(57)【要約】  培養下に任意に存在するか、又は作製されるタンパク質など、具体的な関心のある作用物質（ＡＯＩ）を「取り出す」ため、糖結合モジュール（ＣＢＭ）及びナノ結晶セルロース（ＣＮＣ）の特徴を組み合わせて利用する方法を開示する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体混合物から異種タンパク質（ＨＰ）を単離する方法であって、
・少なくとも１つの糖結合モジュール及び少なくとも１つのＨＰのキメラ（ＣＢＭ−ＨＰキメラ）を含む粗混合物を第１ろ過膜に通して、前記ＣＢＭ−ＨＰキメラを含む透過液を得ることと；
・前記ＣＢＭ−ＨＰキメラをセルロースナノ結晶（ＣＮＣ）と接触させて、前記ＣＢＭ−ＨＰキメラと相互作用させ、ＣＢＭ−ＨＰ−ＣＮＣ複合体を含む混合物を得ることと；
・前記ＣＢＭ−ＨＰ−ＣＮＣ複合体を含む前記混合物を第２ろ過膜に通して、前記ＣＢＭ−ＨＰ−ＣＮＣ複合体を含む保持液を得ることと；
・前記ＣＢＭ−ＨＰ−ＣＮＣ複合体から、前記ＨＰ及び／又は前記ＣＢＭ−ＨＰキメラを分離することと；を含み、
同じ、又は異なる前記第１及び第２ろ過膜が、前記ＣＢＭ−ＨＰキメラを透過させ、前記ＣＢＭ−ＨＰ−ＣＮＣ複合体の透過を妨げるように選択される細孔径を有する、方法。
【請求項２】
粗混合物に前記ＣＢＭ−ＨＰキメラを得ることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記粗混合物が核酸、タンパク質、炭水化物、ポリフェノール及び巨大非重合体分子から選択される、少なくとも１つの他の物質をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記粗混合物が、細胞培養物に含有される細胞の前記細胞膜を破壊することにより形成されるホモジネートである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＣＢＭ−ＨＰキメラが、宿主細胞において作製されるか、又は発現する、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記ＣＢＭ−ＨＰキメラが植物細胞において作製される、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記ＣＢＭ−ＨＰキメラを単離することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＨＰを単離することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＣＢＭ−ＨＰキメラ、及びその後そこから前記ＨＰを単離することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１つの関心のある作用物質（ＡＯＩ）を含む液体培地を、前記ＣＢＭ−ＨＰキメラを用い、前記少なくとも１つのＡＯＩ及び前記ＣＢＭ−ＨＰキメラ間に会合を生じさせる条件下で処理して、ＣＢＭ−ＨＰ−ＡＯＩ複合体を含む混合物を得ることをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＣＢＭ−ＨＰ−ＡＯＩ複合体から前記ＡＯＩを単離することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＣＢＭがセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１及び第２ろ過膜が同じである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＣＢＭ−ＨＰキメラがＣＢＤ−ＨＰキメラである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＨＰが関心のある作用物質を単離する方法における使用に好適な形態で単離される、請求項８に記載の方法。
【請求項１６】
液体混合物から関心のある作用物質（ＡＯＩ）を単離する方法であって、
・請求項１に記載の方法により、ＣＢＭ−ＨＰキメラを得ることと；
・少なくとも１つのＡＯＩを含む液体培地を前記ＣＢＭ−ＨＰキメラを用い、前記少なくとも１つのＡＯＩ及びＣＢＭ−ＨＰキメラ間に会合を生じさせる条件下で処理して、ＣＢＭ−ＨＰ−ＡＯＩ複合体を含む混合物を得ることと；
・ＣＮＣを前記ＣＢＭ−ＨＰ−ＡＯＩ複合体を含む混合物に添加して、ＣＮＣ−ＣＢＭ−ＨＰ−ＡＯＩ複合体を形成することと；
・前記ＣＮＣ−ＣＢＭ−ＨＰ−ＡＯＩ複合体を含む前記混合物を、前記ＣＮＣ−ＣＢＭ−ＨＰ−ＡＯＩ複合体を透過させない細孔径を有するろ過膜に通して、前記ＣＮＣ−ＣＢＭ−ＨＰ−ＡＯＩ複合体を含む保持液を得ることと；
・前記複合体から前記ＡＯＩを単離することと、を含む方法。
【請求項１７】
液体混合物から関心のある作用物質（ＡＯＩ）を単離する方法であって、
・少なくとも１つのＡＯＩを含む液体培地をＣＢＭ−ＨＰキメラを用い、前記少なくとも１つのＡＯＩ及びＣＢＭ−ＨＰキメラ間に会合を生じさせる条件下で処理して、ＣＢＭ−ＨＰ−ＡＯＩ複合体を含む混合物を得ることと；
・ＣＮＣを前記ＣＢＭ−ＨＰ−ＡＯＩ複合体を含む前記混合物に添加して、ＣＮＣ−ＣＢＭ−ＨＰ−ＡＯＩ複合体を形成することと；
・前記ＣＮＣ−ＣＢＭ−ＨＰ−ＡＯＩ複合体を含む前記混合物を、前記ＣＮＣ−ＣＢＭ−ＨＰ−ＡＯＩ複合体を透過させない細孔径を有するろ過膜に通して、前記ＣＮＣ−ＣＢＭ−ＨＰ−ＡＯＩ複合体を含む保持液を得ることと；
・前記複合体から前記ＡＯＩを単離することと、を含む方法。
【請求項１８】
前記ＡＯＩを含む培地を得ることをさらに含み、前記ＡＯＩがこの培地から単離される、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＣＢＭ−ＨＰキメラを含む培地を得ることをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＣＢＭがセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）である、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＣＢＭ−ＨＰキメラがＣＢＤ−ＨＰキメラである、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＣＢＭ−ＨＰ−ＡＯＩ複合体を単離することを含む、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＣＮＣ−ＣＢＭ−ＨＰ−ＡＯＩ複合体の形成後、前記ＣＢＭ−ＨＰキメラを単離することをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＣＮＣ−ＣＢＭ−ＨＰ−ＡＯＩ複合体を含む前記混合物が、前記ＣＮＣ−ＣＢＤ−ＨＰ−ＡＯＩ複合体から前記ＡＯＩを単離する前に、透析又はろ過によりさらに精製される、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項２５】
同じ、又は異なる前記第１ろ過膜及び前記第２ろ過膜が、それぞれ０．２μｍから６０ｋＤａ分子量カットオフの間の細孔径を有する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記第１及び第２ろ過膜が同じである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ろ過膜が、０．２μｍから６０ｋＤａ分子量カットオフの間の細孔径を有する、請求項１６〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記細孔径が０．４５μｍから６０ｋＤａ分子量カットオフの間である、請求項２５又は２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記細孔径が、１μｍから５０ｋＤａ分子量カットオフの間である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記細孔径が０．２μｍである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＣＢＭがＣＢＤであり、ＣＢＭ２〜１３、ＣＢＭ１６〜１７、ＣＢＭ２０〜２８、ＣＢＭ４０〜４６及びＣＢＭ６１〜６７から選択される、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＣＢＤがＣＢＤ機能性誘導体である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＨＰが１つ以上のＣＢＤと会合する、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＣＢＤが１つ以上のＨＰと会合し、各ＨＰが任意に互いに異なり得る、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記キメラの前記ＨＰ部が、さらなるタンパク質と融合するか、又は結合する、請求項１又は１５に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＣＢＭ−ＨＰキメラの前記ＨＰ部が、その後にＣＢＭと結合する他の要素とのキメラとして調製される、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＣＢＭ−ＨＰキメラにおいて、前記ＨＰが、任意に前記ＣＢＭに直接付着する、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＣＢＭ−ＨＰキメラの前記ＨＰが、他のドメイン又は相互作用により前記ＣＢＭと結合する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＣＤＭ−ＨＰキメラが少なくとも１つのリンカーを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＣＢＭが、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＥＥＵ００２６５．１を有するＣＢＤである、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＣＮＣが、少なくとも５０％の結晶化度を有することを特徴とする、請求項１〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＣＮＣが単結晶である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＣＮＣが最大でも長さ約１，０００μｍである、請求項１〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記ＡＯＩがＨＰとの親和性を有する、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項４５】
前記ＡＯＩが、前記ＨＰが抗体、受容体、酵素、基質又はその断片であるアミノ酸系作用物質；前記ＨＰが核酸結合タンパク質又はその断片である核酸系作用物質；前記ＨＰと親和結合することができるペプチド部分を有する糖類、脂肪酸あるいは有機分子から選択される、請求項４４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は概して、ナノ結晶セルロース（ＣＮＣ）のタンパク質−セルロース結合ドメインキメラに対する親和結合を用い、例えば液体細胞培養混合物から、タンパク質などの物質を単離する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＢＭは、様々な有機体に見出される糖結合モジュールである（非特許文献１）。セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）は、ＣＢＭの一例である。ＣＢＤｃｌｏｓ（非特許文献２）は、細菌のクロストリジウムセルロボランス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ）から単離されるタンパク質ドメインである。ＣＢＤｃｌｏｓは、セルロースと強く結合し、安定しているが可逆的な結合を形成する。この結合はせん断力、並びに酸性及び塩基性ｐＨ（ｐＨ４〜１０）、塩度（１０ｍＭから飽和ＮａＣｌ）の穏やかな変化に耐えることができる。ＣＢＤは、以前からセルロースカラムによるタンパク質精製に用いられている（非特許文献６）。しかしながら、表面積が広いクロマトグラフィに好適な利用できるセルロースビーズ、高流速及び高圧に耐える能力の欠如により、その適用は限定される。
【０００３】
ナノ結晶セルロース（ＣＮＣまたはＮＣＣ））粒子は小さく（〜３００ｎｍ）、様々な方法によりセルロースから作製される高アスペクト比の晶子である（非特許文献３〜５）。各粒子は、１０個超のＣＢＤｃｌｏｓドメインと結合することができる。この物質は無毒で、完全に安全である。ｐＨ変化（１〜１３）及び高せん断力に対してもかなり安定しており、安価で、広く利用できる物質である。
【０００４】
米国特許第５８５６２０１号明細書（特許文献１）は、結晶セルロースに対する、並びにＣＢＤ及び第２のタンパク質の融合タンパク質に対するセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）タンパク質の高親和性、並びにこの融合産物を用いたアフィニティ分離の方法を開示している。
【０００５】
クロスフローろ過プロセスは、単純な（デッドエンド）膜ろ過プロセスを改良したものである。膜表面に垂直の高せん断乱流を起こすことにより、膜表面に形成するゲル層を除くことができるため、流束及び作業時間を改善することができる（特許文献２）。膜クロスフローろ過は、乳製品、果物及び野菜ジュース、飲料、ビール、ワインなどの浄化及び濃縮のため、食品産業において非常に大規模（１００ｍ３／日）に使用されている。さらなる大規模な適用は血液製剤及び廃棄物処理である（特許文献２）。膜カットオフに応じて、クロスフローろ過膜は、塩イオン（逆浸透）から砂粒子まで、幅広いサイズの粒子を除去することができる。非常に乾燥した固形分（６０ｇｔ／１００ｇｒ−１）及び粘度で、動作することもできる（非特許文献７）。しかし、膜プロセスは、著しく大きさが異なる微粒子又はタンパク質の分離のため、主に比較的粗い上流の精製段階に用いられる。効率的な分離には、分離された実体間に、１桁（１０倍）のサイズ差が必要とされる（非特許文献８）。このため、類似の大きさのタンパク質又は粒子の集団から特定の実体を分離することが必要とされる場合、この方法を下流の精製及び研磨に用いることは制限される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第５８５６２０１号明細書
【特許文献２】Marinaccio, P. J.; Repetti, R. V., Cross-flow filtration. Google Patents: 1989.
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Shoseyov, O.; Shani, Z.; Levy, I., Carbohydrate binding modules: biochemical properties and novel applications. Microbiology and Molecular Biology Reviews 2006, 70 (2), 283-295.
【非特許文献２】Goldstein, M. A.; Takagi, M.; Hashida, S.; Shoseyov, O.; Doi, R.; Segel, I., Characterization of the cellulose-binding domain of the Clostridium cellulovorans cellulose-binding protein A. Journal of bacteriology 1993, 175 (18), 5762-5768.
【非特許文献３】Charreau, H.; L Foresti, M.; Vazquez, A., Nanocellulose patents trends: a comprehensive review on patents on cellulose nanocrystals, microfibrillated and bacterial cellulose. Recent patents on nanotechnology 2013, 7 (1), 56-80.
【非特許文献４】Rebouillat, S.; Pla, F., State of the art manufacturing and engineering of nanocellulose: a review of available data and industrial applications. 2013.
【非特許文献５】Peng, B.; Dhar, N.; Liu, H.; Tam, K., Chemistry and applications of nanocrystalline cellulose and its derivatives: a nanotechnology perspective. The Canadian Journal of Chemical Engineering 2011, 89 (5), 1191-1206.
【非特許文献６】Shpigel, E.; Goldlust, A.; Eshel, A.; Ber, I. K.; Efroni, G.; Singer, Y.; Levy, I.; Dekel, M.; Shoseyov, O., Expression, purification and applications of staphylococcal Protein A fused to cellulose‐binding domain. Biotechnology and applied biochemistry 2000, 31 (3), 197-203.
【非特許文献７】Daufin, G.; Escudier, J.-P.; Carrere, H.; Berot, S.; Fillaudeau, L.; Decloux, M., Recent and emerging applications of membrane processes in the food and dairy industry. Food and Bioproducts Processing 2001, 79 (2), 89-102.
【非特許文献８】Cheryan, M., Ultrafiltration and Microfiltration Handbook. Taylor & Francis: 1998.
【非特許文献９】Azevedo, A. M.; Rosa, P. A.; Ferreira, I. F.; Aires-Barros, M. R., Chromatography-free recovery of biopharmaceuticals through aqueous two-phase processing. Trends in biotechnology 2009, 27 (4), 240-247.
【非特許文献１０】Thommes, J.; Etzel, M., Alternatives to chromatographic separations. Biotechnology progress 2007, 23 (1), 42-45.
【非特許文献１１】Forsgren, A.; Sjoquist, J., “Protein A” from S. aureus I. Pseudo-immune reaction with human γ-globulin. The Journal of Immunology 1966, 97 (6), 822-827.
【非特許文献１２】Updyke, T. V.; Nicolson, G. L., Immunoaffinity isolation of membrane antigens with biotinylated monoclonal antibodies and immobilized streptavidin matrices. Journal of immunological methods 1984, 73 (1), 83-95.
【非特許文献１３】Stols, L.; Gu, M.; Dieckman, L.; Raffen, R.; Collart, F. R.; Donnelly, M. I., A new vector for high-throughput, ligation-independent cloning encoding a tobacco etch virus protease cleavage site. Protein expression and purification 2002, 25 (1), 8-15.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
高純度、従って高選択性が必要とされるクロマトグラフィ分離プロセス（カラムクロマトグラフィ）が利用されており、基本的にバイオ医薬品業界におけるタンパク質分離の主力である。しかし、クロマトグラフィプロセスは高価（全下流コストの＞７０％を占める（非特許文献９））で、長時間を要し、上流で複雑な調製を必要とする。規模拡大のコスト及び複雑さのため、高容量プロセスには適さない。大量の高純度タンパク質の必要性が増すに伴い、代替精製方法の需要が増している（非特許文献１０）。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の発明者は、糖結合モジュール（ＣＢＭ）及びナノ結晶セルロース（ＣＮＣ）の特徴を組み合わせて利用する方法を開示する。この方法は、任意に培養下に存在するか、又は作製される特定の関心のある作用物質（ＡＯＩ）、例えばタンパク質（ＰＯＩ−関心のあるタンパク質）を「取り出す」ものである。本方法は、細胞培養下における、異種タンパク質（ＨＰ）に付着したＣＢＭ、又はＨＰへの強い親和性を有するアフィニティドメインを含むＣＢＭ−タンパク質キメラの発現、その後の一連のろ過工程に基づいている。ＣＢＭ−ＨＰキメラのＣＢＭ部にＣＮＣが付着することで、最終的に所望のタンパク質を単離することができる。ここに記載するように、タンパク質は純粋、又は実質的に純粋な形態で単離され得るか、あるいは融合産物として単離され得る。
【００１０】
本発明の方法は、中空繊維、クロスフローろ過、その他のろ過装置及び技術を用い、短時間で、経済的及び効率的な３段階の精製／単離方法を行うことができる。本方法は、ＣＢＭ、及びタンパク質などのＡＯＩ、例えば異種タンパク質（ＨＰ）から構成されるキメラが、巨大タンパク質／ＣＮＣ付加物を作製することにより、キメラのＣＢＭ部を介して、ＣＮＣに可逆的に結合することに基づき、この付加物はろ過により汚染物質から分離され、その後「そのまま」用いることができる。ＣＢＭ−ＡＯＩ、例えばＣＢＭ−タンパク質キメラ又はＣＢＭ−ＨＰキメラは、様々な手段、例えばｐＨ変化、又はタンパク質分解により、ＣＮＣ粒子から放出され得、また、タンパク質、例えばＨＰは、後述の様々な開裂又は分離技術により、ＣＢＭからさらに分離され得る。
【００１１】
本発明は、中空繊維分離プロセス及びクロマトグラフィ分離プロセスの両方の長所を組み合わせる点で有利である。これにより、通常アフィニティクロマトグラフィでのみ見られる非常に高い選択性を提供すると同時に、広範囲のタンパク質及び微粒子物質を含む非常に大量の溶液を取り扱うことができる。ここで記載された方法は、カラム充填の必要性、並びに高圧、低流速及び目詰まりなどの関係する制約を回避する。アフィニティクロマトグラフィにおいて、樹脂の標的タンパク質に対する結合能力は、樹脂１グラム当たり数十ミリグラムまでであるが、本発明においては、ＣＮＣ１ｇｒ当たり数百ミリグラムに達する。さらに、精密ろ過を用いながら、保持液に標的タンパク質を選択的に保持する能力は、通常、高圧、比較的低いろ過率及び目詰まりの問題を伴う限外ろ過と比べ、大きな長所である。
【００１２】
従って、その一態様において、本発明は、液体混合物から異種タンパク質（ＨＰ）などのタンパク質を単離する方法を提供し、この方法は、
・ＣＢＭ−タンパク質キメラ、例えばＣＢＭ−ＨＰキメラを含む粗混合物を第１ろ過膜に通して、ＣＢＭ−タンパク質、例えばＣＢＭ−ＨＰを含む透過液を得ることと（一方で、保持液に廃棄することができる高分子量又はサイズの大きな不純物を残すこと）；
・このキメラ、例えばＣＭＢ−ＨＰをＣＮＣと接触させて、例えばＣＢＭ−ＨＰキメラと相互作用させ、キメラ−ＣＮＣ複合体、例えばＣＢＭ−ＨＰ−ＣＮＣ複合体を含む混合物を得ることと；
・キメラ−ＣＮＣ複合体、例えばＣＢＭ−ＨＰ−ＣＮＣ複合体を含む混合物を第２ろ過膜でろ過して、この複合体を含む保持液を得ることと；
・タンパク質、つまりＨＰを単離するため、ＣＢＭ−ＨＰ−ＣＮＣ複合体からＣＢＭ−ＨＰ及び／又はＨＰを任意に分離することと；を含み、
第１及び第２ろ過膜のそれぞれが同じ又は異なり、ＣＢＭ−タンパク質キメラを透過（あるいはろ過又は通過）させ、複合体の透過を妨げる（又は阻む）ように選択される細孔径を有する。
【００１３】
いくつかの実施形態において、本発明は、液体混合物から異種タンパク質（ＨＰ）を単離する方法を提供し、この方法は、
・ＣＢＭ−ＨＰキメラを含む粗混合物を、第１ろ過膜に通し、ろ過して、ＣＢＭ−ＨＰを含む透過液を得ることと（一方で、保持液に廃棄することができる高分子量又はサイズが大きな不純物を残す）；
・ＣＢＭ−ＨＰキメラをＣＮＣと接触させて、ＣＢＭ−ＨＰキメラと相互作用させ、ＣＢＭ−ＨＰ−ＣＮＣ複合体を含む混合物を得ることと；
・ＣＢＭ−ＨＰ−ＣＮＣ複合体を含む混合物を、第２ろ過膜に通し、ろ過して、ＣＢＭ−ＨＰ−ＨＰ−ＣＮＣ複合体を含む保持液を得ることと；
・任意にＣＢＭ−ＨＰ−ＣＮＣ複合体からＣＢＭ−ＨＰ及び／又はＨＰを分離することと；を含み、
第１及び第２ろ過膜のそれぞれが同じ又は異なり、ＣＢＭ−ＨＰキメラを透過（あるいはろ過又は通過）させ、ＣＢＭ−ＨＰ−ＣＮＣ複合体の透過を妨げる（又は阻む）ように選択される細孔径を有する。
【００１４】
いくつかの実施形態において、第１及び第２ろ過膜は同じであり、いくつかの実施形態において、本方法では、単一膜が用いられる。
【００１５】
いくつかの実施形態において、第１及び第２ろ過膜は中空繊維膜から選択される。
【００１６】
いくつかの実施形態において、第１及び第２ろ過膜は精密ろ過膜である。
【００１７】
いくつかの実施形態において、ろ過膜は０．２μｍから６０ｋＤａの細孔径を有する。
【００１８】
いくつかの実施形態において、本方法は粗混合物にＣＢＭ−ＨＰキメラを得ることを含む。いくつかの実施形態において、ＣＢＭ−ＨＰは宿主細胞、例えば植物細胞で作製される／発現する。いくつかの実施形態において、ＣＢＭ−ＨＰは植物由来である。
【００１９】
いくつかの実施形態において、本方法はＣＮＣをＣＢＭ−ＨＰキメラを含有する透過液に、ＣＢＤ−ＨＰキメラ及びＣＮＣ間を相互作用させる条件下で添加することを含み、これによりＣＢＭ−ＨＰ−ＣＮＣ複合体を含む混合物が得られる。
【００２０】
一般的に「異種タンパク質」という用語は、タンパク質を作製する有機体と比較して、同じ又は異なる有機体由来のタンパク質を指す（例えば、異種発現システムにおいて、ほ乳類のタンパク質をコードするベクターを用いて形質転換されるか、又は形質導入される細菌細胞株）。通常、異種タンパク質は、組み換えＤＮＡ技術により、タンパク質をコードするＤＮＡを、宿主生物（例えば、酵母宿主細胞）を形質転換するために用いられる発現ビヒクルに挿入することにより作製される。異種タンパク質のいくつかの非限定例は、酵素（例えば、核酸修飾酵素）及びその基質結合ドメイン、プロテアーゼ、リンホカイン、インターフェロン、ホルモン及びホルモン前駆体、ポリペプチド、ペプチド、抗体及び抗体断片、抗原、抗原エピトープ及びその変異体、ＤＮＡ結合タンパク質、受容体及びその断片、ウイルス抗原又は免疫原、並びに該タンパク質の供給源である有機体とは異なる宿主生物で発現することができる任意のポリペプチド及び糖タンパク質である。従って、キメラは、ＣＢＭ、並びに酵素（例えば、核酸修飾酵素）及びその基質結合ドメイン、プロテアーゼ、リンホカイン、インターフェロン、ホルモン及びホルモン前駆体、ポリペプチド、ペプチド、抗体及び抗体断片、抗原、抗原エピトープ及びその変異体、ＤＮＡ結合タンパク質、受容体及びその断片、ウイルス抗原又は免疫原、該タンパク質及びその他の供給源である有機体とは異なる宿主生物で発現することができる任意のポリペプチド及び糖タンパク質その他のいずれか１つ又は複数の間で形成され得る。
【００２１】
ＨＰは粗混合物又は培地に存在し得、通常、不純物である作用物質、競争反応産物、細胞残屑及び／又は様々な物質も含む「液体混合物」の形態である。不純物からＨＰ（又は以下に示すような関心のある作用物質）が選択的に単離されるが、不純物は以下の有機化合物（例えば、タンパク質、核酸）、細胞、細胞成分（高分子、細胞残屑）、ポリフェノールなどの小分子；アルカロイド；細胞壁成分などの不溶物（例えば、セルロース、リグニン）；ウイルス；細菌；粉塵粒子；塩；農薬；並びにデンプン及びグリコーゲンなどの重合体のいずれか１つ又は複数を含み得る。
【００２２】
ここで用いられるように、「ＣＢＭ−ＨＰキメラ」（融合タンパク質と置き換え可能に用いられる）は一般的に、少なくとも２つのタンパク質を結合することにより作製されるタンパク質を指し、１つがＣＢＭ、もう１つがＨＰである。ＣＢＭは糖結合モジュールであり、糖質関連酵素内に連続するアミノ酸配列を有し、目立たない折りたたみは糖結合活性を有する。ＣＢＭのいくつかの非限定例は、糖結合モジュールファミリー１から８３である。これらは当分野で公知であり、酵素の構造的に関連する触媒及び糖結合モジュール又は機能ドメインのファミリーについてＣＡＺｙデータベースで入手できる。ＣＢＭは、基質特異性に相当な変化を示し得るため、様々な親和性で単糖などの分子（例えば、ガラクトース、ラクトース、アラビノース）、グリコシド結合、及び多糖（例えば、セルロース、グルコマンナン、キシラン、デンプン、キチン）に結合する。
【００２３】
いくつかの実施形態において、ＣＢＭはセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）である。
【００２４】
ＣＢＤは、連続するアミノ酸配列モジュールであり、セルロース／結晶セルロースと結合することができるタンパク質内に見出される。本発明によりＣＢＤ−ＨＰキメラを作製する場合、ＣＢＤはタンパク質のＣ末端又はＮ末端に付着し得る。本発明のＣＢＭ−ＨＰキメラは、いくつかの実施形態においてＣＢＤ−ＨＰキメラであり、約０．５μＭから約５μＭのセルロース結合親和性（解離定数［Ｋｄ］により測定される）を有する。結合親和性は、ｐＨ値のある範囲にわたって、及び様々な緩衝条件下で維持され得、結合親和性は、例えばｐＨを約１１超に高めることにより逆転させることができ、例えばＣＢＤをＣＢＤと結合したＣＮＣから放出する。
【００２５】
ＨＰは１つ以上のＣＢＤ単位（例えば、ＨＰのＣ末端に１つのＣＢＤ単位、及びＨＰのＮ末端に別のＣＢＤ単位）を含み得る。本発明によれば、断片、誘導体、変異体又は修飾がＣＮＣ結合性を保持しさえすれば、ＣＢＤタンパク質は、例えばhttp://www.cazy.org/carbohydrate-binding-modules.htmlで利用できるＣＡＺｙデータベースに記載されたタンパク質又はタンパク質ドメインのいずれかの変異体、誘導体、断片又は化学修飾であり得る。いくつかの実施形態において、各ＣＢＤ単位は、同じか異なり得る１つ又は複数のＨＰと会合し得る。
【００２６】
いくつかの実施形態において、ＣＢＤタンパク質はＣＢＤ機能的ホモログであり、http://www.cazy.org/carbohydrate-binding-modules.htmlに記載されたＧｅｎＢａｎｋ受託番号を有するアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％又は９５％の相同性を有する。「相同性」という用語は一般的に、参照配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ配列番号）との相補性の程度を指し、ある配列は参照配列との部分的相同性（例えば、７０％の相同性）又は完全な相同性（つまり、１００％同一性）を示し得る。「Ｘ％の相同性」（例えば７０％の相同性）という用語は、タンパク質の全長にわたってＸ％の相同性を有する配列に限定されない。このように、７０％の相同性は、特定された機能領域に存在する相同性を含むことも意図される。
【００２７】
いくつかの実施形態において、ＣＢＤは、当技術分野で公知のＣＢＭ２〜ＣＢＭ１３、ＣＢＭ１６〜ＣＢＭ１７、ＣＢＭ２０〜ＣＢＭ２８、ＣＢＭ４０〜ＣＢＭ４６、及びＣＢＭ６１〜ＣＢＭ６７から選択される。完全を期すために、http://www.cazy.org/carbohydrate-binding-modules.htmlで提供されるＣＡＺｙデータベースは、その全体が参照によりここに組み込まれる。
【００２８】
いくつかの実施形態において、機能領域は、高親和性で可逆的にセルロースと結合する能力を有する明確なアミノ酸セットである。いくつかの実施形態において、機能領域は約２００のアミノ酸からなる。いくつかの他の実施形態において、機能領域は約１８５のアミノ酸からなる。いくつかの他の実施形態において、機能領域は約５０のアミノ酸からなる。
【００２９】
いくつかの実施形態において、ＣＢＤタンパク質は、ＧｅｎＢａｎｋ番号がＥＥＵ００２６５．１であり、配列がQLNLKVEFYNSNPSDTTNSINPQFKVTNTGSSAIDLSKLTLRYYYTVDGQKDQTFWCDHAAIIGSNGSYNGITSNVKGTFVKMSSSTNNADTYLEISFTGGTLEPGAHVQIQGRFAKNDWSNYTQSNDYSFKSASQFVEWDQVTAYLNGVLVWGKEPGGSVVPSTQPVTTPPATTKPPATTIPPTである、ルミニクロストリジウムサーモセラム（Ｒｕｍｉｎｉｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）のアミノ酸配列を有する。
【００３０】
いくつかの実施形態において、ＣＢＤはＣＢＤ機能性誘導体である。
【００３１】
ここで用いられるように、「ＣＢＤ機能性誘導体」という用語は、上記ＧｅｎＢａｎｋ配列に示されるＣＢＤタンパク質アミノ酸配列の任意の「断片」、「変異体」、「類似体」又は「化学的誘導体」を指し、高親和性で可逆的にセルロースと結合する能力を保持する。
【００３２】
いくつかの実施形態において、ＣＢＤ機能性誘導体は、長さが約２から約１６０のアミノ酸である。いくつかの他の実施形態において、ＣＢＤ機能性誘導体は、長さが約２５から約１２５のアミノ酸である。さらに他の実施形態において、ＣＢＤ機能性誘導体は、長さが約５０から約１００のアミノ酸である。
【００３３】
ここで用いられるように、一般的に「断片」という用語は、ここで定義されるＣＢＤタンパク質由来のＣＢＤタンパク質を指し、天然に存在する配列を有する。いくつかの実施形態において、ＣＢＤ断片は、完全長ＣＢＤタンパク質のタンパク質分解開裂により作製される。他の実施形態において、Ｃ末端、Ｎ末端、及び／又は天然に存在する配列内の１つ又は複数の部位で、１つ又は複数のアミノ酸を欠失させることにより、ＣＢＤタンパク質をコードするＤＮＡ配列を適切に修飾させて、ＣＢＤ断片が組換え技術により得られる。本発明によれば、ここに記載された、例えばＣＤＢ−ＨＰキメラを作製するのに用いられるＣＢＤの断片は、高親和性で可逆的にセルロースと結合する能力についてスクリーニングされて、機能性誘導体の固有性又は有用性を決定し得る。
【００３４】
「変異体」は、天然に存在する分子のアミノ酸配列、グリコシル化パターン、又は他の特徴が共有結合的、又は非共有結合的に修飾されている分子であり、突然変異体を含むことが意図される。変異体のいくつかの非限定例としては、最終構築物が高親和性で可逆的にセルロースと結合する所望の能力を保持する限り、アミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入が挙げられる。
【００３５】
ＣＢＤタンパク質におけるアミノ酸置換は、関係する残基の極性、帯電、溶解性、疎水性、親水性及び／又は両親媒性における類似性に基づき成され得る。例えば、負に帯電したアミノ酸としてはアスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられ；正に帯電したアミノ酸としてはリシン及びアルギニンが挙げられ；類似の親水性値を有する非帯電極性頭部基又は非極性頭部基を備えたアミノ酸としては、以下のロイシン、イソロイシン、バリン；グリシン、アラニン；アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；フェニルアラニン、及びチロシンが挙げられる。変異体は、高親和性で可逆的にセルロースと結合する能力を保持しさえすれば、Ｃ末端、Ｎ末端、及び天然に存在するＣＢＤ配列内の１つ又は複数の部位にさらなるアミノ酸も含み得る。
【００３６】
一般的に、「化学的誘導体」という用語は、天然に存在する又は変異体のＣＢＤタンパク質を化学修飾することにより作製されるＣＢＤタンパク質を指す。化学修飾のいくつかの非限定例は、例えば、アルキル、アシル、又はアミノ基によるＨの置換である。
【００３７】
ここで記載されたＣＢＤ−ＨＰキメラを作製するため、ＣＢＤをコードする核酸は、ＣＢＤタンパク質又はＣＢＤ−ＨＰキメラを発現することができる組み換え発現ベクターを構築するのに用いられ得る。一般的に、該キメラを発現するのに用いられる発現ベクター（つまり、核酸構築物）は、転写及び翻訳調節情報を有するヌクレオチド配列を含み、これらの配列は動作可能に連結される（つまり、調節ＤＮＡ配列及び発現するＤＮＡ配列が、ＣＢＤ−ＨＰキメラポリペプチドへのＲＮＡの転写及び最終的には翻訳がなされる方法で接続されるように連結される）。本発明によれば、ＣＢＤ−ＨＰキメラ発現ベクターを構築すると同時に、ＣＢＤタンパク質をコードする核酸は、ＣＢＤタンパク質及び第２のタンパク質のオープンリーディングフレームが完全なままであるように、ＨＰをコードする核酸に連結又は結合され、これによりＣＢＤ融合タンパク質の翻訳を開始させる。ＣＢＤ核酸は、高親和性で可逆的に結合するセルロース結合ドメインを作製するか、又はＣＢＤをコードするｍＲＮＡを作製する様々な細胞源から得られ得る。
【００３８】
いくつかの実施形態において、ＣＢＤタンパク質をコードする核酸は、クロストリジウムセルロボランスから得られる。
【００３９】
他の実施形態において、ＣＢＤをコードする核酸は、参照によりここに組み込まれる米国特許第５８５６２０１号明細書に記載のように得られる。
【００４０】
本発明によれば、ＣＢＤタンパク質をコードする核酸は、細胞源から単離、精製されたＤＮＡから、又はゲノムクローニングにより得られ得る。遺伝子クローニングがＣＢＤタンパク質の供給源である場合、クローンのｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーのどちらかが、当業者に周知の技術を用いて調製され得る。ライブラリーは、遺伝子の任意の部分に実質的に相補的であるヌクレオチドプローブを用い、特定のＣＢＤをコードする核酸についてスクリーニングされ得る。ＣＢＤタンパク質をコードする保存ヌクレオチド領域の検出が所望されるなら、ヌクレオチドプローブは種から種へと保存されたＣＢＤヌクレオチド配列に基づく。ＣＢＤタンパク質をコードする固有のヌクレオチド領域の検出が所望されるなら、ヌクレオチドプローブは固有のＣＢＤヌクレオチド配列に基づく。あるいは、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡが、好適なオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲクローニングの鋳型として用いられ得る。完全長クローン、つまり所望のＣＢＤタンパク質の全コード領域を含有するものは、発現ベクターを構築するために選択され得、又は重複ｃＤＮＡは、共にライゲーションされ、完全なコード配列を形成することができる。あるいは、ＣＢＤをコードするＤＮＡは、当技術分野で標準とみなされる技術を用い、化学合成により全体又は一部として合成され得る。
【００４１】
当業者に容易に理解されるように、好適な発現ベクターの選択は、様々なパラメータに依存する。例えば、
・核酸増幅又は核酸発現に用いられるかどうか；
・ベクターに挿入される核酸のサイズ；
・ベクターで形質転換される宿主細胞、である。
【００４２】
本発明によれば、各ベクターは、その機能（核酸の増幅又は核酸の発現）及び適合する宿主細胞に応じて、様々な成分を含有し得る。
【００４３】
ＣＢＤ−ＨＰ融合タンパク質は、宿主細胞（つまり、細胞系培養システム）において、組み換えプラスミドベクターの方向／制御下、ＣＢＤ−ＨＰキメラ融合タンパク質を作製する発現ベクター（例えば、大腸菌発現ベクター）にＣＢＤ−ＨＰのＤＮＡをサブクローニングすることにより得られ得る。「宿主細胞」（ここでは「細胞系培養システム」で置き換え可能）は、培養下で増殖することができ、ＣＢＤタンパク質又はＣＢＤ−ＨＰキメラを発現することができる細胞型である。宿主細胞は、原核、真核、及び昆虫細胞など、生体外培養で増殖する細胞であり得る。宿主細胞は、挿入配列の発現を調節するか、又は所望の具体的な方法で遺伝子産物を修飾及び処理する株から選択され得る。例えば、あるプロモータからの発現は、ある誘導物質（例えば、メタロチオネインプロモータに対して亜鉛及びカドミウムイオン）の存在下で高めることができる。宿主細胞は、最小量のタンパク質分解酵素を分泌するように選択され得る。
【００４４】
いくつかの実施形態において、細胞系培養システムは、大腸菌、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）及びシュードモナスフルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）から選択される細菌システムである。他の実施形態において、細胞系培養システムは、サッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ  Ｐａｓｔｏｒｉｓ）、フィラメンタスフンジ（Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｎｇｉ）、バキュロウイルス感染細胞、非溶解性昆虫細胞発現系及びリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）から選択される真核細胞システムである。他の実施形態において、細胞系培養システムは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、マウス骨髄腫リンパ芽球様細胞、ヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ−２９３）、ヒト胎児網膜細胞、及びヒト羊膜細胞（例えば、グリコトープ及びＣＥＶＥＣ）から選択されるほ乳類システムである。さらに他の実施形態において、細胞系培養システムは、タンパク質合成に必要とされるすべての細胞成分を含有する無細胞システムであり、タンパク質は、精製されたＲＮＡポリメラーゼ、リボソーム、ｔＲＮＡ及びリボヌクレオチドを用い、生体外で作製される。
【００４５】
ＣＢＤ又はＣＢＤ−ＨＰキメラは、参照によりここに組み込まれる米国特許第５８５６２０１号明細書に記載のように作製することができる。
【００４６】
従って、ＣＢＤタンパク質又はＣＢＤ−ＨＰ融合タンパク質の発現は、制御され得る。ＣＢＤタンパク質又はＣＢＤ−ＨＰ融合タンパク質が宿主細胞に対して致死性であれば、発現を制御する能力は重要である。いくつかの実施形態において、ＨＰはＣＢＤタンパク質とのキメラとして調製される組み換えタンパク質であり、ＣＢＤはＨＰのＮ又はＣ末端に融合される。いくつかの実施形態において、キメラのＨＰ部は、第３のタンパク質と融合又は結合し得る。
【００４７】
いくつかの実施形態において、ＨＰは他の要素（例えば、ストレプトアビジン、Ｆｃ断片、抗原その他）とのキメラとして調製され、その後ＣＢＭに結合することができる（又はこの要素の対応物に付着したＣＢＭと結合することができる）。従って、本発明によれば、ＨＰは、例えば組み換え手段により連続するアミノ酸として作製される場合、ＣＢＭに直接付着するか、あるいは例えばタンパク質Ａ／Ｆｃ断片、ストレプトアビジン／ビオチン等、他のドメイン又は相互作用を通してＣＢＭと結合することができる。いくつかの実施形態において、ＨＰは開裂部位（例えば、ＴＥＶドメイン）によりＣＢＭと接続するか、又はＣＢＤ−ＨＰキメラを形成する。
【００４８】
いくつかの実施形態において、ＣＤＭ−ＨＰキメラは少なくとも１つのリンカー（例えば、開裂可能なリンカー）を含む。このリンカーは長さが約１から１００のアミノ酸又は２から２０のアミノ酸を有し、ＣＢＭ及びＨＰ間に挿入され、細胞培養におけるその増殖中（例えば、繰り返す継代培養中）に、ＣＢＤ−ＨＰキメラのタンパク質分解安定性を向上し得る。
【００４９】
「粗混合物」から、例えばＨＰであるＡＯＩがＣＢＤとのキメラとして単離され、「粗混合物」は一般的に液体細胞培養混合物（つまり、酵母又は大腸菌細胞培養などの宿主細胞培養物）であり、無傷で分割された細胞の混合物を含み、ここで定義されるＣＢＤ−ＨＰタンパク質キメラが豊富である。この粗混合物は、核酸、タンパク質、炭水化物、ポリフェノール、及び脂質などの巨大非重合体分子などの他の成分（例えば、高分子）も含有し得る。いくつかの実施形態において、粗混合物はホモジネートであり、細胞培養物に含有される細胞の細胞膜を破壊することにより形成される。
【００５０】
本発明に従って利用される「ろ過膜」は、一般的にマイクロ膜であり、（例えば、汚染又は粗）流体を流通させて、流体に含有される微生物及び懸濁粒子を分離する。第１及び第２ろ過膜は同じか異なり、定義されるようにＣＢＭ−ＨＰ−ＣＮＣ複合体の透過を妨げると同時にＣＢＭ−ＨＰキメラを透過させる細孔径を有し得る。いくつかの実施形態において、このプロセスで使用されるろ過膜は両方のろ過工程で同じである。いくつかの実施形態において、ろ過膜は０．２μｍから６０ｋＤａ分子量カットオフの細孔径を有する。
【００５１】
この膜は、当技術分野で公知の任意の好適なろ過膜であり、ある成分（例えば、タンパク質）をその物理的及び／又は化学的性質に応じて通過させる物的障壁として作用することができる。ろ過膜はここで記載された粗混合物から、所望の分子（例えば、ＣＤＢ−ＨＰキメラ）をろ過するのに好適である。ろ過膜は、適切な強度（例えば、ろ過中に破断及び引裂されない）並びに十分な親水性（適切な濡れ）を特徴とする。本発明によれば、ろ過膜の第１分子量カットオフ（つまり、９０％の溶質が膜に保持される、最小の溶質分子量（ダルトン））は約５０ｋＤａである。
【００５２】
いくつかの実施形態において、ろ過工程のいずれかに用いられるろ過膜は同じであり、同様に作製、構成、構築又は使用され得る。膜の細孔径が０．２μｍから６０ｋＤａ分子量カットオフで選択されるように、このような細孔径選択は、０．１から１０μｍの細孔径を有する精密ろ過膜、並びに０．１から０．０１μｍの細孔径を有する限外ろ過膜の両方を包含することを目的とする。あるいは、ろ過膜は、６０ｋＤａ以下である分子量カットオフに基づき選択され得る。
【００５３】
従って、膜は０．２から１０μｍ、又は０．０１から０．１μｍの細孔径、あるいは６０ｋＤａまでの分子量カットオフを有するように選択され得る。
【００５４】
いくつかの実施形態において、小さめの膜サイズは０．２μｍである細孔径に基づき選択され、最大サイズは６０ｋＤａ以下である分子量カットオフに基づき選択される。
【００５５】
いくつかの実施形態において、ろ過膜のどちらか又は両方は、０．４５μｍから６０ｋＤａ（分子量カットオフ）の細孔径を有する。他の実施形態において、ろ過膜は１μｍから５０ｋＤａ（分子量カットオフ）の細孔径を有する。一実施形態において、ろ過膜は約０．２μｍの細孔径を有する。
【００５６】
ろ過膜は本発明に従って用いられ、（例えば、組み換えプロセスにより作製される）ここで記載されたＣＢＤ−ＨＰキメラを、このキメラを作製した宿主細胞を含有する粗混合物からろ過する。通常、粗混合物はここで記載するように、ＣＢＤ−ＨＰキメラ、並びに様々な可溶性及び不溶性の汚染物質を含む。従って、例えば、約３００ｋＤａ分子量カットオフで、ろ過膜は巨大粒子及び細菌を保持し、多くの球状タンパク質及び小分子がＣＢＭ−ＨＰキメラと共に容易に透過する。ＣＢＭ−ＨＰの多くが膜でろ過された後、（主に汚染物質を含有する）保持液が廃棄される。
【００５７】
ろ過膜は中空繊維膜から選択され、Ｐａｌｌ  Ｍｅｍｂｒａｌｏｘ、ＧＥＡ、Ｎｏｖａｓｅｐ  Ｋｅｒａｓｅｐ製のセラミック中空繊維膜、ＧＥ、ザルトリウスその他製の高分子中空繊維膜など、当技術分野で利用できる任意の材料であり得る。
【００５８】
キメラの分離後、ＣＮＣ（例えば、ＣＮＣ粒子）が添加され、キメラと相互作用して、ＣＢＭ−ＨＰ−ＣＮＣ複合体が得られ、これはＣＢＭ−ＨＰキメラのＣＢＭ部にＣＮＣが結合して形成される。本発明によれば、ＣＮＣは、ＣＮＣ粒子の懸濁液形態で水又は低電導度リン酸緩衝液に添加され得、懸濁液中のＣＮＣ粒子の濃度は、約０．０１％から１０ｗｔ％又は０．５％から２％である。
【００５９】
いくつかの実施形態において、ＣＮＣのＣＢＭ−ＨＰキメラへの結合は、ｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸緩衝液中で行われる。
【００６０】
いくつかの実施形態において、ＣＮＣは約１０分から約２４０分、中性ｐＨで（例えば、ｐＨ７．４の１〜１００ｍＭリン酸緩衝液）、４から２０℃、又は約４℃の温度でキメラを含有する透過液と共にインキュベートされ、その後ＣＢＭ−ＨＰ−ＣＮＣ複合体を含有する混合物をろ過膜に通す。
【００６１】
「結晶ナノ−セルロース」（ＣＮＣ）は、ナノメートルサイズ範囲（高さ、長さ及び幅、全方向）を有するセルロース結晶形態のセルロース由来物質である。ＣＮＣは、バクテリアセルロース、植物セルロースその他など、セルロースの任意の形から作製され得る。本発明によれば、ここで記載された方法で用いられるＣＮＣは、市販の供給源から得られ得るか、又は参照によりここに組み込まれる国際公開第２０１２／０１４２１３号又はそれに相当する米国特許出願に記載のプロセスなど、公知の方法に従って調製され得る。
【００６２】
いくつかの実施形態において、ＣＮＣは少なくとも５０％の結晶化度を有することを特徴とする。いくつかの他の実施形態において、ＣＮＣは単結晶である。いくつかの実施形態において、ＣＮＣは、様々な起源のセルロースから粒子として（例えば、小繊維、又は他の場合、結晶材料として）作製され、長さが少なくとも約１００ｎｍであるように選択される。いくつかの実施形態において、ＣＮＣは長さが最大でも約１，０００μｍである。他の実施形態において、ＣＮＣ粒子は、長さ約１００ｎｍから１，０００μｍ、長さ約１００ｎｍから９００μｍ、長さ約１００ｎｍから６００μｍ、又は長さ約１００ｎｍから５００μｍである。さらに他の実施形態において、ＣＮＣ粒子は、長さ約１００ｎｍから１，０００ｎｍ、長さ約１００ｎｍから９００ｎｍ、長さ約１００ｎｍから８００ｎｍ、長さ約１００ｎｍから６００ｎｍ、長さ約１００ｎｍから５００ｎｍ、長さ約１００ｎｍから４００ｎｍ、長さ約１００ｎｍから３００ｎｍ、又は長さ約１００ｎｍから２００ｎｍである。
【００６３】
本発明によれば、ＣＮＣの厚さは、約５ｎｍから１００ｎｍであり得、ＣＮＣはアスペクト比（長さと直径の比）が１０以上であるように選択され得る。いくつかの実施形態において、アスペクト比は６７から１００である。いくつかの実施形態において、ＣＮＣは長さ約１００ｎｍから４００ｎｍ、厚み約５ｎｍから３０ｎｍであるように選択される。
【００６４】
本発明の方法によれば、ＣＢＭ−ＨＰ−ＣＮＣ（例えば、ＣＢＤ−ＨＰ−ＣＮＣ）複合体を含む混合物を異なる又は同じろ過膜に通過させるが、大きさが増すことにより、ＣＢＤ−ＨＰ−ＣＮＣ複合体は透過しない。（例えば、様々な植物タンパク質を含有する）透過液が廃棄された後、（精製された）ＣＢＭ−ＨＰ−ＣＮＣ複合体を含有する保持液は処理されて、ＨＰを単離又は分離する。ＣＢＭ−ＨＰ−ＣＮＣ複合体からＨＰの分離は、当技術分野で一般的な様々な化学的手法（例えば、ｐＨ上昇、タンパク質分解を用いた溶離）を用いて実施することができる。例えば、ｐＨを上昇させることにより、ＣＢＭ−ＨＰキメラはＣＮＣ粒子から放出され得る。これによりＣＢＭ−ＨＰキメラが得られ、好適なタンパク質分解酵素を用いたタンパク質分解後、ＣＢＭ−ＨＰキメラからＨＰが放出される。いくつかの実施形態において、ｐＨを約１１〜１２のｐＨ値まで上昇させることによりＨＰを単離し得、ＮＣＣからＣＢＭ−ＨＰキメラを放出後、少なくとも１つのタンパク質分解酵素を添加して、ＨＰからＣＢＭを放出させる。タンパク質分解酵素のいくつか非限定例は、タバコエッチ病ウイルス核内封入体ａエンドペプチダーゼ（ＴＥＶ）、第Ｘ因子、エンテロキナーゼ、トロンビンＨＲＶ−３Ｃ、フィシン及びパパインである。
【００６５】
本発明の方法で得られるＨＰは、関心のある作用物質（ＡＯＩ）を「取り出す」のに用いることができ、この作用物質はアミノ酸系又は非アミノ酸系作用物質であり得る。従って、本方法は、単離されたＨＰ又はＨＰキメラ、例えばＣＢＭ−ＨＰキメラ、及び少なくとも１つのＡＯＩ間を相互作用させる工程をさらに含み得る。ＡＯＩは、ＨＰと親和結合することができる任意の作用物質又は物質であり得る。このような作用物質は、ＨＰが抗体、受容体、酵素、基質など、又はその断片であるアミノ酸系作用物質；ＨＰが核酸結合タンパク質又はその断片である核酸系作用物質；ＨＰと親和結合することができるペプチド部分を有する糖、脂肪酸又は小有機分子から選択され得る。
【００６６】
従って、別の一態様において、本発明は液体混合物から関心のある作用物質（ＡＯＩ）を単離する方法を提供し、この方法は、
・少なくとも１つのＡＯＩを含む培地をＣＢＭ−ＨＰキメラ（上記で定義された本発明の方法に従って任意に得られ、単離される；又は任意の他の方法により調製、単離される）を用い、ＡＯＩ及びＣＢＭ−ＨＰキメラ間を会合させる条件下で処理して、ＣＢＭ−ＨＰ−ＡＯＩ複合体を含む混合物を得ることと；
・ＣＢＭ−ＨＰ−ＡＯＩ複合体を含む混合物にＣＮＣを添加して、ＣＮＣ−ＣＢＭ−ＨＰ−ＡＯＩ複合体を形成することと；
・ＣＮＣ−ＣＢＭ−ＨＰ−ＡＯＩ複合体を含む混合物をＣＮＣ−ＣＢＭ−ＨＰ−ＡＯＩ複合体を透過させないろ過膜に通して、ＣＮＣ−ＣＢＭ−ＨＰ−ＡＯＩ複合体を含む保持液を得ることと；
・複合体からＡＯＩを単離することと、を含む。
【００６７】
ろ過膜は上記のように定義され得る。
【００６８】
いくつかの実施形態において、本方法は単離されるＡＯＩを含む培地を得る工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、ここで定義されるように、培地はＡＯＩを含有する粗混合物であるため、約０．２ミクロンの細孔径を有するろ過膜を通過させて、培地から不純物を部分的に除去し得る。
【００６９】
ＣＮＣ−ＣＢＤ−ＨＰ−ＡＯＩ複合体からＡＯＩを単離／分離するため、当技術分野で通常の様々な化学的手段を実施することができる。例えば、ｐＨをｐＨ１．５から３に低下させ、ＮａＣｌなどの特定の塩、塩化グアニジン、又は酢酸リチウムなどの酢酸金属、又はエタノール及びｎ−ブタノールなどの溶媒を添加することにより、ＡＯＩを放出することができる。放出後、ＡＯＩは膜を通過するため、溶液から除去される。いくつかの実施形態において、ＣＮＣ−ＣＢＤ−ＨＰ−ＡＯＩ複合体からＡＯＩを単離する前に、さらなる透析（半透膜を通る拡散率の差により溶液中の分子を分離する）又はろ過により、ＣＮＣ−ＣＢＭ−ＨＰ−ＡＯＩ複合体を含む混合物をさらに精製する。
【００７０】
いくつかの実施形態において、ＣＮＣ−ＣＢＭ−ＨＰ−ＡＯＩ複合体を含む保持液（混合物）が採取され、必要に応じてさらに処理するために保存される。
【００７１】
他の実施形態において、本発明の方法で得られるＣＮＣ−ＣＢＭ−ＨＰ−ＡＯＩ複合体又はＣＮＣ−ＣＢＭ−ＨＰ複合体からＣＮＣを放出するため、複合体を含む混合物のｐＨを約１０から約１３に上昇させる。このような実施形態によれば、ＣＮＣは廃棄、又は再生利用され得、ＣＢＭ−ＨＰ−ＡＯＩ複合体を（例えば、ろ過により）採取することができる。
【００７２】
他の実施形態において、純粋なＨＰを単離するため、ここで記載するように、好適なプロテアーゼを使用し得る。このような実施形態によれば、ＣＢＭタンパク質及びＨＰタンパク質間に存在するリンカータンパク質は消化され、従ってＨＰは膜を透過することができ、透過液に採取され得る。ＣＮＣ−ＣＢＭ複合体は保持液と共に廃棄される。
【００７３】
さらに他の実施形態において、ＨＰがＡＯＩ（例えば、別のタンパク質、小分子核酸配列等）と親和結合しているＣＮＣ−ＣＢＭ−ＨＰ−ＡＯＩ複合体からＡＯＩが単離される場合、ＨＰ及びＡＯＩの結合は、好適な化学的手段（例えば、ｐＨ又は塩濃度変化）を用いて開裂される。従って、例えば、（ＡＯＩである）抗体が、ＣＢＭ−ＣＮＣに連結する（ＨＰである）タンパク質Ａと結合するなら、低ｐＨによりタンパク質Ａから抗体のみが放出され、ＣＢＤはＣＮＣから放出されない。
【００７４】
いくつかの実施形態において、ＣＢＭはここで定義されるようにＣＢＤである。
【００７５】
本発明によれば、ここに記載される方法におけるろ過工程のいずれかは、所望の純度が得られるまで、（例えば、複数の緩衝液体積を用いて）少なくとも１回繰り返され得る。
【００７６】
本発明に記載の方法の概略図は、図１Ａ〜１Ｅに提供され、図１Ａに示すように、キメラ及びすべてのサイズの汚染物質のどちらも含有する粗混合物は、例えば０．２μｍの膜でろ過される。巨大な不溶性粒子のみが保持され、キメラがすべて透過すると、粒子は廃棄され得る。その後、図１Ｂに示すように、キメラを含有する透過液は、混合物に添加されるＣＮＣと接触し、短時間のインキュベーション後、異なる、類似、又は同一のろ過膜、例えば０．２μｍの膜でろ過される。小さな可溶性分子及び汚染タンパク質のみが透過し、廃棄される。図１Ｃに示すように、所望の純度に達すると、ｐＨを上昇させ、ＣＢＤがＮＣＣ粒子から放出される。（例えば、関心のあるタンパク質、ＰＯＩの）キメラは膜を自由に透過し、採取される。（現在ＮＣＣのみを含有する）保持液は廃棄される。
【００７７】
ＣＢＤ部分の無い純粋なキメラのみが所望されるなら、図１Ｄに示すように、好適なタンパク質分解酵素が添加され得る。ＣＢＤ及びＡＯＩ／ＨＰ（例えば、ＰＯＩ）間の接続を切断後、ＣＢＤはＮＣあＣに結合したままで、ＡＯＩ／ＨＰ（例えば、ＰＯＩ）は膜を自由に透過し、採取される。しかし、もし、図１Ｅに示すように、ＮＣＣ−ＣＢＤ−ＨＰ／ＡＯＩ複合体が所望されるなら（例えば、ＮＣＣ−ＩＬ−２−ＴＥＶ−ＣＢＤ）、段階Ｂ後に直接採取することができる。従って、本発明はさらに、液体混合物からＨＰを単離する方法を提供し、この方法は、
・少なくとも１つの糖結合モジュール及び少なくとも１つのＨＰのキメラ（ＣＢＭ−ＨＰキメラ）を含む粗混合物を第１ろ過膜に通して、ＣＢＭ−ＨＰキメラを含む透過液を得ることと；
・ＣＢＭ−ＨＰキメラをセルロースナノ結晶（ＣＮＣ）と接触させて、ＣＢＭ−ＨＰキメラと相互作用させ、ＣＢＭ−ＨＰ−ＣＮＣ複合体を含む混合物を得ることと；
・ＣＢＭ−ＨＰ−ＣＮＣ複合体を含む混合物を第２ろ過膜に通して、ＣＢＭ−ＨＰ−ＣＮＣ複合体を含む保持液を得ることと；
・ＣＢＭ−ＨＰ−ＣＮＣ複合体からＨＰ及び／又はＣＢＭ−ＨＰキメラを分離することと、を含み
同じ又は異なる第１及び第２ろ過膜は、同じ又は異なり、ＣＢＭ−ＨＰキメラを透過させ、ＣＢＭ−ＨＰ−ＣＮＣ複合体の透過を妨げるように選択される細孔径を有する。
【００７８】
いくつかの実施形態において、本方法は、粗混合物にＣＢＭ−ＨＰキメラを得ることをさらに含み、ＣＢＭ−ＨＰキメラは粗混合物から単離され得る。いくつかの実施形態において、粗混合物は核酸、タンパク質、炭水化物、ポリフェノール及び巨大非重合体分子から選択される少なくとも１つの他の物質をさらに含む。いくつかの実施形態において、粗混合物は、細胞培養物に含有される細胞の細胞膜を破壊することにより形成されるホモジネートである。
【００７９】
いくつかの実施形態において、ＣＢＭ−ＨＰキメラは宿主細胞で作製されるか、又は発現する。
【００８０】
いくつかの実施形態において、ＣＢＭ−ＨＰキメラは植物細胞で作製される。
【００８１】
いくつかの実施形態において、本方法は、ＣＢＭ−ＨＰキメラ及び／又はＨＰを単離することをさらに含む。いくつかの実施形態において、ＣＢＭ−ＨＰキメラが最初に単離され、次にそこからＨＰが単離される。
【００８２】
いくつかの実施形態において、本方法は、少なくとも１つの関心のある作用物質（ＡＯＩ）を含む液体培地を、ＣＢＭ−ＨＰキメラを用い、少なくとも１つのＡＯＩ及びＣＢＭ−ＨＰキメラ間に会合を生じさせる条件下で処理することをさらに含み、ＣＢＭ−ＨＰ−ＡＯＩ複合体を含む混合物が得られる。
【００８３】
いくつかの実施形態において、本方法はＣＢＭ−ＨＰ−ＡＯＩ複合体からＡＯＩを単離することを含む。
【００８４】
いくつかの実施形態において、ＣＢＭはセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）である。
【００８５】
いくつかの実施形態において、第１及び第２ろ過膜は同じである。
【００８６】
いくつかの実施形態において、ＣＢＭ−ＨＰキメラはＣＢＤ−ＨＰキメラである。
【００８７】
いくつかの実施形態において、ＨＰは関心のある作用物質を単離する方法で使用するのに好適な形態で単離される。
【００８８】
本発明はさらに、液体混合物から関心のある作用物質（ＡＯＩ）を単離する方法を提供し、この方法は、
・本発明の方法に従って、ＣＢＭ−ＨＰキメラを得ることと；
・少なくとも１つのＡＯＩを含む液体培地を、ＣＢＭ−ＨＰキメラを用い、少なくとも１つのＡＯＩ及びＣＢＭ−ＨＰキメラ間に会合を生じさせる条件下で処理して、ＣＢＭ−ＨＰ−ＡＯＩ複合体を含む混合物を得ることと；
・ＣＢＭ−ＨＰ−ＡＯＩ複合体を含む混合物にＣＮＣを添加して、ＣＮＣ−ＣＢＭ−ＨＰ−ＡＯＩ複合体を形成することと；
・ＣＮＣ−ＣＢＭ−ＨＰ−ＡＯＩ複合体を含む混合物を、ＣＮＣ−ＣＢＭ−ＨＰ−ＡＯＩ複合体を透過させない細孔径を有するろ過膜に通して、ＣＮＣ−ＣＢＭ−ＨＰ−ＡＯＩ複合体を含む保持液を得ることと；
・複合体からＡＯＩを単離することと、を含む。
【００８９】
本発明はさらに、液体混合物から関心のある作用物質（ＡＯＩ）を単離する方法を提供し、この方法は、
・少なくとも１つのＡＯＩを含む液体培地を、ＣＢＭ−ＨＰキメラを用い、少なくとも１つのＡＯＩ及びＣＢＭ−ＨＰキメラ間に会合を生じさせる条件下で処理して、ＣＢＭ−ＨＰ−ＡＯＩ複合体を含む混合物を得ることと；
・ＣＢＭ−ＨＰ−ＡＯＩ複合体を含む混合物にＣＮＣを添加して、ＣＮＣ−ＣＢＭ−ＨＰ−ＡＯＩ複合体を形成することと；
・ＣＢＭ−ＨＰ−ＡＯＩ複合体を含む混合物を、ＣＮＣ−ＣＢＭ−ＨＰ−ＡＯＩ複合体を透過させない細孔径を有するろ過膜に通して、ＣＮＣ−ＣＢＭ−ＨＰ−ＡＯＩ複合体を含む保持液を得ることと；
・この複合体からＡＯＩを単離することと、を含む。
【００９０】
以下の図は、本発明のいくつかの有利な特徴を示す。なお、提示する詳細は例であり、本発明の実施形態を説明するためのものである。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】図１は、本発明による単離方法の概略図を提供する。
【図２】図２は、本発明による単離方法の概略図を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００９２】
他に定義されない限り、ここで用いられる技術及び科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。ここで記載されたものと類似又は同等の任意の方法及び材料は、本発明の実施又は試験で用いることができるが、好ましい方法及び材料は以下に記載する。
【００９３】
主な態様の１つにおいて、本発明は液体混合物に存在する異質タンパク質を得る方法を提供し、この方法は、
・第１粗混合物において、セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）に付着した異質タンパク質（ＨＰ）を作製することと；
・第１粗混合物を６０ｋＤａ（ＵＦ範囲）から０．４５ミクロン（ＭＦ範囲）までの第１カットオフを有する第１ろ過膜に通し、巨大汚染粒子から構成される保持液を廃棄して、透過液を得ることと；
・（２）の透過液にＣＮＣ粒子を添加して、第２混合物を得ることと；
・（３）の第２混合物を最大０．４５ミクロンのカットオフを有する第２ろ過膜に通し、これにより精製されたＣＮＣ粒子に付着した異質タンパク質を得ることと、を含む。
【００９４】
異種タンパク質（ＨＰ）は、例えばＣＢＤタンパク質とのキメラとして調製されるか、または後でＣＢＤ（又は要素の対応物を有するＣＢＤ）と結合可能な別の要素（ストレプトアビジン、Ｆｃ断片、抗原等）とのキメラとして調製される組み換えタンパク質など、産物の末端に得られることが必要な関心のあるタンパク質であり得る。
【００９５】
ＨＰは、粗混合物から関心のある作用物質（アミノ酸系又は非アミノ酸系作用物質であり得る）を「取り出す」のに用いられ得る。
【００９６】
本第２の態様によれば、本発明は、液体混合物に存在し、異質タンパク質と親和結合することができる関心のある作用物質を得ることに関し、この方法は、
・第１粗混合物におけるセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）に付着した異質タンパク質（ＨＰ）を液体混合物に添加することと；
・ＣＢＤ−ＨＰキメラの添加前又は後のどちらかに、第１粗混合物を１０ｋＤａ（ＵＦ）から０．４５ミクロン（ＭＦ範囲）の第１カットオフを有する第１ろ過膜に通し、巨大汚染粒子から構成される保持液を廃棄して、透過液を得ることと；
・（２）の透過液にＣＮＣ粒子を添加して、第２混合物を得ることと；
・（３）の第２混合物を最大０．４５ミクロンのカットオフを有する第２ろ過膜に通し、保持液を得て、これにより関心のある作用物質を得ることと、を含む。
【００９７】
なお、工程２では、第１ろ過後、ＣＢＤ−ＨＰキメラを添加することが好ましく、これにより、より低いカットオフの膜を使用することができ、従って精製を改善することができる。
【００９８】
本方法は、関心のある作用物質及び異質タンパク質の親和結合を分離するため、当技術分野で公知の追加の工程をさらに含み得、ｐＨ調整、イオン調整、カオトロピック又はコスモトロピック剤、尿素、有機溶媒又は洗浄剤、糖類、ヌクレオチド（例えば、ＡＴＰ）の添加、温度調整、あるいは親和結合ドメインの除去を含むが、これらに限定されない。さらなる透析又はろ過により、任意の添加材料を、その後廃棄することができる。
【００９９】
異質タンパク質と親和結合することができる関心のある作用物質（ＡＯＩ）は、アミノ酸系作用物質（ＨＰが抗体、受容体、酵素、基質など、又はその断片）、核酸系作用物質（及びＨＰが核酸結合タンパク質又はその断片）、ＨＰと親和結合することができる（ＨＰである）アミノ酸系分子を有する糖、脂肪酸、小有機分子であり得る。
【０１００】
下記は、第１及び第２オプションのどちらにも関連する。
【０１０１】
一般的に、第１膜及び第２膜は同じであり、０．２ミクロンのカットオフを有する。
【０１０２】
膜は中空繊維又はクロスフローろ過膜であり得る。
【０１０３】
ＨＰは、例えば組み換え手段により連続するアミノ酸として作製されるＣＢＤに直接付着するか、あるいは別のドメイン又は相互作用、例えば、タンパク質Ａ／Ｆｃ断片、ストレプトアビジン／ビオチン等によりＣＢＤに結合する。ＴＥＶドメインなど開裂部位を介してＣＢＤにＨＰを接続することもできる。これはＣＢＤ−ＨＰキメラを形成する。
【０１０４】
本発明の方法の工程（４）で得られる保持液は、下記によりさらに処理され得る。
・ＣＮＣ−ＣＢＤ−ＨＰ複合体全体が所望されるなら、単純に採取することができる。
・ＣＢＤ−ＨＰキメラが所望の産物であり、ＣＮＣが廃棄されるのであれば、ｐＨを約ｐＨ１０．５〜１３に上昇させて、タンパク質が直ちに放出され、膜を透過して採取される。ＣＮＣ粒子は（コストがわずかであることから）廃棄されるか、再生利用される。
・純粋なＨＰのみが所望されるなら、好適なプロテアーゼが溶液に添加され、ＣＢＤタンパク質及びＨＰタンパク質間のリンカータンパク質を消化し、従ってＮＣＣに結合したままのＣＢＤからＨＰが放出される。放出されたＨＰは、膜を透過することができ、透過液に採取され、ＣＮＣ−ＣＢＤ複合体は保持液と共に廃棄される。
【０１０５】
切断されたＣＢＤからＨＰを分離することは、ＣＢＤ−ＨＰキメラが切断され、ＣＢＤがＣＮＣから放出される非常に特異的な場合でのみ必要であり、そうでなければ、ＣＢＤはＣＮＣに結合したまま、一緒に廃棄される。
【０１０６】
実際にキメラがまずＣＮＣから放出され、その後消化されるなら、クロマトグラフィ、又は特異的なタンパク質生化学的性質に依存する他の分離方法を用いて、分離を行うことができる。
【０１０７】
本発明は、膜分離プロセス及びクロマトグラフィ分離プロセスの両方の利点を兼ね備える点で有利である。つまり、アフィニティクロマトグラフィでのみ見られる非常に高い選択性を提供すると同時に、広範囲のタンパク質及び微粒子物質を含む非常に大量の溶液を取り扱うことができる。カラム充填の必要性、並びに高圧、低流速及び目詰まりなどの関係する制約を回避する。
【０１０８】
通常、アフィニティクロマトグラフィにおいて、標的タンパク質に対するアフィニティクロマトグラフィ樹脂の結合能力は、樹脂１グラム当たり数十ミリグラムまでである。本発明において、ＣＮＣ１ｇｒの能力は、ＣＮＣ１グラム当たり数百ミリグラムに達する。さらに、精密ろ過を用いながら、保持液に選択的に標的タンパク質を保持する能力は、高圧、比較的遅いろ過速度及び目詰まりの問題を伴う限外ろ過と比較して、大きな長所である。
【０１０９】
記載された精製方法は、中空繊維及びクロスフローろ過等の既存のろ過装置及び技術を用い、短時間で、経済的及び効率的な３段階のタンパク質精製を行うことができる。本発明の方法は、セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）及び異種タンパク質（ＨＰ）から構成されるキメラの、このキメラのＣＢＤ部を介した、結晶ナノセルロース（ＣＮＣ）への可逆的結合に基づいており、このようにして巨大なタンパク質／ＣＮＣ付加物を作製する。付加物はろ過により汚染物質から分離され、その後「そのまま」用いられるか、あるいはキメラ（ＣＢＤ−ＨＰ）がｐＨ変化又はタンパク質分解によりＣＮＣ粒子から放出されるか、あるいはＨＰが以下に説明するような様々な開裂又は分離技術によりＣＢＤから分離される。
【０１１０】
ＨＰは、ＣＢＤに直接付着するか、あるいは別のドメイン又は相互作用、例えばタンパク質Ａ／Ｆｃ断片、ストレプトアビジン／ビオチン等を介してＣＢＤに結合する必要がある。ＴＥＶドメインなど開裂部位を介してＣＢＤにＨＰを接続することもできる。これはＣＢＤ−ＨＰキメラを形成する。
【０１１１】
異種タンパク質（ＨＰ）は、例えばＣＢＤタンパク質とのキメラとして調製されるか、または後でＣＢＤ（又は要素の対応物を有するＣＢＤ）と結合可能な別の要素（ストレプトアビジン、Ｆｃ断片、抗原等）とのキメラとして調製される組み換えタンパク質など、産物の末端に得られることが必要な関心のあるタンパク質であり得る。
【０１１２】
あるいは、ＨＰは、サンプル中に存在し、分離する必要がある関心のあるタンパク質と親和結合することができるタンパク質（抗体又は断片、受容体又は断片、酵素の基質結合ドメイン、基質、ＤＮＡ結合タンパク質等）である。
【０１１３】
ＣＢＤ−ＨＰキメラは、例えば組み換えプロセスにより作製することができ、調製された粗混合物から精製される必要がある。このような場合、ＣＢＤ−ＨＰキメラ、並びに様々な種類及びサイズ（可溶性及び不溶性のどちらも）の汚染物質を含有する粗混合物は、まず０．１〜０．４５、好ましくは０．２μｍの精密ろ過膜、好ましくは中空繊維膜又はクロスフロー装置でろ過される。このカットオフで、膜は巨大粒子及び細菌を保持するが、多くの球状タンパク質及び小分子は、ＣＢＤ−ＨＰキメラと共に容易に透過する。多くのＣＢＤ−ＨＰが分離された後、保持液（現在主に汚染物質を含有する）は廃棄される。
【０１１４】
ＣＢＤ−ＨＰが、粗混合物から（キメラのＨＰ部と親和結合する）関心のあるタンパク質を「探す」ことが意図されるなら、上記と同じ工程が実施され得るか、あるいはまず粗混合物が０．１〜０．４５、好ましくは０．２μｍの精密ろ過膜、好ましくは中空繊維膜又はクロスフロー装置でろ過される。このカットオフで、膜は巨大粒子及び細菌を保持するが、多くの球状タンパク質は保持されず、この工程後にのみ、ＣＢＤ−ＨＰが添加される。
【０１１５】
第２段階で、ＣＮＣが添加され、ＣＢＤ−ＨＰはＣＮＣ粒子と結合し、膜のカットオフ０．１〜０．４５、好ましくは０．２μｍの膜カットオフよりも大きい巨大な付加物を形成し、膜を透過することができない。従って、これらは保持液に保持されるが、他のすべての汚染小分子及びタンパク質は除去される。所望の純度が達成されるまで、様々な緩衝液体積を交換することができる。
【０１１６】
最終段階で、産物が採取される。これは４つの方法のうちの１つで実施することができる。
ＨＰが（例えば、組み換え技術で作製される）関心のあるタンパク質である場合：
１．ＣＮＣ−ＣＢＤ−ＨＰ複合体全体が所望されるなら、簡単に採取することができる。
２．ＣＢＤ−ＨＰキメラが所望の産物であり、ＣＮＣが廃棄されるのであれば、ｐＨを約ｐＨ１０．５〜１１に上昇させ、タンパク質が直ちに放出され、膜を透過して採取される。ＣＮＣ粒子は（コストがわずかであることから）廃棄されるか、又は再生利用される。
３．純粋なＨＰのみが所望されるなら、好適なプロテアーゼが溶液に添加され、ＣＢＤタンパク質及びＨＰタンパク質間のリンカータンパク質が消化され、ＮＣＣと結合したままのＣＢＤからＨＰが放出される。放出されたＨＰは膜を透過することができ、透過液に採取され、ＣＮＣ−ＣＢＤ複合体は保持液と共に廃棄される。
４．ＨＰが関心のある作用物質である別の作用物質（別のタンパク質、小分子、核酸配列等）と親和結合する場合において、ＨＰが上記（１）のようにそのままであるか、あるいは例えば、ｐＨ又は塩濃度変化により上記２又は３のように分離される場合、ＨＰ及び関心のある作用物質間の親和結合は切断される。ＣＮＣからＣＢＤを放出することなく、親和結合のみが切断される好適な条件が定義されなければならない。
【０１１７】
結晶ナノ−セルロース（ここで用いられるようにＣＮＣ）は、すべての方向（長さ及び幅）にナノメートルサイズ範囲であり、バクテリアセルロース、植物セルロース等を含むセルロースの任意の形であるセルロース結晶を指す。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、ナノ−セルロース材料は、少なくとも５０％の結晶化度を有することを特徴とする。さらなる実施形態において、ナノ−セルロース材料は単結晶である。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、様々な起源のセルロースから粒子として（例えば、小繊維、又は他の場合、結晶材料として）作製されるナノ−セルロース材料は、長さが少なくとも約１００ｎｍであるように選択される。他の実施形態において、長さは最大でも約１，０００μｍである。他の実施形態において、ナノ−セルロース材料粒子は、長さ約１００ｎｍから１，０００μｍ、長さ約１００ｎｍから９００μｍ、長さ約１００ｎｍから６００μｍ、又は長さ約１００ｎｍから５００μｍである。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、ＣＮＣ粒子は長さ約１００ｎｍから１，０００ｎｍ、長さ約１００ｎｍから９００ｎｍ、長さ約１００ｎｍから８００ｎｍ、長さ約１００ｎｍから６００ｎｍ、長さ約１００ｎｍから５００ｎｍ、長さ約１００ｎｍから４００ｎｍ、長さ約１００ｎｍから３００ｎｍ、又は長さ約１００ｎｍから２００ｎｍである。
【０１２１】
ＣＮＣの厚さは、約５ｎｍから１００ｎｍの間で変わり得る。
【０１２２】
ＣＮＣの小繊維は、アスペクト比（長さと直径の比）が１０以上であるように選択され得る。いくつかの実施形態において、アスペクト比は６７〜１００である。
【０１２３】
ＮＣＮＣは長さが約１００ｎｍから４００ｎｍ、厚みが約５ｎｍから３０ｎｍであるように選択される。
【０１２４】
ＮＣＣは市販のものを使用し得るか、あるいは参照によりここに組み込まれる国際特許第２０１２／０１４２１３号又はそれに相当する米国出願に記載されたプロセスなど、公知の方法に従って調製され得る。
【０１２５】
ＣＢＤタンパク質
ＣＢＤタンパク質は、断片、誘導体、変異体又は修飾がＣＮＣ結合性を保持しさえすれば、http://www.cazy.org/carbohydrate-binding-modules.htmlに示すタンパク質又はタンパク質ドメインのいずれかの変異体、誘導体、断片又は化学修飾であり得る。
【０１２６】
本発明のＣＢＤタンパク質は、上記ＧｅｎＢａｎｋ受託番号のアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性、好ましくは少なくとも８０％の相同性、より好ましくは少なくとも９０％の相同性、最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するものである。「Ｘ％の相同性」という用語は、タンパク質の全長にわたってＸ％の相同性を有する配列に限定されるとは意図されない。７０％の相同性は、上記ＧｅｎＢａｎｋ受託番号のＣＢＤタンパク質内における特定された機能領域に生じるＸ％の相同性を含むことも意図される。機能領域の一例は、高親和性で可逆的にセルロースと結合する能力を有する定義されたアミノ酸セットである。このようなタンパク質ホモログは、ここでは「ＣＢＤ機能的ホモログ」とも呼ばれ得る。本発明の一実施形態において、このような機能領域は約１００のアミノ酸を有し得る。本発明の別の実施形態において、このような機能領域は約５０のアミノ酸を有し得る。本発明の最も望まれるＣＢＤタンパク質は、上述のアミノ酸配列から構成されるものである。
【０１２７】
ここで用いられる「ＣＢＤ機能性誘導体」という用語は、上述のＧｅｎＢａｎｋ配列で示すＣＢＤタンパク質アミノ酸配列の任意の「断片」、「変異体」、「類似体」又は「化学的誘導体」を指し、高親和性で可逆的にセルロースと結合する能力を保持し、好ましくは長さ約２から約１６０のアミノ酸、より好ましくは長さ約２５から約１２５のアミノ酸、最も好ましくは長さ約５０から約１００のアミノ酸である。
【０１２８】
「断片」という用語は、提示するＣＢＤタンパク質由来で、天然に存在する配列を有するＣＢＤタンパク質を指すために用いられる。このような断片は、完全長タンパク質のタンパク質分解開裂により作製され得る。あるいは、断片は、ＣＢＤタンパク質をコードするＤＮＡ配列を適切に修飾して、Ｃ末端、Ｎ末端、及び天然に存在する配列内の１つ又は複数の部位で１つ又は複数のアミノ酸を欠失することにより、組み換え技術によって得られる。ＣＢＤタンパク質の断片は、高親和性で可逆的にセルロースと結合する能力についてスクリーニングされ、機能性誘導体の固有性又は有用性を決定することができる。
【０１２９】
ここで用いられるような「変異体」という用語は、天然に存在する分子のアミノ酸配列、グリコシル化パターン、又は他の特徴が共有結合的又は非共有結合的に修飾されている分子として定義され、突然変異体を含むことが意図される。本発明に含まれるいくつかの変異体は、最終構築物が高親和性で可逆的にセルロースと結合する所望の能力を保持するという条件で、アミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を有する。ＣＢＤタンパク質におけるアミノ酸置換は、関係する残基の極性、帯電、溶解性、疎水性、親水性及び／又は両親媒性における類似性に基づいてなされ得る。例えば、負に帯電したアミノ酸としては、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられ；正に帯電したアミノ酸としては、リシン及びアルギニンが挙げられ；類似の親水性値を有する非帯電極性頭部基又は非極性頭部基を有するアミノ酸としては、以下のロイシン、イソロイシン、バリン；グリシン、アラニン；アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；フェニルアラニン、チロシンが挙げられる。変異体が、高親和性で可逆的にセルロースと結合する能力を保持しさえすれば、変異体の定義内で、Ｃ末端、Ｎ末端、及び天然に存在するＣＢＤ配列内の１つ又は複数の部位で追加のアミノ酸を有するタンパク質も含まれる。
【０１３０】
ここで用いられるように、「化学的誘導体」という用語は、天然に存在する又は変異体のＣＢＤタンパク質を化学修飾することにより作製されるＣＢＤタンパク質を指す。化学修飾の一例は、アルキル、アシル、又はアミノ基によるＨの置換である。
【０１３１】
ＣＢＤ−ＨＰキメラ
ここで用いられるように、「ＣＢＤ−ＨＰキメラ」という用語は、少なくとも２つのタンパク質、つまりＣＢＤタンパク質及びＨＰである第２のタンパク質の結合を指す。本発明のいくつかの実施形態において、ＨＰは第３のタンパク質と融合するか、又は結合し得る。本発明において、ＨＰの例としては、核酸修飾酵素、プロテアーゼなどの酵素、ホルモン又はホルモン前駆体、ポリペプチド、ペプチド、抗体、抗原、抗原エピトープ及びその変異体が挙げられる。
【０１３２】
ＣＢＤをコードする核酸は、本発明のＣＢＤタンパク質又はＣＢＤ−ＨＰキメラを発現することができる組み換え発現ベクターを構築するのに用いられ得る。核酸構築物は、転写及び翻訳調節情報を含有するヌクレオチド配列を含有し、このような配列がヌクレオチドをコードする配列に「動作可能に連結されている」なら、タンパク質を発現することができる。「動作可能に連結されている」とは、調節ＤＮＡ配列及び発現するＤＮＡ配列が、転写及び最終的な翻訳がなされるように接続する結合を指す。
【０１３３】
ＣＢＤ−ＨＰキメラ発現ベクターを構築する際、ＣＢＤタンパク質及び第２のタンパク質のオープンリーディングフレームが完全なままであるように、ＣＢＤタンパク質をコードする核酸が、ＨＰをコードする核酸に連結又は結合され、ＣＢＤ融合タンパク質の翻訳を開始させる。ＣＢＤ核酸は、高親和性で可逆的に結合するセルロース結合ドメインを作製するか、又はＣＢＤをコードするｍＲＮＡを作製する様々な細胞源から得られ得る。ＣＢＤをコードする核酸の好ましい供給源は、クロストリジウムセルロボランスである。ＣＢＤをコードする核酸は、参照によりここに取り込まれる米国特許第５８５６２０１号明細書に記載のように得られ得る。
【０１３４】
本発明のＣＢＤタンパク質をコードする核酸は、細胞源から単離、精製されたＤＮＡから、又はゲノムクローニングにより得られ得る。クローンのｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーは、当技術分野で周知の技術を用いて調製され得、遺伝子の任意の部分に実質的に相補的であるヌクレオチドプローブを用い、特定のＣＢＤをコードする核酸についてスクリーニングされ得る。ＣＢＤタンパク質をコードする保存ヌクレオチド領域の検出が所望されるなら、ヌクレオチドプローブは、種から種へ保存されたＣＢＤヌクレオチド配列に基づくべきである。ＣＢＤタンパク質をコードする特有のヌクレオチド領域の検出が所望されるなら、ヌクレオチドプローブは、特有のＣＢＤヌクレオチド配列に基づくべきである。あるいは、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡは、好適なオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲクローニングの鋳型として使用され得る。完全長クローン、つまり、所望のＣＢＤタンパク質の全コード領域を含有するものは、発現ベクターを構築するために選択され得る。又は重複ｃＤＮＡが共にライゲーションされて、完全なコード配列を形成することができる。あるいは、ＣＢＤをコードするＤＮＡは、当技術分野で標準であるとみなされる技術を用い、化学合成により、全体又は一部で合成され得る。
【０１３５】
多くのベクターを利用することができ、適切なベクターの選択は、下記１）核酸増幅又は核酸発現に用いられるかどうか、２）ベクターに挿入される核酸の大きさ、及び３）ベクターを用いて形質転換される宿主細胞など、様々な要因に依存するが、これらに限定されない。各ベクターは、その機能（核酸の増幅又は核酸の発現）並びに適合する宿主細胞に応じて様々な成分を含有する。
【０１３６】
「宿主細胞」という用語は、培養下で増殖することができ、ＣＢＤタンパク質又はＣＢＤ−ＨＰキメラを発現することができる細胞を指す。本発明の宿主細胞は、体外培養での細胞を包含し、原核、真核、及び昆虫細胞を含む。挿入配列の発現を調節するか、又は所望の特異的な方法で遺伝子産物を修飾、処理する宿主細胞株が選択され得る。特定のプロモータからの発現は、特定の誘導物質（例えば、メタロチオネインプロモータの場合、亜鉛及びカドミウムイオン）の存在下で上昇させることができる。従って、ＣＢＤタンパク質又はＣＢＤ融合タンパク質の発現は、制御され得る。発現を制御する能力は、ＣＢＤタンパク質又はＣＢＤ融合タンパク質が宿主細胞に対して致死性であれば重要である。タンパク質産物の修飾（例えば、リン酸化）及び処理（例えば、開裂）は、タンパク質の機能に重要である。種々の宿主細胞は、タンパク質の翻訳後処理及び修飾に特有の特異的機構を有する。適切な細胞株又は宿主システムは、発現するＣＢＤタンパク質又はＣＢＤ融合タンパク質の正しい修飾及び処理が確保されるように選択することができる。宿主細胞のタンパク質分解酵素の分泌は最少量であることが好ましい。
【０１３７】
参照によりここに組み込まれる米国特許第５８５６２０１号明細書において、ＣＢＤ又はＣＢＤ−ＨＰキメラを作製する他の詳細な情報を見出すことができる。
【図１】
2020512346.tif 000003
【図２】
2020512346.tif 000004
【手続補正書】
【提出日】平成30年12月17日(2018.12.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
いくつかの実施形態において、ＣＢＤタンパク質は、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＥＥＵ００２６５．１であるルミニクロストリジウムサーモセラム（Ｒｕｍｉｎｉｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、ＣＢＤ配列は、NLKVEFYNSNPSDTTNSINPQFKVTNTGSSAIDLSKLTLRYYYTVDGQKDQTFWCDHAAIIGSNGSYNGITSNVKGTFVKMSSSTNNADTYLEISFTGGTLEPGAHVQIQGRFAKNDWSNYTQSNDYSFKSASQFVEWDQVTAYLNGVLVWGKEPGGSVVPSTQPVTTPPATTKPPATTIPPである。
【国際調査報告】
2020512346.tif 000005
2020512346.tif 000006
2020512346.tif 000007