(57)【要約】  本発明は、患者における形質細胞新生物の進行の指標として、循環する細胞および／または細胞外小胞を用いて、癌を予後診断（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）および監視する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
形質細胞新生物を有するか、または、形質細胞新生物を有することが疑われる、患者の予後診断（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）のための方法であって、細胞外小胞を含むサンプルを前記患者から単離すること、および、ＣＤ１３８−およびＰ−糖タンパク質＋（ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋）である細胞外小胞のレベルを判定することを含む方法。
【請求項２】
形質細胞新生物を有するか、または、形質細胞新生物を有することが疑われる患者の予後診断（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）のための方法であって、細胞を含むサンプルを前記患者から単離すること、および、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞のレベルを判定することを含む方法。
【請求項３】
形質細胞新生物を有するか、または、形質細胞新生物を有することが疑われる、患者の予後診断（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）のための方法であって、細胞および細胞外小胞を含むサンプルを前記患者から単離すること、および、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞および細胞外小胞のレベルを判定することを含む方法。
【請求項４】
形質細胞新生物を有するか、または、形質細胞新生物を有することが疑われる患者の予後診断（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）のための方法であって、細胞および／または細胞外小胞を含むサンプルを前記患者から単離すること、および、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞および／または細胞外小胞のレベルを判定することを含む方法。
【請求項５】
前記形質細胞新生物は、骨髄腫である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記形質細胞新生物が、多発性骨髄腫である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記サンプルが、血液由来サンプルである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記サンプルが、血漿サンプルである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記サンプルが、血小板を含まない血漿サンプルである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞および／または細胞外小胞が、ＣＤ４１ａ−でもある、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記サンプルが、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞および／または細胞外小胞を、形質細胞新生物を有しないかまたは寛解性の形質細胞新生物を有する対象の示す参照対照指標よりも高いレベルで含むとき、前記新生物が安定、進行性または難治性であるという予後（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）が判定される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記サンプルが、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞および／または細胞外小胞を、安定な形質細胞新生物を有する対象の参照対照指標よりも高いレベルで含むとき、前記新生物が進行性または難治性であるという予後（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）が判定される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記サンプルが、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞および／または細胞外小胞を、進行性の形質細胞新生物を有する対象の参照対照指標よりも高いレベルで含むとき、前記新生物が難治性であるという予後（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）が判定される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞および／または細胞外小胞が、ＣＤ３４＋でもある、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記サンプルが、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋である細胞および／または細胞外小胞を、形質細胞新生物を有しないかまたは寛解性の形質細胞新生物を有する対象の参照対照指標よりも高いレベルで含むとき、前記新生物が安定、進行性または難治性であるという予後（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）が判定される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記サンプルが、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋である細胞および／または細胞外小胞を、安定な形質細胞新生物を有する対象の参照対照指標よりも高いレベルで含むとき、前記新生物が進行性または難治性であるという予後（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）が判定される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記サンプルが、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋である細胞および／または細胞外小胞を、進行性の形質細胞新生物を有する対象の参照対照指標よりも高いレベルで含むとき、前記新生物が難治性であるという予後（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）が判定される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞および／または細胞外小胞が、ホスファチジルセリン＋（ＰＳ＋）でもある、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記サンプルが、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋／ＰＳ＋である細胞および／または細胞外小胞を、形質細胞新生物または寛解性の形質細胞新生物を有しない対象の参照対照指標よりも高いレベルで含むとき、前記新生物が安定、進行性または難治性であるという予後（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）が判定される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記サンプルが、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋／ＰＳ＋である細胞および／または細胞外小胞を、安定な形質細胞新生物を有する対象の参照対照指標よりも高いレベルで含むとき、前記新生物が進行性または難治性であるという予後が判定される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記サンプルが、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋／ＰＳ＋である細胞および／または細胞外小胞を、進行性の形質細胞新生物を有する対象の参照対照指標よりも高いレベルで含むとき、前記新生物が難治性であるという予後が判定される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
形質細胞新生物を有するかまたは形質細胞新生物を有することが疑われる患者の進行を監視するための方法であって、少なくとも、２つの時点において、細胞外小胞を含むサンプルを前記患者から単離すること、および、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞外小胞のレベルの変化を判定することを含む方法。
【請求項２３】
形質細胞新生物を有するかまたは形質細胞新生物を有することが疑われる患者の進行を監視するための方法であって、少なくとも、２つの時点において、細胞を含むサンプルを前記患者から単離すること、および、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞のレベルの変化を判定することを含む方法。
【請求項２４】
形質細胞新生物を有するかまたは形質細胞新生物を有することが疑われる患者の進行を監視するための方法であって、少なくとも、２つの時点において、細胞および／または細胞外小胞を含むサンプルを前記患者から単離すること、および、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞および／または細胞外小胞のレベルの変化を判定することを含む方法。
【請求項２５】
ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞および／または細胞外小胞の前記レベルがその後の時点間で増加するとき、前記新生物の重症度が増加する予後（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ））が判定される、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞および／または細胞外小胞の前記レベルがその後の時点間で減少するとき、前記新生物の重症度が減少している予後が判定される、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記形質細胞新生物が、骨髄腫である、請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記形質細胞新生物が、多発性骨髄腫である、請求項２２〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記サンプルが、血液由来サンプルである、請求項２２〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記サンプルが、血漿サンプルである、請求項２２〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記サンプルが、血小板を含まない血漿サンプルである、請求項２２〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞および／または細胞外小胞が、ＣＤ４１ａ−でもある、請求項２２〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞および／または細胞外小胞が、ＣＤ３４＋でもある、請求項２２〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞および／または細胞外小胞が、ホスファチジルセリン＋（ＰＳ＋）でもある、請求項２２〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記サンプルが細胞を含むとき、前記サンプルは、骨髄において生成される細胞を含む、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記サンプルが細胞を含むとき、前記サンプルが、造血幹細胞である細胞を含む、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記サンプルが細胞を含むとき、前記サンプルは、造血幹細胞に起源をもつ細胞を含む、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記サンプルが細胞を含むとき、前記サンプルが、骨髄系前駆細胞である細胞を含む、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記サンプルが細胞を含むとき、前記サンプルが、骨髄系前駆細胞に起源をもつ細胞を含む、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記サンプルが細胞を含むとき、前記サンプルが、リンパ系前駆細胞である細胞を含む、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記サンプルが細胞を含むとき、前記サンプルが、リンパ系前駆細胞に起源をもつ細胞を含む、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記サンプルが細胞を含むとき、前記サンプルが、Ｂリンパ球細胞に起源をもつ細胞を含む、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記サンプルが細胞を含むとき、前記サンプルが、形質様細胞である細胞を含む、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記サンプルが細胞を含むとき、前記サンプルが、新生物細胞である細胞を含む、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記サンプルが細胞を含むとき、前記サンプルが、多発性骨髄腫細胞である細胞を含む、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記サンプルが細胞外小胞を含むとき、前記サンプルが、骨髄において生成される細胞に由来する細胞外小胞を含む、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記サンプルが細胞外小胞を含むとき、前記サンプルが、造血幹細胞である細胞に由来する細胞外小胞を含む、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記サンプルが細胞外小胞を含むとき、前記サンプルが、造血幹細胞に起源をもつ細胞に由来する細胞外小胞を含む、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記サンプルが細胞外小胞を含むとき、前記サンプルが、骨髄系前駆細胞である細胞に由来する細胞外小胞を含む、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記サンプルが細胞外小胞を含むとき、前記サンプルが、骨髄系前駆細胞に起源をもつ細胞に由来する細胞外小胞を含む、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記サンプルが細胞外小胞を含むとき、前記サンプルが、リンパ系前駆細胞である細胞に由来する細胞外小胞を含む、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記サンプルが細胞外小胞を含むとき、前記サンプルが、リンパ系前駆細胞に起源をもつ細胞に由来する細胞外小胞を含む、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記サンプルが細胞外小胞を含むとき、前記サンプルが、Ｂリンパ球細胞に起源をもつ細胞に由来する細胞外小胞を含む、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記サンプルが細胞外小胞を含むとき、前記サンプルが、形質様細胞に由来する細胞外小胞を含む、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記サンプルが細胞外小胞を含むとき、前記サンプルが、新生物細胞に由来する細胞外小胞を含む、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記サンプルが細胞外小胞を含むとき、前記サンプルが、多発性骨髄腫細胞に由来する細胞外小胞を含む、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記サンプルが細胞外小胞を含むとき、前記サンプルが、エキソソームである細胞外小胞を含む、請求項１〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記サンプルが細胞外小胞を含むとき、前記サンプルが、微小粒子である細胞外小胞を含む、請求項１〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記サンプルが細胞外小胞を含むとき、前記サンプルが、オンコソームである細胞外小胞を含む、請求項１〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記サンプルが細胞外小胞を含むとき、前記サンプルが、大型オンコソームである細胞外小胞を含む、請求項１〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記サンプルが細胞外小胞を含むとき、前記サンプルが、ミグラソームである細胞外小胞を含む、請求項１〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌を予後診断（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）および監視する方法に関する。
特に、本発明は、患者における形質細胞新生物の進行の指標としての循環細胞および／または細胞外小胞の使用を検討する。
本発明は、形質細胞新生物の進行の指標としての患者における特定のバイオマーカー特性を含む、微小粒子およびエキソソームを含む細胞外小胞のレベルを判定することにさらに関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書全体を通した先行技術についての任意の考察は、かかる先行技術が周知されているか、または当技術分野における共通の一般的知識の一部を形成することの承認として決して見なされるべきではない。
【０００３】
癌からの生存率は、癌の侵襲性、有効な抗癌療法の存在および癌が１つ以上の抗癌療法に対する耐性を発現するか否かに密接に関連する。
【０００４】
一部の癌は、１つ以上の抗癌療法に対して耐性を示すようになり、これは、数日または数週間にわたり急速に発生し得る。
さらに、癌は、活動状態と非活動状態との間を急速に移行し、進行し得る。
癌を監視する現行の方法の多くは、非活動性癌が活動性癌になっているか否かを判定すること、または抗癌療法に対する耐性を検出することができず、やがて、癌は、既に治療に対して進行性または難治性になっている。
したがって、癌の進行および抗癌療法に対する耐性の出現を監視できることで、癌が有意に進行する前に治療が適応可能であれば有利であろう。
【０００５】
癌の進行を監視する方法が侵襲性であり、患者が不便を被り且つ疼痛試験を受けることなく、必要に応じて定期的に実施できないことは、多くの癌に共通する。
さらに、それらの試験自体が面倒であり、高価であり、且つ時間がかかりうる。
したがって、癌を監視する方法は、癌が活動状態と非活動状態との間を移行することから、遅れを伴うことが多く、適切な治療薬の投与も遅れることから、これは、患者の全生存にとって有害であり得る。
たとえば、治療の変更が可能であるように、患者の癌が小康状態から進行性に向けて移行しているか否かをできるだけ早く判定することができれば、多大な利益が得られるであろう。
【０００６】
患者にとって迅速であり、便利であり、且つ比較的痛みのない通常の検査方法を用いてかかる判定を行う一方、さらに患者とヘルスケアシステムとの両方に大きい財政的負担を課さないことができれば、さらに多大な利益が得られるであろう。
効果に対する流れとして、患者がかかる検査に同意する意向が高まり、それにより癌のより精密な監視およびより良好な長期的転帰が可能になるであろう。
【０００７】
形質細胞新生物は、異常な形質細胞の過剰な生成によって特徴付けられる血液学的疾患の一クラスであり、その多くは、癌性がある。
形質細胞新生物の一形態は、骨髄腫、特に多発性骨髄腫であり、これは、異常な形質細胞が骨髄において腫瘍を形成し、形質細胞、一般には骨髄の正常な機能を中断するときに生じる。骨髄腫は、米国において癌死の１４番目に多い原因である。
【０００８】
アメリカ癌協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）によると、多発性骨髄腫は、最高５０％の５年生存率を有するが、この統計値は、多発性骨髄腫を有する患者が高い再発傾向を有することから、誤解を招くことがある。
多発性骨髄腫における高い再発率は、多発性骨髄腫患者の治療に用いられる抗癌療法に対する耐性の高い発生率に部分的に起因する。
【０００９】
多発性骨髄腫は、診断および監視することが困難であることが多い複合疾患である。
多発性骨髄腫を診断するための現行の方法は、身体検査、血液および／または尿中のβ‐２−ミクログロブリン、アルブミン、モノクローナルパラプロテイン（Ｍタンパク質）の測定、骨髄生検と任意選択的にそれに続く細胞発生分析、Ｘ線、ＭＲＩ、ＣＴスキャン、完全血球数および血中カルシウムレベル検査を含む。
残念ながら、多発性骨髄腫を正確に診断するのに十分な単一の試験はなく、選択される試験は、患者の疾患の認知された重症度、年齢および健康、財政的配慮、試験の有効性並びに患者の意向などの多くの要素に依存し得る。
【００１０】
新規に診断された多発性骨髄腫患者は、一般に高用量の組み合わせ化学療法および自家幹細胞移植で最初に治療される。
治療における初期の抗癌療法の必要な組み合わせは、多くの場合、多剤耐性（ＭＤＲ）癌を発生する患者をもたらし得る。
ＭＤＲは、癌細胞が組み合わせ化学療法において用いられる広範囲の薬剤に対して交差耐性になる固有の耐性タイプである。
【００１１】
一般に、多発性骨髄腫の進行を監視するため、多発性骨髄腫を診断するために用いられる同じ試験が用いられ得る。
免疫グロブリンをほとんどまたは全く分泌せず、そのため血液および尿検査を回避させ得る骨髄腫の形態が存在することから、骨髄生検に基づく試験は、多発性骨髄腫の診断および監視にとってほぼ間違いなく最も広範に適用可能であり、且つ正確である。
しかし、この処置は、生検を実施するのに、鎮静だけでなく、麻酔、術後疼痛緩和薬、極めて多数の訓練を受けた医師を多大な費用で必要とし、また、既に易感染性の患者に対してさらなる感染リスクを齎す。
【００１２】
臨床的展望からの骨髄生検の有用性に反して、たとえ骨髄生検であっても、薬剤耐性の意外な出現に関連する複雑さを直接的且つ有効に評価することができない。
さらに、かかる生検が毎日、毎週またはさらに毎月実施できないことから、それは、癌の進行を時間的またはルーチン的な様式で判定または予測するための適切な方法でない。
【００１３】
加えて、他の侵襲性が低めの試験、たとえば血液および尿サンプルに基づくものは、さらに腫瘍負荷を監視するのみであり、臨床症状によって明らかなように、疾患が既に再出現しているときに限って有用である。
したがって、それらは、有意に予後の見通しを提供することができない。
【００１４】
詳細には、骨髄生検に重度に依存するのではなく、好ましくは末梢血サンプルに基づく単純な方を用いて、形質細胞新生物を正確に監視するための方法が必要である。
【００１５】
細胞外小胞、たとえば微小粒子（微小胞またはエクトソームとしても公知）、アポトーシス体、オンコソームおよびエキソソームは、癌性細胞および癌に対する前駆体である細胞並びに幹細胞および前駆細胞を含む広範囲の細胞によって放出される。
それらは、細胞外環境に放出され、身体全体を通して循環し、輸送されることが可能である。
細胞外小胞は、大部分の体液、たとえば唾液、血液、尿、腹水および脳脊髄液、粘液および母乳から単離されている。
細胞外小胞がそれらの由来元である細胞と特徴を共有することが多いことから、それは、これら細胞の状態について示唆的であり得る。
これは、通常、循環しない細胞にとって特に有利であり、なぜなら、細胞外小胞は、収集することがより容易であるためである。
【００１６】
細胞外小胞の１つのタイプである微小粒子は、大部分の細胞型の原形質膜から放出される小さい膜小胞（０．１〜１μｍの直径）であり、末梢血、尿および他の体液、たとえば唾液中に存在する。
したがって、微小粒子は、その由来元である細胞の原形質膜の幾つかの重要な特徴、たとえば特定の膜関連タンパク質の存在などを共有することになる。
【００１７】
循環する癌細胞由来の細胞外小胞は、幾つかの異なる癌に対して患者において検出されている。
幾つかの癌細胞由来の細胞外小胞は、癌細胞集団内での多剤耐性の導入および伝播に関与し、機能的な耐性タンパク質および核酸を運搬し、移動させることにより、数時間でそのように作用し得ることが示されている。
【００１８】
多発性骨髄腫に関連して、本発明者らは、多発性骨髄腫患者の血漿中のマーカータンパク質ＣＤ１３８について陽性である細胞外小胞（即ち、ＣＤ１３８＋である微小粒子）の存在について以前に報告しており、そこでは、多発性骨髄腫患者におけるＣＤ１３８＋微小粒子数が健常対象と比べてより多いことが認められた（Ｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｂｅｂａｗｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ２０１６；参照により援用される）。
興味深いことに、寛解患者（完全寛解（ＣＲ）および部分寛解（ＰＲ））および進行性疾患（ＰＤ）を有する患者において、健常対象と比べてより多いＣＤ１３８＋微小粒子数が検出された。
しかし、健常対象と新規に診断された患者との間に有意差は認められなかった。報告された試験において、分析対象の（国際骨髄腫作業部会（ＩＭＷＧ）応答基準を用いて定義された）９名のＣＲ患者は、対象の残りと比べてより多いＣＤ１３８＋微小粒子数を有した。
後に、それら９名中５名のＣＲ患者は、試験の４週間以内に臨床的に再発することが見出され、ＣＤ１３８＋微小粒子数は、より一般的な臨床マーカーの前に非活動性病態と活動性病態との間の移行を予測する可能性が示された。
【００１９】
しかし、ルーチン的且つ容易に実施可能な最小限の侵襲性試験で、骨髄腫の進行を監視するにとどまらず、予め骨髄腫を予後診断（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）する手段は、臨床状況下で潜在的により多く用いられるであろう。
骨髄腫をより精密に監視する能力は、たとえば、改善が検出されると投薬を低減するか、または難治性癌が検出されるとまたは癌の重症度の増加の予測に先立って投薬を変更するなどの治療戦略の改良を可能にするであろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
先行技術の不利益の少なくとも、１つを克服若しくは改善するかまたは有用な代替案を提示することが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
多発性骨髄腫を有する患者から単離された循環細胞外小胞は、患者の予後診断（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）に関して示唆的であり得る明確なマーカー特性を有することが以前に示されている。
特に、マーカータンパク質ＣＤ１３８について陽性である細胞外小胞（即ちＣＤ１３８＋微小粒子）のレベルを監視することは、多発性骨髄腫に対して有用な予後診断（prognosis）ツールとなり得ることが予測された。
【００２２】
この以前の研究にもかかわらず、本発明者らは、意外にも、ＣＤ１３８マーカータンパク質を有しない（ＣＤ１３８−）が、形質細胞新生物を有する患者の血漿中の少なくとも、Ｐ−糖タンパク質について陽性である（Ｐ−ｇｐ＋）細胞外小胞のレベルが、疾患進行に対する優れた指示であることを見出している。
【００２３】
かかる知見は、形質細胞新生物を有する患者が、骨髄に由来する細胞および／または細胞外小胞、たとえば「液体生検」との関連での血液サンプル中の細胞由来の微小胞を分析することにより、厳密且つ正確に連続的に監視されることを可能にする。
これは、癌を監視するための侵襲的方法、たとえば骨髄生検への依存を低下させる。細胞およびそれらに由来する細胞外小胞は、本質的に骨髄区画内の組織にアクセスすることが困難なものとしての「代替マーカー」である。
【００２４】
治療期間中、患者を病態表現型について継続的に監視する能力は、疾患進行を予防するため、代替療法が迅速に開始可能であることから、最適な患者管理を可能にする。
これは、Ｍ−タンパク質レベルの上昇といった古典的症状が欠如し、結果として監視するのが困難である非分泌性骨髄腫の症例において特に有用となる。
【００２５】
したがって、本発明の第１の態様では、形質細胞新生物を有するかまたは形質細胞新生物を有することが疑われる患者の予後診断（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）のための方法であって、細胞外小胞を含むサンプルを前記患者から単離することと、ＣＤ１３８−およびＰ−糖タンパク質＋（ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋）である細胞外小胞のレベルを判定することとを含む方法が提供される。
【００２６】
有利には、方法は、有痛性または侵襲性技術を必要としないインビトロな方法である。
【００２７】
本発明の方法はまた、新生物形質細胞の骨髄からの単離を必ずしも必要とせず、好ましい実施形態では、方法は、専ら循環細胞外小胞の体液からの単離のみを必要とする。
【００２８】
しかし、ＣＤ１３８−およびＰ−ｇｐ＋である細胞外小胞は、ＣＤ１３８マーカータンパク質を有しないが、少なくとも、Ｐ−糖タンパク質について陽性である細胞の存在の指標であり得ることが理解されるであろう。
細胞外小胞の由来元である細胞は、サンプル中の細胞が、ＣＤ１３８−およびＰ−ｇｐ＋である細胞外小胞のレベルを判定するために適用される同一または類似の分析技術を施される場合、同定可能である。
これらの細胞も、循環中にもあり得ることから、非侵襲性技術により、容易に単離することができる。
【００２９】
したがって、本発明の第２の態様では、形質細胞新生物を有するかまたは形質細胞新生物を有することが疑われる患者の予後診断（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）のための方法であって、細胞を含むサンプルを前記患者から単離することと、および、ＣＤ１３８−およびＰ−ｇｐ＋である細胞のレベルを判定することとを含む方法が提供される。
【００３０】
患者は、任意の形質細胞新生物を有し得るかまたは有することが疑われ得る。
形質細胞新生物は、骨髄において形質細胞の異常な増殖を引き起こす任意の疾患である。
形質細胞新生物は、意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症（ＭＧＵＳ）、形質細胞腫および多発性骨髄腫（くすぶり型多発性骨髄腫および非分泌性骨髄腫を含む）を含む。
骨髄腫は、１つの骨髄部位に生じることがあるが、患者における骨髄部位に止まらずにほぼ常に局所化され、そのため一般に多発性骨髄腫と称される。
【００３１】
患者は、骨髄腫または多発性骨髄腫を有し得るかまたは有することが疑われ得る。本発明の好ましい実施形態では、患者は、多発性骨髄腫を有する。
【００３２】
本発明の実施形態では、多発性骨髄腫を有するかまたは多発性骨髄腫を有することが疑われる患者の予後診断（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）のための方法が提供され、細胞外小胞を含むサンプルを前記患者から単離すること、および、ＣＤ１３８−およびＰ−糖タンパク質＋である（ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋）細胞外小胞のレベルを判定することを含む方法が提供される。別の実施形態では、多発性骨髄腫を有するかまたは多発性骨髄腫を有することが疑われる患者の予後診断（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）のための方法であって、細胞を含むサンプルを前記患者から単離することと、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞のレベルを判定することとを含む方法が提供される。
【００３３】
多発性骨髄腫は、不治の癌であると考えられ、そのため、患者が寛解状態に入るか否か、および／または癌がもはや検出不能か否かに関係なく、多発性骨髄腫と診断されている患者が多発性骨髄腫を有すると常に見なされることになることが理解されるであろう。
したがって、本発明の方法は、寛解状態にあるかまたはもはや検出不能である多発性骨髄腫を有すると見なされている患者を定期的に評価し、多発性骨髄腫が臨床的に再出現する可能性があるか否かを判定するために用いられ得る。
本発明の方法は、多発性骨髄腫が再出現しているが、通常の方法により依然として検出不能であり、且つ／または依然として臨床症状を有しないことについて判定するためにも用いられ得る。
【００３４】
多発性骨髄腫は、限定はされないが、身体検査、血液および／または尿中のβ−２−ミクログロブリン、アルブミン、モノクローナルパラプロテイン（Ｍタンパク質）の測定、骨髄生検と、所望により、それに続く細胞発生分析、Ｘ線、ＭＲＩ、ＣＴスキャン、完全血球数および血中カルシウムレベル検査を含む、当技術分野で公知の任意の通常の疾患指標を用いて最初に診断され得る。
【００３５】
患者は、限定はされないが、Ｄｕｒｉｅ−Ｓａｌｍｏｎ判定基準または国際病期分類（ＩＳＳ）を含む任意の分類方法による分類として、任意のステージでの多発性骨髄腫を有し得る。
患者は、ステージＩ、ステージＩＩまたはステージＩＩＩ骨髄腫と分類され得る。
【００３６】
骨髄腫を有する患者は、無症候性または症候性であり得ることが理解されるであろう。
たとえば、ＩＳＳステージＩＩ多発性骨髄腫と診断された患者は、限定はされないが、腎不全、頻発する感染、骨痛、貧血、四肢における嗜眠、呼吸困難、鼻出血および内出血傾向並びに眠気、悪心および錯乱の感覚を含む幾つかの症状を有し得る。
しかし、くすぶり型骨髄腫を有するかまたは有することが疑われる患者は、Ｍ−タンパク質レベルの上昇および骨髄における形質細胞のレベルの上昇を有することがあるが、これは、一般に骨髄腫に関連した症状を伴うことがない。
別の例では、ＭＧＵＳを有する患者は、Ｍ−タンパク質のレベルの上昇を有することがあるが、骨髄腫に関連した他の症状を有することがない。
【００３７】
骨髄腫を有する患者は、症状の存在および出現並びに重症度の変動を経験することがあり、且つ無症候性と症候性との間を変動することがある。
ＭＧＵＳまたはくすぶり型骨髄腫を有するかまたは有することが疑われる患者は、その余命中に症候性骨髄腫を発現する可能性が高いことも理解されるであろう。
【００３８】
本発明との関連では、予後診断（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）は、形質細胞新生物の最も起こりそうな結果（即ち、生存）に関する予報または形質細胞新生物が進行することがある次の状態に関する予報である。
形質細胞新生物の状態は、一般に、腫瘍が治療に応答している場合の、新生物細胞が増殖している速度および／または患者内に存在し得る新生物細胞の総数に関連する。
その状態は、腫瘍が活動性または非活動性癌のいずれであるかの観点でも定義することができ、また特定のステージにおける重症度の観点で比較的に類別され得る。
【００３９】
通常の方法を用いる、骨髄腫が活動性または非活動性のいずれであるかの評価は、疾患指標における任意の変化を判定するために、一般に、骨髄腫が少なくとも、２つの連続した時点で評価されることが必要となる。
本発明の実施形態では、骨髄腫が活動性または非活動性のいずれであるかは、単一の時点で判定され得る。
【００４０】
本発明は、形質細胞新生物が治療に応答する可能性が高いか否かの早期指標も提供し得る。
本発明の方法は、この能力において診断方法と見なされ得る。
【００４１】
本発明との関連では、予後診断（prognosis）は、形質細胞新生物の特定の状態の診断でもあり得る。
形質細胞新生物の最も起こりそうな結果に関する予報は、本発明の方法に関連し得、それは、方法が患者に対して実施される時点での形質細胞新生物の状態の指標を提供する。
たとえば、予後診断（prognosis）は、形質細胞新生物を有することが疑われる患者に対して実施されている本発明の方法に基づき得、ここで、患者は、難治性であるかまたは難治性になる可能性が高い形質細胞新生物を有することが判定される。
この例では、この特定の状態の診断は、その患者において、治療に応答するようになる可能性が高まった形質細胞新生物を有すると診断された患者と比較されるとき、潜在的により不良な転帰であることをそれが示すことから、予後診断（prognosis）的な意味で示唆的である
【００４２】
本発明の実施形態では、方法は、多発性骨髄腫を診断するために用いられ得る。
この実施形態では、患者におけるＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞および／または細胞外小胞の存在は、多発性骨髄腫の侵襲性形態を有する患者を示し得る。
【００４３】
活動性骨髄腫状態は、応答性、安定、進行性および難治性を含み、ここで、難治性骨髄腫は、進行性骨髄腫よりも重篤であり、進行性骨髄腫は、安定骨髄腫よりも重篤であり、安定骨髄腫は、応答性骨髄腫よりも重篤である。
活動性骨髄腫状態は、骨髄腫の任意のステージで生じ得る。
たとえば、患者は、ステージＩＩ応答性骨髄腫（即ち、潜在的にステージＩ骨髄腫状態に移行する）またはステージＩ進行性骨髄腫（即ち、潜在的にステージＩＩまたはステージＩＩＩ骨髄腫状態に移行する）を有し得る。
【００４４】
応答性骨髄腫は、骨髄腫が１つ以上の抗癌療法に応答している場合であり、長期にわたり症状の数および／または重症度の減少を経験している患者によって特徴付けられ得る。
【００４５】
安定骨髄腫は、骨髄腫が悪化していないが、患者に依然として症候があり得る場合である。
安定骨髄腫は、たとえば、骨髄腫が重症度において増加すると予想されることになるが、１つ以上の抗癌療法に応答して長期にわたり安定性を維持する場合などにおいて、応答性骨髄腫であり得る。
【００４６】
進行性骨髄腫は、骨髄腫が悪化しており、そして、長期にわたり、症状の数および重症度の増加を経験している患者によって特徴付けられ得る。
【００４７】
難治性骨髄腫は、治療に応答しないかまたは治療に十分に応答しないものである。
難治性骨髄腫は、侵襲性、抵抗性または非応答性とも称され得、これらの用語は、交換可能である。
難治性骨髄腫は、１つ以上の抗癌療法に応答しない患者において生じることがあるか、または１つ以上の抗癌療法に初期に確実に応答するが、次いで１つ以上の抗癌療法に対して難治性になる患者において生じることがある。
【００４８】
骨髄腫は、任意の段階で難治性であり得る。
患者は、多剤耐性（ＭＤＲ）骨髄腫と称されることがある、２つ以上の抗癌療法に応答しない難治性骨髄腫を発症することがあることが理解されるであろう
【００４９】
非活動性骨髄腫状態は、小康状態、たとえば、部分寛解および完全寛解を含む。くすぶり型骨髄腫またはＭＧＵＳを有する患者は、非活動性癌を有すると見なされ得る。
【００５０】
寛解性骨髄腫は、患者における疾患の証拠が最小であるかまたは全くない場合である。
【００５１】
本発明の方法において用いられるサンプルは、細胞を含み、したがって、たとえば、唾液サンプル、尿サンプル、母乳サンプル、血液サンプルまたは血液由来サンプルなどであり得る、細胞外小胞も含むことができる患者に由来する任意のサンプルである、またはことが理解されるであろう。
【００５２】
サンプルは、主に、細胞外小胞または主に細胞を含み得る。他の実施形態では、サンプルは、細胞と細胞外小胞との両方の混合物を含み得る。
【００５３】
サンプルが細胞と細胞外小胞との両方を含む場合、本発明の方法は、単に細胞のレベルまたは細胞外小胞のレベルが判定されることを必要とし得る。
【００５４】
幾つかの実施形態では、サンプルは、細胞と細胞外小胞との両方を含むが、本発明の方法を実施するとき、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞のレベルのみが判定される。
他の実施形態では、サンプルは、細胞と細胞外小胞との両方を含むが、本発明の方法を実施するとき、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞外小胞のレベルのみが判定される。
【００５５】
幾つかの実施形態では、サンプルは、細胞と細胞外小胞との両方を含み、本発明の方法を実施するとき、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞のレベルおよびＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞外小胞のレベルが判定される。
【００５６】
実施形態では、サンプルは、細胞と細胞外小胞との両方を含み、そして、本発明の方法を実施するとき、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞のレベルおよびＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞外小胞のレベルが判定され、またＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞のレベルを判定するために用いられる方法は、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞外小胞のレベルを判定するために用いられる方法と異なる。
【００５７】
他の実施形態では、サンプルは、細胞と細胞外小胞との両方を含み、そして、本発明の方法を実施するとき、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞のレベルおよびＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞外小胞のレベルが判定され、またＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞のレベルを判定するために用いられる方法は、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞外小胞のレベルを判定するために用いられる方法と同じである。
【００５８】
好ましくは、サンプルは、血液または血液由来サンプルである。
血液由来サンプルは、任意のサンプルであり得、前記サンプルを調製するための出発物質は、形質細胞新生物を有するかまたは形質細胞新生物を有することが疑われる患者から採取される血液である。
本発明のより好ましい実施形態では、サンプルは、血漿サンプルである。
血漿は、当技術分野で公知の方法を用いて、患者から採取される任意の全血または血清サンプルから入手され得る。
【００５９】
本発明の好ましい実施形態では、血漿サンプルは、血小板を含まない。
血小板を含まない血漿サンプル中のＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞外小胞または細胞のレベルを判定することは、血小板および／または血小板由来細胞外小胞による汚染を最小化し得る。
【００６０】
本発明の他の好ましい実施形態では、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞外小胞または細胞はまた、ＣＤ４１ａ−でもある。
ＣＤ４１ａが典型的な血小板マーカーであるので、これは、血小板および／または血小板由来細胞外小胞による汚染を最小化し得る。
【００６１】
本発明の実施形態では、多発性骨髄腫を有するかまたは多発性骨髄腫を有することが疑われる患者の予後診断（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）のための方法であって、細胞外小胞を含むサンプルを前記患者から単離することと、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ４１ａ−である細胞外小胞のレベルを判定することとを含む方法が提供される。
別の実施形態では、多発性骨髄腫を有するかまたは多発性骨髄腫を有することが疑われる患者の予後診断（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）のための方法であって、細胞を含むサンプルを前記患者から単離することと、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ４１ａ−である細胞のレベルを判定することとを含む方法が提供される。
【００６２】
サンプルは、主に、細胞外小胞を含む濃縮または清澄化されたサンプルであり得る。
これは、細胞、並びに他の細胞および小胞成分、並びにデブリをサンプルから除去するためのステップが取られ得ることを意味する。
血液由来サンプル、尿サンプルまたは唾液サンプルから細胞外小胞を調製するための方法は、当技術分野で周知であり、たとえば、遠心分離（即ち、密度勾配遠心分離、分画遠心および超遠心分離）、免疫親和性、濾過、スクロース勾配、電気泳動、フィールドフローフラクショネーションおよびクロマトグラフィー技術、たとえばサイズ排除を含む。
【００６３】
サンプルは、主に、細胞を含む濃縮または清澄化されたサンプルであり得る。
これは、細胞片および小胞成分をサンプルから除去するためのステップが取られ得ることを意味する。
血液由来サンプル、尿サンプルまたは唾液サンプルから細胞を調製するための方法は、当技術分野で周知であり、たとえば遠心分離、濾過、スクロース勾配、電気泳動およびクロマトグラフィー技術を含む。
【００６４】
本発明では、細胞および／または細胞外小胞を含むサンプル中のＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞および／または細胞外小胞のレベルは、予後診断（prognosis）における方法を提供する。
【００６５】
Ｐ−ｇｐは、癌細胞の原形質膜からの多剤排出輸送に関与する１７０ｋＤａのリン糖タンパク質であり、ＡＴＰ結合カセットスーパーファミリーに属する。
Ｐ−ｇｐとしてタンパク質の同じファミリーに属する他の耐性マーカーは、多剤耐性タンパク質１（ＭＲＰ１またはＡＢＣＣ１）、ＡＢＣＡ１およびＡＢＣＧ１を含む。
当業者であれば、同じファミリーのこれらメンバーが機能的に冗長であり、そして、他方の不在下で代替し得ることを理解するであろう。
したがって、本発明を意図して、Ｐ−ｇｐが、形質細胞新生物を有するかまたは形質細胞新生物を有することが疑われる患者から単離されたサンプル中に存在する細胞および／または細胞外小胞上で検出可能でない場合、サンプルは、ＡＴＰ結合カセットスーパーファミリーの別のメンバーについてアッセイされ得る。
ＣＤ１３８は、膜貫通ヘパリン硫酸プロテオグリカンであり、正常な成熟形質細胞の表面上に発現される。
したがって、正常な成熟形質細胞および正常な成熟形質細胞から生成される細胞外小胞は、一般にＣＤ１３８＋となる。
【００６６】
意外にも、形質細胞新生物を有する患者では、Ｐ−ｇｐについて陽性であり且つＣＤ１３８について陰性である細胞および／または細胞外小胞の数が、疾患が進行するにつれて増加する傾向があることが見出されている。
特に、多発性骨髄腫の活性型を有する患者が、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞外小胞および／または細胞を、多発性骨髄腫の非活性型を有する患者または健常患者と比べてより高いレベルで有し、それにより有用な予後診断（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）および診断指標を提供することが見出されている。
【００６７】
形質細胞新生物を有する患者または形質細胞新生物を有することが疑われる患者において、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞および／または細胞外小胞のレベルの上昇は、患者が、難治性であるかまたは難治性となる形質細胞新生物を有する可能性の増加と相関することも予測されている。
【００６８】
本発明との関連では、細胞外小胞が特定の標的分子について陽性である（＋）場合、分子は、微小粒子内部に完全に若しくは部分的に含有されるかまたはその表面上に位置し得る（即ち、微小粒子関連タンパク質または微小粒子関連リン脂質）。
分子は、完全長タンパク質若しくはその断片またはタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡ若しくはその断片であり得、且つ任意の配向性であり得、且つ細胞外小胞を含むサンプル中で検出可能であり得る。
分子は、微小粒子がインタクトであるとき、検出可能であり得るか、または微小粒子が破裂されるときに限り検出可能であり得る。
検出されている分子は、標的分子の任意の変異体、アイソフォームまたは多形であり得る。
【００６９】
本発明との関連では、細胞が特定の標的分子について陽性である（＋）場合、分子は、細胞内部に完全に若しくは部分的に含有されるかまたはその原形質膜上に位置し得る。
分子は、完全長タンパク質若しくはその断片またはタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡ若しくはその断片であり得、且つ任意の配向性であり得、且つ細胞を含むサンプル中で検出可能であり得る。
分子は、細胞がインタクトであるとき、検出可能であり得るか、または細胞が破裂若しくは溶解されるときに限り検出可能であり得る。
検出されている分子は、標的分子の任意の変異体、アイソフォームまたは多形であり得る。
【００７０】
本発明との関連では、細胞または細胞外小胞が特定の標的分子について陰性である（−）場合、分子は、細胞および／または細胞外小胞を含むサンプル中の細胞および／または細胞外小胞の表面または内部で検出可能でない。
本発明との関連では、細胞または細胞外小胞がある分子について陰性である場合を考えるとき、分子は、完全長タンパク質またはその断片であり得る。
【００７１】
たとえば、サンプルは、前記細胞の可溶化液中のＰ−ｇｐタンパク質および／またはｍＲＮＡの存在並びにＣＤ１３８−タンパク質の不在が理由で、Ｐ−ｇｐ＋およびＣＤ１３８−であると判定された細胞を含み得る。
さらなる例では、サンプルは、前記細胞および微小粒子の表面上でのＰ−ｇｐエピトープの存在並びにＣＤ１３８−エピトープの不在が理由で、Ｐ−ｇｐ＋およびＣＤ１３８−であると判定された細胞および細胞外小胞を含み得る。
別の例では、サンプルは、前記微小胞が破裂した後、Ｐ−ｇｐ  ｍＲＮＡの存在およびＣＤ１３８−タンパク質またはその断片の不在が理由で、Ｐ−ｇｐ＋およびＣＤ１３８−であると判定された細胞外小胞を含み得る。
【００７２】
したがって、本発明の実施形態では、判定されている細胞外小胞のレベルは、Ｐ−ｇｐを含む（Ｐ−ｇｐ＋）が、ＣＤ１３８を含まない（ＣＤ１３８−）、患者の細胞に由来する細胞外小胞の集団に関する。
【００７３】
他の実施形態では、判定されている細胞外小胞のレベルは、Ｐ−ｇｐを含む（Ｐ−ｇｐ＋）が、ＣＤ１３８を含まない（ＣＤ１３８−）かまたはＣＤ４１ａを含まない（ＣＤ４１ａ−）、患者の細胞に由来する細胞外小胞の集団に関する。
【００７４】
本発明の実施形態では、判定されている細胞のレベルは、Ｐ−ｇｐを含む（Ｐ−ｇｐ＋）が、ＣＤ１３８を含まない（ＣＤ１３８−）細胞の集団に関する。
【００７５】
他の実施形態では、判定されている細胞のレベルは、Ｐ−ｇｐを含む（Ｐ−ｇｐ＋）が、ＣＤ１３８を含まない（ＣＤ１３８−）かまたはＣＤ４１ａを含まない（ＣＤ４１ａ−）、患者における細胞の集団に関する。
【００７６】
本発明の予後診断（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）における方法の実施形態では、サンプルが、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞および／または形質細胞由来の細胞外小胞を、形質細胞新生物を有しないかまたは寛解性の形質細胞新生物を有する対象を示す参照対照よりも高いレベルで含むとき、新生物が安定、進行性または難治性である予後が判定される。
【００７７】
本発明の予後診断（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）の方法の他の実施形態では、サンプルが、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞および／または細胞外小胞を、安定な形質細胞新生物を有する対象を示す参照対照よりも高いレベルで含むとき、新生物が進行性または難治性である予後（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）が判定される。
【００７８】
本発明の予後診断（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）の方法の別の実施形態では、サンプルが、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞および／または細胞外小胞を、進行性の形質細胞新生物を有する対象を示す参照対照よりも高いレベルで含むとき、新生物が難治性である予後（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）が判定される。
【００７９】
形質細胞新生物を有しない対象を示す参照対照は、正常な血液（ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ）を伴い、形質細胞新生物と決して診断されていない任意の非癌患者に由来し得る。
【００８０】
寛解性の形質細胞新生物を有する対象を示す参照対照は、以前に形質細胞新生物と診断されているが、抗癌療法を用いた治療を少なくとも、６か月間にわたり必要としておらず、血液、尿および／または唾液中でＭ−タンパク質レベルが検出不能である任意の患者に由来し得る。
【００８１】
本発明の実施形態では、多発性骨髄腫を有するかまたは多発性骨髄腫を有することが疑われる患者の予後診断（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）のための方法であって、細胞および／または細胞外小胞を含むサンプルを前記患者から単離することと、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞および／または細胞外小胞のレベルを判定することとを含み、サンプルが、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞および／または細胞外小胞を、多発性骨髄腫を有しないかまたは寛解性の多発性骨髄腫を有する対象を示す参照対照よりも高いレベルで含むとき、多発性骨髄腫が安定、進行性または難治性である予後が判定される、方法が提供される。
【００８２】
本発明の実施形態では、多発性骨髄腫を有するかまたは多発性骨髄腫を有することが疑われる患者の予後診断（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）のための方法であって、細胞および／または細胞外小胞を含むサンプルを前記患者から単離することと、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞および／または細胞外小胞のレベルを判定することとを含み、サンプルが、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞および／または細胞外小胞を、安定な多発性骨髄腫を有する対象を示す参照対照よりも高いレベルで含むとき、多発性骨髄腫が進行性または難治性である予後（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）が判定される、方法が提供される。
【００８３】
本発明の実施形態では、多発性骨髄腫を有するかまたは多発性骨髄腫を有することが疑われる患者の予後診断（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）のための方法であって、細胞および／または細胞外小胞を含むサンプルを前記患者から単離することと、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞および／または細胞外小胞のレベルを判定することとを含み、サンプルが、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞および／または細胞外小胞を、進行性多発性骨髄腫を有する対象を示す参照対照よりも高いレベルで含むとき、多発性骨髄腫が難治性である予後が判定される、方法が提供される。
【００８４】
本発明の方法を意図して、サンプル中のＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞および／または細胞外小胞のレベルが、参照対照よりも高いか否かは、直接的比較により、或いは形質細胞新生物を有しないかまたは寛解性、安定若しくは進行性の形質細胞新生物を有する対象を示す所定のレベルとの比較により判定され得る。
細胞または細胞外小胞のレベルは、定性的または定量的に判定され得、そして、特定のサンプル中のＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞および／または細胞外小胞の絶対数に関連し得るか、または特定のサンプル中のＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞および／または細胞外小胞の濃度に関連し得るか、または特定のサンプル中のＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞および／または細胞外小胞の存在若しくは不在の目視判定に関連し得る。
【００８５】
レベルは、サンプル中で判定され得、次いで患者における絶対数またはたとえば患者の血液、尿若しくは唾液中の濃度に関連し得る。
特定のサンプル中のＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞および／または細胞外小胞のレベルは、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞および／または細胞外小胞のレベルが、レベルを比較する手段が存在することを条件として、参照対照において判定されるのと同じ方法で判定される必要はない。
【００８６】
本発明の実施形態では、サンプル中のＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞および／または細胞外小胞のレベルが参照対照よりも高い場合、小胞および／または細胞外小胞のレベルは、参照対照におけるＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞および／または細胞外小胞のレベルよりも少なくとも、１．０１倍高い。
たとえば、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋であるサンプル中の小胞および／または細胞外小胞のレベルは、参照対照におけるＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋である細胞および／または細胞外小胞のレベルよりも、少なくとも、１．０１、１．１、１．５、２、３、４、５、１０、２５、５０、１００または１０００倍高いことができる。
別の例では、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋／ＣＤ４１ａ−であるサンプル中の小胞および／または細胞外小胞のレベルは、参照対照におけるＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋／ＣＤ４１ａ−である細胞および／または細胞外小胞のレベルよりも少なくとも、１．０１、１．１、１．５、２、３、４、５、１０、２５、５０、１００または１０００倍高いことができる。
さらなる例では、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ４１ａ−であるサンプル中の小胞および／または細胞外小胞のレベルは、参照対照におけるＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ４１ａ−である細胞および／または細胞外小胞のレベルよりも、少なくとも、１．０１、１．１、１．５、２、３、４、５、１０、２５、５０、１００または１０００倍高いことができる。
【００８７】
本発明の実施形態では、多発性骨髄腫を有するかまたは多発性骨髄腫を有することが疑われる患者の予後診断（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）のための方法であって、細胞および／または細胞外小胞を含むサンプルを前記患者から単離すること、および、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞および／または細胞外小胞のレベルを判定することを含み、サンプルが、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞および／または細胞外小胞を、多発性骨髄腫を有しないかまたは寛解性の多発性骨髄腫を有する対象を示す参照対照よりも少なくとも、１．１倍高いレベルで含むとき、多発性骨髄腫が安定、進行性または難治性である予後が判定される、方法が提供される。
【００８８】
本発明の実施形態では、多発性骨髄腫を有するかまたは多発性骨髄腫を有することが疑われる患者の予後診断（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）のための方法であって、細胞および／または細胞外小胞を含むサンプルを前記患者から単離すること、および、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞および／または細胞外小胞のレベルを判定することを含み、サンプルが、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞および／または細胞外小胞を、安定な多発性骨髄腫を有する対象を示す参照対照よりも少なくとも、１．１倍高いレベルで含むとき、多発性骨髄腫が進行性または難治性である予後が判定される、方法が提供される。
【００８９】
本発明の実施形態では、多発性骨髄腫を有するかまたは多発性骨髄腫を有することが疑われる患者の予後診断（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）のための方法であって、細胞および／または細胞外小胞を含むサンプルを前記患者から単離すること、および、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞および／または細胞外小胞のレベルを判定することを含み、サンプルが、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞および／または細胞外小胞を、進行性多発性骨髄腫を有する対象を示す参照対照よりも少なくとも、１．１倍高いレベルで含むとき、多発性骨髄腫が難治性である予後が判定される、方法が提供される。
【００９０】
本発明の実施形態では、多発性骨髄腫を有するかまたは多発性骨髄腫を有することが疑われる患者の予後診断（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）のための方法であって、細胞および／または細胞外小胞を含むサンプルを前記患者から単離すること、および、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞および／または細胞外小胞のレベルを判定することを含み、サンプルが、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞および／または細胞外小胞を、多発性骨髄腫を有しないかまたは寛解性の多発性骨髄腫を有する対象を示す参照対照よりも少なくとも、２倍高いレベルで含むとき、多発性骨髄腫が安定、進行性または難治性である予後が判定される、方法が提供される。
【００９１】
本発明の実施形態では、多発性骨髄腫を有するかまたは多発性骨髄腫を有することが疑われる患者の予後診断（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）のための方法であって、細胞および／または細胞外小胞を含むサンプルを前記患者から単離すること、および、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞および／または細胞外小胞のレベルを判定することを含み、サンプルが、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞および／または細胞外小胞を、安定な多発性骨髄腫を有する対象を示す参照対照よりも少なくとも、２倍高いレベルで含むとき、多発性骨髄腫が進行性または難治性である予後が判定される、方法が提供される。
【００９２】
本発明の実施形態では、多発性骨髄腫を有するかまたは多発性骨髄腫を有することが疑われる患者の予後診断（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）のための方法であって、細胞および／または細胞外小胞を含むサンプルを前記患者から単離すること、および、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞および／または細胞外小胞のレベルを判定することを含み、サンプルが、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞および／または細胞外小胞を、進行性多発性骨髄腫を有する対象を示す参照対照よりも少なくとも、２倍高いレベルで含むとき、多発性骨髄腫が難治性である予後が判定される、方法が提供される。
【００９３】
本発明の実施形態では、多発性骨髄腫を有するかまたは多発性骨髄腫を有することが疑われる患者の予後診断（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）のための方法であって、細胞および／または細胞外小胞を含むサンプルを前記患者から単離すること、および、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞および／または細胞外小胞のレベルを判定することを含み、サンプルが、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞および／または細胞外小胞を、多発性骨髄腫を有しないかまたは寛解性の多発性骨髄腫を有する対象を示す参照対照よりも少なくとも、５倍高いレベルで含むとき、多発性骨髄腫が安定、進行性または難治性である予後が判定される、方法が提供される。
【００９４】
本発明の実施形態では、多発性骨髄腫を有するかまたは多発性骨髄腫を有することが疑われる患者の予後診断（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）のための方法であって、細胞および／または細胞外小胞を含むサンプルを前記患者から単離すること、および、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞および／または細胞外小胞のレベルを判定することを含み、サンプルが、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞および／または細胞外小胞を、安定な多発性骨髄腫を有する対象を示す参照対照よりも少なくとも、５倍高いレベルで含むとき、多発性骨髄腫が進行性または難治性である予後が判定される、方法が提供される。
【００９５】
本発明の実施形態では、多発性骨髄腫を有するかまたは多発性骨髄腫を有することが疑われる患者の予後診断（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）のための方法であって、細胞および／または細胞外小胞を含むサンプルを前記患者から単離すること、および、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞および／または細胞外小胞のレベルを判定することを含み、サンプルが、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞および／または細胞外小胞を、進行性多発性骨髄腫を有する対象を示す参照対照よりも少なくとも、５倍高いレベルで含むとき、多発性骨髄腫が難治性である予後が判定される、方法が提供される。
【００９６】
本発明の実施形態では、多発性骨髄腫を有するかまたは多発性骨髄腫を有することが疑われる患者の予後診断（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）のための方法であって、細胞および／または細胞外小胞を含むサンプルを前記患者から単離すること、および、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋である細胞および／または細胞外小胞のレベルを判定することを含み、サンプルが、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋である細胞および／または細胞外小胞を、多発性骨髄腫を有しないかまたは寛解性の多発性骨髄腫を有する対象を示す参照対照よりも少なくとも、１．１倍高いレベルで含むとき、多発性骨髄腫が安定、進行性または難治性である予後が判定される、方法が提供される。
【００９７】
本発明の実施形態では、多発性骨髄腫を有するかまたは多発性骨髄腫を有することが疑われる患者の予後診断（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）のための方法であって、細胞および／または細胞外小胞を含むサンプルを前記患者から単離すること、および、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋である細胞および／または細胞外小胞のレベルを判定することを含み、サンプルが、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋である細胞および／または細胞外小胞を、安定な多発性骨髄腫を有する対象を示す参照対照よりも少なくとも、１．１倍高いレベルで含むとき、多発性骨髄腫が進行性または難治性である予後が判定される、方法が提供される。
【００９８】
本発明の実施形態では、多発性骨髄腫を有するかまたは多発性骨髄腫を有することが疑われる患者の予後診断（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）のための方法であって、細胞および／または細胞外小胞を含むサンプルを前記患者から単離すること、および、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋である細胞および／または細胞外小胞のレベルを判定することを含み、サンプルが、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋である細胞および／または細胞外小胞を、進行性多発性骨髄腫を有する対象を示す参照対照よりも少なくとも、１．１倍高いレベルで含むとき、多発性骨髄腫が難治性である予後が判定される、方法が提供される。
【００９９】
上記の細胞および／または細胞外小胞の集団は、骨髄腫を有する患者におけるＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞および／または細胞外小胞の増加するレベルが骨髄腫の重症度の増加も示すことが示されていることから、特定の患者における形質細胞新生物の進行を経時的に監視するために利用され得る。
【０１００】
したがって、本発明の第３の態様では、形質細胞新生物を有するかまたは形質細胞新生物を有することが疑われる患者の進行を監視するための方法であって、少なくとも、２つの時点において、細胞および／または細胞外小胞を含むサンプルを前記患者から単離することと、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞および／または細胞外小胞のレベルの変化を判定することとを含む方法が提供される。
【０１０１】
ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞および／または細胞外小胞のレベルの変化は、絶対値であり得るか、またはそれぞれ細胞および／または細胞外小胞の他の集団との比較であり得る。
【０１０２】
時点は、数日〜数年の任意の期間によって隔てられ得る。
関連の細胞外小胞のレベルの変化は、２つの時点を通して判定され得、また複数の時点にわたり継続的に判定され得る。
たとえば、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞および／または細胞外小胞のレベルは、第１、第２、第３および第４の時点で判定され得、ここで、各時点は、１週間だけ隔てられる。
ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞および／または細胞外小胞のレベルの変化は、第１の時点および第２の時点、第２の時点および第４の時点または第１の時点および第３の時点を比較することにより判定され得る。
【０１０３】
時点は、同じ期間または異なる期間だけ隔てられ得る。たとえば、第１の時点と第２の時点とは、２週間だけ隔てられ得る一方、第３の時点は、第２の時点から６か月後であり得る。
【０１０４】
本発明の実施形態では、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞および／または細胞外小胞のレベルのその後の時点間での増加は、形質細胞新生物の診断を提供し得る。
たとえば、第１の時点において、患者は、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞および／または細胞外小胞を検出可能なレベルで有しなくてもよいが、次いで、第２の時点において、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞および／または細胞外小胞を検出可能なレベルで有し得、それは、出現しているかまたは出現する可能性がある形質細胞新生物を示し得る。
【０１０５】
本発明の実施形態では、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞および／または細胞外小胞のレベルのその後の時点間での増加は、難治性の形質細胞新生物の診断を提供し得る。
たとえば、第１の時点において、患者は、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞および／または細胞外小胞を検出可能なレベルで有しなくてもよいが、次いで、第２の時点において、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞および／または細胞外小胞を検出可能なレベルで有し得、それは、難治性になっている形質細胞新生物を示し得る。
【０１０６】
本発明の実施形態では、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞および／または細胞外小胞のレベルのその後の時点間での増加は、形質細胞新生物の重症度が増加していることを示す。
【０１０７】
本発明の実施形態では、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞および／または細胞外小胞のレベルが経時的に増加する場合、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である、１つの時点でのサンプル中の小胞および／または細胞外小胞のレベルは、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である、より早期の時点からのサンプル中の細胞および／または細胞外小胞のレベルよりも少なくとも、１．０１倍高い。
たとえば、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である、１つの時点でのサンプル中の小胞および／または細胞外小胞のレベルは、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である、より早期の時点からのサンプル中の細胞および／または細胞外小胞のレベルよりも少なくとも、１．０１、１．１、１．５、２、３、４、５、１０、２５、５０、１００または１０００倍高いことができる。
別の例では、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋である、１つの時点でのサンプル中の小胞および／または細胞外小胞のレベルは、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋である、より早期の時点からのサンプル中の細胞および／または細胞外小胞のレベルよりも少なくとも、１．０１、１．１、１．５、２、３、４、５、１０、２５、５０、１００または１０００倍倍高いことができる。
さらなる例では、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋／ＣＤ４１ａ−である、１つの時点でのサンプル中の小胞および／または細胞外小胞のレベルは、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋／ＣＤ４１ａ−である、より早期の時点からのサンプル中の細胞および／または細胞外小胞のレベルよりも少なくとも、１．０１、１．１、１．５、２、３、４、５、１０、２５、５０、１００または１０００倍高いことができる。
【０１０８】
重症度の増加は、腫瘍が不活性状態から活性状態に変化中であるか若しくは変化したか、またはある活性状態からより重篤な活性状態に変化中であるか若しくは変化したかを意味する。
たとえば、Ｍ−タンパク質レベルに基づいて、寛解性骨髄腫を有することが判定された患者では、その後の時点間でのＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞および／または細胞外小胞のレベルの増加は、骨髄腫が安定骨髄腫に変化中であるか若しくは変化したことを示し得る。
この例では、本発明の方法によって提供される早期予後診断（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）であれば、骨髄腫が再び活性状態になる前での治療の開始を可能にし得る。
【０１０９】
別の例では、応答性があるように見られる骨髄腫を有する患者では、その後の時点間でのＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞および／または細胞外小胞のレベルの増加は、骨髄腫が進行性骨髄腫に変化中であるか若しくは変化したことを示し得る。
この例では、本発明の方法によって提供される早期予後診断（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）であれば、治療レジームの変更を可能にし得る。
【０１１０】
極めて多数の抗癌療法により治療中である進行性骨髄腫を有する患者における別の実施形態では、その後の時点でのＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞および／または細胞外小胞のレベルを、難治性骨髄腫の出現について監視し得る。
この例では、時点は、骨髄腫の療法に対する応答性が必要に応じて密に監視され、変化することができ、日、週または月単位で隔てられ得る。
【０１１１】
本発明の実施形態では、形質細胞新生物を有するかまたは形質細胞新生物を有することが疑われる患者の進行を監視するための方法であって、少なくとも、２つの時点において、細胞および／または細胞外小胞を含むサンプルを前記患者から単離すること、および、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋／ＰＳ＋／ＣＤ４１ａ−である細胞および／または細胞外小胞のレベルの変化を判定することとを含み、その後の時点間でのＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋／ＰＳ＋／ＣＤ４１ａ−である細胞および／または細胞外小胞のレベルの少なくとも、１．１の増加は、形質細胞新生物の重症度が増加していることを示す、方法が提供される。
【０１１２】
さらなる実施形態では、多発性骨髄腫を有するかまたは多発性骨髄腫を有することが疑われる患者の進行を監視するための方法であって、少なくとも、２つの時点において、細胞および／または細胞外小胞を含むサンプルを前記患者から単離すること、および、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋である細胞および／または細胞外小胞のレベルの変化を判定することを含み、その後の時点間でのＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋である細胞および／または細胞外小胞のレベルの少なくとも、１．１の増加は、形質細胞新生物の重症度が増加していることを示す、方法が提供される。
【０１１３】
別の実施形態では、多発性骨髄腫を有するかまたは多発性骨髄腫を有することが疑われる患者の進行を監視するための方法であって、少なくとも、２週間だけ離れた少なくとも、２つの時点において、細胞および／または細胞外小胞を含む血液由来サンプルを前記患者から単離すること、および、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ４１ａ−である細胞および／または細胞外小胞のレベルの変化を判定することを含み、その後の時点間でのＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ４１ａ−である細胞および／または細胞外小胞のレベルの少なくとも、１．１の増加は、形質細胞新生物の重症度が増加していることを示す、方法が提供される。
【０１１４】
本発明の実施形態では、その後の時点間でのＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞および／または細胞外小胞のレベルの減少は、形質細胞新生物の重症度が減少していることを示す。
【０１１５】
本発明の実施形態では、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞および／または細胞外小胞のレベルが経時的に減少する場合、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である、１つの時点でのサンプル中の小胞および／または細胞外小胞のレベルは、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である、より早期の時点からのサンプル中の細胞および／または細胞外小胞のレベルよりも少なくとも、０．９９倍低い。
たとえば、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である、１つの時点でのサンプル中の小胞および／または細胞外小胞のレベルは、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である、より早期の時点からのサンプル中の細胞および／または細胞外小胞のレベルよりも、少なくとも、０．９９、０．９０、０．６６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１、０．０４、０．０２、０．０１、０．００１倍低いことができる。
別の例では、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋である、１つの時点でのサンプル中の小胞および／または細胞外小胞のレベルは、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋である、より早期の時点からのサンプル中の細胞および／または細胞外小胞のレベルよりも少なくとも、０．９９、０．９０、０．６６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１、０．０４、０．０２、０．０１、０．００１倍低いことができる。
さらなる例では、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋／ＣＤ４１ａ−である、１つの時点でのサンプル中の小胞および／または細胞外小胞のレベルは、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋／ＣＤ４１ａ−である、より早期の時点からのサンプル中の細胞および／または細胞外小胞のレベルよりも少なくとも、０．９９、０．９０、０．６６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１、０．０４、０．０２、０．０１、０．００１倍低いことができる。
【０１１６】
重症度の減少は、腫瘍が活性状態から不活性状態に変化中であるか若しくは変化したか、またはある活性状態から重症度が低下した活性状態に変化中であるか若しくは変化したか、または治療に対して応答中であるか若しくは応答的になりつつあることを意味する。
【０１１７】
本発明の実施形態では、形質細胞新生物を有するかまたは形質細胞新生物を有することが疑われる患者の進行を監視するための方法であって、少なくとも、２つの時点において、細胞および／または細胞外小胞を含むサンプルを前記患者から単離することと、および、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋／ＰＳ＋／ＣＤ４１ａ−である細胞および／または細胞外小胞のレベルの変化を判定することとを含み、その後の時点間でのＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋／ＰＳ＋／ＣＤ４１ａ−である細胞および／または細胞外小胞のレベルの、少なくとも、０．９の減少は、形質細胞新生物の重症度が減少していることを示す、方法が提供される。
【０１１８】
さらなる実施形態では、多発性骨髄腫を有するかまたは多発性骨髄腫を有することが疑われる患者の進行を監視するための方法であって、少なくとも、２つの時点において、細胞および／または細胞外小胞を含むサンプルを前記患者から単離すること、およびＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋である細胞および／または細胞外小胞のレベルの変化を判定することを含み、その後の時点間でのＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋である細胞および／または細胞外小胞のレベルの少なくとも、０．９の減少は、形質細胞新生物の重症度が減少していることを示す、方法が提供される。
【０１１９】
別の実施形態では、多発性骨髄腫を有するかまたは多発性骨髄腫を有することが疑われる患者の進行を監視するための方法であって、少なくとも、２週間だけ離れた少なくとも、２つの時点において、細胞および／または細胞外小胞を含む血液由来サンプルを前記患者から単離すること、および、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ４１ａ−である細胞および／または細胞外小胞のレベルの変化を判定することを含み、その後の時点間でのＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ４１ａ−である細胞および／または細胞外小胞のレベルの少なくとも、０．９の減少は、形質細胞新生物の重症度が減少していることを示す、方法が提供される。
【０１２０】
本発明者らは、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋であるとともにＣＤ３４＋である細胞および／または細胞外小胞のレベルを判定することが、形質細胞新生物の予後のより高感度な指標をもたらすことも見出している。
ＣＤ３４は、造血幹細胞上に見出され、幹細胞マーカーとして用いられる膜貫通タンパク質である。
【０１２１】
したがって、本発明の方法の好ましい実施形態では、判定されている細胞および／または細胞外小胞のレベルは、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋である細胞および／または細胞外小胞の集団に関する。
【０１２２】
本発明の方法の他の好ましい実施形態では、判定されている細胞および／または細胞外小胞のレベルは、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋／ＣＤ４１ａ−である細胞および／または細胞外小胞の集団に関する。
【０１２３】
本発明の実施形態では、多発性骨髄腫を有するかまたは多発性骨髄腫を有することが疑われる患者の予後診断（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）のための方法であって、細胞外小胞を含む血液由来サンプルを前記患者から単離すること、および、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋／ＣＤ４１ａ−である細胞外小胞のレベルを判定することを含む方法が提供される。
別の実施形態では、多発性骨髄腫を有するかまたは多発性骨髄腫を有することが疑われる患者の予後診断（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）のための方法であって、細胞を含む血液由来サンプルを前記患者から単離すること、および、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋／ＣＤ４１ａ−である細胞のレベルを判定することを含む方法が提供される。
【０１２４】
本発明者らは、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋であるとともに、ホスファチジルセリン陽性（ＰＳ＋）である細胞および／または細胞外小胞のレベルを判定することが、形質細胞新生物の予後診断（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）のより高感度な指標をもたらすことも見出している。
ＰＳは、一般に形質細胞膜に関連するリン脂質である。
【０１２５】
本発明の方法の好ましい実施形態では、判定されている細胞および／または細胞外小胞のレベルは、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋／ＰＳ＋である細胞および／または細胞外小胞の集団に関する。
【０１２６】
本発明の方法の特に好ましい実施形態では、判定されている細胞および／または細胞外小胞のレベルは、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋／ＰＳ＋／ＣＤ４１ａ−である細胞および／または細胞外小胞の集団に関する。
【０１２７】
本発明の実施形態では、多発性骨髄腫を有するかまたは多発性骨髄腫を有することが疑われる患者の予後診断（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）のための方法であって、細胞外小胞を含む血液由来サンプルを前記患者から単離すること、および、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋／ＰＳ＋／ＣＤ４１ａ−である細胞外小胞のレベルを判定することを含む方法が提供される。
別の実施形態では、多発性骨髄腫を有するかまたは多発性骨髄腫を有することが疑われる患者の予後診断（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）のための方法であって、細胞を含む血液由来サンプルを前記患者から単離すること、および、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋／ＰＳ＋／ＣＤ４１ａ−である細胞のレベルを判定することを含む方法が提供される。
【０１２８】
さらなる実施形態では、形質細胞新生物を有するかまたは形質細胞新生物を有することが疑われる患者の進行を監視するための方法であって、少なくとも、２つの時点において、細胞および／または細胞外小胞を含むサンプルを前記患者から単離すること、およびＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋／ＰＳ＋／ＣＤ４１ａ−である細胞および／または細胞外小胞のレベルの変化を判定することを含む方法が提供される。
【０１２９】
形質細胞新生物を有する患者において過剰生成され、且つ／または異常になり、且つ／またはＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞は、骨髄において生成されるか、またはそれらの起源を有することになることが理解されるであろう。
発生のいずれかの段階において、細胞は、骨髄から外部に遊走し、本発明の方法において用いられるサンプル中に存在し得る循環細胞になることがある。
【０１３０】
骨髄は、発生の様々な段階での血球を有する。
しかし、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞およびそれらの由来元であり得る細胞の特徴付けは、細胞がたとえば脱分化状態になり、且つ／または通常の同定方法において用いられる「既知の」細胞表面マーカーを脱落させ（ｓｈｅｄ）、且つ／または分裂し（ｄｉｖｉｄｅ）、通常の方法により特徴付け可能な細胞型に決して完全に分化しないことがあるという理由から問題を含む。
これらの要素は、細胞の発生段階を特徴付けることも困難にする。
【０１３１】
さらに、患者が形質細胞新生物を有するとき、腫瘍化する細胞が「形質細胞」と称されることが多いが、これは、実際には、多種の形質様細胞または発生的に形質細胞に先行する細胞の異質性集団を反映している可能性がある。
理論によって制限されることを望むものではないが、腫瘍または形質細胞と見なされることがない前駆細胞も形質細胞新生物の予後診断（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）および診断にとって示唆的であり得ることが提起される。
【０１３２】
したがって、本発明の方法において用いられるサンプルは、骨髄において生成される任意の細胞を含有し得、たとえば、造血幹細胞または間葉系幹細胞に由来する細胞を含み得る。
造血幹細胞は、一般に、造血幹細胞マーカーＣＤ３４の存在によって同定され得る一方、間葉系幹細胞は、一般に、その細胞表面上にＣＤ３４を発現しない。
【０１３３】
本発明の実施形態では、サンプルは、造血幹細胞であるかまたは造血幹細胞に起源をもつ細胞を含む。
サンプル中の細胞は、造血幹細胞として分類され得るか、または細胞は、幹細胞段階を越えて分化し得る。
造血幹細胞が本発明の方法において用いられるサンプル中の細胞になるこの分化は、典型的であるかまたは異常であり得る。
【０１３４】
典型的には、造血幹細胞分化のより早期の段階の１つは、骨髄系前駆細胞またはリンパ系前駆細胞のいずれかへの分化である。
骨髄系前駆細胞は、最終的に、赤血球、血小板、顆粒球およびマクロファージを含む極めて多数の異なる細胞型に発現する。
【０１３５】
したがって、本発明の実施形態では、サンプルは、骨髄系前駆細胞であるかまたは骨髄系前駆細胞に起源をもつ細胞を含む。
本発明の他の実施形態では、サンプルは、リンパ系前駆細胞であるかまたはリンパ系前駆細胞に起源をもつ細胞を含む。
【０１３６】
典型的には、リンパ系前駆細胞は、Ｔリンパ球細胞、ナチュラルキラー細胞およびＢリンパ球細胞へのさらなる発生を経る。
Ｂリンパ球は、活性化時、抗体を産生する形質細胞になる。
一般に、Ｂ細胞は、新生物が、後に細胞死を経ないどころか、制御されない様式で分裂し続ける、異常な形質細胞（または「形質様」細胞）の１つの生成とともに開始すると考えられることから、形質細胞新生物に関連する。
形質様細胞は、典型的に発生している形質細胞と表現型的に類似し得るか、またはたとえば、大きさ、形態学的細胞表面マーカー、遊走パターンおよび／若しくは細胞周期の長さにおいて異なり得る。
【０１３７】
したがって、本発明の実施形態では、サンプルは、Ｂリンパ球細胞に起源をもつ細胞を含む。
【０１３８】
発生のいずれかの段階において、上記細胞のいずれかは、本発明の方法において用いられるサンプル中に存在し得る循環細胞になり得る。
【０１３９】
本発明の方法において用いられるサンプルは、主に特定の細胞型を含む濃縮または清澄化されたサンプルであり得る。
これは、望まれない細胞型をサンプルから除去するためのステップが取られ得ることを意味し、またこれは、たとえば、遠心分離方法、特定の細胞表面マーカーに基づく親和性方法によりまたは大きさ、密度若しくは形態学的差異を用いることにより達成され得る。
たとえば、リンパ系前駆細胞およびリンパ系前駆細胞に起源をもつ細胞は、細胞表面マーカー、ＣＤ３４および／または、ＣＤ３８および／または、ネプリライシンを含み得、またこれは、これらの細胞を免疫親和性方法により単離するために用いられ得る。
【０１４０】
本発明の方法において用いられるサンプルは、上記の細胞のいずれかから生成または誘導される細胞外小胞を含有し得る。任意の個別の細胞または特定の細胞型は、細胞外小胞の２つ以上のタイプを放出し得る。
【０１４１】
サンプルは、循環することのない細胞または様々な組織内で維持されるか若しくはそれらの一部を形成する細胞から生成される細胞外小胞を含有し得、たとえば、サンプルは、骨髄または患者の血流に侵入している内皮若しくは胸腺における細胞からの細胞外小胞を含み得る。
形質細胞新生物を有する患者では、サンプルは、患者の血液、唾液若しくは尿に侵入する前、様々な組織内の新生物形質細胞から排出（ｓｈｅｄ）されているか、または患者の血液、唾液若しくは尿中に既に存在する新生物形質細胞から排出された（ｓｈｅｄ）細胞外小胞を含み得る。
【０１４２】
細胞外小胞は、異常な形質細胞または形質様細胞により生成され得、たとえば骨髄腫を有する患者によって生成されるものが挙げられる。
【０１４３】
サンプルは、他の細胞型、および／または細胞成分、および／または小胞成分を、これらの成分が前記形質細胞および／または形質細胞由来の細胞外小胞のレベルを判定するためのアッセイに明確に干渉しないことを条件として含み得る。
【０１４４】
本発明の方法において用いられるサンプル中に含まれる細胞外小胞は、細胞間環境内に放出されるリン脂質二重層膜を含む任意の小胞であり得る。
小胞は、一般に球状であり、且つサイズが１ｎｍ〜１００００ｎｍ厚の範囲であり得、またそれらの由来元である細胞からのタンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡおよび脂質を含み得る。一般に、細胞外小胞の組成物は、その由来元であった細胞のものを反映する。
【０１４５】
細胞外小胞として、たとえばエキソソーム、微小粒子、オンコソーム、大型オンコソーム、ミグラソーム（ｍｉｇｒａｓｏｍｅｓ）およびアポトーシス小胞が挙げられる。エキソソームは、エンドソーム起源を有し、多胞体エンドソームと細胞の原形質膜との融合により細胞から放出される。
微小粒子が細胞の原形質膜から直接的に出芽し、それらの膜組成物がそれらの親細胞と密接に関連することが多い。
アポトーシス体は、アポトーシス過程で原形質膜断片として細胞から放出されるより大型の細胞外小胞であり、細胞小器官および核断片などの追加的成分を含み得る。
【０１４６】
一般に、腫瘍細胞から放出される、構造的且つ機能的に異常である、突然変異体および潜在的に形質転換分子（即ち癌遺伝子および／または腫瘍性タンパク質など）を含む任意の細胞外小胞は、オンコソームと称され得る。
大型オンコソームは、原形質膜の出芽または小疱形成を介して、侵襲性または転移性腫瘍細胞に由来するオンコソームの異なるカテゴリーであり、発癌性材料を含有する。
ミグラソームは、遊走細胞間のコミュニケーションを可能にする遊走細胞の後端（後縁）に由来する細胞外小胞であり、より小型の内部小胞を含有し得る。
【０１４７】
本発明の方法において用いられるサンプル中の特定の細胞外小胞は、細胞外小胞の２つ以上の異なるタイプとして分類可能であり得ることが理解されるであろう。
たとえば、形質細胞新生物を有する患者における異常な形質細胞から放出されるエキソソームもオンコソームと称され得る。
【０１４８】
本発明の方法において用いられるサンプルは、エキソソーム、微小粒子、オンコソーム、大型オンコソーム、ミグラソーム、アポトーシス小胞および／または任意の他の細胞外小胞の混合物を含み得る。
好ましくは、サンプルは、エキソソームおよび／または微小粒子を含む。
【０１４９】
本発明の実施形態では、細胞外小胞は、微小胞またはエクトソームと称されることが多い微小粒子である。
【０１５０】
本発明の方法において用いられる微小粒子は、大部分の細胞型の原形質膜の出芽によって生成される小型の膜小胞である。
サンプルは、微小粒子の異質集団を含み得る。
微小粒子のサイズは、典型的には０．１〜１ｍｍの直径であり得るが、限定はされない。
【０１５１】
本発明の実施形態では、多発性骨髄腫を有するかまたは多発性骨髄腫を有することが疑われる患者の予後診断（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）のための方法であって、骨髄において生成される細胞および／または骨髄において生成される細胞由来の微小粒子を含むサンプルを前記患者から単離すること、および、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ４１ａ−である、骨髄において生成される細胞および／または骨髄において生成される細胞由来の微小粒子のレベルを判定することとを含み、サンプルが、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ４１ａ−である、骨髄において生成される細胞および／または骨髄において生成される細胞由来の微小粒子を、多発性骨髄腫を有しないかまたは寛解性の多発性骨髄腫を有する対象を示す参照対照よりも少なくとも、１．１倍高いレベルで含むとき、多発性骨髄腫が安定、進行性または難治性である予後が判定される、方法が提供される。
【０１５２】
本発明の実施形態では、多発性骨髄腫を有するかまたは多発性骨髄腫を有することが疑われる患者の予後診断（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）のための方法であって、骨髄において生成される細胞および／または骨髄において生成される細胞由来の微小粒子を含むサンプルを前記患者から単離すること、および、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ４１ａ−である、骨髄において生成される細胞および／または骨髄において生成される細胞由来の微小粒子のレベルを判定することを含み、サンプルが、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ４１ａ−である、骨髄において生成される細胞および／または骨髄において生成される細胞由来の微小粒子を、安定な多発性骨髄腫を有する対象を示す参照対照よりも少なくとも、１．１倍高いレベルで含むとき、多発性骨髄腫が進行性または難治性である予後が判定される、方法が提供される。
【０１５３】
本発明の実施形態では、多発性骨髄腫を有するかまたは多発性骨髄腫を有することが疑われる患者の予後診断（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）のための方法であって、骨髄において生成される細胞および／または骨髄において生成される細胞由来の微小粒子を含むサンプルを前記患者から単離すること、および、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ４１ａ−である、骨髄において生成される細胞および／または骨髄において生成される細胞由来の微小粒子のレベルを判定することを含み、サンプルが、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ４１ａ−である、骨髄において生成される細胞および／または骨髄において生成される細胞由来の微小粒子を、進行性多発性骨髄腫を有する対象を示す参照対照よりも少なくとも、１．１倍高いレベルで含むとき、多発性骨髄腫が難治性である予後（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）が判定される、方法が提供される。
【０１５４】
別の実施形態では、多発性骨髄腫を有するかまたは多発性骨髄腫を有することが疑われる患者の進行を監視するための方法であって、少なくとも、２週間だけ離れた少なくとも、２つの時点において、骨髄において生成される細胞および／または骨髄において生成される細胞由来の微小粒子を含む血液由来サンプルを前記患者から単離すること、および、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ４１ａ−である、骨髄において生成される細胞および／または骨髄において生成される細胞由来の微小粒子のレベルの変化を判定することを含み、その後の時点間での、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ４１ａ−である、骨髄において生成される細胞および／または骨髄において生成される細胞由来の微小粒子のレベルの少なくとも、１．１倍の増加は、形質細胞新生物の重症度が増加していることを示す、方法が提供される。
【０１５５】
別の実施形態では、多発性骨髄腫を有するかまたは多発性骨髄腫を有することが疑われる患者の進行を監視するための方法であって、少なくとも、２週間だけ離れた少なくとも、２つの時点において、骨髄において生成される細胞および／または骨髄において生成される細胞由来の微小粒子を含む血液由来サンプルを前記患者から単離すること、および、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ４１ａ−である、骨髄において生成される細胞および／または骨髄において生成される細胞由来の微小粒子のレベルの変化を判定することを含み、その後の時点間での、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ４１ａ−である、骨髄において生成される細胞および／または骨髄において生成される細胞由来の微小粒子のレベルの少なくとも、０．９の減少は、形質細胞新生物の重症度が減少していることを示す、方法が提供される。
【０１５６】
本発明の実施形態では、細胞外小胞は、エキソソームである。
サンプルは、１〜２００ｎｍの直径の範囲であるサイズを有するエキソソームの異質集団を含み得る。
【０１５７】
本発明の実施形態では、細胞外小胞は、アポトーシス小胞である。
サンプルは、１０００〜５０００ｎｍの直径の範囲であるサイズを有するアポトーシス小胞の異質集団を含み得る。
【０１５８】
本発明の実施形態では、細胞外小胞は、大型オンコソームである。
サンプルは、１０００〜１００００ｎｍの直径の範囲であるサイズを有する大型オンコソームの異質集団を含み得る。
【０１５９】
本発明の実施形態では、細胞外小胞は、ミグラソームである。
サンプルは、５００〜１５００ｎｍの直径の範囲であるサイズを有するミグラソームの異質集団を含み得る。
【０１６０】
本発明の方法において用いられるサンプルは、主にエキソソーム、微小粒子、オンコソーム、大型オンコソーム、ミグラソームおよびアポトーシス小胞を含む濃縮または清澄化されたサンプルであり得る。
これは、望まれない細胞外小胞をサンプルから除去するためのステップが取られ得ることを意味し、またこれは、一般に細胞外小胞のタイプ間のサイズおよび密度の差異を用いることによってなされ、それは、顕微鏡分析によって確認され得る。
主にエキソソーム、微小粒子、オンコソーム、大型オンコソーム、ミグラソームおよびアポトーシス小胞を含むサンプルは、たとえば、分画遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー、高分子沈降法、水性２相系、ショ糖密度勾配遠心分離および精密濾過を介して調製され得る。
【０１６１】
エキソソーム、微小粒子、オンコソーム、大型オンコソーム、ミグラソームまたはアポトーシス小胞を主に含む細胞外小胞の集団は、分画遠心を含む方法を介することにより単離され得る。
【０１６２】
たとえば、エキソソームは、１００，０００〜２００，００ｇでの超遠心分離により単離され得る一方、微小粒子は、１０，０００〜２０，０００ｇでの遠心分離により単離され得る。
微小粒子は、より高速な遠心分離を用いて単離され得るが、これらのサンプルは、幾つかのエキソソームも含み得る。
【０１６３】
エキソソーム、微小粒子、オンコソーム、大型オンコソーム、ミグラソームまたはアポトーシス小胞を主に含む細胞外小胞の集団は、特定のマーカーに依存する親和性方法によっても単離され得る。
たとえば、エキソソームは、テトラスパニン、Ａｌｉｘ、セラミド、フロチリン、ＲａｂおよびＴＳＧ１０１などの輸送に必要なエンドソーム選別複合体（ＥＳＣＲＴ）の成分並びにエキソソーム生合成に関与する他のタンパク質の存在を介して単離され得る。
微小粒子は、インテグリン、セレクチンおよびそれらの親細胞由来の膜関連マーカー並びにＡＲＦ６およびＲｈｏファミリーメンバーの存在を介して単離され得る。
アポトーシス体は、ホスファチジルセリンおよびそれらの親細胞からの膜関連マーカーを介して単離され得る。
オンコソームは、癌特異的バイオマーカーにより単離され得る。
ミグラソームは、インテグリンまたは遊走細胞のリトラクションファイバー（ｒｅｔｒａｃｔｉｏｎ  ｆｉｂｒｅ）に関連するマーカーの存在を介して単離され得る。
【０１６４】
細胞および／または細胞外小胞の関連集団のレベルを判定するため、ＣＤ１３８、ＣＤ３４、Ｐ−ｇｐ、ＰＳおよび／またはＣＤ４１ａに対応する適切な細胞関連および／または小胞関連分子を検出することに依存した様々な方法が用いられ得る。
細胞および／または細胞外の関連集団のレベルは、ＣＤ１３８、ＣＤ３４、Ｐ−ｇｐ、ＰＳおよび／若しくはＣＤ４１ａタンパク質およびその断片並びに／またはＣＤ１３８、ＣＤ３４、Ｐ−ｇｐ、ＰＳおよび／若しくはＣＤ４１ａをコードするｍＲＮＡおよびその断片を検出することに依存する任意のアッセイにより判定され得る。
【０１６５】
本発明の方法は、ＣＤ１３８、ＣＤ３４、Ｐ−ｇｐ、ＰＳおよび／若しくはＣＤ４１ａ分子の上のエピトープに特異的に結合する分子、たとえば抗体および他の親和性ペプチドなど、並びに核酸に結合および／またはハイブリダイズし得る分子に依存し得る。
抗体を含む方法は、集合的に免疫親和性法と称され得る。
細胞および／または形質細胞由来微小粒子を全体、破裂、溶解またはそれらの組み合わせのいずれかで含むサンプルは、関連集団のレベルを判定するため、細胞表面および／または微小粒子関連タンパク質に特異的な抗体を用いて、さらなる選択および／または検出ステップを施すことができる。
【０１６６】
ＣＤ１３８、ＣＤ３４、Ｐ−ｇｐ、ＰＳおよび／またはＣＤ４１ａに特異的に結合する抗体は、直接的にまたはＣＤ１３８、ＣＤ３４、Ｐ−ｇｐ、ＰＳおよびＣＤ４１ａ抗体（すなわち、一次抗体）に特異的に結合する分子、たとえば二次抗体を介して検出され得る
【０１６７】
一次および／または二次抗体は、サンプル中において、たとえば、
ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋、
ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋、
ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＰＳ＋、
ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋／ＰＳ＋、
ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ４１ａ、
ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋／ＣＤ４１ａ−、
ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＰＳ＋／ＣＤ４１ａ−および／または
ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋／ＰＳ＋／ＣＤ４１ａ−
である細胞および／または細胞外小胞を捕捉、単離、計数および／または検出し、それによりサンプル中の前記細胞および／または細胞外小胞のレベルの判定を可能にするために用いられ得る。
【０１６８】
細胞および／または細胞外小胞の関連集団のレベルは、親和性分子を用いるＣＤ１３８、ＣＤ３４、Ｐ−ｇｐ、ＰＳおよび／またはＣＤ４１ａの検出に依存する任意の免疫親和性または捕捉アッセイにより判定され得る。
抗体などの親和性分子を用いて細胞および／または細胞外小胞を捕捉、単離、計数および／または検出するために用いられるこれらの方法は、当業者に周知であり、たとえば親和性プルダウン、ウエスタンブロット解析、ドットブロット解析、ラジオ免疫アッセイ、フローサイトメトリー、ＦＡＣＳ分析、磁気ビーズ、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光およびアフィニティークロマトグラフィーを含むことになる。
当業者であれば、これらの方法の一部または全部が、定量的且つ／または定性的に（すなわち、細胞および／若しくは小胞についての数を判定するため、または単に特定の集団を同定および／若しくは単離するために、ＦＡＣＳ分析を用いて；バンドのデンシオメトリー（ｄｅｎｓｉｏｍｅｔｒｉｃ）分析により、サンプル中のタンパク質またはその断片のレベルを判定するため、または単にタンパク質若しくはその断片の存在若しくは不在を判定するためのウエスタンブロット解析を用いて）利用され得ることを理解するであろう。
【０１６９】
本発明の方法は、ノーザンブロット分析、ヌクレアーゼ保護アッセイ、インサイチュハイブリダイゼーションおよびＲＴ−ＰＣＲなどの方法を用いてのｍＲＮＡまたはその断片の検出にも依存し得る。
【０１７０】
捕捉または単離されている細胞外小胞の集団は、当業者に公知の任意の他の方法、たとえば、限定はされないが、電子顕微鏡、光学的な単一粒子追跡および抵抗パルスセンシングを介しても定量化され得る。
【０１７１】
定義
文脈上特に明確に要求されない限り、本明細書および特許請求の範囲の全体を通して、用語「含む」、「含んでいる」などは、排他的または厳密な意味に対抗するように包括的意味で、即ち「限定はされないが、含む」の意味で解釈されるべきである。
【０１７２】
本明細書との関連では、用語「約」は、当技術分野での実施あたり１つ以上の標準偏差以内を意味し得る。
代わりに、「約」は、最大２０％の範囲を意味し得る。本明細書および特許請求の範囲で特定の値が提供されるとき、「約」の意味は、その特定の値における許容できる誤差範囲内に含まれると仮定される必要がある。
【０１７３】
本明細書との関連では、ある範囲があるパラメータに対して記述される場合、パラメータは、記述された範囲内のすべての値を含み、記述された範囲のエンドポイントを含むことが理解されるであろう。
【０１７４】
本発明との関連では、用語「患者」は、癌に関連した少なくとも、１つの症状を経験し且つ／または呈している動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを指す。
典型的には、患者は、癌を有する個体であり、医師の臨床管理下にある。
患者は、ヒトであり得るかまたは非ヒトであり得ることから、患者または個体を指すとき、ヒトまたは非ヒト、たとえば社会的、経済的または研究的に重要ないずれかの種の個体、たとえば、限定はされないが、ヒツジ、ウシ、ウマ、ブタ、ネコ、イヌ、霊長類、齧歯類の分類のメンバー、特にそれら分類の家畜化されたメンバー、たとえば、ヒツジ、ウシ、ウマおよびイヌを意味する。
さらに、本明細書で用いられるとき、さらに「それを必要とする患者」は、癌のいずれの症状も示していないが、医師、臨床医または他の医学的専門家により癌を発現するリスクがあると見なされている患者であり得る。
たとえば、患者は、限定はされないが、家族歴、素因、共存／寄与する癌を含む患者の病歴の結果として、癌を発現するリスクがある（したがって予防または予防治療を必要とする）と見なされ得る。
【０１７５】
【図面の簡単な説明】
【０１７６】
ここで、本発明の実施形態が、あくまで例として、以下の貼付の図面を参照して記載される。
【図１】Ｐ−ｇｐ＋微小粒子は、多発性骨髄腫において増加する。多発性骨髄腫患者および健常対象における全微小粒子（ＣＤ４１ａ−）集団中のＰ−ｇｐ＋微小粒子数がＴｒｕＣｏｕｎｔ（商標）ビーズを用いて判定された。（Ａ）Ｐ−ｇｐ＋微小粒子数は、多発性骨髄腫患者（ｎ＝６９）において健常ボランティア（ｎ＝２５）と比べて有意により多かった（ｐ＜０．０１（＊＊））。（Ｂ）Ｐ−ｇｐ＋微小粒子数は、ｄｅ  ｎｏｖｏ（ｎ＝１４）および進行性疾患（ＰＤ、ｎ＝１７）における患者において健常ボランティアと比べてより多かった（ｐ＜０．０１（＊＊））。  健常ボランティアのＰ−ｇｐ＋微小粒子数における、部分寛解（ＰＲ、ｎ＝３２）および完全寛解（ＣＲ、ｎ＝１３）における患者と比べた有意差は認められなかった。Ｐ値は、マン・ホイットニーのＵ検定を用いて生成され、データは、平均として表される。
【図２】ＣＤ１３８＋微小粒子は、Ｐ−ｇｐを有意に発現しない。（Ａ）ＣＤ１３８＋Ｐ−ｇｐ＋微小粒子数は、多発性骨髄腫において健常ボランティアと比べて増加したが、ＣＤ１３８＋微小粒子集団内で有意でなかった。（Ｂ）結果として、ｄｅ  ｎｏｖｏ（ｎ＝１４）、ＰＲ（ｎ＝３２）、ＣＲ（ｎ＝１３）およびＰＤを通したＣＤ１３８＋Ｐ−ｇｐ＋微小粒子数は、増加したが、有意でなかった。（Ｃ）ＣＤ１３８−Ｐ−ｇｐ＋微小粒子数は、多発性骨髄腫患者において健常ボランティア（ｎ＝２５）と比べて有意に増加した（ｐ＜０．０１（＊＊））。（Ｄ）ＣＤ１３８−Ｐ−ｇｐ数は、ｄｅ  ｎｏｖｏコホート（Ｐ＝０．０００２（＊＊＊））およびＰＤ（ｐ＜０．０５（＊））において有意により高かったが、ＣＲ、ＰＲでは有意でなかった。Ｐ値は、マン・ホイットニーのＵ検定を用いて生成され、データは、平均として表される。
【図３】治療期間中、侵襲性疾患を有する５６歳患者（患者１）におけるＰ−ｇｐ＋微小粒子  微小粒子は、診断時および治療期間中、５６歳多発性骨髄腫患者のＰＦＰから単離された。絶対Ｐ−ｇｐ＋微小粒子数（Ｙ軸）および診断後の微小粒子サンプリングの時間（Ｘ軸）が示される。（Ａ）（ＣｙＢｏｒＤ、黒点；ＢｏｒＤ、淡紅点；ＶＴＤ、青点、レナリドミド／デキサメタゾン、赤点およびＤ−ＰＡＣＥおよびメルファラン、緑点）、（Ｂ）患者１のＣＤ４１ａ−ＣＤ１３８＋微小粒子特性、（Ｃ）対応するＣＤ４１ａ−ＣＤ１３８Ｐ−ｇｐ＋および（Ｄ）患者１のＣＤ４１ａ−ＣＤ１３８＋Ｐ−ｇｐ＋微小粒子特性。
【図４】２０１５年５月の部分寛解および「二重陽性」集団における、＋／−染色患者１におけるパラメータを規定するためのアイソタイプマッチ対照  ＣＤ１３８＋／−集団が、ＰＲにおける患者１における抗ＣＤ１３８−ＡＰＣ＋／−染色に基づいてゲーティングされた。アイソタイプマッチ対照は、ＰＲにおける患者１に対して、ＣＤ１３８−Ｐ−ｇｐ＋ＣＤ３４＋（４Ａ、左パネル）およびＣＤ１３８＋／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋（４Ａ、右パネル）についての陽性および陰性染色に対するゲーティングパラメータを規定するために用いられた。（Ｂ）ゲートは、ＰＲにおける患者１に対する、ＣＤ１３８−ＣＤ３４＋アネキシンＶ＋（４Ｂ、左パネル）およびＣＤ１３８＋／ＣＤ３４＋アネキシンＶ＋（４Ｂ、右パネル）について規定された。（Ｃ）微小粒子は、ＣＤ１３８−／＋染色に基づいて、「二重陽性」集団の存在のために、部分寛解状態で、患者１の表現型が決定された。本発明者らは、ＣＤ１３８−（赤色事象）およびＣＤ１３８＋（青色事象）微小粒子サブセットにおけるＰ−ｇｐ、ＣＤ３４の存在をフローサイトメトリーにより評価した（４Ｃ、それぞれ左およびパネル）。（Ｄ）微小粒子は、微小粒子のＣＤ１３８−（４Ｄ、左パネル、黄色事象）およびＣＤ１３８＋亜集団（４Ｄ、右パネル、オレンジ色事象）において、アネキシンＶを用いてＰＳ濃縮のレベルについても表現型が決定された。
【図５】侵襲性疾患を有する患者１における「二重陽性」微小粒子のレベルの上昇である。  ＣＤ１３８−（赤色事象）およびＣＤ１３８＋（青色事象）微小粒子亜集団におけるＰ−ｇｐおよびＣＤ３４の存在が患者１において、フローサイトメトリーにより確立された。（Ａ）微小粒子径ゲート（左パネル）、次いでＣＤ４１ａ（中間パネル）およびＣＤ１３８（右パネル）に対するゲーティングを用いる連続ゲーティング法が全微小粒子集団（左パネル）に適用された。ＣＤ４１ａ−集団は、抗ＣＤ４１ａ−ＰＥについての＋／−染色に基づいて規定された（中間パネル）。（Ｂ）全集団（ＣＤ４１ａ−）は、ＣＤ１３８−／＋染色に基づいてゲーティングされた（それぞれ左パネル、赤色事象、右パネル、青色事象）。この微小粒子集団内において、本発明者らは、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋（左パネル、ゲートＰ１）集団およびＣＤ１３８＋Ｐ−ｇｐ＋ＣＤ３４＋亜集団（右パネル、ゲートＰ４）について表現型を決定した。（Ｃ）ＣＤ１３８微小粒子サブタイプ（それぞれ左および右パネルのゲートＰ１およびＰ４）。ＣＤ１３８微小粒子サブタイプ（それぞれ左および右パネルのゲートＰ１およびＰ４）は、それぞれ、アネキシンＶを用いてＰＳ曝露の存在について、ゲーティングおよび表現型が決定された（左パネル、ゲートＰ１１、黄色事象）（右パネル、ゲートＰ１２、オレンジ色事象）。
【図６】患者２（ＰＤ）および３（安定）における、＋／−染色に対するパラメータを規定するためのアイソタイプマッチ対照である。（Ａ）ＣＤ１３８＋／−集団が、患者２および３における抗ＣＤ１３８−／ＡＰＣ＋／−染色に基づいてゲーティングされた。アイソタイプマッチ対照は、患者２におけるＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋（２Ａ、左パネル）およびＣＤ１３８＋／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋（２Ａ、右パネル）についての陽性および陰性染色に対するゲーティングパラメータを規定するために用いられた。（Ｂ）ゲートは、患者２におけるＣＤ１３８−／ＣＤ３４＋／アネキシンＶ＋（２Ｂ、左パネル）およびＣＤ１３８＋／ＣＤ３４＋／アネキシンＶ＋（２Ｂ、右パネル）について規定された。（Ｃ）アイソタイプマッチ対照は、患者３におけるＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋（２Ｃ、左パネル）およびＣＤ１３８＋／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋（２Ｃ、右パネル）についての陽性および陰性染色に対するゲーティングパラメータを規定するために用いられた。（Ｄ）ゲートは、患者３におけるＣＤ１３８−／ＣＤ３４＋／アネキシンＶ＋（２Ｄ、左パネル）およびＣＤ１３８＋／ＣＤ３４＋アネキシンＶ＋（２Ｄ、右パネル）について規定された。
【図７】進行性疾患の６６歳女性患者（患者２）および安定状態の６３歳男性患者（患者３）である。  ＣＤ１３８−（赤事象）およびＣＤ１３８＋（青事象）微小粒子亜集団におけるＰ−ｇｐおよびＣＤ３４の存在が、患者２および３においてフローサイトメトリーにより確立された。（Ａ）全集団（ＣＤ４１ａ−）がＣＤ１３８−／＋染色に基づいてゲーティングされた（それぞれ、左パネル、赤事象、右パネル、青事象）。  この微小粒子集団内において、本発明者らは、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋（左パネル、ゲートＰ１）集団およびＣＤ１３８＋／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋亜集団（右パネル、ゲートＰ４）について表現型を決定した。（Ｂ）ＣＤ１３８微小粒子サブタイプ（それぞれ、左および右パネルのゲートＰ１およびＰ４）は、それぞれ、アネキシンＶを用いて、ＰＳ曝露の存在についてゲーティングおよび表現型が決定された（左パネル、ゲートＰ１１、黄色事象）（右パネル、ゲートＰ１２、オレンジ色事象）。
【図８】患者４（ＰＲ）および５（寛解）における＋／−染色に対するパラメータを規定するためのアイソタイプマッチ対照である。（Ａ）ＣＤ１３８＋／−集団が患者４および５における抗ＣＤ１３８−／ＡＰＣ＋／−染色に基づいてゲーティングされた。  アイソタイプマッチ対照は、患者４におけるＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋（３Ａ、左パネル）およびＣＤ１３８＋／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋（３Ａ、右パネル）についての陽性および陰性染色に対するゲーティングパラメータを規定するために用いられた。（Ｂ）ゲートは、患者４におけるＣＤ１３８−／ＣＤ３４＋／アネキシンＶ＋（３Ｂ、左パネル）およびＣＤ１３８＋／ＣＤ３４＋／アネキシンＶ＋（３Ｂ、右パネル）について規定された。（Ｃ）アイソタイプマッチ対照は、患者５におけるＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋（３Ｃ、左パネル）およびＣＤ１３８＋／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋（３Ｃ、右パネル）についての陽性および陰性染色に対するゲーティングパラメータを規定するために用いられた。（Ｄ）ゲートは、患者５におけるＣＤ１３８−／ＣＤ３４＋／アネキシンＶ＋（３Ｄ、左パネル）およびＣＤ１３８＋／ＣＤ３４＋／アネキシンＶ＋（３Ｄ、右パネル）について規定された。
【図９】部分寛解にある７１歳男性患者（患者４）および寛解期の６２歳男性患者（患者５）−長期生存者。  ＣＤ１３８−（赤事象）およびＣＤ１３８＋（青事象）微小粒子亜集団におけるＰ−ｇｐおよびＣＤ３４の存在が患者４および５においてフローサイトメトリーにより確立された。（Ａ）全集団（ＣＤ４１ａ−）がＣＤ１３８−／＋染色に基づいてゲーティングされた（それぞれ、左パネル、赤事象、右パネル、青事象）。  この微小粒子集団内において、本発明者らは、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋（左パネル、ゲートＰ１）集団およびＣＤ１３８＋／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋亜集団（右パネル、ゲートＰ４）について表現型を決定した。（Ｂ）ＣＤ１３８微小粒子サブタイプ（それぞれ、左および右パネルのゲートＰ１およびＰ４）は、それぞれアネキシンＶを用いてＰＳ曝露の存在についてゲーティングおよび表現型が決定された（左パネル、ゲートＰ１１、黄色事象）（右パネル、ゲートＰ１２、オレンジ色事象）。
【図１０】ＰＳ＋微小粒子は、多発性骨髄腫におけるより侵襲性の高い状態を表す。  多発性骨髄腫患者および健常対象におけるアネキシンＶ＋微小粒子数がＴｒｕｃｏｕｎｔ（商標）ビーズを用いて比較された。（Ａ）ＰＳ＋微小粒子数は、多発性骨髄腫患者（ｎ＝７４）において健常ボランティア（ｎ＝２５）と比べて有意により多かった（ｐ＜０．０１（＊＊））。（Ｂ）ＰＳ＋微小粒子数は、ｄｅ  ｎｏｖｏ（ｎ＝１４）、部分寛解（ｎ＝３１）および進行性疾患（ＰＤ、ｎ＝１８）において、健常ボランティア（ｎ＝２５）と比べて、より多かった。ＣＲ（ｎ＝１５）と健常ボランティアとの間で、アネキシンＶ＋微小粒子数の有意差は認められなかった。Ｐ値は、マン・ホイットニーのＵ検定を用いて生成され、データは、平均として表される（Ｐ＜０．０１（＊＊）、ｐ＜０．０５（＊））。
【図１１】ＰＳ＋およびＣＤ１３８は、進行性疾患において同時発現しない。（Ａ）多発性骨髄腫患者におけるＣＤ１３８＋微小粒子サブセットにおけるＰＳ＋微小粒子は、多発性骨髄腫患者において、健常ボランティアと比べて、有意に増加した（ｐ＜０．０１、（＊＊））。（Ｂ）ｄｅ  ｎｏｖｏおよびＰＲコホートにおけるＣＤ１３８＋／ＰＳ＋微小粒子レベルは、健常ボランティアと比べて有意により高かった（ｐ＜０．０１、（＊＊））一方、ＣＲおよびＰＤは、健常ボランティアと比べてわずかなレベルを有した。（Ｃ）ＣＤ１３８−微小粒子サブセットにおけるＰＳ＋微小粒子は、多発性骨髄腫患者において、健常ボランティアにおける場合と比べて、有意に増加した。（Ｄ）ＣＤ１３８−／ＰＳ＋微小粒子は、ｄｅ  ｎｏｖｏおよびＰＤコホートにおいて、健常ボランティアと比べて、有意により高かった。ＣＲおよびＰＲコホートにおける健常ボランティアと比べた有意差は認められなかった。Ｐ値を生成するため、マン・ホイットニーのＵ検定が実施され、データは、平均として表される（Ｐ＜０．０１（＊＊））。
【図１２】異なる臨床状態を通した微小粒子サブタイプを示す表である。
【発明を実施するための形態】
【０１７７】
ここで、本発明の好ましい実施形態があくまで例として貼付の図面に関連して記載される。
【実施例】
【０１７８】
実施例１
試薬および抗体
アネキシンＶ−Ｖ４５０（ＢＤ  Ｈｏｒｉｚｏｎ（商標））、抗ＣＤ１３８−ＡＰＣ（クローンＭＩ１５）、抗ＣＤ４１ａ−ＰＥ（クローンＨＩＰ８）、抗Ｐ−ｇｐ−ＦＩＴＣ（クローン１７Ｆ９）、抗ＣＤ３４−ＰＥ−Ｃｙ７（クローン８Ｇ１２  Ｙ７）、マッチしたアイソタイプ対照ＢＤ（商標）ＣｏｍｐＢｅａｄ抗マウス−Ｉｇｋ、Ｓｐｈｅｒｏ（商標）Ｒａｉｎｂｏｗ較正粒子およびＴｒｕＣｏｕｎｔ（商標）チューブは、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ａｕｓｔｒａｌｉａから入手した。
直径０．３（カタログ番号ＬＢ３）および１．１（カタログ番号ＬＢ１１）μｍのラテックスビーズを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ａｕｓｔｒａｌｉａから購入した。
【０１７９】
試験設計および患者
この試験は、シドニー地区保健局（ＳＬＨＤ）−  Ｃｏｎｃｏｒｄ  Ｒｅｐａｔｒｉａｔｉｏｎ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ（ＣＲＧＨ）のヒト研究倫理委員会（ＨＲＥＣ）［（ＨＲＥＣ／１１／ＣＲＧＨ／２２３−ＣＨ６２／６／２０１１−１５０］、Ｒｏｙａｌ  Ｐｒｉｎｃｅ  Ａｌｆｒｅｄ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ（ＲＰＡＨ）ＨＲＥＣ（ＳＳＡ／１２／ＲＰＡＨ／１０）およびシドニー工科大学（２０１２−００４Ｒ）によって認可された。
血液サンプルは、ヘルシンキ宣言に従い、多発性骨髄腫患者および健常ボランティア（＞１８歳）からインフォームドコンセント後にＣＲＧＨおよびＲＰＡＨ採血センターで収集された。
対象は、再び同定され、臨床情報へのアクセスのためのコードが割り当てられた。
健常ボランティアは、血液学的に正常であり、過去５年にわたっていずれの細胞傷害性治療またはいかなる性質の放射線療法も受けていない、年齢を適合させた非癌患者であった。
妊娠についても除外基準であった。全部で正常対象２５名および多発性骨髄腫対象７４名が評価され、それは、治療応答性（部分寛解および完全寛解の各々についてｎ＝３２、ｎ＝１５）、ｄｅ  ｎｏｖｏ（ｎ＝１４）および再発性（ｎ＝１８）多発性骨髄腫患者を含んだ。患者応答は、ＩＭＷＧガイドラインに従って判定された。
【０１８０】
微小粒子の単離およびフローサイトメトリー検出
血小板を含まない血漿（ＰＦＰ）が前述のように調製された。
ＰＦＰが２００μｌの一定分量に分割され、直接免疫標識または１８，８９０×ｇ、４℃で３０分間の超遠心分離による微小粒子単離が施された。
上清が除去され、微小粒子ペレットは、各患者の微小粒子数について、技術的３連でのフローサイトメトリーのために免疫標識された。
微小粒子のゲートを規定するため、直径が０．３および１．１μｍのラテックスビーズが製造業者の推奨に従って調製および使用され、分析中、すべてのサンプルに適用された（２６）。
ＬＳＲＩＩフローサイトメーター／ＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ  Ｘ２０およびＣｅｌｌＱｕｅｓｔ  Ｐｒｏ、ＦＡＣＳＤｉｖａ分析ソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、フローサイトメトリー分析が実施された。
【０１８１】
全身の微小粒子の表面表現型の決定および定量
前述の通り、ＣＤ１３８、ＣＤ４１ａ、ＣＤ３４、Ｐ−ｇｐおよびホスファチジルセリンに特異的な細胞表面抗体が微小粒子ペレットに添加された。
適切なアイソタイプマッチおよび未染色対照が併行して走らされた。
抗ＣＤ４１ａ−ＰＥを用いる分析中、血小板由来微小粒子が除外された。
前述の通り、微小粒子が５００μＬのＰＢＳに再懸濁され、ＢＤ  ＴｒｕＣｏｕｎｔ（商標）ビーズを用いて定量化された。
【０１８２】
統計分析
Ｍａｃ用ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）バージョン７．０（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、非パラメトリックデータに対してマン・ホイットニー（Ｕ）検定が実施された。
データは、平均およびマン・ホイットニーの定数Ｕとして表された。
的中率が（＊＊＊）Ｐ＜０００２、（＊＊）Ｐ＜０．０１および（＊）Ｐ＜０．０５である結果が有意と見なされた。
【０１８３】
結果
Ｐ−ｇｐ＋微小粒子数は、ｄｅ  ｎｏｖｏおよび進行性疾患の多発性骨髄腫患者において増加される
多発性骨髄腫患者における、健常ボランティアと比べて、有意により多い数のＰ−ｇｐ＋微小粒子が全（ＣＤ４１ａ−）微小粒子集団中に存在することが認められた（図１Ａ）。
多発性骨髄腫患者からのＰ−ｇｐ＋微小粒子の絶対数は、健常ボランティアと比べて、１μｌあたり５．１倍多い数であった（Ｕ＝６０５、ｐ＜０．０１）。
詳細には、ｄｅ  ｎｏｖｏおよび進行性疾患（ＰＤ）におけるＰ−ｇｐ＋微小粒子において、健常ボランティアと比べてそれぞれ５．６７（Ｕ＝７０、ｐ＜０．０１）および１２．４（Ｕ＝１０４、ｐ＜０．０１）倍増加することが認められた（図１Ｂ）。
健常ボランティアと完全寛解（ＣＲ）または部分寛解（ＰＲ）の患者との間のＰ−ｇｐ＋微小粒子間に有意差は認められなかった（図１Ｂ）。
【０１８４】
ＣＤ１３８＋微小粒子は、それら表面上にＰ−ｇｐを有意なレベルで発現しない
多発性骨髄腫患者におけるＣＤ１３８＋微小粒子集団に対するＰ−ｇｐの発現は、健常ボランティアと比べて有意に増加しなかった（Ｕ＝７１６、ｐ＝０．２８）（図２Ａ）。ｄｅ  ｎｏｖｏ、ＣＲ、ＰＲおよびＰＤ亜集団を通して、健常ボランティアと比べて有意な増加がそれぞれ認められなかった（図２Ｂ）。
【０１８５】
対照的に、ＣＤ１３８−微小粒子に対するＰ−ｇｐの発現は、健常ボランティアと比べて有意な４．５倍の増加を示した（Ｕ＝５５３、ｐ＝０．００９、図２Ｃ）。
Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ１３８−微小粒子数は、健常ボランティアと比べて、ｄｅ  ｎｏｖｏコホートにおいて３．６倍多く（Ｕ＝５７、ｐ＝０．０００３）、ＰＤにおいて１２．２倍多かった（Ｕ＝１２６、ｐ＝０．０４）。
絶対数は、ＣＲ（Ｕ＝１５１、ｐ＝０．１９）コホートまたはＰＲ（Ｕ＝１９５、ｐ＝０．１４）コホートにおいて、健常ボランティアと比べて有意に異ならなかった（図２Ｄ）。
【０１８６】
実施例２
すべての病態を通して個別患者５名が選択され、Ｐ−ｇｐ、ＣＤ３４およびＣＤ１３８の存在についてそれらの微小粒子が表現型が決定された。
ＣＤ３４は、シアロムチンのＣＤ３４ファミリーに属する膜貫通タンパク質であり、確立された造血幹細胞マーカーである。
ＣＤ３４は、形質細胞の表現型決定において典型的には用いられないが、多発性骨髄腫幹細胞クローンの少数の亜集団上に存在する。
選択された個別患者のパネルは、
（ａ）侵襲性疾患、患者１、
（ｂ）進行性疾患、患者２、
（ｃ）安定疾患、患者３、
（ｄ）部分寛解、患者４、および
（ｅ）寛解における長期生存者、患者５
を含んだ。
本発明者らは、アネキシンＶを用いて、ホスファチジルセリン（ＰＳ）に範囲についても微小粒子の表現型を決定した。
ＰＳは、「幹細胞様」起源の癌細胞の微小粒子の表面上に優先的に発現される。近年、微小粒子上のＰＳは、血管新生における血管内皮細胞との相互作用に必要とされることが示されており、癌の進行に関連する。
【０１８７】
ケース１：侵襲性疾患を有する５８歳女性患者
図３Ａ〜Ｄは、２０１３年９月に骨髄吸引物中に８６％の形質細胞増加症を伴うＩｇＧ多発性骨髄腫と診断された５８歳女性患者（患者１）の連続的なＰ−ｇｐ＋微小粒子数を示す。
診断時、Ｐ−ｇｐ＋微小粒子数は、最少であった。
シクロホスファミド、ボルテゾミブ、デキサメタゾン（ＣｙＢｏｒＤ）を用いた誘導療法が２０１３年９月に開始された（図３の黒点）が、２０１３年１１月、重度貧血が原因でシクロホスファミドが中止された。（図３の淡紅点）。
２０１３年１２月、骨髄生検は、４６％の形質細胞増加を伴う部分寛解を示した。
この期間中、Ｐ−ｇｐ＋微小粒子の数は、着実に増加中であり、それは、ＭＤＲの出現に一致した。
２０１４年１月〜４月、サリドマイドを添加した（図３、青点）。
２０１４年４月、フォローアップ生検は、形質細胞増加の２３％の減少を示した（約７０〜８０日）。
２０１４年６月〜７月、パラプロテインが３８．３ｇ／ｌに増加し（進行性疾患）、２０１４年７月〜１０月（約１００日）、治療計画が、レナリドミド／デキサメタゾンに変更された（図３、赤点）。
２０１５年２月早期に、患者１は、胸壁に沿う右側後方に腫瘍が再発した（６０％の形質細胞増加症、約１３０日）一方、Ｍ−タンパク質レベルは、その時点でわずか１８ｇ／ｌであった（データは示さず）。
この時点において、ＰＦＰ中のＰ−ｇｐ＋微小粒子は、有意に増加し続けた。
この時点において、プラチノール、アドリアマイシン、シクロホスファミドおよびエトポシド（Ｄ−ＰＡＣＥ）とともにデキサメタゾン並びにメルファランが治療計画に加えられ（図３、緑点）、患者１は、部分寛解を達成した（〜４９５日目）。
２０１５年７月、患者１は、自家幹細胞移植が奏功した。しかし、患者１は、まもなく再発し、２０１５年１１月にすべての治療に対して非応答性になり、１２月に死去した。
図３Ｂは、同じ患者におけるＰ−ｇｐ＋／ＣＤ１３８＋微小粒子の特性を示す。
本発明者らの先行的知見に一致し、これらの微小粒子のレベルは、疾患負荷および治療成績に対応する（図３Ｂ）。
カウントとの関連では、ＣＤ１３８＋微小粒子サブタイプは、主要なＰ−ｇｐ＋集団でなかった（図３Ｃ）。
むしろ、主要なＰｇｐ＋微小粒子サブタイプは、ＣＤ１３８−であった（図３Ｄ）。
患者１におけるアネキシンＶ＋亜集団についての微小粒子特性の試験時、ＣＤ１３８＋およびＣＤ１３８−サブタイプ間のレベルの有意差は認められなかった（データは示さず）。
【０１８８】
進行性疾患中で幹細胞移植前、２０１５年２月１１日、患者１から血液サンプルが採取された。
このサンプルは、２０１５年５月に患者が部分寛解中であったときに観察されたのと比較して（ＣＤ３４＋およびＰ−ｇｐ＋に対して、それぞれ、７．３３／μｌおよび６．３１／μｌ、図４）、ＣＤ３４＋（４９６．８１／μｌ）およびＰ−ｇｐ＋（１５５．２９／μｌ）全ＣＤ４１ａ−微小粒子事象の増加を示した（表１）。
ＣＤ１３８との関連で、ＣＤ４１ａ−事象を検出するため、ゲーティングパラメータが確立され、それを図５Ａに示す。
ＣＤ１３８＋（赤）およびＣＤ１３８−（青）微小粒子サブタイプ（図４ＢおよびＣ）内のＣＤ３４＋およびＰ−ｇｐ＋微小粒子事象のレベルが比較された。
Ｐ−ｇｐ＋およびＣＤ３４＋である主要な集団は、ＣＤ１３８−微小粒子サブタイプであった（単純化のために、「二重陽性」集団と称される）図５Ｂ、左パネル、ゲートＰ１、１２．４８／μｌ）。
ごくわずかなＰ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋／ＣＤ１３８＋微小粒子（図５Ｂ、右パネル、ゲートＰ４、０．３０／μｌ）が検出された。
ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４−（図４Ｂ、左パネル、ゲートＰ３、５６．４５／μｌ）およびＣＤ１３８＋／Ｐ−ｇｐ−／ＣＤ３４＋微小粒子（図５Ｂ、右パネル、ゲートＰ２、２８．５／μｌ）である、さらなる微小粒子サブセットについても検出された。
単にＣＤ３４＋およびＰ−ｇｐ＋であるＣＤ１３８＋集団内部の微小粒子は、検出されなかった（図５Ｂ、右パネル、ゲートＰ５およびＰ６）。
【０１８９】
ＣＤ１３８微小粒子サブタイプは、アネキシンＶを用いてＰＳ曝露の存在についてゲーティングおよび表現型が決定された。
ＣＤ１３８＋／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４−微小粒子集団内でのアネキシンＶ＋微小粒子の存在（図５Ｃ、左パネル、ゲートＰ１１、５／μｌ）が検出された。
対照的に、ＣＤ１３８＋／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋微小粒子に対するアネキシンＶ陽性事象は、検出されなかった（図５Ｃ、右パネル、ゲートＰ１２、０事象）（表１）。
【０１９０】
要するに、侵襲性疾患経過を有するこの患者は、「幹細胞様」起源の微小粒子（すなわち、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋）上でのＰ−ｇｐの有意なレベルの上昇を示した。
この集団の極一部もＰＳについて陽性であった。
【０１９１】
ケース２：進行性疾患における６６歳女性患者
２０１４年、６６歳女性患者（患者２）がκ軽鎖骨髄腫と診断された。
この患者は、２０１４年１２月から２０１５年３月までの臨床試験ＭＬＮ９７０８（シクロホスファミド／デキサメタゾン）に登録され、治療され、κ軽鎖の増加を伴う進行性疾患が原因で２０１５年２月に停止された。
２０１５年５月５日のサンプリング時、この患者は、自らの進行性疾患に対してＣｙＢｏｒＤ療法を受けていた。
この期間中、全（ＣＤ４１ａ−）微小粒子中にＣＤ３４＋（４０．５／μｌ）およびＰ−ｇｐ＋微小粒子事象（６０／μｌ）（アイソタイプマッチ対照；図６）が存在することが認められた。
この集団内において、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋集団（図７Ａ、左パネル、ゲートＰ１、４．６／μｌ）およびＣＤ１３８＋／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋集団（図７Ａ、右パネル、ゲートＰ４、０．５／μｌ）の存在が検出された。
ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４−微小粒子のサブセット（図７Ａ、左パネル、ゲートＰ３、５８．８／μｌ）およびＣＤ１３８＋／Ｐ−ｇｐ−／ＣＤ３４＋のサブセット（図７Ａ、右パネル、ゲートＰ６、３／μｌ）も検出された。
【０１９２】
ＣＤ１３８微小粒子サブタイプは、アネキシンＶを用いて、ＰＳ曝露の存在についてゲーティングおよび表現型が決定された。この所与の時点でのこの患者におけるＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋アネキシンＶ＋微小粒子（図７Ｂ、左パネル、ゲートＰ１１、１．１／μｌ）の最低限の存在が検出された。
ＣＤ１３８＋／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋アネキシンＶ＋微小粒子レベルも最低であった（図７Ｂ、右パネル、ゲートＰ１２、０．４／μｌ）（表１）。
【０１９３】
要するに、患者１と比べて、進行性疾患を有する患者は、「二重陽性」の集団のより低いレベルを示し、ＰＳで最低限の陽性を示すに過ぎなかった。
【０１９４】
ケース３：安定状態での６３歳男性患者
サンプリング時に安定疾患状態である６３歳男性（患者３）は、２０１１年、ＩｇＧκ多発性骨髄腫と診断された（２００８年、くすぶり型骨髄腫、２０１１年７月、活性骨髄腫）。
誘導療法は、シクロホスファミド、サリドマイドおよびデキサメタゾンの６サイクルとそれに続く２０１２年３月３０日の自家幹細胞移植からなった。
患者は、サリドマイドに関連した重度の末梢神経障害および血清パラプロテインの増加を経験し、２０１２年７月、レナリドミドおよびデキサメタゾンへの治療変更をもたらした。
２０１５年５月のサンプリング時、患者は、レナリドミドおよびデキサメタゾン、ゾメタおよびアスピリンを受けていた。
【０１９５】
患者は、サンプリング時、全微小粒子（ＣＤ４１ａ−）中、ＣＤ３４＋（５．１３／μｌ）およびＰ−ｇｐ＋（６．３／μｌ）微小粒子を呈した（アイソタイプマッチ対照；図６）。
この集団内において、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋集団（図７Ｃ、左パネル、ゲートＰ１、４．７／μｌ）およびＣＤ１３８＋／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋（図７Ｃ、右パネル、ゲートＰ４、０．２／μｌ）の存在が検出された。
ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４−のサブセット（図７Ｃ、左パネル、ゲートＰ３、２３．１３／μｌ）およびＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ−／ＣＤ３４＋のサブセット（図７Ｃ、左パネル、ゲートＰ２、１８．５４／μｌ）も見出された。
ＣＤ１３８＋／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋のサブセット（図７Ｃ、右パネル、ゲートＰ５、１．２／μｌ）、ＣＤ１３８＋／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４−のサブセット（図７Ｃ、右パネル、ゲートＰ６、１／μｌ）も認められた。
【０１９６】
ＣＤ１３８微小粒子サブタイプは、アネキシンＶを用いてＰＳ曝露の存在について、ゲーティングおよび表現型が決定された。
この所与の時点でのこの患者におけるＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋アネキシンＶ＋微小粒子（図７Ｄ、左パネル、ゲートＰ１１、１．６／μｌ）およびＣＤ１３８＋／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋アネキシンＶ＋微小粒子（図７Ｄ、右パネル、ゲートＰ１２、０．３／μｌ事象）の存在（表１）が認められた。
【０１９７】
要するに、「二重陽性」集団は、患者３において、患者２と比べて同等のレベルで存在した。
サブセットは、ＰＳでも有意に濃縮されなかった。
【０１９８】
ケース４：部分寛解における７１歳男性患者
２０１４年２月、７１歳男性（患者４）が生検後に右肩腫瘍と診断された。
この患者は、陽電子放射断層撮影スキャンから明らかなように、複数の病変を伴う広範播種性骨格疾患を呈した。
誘導療法は、２０１４年４月からのＣｙＢｏｒＤ治療からなった。
患者は、６サイクル後、非常に良好な部分寛解を達成し、８サイクルでなく、６サイクル目に、ボルテゾミブに起因する重度の末梢神経障害が原因で治療が停止された。
分析用サンプルは、２０１４年８月１２日に採取された。
全（ＣＤ４１ａ−）微小粒子集団内に、ＣＤ３４＋（１５．１３／μｌ）およびＰ−ｇｐ＋微小粒子事象（１０／μｌ）の数が認められた（アイソタイプマッチ対照；図８）。
この集団内において、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋集団（図９Ａ、左パネル、ゲートＰ１、７．２／μｌ）およびＣＤ１３８＋／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋（図９Ａ、右パネル、ゲートＰ４、０．５／μｌ）の存在が検出され、このサンプル中において、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４−のサブセット（図９Ａ、右パネル、ゲートＰ３、３６．５３／μｌ）およびＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ−／ＣＤ３４＋のサブセット（図９Ａ、左パネル、ゲートＰ２、６３．１７／μｌ）が見出された。
ごく小さいサブセットとしてＣＤ１３８＋／Ｐ−ｇｐ−／ＣＤ３４＋（図９Ａ、右パネル、ゲートＰ５、４／μｌ）およびＣＤ１３８＋／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４−（図９Ａ、右パネル、ゲートＰ６、２．２／μｌ）も認められた。
【０１９９】
ＣＤ１３８微小粒子サブタイプは、アネキシンＶを用いて、ＰＳ曝露の存在について、ゲーティングおよび表現型が決定された。
ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋アネキシンＶ＋微小粒子（図９Ｂ、左パネル、ゲートＰ１１、２．５／μｌ）の存在が検出され、ＣＤ１３８＋／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋アネキシンＶ＋微小粒子は、陰性であった（図９Ｂ、右パネル、ゲートＰ１２、０事象）（表１）。
【０２００】
要するに、患者４は、患者１の場合と比べてより低いレベルではあるが、「二重陽性」集団の上昇を示した。
サブセットは、ＰＳが豊富に存在したが、患者１において検出されたレベルよりも低いレベルであった。
【０２０１】
ケース５：寛解  −  長期生存における６２歳男性患者
６２歳男性（患者５）は、５０歳のとき、骨髄生検で１０〜１５％の形質細胞浸潤を示し、ＩｇＧκ多発性骨髄腫を有すると診断された。
この患者の誘導レジメンは、ＶＡＤ（ビンクリスチン、アドリアマイシン（ドキソルビシン）およびデキサメタゾン）からなった。
この後、２００７年、自家幹細胞移植を受け、その後、この患者は、ほぼ３年間維持されない完全寛解状態のままであった。
この患者は、２０１２年、他の課題を有しなかったにもかかわらず、血清パラプロテインの上昇を伴う再発を経験した。
この患者は、サリドマイドが投与され、２０１３年早期に、骨髄生検でわずか３％の形質細胞浸潤および定量するには過度に低いＭ−タンパク質を示し、非常に良好な部分応答を達成した。
この患者のＭ−タンパク質は、２０１４年後半に増加し始め、２０１４年１０月に１７ｇ／ｌに達した。
その後、患者は、２０１４年１２月、臨床試験（レナリドミド／デキサメタゾン±ダラツムマブ）において登録され、治療された。
サンプリング時、患者は、非常に良く応答しており、この患者は、最終的に、進行中の化学療法を伴う厳密な完全寛解を達成した。
この患者は、長期にわたり治療的介入が奏功した長期生存者（１２年）である。
【０２０２】
２０１５年５月５日、サンプリング時、全（ＣＤ４１ａ−）微小粒子集団内で、ＣＤ３４＋微小粒子事象数（５．１３／μｌ）およびＰ−ｇｐ＋微小粒子事象数（６．３／μｌ）が認められた（アイソタイプマッチ対照；図８）。
ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋集団（図９Ｃ、左パネル、ゲートＰ１、２．５４／μｌ）およびＣＤ１３８＋／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋（図９Ｃ、右パネル、ゲートＰ４、３．０／μｌ）の存在が検出された。
本発明者らは、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４−のサブセット（図９Ｃ、左パネル、ゲートＰ３、５２．８３／μｌ）およびＣＤ１３８＋／Ｐ−ｇｐ−／ＣＤ３４＋のサブセット（図９Ｃ、左パネル、ゲートＰ２、１４．４６／μｌ）も見出した。
ごく小さいサブセットとして、ＣＤ１３８＋／Ｐ−ｇｐ−／ＣＤ３４＋（図９Ｃ、右パネル、ゲートＰ５、４．５／μｌ）およびＣＤ１３８＋／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４−（図９Ｃ、右パネル、ゲートＰ６、２．４／μｌ）も認められた。
【０２０３】
ＣＤ１３８微小粒子サブタイプは、アネキシンＶを用いて、ＰＳ曝露の存在についてゲーティングおよび表現型が決定された。
ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋アネキシンＶ＋微小粒子（図９Ｄ、左パネル、ゲートＰ１１、０．５／μｌ）およびＣＤ１３８＋／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋アネキシンＶ＋微小粒子（図９Ｄ、右パネル、ゲートＰ１２、１．１７／μｌ）の存在（表１）が検出された。
【０２０４】
要するに、この患者は、他のあらゆる病態と比べて有意に低下した「二重陽性」集団のレベルを示した。微小粒子のこの集団に対するＰＳ曝露がかろうじて検出可能であった。
【０２０５】
全体として、多発性骨髄腫患者では、疾患のより重篤な形態の場合、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋微小粒子サブセットのレベルの上昇が認められた。
【０２０６】
ＰＳ＋微小粒子は、多発性骨髄腫におけるより侵襲性の高い状態を表す
全（ＣＤ４１ａ−）微小粒子集団内のＰＳ＋微小粒子亜集団は、多発性骨髄腫患者において、健常ボランティアと比べて有意に（５．６倍）増加した（Ｕ＝６０７、ｐ＝０．００９）（図１０Ａ）。
ＰＳ  Ｖ＋微小粒子数は、ｄｅ  ｎｏｖｏコホートにおいて、健常ボランティアと比べて、３．１倍増加した（Ｕ＝８０、ｐ＝００４）。一方、部分寛解コホートは、アネキシンＶ＋微小粒子数において、健常ボランティアの場合に対して、３．０８倍の増加を示した（Ｕ＝２４９、ｐ＝０．０２）。
アネキシンＶ＋微小粒子数は、進行性疾患コホートにおいて、健常ボランティアと比べて、１３．９倍高かった（Ｕ＝１３６、ｐ＝０．０２）。
本発明者らは、アネキシンＶ＋微小粒子数においてＣＲコホートと健常ボランティアとの間に全く有意差を認めなかった（図１０Ｂ）。
【０２０７】
ＰＳおよびＣＤ１３８は、進行性疾患において同時発現しない
図１１Ａは、健常ボランティアと関連して、多発性骨髄腫患者のＣＤ１３８＋アネキシンＶ＋微小粒子特性を示す。
多発性骨髄腫患者におけるＣＤ１３８＋微小粒子サブセットにおいて、健常ボランティアと比べて、有意な２．４倍大きいＰＳ曝露が認められた（Ｕ＝４５２．５、ｐ＝０．００６）。
コホートデータでは、ｄｅ  ｎｏｖｏおよびＰＲコホートは、それぞれ、ＰＳ曝露における、健常ボランティアの場合に対して、３．１倍（Ｕ＝８２．５、ｐ＝０．００５）および３．６１倍（Ｕ＝９６．５、ｐ＝００２）の増加を示した一方、健常ボランティアと比べてＣＲまたはＰＤコホートとの有意差が全く認められなかった（図１１Ｂ）。
【０２０８】
図１１Ｃは、多発性骨髄腫患者のＣＤ１３８−アネキシンＶ＋微小粒子特性を示す。
多発性骨髄腫患者における微小粒子のＣＤ１３８−サブセットにおいて、健常ボランティアと比べて、ＰＳ曝露における有意な４．３倍の増加が認められた（Ｕ＝５７０、ｐ＝０．００９）。
コホートデータでは、ｄｅ  ｎｏｖｏ患者は、健常ボランティアと比べて、ＣＤ１３８−微小粒子について７．７３倍高いＰＳ曝露を有した（Ｕ＝７７、ｐ＝０．００３）。一方、ＰＤを有する患者は、ＣＤ１３８−サブセットにおいて、健常ボランティアと比べて、６．９倍高いＰＳ曝露を有した（Ｕ＝９４、ｐ＝０．００３）（図１１Ｄ）。
ＣＲおよびＰＲコホートにおけるＰＳ曝露において健常ボランティアに対して有意差は認められなかった（図１１Ｄ）。
【０２０９】
考察
結果は、多発性骨髄腫患者が、全ＣＤ４１ａ−およびＣＤ１３８−微小粒子集団内、特に、ｄｅ  ｎｏｖｏおよびＰＤコホートにおいて、健常ボランティアと比べて、より高いＰ−ｇｐ事象を有することを示す。
全微小粒子集団内および各微小粒子サブタイプ内のＰ−ｇｐ＋事象は、個別患者におけるレベルが監視されるとき、治療応答に対応することが示された。
【０２１０】
ＣＤ１３８は、形質細胞における有用な代替マーカーである一方、結果は、多発性骨髄腫患者におけるＰ−ｇｐ＋微小粒子事象が、主に、ＣＤ１３８−集団内に存在することを示した。
進行性疾患を有する患者におけるＰ−ｇｐ＋微小粒子事象が有意により多いことが認められた。
全ＣＤ４１ａ−微小粒子集団内において、本発明者らは、多くの異なるサブタイプをＣＤ１３８およびＰ−ｇｐの存在に基づいて同定した。
【０２１１】
患者２（ＰＤ）および患者３（安定）は、ほぼ同一の「二重陽性集団」を有した。
サンプリング時、患者３は、安定状態であった一方、患者２は、（軽鎖レベルの低下によって規定される通り）ボルテゾミブの１サイクル後の応答を既に示しており、それに対応して、患者１および４と比べて、より少ない「二重集団」を有した。
患者５は、寛解および長期生存者状態に対応するかろうじて検出可能な「二重陽性」微小粒子集団を有した。
このデータは、「二重陽性」微小粒子集団のレベルの上昇と、疾患活動性同様、治療非応答性との間の関連性を明示する。
【０２１２】
ＰＳは、微小粒子生合成中のリン脂質非対称性の欠損から生じる微小粒子の汎用マーカーである。
健常ボランティアと比べて、多発性骨髄腫患者における全ＣＤ４１ａ−微小粒子集団内において、ＰＳ＋微小粒子数の有意な増加が生じることが認められた。
多発性骨髄腫患者（具体的にはｄｅ  ｎｏｖｏおよびＰＤ）におけるＣＤ１３８−微小粒子サブセット内でも有意により高いＰＳ＋事象が認められた。
【０２１３】
結果は、「二重陽性」微小粒子集団（ＣＤ１３８−／ＣＤ３４＋／Ｐ−ｇｐ＋）の存在が、個別患者内部、具体的には進行性疾患における疾患進行および治療応答性のマーカーを提供することを示す。
ＣＤ１３８＋が多発性骨髄腫の疾患進行の「静的」バイオマーカーと見なされ得ないと思われる。
それは、応答性疾患における腫瘍量の尺度として重要な役割を担う一方、その存在は、侵襲性病態において減少する。
【０２１４】
実施例３
さらなる患者４名のあらゆる病態を通して、ある範囲の時間にわたり、サンプルが収集され、その微小粒子は、実施例１に記載の方法に従い、Ｐ−ｇｐ、ＣＤ３４およびＣＤ１３８の存在について遡及的に表現型が決定された。
患者は、（通常の血液検査による判定として）以下の臨床特性を有した。
【０２１５】
ＭＭ３４、女性
患者は、２０１４年４月４日に死亡する前に進行性、難治性多発性骨髄腫を有し、そして、シクロホスファミド、ベルケイドおよびデキサメタゾンを経て進行した。
【０２１６】
ＭＭ１９、男性
患者は、２０１３年９月３日、安定な多発性骨髄腫を有すると診断され、そして、サリドマイド５０ｍｇで（夜は、プレドニゾン５０ｍｇと一緒に１００ｍｇ）、毎月７日間治療された。
患者の多発性骨髄腫は、進行性になった。
【０２１７】
ＭＭ７９、男性
２０１４年４月、κ軽鎖多発性骨髄腫と診断され、次いで、ＶＣＡＴ誘導により治療され、次いで、ＡＳＣＴおよびＴｈａｌＶｓベルケイドによる維持がなされた。
２０１４年１０月、部分的再発前は、治療に十分に応答した。
【０２１８】
ＭＭ４９、男性
２００９年、ＩｇＡκ骨髄腫と診断され、２０１４年５月、部分的再発前には、治療に十分に応答した。
微小粒子の表現型決定の結果を下の表１に示す。
【０２１９】
【表１】
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【０２２０】
ＭＭ３４は、一貫して高レベルの、ＣＤ１３８−Ｐ−ｇｐ＋ＣＤ３４＋ＭＰを有し、それは、患者が最終的に死亡することになる侵襲性／難治性癌を示す。
ＭＭ１９は、２０１３年９月３０日、安定と診断されているにもかかわらず、高レベルのＣＤ１３８−Ｐ−ｇｐ＋ＣＤ３４＋ＭＰを有し、その後、２０１３年１１月４日、疾患は、進行性になる。
ＭＭ７９は、２０１４年７月７日に至るまで、ＣＤ１３８−Ｐ−ｇｐ＋ＣＤ３４＋ＭＰを漸増レベルで有し、その後の時点において、患者は、２０１４年１０月に部分的再発と診断された。
ＭＭ４９は、２０１４年５月５日、ＣＤ１３８−Ｐ−ｇｐ＋ＣＤ３４＋ＭＰを増加レベルで有し、その後、患者は、２０１４年５月１３日に再発性と疑われた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年1月6日(2020.1.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
形質細胞新生物を有するか、または、形質細胞新生物を有することが疑われる、患者の予後診断（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）のための方法であって、
細胞外小胞、または、細胞および細胞外小胞を含むサンプルを、前記患者から単離すること、ならびに、
ＣＤ１３８−およびＰ−糖タンパク質＋（ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋）である細胞外小胞、または、細胞および細胞外小胞のレベルを判定することを含む方法。
【請求項２】
前記形質細胞新生物は、骨髄腫または多発性骨髄腫である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記サンプルが、血液由来のサンプル、血漿サンプルまたは血小板を含まない血漿サンプルである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞外小胞、あるいは、前記細胞および細胞外小胞が、ＣＤ４１ａ−でもある、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記サンプルが、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞外小胞、あるいは、細胞および細胞外小胞を、形質細胞新生物を有しないかまたは寛解性の形質細胞新生物を有する対象の示す参照対照指標よりも高いレベルで含むとき、前記新生物が安定な、進行性または難治性であるという予後（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）が判定され、
前記サンプルが、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞外小胞、あるいは、細胞および細胞外小胞を、安定な形質細胞新生物を有する対象の参照対照指標よりも高いレベルで含むとき、前記新生物が進行性または難治性であるという予後（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）が判定され、あるいは、
前記サンプルが、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞外小胞、あるいは、細胞および細胞外小胞を、進行性の形質細胞新生物を有する対象の参照対照指標よりも高いレベルで含むとき、前記新生物が難治性であるという予後（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）が判定される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞外小胞、あるいは、前記細胞および細胞外小胞が、ＣＤ３４＋でもある、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記サンプルが、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋である、前記細胞外小胞、あるいは、細胞および細胞外小胞を、形質細胞新生物を有しないかまたは寛解性の形質細胞新生物を有する対象の参照対照指標よりも高いレベルで含むとき、前記新生物が安定、進行性または難治性であるという予後（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）が判定され、
前記サンプルが、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋である、細胞外小胞、あるいは、細胞および細胞外小胞を、安定な形質細胞新生物を有する対象の参照対照指標よりも高いレベルで含むとき、前記新生物が進行性または難治性であるという予後（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）が判定され、または、
前記サンプルが、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋である、細胞外小胞、あるいは、細胞および細胞外小胞を、進行性の形質細胞新生物を有する対象の参照対照指標よりも高いレベルで含むとき、前記新生物が難治性であるという予後（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）が判定される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞外小胞、あるいは、前記細胞および細胞外小胞が、ホスファチジルセリン＋（ＰＳ＋）でもある、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記サンプルが、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋／ＰＳ＋である、細胞外小胞、あるいは、細胞および細胞外小胞を、形質細胞新生物または寛解性の形質細胞新生物を有しない対象の参照対照指標よりも高いレベルで含むとき、前記新生物が安定、進行性または難治性であるという予後（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）が判定され、
前記サンプルが、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋／ＰＳ＋である、細胞外小胞、あるいは、細胞および細胞外小胞を、安定な形質細胞新生物を有する対象の参照対照指標よりも高いレベルで含むとき、前記新生物が進行性または難治性であるという予後が判定され、または、
前記サンプルが、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋／ＣＤ３４＋／ＰＳ＋である、細胞外小胞、あるいは、細胞および細胞外小胞を、進行性の形質細胞新生物を有する対象の参照対照指標よりも高いレベルで含むとき、前記新生物が難治性であるという予後が判定される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
形質細胞新生物を有するかまたは形質細胞新生物を有することが疑われる患者の進行を監視するための方法であって、少なくとも、２つの時点において、細胞外小胞、あるいは、細胞および細胞外小胞を含むサンプルを前記患者から単離すること、ならびに、ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である細胞外小胞、あるいは、細胞および細胞外小胞のレベルの変化を判定することを含む方法。
【請求項１１】
ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である、細胞外小胞、あるいは、細胞および細胞外小胞のレベルが、その後の時点間で増加するとき、前記新生物の重症度が増加する予後（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ））が判定され、
ＣＤ１３８−／Ｐ−ｇｐ＋である、細胞外小胞、あるいは、細胞および細胞外小胞の前記レベルが、その後の時点間で減少するとき、前記新生物の重症度が減少している予後が判定される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記形質細胞新生物が、骨髄腫または多発性骨髄腫である、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記サンプルが、血液由来のサンプル、血漿サンプル、血小板を含まない血漿サンプルからなる群から選択される、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞外小胞、あるいは、前記細胞および細胞外小胞が、ＣＤ４１ａ−でもある、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞外小胞、あるいは、前記細胞および細胞外小胞が、ＣＤ３４＋でもある、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞外小胞、あるいは、前記細胞および細胞外小胞が、ホスファチジルセリン＋（ＰＳ＋）でもある、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記サンプルが、以下の細胞を含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
・骨髄において生成される細胞；
・造血幹細胞である細胞；
・造血幹細胞に起源をもつ細胞；
・骨髄系前駆細胞である細胞;
・骨髄系前駆細胞に起源をもつ細胞；
・リンパ系前駆細胞である細胞；
・リンパ系前駆細胞に起源をもつ細胞；
・Ｂリンパ球細胞に起源をもつ細胞；
・形質様細胞である細胞；
・新生物細胞である細胞；または、
・多発性骨髄腫細胞である細胞。
【請求項１８】
前記サンプルが、以下から由来する細胞外小胞を含む、、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法：
・骨髄において生成される細胞；
・造血幹細胞である細胞；
・造血幹細胞に起源をもつ細胞；
・骨髄系前駆細胞である細胞；
・骨髄系前駆細胞に起源をもつ細胞；
・リンパ系前駆細胞である細胞；
・リンパ系前駆細胞に起源をもつ細胞；
・Ｂリンパ球細胞に起源をもつ細胞；
・形質様細胞
・新生物細胞；または、
・多発性骨髄腫細胞。
【請求項１９】
前記サンプルが、エキソソーム、微小粒子、オンコソーム、大型オンコソームまたはミグラソームである細胞外小胞を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【国際調査報告】
2020530097.tif 000015
2020530097.tif 000016