(57)【要約】  本発明は、ハイドロゲル中の個別の生物学的単位を捕捉およびバーコード付与するための方法に関する。さらに本発明は、個別の生物学的単位における遺伝子発現、遺伝子型、ハプロタイプ、またはエピゲノムを解析するための方法に関する。また本発明は、本開示の方法を実施するためのキットに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハイドロゲル中の個別の生物学的単位を捕捉するための方法であって、
ａ）複数の生物学的単位を複数のバーコード単位と接触させて、生物学的単位／バーコード単位の複合体を形成するステップと、
ｂ）前記生物学的単位／バーコード単位の複合体をハイドロゲル溶液と接触させるステップと、
ｃ）前記ハイドロゲル溶液を重合させて、ハイドロゲルマトリックスに前記生物学的単位／バーコード単位の複合体を埋め込むステップと、
ｄ）ハイドロゲルマトリックス中の前記生物学的単位／バーコード単位の複合体のそれぞれの中にある生物学的単位の核酸にバーコードを付与するステップと、
を含み、各バーコード単位が固有のバーコードを含む、方法。
【請求項２】
個別の生物学的単位における遺伝子発現を解析するための方法であって、
ａ）複数の生物学的単位を複数のバーコード単位と接触させて、生物学的単位／バーコード単位の複合体を形成するステップであって、各バーコード単位が固有のバーコードを含み、前記バーコード単位が、前記生物学的単位への結合に関与する少なくとも１つの手段を含む、ステップと、
ｂ）前記生物学的単位／バーコード単位の複合体をハイドロゲル溶液と接触させるステップと、
ｃ）前記ハイドロゲル溶液を重合させて、ハイドロゲルマトリックスに前記生物学的単位／バーコード単位の複合体を埋め込むステップと、
ｄ）前記ハイドロゲルマトリックス中の各生物学的単位から核酸を放出させるステップと、
ｅ）前記ハイドロゲルマトリックス中の各生物学的単位に由来する前記核酸にバーコードを付与するステップと、
ｆ）各生物学的単位由来の核酸からｃＤＮＡライブラリーを合成するステップと、
ｇ）各生物学的単位由来の前記ｃＤＮＡライブラリーを増幅させるステップであって、各生物学的単位由来の前記ｃＤＮＡライブラリーの増幅が、前記固有のバーコードのクローンコピーを、各生物学的単位由来の増幅産物に組み込む、ステップと、
ｈ）任意選択で、前記増幅産物をシーケンシングするステップと
を含む、方法。
【請求項３】
個別の生物学的単位における遺伝子型を解析するための方法であって、
ａ）複数の生物学的単位を複数のバーコード単位と接触させて、生物学的単位／バーコード単位の複合体を形成するステップであって、各バーコード単位が固有のバーコードを含み、前記バーコード単位が、前記生物学的単位への結合に関与する少なくとも１つの手段を含む、ステップと、
ｂ）前記生物学的単位／バーコード単位の複合体をハイドロゲル溶液と接触させるステップと、
ｃ）前記ハイドロゲル溶液を重合させて、ハイドロゲルマトリックスに前記生物学的単位／バーコード単位の複合体を埋め込むステップと、
ｄ）前記ハイドロゲルマトリックス中の各生物学的単位からゲノムＤＮＡを放出させるステップと、
ｅ）前記ハイドロゲルマトリックス中の各生物学的単位に由来する前記ゲノムＤＮＡにバーコードを付与するステップと、
ｆ）任意選択で、各生物学的単位由来の核酸からＤＮＡライブラリーを合成するステップと、
ｇ）各生物学的単位由来の前記ゲノムＤＮＡまたはＤＮＡライブラリーを増幅させるステップであって、各生物学的単位由来の前記ゲノムＤＮＡまたはＤＮＡライブラリーの増幅が、前記固有のバーコードのクローンコピーを、各生物学的単位の増幅産物に組み込む、ステップと、
ｈ）任意選択で、前記増幅産物をシーケンシングするステップと
を含む、方法。
【請求項４】
個別の生物学的単位のハプロタイプを解析するための方法であって、
ａ）複数の生物学的単位を複数のバーコード単位と接触させて、生物学的単位／バーコード単位の複合体を形成するステップであって、各バーコード単位が固有のバーコードを含み、前記バーコード単位が、前記生物学的単位への結合に関与する少なくとも１つの手段を含む、ステップと、
ｂ）前記生物学的単位／バーコード単位の複合体をハイドロゲル溶液と接触させるステップと、
ｃ）前記ハイドロゲル溶液を重合させて、ハイドロゲルマトリックスに前記生物学的単位／バーコード単位の複合体を埋め込むステップと、
ｄ）任意選択で、前記ハイドロゲルマトリックス中の各生物学的単位から核酸を放出させるステップと、
ｅ）前記ハイドロゲルマトリックス中の各生物学的単位由来の前記核酸にバーコードを付与するステップと、
ｆ）任意選択で、各生物学的単位由来の核酸からＤＮＡライブラリーを合成するステップと、
ｇ）各生物学的単位由来の前記核酸またはＤＮＡライブラリーを増幅させるステップであって、各生物学的単位由来の前記核酸またはＤＮＡライブラリーの増幅が、前記固有のバーコードのクローンコピーを、各生物学的単位由来の増幅産物に組み込む、ステップと、
ｈ）任意選択で、前記増幅産物をシーケンシングするステップと
を含む、方法。
【請求項５】
個別の生物学的単位のエピゲノムを解析するための方法であって、
ａ）複数の細胞の生物学的単位を複数のバーコード単位と接触させて、生物学的単位／バーコード単位の複合体を形成するステップであって、各バーコード単位が固有のバーコードを含み、前記バーコード単位が、前記生物学的単位への結合に関与する少なくとも１つの手段を含む、ステップと、
ｂ）前記生物学的単位／バーコード単位の複合体をハイドロゲル溶液と接触させるステップと、
ｃ）前記ハイドロゲル溶液を重合させて、ハイドロゲルマトリックスに前記生物学的単位／バーコード単位の複合体を埋め込むステップと、
ｄ）前記ハイドロゲルマトリックス中の各生物学的単位から、非ヌクレオソーム結合型ＤＮＡを放出させるステップと、
ｅ）前記ハイドロゲルマトリックス中の各生物学的単位由来の前記非ヌクレオソーム結合型ＤＮＡにバーコードを付与するステップと、
ｆ）任意選択で、各生物学的単位由来の非ヌクレオソーム結合型ＤＮＡからＤＮＡライブラリーを合成するステップと、
ｇ）各生物学的単位由来の前記非ヌクレオソーム結合型ＤＮＡまたはＤＮＡライブラリーを増幅させるステップであって、各生物学的単位由来の前記非ヌクレオソーム結合型ＤＮＡまたはＤＮＡライブラリーの増幅が、前記固有のバーコードのクローンコピーを、各生物学的単位由来の増幅産物に組み込む、ステップと、
ｈ）任意選択で、前記増幅産物をシーケンシングするステップと
を含む、方法。
【請求項６】
前記生物学的単位が、担体に固定される、請求項１、２、３、４または５に記載の方法。
【請求項７】
前記バーコード単位が、担体に固定される、請求項１、２、３、４または５に記載の方法。
【請求項８】
前記生物学的単位または前記バーコード単位が、ハイドロゲル層にある担体に固定される、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記固有のバーコードが、各バーコード単位に関する複数のクローンコピーに存在する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記固有のバーコードが、核酸配列のバーコードを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記固有のバーコードが、核酸配列のプライマーをさらに含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記核酸配列のプライマーが、ランダムな核酸配列のプライマーおよび／または特定の核酸配列のプライマーを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記バーコード単位が、前記生物学的単位への結合に関与する少なくとも１つの手段をさらに含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記生物学的単位への結合に関与する前記少なくとも１つの手段が、タンパク質、ペプチド、および／もしくはそれらのフラグメント；抗体および／もしくはそのフラグメント；核酸；炭水化物；ビタミンおよび／もしくはその誘導体；補酵素および／もしくはその誘導体；受容体リガンドおよび／もしくはその誘導体；ならびに／または疎水基を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記各バーコード単位が、ビーズからなる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記バーコード付与のステップが、プライマー・テンプレートアニーリング、プライマー誘導型の伸長および／またはライゲーションにより、ハイドロゲルマトリックス中で実施される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記個別の生物学的単位が、細胞、細胞群、ウイルス、核、ミトコンドリア、葉緑体、生体高分子、エキソソーム、染色体、連結性が保存された転位ＤＮＡフラグメント、および／または核酸フラグメントを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞または細胞群が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの培養物中の細胞、幹細胞、腫瘍細胞、組織生検細胞、血液細胞、および組織切片の細胞を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
複数のバーコード単位であって、生物学的単位への結合に関与する少なくとも１つの手段を含み、各バーコード単位が、固有のバーコードを含む、複数のバーコード単位と、
ハイドロゲル溶液および／またはハイドロゲル溶液を調製するためのハイドロゲルモノマーと、
任意選択で、生物学的単位および／またはバーコード単位を結合するための担体と、
生化学アッセイおよび分子生物学アッセイのための試薬および溶液と、
使用説明書と
を含む、キット。
【請求項２０】
複数のあらかじめ結合させたバーコード単位を含む担体であって、前記バーコード単位が、生物学的単位への結合に関与する少なくとも１つの手段を含み、各バーコード単位が、固有のバーコードを含む、担体と、
ハイドロゲル溶液および／またはハイドロゲル溶液を調製するためのハイドロゲルモノマーと、
生化学アッセイおよび分子生物学アッセイのための試薬および溶液と、
使用説明書と
を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハイドロゲル中の個別の生物学的単位を捕捉およびバーコード付与するための方法に関する。特に本発明は、個別の生物学的単位の発現解析のための方法、および本発明の方法を実施するためのキットに関する。さらに本発明の方法は、単一細胞のトランスクリプトームのプロファイリング、ジェノタイピング、フェーズ化（phasing）、および／またはハプロタイピング（haplotyping）に使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
次世代シーケンシング（ＮＧＳ）解析を駆動するためには、３つのタスク：１）サンプルの調製（サンプルプレップ（sample prep））、２）シーケンシング、および３）バイオインフォマティクスが起こらなければならない。この３つの必要条件の１番目のサンプルプレップを、特に高スループット（ＨＴ）な反応の並列化およびスケールの効率性を可能にすることによって向上させるために、マイクロ流体学が用いられている。ＨＴなマイクロ流体学を用いたサンプルプレップを火急に必要としている適用技術の１つとして、ＲＮＡシーケンシングによる単一細胞の遺伝子発現解析（単一細胞ＲＮＡｓｅｑ）がある。この理由は、解析される細胞の数が、数百から数千の範囲である可能性があり、各ワークフローが、まず個別の反応チャンバーに単一の細胞を単離することにより開始するためである。よって、いずれかのマイクロ流体的なプラットフォームのＨＴ並列化反応能が、これら細胞数の必要要件に合致する必要がある。
【０００３】
単一細胞ＲＮＡｓｅｑ解析に関して商業化されている第１のマイクロ流体的なプラットフォームは、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）チップ技術に基づくものであった。入手可能なバージョンのプラットフォームは、数十から数百の細胞を処理することができる。懸濁液由来の細胞は、ナノリットル（ｎＬ）の容量のＰＤＭＳチャンバーに単離され、その後、バルブの開口および適切な溶解試薬の入口へのアクセスを介した溶解試薬の使用により溶解される。ｍＲＮＡの逆転写、ｃＤＮＡへのアダプター配列の付加、およびＰＣＲを、連続して達成するために、バルブの開口および特定の試薬の入口の選択が、その後の各ステップで行われる。次に、単一細胞産物由来のアンプリコンを、チップから回収し、バルクで処理し、シーケンシングのサンプルプレップを完了する。ＰＤＭＳの構造を使用するプラットフォームは、費用のかかる多層のＰＤＭＳチップ、ならびにこれらチップを作動させるための洗練された圧力および熱の制御の計測手段を必要とするため、限定されている。さらに、反応の数は、製造され得る最小のＰＤＭＳの特性により決定される。合理的な大きさのチップで、所定の時間に１０００個以下の細胞を処理できるこの手段は、生体サンプルの大部分にとっては十分ではない。さらにスループットが適切な場合であっても、チップおよび器具の観点の両方からみて、ＰＤＭＳの基盤は、非常に費用がかかる。
【０００４】
油滴中水型のエマルジョンは、別の形態のマイクロ流体学である。ＰＤＭＳベースの技術と比較すると、液滴は、反応の数を有意に増やす利点がある。スループットは、エマルジョンの体積によってのみ限定され、この数は、液滴の大きさの減少に比例して増大する。各ビーズに固有のクローンオリゴ（clonal oligo）でコーティングされたビーズをカプセル化することが、液滴反応の並列した分子のコード化を可能にすることが発見された。たとえば、遺伝子発現の適用空間において、液滴への細胞溶解の後に、ビーズオリゴは、ｍＲＮＡに結合し、このプロセスにおいて、ビーズのバーコードとしても知られている一般的なビーズ分子タグ（bead molecular tag）で単一の細胞のトランスクリプトームをコードする。シーケンシング後に、同じバーコードを有する配列を、まとめてグループ分けすることができ、これによって、個々の反応チャンバーまたは液滴におけるビーズおよび細胞の以前のカップリングを効率的に再構成し、単一細胞の解析を可能にする。分子生物学のステップは、様々な形態の液滴コード化技術のプラットフォームによって変動する。Ｄｒｏｐ−ＳＥＱでは、液滴でのビーズオリゴへのｍＲＮＡの結合後に、逆転写およびその後のサンプル調製のステップが、崩壊したエマルジョンに関するバルクで行われる。他の市販のプラットフォームでは、逆転写が液滴で起こり、ここでは最終的なサンプル調製のステップはバルクで行われる。スループットのボトルネックを除去した後に、液滴は、他の有意な欠点を有する。第１に、液滴およびそれらの単分散の形態は、溶解することが困難な細胞（植物細胞、特定の細菌、特にグラム陽性細菌、カビ、胞子、酵母、マイコバクテリアなど）を溶解するため、核へのアクセスするため、および多くの重要な分子生物学のステップを行うために使用される界面活性剤のレベルと適合しない。第２に、複数のステップの分子生物学の反応を行うことは、液滴では非常に困難である。たとえば液滴の混合またはｐｉｃｏ−ｉｎｊｅｃｔｉｏｎにより可能性はあるが、複数のステップの液滴のワークフローは、複雑さおよびマイクロ流体の設定の費用を著しく増大させる。第３に、液滴のプラットフォームは、高いグレードの油、その特性が産業規模で製造することが困難である洗練されたチップ、ならびにこれらチップを介した正確な流量制御を調整および行うための器具を必要とする。液滴のプラットフォームに必要な３つの要素の全て、すなわち油、チップ、および器具は、製造および技術サポートに重荷を負わせ、かつ重要なことに、エンドユーザに対する費用を増大させることにより、幅広い液滴技術の採用を限定している。
【０００５】
本発明は、既存の技術の欠点を排除するために設計されている。驚くべきことに、実際に本発明者らは、数千超の細胞を処理できる点における液滴のプラットフォームの鍵となる利点を保ちつつ、ＰＤＭＳチップまたは液滴を必要としない単一細胞遺伝子発現解析に関する新規の方法を開発した。この新規の技術はまた、ハイドロゲルのプラットフォームの使用に基づき、液滴の技術に関連する鍵となる３つの問題をも解決している。第１に、いずれの界面活性剤のレベルもが、ハイドロゲルのプラットフォームにより担持され、いずれの細胞または核を溶解する可能性をもたらし、鍵となる生化学および分子生物学の反応を支援する。第２に、可溶性の試薬がハイドロゲルを介して反応器の空間に容易にアクセスできるため、複数のステップの反応を容易に行うことができる。その後の反応は、単純に、ハイドロゲルと接触した大部分の溶液を交換することにより行われる。第３に、費用のかかる油、チップ、および／または液滴の作製器具を必要としない。自動化のため、ハイドロゲル反応器のプラットフォームを管理するための器具が使用される場合があるが、必須ではない。
【０００６】
ＰＤＭＳおよび液滴の技術の限定およびハイドロゲル反応器のプラットフォームの改善は、単一細胞の遺伝子発現の分野に限定されてはいない。これらは、基質が、フェーズ化およびゲノム構造の適用技術における基質として使用される単一細胞のゲノムおよび長いネイキッドＤＮＡ分子などの複数のプライマー結合部位を有するいずれの応用にも当てはまる。分子生物学の反応は、基質の同定およびサンプルプレップ法の出力の必要条件により変動する。しかしながら、ハイドロゲル中の生物学的単位を捕捉およびバーコード付与するための基本的な方法は、変化しないままである。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、ハイドロゲル中の個別の生物学的単位を捕捉するための方法であって、
ａ）複数の生物学的単位を複数のバーコード単位と接触させて、生物学的単位／バーコード単位の複合体を形成するステップと、
ｂ）前記生物学的単位／バーコード単位の複合体をハイドロゲル溶液と接触させるステップと、
ｃ）前記ハイドロゲル溶液を重合させて、ハイドロゲルマトリックスに前記生物学的単位／バーコード単位の複合体を埋め込むステップと、
ｄ）ハイドロゲルマトリックス中の前記生物学的単位／バーコード単位の複合体のそれぞれの中にある生物学的単位の核酸にバーコードを付与するステップと
を含む、方法に関する。
【０００８】
一実施形態では、各バーコード単位は、固有のバーコードを含む。
【０００９】
さらに本発明は、個別の生物学的単位における遺伝子発現を解析するための方法であって、
ａ）複数の生物学的単位を複数のバーコード単位と接触させて、生物学的単位／バーコード単位の複合体を形成するステップであって、各バーコード単位が固有のバーコードを含み、前記バーコード単位が、前記生物学的単位への結合に関与する少なくとも１つの手段を含む、ステップと、
ｂ）前記生物学的単位／バーコード単位の複合体をハイドロゲル溶液と接触させるステップと、
ｃ）前記ハイドロゲル溶液を重合させて、ハイドロゲルマトリックスに前記生物学的単位／バーコード単位の複合体を埋め込むステップと、
ｄ）前記ハイドロゲルマトリックス中の各生物学的単位から核酸を放出させるステップと、
ｅ）前記ハイドロゲルマトリックス中の各生物学的単位に由来する核酸にバーコードを付与するステップと、
ｆ）前記各生物学的単位由来の核酸からｃＤＮＡライブラリーを合成するステップと、
ｇ）各生物学的単位由来の前記ｃＤＮＡライブラリーを増幅させるステップであって、各生物学的単位由来の前記ｃＤＮＡライブラリーの増幅が、前記固有のバーコードのクローンコピー（clonal copies）を、各生物学的単位由来の増幅産物に組み込む、ステップと、
ｈ）任意選択で、前記増幅産物をシーケンシングするステップと
を含む、方法に関する。
【００１０】
さらに本発明は、個別の生物学的単位における遺伝子型を解析するための方法であって、
ａ）複数の生物学的単位を複数のバーコード単位と接触させて、生物学的単位／バーコード単位の複合体を形成するステップであって、各バーコード単位が固有のバーコードを含み、前記バーコード単位が、前記生物学的単位への結合に関与する少なくとも１つの手段を含む、ステップと、
ｂ）前記生物学的単位／バーコード単位の複合体をハイドロゲル溶液と接触させるステップと、
ｃ）前記ハイドロゲル溶液を重合させて、ハイドロゲルマトリックスに前記生物学的単位／バーコード単位の複合体を埋め込むステップと、
ｄ）前記ハイドロゲルマトリックス中の各生物学的単位からゲノムＤＮＡを放出させるステップと、
ｅ）ハイドロゲルマトリックス中の各生物学的単位に由来する前記ゲノムＤＮＡにバーコードを付与するステップと、
ｆ）任意選択で、各生物学的単位由来の核酸からＤＮＡライブラリーを合成するステップと、
ｇ）各生物学的単位由来の前記ゲノムＤＮＡまたはＤＮＡライブラリーを増幅させるステップであって、各生物学的単位由来の前記ゲノムＤＮＡまたはＤＮＡライブラリーの増幅が、前記固有のバーコードのクローンコピーを、各生物学的単位の増幅産物に組み込む、ステップと、
ｈ）任意選択で、前記増幅産物をシーケンシングするステップと
を含む、方法に関する。
【００１１】
さらに本発明は、個別の生物学的単位のハプロタイプを解析するための方法であって、
ａ）複数の生物学的単位を複数のバーコード単位と接触させて、生物学的単位／バーコード単位の複合体を形成するステップであって、各バーコード単位が固有のバーコードを含み、前記バーコード単位が、前記生物学的単位への結合に関与する少なくとも１つの手段を含む、ステップと、
ｂ）前記生物学的単位／バーコード単位の複合体をハイドロゲル溶液と接触させるステップと、
ｃ）前記ハイドロゲル溶液を重合させて、ハイドロゲルマトリックスに前記生物学的単位／バーコード単位の複合体を埋め込むステップと、
ｄ）任意選択で、前記ハイドロゲルマトリックス中の各生物学的単位から核酸を放出させるステップと、
ｅ）ハイドロゲルマトリックス中の各生物学的単位由来の前記核酸にバーコードを付与するステップと、
ｆ）任意選択で、各生物学的単位由来の核酸からＤＮＡライブラリーを合成するステップと、
ｇ）各生物学的単位由来の前記核酸またはＤＮＡライブラリーを増幅させるステップであって、各生物学的単位由来の前記核酸またはＤＮＡライブラリーの増幅が、前記固有のバーコードのクローンコピーを、各生物学的単位由来の増幅産物に組み込む、ステップと、
ｈ）任意選択で、前記増幅産物をシーケンシングするステップと
を含む、方法に関する。
【００１２】
さらに本発明は、個別の生物学的単位のエピゲノムを解析するための方法であって、
ａ）複数の細胞の生物学的単位を複数のバーコード単位と接触させて、生物学的単位／バーコード単位の複合体を形成するステップであって、各バーコード単位が固有のバーコードを含み、前記バーコード単位が、前記生物学的単位への結合に関与する少なくとも１つの手段を含む、ステップと、
ｂ）前記生物学的単位／バーコード単位の複合体をハイドロゲル溶液と接触させるステップと、
ｃ）前記ハイドロゲル溶液を重合させて、ハイドロゲルマトリックスに前記生物学的単位／バーコード単位の複合体を埋め込むステップと、
ｄ）前記ハイドロゲルマトリックス中の各生物学的単位から、非ヌクレオソーム結合型ＤＮＡを放出させるステップと、
ｅ）ハイドロゲルマトリックス中の各生物学的単位由来の前記非ヌクレオソーム結合型ＤＮＡにバーコードを付与するステップと、
ｆ）任意選択で、各生物学的単位由来の非ヌクレオソーム結合型ＤＮＡからＤＮＡライブラリーを合成するステップと、
ｇ）各生物学的単位由来の前記非ヌクレオソーム結合型ＤＮＡまたはＤＮＡライブラリーを増幅させるステップであって、各生物学的単位由来の前記非ヌクレオソーム結合型ＤＮＡまたはＤＮＡライブラリーの増幅が、前記固有のバーコードのクローンコピーを、各生物学的単位由来の増幅産物に組み込む、ステップと、
ｈ）任意選択で、前記増幅産物をシーケンシングするステップと
を含む、方法に関する。
【００１３】
一実施形態では、生物学的単位を、担体に固定する。一実施形態では、バーコード単位を、担体に固定する。
【００１４】
一実施形態では、生物学的単位を、ハイドロゲル層にある担体に固定する。一実施形態では、バーコード単位を、ハイドロゲル層にある担体に固定する。
【００１５】
一実施形態では、固有のバーコードは、各バーコード単位に関する複数のクローンコピーに存在する。
【００１６】
一実施形態では、固有のバーコードは、核酸配列のバーコードを含む。
【００１７】
一実施形態では、固有のバーコードは、核酸配列のプライマーを含む。一実施形態では、核酸配列のプライマーは、ランダムな核酸配列のプライマーを含む。一実施形態では、核酸配列のプライマーは、特定の核酸配列のプライマーを含む。
【００１８】
一実施形態では、バーコード単位は、生物学的単位への結合に関与する少なくとも１つの手段を含む。一実施形態では、生物学的単位への結合に関与する少なくとも１つの手段は、タンパク質、ペプチド、および／もしくはそれらのフラグメント；抗体および／もしくはそのフラグメント；核酸；炭水化物；ビタミンおよび／もしくはその誘導体；補酵素および／もしくはその誘導体；受容体リガンドおよび／もしくはその誘導体；ならびに／または疎水基を含む。
【００１９】
一実施形態では、各バーコード単位は、ビーズからなる。
【００２０】
一実施形態では、バーコード付与のステップは、プライマー・テンプレートアニーリング（primer template annealing）により、ハイドロゲルマトリックス中で行われる。一実施形態では、バーコード付与のステップは、プライマー誘導型の伸長（primer-directed extension）により、ハイドロゲルマトリックス中で行われる。一実施形態では、バーコード付与のステップは、ライゲーションにより、ハイドロゲルマトリックス中で行われる。
【００２１】
一実施形態では、個別の生物学的単位は、細胞、細胞群、ウイルス、核、ミトコンドリア、葉緑体、生体高分子、エキソソーム、染色体、連結性が保存された転位ＤＮＡフラグメント、および／または核酸フラグメントを含む。
【００２２】
一実施形態では、細胞または細胞群は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの培養物中の細胞、幹細胞、腫瘍細胞、組織生検細胞、血液細胞、および組織切片の細胞を含む。
【００２３】
さらに本発明は、
複数のバーコード単位であって、生物学的単位への結合に関与する少なくとも１つの手段を含み、各バーコード単位が、固有のバーコードを含む、複数のバーコード単位と、
ハイドロゲル溶液および／またはハイドロゲル溶液を調製するためのハイドロゲルモノマーと、
任意選択で、生物学的単位および／またはバーコード単位を結合するための担体と、
生化学アッセイおよび分子生物学アッセイのための試薬および溶液と、
使用説明書と
を含む、キットに関する。
【００２４】
さらに本発明は、
複数のあらかじめ結合させたバーコード単位を含む担体であって、前記バーコード単位が、生物学的単位への結合に関与する少なくとも１つの手段を含み、各バーコード単位が、固有のバーコードを含む、担体と、
ハイドロゲル溶液および／またはハイドロゲル溶液を調製するためのハイドロゲルモノマーと、
生化学アッセイおよび分子生物学アッセイのための試薬および溶液と、
使用説明書と
を含む、キットに関する。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
定義
本発明では、以下の用語は以下の意味を有する。
【００２６】
用語「約（「ａｂｏｕｔ」または「ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ」）」は、当業者により決定される場合に、特定の値についての許容可能な誤差の範囲内を意味し得、どのように値が測定または決定されるか、すなわち測定システムの限界に部分的に依存している。たとえば、「約」は、当該分野の実務ごとに、１以内または１超の標準偏差を意味し得る。あるいは、ある数字の前の「約」は、上記数字の値の±１０％を意味する。あるいは、特に生体の系またはプロセスに関しては、この用語は、ある値の桁の範囲内、５倍の範囲内、より好ましくは２倍の範囲内を意味し得る。特定の値が本出願および特許請求の範囲に記載されている場合、他の意味が記載されていない限り、特定の値に関して容認可能な誤差の範囲内を意味する用語「約」が想定されるべきである。
【００２７】
用語「増幅」は、所望のテンプレート配列の複数のコピー、すなわち少なくとも２つのコピーを産生させるプロセスを表す。核酸を増幅させるための技術は当業者によく知られており、特定の増幅方法および無作為な増幅方法を含む。
【００２８】
用語「Ａ鎖形成（Ａ−ｔａｉｌｉｎｇ）」は、平滑末端化した二本鎖のＤＮＡ分子の３’末端に、鋳型形成されていないＡヌクレオチドを付加するための酵素を用いる方法を表す。
【００２９】
用語「バーコード」は、個別の生物学的単位を独自に同定するための、固有の識別子として使用できる分子のパターンを表す。用語「バーコード」はさらに、たとえば個別の生物学的単位から抽出されるかまたはこれに由来する核酸配列などのサンプルの中の解析物の供給源または起源を同定するために使用される分子のパターンを表す。
【００３０】
用語「バーコード単位」は、生物学的単位が結合または固定され得る同定可能な基質またはマトリックスを表す。バーコード単位は、強固な固体または半固体であり得る。
【００３１】
用語「バーコードを付与する」は、プライマー・テンプレートアニーリング、プライマー依存性のＤＮＡ合成、および／またはライゲーションを介した、個別のバーコード単位のバーコード、好ましくは核酸のバーコードの、生物学的単位のテンプレートの核酸配列への結合を表す。
【００３２】
用語「ビーズ」は、球状であり得るか（たとえばマイクロスフィア）または不規則な形状を有し得る個別の粒子を表す。ビーズは、直径が約０．１μｍほどの小ささであってもよく、または直径約数ミリメートル程度の大きさであってもよい。
【００３３】
用語「生物学的単位」は、個別の生体構造、および、生体構造の一部、構成要素、または組み合わせを表す。生物学的単位の例として、限定するものではないが、細胞、細胞群、ウイルス、核、ミトコンドリア、または葉緑体などのオルガネラ、エキソソームなどの高分子複合体、生体高分子、たとえば染色体、核酸フラグメント、連結性が保存された転位ＤＮＡ（ＣＰＴ−ＤＮＡ）フラグメント、タンパク質、またはペプチドが挙げられる。
【００３４】
用語「炭水化物」は、一般式Ｃｘ（Ｈ２Ｏ）ｙを有するいずれかのクラスの有機化合物を表す。炭水化物として、糖、デンプン、セルロース、およびガムが挙げられる。炭水化物は、単糖、二糖、または多糖であり得る。炭水化物は、天然に存在するものであってもよく、または合成されたものであっってもよい。
【００３５】
単糖は、単鎖または単環構造を有するモノマーまたは単純な糖である。単糖は、特にアルドース、ケトース、ピラノース、フラノース、トリオース、テトロース、ペントース、ヘキソース、およびヘプトースなど、自身の構造およびその環または鎖の炭素原子の数によりさらに分類することができる。単糖の例として、限定するものではないが、Ｎ−アセチルグルコサミン、アロース、アルトロース、アラビノース、デオキシリボース、ジヒドロキシアセトン、エリトロース、フルクトース、フコース、α−Ｌ−フコピラノース、ガラクトース、β−Ｄ−ガラクトピラノース、ガラクツロン酸、グルコース（ブドウ糖）、グルクロン酸、グリセルアルデヒド、グロース、イドース、リキソース、マンノース、α−Ｄ−マンノピラノース、マンヌロン酸、ノイラミン酸、プシコース、ラムノース、リボース、リブロース、ソルボース、タガトース、トレオース、キシロース、およびキシルロースが挙げられる。
【００３６】
二糖は、グリコシド結合により結合した２つの単糖から形成されている。二糖の例として、限定するものではないが、セロビオース、ゲンチオビオース、イソマルトース、ラクトース、ラクツロース、ラミナリビオース、マルトース、マンノビオース、メリビオース、ニゲロース、ルチノース、スクロース、トレハロース、およびキシロビオースが挙げられる。
【００３７】
多糖は、グリコシド結合により結合した２つ以上の単糖から形成されたポリマーである。３〜１０個の単糖から形成された多糖は、多くの場合オリゴ糖と呼ばれる。多糖の例として、限定するものではないが、アガロース、アルギン酸塩、アミロペクチン、アミロース、カラギーナン（ｃａｒａｇｅｅｎａｎ）、セルロース、キチン、キトヘキサノース（ｃｈｉｔｏｈｅｘａｎｏｓｅ）、キトサン、コンドロイチン硫酸、カードラン、デルマタンスルファート、デキストラン、デキストリン、エマルサン（ｅｍｕｌｓａｎ）、フルセララン、ガラクトマンナン、グルコマンナン、ゲランガム、グルコサミン、グリコーゲン、グリコサミノグリカン、グアーガム、アラビアゴム、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、脱アシル化ヒアルロン酸、イヌリン、イソマルツロース、カラヤゴム、ケラタン硫酸、ラミナラン、ローカストビーンガム、ムラミン酸、ペクチン酸、ペクチン、プルラン、プスツラン、ラムザンガム、シゾフィラン、スクレログルカン、スタキオース、デンプン、トラガントガム（ｔｒａｇａｃａｎｔ  ｇｕｍ）、ウェランガム、キサンタン、およびキサンタンガムが挙げられる。
【００３８】
本明細書中使用される場合、用語「炭水化物」はまた、たとえばタンパク質および脂質などの他の化学種と共有結合した炭水化物である「複合糖質」をも表す。複合糖質の例として、限定するものではないが、糖脂質、グリコペプチド、糖タンパク質、リポ多糖、およびペプチドグリカンが挙げられる。
【００３９】
用語「ｃＤＮＡライブラリー」は、ｍＲＮＡから逆転写した相補的ＤＮＡから構成されたライブラリーを表す。
【００４０】
用語「細胞」および「細胞群」は、限定するものではないが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの培養物中の細胞；胚性幹細胞、成体幹細胞、がん幹細胞、人工多能性幹細胞、または誘導性幹細胞などの幹細胞；新生細胞などの腫瘍細胞；組織生検細胞；赤血球、白血球、マスト細胞、マクロファージ、血小板、またはそれらの前駆細胞などの血液細胞；および組織切片の細胞が挙げられる。
【００４１】
用語「クローンコピー」は、単一のバーコードの同一コピーの集合を表す。
【００４２】
用語「コーティングする（ｃｏａｔ）」および「コーティング（ｃｏａｔｉｎｇ）」は、基質、たとえば担体および／またはバーコード単位の被覆、修飾、または官能基付与を表す。
【００４３】
用語「補酵素」は、酵素反応中に化学構造を変化させ、反応基質に原子または電子などの機能的な要素を送達することにより、酵素反応を支援する因子である、アポ酵素に結合する非タンパク質要素を表す。また「補酵素」は、「補因子」または「ヘルパー酵素」とも呼ばれ得る。
【００４４】
補酵素の例として、限定するものではないが、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、ＮＡＤＨ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）、ＮＡＤＰＨ、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、ホスホアデニル硫酸（ＰＡＰＳ）、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、イノシン三リン酸（ＩＴＰ）、チアミンピロリン酸（ＴＰＰ）、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＭ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、補酵素Ａ（ＣｏＡ）、ビオサイチン、テトラヒドロ葉酸、補酵素Ｂ１２、リポイルリシン、１，１−シス−レチナール、および１，２，５−ジヒドロキシコレカルシフェロールが挙げられる。
【００４５】
用語「補完する（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）」または「相補的な（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」は、水素結合による別のポリヌクレオチド配列との塩基の対形成を形成できるポリヌクレオチド配列を表す。たとえば、グアニン（Ｇ）は、シトシン（Ｃ）の相補的な塩基であり、アデニン（Ａ）は、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）の相補的な塩基である。
【００４６】
用語「連結性」は、共有した情報に基づく２つ以上のＤＮＡフラグメント間の空間的な関係を表す。共有される情報の態様は、隣接した区画の距離空間的な関係に関するものであり得る。その後、これら関係に関する情報は、ＤＮＡフラグメントに由来する配列の読み取りの階層的な構築またはマッピングを促進する。この連結性の情報は、このような構築またはマッピングの効率および正確性を向上させる。この理由は、従来のショットガンシーケンシングに関連して使用される従来の構築またはマッピングの方法が、個別の配列の読み取りが派生する２つ以上のＤＮＡフラグメント間の空間的な関係に関連する場合の、個別の配列の読み取りの相対的なゲノムの起源または座標（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ）を考慮していないためである。
【００４７】
用語「所望のテンプレート配列のコピー」は、必ずしもテンプレート配列との完全な配列の相補性または同一性を意味するものではない。コピーは、たとえば、デオキシイノシンなどのヌクレオチド類縁体、意図的な配列の交代、および／または増幅中に起こる配列のエラーを含み得る。一実施形態では、所望の配列のコピーは、テンプレート配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約１００％同一である。
【００４８】
用語「界面活性剤」は、親油性および親水性（すなわち両親媒性）の特徴を有する分子を表す。界面活性剤は、界面活性物質の電荷に応じて、４つの広いグループに分類される：
（１）陰イオン性界面活性剤は、負のイオン電荷を有する界面活性剤を表す。陰イオン性界面活性剤の例として、限定するものではないが、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、Ｎ−ラウリルサルコシン（サルコシル）、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム、およびドデシル硫酸リチウム（ＬＤＳ）が挙げられる。
（２）陽イオン性界面活性剤は、正のイオン電荷を有する界面活性剤を表す。陽イオン性界面活性剤の例として、限定するものではないが、四級アンモニウム塩、アミド結合を有するアミン、ポリオキシエチレンアルキル、および脂環式アミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’［４］置換型エチレンジアミン、２−アルキル  １−ヒドロキシエチル  ２  イミダゾリンエトキシル化アミン、およびアルキルアンモニウム塩が挙げられる。
（３）非イオン性界面活性剤は、いずれのイオン基も有さない界面活性剤を表す。非イオン性界面活性剤の例として、限定するものではないが、ポリソルベート、オクチルフェノールエトキシレート、グルカミン、Ｌｕｂｒｏｌ、Ｂｒｉｊ、Ｎｏｎｉｄｅｔ、ポロクサマー、Ｇｅｎａｐｏｌ、およびＩｇｅｐａｌが挙げられる。
ポリソルベートの例として、限定するものではないが、ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ  ２０）、ポリソルベート４０（Ｔｗｅｅｎ  ４０）、ポリソルベート６０（Ｔｗｅｅｎ  ６０）、ポリソルベート６５（Ｔｗｅｅｎ  ６５）、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ  ８０）、およびポリソルベート８５（Ｔｗｅｅｎ  ８５）が挙げられる。
オクチルフェノールエトキシレートの例として、限定するものではないが、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１５、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−３５、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１０２、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１６５（７０％）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−３０５（７０％）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４０５（７０％）、およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−７０５（７０％）が挙げられる。
グルカミンの例として、限定するものではないが、Ｎ−オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミン（ＭＥＧＡ−８）、Ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミン（ＭＥＧＡ−９）、およびＮ−デカノイル−Ｎ−メチルグルカミン（ＭＥＧＡ−１０）が挙げられる。
Ｌｕｂｒｏｌの例として、限定するものではないが、Ｌｕｂｒｏｌ  ＷＸ、Ｌｕｂｒｏｌ  ＰＸ、Ｌｕｂｒｏｌ  １２Ａ９、Ｌｕｂｒｏｌ  １７Ａ１０、Ｌｕｂｒｏｌ  １７Ａ１７、Ｌｕｂｒｏｌ  Ｎ１３、およびＬｕｂｒｏｌ  Ｇが挙げられる。
Ｂｒｉｊの例として、限定するものではないが、Ｂｒｉｊ  ３５、Ｂｒｉｊ  ５８、Ｂｒｉｊ  ９３、Ｂｒｉｊ  ９７、Ｂｒｉｊ  Ｃ２、Ｂｒｉｊ  Ｓ２、Ｂｒｉｊ  Ｌ４、Ｂｒｉｊ  Ｃ１０、Ｂｒｉｊ  Ｏ１０、Ｂｒｉｊ  Ｓ１０、Ｂｒｉｊ  Ｏ２０、Ｂｒｉｊ  Ｓ２０、Ｂｒｉｊ  Ｌ２３、およびＢｒｉｊ  Ｓ１００が挙げられる。
Ｎｏｎｉｄｅｔの例として、限定するものではないが、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０が挙げられる。
ポロクサマーの例として、限定するものではないが、ポロクサマー１２４、ポロクサマー１８１、ポロクサマー１８２、ポロクサマー１８４、ポロクサマー１８８（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８）、ポロクサマー３３１、ポロクサマー４０７（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７）が挙げられる。
Ｇｅｎａｐｏｌの例として、限定するものではないが、Ｇｅｎａｐｏｌ  Ｘ−０８０、Ｇｅｎａｐｏｌ  Ｘ−１００、およびＧｅｎａｐｏｌ  Ｃ−１００が挙げられる。
Ｉｇｅｐａｌの例として、限定するものではないが、Ｉｇｅｐａｌ  ＣＡ−２１０、Ｉｇｅｐａｌ  ＣＡ−５２０、Ｉｇｅｐａｌ  ＣＡ−６３０、Ｉｇｅｐａｌ  ＣＡ−７２０、Ｉｇｅｐａｌ  ＣＯ−５２０、Ｉｇｅｐａｌ  ＣＯ−６３０、Ｉｇｅｐａｌ  ＣＯ−７２０、Ｉｇｅｐａｌ  ＣＯ−８９０、およびＩｇｅｐａｌ  ＤＭ−９７０が挙げられる。
（４）双性イオン界面活性剤は、イオン基を有するが、正味の電荷を有さない界面活性剤を表す。双性イオン界面活性剤の例として、限定するものではないが、アミドスルホベタイン、アルキルベタイン、およびアンモニオプロパンスルホナート、たとえばアミドスルホベタイン−１４、アミドスルホベタイン−１６、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳＯ）、３−（４−ヘプチル）フェニル−３−ヒドロキシプロピル）ジメチルアンモニオプロパンスルホナート（Ｃ７ＢｚＯ）、ＥＭＰＩＧＥＮ（登録商標）ＢＢ、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルオクチルアンモニオ）プロパンスルホナート分子内塩、３−（デシルジメチルアンモニオ）プロパンスルホナート分子内塩、３−（ドデシルジメチルアンモニオ）プロパンスルホナート分子内塩、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルミリスチルアンモニオ）プロパンスルホナート分子内塩、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルパルミチルアンモニオ）プロパンスルホナート分子内塩、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルオクタデシルアンモニオ）プロパンスルホナート分子内塩が挙げられる。
【００４９】
用語「エピゲノム」は、細胞のＤＮＡおよび／またはヒストンタンパク質に対する化学的変化の全てを表し、遺伝子発現の制御、発達、分化、および転移因子の抑制に寄与している。
【００５０】
用語「ゲノム構造」は、染色体に沿って配置されている遺伝子単位（座位、遺伝子など）の順序、数、および存在を表す。
【００５１】
用語「ハプロタイプ」は、単一の親からまとまって遺伝した単一の染色体上にある異なる座位由来の遺伝子のグループを表す。ハプロタイプの情報は、同じ（シス）または対立遺伝子（トランス）のＤＮＡ鎖上の遺伝子バリアントの潜在的な機能的効果の理解に寄与している。
【００５２】
用語「ハイドロゲル」は、物理的または化学的な架橋を伴う、親水性であり高含水性の、ポリマーのネットワークを表す。通常ハイドロゲルは、特に架橋の度合いに応じて、２つの状態：ゾル状態およびゲル状態で、見いだされる。ゾル状態では、ハイドロゲルは液体としてふるまい、ゲル状態では、ハイドロゲルは、流動を呈さない。当業者にはっきりと明らかであるように、ハイドロゲルは、ゾル状態ですでにポリマーであり得るが、「ハイドロゲルを重合化すること」との文言は、ゾルからゲルの移行を達成するために必要とされる重合化および／または架橋を指定するように、本明細書中で使用される。
【００５３】
用語「ハイドロゲルマトリックス」は、ゲル状態、すなわち、本明細書中さらに開示されるように、本発明の目的にとって望ましい多孔度を達成する架橋したポリマーのネットワーク状である、ハイドロゲルの物理的な構造を表す。
【００５４】
用語「同一性」は、２つ以上の核酸配列の配列間の関係に使用される場合、２つ以上のヌクレオチド残基の鎖間の一致数により決定される、核酸間の配列の関連性の度合いを表す。「同一性」は、特定の数学モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち「アルゴリズム」）により提示される、ギャップアライメント（存在する場合）を伴う２つ以上の配列のうちの小さい方に合わせた配列間の同一である一致のパーセントを測定する。関連する核酸配列の同一性は、既知の方法によって容易に計算できる。このような方法として、限定するものではないが、Ｌｅｓｋ，  Ａｒｔｈｕｒ  Ｍ．  （１９８８），  “Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ”，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｓｍｉｔｈ，  Ｄｏｕｇｌａｓ  Ｗ．  （１９９３），  “Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｐｒｏｊｅｃｔｓ”，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ａｎｎｅｔｔｅ  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｈｕｇｈ  Ｇ．  Ｇｒｉｆｆｉｎ  （１９９４），  “Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａ，  ｐａｒｔ  １”，  Ｔｏｔｏｗａ，  ＮＪ：  Ｈｕｍａｎａ；ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，  Ｇｕｎｎａｒ  （１９８７），  “Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ：ｔｒｅａｓｕｒｅ  ｔｒｏｖｅ  ｏｒ  ｔｒｉｖｉａｌ  ｐｕｒｓｕｉｔ”，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，  Ｍｉｃｈａｅｌ，  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  （１９９１），  “Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｐｒｉｍｅｒ”，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ：Ｍ．  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃａｒｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８．  ＳＩＡＭ  Ｊ．  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．  ４８：１０７３に記載されるものが挙げられる。同一性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間に最大の一致を提供するように設計されている。同一性を決定する方法は、公的に利用可能なコンピュータプログラムで記載されている。２つの配列間の同一性を決定するための好ましいコンピュータプログラム法として、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８４．  Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  ２：３８７；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓ．）、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０．  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−４１０）を含むＧＣＧプログラムパッケージが挙げられる。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）および他の供給源（ＢＬＡＳＴマニュアル；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．  ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍｄ．  ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０．  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−４１０）から、公的に入手可能である。よく知られているＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムもまた、同一性を決定するために使用されてもよい。
【００５５】
用語「キット」および「キットオブパーツ」は、輸送および保存を可能にするためにパッケージングされている、本発明に係る方法を行うために必要な異なる試薬を含むいずれかの製造物品（たとえばパッケージまたは少なくとも１つの容器）を表す。用語「キット」および「キットオブパーツ」は、個別の使用が意図されているが、互いに機能的に関連している、物理的に別々の構成要素の実体を包有すべきである。キットは、本発明の方法を行うための単位として、奨励、配布、または販売され得る。さらに、キットの試薬のいずれかまたは全てが、密閉された無菌性の容器などの、試薬を外部環境から保護する容器の中に提供され得る。またキットは、キットおよびその使用方法を説明する添付文書を含み得る。
【００５６】
用語「ライゲーション」は、共有結合でＤＮＡ分子をまとめて結合するプロセスを表す。たとえばＤＮＡのライゲーションは、１つのヌクレオチドの３’ヒドロキシル基と別のヌクレオチドの５’リン酸基との間にホスホジエステル結合を作製することを含む。ライゲーションは、好ましくは、リガーゼ酵素の存在下にて、約４〜約３７℃の範囲の温度で行われる。適切なリガーゼの例として、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のリガーゼ、テルムス・アクウァーティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｃｑｕａｔｉｃｕｓ）のリガーゼ、大腸菌のリガーゼ、Ｔ４リガーゼ、およびパイロコッカスのリガーゼが挙げられる。
【００５７】
用語「ライセート」は、生物学的単位の溶解手法を受けた後の、液体または固体の物質の集合を表す。
【００５８】
用語「溶解（ｌｙｓｉｓ）」または「溶解する（ｌｙｓｅ）」は、他の場合では接近できない物質へのアクセスを可能にするための、生物学的単位の崩壊を表す。生物学的単位が細胞である場合、溶解は、細胞の細胞膜を破壊すること、細胞膜の孔を介した細胞内への試薬の伝達を可能にすること、および／または細胞の中身の波及をもたらすことを表す。溶解方法は、当業者によく知られており、限定するものではないが、タンパク質分解性の溶解、化学的な溶解、熱的溶解、機械的溶解、および浸透圧性の溶解を含む。
【００５９】
用語「核酸配列のプライマー」または「プライマー」は、適切な条件、たとえば適切なバッファーおよび適切な温度における、ヌクレオシド三リン酸、およびＤＮＡもしくはＲＮＡのポリメラーゼまたは逆転写酵素などの重合化のための酵素の存在下で、核酸とハイブリダイゼーションまたはアニーリングでき、かつヌクレオチドの重合化の開始部位として機能できるオリゴヌクレオチドを表す。
【００６０】
用語「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドのポリマー、全般的にヌクレオチドの一本鎖のポリマーを表す。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２〜５００ヌクレオチド、好ましくは１０〜１５０ヌクレオチド、好ましくは２０〜１００ヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、合成されたものであってもよく、または酵素により産生されてもよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチドモノマー、デオキシリボヌクレオチドモノマー、または両者の混合物を含み得る。
【００６１】
用語「ＰＣＲハンドル配列」および「ユニバーサルなタグ配列」は、互換可能であり、生物学的単位から抽出されるかこれに由来する核酸配列の増幅、好ましくはＰＣＲ増幅、さらには、シーケンシングに有用な核酸配列を表す。一実施形態では、ＰＣＲハンドルは、テンプレート配列との相同性がない。一実施形態では、ＰＣＲハンドル配列は、全サンプル調製のワークフローに共通している。
【００６２】
用語「フェーズ化」は、相同染色体の個々の補体の同定を表す。
【００６３】
用語「ポリッシング（ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ）」または「平滑末端化」は、平滑末端のライゲーションの促進のための、適合しない３’または５’のＤＮＡのオーバーハングの排除を表す。当業者によく知られているいくつかの技術が、ＤＮＡ末端のポリッシングに使用され得る。たとえば、末端の対形成されていないヌクレオチドは、末端のホスホジエステル結合を加水分解するエキソヌクレアーゼの活性を伴う酵素を使用し、よって一度にオーバーハングした塩基を１つずつ除去することにより、ＤＮＡ末端から除去され得る。５’にオーバーハングを有するＤＮＡフラグメントは、ｄＮＴＰの存在下で、ＤＮＡポリメラーゼにて、くぼんでいる３’末端に充填されることにより、平滑末端化され得る。末端の除去または充填（ｆｉｌｌ−ｉｎ）は、ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｉ  Ｌａｒｇｅ（Ｋｌｅｎｏｗ）Ｆｒａｇｍｅｎｔ、Ｔ４  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、またはＭｕｎｇ  Ｂｅａｎ  Ｎｕｃｌｅａｓｅを含む多くの酵素を使用して、達成することができる。
【００６４】
用語「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」は、限定するものではないが、アレルに特異的なＰＣＲ、非対称ＰＣＲ、ホットスタートＰＣＲ、配列間に特異的なＰＣＲ、メチル化に特異的なＰＣＲ、ミニプライマーＰＣＲ、マルチプレックなライゲーション依存性のプローブ増幅、マルチプレックスＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ１  定量的ＰＣＲ、逆転写ＰＣＲ、および／またはタッチダウンＰＣＲを含む方法を包有する。核酸の増幅に適切なＤＮＡポリメラーゼ酵素として、限定するものではないが、ＴａｑポリメラーゼＳｔｏｆｆｅｌフラグメント、Ｔａｑポリメラーゼ、Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＡｍｐｌｉＴａｑ、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ、Ｔｉｔａｎｉｕｍ  Ｔａｑポリメラーゼ、ＫｌｅｎＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑポリメラーゼ、Ａｃｃｕｐｒｉｍｅ  Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼｔｕｒｂｏ、Ｖｅｎｔポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ  ｅｘｏ−ポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、９  Ｎｍ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ、Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅｘｐａｎｄ  ＤＮＡポリメラーゼ、ｒＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｙＮＡｚｙｍｅ−ＥＸＴポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ７ポリメラーゼ、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）、Ｔｆｉポリメラーゼ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、Ｂｃａポリメラーゼ、ＢＳＵポリメラーゼ、ｐｈｉ−２９  ＤＮＡポリメラーゼ、およびＤＮＡポリメラーゼＢｅｔａ、またはそれらの改変したバージョンが挙げられる。一実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、３’−５’のプルーフリーディング、すなわちエキソヌクレアーゼの活性を有する。一実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、５’−３’のプルーフリーディング、すなわちエキソヌクレアーゼの活性を有する。一実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換活性を有し、すなわちＤＮＡポリメラーゼは、鋳型依存性の核酸合成と併せてかつこの近くで、５’から３’への方向にて、対形成している核酸のその相補鎖からの解離をもたらす。大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント、Ｔ７またはＴ５のバクテリオファージＤＮＡポリメラーゼ、およびＨＩＶウイルス逆転写酵素などのＤＮＡポリメラーゼは、ポリメラーゼの活性および鎖置換活性の両方を有する酵素である。ヘリカーゼなどの作用物質を、鎖置換作用、すなわち同じ配列の核酸の合成に関連した核酸の置換をもたらすために、鎖置換活性を有さない作用物質の誘導と併せて使用することができる。同様に、大腸菌または別の生物由来のＲｅｃ  Ａまたは一本鎖結合タンパク質などのタンパク質を、鎖置換をもたらすかまたは促進させるために、他の誘導する作用物質と併せて使用することができる（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ  Ａ．  ＆  Ｂａｋｅｒ  Ｔ．Ａ．  （１９９２）．  Ｃｈａｐｔｅｒｓ  ４−６．  Ｉｎ  ＤＮＡ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ（２ｎｄ  ｅｄ．，  ｐｐ．  １１３−２２５）．  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ）。
【００６５】
用語「プライマー誘導型の伸長」は、核酸分子の線形または対数的な増幅での核酸配列の複製を開始するためにプライマーを使用する、当該分野で知られているいずれかの方法を表す。プライマー誘導型の伸長は、限定するものではないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、およびＳＤＡ（ｓｔｒａｎｄ−ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を含む、この分野で知られているいくつかのスキームのいずれかにより、達成され得る。「プライマー誘導型の伸長」は、本明細書中上述されるＤＮＡポリメラーゼ酵素により、行うことができる。
【００６６】
用語「無作為な増幅技術」は、限定するものではないが、ＭＤＡ（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ランダムＰＣＲ、ＲＡＰＤ（ｒａｎｄｏｍ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ＤＮＡ）、またはＭＡＬＢＡＣ（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ａｎｎｅａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｌｏｏｐｉｎｇ  ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｃｙｃｌｅｓ）を含む。
【００６７】
用語「受容体リガンド」は、大きな複合体から、受容体などの別の実体に結合するいずれかの物質を表す。
【００６８】
用語「逆転写」は、ＤＮＡの相補鎖（ｃＤＮＡ）を産生させるための、ＲＮＡ誘導性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素、ＲＴ）を使用したＲＮＡの複製を表す。ＲＮＡの逆転写は、逆転写酵素、ならびに４つのデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、すなわちデオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、および（デオキシ）チミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）の混合物を使用して、当業者によく知られている技術により、行われ得る。一部の実施形態では、ＲＮＡの逆転写は、第１の鎖のｃＤＮＡの合成である第１のステップを含む。第１の鎖のｃＤＮＡ合成のための方法は、当業者によく知られている。第１の鎖のｃＤＮＡの合成反応は、配列に特異的なプライマー、オリゴ（ｄＴ）プライマー、またはランダムプライマーの組み合わせを使用し得る。逆転写酵素の例として、限定するものではないが、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｍａｘｉｍａ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＰｒｏｔｏＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（ＣｌｏｎＴｅｃｈ）が挙げられる。
【００６９】
用語「単一細胞のエピゲノムのプロファイリング」または「単一細胞のエピゲノミクス」は、単一細胞のエピゲノムの解析を表す。
【００７０】
用語「単一細胞のジェノタイピング」または「単一細胞のゲノミクス」は、単一細胞のゲノムの解析を表す。
【００７１】
用語「単一細胞のハプロタイピング」は、全ゲノムに基づくハプロタイプの解明を表す。
【００７２】
用語「単一細胞のトランスクリプトームのプロファイリング」または「単一細胞のトランスクリプトミクス」は、単一の細胞のトランスクリプトームの解析を表す。
【００７３】
用語「スペーサー領域」は、オリゴヌクレオチドの長さを伸長させるために使用される化学基またはアンカー部分を表す。スペーサーの例として、限定するものではないが、エチレングリコールポリマー、アルキル、オリゴヌクレオチド、ペプチド、およびペプチド模倣体が挙げられる。
【００７４】
用語「特定の増幅技術」として、限定するものではないが、温度サイクリングを必要とする方法（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応、転写ベースの増幅など）、および／または等温の増幅システム（自立した配列の複製、レプリカーゼ系、ヘリカーゼ系、鎖置換増幅、ローリングサークルベースの増幅、およびＮＡＳＢＡなど）が挙げられる。
【００７５】
用語「担体」は、生物学的単位および／またはバーコード単位がその上に固定され得るマトリックスを表す。担体は、強固な固体または半固体であり得る。
【００７６】
用語「テンプレート」または「テンプレート配列」は、増幅が望まれている核酸配列を表す。テンプレートは、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み得る。一実施形態では、テンプレート配列は知られている。一実施形態では、テンプレート配列は知られていない。
【００７７】
用語「テンプレートのスイッチング（ｔｅｍｐｌａｔｅ  ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ）」は、最初の核酸配列のテンプレートから、最初のテンプレートから合成されたｃＤＮＡの３’末端にほとんどまたは全く相補性がない新規の核酸配列のテンプレート（「テンプレートスイッチオリゴヌクレオチド」と呼ばれる）の３’末端へと切り替える、逆転写酵素の能力を表す。
【００７８】
用語「テンプレートスイッチアダプター配列」および「テンプレートスイッチオリゴヌクレオチド」は、核酸重合化反応の間に、ポリメラーゼが最初のテンプレート（たとえばテンプレートのＤＮＡまたはＲＮＡ）から切り替わるオリゴヌクレオチドのテンプレートを表す。これに関して、テンプレートのＤＮＡまたはＲＮＡは、「ドナーテンプレート」と呼ばれてもよく、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドは、「アクセプターテンプレート」と呼ばれてもよい。
【００７９】
逆転写がＭｏｌｏｎｅｙ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素）を使用して起こる場合、酵素のＴｄＴ（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）の活性は、新生のｃＤＮＡ鎖の３’末端に対するヌクレオチドの非テンプレート誘導性の付加をもたらす。外因的に付加された「テンプレートスイッチオリゴヌクレオチド」は、ポリ（Ｇ）プライマー部位によりＣ−末端（Ｃ−ｔｒａｃｔ）にアニールする。次に、逆転写酵素は、ｍＲＮＡからテンプレートスイッチオリゴヌクレオチドへと、テンプレートを切り替え、第１の鎖のｃＤＮＡに「アダプター配列」または「アダプター」を付加する（「アダプター付与」）。好ましくは、アダプター配列は、ＰＣＲハンドルと相同性を共有する。
【００８０】
用語「トランスクリプトーム」は、個々の細胞の全ＲＮＡ構成要素を表す。一部の実施形態では、用語「トランスクリプトーム」は、特に、ＲＮＡポリメラーゼＩＩのポリアデニル化産物を表し得る。
【００８１】
用語「固有の分子の識別子配列」は、生物学的単位由来の核酸配列のＰＣＲ増幅およびさらにはシーケンシング後に二連の増幅産物間を区別するために有用な核酸配列を表す。
【００８２】
用語「ビタミン」は、対象の正常な代謝にとって少量で重要ないずれかの群の有機物質を表す。ビタミンの例として、限定するものではないが、α−カロテン、β−カロテン、γ−カロテン、レチノール、およびトレチノイン（ビタミンＡ）；チアミン（ビタミンＢ１）および類縁体、たとえばアセフルチアミン、アリチアミン、ベンホチアミン、フルスルチアミン、オクトチアミン、プロスルチアミン、およびスルブチアミン；リボフラビン（ビタミンＢ２）；ナイアシンおよびニコチン酸（ビタミンＢ３）；アデニン、カルニチンおよびコリン（ビタミンＢ４）；パントテン酸、デクスパンテノール、およびパンテチン（ビタミンＢ５）；ピリドキシン、リン酸ピリドキサール、ピリドキサミン、およびピリチノール（ビタミンＢ６）；ビオチン（ビタミンＢ７）；アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）およびイノシトール（ビタミンＢ８）；葉酸、ジヒドロ葉酸、フォリン酸、およびレボメ葉酸（ｌｅｖｏｍｅｆｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）（ビタミンＢ９）；４−アミノ安息香酸（ｐＡＢＡ）（ビタミンＢ１０）；プテリル−ヘプタ−グルタミン酸（pteryl-hepta-glutamic acid：ＰＨＧＡ）（ビタミンＢ１１）；アデノシルコバラミン、シアノコバラミン、ヒドロキソコバラミン、およびメチルコバラミン（ビタミンＢ１２）；オロト酸（ビタミンＢ１３）；パンガミン酸（ビタミンＢ１５）；ジメチルグリシン（ＤＭＧ）（ビタミンＢ１６）；アミグダリン（ビタミンＢ１７）；Ｌ−カルニチン（ビタミンＢ２０）；アスコルビン酸、およびデヒドロアスコルビン酸（ビタミンＣ）；エルゴステロール、およびエルゴカルシフェロール（ビタミンＤ２）；７−デヒドロコレステロール、プレビタミンＤ３、コレカルシフェロール、２５−ヒドロキシコレカルシフェロール、カルシトリオール、およびカルシトロン酸（ビタミンＤ３）；ジヒドロエルゴカルシフェロール（ビタミンＤ４）；アルファカルシドール、ジヒドロタキステロール、カルシポトリオール、タカルシトール、およびパリカルシトール（ビタミンＤ５）；α−トコフェロール、β−トコフェロール、γ−トコフェロール、δ−トコフェロール、α−トコトリエノール、β−トコトリエノール、γ−トコトリエノール、δ−トコトリエノール、およびトコフェルソラン（ビタミンＥ）；フィロキノン（ビタミンＫ１）；メナキノン（ビタミンＫ２）；メナジオン（ビタミンＫ３）；メナジオール（ビタミンＫ４）；ならびにそれらの誘導体が挙げられる。
【００８３】
本明細書中使用される専門用語は、単に特定の事例を説明する目的のためにあり、限定とは意図されていない。本明細書中使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が他の意味を明記しない限り、同様に複数形を含むと意図されている。さらに、用語「〜を含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「を含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「〜を有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「を有する（ｈａｓ）」、「伴う（ｗｉｔｈ）」、またはそれらのバリアントが、詳細な説明および／または特許請求の範囲に使用されている限りは、当該用語は、用語「を含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同様の意味を含むと意図されている。
【００８４】
詳細な説明
本発明は、ハイドロゲル中の個別の生物学的単位を捕捉およびバーコード付与するための方法に関する。
【００８５】
一実施形態では、複数の生物学的単位が、担体に結合される。一実施形態では、複数のバーコード単位が、担体に結合される。
【００８６】
一実施形態では、本方法は、複数の生物学的単位を複数のバーコード単位と接触させて生物学的単位／バーコード単位の複合体を形成するステップを含む。一実施形態では、本方法はさらに、生物学的単位／バーコード単位の複合体をハイドロゲル溶液と接触させるステップを含む。一実施形態では、本方法はさらに、ハイドロゲル溶液を重合化して、ハイドロゲルマトリックスに生物学的単位／バーコード単位の複合体を埋め込むステップを含む。一実施形態では、本方法はさらに、ハイドロゲルマトリックス中の各生物学的単位／バーコード単位の複合体の中の生物学的単位の核酸にバーコードを付与するステップを含む。
【００８７】
一実施形態では、生物学的単位およびバーコード単位は、ハイドロゲルの重合化の後には結合せず、すなわち生物学的単位／バーコード単位の複合体の結合の化学的性質は、劣化される。複合体を分解する技術は、当業者によく知られている。
【００８８】
一実施形態では、生化学および分子生物学のアッセイを、本発明に係るハイドロゲルに捕捉した生物学的単位で行うことができる。一実施形態では、生化学および分子生物学のアッセイは、本発明に係るハイドロゲルに捕捉した個別の生物学的単位で行うことができる。一実施形態では、生化学および分子生物学のアッセイは、本発明に係るハイドロゲルに捕捉したバーコード単位で行うことができる。一実施形態では、生化学および分子生物学のアッセイは、本発明に係るハイドロゲルに捕捉した個別のバーコード単位で行うことができる。一実施形態では、ハイドロゲルは、溶液および／またはバルクにおける特定の生化学および分子生物学のアッセイを可能にするために脱重合され得る。
【００８９】
生化学および分子生物学のアッセイの例として、限定するものではないが、細胞の溶解、ＰＣＲ、逆転写、核酸の加水分解、キャップ除去（すなわち５’キャップ構造の加水分解）、トランスクリプトームのプロファイリング（またはトランスクリプトミクス）、ジェノタイピング（またはゲノミクス）、エピゲノムのプロファイリング（またはエピゲノミクス）、フェーズ化、およびハプロタイピングが挙げられる。
【００９０】
本発明に係る方法のいくつかの態様は、例示のために例となる適用に準拠して、本明細書中に記載されている。多くの特定の詳細、関係、および方法は、本明細書中記載される特性の完全な理解を提供するために記載されていることを理解されたい。しかしながら、関連する分野の当業者は、１つ以上の特定の詳細を伴わないかまたは他の方法を用いて、本明細書中記載される特性を実施できることを容易に理解している。本明細書中記載される特性は、一部の作用が、他の作用または事象と異なる順序で起こり得るためおよび／または他の作用または順序と同時に起こり得るため、例示した作用または事象の順序によって限定されてはいない。さらに、本明細書中記載される特性に係る方法を実施するために、例示した全ての作用または事象が必要というわけではない。
【００９１】
ハイドロゲルは、その架橋機構に基づき、物理的なハイドロゲルおよび化学的なハイドロゲルに分類され得る。
【００９２】
一実施形態では、ハイドロゲルは、少なくとも１つの天然のポリマーから調製されている。一実施形態では、ハイドロゲルは、少なくとも１つの合成ポリマーから調製されている。一実施形態では、ハイドロゲルは、少なくとも１つの天然／合成のハイブリッドポリマーから調製されている。一実施形態では、ハイドロゲルは、少なくとも１つの天然のポリマーおよび少なくとも１つの合成ポリマーから調製されている。
【００９３】
一実施形態では、本発明で使用されるハイドロゲルは、物理的なハイドロゲルである。
【００９４】
物理的なハイドロゲルの架橋として、限定するものではないが、もつれた鎖（ｅｎｔａｎｇｌｅｄ  ｃｈａｉｎ）、水素結合、疎水性相互作用、および微結晶形成が挙げられる。物理的なハイドロゲルは、イオン相互作用、結晶化、ステレオコンプレックス形成、疎水化した多糖、タンパク質の相互作用、および水素結合により、合成できる。
【００９５】
一実施形態では、物理的なハイドロゲルは、永続性である。一実施形態では、物理的なハイドロゲルは、可逆性である。
【００９６】
一実施形態では、本発明で使用されるハイドロゲルは、化学的なハイドロゲルである。
【００９７】
化学的なハイドロゲルの架橋として、限定するものではないが、共有結合が挙げられる。化学的なハイドロゲルは、連鎖重合（ｃｈａｉｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）、付加重合および縮合重合、ならびにγ線および電子線による重合により、合成することができる。
【００９８】
一実施形態では、化学的なハイドロゲルは、末端官能基化マクロマーの重合により、形成されている。
【００９９】
一実施形態では、化学的なハイドロゲルは、永続性である。一実施形態では、化学的なハイドロゲルは、可逆性である。
【０１００】
一実施形態では、ハイドロゲルは、多糖のハイドロゲルである。
【０１０１】
多糖として、限定するものではないが、アルギン酸塩、アガロース、κ−カラゲナン、ι−カラゲナン、キトサン、デキストラン、ヘパリン、ゲラン、天然のゲランガム、ラムザン、脱アセチル化ラムザン、Ｓ−６５７、ウェランが挙げられる。
【０１０２】
一実施形態では、重合した多糖のハイドロゲルは、共有性の架橋、イオン性の架橋、化学的なコンジュゲート、エステル化、および／または重合により、形成されている。
【０１０３】
一実施形態では、多糖のハイドロゲルは、アルギン酸塩であり、重合したアルギン酸塩は、カルシウムなどの二価の陽イオンの存在下でのイオン性の架橋により、形成されている。
【０１０４】
一実施形態では、ハイドロゲルは、タンパク質ベースのハイドロゲルである。
【０１０５】
タンパク質として、限定するものではないが、コラーゲン、フィブリン、ゼラチン、ラミニンが挙げられる。
【０１０６】
一実施形態では、重合したタンパク質ベースのハイドロゲルは、熱的なゲル化により、形成されている。一実施形態では、タンパク質ベースのハイドロゲルは、架橋剤を使用して架橋されている。
【０１０７】
タンパク質ベースのハイドロゲルの架橋剤として、限定するものではないが、カルボジイミド、シアナミド、ジアルデヒドデンプン、ジイミド、ジイソシアネート、ジメチルアジピミダート、エポキシ化合物、エチルアルデヒド、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、グリセルアルデヒド、ヘキサメチレンジアミン、テレフタルアルデヒド、およびそれらの混合物が挙げられる。
【０１０８】
一実施形態では、ハイドロゲルは、本明細書中上述されるタンパク質と組み合わせた多糖のハイドロゲルである。
【０１０９】
一実施形態では、ハイドロゲルは、非生分解性の合成ハイドロゲルである。
【０１１０】
非生分解性ポリマーとして、限定するものではないが、ビニル化モノマーおよびビニル化マクロマー、特に２−ヒドロキシエチルメタクリラート、２−ヒドロキシプロピルメタクリラート、アクリルアミド、アクリル酸、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、ポリＮ−イソプロピルアクリルアミド、メトキシポリエチレングリコールモノアクリラートが挙げられる。
【０１１１】
一実施形態では、非生分解性分子の重合は、少なくとも１つの架橋剤を必要とする。一実施形態では、非生分解性の合成ハイドロゲルは、非生分解性分子および架橋剤の共重合により形成されている。
【０１１２】
非生分解性の合成ハイドロゲルの架橋剤として、限定するものではないが、Ｎ，Ｎ′−メチレンビスアクリルアミド、エチレングリコールジアクリラート、ポリエチレングリコールジアクリラートが挙げられる。
【０１１３】
一実施形態では、非生分解性分子の重合は、さらに、少なくとも１つのイニシエーター、たとえば過硫酸イオン（過硫酸アンモニウム、過硫酸カリウムなど）、硝酸セリウム（ＩＶ）アンモニウム、テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）を必要とする。
【０１１４】
一実施形態では、ハイドロゲルは、脱重合され得る。「脱重合」は、ハイドロゲルが溶液に戻る間の反応を意味する。当業者に明らかであるように、これは、必ずしも、過剰な脱重合および／または架橋の過剰な切断を必要とするものではない。ゲル−ゾルへの移行を達成するために必要な脱重合および／または架橋の切断の度合いは、ハイドロゲルの性質に基づき変化し、一般的な方法により容易に決定することができる。一実施形態では、ハイドロゲルの脱重合は、化学的である。一実施形態では、ハイドロゲルの脱重合は、熱性である。一実施形態では、ハイドロゲルの脱重合は、酵素を用いる。
【０１１５】
一実施形態では、ハイドロゲルの脱重合は、二価の陽イオンの除去により達成することができる。二価の陽イオンの除去により脱重合され得るハイドロゲルの例として、限定するものではないが、アルギン酸塩が挙げられる。
【０１１６】
一実施形態では、ハイドロゲルの脱重合は、還元剤の添加により達成することができる。還元剤の例として、限定するものではないが、ホスフィン（たとえばトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ））およびジチオスレイトール（ＤＴＴ）が挙げられる。還元剤の添加により脱重合され得るハイドロゲルの例として、限定するものではないが、架橋剤と共重合したハイドロゲル、たとえば非生分解性の合成ハイドロゲルが挙げられる。
【０１１７】
一実施形態では、ハイドロゲルの脱重合は、熱融解、すなわち温度上昇による融解により、達成できる。
【０１１８】
一実施形態では、本発明に使用されるハイドロゲルは、熱感受性である。
【０１１９】
「熱感受性」は、形成後に、少なくとも１つのポリマーの融点を超えて上昇する場合に脱重合し、室温またはその融点未満に冷却されると再編成する、ハイドロゲルを意味する。
【０１２０】
一実施形態では、本発明で使用されるハイドロゲルは、熱可逆性である。
【０１２１】
「熱可逆性」は、形成後に、少なくとも１つのポリマーの融点を超えて上昇する場合に脱重合し、さらには、室温またはその融点未満に冷却される場合であっても再編成しない、ハイドロゲルを表す。
【０１２２】
一実施形態では、ハイドロゲルの少なくとも１つのポリマーの融点は、約２０℃〜約２００℃、好ましくは約２５℃〜約１００℃である。
【０１２３】
一実施形態では、ハイドロゲルは、生物学的単位、バーコード単位、および／または生物学的単位から抽出されるかもしくはこれに由来する解析物を捕捉するために十分小さい孔径を有する。一実施形態では、ハイドロゲルは、生化学および分子生物学の試薬の拡散を可能にするために十分大きい孔径を有する。
【０１２４】
一実施形態では、ハイドロゲルは、約１ｎｍ〜約１μｍ、好ましくは約１０ｎｍ〜５００ｎｍ、より好ましくは２５ｎｍ〜２５０ｎｍの範囲の孔径を有する。
【０１２５】
一実施形態では、ハイドロゲルマトリックスは、生化学および分子生物学の試薬にアクセス可能である。一実施形態では、ハイドロゲルマトリックスは、生化学および分子生物学の試薬にアクセス可能な少なくとも１つの表面を有する。一実施形態では、生化学および分子生物学の試薬にアクセス可能な少なくとも１つの表面は、天然に存在する。一実施形態では、生化学および分子生物学の試薬にアクセス可能な少なくとも１つの表面は、ハイドロゲルの重合の前、最中、および／または後に、成型される。
【０１２６】
一実施形態では、バーコード単位の組成、形状、形態、および修飾は、応用に応じた選択肢の範囲から、選択することができる。
【０１２７】
本発明においてバーコード単位として使用できる例示的な物質として、限定するものではないが、アクリル、炭素（たとえば、グラファイト、カーボンファイバー）、セルロース（たとえば酢酸セルロース）、セラミクス、ＣＰＧ（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）、架橋した多糖（たとえば、アガロース、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）またはアルギン酸塩）、ゲル、ガラス（たとえば改変または機能化したガラス）、金（たとえば原子的に平滑なＡｕ（１１１））、グラファイト、無機ガラス、無機ポリマー、ラテックス、金属酸化物（たとえばＳｉＯ２、ＴｉＯ２、ステンレス鋼）、メタロイド、金属（たとえば原子的に平滑なＡｕ（１１１））、雲母、硫化モリブデン、ナノマテリアル（たとえば高配向性熱分解グラファイト（ＨＯＰＧ）ナノシート）、ニトロセルロース、ＮＹＬＯＮ（商標）、光ファイバーの束、有機ポリマー、紙、プラスチック、ポリアクリロイルモルホリド（ｐｏｌａｃｒｙｌｏｙｌｍｏｒｐｈｏｌｉｄｅ）、ポリ（４−メチルブテン）、ポリエチレンテレフタラート）、ポリ（ビニルブチラート）、ポリブチレン、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリエチレン、ポリホルムアルデヒド、ポリメタクリラート、ポリプロピレン、多糖、ポリスチレン、ポリウレタン、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、水晶、レーヨン、樹脂、ゴム、半導体材料、シリカ、シリコン（たとえば表面を酸化させたシリコン）、硫化物、およびＴＥＦＬＯＮ（登録商標）が挙げられる。
【０１２８】
一実施形態では、バーコード単位は、単一の物質から構成されている。別の実施形態では、バーコード単位は、いくつかの異なる物質の混合物から構成されている。
【０１２９】
一実施形態では、本発明で使用されるバーコード単位は、単純な四角のグリッド、チェッカーボードのグリッド、六角形のアレイなどであり得る。また、適切なバーコード単位として、限定するものではないが、ビーズ、スライド、チップ、粒子、鎖、ゲル、シート、チュービング、スフィア、容器、毛細管、パッド、スライス、フィルム、培養ディッシュ、マイクロタイタープレート、たとえば７６８−ウェル、３８４−ウェル、９６−ウェル、４８−ウェル、２４−ウェル、１２−ウェル、８−ウェル、６−ウェル、４−ウェル、１−ウェルのプレートなどが挙げられる。様々な実施形態では、バーコード単位は、生体由来、非生体由来、有機物由来、無機物由来、またはそれらのいずれかの組み合わせであってもよい。
【０１３０】
よって、複数のバーコード単位における単一のバーコード単位は、上記複数のバーコード単位の最小限の分割できない部分であり得る。複数のバーコード単位における単一のバーコード単位は、たとえば、グリッド上の単一の四角、ビーズの集合における単一のビーズ、マイクロタイタープレートにおける単一のウェルなどであり得る。あるいは、複数のバーコード単位における単一のバーコード単位は、上記複数のバーコード単位の最小限の部分であって、生物学的単位とバーコード単位との間の単一の結合事象が、分子レベルで起こる、部分であり得る。あるいは、複数のバーコード単位における単一のバーコード単位は、約１μｍ２〜約１ｍｍ２、好ましくは約１μｍ２〜約１００μｍ２、より好ましくは約１μｍ２〜約５０μｍ２の範囲の、上記複数のバーコード単位の一部であり得る。一実施形態では、この大きさの範囲は、製造能を考慮して選択される。一実施形態では、この大きさの範囲は、生物学的単位／バーコード単位の複合体の１：１の比での形成を確保するために選択される。
【０１３１】
バーコード単位の表面は、その上への生物学的単位の捕捉または固定化を促進するために、当業者に知られている方法により修飾することができる。
【０１３２】
一実施形態では、バーコード単位は、カルボキシル、アミノ、ヒドロキシル、エポキシなどの化学反応基をその表面に含む。
【０１３３】
一実施形態では、バーコード単位は、その表面に結合した官能基などの、官能基修飾を有し得る。
【０１３４】
一実施形態では、本発明に使用されるバーコード単位は、バーコード付与されている。
【０１３５】
一実施形態では、複数のバーコード単位における単一のバーコード単位は、それぞれ、固有のバーコードを含む。一実施形態では、複数のバーコード単位における単一のバーコード単位は、それぞれ、固有のバーコードのクローンコピーを含む。
【０１３６】
一実施形態では、バーコード単位は、少なくとも１つの生物学的単位への結合に関与する少なくとも１つの手段を含む。
【０１３７】
好ましい実施形態では、バーコード単位はビーズである。
【０１３８】
本発明に係る方法の実施は、各個別の生物学的単位および／または各バーコード単位に結合した反応解析物の下流での同定に依存し得る。よって、生物学的単位の供給源もしくは起源、および／またはサンプルの中の解析物、たとえば個別の生物学的単位から抽出されるかもしくはこれに由来する核酸配列などについての情報を伝達するために、バーコード単位に少なくとも１つの識別子またはバーコードを追加することが望ましいとされ得る。
【０１３９】
一実施形態では、バーコード単位は、バーコードを付与されている。一実施形態では、複数のバーコード単位における単一のバーコード単位はそれぞれ、固有のバーコードを含む。一実施形態では、複数のバーコード単位における単一のバーコード単位はそれぞれ、固有のバーコードのクローンコピーを含む。
【０１４０】
バーコードは、ラベル、タグ、プローブなどを含む様々な異なる形式であり得る。
【０１４１】
一実施形態では、バーコード単位は、光学的にバーコード付与されている。一実施形態では、バーコード単位は、非光学的にバーコード付与されている。一実施形態では、バーコード単位は、光学的かつ非光学的にバーコード付与されている。
【０１４２】
光学的なバーコードとして、限定するものではないが、たとえばラマンスペクトルもしくは電磁性スペクトルなどの自身のスペクトルにより、および／または自身の色の強度により同定できる、発色団、フルオロフォア、量子ドット、スチレンモノマー、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【０１４３】
非光学的なバーコードとして、限定するものではないが、たとえばシーケンシングにより同定できる、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および／またはタンパク質の配列などの生体分子の配列が挙げられる。
【０１４４】
一実施形態では、本発明に使用される固有のバーコードの数は、約２〜約１０１２の範囲にある。
【０１４５】
一実施形態では、複数のバーコード単位における単一のバーコード単位のそれぞれに含まれる各固有のバーコードのクローンコピーの数は、約２〜約１０１２の範囲にある。
【０１４６】
一実施形態では、本発明に係るバーコード単位は、非光学的なバーコードを含む。一実施形態では、本発明に係るバーコード単位は、核酸のバーコードを含む。一実施形態では、この核酸のバーコードは、一本鎖である。一実施形態では、核酸のバーコードは二本鎖である。一実施形態では、核酸のバーコードは、一本鎖および／または二本鎖である。一実施形態では、本発明に係るバーコード単位は、ＤＮＡのバーコードを含む。一実施形態では、本発明に係るバーコード単位は、ＲＮＡのバーコードを含む。一実施形態では、本発明に係るバーコード単位は、ＤＮＡおよびＲＮＡのバーコードの混合物を含む。
【０１４７】
一実施形態では、本発明に係る核酸のバーコードは、５〜２０ヌクレオチド、好ましくは８〜１６ヌクレオチドを含む。
【０１４８】
一実施形態では、バーコード単位は、複数の固有の核酸配列、すなわち固有のバーコードのクローンコピーを含む。
【０１４９】
一実施形態では、上記固有の核酸配列は、縮重した配列である。一実施形態では、上記固有の核酸配列は、コンビナトリアルケミストリーに基づくものである。
【０１５０】
担体、好ましくはバーコード単位上にバーコードを共有結合させるために技術は、当業者によく知られており、限定するものではないが、コンビナトリアルの形式での結合したプライマーの複製、コンビナトリアルの形式でのアダプターのライゲーション、およびコンビナトリアルな形式でのヌクレオチドの化学的付加を含む。
【０１５１】
一実施形態では、上記固有の核酸配列は、複数のバーコード単位における単一のバーコード単位がそれぞれ、開始した核酸配列のクローンコピーでコーティングされるように、バーコード単位上で増幅される。
【０１５２】
一実施形態では、核酸のバーコードのバーコード単位への共有結合は、バーコードの合成の間に直接行われる。一実施形態では、核酸のバーコードのバーコード単位への共有結合は、バーコードの合成の後に行われる。
【０１５３】
バーコード単位上に核酸のバーコードを共有結合するために技術は、当業者によく知られている。
【０１５４】
一実施形態では、生物学的単位の核酸へのバーコード付与は、生物学的単位の核酸へのバーコードのプライマーテンプレートアニーリングにより、達成される。一実施形態では、生物学的単位の核酸へのバーコード付与は、生物学的単位の核酸へのバーコードのプライマー誘導型の伸長により、達成される。一実施形態では、生物学的単位の核酸へのバーコード付与は、生物学的単位の核酸へのバーコードのライゲーションにより、達成される。
【０１５５】
本発明に係る方法の実施は、生物学的単位の核酸配列または生物学的単位由来の核酸配列の固定化、複製、伸長、および／または増幅に依存し得る。よって、生物学的単位の遺伝子情報または生物学的単位由来の遺伝子情報を固定、複製、伸長、および／または増幅させるために、バーコード単位に対して少なくとも１つの核酸配列のプライマーを付加すること、好ましくは複数のバーコード単位における単一のバーコード単位のそれぞれに対して少なくとも１つの核酸配列のプライマーを付加することが、望ましいとされ得る。
【０１５６】
一実施形態では、核酸配列のプライマーは、一本鎖である。一実施形態では、核酸配列のプライマーは二本鎖である。一実施形態では、核酸配列のプライマーは、一本鎖および／または二本鎖である。
【０１５７】
一実施形態では、核酸配列のプライマーは、縮重した（すなわちランダムな）核酸配列のプライマーである。一実施形態では、核酸配列のプライマーは、目的の核酸配列に特異的である。
【０１５８】
一実施形態では、核酸配列のプライマーは、生物学的単位の核酸配列または生物学的単位由来の核酸配列の複数の位置で、プライミングすることができる。一実施形態では、生物学的単位の核酸配列または生物学的単位由来の核酸配列は、複数のプライミング部位を含む。
【０１５９】
一実施形態では、核酸配列のプライマーは、ｐｏｌｙ−ｄＴ配列を含む。一実施形態では、核酸配列のプライマーは、ｐｏｌｙ−ｄＵ配列を含む。よって核酸配列のプライマーは、ポリＡ配列に特異的である。ポリＡ配列は、たとえば、ｍＲＮＡの３’末端の、ポリＡ鎖の中で見出され得る。
【０１６０】
一実施形態では、核酸配列のプライマーは、配列（ｄＴ）ｎＶＮ（式中ｎは、５〜５０の範囲にあり、Ｖは、Ｔ／Ｕ以外の任意のヌクレオチド（すなわちＡ、Ｃ、またはＧ）を表し、Ｎは、任意のヌクレオチド（すなわちＡ、Ｔ／Ｕ、Ｃ、またはＧ）を表す）を含む。一実施形態では、核酸配列のプライマーは、配列（ｄＵ）ｎＶＮ（式中、ｎは５〜５０の範囲にあり、Ｖは、Ｔ／Ｕ以外の任意のヌクレオチド（すなわちＡ、Ｃ、またはＧ）を表し、Ｎは、任意のヌクレオチド（すなわちＡ、Ｔ／Ｕ、Ｃ、またはＧ）を表す）を含む。よって、核酸配列のプライマーは、（Ａ）ｎＢＮ配列（式中ｎは、５〜５０の範囲にあり、Ｂは、Ａ以外の任意のヌクレオチド（すなわちＴ／Ｕ、Ｃ、またはＧ）を表し、Ｎは、任意のヌクレオチド（すなわちＡ、Ｔ／Ｕ、Ｃ、またはＧ）を表す）に特異的である。（Ａ）ｎＢＮ配列は、たとえば、ポリＡ鎖と３’ＵＴＲまたはＣＤＳとの間で重複する、ｍＲＮＡの３末端上で見出され得る。
【０１６１】
一実施形態では、核酸配列のプライマーは、ｐｏｌｙ−Ｉ配列を含む。よって核酸配列のプライマーは、非特異的であり、生物学的単位のいずれかの核酸配列または生物学的単位由来のいずれかの核酸配列に対してプライミングし得る。
【０１６２】
一実施形態では、核酸配列のプライマーは、５〜５０ヌクレオチド、好ましくは５〜３０ヌクレオチドを含む。
【０１６３】
一実施形態では、バーコード単位への核酸配列のプライマーの共有結合は、核酸配列のプライマーの合成の間に、直接行われる。一実施形態では、バーコード単位への核酸配列のプライマーの共有結合は、核酸配列のプライマーの合成の後に、行われる。
【０１６４】
一実施形態では、バーコード単位は、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む。
【０１６５】
一実施形態では、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡオリゴヌクレオチドである。一実施形態では、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡオリゴヌクレオチドである。一実施形態では、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドのオリゴヌクレオチドである。
【０１６６】
一実施形態では、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、一本鎖である。一実施形態では、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、二本鎖である。一実施形態では、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、一本鎖および／または二本鎖である。
【０１６７】
一実施形態では、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの核酸のバーコードおよび少なくとも１つの核酸配列のプライマーを含む。一実施形態では、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、５’から３’の方向に、少なくとも１つの核酸のバーコードおよび少なくとも１つの核酸配列のプライマーを含む。一実施形態では、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、５’から３’の方向に、少なくとも１つの核酸配列のプライマーおよび少なくとも１つの核酸のバーコードを含む。一実施形態では、核酸のバーコードは、所定のバーコード単位の表面上の全てのオリゴヌクレオチドで同一である。一実施形態では、核酸のバーコードは、１つのバーコード単位の表面上のオリゴヌクレオチドで、別のバーコード単位とは異なっている。一実施形態では、核酸配列のプライマーは、所定のバーコード単位の表面上の全てのオリゴヌクレオチドで同一である。一実施形態では、核酸配列のプライマーは、所定のバーコード単位の表面上の全てのオリゴヌクレオチドで異なっている。一実施形態では、核酸配列のプライマーは、全てのオリゴヌクレオチドおよびバーコード単位で同一である。一実施形態では、核酸のバーコードは、５〜２０ヌクレオチド、好ましくは８〜１６ヌクレオチドを含む。一実施形態では、核酸配列のプライマーは、５〜５０ヌクレオチド、好ましくは５〜３０ヌクレオチドを含む。
【０１６８】
一実施形態では、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドはさらに、ＰＣＲハンドル配列を含む。一実施形態では、ＰＣＲハンドル配列は、全てのオリゴヌクレオチドおよびバーコード単位で同一である。一実施形態では、ＰＣＲハンドル配列は、１０〜３０ヌクレオチド、好ましくは１５〜２５ヌクレオチドを含む。
【０１６９】
一実施形態では、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドはさらに、固有の分子の識別子配列を含む。一実施形態では、固有の分子の識別子配列は、所定のバーコード単位の表面上の全てのオリゴヌクレオチドで異なっている。一実施形態では、固有の分子の識別子配列は、１０〜３０ヌクレオチド、好ましくは１５〜２５ヌクレオチドを含む。
【０１７０】
一実施形態では、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドはさらに、スペーサー領域を含む。
【０１７１】
一実施形態では、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、５’から３’の方向に（すなわちバーコード単位の表面に関して、近位から遠位の方向に）、
任意選択でスペーサー領域と、
任意選択でＰＣＲハンドル配列と、
核酸のバーコードと、
任意選択で固有の分子の識別子配列と、
核酸配列のプライマーと
を含む。
【０１７２】
一実施形態では、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、３’から５’の方向に（すなわちバーコード単位の表面に関して遠位から近位の方向に）、
任意選択でスペーサー領域と、
任意選択で、ＰＣＲハンドル配列と、
核酸のバーコードと、
任意選択で固有の分子の識別子配列と、
核酸配列のプライマーと
を含む。
【０１７３】
一実施形態では、核酸のオリゴヌクレオチドのバーコード単位への共有結合は、核酸のオリゴヌクレオチドの合成の間に、直接行われる。一実施形態では、核酸のオリゴヌクレオチドのバーコード単位への共有結合は、核酸のオリゴヌクレオチドの合成の後に、行われる。
【０１７４】
ガラスまたはプラスチックのチューブまたはビーズ、ニトロセルロースまたはナイロンのファイバー、マイクロタイターのウェル、アガロースビーズゲル、および磁性粒子などのバーコード単位上に核酸のオリゴヌクレオチドを共有結合および／またはこれを合成するための技術は、当業者によく知られている。これら技術として、限定するものではないが、ＵＶ照射、ビオチン−アビジン／ストレプトアビジン、および化学的な共有結合（Ｍａｃｏｓｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５．  Ｃｅｌｌ．  １６１：１２０２−１２１４；  Ｆａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５．  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ３４７（６２２２）：１２５８３６７；  Ｂｅａｕｃａｇｅ，  Ｓ．Ｌ．  （１９９３），  Ｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ａｎａｌｏｇｓ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．  Ｔｏｔｏｗａ，  ＮＪ：  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  ２０：３３−６１；  Ｃｏｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８３．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．  ８０：２７８−２８２；  Ｌｏｃｋｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：１３１３−１３１４；  Ｊｏｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７．  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２４７：９６−１０１；  Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７．  Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  ２５：９１１−９１２；  Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８．  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ．  ３：２５７−２５８；  Ｍａｓｋｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２．  Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  ２０：１６７９−１６８４；  Ｃｈｒｉｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６．  Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  ２４：３１３１−３０３９；  Ｃｈｒｉｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６．  Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  ２４：３０４０−３０４７；  Ｍａｒｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ．  １１：３９３−３９６；  Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７．  Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｎｏｔｅｓ  Ｍａｇ．  ６４：２１−２５；  Ｗｅｉｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６．  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２４３：２１８−２２７；  Ｂｅａｔｔｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５．  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ４：２１３−２２５；Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１．  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９８：１３８−１４２；Ｔｉｍｏｆｅｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６．  Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  ２４：３１４２−３１４８；Ｙｅｒｓｈｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７．  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２５０：２０３−２１１；ＤｅＡｎｇｅｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５．  Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  ２３：４７４２−４７４３；Ｈａｕｋａｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．  １１：６０−６３）が挙げられる。
【０１７５】
本発明に係る方法の実施は、バーコード単位上の生物学的単位の結合および／または固定化に依存し得る。よって、個別の生物学的単位を捕捉するために、バーコード単位に生物学的単位を結合するための少なくとも１つの手段を加えることが望ましいとされ得る。
【０１７６】
一実施形態では、生物学的単位のバーコード単位への結合および／または固定化は、特異的ではない（ａｓｐｅｃｉｆｉｃ）。一実施形態では、生物学的単位のバーコード単位への結合および／または固定化は、特異的である。
【０１７７】
一実施形態では、バーコード単位上への生物学的単位の結合および／または固定化は、生物学的単位上にバーコード単位を結合するための少なくとも１つの手段の存在を必要とする。
【０１７８】
生物学的単位を結合するための手段および／またはバーコード単位を結合するための手段として、限定するものではないが、タンパク質またはそのフラグメント、ペプチド、抗体またはそのフラグメント、核酸（一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡなど）、炭水化物、ビタミンまたはその誘導体、補酵素またはその誘導体、受容体リガンドまたはその誘導体、疎水基が挙げられる。
【０１７９】
一実施形態では、生物学的単位を結合するための手段および／またはバーコード単位を結合するための手段は、少なくとも１つのタンパク質および／または少なくとも１つのペプチドを含む。タンパク質またはペプチドの例として、限定するものではないが、抗体（たとえばＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）およびそのフラグメント（限定するものではないが、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、ジアボディ、トリアボディ、ｓｃＦｖ−Ｆｃフラグメント、ミニボディを含む）；プロテインＡ、プロテインＧ、アビジン、ストレプトアビジン、受容体およびそのフラグメント、ならびにリガンドおよびそのフラグメントが挙げられる。
【０１８０】
一実施形態では、生物学的単位を結合するための手段および／またはバーコード単位を結合するための手段は、少なくとも１つの核酸を含む。核酸の例として、限定するものではないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ならびに人工的な核酸、たとえばイノシン、キサントシン、ワイブトシン（ｗｙｂｕｔｏｓｉｎｅ）、および／またはそれらの誘導体を含む核酸が挙げられる。
【０１８１】
一実施形態では、生物学的単位を結合するための手段および／またはバーコード単位を結合するための手段は、少なくとも１つの炭水化物を含む。炭水化物の例として、限定するものではないが、単糖、二糖、および多糖が挙げられる。
【０１８２】
一実施形態では、生物学的単位を結合するための手段および／またはバーコード単位を結合するための手段は、少なくともビタミンを含む。
【０１８３】
一実施形態では、生物学的単位を結合するための手段および／またはバーコード単位を結合するための手段は、少なくとも補酵素を含む。
【０１８４】
一実施形態では、生物学的単位を結合するための手段および／またはバーコード単位を結合するための手段は、少なくとも受容体リガンドを含む。
【０１８５】
一実施形態では、生物学的単位を結合するための手段および／またはバーコード単位を結合するための手段は、少なくとも疎水基を含む。疎水基の例として、限定するものではないが、約２〜８個の炭素原子を有するアルキル基、たとえばエチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘプチル、もしくはオクチル、およびそれらの異性体の形態；またはアリール基、たとえばフェニル、ベンジル、またはナフチルが挙げられる。
【０１８６】
生物学的単位を結合するための手段でバーコード単位をコーティングするための技術は、当業者によく知られている。
【０１８７】
一実施形態では、コーティングは、全体のコーティング、すなわちバーコード単位を完全にカバーすることであってもよく、または部分的なコーティング、すなわちバーコード単位の一部のみをカバーすることであってもよい。
【０１８８】
一実施形態では、生物学的単位を結合するための手段でのバーコード単位のコーティングは、バーコード単位の官能基付与を必要とする。官能基付与したバーコード単位の例として、限定するものではないが、アミノ官能基付与したバーコード単位、カルボキシル官能基付与したバーコード単位、ヒドロキシル官能基付与したバーコード単位、およびエポキシ官能基付与したバーコード単位が挙げられる。バーコード単位に官能基を付与するための技術は、当該分野でよく知られており、限定するものではないが、メトキシシラン、エトキシシラン、およびアセトキシシランの誘導体などのオルガノシランの架橋が挙げられる。
【０１８９】
生物学的単位を結合するための手段でバーコード単位をコーティングするための技術の例として、限定するものではないが、吸着および共有結合が挙げられる。共有結合は、カルボジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、スルホ−ＮＨＳ、ジメチルアミノプロピル（ＤＥＡＰ）、グルタルアルデヒド、アルデヒド、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３）、スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、および／または臭化シアン（ＢｒＮＣ）などのカップリング剤を使用して、官能基付与したバーコード単位で行われ得る。
【０１９０】
一実施形態では、バーコード単位を結合するための少なくとも１つの手段は、生物学的単位の表面および／または内部に天然に存在する。一実施形態では、バーコード単位を結合するための少なくとも１つの手段は、生物学的単位の表面および／または内部に天然には存在していない。
【０１９１】
一実施形態では、生物学的単位は、バーコード単位上への結合および／または固定化の前に、少なくとも１つの抗体と共にインキュベートされる。一実施形態では、少なくとも１つの抗体は、生物学的単位に特異的である。一実施形態では、少なくとも１つの抗体は、機能付与されている。機能付与の例として、限定するものではないが、タンパク質またはそのフラグメント、ペプチド、抗体またはそのフラグメント、核酸（一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡなど）、炭水化物、ビタミンまたはその誘導体、補酵素またはその誘導体、受容体リガンドまたはその誘導体、および疎水基が挙げられる。一実施形態では、抗体は、ビオチン化されており、すなわちビオチン部分で機能付与されている。
【０１９２】
本発明に係る方法の実施は、単一のバーコード単位上への単一の生物学的単位の結合および／または固定化に依存し得る。よって、１超の生物学的単位が各バーコード単位に結合しないこと；またはあるいは、１超のバーコード単位が各生物学的単位に結合しないことが望ましいとされ得る。
【０１９３】
生物学的単位およびバーコード単位の両方の濃度および／大きさなどのパラメータに応じて、１超の生物学的単位が、単一のバーコード単位に結合し得、その逆も同様である。結果として、本発明に係る方法は、１：１の比の生物学的単位／バーコード単位の複合体を確保、選択、および／または精製するための手段を提供する。また本発明に係る方法は、１：１の比の生物学的単位／バーコード単位の複合体を形成するための手段を提供する。
【０１９４】
一実施形態では、本発明の方法は、１：１の比の生物学的単位／バーコード単位の複合体の選択および／または精製のステップを含む。一実施形態では、複数の生物学的単位を複数のバーコード単位と接触させて生物学的単位／バーコード単位の複合体を形成してもよく、これはさらに選択および／または精製され得る。
【０１９５】
複合体を選択および／または精製するための技術は、当業者によく知られており、限定するものではないが、サイズ排除クロマトグラフィー技術、密度勾配技術、および／またはろ過技術を含む。
【０１９６】
一実施形態では、本発明の方法は、１：１の比の生物学的単位／バーコード単位の複合体を形成するための手段を含む。
【０１９７】
一実施形態では、生物学的単位は、担体に結合される。一実施形態では、バーコード単位は、担体に結合される。
【０１９８】
複数のバーコード単位と接触させる前に、複数の生物学的単位を担体に結合させることは、障害物をもたらし、担体を妨害として作用させ、単一の生物学的単位へのバーコード単位の複数の結合を防止する。よって、生物学的単位と比較して大きなバーコード単位を使用することが望ましいとされ得る。さらに、生物学的単位に関連したバーコード単位の限界濃度を、生物学的単位あたり最大１つのバーコード単位の結合を確保するために使用してもよい。
【０１９９】
あるいは、複数の生物学的単位と接触させる前に、複数のバーコード単位を担体に結合させることは、障害物をもたらし、担体を妨害として作用させ、単一のバーコード単位への生物学的単位の複数の結合を防止する。よって、生物学的単位と比較して小さなバーコード単位を使用することが望ましいとされ得る。さらに、バーコード単位に関連した生物学的単位の限界濃度を、バーコード単位あたり最大１つの生物学的単位の結合を確保するために使用してもよい。
【０２００】
一実施形態では、担体の組成、形状、形態、および修飾は、応用に応じた選択肢の範囲から選択され得る。
【０２０１】
本発明の担体に使用され得る例示的な物質として、限定するものではないが、アクリル、炭素（たとえば、グラファイト、カーボンファイバー）、セルロース（たとえば酢酸セルロース）、セラミクス、ＣＰＧ（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）、架橋した多糖（たとえば、アガロース、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）またはアルギン酸塩）、ゲル、ガラス（たとえば改変または機能化したガラス）、金（たとえば原子的に平滑なＡｕ（１１１））、グラファイト、無機ガラス、無機ポリマー、ラテックス、金属酸化物（たとえばＳｉＯ２、ＴｉＯ２、ステンレス鋼）、メタロイド、金属（たとえば原子的に平滑なＡｕ（１１１））、雲母、硫化モリブデン、ナノマテリアル（たとえば高配向性熱分解グラファイト（ＨＯＰＧ）ナノシート）、ニトロセルロース、ＮＹＬＯＮ（商標）、光ファイバーの束、有機ポリマー、紙、プラスチック、ポリアクリロイルモルホリド（ｐｏｌａｃｒｙｌｏｙｌｍｏｒｐｈｏｌｉｄｅ）、ポリ（４−メチルブテン）、ポリエチレンテレフタラート）、ポリ（ビニルブチラート）、ポリブチレン、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリエチレン、ポリホルムアルデヒド、ポリメタクリラート、ポリプロピレン、多糖、ポリスチレン、ポリウレタン、フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）、水晶、レーヨン、樹脂、ゴム、半導体材料、シリカ、シリコン（たとえば表面を酸化させたシリコン）、硫化物、およびＴＥＦＬＯＮ（商標）が挙げられる。
【０２０２】
一実施形態では、担体は、単一の物質から構成されている。別の実施形態では、担体は、いくつかの異なる物質の混合物から構成されている。
【０２０３】
一実施形態では、本発明で使用される担体は、チューブ、ビーズ、スライド、チップ、粒子、鎖、ゲル、シート、チュービング、スフィア、容器、毛細管、パッド、スライス、フィルム、培養ディッシュ、マイクロタイタープレート、たとえば７６８−ウェル、３８４−ウェル、９６−ウェル、４８−ウェル、２４−ウェル、１２−ウェル、８−ウェル、６−ウェル、４−ウェル、１−ウェルのプレート、四角形のグリッド、チェッカーボードのグリッド、六角形のアレイなどであり得る。様々な実施形態では、担体は、生物学的、非生物学的、有機、無機、またはそれらのいずれかの組み合わせであり得る。
【０２０４】
担体の表面は、その上への生物学的単位および／またはバーコード単位の捕捉または固定化を促進するために、当業者に知られている方法により修飾することができる。
【０２０５】
一実施形態では、担体への生物学的単位および／またはバーコード単位の捕捉または固定化は、特異的なものではない。
【０２０６】
一実施形態では、生物学的単位および／またはバーコード単位は、担体をコーティングするハイドロゲルの層に捕捉または固定される。
【０２０７】
一実施形態では、担体への生物学的単位および／またはバーコード単位の捕捉または固定化は、特異的なものである。
【０２０８】
一実施形態では、担体は、その表面に、カルボキシル、アミノ、ヒドロキシル、エポキシなどの反応基を含む。一実施形態では、担体は、その表面に結合した官能基などの官能基の修飾を有し得る。一実施形態では、担体は、少なくとも１つの生物学的単位および／または少なくとも１つのバーコード単位への結合に関与する少なくとも１つの手段を含む。
【０２０９】
生物学的単位および／またはバーコード単位を結合するための手段として、限定するものではないが、本明細書中上述されるように、タンパク質またはそのフラグメント、ペプチド、抗体またはそのフラグメント、核酸（一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡなど）、炭水化物、ビタミンまたはその誘導体、補酵素またはその誘導体、受容体リガンドまたはその誘導体、および疎水基が挙げられる。
【０２１０】
生物学的単位および／またはバーコード単位を結合するための手段で担体をコーティングするための技術は、当業者によく知られている。
【０２１１】
一実施形態では、コーティングは、全体のコーティング、すなわち担体を完全にカバーすることであってもよく、または部分的なコーティング、すなわち担体の一部のみをカバーすることであってもよい。
【０２１２】
一実施形態では、生物学的単位および／またはバーコード単位を結合するための手段での担体のコーティングは、担体の官能基付与を必要とする。官能基付与した担体の例として、限定するものではないが、アミノ官能基付与した担体、カルボキシル官能基付与した担体、ヒドロキシル官能基付与した担体、およびエポキシ官能基付与した担体が挙げられる。担体に官能基を付与するための技術は、当業者によく知られており、限定するものではないが、メトキシシラン、エトキシシラン、およびアセトキシシランの誘導体などのオルガノシランの架橋を含む。
【０２１３】
生物学的単位および／またはバーコード単位を結合するための手段で担体をコーティングするための技術の例として、限定するものではないが、吸着および共有結合が挙げられる。共有結合は、カルボジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、スルホ−ＮＨＳ、ジメチルアミノプロピル（ＤＥＡＰ）、グルタルアルデヒド、アルデヒド、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３）、スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、および／または臭化シアン（ＢｒＮＣ）などのカップリング剤を使用して、官能基付与した担体で行われ得る。
【０２１４】
一実施形態では、本発明に係るハイドロゲル中の個別の生物学的単位を捕捉するための方法は、
ａ）複数の生物学的単位を複数のバーコード単位と接触させて、生物学的単位／バーコード単位の複合体を形成するステップと、
ｂ）前記生物学的単位／バーコード単位の複合体をハイドロゲル溶液と接触させるステップと、
ｃ）前記ハイドロゲル溶液を重合化して、ハイドロゲルマトリックスに前記生物学的単位／バーコード単位の複合体を埋め込むステップと、
ｄ）前記ハイドロゲルマトリックス中の前記生物学的単位／バーコード単位の複合体のそれぞれの中の生物学的単位の核酸にバーコードを付与するステップと
を含む。
【０２１５】
一実施形態では、各バーコード単位は、本明細書中上記に定義される生物学的単位への結合に関与する少なくとも１つの手段を含む。一実施形態では、各生物学的単位は、本明細書中上記に定義されるバーコード単位への結合に関与する少なくとも１つの手段を含む。
【０２１６】
一実施形態では、各バーコード単位は、本明細書中上記に定義される固有のバーコードを含む。一実施形態では、各バーコード単位は、固有のバーコードのクローンコピーを含む。
【０２１７】
一実施形態では、各バーコード単位は、本明細書中上記に定義される少なくとも１つの核酸配列のプライマーを含む。
【０２１８】
一実施形態では、各バーコード単位は、本明細書中上記に定義される核酸オリゴヌクレオチドを含む。
【０２１９】
一実施形態では、複数の生物学的単位は、本明細書中上記に定義されるように、担体に結合する。一実施形態では、複数のバーコード単位は、本明細書中上記に定義されるように、担体に結合する。
【０２２０】
一実施形態では、本発明に係る方法は、生物学的単位の選択および／またはソーティングのステップを含み得る。生物学的単位の選択および／またはソーティングは、タンパク質もしくは炭水化物などの所定の表面分子の発現、または各生物学的単位の特定の光散乱および蛍光の特徴に基づくものであってもよい。また、生物学的単位の選択および／またはソーティングは、それらの大きさに基づいていてもよい。生物学的単位を選択および／またはソーティングするための方法は、当業者によく知られており、限定するものではないが、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）、ＦＩＳＨ−ＦＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ−ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）、ＩｓｏＲａｆｔ  ａｒｒａｙ、ＤＥＰＡｒｒａｙ  ｌａｂ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ技術、ＭＡＣＳ（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）、免疫沈降法、ろ過などを含む。
【０２２１】
一実施形態では、本発明に係る方法は、生物学的単位の溶解のステップを含み得る。
【０２２２】
一実施形態では、本発明に係る方法は、生物学的単位のＲＮＡ内容物、好ましくは生物学的単位のｍＲＮＡ内容物の逆転写のステップを含み得る。
【０２２３】
一実施形態では、生化学および分子生物学のアッセイは、ハイドロゲルマトリックス中の生物学的単位／バーコード単位の複合体のそれぞれの中の生物学的単位の核酸にバーコード付与するステップの前、最中、または後に、行うことができる。
【０２２４】
一実施形態では、本発明に係る方法は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｃＤＮＡなどの生物学的単位の核酸の事前の増幅（ｐｒｅ−ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）のステップを含み得る。一実施形態では、本発明に係る方法は、ハイドロゲルマトリックス中の生物学的単位／バーコード単位の複合体のそれぞれの中の生物学的単位の核酸にバーコード付与するステップの前に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｃＤＮＡなどの生物学的単位の核酸の事前の増幅のステップを含み得る。
【０２２５】
一実施形態では、本発明に係る方法は、生化学および分子生物学のアッセイのためのテンプレートを精製するステップを含み得る。核酸のテンプレートまたは核酸のテンプレートを封入する膜に結合した内因的または外因的なタンパク質および複合体は、生物学的単位／バーコード単位の複合体の捕捉の後に、ハイドロゲルから除去することができる。核酸精製に関する技術は、当業者によく知られており、限定するものではないが、プロテイナーゼＫ、および／または界面活性剤、たとえばＳＤＳ、サルコシル、ＮＰ−４０などを含む。
【０２２６】
一実施形態では、本発明に係る方法は、増幅した核酸をクリーニングするステップを含み得る。シーケンシング用の核酸のライブラリーを調製する前に、一本鎖のプライマーおよび酵素などの反応産物を除去することが望ましいとされ得る。核酸のクリーンアップに関する技術は、当業者によく知られており、限定するものではないが、一本鎖に特異的なヌクレアーゼの使用、および／または核酸のリン酸化末端を脱リン酸化するホスファターゼの使用を含む。一本鎖に特異的なヌクレアーゼの例として、限定するものではないが、エキソヌクレアーゼＩ、マングビーンヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＢｈ１、ヌクレアーゼＰ１、ヌクレアーゼＳ１、ＢＡＬ  ３１ヌクレアーゼが挙げられる。ホスファターゼの例として、限定するものではないが、エビのアルカリホスファターゼなどのアルカリホスファターゼが挙げられる。
【０２２７】
一実施形態では、本発明に係る方法は、増幅した核酸の大きさを調節する（ｓｉｚｉｎｇ）ステップを含み得る。ＩｌｌｕｍｉｎａまたはＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔなどのショートリードシーケンサーは、製造社の推奨に従い、同様の大きさのフラグメントを含むＤＮＡライブラリーを供給する際に、最良に作動する。ライブラリーの大きさの選択が適切ではない場合、これらシーケンサーの効率は低下し得る。限定するものではないが、核酸ゲル電気泳動、ビーズベースのプロトコル、パルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）、自動化されたサイズの選択を含む、ＤＮＡの大きさの選択に関する技術が、当業者によく知られている。
【０２２８】
一実施形態では、本発明に係る方法は、核酸および／またはｃＤＮＡライブラリーのフラグメント化のステップを含み得る。
【０２２９】
一実施形態では、本発明に係る方法は、核酸および／またはｃＤＮＡライブラリーの酵素を用いたフラグメント化のステップを含み得る。
【０２３０】
一実施形態では、本発明に係る方法は、核酸および／またはｃＤＮＡライブラリーの機械的なフラグメント化のステップを含み得る。
【０２３１】
一実施形態では、本発明に係る方法は、核酸および／またはｃＤＮＡライブラリーのポリッシングのステップを含み得る。
【０２３２】
一実施形態では、本発明に係る方法は、核酸および／またはｃＤＮＡライブラリーのＡ鎖形成のステップを含み得る。
【０２３３】
一実施形態では、本発明に係る方法は、核酸および／またはｃＤＮＡライブラリーのライゲーションのステップを含み得る。
【０２３４】
一実施形態では、本発明に係る方法は、タグ処理（ｔａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）のステップを含み得る。核酸および／またはｃＤＮＡライブラリーをタグ処理するための技術は、当業者によく知られている。
【０２３５】
一実施形態では、本発明に係る方法は、核酸のシーケンシングのステップを含み得る。一実施形態では、核酸のシーケンシングは、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）により行われ得る。核酸ライブラリーのＮＧＳに関する方法は、当業者に知られており、限定するものではないが、ペアエンドシーケンシング（ｐａｉｒｅｄ−ｅｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、ＳＢＳ（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、およびシングルリードシーケンシング（ｓｉｎｇｌｅ−ｒｅａｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を含む。
【０２３６】
一実施形態では、本発明に係る方法は、ハイドロゲルマトリックスを、本方法を行うために有用な生化学および分子生物学の試薬と接触させるステップを含む。一実施形態では、ハイドロゲルマトリックスは、バーコード単位、生物学的単位、および／または解析物、たとえば個別の生物学的単位から抽出した核酸またはこれに由来する核酸などの拡散を許容することなく、生化学および分子生物学の試薬の拡散を可能にするように十分に多孔性である。一実施形態では、その後のステップを、ハイドロゲルマトリックスと接触した生化学および分子生物学の試薬を交換および／または洗浄することにより、行うことができる。
【０２３７】
生化学および分子生物学の試薬は、当業者によく知られており、溶液（バッファー溶液、洗浄溶液など）、界面活性剤、酵素、核酸プライマーなどの、生化学および分子生物学のアッセイを行うための既知の全ての試薬を包有する。
【０２３８】
一実施形態では、生化学および分子生物学の試薬の拡散は、受動拡散である。受動拡散として、限定するものではないが、浸透および拡散泳動（ｄｉｆｆｕｓｉｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）が挙げられる。
【０２３９】
一実施形態では、生化学および分子生物学の試薬の拡散は、能動拡散である。ハイドロゲルにおける能動拡散に関する技術は、当業者によく知られており、限定するものではないが、ポンプの使用、電気浸透、および電気泳動を含む。
【０２４０】
一実施形態では、その後のステップは、ハイドロゲルと接触した試薬の大部分を交換することにより、行われる。
【０２４１】
一実施形態では、本発明に係る方法は、高価な油、チップ、および／または液滴生成器具の使用を必要としない。
【０２４２】
一実施形態では、本発明に係る方法は、自動化することができる。
【０２４３】
一実施形態では、本発明に係る方法は、ハイドロゲルマトリックスを溶解するステップを含み得る。一実施形態では、ハイドロゲルマトリックスの溶解は、本方法を通して任意の時点で起こり得る。ハイドロゲルマトリックスを溶解するための技術は、当業者によく知られており、限定するものではないが、アガラーゼなどの酵素を用いた酵素による脱重合および熱を使用した熱的な脱重合を含む。
【０２４４】
一実施形態では、ハイドロゲルマトリックスの溶解は、少なくとも１つのバーコード単位由来の固有のバーコードの少なくとも１つのコピー、好ましくはクローンコピーが、生物学的単位および／または解析物、たとえば個別の生物学的単位から抽出した核酸もしくは個別の生物学的単位由来の核酸などに組み込まれた後に、起こり得る。
【０２４５】
一実施形態では、ハイドロゲルマトリックスの脱重合は、個別の生物学的単位から抽出されるかまたはこれに由来する少なくとも１つの核酸が、少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、好ましくは個別のバーコード単位由来の核酸配列のプライマーを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドに対してプライミングされた後に、起こり得る。
【０２４６】
本明細書中記載の方法は、限定するものではないが、単一細胞のトランスクリプトームのプロファイリング、単一細胞のジェノタイピング、フェーズ化、および単一細胞のエピゲノムのプロファイリングを含む様々な応用において、実施できる。
【０２４７】
開示した出願に記載される実施形態は、全てが本発明の必須の特性ではなく、むしろ本発明の実施の単なる例であることは、明らかである。単一細胞のトランスクリプトームのプロファイリング、単一細胞のジェノタイピング、フェーズ化、および／または単一細胞のエピゲノムのプロファイリングの当業者は、この分野の一般的な知識を使用して、本方法を適切に行う方法を承知している。さらに、これらステップは、本開示に列挙されているかまたは当業者に知られている科学文献および特許文書に記載されるものを含む、本開示の他のいずれかの適切なステップ、態様、および／または特性と組み合わせてもよく、かつ／またはこれらにより修正されてもよい。
【０２４８】
本発明は、個別の生物学的単位における遺伝子発現を解析するための方法に関する。
【０２４９】
単一細胞のトランスクリプトームのプロファイリングは、単一の細胞のｍＲＮＡの含有物の増幅およびそのシーケンシングに依存する。単一の細胞のトランスクリプトームの作製は、全般的に、ポリ（Ａ）鎖を有するｍＲＮＡを、さらに増幅およびシーケンシングされ得る第１の鎖のｃＤＮＡに変換するように逆転写させる第１のステップを必要とする。
【０２５０】
一実施形態では、個別の生物学的単位における遺伝子発現を解析するための方法は、
ａ）複数の生物学的単位を複数のバーコード単位と接触させて、生物学的単位／バーコード単位の複合体を形成するステップであって、各バーコード単位が固有のバーコードを含み、前記バーコード単位が、前記生物学的単位への結合に関与する少なくとも１つの手段を含む、ステップと、
ｂ）前記生物学的単位／バーコード単位の複合体をハイドロゲル溶液と接触させるステップと、
ｃ）前記ハイドロゲル溶液を重合化して、ハイドロゲルマトリックスに前記生物学的単位／バーコード単位の複合体を埋め込むステップと、
ｄ）前記ハイドロゲルマトリックス中の各生物学的単位から核酸を放出するステップと、
ｅ）前記ハイドロゲルマトリックス中の各生物学的単位に由来する核酸にバーコードを付与するステップと、
ｆ）前記各生物学的単位由来の核酸からｃＤＮＡライブラリーを合成するステップと、
ｇ）前記各生物学的単位由来のｃＤＮＡライブラリーを増幅させるステップであって、前記各生物学的単位由来のｃＤＮＡライブラリーの増幅が、前記固有のバーコードのクローンコピーを、各生物学的単位由来の増幅産物に組み込む、ステップと、
ｈ）前記増幅産物をシーケンシングするステップと
を含み得る。
【０２５１】
一実施形態では、本発明に係る個別の生物学的単位における遺伝子発現を解析するための方法は、当業者によく知られている追加的なステップを含む。このようなステップは、それら内容の全てが参照によって本明細書中に組み込まれている、Ｍａｃｏｓｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５．  Ｃｅｌｌ．  １６１：１２０２−１２１４；  Ｆａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５．  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ３４７（６２２２）：１２５８３６７；  Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５．  Ｃｅｌｌ．  １６１（５）：１１８７−２０１；  Ｇｉｅｒａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１７．  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  １４（４）：３９５−３９８；ならびに米国特許出願ＵＳ２０１６−０２８９６６９号、ＵＳ２０１６−０２６５０６９号、ＵＳ２０１６−００６０６２１号、およびＵＳ２０１５−０３７６６０９号に記載されている。
【０２５２】
一実施形態では、各バーコード単位は、ｐｏｌｙ−ｄＴ核酸配列のプライマー、固有のバーコード、および／またはＰＣＲハンドルを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む。
【０２５３】
一実施形態では、各バーコード単位は、ｐｏｌｙ−ｄＵ核酸配列のプライマー、固有のバーコード、および／またはＰＣＲハンドルを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む。
【０２５４】
一実施形態では、各バーコード単位は、（ｄＴ）ｎＶＮ核酸配列のプライマー、固有のバーコード、および／またはＰＣＲハンドルを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む（式中ｎは、５〜５０の範囲にあり、Ｖは、Ｔ／Ｕ以外の任意のヌクレオチド（すなわちＡ、Ｃ、またはＧ）を表し、Ｎは、任意のヌクレオチド（すなわちＡ、Ｔ／Ｕ、Ｃ、またはＧ）を表す）。
【０２５５】
一実施形態では、各バーコード単位は、（ｄＵ）ｎＶＮ核酸配列のプライマー、固有のバーコード、および／またはＰＣＲハンドルを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む（式中ｎは、５〜５０の範囲にあり、Ｖは、Ｔ／Ｕ以外の任意のヌクレオチド（すなわちＡ、Ｃ、またはＧ）を表し、Ｎは、任意のヌクレオチド（すなわちＡ、Ｔ／Ｕ、Ｃ、またはＧ）を表す）。
【０２５６】
一実施形態では、各生物学的単位からの核酸の放出は、細胞の溶解、好ましくは非イオン性界面活性剤および／またはプロテイナーゼＫを使用する細胞の溶解により、行われる。
【０２５７】
一実施形態では、本方法はさらに、非イオン性界面活性剤および／またはプロテイナーゼＫを洗い出すステップを含む。
【０２５８】
一実施形態では、本方法はさらに、プロテイナーゼＫを不活性化するステップを含む。一実施形態では、プロテイナーゼＫの不活性化は、熱および／または化学的な阻害により行われる。
【０２５９】
一実施形態では、各生物学的単位由来の核酸からｃＤＮＡライブラリーを合成するステップは、バーコード単位の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドの少なくとも１つの核酸配列のプライマーを用いて行われる。
【０２６０】
一実施形態では、各生物学的単位由来の核酸からｃＤＮＡライブラリーを合成するステップは、逆転写により、すなわち逆転写酵素を使用して行われる。
【０２６１】
一実施形態では、逆転写酵素は、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素である。
【０２６２】
一実施形態では、ｃＤＮＡライブラリーのｃＤＮＡの相補鎖は、好ましくは第２の鎖反応の構成要素を使用して、合成される。一実施形態では、ｃＤＮＡライブラリーのｃＤＮＡの相補鎖は、ＲＮＡｓｅ  Ｈ、ＤＮＡポリメラーゼＩ、および／またはＤＮＡリガーゼを使用して合成される。
【０２６３】
一実施形態では、ｃＤＮＡライブラリーは、ｃＤＮＡフラグメントを入手するためにフラグメント化される。ＤＮＡをフラグメント化するための方法は、当該分野でよく知られており、限定するものではないが、Ｃｏｖａｒｉｓの超音波処理およびＤＮＡの酵素を用いた切断を含む。
【０２６４】
一実施形態では、ｃＤＮＡのフラグメントは、ポリッシングされる。一実施形態では、ｃＤＮＡフラグメントは、Ａ鎖形成される。
【０２６５】
一実施形態では、アダプターが、ｃＤＮＡライブラリーに付加される。アダプターは、限定するものではないが、Ｔｎ５の転位およびライゲーションを含む様々な方法を使用して、ｃＤＮＡライブラリーに付加され得る。
【０２６６】
一実施形態では、ｃＤＮＡライブラリーの増幅は、バーコード単位の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドの少なくとも１つの核酸配列のプライマーを用いて、行われる。
【０２６７】
一実施形態では、増幅のステップは、遊離する核酸配列のプライマー、すなわちバーコード単位に結合していない核酸配列のプライマーを使用して、増強され得る。
【０２６８】
また本発明は、個別の生物学的単位における遺伝子型を解析するための方法に関する。
【０２６９】
単一細胞のジェノタイピングは、シーケンシングにとって十分なＤＮＡをもたらすための、単一細胞のＤＮＡのＷＧＡ（全ゲノム増幅法：ｗｈｏｌｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）に依存する。ＷＧＡに関するいくつかの方法が利用可能であり、当業者によく知られている。しかしながらこれら方法のいくつかは、増幅のバイアスおよびその後の不適切なゲノムのカバー率（ｇｅｎｏｍｅ  ｃｏｖｅｒａｇｅ）をもたらす。縮重したプライマーを用いたＰＣＲベースの指数関数的なＷＧＡは、配列依存的なバイアスを導入する。鎖を置換させる（ｓｔｒａｎｄ−ｄｉｓｐｌａｃｉｎｇ）Φ２９ＤＮＡポリメラーゼを使用するＭＤＡ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は、改善を呈するが、同様に、非線形の増幅によりバイアスを導入し得る。ＭＡＬＢＡＣ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ａｎｎｅａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｌｏｏｐ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｃｙｃｌｅｓ）は、非線形な増幅に関連したバイアスを低減するために、準線型（ｑｕａｓｉｌｉｎｅａｒ）の事前の増幅を導入する別の方法である。これは、その後の指数関数的な増幅のためのｈｉｇｈ−ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ酵素に加え、準線型の事前の増幅の段階のためのＢｓｔＩ  ＤＮＡポリメラーゼに依存する（Ｚｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２．  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ３３８（６１１４）：１６２２−６；  Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２．  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ３３８（６１１４）：１６２７−３０）。
【０２７０】
一実施形態では、個別の生物学的単位における遺伝子型を解析するための方法は、
ａ）複数の生物学的単位を複数のバーコード単位と接触させて、生物学的単位／バーコード単位の複合体を形成するステップであって、各バーコード単位が固有のバーコードを含み、前記バーコード単位が、前記生物学的単位への結合に関与する少なくとも１つの手段を含む、ステップと、
ｂ）前記生物学的単位／バーコード単位の複合体をハイドロゲル溶液と接触させるステップと、
ｃ）前記ハイドロゲル溶液を重合化して、ハイドロゲルマトリックスに前記生物学的単位／バーコード単位の複合体を埋め込むステップと、
ｄ）前記ハイドロゲルマトリックス中の各生物学的単位からゲノムＤＮＡを放出するステップと、
ｅ）前記ハイドロゲルマトリックス中の各生物学的単位に由来するゲノムＤＮＡにバーコードを付与するステップと、
ｆ）任意選択で、前記各生物学的単位由来の核酸からＤＮＡライブラリーを合成するステップと、
ｇ）前記各生物学的単位由来のゲノムＤＮＡまたはＤＮＡライブラリーを増幅させるステップであって、前記各生物学的単位由来のゲノムＤＮＡまたはＤＮＡライブラリーの増幅が、前記固有のバーコードのクローンコピーを、各生物学的単位の増幅産物に組み込む、ステップと、
ｈ）前記増幅産物をシーケンシングするステップと
を含み得る。
【０２７１】
一実施形態では、本発明に係る個別の生物学的単位における遺伝子型を解析するための方法は、当業者によく知られているさらなるステップを含む。このようなステップは、それら内容の全てが参照によって本明細書中に組み込まれている、Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．  １０２（４８）：１７３３２−６；  Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．  １１３（３０）：８４８４−９；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２．  Ｃｅｌｌ．  １５０（２）：４０２−１２；Ｍａｒｃｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７．  ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ．  ３（９）：１７０２−８；Ｇｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ３１（１２）：１１２６−３２；  Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２４（６）：６８０−６；ならびに国際公開第２０１６／０６１５１７号および同第２００５／００３３０４号に記載されている。
【０２７２】
一実施形態では、各バーコード単位は、核酸配列のプライマー、固有のバーコード、および／またはＰＣＲハンドルを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む。一実施形態では、各バーコード単位は、ｏｌｉｇｏ−ｄＮプライマー（ヘキサヌクレオチドｄ（Ｎ６）またはオクタヌクレオチドｄ（Ｎ８）プライマーなど）（式中Ｎは、任意のヌクレオチド（すなわち（すなわちＡ、Ｔ／Ｕ、Ｃ、またはＧ）を表す）、固有のバーコード、および／またはＰＣＲハンドルを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む。
【０２７３】
一実施形態では、各生物学的単位からゲノムＤＮＡを放出するステップは、細胞および／または核の溶解、好ましくはイオン性界面活性剤および／またはプロテイナーゼＫを使用した細胞および／または核の溶解により、行われる。
【０２７４】
一実施形態では、本方法はさらに、イオン性界面活性剤および／またはプロテイナーゼＫを洗い出すステップを含む。
【０２７５】
一実施形態では、本方法はさらに、プロテイナーゼＫを不活性化するステップを含む。一実施形態では、プロテイナーゼＫの不活性化は、熱および／または化学的な阻害により行われる。
【０２７６】
一実施形態では、本方法はさらに、ゲノムＤＮＡの変性のステップを含む。ゲノムＤＮＡを変性するための方法は、当業者によく知られており、限定するものではないが、アルカリ処理および／または熱を含む。
【０２７７】
一実施形態では、各生物学的単位由来の核酸からｃＤＮＡライブラリーを合成するステップは、バーコード単位の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドの少なくとも１つの核酸配列のプライマーを用いて行われる。
【０２７８】
一実施形態では、各生物学的単位由来の核酸からｃＤＮＡライブラリーを合成するステップは、プライマー誘導型の伸長により行われる。
【０２７９】
一実施形態では、ゲノムＤＮＡの増幅は、ＷＧＡ（ｗｈｏｌｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）により行われる。一実施形態では、ゲノムＤＮＡの増幅は、バーコード単位の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドの少なくとも１つの核酸配列のプライマーを用いて行われる。
【０２８０】
一実施形態では、増幅したゲノムＤＮＡは、ＤＮＡフラグメントを入手するためにフラグメント化される。ＤＮＡをフラグメント化するための方法は、当該分野でよく知られており、限定するものではないが、Ｃｏｖａｒｉｓの超音波処理およびＤＮＡの酵素を用いた切断を含む。
【０２８１】
一実施形態では、ｃＤＮＡフラグメントは、ポリッシングされる。一実施形態では、ｃＤＮＡフラグメントは、Ａ鎖形成される。
【０２８２】
一実施形態では、アダプターがＤＮＡフラグメントに付加される。限定するものではないが、アダプターは、Ｔｎ５の転位およびライゲーションを含む様々な方法を使用して、ＤＮＡフラグメントに付加され得る。
【０２８３】
一実施形態では、個別の生物学的単位における遺伝子型を解析するための方法は、ＤＬＰ（ｄｉｒｅｃｔ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）を実施し得る。一実施形態では、増幅したゲノムＤＮＡは、タグ処理される。一実施形態では、増幅していないゲノムＤＮＡが、タグ処理される。ＤＬＰおよびタグ処理は、当業者によく知られている。たとえば、それら内容の全てが参照によって本明細書中に組み込まれている、Ｖｉｔａｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１７．  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  １４（３）：３０２−３０８；  Ａｄｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０．  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．  １１（１２）：Ｒ１１９；  Ｇｅｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２．  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  ２２（１）：１３４−４１；およびＺａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１７．  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  １４（２）：１６７−１７３を参照することができる。よって一実施形態では、各バーコード単位は、核酸配列のプライマー、固有のバーコード、および／またはＰＣＲハンドルを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む。一実施形態では、核酸配列のプライマーは、少なくとも１つのＴｎ５アダプターに相補的な配列を有する。一実施形態では、核酸配列のプライマーは、配列５’−ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣ−３’（配列番号１）または５’−ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧ−３’（配列番号２）を含む、またはからなる。
【０２８４】
一実施形態では、本方法は、各バーコード単位の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドに各生物学的単位由来のタグ処理されたゲノムＤＮＡをライゲートするステップを含む。
【０２８５】
一実施形態では、本方法は、ＤＮＡフラグメントの増幅のステップを含む。ＤＮＡフラグメントを増幅させるための技術は、当業者によく知られている。
【０２８６】
一実施形態では、ＤＮＡフラグメントの増幅は、バーコード単位の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドの少なくとも１つの核酸配列のプライマーを用いて行われる。一実施形態では、ＤＮＡフラグメントの増幅は、バーコード単位の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドの少なくとも１つの核酸配列のプライマーではない少なくとも１つの核酸配列のプライマーを用いて、行われる。
【０２８７】
一実施形態では、増幅ステップは、遊離する核酸配列のプライマー、すなわちバーコード単位に結合していない核酸配列のプライマーを使用して、増強され得る。
【０２８８】
また本発明は、個別の生物学的単位のハプロタイプを解析するため、すなわちフェーズ化のための方法に関する。
【０２８９】
フェーズ化は、シーケンシングにとって十分なＤＮＡを作製するための、高分子量、すなわち２５または５０キロベース超のＤＮＡのＷＧＡ（ｗｈｏｌｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）に依存する。ＷＧＡに関するいくつかの方法が利用可能であり、当業者によく知られている。しかしながらこれら方法のいくつかは、増幅のバイアス、およびその後の不適切なゲノムのカバー率をもたらす。縮重したプライマーを用いたＰＣＲベースの指数関数的なＷＧＡは、配列依存的なバイアスを導入する。鎖を置換させるΦ２９ＤＮＡポリメラーゼを使用するＭＤＡ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は、改善を呈するが、同様に、非線形の増幅によりバイアスを導入し得る。ＭＡＬＢＡＣ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ａｎｎｅａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｌｏｏｐ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｃｙｃｌｅｓ）は、非線形な増幅に関連したバイアスを低減するために、準線型の事前の増幅を導入する別の方法である。これは、その後の指数関数的な増幅のためのｈｉｇｈ−ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ酵素に加え、準線型の事前の増幅の段階のためのＢｓｔＩ  ＤＮＡポリメラーゼに依存する（Ｚｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２．  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ３３８（６１１４）：１６２２−６；  Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２．  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ３３８（６１１４）：１６２７−３０）。あるいは、Ｔｎ５トランスポザーゼおよびその後の増幅が、「Ｃｏｎｔｉｇｕｉｔｙ−Ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ  Ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ」（ＣＰＴ−ｓｅｑ）と呼ばれる方法でのライブラリーの調製（ｌｉｂｒａｒｙ  ｐｒｅｐ）のために、使用され得る（Ａｍｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４．  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．  ４６（１２）：１３４３−９）。この方法では、ゲノムＤＮＡが、任意選択で精製された後の第１のステップは、Ｔｎ５転位を介してＤＮＡをタグ処理することである。これは、ＤＮＡをフラグメント化し、ユニバーサルなアダプターをテンプレートに直接付加する。ギャップファイリングの後、次に、ＰＣＲを、挿入したＴｎ５アダプターに相補的なプライマーを使用して行った後、シーケンシングを行う。
【０２９０】
一実施形態では、個別の生物学的単位のハプロタイプを解析するための方法は、
ａ）複数の生物学的単位を複数のバーコード単位と接触させて、生物学的単位／バーコード単位の複合体を形成するステップであって、各バーコード単位が固有のバーコードを含み、前記バーコード単位が、前記生物学的単位への結合に関与する少なくとも１つの手段を含む、ステップと、
ｂ）前記生物学的単位／バーコード単位の複合体をハイドロゲル溶液と接触させるステップと、
ｃ）前記ハイドロゲル溶液を重合化して、ハイドロゲルマトリックスに前記生物学的単位／バーコード単位の複合体を埋め込むステップと、
ｄ）任意選択で、前記ハイドロゲルマトリックス中の各生物学的単位から核酸を放出するステップと、
ｅ）前記ハイドロゲルマトリックス中の各生物学的単位に由来する核酸にバーコードを付与するステップと、
ｆ）任意選択で、前記各生物学的単位由来の核酸からＤＮＡライブラリーを合成するステップと、
ｇ）前記各生物学的単位由来の核酸またはＤＮＡライブラリーを増幅させるステップであって、前記各生物学的単位由来の核酸またはＤＮＡライブラリーの増幅が、前記固有のバーコードのクローンコピーを、各生物学的単位由来の増幅産物に組み込む、ステップと、
ｈ）前記増幅産物をシーケンシングするステップと
を含み得る。
【０２９１】
一実施形態では、本発明に係る個別の生物学的単位のハプロタイプを解析するための方法は、当業者によく知られているさらなるステップを含む。このようなステップは、それら内容の全てが参照によって本明細書中に組み込まれている、国際特許出願公開公報第２０１５／１２６７６６号、同２０１６／１３０７０４号、同２０１６／６１５１７号、同２０１５／９５２２６号、同２０１６／００３８１４号、同２００５／００３３０４号、同２０１５／２００８６９号、同２０１４／１２４３３８号、同２０１４／０９３６７６号；米国特許出願公開公報第２０１５−０６６３８５号；Ｋｕｌｅｓｈｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ３２（３）：２６１−６；  Ａｍｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４．  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．  ４６（１２）：１３４３−９；  Ｋａｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．  １１０（１４）：５５５２−７；  Ｐｅｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２．  Ｎａｔｕｒｅ．  ４８７（７４０６）：１９０−５、およびＺｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ３４（３）：３０３−１１に記載されている。
【０２９２】
一実施形態では、生物学的単位を結合するための少なくとも１つの手段は、抗Ｔｎ５抗体である。一実施形態では、生物学的単位を結合するための少なくとも１つの手段は、ストレプトアビジンであり、生物学的単位は、ビオチン化した抗Ｔｎ５抗体と接触する。
【０２９３】
一実施形態では、各バーコード単位は、核酸配列のプライマー、固有のバーコード、および／またはＰＣＲハンドルを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む。一実施形態では、核酸配列のプライマーは、少なくとも１つのＴｎ５アダプターに相補的な配列を有する。一実施形態では、核酸配列のプライマーは、配列５’−ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣ−３’（配列番号１）または５’−ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧ−３’（配列番号２）を含む、またはからなる。別の実施形態では、各バーコード単位は、ｏｌｉｇｏ−ｄＮプライマー（ヘキサヌクレオチドｄ（Ｎ６）またはオクタヌクレオチドｄ（Ｎ８）プライマーなど（式中Ｎは任意のヌクレオチド（すなわちＡ、Ｔ／Ｕ、Ｃ、またはＧ）を表す））、固有のバーコード、および／またはＰＣＲハンドルを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む。
【０２９４】
一実施形態では、各生物学的単位から核酸を放出するステップは、細胞および／または核の溶解、好ましくはイオン性界面活性剤および／またはプロテイナーゼＫを使用した細胞および／または核の溶解により、行われる。
【０２９５】
一実施形態では、各生物学的単位由来の核酸からＤＮＡライブラリーを合成するステップは、バーコード単位の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドの少なくとも１つの核酸配列のプライマーを用いて行われる。
【０２９６】
一実施形態では、本方法はさらに、イオン性界面活性剤および／またはプロテイナーゼＫを洗い出すステップを含む。
【０２９７】
一実施形態では、本方法はさらに、プロテイナーゼＫを不活性化するステップを含む。一実施形態では、プロテイナーゼＫの不活性化は、熱および／または化学的な阻害により行われる。
【０２９８】
一実施形態では、本方法はさらに、各生物学的単位由来の核酸の変性のステップを含む。核酸を変性させるための方法は、当業者によく知られており、限定するものではないが、アルカリ処理および／または熱を含む。
【０２９９】
一実施形態では、各生物学的単位由来の核酸の増幅は、ＷＧＡ（ｗｈｏｌｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）により行われる。一実施形態では、各生物学的単位由来の核酸の増幅は、バーコード単位の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドの少なくとも１つの核酸配列のプライマーを用いて、行われる。
【０３００】
一実施形態では、各生物学的単位から増幅された核酸は、核酸フラグメントを得るためにフラグメント化される。ＤＮＡをフラグメント化するための方法は、当該分野でよく知られており、限定するものではないが、Ｃｏｖａｒｉｓの超音波処理およびＤＮＡの酵素を用いた切断を含む。
【０３０１】
一実施形態では、核酸フラグメントは、ポリッシングされる。一実施形態では、核酸フラグメントは、Ａ鎖形成される。
【０３０２】
一実施形態では、アダプター、好ましくはＴｎ５アダプターが、核酸フラグメントに付加される。アダプターは、限定するものではないが、Ｔｎ５転位およびライゲーションを含む様々な方法を使用して、核酸フラグメントに付加され得る。
【０３０３】
一実施形態では、個別の生物学的単位のハプロタイプを解析するための方法は、ＣＴＰ−ｓｅｑ（ｃｏｎｔｉｇｕｉｔｙ−ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ  ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）を実施し得る。このような方法は、本明細書中参照により組み込まれている国際特許出願公開公報第２０１６／０６１５１７号に記載されている。
【０３０４】
一実施形態では、本方法は、好ましくはＴｎ５トランスポザーゼで、各生物学的単位由来の核酸をタグ処理するステップを含む。一実施形態では、各生物学的単位由来の核酸は、高分子量のＤＮＡ（ＨＭＷ−ＤＮＡ）である。一実施形態では、各生物学的単位由来のＨＭＷ−ＤＮＡをタグ処理するステップは、各生物学的単位（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）由来のＨＭＷ−ＤＮＡの連結性を保存する。
【０３０５】
一実施形態では、本方法は、各生物学的単位由来の核酸、好ましくは各生物学的単位由来のＨＭＷ−ＤＮＡを断片化する（disrupting contiguity）ステップを含む。断片化のための技術は、当業者によく知られており、限定するものではないが、好ましくはイオン性界面活性剤および／またはプロテイナーゼＫを使用することによる、各生物学的単位由来の核酸からのＴｎ５複合体の放出を含む。
【０３０６】
一実施形態では、本方法は、アダプター、好ましくはＴｎ５アダプターのギャップファイリングのステップを含む。
【０３０７】
一実施形態では、本方法は、タグ処理した、各生物学的単位由来の核酸の増幅のステップを含む。一実施形態では、タグ処理した、各生物学的単位由来の核酸の増幅は、バーコード単位の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドの少なくとも１つの核酸配列のプライマーを用いて、行われる。
【０３０８】
一実施形態では、本方法は、各バーコード単位の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドに、タグ処理した各生物学的単位由来の核酸をライゲートするステップを含む。
【０３０９】
一実施形態では、本方法は、タグ処理した核酸の増幅のステップを含む。核酸を増幅させるための技術は、当業者によく知られている。一実施形態では、タグ処理した核酸の増幅は、バーコード単位の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドの少なくとも１つの核酸配列のプライマーを用いて、行われる。
【０３１０】
一実施形態では、増幅ステップは、遊離する核酸配列のプライマー、すなわちバーコード単位に結合していない核酸配列のプライマーを使用して、増強され得る。
【０３１１】
また本発明は、個別の生物学的単位のエピゲノムを解析するための方法に関する。
【０３１２】
Ｔｎ５転位に基づいた単一細胞のヌクレオソーム配置の決定法が開発されており、「Ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  Ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ−Ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ  Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」（ＡＴＡＣ−ｓｅｑ）と呼ばれている（Ｂｕｅｎｒｏｓｔｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５．  Ｎａｔｕｒｅ．  ５２３（７５６１）：４８６−９０）。この方法では、第１のステップは、インタクトな細胞または単離した核で非イオン性界面活性剤を低いパーセンテージで使用することにより、分子を、ヌクレオソームフリーのＤＮＡへアクセスさせることができる。次に、このアクセス可能なＤＮＡを、Ｔｎ５転位を介してタグ処理する。これは、ＤＮＡをフラグメント化し、テンプレートに直接ユニバーサルなアダプターを付加する。次に、これらアダプターに相補的なプライマーを使用してＰＣＲを行った後、シーケンシングを行う。
【０３１３】
よって一実施形態では、個別の生物学的単位のエピゲノムを解析するための方法は、
ａ）複数の細胞の生物学的単位を複数のバーコード単位と接触させて、生物学的単位／バーコード単位の複合体を形成するステップであって、各バーコード単位が固有のバーコードを含み、前記バーコード単位が、前記生物学的単位への結合に関与する少なくとも１つの手段を含む、ステップと、
ｂ）前記生物学的単位／バーコード単位の複合体をハイドロゲル溶液と接触させるステップと、
ｃ）前記ハイドロゲル溶液を重合化して、ハイドロゲルマトリックスに前記生物学的単位／バーコード単位の複合体を埋め込むステップと、
ｄ）前記ハイドロゲルマトリックス中の各生物学的単位から非ヌクレオソーム結合型ＤＮＡを放出するステップと、
ｅ）前記ハイドロゲルマトリックス中の各生物学的単位に由来する非ヌクレオソーム結合型ＤＮＡにバーコードを付与するステップと、
ｆ）任意選択で、前記各生物学的単位由来の非ヌクレオソーム結合型ＤＮＡからＤＮＡライブラリーを合成するステップと、
ｇ）前記各生物学的単位由来の非ヌクレオソーム結合型ＤＮＡまたはＤＮＡライブラリーを増幅させるステップであって、前記各生物学的単位由来の非ヌクレオソーム結合型ＤＮＡまたはＤＮＡライブラリーの増幅が、前記固有のバーコードのクローンコピーを、各生物学的単位由来の増幅産物に組み込む、ステップと、
ｈ）前記増幅産物をシーケンシングするステップと
を含み得る。
【０３１４】
一実施形態では、各生物学的単位由来の非ヌクレオソーム結合型ＤＮＡまたはＤＮＡライブラリーの増幅は、非ヌクレオソーム開始部位から開始する。非ヌクレオソーム開始部位は、転位が起こる部位、すなわちＤＮＡがアクセス可能な部位である。任意選択で、非ヌクレオソーム開始部位は、ＤＮＡが、酵素によりフラグメント化され、ＤＮＡがライゲートされる部位である。
【０３１５】
一実施形態では、本発明に係る個別の生物学的単位のエピゲノムを解析するための方法は、当業者によく知られているさらなるステップを含む。このようなステップは、それら内容の全てが参照によって本明細書中に組み込まれている、国際特許出願公開公報第２０１４／１８９９５７号；Ｂｕｅｎｒｏｓｔｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５．  Ｎａｔｕｒｅ．  ５２３（７５６１）：４８６−９０；Ｂｕｅｎｒｏｓｔｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３．  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  １０（１２）：１２１３−８；およびＣｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１７．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  １５５１：２０７−２２１に記載されている。
【０３１６】
一実施形態では、各バーコード単位は、核酸配列のプライマー、固有のバーコード、および／またはＰＣＲハンドルを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む。一実施形態では、核酸配列のプライマーは、少なくとも１つのアダプター配列、好ましくは少なくとも１つのＩｌｌｕｍｉｎａアダプター配列に相補的な配列を有する。一実施形態では、核酸配列のプライマーは、少なくとも１つのＴｎ５アダプターに相補的な配列を有する。一実施形態では、核酸配列のプライマーは、配列５’−ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣ−３’（配列番号１）または５’−ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧ−３’（配列番号２）を含む、またはからなる。
【０３１７】
一実施形態では、各生物学的単位から非ヌクレオソーム結合型ＤＮＡを放出するステップは、細胞の溶解、好ましくは非イオン性界面活性剤および／またはプロテイナーゼＫを使用する細胞の溶解により、行われる。
【０３１８】
一実施形態では、各生物学的単位由来の非ヌクレオソーム結合型ＤＮＡからＤＮＡライブラリーを合成するステップは、バーコード単位の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドの少なくとも１つの核酸配列のプライマーを用いて、行われる。
【０３１９】
一実施形態では、本方法はさらに、非イオン性界面活性剤および／またはプロテイナーゼＫを洗い出すステップを含む。
【０３２０】
一実施形態では、本方法はさらに、プロテイナーゼＫを不活性化するステップを含む。一実施形態では、プロテイナーゼＫの不活性化は、熱および／または化学的な阻害により行われる。
【０３２１】
一実施形態では、非ヌクレオソーム結合型ＤＮＡは、タグ処理される。タグ処理するための技術は、当業者によく知られている。一実施形態では、非ヌクレオソーム結合型ＤＮＡのタグ処理は、Ｔｎ５転位、好ましくはＩｌｌｕｍｉｎａのアダプター配列を使用して行われる。
【０３２２】
一実施形態では、本方法は、各生物学的単位由来のタグ処理した非ヌクレオソーム結合型ＤＮＡを、各バーコード単位の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドにライゲートするステップを含む。
【０３２３】
一実施形態では、本方法は、各生物学的単位由来のタグ処理した非ヌクレオソーム結合型ＤＮＡの増幅のステップを含む。ＤＮＡを増幅させるための技術は、当業者によく知られている。
【０３２４】
一実施形態では、タグ処理した非ヌクレオソーム結合型ＤＮＡの増幅は、バーコード単位の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドの少なくとも１つの核酸配列のプライマーを用いて、行われる。一実施形態では、タグ処理した非ヌクレオソーム結合型ＤＮＡの増幅は、バーコード単位の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドの少なくとも１つの核酸配列のプライマーではない少なくとも１つの核酸配列のプライマーを用いて、行われる。
【０３２５】
一実施形態では、タグ処理した非ヌクレオソーム結合型ＤＮＡの増幅は、Ｔｎ５トランスポザーゼ由来のアダプター配列を、各生物学的単位由来の増幅産物に組み込む。
【０３２６】
一実施形態では、増幅ステップは、遊離する核酸配列のプライマー、すなわちバーコード単位に結合していない核酸配列のプライマーを使用して、増強され得る。
【０３２７】
また本発明は、キットに関する。一実施形態では、本キットは、
複数のバーコード単位と、
ハイドロゲル溶液および／またはハイドロゲル溶液を調製するためのハイドロゲルモノマーと、
生化学および分子生物学のアッセイのための試薬および溶液と、
使用説明書と
を含む。
【０３２８】
一実施形態では、各バーコード単位は、本明細書中上記に定義される生物学的単位への結合に関与する少なくとも１つの手段を含む。一実施形態では、各バーコード単位は、本明細書中上記に定義される少なくとも１つの核酸配列のプライマーを含む。一実施形態では、各バーコード単位は、本明細書中上記に定義される少なくとも１つの核酸のオリゴヌクレオチドを含む。
【０３２９】
一実施形態では、本キットはさらに、生物学的単位および／またはバーコード単位の結合のための少なくとも１つの担体を含む。
【０３３０】
一実施形態では、本キットは、
あらかじめ結合した複数のバーコード単位を含む担体と、
ハイドロゲル溶液および／またはハイドロゲル溶液を調製するためのハイドロゲルモノマーと、
生化学および分子生物学のアッセイのための試薬および溶液と、
使用説明書と
を含む。
【０３３１】
一実施形態では、各バーコード単位は、本明細書中上記に定義される生物学的単位への結合に関与する少なくとも１つの手段を含む。一実施形態では、各バーコード単位は、本明細書中上記に定義される少なくとも１つの核酸配列のプライマーを含む。一実施形態では、各バーコード単位は、本明細書中上記に定義される少なくとも１つの核酸のオリゴヌクレオチドを含む。
【図面の簡単な説明】
【０３３２】
【図１】図１は、ハイドロゲル中の生物学的単位の捕捉およびバーコード付与を表す図である。以下の記号が使用される：（Ａ）バーコード単位；（Ｂ）生物学的単位；（Ｂ＊）バーコード付与した生物学的単位；（Ｃ）生物学的単位を結合するための手段；（ＨＳ）ハイドロゲル（ゾル状態）；（ＨＧ）ハイドロゲルマトリックス（ゲル状態のハイドロゲル）；（ＨＧ／ＨＳ）固体またはゲルの状態のハイドロゲル；（１）生物学的単位およびバーコード単位の結合；（２）ハイドロゲル溶液との接触；（３）ハイドロゲルの重合化；（４）生物学的単位のバーコード付与；（５）プライマー誘導型の伸長、ライゲーション、増幅、フラグメント化、アダプター付与(Adaptering)；（６）次世代シーケンシング。
【図２】図２は、単一のバーコード単位への複数の生物学的単位の結合を表す図である。以下の記号が使用される：（Ａ１、Ａ２）バーコード単位；（Ｂ１、Ｂ２）生物学的単位；（Ｃ）生物学的単位を結合するための手段；（Ｙ）バイアスのかかったデータ；（１）生物学的単位およびバーコード単位の結合；（２−６）図１のステップ２〜６。
【図３】図３は、単一の生物学的単位への複数のバーコード単位の結合を表す図である。以下の記号が使用される：（Ａ１、Ａ２）バーコード単位；（Ｂ１、Ｂ２）生物学的単位；（Ｃ）生物学的単位を結合するための手段；（１）生物学的単位およびバーコード単位の結合；（２−６）図１のステップ２〜６。
【図４】図４は、バーコード単位への結合、捕捉、およびバーコード付与の前の、固体の担体への生物学的単位の結合を表す図である。バーコード単位は、生物学的単位よりも著しく大きく、よって、単一の生物学的単位への複数のバーコード単位の結合を妨げる。以下の記号が使用される：（Ａ１、Ａ２）バーコード単位；（Ｂ１、Ｂ２）生物学的単位；（Ｃ）生物学的単位を結合するための手段；（Ｓ）固体の担体；（１１）固体の担体への生物学的単位の結合；（１２）溶液へのバーコード単位の添加；（１）生物学的単位およびバーコード単位の結合；（２−６）図１のステップ２〜６。
【図５】図５は、生物学的単位への結合、捕捉、およびバーコード付与の前の、固体の担体へのバーコード単位の結合を表す図である。生物学的単位は、バーコード単位よりも著しく大きいため、単一のバーコード単位への複数の生物学的単位の結合を妨げる。以下の記号が使用される：（Ａ１、Ａ２）バーコード単位；（Ｂ１、Ｂ２）生物学的単位；（Ｃ）生物学的単位を結合するための手段；（Ｄ）バーコード単位を結合するための手段；（Ｓ）固体の担体；（２１）固体の担体へのバーコード単位の結合；（２２）溶液への生物学的単位の添加；（１）生物学的単位およびバーコード単位の結合；（２−６）図１のステップ２〜６。
【図６】図６は、バーコード単位への結合、捕捉、およびバーコード付与の前の、固体の担体への生物学的単位の結合を表す図である。バーコード単位および生物学的単位は、おおよそ同じ大きさである。バーコード単位は、単一の生物学的単位への複数のバーコード単位の結合を防止するために、限界希釈されている。以下の用語が使用される：（Ａ）バーコード単位；（Ｂ１、Ｂ２）生物学的単位；（Ｃ）生物学的単位を結合するための手段；（Ｓ）固体の担体；（１１）固体の担体への生物学的単位の結合；（１２＊）限界濃度での溶液へのバーコード単位の添加；（１）生物学的単位およびバーコード単位の結合；（２−６）図１のステップ２〜６。
【図７】図７は、生物学的単位への結合、捕捉、およびバーコード付与の前の、固体の担体へのバーコード単位の結合を表す図である。生物学的単位およびバーコード単位は、おおよそ同じ大きさである。生物学的単位は、単一のバーコード単位への複数の生物学的単位の結合を防止するために、限界希釈されている。以下の記号が使用される：（Ａ１、Ａ２）バーコード単位；（Ｂ）生物学的単位；（Ｃ）生物学的単位を結合するための手段；（Ｄ）バーコード単位を結合するための手段；（Ｓ）固体の担体；（２１）固体の担体へのバーコード単位の結合；（２２＊）限界濃度での溶液への生物学的単位の添加；（１）生物学的単位およびバーコード単位の結合；（２−６）図１のステップ２〜６。
【図８】図８は、自身がポリ−ｄＴ核酸配列のプライマー、固有のバーコード、およびＰＣＲハンドルを含む、オリゴヌクレオチドを含むバーコード単位を使用する、見込みのある単一細胞のＲＮＡｓｅｑのトランスクリプトームのワークフローを表す図である。複数のバーコードのオリゴヌクレオチドが、第１のステップから存在しているが、ここでは簡便性のため、ステップ８４の後では（ａ）として、１つのみが示されている。ステップ１−３（１−３）は、図１のように行われてもよく、または固体の担体を含んでもよく、よって図４〜７の追加的なステップを含んでもよい。以下の記号が使用される：（Ａ）バーコード単位；（Ｂ）生物学的単位；（ＨＧ）ハイドロゲルマトリックス（ゲル状態のハイドロゲル）；（ＨＧ／ＨＳ）固体またはゲルの状態のハイドロゲル；（Ｒ）ポリ（Ａ）ｍＲＮＡ；（ａ）バーコード；（ＰＣＲ）ＰＣＲハンドル；（Ｔｎ）ポリ（Ｔ）プライマー；（ＤＮＡ１）第１の鎖のｃＤＮＡ；（ＤＮＡ２）第２の鎖のｃＤＮＡ；（８３＊）非イオン性界面活性剤の使用による細胞溶解：（８４）バーコード付与、すなわちバーコードオリゴヌクレオチドのオリゴｄ（Ｔ）プライマーでのポリ（Ａ）ｍＲＮＡのプライミング；（８５）第２の鎖のｃＤＮＡ合成（任意選択でテンプレートのスイッチングおよび増幅を介する）；（８６）フラグメント化、アダプター付与、増幅、次世代シーケンシング。
【図９】図９は、自身が相補的なＴｎ５アダプター核酸配列のプライマー、固有のバーコード、およびＰＣＲハンドルを含む、オリゴヌクレオチドを含むバーコード単位を使用した、見込みのあるフェーズ化のワークフローを表す図である。複数のバーコードのオリゴヌクレオチドが、第１のステップから存在しているが、ここでは簡便性のため、ステップ９４の後では、１つのみが示されている。図５および図７などのバーコード単位または図４〜６などのトランスポザーゼの、固体の担体への結合が、可能である。以下の記号が使用される：（Ａ）バーコード単位；（ＣＰＴ）連結性が保存された転位ＤＮＡ；（Ｔｎ５）Ｔｎ５トランスポザーゼ；（Ｔｎ５Ｓ）Ｔｎ５アダプター配列；（ａ）バーコード；（ＰＣＲ）ＰＣＲハンドル；（Ｔｎ５Ｐ）Ｔｎ５アダプターのプライマー；（ＨＳ）ハイドロゲル（ゾル状態）；（ＨＧ）ハイドロゲルマトリックス（ゲル状態のハイドロゲル）；（ＨＧ／ＨＳ）固体またはゲルの状態のハイドロゲル；（９１）バーコード単位へのトランスポザーゼの結合；（２）ハイドロゲル溶液との接触；（３）ハイドロゲルの重合化；（９４）トランスポザーゼの放出；（９５）ライゲーション、ギャップファイリング；（９６）増幅、次世代シーケンシング。
【実施例】
【０３３３】
実施例
本発明を、以下の実施例により示す。しかしながら、本発明はこれら実施例の特定の詳細に限定されないことを理解されたい。
【０３３４】
実施例１：ハイドロゲル中の個別の生物学的単位の捕捉およびバーコード付与
本発明は、個別の生物学的単位（すなわち細胞もしくは細胞群、ウイルス、オルガネラ、高分子複合体、または生体高分子）の捕捉に関する。
【０３３５】
本発明およびその応用は、図１に記載される連続したステップの実施に基づくものである。
【０３３６】
第１のステップでは、複数の生物学的単位／バーコード単位の複合体が形成され、ここで各複合体は、単一のバーコード単位および単一の生物学的単位を含んでいる（図１のステップ１）。生物学的単位／バーコード単位の複合体は、バーコード単位上への生物学的単位の結合および／または固定化により、形成され得る。よってバーコード単位はその表面に、生物学的単位と特異的または非特異的に結合するための手段を担持していなければならない。この手段として、タンパク質もしくはそのフラグメント、ペプチド、抗体もしくはそのフラグメント、核酸、炭水化物、ビタミンもしくはその誘導体、補酵素もしくはその誘導体、受容体リガンドもしくはその誘導体、および／または疎水基が挙げられる。同時に、生物学的単位は、バーコード単位の手段に結合する、天然であるかまたはそうではない、相補的な手段を担持していなければならない。たとえば、生物学的単位を結合するための手段は、生物学的単位の表面に（天然または人工的に）発現または存在する分子を対象とする抗体であり得る。別の選択肢は、生物学的単位の表面に発現または存在する分子を対象とするビオチン化抗体の使用、およびその後の、ストレプトアビジンでコーティングされたバーコード単位に対するビオチン化抗体を担持する生物学的単位の結合であり得る。
【０３３７】
生物学的単位／バーコード単位の複合体が形成された後、これらを、ハイドロゲル溶液と接触させ、ハイドロゲル溶液の重合後に、生物学的単位／バーコード単位の複合体が捕捉される（図１のステップ２〜３）。
【０３３８】
次に、生化学および分子生物学のアッセイを、ハイドロゲルをいずれかの必要な試薬および／または溶液と接触させることにより、ハイドロゲルマトリックスにおいて直接行うことができる。
【０３３９】
たとえば、適切なハイドロゲル溶液は、アルギン酸塩であり得る。この微細な粒径は、カルシウムを用いた重合による非常に小さな穴の形成を可能にすることにより、拡散のリスクを全く伴わずに生物学的単位／バーコード単位の複合体を捕捉しながら、試薬および／または溶液のようなこれよりも小さな成分の拡散を可能にする。
【０３４０】
通常、生物学的単位が細胞、細胞群、核、またはオルガネラである場合、第１のステップは、その核酸含有物を放出するための生物学的単位の溶解を含む。いずれの界面活性剤のレベルも、ハイドロゲルのプラットフォームにより支援されており、溶解が困難な生物学的単位を溶解することをも可能にする。
【０３４１】
次に、放出された核酸に、バーコード単位の表面にコーティングされたオリゴヌクレオチドに対するプライミングを介して、バーコードが付与され得る（図１のステップ４）。通常、各バーコード単位は、少なくとも１つのプライミング部位（核酸配列のプライマー）およびバーコード配列から構成されている、オリゴヌクレオチドのクローンコピーを含む。１つの個別の生物学的単位から抽出されるかまたはこれに由来する核酸の供給源または起源の同定を可能にするために、バーコード配列は、常に、所定のバーコード単位の全てのオリゴヌクレオチドで同一であるべきである。
【０３４２】
バーコード付与（すなわちバーコード単位の核酸配列のプライマーに対する生物学的単位の核酸のプライミング）が達成されると、従来の生化学および分子生物学のアッセイを、依然としてハイドロゲルマトリックスに取り込まれた状態またはハイドロゲルマトリックスが溶解した後の溶液中のいずれかで、バーコード付与された核酸で行うことができる。これらは、限定するものではなく、必ずしもこの順序ではないが、プライマー誘導型の伸長、ライゲーション、増幅、フラグメント化、アダプター配列の付加、次世代シーケンシングなどを含む（図１のステップ５〜６）。たとえば、ハイドロゲルとしてアルギン酸塩を使用する場合、カルシウムをハイドロゲルから洗いだして脱重合させることができる。いずれかの生化学および分子生物学のアッセイの前、特にプライマー誘導型の伸長の前に、プライミングされた、すなわちバーコード付与された核酸の安定化を、ナトリウムなどの他の陽イオンを使用して達成することができる。
【０３４３】
本発明の方法を実施する際の重要なステップは、単一の生物学的単位を単一のバーコード単位に結合させて１：１の複合体を形成することである。図２に示されるような、単一のバーコード単位への複数の生物学的単位の結合は、その後回収されるデータ、特に単一の細胞の次世代シーケンシングデータをゆがめる。配列解析後に、「バーコード１」を有する配列は、２つの個別の生物学的単位から集められているため、バイアスがかかっているかまたはエラーを含んでいる。
【０３４４】
同様に、単一の生物学的単位への複数のバーコード単位の結合は、単一の細胞の次世代シーケンシングデータをゆがめる（図３）。「生物学的単位１」（Ｂ１）から集められた配列データは、「バーコード１」および「バーコード２」（Ａ１およびＡ２）により２回表される。
【０３４５】
いくつかの方法は、非化学両論的な生物学的単位／バーコード単位の複合体の形成の回避を支援することができる。
【０３４６】
図４は、上記生物学的単位を結合するための手段でコーティングされた担体表面への、目的の生物学的単位の固定化を示す（ステップ１１）。担体表面へ固定されると、生物学的単位は、バーコード単位（ステップ１２）、好ましくは、妨害を作製し単一の生物学的単位上に複数のバーコード単位の結合を防止するために生物学的単位と比較して大きな大きさであるバーコード単位と、接触し得る（ステップ１）。よって、生物学的単位あたり１つのバーコード単位のみが結合されるため、その後の次世代シーケンシングデータを、単一の生物学的単位において解析することが可能である。
【０３４７】
このような構成は、担体、たとえば、ビオチンなどの生物学的単位を結合するための手段でコーティングされた微量遠心機のチューブを使用して、容易に実施することができる。細胞などの生物学的単位は、ストレプトアビジンが結合した抗体と接触され、次に、結合を可能にするためにチューブに入れられる。過剰な細胞は、除去される。次に、ビーズなどのビオチンでコーティングされたバーコード単位が、細胞への結合を可能にするためにチューブに入れられる。過剰なビーズは、除去される。次に、アルギン酸塩を重合化させるためのカルシウムイオンとまとめられたアルギン酸塩ナトリウムなどのハイドロゲル溶液が、チューブに注がれる。次に捕捉された細胞が、たとえばチューブ上部への界面活性剤の添加などにより、処理され得る。毛細管現象により、界面活性剤は捕捉した細胞に達し、細胞膜を溶解し、細胞の核酸含有物を放出する。アルギン酸塩の孔径は、核酸の拡散を回避しつつ、それよりも小さな反応物および基質の拡散を可能にするように十分に小さい。バーコード付与は、個別の細胞由来の核酸が放出され、隣接するバーコードのビーズの核酸配列のバーコードに結合する際に、起こる。核酸に適切にバーコードが付与された後に、サンプルを洗い出し、カルシウムイオンを除去することができる。アルギン酸塩のハイドロゲルは、溶解し、さらなるステップを、チューブの溶液中で直接処理することができる。
【０３４８】
あるいは、バーコード単位は、上記バーコード単位を結合するための手段でコーティングされた担体表面に結合させることができる。担体に結合されると、バーコード単位は、生物学的単位、好ましくは妨害を作製し単一のバーコード単位上への複数の生物学的単位の結合を防止するために、バーコード単位と比較して大きな大きさである生物学的単位と接触し得る（図５）。
【０３４９】
このような構成は同様に、担体（ハイドロゲルの薄層でコーティングされており、重合後に担体全体にわたってバーコード単位を固定する、微量遠心機のチューブなど）を使用して実施することができる。次に、細胞などの生物学的単位を、バーコード単位への結合を可能にするためにチューブに入れる（ただし、バーコード単位を固定化するハイドロゲルの層がバーコード単位の最小の寸法よりも薄い場合、すなわちバーコード単位の少なくとも一部が接触する生物学的単位にアクセス可能なままである場合）。過剰な細胞は、除去される。次に、ハイドロゲル溶液をチューブに注ぎ、重合させる。次に、捕捉した細胞が、本明細書中上述されるように処理され得る。核酸に適切にバーコード付与がなされた後に、両方のハイドロゲル（すなわちチューブをコーティングした薄層および生物学的単位を捕捉したハイドロゲルマトリックス）を溶解することができ、さらなるステップを、チューブの溶液中で直接処理することができる。
【０３５０】
非化学量論的な生物学的単位／バーコード単位の複合体の形成を回避するための別の戦略は、目的の生物学的単位（図６）またはバーコード単位（図７）が、それぞれ限界濃度のバーコード単位または生物学的単位と、上述のように結合および／または固定される担体の使用である。好ましくは、遊離する単位（それぞれバーコード単位または生物学的単位）の濃度は、担体に結合した単位（それぞれ生物学的単位またはバーコード単位）の濃度よりも低い。よってこのことは、生物学的単位あたり最大１のバーコード単位の結合およびその逆を確保し、その後の次世代シーケンシングデータを単一の生物学的単位において解析することを可能にする。一部の生物学的単位（図６のステップ１）またはバーコード単位（図７のステップ１）は、それぞれバーコード単位または生物学的単位と結合せず、よって、いずれのデータをも生成しない。
【０３５１】
実施例２：単一細胞のトランスクリプトームのプロファイリング
単一細胞のトランスクリプトームのプロファイリングは、本発明の方法を使用して行うことができる多くの生化学および分子生物学のアッセイのうちの１つである（図８）。
【０３５２】
実施例１に記載されるようにハイドロゲル溶液中に生物学的単位／バーコード単位の複合体を形成（図１のステップ１〜３）した後；任意選択で図４〜７のいずれかの追加的なステップ（１１および１２もしくは１２＊、または２１および２２もしくは２２＊）の後に、ハイドロゲルを重合化させ、よって、生物学的単位／バーコード単位の複合体を捕捉する（図８の１〜３）。
【０３５３】
最も一般的には、生物学的単位は、たとえば哺乳類細胞などの細胞、または単一細胞のトランスクリプトームのプロファイリングに適切な他のいずれかの細胞である。単一細胞のトランスクリプトームのプロファイリングは、単一の細胞のｍＲＮＡ含有物の増幅およびそのシーケンシングに依存する。よって第１のステップは、ハイドロゲル中の細胞を直接溶解することにより、細胞のｍＲＮＡ含有物を放出することである。これを行うために、細胞溶解のための非イオン性界面活性剤または他のいずれかの適切な試薬を、ハイドロゲルマトリックス上で直接使用することができる。拡散により、この試薬は、生物学的単位にまで達し、これらを溶解することができる（図８のステップ８３＊）。
【０３５４】
放出されたｍＲＮＡは、局所的な環境において、バーコード単位により担持されるオリゴヌクレオチドに結合する。これらオリゴヌクレオチドは、各バーコード単位に関する複数のクローンコピーに存在し、各バーコード単位で配列に関して固有である。これらは、ＰＣＲハンドル、固有のバーコード配列、および核酸配列のプライマーを含む。
【０３５５】
哺乳類のｍＲＮＡは、天然の３’ポリ（Ａ）配列を有し、よって、ポリ（Ｔ）配列を含む核酸配列のプライマーに対しプライミングすることができる（図８のステップ８４）。プライミング（すなわちバーコード付与）の後に、以下の分子生物学のステップを、ハイドロゲルマトリックスまたは溶液のいずれかにおいて行うことができる。通常、第１の鎖のｃＤＮＡ合成は、逆転写酵素を使用して、バーコード単位オリゴヌクレオチドの３’で起こる。
【０３５６】
次に、第２の鎖のｃＤＮＡ合成が、任意選択でテンプレートのスイッチングおよび増幅を介して起こり得る（図８のステップ８５）。次のステップは、たとえばｃＤＮＡライブラリーのフラグメント化、アダプター付与、および増幅を含む。
【０３５７】
バーコード付与、増幅、およびアダプター付与が行われた産物は、最後に、次世代シーケンシングによりシーケンスすることができる（図８のステップ８６）。
【０３５８】
実施例３：フェーズ化
フェーズ化は、本発明の方法を使用して行うことができる別の分子生物学アッセイである（図９）。
【０３５９】
第１のステップでは、高分子量のＤＮＡ（すなわち生物学的単位）とＴｎ５トランスポザーゼを混合することにより、溶液中でトランスポソームが構築される。場合によりタグ処理とも呼ばれるこのステップは、連結性が保存された転位ＤＮＡ（ＣＰＴ−ＤＮＡ）フラグメントを作製し、次に、第２のステップが行われ、ここでトランスポソームを、生物学的単位を結合するための手段を含むバーコード単位と接触させる（図９のステップ９１）。好適には、この手段は、Ｔｎ５トランスポザーゼと結合する。
【０３６０】
次に、ハイドロゲル溶液を、ＣＰＴ−ＤＮＡ／バーコード単位の複合体と接触させ、重合させる（図９のステップ２〜３）。ハイドロゲルマトリックス中に捕捉した後、Ｔｎ５トランスポザーゼが、イオン性界面活性剤および／またはプロテイナーゼＫを使用して放出され、よって、断片化が生じ、Ｔｎ５アダプター配列を含むＤＮＡフラグメントが回収される（図９のステップ９４）。
【０３６１】
Ｔｎ５アダプター配列を含む放出したＤＮＡフラグメントは、局所的な環境において、バーコード単位により担持され相補的なＴｎ５アダプター配列（たとえば配列番号１または配列番号２など）を含む核酸配列のプライマーに対しプライミングすることができる。これらオリゴヌクレオチドは、各バーコード単位に関する複数のクローンコピーに存在し、各バーコード単位で配列に関して固有である。これらは、ＰＣＲハンドル、固有のバーコード配列、およびＴｎ５アダプター配列に相補的な核酸配列のプライマー（Ｔｎ５アダプターのプライマー、Ｔｎ５Ｐ）を含む。プライミング（すなわちバーコード付与）の後、以下の分子生物学のステップを、ハイドロゲルマトリックスまたはハイドロゲルの溶解後の溶液中のいずれかで行うことができる。
【０３６２】
ライゲーション、ギャップファイリング、および増幅（図９のステップ９５）は、ハイドロゲルマトリックスまたは溶液のいずれかにおいて起こり得る。
【０３６３】
バーコード付与、増幅、およびアダプター付与が行われた産物は、最後に、次世代シーケンシングによりシーケンスすることができる（図９のステップ９６）。
【０３６４】
他のバリエーションの分子生物学は、本明細書中参照により組み込まれている国際公開第２０１６／０６１５１７号（たとえば図１５〜２１中）で見出すことができる。
【図１】
2020518292.tif 000002
【図２】
2020518292.tif 000003
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年1月9日(2020.1.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2020518292000001.app
【国際調査報告】
2020518292.tif 000011
2020518292.tif 000012
2020518292.tif 000013