(57)【要約】  本発明は、アミノ酸配列ＹＥＫＬＬＤＴＥＩもしくはその機能的変異体を含むペプチド、または前記ペプチドを含む医薬組成物の、疼痛（特に侵害受容性疼痛）を予防、緩和または治療する医薬の製造における使用、および疼痛の予防、緩和または治療方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列ＹＥＫＬＬＤＴＥＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）もしくはその機能的変異体を含むペプチド、または前記ペプチドを含む医薬組成物の、対象の疼痛を予防、緩和または治療する医薬の製造における使用。
【請求項２】
アミノ酸配列ＹＥＫＬＬＤＴＥＩもしくはその機能的変異体を含むペプチド、または前記ペプチドを含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、疼痛の予防、緩和または治療方法。
【請求項３】
前記機能的変異体は、ＹＥＫＬＬＤＴＥＩにおけるＬＤＴＥＩセグメントの１つまたは複数の保存的置換によって生成された変異体であり、好ましくは、前記保存的置換はＤとＥとの間の置換、ＬとＶとＩとの間の置換、およびＴとＳとの間の置換からなる群より選ばれる、請求項１に記載の使用または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記機能的変異体は、ＹＥＫＬＬＤＴＥＩにおけるＬＤＴＥＩセグメントを、ＬＤＴＥＬ、ＬＤＴＥＶ、ＬＤＴＤＩ、ＬＤＴＤＬ、ＬＤＴＤＶ、ＬＤＳＥＩ、ＬＤＳＥＬ、ＬＤＳＥＶ、ＬＤＳＤＩ、ＬＤＳＤＬ、ＬＤＳＤＶ、ＬＥＴＥＩ、ＬＥＴＥＬ、ＬＥＴＥＶ、ＬＥＴＤＩ、ＬＥＴＤＬ、ＬＥＴＤＶ、ＶＤＴＥＩ、ＶＤＴＥＬ、ＶＤＴＥＶ、ＶＤＴＤＩ、ＶＤＴＤＬ、ＶＤＴＤＶ、ＩＤＴＥＩ、ＩＤＴＥＬ、ＩＤＴＥＶ、ＩＤＴＤＩ、ＩＤＴＤＬ、ＩＤＴＤＶ、ＩＥＴＥＩ、ＩＥＴＥＬ、ＩＥＴＥＶ、ＩＥＴＤＩ、ＩＥＴＤＬ、およびＩＥＴＤＶからなる群より選ばれる配列のいずれかで置換することによって生成される変異体である、請求項３に記載の使用または方法。
【請求項５】
前記ペプチドは、アミノ酸配列ＹＥＫＬＬＤＴＥＩもしくはその機能的変異体、および内在化ペプチドを含むキメラペプチドであり、好ましくは、前記内在化ペプチドは、アミノ酸配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を含む、前記請求項のいずれか１項に記載の使用または方法。
【請求項６】
前記キメラペプチドは、アミノ酸配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＹＥＫＬＬＤＴＥＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）を含む、請求項５に記載の使用または方法。
【請求項７】
前記疼痛は侵害受容性疼痛であり、好ましくは、前記疼痛は外部ストレスまたは刺激による疼痛であり、より好ましくは、前記外部ストレスまたは刺激は熱刺激もしくはタッチである、前記請求項のいずれか１項に記載の使用または方法。
【請求項８】
前記侵害受容性疼痛は体性痛および／または内臓痛である、請求項７に記載の使用または方法。
【請求項９】
前記体性痛は火傷、切り傷、挫傷、肩痛、四肢痛、腰痛、関節炎、腱炎、筋膜炎を含み、および／または前記内臓痛は胃痛、虫垂炎、膵炎、消化性潰瘍を含む、請求項８に記載の使用または方法。
【請求項１０】
前記対象は神経損傷していない対象であり、好ましくは、前記対象は健常な対象である、前記請求項のいずれか１項に記載の使用または方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の参照）
本願は、２０１６年１０月１０日に提出した、出願番号が２０１６１０８８５２９５．４である中国特許出願に基づく優先権を主張し、当該特許文献の内容の全てを引用することにより本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、医療の分野に関し、具体的には、疼痛の予防、緩和または治療における神経興奮性損傷関連ポリペプチドの使用を提供する。
【背景技術】
【０００３】
疼痛は、人々が一生の間にしばしば遭遇する不快感である。それは、体躯が脅かされていることを警告しており、生命に欠かせない特別な保護機能である。一方、それは、様々な病気の最も一般的な症状であり、現在の人々の健常を悩ませている最も深刻な問題の１つである。疼痛は機構が非常に複雑な神経活動である。疼痛研究は、現在の神経科学研究における重要な課題の１つとなっている。
【０００４】
既存の研究によれば、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（Ｎ−ｍｅｔｈｙ−Ｄ−ｓｐａｒｔａｔｅ：ＮＭＤＡ）受容体のＮＲ２Ｂサブユニットは、脊髄ニューロンの興奮性シナプス伝達、中枢感作および慢性疼痛などの生理学的および病理学的プロセスに関与していることを示している。後根神経節（ｄｏｒｓａｌ  ｒｏｏｔ  ｇａｎｇｌｉｏｎ：ＤＲＧ）のニューロンは、周縁突起（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｐｒｏｃｅｓｓ）および中心突起（ｃｅｎｔｒａｌ  ｐｒｏｃｅｓｓ）を有し、周縁突起末端は傷害性刺激を直接受け、それらはＡδ線維およびＣ線維を介して脊髄後角表層の中心突起末端に伝達され、グルタミン酸、アスパラギン酸、ＳＰ、およびＣＧＲＰなどの神経伝達物質を放出し、グルタミン酸をさらにＮＭＤＡ受容体およびＡＭＰＡ受容体に結合させる。Ｍｇ２＋がＮＭＤＡ受容体イオンチャネルを遮断したので、ＡＭＰＡ受容体のみが活性化され、前記活性化されたＡＭＰＡ受容体はＮａ＋の細胞への流入を活性化し続け、膜の脱分極をもたらし、Ｍｇ２＋によるチャネルの遮断を排除し、Ｃａ２＋透過性を高め、そして大量に細胞に入るＣａ２＋はＰＫＣを活性化し、ＰＫＣはＮＭＤＡ受容体をリン酸化し、異なるＮＭＤＡ受容体サブタイプの発現比を変化させ、同時にＮＭＤＡ受容体のサイレントシナプスを機能性シナプスに変換する。ＮＭＤＡ関連ＮＯＳはＣａ２＋濃度の影響を受け、ＮＯＳはＰＳＤ−９５およびＰＳＤ−９３のＰＤＺ部位で酵素反応を起こし、ＮＯを生成してグアニル酸シクラーゼを活性化させ、そしてグアニル酸を合成し、そしてＰＳＤカルモジュリン依存性リン酸化を増強し、シナプス伝達物質の放出を調節し、神経細胞の興奮性を変える。そのようなフィードバック増幅効果は、さらに侵害性情報を中枢に伝達し、痛覚敏感および疼痛信号増幅を引き起こす。
【０００５】
上記のプロセスでは、Ｃａ２＋濃度およびＮＲ２ＢとＰＳＤ−９５との相互作用が疼痛信号を増幅する重要な条件であることがわかり、したがって、これらの条件の１つを制限しても疼痛信号を低減する可能性がある。したがって、ＰＳＤ９５の阻害剤の研究開発は、疼痛の治療のためにも重要な意味を持っている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】中国特許出願番号２０１６１０８８５２９５．４
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
第１の態様によれば、本発明は、アミノ酸配列ＹＥＫＬＬＤＴＥＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）もしくはその機能的変異体を含むペプチド、または前記ペプチドを含む医薬組成物の、対象（患者）の疼痛を予防、緩和または治療する医薬の製造における使用を提供する。
【０００８】
第２の態様によれば、本発明は、アミノ酸配列ＹＥＫＬＬＤＴＥＩもしくはその機能的変異体を含むペプチド、または前記ペプチドを含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、疼痛の予防、緩和または治療方法を提供する。
【０００９】
第１の態様に係る使用または第２の態様に係る方法のいくつかの実施形態において、機能的変異体は、ＹＥＫＬＬＤＴＥＩにおけるＬＤＴＥＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）セグメントに１つまたは複数の所で保存的置換によって生成された変異体である。
【００１０】
いくつかの実施形態において、保存的な置換は、ＤとＥの間、Ｌ、ＶとＩの間、およびＴとＳの間の置換からなる群から選ばれる。
【００１１】
いくつかの実施形態において、機能的変異体は、ＹＥＫＬＬＤＴＥＩにおけるＬＤＴＥＩセグメントがＬＤＴＥＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、ＬＤＴＥＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、ＬＤＴＤＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、ＬＤＴＤＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）、ＬＤＴＤＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）、ＬＤＳＥＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、ＬＤＳＥＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）、ＬＤＳＥＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）、ＬＤＳＤＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）、ＬＤＳＤＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、ＬＤＳＤＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）、ＬＥＴＥＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、ＬＥＴＥＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）、ＬＥＴＥＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）、ＬＥＴＤＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）、ＬＥＴＤＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）、ＬＥＴＤＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）、ＶＤＴＥＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）、ＶＤＴＥＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）、ＶＤＴＥＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）、ＶＤＴＤＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）、ＶＤＴＤＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）、ＶＤＴＤＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）、ＩＤＴＥＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）、ＩＤＴＥＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）、ＩＤＴＥＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）、ＩＤＴＤＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１）、ＩＤＴＤＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２）、ＩＤＴＤＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）、ＩＥＴＥＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）、ＩＥＴＥＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５）、ＩＥＴＥＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）、ＩＥＴＤＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７）、ＩＥＴＤＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）、およびＩＥＴＤＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）からなる群より選ばれる配列のいずれかで置換することによって生成される変異体である。
【００１２】
第１の態様に係る使用または第２の態様に係る方法のいくつかの実施形態において、前記ペプチドは、アミノ酸配列ＹＥＫＬＬＤＴＥＩもしくはその機能的変異体、および内在化ペプチドを含むキメラペプチドである。
【００１３】
いくつかの実施形態において、内在化ペプチドは、アミノ酸配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を含む。
【００１４】
いくつかの実施形態において、キメラペプチドは、アミノ酸配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＹＥＫＬＬＤＴＥＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）を含む。
【００１５】
第１の態様に係る使用または第２の態様に係る方法のいくつかの実施形態において、疼痛は侵害受容性疼痛である。
【００１６】
いくつかの実施形態において、疼痛は外部ストレスまたは刺激による疼痛である。
いくつかの実施形態において、外部ストレスまたは刺激は熱刺激もしくはタッチである。
いくつかの実施形態において、前記侵害受容性疼痛は体性痛および／または内臓痛である。
いくつかの実施形態において、体性痛は火傷、切り傷、挫傷、肩痛、四肢痛、腰痛、関節炎、腱炎、筋膜炎を含む。
いくつかの実施形態において、内臓痛は胃痛、虫垂炎、膵炎、消化性潰瘍を含む。
いくつかの実施形態において、前記の使用および方法に係る前記対象は神経損傷していない対象である。
いくつかの実施形態において、前記対象は健常な対象である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】プルダウン実験でＰ５とＰＤＺ１／２ドメインとの相互作用を検出することを示している図である。ＭはＤＮＡ分子量マーカーを表し、レーン１はＨｉｓ＋ＰＤＺ１／２＋Ｐ５であり、レーン２は単独のＰ５であり、レーン３はＨｉｓ＋Ｐ５であり、レーン４はＨｉｓ＋ＰＤＺ１／２である。レーン１に示す溶出バンドには、Ｐ５およびＰＤＺ１／２の両方を含み、Ｐ５がＰＤＺ１／２ドメインとを結合できることが裏付けられる。
【図２】熱板実験において、ポリペプチドＰ５、陰性対照（生理食塩水）、および陽性対照（イブプロフェン）でラットを処理することによって得られた結果を示す図である。
【図３】プリック実験（プリックテスト）において、ポリペプチドＰ５、陰性対照（生理食塩水）、および陽性対照（イブプロフェン）でラットを処理した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
〔発明の詳細な説明〕
本発明者らは、疼痛のメカニズムを研究することにより疼痛治療のための複数の標的を推定し、実験を通して疼痛を予防、緩和または治療することができるペプチドを設計およびスクリーニングし、そして最終的に理想的な特性を有するペプチドを選択した。本発明で得られたペプチドは、高効率および低毒性という利点を有する。
【００１９】
特に断らない限り、本明細書に記載された全ての用語は、一般的に、当業者によって理解される意味を有する。
【００２０】
用語「キメラペプチド」は、自然に互いに結合していない２つのペプチド成分を有するペプチドを意味する。前記２つのペプチド成分は、融合タンパク質として、または化学結合によって互いに結合されてもよい。
【００２１】
用語「機能的変異体」は、母体（親）が同一または類似の生物学的機能および特性を有する変異体を指す。非限定的な例として、「機能的変異体」は、母体における１つまたは複数の所で保存的置換を行うことによって得られてもよい。
【００２２】
用語「ＰＤＺドメイン」は、約９０アミノ酸のモジュラータンパク質ドメインを意味し、脳シナプスタンパク質ＰＳＤ−９５、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）分離コネキシンディスク・ラージＤｉｓｃｓ−Ｌａｒｇｅ（ＤＬＧ）、および上皮タイトジャンクションタンパク質Ｚ０１とが高い配列同一性（例えば、少なくとも６０％）を有することを特徴とする。ＰＤＺドメインは、ディスク・ラージホモログリピート（「ＤＨＲｓ」）およびＧＬＧＦリピートとしても呼ばれている。ＰＤＺドメインは、通常、コアコンセンサス配列（Ｄｏｙｌｅ，  Ｄ．  Ａ．，  １９９６，Ｃｅｌｌ  ８５：１０６７−７６）を保持することを示す。例示的なＰＤＺドメイン含有タンパク質およびＰＤＺドメイン配列は、米国特許出願Ｎｏ．１０／７１４，５３７に開示された。
【００２３】
用語「特異的結合」とは、２つの分子（例えば、リガンドと受容体）間の結合を指し、多くの他の異なる分子の存在下であっても、１種の分子（例えば、リガンド）と他の１種の特定の分子（例えば、受容体）に結合する能力、すなわち、異種分子の混合物中に、１種の分子と別の１種の分子に優先的に結合する能力を特徴とする。リガリガンドと受容体との特定的結合も、次のように、過剰量の非標識リガンドが存在する場合、検出可能に標識されたリガンドと受容体との結合が低下した（すなわち、結合競合実験）ことが実証された。
【００２４】
第１の態様によれば、本発明は、アミノ酸配列ＹＥＫＬＬＤＴＥＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）もしくはその機能的変異体を含むペプチド、または前記ペプチドを含む医薬組成物の、疼痛を予防、緩和または治療する医薬の製造における使用を提供する。
【００２５】
いくつかの実施形態において、前記機能的変異体は、ＹＥＫＬＬＤＴＥＩにおけるＬＤＴＥＩセグメントに１つまたは複数の所で保存的置換によって生成された変異体である。
【００２６】
いくつかの実施形態において、保存的な置換は、ＤとＥの間、Ｌ、ＶとＩの間、およびＴとＳの間の置換からなる群から選ばれる。
【００２７】
いくつかの特定の実施形態において、機能的変異体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１におけるＬＤＴＥＩセグメントを、ＬＤＴＥＬ、ＬＤＴＥＶ、ＬＤＴＤＩ、ＬＤＴＤＬ、ＬＤＴＤＶ、ＬＤＳＥＩ、ＬＤＳＥＬ、ＬＤＳＥＶ、ＬＤＳＤＩ、ＬＤＳＤＬ、ＬＤＳＤＶ、ＬＥＴＥＩ、ＬＥＴＥＬ、ＬＥＴＥＶ、ＬＥＴＤＩ、ＬＥＴＤＬ、ＬＥＴＤＶ、ＶＤＴＥＩ、ＶＤＴＥＬ、ＶＤＴＥＶ、ＶＤＴＤＩ、ＶＤＴＤＬ、ＶＤＴＤＶ、ＩＤＴＥＩ、ＩＤＴＥＬ、ＩＤＴＥＶ、ＩＤＴＤＩ、ＩＤＴＤＬ、ＩＤＴＤＶ、ＩＥＴＥＩ、ＩＥＴＥＬ、ＩＥＴＥＶ、ＩＥＴＤＩ、ＩＥＴＤＬ、およびＩＥＴＤＶからなる群より選ばれる配列のいずれかで置換することによって生成される変異体である。
【００２８】
いくつかの実施形態において、本発明に記載の機能的変異体は、前記ペプチドと少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列をさらに含む。本領域で既に分かるように、２種の蛋白質の間の「同一性（アイデンティティ）」は、１種のタンパク質のアミノ酸配列と、その保守的アミノ酸で置換された第２種の蛋白質の配列との比較によって決定される。２種のタンパク質の間の同一性の程度は、当業者に周知のコンピュータアルゴリズムおよび方法によって決定される。２つのアミノ酸配列の間の同一性は、好ましくは、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムによって決定される。
【００２９】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の機能的変異体は、上記ペプチドに比べると、上記で開示された具体的なペプチドと異なっている１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上の位置におけるアミノ酸残基の置換、削除、追加、および／または挿入を有する。
【００３０】
上述したように、機能的変異体は、１つまたは多数の置換、削除、追加、および／または挿入により、上記で開示された特定のペプチドから区別することができる。これらの変異体は、天然に存在しまたは合成的に生成したものでもよい。例えば、本明細書に記載の上記ペプチド配列の１つ以上を修飾し、本明細書に記載の当該分野によく知られている様々な技術のいずれかでその生物活性を評価することができる。
【００３１】
いくつかの実施形態において、アミノ酸配列ＹＥＫＬＬＤＴＥＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、またはその機能的変異体を含むペプチドは、アミノ酸配列ＹＥＫＬＬＤＴＥＩまたはその機能的変異体、および内在化ペプチドを含むキメラペプチドである。
【００３２】
内在化ペプチドは、細胞透過性ペプチドとも呼ばれ、タンパク質薬物の分野で広く用いられ、その機能は、それに結合した活性ペプチドが細胞に取り込まれ、および吸収されることを促進することである。非限定的な例として、内在化ペプチドは、Ｔａｔペプチドであってもよく、その中で、Ｔａｔペプチドの非限定的な例としては、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）であってもよい。
【００３３】
いくつかの実施形態において、前記内在化ペプチドは、アミノ酸配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を含む。
【００３４】
いくつかの実施形態において、前記キメラペプチドは、アミノ酸配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＹＥＫＬＬＤＴＥＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）を含む。
【００３５】
上記のようなペプチドが、必要に応じて誘導体化（例えば、アセチル化、リン酸化、および／またはグリコシル化）を行って、それらの標的との親和性を促進し、その細胞膜を横切る輸送能を促進し、またはその安定性を促進することができることは、当業者にとって理解すべきである。
【００３６】
疼痛は、実際的または潜在的な組織損傷に関連付けられている不快な感覚や感情的な経験である。疼痛の病態生理学によると、疼痛は、侵害受容性疼痛、非侵害受容性疼痛、および総疼痛に分類することができ、その中で、侵害受容性疼痛には体性痛および内臓痛を含み、非侵害受容性疼痛には中心性疼痛（中枢性疼痛（ｃｅｎｔｒａｌ  ｐａｉｎ））、末梢性疼痛（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｐａｉｎ）、および心理性疼痛（ｐｓｙｃｈｏｌｏｇｉｃ  ｐａｉｎ）を含む。
【００３７】
いくつかの実施形態において、本発明の予防、緩和または治療される疼痛は侵害受容性疼痛である。侵害受容性疼痛は、侵害性刺激の活性化、および感作侵害性受容器（例えばＡδおよびＣ系神経線維によって引き起こされる生理学的反応であり、組織損傷に対して引き起こす病態生理学的過程であり、組織損傷で生じるさまざまな媒介物質(例えばＨ＋、プロスタグランジン、ブラジキニン、セロトニン、アデノシンなど)が感覚神経終末を刺激し、さまざまな神経終末受容体を感作させ、さまざまな痛み信号を神経線維に沿って伝達することを引き起こし、痛感覚を引き起こす。
【００３８】
いくつかの実施形態において、本発明の予防、緩和または治療される疼痛は、外部ストレスまたは刺激による疼痛である。いくつかの実施形態において、前記外部ストレスまたは刺激は熱刺激もしくはタッチである。
【００３９】
いくつかの実施形態において、本発明の予防、緩和または治療される侵害受容性疼痛は体性痛である。体性痛は、体表面（皮膚組織）または深部組織（骨格や筋組織）の痛覚受容器にさまざまな侵害性刺激を受けて引き起こされた疼痛であって、前者は表在体性痛とも呼ばれ、後者は深部体性痛とも呼ばれる。
【００４０】
いくつかの実施形態において、体性痛は火傷、切り傷、挫傷、肩痛、四肢痛、腰痛、関節炎、腱炎、筋膜炎を含むが、これらに限定されない。
【００４１】
いくつかの実施形態において、本発明の予防、緩和または治療される侵害受容性疼痛は内臓痛である。内臓痛は、胸部、腹部、骨盤における臓器などに対する浸透、圧迫、引っ張りまたはねじれに起因するこれらの領域の疼痛受容体の活性化で引き起こされる疼痛であり、これらの通常位置決めが困難である。
【００４２】
いくつかの実施形態において、内臓痛は胃痛、虫垂炎、膵炎、消化性潰瘍を含むが、これに限定されない。
【００４３】
本発明のいくつかの実施形態において、アミノ酸配列ＹＥＫＬＬＤＴＥＩまたはその機能的変異体を含む医薬組成物は、従来の方法、例えば、混合、溶解、造粒、錠剤化、研磨、乳化、カプセル化、捕捉、または凍結乾燥という方法により調製することができる。
【００４４】
本発明のいくつかの実施形態において、医薬組成物は、１つ以上の生理学的に許容される担体（キャリア）、希釈剤、賦形剤または補助原料を用い、従来の方法で製剤化することができる。
【００４５】
本発明のいくつかの実施形態において、ペプチドまたは医薬組成物を水溶液に加えて調製してもよく、好ましくは、（注射部位に不快感を低減させるために）生理学的に適合する緩衝液、例えばハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理食塩水もしくは酢酸緩衝液に加えて調製する。当該溶液は、懸濁剤、安定剤、および／または分散剤などの製剤化薬剤を含有してもよい。
【００４６】
本発明のいくつかの実施形態において、本発明に係るペプチドまたは医薬組成物は、使用前に適切な担体(例えば滅菌非発熱性水)を用いて再構成するための粉末形態であってもよい。
【００４７】
本発明のいくつかの実施形態において、浸透しようとするバリアに適した浸透剤を製剤中に用いてもよい。
【００４８】
いくつかの実施形態において、本発明に係るペプチドは、薬学的に許容可能な担体と共に、タブレット、丸剤、錠剤、トローチ、カプセル、液体、ゲル（ジェル）、シロップ、スラリー、懸濁液などに調製することに用いてもよい。例えば、粉末、カプセルおよびタブレットなどの固形製剤に対して適切な賦形剤は、乳糖、ショ糖、マンニトールおよびソルビトール等の糖類などの充填剤、コーンスターチ、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロースおよび／またはポビドン（ＰＶＰ）などのセルロース調剤、並びに造粒剤および結合剤が挙げられる。必要に応じて、崩壊剤（例えば、架橋性のポリビニルピロリドン、寒天など）、またはアルギン酸もしくはその塩（例えば、アルギン酸ナトリウムなど）を添加してもよい。必要に応じて、固形剤形は、標準的な技術を用いて、糖または腸溶性コーティングで被覆することができる。例えば、懸濁剤、エリキシル剤および液剤などのような液体製剤に対して適切な担体、賦形剤または希釈剤は、水、グリセロール、油およびアルコールが挙げられる。さらに、矯味剤、防腐剤、着色剤等を添加してもよい。
【００４９】
前記製剤に加えて、本発明に係るペプチドをデポー製剤として製剤化してもよい。したがって、例えば、化合物は、適当なポリマー材料、または疎水性材料（例えば、許容される油におけるエマルジョンとして調製され）、またはイオン交換樹脂と共に製剤化することができ、または、例えば難溶性塩のような難溶性誘導体に製剤化することができる。
【００５０】
いくつかの実施形態において、前記対象は神経損傷していない対象である。いくつかの実施形態において、前記対象は健常な対象である。
【００５１】
第２の態様によれば、本発明は、アミノ酸配列ＹＥＫＬＬＤＴＥＩもしくはその機能的変異体を含むペプチド、または前記ペプチドを含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、疼痛の予防、緩和または治療方法を提供する。
【００５２】
いくつかの実施形態において、前記機能的変異体は、ＹＥＫＬＬＤＴＥＩにおけるＬＤＴＥＩセグメントに１つまたは複数の所で保存的置換によって生成された変異体である。いくつかの実施形態において、保存的な置換は、ＤとＥの間、Ｌ、ＶとＩの間、およびＴとＳの間の置換からなる群から選ばれる。いくつかの特定の実施形態において、機能的変異体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１におけるＬＤＴＥＩセグメントを、ＬＤＴＥＬ、ＬＤＴＥＶ、ＬＤＴＤＩ、ＬＤＴＤＬ、ＬＤＴＤＶ、ＬＤＳＥＩ、ＬＤＳＥＬ、ＬＤＳＥＶ、ＬＤＳＤＩ、ＬＤＳＤＬ、ＬＤＳＤＶ、ＬＥＴＥＩ、ＬＥＴＥＬ、ＬＥＴＥＶ、ＬＥＴＤＩ、ＬＥＴＤＬ、ＬＥＴＤＶ、ＶＤＴＥＩ、ＶＤＴＥＬ、ＶＤＴＥＶ、ＶＤＴＤＩ、ＶＤＴＤＬ、ＶＤＴＤＶ、ＩＤＴＥＩ、ＩＤＴＥＬ、ＩＤＴＥＶ、ＩＤＴＤＩ、ＩＤＴＤＬ、ＩＤＴＤＶ、ＩＥＴＥＩ、ＩＥＴＥＬ、ＩＥＴＥＶ、ＩＥＴＤＩ、ＩＥＴＤＬ、およびＩＥＴＤＶからなる群より選ばれる配列のいずれかで置換することによって生成される変異体である。
【００５３】
いくつかの実施形態において、本発明に記載の機能的変異体は、前記ペプチドと少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列をさらに含む。本領域で既に分かるように、２種の蛋白質の間の「同一性（アイデンティティ）」は、１種のタンパク質のアミノ酸配列と、その保守的アミノ酸で置換された第２種の蛋白質の配列との比較によって決定される。２種のタンパク質の間の同一性の程度は、当業者に周知のコンピュータアルゴリズムおよび方法によって決定される。２つのアミノ酸配列の間の同一性は、好ましくは、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムによって決定される。
【００５４】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の機能的変異体は、上記ペプチドに比べると、上記で開示された具体的なペプチドと異なっている１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上の位置におけるアミノ酸残基の置換、削除、追加、および／または挿入を有する。
【００５５】
上述したように、機能的変異体は、１つまたは多数の置換、削除、追加、および／または挿入により、上記で開示された特定のペプチドから区別することができる。これらの変異体は、天然に存在しまたは合成的に生成したものでもよい。例えば、本明細書に記載の上記ペプチド配列の１つ以上を修飾し、本明細書に記載の当該分野によく知られている様々な技術のいずれかでその生物活性を評価することができる。
【００５６】
いくつかの実施形態において、アミノ酸配列ＹＥＫＬＬＤＴＥＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、またはその機能的変異体を含むペプチドは、アミノ酸配列ＹＥＫＬＬＤＴＥＩまたはその機能的変異体、および内在化ペプチドを含むキメラペプチドである。
【００５７】
内在化ペプチドは、細胞透過性ペプチドとも呼ばれ、タンパク質薬物の分野で広く用いられ、その機能は、それに結合した活性ペプチドが細胞に取り込まれ、および吸収されることを促進することである。非限定的な例として、内在化ペプチドは、Ｔａｔペプチドであってもよく、その中で、Ｔａｔペプチドの非限定的な例としては、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）であってもよい。
【００５８】
いくつかの実施形態において、前記内在化ペプチドは、アミノ酸配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を含む。
【００５９】
いくつかの実施形態において、前記キメラペプチドは、アミノ酸配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＹＥＫＬＬＤＴＥＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）を含む。
【００６０】
上記のようなペプチドが、必要に応じて誘導体化（例えば、アセチル化、リン酸化、および／またはグリコシル化）を行って、それらの標的との親和性を促進し、その細胞膜を横切る輸送能を促進し、またはその安定性を促進することができることは、当業者にとって理解すべきである。
【００６１】
いくつかの実施形態において、前記疼痛は侵害受容性疼痛である。
いくつかの実施形態において、前記疼痛は熱刺激もしくはタッチによる疼痛である。
いくつかの実施形態において、前記疼痛は灼熱痛もしくは刺痛である。
【００６２】
いくつかの実施形態において、予防、緩和または治療される侵害受容性疼痛は体性痛である。いくつかの実施形態において、体性痛は火傷、切り傷、挫傷、肩痛、四肢痛、腰痛、関節炎、腱炎、筋膜炎を含むが、これらに限定されない。
【００６３】
いくつかの実施形態において、予防、緩和または治療される侵害受容性疼痛は内臓痛である。いくつかの実施形態において、内臓痛は胃痛、虫垂炎、膵炎、消化性潰瘍を含むが、これに限定されない。
【００６４】
いくつかの実施形態において、アミノ酸配列ＹＥＫＬＬＤＴＥＩまたはその機能的変異体を含むペプチド、あるいは前記ペプチドを含む医薬組成物の投与は、非経口、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、髄腔内、腹腔内、局所、鼻腔内、または筋肉内であってもよく、好ましくは静脈内投与である。
【００６５】
いくつかの実施形態において、非経口投与のための本発明に係る医薬組成物は、好ましくは無菌、および実質的に等張性である。注射については、ペプチドまたは医薬組成物を水溶液に加えて調製してもよく、好ましくは、（注射部位に不快感を低減させるために）生理学的に適合する緩衝液、例えばハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理食塩水もしくは酢酸緩衝液に加えて調製する。当該溶液は、懸濁剤、安定剤、および／または分散剤などの製剤化薬剤を含有してもよい。
【００６６】
あるいは、本発明に係るペプチドまたは医薬組成物は、使用前に適切な担体（例えば滅菌非発熱性水）を用いて再構成するための粉末形態であってもよい。
【００６７】
経粘膜投与については、浸透しようとするバリアに適した浸透剤が製剤中に用いられる。該投与経路は、化合物を鼻腔まで転送するために用いられ、または舌下投与に用いられる。
【００６８】
いくつかの実施形態において、経口投与については、本発明に係るペプチドと薬学的に許容可能な担体と共に、タブレット、丸剤、錠剤、トローチ、カプセル、液体、ゲル（ジェル）、シロップ、スラリー、懸濁液などに調製して、患者の治療のために経口摂取することに用いられる。例えば、粉末、カプセルおよびタブレットなどの経口固形製剤に対して適切な賦形剤は、乳糖、ショ糖、マンニトールおよびソルビトール等の糖類などの充填剤、コーンスターチ、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロースおよび／またはポビドン（ＰＶＰ）などのセルロース調剤、並びに造粒剤および結合剤が挙げられる。必要に応じて、崩壊剤（例えば、架橋性のポリビニルピロリドン、寒天など）、またはアルギン酸もしくはその塩（例えば、アルギン酸ナトリウムなど）を添加してもよい。必要に応じて、固形剤形は、標準的な技術を用いて、糖または腸溶性コーティングで被覆することができる。例えば、懸濁剤、エリキシル剤および液剤などのような経口液体製剤に対して適切な担体、賦形剤または希釈剤は、水、グリセロール、油およびアルコールが挙げられる。さらに、矯味剤、防腐剤、着色剤等を添加してもよい。
【００６９】
前記製剤に加えて、本発明に係るペプチドをデポー製剤として製剤化してもよい。そのような長時間作用型製剤は、移植（例えば、皮下または筋肉内）、または筋肉内注射によって投与することができる。したがって、例えば、化合物は、適当なポリマー材料、または疎水性材料（例えば、許容される油におけるエマルジョンとして調製され）、またはイオン交換樹脂と共に製剤化することができ、または、例えば難溶性塩のような難溶性誘導体に製剤化することができる。
【００７０】
あるいは、他の薬物送達システムを用いることができる。キメラペプチドは、リポソーム、エマルションを用いて送達することができる。また、いくつかの有機溶剤、例えばジメチルスルホキシドなども用いることができる。さらに、化合物は、治療剤含有固体重合体の半透性基質のような徐放性システム（持続放出性製剤）を用いて送達することができる。
【００７１】
本発明に係るペプチドまたは医薬組成物は、意図する目的を有効に達成するため（例えば、侵害受容性疼痛を予防、緩和または治療するため）の治療有効量で投与される。治療有効量とは、本明細書に開示のペプチドまたは医薬組成物で治療されていない対象（または動物モデル）の対照群における疼痛に対しては、本明細書に開示のペプチドまたは医薬組成物で治療される対象（または動物モデル）について、有意に疼痛を予防、緩和または治療するのために用いられるペプチドまたは医薬組成物の十分な量を意味する。
【００７２】
いくつかの実施形態において、前記ペプチドの投与用量の範囲は、０．１μｇ〜１０μｇ／ｋｇであり、例えば０．１μｇ／ｋｇ、０．２μｇ／ｋｇ、０．３μｇ／ｋｇ、０．４μｇ／ｋｇ、０．５μｇ／ｋｇ、０．６μｇ／ｋｇ、０．７μｇ／ｋｇ、０．８μｇ／ｋｇ、０．９μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ、２μｇ／ｋｇ、３μｇ／ｋｇ、４μｇ／ｋｇ、５μｇ／ｋｇ、６μｇ／ｋｇ、７μｇ／ｋｇ、８μｇ／ｋｇ、９μｇ／ｋｇ、または１０μｇ／ｋｇが挙げられる。いくつかの実施形態において、用量は、好ましくは０．２μｇ／ｋｇである。
【００７３】
いくつかの実施形態において、投与される本発明に係るペプチドまたは医薬組成物の量は、治療されている被験者の体重、痛みの重症度、投与方法、処方医師の調整に依存している。
【００７４】
いくつかの実施形態において、本発明に係るペプチドまたは医薬組成物の治療に有効な投与量は、有意な毒性を引き起こすことがなく、治療上の有益効果を与えることができる。キメラペプチドの毒性は、標準的な薬学的手順によって細胞培養または実験動物において測定し、例えば、ＬＤ５０（対象群の５０％を殺す用量）やＬＤ１ＯＯ（対象群の１００％を殺す用量）を測定して決定することができる。毒性効果と治療効果との用量比は、治療指数である。実験では、本発明に係るペプチドが用量２００ｍｇ／ｋｇで有意な毒性を有さないことを確認した。
【００７５】
いくつかの実施形態において、本発明のペプチドまたは組成物の有効性（薬効）は、少なくとも２時間持続することができる。
【００７６】
いくつかの実施形態において、前記対象は神経損傷していない対象である。
【００７７】
いくつかの実施形態において、前記対象は健常な対象である。
【００７８】
上記の詳細な説明は、本発明を当業者にさらに明確に理解させるだけを目指しているが、いずれの態様を限定するものではないことを理解すべきである。当業者は、前記実施形態に様様な修正および変更をすることができる。
【実施例】
【００７９】
以下の実施例は、単に本発明のいくつかの実施形態を説明するために提供されたものであり、如何なる制限の目的や性質にならない。
【００８０】
実施例１：活性ペプチド分子のスクリーニング
既に報告された研究結果によれば、Ｔａｔ膜貫通ペプチドＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲを選択して他の異なる数のアミノ酸に連結してペプチドライブラリーを形成した。ペプチドライブラリーにおけるペプチド分子を、それぞれ生体外で発現・精製されたＰＤＺ１／２ドメインに相互作用し、相互作用力の強さによりポリペプチドに対して予備スクリーニングをした。
【００８１】
固定相分子（リガンド）は、ＰＤＺ１／２タンパク質で、分子量：約２０ｋＤ、濃度：２ｍｇ／ｍＬであった。移動相分子（分析物）は、スクリーニングされているポリペプチドで、分子量：約２ｋＤ、濃度：１０ｍｇ／ｍＬであった。Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００機器を使用して、ＣＭ５チップが固定に用いられた。泳動バッファーは、ＰＢＳ＋０．００５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０であった。アミノカップリング法を用いて固定した。リガンドの濃度は、１０μｇ／ｍＬであった。固定バッファーは、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０であった。一定量の１４００  ＲＵでフロー細胞（ｆｌｏｗｃｅｌｌ）２に固定された。流速が１０μＬ／ｍＬで、リガンド試料導入が１分間であった。再生液（再生剤）がＰＨ２．０＋２．５の１０ｍＭのＧｌｙを用い、再生は流速３０μＬ／分間で行った。試料導入時間（ロードする時間）は３０ｓであった。
【００８２】
動力学的分析は以下の条件で行われ、すなわち、対照チャネル：フロー細胞１、泳動バッファー：ＰＢＳ、運行モード：Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｗｉｚａｒｄモード、濃度勾配：６．２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、試料導入時間：１分間、解離時間：２分間、流速：３０μＬ／分間。
【００８３】
データは、フィッティングソフトウェアＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ４．１により適合（フィッティング）させた。フィッティングモデルは、１：１の結合モデルである。解離定数ＫＤ値は作用力に反比例した。
【００８４】
スクリーニングにより、ＰＤＺ１／２ドメインと強い相互作用能力を持つキメラペプチドが得られ、Ｐ５と命名し、その配列は次の通りである。
Ｐ５：  ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＹＥＫＬＬＤＴＥＩ
【００８５】
以下の実験において、さらにキメラペプチドＰ５を試験した。
【００８６】
実施例２：プルダウン実験でＰ５とＰＤＺ１／２ドメインとの相互作用を検出する
Ｐ５がＰＤＺ１／２ドメインとを相互作用できることを裏付けるために、プルダウン実験をした。
【００８７】
カラムは、１００μＬのＨｉｓビーズおよび１ｍＬのＭＣＡＣ−０バッファーを用いて５分間平衡させた。４℃で振とうした。得られた混合物を、４℃で５０００ｇで遠心分離させ、上澄みを捨てた。混合物に、ＰＤＺ１／２タンパク質１ｍｇを加え、そしてバッファーを用いて１ｍＬになるまで追加した。４℃で、得られた混合物を１時間回転して結合させた。前記混合物を、４℃で５０００ｇで遠心分離させ、上澄みを捨てた。得られた混合物を、１ｍＬのＭＣＡＣ−０バッファーを用いて、１回あたり５分間（４℃で、振とうで洗浄し）で３回洗浄した。混合物に、Ｐ５タンパク質１ｍｇを加え、そしてバッファーを用いて１ｍＬになるまで追加した。４℃で、得られた混合物を２時間回転して結合させた。前記混合物を、４℃で５０００ｇで遠心分離させ、上澄みを捨てた。得られた混合物を、１ｍＬの溶解液（ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）を用いて、１回あたり５分間（４℃で、振とうで洗浄し）で３回洗浄した。洗浄後、２０μＬのＭＣＡＣ−３００を加えた。遠心分離し、溶出液を取ってＳＤＳ−ＰＡＧＥ検出を行った。実験結果は図１に示した。
【００８８】
図１に示すように、ポリペプチドＰ５の溶出バンドに、Ｐ５とＰＤＺ１／２ドメインとの両方を同時に含んでおり、これにより、ポリペプチドＰ５がＰＤＺ１／２ドメインに結合できることを裏付けた。
【００８９】
実施例３：  ポリペプチドＰ５の熱板鎮痛効果の検出
実験手順
動物のスクリーニング
実験用ラットとしては、２４０〜２６０ｇの雄性ＳＤラット（化阜康成有限公司から入手）１８匹を選択し、ポリペプチドＰ５の０．２μｇ／ｋｇ用量での投与群、生理食塩水群、および陽性薬物対照群（イブプロフェン、５０ｍｇ／ｋｇ）という３群に６匹ずつ分け、熱板実験に使用された。
【００９０】
実験前のスクリーニング
熱板実験のモデル化前に、ラットを５５℃の熱板上に置き、そして３０秒以内に後足をなめたり足を持ち上げたりしなかったラットは、実験に使用されない。
【００９１】
動物モデルの作成
４．０クロム製腸線（山東博達医療用品有限公司製）を生理食塩水（中国石家荘四薬有限公司製、中国医薬承認番号Ｈ１３０２３２００）に入れて３０分間予め浸漬して軟化させる必要がある。ラットの大腿（太股）の中部を剃毛し、ヨウ素を拭き取り、ハサミで表皮に１ｃｍ以下の傷を切り、次にＪ３１０６０止血鉗子を用いて大腿二頭筋を裂き、大腿中部に坐骨神経を可視に露出させた。大腿に近い端は坐骨神経の三叉があり、坐骨神経の大腿骨中央部を選択し、４．０クロム製腸線で４回緩く結紮し、ここで、力の大きさは結紮箇所の付近における筋肉が軽微に震える程度になると適宜であり、隣接結紮箇所のピッチ１ｍｍとし、その後、それぞれ筋肉および表皮組織を縫合した。
【００９２】
投与
実験前に、手術に成功した実験群のラットには、ペプチドＰ５生理食塩水溶液（用量０．２μｇ／ｋｇ）を１回限りで尾静脈注射し、ＮＳ（生理食塩水）群のラットには生理食塩水０．３ｍＬを腹腔内注射し、陽性薬物群にはイブプロフェン懸濁液（上海強生製薬有限公司製、中国医薬承認番号Ｈ１９９９１０１１）（用量５０ｍｇ／ｋｇ）を胃内投与した。
【００９３】
熱板実験
ラットは、手術してから７日間後に熱板実験を行った。ラットを摂食に適応させ、室内環境を約２５℃に維持し、そしてＹＬＳ−６Ｂインテリジェント熱板装置（北京衆実迪創科技発展有限公司製）の温度を約５５℃に設定した。ラットは、密封で取り外し可能な透明の有機ガラス製シリンダー内の熱板機器に置き、ラットの後足を舐める時間または跳躍反応の時間を記録した。このラット（ＳＤラット）が投与後磁製ジャーに入れてから２０秒間に反応がない場合、ラットの足をやけどしないように、間もなくラットを取り出し、その疼痛閾値は２０秒で計算できる。各ラットを連続して２回試験し、各試験の間隔は少なくとも３０秒であり、それらの平均値を取った。
【００９４】
実験終了後、生理食塩水対照群および各薬物投与群のラットの投与前および投与後１０分、７０分、および１３０分の灼熱痛反応時間（すなわち、疼痛閾値、単位ｓ）を記録した。
【００９５】
実験結果
表計算ソフトＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌに付属しているＴ検定関数（両側等分散）を用いて、実験用ラットについてモデル化前後の灼熱痛足持ち上げ（足を持ち上げる）閾値の統計的有意差（統計学的差異）を分析し、モデル化に成功したか否かを評価し、次に投与前、投与後の各時間点での灼熱痛閾値の差異を分析して薬効（有効性）を評価した。Ｐ＜０．０５は統計的有意差があり、Ｐ＜０．０１は顕著な統計的有意差があると考えられた。
実験結果を以下の表１および図２に示した。
【００９６】
【表１】
2020503248.tif 000002
【００９７】
結果は、用量０．２μｇ／ｋｇの治療群のラットは、手術側のモデル化前とモデル化後との閾値時間に顕著な統計的有意差（ｐ＝０．０００２）があり、モデル化に成功したことを示している。用量０．２μｇ／ｋｇの投与前と投与後１０分間との間は、統計的有意差（ｐ＝０．０１３）があった。Ｐ５投与後１０分間と生理食塩水投与後１０分間との間は、統計的有意差（ｐ＝０．０２８）もあって、Ｐ５投与が短時間で鎮痛効果を奏し得ることを示している。さらに、用量０．２μｇ／ｋｇのＰ５投与前と投与後１３０分間との間は、統計的有意差（Ｐ＝０．０４７）が存在しており、投与後１０分間と投与後１３０分間との間は、統計的有意差がなかった（ｐ＝０．６９７）ので、投与後１０分間と投与後１３０分間内に鎮痛効果に統計的有意差がなく、すなわち、ポリペプチドＰ５の治療効果は少なくとも１３０分間持続することを明らかにされた。
【００９８】
陽性対照群の結果によれば、用量５０ｍｇ／ｋｇのイブプロフェン治療群ラットは、健常側と手術側との足持ち上げ閾値に、統計的有意差（ｐ＜０．０１）があり、モデル化に成功したことを示している。投与前と投与後１０分間との間は、統計的有意差（ｐ＝０．０３）があって、イブプロフェン投与が短時間で鎮痛効果を奏し得ることを示している。しかしながら、手術側のイブプロフェン投与１３０分間後とその投与前との足持ち上げ閾値において統計的有意差がなく（ｐ＞０．０５）、鎮痛効果を１３０分間維持することができないことを示している。
【００９９】
実施例４：  プリック実験でのポリペプチドＰ５による鎮痛効果の検出
実験手順
ラットのスクリーニング
実験用ラットとしては、２４０〜２６０ｇの雄性ＳＤラット（化阜康成有限公司から入手）１８匹を選択し、ポリペプチド０．２μｇ／ｋｇ用量での投与群、生理食塩水群、および陽性薬物対照群（イブプロフェン、５０ｍｇ／ｋｇ）という３群に６匹ずつ分け、プリック実験（プリックテスト）に使用された。
【０１００】
モデル化
４．０クロム製腸線（山東博達医療用品有限公司製）を生理食塩水（中国石家荘四薬有限公司製、中国医薬承認番号Ｈ１３０２３２００）に入れて３０分間予め浸漬して軟化させる必要がある。ラットの大腿（太股）の中部を剃毛し、ヨウ素を拭き取り、ハサミで表皮に１ｃｍ以下の傷を切り、次にＪ３１０６０止血鉗子を用いて大腿二頭筋を裂き、大腿中部に坐骨神経を可視に露出させた。大腿に近い端は坐骨神経の三叉があり、坐骨神経の大腿骨中央部を選択し、４．０クロム製腸線で４回緩く結紮し、ここで、力の大きさは結紮箇所の付近における筋肉が軽微に震える程度になると適宜であり、隣接結紮箇所のピッチ１ｍｍとし、その後、それぞれ筋肉および表皮組織を縫合した。
【０１０１】
投与
実験前に、手術に成功した実験群のラットには、ペプチドＰ５生理食塩水溶液（用量０．２μｇ／ｋｇ）を１回限りで尾静脈注射し、ＮＳ群には生理食塩水０．３ｍＬを腹腔内注射し、陽性薬物群にはイブプロフェン懸濁液（上海強生製薬有限公司製、中国医薬承認番号Ｈ１９９９１０１１）（用量５０ｍｇ／ｋｇ）を胃内投与（強制経口投与）した。
【０１０２】
プリック実験
ラットの手術をしてから１４日間後、投与群は投与前、および投与後１０分＼７０分＼１３０分後に実験を行った。実験用ラットを有機ガラス製観察用格子形装置に入れ、ラットが周りを見ていなくなるまで、ラットに５分間環境に順応させた。ＺＳ−ＣＴＹ足底刺痛システム（北京衆実迪創科技発展有限責任公司製）を、Ｗｉｎ７の３２ビットのコンピュータに接続し、テスト用ソフトウェアを実行し、機器を零位補正し、１０ｇの分銅をかけた後に再度１回補正し、ラットの被検後肢の足底中央にゆっくりとｖｏｎＦｒｅｙプローブで優しく刺激し、ラットの足収縮（足を引っ込める）反応を観察し、ラットの刺激による足収縮反応が迅速に発生した場合、陽性反応としてマークされ、ラットの身体活動による足収縮反応は勘定に入れない。各時間点に対して２回記録して平均値を計算して刺痛による足持ち上げの(力強度)閾値（単位：ｇ）とし、１０ｇの分銅で足底刺痛システム（製造元：北京衆実迪創科技発展有限公司、シリアル番号：２０１６０１０１０６０００１）を零位補正した後、ラットの足裏にタッチすると、依然として基本的な示度の変動が存在し、変動は一般に＋３ｇ〜＋５ｇであり、最終値はこの値を減算する必要がある。まだベースラインがある場合、それは削除される。
【０１０３】
実験結果
表計算ソフトＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌに付属しているＴ検定関数（両側異分散）を用いて、実験用ラットについて未処理側および手術側のプリックによる足持ち上げの（力強度）閾値の統計的有意差を分析し、モデル化に成功したか否かを評価し、次に投与前後、投与後の各時間点での刺痛閾値の差異を分析して薬効および薬効継続期間を評価した。Ｐ＜０．０５は統計的有意差があり、Ｐ＜０．０１は顕著な統計的有意差があると考えられた。
実験結果を以下の表２および図３に示した。
【０１０４】
【表２】
2020503248.tif 000003
【０１０５】
結果は、用量０．２μｇ／ｋｇの治療群のラットは、健常側と手術側とのプリックによる足持ち上げの(力強度)閾値において統計的有意差（ｐ＝０．０００４）があり、モデル化に成功したことを示している。用量０．２μｇ／ｋｇの治療群のラットは、投与前と投与後１０分間との間は、ラット手術側のプリックによる足持ち上げ閾値において、統計的有意差（ｐ＝０．０３）があった。Ｐ５投与後１０分間と生理食塩水投与後１０分間との間は、ラット手術側のプリックによる足持ち上げ閾値において、統計的有意差（ｐ＝０．０３）もあって、Ｐ５投与が短時間で鎮痛効果を奏し得ることを示している。また、用量０．２μｇ／ｋｇの治療群のラットは、Ｐ５投与前と投与後１３０分間との間は、ラット手術側のプリックによる足持ち上げ閾値において、統計的有意差（ｐ＝０．０３）があった。投与後１０分間と投与後１３０分間との間は、ラット手術側のプリックによる足持ち上げ閾値において、投与後１３０分間内にプリックによる足持ち上げ時間は統計的有意差がなく（ｐ＝０．６８７）、すなわち、ポリペプチドＰ５の治療効果は少なくとも１３０分間を持続し得ることを示している。
【０１０６】
陽性薬物対照群の結果は、用量５０ｍｇ／ｋｇのイブプロフェン治療群が、健常側および手術側のプリックの力強度による足持ち上げ閾値において統計的有意差（ｐ＜０．０１）があり、モデル化に成功したことを示している。投与前と投与後１０分間との間は、統計的有意差が明らかにされなく（ｐ＝０．０６９）、Ｐ５投与後１０分間と生理食塩水投与後１０分間との間は、統計的有意差も明らかにされなかった（ｐ＝０．０８）。さらに、イブプロフェン投与後１３０分間と投与前との間はｐ＞０．０５であり、これは、陽性薬物の鎮痛効果が１３０分間維持できず、ポリペプチドＰ５の鎮痛効果が陽性薬物よりも優れていたことを示している。
【０１０７】
実施例５：  急性毒性試験
ラットに対する急性毒性試験結果は、用量１０００ｍｇ／ｋｇ体重の場合、Ｐ５がラットに致死効果および有意な毒性副作用を持たないことが明らかにされた。
【０１０８】
本発明に開示された精神および範囲から逸脱しない限り、本明細書に記載の実施形態に対してさまざまな変更および同等物の入替をすることができる。特に文脈で断らない限り、本明細書に記載の実施態様に係る任意の特徴、手順（ステップ）や実施形態は、任意の他の特徴、手順や実施形態とを組み合わせて用いることができる。
【図１】
2020503248.tif 000004
【図２】
2020503248.tif 000005
【図３】
2020503248.tif 000006
【配列表】
2020503248000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年7月18日(2019.7.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の疼痛を予防、緩和または治療するための、アミノ酸配列ＹＥＫＬＬＤＴＥＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）もしくはその機能的変異体を含むペプチドを含む医薬組成物。
【請求項２】
前記機能的変異体は、ＹＥＫＬＬＤＴＥＩにおけるＬＤＴＥＩセグメントの１つまたは複数の保存的置換によって生成された変異体である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記保存的置換はＤとＥとの間の置換、ＬとＶとＩとの間の置換、およびＴとＳとの間の置換からなる群より選ばれる、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記機能的変異体は、ＹＥＫＬＬＤＴＥＩにおけるＬＤＴＥＩセグメントを、ＬＤＴＥＬ、ＬＤＴＥＶ、ＬＤＴＤＩ、ＬＤＴＤＬ、ＬＤＴＤＶ、ＬＤＳＥＩ、ＬＤＳＥＬ、ＬＤＳＥＶ、ＬＤＳＤＩ、ＬＤＳＤＬ、ＬＤＳＤＶ、ＬＥＴＥＩ、ＬＥＴＥＬ、ＬＥＴＥＶ、ＬＥＴＤＩ、ＬＥＴＤＬ、ＬＥＴＤＶ、ＶＤＴＥＩ、ＶＤＴＥＬ、ＶＤＴＥＶ、ＶＤＴＤＩ、ＶＤＴＤＬ、ＶＤＴＤＶ、ＩＤＴＥＩ、ＩＤＴＥＬ、ＩＤＴＥＶ、ＩＤＴＤＩ、ＩＤＴＤＬ、ＩＤＴＤＶ、ＩＥＴＥＩ、ＩＥＴＥＬ、ＩＥＴＥＶ、ＩＥＴＤＩ、ＩＥＴＤＬ、およびＩＥＴＤＶからなる群より選ばれる配列のいずれかで置換することによって生成される変異体である、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記ペプチドは、アミノ酸配列ＹＥＫＬＬＤＴＥＩもしくはその機能的変異体、および内在化ペプチドを含むキメラペプチドである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記内在化ペプチドは、アミノ酸配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を含む、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記キメラペプチドは、アミノ酸配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＹＥＫＬＬＤＴＥＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）を含む、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記疼痛は侵害受容性疼痛である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記疼痛は外部ストレスまたは刺激による疼痛である、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記外部ストレスまたは刺激は熱刺激もしくはタッチである、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記侵害受容性疼痛は体性痛および／または内臓痛である、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記体性痛は火傷、切り傷、挫傷、肩痛、四肢痛、腰痛、関節炎、腱炎、もしくは、筋膜炎を含み、および／または前記内臓痛は胃痛、虫垂炎、膵炎、もしくは、消化性潰瘍を含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記対象は神経損傷していない対象である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記対象は健常な対象である、請求項１３に記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
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