘍細胞に対して抗腫瘍活性であり、及び／又は血液腫瘍を有する患者において臨床活性であることが示されている。以下の実施例に記載されるように、新規のＩＬ−１５スーパーアゴニスト複合体であるＡＬＴ−８０３が、併用治療においてダラツムマブの抗ＣＤ３８抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を強化する、インビトロ及びインビボでの能力を調べた。新たに単離されたＰＢＭＣを用いて、ＡＬＴ−８０３が、ＤａｕｄｉヒトＢリンパ腫細胞に対するダラツムマブのＡＤＣＣ活性を大幅に強化することを実証した。以下の実施例に記載されるように、ＡＬＴ−８０３により活性化された精製ヒトＮＫ細胞は、初代ヒトＢリンパ腫細胞に対するダラツムマブ媒介性ＡＤＣＣ活性を強化した。Ｄａｕｄｉ細胞に対するダラツムマブ媒介性抗腫瘍活性におけるＡＬＴ−８０３のインビボでの効果も、ＳＣＩＤ異種移植片モデルで調べた。ＡＬＴ−８０３及びダラツムマブは両方とも単独で腫瘍担持マウスのＤａｕｄｉ腫瘍量をできることが観察された。しかしながら、ＡＬＴ−８０３とダラツムマブとを組み合わせると抗腫瘍活性が増大され、骨髄におけるＤａｕｄｉ細胞が著しく減少した。これらの観察により、ダラツムマブ処置へのＡＬＴ−８０３の付加は、ダラツムマブ単独の場合と比較して、ダラツムマブの抗腫瘍効力を強化することが示される。加えて、本明細書に記載されるように、ＡＬＴ−８０３は、腫瘍細胞に対するダラツムマブの食作用の抗体依存性細胞傷害も増強する。現在の臨床研究において、相関研究もＡＬＴ−８０３がＤａｕｄｉ細胞に対するダラツムマブのＡＤＣＣ活性を増強することを示す。これはまた、ＡＬＴ−８０３がインビボで腫瘍特異的抗体との相乗的な抗腫瘍活性を有することも実証する。
【０１９３】
以下の実施例は、本発明のアッセイ、スクリーニング、及び治療方法をどのように作製及び使用するかの完全な開示及び説明を当業者に提供するように提示されており、本発明者らが彼らの発明であるとするものの範囲を限定することは意図されない。
【実施例】
【０１９４】
実施例１：抗ＣＤ３８抗体と組み合わせたＡＬＴ−８０３による細胞媒介性細胞傷害の誘導
この例では、「ＡＬＴ−８０３」は、二量体ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質と非共有結合的に結合したＩＬ−１５Ｎ７２Ｄを含む複合体を意味し、前記複合体は免疫刺激活性を示す。任意選択的に、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ及び／又はＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質は、参照配列に対して１つ、２つ、３つ、４つ又はそれ以上のアミノ酸変化を含む。例示的なＩＬ−１５Ｎ７２Ｄアミノ酸配列は以下に提供される（例えば、参照によって本明細書中に援用される米国特許出願第１３／７６９，１７９号明細書を参照）。
【０１９５】
例示的なＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ核酸配列（リーダーペプチドを有する）は以下に提供される（配列番号１）：
（リーダーペプチド）
ａｔｇｇａｇａｃａｇａｃａｃａｃｔｃｃｔｇｔｔａｔｇｇｇｔａｃｔｇｃｔｇｃｔｃｔｇｇｇｔｔｃｃａｇｇｔｔｃｃａｃｃｇｇｔ−
（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）
【化１】
2020512361.tif 000003
（終止コドン）
ｔａａ
【０１９６】
例示的なＩＬ−１５Ｎ７２Ｄアミノ酸配列（リーダーペプチドを有する）は以下に提供される（配列番号２）：
（リーダーペプチド）
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ−
（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）
【化２】
2020512361.tif 000004
【０１９７】
一部の場合には、リーダーペプチドは成熟ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄポリペプチドから切断されている（配列番号３）：
（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）
【化３】
2020512361.tif 000005
【０１９８】
例示的なＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ核酸配列（リーダーペプチドを有する）は以下に提供される（配列番号４）：
（リーダーペプチド）
ａｔｇｇａｃａｇａｃｔｔａｃｔｔｃｔｔｃａｔｔｃｃｔｇｃｔｃｃｔｇａｔｔｇｔｃｃｃｔｇｃｇｔａｃｇｔｃｔｔｇｔｃｃ−
（ＩＬ−１５ＲαＳｕ）
【化４】
2020512361.tif 000006
（ＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３（Ｆｃドメイン））
【化５】
2020512361.tif 000007
（終止コドン）
ｔａａ
【０１９９】
例示的なＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃアミノ酸配列（リーダーペプチドを有する）は以下に提供される（配列番号５）：
（リーダーペプチド）
ＭＤＲＬＴＳＳＦＬＬＬＩＶＰＡＹＶＬＳ−
（ＩＬ−１５ＲαＳｕ）
【化６】
2020512361.tif 000008
（ＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３（Ｆｃドメイン））
【化７】
2020512361.tif 000009
【０２００】
一部の場合には、成熟ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃタンパク質はリーダー配列を欠いている（配列番号６）：
（ＩＬ−１５ＲαＳｕ）
【化８】
2020512361.tif 000010
（ＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３（Ｆｃドメイン））
【化９】
2020512361.tif 000011
【０２０１】
抗ＣＤ３８Ａｂと組み合わせたＡＬＴ−８０３が、癌細胞に対する細胞媒介性細胞傷害に影響を与えられるかどうかを評価するために、血液バフィーコートから単離したヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用した。ＤａｕｄｉヒトＢ細胞リンパ腫細胞を標的細胞として使用し、製造業者により説明されるように３７℃において２０分間、ＲＰＭＩ−１０（ＲＰＭＩ−１６４０、２−メルカプトエタノール、ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、及び１０％ウシ胎児血清）中５μＭのＣｅｌｌＴｒａｃｅＴＭＶｉｏｌｅｔで標識した。エフェクター細胞を５：１の比率でバイオレット標識した標的腫瘍細胞と混合し、ＡＬＴ−８０３を用いて、そして用いずに、又は抗ＣＤ３８Ａｂ（ダラツムマブ）と組み合わせて、ＲＰＭＩ−１０中５％のＣＯ２と共に３７℃で２日間インキュベートした。次に、混合物を遠心分離により回収し、２ｍｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムを含有するＲＰＭＩ−１０中に再懸濁させた。標的細胞に対するエフェクター細胞の細胞傷害を、フローサイトメトリーにより、ヨウ化プロピジウム染色後に死んだバイオレット標識標的細胞の割合を決定することによって評価した。図１に示されるように、新鮮なヒトＰＢＭＣはＡＬＴ−８０３の非存在下でＤａｕｄｉ細胞に対して弱い細胞傷害性を有した。対照的に、ＰＢＭＣは、１０ｎＭのＡＬＴ−８０３の存在下でＤａｕｄｉ腫瘍標的細胞に対して強力な細胞傷害性を有した。Ｄａｕｄｉ腫瘍細胞は、抗ＣＤ３８Ａｂ（ダラツムマブ）によって認識され得るＣＤ３８分子を発現する。ヒトＰＢＭＣは、抗ＣＤ３８Ａｂが単独で媒介する抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）によってＤａｕｄｉ細胞を溶解させることができる（図１）。重要なことに、ＡＬＴ−８０３の添加により、Ｄａｕｄｉ腫瘍細胞に対するヒトＰＢＭＣの抗ＣＤ３８Ａｂ媒介性ＡＤＣＣ活性を著しく強化することができた。
【０２０２】
Ｄａｕｄｉ細胞に対するヒトＰＢＭＣ細胞傷害のＡＬＴ−８０３濃度依存性誘導を調査した。新鮮なヒトＰＢＭＣを、種々の濃度（１ｎＭ〜２５ｎＭ）のＡＬＴ−８０３及び固定濃度の抗ＣＤ３８Ａｂ（１０ｎＭ）を含むＲＰＭＩ−１０培地中で、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔで標識したＤａｕｄｉ細胞と混合した後、２日間インキュベーションを行った。標的細胞に対するヒトＰＢＭＣの細胞傷害を上記のようにフローサイトメトリーにより評価した。図１の結果と一致して、ＡＬＴ−８０３は、わずか１ｎＭでＤａｕｄｉ細胞に対するヒトＰＢＭＣの抗ＣＤ３８Ａｂ媒介性細胞傷害を増強することができた（図２Ａ）。また、このＡＤＣＣアッセイにおいて、様々な濃度の抗ＣＤ３８Ａｂ（０．１ｎＭ〜５０ｎＭ）及び固定１０ｍＭのＡＬＴ−８０３を用いた用量応答研究も行った（図２Ｂ）。わずか０．１ｎＭの抗ＣＤ３８Ａｂ、そして全てのＡｂ濃度でＤａｕｄｉ細胞の死滅の増大が見られ、腫瘍細胞の死滅はＡＬＴ−８０３の添加によってさらに増強された。
【０２０３】
観察された標的腫瘍細胞の死滅の原因である免疫エフェクター細胞を同定するために、ＭＡＣＳによってヒトＰＢＭＣからＮＫ細胞を単離し、上記のＡＤＣＣアッセイにおいてエフェクター細胞として使用した。全ヒトＰＢＭＣによる結果と同様に、ＮＫ細胞は、ＡＬＴ−８０３の添加により強化された抗ＣＤ３８Ａｂ媒介性ＡＤＣＣ活性によりＤａｕｄｉ腫瘍細胞を死滅させることができた（図２Ｃ）。全ＰＢＭＣと比べて、ＡＬＴ−８０３及び抗ＣＤ３８Ａｂと共にインキュベートしたＮＫ細胞を用いると、腫瘍標的に対してより大きい細胞傷害が観察された。
【０２０４】
実施例２：血液腫瘍を有するマウスにおけるＡＬＴ−８０３と抗ＣＤ３８Ａｂとの併用処置の抗腫瘍活性
ＡＬＴ−８０３が抗ＣＤ３８Ａｂの抗腫瘍効力を増強させる能力を、Ｄａｕｄｉ腫瘍を有するＳＣＩＤマウスにおいてさらに評価した。さらに、ステロイドによる前処置の後に腫瘍担持マウスにおいてＡＬＴ−８０３と抗ＣＤ３８Ａｂとの併用の効果を評価した。ステロイドは、注入反応を低減するための抗炎症薬として、抗ＣＤ３８Ａｂ治療と共に一般的に使用される。しかしながら、これらのステロイドの免疫抑制効果が抗ＣＤ３８Ａｂ治療の免疫介在性効力も制限し得るという懸念も存在する。この研究のために、Ｆｏｘ  Ｃｈａｓｅ  ＳＣＩＤ雌マウス（Ｈａｒｌａｎ，Ｃ．Ｂ−１７／ＩｃｒＨｓｄ−Ｐｒｋｄｃ−ｓｃｉｄ：６週齢）に、Ｄａｕｄｉ細胞（１０ｘ１０６／マウス）を静脈内（ｉ．ｖ．）接種した（６匹のマウス／群）。これらのマウスは、腫瘍に対するＡＤＣＣ応答を媒介する見込みのある機能性ＮＫ細胞を有する。いくつかの群では、１５日目（腫瘍接種の後）に、腫瘍担持マウスを、ＰＢＳ又は抗ＣＤ３８Ａｂ（１０ｍｇ／ｋｇ）による静脈内処置の１時間前にステロイド（ヒドロコルチゾン、０．２ｍｇ／マウス、腹腔内）でも処置した。処置群に応じてＰＢＳ又は抗ＣＤ３８Ａｂ処置のいずれかの２日後の１７日目に、マウスをＡＬＴ−８０３（０．２ｍｇ／ｋｇ、皮下）でさらに処置した。抗ＣＤ３８Ａｂ処置の７日後に、マウスを屠殺し、骨髄中のＤａｕｄｉ細胞のレベルを決定した。ＰＥコンジュゲート抗ヒトＨＬＡ−ＤＲ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）による染色及びフローサイトメトリー分析の後、大腿骨骨髄細胞のＤａｕｄｉ細胞の割合を評価した。図３に示されるように、ＡＬＴ−８０３及び抗ＣＤ３８Ａｂの単独療法は、腫瘍担持マウスの骨髄中のＤａｕｄｉ細胞の割合を低減することができる。しかしながら、ＡＬＴ−８０３と抗ＣＤ３８Ａｂとの併用は最大の抗腫瘍活性を提供し、骨髄Ｄａｕｄｉ細胞は、対照マウスにおける６２％から、ＡＬＴ−８０３＋抗ＣＤ３８Ａｂ処置マウスにおける１０％まで低減された。この増強効力は、ＡＬＴ−８０３と抗ＣＤ３８Ａｂとの併用治療の前にステロイドで処置した腫瘍担持マウスにおいても観察された。実際、ステロイドによる前処置の有無にかかわらず、ＡＬＴ−８０３＋抗ＣＤ３８Ａｂで処置したマウスにおいて同様の抗腫瘍活性が見られた。
【０２０５】
実施例３．抗ＣＤ３８Ａｂと組み合わせたＡＬＴ−８０３は血液腫瘍を有するマウスの生存期間を延長する
ＡＬＴ−８０３＋抗ＣＤ３８ＡｂがＤａｕｄｉ細胞腫瘍を有するマウスの生存期間を延長する能力も評価した。この研究のために、Ｆｏｘ  Ｃｈａｓｅ  ＳＣＩＤ雌マウスに、Ｄａｕｄｉ細胞（１０ｘ１０６／マウス）を静脈内（ｉ．ｖ．）接種した。１５日後に、腫瘍担持マウスをＰＢＳ又は抗ＣＤ３８Ａｂ（１０ｍｇ／ｋｇ、静脈内）のいずれかで処置した。注入反応を低減するために、ＰＢＳ処置マウスを除いて全てのマウスをステロイド（ヒドロコルチゾン、０．２ｍｇ／マウス、腹腔内）で前処置した。１７日目に、ＡＬＴ−８０３群及びＡＬＴ−８０３と抗ＣＤ３８Ａｂの併用群のマウスをＡＬＴ−８０３（０．２ｍｇ／ｋｇ、皮下）で処置した。２２日目に、ＡＬＴ−８０３群、抗ＣＤ３８Ａｂ群、及びＡＬＴ−８０３と抗ＣＤ３８Ａｂの併用群を１５日目及び１７日目と同様に処置した。マウスの生存（後肢の麻痺に基づく病的状態を含む）をモニターした。図４に示されるように、ＰＢＳ、ＡＬＴ−８０３及び抗ＣＤ３８Ａｂ単独療法で処置した腫瘍担持マウスの群は、３１〜４１日の生存期間中央値を示したが、抗ＣＤ３８Ａｂで処置した全ての腫瘍担持マウスは４５日を超えて生存し、併用治療がＢ細胞リンパ腫を有するマウスの生存期間を著しく延長することが示された。まとめると、これらの結果は、インビボで抗ＣＤ３８Ａｂと組み合わせたＡＬＴ−８０３の相乗的な抗腫瘍効果を確認する。これらの結果は、ステロイド前処置の存在下で観察された。
【０２０６】
実施例４．ＡＬＴ−８０３刺激性のＮＫ細胞は、腫瘍細胞に対する抗ＣＤ３８媒介性マクロファージ活性を強化する。
治療抗体は、一部分において、腫瘍細胞に対するマクロファージの抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）活性によって抗腫瘍活性を媒介し得る。マクロファージ活性は、次に、サイトカイン及び他の免疫エフェクター細胞により放出される他の薬剤によって刺激され得る。ＡＬＴ−８０３がマクロファージの抗腫瘍活性に影響を与える能力を評価するために、我々は、一次エフェクター細胞としてヒトマクロファージ細胞株ＴＨＰ−１、二次エフェクター細胞としてヒトＮＫ−９２細胞株（ＮＫ細胞株）、及び標的腫瘍細胞としてＤａｕｄｉ細胞を用いて、フローサイトメトリーベースの食作用アッセイを設定した。この研究では、ＮＫ−９２細胞（ａＮＫ細胞）をＴＨＰ−１及びＤａｕｄｉ細胞から分離するためにＴｒａｎｓｗｅｌｌＴＭシステムを使用した。ＮＫ−９２細胞（１ｘ１０５）をＴｒａｎｓｗｅｌｌＴＭインサート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の上部ウェル内で培養し、一方、ＴＨＰ−１細胞（１ｘ１０５）（製造プロトコル−ＳｉｇｍａによりＰＫＨ６７で標識）及びＤａｕｄｉ細胞（１ｘ１０５）（製造プロトコル−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＰｒｏｂｅｓによりＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔで標識）を２４ウェルプレートの底部ウェル内で培養した。各ウェルにおいて、培地単独か、又は１０ｎＭのＡＬＴ−８０３、１０ｎＭの抗ＣＤ３８Ａｂ、又は１０ｎＭのＡＬＴ−８０３＋１０ｎＭの抗ＣＤ３８Ａｂを１ｍｌの総体積中に含有する培地のいずれかで細胞を処置した。２４時間後に、ＴＨＰ−１及びＤａｕｄｉ細胞を遠心分離により回収し、ＰＫＨ６７及びＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔで標識された細胞の割合を決定することにより食作用を評価するために、フローサイトメーター緩衝液中に再懸濁させた（代表的なフローサイトメトリープロットは図５に示される）。このような二重陽性細胞は、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔで標識したＤａｕｄｉ細胞を貪食した、ＰＫＨ６７で標識したＴＨＰ−１マクロファージを表す。ＡＬＴ−８０３と抗ＣＤ３８Ａｂとの併用は、ＰＫＨ６７＋ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ＋細胞の割合の増大により示されるように（図５）、ＡＬＴ−８０３又は抗ＣＤ３８Ａｂ単独でインキュベートされた細胞と比較したときに、腫瘍細胞のマクロファージ媒介性食作用を増大させた。この強化された活性はＮＫ細胞及びＡＬＴ−８０３の存在に依存し、これは、ＮＫ細胞のＡＬＴ−８０３依存性の活性化が、罹患細胞、例えば、腫瘍細胞のＡｂ指向性マクロファージ食作用の刺激をもたらすことを示唆した。
【０２０７】
他の実施形態
本発明はその詳細な説明に関して説明されたが、上述の説明は本発明の範囲を説明することを意図したものであって、限定は意図されず、本発明は添付の請求項の範囲によって定義される。他の態様、利点、及び修正は、以下の請求項の範囲に含まれる。
【０２０８】
本明細書で言及される特許及び科学文献は、当業者に利用可能な知識を確立する。本明細書で引用される米国特許及び公開又は未公開の米国特許出願は全て、参照によって援用される。本明細書で引用される公開された外国特許及び特許出願は全て、参照によって本明細書に援用される。本明細書で引用される受託番号で示されるＧｅｎｂａｎｋ及びＮＣＢＩの提出は、参照によって本明細書に援用される。本明細書で引用される他の公開された参考文献、文書、原稿及び科学文献は全て、参照によって本明細書に援用される。
【０２０９】
本発明はその好ましい実施形態に関して具体的に図示及び記載されたが、添付の請求項によって包含される本発明の範囲から逸脱することなく、形態及び詳細の種々の変化がそこに成され得ることは、当業者によって理解されるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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