(57)【要約】  被験体において癌を処置するための組成物および方法を本明細書中に開示する。これは、１つまたは複数の目的の免疫調節性および／または免疫賦活性ポリペプチド（複数可）をコードする異種ＤＮＡ配列を含む腫瘍崩壊ウイルスを、被験体における抗腫瘍免疫応答を増強し癌を処置するのに有効な条件下で、被験体に投与することを含む。治療ウイルスの腫瘍塊への送達および腫瘍塊内の分布を増強する方法にも関する。【選択図】図なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量の組換えアデノウイルスベクターを含む医薬組成物であって、アデノウイルスＥ１ｂ−１９Ｋの開始部位とアデノウイルスＥ１ｂ−５５Ｋの開始部位との間に位置する導入遺伝子挿入部位を含み、第１のＤＮＡ配列および第２のＤＮＡ配列が、前記導入遺伝子挿入部位に各々挿入されており；
前記第１のＤＮＡ配列が、キメラヒトＩＬ−１２、ヒトＩＬ−７、抗ＣＴＬＡ−４抗体、ＩＬ−１０Ｒｔｒａｐ、ヒトＣＤ７０、ヒトＩＬ−２ポリペプチド、ヒトＣＤ４０リガンド、およびヒトＯＸ４０リガンドからなる群から選択されるポリペプチドをコードし、前記第２のＤＮＡ配列が、キメラヒトＩＬ−１２、ヒトＩＬ−７、抗ＣＴＬＡ−４抗体、ＩＬ−１０Ｒｔｒａｐ、ヒトＣＤ７０、ヒトＩＬ−２ポリペプチド、ヒトＣＤ４０リガンド、およびヒトＯＸ４０リガンドからなる群から選択されるポリペプチドをコードし；
前記アデノウイルスベクターが改変アデノウイルスＥ１ａ制御配列を含み、前記組換えアデノウイルスベクターの少なくとも１つのＰｅａ３結合部位またはその機能的部分が改変または欠失している、
医薬組成物。
【請求項２】
前記アデノウイルスベクターが、ＩＲＥＳエレメントを含むか、または前記第１のＤＮＡ配列と前記第２のＤＮＡ配列との間の自己切断型２Ａペプチド配列をコードする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
改変Ｅ３領域を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
インタクトなＥ３領域を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記Ｅ３領域に挿入された第３のＤＮＡ配列をさらに含み、前記第３のＤＮＡ配列が、キメラヒトＩＬ−１２、ヒトＩＬ−７、抗ＣＴＬＡ−４抗体、ＩＬ−１０Ｒｔｒａｐ、ヒトＣＤ７０、ヒトＩＬ−２ポリペプチド、ヒトＣＤ４０リガンド、またはヒトＯＸ４０リガンドからなる群から選択されるポリペプチドをコードする、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記アデノウイルスベクターが、ベクターｄｌ３２７のＥ３領域と少なくとも９５％同一の核酸配列を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記キメラヒトＩＬ−１２ポリペプチドが、ｐ４０ポリペプチド、ｐ３５ポリペプチド、およびリンカーポリペプチドを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記キメラヒトＩＬ−１２ポリペプチドが、配列番号４６に記載の配列を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項９】
全身投与のために製剤化されている、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
腫瘍内投与のために製剤化されている、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
有効量の組換えアデノウイルスベクターを含む医薬組成物であって、
ａ．アデノウイルスＥ１ｂ−１９Ｋの開始部位とアデノウイルスＥ１ｂ−５５Ｋの開始部位との間に位置する第１の導入遺伝子挿入部位；
ｂ．アデノウイルスＥ３領域内に位置する第２の導入遺伝子挿入部位；
ｃ．前記第１の導入遺伝子挿入部位内に存在し、キメラヒトＩＬ−１２、ヒトＩＬ−７、抗ＣＴＬＡ−４抗体、ＩＬ−１０Ｒｔｒａｐ、ヒトＣＤ７０、ヒトＩＬ−２ポリペプチド、ヒトＣＤ４０リガンド、およびヒトＯＸ４０リガンドからなる群から選択される１つまたは複数のポリペプチドをコードする第１のＤＮＡ配列；ならびに
ｄ．前記第２の導入遺伝子挿入部位内に存在し、キメラヒトＩＬ−１２、ヒトＩＬ−７、抗ＣＴＬＡ−４抗体、ＩＬ−１０Ｒｔｒａｐ、ヒトＣＤ７０、ヒトＩＬ−２ポリペプチド、ヒトＣＤ４０リガンド、およびヒトＯＸ４０リガンドからなる群から選択される１つまたは複数のポリペプチドをコードする第２のＤＮＡ配列
を含み、
前記アデノウイルスベクターが改変アデノウイルスＥ１ａ制御配列を含む、
医薬組成物。
【請求項１２】
第３の導入遺伝子挿入部位に挿入され、キメラヒトＩＬ−１２、ヒトＩＬ−７、抗ＣＴＬＡ−４抗体、ＩＬ−１０Ｒｔｒａｐ、ヒトＣＤ７０、ヒトＩＬ−２ポリペプチド、ヒトＣＤ４０リガンド、およびヒトＯＸ４０リガンドからなる群から選択される１つまたは複数のポリペプチドをコードする第３のＤＮＡ配列をさらに含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記第１のＤＮＡ配列、前記第２のＤＮＡ配列、および前記第３のＤＮＡ配列のうちの少なくとも１つが、独立して、ＩＲＥＳエレメントおよび／または自己切断型２Ａペプチドを含む、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記アデノウイルスベクターの少なくとも１つのＥ１ａ制御配列Ｐｅａ３結合部位またはその機能的部分が改変または欠失している、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記アデノウイルスベクターの２つのＰｅａ３部位間の配列が欠失している、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
改変Ｅ３領域を含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記アデノウイルスベクターが、ベクターｄｌ３２７のＥ３領域と少なくとも９５％同一の核酸配列を含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記キメラヒトＩＬ−１２ポリペプチドが、ｐ４０ポリペプチド、ｐ３５ポリペプチド、およびリンカーポリペプチドを含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
腫瘍の処置を必要とするヒト被験体において腫瘍を処置する方法であって、治療量の請求項１に記載の医薬組成物を全身投与または腫瘍内投与によって腫瘍を有するヒトに投与する工程を含む、方法。
【請求項２０】
腫瘍の処置を必要とするヒト被験体において腫瘍を処置する方法であって、治療量の請求項１１に記載の医薬組成物を全身投与または腫瘍内投与によって腫瘍を有するヒトに投与する工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書中に記載の発明は、一般に、免疫学、ウイルス学、分子生物学の分野に関し、より具体的には、治療適応性のある腫瘍崩壊性アデノウイルスに関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、米国およびその他の地域における死亡の主因である。癌のタイプに応じて、典型的には、手術、化学療法、および／または放射線療法で処置される。これらの処置はしばしば上手くいかず、単独で使用されるか、現在の標準治療と組み合わせて使用される新規の治療が必要であることは明白である。
【０００３】
元来は専ら腫瘍崩壊治療薬と考えられた、腫瘍細胞の破壊のために腫瘍細胞を優先的に標的にすることができるウイルスは、免疫刺激カーゴの送達用のベクターとして実験的に使用されている。腫瘍細胞の破壊と組み合わせた持続的な抗腫瘍宿主免疫応答の伝播は、例えば、Ｌｉｃｈｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ，１４：５５９−５６７に記載されている。
【０００４】
腫瘍崩壊ウイルスとしてアデノウイルス、レオウイルス、麻疹ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ニューカッスル病ウイルス、およびワクシニアを使用する臨床試験は、これらのプラットフォームが全て安全な治療アプローチであり得ることを示唆している。
【０００５】
アデノウイルスは、中型（９０〜１００ｎｍ）のエンベロープのない正二十面体ウイルスであり、タンパク質キャプシド中に約３６キロ塩基対の二本鎖線状ＤＮＡを有する。ウイルスキャプシドは、標的細胞へのウイルスの付着に関与する繊維構造を有する。第１に、線維タンパク質のノブドメインが標的細胞の受容体（例えばＣＤ４６またはコクサッキーアデノウイルス受容体（ＣＡＲ））に結合し、第２にウイルスがインテグリン分子と相互作用し、第３にウイルスが標的細胞内に取り込まれる。次に、ウイルスゲノムがエンドソームから核に輸送され、標的細胞の複製機構が増殖目的にも利用される。
【０００６】
アデノウイルスゲノムは、初期遺伝子（Ｅ１〜Ｅ４）、中期遺伝子（ＩＸおよびＩＶａ２）、および後期遺伝子（Ｌ１〜Ｌ５）を有し、これらが順次転写される。初期遺伝子産物は、宿主細胞の防御機構、細胞周期、および細胞代謝に影響を及ぼす。中期遺伝子および後期遺伝子は、新規のビリオン産生のための構造ウイルスタンパク質をコードする。
【０００７】
６０を超える異なる血清型のアデノウイルスがヒトにおいて見出されている。血清型は６つのサブグループＡ〜Ｆに分類され、異なる血清型は異なる病状（すなわち、呼吸器疾患、結膜炎、および胃腸炎）に関連することが知られている。アデノウイルス血清型５（Ａｄ−５）は呼吸器疾患を引き起こすことが知られており、それは遺伝子療法分野で研究されている最も一般的な血清型である。最初のＡｄ５ベクターでは、Ｅ１および／またはＥ３領域が欠失され、それによりベクターへの外来ＤＮＡの挿入が可能になった。
【０００８】
さらに、他の領域の欠失およびさらなる変異により、ウイルスベクターに追加の性質が得られている。実際、効率的な抗腫瘍効果を達成するために、アデノウイルスの様々な改変が示唆されている。
【０００９】
アデノウイルスベクターは他のベクター系と比較して遺伝子移入の媒介効率が高く、現在、癌遺伝子療法のために最も頻繁に使用されているベクターである。非複製ｐ５３発現アデノウイルスベクターおよび複製選択ウイルス（Ｈ１０１）は、中国で規制当局の承認を受けている。Ｅ１または他のアデノウイルス重要プロモーターの上流に腫瘍選択性プロモーターエレメントを挿入することによって腫瘍選択的に制御しようとする試みのいくつかは様々なレベルの成功を収めてきたが、これらの試みは、最終的に、非腫瘍細胞におけるウイルスタンパク質の「漏出」遺伝子発現および野生型ウイルス感染と比較して腫瘍細胞を増殖および溶解させる能力の低下により制約を受けた。
【発明の概要】
【００１０】
第１の態様では、有効量の組換えアデノウイルスベクターを含む医薬組成物であって、アデノウイルスＥ１ｂ−１９Ｋの開始部位とアデノウイルスＥ１ｂ−５５Ｋの開始部位との間に位置する導入遺伝子挿入部位を含み、第１のＤＮＡ配列および第２のＤＮＡ配列が、導入遺伝子挿入部位に各々挿入されており、第１のＤＮＡ配列が、キメラヒトＩＬ−１２、ヒトＩＬ−７、抗ＣＴＬＡ−４抗体、ＩＬ−１０Ｒｔｒａｐ、ヒトＣＤ７０、ヒトＩＬ−２ポリペプチド、ヒトＣＤ４０リガンド、およびヒトＯＸ４０リガンドからなる群から選択されるポリペプチドをコードし、第２のＤＮＡ配列が、キメラヒトＩＬ−１２、ヒトＩＬ−７、抗ＣＴＬＡ−４抗体、ＩＬ−１０Ｒｔｒａｐ、ヒトＣＤ７０、ヒトＩＬ−２ポリペプチド、ヒトＣＤ４０リガンド、およびヒトＯＸ４０リガンドからなる群から選択されるポリペプチドをコードし、アデノウイルスベクターが改変アデノウイルスＥ１ａ制御配列を含み、組換えアデノウイルスベクターの少なくとも１つのＰｅａ３結合部位またはその機能的部分が改変または欠失している医薬組成物を提供する。
【００１１】
１つの実施形態では、アデノウイルスベクターは、ＩＲＥＳエレメントを含むか、または第１のＤＮＡ配列と前述の第２のＤＮＡ配列との間の自己切断型２Ａペプチド配列をコードする。別の実施形態では、ベクターは、改変Ｅ３領域を含む。別の実施形態では、ベクターは、インタクトなＥ３領域を含む。別の実施形態では、ベクターは、Ｅ３領域に挿入された第３のＤＮＡ配列を含み、第３のＤＮＡ配列は、キメラヒトＩＬ−１２、ヒトＩＬ−７、抗ＣＴＬＡ−４抗体、ＩＬ−１０Ｒｔｒａｐ、ヒトＣＤ７０、ヒトＩＬ−２ポリペプチド、ヒトＣＤ４０リガンド、またはヒトＯＸ４０リガンドからなる群から選択されるポリペプチドをコードする。１つの実施形態では、キメラヒトＩＬ−１２ポリペプチドは、ｐ４０ポリペプチド、ｐ３５ポリペプチド、およびリンカーポリペプチドを含む。別の実施形態では、キメラヒトＩＬ−１２ポリペプチドは、配列番号４６に記載の配列を含む。
【００１２】
１つの実施形態では、アデノウイルスベクターは、ベクターｄｌ３２７のＥ３領域と少なくとも９５％同一の核酸配列を含む。別の実施形態では、アデノウイルスベクターは、ベクターｄｌ３２７のＥ３領域と少なくとも８５％同一の核酸配列を含む。別の実施形態では、アデノウイルスベクターは、ベクターｄｌ３２７のＥ３領域と少なくとも７５％同一の核酸配列を含む。
【００１３】
１つの実施形態では、医薬組成物は、全身投与のために製剤化されている。別の実施形態では、医薬組成物は、腫瘍内投与のために製剤化されている。
【００１４】
第２の態様では、有効量の組換えアデノウイルスベクターを含む医薬組成物であって、アデノウイルスＥ１ｂ−１９Ｋの開始部位とアデノウイルスＥ１ｂ−５５Ｋの開始部位との間に位置する第１の導入遺伝子挿入部位；アデノウイルスＥ３領域内に位置する第２の導入遺伝子挿入部位；第１の導入遺伝子挿入部位内に存在し、キメラヒトＩＬ−１２、ヒトＩＬ−７、抗ＣＴＬＡ−４抗体、ＩＬ−１０Ｒｔｒａｐ、ヒトＣＤ７０、ヒトＩＬ−２ポリペプチド、ヒトＣＤ４０リガンド、およびヒトＯＸ４０リガンドからなる群から選択される１つまたは複数のポリペプチドをコードする第１のＤＮＡ配列；ならびに第２の導入遺伝子挿入部位内に存在し、キメラヒトＩＬ−１２、ヒトＩＬ−７、抗ＣＴＬＡ−４抗体、ＩＬ−１０Ｒｔｒａｐ、ヒトＣＤ７０、ヒトＩＬ−２ポリペプチド、ヒトＣＤ４０リガンド、およびヒトＯＸ４０リガンドからなる群から選択される１つまたは複数のポリペプチドをコードする第２のＤＮＡ配列を含み、アデノウイルスベクターが改変アデノウイルスＥ１ａ制御配列を含む、医薬組成物を提供する。１つの実施形態では、医薬組成物は、第３の導入遺伝子挿入部位に挿入され、キメラヒトＩＬ−１２、ヒトＩＬ−７、抗ＣＴＬＡ−４抗体、ＩＬ−１０Ｒｔｒａｐ、ヒトＣＤ７０、ヒトＩＬ−２ポリペプチド、ヒトＣＤ４０リガンド、およびヒトＯＸ４０リガンドからなる群から選択される１つまたは複数のポリペプチドをコードする第３のＤＮＡ配列をさらに含む。
【００１５】
別の実施形態では、第１のＤＮＡ配列、第２のＤＮＡ配列、および第３のＤＮＡ配列のうちの少なくとも１つが、独立して、ＩＲＥＳエレメントおよび／または自己切断型２Ａペプチドを含む。１つの実施形態では、アデノウイルスベクターの少なくとも１つのＥ１ａ制御配列Ｐｅａ３結合部位またはその機能的部分が改変または欠失している。別の実施形態では、アデノウイルスベクターの２つのＰｅａ３部位の間の配列が欠失している。１つの実施形態では、アデノウイルスベクターは、改変Ｅ３領域を含む。別の実施形態では、アデノウイルスベクターは、ベクターｄｌ３２７のＥ３領域と少なくとも９５％同一の核酸配列を含む。別の実施形態では、アデノウイルスベクターは、ベクターｄｌ３２７のＥ３領域と少なくとも８５％同一の核酸配列を含む。別の実施形態では、アデノウイルスベクターは、ベクターｄｌ３２７のＥ３領域と少なくとも７５％同一の核酸配列を含む。
【００１６】
１つの実施形態では、キメラヒトＩＬ−１２ポリペプチドは、ｐ４０ポリペプチド、ｐ３５ポリペプチド、およびリンカーポリペプチドを含む。
【００１７】
別の態様では、腫瘍の処置を必要とするヒト被験体において腫瘍を処置する方法であって、治療量の第１の態様の医薬組成物を全身投与または腫瘍内投与によって腫瘍を有するヒトに投与する工程を含む方法を提供する。
【００１８】
別の態様では、腫瘍の処置を必要とするヒト被験体において腫瘍を処置する方法であって、治療量の第２の態様の医薬組成物を全身投与または腫瘍内投与によって腫瘍を有するヒトに投与する工程を含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】Ｅ１ａエンハンサー領域の立体構造／活性の転写因子結合による制御を図示したイラストである。
【図２】２つの免疫調節性ポリペプチドを発現するアデノウイルスベクターを示すベクターマップの図である。
【図３】Ｅ４部位で少なくとも１つの免疫調節性ポリペプチドを発現するアデノウイルスベクターを示すベクターマップの図である。
【図４】ＴＲＺ２００ウイルスゲノム：Ｅ１ｂ  １９ｋ空、Ｅ３欠失ウイルスの図である。
【図５】ＴＲＺ６  ｈＩＬ−１２プラスミドを含むプラスミドを示すベクターマップの図である。
【図６】抗ＰＤ−Ｌ１の有無に関わらず、種々の導入遺伝子を含む腫瘍崩壊ウイルスを用いた担癌マウス（各群においてｎ＝８）の処置の結果を示す一連のグラフである。図６Ａは、細胞移植（原発性腫瘍）の３８日後の空のウイルス（「ｄ１９ｋ」）と比較した種々の腫瘍崩壊ウイルスの活性を示す。黒いバーはウイルス単独を表し、斜線のバーはウイルス＋抗ＰＤ−Ｌ１抗体を表す。図６Ｂは、ウイルス緩衝液（黒丸）、空のベクター（青色の四角）、抗ＰＤ−Ｌ１単独（抗体を、１６、２０、２４、および２８日目に投与した、矢印の各対における右側の矢印）、５つのウイルス単独（ＣＴＬＡ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−７、ＣＤ７０、およびＩＬ−１０）の各々、または抗ＰＤ−Ｌ１抗体との組み合わせを注射した腫瘍の経時的な平均腫瘍サイズ（原発性腫瘍）を比較するグラフである。図６Ｃは、以下の残りの３つのウイルスを示す類似のグラフである：ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、およびＧＭ−ＣＳＦ。示したさらなるマウス処置は以下である：６Ｄ、ウイルス緩衝液およびコントロールＩｇＧのみ（左）ならびにウイルス緩衝液および抗ＰＤ−Ｌ１抗体（右）；６Ｅ、ｄ１９ｋ（空のウイルス）およびコントロールＩｇＧのみ（左）ならびにｄ１９ｋおよび抗ＰＤ−Ｌ１抗体（右）；６Ｆ、コントロールＩｇＧ（左）または抗ＰＤ−Ｌ１（右）を用いたＣＴＬＡ−４ウイルス；６Ｇ、コントロールＩｇＧ（左）または抗ＰＤ−Ｌ１抗体（右）を用いたＩＬ−１２ウイルス；６Ｈ、コントロールＩｇＧ（左）または抗ＰＤ−Ｌ１抗体（右）を用いたＧＭ−ＣＳＦウイルス；６Ｉ、コントロールＩｇＧ（左）または抗ＰＤ−Ｌ１抗体（右）を用いたＩＬ−７ウイルス；６Ｊ、コントロールＩｇＧ（左）または抗ＰＤ−Ｌ１抗体（右）を用いたＣＤ４０Ｌウイルス；６Ｋ、コントロールＩｇＧ（左）または抗ＰＤ−Ｌ１抗体（右）を用いたＬ１０ｔｒａｐウイルス；および６Ｌ、コントロールＩｇＧ（左）または抗ＰＤ−Ｌ１抗体を用いたＯＸ４０Ｌウイルス。各グラフ内の太線は、平均腫瘍容積（ｍｍ３）を示す。ｘ軸上の矢印の対は、使用する場合のウイルス（腫瘍内、左側の矢印）および抗ＰＤ−Ｌ１抗体（腹腔内、右側の矢印）での処置日を表す。
【図７】抗ＰＤ−Ｌ１処置の有無に関わらず、種々の導入遺伝子を含む腫瘍崩壊ウイルスの単独または組み合わせを用いた担癌マウス（各群においてｎ＝８）の処置を示す一連のグラフである。各図の左側のパネルは、ウイルスが注射された原発性腫瘍を表し；右側のパネルは、対側腫瘍を表す。各グラフ内の太線は、平均腫瘍容積（ｍｍ３）を示す。ｘ軸上の矢印の対は、ウイルス（腫瘍内、左側の矢印）および抗体（腹腔内、右側の矢印）での処置日を表す。８匹のマウスの奏効のまとめを各グラフの下の表中に示す（表中、ＣＲ＝完全奏効（腫瘍容積＝０）およびＰＲ＝部分奏効（測定最終日の腫瘍容積が、測定１日目の腫瘍容積より小さい））。処置を以下に示す：７Ａ、ウイルス緩衝液のみ；７Ｂ、空のウイルスのみ（ＴＲＺ０００）；７Ｃ、ＴＲＺ０１０（ＩＬ−１０ｔｒａｐ）＋空のウイルス；７Ｄ、ＴＲＺ０１１（ＯＸ４０リガンド）＋空のウイルス；７Ｅ、ＴＲＺ００９（ＣＤ７０）＋空のウイルス；７Ｆ、ＴＲＺ００７（ＩＬ−７）＋空のウイルス、７Ｇ、ＴＲＺ００２（ＩＬ−１２）＋空のウイルス；７Ｈ、ＴＲＺ００４（ＧＭ−ＣＳＦ）＋空のウイルス；７Ｉ、ＴＲＺ００３（フラジェリン）＋空のウイルス；７Ｊ、ＴＲＺ００２＋ＴＲＺ０１０；７Ｋ、ＴＲＺ００２＋ＴＲＺ００７；７Ｌ、ＴＲＺ００７＋ＴＲＺ０１０；７Ｍ、ＴＲＺ０１１＋ＴＲＺ００４；７Ｎ、ＴＲＺ００９＋ＴＲＺ００３；７Ｏ、ＴＲＺ００２＋ＴＲＺ００９；７Ｐ、ＴＲＺ００７＋ＴＲＺ００９；７Ｑ、ＴＲＺ００７＋ＴＲＺ００４；７Ｒ、ＴＲＺ００２＋ＴＲＺ０１１；７Ｓ、ＴＲＺ０１０＋ＴＲＺ００４；７Ｔ、ＴＲＺ００２＋ＴＲＺ００４；７Ｕ、ウイルス緩衝液および抗ＰＤ−Ｌ１；７Ｖ、ＴＲＺ００２＋空のウイルス＋抗ＰＤ−Ｌ１；７Ｗ、ＴＲＺ００９＋抗ＰＤ−Ｌ１；７Ｘ、ＴＲＺ００７＋空のウイルス＋抗ＰＤ−Ｌ１；７Ｙ、ＴＲＺ００２＋ＴＲＺ００７＋抗ＰＤ−Ｌ１；７Ｚ、ＴＲＺ００７＋ＴＲＺ００９＋抗ＰＤ−Ｌ１；７ＡＡ、ＴＲＺ００２＋ＴＲＺ００９＋抗ＰＤ−Ｌ１、７ＢＢ、
【図８】種々の発現の特徴を有するベクターを産生するためにＰｅａ３部位を変更、移動、または欠失するアデノウイルスベクターのＥ１ａエンハンサー領域の改変の原理を示す略図である。図８Ａは、野生型アデノウイルスゲノム（上）および残基−３０５〜−２５５が欠失しているＴＡＶ−２５５アデノウイルス構築物（下）の図である。図８Ｂは、欠失によってＰｅａ３部位ＩＩおよびＩＩＩを除去し、Ｐｅａ３部位ＩＶおよびＶを遠位調節エレメントとしてプロモーターに近づくように移動させる、ＴＡＶ−２５５構築物の潜在的な処置方法の図である。
【図９】抗ＰＤ−Ｌ１抗体または抗ＰＤ−１抗体処置のいずれかを用いた、種々の導入遺伝子を含む二重導入遺伝子（Ｅ１およびＥ３の両方から発現される二重導入遺伝子またはＥ１もしくはＥ３のいずれかから発現される二重導入遺伝子）腫瘍崩壊ウイルスを用いた担癌マウス（各群においてｎ＝８）の処置を示す一連のグラフである。図９Ａは、ウイルス混合例で使用した単一導入遺伝子構築物（上）と、Ｅ１／Ｅ３導入遺伝子アデノウイルスを作製するために使用した二重導入遺伝子ベクターとを対比したイラストである。図９Ｂは、空のウイルス＋／−抗ＰＤ−Ｌ１またはＴＲＺ−４０９（ＩＬ−１２／ＩＬ−７二重導入遺伝子）＋／−抗ＰＤ−Ｌ１を腫瘍内注射したマウスの結果を示す。注射した腫瘍の腫瘍容積を左側のパネルに示し、対側腫瘍の腫瘍容積を右側のパネルに示す。矢印の各対について、左側の矢印はウイルス注射を示し、右側の矢印は抗ＰＤ−Ｌ１注射を示す。原発性腫瘍および対側腫瘍の両方について認められるように、ＴＲＺ−４０９注射により空のウイルスと比較して腫瘍容積が有意に減少した。この研究では、抗ＰＤ−Ｌ１との組み合わせはわずかにより有効であった。図９Ｃは、ＴＲＺ−４０９の逆であるＴＲＺ−４０３（ＩＬ−７導入遺伝子がＥ１領域を占め、ＩＬ−１２遺伝子がＥ３領域（Ｅ１よりも強力なプロモーターを有する）を占める）を使用した第２の実験の結果を示す。図中に認められるように、ＴＲＺ−４０３は、抗ＰＤ−Ｌ１の有無に関わらず、原発性腫瘍および遠位腫瘍の成長を強く阻害する。ＴＲＺ−４０３を注射した全てのマウスのＩＬ−１２およびＩＦＮ−γの血漿レベル（図９Ｄ）は、導入遺伝子の発現には高い忍容性が認められることを示す。本研究を、５００ｍｍ３超の腫瘍を有する全てのマウスに展開した。図９Ｅに認められるように、ＴＲＺ−４０３を注射したマウスは、研究終了時に（７０日目）ＴＲＺ−４０９よりもはるかに高い生存率を示した。ＴＲＺ−４０３（ＩＬ−７＋ＩＬ−１２）、ＴＲＺ−４０３＋抗ＰＤ−Ｌ１、ＴＲＺ−４０３＋コントロールＩｇＧ、またはＴＲＺ−４０９（ＩＬ−１２＋１Ｌ−７）を注射した原発性腫瘍を有するマウスおよびコントロール（無処置マウスおよび抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＰＤ−１、またはコントロールＩｇＧを有する空のベクターＴＲＺ−ｄ１９Ｋを注射したマウスが含まれる）。図に認められるように、ＴＲＺ−４０３を注射したマウスは、研究終了時に（７０日目）ＴＲＺ−４０９よりもはるかに高い生存率を示した。ＴＲＺ−４０３およびＴＲＺ−４０９の両方は、コントロールよりも有効であった；コントロール注射を受けた全てのマウスは、研究５６日目に死亡した。図９Ｆは、２つの単一導入遺伝子ウイルスの混合物を、同一の導入遺伝子を有する二重導入遺伝子ウイルスと比較している。原発性腫瘍（左側のパネル）に認められるように、ＴＲＺ−４０３は、腫瘍容積の減少に最も有効であり、ＩＬ−７単一導入遺伝子ウイルスとＩＬ−１２単一導入遺伝子ウイルスとの混合物がそれに続いた。単一導入遺伝子ＩＬ−１２ウイルスは、比較すると有効性は小さかった。しかし、対側腫瘍（右側のパネル）では、二重導入遺伝子ウイルス（ＴＲＺ−４０３）のみが腫瘍容積を減少させることから���ＴＲＺ−４０３はウイルス混合物より有意に優れていることを示していた。図９Ｇ〜９Ｚは、種々の二重導入遺伝子ウイルスおよびコントロールの抗腫瘍活性の比較（抗体処置との比較が含まれる）を示す。各図は、左側のパネルに原発性腫瘍を示し、右側のパネルに対側腫瘍を示す。全てのウイルスを腫瘍内投与し、抗体を腹腔内投与した。ウイルス投与計画は様々であり、表７（実施例１２）に示す。全ての抗体を２５０μＬの用量で投与する。図９Ｇは、無処置動物コントロールにおける腫瘍活性を示す；図９Ｈは、ＴＲＺ０００（Ｅ１−空／Ｅ３インタクト）を示す；図９Ｉ〜９Ｋは、ＴＲＺ００２（Ｅ１−ｍＩＬ−１２／Ｅ３  Ｄｅｌ）を示す；図９Ｌ〜９Ｎは、ＴＲＺ５１０（Ｅ１−ｍＩＬ−７−Ｐ２Ａ−ｍＩＬ−１２／Ｅ３  Ｄｅｌ）を示す；図９Ｏ〜９Ｑは、ＴＲＺ０２１（Ｅ１−空／Ｅ３−ｍＩＬ−２）を示す；図９Ｒ〜９Ｖは、ＴＲＺ４２１（Ｅ１−ｍＩＬ−１２／Ｅ３−ｍＩＬ−２）を示す；図９Ｗは、ＴＲＺ００２（Ｅ１−ｍＩＬ−１２／Ｅ３  Ｄｅｌ）＋抗ＣＴＬＡ４抗体の組み合わせを示す（用量については、表７を参照のこと）；図９Ｘは、抗ＰＤ−１抗体処置のみを示し、図９Ｙは抗ＣＴＬＡ４抗体のみを示し、図９Ｚは、抗ＣＴＬＡ−４抗体と抗ＰＤ−１抗体（共に、ＢｉｏＸＣｅｌｌ）の組み合わせでの処置の結果を示す。
【図１０】腫瘍崩壊性アデノウイルスのＥ１部位またはＥ３部位にクローン化した導入遺伝子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現の測定を示す一連のグラフである。Ａ５４９細胞またはＡＤＳ１２細胞に、ＴＲＺ０００（空のウイルス）、ＴＲＺ４０３（Ｅ１  ＩＬ−７／Ｅ３  ＩＬ−１２）、ＴＲＺ４１６（Ｅ１  ＯＸ４０Ｌ／Ｅ３  ＩＬ−１２）、ＴＲＺ４２１（Ｅ１  ＩＬ−１２／Ｅ３  ＩＬ−２）、ＴＲＺ５１０（Ｅ１  ＩＬ−７−Ｐ２Ａ−ＩＬ−１２／Ｅ３）、またはＴＲＺ５１２（Ｅ１−ＩＬ−１２−Ｐ２Ａ−ＩＬ−７／Ｅ３）を、感染多重度（ＭＯＩ）１０または２５で感染させた。感染４８時間後、上清を回収し、遠心分離によって清澄化し、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）キット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）（マウスＩＬ−１２、マウスＩＬ−２、およびマウスＩＬ−７）；およびマウスＯＸ４０ＬについてはＤｕｏＳｅｔ（登録商標）キット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した標準的なＥＬＩＳＡ法によってタンパク質発現についてアッセイした。ＩＬ−７（ＴＲＺ４０３、図１０Ａ、Ａ５４９細胞）、ＩＬ−７（ＴＲＺ５１０およびＴＲＺ５１２、図１０Ｂ、ＡＤＳ−１２細胞）、ＯＸ４０Ｌ（ＴＲＺ４１６、図１０Ｃ、Ａ５４９細胞）、ＩＬ−１２（ＴＲＺ４２１）、図１０Ｄ、Ａ５４９細胞）、ＩＬ−１２（ＴＲＺ５１０およびＴＲＺ５１２、図１０Ｅ、ＡＤＳ−１２細胞）について、アデノウイルスＥ１部位由来の導入遺伝子発現を示す。ＩＬ−１２（ＴＲＺ４０３およびＴＲＺ４１６、図１０Ｆ、Ａ５４９細胞）およびＩＬ−２（ＴＲＺ４２１、図１０Ｇ、Ａ５４９細胞）について、Ｅ３部位由来の導入遺伝子発現を示す。図に認められるように、全ての導入遺伝子は、Ｅ１部位またはＥ３部位のいずれかから十分に発現された。
【図１１】腫瘍崩壊性アデノウイルスのＥ１部位またはＥ３部位にクローン化した導入遺伝子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能の測定を示す一連のグラフである。Ａ５４９細胞に、ＴＲＺ５１０（Ｅ１  ＩＬ−７−Ｐ２Ａ−ＩＬ−１２／Ｅ３）、ＴＲＺ５１２（Ｅ１  ＩＬ−１２−Ｐ２Ａ−ＩＬ−７／Ｅ３）、ＴＲＺ４０３（Ｅ１  ＩＬ−７／Ｅ３  ＩＬ−１２）、およびＴＲＺ４１６（Ｅ１  ＯＸ４０Ｌ／Ｅ３  ＩＬ−１２）を、感染多重度（ＭＯＩ）１０または２５で感染させた。感染４８時間後、上清を回収し、遠心分離によって清澄化し、分泌型ＩＬ−１２の生物学的機能について、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ−１２細胞を使用してアッセイするか、分泌型ＩＬ−２の生物学的機能について、ＣＴＬＬ−２細胞を使用してアッセイした。上清中のＥ１領域（図１１Ａ、ＴＲＺ５１０；図１１Ｂ、ＴＲＺ５１２）およびＥ３領域（図１１Ｃ、ＴＲＺ４０３；図１１Ｄ、ＴＲＺ４１６）から発現したＩＬ−１２についてのＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−１２細胞におけるＩＬ−１２導入遺伝子の機能を示す。Ｅ３領域から発現した上清についてのＣＴＬＬ−２細胞におけるＩＬ−２導入遺伝子の機能を、図１１Ｅ（ＴＲＺ４２１）に示す。図に認められるように、全ての導入遺伝子は、Ｅ１部位またはＥ３部位（Ｐ２Ａ配列に接続された部位が含まれる）から発現されたときに機能的であった。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
定義
用語「複製ウイルス」は、タンパク質、核酸、および時折脂質の合成、ならびにこれらを新規の感染性粒子に組み立てることからなる、細胞内ウイルス増殖プロセスを経るウイルスを含むことを意味する。
【００２１】
本明細書中で使用する場合、用語「アデノウイルス」は、ヒトにおける結膜炎および上気道感染を引き起こす任意のＤＮＡ含有ウイルス群（小型感染性因子）をいう。アデノウイルスベクターは、Ｐｅｎｇ，Ｚ．，“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｓｔａｔｕｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｄｉｃｉｎｅ  ｉｎ  Ｃｈｉｎａ：Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  Ａｄ−ｐ５３  Ａｇｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒｓ，”Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １６：１０１６−１０２７（２００５）；Ｎｏ  ａｕｔｈｏｒｓ  ｌｉｓｔｅｄ，“Ｔｈｅ  Ｅｎｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂｅｇｉｎｎｉｎｇ：Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  Ｖｉｒｏｔｈｅｒａｐｙ  Ａｃｈｉｅｖｅｓ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒｏｏｆ−ｏｆ−ｃｏｎｃｅｐｔ，”Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １３：２３７−２３８（２００６）；Ｖｉｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  Ｖｉｒｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ：Ｕｎｉｑｕｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｓａｆｅｔｙ  Ｐｏｉｎｔｓ  ｔｏ  Ｃｏｎｓｉｄｅｒ，”Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ９：１０６２−１０６７（２００２）；Ｈａｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｄｅｃｒｅａｓｅｓ  Ｔｕｍｏｒ  Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  Ｇｒｏｗｔｈ，ｂｕｔ  Ｄｅｓｐｉｔｅ  Ｖｉｒａｌ  Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｔｕｍｏｒ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ａｒｅ  Ｒａｒｅｌｙ  Ａｃｈｉｅｖｅｄ−−Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｖｉｒａｌ  Ｅ１ｂ−１９−ｋＤ  Ｇｅｎｅ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｔｈｅ  Ｖｉｒａｌ  Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  Ｅｆｆｅｃｔ，”Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １２：１３２３−１３３２（２００１）；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｓｕｌｔｓ  ｗｉｔｈ  ｄ１１５２０（Ｏｎｙｘ−０１５），ａ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ：Ｗｈａｔ  Ｈａｖｅ  Ｗｅ  Ｌｅａｒｎｅｄ？，”Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ８：８９−９８（２００１）；およびＴｈｏｒｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  Ｖｉｒｏｔｈｅｒａｐｙ：Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  Ｔｕｍｏｒ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  Ｅｆｆｅｃｔｓ，”Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ３２：５３７−５４８（２００５）（それぞれ、その全体が本明細書中で参照として援用される）に記載されている。本明細書中で言及されるアデノウイルスは、アデノウイルス５型（ＧｅｎＢａｎｋ１０受入番号Ｍ７３２６０；このウイルスは、米国メリーランド州ロックビルのアメリカンタイプカルチャーコレクションから受入番号ＶＲ−５で入手可能である）に位置付けられている。他のアデノウイルスベクター中の対応する位置を、デフォルト設定の下でＢＬＡＳＴ２．０を用いたアラインメントによって同定することができることが理解されるであろう（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、国立生物工学情報センター（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通してウェブ上で公的に利用可能である。
【００２２】
ウイルスベクター分野における現在の研究は、力価が高く、哺乳動物細胞への形質導入効率が高い改良されたウイルスベクターの産生である（例えば、Ｆｉｎｅｒらの米国特許第６，２１８，１８７号（その全体が、本明細書中で参照として援用される）を参照のこと）。かかるベクターは、１つまたは複数の本明細書中に記載のウイルスベクター由来の所望のエレメントの組み合わせを含む任意のウイルスベクターと同様に、本発明において適している。発現ベクターが特定のウイルスベクターに制限されることを意図しない。
【００２３】
ある「調節エレメント」または「制御配列」を、ベクター構築物に組み込むこともできる。用語「調節エレメント」は、プロモーター領域、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流制御ドメイン、複製起点、配列内リボゾーム進入部位（「ＩＲＥＳ」）、およびエンハンサーなどを総称し、これらがまとまって、レシピエント細胞内のコード配列（複数可）を複製、転写、および翻訳する。選択されたコード配列を適切な宿主細胞内で複製、転写、翻訳させることができる限り、これらの調節エレメントの全てが常に存在する必要があるわけではない。
【００２４】
用語「プロモーター領域」は、ＤＮＡ制御配列を含むヌクレオチド領域を指すために通常の意味で本明細書中にて使用され、制御配列は、ＲＮＡポリメラーゼに結合し、下流の（３’方向）コード配列の転写を開始することができる遺伝子に由来する。真核生物中の転写調節シグナルは、「プロモーター」エレメントおよび「エンハンサー」エレメントを含む。プロモーターエレメントおよびエンハンサーエレメントは、多様な真核生物供給源（酵母、昆虫、および哺乳動物細胞内の遺伝子が含まれる）およびウイルスから単離されている。原核生物内で類似の調節エレメント（すなわち、プロモーター）も見出されている。かかるエレメントは、その強度および特性が異なり得る。例えば、プロモーターは、「構成性」または「誘導性」であり得る。
【００２５】
構成性プロモーターは、生物の発生および寿命を通して遺伝子の発現を指示するプロモーターである。導入遺伝子の発現誘導で広く使用されているいくつかの構成性プロモーターの例には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期プロモーター（いくつかのアクチン遺伝子のうちのいずれかに由来し、ほとんどの細胞型で発現することが公知）（その全体が本明細書中で参照として援用される、Ｐｒｉｖａｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，の米国特許第６，００２，０６８号）およびユビキチンプロモーター（多数の細胞型で蓄積されることが公知の遺伝子産物である）が含まれる。
【００２６】
効率的な発現を確実にするために、ｍＲＮＡ転写物を適切に成熟させるための３’ポリアデニル化領域を存在させることができる。３’ポリアデニル化領域は、挿入された導入遺伝子の下流のアデノウイルス配列に由来することが好ましいであろうが、免疫調節性遺伝子の未変性３’−非翻訳領域を使用することができるか、または例えば、より効率的に発現させる、特にスプライス部位を含むＳＶ４０由来の代替ポリアデニル化シグナルも使用することができる。あるいは、特定の細胞型で高発現する遺伝子由来の３’−非翻訳領域を、免疫調節性遺伝子と融合することができる。
【００２７】
発現または活性の「インヒビター」、「アクチベーター」、および「モジュレーター」を、記載の標的タンパク質（例えば、リガンド、アゴニスト、アンタゴニスト、ならびにそのホモログおよび模倣物）の発現または活性についてのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイおよびｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを使用して同定した阻害分子、活性化分子、または調整分子をそれぞれ指すために使用する。用語「モジュレーター」には、インヒビターおよびアクチベーターが含まれる。インヒビターは、例えば、記載の標的タンパク質の発現を阻害するかこれに結合して、刺激またはプロテアーゼインヒビター活性を部分的または完全に遮断し、活性化を減少、防止、遅延させ、記載の標的タンパク質の活性を不活化、脱感作、または下方制御する作用因子（例えば、アンタゴニスト）である。アクチベーターは、例えば、記載の標的タンパク質の発現を誘導もしくは活性化し、または記載の標的タンパク質に結合して活性化またはプロテアーゼインヒビター活性を刺激、増加、開放、活性化、促進、増強させ、記載の標的タンパク質（もしくは標的タンパク質をコードするポリヌクレオチド）の活性を感作もしくは上方制御する作用因子（例えば、アゴニスト）である。モジュレーターには、天然に存在する、および合成のリガンド、アンタゴニスト、およびアゴニスト（例えば、アゴニストまたはアンタゴニストのいずれかとして機能する化学的小分子および抗体など）が含まれる。かかるインヒビターおよびアクチベーターのためのアッセイには、例えば、上記のように、記載の標的タンパク質を発現する細胞に推定モジュレーター化合物を適用し、次いで、記載の標的タンパク質活性に及ぼす機能的影響を決定することを含む。潜在的なアクチベーター、インヒビター、またはモジュレーターで処置した記載の標的タンパク質を含む試料またはアッセイを、インヒビター、アクチベーター、またはモジュレーターを用いないコントロール試料と比較して、影響の程度を試験する。コントロール試料（モジュレーターで無処置の試料）に、相対活性値１００％を割り当てる。コントロールと比較した活性値が約８０％、任意選択的に５０％または２５、１０％、５％または１％であるとき、記載の標的タンパク質は阻害されている。コントロールと比較した活性値が１１０％、任意選択的に１５０％、任意選択的に２００、３００％、４００％、５００％、もしくは１０００〜３０００％、またはそれを超えるとき、記載の標的タンパク質は活性化されている。
【００２８】
「抗体」は、抗原に特異的に結合してそれを認識する、免疫グロブリン遺伝子またはそのフラグメントに由来するフレームワーク領域を含むポリペプチドを指す。認識されている免疫グロブリン遺伝子には、κ、λ、α、γ、δ、ε、およびμといった各定常領域遺伝子、ならびに種々の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖は、κまたはλのいずれかに分類される。重鎖は、γ、μ、α、δ、またはεに分類され、これらはそれぞれ免疫グロブリンクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥを規定する。
【００２９】
天然に存在する免疫グロブリンは、２つの同一の軽鎖（約２４ｋＤ）および２つの同一の重鎖（約５５または７０ｋＤ）が四量体を形成している共通のコア構造を有する。各鎖のアミノ末端部分は、可変（Ｖ）領域として公知であり、各鎖の残部のより保存された定常（Ｃ）領域と区別することができる。軽鎖の可変領域内には、Ｊ領域として公知のＣ末端部分がある。重鎖の可変領域内には、Ｊ領域に加えてＤ領域がある。免疫グロブリン内のほとんどのアミノ酸配列の変異は、抗原結合に直接関与する超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）として公知のＶ領域内の３つの個別の位置に限定される。アミノ末端から始めて、これらの領域はそれぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と命名されている。ＣＤＲは、より保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）によって適所に保持されている。アミノ末端から始めて、これらの領域はそれぞれＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４と命名されている。ＣＤＲおよびＦＲ領域の位置および付番システムは、例えば、Ｋａｂａｔら（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｏｆｆｉｃｅ（１９９１））によって定義されている。
【００３０】
例示的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、四量体を含む。各四量体は、２つの同一のポリペプチド鎖対から構成され、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のＮ末端は、主に抗原認識を担う約１００〜１１０個またはそれを超えるアミノ酸の可変領域を規定する。可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）という用語は、それぞれこれらの軽鎖および重鎖を指す。
【００３１】
抗体は、例えば、インタクトな免疫グロブリンとして、または種々のペプチダーゼでの消化によって産生されるいくつかの十分に特徴付けられたフラグメントとして存在する。したがって、例えば、ペプシンは、ヒンジ領域内のジスルフィド結合の下部で抗体を消化してＦ（ａｂ）’２を産生する。このＦ（ａｂ）’２はＦａｂの二量体であり、Ｆａｂ自体はジスルフィド結合によって軽鎖とＶＨ−ＣＨ１が接合したものである。Ｆ（ａｂ）’２を穏やかな条件下で還元してヒンジ領域内のジスルフィド結合を破壊し、それにより、Ｆ（ａｂ）’２二量体をＦａｂ’単量体に変換することができる。Ｆａｂ’単量体は、本質的にはＦａｂであるが、ヒンジ領域の一部を有する（ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（Ｐａｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，３ｄ  ｅｄ．１９９３を参照のこと）。種々の抗体フラグメントがインタクトな抗体の消化に関して定義されているが、当業者は、かかるフラグメントを、化学的に、または組換えＤＮＡ法の使用によってｄｅ  ｎｏｖｏで合成することができることを認識するであろう。したがって、抗体という用語には、本明細書中で使用される場合、全抗体の改変によって産生された抗体フラグメント、組換えＤＮＡ法を使用してｄｅ  ｎｏｖｏで合成した抗体フラグメント（例えば、一本鎖Ｆｖ）、またはファージディスプレイライブラリーを使用して同定した抗体フラグメント（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４（１９９０）を参照のこと）も含まれる。
【００３２】
モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の調製のために、当該分野で公知の任意の技術を使用することができる（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７（１９７５）；Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２（１９８３）；Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，ｐｐ．７７−９６  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９８５）を参照のこと）。「モノクローナル」抗体は、単一クローン由来の抗体を指す。一本鎖抗体の産生技術（米国特許第４，９４６，７７８号）を適応させて、本発明のポリペプチドに対する抗体を産生することができる。また、トランスジェニックマウスまたは他の生物（他の哺乳動物など）を使用して、ヒト化抗体を発現させることができる。あるいは、ファージディスプレイテクノロジーを使用して、選択した抗原に特異的に結合する抗体およびヘテロマーＦａｂフラグメントを同定することができる（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４（１９９０）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２）を参照のこと）。
【００３３】
「キメラ抗体」は、（ａ）定常領域またはその一部が、抗原結合部位（可変領域）が、異なるもしくは変化したクラスの定常領域、エフェクター機能、および／もしくは種、またはキメラ抗体に新規の性質を付与する全く異なる分子（例えば、酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬物など）に連結するように、変化、置換、または交換され；あるいは、（ｂ）可変領域またはその一部が、異なるもしくは変化した抗原特異性を有する可変領域に変化、置換、または交換された抗体分子である。
【００３４】
「ヒト化」抗体は、ヒトにおける抗原性を抑えながら非ヒト抗体の反応性を保持している抗体である。例えば、非ヒトＣＤＲ領域を保持し、抗体の残部をヒト対応物と置換することによってこれを達成することができる。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｏｉ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４４：６５−９２（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．，２８：４８９−４９８（１９９１）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．，３１（３）：１６９−２１７（１９９４）を参照のこと。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、治療実施の文脈における用語「処置する」および「処置」は、被験体が有益な影響（癌の発症もしくは進行、またはその症状の低下、減少、減弱、縮小、安定化、寛解、抑制、阻害、または停止など）を受ける処置／治療を指す。ある実施形態では、被験体が受けた処置／治療により、以下の効果のうちの少なくとも１つまたは複数が得られる：（ｉ）癌の重症度または癌に関連する症状の低下または回復；（ｉｉ）癌に関連する症状の持続期間の短縮；（ｉｉｉ）癌に関連する症状の再発の防止；（ｉｖ）癌および／または癌に関連する症状の後退；（ｖ）被験体の入院の減少；（ｖｉ）入院期間の短縮；（ｖｉｉ）被験体の生存率の増加；（ｖｉｉｉ）癌の進行および／または癌に関連する症状の抑制；（ｉｘ）別の治療の治療効果の増強または改善；（ｘ）癌細胞集団の減少または排除；（ｘｉ）腫瘍または新生物の成長の減少；（ｘｉｉ）腫瘍サイズの減少；（ｘｉｉｉ）腫瘍形成の減少；（ｘｉｖ）原発性癌、局所癌、および／または転移癌の根絶、除去、または制御；（ｘｖ）転移数または転移サイズの減少；（ｘｖｉ）死亡率の低下；（ｘｖｉｉ）患者の無癌生存率の増加；（ｘｖｉｉｉ）無再発生存期間の増加；（ｘｉｘ）寛解患者数の増加；（ｘｘ）入院率の低下；（ｘｘｉ）腫瘍サイズが維持されており、当業者が利用可能な従来の方法（ＭＲＩ、Ｘ線、およびＣＡＴスキャンなど）によって測定した場合に、治療後に腫瘍サイズが増加しないか、腫瘍サイズの増加が５％または１０％未満であること；（ｘｘｉｉ）癌の発症もしくは発病および／または癌に関連する症状の防止；（ｘｘｉｉｉ）患者の寛解期間の延長；（ｘｘｉｖ）癌に関連する症状の数の減少；（ｘｘｖ）癌患者の無症状生存期間の延長；および／または（ｘｘｖｉ）転移の制限または減少。いくつかの実施形態では、被験体が受ける処置／治療により、癌は治癒しないが、この疾患の進行または悪化が防止される。ある実施形態では、被験体が受ける処置／治療により、癌の発病／発症は防止されないが、癌の症状の発生を防止することができる。
【００３６】
本明細書中で使用する場合、被験体への治療の実施の文脈での用語「組み合わせて」は、１つを超える治療の使用を指す。用語「組み合わせて」の使用は、被検体に施される治療の順序を制限しない。第１の治療を、被験体に第２の治療を実施する前に（例えば、５分前、１５分前、３０分前、４５分前、１時間前、２時間前、４時間前、６時間前、１２時間前、２４時間前、４８時間前、７２時間前、９６時間前、１週間前、２週間前、３週間前、４週間前、５週間前、６週間前、８週間前、または１２週間前）、同時に、または後に（例えば、５分後、１５分後、３０分後、４５分後、１時間後、２時間後、４時間後、６時間後、１２時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後、９６時間後、１週間後、２週間後、３週間後、４週間後、５週間後、６週間後、８週間後、または１２週間後）実施することができる。
【００３７】
２つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列の文脈における用語「同一の」または「同一」率は、以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用するか、手作業のアラインメントおよび目視による調査によって測定した場合、比較ウィンドウまたは指定領域にわたって最大限に一致するように比較およびアラインメントしたときに同一であるか、同一であるアミノ酸残基またはヌクレオチドの特定の比率（すなわち、例えば、全ポリペプチド配列または特定の領域（示す場合）の特定の領域にわたって６０％同一、任意選択的に、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一）を有する２つ以上の配列または部分配列を指す。かかる配列を、その後、「実質的に同一である」という。
【００３８】
配列比較のために、１つの配列が参照配列の役割を果たし、この配列と試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じて部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムのパラメータを指定する。デフォルトプログラムパラメータを使用することができるか、代替パラメータを指定することができる。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて参照配列と比較した試験配列についての配列同一率を計算する。
【００３９】
「比較ウィンドウ」は、本明細書中で使用される場合、ある配列を同数の連続する位置の参照配列と、これらの２つの配列を最適にアラインメントした後に比較することができる、例えば、全長配列または２０〜６００、約５０〜約２００、もしくは約１００〜約１５０個のアミノ酸もしくはヌクレオチドからなる群から選択される連続する位置の数のいずれか１つのセグメントへの言及 を含む。比較のための配列アラインメント方法は、当該分野で周知である。比較のための最適な配列アラインメントを、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０に記載のＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムによって行う。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、国立生物工学情報センター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）と通じて公的に利用可能である。このアルゴリズムは、最初に、データベース配列内の同一の長さのワードとアラインメントしたときにいくつかの正の値の閾値スコアＴと適合するかこれを満たす問い合わせ配列内の長さＷの短いワードを同定することによって高スコアリング配列対（ＨＳＰ）を同定することを含む。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，前出）。これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含むさらに長いＨＳＰを発見するための検索を開始するためのシードとして働く。次いで、このワードヒットは、累積アラインメントスコアを増加させることができる限り、各配列に沿って両方向に延長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメータＭ（一対のマッチ残基の報酬スコア；常に、＞０）およびＮ（ミスマッチ残基のペナルティースコア；常に、＜０）を用いて計算される。アミノ酸配列については、累積スコアを計算するためにスコアリングマトリックスが用いられる。累積アラインメントスコアが、その達成される最大値から量Ｘだけ減少したとき；１つまたは複数の負のスコアの残基アラインメントの蓄積に起因して累積スコアが０またはそれ未満なったとき；あるいは、いずれかの配列の末端に到達したときに、各方向のワードヒットの延長は止まる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、およびＸは、アラインメントの感度および速度を決定づける。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列のためのＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５を参照のこと）、アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を使用する。
【００４０】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２配列間の類似性の統計解析も行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は最小和確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド配列間またはアミノ酸配列間の一致が偶然に起こる確率を示す。例えば、試験核酸と参照核酸を比較した時の最小合計確率が約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、核酸は参照配列に類似していると見なされる。
【００４１】
詳細な説明
被験体における癌を処置のための組成物および方法を本明細書中に開示する。１つまたは複数の、治療ポリペプチドをコードする組換え核酸配列を含む複製ウイルスベクター、具体的には腫瘍崩壊性アデノウイルスベクターを提供する。
【００４２】
導入遺伝子を発現する腫瘍崩壊性アデノウイルス（ＡＶ）は、高い腫瘍崩壊性および免疫原性を示す。したがって、本明細書中に提供した組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルスを感染させた原発性腫瘍に対してだけでなく、転移性疾患の状況における腫瘍に対しても広い活性を有する可能性がある。いくつかの実施形態では、転移性腫瘍にウイルスを直接注入する必要はなく、また原発部位に注入されたウイルスが（例えば、血流を介して）転移部に移動する必要もない。しかし、アデノウイルスからの免疫刺激性導入遺伝子の発現（例えば、ＴＡＶ−２５５（例えば、ＴＡＶ−２５５Δ１９）などの例示的ベクター内のＥ１ｂ  １９Ｋ欠失領域が含まれるが、これに限定されない）に起因して、免疫系は、転移性腫瘍細胞が原発性腫瘍細胞と同一の腫瘍抗原を発現する限り、癌患者の全身で全身的に癌と闘うように刺激されるであろう。転移は原発性腫瘍に由来し、原発腫瘍細胞と遺伝的に非常に類似しているので、いくつかの実施形態では、転移性腫瘍増殖は原発腫瘍と同程度に阻害されるであろう。
【００４３】
本明細書中に記載のアデノウイルスを提供する。別の態様では、本明細書中に記載の組換えアデノウイルスのうちのいずれか１つで形質転換された細胞を提供する。
【００４４】
別の態様では、本明細書中に記載の組換えアデノウイルスのうちのいずれか１つと標的細胞を接触させることを含む、標的細胞内でペプチドを選択的に発現させる方法を提供する。１つの態様では、組換えアデノウイルスは、ペプチド（例えば、ウイルス複製または癌に関連するペプチド）をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたＥ１ａ制御配列欠失変異体を含む。
【００４５】
１つ、２つ、またはそれを超える組換え免疫調節性遺伝子を発現するアデノウイルスベクターとして本発明の腫瘍崩壊性アデノウイルスを利用するアデノウイルス治療法も本明細書中に提供する。腫瘍崩壊性アデノウイルスは、異種遺伝子が感染細胞内で発現するように、ウイルスゲノム内に組み込まれた治療タンパク質をコードする異種遺伝子を含む。治療タンパク質は、本明細書中で使用される場合、所与の細胞内で発現した場合に１つまたは複数の治療上の利点を提供するタンパク質を指す。特に、治療上の利点には、腫瘍に宿主免疫系を補充することが含まれる。
【００４６】
調節領域の改変
Ｅ１ａは、細胞感染時にアデノウイルスによって産生される第１のタンパク質であり、他のアデノウイルスプロモーターを活性化し、感染細胞が細胞分裂に入るのを容易にする。腫瘍選択的調節下でこのタンパク質を発現させることは、ウイルスタンパク質の発現を制限し、腫瘍細胞を腫瘍崩壊させる有効な手段である。
【００４７】
正常細胞は、静止状態から活発な増殖状態に移行することできるようになる前に分裂誘発増殖シグナル（ＧＳ）を必要とする。腫瘍細胞は、腫瘍細胞自体の増殖シグナルの多くを生成するか正常な増殖シグナルを模倣することができ、転写因子（Ｅ２Ｆ１およびＰｅａ３など）はアデノウイルスの感染および複製中のＥ１ａ転写を駆動するのに最適な立体構造の形成において協働することができるレベルにて腫瘍細胞内で一般的に過剰発現される。（Ｈａｎａｈａｎ  Ｄ，Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  ＲＡ．Ｔｈｅ  Ｈａｌｌｍａｒｋｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ．Ｃｅｌｌ  ２０００；１００：５７−７０；ｄｅ  Ｌａｕｎｏｉｔ  Ｙ，Ｃｈｏｔｔｅａｕ−Ｌｅｌｉｅｖｒｅ  Ａ，Ｂｅａｕｄｏｉｎ  Ｃ，Ｃｏｕｔｔｅ  Ｌ，Ｎｅｔｚｅｒ  Ｓ，Ｂｒｅｎｎｅｒ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ＰＥＡ３  Ｇｒｏｕｐ  ｏｆ  ＥＴＳ−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒｓ：Ｒｏｌｅ  ｉｎ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ  ２０００；４８０：１０７−１１６；Ｂｒｕｄｅｒ  ＪＴ，Ｈｅａｒｉｎｇ  Ｐ：Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ＥＦ−１Ａ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｅ１Ａ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ  Ｒｅｇｉｏｎ  Ｍｅｄｉａｔｅｓ  Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  Ｅ１Ａ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｄｕｒｉｎｇ  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  １９９１；６５：５０８４−５０８７）。
【００４８】
Ｅ１ａエンハンサー領域内のＥ２Ｆ１部位およびＰｅａ３部位の結合部位を選択的に標的にする小さな欠失は、Ｅ１ａエンハンサー領域を転写が制限されるプロモーターエレメントと完全に置換するよりも代替的で破壊性の低い方法である。腫瘍細胞で見出される過剰な転写因子に起因して、Ｅ１ａエンハンサー領域の協同的結合および転写のために最適化された立体構造が依然として生じ得る一方で、正常な非分裂細胞において、結合部位の破壊は、分裂誘発増殖シグナルレベルの制限下において最適な立体構造を形成する能力をさらに阻害するであろう。
【００４９】
したがって、Ｐｅａ３結合部位を介してアデノウイルスベクターを操作する方法を本明細書中に開示する。Ｅ１ＡＦとしても公知の（あるいは、本来は、Ｅ１ａコアモチーフに対するＥＦ−１Ａ−エンハンサー結合因子として公知の）５つのＰｅａ３転写因子結合部位は、個別の部位および対の部位の特異的欠失によって証明されるように、Ｅ１ａｍＲＮＡの産生レベルに異なる影響を及ぼす。マウスＰｅａ３部位は、本明細書中で、Ｐｅａ３部位Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、およびＶと記載している。Ｐｅａ３の主な結合部位は部位ＩおよびＩＩＩであり、一方、部位ＩＩ、ＩＶ、およびＶは、わずかに縮重したバージョンである。Ｐｅａ３は、部位ＩＩと部位ＩＩＩ、部位ＩＶと部位Ｖ、および部位ＩＩと部位Ｉとの間で協同的に結合し、この協同的結合によってＥ１ａ転写が活性化される。（例えば、Ｈｅａｒｉｎｇ（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ６５，１９９１，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ９，１９８９およびＮｕｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２０，１９９２を参照のこと）。Ｐｅａ３自体は、αサブユニットおよびβサブユニットの両方の二量体であり、αサブユニットは一次ＤＮＡに接触し、βサブユニットは溶液中または二量体結合部位の両方でβサブユニットとヘテロ多量体複合体を形成する。通常の感染状態の間に、部位ＩおよびＩＩＩでの結合、それに続く部位ＩＩでの協同的結合により、Ｅ１ａ  ｍＲＮＡ発現を完全に活性化するためにこのタンパク質／ＤＮＡ複合体を活性化転写因子（ＡＴＦ）結合部位およびＴＡＴＡボックスに近づけるのに役立つ立体構造の変化が起こるであろう。２つの親和性がより低い部位であるＰｅａ３  ＩＶおよびＰｅａ３  ５は、これらが離れすぎているか、占有されていない可能性があるので、これらの通常の環境下では活性化にあまり寄与しないようである。部位ＩＩの欠失によって転写活性が最も低下することから、おそらく立体構造の変化による、転写活性化において部位ＩＩが部位ＩＩＩおよびＩに対して有する協同的結合効果の重要性を暗示している。部位ＩＩＩまたはＩのいずれかの欠失による活性の低下ははるかに低く、これはおそらく部位ＩＩと残存する部位ＩＩＩまたはＩとの間に依然として協同的結合が存在し得るからである。部位ＩおよびＩＩＩの両方（ＩＩではない）の欠失は、Ｐｅａ３部位ＩＩ欠失のみで認められるレベルまで転写を低下させ、部位ＩＩＩおよびＩＩの両方、または部位ＩＩおよびＩの両方の欠失の組み合わせも類似の（しかし、超えない）レベルで低下させる。
【００５０】
部位ＩＩＩおよびＩＩを含む領域の欠失により、部位ＩＩに由来するこの協同的結合能力が除去されるが、部位ＩＶおよびＶが移動して部位Ｉに近づきもする。親和性がより低いにもかかわらず、部位ＩＶおよびＶは協同的結合を示し、これらの部位が移動して部位Ｉに近づくことにより、これら３つの部位での結合が通常は部位Ｉ〜ＩＩＩの結合で起こる立体構造の変化を模倣し、それにより、転写を活性化することができるのかもしれない。部位ＩＶおよびＶは親和性がより低い部位であるので、正常細胞の周囲のこの転写因子では、活性化するために欠失構築物上に完全に結合するには十分ではないかもしれないが、しかし、いくつかの刊行物では腫瘍の進行および浸潤性を伴うＥ１ＡＦ／Ｐｅａ３レベルの増加が報告されており（すなわち、Ｈｏｒｉｕｃｈｉ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  ２００３  Ａｕｇ；２００（５）：５６８−７６）、これは、腫瘍細胞が部位Ｉと共に親和性のより低い結合部位ＩＶおよびＶに結合するのに十分なＥ１ＡＦを有し、それにより、この欠失ウイルスを使用して正常細胞ではなく腫瘍内のＥ１ａの転写を活性化するのに必要な立体構造の変化を生じる可能性があることを示している。
【００５１】
本発明は、複製アデノウイルスを提供する。いくつかの実施形態では、本発明の複製ベクターは、内因性アデノウイルス初期プロモーターによって調節され、それにより、複製欠損ウイルスで一般的に達成することができる発現レベルよりも有意義に高い発現レベルを駆動する免疫調節性ポリペプチドを発現する組換え（例えば、外因性）導入遺伝子（複数可）を含む。複製アデノウイルスに由来する腫瘍特異的腫瘍崩壊に起因する抗腫瘍有効性の増強に加えて、複製ウイルス内での組換え導入遺伝子由来のより高い発現レベルにより、複製欠損ウイルスにおけるより低い発現レベルを超えて免疫調節効果（複数可）が増強される。
【００５２】
１つの態様では、組換えウイルスは、少なくとも１つのＰｅａ３結合部位またはその機能的部分が欠失している改変Ｅ１ａ制御配列を含む。１つの態様では、成長停止した正常細胞ではなく、腫瘍内のＡｄパッケージングシグナル機能の機能活性およびＥ１ａタンパク質の（ほぼ）最適な転写を維持するために、−３０５〜−１４１の範囲の十分なヌクレオチド数が保持されている。
【００５３】
塩基対−３９４と−２１８との間のＰｅａ３Ｖ、Ｐｅａ３ＩＶ、Ｐｅａ３ＩＩＩ、Ｐｅａ３ＩＩ、および／またはＥ２Ｆ１結合部位の個々または組み合わせの、Ｐｅａ３および／またはＥ２Ｆ１のこれらの部位への結合を阻害し、協同的結合に誘導されるＥ１ａエンハンサー領域の立体構造の変化に関与するように設計されたさらなる欠失または改変もまたこの記載に含まれる。
【００５４】
１つの態様では、Ｐｅａ３ＩＩ、Ｐｅａ３ＩＩＩ、Ｐｅａ３ＩＶ、およびＰｅａ３Ｖ、またはその機能的部分のうちの少なくとも１つが欠失または改変されている（例えば、配列の少なくとも１つのヌクレオチドが変化しているか、さらなるヌクレオチドが配列に挿入されている）。別の態様では、Ｐｅａ３ＩＩおよびＰｅａ３ＩＩＩ、またはその機能的部分のうちの少なくとも１つが欠失または改変されている。１つの態様では、Ｐｅａ３ＩＩまたはその機能的部分、およびＰｅａ３ＩＩＩまたはその機能的部分が欠失または改変されている。別の態様では、Ｐｅａ３ＩＶおよびＰｅａ３Ｖ、またはその機能的部分が欠失または改変されている。別の態様では、Ｐｅａ３Ｉまたはその機能的部分が保持されている。「保持された」は、エレメントが、組換えアデノウイルスベクター内の、好ましくは参照アデノウイルスベクターと同一の位置に存在することを意味する。１つの態様では、少なくとも１つのＥ２Ｆ１結合部位またはその機能的部分が保持されている。
【００５５】
１つの態様では、ベクターは、ｄｌ３０９−６、ＴＡＶ−２５５、ｄｌ５５、ｄｌ２００、ｄｌ２３０、またはｄｌ２００＋２３０である。別の態様では、ベクターは、ＴＡＶ−２５５である。別の態様では、ｄｌ３０９−６、ＴＡＶ−２５５、ｄｌ５５、ｄｌ２００、ｄｌ２３０、ｄｌ２００＋２３０におけるＥ１ａ欠失、または−３９４から−２１８の間のＰｅａ３および／またはＥ２Ｆ１結合部位に影響を及ぼす他のＥ１ａ改変を、３ｋｂ超の外因性ＤＮＡを首尾よくパッケージングし、上に列挙したＥ１ａ欠失を有する組換えアデノウイルスから発現することができるように、Ｅ１ｂ  １９Ｋタンパク質の開始部位とＥ１ｂ  ５５Ｋタンパク質の開始部位との間のおよそ２０２塩基対の欠失と組み合わせて、非ｄｌ３０９ベースのＥ３欠失（ｐＢＨＧ１０で見出されるＥ３欠失（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ、Ａｄ５塩基対（ｂｐ）２８１３３〜３０８１８）、ｄｌ３２７（Ａｄ５  ｂｐ２８５９３〜３０４７０）、または類似のサイズのＥ３欠失など）と対にする。１つの態様では、ベクターは、Ａｄ５の野生型配列（例えば、本明細書中で参照として援用されるＣｈｒｏｂｏｃｚｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９２）Ｊａｎ；１８６（１）：２８０−５を参照のこと）を参照して１つまたは複数の変異（Ｅ３領域内の１０．４Ｋ、１４．５Ｋ、および１４．７Ｋタンパク質のうちの１つまたは複数のコード配列の破壊を含む）を有するｄｌ３０９ベクターである。
【００５６】
１つの態様では、組換えウイルスは、少なくとも１つのＥ１ａイソ型（例えば、Ｅ１ａ−１２ＳまたはＥ１ａ−１３Ｓ）を選択的に発現する。１つの態様では、Ｅ１ａイソ型をコードする配列は、改変Ｅ１ａ制御配列に作動可能に連結されており、少なくとも１つのＰｅａ３結合部位またはその機能的部分が欠損または改変されている。
【００５７】
１つの態様では、組換えウイルスは、ＤＮＡ配列（例えば、Ｅ１ｂ−１９Ｋ挿入部位に挿入された導入遺伝子）を含む。１つの態様では、挿入部位は、Ｅ１ｂ−１９Ｋの開始部位とＥ１ｂ  ５５Ｋの開始部位との間に位置する。別の態様では、挿入部位は、Ｅ１ｂ−１９Ｋの開始部位の後の２０２塩基対の欠失を含む。導入遺伝子（「インサート」ともいう）は、目的の遺伝子の天然全長配列またはそのフラグメントであり得る。導入遺伝子を、Ｋｏｚａｋ配列、終止コドン、または他の制御エレメントを含むように改変することができる。導入遺伝子は、１つまたは複数のエンドヌクレアーゼ制限部位を含み得る。
【００５８】
別の態様では、発現導入遺伝子は、改変Ｅ１ａ制御配列に作動可能に連結されており、少なくとも１つのＰｅａ３結合部位またはその機能的部分が改変または欠失されている。導入遺伝子は、アデノウイルスのＥ１、Ｅ２、Ｅ３、および／またはＥ４領域内に位置することができるが、その発現は、内因性上流アデノウイルスプロモーターのＥ１ａ媒介活性化によって制御され、それにより、Ｅ１ａ媒介ウイルス複製中のみで高レベルで導入遺伝子が発現する。
【００５９】
特定の実施形態では、導入遺伝子は、Ｅ３領域内に位置する。外因性導入遺伝子を、アデノウイルスＥ３領域の１つまたは複数の欠失領域に挿入することができ、一般に、かかる導入遺伝子は、その発現が内因性Ｅ３プロモーターによって調節されるように、アデノウイルスベクターに挿入されている（Ｌｕｏ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００８：１４  ２４５０−２４５７）。これにより、ウイルス複製期間中にＥ３プロモーターのみが転写活性になるので、これらの期間中に特異的に発現する導入遺伝子が高レベルで発現される。ウイルス複製を感染腫瘍細胞に制限するための改変アデノウイルス骨格（本明細書中に記載のＥ１ａエンハンサー改変など）を使用して、導入された導入遺伝子由来の発現はまた、通常は正常細胞ではなく感染腫瘍細胞に制限される。ある実施形態では、Ｅ３領域全体またはＥ３領域のかなりの部分が欠失している。
【００６０】
特定の実施形態では、導入遺伝子は、Ｅ４領域内に位置する。アデノウイルスのＥ３領域またはＥ１領域内の欠失領域への外因性導入遺伝子の挿入と類似の様式で、アデノウイルスのＥ４領域内に、ウイルス増殖特性に有意な影響を及ぼさずに欠失することができる領域が存在する（Ｇａｏ，ＧＰ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  １９９６：７０；８９３４−８９４３）。一般に、アデノウイルスベクターのＥ４領域の残部に少なくともＯＲＦ３および／またはＯＲＦ６が保持される。外来導入遺伝子をＥ４領域内のこれらの欠失のうちの１つに挿入し、アデノウイルスの内因性Ｅ４プロモーターを用いてこの遺伝子の発現を駆動し、それにより、ウイルス複製が起こると予想される条件にこの遺伝子の高レベル発現を制限することが可能なはずである。
【００６１】
腫瘍指向性組換え免疫調節性ポリペプチドの産生
本明細書中に記載のアデノウイルスを、免疫調節剤または免疫調節性ポリペプチド（例えば、免疫細胞の共刺激シグナルのポリペプチドアゴニスト）を発現するように操作することができる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドアゴニストは、Ｔエフェクター細胞のアゴニストであり、そして／またはポリペプチドアゴニストは、免疫細胞（制御性Ｔ細胞など）の阻害シグナルのポリペプチドアンタゴニストとして機能する。本明細書中に提供される場合、「免疫調節性タンパク質」または「免疫調節性ポリペプチド」には、アデノウイルスによって誘導された抗腫瘍免疫応答を調整する（例えば、刺激する）ことができる任意のポリペプチドまたはポリペプチドのセットが含まれる。一般に、「免疫調節性ポリペプチド」は、所望の免疫賦活活性を含む。免疫調節性ポリペプチドは、アデノウイルスによって誘導された抗腫瘍免疫応答を調整することができる多量体（例えば、二量体）（例えば、リンカーの有無に関わらずｐ４０およびｐ３５から形成されたＩＬ−１２二量体）を形成することができる、連結または非連結のポリペプチドのセットが含まれる得る。免疫調節性ポリペプチドは、天然に存在する全長タンパク質、あるいは全長タンパク質の免疫調節活性の少なくとも約９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、もしくは１０％を保持するその融合物、バリアント、またはフラグメントであり得る。
【００６２】
本明細書中で使用する場合、用語「アゴニスト（複数可）」は、別の分子に結合し、生体反応の増加を誘導する分子（複数可）を指す。１つの特定の実施形態では、アゴニストは、細胞上の受容体に結合し、１つまたは複数のシグナル伝達経路を始動または刺激する分子である。例えば、アゴニストには、細胞上の受容体に結合し、１つもしくは複数のシグナル伝達経路を誘導する抗体またはリガンドが含まれ得る。他の実施形態では、アゴニストは、未変性リガンドの未変性受容体との相互作用を容易にする。本明細書中で使用する場合、用語「アンタゴニスト（複数可）」は、任意選択的に非依存性の生物学的応答自体を誘発することなく別の分子の作用を阻害する分子（複数可）を指す。１つの特定の実施形態では、アンタゴニストは、細胞上の受容体に結合し、アゴニストの生物学的活性を遮断または低下させる分子である。例えば、アンタゴニストには、細胞上の受容体に結合し、任意選択的に１つまたは複数のシグナル伝達経路を誘導することなく未変性リガンドの細胞への結合を遮断もしくは低下させる抗体またはリガンドが含まれ得る。アンタゴニストの別の例には、細胞上の未変性の受容体と未変性リガンドへの結合を競合し、したがって、未変性受容体が未変性リガンドに結合したときに誘導される１つまたは複数のシグナル伝達経路を遮断もしくは低下させる抗体または可溶性受容体が含まれる。アンタゴニストのさらなる例には、細胞上の未変性の受容体と未変性リガンドへの結合を競合するか、受容体内在化を遮断し、したがって、未変性受容体が未変性リガンドに結合したときに誘導される１つまたは複数のシグナル伝達経路を遮断するか低下させる抗体または可溶性受容体が含まれる。
【００６３】
特定の実施形態では、アデノウイルスによって発現される免疫調節性ポリペプチドは、共刺激性リガンド（例えば、ＧＩＴＲリガンド（ＧＩＴＲＬ）、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）、またはＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ））である。腫瘍微小環境内での１つまたは複数の共刺激性リガンドの発現および同種受容体への特異的結合により、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の活性（かかる活性には、ＴＩＬ増殖およびサイトカイン放出が含まれる）が増加し、それにより、医薬組成物の抗腫瘍活性が増加する。
【００６４】
特定の実施形態では、アデノウイルスによって発現される免疫調節性ポリペプチドは、炎症促進性サイトカイン（例えば、ＧＭＣＳＦ、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、またはＩＬ−１５ハイブリッド（例えば、ＩＬ−１５とＩＬ−１５受容体αとのハイブリッド））である。腫瘍微小環境内での１つまたは複数の炎症促進性サイトカインの発現により炎症環境が腫瘍局在性に増加し、それにより、医薬組成物の抗腫瘍活性が増加し、炎症促進性サイトカインの全身投与による望ましくない影響の減少または排除によって組成物の安全性も増大する。
【００６５】
特定の実施形態では、アデノウイルスによって発現される免疫調節性ポリペプチドは、抑制性サイトカイン（例えば、ＩＬ−１０またはＩＬ−２７）のインヒビター（例えば、「受容体ｔｒａｐ」または「ｔｒａｐ」）である。他の実施形態では、抑制性サイトカインの免疫調節剤／インヒビターは、例えば、ＴＧＦＢまたはＩＬ−１０Ｒに対する抗体である。かかる抑制性サイトカインは、Ｔエフェクター細胞機能を減少させる。腫瘍微小環境内での１つまたは複数の抑制性サイトカイン受容体ｔｒａｐの発現により、抑制性サイトカインへ腫瘍局在性に結合して中和し、それにより、その阻害活性が低下または阻止され、医薬組成物の抗腫瘍活性が増加し、また、全身投与による抑制性サイトカインの遮断という望ましくない影響の減少または排除によって組成物の安全性が増大する。
【００６６】
特定の実施形態では、アデノウイルスによって発現される免疫調節性ポリペプチドは、局在化免疫応答のイニシエーター（例えば、Ｔｏｌｌ様受容体リガンド（ＴＬＲ−５など）を活性化するタンパク質（例えば、分泌型フラジェリン））である。腫瘍微小環境内での１つまたは複数の免疫応答イニシエーターの発現により、腫瘍局在化免疫応答（例えば、ＴＩＬおよび抗原提示細胞（ＡＰＣ）の浸潤）が得られ、医薬組成物の抗腫瘍活性が増加する。
【００６７】
特定の実施形態では、アデノウイルスによって発現される免疫調節性ポリペプチドは、共抑制性チェックポイント分子（例えば、ＣＴＬＡ４）のインヒビター（例えば、抗体アンタゴニスト）である。かかる抑制性チェックポイント分子は、Ｔエフェクター細胞機能を低下させる。活性化Ｔ細胞（例えば、活性化Ｔエフェクター細胞）の表面での１つまたは複数の抑制性チェックポイント分子の発現により、Ｔ細胞の機能活性が減弱される。したがって、腫瘍微小環境内での共抑制性チェックポイント分子のアンタゴニストの発現により、共阻害活性が遮断され、医薬組成物の抗腫瘍活性が増加し、また、全身投与による共抑制性チェックポイント分子の遮断という望ましくない影響の減少または排除によって組成物の安全性が増大する。
【００６８】
特定の実施形態では、アデノウイルスによって発現される免疫調節性ポリペプチドは、分化抗原群（ＣＤ）分子または分化抗原群（ＣＤ）分子のリガンド（ＣＤ２７、例えば、ＣＤ７０など）である。腫瘍微小環境内のＣＤ２７リガンドの発現により、腫瘍局在化ＮＫ媒介性の腫瘍クリアランスが起こり、腫瘍に対する適応免疫応答が促進され、それにより、医薬組成物の抗腫瘍活性が増加する。他の適切なＣＤ分子には、ＣＤ１ｄ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ９、ＣＤ２１、ＣＤ２５、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ５３、ＣＤ５７、ＣＤ６９、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８６、ＣＤ９９、ＣＤ１０３、ＣＤ１３４、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＣＤ１６５、ＣＤ２４４、ＣＤ２６７、ＣＤ２７２、ＣＤ２７３、ＣＤ２７４、ＣＤ２７８、ＣＤ３０５、ＣＤ３１４、ＣＤ３５７、およびＣＤ３６０、もしくはそのリガンド、またはその任意のモジュレーター（例えば、刺激因子またはインヒビター）が含まれる。
【００６９】
特定の実施形態では、アデノウイルスによって発現される免疫調節性ポリペプチドは、表１に提供したポリペプチドから選択される。
【００７０】
【表１】
2020503342.tif 000002
2020503342.tif 000003
【００７１】
本明細書中に記載のアデノウイルスベクターから発現することができる上述のアゴニストについてのさらなる詳細を、以下に提供する。
【００７２】
ＧＩＴＲリガンド
１つの実施形態では、異種遺伝子は、ＴＮＦＳＦ１８（ＧＩＴＲＬとしても公知）などのＧＩＴＲリガンドファミリー遺伝子である（例えば、Ｔｏｎｅ，Ｍ．，Ｔｏｎｅ，Ｙ．，Ａｄａｍｓ，Ｅ．，Ｙａｔｅｓ，Ｓ．Ｆ．，Ｆｒｅｗｉｎ，Ｍ．Ｒ．，Ｃｏｂｂｏｌｄ，Ｓ．Ｐ．，＆  Ｗａｌｄｍａｎｎ，Ｈ．（２００３）．Ｍｏｕｓｅ  ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｌｉｇａｎｄ  ｉｓ  ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｆｏｒ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，１００（２５），１５０５９−１５０６４．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．２３３４９０１１００を参照のこと）。ＧＩＴＲ／ＧＩＴＲＬシグナル伝達経路は、免疫細胞の活性化に関連する（Ｎｏｃｅｎｔｉｎｉ，Ｇ．，Ｒｏｎｃｈｅｔｔｉ，Ｓ．，Ｐｅｔｒｉｌｌｏ，Ｍ．Ｇ．，＆  Ｒｉｃｃａｒｄｉ，Ｃ．（２０１２）．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＧＩＴＲＬ／ＧＩＴＲ  ｓｙｓｔｅｍ：ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ．Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１６５（７），２０８９−９９．ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１４７６−５３８１．２０１１．０１７５３．ｘ）。具体的には、ＧＩＴＲＬタンパク質は、免疫調節活性（調節性Ｔ細胞の抑制活性の阻害およびＴエフェクター細胞の活性化が含まれる）を有する。有効量のＧＩＴＲＬタンパク質の腫瘍内局在化により、免疫系が刺激され、腫瘍が抑制され、それにより、癌を罹患しているヒト被験体に対するより有効なウイルスベースの治療上の処置が得られる。さらに、ＧＩＴＲＬタンパク質の共刺激活性は、アデノウイルスの腫瘍指向性細胞溶解活性との相乗効果を有し、これは腫瘍に対する免疫系の活性化および／または補充ならびに抗原提示の増強に起因する。
【００７３】
ＩＬ−１０  Ｔｒａｐ
１つの実施形態では、異種遺伝子は、ヒト免疫グロブリンＦｃドメインに融合したＩＬ−１０受容体などの操作されたＩＬ−１０ｔｒａｐである。例には、ＩＬ１０ＲＡ−Ｆｃ融合タンパク質またはＩＬ１０ＲＡ−ＩＬ１０ＲＢ−Ｆｃ融合タンパク質が含まれる（例えば、Ｅｃｏｎｏｍｉｄｅｓ，Ａ．Ｎ．，Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，Ｌ．Ｒ．，Ｒｕｄｇｅ，Ｊ．Ｓ．，Ｗｏｎｇ，Ｖ．，Ｋｏｅｈｌｅｒ−Ｓｔｅｃ，Ｅ．Ｍ．，Ｈａｒｔｎｅｔｔ，Ｃ．，…Ｓｔａｈｌ，Ｎ．（２００３）．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｔｒａｐｓ：ｍｕｌｔｉ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ，ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｂｌｏｃｋｅｒｓ  ｏｆ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ａｃｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，９（１），４７−５２．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ８１１を参照のこと）。ＩＬ−１０ファミリーは、炎症誘発性サイトカインおよび共刺激分子の発現の阻害による免疫細胞における炎症応答の阻害に関連する。調節性Ｔ細胞によるＩＬ−１０の発現により、Ｔエフェクター細胞の活性が抑制される（Ｍｏｓｓｅｒ  ＤＭ，Ｚｈａｎｇ  Ｘ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ．２００８  Ｄｅｃ；２２６：２０５−１８．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１０：ｎｅｗ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｏｎ  ａｎ  ｏｌｄ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ）。具体的には、ＩＬ−１０ｔｒａｐタンパク質は、ＩＬ−１０の抗炎症活性の阻害による免疫調節活性を有する。有効量のＩＬ−１０ｔｒａｐタンパク質の腫瘍内局在化により、免疫系が刺激され、腫瘍が阻害され、それにより、癌を罹患しているヒト被験体に対するより有効なウイルスベースの治療上の処置が得られる。さらに、ＩＬ−１０の抗炎症活性のＩＬ−１０ｔｒａｐタンパク質阻害は、アデノウイルスの腫瘍指向性細胞溶解活性との相乗効果を有し、これは腫瘍に対する免疫系の活性化および／または補充ならびに抗原提示の増強に起因する。１つの実施形態では、ＩＬ−１０受容体Ｔｒａｐには、ＩＬ−１０Ｒαの細胞外ドメインの全部または一部およびＩＬ−１０Ｒαが含まれる。
【００７４】
抗ＣＴＬＡ４
１つの実施形態では、異種遺伝子は、ＣＴＬＡ４の機能を阻害する抗体（またはそのドメインもしくはフラグメント）である（例えば、Ｌｅａｃｈ  ＤＲ，Ｋｒｕｍｍｅｌ  ＭＦ，Ａｌｌｉｓｏｎ  ＪＰ．Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｂｙ  ＣＴＬＡ−４  ｂｌｏｃｋａｄｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９６  Ｍａｒ  ２２；２７１（５２５６）：１７３４−６を参照のこと）。ＣＴＬＡ４ファミリーは、リガンドＣＤ８０およびＣＤ８６との相互作用を介したＴ細胞の阻害に関連する（Ｋｒｕｍｍｅｌ  ＭＦ，Ａｌｌｉｓｏｎ  ＪＰ（１９９５）．“ＣＤ２８  ａｎｄ  ＣＴＬＡ−４  ｈａｖｅ  ｏｐｐｏｓｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ”．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２（２）：４５９−６５）。具体的には、抗ＣＴＬＡ４抗体は、ＣＴＬＡ４の阻害機能を遮断し、それにより、Ｔエフェクター細胞をより効率的に活性化する免疫調節活性を有する。有効量の抗ＣＴＬＡ４抗体の腫瘍内局在化により、免疫系が刺激され、腫瘍が抑制され、それにより、癌を罹患しているヒト被験体に対するより有効なウイルスベースの治療上の処置が得られる。さらに、ＣＴＬＡ４のＴ細胞阻害活性の抗ＣＴＬＡ４阻害は、アデノウイルスの腫瘍指向性細胞溶解活性との相乗効果を有し、これは腫瘍に対する免疫系の活性化および／または補充ならびに抗原提示の増強に起因する。
【００７５】
ＩＬ−１２：
１つの実施形態では、異種遺伝子は、ＩＬ−１２などのインターロイキンサイトカインファミリーのメンバーである。ＩＬ−１２サイトカインファミリーは、ＩＦＮγの誘導およびＴ細胞依存性免疫の媒介に関連する。具体的には、ＩＬ−１２は、強い抗血管新生作用を有する免疫賦活性サイトカインである。ＩＬ−１２は、免疫調節活性（細胞増殖、リンパ球分化、およびＮＫ細胞活性化が含まれる）を有する。有効量のＩＬ−１２の腫瘍内局在化により、Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）が分化、増殖し、ＩＦＮγおよびＩＬ−２の産生を引き起こすＴヘルパー１（Ｔｈ１）の応答が維持され、それにより、Ｔ細胞応答およびマクロファージ活性化が促進される。有効量の、腫瘍内注射由来のＩＬ−１２の局所発現は、全身投与およびＩＬ−１２の高血清レベルに伴う副作用よりも安全上の利点を得ることができる。さらに、ＩＬ−１２によるナチュラルキラー細胞およびＴ細胞によって媒介される免疫賦活活性および細胞傷害性の誘導は、本発明者らのアデノウイルスの腫瘍指向性の細胞溶解活性および免疫刺激活性との相乗効果を有することができ、それにより、癌を罹患しているヒト被験体に対するより有効なウイルスベースの治療上の処置が得られる。１つの実施形態では、ＩＬ−１２ポリペプチドは、４５ｂｐリンカーによって連結されたＩＬ−１２サブユニットｐ３５およびｐ４０の融合物である（ＩＬ−１２β：ｐ４０（ＮＭ＿００１３０３２４４）およびＩＬ−１２α：ｐ３５（ＮＭ＿００８３５１．１）が含まれる）。
【００７６】
ＧＭ−ＣＳＦ：
１つの実施形態では、異種遺伝子は、コロニー刺激因子２（ＣＳＦ２）としても公知の顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）などのサイトカインである。サイトカインは、免疫および炎症を媒介および制御する分泌型のタンパク質またはペプチドである。具体的には、ＧＭ−ＣＳＦは、免疫アジュバントとして機能する免疫調節活性を有し、ＤＣおよびＡＰＣの増殖因子として作用して免疫系の発達を容易にする。有効量のＧＭ−ＣＳＦの局在化分泌により、腫瘍処置の炎症部位に免疫細胞が補充されて樹状細胞（ＤＣ）の成熟および機能ならびにマクロファージ活性が増加し、それにより、癌を罹患しているヒト被験体に対するより有効な治療上の処置が得られる。さらに、ＧＭ−ＣＳＦは、癌ワクチンと組み合わせたときに持続性の特異的抗腫瘍免疫を誘導することができることが証明されており、このことは潜在的に本発明者らのアデノウイルスの腫瘍指向性細胞溶解活性との相乗効果を提供する。最近の第ＩＩＩ相臨床試験では、ＧＭ−ＣＳＦで補強した腫瘍崩壊性単純ヘルペスウイルス（Ｔ−ＶＥＣ）は、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質のみと比較して、進行性黒色腫患者において持続的奏効率を示した。
【００７７】
分泌型フラジェリン：
１つの実施形態では、異種遺伝子は、フラジェリンをコードする遺伝子などのサルモネラファミリーのグラム陰性細菌に由来する。フラジェリンなどの細菌タンパク質は、炎症誘発性サイトカインの産生および共刺激分子の上方制御をもたらす先天性免疫応答の活性化に関連する。具体的には、フラジェリンはＴＬＲ５アゴニストであり、分泌型フラジェリンのＴＬＲ５への結合により、ＴＮＦαの産生を刺激し、ＡＰＣおよびＴＩＬの局所腫瘍環境への浸潤を誘導する。強力なアジュバントとして作用することにより、フラジェリンは、強力な適応免疫応答を誘発するように免疫系を刺激し、それにより、免疫応答を増強し、その範囲を広げることができ、癌を罹患しているヒト被験体に対するより有効なウイルスベースの治療上の処置が得られる。いくつかの実施形態では、分泌型フラジェリンは、マウスＩＬ−２シグナル配列（ＮＭ＿００８３６６を参照のこと）およびサルモネラフラジェリン（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｄ１３６８９）を含む。
【００７８】
ＴＮＦαおよび非切断性ＴＮＦα
１つの実施形態では、異種遺伝子は、ＴＮＦαの非切断性（膜結合型、膜貫通）形態などの操作されたＴＮＦαリガンドファミリー遺伝子である（例えば、Ｌｉ  Ｑ，Ｌｉ  Ｌ，Ｓｈｉ  Ｗ，Ｊｉａｎｇ  Ｘ，Ｘｕ  Ｙ，Ｇｏｎｇ  Ｆ，Ｚｈｏｕ  Ｍ，Ｅｄｗａｒｄｓ  ＣＫ  ３ｒｄ，Ｌｉ  Ｚ．，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００６：５５，１４７０−９を参照のこと）。ＴＮＦαは、炎症促進性サイトカインファミリーに属する（Ｃａｌｃｉｎｏｔｔｏ  Ａ，Ｇｒｉｏｎｉ  Ｍ，Ｊａｃｈｅｔｔｉ  Ｅ，Ｃｕｒｎｉｓ  Ｆ，Ｍｏｎｄｉｎｏ  Ａ，Ｐａｒｍｉａｎｉ  Ｇ，Ｃｏｒｔｉ  Ａ，Ｂｅｌｌｏｎｅ  Ｍ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ＴＮＦα  ｔｏ  ｎｅｏａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｖｅｓｓｅｌｓ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒｓ  ａｎｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｔｈｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２；１８８：２６８７−９４）。具体的には、腫瘍微小環境内でのＴＮＦαの発現は、炎症環境を増加させ、それにより抗腫瘍免疫応答を増加させると予想される。非切断性ＴＮＦαを使用すると、膜に結合したままの繋留型のＴＮＦαが得られる。有効量のＴＮＦαタンパク質の腫瘍内局在化により、免疫系が刺激され、腫瘍の成長が抑制され、それにより、癌を罹患しているヒト被験体に対するより有効なウイルスベースの治療上の処置が得られる。さらに、局所発現は、ＴＮＦαの全身投与よりも安全上の利点を得ることができる。さらに、膜結合型ＴＮＦαタンパク質の免疫調節活性は、アデノウイルスの腫瘍指向性細胞溶解活性との相乗効果を有し、これは腫瘍に対する免疫系の活性化および／または補充ならびに抗原提示の増強に起因する。
【００７９】
ＯＸ４０Ｌ
１つの実施形態では、異種遺伝子は、ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ２５２とも呼ばれる）などのＯＸ４０Ｌファミリー遺伝子である（例えば、Ｄａｎｎｕｌｌ  Ｊ，Ｎａｉｒ  Ｓ，Ｓｕ  Ｚ，Ｂｏｃｚｋｏｗｓｋｉ  Ｄ，ＤｅＢｅｃｋ  Ｃ，Ｙａｎｇ  Ｂ，Ｇｉｌｂｏａ  Ｅ，Ｖｉｅｗｅｇ  Ｊ．Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｍＲＮＡ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ＯＸ４０  ｌｉｇａｎｄ．Ｂｌｏｏｄ．２００５，１０５：３２０６−１３を参照のこと）。ＴＮＦＳＦは、免疫細胞の活性化に関連する（Ｃｒｏｆｔ  Ｍ，Ｓｏ  Ｔ，Ｄｕａｎ  Ｗ，Ｓｏｒｏｏｓｈ  Ｐ．Ｔｈｅ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ＯＸ４０  ａｎｄ  ＯＸ４０Ｌ  ｔｏ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ．２００９；２２９：１７３−９１）。具体的には、ＯＸ４０Ｌは、Ｔ細胞を活性化させるＴＮＦＲＳＦ４（ＯＸ４０、ＣＤ１３４）の共刺激リガンドである。腫瘍微小環境内でのＯＸ４０Ｌの発現およびその同種受容体（ＯＸ４０）への結合は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の活性（増殖、サイトカイン放出）を増加させ、それにより、抗腫瘍活性が得られると予想される。有効量のＯＸ４０Ｌタンパク質の腫瘍内局在化により、免疫系が刺激され、腫瘍の成長が抑制され、それにより、癌を罹患しているヒト被験体に対するより有効なウイルスベースの治療上の処置が得られる。局所発現は、ＯＸ４０Ｌの全身投与よりも安全上の利点を得ることができる。さらに、ＯＸ４０Ｌタンパク質の免疫調節活性は、アデノウイルスの腫瘍指向性細胞溶解活性との相乗効果を有し、これは腫瘍に対する免疫系の活性化および／または補充ならびに抗原提示の増強に起因する。
【００８０】
ＩＬ−７
１つの実施形態では、異種遺伝子は、ＩＬ−７などのＩＬ−７サイトカインファミリー遺伝子である（例えば、Ｇａｏ  Ｊ，Ｚｈａｏ  Ｌ，Ｗａｎ  ＹＹ，Ｚｈｕ  Ｂ．，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  Ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＬ−７  ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｓｃｉ．２０１５，１６：１０２６７−８０を参照のこと）。ＩＬ−７は、炎症促進性サイトカインファミリーに属する（Ｇｅｉｓｅｌｈａｒｔ  ＬＡ，Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ  ＣＡ，Ｇｒｅｇｏｒｉｏ  ＴＡ，Ｍｏｕ  Ｓ，Ｓｕｂｌｅｓｋｉ  Ｊ，Ｋｏｍｓｃｈｌｉｅｓ  ＫＬ．ＩＬ−７  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ａｌｔｅｒｓ  ｔｈｅ  ＣＤ４：ＣＤ８  ｒａｔｉｏ，ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｎｕｍｂｅｒｓ，ａｎｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１；１６６：３０１９−２７）。具体的には、腫瘍微小環境内でのＩＬ−７の発現は、炎症環境を増加させ、それにより抗腫瘍免疫応答を増加させると予想される。有効量のＩＬ−７タンパク質の腫瘍内局在化により、免疫系が刺激され、腫瘍の成長が抑制され、それにより、癌を罹患しているヒト被験体に対するより有効なウイルスベースの治療上の処置が得られる。さらに、ＩＬ−７タンパク質の免疫調節活性は、アデノウイルスの腫瘍指向性細胞溶解活性との相乗効果を有し、これは腫瘍に対する免疫系の活性化および／または補充ならびに抗原提示の増強に起因する。
【００８１】
ＣＤ４０Ｌ
１つの実施形態では、異種遺伝子は、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ４０ＬＧまたはＣＤ１５４としても公知）などのＴＮＦスーパーファミリーのメンバーである（例えば、Ｈａｓｓａｎ  ＧＳ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５．“Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＣＤ１５４  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．”Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ  Ｒｅｖ  ４  １（５）：４３１−４０を参照のこと）。ＣＤ４０Ｌは、抗原提示細胞上に発現されるＣＤ４０のリガンドである。具体的には、ＣＤ４０Ｌタンパク質は、Ｔ細胞依存性免疫応答の活性化に重要な共刺激活性を有する（Ｓｏｔｏｍａｙｏｒ  ＥＭ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９．“Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ＣＤ４＋  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｏ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｐｒｉｍｉｎｇ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ４０．”Ｎａｔ  Ｍｅｄ．５：７８０−７８７；Ｆｒｅｎｃｈ  ＲＲ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９．“ＣＤ４０  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｅｖｏｋｅｓ  ａ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｈａｔ  ｅｒａｄｉｃａｔｅｓ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ａｎｄ  ｂｙｐａｓｓｅｓ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｈｅｌｐ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ．５：５４８−５５３）。有効量のＣＤ４０タンパク質の腫瘍内局在化により、免疫系が活性化され、腫瘍が溶解し、それにより、癌を罹患しているヒト被験体に対するより有効なウイルスベースの治療上の処置が得られる。さらに、ＣＤ４０タンパク質の共刺激性免疫調節活性は、アデノウイルスの腫瘍指向性細胞溶解活性との相乗効果を有し、それにより、腫瘍に対する局所および全身の免疫応答が得られる。
【００８２】
ＩＬ−１５およびＩＬ−１５ハイブリッド
１つの実施形態では、異種遺伝子は、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）などのサイトカインファミリー遺伝子である（例えば、Ｄｉ  Ｓａｂａｔｉｎｏ  Ａ，ｅｔ．ａｌ．，２０１１  “Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＩＬ−１５  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｎｄ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ”．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．２２（１）：１９−３３．；Ｓｔｅｅｌ  ＪＣ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，“Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１５  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ”．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．３３（１）：３５−４１を参照のこと）。ＩＬ−１５は、Ｔ細胞およびＮＫ細胞の活性化および増殖を制御するサイトカインである（Ｗａｌｄｍａｎｎ  ＴＡ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）．“Ｔｈｅ  ｍｕｌｔｉｆａｃｅｔｅｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１５  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｉｓ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｉｎ  ＮＫ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｈｏｓｔ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐａｔｈｏｇｅｎｓ”．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：１９−４９）。具体的には、ＩＬ−１５タンパク質は、抗原の非存在下で記憶Ｔ細胞を維持するための生存シグナルを提供することによって免疫調節活性を有する。ＩＬ−１５はまた、ＣＤ８＋Ｔ細胞の抗腫瘍免疫を増強することが示されている（Ｋｌｅｂａｎｏｆｆ  ＣＡ  ｅｔ  ａｌ．，“ＩＬ−１５  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｈｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ＣＤ８＋  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１（７）：１９６９−７４；およびＴｅａｇｕｅ  ＲＭ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１５  ｒｅｓｃｕｅｓ  ｔｏｌｅｒａｎｔ  ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  ｔｕｍｏｒｓ”Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１２（３）：３３５−４１を参照のこと）。ＩＬ−１５ハイブリッド分子（ＩＬ−１５受容体αに連結したＩＬ−１５、Ｔｏｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏｓ  ＯＮＥ  ９（１０）：ｅ１０９８０１（２０１４）を参照のこと）の発現により、生物活性が安定化および増加する（Ｂｅｒｇａｍａｓｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８．“Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１５  ｗｉｔｈ  Ｉｔｓ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  α  ｄｕｒｉｎｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌｅａｄｓ  ｔｏ  Ｍｕｔｕａｌ  Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  Ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ”，ＪＢＣ，２８３（７）：４１８９−９９；Ｂｅｒｇａｍａｓｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３．“Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ＩＬ−１５  ｅｘｉｓｔｓ  ａｓ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｗｉｔｈ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ＩＬ−１５Ｒα  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｍｏｕｓｅ  ｓｅｒｕｍ”，Ｂｌｏｏｄ  １２０（１）：ｅ１）。有効量のＩＬ−１５タンパク質の腫瘍��局在化により、免疫系が活性化され、腫瘍が溶解し、それにより、癌を罹患しているヒト被験体に対するより有効なウイルスベースの治療上の処置が得られる。さらに、ＩＬ−１５タンパク質によって提供される生存シグナルは、アデノウイルスの腫瘍指向性細胞溶解活性との相乗効果を有し、それにより、腫瘍に対する局所および全身の免疫応答が得られる。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５ハイブリッドには、ＩＬ−１５、Ｐ２Ａ、およびＩＬ−１５Ｒα、ＩＬ−１５（ＮＭ＿００８３５７）、６８ｂｐ  Ｐ２Ａ、およびＩＬ−１５Ｒα（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＣ１３２２３３．１）が含まれる。
【００８３】
ＣＤ７０
１つの実施形態では、異種遺伝子は、ＣＤ７０（ＴＮＦＳＦ７またはＣＤ２７Ｌとしても公知）などのＴＮＦスーパーファミリーのメンバーである。（例えば、Ｄｅｎｏｅｕｄ  Ｊ  ａｎｄ  Ｍｏｓｅｒ  Ｍ．，２０１１．“Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＣＤ２７／ＣＤ７０  ｐａｔｈｗａｙ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ．”Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ．８９（２）：１９５−２０３を参照のこと）。ＣＤ７０は、活性化されたＴ細胞およびＢ細胞上、ならびに成熟樹状細胞上に発現し、ＣＤ２７のリガンドとして作用する。ＣＤ７０は、Ｔ細胞の増殖および分化の促進において共刺激的役割を果たす（Ｋｅｌｌｅｒ  ＡＭ  ｅｔ  ａｌ．，２００８．“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｌｉｇａｎｄ  ＣＤ７０  ｏｎ  ｓｔｅａｄｙ−ｓｔａｔｅ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｂｒｅａｋｓ  ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ａｎｄ  ｐｅｒｍｉｔｓ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ，”Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２９（６）：９３４−４６；Ｂｏｎｅｈｉｌｌ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８．“Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｃｏ−ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＣＤ４０Ｌ，ＣＤ７０  ａｎｄ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ＴＬＲ４  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｍＲＮＡ，”Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．１６（６）：１１７０−８０）。さらに、腫瘍微小環境内のＣＤ７０発現は、ＮＫ媒介性の腫瘍クリアランスを増加させ、腫瘍に対する適応免疫応答を促進するであろう（Ｋｅｌｌｙ  ＪＭ  ｅｔ  ａｌ．，２００２．“Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｍｅｍｏｒｙ  ｂｙ  ＮＫ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｕｍｏｒ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ，”Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３（１）：８３−９０）。有効量のＣＤ７０タンパク質の腫瘍内局在化により、免疫系が活性化され、腫瘍が溶解し、それにより、癌を罹患しているヒト被験体に対するより有効なウイルスベースの治療上の処置が得られる。さらに、ＣＤ７０タンパク質の免疫調節活性は、アデノウイルスの腫瘍指向性細胞溶解活性との相乗効果を有し、それにより、腫瘍に対する局所および全身の免疫応答が得られる。
【００８４】
１つの特定の実施形態では、アデノウイルスによって発現される免疫細胞の共刺激シグナルのアゴニストは、免疫細胞によって発現される共刺激性受容体のアゴニストである。アデノウイルスによって発現され得る共刺激性受容体の具体例には、糖質コルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳまたはＣＤ２７８）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−ＩＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ４０、ＣＤ２２６、細胞傷害性Ｔ細胞分子および制御性Ｔ細胞分子（ＣＲＴ  ＡＭ）、細胞死受容体３（ＤＲ３）、リンホトキシン−β受容体（ＬＴＢＲ）、膜貫通アクチベーターおよびＣＡＭＬインタラクター（ＴＡＣＩ）、Ｂ細胞活性化因子受容体（ＢＡＦＦＲ）、およびＢ細胞成熟タンパク質（ＢＣＭＡ）が含まれる。１つの特定の実施形態では、免疫細胞によって発現される共刺激性受容体のアゴニストは、共刺激性受容体に特異的に結合する抗体（またはその抗原結合フラグメント）またはリガンドである。１つの実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。別の実施形態では、抗体はｓｃ−Ｆｖである。１つの特定の実施形態では、抗体は、免疫細胞上の２つの受容体に結合する二重特異性抗体である。１つの実施形態では、二重特異性抗体は、免疫細胞上のある受容体および癌細胞上の別の受容体に結合する。特定の実施形態では、抗体は、ヒト抗体またはヒト化抗体である。ある実施形態では、リガンドまたは抗体は、キメラタンパク質である。
【００８５】
１つの特定の実施形態では、免疫細胞の阻害シグナルのアンタゴニストは、免疫細胞によって発現される抑制性受容体のアンタゴニストである。抑制性受容体の具体例には、細胞傷害性Ｔ−リンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ−４またはＣＤ５２）、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１またはＣＤ２７９）、Ｂリンパ球およびＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）、Ｔ−細胞膜タンパク質３（ＴＩＭ３）、アデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ａＲ）、免疫グロブリンおよびＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）、白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）、およびＣＤ１６０が含まれる。１つの特定の実施形態では、免疫細胞によって発現される抑制性受容体のアンタゴニストは、共刺激性受容体に特異的に結合する抗体（またはその抗原結合フラグメント）である。
【００８６】
抗体には、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、合成抗体、キメラ抗体、ポリクローナル抗体、単一ドメイン抗体、ラクダ抗体またはラクダ化抗体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、ジスルフィド結合二重特異性Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、細胞内抗体、および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、抗体に対する抗Ｉｄ抗体および抗抗Ｉｄ抗体が含まれる）、ならびに上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントが含まれるが、これらに限定されない。特に、抗体には、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性なフラグメントが含まれる。免疫グロブリン分子は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡｌ、およびＩｇＡ２）、またはサブクラスであり得る。１つの特定の実施形態では、抗体は、ヒト抗体またはヒト化抗体である。別の特定の実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体またはｓｃＦｖである。ある実施形態では、抗体は、ヒトまたはヒト化されたモノクローナル抗体またはｓｃＦｖである。他の特定の実施形態では、抗体は二重特異性抗体である。ある実施形態では、二重特異性抗体は、免疫細胞の共刺激性受容体または免疫の抑制性受容体、および癌細胞上の受容体に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、免疫細胞上の２つの受容体（例えば、免疫細胞上の２つの共刺激性受容体、免疫細胞上の２つの抑制性受容体、または免疫細胞上の１つの共刺激性受容体および免疫細胞上の１つの抑制性受容体）に特異的に結合する。
【００８７】
本明細書中に記載の組換えＡＶを、免疫細胞（例えば、Ｔ−リンパ球、ＮＫ細胞、または抗原提示細胞（例えば、樹状細胞またはマクロファージ）など）の共刺激シグナルの任意のアゴニストおよび／または阻害シグナルの任意のアンタゴニストを発現するように操作することができる。特定の実施形態では、アゴニストおよび／またはアンタゴニストは、免疫細胞のヒト共刺激シグナルのアゴニストおよび／または免疫細胞のヒト阻害シグナルのアンタゴニストである。ある実施形態では、共刺激シグナルのアゴニストは、免疫細胞（例えば、Ｔ−リンパ球（例えば、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ−リンパ球）、ＮＫ細胞、および／または抗原提示細胞（例えば、樹状細胞またはマクロファージ）など）上に見出される共刺激分子（例えば、共刺激性受容体）のアゴニストである。共刺激分子の具体例には、糖質コルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳまたはＣＤ２７８）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−ＩＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ４０、リンホトキシンα（ＬＴα）、ＬＩＧＨＴ（リンホトキシン様、誘導性発現を示し、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質ＤとＨＶＥＭ（Ｔリンパ球によって発現される受容体）を競合する）、ＣＤ２２６、細胞傷害性Ｔ細胞分子および制御性Ｔ細胞分子（ＣＲＴ  ＡＭ）、細胞死受容体３（ＤＲ３）、リンホトキシン−β受容体（ＬＴＢＲ）、膜貫通アクチベーターおよびＣＡＭＬインタラクター（ＴＡＣＩ）、Ｂ細胞活性化因子受容体（ＢＡＦＦＲ）、およびＢ細胞成熟タンパク質（ＢＣＭＡ）が含まれる。特定の実施形態では、アゴニストは、免疫細胞のヒト共刺激性受容体のアゴニストである。ある実施形態では、共刺激性受容体のアゴニストは、ＩＣＯＳのアゴニストではない。いくつかの実施形態では、アンタゴニストは、免疫細胞（例えば、Ｔ−リンパ球（例えば、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ−リンパ球）、ＮＫ細胞、および／または抗原提示細胞（例えば、樹状細胞またはマクロファージ）など）上に見出される抑制分子（例えば、抑制性受容体）のアンタゴニストである。抑制分子の具体例には、細胞傷害性Ｔ−リンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ−４またはＣＤ５２）、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１またはＣＤ２７９）、Ｂリンパ球およびＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）、Ｔ−細胞膜タンパク質３（ＴＩＭ３）、ＣＤ１６０、アデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ａＲ）、免疫グロブリンおよびＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）、白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）、およびＣＤ１６０が含まれる。特定の実施形態では、アンタゴニストは、免疫細胞のヒト抑制性受容体のアンタゴニストである。
【００８８】
１つの特定の実施形態では、共刺激性受容体のアゴニストは、共刺激性受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントである。共刺激性受容体の具体例には、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＣＤ４０、ＬＴα、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ２２６、ＣＲＴ  ＡＭ、ＤＲ３、ＬＴＢＲ、ＴＡＣＩ、ＢＡＦＦＲ、およびＢＣＭＡが含まれる。ある特定の実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。他の特定の実施形態では、抗体はｓｃ−Ｆｖである。１つの特定の実施形態では、抗体は、免疫細胞上の２つの受容体に結合する二重特異性抗体である。他の実施形態では、二重特異性抗体は、免疫細胞上のある受容体および癌細胞上の別の受容体に結合する。特定の実施形態では、抗体は、ヒト抗体またはヒト化抗体である。
【００８９】
別の実施形態では、アデノウイルスによって発現される共刺激性受容体のアゴニストは、共刺激性受容体のリガンドである。ある実施形態では、リガンドは、未変性リガンドのフラグメントである。未変性リガンドの具体例には、ＩＣＯＳＬ、Ｂ７ＲＰ１、ＣＤ１３７Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、ヘルペスウイルス侵入メディエーター（ＨＶＥＭ）、ＣＤ８０、およびＣＤ８６が含まれる。未変性リガンドをコードするヌクレオチド配列および未変性リガンドのアミノ酸配列は、当該分野で公知である。例えば、Ｂ７ＲＰ１（ＩＣＯＳＬとして公知；ＧｅｎＢａｎｋ  ｈｕｍａｎ：ＮＭ＿０１５２５９．４、ＮＰ＿０５６０７４．１  ｍｕｒｉｎｅ：ＮＭ＿０１５７９０．３、ＮＰ＿０５６６０５．１）、ＣＤ１３７Ｌ（ＧｅｎＢａｎｋ  ｈｕｍａｎ：ＮＭ  ００３８１１．３、ＮＰ  ００３８０２．１、ｍｕｒｉｎｅ：ＮＭ  ００９４０４．３、ＮＰ  ０３３４３０．１）、ＯＸ４０Ｌ（ＧｅｎＢａｎｋ  ｈｕｍａｎ：ＮＭ＿００３３２６．３、ＮＰ＿００３３１７．１、ｍｕｒｉｎｅ：ＮＭ＿００９４５２．２、ＮＰ＿０３３４７８．１）、ＣＤ７０（ＧｅｎＢａｎｋ  ｈｕｍａｎ：ＮＭ＿００１２５２．３、ＮＰ＿００１２４３．１、ｍｕｒｉｎｅ：ＮＭ＿０１１６１７．２、ＡＡＤ００２７４．１）、ＣＤ８０（ＧｅｎＢａｎｋ  ｈｕｍａｎ：ＮＭ＿００５１９１．３、ＮＰ＿００５１８２．１、ｍｕｒｉｎｅ：ＮＭ＿００９８５５．２、ＮＰ＿０３３９８５．３）、およびＣＤ８６（ＧｅｎＢａｎｋ  ｈｕｍａｎ：ＮＭ＿００５１９１．３、ＣＡＧ４６６４２．１、ｍｕｒｉｎｅ：ＮＭ＿０１９３８８．３、ＮＰ＿０６２２６１．３）のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、ＧｅｎＢａｎｋで見出すことができる。他の実施形態では、リガンドは、未変性リガンドの誘導体（例えば、全長ポリペプチドのフラグメント、ドメイン、融合物、または他の改変物）である。いくつかの実施形態では、リガンドは、共刺激性受容体に特異的に結合する未変性リガンドの少なくとも一部または未変性リガンドの誘導体および異種アミノ酸配列を含む融合タンパク質である。特定の実施形態では、融合タンパク質は、共刺激性受容体に特異的に結合する未変性リガンドの少なくとも一部または未変性リガンドの誘導体および免疫グロブリンのＦｃ部分またはそのフラグメントを含む。リガンド融合タンパク質の例は、免疫グロブリンのＦｃ部分に融合した４−ＩＢＢリガンドである（Ｍｅｓｅｃｋ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０１１  ３４：１７５−８２に記載）。
【００９０】
別の実施形態では、アデノウイルスによって発現される抑制性受容体のアンタゴニストは、抑制性受容体のための未変性リガンドに特異的に結合し、未変性リガンドが抑制性受容体に結合して阻害シグナル（複数可）を伝達するのを遮断する抗体（または抗原結合フラグメント）または可溶性受容体である。抑制性受容体のための未変性リガンドの具体例には、ＰＤＬ−１、ＰＤＬ−２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＶＥＭ、Ｇａｌ９、およびアデノシンが含まれる。未変性リガンドに結合する抑制性受容体の具体例には、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＢＴＬＡ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、およびＡ２ａＲが含まれる。
【００９１】
特定の実施形態では、アデノウイルスによって発現される抑制性受容体のアンタゴニストは、抑制性受容体のための未変性リガンドに特異的に結合し、未変性リガンドが抑制性受容体に結合して阻害シグナル（複数可）を伝達するのを遮断する可溶性受容体である。ある実施形態では、可溶性受容体は、未変性リガンド（例えば、未変性の抑制性受容体の細胞外ドメインまたは抑制性受容体の誘導体）に特異的に結合する未変性の抑制性受容体のフラグメントまたは未変性の抑制性受容体の誘導体のフラグメントである。いくつかの実施形態では、可溶性受容体は、未変性の抑制性受容体の少なくとも一部または未変性の抑制性受容体の誘導体（例えば、未変性の抑制性受容体の細胞外ドメインまたは未変性の抑制性受容体の誘導体）および異種アミノ酸配列を含む融合タンパク質である。特定の実施形態では、融合タンパク質は、未変性の抑制性受容体の少なくとも一部または未変性の抑制性受容体の誘導体、および免疫グロブリンのＦｃ部分またはそのフラグメントを含む。可溶性受容体融合タンパク質の例は、ＬＡＧ３−Ｉｇ融合タンパク質である（Ｈｕａｒｄ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９５）２５：２７１８−２１に記載）。
【００９２】
特定の実施形態では、アデノウイルスによって発現される抑制性受容体のアンタゴニストは、抑制性受容体のための未変性リガンドに特異的に結合し、未変性リガンドが抑制性受容体に結合して阻害シグナル（複数可）を伝達するのを遮断する抗体（または抗原結合フラグメント）である。ある特定の実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。他の特定の実施形態では、抗体はｓｃＦｖである。特定の実施形態では、抗体は、ヒト抗体またはヒト化抗体である。抑制性リガンドに対する抗体の具体例は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体である（Ｉｗａｉ  Ｙ，ら  ＰＮＡＳ  ２００２；９９：１２２９３−１２２９７）。
【００９３】
別の実施形態では、アデノウイルスによって発現される抑制性受容体のアンタゴニストは、抑制性受容体に結合するが、阻害シグナル（複数可）を伝達しない抗体（または抗原結合フラグメント）またはリガンドである。抑制性受容体の具体例には、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ１、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、およびＡ２ａＲが含まれる。ある特定の実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。他の特定の実施形態では、抗体はｓｃＦｖである。特定の実施形態では、抗体は、ヒト抗体またはヒト化抗体である。抑制性受容体に対する抗体の具体例は、抗ＣＴＬＡ−４抗体である（Ｌｅａｃｈ  ＤＲ，ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９６；２７１：１７３４−１７３６）。抑制性受容体に対する抗体の別の例は、抗ＰＤ−１抗体である（Ｔｏｐａｌｉａｎ  ＳＬ，ＮＥＪＭ  ２０１２；２８：３１６７−７５）。
【００９４】
ある実施形態では、本明細書中に記載のキメラアデノウイルスは、ＣＴＬＡ−４のアンタゴニスト（例えば、イプリムマブまたはトレメリムマブなど）を産生するように操作されている。ある実施形態では、本明細書中に記載のキメラアデノウイルスは、ＰＤ１のアンタゴニスト（例えば、ＭＤＸ−１１０６（ＢＭＳ−９３６５５８）、ＭＫ３４７５、ＣＴ−０１１、ＡＭＰ−２２４、またはＭＤＸ−１１０５など）を発現するように操作されている。ある実施形態では、本明細書中に記載のキメラアデノウイルスは、ＬＡＧ３のアンタゴニスト（例えば、ＩＭＰ３２１など）を発現するように操作されている。ある実施形態では、本明細書中に記載のキメラアデノウイルスは、Ｂ７−Ｈ３に結合する抗体（例えば、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント、すなわち、ｓｃＦｖ）（例えば、ＭＧＡ２７１など）を発現するように操作されている。特定の実施形態では、本明細書中に記載のキメラアデノウイルスは、免疫細胞の共刺激シグナルのアゴニストおよび／または免疫細胞の阻害シグナルのアンタゴニストを発現するように操作されている。特定の実施形態では、本明細書中に記載のアデノウイルスは、抗ＣＤ２８  ｓｃＦｖ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ１３７Ｌ、ＧＩＴＲＬ、および／またはＣＤ７０を発現するように操作されている。
【００９５】
ある実施形態では、アデノウイルスによって発現される免疫細胞の共刺激シグナルのアゴニストは、共刺激性受容体のそのリガンドへの結合によって誘導される１つまたは複数のシグナル伝達経路を（例えば、選択的に）誘導する。特定の実施形態では、共刺激性受容体のアゴニストは、共刺激性受容体の１つまたは複数のそのリガンドへの結合によって誘導される１つまたは複数のシグナル伝達経路を、アゴニストの非存在下での共刺激性受容体の１つまたは複数のそのリガンドへの結合によって誘導される１つまたは複数のシグナル伝達経路と比較して、少なくとも２５％、３０％、４０％＞、５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％、または２５％〜５０％、２５％〜７５％、５０％〜７５％、５０％〜９５％、７５％〜９５％、もしくは７５％〜１００％の範囲で誘導する。特定の実施形態では、共刺激性受容体のアゴニストは、（ｉ）共刺激性受容体の１つの特定のリガンドへの結合によって誘導される１つまたは複数のシグナル伝達経路を、アゴニストの非存在下での共刺激性受容体の特定のリガンドへの結合によって誘導される１つまたは複数のシグナル伝達経路と比較して、少なくとも２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％、または２５％〜５０％、２５％〜７５％、５０％〜７５％、５０％〜９５％、７５％〜９５％、もしくは７５％〜１００％の範囲で誘導し；（ｉｉ）共刺激性受容体の１つまたは複数の他のリガンドへの結合によって誘導される１つまたは複数のシグナル伝達経路を、アゴニストの非存在下での共刺激性受容体のかかる１つまたは複数の他のリガンドへの結合によって誘導される１つまたは複数のシグナル伝達経路と比較して、２０％、１５％、１０％、５％、もしくは２％未満、または２％〜５％、２％〜１０％、５％〜１０％、５％〜１５％、５％〜２０％、１０％〜１５％、もしくは１５％〜２０％の範囲で誘導しないか、誘導する。
【００９６】
ある実施形態では、免疫細胞の共刺激シグナルのアゴニストは、共刺激性受容体のそのリガンドへの結合によって誘導される１つまたは複数のシグナル伝達経路を活性化または増強する（例えば、選択的に活性化または増強する）。特定の実施形態では、共刺激性受容体のアゴニストは、共刺激性受容体の１つまたは複数のそのリガンドへの結合によって誘導される１つまたは複数のシグナル伝達経路を、アゴニストの非存在下での共刺激性受容体の１つまたは複数のそのリガンドへの結合によって誘導される１つまたは複数のシグナル伝達経路と比較して、少なくとも２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％、または２５％〜５０％、２５％〜７５％、５０％〜７５％、５０％〜９５％、７５％〜９５％）、もしくは７５％）〜１００％の範囲で活性化または増強する。特定の実施形態では、共刺激性受容体のアゴニストは、（ｉ）共刺激シグナルのアゴニストは、共刺激性受容体の１つの特定のリガンドへの結合によって誘導される１つまたは複数のシグナル伝達経路を、アゴニストの非存在下での共刺激性受容体の特定のリガンドへの結合によって誘導される１つまたは複数のシグナル伝達経路と比較して、少なくとも２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％、または２５％〜５０％、２５％〜７５％、５０％〜７５％、５０％〜９５％、７５％〜９５％、もしくは７５％〜１００％の範囲で活性化または増強し；（ｉｉ）共刺激性受容体の１つまたは複数の他のリガンドへの結合によって誘導される１つまたは複数のシグナル伝達経路を、アゴニストの非存在下での共刺激性受容体のかかる１つまたは複数の他のリガンドへの結合によって誘導される１つまたは複数のシグナル伝達経路と比較して、２０％、１５％、１０％、５％、もしくは２％未満、または２％〜５％、２％〜１０％、５％〜１０％、５％〜１５％、５％〜２０％、１０％〜１５％、もしくは１５％〜２０％の範囲で活性化または増強しないか、活性化または増強する。
【００９７】
いくつかの実施形態では、免疫細胞の阻害シグナルのアンタゴニストは、抑制性受容体のそのリガンドへの結合によって誘導される１つまたは複数のシグナル伝達経路を、（例えば、選択的に）阻害または減少させる。特定の実施形態では、抑制性受容体のアンタゴニストは、抑制性受容体の１つまたは複数のそのリガンドへの結合によって誘導される１つまたは複数のシグナル伝達経路を、アンタゴニストの非存在下での抑制性受容体の１つまたは複数のそのリガンドへの結合によって誘導される１つまたは複数のシグナル伝達経路と比較して、少なくとも２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％、または２５％〜５０％、２５％〜７５％、５０％〜７５％、５０％〜９５％、７５％〜９５％、もしくは７５％〜１００％の範囲で阻害または減少させる。特定の実施形態では、抑制性受容体のアンタゴニストは、（ｉ）抑制性受容体の１つの特定のリガンドへの結合によって誘導される１つまたは複数のシグナル伝達経路を、アンタゴニストの非存在下での抑制性受容体の１つの特定のリガンドへの結合によって誘導される１つまたは複数のシグナル伝達経路と比較して、少なくとも２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％、または２５％〜５０％、２５％〜７５％、５０％〜７５％、５０％〜９５％、７５％〜９５％、もしくは７５％〜１００％の範囲で阻害または減少させ；（ｉｉ）抑制性受容体の１つまたは複数の他のリガンドへの結合によって誘導される１つまたは複数のシグナル伝達経路を、アンタゴニストの非存在下での抑制性受容体のかかる１つまたは複数の他のリガンドへの結合によって誘導される１つまたは複数のシグナル伝達経路と比較して、２０％、１５％、１０％、５％、もしくは２％未満、または２％〜５％、２％〜１０％、５％〜１０％、５％〜１５％、５％〜２０％、１０％〜１５％、もしくは１５％〜２０％の範囲で阻害または減少させないか、阻害または減少させる。
【００９８】
特定の実施形態では、免疫細胞の共刺激シグナルのアゴニストおよび／または免疫細胞の阻害シグナルのアンタゴニストは、１つまたは複数の免疫の活性、機能、または応答を誘導、活性化、および／または増強する。１つまたは複数の免疫の活性、機能、または応答は、例えば、抗体応答（体液性応答）または細胞性免疫応答（例えば、サイトカイン分泌（例えば、インターフェロン−γ）、ヘルパー活性、または細胞傷害性）の形態であり得る。１つの実施形態では、免疫細胞上の活性化マーカー（例えば、ＣＤ４４、グランザイム、またはＫｉ−６７）の発現、免疫細胞上の共刺激性受容体（例えば、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＯＸ４０、またはＣＤ２７）の発現、共刺激性受容体のリガンド（例えば、Ｂ７ＨＲＰ１、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＯＸ４０Ｌ、またはＣＤ７０）の発現、サイトカイン分泌、免疫細胞（例えば、Ｔ−リンパ球、Ｂリンパ球、および／またはＮＫ細胞）の腫瘍への浸潤、抗体産生、エフェクター機能、Ｔ細胞活性化、Ｔ細胞分化、Ｔ細胞増殖、Ｂ細胞分化、Ｂ細胞増殖、および／またはＮＫ細胞増殖は、免疫細胞の共刺激シグナルのアゴニストおよび／または免疫細胞の阻害シグナルのアンタゴニストとの接触後に、誘導、活性化、および／または増強される。別の実施形態では、骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）の腫瘍浸潤および増殖、Ｔｒｅｇの腫瘍浸潤、活性化、および増殖、末梢血ＭＤＳＣおよびＴｒｅｇの細胞数は、免疫細胞の共刺激シグナルのアゴニストおよび／または免疫細胞の阻害シグナルのアンタゴニストとの接触後に抑制される。
【００９９】
ある実施形態では、本明細書中に記載のキメラアデノウイルスは、２つ以上の免疫調節性ポリペプチドを産生するように操作されている。いくつかの実施形態では、キメラアデノウイルスは、第１の免疫調節性ポリペプチドおよび第２の免疫調節性ポリペプチドを産生する。
【０１００】
例えば、第１の免疫調節性ポリペプチドは、共刺激性リガンド、炎症誘発性サイトカイン、抑制性サイトカインのインヒビター、局在化免疫応答のイニシエーター、共抑制性チェックポイント分子のインヒビター、または分化抗原群（ＣＤ）分子のリガンドであり、第２の免疫調節性ポリペプチドは、共刺激性リガンド、炎症誘発性サイトカイン、抑制性サイトカインのインヒビター、局在化免疫応答のイニシエーター、共抑制性チェックポイント分子のインヒビター、または分化抗原群（ＣＤ）分子のリガンドである。
【０１０１】
例えば、第１の免疫調節性ポリペプチドは共刺激性リガンドであり、第２の免疫調節性ポリペプチドは共刺激性リガンドである。
【０１０２】
別の例を挙げると、第１の免疫調節性ポリペプチドは共刺激性リガンドであり、第２の免疫調節性ポリペプチドは炎症促進性サイトカインである。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、２つ以上の免疫調節性ポリペプチドが単一の転写物から発現される。ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターによって決定される単一の転写物から２つ以上のタンパク質を発現するために、第２、第３、第４のコード配列などの発現を駆動するために、配列内リボゾーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列が一般的に使用される。ＩＲＥＳを介して２つのコード配列を連結する場合、第２のコード配列の翻訳発現レベルは、しばしば著しく低下する（Ｆｕｒｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ８：８６４−８７３）。実際に、同一のプロモーターに作動可能に連結された２つ以上のコード配列の転写を調節するためのＩＲＥＳの使用により、プロモーターに隣接するコード配列と比較して、第２、第３のコード配列などの発現レベルを低下させることができる。さらに、ＩＲＥＳ配列は、ベクターの完全なパッケージングに影響を及ぼすのに十分な長さであり得る（例えば、ｅＣＭＶ  ＩＲＥＳの長さは、５０７塩基対である）。
【０１０４】
配列内リボゾーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントは、ピコルナウイルスｍＲＮＡで最初に発見された（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１５：４７７−８３）およびＪａｃｋｓｏｎ  ａｎｄ  Ｋａｍｉｎｓｋｉ，ＲＮＡ（１９９５）１：９８５−１０００）。当業者によって一般に使用されているＩＲＥＳの例には、表Ｉおよび添付書類Ａに引用されたＩＲＥＳ、ならびに米国特許第６，６９２，７３６号に記載のＩＲＥＳが含まれる。当該分野で公知の「ＩＲＥＳ」の例には、ピコルナウイルスから得たＩＲＥＳ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）およびウイルスまたは細胞のｍＲＮＡ供給源から入手可能なＩＲＥＳ（例えば、免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）（Ｈｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：６１７８−６１９０）、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ−２）、およびインスリン様成長因子（ＩＧＦＩＩ）、翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｇおよび酵母転写因子ＴＦＩＩＤおよびＨＡＰ４、Ｎｏｖａｇｅｎから市販されている脳心筋炎ウイルス（ｅｎｃｅｐｈｅｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）（ＥＭＣＶ）（Ｄｕｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ６６：１６０２−９）、およびＶＥＧＦのＩＲＥＳ（Ｈｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：６１７８−９０）など）が含まれるが、これらに限定されない。カルジオウイルス、ライノウイルス、アフトウイルス、ＨＣＶ、フレンドマウス白血病ウイルス（ＦｒＭＬＶ）、およびモロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）などの異なるウイルスにおけるＩＲＥＳも報告されている。本明細書中で使用される場合、ＩＲＥＳ配列の機能的異形がシストロンの開始コドンへの直接的な内部リボゾーム進入を促進することができる限り、「ＩＲＥＳ」は、この異形を含む。ＩＲＥＳは、哺乳動物、ウイルス、または原生動物のＩＲＥＳであり得る。ＩＲＥＳは、下流シストロンの開始コドンへの直接的な内部リボゾーム進入を促進し、それにより、ｃａｐ非依存性に翻訳する。したがって、下流シストロン産物を、ポリタンパク質の切断やモノシストロニックｍＲＮＡの生成を必要とせずにバイシストロン性（またはマルチシストロン性）ｍＲＮＡから発現させることができる。配列内リボゾーム進入部位は、およそ４５０ヌクレオチド長であり、一次配列の中程度の保存および二次構造の強い保存を特徴とする。ＩＲＥＳの最も重要な一次配列の特徴は、その開始がＩＲＥＳの３’末端のおよそ２５ヌクレオチド上流に位置付けられているピリミジンリッチ部位である。Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）を参照のこと。ピコルナウイルスＩＲＥＳの３つの主なクラスが同定されており、以下のように特徴付けられている：カルジオウイルスおよびアフトウイルスクラス（例えば、脳心筋炎ウイルス、Ｊａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０．Ｇｅｎｅ  Ｄｅｖ  ４：１５６０−１５７２）；エンテロウイルスおよびライノウイルスクラス（例えば、ポリオウイルス、Ｂｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４．ＥＭＢＯ  Ｊ．１３：３１４９−３１５７）；およびＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）クラス（Ｇｌａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３．Ｖｉｒｏｌ  １９３：８４２−８５２）。最初の２つのクラスについて、以下の２つの一般原則を適用する。第１に、ＩＲＥＳの４５０−ヌクレオチド配列のほとんどが、リボソーム結合および翻訳開始に役立つ特定の二次構造および三次構造を維持するように機能する。第２に、リボソーム進入部位は、ＩＲＥＳの３’末端（保存オリゴピリミジントラクトのおよそ２５ヌクレオチド下流）に位置するＡＵＧトリプレットである。リボソーム進入部位（カルジオウイルス）または次の下流ＡＵＧ（エンテロウイルス／ライノウイルスクラス）のいずれかで翻訳が開始され得る。アフトウイルスにおいては、両方の部位で翻訳が開始される。ＨＣＶおよびペスチウイルス（ウシウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）またはブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）など）は、３４１ｎｔ長および３７０ｎｔ長の５’−ＵＴＲをそれぞれ有する。これらの５’−ＵＴＲフラグメントは、類似するＲＮＡ二次構造を形成し、中程度に効率的なＩＲＥＳ機能を有し得る（Ｔｓｕｋｉｙａｍａ−Ｋｏｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１４７６−１４８３；Ｆｒｏｌｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８．ＲＮＡ  ４：１４１８−１４３５）。最近の研究では、フレンド−マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）５’−ＵＴＲおよびラットレトロトランスポゾンウイルス様３０Ｓ（ＶＬ３０）配列の両方がレトロウイルス起源のＩＲＥＳ構造を含むことが示されている（Ｔｏｒｒｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ７：６０３−６１２）。真核細胞では、翻訳は、通常は、開始因子の調節下でのキャップ化されたｍＲＮＡ５’末端からのリボソームスキャニングによって開始される。しかし、いくつかの細胞ｍＲＮＡは、キャップ非依存性翻訳を媒介するためのＩＲＥＳ構造を有することが見出されている（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｅｌｄｅ，ｅｔ  ａｌ．，１９９９．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３１：８７−１０６）。ＩＲＥＳエレメントの例には、免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）（Ｍａｃｅｊａｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１．Ｎａｔｕｒｅ  ３５３：９０−９４）、ショウジョウバエのアンテナペディアｍＲＮＡ（Ｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２．Ｇｅｎｅ  ａｎｄ  Ｄｅｖ  ６：１６４３−１６５３）、線維芽細胞成長因子−２（ＦＧＦ−２）（Ｖａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５：３５−４４）、血小板由来成長因子Ｂ（ＰＤＧＦ−Ｂ）（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：９３５６−９３６２）、インスリン様成長因子ＩＩ（Ｔｅｅｒｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １２６４：４０３−４０８）、および翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｇ（Ｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：６２３−６２６）が含まれるが、これらに限定されない。最近、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）もＩＲＥＳエレメントを有することが見出された（Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：３１１２−３１１９；Ｈｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８．���ｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：６１７８−６１９０）。ＩＲＥＳ配列のさらなる例には、ピコルナウイルスＨＡＶ（Ｇｌａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９３：８４２−８５２）；ＥＭＣＶ（Ｊａｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｍｍｅｒ．１９９０．Ｇｅｎｅ  Ｄｅｖ．４：１５６０−１５７２）；ポリオウイルス（Ｂｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４．ＥＭＢＯ  Ｊ．１３：３１４９−３１５７）；ＨＣＶ（Ｔｓｕｋｉｙａｍａ−Ｋｏｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１４７６−１４８３）；ペスチウイルスＢＶＤＶ（Ｆｒｏｌｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８．ＲＮＡ．４：１４１８−１４３５）；Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ＬＲＶ−１（Ｍａｇａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５：４８８４−４８８９）；レトロウイルス：ＭｏＭＬＶ（Ｔｏｒｒｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：６０３−６１２）、ＶＬ３０、ハーベイマウス肉腫ウイルス、ＲＥＶ（Ｌｏｐｅｚ−Ｌａｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８：１８５５−１８６５）が含まれる。ＩＲＥＳを、当該分野で公知の標準的な組換え方法および合成方法を使用して調製することができる。都合よくクローニングするために、制限部位を、使用されるＩＲＥＳフラグメントの末端で操作することができる。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、２つの免疫調節性ポリペプチドは、個別の転写物（すなわち、第１の転写物および第２の転写物）から発現される。いくつかの実施形態では、２つの転写物は、アデノウイルス内の同一の位置でのＤＮＡ挿入（例えば、両方をＥ１ｂ、Ｅ３、またはＥ４に挿入する）によってコードされる。いくつかの実施形態では、２つの転写物は、アデノウイルス内の異なる位置でのＤＮＡ挿入（例えば、第１の転写物ＤＮＡをＥ１ｂに挿入し、第２の転写物ＤＮＡをＥ３またはＥ４に挿入し、あるいは、第１の転写物ＤＮＡをＥ３に挿入し、第２の転写物ＤＮＡをＥ４に挿入する）によってコードされる。
【０１０６】
本発明の別の態様は、複数の目的の組換え免疫調節性ポリペプチドまたは他のタンパク質（複数可）またはポリペプチドを標的細胞内で発現させるためのウイルスを提供し、ベクターは、第１の組換え免疫調節性ポリペプチドの第１のコード配列、自己プロセシングコード配列、または他の切断コード配列（２Ａ配列もしくは２Ａ様配列またはプロテアーゼ認識部位など）および第２の組換え免疫調節性ポリペプチドの第２のコード配列に作動可能に連結されたプロモーターも含み、自己プロセシング切断配列またはプロテアーゼ認識部位のコード配列は、第１のコード配列と第２のコード配列との間に挿入されている。１つの関連する実施形態では、ウイルスベクターは、上記の発現ベクターを含み、この発現ベクターは、第１の組換え免疫調節性ポリペプチドと第２の組換え免疫調節性ポリペプチドとの間にさらなるタンパク質分解的切断部位をさらに含む。好ましいさらなるタンパク質分解的切断部位は、コンセンサス配列ＲＸＲ／Ｋ−Ｒを有するフューリン切断部位である。
【０１０７】
腫瘍崩壊活性と免疫調節活性との相互作用
腫瘍崩壊ウイルス（ＯＶ）は、元来は癌細胞の単なる標的破壊手段と考えられていた。しかし、現在は、最も有効なＯＶ治療は腫瘍細胞死を宿主抗腫瘍免疫応答の刺激と組み合わせる治療であろうと考えられている。腫瘍細胞中に特定の免疫調節性サイトカインを発現するように操作されたＯＶは、免疫系を癌細胞と戦うように特異的に導くことができるであろう。癌細胞のウイルス溶解の際にこれらのサイトカイン発現を腫瘍関連抗原（ＴＡＡ、すなわち、腫瘍細胞デブリ）の放出と組み合わせることにより、細胞または抗体媒介性の抗腫瘍免疫応答を生じることが可能であろう（Ｌｉｃｈｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ，１４：５５９−５６７）。
【０１０８】
医薬組成物
本発明の医薬組成物は、少なくとも１つの本明細書中に記載の本発明のベクターを含む。さらに、組成物は、少なくとも２つ、３つ、または４つの異なる（すなわち、異なる導入遺伝子を発現する）本発明のベクターを含み得る。ベクターに加えて、医薬組成物はまた、任意の他のベクター（他のアデノウイルスベクターなど）、他の治療的に有効な薬剤、任意の他の薬剤（薬学的に許容され得るキャリア、緩衝液、賦形剤、アジュバント、防腐剤、充填剤、安定剤、または増粘剤など）、および／または任意の成分（例えば、対応するウイルス産物または医薬製品中で見出される成分など）を含み得る。
【０１０９】
本明細書中に記載のベクター（複数可）を、（例えば、医薬組成物中に含めて）任意のヒトまたは動物（癌を有するか癌と診断されたヒトまたは非ヒト動物が含まれるが、これらに限定されない）に投与することができる。１つの実施形態によれば、癌は、鼻咽喉癌、滑膜癌、肝細胞癌、腎癌、結合組織の癌、黒色腫、肺癌、腸癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、脳癌、咽頭癌、口腔癌、肝臓癌、骨の癌、膵臓癌、絨毛癌、ガストリノーマ、クロム親和性細胞腫、プロラクチノーマ、Ｔ細胞白血病／リンパ腫、神経腫、フォンヒッペル・リンダウ病、ゾリンジャー・エリソン症候群、副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、尿管癌、脳癌、乏突起膠腫、神経芽細胞腫、髄膜腫、脊髄腫瘍、骨の癌、骨軟骨腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、原発部位不明の癌、カルチノイド、胃腸管のカルチノイド、線維肉腫、乳癌、パジェット病、子宮頸癌、結腸直腸癌、直腸癌、食道癌、胆嚢癌、頭部癌、眼球の癌、頸部癌、腎臓癌、ウィルムス腫瘍、肝臓癌、カポジ肉腫、前立腺癌、肺癌、睾丸癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、口腔癌、皮膚癌、中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、内分泌性膵臓癌、グルカゴノーマ、膵臓癌、副甲状腺癌、陰茎癌、下垂体癌、軟部組織肉腫、網膜芽細胞腫、小腸癌、胃癌、胸腺癌、甲状腺癌、栄養膜癌、胞状奇胎、子宮癌、子宮内膜癌、膣癌、外陰癌、聴神経腫、菌状息肉症、インスリノーマ、カルチノイド症候群、ソマトスタチン産生腫瘍、歯肉癌、心臓癌、口唇癌、髄膜癌、口腔癌、神経癌、口蓋癌、耳下腺癌、腹膜癌、咽頭癌、胸膜癌、唾液腺癌、舌癌、扁桃腺癌である。本発明のベクターまたは医薬組成物を、動物およびヒトからなる群から選択される任意の真核生物被験体に投与することができ、本発明の１つの好ましい実施形態では、被験体はヒトまたは非ヒト動物である。動物を、ペット、家畜、および生産動物からなる群から選択することができる。
【０１１０】
本発明のアデノウイルスベクター（複数可）を、好ましくは、生物学的に適合する溶液または薬学的に許容され得る送達ビヒクル中に懸濁させて、被験体に投与することができる。適切なビヒクルには、滅菌生理食塩水が含まれる。薬学的に許容され得るキャリアであることが公知であり、且つ、当業者に周知の他の水性および非水性の等張滅菌注射液ならびに水性および非水性の滅菌懸濁液を、この目的のために使用することができる。
【０１１１】
本発明の治療薬を、腫瘍内注射によって導入される液体、ゲル、または懸濁液の形態で腫瘍に直接投与することもできる。皮下ヒト膵臓腺癌異種移植片を保有するマウスの組換えニューカッスル病ウイルス（ｒＮＤＶ）での処置を試験した研究では、静脈内注射よりも腫瘍内注射で良好な腫瘍退縮が認められたことが示された。この研究では、動物に、それぞれ５０μｌ中に５×１０７個の５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）のｒＮＤＶを含む合計で４回の注射を１日おきに腫瘍内注射した（Ｂｕｉｊｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｖｉｒｕｓｅｓ，６：２９８０−２９９８）。同様に、皮下膀胱癌異種移植片を保有するマウスの改変腫瘍崩壊性アデノウイルスでの処置を試験した別の研究では、腫瘍内注射によって腫瘍成長が有意に抑制されることが見出された。この研究では、動物に、１００μｌ中５×１０８感染単位（ＩＦＵ）のウイルスを１日間隔で２回腫瘍内注射した（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ，ｅ１７６０）。第１相試験で高い忍容性が認められたので、Ｐｅｘａ−Ｖｅｃ（ＪＸ−５９４）（腫瘍崩壊性の免疫治療ワクシニアウイルス）は、進行性肝細胞癌（ＨＣＣ）患者のための腫瘍内投与処置として試験されている。この研究デザインでは、患者に、以下の２つの用量レベルのうちの１つを２週間毎に３回腫瘍内注射することになっていた：１×１０８プラーク形成単位（ｐｆｕ）または１×１０９ｐｆｕ（Ｗａｌｔｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｔｅｉｎ，２０１５，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１３１７：３４３−３５７）。
【０１１２】
本発明の腫瘍崩壊性アデノウイルスベクターの単回投与は、治療効果を有し得る。しかし、本発明のいくつかの実施形態では、腫瘍崩壊性アデノウイルスベクターまたは医薬組成物を、処置期間中に数回投与する。腫瘍崩壊性アデノウイルスベクターまたは医薬組成物を、例えば、最初の２週間、４週間、毎月、または処置期間にわたって１〜１０回投与することができる。本発明の１つの実施形態では、最初の２週間、次いで４週間、次いで毎月３〜７回投与し、本発明の特定の実施形態では、最初の２週間、次いで４週間、次いで毎月４回投与する。処置期間は変動してよく、例えば、２〜１２ヶ月、またはそれを超えて継続し得る。
【０１１３】
本発明の有効性を改善するために、いくつかの実施形態では、本発明の治療薬を、アジュバントと共に投与する。適切なアジュバントには、アルミニウム塩（ミョウバン）（水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、および硫酸アルミニウムなど）、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、およびモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）が含まれる。これらのアジュバントは、単独でまたは任意選択的にそれらの全ての組み合わせのいずれかで、ヒトへの投与に適している（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  Ａｄｊｕｖａｎｔ，”Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ  ３２：１７３−１８６（１９９８）（その全体が本明細書中で参照として援用される））。他のアジュバントには、サイトカイン（インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２、およびＩＬ−１２）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）など）、ジ−およびトリ−パルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイン（それぞれ、Ｐａｍ２ＣｙｓおよびＰａｍ３Ｃｙｓ）、ＴＬＲ２アゴニスト、抗顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）抗体、ＲＲ−ＸＳ１５、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（登録商標）、およびＭＡＬＰ−２が含まれる。
【０１１４】
本発明のアデノウイルスベクターを、経口、非経口（例えば、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内）で、鼻腔内滴下によって、または粘膜（鼻、咽頭、および気管支の粘膜など）への適用によって投与することができる。前述のアデノウイルスベクターを、単独または適切な薬学的担体と共に投与することができ、このベクターは、固体または液体（例えば、水性）の形態（錠剤、カプセル、散剤、液剤、懸濁剤、または乳剤など）であり得る。
【０１１５】
本発明の治療薬は、例えば、不活性希釈剤または適切な食用担体と共に経口投与することができ、または硬カプセルまたは軟カプセルに封入することができ、または錠剤に圧縮することができ、または食物に直接組み込むことができる。治療薬の経口投与のために、治療薬を賦形剤と共に組み込み、錠剤、カプセル、エリキシル、懸濁剤、およびシロップなどの形態で使用することができる。コーティングとして、または投薬単位の物理的形態を改変するために、他の様々な材料が存在してよい。
【０１１６】
治療薬を、非経口投与することもできる。これらの活性化合物の溶液または懸濁液を、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合した水中で調製することができる。分散液もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの油中混合物中で調製することができる。例示的な油は、石油、動物、植物、または合成起源のもの、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、または鉱油である。一般に、水、生理食塩水、水性デキストロースおよび関連する糖溶液、ならびにグリコール（プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなど）は、特に注射液にとって好ましい液体担体である。通常の保存および使用条件下では、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するための保存料を含む。
【０１１７】
注射用途に適切な医薬形態には、滅菌水溶液または分散液、および滅菌注射溶液または分散液の即時調製用の滅菌粉末が含まれる。全ての場合において、医薬形態は無菌でなければならず、そして容易に注射可能である程度に流動的でなければならない。医薬形態は製造および保存の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール）、それらの適切な混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒であり得る。
【０１１８】
本発明の治療薬を、エアロゾルの形態で気道に直接投与することもできる。エアロゾルとして使用するために、溶液または懸濁液中の本発明の化合物を、従来のアジュバントを有する適切な噴射剤（例えば、プロパン、ブタン、またはイソブタンのような炭化水素噴射剤）と共に加圧エアロゾル容器に包装することができる。本発明の材料は、ネブライザーまたはアトマイザーなどの非加圧形態で投与することもできる。
【０１１９】
本発明の治療薬は、医学分野の当業者によって決定することができる、過度の有害作用伴わない、または医学的に許容される生理学的作用を伴う治療上の利点を得るために、所望の細胞をトランスフェクトして、十分なレベルの複製ウイルスの組み込みおよび発現を得るのに十分な量で投与することができる。
【０１２０】
治療薬の投薬量は、主に、治療されている状態、患者の年齢、体重、および健康状態などの要因に依存し、したがって、患者によって異なり得る。投薬量は、治療上の利点と任意のウイルス毒性または副作用とのバランスをとるように調整されるであろう。
【０１２１】
本発明はまた、ウイルスから発現された治療用タンパク質の腫瘍塊への送達および腫瘍塊内での分布を増強する方法に関する。例えば、本明細書に記載のアデノウイルスは、任意選択的に本明細書に記載の医薬組成物中で、ウイルスが１つまたは複数の腫瘍細胞に感染して溶解するように腫瘍塊に注射することができる。
【０１２２】
併用療法
本発明のウイルス免疫療法は単独で有効であるが、複数のアデノウイルス免疫療法、または伝統的治療などの任意の他の治療との１つまたは複数のアデノウイルス免疫療法の組み合わせは、どちらか一方を単独で用いるよりも有効であり得る。例えば、併用療法の各薬剤は腫瘍組織において独立して作用することができ、アデノウイルスベクターは細胞を化学療法または放射線療法に対して感作することができ、そして／または化学療法剤はウイルス複製のレベルを増強、もしくは標的細胞の受容体の状態に影響することができる。併用療法の薬剤は、同時にまたは連続的に投与することができる。
【０１２３】
本発明の１つの好ましい実施形態では、方法または使用は、さらに、被験体への同時照射療法の適用を含む。本発明の別の好ましい実施形態では、方法または使用は、さらに、被験体への同時化学療法の適用を含む。本明細書中で使用される場合、「同時」は、本発明の遺伝子治療の前、後、または同時に適用された治療を指す。同時療法の期間は数分から数週間まで変動し得る。いくつかの実施形態では、同時療法は数時間続く。
【０１２４】
併用療法に適切な薬剤には、アファチニブ、オールトランスレチノイド酸、アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、カルボプラチン、カペシタビン、シスプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、シタラビン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エポチロン、エトポシド、フルオロウラシル、５−フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イマチニブ、メクロレタミン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、テモゾロミド、テニポシド、チオグアニン、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビノレルビンが含まれるが、これらに限定されない。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、方法または使用は、さらに、被験体へのベラパミルまたは他のカルシウムチャネル遮断薬の投与を含む。「カルシウムチャネル遮断薬」は、カルシウムチャネルの伝導を破壊する薬物および天然物質のクラスを指し、ベラパミル、ジヒドロピリジン、ガロパミル、ジルチアゼム、ミベフラジル、ベプリジル、フルスピリレン、およびフェンジリンからなる群から選択することができる。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、方法または使用は、さらに、自食被験体への作用誘発剤の投与を含む。自食作用は、リソソーム機構を介した細胞自体の構成要素の分解を含む異化過程を指す。「自食作用誘発剤」は、自食作用を誘発することができる薬剤を指し、ｍＴＯＲインヒビター（例えば、テムシロリムス、シロリムス、エベロリムス、およびリダフォロリムス）、Ｐ１３Ｋインヒビター（例えば、ウォルトマンニン、リチウム、タモキシフェン、クロロキン、バフィロマイシン、およびテモゾロミド）からなる群から選択することができるが、これらに限定されない。本発明の１つの特定の実施形態では、方法は、さらに、被験体へのテモゾロミドの投与を含む。テモゾロミドは、経口テモゾロミドまたは静脈内テモゾロミドのいずれでもよい。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、方法または使用は、さらに、化学療法もしくは抗ＣＤ２０療法の適用、または中和抗体を遮断するための他のアプローチを含む。「抗ＣＤ２０療法」は、ＣＤ２０陽性細胞を死滅させることができる薬剤を指し、リツキシマブおよび他の抗ＣＤ２０モノクローナル抗体からなる群から選択することができる。「中和抗体を遮断するためのアプローチ」は、通常は感染に起因する抗ウイルス抗体の生成を阻害することができ、異なる化学療法薬、免疫調節性物質、コルチコイド、および他の薬物からなる群から選択することができる薬剤を指す。これらの物質は、シクロホスファミド、シクロスポリン、アザチオプリン、メチルプレドニゾロン、エトポシド、ＣＤ４０Ｌ、ＣＴＬＡ４、ＦＫ５０６（タクロリムス）、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、インターロイキン１０、抗ＣＤ８、抗ＣＤ４抗体、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）、および経口アデノウイルスタンパク質からなる群から選択することができるが、これらに限定されない。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、本発明の腫瘍崩壊性アデノウイルスベクターは、腫瘍細胞のビリオン媒介性腫瘍崩壊を誘導し、腫瘍細胞に対するヒト免疫応答を活性化する。いくつかの実施形態では、方法または使用は、さらに、被験体において調節性Ｔ細胞を下方制御することができる物質の、被験体において調節性Ｔ細胞を（例えば、少なくとも１０％、２０％、５０％、７０％、９０％、またはそれを超えて）下方制御する量での投与を含む。「調節性Ｔ細胞を下方制御することができる物質」は、Ｔ−サプレッサー細胞または調節性Ｔ細胞と同定された細胞の数を減少させる薬剤を指す。これらの細胞は、以下の免疫表現型マーカーのうちの１つまたは多数からなると同定されている：ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＦｏｘＰ３＋、ＣＤ１２７−、およびＧＩＴＲ＋。Ｔ−サプレッサー細胞または調節性Ｔ細胞を減少させるかかる薬剤を、抗ＣＤ２５抗体または化学療法薬からなる群から選択することができる。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、方法または使用は、さらに、被験体へのシクロホスファミドの投与を含む。シクロホスファミドは、いくつかの自己免疫障害においても使用されている一般的な化学療法剤である。本発明では、シクロホスファミドを、腫瘍に対する免疫応答を増強するためのウイルス複製およびＮＫ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞のＧＭ−ＣＳＦ誘導刺激の効果を増強するために使用することができる。シクロホスファミドを、静脈内ボーラス用量または低用量経口メトロミック投与として使用することができる。
【０１３０】
キット
本発明は、さらに、本発明の前述の組成物の１つまたは複数の成分を充填した１つまたは複数の容器を含む医薬パックおよびキットに関する。かかる容器（複数可）には、医薬品または生物学的製品の製造、使用、または販売を規制する政府機関によって規定された形式の、前述の政府機関によるヒトへの投与用の製品の製造、使用、または販売の承認を反映させた通知が付随し得る。
【０１３１】
実施例
本発明は、以下の実施例によってさらに説明され、これらの実施例は本発明の特定の実施形態、およびその様々な用途の例示である。本発明のある特定の態様を説明するこれらの例示は、開示の発明の制限を示すこともその範囲を限定することもない。
【０１３２】
別段の指示がない限り、本発明の実施には、細胞培養、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ操作、免疫科学の従来の技術を使用し、これらの技術は、当技術分野の範囲内である。かかる技術は、文献に十分に説明されている。例えば、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ：Ｊ．Ｃｅｌｌｓ（Ｅｄ）．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ．Ｎ．Ｙ．（１９９６）；Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｃ，Ｌ．Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｉｎ：Ｖａｃｃｉｎｅｓ：Ｎｅｗ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｂｌｅｍｓ．Ｒ．Ｗ．Ｅｌｌｉｓ（ｅｄ）Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ．Ｐｐ  ３６３−３９０；Ｇｒａｈａｎ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７：Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ  ａｎｄ  Ｊ．Ｍ．Ｗａｌｋｅｒ（ｅｄｓ）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．ｐｐ  １０９−１２８，１９９１；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９），ａｎｄ  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５），Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓを参照のこと。
【０１３３】
実施例１．ウイルス学および組換え核酸
組換え核酸法、ポリヌクレオチド合成、ならびに微生物の培養および形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）のために標準的な技術を使用する。一般に、酵素反応および精製工程を、製造者の仕様書に従って行う。技術および手順を、一般に、当該分野における従来の方法およびこの文書を通して提供された種々の一般的な参考文献に従って行う（一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ．ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照のこと）。本明細書中で使用した命名法、ならびに分析化学、有機合成化学、および薬学的処方物およびその送達における実験手順、ならびに患者の処置。アデノウイルス変異体の構築方法は、当該分野で一般的に知られている。Ｂｅｔｔ，Ａ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  １９９４  ｖｏｌ：９１，ｐａｇｅｓ  ８８０２−８８０６，Ｍｉｔｔａｌ，Ｓ．Ｋ．，Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．，１９９３，ｖｏｌ：２８，ｐａｇｅｓ  ６７−９０；およびＨｅｒｍｉｓｔｏｎ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｗ．Ｓ．Ｍ．Ｗｏｌｄ，ｅｄ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９を参照のこと。さらに、アデノウイルス５ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ  １０受入番号Ｍ７３２６０として登録されており、ウイルスは、米国メリーランド州ロックビルのアメリカンタイプカルチャーコレクションから受入番号ＶＲ−５で入手可能である。
【０１３４】
ウイルスおよび細胞株
アデノウイルスおよび細胞株は、特に明記しない限り、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（バージニア州マナッサス）から一般的に入手した。以下の実施例で使用した細胞株は、表２に列挙した細胞株のうちの１つまたは複数を含み得る。
【０１３５】
【表２】
2020503342.tif 000004
【０１３６】
ウイルスの精製および定量
ウイルスストックをＨＥＫ−２９３細胞上で増殖させ、カラム精製キット（Ｖｉｒａｐｕｒｅ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）またはＣｓＣｌ勾配遠心分離（Ｔｏｌｌｅｆｓｏｎ，Ａ．，Ｈｅｒｍｉｓｔｏｎ，Ｔ．Ｗ．，ａｎｄ  Ｗｏｌｄ，Ｗ．Ｓ．Ｍ．；“Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣｓＣｌ−ｂａｎｄｅｄ  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｓｔｏｃｋ”ｉｎ  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９，ｐｐ  １−１０，Ｗ．Ｓ．Ｍ．Ｗｏｌｄ，Ｅｄ．に記載の通り）などの標準的方法により精製した。ウイルス粒子を定量するために使用した方法は、例えばＬｅｈｍｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．Ｂ，７３２：４１１−４２３の方法を使用した簡潔なＯＤ２６０／２８０の読み取りに基づく。使用したウイルス濃度範囲において、各試料のＡ２６０ｎｍピーク面積は、試料中のウイルス粒子数に正比例する。各試験試料１ｍｌ当たりのウイルス粒子数は、標準１ｍｌ当たりのウイルス粒子の既知の数に、標準のＡ２６０ｎｍウイルスピーク面積に対する試料のＡ２６０ｎｍウイルスピーク面積の比を掛けることにより計算した。１単位のＡ２６０は、およそ１×１０１２個のウイルス粒子を含む。１ｍｌ当たりのウイルス感染単位（ＩＵ／ｍｌ）を、感染細胞のヘキソン染色（例えば、Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ．（ＴＢＵＳＡ、以前はＣｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．として知られていた）のＡｄｅｎｏ−Ｘ（商標）Ｒａｐｉｄ力価キットを用いて）によって決定した。
【０１３７】
実施例２．生物学的選択
組換えウイルスの初期スクリーニングは、ウイルス増殖に基づく細胞変性効果（ＣＰＥ）が観察されたトランスフェクト済み２９３細胞から救済された単離ウイルスＤＮＡに基づいた。ウイルスＤＮＡを、ＴＡＶ−２５５  Ｅ１ａエンハンサー欠失領域の部位に隣接する配列のＰＣＲベースの検出のための鋳型として使用した。野生型配列は３５０ｂｐのバンドを生成するであろうが、一方で、Ｅｌａエンハンサー欠失を有するＤＮＡは明らかに識別可能な３００ｂｐバンドを生成するだけであろう。さらに、ＩＬ−１２導入遺伝子の内部配列およびＡｄヘキソン配列に特異的なプライマーを使用して、４００ｂｐおよび３ｋｂのＰＣＲ増幅バンドをそれぞれ確認した。これらのバンドは、Ｅ１領域および導入遺伝子インサートまたはｐＡｄＥａｓｙ（商標）プラスミドのみに由来する後期Ａｄ構造タンパク質のいずれかを含む２つの親プラスミドの間の組換えによって生成されたウイルスＤＮＡ中のみに存在するであろう。個別の構築物を、標準的な方法（Ｔｏｌｌｅｆｓｏｎ，Ａ．，Ｈｅｒｍｉｓｔｏｎ，Ｔ．Ｗ．，ａｎｄ  Ｗｏｌｄ，Ｗ．Ｓ．Ｍ．；“Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣｓＣｌ−ｂａｎｄｅｄ  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｓｔｏｃｋ”ｉｎ  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９，ｐｐ  １−１０，Ｗ．Ｓ．Ｍ．Ｗｏｌｄ，Ｅｄ）を使用したＡ５４９細胞または２９３細胞に対する２回のプラーク精製によって単離した。アデノウイルス溶解物の希釈物を使用して、標準的なプラークアッセイにおいてＡ５４９細胞または２９３細胞に感染させた。十分に個別化されたプラークを採取し、同一のプラークアッセイ法を使用して、これらの採取物から２回目の個別のプラークを生成した。２回目のプラーク精製由来の十分に単離されたプラークを純粋と見なし、感染培養物をこれらの精製されたプラークを使用して調製し、これらの培養上清の腫瘍崩壊力および選択性を決定した。
【０１３８】
実施例３．細胞溶解アッセイ
マウスおよびヒト起源の腫瘍細胞株および非腫瘍細胞株の両方において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでウイルスを細胞に感染させ、その後にキットマニュアルの指示の通りに細胞生存率について標準クリスタルバイオレットを用いて腫瘍特異的ウイルス溶解を評価した。
【０１３９】
実施例４．ＤＮＡ配列決定
ヒトＡｄ５ベースの組換えアデノウイルスゲノムＤＮＡのＤＮＡ配列決定を、以下のように行った。Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）のＱｉａ−ａｍｐ（登録商標）血液ＤＮＡ精製キットなどの標準的なカラム精製方法によって、ＴＡＶ−２５５などの組換えアデノウイルスまたはこれらの構築物の他の修飾物からウイルスＤＮＡを精製した。ＰＣＲプライマーを使用して、Ｅ１ａ修飾領域および導入遺伝子インサートを含む領域に及ぶ領域を増幅および単離し、配列決定のためにＣＲＯに送った。また、単離されたＤＮＡを、消化されたＤＮＡの適切なサイズのバンドの検証のために、標準的な制限消化およびＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析によって分析した。Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩプログラム（Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｘ）を用いて配列情報を解析した。
【０１４０】
実施例５．組換えウイルスの構築
基本シャトル移入ベクターは、ｐＸＣ１  ＴＡＶ  ２５５  ｄ１９ｋを含む（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．（２０１５）２２（１）：１７−２２）。このプラスミドは、２つのＰｅａ３結合部位および１つのＥ２Ｆ結合部位が除去されているＥ１ａエンハンサー領域のｂｐ−３０５〜−２５５の欠失を有し、それにより、この欠失を有するアデノウイルスの複製および腫瘍崩壊が感染された腫瘍細胞に制限される（Ｈｅｄｒｕｎ，Ｆ．Ｈ．，Ｓｈａｎｔａｎｕ  Ｋ．，ａｎｄ  Ｒｅｉｄ，Ｔ．（２０１１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １８；７１７−７２３）。このプラスミドはまた、ＳａｌＩ／ＸｈｏＩ消化によってＥ１ｂ  １９ｋ領域および外因性導入遺伝子インサートを欠失可能な部位を含む。消化を用いない場合、Ｅ１ｂ  １９ｋ領域の大部分はインタクトであるが、機能しない。目的の各導入遺伝子のｃＤＮＡを、合成したか（ＧｅｎｅＡｒｔ（商標））、ＳａｌＩ／ＸｈｏＩ消化したｐＸＣ１  ＴＡＶ２５５プラスミドへの挿入のために５’ＳａｌＩおよび３’ＸｈｏＩ制限配列上に付加したプライマーを使用したＰＣＲによって市販のプラスミド供給源（ＧＥ  ＬｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓまたはＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ（商標））から単離した。改変されたｐＸＣ１  ＴＡＶ２５５遺伝子インサートプラスミドを大腸菌内で増幅させ、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）Ｍａｘｉ−ｐｒｅｐプラスミドキットを使用して精製した。
【０１４１】
組換えアデノウイルスを得るために、ｐＸＣ１  ＴＡＶ２５５遺伝子インサート含有プラスミドを、ｐＢＨＧ１０（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ）と共に、６０ｍｍの細胞皿あたり２〜５μｇのプラスミドＤＮＡ（それにより、両方のプラスミドについて、ｐＸＣ１がモル過剰量で存在するであろう）について、記載のように（Ｂｅｔｔ，Ａ．Ｊ．，Ｈａｄｄａｒａ，Ｗ．，Ｐｒｅｖｅｃ，Ｌ．，ａｎｄ  Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．（１９９４）ＰＮＡＳ  ９１；８８０２−８８０６）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｖｏｌ．３；１６．３０−１６．３６）のリン酸カルシウムトランスフェクションプロトコールを使用して、ＨＥＫ−２９３細胞（ＡＴＣＣ）に同時トランスフェクトした。各プラスミド由来の相同アデノウイルス配列間の組換えにより、前述のＥ１改変およびＥ１ｂ  １９ｋ欠失部位に挿入された特異的導入遺伝子およびｐＢＨＧ１０プラスミドによって供給されたＥ３欠失を含む複製能を有する全長アデノウイルスが生成される。任意選択的に、ｐＢＨＧ１０を、ｐＪＭ１７などのベクターを超える実質的に付加的な有用性を有するアデノウイルスゲノム供給源として提供する（例えば、Ｈｅｄｒｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）を参照のこと）。優先的に、Ｅ３欠失および／または他の改変により、外因性遺伝子のパッケージング能力を、ｐＪＭ１７の能力を超えるように増加させることが可能である。
【０１４２】
別の実施形態では、ヒトＩＬ−１２ウイルスであるＴＲＺ６２７を、ｐＡｄＥａｓｙ（商標）アデノウイルスベクターシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の改変を使用して構築した。第１に、ウイルス増殖が非腫瘍細胞と比較して腫瘍細胞に制限されるようにＥ１Ａのエンハンサー内の５０ヌクレオチドが欠失したｐＸＣＩ−ＴＡＶ  ｄ１９Ｋプラスミド（Ｈｅｄｊｒａｎ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（２０１１）１８，７１７−７２３）由来の配列を、ｐＡｄＥａｓｙ（商標）キットのｐＳｈｕｔｔｌｅ（商標）ベクターにサブクローン化して、ＴＡＶ−２５５ＳｈｕｔｔｌｅＥ１クローニングプラスミドを作出した。ｐＳｈｕｔｔｌｅ内の第１のＰａｃＩ部位（６）と単一のＭｆｅＩ部位（８０７）との間の配列を、５’ＩＴＲ配列（２１）からＭｆｅＩ部位（３８７４）（ｐＳｈｕｔｔｌｅ内の同一のＭｆｅＩ部位に対応する）までのｐＸＣ１  ＴＡＶ  ｄ１９Ｋ配列と置換した。ＰａｃＩクローニング部位を、このフラグメントの５’末端上のＰＣＲによって付加し、それにより、元のｐＳｈｕｔｔｌｅプラスミドに見出されないＡｄ  Ｅ１ａ配列およびＥ１ｂ配列が取り込まれた。Ｅ１ａエンハンサー領域内の５０ｂｐのＴＡＶ−２５５欠失により、Ｐｅａ３ＩＩＩ、Ｐｅａ３ＩＩ、およびＥ２Ｆ転写因子の結合部位が除去され、これは、塩基１９４〜２４４のヒト野生型Ａｄ５配列に相当する。付加した配列は、ＳａｌＩ／ＸｈｏＩクローニング部位をＥ１ｂ  １９ｋコード領域に移入する改変も含んでおり、それにより、Ｅ１ｂ  １９ｋ  ＯＲＦを外因性導入遺伝子インサートと置換するために使用することができ、その発現は、ウイルス複製中にＡｄ  Ｅ１ｂプロモーターによって駆動されるであろう。Ｅ１ｂ  １９ｋ部位にクローン化されたｈＩＬ−１２を含むＰｍｅＩ線状化ｐＴＡＶ−２５５Ｓｈｕｔｔｌｅ  Ｅ１とｐＡｄＥａｓｙベクターとの間の組換えは、既にｐＡｄＥａｓｙプラスミドを含むように改変されているｒｅｃＡ機能保持ＢＪ５１８３細菌株内で生じた。プレートしたカナマイシン耐性コロニーから単離したＤＮＡを、制限消化によって全長ウイルスＤＮＡ組換え体についてスクリーニングした。陽性クローン（ＴＲＺ−６２７、ｈＩＬ−１２）を、その後にＰａｃＩで消化してＡｄ  ＩＴＲを解放し、次いで２９３細胞にトランスフェクトしてウイルスを増幅させた。
【０１４３】
ウイルス複製に起因する細胞変性効果の目視可能な兆候が感染２週間後までに認められたときに感染ＨＥＫ−２９３細胞を回収し、その培地に再懸濁し、３ラウンドの凍結融解によって溶解した。ウイルスを、いくつかの方法（陰イオン交換ＨＰＬＣ（Ｓｈａｂｒａｍ，Ｐ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ（１９９７）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ８；４５３−４６５）またはアフィニティクロマトグラフィまたはサイズ排除メンブレンもしくはカラムに基づいたいくつかの市販のキット（例えば、Ａｄｅｎｏ−Ｘ（商標）Ｍａｘｉ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（登録商標）（Ｔａｋａｒａ），Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｖｉｒａｋｉｔ（登録商標）、Ｖｉｒａｐｕｒ（登録商標））が含まれる）によって溶解物から精製することができる。精製されたウイルスはまた、標準的なプラーク精製法、その後のプラーク精製されたウイルスクローンの再増幅および精製によってクローンを単離することができる。
【０１４４】
実施例６．免疫調節性ポリペプチドをコードする腫瘍崩壊性アデノウイルスベクターを用いた腫瘍容積の減少のｉｎ  ｖｉｖｏでの実証：抗体処置の有無に関わらない単一のウイルス
材料と方法
抗ｍＰＤ−Ｌ１抗体は、例えば、ＢｉｏＸＣｅｌｌ（登録商標）のカタログ番号ＢＥ０１０１（ラットＩｇＧ２ｂ）である。この抗体を、以下の実験で使用した。
【０１４５】
ウイルス試料を、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭトリストリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、および５％グリセロール（ｐＨ８．０）に保存した。バイアルを遮光して−８０℃で保存した。各投薬日に、１つのバイアルを、室温でおよそ２０分間解凍した。単回用量は、１×１０９ｐｆｕである。
【０１４６】
本実施例のマウス腫瘍モデルは、同系免疫適格マウスを使用する。雌Ｊａｃｋｓｏｎ  １２９Ｓ１（１２９Ｓ１／Ｓｖ１ｍＪ）マウスを、本研究で使用した。マウスは、実験１日目に６〜７週齢であった。動物に照射Ｈａｒｌａｎ２９１８．１５げっ歯類用飼料および水を自由に与えた。１時間当たり１００回完全に換気するバブル環境中にＨ．Ｅ．Ｐ．Ａ濾過空気を提供するｂｉｏＢｕｂｂｌｅ（登録商標）クリーンルーム内のＢｅｄ−Ｏ’Ｃｏｂｓ（登録商標）敷料を用いた静置ケージに動物を収容した。全ての処置、体重測定、および腫瘍測定を、バブル環境で行った。この環境を、７０°±２°Ｆの温度範囲および３０〜７０％の湿度範囲に制御した。
【０１４７】
細胞調製
ＡＤＳ−１２細胞を、１％の１００ｍＭピルビン酸ナトリウム、１％の２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１％の１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、１％の４５％グルコース溶液で改変し、１０％非熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％の１００Ｘペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ−グルタミン（ＰＳＧ）を補足したＲＰＭＩ１６４０培地中で成長させた。成長環境を、３７℃の５％ＣＯ２大気を有するインキュベーター中で維持した。増殖が完了したとき、細胞（第７継代）を、０．２５％トリプシン／２．２１ｍＭ  ＥＤＴＡのＨＢＳＳ溶液を使用してトリプシン処理した。細胞剥離後、完全成長培地での希釈によってトリプシンを不活化し、細胞の任意のクランプをピペット操作によって分離した。細胞を２００ｒｃｆにて４℃で８分間遠心分離し、上清を吸引し、ペレットをピペット操作によって冷ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）に再懸濁した。均一な細胞懸濁液のアリコートを、トリパンブルー溶液で希釈し、Ｌｕｎａ自動細胞計数装置を使用して計数した。細胞懸濁液を、２００ｒｃｆにて４℃で８分間遠心分離した。上清を吸引し、細胞ペレットを冷ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）に再懸濁して、１×１０７トリパン排除細胞／ｍｌの最終濃度を得た。移植中、細胞懸濁液を氷上に維持した。移植後、残存細胞のアリコートをトリパンブルー溶液で希釈し、計数して移植後細胞生存率を決定した。移植のために使用した懸濁液（２調製物）の細胞生存率を、表３に列挙する。
【０１４８】
【表３】
2020503342.tif 000005
【０１４９】
試験動物に、１×１０６細胞を含む０．１ｍｌの無血清培地を、固定針を有する２８ゲージインスリン用シリンジを使用して、両側腹部（背中側の脊椎と臀部との間）（右腹側部０日目および左側腹部８日目）に皮下移植した。
【０１５０】
全動物の右側腹部の平均腫瘍負荷量がおよそ８２ｍｍ３（群平均範囲、７５〜９０ｍｍ３）であったときの１５日目の腫瘍負荷量のカリパス測定の推定に基づいて全マウスを研究群に分類した。マウスを、全ての群についての右側腹部の平均腫瘍負荷量が確実に研究集団の全体の平均腫瘍負荷量の１０％以内になるように分配した。
【０１５１】
結果
処置第１日目の実験における全群についての右側の平均推定腫瘍負荷量は８２ｍｍ３であり、実験中の全群は、よく一致していた（群平均範囲、７５〜９０ｍｍ３）。治療開始時の全動物の体重は、少なくとも１３．３ｇであった。第１の処置での群平均体重もよく一致していた（範囲、１５．４〜１８．３ｇ）。５００ｍｍ３の腫瘍負荷量を、右側および左側の腫瘍についての腫瘍成長の遅延による有効性の評価のために選択した。コントロール群（図６Ａ）の腫瘍負荷量の中央値は、右側の腫瘍については４７日目に５００ｍｍ３に到達し、左側の腫瘍については４３日目に到達した。コントロール群についての腫瘍容積の倍加時間の中央値は、右側の腫瘍および左側の腫瘍についてそれぞれ１２．１日および１０．１日であった。コントロール動物は、処置レジメン中に７．３％の平均体重増加を経験した。右側または左側の腫瘍のいずれについてもコントロール群において自発的後退は認められなかったが、しかしながら、左側の腫瘍の５０％は、決して触診限界に到達しなかった。いくつかの実施形態では、触診可能な左側腫瘍を有するマウスを、実験に用いた。この実験では移植が８日間遅延したので、左側の腫瘍は病期分類時に触診不可能であった。研究を通して左側の腫瘍が０のままであったこれらのマウスを、右側と同日に移植した場合に研究から選別して排除できたかもしれない。
【０１５２】
マウスへの接種および腫瘍成長の結果を、図６に示す。一連のグラフは、抗ＰＤ−Ｌ１の有無に関わらず、種々の導入遺伝子を含む腫瘍崩壊ウイルスを用いた担癌マウス（各群においてｎ＝８）の処置を示す。
【０１５３】
図６Ａは、腫瘍成長阻害の関数としての細胞移植（原発性腫瘍）の３８日後の空のウイルス（「ｄ１９ｋ」）と比較した種々の腫瘍崩壊ウイルスの活性を示すグラフである。黒いバーはウイルス単独を表し、斜線のバーはウイルス＋抗ＰＤ−Ｌ１抗体を表す。図６Ｂは、ウイルス緩衝液（黒丸）、空のベクター（青色の四角）、抗ＰＤ−Ｌ１単独（抗体を、１６、２０、２４、および２８日目に投与した、矢印の各対における右側の矢印）、５つのウイルス単独（ＣＴＬＡ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−７、ＣＤ７０、およびＩＬ−１０導入遺伝子を保有するウイルス）の各々、または抗ＰＤ−Ｌ１抗体との組み合わせを注射した腫瘍の経時的な平均腫瘍サイズ（原発性腫瘍）を比較するグラフである。図６Ｃは、３つのさらなるウイルス（ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、およびＧＭ−ＣＳＦ導入遺伝子を保有するウイルス）についての類似のデータを示す。図に示すように、ＩＬ−１２腫瘍崩壊ウイルス処置（単独または抗ＰＤ−Ｌ１抗体との組み合わせ）は、腫瘍成長の低下に最も有効であった。ＣＤ７０、ＩＬ−７、およびＣＴＬＡ−４ウイルスはまた、抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わせた場合に腫瘍容積を有意に低下させることができた。
【０１５４】
以下の図は、原発性腫瘍のみに対するＰＤ−Ｌ１の有無に関わらず導入遺伝子を有する種々のウイルスの有効性（またはその欠如）を示す；各グラフ内の太線は、平均腫瘍容積（ｍｍ３）を示す。ｘ軸上の矢印の対は、ウイルス（腫瘍内、左側の矢印）および使用する場合の抗ＰＤ−Ｌ１抗体（腹腔内、右側の矢印）での処置日を表す。原発性腫瘍についての処置（腫瘍崩壊ウイルス注射）を示し、この処置を以下に示す：６Ｄ、ウイルス緩衝液およびコントロールＩｇＧのみ（左）ならびにウイルス緩衝液および抗ＰＤ−Ｌ１抗体（右）；６Ｅ、ｄ１９ｋ（空のウイルス）およびコントロールＩｇＧのみ（左）ならびにｄ１９ｋおよび抗ＰＤ−Ｌ１抗体（右）；６Ｆ、コントロールＩｇＧ（左）または抗ＰＤ−Ｌ１（右）を用いたＣＴＬＡ−４ウイルス；６Ｇ、コントロールＩｇＧ（左）または抗ＰＤ−Ｌ１抗体（右）を用いたＩＬ−１２ウイルス；６Ｈ、コントロールＩｇＧ（左）または抗ＰＤ−Ｌ１抗体（右）を用いたＧＭ−ＣＳＦウイルス；６Ｉ、コントロールＩｇＧ（左）または抗ＰＤ−Ｌ１抗体（右）を用いたＩＬ−７ウイルス；６Ｊ、コントロールＩｇＧ（左）または抗ＰＤ−Ｌ１抗体（右）を用いたＣＤ４０Ｌウイルス；６Ｋ、コントロールＩｇＧ（左）または抗ＰＤ−Ｌ１抗体（右）を用いたＬ１０ｔｒａｐウイルス；および６Ｌ、コントロールＩｇＧ（左）または抗ＰＤ−Ｌ１抗体を用いたＯＸ４０Ｌウイルス。
【０１５５】
図に示すように、ＩＬ−１２アデノウイルスとの組み合わせ（図６Ｇ）は、腫瘍容積を減少させる能力が最も高かった。図６Ａと同様に、ＩＬ−７（図６Ｉ）およびＣＴＬＡ−４（図６Ｆ）腫瘍崩壊ウイルスはまた、抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わせたときに活性を示した。ＣＤ４０リガンドをコードする腫瘍崩壊ウイルスを用いた処置はまた、抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わせたときにいくらかの活性を示した（図６Ｊ）。
【０１５６】
実施例７．免疫調節性ポリペプチドをコードする腫瘍崩壊性アデノウイルスベクターを用いた腫瘍容積の減少のｉｎ  ｖｉｖｏでの実証：ウイルス混合研究。
本実施例のマウス腫瘍モデルは、同系免疫適格マウスを使用する。動物に、およそ１，０００，０００個の細胞をマウスの右後側腹部に皮下（ｓ．ｃ．）注射した。同時に、両側腫瘍モデルを作出するために、マウスの左後側腹部にも１，０００，０００個の細胞を皮下注射した。右側（原発性）腫瘍のサイズが６３〜８０ｍｍ３に達し、左側の腫瘍が触知可能になったとき、腫瘍に２５μｌのウイルス緩衝液または２５μｌのウイルスを４×１０９ｐｆｕ／ｍｌ（プラーク形成単位／ｍｌ）で、原発腫瘍の中心部に４日毎に全部で３回直接注入した。また、マウスを、２ｍｇ／ｍｌの抗ＰＤ−Ｌ１抗体２５０μｌで４日毎に合計３回腹腔内処置した。抗体を、ウイルス投与の２４時間後に投与した。原発性および遠位（対側）腫瘍のサイズの縮小は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の投与の有無にかかわらず、ウイルス緩衝液コントロールおよび野生型ウイルス（導入遺伝子を発現しない）などのさらなるコントロールと比較して注目されるであろう。腫瘍崩壊性アデノウイルスベクターでの処置の具体例は、かかるベクターのパネルについて以下により詳細に記載される。
【０１５７】
原発性腫瘍（右側腹部）の評価を用いて腫瘍溶解性ウイルスの直接効果を決定したのに対して、対側腫瘍（左側腹部）の評価を用いて腫瘍溶解性ウイルスの全身への影響を調査した。同系マウス株で増殖させたＡＤＳ−１２（マウスＫＲＡＳ変異肺腺癌細胞株）は、アデノウイルスの感染および複製を支持することが公知の腫瘍モデルであり、腫瘍崩壊性ヒトアデノウイルスに対する宿主免疫応答の評価に有用である。
【０１５８】
材料と方法
抗ｍＰＤ−Ｌ１抗体は、例えば、ＢｉｏＸＣｅｌｌ（登録商標）のカタログ番号ＢＥ０１０１（ラットＩｇＧ２ｂ）である。この抗体を、以下の実験で使用した。
【０１５９】
ウイルス試料を、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭトリストリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、および５％グリセロール（ｐＨ８．０）に保存した。バイアルを遮光して−８０℃で保存した。各投薬日に、１つのバイアルを、室温でおよそ２０分間解凍した。
【０１６０】
動物研究
ジャクソン研究所の雌１２９Ｓ１（１２９Ｓ１／ＳｖＩｍＪ）マウスを、本研究で使用した。マウスは、実験１４日目におよそ７〜８週齢であった。動物に照射Ｈａｒｌａｎ２９１８．１５げっ歯類用飼料および水を自由に与えた。１時間当たり１００回完全に換気するバブル環境中にＨ．Ｅ．Ｐ．Ａ濾過空気を提供するＢｉｏＢｕｂｂｌｅ（登録商標）クリーンルーム内のＢｅｄ−Ｏ’Ｃｏｂｓ（登録商標）敷料を用いた静置ケージに動物を収容した。全ての処置、体重測定、および腫瘍測定を、バブル環境で行った。この環境を、７０°±２°Ｆの温度範囲および３０〜７０％の湿度範囲に制御した。この実験で行った全ての手順を、国立衛生研究所（ＮＩＨ）の全ての法律、規制、および指針、ならびにＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ，Ｉｎｃ．の実験動物委員会の承認に従って行った。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ，Ｉｎｃ．は、ＡＡＡＬＡＣ認定施設である。
【０１６１】
細胞調製
ＡＤＳ−１２細胞（マウスＫＲＡＳ−変異体肺腺癌）を、１％の１００ｍＭピルビン酸ナトリウム、１％の２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１％の１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、１％の４５％グルコース溶液で改変し、１０％非熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％の１００Ｘペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ−グルタミン（ＰＳＧ）を補足したＲＰＭＩ１６４０培地中で成長させた。成長環境を、３７℃の５％ＣＯ２大気を有するインキュベーター中で維持した。増殖が完了したとき、細胞を、０．２５％トリプシン／２．２１ｍＭ  ＥＤＴＡのＨＢＳＳ溶液を使用してトリプシン処理する。その後、移植のために使用した懸濁液（２調製物）の細胞生存率を、以下の表に列挙する。
【０１６２】
【表４】
2020503342.tif 000006
【０１６３】
試験動物に、１．００×１０６細胞を含む０．１ｍｌの無血清培地を、固定針を有する２８ゲージインスリン用シリンジを使用して、両側腹部（背中側の脊椎と臀部との間）に０日目に皮下移植した。
【０１６４】
処置
全動物の右側腹部の平均腫瘍負荷量がおよそ６８ｍｍ３（群平均範囲、６５〜７１ｍｍ３）であるときの１４日目の腫瘍負荷量のカリパス測定の推定に基づいて全マウスを研究群に分類した。マウスを、全ての群についての平均腫瘍負荷量が確実に研究集団の全体の平均腫瘍負荷量の１０％以内になるように分配した。
【０１６５】
測定およびエンドポイント
キャリパー測定値から、以下のように単位密度を仮定して扁長楕円体の体積の式により、腫瘍負荷量（ｍｍ３）を推定した：腫瘍負荷量（ｍｍ３）＝（Ｌ×Ｗ２）／２（式中、ＬおよびＷは、それぞれ直交する腫瘍の長さおよび幅の測定値（ｍｍ）である）。全ての群をウイルス緩衝液コントロール群と比較した。
【０１６６】
有効性を評価するために使用された主要評価項目は、腫瘍成長遅延、完全および部分的な腫瘍奏効、ならびに試験終了時の左側および右側両方の腫瘍についての無腫瘍生存者の数であった。完全奏効（ＣＲ）は、検出不可能なサイズ（６３ｍｍ３未満）までの腫瘍塊の減少として定義され、部分奏効（ＰＲ）は、最初の治療時と比較して最後の測定で腫瘍塊がより小さいこととして定義される。ＰＲはＣＲを除く。
【０１６７】
全ての動物を、少なくとも１日１回臨床徴候について観察した。動物を、各処置日に体重測定した。個別の体重を週に３回記録した。明らかな苦痛または瀕死の状態で見出された動物と同様に、２０００ｍｍ３を超える合計の腫瘍負荷量を有する動物を安楽死させた。２０％を超える処置に関連する体重減少は、一般に、許容しがたいほど有毒と見なす。この実施例では、処置に関連する体重減少（治療中および治療後２週間）が２０％未満であり、そして潜在的に致命的な腫瘍負荷量がない場合のこの期間中の死亡率が１０％以下である場合、投薬レベルは容認性が認められると決定された。
【０１６８】
結果
マウスへの接種および腫瘍成長の結果を、図７に示す。一連のグラフは、抗ＰＤ−Ｌ１の有無に関わらず、種々の導入遺伝子を含む腫瘍崩壊ウイルスでの単剤または組み合わせを用いた担癌マウス（各群においてｎ＝８）の処置を示す。各図の左側のパネルは、ウイルスが注射された原発性腫瘍を表し；右側のパネルは、対側腫瘍を表す。各グラフ内の太線は、平均腫瘍容積（ｍｍ３）を示す。ｘ軸上の矢印の対は、ウイルス（腫瘍内、左側の矢印）および使用する場合の抗ＰＤ−Ｌ１抗体（腹腔内、右側の矢印）での処置日を表す。８匹のマウスの奏効のまとめを各グラフの下の表中に示す（表中、ＣＲ＝完全奏効（腫瘍容積＝０）およびＰＲ＝部分奏効（測定最終日の腫瘍容積が、測定１日目の腫瘍容積より小さい））。処置を以下に示す：７Ａ、ウイルス緩衝液のみ；７Ｂ、空のウイルスのみ（ＴＲＺ０００）；７Ｃ、ＴＲＺ０１０（ＩＬ−１０ｔｒａｐ）＋空のウイルス；７Ｄ、ＴＲＺ０１１（ＯＸ４０リガンド）＋空のウイルス；７Ｅ、ＴＲＺ００９（ＣＤ７０）＋空のウイルス；７Ｆ、ＴＲＺ００７（ＩＬ−７）＋空のウイルス、７Ｇ、ＴＲＺ００２（ＩＬ−１２）＋空のウイルス；７Ｈ、ＴＲＺ００４（ＧＭ−ＣＳＦ）＋空のウイルス；７Ｉ、ＴＲＺ００３（フラジェリン）＋空のウイルス；７Ｊ、ＴＲＺ００２＋ＴＲＺ０１０；７Ｋ、ＴＲＺ００２＋ＴＲＺ００７；７Ｌ、ＴＲＺ００７＋ＴＲＺ０１０；７Ｍ、ＴＲＺ０１１＋ＴＲＺ００４；７Ｎ、ＴＲＺ００９＋ＴＲＺ００３；７Ｏ、ＴＲＺ００２＋ＴＲＺ００９；７Ｐ、ＴＲＺ００７＋ＴＲＺ００９；７Ｑ、ＴＲＺ００７＋ＴＲＺ００４；７Ｒ、ＴＲＺ００２＋ＴＲＺ０１１；７Ｓ、ＴＲＺ０１０＋ＴＲＺ００４；７Ｔ、ＴＲＺ００２＋ＴＲＺ００４；７Ｕ、ウイルス緩衝液および抗ＰＤ−Ｌ１；７Ｖ、ＴＲＺ００２＋空のウイルス＋抗ＰＤ−Ｌ１；７Ｗ、ＴＲＺ００９＋抗ＰＤ−Ｌ１；７Ｘ、ＴＲＺ００７＋空のウイルス＋抗ＰＤ−Ｌ１；７Ｙ、ＴＲＺ００２＋ＴＲＺ００７＋抗ＰＤ−Ｌ１；７Ｚ、ＴＲＺ００７＋ＴＲＺ００９＋抗ＰＤ−Ｌ１；７ＡＡ、ＴＲＺ００２＋ＴＲＺ００９＋抗ＰＤ−Ｌ１。全てのウイルスを、各ウイルスについて１×１０８ｐｆｕ／投与で投与し、それにより、ウイルスの組み合わせの合計は２×１０８ｐｆｕであった。
【０１６９】
図に認められるように、ウイルス導入遺伝子の一定の組み合わせは、腫瘍細胞の溶解において非常に成功した（いくつかの完全奏効の例を含む）。例えば、図７Ｇは、ＩＬ−１２アデノウイルスで処置したマウスにおける腫瘍容積を示す。この図の８匹のマウスのうち５匹が完全奏効を示し、１匹のマウスが部分奏効を示した。しかし、対側腫瘍では、完全奏効または部分奏効は認められなかったことから、ＩＬ−１２ウイルスのみでの処置に由来する全身免疫効果はなかったことを示している。より良い結果が図７Ｋで認められ、この図は、ＩＬ−７アデノウイルスと組み合わせた同一のＩＬ−１２アデノウイルスで処置したマウスを示す。このマウス群では、８匹中７匹が原発性腫瘍（ウイルスが注入された腫瘍）で完全奏効を示し、対側腫瘍では２匹のマウスが完全奏効を示し、１匹が部分奏効を示した。図７Ｖ（ＩＬ−１２アデノウイルス＋抗ＰＤ−Ｌ１抗体）および７ＡＡ（ＩＬ−１２アデノウイルス＋ＣＤ７０アデノウイルス＋抗ＰＤ−Ｌ１抗体）では、８匹のマウスの各群は原発性腫瘍において８つ、および対側腫瘍においていくつかの完全寛解を示した。これらのデータは、腫瘍崩壊性アデノウイルスを含む一定の併用療法が原発性腫瘍および転移性腫瘍の処置で有用であり得ることを実証している。
【０１７０】
実施例８．複数の免疫調節性ポリペプチドを発現するアデノウイルスベクター
アデノウイルス骨格の欠失が、２つの外因的に付加された導入遺伝子を含むウイルスＤＮＡのウイルスキャプシドへのパッケージングを可能にするのに十分に大きい場合、２つの遺伝子を、いくつかの方法によってアデノウイルスの単一の欠失部位から同時発現することができる。両方の付加された遺伝子を、以下に記載の方法によって相互に連結することができ、これらの遺伝子の発現は外因的に付加されたプロモーターではなく内因性のアデノウイルスプロモーターによって制御され、その結果高発現はウイルス複製の条件下でのみで起こるであろう。腫瘍細胞の感染後などの一定の条件にウイルス複製を制限する制御は、本明細書中の他の場所に記載されている。単一の転写物からの２つのタンパク質の同時発現を、配列内リボゾーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントなどのウイルス構成要素の使用（Ｒｅｎａｕｄ−Ｇａｂａｒｄｏｓ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０１５，５：１１−２０）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）などのウイルス由来の自己切断型２Ａペプチド配列の挿入（Ｇａｒｒｙ  Ａ．Ｌｕｋｅ（２０１２），Ｔｒａｎｓｌａｔｉｎｇ  ２Ａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎｔｏ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄｒ．Ｅｄｄｙ  Ｃ．Ａｇｂｏ（Ｅｄ．），ＩＳＢＮ：９７８−９５３−５１−００９６−６，ＩｎＴｅｃｈ）、または２つの導入遺伝子の配列を単一の融合タンパク質に組み合わせることによって行うことができる。ＩＲＥＳエレメントを使用したときに第２の導入遺伝子から典型的に認められるより低い発現レベルとは対照的に、例示的な方法は両方の導入遺伝子からより等しいレベルの発現を指示するために２Ａ配列の１つを使用するであろう。
【０１７１】
異なる部位で２つの単一遺伝子インサートからの同時発現を維持するために、それぞれの発現が内因性上流アデノウイルスプロモーターによって別々に制御されるように、各導入遺伝子のｃＤＮＡをアデノウイルスの個別の欠失領域に挿入することができる。外因性プロモーターは、外因性導入遺伝子配列に付加されないであろう。Ｅ１ａタンパク質の発現は他のアデノウイルスプロモーターの活性化およびウイルス複製をもたらし、したがって各内因性アデノウイルスプロモーター由来の発現はウイルス複製に関連する。これらの領域における欠失の代わりに異なるアデノウイルスプロモーター（Ｅ１ｂプロモーター、Ｅ３プロモーター、およびＥ４プロモーターなど）の後ろに挿入された外因性導入遺伝子により、それぞれの挿入された導入遺伝子由来の同時発現が、ウイルス複製が起こる条件に制限される構築物が得られる。ウイルス複製を腫瘍細胞に制限するための本明細書中の前に記載のＥｌａエンハンサー領域における修飾と組み合わせると、両方の外因性導入遺伝子の同時発現は腫瘍細胞に制限される。
【０１７２】
図２に概略的に示すように、パッケージング容量をおよそ２００ｂｐ増加させる、ｂｐ１７１４〜１９１６（ｈＡｄ５ベクター配列に従って付番）の欠失を含むΔＥ１ｂ１９Ｋ部位を提供する。Ｅ３部位（図２に示すようにΔＥ３部位）での欠失も提供する；この欠失は、一般に２７，９００〜３０，８００ｂｐ（ｈＡｄ５ベクター配列に従って付番）またはその付近のＥ３領域における任意の欠失であり得、この欠失は、典型的にはおよそ１８００ｂｐの外因性配列の含有（すなわち、パッケージング）に限定されるほとんどの野生型アデノウイルスと比較してさらにおよそ２４００ｂｐまでパッケージング容量を増加させる。
【０１７３】
ウイルス増殖を実質的に減少させることなく改変（例えば、短縮または欠失）に適したＥ３読み取り枠中の欠失を本明細書中に提供する。非限定的な例として、Ｅ３  １２．５Ｋコード領域（２７，８５２〜２８，１７５ｂｐ）が短縮されているか（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３２０塩基、または３２０塩基超が、領域内の１つまたは複数の短縮部位から欠失されている）、完全に欠失したアデノウイルスベクターを提供する。Ｅ３  ７．１Ｋコード領域（２８，５４１〜２８，７３２）が短縮されているか（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０塩基、または１９０塩基超が、領域内の１つまたは複数の短縮部位から欠失されている）、完全に欠失したアデノウイルスベクターも提供する。７．１Ｋ配列は、ＴＲＡＩＬアポトーシスの阻害に関連し、１つまたは複数のＲＩＤタンパク質に関連する。Ｅ３  ｇｐ１９Ｋ（２８，７２９〜２９２１１）が短縮されているか（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０塩基、または４５０塩基超が、領域内の１つまたは複数の短縮部位から欠失されている）、完全に欠失したアデノウイルスベクターも提供する。ｇｐ１９Ｋ配列は、ＣＴＬ死滅の阻害に関連する。Ｅ３１０．５（Ｅ３１１．６（ＡＤＰ）とも呼ばれる）（２９、４８５〜２９，７６６）が短縮されているか（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０塩基、または２５０塩基超が、領域内の１つまたは複数の短縮部位から欠失されている）、完全に欠失したアデノウイルスベクターも提供する。１０．５配列は、ウイルス放出の促進に関連する。Ｅ３（ＲＩＤα）（２９，７７８〜２９，９６９）および／またはＥ３（ＲＩＤβ）（３０，０５７〜３０，４５５）が短縮されているか（例えば、Ｅ３（ＲＩＤα）に関して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０塩基、または１９０塩基超が、領域内の１つまたは複数の短縮部位から欠失されている）、完全に欠失しているか、あるいは、短縮されているか（例えば、Ｅ３（ＲＩＤβ）に関して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０���６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、３９０塩基、または３９０塩基超が、領域内の１つまたは複数の短縮部位から欠失されている）、完全に欠失したアデノウイルスベクターも提供する。これらのＲＩＤ配列は、ＴＮＦ、ＦａｓＬ、およびＴＲＡＩＬのアポトーシスの阻害に関連し、ＥＧＦＲを分解する。上記で言及した欠失の任意の組み合わせも提供する。
【０１７４】
Ｅ３  １４．７Ｋ（３０，４８８〜３０，８３４）が短縮されているか（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３４０塩基、または３４０塩基超が、領域内の１つまたは複数の短縮部位から欠失されている）、完全に欠失したアデノウイルスベクターも提供する。１４．７Ｋ配列は、ＴＮＦ、ＦａｓＬ、およびＴＲＡＩＬのアポトーシスの阻害に関連する。
【０１７５】
この実施例中の表５および実施例１３中の表６に示す例示的な二重導入遺伝子構築物の説明。表に認められるように、任意の導入遺伝子を、Ｅ１領域またはＥ３領域に挿入することができる。例えば、１つの実施形態では、二重導入遺伝子構築物は、Ｅ１領域に挿入されたＩＬ−１２およびＥ３領域に挿入されたＩＬ−２を有し得る。別の実施形態では、二重導入遺伝子構築物は、Ｅ１領域に挿入されたＩＬ−２およびＥ３領域に挿入されたＩＬ−１２を有し得る。治療腫瘍崩壊性アデノウイルス中の二重導入遺伝子構築物の使用を、実施例９および１３に記載する。
【０１７６】
【表５】
2020503342.tif 000007
ｍ＝マウス；Ｐ２Ａ＝切断部位
＊表６も参照のこと。
【０１７７】
実施例９．Ｅ４領域由来の免疫調節性ポリペプチドを発現するアデノウイルスベクター
１つまたは複数の免疫調節性ポリペプチドをコードする核酸配列を、ウイルスゲノムのＥ４領域の一部の短縮または欠失によってアデノウイルスゲノムに挿入する。Ｅ４欠失および外因性挿入を、本明細書中に提供されているか、そうでなければ当該分野で公知の任意の他のウイルス改変と組み合わせて、あるいは、いかなる他のウイルス改変も用いずに利用することができる。挿入部位として有用なＥ４領域の例には、Ｅ４  ＯＲＦ１（３５，１３６〜３５，５２２ｂｐ）および／またはＥ４  ＯＲＦ２（３４，６９６〜３５，１０６ｂｐ）（それぞれ、ｈＡｄ５ベクター配列に従って付番）の短縮または欠失が含まれる。１つまたは複数の免疫調節性ポリペプチドの発現を、内因性Ｅ４プロモーターによって調節する。この実施形態の略図を、図３に提供する。
【０１７８】
実施例１０．Ｐｅａ３部位の立体配置が変化しているアデノウイルスベクター
多様な発現特性を有するベクターを産生するためにアデノウイルスベクターのＥ１ａエンハンサー領域付近のＰｅａ３部位Ｉ〜Ｖ内およびその周囲の配列、Ｐｅａ３部位内およびその周囲の配列が、変化、移動、または欠失されているアデノウイルスベクターを設計する。１つの実施形態では、野生型アデノウイルスベクターと比較してＰｅａ３部位の親和性が低いアデノウイルスベクターを操作する。かかるベクターを、転写因子の濃度が高い腫瘍微小環境において細胞内で効率的であるが、正常な（例えば、非新生物の）細胞内で比較的不活性であり、したがって、正常な組織細胞への損傷に原因する副作用の可能性が低いように設計する。野生型およびＴＡＶ−２５５構築物のＥ１ａ領域の図を図９Ａに示す。Ｅ１ａエンハンサー領域変異体の提案された作用方法のイラストを、図９Ｂに示す。構築物ＮＶ１〜ＮＶ７は、ＴＡＶ−２５５構築物に一部基づく。
【０１７９】
１つの実施形態では、（野生型配列に関して）Ｐｅａ３ＩＶ部位とＰｅａ３ＩＩＩ部位との間の配列を除去し、Ｐｅａ３ＩＩＩが単一変異し、Ｐｅａ３ＩＩＩとＰｅａ３ＩＩとの間の配列およびＰｅａ３ＩＩ部位が変異したベクターを提供する。例示的な構築物ＮＶ１のＥ１ａエンハンサー領域の配列を、配列番号９９に記載している。
【０１８０】
別の実施形態では、（野生型配列に関して）Ｐｅａ３ＩＶ部位とＰｅａ３ＩＩＩ部位との間の配列を除去し、Ｐｅａ３ＩＩＩおよびＰｅａ３ＩＩの両方が変異し、得られたＰｅａ３Ｖ部位がＰｅａ３ＩＩＩおよびエンハンサー１により類似する親和性を有するようにＰｅａ３Ｖ隣接部位が変異したベクターを提供する。例示的な構築物ＮＶ２のＥ１ａエンハンサー領域の配列を、配列番号１００に記載している。
【０１８１】
別の実施形態では、（野生型配列に関して）Ｐｅａ３Ｖ部位とＰｅａ３ＩＶ部位との間の配列がＰｅａ３ＩＩＩ部位とＰｅａ３ＩＩ部位との間の配列と置換され；Ｐｅａ３ＩＶとＰｅａ３ＩＩＩとの間の配列が欠失し；Ｐｅａ３ＩＩＩとＰｅａ３ＩＩとの間の配列が欠失し；Ｐｅａ３ＩＩＩ部位およびＰｅａ３ＩＩ部位の両方が変異し、Ｐｅａ３Ｖ部位のすぐ５’側にある残基３ｂｐも変異したベクターを提供する。例示的な構築物ＮＶ３のＥ１ａエンハンサー領域の配列を、配列番号１０１に記載している。
【０１８２】
別の実施形態では、（野生型配列に関して）Ｐｅａ３ＩＩＩ部位およびＰｅａ３ＩＩ部位の周囲の隣接配列が、親和性がより低いＰｅａ３Ｖ部位およびＰｅａ３ＩＶ部位を模倣するように変更された（したがって、Ｐｅａ３Ｉ以外の全てのＰｅａ３部位の親和性がより低いようにベクターを操作している）ベクターを提供する。例示的な構築物ＮＶ４のＥ１ａエンハンサー領域の配列を、配列番号１０２に記載している。
【０１８３】
別の実施形態では、（野生型配列に関して）Ｐｅａ３ＩＩＩ部位およびＰｅａ３ＩＩ部位の周囲の隣接配列が、親和性がより低いＰｅａ３Ｖ部位およびＰｅａ３ＩＶ部位を模倣するように変更され、単一の点変異がＰｅａ３Ｉ部位に導入され、それにより、Ｐｅａ３Ｉ部位の親和性をより低くした（したがって、全てのＰｅａ３部位の親和性がより低いようにベクターを操作している）ベクターを提供する。例示的な構築物ＮＶ５のＥ１ａエンハンサー領域の配列を、配列番号１０３に記載している。
【０１８４】
別の実施形態では、（野生型配列に関して）、Ｐｅａ３ＩＩＩ部位およびＰｅａ３ＩＩ部位の周囲の隣接配列が、親和性がより低いＰｅａ３Ｖ部位およびＰｅａ３ＩＶ部位を模倣するように変更され、Ｐｅａ３Ｉ部位の隣接領域が変更され、それにより、Ｐｅａ３Ｉ部位の親和性をより低くした（したがって、全てのＰｅａ３部位の親和性がより低いようにベクターを操作している）ベクターを提供する。例示的な構築物ＮＶ６のＥ１ａエンハンサー領域の配列を、配列番号１０４に記載している。
【０１８５】
別の実施形態では、（野生型配列に関して）Ｐｅａ３Ｉ部位周囲の隣接配列が、親和性がより低いＰｅａ３Ｉ部位を産生するように変更され、Ｐｅａ３ＩＩ部位周囲の隣接配列が、親和性がより低いＰｅａ３ＩＶ部位を模倣するように変更された（したがって、Ｐｅａ３ＩＩＩ以外の全てのＰｅａ３部位の親和性がより低いようにベクターを操作している）ベクターを提供する。例示的な構築物ＮＶ７のＥ１ａエンハンサー領域の配列を、配列番号１０５に記載している。
【０１８６】
実施例１１．Ｅ１ａエンハンサー領域が変更され、且つ免疫調節性ポリペプチドをコードする腫瘍崩壊性アデノウイルスベクターを用いた腫瘍容積の減少のｉｎ  ｖｉｖｏでの実証：抗体処置の有無に関わらない単一のウイルス
材料と方法
抗ｍＰＤ−Ｌ１抗体は、例えば、ＢｉｏＸＣｅｌｌ（登録商標）のカタログ番号ＢＥ０１０１（ラットＩｇＧ２ｂ）である。この抗体を、以下の実験で使用した。
【０１８７】
ウイルス試料を、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭトリストリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、および５％グリセロール（ｐＨ８．０）に保存する。バイアルを遮光して−８０℃で保存する。各投薬日に、１つのバイアルを、室温でおよそ２０分間解凍する。単回用量は、１×１０９ｐｆｕである。この実施例において抗ＰＤ−Ｌ１と組み合わせるべきウイルスは、ＮＶ１〜ＮＶ７（配列番号９９〜１０５に記載のＥ１ａエンハンサー領域の配列を有する）を含む。
【０１８８】
本実施例のマウス腫瘍モデルは、同系免疫適格マウスを使用する。雌Ｊａｃｋｓｏｎ  １２９Ｓ１（１２９Ｓ１／Ｓｖ１ｍＪ）マウスを、本研究で使用する。マウスは、実験１日目に６〜７週齢である。動物に照射Ｈａｒｌａｎ２９１８．１５げっ歯類用飼料および水を自由に与える。１時間当たり１００回完全に換気するバブル環境中にＨ．Ｅ．Ｐ．Ａ濾過空気を提供するｂｉｏＢｕｂｂｌｅ（登録商標）クリーンルーム内のＢｅｄ−Ｏ’Ｃｏｂｓ（登録商標）敷料を用いた静置ケージに動物を収容する。全ての処置、体重測定、および腫瘍測定を、バブル環境で行う。この環境を、７０°±２°Ｆの温度範囲および３０〜７０％の湿度範囲に制御する。
【０１８９】
細胞調製
ＡＤＳ−１２細胞を、１％の１００ｍＭピルビン酸ナトリウム、１％の２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１％の１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、１％の４５％グルコース溶液で改変し、１０％非熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％の１００Ｘペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ−グルタミン（ＰＳＧ）を補足したＲＰＭＩ１６４０培地中で成長させる。成長環境を、３７℃の５％ＣＯ２大気を有するインキュベーター中で維持した。増殖が完了したとき、細胞（第７継代）を、０．２５％トリプシン／２．２１ｍＭ  ＥＤＴＡのＨＢＳＳ溶液を使用してトリプシン処理する。細胞剥離後、完全成長培地での希釈によってトリプシンを不活化し、細胞の任意のクランプをピペット操作によって分離する。細胞を２００ｒｃｆにて４℃で８分間遠心分離し、上清を吸引し、ペレットをピペット操作によって冷ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）に再懸濁する。均一な細胞懸濁液のアリコートを、トリパンブルー溶液で希釈し、Ｌｕｎａ自動細胞計数装置を使用して計数する。細胞懸濁液を、２００ｒｃｆにて４℃で８分間遠心分離する。上清を吸引し、細胞ペレットを冷ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）に再懸濁して、１×１０７トリパン排除細胞／ｍｌの最終濃度を得る。移植中、細胞懸濁液を氷上に維持する。移植後、残存細胞のアリコートをトリパンブルー溶液で希釈し、計数して移植後細胞生存率を決定する。
【０１９０】
試験動物に、１×１０６細胞を含む０．１ｍｌの無血清培地を、固定針を有する２８ゲージインスリン用シリンジを使用して、両側腹部（背中側の脊椎と臀部との間）（右腹側部０日目および左側腹部８日目）に皮下移植する。
【０１９１】
全動物の右側腹部の平均腫瘍負荷量がおよそ８２ｍｍ３（群平均範囲、７５〜９０ｍｍ３）であったときの１５日目の腫瘍負荷量のカリパス測定の推定に基づいて全マウスを研究群に分類する。マウスを、全ての群についての右側腹部の平均腫瘍負荷量が確実に研究集団の全体の平均腫瘍負荷量の１０％以内になるように分配する。
【０１９２】
結果
処置第１日目の実験における全群についての右側の平均推定腫瘍負荷量はおよそ８２ｍｍ３であり、実験中の全群は、よく一致している（群平均範囲、７５〜９０ｍｍ３）。治療開始時の全動物の体重は、少なくとも１３．３ｇである。第１の処置での群平均体重もよく一致している（範囲、およそ１５．４〜１８．３ｇ）。５００ｍｍ３の腫瘍負荷量を、右側および左側の腫瘍についての腫瘍成長の遅延による有効性の評価のために選択した。コントロール群の腫瘍負荷量の中央値は、右側の腫瘍については４７日目ごろに５００ｍｍ３に到達し、左側の腫瘍については４３日目ごろに到達するであろう。コントロール群についての腫瘍容積の倍加時間の中央値は、右側の腫瘍および左側の腫瘍についてそれぞれおよそ１２日および１０日であろう。
【０１９３】
マウス接種および腫瘍成長の結果は、抗ＰＤ−Ｌ１の有無に関わらず、Ｅ１ａ領域が変更され、且つ種々の導入遺伝子をコードする腫瘍崩壊ウイルスで担癌マウスを処置することは腫瘍容積の減少に有効であることを示すであろう。
【０１９４】
実施例１２．両側性腫瘍モデルにおける二重特異性腫瘍崩壊性アデノウイルスベクターのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性
癌免疫療法は、有効性を高めるための併用に移行しつつある。癌免疫治療薬を併用することで、既存の承認された単剤治療の臨床上の利点を拡大することができる；しかし、組み合わせを全身投与すると毒性が過剰になる可能性がある。したがって、全身の抗腫瘍免疫を増強するためにアデノウイルスによって送達される免疫調節薬の組み合わせを評価するために、Ｅ１領域およびＥ３領域の両方に導入遺伝子を有する新規の二重特異性腫瘍崩壊性アデノウイルスベクターを開発した。（表５に開示の構築物に加えて）本明細書中に開示の方法による使用を意図した例示的な構築物のまとめを、表６に列挙する。
【０１９５】
【表６】
2020503342.tif 000008
【０１９６】
両側性腫瘍モデルを、上記の実施例（例えば、実施例７）に記載のようにＡＤＳ−１２腫瘍細胞を使用して調製した。１×１０６個のＡＤＳ−１２腫瘍細胞を、原発性（−２日目）および対側（０日目）の腹側部に注射した。病期分類時に、対側腫瘍（８８〜１５０ｍｍ３）および原発性腫瘍（８８〜２５０ｍｍ３）に基づいてマウスを無作為化する。群あたりのマウス数は８であり、腫瘍および体重を、１週間に３回測定した。抗ＰＤ−Ｌ１（５００μｇ／用量）または抗ＰＤ−１抗体（２５０μｇ／用量）を腹腔内投与して、全身性のＴ細胞活性化を誘導する。
【０１９７】
このモデルでは、ウイルスを原発性腫瘍のみに腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射し；かかる注射により、腫瘍崩壊、免疫浸潤、および腫瘍の縮小が生じる。対側腫瘍には注射せず、腫瘍崩壊は生じない。むしろ、腫瘍縮小は、専ら、抗原特異的に活性化された腫瘍浸潤リンパ球に起因する。
【０１９８】
結果を図９に示す。図９Ａは、ウイルス混合例で使用した単一導入遺伝子構築物（上）と、Ｅ１／Ｅ３導入遺伝子アデノウイルスを作製するために使用した二重導入遺伝子ベクターとを対比したイラストである。図９Ｂは、空のウイルス＋／−抗ＰＤ−Ｌ１またはＴＲＺ−４０９（ＩＬ−１２／ＩＬ−７二重導入遺伝子）＋／−抗ＰＤ−Ｌ１を腫瘍内注射したマウスの結果を示す。注射した腫瘍の腫瘍容積を左側のパネルに示し、対側腫瘍の腫瘍容積を右側のパネルに示す。矢印の各対について、左側の矢印はウイルス注射を示し、右側の矢印は抗ＰＤ−Ｌ１注射を示す。原発性腫瘍および対側腫瘍の両方について認められるように、ＴＲＺ−４０９注射により空のウイルスと比較して腫瘍容積が有意に減少した。この研究では、抗ＰＤ−Ｌ１との組み合わせはわずかにより有効であった。
【０１９９】
図９Ｃは、ＴＲＺ−４０９の逆であるＴＲＺ−４０３（ＩＬ−７導入遺伝子がＥ１領域を占め、ＩＬ−１２遺伝子がＥ３領域（Ｅ１よりも強力なプロモーターを有する）を占める）を使用した第２の実験の結果を示す。図中に認められるように、ＴＲＺ−４０３は、抗ＰＤ−Ｌ１の有無に関わらず、原発性腫瘍および遠位腫瘍の成長を強く阻害する。ＴＲＺ−４０３を注射した全てのマウスのＩＬ−１２およびＩＦＮ−γの血漿レベル（図９Ｄ）は、導入遺伝子の発現には高い忍容性が認められることを示す。
【０２００】
本研究を、５００ｍｍ３超の腫瘍を有する全てのマウスに展開した。ＴＲＺ−４０３（ＩＬ−７＋ＩＬ−１２）、ＴＲＺ−４０３＋抗ＰＤ−Ｌ１、ＴＲＺ−４０３＋コントロールＩｇＧ、またはＴＲＺ−４０９（ＩＬ−１２＋１Ｌ−７）を注射した原発性腫瘍を有するマウスおよびコントロール（無処置マウスおよび抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＰＤ−１、またはコントロールＩｇＧを有する空のベクターＴＲＺ−ｄ１９Ｋを注射したマウスが含まれる）を図９Ｅに示し、ここでは、研究におけるマウスの百分率として生存を示す。図に認められるように、ＴＲＺ−４０３を注射したマウスは、研究終了時に（７０日目）ＴＲＺ−４０９よりもはるかに高い生存率を示した。ＴＲＺ−４０３およびＴＲＺ−４０９の両方は、コントロールよりも有効であった；コントロール注射を受けた全てのマウスは、研究５６日目に死亡した。
【０２０１】
次に、二重導入遺伝子ウイルスＴＲＺ−４０３（Ｉｌ−７＋ＩＬ−１２）と、ＩＬ−７とＩＬ−１２単一導入遺伝子ウイルスとの混合物との間で直接比較した。図９Ｆ（原発性腫瘍（左側のパネル））に認められるように、ＴＲＺ−４０３は、腫瘍容積の減少に最も有効であり、ウイルス混合物がそれに続いた。単一導入遺伝子ＩＬ−１２ウイルスは、比較すると有効性は小さかった。しかし、対側腫瘍（右側のパネル）では、二重導入遺伝子ウイルス（ＴＲＺ−４０３）のみが腫瘍容積を減少させることから、これは、ウイルス混合物より有意に優れていることを示していた。
【０２０２】
次に、Ｅ１領域内に２つの導入遺伝子を含むウイルスを試験した。図９Ｇ〜９Ｚは、種々の二重導入遺伝子ウイルスおよびコントロールの抗腫瘍活性の比較（抗体処置との比較が含まれる）を示す。各図は、左側のパネルに原発性腫瘍を示し、右側のパネルに対側腫瘍を示す。全てのウイルスを腫瘍内投与し、抗体を腹腔内投与した。ウイルス投与計画は様々であり、これを以下の表７に示す。図９Ｇは、無処置動物コントロールにおける腫瘍活性を示す；図９Ｈは、ＴＲＺ０００（Ｅ１−空／Ｅ３インタクト）を示す；図９Ｉ〜９Ｋは、ＴＲＺ００２（Ｅ１−ｍＩＬ−１２／Ｅ３  Ｄｅｌ）を示す；図９Ｌ〜９Ｎは、ＴＲＺ５１０（Ｅ１−ｍＩＬ−７−Ｐ２Ａ−ｍＩＬ−１２／Ｅ３  Ｄｅｌ）を示す；図９Ｏ〜９Ｑは、ＴＲＺ０２１（Ｅ１−空／Ｅ３−ｍＩＬ−２）を示す；図９Ｒ〜９Ｖは、ＴＲＺ４２１（Ｅ１−ｍＩＬ−１２／Ｅ３−ｍＩＬ−２）を示す；図９Ｗは、ＴＲＺ００２（Ｅ１−ｍＩＬ−１２／Ｅ３  Ｄｅｌ）＋抗ＣＴＬＡ４抗体の組み合わせを示す（用量については、表７を参照のこと）；図９Ｘは、抗ＰＤ−１抗体処置のみを示し、図９Ｙは抗ＣＴＬＡ４抗体のみを示し、図９Ｚは、抗ＣＴＬＡ−４抗体と抗ＰＤ−１抗体（共に、ＢｉｏＸＣｅｌｌ）の組み合わせでの処置の結果を示す。
【０２０３】
【表７】
2020503342.tif 000009
【０２０４】
ＴＲＺ４２１およびＴＲＺ５１０が含まれる二重構築物は、マウスにおける腫瘍容積の減少で予備的効果を示した。
【０２０５】
実施例１３．腫瘍崩壊性アデノウイルスのＥ１部位またはＥ３部位にクローン化された導入遺伝子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現
Ａ５４９細胞（ヒト肺腺癌、ＡＴＣＣ（登録商標）、カタログ番号ＣＣＬ−１８５（商標））を、４．５ｇ／Ｌ  Ｄ−グルコースおよび４ｍＭ  Ｌ−グルタミンで改変し、１０％非熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）を補足したＤＭＥＭ培地中で成長させた。成長環境を、３７℃の５％ＣＯ２大気を有するインキュベーター中で維持した。ＡＤＳ−１２細胞（マウス肺腺癌細胞株）を、１％の１００ｍＭピルビン酸ナトリウム、１％の２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１％の１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、１％の４５％グルコース溶液で改変し、１０％非熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％の１００Ｘペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ−グルタミン（ＰＳＧ）を補足したＲＰＭＩ１６４０培地中で成長させた。成長環境を、３７℃の５％ＣＯ２大気を有するインキュベーター中で維持した。
【０２０６】
サブコンフルエントなＡ５４９細胞またはＡＤＳ−１２細胞に、ＴＲＺ０００（空のウイルス）、ＴＲＺ５１０（Ｅ１  ＩＬ−７−Ｐ２Ａ−ＩＬ−１２／Ｅ３）、ＴＲＺ５１２（Ｅ１  ＩＬ−１２−Ｐ２Ａ−ＩＬ−７／Ｅ３）、ＴＲＺ４０３（Ｅ１  ＩＬ−７／Ｅ３  ＩＬ−１２）、ＴＲＺ４１６（Ｅ１  ＯＸ４０Ｌ／Ｅ３  ＩＬ−１２）、またはＴＲＺ４２１（Ｅ１  ＩＬ−１２／Ｅ３  ＩＬ−２）を感染多重度（ＭＯＩ）１０または２５で感染させた。感染４８時間後、上清を回収し、遠心分離によって清澄化し、標準的なＥＬＩＳＡ法（マウスＩＬ−１２（カタログ番号Ｍ１２７０）、マウスＩＬ−２（カタログ番号Ｍ２０００）、およびマウスＩＬ−７（カタログ番号Ｍ７０００）についてはＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）キット、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓを使用；マウスＯＸ４０Ｌ（カタログ番号ＤＹ１２３６）についてはＤｕｏＳｅｔ（登録商標）キット、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓを使用）によってタンパク質発現についてアッセイした。
【０２０７】
分泌型サイトカインの測定結果を、図１０に示す。ＩＬ−７（図１０Ａおよび１０Ｂ）、ＯＸ４０Ｌ（図１０Ｃ）、およびＩＬ−１２（図１０Ｄおよび１０Ｅ）については、アデノウイルスＥ１部位からの導入遺伝子の発現を示す。ＩＬ−１２（図１０Ｆ）およびＩＬ−２（図１０Ｇ）については、Ｅ３部位からの導入遺伝子の発現を示す。図に認められるように、全ての導入遺伝子は、Ｅ１部位またはＥ３部位のいずれかから十分に発現された。
【０２０８】
実施例１４．腫瘍崩壊性アデノウイルスのＥ１部位またはＥ３部位にクローン化した導入遺伝子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能分析
Ａ５４９細胞を、４．５ｇ／Ｌ  Ｄ−グルコースおよび４ｍＭ  Ｌ−グルタミンで改変し、１０％非熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）を補足したＤＭＥＭ培地中で成長させた。成長環境を、３７℃の５％ＣＯ２大気を有するインキュベーター中で維持した。並行して、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ−１２細胞（改変されたヒト胚腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞；ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、カタログ番号ＨＫＢ−ＩＬ１２）を、４．５ｇ／Ｌ  Ｄ−グルコースおよび４ｍＭ  Ｌ−グルタミンで改変し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、５０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−１２、および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）を補足したＤＭＥＭ培地中で成長させた。成長環境を、３７℃の５％ＣＯ２大気を有するインキュベーター中で維持した。ＣＴＬＬ−２細胞（マウスリンパ球、ＡＴＣＣ（登録商標）、カタログ番号ＴＩＢ−２１４（商標））を、２ｍＭグルタミンで改変し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および２０ＩＵ／ｍｌヒト組換えＩＬ−２を補足したＲＰＭＩ培地中で成長させた。成長環境を、３７℃の５％ＣＯ２大気を有するインキュベーター中で維持した。
【０２０９】
サブコンフルエントなＡ５４９細胞に、ＴＲＺ５１０（Ｅ１  ＩＬ−７−Ｐ２Ａ−ＩＬ−１２／Ｅ３）、ＴＲＺ５１２（Ｅ１  ＩＬ−１２−Ｐ２Ａ−ＩＬ−７／Ｅ３）、ＴＲＺ４０３（Ｅ１  ＩＬ−７／Ｅ３  ＩＬ−１２）、およびＴＲＺ４１６（Ｅ１  ＯＸ４０Ｌ／Ｅ３  ＩＬ−１２）を感染多重度（ＭＯＩ）１０または２５で感染させた。感染４８時間後、上清を回収し、遠心分離によって清澄化し、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ−１２細胞を使用して分泌型ＩＬ−１２の生物学的機能についてアッセイした。ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−１２細胞を２回洗浄して過剰な組換えヒトＩＬ−１２を除去し、９６ウェル丸底プレートを使用して、１８０μＬ中２×１０５細胞／ウェルで各試験ウェルにプレートした。ＴＲＺ４１６感染Ａ５４９細胞由来のＡ５４９上清の系列希釈物を１：３希釈で調製し、２０μＬを、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−１２細胞を含む１８０μＬに添加した。ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−１２細胞を有する最後のウェルに、ネガティブコントロールとして２０μＬの培地のみを添加した。２４時間後、２０μＬのＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−１２細胞上清を、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート中の１８０μＬのＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ（商標）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、カタログ番号ＨＫＢ−ＩＬ１２）に添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。胚アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の分泌レベルを、分光光度計を用いて６２０ｎｍで測定した。あるいは、上記のＡ５４９細胞由来の清澄化上清を、ＣＴＬＬ−２細胞を使用して分泌型ＩＬ−２の生物学的機能についてアッセイした。ＣＴＬＬ−２細胞を２回洗浄して過剰な組換えヒトＩＬ−２を除去し、９６ウェル丸底プレートを使用して、１００μＬ中５×１０４細胞／ウェルで各試験ウェルにプレートした。ＴＲＺ４２１感染Ａ５４９細胞由来のＡ５４９上清の系列希釈物を１：３希釈で調製し、１００μＬを、ＣＴＬＬ−２細胞を含む１００μＬに添加した。ＣＴＬＬ−２細胞を有する最後のウェルに、ネガティブコントロールとして１００μＬの培地のみを添加した。７２時間後、１００μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ９２４１）を１００μＬ中の誘導されたＣＴＬＬ−２細胞に添加し、室温で１０分間インキュベートした。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−ＧｌｏおよびＣＴＬＬ−２細胞の組み合わせを、発光の読み取りのための９６ウェル透明底プレートに移した。０．５秒／ウェルの積分時間で発光を記録した。
【０２１０】
分泌型サイトカインの機能分析の結果を、図１１に示す。上清中のＥ１領域（図１１Ａ、ＴＲＺ５１０；図１１Ｂ、ＴＲＺ５１２）およびＥ３領域（図１１Ｃ；ＴＲＺ４０３；図１１Ｄ；ＴＲＺ４１６）から発現したＩＬ−１２についてのＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−１２細胞におけるＩＬ−１２導入遺伝子の機能を示す。Ｅ３領域から発現した上清についてのＣＴＬＬ−２細胞におけるＩＬ−２導入遺伝子の機能を、図１１Ｅ（ＴＲＺ４２１）に示す。図に認められるように、全ての導入遺伝子は、Ｅ１部位またはＥ３部位（Ｐ２Ａ配列に接続された部位が含まれる）から発現されたときに機能的であった。
【０２１１】
章末の注
本発明を、理解を明確にする目的で例示および実施例によってある程度詳細に記載しているが、本発明の教示に照らして、添付の特許請求の範囲の趣旨または範囲から逸脱することなく一定の変更および修正が可能であることは当業者には容易に明らかであろう。
【０２１２】
本明細書中に引用した全ての刊行物、データベース、ＧｅｎＢａｎｋ配列、特許、および特許出願は、あたかも各々が具体的且つ個別に参照として援用されることが示されるように、本明細書中で参照として援用される。
【０２１３】
【表８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
2020503342.tif 000058
【図６Ｂ】
2020503342.tif 000059
【図６Ｃ】
2020503342.tif 000060
【図６Ｄ】
2020503342.tif 000061
【図６Ｅ】
2020503342.tif 000062
【図６Ｆ】
2020503342.tif 000063
【図６Ｇ】
2020503342.tif 000064
【図６Ｈ】
2020503342.tif 000065
【図６Ｉ】
2020503342.tif 000066
【図６Ｊ】
2020503342.tif 000067
【図６Ｋ】
2020503342.tif 000068
【図６Ｌ】
2020503342.tif 000069
【図７Ａ】
2020503342.tif 000070
【図７Ｂ】
2020503342.tif 000071
【図７Ｃ】
2020503342.tif 000072
【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
2020503342.tif 000074
【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
2020503342.tif 000076
【図７Ｈ】
2020503342.tif 000077
【図７Ｉ】
2020503342.tif 000078
【図７Ｊ】
2020503342.tif 000079
【図７Ｋ】
2020503342.tif 000080
【図７Ｌ】
2020503342.tif 000081
【図７Ｍ】
2020503342.tif 000082
【図７Ｎ】
2020503342.tif 000083
【図７Ｏ】
2020503342.tif 000084
【図７Ｐ】
2020503342.tif 000085
【図７Ｑ】
2020503342.tif 000086
【図７Ｒ】
2020503342.tif 000087
【図７Ｓ】
2020503342.tif 000088
【図７Ｔ】
2020503342.tif 000089
【図７Ｕ】
2020503342.tif 000090
【図７Ｖ】
2020503342.tif 000091
【図７Ｗ】
2020503342.tif 000092
【図７Ｘ】
2020503342.tif 000093
【図７Ｙ】
2020503342.tif 000094
【図７Ｚ】
2020503342.tif 000095
【図７ＡＡ】
2020503342.tif 000096
【図８Ａ】
2020503342.tif 000097
【図８Ｂ】
2020503342.tif 000098
【図９Ａ】
2020503342.tif 000099
【図９Ｂ】
2020503342.tif 000100
【図９Ｃ】
2020503342.tif 000101
【図９Ｄ】
2020503342.tif 000102
【図９Ｅ】
2020503342.tif 000103
【図９Ｆ】
2020503342.tif 000104
【図９Ｇ】
2020503342.tif 000105
【図９Ｈ】
2020503342.tif 000106
【図９Ｉ】
2020503342.tif 000107
【図９Ｊ】
2020503342.tif 000108
【図９Ｋ】
2020503342.tif 000109
【図９Ｌ】
2020503342.tif 000110
【図９Ｍ】
2020503342.tif 000111
【図９Ｎ】
2020503342.tif 000112
【図９Ｏ】
2020503342.tif 000113
【図９Ｐ】
2020503342.tif 000114
【図９Ｑ】
2020503342.tif 000115
【図９Ｒ】
2020503342.tif 000116
【図９Ｓ】
2020503342.tif 000117
【図９Ｔ】
2020503342.tif 000118
【図９Ｕ】
2020503342.tif 000119
【図９Ｖ】
2020503342.tif 000120
【図９Ｗ】
2020503342.tif 000121
【図９Ｘ】
2020503342.tif 000122
【図９Ｙ】
2020503342.tif 000123
【図９Ｚ】
2020503342.tif 000124
【図１０Ａ】
2020503342.tif 000125
【図１０Ｂ】
2020503342.tif 000126
【図１０Ｃ】
2020503342.tif 000127
【図１０Ｄ】
2020503342.tif 000128
【図１０Ｅ】
2020503342.tif 000129
【図１０Ｆ】
2020503342.tif 000130
【図１０Ｇ】
2020503342.tif 000131
【図１１Ａ】
2020503342.tif 000132
【図１１Ｂ】
2020503342.tif 000133
【図１１Ｃ】
2020503342.tif 000134
【図１１Ｄ】
2020503342.tif 000135
【図１１Ｅ】
2020503342.tif 000136
【国際調査報告】
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2020503342.tif 000138
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