(57)【要約】  本出願は、内因性膵島の機能および特徴に類似した細胞クラスター、およびこのような細胞クラスターを作製および使用するための方法を開示する。本開示は、グルコース負荷にさらされる場合、インビトロでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含むインビトロの細胞クラスターであって、細胞クラスターは、ソートされていない細胞クラスターであり、細胞クラスターは、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する少なくとも約３５％の細胞；クロモグラニンＡを発現する少なくとも約７０％の細胞；ＳＯＸ２を発現する最大で約２％の細胞；またはＳＯＸ９を発現する最大で約１０％の細胞を含む、細胞クラスターを提供する。インビトロの細胞クラスターは、対象に移植される場合、対象におけるグルコース負荷に対して、インビボでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す。【選択図】図２６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコース負荷にさらされる場合、インビトロでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含むインビトロの細胞クラスターであって、細胞クラスターは、ソートされていない細胞クラスターであり、細胞クラスターは、
（ａ）ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する少なくとも約３５％の細胞；
（ｂ）クロモグラニンＡを発現する少なくとも約７０％の細胞；
（ｃ）ＳＯＸ２を発現する最大で約２％の細胞；または
（ｄ）ＳＯＸ９を発現する最大で約１０％の細胞
を含む、細胞クラスター。
【請求項２】
蛍光タンパク質を含まない少なくとも１つのＮＫＸ６．１＋およびＣ−ペプチド＋細胞を含むインビトロの細胞クラスターであって、細胞クラスターは、グルコース負荷にさらされる場合、インビトロでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示し、細胞クラスターは、
（ａ）ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する少なくとも約３５％の細胞；
（ｂ）クロモグラニンＡを発現する少なくとも約７０％の細胞；
（ｃ）ＳＯＸ２を発現する最大で約２％の細胞；または
（ｄ）ＳＯＸ９を発現する最大で約１０％の細胞
を含む、細胞クラスター。
【請求項３】
少なくとも１つのＮＫＸ６．１＋およびＣ−ペプチド＋細胞が、グルコース負荷にさらされる場合、インビトロでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す非天然膵臓β細胞である、請求項１に記載の細胞クラスター。
【請求項４】
ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する少なくとも約３５％の細胞を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の細胞クラスター。
【請求項５】
ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドの両方を発現する少なくとも約４０％または少なくとも約６０％の細胞を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の細胞クラスター。
【請求項６】
クロモグラニンＡを発現する少なくとも約７０％の細胞を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の細胞クラスター。
【請求項７】
クロモグラニンＡを発現する少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または１００％の細胞を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の細胞クラスター。
【請求項８】
細胞クラスター中最大で約２％の、ＳＯＸ２を発現する細胞を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の細胞クラスター。
【請求項９】
ＳＯＸ２を発現する最大で約１．５％、最大で約１％、または最大で約０．５％の細胞を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の細胞クラスター。
【請求項１０】
ＳＯＸ９を発現する最大で約１０％の細胞を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の細胞クラスター。
【請求項１１】
ＳＯＸ９を発現する最大で約５％、最大で約３％、または最大で約２％の細胞を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の細胞クラスター。
【請求項１２】
Ｋｉ６７を発現する最大で約２％、最大で約１％、最大で約０．５％、または最大で約０．１％の細胞を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の細胞クラスター。
【請求項１３】
インビトロの細胞クラスターが、約１５０μｍの直径を有する、請求項１から１２のいずれか一項に記載の細胞クラスター。
【請求項１４】
インビトロの細胞クラスターが、約５０μｍから約２５０μｍの直径を有する、請求項１から１２のいずれか一項に記載の細胞クラスター。
【請求項１５】
インビトロの細胞クラスターが、約１００μｍから約２００μｍの直径を有する、請求項１から１４のいずれか一項に記載の細胞クラスター。
【請求項１６】
インビトロの細胞クラスターが、第１のグルコース濃度への応答として、第２のグルコース濃度への場合と比較してより高いインスリン分泌を示し、第１のグルコース濃度は、第２のグルコース濃度より高い、請求項１から１５のいずれか一項に記載の細胞クラスター。
【請求項１７】
インビトロの細胞クラスターが、グルカゴンを発現する少なくとも１つの細胞またはソマトスタチンを発現する少なくとも１つの細胞をさらに含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載の細胞クラスター。
【請求項１８】
インビトロの細胞クラスターが、第１の濃度のＫ＋に応答して、インスリン分泌を示す、請求項１から１７のいずれか一項に記載の細胞クラスター。
【請求項１９】
インビトロの細胞クラスターが、対象に移植される場合、移植後の２８日以内に、対象におけるグルコース負荷に対して、インビボでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す、請求項１から１８のいずれか一項に記載の細胞クラスター。
【請求項２０】
第２のインビトロの細胞クラスターが、対象に移植される場合、移植後の１４日以内に、対象におけるグルコース負荷に対して、インビボでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す、請求項１から１８のいずれか一項に記載の細胞クラスター。
【請求項２１】
（ａ）少なくとも１つの非天然膵臓β細胞が、１つまたは複数の結晶性インスリン顆粒を含むか；
（ｂ）少なくとも１つの非天然膵臓β細胞が、以下の遺伝子：ＩＮＳ、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６−１、およびＺＮＴ８を発現するか；または
（ｃ）少なくとも１つの非天然膵臓β細胞が、ソマトスタチンとグルカゴンの少なくとも一方を発現しない、請求項１または３から２０のいずれか一項に記載の細胞クラスター。
【請求項２２】
少なくとも１つの非天然膵臓β細胞が、第１のグルコース負荷、第２のグルコース負荷、および第３のグルコース負荷が逐次的にかかる場合、第１のグルコース負荷、第２のグルコース負荷、および第３のグルコース負荷に対して、インビトロでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す、請求項１または３から２１のいずれか一項に記載の細胞クラスター。
【請求項２３】
グルコース負荷に応答した、少なくとも１つの非天然膵臓β細胞によるインスリンの分泌が、グルコース負荷におけるグルコース濃度に比例する、請求項１または３から２２のいずれか一項に記載の細胞クラスター。
【請求項２４】
少なくとも１つの非天然膵臓β細胞が、遺伝子改変されている、請求項１または３から２３のいずれか一項に記載の細胞クラスター。
【請求項２５】
少なくとも１つの非天然膵臓β細胞が、少なくとも１つの非天然膵臓β細胞におけるインスリン発現の指標であるシグナルポリペプチドをコードする、外因性核酸配列を含まない、請求項１または３から２４のいずれか一項に記載の細胞クラスター。
【請求項２６】
非天然膵臓β細胞におけるシグナルポリペプチドの発現が、インスリンプロモーターによって駆動される、請求項２５に記載の細胞クラスター。
【請求項２７】
シグナルポリペプチドが、蛍光タンパク質を含む、請求項２５に記載の細胞クラスター。
【請求項２８】
培養培地中に請求項１から２７のいずれか一項に記載の少なくとも１つの細胞クラスターを含む組成物。
【請求項２９】
培養培地が、無血清である、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
再凝集培養培地が、トリヨードチロニンを含まない、請求項２８または２９に記載の組成物。
【請求項３１】
再凝集培養培地が、外因性甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤を含まない、請求項２８から３０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３２】
再凝集培養培地が、アクチビン受容体様キナーゼ−５（Ａｌｋ５）阻害剤を含まない、請求項２８から３１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３３】
培養培地が、Ｒｈｏ関連コイルドコイル含有プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）の外因性阻害剤を含まない、請求項２８から３２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３４】
培養培地が、外因性細胞外マトリックス分子を含まない、請求項２８から３３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３５】
細胞クラスターが、培養培地中で懸濁した状態にある、請求項２８から３４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３６】
培養培地が、少なくとも３０ｒｐｍの予め決定された速度で撹拌される、請求項２８から３５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３７】
培養培地が、少なくとも６０ｒｐｍの予め決定された速度で撹拌される、請求項２８から３６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３８】
培養培地が、ＭＣＤＢ１３１基礎培地を含む、請求項２８から３７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３９】
ＭＣＤＢ１３１基礎培地は、２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が補充されている、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
培養培地が、ＣＭＲＬｓ培地を含む、請求項２８から３９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４１】
少なくとも１つの細胞クラスターおよび培養培地を含有するバイオリアクターをさらに含む、請求項２８から４０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４２】
バイオリアクターが、スピナーフラスコを含む、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
（ａ）少なくとも１つのＮＫＸ６．１＋細胞を含む細胞の集団を、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）シグナル伝達経路阻害剤、甲状腺ホルモン（ＴＨ）シグナル伝達経路活性化剤、少なくとも１種のソニック−ヘッジホッグ（ＳＨＨ）経路阻害剤、レチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤、γ−セクレターゼ阻害剤、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤、上皮増殖因子（ＥＧＦ）ファミリー由来の少なくとも１種の増殖因子、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される因子を含む培養培地中で、少なくとも１つのＮＫＸ６．１＋およびＣ−ペプチド＋細胞を含む第１の細胞クラスターに分化させるステップ；
（ｂ）第１の細胞クラスターから、複数の細胞を解離させるステップ；ならびに
（ｃ）再凝集培養培地中で、（ｂ）からの複数の細胞を培養し、複数の細胞の少なくとも一部に、
（ｉ）少なくとも約３５％の細胞が、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現するか；
（ｉｉ）少なくとも約７０％の細胞が、クロモグラニンＡを発現するか；
（ｉｉｉ）最大で約２％の細胞が、ＳＯＸ２を発現するか；または
（ｉｖ）最大で約１０％の細胞が、ＳＯＸ９を発現する、第２のインビトロの細胞クラスターを形成させるステップ
を含む方法。
【請求項４４】
（ａ）少なくとも１つのＮＫＸ６．１＋およびＣ−ペプチド＋細胞を含む第１の細胞クラスターを得るステップ；
（ｂ）第１の細胞クラスターから、複数の細胞を解離させるステップ；ならびに
（ｃ）再凝集培養培地中で、（ｂ）からの複数の細胞を培養し、複数の細胞の少なくとも一部に、
（ｉ）少なくとも約３５％の細胞が、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現するか；
（ｉｉ）少なくとも約７０％の細胞が、クロモグラニンＡを発現するか；
（ｉｉｉ）最大で約２％の細胞が、ＳＯＸ２を発現するか；または
（ｉｖ）最大で約１０％の細胞が、ＳＯＸ９を発現する、第２のインビトロの細胞クラスターを形成させるステップ
を含む方法。
【請求項４５】
上皮増殖因子（ＥＧＦ）ファミリー由来の少なくとも１種の増殖因子が、ベータセルリンを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
（ａ）少なくとも１つのＮＫＸ６．１＋およびＣ−ペプチド＋細胞を含む第１の細胞クラスターを得るステップ；
（ｂ）第１の細胞クラスターから、複数の細胞を解離させるステップであって、解離させることは、複数の細胞をフローサイトメトリーに供することを含まない、ステップ；ならびに
（ｃ）無血清再凝集培養培地中で、（ｂ）からの複数の細胞を培養し、複数の細胞の少なくとも一部に、第２のインビトロの細胞クラスターを形成させるステップ
を含み、
（ｉ）第２のインビトロの細胞クラスターは、第１の細胞クラスターと比較して、クロモグラニンＡを発現するより高いパーセンテージの細胞を含むか；
（ｉｉ）第２のインビトロの細胞クラスターは、第１の細胞クラスターと比較して、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現するより高いパーセンテージの細胞を含むか；
（ｉｉｉ）第２のインビトロの細胞クラスターは、第１の細胞クラスターと比較して、ＳＯＸ２を発現するより低いパーセンテージの細胞を含むか；または
（ｉｖ）第２のインビトロの細胞クラスターは、第１の細胞クラスターと比較して、ＳＯＸ９を発現するより低いパーセンテージの細胞を含む、方法。
【請求項４７】
（ａ）少なくとも１つのＮＫＸ６．１＋およびＣ−ペプチド＋細胞を含む第１の細胞クラスターを得るステップ；
（ｂ）第１の細胞クラスターから、複数の細胞を解離させるステップであって、解離させることは、複数の細胞をフローサイトメトリーに供することを含まない、ステップ；ならびに
（ｃ）再凝集培養培地中で、（ｂ）からの複数の細胞を培養し、複数の細胞の少なくとも一部に、第２のインビトロの細胞クラスターを形成させるステップ
を含み、第２のインビトロの細胞クラスターは、グルコース負荷にさらされる場合、インビトロでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含み；
（ｉ）少なくとも約３５％の細胞が、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現するか；
（ｉｉ）少なくとも約７０％の細胞が、クロモグラニンＡを発現するか；
（ｉｉｉ）最大で約２％の細胞が、ＳＯＸ２を発現するか；または
（ｉｖ）最大で約１０％の細胞が、ＳＯＸ９を発現する、方法。
【請求項４８】
第２のインビトロの細胞クラスターが、グルコース負荷にさらされる場合、インビトロでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含む、請求項４３から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
解離させることが、第１の細胞クラスターの酵素による解離を含む、請求項４３から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
解離させることが、第１の細胞クラスターをトリプシンと接触させることを含む、請求項４３から４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
再凝集培養培地が、無血清である、請求項４３から４５または４７から５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
再凝集培養培地が、予め決定された速度で撹拌される、請求項４３から５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
予め決定された速度が、少なくとも３０ｒｐｍまたは少なくとも６０ｒｐｍである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
再凝集培養培地が、ＭＣＤＢ１３１基礎培地を含む、請求項４３から５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
ＭＣＤＢ１３１基礎培地は、２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が補充されている、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
再凝集培養培地が、ＣＭＲＬｓ培地を含む、請求項４３から５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
再凝集培養培地が、ＭＣＤＢ１３１基礎培地を含む、請求項４３から５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
（ａ）少なくとも１つの非天然膵臓β細胞が、１つまたは複数の結晶性インスリン顆粒を含むか；
（ｂ）少なくとも１つの非天然膵臓β細胞が、以下の遺伝子：ＩＮＳ、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６−１、およびＺＮＴ８を発現するか；または
（ｃ）少なくとも１つの非天然膵臓β細胞が、ソマトスタチンとグルカゴンの少なくとも一方を発現しない、請求項４７から５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
少なくとも１つの非天然膵臓β細胞が、第１のグルコース負荷、第２のグルコース負荷、および第３のグルコース負荷が逐次的にかかる場合、第１のグルコース負荷、第２のグルコース負荷、および第３のグルコース負荷に対して、インビトロでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す、請求項４７から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
少なくとも１つの非天然膵臓β細胞が、遺伝子改変されている、請求項４７から５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
グルコース負荷に応答した、少なくとも１つの非天然膵臓β細胞によるインスリンの分泌が、グルコース負荷におけるグルコース濃度に比例する、請求項４７から６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
再凝集培養培地が、トリヨードチロニンを含まない、請求項４３から６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
再凝集培養培地が、外因性甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤を含まない、請求項４３から６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
再凝集培養培地が、アクチビン受容体様キナーゼ−５（Ａｌｋ５）阻害剤を含まない、請求項４３から６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
再凝集培養培地が、外因性トランスフォーミング増殖因子βシグナル伝達経路阻害剤を含まない、請求項４３から６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
再凝集培養培地が、Ｒｈｏ関連コイルドコイル含有プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）の外因性阻害剤を含まない、請求項４３から６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
再凝集培養培地が、外因性細胞外マトリックス分子を含まない、請求項４３から６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
第１の細胞クラスターが、低温保存から回復される、請求項４３から６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
第１の細胞クラスターを低温保存から回復することをさらに含む、請求項４３から６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
培養する前に、所定期間にわたり、複数の細胞を低温保存することをさらに含む、請求項４３から６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
培養する前に、複数の細胞を低温保存から回復することをさらに含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
第２のインビトロの細胞クラスターが、最大で第１の細胞クラスターの５０％の直径を有する、請求項４３から７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
第２のインビトロの細胞クラスターが、最大で第１の細胞クラスターの３０％の直径を有する、請求項４３から７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
第２のインビトロの細胞クラスターが、約１５０μｍの直径を有する、請求項４３から７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
第２のインビトロの細胞クラスターが、約５０μｍから約２５０μｍの直径を有する、請求項４３から７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
第２のインビトロの細胞クラスターが、約１００μｍから約２００μｍの直径を有する、請求項４３から７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
クロモグラニンＡを発現する第２のインビトロの細胞クラスターにおける細胞のパーセンテージが、クロモグラニンＡを発現する第１の細胞クラスターにおける細胞のパーセンテージより、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、または少なくとも１．５倍大きい、請求項４３から７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
第２のインビトロの細胞クラスターが、クロモグラニンＡを発現する少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または１００％の細胞を含む、請求項４３から７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドの両方を発現する第２のインビトロの細胞クラスターにおける細胞のパーセンテージが、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドの両方を発現する第１の細胞クラスターにおける細胞のパーセンテージより、少なくとも１．５倍、少なくとも１．７５倍、または少なくとも２倍大きい、請求項４３から７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
第２のインビトロの細胞クラスターが、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドの両方を発現する少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、または少なくとも約６０％の細胞を含む、請求項４３から７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
第２のインビトロの細胞クラスターにおける、ＳＯＸ２を発現する細胞のパーセンテージが、第１の細胞クラスターにおける、ＳＯＸ２を発現する細胞のパーセンテージの最大で２分の１、最大で３分の１、最大で５分の１、または最大で１０分の１である、請求項４３から８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
第２のインビトロの細胞クラスターが、ＳＯＸ２を発現する最大で約２％、最大で約１．５％、最大で約１％、または最大で約０．５％の細胞を含む、請求項４３から８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
ＳＯＸ９を発現する第２のインビトロの細胞クラスターにおける細胞のパーセンテージが、ＳＯＸ９を発現する第１の細胞クラスターにおける細胞のパーセンテージの最大で２分の１、最大で３分の１、最大で５分の１、または最大で１０分の１である、請求項４３から８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
第２のインビトロの細胞クラスターが、ＳＯＸ９を発現する最大で約１０％、最大で約５％、最大で約３％、または最大で約２％の細胞を含む、請求項４３から８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
第２のインビトロの細胞クラスターが、第１の細胞クラスターと比較して、Ｋｉ６７を発現するより低いパーセンテージの細胞を有する、請求項４３から８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
第２のインビトロの細胞クラスターが、Ｋｉ６７を発現する最大で約２％、最大で約１％、最大で約０．５％、または最大で約０．１％の細胞を含む、請求項４３から８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
第２のインビトロの細胞クラスターが、第１の細胞クラスターと比較して、より高いインスリン含量を有する、請求項４３から８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
第２のインビトロの細胞クラスターが、第１の細胞クラスターと比較して、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２５倍または少なくとも１．５倍高いインスリン含量を有する、請求項４３から８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
第２のインビトロの細胞クラスターが、第１の細胞クラスターと比較して、より高い刺激指標を示し、刺激指標が、第２のグルコース濃度と比較した場合の、第１のグルコース濃度に応答して分泌されたインスリンの比率に等しく、第１のグルコース濃度は、第２のグルコース濃度より高い、請求項４３から８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
第２のインビトロの細胞クラスターが、第１の濃度のＫ＋に応答して、インスリン分泌を示す、請求項４３から８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
第２のインビトロの細胞クラスターが、１０ｍＭより大きい高いグルコース濃度に応答して、二相性インスリン分泌を示す、請求項４３から９０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
第２のインビトロの細胞クラスターが、グルカゴンを発現する少なくとも１つの細胞またはソマトスタチンを発現する少なくとも１つの細胞をさらに含む、請求項４３から９１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
第１の細胞クラスター中のＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドの両方を発現する細胞の少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％が、第２のインビトロの細胞クラスター中に保持される、請求項４３から９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
第２のインビトロの細胞クラスターが、第１の細胞クラスターと比較して、より高い酸素消費速度を有する、請求項４３から９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
第２のインビトロの細胞クラスターが、第１の細胞クラスターと比較して、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２５倍または少なくとも１．５倍高い酸素消費速度を有する、請求項４３から９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
第２のインビトロの細胞クラスターが、対象に移植される場合、移植後の２８日以内に、対象におけるグルコース負荷に対して、インビボでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す、請求項４３から９５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
第２のインビトロの細胞クラスターが、対象に移植される場合、移植後の１４日以内に、対象におけるグルコース負荷に対して、インビボでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す、請求項４３から９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
請求項４３から９７のいずれか一項に記載の方法によって生成されるインビトロの細胞クラスター。
【請求項９９】
請求項１から２７または９８のいずれか一項に記載のインビトロの細胞クラスターを含むデバイスであって、対象に植え込まれると、インスリンを産生および放出するように構成される、デバイス。
【請求項１００】
半透膜をさらに含み、半透膜は、デバイス中に細胞クラスターを保持し、細胞クラスターによって分泌されたインスリンの通過を許容するように構成される、請求項９９に記載のデバイス。
【請求項１０１】
細胞クラスターが、半透膜によって封入される、請求項１００に記載のデバイス。
【請求項１０２】
半透膜が、多糖またはポリカチオンで作製される、請求項１００または１０１に記載のデバイス。
【請求項１０３】
半透膜が、ポリ（ラクチド）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、他のポリヒドロキシ酸、ポリ（カプロラクトン）、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリ無水物、ポリホスファゼン、ポリアミノ酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリシアノアクリレート、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、生分解性ポリウレタン、アルブミン、コラーゲン、フィブリン、ポリアミノ酸、プロラミン、アルギネート、アガロース、ゼラチンを含むアガロース、デキストラン、ポリアクリレート、エチレン−酢酸ビニルポリマーおよび他のアシル置換酢酸セルロースならびにそれらの誘導体、ポリウレタン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニル、ポリ（ビニルイミダゾール）、クロロスルホン化ポリオレフィン、ポリエチレンオキシド、ならびにそれらの任意の組合せからなる群から選択される材料で作製される、請求項１００から１０２のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１０４】
半透膜が、アルギネートを含む、請求項１００から１０３のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１０５】
細胞クラスターが、半透膜によって取り囲まれたアルギネートコアを含むマイクロカプセル中に封入される、請求項１００から１０４のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１０６】
疾患の処置または予防を必要とする対象における疾患を処置または予防する方法であって、請求項１から２７または９８のいずれか一項に記載の細胞クラスターまたはその一部を対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項１０７】
疾患の処置または予防を必要とする対象における疾患を処置または予防する方法であって、請求項９９から１０５のいずれか一項に記載のデバイスを対象に植え込むステップを含む、方法。
【請求項１０８】
対象が、代謝性疾患を有するか、または発症する高いリスクを有する、請求項１０６または１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
対象が、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、および１．５型糖尿病からなる群から選択される糖尿病を有する、請求項１０６から１０８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１０】
少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含む細胞クラスターであって、細胞クラスター中の細胞の少なくとも約７０％が、フローサイトメトリーによる測定によれば、クロモグラニンＡを発現し、細胞クラスターは、グルコース負荷にさらされる場合、インビトロでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す、細胞クラスター。
【請求項１１１】
少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含む細胞クラスターであって、細胞クラスター中の細胞の少なくとも約２５％が、フローサイトメトリーによる測定によれば、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現し、細胞クラスターは、グルコース負荷にさらされる場合、インビトロでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す、細胞クラスター。
【請求項１１２】
少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含む細胞クラスターであって、細胞クラスター中の細胞の少なくとも約７０％が、フローサイトメトリーによる測定によれば、クロモグラニンＡを発現し、細胞クラスターは、対象に移植される場合、移植後の２８日以内に、対象におけるグルコース負荷に対して、インビボでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す、細胞クラスター。
【請求項１１３】
少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含む細胞クラスターであって、細胞クラスター中の細胞の少なくとも約２５％が、フローサイトメトリーによる測定によれば、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現し、細胞クラスターは、対象に移植される場合、移植後の約２８日以内に、対象におけるグルコース負荷に対して、インビボでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す、細胞クラスター。
【請求項１１４】
細胞クラスター中の細胞の少なくとも約９０％が、フローサイトメトリーによる測定によれば、クロモグラニンＡを発現する、請求項１１０または１１２に記載の細胞クラスター。
【請求項１１５】
細胞クラスター中の細胞の少なくとも約７０％が、フローサイトメトリーによる測定によれば、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する、請求項１１１または１１３に記載の細胞クラスター。
【請求項１１６】
細胞クラスター中の細胞の少なくとも約２５％が、フローサイトメトリーによる測定によれば、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する、請求項１１０または１１２に記載の細胞クラスター。
【請求項１１７】
細胞クラスターが、第１および第２のグルコース負荷が逐次的にかかる場合、第１のグルコース負荷および第２のグルコース負荷に対して、インビトロでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す、請求項１１１または１１３に記載の細胞クラスター。
【請求項１１８】
細胞クラスターが、対象に移植される場合、移植後の１４日以内に、対象におけるグルコース負荷に対して、インビボでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す、請求項１１２または１１３に記載の細胞クラスター。
【請求項１１９】
細胞クラスターが、約３００μｍ未満の直径を有する、請求項１１０から１１８のいずれか一項に記載の細胞クラスター。
【請求項１２０】
直径が、約１００μｍ未満である、請求項１１９に記載の細胞クラスター。
【請求項１２１】
細胞クラスター中の細胞の約１０％未満が、生存可能ではない、請求項１１０から１２０のいずれか一項に記載の細胞クラスター。
【請求項１２２】
細胞クラスターが、グルコース負荷にさらされる場合、グルコースによって刺激されたカルシウムフラックス応答を示す、請求項１１０から１２１のいずれか一項に記載の細胞クラスター。
【請求項１２３】
少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含む細胞クラスターであって、細胞クラスター中の細胞の少なくとも約７０％は、クロモグラニンＡを発現し、細胞クラスター中の細胞の少なくとも約２５％は、フローサイトメトリーによる測定によれば、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現し、細胞クラスターは、グルコース負荷にさらされる場合、インビトロでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示し、細胞クラスターは、対象に移植される場合、移植後の約２８日以内に、対象におけるグルコース負荷に対して、インビボでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す、細胞クラスター。
【請求項１２４】
請求項１１０から１１８のいずれか一項に記載の細胞クラスターおよび足場を含む組成物。
【請求項１２５】
足場が、生分解性の足場である、請求項１２４に記載の組成物。
【請求項１２６】
（ａ）少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含む第１の細胞クラスターを得るステップ；
（ｂ）第１の細胞クラスターから、複数の細胞を解離させるステップ；
（ｃ）（ｂ）からの複数の細胞を、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤およびトランスフォーミング増殖因子βシグナル伝達経路阻害剤を含む培地中で培養し、それによって、複数の細胞の少なくとも一部を使用して、インビトロで第２の細胞クラスターを形成するステップを含み、第２の細胞クラスターは、少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含み、（ｉ）第２の細胞クラスター中の細胞の少なくとも約７０％は、フローサイトメトリーによる測定によれば、クロモグラニンＡを発現し、および／または（ｉｉ）第２の細胞クラスター中の細胞の少なくとも約４０％は、フローサイトメトリーによる測定によれば、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する、方法。
【請求項１２７】
（ａ）少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含む第１の細胞クラスターを得るステップ；
（ｂ）第１の細胞クラスターから、複数の細胞を解離させるステップ；
（ｃ）（ａ）からの複数の細胞を、
（ｉ）血清；ならびに
（ｉｉ）甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤およびトランスフォーミング増殖因子βシグナル伝達経路阻害剤のうち１つ
を含む培地中で培養し、それによって、複数の細胞の少なくとも一部を使用して、インビトロで第２の細胞クラスターを形成するステップを含み、第２の細胞クラスターは、非天然膵臓β細胞を含み、（ｉ）第２の細胞クラスター中の細胞の少なくとも約７０％は、フローサイトメトリーによる測定によれば、クロモグラニンＡを発現し、および／または（ｉｉ）第２の細胞クラスター中の細胞の少なくとも約４０％は、フローサイトメトリーによる測定によれば、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する、方法。
【請求項１２８】
培地が、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤をさらに含む、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
培地が、トランスフォーミング増殖因子βシグナル伝達経路阻害剤をさらに含む、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３０】
甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤が、トリヨードチロニンである、請求項１２６または１２８に記載の方法。
【請求項１３１】
培地中のトリヨードチロニンの濃度が、約０．１μＭから約１０μＭである、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３２】
トランスフォーミング増殖因子βシグナル伝達経路阻害剤が、アクチビン受容体様キナーゼ−５阻害剤である、請求項１２６または１２９に記載の方法。
【請求項１３３】
培地中のアクチビン受容体様キナーゼ−５阻害剤の濃度が、約１μＭから約５０μＭである、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３４】
培地が、ヒト血清、ヒト血小板溶解産物、ウシ胎児血清、および血清代替物からなる群から選択される血清をさらに含む、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１３５】
培地が、約５％から約１５％の血清を含む、請求項１２７または１３４に記載の方法。
【請求項１３６】
培地が、約１０％の血清を含む、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１３７】
培地が、Ｃｏｎｎｏｕｇｈｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  １０６６補充膵島培地（ＣＭＲＬＳ）またはＭＣＤＢ１３１基礎培地をさらに含む、請求項１２６または１２７に記載の方法。
【請求項１３８】
培地が、細胞外マトリックス分子をさらに含む、請求項１２６または１２７に記載の方法。
【請求項１３９】
細胞外マトリックス分子が、ヘパリンである、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４０】
細胞外マトリックス分子が、ラミニンである、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４１】
第２の細胞クラスターが、フローサイトメトリーによる測定によれば、第１の細胞クラスターと比較して、クロモグラニンＡを発現するより高いパーセンテージの細胞を含む、請求項１２６または１２７に記載の方法。
【請求項１４２】
第２の細胞クラスターが、フローサイトメトリーによる測定によれば、第１の細胞クラスターと比較して、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現するより高いパーセンテージの細胞を含む、請求項１２６または１２７に記載の方法。
【請求項１４３】
第２の細胞クラスターが、第１の細胞クラスターと比較して、より少ない生存不能な細胞を含む、請求項１２６または１２７に記載の方法。
【請求項１４４】
複数の細胞の一部が、第２の細胞クラスターを形成することができず、第２の細胞クラスターを形成することができない複数の細胞の一部の約１０％未満は、フローサイトメトリーによる測定によれば、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する、請求項１２６または１２７に記載の方法。
【請求項１４５】
第２の細胞クラスターの直径が、第１の細胞クラスターの直径未満である、請求項１２６または１２７に記載の方法。
【請求項１４６】
インビトロでグルコース負荷にさらされる場合、第２の細胞クラスターが、第１の細胞クラスターと比較して、より高い刺激指標を示し、刺激指標が、第２のグルコース濃度と比較した場合の、第１のグルコース濃度に応答して分泌されたインスリンの比率に等しく、第１のグルコース濃度は、第２のグルコース濃度より高い、請求項１２６または１２７に記載の方法。
【請求項１４７】
インビボでグルコース負荷にさらされる場合、第２の細胞クラスターが、第１の細胞クラスターと比較して、より高い刺激指標を示し、刺激指標が、第２のグルコース濃度と比較した場合の、第１のグルコース濃度に応答して分泌されたインスリンの比率に等しく、第１のグルコース濃度は、第２のグルコース濃度より高い、請求項１２６または１２７に記載の方法。
【請求項１４８】
（ｂ）からの複数の細胞が、スピナーフラスコ中で培養される、請求項１２６または１２７に記載の方法。
【請求項１４９】
（ｂ）からの複数の細胞が、インビトロで１つまたは複数の幹細胞から生成される、請求項１２６または１２７に記載の方法。
【請求項１５０】
（ｂ）からの複数の細胞が、１つまたは複数の人工多能性幹細胞から生成される、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５１】
（ｂ）からの複数の細胞が、培地中で、少なくとも１日間培養される、請求項１２６または１２７に記載の方法。
【請求項１５２】
複数の細胞が、培地中で、少なくとも４日間培養される、請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５３】
疾患の処置または予防を必要とする対象における疾患を処置または予防するための方法であって、請求項１、２、３、４のいずれか一項に記載の細胞クラスターまたはその一部を含む組成物を対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項１５４】
対象が、ヒトである、請求項１５３に記載の方法。
【請求項１５５】
対象が、糖尿病を有するか、または糖尿病を発症する高いリスクを有する、請求項１５３または１５４に記載の方法。
【請求項１５６】
糖尿病が、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、１．５型糖尿病、または前糖尿病である、請求項１５５に記載の方法。
【請求項１５７】
投与するステップが、組成物を、腎被膜下に、肝臓中に、または膵臓中に投与することを含む、請求項１５３に記載の方法。
【請求項１５８】
第２の細胞クラスターを低温保存し、それによって低温保存した第２の細胞クラスターを産生することをさらに含む、請求項１５３または１５４に記載の方法。
【請求項１５９】
低温保存した第２の細胞クラスターを融解させ、それによって少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含む融解した第２の細胞クラスターを産生することをさらに含む、請求項１５８に記載の方法。
【請求項１６０】
（ｉ）融解した第２の細胞クラスター中の細胞の少なくとも約７０％が、フローサイトメトリーによる測定によれば、クロモグラニンＡを発現し、および／または（ｉｉ）融解した第２の細胞クラスター中の細胞の少なくとも約２５％が、フローサイトメトリーによる測定によれば、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する、請求項１５９に記載の方法。
【請求項１６１】
請求項１２６から１６０のいずれか一項に記載の方法で使用するためのシステムであって、磁気撹拌プレートと、第１の細胞クラスターからの複数の細胞を含むスピナーフラスコとを含み、磁気撹拌プレートおよびスピナーフラスコは、第１のクラスターからの複数の細胞を撹拌し、それによって複数の細胞の少なくとも一部を使用してインビトロで第２の細胞クラスターを形成するように構成される、システム。
【請求項１６２】
疾患の処置または予防を必要とする対象における疾患を処置または予防するための方法であって、
（ａ）少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含む第１の細胞クラスターを得るステップ；
（ｂ）第１の細胞クラスターから、複数の細胞を解離させるステップ；
（ｃ）（ａ）からの複数の細胞を、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤およびトランスフォーミング増殖因子βシグナル伝達経路阻害剤を含む培地中で培養し、それによって、複数の細胞の少なくとも一部を使用して、インビトロで第２の細胞クラスターを形成するステップであって、第２の細胞クラスターは、少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含み、（ｉ）第２の細胞クラスター中の細胞の少なくとも約７０％は、フローサイトメトリーによる測定によれば、クロモグラニンＡを発現し、および／または（ｉｉ）第２の細胞クラスター中の細胞の少なくとも約２５％は、フローサイトメトリーによる測定によれば、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する、ステップ；ならびに
（ｄ）第２の細胞クラスターまたはその一部を含む組成物を対象に投与するステップ
を含む、方法。
【請求項１６３】
疾患の処置または予防を必要とする対象における疾患を処置または予防するための方法であって、
（ａ）少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含む第１の細胞クラスターを得るステップ；
（ｂ）第１の細胞クラスターから、複数の細胞を解離させるステップ；
（ｃ）（ｂ）からの複数の細胞を、
（ｉ）血清；ならびに
（ｉｉ）甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤またはトランスフォーミング増殖因子βシグナル伝達経路阻害剤
を含む培地中で培養し、それによって、複数の細胞の少なくとも一部から、インビトロで第２の細胞クラスターを形成するステップであって、第２の細胞クラスターは、少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含み、（ｉ）第２の細胞クラスター中の細胞の少なくとも約７０％は、フローサイトメトリーによる測定によれば、クロモグラニンＡを発現し、および／または（ｉｉ）第２の細胞クラスター中の細胞の少なくとも約２５％は、フローサイトメトリーによる測定によれば、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する、ステップ；ならびに
（ｄ）第２の細胞クラスターまたはその一部を含む組成物を対象に投与するステップ
を含む、方法。
【請求項１６４】
請求項１から２７または９８または１１０から１２３のいずれか一項に記載の細胞クラスターまたはその一部および少なくとも１種の医薬的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１６５】
液体組成物である、請求項１６４に記載の医薬組成物。
【請求項１６６】
カプセルである、請求項１６５に記載の医薬組成物。
【請求項１６７】
カプセルが、ゲルカプセルである、請求項１６６に記載の医薬組成物。
【請求項１６８】
カプセルが、リポソームである、請求項１６６に記載の医薬組成物。
【請求項１６９】
少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含む細胞クラスターであって、細胞クラスターが、
（ａ）少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含む第１の細胞クラスターを得るステップ；
（ｂ）第１の細胞クラスターから、複数の細胞を解離させるステップ；
（ｃ）（ｂ）からの複数の細胞を、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤およびトランスフォーミング増殖因子βシグナル伝達経路阻害剤を含む培地中で培養し、それによって、複数の細胞の少なくとも一部から、インビトロで第２の細胞クラスターを形成するステップを含み、第２の細胞クラスターは、少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含み、（ｉ）第２の細胞クラスター中の細胞の少なくとも約７０％は、フローサイトメトリーによる測定によれば、クロモグラニンＡを発現し、および／または（ｉｉ）第２の細胞クラスター中の細胞の少なくとも約４０％は、フローサイトメトリーによる測定によれば、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する、プロセスによって調製される、細胞クラスター。
【請求項１７０】
（ｉ）少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含む細胞クラスターであって、細胞クラスター中の細胞の少なくとも約７０％が、フローサイトメトリーによる測定によれば、クロモグラニンＡを発現し、細胞クラスターは、グルコース負荷にさらされる場合、インビトロでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す、細胞クラスター、および（ｉｉ）緩衝液を含むキット。
【請求項１７１】
（ｉ）少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含む細胞クラスターであって、細胞クラスター中の細胞の少なくとも約２５％が、フローサイトメトリーによる測定によれば、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現し、細胞クラスターは、グルコース負荷にさらされる場合、インビトロでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す、細胞クラスター、および（ｉｉ）緩衝液を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
[0001]本出願は、２０１７年７月２１日に出願された米国仮出願第６２／５３５，６５９号の利益を主張し、この出願は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
[0002]糖尿病、例えばＩ型糖尿病を処置するために、膵臓または膵島の移植が使用されてきた。膵島移植は、大手術を必要とせず、膵島移植片の機能は、レシピエント中で何年も維持することができる。しかしながら、膵島ドナーの不足が、この療法の効果的な実行を妨げている。人工膵臓または膵島が、移植可能な膵島の代替供給源を提供する。したがって、機能および特徴が内生の膵島と類似した膵島をインビトロで回復させる方法への必要性がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
[0003]一態様において、本開示は、グルコース負荷にさらされる場合、インビトロでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含むインビトロの細胞クラスターであって、細胞クラスターは、ソートされていない細胞クラスターであり、細胞クラスターは、（ａ）ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する少なくとも約３５％の細胞；（ｂ）クロモグラニンＡを発現する少なくとも約７０％の細胞；（ｃ）ＳＯＸ２を発現する最大で約２％の細胞；または（ｄ）ＳＯＸ９を発現する最大で約１０％の細胞を含む、細胞クラスターを提供する。
【０００４】
[0004]別の態様において、本開示は、蛍光タンパク質を含まない少なくとも１つのＮＫＸ６．１＋およびＣ−ペプチド＋細胞を含むインビトロの細胞クラスターであって、細胞クラスターは、グルコース負荷にさらされる場合、インビトロでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示し、細胞クラスターは、（ａ）ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する少なくとも約３５％の細胞；（ｂ）クロモグラニンＡを発現する少なくとも約７０％の細胞；（ｃ）ＳＯＸ２を発現する最大で約２％の細胞；または（ｄ）ＳＯＸ９を発現する最大で約１０％の細胞を含む、細胞クラスターを提供する。
【０００５】
[0005]一部の場合において、少なくとも１つのＮＫＸ６．１＋およびＣ−ペプチド＋細胞は、グルコース負荷にさらされる場合、インビトロでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す非天然膵臓β細胞である。一部の場合において、細胞クラスターは、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する少なくとも約３５％の細胞を含む。一部の場合において、細胞クラスターは、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドの両方を発現する少なくとも約４０％または少なくとも約６０％の細胞を含む。一部の場合において、細胞クラスターは、クロモグラニンＡを発現する少なくとも約７０％の細胞を含む。一部の場合において、細胞クラスターは、クロモグラニンＡを発現する少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または１００％の細胞を含む。一部の場合において、細胞クラスターは、細胞クラスター中最大で約２％の、ＳＯＸ２を発現する細胞を含む。一部の場合において、細胞クラスターは、ＳＯＸ２を発現する最大で約１．５％、最大で約１％、または最大で約０．５％の細胞を含む。一部の場合において、細胞クラスターは、ＳＯＸ９を発現する最大で約１０％の細胞を含む。一部の場合において、細胞クラスターは、ＳＯＸ９を発現する最大で約５％、最大で約３％、または最大で約２％の細胞を含む。一部の場合において、細胞クラスターは、Ｋｉ６７を発現する最大で約２％、最大で約１％、最大で約０．５％、または最大で約０．１％の細胞を含む。
【０００６】
[0006]一部の場合において、インビトロの細胞クラスターは、約１５０μｍの直径を有する。一部の場合において、インビトロの細胞クラスターは、約５０μｍから約２５０μｍの直径を有する。一部の場合において、インビトロの細胞クラスターは、約１００μｍから約２００μｍの直径を有する。一部の場合において、インビトロの細胞クラスターは、第１のグルコース濃度への応答として、第２のグルコース濃度への場合と比較してより高いインスリン分泌を示し、第１のグルコース濃度は、第２のグルコース濃度より高い。一部の場合において、インビトロの細胞クラスターは、グルカゴンを発現する少なくとも１つの細胞またはソマトスタチンを発現する少なくとも１つの細胞をさらに含む。一部の場合において、インビトロの細胞クラスターは、第１の濃度のＫ＋に応答して、インスリン分泌を示す。一部の場合において、インビトロの細胞クラスターは、対象に移植される場合、移植後の２８日以内に、対象におけるグルコース負荷に対して、インビボでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す。一部の場合において、第２のインビトロの細胞クラスターは、対象に移植される場合、移植後の１４日以内に、対象におけるグルコース負荷に対して、インビボでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す。
【０００７】
[0007]一部の場合において、（ａ）少なくとも１つの非天然膵臓β細胞は、１つまたは複数の結晶性インスリン顆粒を含むか；（ｂ）少なくとも１つの非天然膵臓β細胞は、以下の遺伝子：ＩＮＳ、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６−１、およびＺＮＴ８を発現するか；または（ｃ）少なくとも１つの非天然膵臓β細胞は、ソマトスタチンとグルカゴンの少なくとも一方を発現しない。一部の場合において、少なくとも１つの非天然膵臓β細胞は、第１のグルコース負荷、第２のグルコース負荷、および第３のグルコース負荷が逐次的にかかる場合、第１のグルコース負荷、第２のグルコース負荷、および第３のグルコース負荷に対して、インビトロでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す。一部の場合において、グルコース負荷に応答した、少なくとも１つの非天然膵臓β細胞によるインスリンの分泌は、グルコース負荷におけるグルコース濃度に比例する。一部の場合において、少なくとも１つの非天然膵臓β細胞は、遺伝子改変されている。
【０００８】
[0008]一部の場合において、少なくとも１つの非天然膵臓β細胞は、その少なくとも１つの非天然膵臓β細胞におけるインスリン発現の指標であるシグナルポリペプチドをコードする、外因性核酸配列を含まない。一部の場合において、非天然膵臓β細胞におけるシグナルポリペプチドの発現は、インスリンプロモーターによって駆動される。一部の場合において、シグナルポリペプチドは、蛍光タンパク質を含む。
【０００９】
[0009]さらに別の態様において、本開示は、培養培地中に本明細書で提供される少なくとも１つの細胞クラスターを含む組成物を提供する。
[0010]一部の場合において、培養培地は、無血清である。一部の場合において、再凝集培養培地は、トリヨードチロニンを含まない。一部の場合において、再凝集培養培地は、外因性甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤を含まない。一部の場合において、再凝集培養培地は、アクチビン受容体様キナーゼ（ａｃｔｉｖｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｋｉｎｓｅ）−５（Ａｌｋ５）阻害剤を含まない。一部の場合において、培養培地は、Ｒｈｏ関連コイルドコイル含有プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）の外因性阻害剤を含まない。一部の場合において、培養培地は、外因性細胞外マトリックス分子を含まない。一部の場合において、細胞クラスターは、培養培地中で懸濁した状態にある。一部の場合において、培養培地は、少なくとも３０ｒｐｍの予め決定された速度で撹拌される。一部の場合において、培養培地は、少なくとも６０ｒｐｍの予め決定された速度で撹拌される。一部の場合において、培養培地は、ＭＣＤＢ１３１基礎培地を含む。一部の場合において、ＭＣＤＢ１３１基礎培地は、２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が補充されている。一部の場合において、培養培地は、ＣＭＲＬｓ培地を含む。一部の場合において、組成物は、少なくとも１つの細胞クラスターおよび培養培地を含有するバイオリアクターをさらに含む。一部の場合において、バイオリアクターは、スピナーフラスコを含む。
【００１０】
[0011]さらに別の態様において、本開示は、（ａ）少なくとも１つのＮＫＸ６．１＋細胞を含む細胞の集団を、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）シグナル伝達経路阻害剤、甲状腺ホルモン（ＴＨ）シグナル伝達経路活性化剤、少なくとも１種のソニック−ヘッジホッグ（ＳＨＨ）経路阻害剤、レチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤、γ−セクレターゼ阻害剤、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤、上皮増殖因子（ＥＧＦ）ファミリー由来の少なくとも１種の増殖因子、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される因子を含む培養培地中で、少なくとも１つのＮＫＸ６．１＋およびＣ−ペプチド＋細胞を含む第１の細胞クラスターに分化させるステップ；（ｂ）第１の細胞クラスターから、複数の細胞を解離させるステップ；ならびに（ｃ）再凝集培養培地中で、（ｂ）からの複数の細胞を培養し、複数の細胞の少なくとも一部に、（ｉ）少なくとも約３５％の細胞が、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現するか；（ｉｉ）少なくとも約７０％の細胞が、クロモグラニンＡを発現するか；（ｉｉｉ）最大で約２％の細胞が、ＳＯＸ２を発現するか；または（ｉｖ）最大で約１０％の細胞が、ＳＯＸ９を発現する、第２のインビトロの細胞クラスターを形成させるステップを含む方法を提供する。一部の場合において、上皮増殖因子（ＥＧＦ）ファミリー由来の少なくとも１種の増殖因子は、ベータセルリンを含む。
【００１１】
[0012]さらに別の態様において、本開示は、（ａ）少なくとも１つのＮＫＸ６．１＋およびＣ−ペプチド＋細胞を含む第１の細胞クラスターを得るステップ；（ｂ）第１の細胞クラスターから、複数の細胞を解離させるステップ；ならびに（ｃ）再凝集培養培地中で、（ｂ）からの複数の細胞を培養し、複数の細胞の少なくとも一部に、（ｉ）少なくとも約３５％の細胞が、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現するか；（ｉｉ）少なくとも約７０％の細胞が、クロモグラニンＡを発現するか；（ｉｉｉ）最大で約２％の細胞が、ＳＯＸ２を発現するか；または（ｉｖ）最大で約１０％の細胞が、ＳＯＸ９を発現する、第２のインビトロの細胞クラスターを形成させるステップを含む方法を提供する。
【００１２】
[0013]さらに別の態様において、本開示は、（ａ）少なくとも１つのＮＫＸ６．１＋およびＣ−ペプチド＋細胞を含む第１の細胞クラスターを得るステップ；（ｂ）第１の細胞クラスターから、複数の細胞を解離させるステップであって、解離させることは、複数の細胞をフローサイトメトリーに供することを含まない、ステップ；ならびに（ｃ）無血清再凝集培養培地中で、（ｂ）からの複数の細胞を培養し、複数の細胞の少なくとも一部に、第２のインビトロの細胞クラスターを形成させるステップを含み、（ｉ）第２のインビトロの細胞クラスターは、第１の細胞クラスターと比較して、クロモグラニンＡを発現するより高いパーセンテージの細胞を含むか；（ｉｉ）第２のインビトロの細胞クラスターは、第１の細胞クラスターと比較して、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現するより高いパーセンテージの細胞を含むか；（ｉｉｉ）第２のインビトロの細胞クラスターは、第１の細胞クラスターと比較して、ＳＯＸ２を発現するより低いパーセンテージの細胞を含むか；または（ｉｖ）第２のインビトロの細胞クラスターは、第１の細胞クラスターと比較して、ＳＯＸ９を発現するより低いパーセンテージの細胞を含む、方法を提供する。
【００１３】
[0014]さらに別の態様において、本開示は、（ａ）少なくとも１つのＮＫＸ６．１＋およびＣ−ペプチド＋細胞を含む第１の細胞クラスターを得るステップ；（ｂ）第１の細胞クラスターから、複数の細胞を解離させるステップであって、解離させることは、複数の細胞をフローサイトメトリーに供することを含まない、ステップ；ならびに（ｃ）再凝集培養培地中で、（ｂ）からの複数の細胞を培養し、複数の細胞の少なくとも一部に、第２のインビトロの細胞クラスターを形成させるステップを含み、第２のインビトロの細胞クラスターは、グルコース負荷にさらされる場合、インビトロでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含み；（ｉ）少なくとも約３５％の細胞が、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現するか；（ｉｉ）少なくとも約７０％の細胞が、クロモグラニンＡを発現するか；（ｉｉｉ）最大で約２％の細胞が、ＳＯＸ２を発現するか；または（ｉｖ）最大で約１０％の細胞が、ＳＯＸ９を発現する、方法を提供する。
【００１４】
[0015]一部の場合において、第２のインビトロの細胞クラスターは、グルコース負荷にさらされる場合、インビトロでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含む。一部の場合において、解離させるステップは、第１の細胞クラスターの酵素による解離を含む。一部の場合において、解離させるステップは、第１の細胞クラスターをトリプシンと接触させることを含む。一部の場合において、再凝集培養培地は、無血清である。一部の場合において、再凝集培養培地は、予め決定された速度で撹拌される。一部の場合において、予め決定された速度は、少なくとも３０ｒｐｍまたは少なくとも６０ｒｐｍである。一部の場合において、再凝集培養培地は、ＭＣＤＢ１３１基礎培地を含む。一部の場合において、ＭＣＤＢ１３１基礎培地は、２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が補充されている。一部の場合において、再凝集培養培地は、ＣＭＲＬｓ培地を含む。一部の場合において、再凝集培養培地は、ＭＣＤＢ１３１基礎培地を含む。
【００１５】
[0016]一部の場合において、（ａ）少なくとも１つの非天然膵臓β細胞は、１つまたは複数の結晶性インスリン顆粒を含むか；（ｂ）少なくとも１つの非天然膵臓β細胞は、以下の遺伝子：ＩＮＳ、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６−１、およびＺＮＴ８を発現するか；または（ｃ）少なくとも１つの非天然膵臓β細胞は、ソマトスタチンとグルカゴンの少なくとも一方を発現しない。一部の場合において、少なくとも１つの非天然膵臓β細胞は、第１のグルコース負荷、第２のグルコース負荷、および第３のグルコース負荷が逐次的にかかる場合、第１のグルコース負荷、第２のグルコース負荷、および第３のグルコース負荷に対して、インビトロでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す。一部の場合において、少なくとも１つの非天然膵臓β細胞は、遺伝子改変されている。一部の場合において、グルコース負荷に応答した、少なくとも１つの非天然膵臓β細胞によるインスリンの分泌は、グルコース負荷におけるグルコース濃度に比例する。
【００１６】
[0017]一部の場合において、再凝集培養培地は、トリヨードチロニンを含まない。一部の場合において、再凝集培養培地は、外因性甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤を含まない。一部の場合において、再凝集培養培地は、アクチビン受容体様キナーゼ−５（Ａｌｋ５）阻害剤を含まない。一部の場合において、再凝集培養培地は、外因性トランスフォーミング増殖因子βシグナル伝達経路阻害剤を含まない。一部の場合において、再凝集培養培地は、Ｒｈｏ関連コイルドコイル含有プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）の外因性阻害剤を含まない。一部の場合において、再凝集培養培地は、外因性細胞外マトリックス分子を含まない。
【００１７】
[0018]一部の場合において、第１の細胞クラスターは、低温保存から回復される。一部の場合において、本方法は、第１の細胞クラスターを低温保存から回復することをさらに含む。一部の場合において、本方法は、培養する前に、所定期間にわたり、複数の細胞を低温保存することをさらに含む。一部の場合において、本方法は、培養する前に、複数の細胞を低温保存から回復することをさらに含む。
【００１８】
[0019]一部の場合において、第２のインビトロの細胞クラスターは、最大で第１の細胞クラスターの５０％の直径を有する。一部の場合において、第２のインビトロの細胞クラスターは、最大で第１の細胞クラスターの３０％の直径を有する。一部の場合において、第２のインビトロの細胞クラスターは、約１５０μｍの直径を有する。一部の場合において、第２のインビトロの細胞クラスターは、約５０μｍから約２５０μｍの直径を有する。一部の場合において、第２のインビトロの細胞クラスターは、約１００μｍから約２００μｍの直径を有する。一部の場合において、第２のインビトロの細胞クラスターにおいて、クロモグラニンＡを発現する細胞のパーセンテージは、第１の細胞クラスターにおいて、クロモグラニンＡを発現する細胞のパーセンテージより、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、または少なくとも１．５倍大きい。一部の場合において、第２のインビトロの細胞クラスターは、クロモグラニンＡを発現する少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または１００％の細胞を含む。一部の場合において、第２のインビトロの細胞クラスターにおいて、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドの両方を発現する細胞のパーセンテージは、第１の細胞クラスターにおいて、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドの両方を発現する細胞のパーセンテージより、少なくとも１．５倍、少なくとも１．７５倍、または少なくとも２倍大きい。一部の場合において、第２のインビトロの細胞クラスターは、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドの両方を発現する少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、または少なくとも約６０％の細胞を含む。一部の場合において、第２のインビトロの細胞クラスターにおいて、ＳＯＸ２を発現する細胞のパーセンテージは、第１の細胞クラスターにおいて、ＳＯＸ２を発現する細胞のパーセンテージの最大で２分の１、最大で３分の１、最大で５分の１、または最大で１０分の１である。一部の場合において、第２のインビトロの細胞クラスターは、ＳＯＸ２を発現する最大で約２％、最大で約１．５％、最大で約１％、または最大で約０．５％の細胞を含む。一部の場合において、第２のインビトロの細胞クラスターにおいて、ＳＯＸ９を発現する細胞のパーセンテージは、第１の細胞クラスターにおいて、ＳＯＸ９を発現する細胞のパーセンテージの最大で２分の１、最大でも３分の１、最大で５分の１、または最大で１０分の１である。一部の場合において、第２のインビトロの細胞クラスターは、ＳＯＸ９を発現する最大で約１０％、最大で約５％、最大で約３％、または最大で約２％の細胞を含む。一部の場合において、第２のインビトロの細胞クラスターは、第１の細胞クラスターと比較して、Ｋｉ６７を発現するより低いパーセンテージの細胞を有する。一部の場合において、第２のインビトロの細胞クラスターは、Ｋｉ６７を発現する最大で約２％、最大で約１％、最大で約０．５％、または最大で約０．１％の細胞を含む。一部の場合において、第２のインビトロの細胞クラスターは、第１の細胞クラスターと比較して、より高いインスリン含量を有する。一部の場合において、第２のインビトロの細胞��ラスターは、第１の細胞クラスターと比較して、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２５倍または少なくとも１．５倍高いインスリン含量を有する。一部の場合において、第２のインビトロの細胞クラスターは、第１の細胞クラスターと比較して、より高い刺激指標を示し、刺激指標は、第２のグルコース濃度と比較した場合の、第１のグルコース濃度に応答して分泌されたインスリンの比率に等しく、第１のグルコース濃度は、第２のグルコース濃度より高い。
【００１９】
[0020]一部の場合において、第２のインビトロの細胞クラスターは、第１の濃度のＫ＋に応答して、インスリン分泌を示す。一部の場合において、第２のインビトロの細胞クラスターは、１０ｍＭより大きい高いグルコース濃度に応答して二相性インスリン分泌を示す。一部の場合において、第２のインビトロの細胞クラスターは、グルカゴンを発現する少なくとも１つの細胞またはソマトスタチンを発現する少なくとも１つの細胞をさらに含む。一部の場合において、第１の細胞クラスター中のＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドの両方を発現する細胞の少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％は、第２のインビトロの細胞クラスター中に保持される。一部の場合において、第２のインビトロの細胞クラスターは、第１の細胞クラスターと比較して、より高い酸素消費速度を有する。一部の場合において、第２のインビトロの細胞クラスターは、第１の細胞クラスターと比較して、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２５倍または少なくとも１．５倍高い酸素消費速度を有する。一部の場合において、第２のインビトロの細胞クラスターは、対象に移植される場合、移植後の２８日以内に、対象におけるグルコース負荷に対して、インビボでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す。一部の場合において、第２のインビトロの細胞クラスターは、対象に移植される場合、移植後の１４日以内に、対象におけるグルコース負荷に対して、インビボでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す。
【００２０】
[0021]さらに別の態様において、本開示は、本明細書で提供される方法によって生成されるインビトロの細胞クラスターを提供する。
[0022]さらに別の態様において、本開示は、本明細書で開示されるインビトロの細胞クラスターを含むデバイスであって、対象に植え込まれると、インスリンを産生および放出するように構成される、デバイスを提供する。一部の場合において、デバイスは、半透膜をさらに含み、半透膜は、デバイス中に細胞クラスターを保持し、細胞クラスターによって分泌されたインスリンの通過を許容するように構成される。一部の場合において、細胞クラスターは、半透膜によって封入される。一部の場合において、半透膜は、多糖またはポリカチオンで作製される。一部の場合において、半透膜は、ポリ（ラクチド）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、および他のポリヒドロキシ酸、ポリ（カプロラクトン）、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリ無水物、ポリホスファゼン、ポリアミノ酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリシアノアクリレート、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、生分解性ポリウレタン、アルブミン、コラーゲン、フィブリン、ポリアミノ酸、プロラミン、アルギネート、アガロース、ゼラチンを含むアガロース、デキストラン、ポリアクリレート、エチレン−酢酸ビニルポリマーおよび他のアシル置換酢酸セルロースならびにそれらの誘導体、ポリウレタン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニル、ポリ（ビニルイミダゾール）、クロロスルホン化ポリオレフィン、ポリエチレンオキシド、ならびにそれらの任意の組合せからなる群から選択される材料で作製される。一部の場合において、半透膜は、アルギネートを含む。一部の場合において、細胞クラスターは、半透膜によって取り囲まれたアルギネートコアを含むマイクロカプセル中に封入される。
【００２１】
[0023]さらに別の態様において、本開示は、それを必要とする対象における疾患を処置または予防する方法であって、本明細書で提供される請求項のいずれか一項に記載の細胞クラスターまたはその一部を対象に投与するステップを含む、方法を提供する。
【００２２】
[0024]さらに別の態様において、本開示は、それを必要とする対象における疾患を処置または予防する方法であって、本明細書で提供されるデバイスを対象に植え込むステップを含む、方法を提供する。一部の場合において、対象は代謝性疾患を発症しているか、または発症する高いリスクを有する。一部の場合において、対象は、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、および１．５型糖尿病からなる群から選択される糖尿病を有する。
【００２３】
[0025]さらに別の態様において、本開示は、組成物、方法、およびキットを提供する。組成物は、少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含む細胞クラスターを含んでいてもよい。本方法は、少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を得ることを含んでいてもよい。キットは、少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含む細胞クラスターを含んでいてもよい。一部の態様において、この開示は、少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含む細胞クラスターを提供する。一部の実施形態において、細胞クラスター中の細胞の少なくとも約７０％は、フローサイトメトリーによる測定によれば、クロモグラニンＡを発現する。一部の実施形態において、細胞クラスターは、グルコース負荷にさらされる場合、インビトロでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す。一部の態様において、この開示は、少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含む細胞クラスターを提供する。一部の実施形態において、細胞クラスター中の細胞の少なくとも約２５％は、フローサイトメトリーによる測定によれば、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する。一部の実施形態において、細胞クラスター中の細胞の少なくとも約３０％は、フローサイトメトリーによる測定によれば、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する。一部の実施形態において、細胞クラスター中の細胞の少なくとも約３５％は、フローサイトメトリーによる測定によれば、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する。一部の実施形態において、細胞クラスター中の細胞の少なくとも約４０％は、フローサイトメトリーによる測定によれば、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する。一部の実施形態において、細胞クラスター中の細胞の少なくとも約４５％は、フローサイトメトリーによる測定によれば、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する。一部の実施形態において、細胞クラスター中の細胞の少なくとも約５０％は、フローサイトメトリーによる測定によれば、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する。一部の実施形態において、細胞クラスターは、グルコース負荷にさらされる場合、インビトロでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す。一部の態様において、この開示は、少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含む細胞クラスターを提供する。一部の実施形態において、細胞クラスター中の細胞の少なくとも約７０％は、フローサイトメトリーによる測定によれば、クロモグラニンＡを発現する。一部の実施形態において、細胞クラスターは、対象に移植される場合、対象におけるグルコース負荷に対して、インビボでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す。一部の実施形態において、細胞クラスターは、移植後の２８日以内に、対象におけるグルコース負荷に対して、インビボでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す。一部の態様において、この開示は、少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含む細胞クラスターであって、細胞クラスター中の細胞の少なくとも約２５％は、フローサイトメトリーによる測定によれば、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する、細胞クラスターを提供する。一部の実施形態において、細胞クラスター中の細胞の少なくとも約３０％は、フローサイト���トリーによる測定によれば、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する。一部の実施形態において、細胞クラスター中の細胞の少なくとも約３５％は、フローサイトメトリーによる測定によれば、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する。一部の実施形態において、細胞クラスター中の細胞の少なくとも約４０％は、フローサイトメトリーによる測定によれば、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する。一部の実施形態において、細胞クラスター中の細胞の少なくとも約４５％は、フローサイトメトリーによる測定によれば、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する。一部の実施形態において、細胞クラスター中の細胞の少なくとも約５０％は、フローサイトメトリーによる測定によれば、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する。一部の実施形態において、細胞クラスターは、対象に移植される場合、対象におけるグルコース負荷に対して、インビボでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す。一部の実施形態において、細胞クラスターは、対象に移植された後の約２８日以内に、グルコース負荷に対して、インビボでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す。一部の実施形態において、細胞クラスター中の細胞の少なくとも約９０％は、フローサイトメトリーによる測定によれば、クロモグラニンＡを発現する。一部の実施形態において、細胞クラスター中の細胞の少なくとも約７０％は、フローサイトメトリーによる測定によれば、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する。一部の実施形態において、細胞クラスター中の細胞の少なくとも約２５％は、フローサイトメトリーによる測定によれば、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する。一部の実施形態において、細胞クラスター中の細胞の少なくとも約３０％は、フローサイトメトリーによる測定によれば、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する。一部の実施形態において、細胞クラスター中の細胞の少なくとも約３５％は、フローサイトメトリーによる測定によれば、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する。一部の実施形態において、細胞クラスター中の細胞の少なくとも約４０％は、フローサイトメトリーによる測定によれば、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する。一部の実施形態において、細胞クラスター中の細胞の少なくとも約４５％は、フローサイトメトリーによる測定によれば、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する。一部の実施形態において、細胞クラスター中の細胞の少なくとも約５０％は、フローサイトメトリーによる測定によれば、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する。一部の実施形態において、細胞クラスターは、第１および第２のグルコース負荷が逐次的にかかる場合、第１のグルコース負荷および第２のグルコース負荷に対して、インビトロでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す。一部の実施形態において、細胞クラスターは、対象に移植される場合、移植後の１４日以内に、対象におけるグルコース負荷に対して、インビボでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す。一部の実施形態において、細胞クラスターは、約２００μｍ未満の直径を有する。一部の実施形態において、細胞クラスタ��は、約３００μｍ未満の直径を有する。一部の実施形態において、細胞クラスターは、約４００μｍ未満の直径を有する。一部の実施形態において、直径は、約１００μｍ未満である。一部の実施形態において、細胞クラスター中の細胞の約１０％未満は、生存可能ではない。一部の実施形態において、細胞クラスターは、グルコース負荷にさらされる場合、グルコースによって刺激されたカルシウムフラックス応答を示す。一部の態様において、この開示は、少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含む細胞クラスターであって、フローサイトメトリーによる測定によれば、細胞クラスター中の細胞の少なくとも約７０％は、クロモグラニンＡを発現し、細胞クラスター中の細胞の少なくとも約２５％は、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する、細胞クラスターを提供する。一部の態様において、この開示は、少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含む細胞クラスターであって、フローサイトメトリーによる測定によれば、細胞クラスター中の細胞の少なくとも約７０％は、クロモグラニンＡを発現し、細胞クラスター中の細胞の少なくとも約３０％は、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する、細胞クラスターを提供する。一部の態様において、この開示は、少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含む細胞クラスターであって、フローサイトメトリーによる測定によれば、細胞クラスター中の細胞の少なくとも約７０％は、クロモグラニンＡを発現し、細胞クラスター中の細胞の少なくとも約３５％は、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する、細胞クラスターを提供する。一部の態様において、この開示は、少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含む細胞クラスターであって、フローサイトメトリーによる測定によれば、細胞クラスター中の細胞の少なくとも約７０％は、クロモグラニンＡを発現し、細胞クラスター中の細胞の少なくとも約４０％は、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する、細胞クラスターを提供する。一部の態様において、この開示は、少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含む細胞クラスターであって、フローサイトメトリーによる測定によれば、細胞クラスター中の細胞の少なくとも約７０％は、クロモグラニンＡを発現し、細胞クラスター中の細胞の少なくとも約４５％は、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する、細胞クラスターを提供する。一部の態様において、この開示は、少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含む細胞クラスターであって、フローサイトメトリーによる測定によれば、細胞クラスター中の細胞の少なくとも約７０％は、クロモグラニンＡを発現し、細胞クラスター中の細胞の少なくとも約５０％は、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する、細胞クラスターを提供する。一部の実施形態において、細胞クラスターは、グルコース負荷にさらされる場合、インビトロでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す。一部の実施形態において、細胞クラスターは、対象に移植される場合、移植後の約２８日以内に、対象におけるグルコース負荷に対して、インビボでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す。一部の実施形態において、この開示は、足場を含む組成物を提供する。一部の実施形態において、足場は、生分��性の足場である。
【００２４】
[0026]一部の態様において、この開示は、少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含む第１の細胞クラスターを得るステップ、第１の細胞クラスターから、複数の細胞を解離させるステップ、複数の細胞を、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤およびトランスフォーミング増殖因子βシグナル伝達経路阻害剤を含む培地中で培養し、それによって、複数の細胞の少なくとも一部を使用して、インビトロで第２の細胞クラスターを形成するステップを含み、第２の細胞クラスターは、少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含み、（ｉ）第２の細胞クラスター中の細胞の少なくとも約７０％は、フローサイトメトリーによる測定によれば、クロモグラニンＡを発現し、および／または（ｉｉ）第２の細胞クラスター中の細胞の少なくとも約４０％は、フローサイトメトリーによる測定によれば、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する、方法を提供する。一部の態様において、この開示は、少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含む第１の細胞クラスターを得るステップ、第１の細胞クラスターから、複数の細胞を解離させるステップ、（ａ）からの複数の細胞を、血清、ならびに甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤およびトランスフォーミング増殖因子βシグナル伝達経路阻害剤のうち１つを含む培地中で培養し、それによって、複数の細胞の少なくとも一部を使用して、インビトロで第２の細胞クラスターを形成するステップを含み、第２の細胞クラスターは、非天然膵臓β細胞を含み、（ｉ）第２の細胞クラスター中の細胞の少なくとも約７０％は、フローサイトメトリーによる測定によれば、クロモグラニンＡを発現し、および／または（ｉｉ）第２の細胞クラスター中の細胞の少なくとも約４０％は、フローサイトメトリーによる測定によれば、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する、方法を提供する。一部の実施形態において、培地は、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤をさらに含む。一部の実施形態において、培地は、トランスフォーミング増殖因子βシグナル伝達経路阻害剤をさらに含む。一部の実施形態において、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤は、トリヨードチロニンである。一部の実施形態において、培地中のトリヨードチロニンの濃度は、約０．１μＭから約１０μＭである。一部の実施形態において、トランスフォーミング増殖因子βシグナル伝達経路阻害剤は、アクチビン受容体様キナーゼ−５阻害剤である。一部の実施形態において、培地中のアクチビン受容体様キナーゼ−５阻害剤の濃度は、約１μＭから約５０μＭである。一部の実施形態において、培地は、ヒト血清、ヒト血小板溶解産物、ウシ胎児血清、および血清代替物からなる群から選択される血清をさらに含む。一部の実施形態において、培地は、約５％から約１５％の血清を含む。一部の実施形態において、培地は、約１０％の血清を含む。一部の実施形態において、培地は、Ｃｏｎｎｏｕｇｈｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  １０６６補充膵島培地（ＣＭＲＬＳ）またはＭＣＤＢ１３１基礎培地をさらに含む。一部の実施形態において、培地は、細胞外マトリックス分子をさらに含む。一部の実施形態において、細胞外マトリックス分子は、ヘパリンである。一部の実施���態において、細胞外マトリックス分子は、ラミニンである。一部の実施形態において、第２の細胞クラスターは、フローサイトメトリーによる測定によれば、第１の細胞クラスターと比較して、クロモグラニンＡを発現するより高いパーセンテージの細胞を含む。一部の実施形態において、第２の細胞クラスターは、フローサイトメトリーによる測定によれば、第１の細胞クラスターと比較して、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現するより高いパーセンテージの細胞を含む。一部の実施形態において、第２の細胞クラスターは、第１の細胞クラスターと比較して、より少ない生存不能な細胞を含む。一部の実施形態において、複数の細胞の一部は、第２の細胞クラスターを形成することができず、第２の細胞クラスターを形成することができない複数の細胞の一部の約１０％未満は、フローサイトメトリーによる測定によれば、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する。一部の実施形態において、第２の細胞クラスターの直径は、第１の細胞クラスターの直径未満である。一部の実施形態において、インビトロでグルコース負荷にさらされる場合、第２の細胞クラスターは、第１の細胞クラスターと比較して、より高い刺激指標を示し、刺激指標が、第２のグルコース濃度と比較した場合の、第１のグルコース濃度に応答して分泌されたインスリンの比率に等しく、第１のグルコース濃度は、第２のグルコース濃度より高い。一部の実施形態において、インビボでグルコース負荷にさらされる場合、第２の細胞クラスターは、第１の細胞クラスターと比較して、より高い刺激指標を示し、刺激指標が、第２のグルコース濃度と比較した場合の、第１のグルコース濃度に応答して分泌されたインスリンの比率に等しく、第１のグルコース濃度は、第２のグルコース濃度より高い。一部の実施形態において、複数の細胞は、スピナーフラスコ中で培養される。一部の実施形態において、複数の細胞は、インビトロで１つまたは複数の幹細胞から生成される。一部の実施形態において、複数の細胞は、１つまたは複数の人工多能性幹細胞から生成される。一部の実施形態において、複数の細胞は、培地中で、少なくとも１日間培養される。一部の実施形態において、複数の細胞は、培地中で、少なくとも４日間培養される。
【００２５】
[0027]一部の態様において、この開示は、それを必要とする対象における疾患を処置または予防するための方法であって、本開示の組成物のいずれかを対象に投与するステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態において、対象はヒトである。一部の実施形態において、対象は、糖尿病を有するか、または糖尿病を発症する高いリスクを有する。一部の実施形態において、糖尿病は、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、１．５型糖尿病、または前糖尿病である。一部の実施形態において、投与するステップは、組成物を、腎被膜下に、肝臓中に、または膵臓中に投与することを含む。一部の実施形態において、本方法は、第２の細胞クラスターを低温保存し、それによって低温保存した第２の細胞クラスターを産生することをさらに含む。一部の実施形態において、本方法は、低温保存した第２の細胞クラスターを融解させ、それによって少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含む融解した第２の細胞クラスターを産生することをさらに含む。一部の実施形態において、融解した第２の細胞クラスター中の細胞の少なくとも約７０％は、フローサイトメトリーによる測定によれば、クロモグラニンＡを発現する。一部の実施形態において、融解した第２の細胞クラスター中の細胞の少なくとも約２５％は、フローサイトメトリーによる測定によれば、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する。一部の実施形態において、融解した第２の細胞クラスター中の細胞の少なくとも約３０％は、フローサイトメトリーによる測定によれば、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する。一部の実施形態において、融解した第２の細胞クラスター中の細胞の少なくとも約３５％は、フローサイトメトリーによる測定によれば、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する。一部の実施形態において、融解した第２の細胞クラスター中の細胞の少なくとも約４０％は、フローサイトメトリーによる測定によれば、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する。一部の実施形態において、融解した第２の細胞クラスター中の細胞の少なくとも約４５％は、フローサイトメトリーによる測定によれば、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する。一部の実施形態において、融解した第２の細胞クラスター中の細胞の少なくとも約５０％は、フローサイトメトリーによる測定によれば、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する。
【００２６】
[0028]一部の態様において、本開示は、本開示の方法のいずれかで使用するためのシステムを提供する。一部の実施形態において、システムは、磁気撹拌プレートと、第１の細胞クラスターからの複数の細胞を含むスピナーフラスコとを含んでいてもよく、磁気撹拌プレートおよびスピナーフラスコは、第１のクラスターからの複数の細胞を撹拌し、それによって、複数の細胞の少なくとも一部を使用してインビトロで第２の細胞クラスターを形成するように構成される。
【００２７】
[0029]一部の態様において、本開示は、それを必要とする対象における疾患を処置または予防するための方法であって、少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含む第１の細胞クラスターを得るステップ、第１の細胞クラスターから、複数の細胞を解離させるステップ、（ａ）からの複数の細胞を、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤およびトランスフォーミング増殖因子βシグナル伝達経路阻害剤を含む培地中で培養し、それによって、複数の細胞の少なくとも一部を使用して、インビトロで第２の細胞クラスターを形成するステップであって、第２の細胞クラスターは、少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含み、（ｉ）第２の細胞クラスター中の細胞の少なくとも約７０％は、フローサイトメトリーによる測定によれば、クロモグラニンＡを発現し、および／または（ｉｉ）第２の細胞クラスター中の細胞の少なくとも約２５％は、フローサイトメトリーによる測定によれば、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する、ステップ、ならびに第２の細胞クラスターまたはその一部を含む組成物を対象に投与するステップを含む、方法を提供する。
【００２８】
[0030]一部の態様において、本開示は、それを必要とする対象における疾患を処置または予防するための方法であって、少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含む第１の細胞クラスターを得るステップ、第１の細胞クラスターから、複数の細胞を解離させるステップ、複数の細胞を、血清、および甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤またはトランスフォーミング増殖因子βシグナル伝達経路阻害剤を含む培地中で培養し、それによって、複数の細胞の少なくとも一部から、インビトロで第２の細胞クラスターを形成するステップであって、第２の細胞クラスターは、少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含み、（ｉ）第２の細胞クラスター中の細胞の少なくとも約７０％は、フローサイトメトリーによる測定によれば、クロモグラニンＡを発現し、および／または（ｉｉ）第２の細胞クラスター中の細胞の少なくとも約２５％は、フローサイトメトリーによる測定によれば、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する、ステップ、ならびに第２の細胞クラスターまたはその一部を含む組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【００２９】
[0031]一部の態様において、本開示は、本開示の細胞クラスターおよび少なくとも１種の医薬的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。一部の実施形態において、医薬組成物は、液体組成物である。一部の実施形態において、医薬組成物は、カプセルである。一部の実施形態において、カプセルは、ゲルカプセルである。一部の実施形態において、カプセルは、リポソームである。
【００３０】
[0032]一部の態様において、本開示は、少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含む細胞クラスターであって、この細胞クラスターは、少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含む第１の細胞クラスターを得るステップ、第１の細胞クラスターから、複数の細胞を解離させるステップ、複数の細胞を、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤およびトランスフォーミング増殖因子βシグナル伝達経路阻害剤を含む培地中で培養し、それによって、複数の細胞の少なくとも一部から、インビトロで第２の細胞クラスターを形成するステップを含み、第２の細胞クラスターは、少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含み、（ｉ）第２の細胞クラスター中の細胞の少なくとも約７０％は、フローサイトメトリーによる測定によれば、クロモグラニンＡを発現し、および／または（ｉｉ）第２の細胞クラスター中の細胞の少なくとも約４０％は、フローサイトメトリーによる測定によれば、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する、プロセスによって調製される、細胞クラスターを提供する。
【００３１】
[0033]一部の態様において、本開示は、（ｉ）少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含む細胞クラスターであって、細胞クラスター中の細胞の少なくとも約７０％は、フローサイトメトリーによる測定によれば、クロモグラニンＡを発現し、細胞クラスターは、グルコース負荷にさらされる場合、インビトロでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す、細胞クラスター、および（ｉｉ）緩衝液を含むキットを提供する。一部の態様において、本開示は、（ｉ）少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含む細胞クラスターであって、細胞クラスター中の細胞の少なくとも約２５％は、フローサイトメトリーによる測定によれば、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現し、細胞クラスターは、グルコース負荷にさらされる場合、インビトロでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す、細胞クラスター、および（ｉｉ）緩衝液を含むキットを提供する。
【００３２】
[0034]特定の実施形態において、２０１３年６月１１日に出願された米国仮出願第６１／８３３，８９８号および２０１４年３月２８日に出願された米国仮出願第６１／９７２，２１２号への優先権を主張する、２０１５年４月１０日に出願された米国特許出願第１４／６８４，１０１号および２０１５年４月１０日に出願された米国特許出願第１４／６８４，１２９号の方法、組成物、およびシステムの改善が本明細書で提供され、これらのそれぞれは、参照により全体が本明細書に組み入れられる。
【００３３】
[0035]本開示の追加の態様および利点は、本開示の例示的な実施形態のみを示し記載した以下の詳細な説明から当業者に容易に明らかになると予想される。理解されるように、本開示は、他のおよび異なる実施形態であることが可能であり、その数々の詳細は、様々な明白な観点で、いずれも開示から逸脱することなく改変が可能である。したがって、図面および説明は、本質的に例示とみなされ、限定とみなされないものとする。
参照による組み入れ
[0036]本明細書に記載される全ての公報、特許、および特許出願は、それぞれ個々の公報、特許、または特許出願が具体的かつ個々に参照により組み入れられると示されたのと同程度に、参照により本明細書に組み入れられる。参照により組み入れられる公報および特許または特許出願が明細書に含有される開示と矛盾する限り、明細書は、このような矛盾する資料のいずれに対しても優先されるか、および／または優位にとらえられることが意図される。
【００３４】
[0037]添付の特許請求の範囲で、本開示の新規の特色が詳細に述べられる。本開示の特色および利点をよりよく理解することは、本開示の原理が利用される例示的な実施形態を示す以下の詳細な説明、および以下の添付の図面（また本明細書では「図（Ｆｉｇｕｒｅ）」および「図（ＦＩＧ．）」）を参照することにより達成されると予想される。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】[0038]再凝集した細胞クラスターのインビトロでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答に対する、様々な段階の６種の細胞培養培地の使用の作用を示す図である。
【図２】[0039]ＬＩＮ２８を発現する細胞の蛍光画像（上）および定量化（下）を示す図である。
【図３】[0040]細胞クラスターを再凝集させるための例示的なプロトコールの概要および再凝集中のクラスターの形態を示す図である。
【図４】[0041]ＤＡＰＩ（例えば、核）、クロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）、またはインスリン（ＩＮＳ）に関して染色された天然細胞クラスター（上）および再凝集した細胞クラスター（下）の免疫蛍光画像を示す。
【図５Ａ】[0042]図５Ａおよび５Ｂは、再凝集した細胞クラスター中での内因性成熟膵臓β細胞のマーカーを発現する細胞の濃縮を示す図である。図５Ａは、天然クラスター、再凝集した細胞クラスター、および低温保存後の再凝集した細胞クラスターにおける、様々なマーカーを発現する細胞のフローサイトメトリーによる特徴付けを示す。
【図５Ｂ】図５Ａおよび５Ｂは、再凝集した細胞クラスター中での内因性成熟膵臓β細胞のマーカーを発現する細胞の濃縮を示す図である。図５Ｂは、天然クラスター、再凝集した細胞クラスター、および低温保存後の再凝集した細胞クラスターにおける、様々なマーカーを発現する細胞のパーセンテージの定量化である。
【図６】[0043]ヒトドナー膵島と比較した、再凝集した細胞クラスター中での内因性成熟膵臓β細胞のマーカーを発現する細胞の濃縮を示す（ヒトドナー膵島のフローサイトメトリーによる特徴付けを上に示す）。
【図７】[0044]再凝集した細胞クラスターおよび再凝集できなかった細胞における内因性成熟膵臓β細胞のマーカーを発現する細胞の分布を示す図である。
【図８】[0045]低温保存を行ったおよび行わなかった再凝集した細胞クラスター中でのオフターゲット細胞集団（ＳＯＸ２発現細胞およびＳＯＸ９発現細胞）のマーカーを発現する細胞の枯渇を示す図である。
【図９】[0046]（左）ＤＡＰＩ（例えば、核）または（右）Ｋｉ６７に関して染色された天然細胞クラスター（上）および再凝集した細胞クラスター（下）の免疫蛍光画像を示す図である。
【図１０】[0047]天然クラスター、再凝集した細胞クラスター、および低温保存後の再凝集した細胞クラスターの例示的なインビトロでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す図である。ＳＩは、２０ｍＭのグルコース負荷に応答する場合対２．８ｍＭのグルコース負荷に応答する場合のインスリン分泌の比率として計算した場合の刺激指標を意味する。
【図１１】[0048] 再凝集した細胞クラスターの、低温保存に続くグルコース濃度の逐次的な変化の後のインビトロでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答およびＫＣｌ負荷に応答したインビトロでのインスリン分泌を示す図である。
【図１２】[0049]天然クラスター、再凝集した細胞クラスター、および低温保存後の再凝集した細胞クラスターにおけるインスリン含量を示す図である。
【図１３】[0050]２週間での、天然クラスターおよび再凝集した細胞クラスターのインビボにおけるグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す図である。
【図１４】[0051]４週間での、天然クラスターおよび再凝集した細胞クラスターのインビボにおけるグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す図である。
【図１５】[0052]移植後の天然細胞クラスターおよび再凝集した細胞クラスターの外植した移植片におけるオフターゲット増殖を示す図である。
【図１６】[0053]（左）ミトコンドリアの機能のパラメーターを測定するための、様々な化学物質の逐次的な添加による細胞の経時的な酸素消費速度（ＯＣＲ）のサンプルグラフ、および（右）どのように様々な化学物質がミトコンドリアの機能に影響を与えるのかを示すミトコンドリア膜の図表を示す図である。
【図１７】[0054]天然細胞クラスター、再凝集した細胞クラスター、およびヒト膵島細胞のグルコース刺激の前および後の酸素消費速度を示す図である。
【図１８】[0055]本開示の方法を使用して得られたヒト膵島および膵島の経時的なミトコンドリアのストレス試験におけるＯＣＲレベルを示す図である。
【図１９】[0056]ＣＨＧＡおよびヒトマーカー（ＨｕＭｉｔ）の再凝集した細胞クラスター（ＳＣ−膵島移植片）の、移植片を有する腎臓の組織断面図の組織染色を示す図である。
【図２０】[0057]Ｃ−ペプチド、グルカゴン、およびＤＡＰＩ（例えば、核）の、再凝集した細胞クラスター（ＳＣ−膵島移植片）の移植片を有する腎臓の組織断面図の免疫蛍光染色を示す図である。
【図２１】[0058]細胞外マトリックスタンパク質としてのラミニン−３３２（ＬＮ−３３２）の使用の細胞増殖に対する作用を示す、（左）インスリンおよびヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）または（右）クロモグラニンＡおよびヘキストの、再凝集した細胞クラスターの免疫蛍光画像を示す図である。
【図２２】[0059]天然クラスター、再凝集したクラスター（ＲＡ）およびＬＮ−３３２マトリックスタンパク質を使用して増殖した細胞における、Ｃ−ペプチド（左のパネル）、クロモグラニンＡ（中央のパネル）、およびＳＯＸ９（右のパネル）について陽性細胞のパーセンテージの棒グラフを示す図である。
【図２３】[0060]プレーティングの８日後における３Ｄ懸濁培養（左）およびＬＮ−３３２を使用した２Ｄ培養（右）を使用して増殖した細胞のインビトロでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌を示す図である。
【図２４】[0061]再凝集後の数日にわたる再凝集したクラスターのサイズに対する異なる撹拌速度の作用を示す図である。
【図２５】[0062]異なる細胞マーカーの発現によって示される再凝集した細胞クラスターの不均質な組成を示す図である。
【図２６】[0063]図２６Ａは、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって測定された、それぞれ天然および再凝集した細胞クラスターにおける内分泌細胞およびβ（ベータ）細胞のパーセンテージの定量化を示す図である。図２６Ｂは、天然および再凝集した細胞クラスターのインスリン刺激指標の定量化を示す図である。
【図２７】[0064]別の実施例における、天然クラスター、再凝集した細胞クラスター、および低温保存後の再凝集した細胞クラスターのインビトロでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す図である。ＳＩは、２０ｍＭのグルコース負荷に応答する場合対２．８ｍＭのグルコース負荷に応答する場合のインスリン分泌の比率としての刺激指標を意味する。
【図２８】[0065]一連の動的なグルコース負荷およびＫＣｌ負荷に応答した、ヒトドナー膵島、天然および再凝集した細胞クラスターにおける経時的な動的なグルコース刺激インスリン分泌（左）および応答の定量化（右）を示す図である。
【図２９】[0066]糖尿病マウスにおける再凝集した細胞クラスターによる長期にわたるインビボでの血糖制御を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
[0067]本開示の様々な実施形態が本明細書に示され記載されるが、このような実施形態は単に一例として提供されるにすぎないことは当業者に明白であると予想される。当業者であれば、本開示から逸脱することなく、多数のバリエーション、変化、および置換を想起し得る。本明細書に記載される開示の実施形態の様々な代替例が採用される可能性があることが理解されるものとする。
【００３７】
[0068]Ｉ．概要
[0069]内因性膵島の機能および特徴と類似した細胞クラスターが、本明細書で提供される。また、このような細胞クラスターを作製および使用する方法も本明細書で提供される。
【００３８】
[0070]本明細書で提供される細胞クラスターは、内因性膵島と類似した特徴を有し得る。例えば、細胞クラスターは、内因性膵島と類似した直径、例えば、約５０μｍから約２５０μｍの間、約７５μｍから約２５０μｍの間、または約１００μｍから約２００μｍの間の直径を有していてもよい。細胞クラスターは、内因性成熟膵臓β細胞のマーカー遺伝子を発現する複数の細胞を含んでいてもよい。一部の場合において、細胞クラスター中の少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または１００％の細胞は、クロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）を発現する。一部の場合において、細胞クラスター中の少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％の細胞は、ＮＫＸ６．１とインスリンまたはＣ−ペプチドとの両方を発現する。
【００３９】
[0071]細胞クラスターはまた、内因性膵島に類似した機能を有していてもよい。例えば、細胞クラスターは、グルコース負荷に対して、インビトロでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示すことができる。細胞クラスターはまた、対象に移植される場合、例えば、移植後の１４日以内に、対象におけるグルコース負荷に対して、インビボでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示すこともできる。
【００４０】
[0072]この開示はまた、それを必要とする対象に、内因性膵島の機能および特徴に類似した細胞クラスターを投与すること、例えば移植することによって、糖尿病（例えば、Ｉ型またはＩＩ型糖尿病）を処置する方法も提供する。細胞クラスターは、腎被膜下に、生分解性の足場と共に移植することができる。
【００４１】
[0073]また、内因性膵島に類似した機能および特徴を有する細胞クラスターを作製するための方法も本明細書で提供される。本方法は、第１の細胞クラスターを解離させるステップを含んでいてもよい。次いで第１の細胞クラスターからの細胞を、スピナーフラスコ中に播種し、トリヨードチロニン（Ｔ３）およびアクチビン受容体様キナーゼ−５（Ａｌｋ５）阻害剤を含む培地中で培養することができる。一部の場合において、第１の細胞クラスターからの細胞は、血清を含まない培地、例えばウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含まない培地中で培養される。一部の場合において、培地は、Ｔ３を含まない。一部の場合において、培地は、外因性甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤を含まない。一部の場合において、培地は、Ａｌｋ５阻害剤を含まない。一部の場合において、培地は、外因性の小分子化合物を含まない。一部の場合において、培地は、Ｒｈｏ関連コイルドコイル含有プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）の外因性阻害剤を含まない。スピナーフラスコ中で、細胞は、内因性膵島に類似した機能および特徴を有する第２の細胞クラスターに再凝集することができる。第２の細胞クラスターは、少なくとも１つの膵臓β細胞（例えば、幹細胞から分化した非天然β細胞）を含んでいてもよい。
【００４２】
[0074]さらに、細胞クラスター中の膵臓β細胞（例えば、幹細胞から分化した非天然β細胞）を濃縮するための方法が本明細書で提供される。用語「濃縮すること」およびその文法上同等の表現は、１つのタイプの細胞の収率（割合）を、開始のクラスターまたは培養物中のそのタイプの細胞の割合より少なくとも約５％増加させることを意味し得る。本方法は、少なくとも膵臓β細胞（例えば、幹細胞から分化した非天然β細胞）を含む第１の細胞クラスターを解離させるステップを含んでいてもよい。次いで第１の細胞からの細胞を、スピナーフラスコ中に播種し、Ｔ３およびＡｌｋ５阻害剤を含む培地中で培養することができる。スピナーフラスコ中で、細胞は、第２の細胞クラスターに再凝集することができる。第２の細胞クラスターは、第１の細胞クラスターと比較して、内因性成熟膵臓β細胞のマーカーを発現し、グルコース負荷に対して、インビトロおよびインビボでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す細胞をより多く含んでいてもよい。
【００４３】
[0075]ＩＩ．内因性膵島の機能および特徴に類似した細胞クラスター
[0076]内因性膵島に類似した機能および特徴を有する細胞クラスターが、本明細書で提供される。このような細胞クラスターは、対象において代謝、例えばグルコース代謝を調節することにおいて、内因性膵島の機能を模することができる。したがって、細胞クラスターは、不十分な膵島の機能に起因する疾患、例えば糖尿病を処置するために、対象に移植することができる。用語「クラスター」および「凝集」は、同義的に使用でき、近接した細胞間の接触を有する細胞の群を指し、一部の場合において、クラスター中の細胞が互いに接着していてもよい。
【００４４】
[0077]本明細書に記載の細胞クラスターは、少なくとも１つの非天然細胞、例えば非天然膵臓β細胞を含んでいてもよい。非天然細胞（例えば、非天然膵臓β細胞）は、内因性細胞（例えば、内因性成熟膵臓β細胞）の特徴を有し得るが、特定の態様（例えば、遺伝子発現プロファイル）において異なっている。非天然細胞は、遺伝子改変された細胞であってもよい。非天然細胞は、前駆細胞、例えば、幹細胞から分化した細胞であってもよい。幹細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であってもよい。一部の場合において、非天然細胞は、インビトロで前駆細胞から分化した細胞であってもよい。一部の場合において、非天然細胞は、インビボで前駆細胞から分化した細胞であってもよい。例えば、細胞クラスターは、少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含んでいてもよい。非天然膵臓β細胞は、その全体が本明細書に組み入れられる米国特許出願第１４／６８４，１２９号および１４／６８４，１０１号に記載されたものであってもよい。細胞クラスターは、複数の非天然膵臓β細胞を含んでいてもよい。一部の場合において、細胞クラスター中の少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％の細胞は、非天然膵臓β細胞である。細胞クラスターは、１つまたは複数の天然細胞を含んでいてもよい。例えば、細胞クラスターは、１つまたは複数の初代細胞、例えば、内因性膵島由来の初代細胞を含んでいてもよい。
【００４５】
[0078]細胞クラスターは、内因性細胞、例えば内因性成熟膵臓β細胞の少なくとも１つのマーカーを発現する１つまたは複数の細胞を含んでいてもよい。用語「マーカー」は、観察または検出可能な分子を指す場合がある。例えば、マーカーとしては、これらに限定されないが、核酸、例えば特異的な遺伝子の転写物、遺伝子のポリペプチド生成物、非遺伝子生成物のポリペプチド、糖タンパク質、炭水化物、グリコリピド、脂質、リポタンパク質、または小分子を挙げることができる。多くの場合において、マーカーは、特定のタイプの細胞の特徴を示す可能性がある分子を指す場合があり、このような場合、そのマーカーは、そのタイプの細胞のマーカーと呼ぶことができる。例えば、インスリン遺伝子は、β細胞のマーカーと称することができる。一部の場合において、マーカーは、遺伝子である。内因性成熟膵臓β細胞のマーカーの非限定的例としては、インスリン、Ｃ−ペプチド、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＣＨＧＡ、ＭＡＦＡ、ＺＮＴ８、ＰＡＸ６、ＮＥＵＲＯＤ１、グルコキナーゼ（ＧＣＫ）、ＳＬＣ２Ａ、ＰＣＳＫ１、ＫＣＮＪ１１、ＡＢＣＣ８、ＳＬＣ３０Ａ８、ＳＮＡＰ２５、ＲＡＢ３Ａ、ＧＡＤ２、およびＰＴＰＲＮが挙げられる。
【００４６】
[0079]細胞クラスターは、内因性細胞、例えば内因性成熟膵臓β細胞の１つまたは複数のマーカーを発現する１つまたは複数の細胞を含んでいてもよい。例えば、細胞クラスターは、内因性細胞、例えば内因性成熟膵臓β細胞の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０種のマーカーを共に発現する１つまたは複数の細胞を含んでいてもよい。一部の場合において、細胞クラスターは、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する細胞を含み、その両方は、β細胞のマーカーであってもよい。
【００４７】
[0080]細胞クラスターは、内因性細胞の少なくとも１つのマーカーを発現する複数の細胞を含んでいてもよい。例えば、細胞クラスター中の少なくとも約１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％の細胞は、内因性細胞の少なくとも１つのマーカーを発現することができる。一部の場合において、細胞クラスター中の全ての細胞は、内因性細胞のマーカーを発現することができる。一部の場合において、内因性細胞は、膵臓細胞、例えば膵臓β細胞、膵臓α細胞、膵臓β細胞、膵臓Δ細胞、または膵臓γ細胞であってもよい。本明細書で提供される細胞クラスターは、細胞の、例えば異なるタイプの細胞の不均質な群を含んでいてもよい。例えば、細胞クラスターは、膵臓β細胞のマーカーであり得るインスリン／Ｃ−ペプチドを発現する細胞、膵臓α細胞のマーカーであり得るグルカゴンを発現する細胞、膵臓Δ細胞のマーカーであり得るソマトスタチンを発現する細胞、膵臓ポリペプチドを発現する細胞、またはそれらの任意の組合せを含んでいてもよい。
【００４８】
[0081]例えば、本明細書に記載の細胞クラスターは、内因性成熟膵臓β細胞の１つまたは複数のマーカーを発現する複数の細胞を含んでいてもよい。例えば、細胞クラスター中の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の細胞は、内因性成熟膵臓β細胞の１つまたは複数のマーカーを発現することができる。
【００４９】
[0082]細胞クラスターは、ＣＨＧＡを発現する複数の細胞を含んでいてもよい。一部の場合において、細胞クラスター中の少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の細胞は、ＣＨＧＡを発現する。一部の場合において、細胞クラスター中の少なくとも約８５％の細胞は、ＣＨＧＡを発現することができる。一部の場合において、細胞クラスターは、ＣＨＧＡを発現する約９０％の細胞を含んでいてもよい。一部の場合において、細胞クラスターは、ＣＨＧＡを発現する約９５％の細胞を含んでいてもよい。特定の場合において、細胞クラスター中の全ての細胞は、ＣＨＧＡを発現することができる。
【００５０】
[0083]細胞クラスターは、ＮＫＸ６．１を発現する複数の細胞を含んでいてもよい。例えば、細胞クラスター中の少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％の細胞は、ＮＫＸ６．１を発現することができる。一部の場合において、細胞クラスター中の少なくとも約５０％の細胞は、ＮＫＸ６．１を発現することができる。一部の場合において、細胞クラスター中の全ての細胞は、ＮＫＸ６．１を発現することができる。
【００５１】
[0084]細胞クラスターは、Ｃ−ペプチドを発現する複数の細胞を含んでいてもよい。例えば、細胞クラスター中の少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の細胞は、Ｃ−ペプチドを発現することができる。一部の場合において、細胞クラスター中の少なくとも約６０％の細胞は、Ｃ−ペプチドを発現することができる。一部の場合において、細胞クラスター中の全ての細胞は、Ｃ−ペプチドを発現することができる。
【００５２】
[0085]細胞クラスターは、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドの両方を発現する複数の細胞を含んでいてもよい。例えば、細胞クラスター中の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の細胞は、Ｃ−ペプチドを発現することができる。一部の場合において、細胞クラスター中の少なくとも約３５％の細胞は、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現することができる。一部の場合において、細胞クラスター中の少なくとも約４０％の細胞は、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現することができる。一部の場合において、細胞クラスター中の少なくとも約３５％の細胞は、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現することができる。一部の場合において、細胞クラスターは、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する約６０％の細胞を含んでいてもよい。一部の場合において、細胞クラスターは、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する約７５％の細胞を含んでいてもよい。一部の場合において、細胞クラスター中の全ての細胞は、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現することができる。
【００５３】
[0086]細胞クラスターは、幹細胞または前駆細胞、例えば、膵臓前駆細胞をごくわずかしか含まないか、まったく含んでいなくてもよい。例えば、本明細書で提供される細胞クラスターは、ＬＩＮ２８を発現する最大で約５％の細胞、最大で約５％の細胞、最大で約５％の細胞、最大で約５％の細胞、最大で約５％の細胞、最大で約２％の細胞、最大で約１％の細胞、最大で約０．５％の細胞、最大で約０．１％の細胞、最大で約０．０５％の細胞、最大で約０．０１％の細胞を含んでいてもよいし、またはＬＩＮ２８を発現する細胞を含んでいなくてもよい。一部の例において、本明細書で提供される細胞クラスターは、Ｋｉ６７を発現する最大で約５％の細胞、最大で約５％の細胞、最大で約５％の細胞、最大で約５％の細胞、最大で約５％の細胞、最大で約２％の細胞、最大で約１％の細胞、最大で約０．５％の細胞、最大で約０．１％の細胞、最大で約０．０５％の細胞、最大で約０．０１％の細胞を含んでいてもよいし、またはＫｉ６７を発現する細胞を含んでいなくてもよい。
【００５４】
[0087]一部の場合において、細胞クラスターは、ＳＯＸ２を発現する最大で３％の細胞、最大で約２％の細胞、最大で約１％の細胞、最大で約０．５％の細胞、最大で約０．１％の細胞、最大で約０．０５％の細胞、最大で約０．０１％の細胞を含んでいてもよいし、またはＳＯＸ２を発現する細胞を含んでいなくてもよい。一部の場合において、細胞クラスターは、ＳＯＸ２を発現する約１％の細胞を含んでいてもよい。一部の場合において、細胞クラスターは、ＳＯＸ２を発現する約０．６％の細胞を含んでいてもよい。一部の場合において、細胞クラスターは、ＳＯＸ２を発現する約０．３％の細胞を含んでいてもよい。一部の場合において、細胞クラスターは、ＳＯＸ２を発現する約０．１％の細胞を含んでいてもよい。
【００５５】
[0088]一部の例において、細胞クラスターは、ＳＯＸ９を発現する最大で１０％の細胞、最大で約８％の細胞、最大で約６％の細胞、最大で約５％の細胞、最大で約２％の細胞、最大で約１％の細胞、最大で約０．５％の細胞、最大で約０．１％の細胞、最大で約０．０５％の細胞、最大で約０．０１％の細胞を含んでいてもよいし、またはＳＯＸ９を発現する細胞を含んでいなくてもよい。一部の場合において、細胞クラスターは、ＳＯＸ９を発現する約２％の細胞を含んでいてもよい。一部の場合において、細胞クラスターは、ＳＯＸ９を発現する約６％の細胞を含んでいてもよい。一部の場合において、細胞クラスターは、ＳＯＸ９を発現する約１．２％の細胞を含んでいてもよい。
【００５６】
[0089]本明細書に記載の細胞クラスターは、グルコース負荷にさらされる場合に１回または複数のインビトロでのグルコース刺激されたインスリン分泌（ＧＳＩＳ）応答を示すことができる。ＧＳＩＳ応答は、内因性膵島のＧＳＩＳ応答に類似していてもよい。一部の場合において、細胞クラスターは、グルコース負荷に対して、インビトロでのＧＳＩＳ応答を示す。一部の場合において、細胞クラスターは、複数回のグルコース負荷に対して、例えば逐次的なグルコース負荷に対してインビトロでのＧＳＩＳ応答を示す。例えば、細胞クラスターは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０回の逐次的なグルコース負荷に対して、インビトロでのＧＳＩＳ応答を示すことができる。
【００５７】
[0090]本明細書で提供される細胞クラスターは、ＧＳＩＳをインビトロで示す少なくとも１つの細胞を含んでいてもよい。例えば、細胞クラスター中の少なくとも１つの細胞は、成熟膵臓β細胞と称することができる。一部の場合において、少なくとも１つの細胞は、非天然膵臓β細胞である。一部の場合において、少なくとも１つの細胞は、天然／内因性β細胞に類似した膵臓β細胞である。一部の場合において、細胞は、インビトロでのグルコース刺激されたインスリン分泌（ＧＳＩＳ）応答を示す。一部の場合において、少なくとも１つの細胞は、少なくとも１回のグルコース負荷に対して、ＧＳＩＳ応答を示す。一部の場合において、細胞は、少なくとも２回の逐次的なグルコース負荷に対して、ＧＳＩＳ応答を示す。一部の場合において、細胞は、少なくとも３回の逐次的なグルコース負荷に対して、ＧＳＩＳ応答を示す。
【００５８】
[0091]本明細書で提供されるように、細胞クラスターは、内因性膵島に類似したＧＳＩＳ刺激指標を示すことができる。細胞クラスターまたは細胞の刺激指標は、低いグルコース濃度と比較した場合の、高いグルコース濃度に応答して分泌されたインスリンの比率によって特徴付けることができる。例えば、本明細書で提供される細胞クラスターまたは細胞の刺激指標は、２０ｍＭグルコース刺激に応答して分泌されたインスリン対２．８ｍＭグルコース刺激に応答して分泌されたインスリンの比率として計算することができる。一部の例において、本明細書で提供される細胞クラスターまたは細胞の刺激指標は、１より大きいかまたはそれに等しい、または１．１より大きいかまたはそれに等しい、または１．３より大きいかまたはそれに等しい、または２より大きいかまたはそれに等しい、または２．３より大きいかまたはそれに等しい、または２．６より大きいかまたはそれに等しい。いくつかの場合において、細胞クラスターまたは細胞は、サイトカインに応答して、サイトカイン誘導アポトーシスを示す。一部の場合において、サイトカインは、インターロイキン−β（ＩＬ−β）、インターフェロン−γ（ＩＮＦ−γ）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、またはそれらの任意の組合せを含む。一部の場合において、細胞クラスターまたは細胞からのインスリン分泌は、抗糖尿病剤に応答して強化される。一部の場合において、抗糖尿病剤は、インクレチン模倣剤、スルホニル尿素、メグリチニド、およびそれらの組合せからなる群から選択される分泌促進剤を含む。一部の場合において、細胞クラスターまたは細胞は、単一ホルモン性（ｍｏｎｏｈｏｒｍｏｎａｌ）である。一部の場合において、細胞クラスターまたは細胞は、内因性成熟膵臓β細胞の形態に類似した形態を示す。一部の場合において、細胞クラスターまたは細胞は、電子顕微鏡下で、内因性成熟膵臓β細胞のインスリン顆粒に類似した、封入された結晶性インスリン顆粒を示す。一部の場合において、細胞クラスターまたは細胞は、低い速度の複製を示す。一部の場合において、細胞クラスターまたは細胞は、内因性成熟膵臓β細胞のＧＳＣＦに類似したグルコース刺激されたＣａ２＋フラックス（ＧＳＣＦ）を示す。一部の場合において、細胞クラスターまたは細胞は、少なくとも１回のグルコース負荷に対してＧＳＣＦ応答を示す。一部の場合において、細胞クラスターまたは細胞は、少なくとも２回のグルコース負荷に対してＧＳＣＦ応答を示す。一部の場合において、細胞クラスターまたは細胞は、少なくとも３回のグルコース負荷に対してＧＳＣＦ応答を示す。一部の場合において、細胞クラスターまたは細胞は、カルシウムフラックスの増加を示す。一部の場合において、カルシウムフラックスの増加は、高いグルコース濃度に比べて、低いグルコース濃度での流入の量または流入の比率の増加を含む。
【００５９】
[0092]本明細書で提供される細胞クラスターは、内因性膵島、例えばヒト膵島と同様に高いグルコース濃度刺激に応答して、二相性インスリン分泌を示すことができる。二相性インスリン分泌は、内因性膵島、例えばヒト膵島に特徴的な現象であり得る。図２８で実証されたように、高いグルコース濃度での負荷、例えば、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、または３０ｍＭでの負荷に応答して、本明細書で提供される細胞クラスター、例えば再凝集した膵臓細胞クラスターは、インスリン分泌におけるピーク値への過渡的な増加を示し、それに続いて、相対的に高いインスリン分泌レベルへの急速な減少、例えば、より低いグルコース濃度、例えば２．８ｍＭのグルコースに応答したインスリン分泌レベルより高いレベルへの急速な減少を示すことができる。このような過渡的な増加および減少プロセスは、二相性インスリン分泌パターンの第１の相と呼ぶことができる。したがって、持続的な高いグルコース負荷により、第１の相に続いて、細胞クラスターによるインスリン分泌を相対的に上昇したレベルで維持できる第２の相をもたらすことができる。第２の相は、長期間にわたり、例えば、高いグルコース濃度の負荷が継続する限り、または相対的に第１の相より長く、継続することができる。このような二相性インスリン分泌パターンは、成熟天然膵臓β細胞に特徴的な固有の細胞内シグナル伝達の変化に起因する可能性がある。
【００６０】
[0093]細胞クラスターは、対象に移植される場合、グルコース負荷にさらされる場合、１回または複数のインビボでのＧＳＩＳ応答を示すことができる。本明細書に記載の細胞クラスターは、対象に移植した後の短い期間内に、インビボでのＧＳＩＳ応答を示す能力を持ち得る。例えば、細胞クラスターは、移植後の約６、１２、または２４時間以内に、インビボでのＧＳＩＳを示すことができる。一部の場合において、細胞クラスターは、移植後の約２日、４日、６日、８日、１０日、１２日、１４日、２１日、２８日、３５日、または４２日以内に、インビボでのＧＳＩＳを示す。細胞クラスターによって分泌されたインスリンの量は、内因性膵島と類似していてもよいし、またはそれより高くてもよい。用語「約」は、本出願にわたり使用される参照数値に関して、その値からプラスまたはマイナス１０％の値の範囲を含み得る。例えば、「約１０」という量は、９から１１の量を含む。例えば、用語「約」はまた、参照数値に関して、その値からプラスまたはマイナス１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％の値の範囲を含み得る。
【００６１】
[0094]細胞クラスターは、対象に移植した後の所定期間にわたり、インビボでのＧＳＩＳ応答を示す能力を維持することができる。例えば、細胞クラスターのインビボでのＧＳＩＳ応答は、対象（例えば、ヒト）に細胞クラスターを移植した後、少なくとも２週間まで、３週間まで、４週間まで、５週間まで、１０週間まで、１５週間まで、２０週間まで、６カ月まで、７カ月まで、８カ月まで、９カ月まで、１０カ月まで、１１カ月まで、１年まで、２年まで、３年まで、４年まで、５年まで、１０年まで、２０年まで、３０年まで、４０年まで、６０年まで、８０年まで、または１００年まで観察することができる。
【００６２】
[0095]細胞クラスターのＧＳＩＳは、刺激指標によって測定することができる。細胞クラスターの刺激指標は、低いグルコース濃度に応答して分泌されたインスリンと比較した場合の、高いグルコース濃度に応答して分泌されたインスリンの比率に等しくてもよい。細胞クラスターは、内因性膵島に類似した刺激指標を有していてもよい。一部の場合において、細胞クラスターは、少なくとも１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、または５．０の刺激指標を有する。
【００６３】
[0096]グルコース負荷（例えば、高濃度の、例えば２０ｍＭのグルコース）に応答して細胞クラスターによって分泌されたインスリンの量は、細胞１０３個当たり約０．１μＩＵから細胞１０３個当たり約５μＩＵ、細胞１０３個当たり約０．２μＩＵから細胞１０３個当たり約４μＩＵ、細胞１０３個当たり約０．２μＩＵから細胞１０３個当たり約３μＩＵ、または細胞１０３個当たり約０．２３μＩＵから細胞１０３個当たり約２．７μＩＵの範囲であってもよい。一部の場合において、グルコース負荷（例えば、高濃度の、例えば２０ｍＭのグルコース）に応答して細胞クラスターによって分泌されたインスリンの量は、細胞１０３個当たり、少なくとも０．０５、０．１、０．１５、０．２、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４、０．２５、０．２６、０．２７、０．２８、０．２９、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、または３μＩＵである。
【００６４】
[0097]細胞クラスターは、プロインスリンとインスリンの両方を分泌することができる。例えば、細胞クラスターは、内因性膵島によって分泌されたインスリンに対するプロインスリンの比率と実質的に同じインスリンに対するプロインスリンの比率で、プロインスリンおよびインスリンを分泌することができる。一部の場合において、細胞クラスターは、約０．０１から約０．０５、約０．０２から約０．０４、約０．０２から約０．０３、または０．０２９から約０．０３１のインスリンに対するプロインスリンの比率で、プロインスリンおよびインスリンを分泌する。一部の場合において、細胞クラスターは、約０．０２、０．０２１、０．０２２、０．０２３、０．０２４、０．０２５、０．０２６、０．０２７、０．０２８、０．０２９、０．０３、０．０３１、０．０３２、０．０３３、０．０３４、０．０３５、０．０３６、０．０３７、０．０３８、０．０３９、または０．０４のインスリンに対するプロインスリンの比率で、プロインスリンおよびインスリンを分泌する。
【００６５】
[0098]細胞クラスターは、内因性膵島に類似したサイズであり得る。例えば、細胞クラスターは、内因性膵島に類似した直径を有していてもよい。細胞クラスターの直径は、細胞クラスターの表面上の２つの点の間の最も大きい直線距離を指す場合がある。一部の場合において、細胞クラスターの直径は、最大で３００μｍ、２００μｍ、１５０μｍ、１００μｍ、９０μｍ、８０μｍ、７０μｍ、６０μｍ、５０μｍ、または４０μｍである。細胞クラスターの直径は、約７５μｍから約２５０μｍであってもよい。細胞クラスターの直径は、最大で１００μｍであってもよい。
【００６６】
[0099]細胞クラスターは、死細胞をごくわずかしか含まないか、またはまったく含んでいなくてもよい。細胞クラスターは、周囲の環境から細胞クラスターのコアへの分子（例えば、栄養およびガス）の有効な拡散を可能にするサイズであってもよい。拡散した分子は、コア中での細胞の生存および機能にとって重要な場合がある。一部の場合において、細胞クラスターは、約１％未満、２％未満、３％未満、４％未満、５％未満、６％未満、７％未満、８％未満、９％未満、１０％未満の死細胞、例えばそのコア中の死細胞を有していてもよい。一部の場合において、細胞クラスターは、死細胞を有していなくてもよい。死細胞は、アポトーシス細胞、麻酔性細胞（ｎａｒｃｏｔｉｃ  ｃｅｌｌ）またはそれらの任意の組合せであってもよい。
【００６７】
[0100]細胞クラスターは、１つまたは複数のタイプの細胞を含んでいてもよい。一部の場合において、細胞クラスターは、１つまたは複数のタイプの膵臓細胞を含む。例えば、細胞クラスターは、１種または複数の膵臓β細胞、膵臓α細胞、膵臓Δ細胞、膵臓γ細胞、およびそれらの任意の組合せを含んでいてもよい。一部の場合において、膵臓細胞は、非天然膵臓細胞、例えば幹細胞由来の細胞、例えばＥＳＣおよび／またはｉＰＳＣであってもよい。一部の場合において、細胞クラスターはまた、成熟膵臓細胞の１つまたは複数の前駆細胞、例えば、ｉＰＳＣ、ＥＳＣ、胚体内胚葉細胞、原始消化管細胞、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞、Ｐｄｘ１陽性／ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞、Ｎｇｎ３陽性内分泌前駆細胞、およびそれらの任意の組合せなどを含んでいてもよい。
【００６８】
[0101]細胞クラスターは、サイトカインに応答して、サイトカイン誘導アポトーシスを示すことができる。例えば、細胞クラスターは、インターロイキン−１β（ＩＬ−β）、インターフェロン−γ（ＩＮＦ−γ）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、およびそれらの組合せなどのサイトカインに応答して、サイトカイン誘導アポトーシスを示すことができる。
【００６９】
[0102]本明細書に記載の細胞クラスターからのインスリン分泌は、抗糖尿病薬（例えば、エクスビボ、インビトロ、および／またはインビボで膵臓β細胞に作用する抗糖尿病薬）によって強化することができる。本開示は、任意の公知の抗糖尿病薬を予期することができる。一部の場合において、細胞クラスターからのインスリン分泌は、分泌促進剤によって強化することができる。分泌促進剤は、インクレチン模倣剤、スルホニル尿素、メグリチニド、およびそれらの組合せであってもよい。
【００７０】
[0103]細胞クラスターは、単一ホルモン性細胞を含んでいてもよい。例えば、細胞クラスターは、単一ホルモン性の膵臓細胞（例えば、膵臓β細胞、膵臓α細胞、膵臓β細胞、膵臓Δ細胞、または膵臓γ細胞）を含んでいてもよい。一部の場合において、細胞クラスターは、単一ホルモン性のインスリン分泌性非天然膵臓細胞を含む。細胞クラスターは、多ホルモン性（ｐｏｌｙｈｏｒｍｏｎａｌ）細胞を含んでいてもよい。一部の場合において、細胞クラスターは、単一ホルモン性細胞および多ホルモン性細胞を含む。
【００７１】
[0104]細胞クラスターは、内因性成熟膵臓β細胞の形態に類似した形態を有する細胞（例えば、非天然膵臓細胞）を含んでいてもよい。一部の場合において、細胞クラスターは、例えば電子顕微鏡によって検出した場合、内因性成熟膵臓β細胞のインスリン顆粒に類似した結晶性インスリン顆粒を封入した細胞を含んでいてもよい。細胞クラスターは、内因性成熟膵臓β細胞の形態に類似した形態を有する複数の細胞を含んでいてもよい。例えば、細胞クラスター中の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％の細胞が、内因性成熟膵臓β細胞のインスリン顆粒に類似した結晶性インスリン顆粒を封入することができる。一部の場合において、細胞クラスター中の１００％の細胞が、内因性成熟膵臓β細胞のインスリン顆粒に類似した結晶性インスリン顆粒を封入する。
【００７２】
[0105]細胞クラスターは、１回または複数のグルコース負荷に対して、グルコースによって刺激されたカルシウム（Ｃａ２＋）フラックスを示すことができる。一部の場合において、細胞クラスターは、内因性膵島のＧＳＣＦに類似したグルコースによって刺激されたＣａ２＋フラックス（ＧＳＣＦ）を示す。一部の場合において、細胞クラスターは、複数回のグルコース負荷に対する内因性膵島のＧＳＣＦ応答に類似した方式で、少なくとも１、２、３、４、５、６、８、または１０回の逐次的なグルコース負荷に対してＧＳＣＦ応答を示す。細胞クラスターは、グルコース負荷にさらされる場合、インビトロおよび／またはインビボでのＧＳＣＦ応答を示し得る。
【００７３】
[0106]細胞クラスターは、任意の種に由来する細胞を含んでいてもよい。例えば、細胞クラスターは、哺乳類種由来の細胞を含んでいてもよく、哺乳類の非限定的な例としては、マウス、ウシ、サル、ブタ、ウマ科動物、ヒツジ、またはヒト細胞などが挙げられる。一部の場合において、細胞クラスター中の少なくとも１つの細胞が、ヒト細胞である。
【００７４】
[0107]本明細書で提供されるものとしては、本出願にわたり開示された細胞クラスターを含む組成物も挙げられる。組成物は、細胞クラスターに加えて、対象に細胞クラスターを移植するのに使用できる足場またはマトリックスをさらに含んでいてもよい。足場は、細胞クラスターをそこに接着させるための構造を提供することができる。細胞クラスターは、足場と共に対象に移植することができる。足場は、生分解性であってもよい。一部の場合において、足場は、生分解性ポリマーを含む。生分解性ポリマーは、合成ポリマーであってもよく、例えば、ポリ（ラクチド）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、および他のポリヒドロキシ酸、ポリ（カプロラクトン）、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリ無水物、ポリホスファゼン、ポリアミノ酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリシアノアクリレート、ならびに生分解性ポリウレタンなどであってもよい。生分解性ポリマーはまた、天然ポリマーであってもよく、例えば、アルブミン、コラーゲン、フィブリン、ポリアミノ酸、プロラミン、および多糖（例えば、アルギネート、ヘパリン、および他の天然に存在する糖単位の生分解性ポリマー）などであってもよい。代替として、足場は、非生分解性であってもよい。例えば、足場は、非生分解性ポリマーを含んでいてもよく、例えば、ポリアクリレート、エチレン−酢酸ビニルポリマーおよび他のアシル置換酢酸セルロースならびにそれらの誘導体、ポリウレタン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニル、ポリ（ビニルイミダゾール）、クロロスルホン化ポリオレフィン、ならびにポリエチレンオキシドを含んでいてもよい。
【００７５】
[0108]ＩＩＩ  医薬組成物
[0109]一部の場合において、本開示は、疾患（例えば、糖尿病）を処置するための様々な方法で非天然膵臓ベータ細胞集団ならびに細胞の要素および生成物を利用できる医薬組成物を提供する。特定の場合において、生細胞（例えば、単独の、または他の細胞型と混合された、非天然膵臓ベータ細胞）を含む医薬組成物が包含される。他の場合において、非天然膵臓ベータ細胞の要素（例えば、細胞溶解産物、可溶性細胞画分、馴化培地、ＥＣＭ、または前述のもののいずれかの要素）または生成物（例えば、非天然膵臓ベータ細胞によって、または遺伝学的改変を介して産生された栄養性および他の生物学的な因子、非天然膵臓ベータ細胞培養からの馴化培地）を含む医薬組成物が包含される。いずれの場合においても、医薬組成物は、他の活性薬剤、例えば抗炎症剤、外因性小分子アゴニスト、外因性小分子アンタゴニスト、抗アポトーシス剤、抗酸化剤、および／または当業者公知の増殖因子をさらに含んでいてもよい。
【００７６】
[0110]本開示の医薬組成物は、医薬的に許容される担体（例えば培地または賦形剤）と共に製剤化された、非天然膵臓ベータ細胞、またはその要素もしくは生成物を含んでいてもよい。医薬的に許容される担体（または培地）という用語は、生体適合性の担体または培地という用語と同義的に使用することができ、治療のために投与される細胞および他の薬剤に適合するだけでなく、過剰な毒性、刺激、アレルギー性応答、または他の合併症を起こすことなくヒトおよび動物の組織と接触して使用するのにも好適な、試薬、細胞、化合物、材料、組成物、および／または剤形を指す。好適な医薬的に許容される担体としては、水、塩溶液（例えばリンゲル液）、アルコール、油、ゼラチン、および炭水化物、例えばラクトース、アミロース、またはデンプン、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、およびポリビニルピロリジン（ｐｙｒｏｌｉｄｉｎｅ）を挙げることができる。このような製剤は、滅菌されていてもよいし、必要に応じて、潤滑剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与えるための塩、緩衝液、および着色剤などの補助剤と混合されていてもよい。細胞性の要素または生成物を含むが生細胞を含まない医薬組成物は、液体として製剤化することができる。生きた非天然膵臓ベータ細胞を含む医薬組成物は、液体、半固体（例えば、ゲル、ゲルカプセル、またはリポソーム）または固体（例えば、マトリックス、足場など）として製剤化することができる。
【００７７】
[0111]医薬組成物は、当業者によく知られていると予想される補助成分を含んでいてもよい。例えば、これらは、使用される抗酸化剤の種類に応じて様々な範囲で抗酸化剤を含有していてもよい。一般的に使用される抗酸化剤の適度な範囲は、約０．０１％重量／体積から約０．１５％重量／体積のＥＤＴＡ、約０．０１％重量／体積から約２．０％重量／体積の亜硫酸ナトリウム、および約０．０１％重量／体積から約２．０％重量／体積のメタ重亜硫酸ナトリウムである。当業者は、上記のものそれぞれにつき約０．１％重量／体積の濃度を使用することができる。他の代表的な化合物としては、メルカプトプロピオニルグリシン、Ｎ−アセチルシステイン、ベータ−メルカプトエチルアミン、グルタチオンおよび類似の種が挙げられるが、腎臓投与に好適な他の抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸およびその塩または亜硫酸塩またはメタ重亜硫酸ナトリウムも採用することができる。
【００７８】
[0112]緩衝剤は、標的組織での刺激を最小化するように、配合物のｐＨを約４．０から約８．０の範囲に維持するのに使用することができる。直接の腹膜内注射の場合、配合物は、ｐＨ７．２から７．５であるべきであり、好ましくはｐＨ７．３５〜７．４５である。組成物はまた、腎臓への投与に好適な等張化剤を含んでいてもよい。そのなかでも、配合物を血液とほぼ等張にするためには、塩化ナトリウムが好適である。
【００７９】
[0113]特定の場合において、医薬組成物は、粘度増強剤を用いて製剤化される。例示的な粘度増強剤は、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、およびポリビニルピロリドンである。医薬組成物は、必要に応じて添加される共溶媒を有していてもよい。好適な共溶媒としては、グリセリン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリソルベート、プロピレングリコール、およびポリビニルアルコールを挙げることができる。また保存剤が含まれていてもよく、例えば、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、クロロブタノール、酢酸フェニル水銀もしくは硝酸フェニル水銀、チメロサール、またはメチルもしくはプロピルパラベンが挙げられる。
【００８０】
[0114]細胞、細胞要素または細胞生成物を含む医薬組成物は、当業界において公知の数々の送達方法の１つまたは複数で患者の腎臓に送達することができる。一部の場合において、組成物は、腎臓に（例えば、腎被膜上および／または腎被膜の真下に）送達される。別の実施形態において、組成物は、定期的な腹膜内または腎内への注射を介して、腎臓内の様々な場所に送達することができる。代替として、組成物は、当業者公知の他の剤形で、例えば予備形成された、またはその場で形成されたゲルまたはリポソームで適用することもできる。
【００８１】
[0115]半固体または固形担体中に生細胞を含む医薬組成物は、腎被膜上またはその真下への外科的な植え込みのために製剤化することができる。液体組成物も外科手術によって投与できることも理解されるものとする。特定の場合において、半固体または固体医薬組成物は、半透性のゲル、結晶格子、細胞性の足場などを含んでいてもよく、これらは非生分解性であってもよいし、または生分解性であってもよい。例えば、特定の場合において、それらの周囲からの外因性細胞を隔離しながらも、細胞が生体分子（例えば、インスリン）を周囲の細胞または血流に分泌および送達することが可能であることが、望ましいかまたは適切であり得る。これらの場合において、細胞は、移植した宿主組織由来の細胞を物理的に分離する非分解性の、選択的に透過性のバリアによって取り囲まれた、生きた非天然膵臓ベータ細胞または非天然膵臓ベータ細胞を含む細胞集団を含む自律的なインプラントとして製剤化されてもよい。このようなインプラントは、それらが、薬理学的に誘発された免疫抑制の非存在下で、免疫細胞および巨大分子が、移植された細胞を致死させることを防ぐ能力を有することから、「免疫防御性（ｉｍｍｕｎｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ）」と称されることがある。
【００８２】
[0116]他の場合において、様々な分解可能なゲルおよびネットワークを、本開示の医薬組成物のために使用することができる。例えば、持続放出配合物に特に好適な分解可能な材料としては、生体適合性ポリマー、例えばポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、メチルセルロース、ヒアルロン酸、コラーゲンなどが挙げられる。
【００８３】
[0117]他の場合において、生分解性の、好ましくは生体吸収性（ｂｉｏｒｅｓｏｒｂａｂｌｅ）または生体吸収性（ｂｉｏａｂｓｏｒｂａｂｌｅ）の足場またはマトリックス上またはその中に細胞を送達することが望ましいかまたは適切であり得る。これらの典型的には３次元のバイオマテリアルは、足場に付着させた、足場内に分散させた、または足場中に閉じ込められた細胞外マトリックス中に取り込まれた生きた細胞を含有する。これらのインプラントは、体の標的領域に一旦植え込まれると宿主組織と統合されるようになり、そこで移植した細胞が次第に確立されてくる。
【００８４】
[0118]本開示で使用可能な足場またはマトリックス（時には集合的に「フレームワーク」とも称される）材料の例としては、不織布マット、多孔質フォーム、または自己集合ペプチドが挙げられる。例えば、不織布マットは、グリコール酸と乳酸の合成吸収性コポリマー（ＰＧＡ／ＰＬＡ）、フォーム、および／またはポリ（イプシロン−カプロラクトン）／ポリ（グリコール酸）（ＰＣＬ／ＰＧＡ）コポリマーを含む繊維を使用して形成することもできる。
【００８５】
[0119]別の実施形態において、フレームワークは、フェルトであり、これは、生体吸収性材料、例えば、ＰＧＡ、ＰＬＡ、ＰＣＬコポリマーもしくはブレンド、またはヒアルロン酸から作製されるマルチフィラメントヤーンで構成されていてもよい。このようなヤーンは、クリンピング、切断、梳綿および穿刺からなる標準的なテキスタイル加工技術を使用して、フェルト化される。別の実施形態において、細胞は、複合構造であり得るフォーム状の足場上に播種される。上述の場合の多くにおいて、フレームワークは、有用な形状に成形されていてもよい。さらに、非天然膵臓ベータ細胞は、予備形成された非分解性の外科的または植え込み可能なデバイスで培養が可能であることが理解されると予想される。
【００８６】
[0120]マトリックス、足場またはデバイスは、細胞の付着を強化するために、細胞の接種の前に処理されていてもよい。例えば、接種の前に、ナイロンマトリックスを０．１モルの酢酸で処理し、ポリリシン、ＰＢＳ、および／またはコラーゲン中でインキュベートして、ナイロンをコーティングすることができる。ポリスチレンは、硫酸を使用して同様に処理することができる。またフレームワークの外部表面も、例えば、フレームワークを血漿でコーティングすることによって、または１つまたは複数のタンパク質（例えば、コラーゲン、弾性線維、細網線維）、糖タンパク質、グリコサミノグリカン（例えば、ヘパリン硫酸（ｈｅｐａｒｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）、コンドロイチン−４−硫酸、コンドロイチン−６−硫酸、デルマタン硫酸、ケラチン硫酸）、細胞性マトリックス、および／または他の材料、例えばこれらに限定されないが、なかでも特に、ゼラチン、アルギネート、寒天、アガロース、および植物ゴムなどの添加によって、細胞の付着または増殖および組織の分化を改善するように改変することができる。
【００８７】
一態様において、本開示は、少なくとも１つの膵臓β細胞を含む細胞クラスターを含むデバイスを提供する。本明細書で提供されるデバイスは、対象に植え込まれるとインスリンを産生および放出するように構成されていてもよい。デバイスは、少なくとも１つの膵臓β細胞、例えば非天然膵臓β細胞を含む細胞クラスターを含んでいてもよい。デバイス中の細胞クラスターは、インビトロでＧＳＩＳを示すことができる。デバイスは、半透膜をさらに含んでいてもよい。半透膜は、デバイス中に細胞クラスターを保持し、細胞クラスターによって分泌されたインスリンの通過を許容するように構成されていてもよい。デバイスの一部の場合において、細胞クラスターは、半透膜によって封入されていてもよい。封入は、当業者が利用可能な任意の技術によって実行することができる。半透膜はまた、当業者の認識および検証通りと予想される任意の好適な材料で作製することもできる。例えば、半透膜は、多糖またはポリカチオンで作製されていてもよい。一部の場合において、半透膜は、ポリ（ラクチド）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、および他のポリヒドロキシ酸、ポリ（カプロラクトン）、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリ無水物、ポリホスファゼン、ポリアミノ酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリシアノアクリレート、生分解性ポリウレタン、アルブミン、コラーゲン、フィブリン、ポリアミノ酸、プロラミン、アルギネート、アガロース、ゼラチンを含むアガロース、デキストラン、ポリアクリレート、エチレン−酢酸ビニルポリマーおよび他のアシル置換酢酸セルロースならびにそれらの誘導体、ポリウレタン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニル、ポリ（ビニルイミダゾール）、クロロスルホン化ポリオレフィン、ポリエチレンオキシド、または任意のそれらの組合せで作製されていてもよい。一部の場合において、半透膜は、アルギネートを含む。一部の場合において、細胞クラスターは、半透膜によって取り囲まれたアルギネートコアを含むマイクロカプセル中に封入される。一部の場合において、アルギネートコアは、例えば、ＲＧＤ配列（アルギニン、グリシン、アスパラギン酸）を有するオリゴペプチドと共有結合でコンジュゲートしたアルギネートコアを含む足場が産生されるように改変される。一部の場合において、アルギネートコアは、例えば、強化された安定性を有する化学酵素的に操作されたアルギネートを含む共有結合で補強されたマイクロカプセルが産生されるように改変される。一部の場合において、アルギネートコアは、例えば、アクリル酸で官能化したリン脂質のその場での重合によって組み立てられた膜模倣フィルムが産生されるように改変される。一部の場合において、マイクロカプセルは、エピメラーゼを使用して酵素的に改変されたアルギネートで構成される。一部の場合において、マイクロカプセルは、マイクロカプセル膜の隣接する層間の共有結合による連結を含む。一部の実施形態において、マイクロカプセルは、フェノール部分とカップリングされたアルギネートを含むサブシーブサイズのカプセルを含む。一部の場合において、マイクロカプセルは、アルギネート−アガロースを含む足場を含む。一部の場合において、ＳＣ−β細胞は、アルギネート内に封入される前に、ＰＥＧで改変される。一部の場合において、細胞、例えばＳＣ−β細胞の単離された集団は、光反応性のリポソームおよびアルギネート中に封入される。マイクロカプセルで採用されるアルギネートは、他の好適なバイオマテリアル、例えば、これらに限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、キトサン、ポリエステル中空糸、コラーゲン、ヒアルロン酸、ＲＯＤ、ＢＨＤおよびポリエチレングリコールジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）を含むデキストラン、ポリ（ＭＰＣ−ｃｏ−ｎ−ブチルメタクリル酸−ｃｏ−４−ビニルフェニルボロン酸）（ＰＭＢＶ）およびポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、アガロース、ゼラチンを含むアガロース、ならびにこれらが多層になったものなどで置き換えることができることが理解されるものとする。
【００８８】
[0121]ＩＶ  細胞クラスターを作製するための方法
[0122]さらに、内因性組織または細胞クラスター、例えば内因性膵島に類似した機能および特徴を有する細胞クラスターを作製するための方法が本明細書で開示される。本方法は、第１の細胞クラスターを解離させるステップ、および解離した細胞を、第２の細胞クラスターに再凝集させるステップを含んでいてもよく、第２の細胞クラスターは、第１の細胞クラスターと比較して、内因性組織または細胞クラスター、例えば内因性膵島により類似性の高い機能および特徴を有する。本明細書で使用される用語「再凝集すること」およびその文法上同等の表現は、クラスターがより小さいクラスターまたは単一の細胞に解離し、次いで解離した細胞が、新しい細胞間の接触を形成し、新しいクラスターを形成することを指す場合がある。本方法は、ａ）第１の細胞クラスターから、複数の細胞を解離させるステップ；およびｂ）ａ）からの複数の細胞を、培地中で培養し、それによって複数の細胞から第２の細胞クラスターを形成するステップによって、インビトロで細胞クラスターを産生するために使用することができる。一部の場合において、第２の細胞クラスターは、インビトロの細胞クラスターである。第１の細胞クラスターは、インビトロの細胞クラスター、例えば、インビトロにおいて培養培地中で単一の細胞を懸濁することによって形成されたクラスターであってもよい。一部の場合において、第１の細胞クラスターは、エクスビボの細胞クラスター、例えば、生きた生物の体内で形成され、前記生物から単離される細胞クラスターであってもよい。例えば、本明細書で提供される方法が適用可能な第１の細胞クラスターは、ヒト膵島であってもよい。一部の場合において、第１の細胞クラスターは、死体の膵島であってもよい。
【００８９】
[0123]本明細書で提供される方法は、細胞クラスター中の膵臓細胞、例えば、膵臓β細胞、内分泌細胞、または内分泌前駆細胞を濃縮することができる。一部の例において、本方法は、細胞クラスターから、幹細胞または膵臓前駆細胞を低減したり、またはなくしたりすることができる。一部の場合において、第２の細胞クラスターは、第１の細胞クラスターと比較して、クロモグラニンＡを発現するより高いパーセンテージの細胞を含む。一部の場合において、第２の細胞クラスターは、第１の細胞クラスターと比較して、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現するより高いパーセンテージの細胞を含む。一部の場合において、第２の細胞クラスターは、第１の細胞クラスターと比較して、ＳＯＸ２を発現するより低いパーセンテージの細胞を含む。一部の場合において、第２のインビトロの細胞クラスターは、第１の細胞クラスターと比較して、ＳＯＸ９を発現するより低いパーセンテージの細胞を含む。
【００９０】
[0124]一部の場合において、培地は、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤およびトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）シグナル伝達経路阻害剤を含む。一部の場合において、培地は、ａ）血清、ならびにｂ）甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤およびＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤の一方または両方を含む。一部の場合において、本明細書で提供される再凝集のための培地（再凝集培地）は、小分子化合物を含んでいなくてもよい。例えば、再凝集培地は、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤を含んでいなくてもよい。一部の場合において、再凝集培地は、トリヨードチロニン（Ｔ３）を含まないか、または極めてわずかな量のＴ３を含む。再凝集培地は、ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害剤を含んでいなくてもよい。一部の場合において、再凝集培地は、Ａｌｋ５阻害剤（Ａｌｋ５ｉ）を含まないか、または極めてわずかな量のＡｌｋ５ｉを含む。
【００９１】
[0125]第１の細胞クラスターの解離は、当業界において公知の方法を使用して実行することができる。細胞クラスターを解離させるための非限定的な例示的方法としては、物理的な力（例えば、機械的な解離、例えば細胞スクレーパー、狭い内径のピペットを介した粉砕、細針吸引生検、ボルテックスによる脱凝集、および微細なナイロンまたはステンレス鋼メッシュを介した強制ろ過など）、例えばトリプシン、コラゲナーゼ、ＴｒｙｐＬＥ（商標）などの酵素を使用した酵素による解離、またはそれらの組合せが挙げられる。解離の後、第１の細胞クラスター由来の細胞は、細胞懸濁液、例えば、単一の細胞の懸濁液中にあってもよい。本明細書で使用される用語「懸濁液」は、細胞が固体支持体に付着していない細胞培養物の状態を指す場合がある。懸濁液中で増殖する細胞は、当業者周知の器具を使用して増殖させながら撹拌することができる。
【００９２】
[0126]一部の場合において、本明細書で提供される方法は、活性セルソーティングプロセス、例えば、フローサイトメトリーを含まない。一部の場合において、本明細書に記載される細胞クラスターは、ソートされていない細胞クラスターであってもよい。一部の場合において、本明細書で提供される方法は、第１の細胞クラスター中の特定のタイプの細胞の濃縮または消去のために、活性セルソーティングを頼らない。一部の場合において、方法は単に、第１の細胞クラスターを解離させるステップ、および第１の細胞クラスターから解離した複数の細胞を培地中で培養し、それによって第２の細胞クラスターを形成させるステップを必要とする。
【００９３】
[0127]一部の場合において、本明細書で提供される方法を適用して、細胞クラスターを解離し、１回より多く新しいクラスターに再凝集させることができる。例えば、本明細書で提供される方法に従って、第１の細胞クラスターを解離および再凝集させて、第２の細胞クラスターを形成することができ、さらに、第２の細胞クラスターを解離および再凝集させて、第３の細胞クラスターを形成することができ、以降同様である。本明細書で提供される再凝集は、細胞クラスターに、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回逐次的に実行することができる。
【００９４】
[0128]本明細書に記載されるセルソーティングは、細胞のサイズ、形状（形態）、表面タンパク質発現、内因性シグナルタンパク質発現、またはそれらの任意の組合せの相違を頼りにして、複数の細胞から所定の細胞群を単離するプロセスを指す場合がある。一部の場合において、セルソーティングは、細胞をフローサイトメトリーに供することを含む。フローサイトメトリーは、レーザーまたはインピーダンスベースの生物物理学的な技術であり得る。フローサイトメトリー中、流体のストリーム中に細胞を懸濁し、それらを電子検出器具に通過させることができる。フローサイトメトリーの１つのタイプである、細胞の光学特性の１つまたは複数のパラメーター（例えば、レーザー励起時の放出波長）に基づく蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）において、フローサイトメトリーを使用して、目的の細胞を物理的に分離することによって、それを精製することができる。本明細書に記載される場合、ソートされていない細胞クラスターは、活性セルソーティングプロセス、例えばフローサイトメトリーに供されていない複数の細胞によって形成された細胞クラスターであってもよい。ソートされていない細胞クラスターは、一部の場合、「再凝集した細胞クラスター」と称され、これは、既存の細胞クラスターから解離した複数の細胞によって形成することができ、新しい細胞クラスターに再凝集する前、本明細書で提供される再凝集のための１つまたは複数の特定の細胞型を単離するために、活性セルソーティングプロセス、例えばフローサイトメトリーまたは他の方法は行われなくてもよい。一部の場合において、本明細書で論じられるフローサイトメトリーは、細胞で発現される１つまたは複数のシグナルペプチドに基づいていてもよい。例えば、細胞クラスターは、シグナルペプチド（例えば、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはｔｄＴｏｍａｔｏ）を発現する細胞を含んでいてもよい。一部の場合において、シグナルペプチドは、細胞におけるインスリン発現のインジケーターとして発現される。例えば、細胞クラスターは、インスリンプロモーターの制御下にＧＦＰをコードする外因性核酸配列を内包する細胞を含んでいてもよい。インスリンプロモーターは、内因性または外因性プロモーターであってもよい。一部の場合において、これらの細胞におけるＧＦＰの発現は、前記細胞におけるインスリン発現の指標であり得る。したがってＧＦＰシグナルは、膵臓β細胞のマーカーであり得る。一部の場合において、本明細書に記載されるセルソーティングは、磁気活性化フローサイトメトリーを含んでいてもよく、この場合、異なるタイプの細胞を標識するのに磁気抗体または他のリガンドが使用され、磁気特性の相違をセルソーティングに使用することができる。
【００９５】
[0129]第１の細胞クラスターから解離した細胞を、第２の細胞クラスターに再凝集させるために、培地中で培養することができる。培地は、Ｃｏｎｎｏｕｇｈｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  １０６６補充膵島培地（ＣＭＲＬＳ）を含んでいてもよい。一部の場合において、好適な培養培地は、ＣＭＲＬＳの要素（例えば、補充された亜鉛）を含む。ＣＭＲＬＳに、例えば、血清（例えば、ヒト血清、ヒト血小板溶解産物、ウシ胎児血清、または血清代替物、例えばノックアウト血清代替物（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ））を補充することができる。
【００９６】
[0130]培地は、細胞中の特定のシグナル伝達経路を調節する１種または複数の化合物を含んでいてもよい。例えば、培地は、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）シグナル伝達経路阻害剤、またはその両方を含んでいてもよい。
【００９７】
[0131]本明細書において使用される培地中の甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤は、トリヨードチロニン（Ｔ３）であってもよい。一部の場合において、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤は、Ｔ３の類似体または誘導体であってもよい。Ｔ３の非限定的な例示的な類似体としては、選択的および非選択的なチロミメティック（ｔｈｙｒｏｍｉｍｅｔｉｃ）、ＴＲβ選択的アゴニスト−ＧＣ−１、ＧＣ−２４，４−ヒドロキシ−ＰＣＢ１０６、ＭＢ０７８１１、ＭＢ０７３４４，３，５−ジヨードチロプロピオン酸（ＤＩＴＰＡ）；選択的ＴＲ−βアゴニストＧＣ−１；３−ヨードチロナミン（Ｔ（１）ＡＭ）および３，３’，５−トリヨードチロ酢酸（Ｔｒｉａｃ）（ホルモンであるチロキシン（Ｔ（４）の生物活性代謝産物）；ＫＢ−２１１５およびＫＢ−１４１；チロナミン；ＳＫＦ  Ｌ−９４９０１；ＤＩＢＩＴ；３’−ＡＣ−Ｔ２；テトラヨードチロ酢酸（Ｔｅｔｒａｃ）およびトリヨードチロ酢酸（Ｔｒｉａｃ）（チロキシン（Ｔ４）およびトリヨードチロニン（Ｔ３）アラニン鎖の酸化性脱アミノおよび脱炭酸反応を介して）、３，３’，５’−トリヨードチロニン（ｒＴ３）（Ｔ４およびＴ３の脱ヨウ素化を介して）、３，３’−ジヨードチロニン（３，３’−Ｔ２）および３，５−ジヨードチロニン（Ｔ２）（Ｔ４、Ｔ３、およびｒＴ３脱ヨウ素化を介して）、ならびに３−ヨードチロナミン（Ｔ１ＡＭ）およびチロナミン（Ｔ０ＡＭ）（Ｔ４およびＴ３の脱ヨウ素化およびアミノ酸脱炭酸反応を介して）、加えて、ＴＨ構造類似体として、例えば３，５，３’−トリヨードチロプロピオン酸（Ｔｒｉｐｒｏｐ）、３，５−ジブロモ−３−ピリダジノン−１−チロニン（Ｌ−９４０９０１）、Ｎ−［３，５−ジメチル−４−（４’−ヒドロキシ−３’−イソプロピルフェノキシ）−フェニル］−オキサミン酸（ＣＧＳ２３４２５）、３，５−ジメチル−４−［（４’−ヒドロキシ−３’−イソプロピルベンジル）−フェノキシ］酢酸（ＧＣ−１）、３，５−ジクロロ−４−［（４−ヒドロキシ−３−イソプロピルフェノキシ）フェニル］酢酸（ＫＢ−１４１）、および３，５−ジヨードチロプロピオン酸（ＤＩＴＰＡ）が挙げられる。一部の場合において、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤は、Ｔ３のプロドラッグまたはプロホルモン、例えばＴ４甲状腺ホルモン（例えば、チロキシンまたはＬ−３，５，３’，５’−テトラヨードチロニン）である。甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤はまた、その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第７，１６３，９１８号に記載されるヨードチロニン組成物であってもよい。
【００９８】
[0132]培地中の甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤の濃度は、細胞凝集に好適な範囲内であってもよい。一部の場合において、培地中の甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤の濃度は、約０．１μＭから約１０μＭであり、例えば約０．５μＭから約２μＭ、約０．８μＭから約１．５μＭ、約０．９μＭから約１．５μＭ、約０．９μＭから約１．２μＭ、または約０．９μＭから約１．２μＭである。一部の場合において、培地中の甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤の濃度（ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ）は、少なくとも約０．１μＭ、０．２μＭ、０．４μＭ、０．８μＭ、０．９μＭ、１μＭ、１．１μＭ、１．２μＭ、１．３μＭ、１．４μＭ、１．５μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、または１０μＭである。一部の場合において、培地中の甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤（例えば、Ｔ３）の濃度（ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ）は、約１μＭである。
【００９９】
[0133]本明細書において培地中で使用されるＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤は、ＴＧＦ−β受容体Ｉ型キナーゼ（ＴＧＦ−βＲＩ）シグナル伝達の阻害剤であってもよい。ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤は、アクチビン受容体様キナーゼ−５（Ａｌｋ５）阻害剤、例えば、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（ＣＡＳ４４６８５９−３３−２であってもよく、これは、ＴＧＦ−βＲＩキナーゼのＡＴＰ競合的阻害剤であり、ＲｅｐＳｏｘ、ＩＵＰＡＣ名：２−［５−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−１，５−ナフチリジン）としても公知である。一部の場合において、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる米国特許公報第２０１２／００２１５１９号、２０１０／０２６７７３１号、２００９／０１８６０７６号、および２００７／０１４２３７６号に記載されるものを含むＡＬＫ５阻害剤ＩＩの類似体または誘導体である。一部の場合において、本明細書において培地中で使用できるＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤の例としてはまた、Ｄ４４７６、ＳＢ４３１５４２、３−（６−メチル−２−ピリジニル）−Ｎ−フェニル−４−（４−キノリニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボチオアミドとしても公知のＡ−８３−０１；２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジン、Ｗｎｔ３ａ／ＢＩＯ、ＢＭＰ４、ＧＷ７８８３８８（−（４−［３−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］ピリジン（ｐｙｒｉｄｍ）−２−イル｝−Ｎ−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）ベンズアミド）、ＳＭ１６、ＩＮ−１１３０（３−（（５−（６−メチルピリジン−２−イル）−４−（キノキサリン−６−イル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）メチル）ベンズアミド、ＧＷ６６０４（２−フェニル−４−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）ピリジン）、ＳＢ−５０５１２４（２−（５−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イル−２−ｔｅｒｔ−ブチル−３Ｈ−イミダゾール−４−イル）−６−メチルピリジン塩酸塩）、ＳＵ５４１６、レルデリムマブ（ｌｅｒｄｅｌｉｍｕｍｂ）（ＣＡＴ−１５２）、メテリムマブ（ＣＡＴ−１９２）、ＧＣ−１００８、ＩＤ１１、ＡＰ−１２００９、ＡＰ−１１０１４、ＬＹ５５０４１０、ＬＹ５８０２７６、ＬＹ３６４９４７、ＬＹ２１０９７６１、ＳＤ−２０８、ＳＭ１６、ＮＰＣ−３０３４５、ＫＩ２６８９４、ＳＢ−２０３５８０、ＳＤ−０９３、ＡＬＸ−２７０−４４８、ＥＷ−７１９５、ＳＢ−５２５３３４、ＩＮ−１２３３、ＳＫＩ２１６２、グリーベック（Ｇｌｅｅｖｅｃ）、３，５，７，２’，４’−ペンタヒドロキシフラボン（ｐｅｎｔａｈｙｄｒｏｘｙｆｉａｖｏｎｅ）（モリン）、アクチビン−Ｍ１０８Ａ、Ｐ１４４、可溶性ＴＢＲ２−Ｆｃ、ピリミジン誘導体およびインドリノンも挙げられる。ＴＧＦ−β／アクチビン経路の阻害は、類似の作用を有する場合がある。したがって、ＴＧＦ−β／アクチビン経路の任意の阻害剤（例えば、上流または下流）は、本明細書に記載されるＴＧＦ−β／ＡＬＫ５阻害剤と組み合わせて、またはその代わりに使用することができる。例示的なＴＧＦ−��／アクチビン経路阻害剤としては、これらに限定されないが、ＴＧＦ−β受容体阻害剤、ＳＭＡＤ２／３リン酸化の阻害剤、ＳＭＡＤ２／３とＳＭＡＤ４との相互作用の阻害剤、ならびにＳＭＡＤ６およびＳＭＡＤ７の活性化剤／アゴニストが挙げられる。さらに、本明細書に記載される分類は単に系統化する目的のためであり、当業者であれば、化合物が経路内の１つまたは複数のポイントで影響を与える可能性があり、したがって化合物は、定義されたカテゴリーの１つより多くで機能し得ることをわかっていると予想される。ＴＧＦ−β受容体阻害剤としては、全般的にＴＧＦシグナル伝達の任意の阻害剤、またはＴＧＦ−β受容体（例えば、ＡＬＫ５）に特異的な阻害剤を挙げることができ、これは、ＴＧＦ−β受容体に対する抗体、ＴＧＦ−β受容体のドミナントネガティブバリアント、ならびにＴＧＦ−β受容体の発現を抑制するｓｉＲＮＡおよびアンチセンス核酸を含み得る。
【０１００】
[0134]培地中のＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤の濃度は、細胞凝集に好適な範囲内であってもよい。一部の場合において、培地中のＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤の濃度は、約１μＭから約５０μＭ、例えば約５μＭから約１５μＭ、約８μＭから約１２μＭ、または約９μＭから約１１μＭである。一部の場合において、培地中のＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤の濃度（ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ）は、少なくとも約１μＭ、５μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭである。一部の場合において、培地中のＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤（例えば、Ａｌｋ５阻害剤ＩＩ）の濃度（ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ）は、約１０μＭである。
【０１０１】
[0135]第１の細胞クラスターから解離した細胞を培養するのに使用される培地は、ゼノフリーであってもよい。動物に由来する細胞および／または細胞クラスターを培養するためのゼノフリー培地は、他の動物由来の生成物を含まないものであり得る。一部の場合において、ヒト細胞および／または細胞クラスターを培養するためのゼノフリー培地は、いずれの非ヒト動物由来の生成物も含まないものであり得る。例えば、ヒト細胞および／または細胞クラスターを培養するためのゼノフリー培地は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）の代わりに、ヒト血小板溶解産物（ＰＬＴ）を含んでいてもよい。例えば、培地は、約１％から約２０％、約５％から約１５％、約８％から約１２％、約９から約１１％の血清を含んでいてもよい。一部の場合において、培地は、約１０％の血清を含んでいてもよい。一部の場合において、培地は、小分子および／またはＦＢＳ非含有であってもよい。例えば、培地は、２％ＢＳＡが補充されたＭＣＤＢ１３１基礎培地を含んでいてもよい。一部の場合において、培地は、無血清である。一部の例において、培地は、外因性小分子もしくはシグナル伝達経路アゴニストもしくはアンタゴニスト、例えば、線維芽細胞増殖因子ファミリー由来の増殖因子（ＦＧＦ、例えばＦＧＦ２、ＦＧＦ８Ｂ、ＦＧＦ１０、またはＦＧＦ２１）、ソニックヘッジホッグアンタゴニスト（例えばＳａｎｔ１、Ｓａｎｔ２、Ｓａｎｔ４、Ｓａｎｔ４、Ｃｕｒ６１４１４、フォルスコリン、トマチジン、ＡＹ９９４４、トリパラノール、シクロパミン、またはそれらの誘導体）、レチノイン酸シグナル伝達アゴニスト（例えば、レチノイン酸、ＣＤ１５３０、ＡＭ５８０、ＴＴＨＰＢ、ＣＤ４３７、Ｃｈ５５、ＢＭＳ９６１、ＡＣ２６１０６６、ＡＣ５５６４９、ＡＭ８０、ＢＭＳ７５３、タザロテン、アダパレン、またはＣＤ２３１４）、Ｒｈｏ関連コイルドコイル含有プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）の阻害剤（例えば、チアゾビビン、Ｙ−２７６３２、ファスジル／ＨＡ１０７７、または１４−１１５２）、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性化剤（例えば、ホルボール１２，１３−ジブチレート（ＰＤＢＵ）、ＴＰＢ、ホルボール１２−ミリスチン酸１３−アセテート、ブリオスタチン１、またはそれらの誘導体）、ＴＧＦベータスーパーファミリーのアンタゴニスト（例えば、Ａｌｋ５阻害剤ＩＩ（ＣＡＳ４４６８５９−３３−２）、Ａ８３−０１、ＳＢ４３１５４２、Ｄ４４７６、ＧＷ７８８３８８、ＬＹ３６４９４７、ＬＹ５８０２７６、ＳＢ５０５１２４、ＧＷ６６０４、ＳＢ−５２５３３４、ＳＤ−２０８、ＳＢ−５０５１２４、またはそれらの誘導体）、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）１型受容体の阻害剤（例えば、ＬＤＮ１９３１８９またはそれらの誘導体）、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤（例えば、Ｔ３またはそれらの誘導体）、ガンマ−セクレターゼ阻害剤（例えば、ＸＸＩ、ＤＡＰＴ、またはそれらの誘導体）、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路の活性化剤（例えば、ＷＮＴ３ａまたはアクチビンＡ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）ファミリー由来の増殖因子（例えば、ベータセルリンまたはＥＧＦ）、広域キナーゼ（例えば、スタウロスポリンまたはそれらの誘導体）、非必須アミノ酸、ビタ���ンまたは抗酸化剤（例えば、シクロパミン、ビタミンＤ、ビタミンＣ、ビタミンＡ、またはそれらの誘導体）、またはＮ−アセチルシステイン、硫酸亜鉛、もしくはヘパリンのような他の追加物を含んでいなくてもよい。一部の場合において、再凝集培地は、外因性細胞外マトリックス分子を含んでいなくてもよい。一部の場合において、再凝集培地は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）を含まない。一部の場合において、再凝集培地は、他の細胞外マトリックス分子または材料、例えば、コラーゲン、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リシン、ポリ−Ｄ−リシン、ビトロネクチン、ラミニン、フィブロネクチン、ＰＬＯラミニン、フィブリン、トロンビン、およびレトロネクチンならびにそれらの混合物など、または溶解させた細胞膜調製物を含まない。
【０１０２】
[0136]当業者は、培地に補充されたＢＳＡの濃度は変更可能であることを理解しているものと予想される。例えば、培地（例えば、ＭＣＤＢ１３１）は、約０．０１％、０．０５％、０．１％、１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約１０％、または約１５％のＢＳＡを含んでいてもよい。使用される培地（例えば、ＭＣＤＢ１３１培地）は、従来の基礎培地に見出されない要素、例えば微量元素、プトレシン、アデニン、チミジン、およびより高いレベルの一部のアミノ酸およびビタミンを含有していてもよい。これらの添加は、培地に極めて低いレベルの血清または既定の要素を補充することを可能にする。培地は、タンパク質および／または増殖因子非含有であってもよく、ＥＧＦ、ヒドロコルチゾン、および／またはグルタミンが補充されていてもよい。一部の場合において、培地の組成は、経験的に決定してもよい。例えば、図１で示されるように、段階６の培養培地を、インビトロにおける細胞のグルコースによって刺激されたインスリン応答に基づき決定した。細胞を様々な濃度のグルコースまたはＫＣＬ（陽性対照として）に曝露し、小分子含有および非含有の培地組成ごとにインスリン分泌を決定した。ＭＣＤＢ１３１＋２％ＢＳＡ中で培養した細胞は、ＣＭＲＬｓ＋１０％ＦＢＳ＋Ａｌｋ５ｉ＋Ｔ３中で培養した細胞と比較して、より大きいグルコースによって刺激されたインスリン分泌を示した。一部の場合において、細胞培養培地組成物は、細胞特異的マーカーと共に異なる培地中で培養した細胞を染色することによって決定してもよい。一般的に、最終的な集団において望ましい細胞または最終的な集団において望ましくない細胞に対応する任意のマーカーを、細胞を培養するのに最適な培地を経験的に決定するためのマーカーとして使用することができる。一例において、図２で示されるように、細胞をＬＩＮ２８について染色し、ハイスループットイメージング技術（例えば、イメージサイトメトリー）を使用して計数した。ＬＩＮ２８は、未分化幹細胞のマーカーであり、線維芽細胞から人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）を形成する効率を強化することができる。ＭＣＤＢ１３１培地中で天然細胞および再凝集した細胞を培養することにより、ＣＭＲＬｓ培地中で培養した天然細胞と比較してＬＩＮ２８陽性細胞（例えば、未分化細胞）がおよそ９０％低減した。当業者は、任意の細胞マーカー（例えば、ＳＯＸ２、ＳＯＸ９および／またはＫｉ６７）を使用するできることを理解しているものと予想される。
【０１０３】
[0137]培地は、１つまたは複数の細胞外マトリックス分子（例えば、細胞外タンパク質）を含んでいてもよい。培地中で使用される非限定的な例示的な細胞外マトリックス分子としては、コラーゲン、胎盤のマトリックス、フィブロネクチン、ラミニン、メロシン、テネイシン、ヘパリン、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、アグリカン、ビグリカン、トロンボスポンジン、ビトロネクチン、およびデコリンを挙げることができる。一部の場合において、培地は、ラミニン、例えばＬＮ−３３２を含む。一部の場合において、培地は、ヘパリンを含む。
【０１０４】
[0138]培地は、例えば培地中の細胞にとって最適な環境を提供するために、培養中に定期的に交換することができる。再凝集のために第１の細胞クラスターから解離した細胞を培養する場合、培地は、少なくともまたは約４時間毎、１２時間毎、２４時間毎、４８時間毎、３日毎または４日毎に交換することができる。例えば、培地は、約４８時間毎に交換することができる。
【０１０５】
[0139]第１の細胞クラスターから解離した細胞は、再凝集のためのコンテナー中に播種することができる。播種の密度は、再凝集した第２の細胞クラスターのサイズと相関していてもよい。播種の密度は、第２の細胞クラスターのサイズが内因性膵島に類似したサイズになり得るように制御することができる。一部の場合において、播種の密度は、第２の細胞クラスターのサイズが約７５μｍ〜約２５０μｍになり得るように制御される。第１の細胞クラスターから解離した細胞は、細胞約１０万個／ｍＬから細胞約１０００万個／ｍＬ、例えば、細胞約５０万個／ｍＬから細胞約１５０万個／ｍＬ、細胞約８０万個／ｍＬから細胞約１２０万個／ｍＬ、細胞約９０万個／ｍＬから細胞約１１０万個／ｍＬ、細胞約２００万個／ｍＬから細胞約３００万個／ｍＬの密度で播種することができる。一部の場合において、第１の細胞クラスターから解離した細胞は、細胞約１００万個／ｍＬの密度で播種することができる。一部の場合において、第１の細胞クラスターから解離した細胞は、細胞約１５０万個／ｍＬの密度で播種することができる。一部の場合において、第１の細胞クラスターから解離した細胞は、細胞約２００万個／ｍＬの密度で播種することができる。一部の場合において、第１の細胞クラスターから解離した細胞は、細胞約２５０万個／ｍＬの密度で播種することができる。一部の場合において、第１の細胞クラスターから解離した細胞は、細胞約３００万個／ｍＬの密度で播種することができる。
【０１０６】
[0140]第１の細胞クラスターから解離した細胞は、培養容器中で培養することができる。培養容器は、細胞培養物の懸濁液を培養するのに好適なものであり得る。本明細書に記載の細胞または細胞クラスターを培養するのに使用される培養容器としては、これらに限定されないが、中で細胞を培養することが可能であれば、フラスコ、組織培養のためのフラスコ、培養皿、ペトリ皿、組織培養のための培養皿、多目的の皿、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、チューブ、トレイ、培養バッグ、およびローラーボトル、撹拌タンクバイオリアクター、またはポリマー（例えば、バイオポリマーまたはゲル）による封入を挙げることができる。細胞および／または細胞クラスターは、培養の必要性に応じて、少なくともまたは約０．２ｍｌ、０．５ｍｌ、１ｍｌ、５ｍｌ、１０ｍｌ、２０ｍｌ、３０ｍｌ、４０ｍｌ、５０ｍｌ、１００ｍｌ、１５０ｍｌ、２００ｍｌ、２５０ｍｌ、３００ｍｌ、３５０ｍｌ、４００ｍｌ、４５０ｍｌ、５００ｍｌ、６００ｍｌ、８００ｍｌ、１０００ｍｌ、１５００ｍｌ、２０００ｍｌ、３０００ｍｌ、またはそれから導き出せる任意の範囲の体積で培養することができる。
【０１０７】
[0141]一部の場合において、細胞は、動的条件下で（例えば、細胞が懸濁培養中にありながら一定の運動または撹拌に供される条件下で）培養することができる。細胞の動的な培養の場合、細胞は、コンテナー中で（例えば、非接着性コンテナー、例えばスピナーフラスコ（例えば、２００ｍｌから３０００ｍｌ、例えば２５０ｍｌ；１００ｍｌのスピナーフラスコ；または１２５ｍｌの三角フラスコ中で）培養することができ、コンテナーは、制御ユニットに接続されていてもよく、したがって制御された培養システムを提供することができる。一部の場合において、細胞は、それらの増殖能を保存しながら非動的条件下（例えば、静置培養）で培養することができる。細胞の非動的な培養の場合、細胞は、接着性の培養容器中で培養することができる。接着性の培養容器は、容器表面の細胞への接着力を改善するために、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）などの細胞接着のための基材のいずれかでコーティングされていてもよい。細胞接着のための基材は、幹細胞またはフィーダー細胞（使用される場合）への付着が意図された任意の材料であり得る。細胞接着のための基材としては、コラーゲン、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リシン、ポリ−Ｄ−リシン、ビトロネクチン、ラミニン、フィブロネクチン、ＰＬＯラミニン、フィブリン、トロンビン、およびレトロネクチンならびにそれらの混合物、例えばＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）、ならびに溶解させた細胞膜調製物が挙げられる。
【０１０８】
[0142]動的細胞培養容器（例えば、スピナーフラスコ）中の培地は、撹拌することができる（例えば、撹拌器によって）。スピン速度は、再凝集した第２の細胞クラスターのサイズと相関していてもよい。スピン速度は、第２の細胞クラスターのサイズが内因性膵島に類似したサイズになり得るように制御することができる。一部の場合において、スピン速度は、第２の細胞クラスターのサイズが約７５μｍ〜約２５０μｍになり得るように制御される。動的細胞培養容器（例えば、スピナーフラスコ）のスピン速度は、約２０回転／分（ｒｐｍ）から約１００ｒｐｍ、例えば約３０ｒｐｍから約９０ｒｐｍ、約４０ｒｐｍから約６０ｒｐｍ、約４５ｒｐｍから約５０ｒｐｍであり得る。一部の場合において、スピン速度は、約５０ｒｐｍであり得る。
【０１０９】
[0143]第１の細胞クラスターから解離した細胞は、それらが再凝集できるような期間にわたり培養することができる。第１の細胞クラスターから解離した細胞は、少なくとも１２時間、２４時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１５日、２０日、２５日、または３０日培養することができる。一部の場合において、第１の細胞クラスターから解離した細胞は、少なくとも４日培養することができる。
【０１１０】
[0144]本明細書に記載の方法はまた、細胞クラスター中の内因性細胞、例えば内因性成熟膵臓β細胞に類似した細胞を濃縮するのに使用することができる。本方法は、第１の細胞クラスターを解離させるステップ、および第１のクラスターからの細胞を第２のクラスターに再凝集させるステップを含んでいてもよい。第２のクラスターは、第１のクラスターと比較して、より多くの内因性成熟膵臓β細胞に類似した細胞を含んでいてもよい。解離および再凝集は、本出願にわたり開示された任意の方法および試薬を使用して実行することができる。
【０１１１】
[0145]再凝集の後、第２の細胞クラスターは、第１の細胞クラスターと比較してより多くの、内因性細胞の１つまたは複数のマーカーを発現する細胞を含んでいてもよい。例えば、第２のクラスターは、第１の細胞クラスターと比較してより多くの、内因性成熟膵臓β細胞の１つまたは複数のマーカー、例えば、インスリン、Ｃ−ペプチド、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＣＨＧＡ、ＭＡＦＡ、ＺＮＴ８、ＰＡＸ６、ＮＥＵＲＯＤ１、グルコキナーゼ（ＧＣＫ）、ＳＬＣ２Ａ、ＰＣＳＫ１、ＫＣＮＪ１１、ＡＢＣＣ８、ＳＬＣ３０Ａ８、ＳＮＡＰ２５、ＲＡＢ３Ａ、ＧＡＤ２、およびＰＴＰＲＮなどのマーカーを発現する細胞を含んでいてもよい。一部の場合において、第２のクラスターは、より多くの、ＣＨＧＡを発現する細胞を含んでいてもよい。一部の場合において、第２のクラスターは、より多くの、ＮＫＸ６．１を発現する細胞を含んでいてもよい。一部の場合において、第２のクラスターは、より多くの、Ｃ−ペプチドを発現する細胞を含んでいてもよい。一部の場合において、第２のクラスターは、より多くの、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する細胞を含んでいてもよい。一部の場合において、第２のクラスターは、より多くの、ＣＨＧＡ、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する細胞を含んでいてもよい。
【０１１２】
[0146]再凝集の後、第２の細胞クラスターは、第１の細胞クラスターと比較して、より小さいサイズ（例えば、より小さい直径）を有していてもよい。例えば、図４で示されるように、内分泌細胞マーカー（例えば、ＣＨＧＡ、ＩＮＳ、およびＤＡＰＩ）に関して染色された天然細胞クラスター（上）および再凝集した（ＲＡ）細胞クラスター（下）の免疫蛍光画像は、天然細胞クラスターと比較した場合、ＲＡ細胞においてクラスター直径の減少を示す。サイズが小さいほど、より優れた細胞クラスターと周囲の環境との間での分子の交換が可能になる。例えば、サイズが小さいほど、より優れた培地から細胞クラスター中の細胞への分子（例えば、試薬、ガス、および／または栄養）の拡散が可能になる。したがって、より小さいサイズであることから、第２の細胞クラスターは、第１の細胞クラスターと比較してより効率的な方法で周囲の環境と分子を交換することができる。したがって第２の細胞クラスターにおける死細胞（例えば、不十分な栄養および／またはガスのために致死した細胞）を、第１の細胞クラスターと比較してより少なくすることができる。
【０１１３】
[0147]本明細書で提供される方法は、内分泌細胞、例えばクロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）を発現する細胞を濃縮することができる。例えば、第２の細胞クラスターにおけるクロモグラニンＡを発現する細胞のパーセンテージは、第１の細胞クラスターにおけるクロモグラニンＡを発現する細胞のパーセンテージより、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、または少なくとも１．５倍大きい。一部の場合において、第２の細胞クラスターは、ＣＨＧＡを発現する少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％の細胞を含む。一部の場合において、第２の細胞クラスター中の少なくとも約８５％の細胞は、ＣＨＧＡを発現することができる。一部の場合において、第２の細胞クラスターは、ＣＨＧＡを発現する約９０％の細胞を含んでいてもよい。一部の場合において、第２の細胞クラスターは、ＣＨＧＡを発現する約９５％の細胞を含んでいてもよい。特定の場合において、第２の細胞クラスター中の全ての細胞は、ＣＨＧＡを発現することができる。
【０１１４】
[0148]本明細書で提供される方法は、膵臓β細胞を生成または濃縮することができる。例えば、第２の細胞クラスターは、少なくとも１つの膵臓β細胞、例えば少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含む。例えば、第２の細胞クラスターにおけるＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドの両方を発現する細胞のパーセンテージは、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドの両方を発現する第１の細胞クラスターにおける細胞のパーセンテージより、少なくとも１．５倍、少なくとも１．７５倍、または少なくとも２倍大きい。一部の場合において、第２の細胞クラスターは、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％の細胞を含む。一部の場合において、第２の細胞クラスター中の少なくとも約３５％の細胞は、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現することができる。一部の場合において、細胞クラスターは、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する約６０％の細胞を含んでいてもよい。一部の場合において、第２の細胞クラスターは、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する約７５％の細胞を含んでいてもよい。一部の場合において、第２の細胞クラスター中の全ての細胞は、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現することができる。一部の場合において、第２の細胞クラスター中の少なくとも１つの非天然膵臓β細胞の少なくとも約７０％は、フローサイトメトリーによる測定によれば、クロモグラニンＡを発現する。一部の場合において、第２の細胞クラスター中の少なくとも１つの非天然膵臓β細胞の少なくとも約２５％は、フローサイトメトリーによる測定によれば、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する。
【０１１５】
[0149]本明細書で提供される方法は、幹細胞または膵臓内分泌細胞の前駆体細胞を低減したり、またはなくしたりすることができる。一部の場合において、ＳＯＸ２を発現する第２の細胞クラスターにおける細胞のパーセンテージは、ＬＩＮ２８、Ｋｉ６７、ＳＯＸ２、またはＳＯＸ９を発現する第１の細胞クラスターにおける細胞のパーセンテージの最大で２分の１、最大で３分の１、最大で５分の１、または最大で１０分の１である。例えば、第２の細胞クラスターは、ＬＩＮ２８を発現する最大で約５％の細胞、最大で約５％の細胞、最大で約５％の細胞、最大で約５％の細胞、最大で約５％の細胞、最大で約２％の細胞、最大で約１％の細胞、最大で約０．５％の細胞、最大で約０．１％の細胞、最大で約０．０５％の細胞、最大で約０．０１％の細胞を含んでいてもよいし、またはＬＩＮ２８を発現する細胞を含んでいなくてもよい。一部の例において、本明細書で提供される第２の細胞クラスターは、Ｋｉ６７を発現する最大で約５％の細胞、最大で約５％の細胞、最大で約５％の細胞、最大で約５％の細胞、最大で約５％の細胞、最大で約２％の細胞、最大で約１％の細胞、最大で約０．５％の細胞、最大で約０．１％の細胞、最大で約０．０５％の細胞、最大で約０．０１％の細胞を含んでいてもよいし、またはＫｉ６７を発現する細胞を含んでいなくてもよい。例えば、第２の細胞クラスターは、ＳＯＸ２を発現する最大で３％の細胞、最大で約２％の細胞、最大で約１％の細胞、最大で約０．５％の細胞、最大で約０．１％の細胞、最大で約０．０５％の細胞、最大で約０．０１％の細胞を含んでいてもよいし、またはＳＯＸ２を発現する細胞を含んでいなくてもよい。一部の場合において、第２の細胞クラスターは、ＳＯＸ２を発現する約１％の細胞を含んでいてもよい。一部の場合において、第２の細胞クラスターは、ＳＯＸ２を発現する約０．６％の細胞を含んでいてもよい。一部の場合において、第２の細胞クラスターは、ＳＯＸ２を発現する約０．３％の細胞を含んでいてもよい。一部の場合において、第２の細胞クラスターは、ＳＯＸ２を発現する約０．１％の細胞を含んでいてもよい。例えば、第２の細胞クラスターは、ＳＯＸ９を発現する最大で１０％の細胞、最大で約８％の細胞、最大で約６％の細胞、最大で約５％の細胞、最大で約２％の細胞、最大で約１％の細胞、最大で約０．５％の細胞、最大で約０．１％の細胞、最大で約０．０５％の細胞、最大で約０．０１％の細胞を含んでいてもよいし、またはＳＯＸ９を発現する細胞を含んでいなくてもよい。一部の場合において、第２の細胞クラスターは、ＳＯＸ９を発現する約２％の細胞を含んでいてもよい。一部の場合において、第２の細胞クラスターは、ＳＯＸ９を発現する約６％の細胞を含んでいてもよい。一部の場合において、第２の細胞クラスターは、ＳＯＸ９を発現する約１．２％の細胞を含んでいてもよい。
【０１１６】
[0150]第２の細胞クラスターはまた、第１の細胞クラスターと比較して、より内因性膵島に類似して機能することもできる。第２の細胞クラスターは、第１の細胞クラスターより高いインスリン含量を有していてもよく、例えば、第１の細胞クラスターと比較して、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２５倍または少なくとも１．５倍高いインスリン含量を有していてもよい。第２のクラスターは、刺激指標によって測定した場合、第１の細胞クラスターより大きいインビトロでのＧＳＩＳを示すことができる。第２のクラスターはまた、刺激指標によって測定した場合、第１の細胞クラスターより大きいインビボでのＧＳＩＳを示すこともできる。一部の場合において、第２のクラスターは、刺激指標によって測定した場合、第１の細胞クラスターと比較して、より大きいインビトロでのＧＳＩＳおよびより大きいインビボでのＧＳＩＳを示すことができる。例えば、第２の細胞クラスターは、同じ刺激条件下で第１の細胞クラスターより多くのインスリンを分泌することができる。第２の細胞クラスターはまた、カリウム負荷（Ｋ＋）、例えば所定濃度のＫＣｌ、例えば３０ｍＭのＫＣｌに対するインスリン分泌応答を示すこともできる。
【０１１７】
[0151]一部の場合において、本明細書で提供される方法は、第２の細胞クラスター中で第１の細胞クラスターからの細胞、例えば膵臓β細胞または内分泌細胞の、大きいパーセンテージを保持することができる。例えば、第１の細胞クラスター中のＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドの両方を発現する細胞の少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％は、第２のインビトロの細胞クラスター中に保持されていてもよい。一部の場合において、解離および再凝集プロセス中に喪失する第１の細胞クラスター中のＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドの両方を発現する細胞は、最大で約５％、最大で約２％、最大で約１％、最大で約０．５％、または最大で約０．１％である。
【０１１８】
[0152]一部の場合において、本明細書に記載される細胞クラスターは、インビトロで任意の開始細胞集団から生成される。例えば、開始時の細胞としては、これらに限定されないが、インスリン陽性内分泌細胞（例えば、クロモグラニンＡ陽性細胞）またはその任意の前駆体、例えばＮｋｘ６．１陽性膵臓前駆細胞、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞、および多能性幹細胞、胚性幹細胞、ならびに人工多能性幹細胞を挙げることができる。一部の場合において、本方法は、再プログラムされた細胞、部分的に再プログラムされた細胞（例えば、体細胞、例えば、誘導多能性細胞とその由来となった体細胞との間の中間状態で存在するように部分的に再プログラムされた線維芽細胞）、分化転換した細胞の分化を含む。一部の場合において、本明細書で開示された膵臓β細胞を含む細胞クラスターは、インビトロでインスリン陽性内分泌細胞またはその前駆体から分化することができる。一部の場合において、膵臓β細胞を含む細胞クラスターは、インビトロで、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞、および多能性幹細胞からなる群から選択される前駆体から分化する。一部の場合において、多能性幹細胞は、胚性幹細胞および人工多能性幹細胞からなる群から選択される。上記で論じられたように、非天然膵臓β細胞は、インビトロで幹細胞から誘導できるため、幹細胞由来β細胞（ＳＣ−β細胞）と称する場合もある。一部の場合において、ＳＣ−β細胞またはＳＣ−β細胞が誘導される多能性幹細胞は、ヒト由来である。一部の場合において、ＳＣ−β細胞は、ヒト由来である。
【０１１９】
[0153]本開示の一態様は、非天然膵臓β細胞を生成する方法を提供する。一部の場合において、この方法は、任意の現在利用可能なプロトコール、例えばそれぞれその全体が本明細書に取り入れられる米国特許出願第１４／６８４，１２９号および１４／６８４，１０１号に記載されるものであり得る。本開示の態様は、胚体内胚葉細胞を含む。本明細書において有用な胚体内胚葉細胞は、任意の供給源由来のものであってもよいし、または任意の好適なプロトコールに従って生成してもよい。一部の態様において、多能性幹細胞、例えばｉＰＳＣまたはｈＥＳＣは、内胚葉細胞に分化する。一部の態様において、内胚葉細胞（段階１）はさらに、例えば、原始消化管細胞（段階２）、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞（段階３）、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞（段階４）、またはＮｇｎ３陽性内分泌前駆細胞もしくはインスリン陽性内分泌細胞（段階５）に分化し、続いてＳＣ−β細胞（段階６）への誘導または成熟が起こる。
【０１２０】
[0154]一部の場合において、胚体内胚葉細胞は、集団中の少なくとも一部の多能性細胞を、胚体内胚葉細胞に分化させるステップによって、例えば、多能性細胞の集団を、ｉ）ＴＧＦ−βスーパーファミリー由来の少なくとも１種の増殖因子、およびｉｉ）ＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤と接触させて、多能性細胞の少なくとも一部の胚体内胚葉細胞への分化を誘導することによって得ることができ、ここで胚体内胚葉細胞は、胚体内胚葉に特徴的な少なくとも１つのマーカーを発現する。
【０１２１】
[0155]胚体内胚葉細胞に分化するように多能性幹細胞を誘導することが可能なＴＧＦ−βスーパーファミリー由来の任意の増殖因子（例えば、単独で、またはＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤と組み合わせて）を、本明細書で提供される方法で使用することができる。一部の場合において、ＴＧＦ−βスーパーファミリー由来の少なくとも１種の増殖因子は、アクチビンＡを含む。一部の場合において、ＴＧＦ−βスーパーファミリー由来の少なくとも１種の増殖因子は、増殖分化因子８（ＧＤＦ８）を含む。胚体内胚葉細胞に分化するように多能性幹細胞を誘導することが可能な任意のＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤（例えば、単独で、またはＴＧＦ−βスーパーファミリー由来の増殖因子と組み合わせて）を、本明細書で提供される方法で使用することができる。一部の場合において、ＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤は、ＣＨＩＲ９９Ｑ２１を含む。一部の場合において、ＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤は、Ｗｎｔ３ａ組換えタンパク質を含む。
【０１２２】
[0156]一部の場合において、集団中の少なくとも一部の多能性細胞を、胚体内胚葉細胞に分化させるステップは、多能性細胞の集団を、ｉ）アクチビンＡ、およびｉｉ）ＣＨＩＲ９９０２１と３日間にわたり接触させ、集団中の多能性細胞の少なくとも一部の胚体内胚葉細胞への分化を誘導するプロセスによって達成され、ここで胚体内胚葉細胞は、胚体内胚葉に特徴的な少なくとも１つのマーカーを発現する。
【０１２３】
[0157]一部の場合において、本明細書で開示される方法によって産生される胚体内胚葉細胞は、Ｎｏｄａｌ、Ｔｍｐｒｓｓ２、Ｔｍｅｍ３０ｂ、Ｓｔ１４、Ｓｐｉｎｋ３、Ｓｈ３ｇ１２、Ｒｉｐｋ４、Ｒａｂ１Ｓ、Ｎｐｎｔ、Ｃｌｉｃ６、ＣｌｄｎＳ、Ｃａｃｎａ１ｂ、Ｂｎｉｐ１、Ａｎｘａ４、Ｅｍｂ、ＦｏｘＡ１、Ｓｏｘ１７、およびＲｂｍ３５ａからなる群から選択される少なくとも１つのマーカーを発現し、ここで少なくとも１つのマーカーの発現は、その由来となった多能性幹細胞に比べて、胚体内胚葉細胞おいて統計学的に有意な量で上方調節される。一部の場合において、本明細書で開示される方法によって産生される胚体内胚葉細胞は、その由来となった多能性幹細胞に比べて、統計学的に有意な量で、Ｇａｔａ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰおよびＤａｂ２からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーを発現しない。一部の場合において、本明細書で開示される方法によって産生される胚体内胚葉細胞は、その由来となった多能性幹細胞に比べて、統計学的に有意な量で、Ｚｉｃｌ、Ｐａｘ６、ＦｌｋｌおよびＣＤ３１からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーを発現しない。一部の場合において、本明細書で開示される方法によって産生される胚体内胚葉細胞は、その由来となった多能性幹細胞に比べて、統計学的に有意な量で、より高いレベルのＳｍａｄ２のリン酸化を示す。一部の場合において、本明細書で開示される方法によって産生される胚体内胚葉細胞は、インビボで消化管を形成する能力を有する。一部の場合において、本明細書で開示される方法によって産生される胚体内胚葉細胞は、消化管細胞に特徴的な形態を有する細胞に分化することができ、ここで消化管細胞に特徴的な形態を有する細胞は、ＦｏｘＡ２および／またはＣｌａｕｄｉｎ６を発現する。一部の場合において、本明細書で開示される方法によって産生される胚体内胚葉細胞は、内胚葉起源の細胞にさらに分化することができる。
【０１２４】
[0158]一部の場合において、多能性幹細胞の集団は、いずれかの分化の前または分化の第１の段階中に、少なくとも１つのβ細胞成熟因子の存在下で培養される。任意の多能性幹細胞、例えばヒト多能性幹細胞、もしくはヒトｉＰＳ細胞、または本明細書で論じられる多能性幹細胞のいずれかもしくは他の好適な多能性幹細胞を使用することができる。一部の場合において、本明細書に記載されるβ細胞成熟因子は、多能性幹細胞の集団の培養培地中に存在していてもよいし、または多能性幹細胞の集団の増殖（例えば複製または繁殖）中に、ボーラスで、または定期的に添加されてもよい。特定の例において、多能性幹細胞の集団は、いずれかの分化の前に、少なくとも１つのβ細胞成熟因子に曝露されてもよい。他の例において、多能性幹細胞の集団は、分化の第１の段階中に、少なくとも１つのβ細胞成熟因子に曝露されてもよい。
【０１２５】
[0159]本開示の態様は、原始消化管細胞を含む。本明細書において有用な原始消化管細胞は、任意の供給源由来であってもよいし、または任意の好適なプロトコールに従って生成してもよい。一部の態様において、胚体内胚葉細胞を原始消化管細胞に分化させる。一部の態様において、原始消化管細胞を、例えば、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞、Ｎｇｎ３陽性内分泌前駆細胞、インスリン陽性内分泌細胞にさらに分化させ、続いてＳＣ−β細胞に誘導または成熟させる。
【０１２６】
[0160]一部の場合において、原始消化管細胞は、集団中の少なくとも一部の胚体内胚葉細胞を、原始消化管細胞に分化させるステップによって、例えば、胚体内胚葉細胞を、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリー由来の少なくとも１種の増殖因子と接触させて、胚体内胚葉細胞の少なくとも一部の原始消化管細胞への分化を誘導することによって得ることができ、ここで原始消化管細胞は、原始消化管細胞に特徴的な少なくとも１つのマーカーを発現する。
【０１２７】
[0161]原始消化管細胞に分化するように胚体内胚葉細胞を誘導することが可能なＦＧＦファミリー由来の任意の増殖因子（例えば、単独で、または他の因子と組み合わせて）を、本明細書で提供される方法で使用することができる。一部の場合において、ＦＧＦファミリー由来の少なくとも１種の増殖因子は、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）を含む。一部の場合において、ＦＧＦファミリー由来の少なくとも１種の増殖因子は、ＦＧＦ２を含む。一部の場合において、ＦＧＦファミリー由来の少なくとも１種の増殖因子は、ＦＧＦ８Ｂを含む。一部の場合において、ＦＧＦファミリー由来の少なくとも１種の増殖因子は、ＦＧＦ１０を含む。一部の場合において、ＦＧＦファミリー由来の少なくとも１種の増殖因子は、ＦＧＦ２１を含む。
【０１２８】
[0162]一部の場合において、原始消化管細胞は、集団中の少なくとも一部の胚体内胚葉細胞を、原始消化管細胞に分化させるステップによって得ることができ、例えば、胚体内胚葉細胞を、ＫＧＦと２日間にわたり接触させて、胚体内胚葉細胞の少なくとも一部の原始消化管細胞への分化を誘導するステップによって得ることができる。
【０１２９】
[0163]本開示の態様は、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞を含む。本明細書において有用なＰｄｘ１陽性膵臓前駆細胞は、任意の供給源由来であってもよいし、または任意の好適なプロトコールに従って生成してもよい。一部の態様において、原始消化管細胞をＰｄｘ１陽性膵臓前駆細胞に分化させる。一部の態様において、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞を、例えば、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞、Ｎｇｎ３陽性内分泌前駆細胞、インスリン陽性内分泌細胞にさらに分化させ、続いてＳＣ−β細胞に誘導または成熟させる。
【０１３０】
[0164]一部の態様において、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞は、集団中の少なくとも一部の原始消化管細胞を、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞に分化させて、例えば、原始消化管細胞を、ｉ）少なくとも１つの骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤、ｉｉ）ＦＧＦファミリー由来の少なくとも１種の増殖因子、ｉｉｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ｉｖ）少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤；およびｖ）少なくとも１つのプロテインキナーゼＣ活性化剤と接触させて、原始消化管細胞の少なくとも一部の、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞への分化を誘導することによって得ることができ、ここでＰｄｘ１陽性膵臓前駆細胞は、Ｐｄｘ１を発現する。一部の場合において、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞は、集団中の少なくとも一部の原始消化管細胞を、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞に分化させて、例えば、原始消化管細胞を、ｉ）ＦＧＦファミリー由来の少なくとも１種の増殖因子、およびｉｉ）少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤と接触させて、原始消化管細胞の少なくとも一部の、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞への分化を誘導することによって得ることができ、ここでＰｄｘ１陽性膵臓前駆細胞は、Ｐｄｘ１を発現する。
【０１３１】
[0165]Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞に分化するように原始消化管細胞を誘導することが可能な任意のＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤（例えば、単独で、またはＦＧＦファミリー由来の少なくとも１種の増殖因子、少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、少なくとも１つのレチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤、および少なくとも１つのプロテインキナーゼＣ活性化剤のいずれかの組合せで）が、本明細書で提供される方法で使用できる。一部の場合において、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９を含む。
【０１３２】
[0166]Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞に分化するように原始消化管細胞を誘導することが可能なＦＧＦファミリー由来の任意の増殖因子（例えば、単独で、または少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、少なくとも１つのレチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤、および少なくとも１つのプロテインキナーゼＣ活性化剤のいずれかの組合せで）が使用できる。一部の場合において、ＦＧＦファミリー由来の少なくとも１種の増殖因子は、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）を含む。一部の場合において、ＦＧＦファミリー由来の少なくとも１種の増殖因子は、ＦＧＦ２、ＦＧＦ８Ｂ、ＦＧＦ１０、およびＦＧＦ２１からなる群から選択される。
【０１３３】
[0167]Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞に分化するように原始消化管細胞を誘導することが可能な任意のＳＨＨ経路阻害剤（例えば、単独で、または少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ＦＧＦファミリー由来の少なくとも１種の増殖因子、少なくとも１つのレチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤、および少なくとも１つのプロテインキナーゼＣ活性化剤のいずれかの組合せで）が使用できる。一部の場合において、ＳＨＨ経路阻害剤は、Ｓａｎｔ１を含む。
【０１３４】
[0168]Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞に分化するように原始消化管細胞を誘導することが可能な任意のＲＡシグナル伝達経路活性化剤（例えば、単独で、または少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ＦＧＦファミリー由来の少なくとも１種の増殖因子、少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、および少なくとも１つのプロテインキナーゼＣ活性化剤のいずれかの組合せで）が使用できる。一部の場合において、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤は、レチノイン酸を含む。
【０１３５】
[0169]Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞に分化するように原始消化管細胞を誘導することが可能な任意のＰＫＣ活性化剤（例えば、単独で、または少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ＦＧＦファミリー由来の少なくとも１種の増殖因子、少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、および少なくとも１つのＲＡシグナル伝達経路活性化剤のいずれかの組合せで）が使用できる。一部の場合において、ＰＫＣ活性化剤は、ＰｄｂＵを含む。一部の場合において、ＰＫＣ活性化剤は、ＴＰＢを含む。
【０１３６】
[0170]一部の場合において、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞は、集団中の少なくとも一部の原始消化管細胞を、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞に分化させることによって、例えば、原始消化管細胞を、レチノイン酸、ＫＧＦ、Ｓａｎｔ１、ＬＤＮ１９３１８９、ＰｄＢＵと２日間にわたり接触させることによって得ることができる。一部の場合において、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞は、集団中の少なくとも一部の原始消化管細胞を、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞に分化させることによって、例えば、原始消化管細胞を、レチノイン酸およびＫＧＦと２日間にわたり接触させることによって得ることができる。一部の場合において、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞は、Ｓ３培地中の少なくとも一部の原始消化管細胞を分化させることによって得ることができる。
【０１３７】
[0171]本開示の態様は、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞を含む。本明細書において有用なＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞は、任意の供給源由来であってもよいし、または任意の好適なプロトコールに従って生成してもよい。一部の態様において、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞を、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞に分化させる。一部の態様において、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞を、例えば、Ｎｇｎ３陽性内分泌前駆細胞、またはインスリン陽性内分泌細胞にさらに分化させ、続いてＳＣ−β細胞に誘導または成熟させる。
【０１３８】
[0172]一部の態様において、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞からＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞を産生する方法は、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞を含む細胞の集団を、ａ）線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリー由来の少なくとも１種の増殖因子、ｂ）ソニックヘッジホッグ経路阻害剤、および任意選択でｃ）低濃度のレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤を含む少なくとも２つのβ細胞成熟因子と接触させて（例えば、細胞のクラスター化を促進する条件下で）、集団中の少なくとも１つのＰｄｘ１陽性膵臓前駆細胞の分化をＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞に誘導することを含み、ここでＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞は、ＮＫＸ６．１を発現する。
【０１３９】
[0173]一部の場合において、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞は、細胞のクラスター化を促進する条件下でＰｄｘ１陽性膵臓前駆細胞を、ｉ）ＦＧＦファミリー由来の少なくとも１種の増殖因子、ｉｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、および任意選択でｉｉｉ）低濃度のＲＡシグナル伝達経路活性化剤と接触させて、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞の少なくとも一部の、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞への分化を誘導することによって得られ、ここでＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞は、Ｐｄｘ１およびＮＫＸ６．１を発現する。一部の場合において、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞は、細胞のクラスター化を促進する条件下でＰｄｘ１陽性膵臓前駆細胞を、ｉ）ＦＧＦファミリー由来の少なくとも１種の増殖因子、ｉｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、および任意選択でｉｉｉ）低濃度のＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ｉｖ）ＲＯＣＫ阻害剤、およびｖ）ＴＧＦ−βスーパーファミリー由来の少なくとも１種の増殖因子と接触させて、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞の少なくとも一部の、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞への分化を誘導することによって得られる。一部の場合において、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞は、細胞のクラスター化を促進する条件下でＰｄｘ１陽性膵臓前駆細胞を、ＦＧＦファミリー由来の少なくとも１種の増殖因子と接触させることによって得られる。
【０１４０】
[0174]一部の場合において、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞は、多能性細胞の集団から産生される。一部の場合において、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞は、ｉＰＳ細胞の集団から産生される。一部の場合において、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞は、ＥＳＣ細胞の集団から産生される。一部の場合において、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞は、胚体内胚葉細胞の集団から産生される。一部の場合において、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞は、原始消化管細胞の集団から産生される。
【０１４１】
[0175]ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞に分化するようにＰｄｘ１陽性膵臓前駆細胞を誘導することが可能なＦＧＦファミリー由来の任意の増殖因子（例えば、単独で、または少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、または任意選択で少なくとも１つのレチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤のいずれかの組合せで）が、本明細書で提供される方法で使用できる。一部の場合において、ＦＧＦファミリー由来の少なくとも１種の増殖因子は、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）を含む。一部の場合において、ＦＧＦファミリー由来の少なくとも１種の増殖因子は、ＦＧＦ２、ＦＧＦ８Ｂ、ＦＧＦ１０、およびＦＧＦ２１からなる群から選択される。
【０１４２】
[0176]ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞に分化するようにＰｄｘ１陽性膵臓前駆細胞を誘導することが可能な任意のＳＨＨ経路阻害剤（例えば、単独で、またはＦＧＦファミリー由来の少なくとも１種の増殖因子、少なくとも１つのレチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤、ＲＯＣＫ阻害剤、およびＴＧＦ−βスーパーファミリー由来の少なくとも１種の増殖因子のいずれかの組合せで）が、本明細書で提供される方法で使用できる。一部の場合において、ＳＨＨ経路阻害剤は、Ｓａｎｔ１を含む。
【０１４３】
[0177]ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞に分化するようにＰｄｘ１陽性膵臓前駆細胞を誘導することが可能な任意のＲＡシグナル伝達経路活性化剤（例えば、単独で、またはＦＧＦファミリー由来の少なくとも１種の増殖因子、少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、およびＴＧＦ−βスーパーファミリー由来の少なくとも１種の増殖因子のいずれかの組合せで）が使用できる。一部の場合において、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤は、レチノイン酸を含む。
【０１４４】
[0178]ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞に分化するようにＰｄｘ１陽性膵臓前駆細胞を誘導することが可能な任意のＲＯＣＫ阻害剤（例えば、単独で、またはＦＧＦファミリー由来の少なくとも１種の増殖因子、少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＴＧＦ−βスーパーファミリー由来の少なくとも１種の増殖因子のいずれかの組合せで）が使用できる。一部の場合において、ＲＯＣＫ阻害剤は、チアゾビビン、Ｙ−２７６３２、ファスジル／ＨＡ１０７７、または１４−１１５２を含む。
【０１４５】
[0179]ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞に分化するようにＰｄｘ１陽性膵臓前駆細胞を誘導することが可能なＴＧＦ−βスーパーファミリー由来の任意の活性化剤（例えば、単独で、またはＦＧＦファミリー由来の少なくとも１種の増殖因子、少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＲＯＣＫ阻害剤のいずれかの組合せで）が使用できる。一部の場合において、ＴＧＦ−βスーパーファミリー由来の活性化剤は、アクチビンＡまたはＧＤＦ８を含む。
【０１４６】
[0180]一部の場合において、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞は、細胞のクラスター化を促進する条件下でＰｄｘ１陽性膵臓前駆細胞を、ＫＧＦ、Ｓａｎｔ１、およびＲＡと５日間にわたり接触させることによって得られる。一部の場合において、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞は、細胞のクラスター化を促進する条件下でＰｄｘ１陽性膵臓前駆細胞を、ＫＧＦ、Ｓａｎｔ１、ＲＡ、Ｙ２７６３２、およびアクチビンＡと５日間にわたり接触させることによって得られる。一部の場合において、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞は、細胞のクラスター化を促進する条件下でＰｄｘ１陽性膵臓前駆細胞を、ＫＧＦと５日間にわたり接触させることによって得られる。一部の場合において、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞は、Ｓ３培地中でＰｄｘ１陽性膵臓前駆細胞を接触させることによって得られる。
【０１４７】
[0181]本開示の態様は、インスリン陽性内分泌細胞を含む。本明細書において有用なインスリン陽性内分泌細胞は、任意の供給源由来であってもよいし、または任意の好適なプロトコールに従って生成してもよい。一部の態様において、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞を、インスリン陽性内分泌細胞に分化させる。一部の態様において、インスリン陽性内分泌細胞を、例えば、ＳＣ−β細胞への誘導または成熟によってさらに分化させる。
【０１４８】
[0182]一部の態様において、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞からインスリン陽性内分泌細胞を産生する方法は、ＮＫＸ６−ｌ陽性膵臓前駆細胞を含む細胞の集団を、ａ）ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤、およびｂ）甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤と接触させて（例えば、細胞のクラスター化を促進する条件下で）、集団中の少なくとも１つのＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞の分化をインスリン陽性内分泌細胞に誘導することを含み、ここでインスリン陽性内分泌細胞は、インスリンを発現する。一部の場合において、インスリン陽性内分泌細胞は、Ｐｄｘ１、ＮＫＸ６．１、ＮＫＸ２．２、Ｍａｆｂ、ｇｌｉｓ３、Ｓｕｒ１、Ｋｉｒ６．２、Ｚｎｔ８、ＳＬＣ２Ａ１、ＳＬＣ２Ａ３および／またはインスリンを発現する。
【０１４９】
[0183]インスリン陽性内分泌細胞に分化するようにＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞の分化を誘導することが可能な任意のＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤（例えば、単独で、または他のβ細胞−成熟因子、例えば、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤と組み合わせて）が使用できる。一部の場合において、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路は、ＴＧＦ−β受容体Ｉ型キナーゼシグナル伝達を含む。一部の場合において、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤は、Ａｌｋ５阻害剤ＩＩを含む。
【０１５０】
[0184]インスリン陽性内分泌細胞に分化するようにＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞の分化を誘導することが可能な任意の甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤（例えば、単独で、または他のβ細胞−成熟因子、例えば、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤と組み合わせて）が使用できる。一部の場合において、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤は、トリヨードチロニン（Ｔ３）を含む。
【０１５１】
[0185]一部の場合において、本方法は、細胞（例えば、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞）の集団を少なくとも１つの追加の因子と接触させることを含む。一部の場合において、本方法は、Ｐｄｘ１陽性ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞を、ｉ）ＳＨＨ経路阻害剤、ｉｉ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ｉｉｉ）γ−セクレターゼ阻害剤、ｉｖ）上皮増殖因子（ＥＧＦ）ファミリー由来の少なくとも１種の増殖因子、および任意選択でｖ）プロテインキナーゼ阻害剤の少なくとも１つと接触させることを含む。
【０１５２】
[0186]一部の場合において、本方法は、細胞（例えば、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞）の集団を少なくとも１つの追加の因子と接触させることを含む。一部の場合において、本方法は、Ｐｄｘ１陽性ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞を、ｉ）ＳＨＨ経路阻害剤、ｉｉ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ｉｉｉ）γ−セクレターゼ阻害剤、ｉｖ）上皮増殖因子（ＥＧＦ）ファミリー由来の少なくとも１種の増殖因子、およびｖ）少なくとも１つの骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤の少なくとも１つと接触させることを含む。
【０１５３】
[0187]集団中のＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞のインスリン陽性内分泌細胞への分化を誘導することが可能な任意のγ−セクレターゼ阻害剤（例えば、単独で、またはＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤および／もしくは甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤のいずれかと組み合わせて）。一部の場合において、γ−セクレターゼ阻害剤は、ＸＸＩを含む。一部の場合において、γ−セクレターゼ阻害剤は、ＤＡＰＴを含む。
【０１５４】
[0188]集団中のＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞のインスリン陽性内分泌細胞への分化を誘導することが可能なＥＧＦファミリー由来の任意の増殖因子（例えば、単独で、またはＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤および／もしくは甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤のいずれかと組み合わせて）が使用できる。一部の場合において、ＥＧＦファミリー由来の少なくとも１種の増殖因子は、ベータセルリンを含む。一部の場合において、ＥＧＦファミリー由来の少なくとも１種の増殖因子は、ＥＧＦを含む。
【０１５５】
[0189]インスリン陽性内分泌細胞に分化するようにＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞の分化を誘導することが可能な任意のＲＡシグナル伝達経路活性化剤（例えば、単独で、またはＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤および／もしくは甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤のいずれかと組み合わせて）が使用できる。一部の場合において、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤は、ＲＡを含む。
【０１５６】
[0190]インスリン陽性内分泌細胞に分化するようにＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞の分化を誘導することが可能な任意のＳＨＨ経路阻害剤（例えば、単独で、またはＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤および／もしくは甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤のいずれかと組み合わせて）が、本明細書で提供される方法で使用できる。一部の場合において、ＳＨＨ経路阻害剤は、Ｓａｎｔ１を含む。
【０１５７】
[0191]インスリン陽性内分泌細胞に分化するようにＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞の分化を誘導することが可能な任意のＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤（例えば、単独で、またはＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤および／もしくは甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤のいずれかと組み合わせて）が使用できる。一部の場合において、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９を含む。
【０１５８】
[0192]一部の場合において、任意選択で、細胞の集団をプロテインキナーゼ阻害剤と接触させる。一部の場合において、細胞の集団をプロテインキナーゼ阻害剤と接触させない。一部の場合において、細胞の集団をプロテインキナーゼ阻害剤と接触させる。集団中のＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞のインスリン陽性内分泌細胞への分化を誘導することが可能な任意のプロテインキナーゼ阻害剤（例えば、単独で、またはＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤および／もしくは甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤のいずれかと組み合わせて）。一部の場合において、プロテインキナーゼ阻害剤は、スタウロスポリンを含む。
【０１５９】
[0193]一部の場合において、本方法は、細胞（例えば、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞）の集団をＸＸＩ、Ａｌｋ５ｉ、Ｔ３、ＲＡ、Ｓａｎｔ１、およびベータセルリンと７日間にわたり接触させて、集団中の少なくとも１つのＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞のインスリン陽性内分泌細胞への分化を誘導することを含み、ここでインスリン陽性内分泌細胞は、インスリンを発現する。一部の場合において、本方法は、細胞（例えば、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞）の集団をＸＸＩ、Ａｌｋ５ｉ、Ｔ３、ＲＡ、Ｓａｎｔ１、ベータセルリン、およびＬＤＮ１９３１８９と７日間にわたり接触させて、集団中の少なくとも１つのＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞のインスリン陽性内分泌細胞への分化を誘導することを含み、ここでインスリン陽性内分泌細胞は、インスリンを発現する。
【０１６０】
[0194]一部の場合において、本方法は、ＢＥ５培地中で細胞（例えば、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞）の集団を培養して、集団中の少なくとも１つのＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞のインスリン陽性内分泌細胞への分化を誘導することを含み、ここでインスリン陽性内分泌細胞は、インスリンを発現する。
【０１６１】
[0195]本開示の態様は、内因性成熟β細胞に類似した形態および機能を有するが、それでもなお天然β細胞とは異なる非天然膵臓β細胞を生成することを含む。
[0196]一部の場合において、本明細書で提供される方法を使用して生成したインスリン陽性膵臓内分泌細胞は、単独で、または他のタイプの細胞、例えばその前駆体、例えば幹細胞、胚体内胚葉細胞、原始消化管細胞、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞、もしくはＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞（例えば、図１で示される段階６の細胞）と共に、細胞クラスターを形成することができる。一部の場合において、インスリン陽性内分泌細胞を含む細胞クラスターは、本明細書で提供される方法を使用して再凝集させることができる。細胞クラスターの再凝集は、インスリン陽性内分泌細胞を濃縮することができる。一部の場合において、細胞クラスター中のインスリン陽性内分泌細胞は、さらに膵臓β細胞に成熟させることができる。例えば、再凝集の後、第２の細胞クラスターは、天然膵島に類似して、インビトロでＧＳＩＳを示すことができる。例えば、再凝集の後、第２の細胞クラスターは、インビトロでＧＳＩＳを示す非天然膵臓β細胞を含んでいてもよい。
【０１６２】
[0197]本明細書で提供される段階６の細胞は、本明細書に記載される解離および再凝集プロセスに供されてもよいし、または供されなくてもよい。一部の場合において、インスリン陽性内分泌細胞を含む細胞集団は、成熟細胞をＳｃ−β細胞に直接誘導することができる。一部の場合において、成熟因子は、本明細書に記載されるＴＧＦ−βシグナル伝達経路および甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤の少なくとも１つの阻害剤を含んでいてもよい。一部の場合において、Ｓｃ−β細胞は、インスリン陽性内分泌細胞を含む細胞の集団をＡｌｋ５ｉおよびＴ３と接触させることによって得ることができる。一部の場合において、インスリン陽性内分泌細胞は、１０％ＦＢＳが補充されたＣＭＲＬｓ培地中で成熟させることができる。他の場合において、Ｓｃ−β細胞は、２％ＢＳＡが補充されていてもよいＭＣＤＢ１３１培地中で、インスリン陽性内分泌細胞を含有する細胞の集団を培養することによって得ることができる。一部の場合において、インスリン陽性内分泌細胞のＳｃ−β細胞への成熟のための２％ＢＳＡを含むＭＣＤＢ１３１培地は、本明細書に記載される小分子因子を含んでいなくてもよい。一部の場合において、インスリン陽性内分泌細胞のＳｃ−β細胞への成熟のための２％ＢＳＡを含むＭＣＤＢ１３１培地は、血清を含んでいなくてもよい（例えば、ＦＢＳを含んでいなくてもよい）。
【０１６３】
[0198]本開示の一態様は、低温保存の方法を提供する。本明細書で提供されるように、非天然膵臓β細胞を含む細胞集団は、低温保存により貯蔵することができる。例えば、非天然β細胞、例えば、一部の場合において段階６の細胞を含む細胞集団は、細胞懸濁液、例えば、単一の細胞懸濁液に解離することができ、細胞懸濁液は、低温保存することができ、例えば低温保存溶液中で凍結することができる。細胞の解離は、本明細書で提供される技術のいずれか、例えば酵素処理によって実行することができる。細胞は、最大で−２０℃、最大で−３０℃、最大で−４０℃、最大で−５０℃、最大で−６０℃、最大で−７０℃、最大で−８０℃、最大で−９０℃、最大で−１００℃、最大で−１１０℃、最大で−１２０℃、最大で−１３０℃、最大で−１４０℃、最大で−１５０℃、最大で−１６０℃、最大で−１７０℃、最大で−１８０℃、最大で−１９０℃、または最大で−２００℃の温度で凍結することができる。一部の場合において、細胞は、約−８０℃の温度で凍結される。一部の場合において、細胞は、約−１９５℃の温度で凍結される。低温保存に必要な低温を提供するために、例えば、これらに限定されないが、電気冷凍庫、固体二酸化炭素、および液体窒素などの任意の冷却方法を使用することができる。一部の場合において、特注および市販の溶液の両方を含む、低温での貯蔵のために細胞をインキュベートするための当業者が利用可能な任意の低温保存溶液を使用することができる。例えば、凍結防止剤を含有する溶液が使用できる。凍結防止剤は、細胞を凍結のダメージから保護するように構成される薬剤であってもよい。例えば、凍結防止剤は、低温保存溶液のガラス転移温度を低くすることができる物質であってもよい。使用可能な例示的な凍結防止剤としては、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、グリコール（例えば、エチレングリコール、プロピレングリコールおよびグリセロール）、デキストラン（例えば、デキストラン−４０）、およびトレハロースが挙げられる。他の作用のために、追加の薬剤を低温保存溶液に添加してもよい。一部の場合において、市販の低温保存溶液、例えば、ＦｒｏｓｔａＬｉｆｅ（商標）、ｐＺｅｒｖｅ（商標）、Ｐｒｉｍｅ−ＸＶ（登録商標）、Ｇｉｂｃｏ  Ｓｙｎｔｈ−ａ−Ｆｒｅｅｚｅ低温保存培地、ＳＴＥＭ−ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（登録商標）、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）凍結培地、ＨｙｐｏＴｈｅｒｍｏｓｏｌ（登録商標）ＦＲＳ保存培地、およびＣｒｙｏＤｅｆｅｎｄ（登録商標）幹細胞培地が、本明細書で提供される方法で使用できる。
【０１６４】
[0199]一部の場合において、細胞クラスターは、本明細書で提供される方法を使用して再凝集に供する前に低温保存することができる。一部の場合において、細胞クラスターを、本明細書で提供される細胞懸濁液へと解離させ、次いで低温保存することができる。特定の期間にわたり低温保存した後、低温保存した細胞を融解させ、本明細書で提供される方法を使用した再凝集のために培養することができる。本明細書で提供される低温保存は、膵臓β細胞またはその前駆体の利用可能性を長期化することができる。一部の場合において、その前駆体または幹細胞から非天然膵臓β細胞を分化させる間、中間の細胞集団は、例えばヒト患者に移植するために非天然膵臓β細胞が所望されるまで、本明細書で提供される方法に従って保存することができる。一部の場合において、細胞は、細胞のそのさらなる使用またはさらなる処理の前、例えば再凝集の前に、任意の望ましい期間にわたり低温保存することができる。例えば、細胞は、少なくとも１日、少なくとも５日、少なくとも１０日、少なくとも１カ月、少なくとも２カ月、少なくとも３カ月、少なくとも４カ月、少なくとも５カ月、少なくとも６カ月、少なくとも７カ月、少なくとも８カ月、少なくとも９カ月、少なくとも１０カ月、少なくとも１１カ月、少なくとも１年、少なくとも２年、少なくとも３年、少なくとも４年、少なくとも５年、または少なくとも１０年にわたり低温保存することができる。
【０１６５】
[0200]Ｓｃ−β細胞は、少なくとも１回のグルコース負荷に対して応答を示すことができる。一部の場合において、ＳＣ−β細胞は、少なくとも２回の逐次的なグルコース負荷に対する応答を示す。一部の場合において、ＳＣ−β細胞は、少なくとも３回の逐次的なグルコース負荷に対する応答を示す。一部の場合において、ＳＣ−β細胞は、複数回のグルコース負荷に対する内因性ヒト膵島の応答に類似した複数回の（例えば、逐次的な）グルコース負荷に対する応答を示す。一部の場合において、ＳＣ−β細胞は、２回の連続したグルコース負荷に応答してインスリンを放出または分泌することが可能である。一部の場合において、ＳＣ−β細胞は、３回の連続したグルコース負荷に応答してインスリンを放出または分泌することが可能である。一部の場合において、ＳＣ−β細胞は、４回の連続したグルコース負荷に応答してインスリンを放出または分泌することが可能である。一部の場合において、ＳＣ−β細胞は、５回の連続したグルコース負荷に応答してインスリンを放出または分泌することが可能である。一部の場合において、ＳＣ−β細胞は、絶え間ない連続したグルコース負荷に応答してインスリンを放出または分泌する。一部の場合において、細胞は、本明細書に記載の実施例に記載されたように、それらが繰り返して細胞内Ｃａ２＋を増加させるかどうかを決定することによって、それらが逐次的なグルコース負荷に対して応答するかどうかを決定するためにアッセイすることができる。
【０１６６】
[0201]一部の場合において、本明細書で提供される方法は、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞を含む細胞集団を用いて開始することができる。ＮＫＸ６．１陽性細胞は、ＮＫＸ６．１陽性細胞を、ＥＧＦスーパーファミリー由来の少なくとも１つの因子、例えばベータセルリンと接触させることによって、ＮＫＸ６．１陽性およびＣ−ペプチド陽性内分泌細胞に分化することができる。一部の場合において、ＮＫＸ６．１陽性およびＣ−ペプチド陽性内分泌細胞は、インスリン陽性内分泌細胞と称する場合もある。一部の場合において、インスリン陽性内分泌細胞の１つの特徴は、クロモグラニンＡの発現であり得る。一部の場合において、インスリン−内分泌細胞を含む集団は、上述したように、解離し、細胞クラスターに再凝集することができる。
【０１６７】
[0202]一部の場合において、細胞のクラスター化を促進する条件は、懸濁培養を含む。一部の場合において、期間は、Ｃ−ペプチドとＮｋｘ６−１を共に発現する細胞の数を最大化するのに十分な期間を含む。一部の場合において、期間は、少なくとも５日である。一部の場合において、期間は、５日から７日の間である。一部の場合において、期間は、少なくとも７日である。一部の場合において、懸濁培養は、毎日、注ぎ足される（例えば、β細胞成熟因子が補充される）。一部の場合において、５日から７日の期間は、Ｃ−ペプチドとＮＫＸ６．１を共に発現する細胞の数を最大化する。
【０１６８】
[0203]一部の場合において、集団中の少なくとも１５％のＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞が、インスリン陽性内分泌細胞に分化するように誘導される。一部の場合において、集団中の少なくとも９９％のＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞が、インスリン陽性内分泌細胞に分化するように誘導される。
【０１６９】
[0204]一部の態様において、本開示は、多能性細胞からＳＣ−β細胞を生成する方法であって、ａ）集団中の多能性幹細胞を、ＴＧＦβスーパーファミリー由来の少なくとも１つの因子およびＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤と３日間にわたり接触させることによって、多能性幹細胞を胚体内胚葉細胞に分化させるステップ；ｂ）胚体内胚葉細胞を、ＦＧＦファミリー由来の少なくとも１つの因子と３日間にわたり接触させるプロセスによって、胚体内胚葉細胞の少なくとも一部を原始消化管細胞に分化させるステップ；ｃ）原始消化管細胞を、ｉ）レチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤、ｉｉ）ＦＧＦファミリー由来の少なくとも１つの因子、ｉｉｉ）ＳＨＨ経路阻害剤、ｉｖ）ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ｖ）ＰＫＣ活性化剤、および任意選択でｖｉ）ＲＯＣＫ阻害剤と２日間にわたり接触させるプロセスによって、原始消化管細胞の少なくとも一部をＰｄｘ１陽性膵臓前駆細胞に分化させるステップ；ｄ）細胞のクラスター化を促進する条件下で、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞を、ｉ）ＦＧＦファミリー由来の少なくとも１種の増殖因子、ｉｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、および任意選択でｉｉｉ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、および任意選択でｉｖ）ＲＯＣＫ阻害剤およびｖ）ＴＧＦβスーパーファミリー由来の少なくとも１つの因子と５日間にわたり１日おきに接触させるプロセスによって、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞の少なくとも一部を、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞に分化させるステップであって、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞は、Ｐｄｘ１およびＮＫＸ６．１を発現する、ステップ；ｅ）細胞のクラスター化を促進する条件下で、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞を、ｉ）ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤、ｉｉ）ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、ｉｉｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ｉｖ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ｖ）γ−セクレターゼ阻害剤、およびｖｉ）上皮増殖因子（ＥＧＦ）ファミリー由来の少なくとも１種の増殖因子と５日から７日の期間にわたり１日おきに接触させるプロセスによって、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞の少なくとも一部を、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性内分泌細胞に分化させるステップであって、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１、インスリン陽性内分泌細胞は、Ｐｄｘ１、ＮＫＸ６．１、ＮＫＸ２．２、Ｍａｆｂ、ｇｌｉｓ３、Ｓｕｒ１、Ｋｉｒ６．２、Ｚｎｔ８、ＳＬＣ２Ａ１、ＳＬＣ２Ａ３および／またはインスリンを発現する、ステップ；ならびにｆ）細胞のクラスター化を促進する条件下で、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性内分泌細胞を、ｉ）トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）シグナル伝達経路阻害剤、ｉｉ）甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、および任意選択でｉｉｉ）プロテインキナーゼ阻害剤と７日から１４日の期間にわたり１日おきに接触させて、インビトロにおけるＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性内分泌細胞の少なくとも一部のＳＣ−β細胞への成熟を誘導するプロセスによって、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性内分泌細胞の少なくとも一部を、ＳＣ−β細胞に分化させるステップであって、ＳＣ−β細胞は、インビトロおよび／またはインビボでＧＳＩＳ応答を示す、ステップを含む、方法を提供する。一部の場合において、ＧＳＩＳ応答は、内因性成熟β細胞のＧＳＩＳ応答に類似している。
【０１７０】
[0205]一部の態様において、本開示は、多能性細胞からＳＣ−β細胞を生成する方法であって、ａ）集団中の多能性幹細胞を、ＴＧＦβスーパーファミリー由来の少なくとも１つの因子およびＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤と３日間にわたり接触させることによって、多能性幹細胞を胚体内胚葉細胞に分化させるステップ；ｂ）胚体内胚葉細胞を、ＦＧＦファミリー由来の少なくとも１つの因子と３日間にわたり接触させるプロセスによって、胚体内胚葉細胞の少なくとも一部を原始消化管細胞に分化させるステップ；ｃ）原始消化管細胞を、ｉ）レチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤およびｉｉ）ＦＧＦファミリー由来の少なくとも１つの因子と２日間にわたり接触させるプロセスによって、原始消化管細胞の少なくとも一部を、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞に分化させるステップ；ｄ）細胞のクラスター化を促進する条件下で、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞を、ＦＧＦファミリー由来の少なくとも１種の増殖因子と５日間にわたり１日おきに接触させるプロセスによって、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞の少なくとも一部を、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞に分化させるステップであって、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞は、Ｐｄｘ１およびＮＫＸ６．１を発現する、ステップ；ｅ）細胞のクラスター化を促進する条件下で、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞を、ｉ）ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤、ｉｉ）ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、ｉｉｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ｉｖ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ｖ）γ−セクレターゼ阻害剤、ｖｉ）上皮増殖因子（ＥＧＦ）ファミリー由来の少なくとも１種の増殖因子、およびｖｉｉ）ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤と５日から７日の期間にわたり１日おきに接触させるプロセスによって、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞の少なくとも一部を、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性内分泌細胞に分化させるステップであって、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１、インスリン陽性内分泌細胞は、Ｐｄｘ１、ＮＫＸ６．１、ＮＫＸ２．２、Ｍａｆｂ、ｇｌｉｓ３、Ｓｕｒ１、Ｋｉｒ６．２、Ｚｎｔ８、ＳＬＣ２Ａ１、ＳＬＣ２Ａ３および／またはインスリンを発現する、ステップ；ならびにｆ）２％ＢＳＡが補充されているＭＣＢＤ１３１培地中で、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性内分泌細胞を培養して、インビトロにおけるＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性内分泌細胞の少なくとも一部のＳＣ−β細胞への成熟を誘導することによって、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性内分泌細胞の少なくとも一部をＳＣ−β細胞に分化させるステップであって、ＳＣ−β細胞は、インビトロおよび／またはインビボでＧＳＩＳ応答を示す、ステップを含む、方法を提供する。一部の場合において、ＧＳＩＳ応答は、内因性成熟β細胞のＧＳＩＳ応答に類似している。
【０１７１】
[0206]一部の態様において、本開示は、多能性細胞からＳＣ−β細胞を生成する方法であって、ａ）集団中の多能性幹細胞を、好適な条件下で、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞に分化させるステップ；ｂ）細胞のクラスター化を促進する条件下で、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞を、ｉ）ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤、ｉｉ）ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、ｉｉｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ｉｖ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ｖ）γ−セクレターゼ阻害剤、ｖｉ）上皮増殖因子（ＥＧＦ）ファミリー由来の少なくとも１種の増殖因子、およびｖｉｉ）ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤と５日から７日の期間にわたり１日おきに接触させるプロセスによって、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞の少なくとも一部を、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性内分泌細胞に分化させるステップであって、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１、インスリン陽性内分泌細胞は、Ｐｄｘ１、ＮＫＸ６．１、ＮＫＸ２．２、Ｍａｆｂ、ｇｌｉｓ３、Ｓｕｒ１、Ｋｉｒ６．２、Ｚｎｔ８、ＳＬＣ２Ａ１、ＳＬＣ２Ａ３および／またはインスリンを発現する、ステップ；ならびにｃ）２％ＢＳＡが補充されているＭＣＢＤ１３１培地中で、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性内分泌細胞を培養して、インビトロにおけるＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性内分泌細胞の少なくとも一部のＳＣ−β細胞への成熟を誘導することによって、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性内分泌細胞の少なくとも一部をＳＣ−β細胞に分化させるステップであって、ＳＣ−β細胞は、インビトロおよび／またはインビボでＧＳＩＳ応答を示す、ステップを含む、方法を提供する。一部の場合において、ＧＳＩＳ応答は、内因性成熟β細胞のＧＳＩＳ応答に類似している。
【０１７２】
[0207]一部の態様において、本開示は、膵臓β細胞を含有する細胞クラスターを生成する方法であって、ａ）ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞を含む細胞集団を得ること；ｂ）ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞を、上皮増殖因子（ＥＧＦ）ファミリー由来の少なくとも１種の増殖因子と接触させるプロセスによって、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞の少なくとも一部を、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性（またはＣ−ペプチド陽性）内分泌細胞に分化させるステップであって、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１、インスリン陽性内分泌細胞は、Ｐｄｘ１、ＮＫＸ６．１、ＮＫＸ２．２、Ｍａｆｂ、ｇｌｉｓ３、Ｓｕｒ１、Ｋｉｒ６．２、Ｚｎｔ８、ＳＬＣ２Ａ１、ＳＬＣ２Ａ３および／またはインスリンを発現する、ステップ；ならびにｃ）２％ＢＳＡが補充されているＭＣＢＤ１３１培地中で、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性内分泌細胞を培養して、インビトロにおけるＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性内分泌細胞の少なくとも一部の膵臓β細胞への成熟を誘導することによって、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性内分泌細胞の少なくとも一部を膵臓β細胞に分化させるステップであって、膵臓β細胞は、インビトロおよび／またはインビボでＧＳＩＳ応答を示す、ステップを含む、方法を提供する。一部の場合において、ＧＳＩＳ応答は、内因性成熟β細胞のＧＳＩＳ応答に類似している。
【０１７３】
[0208]Ｖ  処置方法
[0209]さらに、対象における疾患を処置または予防するための方法が本明細書で提供される。内因性膵島に類似した細胞クラスターを含む組成物を対象に投与して、対象においてある程度の膵臓の機能を回復させることができる。例えば、内因性膵島に類似した細胞クラスターを対象に移植して、糖尿病を処置することができる。
【０１７４】
[0210]本方法は、本出願で開示された細胞クラスターを、対象に、例えばそれを必要とする対象に移植することを含んでいてもよい。用語「移植すること」および「投与すること」は、同義的に使用でき、細胞もしくは細胞クラスター、細胞もしくはその細胞クラスターのいずれかの部分、または細胞、細胞クラスターもしくはそれらのいずれかの部分を含む任意の組成物を、導入される細胞または細胞クラスターを少なくとも部分的に望ましい部位に局在化させる方法または経路によって、対象に配置することを指す場合がある。細胞または細胞クラスターは、膵臓に直接植え込んでもよいし、または代替として、植え込まれた１つまたは複数の細胞の少なくとも一部が生存可能になるような対象における望ましい配置への送達をもたらす任意の適切な経路によって投与してもよい。対象に投与した後の細胞または細胞クラスターの生存期間は、短くとも数時間、例えば２４時間から、数日、また数年もの長期であってもよい。いくつかの場合において、細胞もしくは細胞クラスター、または細胞もしくはその細胞クラスターのいずれかの部分はまた、植え込まれた細胞または細胞クラスターを植え込んだ配置に維持して移動を回避するために、膵臓以外の配置に、例えば肝臓中または皮下に、例えばカプセル（例えば、マイクロカプセル）で別途投与することもできる。
【０１７５】
[0211]本明細書に記載の方法によって処置できる対象は、ヒトまたは非ヒト動物であり得る。一部の場合において、対象は、哺乳動物であり得る。対象の例としては、これらに限定されないが、霊長類、例えば、サル、チンパンジー、バンブー（ｂａｍｂｏｏ）、またはヒトが挙げられる。一部の場合において、対象は、ヒトである。対象は、非霊長類動物、これらに限定されないが、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギなどであり得る。一部の場合において、処置を受ける対象は、それを必要とする対象、例えば、それを必要とするヒトである。
【０１７６】
[0212]用語「処置すること」および「処置」は、本明細書で使用される場合、対象が、疾患の少なくとも１つの症状の低減または疾患の改善、例えば有益な、または望ましい臨床結果を有するように、対象に有効量の組成物（例えば、細胞クラスターまたはその一部）を投与することを指す場合がある。この開示の目的に関して、有益な、または望ましい臨床結果としては、これらに限定されないが、検出可能かまたは検出不可能かにかかわらず、１つまたは複数の症状の軽減、疾患の程度の低減、疾患の状況の安定化（例えば、悪化させないこと）、疾患進行の遅延または緩徐化、病態の改善または一時的緩和、および寛解（例えば、部分的または完全）が挙げられる。処置は、処置を受けない場合に予測される生存期間と比較して生存期間を延長することを指す場合がある。したがって、当業者は、処置は疾患の状態を改善できるが、疾患を完治させない場合もあることを理解している。用語「処置」は、本明細書で使用される場合、予防を含む。
【０１７７】
[0213]本明細書で提供される方法および組成物は、疾患を有するかまたは疾患を発症するリスク（例えば、高いリスク）を有する対象を処置するのに使用することができる。一部の場合において、疾患は、糖尿病、これらに限定されないが、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、１．５型糖尿病、前糖尿病、嚢胞性線維症関連の糖尿病、外科処置による糖尿病、妊娠糖尿病、およびミトコンドリア糖尿病などである。また疾患は、糖尿病の合併症、例えば、心臓および血管疾患、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、足へのダメージ、ならびに聴覚へのダメージなどであってもよい。
【０１７８】
[0214]本方法は、当業界における任意の手段を使用して、対象に細胞クラスターを移植することを含んでいてもよい。例えば本方法は、腹膜内のスペース、腎被膜下、腎被膜、網、皮下のスペースにより、または膵床（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｂｅｄ）注入により細胞クラスターを移植することを含んでいてもよい。例えば、移植は、被膜下移植、筋肉内移植、または門脈内移植、例えば門脈内注入であってもよい。免疫防御性の封入を実行して、細胞クラスターに免疫防御を提供することができる。
【実施例】
【０１７９】
[0216]実施例１．非天然β細胞を含む細胞クラスターを再凝集させる方法
[0217]この実施例は、その全体が本明細書に組み入れられる米国特許出願第１４／６８４，１２９号および１４／６８４，１０１号に記載の方法を使用して生成した段階６の細胞を含む細胞クラスターから、開示された細胞を再凝集させるための例示的な方法を示す。実施例にわたり、開始時のクラスターが天然クラスターと称される。天然クラスターと比較して、再凝集した細胞クラスターは、より高いパーセンテージの内因性成熟膵臓β細胞のマーカーを発現する細胞を含んでおり、インビトロとインビボの両方において、より大きい、グルコースによって刺激されたインスリン分泌を示した。
【０１８０】
[0218]天然クラスターの解離
[0219]５００ｍＬスピナーフラスコ中で培養した天然クラスターを、インキュベーターから取り出し、フラスコの底部に３〜５分間沈降させた。フラスコを４５°の角度に傾け、真空トラップに取り付けられた吸引チップを使用して、フラスコの２つのアームのうち一方の蓋を通してできる限り多くフラスコ内部の液体を吸引した。
【０１８１】
[0220]堆積物である細胞クラスターを、血清用のピペットを使用して５０ｍＬコニカルチューブに移した。１０ｍＬのＰＢＳを添加することによってスピナーフラスコを洗浄した。残ったクラスターを５０ｍＬコニカルチューブに移した。５０ｍＬコニカルチューブ中に実質的に全てのクラスターが収集されるまで、移動を繰り返した。移動したクラスターを、５０ｍＬコニカルチューブの底部に２〜４分間沈降させ、次いで吸引チップを用いてＰＢＳを吸引して除去した。
【０１８２】
[0221]コニカルチューブ中の細胞に、２０ｍＬの（３７℃に）予め温めたＴｒｙｐＬＥ（商標）（細胞約５億個当たり）を添加し、水浴中、３７Ｃで１５分インキュベートした。コニカルチューブを３分のインターバルで回転させて、クラスター−ＴｒｙｐＬＥ（商標）混合物を撹拌した。
【０１８３】
[0222]ＴｒｙｐＬＥ（商標）中での１５分のインキュベーション後、実質的にクラスターが見えなくなるまで、Ｐ１０００ピペットチップによって細胞を強制的に吸ったり吐いたりした。この段階で、細胞の大部分が、単一の細胞懸濁液の状態になった。次いで、ＴｒｙｐＬＥ（商標）−細胞混合物を、２０ｍＬのＱｕｅｎｃｈ培地によって（１：１のＴｒｙｐＬＥ（商標）：Ｑｕｅｎｃｈ培地の比率で）クエンチした。
【０１８４】
[0223]細胞懸濁液を２０μｍメッシュフィルターに通過させて、解離されていない全てのクラスターを除去した。メッシュ上にはわずかな小さいクラスターしかなく、それらのほとんどは単一の細胞に解離されフィルターを通過した。
【０１８５】
[0224]単一細胞懸濁液を２００ｇで４分遠心分離する。上清を除去し、細胞ペレットを３０ｍＬの（３７℃に）予め温めたＭＣＤＢ培養培地に再懸濁し、均一な単一細胞懸濁液が見られるまでよく混合した。
【０１８６】
[0225]解離した細胞のスピナーフラスコへの播種
[0226]０．５ｍＬの単一細胞懸濁液を採取した。細胞生存率（膜完全性アッセイ）および濃度をＶｉ−Ｃｅｌｌで測定した。細胞を、細胞１×１０６個／ｍＬで（または望ましいクラスターサイズおよび実験目的に応じて、それより高い密度で）スピナーフラスコに播種した。
【０１８７】
[0227]再凝集のために細胞をスピナーフラスコ中で培養すること
[0228]播種した細胞を有するフラスコを、５０ｒｐｍの磁気撹拌プレート上の５％ＣＯ２を含む３７℃のインキュベーター中に置いた。インペラーが均一に回転するように、フラスコを撹拌器の真上に置いた。３０ｍＬのＢｉｏｔｔを使用した場合、Ｂｉｏｔｔを指示された磁気撹拌システム上に置き、６０ｒｐｍで撹拌した。
【０１８８】
[0229]細胞を４８時間再凝集させた。４８時間毎に培地を交換した。第１の培地交換で、再凝集したクラスターを５０ｍＬコニカルチューブに移し、３００ｇで３分遠沈した。ペレットを新鮮なＭＣＤＢ培養培地に再懸濁した。それに続く培地交換（４８時間毎）で、再凝集したクラスターを２０μｍメッシュフィルターでろ過した。凝集しなかった細胞をフィルターに通過させ、同時に再凝集したクラスターをメッシュによって捕獲した。ろ過物をひっくり返し、クラスターを新鮮なＭＣＤＢ培養培地を使用してフラスコにフラッシングした。４〜７日培養した後、再凝集したクラスターは丸く球状になった。再凝集プロセス中の細胞の形態は図３で示した通りであった。
【０１８９】
[0230]細胞の低温保存
[0231]自己植え込みおよび異種移植ならびに研究のための生存可能な組織および細胞の供給は、組織または臓器を生存可能な状況で維持できる時間によって部分的に制限される。組織または臓器が生存可能なままでいる時間の長さを増加させることは、特定の組織がレシピエントまたは研究者に生存可能な状態で届く可能性を大幅に増加させることができる。本開示の一部の場合において、細胞の低温保存を後述するように実行して、ＳＣベータ細胞を分化完了時に凍結および貯蔵し、機能的な細胞を確実に保存した。
【０１９０】
[0232]ＳＣベータ細胞を低温保存するために、ＴｒｙｐＬＥ、ＰＢＳ、および段階６の培地は、３７Ｃに予め温めてもよい。加えて、Ｐｒｉｍｅ−ＸＶ低温保存溶液は、低温保存のために、氷上で維持して低温を維持してもよい。分散プロセスの前に標準的なＱＣを実行して、フラスコ内の細胞数の推測値を決定してもよい。標的的なスピナーフラスコをインキュベーターから取り出し細胞培養フードに入れて、細胞を３から５分間沈降させた。フラスコの１つのアームから蓋を取り、フラスコから全ての古い培地を吸引する。０．０５％ＨＳＡ培地を充填したフラスコの場合、培地を、そのレベルがフラスコの底部の縁に到達するまで吸引チップで除去する。吸引ピペットを取り除き、蓋をアームに再び取りつけた後、主要な蓋をスピナーフラスコからはずす。２５ｍＬ血清用ピペットを用意し、フラスコを傾けてから、残りの培地を慎重に除去する。５ｍＬ血清用ピペット（５ｍＬ血清用ピペット内部にリムがないため、クラスターがトラップされない）を用いて天然細胞クラスターペレットを収集し、５０ｍＬコニカルチューブに移す。スピナーフラスコを１０ｍＬの予め温めたＰＢＳで洗浄して、残りの天然クラスターを収集し、５０ｍＬコニカルチューブに移す。洗浄プロセスをさらに３回繰り返す。クラスターを２から４分間沈降させ、その後、５０ｍＬコニカルチューブから５ｍＬのＰＢＳを残し全てを吸引する。コニカルチューブに４０ｍＬの予め温めたＰＢＳを添加して、細胞を再度洗浄し、天然クラスターを２から４分間沈降させ、その後、できる限り多くのＰＢＳを吸引して取り出す。細胞３００Ｍ毎に２０ｍＬの温めたＴｒｙｐＬＥを添加し、コニカルチューブをインキュベーター中で２０分インキュベートする。最初の１０分の後、インキュベーターのドアを開き、コニカルチューブ中の細胞を回転させて、全ての細胞にＴｒｙｐＬＥが均等に分配されていることを確実にする。細胞をさらに１０分インキュベートする。インキュベーションの後、ペレットがかき混ざらないようにしてコニカルチューブをフードに移す。コニカルチューブからＴｒｙｐＬＥを吸引し、コニカルチューブに１０ｍＬの温めた段階６の培地を添加する。Ｐ１０００ピペットチップを用いて溶液を１０回から１５回吸ったり吐いたりして、クラスターを壊す。コニカルチューブを、温めた段階６の培地で４０ｍＬまで満たす。４０ｕｍフィルターを予め湿潤させた後、細胞をフィルターに通し、全ての解離していないクラスターを溶液から除去する。コニカルチューブを１０ｍＬの段階６の培地で濯いで、チューブを洗浄し、５０ｍＬの最終容量について４０ｕｍメッシュでろ過する。サンプルを、細胞計数および濃度測定のためのＶｉ  Ｃｅｌｌ細胞計数器に入れる。細胞計数が決定されたら、コニカルチューブを３００×ｇで３分遠沈させる。コニカルチューブをフードに戻し、全ての段階６の培地を吸引する。細胞１００Ｍ／ミリリットルの濃度まで細胞を冷たいＰＲＩＭＥ−ＸＶに再懸濁し、ラベルしたクライオバイアル中で適切に等分する。最後に、充填したクライオバイアルをＣｏｏｌ  Ｃｅｌｌに置いて−８０の冷凍庫で一晩静置し、２４時間後、液体窒素貯蔵庫に移す。クライオバイアルはまた、制御速度冷凍庫で迅速に凍結し、次いで即座に液体窒素に移してもよい。
【０１９１】
[0233]実施例２．低温保存した再凝集した細胞クラスターを融解および培養する方法
[0234]細胞の融解
[0235]自己植え込みおよび異種移植ならびに研究のための生存可能な組織および細胞の供給は、組織または臓器が生存可能な状況で維持できる時間によって部分的に制限される。組織または臓器が生存可能なままでいる時間の長さを増加させることは、特定の組織がレシピエントまたは研究者に生存可能な状態で届く可能性を大幅に増加させることができる。本開示の一部の場合において、低温保存した細胞を融解させることを後述するようにして実行して、機能的なＳＣベータ細胞を得た。
【０１９２】
[0236]低温保存したＳＣベータ細胞を融解させ培養するために、低温保存したバイアルを取り、水浴中、３７Ｃで２〜３分迅速に融解させる。少量の氷の結晶が残る程度にバイアルが融解されたら、バイアルを水浴から取り出し、バイアルをエタノールできれいに拭いた後、細胞培養フードに移す。予め温めた段階６の培地を、同じ体積のクライオバイアルの内容物と少なくとも同じ量で含有する１５ｍＬコニカルチューブを調製する。例えば、１つのバイアルを融解させる場合に、各クライオバイアルが２ｍｌを含有するならば、コニカルチューブ中に少なくとも２ｍｌの培地が存在することを確実にする。１つのバイアルを融解する場合、５ｍＬ血清用ピペットを使用して３ｍＬの段階６の培地を吸い上げ、次いで同じピペットを使用して、クライオバイアルの２ｍｌの内容物を吸い上げる。血清用ピペット中の５ｍＬの細胞＋培地の全体を、段階６の培地と共に細胞を含有する１５ｍＬコニカルチューブに、それを回転させながら１滴ずつ供給する。コニカルチューブに細胞を迅速に添加すること（１滴ずつ添加する代わりに）は、浸透圧性ショックを引き起こす可能性があり、細胞にダメージを与える可能性がある。追加の１または２ｍＬの段階６の培地を吸い上げて、細胞を含有するバイアルを洗浄し、次いで１５ｍＬコニカルチューブに添加する。培地および細胞に温めた段階６の培地を加えて１４または１５ｍＬの量まで満たす。これは、凍結培地を希釈し、コニカルチューブの壁に付着した全ての細胞を遠心分離中に確実に洗い落とすためである。
【０１９３】
[0237]その後、細胞を１００ｇで３分遠心分離することによって、３回の遠沈を実行する。上清を収集し、別の１５ｍＬコニカルチューブに移し、再度２００ｇで３分遠心分離する。上清を収集し、別の１５ｍＬコニカルチューブに移し、再度３００ｇで３分遠心分離する。それでも上清が濁っている場合、追加の遠沈を行うことができる。全ての遠沈が完了したら、上清をコニカルチューブから吸い出す。１５ｍＬコニカルチューブのうち１つで、１０ｍＬの段階６の培地中に再懸濁することによって全ての遠沈からの細胞ペレットを収集する。血球計数器またはＶｉ−Ｃｅｌｌ計数器のいずれかを使用した細胞計数のために、単一細胞懸濁液の小さいサンプルを取る。細胞を、生存可能な細胞２×１０６個／ｍＬの密度で（または望ましいクラスターサイズおよび実験目的に応じて、より高い密度で）Ｂｉｏｔｔに播種する。例えば、全ての生存可能な細胞計数が１０ｍＬ中６０００万個の細胞の溶液である場合、１０ｍＬの細胞をＢｉｏｔｔに移し、次いで２０ｍＬの段階６の培地を使用してコニカルチューブを濯ぎ、それをフラスコに添加し戻して、最終容量を３０ｍＬにする。再凝集したクラスター直径は、細胞２×１０６個／ｍＬで播種した場合、Ｓｔ６ｄ４で＜１２０ｕｍである。小さいＢｉｏｔｔは、４０ｍＬまでの培地（８０００万個の生存可能な細胞）を含有し得る。他のプロトコールは、５００ｍＬスピナーフラスコの使用を記載しているが、融解した細胞は、その中でそれほどよく凝集しない場合がある。細胞を播種したフラスコを、６０ｒｐｍの磁気撹拌プレート上の５％ＣＯ２を含む３７℃のインキュベーターに置く。インペラーが均一に回転するように、フラスコが撹拌器の真上に配置されるようにする。そうしなければクラスター形成が不十分になる可能性がある。細胞を２４時間再凝集させる。培地を、融解後２４時間で交換する。
【０１９４】
[0238]培地の交換
[0239]培地は、２４時間（２日目）で交換してもよく、再凝集したクラスターの３回の遠沈を必要とすると予想される。細胞を５０ｍＬコニカルに移し、１００ｇで３分遠心分離する。上清を収集し、血清用ピペットを使用して別の５０ｍＬコニカルチューブに移す。細胞ペレットを新鮮な５ｍＬの段階６の培地に再懸濁し、それらをスピナーＢｉｏｔｔに戻す。上清を再度２００ｇで３分遠沈さる。細胞ペレットを新鮮な段階６の培地に再懸濁し、スピナーフラスコ／Ｂｉｏｔｔに戻す。上清を再度収集し、血清用ピペットを使用して別のコニカルチューブに移し、３００ｇで３分遠心分離する。上清を吸い出す。細胞ペレットを新鮮な段階６の培地に再懸濁し、それらをスピナーフラスコ／Ｂｉｏｔｔに戻す。Ｂｉｏｔｔ／フラスコをその全体積まで満たすのに必要な残りの培地を用いて、コニカルチューブを全ての残りの細胞のために濯ぐ。フラスコ／Ｂｉｏｔｔの残部を、コニカルチューブを洗浄するのに使用した段階６の培地で元の体積まで満たす（ここで細胞密度は、細胞２×１０６個／ｍＬである）。１回目の遠沈は、新たに再凝集したクラスターが一緒に固まるのを回避するために１００ｇでのみなされる。それに続く上清の２回の遠心分離は、一緒にクラスター化しなかった全ての単一の細胞を収集するためである。これは、望ましい細胞が一緒になって集合体にクラスター化するのに十分な時間を与える。２４時間後にそれらをろ過することは、多くの優れた細胞の損失を引き起こし、より低い収量をもたらすと予想される。４日目に（最初の播種の７２時間後）全ての再凝集したクラスターを２０μｍメッシュフィルターに通してろ過することによって、２回目の培地交換を行ってもよい。メッシュフィルターを、使用前に培地で予め湿潤させる。凝集しなかった細胞はフィルターを通過するが、再凝集したクラスターはメッシュによって捕獲される。フィルターをＢｉｏｔｔの真上で裏返し、新鮮な段階６の培地を使用してクラスターをＢｉｏｔｔ中に洗い流す。フィルターから細胞をフラッシングしてＢｉｏｔｔに戻すとき、２５ｍＬ血清用ピペットが使用されてメッシュに押し付けられる。血清用ピペットが、培地を供給しながらメッシュ全体を動き回るようにする。フィルターを使用して培地交換を行い、凝集しなかった不要な細胞を除去する。全ての細胞を十分な時間再凝集させた後、４日後にそれでもなお単一の細胞である細胞は、クラスターを形成しない場合がある。それに続くＳ６ｄ６、Ｓ６ｄ８（例えば、４８時間毎）での培地交換は同様に実行される。全ての再凝集したクラスターを、２０μｍメッシュフィルターに通してろ過する。メッシュフィルターを、使用前に培地で予め湿潤させる。凝集しなかった細胞はフィルターを通過するが、再凝集したクラスターはメッシュによって捕獲される。フィルターを裏返し、新鮮な段階６の培地を使用してクラスターをフラスコに洗い流す。３回目の培地交換で再凝集したクラスターは、通常、小型で球状である。他のプロトコールは、培地交換のために細胞を遠心分離することを示唆する。しかしながら、細胞を遠心分離する場合、より大きい細胞損失が生じる。さらに、遠心分離は、細胞が一緒に固まり、クラスターサイズをより大きくする原因になる可能性がある。メッシュに押し付けた血清用ピペットを動かすことでそれらを洗い落とすことによって、確実にメッシュ上の全てのクラスターを収集することが重要である。細胞収量は、播種した生存可能な細胞（総数ではなく）に基づく。例えば、Ｓ６ｄ１で、融解直後に６０００万個の生存可能な細胞を播種した。Ｓ６ｄ１０で、再凝集しなかった単一の細胞をろ過して除いた後、サンプルを取り、ＴｒｙｐＬＥ中で解離させ、計数する。Ｂｉｏｔｔにより３０００万個の細胞が残っていると計算される場合、それは５０％の収量に相当する。融解直後に約７０％の生存率が見られることが一般的である。Ｓ６ｄ４で、細胞収量は、３０〜５０％の間になり得る。ＳＣ−膵島は、ＧＳＩＳおよびＳ６ｄ７〜Ｓ６ｄ１２の間での試験にとって最適である。Ｓ６ｄ１２を超えると、細胞収量の減少、およびクラスターサイズの増加が観察される可能性がある。
【０１９５】
[0240]実施例３．再凝集した細胞クラスターの特徴付け
[0241]実施例１で生成した再凝集した細胞クラスターを特徴付けて、それらが内因性膵島の機能および特徴を有するかどうかを決定した。再凝集した細胞クラスターの機能および特色を、天然クラスターのそれらと比較した。その比較は、再凝集した細胞クラスターが、天然クラスターと比較して内因性膵島により類似していたことを示した。
【０１９６】
[0242]フローサイトメトリー
[0243] 再凝集したクラスターおよび天然クラスター中で、内因性成熟膵臓β細胞のマーカーを発現する細胞のパーセンテージを、フローサイトメトリーによって検出し、比較した。
【０１９７】
[0244]天然クラスターおよび再凝集したクラスターを、ＴｒｙｐＬＥ（商標）エキスプレス中でのインキュベーションによって単一細胞懸濁液に分散させた。細胞は、一般的に１００万〜２００万個であり、これをＰＢＳ（１ｍＬ）中で１回洗浄し、１．７ｍｌマイクロ遠沈管（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；１１５１０）に移した。細胞を４％ＰＦＡに再懸濁し、氷上で３０分インキュベートした。次いで細胞をＰＢＳで１回洗浄し、続いて、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ＋０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００＋５％ロバ血清）中で氷上で１時間インキュベートした。
【０１９８】
[0245]次いで細胞を一次抗体と共にブロッキング緩衝液に再懸濁し、４℃で一晩インキュベートした。ヒトＮＫＸ６．１、ヒトＣＨＧＡ、およびヒトＣ−ペプチドに対する一次抗体を希釈し、細胞と共にインキュベートした。細胞をブロッキング緩衝液で２回洗浄し、次いで二次抗体と共にブロッキング緩衝液中で氷上で２時間インキュベートした。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８または６４７（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にコンジュゲートした二次抗体を使用して、一次抗体を可視化した。
【０１９９】
[0246]次いで細胞をソーティング緩衝液（ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ；Ａ８４１２）中で３回洗浄し、最終的に５００〜７００ｍｌのソーティング緩衝液に再懸濁し、４０ｍｍナイロンメッシュを通して濾過し、フローサイトメトリーチューブ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ；３５２２３５）で受け、ＬＳＲ−ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、少なくとも３０，０００事象を記録して分析した。結果の分析を、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して実行した。図５は、低温保存を行ったおよび行わなかった再凝集したクラスターにおいて、ＣＨＧＡ、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する細胞が天然クラスターと比較して濃縮されていたことを示す。特定には、およそ９５．５％および９４．６％のＲＡ細胞および低温ＲＡ細胞がそれぞれＣＨＧＡを発現したが、それに比べて天然細胞は６１．６％であった。同様に、およそ９４．４％および８９．８％のＲＡ細胞および低温ＲＡ細胞がそれぞれＮＫＸ６．１およびＣＨＧＡの両方を発現し、それに比べて天然細胞は５７．８％であった。最終的に、本開示の方法を使用して、およそ７５．４％および６２．１％のＲＡ細胞および低温ＲＡ細胞がそれぞれ、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドの両方を発現し、それに比べて天然細胞は３２．４％であった。加えて、図６で示されるように、低温保存を行ったおよび行わなかった再凝集した細胞クラスターにおいて、ＣＨＧＡ、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する細胞は、ヒト死体の膵島と比較して濃縮されていた。特定には、１８．８％、１９．２％、および５６．６％のヒト死体の膵島のみがそれぞれ、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチド、ＮＫＸ６．１およびＣＨＧＡ、またはＣＨＧＡのマーカーを発現した。
【０２００】
[0247]上述したように、凝集しなかった細胞はフィルターを通過するが、再凝集したクラスターはメッシュによって捕獲される。再凝集しなかった細胞（例えば、フィルターを通過する細胞）のフローサイトメトリーによる特徴付けは、再凝集が、全てのＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチド陽性ベータ細胞を捕獲し、細胞収量に有意に影響を与えないことを確認する。図７で示されるように、再凝集により、ベータ細胞特異的マーカー（例えば、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドの両方）を発現する細胞の９８％より多くが、メッシュによって捕獲され、喪失する細胞（例えば、メッシュを通過する）は２％未満であるという結果になった。一般的に、細胞クラスターを形成しない細胞（例えば、再凝集しない細胞、および／またはメッシュを通過する細胞）のうち約１０％未満が、フローサイトメトリーによる測定によれば、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する。一部の場合において、細胞クラスターを形成しない細胞（例えば、再凝集しない細胞、および／またはメッシュを通過する細胞）のうち、約９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満が、フローサイトメトリーによる測定によれば、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する。同様に、細胞の再凝集はまた、ＳＯＸ９陽性およびＳＯＸ−２陽性オフターゲット細胞集団の低減ももたらす。図８で示されるように、低温保存を行ったおよび行わなかった再凝集したクラスターにおいて、天然クラスターと比較して、ＳＯＸ２およびＳＯＸ９を発現する細胞が枯渇した。特定には、およそ０．３％および０．６％のＲＡ細胞および低温ＲＡ細胞がそれぞれ、ＳＯＸ２を発現したが、それに比べて天然細胞は３．１％であった。同様に、およそ１．２％および６．４％のＲＡ細胞および低温ＲＡ細胞がそれぞれＳＯＸ９を発現し、それに比べて天然細胞は１１．９％であった。ＳＯＸ２および／またはＳＯＸ９陽性細胞は、オフターゲット細胞集団（例えば、非ベータ細胞）、例えば増殖性または部分的に分化した細胞を表すことができる。
【０２０１】
[0248]当業者は、再凝集後に細胞を特徴付けるのにフローサイトメトリー以外の技術も使用できることを理解しているものと予想される。細胞特徴付け方法の非限定的な例としては、遺伝子シーケンシング、顕微鏡技術（蛍光顕微鏡法、原子間力顕微鏡法）、核型分析、イソ酵素分析、ＤＮＡ特性、ウイルス感受性が挙げられる。一例において、図９で示されるように、天然細胞（上）および再凝集した細胞（下）は、（左）ＤＡＰＩ（例えば、核を示す）および（右）Ｋｉ６７（例えば、増殖の細胞マーカー）に関して免疫染色される。示した通り、細胞の再凝集は、Ｋｉ６７陽性細胞の数の減少を引き起こしたことから、増殖性（例えば、オフターゲット）細胞集団の数の低減が示される。当業者は、オフターゲット細胞集団（例えば、ＳＯＸ２、ＳＯＸ９、ＬＩＮ２８）を検出するのに任意の細胞マーカーを使用できることを理解しているものと予想される。
【０２０２】
[0249]インビトロでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌
[0250]クレブス緩衝液（Ｋｒｂ）を以下のように調製した：脱イオン水中の、１２８ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、２．７ｍＭのＣａＣｌ２、１．２ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１．２ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、５ｍＭのＮａＨＣＯ３、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；１５６３００８０）、０．１％ＢＳＡ（Ｐｒｏｌｉａｎｔ；６８７００）。２ｍＭグルコース（低グルコース）、２０ｍＭグルコース（高グルコース）、または２ｍＭグルコースおよび３０ｍＭのＫＣｌ（ＫＣｌ極性化負荷）を含有するＫｒｂ溶液を調製し、３７℃に平衡化した。
【０２０３】
[0251]天然の再凝集したクラスター、および低温保存した再凝集したクラスターを１ｍｌのＫｒｂ緩衝液で２回洗浄し、次いで３ｍｌの低グルコースＫｒｂ中で２時間プレインキュベートして、残留したインスリンを除去した。クラスターをＫｒｂで２回洗浄し、次いで１ｍｌの低グルコースＫｒｂ中で３０分インキュベートした。ＥＬＩＳＡ分析のために、インキュベーション後、上清の２００ｕｌのサンプルを収集した（低グルコースサンプル）。クラスターをＫｒｂで２回洗浄し、次いで高グルコースＫｒｂ中で３０分インキュベートし、インキュベーション後、２００ｕｌの上清を収集した（高グルコースサンプル）。最後に、クラスターをＫｒｂで２回洗浄し、次いで２ｍＭのグルコースおよび３０ｍＭのＫＣｌ（極性化負荷）を含有するＫｒｂ中で３０分インキュベートした。ＥＬＩＳＡ分析のために、インキュベーション後、上清の２００ｕｌのサンプルを収集した（ＫＣｌ極性化負荷サンプル）。
【０２０４】
[0252]分泌されたインスリンを含有する上清サンプルを、ヒト超高感度インスリンＥＬＩＳＡ（ＡＬＰＣＯ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ；８０−ＩＮＳＨＵＵ−Ｅ０１．１）を使用して処理し、サンプルを、ＦＬＵＯｓｔａｒ  ｏｐｔｉｍａ分光光度計（ＢＭＧ  ｌａｎｔｅｃｈ）によって４５０ｎｍで測定した。図１０に、天然細胞、再凝集した細胞、および低温保存した再凝集した細胞においてグルコースおよびＫＣｌ（陽性対照として）に応答して分泌されたインスリンのレベルを示す。さらに図２７は、天然細胞、再凝集した細胞、および低温保存した再凝集した細胞のインスリン応答の別の例を示す。さらに細胞を、増加または減少するグルコース濃度の逐次的な用量（例えば、１時間毎に変化するグルコース濃度）でも処理して、細胞が急性の一時的な応答を示す可能性があるかどうかを決定した。図１１で示されるように、再凝集したＳＣ−膵島は、逐次的に増加および減少するグルコース濃度に応答した（例えば、再凝集した細胞におけるインスリン分泌が、グルコース濃度に比例していた）。
【０２０５】
[0253]インビトロでのグルコースによって刺激されたインスリン含量も測定した。細胞溶解後、インスリン含量（例えば、細胞内のインスリンの量）を、天然細胞溶解産物、再凝集した細胞溶解産物、および低温保存した再凝集した細胞溶解産物中で測定した。図１２で示されるように、低温保存を行った（低温ＲＡ）および行わなかった（ＲＡ）再凝集した細胞は、天然細胞と比較して細胞内インスリン含量の増加を示した。
【０２０６】
[0254]インビトロでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌刺激指標も、天然および再凝集した細胞クラスターで試験した。図２６Ａで示されるように、再凝集は、クロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）陽性細胞のパーセンテージを、天然細胞クラスターにおける約５０％から、再凝集した細胞クラスター（ＲＡ）における１００％近くに有意に増加させ、また再凝集は、膵臓β細胞（ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチド二重陽性）のパーセンテージも増加させた。図２６Ｂは、再凝集した細胞クラスターの刺激指標も天然細胞クラスターより有意に高いことを実証することから、再凝集した細胞クラスターにおける内分泌細胞および膵臓β細胞の濃縮は、刺激指標によって実証されたように、膵臓の機能の強化と相関していた。
【０２０７】
[0255]インビボでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌
[0256]インビボにおける天然および再凝集したクラスターのＧＳＩＳ応答を比較するために、高血糖症を有するＮＲＧ−Ａｋｉｔａマウスを使用した。細胞移植の前に高血糖症を確認するための実験に登録する前に、絶食していないマウスにおける血中グルコースレベルを決定した。移植のために、マウスを１６時間絶食させ、絶食血中グルコースレベルを決定し、マウスに天然クラスターまたは再凝集したクラスターを移植した。
【０２０８】
[0257]レシピエントマウスを、５ｍｌ／グラムの１５ｍｇ／ｍｌケタミンと２ｍｇ／ｍｌキシラジンとの混合物の腹膜内注射によって麻酔した。外科用ドレープとして滅菌したガーゼパッドを使用した無菌条件下で、滅菌フード中での無菌技術を使用して全ての外科手術を実行した。およそ２．０ｃｍの切り口を皮膚からその下層の筋肉組織を通して作り、切り口のスペースから腎臓を穏やかに引き出した。１６ゲージのトロカールを使用して、腎被膜下に細胞を含有する血餅を植え込み、腎臓を含む移植片を腹膜腔に戻した。断続縫合を使用した４−０コーティングバイクリル縫合材（Ｅｔｈｉｃｏｎ  ｖｉｃｒｙｌ  Ｊ４６４Ｇ）を使用して筋肉組織および皮膚部位を縫合し、次いで外科創傷クリップ（ＢＤ４２７６３１）を使用して閉じた。
【０２０９】
[0258]外科手術から回復させる間、動物を温かく保ち、２．４ｍｇ／ｋｇブプレノルフィンＳＲ−ＬＡＢの単回のｉ．ｐ．用量を与えて、７２時間にわたり痛みの緩和を提供した（ＺｏｏＰｈａｒｍ  ＢＺ８０６９３１７）。週３回および１４日後にマウスをモニターし、外科創傷クリップを除去した。
【０２１０】
[0259]選択された時間で、動物を少なくとも１６時間絶食させ、ベースラインの血中グルコースを決定し、マウスを２ｇ／ｋｇのＤ−（＋）−グルコースの腹膜内注射で負荷した。グルコース負荷の３０分後の血中グルコースレベルを決定し、ランセットを使用した顔面静脈穿刺により１５０ｍｌの血液を得て、そのまま６０分凝固させ、インビトロでのＧＳＩＳ実験の場合と同様に、ＥＬＩＳＡによるヒトインスリンの決定のために血清を回収した。２週間（例えば、図１３を参照）および４週間（例えば、図１４を参照）での結果は、再凝集したクラスターが、天然クラスターと比較してより優れたインビボでのＧＳＩＳ応答を示したことを示した。
【０２１１】
[0260]細胞の代謝活性
ミトコンドリアの機能および解糖は、細胞活性化、増殖、分化、細胞死、および疾患進行などの様々な細胞プロセスにおいて重要な役割を果たす。細胞性ミトコンドリアの機能を、オリゴマイシン、ＦＣＣＰ（カルボニルシアニドｐ−トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン）およびアンチマイシンＡ／ロテノンの逐次的な注射によって測定して、基底のＯＣＲ、ＡＴＰ関連のＯＣＲ、プロトン漏出、最大の呼吸容量、予備の呼吸容量およびミトコンドリアによらない酸素消費を定義した（例えば、図１６を参照）。細胞をいずれかの化学物質で処理する前、最初の記録は、基底の呼吸に対応する。細胞の酸素消費（例えば、ミトコンドリアの機能）に対する化学物質の作用を決定するために、様々な化学物質を細胞に添加することができる。一例において、細胞をグルコースで処理して、酸素消費速度におけるグルコースによって刺激された応答を決定することができる。オリゴマイシンＡは、プロトンチャネルをブロックすることによってＡＴＰシンターゼを阻害し、電子伝達鎖を介した電子流を有意に低減させ、これは、ＡＤＰのＡＴＰへの酸化的リン酸化に必要である。ＡＴＰ産生を決定するために、培地にオリゴマイシンを添加する。ＡＴＰ産生は、基底の呼吸の低下によって測定することができる。ＡＴＰ産生が主原因ではない基底の呼吸からの残りの相違は、プロトン漏出と呼ばれる。プロトン漏出は、ミトコンドリアのダメージの兆候の場合があるが、ミトコンドリアのＡＴＰ産生を調節するメカニズムとしても使用でき、または細胞の正常なプロセスでもあり得る。上昇した量のプロトン漏出は、ダメージを示す場合がある。ＦＣＣＰは、ミトコンドリアにおける酸化的リン酸化のプロトノフォア（Ｈ＋イオノフォア）および脱共役剤であり、これは、血漿およびミトコンドリア膜を脱分極させることが可能である。ＦＣＣＰを添加した後、電子伝達鎖を介した電子流（ＥＴＣなど）は阻害されず、酸素は、複合体ＩＶによって最大に消費される。余剰能力は、ＯＣＲ曲線のトップ（ＦＣＣＰ添加後）と基底の呼吸との相違として測定され、これは、ストレスの多い条件下で細胞がどれほど多く「仕事」をすることができるか（エネルギー要求の増加に対して応答する細胞の能力）である。ロテノンは、ＮＡＤＨでのミトコンドリアの電子輸送の阻害剤であり、ユビキノンオキシドレダクターゼは、複合体Ｉ中の鉄−硫黄中心からユビキノンへの電子の移動を阻害し、ＮＡＤＨに干渉する。図１７で示されるように、グルコース処理に応答した、成人膵島、天然細胞、および再凝集した細胞における酸素消費速度を測定して、ミトコンドリアの機能を決定した。再凝集した細胞は、天然細胞によって示されるＯＣＲにおけるおよそ２５％の増加と比較して、ＯＣＲにおいておよそ７５％の増加を示した。さらに、オリゴマイシンＡ、ＦＣＣＰおよびロテノン／アンチマイシンＡの逐次的な添加は、成人膵島と再凝集した細胞（Ｓｅｍｍａ  ＳＣ−膵島）との間で類似のＯＣＲプロファイルを示し、これは、再凝集した細胞におけるミトコンドリアの機能が成人膵島に類似していることを示す（図１８）。
【０２１２】
[0261]インビボにおける移植片の特徴付け
[0262]再凝集した細胞を使用して移植片を移植した後、組織切片を得て、ＣＨＧＡおよびＨｕＭｉｔ（例えば、ヒトマーカー）に関して染色した。図１９で示されるように、組織切片は、移植後６カ月で、再凝集したクラスターを含む移植した移植片にわたり内分泌細胞の均一な分布を示した。加えて、組織切片は、Ｃ−ペプチドおよびグルカゴンの免疫蛍光染色によって示されるように（図２０）、移植後６カ月で多数のアルファおよびベータ細胞を示した。
【０２１３】
[0263]図２９は、例示的な細胞クラスターを糖尿病マウスモデルの腎被膜に移植した実験を示す。これらの実験において、ＳＴＺ−糖尿病ＮＳＧマウスに再凝集した細胞クラスターを移植し、植え込みの前および後、ならびに植え込まれた細胞クラスターの外植の後にそれらの血中グルコースレベルをモニターした。図で示されるように、試験された全ての４匹のマウスは、植え込みの後に血糖制御の改善（血中グルコースレベルの減少および安定）を示し、外植の後に血糖制御の悪化を示した。
【０２１４】
[0264]撹拌速度との相関
[0265]図２４は、再凝集中の培養培地の撹拌速度と細胞クラスターのサイズとの例示的な相関を実証する。再凝集プロトコールにつき異なる撹拌速度レジメンを試験した：１０日の再凝集期間全体にわたり４０ｒｐｍ、全体にわたり６０ｒｐｍ、最初の４８時間にわたり６０ｒｐｍ、それに続いて残りの日々にわたり９０ｒｐｍ、最初の４８時間にわたり６０ｒｐｍおよび次の４８時間にわたり９０ｒｐｍ、それに続いて残りの日々にわたり１１０ｒｐｍ。図で示されるように、４０ｒｐｍから６０ｒｐｍへの撹拌速度の増加は、細胞クラスターサイズを有意に低減させ、６０ｒｐｍおよび９０ｒｐｍを含むレジメンは、最も小さいクラスターのサイズをもたらした。
【０２１５】
[0266]不均質な組成物
[0267]図２５は、再凝集した細胞クラスターにおけるクロモグラニンＡ、インスリン、またはグルカゴンを発現する細胞の免疫染色グラフを示し、再凝集した細胞クラスター中の均質な組成が実証される。
【０２１６】
[0268]二相性インスリン応答
[0269]グルコース負荷に応答する動的インスリン分泌も試験した。図２８で実証されたように、高いグルコース濃度である２０ｍＭ負荷に応答して、例示的な天然細胞クラスター、再凝集した膵臓細胞クラスター、その両方は、二相性インスリン応答パターンを示した。二相性応答パターンは、インスリン分泌のピーク値への一過性の増加と、それに続く相対的に高いインスリン分泌レベルへの急速な減少（約２５分から３５分）を特徴とする。この第１の応答相に続いて第２の相が起こり、そこで細胞クラスターによるインスリン分泌は相対的に高いレベルで長期にわたり（約３５分から約６０分）維持された。
【０２１７】
[0270]加えて、図２８はまた、例示的な天然細胞クラスター、再凝集した膵臓細胞クラスター、その両方が、３０ｍＭのＫＣｌ負荷に応答してインスリン分泌を示したことも実証する。
【０２１８】
[0271]本開示の好ましい実施形態を本明細書に示し記載したが、このような実施形態は単に一例として提供されるに過ぎないことは、当業者にとって明白であると予想される。本開示が、明細書内に提供される具体的な実施例によって限定されることは、意図されない。上述の明細書を参照しながら本開示を説明してきたが、本明細書に記載の実施形態の説明および例示は、限定的な意味で解釈されることを意図しない。当業者であれば、この時点で多数のバリエーション、変更、および置換を本開示から逸脱することなく想起するものと予想される。さらに、本開示の全ての態様は、様々な条件および可変値によって決まる、本明細書に記載された具体的な描写、配置または相対的比率に限定されないことが理解されるべきである。本開示の実施において本明細書に記載される本開示の実施形態の様々な代替例が採用され得ることが理解されるべきである。したがって、本開示は、任意のこのような代替例、改変、バリエーションまたは均等物も網羅することが予期される。以下の特許請求の範囲は、本開示の範囲を定義することに加え、これらの特許請求の範囲内に含まれる方法および構造ならびにそれらの均等物が、それに網羅されることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【国際調査報告】
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