(57)【要約】本開示は、ＭＰＯ阻害剤の新しい治療的使用及びそれを含む処置の方法に関する。
2020527137.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
男性不妊の処置又は予防における使用のためのミエロペルオキシダーゼ阻害剤。
【請求項２】
男性不妊の処置を必要とする男性患者における男性不妊の処置の方法であって、治療的有効量のＭＰＯ阻害剤を前記患者に投与することを含む、方法。
【請求項３】
男性不妊の予防を必要とすると判断された男性患者における男性不妊の予防の方法であって、治療的有効量のＭＰＯ阻害剤を前記患者に投与することを含む、方法。
【請求項４】
男性不妊の処置又は予防のための薬剤の製造における使用のための、ミエロペルオキシダーゼ阻害剤又は薬学的に許容可能なその塩若しくは溶媒和物。
【請求項５】
男性不妊の処置又は予防における使用のためのミエロペルオキシダーゼ阻害剤を含む、医薬組成物。
【請求項６】
男性特発性不妊症の患者のためである、請求項１〜５の何れかに記載の、使用のためのミエロペルオキシダーゼ阻害剤、処置若しくは予防の方法又は医薬組成物。
【請求項７】
ヒト患者のためである、請求項１〜６の何れかに記載の、使用のためのミエロペルオキシダーゼ阻害剤、処置若しくは予防の方法又は医薬組成物。
【請求項８】
非ヒト陸上哺乳動物のためである、請求項１〜７の何れかに記載の、使用のためのミエロペルオキシダーゼ阻害剤、処置若しくは予防の方法又は医薬組成物。
【請求項９】
男性特発性不妊症に関して酸化ストレス誘発性精子損傷を阻害する、及び／又は精子誘発ＮＥＴｏｓｉｓを予防するためである、請求項１〜８の何れかに記載の、使用のためのミエロペルオキシダーゼ阻害剤、処置若しくは予防の方法又は医薬組成物。
【請求項１０】
請求項１〜９の何れかに記載の、使用のためのミエロペルオキシダーゼ阻害剤、処置若しくは予防の方法又は医薬組成物であって、前記ミエロペルオキシダーゼ阻害剤が、１−（２−イソプロポキシエチル）−２−チオキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−オン又は薬学的に許容可能なその塩若しくは溶媒和物である、使用のためのミエロペルオキシダーゼ阻害剤、処置若しくは予防の方法又は医薬組成物。
【化１】
2020527137.tif 000005
【請求項１１】
請求項１〜９の何れかに記載の、使用のためのミエロペルオキシダーゼ阻害剤、処置若しくは予防の方法又は医薬組成物であって、前記ミエロペルオキシダーゼ阻害剤が、３−［［（２Ｒ）−テトラヒドロフラン−２−イル］メチル］−２−チオキソ−７Ｈ−プリン−６−オン又は薬学的に許容可能なその塩若しくは溶媒和物である、使用のためのミエロペルオキシダーゼ阻害剤、処置若しくは予防の方法又は医薬組成物。
【化２】
2020527137.tif 000006
【請求項１２】
請求項１〜９の何れかに記載の、使用のためのミエロペルオキシダーゼ阻害剤、処置若しくは予防の方法又は医薬組成物であって、前記ミエロペルオキシダーゼ阻害剤が、式（Ｉ）の化合物：
【化３】
2020527137.tif 000007
（式中、
Ｒ１は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ又はＣＦ３であり；
Ｒ２は、Ｈ、ＣＨ３又はＣ２Ｈ５であり；
Ｒ３は、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、シクロプロピル、シクロプロピルメチル、シクロブチル、シクロブチルメチル又はシクロペンチルである）；
又は薬学的に許容可能なその塩若しくは溶媒和物である、使用のためのミエロペルオキシダーゼ阻害剤、処置若しくは予防の方法又は医薬組成物。
【請求項１３】
ミエロペルオキシダーゼ阻害剤又は薬学的に許容可能なその塩若しくは溶媒和物を含む医薬組成物と、男性特発性不妊症の処置又は予防のための医薬組成物の使用のための説明書と、を含むキット。
【請求項１４】
前記ＭＰＯ阻害剤が、請求項１０、１１又は１２の何れかで定義されるとおりである、請求項１３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、男性不妊の処置における使用のための化合物及び男性不妊の処置の方法を対象とする。
【０００２】
本願中の明らかに以前公開された文書のリスト又は考察は、必ずしもその文書が最先端の一部であるか又は日常的で一般的な知識であることを承諾するものとして解釈すべきではない。
【背景技術】
【０００３】
世界中で妊娠を試みる生殖年齢カップルのおよそ１５％が不妊症であり；これはおよそ４８５０万組前後のカップルに相当する。男性不妊は不妊問題の５０％における要因であり、全症例の２０〜３０％前後で不妊症の唯一の原因であることが報告されている。男性不妊の評価及び報告は多くの国で実際より少なく報告されていると思われるため、これらの数字の見積もりは不十分であり得る。
【０００４】
男性不妊は様々な状態により引き起こされ得、そのうち一部は、管の閉塞及び低ゴナドトロピン性の性腺機能低下症など、容易に同定され、補正され得る。他の状態は、ウイルス性精巣炎に続発する両側性精巣萎縮症など、可逆的ではない。同定可能な原因はないが分析において異常な精液プロファイルを呈する男性について、多くの患者の症例の場合、その状態は特発性男性不妊症と呼ばれる。不妊症検査を受ける男性の評価中に通常適用される精液試料の標準的なＷＨＯ基準が定められている（表１）。男性が要因である不妊症は、一般的に、１週間及び４週間離して回収される２回の精子分析のうち少なくとも１つの試料での精子濃度及び／又は運動性及び／又は形態の変化として定義される。男性不妊症例のうち最大９０％が、同定可能な原因のない、精子濃度、形態又は機能の異常によるものであり；これは特発性乏精子症と呼ばれることがある。このコホートにおいて、酸化ストレスが精子損傷に関与する重要な要因であると思われる。図１は、男性不妊症における酸化ストレスの役割を図式的に示す。
【０００５】
酸化ストレス（ＯＳ）は、活性酸素種（ＲＯＳ）の生成と内因性抗酸化剤の生成との間のアンバランスを反映し、過剰なＲＯＳがある場合、細胞及び組織に対する損傷が生じ得る。米国からの疫学的データにより、過剰なＲＯＳが男性要因不妊症の主要な原因であり；不妊男性の３０〜４０％で精漿中のＲＯＳレベルが上昇していることが示唆される。精子は、それらの細胞膜が多不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）に富み、それにより脂質過酸化の影響を受け易くなるので、ＯＳに対して特に脆弱である。これは、軸糸損傷を引き起こす細胞内アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の急速な喪失、精子生存能の低下及び中片部精子形態学的欠損の増加につながり、これらは全て、精子運動性の低下に関与する。さらに、精子は細胞内抗酸化剤酵素保護において遺伝的な欠失を有し、殆どの細胞型とは異なり、精子はＤＮＡ損傷検出及び修復のための能力が制限されている。
【０００６】
【表１】
2020527137.tif 000003
【０００７】
ＲＯＳは、精子そのもの及び精子形成中に精巣及び精巣上体内で精子と共局在する好中球などの多形核白血球（ＰＭＮ）の両方により産生され、一般的には前立腺及び精嚢が起源である精漿中で見られる。ＰＭＮは、精子よりも１０００倍前後多いＲＯＳを産生し、放出し得、したがって特発性男性不妊症におけるＯＳの主要な起源であると思われる。活性化好中球と同時温置した精子は、好中球数増加とともに、運動性の濃度関連低下を示す。好中球は、男性生殖器で見られるＰＭＮ集団の６０％前後に相当し、活性化される場合、それらの酸化的バーストの一部としてスーパーオキシド及び過酸化水素を生成させる。さらに、好中球は、生成される過酸化水素を利用して、次亜塩素酸及び他の非常に反応性が高いオキシダントを生成させる、大量のヘム酵素ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）を含有する。これらのオキシダントはヒト細胞に有害であり、したがって精子にダメージを与え、それらの生存能及び機能を変化させる可能性がある。精液ミエロペルオキシダーゼレベルの上昇は、若くて健康な男性における精子濃度低下と関連付けられている。さらに、ミエロペルオキシダーゼは、ＮＥＴｏｓｉｓ中の好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）形成において複合的な役割を果たすことが示されている。ヒト精子は、好中球からのＮＥＴの放出を惹起し得、次いでこれが精子に固く付着するようになり、精子が動けなくなる。前臨床ツールＭＰＯ阻害剤である４−アミノ安息香酸ヒドラジドで好中球を処理すると、精子誘発性ＮＥＴ形成が顕著に低下することが示されている。発明者らの知る限り、不妊男性の処置のためのＭＰＯ阻害剤の使用の研究は今日まで行われていなかった。
【０００８】
特発性不妊症を経験している男性に対する最新の処置計画は、禁煙、アルコールからの脱離、体重の最適化などのライフスタイルのアドバイスで開始し、熱及び環境毒素への精巣の曝露を最小化する。市販の経口ビタミン及び抗オキシダントに基づくサプリメントの選択が利用可能である。これらの治療法の効果を評価するために複数の臨床治験が行われてきた。しかし、これらの多くは小規模であり、ともにそれらは顕著な方法論及び臨床不均一性を呈し、全体的に見て、それらが示した結果はまちまちであった。最近のメタ解析から、不妊男性における経口抗酸化剤の使用によって精子の質及び妊娠率が向上し得ると結論付けられた。しかし、臨床診療を先導するために、個々の抗酸化剤及びそれらの組み合わせの適切な検出力を有するロバストな治験が必要とされる。これらの測定にもかかわらずカップルが依然として妊娠できない場合、細胞質内精子注入（ＩＣＳＩ）又はＩＶＦなどの生殖補助技術が使用される。これらの技術は、侵襲性であり、高価であり、普遍的に利用可能ではない。
【０００９】
したがって、男性不妊、特に、男性特発性不妊症の処置のための新しい選択肢に対する明確なニーズがある。これは、有効性が確立されていない現在の「適用外」療法に照らして特に明らかである。本願の目的は、男性不妊の処置のための新規治療法を提供することである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
特発性男性不妊症において酸化ストレスの有病率が高いこと、好中球が介在する強力なオキシダント生成におけるミエロペルオキシダーゼの役割及び精子誘発性ＮＥＴｏｓｉｓにおけるＭＰＯの役割を示す新たなデータを考慮して、発明者らは、ＭＰＯ阻害剤が、男性不妊の処置又は予防及び特に男性特発性不妊症の処置に対する治療剤としての有用性を有し得ると考える。
【００１１】
したがって、第１の態様において、本願は、男性不妊の処置又は予防での使用のためのミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）阻害剤を提供する。男性特発性不妊症の処置のために、使用のためのＭＰＯ阻害剤が使用され得る。それらの精液試料中の活性酸素種のレベル上昇の同定及び／又は酸化ストレスに対する二次的なものとして起因する精子機能不全ゆえに男性特発性不妊症になる傾向があるものとして判断された対象において、使用のためのＭＰＯ阻害剤が予防的に使用され得る。
【００１２】
第２の態様において、本願は、不妊症の処置又は予防を必要とする男性患者における不妊症の処置又は予防の方法を提供し、この方法には、治療的有効量のＭＰＯ阻害剤をこの患者に投与することが含まれる。必要とする男性患者は、一般的には男性特発性不妊症の患者であるか又は男性特発性不妊症の傾向があるものとして判断される対象であろう。
【００１３】
第３の態様において、本願は、男性不妊の処置又は予防のための薬剤の製造における使用のためのミエロペルオキシダーゼ阻害剤又は薬学的に許容可能なその塩若しくは溶媒和物を提供する。
【００１４】
第４の態様において、本願は、男性不妊の処置又は予防での使用のための、特に男性特発性不妊症での使用のための、ミエロペルオキシダーゼ阻害剤又は薬学的に許容可能なその塩若しくは溶媒和物を含む医薬組成物を提供する。
【００１５】
第５の態様において、ミエロペルオキシダーゼ阻害剤又は薬学的に許容可能なその塩若しくは溶媒和物を含む医薬組成物と、男性特発性不妊症の処置又は予防のための医薬組成物の使用のための説明書と、を含むキットが提供される。
【００１６】
本明細書中に記載及び上記の好ましい態様において、必要としている男性患者は、男性特発性不妊症の患者であるか又は、予防の場合、男性特発性不妊症の傾向があるものとして判断される患者である。
【００１７】
本明細書中に記載及び上記の好ましい態様において、男性患者はヒトである。本発明はまた、非ヒト陸生哺乳動物、例えばイヌ科、ネコ科、ウシ科、ウマ科、イノシシ科、ラクダ科及びシカ科のメンバーにおける男性不妊の処置のためのミエロペルオキシダーゼ阻害剤の使用も提供する。
【００１８】
上記で提供される態様の実施形態において、使用のための、処置の方法での使用のための、薬剤の製造での使用のための、又は医薬組成物中で提供される、ミエロペルオキシダーゼ阻害剤は、精子誘発性ＮＥＴｏｓｉｓを阻害するために適用される。このような実施形態において、患者は、それらの精子の試料の分析により処置についてスクリーニングされ得、精子に対する酸化ストレス誘発性損傷の証拠、例えば低精子数／濃度、精子運動性低下、精子ＤＮＡ断片化の証拠、特発性男性不妊症に関する生殖不能性膿精子症又は高度の精液ＮＥＴｏｓｉｓを示すことが分かった。
【００１９】
上記で提供される態様の実施形態において、使用のための、処置の方法での使用のための、薬剤の製造での使用のための、又は医薬組成物中で提供される、ミエロペルオキシダーゼ阻害剤は、活性酸素種及び／又は下流活性酸素介在産物の産生の阻害を介して酸化ストレスを阻害するために適用される。したがって、使用のための、又は処置の方法での使用のためのＭＰＯ阻害剤は、次亜塩素酸などの次亜ハロゲン酸並びに３−クロロチロシン及び３−ニトロチロシンを含むが限定されない他のＭＰＯ介在産物など、活性酸素種の産生を阻害するために使用され得る。
【００２０】
さらに又は或いは、処置を必要とする患者は、例えば６か月以上の期間にわたる妊娠の可能性があるパートナーとの関係において妊娠に失敗した後、男性特発性不妊症であるとして診断されているものであり得る。予防的介入の場合、それを必要とする患者は、それらの精子の特徴又は他の生理学的パラメーターの分析により、男性特発性不妊症に罹患する傾向に対して分析されているものであり得、例えば、酸化ストレス誘発性精子機能不全又は精液酸化ストレスレベルが異常に高いこと（総抗酸化能の低下、活性酸素種の上昇又は脂質過酸化の増加など）又は亜正常男性妊孕性に関して精液の膿精子症（ＷＨＯ定義による）又は高度の精液ＮＥＴｏｓｉｓを示す、精子試料中のマーカー／特徴の、ある一定のプロファイルがある患者である。
【００２１】
上記で提示される態様の実施形態において、妊孕性回復を必要とする特発性不妊症患者と判断される男性対象において妊孕性を回復させる方法が提供され、この方法は治療的有効量のＭＰＯ阻害剤の投与を含む。一実施形態において、男性特発性不妊症の処置の方法又は男性特発性不妊症患者における妊孕性回復の方法は、精子に対する酸化ストレス誘発性損傷を阻害し、精子誘発性ＮＥＴｏｓｉｓを防ぐための治療的有効量のＭＰＯ阻害剤の投与を含む。
【００２２】
使用のための、処置の方法における使用のための、薬剤の製造における使用のための、又は医薬組成物中で提供される、ミエロペルオキシダーゼ阻害剤は、何れかの既知のＭＰＯ阻害剤から選択され得る。上記態様の好ましい実施形態において、ＭＰＯ阻害剤は、国際公開第２００６０６２４６５Ａ１号パンフレット、同第２００８１５２４２０Ａ１号パンフレット及び／又は同第２０１６０８７３３８Ａ１号パンフレットに記載されるＭＰＯ阻害剤から選択される。
【００２３】
実施形態において、ミエロペルオキシダーゼ阻害剤は、３−［［（２Ｒ）−テトラヒドロフラン−２−イル］メチル］−２−チオキソ−７Ｈ−プリン−６−オン（ＡＺＤ５９０４）又は薬学的に許容可能なその塩若しくは溶媒和物である。
【００２４】
実施形態において、ミエロペルオキシダーゼ阻害剤は、１−（２−イソプロポキシエチル）−２−チオキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−オン又は薬学的に許容可能なその塩若しくは溶媒和物である。
【００２５】
実施形態において、ミエロペルオキシダーゼ阻害剤は、式（Ｉ）の化合物：
【化１】
2020527137.tif 000004
（式中、
Ｒ１はＨ、Ｆ、Ｃｌ又はＣＦ３であり；
Ｒ２はＨ、ＣＨ３又はＣ２Ｈ５であり；
Ｒ３はＨ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、シクロプロピル、シクロプロピルメチル、シクロブチル、シクロブチルメチル又はシクロペンチルである）；
又は薬学的に許容可能なその塩若しくは溶媒和物である。
【００２６】
一実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、
１−｛２−［（１Ｒ）−１−アミノプロピル］−４−クロロベンジル｝−２−チオキソ−１，２，３，５−テトラヒドロ−４Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−４−オン；
１−［２−（１−アミノエチル）−４−クロロベンジル］−２−チオキソ−１，２，３，５−テトラヒドロ−４Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−４−オン；
１−｛２−［（１Ｒ）−１−アミノエチル］−４−クロロベンジル｝−２−チオキソ−１，２，３，５−テトラヒドロ−４Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−４−オン；
１−｛２−［（１Ｓ）−１−アミノエチル］−４−クロロベンジル｝−２−チオキソ−１，２，３，５−テトラヒドロ−４Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−４−オン；
１−｛４−クロロ−２−［１−（メチルアミノ）エチル］ベンジル｝−２−チオキソ−１，２，３，５−テトラヒドロ−４Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−４−オン；
１−｛４−クロロ−２−［（エチルアミノ）メチル］ベンジル｝−２−チオキソ−１，２，３，５−テトラヒドロ−４Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−４−オン；
１−［２−（アミノメチル）−４−クロロベンジル］−２−チオキソ−１，２，３，５−テトラヒドロ−４Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−４−オン；
１−｛４−クロロ−２−［（メチルアミノ）メチル］ベンジル｝−２−チオキソ−１，２，３，５−テトラヒドロ−４Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−４−オン；
１−（２−｛［（シクロブチルメチル）アミノ］メチル｝ベンジル）−２−チオキソ−１，２，３，５−テトラヒドロ−４Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−４−オン；
１−｛２−［（シクロブチルアミノ）メチル］ベンジル｝−２−チオキソ−１，２，３，５−テトラヒドロ−４Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−４−オン；
１−｛２−［（シクロペンチルアミノ）メチル］ベンジル｝−２−チオキソ−１，２，３，５−テトラヒドロ−４Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−４−オン；
１−（２−｛［（２−メチルプロピル）アミノ］メチル｝ベンジル）−２−チオキソ−１，２，３，５−テトラヒドロ−４Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−４−オン；
１−｛２−［（プロパン−２−イルアミノ）メチル］ベンジル｝−２−チオキソ−１，２，３，５−テトラヒドロ−４Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−４−オン；
１−［２−（アミノメチル）−４−（トリフルオロメチル）ベンジル］−２−チオキソ−１，２，３，５−テトラヒドロ−４Ｈ−ピロロ［３，２ｄ］ピリミジン−４−オン；
１−｛２−［（メチルアミノ）メチル］−４−（トリフルオロメチル）ベンジル｝−２−チオキソ−１，２，３，５−テトラヒドロ−４Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−４−オン；及び
薬学的に許容可能なその塩又は溶媒和物から選択される。
【００２７】
式（Ｉ）の化合物の単一エナンチオマーの絶対立体配置（Ｒ又はＳ）が上記の式（Ｉ）の化合物のリストで指定される場合において、問題となっている立体中心（キラル中心）はＲ２が連結される炭素原子である。
【００２８】
本明細書中に記載及び上記のような、男性不妊の処置での使用のための、男性不妊の処置の方法における、男性不妊の処置のための薬剤の製造の方法における、又は男性不妊の処置のための医薬組成物における、４−アミノ安息香酸ヒドラジドは、本明細書中に記載の全ての態様及び実施形態から具体的に放棄される。
【００２９】
「薬学的に許容可能な」という用語は、目的（例えば塩、溶媒和物、剤型、希釈剤又は担体）が患者での使用に適切であることを明示するために使用される。薬学的に許容可能な塩の例の一覧は、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ，Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ  ａｎｄ  Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ／Ｚｕｅｒｉｃｈ：Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ／ＶＨＣＡ，２００２で見出され得る。
【００３０】
本願に記載の化合物及び塩は溶媒和形態及び非溶媒和形態で存在し得る。例えば、溶媒和形態は、ヘミ水和物、一水和物、二水和物、三水和物又はその代替的な量など、水和物形態であり得る。本発明は、ミエロペルオキシダーゼ阻害剤、例えば式（Ｉ）の化合物の全てのこのような溶媒和及び非溶媒和形態を包含する。
【００３１】
「治療」という用語は、その症状の１つ、一部若しくは全てを完全に若しくは部分的に緩和するため、又は基本的な病理を補正するか若しくは代償するために、疾患を取り扱う、その通常の意味を有するものとする。「治療」という用語は、それとは反対の具体的な指示がない限り、「予防」も含む。「治療的」及び「治療的に」という用語は、対応する方式で解釈されるべきである。
【００３２】
「予防」という用語は、その通常の意味を有し、疾患の発症を予防するための一次予防及び、疾患が既に発症している場合の二次予防を含むものとし、患者は、疾患の増悪若しくは悪化又は疾患と関連する新しい症状の発症から一時的又は永久的に保護される。本願による、男性特発性不妊症の傾向があるものとして判断され、したがって予防的処置について指示される対象（すなわち予防を必要とする対象）は、一般に、酸化ストレスに対する二次的なものとして起因するそれらの精液試料中の活性酸素種のレベル上昇及び／又は精子機能不全があるものとして判定される患者であると考えられる。いくつかの実施形態において、男性特発性不妊症に対する素質の判定は、喫煙、アルコール消費、体重及び熱及び環境毒素への精巣の曝露などのライフスタイル因子の組み合わせの分析に由来し得る。
【００３３】
「処置」という用語は、「治療」と同意語として使用される。同様に「処置」という用語は、「治療」が本明細書中で定義されるようなものである場合、「治療を適用する」ものとみなされ得る。
【００３４】
「治療的有効量」という用語は、対象において「治療」を提供するために、又は対象において疾患若しくは障害を「処置する」ために有効である、本明細書中で実施形態の何れかにおいて記載されるようなミエロペルオキシダーゼ阻害剤の量を指す。
【００３５】
ミエロペルオキシダーゼ阻害剤及び薬学的に許容可能なその塩又は溶媒和物は、１つ以上の薬学的に許容可能な希釈剤又は担体を含む医薬組成物として投与され得る。
【００３６】
したがって、一実施形態において、ミエロペルオキシダーゼ阻害剤、例えば３−［［（２Ｒ）−テトラヒドロフラン−２−イル］メチル］−２−チオキソ−７Ｈ−プリン−６−オン、１−（２−イソプロポキシエチル）−２−チオキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−オン又は式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容可能なその塩若しくは溶媒和物と、少なくとも１つの薬学的に許容可能な希釈剤若しくは担体と、を含む医薬組成物が提供される。本組成物は、経口での使用（例えば錠剤、薬用キャンディー、硬又は軟カプセル、水性若しくは油性懸濁液、エマルション、分散性粉末又は顆粒剤、シロップ又はエリキシル剤として）のため、局所使用（例えばクリーム、軟膏、ゲル又は水性若しくは油性溶液又は懸濁液として）のため、吸入（例えば微粉化粉末又は液体エアロゾルとして）による投与のため、吹送法（例えば微粉化粉末として）による投与のため、又は非経口投与（例えば静脈内、皮下又は筋肉内投与のための滅菌水性若しくは油性溶液として）のため、又は直腸投与のための坐剤として適切な形態であり得る。本組成物は、当技術分野で周知である従来の医薬賦形剤を使用して従来の手順により得られ得る。したがって、経口での使用が意図される組成物は、例えば１つ以上の着色剤、甘味料、香味料及び／又は保存剤を含有し得る。いくつかの好ましい実施形態において、ＭＰＯ阻害剤は、経口投与しようとするものである。いくつかの好ましい実施形態において、ＭＰＯ阻害剤は、持続放出形態、例えば経口持続放出形態又は皮下持続放出形態として投与しようとするものである。
【００３７】
一実施形態において、男性不妊の処置での使用のための、ミエロペルオキシダーゼ阻害剤、例えば式（Ｉ）の化合物、３−［［（２Ｒ）−テトラヒドロフラン−２−イル］メチル］−２−チオキソ−７Ｈ−プリン−６−オン（ＡＺＤ５９０４）又は１−（２−イソプロポキシエチル）−２−チオキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−オン又は薬学的に許容可能なその塩若しくは溶媒和物と、少なくとも１つの薬学的に許容可能な希釈剤又は担体と、を含む医薬組成物が提供される。
【００３８】
ミエロペルオキシダーゼ阻害剤は、通常、２．５〜５０００ｍｇ／ｍ２動物の体表面積又はおよそ０．０５〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲内の単位用量で温血動物に投与され、これは通常、治療的有効用量を提供する。錠剤又はカプセルなどの単位剤型は通常、例えば０．１〜５００ｍｇの活性成分を含有する。１日用量は、処置される宿主、特定の投与経路、同時に行われる何れかの治療及び処置している疾病の重症度に依存して必ず変動する。したがって、何れかの特定の患者を処置している医師は最適な投与量を決定し得る。
【００３９】
ＭＰＯ阻害剤が男性特発性不妊症の処置に適切であり得るという仮説を試験するために、下記のようにＤｕｎｄｅｅのＮｉｎｅｗｅｌｌｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌにおいて受胎補助ユニット（ＡＣＵ）に通院する患者から同意を得て回収した男性の診断試料に対して一連のエクスビボ試験を行った。下記のように精子運動性及び機能の様々なパラメーターを評価するために、実験を行った。
【００４０】
本発明が良好に理解され得るように、次の図面を参照する。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】図１は、男性不妊における酸化ストレスの役割を図示する。
【図２】図２は、試験する各患者に関するクリニックから入手可能なアンドロロジーに関するベースライン情報の簡単なまとめを例示する表である（年齢、原発性／二次性不妊症及び不妊の長さ）。カウント図面は百万単位／ｍＬ（Ｍ／ｍＬ）であり、ＷＨＯ参照値は濃度１５Ｍ／ｍＬ、前進性３２％、形態４％、白血球１Ｍ／ｍＬである）。
【図３ａ】図３ａは、棒グラフであり、完全データセットについては、運動性、前進運動性、高速運動性、平均進行方向速度（ＶＡＰ）、直線速度（ＶＳＬ）、曲線速度（ＶＣＬ）及び精子頭部変位（ＡＬＨ）に対する、時間ゼロと２４時間温置後との間のＣＡＳＡ測定の％差異を示す（ｎ＝２９）。３つの条件を測定し；対照としての精子単独（左手カラム、ａ）、ビヒクル対照を伴う、精子と活性化好中球（３：１比）（中央カラム、ｂ）及び精子と活性化好中球（３：１比）＋３μＭ  ＡＺＤ５９０４（右手カラム、ｃ）。Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ試験は、ＡＺＤ５９０４に対する陽性傾向を示し、これは測定した各パラメーターに対して統計学的有意性に達しない（Ｐ＞０．１）。エラーバーは平均の標準誤差に相当する。
【図３ｂ】図３ｂは、次の１８名の被験対象よりもベースライン精子パラメーターにおいてより顕著な異常性がある最初の１１名の対象（図２で青で強調）に対する、ベースラインから温置後２時間及び２４時間の全体的な精子運動性の絶対的変化を示す直線図である。３つの条件を測定した；対照としての精子単独（ａ）、ビヒクル対照を伴う、精子と活性化好中球（３：１比）（ｂ）及び精子と活性化好中球（３：１比）＋３μＭ  ＡＺＤ５９０４（ｃ）。ＡＺＤ５９０４とビヒクル処置群との間の両側スチューデントｔ検定から、統計学的傾向が示された：Ｐ＝０．０９。
【図４】図４は、対照に対する比として表される結果（精子単独）を伴う、完全データセット（ｎ＝２９）に対するＫｒｅｍｅｒ貫入アッセイからの累積的な結果を示す。エラーバーは、平均の標準誤差に相当する。スチューデントｔ検定分析から、薬物なしの群よりも、ＡＺＤ５９０４処置群において１ｃｍで有意に多くの精子が見られたことが示される。Ｐ＝０．０２。
【図５】図５は、４名の「反応者」対象に対する２時間の時点でのＫｒｅｍｅｒ貫入試験からのデータの例を示す。データは、対照に対する比として表す（精子単独）。バーの上の値は、１ｃｍでの実際の精子数を指し；上部の数は試験条件（ビヒクル又はＡＺＤ５９０４）を指し、一方で角括弧中の数は対照数である。Ｘ軸に沿うＲ番号は匿名の患者番号を指す。少なくとも０．２５の変化を個体における意義のある差であるとする。
【図６】図６は、２９名の患者から、及びインビトロ処理条件による、平均ＭＤＡ染色を示す：精子単独（ａ）、精子＋好中球＋ビヒクル対照（ｂ）、精子＋好中球＋ＡＺＤ５９０４（薬物）（ｃ）及び精子＋４ｍＭ  Ｈ２Ｏ２（ｄ）。４ｍＭ  Ｈ２Ｏ２を用いた精子に対する結果では、他の条件よりも有意に多くの染色があった（Ｐ＜０．０１）。エラーバーは平均の標準誤差に相当する。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
材料及び方法
実験設計
得られた各精液試料に対して一連の５回の試験を行った（図２）。精子運動性及び機能の様々なパラメーターを評価するために、このアプローチを使用した。結果の信頼性及び再現性を確実にするために、データ回収前に本方法を検証した。
【００４３】
試験対象／試料回収
ＤｕｎｄｅｅのＮｉｎｅｗｅｌｌｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌの受胎補助ユニット（ＡＣＵ）に通院する男性からの同意を得て、余剰診断男性疾患試料（Ｎ＝２９）を回収した。
【００４４】
材料
・非受精能獲得培地（ｐＨ７．４）：１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２、５．４ｍＭ  ＫＣｌ、０．８ｍＭ  ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、１１６．４  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４．２Ｈ２Ｏ、５．５５ｍＭ  Ｄ−グルコース、２．７３ｍＭピルビン酸ナトリウム、４１．７５ｍＭ乳酸ナトリウム、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．３％ＢＳＡ。
・受精能獲得培地（ｐＨ７．４）：１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２、５．４ｍＭ  ＫＣｌ、０．８ｍＭ  ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、１１６．４ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４．２Ｈ２Ｏ、５．５５ｍＭ  Ｄ−グルコース、２．７３ｍＭピルビン酸ナトリウム、２５ｍＭ乳酸ナトリウム、２６ｍＭ重炭酸ナトリウム、０．３％ＢＳＡ。
・ｓＥＢＳＳ（ｐＨ７．４）：１．０１ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、５．４ｍＭ  ＫＣｌ、０．８ｍＭ  ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、５．５ｍＭ  Ｃ６Ｈ１２Ｏ６、２．５ｍＭピルビン酸ナトリウム、１９ｍＭ乳酸ナトリウム、２５ｍＭ重炭酸ナトリウム、１５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、１１８．４ｍＭ  ＮａＣｌ、０．３％ＢＳＡ。
【００４５】
精液試料調製
禁欲から最短で２日後及び最長で７日後に滅菌プラスチック容器へのマスターベーションによって精液試料を回収した。精液試料は、ＡＣＵにおいて現場で作製し、３０分間（３７℃）液化させた。試料調製前に、各試料から２０μＬの未処理精液を回収し、このうち１０μＬを使用して、清潔なスライドガラス上で精液スメアを調製した（白血球の検査）。試料ごとに２枚のスライドを作製し、スズ箔で包み、必要になるまで−２０℃の冷凍庫で保存した。次に、前に記載のようにＰｅｒｃｏｌｌ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ（ＤＧＣ）によって精液試料を調製した（Ｔａｒｄｉｆ  Ｓ，Ｍａｄａｍｉｄｏｌａ  ＯＡ，Ｂｒｏｗｎ  ＳＧ，Ｆｒａｍｅ  Ｌ，Ｌｅｆｉｅｖｒｅ  Ｌ，Ｗｙａｔｔ  ＰＧ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ２０１４；２９：１０  ２１２３−２１３５）。次に、勾配あたり最大２ｍＬの未処理精液を上部に慎重に重ねた。次に、３００ｇで２０分間、勾配を遠心分離した。精液のみを含有した最上層を１．５ｍＬエッペンドルフチューブに回収した。次に、この層を１７ｘ１０６ｘｇで２０分間遠心分離し、精液層中のあらゆる細胞及び残屑をペレット化して、精液のみが回収されるようにした。次いで、上清を回収し、１７，０００ｘｇで２０分間、再び遠心分離した。上清を回収し、必要になるまで−２０℃冷凍庫で保存した。８０％ＤＧＣ分画からのペレットを回収し、４ｍＬの非受精能獲得培地中で３００ｇにて１０分間洗浄した。次に、上清を廃棄した。ペレットを回収し、１ｍＬ  ｓＥＢＳＳ溶液中で再懸濁し、精子機能分析のために温置した（３７℃）。
【００４６】
好中球単離
凝固を停止させるためにＥＤＴＡを含有するバキュテイナー中にボランティアドナーから血液試料を回収した（Ｚａｍｂｒａｎｏ  Ｆ，Ｃａｒｒａｕ  Ｔ，Ｇａｒｎｅｒ  Ｕ，Ｓｅｉｐｐ  Ａ，Ｔａｕｂｅｒｔ  Ａ，Ｆｅｌｍｅｒ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ  ２０１６；１０６（５）：１０５３−１０６０）。１５ｍＬファルコンチューブに１：１．２の比で血液をＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ  １１１９  （Ｓｉｇｍａ，ＵＫ）と混合した（Ｚａｍｂｒａｎｏ  ｅｔ  ａｌ，２０１６．）。次に、これを８００ｇで２０分間遠心分離した。この後、上清を廃棄し、新鮮なファルコンチューブにペレットを移した。次に、このチューブにリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を１５ｍＬまで満たし、３００ｇで１０分間遠心分離した。最初に１００％保存液を作製するために１８ｍＬ  Ｐｅｒｃｏｌｌに２ｍＬの１０Ｘ  ＰＢＳを添加することによってＰｅｒｃｏｌｌ勾配を調製した。次にこれを１ＸＰＢＳで希釈して、６５％、７０％、７５％、８０％及び８５％の濃度で５つの４ｍＬ  Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配保存液を作製した。次に、１５ｍＬファルコンチューブにおいて、チューブの底部が８５％で上部が６５％になるように、２ｍＬの各勾配濃度を他のものの上に重ねた。１０分間の遠心分離後、上清を再び廃棄し、４ｍＬになるようにＰＢＳでペレットを再懸濁した。次に、密度勾配の上部に２ｍＬの血液を慎重に重ね、８００ｇで２０分間遠心分離した。最上部層を廃棄し、７０〜８０％層を回収し、新鮮なファルコンチューブに移した。次にこのチューブに１５ｍＬまでＰＢＳを満たし、３００ｇで１０分間遠心分離した。上清を廃棄し、２ｍＬの赤血球溶解緩衝液中での洗浄時にペレットを回収した。各回で上清を廃棄してペレットが赤くなくなるまでこの段階を反復した。最後に、１ｍＬのｓＥＢＳＳ中でペレットを再懸濁し、３７℃インキュベーター中に置いた。
【００４７】
ＡＺＤ５９０４又はビヒクルでの精子の処理
１００％ＤＭＳＯ中で薬物の１０ｍＭ保存溶液を作製した。次に希釈剤としてｓＥＢＳＳを使用してこれを連続的に希釈して、３μＭの作業濃度にし、４℃で保存した。次に、薬物又はビヒクルを好中球に添加し、３７℃の水浴中に１０分間置いた。次に、約１：３の比でスパーム−セーフ（ｓｐｅｒｍ−ｓａｆｅ）５ｍＬポリスチレン丸底チューブ（Ｆａｌｃｏｎ）中の精子に好中球を添加した。１μｇ／ｍＬの最終濃度のザイモサンを添加して好中球を活性化し、３７℃で２時間温置した。運動性評価、フローサイトメトリー及びＫｒｅｍｅｒアッセイのために４つの条件を調製した：精子単独、精子＋好中球＋ビヒクル、精子＋好中球＋ＡＺＤ５９０４（薬物）及び精子＋４ｍＭ（最終濃度）過酸化水素（Ｈ２Ｏ２；傷害に対する陽性対照）。
【００４８】
運動性評価
Ｈａｍｉｌｔｏｎ−Ｔｈｏｒｎ  ＣＡＳＡ系を使用して精子運動性を評価した。各条件に対して、少なくとも４か所の異なる視野において全部で２００個の細胞を数えた。試料の運動性が非常に低かった場合、少なくとも１００個の細胞を数えた。好中球との同時温置の開始時（時間０）、２時間後及び２４時間後に運動性パラメーターを評価した。運動性は、各試料に対する各時点について、時間０と２時間後との間の差のパーセンテージ及び時間０と２４時間後との間の差のパーセンテージとして表した。
【００４９】
Ｋｒｅｍｅｒ貫入アッセイ
Ｋｒｅｍｅｒ貫入試験は、粘性媒体を通じた精子細胞の貫入及び泳動能を評価する。この試験は、精子−頸管粘液貫入試験としても知られている。受精能獲得培地中で溶解させた１％メチルセルロースを使用して、頸管粘液代用物を作製した。この溶液に対して３７℃５％ＣＯ２インキュベーター中で２０分間ガス供給を行った。次に、平らな毛細管（Ｒｅｃｔａｎｇｌｅ  Ｂｏｒｏ  Ｔｕｂｉｎｇ、ＣＭ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をメチルセルロース溶液中にさらに２０分間置いて、毛細管に媒体を流入させた。２時間温置後、各条件からの１００μＬを新鮮なスパーム−セーフ（ｓｐｅｒｍ  ｓａｆｅ）チューブに分割した。次に、プラスティシンを用いて各チューブの一方の端部を遮断し、次いで最初に１本の管の開口端を各試験条件に置いた。毛細管を含有する各スパーム−セーフ（ｓｐｅｒｍ  ｓａｆｅ）チューブを３７℃で１時間、５％ＣＯ２とともに温置した。１時間後、毛細管を取り出し、１ｃｍの印の位置で細胞数を手作業で数えた。結果は対照（精子単独）に対する比として表した。
【００５０】
フローサイトメトリー
活性化好中球との２時間温置後、５０μＬのアリコートを全４条件から採取し、１．５ｍＬエッペンドルフチューブに移した。陽性対照としてＨ２Ｏ２を使用した。二次単独対照のための余分なアリコートを精子単独チューブから採取した。１：５０の作業比で抗マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）抗体（ａｂ２７６４２，ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）とともに細胞（二次単独のチューブを除く）を３７℃で０．５時間温置した（Ｍｏａｚａｍｉａｎ  Ｒ，Ｐｏｌｈｅｍｕｓ  Ａ，Ｃｏｎｎａｕｇｈｔｏｎ  Ｈ，Ｆｒａｓｅｒ  Ｂ，Ｗｈｉｔｉｎｇ  Ｓ，Ｇｈａｒａｇｏｚｌｏｏ  Ｐ，Ａｉｔｋｅｎ  ＲＪ．Ｍｏｌ  Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ  ２０１５；２１（６）：５０２−１５）。次に、３００ｇで５分間チューブを遠心分離して細胞をペレット化し、上清を廃棄した。次に、細胞をｓＥＢＳＳで２回洗浄し、各回で上清を廃棄した。次いで、蛍光タグ付加ヤギ抗ウサギ二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、ＵＫ）を１：５０の比で全条件に添加し、チューブを３７℃で１０分間温置した。細胞をペレット化し、上記のように２回洗浄した。最終洗浄後、２５０μＬ  ｓＥＢＳＳ溶液中でペレットを再懸濁し、新鮮なスパーム−セーフ（ｓｐｅｒｍ  ｓａｆｅ）チューブに移した。次に、ＢＤ  ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ細胞分析装置において、予め検証したフローサイトメトリープログラムを使用して、１０，０００個の細胞で各条件におけるＭＤＡ染色レベルを評価した。技術的エラーのため、フローサイトメトリーを使用して１つの試料を評価できなかった。
【００５１】
白血球計数
精液スメアスライドを冷凍庫から取り出し、Ｇｉｅｍｓａ  Ｍａｙ−Ｇｒｕｅｎｗａｌｄ溶液（蒸留水中で１：２０希釈）を満たしたコプリンジャーに５分間入れた。次にスライドをＰＢＳ中で１．５分間洗浄した。次に、スライドを新鮮なＧｉｅｍｓａ  Ｍａｙ−Ｇｒｕｅｎｗａｌｄに２０分間入れ、次いで蒸留水で洗浄した。計数前にこれらを風乾した。試料あたり２枚のスライドからの平均数をとった。４００個の精子と同じ視野中で数えた白血球数を記録し、ＷＨＯ  ２０１０推奨方法に従い、精子濃度を使用して試料白血球濃度を計算した（Ｃｏｏｐｅｒ  ＴＧ，Ｎｏｏｎａｎ  Ｅ，ｖｏｎ  Ｅｃｋａｒｄｓｔｅｉｎ  Ｓ，Ａｕｇｕｒ  Ｊ，Ｂａｋｅｒ  ＨＷＧ，Ｂｅｈｒｅ  ＨＭ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｕｐｄａｔｅ，２０１０；１６（３）：２３１−２４５）。
【００５２】
結果
患者層
図２の表は、試験した各患者に関するクリニックから入手可能なアンドロロジーに関するベースライン情報の簡単なまとめに相当する（年齢、原発性／二次性不妊症及び不妊症の長さ）。未処理及び調製精子パラメーターも記録し、白血球数も記録した。
【００５３】
より詳細に、表は、年齢、カップルが妊娠に挑戦し続けた時間の長さ（不妊の長さ）及び患者の不妊症状態（原発性又は二次性）を表す。ＷＨＯマニュアル（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ．（２０１０）．ＷＨＯ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｍｅｎ，５ｔｈ  ｅｄ．Ｇｅｎｅｖａ：Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）に従いアンドロロジストが手作業で評価した未処理計数を除き、Ｈａｍｉｌｔｏｎ−Ｔｈｏｒｎｅ  ＣＡＳＡ系を使用して、密度勾配遠心分離の前（未処理）及び後（調製）に精液パラメーターを測定した。赤字は、ＷＨＯ２０１０による正常値よりも低いパラメーターとともに示される何れかの試料を指す。白血球数は、未調製精液試料中で見られる白血球の濃度を指す。Ｒ番号は匿名の患者番号を指す。
【００５４】
運動性評価
患者らのアンドロロジー試験日に患者から精液試料を回収し、運動性パラメーターを記録した。各試料は３つの試験条件があり、２４時間にわたり測定した；精子単独、３：１の比の精子と好中球＋ビヒクル対照及び３：１の比の精子と好中球＋３μＭ  ＡＺＤ５９０４。時間０、２時間温置後及び２４時間後に運動性を測定した。図３ａは、時間０の精液パラメーターと２４時間温置後の精液パラメーターとの間の％差を表す。Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ試験から、全体的な精子運動性に対する不具合の軽減においてＡＺＤ５９０４処置についておよそ３０％の有利な相対的効果サイズに対する有意ではない傾向があった（測定した各パラメーターに対してｐ＞０．０１）。経時的な運動性の相違を視覚化するために、試験した最初の１１名の対象に対して全体的な運動性、高速及び前進運動性に対するデータも線グラフとしてプロットしたが、この１１名はベースライン精子パラメーターにおいてより顕著な異常性があった。図３ｂは、試験した患者の運動性に対する経時的な差を示す（Ｎ＝１１）。
【００５５】
Ｋｒｅｍｅｒ貫入アッセイ
Ｋｒｅｍｅｒ貫入試験を使用して粘性媒体に対する貫入能についても各試験対象の精子試料を評価した（Ｎ＝２９）。図４は、精子と活性化好中球＋ビヒクル及び精子と活性化好中球＋ＡＺＤ５９０４に対するコホート平均結果を示す。この結果から、ビヒクル対照で処理した試料と比較して、ＡＺＤ５９０４で処理した試料については粘性媒体への精子貫入の改善が示された。スチューデントｔ検定分析から、薬物なしの群よりも、薬物処理群において１ｃｍで有意に多くの精子が見出されたことが示される（ｐ＝０．０２）。ＡＺＤ５９０４後に精子貫入の臨床的に適切な改善があったと感じることを示す２９名の対象のうち１５名で、ＡＺＤ５９０４での処置に対する個々の反応に変動があった。ＡＺＤ５９０４処置に対する陽性反応者の４例を図５で示す。
【００５６】
フローサイトメトリー
フローサイトメトリーを使用して、２時間温置後にＭＤＡレベルを測定した（Ｎ＝２９）。２時間温置後に４つの条件を測定した；精子単独（対照）、３：１の比の精子と好中球＋ビヒクル対照、３：１の比の精子と好中球＋３μＭ  ＡＺＤ５９０４（薬物）及び４ｍＭ  Ｈ２Ｏ２を伴う精子。図６は、全４つの条件に対する平均ＭＤＡ染色を示す。一元配置ＡＮＯＮＡから、４ｍＭ  Ｈ２Ｏ２を伴う精子が他の試験条件よりも有意によく染色されたことが示された（Ｐ＜０．０１）。
【００５７】
結果の分析
男性におけるその詳細な以前の臨床プロファイリング及びそこで観察された良好な安全性プロファイルにより、代表的なＭＰＯ阻害剤としてＡＺＤ５９０４を選択した。この代表的なＭＰＯ阻害剤で得られる結果は、国際公開第２００６０６２４６５Ａ１号パンフレット（１−（２−イソプロポキシエチル）−２−チオキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−オン（ＡＺＤ３２４１としても知られる）を開示する）、同第２００８１５２４２０Ａ１号パンフレット及び／又は同第２０１６０８７３３８Ａ１号パンフレット（具体的に本明細書中で開示される式（Ｉ）の化合物を記載）に記載の化合物などであるが限定されない他の強力で選択的なＭＰＯ阻害剤でも得られることが予想される。
【００５８】
より詳細には、ＡＺＤ５９０４は、マウス及びラットで同様の効力を有する、ヒトＭＰＯの強力な（ＩＣ５０  １４０ｎＭ）不可逆的阻害剤である。これは、密接に関連するラクトペルオキシダーゼ及び甲状腺ペルオキシダーゼと比較して１０〜１９倍選択的であり；他の酵素、イオンチャネル及び受容体の幅広いパネルに対して＞７０倍である。単離ヒト好中球において、１μＭ阻害ＰＭＡはＨＯＣｌを＞９０％刺激した。ラットにおいて、約５μＭの血漿濃度によって、インサイチュのザイモサン活性化腹膜好中球からのグルタチオンスルホンアミド（グルタチオンとのＨＯＣｌの反応の産物）のインビボ形成が減少した。最大１２００ｍｇ（持続放出で１４００ｍｇ、ＥＲ、処方）の単回投与及び最大３２５ｍｇ  ＴＩＤ（ＥＲ処方で１０日間にわたり６００ｍｇ  ＢＩＤ）の複数回投与で健康なボランティアにＡＺＤ５９０４を経口投与した。全体で、５回の第１相試験で１８１名の対象に投与した。明らかな薬物関連の有害事象はまだ同定されていない。
【００５９】
添付の図面で与えられる精子特性に対するＭＰＯ阻害剤の活性に関連する本願に記載の試験で得られた結果は、男性特発性不妊症に罹患している対象から得た精子に対する代表的なＭＰＯ阻害剤（ＡＺＤ５９０４）の効果を例示する。全部で、２９名の対象からの精子試料を試験した。個々の結果は累積的に可変性の程度を示し、試料サイズが小さい（パイロット試験）にもかかわらず、データは、ビヒクルの場合と比べて、ヒト精子と活性化ヒト好中球との同時温置に対して、ＡＺＤ５９０４の投与から２４時間後の全体的な精子運動性の改善について肯定的な傾向を示す。
【００６０】
Ｋｒｅｍｅｒ貫入試験は、精子運動性に対する薬物の影響を評価するための特に有用な試験である。これは、この試験が、インビボで精子が自然に泳ぐ女性生殖管で見られるものと同様の粘性がある媒体を精子が貫入し、泳ぐ能力について精子を評価するからである（Ｉｖｉｃ  Ａ，Ｏｎｙｅａｋａ  Ｈ，Ｇｉｒｌｉｎｇ  Ａ，Ｂｒｅｗｉｓ  ＩＡ，Ｏｌａ  Ｂ，Ｈａｍｍａｄｉｅｈ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ２００２；１７（１）：１４３−１４９）。精子貫入試験は、精子の機能状態に関する、客観的で定量的及び再現性がある情報を提供し、妊孕性、特に男性が要因の不妊症の価値あるマーカーであることが示されている（Ｅｇｇｅｒｔ−Ｋｒａｕｓｅ  Ｗ，Ｇｅｒｈａｒｄ  Ｉ，Ｔｉｌｇｅｎ  Ｗ，Ｒｕｎｎｅｂａｕｍ  Ｂ．Ｆｅｒｔｉｌ  Ｓｔｅｒｉｌ  １９８９；５２：１０３２−１０４０；Ｅｇｇｅｒｔ−Ｋｒａｕｓｅ  Ｗ，Ｌｅｉｎｈｏｓ  Ｇ，Ｇｅｒｈａｒｄ  Ｉ，Ｔｉｌｇｅｎ  Ｗ，Ｒｕｎｎｅｂａｕｍ  Ｂ．Ｆｅｒｔｉｌ  Ｓｔｅｒｉｌ  １９８９；５１：３１７−３２３；Ｐｏｌａｎｓｋｙ  ＦＦ及びＬａｍｂ  ＥＪ．Ｆｅｒｔｉｌ  Ｓｔｅｒｉｌ  １９８９；５１（２）：２１５−２８；Ｏｌａ  Ｂ，Ａｆｎａｎ  Ｍ，Ｐａｐａｉｏａｎｎｏｕ  Ｓ，Ｓｈａｒｉｆ  Ｋ，Ｂｊｏｒｎｄａｈｌ  Ｌ，Ｃｏｏｍａｒａｓａｍｙ  Ａ．Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ  ２００３；１８（５）：１０３７−４６を参照のこと）。メチルセルロース及び受精能獲得培地を使用して作製した、試験で使用する頸管粘液代替物は、ヒト頸管粘液に対する適切な代理物であることが示されている（Ｉｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ，２００２；Ｔａｎｇ  Ｓ，Ｇａｒｒｅｔｔ  Ｃ，Ｂａｋｅｒ  ＨＷ．Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｐｒｏｄ  １９９９；１４（１１）：２８１２−７）。この予備試験からの結果から、活性化好中球と同時温置した精子の２時間の処理後、ビヒクルと比べてＡＺＤ５９０４処理で精子貫入の統計学的に有意な改善が得られた（ｐ＝０．０２）。個々の対象レベルで、ＡＺＤ５９０４は、試験した患者の５０％余りにおいて臨床的に適切で有益な効果をもたらし（評価した２９名の患者のうち反応者１５名）、一方でさらに８名の対象がより小さい改善を示した。ＡＺＤ５９０４処置に対する陽性反応と関連付けられた表現型又は人口統計学的要因の同定を試みたが、これは試料サイズが小さすぎて可能ではなかった。より多数の対象を含むさらなる研究を継続中である。
【００６１】
ＭＰＯ阻害が精子特性の改善をもたらす効果の正確な機序は依然として確立されていない一方で、運動性試験における差は、２４時間温置後、より明らかであった。
【００６２】
まとめるために、上記で開示される男性特発性不妊症の処置のためのＭＰＯ阻害剤の潜在力の予備試験からの結果により、２４時間後の全体的な精子運動性及びちょうど２時間後の精子貫入の改善に関して、ＭＰＯ阻害剤でのヒト精子のインビトロ処理が、好中球介在性損傷からの精子保護における有益な効果に対する強い傾向と関連があることが示される。２９名の対象のうち１５名において、Ｋｒｅｍｅｒ貫入試験での改善は、臨床的に重要であると裁定され、全体的なＭＰＯ阻害剤処理は、Ｋｒｅｍｅｒ試験での精子貫入の統計学的に有意な改善につながった。これらの結果から、ＡＺＤ５９０４などのＭＰＯ阻害剤が男性特発性不妊症の処置に有用であり得るという提案について強力な裏付けが提供される。これらの最初の研究で得られた結果を確認するための拡大試験を継続中である。
【図１】
2020527137.tif 000008
【図２】
2020527137.tif 000009
【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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2020527137.tif 000016