(57)【要約】  本発明は、供給源細胞を心筋細胞にリプログラミングするための、方法およびキットを包含する組成物であって、供給源細胞において、１つまたはそれより多い転写因子またはその変異体のタンパク質発現を増加させる工程を含む、ここで該供給源細胞がリプログラミングされて、心筋細胞の少なくとも１つの特性を示す、前記方法および組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
供給源細胞をリプログラミングして、心筋細胞を産生するための方法であって、供給源細胞において、１つまたはそれより多い転写因子またはその変異体のタンパク質発現を増加させる工程を含む、ここで、該供給源細胞がリプログラミングされて、心筋細胞の少なくとも１つの特性を示す、ここで：
−該供給源細胞が心臓線維芽細胞であり、
−該転写因子が、表１に列挙するものの１つまたはそれより多くである
前記方法。
【請求項２】
供給源細胞から、心筋細胞の少なくとも１つの特性を示す細胞を生成する方法であって：
−供給源細胞において、１つまたはそれより多い転写因子またはその変異体の量を増加させ；そして
−心筋細胞への分化を可能にするために十分な時間および条件下で、該供給源細胞を培養し；それによって、供給源細胞から、心筋細胞の少なくとも１つの特性を示す細胞を生成する工程を含む、ここで：
−該供給源細胞が心臓線維芽細胞であり、そして
−該転写因子が、表１に列挙するものの１つまたはそれより多くである
前記方法。
【請求項３】
以下の転写因子：
（ａ）ＢＭＰ１０、ＧＡＴＡ６、ＴＢＸ５、ＡＮＫＲＤ１、ＨＡＮＤ２、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＮＫＸ２−５およびＧＡＴＡ４；
（ｂ）ＴＢＸ５、ＧＡＴＡ６、ＡＮＫＲＤ１、ＨＡＮＤ２、ＨＡＮＤ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＮＫＸ２−５およびＧＡＴＡ４；
（ｃ）ＧＡＴＡ６、ＡＮＫＲＤ１、ＨＡＮＤ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、Ｓ１００Ａ１、ＮＫＸ２−５およびＧＡＴＡ４；
（ｄ）ＦＨＬ２、ＡＮＫＲＤ１、ＨＡＮＤ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、Ｓ１００Ａ１、ＭＹＯＣＤ、ＮＫＸ２−５およびＧＡＴＡ４；
（ｅ）ＴＢＸ２０、ＡＮＫＲＤ１、ＨＡＮＤ１、ＨＡＮＤ２、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＭＹＯＣＤ、ＮＫＸ２−５およびＧＡＴＡ４；
（ｆ）ＡＮＫＲＤ１、ＨＡＮＤ１、ＨＡＮＤ２、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、Ｓ１００Ａ１、ＭＹＯＣＤ、ＮＫＸ２−５およびＧＡＴＡ４；
（ｇ）ＨＡＮＤ２、ＨＡＮＤ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、Ｓ１００Ａ１、ＭＹＯＣＤ、ＫＬＨＬ３１、ＮＫＸ２−５およびＧＡＴＡ４；
（ｈ）ＨＡＮＤ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、Ｓ１００Ａ１、ＭＹＯＣＤ、ＫＬＨＬ３１、ＮＫＸ２−５、ＧＡＴＡ４およびＴＣＦ２１；
（ｉ）ＳＭＹＤ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、Ｓ１００Ａ１、ＡＢＲＡ、ＭＹＯＣＤ、ＫＬＨＬ３１、ＮＫＸ２−５およびＧＡＴＡ４；
（ｊ）ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、Ｓ１００Ａ１、ＡＢＲＡ、ＭＹＯＣＤ、ＫＬＨＬ３１、ＮＫＸ２−５、ＧＡＴＡ４およびＴＣＦ２１
（ｋ）Ｓ１００Ａ１、ＡＢＲＡ、ＭＹＯＣＤ、ＫＬＨＬ３１、ＮＫＸ２−５、ＧＡＴＡ４およびＴＣＦ２１；
（ｌ）Ｅ２Ｆ８、ＡＢＲＡ、ＭＹＯＣＤ、ＫＬＨＬ３１、ＮＫＸ２−５、ＧＡＴＡ４およびＴＣＦ２１；
（ｍ）ＡＢＲＡ、ＭＹＯＣＤ、ＫＬＨＬ３１、ＮＫＸ２−５、ＧＡＴＡ４およびＴＣＦ２１；
（ｎ）ＭＹＯＣＤ、ＫＬＨＬ３１、ＮＫＸ２−５、ＧＡＴＡ４およびＴＣＦ２１；
（ｏ）ＩＧＦ２、ＫＬＨＬ３１、ＮＫＸ２−５、ＧＡＴＡ４およびＴＣＦ２１；または
（ｐ）ＫＬＨＬ３１、ＮＫＸ２−５、ＧＡＴＡ４およびＴＣＦ２１
のタンパク質発現または量が増加している、請求項１または２の方法。
【請求項４】
以下の転写因子：
（ａ）ＨＡＮＤ１、ＴＢＸ５、ＧＡＴＡ６、ＡＮＫＲＤ１、ＨＡＮＤ２、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＮＫＸ２−５およびＧＡＴＡ４；
（ｂ）ＢＭＰ１０、ＨＡＮＤ１、ＧＡＴＡ６、ＡＮＫＲＤ１、ＨＡＮＤ２、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＮＫＸ２−５およびＧＡＴＡ４；
（ｃ）ＢＭＰ１０、ＴＢＸ５、ＦＨＬ２、ＡＮＫＲＤ１、ＨＡＮＤ２、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＮＫＸ２−５およびＧＡＴＡ４；
（ｄ）ＢＭＰ１０、ＴＢＸ５、ＧＡＴＡ６、ＨＡＮＤ１、ＨＡＮＤ２、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＮＫＸ２−５およびＧＡＴＡ４；
（ｅ）ＢＭＰ１０、ＴＢＸ５、ＧＡＴＡ６、ＡＮＫＲＤ１、ＨＡＮＤ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＮＫＸ２−５およびＧＡＴＡ４；
（ｆ）ＢＭＰ１０、ＴＢＸ５、ＧＡＴＡ６、ＡＮＫＲＤ１、ＨＡＮＤ２、ＨＡＮＤ１、ＮＫＸ２−５およびＧＡＴＡ４；
（ｇ）ＢＭＰ１０、ＴＢＸ５、ＧＡＴＡ６、ＡＮＫＲＤ１、ＨＡＮＤ２、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＨＡＮＤ１およびＧＡＴＡ４；または
（ｈ）ＢＭＰ１０、ＴＢＸ５、ＧＡＴＡ６、ＡＮＫＲＤ１、ＨＡＮＤ２、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＮＫＸ２−５およびＨＡＮＤ１
のタンパク質発現または量が増加している、請求項１または２の方法。
【請求項５】
供給源細胞をリプログラミングして、心筋細胞を産生するための方法であって、供給源細胞において、１つまたはそれより多い転写因子またはその変異体のタンパク質発現を増加させる工程を含む、ここで、該供給源細胞がリプログラミングされて、心筋細胞の少なくとも１つの特性を示す、ここで：
−該供給源細胞が心臓線維芽細胞であり、
−該転写因子が、ＢＭＰ１０、ＧＡＴＡ６、ＴＢＸ５、ＡＮＫＲＤ１、ＨＡＮＤ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＮＫＸ２．５、およびＧＡＴＡ４またはその変異体の１つまたはそれより多くである
前記方法。
【請求項６】
前記転写因子が、ＢＭＰ１０、ＧＡＴＡ６、ＴＢＸ５、ＡＮＫＲＤ１、ＨＡＮＤ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＮＫＸ２．５、およびＧＡＴＡ４である、請求項５の方法。
【請求項７】
心筋細胞への分化を可能にするために十分な時間および条件下で、供給源細胞を培養し；それによって、供給源細胞から、心筋細胞の少なくとも１つの特性を示す細胞を生成する工程を含む、請求項５または６の方法。
【請求項８】
供給源細胞を、１つまたはそれより多い転写因子をコードする少なくとも１つの核酸配列と接触させ、それによって、１つまたはそれより多い転写因子の発現を増加させることによって、１つまたはそれより多い転写因子またはその変異体のタンパク質発現または量を、供給源細胞において増加させる、請求項５〜７のいずれか一項の方法。
【請求項９】
供給源細胞をリプログラミングして、心筋細胞を産生するための方法であって、供給源細胞において、１つまたはそれより多い転写因子またはその変異体のタンパク質発現を増加させる工程を含む、ここで、該供給源細胞がリプログラミングされて、心筋細胞の少なくとも１つの特性を示す、ここで：
−該供給源細胞が間葉系幹細胞であり、そして
−該１つまたはそれより多い転写因子が、表２に列挙する転写因子より選択される
前記方法。
【請求項１０】
供給源細胞から、心筋細胞の少なくとも１つの特性を示す細胞を生成する方法であって：
−供給源細胞において、１つまたはそれより多い転写因子またはその変異体の量を増加させ；そして
−ターゲット細胞への分化を可能にするために十分な時間および条件下で、供給源細胞を培養し；それによって、供給源細胞から、心筋細胞の少なくとも１つの特性を示す細胞を生成する工程を含む、ここで：
−該供給源細胞が間葉系幹細胞であり；
−該転写因子が、表２に列挙するものの１つまたはそれより多くである
前記方法。
【請求項１１】
表２の単一の行に示すような転写因子のタンパク質発現または量が増加している、請求項９または１０の方法。
【請求項１２】
以下の転写因子：
（ａ）ＡＮＫＲＤ１、ＴＢＸ５、ＧＡＴＡ６、ＦＨＬ２、ＮＫＸ２−５、ＨＡＮＤ２、ＧＡＴＡ４およびＰＰＡＲＧＣ１Ａ；
（ｂ）ＢＭＰ１０、ＡＮＫＲＤ１、ＧＡＴＡ６、ＦＨＬ２、ＮＫＸ２−５、ＨＡＮＤ２、ＧＡＴＡ４およびＰＰＡＲＧＣ１Ａ；
（ｃ）ＢＭＰ１０、ＴＢＸ５、ＡＮＫＲＤ１、ＦＨＬ２、ＮＫＸ２−５、ＨＡＮＤ２、ＧＡＴＡ４およびＰＰＡＲＧＣ１Ａ；
（ｄ）ＢＭＰ１０、ＴＢＸ５、ＧＡＴＡ６、ＡＮＫＲＤ１、ＮＫＸ２−５、ＨＡＮＤ２、ＧＡＴＡ４およびＰＰＡＲＧＣ１Ａ；
（ｅ）ＢＭＰ１０、ＴＢＸ５、ＧＡＴＡ６、ＦＨＬ２、ＨＡＮＤ１、ＨＡＮＤ２、ＧＡＴＡ４およびＰＰＡＲＧＣ１Ａ；
（ｆ）ＢＭＰ１０、ＴＢＸ５、ＧＡＴＡ６、ＦＨＬ２、ＮＫＸ２−５、ＨＡＮＤ１、ＧＡＴＡ４およびＰＰＡＲＧＣ１Ａ；
（ｇ）ＢＭＰ１０、ＴＢＸ５、ＧＡＴＡ６、ＦＨＬ２、ＮＫＸ２−５、ＨＡＮＤ２、ＡＮＫＲＤ１およびＰＰＡＲＧＣ１Ａ；または
（ｈ）ＢＭＰ１０、ＴＢＸ５、ＧＡＴＡ６、ＦＨＬ２、ＮＫＸ２−５、ＨＡＮＤ２、ＧＡＴＡ４およびＡＮＫＲＤ１
のタンパク質発現または量が増加している、請求項９または１０の方法。
【請求項１３】
供給源細胞を、１つまたはそれより多い転写因子の発現を増加させる剤と接触させることによって、供給源細胞において、１つまたはそれより多い転写因子またはその変異体のタンパク質発現または量を増加させる、先行する請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
前記剤が：核酸、タンパク質、アプタマーおよび小分子、リボソーム、ＲＮＡｉ剤、ｇＲＮＡおよびペプチド核酸（ＰＮＡ）、ならびにその類似体または変異体からなる群より選択される、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記剤が、表１、２または３のいずれか１つに列挙する転写因子またはタンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
転写因子タンパク質をコードする前記核酸配列が、プラスミドによって細胞内に導入される、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
１つまたはそれより多い転写因子タンパク質をコードする前記少なくとも１つの核酸配列を、単一プラスミド上で、細胞内に導入する、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
前記プラスミドがエピソーム性である、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
検出可能マーカーを前記供給源細胞内に導入して、該供給源細胞がいつリプログラミングされて、心筋細胞の少なくとも１つの特性を示すかを同定する、先行する請求項のいずれか一項の方法。
【請求項２０】
前記検出可能マーカーが、ＳＬＣ８Ａ１遺伝子由来のレポーターまたはエンハンサー配列に機能可能であるように連結されている蛍光レポーターである、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記心筋細胞の少なくとも１つの特性が、いずれかの１つまたはそれより多い心筋細胞マーカーの上方制御、および／または細胞形態における変化、および／または細胞収縮性の証拠である、先行する請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
前記心筋細胞のマーカーに、ＭＥＦ２Ｃ、ＭＹＨ６、ＡＣＴＮ１、ＣＤＨ２、心臓トロポニンＴおよびＧＪＡ１が含まれる、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
収縮性心筋細胞のマーカーがＮＣＸ−１である、請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
前記供給源細胞がリプログラミングされて、ＮＣＸ−１の発現増加を示す、請求項１〜２３のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
前記心筋細胞が胎児心筋細胞である、先行する請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項２６】
供給源細胞を、心筋細胞への分化を可能にするために十分な時間および条件下で培養する工程が、表４に示すような適切な培地中で、細胞を、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３，１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０日間培養する工程を含む、先行する請求項いずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
心筋細胞、好ましくは胎児心筋細胞の少なくとも１つの特性を示す細胞を、個体に投与する工程をさらに含む、先行する請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
請求項１〜２６のいずれか一項記載の方法によって産生される、心筋細胞の少なくとも１つの特性を示す細胞。
【請求項２９】
細胞の少なくとも５％が、心筋細胞の少なくとも１つの特性を示し、そしてこれらの細胞が請求項１〜２６のいずれか一項記載の方法によって産生される、細胞集団。
【請求項３０】
集団中の細胞の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％が、心筋細胞の少なくとも１つの特性を示す、請求項２９記載の細胞集団。
【請求項３１】
心筋細胞、好ましくは胎児心筋細胞の少なくとも１つの特性を示す細胞を産生するための、請求項１〜２６のいずれか一項記載の方法における使用のためのキットであって、本明細書に記載する転写因子またはその変異体をコードする１つまたはそれより多い核酸配列を有する１つまたはそれより多い核酸を含み、供給源細胞を、心筋細胞の少なくとも１つの特性を示す細胞にリプログラミングするための使用説明書をさらに含んでもよい、前記キット。
【請求項３２】
供給源細胞タイプの心筋細胞細胞タイプへの転換を促進するために有用な剤を同定するための方法であって：
−本明細書記載のいずれかの方法による、供給源細胞タイプの心筋細胞細胞タイプへの転換に必要な１つまたはそれより多い転写因子を決定し；
−供給源細胞タイプの心筋細胞細胞タイプへの転換に必要な１つまたはそれより多い転写因子の量を増加させる能力に関して、１つまたはそれより多い候補剤をスクリーニングする工程を含む；
ここで、１つまたはそれより多い転写因子の量を増加させる剤が、供給源細胞タイプの心筋細胞細胞タイプへの転換を促進するために有用な剤である
前記方法。
【請求項３３】
供給源細胞をリプログラミングして、心筋細胞を産生するためのプロセスであって、供給源細胞において、１つまたはそれより多い転写因子またはその変異体のタンパク質発現を増加させる工程を含む、ここで該供給源細胞はリプログラミングされて、心筋細胞の少なくとも１つの特性を示す、ここで：
−該供給源細胞が心臓線維芽細胞であり、
−該転写因子が、ＢＭＰ１０、ＧＡＴＡ６、ＴＢＸ５、ＡＮＫＲＤ１、ＨＡＮＤ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＮＫＸ２．５、およびＧＡＴＡ４またはその変異体の１つまたはそれより多くである
前記プロセス。
【請求項３４】
前記転写因子が、ＢＭＰ１０、ＧＡＴＡ６、ＴＢＸ５、ＡＮＫＲＤ１、ＨＡＮＤ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＮＫＸ２．５、およびＧＡＴＡ４である、請求項３４のプロセス。
【請求項３５】
前記供給源細胞を、心筋細胞への分化を可能にするために十分な時間および条件下で培養し；それによって、供給源細胞から、心筋細胞の少なくとも１つの特性を示す細胞を生成する工程をさらに含む、請求項３３または３４のプロセス。
【請求項３６】
前記供給源細胞を、１つまたはそれより多い転写因子をコードする少なくとも１つの核酸配列と接触させ、それによって、１つまたはそれより多い転写因子の発現を増加させることによって、供給源細胞において、１つまたはそれより多い転写因子またはその変異体のタンパク質発現または量を増加させる、請求項３３〜３５のいずれか一項のプロセス。
【請求項３７】
前記供給源細胞が、ＮＣＸ−１の発現増加を示すようにリプログラミングされている、請求項３３〜３６のいずれか一項のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、その全内容が本明細書に援用される、オーストラリア仮出願ＡＵ２０１７９０２３８４に優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、多様な細胞タイプを心筋細胞に転換するための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
細胞に基づく再生療法は、傷害、疾患または年齢によって損傷を受けた組織を置換するための特定の細胞タイプの生成を必要とする。胚性幹細胞（ＥＳＣ）は、（ヒトの）身体由来のすべての細胞タイプに分化する潜在能力を有し、そしてしたがって、置換療法の供給源として徹底的に研究されてきている。しかし、ＥＳＣは、培養胚盤胞から樹立されているため、患者特異的な方式で得ることは不可能である。したがって、免疫拒絶および道徳的な懸念が、ＥＳＣ技術、そして特にヒトＥＳＣ技術の臨床適用への移行を妨げる主な障壁である。
【０００４】
細胞置換療法は、自身の容易にアクセス可能な組織、例えば皮膚または血液から直接、多様な療法的に重要な細胞タイプを迅速に生成する潜在能力を有する。こうした免疫学的にマッチした細胞はまた、移植後の拒絶に関してより少ないリスクを課すであろう。さらに、これらの細胞は、最終分化しているため、より少ない腫瘍原性を表すであろう。
【０００５】
分化転換は、多能性状態を経ずに、１つの細胞タイプを別のものに転換するプロセスであり、再生医薬に非常に有望でありうるが、いまだに信頼可能に適用されていない。１つの体細胞タイプの表現型を別のものにスイッチすることは可能でありうるが、転換に必要な要素を同定することは困難であり、そして大部分の場合、これらは未知である。細胞タイプの同一性を直接リプログラミングする要因の同定は、現在、とりわけ、ありうる要因のセットを徹底的に実験で試験する費用によって制限されており、これは非効率的で拡張不能なアプローチである。
【０００６】
哺乳動物心臓は、有意な再生能を欠く。移植に十分な量での心筋細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ生成は、したがって、心疾患の治療を非常に補助するであろう。
心筋細胞または心筋細胞の特性を示す細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で生成するための、新規で、そして／または改善された方法に関する必要性がある。
【０００７】
本明細書における、いかなる先行技術への言及も、この先行技術がいかなる権威においても共通の一般的な知識の一部を形成することの承認または示唆ではなく、あるいはこの先行技術が、当業者によって、関連すると理解されるか、見なされるか、そして／または先行技術の他の部分と組み合わされると合理的に予期されうることの承認または示唆ではない。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、供給源細胞をリプログラミングするための方法であって、供給源細胞において、１つまたはそれより多い転写因子またはその変異体のタンパク質発現を増加させる工程を含む、ここで、該供給源細胞がリプログラミングされて、心筋細胞の少なくとも１つの特性を示す、ここで：
−供給源細胞が、心臓線維芽細胞および間葉系幹細胞からなる群より選択され、
−転写因子が、表１、２および３に列挙する転写因子の１つまたはそれより多くである
前記方法を提供する。
【０００９】
本発明は、供給源細胞から、心筋細胞の少なくとも１つの特性を示す細胞を生成する方法であって：
−供給源細胞において、１つまたはそれより多い転写因子またはその変異体の量を増加させ；そして
−心筋細胞への分化を可能にするために十分な時間および条件下で、供給源細胞を培養し；それによって、供給源細胞から、心筋細胞の少なくとも１つの特性を示す細胞を生成する工程を含む、ここで：
−供給源細胞が、心臓線維芽細胞および間葉系幹細胞からなる群より選択され、そして
−転写因子が、表１、２および３に列挙するものの１つまたはそれより多くである
前記方法を提供する。
【００１０】
本発明はまた、心臓線維芽細胞または間葉系幹細胞をリプログラミングするための方法であって、供給源細胞において、表１、２または３中の転写因子またはその変異体の１つまたはそれより多くのタンパク質発現を増加させる工程を含む、ここで、供給源がリプログラミングされて、心筋細胞の少なくとも１つの特性を示す、前記方法も提供する。
【００１１】
本発明は、供給源細胞を、心筋細胞の少なくとも１つの特性を示す細胞にリプログラミングするための方法であって：ｉ）供給源細胞または供給源細胞を含む細胞集団を提供し；ｉｉ）前記供給源細胞を、１つまたはそれより多い転写因子の発現を活性化するかまたは増加させる１つまたはそれより多い剤と接触させ；そしてｉｉｉ）前記細胞または細胞集団を培養し、そして任意に、心筋細胞の少なくとも１つの特性に関して、細胞または細胞集団を監視する工程を含む、ここで：
−供給源細胞が、心臓線維芽細胞および間葉系幹細胞からなる群より選択され、
−転写因子が、表１、２および３に列挙するものの１つまたはそれより多くである
前記方法を提供する。
【００１２】
本発明のいずれかの方法において、供給源細胞は、心臓線維芽細胞および胎児心臓線維芽細胞を含む線維芽細胞であり、そしてターゲット細胞は心筋細胞であり、そして転写因子は、表１および３に列挙する、いずれかの１つまたはそれより多い転写因子である。
【００１３】
好ましい態様において、表１の単一の行における転写因子のいずれかの１つまたはそれより多く、あるいはすべてを用いてもよい。例えば、転写因子は：
（ａ）ＢＭＰ１０、ＧＡＴＡ６、ＴＢＸ５、ＡＮＫＲＤ１、ＨＡＮＤ２、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＮＫＸ２−５およびＧＡＴＡ４；
（ｂ）ＴＢＸ５、ＧＡＴＡ６、ＡＮＫＲＤ１、ＨＡＮＤ２、ＨＡＮＤ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＮＫＸ２−５およびＧＡＴＡ４；
（ｃ）ＧＡＴＡ６、ＡＮＫＲＤ１、ＨＡＮＤ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、Ｓ１００Ａ１、ＮＫＸ２−５およびＧＡＴＡ４；
（ｄ）ＦＨＬ２、ＡＮＫＲＤ１、ＨＡＮＤ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、Ｓ１００Ａ１、ＭＹＯＣＤ、ＮＫＸ２−５およびＧＡＴＡ４；
（ｅ）ＴＢＸ２０、ＡＮＫＲＤ１、ＨＡＮＤ１、ＨＡＮＤ２、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＭＹＯＣＤ、ＮＫＸ２−５およびＧＡＴＡ４；
（ｆ）ＡＮＫＲＤ１、ＨＡＮＤ１、ＨＡＮＤ２、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、Ｓ１００Ａ１、ＭＹＯＣＤ、ＮＫＸ２−５およびＧＡＴＡ４；
（ｇ）ＨＡＮＤ２、ＨＡＮＤ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、Ｓ１００Ａ１、ＭＹＯＣＤ、ＫＬＨＬ３１、ＮＫＸ２−５およびＧＡＴＡ４；
（ｈ）ＨＡＮＤ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、Ｓ１００Ａ１、ＭＹＯＣＤ、ＫＬＨＬ３１、ＮＫＸ２−５、ＧＡＴＡ４およびＴＣＦ２１；
（ｉ）ＳＭＹＤ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、Ｓ１００Ａ１、ＡＢＲＡ、ＭＹＯＣＤ、ＫＬＨＬ３１、ＮＫＸ２−５およびＧＡＴＡ４；
（ｊ）ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、Ｓ１００Ａ１、ＡＢＲＡ、ＭＹＯＣＤ、ＫＬＨＬ３１、ＮＫＸ２−５、ＧＡＴＡ４およびＴＣＦ２１
（ｋ）Ｓ１００Ａ１、ＡＢＲＡ、ＭＹＯＣＤ、ＫＬＨＬ３１、ＮＫＸ２−５、ＧＡＴＡ４およびＴＣＦ２１；
（ｌ）Ｅ２Ｆ８、ＡＢＲＡ、ＭＹＯＣＤ、ＫＬＨＬ３１、ＮＫＸ２−５、ＧＡＴＡ４およびＴＣＦ２１；
（ｍ）ＡＢＲＡ、ＭＹＯＣＤ、ＫＬＨＬ３１、ＮＫＸ２−５、ＧＡＴＡ４およびＴＣＦ２１；
（ｎ）ＭＹＯＣＤ、ＫＬＨＬ３１、ＮＫＸ２−５、ＧＡＴＡ４およびＴＣＦ２１；
（ｏ）ＩＧＦ２、ＫＬＨＬ３１、ＮＫＸ２−５、ＧＡＴＡ４およびＴＣＦ２１；または
（ｐ）ＫＬＨＬ３１、ＮＫＸ２−５、ＧＡＴＡ４およびＴＣＦ２１
のいずれかの１またはそれより多くである。
【００１４】
直前の（ａ）〜（ｐ）において、列挙する転写因子のすべてを用いてもよい。
あるいは、転写因子は、以下のように列挙される転写因子の組み合わせであってもよい：
（ａ）ＨＡＮＤ１、ＴＢＸ５、ＧＡＴＡ６、ＡＮＫＲＤ１、ＨＡＮＤ２、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＮＫＸ２−５およびＧＡＴＡ４；
（ｂ）ＢＭＰ１０、ＨＡＮＤ１、ＧＡＴＡ６、ＡＮＫＲＤ１、ＨＡＮＤ２、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＮＫＸ２−５およびＧＡＴＡ４；
（ｃ）ＢＭＰ１０、ＴＢＸ５、ＦＨＬ２、ＡＮＫＲＤ１、ＨＡＮＤ２、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＮＫＸ２−５およびＧＡＴＡ４；
（ｄ）ＢＭＰ１０、ＴＢＸ５、ＧＡＴＡ６、ＨＡＮＤ１、ＨＡＮＤ２、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＮＫＸ２−５およびＧＡＴＡ４；
（ｅ）ＢＭＰ１０、ＴＢＸ５、ＧＡＴＡ６、ＡＮＫＲＤ１、ＨＡＮＤ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＮＫＸ２−５およびＧＡＴＡ４；
（ｆ）ＢＭＰ１０、ＴＢＸ５、ＧＡＴＡ６、ＡＮＫＲＤ１、ＨＡＮＤ２、ＨＡＮＤ１、ＮＫＸ２−５およびＧＡＴＡ４；
（ｇ）ＢＭＰ１０、ＴＢＸ５、ＧＡＴＡ６、ＡＮＫＲＤ１、ＨＡＮＤ２、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＨＡＮＤ１およびＧＡＴＡ４；または
（ｈ）ＢＭＰ１０、ＴＢＸ５、ＧＡＴＡ６、ＡＮＫＲＤ１、ＨＡＮＤ２、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＮＫＸ２−５およびＨＡＮＤ１。
【００１５】
好ましくは、心臓線維芽細胞はヒト心臓線維芽細胞である。心臓線維芽細胞は、間質性線維芽細胞であってもよいし、あるいは心内膜または心外膜に由来してもよい。心臓線維芽細胞は、胎児心臓線維芽細胞であってもよい。
【００１６】
本発明のいずれかの側面において、心筋細胞は胎児心筋細胞であってもよい。
本明細書記載の本発明のいずれかの方法において、供給源細胞は間葉系幹細胞であり、そしてターゲット細胞は心筋細胞であり、そして転写因子は、表２に列挙する転写因子のいずれかの１つまたはそれより多くである。
【００１７】
好ましい態様において、表２の単一の行に列挙する転写因子のいずれかの１つまたはそれより多く、あるいはすべてを用いてもよい。あるいは、転写因子は、以下に列挙する転写因子の組み合わせであってもよい：
（ａ）ＡＮＫＲＤ１、ＴＢＸ５、ＧＡＴＡ６、ＦＨＬ２、ＮＫＸ２−５、ＨＡＮＤ２、ＧＡＴＡ４およびＰＰＡＲＧＣ１Ａ；
（ｂ）ＢＭＰ１０、ＡＮＫＲＤ１、ＧＡＴＡ６、ＦＨＬ２、ＮＫＸ２−５、ＨＡＮＤ２、ＧＡＴＡ４およびＰＰＡＲＧＣ１Ａ；
（ｃ）ＢＭＰ１０、ＴＢＸ５、ＡＮＫＲＤ１、ＦＨＬ２、ＮＫＸ２−５、ＨＡＮＤ２、ＧＡＴＡ４およびＰＰＡＲＧＣ１Ａ；
（ｄ）ＢＭＰ１０、ＴＢＸ５、ＧＡＴＡ６、ＡＮＫＲＤ１、ＮＫＸ２−５、ＨＡＮＤ２、ＧＡＴＡ４およびＰＰＡＲＧＣ１Ａ；
（ｅ）ＢＭＰ１０、ＴＢＸ５、ＧＡＴＡ６、ＦＨＬ２、ＨＡＮＤ１、ＨＡＮＤ２、ＧＡＴＡ４およびＰＰＡＲＧＣ１Ａ；
（ｆ）ＢＭＰ１０、ＴＢＸ５、ＧＡＴＡ６、ＦＨＬ２、ＮＫＸ２−５、ＨＡＮＤ１、ＧＡＴＡ４およびＰＰＡＲＧＣ１Ａ；
（ｇ）ＢＭＰ１０、ＴＢＸ５、ＧＡＴＡ６、ＦＨＬ２、ＮＫＸ２−５、ＨＡＮＤ２、ＡＮＫＲＤ１およびＰＰＡＲＧＣ１Ａ；または
（ｈ）ＢＭＰ１０、ＴＢＸ５、ＧＡＴＡ６、ＦＨＬ２、ＮＫＸ２−５、ＨＡＮＤ２、ＧＡＴＡ４およびＡＮＫＲＤ１。
【００１８】
好ましくは、間葉系幹細胞は、ヒト間葉系幹細胞である。
好ましくは、心筋細胞の少なくとも１つの特性は、いずれかの１つまたはそれより多いターゲット細胞マーカーの上方制御、および／または細胞形態における変化である。関連するマーカーは、本明細書に記載され、そして当業者に知られる。胎児心筋細胞に関する例示的なマーカー：ＭＥＦ２Ｃ、ＭＹＨ６、ＡＣＴＮ１、ＣＤＨ２およびＧＪＡ１。マーカーＮＣＸ−１は、ターゲット細胞が収縮する能力を示すことの指標である。
【００１９】
典型的には、ターゲット細胞分化に適した条件には、十分な時間、および適切な培地中で、細胞を培養する工程が含まれる。培養の十分な時間は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３，１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０日間であってもよい。適切な培地は、表４に示すものであってもよい。
【００２０】
本明細書に記載するいずれかの方法において、方法には、ターゲット細胞タイプの少なくとも１つの特性を示す細胞を増殖させ、集団において、心筋細胞の少なくとも１つの特性を示す細胞の比率を増加させる工程をさらに含んでもよい。細胞を増殖させる工程は、以下に記載するように、細胞集団を生成するために十分な時間および条件下で、培養中にあってもよい。
【００２１】
本明細書に記載するいずれかの方法において、方法には、心筋細胞の少なくとも１つの特性を示す細胞または細胞を含む細胞集団を、個体に投与する工程がさらに含まれてもよい。
【００２２】
本発明はまた、心臓疾患の治療のための医薬品の製造における、心筋細胞の少なくとも１つの特性を示す、本発明にしたがって産生された細胞またはこうした細胞を含む細胞集団の使用も提供する。例えば、心機能を改善するため、本発明のリプログラミングされた細胞を、心不全のまたは心筋梗塞の心臓に（例えば心発作後に）導入（移植）してもよい。
【００２３】
本発明はまた、本明細書に記載するような方法によって産生された、心筋細胞の少なくとも１つの特性を示す細胞も提供する。好ましくは、心筋細胞は胎児心筋細胞である。典型的には、心筋細胞は、マーカーＮＣＸ−１を発現し、そして収縮性である。
【００２４】
本発明はまた、細胞の少なくとも５％が、心筋細胞の少なくとも１つの特性を示し、そして本明細書に記載するような方法によって産生される細胞集団も提供する。好ましくは、集団中の細胞の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％が、心筋細胞の少なくとも１つの特性を示す。
【００２５】
本発明はまた、本明細書に開示するような心筋細胞の少なくとも１つの特性を示す細胞を産生するためのキットにも関する。いくつかの態様において、キットは、本明細書に記載する転写因子またはその変異体をコードする１つまたはそれより多い核酸配列を有する１つまたはそれより多い核酸を含む。好ましくは、キットを用いて、心筋細胞の少なくとも１つの特性を示す細胞を産生してもよい。好ましくは、キットを、心臓線維芽細胞または間葉系幹細胞である供給源細胞とともに用いてもよい。いくつかの態様において、キットは、本明細書に開示するような方法にしたがって、供給源細胞を、心筋細胞の少なくとも１つの特性を示す細胞にリプログラミングするための使用説明書をさらに含む。好ましくは、本発明は、本明細書記載の本発明の方法で用いた際のキットを提供する。
【００２６】
本発明は、少なくとも１つの心筋細胞、およびターゲット細胞において１つまたはそれより多い転写因子のタンパク質発現を増加させる少なくとも１つの剤を含む、組成物に関する。さらに、転写因子は、本明細書記載の転写因子のいずれであってもよい。好ましくは、転写因子は、表１、２または３に記載されるようなものである。
【００２７】
本発明は、心臓線維芽細胞をリプログラミングするための方法であって、該線維芽細胞において、表１に列挙する転写因子のいずれかの１つまたはそれより多く、あるいは表１の単一の行に列挙する転写因子のすべて、あるいは：
（ａ）ＨＡＮＤ１、ＴＢＸ５、ＧＡＴＡ６、ＡＮＫＲＤ１、ＨＡＮＤ２、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＮＫＸ２−５およびＧＡＴＡ４；
（ｂ）ＢＭＰ１０、ＨＡＮＤ１、ＧＡＴＡ６、ＡＮＫＲＤ１、ＨＡＮＤ２、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＮＫＸ２−５およびＧＡＴＡ４；
（ｃ）ＢＭＰ１０、ＴＢＸ５、ＦＨＬ２、ＡＮＫＲＤ１、ＨＡＮＤ２、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＮＫＸ２−５およびＧＡＴＡ４；
（ｄ）ＢＭＰ１０、ＴＢＸ５、ＧＡＴＡ６、ＨＡＮＤ１、ＨＡＮＤ２、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＮＫＸ２−５およびＧＡＴＡ４；
（ｅ）ＢＭＰ１０、ＴＢＸ５、ＧＡＴＡ６、ＡＮＫＲＤ１、ＨＡＮＤ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＮＫＸ２−５およびＧＡＴＡ４；
（ｆ）ＢＭＰ１０、ＴＢＸ５、ＧＡＴＡ６、ＡＮＫＲＤ１、ＨＡＮＤ２、ＨＡＮＤ１、ＮＫＸ２−５およびＧＡＴＡ４；
（ｇ）ＢＭＰ１０、ＴＢＸ５、ＧＡＴＡ６、ＡＮＫＲＤ１、ＨＡＮＤ２、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＨＡＮＤ１およびＧＡＴＡ４；または
（ｈ）ＢＭＰ１０、ＴＢＸ５、ＧＡＴＡ６、ＡＮＫＲＤ１、ＨＡＮＤ２、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＮＫＸ２−５およびＨＡＮＤ１
より選択される転写因子、あるいはその変異体のタンパク質発現を増加させる工程を含む、ここで、該線維芽細胞がリプログラミングされて、心筋細胞の少なくとも１つの特性を示す、前記方法を提供する。
【００２８】
本発明は、心臓線維芽細胞から、心筋細胞の少なくとも１つの特性を示す細胞を生成する方法であって：
−線維芽細胞において、ＢＭＰ１０、ＧＡＴＡ６、ＴＢＸ５、ＡＮＫＲＤ１、ＨＡＮＤ２、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＮＫＸ２−５およびＧＡＴＡ４、またはその変異体のいずれかの１つまたはそれより多くの量を増加させ；そして
−心筋細胞分化に十分な時間および条件下で、線維芽細胞を培養し；それによって、線維芽細胞から心筋細胞の少なくとも１つの特性を示す細胞を生成する
工程を含む、前記方法を提供する。
【００２９】
本発明はまた、本明細書に開示するように、心筋細胞の少なくとも１つの特性を示す細胞を産生するためのキットにも関する。いくつかの態様において、キットは、（ｉ）ＢＭＰ１０ポリペプチドまたはその変異体をコードする核酸配列；および（ｉｉ）ＧＡＴＡ６ポリペプチドまたはその変異体をコードする核酸配列；および（ｉｉｉ）ＴＢＸ５ポリペプチドまたはその変異体をコードする核酸配列、および（ｉｖ）ＡＮＫＲＤ１ポリペプチドまたはその変異体をコードする核酸配列、および（ｖ）ＨＡＮＤ２ポリペプチドまたはその変異体をコードする核酸配列、および（ｖｉ）ＰＰＡＲＧＣ１Ａポリペプチドまたはその変異体をコードする核酸配列、および（ｖｉｉ）ＮＫＸ２−５ポリペプチドまたはその変異体をコードする核酸配列、および（ｖｉｉｉ）ＧＡＴＡ４ポリペプチドまたはその変異体をコードする核酸配列のいずれかの１つまたはそれより多くを含む。
【００３０】
いくつかの態様において、キットは、本明細書に開示するような方法にしたがって、心臓線維芽細胞を、心筋細胞の少なくとも１つの特性を示す細胞にリプログラミングするための使用説明書をさらに含む。好ましくは、本発明は、本明細書記載の本発明の方法において用いる場合のキットを提供する。
【００３１】
本発明は、少なくとも１つの心臓線維芽細胞、および該線維芽細胞において、ＢＭＰ１０、ＧＡＴＡ６、ＴＢＸ５、ＡＮＫＲＤ１、ＨＡＮＤ２、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＮＫＸ２−５およびＧＡＴＡ４のいずれかの１つまたはそれより多くのタンパク質発現を増加させる少なくとも１つの剤を含む、組成物に関する。
【００３２】
本発明のいずれかの側面において、心筋細胞の少なくとも１つの特性は、収縮する能力である。言い換えると、心筋細胞の少なくとも１つの特性は、拍動する能力である。
典型的には、本明細書に記載するような転写因子のタンパク質発現または量は、細胞と、転写因子の発現を増加させる剤を接触させることによって増加する。好ましくは、剤は：ヌクレオチド配列、タンパク質、アプタマーおよび小分子、リボソーム、ＲＮＡｉ剤およびペプチド核酸（ＰＮＡ）ならびにその類似体または変異体からなる群より選択される。いくつかの態様において、剤は外因性である。本発明はまた、１つまたはそれより多い転写因子の発現を増加させるための、転写活性化系（例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＴＡＬＥＮなどの遺伝子活性化系で使用するためのｇＲＮＡ）の使用も意図する。
【００３３】
典型的には、本明細書に記載するような転写因子のタンパク質発現または量は、細胞において、転写因子をコードするか、またはその機能的断片をコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸を導入することによって増加する。好ましくは、転写因子をコードするヌクレオチド配列は、表３に列挙する寄託番号を持つ配列に対して、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。
【００３４】
本発明の好ましい態様において、転写因子タンパク質をコードする核酸配列を、プラスミドによって細胞内に導入する。１つまたはそれより多い転写因子をコードする１つまたはそれより多い核酸を用いてもよい。したがって、必要な１つまたはそれより多い転写因子の発現または量を増加させる目的のため、１つまたはそれより多いプラスミドを用いてもよいことが明らかである。言い換えると、核酸配列は、単一のプラスミド中またはプラスミド上にあってもよいし、あるいは２つまたはそれより多いプラスミド中で、供給源細胞に提供されてもよい。
【００３５】
本発明のいずれかの態様において、本発明にしたがった使用のための１つまたはそれより多い転写因子をコードする核酸を含有するプラスミドは、エピソームプラスミドであってもよい。
【００３６】
本発明のいずれかの態様において、また、供給源細胞がリプログラミングされて、心筋細胞の少なくとも１つの特性を示すようになったときを同定するために、検出可能マーカーを供給源細胞に導入してもよい。検出可能マーカーは、ＳＬＣ８Ａ１遺伝子由来のレポーターまたはエンハンサー配列に機能可能であるように連結された蛍光レポーターであってもよい。
【００３７】
好ましくは、核酸には、さらに、異種プロモーターが含まれる。好ましくは、核酸は、ベクター、例えばウイルスベクターまたは非ウイルスベクター中にある。好ましくは、ベクターは、宿主細胞ゲノム内に組み込まれないゲノムを含むウイルスベクターである。ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターであってもよい。
【００３８】
本明細書に記載するようないずれかの方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで行う１つまたはそれより多く、あるいはすべての工程を有してもよい。
【００３９】
本明細書において、文脈が別に要求しない限り、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、ならびに該用語の変形、例えば「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含まれる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」は、さらなる添加物、構成要素、整数または工程を排除するとは意図されない。
【００４０】
本発明のさらなる側面および先行する段落に記載する側面のさらなる態様は、例として、そして付随する図に言及しながら提供する、以下の説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】各因子をコードするエピソームプラスミドでの心臓線維芽細胞のトランスフェクション後の、時間の関数として示す、個々の因子、ＡＮＫＲＤ１、ＢＭＰ１０、ＧＡＴＡ６、ＴＢＸ５、ＨＡＮＤ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＮＫＸ２．５およびＧＡＴＡ４の相対発現レベル。
【図２】図１に同定する転写因子をコードするプラスミドでの心臓線維芽細胞のトランスフェクション後の、時間の関数としての、ｍｙｈ６およびｃＴｎＴの相対発現レベル（陰性対照（ｈＣＦＣ）に対するもの）。
【図３】Ａ．  ＧＦＰ陽性細胞のＦＡＣＳプロット。Ｂ．  ＬＨＳ：第８日の総集団におけるＮＣＸ−１−ＧＦＰ＋細胞；中央：第８日のＮＣＸ−１−ＧＦＰ＋細胞（ソーティングし、そして再植え付けしたもの）；ＲＨＳ：第１４日のＮＣＸ−１−ＧＦＰ＋細胞（第８日にソーティングし、そして再植え付けした後のもの）。
【図４】転写因子をコードする核酸でのトランスフェクション後の、ＮＣＸ−１−ＧＦＰレポーター細胞株（ソーティングを伴わない）のｍｙｈ６、ｃＴｎＴ、およびＮＣＸを含む心臓マーカーの相対発現レベル（陰性対照ｈＦＣＦに対するもの）。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
本明細書で開示し、そして定義する本発明は、言及する、あるいは本文または図から明らかである個々の特徴の２つまたはそれより多くのすべての代替の組み合わせに拡張されることが理解されるであろう。これらの異なる組み合わせはすべて、本発明の多様な代替側面を構成する。
【００４３】
本発明の特定の態様に対して、ここで詳細に言及するであろう。本発明は、その態様と組み合わせて記載されるが、本発明がこれらの態様に限定されないことが理解されるであろう。それとは逆に、本発明は、請求項によって定義されるような本発明の範囲内に含まれうる、すべての代替物、修飾、および同等物を含むと意図される。
【００４４】
当業者は、本発明の実施において使用されうる、本明細書に記載するものと類似のまたは同等の多くの方法および材料を認識するであろう。本発明は、いかなる意味でも、記載する方法および材料に限定されない。本明細書に開示し、そして定義する本発明は、言及されるか、あるいは本文または図から明らかである個々の特徴の２つまたはそれより多くのすべての代替の組み合わせに拡張されることが理解されるであろう。これらの異なる組み合わせはすべて、本発明の多様な代替側面を構成する。
【００４５】
本明細書を解釈する目的のため、単数形で用いられる用語にはまた複数形も含まれ、そして逆も当てはまる。
細胞をリプログラミングするプロセスは、細胞が生じうる子孫のタイプを改変し、そしてこうしたプロセスには、順方向プログラミングおよび分化転換の別個のプロセスが含まれる。いくつかの態様において、多分化能細胞または多能性細胞の順方向プログラミングは、多分化能細胞または多能性細胞よりも、より分化した表現型を有する細胞タイプの少なくとも１つの特性を示す細胞を提供する。他の態様において、１つの体細胞の分化転換は、別の体細胞タイプの少なくとも１つの特性を示す細胞を提供する。
【００４６】
本発明は、供給源細胞が、ターゲット細胞になる直前に、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）になることを伴わない、供給源細胞からターゲット細胞への直接リプログラミングまたは分化転換のための組成物および方法を提供する。ｉＰＳ細胞技術と比較して、分化転換は、非常に効率的であり、そして下流適用のため、奇形腫形成のリスクは非常に低い。さらに、分化転換は、１つの細胞タイプから別のタイプへの直接転換のため、ｉｎ  ｖｉｖｏで使用可能である一方、ｉＰＳ細胞技術はそのようには使用できない。
【００４７】
本発明は、特に、供給源細胞の胎児心筋細胞への転換または分化転換に対して向けられる。これらの胎児心筋細胞は、心疾患の治療における補助を含めて、移植のために十分な量の心臓細胞の生成を含む、広範囲の適用に有用性を有しうる。特に、本発明にしたがって産生される胎児心筋細胞を、心機能を改善するため、心不全のまたは心筋梗塞の心臓に（例えば心発作後に）導入（移植）してもよい。胎児心筋細胞を用いる利点は、これらの細胞が、増殖する能力を有し、そして電気的および機械的に、宿主心臓組織に連結可能であることである。
【００４８】
本発明にしたがって産生される細胞はまた、規制当局の承認が必要な薬剤の試験のためおよび疾患モデリングのためを含めて、多様な他の臨床適用においても有用性を見出しうる。
【００４９】
本発明の特定の利点は、当業者が多量の胎児心筋細胞を産生することを可能にすることである。心筋細胞への特定の細胞の転換が、文献に報告されているが、これらの転換は非常に緩慢であり、そして低い比率の転換細胞しか生じない。これは、先行技術の方法が、臨床背景におけるその適用において限定されていることを意味する。対照的に、本発明の方法は、先行技術の方法よりも、はるかに高い転換率を生じる。
【００５０】
さらに、本発明の特定の方法は、供給源細胞からの胎児心筋細胞の産生を可能にする。言い換えると、産生可能であるのは、成熟または完全発生した心筋細胞になる前駆体である。これは、瘢痕を引き起こすことなく、レシピエント内により成功裡に移植可能な細胞集団を産生するさらなる利点を有する。さらに、胎児心筋細胞は、成体または成熟心筋細胞に比較して、再生し、そして増殖する、より大きな能力を有する。
【００５１】
本明細書において、胎児心筋細胞は、胎児心筋細胞の特性を有するいずれかの細胞を指す。細胞は、細胞表面マーカー、遺伝子発現レベルまたは巨大分子の産生を含む、１つまたはそれより多いマーカーに基づいて、胎児心筋細胞の特性を有すると定義されてもよい。特性はまた、１つまたはそれより多い形態学的特質であってもよい。
【００５２】
供給源細胞は、体細胞または疾患細胞を含めて、本明細書に記載するいずれかの細胞タイプであってもよい。体細胞は、成体細胞、あるいは成体または非胚性細胞の１つまたはそれより多い検出可能な特性を示す、成体由来の細胞であってもよい。疾患細胞は、疾患または状態の１つまたはそれより多い検出可能な特性を示す細胞であってもよい。
【００５３】
本明細書において、「分化転換」は、細胞の形態学的および機能的特性が、（中間の多能性状態または前駆体細胞タイプを経ることなく）別の細胞タイプのものに転換されるように、１つのタイプの（または１つのタイプの体細胞の特性を有する）体細胞をリプログラミングする方法を指す。用語、分化転換は、用語「細胞系譜リプログラミング」または「細胞リプログラミング」または「細胞転換」と交換可能に使用可能である。
【００５４】
供給源細胞は、体細胞または疾患細胞を含めて、本明細書に記載するいずれかの細胞タイプであってもよい。体細胞は、成体細胞、あるいは成体または非胚性細胞の１つまたはそれより多い検出可能な特性を示す、成体由来の細胞であってもよい。疾患細胞は、疾患または状態の１つまたはそれより多い検出可能な特性を示す細胞であってもよい。供給源細胞の例には、線維芽細胞（心臓線維芽細胞を含む）および間葉系幹細胞が含まれる。
【００５５】
本明細書において、用語「体細胞」は、生殖系列細胞とは対照的に、生物の体を形成するいずれかの細胞を指す。哺乳動物において、生殖系列細胞（「配偶子」としてもまた知られる）は、精子および卵子であり、これらは受精中に融合して、接合子と呼ばれる細胞を産生し、ここからすべての哺乳動物胚が発生する。哺乳動物の体内のすべての他の細胞タイプは、これらが作製される精子および卵子（生殖母細胞）ならびに未分化幹細胞を除いて、体細胞であり：内臓、皮膚、骨、血液、および結合組織は、すべて、体細胞で構成される。いくつかの態様において、体細胞は、「非胚性体細胞」であり、これは、胚に存在せずまたは胚から得られておらず、そしてｉｎ  ｖｉｔｒｏでこうした細胞の増殖から生じない体細胞を意味する。いくつかの態様において、体細胞は、「成体体細胞」であり、これは、胚または胎児以外の生物に存在し、そしてこれらから得られるか、あるいはｉｎ  ｖｉｔｒｏでこうした細胞の増殖から生じる細胞を意味する。例えばテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）のレベルを増加させることによって、体細胞を不死化して、細胞の限定されない供給を提供することも可能である。例えば、内因性遺伝子からのＴＥＲＴの転写を増加させることによって、あるいはいずれかの遺伝子送達法または系を通じて、導入遺伝子を導入することによって、ＴＥＲＴのレベルを増加させることも可能である。
【００５６】
別に示さない限り、体細胞をリプログラミングするための方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏの両方で実行可能である（ｉｎ  ｖｉｖｏで実施する場合、体細胞は、被験体内に存在し、そしてｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施する場合、培養中で維持されている単離体細胞を用いる）。
【００５７】
分化した体細胞は、胎児、新生児、年少者または成体の、ヒトを含む霊長類個体由来の細胞を含めて、本発明の方法において、適切な供給源細胞である。適切な体細胞には、限定されるわけではないが、心臓線維芽細胞を含む、線維芽細胞が含まれる。適切な体細胞は、転写因子をコードする遺伝物質を含む転写因子の取り込みのため、受容性であるか、または科学的文献において一般的に知られる方法を用いて、受容性にされることが可能である。取り込みを増進する方法は、細胞タイプおよび発現系に応じて多様でありうる。適切な形質導入効率を有する受容性体細胞を調製するために用いられる例示的な条件は、一般の当業者に周知である。出発体細胞は、約２４時間の倍加時間を有してもよい。
【００５８】
用語「単離細胞」は、本明細書において、元来見られた生物から除去されている細胞、またはこうした細胞の子孫を指す。任意に、細胞は、例えば他の細胞の存在下で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養されている。任意に、細胞は、後に、第二の生物内に導入されるか、または該細胞（または該細胞がその子孫である細胞）が単離された生物内に再導入される。
【００５９】
用語、細胞の単離された集団に関して「単離された集団」は、本明細書において、細胞の混合されたまたは異種の集団から取り除かれ、そして分離されている細胞集団を指す。いくつかの態様において、単離された集団は、細胞が単離されたかまたは濃縮された異種集団に比較した際、実質的に純粋な細胞集団である。
【００６０】
用語、特定の細胞集団に関して「実質的に純粋な」は、総細胞集団を構成する細胞に関して、少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、そして最も好ましくは少なくとも約９５％純粋である細胞集団を指す。言い換えると（Ｒｅｃａｓｔ）、用語、ターゲット細胞、すなわち心筋細胞の少なくとも１つの特性を示す細胞の集団に関して「実質的に純粋な」または「本質的に精製された」は、本明細書の用語によって定義した際、ターゲット細胞またはその子孫ではない細胞を約２０％より少なく、より好ましくは約１５％、１０％、８％、７％より少なく、最も好ましくは約５％、４％、３％、２％、１％より少なく、または１％未満しか含有しない細胞集団を指す。
【００６１】
当業者はまた、心筋細胞のものから供給源細胞の特徴を区別する（言い換えると、供給源細胞表現型の喪失に関して試験する）ための手段を知っているであろう。例えば、本明細書の実施例に提供するように、胎児心筋細胞の産生に適した供給源細胞には、胎児心臓線維芽細胞および間葉系幹細胞が含まれる。当業者は、心臓線維芽細胞および心筋細胞の特性の間を容易に区別することが可能であり、例えば：心臓線維芽細胞は、典型的にはビメンチン、ペリオスチン、線維芽細胞特異的タンパク質（ＦＳＰ）、Ｔｈｙ−１（ＣＤ９０）、およびアルファ−平滑筋アクチン（アルファＳＭＡ）に関して陽性である。
【００６２】
当業者はまた、間葉系幹細胞、および胎児心筋細胞を含む心筋細胞の間を、容易に区別することも可能であろう。例えば、国際細胞療法学会（ＩＳＣＴ）の最小限基準に基づき、ヒト間葉系幹細胞は、プラスチックへの接着、ならびに細胞表面マーカー、ＣＤ２９、ＣＤ４４、Ｄ７３（ＳＨ３）、ＣＤ９０、ＣＤ４９ａ−ｆ、ＣＤ５１、ＣＤ１０５（ＳＨ２）、ＣＤ１０６、ＣＤ１６６およびＳｔｒｏ−１の発現、ならびにＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１４またはＣＤ１１ｂ、ＣＤ７９ａまたはＣＤ１９およびＨＬＡ−ＤＲ表面分子の発現の欠如によって、ヒト間葉系幹細胞を同定可能である。これらの細胞上に発現されうる他のマーカーには、ＣＤ１４６、ＣＤ１４０ｂ、Ｓｔｒｏ−３およびＳｔｒｏ−４が含まれる。当業者は、これらのマーカーの発現変化を観察することによって、間葉系幹細胞から心筋細胞への転換を決定可能であろう。
【００６３】
供給源細胞は、心筋細胞の少なくとも１つの特性を示す場合、心筋細胞に転換されていると決定される。例えば、線維芽細胞は、線維芽細胞が、本発明の方法にしたがった処理後、心筋細胞の少なくとも１つの特性を示す場合、心筋細胞に転換されたと同定されるであろう。さらに、ヒト胎児心臓線維芽細胞を含むヒト胎児線維芽細胞は、胎児心筋細胞の少なくとも１つの特性を示す場合、胎児心筋細胞に転換していると同定されるであろう。
【００６４】
胎児心筋細胞を含む心筋細胞の１つまたはそれより多い特性には、１つまたはそれより多い心筋細胞マーカーの上方制御、および／または細胞形態における変化が含まれる。典型的には、心筋細胞に転換された細胞は、心筋細胞の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つまたはそれより多くの特性を示すであろう。
【００６５】
本発明のいずれかの態様において、心筋細胞に特徴的なタンパク質マーカーには、ミオシン重鎖、αアイソフォーム（ＭＨＣ−α）、心臓トロポニン（ｃＴｎＴ）、ＭＥＦ２Ｃ、ＭＹＨ６、ＡＣＴＮ１、ＣＤＨ２、ＧＪＡ１およびＮＫＸ２．５が含まれる。好ましくは、心筋細胞は、収縮する能力を有することを示すマーカー、ＮＣＸ−１を発現する。
【００６６】
胎児心筋細胞はまた、外部の刺激なしに拍動する能力も有するが、成熟（成体）心筋細胞は、外部供給源からのペーシング（例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏでの電気刺激または薬剤、あるいはｉｎ  ｖｉｖｏでのペースメーカー細胞またはプルキンエ細胞）を必要とする。
【００６７】
供給源細胞が、心筋細胞にリプログラミングされているかまたは転換されているかどうかを決定するために使用可能なさらなるマーカーが、当業者に知られるであろう。適切なマーカーの例が、例えば、Ｘｕら，  （２００９）  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，  ２７：  ２１６３−２１７４およびＲｏｂｅｒｔｓｏｎら，  （２０１３）  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，  ３１：  ｄｏｉ：１０．１００２／ｓｔｅｍ．１３３１に開示され、その全内容は全体として本明細書に援用される。
【００６８】
当業者は、細胞形態の変化を観察することによって、心臓線維芽細胞または間葉系幹細胞の心筋細胞への転換を決定するための方法をよく知っているであろう。例えば、成体心筋細胞は、サルコメア・アクチニンのよく組織化された垂直横紋、および長軸に組織化されたミトコンドリアを示す、桿状細胞である。成体心筋細胞はまた、胎児心筋細胞からも区別されうる。成体心筋細胞は、胎児心筋細胞より大きく、多数の核および筋小胞体、広いサルコメア領域、ならびに多数のミトコンドリアを含む。胎児心筋細胞は、形状がより丸いかまたは偏円形であり、そしてより低レベルの横紋、ならびに組織化されたサルコメア・アクチニンおよびランダムに組織化されたミトコンドリアを示す。
【００６９】
本発明のいずれかの側面において、細胞形態、遺伝子発現プロファイル、活性アッセイ、タンパク質発現プロファイル、表面マーカープロファイル、分化能またはその組み合わせの分析によって、心筋細胞特性を決定してもよい。特性またはマーカーの例には、本明細書に記載するものおよび当業者に知られるものが含まれる。
【００７０】
心臓線維芽細胞を、心筋細胞の少なくとも１つの特性を示す細胞に転換するために使用可能な転写因子を、以下の表１に示す。
表１の各行に示すような転写因子のいずれかの１つまたはそれより多くを用いて、心臓線維芽細胞を心筋細胞に分化転換することも可能である。例えば、各行に示すような、いずれかの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つまたは８つすべての転写因子のタンパク質発現または量を、本発明の目的のために用いてもよい。
【００７１】
表１：心臓線維芽細胞を心筋細胞にリプログラミングするための転写因子
【００７２】
【表１】
2020524518.tif 000002
【００７３】
本明細書において、被覆率（％被覆度）は、列挙する転写因子によって直接制御されており、そして供給源細胞およびターゲット細胞タイプの間で、発現が改変されていると予測される遺伝子の割合を指す。例えば、表１の第１行に示す転写因子は、その発現が、供給源細胞をターゲット細胞に転換するためにターゲティングされている遺伝子の９３．５２７％の発現を直接制御する。
【００７４】
本発明者らはまた、上記の好ましい転写因子群に加えて、他のものに関して容易に置換可能であるいくつかの転写因子があることもまた見出してきている。例えば、表１の第１行に示すような転写因子の好ましい群、ＢＭＰ１０、ＴＢＸ５、ＡＮＫＲＤ１、ＨＡＮＤ２、ＰＰＡＲＧＣ１、ＮＫＸ２−５およびＧＡＴＡ４の背景において、本発明者らは、これらの転写因子のいずれも、転写因子ＨＡＮＤ１で置換可能であることを見出してきている。言い換えると、所定の転写因子、ＢＭＰ１０、ＴＢＸ５、ＡＮＫＲＤ１、ＨＡＮＤ２、ＰＰＡＲＧＣ１、ＮＫＸ２−５およびＧＡＴＡ４のいずれかのタンパク質発現または量を増加させることが不可能である場合（例えば、発現を直接増加させるために利用可能な核酸構築物がない場合）、その代わり、ＨＡＮＤ１の発現を増加させるよう試みることが可能である。言い換えると、本発明の方法にしたがって、心臓線維芽細胞を心筋細胞に分化転換するよう試みる際、転写因子ＨＡＮＤ１は、ＢＭＰ１０、ＴＢＸ５、ＡＮＫＲＤ１、ＨＡＮＤ２、ＰＰＡＲＧＣ１、ＮＫＸ２−５およびＧＡＴＡ４のいずれに対しても置換可能である。
【００７５】
類似の背景において、転写因子ＧＡＴＡ６は、転写因子ＦＨＬ２で置換可能である。こうしたものとして、因子ＢＭＰ１０、ＴＢＸ５、ＡＮＫＲＤ１、ＨＡＮＤ２、ＰＰＡＲＧＣ１、ＮＫＸ２−５およびＧＡＴＡ４を用いる際（これらのいずれかの１つがＨＡＮＤ１で置換されている場合を含む）、心臓線維芽細胞を心筋細胞に転換する目的のため、ＧＡＴＡ６またはＦＨＬ２のいずれかを用いることもまた可能である。
【００７６】
間葉系幹細胞を、心筋細胞の少なくとも１つの特性を示す細胞に転換するために使用可能な転写因子を、以下の表２に示す。
表２の各行に示すような転写因子のいずれかの１つまたはそれより多くを用いて、間葉系幹細胞を心筋細胞に転換することも可能である。例えば、各行に示すようないずれかの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つまたは８つすべての転写因子のタンパク質発現または量を、本発明の目的のために用いてもよい。
【００７７】
表２：間葉系幹細胞を心筋細胞に転換するための転写因子
【００７８】
【表２−１】
2020524518.tif 000003
【００７９】
【表２−２】
2020524518.tif 000004
【００８０】
本発明者らはまた、表２に示すような転写因子の上記の好ましい群に加えて、他のものに関して容易に置換可能であるいくつかの転写因子またはタンパク質因子があることもまた見出している。例えば、表２の第１行に示すような転写因子の好ましい群、ＢＭＰ１０、ＴＢＸ５、ＧＡＴＡ６、ＦＨＬ２、ＮＫＸ２−５、ＨＡＮＤ２、ＧＡＴＡ４およびＰＰＡＲＧＣ１Ａの背景において、本発明者らは、転写因子ＢＭＰ１０、ＴＢＸ５、ＧＡＴＡ６、ＦＨＬ２、ＧＡＴＡ４およびＰＰＡＲＧＣ１Ａのいずれも、転写因子ＡＮＫＲＤ１で置換可能であることを見出してきている。言い換えると、所定の転写因子、ＢＭＰ１０、ＴＢＸ５、ＧＡＴＡ６、ＦＨＬ２、ＧＡＴＡ４およびＰＰＡＲＧＣ１Ａのいずれかのタンパク質発現または量を増加させることが不可能である場合（例えば、発現を直接増加させるために利用可能な核酸構築物がない場合）、その代わり、ＡＮＫＲＤ１の発現を増加させるよう試みることが可能である。言い換えると、本発明の方法にしたがって、間葉系幹細胞を胎児心筋細胞に分化転換するよう試みる際、転写因子ＡＮＫＲＤ１は、ＢＭＰ１０、ＴＢＸ５、ＧＡＴＡ６、ＦＨＬ２、ＧＡＴＡ４およびＰＰＡＲＧＣ１Ａのいずれに対しても置換可能である。
【００８１】
なお、さらに、表２の第１行に示すような転写因子の好ましい群の背景において、本発明者らは、転写因子ＮＫＸ２−５およびＨＡＮＤ２が、ＨＡＮＤ１で置換可能であることを見出してきている。言い換えると、所定の転写因子、ＮＫＸ２．５またはＨＡＮＤ２のいずれかのタンパク質発現または量を増加させることが不可能である場合（例えば、発現を直接増加させるために利用可能な核酸構築物がない場合）、その代わり、ＨＡＮＤ１の発現を増加させるよう試みることが可能である。
【００８２】
本明細書で言及する転写因子および他のタンパク質因子は、ＨＵＧＯ遺伝子命名委員会（ＨＧＮＣ）記号によって言及される。表３は、本明細書に列挙する転写因子に関する例示的なＥｎｓｅｍｂｌｅ遺伝子ＩＤおよびＵｎｉｐｒｏｔ  ＩＤを提供する。ヌクレオチド配列はＥｎｓｅｍｂｌデータベース（Ｆｌｉｃｅｋら（２０１４）．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌｕｍｅ  ４２，  Ｉｓｓｕｅ  Ｄ１．  Ｐｐ．  Ｄ７４９−Ｄ７５５）バージョン８３由来である。本発明での使用がやはり意図されるのは、本明細書に言及する転写因子のいずれかの相同体、オルソログまたはパラログである。
【００８３】
当業者は、例えば、供給源細胞における転写因子の量の増加を提供するか、あるいは供給源細胞において転写因子を組換え的に発現するための核酸等を提供する目的のため、本発明の方法を実行する際に、この情報を用いてもよいことを認識するであろう。
【００８４】
表３：本明細書に言及する転写因子のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を同定する寄託番号。
【００８５】
【表３−１】
2020524518.tif 000005
【００８６】
【表３−２】
2020524518.tif 000006
【００８７】
【表３−３】
2020524518.tif 000007
【００８８】
【表３−４】
2020524518.tif 000008
【００８９】
【表３−５】
2020524518.tif 000009
【００９０】
ポリペプチドに言及した際の用語「変異体」は、全長ポリペプチドに対して、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一である。本発明は、表１および２に列挙するＴＦ（転写因子）の変異体ならびに表３に列挙する配列を含めて、本明細書に記載する転写因子の変異体の使用を意図する。変異体は、全長ポリペプチドの断片または天然存在スプライス変異体であってもよい。変異体は、ポリペプチドの断片に対して、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一であるポリペプチドであってもよく、ここで、断片は、全長野生型ポリペプチドまたはそのドメインが、関心対象の機能的活性、例えば供給源細胞タイプのターゲット細胞タイプへの転換を促進する能力を有する限り、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％である。いくつかの態様において、ドメインは、配列のいずれかのアミノ酸位から始まって、そしてＣ末端に伸長し、長さ少なくとも１００、２００、３００、または４００アミノ酸である。タンパク質の活性を排除するかまたは実質的に減少させるような当該技術分野に知られる変動は、好ましくは回避される。いくつかの態様において、変異体は、全長ポリペプチドのＮおよび／またはＣ末端部分を欠き、例えばいずれかの末端から、最大１０、２０、または５０アミノ酸を欠く。いくつかの態様において、ポリペプチドは、成熟（全長）ポリペプチドの配列を有し、これによって、１つまたはそれより多い部分、例えばシグナルペプチドが、正常細胞内タンパク質分解的プロセシング中に（例えば翻訳と同時のまたは翻訳後プロセシング中に）除去されている、ポリペプチドを意味する。天然に発現する細胞から精製することによる以外で、タンパク質を産生するいくつかの態様において、タンパク質はキメラポリペプチドであり、これによって、該タンパク質が２つまたはそれより多い異なる種に由来する部分を含有することを意味する。天然に発現する細胞から精製することによる以外で、タンパク質を産生するいくつかの態様において、タンパク質は誘導体であり、これによって、これらの配列がタンパク質の生物学的活性を実質的に減少させない限り、タンパク質に関連しないさらなる配列を、タンパク質が含むことを意味する。当業者は、特定のポリペプチド変異体、断片、または誘導体が、機能性であるかどうかを知っているか、または当該技術分野に知られるアッセイを用いて、容易に確認することが可能である。例えば、実施例において本明細書に開示するようなアッセイを用いて、転写因子の変異体が、供給源細胞をターゲット細胞タイプに転換する能力を評価してもよい。他の好適なアッセイには、検出可能なマーカー、例えばルシフェラーゼをコードする核酸配列に機能可能であるように連結された転写因子結合部位を含有するレポーター構築物の転写を活性化する能力を測定することが含まれる。本発明の特定の態様において、機能的変異体または断片は、全長野生型ポリペプチドの活性の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれより多くを有する。
【００９１】
用語、転写因子の量を増加させることに関する、「の量を増加させる」は、関心対象の細胞（例えば供給源細胞、例えば線維芽細胞）における転写因子の量を増加させることを指す。いくつかの態様において、転写因子の量は、転写因子の量が、対照（例えば前記発現カセットのいずれも導入されていない線維芽細胞）に比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれより多い場合、関心対象の細胞（例えば１つまたはそれより多い転写因子をコードするポリヌクレオチドの発現を指示する発現カセットが導入されている細胞）において「増加している」。しかし、転写因子（あるいはそれをコードするプレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ）の転写、翻訳、安定性または活性の量、割合または効率を増加させるいずれかの方法を含む、転写因子の量を増加させるいずれかの方法が意図される。さらに、転写発現の負の制御因子の下方制御または干渉、存在する翻訳の効率の増加（例えばＳＩＮＥＵＰ）もまた考慮される。
【００９２】
用語「剤」は、本明細書において、限定されるわけではないが、小分子、核酸、ポリペプチド、ペプチド、薬剤、イオン等のいずれかの化合物または物質を意味する。「剤」は、限定なしに、合成および天然存在タンパク質性および非タンパク質性実体を含む、いずれかの化学的実体または部分であってもよい。いくつかの態様において、剤は、限定なしに、タンパク質、オリゴヌクレオチド、リボザイム、ＤＮＡザイム、糖タンパク質、ｓｉＲＮＡ、リポタンパク質、アプタマー、ならびにその修飾および組み合わせ等を含む、核酸、核酸類似体、タンパク質、抗体、ペプチド、アプタマー、核酸、アミノ酸、または炭水化物のオリゴマーである。特定の態様において、剤は、化学部分を有する小分子である。例えば、化学部分は、未置換または置換アルキル、芳香族、または複素環部分を含み、マクロライド、レプトマイシンおよび関連する天然産物またはその類似体が含まれる。化合物は、所望の活性および／または特性を有することが知られてもよいし、または多様な化合物のライブラリーから選択されてもよい。
【００９３】
用語「外因性」は、細胞または生物におけるタンパク質、遺伝子、核酸、またはポリヌクレオチドと関連して用いた際、人工的または天然手段によって、細胞または生物内に導入されているタンパク質、遺伝子、核酸、またはポリヌクレオチドを指し；あるいは、細胞と関連して用いた際、人工的または天然手段によって、単離され、そして続いて他の細胞または生物内に導入されている細胞を指す。外因性核酸は、異なる生物または細胞に由来していてもよいし、あるいは生物または細胞内に天然に存在する１つまたはそれより多いさらなる核酸コピーであってもよい。外因性細胞は、異なる生物由来であってもよいし、または同じ生物由来であってもよい。限定されない例として、外因性核酸は、天然細胞のものと異なる染色体位置にあるものであるか、またはそうでなければ、天然に見られるものとは異なる核酸配列によって隣接されている。外因性核酸はまた、染色体外、例えばエピソームベクターであってもよい。
【００９４】
供給源細胞タイプからターゲット細胞タイプへの転換に必要な１つまたはそれより多い転写因子の量を増加させる能力に関する、１つまたはそれより多い候補剤のスクリーニングには、転写因子の産生または発現を可能にする系と、候補剤を接触させ、そして転写因子の量が増加しているかどうかを決定する工程が含まれてもよい。系は、ｉｎ  ｖｉｖｏ、例えば生物における組織または細胞であってもよいし、あるいはｉｎ  ｖｉｔｒｏの生物から単離された細胞またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写系、あるいは細胞または組織におけるｅｘ  ｖｉｖｏであってもよい。転写因子の量を、直接または間接的に、そしてタンパク質またはＲＮＡ（例えばｍＲＮＡまたはプレｍＲＮＡ）いずれかの量を決定することによって、測定してもよい。候補剤は、転写因子をコードする遺伝子の転写におけるいずれかの工程を増加させるか、または対応するｍＲＮＡの翻訳を増加させることによって、転写因子の量を増加させるように機能する。あるいは、候補剤は、転写因子をコードする遺伝子の転写のリプレッサーの阻害活性、あるいは転写因子をコードするｍＲＮＡまたは転写因子自体のタンパク質の分解を引き起こす分子の活性を減少させてもよい。
【００９５】
適切な検出手段には、放射性核種、酵素、補酵素、蛍光体（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｒ）、化学発光体、色素原、酵素基質または補因子、酵素阻害剤、補欠分子族錯体、フリーラジカル、粒子、色素等の標識の使用が含まれる。こうした標識試薬を、多様な周知のアッセイ、例えばラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ、例えばＥＬＩＳＡ、蛍光イムノアッセイ等で用いてもよい。例えば、米国特許第３，７６６，１６２号；第３，７９１，９３２号；第３，８１７，８３７号；および第４，２３３，４０２号を参照されたい。
【００９６】
本発明の方法には、ハイスループットスクリーニング適用が含まれる。例えば、転写因子の産生または発現を可能にする系のアリコットを、マルチウェルプレートの異なるウェル内で、複数の候補剤に曝露する、本発明にしたがったいずれかのアッセイを含む、ハイスループットスクリーニングアッセイを用いてもよい。さらに、本開示にしたがったハイスループットスクリーニングアッセイは、いずれかの種類のミニチュア化アッセイ系において、複数の候補剤に曝露された、転写因子の産生または発現を可能にする系のアリコットを伴う。
【００９７】
開示の方法は、限定されるわけではないが、例えばプレートあたり２４、４８、９６または３８４ウェルのマルチウェルプレート、マイクロチップまたはスライドを含めて、ミニチュア化のいずれかの許容されうる方法を通じて、アッセイ系において、「ミニチュア化」されてもよい。マイクロチップ支持体上で行えるようにアッセイサイズを減少させてもよく、これには、好適に、より少ない量の試薬および他の材料が含まれる。ハイスループットスクリーニングにつながるプロセスのいかなるミニチュア化も本発明の範囲内である。
【００９８】
本発明のいずれかの方法において、ターゲット細胞を、供給源細胞を得た哺乳動物と同じ哺乳動物内にトランスファーしてもよい。言い換えると、本発明の方法で用いる供給源細胞は、自己細胞であってもよく、すなわちターゲット細胞を投与しようとする同じ個体から得られていてもよい。あるいは、ターゲット細胞を、別の個体内に同種間でトランスファーしてもよい。好ましくは、細胞は、個体における医学的状態を治療するかまたは防止する方法において、被験体に対して自己である。
【００９９】
用語「細胞培養培地」（本明細書においてまた、「培養培地」または「培地」とも称される）は、細胞生存性を維持し、そして増殖を補助する栄養素を含有する、細胞を培養するための培地である。細胞培養培地は、適切な組み合わせで以下のいずれを含有してもよい：塩（単数または複数）、緩衝剤（単数または複数）、アミノ酸、グルコースまたは他の糖（単数または複数）、抗生物質、血清または血清置換物、および他の構成要素、例えばペプチド増殖因子等。特定の細胞タイプに通常用いられる細胞培養培地は、当業者に知られる。本発明の方法で使用するための例示的な細胞培養培地を、表４に示す。
【０１００】
表４．細胞タイプを培養するために使用可能な細胞培養培地
【０１０１】
【表４】
2020524518.tif 000010
【０１０２】
本明細書に記載するような核酸または核酸を含むベクターには、上記の表３に言及する１つまたはそれより多い配列、あるいは表１および２に列挙するいずれかの１つまたはそれより多い転写因子をコードする配列が含まれてもよい。
【０１０３】
用語「発現」は、適用可能である場合、限定されるわけではないが、例えば、転写、翻訳、フォールディング、修飾およびプロセシングを含めて、ＲＮＡおよびタンパク質を産生し、そして適切であるように、タンパク質を分泌する際に関与する細胞プロセスを指す。
【０１０４】
用語「単離された」または「部分的に精製された」は、本明細書において、核酸またはポリペプチドの場合、天然供給源に見られるように核酸またはポリペプチドとともに存在する、そして／または細胞によって発現されるか、または分泌されるポリペプチドの場合、分泌された際に、核酸またはポリペプチドとともに存在するであろう、少なくとも１つの他の構成要素（例えば核酸またはポリペプチド）から分離された核酸またはポリペプチドを指す。化学的に合成された核酸またはポリペプチド、あるいはｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳を用いて合成されたものは、「単離された」と見なされる。
【０１０５】
用語「ベクター」は、宿主または供給源細胞内に導入するためにＤＮＡ配列を挿入可能であるキャリアーＤＮＡ分子を指す。好ましいベクターは、連結されている核酸の自律複製および／または発現が可能であるものである。これらが機能可能であるように連結されている遺伝子の発現を指示することが可能なベクターは、本明細書において、「発現ベクター」と称される。したがって、「発現ベクター」は、宿主細胞において、関心対象の遺伝子の発現に必要とされる必要な制御領域を含有する特殊化ベクターである。いくつかの態様において、関心対象の遺伝子は、ベクター中の別の配列に機能可能であるように連結されている。ベクターはウイルスベクターまたは非ウイルスベクターであってもよい。ウイルスベクターを用いる場合、ウイルスベクターは複製不全であることが好ましく、これは例えば複製のためにコードするすべてのウイルス核酸を除去することによって達成可能である。複製不全ウイルスベクターは、なおその感染特性を保持し、そして複製するアデノウイルスベクターと類似の方式で細胞に進入するが、ひとたび細胞に受け入れられたら、複製不全ウイルスベクターは、複製もまた増殖もしない。ベクターはまた、リポソームおよびナノ粒子、ならびにＤＮＡ分子を細胞に送達する他の手段も含む。
【０１０６】
用語「機能可能であるように連結された」は、コード配列の発現に必要な制御配列が、コード配列の発現を達成するように、コード配列に関して適切な位置でＤＮＡ分子中に配置されることを意味する。この同じ定義はときに、発現ベクターにおけるコード配列および転写制御要素（例えばプロモーター、エンハンサー、および終結要素）の配置に適用される。用語「機能可能であるように連結された」には、発現しようとするポリヌクレオチド配列の直前に適切な開始シグナル（例えばＡＴＧ）を有し、そして発現制御配列の制御下でのポリヌクレオチド配列の発現、およびポリヌクレオチド配列にコードされる所望のポリペプチドの産生を可能にする正しい読み枠を維持することが含まれる。
【０１０７】
用語「ウイルスベクター」は、細胞への核酸構築物のキャリアーとしての、ウイルスまたはウイルス関連ベクターの使用を指す。構築物は、感染または細胞内への形質導入のため、レトロウイルスおよびレンチウイルスベクターを含む、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、または単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）またはその他のような非複製性の不全ウイルスゲノム内に、組み込まれ、そしてパッケージングされてもよい。ベクターは、細胞ゲノム内に取り込まれてもまたは取り込まれなくてもよい。構築物には、望ましい場合、トランスフェクションのためのウイルス配列も含まれてもよい。あるいは、構築物は、エピソーム複製可能なベクター、例えばＥＰＶおよびＥＢＶベクター内に取り込まれてもよい。
【０１０８】
本明細書において、用語「アデノウイルス」は、アデノウイルス科のウイルスを指す。アデノウイルスは、ヌクレオカプシドおよび二本鎖直鎖ＤＮＡゲノムで構成される、中程度の大きさ（９０〜１００ｎｍ）の非エンベロープ（裸の）正二十面体ウイルスである。
【０１０９】
本明細書において、用語「非組込みウイルスベクター」は、宿主ゲノム内に組み込まれないウイルスベクターを指し；該ウイルスベクターによって送達される遺伝子の発現は一時的である。宿主ゲノム内への組込みはほとんどまたはまったくないため、非組込みウイルスベクターは、ゲノムにおいて、ランダムな点で挿入することによるＤＮＡ突然変異を産生しない利点を有する。例えば、非組込みウイルスベクターは、染色体外に留まり、そしてその遺伝子を宿主ゲノム内に挿入せず、潜在的に内因性遺伝子の発現を破壊することがない。非組込みウイルスベクターには、限定されるわけではないが、以下：アデノウイルス、アルファウイルス、ピコルナウイルス、およびワクシニアウイルスが含まれうる。これらのウイルスベクターは、これらのいずれも、ある稀な状況においては、ウイルス核酸を宿主細胞ゲノム内に組み込む可能性があるにもかかわらず、該用語を本明細書で用いる際、「非組込み」ウイルスベクターである。重要なことは、本明細書に記載する方法で用いるウイルスベクターは、使用する条件下で、一般に、またはその生活環の主な部分として、宿主細胞ゲノム内にその核酸を組み込まないことである。
【０１１０】
療法において使用するための安全性を増加させ、望ましい場合、選択および濃縮マーカーを含め、そして含有するヌクレオチド配列の発現を最適化するため、科学文献に一般的に知られる方法を用いて、本明細書記載のベクターを構築し、そして操作してもよい。ベクターには、ベクターが供給源細胞タイプにおいて自己複製することを可能にする、構造的構成要素が含まれるはずである。例えば、既知のエプスタイン・バーｏｒｉＰ／核抗原−１（ＥＢＮＡ−１）の組み合わせ（例えば、その全体が本明細書に示されたかのように援用される、Ｌｉｎｄｎｅｒ，  Ｓ．Ｅ．およびＢ．  Ｓｕｇｄｅｎ，  Ｔｈｅ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｒｅｐｌｉｃｏｎ  ｏｆ  Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ：  ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ，  ｌｉｃｅｎｓｅｄ，  ｅｘｔｒａｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ，  Ｐｌａｓｍｉｄ  ５８：１  （２００７）を参照されたい）は、ベクター自己複製を支持するために十分であり、そして哺乳動物、特に霊長類において機能することが知られる他の組み合わせもまた使用してもよい。本発明で使用するために適した発現ベクターの構築のための標準的な技術は、一般の当業者に周知であり、そして、その全体が示されるかのように本明細書に援用される、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊら，  “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，”（第３版  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．  Ｙ．  ２００１）などの刊行物に見出されうる。
【０１１１】
本発明の方法において、転換に必要な適切な転写因子をコードする遺伝材料を、１つまたはそれより多いリプログラミングベクターを通じて、供給源細胞内に送達する。各転写因子を、供給源細胞におけるポリヌクレオチドの発現を駆動しうる異種プロモーターに機能可能であるように連結された転写因子をコードするポリヌクレオチド導入遺伝子として、供給源細胞内に導入してもよい。
【０１１２】
適切なリプログラミングベクターは、感染性または複製適合性ウイルスを生じさせるために十分なウイルスゲノムのすべてまたは一部をコードしない、エピソームベクター、例えばプラスミドを含めて、本明細書に記載するいずれかのものであるが、ベクターは、１つまたはそれより多いウイルスから得られる構造要素を含有してもよい。１つまたは複数のリプログラミングベクターを単一の供給源細胞内に導入してもよい。１つまたはそれより多い導入遺伝子を、単一のリプログラミングベクター上に提供してもよい。１つの強い恒常的な転写プロモーターが、発現カセットとして提供されてもよい、複数の導入遺伝子のための転写制御を提供してもよい。ベクター上の別個の発現カセットが、別個の強い恒常性プロモーターの転写制御下にあってもよく、これらのプロモーターは、同じプロモーターのコピーであってもよいし、または別個のプロモーターであってもよい。多様な異種プロモーターが当該技術分野に知られ、そしてこれらを、転写因子の所望の発現レベルなどの要因に応じて用いてもよい。以下に例示するように、供給源細胞において、別個の強度を有する別個のプロモーターを用いて、別個の発現カセットの転写を制御することが好適でありうる。転写プロモーターの選択における別の考慮は、プロモーター（単数または複数）をサイレンシングするレートである。当業者は、遺伝子（単数または複数）の産物が、リプログラミング法において、その役割を完了したかまたは実質的に完了した後、１つまたはそれより多い導入遺伝子または導入遺伝子発現カセットの発現を減少させることが好適でありうることを認識するであろう。例示的なプロモーターは、ヒトＥＦ１α伸長因子プロモーター、ＣＭＶサイトメガロウイルス極初期プロモーター、およびＣＡＧニワトリアルブミンプロモーター、ならびに他の種由来の対応する相同プロモーターである。ヒト体細胞において、ＥＦ１αおよびＣＭＶはどちらも、強いプロモーターであるが、ＣＭＶプロモーターの制御下での導入遺伝子の発現が、ＥＦ１αプロモーターの制御下での導入遺伝子の発現よりもより早期に停止されるように、前者は後者よりも、より効率的にサイレンシングされる。転写因子は、リプログラミング効率を調節するために変動させうる相対比で、供給源細胞において発現されうる。好ましくは、複数の導入遺伝子が単一の転写物上にコードされる場合、内部リボソーム進入部位が、転写プロモーターから遠位の、導入遺伝子（単数または複数）の上流に提供される。因子の相対比は、送達する因子に応じて多様でありうるが、本開示を把握している一般の当業者は、因子の最適な比を決定可能である。
【０１１３】
当業者は、複数のベクターを通じるよりも、単一のベクターを通じて、すべての因子を導入する方が好適に効率的であるが、総ベクターサイズが増加するにつれて、ベクターを導入することがますます困難になることを認識するであろう。当業者はまた、ベクター上の転写因子の位置が、時間的発現および生じるリプログラミング効率に影響を及ぼしうることを認識するであろう。こうしたものとして、出願者らは、ベクターの組み合わせに対して、因子の多様な組み合わせを使用した。リプログラミングを支持する、いくつかのこうした組み合わせを本明細書に示す。
【０１１４】
リプログラミングベクター（単数または複数）を導入した後、そして供給源細胞がリプログラミングされている間、ベクターはターゲット細胞中に存在し続けることが可能であり、この間、導入された導入遺伝子が転写され、そして翻訳される。導入遺伝子発現は、ターゲット細胞タイプにリプログラミングされている細胞においては、好適に下方制御されるかまたは停止されてもよい。リプログラミングベクター（単数または複数）は、染色体外にとどまってもよい。極端に低い効率で、ベクター（単数または複数）は、細胞ゲノム内に組み込まれうる。以下の実施例は、本発明を例示することを意図し、いかなる意味でも限定することを意図しない。
【０１１５】
本発明とともに使用するための、細胞、組織または生物の形質転換のための核酸送達に適した方法には、本明細書に記載するような、または一般の当業者に知られるであろうような、核酸（例えばＤＮＡ）が細胞、組織または生物内に導入されうる、実質的にいずれかの方法が含まれると考えられる（例えば、ＳｔａｄｔｆｅｌｄおよびＨｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６（５）：３２９−３３０  （２００９）；  Ｙｕｓａら，  Ｎａｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６：３６３−３６９  （２００９）；  Ｗｏｌｔｊｅｎら，  Ｎａｔｕｒｅ  ４５８，  ７６６−７７０  （９  Ａｐｒ．  ２００９））。こうした方法には、限定されるわけではないが、ｅｘ  ｖｉｖｏトランスフェクションによるなどのＤＮＡの直接送達（Ｗｉｌｓｏｎら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４４：１３４４−１３４６，  １９８９、ＮａｂｅｌおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３２６：７１１−７１３，  １９８７）が含まれ、任意に、脂質に基づくトランスフェクション試薬、例えばＦｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）またはリポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いても、注入（各々、本明細書に援用される、米国特許第５，９９４，６２４号、第５，９８１，２７４号、第５，９４５，１００号、第５，７８０，４４８号、第５，７３６，５２４号、第５，７０２，９３２号、第５，６５６，６１０号、第５，５８９，４６６号および第５，５８０，８５９号）によってもよく、これにはマイクロインジェクション（本明細書に援用される、ＨａｒｌａｎｄおよびＷｅｉｎｔｒａｕｂ，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  １０１：１０９４−１０９９，  １９８５；米国特許第５，７８９，２１５号）が含まれ；エレクトロポレーション（本明細書に援用される、米国特許第５，３８４，２５３号；  Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａら，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  ６：７１６−７１８，  １９８６；  Ｐｏｔｔｅｒら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８１：７１６１−７１６５，  １９８４）によってもよく；リン酸カルシウム沈殿（ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ  Ｄｅｒ  Ｅｂ，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ５２：４５６−４６７，  １９７３；  ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａ，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  ７（８）：２７４５−２７５２，  １９８７；  Ｒｉｐｐｅら，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  １０：６８９−６９５，  １９９０）によってもよく；ＤＥＡＥ−デキストランを用いた後、ポリエチレングリコールを用いることによってもよく（Ｇｏｐａｌ，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  ５：１１８８−１１９０，  １９８５）；直接超音波装填（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８４：８４６３−８４６７，  １９８７）によってもよく；リポソーム仲介性トランスフェクション（ＮｉｃｏｌａｕおよびＳｅｎｅ，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  ７２１：１８５−１９０，  １９８２；  Ｆｒａｌｅｙら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ７６：３３４８−３３５２，  １９７９；  Ｎｉｃｏｌａｕら，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  １４９：１５７−１７６，  １９８７��  Ｗｏｎｇら，  Ｇｅｎｅ，  １０：８７−９４，  １９８０；  Ｋａｎｅｄａら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４３：３７５−３７８，  １９８９；  Ｋａｔｏら，  Ｊ  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６６：３３６１−３３６４，  １９９１）によってもよく、そして受容体仲介性トランスフェクション（ＷｕおよびＷｕ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２７：８８７−８９２，  １９８８；  ＷｕおよびＷｕ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６２：４４２９−４４３２，  １９８７）によってもよく；そしてこうした方法のいずれかの組み合わせによってもよく、これらの各々は本明細書に援用される。
【０１１６】
会合する分子の細胞内への導入を仲介可能ないくつかのポリペプチドが以前記載されてきており、そしてこれは本発明に適応可能である。例えば、Ｌａｎｇｅｌ  （２００２）  Ｃｅｌｌ  Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  Ｓｅｒｉｅｓを参照されたい。膜を渡る輸送を増進するポリペプチド配列の例には、限定されるわけではないが、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）ホメオタンパク質、アンテナペディア転写タンパク質（ＡｎｔＨＤ）（Ｊｏｌｉｏｔら，  Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌ．  ３：  １１２１−３４，  １９９１；  Ｊｏｌｉｏｔら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８８：  １８６４−８，  １９９１；  Ｌｅ  Ｒｏｕｘら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９０：  ９１２０−４，  １９９３）、単純ヘルペスウイルス構造タンパク質ＶＰ２２（ＥｌｌｉｏｔｔおよびＯ’Ｈａｒｅ，  Ｃｅｌｌ  ８８：  ２２３−３３，  １９９７）；ＨＩＶ−１転写活性化因子ＴＡＴタンパク質（ＧｒｅｅｎおよびＬｏｅｗｅｎｓｔｅｉｎ，  Ｃｅｌｌ  ５５：  １１７９−１１８８，  １９８８；  ＦｒａｎｋｅｌおよびＰａｂｏ，  Ｃｅｌｌ  ５５：  １  ２８９−１１９３，  １９８８）；カポジＦＧＦシグナル配列（ｋＦＧＦ）；タンパク質形質導入ドメイン−４（ＰＴＤ４）；ペネトラチン、Ｍ９１８、トランスポータン−１０；核局在化配列、ＰＥＰ−Ｉペプチド；両親媒性ペプチド（例えば、ＭＰＧペプチド）；送達増進輸送体、例えば米国特許第６，７３０，２９３号に記載されるもの（限定されるわけではないが、少なくとも５〜２５またはそれより多い連続アルギニン、あるいは３０、４０または５０アミノ酸の連続セット中に５〜２５またはそれより多いアルギニンを含むペプチド配列を含むペプチド配列を含み；限定されるわけではないが、十分な、例えば少なくとも５つのグアニジノまたはアミジノ部分を有するペプチドを含む）；ならびに商業的に入手可能なペネトラチンＴＭ１ペプチド、およびフランス・パリのＤｉａｔｏｓ  Ｓ．Ａ．より入手可能なＶｅｃｔｏｃｅｌｌ（登録商標）プラットホームのＤｉａｔｏｓペプチドベクター（「ＤＰＶ」）が含まれる。ＷＯ／２００５／０８４１５８およびＷＯ／２００７／１２３６６７、ならびに該文献に記載されるさらなる輸送体もまた参照されたい。これらのタンパク質は形質膜を通過可能であるだけでなく、他のタンパク質、例えば本明細書に記載する転写因子を付着させると、これらの複合体の細胞取り込みを刺激するために十分である。
【０１１７】
本発明には、以下の限定されない実施例が含まれる。
【実施例】
【０１１８】
実施例１
心臓線維芽細胞の胎児心筋細胞への転換のための候補転写因子は、Ｒａｃｋｈａｍら（２０１６）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ４８（３）：  ３３１−３３５に以前記載された方法にしたがって同定された。
【０１１９】
プラスミド
８つの転写因子、ＢＭＰ１０、ＧＡＴＡ６、ＴＢＸ５、ＡＮＫＲＤ１、ＨＡＮＤ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＮＫＸ２．５、およびＧＡＴＡ４をコードする核酸を、エピソーム発現ベクターｐＣＥＰ４内にクローニングした。線維芽細胞において、これらの転写因子を一過性に発現させる目的のため、心臓線維芽細胞内に、このベクターをトランスフェクションして、細胞を胎児心筋細胞にリプログラミングすることが可能であるかどうかを決定した。
【０１２０】
トランスフェクション
以下に提示するデータにおいて、Ａｍａｘａ  ４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｒｏｒ（ＬｏｎｚａのＰ２初代細胞キット、プログラムＦＦ−１３５）を用いたヌクレオフェクションによって、トランスフェクションを行った。
【０１２１】
実施例２
単一因子発現
ヒト胎児心臓線維芽細胞（ＨＦＣＦ、Ｐ６）を、ヌクレオフェクションによって、転写因子を含有する非組込みプラスミドでトランスフェクションし、ここで、ｑＰＣＲを行って、時間の関数として、各因子の発現レベルを定量化した。参照遺伝子としてＧＰＤＨを用いて、２−ΔΔＣｔ法を用い、遺伝子発現の相対変化を計算した。データは、エピソームプラスミドが実際に、遺伝子の一時的発現を達成可能であり、そして発現が第１４日以後、効果的に抑制されたことを確証する（図１）。
【０１２２】
実施例３
ヒト胎児心臓線維芽細胞（ｈＦＣＦ）のリプログラミング
因子を所持するエピソームベクターを用いた最初の実験セットにおいて、我々は、実施例１に同定する８つの転写因子でのヌクレオフェクションを用いて、ｈＦＣＦのリプログラミングを試み、そしてｍｙｈ６およびｃＴｎＴを含む内因性心臓マーカーの発現を、第１１日まで、ｑＰＣＲによって定量化した（非ソーティング細胞全体に対して）（図２）。培養すると、トランスフェクションされておらず、そしてしたがって移行していない線維芽細胞が過成長するため、第７日以降、心臓遺伝子の発現レベルの減少が予期されることに注目されたい。これは、正常線維芽細胞で希釈された集団由来の総ＲＮＡを生じる。
【０１２３】
実施例４
ＮＣＸ−１−ＧＦＰレポーターを所持するレポーター細胞株、ｈＦＣＦのリプログラミング
ｈＦＣＦを用いたこれらの第一の実験セット後、ＮＣＸ−１−ＧＦＰで安定に形質導入されている社内生成ｈＦＣＦを用いて、第二ラウンドの実験を探求した。これらの細胞は、ＮＣＸ−１遺伝子がオンである場合、ＧＦＰタンパク質を発現する。ＮＣＸ−１タンパク質は心筋細胞の拍動を可能にするため、心筋細胞の機能的振る舞いに必須である。我々は以前、このレポーターが、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞を心筋細胞の運命に移行している細胞を強調する際に非常に有効であることを示した。我々はまた、ＧＦＰを発現する（ＮＣＸ−１遺伝子の発現を示す）幹細胞集団内の細胞もまた、１００％これらと相関し、これが次いで、心筋細胞の拍動につながり、すなわちこれが機能のロバストなレポーターであることも示している。
【０１２４】
図３は、第８日に、３．７％のヒト細胞がＧＦＰ（ＮＣＸ−１）を発現していたことを確証するＦＡＣＳプロットを示す。第二の図は、第８日および第１４日のこれらの細胞を示す（蛍光顕微鏡下で撮影）：ＬＨＳ−非ソーティング、第８日；中央−第８日にソーティングし、そして再植え付けした後、；ＲＨＳ−第１４日の増殖されたソーティング細胞。
【０１２５】
実施例５
図４は、第１４日までの心臓遺伝子（ｃＴｎＴ、ａＭＨＣ、ＮＣＸ−１）の発現レベルを示し、これらの遺伝子各々において、実質的な上方制御およびロバストな増加を確証する。このパネルの遺伝子に関する第１４日のデータは、ｍｙｈ６およびｃＴｎＴは減少するが、ＮＣＸ−１は維持されていることを示す。遺伝子発現のこれらのレベルは細胞総集団、非ＧＦＰおよびＧＦＰ＋細胞の両方に関するものであり（すなわちソーティングされたＧＦＰ＋細胞に関するだけではなく）、このうち、ＧＦＰ＋細胞は、第１４日までに全体ではより小さい比率となるため、これは、転換効率を強調する。
【０１２６】
実施例６
ｃＴｎＴ−ＥＧＦＰレポーターを所持するレポーター細胞株、ｈＦＣＦのリプログラミング
ヒト胎児心臓線維芽細胞（ＨＦＣＦ、Ｐ３）を、転写因子、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＨＡＮＤ１、ＡＮＫＲＤ１、ＮＫＸ２．５、ＴＢＸ５、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、およびＢＭＰ１０をコードするエピソーム（非組込み）プラスミドでのヌクレオフェクションによってトランスフェクションした。
【０１２７】
第２日、細胞培地を誘導培地に交換した。第１４日、細胞を、構造タンパク質、心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）のレポーター構築物でトランスフェクションした。第１４日、およそ１０％の細胞がレポータータンパク質を発現した。
【０１２８】
本明細書で開示し、そして定義する本発明は、言及する、あるいは本文または図から明らかである個々の特徴の２つまたはそれより多くのすべての代替の組み合わせに拡張されることが理解されるであろう。これらの異なる組み合わせはすべて、本発明の多様な代替側面を構成する。
【図１】
2020524518.tif 000011
【図２】
2020524518.tif 000012
【図３】
2020524518.tif 000013
【図４】
2020524518.tif 000014
【手続補正書】
【提出日】令和2年2月25日(2020.2.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
供給源細胞を、心筋細胞の少なくとも１つの特性を示す細胞にリプログラミングするための方法であって：
ｉ）供給源細胞または供給源細胞を含む細胞集団を提供し；
ｉｉ）該供給源細胞と、１つまたはそれより多い転写因子またはその変異体の発現または量を活性化するかまたは増加させる１つまたはそれより多い剤を接触させ；そして
ｉｉｉ）該細胞または細胞集団を培養し、そして、心筋細胞の少なくとも１つの特性に関して、該細胞または細胞集団を監視してもよい
工程を含む、ここで：
−該転写因子が、表１、２および３に列挙するものの１つまたはそれより多くである
前記方法。
【請求項２】
供給源細胞が、心臓線維芽細胞である、請求項１の方法。
【請求項３】
供給源細胞が心臓線維芽細胞であり、そして１つまたはそれより多い転写因子：
（ａ）ＢＭＰ１０、ＧＡＴＡ６、ＴＢＸ５、ＡＮＫＲＤ１、ＨＡＮＤ２、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＮＫＸ２−５およびＧＡＴＡ４；
（ｂ）ＴＢＸ５、ＧＡＴＡ６、ＡＮＫＲＤ１、ＨＡＮＤ２、ＨＡＮＤ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＮＫＸ２−５およびＧＡＴＡ４；
（ｃ）ＧＡＴＡ６、ＡＮＫＲＤ１、ＨＡＮＤ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、Ｓ１００Ａ１、ＮＫＸ２−５およびＧＡＴＡ４；
（ｄ）ＦＨＬ２、ＡＮＫＲＤ１、ＨＡＮＤ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、Ｓ１００Ａ１、ＭＹＯＣＤ、ＮＫＸ２−５およびＧＡＴＡ４；
（ｅ）ＴＢＸ２０、ＡＮＫＲＤ１、ＨＡＮＤ１、ＨＡＮＤ２、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＭＹＯＣＤ、ＮＫＸ２−５およびＧＡＴＡ４；
（ｆ）ＡＮＫＲＤ１、ＨＡＮＤ１、ＨＡＮＤ２、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、Ｓ１００Ａ１、ＭＹＯＣＤ、ＮＫＸ２−５およびＧＡＴＡ４；
（ｇ）ＨＡＮＤ２、ＨＡＮＤ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、Ｓ１００Ａ１、ＭＹＯＣＤ、ＫＬＨＬ３１、ＮＫＸ２−５およびＧＡＴＡ４；
（ｈ）ＨＡＮＤ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、Ｓ１００Ａ１、ＭＹＯＣＤ、ＫＬＨＬ３１、ＮＫＸ２−５、ＧＡＴＡ４およびＴＣＦ２１；
（ｉ）ＳＭＹＤ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、Ｓ１００Ａ１、ＡＢＲＡ、ＭＹＯＣＤ、ＫＬＨＬ３１、ＮＫＸ２−５およびＧＡＴＡ４；
（ｊ）ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、Ｓ１００Ａ１、ＡＢＲＡ、ＭＹＯＣＤ、ＫＬＨＬ３１、ＮＫＸ２−５、ＧＡＴＡ４およびＴＣＦ２１
（ｋ）Ｓ１００Ａ１、ＡＢＲＡ、ＭＹＯＣＤ、ＫＬＨＬ３１、ＮＫＸ２−５、ＧＡＴＡ４およびＴＣＦ２１；
（ｌ）Ｅ２Ｆ８、ＡＢＲＡ、ＭＹＯＣＤ、ＫＬＨＬ３１、ＮＫＸ２−５、ＧＡＴＡ４およびＴＣＦ２１；
（ｍ）ＡＢＲＡ、ＭＹＯＣＤ、ＫＬＨＬ３１、ＮＫＸ２−５、ＧＡＴＡ４およびＴＣＦ２１；
（ｎ）ＭＹＯＣＤ、ＫＬＨＬ３１、ＮＫＸ２−５、ＧＡＴＡ４およびＴＣＦ２１；
（ｏ）ＩＧＦ２、ＫＬＨＬ３１、ＮＫＸ２−５、ＧＡＴＡ４およびＴＣＦ２１；または
（ｐ）ＫＬＨＬ３１、ＮＫＸ２−５、ＧＡＴＡ４およびＴＣＦ２１
のタンパク質発現または量が増加している、請求項１の方法。
【請求項４】
以下の転写因子：
（ａ）ＨＡＮＤ１、ＴＢＸ５、ＧＡＴＡ６、ＡＮＫＲＤ１、ＨＡＮＤ２、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＮＫＸ２−５およびＧＡＴＡ４；
（ｂ）ＢＭＰ１０、ＨＡＮＤ１、ＧＡＴＡ６、ＡＮＫＲＤ１、ＨＡＮＤ２、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＮＫＸ２−５およびＧＡＴＡ４；
（ｃ）ＢＭＰ１０、ＴＢＸ５、ＦＨＬ２、ＡＮＫＲＤ１、ＨＡＮＤ２、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＮＫＸ２−５およびＧＡＴＡ４；
（ｄ）ＢＭＰ１０、ＴＢＸ５、ＧＡＴＡ６、ＨＡＮＤ１、ＨＡＮＤ２、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＮＫＸ２−５およびＧＡＴＡ４；
（ｅ）ＢＭＰ１０、ＴＢＸ５、ＧＡＴＡ６、ＡＮＫＲＤ１、ＨＡＮＤ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＮＫＸ２−５およびＧＡＴＡ４；
（ｆ）ＢＭＰ１０、ＴＢＸ５、ＧＡＴＡ６、ＡＮＫＲＤ１、ＨＡＮＤ２、ＨＡＮＤ１、ＮＫＸ２−５およびＧＡＴＡ４；
（ｇ）ＢＭＰ１０、ＴＢＸ５、ＧＡＴＡ６、ＡＮＫＲＤ１、ＨＡＮＤ２、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＨＡＮＤ１およびＧＡＴＡ４；または
（ｈ）ＢＭＰ１０、ＴＢＸ５、ＧＡＴＡ６、ＡＮＫＲＤ１、ＨＡＮＤ２、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＮＫＸ２−５およびＨＡＮＤ１
のタンパク質発現または量が増加している、請求項１の方法。
【請求項５】
前記転写因子が、ＢＭＰ１０、ＧＡＴＡ６、ＴＢＸ５、ＡＮＫＲＤ１、ＨＡＮＤ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＮＫＸ２．５、およびＧＡＴＡ４である、請求項４の方法。
【請求項６】
前記心臓線維芽細胞を、心筋細胞への分化を可能にするために十分な時間および条件下で培養し；それによって、心臓線維芽細胞から、心筋細胞の少なくとも１つの特性を示す細胞を生成する工程を含む、先行する請求項いずれかの方法。
【請求項７】
前記剤が：核酸、タンパク質、アプタマーおよび小分子、リボソーム、ＲＮＡｉ剤、ｇＲＮＡおよびペプチド核酸（ＰＮＡ）、ならびにその類似体または変異体からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記剤が、請求項３または請求項４に列挙する転写因子またはタンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記心筋細胞の少なくとも１つの特性が、いずれかの１つまたはそれより多い心筋細胞マーカーの上方制御、および／または細胞形態における変化、および／または細胞収縮性の証拠である、先行する請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
前記心筋細胞のマーカーに、ＭＥＦ２Ｃ、ＭＹＨ６、ＡＣＴＮ１、ＣＤＨ２、心臓トロポニンＴおよびＧＪＡ１が含まれる、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
収縮性心筋細胞のマーカーがＮＣＸ−１である、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
前記心臓線維芽細胞がリプログラミングされて、ＮＣＸ−１の発現増加を示す、請求項１〜１１のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
前記心筋細胞が胎児心筋細胞である、先行する請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
前記心臓線維芽細胞がヒト心臓線維芽細胞である、先行する請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項記載の方法によって産生される、心筋細胞の少なくとも１つの特性を示す細胞。
【請求項１６】
細胞の少なくとも５％が、心筋細胞の少なくとも１つの特性を示し、そしてこれらの細胞が請求項１〜１４のいずれか一項記載の方法によって産生される、細胞集団。
【請求項１７】
心疾患の治療のための、心筋細胞の少なくとも１つの特性を示す、請求項１〜１４のいずれか一項記載の方法によって産生される細胞または細胞集団。
【国際調査報告】
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