(57)【要約】  少なくとも１つの細胞外標的受容体結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを含み、前記細胞内ドメインがいかなるシグナルも伝達することができない膜貫通ポリペプチドを含む、改変細胞が提供される。標的細胞の標的受容体によるシグナル伝達を誘導または阻害する方法であって、標的細胞を本発明の改変細胞と接触させることを含む方法も提供される。【選択図】図１Ａ
2020503841.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的細胞の標的受容体によるシグナル伝達を調節する方法であって、前記標的細胞を、少なくとも１つの細胞外標的受容体結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを含み、前記細胞内ドメインがシグナルを伝達しないキメラ膜貫通ポリペプチドを含む、改変細胞と接触させることを含み、前記改変細胞がリガンドとしての役割を果たし、それにより標的細胞の標的受容体によるシグナル伝達を調節する、方法。
【請求項２】
疾患または障害に罹患している対象を治療する方法であって、
ａ．前記疾患または障害の部位にホーミングすることができる細胞を準備することと、
ｂ．少なくとも１つの細胞外標的受容体結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを含み、前記細胞内ドメインがいかなるシグナルも伝達することができず、前記標的受容体が前記疾患または障害に関連するものである、キメラ膜貫通ポリペプチドを前記細胞に発現させることと、
ｃ．前記対象に前記キメラ膜貫通ポリペプチドを発現する前記細胞を投与することと    を含み、
それにより疾患または障害に罹患している前記対象を治療する、方法。
【請求項３】
標的細胞による前記シグナル伝達が、前記標的細胞内でのシグナル伝達カスケードを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記調節することが、誘導すること、または阻害することを含む、請求項１または３に記載の方法。
【請求項５】
前記シグナル伝達を誘導することが、前記標的受容体のシグナル伝達ドメイン内の残基のリン酸化を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記シグナル伝達を誘導することが、前記標的受容体の下流標的のレベルの上方制御を含む、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
前記シグナル伝達を阻害することが、前記標的受容体の下流標的のレベルの下方制御を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記キメラ膜貫通ポリペプチドが、異なるタンパク質に由来する細胞外ドメインと細胞内ドメインとを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞外ドメインが、前記標的受容体のアゴニストまたはアンタゴニストを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記標的受容体結合ドメインが、免疫グロブリン可変重鎖ドメイン（ＶＨ）と免疫グロブリン可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）とを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＶＨとＶＬがペプチドリンカーによって連結している、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記リンカーが、アミノ酸配列ＧＧＳＳＲＳＳＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号４）またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５）を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記膜貫通ドメインが１回膜貫通ドメインである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記膜貫通ドメインがＣＤ３膜貫通ドメインを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＣＤ３膜貫通ドメインが配列ＬＣＹＬＬＤＧＩＬＦＩＹＧＶＩＩＴＡＬＹＬ（配列番号２９）を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記キメラ膜貫通ポリペプチドが、細胞外膜近位ドメインヒンジ領域をさらに含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ヒンジ領域がＣＤ−８ヒンジ領域を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＣＤ−８ヒンジ領域が、アミノ酸配列ＡＬＳＮＳＩＭＹＦＳＨＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＳＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤ（配列番号７）を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記シグナルが、前記細胞内ドメインのシグナル伝達ドメイン内の残基のリン酸化を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記シグナルが、免疫細胞のエフェクター機能の活性化を誘導する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記シグナルが、前記改変細胞からの少なくとも１つのサイトカインの分泌を誘導する、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記少なくとも１つのサイトカインがインターロイキン２（ＩＬ−２）である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記シグナルがＺＡＰ−７０キナーゼの活性化を誘導する、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞内ドメインが、前記改変細胞の表面での検出可能な前記キメラ膜貫通ポリペプチドの発現を可能にするのに十分な長さおよび電荷の人工アミノ酸配列を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記改変細胞の表面での前記キメラ膜貫通ポリペプチドの検出がＦＡＣＳを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞内ドメインが、前記改変免疫細胞の膜内での前記キメラ膜貫通ポリペプチドの移動を可能にするのに十分な長さおよび電荷の人工アミノ酸配列を含む、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞内ドメインが、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＯＸ−４０  ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）以外の任意の膜貫通タンパク質の細胞内ドメインを含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞内ドメインが、活性化シグナルを伝達することができないよう変異したＣＤ３ゼータ鎖を含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＣＤ３ゼータ鎖が、アミノ酸配列ＲＡＫＦＳＲＳＡＥＴＡＡＮＬＱＤＰＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＥＫＫＲＡＲＤＰＥＭＧＧＫＱＱＲＲＲＮＰＱＥＧＶＹＮＡＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＴＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＴＬＡＰＲ（配列番号３０）を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＣＤ３ゼータ鎖の少なくとも１つのチロシンが変異しており、前記変異が、前記細胞内ドメインが活性化シグナルを伝達することができないようにするものである、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記少なくとも１つのチロシンがフェニルアラニンに変異している、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＣＤ３ゼータ鎖の全チロシンが変異している、請求項２８〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
全チロシンがフェニルアラニンに変異している、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞内ドメインが、アミノ酸配列ＲＡＫＦＳＲＳＡＥＴＡＡＮＬＱＤＰＮＱＬＦＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＦＤＶＬＥＫＫＲＡＲＤＰＥＭＧＧＫＱＱＲＲＲＮＰＱＥＧＶＦＮＡＬＱＫＤＫＭＡＥＡＦＳＥＩＧＴＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＦＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＦＤＡＬＨＭＱＴＬＡＰＲ（配列番号３１）を含む、請求項２８〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞内ドメインが、前記改変細胞が前記標的細胞に対して有害となるいかなるシグナルも伝達することができない、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞内ドメインが不活性である、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記キメラ膜貫通ポリペプチドがタグをさらに含む、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記タグがＧＦＰタグおよびＭｙｃタグから選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記標的受容体が疾患または障害に関連するものである、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記標的受容体が、ＧＨＲ、ＧＬＰ１Ｒ、ＴｒｋＢおよびＰＤ−１から選択される、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記標的受容体がＴｒｋＢであり、前記抗ＴｒｋＢ抗原結合ドメインが、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２または配列番号１３のいずれか１つで記載される配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記キメラ膜貫通ポリペプチドが、配列番号１８または配列番号２０で記載されるアミノ酸配列を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記標的受容体がＧＬＰ１Ｒであり、前記抗ＧＬＰ１Ｒ抗原結合ドメインが、配列番号１４または配列番号１５のいずれか１つで記載される配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記キメラ膜貫通ポリペプチドが、配列番号２２で記載されるアミノ酸配列を有する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記標的受容体がＧＨＲであり、前記標的受容体結合ドメインが成長ホルモン（ＧＨ）を含む、請求項１〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記ＧＨが、配列番号１６で記載される配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記キメラ膜貫通ポリペプチドが、配列番号２４で記載されるアミノ酸配列を有する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記標的受容体がＰＤ−１であり、前記抗ＰＤ−１抗原結合ドメインが、配列番号２５または配列番号２６で記載される配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記キメラ膜貫通ポリペプチドが、配列番号２８で記載されるアミノ酸配列を有する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記キメラ膜貫通ポリペプチドが、配列番号１８、２０、２２、２４および２８のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％配列同一性を有し、シグナルを伝達することができない、請求項１〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記改変細胞または準備する細胞が免疫細胞である、請求項１〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記免疫細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞、骨髄性細胞、マクロファージ、単球、好中球、抗原提示細胞および樹状細胞から選択される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記改変細胞または準備する細胞が、ヒトドナー由来の初代ヒト細胞に由来するものであり、前記改変初代ヒト細胞が、ヒトの治療に使用するのに適している、請求項１〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記標的細胞が培養されているものである、請求項１〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記標的細胞が対象内に存在するものである、請求項１〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記準備する細胞が前記対象に対して自家性である、請求項２〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記準備する細胞が前記対象に対して異種性である、請求項２〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記準備することが、前記対象から初代細胞を抽出することを含む、請求項２〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
前記対象の細胞上の前記標的受容体の活性化によって前記疾患または障害を治療し、前記細胞外受容体結合ドメインが前記標的受容体のアゴニストを含む、請求項２〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記対象の細胞上の前記受容体の阻害によって前記疾患または障害を治療し、前記細胞外受容体結合ドメインが前記標的受容体のアンタゴニストを含む、請求項２〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記標的受容体がＴｒｋＢであり、前記疾患または障害が神経疾患または神経障害である、請求項２〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
前記神経疾患または神経障害が、アルツハイマー病、うつ病、記憶喪失、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、癲癇および脳腫瘍から選択される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記標的受容体がＧＬＰ１Ｒであり、前記疾患または障害が、代謝疾患もしくは代謝障害または心血管疾患もしくは心血管障害である、請求項２〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記代謝疾患または代謝障害が、糖尿病、肥満、糖原病、パーキンソン病およびミトコンドリア性ミオパチーから選択される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記心血管疾患または心血管障害が、脳卒中、心筋梗塞、心虚血および冠動脈疾患から選択される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記標的受容体がＧＨＲであり、前記疾患または障害が成長疾患または成長障害である、請求項２〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
前記成長疾患または成長障害が、先端巨大症、成長ホルモン分泌不全症、癌、ターナー症候群およびプラダー・ウィリー症候群から選択される、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記標的受容体がＰＤ−１であり、前記疾患または障害が、免疫疾患もしくは免疫障害または癌である、請求項２〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
前記免疫疾患または免疫障害が、狼瘡、関節リウマチ、乾癬、グレーブス病、免疫介在性炎症およびセリアック病から選択される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記疾患または障害が癌であり、前記標的受容体結合ドメインがＰＤ−１アンタゴニストを含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
少なくとも１つの細胞外標的受容体結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを含み、前記細胞内ドメインがいかなるシグナルも伝達することができないキメラ膜貫通ポリペプチドを含む、改変細胞と、薬学的に許容される担体、賦形剤または補助剤とを含む、医薬組成物。
【請求項７２】
前記標的受容体に関連する疾患または障害の治療に使用する、請求項７１に記載の医薬組成物。
【請求項７３】
前記組成物が少なくとも１００万個の改変細胞を含む、請求項７１または７２に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、２０１６年１０月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／４０６，００５号の優先権を主張するものであり、上記出願の内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる．
【０００２】
（発明の分野）
本発明は細胞療法の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
様々な受容体と特異的に結合しアゴニストまたはアンタゴニストとして作用することが明らかにされている抗体、抗体フラグメントおよびリガンドが多数存在する。このようなアゴニスト／アンタゴニスト物質はこれまで、様々な疾患の治療に使用されてきた。一方、このような分子を使用する際に大きな制約となるのが、分子を特定の器官、組織および／または特定の細胞型に標的化することの複雑さである。大きな分子に血液脳関門を通過させて実質領域の深部まで輸送するのは困難である。さらに、これらの分子は半減期が短いか、免疫原性が高いか、または意図する標的領域に全く到達しないことが多い。
【０００４】
これらの有望な治療用分子の細胞内送達は、上記の問題点の多くを回避し得る手段の１つとなる可能性がある。しかし、このような解決法は、細胞が所望の治療領域または疾患領域にホーミングすることができるかどうかにかかっている。さらに、免疫応答を誘導しない自家治療または同種治療を実施するためには、対象の体外で初代細胞を培養し拡大することが可能でなければならない。上記の治療用分子を送達するには、現在用いられている送達方法では、最良の場合でも免疫細胞を活性化し、それにより局所炎症を引き起こし、最悪の場合、治療する細胞を直接死滅させることもあり得ることから、免疫細胞が未開拓の１つの手段となっている。体内の場所を問わず疾患細胞に、その細胞に害を及ぼすことも疾患領域の炎症を増大させることもなく治療用のアゴニストおよびアンタゴニストを送達する方法が大いに望まれている。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、標的細胞の標的受容体によるシグナル伝達を調節する方法および標的受容体に関連する疾患または障害に罹患している対象を治療する方法を提供する。
【０００６】
第一の態様では、標的細胞の標的受容体によるシグナル伝達を調節する方法であって、標的細胞を、少なくとも１つの細胞外標的受容体結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを含み、細胞内ドメインがシグナルを伝達しないキメラ膜貫通ポリペプチドを含む、改変細胞と接触させることを含み、改変細胞がリガンドとしての役割を果たし、それにより標的細胞の標的受容体によるシグナル伝達を調節する、方法が提供される。
【０００７】
また別の態様では、疾患または障害に罹患している対象を治療する方法であって、
ａ．疾患または障害の部位にホーミングすることができる細胞を準備することと、
ｂ．少なくとも１つの細胞外標的受容体結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを含み、細胞内ドメインがいかなるシグナルも伝達することができず、標的受容体が疾患または障害に関連するものである、キメラ膜貫通ポリペプチドを細胞に発現させることと、
ｃ．対象にキメラ膜貫通ポリペプチドを発現する細胞を投与することと
を含み、
それにより疾患または障害に罹患している対象を治療する、方法が提供される。
【０００８】
いくつかの実施形態では、標的細胞によるシグナル伝達は、標的細胞内でのシグナル伝達カスケードを含む。いくつかの実施形態では、調節することは、誘導すること、または阻害することを含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達を誘導することは、標的受容体のシグナル伝達ドメイン内の残基のリン酸化を含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達を誘導することは、標的受容体の下流標的のレベルの上方制御を含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達を阻害することは、前記標的受容体の下流標的のレベルの下方制御を含む。
【０００９】
いくつかの実施形態では、キメラ膜貫通ポリペプチドは、異なるタンパク質に由来する細胞外ドメインと細胞内ドメインとを含む。
【００１０】
いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは、前記標的受容体のアゴニストまたはアンタゴニストを含む。
【００１１】
いくつかの実施形態では、標的受容体結合ドメインは、免疫グロブリン可変重鎖ドメイン（ＶＨ）と免疫グロブリン可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）とを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨとＶＬはペプチドリンカーによって連結している。いくつかの実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列ＧＧＳＳＲＳＳＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号４）またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５）を含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは１回膜貫通ドメインである。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインはＣＤ３膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３膜貫通ドメインは配列ＬＣＹＬＬＤＧＩＬＦＩＹＧＶＩＩＴＡＬＹＬ（配列番号２９）を含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、キメラ膜貫通ポリペプチドは、細胞外膜近位ドメインヒンジ領域をさらに含む。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域はＣＤ−８ヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ−８ヒンジ領域はアミノ酸配列ＡＬＳＮＳＩＭＹＦＳＨＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＳＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤ（配列番号７）を含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、シグナルは、前記細胞内ドメインのシグナル伝達ドメイン内の残基のリン酸化を含む。いくつかの実施形態では、シグナルは、免疫細胞のエフェクター機能の活性化を誘導する。いくつかの実施形態では、シグナルは、前記改変細胞からの少なくとも１つのサイトカインの分泌を誘導する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのサイトカインはインターロイキン２（ＩＬ−２）である。いくつかの実施形態では、シグナルはＺＡＰ−７０キナーゼの活性化を誘導する。
【００１５】
いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、改変細胞の表面での検出可能なキメラ膜貫通ポリペプチドの発現を可能にするのに十分な長さおよび電荷の人工アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、改変細胞の表面でのキメラ膜貫通ポリペプチドの検出はＦＡＣＳを含む。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、前記改変免疫細胞の膜内でのキメラ膜貫通ポリペプチドの移動を可能にするのに十分な長さおよび電荷の人工アミノ酸配列を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＯＸ−４０  ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）以外の任意の膜貫通タンパク質の細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、活性化シグナルを伝達することができないよう変異したＣＤ３ゼータ鎖を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、ＣＤ３ゼータ鎖は、アミノ酸配列ＲＡＫＦＳＲＳＡＥＴＡＡＮＬＱＤＰＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＥＫＫＲＡＲＤＰＥＭＧＧＫＱＱＲＲＲＮＰＱＥＧＶＹＮＡＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＴＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＴＬＡＰＲ（配列番号３０）を含む。
【００１８】
いくつかの実施形態では、前記ＣＤ３ゼータ鎖の少なくとも１つのチロシンが変異しており、変異は、細胞内ドメインが活性化シグナルを伝達することができないようにするものである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのチロシンはフェニルアラニンに変異している。いくつかの実施形態では、前記ＣＤ３ゼータ鎖の全チロシンが変異している。いくつかの実施形態では、全チロシンがフェニルアラニンに変異している。
【００１９】
いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、アミノ酸配列ＲＡＫＦＳＲＳＡＥＴＡＡＮＬＱＤＰＮＱＬＦＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＦＤＶＬＥＫＫＲＡＲＤＰＥＭＧＧＫＱＱＲＲＲＮＰＱＥＧＶＦＮＡＬＱＫＤＫＭＡＥＡＦＳＥＩＧＴＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＦＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＦＤＡＬＨＭＱＴＬＡＰＲ（配列番号３１）を含む。
【００２０】
いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、改変細胞が標的細胞に対して有害となるいかなるシグナルも伝達することができない。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは不活性である。
【００２１】
いくつかの実施形態では、キメラ膜貫通ポリペプチドはタグをさらに含む。いくつかの実施形態では、タグは、ＧＦＰタグおよびＭｙｃタグから選択される。
【００２２】
いくつかの実施形態では、標的受容体は疾患または障害に関連するものである。いくつかの実施形態では、標的受容体は、ＧＨＲ、ＧＬＰ１Ｒ、ＴｒｋＢおよびＰＤ−１から選択される。
【００２３】
いくつかの実施形態では、標的受容体はＴｒｋＢであり、抗ＴｒｋＢ抗原結合ドメインは、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２または配列番号１３のいずれか１つで記載される配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラ膜貫通ポリペプチドは、配列番号１８または配列番号２０で記載されるアミノ酸配列を含む。
【００２４】
いくつかの実施形態では、標的受容体はＧＬＰ１Ｒであり、抗ＧＬＰ１Ｒ抗原結合ドメインは、配列番号１４または配列番号１５のいずれか１つで記載される配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラ膜貫通ポリペプチドは、配列番号２２で記載されるアミノ酸配列を有する。
【００２５】
いくつかの実施形態では、標的受容体はＧＨＲであり、前記標的受容体結合ドメインは成長ホルモン（ＧＨ）を含む。いくつかの実施形態では、ＧＨは、配列番号１６で記載される配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラ膜貫通ポリペプチドは、配列番号２４で記載されるアミノ酸配列を有する。
【００２６】
いくつかの実施形態では、標的受容体はＰＤ−１であり、抗ＰＤ−１抗原結合ドメインは、配列番号２５または配列番号２６で記載される配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラ膜貫通ポリペプチドは、配列番号２８で記載されるアミノ酸配列を有する。
【００２７】
いくつかの実施形態では、キメラ膜貫通ポリペプチドは、配列番号１８、２０、２２、２４または２８のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有し、シグナルを伝達することができない。
【００２８】
いくつかの実施形態では、改変細胞または準備する細胞は免疫細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞、骨髄性細胞、マクロファージ、単球、好中球、抗原提示細胞および樹状細胞から選択される。
【００２９】
いくつかの実施形態では、改変細胞または準備する細胞は、ヒトドナー由来の初代ヒト細胞に由来するものであり、前記改変初代ヒト細胞は、ヒトの治療に使用するのに適したものである。いくつかの実施形態では、準備する細胞は対象に対して自家性である。いくつかの実施形態では、準備する細胞は対象に対して同種性である。
【００３０】
いくつかの実施形態では、標的細胞は培養されているものである。いくつかの実施形態では、標的細胞は対象内に存在するものである。
【００３１】
いくつかの実施形態では、準備することは、前記対象から初代細胞を抽出することを含む。
【００３２】
いくつかの実施形態では、対象の細胞上の前記標的受容体の活性化によって疾患または障害を治療し、細胞外受容体結合ドメインは標的受容体のアゴニストを含む。いくつかの実施形態では、対象の細胞上の受容体の阻害によって疾患または障害を治療し、細胞外受容体結合ドメインは標的受容体のアンタゴニストを含む。
【００３３】
いくつかの実施形態では、標的受容体はＴｒｋＢであり、疾患または障害は神経疾患または神経障害である。いくつかの実施形態では、神経疾患または神経障害は、アルツハイマー病、うつ病、記憶喪失、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、癲癇および脳腫瘍から選択される。
【００３４】
いくつかの実施形態では、標的受容体はＧＬＰ１Ｒであり、疾患または障害は、代謝疾患もしくは代謝障害または心血管疾患もしくは心血管障害である。いくつかの実施形態では、代謝疾患または代謝障害は、糖尿病、肥満、糖原病、パーキンソン病およびミトコンドリア性ミオパチーから選択される。いくつかの実施形態では、心血管疾患または心血管障害は、脳卒中、心筋梗塞、心虚血および冠動脈疾患から選択される。
【００３５】
いくつかの実施形態では、標的受容体はＧＨＲであり、疾患または障害は成長疾患または成長障害である。いくつかの実施形態では、成長疾患または成長障害は、先端巨大症、成長ホルモン分泌不全症、癌、ターナー症候群およびプラダー・ウィリー症候群から選択される。
【００３６】
いくつかの実施形態では、標的受容体はＰＤ−１であり、疾患または障害は、免疫疾患もしくは免疫障害または癌である。いくつかの実施形態では、免疫疾患または免疫障害は、狼瘡、関節リウマチ、乾癬、グレーブス病、免疫介在性炎症およびセリアック病から選択される。いくつかの実施形態では、疾患または障害は癌であり、標的受容体結合ドメインはＰＤ−１アンタゴニストを含む。
【００３７】
また別の態様では、少なくとも１つの細胞外標的受容体結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを含み、細胞内ドメインがシグナルを伝達しないキメラ膜貫通ポリペプチドを含む、改変細胞と、薬学的に許容される担体、賦形剤または補助剤とを含む、医薬組成物が提供される。
【００３８】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、標的受容体に関連する疾患または障害の治療に使用するものである。いくつかの実施形態では、組成物は少なくとも１００万個の改変細胞を含む。
【００３９】
以下に記載する詳細な説明から、本発明のさらなる実施形態および全適用範囲が明らかになるであろう。ただし、当業者には、この詳細な説明から本発明の趣旨および範囲に含まれる様々な変更および修正が明らかになることから、詳細な説明および具体例は、本発明の好ましい実施形態を示すものであると同時に、単なる例示を目的に記載されるものであることを理解するべきである。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１Ａ】ｐＴｒｋＢ、全長型ＴｒｋＢおよびアクチンを検出したウエスタンブロットの写真露出を示す図である。
【図１Ｂ】図１Ａに示したｐＴｒｋｂの相対量をまとめた棒グラフである。リン酸化型の発現の標準化に作用および全長型ＴｒｋＢを用いている。
【図２】培養細胞から分泌されたＩＬ−２の相対量を示す棒グラフである。結果はＩＬ−２のＥＬＩＳＡアッセイで得たＯＤレベル（波長６５０）として示されている。
【図３−１】（３Ａ）αＴｒｋＢ−Ｍｙｃ−ＷＴ、（３Ｂ）αＴｒｋＢ−Ｍｙｃ−Ｍｕｔ、（３Ｃ）αＴｒｋＢ−ＧＦＰ−ＷＴ、（３Ｄ）αＴｒｋＢ−ＧＦＰ−Ｍｕｔ、（３Ｅ）αＧＬＰ１Ｒ−Ｍｙｃ−ＷＴおよび（３Ｆ）αＧＬＰ１Ｒ−Ｍｙｃ−ＭｕｔをＢＷ細胞に、（３Ｇ）αＧＬＰ１Ｒ−Ｍｙｃ−Ｍｕｔを初代マウスＴヘルパー細胞にウイルスで形質導入した後のＭｙｃまたはＧＦＰの表面発現のヒストグラムである。明灰色−未染色細胞または未形質導入細胞、灰色−Ｍｙｃの図に対する二次抗体単独の対照（抗ＡＰＣ）、黒色−ＭｙｃまたはＧＦＰを形質導入した細胞。
【図３−２】（３Ａ）αＴｒｋＢ−Ｍｙｃ−ＷＴ、（３Ｂ）αＴｒｋＢ−Ｍｙｃ−Ｍｕｔ、（３Ｃ）αＴｒｋＢ−ＧＦＰ−ＷＴ、（３Ｄ）αＴｒｋＢ−ＧＦＰ−Ｍｕｔ、（３Ｅ）αＧＬＰ１Ｒ−Ｍｙｃ−ＷＴおよび（３Ｆ）αＧＬＰ１Ｒ−Ｍｙｃ−ＭｕｔをＢＷ細胞に、（３Ｇ）αＧＬＰ１Ｒ−Ｍｙｃ−Ｍｕｔを初代マウスＴヘルパー細胞にウイルスで形質導入した後のＭｙｃまたはＧＦＰの表面発現のヒストグラムである。明灰色−未染色細胞または未形質導入細胞、灰色−Ｍｙｃの図に対する二次抗体単独の対照（抗ＡＰＣ）、黒色−ＭｙｃまたはＧＦＰを形質導入した細胞。
【図３−３】（３Ａ）αＴｒｋＢ−Ｍｙｃ−ＷＴ、（３Ｂ）αＴｒｋＢ−Ｍｙｃ−Ｍｕｔ、（３Ｃ）αＴｒｋＢ−ＧＦＰ−ＷＴ、（３Ｄ）αＴｒｋＢ−ＧＦＰ−Ｍｕｔ、（３Ｅ）αＧＬＰ１Ｒ−Ｍｙｃ−ＷＴおよび（３Ｆ）αＧＬＰ１Ｒ−Ｍｙｃ−ＭｕｔをＢＷ細胞に、（３Ｇ）αＧＬＰ１Ｒ−Ｍｙｃ−Ｍｕｔを初代マウスＴヘルパー細胞にウイルスで形質導入した後のＭｙｃまたはＧＦＰの表面発現のヒストグラムである。明灰色−未染色細胞または未形質導入細胞、灰色−Ｍｙｃの図に対する二次抗体単独の対照（抗ＡＰＣ）、黒色−ＭｙｃまたはＧＦＰを形質導入した細胞。
【図３−４】（３Ａ）αＴｒｋＢ−Ｍｙｃ−ＷＴ、（３Ｂ）αＴｒｋＢ−Ｍｙｃ−Ｍｕｔ、（３Ｃ）αＴｒｋＢ−ＧＦＰ−ＷＴ、（３Ｄ）αＴｒｋＢ−ＧＦＰ−Ｍｕｔ、（３Ｅ）αＧＬＰ１Ｒ−Ｍｙｃ−ＷＴおよび（３Ｆ）αＧＬＰ１Ｒ−Ｍｙｃ−ＭｕｔをＢＷ細胞に、（３Ｇ）αＧＬＰ１Ｒ−Ｍｙｃ−Ｍｕｔを初代マウスＴヘルパー細胞にウイルスで形質導入した後のＭｙｃまたはＧＦＰの表面発現のヒストグラムである。明灰色−未染色細胞または未形質導入細胞、灰色−Ｍｙｃの図に対する二次抗体単独の対照（抗ＡＰＣ）、黒色−ＭｙｃまたはＧＦＰを形質導入した細胞。
【図４】抗Ｍｙｃ抗体との共インキュベーション後にＭｙｃ含有構築物を発現する形質導入細胞から分泌されたＩＬ−２の相対量を示す棒グラフである。結果はＩＬ−２のＥＬＩＳＡアッセイで得たＯＤレベル（波長６５０）として示されている。
【図５】ＧＬＰ１Ｒ発現細胞との共インキュベーション後にＭｙｃ含有構築物を発現する形質導入細胞から分泌されたＩＬ−２の相対量を示す棒グラフである。結果はＩＬ−２のＥＬＩＳＡアッセイで得たＯＤレベル（波長６５０）として示されている。
【図６】Ｒａｗ細胞から分泌されたＴＮＦアルファの相対量を示す棒グラフである。市販のＥＬＩＳＡキットにより上清中のマウスＴＮＦαレベルを求めた。ＥＬＩＳＡアッセイの結果はＯＤ−６５０として示されている。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
（発明の詳細な説明）
本発明は、標的細胞上の受容体の活性を調節することにより疾患を治療するための組成物および方法を提供する。本発明は、免疫系の細胞が体内に移動し器官内の特定のニッチに集積する能力を利用するものである。このような免疫細胞は、その膜に発現し係留される目的分子の送達プラットフォームとして使用される。係留される治療用分子は、免疫細胞活性化シグナルを伝達することができない細胞内ドメインを含むキメラ膜貫通ポリペプチドの細胞外ドメイン内にある。このようにして、治療用分子がその標的受容体にとどまることによって標的受容体が調節される（例えば、活性化または不活性化される）が、免疫細胞自体は活性化されない。
【００４２】
第一の態様により、標的細胞の標的受容体によるシグナル伝達を調節する方法であって、標的細胞を、少なくとも１つの細胞外標的受容体結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを含み、細胞内ドメインがいかなるシグナルも伝達することができないキメラ膜貫通ポリペプチドを含む、改変細胞と接触させることを含み、それにより標的細胞の標的受容体によるシグナル伝達を調節する、方法が提供される。
【００４３】
また別の態様により、標的細胞の標的受容体によるシグナル伝達を調節する方法であって、標的細胞を、少なくとも１つの細胞外標的受容体結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを含み、細胞内ドメインが免疫細胞活性化シグナルを伝達することができないキメラ膜貫通ポリペプチドを含む、改変免疫細胞と接触させることを含み、それにより標的細胞の標的受容体によるシグナル伝達を調節する、方法が提供される。
【００４４】
また別の態様により、疾患または障害に罹患している対象を治療する方法であって、
ａ．免疫細胞を準備することと、
ｂ．少なくとも１つの細胞外標的受容体結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを含み、前記細胞内ドメインが免疫細胞活性化シグナルを伝達することができず、前記標的受容体が前記疾患または障害に関連するものである、キメラ膜貫通ポリペプチドを前記免疫細胞に発現させることと、
ｃ．前記対象に前記キメラ膜貫通ポリペプチドを発現する前記免疫細胞を投与することと
を含み、
それにより疾患または障害に罹患している前記対象を治療する、方法が提供される。
【００４５】
また別の態様により、疾患または障害に罹患している対象を治療する方法であって、
ａ．前記疾患または障害の部位にホーミングすることができる細胞を準備することと、
ｂ．少なくとも１つの細胞外標的受容体結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを含み、前記細胞内ドメインが不活性であり、前記標的受容体が前記疾患または障害に関連するものである、キメラ膜貫通ポリペプチドを前記細胞に発現させることと、
ｃ．前記対象に前記キメラ膜貫通ポリペプチドを発現する前記細胞を投与することと
を含み、
それにより疾患または障害に罹患している前記対象を治療する、方法が提供される。
【００４６】
また別の態様により、少なくとも１つの細胞外標的受容体結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを含み、細胞内ドメインが免疫細胞活性化シグナルを伝達することができない、キメラ膜貫通ポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインはいかなるシグナルも伝達することができない。
【００４７】
本明細書で使用される「シグナル伝達」という用語は、細胞内シグナル伝達を指す。シグナル伝達は当該技術分野で周知であり、一連の分子事象を介してシグナルを伝達して細胞に生理学的変化をもたらすことを指す。いくつかの実施形態では、シグナル伝達は標的細胞内でのシグナル伝達カスケードを含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達はシグナル伝達タンパク質のリン酸化を含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達を誘導することは、標的受容体のシグナル伝達ドメイン内の残基のリン酸化を含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達を誘導することは、シグナル伝達カスケードのタンパク質のシグナル伝達ドメイン内の残基のリン酸化を含む。いくつかの実施形態では、リン酸化残基はチロシン残基である。いくつかの実施形態では、シグナル伝達を誘導することは、標的受容体の下流標的のレベルの上方制御を含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達を阻害することは、標的受容体の下流標的のレベルの下方制御を含む。
【００４８】
いくつかの実施形態では、シグナル伝達を誘導することは、シグナル伝達の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％の増大を含む。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、シグナル伝達を阻害することは、シグナル伝達の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％の減少を含む。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。
【００４９】
シグナル伝達の変化の測定は当該技術分野で周知であり、シグナル伝達の変化を確認する任意の方法を用いて本発明の方法を実施し得る。このような測定方法としては、特に限定されないが、標的受容体またはシグナル伝達カスケードで受容体の下流にあることが明らかにされている別のシグナル伝達タンパク質のシグナル伝達ドメインのリン酸化の測定が挙げられる。シグナル伝達によって上方制御または下方制御されることが明らかにされているタンパク質の発現レベルの測定を用いてもよい。このような分子の例としては、特に限定されないが、サイトカイン、転写因子およびエフェクタータンパク質が挙げられる。
【００５０】
いくつかの実施形態では、標的細胞は患部組織の細胞である。いくつかの実施形態では、組織は、脳、筋肉、心臓、肺、膵臓、皮膚、肝臓、生殖器系、消化器系および分泌系から選択される。いくつかの実施形態では、標的細胞は血液細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞は免疫細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞は、ニューロン、筋細胞、骨細胞、血液細胞、リンパ細胞、線維芽細胞、免疫細胞、インスリン産生細胞および心臓細胞から選択される。
【００５１】
いくつかの実施形態では、標的細胞は培養されているものである。いくつかの実施形態では、標的細胞は対象内にあるものである。いくつかの実施形態では、標的細胞は対象内にあるものであり、改変細胞は対象に対して同種性である。いくつかの実施形態では、標的細胞は対象内にあるものであり、改変細胞は対象に対して自家性である。いくつかの実施形態では、標的細胞は対象内にあるものであり、改変細胞は、対象に投与したときに免疫応答を誘発しないよう、または免疫応答の低下を誘発するようさらに改変されている。
【００５２】
いくつかの実施形態では、標的受容体は疾患または障害に関連する受容体である。いくつかの実施形態では、標的受容体は、対象の疾患細胞または患部組織上にある。いくつかの実施形態では、標的受容体の活性化によって疾患または障害が治療または改善され、細胞外受容体結合ドメインは標的受容体のアゴニストを含む。いくつかの実施形態では、標的受容体の阻害によって疾患または障害が治療または改善され、細胞外受容体結合ドメインは標的受容体のアンタゴニストを含む。
【００５３】
本明細書で使用される疾患、障害または病態の「治療」または疾患、障害または病態を「治療すること」という用語は、その少なくとも１つの症状の緩和、その重症度の軽減またはその進行の阻害を包含する。治療は、疾患、障害または病態が完全に治癒することを意味する必要はない。効果的な治療であるためには、本明細書の有用な組成物が、疾患、障害もしくは病態の重症度を軽減するか、それに関連する症状の重症度を軽減するか、または患者もしくは対象の生活の質に改善をもたらすだけでよい。
【００５４】
改変細胞
また別の態様により、少なくとも１つの細胞外標的受容体結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを含み、細胞内ドメインが免疫細胞活性化シグナルを伝達することができないキメラ膜貫通ポリペプチドを含む、改変細胞が提供される。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインはいかなるシグナルも伝達することができない。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは不活性である。いくつかの実施形態では、標的細胞を本発明の改変細胞と接触させることにより本発明の方法を実施する。いくつかの実施形態では、必要とする対象に本発明の改変細胞を投与することにより本発明の方法を実施する。
【００５５】
いくつかの実施形態では、本発明の改変細胞は、体内の所望の位置または標的細胞にホーミングすることができる任意の細胞である。いくつかの実施形態では、本発明の改変細胞は、体内の疾患部位にホーミングすることができる任意の細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は線維芽細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である。いくつかの実施形態では、細胞は胚性幹細胞（ＥＳＣ）または人工多能性幹細胞（ＩＰＳＣ）である。いくつかの実施形態では、細胞は多能性幹細胞（ＰＳＣ）である。いくつかの実施形態では、細胞は免疫細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞、骨髄性細胞、マクロファージ、単球、好中球、抗原提示細胞および樹状細胞から選択される。いくつかの実施形態では、免疫細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、ホーミングおよびシナプス形成を促進するよう部分的に活性化されている。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過することができる。いくつかの実施形態では、免疫細胞は血液精巣関門（ＢＴＢ）を通過することができる。
【００５６】
細胞のホーミングは、標的細胞または疾患細胞の位置または組織によって決まり得る。標的細胞が創傷にある実施形態では、改変細胞は線維芽細胞であり得る。標的細胞が脳にある実施形態では、改変細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞であり得る。標的細胞が膵臓にある実施形態では、改変細胞はＢ細胞であり得る。
【００５７】
本発明の改変細胞は、アゴニストもしくはアンタゴニストまたは標的受容体を発現しその膜に係留するよう遺伝子改変されている。いくつかの実施形態では、アゴニスト／アンタゴニストは、以降、一本鎖アゴニスト／アンタゴニスト抗体（ＳＣＡＡＢ）と称する、標的受容体に対するアゴニスト／アンタゴニスト特性を有する一本鎖抗体である。本発明の細胞は、対象の体内の所望の標的部位へのアゴニスト／アンタゴニストの送達を媒介する担体細胞として使用される。いくつかの実施形態では、担体細胞は対象の体内に導入され、そこで所望の器官および／または特定のニッチに移動し集積する。細胞はアゴニストおよび／またはアンタゴニストの担体であるため、本発明の方法には改変細胞の細胞傷害性の活性化は必要ないことが当業者に理解されよう。実際、免疫細胞エフェクター機能の活性化が免疫応答を惹起し、かつ／または細胞を細胞傷害性にすることから、細胞のエフェクター機能の活性化は不利であり、望まれるものではない。
【００５８】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、標的細胞上の標的受容体を活性化または阻害しようとするものであり、免疫細胞が結合時に完全に活性化した場合に起こりうる標的細胞の死滅を望むものではない。このため、本発明のキメラ膜貫通ポリペプチドは、免疫細胞活性化シグナルを伝達して標的細胞に害を及ぼすことができない細胞内領域を有するものであり、したがって、ＣＤ８  Ｔ細胞およびＮＫ細胞などの免疫細胞は標的と結合しても細胞傷害性になることはない。いくつかの実施形態では、本発明の改変免疫細胞は細胞傷害性ではない。いくつかの実施形態では、本発明の改変免疫細胞は、標的受容体と結合することにより細胞傷害性になることはない。いくつかの実施形態では、本発明の改変免疫細胞は、標的受容体との結合によってサイトカインを分泌することはない。いくつかの実施形態では、改変細胞は標的細胞に害を及ぼすことはない。いくつかの実施形態では、改変細胞は標的細胞を死滅させることはない。いくつかの実施形態では、改変細胞は標的細胞に有害なものではない。
【００５９】
改変細胞が免疫細胞であるいくつかの実施形態では、細胞質ドメインは免疫細胞活性化シグナルを伝達することができない。改変細胞が免疫細胞であるいくつかの実施形態では、細胞質ドメインは、改変細胞が標的細胞に害を及ぼす結果となり得るいかなるシグナルも細胞内に伝達することができない。改変細胞が免疫細胞であるいくつかの実施形態では、細胞質ドメインは、細胞内にいかなるシグナルも伝達することができない。改変細胞が免疫細胞以外の別のホーミング細胞であるいくつかの実施形態では、細胞質ドメインは、改変細胞が標的細胞に害を及ぼす結果となり得るいかなるシグナルも細胞内に伝達することができない。改変細胞が免疫細胞以外の別のホーミング細胞であるいくつかの実施形態では、細胞質ドメインは、細胞内にいかなるシグナルも伝達することができない。
【００６０】
いくつかの実施形態では、改変細胞は初代細胞である。いくつかの実施形態では、改変細胞は、ヒトドナー由来の初代細胞に由来するものであり、前記改変初代ヒト細胞は、ヒトの治療に使用するのに適している。いくつかの実施形態では、初代細胞は、ヒトドナーから取り出した後、細胞培地で培養したものである。いくつかの実施形態では、改変細胞は、培養した初代細胞の娘細胞または子孫細胞である。ドナーに戻す初代細胞の培養は当該技術分野で周知であり、培養条件については、細胞をドナーに戻すのに適した健康状態に維持するのに使用し得るものであればいずれも適している。初代細胞培養に関する指示書については、２つの非限定的な例としてＡＴＣＣ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社から入手することができる。いくつかの実施形態では、初代細胞を拡大培養し、拡大した改変細胞をドナーに戻す。いくつかの実施形態では、準備することは、患者から初代免疫細胞を抽出することを含む。
【００６１】
「細胞培地」という用語は、細胞の増殖を可能にする任意の液体培地を指す。増殖培地は当該技術分野で公知であり、増殖させる細胞のタイプに応じて選択することができる。例えば、哺乳動物細胞の増殖に用いる増殖培地として、熱不活化ウシ胎児血清を添加することが可能なダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）がある。
【００６２】
いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドを大量に発現させる効果的な条件下で改変細胞を培養する。いくつかの実施形態では、効果的な培養条件としては、特に限定されないが、タンパク質産生を可能にする効果的な培地、バイオリアクター、温度、ｐＨおよび酸素の条件が挙げられる。一実施形態では、効果的な培地は、細胞を培養して本発明のキメラポリペプチドを産生させる任意の培地を指す。いくつかの実施形態では、培地は通常、同化可能な炭素源、窒素源およびリン酸源ならびに適切な塩、ミネラル、金属、およびビタミンなどのその他の栄養素の入った水溶液を含む。いくつかの実施形態では、本発明の細胞を従来の発酵バイオリアクター、振盪フラスコ、試験管、マイクロタイターディッシュおよびペトリプレートで培養することができる。いくつかの実施形態では、培養を組換え細胞に適した温度、ｐＨおよび酸素含有量で実施する。いくつかの実施形態では、培養条件は当業者の専門知識の範囲内にあるものである。
【００６３】
本明細書で使用される「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すのに互換的に使用される。別の実施形態では、本明細書で使用される「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、天然のペプチド、ペプチド模倣物（通常、非ペプチド結合またはその他の合成修飾を含む）ならびにペプチド類似体であるペプトイドおよびセミペプトイドあるいはその任意の組合せを包含する。別の実施形態では、記載されるペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質は、体内での安定性を高める、または細胞内への浸透能を高める修飾を有する。一実施形態では、「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、天然のアミノ酸ポリマーに適用される。別の実施形態では、「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然のアミノ酸の人工の化学的類似体である、アミノ酸ポリマーに適用される。
【００６４】
本明細書で使用される「キメラ」ポリペプチドという用語は、異なる天然のタンパク質に由来する少なくとも２つのフラグメントが組み合わさって単一の非天然タンパク質になったポリペプチドを指す。キメラタンパク質は当業者に周知であり、ある既知のタンパク質に由来することがわかる１つの明確なドメインまたはフラグメントと、第二の既知のタンパク質に由来することがわかる少なくとも１つの他の明確なドメインまたはフラグメントとを有するものとなる。いくつかの実施形態では、天然のタンパク質はキメラタンパク質ではない。いくつかの実施形態では、異なるタンパク質由来のリーダー配列またはリーダーペプチドを有する天然のタンパク質はともにキメラペプチドとは見なさない。リーダー配列もリーダーペプチドも成熟タンパク質には発現しないため、ポリペプチドがキメラとなることに寄与するものであるとは考えられないことが理解されよう。いくつかの実施形態では、キメラ膜貫通ポリペプチドは、第一のタンパク質の細胞外ドメインと、第二のタンパク質由来の細胞内ドメインとを含む。
【００６５】
本明細書で使用される「フラグメント」は、タンパク質の一部分であって、大きさまたは構造が依然としてそのタンパク質全体の一部として認識できる程度のものを指す。いくつかの実施形態では、フラグメントとはタンパク質全体のことである。本明細書で使用される「〜に由来する」または「〜に対応する」という用語は、当業者に公知のいずれか１つの適切な手段、例えば、当該技術分野の標準的プロトコルによる化学合成を用い、配列に関する知見に基づいてアミノ酸配列を構築することを指す。
【００６６】
本明細書で使用される「リーダー配列」または「リーダーペプチド」は同義であり、膜内に挿入されるタンパク質のＮ末端にみられる１５〜３０個の主に疎水性のアミノ酸を指す。リーダー配列は、膜内に挿入された後、成熟タンパク質から切断されることが最も多い。この配列は多くの場合、小胞体への適切な挿入、膜貫通タンパク質の正しい方向および細胞表面での安定した発現に必要とされる。一般に、細胞表面に発現するいずれの膜貫通タンパク質のリーダー配列でも、細胞表面に発現する他の任意の膜貫通タンパク質のリーダー配列と交換することができ、なおも安定した表面発現が得られる。理想的には、細胞内に優勢に発現するタンパク質、例えばミトコンドリアタンパク質などのリーダーペプチドは使用するべきではないが、表面での発現が得られるのであれば依然として選択肢となる。本発明のキメラ膜貫通ポリペプチドを細胞膜内に挿入し、ひいては細胞表面に効率的に発現させるのに使用し得るリーダー配列の例としては、特に限定されないが、ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＳＧＡＲＣ（配列番号１）、ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＳＧＡＲＣＱ（配列番号２）およびＭＡＴＧＳＲＴＳＬＬＬＡＦＧＬＬＣＬＰＷＬＱＥＧＳＱＡ（配列番号３）が挙げられる。
【００６７】
本明細書で使用される「膜貫通ポリペプチド」は、細胞膜内に係留し横断するタンパク質を指す。したがって、膜貫通ポリペプチドは、少なくとも細胞外アミノ酸と、少なくとも１つの細胞内アミノ酸と、細胞膜内にあるアミノ酸配列とを含むものでなければならない。膜貫通タンパク質は当該技術分野で周知であり、当業者には、ＧＰＩ係留ポリペプチドが「膜貫通型」ではなく細胞内ドメインを持たないため、本発明のポリペプチドではないことが理解されよう。
【００６８】
いくつかの実施形態では、本発明の改変細胞は２つ以上のキメラ膜貫通ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、単一のキメラ膜貫通ポリペプチドが２つ以上の標的受容体結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、２つ以上の標的受容体結合ドメインが同じ受容体を標的とする。いくつかの実施形態では、２つの異なる受容体結合ドメインが異なる受容体を標的とする。したがって、単一の改変細胞が２つ以上の標的受容体と２つ以上の標的細胞とを有することがある。
【００６９】
細胞外ドメイン
いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは標的受容体のアゴニストまたはアンタゴニストを含む。いくつかの実施形態では、標的受容体結合ドメインは抗体の抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは２つ以上の標的受容体結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは２つ以上の標的受容体と結合し得る。いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは、標的受容体に対するアゴニストまたはアンタゴニストを２つ以上含み得る。いくつかの実施形態では、標的受容体結合ドメインは、免疫グロブリン可変重鎖ドメイン（ＶＨ）と免疫グロブリン可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）とを含む。いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは２つ以上の抗体抗原結合ドメインを含む。本発明の方法は標的受容体を調節するためのものであるため、単に標的受容体とは結合するが、受容体を活性化することも阻害することもない細胞外ドメインは本発明の実施形態ではないことが理解されよう。さらに、単に改変細胞を標的細胞に標的化するために使用する標的受容体結合ドメインも標的受容体のシグナル伝達を調節するとは考えられず、これも本発明の実施形態ではない。
【００７０】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、ポリペプチド鎖のフォールディングによって形成され、抗原の抗原決定基の特徴に相補的な内部表面の形状および電荷分布を有する三次元結合空間を持つ少なくとも１つの結合ドメインを含む、ポリペプチドまたはポリペプチドのグループを指す。抗体は通常、２つの同一のポリペプチド鎖の対を含み、各対が１つの「軽」鎖と１つの「重」鎖とを有する、四量体の形態をとる。各軽鎖／重鎖対の可変領域は抗体結合部位を形成する。抗体は任意の種に由来するものであり得る。抗体という用語は、特に限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２一本鎖抗体（ｓｖＦＣ）、二量体可変領域（ダイアボディ）およびジスルフィド結合した可変領域（ｄｓＦｖ）を含めた結合フラグメントも包含する。特に、抗体は免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性なフラグメント、すなわち、抗原結合部位を含む分子を含む。抗体フラグメントは、特に限定されないが、Ｆｃ領域またはそのフラグメントを含めた別の免疫グロブリンドメインと融合されていても、されていなくてもよい。当業者にはさらに、特に限定されないが、ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合体、可変領域（例えば、ＶＬおよびＶＨ）−Ｆｃ融合体およびｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合体を含めたその他の融合産物を作製し得ることが理解されよう。
【００７１】
いくつかの実施形態では、ＶＨとＶＬはペプチドリンカーによって連結されている。抗体として使用する抗原結合フラグメントの設計にあたっては、ＶＨとＶＬとの間のペプチドリンカーはよく知られており、標的受容体と良好に結合する結合ポケットの形成に効果的な任意のリンカーを使用し得る。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列ＧＧＳＳＲＳＳＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号４）またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５）を含む。
【００７２】
いくつかの実施形態では、標的受容体結合ドメインは、少なくとも０．１ｐＭ、０．２ｐＭ、０．３ｐＭ、０．４ｐＭ、０．５ｐＭ、１ｐＭ、５ｐＭ、１０ｐＭ、２０ｐＭ、３０ｐＭ、４０ｐＭ、５０ｐＭ、６０ｐＭ、７０ｐＭ、８０ｐＭ、９０ｐＭまたは１００ｐＭの解離定数（Ｋｄ）で標的受容体と結合する。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、標的受容体結合ドメインは、０．１〜１００ｐＭ、０．１〜２００ｐＭ、０．１〜３００ｐＭ、０．１〜４００ｐＭ、０．１〜５００ｐＭ、０．１〜６００ｐＭ、０．１〜７００ｐＭ、０．１〜８００ｐＭ、０．１〜９００ｐＭ、０．１〜１０００ｐＭ、０．１〜２０００ｐＭ、０．１〜３０００ｐＭ、０．５〜１００ｐＭ、０．５〜２００ｐＭ、０．５〜３００ｐＭ、０．５〜４００ｐＭ、０．５〜５００ｐＭ、０．５〜６００ｐＭ、０．５〜７００ｐＭ、０．５〜８００ｐＭ、０．５〜９００ｐＭ、０．５〜１０００ｐＭ、０．５〜２０００ｐＭ、０．５〜３０００ｐＭ、１〜１００ｐＭ、１〜２００ｐＭ、１〜３００ｐＭ、１〜４００ｐＭ、１〜５００ｐＭ、１〜６００ｐＭ、１〜７００ｐＭ、１〜８００ｐＭ、１〜９００ｐＭ、１〜１０００ｐＭ、１〜２０００ｐＭまたは１〜３０００ｐＭのＫｄで標的受容体と結合する。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。
【００７３】
いくつかの実施形態では、標的受容体結合ドメインは、少なくとも０．１ｎＭ、０．２ｎＭ、０．３ｎＭ、０．４ｎＭ、０．５ｎＭ、１ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭまたは１００ｎＭの５０％最大有効濃度（ＥＣ５０）で標的受容体と結合する。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、標的受容体結合ドメインは、０．１〜１００ｎＭ、０．１〜２００ｎＭ、０．１〜３００ｎＭ、０．１〜４００ｎＭ、０．１〜５００ｎＭ、０．１〜６００ｎＭ、０．１〜７００ｎＭ、０．１〜８００ｎＭ、０．１〜９００ｎＭ、０．１〜１０００ｎＭ、０．１〜２０００ｎＭ、０．１〜３０００ｎＭ、０．５〜１００ｎＭ、０．５〜２００ｎＭ、０．５〜３００ｎＭ、０．５〜４００ｎＭ、０．５〜５００ｎＭ、０．５〜６００ｎＭ、０．５〜７００ｎＭ、０．５〜８００ｎＭ、０．５〜９００ｎＭ、０．５〜１０００ｎＭ、０．５〜２０００ｎＭ、０．５〜３０００ｎＭ、１〜１００ｎＭ、１〜２００ｎＭ、１〜３００ｎＭ、１〜４００ｎＭ、１〜５００ｎＭ、１〜６００ｎＭ、１〜７００ｎＭ、１〜８００ｎＭ、１〜９００ｎＭ、１〜１０００ｎＭ、１〜２０００ｎＭまたは１〜３０００ｎＭのＥＣ５０で標的受容体と結合する。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。
【００７４】
膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインは当該技術分野で周知であり、一般に疎水性残基を含むものである。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、天然のタンパク質に由来する既知の膜貫通ドメインである。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインはマウス膜貫通タンパク質に由来する。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインはヒト膜貫通タンパク質に由来する。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは合成膜貫通ドメインである。本発明の方法および組成物は、本発明のキメラポリペプチドを細胞膜内に係留し、細胞外領域に標的受容体結合ドメインがあり、細胞内領域が免疫細胞活性化シグナルを伝達することができない、任意の膜貫通ドメインを用いて実施し得る。
【００７５】
いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは１回膜貫通ドメインである。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは奇数個の膜貫通領域を含む。当業者には、タンパク質内に偶数個の膜貫通領域が存在する場合、細胞内領域は、２つの膜貫通領域内にある細胞内ループとなることが理解されよう。いくつかの実施形態では、細胞内領域はタンパク質のＣ末端にある。いくつかの実施形態では、細胞内領域はタンパク質のＮ末端にある。いくつかの実施形態では、細胞内領域は２つの膜貫通ドメインの間の細胞内ループである。
【００７６】
いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインはＣＤ３膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインはＣＤ３膜貫通ドメインからなる。いくつかの実施形態では、ＣＤ３膜貫通ドメインは配列ＬＣＹＬＬＤＧＩＬＦＩＹＧＶＩＩＴＡＬＹＬ（配列番号２９）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３膜貫通ドメインは配列番号２９で記載される配列からなる。
【００７７】
いくつかの実施形態では、キメラ膜貫通ポリペプチドはヒンジ領域をさらに含む。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は細胞外領域である。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は膜近位ドメインである。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は細胞外膜近位ドメイン領域である。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は免疫グロブリンヒンジ領域を含む。抗体およびキメラタンパク質へのヒンジ領域の使用は当該技術分野で周知である。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域はＶＨドメインとＶＬドメインを連結する。いくつかの実施形態では、ＶＨドメインとＶＬドメインとを含むポリペプチドのみがヒンジドメインを含む。
【００７８】
いくつかの実施形態では、ヒンジ領域はＣＤ−８ヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域はＣＤ−８ヒンジ領域からなる。いくつかの実施形態では、ＣＤ−８ヒンジ領域はアミノ酸配列ＡＬＳＮＳＩＭＹＦＳＨＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＳＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤ（配列番号７）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ−８ヒンジ領域は配列番号７で記載されるアミノ酸配列からなる。
【００７９】
細胞内ドメイン
いくつかの実施形態では、本発明のキメラ膜貫通ポリペプチドの細胞内ドメインは、免疫細胞活性化シグナルを伝達することができない。いくつかの実施形態では、本発明のキメラ膜貫通ポリペプチドの細胞内ドメインは、改変細胞が標的細胞に害を及ぼす結果となるいかなるシグナルも伝達することができない。いくつかの実施形態では、本発明のキメラ膜貫通ポリペプチドの細胞内ドメインは、いかなるシグナルも伝達することができない。いくつかの実施形態では、本発明のキメラ膜貫通ポリペプチドの細胞内ドメインは不活性である。本明細書で使用される「不活性な」という用語は、タンパク質領域が決してシグナル伝達に影響を及ぼすことができないことを指す。不活性なタンパク質ドメインはシグナルを伝達することができないのみならず、シグナルを制御することも調節することもできない。不活性な細胞質ドメイン依然として、タンパク質が膜内で移動する能力に影響を及ぼし得るか、または膜内でのタンパク質の発現もしくは配向に影響を及ぼし得る。
【００８０】
いくつかの実施形態では、免疫細胞活性化はエフェクター機能活性化を含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞活性化は、サイトカインの分泌、抗体の放出、ＺＡＰ−１０キナーゼの活性化、免疫細胞の増殖ならびにＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＤ２５、ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＴＬＡ−４のうち少なくとも１つの表面の上方制御のうち少なくとも１つのものを含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞活性化はＩＬ−２の分泌を含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞活性化シグナルはＺＡＰ−７０キナーゼの活性化を誘導する。いくつかの実施形態では、免疫細胞活性化シグナルは、膜貫通タンパク質の細胞内ドメインのシグナル伝達ドメイン内の残基のリン酸化を含む。いくつかの実施形態では、残基はチロシン残基である。いくつかの実施形態では、免疫細胞活性化シグナルはエフェクター機能の活性化を含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞活性化シグナルは、Ｔ細胞受容体複合体のタンパク質または共刺激タンパク質の細胞内ドメインのシグナル伝達ドメイン内のチロシンのリン酸化を含む。いくつかの実施形態では、共刺激タンパク質は、ＣＤ２８、ＯＸ−４０、ＣＤ８０（Ｂ７−１）およびＣＤ８６（Ｂ７−２）のいずれか１つのものである。いくつかの実施形態では、免疫細胞活性化シグナルは、ＣＤ２８、ＯＸ−４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６のいずれか１つのものによるＴＣＲの共刺激を含む。
【００８１】
いくつかの実施形態では、免疫細胞活性化シグナルを伝達することは、共刺激シグナル伝達を含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞活性化シグナルを伝達することは、存在しなければシグナルが伝達されず、細胞が活性化されない任意の機能を含む。いくつかの実施形態では、シグナルを伝達することはキナーゼカスケードを含む。いくつかの実施形態では、シグナルを伝達することは、キナーゼ分子と共刺激分子のタンパク質間結合を含む。
【００８２】
いくつかの実施形態では、免疫細胞活性化シグナルを伝達することができる細胞質ドメインは、免疫受容体チロシン依存性活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）ドメインを含む。免疫細胞活性化受容体は当該技術分野で周知である。ＩＴＡＭドメインを含み、シグナル伝達をできなくする変異がないとシグナル伝達ドメインを本発明のキメラポリペプチドの細胞質ドメインに使用することができない免疫細胞活性化タンパク質の非限定的な例を表１に記載する。
【００８３】
【表１】
2020503841.tif 000003
2020503841.tif 000004
2020503841.tif 000005
【００８４】
いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、免疫細胞に発現しない膜貫通タンパク質の細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、免疫細胞に発現するが細胞の活性化には関与しない膜貫通タンパク質の細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、免疫細胞活性化シグナルを伝達することができる細胞内ドメインであって、このシグナルを伝達することができないよう変異した細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは人工アミノ酸配列を含む。
【００８５】
当業者には、細胞内ドメインがシグナル伝達以外の他の機能を有することが理解されよう。細胞内ドメインの長さ、電荷およびアミノ酸モチーフが、タンパク質および膜の動態の側面でもとりわけ、膜への適切な挿入、表面発現、タンパク質のフォールディング、タンパク質の再利用および寿命ならびに膜との移動を調節し得る。
【００８６】
いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、少なくとも１個、３個、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、７５個または１００個のアミノ酸を含む。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、最大で１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、４０個、４５個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個または５００個のアミノ酸を含む。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。
【００８７】
いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは少なくとも１つの正荷電アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、膜貫通ドメインの末端から５アミノ酸以内に少なくとも１つの正荷電アミノ酸を含む。正荷電アミノ酸には、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）およびヒスチジン（Ｈ）ならびに正荷電合成アミノ酸が含まれる。当業者には、正電荷が膜内でのポリペプチドの適切な配向および安定した表面発現に役立ち得ることが理解されよう。
【００８８】
いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、前記改変細胞の表面での検出可能なキメラ膜貫通ポリペプチドの発現を可能にするのに十分な長さおよび電荷のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、改変細胞表面でのキメラ膜貫通ポリペプチドの検出はＦＡＣＳを含む。ＦＡＣＳはよく知られた技術であり、細胞透過化段階を含まない限り、タンパク質の表面発現を確認するのに用いることができる。いくつかの実施形態では、本発明のキメラ膜貫通ポリペプチドはタグをさらに含む。いくつかの実施形態では、タグは細胞外領域にある。いくつかの実施形態では、タグは細胞外領域にあり、このタグに対する抗体を用いて表面発現を確認する。いくつかの実施形態では、タグは細胞内領域にある。このタグは、受容体結合に干渉せず、安定した表面発現に干渉せず、細胞膜内でのタンパク質の移動に干渉しないようにキメラタンパク質内の任意の位置に存在し得る。いくつかの実施形態では、タグはＭｙｃタグおよび蛍光タグから選択される。いくつかの実施形態では、Ｍｙｃタグはアミノ酸配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号６）を含む。いくつかの実施形態では、蛍光タグはＧＦＰである。いくつかの実施形態では、ＧＦＰタグはｅＧＦＰである。いくつかの実施形態では、ＧＦＰタグは、アミノ酸配列ＭＶＳＫＧＥＥＬＦＴＧＶＶＰＩＬＶＥＬＤＧＤＶＮＧＨＫＦＳＶＳＧＥＧＥＧＤＡＴＹＧＫＬＴＬＫＦＩＣＴＴＧＫＬＰＶＰＷＰＴＬＶＴＴＬＴＹＧＶＱＣＦＳＲＹＰＤＨＭＫＱＨＤＦＦＫＳＡＭＰＥＧＹＶＱＥＲＴＩＦＦＫＤＤＧＮＹＫＴＲＡＥＶＫＦＥＧＤＴＬＶＮＲＩＥＬＫＧＩＤＦＫＥＤＧＮＩＬＧＨＫＬＥＹＮＹＮＳＨＮＶＹＩＭＡＤＫＱＫＮＧＩＫＶＮＦＫＩＲＨＮＩＥＤＧＳＶＱＬＡＤＨＹＱＱＮＴＰＩＧＤＧＰＶＬＬＰＤＮＨＹＬＳＴＱＳＡＬＳＫＤＰＮＥＫＲＤＨＭＶＬＬＥＦＶＴＡＡＧＩＴＬＧＭＤＥＬＹＫ（配列番号３３）を含む。
【００８９】
いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、改変細胞の膜内でのキメラ膜貫通ポリペプチドの移動を可能にするのに十分な長さおよび電荷のアミノ酸配列を含む。膜内のタンパク質の横方向の動きは、多数の因子、なかでもとりわけタンパク質の細胞質領域によって制御され得る。標的受容体の活性化には、標的細胞内のシナプスにキメラタンパク質がクラスター形成する必要がある。このため、キメラタンパク質が横方向の動きが可能であることを確認するのに活性化を用いることができる。さらに、タグを付けたタンパク質は、そのタグが蛍光性のものであれば、タグによってｉｎ  ｖｉｖｏで可視化し得る。膜内でのキメラポリペプチドの横方向の動きを確認するのにライブフィールド顕微鏡法（ｌｉｖｅ  ｆｉｅｌｄ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）および生細胞イメージングを用いることができる。
【００９０】
いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、小胞体（ＥＲ）保留シグナルもミトコンドリア標的化モチーフも含まない。ＥＲ保留シグナルは、通常長さがわずか３アミノ酸であり、リジンおよびアルギニンを含む短いモチーフであり、膜貫通タンパク質をＥＲ内に保留して細胞表面に発現させないようにするものである。ミトコンドリア標的化モチーフは、タンパク質を細胞膜ではなくミトコンドリアに標的化する短いアミノ酸配列である。本発明のポリペプチドは細胞表面に発現させなければならないため、ポリペプチドを細胞膜以外の細胞内位置および小器官に保留または標的化するモチーフおよびシグナルは避けるべきであるが、表面発現がある程度得られる限り、細胞内ドメインを用いてもよい。
【００９１】
いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、免疫細胞活性化シグナルを伝達することができるタンパク質以外の任意のタンパク質の未改変細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＯＸ−４０  ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）以外の任意のタンパク質の未改変細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＯＸ−４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６以外の任意のタンパク質の未改変細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、ＣＤ３以外の任意のタンパク質の未改変細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、ＣＤ３およびＣＤ８０以外の任意のタンパク質の未改変細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、ＣＤ３およびＣＤ２８以外の任意のタンパク質の未改変細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、ＣＤ３、ＣＤ２８およびＣＤ８０以外の任意のタンパク質の未改変細胞内ドメインを含む。
【００９２】
いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、免疫細胞活性化シグナルを伝達することができる任意のタンパク質の変異細胞内ドメインを含み、前記変異は、細胞内ドメインが活性化シグナルを伝達することができないようにするものである。いくつかの実施形態では、変異細胞内ドメインは、シグナル伝達ドメインの少なくとも１つのチロシン残基の変異を含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインはＩＴＡＭドメインである。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインの全チロシン残基が変異している。いくつかの実施形態では、チロシンは、リン酸化されないアミノ酸に変異している。いくつかの実施形態では、チロシンはフェニルアラニンに変異している。
【００９３】
いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、活性化シグナルを伝達することができないよう変異したＣＤ３ゼータ鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ゼータ鎖は、アミノ酸配列ＲＡＫＦＳＲＳＡＥＴＡＡＮＬＱＤＰＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＥＫＫＲＡＲＤＰＥＭＧＧＫＱＱＲＲＲＮＰＱＥＧＶＹＮＡＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＴＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＴＬＡＰＲ（配列番号３０）を含む。いくつかの実施形態では、変異ＣＤ３ゼータ鎖は、アミノ酸配列ＲＡＫＦＳＲＳＡＥＴＡＡＮＬＱＤＰＮＱＬＦＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＦＤＶＬＥＫＫＲＡＲＤＰＥＭＧＧＫＱＱＲＲＲＮＰＱＥＧＶＦＮＡＬＱＫＤＫＭＡＥＡＦＳＥＩＧＴＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＦＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＦＤＡＬＨＭＱＴＬＡＰＲ（配列番号３１）を含む。
【００９４】
いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、活性化シグナルを伝達することができないよう変異したＣＤ８０（Ｂ７−１）細胞質側末端を含む。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、ＴＣＲを共刺激することができないよう変異したＣＤ８０（Ｂ７−１）細胞質側末端を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８０細胞質側末端はアミノ酸配列ＫＣＦＣＫＨＲＳＣＦＲＲＮＥＡＳＲＥＴＮＮＳＬＴＦＧＰＥＥＬＡＬＡＥＱＴＶＦＬ（配列番号３２）を含む。いくつかの実施形態では、変異ＣＤ８０細胞質側末端は、配列番号３２のアミノ酸１１〜１４にＲＲＮＥモチーフの変異を含む。いくつかの実施形態では、ＲＲＮＥはＡＡＡＡに変異している。いくつかの実施形態では、変異ＣＤ８０細胞質側末端は、細胞質側末端の少なくとも１つのセリンの変異を含む。いくつかの実施形態では、セリンはアラニンに変異している。いくつかの実施形態では、配列番号３２の１６位のセリンが変異している。いくつかの実施形態では、配列番号３２の２２位のセリンが変異している。いくつかの実施形態では、配列番号３２の１６位のセリンおよび２２位のセリンが変異している。いくつかの実施形態では、ＲＲＮＥモチーフおよび少なくとも１つのセリンが変異している。
【００９５】
いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは不活性である。本明細書で使用される「不活性」ドメインは、いかなるシグナル伝達もすることができない。いくつかの実施形態では、不活性ドメインは一切機能を持たない。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインはいかなるシグナル伝達も不可能である。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、いかなるシグナル伝達能も消失するよう変異している。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、いかなる形でも免疫細胞活性化に寄与することができない。
【００９６】
「胚性幹細胞」という用語は、ヒト胚の未分化内部塊に由来する幹細胞を指す。このような細胞は多能性であり、当業者に公知の手段によって任意の系列の細胞に分化する、または分化させることが可能である。ｈＥＳＣが未分化であると見なされるには、それが幹細胞マーカーを発現し続けるか、分化した細胞のマーカーを発現しないものでなければならない。
【００９７】
ＥＳＣ系は、ＮＩＨ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙに、例えば、ｈＥＳＢＧＮ−０１、ｈＥＳＢＧＮ−０２、ｈＥＳＢＧＮ−０３、ｈＥＳＢＧＮ−０４（ＢｒｅｓａＧｅｎ社）；ＨＥＳ−１、ＨＥＳ−２、ＨＥＳ−３、ＨＥＳ−４、ＨＥＳ−５、ＨＥＳ−６（ＥＳ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）；Ｍｉｚ−ｈＥＳｌ（ＭｉｚＭｅｄｉ病院・ソウル国立大学）；ＨＳＦ−１、ＨＳＦ−６（カリフォルニア大学サンフランシスコ校）；およびＨＩ、Ｈ７、Ｈ９、ＨＩ３、Ｈ１４（ウィスコンシン大学卒業生研究財団（ＷｉＣｅｌｌ研究所））として記載されている。目的の幹細胞としては、他の霊長類由来の胚性幹細胞、例えばアカゲザル幹細胞およびマーモセット幹細胞なども挙げられる。幹細胞は、任意の哺乳動物種、例えば、ヒト、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、げっ歯類、例えばマウス、ラット、ハムスター、霊長類などから入手され得る（Ｔｈｏｍｓｏｎら（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５；Ｔｈｏｍｓｏｎら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９２：７８４４；Ｔｈｏｍｓｏｎら（１９９６）Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５５：２５４；Ｓｈａｍｂｌｏｔｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１３７２６，１９９８）。ＥＳＣを培養すると通常、核・細胞質比が大きく、境界が明確で、核小体の目立つ平坦なコロニーとして増殖する。さらに、ＥＳＣは、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１およびアルカリホスファターゼを発現するが、ＳＳＥＡ−１は発現しない。ＥＳＣを作製し特徴を明らかにする方法の例が、例えば、米国特許第７，０２９，９１３号、同第５，８４３，７８０号および同第６，２００，８０６号にみられる。国際公開第９９／２０７４１号、同第０１／５１６１６号および同第０３／０２０９２０号には、ｈＥＳＣを未分化の形態で増殖させる方法が記載されている。
【００９８】
「人工多能性幹細胞」または「ｉＰＳＣ」は、ＰＳＣでない細胞（すなわち、ＰＳＣよりも分化した細胞）に由来する多能性幹細胞（ＰＳＣ）を意味する。ｉＰＳＣは、最終分化した細胞を含めた複数の異なる細胞型に由来するものであり得る。ｉＰＳＣはＥＳ細胞様の形態を有し、核・細胞質比が大きく、境界が明確で、核の目立つ平坦なコロニーとして増殖する。さらに、ｉＰＳＣは、特に限定されないが、アルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、ＴＲＡ１６０、ＴＲＡ１８１、ＴＤＧＦ１、Ｄｎｍｔ３ｂ、ＦｏｘＤ３、ＧＤＦ３、Ｃｙｐ２６ａｌ、ＴＥＲＴおよびｚｆｐ４２を含めた当業者に公知の１つまたは複数の重要な多能性マーカーを発現する。ｉＰＳＣを作製し特徴を明らかにする方法の例が、例えば、米国特許公開第２００９００４７２６３号、同第２００９００６８７４２号、同第２００９０１９１１５９号、同第２００９０２２７０３２号、同第２００９０２４６８７５号および同第２００９０３０４６４６号にみられる。ｉＰＳＣを作製するには一般に、体細胞に当該技術分野で公知の再プログラム化因子（例えば、Ｏｃｔ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＭＹＣ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８など）を供給して体細胞を再プログラム化し多能性幹細胞にする。
【００９９】
ＰＳＣという用語は、由来に関係なく多能性幹細胞を指し、ＰＳＣという用語は、ＰＳＣのまた別の例であるＥＳＣおよびｉＰＳＣという用語ならびに胚性生殖幹細胞（ＥＧＳＣ）という用語を包含する。「胚性生殖幹細胞」（ＥＧＳＣ）、「胚性生殖細胞」または「ＥＧ細胞」は、生殖細胞および／または生殖前駆細胞、例えば始原生殖細胞、すなわち、精子および卵子になる細胞に由来するＰＳＣを意味する。胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）は、上記の胚性幹細胞と類似した特性を有するものと考えられる。ＥＧ細胞を作製し特徴を明らかにする方法の例が、例えば、米国特許第７，１５３，６８４号；Ｍａｔｓｕｉ，Ｙ．ら（１９９２）Ｃｅｌｌ  ７０：８４１；Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ，Ｍ．ら（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：１１３；Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ，Ｍ．ら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：１３７２６；およびＫｏｓｈｉｍｉｚｕ，Ｕ．ら（１９９６）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２２：１２３５にみられる。ＰＳＣは樹立された細胞系の形態であってよく、これらは、一次胚組織から直接入手しても、あるいは体細胞から誘導してもよい。ＰＳＣは、本明細書に記載される方法の改変細胞であってもよい。
【０１００】
標的受容体
いくつかの実施形態では、標的受容体は、成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）、グルカゴン様ペプチド１受容体（ＧＬＰ１Ｒ）、チロシン受容体キナーゼＢ／トロポミオシン受容体キナーゼＢ（ＴｒｋＢ）およびプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）から選択される。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、標的受容体はＴｒｋＢであり、標的受容体結合ドメインは、アミノ酸配列ＤＶＶＭＴＱＬＰＬＳＬＰＶＩＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＩＨＳＮＧＮＴＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＦＣＳＱＳＴＨＶＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫＲＡ（配列番号１０）を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、標的受容体はＴｒｋＢであり、標的受容体結合ドメインは、アミノ酸配列ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＤＩＮＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＷＩＹＰＲＤＧＳＩＫＦＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＶＤＴＳＳＳＴＡＹＭＥＬＨＳＬＴＳＥＤＳＡＡＹＦＣＡＲＲＧＲＬＬＬＹＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（配列番号１１）を含むＶＨを含む。いくつかの実施形態では、標的受容体はＴｒｋＢであり、標的受容体結合ドメインは配列番号１０と配列番号１１とを含む。いくつかの実施形態では、標的受容体はＴｒｋＢであり、標的受容体結合ドメインは、アミノ酸配列ＤＶＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＮＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＦＣＳＱＧＴＨＶＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲＡ（配列番号１２）を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、標的受容体はＴｒｋＢであり、標的受容体結合ドメインは、アミノ酸配列ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＶＲＰＧＡＳＶＴＬＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＥＭＨＷＶＫＱＴＰＶＨＧＬＥＷＩＧＴＩＤＰＥＴＡＧＴＡＹＮＮＱＫＦＫＧＫＡＩＬＴＡＧＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＴＧＶＴＴＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（配列番号１３）を含むＶＨを含む。いくつかの実施形態では、標的受容体はＴｒｋＢであり、標的受容体結合ドメインは配列番号１２と配列番号１３とを含む。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、標的受容体はＴｒｋＢであり、標的受容体結合ドメインは、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３のいずれか１つのものの類似体を含む。いくつかの実施形態では、標的受容体はＴｒｋＢであり、標的受容体結合ドメインは、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３のいずれか１つのもののホモログを含む。いくつかの実施形態では、標的受容体はＴｒｋＢであり、標的受容体結合ドメインは、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３のいずれか１つのものと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＴｒｋＢと結合することができる。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。
【０１０３】
本明細書で使用される「類似体」という用語は、本発明のポリペプチドと類似しているが同一ではなく、依然として標的受容体と結合することができる、ポリペプチドを指す。類似体は、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列になる欠失または変異を有し得る。本発明のポリペプチドの類似体はいずれも依然として、標的受容体と結合することができることが理解されるべきである。さらに、類似体は、本発明のポリペプチドのフラグメントと類似したものであってよいが、そのような場合、フラグメントは、本発明のポリペプチドの少なくとも５０個の連続するアミノ酸を含むものでなければならない。いくつかの実施形態では、類似体またはホモログは、本明細書に記載されるマウスの抗体または抗原結合フラグメントのヒト類似体またはヒトホモログである。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、標的受容体はＴｒｋＢであり、キメラ膜貫通ポリペプチドは、アミノ酸配列ＤＶＶＭＴＱＬＰＬＳＬＰＶＩＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＩＨＳＮＧＮＴＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＦＣＳＱＳＴＨＶＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫＲＡＧＧＳＳＲＳＳＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＱＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＤＩＮＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＷＩＹＰＲＤＧＳＩＫＦＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＶＤＴＳＳＳＴＡＹＭＥＬＨＳＬＴＳＥＤＳＡＡＹＦＣＡＲＲＧＲＬＬＬＹＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＸＸＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＡＬＳＮＳＩＭＹＦＳＨＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＳＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＬＣＹＬＬＤＧＩＬＦＩＹＧＶＩＩＴＡＬＹＬＲＡＫＦＳＲＳＡＥＴＡＡＮＬＱＤＰＮＱＬＦＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＦＤＶＬＥＫＫＲＡＲＤＰＥＭＧＧＫＱＱＲＲＲＮＰＱＥＧＶＦＮＡＬＱＫＤＫＭＡＥＡＦＳＥＩＧＴＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＦＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＦＤＡＬＨＭＱＴＬＡＰＲ（配列番号１８）またはＤＶＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＮＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＦＣＳＱＧＴＨＶＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲＡＧＧＳＳＲＳＳＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＶＲＰＧＡＳＶＴＬＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＥＭＨＷＶＫＱＴＰＶＨＧＬＥＷＩＧＴＩＤＰＥＴＡＧＴＡＹＮＮＱＫＦＫＧＫＡＩＬＴＡＧＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＴＧＶＴＴＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＸＸＡＬＳＮＳＩＭＹＦＳＨＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＳＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＬＣＹＬＬＤＧＩＬＦＩＹＧＶＩＩＴＡＬＹＬＲＡＫＦＳＲＳＡＥＴＡＡＮＬＱＤＰＮＱＬＦＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＦＤＶＬＥＫＫＲＡＲＤＰＥＭＧＧＫＱＱＲＲＲＮＰＱＥＧＶＦＮＡＬＱＫＤＫＭＡＥＡＦＳＥＩＧＴＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＦＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＦＤＡＬＨＭＱＴＬＡＰＲＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰＭＶＳＫＧＥＥＬＦＴＧＶＶＰＩＬＶＥＬＤＧＤＶＮＧＨＫＦＳＶＳＧＥＧＥＧＤＡＴＹＧＫＬＴＬＫＦＩＣＴＴＧＫＬＰＶＰＷＰＴＬＶＴＴＬＴＹＧＶＱＣＦＳＲＹＰＤＨＭＫＱＨＤＦＦＫＳＡＭＰＥＧＹＶＱＥＲＴＩＦＦＫＤＤＧＮＹＫＴＲＡＥＶＫＦＥＧＤＴＬＶＮＲＩＥＬＫＧＩＤＦＫＥＤＧＮＩＬＧＨＫＬＥＹＮＹＮＳＨＮＶＹＩＭＡＤＫＱＫＮＧＩＫＶＮＦＫＩＲＨＮＩＥＤＧＳＶＱＬＡＤＨＹＱＱＮＴＰＩＧＤＧＰＶＬＬＰＤＮＨＹＬＳＴＱＳＡＬＳＫＤＰＮＥＫＲＤＨＭＶＬＬＥＦＶＴＡＡＧＩＴＬＧＭＤＥＬＹＫ（配列番号２０）を含む。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、標的受容体はＧＬＰ１Ｒであり、標的受容体結合ドメインは、アミノ酸配列ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＲＶＴＹＭＨＷＹＱＱＲＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＧＮＮＰＱＹＴＦＧＧＧＴＲＬＥＩＫＲ（配列番号１４）を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、標的受容体はＧＬＰ１Ｒであり、標的受容体結合ドメインは、アミノ酸配列ＱＶＴＬＫＥＳＧＰＧＩＬＱＰＳＱＴＬＳＬＴＣＳＦＳＧＦＳＬＳＴＳＧＴＧＶＧＷＩＲＱＰＳＧＫＧＬＥＷＬＳＨＩＷＷＤＤＶＫＲＹＮＰＡＬＫＳＲＬＴＩＳＲＤＴＳＹＳＱＶＦＬＲＩＡＳＶＤＴＡＤＴＡＴＹＹＣＡＲＩＬＤＧＴＧＰＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ（配列番号１５）を含むＶＨを含む。いくつかの実施形態では、標的受容体はＧＬＰ１Ｒであり、標的受容体結合ドメインは配列番号１４と配列番号１５とを含む。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、標的受容体はＧＬＰ１Ｒであり、標的受容体結合ドメインは、配列番号１４および配列番号１５のいずれか一方のものの類似体を含む。いくつかの実施形態では、標的受容体はＧＬＰ１Ｒであり、標的受容体結合ドメインは、配列番号１４および配列番号１５のいずれか一方のもののホモログを含む。いくつかの実施形態では、標的受容体はＧＬＰ１Ｒであり、標的受容体結合ドメインは、配列番号１４および配列番号１５のいずれか一方と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＧＬＰ１Ｒと結合することができる。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、標的受容体はＧＬＰ１Ｒであり、キメラ膜貫通ポリペプチドは、アミノ酸配列ＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＲＶＴＹＭＨＷＹＱＱＲＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＧＮＮＰＱＹＴＦＧＧＧＴＲＬＥＩＫＲＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＴＬＫＥＳＧＰＧＩＬＱＰＳＱＴＬＳＬＴＣＳＦＳＧＦＳＬＳＴＳＧＴＧＶＧＷＩＲＱＰＳＧＫＧＬＥＷＬＳＨＩＷＷＤＤＶＫＲＹＮＰＡＬＫＳＲＬＴＩＳＲＤＴＳＹＳＱＶＦＬＲＩＡＳＶＤＴＡＤＴＡＴＹＹＣＡＲＩＬＤＧＴＧＰＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳＸＸＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＡＬＳＮＳＩＭＹＦＳＨＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＳＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＬＣＹＬＬＤＧＩＬＦＩＹＧＶＩＩＴＡＬＹＬＲＡＫＦＳＲＳＡＥＴＡＡＮＬＱＤＰＮＱＬＦＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＦＤＶＬＥＫＫＲＡＲＤＰＥＭＧＧＫＱＱＲＲＲＮＰＱＥＧＶＦＮＡＬＱＫＤＫＭＡＥＡＦＳＥＩＧＴＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＦＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＦＤＡＬＨＭＱＴＬＡＰＲ（配列番号２２）を含む。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、標的受容体はＧＨＲであり、標的受容体結合ドメインは成長ホルモン（ＧＨ）を含む。いくつかの実施形態では、ＧＨはヒトＧＨ（ｈＧＨ）である。いくつかの実施形態では、ｈＧｈは、アミノ酸配列ＥＧＳＡＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫＦＰＴＩＰＬＳＲＬＦＤＮＡＭＬＲＡＨＲＬＨＱＬＡＦＤＴＹＱＥＦＥＥＡＹＩＰＫＥＱＫＹＳＦＬＱＮＰＱＴＳＬＣＦＳＥＳＩＰＴＰＳＮＲＥＥＴＱＱＫＳＮＬＥＬＬＲＩＳＬＬＬＩＱＳＷＬＥＰＶＱＦＬＲＳＶＦＡＮＳＬＶＹＧＡＳＤＳＮＶＹＤＬＬＫＤＬＥＥＧＩＱＴＬＭＧＲＬＥＤＧＳＰＲＴＧＱＩＦＫＱＴＹＳＫＦＤＴＮＳＨＮＤＤＡＬＬＫＮＹＧＬＬＹＣＦＲＫＤＭＤＫＶＥＴＦＬＲＩＶＱＣＲＳＶＥＧＳＣＧＦ（配列番号１６）を含む。いくつかの実施形態では、ＧＨは、ＧＨＲと結合することができるｈＧＨのフラグメント、ホモログ、類似体または誘導体である。いくつかの実施形態では、ＧＨは、配列番号１６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１０９】
本明細書で使用される「誘導体」という用語は、本発明のポリペプチドをベースとし、依然として標的受容体と結合することができる、任意のポリペプチドを指す。誘導体は、単なるポリペプチドのフラグメントであるわけでも、置き換えられた、または除去されたアミノ酸を有するもの（類似体）でもなく、むしろ、ポリペプチドに施された翻訳後修飾などの追加の修飾を有し得る。さらに、誘導体は本発明のポリペプチドのフラグメントの誘導体であってもよいが、そのような場合、フラグメントは、本発明のポリペプチドの少なくとも５０個の連続するアミノ酸を含むものでなければならない。いくつかの実施形態では、本発明のキメラ膜貫通ポリペプチドは、本明細書に記載されるポリペプチドの誘導体である。いくつかの実施形態では、誘導体はポリペプチドのグリコシル化を含む。当業者には、安定した表面発現にポリペプチドのグリコシル化が必要であり得ることが理解されよう。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、標的受容体はＧＨＲであり、キメラ膜貫通ポリペプチドは、アミノ酸配列ＥＧＳＡＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫＦＰＴＩＰＬＳＲＬＦＤＮＡＭＬＲＡＨＲＬＨＱＬＡＦＤＴＹＱＥＦＥＥＡＹＩＰＫＥＱＫＹＳＦＬＱＮＰＱＴＳＬＣＦＳＥＳＩＰＴＰＳＮＲＥＥＴＱＱＫＳＮＬＥＬＬＲＩＳＬＬＬＩＱＳＷＬＥＰＶＱＦＬＲＳＶＦＡＮＳＬＶＹＧＡＳＤＳＮＶＹＤＬＬＫＤＬＥＥＧＩＱＴＬＭＧＲＬＥＤＧＳＰＲＴＧＱＩＦＫＱＴＹＳＫＦＤＴＮＳＨＮＤＤＡＬＬＫＮＹＧＬＬＹＣＦＲＫＤＭＤＫＶＥＴＦＬＲＩＶＱＣＲＳＶＥＧＳＣＧＦＸＸＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＡＬＳＮＳＩＭＹＦＳＨＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＳＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＬＣＹＬＬＤＧＩＬＦＩＹＧＶＩＩＴＡＬＹＬＲＡＫＦＳＲＳＡＥＴＡＡＮＬＱＤＰＮＱＬＦＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＦＤＶＬＥＫＫＲＡＲＤＰＥＭＧＧＫＱＱＲＲＲＮＰＱＥＧＶＦＮＡＬＱＫＤＫＭＡＥＡＦＳＥＩＧＴＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＦＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＦＤＡＬＨＭＱＴＬＡＰＲ（配列番号２４）を含む。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、標的受容体はＰＤ−１であり、標的受容体結合ドメインは、アミノ酸配列ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＫＧＶＳＴＳＧＹＳＹＬＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＬＡＳＹＬＥＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＨＳＲＤＬＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号２５）を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、標的受容体はＰＤ−１であり、標的受容体結合ドメインは、アミノ酸配列ＱＶＱＬＶＱＳＧＶＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＹＭＹＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＮＰＳＮＧＧＴＮＦＮＥＫＦＫＮＲＶＴＬＴＴＤＳＳＴＴＴＡＹＭＥＬＫＳＬＱＦＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＤＹＲＦＤＭＧＦＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号２６）を含むＶＨを含む。いくつかの実施形態では、標的受容体はＰＤ−１であり、標的受容体結合ドメインは配列番号２５と配列番号２６とを含む。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、標的受容体はＰＤ−１であり、標的受容体結合ドメインは、配列番号２５および配列番号２６のいずれか一方のものの類似体を含む。いくつかの実施形態では、標的受容体はＰＤ−１であり、標的受容体結合ドメインは、配列番号２５および配列番号２６のいずれか一方のもののホモログを含む。いくつかの実施形態では、標的受容体はＰＤ−１であり、標的受容体結合ドメインは、配列番号２５および配列番号２６のいずれか一方と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＰＤ−１と結合することができる。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、標的受容体はＰＤ−１であり、キメラ膜貫通ポリペプチドは、アミノ酸配列ＱＶＱＬＶＱＳＧＶＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＹＭＹＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＮＰＳＮＧＧＴＮＦＮＥＫＦＫＮＲＶＴＬＴＴＤＳＳＴＴＴＡＹＭＥＬＫＳＬＱＦＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＤＹＲＦＤＭＧＦＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫＧＧＳＳＲＳＳＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＫＧＶＳＴＳＧＹＳＹＬＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＬＡＳＹＬＥＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＨＳＲＤＬＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣＸＸＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＡＬＳＮＳＩＭＹＦＳＨＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＳＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＬＣＹＬＬＤＧＩＬＦＩＹＧＶＩＩＴＡＬＹＬＲＡＫＦＳＲＳＡＥＴＡＡＮＬＱＤＰＮＱＬＦＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＦＤＶＬＥＫＫＲＡＲＤＰＥＭＧＧＫＱＱＲＲＲＮＰＱＥＧＶＦＮＡＬＱＫＤＫＭＡＥＡＦＳＥＩＧＴＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＦＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＦＤＡＬＨＭＱＴＬＡＰＲ（配列番号２８）を含む。
【０１１４】
いずれの配列のＸＸも、これらのアミノ酸がキメラタンパク質のコード配列内の制限酵素部位によるものであり、いかなる機能的役割もないため、任意の２つのアミノ酸であっても、いずれのアミノ酸でなくてもよい。いくつかの実施形態では、ＸＸはバリン−アスパラギン酸である。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、本発明のキメラ膜貫通ポリペプチドは、そのＮ末端にリーダーペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、リーダーペプチドは、配列ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＳＧＡＲＣＱ（配列番号２）を含むか、これよりなるものである。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、キメラ膜貫通ポリペプチドは、配列番号１８、２０、２２、２４または２８のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％の相同性または同一性を有し、免疫細胞活性化シグナルを伝達することができない。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、キメラ膜貫通ポリペプチドは、配列番号１８、２０、２２、２４または２８のいずれか１つのものの誘導体または類似体である。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。
【０１１７】
医薬組成物
また別の態様により、本発明のいずれかの改変細胞と、薬学的に許容される担体、賦形剤または補助剤とを含む、医薬組成物が提供される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、治療有効量の本発明の改変細胞を含む。
【０１１８】
本明細書で使用される「担体」、「補助剤」または「賦形剤」という用語は、活性な物質ではない医薬組成物の任意の成分を指す。本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」という用語は、無毒性で不活性な固体、半固体液体の充填剤、希釈剤、カプセル化材料、任意のタイプの製剤助剤、または生理食塩水などの単なる無菌水性媒体を指す。薬学的に許容される担体としての役割を果たし得る材料のいくつかの例として、ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖、コーンスターチおよびバレイショデンプンなどのデンプン、セルロースおよびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなど；トラガント末；麦芽、ゼラチン、タルク；カカオ脂および坐剤ワックスなどの賦形剤；油、例えばラッカセイ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油など；プロピレングリコールなどのグリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなどのポリオール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル、寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；無発熱物質水；等張食塩水、リンガー溶液；エチルアルコールおよびリン酸緩衝液ならびに医薬製剤に使用される無毒性で適合性のあるその他の物質がある。これに関連する適切な薬学的に許容される担体、賦形剤および希釈剤は当業者に周知であり、例えば、Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ，第１３版，Ｂｕｄａｖａｒｉら編，Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．（２００１））；ＣＴＦＡ（Ｃｏｓｍｅｔｉｃ，Ｔｏｉｌｅｔｒｙ，ａｎｄ  Ｆｒａｇｒａｎｃｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，第１０版（２００４）；および「Ｉｎａｃｔｉｖｅ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ  Ｇｕｉｄｅ」，Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（ＦＤＡ）Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＣＤＥＲ）Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ（以上、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているものなどがある。本発明の組成物に有用な薬学的に許容される賦形剤、担体および希釈剤の例としては、蒸留水、生理的食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、ハンクス液およびＤＭＳＯが挙げられる。これらの追加の不活性成分ならびに効果的な製剤および投与方法は当該技術分野で周知であり、標準的なテキスト、例えばＧｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｌｍａｎ’ｓ：Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，第８版，Ｇｉｌｍａｎら編，Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９９０）；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，第２１版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａ��ｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，（２００５）（それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる）などに記載されている。本明細書に記載される組成物は、人工的に作製した構造物、例えばリポソーム、ＩＳＣＯＭＳ、徐放粒子およびペプチドまたはポリペプチドの血清中での半減期を増大させるその他の媒体などに含まれていてもよい。リポソームは、乳剤、泡状剤、ミセル、不溶性単分子膜、液晶、リン脂質分散剤、ラメラ層などを含む。本明細書に記載されるペプチドとともに使用するリポソームは、一般に中性および負荷電リン脂質とコレステロールなどのステロールとを含む標準的な小胞形成脂質から形成される。脂質の選択は一般に、リポソームの大きさおよび血中での安定性などの考慮事項によって決まる。リポソームの調製には、例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに概説されているように、様々な方法を用いることができ、また米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、同第４，８３７，０２８号および同第５，０１９，３６９号も参照されたい。
【０１１９】
担体は、本明細書に示される医薬組成物を全体で約０．１重量％〜約９９．９９９９９重量％含み得る。
【０１２０】
「治療有効量」という用語は、哺乳動物の疾患または障害を治療するのに有効な細胞の数を指す。「治療有効量」という用語は、治療または予防による所望の結果を得るのに必要な用量および期間で有効な量を指す。正確な剤形およびレジメンについては、医師により患者の状態に応じて決定され得る。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１００万個、２００万個、３００万個、５００万個、１，０００万個、５，０００万個または１０，０００万個の免疫細胞を含む。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。
【０１２２】
治療方法
いくつかの実施形態では、準備することは、対象から初代細胞を抽出することを含む。いくつかの実施形態では、対象から初代細胞を抽出することは、血液試料または血清試料を採取することを含む。いくつかの実施形態では、対象から初代細胞を抽出することは、リンパ試料を採取することを含む。いくつかの実施形態では、初代細胞は、キットを用いた単離である。このようなキットは当該技術分野では一般的なものであり、特に限定されないが、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ細胞単離および細胞分離キット、ＣＤ４＋磁気ビーズキット、ＣＤ８＋磁気ビーズキットなどがこれに含まれる。いくつかの実施形態では、抗体コンジュゲートカラムを用いて初代細胞を単離する。いくつかの実施形態では、ＦＡＣＳ分取を用いて初代細胞を単離する。細胞分取には、標的細胞を同定する任意の適切なＦＡＣＳ抗体を使用し得る。
【０１２３】
標的細胞での異種タンパク質の発現は当該技術分野で周知である。本発明キメラ膜貫通タンパク質を細胞に発現させる任意の方法を用いて本発明の方法を実施し得る。
【０１２４】
本明細書で使用される「発現」という用語は、前記遺伝子産物の翻訳を含めたタンパク質の生合成を指す。したがって、タンパク質の発現は、核酸フラグメントの転写（例えば、ｍＲＮＡもしくはその他の機能性ＲＮＡが生じる転写）および／またはＲＮＡから前駆体タンパク質もしくは成熟タンパク質（ポリペプチド）への翻訳を指し得る。いくつかの実施形態では、発現とは細胞表面での発現のことである。いくつかの実施形態では、発現とは、リーダーペプチドを含む前駆体タンパク質の発現、そのペプチドの切断および成熟タンパク質の表面発現のことである。
【０１２５】
細胞内での異種転写物の発現は当業者に周知である。それは、多数ある方法のなかでも特に、トランスフェクション、ウイルス感染または細胞のゲノムの直接改変によって実施することができる。いくつかの実施形態では、異種転写物は、プラスミドなどの発現ベクターまたはウイルスベクター内にある。
【０１２６】
ベクター核酸配列には一般に、少なくとも細胞内で増殖するための複製起点と、任意選択で追加のエレメント、例えば異種ポリヌクレオチド配列、発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー）、選択マーカー（例えば抗生物質耐性）、ポリアデニン配列が含まれている。
【０１２７】
ベクターは、非ウイルス法またはウイルス法により送達するＤＮＡプラスミドであり得る。ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターまたはポックスウイルスベクターであり得る。プロモーターは哺乳動物細胞内で活性なものであり得る。プロモーターはウイルスプロモーターであり得る。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、異種転写物はプロモーターと作動可能に連結されている。「作動可能に連結されている」という用語は、目的のヌクレオチド配列が、そのヌクレオチド配列が（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの転写／翻訳系で、またはベクターを宿主細胞に導入する場合は宿主細胞内で）発現できるよう１つまたは複数の調節エレメントと連結されていることを意味するものとする。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、エレクトロポレーション（例えば、Ｆｒｏｍら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２，５８２４（１９８５）に記載されている）、熱ショック、ウイルスベクターによる感染、微小なビーズもしくは粒子のマトリックス内もしくは表面に核酸を含む微小粒子の高速衝撃による貫通（Ｋｌｅｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３２７．７０−７３（１９８７））および／またはこれらに類似したものを含めた標準的な方法によりベクターを細胞内に導入する。
【０１３０】
本明細書で使用される「プロモーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼ、すなわち、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの開始部位付近にクラスター化した転写制御モジュール群を指す。プロモーターは別個の機能的モジュールからなり、各モジュールは約７〜２０ｂｐのＤＮＡからなり、転写活性化因子またはリプレッサータンパク質の１つまたは複数の認識部位を含む。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、核酸配列はＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＲＮＡＰ  ＩＩおよびＰｏｌ  ＩＩ）によって転写される。ＲＮＡＰ  ＩＩは真核細胞にみられる酵素である。この酵素は、ＤＮＡの転写を触媒してｍＲＮＡならびに大部分のｓｎＲＮＡおよびマイクロＲＮＡの前駆体を合成する。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、哺乳動物発現ベクターとしては、特に限定されないが、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から入手可能なｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（±）、ｐＧＬ３、ｐＺｅｏＳＶ２（±）、ｐＳｅｃＴａｇ２、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＳｉｎＲｅｐ５、ＤＨ２６Ｓ、ＤＨＢＢ、ｐＮＭＴ１、ｐＮＭＴ４１、ｐＮＭＴ８１、Ｐｒｏｍｅｇａ社から入手可能なｐＣＩ、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社から入手可能なｐＭｂａｃ、ｐＰｂａｃ、ｐＢＫ−ＲＳＶおよびｐＢＫ−ＣＭＶ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社から入手可能なｐＴＲＥＳならびにその誘導体が挙げられる。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、レトロウイルスなどの真核ウイルスに由来する調節エレメントを含む発現ベクターを本発明に使用する。ＳＶ４０ベクターとしては、ｐＳＶＴ７およびｐＭＴ２が挙げられる。いくつかの実施形態では、ウシパピローマウイルスに由来するベクターとしてはｐＢＶ−１ＭＴＨＡが挙げられ、エプスタインバーウイルスに由来するベクターとしてはｐＨＥＢＯおよびｐ２Ｏ５が挙げられる。その他の例示的ベクターとしては、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥおよびＳＶ−４０初期プロモーター、ＳＶ−４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーターまたは真核細胞での発現に効果的であることが示されているその他のプロモーターの指令下でタンパク質を発現させる任意の他のベクターが挙げられる。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、水平感染および標的化特異性などの利点が得られる組換えウイルスベクターをｉｎ  ｖｉｖｏ発現に使用する。一実施形態では、水平感染は、例えばレトロウイルスの生活環に本来みられるものであり、単一の感染細胞から多数の子孫ビリオンが生じて出芽し、隣接する細胞に感染する過程である。一実施形態では、その結果、大部分が最初に元のウイルス粒子に感染していなかった広い領域が短時間で感染する。一実施形態では、水平に伝播することができないウイルスベクターが生じる。一実施形態では、所望の目的が特定の遺伝子を局所的な数の標的細胞にのみ導入することである場合、この特徴が有用なものであり得る。
【０１３５】
本発明の発現ベクターを細胞内に導入するのに様々な方法を用いることができる。このような方法については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９，１９９２），Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．（１９８９），Ｃｈａｎｇら，Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，Ｍｉｃｈ．（１９９５），Ｖｅｇａら，Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ  Ｍｉｃｈ．（１９９５），Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｂｏｓｔｏｎ  Ｍａｓｓ．（１９８８）およびＧｉｌｂｏａら［Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４（６）：５０４−５１２，１９８６］に全般的に記載されており、例えば、安定な、または一過性のトランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーションおよび組換えウイルスベクターによる感染がこれに含まれる。さらに、ポジティブ・ネガティブ選択法については米国特許第５，４６４，７６４号および同第５，４８７，９９２号を参照されたい。
【０１３６】
本発明の発現構築物は、（キメラ膜貫通ポリペプチドをコードする）挿入するコード配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含む以外に、発現するポリペプチドの安定性、産生、精製、収率または活性を最適化するよう操作された配列も含み得ることが理解されよう。
【０１３７】
また別の態様により、本発明のキメラ膜貫通タンパク質をコードする人工発現ベクターが提供される。
【０１３８】
本明細書で使用される「投与すること」、「投与」という用語およびこれに類する用語は、妥当な医療行為において活性薬剤を含有する組成物を治療効果がえられるように対象に送達する任意の方法を指す。その他の適切な投与経路としては、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、頭蓋内、脳室内、髄腔内または腹腔内を挙げ得る。当業者には、免疫細胞にはホーミング能があるため、局所的な補給による治療にも全身投与で十分であることが理解されよう。いくつかの実施形態では、投与を疾患部位に直接実施する。このような場合の非限定的な例には、脳疾患に対する頭蓋内投与、皮膚疾患に対する局所投与および筋疾患に対する筋肉内投与がある。
【０１３９】
投与する用量は、レシピエントの年齢、健康状態および体重、併用治療の種類（実施している場合）、治療頻度ならびに所望の効果の性質に左右される。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、改変細胞を対象に投与する。いくつかの実施形態では、治療有効量の改変細胞を対象に投与する。いくつかの実施形態では、治療有効量の改変細胞を含む医薬組成物を対象に投与する。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、ある標的分子が関連していることが明らかにされている任意の疾患、障害または病態であって、その分子の活性化または阻害が正の効果を示すことが明らかにされている疾患、障害または病態を治療するのに本発明の方法を用い得る。いくつかの実施形態では、正の効果は、上記の疾患、障害または病態の症状の何らかの改善である。いくつかの実施形態では、正の効果は、症状の重症度または持続期間の何らかの減少である。いくつかの実施形態では、正の効果は、対象の生活の質の何らかの改善である。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、標的受容体はＴｒｋＢであり、疾患または障害は神経疾患または神経障害である。いくつかの実施形態では、神経疾患または神経障害は、アルツハイマー病，うつ病，記憶喪失，筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ），癲癇および脳腫瘍から選択される。いくつかの実施形態では、神経疾患または神経障害は、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）に関連する疾患または障害である。いくつかの実施形態では、標的受容体結合ドメインは抗ＴｒｋＢ抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＴｒｋＢ抗原結合ドメインは、市販の抗ＴｒｋＢ抗体に由来するものである。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、標的受容体はＧＬＰ１Ｒであり、疾患または障害は、代謝疾患もしくは代謝障害または心血管疾患もしくは心血管障害である。いくつかの実施形態では、代謝疾患または代謝障害は、糖尿病、肥満、糖原病、パーキンソン病およびミトコンドリア性ミオパチーから選択される。いくつかの実施形態では、代謝疾患または代謝障害はミトコンドリア疾患またはミトコンドリア性障害である。いくつかの実施形態では、代謝疾患はグルコース恒常性の疾患である。いくつかの実施形態では、心血管疾患または心血管障害は、脳卒中、心筋梗塞、心虚血および冠動脈疾患から選択される。いくつかの実施形態では、標的受容体結合ドメインは抗ＧＬＰ１Ｒ抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＧＬＰ１Ｒ抗原結合ドメインは、市販の抗ＧＬＰ１Ｒ抗体に由来するものである。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、標的受容体はＧＨＲであり、疾患または障害は成長疾患または成長障害である。いくつかの実施形態では、成長疾患または成長障害は、先端巨大症、成長ホルモン分泌不全症、癌、ターナー症候群およびプラダー・ウィリー症候群から選択される。いくつかの実施形態では、成長疾患または成長障害は、ｈＧＨの投与により治療することができる任意の疾患または障害である。いくつかの実施形態では、ｈＧＨで治療することができる疾患は筋疾患である。いくつかの実施形態では、筋疾患は筋消耗性疾患および筋ジストロフィーから選択される。いくつかの実施形態では、筋消耗性疾患は、多発性硬化症、悪液質およびサルコペニアから選択される。いくつかの実施形態では、筋ジストロフィーは、デシェンヌ型筋ジストロフィー（Ｄｅｓｃｈｅｎｅ’ｓ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、ベッカー型筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィーおよび顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーから選択される。いくつかの実施形態では、標的受容体結合ドメインはＧＨを含む。いくつかの実施形態では、ＧＨはｈＧＨである。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、標的受容体はＰＤ−１であり、疾患または障害は、免疫疾患もしくは免疫障害または癌である。いくつかの実施形態では、免疫疾患または免疫障害は、狼瘡、関節リウマチ、乾癬、グレーブス病、免疫介在性炎症およびセリアック病から選択される。いくつかの実施形態では、疾患または障害は癌であり、標的受容体結合ドメインはＰＤ−１アンタゴニストを含む。いくつかの実施形態では、標的受容体結合ドメインは抗ＰＤ−１抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１抗原結合ドメインは、市販の抗ＰＤ−１抗体に由来するものである。
【０１４６】
参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１４／０９１１９１０号、同第２０１４／０７７５０７４号、同第２０１３／０６５０４６９号、同第２０１５０９６５８４１号、同第２００９／０３９２２４４号、同第２００７／０３７４５６９号ならびに米国特許第９，３５８，２８７号；同第８，５０１，６９３号および同第９，３２８，１５４号には、ＧＬＰ１−Ｒ可変重鎖および軽鎖の供給源として使用し得るＧＬＰ１−Ｒアゴニスト抗体の非限定的な例が記載されている。
【０１４７】
参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００７／０５１６１８７号、同第２００８／０６８２５０５号、同第２０１０／０６９７９８３号および米国特許第７，４５９，１５６号；同第７，７５０，１２２号；同第８，６４２，０３５号；同第９，０２８，８２０号には、ＴｒｋＢ可変重鎖および軽鎖の供給源として使用し得るＴｒｋＢアゴニスト抗体の非限定的な例が記載されている。
【０１４８】
参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，４２７，６６５号；同第７，７２２，８６８号；同第７，５９５，０４８号；同第７，４８８，８０２号；同第８，００８，４４９号；同第７，９４３，７４３号；同第９，１８１，３４２号および同第８，６１７，５４６号には、可変重鎖および軽鎖の供給源として使用し得るＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１アゴニスト抗体の非限定的な例が記載されている。
【０１４９】
参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，５９２，００７号；同第７，１０９，００３号；同第７，０３４，１２１号；同第７，６０５，２３８号；同第７，４５２，５３５号には、ＣＴＬＡ４可変重鎖および軽鎖の供給源として使用し得るＣＴＬＡ４アゴニスト抗体の非限定的な例が記載されている。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、改変細胞を部分的に活性化させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、部分的活性化は、ホーミング能および／または標的細胞とのシナプス形成能を含む。いくつかの実施形態では、部分的活性化は、エフェクター機能活性化および／または細胞傷害性の活性化を含まない。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、標的細胞でのシグナル伝達の調節を判定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、標的受容体の調節を判定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、改変細胞が細胞傷害性ではないことを判定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、改変免疫細胞が活性化されていないことを判定することをさらに含む。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、判定することは、少なくとも１つのシグナル伝達タンパク質のリン酸化を判定することを含む。いくつかの実施形態では、判定することは、標的受容体のシグナル伝達ドメイン内の残基のリン酸化を判定することを含む。いくつかの実施形態では、判定することは、シグナル伝達カスケードのタンパク質のシグナル伝達ドメイン内の残基のリン酸化を判定することを含む。いくつかの実施形態では、リン酸化残基はチロシン残基である。いくつかの実施形態では、判定することは、標的受容体の下流標的のレベルの上方制御を判定することを含む。いくつかの実施形態では、判定することは、標的受容体の下流標的のレベルの下方制御を判定することを含む。
【０１５３】
本明細書で数値とともに使用される「約」という用語は記載数値の±１０％を指す。例えば、長さ約１０００ナノメートル（ｎｍ）は長さ１０００ｎｍ±１００ｎｍを指す。
【０１５４】
本明細書および添付の請求項で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに別の意味を表す場合を除き、複数形の指示対象を包含することが留意される。したがって、例えば、「ポリヌクレオチド（ａ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」に言及する場合、複数のこのようなポリヌクレオチドが包含され、「ポリヌクレオチド（ｔｈｅ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」に言及する場合、１つまたは複数のポリペプチドおよび当業者に公知のその等価物への言及などが包含される。さらに、請求項はあらゆる任意選択の要素を除外するよう起草され得ることが留意される。したがって、この記述は、請求項の要素の記載に関連して「単に」、「〜のみ」などの排他的用語を使用する、または「消極的」限定を用いるための先行詞としての役割を果たすことを意図するものではない。
【０１５５】
「Ａ、ＢおよびＣなどのうち少なくとも１つ」に類似した慣用的表現が使用される場合、このような構文は一般に、当業者であればその慣用的表現を理解するであろう（例えば、「Ａ、ＢおよびＣのうち少なくとも１つのものを有するシステム」には、限定されないが、Ａを単独で、Ｂを単独で、Ｃを単独で、ＡとＢをともに、ＡとＣをともに、ＢとＣをともに、および／またはＡとＢとＣをともに有するシステムなどが包含され得る）という意味で意図されるものである。当業者にはさらに、説明、請求項または図面を問わず、２つ以上の代替用語を示す離接語および／または離接句は実質的にいずれも、その用語のうちの１つを、その用語のうちのいずれかを、またはその用語をともに含む可能性を企図するものと理解するべきであることが理解されよう。例えば、「ＡまたはＢ」という句は、「Ａ」、「Ｂ」または「ＡおよびＢ」の可能性を含むことが理解されよう。
【０１５６】
明確にするため別個の実施形態との関連で記載される本発明の特定の特徴が、単一の実施形態の形で組み合わさってもたらされる場合もあることが理解される。これとは逆に、簡潔にするため単一の実施形態との関連で記載される本発明の様々な特徴が、別個に、または任意の適切な部分的組合せの形でもたらされることもある。本発明に属する実施形態のあらゆる組合せが、ありとあらゆる組合せが個別にかつ明確に開示された場合と同様に、本発明に具体的に包含され本明細書に開示される。さらに、様々な実施形態およびその要素のあらゆる部分的組合せについても、ありとあらゆる部分的組合せが個別にかつ明確に本明細書に開示された場合と同様に、本発明に具体的に包含され本明細書に開示される。
【０１５７】
限定することを意図するものでない以下の実施例を検討すれば、本発明のさらなる目的、利点および新規な特徴が当業者に明らかになるであろう。さらに、以下の実施例では、上に詳述され、のちの請求項の節で特許請求される本発明の様々な実施形態および態様がそれぞれ実験的に裏付けられる。
【０１５８】
以下の実施例では、上に詳述され、のちの請求項の節で特許請求される本発明の様々な実施形態および態様が実験的に裏付けられる。
【０１５９】
（実施例）
本明細書で用いる命名法および本発明に用いる実験法には一般に、分子技術、生化学的技術、微生物学的技術および組換えＤＮＡ技術が含まれる。このような技術は文献で十分に説明されている。例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」第Ｉ〜ＩＩＩ巻，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌら，「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ，「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら，「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎら（編）「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」，第１〜４巻，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８）；米国特許第４，６６６，８２８号；同第４，６８３，２０２号；同第４，８０１，５３１号；同第５，１９２，６５９号および同第５，２７２，０５７号に記載されている方法論；「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」，第Ｉ〜ＩＩＩ巻，Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ著「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ−Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９４），第３版；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」第Ｉ〜ＩＩＩ巻，Ｃｏｌｉｇａｎ  Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓら（編），「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版），Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）；ＭｉｓｈｅｌｌおよびＳｈｉｉｇｉ（編），「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ」ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）（上記のいずれも参照により組み込まれる）を参照されたい。その他の一般的な参考文献については、本明細書全体を通じて記載されている。
【０１６０】
材料および方法
キメラ膜貫通タンパク質のクローニングおよびＢＷ５１４７細胞のレトロウイルス形質導入
抗ＴｒｋＢには、リーダーペプチド−ＶＬ−リンカー−ＶＨ−ヒンジ−ＴＭ細胞質内部分−ＧＦＰ（ＴｒｋＢ−ＧＦＰ−ＷＴ）およびＶＬ−リンカー−ＶＨ−ヒンジ−変異ＴＭ細胞質内部分−ＧＦＰ（ＴｒｋＢ−ＧＦＰ−Ｍｕｔ）およびＶＬ−リンカー−ＶＨ−Ｍｙｃ−ヒンジ−ＴＭ細胞質内部分（ＴｒｋＢ−Ｍｙｃ−ＷＴ）およびＶＬ−リンカー−ＶＨ−Ｍｙｃ−ヒンジ−変異ＴＭ細胞質内部分（ＴｒｋＢ−Ｍｙｃ−Ｍｕｔ）を含むキメラ膜貫通（ＴＭ）タンパク質配列を合成した。ＧＬＰ１ＲおよびＰＤ−１には、リーダーペプチド−ＶＬ−リンカー−ＶＨ−ＭＹＣ＋ヒンジ−ＴＭ−細胞質内部分を含むキメラ膜貫通タンパク質配列を２種類合成した。
【０１６１】
使用したＷＴマウスゼータＴＭ−細胞質内配列は、ＬＣＹＬＬＤＧＩＬＦＩＹＧＶＩＩＴＡＬＹＬＲＡＫＦＳＲＳＡＥＴＡＡＮＬＱＤＰＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＥＫＫＲＡＲＤＰＥＭＧＧＫＱＱＲＲＲＮＰＱＥＧＶＹＮＡＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＴＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＴＬＡＰＲ（配列番号８）である。使用した変異ゼータＴＭ−細胞質内配列は、ＬＣＹＬＬＤＧＩＬＦＩＹＧＶＩＩＴＡＬＹＬＲＡＫＦＳＲＳＡＥＴＡＡＮＬＱＤＰＮＱＬＦＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＦＤＶＬＥＫＫＲＡＲＤＰＥＭＧＧＫＱＱＲＲＲＮＰＱＥＧＶＦＮＡＬＱＫＤＫＭＡＥＡＦＳＥＩＧＴＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＦＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＦＤＡＬＨＭＱＴＬＡＰＲ（配列番号９）である。
【０１６２】
作製した８種類の配列は、ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＳＧＡＲＣＱ（配列番号２）のＮ末端リーダーペプチドを有する以下のものであった：
ＴｒｋＢ−Ｍｙｃ−ＷＴ：
ＤＶＶＭＴＱＬＰＬＳＬＰＶＩＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＩＨＳＮＧＮＴＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＦＣＳＱＳＴＨＶＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫＲＡＧＧＳＳＲＳＳＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＱＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＤＩＮＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＷＩＹＰＲＤＧＳＩＫＦＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＶＤＴＳＳＳＴＡＹＭＥＬＨＳＬＴＳＥＤＳＡＡＹＦＣＡＲＲＧＲＬＬＬＹＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＸＸＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＡＬＳＮＳＩＭＹＦＳＨＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＳＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＬＣＹＬＬＤＧＩＬＦＩＹＧＶＩＩＴＡＬＹＬＲＡＫＦＳＲＳＡＥＴＡＡＮＬＱＤＰＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＥＫＫＲＡＲＤＰＥＭＧＧＫＱＱＲＲＲＮＰＱＥＧＶＹＮＡＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＴＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＴＬＡＰＲ（配列番号１７）。
ＴｒｋＢ−Ｍｙｃ−Ｍｕｔ：
ＤＶＶＭＴＱＬＰＬＳＬＰＶＩＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＩＨＳＮＧＮＴＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＦＣＳＱＳＴＨＶＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫＲＡＧＧＳＳＲＳＳＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＱＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＤＩＮＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＷＩＹＰＲＤＧＳＩＫＦＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＶＤＴＳＳＳＴＡＹＭＥＬＨＳＬＴＳＥＤＳＡＡＹＦＣＡＲＲＧＲＬＬＬＹＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＸＸＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＡＬＳＮＳＩＭＹＦＳＨＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＳＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＬＣＹＬＬＤＧＩＬＦＩＹＧＶＩＩＴＡＬＹＬＲＡＫＦＳＲＳＡＥＴＡＡＮＬＱＤＰＮＱＬＦＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＦＤＶＬＥＫＫＲＡＲＤＰＥＭＧＧＫＱＱＲＲＲＮＰＱＥＧＶＦＮＡＬＱＫＤＫＭＡＥＡＦＳＥＩＧＴＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＦＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＦＤＡＬＨＭＱＴＬＡＰＲ（配列番号１８）。
ＴｒｋＢ−ＧＦＰ−ＷＴ：
ＤＶＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＮＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＦＣＳＱＧＴＨＶＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲＡＧＧＳＳＲＳＳＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＶＲＰＧＡＳＶＴＬＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＥＭＨＷＶＫＱＴＰＶＨＧＬＥＷＩＧＴＩＤＰＥＴＡＧＴＡＹＮＮＱＫＦＫＧＫＡＩＬＴＡＧＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＴＧＶＴＴＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＸＸＡＬＳＮＳＩＭＹＦＳＨＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＳＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＬＣＹＬＬＤＧＩＬＦＩＹＧＶＩＩＴＡＬＹＬＲＡＫＦＳＲＳＡＥＴＡＡＮＬＱＤＰＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＥＫＫＲＡＲＤＰＥＭＧＧＫＱＱＲＲＲＮＰＱＥＧＶＹＮＡＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＴＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＴＬＡＰＲＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰＭＶＳＫＧＥＥＬＦＴＧＶＶＰＩＬＶＥＬＤＧＤＶＮＧＨＫＦＳＶＳＧＥＧＥＧＤＡＴＹＧＫＬＴＬＫＦＩＣＴＴＧＫＬＰＶＰＷＰＴＬＶＴＴＬＴＹＧＶＱＣＦＳＲＹＰＤＨＭＫＱＨＤＦＦＫＳＡＭＰＥＧＹＶＱＥＲＴＩＦＦＫＤＤＧＮＹＫＴＲＡＥＶＫＦＥＧＤＴＬＶＮＲＩＥＬＫＧＩＤＦＫＥＤＧＮＩＬＧＨＫＬＥＹＮＹＮＳＨＮＶＹＩＭＡＤＫＱＫＮＧＩＫＶＮＦＫＩＲＨＮＩＥＤＧＳＶＱＬＡＤＨＹＱＱＮＴＰＩＧＤＧＰＶＬＬＰＤＮＨＹＬＳＴＱＳＡＬＳＫＤＰＮＥＫＲＤＨＭＶＬＬＥＦＶＴＡＡＧＩＴＬＧＭＤＥＬＹＫ（配列番号１９）。
ＴｒｋＢ−ＧＦＰ−Ｍｕｔ：
ＤＶＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＮＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＦＣＳＱＧＴＨＶＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲＡＧＧＳＳＲＳＳＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＶＲＰＧＡＳＶＴＬＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＥＭＨＷＶＫＱＴＰＶＨＧＬＥＷＩＧＴＩＤＰＥＴＡＧＴＡＹＮＮＱＫＦＫＧＫＡＩＬＴＡＧＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＴＧＶＴＴＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＸＸＡＬＳＮＳＩＭＹＦＳＨＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＳＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＬＣＹＬＬＤＧＩＬＦＩＹＧＶＩＩＴＡＬＹＬＲＡＫＦＳＲＳＡＥＴＡＡＮＬＱＤＰＮＱＬＦＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＦＤＶＬＥＫＫＲＡＲＤＰＥＭＧＧＫＱＱＲＲＲＮＰＱＥＧＶＦＮＡＬＱＫＤＫＭＡＥＡＦＳＥＩＧＴＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＦＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＦＤＡＬＨＭＱＴＬＡＰＲＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰＭＶＳＫＧＥＥＬＦＴＧＶＶＰＩＬＶＥＬＤＧＤＶＮＧＨＫＦＳＶＳＧＥＧＥＧＤＡＴＹＧＫＬＴＬＫＦＩＣＴＴＧＫＬＰＶＰＷＰＴＬＶＴＴＬＴＹＧＶＱＣＦＳＲＹＰＤＨＭＫＱＨＤＦＦＫＳＡＭＰＥＧＹＶＱＥＲＴＩＦＦＫＤＤＧＮＹＫＴＲＡＥＶＫＦＥＧＤＴＬＶＮＲＩＥＬＫＧＩＤＦＫＥＤＧＮＩＬＧＨＫＬＥＹＮＹＮＳＨＮＶＹＩＭＡＤＫＱＫＮＧＩＫＶＮＦＫＩＲＨＮＩＥＤＧＳＶＱＬＡＤＨＹＱＱＮＴＰＩＧＤＧＰＶＬＬＰＤＮＨＹＬＳＴＱＳＡＬＳＫＤＰＮＥＫＲＤＨＭＶＬＬＥＦＶＴＡＡＧＩＴＬＧＭＤＥＬＹＫ（配列番号２０）．
ＧＬＰ１Ｒ−Ｍｙｃ−ＷＴ：
ＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＲＶＴＹＭＨＷＹＱＱＲＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＧＮＮＰＱＹＴＦＧＧＧＴＲＬＥＩＫＲＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＴＬＫＥＳＧＰＧＩＬＱＰＳＱＴＬＳＬＴＣＳＦＳＧＦＳＬＳＴＳＧＴＧＶＧＷＩＲＱＰＳＧＫＧＬＥＷＬＳＨＩＷＷＤＤＶＫＲＹＮＰＡＬＫＳＲＬＴＩＳＲＤＴＳＹＳＱＶＦＬＲＩＡＳＶＤＴＡＤＴＡＴＹＹＣＡＲＩＬＤＧＴＧＰＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳＸＸＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＡＬＳＮＳＩＭＹＦＳＨＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＳＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＬＣＹＬＬＤＧＩＬＦＩＹＧＶＩＩＴＡＬＹＬＲＡＫＦＳＲＳＡＥＴＡＡＮＬＱＤＰＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＥＫＫＲＡＲＤＰＥＭＧＧＫＱＱＲＲＲＮＰＱＥＧＶＹＮＡＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＴＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＴＬＡＰＲ（配列番号２１）。
ＧＬＰ１Ｒ−Ｍｙｃ−Ｍｕｔ：
ＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＲＶＴＹＭＨＷＹＱＱＲＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＧＮＮＰＱＹＴＦＧＧＧＴＲＬＥＩＫＲＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＴＬＫＥＳＧＰＧＩＬＱＰＳＱＴＬＳＬＴＣＳＦＳＧＦＳＬＳＴＳＧＴＧＶＧＷＩＲＱＰＳＧＫＧＬＥＷＬＳＨＩＷＷＤＤＶＫＲＹＮＰＡＬＫＳＲＬＴＩＳＲＤＴＳＹＳＱＶＦＬＲＩＡＳＶＤＴＡＤＴＡＴＹＹＣＡＲＩＬＤＧＴＧＰＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳＸＸＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＡＬＳＮＳＩＭＹＦＳＨＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＳＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＬＣＹＬＬＤＧＩＬＦＩＹＧＶＩＩＴＡＬＹＬＲＡＫＦＳＲＳＡＥＴＡＡＮＬＱＤＰＮＱＬＦＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＦＤＶＬＥＫＫＲＡＲＤＰＥＭＧＧＫＱＱＲＲＲＮＰＱＥＧＶＦＮＡＬＱＫＤＫＭＡＥＡＦＳＥＩＧＴＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＦＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＦＤＡＬＨＭＱＴＬＡＰＲ（配列番号２２）。
ＰＤ−１−Ｍｙｃ−ＷＴ：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＶＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＹＭＹＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＮＰＳＮＧＧＴＮＦＮＥＫＦＫＮＲＶＴＬＴＴＤＳＳＴＴＴＡＹＭＥＬＫＳＬＱＦＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＤＹＲＦＤＭＧＦＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫＧＧＳＳＲＳＳＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＫＧＶＳＴＳＧＹＳＹＬＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＬＡＳＹＬＥＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＨＳＲＤＬＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣＸＸＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＡＬＳＮＳＩＭＹＦＳＨＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＳＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＬＣＹＬＬＤＧＩＬＦＩＹＧＶＩＩＴＡＬＹＬＲＡＫＦＳＲＳＡＥＴＡＡＮＬＱＤＰＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＥＫＫＲＡＲＤＰＥＭＧＧＫＱＱＲＲＲＮＰＱＥＧＶＹＮＡＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＴＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＴＬＡＰＲ（配列番号２７）
ＰＤ−１−Ｍｙｃ−Ｍｕｔ：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＶＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＹＭＹＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＮＰＳＮＧＧＴＮＦＮＥＫＦＫＮＲＶＴＬＴＴＤＳＳＴＴＴＡＹＭＥＬＫＳＬＱＦＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＤＹＲＦＤＭＧＦＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫＧＧＳＳＲＳＳＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＫＧＶＳＴＳＧＹＳＹＬＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＬＡＳＹＬＥＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＨＳＲＤＬＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣＸＸＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＡＬＳＮＳＩＭＹＦＳＨＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＳＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＬＣＹＬＬＤＧＩＬＦＩＹＧＶＩＩＴＡＬＹＬＲＡＫＦＳＲＳＡＥＴＡＡＮＬＱＤＰＮＱＬＦＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＦＤＶＬＥＫＫＲＡＲＤＰＥＭＧＧＫＱＱＲＲＲＮＰＱＥＧＶＦＮＡＬＱＫＤＫＭＡＥＡＦＳＥＩＧＴＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＦＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＦＤＡＬＨＭＱＴＬＡＰＲ（配列番号２８）。
【０１６３】
ＶＬおよびＶＨの代わりにｈＧＨアミノ酸配列を使用した配列をさらに２種類、上記の通りに作製した。内在性ｈＧＨリーダーペプチドＭＡＴＧＳＲＴＳＬＬＬＡＦＧＬＬＣＬＰＷＬＱ（配列番号３４）を使用した。
【０１６４】
ＧＨＲ−Ｍｙｃ−ＷＴ：
ＥＧＳＡＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫＦＰＴＩＰＬＳＲＬＦＤＮＡＭＬＲＡＨＲＬＨＱＬＡＦＤＴＹＱＥＦＥＥＡＹＩＰＫＥＱＫＹＳＦＬＱＮＰＱＴＳＬＣＦＳＥＳＩＰＴＰＳＮＲＥＥＴＱＱＫＳＮＬＥＬＬＲＩＳＬＬＬＩＱＳＷＬＥＰＶＱＦＬＲＳＶＦＡＮＳＬＶＹＧＡＳＤＳＮＶＹＤＬＬＫＤＬＥＥＧＩＱＴＬＭＧＲＬＥＤＧＳＰＲＴＧＱＩＦＫＱＴＹＳＫＦＤＴＮＳＨＮＤＤＡＬＬＫＮＹＧＬＬＹＣＦＲＫＤＭＤＫＶＥＴＦＬＲＩＶＱＣＲＳＶＥＧＳＣＧＦＸＸＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＡＬＳＮＳＩＭＹＦＳＨＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＳＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＬＣＹＬＬＤＧＩＬＦＩＹＧＶＩＩＴＡＬＹＬＲＡＫＦＳＲＳＡＥＴＡＡＮＬＱＤＰＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＥＫＫＲＡＲＤＰＥＭＧＧＫＱＱＲＲＲＮＰＱＥＧＶＹＮＡＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＴＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＴＬＡＰＲ（配列番号２３）。
ＧＨＲ−Ｍｙｃ−ＭｕＴ：
ＥＧＳＡＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫＦＰＴＩＰＬＳＲＬＦＤＮＡＭＬＲＡＨＲＬＨＱＬＡＦＤＴＹＱＥＦＥＥＡＹＩＰＫＥＱＫＹＳＦＬＱＮＰＱＴＳＬＣＦＳＥＳＩＰＴＰＳＮＲＥＥＴＱＱＫＳＮＬＥＬＬＲＩＳＬＬＬＩＱＳＷＬＥＰＶＱＦＬＲＳＶＦＡＮＳＬＶＹＧＡＳＤＳＮＶＹＤＬＬＫＤＬＥＥＧＩＱＴＬＭＧＲＬＥＤＧＳＰＲＴＧＱＩＦＫＱＴＹＳＫＦＤＴＮＳＨＮＤＤＡＬＬＫＮＹＧＬＬＹＣＦＲＫＤＭＤＫＶＥＴＦＬＲＩＶＱＣＲＳＶＥＧＳＣＧＦＸＸＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＡＬＳＮＳＩＭＹＦＳＨＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＳＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＬＣＹＬＬＤＧＩＬＦＩＹＧＶＩＩＴＡＬＹＬＲＡＫＦＳＲＳＡＥＴＡＡＮＬＱＤＰＮＱＬＦＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＦＤＶＬＥＫＫＲＡＲＤＰＥＭＧＧＫＱＱＲＲＲＮＰＱＥＧＶＦＮＡＬＱＫＤＫＭＡＥＡＦＳＥＩＧＴＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＦＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＦＤＡＬＨＭＱＴＬＡＰＲ（配列番号２４）。上記のいずれの配列も、ＸＸは任意のアミノ酸であっても、いずれのアミノ酸でなくてもよい。ＸＸは、タンパク質をコードする核酸配列内の制限酵素部位によるものである。使用した実際のタンパク質では、ＸＸがバリン−アスパラギン酸であった。
【０１６５】
全１０種類の配列をレトロウイルスベクターｐＭＰ７１−Ｇ−ＰＲＥにクローニングした。ＤＨ５アルファ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてプラスミドを増幅し、Ｍａｘｉｐｒｅｐ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｒｔｏｇｅｎ社）で精製した。１０ｃｍのプレートでパッケージング細胞系Ｐｌａｔｉｎｕｍ−Ｅ（Ｃｅｌｌｂｉｏｌａｂｓ社）にプラスミドＤＮＡ  ２０μｇおよびＰｏｌｙＪｅｔ（商標）（ＳｉｇｎａＧｅｎ社）６０μＬをトランスフェクトした。１６時間後、培地をＲＰＭＩ完全培地１０ｍｌと交換した。２４時間後および４８時間後、レトロウイルス上清を収集し、０．４５μｍのフィルターでろ過した。ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎでコートしたプレート（１２．５μｇ／ｍＬ；ＴａＫａＲａ社、Ｃｌｏｎｔｈｅｃｈ社）にＢＷ５１４７細胞（１×１０６個／ｍＬ）をウイルス上清とともに播き、４μｇ／ｍＬの硫酸プロタミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）とともに３２℃、９０分間、１５００ｇで遠心接種した。
【０１６６】
ＴｒｋＢ−Ｔ２ＡのクローニングならびにＲＡＷ５１４７細胞、３Ｔ３細胞およびＨＥＫ２９３細胞のレトロウイルス感染。
Ｔ２Ａ−ＧＦＰを有するｐＭＰ７１−ＰＲＥ発現ベクターにマウスＴｒｋＢ  ｃＤＮＡ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社）をクローニングした。１０ｃｍのプレートでパッケージング細胞系Ｐｌａｔｉｎｕｍ−Ｅ（Ｃｅｌｌｂｉｏｌａｂｓ社）にプラスミドＤＮＡ  ２０μｇおよびＰｏｌｙＪｅｔ（商標）（ＳｉｇｎａＧｅｎ社）６０μＬをトランスフェクトした。１６時間後、培地をＤＭＥＭ完全培地１０ｍｌと交換した。２４時間後および４８時間後、レトロウイルス上清を収集し、０．４５μｍのフィルターでろ過した。簡潔に述べれば、ヒト胎児腎（ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞、ＲＡＷ５１４７細胞および３Ｔ３細胞を２４ウェルプレート（ＮＵＮＣ社）に播種した。翌日、細胞をウイルス上清および４μｇ／ｍＬの硫酸プロタミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）とともにインキュベートした。分取（ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ細胞分取器（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、サンノゼ、カリフォルニア州、米国））から４８〜７２時間後、形質導入されたＴ細胞を染色し解析した。
【０１６７】
ＴｒｋＢ受容体とキメラＴｒｋＢ抗体との間の相互作用に関するｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験
細胞ベースの結合アッセイでは、ＴｒｋＢ受容体を発現するＲａｗ２６４．７細胞をＤＭＥＭベースの培地（１０％ＦＢＳ、ＰＳＮ）に入れ１２ウェルプレート（Ｎｕｎｃ社）に播種した。集密度８５〜９５％に達した後、細胞を２回洗浄し、０．２％ＦＢＳを含むＤＭＥＭメイダ（ｍｅｉｄａ）を４時間加えた。次いで、細胞を洗浄し、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭで１時間インキュベートした後、ニューロトロフィンまたはＢＷ５１４７細胞を加えた。その後、ＴｒｋＢ発現Ｒａｗ２６４．７細胞をＢＤＮＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）およびキメラ受容体を有するＢＷ５１４７細胞とともに３０分間および１時間インキュベートした。共培養した細胞を回収し、ウエスタンブロット解析用に処理した。
【０１６８】
ウエスタンブロット法解析
プロテアーゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ社）およびホスファターゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ社）を含有するＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム）中で細胞を溶解させた。溶解物３０〜５０μｇを１２％トリス−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、次いでＰＶＤＦまたはニトロセルロース膜に写した。膜をｐＴｒｋＢ（Ｔｙｒ７０６／７０７）、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社の全長型ＴｒｋＢ（ＴｒｋＢ（８０Ｅ３））およびアクチンに対する抗体とともにインキュベートした。ＷｅｓｔｅｒｎＢｒｉｇｈｔ  Ｑｕａｎｔｕｍ（Ａｄｖａｎｓｔａ社）をシグナルの可視化に用いた。バイオイメージング解析装置（Ｆｕｓｉｏｎ−ＦＸ；Ｖｉｌｂｅｒ社、フランス）を用いて画像を取得し、ＩｍａｇｅＪプログラムを用いて解析した。リン酸化ＴｒｋＢのウエスタンブロットの定量化。デンシトメトリー（ＩｍａｇｅＪ）を用いてウエスタンブロットのバンドの総合密度の値を求め、データをアクチンおよび全長型ＴｒｋＢに正規化した。
【０１６９】
サイトカインＥＬＩＳＡ
ＴｒｋＢ受容体を発現するＲａｗ２６４．７細胞とＲａｗ２６４．７細胞をＤＭＥＭベースの培地（１０％ＦＢＳ、ＰＳＮ）に入れ９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ社）に播種した。集密度８５〜９５％に達した後、細胞を２回洗浄し、０．２％ＦＢＳを含むＤＭＥＭメイダ（ｍｅｉｄａ）１００ｕｌを４時間加えた。４時間後、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭ培地１００ｕｌにＢＷ５１４７細胞を入れウェルに一晩加えた。１６時間後、上清を収集し、サンドイッチＥＬＩＳＡ法（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）で製造業者の指示通りにＩＬ−２に関して解析した。試料を３連で解析した。
【０１７０】
統計解析
統計解析はいずれもＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．０２  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）で実施した。図の説明文に示されるように、変数をいずれも平均値６ＳＥＭまたはＳＤで表す。ｐ値を一元配置ＡＮＯＶＡ検定で算出した。
【０１７１】
実施例１．αＴｒｋＢ−Ｍｙｃを発現するＢＷ細胞またはαＴｒｋＢ−ＧＦＰキメラ受容体細胞は標的ＲＡＷ−ＴｒｋＢ細胞にＴｒｋＢのリン酸化を誘導する。
ＴＲＡＭＭＩＣＳ発現細胞が標的細胞上のチロシン受容体キナーゼＢ（ＴｒｋＢ）受容体のリン酸化を誘導することができるかどうかを試験するため、以下の実験を実施した。ＴｒｋＢを安定に発現するＲＡＷ２６４．７細胞を作製した。このＲＡＷ−ＴｒｋＢ細胞を未形質転換ＢＷ５１４７、変異型（Ｍｕｔ）ゼータ鎖を有するＢＷ−αＴｒｋＢ−ＧＦＰ（配列番号２０）およびＢＷ−αＴｒｋＢ−Ｍｙｃ−Ｍｕｔ（配列番号１８）と３０分間および６０分間インキュベートした。この実験の結果を図１Ａ〜１Ｂに示す。図１Ａでは、１４５ｋＤａの位置にＴｒｋＢのチロシン７０６のリン酸化に対応するタンパク質バンドがみられ、図１Ｂはこれを定量化したものである。未改変ＢＷ５１４７細胞（図１Ｂ、番号５）との共培養と比較すると、３０分間の共培養後のＲＡＷ−ＴｒｋＢ細胞のリン酸化ＴｒｋＢ（ｐＴｒｋＢ）のレベルがＢＷ−αＴｒｋＢ−ＧＦＰ−Ｍｕｔ細胞（図１Ｂ、番号６）との共培養では増大し、ＢＷ−αＴｒｋＢ−Ｍｙｃ−Ｍｕｔ細胞（図１Ｂ、番号７）との共培養ではそれより大幅に増大していた。１時間の共培養後、ＢＷαＴｒｋＢ−ＧＦＰ−Ｍｕｔ細胞（図１Ｂ、番号９）およびＢＷαＴｒｋＢ−Ｍｙｃ−Ｍｕｔ細胞（図１Ｂ、番号１０）ともに、ＲＡＷ−ＴｒｋＢ細胞でのｐＴｒｋＢ誘導がみられた。基準として総ＴｒｋＢ受容体発現レベルおよびアクチン負荷対照の発現レベルを用いた。
【０１７２】
実施例２．標的細胞のＴｒｋＢ受容体との結合時のキメラ受容体発現ＢＷ細胞によるＩＬ−２産生。
次に、野生型または変異型ＩＴＡＭ領域を有するキメラ受容体を発現するＢＷ細胞にＩＬ−２の分泌を誘導することができるかどうかを検討した。ＴｒｋＢ受容体を発現するＲａｗ２６４．７細胞およびＷＴ  Ｒａｗ２６４．７細胞を９６ウェルプレートのＤＭＥＭベースの培地（１０％ＦＢＳ、ＰＳＮ）に播種した。集密度８５〜９５％に達した後、細胞を２回洗浄し、０．２％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地１００ｕｌを４時間加えた。４時間後、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭ培地１００ｕｌにＢＷ５１４７細胞を入れウェルに加えて一晩インキュベートした。１６時間後、共培養した細胞から上清を収集し、サンドイッチＥＬＩＳＡ法により製造業者の指示通りにＩＬ−２に関して解析した。試料を３連で解析した。
【０１７３】
野生型ＩＴＡＭ領域を有するＢＷαＴｒｋＢ−Ｍｙｃを発現する細胞のみが、ＴｒｋＢ受容体を過剰発現するＲＡＷ細胞と結合したときにＩＬ−２を産生することができた（図２、番号８）。内因性に少量のＴｒｋＢ受容体を発現するＷＴ  ＲＡＷ細胞とのインキュベーションでは、それより有意に低いレベルのＩＬ−２が誘導された（図２、番号７）。変異ゼータ鎖を含む受容体の場合、ＷＴ  ＲＡＷ細胞（図２、番号１０）またはＴｒｋＢ受容体を過剰発現するＲＡＷ細胞（図２、番号１１）のいずれとインキュベートしたかどうかに関係なく、ＢＷ細胞の活性化は観察されなかった。
【０１７４】
実施例３．Ｔ細胞へのトランスフェクション後のキメラ受容体の発現
Ｔ細胞上でのキメラ受容体の膜関連発現を評価するため、マウスＴ細胞系ＢＷ５１４７．３（ＡＴＣＣ（登録商標）ＴＩＢ−４７）または初代マウスＴヘルパー細胞を用いた。細胞に６種類の異なるキメラ受容体をコードする組換えレトロウイルスベクターを形質導入した。形質導入から４８〜７２時間後、Ｍｙｃ発現（Ｍｙｃタグがキメラ受容体の一部である場合）またはＧＦＰ発現（ＧＦＰがキメラ受容体の一部である場合）の染色を用いて、細胞を受容体陽性細胞に関して分取した（図３Ａ〜３Ｇ）。いずれの場合も表面での明らかなキメラ受容体の高発現が観察された。具体的には、αＴｒｋＢ−Ｍｙｃ−ＷＴ（図３Ａ、配列番号１７）、αＴｒｋＢ−Ｍｙｃ−Ｍｕｔ（図３Ｂ、配列番号１８）、αＧＬＰ１Ｒ−Ｍｙｃ−ＷＴ（図３Ｅ、配列番号２１）、αＧＬＰ１Ｒ−Ｍｙｃ−Ｍｕｔ（図３Ｆ、配列番号２２）、αＴｒｋＢ−ＧＦＰ−ＷＴ（図３Ｃ、配列番号１９）およびαＴｒｋＢ−ＧＦＰ−Ｍｕｔ（図３Ｄ、配列番号２０）がＢＷ細胞の表面に高発現した。さらに、αＧＬＰ１Ｒ−Ｍｙｃ−Ｍｕｔ（図３Ｇ、配列番号２２）も形質導入マウスＴヘルパー細胞の表面に高発現することがわかった。
【０１７５】
実施例４．プラスチック結合抗Ｍｙｃ抗体によるキメラ受容体発現ＢＷ細胞の活性化。
プラスチック結合抗Ｍｙｃ抗体によりＭｙｃ含有キメラタンパク質を発現するＴ細胞を活性化させてＩＬ−２を分泌させることができるかどうかを試験するため、以下の実験を実施した。６種類の異なるＭｙｃ含有構築物、すなわち、実施例３で言及した４種類のＭｙｃ含有構築物およびαＧＨ−Ｍｙｃ−ＷＴ（配列番号２３）、αＧＨ−Ｍｙｃ−Ｍｕｔ（配列番号２４）をＢＷ細胞に発現させた。得られた６種類の細胞系を、漸増量（コーティング溶液中２５００〜４．８ｎｇ／ｍｌ）のプラスチックと結合した市販の抗Ｍｙｃ  Ａｂと１６〜１８時間インキュベートした（５００００個／９６プレートウェル）。抗ＣＤ１６（コーティング溶液中２５００ｎｇ／ｍｌ）を抗Ｍｙｃに対する陰性対照として用いた。一晩インキュベートした後、市販のＥＬＩＳＡキットにより上清中のｍＩＬ−２レベルを求めた。
【０１７６】
ＷＴゼータ鎖を含む構築物を発現する細胞にはいずれも明らかな活性化が観察され（ＩＬ−２分泌に基づく）、さらに、Ｉｌ−２分泌の強度は、用いたプラスチック結合抗Ｍｙｃ抗体の量と直接相関していた（図４）。発現した受容体に変異ゼータ鎖が含まれている場合、用いた最大濃度の抗Ｍｙｃ抗体でも活性化は観察されなかった。
【０１７７】
したがって、抗ＴｒＫｂ  ＶＬ−リンカー−ＶＨ配列、抗ＧＬＰ１Ｒ  ＶＬ−リンカー−ＶＨ配列または成長ホルモン（ＧＨ）配列のいずれか１つとともにＭｙｃタグおよびＷＴゼータ鎖を含むキメラ受容体は、プラスチック結合抗Ｍｙｃによって効率的に活性化されるとする結論が導かれた。この結果から、キメラ受容体は機能的であり、標的側からの適切なシグナル（ここではプラスチック結合抗Ｍｙｃ抗体により模倣した）が存在すると、Ｔ細胞の膜上に動員され凝集して機能的シナプスを形成し得ることがわかる。さらに、標的と相互作用した後、Ｔ細胞によるいかなる活性化を防止するのにも、ゼータ鎖上にチロシン（Ｙ）からフェニルアラニン（Ｆ）への単一アミノ酸変異が６つあれば十分であることは明らかである。
【０１７８】
実施例５．ＧＬＰ１Ｒを有する標的細胞によるαＧＬＰ１Ｒキメラ受容体発現Ｔ細胞の活性化
次に、ＧＬＰ１Ｒを発現する細胞（ＣＨＯ−ＧＬＰ１Ｒ、カタログ番号ＭＯＯ４５１、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州、米国）がキメラ抗ＧＬＰ１Ｒ受容体を発現するＴ細胞を活性化させてＩＬ−２を分泌させることができるかどうかを検討した。図５に、αＧＬＰ１Ｒ−Ｍｙｃ−ＷＴまたはαＧＬＰ１Ｒ−Ｍｙｃ−Ｍｕｔを発現するＴ細胞、キメラ受容体（ＢＷ５１４７）のないＴ細胞およびＴ細胞を加えていないＣＨＯ−ＧＬＰ１Ｒ（ＰＢＳ）を示す。対照として、Ｔ細胞の代わりにＧＬＰ１Ｒアゴニストのエキセンジン４（Ｅｘｎ４）も加えた。最初に、市販のＧＬＰ１Ｒ発現ＣＨＯ細胞を予め播種し、２４時間付着させた。Ｔ細胞または対照と１８時間インキュベートした後、上清を回収し、市販のＥＬＩＳＡキットによりマウスＩＬ−２のレベルを求めた。
【０１７９】
Ｔ細胞がαＧＬＰ１Ｒ−Ｍｙｃ−ＷＴを発現する場合のみ明らかな活性化が観察され（ＩＬ−２分泌に基づく）、この活性化（ＩＬ−２分泌）は、加えたＴ細胞の量と直接相関していた（図４）。キメラ受容体αＧＬＰ１Ｒ−Ｍｙｃ−ｍｕｔを発現するＴ細胞を加えた場合を含めた他のいずれの場合も活性化は測定されなかった。以上の結果は、変異ゼータ鎖が、キメラタンパク質が関与する方法に関係なくＴ細胞を活性化させないとする主張を裏付けるものである。
【０１８０】
実施例６．適切なキメラ受容体を発現するエフェクター細胞とインキュベートした標的ＲＡＷ細胞からのｍＴＮＦα発現。
αＧＬＰ１Ｒ−Ｍｙｃ−Ｍｕｔを発現するＢＷ細胞自体は活性化することができないことが明らかになったため、同細胞がＧＬＰ１Ｒを発現する細胞を活性化させてｍＴＮＦαを分泌させることができるかどうか検討した。ＲＡＷ２６４．７細胞（ＲＡＷ２６４．７  ＡＴＣＣ（登録商標）ＴＩＢ−７１（商標））は、生来的にマウスＧＬＰ１Ｒを発現するマウスマクロファージ／単球細胞系である。ＧＬＰ１Ｒが活性化すると、このＲＡＷ細胞によるＴＮＦα分泌が誘導されることがわかっている。ＷＴ  ＢＷ細胞、キメラ抗ＧＬＰ１Ｒ受容体を発現するＢＷ細胞またはＧＬＰ１ＲアゴニストのＥｘｎ４と共インキュベートした後、Ｒａｗ細胞の上清を回収し、市販のＥＬＩＳＡキットにより上清中のマウスＴＮＦαレベルを求めた（図６）。
【０１８１】
αＧＬＰ１Ｒ−Ｍｙｃ−Ｍｕｔを発現するＴ細胞と標的ＲＡＷ細胞を共インキュベートした場合のみ標的ＲＡＷ細胞の明らかな活性化が観察された（ｍＴＮＦαに基づく）。Ｔ細胞を加えなかった場合（それぞれＲａｗ単独（低濃度１ｕｇ／ｍｌのＬＰＳで処理）およびＬＰＳ処理を実施しなかったＲＡＷ（ＬＰＳ無し）のカラム）、ＲＡＷ細胞の活性化レベルは低いか皆無であった。受容体を発現しないＴ細胞を加えた場合（ＢＷ５１４７）、活性化が若干観察されたが、抗ＧＬＰ１Ｒ受容体を発現するＴ細胞を加えた場合と比較して有意に低い値である。この実験の設定の有効性を示す陽性対照は、ＧＬＰ１Ｒアゴニストでありキメラ受容体と同程度のＴＮＦα発現を誘導するエキセンジン４（Ｅｘｎ４）を加えたものである。
【０１８２】
したがって、変異型ゼータ鎖を含むキメラ抗ＧＬＰ１Ｒ受容体を発現するＴ細胞には、ＧＬＰ１Ｒ受容体発現する標的細胞をＧＬＰ１Ｒ受容体を介して活性化させる効果があるとする結論が導かれる。この結果は、キメラ受容体が、ゼータが変異していても機能的であり、適切な受容体を発現する標的細胞から強力な応答を誘導することが可能であることを示している。
【０１８３】
実施例７．抗ＰＤ−１  ＳＣＡＡＢを用いた免疫細胞の負の調節の遮断
ＰＤ１陽性ＮＫ細胞と、抗ＰＤ１  ＳＣＡＡＢ（配列番号２８）を発現する免疫細胞とをインキュベートする。次に、ＰＤ−１Ｌ陽性腫瘍細胞を加え、ＮＫ活性化を測定する。あるいは、抗原媒介性Ｔ細胞活性化アッセイを用いてＮＫ細胞活性化をアッセイする。
【０１８４】
ここまで、本発明をその特定の実施形態とともに説明してきたが、当業者には多数の代替形態、修正形態および変形形態が明らかになろうことは明白である。したがって、添付の請求項の趣旨および広い範囲に含まれるそのような代替形態、修正形態および変形形態はすべて包含されるものとする。
【図１Ａ】
2020503841.tif 000006
【図１Ｂ】
2020503841.tif 000007
【図２】
2020503841.tif 000008
【図３−１】
2020503841.tif 000009
【図３−２】
2020503841.tif 000010
【図３−３】
2020503841.tif 000011
【図３−４】
2020503841.tif 000012
【図４】
2020503841.tif 000013
【図５】
2020503841.tif 000014
【図６】
2020503841.tif 000015
【配列表】
2020503841000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年6月10日(2019.6.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2020503841000001.app
【国際調査報告】
2020503841.tif 000016
2020503841.tif 000017