(57)【要約】本発明は、一般にStreptococcus pyogenes感染、リウマチ熱、又は連鎖球菌後糸球体腎炎（PSGN）の治療、検出、及び補佐するための組成物及び方法、並びにそれを必要とする対象におけるリウマチ熱又はPSGNの発症傾向を評価するための組成物及び方法に関する。組み換えStreptococcus pyogenes SpnAポリペプチドを含む組み換えポリペプチド、及びそのようなポリペプチドを含む組成物も、前記方法における使用のために提供される。【選択図】図９−２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
リウマチ熱又はPSGNを患う患者を治療する方法であって、
ｉ）Streptococcus pyogenesに特異的な１つ以上の抗体を含むことができる又は含む疑いがある対象から生体試料を提供すること；及び
ｉｉ）前記生体試料を1つ以上のStreptococcus pyogenes SpnA抗原集団と接触させることであって、前記1つ以上のStreptococcus pyogenes SpnA抗原集団は、前記生体試料中に抗原特異的抗体が存在する時は、前記生体試料中に存在する抗原特異的抗体と結合して1つ以上の抗原特異的抗体複合体の集団を形成することができる、接触させること；及び
ｉｉｉ）対象におけるリウマチ熱又はPSGNに対する１つ以上の他の診断基準を評価すること；
を含み、
ｉｖ）Streptococcus pyogenes SpnA抗原特異的複合体の存在、又は閾値を超えるStreptococcus pyogenes SpnA抗原特異的複合体の検出は、対象におけるStreptococcus pyogenesへの最近の曝露を示唆し；
ｖ）リウマチ熱又はPSGNに対する1つ以上の他の診断基準の存在は、Streptococcus pyogenes SpnA抗原特異的複合体の欠如、又は閾値を下回るStreptococcus pyogenes SpnA抗原特異的複合体の量の検出と共に、対象におけるStreptococcus pyogenesへの以前の曝露を示唆し；及び
ｖｉ）対象がStreptococcus pyogenesに最近曝露された場合、続いて最近発症したリウマチ熱又は急性PSGNに対する治療を行い；及び対象がStreptococcus pyogenesへ以前に曝露された場合には、確立した又は続くStreptococcus pyogenes感染への治療を行い、又はリウマチ熱又はPSGNに対する治療を行う、
治療する方法。
【請求項２】
リウマチ熱又はPSGNを患う患者を、Streptococcus pyogenesに対して効果のある抗菌剤で治療する方法であって、
ｉ）1つ以上のStreptococcus pyogenesに特異的な抗体を含むことができる、又は疑いのある対象から生体試料を提供すること；
ｉｉ）生体試料を、１つ以上のStreptococcus pyogenes SpnA由来の抗原の集団及び、１つ以上のStreptococcus pyogenesデオキシリボヌクレアーゼＢ由来の抗原の集団、及び/又は１つ以上のStreptococcus pyogenesＳＬＯ由来の抗原の集団と接触させることであって、１つ以上のStreptococcus pyogenes抗原は、生体試料内に抗原特異的抗体が存在する時は、生体試料中に存在する抗原特異的抗体と結合して1つ以上の抗原：特異的抗体複合体の集団を形成することができる、接触させることと；及び
ｉｉｉ）前記複合体を形成することであって、
Streptococcus pyogenes SpnA特異的複合体の存在、又は閾値を超えるStreptococcus pyogenes SpnA特異的複合体の量の検出は、対象がStreptococcus pyogenesに最近曝露されたことを示唆し、及び
Streptococcus pyogenesデオキシリボヌクレアーゼＢ特異的複合体及び/又はStreptococcus pyogenesＳＬＯ特異的複合体の存在、及びStreptococcus pyogenes SpnA特異的複合体の欠如又は閾値を下回るStreptococcus pyogenes SpnA特異的複合体の検出は、対象が以前にStreptococcus pyogenesに曝露されたことを示唆する、
形成することと、
ｉｖ）対象が最近Streptococcus pyogenesに曝露された場合には、その後急性Streptococcus pyogenes感染に対し効果のある抗菌剤を投与し；及び対象が以前にStreptococcus pyogenesに曝露された場合には、その後、確立された又は続くStreptococcus pyogenes感染に対し、効果のある抗菌剤を投与すること、
を含む方法。
【請求項３】
前記最近発症したリウマチ熱又は急性のStreptococcus pyogenesに対する治療は、急性治療期間を超える前記抗生物質の初回投与量の投与を含む治療投与計画に基づく、急性のStreptococcus pyogenes感染に対して効果的な抗菌剤の投与である、請求項1又は請求項2に記載の方法。
【請求項４】
急性治療期間が約５日〜約２０日、例えば、８日〜１５日、又は１０日〜約１２日である、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
抗生物質がバイシリンである、請求項２〜４のいずれか1つに記載の方法。
【請求項６】
対象においてStreptococcus pyogenesへの最近の曝露を検出する方法であって、
ｉ）1つ以上のStreptococcus pyogenes抗原に対して特異的な抗体を含むことができる、又は疑いのある対象から生体試料を提供すること；
ｉｉ）2つ以上のStreptococcus pyogenes抗原の集団を含む生体試料を接触させることであって、2つ以上のStreptococcus pyogenes抗原集団の其々は、生体試料中に存在する抗原特異的抗体に結合して、2つ以上の抗原、抗原特異的抗体複合体が生体試料に存在する場合は、抗原特異的抗体複合体、の集団を形成することを可能にする、接触させること；及び
ｉｉｉ）、1つ以上の複合体の閾値を超える検出の増加は、対象のStreptococcus pyogenesへの最近の曝露を示唆する、複合体を検出すること、
を含む方法。
【請求項７】
対象における急性連鎖球菌感染後糸球体腎炎（ＡＰＳＧＮ）を含むリウマチ熱又は連鎖球菌感染後糸球体腎炎（ＰＳＧＮ）、又は対象におけるリウマチ熱又はＰＳＧＮの進展の増加の可能性を検出又は診断する方法であって、
ｉ）1つ以上のStreptococcus pyogenes抗原に対して特異的な1つ以上の抗体を含むことができる、又は疑いのある対象から生体試料を提供すること；
ｉｉ）2つ以上のStreptococcus pyogenes抗原集団を生体試料と接触させることであって、Streptococcus pyogenes抗原は生体試料に存在する抗原特異的抗体に結合して2つ以上の抗原、抗原特異的抗体が生体試料に存在する場合は抗原特異的抗体複合体、の集団を形成することを可能にする、接触させること；及び
ｉｉｉ）閾値を超える1つ以上の複合体の増加は発達するリウマチ熱又はＡＰＳＧＮの増加の可能性を示唆し、又は対象におけるリウマチ熱又はＰＳＧＮの存在の一つの指標として、対象におけるStreptococcus pyogenesへの最近の曝露を示唆する、複合体を検出すること；
ｉｖ）リウマチ熱又はＰＳＧＮに対する１つ以上の診断基準を評価すること；及び
ｖ）及びリウマチ熱又はＡＰＳＧＮに対する1つ以上の他の診断基準と併せて、閾値を超える1つ以上の複合体の検出の増加は、対象におけるリウマチ熱又はＰＳＧＮを示唆すること、
を含む方法。
【請求項８】
対象におけるStreptococcus pyogenes抗原感染の存在を検出する方法であって、
ｉ）1つ以上のStreptococcus pyogenes抗原に対する1つ以上の抗体を含むことができる、又は疑いがある対象から生体試料を提供すること；
ｉｉ）2つ以上のStreptococcus pyogenes抗原を生体試料に接触させることであって、生体試料内に抗原特異的抗体複合体が存在する場合、2つ以上のStreptococcus pyogenes抗原は其々生体試料内で抗原特異的抗体に結合して2つ以上の抗原、抗原特異的抗体複合体の集団を形成する、接触させること；及び
ｉｉｉ）複合体を検出することであって、1つ以上の複合体の検出増加は対象におけるStreptococcus pyogenesの存在又はStreptococcus pyogenesに対象を最近曝露したことを示唆する、検出すること、
を含む方法。
【請求項９】
生体試料中のStreptococcus pyogenes抗原特異的抗体を検出する方法であって、Streptococcus pyogenes抗原特異的抗体がStreptococcus pyogenes抗原に特異的に結合する方法であって、
ｉ）1つ以上のStreptococcus pyogenes抗原に特異的な1つ以上の抗体を含むことができる又は含むと疑われる対象から生体試料を提供すること；
ｉｉ）生体試料をStreptococcus pyogenes抗原の2つ以上の集団と接触させることであって、Streptococcus pyogenes抗原の2つ以上の集団の其々は、抗原特異的抗体が生物学的サンプルに存在する場合、生体試料中の抗原特異的抗体と結合して抗原：特異的抗体複合体;の2つ以上の集団を形成する、接触させること；及び
ｉｉｉ）複合体を検出することであって、1つ以上の複合体の検出増加は、生体試料がStreptococcus pyogenes抗原に特異的な抗体を含むことを示唆する、検出すること、
を含む方法。
【請求項１０】
１つ以上の複合体の検出の増加が、各試験集団に対して確立された抗原の参照レベルに対する増加である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
１つ以上のStreptococcus pyogenes抗原に特異的な１つ以上の抗体が１つ以上の血清抗体である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記１つ以上の血清抗体が１つ以上のＩｇＧ抗体である、請求項１１に記載の方法。  
【請求項１３】
前記１つ以上の血清抗体が、１つ以上のＩｇＡ抗体又は１つ以上のＩｇＭ抗体である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記１つ以上の診断基準が、リウマチ熱又はＰＳＧＮに関連する１つ以上の臨床症状の有無である、請求項１又は請求項７に記載の方法。
【請求項１５】
前記１つ以上の臨床症状が、移動性多発性関節炎、心臓炎、血尿、辺縁部紅斑、皮下結節、セイデンハム舞踏病、又は膿皮症から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
Streptococcus pyogenes抗原の１つ以上が、以下：
i）Streptococcus pyogenesヌクレアーゼA（SpnA）、
ii）デオキシリボヌクレアーゼ-B（DNaseB）、又は
iii）ストレプトリジン-O（SLO）、
のタンパク質の1つに由来する抗原である、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
１つ以上のStreptococcus pyogenes抗原が：
i）Streptococcus pyogenesヌクレアーゼA（SpnA）、又は
ii）配列番号8のアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなるSpnAの抗原性断片、又は
iii）配列番号8のアミノ酸配列から少なくとも10個の連続したアミノ酸を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなるSpnAの抗原性断片、又は
iv）デオキシリボヌクレアーゼ-B（DNaseB）、又は
v）配列番号5のアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなるDNaseBの抗原性断片、又は
vi）配列番号5のアミノ酸配列から少なくとも10個の連続したアミノ酸を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなるDNaseBの抗原性断片、又は
vii）ストレプトリジン-O（SLO）、又は
viii）配列番号1又は配列番号2のアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなるSLOの抗原性断片、又は
ix）配列番号1又は配列番号2のアミノ酸配列から少なくとも10個の連続したアミノ酸を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなるSLO抗原性フラグメント
x）上記のi）からix）の2つ以上の任意の組み合わせ
を含む群より選択される、請求項1〜16のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
前記生物学的試料が、以下：
i）Streptococcus pyogenesヌクレアーゼA（SpnA）、又は
ii）配列番号8のアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなるSpnAの抗原性断片、又は
iii）配列番号8のアミノ酸配列からの少なくとも10個の連続したアミノ酸を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなるSpnAの抗原性断片、及び
iv）デオキシリボヌクレアーゼ-B（DNaseB）、又は
v）配列番号5のアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなるDNaseBの抗原性断片、又は
vi）配列番号5のアミノ酸配列からの少なくとも10個の連続したアミノ酸を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなるDNaseBの抗原性断片、及び
vii）ストレプトリジン-O（SLO）、又は
viii）配列番号1又は配列番号2のアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなるSLOの抗原性断片、又は
ix）配列番号1又は配列番号2のアミノ酸配列からの少なくとも10個の連続したアミノ酸を含む、本質的にそれから、又はそれからなるSLOの抗原性断片、
のStreptococcus pyogenes抗原のそれぞれの集団と接触される、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
生体試料が、以下：
i）Streptococcus pyogenesヌクレアーゼA（SpnA）、
ii）デオキシリボヌクレアーゼ-B（DNaseB）、及び
iii）ストレプトリジン-O（SLO）、
のStreptococcus pyogenes抗原のそれぞれの集団と接触される、請求項17記載の方法。
【請求項２０】
生体試料が、以下：
ｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなるSpnAの抗原性フラグメント。
ii）配列番号5のアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなるDNaseBの抗原性断片、及び
iii）配列番号1又は配列番号2のアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなるSLOの抗原性断片、
のStreptococcus pyogenes抗原のそれぞれの集団と接触される、請求項17記載の方法
【請求項２１】
Streptococcus pyogenes抗原の2つ以上の集団が組成物中に存在する、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
Streptococcus pyogenes抗原の１つ以上が検出可能な標識で標識され、及び/又は微粒子、ビーズ、又は検出可能な薬剤に結合している、請求項1〜21のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
Streptococcus pyogenes抗原の集団の１つ以上がビーズ又は微粒子に共有結合している、請求項1〜22のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
Streptococcus pyogenes抗原の各集団がビーズ又は微粒子に共有結合し、場合により、ビーズ又は微粒子の異なる集団のそれぞれが互いに区別可能である、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
前記ビーズがポリエチレンビーズ、磁気ビーズ、カルボキシル化ビーズ、官能化ビーズであるか、又は前記微粒子がポリスチレン微粒子、磁気微粒子、カルボキシル化微粒子、又は官能化微粒子である、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
抗原：抗体複合体の検出が、検出可能な標識を運ぶ特異的結合パートナーに複合体を曝露すること、及び抗原特異的抗体が生体試料に存在する場合は標識からのシグナルを検出することを含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
特定の結合パートナーが抗体又はその断片を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
特定の結合パートナーが抗IgG抗体、抗IgG-PE、又はその断片である請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
抗原：抗体複合体が浮遊機器、プレートに基づくイムノロジカルアッセイ、電気泳動及び／又はイムノブロット、イムノクロマトグラフィーストリップ、電気バイオセンサー、共振バイオセンサー、又はマイクロ流体機器又はセンサーを使用して検出される、請求項１〜２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
検出がELISA又はルミネックスアッセイである請求項１〜２９に記載の方法又は、イムノロジカルアッセイがELISA又はルミネックスアッセイである請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
１つ以上の複合体又は１つ以上の抗体特異的抗体の存在が、検出可能に標識された二次抗体を用いて検出される請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
検出可能に標識された二次抗体が抗IgG-PEである請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
Streptococcus pyogenes抗原が検出可能に標識されている請求項１〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
標識可能ラベルが蛍光体である請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
生体試料が哺乳類から得られる請求項１から３４に記載の方法。
【請求項３６】
生体試料が体液サンプルである請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
対象が人間である請求項３５又は３６に記載の方法。
【請求項３８】
単離、精製、又は組み換えSpnAポリペプチドであって、前記SpnAポリペプチドが野生型SpnAに関して：
N末端が切断されている、
C末端が切断されている、又は
両N末端及びC末端が切断されている、
である、ポリペプチド。
【請求項３９】
請求項３８に記載の前記SpnAポリペプチドが：
ｉ）免疫原性である、又は
ｉｉ）免疫学的に野生型SpnAと交差反応である、又は
ｉｉｉ）検出可能にラベルされている、及び
ｉｖ）野生型SpnAと比較して室温で保存した場合、安定性が強化されている、又は
ｖ）配列番号No.８由来の１０個以上の隣接したアミノ酸を含む、又は
ｖｉ）上記ｉ）〜ｖ）の２つ以上の組み合わせを持つ、
単離、精製、又は組み換えSpnAポリペプチド。
【請求項４０】
ポリペプチドが強化された熱安定性、免疫原性安定性、又は熱安定性、免疫原性安定性の両方を持つ、請求項３８又は３９に記載の単離、精製、又は組み換えSpnAポリペプチド。
【請求項４１】
請求項３８〜４０のいずれか一項に記載の単離、精製、又は組み換えSpnAポリペプチドを含む組成物。
【請求項４２】
検出可能に標識されたSpnAを含む組成物。
【請求項４３】
対象においてリウマチ熱又はＰＳＧＮを検出又は診断するため、対象内のStreptococcus pyogenes感染の存在を検出するため、又は生体試料内のStreptococcus pyogenes抗原特異的抗体を検出するためのキットであって、前記キットは：
ｉ）Streptococcus pyogenesヌクレアーゼＡ（SpnA）、又は
ｉｉ）アミノ酸配列No.8を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなるSpnA抗原断片
ｉｉｉ）アミノ酸配列No.8のアミノ酸の少なくとも10個の連続したアミノ酸を含む、本質的にそれから、又はそれからなるSpnA抗原性断片。
ｉｖ）デオキシリボヌクレアーゼＢ(DNaseB)、又は
ｖ）アミノ酸配列No.5を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなるDNaseB抗原断片、又は
ｖｉ）アミノ酸配列No.5のアミノ酸の少なくとも10個の連続したアミノ酸を含む、本質的にそれから、又はそれからなるDNaseB抗原断片、又は
ｖｉｉ）ストレプトリジン-Ｏ（ＳＬＯ）、又は
ｖｉｉｉ）配列番号1又は配列番号2のアミノ酸の少なくとも10個の連続したアミノ酸を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなるSLO抗原性断片、又は
ｉｘ）配列番号1又は配列番号2のアミノ酸の少なくとも10個の連続したアミノ酸を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなるSLO抗原性断片であり、
少なくとも１つの参照抗体コントロールを含む組成物を選択的に含み、前記抗体コントロールはキットに存在するStreptococcus pyogenes抗原の1つに特異的な抗体を含み、
1つ以上の抗原を生体試料と接触させるのに適した培地を構成するための1つ以上の試薬を選択的に含み、
生体試料に存在する1つ以上の抗原及び1つ以上のStreptococcus pyogenes抗原に特異的な抗体の間に形成された複合体の検出を可能にする試薬を1つ以上選択的に含み、
及びその使用のための指示、
を含む群から選択されたStreptococcus pyogenes抗原の少なくとも一つを含む組成物を含む、キット。
【請求項４４】
少なくとも1つのStreptococcus pyogenes抗原がビーズ又は微粒子と共有結合している請求項43に記載のキット。
【請求項４５】
前記組成物が：
ｉ）Streptococcus pyogenesヌクレアーゼＡ(SpnA)、又は
ｉｉ）配列番号No.8のアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなるSpnA抗原断片、又は
ｉｉｉ）アミノ酸配列No.8のアミノ酸の少なくとも10個の連続したアミノ酸を含む、本質的にそれから、又はそれからなるSpnA抗原性断片、
の集団を含む、請求項４３又は４４に記載のキット。
【請求項４６】
前記組成物が、以下：
ｉ）Streptococcus pyogenesヌクレアーゼＡ(SpnA)、又は
ｉｉ）配列番号No.8のアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなるSpnA抗原断片、又は
ｉｉｉ）アミノ酸配列No.8のアミノ酸の少なくとも10個の連続したアミノ酸を含む、本質的にそれから、又はそれからなるSpnA抗原性断片、又は
ｉｖ）デオキシリボヌクレアーゼＢ(DBaseB)、又は
ｖ）アミノ酸配列No.5を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなるDNaseB抗原断片、又は
ｖｉ）アミノ酸配列No.5のアミノ酸の少なくとも10個の連続したアミノ酸を含む、本質的にそれから、又はそれからなるDNaseB抗原断片、及び
ｖｉｉ）ストレプトリジンO（SLO）、又は
ｖｉｉｉ）配列番号No.1又はNo.2のアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなるSLO抗原断片、又は
ｉｘ）配列番号No.1又はNo.2の少なくとも10個の連続したアミノ酸を含む、本質的にそれから、又はそれからなるSLO抗原性断片、
のStreptococcus pyogenes抗原のそれぞれの集団を含む、請求項４５に記載のキット。
【請求項４７】
請求項４３〜４６のいずれかに記載のキットを工程ｉｉ）の前に提供することを更に含む、請求項１〜４６のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
1つ以上のStreptococcus pyogenes抗原が抗ストレプトリジン（ASO）、抗ヒアルロニダーゼ（AHase）、抗ストレプトキナーゼ（ASKase）、抗ニコチンアミド-アデニンジヌクレオチダーゼ（抗-NAD）を含む群から選択される、請求項１〜４６のいずれかに記載の方法又はキット。
【請求項４９】
対象への最近のStreptococcus pyogenesの曝露を検出する方法であって、前記方法が：
ｉ）1つ以上のStreptococcus pyogenes SpnAに特異的な抗体を含むことができる、又は疑いのある対象から生体試料を提供すること；
ｉｉ）前記抗原特異的抗体が生体試料に存在する場合、1つ以上のStreptococcus pyogenes SpnA抗原は生体試料に存在する抗原特異的抗体に結合することを可能にして、1つ以上の抗原：抗原特異的抗体複合体を形成する、生体試料をStreptococcus pyogenes SpnA由来の1つ以上の抗原集団と接触させること、及び；
ｉｉｉ）1つ以上の複合体の閾値を上回る検出の増加は対象におけるStreptococcus pyogenesの最近の曝露を示唆する、前記複合体を形成すること、
を含む方法。
【請求項５０】
対象において急性連鎖球菌後糸球体腎炎（ＡＰＳＧＮ）を含むリウマチ熱又は連鎖球菌後糸球体腎炎（ＰＳＧＮ）又は対象におけるリウマチ熱又はPSGNを発症する可能性の増加を検出又は診断する方法であって：
ｉ）Streptococcus pyogenes SpnAに特異的な1つ以上の抗体を含むことができる、又は含むと疑われる対象から生体試料を提供すること；
ｉｉ）前記抗原特異的抗体が生体試料に存在する場合、1つ以上のStreptococcus pyogenes SpnA抗原は生体試料に存在する抗原特異的抗体に結合することを可能にして、1つ以上の抗原：抗原特異的抗体複合体を形成する、生体試料をStreptococcus pyogenes SpnA由来の1つ以上の抗原集団と接触させること；及び
ｉｉｉ）閾値を超える1つ以上の複合体の増加は発達するリウマチ熱又はＡＰＳＧＮの増加の可能性を示唆し、又は対象におけるリウマチ熱又はＰＳＧＮの存在の一つの指標として、対象におけるStreptococcus pyogenesへの最近の曝露を示唆する、複合体を検出すること；
ｉｖ）対象に対する1つ以上のリウマチ熱又はＰＳＧＮに対する診断基準を評価すること；
ｖ）及びリウマチ熱又はＡＰＳＧＮに関する1つ以上の他の診断基準と併せて閾値を上回る1つ以上の複合体の検出の増加は、対象におけるリウマチ熱又はＡＰＳＧＮを示唆すること；
を含む方法。
【請求項５１】
前記１つ以上の診断基準が、リウマチ熱又はＰＳＧＮに関連する１つ以上の臨床症状の有無である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記１つ以上の臨床症状が、移動性多発性関節炎、心臓炎、血尿、辺縁部紅斑、皮下結節、セイデンハム舞踏病、又は膿皮症から選択される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
対象におけるStreptococcus pyogenes感染の存在を検出する方法であって、前記方法は：
ｉ）Streptococcus pyogenes SpnAに特異的な1つ以上の抗体を含むことができる、又は疑いがある対象から生体試料を提供すること；
ｉｉ）1つ以上のStreptococcus pyogenes SpnA由来の抗原集団を生体試料に接触させること、生体試料に抗原特異的抗体が存在する場合、1つ以上のStreptococcus pyogenes SpnA由来の抗原は生体試料に存在する抗原特異的抗体に結合することができ、1つ以上の抗原抗体複合体を形成すること；及び
ｉｉｉ）1つ以上の複合体の検出の増加は対象におけるStreptococcus pyogenesの存在又はStreptococcus pyogenesの対照への最近の曝露を示唆する、前記複合体を検出すること；
を含む方法。
【請求項５４】
生体試料中のStreptococcus pyogenes抗原に特異的な抗体を検出する方法であって、Streptococcus pyogenes抗原特異的抗体は、Streptococcus pyogenes SpnAに特異的に結合することができ、前記方法は：
ｉ）Streptococcus pyogenes SpnAに特異的な1つ以上の抗体を含むことができる又は疑いのある対象から生体試料を提供すること；
ｉｉ）Streptococcus pyogenes SpnA由来の1つ以上の抗原集団を生体試料に接触させること、1つ以上のStreptococcus pyogenes SpnA抗原は生体試料中の抗原特異的抗体に結合することができ、抗原抗体特異的複合体が生体試料に存在する時は、1つ以上の抗原：抗体特異的抗体複合体に結合することができること、及び；
ｉｉｉ）１つ以上の複合体の検出の増加は前記生体試料がStreptococcus pyogenes抗原に対して特異的な抗体を含むことを示唆する、前記複合体を検出すること；
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、Streptococcus pyogenes感染、リウマチ熱又は連鎖球菌性糸球体腎炎（PSGN）の診断を治療、検出及び支援するための組成物及び方法、並びにリウマチ熱又はPSGNを発症する傾向を評価するための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
A群連鎖球菌（GAS、Streptococcus pyogenes）は、軽度の皮膚感染症及び咽頭炎からリウマチ熱やレンサ球菌感染後糸球体腎炎（PSGN）など重篤な浸潤性疾患や感染後の免疫後遺症といった、様々な重症度の多くの疾患を引き起こすか、又は関連している。急性リウマチ熱及び関連するリウマチ性心疾患は、発展途上国における後天性心疾患の主要な原因である。
【０００３】
連鎖球菌血清学は、感染後の免疫性後遺症の診断に重要である。これらの後遺症は、原因菌の診断培養が通常は不可能になった時点で、GAS感染の数週間後に発生するためである。一般に、現在の臨床診療では、ストレプトリジン-O（SLO）とデオキシリボヌクレアーゼ-B（デオキシリボヌクレアーゼB）の2つの抗原に対する抗体価の測定が行われる。血清学的検査は、其々抗ストレプトリジン-O（ASO）及び抗デオキシリボヌクレアーゼ-B（ADB）と呼ばれる。ASO力価は一般に比濁（nephelometric）分析又は比濁（turbidimetric）分析を使用して測定され、値は通常ミリリットル当たりの国際単位（IU / mL）として報告される。ADBテストは、ASOとは対照的に、デオキシリボヌクレアーゼBで使用可能な参照血清がないため、標準化されていない。ADB力価は通常、酵素阻害アッセイを使用して測定される。このアッセイでは、血清によるデオキシリボヌクレアーゼB活性の阻害が着色色素を使用して検出される。
【０００４】
紛らわしいことに、ASO及びADB抗体反応の免疫動態の著しい変動が報告されており、GAS咽頭炎を患っている子供の大多数は、（感染前のレベルと比較して）感染後1年以上にわたってASO及びADB力価の上昇を示している [1] 。従って、偽陽性診断の実質的なリスクが存在する。
【０００５】
GAS感染症のある、又は最近感染した対象を特定するより効果的な方法、及びリウマチ熱又はPSGNを発症する傾向がある対象を特定し、リウマチ熱又はPSGNをより効果的に検出及び診断する必要性が残っている。
【０００６】
本発明の目的は、前述の問題に対処するか、又はリウマチ熱若しくは連鎖球菌性糸球体腎炎の診断を検出及び支援するため、又はリウマチ熱若しくは連鎖球菌性糸球体腎炎を発症する傾向を評価するための方法及び組成物を提供すること、及び/又は少なくとも有用な選択肢を公衆に提供することである。
【０００７】
本明細書で引用された特許又は特許出願を含む全ての参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。参考文献が先行技術を構成することを認めるものではない。前記参照の議論は、著者が主張することを述べており、出願人は引用された文書の正確性と適切性に挑戦する権利を留保する。多くの先行技術の出版物が本明細書で言及されているが、この言及は、これらの文書のいずれかがニュージーランド、又は他の国における当技術分野の一般的な一般知識の一部を形成することの承認を構成しないことは明確に理解されるであろう 。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
これら及び他の目的は、本発明の1つ以上の態様に従って達成される。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
従って、一態様では、本発明は、対象におけるStreptococcus pyogenesへの最近の曝露を検出する方法に関し、前記方法は以下を含む：
1つ以上のStreptococcus pyogenes抗原に特異的な抗体を含むことができる又は含むと疑われる対象から生体試料を提供すること；
生物学的試料をStreptococcus pyogenes抗原の2つ以上の集団と接触させること、2つ以上のStreptococcus pyogenes抗原の各集団は、生物学的試料に存在する抗原特異的抗体（生体試料中に抗原特異的抗体が存在する場合、特異的抗体複合体）と結合して、抗原の2つ以上の集団を形成することができる; 及び
複合体を検出すること、閾値を超える1つ以上の複合体の検出の増加は、対象におけるStreptococcus pyogenesへの最近の曝露を示す。
【００１０】
別の態様では、本発明は、対象におけるリウマチ熱又は急性連鎖球菌性糸球体腎炎（APSGN）を含む連鎖球菌性糸球体腎炎（PSGN）、又は対象におけるリウマチ熱又はPSGNを発症する可能性の増加を検出又は診断する方法に関し、前記方法は以下を含む：
ｉ）1つ以上のStreptococcus pyogenes抗原に特異的な1つ以上の抗体を含むことができる、又は含むと疑われる対象から生体試料を提供する；
ｉｉ）2つ以上のStreptococcus pyogenes抗原集団を生体試料と接触させることであって、Streptococcus pyogenes抗原は生体試料に存在する抗原特異的抗体に結合して2つ以上の抗原、抗原特異的抗体が生体試料に存在する場合は抗原特異的抗体複合体、の集団を形成することを可能にする、接触させること；及び
ｉｉｉ）複合体の検出、閾値を超える1つ以上の複合体の検出の増加は、リウマチ熱又はAPSGNを発症する可能性の増加を示すか、又は対象のStreptococcus pyogenesへの最近の暴露を示す1つの基準対象におけるリウマチ熱又はPSGNの存在;
iv）リウマチ熱又はPSGNの1つ以上の診断基準を評価すること；
ｖ）リウマチ熱又はＡＰＳＧＮに関する1つ以上の他の診断基準と併せて閾値を超える1つ以上の複合体の検出の増加は、対象のリウマチ熱又はＰＳＧＮを示す。
【００１１】
別の態様では、本発明は、対象におけるStreptococcus pyogenes感染の存在を検出する方法に関し、前記方法は、以下を含む：
i）1つ以上のStreptococcus pyogenes抗原に特異的な1つ以上の抗体を含むことができる又は含むと疑われる対象から生体試料を提供すること；
ｉｉ）生物学的試料をStreptococcus pyogenes抗原の2つ以上の集団と接触させる、、Streptococcus pyogenes抗原の2つ以上の集団の其々は、生物学的試料中の抗原特異的抗体（抗原特異的抗体が生物学的サンプルに存在する場合、抗原特異的抗体複合体）と結合して、抗原の2つ以上の集団を形成する; 及び
iii）複合体の検出、1つ以上の複合体の検出の増加は、対象におけるStreptococcus pyogenesの存在又はStreptococcus pyogenesに対する対象への最近の曝露を示す。
【００１２】
別の態様において、本発明は、生体試料中のStreptococcus pyogenes抗原特異的抗体を検出する方法に関し、Streptococcus pyogenes抗原特異的抗体は、Streptococcus pyogenes抗原に特異的に結合し、前記方法は以下を含む：
i）1つ以上のStreptococcus pyogenes抗原に特異的な1つ以上の抗体を含むことができる又は含むと疑われる対象から生体試料を提供すること；
ｉｉ）2つ以上のStreptococcus pyogenes抗原集団を生体試料と接触させることであって、Streptococcus pyogenes抗原は生体試料に存在する抗原特異的抗体に結合して2つ以上の抗原、抗原特異的抗体が生体試料に存在する場合は抗原特異的抗体複合体、の集団を形成することを可能にする、接触させること；及び
iii）複合体を検出すること、1つ以上の複合体の検出の増加は、Streptococcus pyogenes抗原に特異的な抗体が生体サンプルに含まれていることを示す。
【００１３】
様々な実施形態では、1つ以上の複合体の検出の増加は、1つ以上の複合体の存在を検出することである。
【００１４】
従って、一実施形態では、対象におけるリウマチ熱又は急性連鎖球菌性糸球体腎炎（APSGN）を含む連鎖球菌性糸球体腎炎（PSGN）、又は対象におけるリウマチ熱又はPSGNを発症する可能性の増加を検出又は診断する方法は、以下を含む；
i）1つ以上のStreptococcus pyogenes抗原に特異的な1つ以上の抗体を含むことができる、又は含むと疑われる対象から生体試料を提供すること；
ｉｉ）2つ以上のStreptococcus pyogenes抗原集団を生体試料と接触させることであって、Streptococcus pyogenes抗原は生体試料に存在する抗原特異的抗体に結合して2つ以上の抗原、抗原特異的抗体が生体試料に存在する場合は抗原特異的抗体複合体、の集団を形成することを可能にする、接触させること；及び
ｉｉｉ）1つ以上の抗原：抗原特異的抗体複合体の存在がリウマチ熱又はAPSGNを発症する可能性の増加を示す、又は対象のStreptococcus pyogenesへの最近の曝露を示す1つの基準としての複合体の検出対象におけるリウマチ熱又はPSGNの存在;
iv）リウマチ熱又はPSGNの1つ以上の診断基準の評価;
ｖ）及び１つ以上の抗原：抗原特異的抗体複合体の存在が、リウマチ熱又はＡＰＳＧＮに関する１つ以上の他の診断基準と共に存在する場合、対象におけるリウマチ熱又はＰＳＧＮを示すこと。
【００１５】
別の実施形態では、対象におけるStreptococcus pyogenes感染の存在を検出する方法は以下を含む：
i）1つ以上のStreptococcus pyogenes抗原に特異的な1つ以上の抗体を含むことができる又は含むと疑われる対象から生体試料を提供すること；
ii）2つ以上のStreptococcus pyogenes抗原集団を生体試料と接触させることであって、Streptococcus pyogenes抗原は生体試料に存在する抗原特異的抗体に結合して2つ以上の抗原、抗原特異的抗体が生体試料に存在する場合は抗原特異的抗体複合体、の集団を形成することを可能にする、接触させること；及び
iii）複合体を検出すること、1つ以上の抗原：抗原特異的抗体複合体の存在は、対象におけるStreptococcus pyogenesの存在又はStreptococcus pyogenesへの対象の最近の曝露を示すこと。
【００１６】
別の実施形態では、Streptococcus pyogenes抗原特異的抗体がStreptococcus pyogenes抗原に特異的に結合する生体試料中のStreptococcus pyogenes抗原特異的抗体を検出する方法は、以下を含む：
i）1つ以上のStreptococcus pyogenes抗原に特異的な1つ以上の抗体を含むことができる又は含むと疑われる対象から生体試料を提供すること；
ｉｉ）2つ以上のStreptococcus pyogenes抗原集団を生体試料と接触させることであって、Streptococcus pyogenes抗原は生体試料に存在する抗原特異的抗体に結合して2つ以上の抗原、抗原特異的抗体が生体試料に存在する場合は抗原特異的抗体複合体、の集団を形成することを可能にする、接触させること；及び
iii）1つ以上の抗原：抗原特異的抗体複合体の存在が、生体試料がStreptococcus pyogenes抗原に特異的な抗体を含むことを示す複合体を検出すること。
【００１７】
一態様では、本発明は、リウマチ熱又はPSGNを患っている患者を治療する方法に関し、この方法は以下の段階を含む：
i）Streptococcus pyogenesに特異的な1つ以上の抗体を含むことができる、又は含むと疑われる対象から生体試料を提供すること；及び
ii）１つ以上のStreptococcus pyogenes抗原集団を生体試料と接触させることであって、Streptococcus pyogenes抗原は生体試料に存在する抗原特異的抗体に結合して１つ以上の抗原、抗原特異的抗体が生体試料に存在する場合は抗原特異的抗体複合体、の集団を形成することを可能にする、接触させること；及び
iii）対象のリウマチ熱又はPSGNに対する1つ以上の他の診断基準の評価すること；
iv）、Streptococcus pyogenes SpnA抗原特異的複合体の存在、又は閾値を超えるStreptococcus pyogenes SpnA抗原特異的複合体の量の検出は、対象におけるStreptococcus pyogenesへの最近の曝露を示すこと;
v）及びリウマチ熱又はPSGNの1つ以上の他の診断基準の存在、Streptococcus pyogenes SpnA抗原特異的複合体の不在と共に、又は、閾値未満のStreptococcus pyogenes SpnA抗原特異的複合体の量の検出は、対象におけるStreptococcus pyogenesへの以前の暴露を示すこと； 及び
vi）対象がStreptococcus pyogenesに最近曝露したことがある場合、その時には最近発症したリウマチ熱又は急性PSGNの治療を施すこと；及び、対象がStreptococcus pyogenesに以前に曝露したことがある場合、確立された又はその後のStreptococcus pyogenes感染の治療を施すか、リウマチ熱又はPSGNの治療を施す。
【００１８】
一態様において、本発明は、リウマチ熱又はPSGNを患っている患者をStreptococcus pyogenesに対して有効な抗生物質で治療する方法に関し、この方法は以下の段階を含む：
i）Streptococcus pyogenesに特異的な1つ以上の抗体を含むことができる、又は含むと疑われる対象から生体試料を提供すること；及び
ii）生体試料を、Streptococcus pyogenes SpnAの抗原の1つ以上の集団及びStreptococcus pyogenesデオキシリボヌクレアーゼBの抗原の1つ以上の集団及び/又はStreptococcus pyogenesSLOの抗原の1つ以上の集団と接触させること；Streptococcus pyogenes抗原の集団は、生体試料に存在する抗原特異的抗体と結合して、抗原の1つ以上の集団を形成することができる：抗原特異的抗体が生体試料に存在する場合、抗原特異的抗体複合体; 及び
iii）対象のリウマチ熱又はPSGNに対する1つ以上の他の診断基準の評価；
iv）、Streptococcus pyogenes SpnA抗原特異的複合体の存在、又は閾値を超えるStreptococcus pyogenes SpnA抗原特異的複合体の量の検出は、対象におけるStreptococcus pyogenesへの最近の曝露を示す;
v）及びリウマチ熱又はPSGNに対する1つ以上の他の診断基準の存在、Streptococcus pyogenes SpnA抗原特異的複合体の不在、又は閾値を下回るStreptococcus pyogenes SpnA抗原特異的複合体の量の検出は、対象におけるStreptococcus pyogenesへの以前の曝露の指標であること;及び
vi）対象がStreptococcus pyogenesに最近曝露した場合、急性又は現在のStreptococcus pyogenes感染に対して有効な抗生物質を投与すること；及び、対象がStreptococcus pyogenesに以前（以前）に曝露した場合、確立された又はその後のStreptococcus pyogenes感染に対して有効な抗生物質を投与する。
【００１９】
一態様では、本発明は、リウマチ熱又はPSGNを患っている患者をStreptococcus pyogenesに対して有効な抗生物質で治療する方法に関し、この方法は以下の段階を含む：
i）Streptococcus pyogenesに特異的な1つ以上の抗体を含むことができる、又は含むと疑われる対象から生体試料を提供すること；
ii）生体試料を、Streptococcus pyogenes SpnAの抗原の1つ以上の集団及びStreptococcus pyogenesデオキシリボヌクレアーゼBの抗原の1つ以上の集団及び/又はStreptococcus pyogenesSLOの抗原の1つ以上の集団と接触させること；Streptococcus pyogenes抗原の集団は、生体試料に存在する抗原特異的抗体と結合して、抗原の1つ以上の集団を形成することができる：抗原特異的抗体が生体試料に存在する場合、抗原特異的抗体複合体; 及び
iii）複合体を検出することであって、
a. Streptococcus pyogenesのSpnA特異的複合体の存在、又は閾値を超えるStreptococcus pyogenesのSpnA特異的複合体の量の検出は、対象におけるStreptococcus pyogenesへの最近の曝露の指標であり、
b. Streptococcus pyogenesデオキシリボヌクレアーゼB特異的複合体及び/又はStreptococcus pyogenesSLO特異的複合体の存在、及びStreptococcus pyogenes SpnA特異的複合体の不在、又は閾値を下回るStreptococcus pyogenes SpnA特異的複合体の量の検出は対象におけるStreptococcus pyogenesへの以前の暴露の指標であり、、
iv）対象がStreptococcus pyogenesに最近曝露した場合、急性Streptococcus pyogenes感染に対して有効な抗生物質を投与する。及び、対象がStreptococcus pyogenesに以前に曝露したことがある場合、確立された又はその後のStreptococcus pyogenes感染に対して有効な抗生物質を投与すること。
【００２０】
一態様では、本発明は、リウマチ熱又はPSGNを患っている患者を治療する方法に関し、この方法は以下の段階を含む：
i）Streptococcus pyogenesに特異的な1つ以上の抗体を含むことができる、又は含むと疑われる対象から生体試料を提供すること；
ii）生体試料を、Streptococcus pyogenes SpnAの抗原の1つ以上の集団及びStreptococcus pyogenesデオキシリボヌクレアーゼBの抗原の1つ以上の集団及び/又はStreptococcus pyogenesSLOの抗原の1つ以上の集団と接触させること；Streptococcus pyogenes抗原の集団は、生体試料に存在する抗原特異的抗体と結合して、抗原の1つ以上の集団を形成することができる：抗原特異的抗体が生体試料に存在する場合、抗原特異的抗体複合体; 及び
iii）複合体を検出することであって、
Streptococcus pyogenesのSpnA特異的複合体の存在、又は閾値を超えるStreptococcus pyogenesのSpnA特異的複合体の量の検出は、対象におけるStreptococcus pyogenesへの最近の曝露の指標であり、
Streptococcus pyogenes DNAアーゼB特異的複合体及び/又はStreptococcus pyogenesSLO特異的複合体の存在、及びStreptococcus pyogenes SpnA特異的複合体の不在、又は閾値を下回るStreptococcus pyogenes SpnA特異的複合体の量の検出は、対象におけるStreptococcus pyogenesへの以前の暴露を示唆する、
iv）前記対象がStreptococcus pyogenesに最近曝露したことがある場合、最近発症したリウマチ熱又は急性PSGNの治療を行うこと；及び対象がStreptococcus pyogenesに以前に曝露したことがある場合、リウマチ熱又はPSGNの治療を行うこと。
【００２１】
別の態様では、本発明は、それを必要とする対象においてリウマチ熱又はPSGNを治療する方法に関し、この方法は以下の段階を含む：
i）Streptococcus pyogenesに特異的な1つ以上の抗体を含むことができる、又は含むと疑われる対象から生体試料を提供すること、及び
ii）Streptococcus pyogenes SpnA抗原の1つ以上の集団が、生体試料に存在する抗原特異的抗体と結合して、抗原の1つ以上の集団を形成することができる、Streptococcus pyogenes SpnA由来の抗原の1つ以上の集団と生体試料を接触させる：抗原特異的抗体が生体試料に存在する場合、抗原特異的抗体複合体; 及び
iii）対象のリウマチ熱又はPSGNに対する1つ以上の他の診断基準を評価すること；
iv）、Streptococcus pyogenes SpnA抗原特異的複合体の存在、又は閾値を超えるStreptococcus pyogenes SpnA抗原特異的複合体の量の検出は、対象におけるStreptococcus pyogenesへの最近の曝露を示すこと;
v）リウマチ熱又はPSGNに対する1つ以上の他の診断基準の存在と、Streptococcus pyogenes SpnA抗原特異的複合体の不在、又は、閾値未満のStreptococcus pyogenes SpnA抗原特異的複合体の量の検出は、対象におけるStreptococcus pyogenesへの以前の暴露を示すこと；
vi）対象がStreptococcus pyogenesに最近曝露したことがある場合、最近発症したリウマチ熱又は急性PSGNの治療を施すこと；対象がStreptococcus pyogenesに以前に曝露したことがある場合、リウマチ熱又はPSGNの治療を行うこと。
【００２２】
別の態様では、本発明は、それを必要とする対象においてリウマチ熱又はPSGNを治療する方法に関し、この方法は以下の段階を含む：
i）対象の生体サンプル中のStreptococcus pyogenes SpnAに特異的な1つ以上の抗体の有無、又は量を決定すること；及び
ii）対象のリウマチ熱又はPSGNに対する1つ以上の他の診断基準を任意に評価すること；
iii）サンプルが閾値を超える量のStreptococcus pyogenes SpnAに特異的な1つ以上の抗体を含む場合、最近発症したリウマチ熱又は急性PSGNに罹患していると対象を予測すること；及び
iv）最近のStreptococcus pyogenes感染に対して治療有効量の抗生物質を対象に投与すること。
【００２３】
一実施形態では、リウマチ熱又はPSGNを治療する方法は、必要とする対象において、以下の段階を含む：
i）対象の生体試料中のStreptococcus pyogenes SpnAに特異的な1つ以上の抗体の有無、又は量を決定すること；及び
ii）対象のリウマチ熱又はPSGNに対する1つ以上の他の診断基準の評価；
iii）サンプルが閾値を超える量のStreptococcus pyogenes SpnAに特異的な1つ以上の抗体を含み、対象がリウマチ熱又はPSGNに関する1つ以上の他の診断基準を持っている場合、対象が最近発症したリウマチ熱又は急性PSGNに罹患していると予測すること；及び
iv）急性Streptococcus pyogenes感染に対して有効な治療有効量の抗生物質をその対象に投与すること。
【００２４】
別の態様では、本発明は、リウマチ熱又はPSGNを治療する方法は、必要とする対象において、以下の段階を含む：
i）対象の生体試料中のStreptococcus pyogenes SpnAに特異的な1つ以上の抗体の有無、又は量を決定すること；及び
ii）対象のリウマチ熱又はPSGNに対する1つ以上の他の診断基準を評価すること；  
iii）サンプルがしきい値未満の量のStreptococcus pyogenes SpnAに特異的な1つ以上の抗体を含み、対象がリウマチ熱又はPSGNに対する1つ以上の他の診断基準を持っている場合、リウマチ熱又はPSGNに罹患していると対象を予測すること;及び
iv）確立された又はその後のStreptococcus pyogenes感染に対して有効な治療有効量の抗生物質を対象に投与すること。
【００２５】
様々な実施形態において、Streptococcus pyogenes SpnAに特異的な1つ以上の抗体の存在、非存在又は量は、Streptococcus pyogenes SpnA由来の抗原の1つ以上の集団と生体試料を接触させることにより決定され、Streptococcus pyogenesの1つ以上の集団SpnA抗原は、生体サンプルに存在する抗原特異的抗体と結合して、抗原：抗原特異的抗体が生体サンプルに存在する場合、抗原特異的抗体複合体の1つ以上の集団を形成することができる。
【００２６】
様々な実施形態において、閾値を超えるStreptococcus pyogenes SpnAに特異的な1つ以上の抗体の量は、対象におけるStreptococcus pyogenesへの最近の曝露に関連するか、又は示す抗体力価である。
【００２７】
様々な実施形態において、閾値未満のStreptococcus pyogenes SpnAに特異的な１つ以上の抗体の量は、対象におけるStreptococcus pyogenesへの以前の曝露に関連するか、又は示す抗体価である。
【００２８】
様々な実施形態において、閾値は、抗体力価又は平均の範囲から入院20日以内にリウマチ熱又はPSGN患者の集団で観察される抗体力価又は平均抗体力価の範囲を分けるSpnA特異的抗体の量である入院20日後にリウマチ熱又はPSGN患者の集団で観察された抗体価である。
【００２９】
一実施形態では、閾値は正常な上限（ULN）であり、適合した健康な集団の80百分位値である。
【００３０】
一態様において、本発明は、Streptococcus pyogenesに有効な抗生物質で患者を治療する方法に関し、前記患者はStreptococcus pyogenesの感染を患っている、又は感染に曝されており、前記方法は以下の段階を含む：
i）Streptococcus pyogenesに特異的な1つ以上の抗体を含むことができる、又は含むと疑われる対象から生体試料を提供すること；及び
ii）Streptococcus pyogenes SpnA抗原の1つ以上の集団と生体試料を接触させることであって、１つ以上のStreptococcus pyogenes抗原集団の其々は、生体試料中に存在する抗原特異的抗体に結合して、１つ以上の抗原、抗原特異的抗体複合体が生体試料に存在する場合は、抗原特異的抗体複合体、の集団を形成することを可能にする、接触させること；及び
iii）対象におけるStreptococcus pyogenesの存在又は対象におけるリウマチ熱又はPSGNについて、1つ以上の他の診断基準を評価すること；
iv）、Streptococcus pyogenes SpnA抗原特異的複合体の存在、又は閾値を超えるStreptococcus pyogenes SpnA抗原特異的複合体の量の検出は、対象におけるStreptococcus pyogenesへの最近の曝露を示すこと;
v）及びリウマチ熱又はPSGNの1つ以上の他の診断基準の存在、Streptococcus pyogenes SpnA抗原特異的複合体の非存在又は閾値を下回るStreptococcus pyogenes SpnA抗原特異的複合体の量の検出は、対象におけるStreptococcus pyogenesへの以前の曝露の指標であること；及び
vi）対象がStreptococcus pyogenesに最近暴露した場合、急性Streptococcus pyogenes感染に対して有効な抗生物質を投与すること；及び、対象がStreptococcus pyogenesに以前に曝露したことがある場合、確立された又は続くStreptococcus pyogenes感染に対して有効な抗生物質を投与すること。
【００３１】
一実施形態では、Streptococcus pyogenesに対して有効な抗生物質で患者を治療する方法は、以下の段階を含む；
i）Streptococcus pyogenesに特異的な1つ以上の抗体を含むことができる、又は含むと疑われる対象から生体試料を提供すること；
ii）生体試料を、Streptococcus pyogenes SpnAの抗原の1つ以上の集団及びStreptococcus pyogenesデオキシリボヌクレアーゼBの抗原の1つ以上の集団及び/又はStreptococcus pyogenesSLOの抗原の1つ以上の集団と接触させること；Streptococcus pyogenes抗原の集団は、生体試料に存在する抗原特異的抗体と結合して、抗原の1つ以上の集団を形成することができる：抗原特異的抗体が生体試料に存在する場合、抗原特異的抗体複合体;及び
iii）複合体を検出することであって、  
Streptococcus pyogenes SpnA特異的複合体の存在、又は閾値を超えるStreptococcus pyogenesのSpnA特異的複合体の量の検出は、対象におけるStreptococcus pyogenesへの最近の曝露の指標であり、
Streptococcus pyogenesデオキシリボヌクレアーゼB特異的複合体及び/又はStreptococcus pyogenesSLO特異的複合体の存在、及びStreptococcus pyogenes SpnA特異的複合体の不在、又は閾値を下回るStreptococcus pyogenes SpnA特異的複合体の量の検出は、対象におけるStreptococcus pyogenesへの以前の暴露示唆し、
iv）前記対象がStreptococcus pyogenesに最近曝露した場合、急性Streptococcus pyogenes感染に対して有効な抗生物質を投与すること；及び、前記対象がStreptococcus pyogenesに以前に曝露したことがある場合、確立された又は続くStreptococcus pyogenes感染に対して有効な抗生物質を投与すること。
【００３２】
様々な実施形態において、最近発症したリウマチ熱又は急性PSGNの治療、又は急性又は現在のStreptococcus pyogenes感染症の治療は、例えば治療計画に従った投与など、急性Streptococcus pyogenes感染に対して有効な抗生物質の投与である。例えば、急性Streptococcus pyogenes感染に対して有効な投与計画、又は最近発症したリウマチ熱又は急性PSGNを治療するのに有効な投与計画は、10日間のビシリンなどの1つ以上の抗生物質の10日間のコースを含む。本明細書に開示される特定の代表的な例を含む他の適切な治療計画は、本開示の利益を有する当業者に知られているであろう。
【００３３】
様々な実施形態において、リウマチ熱又はPSGNの治療、又は確立又は後続のStreptococcus pyogenes感染の治療は、確立又は後続のStreptococcus pyogenes感染に対して有効な抗生物質の投与、例えば予防的治療計画などの治療計画に従った投与である。例えば、確立された又はその後のStreptococcus pyogenes感染に対して有効な投与計画、又はリウマチ熱又はPSGNを治療するのに有効な投与計画は、ビシリンの毎月投与などの1つ以上の抗生物質の毎月投与を含む。本明細書に開示される特定の代表的な例を含む、本開示の利益を有する他の適切な治療計画が当業者に知られている。
【００３４】
一例では、リウマチ熱又はPSGNの治療、又は確立された又はその後のStreptococcus pyogenes感染症の治療は、安静及び/又は入院を含む。
【００３５】
一例では、最近発症したリウマチ熱又は急性PSGNの治療を施すことは、対象に急性Streptococcus pyogenes感染に対して有効な抗生物質を投与することを含む。
【００３６】
一例では、リウマチ熱又はPSGNの治療を施すことは、確立された又はその後のStreptococcus pyogenes感染に対して有効な抗生物質を対象に投与することを含む。
【００３７】
一例では、リウマチ熱又はPSGNの治療を施すことは、対象を入院させること、及び/又は対象を安静に処方又は委託することを含む。
【００３８】
一態様では、本発明は、抗生物質による治療に対するリウマチ熱又はPSGNを患っている患者の反応性を予測する方法に関し、この方法は以下の段階を含む：
i）対象の生体サンプル中のStreptococcus pyogenes SpnAに特異的な1つ以上の抗体の有無、又は量を決定すること；及び
ii）対象のリウマチ熱又はPSGNに対する1つ以上の他の診断基準を評価すること；
iii）サンプルがStreptococcus pyogenes SpnAに特異的な1つ以上の抗体を閾値以下の量で含み、リウマチ熱またはPSGNに対する1つ以上の他の診断基準を持っている場合、抗生物質による治療に反応する可能性が高いと対象を予測すること;及び
iv）確立された又はその後のStreptococcus pyogenes感染に対して有効な治療有効量の抗生物質を対象に投与すること。
【００３９】
一態様では、本発明は、抗生物質による治療に対するリウマチ熱又はPSGNを患っている患者の反応性を予測する方法に関し、この方法は以下の段階を含む。
i）対象の生体試料中のStreptococcus pyogenes SpnAに特異的な1つ以上の抗体の有無、又は量を決定すること；及び
ii）対象のリウマチ熱又はPSGNに対する1つ以上の他の診断基準を任意に評価すること；
iii）サンプルが閾値を超える量のStreptococcus pyogenes SpnAに特異的な1つ以上の抗体を含む場合、最近発症したリウマチ熱又は急性PSGNの治療に有効な抗生物質による治療に反応する可能性が高いと対象を予測し、対象がリウマチ熱又はPSGNの診断基準を1つ以上持っている場合は、オプションであること；及び
iv）対象に、Streptococcus pyogenes感染に対して有効な治療有効量の抗生物質を投与すること。
【００４０】
別の態様では、本発明は、リウマチ熱又はPSGNを患っている患者の治療計画を決定する方法に関し、この方法は以下の段階を含む：
i）対象の生体サンプル中のStreptococcus pyogenes SpnAに特異的な1つ以上の抗体の有無、又は量を決定すること；及び
ii）対象のリウマチ熱又はPSGNに対する1つ以上の他の診断基準の評価すること；
iii）サンプルが閾値未満の量のStreptococcus pyogenes SpnAに特異的な1つ以上の抗体を含み、リウマチ熱又はPSGNに関する1つ以上の他の診断基準を持っている場合、リウマチ熱又はPSGNの治療に適した治療レジメンを受けるべきであると判断すること;及び
iv）リウマチ熱又はPSGNの治療に適した治療計画に従って対象を治療すること。
【００４１】
一実施形態では、リウマチ熱又はPSGNの治療は慢性リウマチ性心疾患の治療である。
【００４２】
一実施形態では、リウマチ熱又はＰＳＧＮの治療は、確立された又はその後のStreptococcus pyogenes感染に対して有効な治療有効量の抗生物質、例えばそのような抗生物質の予防有効量を対象に投与することを含む。
【００４３】
一実施形態において、リウマチ熱又はＰＳＧＮの治療に適した治療計画は、ビシリン（ベンザチンベンジルペニシリン）の毎月投与などの抗生物質の毎月投与である。
【００４４】
別の態様では、本発明は、リウマチ熱又はPSGNを患っている患者の治療計画を決定する方法に関し、この方法は以下の段階を含む：
対象の生体サンプル中のStreptococcus pyogenes SpnAに特異的な1つ以上の抗体の有無、又は量を決定すること；及び
対象のリウマチ熱又はPSGNに対する1つ以上の他の診断基準を任意に評価すること；
サンプルが閾値未満の量のStreptococcus pyogenes SpnAに特異的な1つ以上の抗体を含み、リウマチ熱又はPSGNに関する1つ以上の他の診断基準を持っている場合、リウマチ熱又はPSGNの治療に適した治療レジメンを受けるべきであると判断すること；及び
治療計画に従って、化膿性連鎖球菌感染に対して有効な治療有効量の抗生物質を対象に任意に投与すること。
【００４５】
一実施形態では、対象がStreptococcus pyogenesに最近曝露した場合、Streptococcus pyogenes感染に対して有効な抗生物質は、Streptococcus pyogenes感染に対して有効な投与速度で投与される。
【００４６】
一実施形態において、対象がStreptococcus pyogenesに最近曝露した場合、急性Streptococcus pyogenes感染に対して有効な抗生物質は、確立された又は後続のStreptococcus pyogenes感染又はリウマチ発熱又はPSGNに罹患している対象に投与される投与速度よりも高い投与速度で投与される。
【００４７】
一実施形態において、対象がStreptococcus pyogenesに最近曝露した場合、急性Streptococcus pyogenes感染に対して有効な抗生物質は、抗炎症剤、例えばアスピリン、グルココルチコイドなどの1つ以上の他の治療薬と併せて投与されるプレドニゾンなどの神経弛緩薬、ハロペリドールなどの神経弛緩薬、ジゴキシンなどの陽性変力剤、又は長期入院、ベッドレストなどの1つ以上の他の療法と併用する。
【００４８】
一実施形態では、Streptococcus pyogenesに曝露されたが最近曝露されていない患者における抗生物質投与による有害な抗生物質反応又は後遺症のリスクは、Streptococcus pyogenes感染に対して有効な抗生物質の投与後、抗生物質の投与は、Streptococcus pyogenes感染症又は最近発症したリウマチ熱又は急性PSGNを患っている対象に投与された抗生物質であった。
【００４９】
一実施形態では、Streptococcus pyogenesに曝露されたが、最近曝露されていない患者における抗生物質投与による有害な抗生物質反応又は後遺症のリスクは、確立された又は慢性Streptococcus pyogenes感染に対して有効な量の抗生物質を投与すると、最近発症したリウマチ熱又は急性Streptococcus pyogenes感染の治療に有効な量の抗生物質を投与した場合よりも低い。
【００５０】
一実施形態では、対象がStreptococcus pyogenesに最近曝露された場合、急性Streptococcus pyogenes感染に対して有効な抗生物質の投与は、抗生物質の非経口投与を含む。
【００５１】
様々な実施形態において、Streptococcus pyogenesに対して有効な抗生物質は、ペニシリン、アモキシシリン、オキサシリン、エリスロマイシン、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、セファロチン、セフォキシチン、セフィキシム、セフロキシム、セフォタキシム、セフトリアキソン、バンコマイシン、クリンダマイシン、シリンフィマイシン、シムリンシフィシン、リクリマイシン、コトリモキサゾール、クロラムフェニコールである。
【００５２】
様々な実施形態において、Streptococcus pyogenesに対して有効な抗生物質は、ペニシリン、アモキシリン（アモキシシリン）、セフィキシム、セフポドキシン、セフォタキシム、セフトリアキソン、オキサシリンなどのβ-ラクタミンを含む群から選択される。 エリスロマイシン、スピラマイシン、アジスロマイシンなどのマクロライド。 クリンダマイシンなどのリンコサミン; プリスチナマイシンなどのストレプトグラミン; テリスロマイシンなどのケトリド; クロラムフェニコールなどのフェニコール; テイコプラニン、バンコマイシンなどの糖ペプチド：レボフロキサシンなどのフルオロキノロン; テトラサイクリンなどのテトラサイクリンである。
【００５３】
一実施形態では、Streptococcus pyogenes感染に対して有効な抗生物質は、ペニシリン、例えば、ペニシリンGプロカイン（例えば、クリスティシリン）及びペニシリンGベンザチン（例えば、ビシリン、ビシリンL-A）、ペニシリンVK（例えば、ビーペン-VK、ベタペン-VK、Robicillin VK、Veetids）、エリスロマイシン、たとえばE-マイシン、Ery-Tab、エリスロシン、又はスルファジアジン、たとえばマイクロサルフォンを含むペニシリンGである。
【００５４】
一実施形態では、患者がStreptococcus pyogenesに最近曝露した場合、急性Streptococcus pyogenes感染に対して有効な抗生物質の投与は、ペニシリンG、エリスロマイシン、又はスルファジアジンの非経口投与、例えばペニシリンG、エリスロマイシンの静脈内又は筋肉内投与を含む 、又はスルファジアジンである。 別の実施形態では、経口投与が非経口投与の代わりに使用される。
【００５５】
様々な実施形態において、急性Streptococcus pyogenes感染に対して有効な抗生物質の投与は、投与計画に従っている。様々な例において、投薬レジメンは、例えば急性治療期間にわたる前記抗生物質の負荷用量の投与を含む。
【００５６】
特定の実施形態では、急性治療期間は、約5日から約20日、例えば、約8日から約15日、又は約10日を含む約10日から約12日である。
【００５７】
一例では、急性化連鎖球菌感染に対して有効な投与計画、又は最近発症したリウマチ熱又は急性PSGNを治療するのに有効な投与計画は、10日間のビシリンなどの1つ以上の抗生物質の10日間のコースを含む。例えば、Streptococcus pyogenes感染に対して有効な特定の例示的な投与計画、又は最近発症したリウマチ熱もしくは急性PSGNを治療するのに有効な投与計画には、以下を含む；
ｉ．ベンザチンベンジルペニシリン（ビシリン）の場合：単回投与で約900 mg（通常、深部IMによる）、30 kgを超える成人及び小児では30 mg、30 kg未満の小児では単回投与で約450〜675 mg、又は単回で600,000 IU 20kg未満の患者にはIMを投与し、20kg以上の患者には単回投与として1.2 x 106 IUを投与する。すべて通常10日間；
ｉｉ．フェノキシメチルペニシリンの場合：1日2回125−250 mg、IMできない場合は通常10日間経口投与、又は10 mg / kgまで500 mgまで1日2回10日間。
ｉｉｉ．エリスロマイシンの場合：10 mg / kg、最大500 mg、1日2回、10日間。
ｉｖ．エリスロマイシンコハク酸エチルの場合：40 mg / kg / dayを2〜4回に分け、子供は1 g / dayまで。
【００５８】
様々な実施形態において、確立された又は慢性のStreptococcus pyogenes感染に対して有効な抗生物質の投与は、投与計画に従っている。 例えば、確立された又はその後のStreptococcus pyogenes感染に対して有効な特定の例示的な投与計画、又は慢性リウマチ性心疾患を含むリウマチ熱又はPSGNの治療に有効な投与計画には、
ｉ．ベンザチンベンジルペニシリンの場合：約900 mg（通常、深部IM）、4週間ごとに30 kgを超える成人及び子供向け、4週間ごとに30 kg未満の子供向け約450−675 mg、又は20才未満の患者について4週間ごとに600,000 IU kg、及び20 kgを超える患者の場合は4週間ごとに筋肉内で1.2 x 106 IU。
ｉｉ．フェノキシメチルペニシリンの場合：125-250 mgを1日2回、IMが不可能な場合は経口で、通常10日間。
ｉｉｉ．エリスロマイシンの場合：250 mg、1日2回。
ｉｖ．コハク酸エリスロマイシンエチルの場合：1日2回400mg。
【００５９】
別の態様では、本発明は、対象におけるStreptococcus pyogenesへの最近の曝露を検出する方法に関し、この方法は、以下を含む；
i）Streptococcus pyogenesに特異的な1つ以上の抗体を含むことができる、又は含むと疑われる対象から生体試料を提供する；
ｉｉ）生物学的サンプルをStreptococcus pyogenes SpnAからの抗原の1つ以上の集団と接触させる SpnA抗原の：SpnA抗原特異的抗体が生物学的サンプルに存在する場合、SpnA抗原特異的抗体複合体； 及び
ｉｉｉ）複合体の有無を検出し、
iv）対象のリウマチ熱又はPSGN中のStreptococcus pyogenesの存在に関する1つ以上の他の診断基準を任意に評価する；
v）、Streptococcus pyogenes SpnA抗原特異的複合体の存在、又は閾値を超えるStreptococcus pyogenes SpnA抗原特異的複合体の量は、対象におけるStreptococcus pyogenesへの最近の暴露を示す;
vi）及びリウマチ熱又はPSGNに対する1つ以上の他の診断基準の存在と、Streptococcus pyogenes SpnA抗原特異的複合体の不存在、又は閾値を下回るStreptococcus pyogenes SpnA抗原特異的複合体の量の存在は、対象におけるStreptococcus pyogenesへの事前の曝露。
【００６０】
別の態様において、本発明は、対象におけるリウマチ熱又は急性連鎖球菌性糸球体腎炎（APSGN）を含む連鎖球菌性糸球体腎炎（PSGN）、又は対象におけるリウマチ熱もしくはPSGNを発症する可能性の増加を検出又は診断する方法に関し、前記方法は以下を含む；
i）Streptococcus pyogenesに特異的な1つ以上の抗体を含むことができる、又は含むと疑われる対象から生体試料を提供すること；
ii）生物学的サンプルをStreptococcus pyogenes SpnAからの抗原の1つ以上の集団と接触させること。生物学的サンプルに抗原特異的抗体が存在する場合、SpnA抗原の：SpnA抗原特異的抗体複合体; そして
iii）複合体の有無を検出すること；
iv）対象のリウマチ熱又はPSGNの1つ以上の他の診断基準を評価すること；
v）リウマチ熱又はPSGNに対する1つ以上の他の診断基準の存在とStreptococcus pyogenes SpnA特異的複合体の存在、又は閾値を超えるStreptococcus pyogenes SpnA特異的複合体の量の検出は、 リウマチ熱又はAPSGNを発症する可能性の増加、又は対象におけるリウマチ熱又はPSGNの存在の1つの基準としての対象におけるStreptococcus pyogenesへの最近の暴露を示すこと；
vi）及びリウマチ熱又はPSGNの1つ以上の他の診断基準の存在と、Streptococcus pyogenes SpnA特異的複合体の不存在、又は閾値未満のStreptococcus pyogenes SpnA特異的複合体の量が、リウマチ熱の指標である場合 又は対象のPSGN、又は後続のStreptococcus pyogenes感染のリスクの増加など、対象のリウマチ熱又はPSGNの存在の1つの基準として、対象のStreptococcus pyogenesへの事前の暴露を示すこと。
【００６１】
一実施形態では、1つ以上の他の診断基準は、SpnA以外の1つ以上のStreptococcus pyogenes抗原に特異的な抗体の有無である。例えば、1つ以上の他の診断基準は、Streptococcus pyogenesデオキシリボヌクレアーゼBに特異的な抗体、又はStreptococcus pyogenesSLOに特異的な抗体の有無である。
【００６２】
本明細書に開示される実施形態のいずれかは、本明細書に記載される態様のいずれかに関連し得る。混乱を避けるために、本明細書の開示から明らかなように、本明細書に開示される態様のいずれか、例えば本明細書に記載される方法のいずれかは、特定の実施形態において、1つ以上のStreptococcus pyogenesヌクレアーゼA（SpnA）ポリペプチド、本明細書に記載されるように、1つ以上の短縮型SpnAポリペプチド、又は1つ以上のSpnA断片を使用する。例えば、様々な実施形態において、前記Streptococcus pyogenes SpnA由来の1つ以上の抗原又は抗原の1つ以上の集団は、本明細書に記載の1つ以上の短縮型SpnAポリペプチド又は1つ以上のSpnA断片などの、1つ以上のSpnAポリペプチドとして存在する。
【００６３】
同様に、本明細書に開示される態様のいずれか、例えば本明細書に記載の方法のいずれかで使用される場合、前記1つ以上のStreptococcus pyogenesDNaseB抗原又はポリペプチドは、特定の実施形態では、本明細書に記載の1つ以上のDNaseB抗原断片などの1つ以上のDNaseBポリペプチドである。例えば、様々な実施形態において、前記Streptococcus pyogenesDNaseB由来の1つ以上の抗原又は1つ以上の抗原の集団は、本明細書に記載の1つ以上のDNaseB断片などの1つ以上のDNaseBポリペプチドとして存在する。
【００６４】
同様に、本明細書に開示される態様のいずれか、例えば本明細書に記載の方法のいずれかで使用される場合、前記1つ以上のStreptococcus pyogenesSLO抗原又はSLOポリペプチドは、特定の実施形態では、例えば本明細書に開示される1つ以上の抗原性 SLO断片などの1つ以上のDNaseBポリペプチドである。例えば、様々な実施形態において、前記Streptococcus pyogenesSLO由来の1つ以上の抗原又は抗原の1つ以上の集団は、本明細書に記載の1つ以上のSLO断片などの1つ以上のSLOポリペプチドとして存在する。
【００６５】
一実施形態において、抗原：抗原特異的抗体複合体の2つ以上の集団の存在は、対象におけるStreptococcus pyogenesの存在を示す、又はStreptococcus pyogenesに対する対象の最近の曝露を示す、又は生体試料が2つ以上のStreptococcus pyogenes抗原に対して特異的な抗体を含むことを示す。
【００６６】
一実施形態では、1つ以上の複合体の検出の増加は、各試験集団について確立された抗原の参照レベルと比較した増加である。
【００６７】
一実施形態では、前記１つ以上のStreptococcus pyogenes抗原に特異的な１つ以上の抗体は、１つ以上の血清抗体である。
【００６８】
一実施形態では、1つ以上の血清抗体は1つ以上のIgG抗体である。
【００６９】
一実施形態では、前記1つ以上の血清抗体は、1つ以上のIgA抗体又は1つ以上のIgM抗体である。
【００７０】
一実施形態では、前記1つ以上の他の診断基準は、リウマチ熱又はPSGNに関連する1つ以上の臨床症状の有無である。
【００７１】
一実施形態では、1つ以上の臨床症状は、移動性多発性関節炎、心臓炎、血尿、辺縁部紅斑、皮下結節、セイデンハム舞踏病、又は膿皮症から選択される。
【００７２】
一実施形態では、1つ以上のStreptococcus pyogenes抗原は、以下のタンパク質の1つに由来する抗原である：
i）Streptococcus pyogenesヌクレアーゼA（SpnA）、
ii）デオキシリボヌクレアーゼ-B（DNaseB）、又は
iii）ストレプトリジン-O（SLO）。
【００７３】
一実施形態では、Streptococcus pyogenes抗原の1つ以上は、以下からなる群より選択される：
i）Streptococcus pyogenesヌクレアーゼA（SpnA）、又は
ii）配列番号8のアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなるSpnAの抗原性断片、又は
iii）配列番号8のアミノ酸配列からの少なくとも10個の連続したアミノ酸を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなるSpnAの抗原性断片、又は
iv）デオキシリボヌクレアーゼ-B（DNaseB）、又は
v）配列番号5のアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなるDNaseBの抗原性断片、又は
vi）配列番号5のアミノ酸配列からの少なくとも10個の連続したアミノ酸を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなるDNaseBの抗原性断片、又は
vii）ストレプトリジン-O（SLO）、又は  
viii）配列番号1又は配列番号2のアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなるSLOの抗原性断片、又は
ix）配列番号1又は配列番号2のアミノ酸配列からの少なくとも10個の連続したアミノ酸を含む、本質的にそれから、又はそれからなるSLO抗原性断片、又は
x）上記のi）からix）の2つ以上の任意の組み合わせ。
【００７４】
一実施形態では、前記生体試料を以下のStreptococcus pyogenes抗原の其々の集団と接触させる：
i）Streptococcus pyogenesヌクレアーゼA（SpnA）、又は
ii）配列番号8のアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなるSpnA抗原性断片、又は
iii）配列番号8のアミノ酸配列からの少なくとも10個の連続したアミノ酸を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなるSpnAの抗原性断片。
及び
iv）デオキシリボヌクレアーゼ-B（DNaseB）、又は
v）配列番号5のアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなるDNaseBの抗原性断片、又は
vi）配列番号5のアミノ酸配列からの少なくとも10個の連続したアミノ酸を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなるDNaseBの抗原性断片。
及び
vii）ストレプトリジン-O（SLO）、又は
vｉｉｉ）配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなるＳＬＯ抗原性フラグメント、又は
ix）配列番号1又は配列番号2のアミノ酸配列からの少なくとも10個の連続したアミノ酸を含む、本質的にそれから、又はそれからなるSLOの抗原性断片。
【００７５】
一実施形態において、前記生体試料を以下のStreptococcus pyogenes抗原のそれぞれの集団と接触させる：
i）Streptococcus pyogenesヌクレアーゼA（SpnA）、
ii）デオキシリボヌクレアーゼ-B（DNaseB）、及び
iii）ストレプトリジン-O（SLO）。
【００７６】
一実施形態において、前記生体試料を以下のStreptococcus pyogenes抗原のそれぞれの集団と接触させる：
ｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなるSpnA抗原性断片。
ii）配列番号5のアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなるDNaseB抗原性断片、及び
iii）配列番号1又は配列番号2のアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなるSLO抗原性断片。
【００７７】
一実施形態では、2つ以上のStreptococcus pyogenes抗原集団が組成物中に存在する。
【００７８】
一実施形態では、1つ以上のStreptococcus pyogenes抗原が検出可能な標識で標識され、及び/又は微粒子、ビーズ、又は検出可能な薬剤に結合される。
【００７９】
一実施形態では、Streptococcus pyogenes抗原の1つ以上の集団は、ビーズ又は微粒子に共有結合している。
【００８０】
一実施形態では、Streptococcus pyogenes抗原の各集団は、ビーズ又は微粒子に共有結合し、場合により、ビーズ又は微粒子の異なる集団のそれぞれは互いに区別可能である。
【００８１】
一実施形態では、前記ビーズはポリスチレンビーズ、磁気ビーズ、カルボキシル化ビーズ、機能化ビーズ、又は前記微粒子はポリスチレン微粒子、磁性微粒子、カルボキシル化微粒子、又は機能化微粒子である。様々な例において、前記ビーズは、各集団が異なる抗原に結合しているビーズ又は微粒子の2つ以上の集団を含むものなどの複合アッセイでの使用に適している。様々な例において、前記ビーズ又は微粒子は、CBA、luminexアッセイなどの免疫アッセイでの使用に適している。
【００８２】
一実施形態において、抗原：抗体複合体の検出は、抗原特異的抗体が前記生体試料に存在する場合、前記複合体を検出可能な標識を運ぶ特異的結合パートナーに曝露し、標識からのシグナルを検出することを含む。
【００８３】
一実施形態では、特異的結合パートナーは抗体又はその断片を含む。
【００８４】
一実施形態では、特異的結合パートナーは、抗IgG抗体、抗IgG-PE、又はその断片である。
【００８５】
一実施形態では、前記抗原：抗体複合体は、フロー機器、プレートベースの免疫学的アッセイなどの免疫アッセイ、電気泳動及び/又は免疫ブロット、免疫クロマトグラフィーストリップ、電子バイオセンサー、共鳴バイオセンサー、又はマイクロ流体デバイス又はセンサーを使用して検出される。
【００８６】
一実施形態では、プレートベースのイムノアッセイなどの前記イムノアッセイは、ELISA又はluminexアッセイである。
【００８７】
一実施形態では、前記抗原：抗体複合体は、luminexアッセイ、例えば本明細書で例示されるluminexアッセイで検出される。
【００８８】
一実施形態では、１つ以上の複合体又は１つ以上の抗原特異的抗体の存在は、検出可能に標識された二次抗体を使用して検出される。
【００８９】
一実施形態では、検出可能に標識された二次抗体は抗IgG-PEである。
【００９０】
一実施形態では、Streptococcus pyogenes抗原は検出可能に標識される。
【００９１】
一実施形態では、検出可能な標識は蛍光体である。
【００９２】
一実施形態では、生体試料は哺乳動物種から得られる。
【００９３】
一実施形態では、生体試料は体液試料である。
【００９４】
一実施形態では、対象はヒトである。
【００９５】
別の態様では、本発明は、単離、精製、又は組換えSpnAポリペプチドに関し、、前記SpnAポリペプチドは野生型SpnAに関して：
i）N末端が切断されており、
ii）C末端が切断されており、又は
iii）N末端及びC末端の両方が切断されている。
【００９６】
一実施形態では、前記SpnAポリペプチドは：
i）免疫原性がある、又は
ii）野生型SpnAと免疫学的に交差反応する、又は
iii）検出可能にラベル付けされている、又は
iv）野生型SpnAと比較して、室温で保存した場合の安定性が向上している、又は
v）配列番号8由来の10個以上の連続したアミノ酸を含む、又は
vi）上記のi）からv）の2つ以上の組み合わせ。
【００９７】
一実施形態において、前記SpnAポリペプチドは野生型SpnAと比較して高い平均Taggを有し、Taggとは例えば、SDS-PAGE分析により決定されるタンパク質の50％が凝集する温度である。例えば、前記SpnAポリペプチドはSDS−PAGE分析により決定される少なくとも約50℃の平均Taggなど、少なくとも約５０℃の平均Taggを有する。
【００９８】
一実施形態では、前記SpnAポリペプチドは、野生型SpnAポリペプチドと比較して約３５℃〜約６０℃の温度でより高い程度の熱安定性を有する。
【００９９】
一実施形態において、前記ポリペプチドは強化された熱安定性、強化された免疫原性安定性、又は強化された熱安定性と強化された免疫原性安定性の両方を有する。
【０１００】
疑念を避けるために、当業者は本明細書に開示された態様のいずれか、例えば本明細書に記載された方法のいずれかが、特定の実施形態において1つ以上の切断されたStreptococcus pyogenesヌクレアーゼA（SpnA）ポリペプチド、本明細書に記載の、1つ以上のSpnA断片を含む、1つ以上の上記切断型SpnAポリペプチドなどを使用することを理解するであろう。例えば、様々な実施形態において、前記1つ以上のStreptococcus pyogenes SpnA由来抗原又は1つ以上の抗原の集団は、本明細書に記載されるように、1つ以上の切断型SpnAポリペプチド、1つ以上のN末端切断型SpnAポリペプチド、又は１つ以上のC末端切断型SpnAポリペプチド、又は１つ以上のSpnA断片として存在する。
【０１０１】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の単離、精製、又は組換えSpnAポリペプチドを含む組成物に関する。
【０１０２】
さらなる態様では、本発明は、検出可能に標識されたSpnAを含む組成物に関する。
【０１０３】
一実施形態では、前記検出可能に標識されたSpnAは、切断型SpnAポリペプチド、本明細書に記載の1つ以上のN末端切断型SpnAポリペプチド、又は1つ以上のC末端切断型SpnAポリペプチド、又は1つ以上のSpnA断片などである。
【０１０４】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載の1つ以上のStreptcoccus pyogenesヌクレアーゼA（SpnA）ポリペプチドなどの1つ以上のStreptcoccus pyogenes抗原又はStreptcoccus pyogenes抗原の1つ以上の集団に結合したビーズ又は微粒子に関する。
【０１０５】
別の態様において、本発明は本明細書に開示された1つ以上のビーズ又は微粒子を含む組成物に関する。
【０１０６】
更に別の態様では、本発明は、対象におけるリウマチ熱又はPSGNを検出又は診断するため、対象におけるStreptococcus pyogenes感染の存在を検出するため、又は生体試料中のStreptococcus pyogenes抗原特異的抗体を検出するためのキットに関し 、前記キットは以下からなる群から選択されるStreptococcus pyogenes抗原の少なくとも1つを含む組成物を含む：
i）Streptococcus pyogenesヌクレアーゼA（SpnA）、又は
ii）配列番号8のアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなるSpnA抗原性断片、又は
iii）配列番号8のアミノ酸配列由来の少なくとも10個の連続したアミノ酸を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなるSpnAの抗原性断片、又は
iv）デオキシリボヌクレアーゼ-B（DNaseB）、又は
v）配列番号5のアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなるDNaseBの抗原性断片、又は
vi）配列番号5のアミノ酸配列からの少なくとも10個の連続したアミノ酸を含む、又は本質的にそれからなる、又はそれからなるDNaseBの抗原性断片、又は
vii）ストレプトリジン-O（SLO）、又は
viii）配列番号1又は配列番号2のアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなるSLO抗原性断片、又は
ix）配列番号1又は配列番号2のアミノ酸配列由来の少なくとも10個の連続したアミノ酸を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなるSLO抗原性断片であって、
少なくとも一つの組成物が選択的に参照抗体対照を含み、前記抗体参照は前記キットに存在するStreptococcus pyogenes抗原に特異的な抗体、
1つ以上の抗原に生体試料を接触させるのに適した媒体を構成するための1つ以上の試薬、
選択的に、生体試料中に存在する前記1つ以上の抗原及び1つ以上のStreptococcus pyogenes抗原特異的抗体との間に形成される複合体の検出を可能にする1つ以上の試薬、
及び使用のための説明書。
【０１０７】
一実施形態では、Streptococcus pyogenes抗原の少なくとも1つは、ビーズ又は微粒子に共有結合している。
【０１０８】
一実施形態では、前記組成物は以下の集団を含む：
i）Streptococcus pyogenesヌクレアーゼA（SpnA）、又は
ii）配列番号8のアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなるSpnAの抗原性断片、又は
iii）配列番号8のアミノ酸配列からの少なくとも10個の連続したアミノ酸を含む、又は本質的にそれからなるか、又はそれからなるSpnA抗原性断片。
【０１０９】
一実施形態では、前記組成物は、以下のStreptococcus pyogenes抗原のそれぞれの集団を含む：
i）Streptococcus pyogenesヌクレアーゼA（SpnA）、又は
ii）配列番号8のアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなるSpnAの抗原性断片、又は
iii）配列番号8のアミノ酸配列由来の少なくとも10個の連続したアミノ酸を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなるSpnAの抗原性断片。
及び
iv）デオキシリボヌクレアーゼ-B（DNaseB）、又は
v）配列番号5のアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなるDNaseBの抗原性断片、又は
vi）配列番号5のアミノ酸配列からの少なくとも10個の連続したアミノ酸を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなるDNaseBの抗原性断片。
そして
vii）ストレプトリジン-O（SLO）、又は
viii）配列番号1又は配列番号2のアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなるSLOの抗原性断片、又は
ix）配列番号1又は配列番号2のアミノ酸配列からの少なくとも10個の連続したアミノ酸を含む、本質的にそれから、又はそれからなるSLOの抗原性断片。
【０１１０】
本明細書で提供される方法の様々な実施形態では、前記方法は、ステップii）の前に本明細書で説明されるキットを提供することをさらに含む。
【０１１１】
本明細書で提供される方法又はキットの様々な実施形態では、1つ以上のStreptococcus pyogenes抗原は、抗ストレプトリジン（ASO）、抗ヒアルロニダーゼ（AHase）、抗ストレプトキナーゼ（ASKase）、抗ニコチンアミド-アデニンジヌクレオチダーゼ（抗NAD）を含む群から選択される。
【０１１２】
一実施形態では、前記方法は、ビーズ又は微粒子の2つ以上の集団を含む組成物又はキットの使用を含み、ビーズ又は微粒子の各集団は異なるStreptococcus pyogenes抗原を含み、ビーズの集団の少なくとも1つは 又は微粒子は、以下のStreptococcus pyogenes抗原のいずれかの集団を含む：
i）Streptococcus pyogenesヌクレアーゼA（SpnA）、又は
ii）配列番号8のアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなるSpnAの抗原性断片、又は
iii）配列番号8のアミノ酸配列由来の少なくとも10個の連続したアミノ酸を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなるSpnAの抗原性断片、
及び、前記ビーズ又は微粒子は、フロー機器、プレートベースの免疫学的アッセイなどの免疫アッセイ、電気泳動及び/又は免疫ブロット、免疫クロマトグラフィーストリップ、電子バイオセンサー、共鳴バイオセンサー、マイクロ流体デバイス又はセンサー、たとえば、ELISA、Luminex、又はCBAアッセイを含む使用に適している。
【０１１３】
様々な態様において、前記使用は本明細書に記載の任意の方法における。例えば、前記使用は以下の任意の一つを含む使用であるが、限定されない：対象においてStreptcoccus pyogenesに対する最近の曝露を検出するための方法、対象において急性連鎖球菌後糸球体腎炎（APSGN）を含むリウマチ熱又は連鎖球菌後糸球体腎炎（PSGN）を検出又は診断する方法、対象における進展するリウマチ熱又はPSGNの増加傾向を検出又は診断する方法、対象におけるStreptcoccus pyogenesの存在を検出する方法、生体試料中のStreptcoccus pyogenes抗原特異的抗体を検出するための方法、リウマチ熱又はPSGNを患う患者を治療する方法、リウマチ熱又はPSGNを患う患者をStreptcoccus pyogenesに対して効果のある抗生物質で治療する方法、Streptcoccus pyogenesに対して効果のある抗生物質で治療する方法、前記患者はStreptcoccus pyogenes感染を患っている、又はStreptcoccus pyogenes感染に曝露されたことがある、リウマチ熱又はPSGNを患う患者の抗生物質による治療に対する応答性を予測する方法、リウマチ熱又はPSGNを患う患者に対する治療計画を決定する方法、又は対象におけるStreptcoccus pyogenesの最近の曝露を検出する方法。
【０１１４】
選択的に、ビーズ又は微粒子の2つ以上の集団の1つ以上は、以下のStreptococcus pyogenes抗原のうちの1つの集団を含む：
i）Streptococcus pyogenesヌクレアーゼA（SpnA）、又は
ii）配列番号8のアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなるSpnAの抗原性断片、又は
iii）配列番号8のアミノ酸配列からの少なくとも10個の連続したアミノ酸を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなるSpnA抗原性断片、又は
iv）デオキシリボヌクレアーゼ-B（DNaseB）、又は
v）配列番号5のアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなるDNaseBの抗原性断片、又は
vi）配列番号5のアミノ酸配列からの少なくとも10個の連続したアミノ酸を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなるDNaseBの抗原性断片、又は
vii）ストレプトリジン-O（SLO）、又は
viii）配列番号1又は配列番号2のアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなるSLOの抗原性断片、又は
ix）配列番号1又は配列番号2のアミノ酸配列からの少なくとも10個の連続したアミノ酸を含む、本質的にそれから、又はそれからなるSLOの抗原性断片。
【０１１５】
別の態様において、本発明は単離、精製、又は組み換えSpnAポリペプチド、1つ以上のStreptcoccus pyogenesヌクレアーゼA（SpnA）ポリペプチドなどの1つ以上のStreptcoccus pyogenes抗原又はStreptcoccus pyogenes抗原の1つ以上の集団を含む、又は結合したビーズ又は微粒子、本明細書に記載の単離、精製、又は組み換えSpnAポリペプチドを含む組成物、検出できるよう標識されたSpnAを含む組成物、本明細書に記載の微粒子のビーズを1つ以上含む組成物、対照においてリウマチ熱又はPSGNを検出又は診断するためのキット、対象におけるStreptcoccus pyogenes感染の存在を検出ためのキット、又は生体試料中のStreptcoccus pyogenes抗原特異的抗体を検出するためのキットであり、以下のいずれかのためである：対象においてStreptcoccus pyogenesの最近の曝露を検出するため；対象において急性連鎖球菌後糸球体腎炎（APSGN）を含むリウマチ熱又は連鎖球菌後糸球体腎炎（PSGN）を検出又は診断するため；対象における進展するリウマチ熱又はPSGNの増加傾向を診断するため；対象におけるStreptcoccus pyogenes感染の存在を検出するため；生体試料中のStreptcoccus pyogenes抗原特異的抗体を検出するため；リウマチ熱又はPSGNを患う患者を治療するため；リウマチ熱又はPSGNを患う患者をStreptcoccus pyogenesに対して効果のある抗生物質で治療するため、前記患者はStreptcoccus pyogenes感染を患っている、又はStreptcoccus pyogenes感染に曝露されたことがある；リウマチ熱又はPSGNを患う患者を抗生物質での治療に対する応答性を予測するため；又は対象においてStreptcoccus pyogenesに最近曝露されたことを検出するため。
【０１１６】
様々な態様において、前記ポリペプチド、ビーズ又は微粒子、組成物、又はキットは、以下を含む群から選択されるStreptcoccus pyogenes抗原の少なくとも一つである、又は含む：
i）Streptcoccus pyogenesヌクレアーゼA（SpnA）、又は
ii）配列番号８のアミノ酸配列を含む、本質的に含む、又はそれからなるSpnA抗原断片、又は
iii）配列番号８のアミノ酸配列由来の10個の連続したアミノ酸を少なくとも含む、本質的に含む、又はそれからなるSpnA抗原断片、又は
iv）デオキシリボヌクレアーゼ（DNAアーゼB）、又は
v） 配列番号５のアミノ酸配列を含む、本質的に含む、又はそれからなるSpnA抗原断片、又は
vi）配列番号５のアミノ酸配列由来の10個の連続したアミノ酸を少なくとも含む、本質的に含む、又はそれからなるDNAアーゼB抗原断片、又は
vii）ストレプトリジン-O（SLO）、又は
viii）配列番号1又は配列番号2のアミノ酸配列を含む、本質的に含む、又はそれからなるSLO抗原断片、又は
ix）配列番号1又は配列番号2のアミノ酸配列由来の10個の連続したアミノ酸を少なくとも含む、本質的に含む、又はそれからなるSLO抗原断片、又は
【０１１７】
様々な態様において、前記対象又は患者は、閾値を上回る抗Streptcoccus pyogenes SpnA抗原量又は力価を持つ対象であり、前記閾値を上回る前記抗体の量又は抗体力価はStreptcoccus pyogenesの最近の曝露を示唆する。例えば、前記閾値とは通常の上限値（ULN）、対応する健康な人口の80百分位値である。
【０１１８】
別の態様において、前記対象又は患者は、閾値を下回る抗Streptcoccus pyogenes SpnA抗原量又は力価を持つ対象であり、前記閾値を下回る前記抗体の量又は抗体力価はStreptcoccus pyogenesの以前の曝露を示唆する。例えば、前記閾値とは正常な上限値（ULN）、対応する健康な人口の80百分位値である。
【０１１９】
別の態様では、本発明は、対象におけるStreptococcus pyogenesへの最近の曝露を検出する方法に関し、前記方法は：
i）Streptococcus pyogenes SpnAに特異的な1つ以上の抗体を含むことができる、又は含むと疑われる前記対象から生体試料を提供すること；
ii）前記生体試料をStreptococcus pyogenes SpnA由来の抗原の1つ以上の集団と接触させること、前記1つ以上のStreptococcus pyogenes SpnA抗原の集団は、前記抗原：抗原特異的抗体が生体試料中に存在する場合、前記生体試料に存在する抗原特異的抗体と結合して、1つ以上の抗原特異的抗体複合体の集団を形成することができる、及び
iii）閾値を超える1つ以上の複合体の検出の増加は、対象におけるStreptococcus pyogenesへの最近の曝露を示す、前記複合体の検出。
【０１２０】
別の態様において、本発明は、対象におけるリウマチ熱又は急性連鎖球菌性糸球体腎炎（APSGN）を含む連鎖球菌性糸球体腎炎（PSGN）、又は対象におけるリウマチ熱又はPSGNを発症する可能性の増加を検出又は診断する方法に関し、前記方法は以下を含む：
i）Streptococcus pyogenes SpnAに特異的な1つ以上の抗体を含むことができる、又は含むと疑われる対象から生体試料を提供すること；
ii）1つ以上のStreptococcus pyogenes SpnA抗原集団は、生体試料中に存在する抗原特異的抗体と結合して、生体試料内に抗原特異的抗体が存在する時は、1つ以上の抗原特異的抗体複合体の集団を形成することができるStreptococcus pyogenes SpnA由来の抗体の1つ以上の集団と生体試料を接触させること；及び
ｉｉｉ）閾値を超える1つ以上の複合体の増加は発達するリウマチ熱又はＡＰＳＧＮの増加の可能性を示唆し、又は対象におけるリウマチ熱又はＰＳＧＮの存在の一つの指標として、対象におけるStreptococcus pyogenesへの最近の曝露を示唆する、複合体を検出すること；
ｉｖ）リウマチ熱又はＰＳＧＮに対する１つ以上の診断基準を評価すること；及び
ｖ）及びリウマチ熱又はＡＰＳＧＮに対する1つ以上の他の診断基準と併せて、閾値を超える1つ以上の複合体の検出の増加は、対象におけるリウマチ熱又はＰＳＧＮを示唆する。
【０１２１】
一実施形態では、前記1つ以上の診断基準は、リウマチ熱又はPSGNに関連する1つ以上の臨床症状の有無である。
【０１２２】
一実施形態では、前記１つ以上の臨床症状は、移動性多発性関節炎、心臓炎、血尿、辺縁部紅斑、皮下結節、セイデンハム舞踏病、又は膿皮症から選択される。
【０１２３】
別の態様では、本発明は、対象におけるStreptococcus pyogenes感染の存在を検出する方法に関し、前記方法は以下を含む：
ｉ）１つ以上のStreptococcus pyogenes SpnAに特異的な抗体を含むことができる又は疑いがある対象から生体試料を提供すること；及び
ｉｉ）1つ以上のStreptococcus pyogenes SpnA抗原集団は、生体試料中に存在する抗原特異的抗体と結合して、生体試料内に抗原特異的抗体が存在する時は、1つ以上の抗原特異的抗体複合体の集団を形成することができる前記Streptococcus pyogenes SpnA由来の抗体の1つ以上の集団と生体試料を接触させること；及び
ｉｉｉ）、1つ以上の複合体の閾値を超える検出の増加は、対象のStreptococcus pyogenesへの最近の曝露を示唆する、複合体を検出すること。
【０１２４】
別の態様では、本発明は、生体試料中のStreptococcus pyogenes抗原特異的抗体を検出する方法に関し、、Streptococcus pyogenes抗原特異的抗体は、Streptococcus pyogenes SpnAに特異的に結合し、前記方法は以下を含む：
ｉ）1つ以上のStreptococcus pyogenes抗原に対して特異的な抗体を含むことができる、又は疑いのある対象から生体試料を提供すること；
ｉｉ）2つ以上のStreptococcus pyogenes抗原の集団を含む生体試料を接触させることであって、2つ以上のStreptococcus pyogenes抗原集団の其々は、生体試料中に存在する抗原特異的抗体に結合して、2つ以上の抗原、抗原特異的抗体複合体が生体試料に存在する場合は、抗原特異的抗体複合体、の集団を形成することを可能にする；及び
ｉｉｉ）、1つ以上の複合体の閾値を超える検出の増加は、対象のStreptococcus pyogenesへの最近の曝露を示唆する、複合体を検出すること。
【０１２５】
一実施形態では、連鎖球菌後糸球体腎炎は、急性連鎖球菌後糸球体腎炎（APSGN）である。
【０１２６】
様々な実施形態において、１つ以上の複合体の検出の増加は、閾値を超える１つ以上の複合体の検出の増加である。
【０１２７】
様々な態様において、前記参照値、参照閾値、又は閾値（本明細書において互換的に及びカットオフとも呼ばれる）は特定の集団について決定される。一例では、特定の国で最近発症したリウマチ熱（ARF）、例えば、NZでのARFの場合、前記閾値は健康な、よく一致したボランティアのコホートを用いて決定される。このように確立されたカットオフ(又は参照レベル)は、次にNZの全てのARFに適用される。参照閾値は国、民族、及び集団間で異なる可能性があり、従って特定の実施形態では、異なる国又は集団がそれぞれ独自の参照閾値を決定することが理解されよう。一実施形態において、前記参照レベル、参照閾値、又は閾値は通常の上限値（ULN）、対応する健康な人口の80百分位値である。
【０１２８】
一実施形態では、Streptococcus pyogenes抗原を検出するための前記参照閾値は、入院後20日以内にリウマチ熱又はPSGN患者の集団から得られたサンプルで観察される抗体の平均力価である。例えば、本明細書に記載の方法で使用するStreptococcus pyogenes抗原の参照閾値は、入院の20日以内の対照と比較できるリウマチ熱又はPSGN患者の人口統計学的に同等の集団から得られたサンプルで本明細書に記載の方法を使用して観察された平均抗原特異的抗体力価である。
【０１２９】
一実施形態では、抗SpnA抗体：SpnA複合体を検出するための前記参照閾値、例えばStreptococcus pyogenesへの最近の曝露を決定する際に使用するためのSpnAの参照閾値は、入院から20日以内にリウマチ熱又はPSGN患者の集団から得られたサンプルで観察された平均抗SpnA抗体価である。例えば、Streptococcus pyogenesへの最近の曝露の判定に使用するSpnAの参照閾値は、入院の20日以内の対照と比較できるリウマチ熱又はPSGN患者の人口統計学的に同等の集団から得られたサンプルで本明細書に記載の方法を使用して観察された平均抗原特異的抗体力価である。
【０１３０】
本発明の他の目的、態様、特徴及び利点は、以下の説明から明らかになるであろう。 ただし、詳細な説明及び特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、本発明の精神及び範囲内の様々な変更及び修正が本詳細な説明から当業者にとって明らかになるため、例示のみを目的とするものであることを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【０１３１】
本発明の更なる態様は、例としてのみ与えられ、添付の図面を参照して与えられる以下の説明から明らかである：
【図１−１】図1は、10個の血清サンプル中のSLO（図1A）、DNaseB（図1B）、及びSpnA（図1C）のサイトメトリービーズアレイによって決定されたシングルプレックス及びマルチプレックス蛍光中央値（MFI）の相関を示す散布図である。線形回帰分析が実行され、R2は次のように決定された：SLO= 0.999; DNaseB B = 0.998;及びSpnA = 0.998;
【図１−２】同上。
【図２−１】図2は、3つのグループA連鎖球菌抗原に対する精製IgGのELISAの結果を示す。アフィニティークロマトグラフィーを使用してIVIGから抗体を精製し、SLO（A）、DNaseB（B）及びSpnA（C）に特異性のあるIgGをもたらした。エラーバーは標準偏差を表す；
【図２−２】同上。
【図３−１】図3は、SLO（A）、DNaseB（B）、及びSpnA（C）のサイトメトリービーズアレイによって決定された血清抗体濃度を示す散布図である。各抗原のULN値が示されている（点線）。 クラスカル・ワリス一元配置分散分析を実行して、p値を決定した；
【図３−２】同上。
【図４】図4は、SLO（A）、DNaseB（B）の市販のテストとサイトメトリービーズアレイの相関を示す散布図である。線形回帰分析が実行され、R2はSLO = 0.968及びDNaseB B = 0.934として決定された。
【図５−１】図5は、FCAPアレイソフトウェアの5パラメーターロジスティック式を備えたサイトメトリービーズアレイのSLO、DNAseB、及びSpnAの標準曲線を示す。SLO（500ng / ml）、DNAse B（500ng / ml）及びSpnA（1500ng / ml）に特異的な精製IgGを2倍に希釈し、抗原結合ビーズとインキュベートした；
【図５−２】同上。
【図６】図6は、アミノ酸34〜571を含むSLOの組換え断片のアミノ酸配列を示し（図6A）、解毒されたSLO類似体のアミノ酸配列は図6Bに示す。置換されたアミノ酸は強調表示され、下線が引かれている；
【図７】図7は、アミノ酸43〜271を含むDNaseBの組換え断片のアミノ酸配列を示す；
【図８】図8は、アミノ酸28〜854を含むSpnAの組換え断片のアミノ酸配列を示す；
【図９−１】図9は、シングルプレックスluminexアッセイ（各抗原を個別）と、3つの抗原ビーズを同じ部分で混合し、単一のアッセイでテスト血清とインキュベートしたマルチプレックスluminexアッセイを比較する3つの散布図を示す。図9Aは、シングルプレックスluminexアッセイとマルチプレックスluminexアッセイにおけるSLOのMFIの相関関係を示す。 図9Bは、シングルプレックスluminexアッセイとマルチプレックスluminexアッセイにおけるDNaseBのMFI間の相関を示す；図9Cは、シングルプレックスluminexアッセイとマルチプレックスluminexアッセイにおけるSpnAのMFIの相関関係を示す。本明細書の実施例2に記載の通りである。
【図９−２】同上。
【図１０】図10は、市販のテストとSLO（図10A）及びDNaseB（図10B）のluminexアッセイとの相関関係を示す2つの散布図である。線形回帰分析が実行され、R2はSLO = 0.933及びDNaseB B = 0.942として決定された；
【図１１】図11は、luminexアッセイで測定された患者から採取された血清に存在するIgG抗体のレベルを示す3つのグラフを示し、前記血清は入院から数日で分離されている。入院から20日以上採取した血清と比較して、入院から20日未満採取した血清の抗SLO抗体濃度（図11、左側のパネル）、及びこれら2つのグループ間の抗DNaseB抗体濃度（図 11、中央パネル）で大きな違いはなかった。対照的に、抗SpnA抗体濃度の有意な減少は、本明細書の実施例2に記載されているように、入院から20日未満で収集された血清のそれと比較した場合、入院から20日以上収集された血清で観察された（図11、右側のパネル）。
【図１２】図12は、luminexアッセイによって決定された患者から収集された血清中に存在するIgG抗体のレベルを示す3つのグラフを示しており、前記血清は入院から数日で分離されている。入院から20日以上収集した血清と、入院から20日未満に収集した血清の抗SLO抗体濃度（図12、左パネル）、及びこれら2つのグループ間の抗DNaseB抗体濃度（図 12、中央パネル）で大きな違いはなかった。対照的に、抗SpnA抗体濃度の有意な減少が、本明細書の実施例3に記載されるように、入院から20日未満で収集された血清と比較した場合、入院から20日未満で収集された血清で観察された（図12、右側のパネル）。
【図１３】図１３は、実施例４に記載されるように、本明細書に開示される天然SpnA及び切断SpnAポリペプチドの熱安定性の分析を示す３つのグラフを提示する。 図13Aは、各温度での折りたたまれたタンパク質の割合のSDS-PAGE分析のクロマトグラフである。図13Bは、各温度での各タンパク質のTagg（タンパク質の50％が凝集する温度）を示すグラフである。図13Cは、各ポリペプチドの平均Tagg値のグラフであり、51.0 +/- 0.6℃の切断型構造で決定されたより高い平均Taggを示し、これは、ネイティブSpnAポリペプチド（47.5 +/- 0.9℃）のために決定されたものよりも明らかに高い。
【図１４】図14は、実施例５として記載される、本明細書で開示される天然SpnA及び切断SpnAポリペプチドの熱安定性の分析を示す１つのクロマトグラフ及び２つのグラフを示す。図14Aは各温度での折りたたまれたタンパク質の百分率のSDS-PAGEのクロマトグラフである。図14Bはそれぞれの温度においてそれぞれのタンパク質がTagg（タンパク質の５０％が凝集する温度）を示すグラフである。図14Cはそれぞれのポリペプチドの平均Tagg値のグラフであり、51.0＋/−0.6℃における切断コンストラクトにより決定されたより高い平均Taggを示し、天然SpnAポリペプチド（47.5＋/−0.9℃）により決定されたものよりも明らかに高い。詳細な説明
【発明を実施するための形態】
【０１３２】
本発明は一般に、生体試料中のＧＡＳ特異的抗体の存在を検出するための方法及び組成物に関する。そのような抗体の検出は、以下の開示を読むことで当業者に明らかになるであろう他の用途に加えて、感染後免疫後遺症のリスクが高い対象を特定し、特定の治療から利益を得る可能性がある対象を特定するのに役立つ 。
【０１３３】
文脈がそうでないことを明確に要求しない限り、記述及び特許請求の範囲を通して、「含む（comprise）」、「含んでいる(comprising)」などの単語は、排他的又は網羅的な意味とは対照的に包括的な意味で、つまり、「含むが、これに限定されない」という意味で解釈される。
【０１３４】
特定の実施形態において、本発明は、リウマチ熱又は連鎖球菌性糸球体腎炎（PSGN）の診断を支援する方法、又は対象の生体試料中の1つ以上のStreptococcus pyogenes抗原に特異的な1つ以上の抗体の存在又は量を決定することを含む、対照中の前記抗体のレベルと比較した生体試料中の前記抗体のレベルの上昇は、リウマチ熱又はPSGNの発症傾向の増加を示す、対象においてリウマチ熱又はPSGNを発症する傾向を評価する方法に関する方法に関する。
【０１３５】
他の実施形態では、本発明は、1つ以上の治療の前又は治療中に対象から得られた生体試料由来の1つ以上のStreptococcus pyogenes抗原に特異的な1つ以上の抗体の存在又は量を決定することを含む、対象におけるリウマチ熱又はPSGNの治療の有効性を判定する方法に関し、対象から得られたサンプル中の1つ以上のStreptococcus pyogenes抗原に特異的な1つ以上の前記抗体のレベルの経時的減少は、治療が有効であることを示す。
【０１３６】
さらなる実施形態において、本発明は、リウマチ熱又はPSGNの治療のために対象を選択する方法に関し、（a）対象から得られた生体試料中の一つ以上のStreptococcus pyogenes抗原に特異的な一つ以上の抗体の存在又は量を決定する;（b）生体試料中の前記抗体のレベルを、対照中の前記抗体のレベルと比較する;及び（c）生体試料中の前記抗体のレベルが対照中の前記抗体のレベルよりも高い場合、治療対象を選択する；ことを含む。
【０１３７】
本発明は、抗原成分に対する抗体の親和性、抗原又はエピトープを特異的に認識して結合する抗体の能力、及びこの特異的な認識及び結合の決定に一部依存している。 言い換えれば、本発明は、抗体が特定のエピトープを認識して結合するときに形成される複合体の検出又は同定に部分的に依存する。
【０１３８】
「親和性（affinity）」という用語は、結合分子、本発明の文脈において、典型的には免疫グロブリン分子、の個々のエピトープと相補性決定領域（CDR）との結合の強さの尺度を指す。「結合力（adivity）」という用語は、免疫グロブリンの集団と抗原の間の複合体の全体的な安定性、すなわち免疫グロブリン混合物及び抗原の機能的結合強度を指す。当業者は、結合力（adivity）が、特定のエピトープを有する集団中の個々の免疫グロブリン分子の親和性（affinity）、及び免疫グロブリンと抗原の価数の両方に関連することを理解するであろう。例えば、二価モノクローナル抗体と、ポリマーなどの高度に反復するエピトープ構造を持つ抗原との間の相互作用は、高い結合力（adivity）の1つである。抗原に対する抗体の親和性又は結合力は、本明細書に記載の特定の方法を含む、当業者に周知の任意の適切な方法を使用して実験的に決定することができる。 抗原に対する抗体の親和性を測定する一般的な手法には、ELISA、RIA、及び表面プラズモン共鳴が含まれる。特定の抗体：抗原相互作用の測定された親和性（affinity）は、異なる条件（塩濃度、pH、緩衝液、温度など）で測定された場合、異なる場合がある。従って、特に比較データが必要な場合、親和性及び他の抗原結合パラメーター、例えばKD、IC50の測定は、通常、抗体及び抗原の標準化された溶液、標準化されたバッファー、及び標準化されたアッセイ条件で行われる。
【０１３９】
本明細書で交換可能に使用される「特異的に結合する（specifically binding）」又は「特異的に認識する(specifically recognizing)」は、一般に、結合分子、例えばある抗体がその抗原結合ドメインを介してエピトープに結合し、前記結合が抗原結合ドメインとエピトープ間の相補性を伴うことを意味する。したがって、抗体は、その抗原結合ドメインを介して、ランダムな無関係のエピトープに結合するよりも容易にそのエピトープに結合すると、エピトープに「特異的に結合する」と言われる。そのような抗体は、本明細書では、列挙されたエピトープ又はエピトープの分類に「特異的な抗体」と呼ばれる場合がある。本明細書において「特異性(specificity)」という用語は、特定の抗体が特定のエピトープに結合する相対的親和性を認定するために本明細書で使用される。例えば、抗体「A」は抗体「B」よりも特定のエピトープに対してより高い特異性を持っていると見なされるか、又は抗体「A」は関連するエピトープ「y」よりも高い特異性でエピトープ「x」に結合すると言われる。
【０１４０】
本明細書で使用される「決定」への言及は、特定の試料中に存在する参照物質（例えば、抗体、抗原、又はバイオマーカー）の量の推定、定量、計算又はその他の導出を含む。これは、例えば検出可能な製品の外観、例えば基質レベルの検出可能な変化、又は製品の外観又は基質の消失の速度の変化であり得る終点指標を測定することにより達成され得る、又は、本明細書に記載の抗原、バイオマーカー、複合体、又は他の試薬に結合した抗体の量を測定する。
【０１４１】
存在する場合、用語「免疫学的結合特性」又は抗原と抗体との様々な文法形態の他の結合特性は、抗体の特異性、親和性、交差反応性、及び他の結合特性を指す。
【０１４２】
本明細書で使用する場合、「免疫原性安定性（immunogenic stability）」、「免疫学的安定性(immunological stability)」、という用語及び文法的同等物は、特定の免疫応答を含む所定の生成能力の維持など、1つ以上の免疫原性又は免疫学的特性、例えば、抗体に結合又は認識される能力、又は細胞性免疫応答を誘発する能力などの維持を意図している。例えば、特定の抗原、ポリペプチド、又は他の薬剤に関して使用される場合、免疫原性安定性（immunogenic stability）又は免疫学的安定性(immunological stability)には、例えば、抗体特異的認識の維持、例えば、抗原、ポリペプチド、又は他の薬剤の能力が含まれる特定の抗体によって結合される。免疫学的安定性は、エピトープを認識して結合する維持された能力など、抗体の安定性も指す場合があることが理解されよう。
【０１４３】
本明細書で使用される「優先的に結合する（preferentially binding）」という用語は、例えば、エピトープに対する抗体の、他のエピトープ、例えば関連、類似、相同、又は類似のエピトープよりも容易に生じる結合を意図する。したがって、所与のエピトープに「優先的に結合する」抗体は、そのような抗体が他のエピトープとある程度の交差反応性を示す場合であっても、別のエピトープよりもそのエピトープに結合する可能性が高い。
【０１４４】
例えば、抗体は、第2エピトープに対する抗体の解離定数（KD）よりも小さい解離定数（KD）で第1エピトープに結合する場合、第1エピトープに優先的に結合すると見なされ得る。一実施形態では、抗体は、第２エピトープに対する抗体のＫＤよりも少なくとも一桁小さい親和性で第１エピトープに結合する場合、第１の抗原に優先的に結合すると考えられ得る。別の実施形態において、抗体は、第２エピトープに対する抗体のＫＤよりも少なくとも２桁小さい親和性で第１エピトープに結合する場合、第１エピトープに優先的に結合すると見なされ得る。
【０１４５】
別の実施例では、抗体は、2番目の抗体のk（on）より小さい結合速度定数（on rate、（k（on））で第１エピトープに結合する場合、第１エピトープに優先的に結合すると見なされ得る。一実施形態では、抗体は、第2エピトープに対する抗体のk（on）よりも少なくとも1桁大きいk（on）で第1のエピトープに結合する場合、第1エピトープに優先的に結合すると見なされ得る。別の実施形態では、抗体は、第2エピトープに対する抗体のk（on）よりも少なくとも2桁大きいk（on）で第1エピトープに結合する場合、第1エピトープに優先的に結合すると見なされ得る。
【０１４６】
他の実施例では、抗体は、解離速度定数（off rate（k（off））が第2エピトープに対する抗体のk（off）より小さい第1エピトープに結合する場合、第1エピトープに優先的に結合すると見なされる。一実施形態において、抗体は、第2エピトープに対する抗体のk（off）よりも少なくとも1桁小さいk（off）で第1エピトープに結合する場合、第1エピトープに優先的に結合すると見なされ得る。別の実施形態では、抗体は、第2のエピトープに対する抗体のk（off）よりも少なくとも2桁小さいk（off）で第1のエピトープに結合する場合、第1のエピトープに優先的に結合すると見なされ得る。
【０１４７】
本明細書で有用な特定の方法では、一般に1つの抗体がエピトープへの1つ以上の他の抗体の結合を阻害する能力を評価することにより、2つ以上の抗体の競合的結合が評価される。特定の実施形態において、抗体は、参照抗体のエピトープへの結合をある程度ブロックする程度までそのエピトープに優先的に結合する場合、所与のエピトープへの参照抗体の結合を競合的に阻害すると言われる。競合的阻害は、当技術分野で知られている任意の方法、例えば競合ELISAアッセイによって決定することができる。一般に、抗体は、参照抗体の所定のエピトープへの結合を少なくとも90％、少なくとも80％、少なくとも70％、少なくとも60％、又は少なくとも50％競合的に阻害すると言われている。
【０１４８】
本明細書に記載の抗体、又はその抗原結合断片、変異体、又はそれらの誘導体は、交差反応性の観点から記載又は特定され得る。 本明細書で使用される「交差反応性（cross-reactivity）」という用語は、ある抗原に特異的な抗体が、第2の抗原を認識して結合する能力を指す。一般に、抗体の交差反応性の観察は、交差反応性を支持する2つ（又はそれ以上）の異なる抗原性物質間の関連性の尺度として採用される。したがって、抗体は、その形成を誘発したエピトープ以外のエピトープに結合する場合、交差反応性である。
【０１４９】
特定の文脈において、エピトープは交差反応性であると呼ばれるか、又は記述され、それにより2つ以上の異なるエピトープが特定の抗体によって認識及び/又は結合され得ると考えられる。交差反応性エピトープは、一般に、誘導性又は起源のエピトープと同じ相補的な構造的特徴の多くを含む。環境によって、交差反応性エピトープは、元のエピトープよりも高い親和性で結合する場合がある。
【０１５０】
診断目的のために、交差反応性が低い、又は持たない抗体や抗原が一般に好まれると考えられる。
【０１５１】
本明細書で使用される「ポリペプチド（polypeptide）」という単語は、単「ポリペプチド（polypeptide）」及び複「ポリペプチド（polypeptides）」を含んでおり、及びアミド結合（ペプチド結合としても知られる）によって直線的に結合したモノマー（アミノ酸）で構成される分子をいう。「ポリペプチド（polypeptide）」という単語は、2つ以上の任意の単アミノ酸鎖又は複アミノ酸鎖をいい、産生物の特定の長さは問わない。よって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、又は単アミノ酸鎖又は2つ以上のアミノ酸の複アミノ酸鎖を言及するのに使用される任意の他の用語は、「ポリペプチド（polypeptide）」の定義に含まれ、「ポリペプチド（polypeptide）」という単語は任意のこれらの単語の代わり、又は互換的に使用される。
【０１５２】
「ポリペプチド（polypeptide）」という単語は、また前記ポリペプチドの複製の発現後の産生物を言及することを目的とし、糖鎖形成、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護／ブロッキング基、タンパク質分解切断、又は非天然アミノ酸による修飾による誘導体化による制限なく含まれる。ポリペプチドは天然生物学的資源又は組み換え技術から製造されるが、必ずしも決まった核酸配列から翻訳されるとは限らない。それは、化学合成を含む任意の方法から作り出される。
【０１５３】
本発明のポリペプチドは約3個以上、5個以上、10個以上、20個以上、25個以上、50個以上、75個以上、100個以上、200個以上、500個以上、1000個以上、又は2000個以上のアミノ酸のサイズからなる。ポリペプチド（polypeptides）は合成された3次元構造をとることもあるが、そのような構造に必ずしも限定されない。糖タンパク質（glycoprotein）という単語は、酸素を含む、又は窒素を含む、例えばセリン残基又はアスパラギン残基の側鎖などの、アミノ酸残基の側鎖を介してタンパク質と結合する少なくとも一つのカルボキシ基とカップリングするタンパク質をさす。
【０１５４】
「単離された（isolated）」ポリペプチド又は断片、変異体、又はそれらの誘導物は、天然環境にないポリペプチドを指す。特定の精製のレベルは要求されない。例えば、単離されたポリペプチドはその自然又は天然環境から移動させることができる。宿主細胞内において発現した組み換えで産生ポリペプチド及びタンパク質は、任意の適した技術によって分離、分画又は部分的又は実質的に精製された自然又は組み換えポリペプチドと同様、本発明の目的のために単離されたと考えられる。
【０１５５】
本発明のポリペプチドとして、前述のポリペプチドの断片、誘導体、類似体、又は変異体、及びそれらの任意の組み合わせも含まれる。本発明の抗体又は抗体ポリペプチドを指す場合、用語「断片」、「変異体」、「誘導体」及び「類似体」には、対応する天然結合分子、抗体、又はポリペプチドの抗原結合特性の少なくとも一部を保持するポリペプチドが含まれる。本発明のポリペプチド断片は欠失断片と同様に、タンパク質分解性の断片を含む。ポリペプチド変異体は上記に記載の断片、及び／又はアミノ酸置換、欠失、又は挿入によるアミノ酸配列置換を伴うポリペプチドを含む。変異は自然に、又は非自然発生的に起こりうる。非自然発生的変異は既知の変異誘発性技術を用いて起こりうる。変異ポリペプチドは保存、又は非保存アミノ酸置換、欠失又は付加を含む。変異ポリペプチドは「ポリペプチド類似体」とも表現される。ポリペプチドの誘導体は、本明細書では、天然のポリペプチドには見られない追加の特徴を示すように改変されたポリペプチドと見なされる。例には、融合タンパク質、又はペグ化ポリペプチドなどの機能的に修飾されたポリペプチド、ビーズ結合ポリペプチド、及び1つ以上の他の薬剤又は化合物に共有結合したポリペプチドが含まれる。一実施形態において、ポリペプチドの「誘導体」とは、官能性側基の反応によって化学的に誘導体化した1つ以上の残基を持つ対象ポリペプチドをいう。「誘導体」として含まれるのは、20個の標準アミノ酸の天然に存在する1つ以上のアミノ酸誘導体を含むペプチドである。例えば、プロリンの代わりに4-ヒドロキシプロリンを使用できる；リジンの代わりに5-ヒドロキシリジンを使用できる；ヒスチジンの代わりに3-メチルヒスチジンを使用できる；セリンの代わりにホモセリンを使用できる；オルニチンはリジンの代わりに使用できる。
【０１５６】
一実施形態では、特異的に同定されたポリペプチドの誘導体は、例えば、10以上の連続したアミノ酸配列を超える、図又はそれらの断片において説明されたアミノ酸配列のような、特定されたポリペプチドと約70％同一の配列を持つ。つまり、それぞれのポリペプチドの残基と70％は同一である。更なる一実施形態において、特異的に同定されたポリペプチドは75％を超える同一性を有する。更なる一実施形態において、特異的に同定されたポリペプチドは80％を超える同一性を有する。更なる一実施形態において、特異的に同定されたポリペプチドは85％を超える同一性を有する。更なる一実施形態において、特異的に同定されたポリペプチドは90％を超える同一性を有する。更なる一実施形態において、特異的に同定されたポリペプチドは95％を超える同一性を有する。更なる一実施形態において、特異的に同定されたポリペプチドは99％を超える同一性を有する。更なる一実施形態において、本発明のポリペプチドの誘導体は、特定のポリペプチドの配列に関して、約20より少ない、例えば10より少ない、アミノ酸残基置換、変異、又は欠失を持つ。
【０１５７】
更なる一実施形態において、ポリペプチドは70％以上の相同性を持つ。更なる一実施形態において、ポリペプチドは75％以上の相同性を持つ。更なる一実施形態において、ポリペプチドは80％以上の相同性を持つ。更なる一実施形態において、ポリペプチドは85％以上の相同性を持つ。更なる一実施形態において、ポリペプチドは90％以上の相同性を持つ。更なる一実施形態において、ポリペプチドは95％以上の相同性を持つ。更なる一実施形態において、ポリペプチドは99％以上の相同性を持つ。更なる一実施形態においては、本発明のポリペプチドの誘導体及び類似体は、20個、より好ましくは10個未満のアミノ酸残基置換、変異、又は欠失を持つ。好まれる置換は、当該技術分野で保存されているものとして知られているもの、すなわち、置換された残基は、疎水性、サイズ、電荷又は官能基などの物理的又は化学的特性を共有する。
【０１５８】
指定された数の連続したアミノ酸残基にわたって指定された同一性の程度を有するポリペプチドの類似体も考えられる。例えば、一実施形態における特定のポリペプチドの類似体は、参照/特定の配列の10個以上の連続するアミノ酸にわたって90％を超えるアミノ酸配列同一性を有する。別の実施形態では、特定のポリペプチドの類似体は、参照/特定の配列の20以上の連続したアミノ酸にわたって90％を超えるアミノ酸配列同一性を有する。
【０１５９】
「ポリヌクレオチド」という用語は、単一の核酸及び複数の核酸を包含することを意図し、例えば、メッセンジャーRNA（mRNA）又はプラスミドDNA（pDNA）を含む単離された核酸分子又は組成物を指す。ポリヌクレオチドは、従来のホスホジエステル結合又は非従来の結合（例えば、ペプチド核酸（PNA）に見られるようなアミド結合）を含み得る。「核酸」という用語は、ポリヌクレオチドに存在する任意の1つ以上の核酸セグメント、例えばDNA又はRNA断片を指す。「単離された」核酸又はポリヌクレオチドとは、その自然環境から除去された核酸分子、DNA又はRNAを意味する。例えば、ベクターに含まれる抗体又は抗原をコードする組換えポリヌクレオチドは、本開示の目的のために単離されたとみなされる。単離されたポリヌクレオチドの更なる例には、異種宿主細胞に維持された組換えポリヌクレオチド又は溶液中の精製された（部分的又は実質的に）ポリヌクレオチドが含まれる。単離されたRNA分子には、本明細書に記載のポリヌクレオチドのインビボ又はインビトロRNA転写物が含まれる。本明細書に記載の単離されたポリヌクレオチド又は核酸は、合成的に生成されたそのような分子を更に含む。加えて、ポリヌクレオチド又は核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、又は転写ターミネーターなどの調節要素であってもよく、又はそれを含んでもよい。
【０１６０】
本明細書で使用される「サンプル」という用語は、対象又は患者から得られる任意の生物学的材料を指すが、本明細書に記載される実施形態の大部分（例えば方法）では、1つ以上の抗体が存在する可能性があるサンプルが優先されることが理解されよう。一実施形態において、サンプルは、血液、血漿、血清、脳脊髄液（「ＣＳＦ」）、又は尿を含むことができる。例えばサンプルは、全血、血漿、血液サンプルから濃縮されたB細胞、又は培養細胞（例えば、対象由来のB細胞）を含むことができる。サンプルには、粘膜又は神経組織を含む生検又は組織サンプルも含まれる。さらに他の実施形態では、サンプルは、細胞全体及び／又は細胞の溶解物を含むことができる。サンプルの収集及び/又は調製方法は、当技術分野で周知である。
【０１６１】
「対象」又は「個体」又は「動物」又は「患者」又は「哺乳類」は、そのために診断、予後、予防、又は治療が望まれる任意の対象、特に哺乳類の対象、例えばヒト患者を意味する。
【０１６２】
本明細書で使用される「治療する」又は「治療」という用語は、治療的治療及び予防又は予防措置の両方を指し、その目的は、又はリウマチ熱又はAPSGNの進行の発症などの望ましくない生理学的変化又は障害を予防又は減速（軽減）することである。有益又は望ましい臨床結果には、症状の緩和、病気の程度の減少、病気の状態の安定化（すなわち悪化しない）、病気の進行の遅延又は緩徐化、病気の状態の回復又は寛解、病原体クリアランス、及び寛解（部分的又は全体的）、検出可能又は検出不能なものが含まれるが、これらに限定されない。「治療」は、治療を受けていない場合に予想される生存期間と比較して、生存期間を延長することも意味する。治療を必要とする人には、すでに状態又は障害を有する人、ならびに状態又は障害を有する傾向がある人、又は状態又は障害の徴候を予防する人が含まれる。
【０１６３】
特定の実施形態では、本明細書に記載の抗原を使用して、サンプル中のStreptococcus pyogenes特異的抗体を定量的又は定性的に検出する。これは、蛍光（免疫蛍光）、酵素反応の発色産物、沈殿物の生成、化学発光又は生物発光のいずれかである視覚的に検出可能な信号を与える技術によって達成できる。特定の実施形態は、光学顕微鏡検査、フローサイトメトリー、又は蛍光検出と共に蛍光又は色標識抗体を使用する。 抗体の検出に使用できる他の手法とラベルには、金コロイド、放射性タグ、GFP（緑色蛍光タンパク質）など、アビジン/ストレプトアビジン-ビオチン、磁気ビーズ、物理システム、例えば 実際の結合に敏感なナノテクノロジーシステムが含まれるが、これらに限定されない。
【０１６４】
抗原、抗体、又はその断片は、免疫組織化学、免疫蛍光又は免疫電子顕微鏡法などの組織学染色、ならびに抗体又はタンパク質のin situ検出に使用することができる。当業者は、そのようなインサイチュ検出を達成するために、染色手順などの多種多様な組織学的方法のいずれかを修正できることを容易に認識するだろう。
【０１６５】
本明細書に記載の抗体又は抗原を標識し、直接検出できる方法の1つは、それを酵素に結合させ、酵素免疫測定法（EIA）で使用することによる。次に、この酵素は、後で適切な基質にさらされると、例えば、分光光度法、蛍光光度法、又は視覚的手段によって検出できる化学部分を生成するような方法で基質と反応する。抗体又は抗原を検出可能に標識するために使用できる酵素には、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ-5-ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α-グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ及びアセチルコリンエステラーゼが含まれるが、これらに限定されない。前記検出は、酵素の発色基質を使用する比色法により達成できる。特定の実施形態では、検出は基質の酵素反応の程度と同様に調製された標準との視覚的比較により達成され、この手順は、例えばニトロセルロース又はプラスチック支持体、ディップストリップなど上に実装されたものを含む可溶性着色製品及び不溶性着色製品の両方に適している）。
【０１６６】
いくつかの実施形態において、抗体の抗原との反応の検出は、適切な場合、二次抗体又は抗原：抗体複合体に結合する他の結合パートナーの使用によりさらに支援することができる（抗原又はより通常に反応する抗体）。一般に、この二次抗体又はリガンドは検出可能に標識されており、二次抗体の検出により抗原：抗体複合体の存在を推測できる。
【０１６７】
二次抗体などの特異的結合パートナーは、サンプルが由来する種の免疫グロブリンの保存領域に反応することがよくある。本明細書で特に企図される例では、二次抗体又は特異的結合パートナーは、IgGなどのヒト免疫グロブリンに対して親和性を有する。二次抗体の選択は、少なくとも部分的にサンプルの供給源に依存し、従ってそこに存在すると予想される抗体の性質に依存する。
【０１６８】
多数の周知の検出方法が、本明細書に記載の方法の実施における使用に適している。例えば、免疫蛍光アッセイ（IFA）、測光アッセイ、酵素結合免疫吸収アッセイ（ELISA）、ELISPOTアッセイ、免疫ブロット法などの酵素免疫アッセイは、特定の抗体の検出を達成するために容易に適合させることができる。
【０１６９】
使用できる他の検出システムには、黄色ブドウ球菌Cowan系統I由来のプロテインA、C群連鎖球菌由来のプロテインG（例えば26RP66系統）の使用に基づくもの、又はビオチン-アビジン結合反応の用途を用いるシステムが含まれる。
【０１７０】
本明細書に記載の抗原及び抗体を使用できる免疫酵素検出の他の方法は、試薬を電気泳動により分離し、ニトロセルロース膜又は他の適切な支持体に移すウエスタンブロット及びドットブロットである。次いで、試験されるサンプル（例えば、血漿）が膜と接触させられ、形成された免疫複合体の存在が既に記載された方法により検出される。この方法のバリエーションでは、精製抗原を膜上のラインまたはスポットに適用し、サンプルに存在する抗体と結合させ、形成された免疫複合体を本明細書に記載の技術を使用して検出する。
【０１７１】
抗体：抗原複合体の存在は、凝集によっても検出される。そのような方法の代表的な一例では、本明細書に記載の抗原を使用して、例えばラテックス粒子をコーティングし、均一な懸濁液を形成する。サンプルと混合した場合、例えば抗原を認識することができる特定の抗体を含む血清、前記ラテックス粒子が凝集し、大きな凝集体の存在を視覚的に検出できる。
【０１７２】
抗体と抗原との反応の検出は、当技術分野で公知の方法により検出可能な部分で標識された抗体又はリガンドの使用により促進され得る。そのような検出可能部分は、沈殿物又は色の変化の視覚的検出、顕微鏡検査による視覚的検出、又は分光測定又は放射測定などによる自動検出を可能にする。検出可能な部分の例には、フルオレセイン及びローダミン（蛍光顕微鏡検査用）、西洋ワサビペルオキシダーゼ及びアルカリホスファターゼ（光学顕微鏡検査又は電子顕微鏡検査及び生化学的検出及び色変化による生化学的検出用）、及びビオチン-ストレプトアビジン（光学又は電子顕微鏡用）が含まれる。使用される検出方法および部分は、例えば、上記のリストまたは他の適切な例から、当技術分野で周知のそのような選択に適用される標準的な基準によって選択することができる。
【０１７３】
現在、放射性同位体に依存する方法は以前よりも好意的に見られていないが、抗原、抗体、又は抗体フラグメントの放射性標識による検出を達成する放射性検出法、及び放射免疫測定法（RIA）の使用が利用可能である。放射性同位体は、ガンマ/ベータカウンター又はシンチレーションカウンターの使用などの手段によって、又はオートラジオグラフィーによって検出できる。
【０１７４】
より頻繁に使用される方法は、検出される抗体又は抗原を、蛍光化合物などの非放射性の検出可能な標識で標識する。蛍光標識された抗体又は抗原が適切な波長の光にさらされると、蛍光によりその存在が検出される。最も一般的に使用される蛍光標識化合物には、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o-フタルアルデヒド及びフルオレスカミンがある。
【０１７５】
抗体又は抗原はまた、152Eなどの蛍光発光金属又はランタニド系列の他のものを使用して検出可能に標識することができる。 これらの金属は、ジエチレントリアミン五酢酸（ETPA）などの金属キレート基を使用して、抗体又は抗原に結合できる。
【０１７６】
抗体又は抗原は、化学発光化合物に結合させることにより検出可能に標識することもできる。次に、化学発光タグ付き抗体又は抗原の存在は、化学反応中に生じる発光の存在を検出することにより決定される。特に有用な化学発光標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、熱アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩及びシュウ酸エステルである。
【０１７７】
同様に、生物発光化合物を使用して、抗体又は抗原を標識してもよい。生物系では、一般に化学発光反応の効率を高める触媒タンパク質の活性により生物発光が起こる。所定の生物発光タンパク質の存在は、発光の存在を検出することにより決定される。標識目的の重要な生物発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、エクオリンである。
【０１７８】
浸漬ストリップ又は他の固定化アッセイ装置を使用する方法を含む、生体試料中の抗体を検出する方法の特定の例は、例えば、以下の特許に開示されている：米国特許第5,965,356号（単純ヘルペスウイルス型特異的血清検査）；米国特許第6,114,179号（抗原及び/又は抗体の検出のための方法及び試験キット）；米国特許 6,077,681（抗体の検出による運動神経障害の診断）;米国特許第6,057,097号（自己免疫反応を含む病理及び/又は炎症性疾患のマーカー）；及び米国特許第5,552,285号（酸化されたDNA塩基に対する抗体のための免疫測定法、組成物及びキット）。
【０１７９】
例として、微粒子ッセイ（フロービーズアッセイとも呼ばれる）を使用して、体液（対象の血液又は血清サンプルなど）の1つ以上のStreptococcus pyogenes抗原に特異的な1つ以上の抗体を検出することもできる。ルミネックスコーポレーション（Luminex Corporation）が開発したシステムやBecton Dickinsonが開発した他のシステムに代表されるこの技術により、1つ以上の検体を検出するために、通常20 μLの非常に少量のサンプルを処理できる。このアッセイの原理は、特定量の赤色色素と赤外色素を含む微粒子への捕捉抗体の結合に基づいている。これらの微粒子をサンプル、フィコエルトリン（PE）と結合した二次検出抗体とインキュベートした後、フローサイトメーターでビーズを分析する。1つのレーザーがビーズを検出し、2つ目のレーザーがそれらのビーズに結合したPEの強度を検出する。この技術は、マルチプレックスアッセイでのサイトカイン、肺炎連鎖球菌の血清型別、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG）及びアルファフェトプロテイン（AFP）の同時測定、血清IgGからトキソプラズマゴンディへの同時検出、風疹ウイルス、サイトメガロウイルス、及び単純ヘルペスウイルスタイプ1及び2（例えば、Webサイト又はカタログを通してルミネックス社から入手可能なテクニカルノートを参照）など、多くの生物学的に重要な分子又は薬剤の検出に使用されている。 
【０１８０】
特定の実施形態では、生体試料に存在するStreptococcus pyogenes抗原に特異的な一つ以上の抗体は、微粒子に結合した抗原タンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、二次検出抗体（本明細書で特異的結合パートナーとも呼ばれるものの例）は、例えばヒトIgGに対するモノクローナル抗体である。他の実施形態では、二次検出抗体は、例えばヒトIgGに対するポリクローナル抗体である。そのような方法で使用される二次抗体は、例えば、ビオチンに結合されるか、さもなければ検出可能に標識される。
【０１８１】
本明細書で意図される使用に適した免疫学的技術には、例えば標識抗体又は標識二次抗体を含む抗体断片を使用する、抗体：抗原複合体の形成に依存する免疫学的方法が含まれる。例示的な方法は、免疫クロマトグラフィーストリップ、蛍光免疫微粒子、ウエスタンブロット、酵素によって触媒される電気化学反応に基づくバイオセンサーなどの他の免疫学に基づく方法、薬剤、又は装置に加えて、ELISA法、例えば間接ELISA、競合ELISA、サンドイッチELISAを含む抗体に結合した、抗体でコーティングされた磁性粒子、表面プラズモン共鳴、及び抗体に結合した検体が他の技術によって検出される。これらの方法を実施するためのさまざまな方法及び技術が存在し、当業者には周知であり、マイクロ流体技術、自動化された、及び/又は高スループット技術が含まれ得る。
【０１８２】
適切なアッセイは、ELISAなどの定量的技術、又は迅速イムノクロマトグラフィーアッセイ、イムノブロット、ディップストリップなどの定性的技法であり得る。定量的アッセイとして通常使用されるアッセイは、特定の状況では定性的に使用できることを理解されたい。
【０１８３】
イムノクロマトグラフィー分析、特にイムノクロマトグラフィーストリップを使用するものなど、定性的で任意に迅速な分析は、より複雑な分析技術が利用できない又は非実用的な分野、例えば発展途上国での使用、又はさらなる評価の恩恵を受ける対象を識別する第一線の診断として特に適している。
【０１８４】
例えば、1つ以上のStreptococcus pyogenes抗原に特異的な1つ以上の抗体の存在又は量が特定の量よりも多い又は少ない場合に見られる定性アッセイの一実施形態では、2つ以上の 本明細書に記載される抗原が使用される。手順は、緩衝液又はStreptococcus pyogenes抗原を含む試料調製液などの組成物を含むキットなどの本明細書に記載のキット、場合により1つ以上のStreptococcus pyogenes抗原に特異的な抗体が存在しない陰性対照、Streptococcus pyogenes抗原、任意で1つ以上のStreptococcus pyogenes抗原に特異的な1つ以上の抗体が存在する陽性対照、及び反応容器、例えばマルチウェルプレートなどのELISAの構成要素が存在する。1つ以上のStreptococcus pyogenes抗原に特異的な1つ以上の抗体と1つ以上のStreptococcus pyogenes抗原との複合体の形成を検出する１つ以上の二次検出抗体、及び任意でアッセイの開発のために及び/又は複合体を固定するための1つ以上の構成成分を用いて実施される。さらに具体的に企図される例では、1つ以上の二次検出抗体は、反応容器上または反応容器内に既に固定されているか、組成物で提供され、検出抗体を固定する条件下で反応容器に導入される。分析物依存性複合体の形成、捕捉及び標識化が検出可能なシグナルを提供するさまざまな代替方法が存在すること、及びこれらの方法は一般に、検出を可能にする抗体：抗原複合体の固定化に依存することは、当業者には理解されよう。
【０１８５】
1つ以上のStreptococcus pyogenes抗原に特異的な1つ以上の抗体の存在を判定する定性アッセイ、または前記抗体の量が特定の閾値を上回るか下回るかを判定する定性アッセイの別の実施形態において、イムノクロマトグラフィーストリップが使用される。一例では、前記ストリップは、本明細書に記載の2つ以上の抗原を含み、一般に、バッファー溶液またはサンプル調製溶液などの1つ以上の組成物、任意で、Streptococcus pyogenes抗原に対する抗体を含まないネガティブコントロール、必要に応じて、1つ以上の抗原に特異的な1つ以上の抗体が存在する陽性対照、及び１つ以上のStreptococcus pyogenes抗原と1つ以上のStreptococcus pyogenes抗原に特異的な1つ以上の抗体の複合体の形成を検出する特異的結合パートナー、及び任意で、アッセイの開発のための１つ以上の構成成分が提供される。一例では、ネガティブコントロールとして機能するために、Streptococcus pyogenes抗原が存在しない別個の免疫クロマトグラフィーストリップが提供される。他の実施形態では、1つ以上の免疫クロマトグラフィーストリップは少なくとも2つの異なる領域を有し、その1つは1つ以上のStreptococcus pyogenes抗原を含み、任意で別の領域はStreptococcus pyogenes抗原を含まず、陽性対照領域として作用するように、任意で別の領域は1つ以上の固定化抗体またはその他の二次検出抗体または特異的結合パートナーによって結合されることができる薬剤を含む。
【０１８６】
特定の一実施形態では、検出は捕捉ELISAにより行われる。捕捉ELISA（「サンドイッチ」ELISAとも知られる）は、非常に少量（ピコグラムからマイクログラム）の物質（ホルモン、細胞シグナル伝達化学物質、感染症抗原、サイトカイン、本開示の文脈においては、抗体）を定量化する高感度アッセイである。このタイプのELISAは、分析する物質が希釈されすぎてポリスチレンマイクロタイタープレート（細胞培養上清中のタンパク質など）などの支持材料に結合できない場合、またはプラスチックにうまく結合しない場合（たとえば、 小さな有機分子として）が一般に考えられる。捕捉試薬（例えば、捕捉抗原）、サンプル、コントロール、及び抗体検出のための最適な希釈は、インキュベーション時間と同様、一般に経験的に決定され、広範な滴定が必要になる場合がある。理想的には、酵素標識された検出抗体又は検出抗原を使用するのが良い。しかしながら、検出抗体又は抗原が標識されていない場合、前記二次抗体は前記被覆抗体又は抗原と交差反応性であってはならない。
【０１８７】
本明細書で使用されるように、「検出可能な部分」、「検出可能な標識」、及び文法的に同等のものは、任意の原子、分子、又はそれらの一部分、又は剤を指し、その存在、非存在、又はレベルは直接的又は非直接的に監視される。一例として放射性アイソトープを含む。他の例として（ｉ）色又は光を放出する（ルミネセンス）反応を触媒可能な酵素、及び（ｉｉ）フルオロフォアを含む。検出可能な部分の検出は、例えばフルオロフォアの場合のように、検出可能な部分自体が検出可能であるという条件で直接行うことができる。代わりに、前記検出可能な部分の検出が間接的であり得る。後者の場合、検出可能な部分と反応する二次部分は、直接検出可能なそれ自体が典型的に用いられる。前記検出可能な部分は前記抗体又は標識された抗原に、例えば共有結合によって、固有であるものであり得る。例えば、抗体の定常領域は直接検出可能な部分を持つ二次抗体が特異的に結合することができる、間接的に検出可能な部分として機能し得る。
【０１８８】
よって、二次抗体は本明細書で記載される方法において抗体の検出に特に適した手段である。この二次抗体はそれ自体検出可能な部分と結合している。本発明による抗体を検出可能に標識することができる方法の一つは、それを酵素に連結することである。この酵素もまた、後に適切な基質に曝露されたときに、例えば、分光光度法、蛍光定量的、又は可視化できる方法によって、検出可能な化学的部分を産生するような方法で、前記基質と反応する。前記抗体を検出可能に標識するために使うことができる酵素は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリンフォスファターゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母発酵デヒドロゲナーゼ、α−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ及びアセチルコリンエステラーゼを含むが、それらに限定されない。
【０１８９】
前記検出は、酵素の発色基質を使用する比色法により行うことができる。検出は、同様に調製された標準と比較して、基質の酵素反応の程度を視覚的に比較することでも達成できる。
【０１９０】
例えば抗原又は抗体が適用可能な試薬が結合した個体の支持体を用いる形態（例えば、方法、アッセイ、キットで）において、固体支持体は任意の水に不溶性、水に浮かばない、固体支持体である。適切な個体支持体の例としては、例えばポリスチレンのビーズ、濾紙、試験管、ディップストリップ（dipstrips）、及びマイクロタイタープレートが含まれる。結合試薬は共有結合又は吸着により固体支持体に結合され得る。遠心分離は、処理を促進するために、例えば、ビーズベースアッセイなどの、特定の実施形態において用いることができるが、固体支持体を用いる方法の利点は、固相と液相の分離に遠心分離の段階が必要とされないことである。
【０１９１】
上述の固体支持体はポリスチレン、アガロース、セファロース、セルロース、ガラスビーズ及びセルロース又は他のポリマーの磁気微粒子のようなポリマーを含むことができる。前記固体支持体は大きな、又は小さなビーズ、又は粒子、チューブ、プレート、ストリップの形態、又は他の形態をとることができる。
【０１９２】
固体支持体として、一般に試験管又はマイクロタイタープレートが使用され、その内壁は一次抗体又は抗原、例えば特異的な抗原、又は任意の断片、又はそれらの誘導体、検出されるStreptococcus pyogenes抗体、本明細書で特異的に開示されるような抗原で覆われる。
【０１９３】
1つ以上の本明細書に記載の方法を実行するのに必要な1つ以上の構成要素を含むキットの提供も企図される。キットは、典型的には、本明細書に記載のStreptococcus pyogenes抗原の少なくとも1つを含む組成物、例えば2つ以上の前記抗原を含む組成物を含む。本開示による方法を実施するための他の構成要素は、キットに有用に含まれるであろう。例えば、キットは、１つ以上の抗原を生物学的サンプルと接触させるのに有利な媒体を構成するための１つ以上の試薬を含み得る。例えば、キットは、１つ以上の抗原を生物学的サンプルと接触させるのに有利な媒体を構成するための１つ以上の試薬を含み得る。キットには、スワブ、ピペット、または同様の収集手段などのサンプル収集用機器、及び試薬を接触させる1つ以上の反応ステップを実行する機器、プレート、試験管、ガラスまたはプラスチックの表面、ウェル、または吸収紙のストリップ、または同様の手段に置かれた、液体または半固体の培地試薬を含むインキュベーション手段なども含まれる場合がある。
【０１９４】
本明細書で企図される方法、アッセイ及びキットは、特定の実施形態において、1つまたは複数のサンプルと他のアッセイ試薬（1つまたは複数のStreptococcus pyogenes抗原など）との接触を含むか、または利用して、後者をアレイに配置することができ、例えばハイスループット実装を含む複数のサンプルの迅速な処理を可能にする。
【０１９５】
本明細書で使用される「アレイ」という用語は、2つ以上のStreptococcus pyogenes抗原の組み合わせのような、「配置された（addressed）」空間配置を指す。アレイのそれぞれの「配置（adress）」
は1つ以上の認識剤を含む、事前に決められた特異的空間領域である。例えば、アレイは複数の容器（試験管）、プレート、マイクロプレート内のマイクロウェルであり得、それぞれ一連の抗原を含んでいる。様々なアレイの実装が想定される。一実施形態では、それぞれの配置は似たような又は同一の認識剤を含み、及び複数のサンプルがそれぞれの配置に１つずつアッセイされる。別の一実施形態では、それぞれのアドレスが異なる認識剤又は異なる認識剤の組み合わせを含み、それぞれのアドレスが異なる認識剤又は異なる認識剤の組み合わせを含み、及び単サンプルのアリコートがそれぞれのアドレスに導入される。他の実施形態においては、これらのアプローチの組み合わせが取られる。アレイは、たとえば、異なる認識剤が1つまたは複数の異なる場所で異なる組み合わせで配置されている場合、または異なる場所で異なるサンプルが接触している場合、既知の認識剤の異なる領域（点、線、列）を保持する任意の固体支持体でもよい。特定の実施形態において、アレイは一体型の適切なコントロール、例えばサンプルなしの領域、抗体なしの領域、そのどちらかがない領域（例えば溶媒及び剤のみ）、及び陽性対照として1つ以上の抗原に結合した合成又は単離された抗体を含む領域を含む。
【０１９６】
使用される固体支持体、例えばアレイ又はキットは、典型的には実質的に液相に不溶である。本発明の固体支持体は特定の支持体の種類に限定されない。更に、多数の支持体が利用可能であり、当業者に既知である。よって、有効な固体支持体は、エアロゲル及びハイドロゲル、レジン、ビーズ、バイオチップ（バイオチップでコートされた細いフィルムを含む）、微小溶液チップ、シリコンチップ、マルチウェルプレート（マイクロタイタープレート又はマイクロプレートとも呼ばれる）、メンブレン、フィルター、誘電メタル又は非誘電メタル、ガラス（顕微鏡の対物ガラスを含む）及び磁気支持体のような、固体又は半固体マトリックスを含む。有効な固体支持体のより特異的な例は、シリカゲル、重合体膜、粒子、誘電プラスチックフィルム、ガラスビーズ、綿、プラスチックビーズ、アルミナゲル、セファロースのようなポリサッカロイド、ラテックスビーズ、磁気ビーズ、常磁性ビーズ、超常磁性ビーズ、澱粉などを含む。
抗原
【０１９７】
原則として、対象において抗体がインビボで生成されるStreptococcus pyogenes抗原は、本明細書に記載の方法、特に本明細書に記載の多重法で使用できることが理解されよう。本明細書の実施例に示されるように、臨床的に確立された抗原DNaseB及びSLOは、多重CBAアッセイで使用するためにビーズに架橋することができる。 特定の場合において、いかなる理論にも束縛されることを望まずに、出願人は、特定の抗原、例えばSpnAを本明細書に記載の多重アッセイへの包含を促進するために有用に安定化できることを確立した。SpnAの場合、完全長ポリペプチドの切断は、特に本明細書に記載の方法の実施に使用される固体支持体（この場合はビーズ）に架橋または結合した場合、免疫学的安定性を改善した。
【０１９８】
一実施形態では、2つ以上、及び特に企図される例では、3つ以上のStreptococcus pyogenes抗原が、例えば、単一の多重アッセイで利用される。 一例では、各抗原はビーズまたは別の基質に結合され、抗原結合ビーズの各集団は他と区別可能である。そのようなマルチプレックスアッセイの一例は、本明細書の実施例に示されており、SLO、DNaseB、及びSpnAはそれぞれ、抗原標識ビーズの各集団が個別に識別可能であるように、ビーズの異なる集団に共有結合され、結果として、 各抗原に特異的な抗体の量は、単一のアッセイで決定することができる。
【０１９９】
特定の実施形態において、2つ以上のStreptococcus pyogenes抗原は単一の組成物から提供される―例えば、サンプルと接触させたときに、任意の必要な緩衝液又は担体、安定剤などを含む単一の溶液であり、したがって多発性実装（multiplex implementation）に適している。一例としては、少なくとも一つの他のStreptococcus pyogenes抗原と共にStreptococcus pyogenes SpnA抗原が提供され、例えば、試料と接触したときに、SpnA及び少なくとも1つの他のStreptococcus pyogenes抗原が単一の構成物に存在する。具体的に熟慮された例では、Streptococcus pyogenesのSpnA抗原およびSLOは、例えば、サンプルと接触させた場合などの単一の組成物で提供される。特に熟慮された例では、例えば、単一の構成物において、試料と接触したときに、Streptococcus pyogenes SpnA抗原及びDNaseBが提供される。更に特異的に熟慮された例においては、例えば、単一の構成物において、試料と接触したときに、Streptococcus pyogenes SpnA抗原、DNaseB、及びSLOが提供される。
【０２００】
SLO（AAK33267.1）は分泌された、膜孔形成細胞溶解素である。一実施形態において、SLOはStreptococcus pyogenesM1 GAS(系統：SF370、血清型：M1、遺伝子座タグ：SPｙ_0167(NCBl:NP_268546.1))由来である。一実施形態において、SLO組み換え断片、例えばアミノ酸34-571（図６A、配列番号1参照）を含む組み換えポリペプチドが用いられる。一実施形態において、前記組み換えポリペプチドは、例えば精製を助けるために、標識され、N末端及びC末端Hisタグは特に熟慮される。他の実施形態においては、「解毒された」SLO類似体が用いられ、その中で解毒に寄与すると決定された1つ以上のアミノ酸が野生型SLOに対して免疫学的に交差反応性を持つポリペプチドをもたらすが、解毒の減少性を示すアミノ酸に置換される（例えば、産生、取り扱い又は封じ込め又は要求を減らすために）。解毒されたSLO類似体の代表例のアミノ酸配列は図６B及び配列番号2に説明されている。解毒されたSLOのこの例では、エンコーディングヌクレオチドにおける2点での突然変異がP427L及びW535F置換に結果としてなる：エンコーディングヌクレオチド内の前記置換されたアミノ酸は図６A及び６Bに下線が引いてある。
【０２０１】
DNase-B（AAK34710.1）はDNAを分解する分泌酵素である。一実施形態では、DNaseBはStreptococcus pyogenesM1 GAS(系統：SF370、血清型：M1、遺伝子座タグ：SPｙ_2043（NCBl：NP_269989.1）由来である。一実施形態では、DNaseBの組み換え断片、例えば、アミノ酸43-271を含む組み換えポリペプチドが使用される（図７、配列番号 5参照）。一実施形態では、前記組み換えポリペプチドが標識され、例えば精製を助けるために、N末端又はC末端Hisタグが特に熟慮される。
【０２０２】
SpnA（AAK33693.1）は細胞壁に固定された酵素で、DNAを分解する。一実施形態において、SpnAはStreptococcus pyogenesM1 GAS(系統：SF370、血清型：M1、遺伝子座タグ：Spy_0747（NCBl：NP_268972.1）由来である。一実施形態において、SpnA組み換え断片、例えば、アミノ酸28-854を含む組み換えポリペプチドが用いられる（図８、配列番号 8参照）。一実施形態では、前記組み換えポリペプチドが用いられ、例えば、精製を助けるために、N末端又はC末端Hisタグが特に熟慮される。
【０２０３】
当業者は、特定の実施形態において、本明細書で開示された前記方法、ポリペプチド、ビーズ、組成物及びキット及び本明細書で開示される複合診断方法及び組成物に関する特定の実施形態を含む本明細書で開示された発明は、急性及び急速の診断及び／又は最近発症したリウマチ熱又はＡＰＳＧＮの治療を必要とするが、リウマチ熱、ＰＧＳＮ，又は持続的Streptococcus pyogenes感染のための長期治療を含む長期治療を必要としない、又は、例えば引き続くStreptococcus pyogenes感染を急速に特定するために、継続的なモニタリングのみを必要とする患者の特定を提供することを、認識するであろう。
【０２０４】
様々な実施形態において、例えば本明細書で記載される方法を用いるときに、患者はStreptococcus pyogenes又は最近のStreptococcus pyogenes感染症に最近曝露された、又は経験したことを特定され、その患者は続くStreptococcus pyogenes感染を予防するための予防的治療のような、最近のStreptococcus pyogenes感染症の治療に適した治療及び進行中の治療を、又はリウマチ熱、ＰＳＧＮ、慢性リウマチ性心疾患の1つ以上を緩解させるために、又は病状をモニターするために、経験する。他の実施形態においては、本明細書で記載される方法を用いるときに、患者はStreptococcus pyogenes又は過去のStreptococcus pyogenes感染症に以前曝露された、又は経験したことを特定され、その患者は続くStreptococcus pyogenes感染を予防するための予防的治療のような、続くStreptococcus pyogenes感染症の治療に適した治療及び進行中の治療を、又はリウマチ熱、ＰＳＧＮ、慢性リウマチ性心疾患の1つ以上を緩解させるために、又は病状をモニターするために、経験する。代表的な治療には、以下に関連して本明細書に記載されているものが含まれる。
【０２０５】
続く実施例、配列リスト及び図は本発明の理解を助けるために提供され、その真の範囲は添付の特許請求の範囲に記載されている。本発明の精神から逸脱することなく、示された手順に変更を加えることができることが理解される。
【実施例】
【０２０６】
実施例1
この実施例は、生体試料中のＧＡＳ−特異的抗体の存在及び量を決定するビーズベースのマルチプレックスアッセイの開発について説明している。
方法
研究対象
【０２０７】
この研究において、ヒト血清は4つの異なる供給源から得られる。ＡＲＦを持つ患者は、
2004年から2006年（ｎ＝８）の間オークランドのスターシップチルドレンズホスピタル及び2012年から2015年の間ハミルトンのワイカトホスピタルにて入院していた間、ジョーンズ基準[3]のニュージーランド修正に従って診断され、補充されていた。6歳の民族的に一致した健康的な子供から得られた血清は、チルドレンオブスコープ（Cos）研究から得られた。最後に、追加の対照群として、オークランドユニバーシティから補充された20歳以上の比類ない健康的なボランティアから血清が得られた。人口統計が表1に示されている。全参加者は書面インフォームドコンセントを提供し、4つのサイトのそれぞれについて、適切な倫理委員会の承認が得られた。
表1−研究参加者*
【表１】
2020518575.tif 000003
*健康な大人のグループ（ｎ＝18）は咽頭炎の最近の病歴のない20歳以上の成人ボランティアで構成されていた。これらの参加者の民族データは利用できなかった。
【０２０８】
抗原の準備
この研究で用いられた組み換え抗原はＮ末端シグナル配列のない成熟型において全て用意された。分子量64.4kDa（アミノ酸34-571、配列番号 1）であり、Ｎ末端His6タグを有するＳＬＯは、フィッツジェラルドインダストリーインターナショナル（Fitzgerald Industries International）から購入した。DNaseBをコードする遺伝子は、次のプライマーを用いるS.pyogenes SF370(ATCC 700294)ゲノムDNAからTopoクローニング手法を用いたpET101/D TOPO(ライフテクノロジーズ)ヘのクローニングのために増幅された：前、5´ CACCATGCGACAAACACAGGTCTCAAATGATGTTG-3'(配列番号3)及びその逆、5 'TTTCTGAGTAGGTGTACCGTTATGGTAGTTAATGG-3'(配列番号4)  。得られたベクターはDNaseB（アミノ酸43-271、アミノ酸配列は配列番号 5として示された）をエンコードし、総分子量29kDaのC末端His6タグをコードする。このタンパク質は、アンピシリンと0.1％グルコースを添加したLennoxブイヨン（LB）培地で、37℃で3時間、1 mM IPTGを誘導した大腸菌BL21λDE3細胞で発現した。SpnAは、KasI及びXhoI制限酵素部位（下線）を含むプライマーを使用して、Streptococcus pyogenesSF370ゲノムDNAから増幅した：前方、5 'AAAGGCGCCCGCCAAAATTTGACTTATGCCAA-3'（配列番号6）及びその逆、5 'AAACTCGAGCTATTTGGAAAATGATAATTGAAGTAACA-3' （配列番号 7）。得られたSpnA単位複製配列（SpnAアミノ酸28-854をコードする、（配列番号８））を、Ｎ末端His６タグをコードするpProExHtaベクターにクローニングし、大腸菌BL21 λDE３細胞に形質転換した。タンパク質発現は、アンピシリンを含むLBで16時間、18℃の0.3 mM IPTGで誘導された。rDNaseB及びrSpnAは両方、標準のNi2 + -NTAアフィニティークロマトグラフィーを使用して大腸菌細胞溶解物から精製された。組換えタバコエッチウイルスプロテアーゼ（rTEVと組換えタンパク質の1：100の比率）を使用して、前記His6タグをrSpnAから切断して、85 kDaのタンパク質を得た。全ての抗原の純度は、SDS-PAGEによって検証された。
【０２０９】
抗原特異的IｇGの精製
SLO、DNaseB、及びSpnAに特異的なIgGは、プールされたヒト免疫グロブリン（静脈内免疫グロブリン、IVIG（Intragam（登録商標）P））から精製された。それぞれのGAS抗原のアフィニティーカラムは、Aminolink(登録商標)カップリングキット（Thermo Scientific）を用いて第1級アミンを介して抗原をアガロース樹脂に共有結合させることにより作成した。IVIGの5 ml溶液をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）（pH 7.4）で4倍に希釈し、樹脂に通して抗体結合を可能にした。樹脂をPBSで4回洗浄して、結合していない抗体を除去した。結合した抗体は0.2Mグリシン-HClバッファー（pH 2.5-3.0）を使用して溶出し、すぐに1Mトリスバッファー（pH 9）で中和した。微量IgAはメロンスピンカラム（Thermo Scientific）を使用して除去され、結果として得られた抗原特異的IgGは遠心フィルター（Merck Millipore）を使用して濃縮された。溶出されたIgGが分離された抗原に特異的であることを確認するために、酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）を実施した。プレートを5 μg / mlの抗原でコーティングし、0.1％Tween-20及び5％スキムミルクパウダー（PBST-5％ミルク）を添加したPBSで室温（RT）で1時間ブロッキングした。精製IgGをRTで1時間添加し、結合は、以前に公開されたように、抗ヒト西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）二次抗体（1：3000; Santa Cruz Biotechnology）を使用して検出した[4]。
【０２１０】
サイトメトリービーズアレイアッセイ
各抗原は、製造業者の指示（Becton、Dickinson and Company）に従って、アミン-スルフヒドリル架橋剤、sulfo-SMCCを使用して機能性ビーズに結合した。手短に言えば、25mMジチオトレイトール（DTT）を添加することにより、結合用に色分けされた7.5 μmポリスチレンビーズを調製した。標的抗原（90 μg）に44 μg / mlスルホSMCC溶液を加えて修飾し、Bio-Radスピンカラム（Biorad）を使用して未反応タンパク質を除去した。次に、修飾タンパク質と機能性ビーズを混合し、室温で1時間インキュベートした後、Nエチルマレイミド（44 μg / ml）を加え、さらに15分間インキュベートした。洗浄した結合ビーズは、光から保護して4℃で保存した。抗原は、異なる比率のフルオロフォア（APCy7及びAPC）を含む機能ビーズに結合され、フローサイトメーターの2つの検出器（FL3及びFL4）を使用して一意の位置で蛍光を確保した。ビーズの位置は、次のように抗原間の分離が最大になるように選択された：rSLO、位置E4；rDNaseB、位置A4; 及びrSpnA、位置A9。
【０２１１】
サイトメトリービーズアッセイ（CBA）実験のインキュベーションは、96ウェルU底プレートで2回実施した。rSLO、rDNaseB、及びrSpnAでコーティングされたビーズを、アッセイ希釈液で1：10,000に希釈した血清サンプルとともに室温で1時間個別にインキュベートすることにより、シングルプレックスアッセイを実施した。血清抗体結合を検出するために、R-フィコエリトリン結合ロバ抗ヒトIgG Fcγ特異的抗体（Jackson ImmunoResearch）を室温で2時間、1：100の濃度で添加した。各反応の蛍光強度の中央値（MFI）をフローサイトメーター（BD Accuri C6）で読み取った。rSLO、rDNaseB、及びrSpnAに結合したビーズを1：10,000に希釈した血清サンプルを加える前に等しい比率で混合したことを除き、同じプロトコルに従ってマルチプレックスビーズアッセイを実施した。ロバ抗ヒトIgG Fcγ特異抗体の1:30希釈液を検出用のマルチプレックスアッセイで使用した。
【０２１２】
既知の開始濃度のSLO、DNaseB、及びSpnAに特異的な抗体を1つのチューブに混合し、2倍希釈シリーズを実行して、各抗原の7点標準曲線を作成した。500 ng / mlの開始濃度がSLO及びDNaseBに使用され、1500 ng / mlがSpnAに使用された。ビーズを各希釈標準液と1時間インキュベートした後、上記のようにロバ抗ヒトIgG Fcγ特異的二次抗体で検出した。MFI値を濃度（μg / ml）に変換し、5パラメーターロジスティック回帰式を使用して、フローサイトメトリックアナリシスプログラム（FCAP）アレイソフトウェア、バージョン3（BD）を使用して、各抗原の標準曲線を作成した。試験対象の血清を各抗原の7点標準曲線とともにマルチプレックスアッセイで実行した場合、MFIはFCAPアレイソフトウェアを使用して濃度（μg / ml）に変換された。各抗原の検出下限は、以前に公開されたように、MFIがブランク（前記ブランクはビーズ＋二次）の3標準偏差を超える標準曲線上の最低濃度として定義された[5]。
【０２１３】
データ分析及び統計
CoS血清サンプルごとに決定された抗体濃度をランク付けし、マイクロソフト  エクセル（バージョン15.24）で80パーセンタイルを決定することにより、各抗原の正常上限（ULN）値を計算した。GraphPad Prism（バージョン7a）を使用して、統計分析とグラフを作成した。全ての相関は、線形回帰を使用して分析された。
【０２１４】
市販のアッセイを使用したASOおよびADB力価
ASO及びADB力価は、ニュージーランド、オークランドのLabtests Pathologyで決定された。ASO力価（IU / mL）は、SPAplusアナライザー（The Binding Site、CA、USA）上のヒト抗ストレプトリジンOキットを使用した比濁法により測定した。ADB力価（U / mL）は、酵素阻害アッセイ（bioMerieux、Marcy l’Etoile、フランス）によって測定された。 このアッセイでは、力価が100 U / ml未満の場合に不正確な数値が得られる；この範囲に該当するサンプルについては、50 U / mLのミッドタイター値が推定された。
【０２１５】
結果
ビーズ結合及びマルチプレックスアッセイ
この研究の分析のためのGAS抗原結合ビーズを生成するために、3つの抗原のそれぞれの高度に精製された調製物が大腸菌（E.coli）で組換え生産された。分泌タンパク質（SLO及びDNaseB）は、N末端シグナル配列なしで発現し、SpnAはN末端シグナル配列なしで発現し、タンパク質安定性を改善するために、ソルターゼモチーフ（sortase motif）のK854上流で切断された。3つのタンパク質はそれぞれ、rSLO（位置E4）、rDNaseB（位置A4）、及びrSpnA（位置A9）で蛍光を発する機能的CBAビーズに結合していた。前記ビーズの位置は、2色蛍光プロットで最大の分離を確保するために選択された。様々な血清希釈と抗IgG検出試薬の濃度をテストして、アッセイの直線範囲と飽和点を決定した。この試行錯誤のプロセスにより、1：10,000の血清希釈が3つの抗原全てに対して線形範囲にあることが確認された。
【０２１６】
3つの抗原の力価を同時に測定できるかどうかを評価するために、シングルプレックスアッセイの結果をマルチプレックスアッセイと比較した。各ビーズを1：10,000に希釈した10人の参加者の血清とインキュベートするシングルプレックスアッセイを実施した。 これらの10個の血清は、以前のELISAが3つの抗原に対するこれらの参加者の反応性を低から高までの範囲で示し、CBAアッセイでのMFIの良好な広がりを保証するために選択されたARFとコントロールサンプルの混合物であった（図1）。次に、これらの同じ10個の血清を、3つの抗原ビーズを等しい部分で混合し、単一のアッセイウェルで試験血清とともにインキュベートした多重アッセイで試験した。これらのマルチプレックスアッセイのMFIは、図1に示すように、各抗原のシングルプレックスMFIと非常に強い相関関係を示した（R2値：SLO = 0.999; DNaseB B = 0.998;及びSpnA = 0.998）。これは、ビーズ間に干渉またはIgG交差反応性がなかったことを示し、3つの連鎖球菌抗原を含むマルチプレックスアッセイの実行可能性を示す。
【０２１７】
マルチプレックスCBAアッセイの標準化及び精度
3つの抗原それぞれの標準曲線を作成して、抗原結合ビーズに結合する抗体の濃度を決定し、アッセイの実行間の比較を可能にした。SLO、DNaseB及びSpnAに特異的なIgGは、アフィニティークロマトグラフィーによりIVIGから精製された。精製された抗体の特異性は、ELISAによって検証された。図2に示すように、前記SLO、DNaseB、及びSpnA特異抗体は、対応する抗原に対してのみ反応性を示し、他の2つの抗原とは検出可能な反応性を示さなかった。精製したIgGを使用して各抗原の7点標準曲線を作成した。既知の濃度の精製IgGを、抗SLO及び抗DNase Bの場合は500 ng / ml、抗SpnAの場合は1500 ng / mlの開始濃度で2倍に希釈した。これらの希釈された標準は、マルチプレックス形式で抗原結合ビーズとインキュベートされ、標準曲線は5パラメータロジスティック式を使用して適合された。標準曲線の例を図5に示す。標準曲線は少なくとも98％のフィッティング精度で再現性が高く、これらの抗原の参照標準としてアフィニティ精製されたポリクローナル抗体の有用性を示す。
【０２１８】
CBAアッセイにおける3つの抗原の検出下限を決定するために、精製された抗体標準が使用された：抗SLO、1ng/mL;抗DNaseB、0.1ng/mL; 及び抗SpnA 0.1ng/mL。マルチプレックスアッセイの変動係数（CV）は、上記のシングルプレックス/マルチプレックス比較で使用された同じ10の血清を使用して評価された。これらの10個の血清のIgG濃度は、IgG標準曲線を組み込んだアッセイで測定され、アッセイ内及びアッセイ間の平均CVは、各抗原についてそれぞれ<4％及び<15％だった（表2）。これらのCVは、マルチプレックスビーズベースのアッセイの精度が高く、再現性があることを示す。標準曲線とアッセイ試験結果の両方の再現性により、これらの試薬を利用して、抗原結合ビーズの将来のバッチ（batch）の結合効率と完全性を確認できる。
表２−変動係数
【表２】
2020518575.tif 000004
【０２１９】
ARF患者血清の抗体価の測定
臨床連鎖球菌血清学におけるSpnA抗原及びビーズベースの技術の有用性を評価するために、全ての研究対象で多重アッセイを実施した（表1）。SLO、DNaseB、及びSpnAに特異的なIgGの濃度は、1人のオペレーターが1日に実施した1回の実験で、47人全ての参加者について決定できた。図3に示すように、ARFサンプルの平均抗体価は、3つの抗原のそれぞれについて、健康な子供と健康な成人の両方の対照群の平均力価よりも有意に高かった。以前の研究[6]での観察に沿って、ASO及びADBの力価はより高く、表3のより大きな信頼区間によって示されるように、健康な成人よりも健康な子供でより多くの広がりを示した。特に、健康な子供のSpnAの力価は、健康な大人の力価と類似しており、健康な子供のグループのASO及びADBの力価と比較して狭い信頼区間があった（表1）。これは、健康な個人ではSpnAのバックグラウンド力価が低いという以前の観察をサポートする[2]。
【０２２０】
ARF診断のための以前のGAS暴露を検出する抗原の能力は、ULN値を使用して評価された。ULN、つまり80パーセンタイルは、健康な子供のグループから、SLO、DNaseB、及びSpnAに対してそれぞれ644、360、及び170μg/mlとして計算された。SpnAの低いULNは、SLO及びDNaseBと比較して健康な子供で見られる力価の低下を反映している。次に、図3に点線で示されているこれらの実験的に決定されたカットオフをARFサンプルに適用して、各抗原の感度を決定した。これは、観察された力価がULNを上回ったかどうかに基づいて検出された真の陽性の数である。 DNaseBは、16のARFサンプルのうちわずか9（56.25％）を検出する最も感度が低いものだった。SLOは、16個のARFサンプルのうち12個（75％）を検出することにより、中程度の感度を示した。SpnAは、16個のARFサンプルのうち14個（87.5％）を検出する最高の感度を示した。
表3 Cytometric Bead Assayによって決定されたSLO、DNaseB、及びSpnAに特異的な抗体濃度（μg/ml）の要約統計量
【表３】
2020518575.tif 000005
【０２２１】
既存の血清学的検査との比較
多重CBAアッセイを既存の市販の方法論と比較するために、十分な量が利用可能な20人の参加者の血清を、商業研究所でASO及びADBテストにかけた。ASOは、広く採用されている比濁法を使用して測定され、国際単位（IU / mL）で正確な値が得られた。対照的に、ADB力価は、力価範囲（100、200、300、400、600、800、1200及び〜1600）を提供する酵素阻害アッセイを使用して測定された。図4Aに示すように、CBAアッセイで測定したASO IgGの濃度と市販の比濁法との間に優れた相関関係があった（R2 = 0.968）。図4Bに示すように、CBAアッセイで測定されたADB IgGの濃度と市販の酵素阻害アッセイの間にも良好な相関があった（R2 = 0.934）。
【０２２２】
ただし、ADB酵素阻害アッセイの精度の欠如も図に示されている。酵素阻害アッセイでは3つのサンプルが「1200」として分類されたが、CBAアッセイで測定された抗DNaseB IgGの濃度は、それぞれ1508、1070、及び914μg/ mlだった（四角で囲まれたデータポイント（boxed data point））。
【０２２３】
ディスカッション
この例は、GAS血清学用のマルチプレックスビーズベースアッセイの準備、及び健康な対象及びARF対象からのサンプルの範囲で抗体濃度を決定する際のこのアッセイの使用を示す。有用なことに、この例は、3つのStreptococcus pyogenes抗原を単一のマルチプレックスアッセイで組み合わせ、Streptococcus pyogenes抗原に特異的な異なる集団の存在を識別するために、
有意な交差反応性なしで、非常に少ないサンプル量（1μL以下）で使用することができるということを示した。
【０２２４】
本明細書に提示される多重アッセイは、特に既存のDNaseBアッセイとは異なり、抗原：抗体複合体のそれぞれに対して定量的に使用することができる。さらに、一部は健康な対象のバックグラウンドが低いSpnAを含むことによる感度/特異性の改善が期待され、一部は特に多重実装によって悪影響を受けない感度の改善によるものである。
【０２２５】
実施例２
この例では、Luminexプラットフォームを使用して、生体試料中のGAS特異抗体の存在と量を測定するビーズベースのマルチプレックスアッセイの開発について説明する。
【０２２６】
方法
研究対象
この研究では、ヒト血清が上記の実施例１に記載されているように得られた。再び、全ての参加者は書面のインフォームドコンセントを提供し、適切な倫理委員会の承認が得られた。
【０２２７】
血清の準備
血清サンプルを収集し、分析用に1：15,000に希釈した。 IVIGリファレンスは、使用前に1：60,000に希釈された。
【０２２８】
ルミネックスビーズの調製及びアッセイ
各抗原は、製造者（Luminex Corporation）の指示に基づいて、それぞれxMAP微粒子にアミンからカルボキシル基への架橋剤を用いて結合させた。3つの異なる抗原：ビーズの比率を結合のために試行し、12.5 μgの抗原と結合したビーズをさらに分析するために選択した。
【０２２９】
ビーズ位置030にDNAseBを持つ、3つの十分に分離されたビーズ位置が選択された；ビーズ位置072のSLO。結合されたビーズは、多重反応のために抗ヒトIgG二次抗体の1：30希釈液とともにインキュベートされた。
【０２３０】
Luminexアッセイは、製造元の指示に従って、Magpix（商標）システム（Merck）で実施した。
【０２３１】
結果
シングルプレックス及びマルチプレックスアッセイ
3つの抗原に対する力価を同時に測定できるかどうかを評価するために、シングルプレックスアッセイの結果をマルチプレックスアッセイと比較した。各ビーズを参加者の血清とインキュベートするシングルプレックスアッセイを実施し、その後、3つの抗原ビーズを同じ部分で混合し、単一のアッセイウェルで試験血清とインキュベートするマルチプレックスアッセイで同じ血清を試験した。これらのマルチプレックスアッセイのMFIは、図9に示すように、各抗原のシングルプレックスMFIと非常に強い相関関係を示し、R2値は次のとおりである：SLO= 0.999（図9A）; DNaseB B = 0.999（図9B）; 及びSpnA = 0.999（図9C）。これは、ビーズ間に干渉またはIgG交差反応性がなかったことを示し、3つの連鎖球菌抗原を含むマルチプレックスLuminexベースのアッセイの実行可能性を示す。
【０２３２】
マルチプレックスLuminexアッセイの変動係数（CV）は、上記のシングルプレックス/マルチプレックス比較で使用された同じ10血清を使用して評価された。これらの10個の血清のIgG濃度は、IgG標準曲線を組み込んだアッセイで測定され、アッセイ内及びアッセイ間の平均CVは、各抗原についてそれぞれ<2％及び<11％だった（表3）。
表３−変動係数
【表４】
2020518575.tif 000006
【０２３３】
これらのCVは、Luminexベースのマルチプレックスアッセイの精度が高く、再現性があることを示す。標準曲線とアッセイ試験結果の両方の再現性は、これらの試薬を利用して、抗原結合ビーズの将来のバッチの結合効率と完全性もチェックできることを意味する。
【０２３４】
既存の血清学的検査との比較
Luminexアッセイを既存の市販の方法論と比較するために、十分な量が利用可能であった61人の参加者の血清をASO及びADBテストにかけた。ASOは、上記の例1に記載されているように、広く採用されている比濁法を使用して測定され、国際単位（IU / mL）での正確な値が得られた。力価範囲（100、200、300、400、600、800、1200及び〜約1600）を提供する酵素阻害アッセイを使用して、ADB力価を測定した（上記の実施例1に記載のとおり）。図10Aに示すように、市販の比濁法で測定されたASO IgGの濃度とLuminexアッセイで測定された抗SLO抗体価との間に良い相関関係があった（R2 = 0.933）。図10Bに示すように、市販の酵素阻害アッセイで測定されたADB IgG濃度とLuminexアッセイで測定された抗DNaseB抗体価の間にも良好な相関があった（R2 = 0.942）。
【０２３５】
ARFの免疫動力学
ARF（RFRF研究）と診断された患者の血清は、入院から数日で層別化された。図11で明らかなように、抗SpnA IgGのレベルは、入院から20日以上収集した血清（n = 17）において、20日未満収集した血清のレベル（n = 19）と比較してかなり減少し、抗SLO抗体又は抗DNaseB抗体よりも短い半減期を示唆している。
【０２３６】
これは、SpnAが連鎖球菌血清学に好ましい免疫動態を有し、診断分析、特に本明細書に記載および例示されるような多重アッセイでの使用を支持することを示唆している。 本明細書に開示された発明により可能になった分析により、Streptococcus pyogenesに最近曝露された、長期にわたる患者の迅速な同定及び治療−長期の抗生物質治療、多くの場合付随費用とリスクを伴う−が不要であり、回避できることが可能になることが理解されよう。
実施例３
【０２３７】
この例では、Luminexプラットフォームを使用して、生体試料中のGAS特異抗体の存在、量、および免疫動態を決定するビーズベースのマルチプレックスアッセイのさらなる評価について説明する。
方法
研究対象
【０２３８】
この研究では、上記の実施例1に記載されているようにヒト血清が得られた。再び、全ての参加者は書面によるインフォームドコンセントを提供し、適切な倫理委員会の承認が得られた。
血清の調製
【０２３９】
急性リウマチ熱患者の血清サンプルは、血液サンプルが採取された日ごとにグループ分けされた：入院日から20日未満；入院後20日以上。分析のために血清サンプルを1：15,000に希釈した。前記IVIGリファレンスは、使用前に1：60,000に希釈された。
Luminexビーズの調製とアッセイ
【０２４０】
アッセイで使用するための各抗原：xMAPミクロスフェアは、実施例2に記載のように調製された。Luminexアッセイは、製造元の指示に従いMagpix（商標）システム（Merck）によって実施された。
【０２４１】
SLO、DnaseB、及びSpnAの血清抗体価の比較は、Triplex Luminexアッセイを使用して決定した。GraphPad Prism 7.0ソフトウェアを使用して統計分析を実行した。
結果
ARFの免疫動態
【０２４２】
ARF（RFRF研究）と診断された患者の血清は、入院から数日で層別化された。この分析の結果を以下の表4及び図12に示す。
表4−免疫動態
【表５】
2020518575.tif 000007
【０２４３】
これらのグループ間で、SLOとDnaseBの抗体価に有意差はなかった。ただし、図12から容易にわかるように、入院から20日未満で収集された血清のレベル（n=37）と比較して、入院から20日以上収集された血清の抗SpnA IgGのレベルは大幅に減少し（n=48）、上記の例2に示した結果と一致する。このことは、抗SpnA抗体は抗SLO抗体又は抗DNaseB抗体よりも半減期が短いという結論を裏付けている。
【０２４４】
これは、SpnAが連鎖球菌血清学に好ましい免疫動態を持ち、診断分析（特に本明細書に記載及び例示されているような多重アッセイ）、治療評価、および治療レジメンでの使用を支持していることを示唆している。
実施例４
【０２４５】
この例では、例えば、前記Luminexプラットフォームなどのビーズベースのマルチプレックスアッセイ、又はディップストリップ/ディップスティックアッセイ（特にコールドチェーンストレージの場合は実用的または利用可能ではない）などの、診断アッセイでの使用の適合性の評価の一部としてのSpnA熱安定性の特性評価について説明する。
方法
【０２４６】
全長SpnA（aa28-877）及びC末端切断型SpnA（aa28-854、配列番号８）の室温における安定性が決定された。手短に言うと、各タンパク質のアリコートが室温で5日間保存された。タンパク質はSDS-PAGEを用いて可視化され、室温で全く保存されなかったタンパク質と比較された（0日）。
【０２４７】
結果
インタクトなSpnAは、全長及びC末端が切断されたポリペプチドの両方に、約85 kDaのバンドとして存在する。しかしながら、全長コンストラクトは室温でより安定的でなく、5日のインキュベーションの後、約85 kDaの量における目立った減少として示される（図13A）。
【０２４８】
このデータは、室温で保存した時に、全長、天然SpnAポリペプチドと比較して、切断型SpnAポリペプチドのより高い安定性を明らかに示す。この結果は、診断アッセイ、治療の評価、及び治療療法、特に試薬が長期保存される環境、又は典型的なタンパク質ベースの組成物にとって最適でない環境下（例えば、室温下やコールドチェーンがない環境）での保存において、切断型SpnAの使用を支持する。
【０２４９】
実施例5
本実施例では診断型アッセイ、例えばLuminexプラットフォームのようなマルチプレックスアッセイにおける例、又はディップストリップ／ディップスティックアッセイ（特にコールドチェーンが現実的又は使用可能でない環境において）における使用のための安定性の評価の一部としてのSpnA温度安定性の特徴を述べる。
【０２５０】
SpnA安定性は、公開されているプロトコル（Moreau、M. J. J.、Morin、I.＆Schaeffer、P. M. Mol. BioSyst.6、1285-1292（2010））に従って熱融解を使用して決定した。簡単に説明すると、元のSpnAコンストラクト（aa28-877）の熱安定性は、図13Aに示す温度で5分間同一のバッファーでタンパク質をインキュベートすることにより、切断コンストラクト（aa28-854）と比較した。
【０２５１】
これに続いて、タンパク質凝集物を除去するための冷却および遠心分離ステップが行われた。折りたたまれたタンパク質の割合をSDS-PAGEで決定し、Graphgad Prism 7.0ソフトウェアを使用して、熱凝集プロファイルからのTagg値（タンパク質の50％が凝集する温度）を計算した。
結果
【０２５２】
SDS-PAGEで評価した各温度での折りたたまれたタンパク質の割合を図13Aのクロマトグラフに示す。各温度での各タンパク質のTagg（タンパク質の50％が凝集する温度）をプロットし（図13B）、これら2つのタンパク質の融解曲線の違いを明確に示す。図13Cから明らかなように、3回の反復実験で切り捨てられたコンストラクトの平均Tagg値は51.0 +/- 0.6℃で、元のコンストラクトの47.5 +/- 0.9℃よりも有意に高く、p <0.05だった。
【０２５３】
これは、切断されたSpnAポリペプチドの熱安定性が高いことを明確に示しており、特に試薬の長期保存、または典型的なコールドチェーンがないなどタンパク質ベースの組成物に最適ではない条件下での保存の状況での診断アッセイ、治療評価、治療計画での使用を支持している。
出版物
1.  Johnson DR, Kurlan R, Leckman J, Kaplan EL. The human immune response to streptococcal extracellular antigens: clinical, diagnostic, and potential pathogenetic implications. Clin. Infect. Dis. 2010;50:481-90.
2.  Chang A, Khemlani A, Kang H, Proft T. Functional analysis of Streptococcus pyogenes nuclease A (SpnA), a novel group A streptococcal virulence factor. Molecular Microbiology. 2011;79:1629-42.
3.  Atatoa-Carr P, Lennon D, Wilson N, New Zealand Rheumatic Fever Guidelines Writing Group. Rheumatic fever diagnosis, management, and secondary prevention: a New Zealand guideline. N Z Med J. 2008;121:59-69.
4.  Raynes JM, Frost HRC, Williamson DA, Young PG, Baker EN, steemson JD, et al. Serological Evidence of Immune Priming by Group A Streptococci in Patients with Acute Rheumatic Fever. Front Microbiol. 2016;7:1119.
5.  Dabitao D, Margolick JB, Lopez J, Bream JH. Multiplex measurement of proinflammatory cytokines in human serum: comparison of the Meso Scale Discovery electrochemiluminescence assay and the Cytometric Bead Array. J Immunol Methods. 2011;372:71-7.
6.  Steer AC, Vidmar S, Ritika R, Kado J, Batzloff M, Jenney AWJ, et al. Normal ranges of streptococcal antibody titers are similar whether streptococci are endemic to the setting or not. Clin. Vaccine Immunol. 2009;16:172-5.
7.  Moreau, M. J. J., Morin, I. & Schaeffer, P. M. Mol. BioSyst. 6, 1285-1292 (2010).
【０２５４】
上記および下記の引用された全ての出願、特許及び刊行物の開示全体は、もしあるならば、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２５５】
本明細書における先行技術への言及は、その先行技術が世界のあらゆる国における努力の分野における一般的な一般知識の一部を形成するという承認または示唆の形式ではなく、またそのように解釈されるべきではない。
【０２５６】
本発明は、本明細書で言及または示される部品、要素、及び特徴、個別に又は集合的に、2つ以上の前記部品、要素、または特徴の任意または全ての組み合わせで構成されると広く言うこともできる。
【０２５７】
上記の説明において、整数またはその既知の同等物を有する構成要素が参照された場合、それらの整数は、個別に記載されているかのように本明細書に組み込まれる。
【０２５８】
本明細書に記載の現在好ましい実施形態に対する様々な変更及び修正が当業者には明らかであることを留意すべきである。そのような変更および修正は、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、またそれに付随する利点を損なうことなく行うことができる。 したがって、そのような変更及び修正は、本発明に含まれることが意図されている。
【０２５９】
本発明は、個別にまたは集合的に、本明細書で参照または示される部品、要素、および特徴から成り、2つ以上の前記部品、要素、または特徴の任意または全ての組み合わせで構成されると広く言うこともできる。
【０２６０】
本発明の態様は、例としてのみ記載されており、その範囲から逸脱することなく、修正及び追加がなされ得ることが理解されるべきである。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
2020518575.tif 000020
【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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