(57)【要約】複数の個別のウェルを含む支持体と、前記個別のウェルのそれぞれに配置されたゲル材料と、ゲル材料にグラフトされた配列決定プライマーと、ゲル材料にグラフトされた非配列決定エンティティと、を含むアレイの一例。前記配列決定プライマーおよび前記非配列決定エンティティのそれぞれは、そのグラフトされたままの形態である。
2020503022.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の個別のウェルを含む支持体と、
前記個別のウェルのそれぞれに配置されたゲル材料と、
前記ゲル材料にグラフトされた配列決定プライマーと、
前記ゲル材料にグラフトされた非配列決定エンティティと、
を含み、
前記配列決定プライマーおよび前記非配列決定エンティティのそれぞれは、そのグラフトされたままの形態である、アレイ。
【請求項２】
前記非配列決定エンティティは、デンドリマー、ポリデキストラン、メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンイミン）、ポリ−Ｌ−リジン、プロパルギルメタクリレート、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（エチレングリコール）アクリレート、ポリ（プロピレンイミン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）、ポリアクリル酸、ポリ（トロロクスエステル）、ペプチド、および非機能性プライマーからなる群から選択される、請求項１に記載のアレイ。
【請求項３】
前記非配列決定エンティティは非機能性プライマーであって、該非機能性プライマーはポリＴまたはポリＡである、請求項２に記載のアレイ。
【請求項４】
前記非配列決定エンティティは、約０．５ＫＤａ〜約１０ＫＤａの範囲の分子量を有するポリ（エチレングリコール）である、請求項２に記載のアレイ。
【請求項５】
前記非配列決定エンティティは、アルキン、ノルボルニル、銅フリークリック部分、およびチオールからなる群から選択される末端官能基を介したゲル材料にグラフトされる、請求項１または２に記載のアレイ。
【請求項６】
前記非配列決定エンティティは、リンカーと、該リンカーに結合した三重項状態消光剤または酸化防止剤とを含む、請求項１または５に記載のアレイ。
【請求項７】
前記リンカーは、デンドリマー、ポリデキストラン、メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンイミン）、ポリ−Ｌ−リジン、プロパルギルメタクリレート、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（エチレングリコール）アクリレート、ポリ（プロピレンイミン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）、ポリアクリル酸、およびポリ（トロロクスエステル）からなる群から選択され、
以下のいずれかである：
前記三重項状態消光剤は、シクロオクチルテトラエン（ＣＯＴ）、トロロクス（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸）、およびニトロベンジルアルコール（ＮＢＡ）からなる群から選択され、または
前記酸化防止剤は、アスコルベート、グルタチオン、没食子酸、カテキン、トロロクス（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸）、およびビタミンＥからなる群から選択される、請求項６に記載のアレイ。
【請求項８】
前記非配列決定エンティティは、リンカーと、該リンカーに結合する蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）供与体とを含む、請求項１または５に記載のアレイ。
【請求項９】
前記リンカーは、デンドリマー、ポリデキストラン、メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンイミン）、ポリ−Ｌ−リジン、プロパルギルメタクリレート、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（エチレングリコール）アクリレート、ポリ（プロピレンイミン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）、ポリアクリル酸、およびポリ（トロロクスエステル）からなる群から選択され、
前記ＦＲＥＴ供与体は、緑色発光色素を有するＦＲＥＴに対する供与体色素および赤色発光色素を有するＦＲＥＴに対する供与体色素からなる群から選択される、請求項８に記載のアレイ。
【請求項１０】
前記配列決定プライマーに対する前記非配列決定エンティティのモル比は、約０．２５：１〜約５：１の範囲である、請求項１〜９のいずれかに記載のアレイ。
【請求項１１】
ゲル材料は、式（１）：
【化１】
2020503022.tif 000009
の繰り返し単位を含む、請求項１〜１０のいずれかに記載のアレイ。
ここで、
Ｒ１は、Ｈまたは任意に置換されたアルキルであり、
ＲＡは、アジド、任意に置換されたアミノ、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたヒドラゾン、任意に置換されたヒドラジン、カルボキシル、ヒドロキシ、任意に置換されたテトラゾール、任意に置換されたテトラジン、ニトリルオキシド、ニトロン、およびチオールからなる群から選択され、
Ｒ５は、Ｈおよび任意に置換されたアルキルからなる群から選択され、
−（ＣＨ２）ｐ−のそれぞれは、任意に置換されていてもよく、
ｐは、１〜５０の範囲の整数であり、
ｎは、１〜５０，０００の範囲の整数であり、
ｍは、１〜１００，０００の範囲の整数である。
【請求項１２】
複数の個別のウェルを含む支持体と、
前記個別のウェルのそれぞれに配置されたゲル材料と、
前記ゲル材料にグラフトされた配列決定プライマーと、
前記ゲル材料にグラフトされたスペーサーと、
を含み、
前記スペーサーは、デンドリマー、ポリデキストラン、メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンイミン）、ポリ−Ｌ−リジン、プロパルギルメタクリレート、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（エチレングリコール）アクリレート、ポリ（プロピレンイミン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）、ポリアクリル酸、ポリ（トロロクスエステル）、およびその組み合わせから選択される、アレイ。
【請求項１３】
三重項状態消光剤、酸化防止剤、または前記スペーサーに結合する蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）供与体をさらに含む、請求項１２に記載のアレイ。
【請求項１４】
前記三重項状態消光剤は、前記スペーサーに結合され、
前記三重項状態消光剤は、シクロオクチルテトラエン（ＣＯＴ）、トロロクス（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸）、およびニトロベンジルアルコール（ＮＢＡ）からなる群から選択される、請求項１３に記載のアレイ。
【請求項１５】
前記酸化防止剤は、前記スペーサーに結合され、
前記酸化防止剤は、アスコルベート、グルタチオン、没食子酸、カテキン、トロロクス（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸）、およびビタミンＥからなる群から選択される、請求項１３に記載のアレイ。
【請求項１６】
前記ＦＲＥＴ供与体は、前記スペーサーに結合され、
前記ＦＲＥＴ供与体は、緑色発光色素を有するＦＲＥＴに対する供与体色素および赤色発光色素を有するＦＲＥＴに対する供与体色素からなる群から選択される、請求項１３に記載のアレイ。
【請求項１７】
前記配列決定プライマーに対する前記スペーサーのモル比は、約０．２５：１〜約５：１の範囲である、請求項１２〜１６のいずれかに記載のアレイ。
【請求項１８】
前記スペーサーは、アルキン、ノルボルニル、銅フリークリック部分、およびチオールからなる群から選択される末端官能基を介したゲル材料にグラフトされる、請求項１２〜１７のいずれかに記載のアレイ。
【請求項１９】
支持体の複数の個別のウェルのそれぞれにゲル材料を配置し、
前記ゲル材料に配列決定プライマーをグラフトし、
前記ゲル材料に非配列決定エンティティをグラフトすることを含む、方法。
【請求項２０】
前記非配列決定エンティティが前記ゲル材料にグラフトされる前にまたはグラフトされる後に、前記配列決定プライマーが、前記ゲル材料にグラフトされる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記配列決定プライマーおよび前記非配列決定エンティティは、前記ゲル材料に共グラフトされる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
共グラフトは、
その上に前記ゲル材料を有する前記支持体に、前記配列決定プライマーおよび前記非配列決定エンティティの混合物を沈着させ、
前記支持体を所定の温度でインキュベートする
ことにより達成される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記非配列決定エンティティは、デンドリマー、ポリデキストラン、メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンイミン）、ポリ−Ｌ−リジン、プロパルギルメタクリレート、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチレングリコール）アクリレート、ポリ（プロピレンイミン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）、ポリアクリル酸、ポリ（トロロクスエステル）、ペプチド、および非機能性プライマーからなる群から選択され、
前記非配列決定エンティティは、アルキン、ノルボルニル、銅フリークリック部分、およびチオールからなる群から選択される末端官能基を介したゲル材料にグラフトされる、請求項１９〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記ゲル材料が式（Ｉ）：
【化２】
2020503022.tif 000010
の繰り返し単位を含む、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載のアレイ。
ここで、
Ｒ１は、Ｈまたは任意に置換されたアルキルであり、
ＲＡは、アジド、任意に置換されたアミノ、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたヒドラゾン、任意に置換されたヒドラジン、カルボキシル、ヒドロキシ、任意に置換されたテトラゾール、任意に置換されたテトラジン、ニトリルオキシド、ニトロン、およびチオールからなる群から選択され、
Ｒ５は、Ｈおよび任意に置換されたアルキルからなる群から選択され、
−（ＣＨ２）ｐ−のそれぞれは、任意に置換されていてもよく、
ｐは、１〜５０の範囲の整数であり、
ｎは、１〜５０，０００の範囲の整数であり、
ｍは、１〜１００，０００の範囲の整数である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との相互参照
本出願は、２０１６年１２月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／４３８，２９４号の利益を主張し、その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表の参照
本明細書と共にＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出された配列表は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ファイルの名前はILI102BPCT_IP-1486-PCT_sequence_listing_ST25.txt、ファイルのサイズは６４７バイト、ファイルの作成日は、２０１７年１２月２０日である。
【背景技術】
【０００３】
生物学的アレイは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）を含む分子を検出および分析するために使用される広範囲のツールのうちの１つである。これらの用途において、アレイは、ヒトおよび他の生物における遺伝子に存在するヌクレオチド配列に対するプローブを含むように設計されている。特定の用途では、例えば、個々のＤＮＡおよびＲＮＡプローブは、アレイ支持体上の幾何学的グリッド内の小さい位置に（またはランダムに）付着させることができる。例えば既知の人または生物からの試験試料は、相補的フラグメントがアレイ中の個々の部位でプローブとハイブリダイズするようにグリッドに曝露されてもよい。次に、断片がハイブリダイズした部位の蛍光によって、どの断片が試料中に存在するかを同定するために、その部位にわたって特定の周波数の光を走査することによってアレイを検査することができる。
【０００４】
生物学的アレイを遺伝子配列決定に使用することができる。一般に、遺伝子配列決定は、ＤＮＡまたはＲＮＡの断片などの、ある長さの遺伝物質におけるヌクレオチドまたは核酸の順序を決定することを含む。ますます長い塩基対の配列が分析されており、得られた配列情報は、断片が由来する広範な長さの遺伝物質の配列を確実に決定するために、断片を互いに論理的に合わせるための様々なバイオインフォマティクス方法において使用され得る。特徴的な断片の自動化されたコンピュータベースの検査が開発されており、ゲノムマッピング、遺伝子およびそれらの機能の同定、特定の状態および病状の危険性の評価などにおいて使用されてきた。これらの用途を超えて、生物学的アレイは、広範囲の分子、分子のファミリー、遺伝子発現レベル、一塩基多型、および遺伝子型決定の検出および評価に使用され得る。
【発明の概要】
【０００５】
アレイの一例は、複数の個別のウェルを含む支持体と、前記個別のウェルのそれぞれに配置されたゲル材料と、ゲル材料にグラフトされた配列決定プライマーと、前記ゲル材料にグラフトされた非配列決定エンティティと、を含む。前記配列決定プライマーおよび前記非配列決定エンティティのそれぞれは、そのグラフトされたままの形態である。
【０００６】
アレイの別の例は、複数の個別のウェルを含む支持体と、前記個別のウェルのそれぞれに配置されたゲル材料と、前記ゲル材料にグラフトされた配列決定プライマーと、前記ゲル材料にグラフトされたスペーサーと、を含む。前記スペーサーは、デンドリマー、ポリデキストラン、メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンイミン）、ポリ−Ｌ−リジン、プロパルギルメタクリレート、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（エチレングリコール）アクリレート、ポリ（プロピレンイミン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）、ポリアクリル酸、ポリ（トロロクスエステル）、およびその組み合わせからなる群から選択される。
【０００７】
方法の例では、ゲルは、支持体の複数の個別のウェルのそれぞれに配置され、前記ゲル材料に配列決定プライマーをグラフトし、前記ゲル材料に非配列決定エンティティをグラフトする。
【０００８】
本開示の実施例の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図面を参照することによって明らかになるであろう。図面において、同様の参照番号は、おそらく同一ではないが同様の構成要素に対応する。簡潔にするために、前述の機能を有する参照番号または特徴は、それらが現れる他の図面に関連して説明されてもされなくてもよい。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、本開示による例示的なアレイの概略図であり、アレイの全体的なレイアウトを示し、個々の部位の配置を詳細に示している。
【図２】図２のＡ〜Ｄは、本明細書に開示する方法の一例を一緒に示す断面図である。
【図３】図３は、図１および図２Ｄに示される個々の部位のうちの１つの拡大斜視切り取り図である。
【図４】図４は、一例において、テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）品質管理対照（ＱＣ）結果を、強度に関して、異ならせたモル比の非配列決定プライマー対配列決定プライマーを含むレーンについて示すグラフである。
【図５】図５は、一実施例において、異ならせたモル比の、配列決定プライマーに対する非配列決定プライマーのリード（読み取り）２ Ｃ１Ａ強度を示すグラフである。
【図６】図６のＡおよびＢは、一例において、異ならせたモル比の配列決定プライマーに対するポリマー鎖非配列決定エンティティについてフィルターを通過するクラスタのパーセンテージを示すグラフである。
【図７】図７のＡおよびＢは、一例において、異ならせたモル比の配列決定プライマーに対するポリマー鎖非配列決定エンティティについてのパッドホッピングのパーセンテージを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
導入
本明細書に開示されるアレイの第１の態様では、アレイは、複数の個別のウェルを含む支持体、個別のウェルのそれぞれに配置されたゲル材料、ゲル材料にグラフトされた配列決定プライマー、ゲル材料にグラフトされた非配列決定エンティティを含み、各配列決定プライマーおよび非配列決定エンティティはそのグラフトされたままの形態である。
【００１１】
アレイの第１の態様では、配列決定プライマーに対する非配列決定エンティティのモル比は約０．２５：１から約５：１の範囲である。
【００１２】
アレイの第１の態様の一実施例では、非配列決定エンティティは、デンドリマー、ポリデキストラン、メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンイミン）、ポリ−Ｌ−リジン、プロパルギルメタクリレート、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（エチレングリコール）アクリレート、ポリ（プロピレンイミン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）、ポリアクリル酸、ポリ（トロロクスエステル）、ペプチド、および非機能性プライマーからなる群から選択される。非配列決定エンティティは、末端官能基を介したゲル材料にグラフトされる。いくつかの実施例では、官能基は、アルキン、ノルボルニル、銅フリークリック部分、およびチオールからなる群から選択される。本第１の態様の一実施例として、非配列決定エンティティは非機能性プライマーであり、非機能性プライマーはポリＴまたはポリＡである。本第１の態様の別の実施例では、非配列決定エンティティは、約０．５ＫＤａから約１０ＫＤａ未満の範囲の分子量を有するポリ（エチレングリコール）である。
【００１３】
アレイの第１の態様の他の実施例は、非配列決定エンティティは、リンカーおよび該リンカーに結合する三重項状態消光剤または酸化防止剤を含む。いくつかの実施例では、リンカーは、デンドリマー、ポリデキストラン、メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンイミン）、ポリ−Ｌ−リジン、プロパルギルメタクリレート、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（エチレングリコール）アクリレート、ポリ（プロピレンイミン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）、ポリアクリル酸、およびポリ（トロロクスエステル）からなる群から選択される。本態様のいくつかの実施例では、三重項状態消光剤は、シクロオクチルテトラエン（ＣＯＴ）、トロロクス、およびニトロベンジルアルコール（ＮＢＡ）からなる群から選択され、いくつかの実施例では、酸化防止剤は、アスコルベート、グルタチオン、没食子酸、カテキン、トロロクス、およびビタミンＥからなる群から選択される。
【００１４】
第１の態様のアレイのさらに他の実施例では、非配列決定エンティティは、リンカーおよび該リンカーに結合する蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）供与体（ドナー）を含む。いくつかの実施例では、リンカーは、デンドリマー、ポリデキストラン、メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンイミン）、ポリ−Ｌ−リジン、プロパルギルメタクリレート、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチレングリコール）アクリレート、ポリ（プロピレンイミン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）、ポリアクリル酸、およびポリ（トロロクスエステル）からなる群から選択される。本態様のいくつかの実施例では、ＦＲＥＴ供与体は、緑色発光色素を有するＦＲＥＴに対する供与体色素および赤色発光色素を有するＦＲＥＴに対する供与体色素からなる群から選択される。
【００１５】
アレイの第１の態様の任意の特徴を任意の望ましい方法および／または構成で互いに組み合わせることができることを理解されたい。
【００１６】
本明細書に開示されるアレイの第２の態様は、アレイが、複数の個別のウェルを含む支持体と、個別のウェルのそれぞれに配置されたゲル材料と、ゲル材料にグラフトされた配列決定プライマーと、ゲル材料にグラフトされたスペーサーと、を含む。いくつかの実施例では、スペーサーは、デンドリマー、ポリデキストラン、メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンイミン）、ポリ−Ｌ−リジン、プロパルギルメタクリレート、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチレングリコール）アクリレート、ポリ（プロピレンイミン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）、ポリアクリル酸、ポリ（トロロクスエステル）、およびその組み合わせからなる群から選択される。
【００１７】
アレイ１０の第２の態様では、配列決定プライマーに対するスペーサーのモル比は約０．２５：１〜約５：１の範囲である。
【００１８】
アレイの第２の態様の一実施例は、三重項状態消光剤、酸化防止剤、またはスペーサーに結合する蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）供与体をさらに含む。本態様のいくつかの実施例では、三重項状態消光剤は、シクロオクチルテトラエン（ＣＯＴ）、トロロクス、およびニトロベンジルアルコール（ＮＢＡ）からなる群から選択される。本態様のいくつかの実施例では、酸化防止剤は、アスコルベート、グルタチオン、没食子酸、カテキン、トロロクス、およびビタミンＥからなる群から選択される。本態様のいくつかの実施例では、ＦＲＥＴ供与体は、緑色発光色素を有するＦＲＥＴに対する供与体色素および赤色発光色素を有するＦＲＥＴに対する供与体色素からなる群から選択される。
【００１９】
アレイの第２の態様の一実施形態では、スペーサーは、末端官能基を介したゲル材料にグラフトされる。いくつかの実施例では、官能基は、アルキン、ノルボルニル、銅フリークリック部分、およびチオールからなる群から選択される。
【００２０】
アレイの第２の態様の任意の特徴を任意の望ましい方法で一緒に組み合わせることができることを理解されたい。さらに、第１の態様および／または第２の態様の特徴の任意の組み合わせを一緒に使用することができ、および／またはこれらの態様のいずれかまたは両方からの任意の特徴を本明細書に開示の実施例のいずれと組み合わせることもできることを理解されたい。
【００２１】
本方法の一態様は、支持体の複数の別々のウェルのそれぞれにゲル材料を配置し、ゲル材料に配列決定プライマーをグラフトし、ゲル材料に非配列決定エンティティをグラフトすることを含む。
【００２２】
方法の本態様の一実施例では、非配列決定エンティティがゲル材料にグラフトされる前にまたはグラフトされる後に、配列決定プライマーが、ゲル材料にグラフトされる。
【００２３】
方法の本態様の別の一実施例では、配列決定プライマーおよび非配列決定エンティティは、ゲル材料に共グラフトされる。共グラフトは、その上にゲル材料を有する支持体に、配列決定プライマーおよび非配列決定エンティティの混合物を沈着させ、支持体を所定の温度でインキュベートすることにより達成される。
【００２４】
方法の本態様では、非配列決定エンティティは、デンドリマー、ポリデキストラン、メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンイミン）、ポリ−Ｌ−リジン、プロパルギルメタクリレート、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチレングリコール）アクリレート、ポリ（プロピレンイミン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）、ポリアクリル酸、ポリ（トロロクスエステル）、ペプチド、および非機能性プライマーからなる群から選択され、非配列決定エンティティは、末端官能基を介したゲル材料にグラフトされる。いくつかの実施例では、末端官能基は、アルキン、ノルボルニル、銅フリークリック部分、およびチオールからなる群から選択される。
【００２５】
方法のいくつかの態様では、非配列決定エンティティは、三重項状態消光剤、酸化防止剤、またはそれに結合する蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）供与体をさらに含む。
【００２６】
方法のこの態様の任意の特徴は、任意の望ましい方法で一緒に組み合わせることができることを理解されたい。さらに、本方法のこの態様の特徴の任意の組み合わせを、本明細書に開示されているアレイの任意の態様および／または任意の実施例と組み合わせることができることを理解されたい。
【００２７】
詳細な説明
本明細書に開示されているアレイの例にはいくつかの部位が含まれ、それぞれの部位はゲル材料に結合した配列決定プライマーおよび非配列決定エンティティを有する。配列決定プライマーは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）の結合および増幅に使用され得るが、非配列決定エンティティは結合または増幅に関与しない。むしろ、非配列決定エンティティは配列決定プライマー間のスペーサーとして作用する。配列決定プライマーを離間させることは、増幅プロセスに関与するタンパク質の立体障害を制限することによって増幅を増強し得る。
【００２８】
スペーサーとして作用することに加えて、非配列決定エンティティはまた、他の機能性をアレイに導入し得る。例として、非配列決定エンティティは、ｉ）増幅および配列決定中の酵素、タンパク質、および／または他の小分子のゲル材料への非特異的結合を制限し得、ｉｉ）ゲル材料の親水性を高め、それは乾燥条件下でのその崩壊を防ぐのを助けることができ、ｉｉｉ）ゲル材料に結合した色素の蛍光特性を増強し、および/またはｉｖ）ｉ、ｉｉ、および／またはｉｉｉの組み合わせであり得る。さらにまた、非配列決定エンティティは、表面から機能性表面プライマーを露出させるのを助けてもよい。
【００２９】
本明細書で使用される用語は、他に特定されない限り、関連技術におけるそれらの通常の意味をとることが理解されるべきである。本明細書中で使用されるいくつかの用語およびそれらの意味を以下に記載する。
【００３０】
単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかにそうでないと指示しない限り、複数の指示対象を含む。
【００３１】
本明細書で使用されるとき、「アルキル」は、完全に飽和している（すなわち、二重結合または三重結合を含まない）直鎖または分岐の炭化水素鎖を指す。アルキル基は、１〜２０個の炭素原子を有していてもよい。アルキル基の例には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ターシャリーブチル、ペンチル、ヘキシルなどが含まれる。例として、「Ｃ１−４アルキル」という表示は、アルキル鎖中に１〜４個の炭素原子があることを示し、すなわち、アルキル鎖は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、およびｔ−ブチルからなる群から選択される。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、「アルケニル」とは、１つ以上の二重結合を含有する直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖をいう。アルケニル基は、２〜２０個の炭素原子を有していてもよい。アルケニル基の例には、エテニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニルなどが含まれる。アルケニル基は、例えば「Ｃ２−４アルケニル」と命名することができ、これはアルケニル鎖中に２〜４個の炭素原子があることを示す。
【００３３】
本明細書で使用されるとき、「アルキニル」は、１つまたは複数の三重結合を含有する直鎖または分岐の炭化水素鎖を指す。アルキニル基は、２〜２０個の炭素原子を有していてもよい。アルキニル基は、例えば、「Ｃ２−４アルキニル」と指定することができ、これはアルキニル鎖中に２〜４個の炭素原子があることを示す。
【００３４】
「アミノ」官能基は、本明細書で定義されているように、−ＮＲａＲｂ基を指し、式中、ＲａおよびＲｂはそれぞれ独立して水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ３−７カルボシクリル、Ｃ６−１０アリール、５−１０員ヘテロアリール、および５−１０員ヘテロシクリルから選択される。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、「アリール」とは、環骨格中に炭素のみを含有する芳香環または環系（すなわち、２つの隣接する炭素原子を共有する２つ以上の縮合環）をいう。アリールが環系であるとき、その系中の全ての環は芳香族である。アリール基は、６〜１８個の炭素原子を有していてもよく、これはＣ６〜１８と表されてもよい。アリール基の例には、フェニル、ナフチル、アズレニル、およびアントラセニルが含まれる。
【００３６】
「グラフトされたままの形態」という語句は、グラフトの結果としてゲル材料に結合されているので、いかなる変更もなしに、プライマーおよび／または非配列決定エンティティの状態を指す。本明細書に開示される実施例では、そのグラフトされたままの形態の非配列決定エンティティは、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列決定を受けることができない。言い換えれば、非配列決定エンティティがゲル材料にグラフトされる点からは、配列決定することができない。このように、配列決定中に非配列決定エンティティを非反応性にするために追加の処理工程をとる必要はない。むしろ、非配列決定エンティティがグラフトされるとき、それは配列決定することができない。
【００３７】
本明細書で使用されるとき、用語「結合された（attached）」は、２つのものが互いに接合、固定、接着、接続、または結合（bound）されている状態を指す。例えば、核酸は、共有結合または非共有結合によってゲル材料などの材料に結合することができる。共有結合は、原子間の電子対の共有によって特徴付けられる。非共有結合は、電子対の共有を含まない化学結合であり、例えば、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、親水性相互作用および疎水性相互作用を含み得る。
【００３８】
「アジド」または「アジド」官能基は、−Ｎ３を指す。
【００３９】
本明細書で使用されるとき、「カルボシクリル」は、環系主鎖に炭素原子のみを含有する非芳香族環式環または環系を意味する。カルボシクリルが環系であるとき、２つ以上の環が縮合、架橋またはスピロ結合様式でともに結合されてもよい。カルボシクリルは、環系中の少なくとも１つの環が芳香族ではないという条件で、任意の程度の飽和を有していてもよい。従って、カルボシクリルはシクロアルキル、シクロアルケニル、およびシクロアルキニルを含む。カルボシクリル基は、３〜２０個の炭素原子（すなわち、Ｃ３〜２０）を有していてもよい。カルボシクリル環の例には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、２，３−ジヒドロ−インデン、ビシクロ［２．２．２］オクタニル、アダマンチル、およびスピロ［４．４］ノナニルが含まれる。
【００４０】
本明細書で使用されるとき、用語「カルボン酸」または「カルボキシル」は、本明細書で使用されるとき、−Ｃ（Ｏ）ＯＨを指す。
【００４１】
本明細書で使用されるとき、「シクロアルキル」は、完全飽和カルボシクリル環または環系を意味する。例には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、およびシクロヘキシルが含まれる。
【００４２】
本明細書で使用されるとき、「シクロアルキレン」は、２つの結合点を介して分子の残りの部分に結合している完全飽和カルボシクリル環または環系を意味する。
【００４３】
本明細書で使用されるとき、「シクロアルケニル」または「シクロアルカン」は、少なくとも１つの二重結合を有するカルボシクリル環または環系を意味し、環系中の環は芳香族ではない。例には、シクロヘキセニルまたはシクロヘキセンおよびノルボルネンまたはノルボルネニルが含まれる。また本明細書で使用されるとき、「ヘテロシクロアルケニル」または「ヘテロシクロアルケン」は、少なくとも１つの二重結合を有する環骨格中に少なくとも１つのヘテロ原子を有するカルボシクリル環または環系を意味し、ここで、環系中の環は芳香族ではない。
【００４４】
本明細書で使用されるとき、「シクロアルキニル」または「シクロアルキン」は、少なくとも１つの三重結合を有するカルボシクリル環または環系を意味し、環系中の環は芳香族ではない。例はシクロオクチンである。他の例はビシクロノニンである。また本明細書で使用されるとき、「ヘテロシクロアルキニル」または「ヘテロシクロアルキン」は、少なくとも１つの三重結合を有する、環骨格中に少なくとも１つのヘテロ原子を有するカルボシクリル環または環系を意味し、ここで、環系中の環は芳香族ではない。
【００４５】
本明細書で使用される「沈着させる」という用語は、手動または自動であり得る任意の適切な塗布技術を指す。一般に、沈着は、蒸着技術、コーティング技術、グラフト技術などを使用して実行され得る。いくつかの具体例には、化学気相成長（ＣＶＤ）、スプレーコーティング、スピンコーティング、ダンクまたはディップコーティング、パドルディスペンスなどが含まれる。
【００４６】
アイテムの集まりに関して使用される場合、「それぞれ」という用語は、コレクション内の個々のアイテムを識別することを意図しているが、必ずしもコレクション内のすべてのアイテムを指すとは限らない。明示的な開示または文脈が明らかにそうではないことを示す場合、例外が発生する可能性がある。
【００４７】
「蛍光増強剤」は、蛍光特性を改善することができるか、または光誘発損傷を減少させることができる任意の分子である。例えば、蛍光増強剤は、蛍光色素（または合成による配列決定（ＳＢＳ）プロセスに組み込まれた完全に機能的なヌクレオチド（ＦＦＮ））の光安定性を向上させる抗酸化剤であり得る。別の例では、蛍光増強剤は蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）供与体であり得、これは、吸収スペクトルのある領域でエネルギーを吸収し、別の領域で（例えば、ヌクレオチドに結合している可能性がある）色素を励起するためにエネルギーを供与する。ＦＲＥＴ供与体は、合成による配列決定（ＳＢＳ）ワークフローにおいて組み込まれそして検出される色素を有するＦＲＥＴに対する供与体色素であり得る。さらに別の例では、蛍光増強剤は、高度に反応性の三重項状態フルオロフォアによって引き起こされ得る（例えば、核酸に対する）光誘導損傷を軽減することができる三重項状態消光剤であり得る。三重項状態消光剤は、三重項状態の励起化合物の寿命を短くすることができ、それによって三重項状態化合物がゲル材料に付着した他の成分に光誘起損傷を引き起こすことができる時間量を減らすことができる。
【００４８】
本明細書で使用されるとき、用語「ゲル材料」は、液体および気体に対して透過性である半硬質材料を意味することを意図している。典型的には、ゲル材料は、液体が吸収されたときに膨潤し得、そして液体が乾燥によって除去されたときに収縮し得るヒドロゲルである。
【００４９】
本明細書中で使用される場合、「ヘテロアリール」とは、１個以上のヘテロ原子を含む芳香族環または環系（すなわち、２個の隣接する原子を共有する２個以上の縮合環）を指し、すなわち、環主鎖中の、窒素、酸素および硫黄を含むがこれらに限定されない、炭素以外の元素である。ヘテロアリールが環系であるとき、その系中のすべての環は芳香族である。ヘテロアリール基は、５〜１８個の環員を有し得る。
【００５０】
本明細書で使用されるとき、「ヘテロシクリル」は、環骨格中に少なくとも１個のヘテロ原子を含有する非芳香族環式環または環系を意味する。ヘテロシクリルは、融合、架橋またはスピロ結合様式でともに結合することができる。ヘテロシクリルは、環系中の少なくとも１つの環が芳香族ではないという条件で、任意の程度の飽和を有していてもよい。環系において、ヘテロ原子は非芳香族環または芳香族環のいずれかに存在し得る。ヘテロシクリル基は、３〜２０個の環員（すなわち、炭素原子およびヘテロ原子を含む環主鎖を構成する原子の数）を有していてもよい。ヘテロシクリル基は、「３〜６員ヘテロシクリル」または同様の指定として指定され得る。いくつかの例では、ヘテロ原子はＯ、Ｎ、またはＳである。
【００５１】
本明細書で使用される「ヒドラジン」または「ヒドラジニル」という用語は、−ＮＨＮＨ２基を指す。
【００５２】
本明細書で使用されるとき、本明細書で使用される「ヒドラゾン」または「ヒドラゾニル」という用語は、ＲａおよびＲｂが本明細書で先に定義されている
【化１】
2020503022.tif 000003
基を指す。
【００５３】
本明細書で使用されるとき、「ヒドロキシル」は−ＯＨ基である。
【００５４】
本明細書で使用されるとき、「間質領域」という用語は、基板／支持体中または表面上の、基板または表面の他の領域を分離する領域を指す。例えば、間質領域は、アレイの１つの特徴をアレイの別の特徴から分離することができる。互いに分離されている２つの特徴は離散的、すなわち互いに接触していないことがある。別の例では、間質領域は、特徴の第１の部分を特徴の第２の部分から分離することができる。多くの例では、間隙領域は連続的であるが、別の連続的な表面に画定された複数のウェルの場合のように、特徴は離散的である。間質領域によって提供される分離は、部分的または完全な分離であり得る。間質領域は、表面に画定された特徴の表面材料とは異なる表面材料を有することができる。例えば、アレイの特徴は、間質領域に存在する量または濃度を超える量または濃度のゲル材料、配列決定プライマー、および非配列決定実体を有することができる。いくつかの例では、ゲル材料、配列決定プライマー、および非配列決定要素は、間質領域に存在しなくてもよい。
【００５５】
本明細書で使用される「ニトリルオキシド」は、「ＲａＣ≡Ｎ＋Ｏ−」基を意味し、ここでＲａは本明細書で先に定義されている。ニトリルオキシドを調製する例としては、クロラミド−Ｔでの処理による、またはイミドイルクロリドに対する塩基の作用による、アルドキシムからのｉｎ ｓｉｔｕ生成が挙げられる［ＲＣ（Ｃｌ）＝ＮＯＨ］。
【００５６】
本明細書で使用される「ニトロン」は、「ＲａＲｂＣ＝ＮＲｃ＋Ｏ−」基を意味し、ここでＲａおよびＲｂは本明細書で先に定義され、Ｒｃは、本明細書に定義のＣ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ３−７カルボシクリル、Ｃ６−１０アリール、５−１０員ヘテロアリール、および５−１０員ヘテロシクリルから選択される。
【００５７】
本明細書で使用されるとき、「ヌクレオチド」は、窒素含有複素環式塩基、糖、および１つ以上のリン酸基を含む。ヌクレオチドは核酸配列の単量体単位である。ＲＮＡでは、糖はリボースであり、ＤＮＡではデオキシリボース、すなわちリボースの２’位に存在するヒドロキシル基を欠く糖である。窒素含有複素環式塩基はプリン塩基またはピリミジン塩基であり得る。プリン塩基としては、アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにそれらの修飾誘導体または類似体が挙げられる。ピリミジン塩基は、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、およびウラシル（Ｕ）、ならびにそれらの修飾誘導体または類似体を含む。デオキシリボースのＣ−１原子は、ピリミジンのＮ−１またはプリンのＮ−９に結合している。
【００５８】
本明細書で言及される「非配列決定エンティティ」は、ＤＮＡまたはＲＮＡ合成に積極的に参加しない任意の傍観分子（spectator molecule）であり得る。非配列決定エンティティは、グラフト化配列決定プライマー間の間隔を提供するために使用され得る。非配列決定エンティティはまた、非特異的結合を制限するため、ゲル材料の親水性を高めるため、蛍光特性を増強するため、またはそれらの組み合わせなどの他の機能を有してもよい。そのように、非配列決定エンティティは、単官能性、二官能性、または多官能性であり得る。非配列決定エンティティの例には、非機能的プライマー、ポリマー鎖、ペプチド、および／または蛍光増強剤が含まれる。
【００５９】
「非機能的プライマー」は、ＤＮＡまたはＲＮＡ合成に関与しないであろう任意の一本鎖核酸配列である。非機能性プライマーの例には、ポリＴ配列またはポリＡ配列が含まれる。非機能的プライマーの長さは、非特異的ハイブリダイゼーションが起こらないように選択することができる。一例として、非機能的プライマー長は３〜１０の範囲であり得る。場合によっては、非機能的プライマー長は１０塩基未満である。
【００６０】
「ポリマー鎖」は、数個の反復モノマー単位（すなわちオリゴマー）または多数の反復モノマー単位（すなわちポリマー）からなる分子である。ポリマー鎖は、直鎖状、分岐状、または超分岐状であり得る。分岐ポリマーの例には、スターポリマー、コームポリマー、ブラシポリマー、デンドロン化ポリマー、ラダー、およびデンドリマーが含まれる。本明細書に開示されている例では、ポリマー鎖は、ゲル材料と反応することができる末端官能基を一端に含む。場合によっては、ポリマー鎖の他方の末端は、三重項状態消光剤、酸化防止剤、または色素を結合する末端官能基を含み得る。これらの例では、ポリマー鎖は、三重項状態消光剤、酸化防止剤、または色素をゲル材料に結合（付着）させるリンカーとして機能し得る。
【００６１】
「ペプチド」は、ペプチド（アミド）結合によって連結されたアミノ酸モノマーの短鎖である。
【００６２】
本明細書中で使用される場合、「配列決定プライマー」は、ＤＮＡまたはＲＮＡ合成のための出発点として働く一本鎖核酸配列（例えば、一本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＲＮＡ）として定義される。配列決定用プライマーの５’末端は、ゲル材料とのカップリング反応を可能にするように修飾されてもよい。配列決定プライマー長は、任意の長さの塩基であり得、そして種々の非天然ヌクレオチドを含み得る。一例では、配列決定プライマーは、２０塩基から４０塩基を含む短鎖である。
【００６３】
本明細書中で使用される場合、「部位」とは、ゲル材料、配列決定プライマー、および非配列決定エンティティが付着し得る支持体上または支持体内に規定される位置をいう。
【００６４】
「基材」および「支持体」という用語は本明細書では互換的に使用され、その部位がその中または上に位置する表面を指す。支持体は一般に硬質でありそして水性液体に不溶性である。支持体は、ゲル材料を修飾するために使用される化学物質に対して不活性であり得る。例えば、固体支持体は、本明細書に記載の方法において、配列決定用プライマーおよび非配列決定エンティティをゲル材料に付着させるために使用される化学的性質に対して不活性であり得る。適切な支持体の例には、ガラスおよび修飾または官能化ガラス、プラスチック（アクリル、ポリスチレンおよびスチレンと他の材料とのコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）（ＣｈｅｍｏｕｒｓからのＴＥＦＬＯＮ（登録商標）など）、環状オレフィン／シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）（ゼオンからのＺＥＯＮＯＲ（登録商標）など）を含む）、ナイロン、セラミック、シリカまたはシリカベースの材料、シリコンおよび変性シリコン、カーボン、金属、無機ガラス、および光ファイババンドルが含まれる。
【００６５】
本明細書中で使用される場合、用語「テトラジン」および「テトラジニル」とは、４個の窒素原子を含む６員のヘテロアリール基をいう。テトラジンは任意に置換され得る。
【００６６】
本明細書で使用される「テトラゾール」は、４個の窒素原子を含む５員複素環式基を指す。テトラゾールは任意に置換され得る。
【００６７】
「末端官能基」という用語は、非配列決定エンティティに懸垂しており、したがってゲル材料との反応に利用しやすい官能基を指す。
【００６８】
「チオール」官能基は、−ＳＨを指す。
【００６９】
本明細書で使用されるとき、用語「ウェル」は、支持体表面の隙間領域によって完全に囲まれている表面開口部を有する支持体中の個別の凹状特徴を指す。ウェルは、例えば、円形、楕円形、正方形、多角形、星形（任意の数の頂点を有する）などを含む、表面の開口部に様々な形状のいずれかを有することができる。表面と直角にとられたウェルの断面は、曲線、正方形、多角形、双曲線、円錐、角などであり得る。
【００７０】
本明細書に記載され特許請求の範囲に記載された態様および実施例は、上記の定義に鑑みて理解することができる。
【００７１】
図１を参照すると、アレイ１０の一例が示されている。一般に、アレイ１０は、基板または支持体１２と、支持体１２を横切るラインまたは流路１４とを含む。流路１４の各々は、間隙領域１８によって互いに隔てられている複数の部位１６を含む。各部位１６において、配列決定プライマー２０および非配列決定エンティティ（単数または複数）２２が沈着され、ゲル材料に付着される（例えば、図２Ｄの２４、２４’）。
【００７２】
図１に示されかつ本開示において論じられるアレイ１０は、フローセルの一部として配置され得るか、またはその一部として形成され得、これは、様々なキャリア流体、試薬などがその全体にわたって流れることができる固体表面を含むチャンバである。一例では、フローセルは、シーリング材料（例えば、黒色ポリイミドまたは他の適切な接合材料）を介して上部基板に接合されたアレイ１０を含み得る。接合は、支持体１２、封止材料、および上部基板の接合領域で行われる。（交差汚染を防ぐために）シール材料が１つの流路１４を隣接する流路１４から物理的に分離するように、結合領域は流路間に配置されてもよく、（フローセルを外部の汚染からシールするために）フローセルの周囲に配置されてもよい。しかしながら、実装領域に応じて、接着領域および封止材料を任意の所望の領域に配置することができることを理解されたい。接合は、レーザ接合、拡散接合、陽極接合、共晶接合、プラズマ活性化接合、ガラスフリット接合、または当技術分野で知られている他の方法を介して達成することができる。
【００７３】
アレイ１０と一体化することができ、および／または本開示の方法で容易に使用することができるフローセルおよび関連する流体システムおよび検出プラットフォームの他の例は、例えば、これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Bentley et al., Nature 456:53-59 (2008)、WO 04/018497、US 7,057,026、WO 91/06678、WO 07/123744、US 7,329,492、US 7,211,414、US 7,315,019、US 7,405,281、およびUS 2008/0108082に記載されている。
【００７４】
いくつかの用途において、フローセルは、ヌクレオチドシーケンサーのような反応自動化装置において制御された化学的または生化学的反応を行うために使用される。ポート２６は支持体１２を通して穿孔されてもよい。ポート２６に接続することによって、反応自動化装置は、密封流路１４内の試薬および生成物の流れを制御することができる。反応自動化装置は、いくつかの用途では、フローセルの圧力、温度、ガス組成および他の環境条件を調整することができる。さらに、いくつかの用途では、ポート２６は上部基板または支持体１２と上部基板の両方に穿孔されてもよい。いくつかの用途では、封止された流路１４内で起こる反応は、熱、発光および／または蛍光の画像化または測定によって上部基板および／または支持体１２を通してモニターされてもよい。
【００７５】
流路１４、部位１６などの特定の向きは、図１に示すものとは異なり得ることを理解されたい。いくつかの例では、部位１６は連続しており、したがって間質領域１８によって分離される必要はない。
【００７６】
図１のアレイ１０、およびアレイ１０をどのように製造することができるかの例を、図２Ａから図２Ｄを参照してより詳細に説明する。
【００７７】
図２Ａは、その中に画定され、間隙領域１８によって分離された部位１６を有する支持体１２を示す。この支持体１２はパターン化表面を有する。「パターン化表面」とは、固体支持体１２の露出層内または上の異なる領域（すなわち部位１６）の配置を指す。例えば、１つ以上の部位１６は、１つ以上の配列決定（増幅）プライマー２０および非配列決定実体２２が存在する特徴であり得る。特徴は、配列決定プライマー２０および非配列決定実体２２が存在しない間質領域１８によって分離することができる。規則的なパターン、繰り返しのパターン、および規則的でないパターンを含む、サイト１６の多くの異なるレイアウトが考えられ得る。一例では、サイト１６は、最密充填および改善された密度のために六角形格子に配置される。他のレイアウトは、例えば、直線（すなわち、長方形）レイアウト、三角形レイアウトなどを含み得る。例として、レイアウトまたはパターンは、行および列にあるサイト１６のｘ−ｙフォーマットであり得る。いくつかの他の例では、レイアウトまたはパターンは、部位１６および／または間質領域１８の繰り返し配列であり得る。さらに他の例では、レイアウトまたはパターンは、部位１６および／または間質領域１８のランダムな配置であり得る。パターンは、スポット、パッド、ウェル、ポスト、ストライプ、スワール、ライン、トライアングル、レクタングル、サークル、アーク、チェック、格子、対角線、矢印、正方形、および／またはクロスハッチを含み得る。本明細書に記載の実施例で使用することができるパターン化表面のさらに他の例は、これらのそれぞれが、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，７７８，８４９号、米国特許第９，０７９，１４８号、米国特許第８，７７８，８４８号、および米国特許公開第２０１４／０２４３２２４号に記載されている。
【００７８】
レイアウトまたはパターンは、定義された領域内のサイト１６の密度（すなわち、サイト１６の数）に関して特徴付けることができる。例えば、部位１６は、１ｍｍ２当たり約２００万個の密度で存在し得る。密度は、例えば、少なくとも約１００／ｍｍ２、約１，０００／ｍｍ２、約１０万／ｍｍ２、約１００万／ｍｍ２、約２００万／ｍｍ２、約５００万／ｍｍ２、約１０００万／ｍｍ２、約５０００万／ｍｍ２以上の密度を含む異なる密度に調整することができる。代替的に又は付加的に、密度は、１ｍｍ２あたり約５千万以下、１ｍｍ２あたり約１０００万個以下、１ｍｍ２あたり約５００万個以下、１ｍｍ２あたり約２００万個以下、１ｍｍ２あたり約１００万個以下、１ｍｍ２あたり約１０万個以下、１ｍｍ２あたり約１０００個以下、１ｍｍ２あたり約１００個以下であるように調整されてもよい。支持体１２上の部位１６の密度は、上記の範囲から選択される下限値のうちの１つと上限値のうちの１つとの間であり得ることがさらに理解されるべきである。例として、高密度アレイは、約１５μｍ未満の間隔で離れたサイト１６を有することを特徴とし得、中密度アレイは、約１５μｍから約３０μｍの間隔で離れた部位１６を有することを特徴とし得、低密度アレイは、約３０μｍ以上離れている部位１６を有することを特徴とし得る。
【００７９】
レイアウトまたはパターンは、平均ピッチ、すなわち部位１６の中心から隣接する間質領域１８の中心までの間隔（中心間間隔）に関しても特徴付けられる。パターンは、平均ピッチの周りの変動係数が小さくなるように規則的とすることができ、またはパターンは非規則的とすることができ、その場合変動係数は比較的大きくなり得る。いずれの場合も、平均ピッチは、例えば、少なくとも約１０ｎｍ、約０．１μｍ、約０．５μｍ、約１μｍ、約５μｍ、約１０μｍ、約１００μｍ、またはそれ以上であり得る。代替的または追加的に、平均ピッチは、例えば、最大で約１００μｍ、約１０μｍ、約５μｍ、約１μｍ、約０．５μｍ、約０．１μｍ以下であり得る。特定のパターンの部位１６の平均ピッチは、上記の範囲から選択された下限値の１つと上限値の１つとの間であり得る。一例では、部位１６は約１．５μｍのピッチ（中心間距離）を有する。
【００８０】
いくつかの例では、部位１６はウェル１６’であり、したがって支持体１２はその表面にウェル１６’のアレイを含む。ウェル１６’（または形状、断面などの異なる構成を有する他の部位１６）は、例えば、フォトリソグラフィ、ナノインプリントリソグラフィ、スタンピング技術、エンボス加工技術、成形技術、マイクロエッチング技術、印刷技術などを含む様々な技術を使用して製造することができる。当業者には理解されるように、使用される技術は組成および支持体１２の形状に依存するであろう。
【００８１】
ウェル１６’は、マイクロウェル（ミクロンスケールで少なくとも１つの寸法、例えば、約１μｍ〜約１０００μｍを有する）またはナノウェル（ナノスケールで少なくとも１つの寸法、例えば約１ｎｍ〜約１０００ｎｍを有する）であり得る。各ウェル１６’は、その容積、ウェル開口面積、深さ、および／または直径によって特徴付けることができる。
【００８２】
各ウェル１６’は、液体を閉じ込めることができる任意の容積を有することができる。最小容量または最大容量は、例えば、アレイ１０の下流での使用に予想されるスループット（例えば、多重度）、分解能、検体組成、または検体反応性に適応するように選択することができる。例えば、体積は、少なくとも約１×１０−３μｍ３、約１×１０−２μｍ３、約０．１μｍ３、約１μｍ３、約１０μｍ３、約１００μｍ３、またはそれ以上であり得る。あるいはまたはさらに、体積は、最大で約１×１０４μｍ３、約１×１０３μｍ３、約１００μｍ３、約１０μｍ３、約１μｍ３、約０．１μｍ３以下であり得る。ゲル材料２４はウェル１６’の容積の全部または一部を満たすことができることを理解されたい。個々のウェル１６’内のゲル材料２４の体積は、上で特定された値よりも大きい、小さい、またはその間であり得る。
【００８３】
表面上の各ウェル開口部によって占有される面積は、ウェル容積について上述したものと同様の基準に基づいて選択することができる。例えば、表面上の各ウェル開口部の面積は、少なくとも約１×１０−３μｍ２、約１×１０−２μｍ２、約０．１μｍ２、約１μｍ２、約１０μｍ２、約１００μｍ２、またはそれ以上であり得る。代替的に又は追加的に、面積は最大で約１×１０３μｍ２、約１００μｍ２、約１０μｍ２、約１μｍ２、約０．１μｍ２、約１×１０−２μｍ２以下であり得る。
【００８４】
各ウェル１６’の深さは、少なくとも約０．１μｍ、約１μｍ、約１０μｍ、約１００μｍ、またはそれ以上であり得る。代替的または追加的に、深さは最大で約１×１０３μｍ、約１００μｍ、約１０μｍ、約１μｍ、約０．１μｍ以下であり得る。
【００８５】
場合によっては、各ウェル１６’の直径は、少なくとも約５０ｎｍ、約０．１μｍ、約０．５μｍ、約１μｍ、約１０μｍ、約１００μｍ、またはそれ以上であり得る。代替的または追加的に、直径は最大で約１×１０３μｍ、約１００μｍ、約１０μｍ、約１μｍ、約０．５μｍ、約０．１μｍ、約５０ｎｍ以下であり得る。
【００８６】
形成されたアレイ１０において、ゲル材料２４は個々のウェル１６’の各々に配置されている。各ウェル１６’内にゲル材料２４を配置することは、図２Ｂに示すように、支持体１２のパターン化表面をゲル材料２４で最初にコーティングすることによって達成することができ、次いで、例えば化学的または機械的研磨によって、ウェル１６’間の構造化支持体１２の表面上の少なくとも間隙領域１８からゲル材料２４を除去する。いくつかの例では、ゲル材料は、化学的または機械的研磨を必要としない洗浄工程によって間質領域から除去されてもよい。これらのプロセスは、ウェル１６’内にゲル材料２４の少なくとも一部を保持するが、ウェル１６’間の構造化支持体１２の表面上の隙間領域１８からゲル材料２４の少なくとも実質的に全部を除去または不活性化する。そのように、これらのプロセスは、多数のサイクルを伴う配列決定の実行にわたって安定であり得る配列決定に使用されるゲルパッド２４’（図２Ｄ）を作り出す。他の例では、ゲル材料２４は、間質領域からゲル材料を除去するために同様に化学的または機械的研磨工程を必要としない選択的堆積技術によって各ウェル１６’内に配置される。
【００８７】
特に有用なゲル材料２４は、それが存在する部位１６の形状に適合するであろう。いくつかの有用なゲル材料２４は、（ａ）それが存在する部位１６の形状（例えば、ウェル１６’または他の凹状の特徴）に適合することができ、（ｂ）存在する場所１６の体積を少なくとも実質的に超えない体積を有することができる。
【００８８】
適切なゲル材料２４の一例は、式（Ｉ）：
【化２】
2020503022.tif 000004
の繰り返し単位を有するポリマーを含み、
ここで、
Ｒ１は、Ｈまたは任意に置換されたアルキルであり、
ＲＡは、アジド、任意に置換されたアミノ、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたヒドラゾン、任意に置換されたヒドラジン、カルボキシル、ヒドロキシ、任意に置換されたテトラゾール、任意に置換されたテトラジン、ニトリルオキシド、ニトロン、およびチオールからなる群から選択され、
Ｒ５は、Ｈおよび任意に置換されたアルキルからなる群から選択され、
−（ＣＨ２）ｐ−のそれぞれは、任意に置換されていてもよく、
ｐは、１〜５０の範囲の整数であり、
ｎは、１〜５０，０００の範囲の整数であり、
ｍは、１〜１００，０００の範囲の整数である。
式（Ｉ）としての適切なポリマーは、例えば、米国特許出願公開第２０１４／００７９９２３Ａ１号または同第２０１５／０００５４４７Ａ１号に記載されており、これらはそれぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。式（Ｉ）の構造において、当業者は、「ｎ」および「ｍ」サブユニットがポリマー全体にランダムな順序で存在する繰り返しサブユニットであることを理解するであろう。
【００８９】
式（Ｉ）のようなポリマーコーティングの具体例は、例えば、米国特許出願公開第２０１４／００７９９２３Ａ１号または同第２０１５／０００５４４７Ａ１号に記載されるポリ（Ｎ−（５−アジドアセトアミジルペンチル）アクリルアミド−コ−アクリルアミド（ＰＡＺＡＭ）であり、以下に示す構造：
【化３】
2020503022.tif 000005
が含まれ、
ここで、ｎは１〜２０，０００の範囲の整数であり、そしてｍは１〜１００，０００の範囲の整数である。式（Ｉ）と同様に、当業者は、「ｎ」および「ｍ」サブユニットがポリマー構造全体にわたってランダムな順序で存在する繰り返し単位であることを認識するであろう。
【００９０】
式（Ｉ）のポリマーまたはＰＡＺＡＭポリマーの分子量は、約１０ｋＤａから約１５００ｋＤの範囲であり得るか、または具体例では、約３１２ｋＤａであり得る。
【００９１】
いくつかの例では、式（Ｉ）のポリマーまたはＰＡＺＡＭポリマーは線状ポリマーである。いくつかの他の実施形態では、式（Ｉ）またはＰＡＺＡＭポリマーはわずかに架橋されたポリマーである。他の例では、式（Ｉ）またはＰＡＺＡＭポリマーは分岐を含む。他の適切なポリマーは、ブロモ−アセトアミド基で誘導体化されたＳＦＡおよびＳＦＡのコポリマー（例えば、ＢＲＡＰＡ）、またはアジド−アセトアミド基で誘導体化されたＳＦＡおよびＳＦＡのコポリマーである。
【００９２】
適切なゲル材料２４の他の例には、アガロースなどのコロイド構造、またはゼラチンのようなポリマーメッシュ構造、またはポリアクリルアミドポリマーおよびコポリマー、シランフリーアクリルアミドなどの架橋ポリマー構造（ＳＦＡ、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２０１１／００５９８６５号を参照されたい）、またはＳＦＡのアジド分解版を有するものが含まれる。適切なポリアクリルアミドポリマーの例は、例えば、国際公開第２０００／０３１１４８号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、アクリルアミドおよびアクリル酸、またはビニル基を含有するアクリル酸から、または、例えば、国際公開第２００１／００１１４３号または国際公開第２００３／００１４３９２号に記載されるような（それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、例えば［２＋２］光付加環化反応を形成するモノマーから形成され得る。
【００９３】
ゲル材料２４は予備成形ゲル材料とすることができる。予め形成されたゲル材料は、スピンコーティング、ディッピング、または陽圧もしくは陰圧下でのゲルの流れ、または参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第９，０１２，０２２号に記載の技術を用いてコーティングされ得る。ディッピングまたは浸漬被覆は、使用される支持体１２およびゲル材料２４に応じて、選択的沈着技術であり得る。一例として、パターン化支持体１２を予備成形ゲル材料２４に浸漬し、ゲル材料２４は部位１６を選択的に充填し（すなわち、ゲル材料２４は間隙領域１８上に沈着しない）、研磨（または他の除去プロセス）は必要ではないかもしれない。
【００９４】
予め形成されたポリマーまたはＰＡＺＡＭは、スピンコーティング、ディッピング、または陽圧もしくは陰圧下でのゲルの流動、または米国特許第９，０１２，０２２号に記載の技術を使用してパターン化支持体１２上にコーティングすることができる。ポリマーまたはＰＡＺＡＭの付着はまた、表面開始原子移動ラジカル重合（ＳＩ−ＡＴＲＰ）を介してシラン化表面に起こり得る。本実施例では、支持体１２の表面をＡＰＴＳ（メトキシまたはエトキシシラン）で前処理して、表面上の１つまたは複数の酸素原子にケイ素を共有結合させることができる（機構に束縛されることを意図せずに、各ケイ素は１、２または３個の酸素原子に結合し得る）。この化学的に処理された表面を焼き付けてアミン基単層を形成する。次いでアミン基をスルホ−ＨＳＡＢと反応させてアジド誘導体を形成する。１Ｊ／ｃｍ２〜３０Ｊ／ｃｍ２のエネルギーで２１℃でのＵＶ活性化は活性ニトレン種を生成し、これはＰＡＺＡＭとの様々な挿入反応を容易に受けることができる。
【００９５】
支持体１２上にＰＡＺＡＭをコーティングするための他の例は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第２０１４／０２００１５８号に記載されており、アミン官能化表面へのＰＡＺＡＭモノマーの紫外線（ＵＶ）媒介結合、または活性基（塩化アクリロイルまたは他のアルケンまたはアルキン含有分子）を伴う熱結合反応とそれに続くＰＡＺＡＭの沈着および熱の適用を含む。いくつかの実施例では、表面３０はアルケニルまたはシクロアルケニル基で修飾され、それは、クリック化学のような条件下で、ＰＡＺＡＭのようなアジド官能化ポリマーまたはアジド誘導体化ＳＦＡを含むものと反応して、修飾表面とポリマーとの間に共有結合を形成することができる。
【００９６】
さらに他の例では、ＰＡＺＡＭは、その表面に、ＰＡＺＡＭの官能基に結合することができるシランまたはシラン誘導体を含む支持体１２上に沈着させることができる。例えば、シランまたはシラン誘導体は、ＰＡＺＡＭの官能基に共有結合することができる不飽和部分（例えば、シクロアルケン、シクロアルキン、ヘテロシクロアルケン、ヘテロシクロアルキン、それらの置換変種、およびそれらの組み合わせ）を含み得る。シクロアルケン不飽和部分の例には、ノルボルネン、ノルボルネン誘導体（例えば、炭素原子の１つの代わりに酸素または窒素を含む（ヘテロ）ノルボルネン）、トランスシクロオクテン、トランスシクロオクテン誘導体、トランスシクロペンテン、トランスシクロヘプテン、トランスシクロノネン、ビシクロ［３．３．１］ノン−１−エン、ビシクロ［４．３．１］デカ−１（９）−エン、ビシクロ［４．２．１］ノン−１（８）−エン、およびビシクロ［４．２．１］ノン−１−エンが含まれる。これらのシクロアルケンのいずれも、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第２０１５／０００５４４７号に記載されているように置換することができる。ノルボルネン誘導体の例には、［（５−ビシクロ［２．２．１］ヘプト−２−エニル）エチル］トリメトキシシランが含まれる。シクロアルキン不飽和部分の例には、シクロオクチン、シクロオクチン誘導体、またはビシクロノニンが含まれる（例えば、ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−インまたはその誘導体、ビシクロ［６．１．０］ノナ−２−イン、またはビシクロ［６．１．０］ノナ−３−イン）。これらのシクロアルキンは、米国特許公開第２０１５／０００５４４７号に記載されているように置換することもできる。
【００９７】
これらの例では、ＰＡＺＡＭは、スピンコーティング、ディッピングもしくはディップコーティング、または陽圧もしくは陰圧下での官能化分子の流れ、または米国特許第９，０１２，０２２号に記載の技術を用いてシラン化支持体１２の表面に沈着させることができる。沈着のために、ＰＡＺＡＭは溶液（例えば、エタノールと水の混合物）中に存在してもよい。沈着後、ＰＡＺＡＭ溶液を硬化プロセスにさらしてゲル材料２４を形成することもできる。
【００９８】
ゲル材料２４は、後でゲル材料２４を形成する液体であり得る。続いてゲル材料２４を形成する液体を塗布する例は、シランフリーのアクリルアミドおよびＮ−［５−（２−ブロモアセチル）アミノペンチル］アクリルアミド（ＢＲＡＰＡ）により液体形態でアレイの部位１６をコーティングすることであり、試薬が表面で重合することによってゲルを形成することを可能にする。別の例は、液体形態のＰＡＺＡＭモノマーでアレイの部位１６をコーティングすること、および表面上で重合することによって試薬がゲルを形成することを可能にすることを含む。このようにアレイをコーティングすることは、米国特許公開第２０１１／００５９８６５号に記載されているような化学試薬および手順を使用することができる。
【００９９】
ゲル材料２４は、（部位１６において）支持体１２に共有結合していてもよく、または支持体１２に共有結合していなくてもよい。部位１６へのゲル材料１２の共有結合は、様々な使用中にアレイ１０の寿命を通して構造化部位１６内にゲルを維持するのに役立つ。以下は、共有結合をもたらす、支持体１２のいくつかの例においてＰＡＺＡＭとシランまたはシラン誘導体との間で起こり得る反応のいくつかの例である。
【０１００】
支持体１２上のシランまたはシラン誘導体が不飽和部分としてノルボルネンまたはノルボルネン誘導体を含む場合、ノルボルネンまたはノルボルネン誘導体は、ｉ）ＰＡＺＡＭのアジ化物（azide）／アジド（azido）と１，３−双極子環状付加反応を受け、ｉｉ）ＰＡＺＡＭに結合したテトラジン基とのカップリング反応を受け、ＰＡＺＡＭに結合したヒドラゾン基と付加環化反応を受け、ＰＡＺＡＭに結合したテトラゾール基と光クリック反応を起こし、あるいは、ＰＡＺＡＭに結合したニトリルオキシド基との環化付加を受けることができる。
【０１０１】
支持体１２上のシランまたはシラン誘導体が不飽和部分としてシクロオクチンまたはシクロオクチン誘導体を含む場合、シクロオクチンまたはシクロオクチン誘導体は、ｉ）ＰＡＺＡＭのアジ化物／アジドとの歪促進アジド−アルキン１，３−付加環化（ＳＰＡＡＣ）反応を受け、またはｉｉ）ＰＡＺＡＭに結合したニトリルオキシド基との歪促進アルキン−ニトリルオキシド付加環化反応を受けることができる。
【０１０２】
支持体１２上のシランまたはシラン誘導体が不飽和部分としてビシクロノニンを含む場合、ビシクロノニンは、二環式環系における歪みのために、ＰＡＺＡＭに結合したアジ化物またはニトリルオキシドと同様のＳＰＡＡＣアルキン付加環化を受けることができる。
【０１０３】
支持体１２とゲル材料２４との間の共有結合のいくつかの例が、上記および多くの例で示されているように提供されているが、ゲル材料２４は、部位１６に共有結合する必要はない。例えば、シランフリーアクリルアミド、ＳＦＡは、支持体１２のいずれの部分にも共有結合していない。
【０１０４】
上述のように、図２Ｃは、間質領域１８からゲル材料２４を除去することを示している。除去は、研磨によって達成することができる。研磨は、機械的および／または化学的処理工程であり得る。
【０１０５】
機械的研磨は、（その上にゲル材料２４を有する）固体支持体１２の表面に研磨力を加えることによって実施することができる。例示的な方法としては、ビーズのスラリーによる研磨、シートまたは布による拭き取り、掻き取りなどが挙げられる。研磨に使用されるビーズは球状であってもなくてもよく、不規則形状、多角形形状、卵形形状、細長形状、円筒形状などを有することができることが理解されよう。ビーズの表面は滑らかでも粗いものでもよい。様々な粒子のいずれも研磨用ビーズとして有用であり得る。研磨の一例は、間隙領域１８からゲル材料２４を除去するために３μｍのシリカビーズスラリー（水中１０％ｗ／ｖ）で被覆された糸くずのない（クリーンルームグレード）拭き取り用品を使用することを含む。研磨ホイール／グラインダーもまた、これまたは他のスラリーと共に使用することができる。
【０１０６】
機械的研磨のさらに別の例は、間隙領域１８からゲルを除去するために流体ジェットまたはガス（例えば、空気またはアルゴンまたは窒素などの不活性ガス）ジェットを使用して達成することもできる。
【０１０７】
（例えば、過酸化ベンゾイルまたは希過酸化水素への曝露による）アクリルアミドの加水分解またはラジカルベースの分解などの化学研磨技術も使用することができる。この形態の研磨中、化学薬品は固体、液体、気体またはプラズマ状態で供給することができる。したがって、プラズマ研磨はいくつかの例において有用であり得る。
【０１０８】
研磨は、粒子のコロイド懸濁液を含有する化学スラリーを使用して、間隙領域１８からゲル材料２４の変位した部分を機械的に剥離し、次いで化学的に溶解する化学的および機械的研磨方法の組み合わせも含み得る。一例では、化学機械研磨システム、例えばStrasbaugh ViPRRIIを含むウェハ研磨機、または他の適切な研磨ヘッドは、これらの領域１８の下にある支持体１２に有害な影響を与えることなく、間質領域１８からゲル材料２４を除去するために使用することができる。この種の研磨システムは、前述のシリカビーズスラリー、またはより穏やかな化学スラリーと共に使用することができる。一例では、穏やかな化学スラリーは、炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３）およびポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）からなる群から選択される研磨粒子を含む塩基性の水性スラリーである。ＣａＣＯ３の平均粒径は、約１５ｎｍから約５μｍの範囲であり、一例では約７００ｎｍである。ＣａＣＯ３に加えて、塩基性の水性スラリーは、緩衝剤、キレート剤、界面活性剤、および／または分散剤も含み得る。緩衝剤の例はトリス塩基（すなわち、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）を含み、これは約９のｐＨを有する溶液中に存在し得る。キレート剤の例は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）であり、これは約８のｐＨを有する溶液中に存在し得る。界面活性剤の例は、ドデシル硫酸ナトリウムである。異なる分子量を有するポリアクリレート分散剤を使用することができる。分散剤の例は、ポリ（アクリル酸ナトリウム塩）である。
【０１０９】
間質領域１８を研磨または洗浄するための他の方法は、接着剤に基づく技術、例えば、ゲル材料２４に対して親和性を有する硬質の平面接着フィルムが適用され、それにより間質領域１８においてゲル材料２４と（例えば化学結合を介して）密接に接触する技術を含む。この接着フィルムの機械的除去／剥離は、部位１６内にゲル材料２４を残しながら、間質領域１８からゲル材料２４を機械的に除去することになる。
【０１１０】
一例では、チオリン酸グラフトＳＦＡは、以下のように支持体１２表面上の間質領域１８から除去することができる：水で湿らせたＷｈａｔｍａｎの拭き取り布（ワイプ）は、酸化アルミニウム（〜１００ｍｇ、０．３μｍ）またはスチールビーズに浸すことができ、次いで、形成されたスラリーを、均一な圧力を用いて、小さな同心円状に、（チオホスフェートグラフトＳＦＡをその上に有する）支持体の表面上で擦ることができ、その後、きれいな水で濡れたＷｈａｔｍａｎの拭き取り布を使用して、表面からスラリーとチオリン酸グラフトＳＦＡを除去する。
【０１１１】
間隙領域１８からゲル材料２４を除去するために本明細書に例示される機械的および化学的研磨方法はまた、ゲル材料２４が除去されるかどうかにかかわらず、間質領域１８でゲル材料を不活性化するために使用され得る。例えば、ゲル材料２４は、配列決定プライマー２０と非配列決定エンティティ２２とを結合する能力に関して不活性化され得る。
【０１１２】
ゲル材料２４が各ウェル１６’内に配置された後、配列決定プライマー２０および非配列決定エンティティ２２がゲル材料２４にグラフトされる。いくつかの例では、プライマー２０は、非配列決定エンティティ２２（単数または複数）がゲル材料２４にグラフトされる前または後にグラフトされてもよい。他の例では、プライマー２０および非配列決定エンティティ２２（単数または複数）はゲル材料２４に共グラフトされている。
【０１１３】
逐次的グラフト化は、支持体１２（部位１６にゲル材料２４を有する）を、配列決定用プライマー２０を含む溶液または混合物にさらしてインキュベートし、次いで、非配列決定エンティティ２２を含む溶液または混合物にさらしてインキュベートすることによって達成することができる。あるいは、順次グラフト化は、支持体１２（部位１６にゲル材料２４を有する）を、非配列決定エンティティ２２を含む溶液または混合物にさらしてインキュベートし、次いで、配列決定プライマー２０を含有する溶液または混合物にさらしてインキュベートすることによって達成され得る。
【０１１４】
共グラフト化は、（部位１６にゲル材料２４を有する）支持体１２を、配列決定プライマー２０および非配列決定エンティティ２２を含有する溶液または混合物にさらし、次いでインキュベートすることによって達成することができる。この溶液または混合物への支持体１２の曝露は、配列決定プライマー２０および非配列決定エンティティ２２の混合物を支持体１２上に沈着させることによって達成することができる。一例では、溶液または混合物は、ゲル材料２４でコーティングされた支持体１２（図２Ｃに示される）を横切って引き込まれてもよい。
【０１１５】
グラフト例のいずれにおいても、インキュベーションは、使用する配列決定プライマー２０および非配列決定エンティティ２２に部分的に依存する所定の温度で行われる。例として、インキュベーションは室温（すなわち、約２５℃）から約６０℃の範囲の温度で達成することができる。
【０１１６】
グラフト化の例のいずれにおいても、溶液は、配列決定プライマー２０および／または非配列決定エンティティ２２、水、緩衝剤、および触媒を含み得る。同じ溶液／混合物中に存在するか別々の溶液／混合物中に存在するかにかかわらず、非配列決定実体２２の配列決定プライマー２０に対するモル比は、約０．２５：１から約５：１の範囲である。
【０１１７】
適切な配列決定プライマー２０の例には、順方向増幅プライマーまたは逆方向増幅プライマーが含まれる。適切な配列決定プライマー２０の例には、Ｐ５またはＰ７プライマーが含まれる。Ｐ５およびＰ７プライマーは、ＨｉＳｅｑ（登録商標）、ＨｉＳｅｑＸ（登録商標）、ＭｉＳｅｑ（登録商標）、ＮｅｘＳｅｑ（登録商標）およびＧｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ（登録商標）機器プラットフォーム上での配列決定のために、イルミナ社によって販売されている市販のフローセルの表面上で使用される。Ｐ５およびＰ７プライマー配列は以下を含む。
Ｐ５：５’−ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡ（ｄＵ）ＣＴＡＣＡＣ（配列番号１）
Ｐ７：５’−ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧ＊ＡＴ（配列番号２）
式中、Ｇ＊は８−オキソグアニンである。
【０１１８】
任意に、Ｐ５およびＰ７プライマーの一方または両方はポリＴテールを含むことができる。ポリＴテールは一般に配列の５’末端に位置するが、場合によっては３’末端に位置し得る。ポリＴ配列は、例えば２〜２０個の任意の数のＴヌクレオチドを含み得る。
【０１１９】
Ｐ５およびＰ７プライマー、ならびに他の配列決定プライマー２０は、５’末端でゲル材料２４の官能基と反応することができる基で修飾することができる。適切な官能基の一例は、ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン（ＢＣＮ）であり、これはゲル材料２４のアジドと反応することができる。他の例示的な末端プライマーとしては、テトラジン末端プライマー、ノルボルネン末端プライマー、アルキン末端プライマー、アミノ末端プライマー、エポキシまたはグリシジル末端プライマー、チオリン酸末端プライマー、およびトリアゾリンジオン末端プライマーが挙げられる。いくつかの実施形態では、末端停止プライマーはアルキン末端プライマーを含む。他の実施形態では、終結プライマーはチオリン酸終結プライマーを含む。当業者は、本明細書に提示されるような核酸の捕捉および増幅に適した配列決定プライマー２０を設計し使用する方法を理解するであろう。
【０１２０】
適切な非配列決定エンティティ２２の例には、非機能的プライマー、ポリマー鎖、ペプチド、および／または蛍光増強剤が含まれる。
【０１２１】
上記のように、非機能的プライマーは、そのグラフトされたままの形態では、ＤＮＡまたはＲＮＡ合成に関与しないであろう任意の一本鎖核酸配列である。例としては、ポリＴ配列またはポリＡ配列が挙げられる。
【０１２２】
ポリマー鎖の例には、デンドリマー（例えば、ポリ（アミドアミンまたはＰＡＭＡＭ）、ポリデキストラン、メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＰＣＡ）、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ、すなわちポリ（エチレンオキシド）またはＰＥＯ）、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、プロパルギルメタクリレート（ＰＭＡ）、ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＭ）、ポリ（エチレングリコール）アクリレート（ＰＯＥＧＡ）、ポリ（プロピレンイミン）（デンドリマーコアであるＰＰＩ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、およびポリ（トロロクスエステル）が含まれる。
【０１２３】
これらのポリマーストランド材料のそれぞれは、ゲル材料２４に付着している配列決定プライマー２０の間にさらなる空間を作り出すためのスペーサーとして機能し得る。これらのポリマーストランド材料のうちのいくつかはまた、ゲル材料２４に親水性を加え、ゲル材料２４上の非特異的結合を制限することができる特性を有する。このポリマーストランド材料の例はＰＥＧを含む。本明細書中に開示される実施例において、ＰＥＧは、約０．５ＫＤａから約１０ＫＤａの範囲の分子量を有する。他のポリマーストランド材料もまた多官能性であり、例えば、ポリ（トロロクスエステル）はスペーサーであり得、そして酸化防止剤であり得る。
【０１２４】
ポリマー鎖は、ゲル材料２４の基と反応することができる官能基を含むか、またはゲル材料２４の基と反応することができる官能基を含むように修飾される。そのような官能基の例には、アルキン、ノルボルニル、銅フリークリック部分（例えば、ジベンゾシクロオクチン（ＤＩＢＯ）など）、およびチオールが含まれる。アルキン、ノルボルニル、および銅フリークリック部分は、クリック反応を介してＰＡＺＡＭのアジドと反応し得る。チオールはＳＦＡと反応する可能性があります。列挙された官能基のうちの１つを含むポリマーストランド材料の例は、アルキンを含むＰＭＡである。修飾ポリマー鎖の例には、アルキン末端ＰＥＧ、アルキン末端ＰＭＭＡ、ノルボルニル末端ＰＭＭＡ、チオール末端ＰＮＩＰＡＭ、アルキン末端ＰＶＡ、チオール末端ＰＶＡ、アルキン末端ＰＡＡ、およびチオール末端ＰＡＡが含まれる。
【０１２５】
いくつかの例では、記載されているポリマーストランドは、非配列決定エンティティ２２としてゲル材料２４にグラフトされてもよい。
【０１２６】
他の例では、記載のポリマー鎖は、三重項状態消光剤、酸化防止剤、またはＦＲＥＴ供与体などの蛍光増強剤をゲル材料２４に付着させるリンカー分子であり得る。例えば、ポリマー鎖は、ゲル材料２４に結合するために一端でアルキンを、そして三重項状態消光剤、酸化防止剤、またはＦＲＥＴ供与体に結合するために他端上の官能基（チオール、アミン、アルデヒド、カルボン酸など）で終結されてもよい。
【０１２７】
適切な三重項状態消光剤の例は、シクロオクチルテトラエン（ＣＯＴ）、トロロクス（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸（Hoffmann-La Roche AG））およびニトロベンジルアルコール（ＮＢＡ）からなる群から選択される。適切な抗酸化剤の例は、アスコルベート、グルタチオン、没食子酸、カテキン、トロロクス、およびビタミンＥからなる群から選択される。付着したＦＲＥＴ供与体は、完全機能性ヌクレオチド（ＦＦＮ）との最適なスペクトル重複およびＦＲＥＴ効率を有するように調整または選択される（合成による配列決定（ＳＢＳ）に組み込まれる、配列決定において検出される色素）。ＦＲＥＴ供与体の例は、緑色発光色素を有するＦＲＥＴに対する供与体色素（配列決定ワークフローにおいてヌクレオチドに組み込まれる）および赤色発光色素を有するＦＲＥＴに対する供与体色素（配列決定ワークフローにおいてヌクレオチドに組み込まれる）からなる群から選択される。緑色発光完全機能性ヌクレオチド（ＦＦＮ）を有するＦＲＥＴへの供与体色素の具体例は、Ｃｙ２（登録商標）（シアニン色素、Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素（例えば４８８）（ThermoFisher Scientific）、およびＡｔｔｏ色素（例えば４６５、４８８、および４９０）（Atto−Tec）を含み、赤色発光ＦＦＮを有するＦＲＥＴへの供与体色素の具体例には、Ｃｙ３（登録商標）（シアニン染料、Jackson ImmunoResearch Laboratories、Inc.）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素（例えば、５４６、５５５、５６８、および５９４）（ThermoFisher Scientific）、Ａｔｔｏ色素（例えば、５３２）（Atto-Tec）を含む。ＦＲＥＴ供与体は、５４２ｎｍ、５５０ｎｍ、５６５ｎｍ（吸収波長）および／またはローダミン６Ｇを含む合成構成による１つまたは２つの色素配列決定における使用に適している可能性がある。
【０１２８】
これらの他の例では、ポリマー鎖および付着した蛍光増強剤はともに非配列決定エンティティ２２を構成する。これらの他の例では、ポリマー鎖の他方の端部（例えば、ゲル材料２４に結合している端部と反対側の端部）は、蛍光増強剤の基を組み込むかまたはそれと反応することができる官能基を含み、または蛍光エンハンサーの基を組み込むかまたはそれと反応することができる官能基を含むように修飾される。そのような官能基の例には、チオール、アミン、アルデヒド、およびカルボン酸が含まれる。蛍光エンハンサーをポリマー鎖に付着させることができる他の官能基も同様に使用することができる。
【０１２９】
例として、ビタミンＥをＰＡＡにコンジュゲートさせることができ、グルタチオン、アスコルビン酸、没食子酸またはカテキンをＰＥＧまたはＰＭＭＡにコンジュゲートさせることができる。
【０１３０】
他の例として、ＦＲＥＴ供与体はアルキン基を有するかまたはそれで修飾されたポリマー鎖のいずれにも結合させることができる。
【０１３１】
非配列決定エンティティのさらに別の例はペプチドである。
【０１３２】
グラフトされたままの配列決定プライマー２０および非配列決定エンティティ２２（単数または複数）を図２Ｄおよび３に示す。グラフト配列決定プライマー２０に対するグラフト非配列決定エンティティ２２のモル比は、約０．２５：１から約５：１の範囲である。別の例では、グラフト配列決定プライマー２０に対するグラフト非配列決定エンティティ２２のモル比は、約０．５：１から約２：１の範囲である。グラフトされたままの非配列決定エンティティ（単数または複数）２２は、その後に行われる配列決定技術に参加せず、むしろ部位１６内の配列決定プライマー２０をそして部位１６に離して配置し、部位１６にさらなる機能性を提供し得る。
【０１３３】
本明細書に開示されるアレイ１０は、しばしばシーケンシングバイライゲーション（ＳＢＳ）、連結による配列決定、パイロシーケンシングなどと呼ばれる技術を含む、様々な配列決定アプローチまたは技術において使用され得る。これらの技術のいずれにおいても、ゲル材料２４および付着した配列決定プライマー２０は部位１６に存在し、間質領域１８には存在しないので、増幅は様々な部位１６に限定されるであろう。
【０１３４】
簡単に説明すると、合成による配列決定（ＳＢＳ）反応は、Illumina（イルミナ）（San Diego, CA）製のＨｉＳｅｑ（登録商標）、ＨｉＳｅｑＸ（登録商標）、ＭｉＳｅｑ（登録商標）またはＮｅｘＳｅｑ（登録商標）シーケンサーシステムのようなシステムで行われ得る。配列決定されるべき一組の標的ＤＮＡ分子は、結合された配列決定プライマー２０（そして非配列決定エンティティ２２にはそうではない）にハイブリダイズされそして次にブリッジ増幅または動的排除増幅によって増幅される。変性により、一本鎖鋳型がゲル材料２４に固定されたままになり、数百万の二本鎖ＤＮＡの密集クラスタが生成される（すなわちクラスタ生成）。配列決定反応が実行され、そしていくつかの例では、配列決定プライマー２０および非配列決定エンティティ２２（および増幅工程中に標的ＤＮＡのコピーを含むように伸長されたプライマーを含むアンプリコン）はその後ゲル材料２４から結合されず、その結果、表面は将来の配列決定反応において再使用可能である。したがって、配列決定プライマー２０および非配列決定エンティティ２２をゲル材料２４に付着させ、標的ＤＮＡ分子を配列決定プライマー２０にハイブリダイズさせ、増幅を架橋し、標的ＤＮＡを配列決定し、配列決定プライマー２０および非配列決定実体２２およびアンプリコンを除去するステップの１つ以上を繰り返すことができる。１回以上の繰り返しを実行できる。
【０１３５】
本開示をさらに説明するために、本明細書に例を示す。これらの実施例は説明目的のために提供され、そして本開示の範囲を限定すると解釈されるべきではないことが理解されるべきである。
実施例
【０１３６】
実施例１
Illumina, Inc.から入手可能なフローセルのウェル内に、配列決定プライマー（例えば、ポリＴテールを有するＰ５／Ｐ７）を非配列決定プライマー（すなわち、ＮＳＰと呼ばれる５’−ヘキシン−ＴＴＴ）とともにグラフトした。配列決定プライマーに対する非配列決定プライマーのモル比は試料間で変動した。２つの対照試料について、配列決定用プライマーを非配列決定用プライマーなしで使用した。
【０１３７】
各試料について混合物を調製した。混合物は、超純水、緩衝液、および過剰の触媒（例えば、ＣｕＳＯ４（２０ｍＭ〜２００ｍＭ）、アスコルベート（２０ｍＭ〜２００ｍＭ）、およびペンタメチルジエチレントリアミン（ＰＭＤＴＡ）（１０５ｍＭ〜１０５０ｍＭ）を含んでいた。配列決定プライマーの濃度は約１μＭであった。触媒の総量は各試料において同じであった。配列決定プライマーに対する非配列決定用プライマー（ＮＳＰ）のモル比（Ｐ５／Ｐ７）を表１に示す。
【０１３８】
【表１】
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【０１３９】
各混合物をそれぞれのフローセルレーンに塗布し、約６０℃でインキュベートした。フローセルを洗浄して未結合プライマーを除去した。
【０１４０】
緩衝液およびＴＥＴオリゴ（すなわち、Ｔ１０プライマーに対して相補的な配列を有する色素標識オリゴヌクレオチド）を含むテトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）混合物をフローセルレーンに適用して表面配列決定プライマーを染色した。ＴＥＴは表面上のＰ１０プライマーとハイブリダイズすることができ、過剰のＴＥＴは洗い流すことができ、付着した色素濃度（強度に関して）は、Typhoon Scanner（General Electric）のようなスキャニング機器を用いて蛍光検出により測定することができる。強度データから、空間分布およびプライマー密度を決定することができる。結果を図４に示す。結果は、非配列決定プライマーによる配列決定プライマーのグラフト化が、１０：１未満のモル比で、非配列決定プライマーを含まない配列決定プライマーのグラフト化に匹敵することを示している。
【０１４１】
実施例２
配列決定プライマー（例えば、ポリＴテールを有するＰ５／Ｐ７）を、Illumina, Inc.から入手可能なフローセルのウェル中に非配列決定プライマー（すなわち、５’−ヘキシン−ＴＴＴ）を用いてグラフトした。配列決定プライマーに対する非配列決定プライマーのモル比は試料間で変動した。１つの対照試料について、配列決定プライマーを非配列決定プライマーなしで使用した。
【０１４２】
各試料について混合物を調製した。混合物は、超純水、緩衝液、および過剰の触媒（例えば、ＣｕＳＯ４（２０ｍＭ〜２００ｍＭ）、アスコルベート（２０ｍＭ〜２００ｍＭ）、およびペンタメチルジエチレントリアミン（ＰＭＤＴＡ）（１０５ｍＭ〜１０５０ｍＭ）を含んでいた。Ｐ５／Ｐ７配列決定プライマーの濃度は約１μＭであった。触媒のトータル量は混合物のいくつかについては変化した。配列決定プライマーに対する非配列決定プライマーのモル比および触媒量の変動を表２に示す。
【０１４３】
【表２】
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【０１４４】
各混合物をそれぞれのフローセルレーンに塗布し、約６０℃でインキュベートした。フローセルを洗浄して未結合プライマーを除去した。
【０１４５】
フローセルをイメージング、クラスタ化、および配列決定のためにハイブリダイゼーションに曝した。リード２ Ｃ１Ａ強度を測定し、これらの結果を図５に示す。これらの結果は、過剰の触媒なしで配列決定用プライマーを非配列決定用プライマーでグラフト化することが配列決定強度を高めることができることを示している。
【０１４６】
実施例３
ポリＴテールを有するＰ５／Ｐ７配列決定プライマーを、非配列決定エンティティ（非配列決定ポリマー鎖またはＮＳＰＳと呼ばれる）として、Illumina Inc.から入手可能な２つのフローセルにポリマー鎖でグラフトした。ポリマー鎖はＰＥＧ−アルキンであり、ＰＥＧアルキンの分子量は試料間で変動した。配列決定プライマーに対する非配列決定ポリマー鎖のモル比も試料間で変動した。４つの対照試料について、配列決定プライマーを非配列決定ポリマー鎖なしで使用した。
【０１４７】
２つの混合物を調製した。配列決定プライマー混合物は、超純水、緩衝液、および過剰の触媒（例えば、ＣｕＳＯ４（２０ｍＭ〜２００ｍＭ）、アスコルベート（２０ｍＭ〜２００ｍＭ）、およびペンタメチルジエチレントリアミン（ＰＭＤＴＡ）（１０５ｍＭ〜１０５０ｍＭ）を含んだ。Ｐ５／Ｐ７配列決定プライマーの濃度は約１μＭであった。新たに調製したＰＥＧ−アルキン溶液を使用した（例えば、異なる分子量のＰＥＧ−アルキンを水に溶解した）。
【０１４８】
配列決定プライマー混合物を、表３に示すように、所望のモル比で、非配列決定ポリマー鎖溶液の１つを用いてまたは用いずに、それぞれのフローセルレーンに適用した。表３はまた、各レーンで使用されたＰＥＧ−アルキン分子量を示す。フローセルを約６０℃でインキュベートし、洗浄して未結合物質を除去した。
【０１４９】
【表３】
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【０１５０】
フローセルをイメージング、クラスタ化、および配列決定のためにハイブリダイゼーションに曝した。配列決定データを収集し、そしてフィルターを通過するクラスタの割合（％通過フィルター（ＰＦ））の結果を図６Ａ（フローセル１）および６Ｂ（フローセル２）に示し、パッドホッピング（ＰＨ）の結果を図７Ａ（フローセル１）および図７Ｂ（フローセル２）に示す。％通過フィルター（ＰＦ）は、純正しきい値を通過したクラスタを記述するために使用されるメトリックであり、シーケンスデータのさらなる処理と分析に使用される。％パッドホッピングは、固有のクラスタの近くにある重複クラスタの量を表すメトリックである。フィルター通過率が高いほど、そして、パッドホッピング率が低いほど、シーケンスデータに使用される固有のクラスタの歩留まりが向上する。これらの結果は、低分子量のＰＥＧ−アルキン（すなわち、ＫＤａ＞１０）を有する配列決定用プライマーのグラフト化は、ＰＥＧ−アルキンを全く含まない配列決定用プライマーのグラフト化に匹敵したことを示している。そのように、ポリマー鎖非配列決定エンティティの導入は配列決定結果に悪影響を及ぼさず、そしてフローセルウェル中のゲル材料に親水性を付加し、非特異的結合を制限することなどができる。
【０１５１】
その他の注意事項
（そのような概念が互いに矛盾しない限り）前述の概念のすべての組み合わせが、本明細書に開示されている発明の主題の一部であると考えられることを理解されたい。特に、本開示の終わりに現れる特許請求された主題の全ての組み合わせは、本明細書に開示された発明の主題の一部であると考えられる。また、参照により本明細書に組み込まれる任意の開示にも現れる可能性がある本明細書で明示的に使用される用語は、本明細書で開示される特定の概念と最も矛盾しない意味に一致するはずであることも理解されたい。
【０１５２】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許、および特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１５３】
本明細書を通して、「一実施例」、「他の実施例」、「実施例」などへの言及は、実施例に関連して説明された特定の要素（例えば、特徴、構造、および／または特性）は、本明細書に説明された少なくとも１つの実施例に含まれ、他の実施例には存在してもしなくてもよいことを意味する。さらに、文脈が明らかにそうでないことを指示しない限り、任意の例について記載された要素は、さまざまな例において任意の適切な方法で組み合わされてもよいことが理解されるべきである。
【０１５４】
本明細書に提供される範囲は、記載された範囲、および記載された範囲内の任意の値または部分的な範囲を含むことが理解されるべきである。例えば、約０．５ＫＤａから約１０ＫＤａ未満の範囲は、明示的に列挙された約０．５ＫＤａから約１０ＫＤａ未満の範囲だけでなく、約０．８ＫＤａ、約３．２５ＫＤａ、約５ＫＤａ、約７．５ＫＤａなどの個々の値、並びに、約４．２５ＫＤａ〜約９ＫＤａ、約５．４ＫＤａ〜約７．７５ＫＤａなどのサブレンジも含むと解釈されるべきである。さらに、「約」および／または「実質的に」が値を記載するために利用される場合、これは記載された値からのわずかな変動（最大＋／−１０％まで）を包含することを意味する。
【０１５５】
いくつかの例が詳細に説明されているが、開示された例が修正されてもよいことが理解されるべきである。したがって、前述の説明は非限定的であると見なされるべきである。
【図１】
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【図２Ａ−２Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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