(57)【要約】  5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸とナトリウムとのモル比が1：0.5〜1：1.5（モル：モル）である5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩および／またはその水和物および／またはその溶媒和物、ならびにそれを得る方法。【選択図】  図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸とナトリウムとのモル比が1：0.5〜1：1.5である5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩および／またはその水和物および／またはその溶媒和物。
【請求項２】
5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸とナトリウムとのモル比が1：0.75〜1：1.25である、請求項１に記載の結晶性塩。
【請求項３】
5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸とナトリウムとのモル比が約1：1である、請求項1または2に記載の結晶性塩。
【請求項４】
前記塩が、5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸のナトリウム塩であり、少なくとも1つの特性ピーク（2θ±0.2°2θ（ＣｕＫα放射線）で表したとき）が6.5、10.2、13.1、15.3、17.9、20.5および22.0にあるPXRDパターンを有することを特徴とする、先の請求項の少なくとも一項に記載の結晶性塩。
【請求項５】
前記塩が、5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸のナトリウム塩であり、少なくとも1つの特性ピーク（2θ±0.2°2θ（ＣｕＫα放射線）で表したとき）が6.5、10.2、12.5、13.1、14.8、15.1、15.3、16.1、17.2、17.9、20.4、20.5、21.2、22.0、22.5および27.2にあるPXRDパターンを有することを特徴とする、先の請求項の少なくとも一項に記載の結晶性塩。
【請求項６】
5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸のナトリウム塩が実質的に図１に示されるようなPXRDパターンを有することを特徴とする、先の請求項の少なくとも一項に記載の結晶性塩。
【請求項７】
5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸のナトリウム塩が、5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸のモノナトリウム塩であることを特徴とする、先の請求項の少なくとも一項に記載の結晶性塩。
【請求項８】
少なくとも99％以上の化学的および立体異性的純度を有する、先の請求項の少なくとも一項に記載の結晶性塩。
【請求項９】
請求項１〜７の少なくとも一項に記載の5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩を得るための方法であって、
ａ）5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸を、任意に適当な溶媒または溶媒混合物中において提供する工程、
ｂ）工程ａ）の組成物に水酸化ナトリウムを添加する工程、
ｃ）任意に、溶媒、溶媒混合物および／または共塩形成剤を工程ｂ）の組成物に添加する、または工程ｂ）の組成物を溶媒、溶媒混合物および／または共塩形成剤に添加する工程、
ｄ）結晶化する工程、
ｅ）任意に、さらなる溶媒または溶媒混合物を添加する工程、および
ｆ）得られた固形物を単離する工程
を含む方法。
【請求項１０】
工程ｂ）における5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸と水酸化ナトリウムとのモル比が1：0.5〜1：1.5の範囲内にあることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
工程ｃ）における5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸と共塩形成剤とのモル比が1：0.5〜1：3の範囲内であることを特徴とする、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
工程ａ）、ｃ）および／またはｅ）による溶媒および／または溶媒混合物が、水、水溶性アルコール、メタノール、エタノール、イソプロパノール、n-プロパノール、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、ベンジルアルコールおよびそれらの混合物からなる群より選択されることを特徴とする、請求項９〜１１の少なくとも一項に記載の方法。
【請求項１３】
工程ｃ）の共塩形成剤が、ｐＫａ値が6〜11の有機塩基であることを特徴とする、請求項９〜１２の少なくとも一項に記載の方法。
【請求項１４】
工程ｃ）の共塩形成剤が、ｐＫａ値が7〜10の有機塩基であることを特徴とする、請求項９〜１３の少なくとも一項に記載の方法。
【請求項１５】
工程ｃ）の共塩形成剤が、4-(2-ヒドロキシエチル)-モルホリン、1-(2-ヒドロキシエチル)-ピロリジン、イミダゾール、2-ジメチルアミノエタノール、tert-ブチルアミンおよびそれらの混合物からなる群より選択されることを特徴とする、請求項９〜１４の少なくとも一項に記載の方法。
【請求項１６】
工程ｃ）の共塩形成剤が4-(2-ヒドロキシエチル)-モルホリンであることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
工程ｄ）において、温度が少なくとも30℃であることを特徴とする、請求項９〜１６の少なくとも一項に記載の方法。
【請求項１８】
工程ａ）、ｂ）、ｃ）および／またはｄ）において、種晶を添加することを特徴とする、請求項９〜１７の少なくとも一項に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜７の少なくとも一項に記載の5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩および任意に１種または２種以上の許容可能な賦形剤を含んでなる医薬組成物、食品添加物、ビタミンおよび／または他の製剤。
【請求項２０】
錠剤、カプセル剤、経口液体製剤、粉末、凍結乾燥物、顆粒、ロゼンジ、再構成性粉末、注射可能または注入可能な溶液もしくは懸濁液または坐剤の形態である、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
さらに、少なくとも一種の追加の治療薬を含む、請求項１９または２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
経口、非経口、筋肉内、脊髄内、髄腔内、歯周、局所または直腸投与用の医薬組成物である、請求項１９〜２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
薬物および／または食品添加物の生産用の成分としての、請求項１〜７の少なくとも一項に記載の5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩の使用。
【請求項２４】
ホモシステイン低下、貧血、神経管欠損、心臓血管疾患、うつ病、認知障害、アルツハイマー病および骨粗鬆症の治療、および／または、低血漿および／または低赤血球葉酸および／または低脳脊髄液葉酸および／または低末梢もしくはたは中枢神経系葉酸の食事管理において使用するための、請求項１〜７の少なくとも一項に記載の5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸（N-[4-[[(2-アミノ-1,4,5,6,7,8-ヘキサヒドロ-5-メチル-4-オキソ-(6S)-プテリジニル)メチル]アミノ]ベンゾイル]-L-グルタミン酸、本明細書ではMTHFと略す）の結晶性ナトリウム塩、およびそれを得る方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
テトラヒドロ葉酸類は、主に、巨赤芽球葉酸貧血の治療のために、癌治療における葉酸拮抗薬、特にアミノプテリンおよびメトトレキサートの適合性を増加させる（葉酸拮抗薬救助療法）ための対抗手段として、フッ化ピリミジンの治療効果を増加させるためおよび乾癬および関節リウマチのような自己免疫疾患の治療のために、突然変異に対する特定の駆虫剤、例えばトリメトプリム-スルファメトキサゾールの適合性を増加させるために、および化学療法におけるジデアザテトラヒドロ葉酸の毒性の低減のために、5-ホルミルテトラヒドロ葉酸およびその塩（ロイコボリンおよびレボロイコボリン）、5-メチルテトラヒドロ葉酸およびその塩（メタフォリン(Metafolin)(登録商標)）または5,10-メチレンテトラヒドロ葉酸およびその塩（モデュフォリン(Modufolin)(登録商標)）として用いられている。
【０００３】
5-メチルテトラヒドロ葉酸は、特に、薬剤および食品添加物として、ビタミン製剤として、神経管欠損の予防のために、うつ病の治療のために、およびホモシステインレベルに影響を与えるために使用される。
【０００４】
5-メチルテトラヒドロ葉酸およびその塩は非常に不安定であり、特に酸化を受けやすい（この点について、A.L. Fitzhugh, Pteridines 4 (4), 187-191 (1993)も参照されたい）ので、医薬品活性成分または食品添加物に許容される純度のレベルで製造することは困難である。
【０００５】
5-メチルテトラヒドロ葉酸の不安定性を克服するために、酸素を可能な限り完全に排除するか、アスコルビン酸や還元型L-グルタチオンなどの抗酸化剤を添加するなど、さまざまな方法が採用されている。
【０００６】
米国特許第6,441,168号明細書は、5-メチルテトラヒドロ葉酸のアルカリ土類塩、特にカルシウム塩、その結晶化およびその使用を開示している。5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の結晶性カルシウム塩は四つの異なる結晶変態で存在する。
【０００７】
5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸のカルシウム塩は四つの変態で存在し、それぞれを製造するプロセスを非常に正確に制御する必要があるという欠点がある。加えて、水中の5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の前記カルシウム塩の溶解度は比較的低く、そのことが、生物学的利用能の低下およびその使用の適用形態への制限をもたらす可能性がある。また、溶解度が低いと、さらなる処理、例えば再結晶による精製のためにそのような化合物を溶解する必要がある場合、時間体積収率が低くなる。さらに、米国特許第6,441,168号明細書の5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の結晶性塩は、また、5-メチルテトラヒドロ葉酸の1当量当たり少なくとも1当量の結晶水を有している。
【０００８】
医薬的に有用な化合物の新しい結晶形は、医薬品および／またはビタミン／医療食品の性能プロファイルを改善する機会を提供する。これは、向上した特性を有する新しい剤形を設計するために利用できる、製剤科学者が持っている貯蔵材料の幅を広げる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の根底にある技術的課題は、当該分野で公知の5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の結晶性カルシウム塩の欠点を克服する、5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸を含む結晶形態を提供することである。
【００１０】
さらに、新しい結晶形は、規制当局の承認に必要な純度レベルおよび均一性に届くように、活性化合物の製造または製剤化に役立つ可能性のある、望ましい異なる物理的および／または生物学的特性をしばしば示す。
【００１１】
還元された葉酸の安定性のために、貯蔵時の吸水率が低く、製造中に充分に乾燥できる化合物を提供することが常に目指されている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
その技術的課題は、5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸とナトリウムとのモル比が1：0.5〜1：1.5（モル：モル）である5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩および／またはその水和物および／またはその溶媒和物によって解決される。
【００１３】
本発明の固体形態は、改善された薬理学的特性、例えば改善された生物学的利用能を有し、それにより、改善された薬物製品を調節および設計する可能性を高める。
【００１４】
さらに、5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸のナトリウム塩の結晶変態は1つしか存在しないため、それを得るためのプロセスが向上する。
【００１５】
さらに、本発明の５-メチル-（６Ｓ）-テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩は、既知の５-メチル-（６Ｓ）-テトラヒドロ葉酸の結晶性カルシウム塩と比較した場合、予想外に優れた長期安定性を示す。本発明の5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩の向上した安定性は、貯蔵寿命の延長、厳しくない貯蔵条件、および／または、供給連鎖へのより好都合で／安価な前提条件をもたらし得る。
【００１６】
さらに、本発明の5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩は、最先端技術で知られている5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸およびそのそれぞれの塩に対して、増加した溶解度、特に増加した動的溶解度を示す。本発明の５-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩の増加した溶解度、特に増加した動的溶解度は、異なる処理パラメータ、例えば、溶解時間の短縮、それによる製品への酸化ストレスの減少、および／または、最終的には、急速に溶解する粉末などの他の適用形態さえも、もたらし得る。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】実施例１による5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の結晶性モノナトリウム塩のPXRDパターンを示す図である。
【図２】5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸のモノナトリウム塩の乾燥特性を示す図である。
【図３】5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸のカルシウム塩の特性を示す図である。
【図４】5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸のモノナトリウム塩の相対湿度条件の変化の下で変わり得る含水量を示す図である。
【図５】5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸のカルシウム塩の特性を示す図である。
【図６】200〜1800cm-1の波数範囲における実施例１による5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の結晶性モノナトリウム塩のFT-ラマンスペクトルの指紋領域を示す図である。
【図７】25℃／60％相対湿度での5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の結晶性モノナトリウム塩の長期安定性（%(w/w)）を示す図である。
【図８】25℃／60％相対湿度での5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の結晶性モノナトリウム塩の長期安定性（主要分解生成物[MeFox]）（%(w/w)）を示す図である。
【図９】40℃／75％相対湿度での5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の結晶性モノナトリウム塩の長期安定性（%(w/w)）を示す図である。
【図１０】40℃／75％相対湿度での5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の結晶性モノナトリウム塩の長期安定性（主要分解生成物[MeFox]）（%(w/w)）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
好ましくは、結晶性塩は、5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸とナトリウムとのモル比が1：0.75〜1：1.25（モル：モル）である。
【００１９】
さらに好ましい実施形態では、結晶性塩は、5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸とナトリウムとのモル比が約1：1（モル：モル）である。
【００２０】
好ましくは、本発明の結晶性塩は、5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸のナトリウム塩であり、少なくとも1つの特性ピーク（2θ±0.2° 2θ（ＣｕＫα放射線）で表したとき）が6.5、10.2、13.1、15.3、17.9、20.5および22.0にあるPXRDパターンを有する。
【００２１】
さらにより好ましくは、本発明の結晶性塩は、5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸のナトリウム塩であり、少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つ、最も好ましくは少なくとも４つ、好ましくは少なくとも５つ、より好ましくは少なくとも６つ、および最も好ましくは全ての特性ピーク（2θ±0.2°  2θ（ＣｕＫα放射線）で表したとき）が6.5、10.2、13.1、15.3、17.9、20.5および22.0にあるPXRDパターンを有する。 
【００２２】
さらにより好ましくは、本発明の結晶性塩は、5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸のナトリウム塩であり、少なくとも1つの特性ピーク（2θ±0.2°2θ（ＣｕＫα放射線）で表したとき）が6.5、10.2、12.5、13.1、14.8、15.1、15.3、16.1、17.2、17.9、20.4、20.5、21.2、22.0、22.5および27.2にあるPXRDパターンを有する。
【００２３】
好ましくは、本発明の結晶性塩は、5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸のナトリウム塩であり、少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つ、最も好ましくは少なくとも４つ、好ましくは少なくとも５つ、より好ましくは少なくとも６つ、および最も好ましくは全ての特性ピーク（2θ±0.2°2θ（ＣｕＫα放射線）で表したとき）が6.5、10.2、12.5、13.1、14.8、15.1、15.3、16.1、17.2、17.9、20.4、20.5、21.2、22.0、22.5および27.2にあるPXRDパターンを有し、および最も好ましくは実質的に図1に示すようなPXRDパターンを有する。
【００２４】
好ましくは、5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩は、5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の結晶性モノナトリウム塩である。
【００２５】
さらにより好ましくは、5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩の含水量は、5重量％未満、好ましくは3重量％未満、より好ましくは1重量％未満である。特に好ましくは5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩であり、より好ましくは5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の無水結晶性ナトリウム塩であり、最も好ましくは5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の無水結晶性モノナトリウム塩である。
【００２６】
本発明のさらなる態様は、少なくとも１つの特性ピーク（波数cm-1で表され、実験不確実性が±1〜2cm-1である）が3079、3036、2991、2962、2941、2927、2902、2852、1674、1608、1570、1527、1483、1466、1446、1415、1321、1302、1274、1243、1224、1193、1168、1059、1019、947、898、854、810、775、648、637、510、479、415、378、284、260および196cm-1にあるラマンスペクトルを有する5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩である。
【００２７】
本発明のさらに別の態様は、実質的に図６に示されるようなラマンスペクトルを示す5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩である。
【００２８】
本発明のさらなる態様は、本発明による5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩を得るための方法であって、
ａ）5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸を、任意に適当な溶媒または溶媒混合物中において準備する工程、
ｂ）工程ａ）の組成物に水酸化ナトリウムを添加する工程、
ｃ）任意に、溶媒、溶媒混合物および／または共塩形成剤を工程ｂ）の組成物に添加する、または工程ｂ）の組成物を溶媒、溶媒混合物および／または共塩形成剤に添加する工程、
ｄ）結晶化する工程、
ｅ）任意に、さらなる溶媒または溶媒混合物を添加する工程、および
ｆ）得られた固形物を単離する工程
を含む方法である。
【００２９】
好ましくは、工程b）における5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸と水酸化ナトリウムとのモル比は1：0.5〜1：1.5の範囲内であり、さらにより好ましくは0.9〜1.5である。
【００３０】
さらに好ましい態様において、工程ｃ）における5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸と共塩形成剤とのモル比は1：0.5〜1：3の範囲内であり、好ましくは1：0.9〜1：2.5の範囲内であり、より好ましくは約1：2である。
【００３１】
好ましくは、工程a）、c）および／またはe）による溶媒および／または溶媒混合物は、水、水溶性アルコール、メタノール、エタノール、イソプロパノール、n-プロパノール、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、ベンジルアルコールおよびそれらの混合物からなる群より選択される。
【００３２】
好ましくは、工程ｄ）および／またはｅ）における水と溶媒および／または溶媒混合物との比は、1：5v/v以下である。より好ましくは、工程ｄ）および／またはｅ）における水と溶媒および／または溶媒混合物との比は1：6v/v以下であり、さらにより好ましくは1：7v/v以下である。工程ｄ）および／またはe）における溶媒および／または溶媒混合物中のより高い含水量は、より低い結晶化収率をもたらす。
【００３３】
本明細書において用いられる共塩形成剤は、本発明による結晶性ナトリウム塩の形成を促進する化学物質である。本発明による共塩形成剤は、典型的には、プロセス溶媒に充分に可溶性であり、そのため、濾過工程で除去されるまたは濾過後に容易に洗い落とすことができる有機塩基である。
【００３４】
好ましくは、工程ｃ）における共塩形成剤は、6〜11のｐＫａ値を有する有機塩基であり、より好ましくは7〜10のｐＫａ値を有するものである。
【００３５】
さらに好ましい実施形態において、工程ｃ）の共塩形成剤は、4-(2-ヒドロキシエチル)-モルホリン、1-(2-ヒドロキシエチル)-ピロリジン、イミダゾール、２−ジメチルアミノエタノール、tert-ブチルアミンおよびそれらの混合物からなる群より選択される。
【００３６】
好ましい実施形態において、工程ｄ）における温度は、少なくとも30℃、好ましくは少なくとも40℃、より好ましくは少なくとも50℃、さらにより好ましくは少なくとも60℃、さらに好ましくは少なくとも70℃、最も好ましくは少なくとも75℃である。
【００３７】
好ましくは、工程ａ）、ｂ）、ｃ）および／またはｄ）において、種晶が添加される。さらにより好ましくは、種晶は5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の望ましいナトリウム塩である。
【００３８】
本発明のさらなる態様は、本発明の5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩および任意に1種以上の許容される賦形剤を含む医薬組成物、食品添加物、ビタミンおよび／または他の製剤であり、および、薬物および／または食品添加物の製造のための成分としての本発明による5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩の使用である。
【００３９】
ホモシステイン低下、貧血、神経管欠損、心臓血管疾患、うつ病、アルツハイマー病、認知障害および骨粗鬆症の治療において、および／または、低血漿および／または低赤血球葉酸および／または低脳脊髄液葉酸および／または低末梢もしくは中枢神経系葉酸の食事管理において使用するための、本発明の5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩も、本発明の一部である。
【００４０】
驚くべきことに、本発明の5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩は、米国特許第6,441,168号明細書に開示されている結晶性カルシウム塩と比較して改善された動的溶解度を有する。動的溶解度の測定は、実験の部で説明されているように行なった。
【００４１】
水中（室温）での本発明の5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩の溶解度は、水1mLあたり25mgよりも大きいが、カルシウム塩は水1mLあたり10mgよりかなり小さい溶解度を示す。
【００４２】
本発明のナトリウム塩のより高い溶解度のために、生物学的利用能がより優れている。これにより、薬剤または食品添加物の有効性を低下させることなく、活性成分の量を減らすことができる経口剤形が得られる。
【００４３】
さらに、動的蒸気収着分析（DVS）は、固体物質の吸湿特性および乾燥特性を調べるのに適した方法である。
【００４４】
本発明の5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩は、充分に乾燥させることができ、その結果、10時間の窒素パージ後、水を本質的に除去することができる（実施例８、図２）。それに対し、5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸のカルシウム塩は、依然として6〜7％の含水量を有する（実施例９、図３）。本発明の5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩は、より容易に乾燥させることができる。
【００４５】
また、本発明の5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩について、最もふさわしい相対湿度20％〜75％範囲内の含水量の変化は約1.7％である（実施例１０、図４）。5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸のカルシウム塩は、含水量の変化が約3.5％である（実施例１１、図５）。したがって、本発明の5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩は、吸湿性が低く、望ましい。
【００４６】
さらに、本発明の5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸のナトリウム塩の分子量は、米国特許第6,441,168 号明細書に開示されている5-メチルテトラヒドロ葉酸のカルシウム塩と比較して有意に低い。本発明の5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸のナトリウム塩を含む剤形は、等量の活性物質を含む5-メチルテトラヒドロ葉酸のカルシウム塩を含むものと比べて重量が小さい。したがって、例えば、より軽くて小さい錠剤を製造することができ、そのような錠剤はより容易に飲み込むことができるので、子供のような患者にとってより有利である。
【００４７】
本発明による医薬組成物は、すべての投与様式、好ましくは経口、非経口、筋肉内、脊髄内、髄腔内、歯周、局所または直腸投与に適用することができる。
【００４８】
要約すると、本発明の5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の結晶性ナトリウム塩によって提供される特性のプロファイルは、医薬品での使用または食品添加物としての使用に有利である。
【実施例】
【００４９】
Mythen 1K検出器を装備したStoe Stadi P；CuKα1放射線；標準測定条件：透過型；40kVおよび40mAの管出力；湾曲Geモノクロメーター；2θ刻み幅0.02°、ステップ時間48秒、2θスキャン範囲1.5〜50.5°；検出器モード：ステップスキャン；2θ検出器ステップ1°；標準的サンプル調製：サンプル10〜20mgを2つのアセテート箔の間に配置した；サンプルホルダー：Stoe透過型サンプルホルダー；測定中にサンプルを回転させた。すべてのサンプル調製と測定は、周囲空気雰囲気中で行った。
（ＴＧ−ＦＴＩＲ）
熱重量測定は、Bruker FTIR Spectrometer Vector 22に接続されたNetzsch Thermo-Microbalance TG 209を用いて行った（ピンホールを有するサンプル受け皿、N2雰囲気、加熱速度10K/分）。
（ＤＶＳ）
DVS測定は、典型的には、August-Nagel-Str. 23, 89079 Ulm（独国）在のProUmid（以前は「Projekt Messtechnik」）から得られるSPS11-100n「Sorptions Pruefsystem」を用いて25℃で行われる。サンプル約20mgをアルミニウム製サンプル受け皿に入れる。1時間あたり5％の湿度変化率とした。適用された測定プログラムを、図で可視化し（破線トレース）、以下に説明する。
【００５０】
サンプルを、微量天秤の最上部のアルミニウム製ホルダー上に置き、50％相対湿度で平衡化させてから、以下のような予め定められた湿度プログラムを開始した。
（1）相対湿度50％で2時間
（2）相対湿度50→0％(5%/時間）；相対湿度0％で10時間
（3）相対湿度0→75％(5%/時間）；相対湿度75％で5時間
（4）相対湿度75→0％(5%/時間）；相対湿度0％で10時間
（5）相対湿度0→50％(5%/時間）；相対湿度50％で2時間
（ラマン分光法）：
FT-ラマンスペクトルを、1064nmで動作する近赤外Nd：YAGレーザーと液体窒素冷却ゲルマニウム検出器とを備えたBruker MultiRAM FT-RamanまたはBruker RFS 100 FT-Ramanシステムに記録した。2cm-1の解像度での64回のスキャンを3500〜-50cm-1の範囲内に蓄積した。ただし、フィルターカットオフ効果のために、100cm-1を超えるデータのみを評価する。公称レーザー出力は典型的には100または300mWである。
【００５１】
実施例１
種晶を加えることなく共塩形成剤としてのイミダゾールを用いた5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の結晶性モノナトリウム塩の調製
5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸一水和物（分析：5-メチルテトラヒドロ葉酸97.65%(w/w)）467mgを秤量して、マグネティックスターラーバーを備えるガラスバイアルに入れた。1.00モル/Ｌの水酸化ナトリウム標準溶液1.0mLおよびイミダゾール76mgを添加した。周囲温度で、本質的に透明な溶液が得られ、それにエタノール7.0mLを加えた。エタノールの添加により、室温で濃厚な懸濁液が生じた。懸濁液を80℃に加熱し、2時間撹拌した後、固形物を、フリットガラスフィルター（多孔度P4）を用いて熱時濾過により分離し、室温で空気中で乾燥させた。フィルターケーキをエタノール10mLで洗浄し、空気中で約30分間乾燥させた。微細な僅かに黄色の粉末320mg（収率63％、分析：5-メチルテトラヒドロ葉酸89.38%(w/w)）が生成物として得られ、粉末X線回折（図１、表１）およびラマン分光法（図６、表２）により特徴付けた。ICP-OESで検出されたナトリウム含有量は4.49％で、これはモノナトリウム塩とよく一致している。HPLC分析は、97.4面積％の純度を示し、したがって、塩の同一性が確認された。
【００５２】
【表１−１】
2020512383.tif 000002
【００５３】
【表１−２】
2020512383.tif 000003
【００５４】
【表２−１】
2020512383.tif 000004
【００５５】
【表２−２】
2020512383.tif 000005
【００５６】
実施例２
共塩形成剤としての4-(2-ヒドロキシエチル)-モルホリンおよび種晶を用いるイソプロパノール中での5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の結晶性モノナトリウム塩の調製
5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸一水和物（分析：5-メチルテトラヒドロ葉酸97.65%(w/w)）467mgを秤量して、マグネティックスターラーバーを備えたガラスバイアルに入れた。1.00モル／Ｌの水酸化ナトリウム標準溶液1.0mLおよび4-(2-ヒドロキシエチル)-モルホリン140μLを加えた。周囲温度で、本質的に透明な溶液が得られ、そこにイソプロパノール7.0mLを加えた。イソプロパノールの添加により、室温で濃厚な懸濁液が生じた。懸濁液を80℃に加熱し、1時間撹拌した後、実施例１の5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸モノナトリウム塩の種晶を添加し、80℃での撹拌を1時間続けてから、固形物を、フリットガラスフィルター（多孔度P4）を用いる熱時濾過により分離し、室温で空気中で乾燥させた。フィルターケーキをイソプロパノール10mLで洗浄し、室温で空気中で約30分間乾燥させた。生成物として、微細でわずかに黄色の粉末413mgが得られた。粉末X線回折により、モノナトリウム塩の同一性が確認された。
【００５７】
実施例３
共塩形成剤としての4-(2-ヒドロキシエチル)-モルホリンおよび種晶を用いる5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の結晶性モノナトリウム塩の調製
5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸一水和物（分析：5-メチルテトラヒドロ葉酸97.65%(w/w)）4.694gを秤量して、マグネティックスターラーバーを備えた100mLガラスフラスコに入れた。1.00モル／Ｌの水酸化ナトリウム標準溶液10.00mLおよび4-(2-ヒドロキシエチル)-モルホリン1.470mLを加えた。室温で10分間撹拌した後、茶色の透明な溶液が形成された。室温で溶液を攪拌しながら、エタノール50mLを加えた。6分間攪拌した後、濁った溶液が存在した。混合物に、実施例1の結晶MTHFモノナトリウム塩56mgを播種し、室温で5分間攪拌した後、濃厚な懸濁液が形成され、これはもはやマグネティックスターラーバーを用いて撹拌することができなかった。したがって、混合物を約6分以内、80℃に加熱すると、攪拌しやすい薄茶色の懸濁液が形成された。このサンプルに、結晶性MTHFモノNa塩36mgを再び播種した。80℃で6分間攪拌した後、黄色の懸濁液が存在し、いくらかのオフホワイト固体物質がガラス壁に付着していた。懸濁液を80℃で75分間撹拌した後、エタノール20mLを黄色の懸濁液に加え、撹拌を70分間続けた後、フリットガラスフィルター（多孔度P4、φ5cm）を用いる熱時濾過により固体生成物を濾去し、フィルターケーキを約2分間空気中で乾燥した。エタノール-水混合物（7：1（v/v））16mLをフィルターケーキに加え、洗浄液を真空吸引によりフィルターを通した。同じエタノール-水混合物をさらに16mL用いて、洗浄工程を繰り返した。次に、フィルターケーキを20分間空気中で乾燥させた（空気をフリットガラスフィルターを通した；24℃、相対湿度41％）。約10分後、フィルターケーキを小さな破片に砕き、スパチュラを使用して塊をわずかに粉砕した。20分後、固体材料を40mLガラス瓶に移した。微細でわずかに黄色の粉末4.36グラム（収率約86％、分析：5-メチルテトラヒドロ葉酸89.94%(w/w)）が固体生成物として得られ、粉末X線回折、H-NMR分光法およびTG-FTIRによって特徴付けた。光学顕微鏡検査とPXRDにより、サンプルの結晶性が確認され、H-NMR分光法は5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の化学的完全性と一致し、有意な量の4-(2-ヒドロキシエチル)-モルホリンは示されなかった。TG-FTIRによるさらなる検査により、水に起因する約1.6％の質量損失が明らかになった。ICP-OESで検出されたナトリウム含有量は4.59％であり、これはモノナトリウム塩とよく一致している。HPLCは純度97.4％を示した。
【００５８】
実施例４
共塩形成剤としての4-(2-ヒドロキシエチル)-モルホリンおよび種晶を用いる5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の結晶性モノナトリウム塩の調製
実験の最初の工程は、より大きなガラス製反応器における結晶性MTHF遊離酸の種晶を防ぐために、別のバイアルで実行された。
【００５９】
5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸一水和物（分析：5-メチルテトラヒドロ葉酸97.65%(w/w)）9.3888グラムを秤量して、マグネティックスターラーバーを備えた60mLガラス容器に入れた。1.00モル／Ｌの水酸化ナトリウム標準溶液20.00mLおよび4-(2-ヒドロキシエチル)-モルホリン2.940mLを加えた。室温で約15分間撹拌した後、茶色の透明な溶液が形成され、pHは約6.9であった。この溶液を350mLガラス製反応器に移し、パドルスターラーで撹拌した。乾燥窒素流を使用して気相をパージし、混合物を約20分以内、80℃に加熱した。80℃では、溶液が依然として存在し、約6分以内にエタノール20mLを添加した後、実施例１による結晶性MTHFモノナトリウム塩7mgを種晶として添加した。約13分以内に、撹拌（約340rpm）しながらさらにエタノール50mLを加えた。エタノールの添加中に、同じ種晶5mg〜7mgを用いて溶液に数回播種したが、懸濁液ではなく濁った溶液が観察された。約85分以内に、撹拌しながらさらにエタノール80mL（合計150mL）を加えた。エタノールの添加中、同じ播種晶を毎回3mg〜9mgを用いて、播種を数回行った。しかし、目視観察により、システムは、反応器のガラス壁にわずかに茶色の物質が付着しているエマルジョンと判断された。次いで、混合物を80℃で10分間撹拌し、スパチュラを使用してガラス壁から少量の薄茶色の材料をこすり落とした。時間が経つにつれて、弱い懸濁液が形成された。攪拌しながら、ガラス壁に付着したいくつかの材料を、スパチュラを使用してガラス壁からこすり落とすことにより再分散させた。80℃、500rpmで約2.5時間攪拌した後、攪拌しやすい黄色い懸濁液が形成されたが、それでも比較的小さな茶色の塊が含まれていた。フリットガラスフィルター（多孔度P4、φ5cm）を使用して熱時濾過を行い、フィルターケーキを約2分間空気中で乾燥した。ガラス製反応器を、フィルターケーキに加えたエタノール-水混合物（7：1（v/v））30mLで2回洗浄し、洗浄溶液を真空吸引によりフィルターを通した。次に、同じエタノール-水混合物30mLを用いてフィルターケーキを3回洗浄した。次に、フィルターケーキを30分間空気中で乾燥させた（空気をフリットガラスフィルターに通した；23℃、相対湿度59％）。約7分後、フィルターケーキを小さな破片に砕き、スパチュラを使用して塊をわずかに粉砕した。30分後、固体生成物（8.28グラム）を60mLガラス容器に移し、PXRDによる分析のためにサンプルを取り出し、結晶性MTHFモノNa塩の存在を確認した。残った固体物質を80℃／約10ミリバールで0.5時間真空乾燥した。固体生成物は、微細なわずかに黄色の粉末8.05g（収率約78％、分析：5-メチルテトラヒドロ葉酸89.12%(w/w)）であった。PXRDによる特性評価では、乾燥しても結晶形が変化しないことが示された。H-NMR分光法により、5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の化学的完全性が確認され、有意な量の4-(2-ヒドロキシエチル)-モルホリンは示されなかった。サンプルをさらにTG-FTIRおよびHPLCで調べた。HPLCは純度96.5％を示した。
【００６０】
実施例５
共塩形成剤としての2-ジエチルアミノエタノールおよび種晶を用いるエタノール中での5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の結晶性モノナトリウム塩の調製
5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸一水和物（分析：5-メチルテトラヒドロ葉酸97.65%(w/w)）467mgを秤量して、マグネティックスターラーバーを備えたガラスバイアルに入れた。1.00M水酸化ナトリウム標準溶液1.0mL、エタノール5.0mLおよび2-ジエチルアミノエタノール100μlを加えた。混合物を撹拌しながら80℃に加熱し、次いで実施例１の5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸モノナトリウム塩の種晶を加え、80℃での撹拌を1時間続けてから、固形物を、フリットガラスフィルター（多孔度P4）を用いる熱時濾過により分離し、室温で空気中で乾燥する。固体生成物370mg（収率55％、分析：5-メチルテトラヒドロ葉酸68.2%(w/w)）が得られ、粉末X線回折およびHPLCにより特性付けした。HPLCは純度93.7％を示した。
【００６１】
実施例６
5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の結晶性モノナトリウム塩の動的溶解度
工程１：
結晶性5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸モノナトリウム塩23.8mgを秤量して、スクリューキャップ付きの7mLガラスバイアルに入れる。精製／脱イオン水（例えば、クロマトグラフィー用水）2.38mLを、調整可能な容量ピペットを用いて固形物に加える。混合物を室温で激しく攪拌し、短時間超音波処理すると、透明なわずかに黄色の溶液が容易に得られる。すなわち、溶解度は水1mLあたり10mgを超える。溶液は、室温で20時間以上透明のままである。
【００６２】
工程２：
結晶性モノナトリウム塩62.3mgを秤量して、スクリューキャップ付きの7mLガラスバイアルに入れる。精製／脱イオン水（例えば、クロマトグラフィー用水）4.15mLを調整可能な容量ピペットを用いて固形物に加える。混合物を室温で激しく攪拌し、短時間超音波処理すると、透明なわずかに黄色の溶液が容易に得られる。すなわち、溶解度は水1mLあたり15mgを超える。溶液は、室温で数時間透明のままである。
【００６３】
工程３：
結晶性MTHFモノナトリウム塩72.6mgを秤量して、スクリューキャップ付きの7mLガラスバイアルに入れる。精製／脱イオン水（たとえば、クロマトグラフィー用水）2.9mLを調整可能な容量ピペットを用いて固形物に加える。混合物を室温で激しく攪拌し、短時間超音波処理すると、透明なわずかに黄色の溶液が容易に得られる。すなわち、溶解度は水1mLあたり25mgを超える。溶液は、室温で約1時間透明のままである。
【００６４】
参考例７
5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸のカルシウム塩の動的溶解度
MTHFの結晶性カルシウム塩27.9mg（約11％の水を含むため、約25mgの乾燥重量に相当）をスクリューキャップ付きの4mLガラスバイアルに量り入れる。精製／脱イオン水（例えば、クロマトグラフィー用水）2.535mLを調整可能な容量ピペットを用いて固形物に加える。混合物を室温で激しく攪拌し、短時間超音波処理する。透明な溶液を得ることはできず、かなり濃縮された懸濁液が持続する。すなわち、溶解度は水1mLあたり10mgよりかなり小さい。
【００６５】
実施例８
5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の結晶モノナトリウム塩の乾燥時の特性
前述の少なくとも1つの実施例による結晶性モノナトリウム塩のサンプルを、赤外線分光法（TG-FTIR）と組み合わせた熱重量分析によって調べる。熱重量測定は、サンプル質量約6mgで行った。200℃での質量損失は約1.3％であり、これは室温で空気中で乾燥した後の結晶性モノナトリウム塩の含水量に実質的に相当する。ここでは、同じサンプルを動的蒸気収着分析（DVS）によって調べる。サンプル約20mgをアルミニウム製サンプル受け皿に入れる。1時間あたり5％の湿度変化率とした。適用された測定プログラムを、図において視覚化し（破線トレース）、以下に説明する。プレゼンテーションは、TG-FTIRの結果に基づいて補正した有効含水量を示す。サンプルを微量天秤の最上部のアルミニウム製ホルダー上に置き、50％相対湿度で平衡化させてから、以下のような予め定められた湿度プログラムを開始した。
（1）相対湿度50％で2時間
（2）相対湿度50→0％(5%/時間）；相対湿度0％で10時間
（3）相対湿度0→75％(5%/時間）；相対湿度75％で5時間
（4）相対湿度75→0％(5%/時間）；相対湿度0％で10時間
（5）相対湿度0→50％(5%/時間）；相対湿度50％で2時間
図２に示す結果は、室温で10時間窒素パージした後、サンプルのすべての水が実質的に除去されることを示している。
【００６６】
参考例９
5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸のカルシウム塩の乾燥
MTHFの結晶性カルシウム塩のサンプルをカールフィッシャー滴定で調べて、含水量を評価する。含水量は12.4％であると分かる。その後、そのサンプルを、前述の実施例のモノナトリウム塩と全く同じ測定プログラムに従って、DVSにより調べる。図３に示す結果では、室温で窒素下で10時間乾燥した後でも、含水量は依然として6〜7％のオーダーであり、これは同じ条件下で半分未満の水しか除去できないことを意味している。
【００６７】
実施例１０
相対湿度を変化させた条件下における5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の結晶性モノナトリウム塩の含水量
前述の少なくとも1つの実施例によるMTHFの結晶性モノナトリウム塩のサンプルを、赤外線分光法（TG-FTIR）と組み合わせた熱重量分析によって調べる。熱重量測定は、サンプル質量約6mgで行った。200℃での質量損失は約1.3％であり、これは室温で空気中で乾燥した後の結晶性モノナトリウム塩の含水量に実質的に相当する。ここでは、同じサンプルを動的蒸気収着分析（DVS）により調べる。サンプル約20mgをアルミニウム製サンプル受け皿に入れる。1時間あたり5％の湿度変化率とした。該当する場合、適用された測定プログラムを、図において視覚化し（破線トレース）、以下に説明する。プレゼンテーションは、TG-FTIRの結果に基づいて補正した有効含水量を示している。サンプルを微量天秤の最上部のアルミニウムまたは白金ホルダー上に置き、50％相対湿度で平衡化させた後に、以下のような予め定められた湿度プログラムを開始した。
（1）相対湿度50％で2時間
（2）相対湿度50→0％(5%/時間）；相対湿度0％で10時間
（3）相対湿度0→75％(5%/時間）；相対湿度75％で5時間
（4）相対湿度75→0％(5%/時間）；相対湿度0％で10時間
（5）相対湿度0→50％(5%/時間）；相対湿度50％で2時間
図４に示す結果は、最も関連のある相対湿度20％〜75％範囲内の含水量の変化が約1.7％であることを示している。
【００６８】
参考例１１
相対湿度を変化させた条件下における5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸のカルシウム塩の含水量
MTHFの結晶性カルシウム塩のサンプルを、DVS装置において全く同じ相対湿度プログラムに付する。図５に示す結果は、最も関連のある相対湿度20％〜75％範囲内の含水量の変化が約3.5％であることを示している。
【００６９】
実施例１２
共塩形成剤として２当量の4-(2-ヒドロキシエチル)-モルホリンを用いる5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の結晶性モノナトリウム塩の調製
5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸（分析：5-メチルテトラヒドロ葉酸95.4%(w/w)）40gと水86gとの混合物に、固体水酸化ナトリウム3.46gおよび4-(2-ヒドロキシエチル)-モルホリン21.79gを撹拌しながら窒素雰囲気下、室温で加えた。この混合物を、5.5時間以内に、5%(v/v)2-プロパノールを含むエタノール472gと5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の結晶性モノナトリウム塩0.4gとの混合物に、撹拌しながら窒素雰囲気下に、75〜78℃で加えた。水3gを加え、混合物を76℃でさらに1時間撹拌した。固形物を濾過により分離し、各133mLのエタノール5% 2-プロパノール／水（7：1(v/v)）で3回洗い、40℃で16.5時間真空乾燥して、収率102％に相当するオフホワイト粉末42.0gを得た（分析：5-メチルテトラヒドロ葉酸92.45%(w/w)）。PXRDは、サンプルの結晶性を確認し、H-NMR分光法は5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の化学的完全性と一致し、有意な量の4-(2-ヒドロキシエチル)-モルホリンは示さなかった。TGA（熱重量分析）によるさらなる検査により、約0.86％の質量損失が明らかになった。IC（イオンクロマトグラフィー）で検出されたナトリウム含有量は4.94％で、これはモノナトリウム塩とよく一致している。HPLCは、純度98.2%を示した。
【００７０】
実施例１３
1当量の4-(2-ヒドロキシエチル)-モルホリンの存在下に5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸結晶性モノナトリウム塩を再結晶することによる、純度98.6％での5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸結晶性モノナトリウム塩の調製
5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸（分析：5-メチルテトラヒドロ葉酸92.63%(w/w)）の結晶性モノナトリウム塩2gを、窒素雰囲気下に、水10gと4-(2-ヒドロキシエチル)-モルホリン0.51gとの混合物に加えた。25℃で10分間撹拌した後、その混合物を、5%(v/v)2-プロパノールを含むエタノール70mLと5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の結晶性モノナトリウム塩0.05gとの混合物に、2.5時間以内に、撹拌しながら窒素雰囲気下、72℃で加えた。混合物を72℃でさらに2.5時間撹拌した。固形物を濾過により分離し、20mLのエタノール5% 2-プロパノール／水（7：1(v/v)）で洗い、33℃で18時間真空乾燥して、収率87％に相当するオフホワイト粉末1.75gを得た（分析：5-メチルテトラヒドロ葉酸92.5%(w/w)）。PXRDはサンプルの結晶性を確認し、H-NMR分光法は5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の化学的完全性と一致し、有意な量の4-(2-ヒドロキシエチル)-モルホリンは示さなかった。TGA（熱重量分析）によるさらなる検査により、約1.48％の質量損失が明らかになった。IC（イオンクロマトグラフィー）で検出されたナトリウム含有量は4.83％で、これはモノナトリウム塩とよく一致している。HPLCは純度98.6%を示した。
【００７１】
実施例１４
5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸、ナトリウムおよび4-(2-ヒドロキシエチル)-モルホリンの結晶性1：1：1塩から出発する5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の結晶性モノナトリウム塩の調製
5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸、ナトリウムおよび4-(2-ヒドロキシエチル)-モルホリンの1：1：1塩（分析：5-メチルテトラヒドロ葉酸70.60%(w/w)）5gを、窒素雰囲気下、エタノール5%(v/v)2-プロパノール49.4gと水12.5gとの混合物中に懸濁させた。混合物を74℃で3時間撹拌した。固形物を濾過により分離し、エタノール／水（7：1(v/v)）の混合物17mLで洗浄した。固形物を真空中40℃で乾燥させて、収率78%に相当するオフホワイト粉末2.93gを得た（分析：5-メチルテトラヒドロ葉酸93.65%(w/w)）。PXRDはサンプルの結晶性を確認し、H-NMR分光法は5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の化学的完全性と一致し、有意な量の4-(2-ヒドロキシエチル)-モルホリンは示されなかった。TGA（熱重量分析）によるさらなる検査により、約0.30％の質量損失が明らかになった。IC（イオンクロマトグラフィー）で検出されたナトリウム含有量は4.56％であり、これはモノナトリウム塩とよく一致している。HPLCは純度99.02％を示した。
【００７２】
実施例１５
5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の結晶性モノナトリウム塩の大規模調製
特に記載がない限り、すべての操作は窒素雰囲気下で行われた。反応および結晶化容器内の溶媒は、加熱中に濃縮された。
【００７３】
4-(2-ヒドロキシエチル)-モルホリン9.6kgを、撹拌しながら室温で反応容器内の水／エタノール(5% 2-プロパノール)（1：1(v/v)）混合物101.7kgに加えた。さらに、水／エタノール(5% 2-プロパノール）（1：1(v/v)）1.0kgを加え、続いて、撹拌しながら5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸（分析：5-メチルテトラヒドロ葉酸97.17%(w/w)）28.8kgを加えた。水／エタノール(5% 2-プロパノール)（1：1(v/v)）混合物2kgを追加した。次に、水酸化ナトリウム水溶液（分析：水酸化ナトリウム29.22%(w/w)）8.7kgを反応容器に加え、続いて、水／エタノール(5% 2-プロパノール)（1：1(v/v)）混合物1kgを加えた。混合物を38℃に加熱し、得られた溶液のpHは7.56であった。溶液を反応容器からフィルターを通して結晶化容器に移した。移送パイプとフィルターを水／エタノール(5% 2-プロパノール)（1：1(v/v)）混合物9.8kgで洗浄した。洗浄液を濾液に加えた。濾液を撹拌しながら75.1℃に加熱し、59分以内に温度を75.1〜80.4℃に維持しながらエタノール(5% 2-プロパノール）53.8kgを加えた。混合物を64.8℃に冷却し、5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸結晶性モノナトリウム塩0.29kgを播種のために添加した。混合物を再び74.5℃に加熱し、温度を70〜80℃に維持しながら3時間以内にエタノール(5% 2-プロパノール）286.2kgを加えた。混合物を71℃に冷却し、温度を65〜75℃に保ちながら13時間37分撹拌した。次いで、混合物を59.9℃に冷却し、結晶を遠心分離により分離した。遠心分離機上の結晶を、エタノール(5% 2-プロパノール）38.0kgと水6.9kgとの混合物で結晶化容器を介して、および、直接、CIP（所定場所でクリーニング）パイプを介して、エタノール(5% 2-プロパノール）38.1kgと水6.9kgとの混合物、続いて、エタノール(5% 2-プロパノール）43.8kgで洗った。遠心分離による洗浄液の分離後、結晶を乾燥機に移し、500L／分の窒素流を使用して、真空（101mbar）下に50℃で12時間7分乾燥させた。サンプルを取り出し、残留溶媒の含有量を測定した。サンプルの含水量は0.49%(w/w)であり、エタノール含有量は0.04%(w/w)であった。2-プロパノールは検出されなかった。5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸結晶性モノナトリウム塩（分析：5-メチルテトラヒドロ葉酸97.9%(w/w)）22.98kgが乾燥機から取り出され、これは分析補正収率75.9％に相当していた。
【００７４】
実施例１６
5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の結晶性モノナトリウム塩の溶解度
水中の5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸結晶性モノナトリウム塩の溶解度は、フラスコの底部において常に過剰の固体材料を維持しつつ、水中の5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の結晶性モノナトリウム塩の懸濁液を撹拌した後に上澄み液中の5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の濃度を決めることにより測定した。
【００７５】
5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の結晶性モノナトリウム塩の室温での水への溶解度は9.3mg/mL（5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸のカルシウム塩の9.6mg/mLに相当）であった。
【００７６】
同じ条件下で測定された水中における5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸結晶性カルシウム塩の溶解度は7.1mg/mLであった。
【００７７】
参考例１７
5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸のアモルファスモノナトリウム塩の調製
5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸結晶性モノナトリウム塩6.0gを室温で水600gに加えた。吸引濾過により固形物を除去した。濾液を液体窒素を用いた浴で凍結させ、0.07mbarの真空で凍結乾燥した。2日後、真空を窒素ガスに置き換えた。5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸アモルファスモノナトリウム塩6.0gが得られ、純度が面積95.2％、含水量が8.8%(w/w)、分析ナトリウムが4.5%(w/w)であった。
【００７８】
実施例１８
5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の結晶性モノナトリウム塩の安定性
本発明の化合物である5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の結晶性モノナトリウム塩の長期安定性を、EP 1 044 975 B1に従って調製される5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の結晶性カルシウム塩の長期安定性と比較するために、種々の温度および湿度でそれぞれの安定性データを得た。
【００７９】
(a)25℃／60％相対湿度での5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の結晶性モノナトリウム塩の安定性
文献の手順（EP 1 044 975 B1）に従って調製された5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の結晶性カルシウム塩および実施例１５に開示のように調製された5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の結晶性モノナトリウム塩を、25℃／60％相対湿度で貯蔵した。サンプル中に残っている5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の含有量は、HPLCにより周期的間隔で測定した（%(w/w)）。結果を、表３ａおよび図７に示す。残っている5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の含有量を、調製時の初期値とも比較した（相対%）。結果を表３ｂに示す。さらに、主要な分解生成物である４α-ヒドロキシ-5-メチル-THF（MeFox）のピラジノ-s-トリアジン誘導体の含有量を、HPLCにより周期的間隔で測定し、絶対値として開示した（%(w/w)）。結果を表４および図８に示す。
【００８０】
【表３ａ】
2020512383.tif 000006
【００８１】
【表３ｂ】
2020512383.tif 000007
【００８２】
【表４】
2020512383.tif 000008
【００８３】
(b)40℃／75％相対湿度での5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の結晶性モノナトリウム塩の安定性
文献の手順（EP 1 044 975 B1）に従って調製された5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の結晶性カルシウム塩および実施例１５に開示のように調製された5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の結晶性モノナトリウム塩を、40℃／75%相対湿度で貯蔵した。サンプル中に残っている5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の含有量を、HPLCにより周期的間隔で測定した（%(w/w)）。結果を表５ａおよび図９に示す。残っている5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の含有量を、調製時の初期値とも比較した（相対%）。結果を表５ｂに示す。さらに、主要な分解生成物である４α-ヒドロキシ-5-メチル-THF（MeFox）のピラジノ-s-トリアジン誘導体の含有量を、HPLCにより周期的間隔で測定し、絶対値とした開示した（%(w/w)）。結果を表６および図１０に示す。
【００８４】
【表５ａ】
2020512383.tif 000009
【００８５】
【表５ｂ】
2020512383.tif 000010
【００８６】
【表６】
2020512383.tif 000011
【００８７】
本発明に開示のような5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の結晶性モノナトリウム塩の安定性データを有する表３〜６は、以下のことを明らかに示している。
【００８８】
ｉ）5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の結晶性カルシウム塩と比較して5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の結晶性モノナトリウム塩には顕著な安定性の相違がある。
【００８９】
ｉｉ）5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の結晶性モノナトリウム塩は、5-メチル-(6S)-テトラヒドロ葉酸の結晶性カルシウム塩よりも長期間に渡って著しく安定である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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