(57)【要約】本明細書では、がんを有する対象（例えば、ヒト）を検出及び／または治療するための方法及び物質を提供する。いくつかの実施形態では、２クラス以上のバイオマーカーのメンバー（複数可）の存在を検出する、対象ががん（例えば、限局性がん）を有することを同定するための方法及び物質を提供する。いくつかの実施形態では、少なくとも１クラスのバイオマーカーのメンバー（複数可）の存在及び異数性の存在を検出する、対象ががん（例えば、限局性がん）を有することを同定するための方法及び物質を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、対象（例えば、ヒト）のがんの検出における高い感度及び／または特異度を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における膵臓癌の存在を同定するための方法であって、
前記対象から採取した第１の生体試料中において、以下の遺伝子、ＫＲＡＳ、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、または、ＳＭＡＤ４のうちの１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出すること、
前記対象から採取した第２の生体試料中において、以下のタンパク質バイオマーカー、糖鎖抗原１９−９（ＣＡ１９−９）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、または、オステオポンチン（ＯＰＮ）のうちの１つまたは複数のレベルを検出すること、
前記１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの前記検出レベルと前記タンパク質バイオマーカーの１つまたは複数の基準レベルを比較すること、及び
１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在が検出された場合、前記１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの前記検出レベルが前記１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの前記基準レベルよりも高い場合、または、その両方の場合に、前記対象における膵臓癌の存在を同定すること、
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記第１の生体試料、前記第２の生体試料、または、その両方は、血漿を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の生体試料と前記第２の生体試料は同一である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＫＲＡＳ、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ及びＳＭＡＤ４のそれぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
糖鎖抗原１９−９（ＣＡ１９−９）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）及びオステオポンチン（ＯＰＮ）のそれぞれのレベルを検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ａ．前記試料中に存在する複数の鋳型分子のそれぞれに固有識別子（ＵＩＤ）を割り当てること、
ｂ．それぞれ固有にタグ付けした鋳型分子を増幅してＵＩＤファミリーを作製すること、及び
ｃ．前記増幅産物を重複してシークエンシングすること、
を含む、マルチプレックスＰＣＲベースのシークエンシングアッセイを使用して、ＫＲＡＳ、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、または、ＳＭＡＤ４のうちの１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記対象ががん細胞を有することが知られていない場合、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出すること、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの前記レベルを検出すること、または、その両方を実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記対象は、以下の治療介入、外科手術、アジュバント化学療法、ネオアジュバント化学療法、放射線療法、免疫療法、標的化療法、または、免疫チェックポイント阻害薬、のうちの１つまたは複数を実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
対象におけるがんの存在を同定するための方法であって、
前記対象から採取した第１の生体試料中において、以下の遺伝子、ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、または、ＧＮＡＳのうちの１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出すること、
前記対象から採取した第２の生体試料中において、以下のタンパク質バイオマーカー、ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、または、ＭＰＯのうちの１つまたは複数のレベルを検出すること、
前記１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの前記検出レベルと前記タンパク質バイオマーカーの１つまたは複数の基準レベルを比較すること、及び
１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在が検出された場合、前記１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの前記検出レベルが前記１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの前記基準レベルよりも高い場合、または、その両方の場合に、前記対象におけるがんの存在を同定すること、
を含む、前記方法。
【請求項１０】
前記第１の生体試料、前記第２の生体試料、または、その両方は、血漿を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１の生体試料と前記第２の生体試料は同一である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ及びＧＮＡＳのそれぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出する、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１及びＭＰＯのそれぞれの前記レベルを検出する、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
ａ．前記試料中に存在する複数の鋳型分子のそれぞれに固有識別子（ＵＩＤ）を割り当てること、
ｂ．それぞれ固有にタグ付けした鋳型分子を増幅してＵＩＤファミリーを作製すること、及び
ｃ．前記増幅産物を重複してシークエンシングすること、
を含む、マルチプレックスＰＣＲベースのシークエンシングアッセイを使用して、ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、または、ＧＮＡＳのうちの１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出する、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記がんは、肝臓癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、または、前立腺癌である、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記対象ががん細胞を有することが知られていない場合、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出すること、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの前記レベルを検出すること、または、その両方を実施する、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
前記対象は、以下の治療介入、外科手術、アジュバント化学療法、ネオアジュバント化学療法、放射線療法、免疫療法、標的化療法、または、免疫チェックポイント阻害薬、のうちの１つまたは複数を実施される、請求項９に記載の方法。
【請求項１８】
対象におけるがんの存在を同定するための方法であって、
前記対象から採取した第１の生体試料中において、以下の遺伝子、ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、または、ＧＮＡＳのうちの１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出すること、
前記対象から採取した第２の生体試料中において、以下のタンパク質バイオマーカー、ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、フォリスタチン、Ｇ−ＣＳＦ、または、ＣＡ１５−３のうちの１つまたは複数のレベルを検出すること、
前記１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの前記検出レベルと前記タンパク質バイオマーカーの１つまたは複数の基準レベルを比較すること、及び
１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在が検出された場合、前記１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの前記検出レベルが前記１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの前記基準レベルよりも高い場合、または、その両方の場合に、前記対象におけるがんの存在を同定すること、
を含む、前記方法。
【請求項１９】
前記第１の生体試料、前記第２の生体試料、または、その両方は、血漿を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１の生体試料と前記第２の生体試料は同一である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ及びＧＮＡＳのそれぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、フォリスタチン、Ｇ−ＣＳＦ及びＣＡ１５−３のそれぞれの前記レベルを検出する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
ａ．前記試料中に存在する複数の鋳型分子のそれぞれに固有識別子（ＵＩＤ）を割り当てること、
ｂ．それぞれ固有にタグ付けした鋳型分子を増幅してＵＩＤファミリーを作製すること、及び
ｃ．前記増幅産物を重複してシークエンシングすること、
を含む、マルチプレックスＰＣＲベースのシークエンシングアッセイを使用して、ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、または、ＧＮＡＳのうちの１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記がんは、肝臓癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、または、前立腺癌である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
前記対象ががん細胞を有することが知られていない場合、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出すること、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの前記レベルを検出すること、または、その両方を実施する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
前記対象は、以下の治療介入、外科手術、アジュバント化学療法、ネオアジュバント化学療法、放射線療法、免疫療法、標的化療法、または、免疫チェックポイント阻害薬、のうちの１つまたは複数を実施される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２７】
対象におけるがんの存在を同定するための方法であって、
前記対象から採取した第１の生体試料中において、以下の遺伝子、ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、または、ＧＮＡＳのうちの１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出すること、
前記対象から採取した第２の生体試料中において、以下のタンパク質バイオマーカー、ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、または、ＣＡ１５−３のうちの１つまたは複数のレベルを検出すること、
前記１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの前記検出レベルと前記タンパク質バイオマーカーの１つまたは複数の基準レベルを比較すること、及び
１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在が検出された場合、前記１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの前記検出レベルが前記１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの前記基準レベルよりも高い場合、または、その両方の場合に、前記対象におけるがんの存在を同定すること、
を含む、前記方法。
【請求項２８】
前記第１の生体試料、前記第２の生体試料、または、その両方は、血漿を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記第１の生体試料と前記第２の生体試料は同一である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ及びＧＮＡＳのそれぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１及びＣＡ１５−３のそれぞれの前記レベルを検出する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
ａ．前記試料中に存在する複数の鋳型分子のそれぞれに固有識別子（ＵＩＤ）を割り当てること、
ｂ．それぞれ固有にタグ付けした鋳型分子を増幅してＵＩＤファミリーを作製すること、及び
ｃ．前記増幅産物を重複してシークエンシングすること、
を含む、マルチプレックスＰＣＲベースのシークエンシングアッセイを使用して、ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、または、ＧＮＡＳのうちの１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
前記がんは、肝臓癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、または、前立腺癌である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
前記対象ががん細胞を有することが知られていない場合、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出すること、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの前記レベルを検出すること、または、その両方を実施する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】
前記対象は、以下の治療介入、外科手術、アジュバント化学療法、ネオアジュバント化学療法、放射線療法、免疫療法、標的化療法、または、免疫チェックポイント阻害薬、のうちの１つまたは複数を実施される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３６】
対象における膀胱癌または上部尿路上皮癌の存在を同定するための方法であって、
前記対象から採取した第１の生体試料中において、以下の遺伝子、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、または、ＶＨＬのうちの１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出すること、
前記対象から採取した第２の生体試料中のＴＥＲＴプロモーター内における少なくとも１つの変異の存在を検出すること、
前記対象から採取した第３の生体試料中において異数性の存在を検出すること、及び
１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在が検出された場合、前記ＴＥＲＴプロモーター内における前記少なくとも１つの変異の存在が検出された場合、異数性の存在が検出された場合、または、これらの組み合わせの場合に、前記対象における膀胱癌または上部尿路上皮癌の存在を同定すること、
を含む、前記方法。
【請求項３７】
前記第１の生体試料と前記第２の生体試料は同一である、
前記第１の生体試料と前記第３の生体試料は同一である、
前記第２の生体試料と前記第３の生体試料は同一である、または、
前記第１の生体試料と前記第２の生体試料と前記第３の生体試料は同一である、
請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記第１の生体試料、前記第２の生体試料、または、前記第３の生体試料は、尿試料である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
染色体腕５ｑ、８ｑ、または、９ｐのうちの１つまたは複数に異数性の存在を検出する、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ及びＶＨＬのそれぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出する、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
ａ．前記試料中に存在する複数の鋳型分子のそれぞれに固有識別子（ＵＩＤ）を割り当てること、
ｂ．それぞれ固有にタグ付けした鋳型分子を増幅してＵＩＤファミリーを作製すること、及び
ｃ．前記増幅産物を重複してシークエンシングすること、
を含む、マルチプレックスＰＣＲベースのシークエンシングアッセイを使用して、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、または、ＶＨＬのうちの１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出する、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
前記対象ががん細胞を有することが知られていない場合、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出すること、前記ＴＥＲＴプロモーター内における前記少なくとも１つの変異の存在を検出すること、または、異数性の存在を検出すること、を実施する、請求項３６に記載の方法。
【請求項４３】
前記対象は、以下の治療介入、外科手術、アジュバント化学療法、ネオアジュバント化学療法、放射線療法、免疫療法、標的化療法、または、免疫チェックポイント阻害薬、のうちの１つまたは複数を実施される、請求項３６に記載の方法。
【請求項４４】
対象における卵巣癌または子宮内膜癌の存在を同定するための方法であって、
前記対象から採取した第１の生体試料中において、以下の遺伝子、ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、または、ＣＤＫＮ２Ａのうちの１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出すること、
前記対象から採取した第２の生体試料中において異数性の存在を検出すること、及び
１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在が検出された場合、異数性の存在が検出された場合、または、その両方の場合に、前記対象における卵巣癌または子宮内膜癌の存在を同定すること、
を含む、前記方法。
【請求項４５】
前記第１の生体試料と前記第２の生体試料は同一である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記第１の生体試料または前記第２の生体試料は、子宮頸部試料または子宮内膜試料である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
染色体腕４ｐ、７ｑ、８ｑ、または、９ｑのうちの１つまたは複数に異数性の存在を検出する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ及びＣＤＫＮ２Ａのそれぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４９】
ａ．前記試料中に存在する複数の鋳型分子のそれぞれに固有識別子（ＵＩＤ）を割り当てること、
ｂ．それぞれ固有にタグ付けした鋳型分子を増幅してＵＩＤファミリーを作製すること、及び
ｃ．前記増幅産物を重複してシークエンシングすること、
を含む、マルチプレックスＰＣＲベースのシークエンシングアッセイを使用して、ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、または、ＣＤＫＮ２Ａのうちの１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出する、請求項４４に記載の方法。
【請求項５０】
前記対象から採取した循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）試料中において、以下の遺伝子、ＡＫＴ１、ＡＰＣ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＴＮＮＢ１、ＥＧＦＲ、ＦＢＸＷ７、ＦＧＦＲ２、ＧＮＡＳ、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＰＴＥＮ、または、ＴＰ５３のうちの１つまたは複数における少なくとも１つの遺伝子バイオマーカーの存在を検出することを更に含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項５１】
前記対象ががん細胞を有することが知られていない場合、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出すること、または、異数性の存在を検出すること、を実施する、請求項４４に記載の方法。
【請求項５２】
前記対象は、以下の治療介入、外科手術、アジュバント化学療法、ネオアジュバント化学療法、放射線療法、免疫療法、標的化療法、または、免疫チェックポイント阻害薬、のうちの１つまたは複数を実施される、請求項４４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府の資金提供に関する声明文
本発明は、国立衛生研究所による助成金番号ＣＡ０６２９２４及びＨＧ００７８０４のもとで、米国政府による支援を受けて成立した。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
配列表
本出願は、電子出願制度により米国特許商標庁に提出された電子的形態の配列表を含み、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。上記配列表（２０１８年８月６日に作成）の名称は４４８０７０３０６ＷＯ１ＳＬ．ｔｘｔであり、そのサイズは２０８，３０５バイトである。
【０００３】
電子的に出願された表
本出願は、電子出願制度により米国特許商標庁に提出された電子的形態の表を含む。ＡＳＣＩＩテキストファイル（それぞれの内容全体は参照により本明細書に組み込まれる）としては、Ｔａｂｌｅ１．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、１５２，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ２．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、３５１，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ３．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、４３８，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ４．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、１，０８１，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ５．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、３１，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ６．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、１０３，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ７．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、２５，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ８．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、５９，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ９．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、３８，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ１０．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、２２，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ１１．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、１７，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ１２．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、１４，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ１３．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、１０４，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ１４．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、１０６，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ１５．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、３７０，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ１６．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、２６２，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ１７．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、８，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ１８．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、５２，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ１９．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、４１，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ２０．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、１４，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ２１．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、６，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ２２．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、１９，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ２３．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、６，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ２４．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、４２，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ２５．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、２５，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ２６．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、１４，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ２７．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、５，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ２８．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、１０，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ２９．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、９，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ３０．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、３，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ３１．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、２，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ３２．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、９，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ３３．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、３，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ３４．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、２２，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ３５．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、１，５３６，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ３６．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、１，５９１，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ３７．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、１３，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ３８．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、５，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ３９．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、３０，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ４０．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、９，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ４１．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、４，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ４２．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、８，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ４３．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、２５，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ４４．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、１１，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ４５．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、１１，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ４６．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、１８，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ４７．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、１８，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ４８．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、８，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ４９．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、１６７，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ５０．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、３１２，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ５１．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、２０，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ５２．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、１，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ５３．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、３，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ５４．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、３，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ５５．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、８，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ５６．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、１，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ５７．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、１４，０００バイトのサイズを有する）、Ｔａｂｌｅ５８．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、３，０００バイトのサイズを有する）、及び、Ｔａｂｌｅ５９．ｔｘｔという名称のテキストファイル（２０１８年８月７日に作成され、３０９，０００バイトのサイズを有する）、が挙げられる。
【背景技術】
【０００４】
１．技術分野
本明細書では、がんを有する対象（例えば、ヒト）を検出及び／または治療するための方法及び物質を提供する。いくつかの実施形態では、２クラス以上のバイオマーカーの２つ以上のメンバーの存在を検出する、対象ががん（例えば、限局性がん）を有することを同定するための方法及び物質を提供する。いくつかの実施形態では、少なくとも１クラスのバイオマーカーの２つ以上のメンバーの存在及び異数性の存在を検出する、対象ががん（例えば、限局性がん）を有することを同定するための方法及び物質を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、対象（例えば、ヒト）のがんを検出する高い感度及び／または特異度を提供する。
【０００５】
２．背景情報
アメリカ人のがんによる死亡は今年５９２，０００人にのぼり、疾病管理センターによれば、がんは間もなくこの国における死因の第１位となる。この悲惨な状況をどのようにして回避できるであろうか？今日におけるがんの橋渡し研究の大部分は、進行疾患を有する患者の生存期間を延長することに焦点を置いている。本発明者らの研究展望はそれらとは異なり、長期的には、常に予防が治療よりも望ましいものであると考えている。この展望が重要となる例は感染症から心血管疾患の範囲まで豊富である。心血管疾患においては、この疾患の一次予防法と二次予防法の組み合わせが過去６０年間において死亡率を７５％低下させていることから、特に重要である。それに対し、全体的ながんの死亡率は同一期間にわたりほとんど変化していない。
【０００６】
血液検査の実施によるがんのより早期の検出は二次予防の一形態と捉えることができる。単語「ｅａｒｌｉｅｒ（より早期の）」の最後の３文字が特に重要である。研究が行われている全てのがんにおける治癒の見込みは、進行疾患のものと比較して早期の限局性疾患ではるかに高い。ステージがより早期であるほど、外科手術のみで腫瘍を治療できる可能性がより高くなる。更に、治療するがんが早期ステージにある場合は、そのがんを検出する必要はない。理論的には、治療に対する効果は、治療前におけるがん細胞の総数、及びヒト細胞における変異率によって決まる。がん細胞が多いほど、がん細胞のうちの少なくとも１つが、通常の化学療法であれ、放射線療法であれ、標的化療法であれ、または、免疫療法であれ、任意の形態の治療に対する耐性を付与する変異（複数可）を含有または発生する可能性がより高くなる。臨床的には、薬物がアジュバント療法において治療力を有し得るが進行疾患を有する患者においてはそうとはならないということを多数の研究が示している。例えば、ステージＩＩＩ結腸直腸癌を有する患者（自身の疾患により死亡することが想定される）のほぼ半数についてはアジュバント療法を用いて治療することができるが、ステージＩＶ結腸直腸癌を有する患者については同一のレジメンを用いて治療することがほとんどできない。
【０００７】
多くのがんにおいて、腫瘍ステージと予後の間には強い相関関係がある（Ａｎｓａｒｉ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｕｍｏｕｒ  ｓｉｚｅ  ａｎｄ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｄｕｃｔａｌ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｂｒ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  １０４（５）：６００−６０７）。肺、結腸、食道または胃のがんを有する患者（診断時に遠隔転移を有している）において、５年超生存する患者は極めて少ない（Ｈｏｗｌａｄｅｒ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０１６）ＳＥＥＲ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  Ｒｅｖｉｅｗ，１９７５−２０１３，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ｈｔｔｐ：／／ｓｅｅｒ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ｃｓｒ／１９７５＿２０１３／，２０１５年１１月のＳＥＥＲデータ提出に基づく、２０１６年４月にＳＥＥＲウェブサイトに掲載）。より大きな腫瘍と比較してより小さな腫瘍の方が診断時における転移頻度がより少なく、その結果、外科手術のみで治療できる可能性がより高くなるという点で、がんのサイズもまた一般的な意味において重要である。がんが遠隔部位に転移していたとしても、より少ない負荷量の疾患部は、大きな病変と比較してはるかにより容易に管理される（Ｂｏｚｉｃ  Ｉ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｅｌｉｆｅ  ２：ｅ００７４７）。それゆえ、結腸直腸癌に由来する微小転移を有する患者に投与されたアジュバント化学療法剤は、ほぼ５０％の症例において治療力を有し得る（Ｓｅｍｒａｄ  ＴＪ，Ｆａｈｒｎｉ  ＡＲ，Ｇｏｎｇ  ＩＹ，＆  Ｋｈａｔｒｉ  ＶＰ（２０１５）Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｏｌｉｇｏｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｕｓｉｎｇ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌ  Ｆｉｎｄｉｎｇｓ．Ａｎｎ  Ｓｕｒｇ  Ｏｎｃｏｌ  ２２  Ｓｕｐｐｌ  ３：Ｓ８５５−８６２；Ｍｏｅｒｔｅｌ  ＣＧ，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ  ｐｌｕｓ  ｌｅｖａｍｉｓｏｌｅ  ａｓ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ  ａｆｔｅｒ  ｒｅｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔａｇｅ  ＩＩＩ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ａ  ｆｉｎａｌ  ｒｅｐｏｒｔ．Ａｎｎ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ  １２２（５）：３２１−３２６；Ａｎｄｒｅ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｏｖｅｒａｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｗｉｔｈ  ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ，ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ，ａｎｄ  ｌｅｕｃｏｖｏｒｉｎ  ａｓ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｉｎ  ｓｔａｇｅ  ＩＩ  ｏｒ  ＩＩＩ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＭＯＳＡＩＣ  ｔｒｉａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２７（１９）：３１０９−３１１６）。Ｘ線で可視化される転移性病変を有する患者へと送達された同一の化学療法剤はほとんど治療をもたらさない（Ｄｙ  ＧＫ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ���ｕｒｖｉｖｏｒｓ  ｏｆ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｌｏｎｅ：ａ  Ｎｏｒｔｈ  Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｇｒｏｕｐ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ３８１１  ｐａｔｉｅｎｔｓ，Ｎ０１４４．Ｃｌｉｎ  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  ８（２）：８８−９３）。
【０００８】
それゆえ、より早期のがんの検出が膵臓癌を含むこれらの疾患による死亡を減少させるための１つの鍵であるということは明らかである。外科的切除の可能性の提供に加え、新たに開発されたアジュバント化学療法レジメン及び新たに出現した免疫療法レジメンが、外科的に治療可能な疾患部を超えた微小疾患部を有する患者においてより効果的であることは疑いようもなく証明されるだろう（Ｈｕａｎｇ  ＡＣ，ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｔ−ｃｅｌｌ  ｉｎｖｉｇｏｒａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｕｍｏｕｒ  ｂｕｒｄｅｎ  ｒａｔｉｏ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉ−ＰＤ−１  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．  Ｎａｔｕｒｅ  ５４５（７６５２）：６０−６５）。循環血液中のバイオマーカーは原則的に、より早期のステージでがんを検出するための最良の方法のうちの１つを提供する。歴史的に見て、がんをモニターするのに使用するバイオマーカーのタイプはタンパク質であり（Ｌｉｏｔｔａ  ＬＡ  ＆  Ｐｅｔｒｉｃｏｉｎ  ＥＦ，３ｒｄ（２００３）Ｔｈｅ  ｐｒｏｍｉｓｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．Ｃｌｉｎ  Ａｄｖ  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｏｎｃｏｌ  １（８）：４６０−４６２）、それらとしては、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、糖鎖抗原１９−９（ＣＡ１９−９）、及びがん抗原１２５（ＣＡ１２５）が挙げられる。これらのバイオマーカーは既知の疾患を有する患者をフォローするのに有用であることが証明されているが、それらの低い感度または特異度が一因となり、そのどれもがスクリーニング用途においては承認されていない（Ｌｅｎｎｏｎ  ＡＭ  ＆  Ｇｏｇｇｉｎｓ  Ｍ（２０１０）Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｍａｒｋｅｒｓ．Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ），ｐｐ  ６７５−７０１；Ｃｌａｒｋｅ−Ｐｅａｒｓｏｎ  ＤＬ（２００９）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｒａｃｔｉｃｅ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｆｏｒ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６１（２）：１７０−１７７；Ｌｏｃｋｅｒ  ＧＹ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）ＡＳＣＯ  ２００６  ｕｐｄａｔｅ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｉｎ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２４（３３）：５３１３−５３２７）。ごく最近では、バイオマーカーとしての変異ＤＮＡについて研究が行われている。このアプローチ（「リキッドバイオプシー」と呼ばれることが多い）の基礎をなすコンセプトは、がん細胞が、正常な自己複製細胞と同様に頻繁にターンオーバーすることである。瀕死の細胞から放出されたＤＮＡは、尿、糞便及び血漿などの体液へと漏出する場合がある（Ｈａｂｅｒ  ＤＡ  ＆  Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ  ＶＥ（２０１４）Ｂｌｏｏｄ−ｂａｓｅｄ  ａｎａｌｙｓｅｓ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ：ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ＤＮＡ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖ  ４（６）：６５０−６６１；Ｄａｗｓｏｎ  ＳＪ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ＤＮＡ  ｔｏ  ｍｏｎｉｔｏｒ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６８（１３）：１１９９−１２０９；Ｂｅｔｔｅｇｏｗｄａ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｅａｒｌｙ−  ａｎｄ  ｌａｔｅ−ｓｔａｇｅ  ｈｕｍａｎ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６（２２４）：２２４ｒａ２２４；Ｋｉｎｄｅ  Ｉ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｐａｐａｎｉｃｏｌａｏｕ  ｔｅｓｔ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔ  ｏｖａｒｉａｎ  ａｎｄ  ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ  ｃａｎｃｅｒｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５（１６７）：１６７ｒａ１６４；Ｗａｎｇ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ＨＰＶ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓａｌｉｖａ  ａｎｄ  ｐｌａｓｍａ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ７（２９３）：２９３ｒａ１０４；Ｗａｎｇ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｔｕｍｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｒａｉｎ  ａｎｄ  ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １１２（３１）：９７０４−９７０９；Ｗａｎｇ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ＤＮＡ  ｆｒｏｍ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃｙｓｔ  ｆｌｕｉｄ．Ｅｌｉｆｅ  ５；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ａ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍａｒｋｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｆｅａｔｕｒｅｓ  Ｉｍｐｒｏｖｅ  ｔｈｅ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｃｙｓｔｓ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １４９（６）：１５０１−１５１０；Ｆｏｒｓｈｅｗ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｂｙ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｅｅｐ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｐｌａｓｍａ  ＤＮＡ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４（１３６）：１３６ｒａ１６８；Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  Ｂ  ＆  Ｋｉｎｚｌｅｒ  ＫＷ（１９９９）Ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９６（１６）：９２３６−９２４１；Ｄｒｅｓｓｍａｎ  Ｄ，Ｙａｎ  Ｈ，Ｔｒａｖｅｒｓｏ  Ｇ，Ｋｉｎｚｌｅｒ  ＫＷ，＆  Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  Ｂ（２００３）Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｓｉｎｇｌｅ  ＤＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｉｎｔｏ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ��  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １００（１５）：８８１７−８８２２）。循環血液中の変異ＤＮＡをバイオマーカーとして使用することの利点はその正確な特異度である。がん内部の全ての細胞は、それら細胞のクローン増殖に影響を及ぼすドライバー遺伝子内に体細胞変異のコアセットを有している（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｃａｎｃｅｒ  ｇｅｎｏｍｅ  ｌａｎｄｓｃａｐｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９（６１２７）：１５４６−１５５８）。それに対し、正常細胞は成熟期の間にクローン増殖せず、任意の特定の体細胞変異を有する正常細胞の画分は極めて少ない。
【０００９】
循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）に関する研究の大多数は、スクリーニング環境におけるそれらの使用を評価することではなく、がんを有する患者のフォローに焦点を置いている。入手可能なデータは、多くのがんタイプの進行形態を有する患者の＞８５％においてｃｔＤＮＡが上昇していることを示している（Ｂｅｔｔｅｇｏｗｄａ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｅａｒｌｙ−  ａｎｄ  ｌａｔｅ−ｓｔａｇｅ  ｈｕｍａｎ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６（２２４）：２２４ｒａ２２４；Ｗａｎｇ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ＨＰＶ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓａｌｉｖａ  ａｎｄ  ｐｌａｓｍａ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ７（２９３）：２９３ｒａ１０４）。しかしながら、より早期のステージのがんを有する患者のうちのかなり少ない割合は、検出可能レベルのｃｔＤＮＡを自身の血漿中に有している（Ｂｅｔｔｅｇｏｗｄａ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｅａｒｌｙ−  ａｎｄ  ｌａｔｅ−ｓｔａｇｅ  ｈｕｍａｎ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６（２２４）：２２４ｒａ２２４；Ｗａｎｇ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ＨＰＶ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓａｌｉｖａ  ａｎｄ  ｐｌａｓｍａ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ７（２９３）：２９３ｒａ１０４）。
【００１０】
限局性がんの大部分は、何ら全身療法を行うことなく外科手術のみで治療することができる（Ｓｉｅｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７  ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  ６７：７−３０）。しかしながら、一旦遠隔転移が生じてしまうと、外科的切除が治療力を有することは稀である。それゆえ、がん研究における１つの主要な目的は、がんが遠隔部位に転移する前にそれらを検出することである。がんのタイプにもよるが、成人における標準的ながんが初期腫瘍性病変から末期ステージのがんにまで進行するには２０〜３０年間を要するものと思われる（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９：１５４６−１５５８；Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０５：４２８３−４２８８；及びＹａｃｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １８：６３３９−６３４７）。実際には、腫瘍性細胞が成功裏に転移性病変を拡散して生じさせるのは、この長い過程における最後の数年間においてのみであるものと思われる（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９：１５４６−１５５８；Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０５：４２８３−４２８８；Ｙａｃｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １８：６３３９−６３４７；及びＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３７３：１８９５−１８９８）。それゆえ、転移が開始する前には、がんを検出するための幅の広い機会がある。しかしながら、一旦大きな転移性腫瘍が形成されてしまうと現行療法は有効ではなくなる（Ｂｏｚｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３  Ｅｌｉｆｅ  ２：ｅ００７４７；Ｓｅｍｒａｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５  Ａｎｎ  Ｓｕｒｇ  Ｏｎｃｏｌ  ２２（Ｓｕｐｐｌ  ３）：Ｓ８５５−８６２；Ｍｏｅｒｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５  Ａｎｎ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ  １２２：３２１−３２６；Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７  Ｎａｔｕｒｅ  ５４５：６０−６５）。
【００１１】
膵管腺癌（以下「膵臓癌」）はがんによる死亡の原因の第三位であり、米国では２０３０年までに２番目に最も一般的な原因となることが予測されている（Ｒａｈｉｂ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｐｒｏｊｅｃｔｉｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｄｅａｔｈｓ  ｔｏ  ２０３０：ｔｈｅ  ｕｎｅｘｐｅｃｔｅｄ  ｂｕｒｄｅｎ  ｏｆ  ｔｈｙｒｏｉｄ，ｌｉｖｅｒ，ａｎｄ  ｐａｎｃｒｅａｓ  ｃａｎｃｅｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７４（１１）：２９１３−２９２１）。膵臓癌は致死的であることで有名であり、診断後５年間生存する患者は９％未満である（Ｓｉｅｇｅｌ  ＲＬ，Ｍｉｌｌｅｒ  ＫＤ，＆  Ｊｅｍａｌ  Ａ（２０１６）Ｃａｎｃｅｒ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，２０１６．ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  ６６（１）：７−３０）。膵臓癌を有する患者の予後不良の一因は、患者の８０％〜８５％が、周囲の主要血管に腫瘍が浸潤するかまたはＸ線検査で遠隔転移が明らかとなるかのいずれかの時点である進行ステージにおいて診断されるという事実によるものである（Ｒｙａｎ  ＤＰ，Ｈｏｎｇ  ＴＳ，＆  Ｂａｒｄｅｅｓｙ  Ｎ（２０１４）Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３７１（２２）：２１４０−２１４１）。疾患のこの末期の時点では、膵臓癌は外科的切除の対象とはならず、３年生存率は＜５％である。それに対し、切除可能がんの１つである極めて小さな限局性腫瘍ではほぼ６０％の５年生存が報告されており、腫瘍が小さいほど予後がより良好となる（Ａｎｓａｒｉ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｕｍｏｕｒ  ｓｉｚｅ  ａｎｄ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｄｕｃｔａｌ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｂｒ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  １０４（５）：６００−６０７；Ｊｕｎｇ  ＫＷ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｃｌｉｎｉｃｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ５４２  ｃａｓｅｓ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ：ａ  ｓｐｅｃｉａｌ  ｅｍｐｈａｓｉｓ  ｏｎ  ｓｍａｌｌ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ．Ｊ  Ｋｏｒｅａｎ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ  ２２  Ｓｕｐｐｌ：Ｓ７９−８５；Ｅｇａｗａ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｃｌｉｎｉｃｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ．Ｐａｎｃｒｅａｓ  ２８（３）：２３５−２４０；Ｉｓｈｉｋａｗａ  Ｏ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｍｉｎｕｔｅ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｎｃｒｅａｓ  ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  １  ｃｍ  ｏｒ  ｌｅｓｓ  ｉｎ  ｄｉａｍｅｔｅｒ−−ｃｏｌｌｅｃｔｉｖｅ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｃａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔｓ．Ｈｅｐａｔｏｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ４６（２５）：８−１５；Ｔｓｕｃｈｉｙａ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｃｏｌｌｅｃｔｉｖｅ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｎｃｒｅａｓ．Ａｎｎ  Ｓｕｒｇ  ２０３（１）：７７−８１）。
【００１２】
膵臓癌は、腫瘍ステージと予後の間のその強い相関関係という点において、その他のがんとは異ならない（Ａｎｓａｒｉ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｕｍｏｕｒ  ｓｉｚｅ  ａｎｄ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｄｕｃｔａｌ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｂｒ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  １０４（５）：６００−６０７）。肺、結腸、食道または胃のがんを有する患者（診断時に遠隔転移を有している）において、５年超生存する患者は極めて少ない（Ｈｏｗｌａｄｅｒ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０１６）ＳＥＥＲ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  Ｒｅｖｉｅｗ，１９７５−２０１３，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ｈｔｔｐ：／／ｓｅｅｒ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ｃｓｒ／１９７５＿２０１３／，２０１５年１１月のＳＥＥＲデータ提出に基づく、２０１６年４月にＳＥＥＲウェブサイトに掲載）。より大きな腫瘍と比較してより小さな腫瘍の方が診断時における転移頻度がより少なく、その結果、外科手術のみで治療できる可能性がより高くなるという点で、がんのサイズもまた一般的な意味において重要である。がんが遠隔部位に転移していたとしても、より少ない負荷量の疾患部は、大きな病変と比較してはるかにより容易に管理される（Ｂｏｚｉｃ  Ｉ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｅｌｉｆｅ  ２：ｅ００７４７）。それゆえ、結腸直腸癌に由来する微小転移を有する患者に投与されたアジュバント化学療法剤は、ほぼ５０％の症例において治療力を有し得る（Ｓｅｍｒａｄ  ＴＪ，Ｆａｈｒｎｉ  ＡＲ，Ｇｏｎｇ  ＩＹ，＆  Ｋｈａｔｒｉ  ＶＰ（２０１５）Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｏｌｉｇｏｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｕｓｉｎｇ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌ  Ｆｉｎｄｉｎｇｓ．Ａｎｎ  Ｓｕｒｇ  Ｏｎｃｏｌ  ２２  Ｓｕｐｐｌ  ３：Ｓ８５５−８６２；Ｍｏｅｒｔｅｌ  ＣＧ，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ  ｐｌｕｓ  ｌｅｖａｍｉｓｏｌｅ  ａｓ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ  ａｆｔｅｒ  ｒｅｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔａｇｅ  ＩＩＩ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ａ  ｆｉｎａｌ  ｒｅｐｏｒｔ．Ａｎｎ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ  １２２（５）：３２１−３２６；Ａｎｄｒｅ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｏｖｅｒａｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｗｉｔｈ  ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ，ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ，ａｎｄ  ｌｅｕｃｏｖｏｒｉｎ  ａｓ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｉｎ  ｓｔａｇｅ  ＩＩ  ｏｒ  ＩＩＩ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＭＯＳＡＩＣ  ｔｒｉａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２７（１９）：３１０９−３１１６）。Ｘ線で可視化される転移性病変を有する患者へと送達された同一の化学療法剤はほとんど治療をもたらさない（Ｄｙ  ＧＫ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｓｕｒｖｉｖｏｒｓ  ｏｆ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｌｏｎｅ：ａ  Ｎｏｒｔｈ  Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｇｒｏｕｐ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ３８１１  ｐａｔｉｅｎｔｓ，Ｎ０１４４．Ｃｌｉｎ  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  ８（２）：８８−９３）。
【００１３】
それゆえ、より早期のがんの検出が膵臓癌を含むこれらの疾患による死亡を減少させるための１つの鍵であるということは明らかである。外科的切除の可能性の提供に加え、新たに開発されたアジュバント化学療法レジメン及び新たに出現した免疫療法レジメンが、外科的に治療可能な疾患部を超えた微小疾患部を有する患者においてより効果的であることは疑いようもなく証明されるだろう（Ｈｕａｎｇ  ＡＣ，ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｔ−ｃｅｌｌ  ｉｎｖｉｇｏｒａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｕｍｏｕｒ  ｂｕｒｄｅｎ  ｒａｔｉｏ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉ−ＰＤ−１  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．  Ｎａｔｕｒｅ  ５４５（７６５２）：６０−６５）。循環血液中のバイオマーカーは原則的に、より早期のステージでがんを検出するための最良の方法のうちの１つを提供する。歴史的に見て、がんをモニターするのに使用するバイオマーカーのタイプはタンパク質であり（Ｌｉｏｔｔａ  ＬＡ  ＆  Ｐｅｔｒｉｃｏｉｎ  ＥＦ，３ｒｄ（２００３）Ｔｈｅ  ｐｒｏｍｉｓｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．Ｃｌｉｎ  Ａｄｖ  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｏｎｃｏｌ  １（８）：４６０−４６２）、それらとしては、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、糖鎖抗原１９−９（ＣＡ１９−９）、及びがん抗原１２５（ＣＡ１２５）が挙げられる。これらのバイオマーカーは既知の疾患を有する患者をフォローするのに有用であることが証明されているが、それらの低い感度または特異度が一因となり、そのどれもがスクリーニング用途においては承認されていない（Ｌｅｎｎｏｎ  ＡＭ  ＆  Ｇｏｇｇｉｎｓ  Ｍ（２０１０）Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｍａｒｋｅｒｓ．Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ），ｐｐ  ６７５−７０１；Ｃｌａｒｋｅ−Ｐｅａｒｓｏｎ  ＤＬ（２００９）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｒａｃｔｉｃｅ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｆｏｒ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６１（２）：１７０−１７７；Ｌｏｃｋｅｒ  ＧＹ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）ＡＳＣＯ  ２００６  ｕｐｄａｔｅ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｉｎ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２４（３３）：５３１３−５３２７）。ごく最近では、バイオマーカーとしての変異ＤＮＡについて研究が行われている。このアプローチ（「リキッドバイオプシー」と呼ばれることが多い）の基礎をなすコンセプトは、がん細胞が、正常な自己複製細胞と同様に頻繁にターンオーバーすることである。瀕死の細胞から放出されたＤＮＡは、尿、糞便及び血漿などの体液へと漏出する場合がある（Ｈａｂｅｒ  ＤＡ  ＆  Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ  ＶＥ（２０１４）Ｂｌｏｏｄ−ｂａｓｅｄ  ａｎａｌｙｓｅｓ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ：ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ＤＮＡ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖ  ４（６）：６５０−６６１；Ｄａｗｓｏｎ  ＳＪ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ＤＮＡ  ｔｏ  ｍｏｎｉｔｏｒ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６８（１３）：１１９９−１２０９；Ｂｅｔｔｅｇｏｗｄａ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｅａｒｌｙ−  ａｎｄ  ｌａｔｅ−ｓｔａｇｅ  ｈｕｍａｎ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６（２２４）：２２４ｒａ２２４；Ｋｉｎｄｅ  Ｉ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｐａｐａｎｉｃｏｌａｏｕ  ｔｅｓｔ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔ  ｏｖａｒｉａｎ  ａｎｄ  ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ  ｃａｎｃｅｒｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５（１６７）：１６７ｒａ１６４；Ｗａｎｇ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ＨＰＶ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓａｌｉｖａ  ａｎｄ  ｐｌａｓｍａ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ７（２９３）：２９３ｒａ１０４；Ｗａｎｇ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｔｕｍｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｒａｉｎ  ａｎｄ  ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １１２（３１）：９７０４−９７０９；Ｗａｎｇ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ＤＮＡ  ｆｒｏｍ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃｙｓｔ  ｆｌｕｉｄ．Ｅｌｉｆｅ  ５；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ａ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍａｒｋｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｆｅａｔｕｒｅｓ  Ｉｍｐｒｏｖｅ  ｔｈｅ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｃｙｓｔｓ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １４９（６）：１５０１−１５１０；Ｆｏｒｓｈｅｗ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｂｙ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｅｅｐ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｐｌａｓｍａ  ＤＮＡ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４（１３６）：１３６ｒａ１６８；Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  Ｂ  ＆  Ｋｉｎｚｌｅｒ  ＫＷ（１９９９）Ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９６（１６）：９２３６−９２４１；Ｄｒｅｓｓｍａｎ  Ｄ，Ｙａｎ  Ｈ，Ｔｒａｖｅｒｓｏ  Ｇ，Ｋｉｎｚｌｅｒ  ＫＷ，＆  Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  Ｂ（２００３）Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｓｉｎｇｌｅ  ＤＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｉｎｔｏ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ��  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １００（１５）：８８１７−８８２）。循環血液中の変異ＤＮＡをバイオマーカーとして使用することの利点はその正確な特異度である。がん内部の全ての細胞は、それら細胞のクローン増殖に影響を及ぼすドライバー遺伝子内に体細胞変異のコアセットを有している（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｃａｎｃｅｒ  ｇｅｎｏｍｅ  ｌａｎｄｓｃａｐｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９（６１２７）：１５４６−１５５８）。それに対し、正常細胞は成熟期の間にクローン増殖せず、任意の特定の体細胞変異を有する正常細胞の画分は極めて少ない。
【００１４】
循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）に関する研究の大多数は、スクリーニング環境におけるそれらの使用を評価することではなく、がんを有する患者のフォローに焦点を置いている。入手可能なデータは、多くのがんタイプの進行形態を有する患者の＞８５％においてｃｔＤＮＡが上昇していることを示している（Ｂｅｔｔｅｇｏｗｄａ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｅａｒｌｙ−  ａｎｄ  ｌａｔｅ−ｓｔａｇｅ  ｈｕｍａｎ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６（２２４）：２２４ｒａ２２４；Ｗａｎｇ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ＨＰＶ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓａｌｉｖａ  ａｎｄ  ｐｌａｓｍａ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ７（２９３）：２９３ｒａ１０４）。しかしながら、より早期のステージのがんを有する患者のうちのかなり少ない割合は、検出可能レベルのｃｔＤＮＡを自身の血漿中に有している（Ｂｅｔｔｅｇｏｗｄａ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｅａｒｌｙ−  ａｎｄ  ｌａｔｅ−ｓｔａｇｅ  ｈｕｍａｎ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６（２２４）：２２４ｒａ２２４；Ｗａｎｇ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ＨＰＶ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓａｌｉｖａ  ａｎｄ  ｐｌａｓｍａ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ７（２９３）：２９３ｒａ１０４）。
【００１５】
当該技術分野においては、高い特異度を維持した条件下で切除可能または別の方法で治療可能ながんの検出感度を上昇させることに対する継続的な要望がある。
【００１６】
パパニコロウ（Ｐａｐ）検査は、スクリーニング集団における子宮頸癌の罹患率及び死亡率を劇的に低下させている。あいにく、Ｐａｐ検査は一般的に、子宮内膜癌または卵巣癌を検出することができない（（Ｌ．Ｇｅｌｄｅｎｈｕｙｓ，Ｍ．Ｌ．Ｍｕｒｒａｙ，Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐａｐ  ｓｍｅａｒ  ｆｏｒ  ｇｌａｎｄｕｌａｒ  ｌｅｓｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｒｖｉｘ  ａｎｄ  ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｕｍ．Ａｃｔａ  ｃｙｔｏｌｏｇｉｃａ  ５１，４７−５０（２００７）；Ａ．Ｂ．Ｎｇ，Ｊ．Ｗ．Ｒｅａｇａｎ，Ｓ．Ｈａｗｌｉｃｚｅｋ，Ｂ．Ｗ．Ｗｅｎｔｚ，Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ．Ａｃｔａ  ｃｙｔｏｌｏｇｉｃａ  １８，３５６−３６１（１９７４）；Ｐ．Ｆ．Ｓｃｈｎａｔｚ，Ｍ．Ｇｕｉｌｅ，Ｄ．Ｍ．Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｊ．Ｉ．  Ｓｏｒｏｓｋｙ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ａｔｙｐｉｃａｌ  ｇｌａｎｄｕｌａｒ  ｃｅｌｌｓ  ｏｎ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃｙｔｏｌｏｇｙ．Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ  ａｎｄ  ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ  １０７，７０１−７０８（２００６）；Ｃ．Ｚｈａｏ，Ａ．Ｆｌｏｒｅａ，Ａ．Ｏｎｉｓｋｏ，Ｒ．Ｍ．Ａｕｓｔｉｎ，Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃ  ｆｏｌｌｏｗ−ｕｐ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ６６２  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｐａｐ  ｔｅｓｔ  ｆｉｎｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ａｔｙｐｉｃａｌ  ｇｌａｎｄｕｌａｒ  ｃｅｌｌｓ：ｒｅｓｕｌｔｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｌａｒｇｅ  ａｃａｄｅｍｉｃ  ｗｏｍｅｎｓ  ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １１４，３８３−３８９（２００９））。早期ステージの治療可能な子宮頸癌の検出におけるＰａｐ検査の成功を考慮すると、卵巣癌と子宮内膜癌のそれぞれは現在、Ｐａｐ検査が日常的に実施されている国々における最も致死的かつ最も一般的な婦人科悪性腫瘍となっている（Ｎ．Ｈｏｗｌａｄｅｒｅｔ  ａｌ．，ＳＥＥＲ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  Ｒｅｖｉｅｗ，１９７５−２０１４，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．（２０１７））。まとめると、子宮内膜癌及び卵巣癌による死亡は毎年約２５，０００人にのぼり、米国における女性のがん関連死因の第三位となっている（Ｎ．Ｈｏｗｌａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＥＥＲ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  Ｒｅｖｉｅｗ，１９７５−２０１４，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．（２０１７））。これらの死亡の大部分は、症状の発症前に転移する傾向のある高悪性度の腫瘍サブタイプを原因とするものである（Ｒ．Ｊ．Ｋｕｒｍａｎ，Ｍ．Ｓｈｉｈ  Ｉｅ，Ｔｈｅ  ｏｒｉｇｉｎ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ：ａ  ｐｒｏｐｏｓｅｄ  ｕｎｉｆｙｉｎｇ  ｔｈｅｏｒｙ．Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ３��，４３３−４４３（２０１０）；Ｋ．Ｎ．Ｍｏｏｒｅ，Ａ．Ｎ．Ｆａｄｅｒ，Ｕｔｅｒｉｎｅ  ｐａｐｉｌｌａｒｙ  ｓｅｒｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｃｌｉｎ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  ５４，２７８−２９１（２０１１））。
【００１７】
子宮内膜癌は最も一般的な婦人科悪性腫瘍であり、米国における２０１７年の新たな症例は６１，３８０件にのぼると推定されている（Ｎ．Ｈｏｗｌａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＥＥＲ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  Ｒｅｖｉｅｗ，１９７５−２０１４，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．（２０１７））。子宮内膜癌の発症率は、肥満が増加するにつれて、また平均余命が長くなるにつれて、上昇している（Ｍ．Ａｒｎｏｌｄｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｏｂａｌ  ｂｕｒｄｅｎ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ａｔｔｒｉｂｕｔａｂｌｅ  ｔｏ  ｈｉｇｈ  ｂｏｄｙ−ｍａｓｓ  ｉｎｄｅｘ  ｉｎ  ２０１２：ａ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  ｓｔｕｄｙ．Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １６，３６−４６（２０１５））。それと同時に、相対生存率は過去数十年にわたり改善していない（Ｎ．Ｈｏｗｌａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＥＥＲ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  Ｒｅｖｉｅｗ，１９７５−２０１４，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．（２０１７）；Ｌ．Ｒａｈｉｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｊｅｃｔｉｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｄｅａｔｈｓ  ｔｏ  ２０３０：ｔｈｅ  ｕｎｅｘｐｅｃｔｅｄ  ｂｕｒｄｅｎ  ｏｆ  ｔｈｙｒｏｉｄ，ｌｉｖｅｒ，ａｎｄ  ｐａｎｃｒｅａｓ  ｃａｎｃｅｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７４，２９１３−２９２１（２０１４））。このがんタイプ用のスクリーニング検査法の開発に多大な努力が向けられている。最も一般的な診断検査法は、子宮内膜の厚さを測定する経腟超音波法（ＴＶＵＳ）である。スクリーニング検査法としてのＴＶＵＳの潜在能力は、ＴＶＵＳが良性病変と悪性病変を確実に識別できないこと、がんを有さない女性に不必要な侵襲的処置を受けさせてその処置による関連合併症を引き起こすことにより、損なわれている。その高い偽陽性率は、ＴＶＵＳで陽性と判定された５０名の女性のうちのわずか１名だけが、追加の診断法を受けた後に子宮内膜癌を有するということが判明したという事実によって証明されている（Ｊａｃｏｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｖａｇｉｎａｌ  ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｆｏｒ  ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  ｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌ  ｗｏｍｅｎ：ａ  ｃａｓｅ−ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｔｕｄｙ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ＵＫＣＴＯＣＳ  ｃｏｈｏｒｔ．Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １２，３８−４８（２０１１））。
【００１８】
卵巣癌は米国及びヨーロッパにおける２番目に最も一般的な婦人科悪性腫瘍である。５年生存率が３０％未満となる時点である末期ステージに診断が行われることが多い（Ｎ．Ｈｏｗｌａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＥＥＲ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  Ｒｅｖｉｅｗ，１９７５−２０１４，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．（２０１７））。その高い死亡率ゆえに、有効なスクリーニング検査法の開発の優先度が高くなっている。大規模無作為化試験において、卵巣癌用の有望なスクリーニング検査法としてのＣＡ−１２５及びＴＶＵＳの使用について評価が行われている（Ｂｕｙｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｎ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｏｒｔａｌｉｔｙ：ｔｈｅ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ，Ｌｕｎｇ，Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ａｎｄ  Ｏｖａｒｉａｎ（ＰＬＣＯ）Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｔｒｉａｌ．ＪＡＭＡ  ３０５，２２９５−２３０３（２０１１）；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｆｏｒ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ：ａ  ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ  ｓｔｕｄｙ  ｉｎ  Ｊａｐａｎ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  １８，４１４−４２０（２００８）；Ｊａｃｏｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＵＫ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｔｒｉａｌ  ｏｆ  Ｏｖａｒｉａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ（ＵＫＣＴＯＣＳ）：ａ  ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｔｒｉａｌ．Ｌａｎｃｅｔ  ３８７，９４５−９５６（２０１６）；Ｍｅｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｉｓｋ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  Ｕｓｉｎｇ  Ｓｅｒｉａｌ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  Ｄｏｕｂｌｅｓ  ｔｈｅ  Ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  Ｓｃｒｅｅｎ−Ｄｅｔｅｃｔｅｄ  Ｃａｎｃｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｒｅｄ  Ｗｉｔｈ  ａ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  Ｒｕｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｔｒｉａｌ  ｏｆ  Ｏｖａｒｉａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ３３，２０６２−２０７１（２０１５））。しかしながら、現行の診断アプローチを用いたスクリーニング法は、それが「がんを有さない女性における主要な外科的介入を含む重大な損傷」をもたらすことから、一般集団には推奨されない（Ｖ．Ａ．Ｍｏｙｅｒ，Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｓ．Ｔ．Ｆｏｒｃｅ，Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｆｏｒ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ：Ｕ．Ｓ．Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｔａｓｋ  Ｆｏｒｃｅ  ｒｅａｆｆｉｒｍａｔｉｏｎ  ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎ  ｓｔａｔｅｍｅｎｔ．Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １５７，９００−９０４（２０１２））。それゆえ、新規の診断アプローチの必要性が急務となっている。
【００１９】
卵巣癌の１つである高悪性度の漿液性がん（ＨＧＳＣ）は全卵巣癌死の９０％を占めている。ほとんどのＨＧＳＣが卵管で生じ、それに続いて卵巣表面上に侵入しているということを、ますます多くのエビデンスが示唆している（１６−２１Ｒ．Ｊ．Ｋｕｒｍａｎ，Ｍ．Ｓｈｉｈ  Ｉｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｅｘｔｒａｏｖａｒｉａｎ  ｏｒｉｇｉｎ  ｏｆ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ−−ｓｈｉｆｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐａｒａｄｉｇｍ．Ｈｕｍａｎ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ４２，９１８−９３１（２０１１）；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｔｏ  ｓｅｒｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｔｈａｔ  ｏｒｉｇｉｎａｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｉｓｔａｌ  ｆａｌｌｏｐｉａｎ  ｔｕｂｅ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ２１１，２６−３５（２００７）Ａ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｔｏ  ｓｅｒｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｔｈａｔ  ｏｒｉｇｉｎａｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｉｓｔａｌ  ｆａｌｌｏｐｉａｎ  ｔｕｂｅ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ２１１，２６−３５（２００７）；Ｅｃｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｏｆ  Ｏｖａｒｉａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  Ｒｅｖｅａｌｓ  Ｄｉｖｅｒｓｅ  Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  Ｔｒａｊｅｃｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  Ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｆａｌｌｏｐｉａｎ  Ｔｕｂｅ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖ  ６，１３４２−１３５１（２０１６）；Ａ．Ｍ．Ｋａｒｓｔ，Ｋ．Ｌｅｖａｎｏｎ，Ｒ．Ｄｒａｐｋｉｎ，Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｈｉｇｈ−ｇｒａｄｅ  ｓｅｒｏｕｓ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｆａｌｌｏｐｉａｎ  ｔｕｂｅ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０８，７５４７−７５５２（２０１１）；Ｚｈａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｉｇｈ−ｇｒａｄｅ  ｓｅｒｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｒｉｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｏｖｉｄｕｃｔ  ｖｉａ  ｄｅｆｅｃｔｓ  ｌｉｎｋｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ２４３，１６−２５（２０１７）；Ｒ．Ｊ．Ｋｕｒｍａｎ，Ｍ．  Ｓｈｉｈ  Ｉｅ，Ｔｈｅ  Ｄｕａｌｉｓｔｉｃ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｏｖａｒｉａｎ  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ：Ｒｅｖｉｓｉｔｅｄ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，ａｎｄ  Ｅｘｐａｎｄｅｄ．Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １８６，７３３−７４７（２０１６））。ほとんどの早期診断ＨＧＳＣが卵巣外に起源を有していることを症候性女性における最近の前向き研究が報告している（Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ  ｗｏｍｅｎ  ｆｏｒ  ｅａｒｌｙ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ：ｒｅｓｕｌｔｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ＤＯｖＥ  ｐｉｌｏｔ  ｐｒｏｊｅｃｔ．Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １３，２８５−２９１（２０１２））。このことにより、卵巣異常が検出不能な時点である早期疾患に対するＴＶＵＳの低い感度が説明され��る。血清中ＣＡ−１２５レベルを用いたマルチモーダルスクリーニングでは感度が向上したが、ＣＡ−１２５は特異度に欠け様々な一般的な良性状態において上昇している（Ｈ．Ｍｅｄｅｎ，Ａ．Ｆａｔｔａｈｉ−Ｍｅｉｂｏｄｉ，ＣＡ  １２５  ｉｎ  ｂｅｎｉｇｎ  ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｍａｒｋｅｒｓ  １３，２３１−２３７（１９９８））。
【００２０】
腫瘍形成に関係するマーカーとは異なり、がんドライバー遺伝子変異は腫瘍形成の原因因子であり、非腫瘍状態には存在しない。卵巣癌を有する女性の膣管内において腫瘍ＤＮＡが検出され得るということが示されている（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｏｍａｔｉｃ  ＴＰ５３  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔａｍｐｏｎｓ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ−ｇｒａｄｅ  ｓｅｒｏｕｓ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ  ａｎｄ  ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ  １２４，８８１−８８５（２０１４））。更に、最近の原理証明研究では、子宮内膜癌及び卵巣癌から剥離した細胞が子宮頸部に集まることにより、検出可能レベルの腫瘍ＤＮＡが、通常のＰａｐ検査中に採取された体液中に見つかるようになるということを示している（Ｋｉｎｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｐａｐａｎｉｃｏｌａｏｕ  ｔｅｓｔ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔ  ｏｖａｒｉａｎ  ａｎｄ  ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ  ｃａｎｃｅｒｓ．Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ５，１６７ｒａ１６４（２０１３））。これらの細胞は、子宮頸管内に挿入されたブラシ（「Ｐａｐブラシ」）を用いて採取される。次に、そのブラシを保存液に浸す。子宮頸癌を検出するために、体液由来の細胞を細胞学的検査用のスライドに塗布する（標準的なパップスメア）。加えて、ＨＰＶ配列を検出するために体液からＤＮＡを精製することが多い。
【００２１】
膀胱癌（ＢＣ）は尿路における最も一般的な悪性腫瘍である。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙによれば、２０１７年の米国においてだけで、７９，０３０件の膀胱癌の新たな症例、及び１８，５４０件の死亡が発生すると推定されている［Ｓｉｅｇｅｌ  ＲＬ，Ｍｉｌｌｅｒ  ＫＤ，Ｊｅｍａｌ  Ａ（２０１７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，２０１７．ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  ６７：７−３０］。尿路上皮組織の大部分では、浸潤性ＢＣは非浸潤性の乳頭前駆細胞または扁平前駆細胞から発生する。多くのＢＣ患者は進行前に複数回の再発を経験するため、早期の検出及び治療を行うための十分なリードタイムが転移前に用意されている［Ｎｅｔｔｏ  ＧＪ（２０１３）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｒｅｃｅｎｔ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｕｒｏｌｏｇｉｃ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ：ｎｏ  ｌｏｎｇｅｒ  ｃｈａｓｉｎｇ  ａ  “ｍｉｒａｇｅ”？．Ａｄｖ  Ａｎａｔ  Ｐａｔｈｏｌ  ２０：１７５−２０３］。尿細胞診、及び経尿道的生検（ＴＵＲＢ）を伴う膀胱鏡検査は、膀胱癌の診断及びフォローアップのための現時点におけるゴールドスタンダードである。尿細胞診は高悪性度腫瘍の検出において価値を有しているが、低悪性度腫瘍の大部分については検出することができない［Ｎｅｔｔｏ  ＧＪ，Ｔａｆｅ  ＬＪ（２０１６）Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｂｌａｄｄｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ａｎｄ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｕｒｏｌ  Ｃｌｉｎ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ  ４３：６３−７６；Ｌｏｔａｎ  Ｙ，Ｒｏｅｈｒｂｏｒｎ  ＣＧ（２００３）Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｃｏｍｍｏｎｌｙ  ａｖａｉｌａｂｌｅ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｔｕｍｏｒ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｖｅｒｓｕｓ  ｃｙｔｏｌｏｇｙ：ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗ  ａｎｄ  ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｅｓ．Ｕｒｏｌｏｇｙ  ６１：１０９−１８；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  １１８；Ｚｈａｎｇ  ＭＬ，Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ  ＤＬ，ＶａｎｄｅｎＢｕｓｓｃｈｅ  ＣＪ（２０１６）Ｔｈｅ  ｃｙｔｏｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｌｏｗ−ｇｒａｄｅ  ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ  ｎｅｏｐｌａｓｍｓ  ｖａｒｙ  ｂｙ  ｓｐｅｃｉｍｅｎ  ｔｙｐｅ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｙｔｏｐａｔｈｏｌ  １２４：５５２−５６４］。この事実は、膀胱鏡検査とＴＵＲＢの反復手順の高コストかつ侵襲的な性質と共に、新規の非侵襲的戦略の開発へと多大な努力を導いている。これらの非侵襲的戦略としては、スクリーニング及びサーベイランスのための、尿または血清をベースとした遺伝的アッセイ及びタンパク質アッセイが挙げられる［Ｋａｗａｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９）９ｐ２１  Ｉｎｄｅｘ  ａｓ  Ｅｓｔｉｍａｔｅｄ  ｂｙ  Ｄｕａｌ−Ｃｏｌｏｒ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｉｓ  Ｕｓｅｆｕｌ  ｔｏ  Ｐｒｅｄｉｃｔ  Ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  Ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ  ｉｎ  Ｂｌａｄｄｅｒ  Ｗａｓｈｉｎｇ  Ｃｙｔｏｌｏｇｙ．Ｈｕｍ  Ｐａｔｈｏｌ  ４０：１７８３−１７８９；Ｋｒｕｇｅｒ  Ｓ，Ｍｅｓｓ  Ｆ，Ｂｏｈｌｅ  Ａ，Ｆｅｌｌｅｒ  ＡＣ（２００３）Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  ａｂｅｒｒａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １７  ａｎｄ  ｔｈｅ  ９ｐ２１  ｌｏｃｕｓ  ａｒｅ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｅｄｉｃｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｎｏｎ−ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｕｒｉｎａｒｙ  ｂｌａｄｄｅｒ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ  ２３：４１−４８；Ｓｋａｃｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｍｕｌｔｉｔａｒｇｅｔ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ  ｄｅｔｅｃｔｓ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒｉｔｙ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ａｔｙｐｉｃａｌ  ｏｒ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｕｒｉｎｅ  ｃｙｔｏｌｏｇｙ．Ｊ  Ｕｒｏｌ  １６９：２１０１−２１０５；Ｓａｒｏｓｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｕｓｅ  ｏｆ  ａ  ｍｕｌｔｉｔａｒｇｅｔ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ  ｔｏ  ｄｉａｇｎｏｓｅ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｈｅｍａｔｕｒｉａ．Ｊ  Ｕｒｏｌ  １７６：４４−４７；Ｍｏｏｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）ＵｒｏＶｙｓｉｏｎ  ｃｏｍｐａｒｅｄ  ｗｉｔｈ  ｃｙｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｃｙｔｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ  ｏｆ  ｎｏｎ−ｍｕｓｃｌｅ−ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ．Ｅｕｒ  Ｕｒｏｌ  ５１：１２７５−８０；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  １２８０；Ｆｒａｄｅｔ  Ｙ，Ｌｏｃｋｈａｒｄ  Ｃ（１９９７）Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｅｓｔ  ｆｏｒ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ：ＩｍｍｕｎｏＣｙｔ  ｔｒａｄｅ  ｍａｒｋ．Ｃａｎ  Ｊ  Ｕｒｏｌ  ４：４００−４０５；Ｙａｆｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１５）Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｕｒｉｎａｒｙ  ｃｙｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｕｒｉｎａｒｙ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ．Ｕｒｏｌ  Ｏｎｃｏｌ  ３３：６６．ｅ２５−６６．ｅ３１；Ｓｅｒｉｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａｎ  ａｄｄｉｔｉｖｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｖａｌｕｅ  ｏｆ  ＦＧＦＲ３  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｅｖｅｎｔｓ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ；Ｋｉｎｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１３）ＴＥＲＴ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｏｃｃｕｒ  ｅａｒｌｙ  ｉｎ  ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ  ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ａｎｄ  ａｒｅ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  ｅａｒｌｙ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｕｒｉｎｅ．Ｃａｎｃｅ��  Ｒｅｓ  ７３：７１６２−７１６７；Ｈｕｒｓｔ  ＣＤ，Ｐｌａｔｔ  ＦＭ，Ｋｎｏｗｌｅｓ  ＭＡ（２０１４）Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＴＥＲＴ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｉｎ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｖｏｉｄｅｄ  ｕｒｉｎｅ．Ｅｕｒ  Ｕｒｏｌ  ６５：３６７−３６９；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１４）ＴＥＲＴ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｒｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ  ｉｎ  ｕｐｐｅｒ  ｔｒａｃｔ  ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  ｓｅｒｖｅ  ａｓ  ｕｒｉｎａｒｙ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｄｅｔｅｃｔｅｄ  ｂｙ  ａ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｃａｓｔＰＣＲ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ  ５：１２４２８−１２４３９；Ｒａｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ−ｂａｓｅｄ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｉｎ  ｂｏｄｙ  ｆｌｕｉｄｓ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｕｒｏｌｏｇｉｃ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｃｌｉｎ  Ｌａｂ  Ｓｃｉ  ５１：２００−２３１；Ｅｌｌｉｎｇｅｒ  Ｊ，Ｍｕｌｌｅｒ  ＳＣ，Ｄｉｅｔｒｉｃｈ  Ｄ（２０１５）Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｌｏｏｄ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｄｉａｇｎ  １５：５０５−５１６；Ｂａｎｓａｌ  Ｎ，Ｇｕｐｔａ  Ａ，Ｓａｎｋｈｗａｒ  ＳＮ，Ｍａｈｄｉ  ＡＡ（２０１４）Ｌｏｗ−  ａｎｄ  ｈｉｇｈ−ｇｒａｄｅ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ  ａｐｐｒａｉｓａｌ  ｖｉａ  ｓｅｒｕｍ−ｂａｓｅｄ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｃｌｉｎ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ  ４３６：９７−１０３；Ｇｏｏｄｉｓｏｎ  Ｓ，Ｃｈａｎｇ  Ｍ，Ｄａｉ  Ｙ，Ｕｒｑｕｉｄｉ  Ｖ，Ｒｏｓｓｅｒ  ＣＪ（２０１２）Ａ  ｍｕｌｔｉ−ａｎａｌｙｔｅ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｎｏｎ−ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ７：ｅ４７４６９；Ａｌｌｏｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１４）Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ：ｈｉｇｈ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ａｃｒｏｓｓ  ｓｔａｇｅｓ，ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｕｒｉｎｅ，ａｎｄ  ｌａｃｋ  ｏｆ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｏｕｔｃｏｍｅ．Ｅｕｒ  Ｕｒｏｌ  ６５：３６０−３６６］。現在利用可能なＵ．Ｓ．Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（ＦＤＡ）承認済みアッセイとしては、ＩｍｍｕｎｏＣｙｔ  ｔｅｓｔ（Ｓｃｉｍｅｄｘ  Ｃｏｒｐ）、ｎｕｃｌｅａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２２（ＮＭＰ２２）ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｔｅｓｔ（Ｍａｔｒｉｔｅｃｈ）、及びｍｕｌｔｉｔａｒｇｅｔ  ＦＩＳＨ（ＵｒｏＶｙｓｉｏｎ）が挙げられる［Ｋａｗａｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９）９ｐ２１  Ｉｎｄｅｘ  ａｓ  Ｅｓｔｉｍａｔｅｄ  ｂｙ  Ｄｕａｌ−Ｃｏｌｏｒ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉ��  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｉｓ  Ｕｓｅｆｕｌ  ｔｏ  Ｐｒｅｄｉｃｔ  Ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  Ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ  ｉｎ  Ｂｌａｄｄｅｒ  Ｗａｓｈｉｎｇ  Ｃｙｔｏｌｏｇｙ．Ｈｕｍ  Ｐａｔｈｏｌ  ４０：１７８３−１７８９；Ｋｒｕｇｅｒ  Ｓ，Ｍｅｓｓ  Ｆ，Ｂｏｈｌｅ  Ａ，Ｆｅｌｌｅｒ  ＡＣ（２００３）Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  ａｂｅｒｒａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １７  ａｎｄ  ｔｈｅ  ９ｐ２１  ｌｏｃｕｓ  ａｒｅ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｅｄｉｃｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｎｏｎ−ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｕｒｉｎａｒｙ  ｂｌａｄｄｅｒ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ  ２３：４１−４８；Ｓｋａｃｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｍｕｌｔｉｔａｒｇｅｔ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ  ｄｅｔｅｃｔｓ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒｉｔｙ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ａｔｙｐｉｃａｌ  ｏｒ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｕｒｉｎｅ  ｃｙｔｏｌｏｇｙ．  Ｊ  Ｕｒｏｌ  １６９：２１０１−２１０５；Ｓａｒｏｓｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｕｓｅ  ｏｆ  ａ  ｍｕｌｔｉｔａｒｇｅｔ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ  ｔｏ  ｄｉａｇｎｏｓｅ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｈｅｍａｔｕｒｉａ．Ｊ  Ｕｒｏｌ  １７６：４４−４７；Ｍｏｏｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）ＵｒｏＶｙｓｉｏｎ  ｃｏｍｐａｒｅｄ  ｗｉｔｈ  ｃｙｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｃｙｔｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ  ｏｆ  ｎｏｎ−ｍｕｓｃｌｅ−ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ．Ｅｕｒ  Ｕｒｏｌ  ５１：１２７５
−８０；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  １２８０；Ｆｒａｄｅｔ  Ｙ，Ｌｏｃｋｈａｒｄ  Ｃ（１９９７）Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｅｓｔ  ｆｏｒ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ：ＩｍｍｕｎｏＣｙｔ  ｔｒａｄｅ  ｍａｒｋ．Ｃａｎ  Ｊ  Ｕｒｏｌ  ４：４００−４０５；Ｙａｆｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１５）Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｕｒｉｎａｒｙ  ｃｙｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｕｒｉｎａｒｙ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ．Ｕｒｏｌ  Ｏｎｃｏｌ  ３３：６６．ｅ２５−６６．ｅ３１］。これらの検査の一部において、６２％〜６９％の感度及び７９％〜８９％の特異度が報告されている。しかしながら、アッセイ性能のばらつき、コスト、または、必要とされる技術的専門知識ゆえに、このようなアッセイの日常的な臨床業務への導入はまだ行われていない。
【００２２】
膀胱癌は一般的に、膀胱の裏打ちにおける細胞から生じる３つのタイプに分類される。いくつかの実施形態では、膀胱癌は、悪性（がん性）となる細胞のタイプに応じて命名されるが、それらとしては、移行上皮癌、扁平上皮癌、及び腺癌が挙げられる。移行上皮癌は膀胱組織の最内層における細胞から生じる。移行上皮癌は低悪性度または高悪性度であり得る。低悪性度移行上皮癌は治療後に再発する場合もあるが、膀胱の筋層または身体のその他の部位に転移することはめったにない。高悪性度移行上皮癌は治療後に再発する場合があり、膀胱の筋層、身体のその他の部位、及び、リンパ節に転移することが多い。膀胱癌によるほぼ全ての死亡は高悪性度疾患によるものである。扁平上皮癌は、長期にわたる感染または炎症後に膀胱内で形成され得る薄く扁平な細胞である扁平上皮細胞から生じる。腺癌は膀胱の裏打ちに存在する腺（分泌）細胞から生じるものであり、極めて希少なタイプの膀胱癌である。
【００２３】
ＴＥＲＴ遺伝子の上流プロモーターにおける高比率の活性化変異が、ＢＣの大部分、ならびに、その他のがんタイプに見つかっている［Ｈｕａｎｇ  ＦＷ，Ｈｏｄｉｓ  Ｅ，Ｘｕ  ＭＪ，Ｋｒｙｕｋｏｖ  ＧＶ，Ｃｈｉｎ  Ｌ，Ｇａｒｒａｗａｙ  ＬＡ（２０１３）Ｈｉｇｈｌｙ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ＴＥＲＴ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９：９５７−９５９；Ｋｉｌｌｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１３）ＴＥＲＴ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｏｃｃｕｒ  ｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙ  ｉｎ  ｇｌｉｏｍａｓ  ａｎｄ  ａ  ｓｕｂｓｅｔ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｌｏｗ  ｒａｔｅｓ  ｏｆ  ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １１０：６０２１−６０２６；Ｓｃｏｔｔ  ＧＡ，Ｌａｕｇｈｌｉｎ  ＴＳ，Ｒｏｔｈｂｅｒｇ  ＰＧ（２０１４）Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＴＥＲＴ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ａｒｅ  ｃｏｍｍｏｎ  ｉｎ  ｂａｓａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ａｎｄ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｍｏｄ  Ｐａｔｈｏｌ  ２７：５１６−５２３］。ＴＥＲＴプロモーター変異は主に、２つのホットスポット、ｇ．１２９５２２８  Ｃ＞Ｔ、及びｇ．１２９５２５０  Ｃ＞Ｔに影響を及ぼす。ＴＥＲＴプロモーター変異により、ＥＴＳ転写因子用の結合部位を変化させるＣＣＧＧＡＡ／ＴモチーフまたはＧＧＡＡ／Ｔモチーフが生成され、それに続いて、ＴＥＲＴプロモーター活性が上昇する［Ｈｕａｎｇ  ＦＷ，Ｈｏｄｉｓ  Ｅ，Ｘｕ  ＭＪ，Ｋｒｙｕｋｏｖ  ＧＶ，Ｃｈｉｎ  Ｌ，Ｇａｒｒａｗａｙ  ＬＡ（２０１３）Ｈｉｇｈｌｙ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ＴＥＲＴ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９：９５７−９５９；Ｈｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１３）ＴＥＲＴ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｆａｍｉｌｉａｌ  ａｎｄ  ｓｐｏｒａｄｉｃ  ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９：９５９−９６１］。ＴＥＲＴプロモーター変異は、膀胱と上部尿路における浸潤性尿路上皮癌の最大８０％、ならびに、その組織学的変異型のいくつかにおいて生じている［Ｋｉｎｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１３）ＴＥＲＴ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｏｃｃｕｒ  ｅａｒｌｙ  ｉｎ  ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ  ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ａｎｄ  ａｒｅ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  ｅａｒｌｙ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｕｒｉｎｅ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７３：７１６２−７１６７；Ｋｉｌｌｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１３）ＴＥＲＴ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｏｃｃｕｒ  ｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙ  ｉｎ  ｇｌｉｏｍａｓ  ａｎｄ  ａ  ｓｕｂｓｅｔ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｌｏｗ  ｒａｔｅｓ  ｏｆ  ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １１０：６０２１−６０２６；Ａｌｌｏｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１４）Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ｐｒｏｍｏｔｅ���  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ：ｈｉｇｈ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ａｃｒｏｓｓ  ｓｔａｇｅｓ，ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｕｒｉｎｅ，ａｎｄ  ｌａｃｋ  ｏｆ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｏｕｔｃｏｍｅ．Ｅｕｒ  Ｕｒｏｌ  ６５：３６０−３６６；Ｃｏｗａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１６）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＴＥＲＴ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｕｒｉｎａｒｙ  ｂｌａｄｄｅｒ．Ｈｕｍ  Ｐａｔｈｏｌ  ５３：８−１３；Ｎｇｕｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１６）Ｈｉｇｈ  ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ｏｆ  ＴＥＲＴ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｐａｐｉｌｌａｒｙ  ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｖｉｒｃｈｏｗｓ  Ａｒｃｈ  ４６９：４２７−４３４］。更に、ＴＥＲＴプロモーター変異は、低悪性度の乳頭尿路上皮腫瘍［Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１７）Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｄｅ  ｎｏｖｏ  ＰＵＮＬＭＰ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｕｒｉｎａｒｙ  ｂｌａｄｄｅｒ．Ｖｉｒｃｈｏｗｓ  Ａｒｃｈ］、非浸潤性低悪性度乳頭尿路上皮癌、非浸潤性高悪性度乳頭尿路上皮癌、及び、「扁平」上皮内癌（ＣＩＳ）、ならびに、これらの患者のサブセットに由来する尿中細胞［Ｋｉｎｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１３）ＴＥＲＴ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｏｃｃｕｒ  ｅａｒｌｙ  ｉｎ  ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ  ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ａｎｄ  ａｒｅ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  ｅａｒｌｙ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｕｒｉｎｅ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７３：７１６２−７１６７］、を含む、ＢＣ前駆細胞の６０〜８０％において生じている。それゆえ、ＴＥＲＴプロモーター変異は、ＢＣにおける最も一般的な遺伝的改変として確立している［Ｋｉｎｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１３）ＴＥＲＴ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｏｃｃｕｒ  ｅａｒｌｙ  ｉｎ  ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ  ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ａｎｄ  ａｒｅ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  ｅａｒｌｙ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｕｒｉｎｅ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７３：７１６２−７１６７；Ｃｈｅｎｇ  Ｌ，Ｍｏｎｔｉｒｏｎｉ  Ｒ，Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｌｔｒａｎ  Ａ（２０１７）ＴＥＲＴ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  Ｏｃｃｕｒ  Ｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙ  ｉｎ  Ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｐａｐｉｌｌｏｍａ  ａｎｄ  Ｐａｐｉｌｌａｒｙ  Ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｎｅｏｐｌａｓｍ  ｏｆ  Ｌｏｗ  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ．Ｅｕｒ  Ｕｒｏｌ  ７１：４９７−４９８］。その他のがん遺伝子活性化変異としては、非筋肉浸潤性膀胱癌の大部分において生じることが判明している、ＦＧＦＲ３、ＲＡＳ及びＰＩＫ３ＣＡにおけるがん遺伝子活性化変異が挙げられる［Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｇｅｎｃｙ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ．（２０１６）ＷＨＯ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｕｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｒｉｎａｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  Ｍａｌｅ  Ｇｅｎｉｔａｌ  Ｏｒｇａｎｓ．Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ；４  ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｎｅｔｔｏ  ＧＪ（２０１１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｉｎ  ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｌａｄｄｅｒ：ａｒｅ  ｗｅ  ｔｈｅｒｅ  ｙｅｔ？．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｕｒｏｌ  ９：４１−５１］。筋肉浸潤性膀胱癌では、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ及びＥＲＢＢ２における変異もまた頻繁に見つかっている［Ｎｅｔｔｏ  ＧＪ（２０１１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｉｎ  ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｌａｄｄｅｒ：ａｒｅ  ｗｅ  ｔｈｅｒｅ  ｙｅｔ？．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｕｒｏｌ  ９：４１−５１；Ｍｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈａ−ｒａｓ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ，ｂｕｔ  ｎｏｔ  Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ，ｔｒｉｇｇｅｒｓ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１７：３１４−３２５；Ｓａｒｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｎｕｃｌｅａｒ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐ５３  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ａ  ｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  ８５：５３−５９；Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）Ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ，ｌｏｗ  ｇｒａｄｅ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｂｙ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ，ｐ１６，ｐ１４，ＲＡＳＳＦ１Ａ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｕｒｉｎｅ．Ｕｒｏｌ  Ｏｎｃｏｌ  ２８：５９７−６０２；Ｓａｒｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐ５３  ｎｕｃｌｅａｒ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｌａｄｄｅｒ．Ｊ  Ｕｒｏｌ  １５２：３８８−３９２；Ｗｕ  ＸＲ（２００５）Ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ：ａ  ｔａｌｅ  ｏｆ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ５：７１３−７２５；Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｎｅｔｗｏｒｋ（２０１４）Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｎａｔｕｒｅ  ５０７：３１５−３２２］。
【００２４】
尿細胞診の再発検出感度が比較的低いことから、米国におけるこのような患者に対しては３ヶ月毎に膀胱鏡検査が実施される。事実、これらの患者を管理するための合計コストは任意のその他のタイプのがんを管理するためのコストよりも高く、年間３０億ドルにのぼる［Ｎｅｔｔｏ  ＧＪ，Ｅｐｓｔｅｉｎ  ＪＩ（２０１０）Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ：ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ４２：３８４−３９４］。それゆえ、これらの患者のうちのどの患者が最も再発性ＢＣを発症する可能性があるかを予測することのできる非侵襲的検査法が、医学面と経済面の両方において重要となり得る。
【００２５】
４００，０００件超の泌尿器系移行上皮癌の新たな症例が毎年世界中で診断されている（Ａｎｔｏｎｉ，Ｓ．，Ｆｅｒｌａｙ，Ｊ．，Ｓｏｅｒｊｏｍａｔａｒａｍ，Ｉ．，Ｚｎａｏｒ，Ａ．，Ｊｅｍａｌ，Ａ．，＆  Ｂｒａｙ，Ｆ．（２０１７）．Ｂｌａｄｄｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ：Ａ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ａｎｄ  Ｒｅｃｅｎｔ  Ｔｒｅｎｄｓ．Ｅｕｒ  Ｕｒｏｌ，７１（１），９６−１０８．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｅｕｒｕｒｏ．２０１６．０６．０１０）。これらの尿路上皮癌の大部分が下部尿路の膀胱において生じているが、５〜１０％は、上部尿路の腎盂及び／または尿管を起源としている（Ｒｏｕｐｒｅｔ，Ｍ．，Ｂａｂｊｕｋ，Ｍ．，Ｃｏｍｐｅｒａｔ，Ｅ．，Ｚｉｇｅｕｎｅｒ，Ｒ．，Ｓｙｌｖｅｓｔｅｒ，Ｒ．Ｊ．，Ｂｕｒｇｅｒ，Ｍ．，Ｃｏｗａｎ，Ｎ．Ｃ．，Ｂｏｈｌｅ，Ａ．，Ｖａｎ  Ｒｈｉｊｎ，Ｂ．Ｗ．，Ｋａａｓｉｎｅｎ，Ｅ．，Ｐａｌｏｕ，Ｊ．，＆  Ｓｈａｒｉａｔ，Ｓ．Ｆ．（２０１５）．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｕｒｏｌｏｇｙ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｏｎ  Ｕｐｐｅｒ  Ｕｒｉｎａｒｙ  Ｔｒａｃｔ  Ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ：２０１５  Ｕｐｄａｔｅ．Ｅｕｒ  Ｕｒｏｌ，６８（５），８６８−８７９．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｅｕｒｕｒｏ．２０１５．０６．０４４；Ｓｏｒｉａ，Ｆ．，Ｓｈａｒｉａｔ，Ｓ．Ｆ．，Ｌｅｒｎｅｒ，Ｓ．Ｐ．，Ｆｒｉｔｓｃｈｅ，Ｈ．Ｍ．，Ｒｉｎｋ，Ｍ．，Ｋａｓｓｏｕｆ，Ｗ．，Ｓｐｉｅｓｓ，Ｐ．Ｅ．，Ｌｏｔａｎ，Ｙ．，Ｙｅ，Ｄ．，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｍ．Ｉ．，Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｅ．，Ｃｈａｄｅ，Ｄ．Ｃ．，Ｂａｂｊｕｋ，Ｍ．，Ｇｒｏｌｌｍａｎ，Ａ．Ｐ．，＆  Ｔｈａｌｍａｎｎ，Ｇ．Ｎ．（２０１７）．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，ｐｒｅｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｕｐｐｅｒ−ｔｒａｃｔ  ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ（ＵＴＵＣ）．Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｕｒｏｌ，３５（３），３７９−３８７．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ００３４５−０１６−１９２８−ｘ）。欧米諸国におけるこれら上部尿路上皮癌（ＵＴＵＣ）の年間発症率は１００，０００件あたり１〜２症例であるが、アリストロキア酸（ＡＡ）に曝露された集団においては、はるかにより高い割合で生じている（Ｃｈｅｎ，Ｃ．Ｈ．，Ｄｉｃｋｍａｎ，Ｋ．Ｇ．，Ｍｏｒｉｙａ，Ｍ．，Ｚａｖａｄｉｌ，Ｊ．，Ｓｉｄｏｒｅｎｋｏ，Ｖ．Ｓ．，Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｋ．Ｌ．，Ｇｎａｔｅｎｋｏ，Ｄ．Ｖ．，Ｗｕ，Ｌ．，Ｔｕｒｅｓｋｙ，Ｒ．Ｊ．，Ｗｕ，Ｘ．Ｒ．，Ｐｕ，Ｙ．Ｓ．，＆  Ｇｒｏｌｌｍａｎ，Ａ．Ｐ．（２０１２）．Ａｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉｃ  ａｃｉｄ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  Ｔａｉｗａｎ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，１０９（２１），８２４１−８２４６．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１１１９９２０１０９；Ｇｒｏｌｌｍａｎ，Ａ．Ｐ．（２０１３）．Ａｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉｃ  ａｃｉｄ  ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ：Ｈａｒｂｉｎｇｅｒ  ｏｆ  ａ  ｇｌｏｂａｌ  ｉａｔｒｏｇｅｎｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｏｌ  Ｍｕｔａｇｅｎ，５４（１），１−７．ｄｏｉ：１０．１００２／ｅｍ．２１７５６；Ｌａｉ，Ｍ．Ｎ．，Ｗａｎｇ，Ｓ．Ｍ．，Ｃｈｅｎ，Ｐ．Ｃ．，Ｃｈｅｎ，Ｙ．Ｙ．，＆  Ｗａｎｇ，Ｊ．Ｄ．（２０１０）．Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  ｃａｓｅ−ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈｅｒｂａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉｃ  ａｃｉｄ  ａｎｄ  ｕｒｉｎａｒｙ  ｔｒａｃｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｉｓｋ．Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ，１０２（３），１７９−１８６．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｊｎｃｉ／ｄｊｐ４６７；Ｔａｉｗａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ．（２０１７）．Ｂｕｒｅａｕ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ，Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｔａｉｗａｎ．Ｔｈｅ  ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｒｅｎａｌ  ｐｅｌｖｉｃ  ａｎｄ  ｕｒｅｔｅｒａｌ  ｔｕｍｏｒ  ｉｎ  Ｔａｉｗａｎ．Ｔａｉｗａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｇｉｓｔｒｙ．ＵＲＬ  ｃｒｉｓ．ｂｈｐ．ｄｏｈ．ｇｏｖ．ｔｗ／ｐａｇｅｐｕｂ／Ｈｏｍｅ．ａｓｐｘ？ｉｔｅｍＮｏ＝ｃｒ．ｑ．１０から２０１７年８月１４日に入手した。）。ＡＡは、ウマノスズクサ属の植物が生成する、発がん性と腎毒性を有するニトロフェナントレンカルボン酸である（Ｈｓｉｅｈ，Ｓ．Ｃ．，Ｌｉｎ，Ｉ．Ｈ．，Ｔｓｅｎｇ，Ｗ．Ｌ．，Ｌｅｅ，Ｃ．Ｈ．，＆  Ｗａｎｇ，Ｊ．Ｄ．（２００８）．Ｐｒｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｏｆ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌｌｙ  ａｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉｃ  ａｃｉｄ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈｅｒｂａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ：ａｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｉｎｓｕｒａｎｃｅ  ｄａｔａ  ｉｎ  Ｔａｉｗａｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  １９９７  ａｎｄ  ２００３，Ｃｈｉｎ  Ｍｅｄ，３，１３．ｄｏｉ：１０．１１８６／１７４９−８５４６−３−１３；Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｇｒａｍ．（２０１１）．Ａｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉｃ  ａｃｉｄｓ．Ｒｅｐ  Ｃａｒｃｉｎｏｇ，１２，４５−４９）。ＡＡ曝露とＵＴＵＣの間の病因論的因果関係は２つの異なる集団において確立している。第１の集団は、ウマノスズクサ属の植物が小麦畑に自生しているバルカン諸国に居住している（Ｊｅｌａｋｏｖｉｃ，Ｂ．，Ｋａｒａｎｏｖｉｃ，Ｓ．，Ｖｕｋｏｖｉｃ−Ｌｅｌａ，Ｉ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｆ．，Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｋ．Ｌ．，Ｎｉｋｏｌｉｃ，Ｊ．，Ｔｏｍｉｃ，Ｋ．，Ｓｌａｄｅ，Ｎ．，Ｂｒｄａｒ，Ｂ．，Ｔｕｒｅｓｋｙ，Ｒ．Ｊ．，Ｓｔｉｐａｎｃｉｃ，Ｚ．，Ｄｉｔｔｒｉｃｈ，Ｄ．，Ｇｒｏｌｌｍａｎ，Ａ．Ｐ．，＆  Ｄｉｃｋｍａｎ，Ｋ．Ｇ．（２０１２）．Ａｒｉｓｔｏｌａｃｔａｍ−ＤＮＡ  ａｄｄｕｃｔｓ  ａｒｅ  ａ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｏｆ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｔｏ  ａｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉｃ  ａｃｉｄ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ，８１（６），５５９−５６７．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｋｉ．２０１１．３７１）。第２の集団は、ウマノスズクサ属のハーブが中医学の慣習において広く使用されてい���アジアに存在している（Ｇｒｏｌｌｍａｎ，２０１３；Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｇｒａｍ，２０１１）。ウマノスズクサ属ハーブの医薬品利用がもたらす公衆衛生上の脅威の例は台湾であり、台湾におけるＵＴＵＣの発症率は世界で最も高い（Ｃｈｅｎ，Ｃ．Ｈ．，Ｄｉｃｋｍａｎ，Ｋ．Ｇ．，Ｍｏｒｉｙａ，Ｍ．，Ｚａｖａｄｉｌ，Ｊ．，Ｓｉｄｏｒｅｎｋｏ，Ｖ．Ｓ．，Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｋ．Ｌ．，Ｇｎａｔｅｎｋｏ，Ｄ．Ｖ．，Ｗｕ，Ｌ．，Ｔｕｒｅｓｋｙ，Ｒ．Ｊ．，Ｗｕ，Ｘ．Ｒ．，Ｐｕ，Ｙ．Ｓ．，＆  Ｇｒｏｌｌｍａｎ，Ａ．Ｐ．（２０１２）．Ａｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉｃ  ａｃｉｄ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  Ｔａｉｗａｎ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，１０９（２１），８２４１−８２４６．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１１１９９２０１０９；Ｙａｎｇ，Ｍ．Ｈ．，Ｃｈｅｎ，Ｋ．Ｋ．，Ｙｅｎ，Ｃ．Ｃ．，Ｗａｎｇ，Ｗ．Ｓ．，Ｃｈａｎｇ，Ｙ．Ｈ．，Ｈｕａｎｇ，Ｗ．Ｊ．，Ｆａｎ，Ｆ．Ｓ．，Ｃｈｉｏｕ，Ｔ．Ｊ．，Ｌｉｕ，Ｊ．Ｈ．，＆  Ｃｈｅｎ，Ｐ．Ｍ．（２００２）．Ｕｎｕｓｕａｌｌｙ  ｈｉｇｈ  ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｕｐｐｅｒ  ｕｒｉｎａｒｙ  ｔｒａｃｔ  ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｎ  Ｔａｉｗａｎ．Ｕｒｏｌｏｇｙ，５９（５），６８１−６８７）。台湾における成人人口の３分の１超がＡＡを含有するハーブ医薬品を処方されており（Ｈｓｉｅｈ，Ｓ．Ｃ．，Ｌｉｎ，Ｉ．Ｈ．，Ｔｓｅｎｇ，Ｗ．Ｌ．，Ｌｅｅ，Ｃ．Ｈ．，＆  Ｗａｎｇ，Ｊ．Ｄ．（２００８）．Ｐｒｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｏｆ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌｌｙ  ａｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉｃ  ａｃｉｄ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈｅｒｂａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ：ａｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｉｎｓｕｒａｎｃｅ  ｄａｔａ  ｉｎ  Ｔａｉｗａｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  １９９７  ａｎｄ  ２００３．Ｃｈｉｎ  Ｍｅｄ，３，１３．ｄｏｉ：１０．１１８６／１７４９−８５４６−３−１３）、結果として、全尿路上皮癌に対して異常に高い（３７％）割合のＵＴＵＣ症例がもたらされている（Ｔａｉｗａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ．（２０１７）．Ｂｕｒｅａｕ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ，Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｔａｉｗａｎ．Ｔｈｅ  ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｒｅｎａｌ  ｐｅｌｖｉｃ  ａｎｄ  ｕｒｅｔｅｒａｌ  ｔｕｍｏｒ  ｉｎ  Ｔａｉｗａｎ．Ｔａｉｗａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｇｉｓｔｒｙ．ＵＲＬ  ｃｒｉｓ．ｂｈｐ．ｄｏｈ．ｇｏｖ．ｔｗ／ｐａｇｅｐｕｂ／Ｈｏｍｅ．ａｓｐｘ？ｉｔｅｍＮｏ＝ｃｒ．ｑ．１０から２０１７年８月１４日に入手した。）。
【００２６】
腎尿管切除術は、ＵＴＵＣを有する患者において、それが早期のステージで検出された場合に、治療力を有し得る（Ｌｉ，Ｃ．Ｃ．，Ｃｈａｎｇ，Ｔ．Ｈ．，Ｗｕ，Ｗ．Ｊ．，Ｋｅ，Ｈ．Ｌ．，Ｈｕａｎｇ，Ｓ．Ｐ．，Ｔｓａｉ，Ｐ．Ｃ．，Ｃｈａｎｇ，Ｓ．Ｊ．，Ｓｈｅｎ，Ｊ．Ｔ．，Ｃｈｏｕ，Ｙ．Ｈ．，＆  Ｈｕａｎｇ，Ｃ．Ｈ．（２００８）．Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｕｐｐｅｒ  ｕｒｉｎａｒｙ  ｔｒａｃｔ  ｃａｎｃｅｒ  ａｆｔｅｒ  ｒａｄｉｃａｌ  ｎｅｐｈｒｏｕｒｅｔｅｒｅｃｔｏｍｙ  ｉｎ  Ｔａｉｗａｎｅｓｅ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｅｕｒ  Ｕｒｏｌ，５４（５），１１２７−１１３４．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｅｕｒｕｒｏ．２００８．０１．０５４）。しかしながら、これらのがんは、明らかな臨床症状（典型的には血尿）が発症するまではほぼ無症候性であるため、結果として、ほとんどの患者は専ら進行ステージにおいて診断される（Ｒｏｕｐｒｅｔ，Ｍ．，Ｂａｂｊｕｋ，Ｍ．，Ｃｏｍｐｅｒａｔ，Ｅ．，Ｚｉｇｅｕｎｅｒ，Ｒ．，Ｓｙｌｖｅｓｔｅｒ，Ｒ．Ｊ．，Ｂｕｒｇｅｒ，Ｍ．，Ｃｏｗａｎ，Ｎ．Ｃ．，Ｂｏｈｌｅ，Ａ．，Ｖａｎ  Ｒｈｉｊｎ，Ｂ．Ｗ．，Ｋａａｓｉｎｅｎ，Ｅ．，Ｐａｌｏｕ，Ｊ．，＆  Ｓｈａｒｉａｔ，Ｓ．Ｆ．（２０１５）．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｕｒｏｌｏｇｙ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｏｎ  Ｕｐｐｅｒ  Ｕｒｉｎａｒｙ  Ｔｒａｃｔ  Ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ：２０１５  Ｕｐｄａｔｅ．Ｅｕｒ  Ｕｒｏｌ，６８（５），８６８−８７９．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｅｕｒｕｒｏ．２０１５．０６．０４４）。早期ステージＵＴＵＣを検出するための診断検査法は現在利用可能な状態ではない。それゆえ、このタイプの悪性腫瘍を発症するリスクのある集団において早期ＵＴＵＣを同定するのに使用可能な臨床ツールに対する要望がある。ＵＴＵＣが反対側の上部尿路において、及び／または膀胱において再発し得ることから、外科手術後の再発もまた１つの懸念材料である（Ｒｏｕｐｒｅｔ，Ｍ．，Ｂａｂｊｕｋ，Ｍ．，Ｃｏｍｐｅｒａｔ，Ｅ．，Ｚｉｇｅｕｎｅｒ，Ｒ．，Ｓｙｌｖｅｓｔｅｒ，Ｒ．Ｊ．，Ｂｕｒｇｅｒ，Ｍ．，Ｃｏｗａｎ，Ｎ．Ｃ．，Ｂｏｈｌｅ，Ａ．，Ｖａｎ  Ｒｈｉｊｎ，Ｂ．Ｗ．，Ｋａａｓｉｎｅｎ，Ｅ．，Ｐａｌｏｕ，Ｊ．，＆  Ｓｈａｒｉａｔ，Ｓ．Ｆ．（２０１５）．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｕｒｏｌｏｇｙ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｏｎ  Ｕｐｐｅｒ  Ｕｒｉｎａｒｙ  Ｔｒａｃｔ  Ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ：２０１５  Ｕｐｄａｔｅ．Ｅｕｒ  Ｕｒｏｌ，６８（５），８６８−８７９．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｅｕｒｕｒｏ．２０１５．０６．０４４；Ｓｏｒｉａ，Ｆ．，Ｓｈａｒｉａｔ，Ｓ．Ｆ．，Ｌｅｒｎｅｒ，Ｓ．Ｐ．，Ｆｒｉｔｓｃｈｅ，Ｈ．Ｍ．，Ｒｉｎｋ，Ｍ．，Ｋａｓｓｏｕｆ，Ｗ．，Ｓｐｉｅｓｓ，Ｐ．Ｅ．，Ｌｏｔａｎ，Ｙ．，Ｙｅ，Ｄ．，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｍ．Ｉ．，Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｅ．，Ｃｈａｄｅ，Ｄ．Ｃ．，Ｂａｂｊｕｋ，Ｍ．，Ｇｒｏｌｌｍａｎ，Ａ．Ｐ．，＆  Ｔｈａｌｍ���ｎｎ，Ｇ．Ｎ．（２０１７）．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，ｐｒｅｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｕｐｐｅｒ−ｔｒａｃｔ  ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ（ＵＴＵＣ）．Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｕｒｏｌ，３５（３），３７９−３８７．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ００３４５−０１６−１９２８−ｘ）。それゆえ、悪性腫瘍の徴候に対する注意深い監視がＵＴＵＣ患者におけるフォローアップケアの不可欠な要素であり、とりわけ、尿細胞診ではＵＴＵＣの大部分を検出することができないことから、再発性疾患用の非侵襲的検査法が術後管理を大幅に改善することになり得る（Ｂａａｒｄ，Ｊ．，ｄｅ  Ｂｒｕｉｎ，Ｄ．Ｍ．，Ｚｏｎｄｅｒｖａｎ，Ｐ．Ｊ．，Ｋａｍｐｈｕｉｓ，Ｇ．，ｄｅ  ｌａ  Ｒｏｓｅｔｔｅ，Ｊ．，＆  Ｌａｇｕｎａ，Ｍ．Ｐ．（２０１７）．Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｄｉｌｅｍｍａｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｕｐｐｅｒ  ｔｒａｃｔ  ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｕｒｏｌ，１４（３），１８１−１９１．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｕｒｏｌ．２０１６．２５２）。
【発明の概要】
【００２７】
本明細書では一般的に、対象におけるがんの存在を同定するための従来の方法と比較して高い感度及び特異度で、対象におけるがんの存在を同定するための方法及び物質を提供する。いくつかの実施形態では、対象におけるがんの存在を高い感度及び特異度で同定するための本明細書で提供する方法は、対象から採取した液体試料（例えば、血液、血漿または血清）に対して実施される。それに対し、対象におけるがんの存在を同定するための従来の方法では、対象から採取した液体試料に対して実施する際に、感度のレベル、特異度のレベル、または、その両方のレベルが実現されない。いくつかの実施形態では、対象が既にがんを患っていることが確認される前、対象ががん細胞を有していることが確認される前、及び／または、対象ががんに関連する症状を示す前に、対象におけるがんの存在を高い感度及び特異度で同定するための本明細書で提供する方法を実施する。いくつかの実施形態では、対象におけるがんの存在を高い感度及び特異度で同定するための本明細書で提供する方法は第１選択の検出法として使用され、対象ががんを有することの別の検出法の確認（例えば、「オーバーコール」）として単純に使用するものではない。
【００２８】
いくつかの実施形態において、本明細書では、対象から採取した第１の生体試料中において、以下の遺伝子、ＫＲＡＳ、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、または、ＳＭＡＤ４のうちの１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出すること、対象から採取した第２の生体試料中において、以下のタンパク質バイオマーカー、糖鎖抗原１９−９（ＣＡ１９−９）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、または、オステオポンチン（ＯＰＮ）のうちの１つまたは複数のレベルを検出すること、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの検出レベルとタンパク質バイオマーカーの１つまたは複数の基準レベルを比較すること、及び、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在が検出された場合、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの検出レベルが１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの基準レベルよりも高い場合、または、その両方の場合に、対象における膵臓癌の存在を同定すること、を含む、対象における膵臓癌の存在を同定するための方法を提供する。対象における膵臓癌の存在を同定するための方法の一部では、第１の生体試料、第２の生体試料、または、その両方は、血漿を含む。対象における膵臓癌の存在を同定するための方法の一部では、第１の生体試料と第２の生体試料は同一である。対象における膵臓癌の存在を同定するための方法の一部では、ＫＲＡＳ、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ及びＳＭＡＤ４のそれぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出する。対象における膵臓癌の存在を同定するための方法の一部では、糖鎖抗原１９−９（ＣＡ１９−９）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）及びオステオポンチン（ＯＰＮ）のそれぞれのレベルを検出する。対象における膵臓癌の存在を同定するための方法の一部では、ａ．試料中に存在する複数の鋳型分子のそれぞれに固有識別子（ＵＩＤ）を割り当てること、ｂ．それぞれ固有にタグ付けした鋳型分子を増幅してＵＩＤファミリーを作製すること、及び、ｃ．増幅産物を重複してシークエンシングすること、を含む、マルチプレックスＰＣＲベースのシークエンシングアッセイを使用して、ＫＲＡＳ、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、または、ＳＭＡＤ４のうちの１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出する。対象における膵臓癌の存在を同定するための方法の一部では、対象ががん細胞を有することが知られていない場合、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出すること、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーのレベルを検出すること、または、その両方を実施する。対象における膵臓癌の存在を同定するための方法の一部では、対象は、１つまたは複数の治療介入（例えば、外科手術、アジュバント化学療法、ネオアジュバント化学療法、放射線療法、免疫療法、標的化療法、及び／または、免疫チェックポイント阻害薬）を実施される。
【００２９】
いくつかの実施形態において、本明細書では、対象から採取した第１の生体試料中において、以下の遺伝子、ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、または、ＧＮＡＳのうちの１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出すること、対象から採取した第２の生体試料中において、以下のタンパク質バイオマーカー、ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、または、ＭＰＯのうちの１つまたは複数のレベルを検出すること、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの検出レベルとタンパク質バイオマーカーの１つまたは複数の基準レベルを比較すること、及び、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在が検出された場合、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの検出レベルが１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの基準レベルよりも高い場合、または、その両方の場合に、対象におけるがんの存在を同定すること、を含む、対象におけるがんの存在を同定するための方法を提供する。対象におけるがんの存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、第１の生体試料、第２の生体試料、または、その両方は、血漿を含む。対象におけるがんの存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、第１の生体試料と第２の生体試料は同一である。対象におけるがんの存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ及びＧＮＡＳのそれぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出する。対象におけるがんの存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１及びＭＰＯのそれぞれのレベルを検出する。対象におけるがんの存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、ａ．試料中に存在する複数の鋳型分子のそれぞれに固有識別子（ＵＩＤ）を割り当てること、ｂ．それぞれ固有にタグ付けした鋳型分子を増幅してＵＩＤファミリーを作製すること、及び、ｃ．増幅産物を重複してシークエンシングすること、を含む、マルチプレックスＰＣＲベースのシークエンシングアッセイを使用して、ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、または、ＧＮＡＳのうちの１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出する。対象におけるがんの存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、がんは、肝臓癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、または、前立腺癌である。対象におけるがんの存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、対象ががん細胞を有することが知られていない場合、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出すること、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーのレベルを検出すること、または、その両方を実施する。対象におけるがんの存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、対象は、１つまたは複数の治療介入（例えば、外科手術、アジュバント化学療法、ネオアジュバント化学療法、放射線療法、免疫療法、標的化療法、及び／または、免疫チェックポイント阻害薬）を実施される。
【００３０】
いくつかの実施形態において、本明細書では、対象から採取した第１の生体試料中において、以下の遺伝子、ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、または、ＧＮＡＳのうちの１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出すること、対象から採取した第２の生体試料中において、以下のタンパク質バイオマーカー、ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、フォリスタチン、Ｇ−ＣＳＦ、または、ＣＡ１５−３のうちの１つまたは複数のレベルを検出すること、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの検出レベルとタンパク質バイオマーカーの１つまたは複数の基準レベルを比較すること、及び、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在が検出された場合、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの検出レベルが１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの基準レベルよりも高い場合、または、その両方の場合に、対象におけるがんの存在を同定すること、を含む、対象におけるがんの存在を同定するための方法を提供する。対象におけるがんの存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、第１の生体試料、第２の生体試料、または、その両方は、血漿を含む。対象におけるがんの存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、第１の生体試料と第２の生体試料は同一である。対象におけるがんの存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ及びＧＮＡＳのそれぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出する。対象におけるがんの存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、フォリスタチン、Ｇ−ＣＳＦ及びＣＡ１５−３のそれぞれのレベルを検出する。対象におけるがんの存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、ａ．試料中に存在する複数の鋳型分子のそれぞれに固有識別子（ＵＩＤ）を割り当てること、ｂ．それぞれ固有にタグ付けした鋳型分子を増幅してＵＩＤファミリーを作製すること、及び、ｃ．増幅産物を重複してシークエンシングすること、を含む、マルチプレックスＰＣＲベースのシークエンシングアッセイを使用して、ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、または、ＧＮＡＳのうちの１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出する。対象におけるがんの存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、がんは、肝臓癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、または、前立腺癌である。対象におけるがんの存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、対象ががん細胞を有することが知られていない場合、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出すること、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーのレベルを検出すること、または、その両方を実施する。対象におけるがんの存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、対象は、１つまたは複数の治療介入（例えば、外科手術、アジュバント化学療法、ネオアジュバント化学療法、放射線療法、免疫療法、標的化療法、及び／または、免疫チェックポイント阻害薬）を実施される。
【００３１】
いくつかの実施形態において、本明細書では、対象から採取した第１の生体試料中において、以下の遺伝子、ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、または、ＧＮＡＳのうちの１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出すること、対象から採取した第２の生体試料中において、以下のタンパク質バイオマーカー、ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、または、ＣＡ１５−３のうちの１つまたは複数のレベルを検出すること、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの検出レベルとタンパク質バイオマーカーの１つまたは複数の基準レベルを比較すること、及び、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在が検出された場合、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの検出レベルが１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの基準レベルよりも高い場合、または、その両方の場合に、対象におけるがんの存在を同定すること、を含む、対象におけるがんの存在を同定するための方法を提供する。対象におけるがんの存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、第１の生体試料、第２の生体試料、または、その両方は、血漿を含む。対象におけるがんの存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、第１の生体試料と第２の生体試料は同一である。対象におけるがんの存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ及びＧＮＡＳのそれぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出する。対象におけるがんの存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１及びＣＡ１５−３のそれぞれのレベルを検出する。対象におけるがんの存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、ａ．試料中に存在する複数の鋳型分子のそれぞれに固有識別子（ＵＩＤ）を割り当てること、ｂ．それぞれ固有にタグ付けした鋳型分子を増幅してＵＩＤファミリーを作製すること、及び、ｃ．増幅産物を重複してシークエンシングすること、を含む、マルチプレックスＰＣＲベースのシークエンシングアッセイを使用して、ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、または、ＧＮＡＳのうちの１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出する。対象におけるがんの存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、がんは、肝臓癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、または、前立腺癌である。対象におけるがんの存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、対象ががん細胞を有することが知られていない場合、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出すること、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーのレベルを検出すること、または、その両方を実施する。対象におけるがんの存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、対象は、１つまたは複数の治療介入（例えば、外科手術、アジュバント化学療法、ネオアジュバント化学療法、放射線療法、免疫療法、標的化療法、及び／または、免疫チェックポイント阻害薬）を実施される。
【００３２】
いくつかの実施形態において、本明細書では、対象から採取した第１の生体試料中において、以下の遺伝子、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、または、ＶＨＬのうちの１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出すること、対象から採取した第２の生体試料中のＴＥＲＴプロモーター内における少なくとも１つの変異の存在を検出すること、対象から採取した第３の生体試料中において異数性の存在を検出すること、及び、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在が検出された場合、ＴＥＲＴプロモーター内における少なくとも１つの変異の存在が検出された場合、異数性の存在が検出された場合、または、これらの組み合わせの場合に、対象における膀胱癌または上部尿路上皮癌の存在を同定すること、を含む、対象における膀胱癌または上部尿路上皮癌の存在を同定するための方法を提供する。対象における膀胱癌または上部尿路上皮癌の存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、第１の生体試料と第２の生体試料は同一である、第１の生体試料と第３の生体試料は同一である、第２の生体試料と第３の生体試料は同一である、または、第１の生体試料と前記第２の生体試料と前記第３の生体試料は同一である。対象における膀胱癌または上部尿路上皮癌の存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、第１の生体試料、第２の生体試料、または、第３の生体試料は、尿試料である。対象における膀胱癌または上部尿路上皮癌の存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、染色体腕５ｑ、８ｑ、または、９ｐのうちの１つまたは複数に異数性の存在を検出する。対象における膀胱癌または上部尿路上皮癌の存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ及びＶＨＬのそれぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出する。対象における膀胱癌または上部尿路上皮癌の存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、ａ．試料中に存在する複数の鋳型分子のそれぞれに固有識別子（ＵＩＤ）を割り当てること、ｂ．それぞれ固有にタグ付けした鋳型分子を増幅してＵＩＤファミリーを作製すること、及び、ｃ．増幅産物を重複してシークエンシングすること、を含む、マルチプレックスＰＣＲベースのシークエンシングアッセイを使用して、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、または、ＶＨＬのうちの１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出する。対象における膀胱癌または上部尿路上皮癌の存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、対象ががん細胞を有することが知られていない場合、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出すること、ＴＥＲＴプロモーター内における少なくとも１つの変異の存在を検出すること、または、異数性の存在を検出すること、を実施する。対象における膀胱癌または上部尿路上皮癌の存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、対象は、１つまたは複数の治療介入（例えば、外科手術、アジュバント化学療法、ネオアジュバント化学療法、放射線療法、免疫療法、標的化療法、及び／または、免疫チェックポイント阻害薬）を実施される。
【００３３】
いくつかの実施形態において、本明細書では、対象から採取した第１の生体試料中において、以下の遺伝子、ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、または、ＣＤＫＮ２Ａのうちの１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出すること、対象から採取した第２の生体試料中において異数性の存在を検出すること、及び、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在が検出された場合、異数性の存在が検出された場合、または、その両方の場合に、対象における卵巣癌または子宮内膜癌の存在を同定すること、を含む、対象における卵巣癌または子宮内膜癌の存在を同定するための方法を提供する。対象における卵巣癌または子宮内膜癌の存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、第１の生体試料と第２の生体試料は同一である。対象における卵巣癌または子宮内膜癌の存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、第１の生体試料または第２の生体試料は、子宮頸部試料または子宮内膜試料である。対象における卵巣癌または子宮内膜癌の存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、染色体腕４ｐ、７ｑ、８ｑ、または、９ｑのうちの１つまたは複数に異数性の存在を検出する。対象における卵巣癌または子宮内膜癌の存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ及びＣＤＫＮ２Ａのそれぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出する。対象における卵巣癌または子宮内膜癌の存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、ａ．試料中に存在する複数の鋳型分子のそれぞれに固有識別子（ＵＩＤ）を割り当てること、ｂ．それぞれ固有にタグ付けした鋳型分子を増幅してＵＩＤファミリーを作製すること、及び、ｃ．増幅産物を重複してシークエンシングすること、を含む、マルチプレックスＰＣＲベースのシークエンシングアッセイを使用して、ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、または、ＣＤＫＮ２Ａのうちの１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出する。対象における卵巣癌または子宮内膜癌の存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、方法は、対象から採取した循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）試料中において、以下の遺伝子、ＡＫＴ１、ＡＰＣ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＴＮＮＢ１、ＥＧＦＲ、ＦＢＸＷ７、ＦＧＦＲ２、ＧＮＡＳ、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＰＴＥＮ、または、ＴＰ５３のうちの１つまたは複数における少なくとも１つの遺伝子バイオマーカーの存在を検出することを更に含む。対象における卵巣癌または子宮内膜癌の存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、対象ががん細胞を有することが知られていない場合、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出すること、または、異数性の存在を検出すること、を実施する。対象における卵巣癌または子宮内膜癌の存在を同定するための方法のいくつかの実施形態では、対象は、１つまたは複数の治療介入（例えば、外科手術、アジュバント化学療法、ネオアジュバント化学療法、放射線療法、免疫療法、標的化療法、及び／または、免疫チェックポイント阻害薬）を実施される。
【００３４】
特に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解する意味と同一の意味を有する。方法及び物質については本発明で使用するために本明細書に記載しているが、当該技術分野において周知のその他の好適な方法及び物質もまた使用することができる。物質、方法及び例は例示に過ぎず、限定することを意図するものではない。本明細書において言及する全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリー及びその他の参照文献の全体は参照により組み込まれる。矛盾が生じた場合には、本明細書（定義を含む）が優先される。本明細書の様々なセクションにおいて使用する標題は、そのセクションにおける本開示をその標題の主題に限定すると解釈されるものではなく、その他のセクションにおける本開示をその標題の主題以外の主題に限定すると解釈されるものでもない。このような標題は例示的なものであり、単に、読解しやすいように組み込まれるものである。このような標題は更に、本開示のその他のパートへのそのセクションの適用性または普遍性を限定することを意図するものではない。
【００３５】
本発明のその他の特徴及び利点は、以下の発明を実施するための形態及び図面、ならびに、特許請求の範囲により明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】がんの検出及び位置特定を行うためのＣａｎｃｅｒＳＥＥＫ検査を示す概略の全体像を含有する図である。
【図２】血漿試料中における腫瘍特異的変異を同定するためのＰＣＲベースアッセイの発現を示すグラフを含有する図である。色の着いた曲線は、短い（＜４０ｂｐ）アンプリコンの増加数により検出可能な本試験で評価した８タイプのがんの割合を示している。検出の感度はアンプリコンの数に伴い上昇するが、約６０アンプリコンでプラトーに達する。色の着いたドットは、本発明者らの研究で評価した８０５のがんに用いた６１アンプリコンパネルを使用して検出したがんの割合を示しており、その平均は８２％である（本文を参照のこと）。一般に利用可能なシークエンシングデータについては、Ｃａｔａｌｏｇ  ｏｆ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ（ＣＯＳＭＩＣ）リポジトリから入手した。
【図３】評価した８０５の原発性腫瘍内における検出可能な変異の数の分布を示すグラフを含有する図である。
【図４】ＣａｎｃｅｒＳＥＥＫの性能を示すグラフを含有する図である。（Ａ）はＣａｎｃｅｒＳＥＥＫの受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線である。曲線上の赤色の点は、＞９９％特異度における検査の平均性能（６１％）を示している。エラーバーは、この特定の点における感度及び特異度の９５％信頼区間を示している。本文に記載のとおり、評価した８種のがんタイプ間の中央性能は７０％であった。（Ｂ）はステージ毎のＣａｎｃｅｒＳＥＥＫの感度である。エラーバーは中央値の標準誤差を示している。（Ｃ）は腫瘍タイプ毎のＣａｎｃｅｒＳＥＥＫの感度である。エラーバーは９５％信頼区間を示している。
【図５】健康なドナーと健康な患者の間の境界を示すＣａｎｃｅｒＳＥＥＫで使用したｃｔＤＮＡと８種のタンパク質の特性のウォーターフォールプロットを含有する図である。数値については高（左）から低（右）へとソートしている。それぞれのカラムは個々の患者の試料（赤色はがん患者、青色は健康な対照）を示している。
【図６】ＣａｎｃｅｒＳＥＥＫで使用したｃｔＤＮＡと８種のタンパク質の特性の主成分分析を示すグラフを含有する図である。それぞれのドットは個々の患者の試料（赤色はがん患者、青色は健康な対照）を示している。
【図７】感度に対する個々のＣａｎｃｅｒＳＥＥＫ特性の影響を示すグラフを含有する図である。（Ａ）は図４Ｃと同様の腫瘍タイプ毎のＣａｎｃｅｒＳＥＥＫの感度である。（Ｂ〜Ｊ）は、ロジスティック回帰から特定のＣａｎｃｅｒＳＥＥＫ特性を除外した際に達成された感度を示すそれぞれのパネルである。ＣａｎｃｅｒＳＥＥＫによって達成された感度と比較した感度における差異は、ＣａｎｃｅｒＳＥＥＫ検査の性能に対するそれぞれのバイオマーカーの相対的寄与を反映している。
【図８】ＣａｎｃｅｒＳＥＥＫにより陽性と分類された患者における、教師あり機械学習によるがんタイプの同定を示すグラフを含有する図である。患者の割合に相当するパーセンテージは、最も可能性のある２つのタイプ（薄青色バーと濃青色バーの合計）または最も可能性のあるタイプ（薄青色バー）の一方により正確に分類されている。全がんタイプの全患者における予測については表６に記載している。エラーバーは９５％信頼区間を示している。
【図９】ｃｔＤＮＡ  ＫＲＡＳ変異をタンパク質バイオマーカーと組み合わせることによりＰＤＡＣを早期に検出するための感度が上昇することを示すグラフを含有する図である。（Ａ）は、ＡＪＣＣステージに対応した、ｃｔＤＮＡ  ＫＲＡＳ変異単独、ｃｔＤＮＡ  ＫＲＡＳ変異＋ＣＡ１９−９、ならびに、ｃｔＤＮＡ  ＫＲＡＳ変異＋ＣＡ１９−９及びその他のタンパク質（組み合わせアッセイ）、の感度である。（Ｂ）は、腫瘍サイズに対応した、ｃｔＤＮＡ  ＫＲＡＳ変異単独、ｃｔＤＮＡ  ＫＲＡＳ変異＋ＣＡ１９−９、ならびに、ｃｔＤＮＡ  ＫＲＡＳ変異＋ＣＡ１９−９及びその他のタンパク質（組み合わせアッセイ）、の感度である。エラーバーは９５％信頼区間を示している。
【図１０】ほとんどの割合の患者が１つのマーカーのみで検出されることから、ｃｔＤＮＡとタンパク質マーカーを組み合わせることにより感度が上昇することを示す図形を含有する図である。ｃｔＤＮＡ  ＫＲＡＳ変異（赤色の円）、ＣＡ１９−９（緑色の円）、及び、３つのその他のタンパク質バイオマーカー（青色の円）、ならびに、これらの組み合わせ（重複領域）により、検出された患者の数である。８０名の患者（全体の３６％）については、３つのマーカーのいずれかにおいても検出不能であった。
【図１１】１２名の患者の血漿（検出可能な量のＫＲＡＳとＴＰ５３の両方の変異を含有する血漿）中におけるＫＲＡＳ変異の変異アレル頻度（ＭＡＦ）とＴＰ５３変異の変異アレル頻度が強く相関しており（ピアソンｒ＝０．８８５）、ｃｔＤＮＡアッセイの信頼性及びその定量性が実証されていることを示すグラフを含有する図である。網掛け領域は９５％信頼区間を示している。
【図１２】ＡＪＣＣステージ毎に分類した（ステージＩＡまたはＩＢは青色の曲線、ステージＩＩＡまたはＩＩＢは赤色の曲線）、本研究に組み込んだ２２１名のＰＤＡＣ患者のカプランマイヤー生存プロットを含有する図である。
【図１３】トリプレックスアッセイマーカーと腫瘍サイズの間の相関関係を示すグラフを含有する図である。（Ａ）ＫＲＡＳ変異はより小さな腫瘍と比較してより大きな腫瘍でより頻繁に見つかったが、変異アレル頻度は腫瘍サイズとは相関しなかった（ピアソンｒ＝０．０３９）。（Ｂ）ＣＡ１９−９の高い患者では、血漿中ＣＡ１９−９濃度は腫瘍サイズと弱く相関している（ピアソンｒ＝０．２８７）。（Ｃ〜Ｅ）ＣＥＡ、ＨＧＦ及びＯＰＮの血漿中レベルは、ＫＲＡＳ変異またはＣＡ１９−９と比較して、腫瘍サイズにより少なく依存していた（ＣＥＡピアソンｒ＝０．１５３、ＨＧＦピアソンｒ＝０．０３７、ＯＰＮピアソンｒ＝０．０１８）。網掛け領域は９５％信頼区間を示している。
【図１４】プロラクチンのレベル（Ｇ）とミッドカインのレベル（Ｅ）が、麻酔の投与後ではあるが外科的切除前に採取した試料において有意に上昇したことを示すグラフを含有する図である。それに対し、麻酔の投与前後に採取した試料間における、変異ＫＲＡＳ  ｃｔＤＮＡ（Ａ）、血漿中ＣＡ１９−９濃度（Ｂ）、血漿中ＣＥＡ濃度（Ｃ）、血漿中ＨＧＦ濃度（Ｄ）、及び血漿中ＯＰＮ濃度を有する試料の割合に差異は認められなかった。Ｎ．Ｓ．は有意差なし、Ｐ＞０．０５である（正確並べ替えｔ検定）。
【図１５】麻酔の投与前と投与直後に採取した２９ペアの血漿試料に由来するタンパク質バイオマーカーレベルの倍率変化を示すグラフを含有する図である。評価を行った６つのマーカーのうちプロラクチン及びミッドカインのみが麻酔によって上昇したことが判明し、採取部位とタンパク質レベルの間の相関関係と完全に一致した。
【図１６】多変量解析により同定された全生存率の独立した予測因子、（Ａ）組み合わせアッセイの状態（ＨＲ＝１．７６、９５％ＣＩ、１．１０〜２．８４、ｐ＝０．０１８）、（Ｂ）分化のグレード（低分化、ＨＲ＝１．７２、９５％ＣＩ、１．１１〜２．６６、ｐ＝０．０１５）、（Ｃ）リンパ管浸潤（有、ＨＲ＝１．８１、９５％ＣＩ、１．０６〜３．０９、ｐ＝０．０２８）、（Ｄ）結節性病変（有、ＨＲ＝２．３５、９５％ＣＩ、１．２０〜４．６１、ｐ＝０．０１３）、（Ｅ）断端の状態（ＨＲ＝１．５９、９５％ＣＩ、１．０１〜２．５５、ｐ＝０．０５０）毎に分類したカプランマイヤー生存プロットを含有する図である。
【図１７】（Ａ）ＫＲＡＳ変異、（Ｂ）ＣＡ１９−９、（Ｃ）ＣＥＡ、（Ｄ）ＨＧＦ、（Ｅ）ＯＰＮ、及び（Ｆ）組み合わせアッセイの受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を含有する図である。（Ａ〜Ｅ）ＲＯＣ曲線は、それぞれの組み合わせアッセイバイオマーカーの性能を個別に示している。曲線上の赤色の点は、組み合わせアッセイで使用した閾値におけるマーカー性能を示している。エラーバーは、特定の閾値（赤色のフォント）における感度及び特異度の９５％信頼区間を示している。（Ｆ）は、ＫＲＡＳ閾値を変化させてＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ及びＯＰＮの閾値を組み合わせアッセイに使用したレベルに固定した際の（黒色の曲線）、ＣＡ１９−９閾値を変化させてＫＲＡＳ、ＣＥＡ、ＨＧＦ及びＯＰＮの閾値を組み合わせアッセイに使用したレベルに固定した際の（赤色の曲線）、ＣＥＡ閾値を変化させてＫＲＡＳ、ＣＡ１９−９、ＨＧＦ及びＯＰＮの閾値を組み合わせアッセイに使用したレベルに固定した際の（青色の曲線）、ＨＧＦ閾値を変化させてＫＲＡＳ、ＣＡ１９−９、ＣＥＡ及びＯＰＮの閾値を組み合わせアッセイに使用したレベルに固定した際の（緑色の曲線）、及び、ＯＰＮ閾値を変化させてＫＲＡＳ、ＣＡ１９−９、ＣＥＡ及びＨＧＦの閾値を組み合わせアッセイに使用したレベルに固定した際の（オレンジ色の曲線）、組み合わせアッセイの性能を示すＲＯＣ曲線である。これら３つの曲線の交点は、トリプレックスアッセイの総合的な性能（感度６４％、感度９９．５％）を示している。
【図１８】８種のがんタイプにおいて、がんを同定するマーカーパネルの性能を示す図である。（Ａ）は数値データである。（Ｂ）はグラフデータである。
【図１９】子宮内膜癌または卵巣癌を有する患者のＰａｐブラシ試料、Ｔａｏブラシ試料及び血漿試料中における腫瘍ＤＮＡを検出するための例示的なＰａｐＳＥＥＫ検査の概略図を含有する図である。卵巣癌または子宮内膜癌から剥離した腫瘍細胞が子宮腔へと運ばれ、そこで、それら腫瘍細胞がＴａｏブラシにより採取されることができる。子宮頸管内へと通過した腫瘍細胞は、通常のＰａｐ検査で使用されるＰａｐブラシにより捕捉されることができる。これらのブラシを液体固定剤に浸し、そこからＤＮＡを単離及びシークエンスする。体細胞変異及び異数性について配列を解析する。加えて、血流内へと流れ出た腫瘍ＤＮＡをｃｔＤＮＡ解析で検出してもよい。
【図２０】健康な対照由来の、子宮内膜癌を有する患者由来の、卵巣癌を有する患者由来の、Ｐａｐブラシ試料（Ａ）及びＴａｏブラシ試料（Ｂ）中における、異数性及び体細胞変異の検出（ＰａｐＳＥＥＫ）を示すグラフを含有する図である。エラーバーは９５％信頼区間を示している。
【図２１】体細胞変異と異数性の組み合わせ検査が、Ｐａｐブラシ（Ａ）試料に加えＴａｏブラシ（Ｂ）試料中における、卵巣癌と子宮内膜癌の両方に対する感度を上昇させることを示すベン図を含有する図である。卵巣癌において、Ｐａｐブラシ試料と血漿試料の組み合わせ検査はまた、いずれかの試料タイプ単独における検査と比較して、感度を上昇させる（Ｃ）。
【図２２】ＰａｐＳＥＥＫを用いた、Ｐａｐブラシ試料またはＴａｏブラシ試料中におけるステージ毎の子宮内膜癌（Ａ）または卵巣癌（Ｂ）の検出を示すグラフを含有する図である。エラーバーは９５％信頼区間を示している。
【図２３】Ｐａｐ試料及び血漿試料中における卵巣癌の検出を示すグラフを含有する図である。エラーバーは９５％信頼区間を示している。
【図２４】ＰａｐＳＥＥＫを用いた、Ｐａｐブラシ試料、Ｔａｏブラシ試料、及び血漿試料中における子宮内膜癌及び卵巣癌の検出を示すグラフを含有する図である。エラーバーは９５％信頼区間を示している。
【図２５】本研究において尿中細胞を評価するために使用される例示的なアプローチの概略図を含有する図である。
【図２６】データの要約を含む早期検出コホート及びサーベイランスコホートにおける患者の数を示すフローチャートを含有する図である。患者のサブセットに対して細胞診を実施した。
【図２７】早期検出コホート（Ａ）で評価した２３１点の尿中細胞試料及びサーベイランスコホート（Ｂ）で評価した１３２点の尿中細胞試料の１０遺伝子パネル中に存在する変異の割合を示すグラフを含有する図である。
【図２８】早期検出コホート（Ａ）及びサーベイランスコホート（Ｂ）のための３つのアッセイのそれぞれにより陽性であった試料の分布のベン図を含有する図である。ＵＲＯ＝１０遺伝子パネル検査、ＴＥＲＴ＝ＴＥＲＴプロモーター領域検査、ＡＮＥＵ＝異数性検査である。
【図２９】早期検出コホート（Ａ）及びサーベイランスコホート（Ｂ）における、陽性ＵｒｏＳＥＥＫ検査と臨床レベルでの疾患の検出の間のリードタイムの棒グラフを含有する図である。
【図３０】早期検出コホート及びサーベイランスコホートの低及び高悪性度の尿路上皮腫瘍の診断における、ＵｒｏＳＥＥＫと比較した細胞診の性能を示す棒グラフを含有する図である。
【図３１】尿中細胞ＤＮＡの遺伝子解析による、例示的な上部尿路上皮癌（ＵＴＵＣ）の非侵襲的検出の概略図を含有する図である。上部尿路腫瘍は腎盂及び／または尿管において生じ、尿と直接接触している。尿は、存在する場合には悪性細胞（青色）と共に、様々な部位から泌尿器系を通って恒常的に流れ出た正常細胞の混合物を含有している。ＵｒｏＳＥＥＫアッセイは、染色体の喪失及び獲得の同定に加えて、泌尿器癌において頻繁に変異している遺伝子の変異解析に依存している。
【図３２】３つのＵｒｏＳＥＥＫアッセイのそれぞれにおける陽性結果の分布を示すベン図を含有する図である。
【図３３】ＵＴＵＣコホートに由来するマッチした腫瘍及び尿中細胞ＤＮＡ試料におけるコピー数多型の比較を示すグラフを含有する図である。原発性腫瘍をそれぞれのセクションの上段に、尿中細胞ＤＮＡを下段に示している。染色体の獲得は青色で示し、一方、喪失については赤色で示している。獲得と喪失の有意レベルについてはそれぞれ、Ｚスコア＞３と＜−３に設定した。Ｘ軸は染色体腕である。Ｙ軸はＺスコアである。
【図３４】ＵＴＵＣ患者由来の尿中細胞ＤＮＡを解析するのに使用した１０遺伝子パネル中のそれぞれの遺伝子における総変異の割合を示すグラフを含有する図である。
【図３５】４名の個々のＵＴＵＣ患者（図３５Ａ〜Ｄ）に由来するマッチした腫瘍及び尿中細胞ＤＮＡ試料におけるコピー数多型の比較を示すグラフを含有する図である。Ｚスコア＞３または＜−３はそれぞれ、染色体の獲得または喪失において有意であるとみなされた。Ｎ．Ｓ．は有意差なしを示している。全５６名の患者のデータについては表２８に記載している。
【図３６】例示的なＷＡＬＤＯアプローチの全体像を示す概略図を含有する図である。（Ａ）一対のプライマーペアで約３８，０００長鎖散在反復配列（ＬＩＮＥ）を増幅させる。（Ｂ）検査試料を、類似サイズのゲノムＤＮＡを有する７点の正倍数性試料にマッチさせる。（Ｃ）ゲノムを、それぞれが５００ｋｂサイズである４３６１の区間に分割する。（Ｄ）正倍数性試料中におけるこれら５００ｋｂゲノム区間内のリードを４３６１のクラスターにグループ分けする。クラスター内の全５００ｋｂゲノム区間は類似した読み取り深度を有している。（Ｅ）検査試料中の５００ｋｂゲノム区間のそれぞれに由来するリードを所定のクラスター内に配置する。（Ｆ）サポートベクターマシン（ＳＶＭ）ベースのアルゴリズムを含む統計的検定を用いて、試料が正倍数性である場合に、それぞれの染色体腕上の全５００ｋｂゲノム区間に由来する総リードが予測どおりに分布しているかどうかを確認する。統計的検定は検査試料のクラスター内に観察されたリード分布をベースとしているが、正倍数性試料中のリードとの比較によるものではない。（Ｇ）ＬＩＮＥ内の既知の一般的な多型部位における生殖細胞系配列変異型は、個々の染色体腕における異数性を評価するのにも使用可能な腕レベルのアレル不均衡についての情報を提供する。これら同一の多型を使用して、任意の２つの試料が同一個体に由来するかどうかを確認してもよい。（Ｈ）利用可能な同一個体に由来するマッチした正常試料が存在する場合、ＬＩＮＥ内における一塩基置換、一塩基挿入及び一塩基欠失の数及び内容をＷＡＬＤＯで検出することができる。
【図３７】９種のがんタイプにおいて同定された個々の染色体腕の獲得及び喪失を示すグラフを含有する図である。それぞれの染色体腕における獲得または喪失を有する腫瘍の平均割合について、図中に記載している。両方のコホートにおける同一の９種の腫瘍タイプを解析したが、ＷＡＬＤＯ（赤色）またはＧＩＳＴＩＣ（青色）で評価した試料間に重複は認められなかった。ＷＡＬＤＯでは本明細書で報告した腫瘍のＬＩＮＥシークエンシングに由来するデータを採用し、一方、ＧＩＳＴＩＣではＴＣＧＡが提供するＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＳＮＰ６．０アレイに由来するデータを採用した。
【図３８】がん患者由来の血漿試料中に検出された異数性を示す図である。３つの範囲の腫瘍細胞割合についての受信者動作特性（ＲＯＣ）及び曲線下面積（ＡＵＣ）を示している。真陽性を陽性とスコアリングしたがん患者由来の試料と定義し、一方、偽陽性を陽性とスコアリングした正常個体由来の試料と定義した。それぞれの血漿試料の腫瘍細胞割合については、本文に記載のドライバー遺伝子シークエンシングデータから推定した。（Ａ）は＜０．５％の腫瘍細胞割合を有する試料である。（Ｂ）は０．５〜１％の範囲の腫瘍細胞割合を有する試料である。（Ｃ）は＞１％の腫瘍細胞割合を有する試料である。
【図３９】９種の異なるがんタイプに対して、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＳＮＰ６．０及びＧＩＳＴＩＣを使用したＴｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）と比較した、ＦＡＳＴ−ＳｅｑＳ及びＷＡＬＤＯを使用して検出したがんにおける異数性相関関係比較を示すグラフを含有する図である。（Ａ）は染色体腕獲得の割合の相関関係である。（Ｂ）は染色体腕喪失の割合の相関関係である。
【図４０Ａ】Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）と比較した、ＷＡＬＤＯフレームワークを使用して検出された個々のがんタイプにおける異数性比較を示すグラフを含有する図である。それぞれのがんタイプにおいて、それぞれの染色体腕における獲得と喪失の割合を比較した。ＷＡＬＤＯとＴＣＧＡにおけるこれらの獲得と喪失の相関関係を比較した。それぞれのサブ図面は異なるがんタイプを示している。（Ａ）は浸潤性乳癌（ＢＲＣＡ）である。
【図４０Ｂ】Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）と比較した、ＷＡＬＤＯフレームワークを使用して検出された個々のがんタイプにおける異数性比較を示すグラフを含有する図である。それぞれのがんタイプにおいて、それぞれの染色体腕における獲得と喪失の割合を比較した。ＷＡＬＤＯとＴＣＧＡにおけるこれらの獲得と喪失の相関関係を比較した。それぞれのサブ図面は異なるがんタイプを示している。（Ｂ）は結腸腺癌及び直腸腺癌（ＣＯＡＤ、ＣＯＡＤＲＥＡＤ）である。
【図４０Ｃ】Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）と比較した、ＷＡＬＤＯフレームワークを使用して検出された個々のがんタイプにおける異数性比較を示すグラフを含有する図である。それぞれのがんタイプにおいて、それぞれの染色体腕における獲得と喪失の割合を比較した。ＷＡＬＤＯとＴＣＧＡにおけるこれらの獲得と喪失の相関関係を比較した。それぞれのサブ図面は異なるがんタイプを示している。（Ｃ）は食道癌（ＥＳＣＡ）である。
【図４０Ｄ】Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）と比較した、ＷＡＬＤＯフレームワークを使用して検出された個々のがんタイプにおける異数性比較を示すグラフを含有する図である。それぞれのがんタイプにおいて、それぞれの染色体腕における獲得と喪失の割合を比較した。ＷＡＬＤＯとＴＣＧＡにおけるこれらの獲得と喪失の相関関係を比較した。それぞれのサブ図面は異なるがんタイプを示している。（Ｄ）は頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣ）である。
【図４０Ｅ】Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）と比較した、ＷＡＬＤＯフレームワークを使用して検出された個々のがんタイプにおける異数性比較を示すグラフを含有する図である。それぞれのがんタイプにおいて、それぞれの染色体腕における獲得と喪失の割合を比較した。ＷＡＬＤＯとＴＣＧＡにおけるこれらの獲得と喪失の相関関係を比較した。それぞれのサブ図面は異なるがんタイプを示している。（Ｅ）は肝臓肝細胞癌（ＬＩＨＣ）である。
【図４０Ｆ】Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）と比較した、ＷＡＬＤＯフレームワークを使用して検出された個々のがんタイプにおける異数性比較を示すグラフを含有する図である。それぞれのがんタイプにおいて、それぞれの染色体腕における獲得と喪失の割合を比較した。ＷＡＬＤＯとＴＣＧＡにおけるこれらの獲得と喪失の相関関係を比較した。それぞれのサブ図面は異なるがんタイプを示している。（Ｆ）は膵腺癌（ＰＡＡＤ）である。
【図４０Ｇ】Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）と比較した、ＷＡＬＤＯフレームワークを使用して検出された個々のがんタイプにおける異数性比較を示すグラフを含有する図である。それぞれのがんタイプにおいて、それぞれの染色体腕における獲得と喪失の割合を比較した。ＷＡＬＤＯとＴＣＧＡにおけるこれらの獲得と喪失の相関関係を比較した。それぞれのサブ図面は異なるがんタイプを示している。（Ｇ）は卵巣漿液性嚢胞腺癌（ＯＶ）である。
【図４０Ｈ】Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）と比較した、ＷＡＬＤＯフレームワークを使用して検出された個々のがんタイプにおける異数性比較を示すグラフを含有する図である。それぞれのがんタイプにおいて、それぞれの染色体腕における獲得と喪失の割合を比較した。ＷＡＬＤＯとＴＣＧＡにおけるこれらの獲得と喪失の相関関係を比較した。それぞれのサブ図面は異なるがんタイプを示している。（Ｈ）は胃腺癌（ＳＴＡＤ）である。
【図４０Ｉ】Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）と比較した、ＷＡＬＤＯフレームワークを使用して検出された個々のがんタイプにおける異数性比較を示すグラフを含有する図である。それぞれのがんタイプにおいて、それぞれの染色体腕における獲得と喪失の割合を比較した。ＷＡＬＤＯとＴＣＧＡにおけるこれらの獲得と喪失の相関関係を比較した。それぞれのサブ図面は異なるがんタイプを示している。（Ｉ）は子宮体部子宮内膜癌（ＵＣＥＣ）である。
【図４１】読み取り深度に応じた２１トリソミー性能を示すグラフを含有する図である。トリソミーを有する個体由来のＤＮＡ試料を、２ｎｇの正常ＤＮＡと約０．２ｎｇの２１トリソミーＤＮＡと正常な末梢白血球（ＷＢＣ）試料の比率で物理的に混合した。混合物を作製して、非侵襲的出生前検査における通常の胎児画分（約１０％）を複製した。ＬＩＮＥ−アンプリコン中の多型を使用して、試料のトリソミー混和物を７．７％〜１０．４％の範囲と推定した。２．５のｚ閾値を使用して、読み取り深度の範囲にわたる感度（Ａ）及び特異度（Ｂ）を算出した。
【図４２】エキソームシークエンス対ＷＡＬＤＯにおいて検出された体細胞一塩基置換（ＳＢＳ）の総数の比較を示すグラフを含有する図である。
【図４３】エキソームシークエンシング対ＷＡＬＤＯにより検出された、Ａ：Ｔ＞Ｔ：Ａ変異である一塩基置換変異のパーセンテージの比較を示すグラフを含有する図である。
【図４４】一塩基置換（ＳＢＳ）変異のスペクトルを示すグラフを含有する図である。（Ａ）はＷＡＬＤＯにより同定されたＳＢＳである。（Ｂ）はエキソームシークエンシングにより同定されたＳＢＳである。
【図４５】代表的な正常ＷＢＣ試料のクラスター内に含まれるゲノム区間の数の分布を示すグラフを含有する図である。
【図４６Ａ】調整リードの分布を示すグラフを含有する図である。（Ａ）は、ＦＡＳＴ−ＳｅｑＳアンプリコンシークエンシングにおけるリードが無作為に分布していなかったことを示す調整リードの分布である。
【図４６Ｂ】調整リードの分布を示すグラフを含有する図である。（Ｂ）は、クラスター内における調整リードの正規性を示す正常ＷＢＣ試料の代表的なクラスターである。
【図４６Ｃ】調整リードの分布を示すグラフを含有する図である。（Ｃ）は、クラスター内における調整リードの正規性を示す異数性原発性腫瘍試料の代表的なクラスターである。
【図４７】染色体腕の獲得または喪失を同定するための統計的手法の例を示すグラフを含有する図である。
【図４８】読み取り深度に応じたヘテロ接合性ＳＮＰにおけるＢアレル頻度の分散の実験的推定を示すグラフを含有する図である。ＵＩＤ深度が高くなるほど、ヘテロ接合性ＳＮＰにおけるＢアレル頻度の推定は改善した。
【図４９】一腕改変を有する合成物質を作製するための例示的な擬似コードを示す図である。
【図５０】複数腕改変を有する合成物質を作製するための例示的な擬似コードを示す図である。
【図５１】読み取り深度に応じたゲノムワイド異数性スコア（ＳＶＭスコア）の分布を示すグラフを含有する図である。読み取り深度が低いほどより高いスコアが生じる傾向が強く、ＵＩＤ深度の補正に失敗すると偽陽性が生じる場合がある。
【図５２】ボトルネックシークエンシング法の例示的な全体像を示す概略図を含有する図である。図の最上部のそれぞれの色は、集団内における１つの細胞のゲノムに由来する二本鎖ＤＮＡを示している。ランダムで非クローン性の点変異（赤色）は個々の細胞に特有のものである。それに対し、クローン性のリファレンス変異（黒色のＡ）は細胞集団内の全てのゲノムに存在している。（ステップ１）ランダムせん断により様々なサイズのＤＮＡ分子を作製する。（ステップ２）Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｙアダプターの非相補的一本鎖領域（灰色のＰ５及び黒色のＰ７）は、それぞれのＤＮＡ分子の両末端にライゲートしたフォーク構造として示されている。（ステップ３）希釈により、元の集団由来のＤＮＡ分子（５つを示している）の数がランダムな様式で減少する。ＤＮＡ分子の末端は固有にリファレンスゲノムにアラインしている。マッピング座標は、データ処理中における固有の分子「バーコード」として使用される。（ステップ４）ＰＣＲプライマー（黒色の矢印）がアニールし、プライマーが元のＤＮＡ分子のワトソン鋳型とクリック鋳型に個別に伸長する（点線）。赤色のアスタリスクはライブラリのＰＣＲ中に生じたエラーを示している。（ステップ５）ワトソン鋳型とクリック鋳型により、２ファミリーのＰＣＲ複製物が生じる。ＤＮＡ分子（インサート）に対するアダプターを含有するＰ５（灰色）とＰ７（黒色）の方向により、２つのファミリーが識別される。Ｐ５配列とＰ７配列は、Ｉｌｌｕｍｉｎａフローセル上において、どちらの末端がそれぞれリード１対リード２においてシークエンスされるかを決定する。赤色のアスタリスクは、クリックファミリーメンバーにはないがワトソンファミリーメンバーにおいて伝播したＰＣＲエラーを示している。アーチファクトとは対照的に、真の変異（赤色のＣ：Ｇ変異）はワトソンファミリーメンバーとクリックファミリーメンバーの両方に存在する。（ステップ６）ＢｏｔＳｅｑＳパイプラインは、アーチファクトとクローン性の変異（黒色のＡ：Ｔ）を排除することにより、シークエンシングデータ中における固有ＤＮＡ分子と点変異（赤色のＣ：Ｇ）の数を同定及び定量する。
【図５３】対照と比較して、ＤＮＡ修復における欠損を有する個体または環境中の発がん性物質に曝露された個体に由来する正常組織において増加した核点変異を示すグラフを含有する図である。（Ａ）は、異なるＤＮＡミスマッチ修復遺伝子型（ＰＭＳ２＋／＋またはＰＭＳ２−／−）を有する年齢がマッチした正常結腸上皮（べた塗りの円）または発がん性物質曝露を有さない（無）もしくは発がん性物質曝露を有する（アリストロキア酸または喫煙）年齢がマッチした正常腎皮質（べた塗りの四角）における、核ゲノム（左）とミトコンドリアゲノム（右）における点変異有病率の比較である。赤色の線は平均を示している。＊Ｐ＜０．０５、ｔ検定；＊＊Ｐ＜０．００１及び＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ボンフェローニ多重比較事後検定を伴う一元配置ＡＮＯＶＡ；ｎｓ、有意差なしはＰ＞０．０５を示している。（Ｂ）は、６つの発生し得るタイプ（凡例を参照のこと）のうちのそれぞれの置換の置換頻度（ｙ軸）を示す積み重ねカラムである。コホートラベルはそれぞれのカラム真上のＡに示している。それぞれの変異スペクトルを生成する置換の数（Ｎ）をｘ軸上に示している。ｎ．ｄ．は、変異スペクトル解析における不十分な数の変異（Ｎ＝７）による未測定である。＊Ｐ＝０．０４、フィッシャーの正確確率検定；＊＊Ｐ＝２．６×１０−８及び＊＊＊Ｐ＝１．５×１０−１６、ボンフェローニ多重比較補正を伴うフィッシャーの正確確率検定；ｎｓ、有意差なしはＰ＞０．０５を示している。この図における全ての統計的検定は両側であった。
【図５４】ゲノム特異的な変異パターン及び組織特異的な変異パターンで、生涯にわたり点変異を蓄積させた正常ヒト組織を示すグラフを含有する図である。４つの正常組織タイプ（９名の個体における脳前頭皮質、５名の個体における腎皮質、１１名の個体における結腸上皮、及び、１名の個体における十二指腸）における核ゲノム（上段）とミトコンドリアゲノム（下段）における点変異有病率を測定した。合計で２６名の個体について評価を行ったが、それぞれの個体は１つの正常組織タイプを提供した。円グラフ挿入図は、６つの発生し得る置換タイプ（右側の円グラフ凡例を参照のこと）のうちのそれぞれの置換の有病率を示している。それぞれの円グラフを、十二指腸を省略したという点を除いて、個体それぞれの散布図で示した個体から集計した。核ゲノムにおける円グラフを生成する置換の数は、脳でｎ＝３１、腎臓でｎ＝７３、及び結腸でｎ＝９４であり、ミトコンドリアゲノムにおける円グラフを生成する置換の数は、脳でｎ＝１８１、腎臓でｎ＝２９９、及び結腸でｎ＝１１６であった。
【図５５】ＭｉＳｅｑ（商標）プレランを用いた複製カウントの評価を含有する図である。ヒストグラムはファミリーメンバー（ｘ軸上に示す、個々の鋳型分子に由来するＰＣＲ複製物）の分布を示している。６点の試料（ＣＯＬ３７３、ＳＡ＿１１７、ＫＩＤ０３８、ＢＲＡ０１、ＢＲＡ０４、ＢＲＡ０７）についてＭｉＳｅｑ（商標）で２回または３回の系列希釈（１０３、１０４、１０５、または１０６）のいずれかを評価して、ライブラリあたり約５Ｍの適切なペアリードを生成した。ここで、Ｐｉｃａｒｄ’ｓ  Ｅｓｔｉｍａｔｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙプログラムを使用してファミリーメンバーカウントを求めた。それに続き、１０５希釈（青色）で作製したライブラリを本研究で報告した最終のＨｉＳｅｑ（商標）ランに使用した。ライブラリあたりにシークエンスするクラスターの増加により、ＨｉＳｅｑ（商標）分布がＭｉＳｅｑ（商標）分布と比較して右側にシフトすることが予測されるということに留意されたい（約５Ｍのクラスターが約７０Ｍのクラスターに調整される）。例えば、ファミリーあたりのメンバーがＨｉＳｅｑ（商標）ランにとって多すぎて、任意の量のシークエンシングで評価可能な異なるファミリーの数を制限することから、１０６希釈（赤色）由来のＢｏｔＳｅｑＳライブラリは使用しなかった。
【図５６】本研究で報告した４４のＢｏｔＳｅｑＳライブラリのファミリーメンバーカウントを示すグラフを含有する図である。４４のＢｏｔＳｅｑＳライブラリの水平な箱ひげ図（ｙ軸）及びファミリーあたりのメンバーの数（複製カウント、ｘ軸）である。白色の箱は第１四分位数〜第３四分位数の範囲を示しており、ハッシュマークは中央値を示している。ひげは１．５＊ＩＱＲ（四分位数範囲）を示しており、ひげの外側のデータ点は外れ値として示している。ライブラリあたり平均３．９７Ｍ（０．３８〜１０．９１Ｍの範囲）の未フィルターファミリーを評価した。ゲノムマッピング座標を固有分子識別コードとして使用したＢｏｔＳｅｑＳパイプラインによりファミリーを同定した。青色の名称はテクニカルレプリケート試料を示している。Ｂｏｔ０１〜Ｂｏｔ０６とＢｏｔ２３〜２８については、希釈に１００倍の差がある同一試料で実施したということに留意されたい（表４３を参照のこと）。
【図５７】ワトソンファミリーメンバーとクリックファミリーメンバーの両方がアーチファクト、とりわけＧ＞Ｔ塩基転換を減少させることの考察を示すグラフを含有する図である。（Ａ）は、脳前頭皮質（左側）、腎皮質（中央部、網掛け）、または、結腸上皮（右側）に由来する正常組織における「ワトソンＡＮＤ／ＯＲクリック」ファミリー（黒色の円）または「ワトソンＡＮＤクリック」ファミリー（黒色の四角）に認められる変異を考察した核点変異頻度（ｙ軸）である。とりわけ、「ＯＲ」変異は、最低２つのワトソンリードを有するワトソンファミリーにおける≧９０％の変異割合、または、最低２つのクリックリードを有するクリックファミリーにおける≧９０％の変異割合を示している。「ＯＲ」変異がデータに示されるワトソンファミリーまたはクリックファミリーのみを有しているが両方を有しているわけではないということに留意されたい。「ＡＮＤ」変異は、最低２つのワトソンリードを有するワトソンファミリーにおける≧９０％の変異割合、及び、最低２つのクリックリードを有するクリックファミリーにおける≧９０％の変異割合を示している。「ＡＮＤ」変異は、ＢｏｔＳｅｑＳパイプラインの改良型である「ＡＮＤ／ＯＲ」データセットのうちの内部サブセットである。それぞれの組織内において加齢させることにより２５の個体を組織する。（Ｂ）は、（ａ）それぞれの正常組織タイプにおけるワトソンＡＮＤ／ＯＲクリック（上段の円）またはワトソンＡＮＤクリック（下段の円）を考察することによる、６つの発生し得る置換タイプ（凡例を参照のこと）のうちのそれぞれの核置換の頻度の円グラフである。ワトソンＡＮＤ／ＯＲクリックにおける変異スペクトルを生成する核変異の数は、脳でｎ＝６１６、腎臓でｎ＝１，２５７、結腸でｎ＝２，５４２であり、ワトソンＡＮＤクリックにおける変異スペクトルを生成する核変異の数は、脳でｎ＝３３、腎臓でｎ＝７４、結腸でｎ＝９９であった。
【図５８】脳内よりも結腸の正常組織内により多く蓄積する希少な点変異を示すグラフを含有する図である。年齢でグループ分けした（若年乳児／小児は緑色、若年成人は紫色、老年成人は青色）、正常脳前頭皮質（左側）及び正常結腸上皮（右側）における、核ゲノム（上段のグラフ）とミトコンドリアゲノム（下段のグラフ）における点変異頻度（ｙ軸）である。それぞれの年齢コホートにおける平均値については、標準偏差を示すエラーバーで示している。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（商標）５．０ｆソフトウェアを使用してボンフェローニ多重比較事後検定を伴う二元配置ＡＮＯＶＡを実施し、Ｐ値については上記のバーで報告した。ｎ．ｓ．（有意差なし）はＰ＞０．０５を示している。脳における個体の数と群の平均年齢は以下のとおり、乳児／小児：ｎ＝３、３．５歳（ｙ／ｏ）（ＢＲＡ０１、ＢＲＡ０２、ＢＲＡ０３）；若年成人：ｎ＝３名の個体、２２ｙ／ｏ（ＢＲＡ０４、ＢＲＡ０５、ＢＲＡ０６）；及び老年成人：ｎ＝３、９３ｙ／ｏ（ＢＲＡ０７、ＢＲＡ０８、ＢＲＡ０９）である。結腸においては、乳児／小児：ｎ＝２、５．５ｙ／ｏ（ＣＯＬ２２９、ＣＯＬ２３１）；若年成人：ｎ＝６、２８（ＣＯＬ２３５、ＣＯＬ２３６、ＣＯＬ２３７、ＣＯＬ３７３、ＣＯＬ３７４、ＣＯＬ３７５）；老年成人：ｎ＝３、９６ｙ／ｏ（ＣＯＬ２３２、ＣＯＬ２３３、ＣＯＬ２３４）である。
【図５９】同一個体由来の正常組織内におけるミトコンドリア点変異頻度と核点変異頻度を示すグラフを含有する図である。データ点は、同一個体の正常組織内におけるミトコンドリア点変異頻度と核点変異頻度の比率（ｙ軸）を示している。個体を４つのコホート（ｘ軸）にグループ分けしたが、対照にはｎ＝２４名の個体（表５１を参照のこと）、ＤＮＡ修復欠損ＰＭＳ２−／−にはｎ＝２名の個体（ＣＯＬ２３８、ＣＯＬ２３９）、アリストロキア酸曝露にはｎ＝３名の個体（ＡＡ＿１０５、ＡＡ＿１２４、ＡＡ＿１２６）、及び、喫煙曝露にはｎ＝３名の個体（ＳＡ＿１１７、ＳＡ＿１１８、ＳＡ＿１１９）であった。対照コホート（ＣＯＬ２２９）由来の１つの比率がゼロであったため本解析から除外した。それぞれのコホートにおける平均（赤色の線）比率は、対照において２４．５、ＤＮＡ修復欠損ＰＭＳ２−／−において０．５、アリストロキア酸曝露において１．１、及び、喫煙曝露において２．０である。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、ボンフェローニ多重比較事後検定を伴う一元配置ＡＮＯＶＡ。
【図６０】同一組織タイプに由来する正常組織と腫瘍が類似した変異スペクトルを有していることを示すグラフを含有する図である。（Ａ）は、結腸（上段）と腎臓（下段）に由来する正常（左側）と腫瘍（右側）を比較した、６つの発生し得る置換タイプ（凡例を参照のこと）のうちのそれぞれの置換の核とミトコンドリアにおける頻度の円グラフである。「正常」とは、図５４に示す正常組織に由来する希少な変異スペクトルデータのことを示している。「核腫瘍変異」とは、ｓｙｎａｐｓｅ．ｏｒｇのウェブサイトにあるＴＣＧＡデータセット＃！Ｓｙｎａｐｓｅ：ｓｙｎ１７２９３８３の、結腸直腸癌（ＣＯＡＤ／ＲＥＡＤ）または明細胞腎癌（ＫＩＲＣ）に由来するクローン性の変異データのことを示している。結腸と腎臓に由来する「ｍｔＤＮＡ腫瘍変異」については、Ｊｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４  ｅＬｉｆｅ  ３）の補助ファイル２内の「結腸直腸」腫瘍タイプと「腎臓」腫瘍タイプから得た。正常組織について評価した置換の数は、以下のとおり、結腸の核における１３名の個体に由来するｎ＝９４、結腸のｍｔＤＮＡにおける１２名の個体に由来するｎ＝１１６、腎臓の核における７名の個体に由来するｎ＝７３、及び、腎臓のｍｔＤＮＡにおける５名の個体に由来するｎ＝２９９であった。腫瘍組織について評価した置換の数は、以下のとおり、結腸直腸癌の核における１９３名の個体に由来するｎ＝１８，５３８、結腸直腸癌のｍｔＤＮＡにおける７６名の個体に由来するｎ＝６４、明細胞腎細胞癌の核における４１７名の個体に由来するｎ＝２４，５５９、及び、腎癌のｍｔＤＮＡにおける２３名の個体に由来するｎ＝１６であった。（Ｂ）は、（Ａ）に示したコホートに由来する変異スペクトルの主成分分析（ＰＣＡ）である。Ｒソフトウェアを使用してＰＣＡを実施してグラフを作成した。
【図６１】Ｓａｆｅ−ＳｅｑＳのエレメントを示す概略図を含有する図である。第１のステップでは、解析を行うそれぞれのフラグメントに固有識別子（ＵＩＤ）配列（メタルハッチをつけたバーまたは点々をつけたバー）を割り当てる。第２のステップでは、固有にタグ付けしたフラグメントを増幅して、それぞれのメンバーが同一ＵＩＤを有するＵＩＤファミリーを作製する。超変異体を、ファミリーメンバーの≧９５％が同一変異を有するＵＩＤファミリーと定義する。
【図６２】内在ＵＩＤ＋捕捉による例示的なＳａｆｅ−ＳｅｑＳを示す概略図を含有する図である。ランダムせん断により作製されたそれぞれのフラグメントにおける末端の配列（様々に網掛けを施したバー）は、固有識別子（ＵＩＤ）として機能する。続けてＰＣＲで増幅可能となるように、これらのフラグメントにアダプター（アースハッチをつけたバー及びクロスハッチをつけたバー）をライゲートする。二本鎖鋳型のそれぞれのストランドに由来する１つの固有に識別可能なフラグメントを作製する（１つのストランドのみを示している）。目的の配列に対して相補的なオリゴヌクレオチドを含有する固相上で目的のフラグメントを捕捉する。５’「グラフト」配列（接着剤をべた塗りにしたバー及び軽く点々をつけたバー）を含有するプライマーを用いたＰＣＲ増幅によりＵＩＤファミリーを作製した後に、シークエンシングを実施して図６１におけるように超変異体を定義する。
【図６３】外来ＵＩＤによる例示的なＳａｆｅ−ＳｅｑＳを示す概略図を含有する図である。一組の遺伝子特異的プライマーを用いてＤＮＡ（せん断または未せん断）を増幅する。プライマーの一方は、ランダムＤＮＡ配列の遺伝子特異的配列の５’側に配置された固有識別子（ＵＩＤ、様々に網掛けを施したバー）を形成するランダムＤＮＡ配列（例えば、一組の１４Ｎ’）を有しており、両方のプライマーは、次ステップにおけるユニバーサル増幅を可能とする配列（アースハッチをつけたバー及びクロスハッチをつけたバー）を有している。示すように、２回のＵＩＤ割当てサイクルにより、それぞれの二本鎖鋳型分子に由来する２つのフラグメント（それぞれが異なるＵＩＤを有する）が作製される。「グラフト」配列（接着剤をべた塗りにしたバー及び軽く点々をつけたバー）を同様に含有するユニバーサルプライマーを用いた続くＰＣＲにより、ダイレクトシークエンスされるＵＩＤファミリーが作製される。図６１の凡例におけるように超変異体を定義する。
【図６４】通常の解析法及びＳａｆｅ−ＳｅｑＳ解析法により同定された一塩基置換を示すグラフを含有する図である。図６３に示した外来ＵＩＤ戦略を使用して、３名の正常な非血縁個体のＣＴＮＮＢ１遺伝子に由来するＰＣＲフラグメントを作製した。それぞれの位置は、８７の発生し得る一塩基置換（３つの発生し得る置換／塩基×解析した２９の塩基）のうちの１つを示している。これらのフラグメントをＩｌｌｕｍｉｎａ  ＧＡ  ＩＩｘ装置上でシークエンスして、通常の方法（Ａ）またはＳａｆｅ−ＳｅｑＳ（Ｂ）で解析した。直接比較するために、Ｓａｆｅ−ＳｅｑＳの結果を通常の解析法と同じスケールで示している（挿入図は拡大図である）。Ｓａｆｅ−ＳｅｑＳと比較した変異型の高頻度性及び非血縁試料間における変異型の一致性が示すように、通常の解析法により同定された変異型の大部分がシークエンシングエラーを示している可能性があることに留意されたい。
【図６５】内在ＵＩＤ＋インバースＰＣＲによる例示的なＳａｆｅ−ＳｅｑＳを示す概略図を含有する図である。ランダムせん断により作製されたそれぞれのフラグメントにおける末端の配列は、固有識別子（ＵＩＤ、様々に網掛けを施したバー）として機能する。標準的なＩｌｌｕｍｉｎａライブラリ調製と同様に、これらのフラグメントにアダプター（アースハッチをつけたバー及びクロスハッチをつけたバー）をライゲートする。二本鎖鋳型のそれぞれのストランドに由来する１つの固有にタグ付けしたフラグメントを作製する（１つのストランドのみを示している）。リガーゼを用いた環化に続いて、５’「グラフト」配列（接着剤をべた塗りにしたバー及び軽く点々をつけたバー）を同様に含有する遺伝子特異的プライマーを用いたインバースＰＣＲを実施する。このＰＣＲにより、ダイレクトシークエンスされるＵＩＤファミリーが作製される。図６１におけるように超変異体を定義する。
【図６６】ホスホラミダイトを用いて合成したオリゴヌクレオチドとＰｈｕｓｉｏｎを用いて合成したオリゴヌクレオチドにおける一塩基置換の位置対エラー頻度を示すグラフを含有する図である。ホスホラミダイト（Ａ）またはＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（Ｂ）を用いて合成した同一の３１塩基ＤＮＡフラグメントの代表的な部位をＳａｆｅ−ＳｅｑＳで解析した。それぞれのタイプの７回の独立した実験における平均値及び標準偏差をプロットした。ホスホラミダイト合成フラグメントとＰｈｕｓｉｏｎ作製フラグメントにおいて同定されたＳＢＳ超変異体の平均値はそれぞれ、１，７２１±３８３と１９６±１４３であった。ｙ軸は指定位置における総エラーの割合を示している。合成そのものの間にエラーが体系的に導入されていたとすれば予測され得たように、ホスホラミダイト合成ＤＮＡフラグメントにおけるエラーが７つの複製間で一貫していたということに留意されたい。それに対し、Ｐｈｕｓｉｏｎ作製フラグメントにおけるエラーは、確率過程（Ｌｕｒｉａ  ａｎｄ  Ｄｅｌｂｒｕｃｋ，１９４３  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２８：４９１−５１１）から予測されるように、試料間で不均一であると思われた。
【図６７】ＵＩＤファミリーメンバー分布を示すグラフを含有する図である。図６３に示した外来ＵＩＤ戦略を使用して、３名の正常な非血縁個体のＣＴＮＮＢ１の領域に由来するＰＣＲフラグメントを作製したが（表５３）、１名の個体から作製した≦３００のメンバー（総ＵＩＤファミリーの９９％）を含むＵＩＤファミリーの代表例を示している。ｙ軸は、ｘ軸上に示すファミリーメンバーの数に含まれる異なるＵＩＤファミリーの数を示している。
【図６８Ａ】腫瘍位置を分類するための例示的なランダムフォレストモデル木を含有する図である。（Ａ）は完全木を示しており、（Ｂ）〜（Ｋ）は、（Ａ）に示した完全木におけるセクションの拡大像を含有している。
【図６８Ｂ】腫瘍位置を分類するための例示的なランダムフォレストモデル木を含有する図である。（Ａ）は完全木を示している。
【図６８Ｃ】腫瘍位置を分類するための例示的なランダムフォレストモデル木を含有する図である。（Ｃ）は、（Ａ）に示した完全木におけるセクションの拡大像を含有している。
【図６８Ｄ】腫瘍位置を分類するための例示的なランダムフォレストモデル木を含有する図である。（Ｄ）は、（Ａ）に示した完全木におけるセクションの拡大像を含有している。
【図６８Ｅ】腫瘍位置を分類するための例示的なランダムフォレストモデル木を含有する図である。（Ｅ）は、（Ａ）に示した完全木におけるセクションの拡大像を含有している。
【図６８Ｆ】腫瘍位置を分類するための例示的なランダムフォレストモデル木を含有する図である。（Ｆ）は、（Ａ）に示した完全木におけるセクションの拡大像を含有している。
【図６８Ｇ】腫瘍位置を分類するための例示的なランダムフォレストモデル木を含有する図である。（Ｇ）は、（Ａ）に示した完全木におけるセクションの拡大像を含有している。
【図６８Ｈ】腫瘍位置を分類するための例示的なランダムフォレストモデル木を含有する図である。（Ｈ）は、（Ａ）に示した完全木におけるセクションの拡大像を含有している。
【図６８Ｉ】腫瘍位置を分類するための例示的なランダムフォレストモデル木を含有する図である。（Ｉ）は、（Ａ）に示した完全木におけるセクションの拡大像を含有している。
【図６８Ｊ】腫瘍位置を分類するための例示的なランダムフォレストモデル木を含有する図である。（Ｊ）は、（Ａ）に示した完全木におけるセクションの拡大像を含有している。
【図６８Ｋ】腫瘍位置を分類するための例示的なランダムフォレストモデル木を含有する図である。（Ｋ）は、（Ａ）に示した完全木におけるセクションの拡大像を含有している。
【図６９】ランダムフォレストモデルから抽出した組織認識用の例示的なルールを含有する図である。ｒａｎｄｏｍＦｏｒｅｓｔパッケージ（ｖ４．６−１４）のｒａｎｄｏｍＦｏｒｅｓｔ関数を、ＣａｎｃｅｒＳＥＥＫプロジェクトのタンパク質データに適用した。タンパク質データには、ＣａｎｃｅｒＳＥＥＫによりがんと正確に予測された３３のタンパク質と６２６の腫瘍試料が含まれている。正常試料における値の２５分位数未満である場合、それぞれのタンパク質の値をゼロに設定した。特定の決定ルール（表５８）を得るために、ｉｎＴｒｅｅｓパッケージ（ｖ１．２）を適用して、ｒａｎｄｏｍＦｏｒｅｓｔで生成した全５００木から６以下の長さの全てのルールを抽出した。ｉｎＴｒｅｅｓパッケージの関数（ｓｅｌｅｃｔＲｕｌｅＲＲＦ、ｂｕｉｌｄＬｅａｒｎｅｒ、ａｐｐｌｙＬｅａｒｎｅｒ）を使用して、このルールセットから関連ルール及び非冗長ルールを選択し、分類器を生成してデータに適用し、最終ルールリストを抽出した。この最終ルールリストは完全ランダムフォレストと同様に機能し、完全フォレストの良好な近似を示している。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
本明細書中使用される場合、名詞の前の「ａ」という単語は、その特定名詞が単数または複数であることを表す。例えば、「遺伝子変異（ａ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）」という語句は、「１つまたは複数の遺伝子変異（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ）」を包含する。
【００３８】
本明細書中使用される場合、「約」という用語は、およそ、〜の範囲、おおまか、または〜前後、を意味する。数値範囲と合わせて使用される場合、「約」という用語は、その範囲を、指定の数値の境界を上下に拡張することにより修飾する。概して、「約」という用語は、本明細書中、使用することにより、記載される数値に上下それぞれその数値の１０％の幅を持たせる。
【００３９】
本明細書中使用される場合、「異数性」という用語は、天然よりも多いまたは少ない染色体二倍体数を有する状態、すなわち正倍数体からの逸脱を示す。
【００４０】
本明細書中、循環腫瘍ＤＮＡまたは無細胞ＤＮＡの文脈で使用される場合、「遺伝子に由来する」という語句は、循環腫瘍ＤＮＡが、腫瘍細胞（例えば、溶解したもしくはそれ以外により死滅した腫瘍細胞）から脱落したものであることを意味する。例えば、「ＫＲＡＳ遺伝子に由来する」循環腫瘍ＤＮＡは、その循環腫瘍ＤＮＡが、元来、腫瘍細胞中に存在していたことを意味する。遺伝子に由来する循環腫瘍ＤＮＡ中に存在する変異を検出する場合、その変異が腫瘍細胞自身において最初に同定されていることは、必要ではない。
【００４１】
本明細書中使用される場合、「遺伝子バイオマーカー」及び「遺伝子マーカー」という語句は、単独で、または他の遺伝子バイオマーカーもしくは他のバイオマーカーと組み合わせて、対象におけるがんを特性決定する核酸を示す。遺伝子バイオマーカーは、遺伝子中の修飾（例えば、変異）を含むことができる。修飾の例として、特に制限なく、一塩基置換、挿入、欠失、挿入欠失、転座、及びコピー数多型が挙げられる。いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカーとして、腫瘍抑制遺伝子における修飾（例えば、不活化修飾）が挙げられる。いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカーとして、がん遺伝子における修飾（例えば、活性化修飾）が挙げられる。様々な遺伝子バイオマーカー及び遺伝子バイオマーカーパネルを、本明細書中、より詳細に説明する。
【００４２】
本明細書中使用される場合、「変異」、「遺伝子修飾」、及び「遺伝子変異」という用語は、同義で使用され、野生型核酸配列における変更を示す。例えば、いくつかの実施形態では、無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）における変異を検出する方法が、本明細書中記載される。そのような方法は、変異、遺伝子修飾、または遺伝子変異を検出するとして、同義で記載することができることが理解される。
【００４３】
本明細書中使用される場合、「タンパク質バイオマーカー」、「タンパク質マーカー」、「ペプチドバイオマーカー」、及び「ペプチドマーカー」という語句は、単独で、または他のタンパク質もしくは他のバイオマーカーと組み合わせて、対象におけるがんを特性決定するタンパク質を示す。いくつかの実施形態では、タンパク質バイオマーカーとして、対象（例えば、その対象ががんを有すると既知であるか否かに関わらず、がんを有する対象）におけるタンパク質のレベルが、がんを有さない参照対象と比較した場合に、上昇していることが挙げられる。いくつかの実施形態では、タンパク質バイオマーカーとして、対象（例えば、その対象ががんを有すると既知であるか否かに関わらず、がんを有する対象）におけるタンパク質のレベルが、がんを有さない参照対象と比較した場合に、低下していることが挙げられる。本明細書中使用される場合、「タンパク質バイオマーカーを検出する」という語句は、タンパク質バイオマーカーのレベル（例えば、レベル上昇またはレベル低下）を検出することを示すことができる。様々なタンパク質バイオマーカー及びタンパク質バイオマーカーパネルを、本明細書中、より詳細に説明する。いくつかの実施形態では、タンパク質バイオマーカーとは異なるペプチドが、本明細書中提供される方法で使用される。
【００４４】
本明細書中タンパク質バイオマーカーに関連して使用される場合、「上昇したレベル」という語句は、健康な対象（例えば、特定の疾患または症状を呈示していない対象）由来の試料（例えば、参照試料）で典型的に観察されるタンパク質バイオマーカーの参照レベルより高いタンパク質バイオマーカーのレベルを示す。いくつかの実施形態では、参照試料は、がんを有さない対象（例えば、異なる対象または参照対象）から得られた試料が可能である。例えば、結腸直腸癌に関連したタンパク質バイオマーカーの場合、参照試料は、結腸直腸癌を有さない異なる対象または参照対象から得られた試料が可能である。いくつかの実施形態では、参照試料は、タンパク質バイオマーカーの上昇したレベルが観察された同一対象から得られた試料が可能であるが、ただしこの参照試料は、がんの発症前に得られたものである。いくつかの実施形態では、同一対象から得られたそのような参照試料は、参照試料として将来使用するために凍結されているかまたそれ以外で保存されている。いくつかの実施形態では、参照試料が検出不能なレベルのタンパク質バイオマーカーを有する場合、上昇したレベルは、タンパク質バイオマーカーの任意の検出可能なレベルが可能である。比較可能な試料のレベルは、その特定のレベルが上昇したレベルであるか否かを判定するのに使用することができることが理解される。
【００４５】
本明細書中タンパク質バイオマーカーに関連して使用される場合、「参照レベル」という語句は、健康な対象（例えば、特定の疾患または症状を呈示していない対象）に典型的に存在するタンパク質バイオマーカーのレベルを示す。タンパク質バイオマーカーの参照レベルとして、疾患または症状（例えば、がん）を呈示していない参照対象に存在するレベルが可能である。例えば、結腸直腸癌に関連したタンパク質バイオマーカーの場合、参照試料は、結腸直腸癌を有さない対象から得られた試料が可能である。別の例として、タンパク質バイオマーカーの参照レベルとして、ある対象で疾患または症状（例えば、がん）が発症する前にその対象に存在するレベルが可能である。いくつかの実施形態では、疾患または症状は、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーで測定されたまたは検出されたレベルが、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの参照レベル（複数可）よりも高い場合に、その対象において同定することができる。
【００４６】
本明細書中使用される場合、「感度」という用語は、ある方法が持つ、対象における疾患の存在を正確に同定または診断する能力を示す（例えば、ある方法の感度は、その方法が持つ、対象において症状を検出する真の正の検出率または検出可能性を特定する能力として説明することができる）。例えば、本明細書中記載される、対象におけるがんの存在を検出することができる様々な方法のいずれかに関連して使用される場合、高感度は、その方法が、高いパーセンテージの確率で対象におけるがんの存在を正確に同定することを意味する。例えば、本明細書中記載される、その方法を行った場合に９５％の確率で対象中のがんの存在を正確に検出する方法は、９５％の感度を有すると言われる。いくつかの実施形態では、本明細書中記載される、対象におけるがんの存在を検出することができる方法は、少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、またはそれ以上）の感度を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、２つ以上のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー及び／またはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、１つのバイオマーカークラスのみの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法よりも高い感度を提供する。
【００４７】
本明細書中使用される場合、「特異性」という用語は、ある方法が持つ、対象における疾患の存在を正確に排斥する能力を示す（例えば、ある方法の特異性は、その方法が持つ、ある症状が対象中に存在しないことを正確に判定する真の負の判定率または判定可能性を特定する能力として説明することができる）。例えば、本明細書中記載される、対象におけるがんの存在を検出することができる様々な方法のいずれかに関連して使用される場合、高特異性は、その方法が、高いパーセンテージの確率でがんの不在を正確に同定することを意味する（例えば、その方法は、高いパーセンテージの確率で、対象におけるがんの存在を間違って同定することがない）。例えば、本明細書中記載される、その方法を行った場合に９５％の確率で対象におけるがんの不在を正確に検出する方法は、９５％の特異性を有すると言われる。いくつかの実施形態では、本明細書中記載される、対象におけるがんの不在を検出することができる方法は、少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、またはそれ以上）の特異性を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、２つ以上のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー及び／またはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、１つのバイオマーカークラスのみの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法よりも高い特異性を提供する。
【００４８】
本明細書中使用される場合、「対象」という用語は、「患者」という用語と同義で使用され、哺乳綱のあらゆるメンバーを含む脊椎動物を意味し、そのようなメンバーとして、ヒト、家庭用及び家畜動物、ならびに動物園、スポーツ、またはペット用動物、例えば、マウス、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ（例えば、競走馬）、及び高等霊長類などが挙げられる。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、疾患を有する。いくつかの実施形態では、対象は、がんを有する。いくつかの実施形態では、対象は、がん細胞を保有するヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、がん細胞を保有するが、がん細胞を保有していることが知られていないヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、ウイルス性疾患を有する。いくつかの実施形態では、対象は、細菌性疾患を有する。いくつかの実施形態では、対象は、真菌性疾患を有する。いくつかの実施形態では、対象は、寄生虫症を有する。いくつかの実施形態では、対象は、喘息を有する。いくつかの実施形態では、対象は、自己免疫疾患を有する。いくつかの実施形態では、対象は、移植片対宿主病を有する。
【００４９】
本明細書中使用される場合、「治療」という用語は、「治療介入」という語句と同義で使用される。
【００５０】
遺伝子変異が対象中のがん細胞を起源とするかどうかを判定する目的で、白血球細胞（例えば、加齢に関連したクローン性造血（例えば、クローン性造血の拡大、これは不確定潜在性クローン性造血（ｃｌｏｎａｌ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ  ｏｆ  ｉｎｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）、すなわちＣＨＩＰとしても知られる）または骨髄形成異常症から生じる白血球細胞クローン）から単離されたまたは得られたＤＮＡを、がんに関連した遺伝子変異の有無について検査する方法は、本明細書中、概して「白血球細胞に対して遺伝子変異を検証すること」、「白血球細胞由来のＤＮＡに対して遺伝子変異を検証すること」、「白血球細胞検証」、及び同様な語句で記載される。
【００５１】
概要
概して、対象におけるがんの存在を同定する従来方法に比べて高い感度及び特異性で対象におけるがんの存在を検出または同定する方法及び物質が、本明細書中提供される。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、高い感度及び特異性で対象におけるがんの存在を同定する方法は、対象から得られた液体試料（複数可）（例えば、血液、血漿、血清）で行われるが、それに対して、対象におけるがんの存在を同定する従来方法は、対象から得られた液体試料で行った場合に、本方法レベルの感度、本方法レベルの特異性、またはその両方を達成できない。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、高い感度及び特異性で対象におけるがんの存在を同定する方法は、その対象がすでにがんに罹患していると確定する前に、その対象ががん細胞を保有すると確定する前に、及び／またはその対象ががんに関連した症候を呈示する前に、行われる。すなわち、いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、高い感度及び特異性で対象におけるがんの存在を同定する方法は、最初に行われる検出法として使用され、対象ががんを有するとする別の検出法の単なる確認（例えば、「オーバーコール（ｏｖｅｒｃａｌｌ）」）にとどまらない。
【００５２】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法及び物質は、がんの検出または診断において高い感度を提供する（例えば、対象ががんを有すると正確に同定する頻度または発生率が高い）。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法及び物質は、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、またはそれより高い感度を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法及び物質は、単一種のがんの検出に高い感度を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法及び物質は、２種以上のがんの検出に高い感度を提供する。様々ながん種のどれでも、本明細書中提供される方法及び物質を用いて検出可能である（例えば、「がん」とタイトルのついたセクションを参照）。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法及び物質を用いて検出可能ながんとして、膵癌が挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法及び物質を用いて検出可能ながんとして、肝臓癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、膵癌、結腸直腸癌、肺癌、または乳癌が挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法及び物質を用いて検出可能ながんとして、女性生殖管の癌（例えば、子宮頸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、または卵管癌）が挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法及び物質を用いて検出可能ながんとして、膀胱癌または上部尿路上皮癌が挙げられる。
【００５３】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法及び物質は、がんの検出または診断において高い特異性を提供する（例えば、対象ががんを有さない場合に、その対象ががんを有すると間違って同定する頻度または発生率が低い）。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法及び物質は、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、またはそれより高い特異性を提供する。当業者には、９９％の特異性は、がんを有さない対象の１％のみが、がんを有すると間違って同定されることを意味することが理解される。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法及び物質は、単一のがんの検出において高い特異性を提供する（例えば、対象がその単一のがん種を有するとして間違って同定される可能性が低い）。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法及び物質は、２種以上のがんの検出において高い特異性を提供する（例えば、対象がそれら２種以上のがん種を有するとして間違って同定される可能性が低い）。
【００５４】
当業者には当然であるとおり、がんの検出または診断にふさわしい感度または特異性は、様々な因子に基づいて選択可能である。１つの非限定的な例として、がんの検出または診断においてより低い特異性を提供するように設計された方法は、高い感度を有するように設計されていることが可能である。別の非限定的な例として、がんの検出または診断において高い特異性を有するように設計された方法は、より低い感度を有するように設計されていることが可能である。いくつかの実施形態では、低い感度が有利となる場合さえあり得る（例えば、通常はスクリーニングしない集団のスクリーニングにおいて）。いくつかの実施形態では、がん（例えば、ある特定種類のがん）が蔓延している集団において、がんの存在を検出または診断する方法は、特異性を低下させる代償を払ったとしても、比較的高感度を有するように設計することができる。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される様々な検出方法の感度及び特異性は、特定患者集団における疾患の有病率に基づいて決定される。例として、がんを有することが知られていない一般患者集団のスクリーニング検査は、高い特異性を有するように選択することができる（偽陽性診断、及び不要なさらなる診断検査及び／またはモニタリングを排除するために）。別の例として、がんの高リスク集団（例えば、リスクのある行動に従事しているもしくは従事していた、リスクのある家族歴を有する、リスクのある環境を経験しているまたは経験していた、などの集団であるため、例えば、がんを有するまたは発症するリスクが一般集団全体より高い集団）のスクリーニング検査は、高感度を有するように選択することができる（一般集団には適切ではない可能性がある追加のさらなる診断検査及び／またはモニタリングの代償を伴ったとしても、存在するがんの検出をより高い確実性で提供することを高める目的で）。１つの非限定的な例として、９０％の感度及び９５％の特異性を持つ検査は、有病率０．０１％の集団において陽性的中率（ＰＰＶ）が１５％及び陰性適中率（ＮＰＶ）が＞９９％となり、一方、有病率が４０％（高リスク集団）だとしたら、これらの的中率はどちらも９９％超となり得る。ＰＰＶは、以下のとおり計算することができる：真の陽性（ＴＰ）数／（真の陽性数＋偽陽性数）。ＰＰＶは、以下のとおり計算することもできる：（感度×有病率）／（感度×有病率）＋（（１−特異性）×（１−有病率））。ＮＰＶは、以下のとおり計算することができる：真の陰性数／陰性とされた数。ＰＰＶは、以下のとおり計算することもできる：特異性×（１−有病率）／（（１−感度）×有病率）＋（特異性×（１−有病率）。例えば、Ｌａｌｋｈｅｎ  ａｎｄ  ＭｃＣｌｕｓｋｅｙ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｅｓｔｓ：ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，Ｃｏｎｔｉｎｕｉｎｇ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ａｎａｅｓｔｈｅｓｉａ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  ＆  Ｐａｉｎ，Ｖｏｌｕｍｅ  ８，２００８を参照、これはそのまま全体が本明細書中参照により援用される。
【００５５】
検出方法
本明細書中提供されるのは、対象から得られた試料中の、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバー（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のメンバー）の存在及び／または異数性の存在を検出するための方法及び物質である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在は、同時に検査される（例えば、１つの検査手順において、これには、検査手順自身が、複数の別々の検査方法またはシステムを含む場合がある実施形態が含まれる）。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在は、順次検査される（例えば、２つ以上の異なる時点で行われる２つ以上の異なる検査手順において、これには、検査手順自身が、複数の別々の検査方法またはシステムを含む場合がある実施形態が含まれる）。１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在を同時及び順次検査する両方の実施形態のいくつかにおいて、検査は、単一試料で行われる場合も、２つ以上の異なる試料（例えば、同一対象から得られた２つ以上の異なる試料）で行われる場合もある。
【００５６】
本明細書中記載される様々な検出方法（例えば、「遺伝子バイオマーカーの検出」、「タンパク質バイオマーカーの検出」、及び「異数性の検出」とタイトルのついたセクションを参照）のどれであっても、対象から得られた試料中の１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在を検出するのに使用可能である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバー及び／または１つまたは複数のバイオマーカークラスは、対象における疾患に関連する。いくつかの実施形態では、異数性は、対象における疾患に関連する。いくつかの実施形態では、疾患は、がんである（例えば、本明細書中記載される様々な種類のがんのいずれか）。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のメンバーは、１つの遺伝子バイオマーカークラスのメンバーである。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のメンバーは、１つのタンパク質バイオマーカークラスのメンバーである。いくつかの実施形態では、対象から得られた試料中の１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、さらに、対象から得られた試料中の異数性の存在を検出することを含む。例えば、対象から得られた試料中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、対象由来の同一試料または２つの異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含むことができる。別の例として、対象から得られた試料中の１つまたは複数のタンパク質バイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、対象由来の同一試料または２つの異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含むことができる。いくつかの実施形態では、対象から得られた試料中の１つの遺伝子バイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること及び１つのタンパク質バイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること両方を含む方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、対象由来の同一試料または２つ以上の異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含むことができる。
【００５７】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一バイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の異数性の存在を検出することを含む（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一バイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること、及び対象から得られた１つまたは複数の試料中の異数性の存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の２つ以上のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー及びタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の２つ以上のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー及びタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること及び対象から得られた１つまたは複数の試料中の異数性の存在を検出することを含む。
【００５８】
いくつかの実施形態では、対象から得られた単一試料を、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために及び／または異数性の存在について検査することができる。あるいは、２つ以上の試料を対象から得ることができ、２つ以上の試料のそれぞれを、個別に、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために及び／または異数性の存在について検査することができる。１つの非限定的な例として、対象から得られた第１の試料を、第１のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、対象から得られた第２の試料を、第２のバイオマーカークラス（例えば、タンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができる。別の非限定的な例として、対象から得られた第１の試料を、あるバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、対象から得られた第２の試料を、異数性の存在を検出するために検査することができる。別の非限定的な例として、対象から得られた第１の試料を、第１のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために、及び第２のバイオマーカークラス（例えば、タンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、一方で対象から得られた第２の試料を、異数性の存在を検出するために検査することができる。別の非限定的な例として、対象から得られた第１の試料を、第１のバイオマーカークラス（例えば、遺伝的またはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために、及び異数性の存在を検出するために検査することができ、一方で対象から得られた第２の試料を、第２のバイオマーカークラス（例えば、第１の試料で検査される第１のバイオマーカークラスとは異なるクラス）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができる。
【００５９】
いくつかの実施形態では、対象から得られた試料中の、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在（例えば、本明細書中開示される様々な方法のいずれかにより検出される）は、疾患に関連し、対象がその疾患に罹患していることを示す。いくつかの実施形態では、対象から得られた試料中、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在（そのバイオマーカー及び／または異数性は、疾患に関連する）が検出された場合に、対象は、疾患であると診断される。いくつかの実施形態では、疾患は、がんである（例えば、本明細書中記載される様々ながんのいずれか）。いくつかの実施形態では、対象は、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在が検出される前は、疾患（例えば、がん）を有することが知られていない。いくつかの実施形態では、対象は、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在が検出される前は、がん細胞を保有することが知られていない。いくつかの実施形態では、対象は、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在が検出される前に、がんに関連する症候を呈示していない。
【００６０】
診断方法
同じく本明細書中提供されるのは、対象から得られた試料中の、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバー（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のメンバー）及び／または異数性の存在を検出することにより、対象における疾患の存在を診断または同定する（例えば、その対象を、がんを有するとして同定する）ための方法及び物質である。対象における疾患の存在を診断または同定する（例えば、その対象を、がんを有するとして同定する）実施形態のいくつかにおいて、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在は、同時に検査される（例えば、１つの検査手順において、これには、検査手順自身が、複数の別々の検査方法またはシステムを含む場合がある実施形態が含まれる）。対象における疾患の存在を診断または同定する（例えば、その対象を、がんを有するとして同定する）実施形態のいくつかにおいて、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在は、順次検査される（例えば、２つ以上の異なる時点で行われる２つ以上の異なる検査手順において、これには、検査手順自身が、複数の別々の検査方法またはシステムを含む場合がある実施形態が含まれる）。１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在を同時または順次検査することの一方（または両方）を含む、対象における疾患の存在を診断または同定する（例えば、その対象を、がんを有するとして同定する）実施形態のいくつかにおいて、検査は、単一試料で行われる場合も、２つ以上の異なる試料（例えば、同一対象から得られた２つ以上の異なる試料）で行われる場合もある。
【００６１】
本明細書中記載される様々な検出方法（例えば、「遺伝子バイオマーカーの検出」、「タンパク質バイオマーカーの検出」、及び「異数性の検出」とタイトルのついたセクションを参照）のどれであっても、対象から得られた試料中の１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在を検出するのに使用可能である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバー及び／または１つまたは複数のバイオマーカークラスは、対象における疾患に関連する。いくつかの実施形態では、異数性は、対象における疾患に関連する。いくつかの実施形態では、疾患は、がんである（例えば、本明細書中記載される様々な種類のがんのいずれか）。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のメンバーは、遺伝子バイオマーカーの１つのクラスのメンバーである。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のメンバーは、タンパク質バイオマーカーの１つのクラスのメンバーである。いくつかの実施形態では、対象から得られた試料中の１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することにより、対象におけるがんの存在を診断する（例えば、その対象を、がんを有するとして同定する）ことを含む方法は、さらに、対象から得られた試料中の異数性の存在を検出することを含む。例えば、対象から得られた試料中の遺伝子バイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することにより、対象におけるがんの存在を診断する（例えば、その対象を、がんを有するとして同定する）ことを含む方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、対象由来の同一試料または２つの異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含むことができる。別の例として、対象から得られた試料中のタンパク質バイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することにより、対象におけるがんの存在を診断する（例えば、その対象を、がんを有するとして同定する）ことを含む方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、対象由来の同一試料または２つの異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含むことができる。いくつかの実施形態では、対象から得られた試料中の遺伝子バイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること及びタンパク質バイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること両方により、対象におけるがんの存在を診断する（例えば、その対象を、がんを有するとして同定する）ことを含む方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、対象由来の同一試料または２つ以上の異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含むことができる。
【００６２】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一バイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出することにより、対象におけるがんの存在を診断する（例えば、その対象を、がんを有するとして同定する）ことを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の異数性の存在を検出することにより（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）、対象におけるがんの存在を診断する（例えば、その対象を、がんを有するとして同定する）ことを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一バイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること、及び対象から得られた１つまたは複数の試料中の異数性の存在を検出することにより、対象におけるがんの存在を診断する（例えば、その対象を、がんを有するとして同定する）ことを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の２つ以上のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー及びタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出することにより、対象におけるがんの存在を診断する（例えば、その対象を、がんを有するとして同定する）ことを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の２つ以上のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー及びタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること、及び対象から得られた１つまたは複数の試料中の異数性の存在を検出することにより、対象におけるがんの存在を診断する（例えば、その対象を、がんを有するとして同定する）ことを含む。
【００６３】
いくつかの実施形態では、対象から得られた単一試料を、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために及び／または異数性の存在について検査することができ、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在が検出された場合、その対象を、がんを有すると診断する（例えば、がんを有すると同定する）ことができる。あるいは、２つ以上の試料を対象から得ることができ、２つ以上の試料のそれぞれを、個別に、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために及び／または異数性の存在について検査することができ、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在が検出された場合、その対象を、がんを有すると診断する（例えば、がんを有すると同定する）ことができる。１つの非限定的な例として、対象から得られた第１の試料を、第１のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、対象から得られた第２の試料を、第２のバイオマーカークラス（例えば、タンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、及び／または第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出された場合（例えば、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、かつ第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出された場合）、その対象は、がんを有すると診断される（例えば、がんを有すると同定される）。別の非限定的な例として、対象から得られた第１の試料を、あるバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、対象から得られた第２の試料を、異数性の存在を検出するために検査することができ、そのバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、及び／または異数性の存在が検出された場合（例えば、そのバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、かつ異数性の存在が検出された場合）、その対象は、がんを有すると診断される（例えば、がんを有すると同定される）。別の非限定的な例として、対象から得られた第１の試料を、第１のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために、及び第２のバイオマーカークラス（例えば、タンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、一方で対象から得られた第２の試料を、異数性の存在を検出するために検査することができ、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、及び／または異数性の存在が検出された場合（例えば、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、かつ異数性の存在が検出された場合）、その対象は、がんを有すると診断される（例えば、がんを有すると同定される）。別の非限定的な例として、対象から得られた第１の試料を、第１のバイオマーカークラス（例えば、遺伝的またはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために、及び異数性の存在を検出するために検査することができ、一方で対象から得られた第２の試料を、第２のバイオマーカークラス（例えば、第１の試料で検査される第１のバイオマーカークラスとは異なるクラス）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、及び／または異数性の存在が検出された場合（例えば、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、かつ異数性の存在が検出された場合）、その対象は、がんを有すると診断される（例えば、がんを有すると同定される）。
【００６４】
対象における疾患（例えば、がん）の存在を（例えば、本明細書中記載される様々な方法のいずれかを使用して）診断または同定する実施形態のいくつかにおいて、対象は、さらなる診断検査の候補としても同定される。対象における疾患（例えば、がん）の存在を（例えば、本明細書中記載される様々な方法のいずれかを使用して）診断または同定する実施形態のいくつかにおいて、対象は、より詳しいモニタリングの候補としても同定される。対象における疾患（例えば、がん）の存在を（例えば、本明細書中記載される様々な方法のいずれかを使用して）診断または同定する実施形態のいくつかにおいて、対象は、治療（例えば、本明細書中記載される様々な治療介入のいずれか）に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い候補としても同定される。対象における疾患（例えば、がん）の存在を（例えば、本明細書中記載される様々な方法のいずれかを使用して）診断または同定する実施形態のいくつかにおいて、対象は、治療（例えば、本明細書中記載される様々な治療介入のいずれか）も実施される。
【００６５】
対象を、疾患を有するまたは発症するリスクがあるとして同定する方法
本明細書中提供されるのは、対象から得られた試料中の、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバー（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のメンバー）の存在及び／または異数性の存在を検出することにより、対象を、疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があるとして同定するための方法及び物質である。対象を、疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があるとして同定する実施形態のいくつかにおいて、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在は、同時に検査される（例えば、１つの検査手順において、これには、検査手順自身が、複数の別々の検査方法またはシステムを含む場合がある実施形態が含まれる）。対象を、疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があるとして同定する実施形態のいくつかにおいて、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在は、順次検査される（例えば、２つ以上の異なる時点で行われる２つ以上の異なる検査手順において、これには、検査手順自身が、複数の別々の検査方法またはシステムを含む場合がある実施形態が含まれる）。１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在を同時または順次検査することの一方（または両方）を含む、対象を、疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があるとして同定する実施形態のいくつかにおいて、検査は、単一試料で行われる場合も、２つ以上の異なる試料（例えば、同一対象から得られた２つ以上の異なる試料）で行われる場合もある。
【００６６】
本明細書中記載される様々な検出方法（例えば、「遺伝子バイオマーカーの検出」、「タンパク質バイオマーカーの検出」、及び「異数性の検出」とタイトルのついたセクションを参照）のどれであっても、対象から得られた試料中の１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在を検出するのに使用可能である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバー及び／または１つまたは複数のバイオマーカークラスは、対象における疾患に関連する。いくつかの実施形態では、異数性は、対象における疾患に関連する。いくつかの実施形態では、疾患は、がんである（例えば、本明細書中記載される様々な種類のがんのいずれか）。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のメンバーは、遺伝子バイオマーカーの１つのクラスのメンバーである。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のメンバーは、タンパク質バイオマーカーの１つのクラスのメンバーである。いくつかの実施形態では、対象から得られた試料中の１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することにより、対象を、疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があるとして同定することを含む方法は、さらに、対象から得られた試料中の異数性の存在を検出することを含む。例えば、対象から得られた試料中の遺伝子バイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することにより、対象を、疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があるとして同定することを含む方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、対象由来の同一試料または２つの異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含むことができる。別の例として、対象から得られた試料中のタンパク質バイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することにより、対象を、疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があるとして同定することを含む方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、対象由来の同一試料または２つの異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含むことができる。いくつかの実施形態では、対象から得られた試料中の遺伝子バイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること及びタンパク質バイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること両方により、対象を、疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があるとして同定することを含む方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、対象由来の同一試料または２つ以上の異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含むことができる。
【００６７】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象を、疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があるとして同定するための方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一バイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象を、疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があるとして同定するための方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の異数性の存在を検出することを含む（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象を、疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があるとして同定するための方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一バイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること、及び対象から得られた１つまたは複数の試料中の異数性の存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象を、疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があるとして同定するための方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の２つ以上のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー及びタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象を、疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があるとして同定するための方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の２つ以上のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー及びタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること、及び対象から得られた１つまたは複数の試料中の異数性の存在を検出することを含む。
【００６８】
いくつかの実施形態では、対象から得られた単一試料を、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために及び／または異数性の存在について検査することができ、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在が検出された場合、その対象を、疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があるとして同定することができる。あるいは、２つ以上の試料を対象から得ることができ、２つ以上の試料のそれぞれを、個別に、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために及び／または異数性の存在について検査することができ、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在が検出された場合、その対象を、疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があるとして同定することができる。１つの非限定的な例として、対象から得られた第１の試料を、第１のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、対象から得られた第２の試料を、第２のバイオマーカークラス（例えば、タンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、及び／または第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出された場合（例えば、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、かつ第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出された場合）、その対象は、疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があるとして同定される。別の非限定的な例として、対象から得られた第１の試料を、あるバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、対象から得られた第２の試料を、異数性の存在を検出するために検査することができ、そのバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、及び／または異数性の存在が検出された場合（例えば、そのバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、かつ異数性の存在が検出された場合）、その対象は、疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があるとして同定される。別の非限定的な例として、対象から得られた第１の試料を、第１のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために、及び第２のバイオマーカークラス（例えば、タンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、一方で対象から得られた第２の試料を、異数性の存在を検出するために検査することができ、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、及び／または異数性の存在が検出された場合（例えば、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、かつ異数性の存在が検出された場合）、その対象は、疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があるとして同定される。別の非限定的な例として、対象から得られた第１の試料を、第１のバイオマーカークラス（例えば、遺伝的またはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために、及び異数性の存在を検出するために検査することができ、一方で対象から得られた第２の試料を、第２のバイオマーカークラス（例えば、第１の試料で検査される第１のバイオマーカークラスとは異なるクラス）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、及び／または異数性の存在が検出された場合（例えば、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、かつ異数性の存在が検出された場合）、その対象は、疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があるとして同定される。
【００６９】
対象を、疾患を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があるとして同定する（例えば、本明細書中記載される様々な方法のいずれかを使用して）実施形態のいくつかにおいて、対象は、さらなる診断検査の候補としても同定される。対象を、疾患を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があるとして同定する（例えば、本明細書中記載される様々な方法のいずれかを使用して）実施形態のいくつかにおいて、対象は、より詳しいモニタリングの候補としても同定される。対象を、疾患を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があるとして同定する（例えば、本明細書中記載される様々な方法のいずれかを使用して）実施形態のいくつかにおいて、対象は、治療（例えば、本明細書中記載される様々な治療介入のいずれか、そのような治療介入として、化学予防剤が挙げられるが、これに限定されない）に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い候補としても同定される。対象を、疾患を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があるとして同定する（例えば、本明細書中記載される様々な方法のいずれかを使用して）実施形態のいくつかにおいて、対象は、治療（例えば、本明細書中記載される様々な治療介入のいずれか、そのような治療介入として、化学予防剤が挙げられるが、これに限定されない）も実施される。
【００７０】
治療方法
同じく本明細書中提供されるのは、対象から得られた試料中の、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバー（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のメンバー）及び／または異数性の存在を検出することにより、疾患（例えば、がん）を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された対象を治療するための方法及び物質である。疾患（例えば、がん）を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された対象を治療する実施形態のいくつかにおいて、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在は、同時に検査される（例えば、１つの検査手順において、これには、検査手順自身が、複数の別々の検査方法またはシステムを含む場合がある実施形態が含まれる）。疾患（例えば、がん）を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された対象を治療する実施形態のいくつかにおいて、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在は、順次検査される（例えば、２つ以上の異なる時点で行われる２つ以上の異なる検査手順において、これには、検査手順自身が、複数の別々の検査方法またはシステムを含む場合がある実施形態が含まれる）。１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在を同時または順次検査することの一方（または両方）を含む、疾患（例えば、がん）を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された対象を治療する実施形態のいくつかにおいて、検査は、単一試料で行われる場合も、２つ以上の異なる試料（例えば、同一対象から得られた２つ以上の異なる試料）で行われる場合もある。
【００７１】
本明細書中記載される様々な検出方法（例えば、「遺伝子バイオマーカーの検出」、「タンパク質バイオマーカーの検出」、及び「異数性の検出」とタイトルのついたセクションを参照）のどれであっても、対象から得られた試料中の１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在を検出するのに使用可能である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバー及び／または１つまたは複数のバイオマーカークラスは、対象における疾患に関連する。いくつかの実施形態では、異数性は、対象における疾患に関連する。いくつかの実施形態では、疾患は、がんである（例えば、本明細書中記載される様々な種類のがんのいずれか）。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のメンバーは、遺伝子バイオマーカーの１つのクラスのメンバーである。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のメンバーは、タンパク質バイオマーカーの１つのクラスのメンバーである。いくつかの実施形態では、対象から得られた試料中の１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することにより、疾患（例えば、がん）を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（高いリスク）があると同定された対象を治療することを含む方法は、さらに、対象から得られた試料中の異数性の存在を検出することを含む。例えば、対象から得られた試料中の遺伝子バイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することにより、疾患（例えば、がん）を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（高いリスク）があると同定された対象を治療することを含む方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、対象由来の同一試料または２つの異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含むことができる。別の例として、対象から得られた試料中のタンパク質バイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することにより、疾患（例えば、がん）を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（高いリスク）があると同定された対象を治療することを含む方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、対象由来の同一試料または２つの異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含むことができる。いくつかの実施形態では、対象から得られた試料中の遺伝子バイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること及びタンパク質バイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること両方により、疾患（例えば、がん）を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（高いリスク）があると同定された対象を治療することを含む方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、対象由来の同一試料または２つ以上の異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含むことができる。
【００７２】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、疾患（例えば、がん）を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された対象を治療するための方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一バイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、疾患（例えば、がん）を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された対象を治療するための方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の異数性の存在を検出することを含む（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、疾患（例えば、がん）を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された対象を治療するための方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一バイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること、及び対象から得られた１つまたは複数の試料中の異数性の存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、疾患（例えば、がん）を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された対象を治療するための方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の２つ以上のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー及びタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、疾患（例えば、がん）を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された対象を治療するための方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の２つ以上のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー及びタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること、及び対象から得られた１つまたは複数の試料中の異数性の存在を検出することを含む。
【００７３】
いくつかの実施形態では、対象から得られた単一試料を、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために及び／または異数性の存在について検査することができ、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在が検出された場合、その対象を、疾患（例えば、がん）を有すると診断するまたは同定する、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定することができ、及び／またはその対象を治療することができる。あるいは、２つ以上の試料を対象から得ることができ、２つ以上の試料のそれぞれを、個別に、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために及び／または異数性の存在について検査することができ、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在が検出された場合、その対象を、疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（高いリスク）があると診断するまたは同定することができ、及び／またはその対象を治療することができる。１つの非限定的な例として、対象から得られた第１の試料を、第１のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、対象から得られた第２の試料を、第２のバイオマーカークラス（例えば、タンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、及び／または第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出された場合（例えば、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、かつ第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出された場合）、その対象は、疾患（例えば、がん）を有すると診断または同定され、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定され、及び／またはその対象は、治療を受けることができる。別の非限定的な例として、対象から得られた第１の試料を、あるバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、対象から得られた第２の試料を、異数性の存在を検出するために検査することができ、そのバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、及び／または異数性の存在が検出された場合（例えば、そのバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、かつ異数性の存在が検出された場合）、その対象は、疾患（例えば、がん）を有すると診断または同定され、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定され、及び／またはその対象は、治療を受ける。別の非限定的な例として、対象から得られた第１の試料を、第１のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために、及び第２のバイオマーカークラス（例えば、タンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、一方で対象から得られた第２の試料を、異数性の存在を検出するために検査することができ、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、及び／または異数性の存在が検出された場合（例えば、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、かつ異数性の存在が検出された場合）、その対象は、疾患（例えば、がん）を有すると診断または同定され、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定され、及び／またはその対象は、治療を受ける。別の非限定的な例として、対象から得られた第１の試料を、第１のバイオマーカークラス（例えば、遺伝的またはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために、及び異数性の存在を検出するために検査することができ、一方で対象から得られた第２の試料を、第２のバイオマーカークラス（例えば、第１の試料で検査される第１のバイオマーカークラスとは異なるクラス）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、及び／または異数性の存在が検出された場合（例えば、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、かつ異数性の存在が検出された場合）、その対象は、疾患（例えば、がん）を有すると診断または同定され、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定され、及び／またはその対象は、治療を受ける。
【００７４】
対象から得られた試料中の、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバー（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のメンバー）及び／または異数性の存在を検出することにより、疾患を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された対象を治療する実施形態のいくつかにおいて、治療は、本明細書中開示される様々な治療介入のいずれかであり、そのような治療介入として、特に制限なく、化学療法、ネオアジュバント化学療法、放射線療法、ホルモン療法、細胞傷害性療法、免疫療法、養子Ｔ細胞療法（例えば、キメラ抗原受容体及び／または野生型もしくは改変型Ｔ細胞受容体を有するＴ細胞）、キナーゼ阻害剤（例えば、転座または変異などの特定遺伝子損傷を標的とするキナーゼ阻害剤）の投与などの標的化療法、（例えば、キナーゼ阻害剤、抗体、二重特異性抗体）、シグナル伝達阻害剤、二重特異性抗体もしくは抗体断片（例えば、ＢｉＴＥ）、モノクローナル抗体、免疫チェックポイント阻害剤、外科手術（例えば、外科的切除）、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられる。疾患ががんである実施形態のいくつかにおいて、治療介入は、がんの重篤度を低下させ、がんの症候を低減させ、及び／または対象内に存在するがん細胞数を減少させる。
【００７５】
疾患を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された（例えば、本明細書中記載される様々な方法のいずれかを使用して）対象を治療する実施形態のいくつかにおいて、対象は、治療に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い候補としても同定される。疾患を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された（例えば、本明細書中記載される様々な方法のいずれかを使用して）対象を治療する実施形態のいくつかにおいて、対象は、さらなる診断検査（例えば、治療の実施前及び／または治療の実施後に、その治療の効果を判定するため、及び／または対象が、同一治療または異なる治療の追加実施の候補であるかどうかを判定するため）の候補としても同定される。疾患を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された（例えば、本明細書中記載される様々な方法のいずれかを使用して）対象を治療する実施形態のいくつかにおいて、対象は、より詳しいモニタリング（例えば、治療の実施前及び／または治療の実施後に、その治療の効果を判定するため、及び／または対象が、同一治療または異なる治療の追加実施の候補であるかどうかを判定するため）の候補としても同定される。
【００７６】
治療の同定方法
同じく本明細書中提供されるのは、対象から得られた試料中の、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバー（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のメンバー）及び／または異数性の存在を検出することにより、疾患（例えば、がん）を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された対象の治療を同定するための方法及び物質である。疾患（例えば、がん）を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された対象の治療を同定する実施形態のいくつかにおいて、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在は、同時に検査される（例えば、１つの検査手順において、これには、検査手順自身が、複数の別々の検査方法またはシステムを含む場合がある実施形態が含まれる）。疾患（例えば、がん）を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された対象の治療を同定する実施形態のいくつかにおいて、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在は、順次検査される（例えば、２つ以上の異なる時点で行われる２つ以上の異なる検査手順において、これには、検査手順自身が、複数の別々の検査方法またはシステムを含む場合がある実施形態が含まれる）。１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在を同時または順次検査することの一方（または両方）を含む、疾患（例えば、がん）を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された対象の治療を同定する実施形態のいくつかにおいて、検査は、単一試料で行われる場合も、２つ以上の異なる試料（例えば、同一対象から得られた２つ以上の異なる試料）で行われる場合もある。
【００７７】
本明細書中記載される様々な検出方法（例えば、「遺伝子バイオマーカーの検出」、「タンパク質バイオマーカーの検出」、及び「異数性の検出」とタイトルのついたセクションを参照）のどれであっても、対象から得られた試料中の１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在を検出するのに使用可能である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバー及び／または１つまたは複数のバイオマーカークラスは、対象における疾患に関連する。いくつかの実施形態では、異数性は、対象における疾患に関連する。いくつかの実施形態では、疾患は、がんである（例えば、本明細書中記載される様々な種類のがんのいずれか）。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のメンバーは、遺伝子バイオマーカーの１つのクラスのメンバーである。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のメンバーは、タンパク質バイオマーカーの１つのクラスのメンバーである。いくつかの実施形態では、対象から得られた試料中の１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することにより、疾患（例えば、がん）を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された対象の治療を同定することを含む方法は、さらに、対象から得られた試料中の異数性の存在を検出することを含む。例えば、対象から得られた試料中の遺伝子バイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することにより、疾患（例えば、がん）を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された対象の治療を同定することを含む方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、対象由来の同一試料または２つの異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含むことができる。別の例として、対象から得られた試料中のタンパク質バイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することにより、疾患（例えば、がん）を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された対象の治療を同定することを含む方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、対象由来の同一試料または２つの異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含むことができる。いくつかの実施形態では、対象から得られた試料中の遺伝子バイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること及びタンパク質バイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること両方により、疾患（例えば、がん）を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（高いリスク）があると同定された対象の治療を同定することを含む方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、対象由来の同一試料または２つ以上の異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含むことができる。
【００７８】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、疾患（例えば、がん）を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された対象の治療を同定するための方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一バイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、疾患（例えば、がん）を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された対象の治療を同定するための方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の異数性の存在を検出することを含む（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、疾患（例えば、がん）を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された対象の治療を同定するための方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一バイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること、及び対象から得られた１つまたは複数の試料中の異数性の存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、疾患（例えば、がん）を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された対象の治療を同定するための方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の２つ以上のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー及びタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、疾患（例えば、がん）を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された対象の治療を同定するための方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の２つ以上のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー及びタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること、及び対象から得られた１つまたは複数の試料中の異数性の存在を検出することを含む。
【００７９】
いくつかの実施形態では、対象から得られた単一試料を、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために及び／または異数性の存在について検査することができ、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在が検出された場合、その対象を、疾患（例えば、がん）を有すると診断するまたは同定する、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定することができ、及び／またはその対象の治療を同定することができる。あるいは、２つ以上の試料を対象から得ることができ、２つ以上の試料のそれぞれを、個別に、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために及び／または異数性の存在について検査することができ、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在が検出された場合、その対象を、疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると診断または同定することができ、及び／またはその対象の治療を同定することができる。１つの非限定的な例として、対象から得られた第１の試料を、第１のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、対象から得られた第２の試料を、第２のバイオマーカークラス（例えば、タンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、及び／または第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出された場合（例えば、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、かつ第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出された場合）、その対象は、疾患（例えば、がん）を有すると診断または同定され、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定され、及び／またはその対象の治療が同定される。別の非限定的な例として、対象から得られた第１の試料を、あるバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、対象から得られた第２の試料を、異数性の存在を検出するために検査することができ、そのバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、及び／または異数性の存在が検出された場合（例えば、そのバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、かつ異数性の存在が検出された場合）、その対象は、疾患（例えば、がん）を有すると診断または同定され、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定され、及び／またはその対象の治療が同定される。別の非限定的な例として、対象から得られた第１の試料を、第１のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために、及び第２のバイオマーカークラス（例えば、タンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、一方で対象から得られた第２の試料を、異数性の存在を検出するために検査することができ、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、及び／または異数性の存在が検出された場合（例えば、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、かつ異数性の存在が検出された場合）、その対象は、疾患（例えば、がん）を有すると診断または同定され、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定され、及び／またはその対象の治療が同定される。別の非限定的な例として、対象から得られた第１の試料を、第１のバイオマーカークラス（例えば、遺伝的またはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために、及び異数性の存在を検出するために検査することができ、一方で対象から得られた第２の試料を、第２のバイオマーカークラス（例えば、第１の試料で検査される第１のバイオマーカークラスとは異なるクラス）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、及び／または異数性の存在が検出された場合（例えば、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、かつ異数性の存在が検出された場合）、その対象は、疾患（例えば、がん）を有すると診断または同定され、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定され、及び／またはその対象の治療が同定される。
【００８０】
対象から得られた試料中の、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバー（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のメンバー）及び／または異数性の存在を検出することにより、疾患を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された対象の治療を同定する実施形態のいくつかにおいて、同定される治療は、本明細書中開示される様々な治療介入のいずれかであり、そのような治療介入として、特に制限なく、化学療法、ネオアジュバント化学療法、放射線療法、ホルモン療法、細胞傷害性療法、免疫療法、養子Ｔ細胞療法（例えば、キメラ抗原受容体及び／または野生型もしくは改変型Ｔ細胞受容体を有するＴ細胞）、キナーゼ阻害剤（例えば、転座または変異などの特定遺伝子損傷を標的とするキナーゼ阻害剤）の投与などの標的化療法、（例えば、キナーゼ阻害剤、抗体、二重特異性抗体）、シグナル伝達阻害剤、二重特異性抗体もしくは抗体断片（例えば、ＢｉＴＥ）、モノクローナル抗体、免疫チェックポイント阻害剤、外科手術（例えば、外科的切除）、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられる。疾患ががんである実施形態のいくつかにおいて、同定された治療介入は、がんの重篤度を低下させ、がんの症候を低減させ、及び／または対象内に存在するがん細胞数を減少させる。
【００８１】
疾患を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された（例えば、本明細書中記載される様々な方法のいずれかを使用して）対象の治療を同定する実施形態のいくつかにおいて、対象は、治療に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い候補としても同定される。疾患を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された（例えば、本明細書中記載される様々な方法のいずれかを使用して）対象の治療を同定する実施形態のいくつかにおいて、対象は、さらなる診断検査の候補としても同定される。疾患を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された（例えば、本明細書中記載される様々な方法のいずれかを使用して）対象の治療を同定する実施形態のいくつかにおいて、対象は、より詳しいモニタリングの候補としても同定される。疾患を有すると診断されたまたは同定された、あるいは疾患を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された（例えば、本明細書中記載される様々な方法のいずれかを使用して）対象の治療を同定する実施形態のいくつかにおいて、対象は、治療も実施される（例えば、本明細書中記載される様々な治療介入のいずれか）。
【００８２】
治療に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象の同定
同じく本明細書中提供されるのは、対象から得られた試料中の、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバー（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のメンバー）及び／または異数性の存在を検出することにより、治療に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象を同定するための方法及び物質である。治療に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象を同定する実施形態のいくつかにおいて、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在は、同時に検査される（例えば、１つの検査手順において、これには、検査手順自身が、複数の別々の検査方法またはシステムを含む場合がある実施形態が含まれる）。治療に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象を同定する実施形態のいくつかにおいて、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在は、順次検査される（例えば、２つ以上の異なる時点で行われる２つ以上の異なる検査手順において、これには、検査手順自身が、複数の別々の検査方法またはシステムを含む場合がある実施形態が含まれる）。１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在を同時または順次検査することの一方（または両方）を含む、治療に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象を同定する実施形態のいくつかにおいて、検査は、単一試料で行われる場合も、２つ以上の異なる試料（例えば、同一対象から得られた２つ以上の異なる試料）で行われる場合もある。
【００８３】
本明細書中記載される様々な検出方法（例えば、「遺伝子バイオマーカーの検出」、「タンパク質バイオマーカーの検出」、及び「異数性の検出」とタイトルのついたセクションを参照）のどれであっても、対象から得られた試料中の１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在を検出するのに使用可能である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバー及び／または１つまたは複数のバイオマーカークラスは、対象における疾患に関連する。いくつかの実施形態では、異数性は、対象における疾患に関連する。いくつかの実施形態では、疾患は、がんである（例えば、本明細書中記載される様々な種類のがんのいずれか）。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のメンバーは、遺伝子バイオマーカーの１つのクラスのメンバーである。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のメンバーは、タンパク質バイオマーカーの１つのクラスのメンバーである。いくつかの実施形態では、対象から得られた試料中の１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することにより、治療に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象を同定することを含む方法は、さらに、対象から得られた試料中の異数性の存在を検出することを含む。例えば、対象から得られた試料中の遺伝子バイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することにより、治療に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象を同定することを含む方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、対象由来の同一試料または２つの異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含むことができる。別の例として、対象から得られた試料中のタンパク質バイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することにより、治療に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象を同定することを含む方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、対象由来の同一試料または２つの異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含むことができる。いくつかの実施形態では、対象から得られた試料中の遺伝子バイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること及びタンパク質バイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること両方により、治療に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象を同定することを含む方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、対象由来の同一試料または２つ以上の異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含むことができる。
【００８４】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、治療に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象を同定するための方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一バイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、治療に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象を同定するための方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の異数性の存在を検出することを含む（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、治療に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象を同定するための方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一バイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること、及び対象から得られた１つまたは複数の試料中の異数性の存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、治療に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象を同定するための方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の２つ以上のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー及びタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、治療に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象を同定するための方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の２つ以上のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー及びタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること、及び対象から得られた１つまたは複数の試料中の異数性の存在を検出することを含む。
【００８５】
いくつかの実施形態では、対象から得られた単一試料を、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために及び／または異数性の存在について検査することができ、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在が検出された場合、その対象を、疾患（例えば、がん）を有すると診断するまたは同定する、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定することができ、及び／または対象を、治療に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象と同定することができる。あるいは、２つ以上の試料を対象から得ることができ、２つ以上の試料のそれぞれを、個別に、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために及び／または異数性の存在について検査することができ、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在が検出された場合、その対象を、疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると診断または同定することができ、及び／または対象を、治療に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象と同定することができる。１つの非限定的な例として、対象から得られた第１の試料を、第１のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、対象から得られた第２の試料を、第２のバイオマーカークラス（例えば、タンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、及び／または第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出された場合（例えば、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、かつ第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出された場合）、その対象は、疾患（例えば、がん）を有すると診断または同定され、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定され、及び／または対象は、治療に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象と同定される。別の非限定的な例として、対象から得られた第１の試料を、あるバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、対象から得られた第２の試料を、異数性の存在を検出するために検査することができ、そのバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、及び／または異数性の存在が検出された場合（例えば、そのバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、かつ異数性の存在が検出された場合）、その対象は、疾患（例えば、がん）を有すると診断または同定され、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定され、及び／または対象は、治療に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象と同定される。別の非限定的な例として、対象から得られた第１の試料を、第１のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために、及び第２のバイオマーカークラス（例えば、タンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、一方で対象から得られた第２の試料を、異数性の存在を検出するために検査することができ、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、及び／または異数性の存在が検出された場合（例えば、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、かつ異数性の存在が検出された場合）、その対象は、疾患（例えば、がん）を有すると診断または同定され、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定され、及び／または対象は、治療に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象と同定される。別の非限定的な例として、対象から得られた第１の試料を、第１のバイオマーカークラス（例えば、遺伝的またはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために、及び異数性の存在を検出するために検査することができ、一方で対象から得られた第２の試料を、第２のバイオマーカークラス（例えば、第１の試料で検査される第１のバイオマーカークラスとは異なるクラス）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、及び／または異数性の存在が検出された場合（例えば、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、かつ異数性の存在が検出された場合）、その対象は、疾患（例えば、がん）を有すると診断または同定され、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定され、及び／または対象は、治療に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象と同定される。
【００８６】
対象から得られた試料中の、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバー（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のメンバー）及び／または異数性の存在を検出することにより、疾患を有するまたは発症する（例えば高いリスク）の１つまたは複数のメンバーを検出することにより、治療に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象を同定する実施形態のいくつかにおいて、対象は、本明細書中開示される様々な治療介入のいずれかである治療に反応すると思われるまたは反応する可能性が高いと同定され、そのような治療介入として、特に制限なく、化学療法、ネオアジュバント化学療法、放射線療法、ホルモン療法、細胞傷害性療法、免疫療法、養子Ｔ細胞療法（例えば、キメラ抗原受容体及び／または野生型もしくは改変型Ｔ細胞受容体を有するＴ細胞）、キナーゼ阻害剤（例えば、転座または変異などの特定遺伝子損傷を標的とするキナーゼ阻害剤）の投与などの標的化療法、（例えば、キナーゼ阻害剤、抗体、二重特異性抗体）、シグナル伝達阻害剤、二重特異性抗体もしくは抗体断片（例えば、ＢｉＴＥ）、モノクローナル抗体、免疫チェックポイント阻害剤、外科手術（例えば、外科的切除）、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられる。疾患ががんである実施形態のいくつかにおいて、同定された治療介入に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象であると同定される対象は、その対象において治療介入ががんの重篤度を低下させ、がんの症候を低減させ、及び／または対象内に存在するがん細胞数を減少させると思われる、またはそうなる可能性が高い対象として同定される。
【００８７】
いくつかの実施形態では、治療に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象として同定される（例えば、本明細書中記載される様々な方法のいずれかを使用して）対象は、さらなる診断検査の候補としても同定される。いくつかの実施形態では、治療に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象として同定される（例えば、本明細書中記載される様々な方法のいずれかを使用して）対象は、より詳しいモニタリングの候補としても同定される。これに加えてまたはこれに代えて、治療に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象として同定される（例えば、本明細書中記載される様々な方法のいずれかを使用して）対象は、治療（例えば、本明細書中記載される様々な治療介入のいずれか）も受ける。
【００８８】
さらなる診断検査の候補として対象を同定する方法
同じく本明細書中提供されるのは、対象から得られた試料中の、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバー（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のメンバー）及び／または異数性の存在を検出することにより、さらなる診断検査の候補として対象を同定するための方法及び物質である。さらなる診断検査の候補として対象を同定する実施形態のいくつかにおいて、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在は、同時に検査される（例えば、１つの検査手順において、これには、検査手順自身が、複数の別々の検査方法またはシステムを含む場合がある実施形態が含まれる）。さらなる診断検査の候補として対象を同定する実施形態のいくつかにおいて、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在は、順次検査される（例えば、２つ以上の異なる時点で行われる２つ以上の異なる検査手順において、これには、検査手順自身が、複数の別々の検査方法またはシステムを含む場合がある実施形態が含まれる）。１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在を同時または順次検査することの一方（または両方）を含む、さらなる診断検査の候補として対象を同定する実施形態のいくつかにおいて、検査は、単一試料で行われる場合も、２つ以上の異なる試料（例えば、同一対象から得られた２つ以上の異なる試料）で行われる場合もある。
【００８９】
本明細書中記載される様々な検出方法（例えば、「遺伝子バイオマーカーの検出」、「タンパク質バイオマーカーの検出」、及び「異数性の検出」とタイトルのついたセクションを参照）のどれであっても、対象から得られた試料中の１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在を検出するのに使用可能である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバー及び／または１つまたは複数のバイオマーカークラスは、対象における疾患に関連する。いくつかの実施形態では、異数性は、対象における疾患に関連する。いくつかの実施形態では、疾患は、がんである（例えば、本明細書中記載される様々な種類のがんのいずれか）。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のメンバーは、遺伝子バイオマーカーの１つのクラスのメンバーである。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のメンバーは、タンパク質バイオマーカーの１つのクラスのメンバーである。いくつかの実施形態では、対象から得られた試料中の１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することにより、さらなる診断検査の候補として対象を同定することを含む方法は、さらに、対象から得られた試料中の異数性の存在を検出することを含む。例えば、対象から得られた試料中の遺伝子バイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することにより、さらなる診断検査の候補として対象を同定することを含む方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、対象由来の同一試料または２つの異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含むことができる。別の例として、対象から得られた試料中のタンパク質バイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することにより、さらなる診断検査の候補として対象を同定することを含む方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、対象由来の同一試料または２つの異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含むことができる。いくつかの実施形態では、対象から得られた試料中の遺伝子バイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること及びタンパク質バイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること両方により、さらなる診断検査の候補として対象を同定することを含む方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、対象由来の同一試料または２つの異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含むことができる。
【００９０】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、さらなる診断検査の候補として対象を同定することを含む方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一バイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、さらなる診断検査の候補として対象を同定することを含む方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の異数性の存在を検出することを含む（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、さらなる診断検査の候補として対象を同定することを含む方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一バイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること、及び対象から得られた１つまたは複数の試料中の異数性の存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、さらなる診断検査の候補として対象を同定することを含む方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の２つ以上のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー及びタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、さらなる診断検査の候補として対象を同定することを含む方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の２つ以上のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー及びタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること、及び対象から得られた１つまたは複数の試料中の異数性の存在を検出することを含む。
【００９１】
いくつかの実施形態では、対象から得られた単一試料を、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために及び／または異数性の存在について検査することができ、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在が検出された場合、その対象を、疾患（例えば、がん）を有すると診断するまたは同定する、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定することができ、及び／またはその対象を、さらなる診断検査の候補として同定することができる。あるいは、２つ以上の試料を対象から得ることができ、２つ以上の試料のそれぞれを、個別に、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために及び／または異数性の存在について検査することができ、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在が検出された場合、その対象を、疾患（例えば、がん）を有すると診断するまたは同定する、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると診断または同定することができ、及び／またはその対象を、さらなる診断検査の候補として同定することができる。１つの非限定的な例として、対象から得られた第１の試料を、第１のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、対象から得られた第２の試料を、第２のバイオマーカークラス（例えば、タンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、及び／または第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出された場合（例えば、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、かつ第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出された場合）、その対象は、疾患（例えば、がん）を有すると診断または同定され、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定され、及び／またはその対象は、さらなる診断検査の候補として同定される。別の非限定的な例として、対象から得られた第１の試料を、あるバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、対象から得られた第２の試料を、異数性の存在を検出するために検査することができ、そのバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、及び／または異数性の存在が検出された場合（例えば、そのバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、かつ異数性の存在が検出された場合）、その対象は、疾患（例えば、がん）を有すると診断または同定され、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定され、及び／またはその対象は、さらなる診断検査の候補として同定される。別の非限定的な例として、対象から得られた第１の試料を、第１のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために、及び第２のバイオマーカークラス（例えば、タンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、一方で対象から得られた第２の試料を、異数性の存在を検出するために検査することができ、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、及び／または異数性の存在が検出された場合（例えば、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、かつ異数性の存在が検出された場合）、その対象は、疾患（例えば、がん）を有すると診断または同定され、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定され、及び／またはその対象は、さらなる診断検査の候補として同定される。別の非限定的な例として、対象から得られた第１の試料を、第１のバイオマーカークラス（例えば、遺伝的またはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために、及び異数性の存在を検出するために検査することができ、一方で対象から得られた第２の試料を、第２のバイオマーカークラス（例えば、第１の試料で検査される第１のバイオマーカークラスとは異なるクラス）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、及び／または異数性の存在が検出された場合（例えば、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、かつ異数性の存在が検出された場合）、その対象は、疾患（例えば、がん）を有すると診断または同定され、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定され、及び／またはその対象は、さらなる診断検査の候補として同定される。
【００９２】
対象から得られた試料中の、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバー（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のメンバー）及び／または異数性の存在を検出することにより、疾患を有するまたは発症する１つまたは複数のメンバー（例えば高いリスク）を検出することにより、さらなる診断検査の候補として対象を同定する実施形態のいくつかにおいて、対象は、本明細書中開示される様々な種類のさらなる診断検査のいずれかの対象であり、そのような診断検査として、特に制限なく、スキャン（例えば、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、ＣＴ血管造影法（ＣＴＡ）、食道造影図（バリウム飲み込み）、バリウム注腸、核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、ＰＥＴスキャン、コンピュータ断層撮影法（ＰＥＴ−ＣＴ）スキャン、超音波検査（例えば、超音波気管支内検査、超音波内視鏡検査）、Ｘ線、またはＤＥＸＡスキャン）、または理学的検査（例えば、肛門鏡検査、気管支鏡検査（例えば、自己蛍光気管支鏡検査、白色光気管支鏡検査、誘導式気管支鏡検査）、大腸内視鏡検査、デジタル乳房トモシンセシス、内視鏡的逆行性胆道膵管造影（ＥＲＣＰ）、上部消化管内視鏡検査、マンモグラフィ、パップスメア、または婦人科内診）が挙げられる。
【００９３】
いくつかの実施形態では、さらなる診断検査の候補として同定される（例えば、本明細書中記載される様々な方法のいずれかを使用して）対象は、より詳しいモニタリングの候補としても同定される。これに加えてまたはこれに代えて、さらなる診断検査の候補として同定される（例えば、本明細書中記載される様々な方法のいずれかを使用して）対象は、治療に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象としても同定される。これに加えてまたはこれに代えて、さらなる診断検査の候補として同定される（例えば、本明細書中記載される様々な方法のいずれかを使用して）対象は、治療（例えば、本明細書中記載される様々な治療介入のいずれか）も受ける。
【００９４】
より詳しいモニタリングの候補として対象を同定する方法
同じく本明細書中提供されるのは、対象から得られた試料中の、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバー（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のメンバー）及び／または異数性の存在を検出することにより、より詳しいモニタリングの候補として対象を同定するための方法及び物質である。より詳しいモニタリングの候補として対象を同定する実施形態のいくつかにおいて、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在は、同時に検査される（例えば、１つの検査手順において、これには、検査手順自身が、複数の別々の検査方法またはシステムを含む場合がある実施形態が含まれる）。より詳しいモニタリングの候補として対象を同定する実施形態のいくつかにおいて、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在は、順次検査される（例えば、２つ以上の異なる時点で行われる２つ以上の異なる検査手順において、これには、検査手順自身が、複数の別々の検査方法またはシステムを含む場合がある実施形態が含まれる）。１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在を同時または順次検査することの一方（または両方）を含む、より詳しいモニタリングの候補として対象を同定する実施形態のいくつかにおいて、検査は、単一試料で行われる場合も、２つ以上の異なる試料（例えば、同一対象から得られた２つ以上の異なる試料）で行われる場合もある。
【００９５】
本明細書中記載される様々な検出方法（例えば、「遺伝子バイオマーカーの検出」、「タンパク質バイオマーカーの検出」、及び「異数性の検出」とタイトルのついたセクションを参照）のどれであっても、対象から得られた試料中の１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在を検出するのに使用可能である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバー及び／または１つまたは複数のバイオマーカークラスは、対象における疾患に関連する。いくつかの実施形態では、異数性は、対象における疾患に関連する。いくつかの実施形態では、疾患は、がんである（例えば、本明細書中記載される様々な種類のがんのいずれか）。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のメンバーは、遺伝子バイオマーカーの１つのクラスのメンバーである。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のメンバーは、タンパク質バイオマーカーの１つのクラスのメンバーである。いくつかの実施形態では、対象から得られた試料中の１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することにより、より詳しいモニタリングの候補として対象を同定することを含む方法は、さらに、対象から得られた試料中の異数性の存在を検出することを含む。例えば、対象から得られた試料中の遺伝子バイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することにより、より詳しいモニタリングの候補として対象を同定することを含む方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、対象由来の同一試料または２つの異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含むことができる。別の例として、対象から得られた試料中のタンパク質バイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することにより、より詳しいモニタリングの候補として対象を同定することを含む方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、対象由来の同一試料または２つの異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含むことができる。いくつかの実施形態では、対象から得られた試料中の遺伝子バイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること及びタンパク質バイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること両方により、より詳しいモニタリングの候補として対象を同定することを含む方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、対象由来の同一試料または２つ以上の異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含むことができる。
【００９６】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、より詳しいモニタリングの候補として対象を同定することを含む方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一バイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、より詳しいモニタリングの候補として対象を同定することを含む方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の異数性の存在を検出することを含む（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、より詳しいモニタリングの候補として対象を同定することを含む方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一バイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること、及び対象から得られた１つまたは複数の試料中の異数性の存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、より詳しいモニタリングの候補として対象を同定することを含む方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の２つ以上のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー及びタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、より詳しいモニタリングの候補として対象を同定することを含む方法は、対象から得られた１つまたは複数の試料中の２つ以上のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー及びタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出すること、及び対象から得られた１つまたは複数の試料中の異数性の存在を検出することを含む。
【００９７】
いくつかの実施形態では、対象から得られた単一試料を、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために及び／または異数性の存在について検査することができ、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在が検出された場合、その対象を、疾患（例えば、がん）を有すると診断するまたは同定する、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定することができ、及び／またはその対象を、より詳しいモニタリングの候補として同定することができる。あるいは、２つ以上の試料を対象から得ることができ、２つ以上の試料のそれぞれを、個別に、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために及び／または異数性の存在について検査することができ、１つまたは複数のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在及び／または異数性の存在が検出された場合、その対象を、疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると診断または同定することができ、及び／またはその対象を、より詳しいモニタリングの候補として同定することができる。１つの非限定的な例として、対象から得られた第１の試料を、第１のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、対象から得られた第２の試料を、第２のバイオマーカークラス（例えば、タンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、及び／または第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出された場合（例えば、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、かつ第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出された場合）、その対象は、疾患（例えば、がん）を有すると診断または同定され、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定され、及び／またはその対象は、より詳しいモニタリングの候補として同定される。別の非限定的な例として、対象から得られた第１の試料を、あるバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、対象から得られた第２の試料を、異数性の存在を検出するために検査することができ、そのバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、及び／または異数性の存在が検出された場合（例えば、そのバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、かつ異数性の存在が検出された場合）、その対象は、疾患（例えば、がん）を有すると診断または同定され、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定され、及び／またはその対象は、より詳しいモニタリングの候補として同定される。別の非限定的な例として、対象から得られた第１の試料を、第１のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために、及び第２のバイオマーカークラス（例えば、タンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、一方で対象から得られた第２の試料を、異数性の存在を検出するために検査することができ、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、及び／または異数性の存在が検出された場合（例えば、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、かつ異数性の存在が検出された場合）、その対象は、疾患（例えば、がん）を有すると診断または同定され、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定され、及び／またはその対象は、より詳しいモニタリングの候補として同定される。別の非限定的な例として、対象から得られた第１の試料を、第１のバイオマーカークラス（例えば、遺伝的またはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために、及び異数性の存在を検出するために検査することができ、一方で対象から得られた第２の試料を、第２のバイオマーカークラス（例えば、第１の試料で検査される第１のバイオマーカークラスとは異なるクラス）の１つまたは複数のメンバーの存在を検出するために検査することができ、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、及び／または異数性の存在が検出された場合（例えば、第１のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、第２のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在が検出され、かつ異数性の存在が検出された場合）、その対象は、疾患（例えば、がん）を有すると診断または同定され、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定され、及び／またはその対象は、より詳しいモニタリングの候補として同定される。
【００９８】
いくつかの実施形態では、より詳しいモニタリングの候補として同定される（例えば、本明細書中記載される様々な方法のいずれかを使用して）対象は、さらなる診断検査の候補としても同定される。これに加えてまたはこれに代えて、より詳しいモニタリングの候補として同定される（例えば、本明細書中記載される様々な方法のいずれかを使用して）対象は、治療に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象としても同定される。これに加えてまたはこれに代えて、より詳しいモニタリングの候補として同定される（例えば、本明細書中記載される様々な方法のいずれかを使用して）対象は、治療（例えば、本明細書中記載される様々な治療介入のいずれか）も受ける。
【００９９】
遺伝子バイオマーカーとタンパク質バイオマーカーとの併用
１つの態様において、本明細書中提供されるのは、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出するための方法及び物質である。別の態様において、本明細書中提供されるのは、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することにより、対象における疾患の存在を診断または同定する（例えば、対象を、がんを有すると同定する）ための方法及び物質である。別の態様において、本明細書中提供されるのは、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することにより、対象を、疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があるとして同定するための方法及び物質である。別の態様において、本明細書中提供されるのは、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することにより、疾患（例えば、がん）を有すると診断または同定された、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された対象を治療するための方法及び物質である。別の態様において、本明細書中提供されるのは、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することにより、疾患（例えば、がん）を有すると診断または同定された、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された対象の治療を同定するための方法及び物質である。別の態様において、本明細書中提供されるのは、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することにより、治療に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象を同定するための方法及び物質である。別の態様において、本明細書中提供されるのは、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することにより、さらなる診断検査の候補として対象を同定するための方法及び物質である。別の態様において、本明細書中提供されるのは、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することにより、より詳しいモニタリングの候補として対象を同定するための方法及び物質である。
【０１００】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、がんの検出または診断に高い感度を提供する（例えば、対象ががんを有すると正確に同定する頻度または発生率が高い）。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、がんの検出または診断に高い感度を提供し（例えば、対象ががんを有すると正確に同定する頻度または発生率が高い）、その感度は、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在またはタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を別々に検出することにより提供される感度よりも高い。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法及び物質は、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、またはそれより高い感度を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法及び物質は、単一種のがんの検出に高い感度を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法及び物質は、２種以上のがんの検出に高い感度を提供する。様々ながん種類のどれでも、本明細書中提供される方法及び物質を用いて検出することができる（例えば、「がん」とタイトルのついたセクションを参照）。いくつかの実施形態では、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法及び物質を用いて検出可能ながんには、膵癌が含まれる。いくつかの実施形態では、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法及び物質を用いて検出可能ながんには、肝臓癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、膵癌、結腸直腸癌、肺癌、または乳癌が含まれる。いくつかの実施形態では、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法及び物質を用いて検出可能ながんには、女性生殖管の癌（例えば、子宮頸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、または卵管癌）が含まれる。いくつかの実施形態では、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法及び物質を用いて検出可能ながんには、膀胱癌または上部尿路上皮癌が含まれる。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、がんの検出または診断において高い特異性を提供する（例えば、対象ががんを有さない場合に、対象ががんを有すると間違って同定する頻度または発生率が低い）。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、がんの検出または診断において特異性を提供し（例えば、対象ががんを有すると正確に同定する頻度または発生率が高い）、この特異性は、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在またはタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を別々に検出することにより提供される特異性よりも高い。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法及び物質は、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、またはそれより高い特異性を提供する。当業者には当然のことながら、９９％の特異性は、がんを有さない対象の１％のみが、がんを有すると間違って同定されることを意味する。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法及び物質は、単一のがんの検出において高い特異性を提供する（例えば、対象がその単一のがん種を有するとして間違って同定される可能性が低い）。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法及び物質は、２種以上のがんの検出において高い特異性を提供する（例えば、対象がそれら２種以上のがん種を有するとして間違って同定される可能性が低い）。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下の存在を検出することを含む：１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳ、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８）：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、及び／またはミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下の存在を検出することを含む：１）以下の遺伝子それぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及びＧＮＡＳ、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８）：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、及び／またはミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下の存在を検出することを含む：１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳ、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーそれぞれ：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、及びミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下の存在を検出することを含む：１）以下の遺伝子それぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳ、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーそれぞれ：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、及び／またはミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法が、以下の存在：１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳ、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８）：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、及び／またはミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）を検出することを含む実施形態のいくつかにおいて、対象は、以下の種類のがんのうち１種を有すると判定される（例えば、有すると診断される）、あるいは、有するまたは発症するリスクが高いと判定される（例えば、リスクが高いと診断される）：肝臓癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、膵癌、結腸直腸癌、肺癌、及び／または乳癌。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下の存在を検出することを含む：１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳ、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１）：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、フォリスタチン、Ｇ−ＣＳＦ、及び／またはＣＡ１５−３。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下の存在を検出することを含む：１）以下の遺伝子それぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及びＧＮＡＳ、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１）：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、フォリスタチン、Ｇ−ＣＳＦ、及び／またはＣＡ１５−３。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下の存在を検出することを含む：１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳ、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーそれぞれ：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、フォリスタチン、Ｇ−ＣＳＦ、及びＣＡ１５−３。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下の存在を検出することを含む：１）以下の遺伝子それぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳ、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーそれぞれ：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、フォリスタチン、Ｇ−ＣＳＦ、及び／またはＣＡ１５−３。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法が、以下の存在：１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳ、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８）：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、フォリスタチン、Ｇ−ＣＳＦ、及び／またはＣＡ１５−３を検出することを含む実施形態のいくつかにおいて、対象は、以下の種類のがんのうち１種を有すると判定される（例えば、有すると診断される）、あるいは、有するまたは発症するリスクが高いと判定される（例えば、リスクが高いと診断される）：肝臓癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、膵癌、結腸直腸癌、肺癌、及び／または乳癌。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下の存在を検出することを含む：１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳ、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、または９）：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、及び／またはＣＡ１５−３。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下の存在を検出することを含む：１）以下の遺伝子それぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及びＧＮＡＳ、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、または９）：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、及び／またはＣＡ１５−３。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下の存在を検出することを含む：１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳ、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーそれぞれ：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、及びＣＡ１５−３。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下の存在を検出することを含む：１）以下の遺伝子それぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及びＧＮＡＳ、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーそれぞれ：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、及びＣＡ１５−３。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法が、以下の存在：１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳ、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８）：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、及び／またはＣＡ１５−３を検出することを含む実施形態のいくつかにおいて、対象は、以下の種類のがんのうち１種を有すると判定される（例えば、有すると診断される）、あるいは、有するまたは発症するリスクが高いと判定される（例えば、リスクが高いと診断される）：肝臓癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、膵癌、結腸直腸癌、肺癌、及び／または乳癌。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下の存在を検出することを含む：１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、または４）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＫＲＡＳ（例えば、１２番コドン及び／または６１番コドンの遺伝子バイオマーカー）、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、及び／またはＳＭＡＤ４、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、または４）：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、及び／またはＯＰＮ。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下の存在を検出することを含む：１）以下の遺伝子それぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＫＲＡＳ（例えば、１２番コドン及び／または６１番コドンの遺伝子バイオマーカー）、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、及びＳＭＡＤ４、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、または４）：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、及び／またはＯＰＮ。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下の存在を検出することを含む：１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、または４）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＫＲＡＳ（例えば、１２番コドン及び／または６１番コドンの遺伝子バイオマーカー）、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、及び／またはＳＭＡＤ４、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーそれぞれ：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、及びＯＰＮ。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下の存在を検出することを含む：１）以下の遺伝子それぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＫＲＡＳ（例えば、１２番コドン及び／または６１番コドンの遺伝子バイオマーカー）、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、及びＳＭＡＤ４、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーそれぞれ：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、及びＯＰＮ。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法が、以下の存在：１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、または４）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＫＲＡＳ（例えば、１２番コドン及び／または６１番コドンの遺伝子バイオマーカー）、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、及び／またはＳＭＡＤ４、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、または４）：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、及び／またはＯＰＮを検出することを含む実施形態のいくつかにおいて、対象は、膵癌を有すると判定される（例えば、有すると診断される）、あるいは、有するまたは発症するリスクが高いと判定される（例えば、リスクが高いと診断される）。
【０１０６】
対象から得られる試料は、本明細書中記載される、無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）及び／またはタンパク質を含有する様々な試料のどれでも可能である。いくつかの実施形態では、対象から得られた試料中の無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）及び／またはタンパク質は、腫瘍細胞に由来する。いくつかの実施形態では、対象から得られた試料中の無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）は、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーを含む。いくつかの実施形態では、対象から得られた試料中のタンパク質は、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーを含む。遺伝子バイオマーカー及び／またはタンパク質バイオマーカーが検出可能な試料の非限定的な例として、血液、血漿、及び血清が挙げられる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在及び１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの存在は、対象から得られた単一試料で検出される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在は、対象から得られた第１の試料で検出され、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの存在は、対象から得られた第２の試料で検出される。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバー（例えば、遺伝子バイオマーカーパネルの各メンバー）の存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバー（例えば、タンパク質バイオマーカーパネルの各メンバー）の存在を検出することを含む方法では、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの上昇したレベルが検出される可能性がある。例えば、タンパク質バイオマーカーの上昇したレベルは、参照レベルより高いレベルであることが可能である。参照レベルは、がんの存在とは関連しないタンパク質バイオマーカーの任意レベルが可能である。例えば、タンパク質バイオマーカーの参照レベルは、がんを有していない、またはがん細胞を保有していない参照対象において存在するレベルが可能である。タンパク質バイオマーカーの参照レベルは、がんを有していない、またはがん細胞を保有していない複数の参照対象において存在する平均レベルが可能である。がんを有すると判定された対象におけるタンパク質バイオマーカーの参照レベルとして、がんの発症前にその対象において存在したレベルが可能である。いくつかの実施形態では、パネルの１つまたは複数のメンバーが上昇したレベルで存在するタンパク質バイオマーカーパネルは、以下のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または以下のそれぞれ）を含む：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、及び／またはミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）。いくつかの実施形態では、パネルの１つまたは複数のメンバーが上昇したレベルで存在するタンパク質バイオマーカーパネルは、以下のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または以下のそれぞれ）を含む：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、フォリスタチン、Ｇ−ＣＳＦ、及び／またはＣＡ１５−３。いくつかの実施形態では、パネルの１つまたは複数のメンバーが上昇したレベルで存在するタンパク質バイオマーカーパネルは、以下のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、または以下のそれぞれ）を含む：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、及び／またはＣＡ１５−３。いくつかの実施形態では、パネルの１つまたは複数のメンバーが上昇したレベルで存在するタンパク質バイオマーカーパネルは、以下のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、または以下のそれぞれ）を含む：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、及び／またはＯＰＮ。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバー（例えば、遺伝子バイオマーカーパネルの各メンバー）の存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバー（例えば、タンパク質バイオマーカーパネルの各メンバー）の存在を検出することを含む方法では、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの低下したレベルが検出される可能性がある。例えば、タンパク質バイオマーカーの低下したレベルは、参照レベルより低いレベルであることが可能である。参照レベルは、がんの存在とは関連しないタンパク質バイオマーカーの任意レベルが可能である。例えば、タンパク質バイオマーカーの参照レベルは、がんを有していない、またはがん細胞を保有していない参照対象において存在するレベルが可能である。タンパク質バイオマーカーの参照レベルは、がんを有していない、またはがん細胞を保有していない複数の参照対象において存在する平均レベルが可能である。がんを有すると判定された対象におけるタンパク質バイオマーカーの参照レベルとして、がんの発症前にその対象において存在したレベルが可能である。いくつかの実施形態では、パネルの１つまたは複数のメンバーが低下したレベルで存在するタンパク質バイオマーカーパネルは、以下のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または以下のそれぞれ）を含む：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、及び／またはミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）。いくつかの実施形態では、パネルの１つまたは複数のメンバーが低下したレベルで存在するタンパク質バイオマーカーパネルは、以下のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または以下のそれぞれ）を含む：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、フォリスタチン、Ｇ−ＣＳＦ、及び／またはＣＡ１５−３。いくつかの実施形態では、パネルの１つまたは複数のメンバーが低下したレベルで存在するタンパク質バイオマーカーパネルは、以下のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、または以下のそれぞれ）を含む：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、及び／またはＣＡ１５−３。いくつかの実施形態では、パネルの１つまたは複数のメンバーが低下したレベルで存在するタンパク質バイオマーカーパネルは、以下のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、または以下のそれぞれ）を含む：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、及び／またはＯＰＮ。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、対象が、がんを有すると判定される（例えば、有すると診断される）、あるいは、有するまたは発症するリスクが高いと判定される（例えば、リスクが高いと診断される）場合（例えば、：１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳ、ならびに２）この遺伝子バイオマーカーパネルと併用して有用であると本明細書中記載されるパネルのいずれかにおける１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの存在、を検出することにより）、その対象は、さらなる診断検査（例えば、本明細書中記載される様々なさらなる診断検査方法のいずれか）の候補として選択され（例えば、さらなる診断検査に選択され）、その対象は、より詳しいモニタリング（例えば、本明細書中記載される様々なより詳しいモニタリング方法のいずれか）の候補として選択され（例えば、より詳しいモニタリングに選択され）、その対象は、治療（例えば、本明細書中記載される様々な治療介入のいずれか）に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象として同定され、その対象は、治療の候補として選択され（例えば、治療に選択され）、治療（例えば、本明細書中記載される様々な治療介入のいずれか）は、対象に合わせて選択され、及び／または治療（例えば、本明細書中記載される様々な治療介入のいずれか）は、対象に実施される。例えば、対象が、がんを有すると判定された（例えば、有すると診断された）、あるいは、有するまたは発症するリスクが高いと判定された（例えば、リスクが高いと診断された）場合、その対象は、さらなる診断検査を受けることができ、さらなる診断検査は、その対象におけるがんの存在を確認することができる。これに加えてまたはこれに代えて、その対象は、より高い頻度でモニタリングを受けることができる。がんを有すると判定された（例えば、有すると診断された）、あるいは、有するまたは発症するリスクが高いと判定された（例えば、リスクが高いと診断された）対象が、さらなる診断検査及び／またはより詳しいモニタリングを受ける実施形態のいくつかにおいて、その対象は、追加で、治療介入を実施される可能性がある。いくつかの実施形態では、対象が治療介入を実施された後、その対象は、追加のさらなる診断検査（例えば、以前に行われたものと同じ種類のさらなる診断検査及び／または異なる種類のさらなる診断検査）及び／または継続したより詳しいモニタリング（例えば、以前に行われたものと同じ頻度または異なる頻度でのより詳しいモニタリング）を受ける。複数の実施形態において、対象が治療介入を実施され、追加のさらなる診断検査及び／または追加のより詳しいモニタリングを受けた後、その対象は、別の治療介入（例えば、以前に実施されたものと同じ治療介入及び／または異なる治療介入）を実施される。いくつかの実施形態では、対象が治療介入を実施された後、その対象は、以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳ、ならびに２）この遺伝子バイオマーカーパネルと併用して有用であると本明細書中記載されるパネルのいずれかにおける１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの存在、について検査される。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在の一方または両方を検出するのに使用された同一試料、あるいは異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含む。任意の染色体またはその一部分（例えば、染色体腕）における異数性の存在が検出可能である。遺伝子バイオマーカー、タンパク質バイオマーカー、及び異数性の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、染色体腕５ｑ、８ｑ、及び９ｐの１つまたは複数における異数性の存在が検出される。遺伝子バイオマーカー、タンパク質バイオマーカー、及び異数性の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、染色体腕４ｐ、７ｑ、８ｑ、及び９ｑの１つまたは複数における異数性の存在が検出される。
【０１１１】
本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳ、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８）：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、及び／またはミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、本方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在の一方または両方を検出するのに使用された同一試料、あるいは異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含む。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下の遺伝子それぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及びＧＮＡＳ、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８）：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、及び／またはミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、本方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在の一方または両方を検出するのに使用された同一試料、あるいは異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含む。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳ、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーそれぞれ：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、及びミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、本方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在の一方または両方を検出するのに使用された同一試料、あるいは異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含む。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下の遺伝子それぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳ、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーそれぞれ：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、及び／またはミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、本方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在の一方または両方を検出するのに使用された同一試料、あるいは異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含む。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳ、２）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８）：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、及び／またはミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、ならびに３）異数性の存在、の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、対象は、以下の種類のがんのうち１種を有すると判定される（例えば、有すると診断される）、あるいは、有するまたは発症するリスクが高いと判定される（例えば、リスクが高いと診断される）：肝臓癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、膵癌、結腸直腸癌、肺癌、及び／または乳癌。
【０１１２】
本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳ、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１）：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、フォリスタチン、Ｇ−ＣＳＦ、及び／またはＣＡ１５−３の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、本方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在の一方または両方を検出するのに使用された同一試料、あるいは異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含む。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下の遺伝子それぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及びＧＮＡＳ、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーのうちの１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１）：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、フォリスタチン、Ｇ−ＣＳＦ、及び／またはＣＡ１５−３の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、本方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在の一方または両方を検出するのに使用された同一試料、あるいは異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下：１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳ、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーそれぞれ：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、フォリスタチン、Ｇ−ＣＳＦ、及びＣＡ１５−３の存在を検出することを含み、本方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在の一方または両方を検出するのに使用された同一試料、あるいは異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含む。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下の遺伝子それぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳ、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーそれぞれ：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、フォリスタチン、Ｇ−ＣＳＦ、及び／またはＣＡ１５−３の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、本方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在の一方または両方を検出するのに使用された同一試料、あるいは異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含む。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳ、２）以下のタンパク質バイオマーカーのうちの１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８）：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、フォリスタチン、Ｇ−ＣＳＦ、及び／またはＣＡ１５−３、ならびに３）異数性の存在、の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、対象は、以下の種類のがんのうち１種を有すると判定される（例えば、有すると診断される）、あるいは、有するまたは発症するリスクが高いと判定される（例えば、リスクが高いと診断される）：肝臓癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、膵癌、結腸直腸癌、肺癌、及び／または乳癌。
【０１１３】
本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳ、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、または９）：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、及び／またはＣＡ１５−３の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、本方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在の一方または両方を検出するのに使用された同一試料、あるいは異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含む。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下の遺伝子それぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及びＧＮＡＳ、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、または９）：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、及び／またはＣＡ１５−３の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、本方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在の一方または両方を検出するのに使用された同一試料、あるいは異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含む。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳ、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーそれぞれ：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、及びＣＡ１５−３の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、本方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在の一方または両方を検出するのに使用された同一試料、あるいは異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含む。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下の遺伝子それぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及びＧＮＡＳ、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーそれぞれ：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、及びＣＡ１５−３の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、本方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在の一方または両方を検出するのに使用された同一試料、あるいは異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含む。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳ、２）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８）：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、及び／またはＣＡ１５−３、ならびに３）異数性の存在、の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、対象は、以下の種類のがんのうち１種を有すると判定される（例えば、有すると診断される）、あるいは、有するまたは発症するリスクが高いと判定される（例えば、リスクが高いと診断される）：肝臓癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、膵癌、結腸直腸癌、肺癌、及び／または乳癌。
【０１１４】
本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、または４）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＫＲＡＳ（例えば、１２番コドン及び／または６１番コドンの遺伝子バイオマーカー）、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、及び／またはＳＭＡＤ４、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、または４）：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、及び／またはＯＰＮの存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、本方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在の一方または両方を検出するのに使用された同一試料、あるいは異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含む。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下の遺伝子それぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＫＲＡＳ（例えば、１２番コドン及び／または６１番コドンの遺伝子バイオマーカー）、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、及びＳＭＡＤ４、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、または４）：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、及び／またはＯＰＮの存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、本方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在の一方または両方を検出するのに使用された同一試料、あるいは異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含む。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、または４）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＫＲＡＳ（例えば、１２番コドン及び／または６１番コドンの遺伝子バイオマーカー）、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、及び／またはＳＭＡＤ４、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーそれぞれ：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、及びＯＰＮの存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、本方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在の一方または両方を検出するのに使用された同一試料、あるいは異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含む。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下の遺伝子それぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＫＲＡＳ（例えば、１２番コドン及び／または６１番コドンの遺伝子バイオマーカー）、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、及びＳＭＡＤ４、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーそれぞれ：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、及びＯＰＮの存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、本方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在の一方または両方を検出するのに使用された同一試料、あるいは異なる試料）中の異数性の存在を検出することを含む。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、または４）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＫＲＡＳ（例えば、１２番コドン及び／または６１番コドンの遺伝子バイオマーカー）、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、及び／またはＳＭＡＤ４、ならびに２）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、または４）：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、及び／またはＯＰＮ、の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、対象は、膵癌を有すると判定される（例えば、有すると診断される）、あるいは、有するまたは発症するリスクが高いと判定される（例えば、リスクが高いと診断される）
【０１１５】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む様々な方法のどれでも、さらに、１つまたは複数の追加のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む。そのような追加のバイオマーカークラスの非限定的な例として、以下が挙げられる：コピー数変化、ＤＮＡメチル化変化、他の核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、ｍｔＤＮＡ、テロメアＤＮＡ、転座、及びゲノム再編成）、ペプチド、及び／または代謝産物。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、１種または複数の追加のバイオマーカークラスは、代謝産物バイオマーカーを含む。いくつかの実施形態では、生体試料が、がんを示す代謝産物を１つまたは複数含有する場合に、対象は、がんを有するまたは発症するリスクが高いと判定される。いくつかの実施形態では、生体試料が、がんを示す代謝産物を１つまたは複数含有する場合に、対象は、がんを有すると判定される。がんを示す代謝産物の非限定的な例として、以下が挙げられる：５−メチルチオアデノシン（ＭＴＡ）、グルタチオン還元型（ＧＳＨ）、Ｎ−アセチルグルタミン酸塩、ラクトース、Ｎ−アセチルノイラミン酸塩、ＵＤＰ−アセチルグルコサミン、ＵＤＰ−アセチルガラクトサミン、ＵＤＰ−グルクロン酸塩、パントテン酸塩、アラキドン酸塩（２０：４ｎ６）、コリン、シチジン５’−ジホスホコリン、ジホモ−リノレン酸塩（２０：３ｎ３）、ドコサペンタエン酸塩（ＤＰＡ２２：５ｎ３）、エイコサペンタエン酸塩（ＥＰＡ２０：５ｎ３）、グリセロホスホリルコリン（ＧＰＣ）、ドコサヘキサエン酸塩（ＤＨＡ２２：６ｎ３）、リノール酸塩（１８：２ｎ６）、シチジン５’−一リン酸（５’−ＣＭＰ）、ガンマ−グルタミルグルタミン酸塩、Ｘ−１４５７７、Ｘ−１１５８３、イソバレリルカルニチン、ホスホクレアチン、２−アミノアジピン酸、グルコン酸、Ｏ−アセチルカルニチン、アスパラギン酸、デアミド−ＮＡＤ＋、グルタミン酸、イソブチリルカルニチン、カルニチン、ピリドキサール、クエン酸、アデノシン、ＡＴＰ、バリン、ＸＣ００６１、イソロイシン、γ−ブチロベタイン、乳酸、アラニン、フェニルアラニン、グルコノラクトン、ロイシン、グルタチオン（ＧＳＳＧ）＿二価型、チロシン、ＮＡＤ＋、ＸＣ００１６、ＵＴＰ、クレアチン、テオブロミン、ＣＴＰ、ＧＴＰ、３−メチルヒスチジン、コハク酸、グリセロール３−リン酸、グルタミン、５−オキソプロリン、チアミン、ブチリルカルニチン、４−アセトアミドブタン酸、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−ガラクトース、トレオニン、Ｎ−アセチルグリシン、プロリン、ＡＤＰ、コリン、リンゴ酸、Ｓ−アデノシルメチオニン、パントテン酸、システインスルフィン酸、６−アミノヘキサン酸、ホモシステイン酸、ヒドロキシプロリン、メチオニンスルホキシド、３−グアニジノプロピオン酸、グルコース６−リン酸、フェナセツル酸、トレオン酸、トリプトファン、ピリドキシン、Ｎ−アセチルアスパラギン酸、４−グアニジノ酪酸、セリン、シトルリン、ベタイン、Ｎ−アセチルアスパラギン、２−ヒドロキシグルタル酸、アルギニン、グルタチオン（ＧＳＨ）、クレアチニン、ジヒドロキシアセトンリン酸、ヒスチジン、グリシン、グルコース１−リン酸、Ｎ−ホルミルグリシン、ケトプロフェン、リシン、ベータ−アラニン、Ｎ−アセチルグルタミン酸、２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール、オルニチン、ホスホリルコリン、グリセロホスホコリン、テレフタル酸、グリセルアルデヒド３−リン酸、Ｇｌｙ−Ａｓｐ、タウリン、フルクトース１，６−ニリン酸、３−アミノイソ酪酸、スペルミジン、ＧＡＢＡ、トリエタノールアミン、グリセロール、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−アセチルオルニ���ン、ジエタノールアミン、ＡＭＰ、システイングルタチオンジスルフィド、ストレプトマイシン硫酸塩＋Ｈ２Ｏ二価型、ｔｒａｎｓ−グルタコン酸、ニコチン酸、イソブチルアミン、ベタインアルデヒド＋Ｈ２Ｏ、ウロカニン酸、１−アミノシクロプロパン−１−カルボン酸ホモセリンラクトン、５−アミノ吉草酸、３−ヒドロキシ酪酸、エタノールアミン、イソ吉草酸、Ｎ−メチルグルタミン酸、シスタチオニン、スペルミン、カルノシン、１−メチルニコチンアミド、Ｎ−アセチルノイラミン酸、サルコシン、ＧＤＰ、Ｎ−メチルアラニン、パルミチン酸、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−ｒａｃ−グリセロールコレステロール５α、６αエポキシドラノステロール、リグノセリン酸、１オレオイル＿ｒａｃ＿ＧＬ、コレステロール＿エポキシド、エルカ酸、Ｔ−ＬＣＡ、オレオイル−Ｌ−カルニチン、オレアノール酸、３−ホスホグリセリン酸、５−ヒドロキシノルバリン、５−メトキシトリプタミン、アデノシン−５−一リン酸、アルファ−ケトグルタル酸塩、アスパラギン、安息香酸、ヒポキサンチン、マルトース、マルトトリオース、メチオニンスルホキシド、ノルニコチン、フェノール、ホスホエタノールアミン、ピロリン酸塩、ピルビン酸、キナ酸、タウリン、尿酸、イノシン、乳酸アミド、５−ヒドロキシノルバリンＮＩＳＴ、コレステロール、デオキシペンチトール、２−ヒドロキシエストロン、２−ヒドロキシエストラジオール、２−メトキシエストロン、２−メトキシエストラジオール、２−ヒドロキシエストロン−３−メチルエーテル、４−ヒドロキシエストロン、４−メトキシエストロン、４−メトキシエストラジオール、１６アルファ−ヒドロキシエストロン、１７−エピエストリオール、エストリオール、１６−ケトエストラジオール、１６−エピエストリオール、アシルカルニチンＣ１８：１、アミノ酸類のシトルリン及びｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリン、グリセロリン脂質類のＰＣ  ａａ  Ｃ２８：１、ＰＣ  ａｅ  Ｃ３０：０、及びＰＣ  ａｅ  Ｃ３０：２、ならびにスフィンゴ脂質ＳＭ（ＯＨ）Ｃ１４：１。例えば、Ｈａｌａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  ｃｏｌｏｎ  ａｎｄ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｎｉｃｈｅ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｇｌｙｃａｎ  ａｎｄ  ｌｉｐｉｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ｖｏｌｕｍｅ  ７，Ａｒｔｉｃｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ：３９９９９（２０１７）；Ｈｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ  ｔｈｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｏｆ  ｌｉｖｅｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ＣＤ１３３，Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．，７：４５５５７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ４５５５７，（２０１７）；Ｅｌｉａｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕｒｉｎａｒｙ  Ｅｓｔｒｏｇｅｎｓ  ａｎｄ  Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ  ａｎｄ  Ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ  Ｒｉｓｋ  ｏｆ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  ａｍｏｎｇ  Ｐｒｅｍｅｎｏｐａｕｓａｌ  Ｗｏｍｅｎ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ；７２（３）；６９６−��０６（２０１１）；Ｇａｎｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ：ａ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ−ｂａｓｅｄ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｈｉｇｈｌｙ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｎｇ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，Ｆｅｂ  ２；７（５）：５８１５−５８２９（２０１６）；Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｒｕｍ  ａｎｄ  Ｐｌａｓｍａ  Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，１３（６）：２０２−２０８，ｄｏｉ：１０．６０２６／９７３２０６３００１３２０２（２０１７）；Ｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｅ−ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｉｓｋ  ｉｎ  １０７７  ｃａｓｅｓ  ａｎｄ  １０７７  ｍａｔｃｈｅｄ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  Ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，ＢＭＣ  Ｍｅｄ．，１５：１２２，ｄｏｉ：  １０．１１８６／ｓ１２９１６−０１７−０８８５−６（２０１７）；を参照；これらはそれぞれ、そのまま全体が本明細書中参照により援用される。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、１種または複数の追加のバイオマーカークラスとして、ペプチド（例えば、１つまたは複数の方法において有用であると本明細書中記載される様々なタンパク質バイオマーカーとは異なるペプチド）が挙げられる。いくつかの実施形態では、生体試料が、がんを示すペプチドを１種または複数含有する場合に、対象は、がんを有するまたは発症するリスクが高いと判定される。いくつかの実施形態では、生体試料が、がんを示すペプチドを１種または複数含有する場合に、対象は、がんを有すると判定される。いくつかの実施形態では、ペプチドは、タンパク質に由来する（例えば、ペプチドは、タンパク質バイオマーカーまたは異なるタンパク質に存在するアミノ酸配列を含む）。がんを示すペプチドの非限定的な例として、以下のペプチド及び以下のタンパク質に由来するペプチドが挙げられる：ＣＥＡＣＡＭ、ＣＹＦＲＡ２１−１、ＣＡ１２５、ＰＫＬＫ、ＰｒｏＧＲＰ、ＮＳＥ、ＴＰＡ６、ＴＰＡ７、ＴＰＡ８、ＮＲＧ、ＮＲＧ１００、ＣＮＤＰ、ＡＰＯВ１００、ＳＣＣ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＨＥＲ２、ＢＲＡＦ、ＲＯＳ、ＲＥＴ、ＮＲＡＳ、ＭＥＴ、ＭＥＫ１、ＨＥＲ２、Ｃ４．４Ａ、ＰＳＦ３、ＦＡＭ８３Ｂ、ＥＣＤ、ＣＴＮＮＢ、ＶＩＭ、Ｓ１００Ａ４、Ｓ１００Ａ７、ＣＯＸ２、ＭＵＣ１、ＫＬＫＢ１、ＳＡＡ、ＨＰ−β鎖、Ｃ９、Ｐｇｒｍｃ１、Ｃｉｚ１、トランスフェリン、α−１アンチトリプシン、アポリポタンパク質１、補体ｃ３ａ、カベオリン−１、カリクレイン６、グルコース調節タンパク質−８、αディフェンシン−１、−２、−３、血清Ｃ−ペプチド、アルファ−２−ＨＳグリコールタンパク質、トリプシンＫＲＴ８ペプチド、血漿グリコールタンパク質、カテニン、ディフェンシンα６、ＭＭＰ、サイクリンＤ、Ｓ１００Ｐ、ラミンＡ／Ｃ線維タンパク質、熱ショックタンパク質、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、Ｔｘｌ−２、（チオレドキシン様タンパク質−２）、Ｐ５３、ｎｍ２３、ｕ−ＰＡ、ＶＥＧＦ、ＥｐｈＢ４、ＣＲＡＢＰ２、ＷＴ−１、Ｒａｂ−３Ｄ、メソテリン、ＥＲα、ＡＮＸＡ４、ＰＳＡＴ１、ＳＰＢ５、ＣＥＡ５、ＣＥＡ６、Ａ１ＡＴ、ＳＬＰＩ、ＡＰＯＡ４、ＶＤＢＰ、ＨＥ４、ＩＬ−１、−６、−７、−８、−１０、−１１、−１２、−１６、−１８、−２１、−２３、−２８Ａ、−３３、ＬＩＦ、ＴＮＦＲ１−２、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４）、ＩＬ１Ｒ−ａ、ＩＬ１Ｒ−ｂ、ＩＬ−２Ｒ、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＩＰ−１ａ、ＴＮＦ−α、ＣＤ４０、ＲＡＮＴＥＳ、ＣＤ４０Ｌ、ＭＩＦ、ＩＦＮ−β、ＭＣＰ−４（ＣＣＬ１３）、ＭＩＧ（ＣＸＣＬ９）、ＭＩＰ−１δ（ＣＣＬ１５）、ＭＩＰ３ａ（ＣＣＬ２０）、ＭＩＰ−４（ＣＣＬ１８）、ＭＰＩＦ−１、ＳＤＦ−１ａ＋ｂ（ＣＸＣＬ１２）、ＣＤ１３７／４−１ＢＢ、リンホタクチン（ＸＣＬ１）、エオタキシン−１（ＣＣＬ１１）、エオタキシン−２（ＣＣＬ２４）、６Ｃｋｉｎｅ／ＣＣＬ２１）、ＢＬＣ（ＣＸＣＬ１３）、ＣＴＡＣＫ（ＣＣＬ２７）、ＢＣＡ−１（ＣＸＣＬ１３）、ＨＣＣ４（ＣＣＬ１６）、ＣＴＡＰ−３（ＣＸＣＬ７）、ＩＧＦ１、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ３、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＣＴＧＦ、ＰＤＧＦ  ＡＡ、ＢＢ、ＰＤＧＦＲｂ、ｂＦＧＦ、ＴＧＦｂ���ＩＩＩ、β−セルリン、ＩＧＦＢＰ１−４、６、ＢＤＮＦ、ＰＥＤＦ、アンジオポエチン−２、レニン、リゾホスファチジン酸、β２−ミクログロブリン、シアリルＴＮ、ＡＣＥ、ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＣＡ１５−３、ＣＡ−５０、ＣＡ７２−４、ＯＶＸ１、メソテリン、シアリルＴＮ、ＭＭＰ−２、−３、−７、−９、ＶＡＰ−１、ＴＩＭＰ１−２、テネイシンＣ、ＶＣＡＭ−１、オステオポンチン、ＫＩＭ−１、ＮＣＡＭ、テトラネクチン、ナイドジェン−２、カテプシンＬ、プロスタシン、マトリプターゼ、カリクレイン２、６、１０、シスタチンＣ、クローディン、スポンジン２、ＳＬＰＩ、ｂＨＣＧ、尿中ゴナドトロピンペプチド、インヒビン、レプチン、アディポネクチン、ＧＨ、ＴＳＨ、ＡＣＴＨ、ＰＲＬ、ＦＳＨ、ＬＨ、コルチゾール、ＴＴＲ、オステオカルシン、インスリン、グレリン、ＧＩＰ、ＧＬＰ−１、アミリン、グルカゴン、ペプチドＹＹ、フォリスタチン、ヘプシジン、ＣＲＰ、アポＡ１、ＣＩＩＩ、Ｈ、トランスサイレチン、ＳＡＡ、ＳＡＰ、補体Ｃ３、４、補体因子Ｈ、アルブミン、セルロプラスミン、ハプトグロビン、β−ヘモグロビン、トランスフェリン、フェリチン、フィブリノーゲン、トロンビン、フォン・ヴィルブランド因子、ミオグロビン、免疫抑制酸性タンパク質、脂質関連シアル酸、Ｓ１００Ａ１２（ＥＮ−ＲＡＧＥ）、フェチュインＡ、クラスタリン、α１−アンチトリプシン、ａ２−マクログロブリン、セルピン１（ヒトプラスミノーゲン活性化因子インヒビター−１）、Ｃｏｘ−１、Ｈｓｐ２７、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ８０、Ｈｓｐ９０、レクチン型酸化型ＬＤＬ受容体１、ＣＤ１４、リポカリン２、ＩＴＩＨ４、ｓＦａｓＬ、Ｃｙｆｒａ２１−１、ＴＰＡ、パーフォリン、ＤｃＲ３、ＡＧＲＰ、クレアチンキナーゼ−ＭＢ、ヒト乳脂肪球１−２、ＮＴ−Ｐｒｏ−ＢＮＰ、神経特異的エノラーゼ、ＣＡＳＡ、ＮＢ／７０Ｋ、ＡＦＰ、アファミン、コラーゲン、プロヒビチン、ケラチン−６、ＰＡＲＣ、Ｂ７−Ｈ４、ＹＫ−Ｌ４０、ＡＦＰ−Ｌ３、ＤＣＰ、ＧＰＣ３、ＯＰＮ、ＧＰ７３、ＣＫ１９、ＭＤＫ、Ａ２、５−ＨＩＡＡ、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、ＣＡ２７．２９、ＣＡ７２−４、カルシトニン、ＣＧＡ、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ、ＢＡＰ、ＢＣＴ−ＡＢＬ融合タンパク質、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＰＳＡ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ＮＭＰ２２、ＰＡＩ−１、ｕＰＡ、フィブリンＤ−二量体、Ｓ１００、ＴＰＡ、サイログロブリン、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ４４、ＲＳ／ＤＪ−１、ｐ５３、アルファ−２−ＨＳ−糖タンパク質、リポフィリンＢ、ベータ−グロビン、ヘモペキシン、ＵＢＥ２Ｎ、ＰＳＭＢ６、ＰＰＰ１ＣＢ、ＣＰＴ２、ＣＯＰＡ、ＭＳＫ１／２、Ｐｒｏ−ＮＰＹ、セセルニン−１、ビンクリン、ＮＡＡＡ、ＰＴＫ７、ＴＦＧ、ＭＣＣＣ２、ＴＲＡＰ１、ＩＭＰＤＨ２、ＰＴＥＮ、ＰＯＳＴＮ、ＥＰＬＩＮ、ｅＩＦ４Ａ３、ＤＤＡＨ１、ＡＲＧ２、ＰＲＤＸ３＆４、Ｐ４ＨＢ、ＹＷＨＡＧ、エノイルＣｏＡヒドラーゼ、ＰＨＢ、ＴＵＢＢ、ＫＲＴ２、ＤＥＳ、ＨＳＰ７１、ＡＴＰ５Ｂ、ＣＫＢ、ＨＳＰＤ１、ＬＭＮＡ、ＥＺＨ２、ＡＭＡＣＲ、ＦＡＢＰ５、ＰＰＡ２、ＥＺＲ、ＳＬＰ２、ＳＭ２２、Ｂａｘ、Ｓｍａｃ／Ｄｉａｂｌｏホスホリル化Ｂｃｌ２、ＳＴＡＴ３及びＳｍａｃ／Ｄｉａｂｌｏ発現、ＰＨＢ、ＰＡＰ、ＡＭＡＣＲ、ＰＳＭＡ、ＦＫＢＰ４、ＰＲＤＸ４、ＫＲＴ７／８／１８、ＧＳＴＰ１、ＮＤＰＫ１、ＭＴＸ２、ＧＤＦ１５、ＰＣａ−２４、カベオリン−２、プロトロンビン、アンチトロンビン−ＩＩＩ、ハプトグロビン、血清アミロイドＡ−１タンパク質、ＺＡＧ、ＯＲＭ２、ＡＰＯＣ３、ＣＡＬＭＬ５、ＩＧＦＢＰ２、ＭＵＣ５ＡＣ、ＰＮＬＩＰ、ＰＺＰ、ＴＩＭＰ１、ＡＭＢＰ、インター−アルファ−トリプシンインヒビター重鎖Ｈ１、インター−アルファ−トリプシンインヒビター重鎖Ｈ２、インター−アルファ−トリプシンインヒビター重鎖Ｈ３、Ｖ型プロトンＡＴＰアーゼサブユニットＢ、腎臓アイソフォーム、肝細胞増殖因子様タンパク質、血清アミロイドＰ成分、アシルグリセロールキナーゼ、ロイシンリッチリピート含有タンパク質９、ベータ−２−糖タンパク質１、血漿プロテアーゼＣ１インヒビター、リポキシゲナーゼ相同ドメイン含有タンパク質１、プロトカドヘリンアルファ−１３。例えば、Ｋｕｐｐｕｓａｍｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｏｌｕｍｅ  ２４，Ｉｓｓｕｅ  ６，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２０１７，Ｐａｇｅｓ  １２１２−１２２１；Ｅｌｚｅｋ  ａｎｄ  Ｒｏｄｌａｎｄ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ．２０１５  Ｍａｒ；３４（１）：８３−９６；Ｎｏｅｌ  ａｎｄ  Ｌｏｋｓｈｉｎ，Ｆｕｔｕｒｅ  Ｏｎｃｏｌ．２０１２  Ｊａｎ；８（１）：５５−７１；Ｔｓｕｃｈｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２０１５  Ｏｃｔ  ７；２１（３７）：１０５７３−１０５８３；Ｌｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｒｋ  Ｃａｎｃｅｒ．２０１７；９：１−９；Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１７  Ｊｕｎ  ２７；８（２６）：４２７６１−４２７７１；Ｓａｒａｓｗａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｄ．２０１７  Ｊｕｌ；６（７）：１７３８−１７５１；Ｚａｍａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒｓ（Ｂａｓｅｌ）．２０１７  Ｎｏｖ；９（１１）：１５５；Ｔａｎａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１７  Ｍａｒ  １４；８（１１）：１８４９７−１８５１２を参照、これらはそれぞれ、そのまま全体が本明細書中参照により援用される。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、１種または複数の追加のバイオマーカークラスとして、核酸損傷または変異（例えば、１つまたは複数の方法において有用であると本明細書中記載される様々な遺伝子バイオマーカーとは異なる核酸損傷または変異）が挙げられる。いくつかの実施形態では、生体試料が、がんを示す核酸損傷または変異を１種または複数含有する場合に、対象は、がんを有するまたは発症するリスクが高いと判定される。いくつかの実施形態では、生体試料が、がんを示す核酸損傷または変異を１種または複数含有する場合に、対象は、がんを有すると判定される。核酸損傷または変異の非限定的な例として、コピー数変化、ＤＮＡメチル化変化、及び／または他の核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、ｍｔＤＮＡ、テロメアＤＮＡ、転座、及びゲノム再編成）が挙げられる。転座及びゲノム再編成は、様々ながん（例えば、前立腺、神経膠腫、肺癌、非小細胞肺癌、メラノーマ、及び甲状腺癌）と相関するとされてきており、長年にわたりバイオマーカーとして使用されてきた（例えば、Ｄｅｍｅｕｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｓｕｒｇ．，３８：１２９６−３０５；Ｈｏｇｅｎｂｉｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，１１３：Ｅ３６４９−５６；Ｇａｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，６：ｅ１６３３２；Ｏｇｉｗａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２７：４７８８−９７；米国特許第９，７４５，６３２号；及び米国特許第６，５７６，４２０号）。また、コピー数の変化も、様々ながんのバイオマーカーとして使用されてきており、そのようながんとして、特に制限なく、頭頚部扁平上皮癌、リンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫）、及び結腸直腸癌が挙げられる（Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７，Ｔｕｍｏｕｒ  Ｂｉｏｌ，３９：１０１０４２８３１７７４０２９６；Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７，Ｔｕｍｏｕｒ  Ｂｉｏｌ．，３９：１０１０４２８３１７７３６６４３；Ｈｅｎｒｉｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．，１４：４１９−２２；及び米国特許第９，８１６，１３９号）。ＤＮＡメチル化及びＤＮＡメチル化の変化（例えば、低メチル化、高メチル化）も、がんのバイオマーカーとして使用されている。例えば、低メチル化は、肝細胞癌（例えば、Ｈｅｎｒｉｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．，１４：４１９−２２を参照）、食道癌発生（例えば、Ａｌｖａｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ．，７：ｅ１００１３５６を参照）、ならびに胃癌及び肝臓癌（例えば、米国特許第８，７２８，７３２号を参照）に関連するとされてきており、高メチル化は、結腸直腸癌に関連するとされてきた（例えば、米国特許第９，９５７，５７０号を参照）。ゲノム規模でのメチル化の変化に加えて、特定遺伝子内での特異的メチル化変化は、特定のがんを示すものとなり得る（例えば、米国特許第８，１５０，６２６号を参照）。Ｌｉら（２０１２，Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．，２２：３８４−９４）は、多数のがん（例えば、乳癌、膀胱癌、胃癌、肺癌、前立腺癌、頭頚部扁平細胞癌、及び上咽頭癌）と異常なメチル化の間の関連について総説を提供している。これに加えてまたはこれに代えて、さらなる種類の核酸または核酸の特徴が、様々ながんと関連するとされてきた。そのような核酸または核酸の特徴の非限定的な例として、様々なマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の有無が挙げられ、この有無は、結腸癌、前立腺癌、結腸直腸癌、及び卵巣癌の診断に使用されてきている（例えば、Ｄ’Ｓｏｕｚａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８，ＰＬｏｓ  Ｏｎｅ，１３：ｅ０１９４２６８；Ｆｕｋａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７，Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．，１０８：８８６−９６；Ｇｉｒａｌｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１７６８：４５９−７４；米国特許第８，３４３，７１８号；同第９，４１０，９５６号；及び同第９，０７４，２０６号を参照）。ｍｉＲ−２２とがんの特異的関連性の総説については、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．，５０：３４５−５５）を参照；長鎖非翻訳ＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）の異常発現も、前立腺癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、メラノーマ、非小細胞肺癌、胃癌、子宮内膜癌、及び肝細胞癌などのがんのバイオマーカーとして使用されてきている（例えば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，８：５８５７７０８６；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ，１７：１１０；Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８，Ｅｕｒ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，２２：４８１２−９；Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８，Ｅｕｒ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，２２：９９３−１００２；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８，Ｅｕｒ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，２２：４８２０−７；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８，Ｅｕｒ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，２２：２３０４−９；Ｘｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８，ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ，３３：５７−６７；及び米国特許第９，４１０，２０６号を参照）；環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）の有無は、肺癌、乳癌、胃癌、結腸直腸癌、及び肝臓癌（例えば、Ｇｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８，Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．，１１：９８）、ならびにメラノーマ（例えば、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８，Ｏｎｃｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１６：１２１９−２５）のバイオマーカーとして使用されてきている；テロメアＤＮＡの変化（例えば、長さまたはヘテロ接合性の変化）またはセントロメアＤＮＡの変化（例えば、セントロメア遺伝子の発現の変化）も、がんと関連するとされてきた（例えば、前立腺、乳房、肺、リンパ腫、及びユーイング肉腫）（例えば、Ｂａｒｅｔｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５４：４４７２−８０；Ｌｉｓｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８０：８２１−６；Ｐｒｏｃｔｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１７９２：２６０−７４；及びＳｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１３９：８９９−９０７を参照）；ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の様々な変異（例えば、欠失）、��編成、及び／またはコピー数変化は、様々ながん（例えば、前立腺癌、メラノーマ、乳癌、肺癌、及び結腸直腸癌）について予後及び診断に使用されてきた。例えば、Ｍａｒａｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｍａｒｋ．，１５：７６３−７３；Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ，１０：６２−６８；Ｈｏｓｇｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎ．，３１：８４７−９；Ｔｈｙａｇａｒａｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ＆  Ｐｒｅｖ．，２１：１５７４−８１；及び米国特許第９，７４５，６３２号を参照；メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の異常な存在、不在、または量も、様々ながんとの相関が見つかってきており、そのようながんとして、特に制限なく、乳癌、ウィルムス腫瘍、及び子宮頸癌が挙げられる（例えば、Ｇｕｅｔｓｃｈｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌｙ．Ｃｈｅｍ．，４０４：３９９−４０６；Ｓｃｈｗｉｅｎｂａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６０：１５２１−５；及びＮｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｉｔｏｕｒｉｎ  Ｍｅｄ．，７３：５４−８を参照）。これらの引用は、それぞれ、そのまま全体が本明細書中参照により援用される。
【０１１９】
本文書は、がんを有する、または有することが疑われる哺乳類（例えば、ヒト）を評価及び／または治療するための方法及び物質を提供する。いくつかの実施形態では、本文書は、哺乳類を、がんを有するとして同定するための方法及び物質を提供する。例えば、哺乳類から得られた試料（例えば、血液試料）を評価して、少なくとも部分的に、試料中の、１つまたは複数の第１のバイオマーカー（例えば、遺伝子バイオマーカー）の有無及び／または１つまたは複数の第２バイオマーカー（例えば、ペプチドバイオマーカー）のレベル上昇に基づき、その哺乳類ががんを有するかどうかを判定することができる。本明細書中記載されるバイオマーカーパネル（例えば、１つまたは複数のバイオマーカーのセット）は、２つ以上（例えば、３つ、５つ、９つ、１０、２５、１００、２５０、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、またはそれ以上）のバイオマーカー（例えば、がんに関連したバイオマーカー）の存在を含むことができる。いくつかの実施形態では、バイオマーカーパネルは、約２，０１１のバイオマーカー（例えば、約２，００１の遺伝子バイオマーカー及び約１０のペプチドバイオマーカー）を含むことができる。いくつかの実施形態では、本明細書中記載される方法及び物質は、哺乳類におけるがんの位置（例えば、解剖学的部位）を同定することも含むことができる。例えば、哺乳類から得られた試料（例えば、血液試料）を評価して、少なくとも部分的に、１つまたは複数の第１のバイオマーカー（例えば、遺伝子バイオマーカー）の有無及び／または１つまたは複数の第２バイオマーカー（例えば、ペプチドバイオマーカー）のレベル上昇に基づき、その哺乳類におけるがんの位置を特定することができる。いくつかの実施形態では、本明細書中記載される方法及び物質は、がんを有する哺乳類を治療すること（例えば、１種または複数のがん治療を実施して哺乳類を治療すること）も含むことができる。例えば、哺乳類から得られた試料（例えば、血液試料）を評価して、少なくとも部分的に、１つまたは複数の第１のバイオマーカー（例えば、遺伝子バイオマーカー）の有無及び／または１つまたは複数の第２バイオマーカー（例えば、ペプチドバイオマーカー）のレベル上昇に基づき、その哺乳類ががんを有するかどうかを判定し、１種または複数のがん治療を実施して哺乳類を治療する（例えば、がんの重篤度を低下させる、がんの症候を低減させる、及び／または哺乳類内に存在するがん細胞数を減少させる）ことができる。
【０１２０】
「上昇したレベル」という用語は、ペプチドバイオマーカーのレベルに関して本明細書中使用される場合、１種または複数の健康な哺乳類由来の試料（例えば、参照試料）で典型的に観察されるペプチドの参照レベルより高い任意のレベルを示す。いくつかの実施形態では、参照試料は、がんを有さない哺乳類から得られた試料が可能である。例えば、結腸直腸癌に関連したペプチドバイオマーカーの場合、参照試料は、結腸直腸癌を有さない対象から得られた試料が可能である。いくつかの実施形態では、参照試料は、ペプチドバイオマーカーのレベル上昇が観察された同一対象から得られた試料が可能であるが、ただしこの参照試料は、がんの発症前に得られたものである。いくつかの実施形態では、同一哺乳類から得られたそのような参照試料は、参照試料として将来使用するために凍結されているかまたそれ以外で保存されている。いくつかの実施形態では、参照試料が検出不能なレベルのペプチドバイオマーカーを有する場合、上昇したレベルは、ペプチドバイオマーカーの任意の検出可能なレベルが可能である。比較可能な試料のレベルは、その特定のレベルが上昇したレベルであるか否かを判定するのに使用することが理解される。
【０１２１】
任意の適切な哺乳類を、本明細書中記載されるとおり、評価及び／または治療することができる。哺乳類として、がんを有する哺乳類が可能である。哺乳類として、がんを有することが疑われる哺乳類が可能である。いくつかの実施形態では、ヒトまたは他の霊長類、例えばサルを、本明細書中記載されるとおり、１つまたは複数の第１のバイオマーカー（例えば、遺伝子バイオマーカー）の有無及び／または１つまたは複数の第２バイオマーカー（例えば、ペプチドバイオマーカー）のレベル上昇について評価することができる。いくつかの実施形態では、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、マウス、及びラットを、本明細書中記載されるとおり、１つまたは複数の第１のバイオマーカー（例えば、遺伝子バイオマーカー）の有無及び／または１つまたは複数の第２バイオマーカー（例えば、ペプチドバイオマーカー）のレベル上昇について評価することができる。例えば、ヒトを、本明細書中記載されるとおり、１つまたは複数の第１のバイオマーカー（例えば、遺伝子バイオマーカー）の有無及び／または１つまたは複数の第２バイオマーカー（例えば、ペプチドバイオマーカー）のレベル上昇について評価することができ、任意選択で、本明細書中記載されるとり、１種または複数のがん治療で治療することができる。
【０１２２】
哺乳類由来の任意の適切な試料を、本明細書中記載されるとおり評価することができる（例えば、１つまたは複数の第１のバイオマーカー（例えば、遺伝子バイオマーカー）の有無及び／または１つまたは複数の第２バイオマーカー（例えば、ペプチドバイオマーカー）のレベル上昇について評価する）。いくつかの実施形態では、試料は、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ）を含むことができる。いくつかの実施形態では、試料は、無細胞ＤＮＡ（例えば、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ））を含むことができる。いくつかの実施形態では、試料は、ペプチドを含むことができる。例えば、試料は、循環ペプチド（例えば、がん関連ペプチド）を含むことができる。本明細書中使用される場合、「循環ペプチド」とは、哺乳類の体内の任意の閉鎖系（例えば、循環系）で検出可能なペプチドである。いくつかの実施形態では、試料は、流体試料（例えば、リキッドバイオプシー）が可能である。ＤＮＡ及び／またはペプチドを含む可能性がある試料の例として、特に制限なく、血液（例えば、全血、血清、または血漿）、羊膜、組織、尿、脳脊髄液、唾液、痰、気管支肺胞洗浄検査、胆汁、リンパ液、嚢胞液、糞便、腹水、パップスメア、母乳、及び呼気凝縮液が挙げられる。例えば、血漿試料を、本明細書中記載されるとおり、１つまたは複数の第１のバイオマーカー（例えば、遺伝子バイオマーカー）の有無及び／または１つまたは複数の第２バイオマーカー（例えば、ペプチドバイオマーカー）のレベル上昇について評価することができる。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、試料を、処理することができる（例えば、試料からＤＮＡ及び／またはペプチドを単離及び／または精製するため）。例えば、ＤＮＡ単離及び／または精製は、細胞溶解（例えば、洗浄剤及び／または界面活性剤を用いる）、タンパク質除去（例えば、プロテアーゼを用いる）、及び／またはＲＮＡ除去（例えば、ＲＮＡ分解酵素を用いる）を含むことができる。別の例として、ペプチド単離及び／または精製は、細胞溶解（例えば、洗浄剤及び／または界面活性剤を用いる）、ＤＮＡ除去（例えば、ＤＮＡアーゼを用いる）、及び／またはＲＮＡ除去（例えば、ＲＮＡアーゼを用いる）を含むことができる。
【０１２４】
任意の適切なバイオマーカーを、本明細書中記載されるとおり、使用することができる（例えば、少なくとも部分的に、試料中の１つまたは複数の第１のバイオマーカー（例えば、遺伝子バイオマーカー）の有無及び／または１つまたは複数の第２バイオマーカー（例えば、ペプチドバイオマーカー）のレベル上昇に基づいて、哺乳類ががんを有するかどうかを判定するために）。バイオマーカーの例として、特に制限なく、遺伝子バイオマーカー、ペプチドバイオマーカー、代謝産物、ｍＲＮＡ転写物、ｍｉＲＮＡ、メチル化パターン（例えば、ＤＮＡメチル化パターン）、タンパク質（例えば、抗体）、及びクロマチンパターンが挙げられる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を用いて、哺乳類を、がんを有すると同定することができる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のペプチドバイオマーカーのレベル上昇を用いて、哺乳類を、がんを有すると同定することができる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在及び１つまたは複数のペプチドバイオマーカーのレベル上昇を併用して、哺乳類を、がんを有すると同定することができる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在及び１つまたは複数のペプチドバイオマーカーのレベル上昇を併用して検出することは、遺伝子バイオマーカーまたはペプチドバイオマーカー一方を単独で検出することと比べた場合に検出の特異性及び／または感度を上昇させる可能性がある。
【０１２５】
遺伝子バイオマーカーとして、任意の適切な遺伝子バイオマーカーが可能である。例えば、遺伝子バイオマーカーは、がんに関連した遺伝子バイオマーカーが可能である。遺伝子バイオマーカーは、遺伝子における修飾を含むことができる。修飾の例として、特に制限なく、一塩基置換、挿入、欠失、挿入欠失、転座、及びコピー数多型が挙げられる。遺伝子バイオマーカーは、任意の適切な遺伝子中にあることができる。いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカーは、腫瘍抑制遺伝子における修飾（例えば、不活化修飾）を含むことができる。いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカーは、がん遺伝子における修飾（例えば、活性化修飾）を含むことができる。遺伝子バイオマーカーを含むことができる遺伝子の例として、特に制限なく、ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＧＮＡＳ、ＪＵＮ、ＡＢＣＡ７、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＪＵＢＡ、ＡＫＴ１、ＡＬＢ、ＡＬＤＯＢ、ＡＬＫ、ＡＭＢＲＡ１、ＡＭＥＲ１、ＡＭＯＴ、ＡＮＫＲＤ４６、ＡＰＣ、ＡＲ、ＡＲＨＧＡＰ３５、ＡＲＩＤ１Ａ、ＡＲＩＤ１Ｂ、ＡＲＩＤ２、ＡＲＩＤ４Ｂ、ＡＲＬ１５、ＡＲＭＣＸ１、ＡＳＸＬ１、ＡＳＸＬ２、ＡＴＡＤ２、ＡＴＧ１４、ＡＴＧ５、ＡＴＭ、ＡＴＲＸ、ＡＴＸＮ２、ＡＸＩＮ１、Ｂ２Ｍ、ＢＡＰ１、ＢＣＬ９、ＢＣＬＡＦ１、ＢＣＯＲ、ＢＩＲＣ６、ＢＩＲＣ８、ＢＬＶＲＡ、ＢＲＡＦ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＢＲＤ７、ＢＲＥ、ＢＲＷＤ３、ＢＴＢＤ７、ＢＴＲＣ、Ｃ１１ｏｒｆ７０、Ｃ１２ｏｒｆ５７、Ｃ２ＣＤ５、Ｃ３ｏｒｆ６２、Ｃ８ｏｒｆ３４、ＣＡＭＫＶ、ＣＡＰＧ、ＣＡＳＰ８、ＣＢＦＢ、ＣＢＸ４、ＣＣＡＲ１、ＣＣＤＣ１１７、ＣＣＤＣ８８Ａ、ＣＣＭ２、ＣＣＮＣ、ＣＣＮＤ１、ＣＣＲ３、ＣＤ１Ｄ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤＣ７３、ＣＤＣＰ１、ＣＤＨ１、ＣＤＫ１２、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＥＢＰＡ、ＣＥＬＦ１、ＣＥＮＰＢ、ＣＥＰ１２８、ＣＨＤ２、ＣＨＤ４、ＣＨＤ８、ＣＨＥＫ２、ＣＨＲＤＬ１、ＣＨＵＫ、ＣＩＣ、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＣＭＴＲ２、ＣＮＮ２、ＣＮＯＴ１、ＣＮＯＴ４、ＣＯＬ１１Ａ１、ＣＯＰＳ４、ＣＯＸ７Ｂ２、ＣＲＥＢＢＰ、ＣＳＤＥ１、ＣＳＭＤ３、ＣＴＣＦ、ＣＴＤＮＥＰ１、ＣＴＮＮＢ１、ＣＵＬ１、ＣＵＬ２、ＣＹＢ５Ｂ、ＤＡＣＨ１、ＤＣＨＳ１、ＤＣＵＮ１Ｄ１、ＤＤＸ３Ｘ、ＤＤＸ５、ＤＨＸ１５、ＤＨＸ１６、ＤＩＣＥＲ１、ＤＩＲＣ２、ＤＩＳ３、ＤＩＸＤＣ１、ＤＫＫ２、ＤＮＡＪＢ５、ＤＮＥＲ、ＤＮＭ１Ｌ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＥＥＤ、ＥＧＦＲ、ＥＩＦ１ＡＸ、ＥＩＦ２ＡＫ３、ＥＩＦ２Ｓ２、ＥＩＦ４Ａ１、ＥＩＦ４Ａ２、ＥＬＦ３、ＥＭＧ１、ＥＭＲ３、ＥＰ３００、ＥＰＢ４１Ｌ４Ａ、ＥＰＨＡ２、ＥＰＳ８、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＥＲＲＦＩ１、ＥＸＯ５、ＥＺＨ２、Ｆ５、ＦＡＮＣＭ、ＦＡＴ１、ＦＢＮ２、ＦＢＸＷ７、ＦＣＥＲ１Ｇ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＬＴ３、ＦＮ１、ＦＯＸＡ１、ＦＵＢＰ１、ＦＵＳ、ＧＡＬＮＴＬ５、ＧＡＴＡ３、ＧＧＣＴ、ＧＩＧＹＦ２、ＧＫ２、ＧＬＩＰＲ２、ＧＮＰＴＡＢ、ＧＮＲＨＲ、ＧＯＬＭ１、ＧＯＴ２、ＧＰＳ２、ＧＰＸ７、ＧＲＫ１、ＧＳＥ１、ＧＺＭＡ、ＨＤＡＣ１、ＨＥＲＣ１、ＨＥＲＣ４、ＨＧＦ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＯ、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＭＣＮ１、ＨＮＲＮＰＡ１、ＨＲＡＳ、ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＩＤ３、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＩＦＮＧＲ２、ＩＦＴ８８、ＩＫＺＦ２、ＩＮＯ８０Ｃ、ＩＮＰＰ４Ａ、ＩＮＰＰＬ１、ＩＷＳ１、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＫＡＮＳＬ１、ＫＡＴ８、ＫＡＴＮＡＬ１、ＫＢＴＢＤ７、ＫＣＮＭＢ４、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ６Ａ、ＫＥＡＰ１、ＫＩＡＡ１４６７、ＫＬＦ４、ＫＭＴ２Ａ、ＫＭＴ２Ｂ、ＫＭＴ２Ｃ、ＫＭＴ２Ｄ、ＫＭＴ２Ｅ、ＫＲＡＳ、ＫＲＴ１５、ＬＡＭＴＯＲ１、ＬＡＲＰ４Ｂ、ＬＰＡＲ２、ＬＹＮ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＭＡＰ２Ｋ４、ＭＡＰ３Ｋ１、ＭＡＰ４Ｋ３、ＭＡＰＫ１、ＭＡＸ、ＭＢ２１Ｄ２、ＭＢＤ１、ＭＢＤ６、ＭＢＮＬ１、ＭＢＮＬ３、ＭＥＤ１２、ＭＥＤ２３、ＭＥＮ１、ＭＧＡ、ＭＫＬＮ１、ＭＬＬＴ４、ＭＯＡＰ１、ＭＯＲＣ４、ＭＳ４Ａ１、ＭＳＩ１、ＭＴＯＲ、ＭＹＣ、ＭＹＣＮ、ＭＹＤ８８、ＭＹＬ６、ＭＹＯ１Ｂ、ＭＹＯ６、ＮＡＡ１５、ＮＡＡ２５、ＮＡＰ１Ｌ２、ＮＡＰ１Ｌ４、ＮＣＯＡ２、ＮＣＯＲ１、ＮＥＫ９、ＮＦ１、ＮＦ２、ＮＦＥ２Ｌ２、ＮＦＥ２Ｌ３、ＮＩＰＢＬ、ＮＩＴ１、ＮＫＸ３−１、ＮＭＥ４、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＰＭ１、ＮＲＡＳ、ＮＳＤ１、ＰＢＲＭ１、ＰＣＢＰ１、ＰＣＯＬＣＥ２、ＰＨＦ６、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３ＣＢ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＯＬＡ２、ＰＯＴ１、ＰＰＡＲＤ、ＰＰＭ１Ｄ、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＰＰＰ６Ｃ、ＰＲＫＡＣＡ、ＰＲＫＣＩ、ＰＲＰＦ４０Ａ、ＰＳＩＰ１、ＰＴＥＮ、ＰＴＨ２、ＰＴＭＳ、ＰＴＮ、ＰＴＰＮ１１、ＲＡＢ１８、ＲＡＣ１、ＲＡＦ１、ＲＡＮＢＰ３Ｌ、ＲＡＰＧＥＦ６、ＲＡＳＡ１、ＲＢ１、ＲＢＢＰ６、ＲＢＭ１０、ＲＢＭ２６、ＲＣ３Ｈ２、ＲＥＬ、ＲＥＲＥ、ＲＦＣ４、ＲＨＥＢ、ＲＨＯＡ、ＲＩＭＳ２、ＲＩＴ１、ＲＮＦ１１１、ＲＮＦ４３、ＲＰＬ１１、ＲＰＬ５、ＲＱＣＤ１、ＲＲＡＳ２、ＲＵＮＸ１、ＲＸＲＡ、ＳＡＲＭ１、ＳＣＡＦ１１、ＳＥＣ２２Ａ、ＳＥＮＰ３、ＳＥＮＰ８、ＳＥＴＤ１Ｂ、ＳＥＴＤ２、ＳＦ３Ａ３、ＳＦ３Ｂ１、ＳＦＰＱ、ＳＩＮ３Ａ、ＳＫＡＰ２、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＲＣＡ４、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＭＡＲＣＣ２、ＳＮＣＢ、ＳＯＳ１、ＳＯＸ４、ＳＯＸ９、ＳＰ３、ＳＰＥＮ、ＳＰＯＰ、ＳＰＳＢ２、ＳＴＡＧ２、ＳＴＫ１１、ＳＴＫ３１、ＳＵＦＵ、ＴＡＦ１Ａ、ＴＡＲＤＢＰ、ＴＡＳ２Ｒ３０、ＴＢＬ１ＸＲ１、ＴＢＸ３、ＴＣＦ１２、ＴＣＦ７Ｌ２、ＴＥＴ２、ＴＥＸ１１、ＴＦＤＰ２、ＴＧＦＢＲ２、ＴＨＲＡＰ３、ＴＭ９ＳＦ１、ＴＭＣＯ２、ＴＭＥＤ１０、ＴＭＥＭ１０７、ＴＭＥＭ３０Ａ、ＴＭＰＯ、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＮＲＣ６Ｂ、ＴＰ５３、ＴＰ５３ＢＰ１、ＴＲＡＦ３、ＴＲＩＭ８、ＴＲＩＰ１２、ＴＳＣ１、ＴＴＫ、ＴＴＲ、ＴＵＢＡ３Ｃ、Ｕ２ＡＦ１、ＵＢＥ２Ｄ３、ＵＢＲ５、ＵＮＣ１３Ｃ、ＵＮＫＬ、ＵＰＰ１、ＵＳＯ１、ＵＳＰ２８、ＵＳＰ９Ｘ、ＶＨＬ、ＶＮ１Ｒ２、ＶＰＳ３３Ｂ、ＷＡＣ、ＷＤＲ３３、ＷＤＲ４７、ＷＴ１、ＷＷＰ１、ＸＰＯ１、ＹＯＤ１、ＺＣ３Ｈ１３、ＺＤＨＨＣ４、ＺＦＨＸ３、ＺＦＰ３６Ｌ１、ＺＦＰ３６Ｌ２、ＺＧＲＦ１、ＺＭＹＭ３、ＺＭＹＭ４、ＺＮＦ２３４、ＺＮＦ２６８、ＺＮＦ２９２、ＺＮＦ３１８、ＺＮＦ３４５、ＺＮＦ６００、ＺＮＦ７５０、及びＺＮＦ８００を挙げることができる。例えば、遺伝子バイオマーカーは、ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳの１つまたは複数中に存在することができる。いくつかの実施形態では、本明細書中記載される方法及び物質は、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子中の１つまたは複数の修飾）を検出することを含むことができる。例えば、本明細書中記載される方法及び物質は、実施例１に記載されるタンパク質のいずれかをコードする１つまたは複数の遺伝子における変異、あるいは表３または表５に記載される遺伝子の１つまたは複数における変異を検出することを含むことができる。いくつかの実施形態では、本明細書中記載される方法及び物質は、表３または表５に記載される修飾の１つまたは複数を検出することを含むことができる。いくつかの実施形態では、本明細書中記載される方法及び物質は、約１６の遺伝子における約２，００１の修飾の有無を検出することを含むことができる。例えば、本明細書中記載される方法及び物質は、ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及びＧＮＡＳの１つまたは複数における約２，００１の修飾の有無を検出することを含むことができる。いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカーは、どこかで記載されたとおりであることが可能である（例えば、Ｂｅｔｔｅｇｏｗｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６：２２４ｒａ２２４；Ｈａｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖ  ４：６５０−６６１；Ｄａｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６８：１１９９−１２０９；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ７：２９３ｒａ１０４；Ｆｏｒｓｈｅｗ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４：１３６ｒａ１６８；Ａｂｂｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７  Ｎａｔｕｒｅ  ５４５：４４６−４５１；Ｂｅｄｄｏｗｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７  Ｂｒｅａｓｔ  ３４（Ｓｕｐｐｌ  １）：Ｓ３１−Ｓ３５；及びＰｈａｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ９を参照）。
【０１２６】
任意の適切な方法を使用して、本明細書中記載されるとおり、１つまたは複数のバイオマーカー（例えば、遺伝子バイオマーカー）の有無を検出することができる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーは、それぞれ別個に検出することができる（例えば、シングルプレックスペプチドツールを介して）。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーは、同時に検出することができる（例えば、「チップ」またはマイクロアレイなどのマルチプレックスＤＮＡツールを介して）。遺伝子バイオマーカーの検出方法の例として、特に制限なく、配列決定法（例えば、マルチプレックスＰＣＲ系配列決定などのＰＣＲ系配列決定）、ＤＮＡハイブリダイゼーション法（例えば、サザンブロッティング法）、制限酵素消化法、ＰＣＲ系マルチプレックス法、デジタルＰＣＲ法、液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）法、ＰＣＲ系シングルプレックスＰＣＲ法、サンガー配列決定法、次世代配列決定法（例えば、単分子リアルタイム配列決定、ナノポア配列決定、及びポロニー配列決定）、定量ＰＣＲ法、ライゲーション法、及びマイクロアレイ法が挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書中記載される方法及び物質は、マルチプレックスＰＣＲ系配列決定を含むことができる。例えば、本明細書中記載される方法及び物質は、実施例１に記載されるとおりにマルチプレックスＰＣＲ系配列決定を含むことができる。本明細書中提供される方法の実施形態のいくつかにおいて、対象から得られた試料中に存在する１つまたは複数の変異の存在は、超並列シークエンシング装置の感度を上昇させることが可能な方法を、エラー削減手法と合わせて行うことにより、検出される。例えば、そのような技法は、５，０００〜１，０００，０００の野生型テンプレートの中の１つの変異テンプレートの範囲で希な変異アレルを検出することを可能にし得る。いくつかの実施形態では、対象から得られた試料中に存在する１つまたは複数の変異の存在は、ＤＮＡ（例えば、試料中の細胞から得られたＤＮＡまたは無細胞ＤＮＡ）を増幅してファミリーの各メンバーが無細胞ＤＮＡの単一テンプレート分子に由来するアンプリコンのファミリーを形成することにより検出され、この場合、ファミリーの各メンバーは、共通するオリゴヌクレオチドバーコードを目印として持ち、各ファミリーは、異なるオリゴヌクレオチドバーコードを目印として持つ。例えば、対象から得られた試料中に存在する１つまたは複数の変異の存在は、各テンプレート分子に識別子（ＵＩＤ）を割り当て、それぞれ独特のタグを付けられたテンプレート分子を増幅してＵＩＤ−ファミリーを作製し、増幅産物の配列決定を重複して行うことにより検出可能である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドバーコードは、複数のオリゴヌクレオチドバーコードをまとめて含有するプライマー集団を用いる増幅ステップにより、テンプレート分子に導入される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドバーコードは、テンプレート分子に内在するものであり、ＤＮＡ合成プライミング部位を含むアダプターを、オリゴヌクレオチドバーコードに隣接するテンプレート分子末端に結合させる。例えば、Ｋｉｎｄｅ  ���ｔ  ａｌ．，２０１１  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０８：９５３０−９５３５を参照。
【０１２７】
本明細書中提供される方法の実施形態のいくつかにおいて、対象から得られた試料中に存在する１つまたは複数の変異の存在は、配列決定技術（例えば、次世代配列決定技術）を用いて検出される。様々な配列決定技術が、当該分野で既知である。例えば、無細胞ＤＮＡ中の循環腫瘍ＤＮＡの検出及び特性決定のための方法が、いずれかの場所で記載されている可能性がある（例えば、Ｈａｂｅｒ  ａｎｄ  Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ，２０１４  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖ．，４：６５０−６１を参照）。そのような技法の非限定的な例として、ＳａｆｅＳｅｑｓ（例えば、Ｋｉｎｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ；１０８：９５３０−５を参照）、ＯｎＴａｒｇｅｔ（例えば、Ｆｏｒｓｈｅｗ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２  Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ；４：１３６ｒａ６８を参照）、及びＴａｍＳｅｑ（例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，７：ｅ３１５９７を参照）が挙げられる。いくつかの実施形態では、対象から得られた試料中に存在する１つまたは複数の変異の存在は、液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を用いて検出され、この方法は、変異検出に対して非常に高感度であることが知られている。いくつかの実施形態では、対象から得られた試料中に存在する１つまたは複数の変異の存在は、他の配列決定技術を用いて検出され、そのような技術として、チェーンターミネーション技術、ショットガン技術、合成によるシークエンシング法、マイクロ流体技術を利用する方法、他の捕捉技術、または試料中の少量のＤＮＡ（例えば、無細胞ＤＮＡ試料中のｃｔＤＮＡ）を検出するのに有用である当該分野で既知のその他の配列決定技法のいずれかが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、対象から得られた試料中に存在する１つまたは複数の変異の存在は、アレイに基づく方法を用いて検出される。例えば、無細胞ＤＮＡ中の遺伝子変異（例えば、１つまたは複数の遺伝子変異）を検出するステップは、ＤＮＡマイクロアレイを用いて行われる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡマイクロアレイは、複数のがん細胞変異のうち１つまたは複数を検出することができる。いくつかの実施形態では、無細胞ＤＮＡは、遺伝子変異の検出の前に増幅される。本明細書中記載される方法のいずれかで使用可能なアレイに基づく方法の非限定的な例として、以下が挙げられる：相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）マイクロアレイ（例えば、Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１２  Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏａｌｌｉｅｄ  Ｓｃｉ．４（１）：２１−２６；Ｌａｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．２００９  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５１２：７１−９８；Ｍａｃｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．２００３  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２：２６８０−２６８８；Ａｌｉｚａｄｅｈ  ｅｔ  ａｌ．１９９６  Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１４：４５７−４６０を参照）、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ（例えば、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．２００６  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２７（３）：３９２−４０４；Ｌｏｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．２００９  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ４（７）：ｅ６２２９を参照）、細菌性人工染色体（ＢＡＣ）クローンチップ（例えば、Ｃｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００４  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１４（１）：１８８−１９６；Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．２００５  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１５（１２）：１８３１−１８３７を参照）、一塩基多型（ＳＮＰ）マイクロアレイ（例えば、Ｍａｏ  ｅｔ  ａｌ．２００７  Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ８（４）：２１９−２２８；Ｊａｓｍｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１２  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ７（２）：ｅ３１９６８を参照）、マイクロアレイベースの比較ゲノムハイブリダイゼーションアレイ（アレイＣＧＨ）（例えば、Ｂｅｅｒｓ  ａｎｄ  Ｎｅｄｅｒｌｏｆ，２００６  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．８（３）：２１０；Ｐｉｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．２００５  Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３７：Ｓ１１−Ｓ１７；Ｍｉｃｈｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．２００７  Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｄ．９：５７４−５８４を参照）、分子反転プローブ（ＭＩＰ）アッセイ（例えば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１２  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅｔ  ２０５（７−８）：３４１−５５；Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１０  ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １１：７１２を参照）。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡマイクロアレイは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイ（例えば、Ｉｒｉｚａｒｒｙ  ２００３  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３１：ｅ１５；Ｄａｌｍａ−Ｗｅｉｓｚｈａｕｓｚ  ｅｔ  ａｌ．２００６  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．４１０：３−２８を参照）、ＮｉｍｂｌｅＧｅｎマイクロアレイ（例えば、Ｗｅｉ  ｅｔ  ａｌ．２００８  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３６（９）：２９２６−２９３８；Ａｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．２００７  Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４：９０３−９０５を参照）、Ａｇｉｌｅｎｔマイクロアレイ（例えば、Ｈｕｇｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．２００１  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔ���ｃｈｎｏｌ．１９（４）：３４２−３４７を参照）、またはＢｅａｄＡｒｒａｙアレイ（例えば、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．２０１７  Ｂｉｏｓｅｎｓ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ  ９２：５９６−６０１を参照）である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドマイクロアレイは、ＤＮＡタイリングアレイ（例えば、Ｍｏｃｋｌｅｒ  ａｎｄ  Ｅｃｋｅｒ，２００５  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ８５（１）：１−１５；Ｂｅｒｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．２００６  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  １６（２）：２７１−２８１を参照）である。他の適切なアレイに基づく方法は、当該分野で既知である。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、マルチプレックスＰＣＲ系配列決定は、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの検出感度の改善をもたらす複数のアンプリコンを含むことができる。例えば、マルチプレックスＰＣＲ系配列決定は、約６０のアンプリコン（例えば、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、または７０のアンプリコン）を含むことができる。いくつかの実施形態では、マルチプレックスＰＣＲ系配列決定は、６１のアンプリコンを含むことができる。マルチプレックスＰＣＲ系配列決定を用いて生成されたアンプリコンは、長さが約１５ｂｐ〜約１０００ｂｐ（例えば、約２５ｂｐ〜約１０００ｂｐ、約３５ｂｐ〜約１０００ｂｐ、約５０ｂｐ〜約１０００ｂｐ、約１００ｂｐ〜約１０００ｂｐ、約２５０ｂｐ〜約１０００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約１０００ｂｐ、約７５０ｂｐ〜約１０００ｂｐ、約１５ｂｐ〜約７５０ｂｐ、約１５ｂｐ〜約５００ｂｐ、約１５ｂｐ〜約３００ｂｐ、約１５ｂｐ〜約２００ｂｐ、約１５ｂｐ〜約１００ｂｐ、約１５ｂｐ〜約８０ｂｐ、約１５ｂｐ〜約７５ｂｐ、約１５ｂｐ〜約５０ｂｐ、約１５ｂｐ〜約４０ｂｐ、約１５ｂｐ〜約３０ｂｐ、約１５ｂｐ〜約２０ｂｐ、約２０ｂｐ〜約１００ｂｐ、約２５ｂｐ〜約５０ｂｐ、または約３０ｂｐ〜約４０ｂｐ）である核酸を含むことができる。例えば、マルチプレックスＰＣＲ系配列決定を用いて生成されたアンプリコンは、長さ約３３ｂｐの核酸を含むことができる。
【０１３０】
ペプチドバイオマーカーは、任意の適切なペプチドバイオマーカーが可能である。いくつかの実施形態では、ペプチドバイオマーカーは、がんに関連したペプチドバイオマーカーが可能である。例えば、ペプチドバイオマーカーは、がんにおいてレベルが上昇する（例えば、ペプチドの参照レベルと比較した場合）ペプチドが可能である。ペプチドバイオマーカーの例として、特に制限なく、ＡＦＰ、アンジオポエチン−２、ＡＸＬ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、ＣＤ４４、ＣＥＡ、ＣＹＦＲＡ２１−１、ＤＫＫ１、エンドグリン、ＦＧＦ２、フォリスタチン、ガレクチン−３、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＤＦ１５、ＨＥ４、ＨＧＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、カリクレイン−６、レプチン、ＬＲＧ−１、メソテリン、ミッドカイン、ミエロペルオキシダーゼ、ＮＳＥ、ＯＰＧ、ＯＰＮ、ＰＡＲ、プロラクチン、ｓＥＧＦＲ、ｓＦａｓ、ＳＨＢＧ、ｓＨＥＲ２／ｓＥＧＦＲ２／ｓＥｒｂＢ２、ｓＰＥＣＡＭ−１、ＴＧＦａ、トロンボスポンジン−２、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２、及びビトロネクチンが挙げられる。例えば、ペプチドバイオマーカーは、ＯＰＮ、ＩＬ−６、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＨＧＦ、ミエロペルオキシダーゼ、ＣＡ１９−９、ミッドカイン、及び／またはＴＩＭＰ−１のうち１つまたは複数を含むことができる。いくつかの実施形態では、本明細書中記載される方法及び物質は、１つまたは複数のペプチドバイオマーカーを含むことができる（例えば、１つまたは複数のペプチドが、がんにおいて上昇したレベルを有する）。例えば、本明細書中記載される方法及び物質は、実施例１に記載されるペプチドバイオマーカーのうち１つまたは複数を含むことができる。例えば、本明細書中記載される方法及び物質は、表４に記載されるペプチドバイオマーカーのうち上昇したレベルにある１種または複数を含むことができる。いくつかの実施形態では、本明細書中記載される方法及び物質は、約１０種のペプチドのレベルを検出することを含むことができる。例えば、本明細書中記載される方法及び物質は、ＯＰＮ、ＩＬ−６、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＨＧＦ、ミエロペルオキシダーゼ、ＣＡ１９−９、ミッドカイン、及び／またはＴＩＭＰ−１のレベルを検出することを含むことができる。いくつかの実施形態では、ペプチドバイオマーカーは、いずれかの場所で記載されるとおりであることができる（例えば、Ｌｉｏｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３  Ｃｌｉｎ  Ａｄｖ  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｏｎｃｏｌ  １：４６０−４６２；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  １３：９９−１１４；及びＰａｔｚ，Ｊｒ．ｅｔ  ａｌ．，２００７  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２５：５５７８−５５８３を参照）。
【０１３１】
任意の適切な方法を用いて、本明細書中記載されるとおり、１つまたは複数のバイオマーカー（例えば、ペプチドバイオマーカー）のレベル（例えば、レベル上昇）を検出することができる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のペプチドバイオマーカーのレベルは、それぞれ別個に検出することができる（例えば、シングルプレックスペプチドツールを介して）。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のペプチドバイオマーカーのレベルは、同時に検出することができる（例えば、「チップ」またはマイクロアレイなどのマルチプレックスＤＮＡツールを介して）。ペプチドレベルの検出方法の例として、特に制限なく、スペクトル測定法（例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及び液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣ／ＭＳ））、抗体依存式方法（例えば、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、タンパク質免疫沈殿法、免疫電気泳動法、ウエスタンブロット法、及びタンパク質免疫染色法）、ならびにアプタマー依存式方法が挙げられる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のペプチドバイオマーカーのレベルは、実施例において記載されるとおりに検出することができる。例えば、１つまたは複数のペプチドバイオマーカーのレベルは、マルチプレックス免疫アッセイにより検出することができる。
【０１３２】
任意の適切ながんを、本明細書中記載されるとおりに同定及び／または治療することができる。いくつかの実施形態では、がんは、一般的ながんが可能である。いくつかの実施形態では、がんは、血液検査不可であるがんが可能である。いくつかの実施形態では、がんは、早期検出不可であるがんが可能である。いくつかの実施形態では、がんは、ステージＩのがんが可能である。いくつかの実施形態では、がんは、ステージＩＩのがんが可能である。いくつかの実施形態では、がんは、ステージＩＩＩのがんが可能である。いくつかの実施形態では、がんは、ステージＩＶのがんが可能である。いくつかの実施形態では、がんは、外科切除可能ながんが可能である。本明細書中記載されるとおりに（例えば、少なくとも部分的に、１つまたは複数の第１のバイオマーカー（例えば、遺伝子バイオマーカー）の有無及び／または１つまたは複数の第２バイオマーカー（例えば、ペプチドバイオマーカー）のレベル上昇に基づき）同定されるがんの例として、特に制限なく、肝臓癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、膵癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、及び前立腺癌が挙げられる。
【０１３３】
本明細書中提供される方法及び物質は、哺乳類におけるがんの位置も同定することができる（例えば、がんの部位及び／または種類を特定することができる）。本明細書中記載されるとおり１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー及び／または１つまたは複数のペプチドバイオマーカーに変異を有する任意のがんの位置（例えば、がんの部位及び／または種類）を特定することができる。いくつかの実施形態では、本明細書中記載される方法及び物質は、結腸直腸癌の存在を同定することができる。例えば、哺乳類から得られた試料中の、ＡＰＣ、ＫＲＡＳ、及び／またはＴＰ５３遺伝子変異のうち１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在及びＣＥＡのレベル上昇を用いて、哺乳類における結腸直腸癌の存在を同定することができる。いくつかの実施形態では、本明細書中記載される方法及び物質は、肝臓癌の存在を同定することができる。例えば、哺乳類から得られた試料中の、ＴＰ５３、ＣＴＮＮＢ１、及び／またはＴＥＲＴのうち１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在及びＡＦＰのレベル上昇を用いて、哺乳類における肝臓癌の存在を同定することができる。いくつかの実施形態では、本明細書中記載される方法及び物質は、卵巣癌の存在を同定することができる。例えば、哺乳類から得られた試料中の、ＴＰ５３における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在及びＣＡ１２５のレベル上昇を用いて、哺乳類における卵巣癌の存在を同定することができる。いくつかの実施形態では、本明細書中記載される方法及び物質は、膵癌の存在を同定することができる。例えば、哺乳類から得られた試料中の、ＫＲＡＳ（例えば、ＫＲＡＳの１２番コドン）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在及びＣＡ１９−９のレベル上昇を用いて、哺乳類における膵癌の存在を同定することができる。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、本明細書中記載されるとおり（例えば、少なくとも部分的に、１つまたは複数の第１のバイオマーカー（例えば、遺伝子バイオマーカー）の有無及び／または１つまたは複数の第２バイオマーカー（例えば、ペプチドバイオマーカー）のレベル上昇に基づき）がんを有すると同定された哺乳類は、任意の適切な方法を用いて、がん診断を確定することが可能である。がんを診断するまたは診断を確定するのに使用可能な方法の例として、特に制限なく、理学的検査（例えば、婦人科内診）、画像化検査（例えば、超音波またはＣＴスキャン）、細胞診断、及び組織検査（例えば、バイオプシー）が挙げられる。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、本明細書中開示される様々な方法のどれでも、以前にがん治療を受けたことがある対象で行うことができる。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法を用いて、治療の有効性を判定することができる。例えば、がんを有する対象に治療（本明細書中、「治療介入」とも称する）を実施することができ、その後、１つまたは複数の遺伝子（例えば、ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳ）における１つまたは複数の変異の存在及び／または１つまたは複数のペプチドバイオマーカー（例えば、ＯＰＮ、ＩＬ−６、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＨＧＦ、ミエロペルオキシダーゼ、ＣＡ１９−９、ミッドカイン、及び／またはＴＩＭＰ−１）のレベル上昇を検出することにより、がんが継続して存在するかどうかまたはがんの量（あるいはそれらがないこと）を判定する。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、対象は、いったんがんを有すると特定された後、さらにモニタリングされるまたはより詳しいモニタリングに選出される場合がある。いくつかの実施形態では、従来技法が対象を初期段階のがんを有すると診断することができる時点よりも前の時点で、本明細書中提供される方法を用いて、より詳しいモニタリングの対象を選出することができる。例えば、本明細書中提供される、より詳しいモニタリングの対象を選出する方法は、対象が従来方法によりがんと診断されたことがない場合及び／または対象ががんを保有することが知られていない場合に、使用可能である。いくつかの実施形態では、より詳しいモニタリングに選出された対象には、より詳しいモニタリングに選出されなかった対象に比べてより高い頻度で診断検査（例えば、本明細書中開示される診断検査のいずれか）を実施することができる。例えば、より詳しいモニタリングに選出された対象には、１日２回、毎日、週２回、毎週、月２回、毎月、年４回、年２回、年１回の頻度、またはこれらの間の任意の頻度で診断検査を実施することができる。いくつかの実施形態では、より詳しいモニタリングに選出された対象には、より詳しいモニタリングに選出されなかった対象に比べて追加の診断検査を１つまたは複数実施することができる。例えば、より詳しいモニタリングに選出された対象には、２つの診断検査を実施することができ、一方より詳しいモニタリングに選出されなかった対象には、１つの診断検査のみを実施する（または診断検査を実施しない）。いくつかの実施形態では、より詳しいモニタリングに選出された対象は、さらなる診断検査にも選出される可能性がある。いったんがん細胞の存在が同定されたら（例えば、本明細書中開示される様々な方法のいずれかにより）、より詳しいモニタリング（例えば、対象における腫瘍またはがんの進行を評価するため、及び／またはさらなるがん細胞変異の発生を評価するため）、及びさらなる診断検査（例えば、がん細胞を保有する腫瘍の寸法及び／または正確な場所を特定するため）の両方を行うことが対象にとって有益である場合がある。いくつかの実施形態では、がん細胞変異が検出された後、より詳しいモニタリングに選出された対象に治療介入が実施される。本明細書中開示されるまたは当該分野で既知である治療介入のいずれかを実施することができる。例えば、より詳しいモニタリングに選出された対象を、さらにモニタリングすることができ、より詳しいモニタリングの期間全体を通じてがん細胞の存在が維持されるならば、治療介入を実施することができる。これに加えてまたはこれに代えて、より詳しいモニタリングに選出された対象には、治療介入を実施することができ、治療介入の進行に合わせてさらにモニタリングすることができる。いくつかの実施形態では、より詳しいモニタリングに選出された対象に治療介入を実施した後、より詳しいモニタリングは、１つまたは複数のさらなるがん細胞変異を明らかにする場合がある。いくつかの実施形態では、そのような１つまたは複数のさらなるがん細胞変異は、異なる治療介入を実施する理由を提供することになる（例えば、治療介入中にがん細胞において抵抗性変異が生じる場合があり、この抵抗性変異を保有するがん細胞は、元来の治療介入に対して抵抗性である）。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、いったん対象ががんを有すると判定されたら、その対象にさらなる検査を実施する、またはその対象をさらなる診断検査に選出することができる。いくつかの実施形態では、従来技法が対象を初期段階のがんを有すると診断することができる時点よりも前の時点で、本明細書中提供される方法を用いて、さらなる診断検査の対象を選出することができる。例えば、本明細書中提供される、さらなる診断検査の対象を選出する方法は、対象が従来方法によりがんと診断されたことがない場合及び／または対象ががんを保有することが知られていない場合に、使用可能である。いくつかの実施形態では、さらなる診断検査に選出された対象には、さらなる診断検査に選出されなかった対象に比べてより高い頻度で診断検査（例えば、本明細書中開示される診断検査のいずれか）を実施することができる。例えば、さらなる診断検査に選出された対象には、１日２回、毎日、週２回、毎週、月２回、毎月、年４回、年２回、年１回の頻度、またはこれらの間の任意の頻度で診断検査を実施することができる。いくつかの実施形態では、さらなる診断検査に選出された対象には、さらなる診断検査に選出されなかった対象に比べて追加の診断検査を１つまたは複数実施することができる。例えば、さらなる診断検査に選出された対象には、２つの診断検査を実施することができ、一方さらなる診断検査に選出されなかった対象には、１つの診断検査のみを実施する（または診断検査を実施しない）。いくつかの実施形態では、診断検査方法は、最初に検出されたがんと同じ種類のがんの存在を判定することができる。これに加えてまたはこれに代えて、診断検査方法は、最初に検出されたがんとは異なる種類のがんの存在を判定することができる。いくつかの実施形態では、診断検査方法は、スキャンである。いくつかの実施形態では、スキャンは、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、ＣＴ血管造影法（ＣＴＡ）、食道造影図（バリウム飲み込み）、バリウム注腸、核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、ＰＥＴスキャン、超音波検査（例えば、超音波気管支内検査、超音波内視鏡検査）、Ｘ線、ＤＥＸＡスキャンである。いくつかの実施形態では、診断検査方法は、理学的検査、例えば、肛門鏡検査、気管支鏡検査（例えば、自己蛍光気管支鏡検査、白色光気管支鏡検査、誘導式気管支鏡検査）、大腸内視鏡検査、デジタル乳房トモシンセシス、内視鏡的逆行性胆道膵管造影（ＥＲＣＰ）、上部消化管内視鏡検査、マンモグラフィ、パップスメア、婦人科内診、ポジトロン断層撮影法、及びコンピュータ断層撮影法（ＰＥＴ−ＣＴ）スキャンである。いくつかの実施形態では、さらなる診断検査に選出された対象は、より詳しいモニタリングにも選出される可能性がある。いったんがん細胞の存在が同定されたら（例えば、本明細書中開示される様々な方法のいずれかにより）、より詳しいモニタリング（例えば、対象における腫瘍またはがんの進行を評価するため、及び／またはさらなるがん細胞変異の発生を評価するため）、及びさらなる診断検査（例えば、がん細胞を保有する腫瘍の寸法及び／または正確な場所を特定するため）の両方を行うことが対象にとって有益である場合がある。いくつかの実施形態では、がん細胞変異が検出された後、さらなる診断検査に選出された対象に治療介入が実施される。本明細書中開示されるまたは当該分野で既知である治療介入のいずれかを実施することができる。例えば、さらなる診断検査に選出された対象に、さらなる診断検査を実施することができ、がん細胞の存在が確認されたならば、治療介入を実施することができる。これに加えてまたはこれに代えて、さらなる診断検査に選出された対象には、治療介入を実施することができ、治療介入の進行に合わせてさらにモニタリングすることができる。いくつかの実施形態では、さらなる診断検査に選出された対象に治療介入を実施した後、さらなる診断検査は、１つまたは複数のさらなるがん細胞変異を明らかにする場合がある。いくつかの実施形態では、そのような１つまたは複数のさらなるがん細胞変異は、異なる治療介入を実施する理由を提供することになる（例えば、治療介入中にがん細胞において抵抗性変異が生じる場合があり、この抵抗性変異を保有するがん細胞は、元来の治療介入に対して抵抗性である）。
【０１３８】
いったん、本明細書中記載されるとおり、がんを有すると同定されたら（例えば、少なくとも部分的に、１つまたは複数の第１のバイオマーカー（例えば、遺伝子バイオマーカー）の有無、及び／または１つまたは複数の第２バイオマーカー（例えば、ペプチドバイオマーカー）のレベル上昇、及び／または異数性の存在に基づき）、哺乳類を、１つまたは複数のがん治療（本明細書中、「治療介入」とも称する）で治療することができる。
【０１３９】
ある特定の態様において、本明細書中提供されるのは、血流中に放出されるがん細胞における変異を検出可能な最新鋭の検査である。いくつかの実施形態では、１種または複数のがん種を検出可能である。本明細書中記載されるとおりのアッセイは、特異性を保持したまま感度を向上させたがんスクリーニング検査として使用可能である。例えば、そのようなアッセイは、血漿中の、遺伝子バイオマーカー（例えば、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）における変異）の検出を、閾値化されたタンパク質マーカーの検出と組み合わせることができる。いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）における変異）のみが検査される。いくつかの実施形態では、タンパク質バイオマーカーのみが検査される。いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）における変異）とタンパク質マーカーの組み合わせは、どの単一マーカーよりも優れている可能性がある。１，７０３人の患者（１，２４０例のがん及び４６３例の健康な対照）での模範的予備研究において、ｃｔＤＮＡ及びタンパク質バイオマーカーのパネルは、感度が６４％であり、特異性が９９．３５％であった。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、本明細書中記載されるとおりのアッセイは、一見健康な個体に対して適用される場合がある。例えば、本明細書中記載されるとおりのアッセイは、医者への定期外来診療中に行われる血液検査を通じて、症状が出る前のがんを検出することにより、がんによる死亡及びがんの罹患を減少させる可能性がある。さらに、本明細書中記載されるとおりのアッセイは、限局性がんを有する患者、特にこれまでに治療されたもしくは切除されたことがあるまたはそうすることが可能ながんを有する患者に適用される場合がある。明細書中記載されるとおりのアッセイは、再発の早期検出を通じて、管理及び予後を改善する可能性がある。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、無細胞ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）における変異）は、対象（例えば、ヒト対象）から得られる様々な生体試料のいずれかで検査される可能性があり、そのような試料として、血液、血漿、血清、尿、脳脊髄液、唾液、痰、気管支肺胞洗浄検査、胆汁、リンパ液、嚢胞液、糞便、腹水、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、１０の代表的な遺伝子（ＡＫＴ１、ＡＰＣ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＴＮＮＢ１、ＦＢＸＷ７、ＦＧＦ２、ＧＮＡＳ、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ）における遺伝子バイオマーカー（例えば、ｃｔＤＮＡにおける変異）及び血清中の１１の代表的なタンパク質マーカーの閾値を超える上昇（ＣＡ１９−９（＞９２Ｕ／ｍｌ）、ＣＥＡ（＞７，５０７ｐｇ／ｍｌ）、ＣＡ１２５（＞５７７Ｕ／ｍｌ）、ＡＦＰ（＞２１，３２１ｐｇ／ｍｌ）、プロラクチン（＞１４５，３４５ｐｇ／ｍｌ）、ＨＧＦ（＞８９９ｐｇ／ｍｌ）、ＯＰＮ（＞１５７，７７２ｐｇ／ｍｌ）、ＴＩＭＰ−１（＞１７６，９８９ｐｇ／ｍｌ）、フォリスタチン（＞１，９７０ｐｇ／ｍｌ）、Ｇ−ＣＳＦ（＞８００ｐｇ／ｍｌ）、及びＣＡ１５−３（＞９８Ｕ／ｍｌ））を、アッセイで検査する場合がある。いくつかの実施形態では、１６の代表的な遺伝子（ＫＴ１、ＡＰＣ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２、ＣＴＮＮＢ１、ＦＢＸＷ７、ＦＧＦＲ２、ＧＮＡＳ、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＴＰ５３、ＰＴＥＮ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＥＧＦＲ、及びＮＲＡＳ）における遺伝子バイオマーカー（例えば、ｃｔＤＮＡにおける変異）及び血清中の１１の代表的なタンパク質マーカーの閾値を超える上昇（ＣＡ１９−９（＞９２Ｕ／ｍｌ）、ＣＥＡ（＞７，５０７ｐｇ／ｍｌ）、ＣＡ１２５（＞５７７Ｕ／ｍｌ）、ＡＦＰ（＞２１，３２１ｐｇ／ｍｌ）、プロラクチン（＞１４５，３４５ｐｇ／ｍｌ）、ＨＧＦ（＞８９９ｐｇ／ｍｌ）、ＯＰＮ（＞１５７，７７２ｐｇ／ｍｌ）、ＴＩＭＰ−１（＞１７６，９８９ｐｇ／ｍｌ）、フォリスタチン（＞１，９７０ｐｇ／ｍｌ）、Ｇ−ＣＳＦ（＞８００ｐｇ／ｍｌ）、及びＣＡ１５−３（＞９８Ｕ／ｍｌ））を、アッセイで検査する場合がある。いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在またはタンパク質バイオマーカーのいずれか１つの閾値を超える上昇が、陽性結果（例えば、対象におけるがんの同定）を構成する。いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在または２つ以上のタンパク質バイオマーカーの上昇が、陽性結果を構成する。例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０の代表的な遺伝子における遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在、及び／または２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、または１１のタンパク質バイオマーカーにおける上昇が、陽性結果を構成する。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、タンパク質（例えば、タンパク質バイオマーカー）は、対象（例えば、ヒト対象）から得られる様々な生体試料のいずれかで検査される場合があり、そのような試料として、血液、血漿、血清、尿、脳脊髄液、唾液、痰、気管支肺胞洗浄検査、胆汁、リンパ液、嚢胞液、糞便、腹水、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。がんで大量に見つかるタンパク質（例えば、タンパク質バイオマーカー）を、そのタンパク質が、健康なヒト対象では生じない量であるかどうかについて検査することができる。任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、または１１が検査される可能性があるタンパク質（例えば、タンパク質バイオマーカー）の例として、特に制限なく、炭水化物抗原１９−９（ＣＡ１９−９）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、オステオポンチン（ＯＰＮ）、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、フォリスタチン、Ｇ−ＣＳＦ、及びＣＡ１５−３が挙げられる。健康なヒト対象では超えないが、がんを有するヒト対象では超える閾値が得られる場合に、当該分野で既知である任意のタンパク質バイオマーカーを使用することができる。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、ＣＡ１９−９の閾値は、少なくとも約９２Ｕ／ｍＬ（例えば、約９２Ｕ／ｍＬ）の可能性がある。いくつかの実施形態では、ＣＡ１９−９の閾値は、９２Ｕ／ｍＬの可能性がある。いくつかの実施形態では、ＣＥＡの閾値は、少なくとも約７，５０７ｐｇ／ｍｌ（例えば、約７，５０７ｐｇ／ｍｌ）の可能性がある。いくつかの実施形態では、ＣＥＡの閾値は、７．５ｎｇ／ｍＬの可能性がある。いくつかの実施形態では、ＨＧＦの閾値は、少なくとも約８９９ｐｇ／ｍｌ（例えば、約８９９ｐｇ／ｍｌ）の可能性がある。いくつかの実施形態では、ＨＧＦの閾値は、０．９２ｎｇ／ｍＬの可能性がある。いくつかの実施形態では、ＯＰＮの閾値は、少なくとも約１５７，７７２ｐｇ／ｍｌ（例えば、約１５７，７７２ｐｇ／ｍｌ）の可能性がある。いくつかの実施形態では、ＯＰＮの閾値は、１５８ｎｇ／ｍＬの可能性がある。いくつかの実施形態では、ＣＡ１２５の閾値は、少なくとも約５７７Ｕ／ｍｌ（例えば、約５７７Ｕ／ｍｌ）の可能性がある。いくつかの実施形態では、ＣＡ１２５の閾値は、５７７Ｕ／ｍＬの可能性がある。いくつかの実施形態では、ＡＦＰの閾値は、少なくとも約２１，３２１ｐｇ／ｍｌ（例えば、約２１，３２１ｐｇ／ｍｌ）の可能性がある。いくつかの実施形態では、ＡＦＰの閾値は、２１，３２１ｐｇ／ｍｌの可能性がある。いくつかの実施形態では、プロラクチンの閾値は、少なくとも約１４５，３４５ｐｇ／ｍｌ（例えば、約１４５，３４５ｐｇ／ｍｌ）の可能性がある。いくつかの実施形態では、プロラクチンの閾値は、１４５，３４５ｐｇ／ｍｌの可能性がある。いくつかの実施形態では、ＴＩＭＰ−１の閾値は、少なくとも約１７６，９８９ｐｇ／ｍｌ（例えば、約１７６，９８９ｐｇ／ｍｌ）の可能性がある。いくつかの実施形態では、ＴＩＭＰ−１の閾値は、１７６，９８９ｐｇ／ｍｌの可能性がある。いくつかの実施形態では、フォリスタチンの閾値は、少なくとも約１，９７０ｐｇ／ｍｌ（例えば、約１，９７０ｐｇ／ｍｌ）の可能性がある。いくつかの実施形態では、フォリスタチンの閾値は、１，９７０ｐｇ／ｍｌの可能性がある。いくつかの実施形態では、Ｇ−ＣＳＦの閾値は、少なくとも約８００ｐｇ／ｍｌ（例えば、約８００ｐｇ／ｍｌ）の可能性がある。いくつかの実施形態では、Ｇ−ＣＳＦの閾値は、８００ｐｇ／ｍｌの可能性がある。いくつかの実施形態では、ＣＡ１５−３の閾値は、少なくとも約９８Ｕ／ｍｌ（例えば、約９８Ｕ／ｍｌ）の可能性がある。いくつかの実施形態では、ＣＡ１５−３の閾値は、９８Ｕ／ｍｌの可能性がある。いくつかの実施形態では、ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、及び／またはＯＰＮの閾値は、上記に列挙した閾値より５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、またはそれ以上に高い（例えば、ＣＡ−１９−９の９２Ｕ／ｍＬ、ＣＥＡの７，５０７ｐｇ／ｍｌ、ＨＧＦの８９９ｐｇ／ｍｌ、ＯＰＮの１５７，７７２ｐｇ／ｍｌ、ＣＡ１２５の５７７Ｕ／ｍｌ、ＡＦＰの２１，３２１ｐｇ／ｍｌ、プロラクチンの１４５，３４５ｐｇ／ｍｌ、ＴＩＭＰ−１の１７６，９８９ｐｇ／ｍｌ、フォリスタチンの１，９７０ｐｇ／ｍｌ、Ｇ−ＣＳＦの８００ｐｇ／ｍｌ、及び／またはＣＡ１５−３の９８Ｕ／ｍｌという閾値より高い）可能性がある。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、タンパク質バイオマーカーの閾値は、診断または臨床目的で典型的に検査されるレベルよりも高い可能性がある。例えば、ＣＡ１９−９の閾値は、約３７Ｕ／ｍｌより高い（例えば、約４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、またはそれ以上のＵ／ｍＬより高い）可能性がある。これに加えてまたはこれに代えて、ＣＥＡの閾値は、約２．５ｕｇ／Ｌより高い（例えば、約３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、またはそれ以上のｕｇ／Ｌより高い）可能性がある。これに加えてまたはこれに代えて、ＣＡ１２５の閾値は、約３５Ｕ／ｍＬより高い（例えば、約４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、またはそれ以上のＵ／ｍＬより高い）可能性がある。これに加えてまたはこれに代えて、ＡＦＰの閾値は、約２１ｎｇ／ｍＬより高い（例えば、約２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、またはそれ以上のｎｇ／Ｌより高い）可能性がある。これに加えてまたはこれに代えて、ＴＩＭＰ−１の閾値は、約２３００ｎｇ／ｍＬより高い（例えば、約２，５００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、またはそれ以上のｎｇ／Ｌより高い）可能性がある。これに加えてまたはこれに代えて、フォリスタチンの閾値は、約２ｕｇ／ｍＬより高い（例えば、約２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、またはそれ以上のｕｇ／Ｌより高い）可能性がある。これに加えてまたはこれに代えて、ＣＡ１５−３の閾値は、約３０Ｕ／ｍＬより高い（例えば、約３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、またはそれ以上のＵ／ｍＬより高い）可能性がある。いくつかの実施形態では、従来の診断または臨床アッセイ中に典型的に検査されるよりも高い閾値で１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーを検出することは、がん検出の感度を向上させる可能性がある。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、アッセイは、遺伝子バイオマーカー（例えば、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）における変異）を検出することなく、生体試料（例えば、血漿など本明細書中開示される任意の生体試料）中の閾値化されたタンパク質バイオマーカーを検出することを含む。例えば、アッセイは、生体試料中のＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、フォリスタチン、Ｇ−ＣＳＦ、及び／またはＣＡ１５−３のうち１種または複数を検出することを含む場合がある。いくつかの実施形態では、アッセイは、生体試料中のＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、フォリスタチン、Ｇ−ＣＳＦ、及び／またはＣＡ１５−３のうち１種または複数を、本明細書中開示される閾値のいずれかで、検出することを含む場合がある。いくつかの実施形態では、生体試料中の閾値化されたタンパク質バイオマーカーを検出することを含むアッセイが行われると、後続の検査またはモニタリング（例えば、本明細書中開示される様々なさらなる診断検査またはより詳しいモニタリング技法のいずれか）が行われる。いくつかの実施形態では、生体試料中の閾値化されたタンパク質バイオマーカーを検出することを含むアッセイが行われると、遺伝子バイオマーカー（例えば、無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）に存在する遺伝子バイオマーカー）を検出することを含む第２のアッセイ（例えば、本明細書中記載されるとおり無細胞ＤＮＡまたはｃｔＤＮＡに存在する遺伝子バイオマーカーにおける様々な遺伝子変異のいずれかを検出すること）が行われ得る。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、アッセイは、閾値化されたタンパク質バイオマーカーを検出することなく、生体試料（例えば、血漿など本明細書中開示される任意の生体試料）中の循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）における遺伝子バイオマーカーを検出することを含む。例えば、アッセイは、本明細書中開示される遺伝子のうちいずれか１種または複数における遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）の検出を含む場合があり、そのような遺伝子として、制限なく、ＣＤＫＮ２Ａ、ＦＧＦ２、ＧＮＡＳ、ＡＢＬ１、ＥＶＩ１、ＭＹＣ、ＡＰＣ、ＩＬ２、ＴＮＦＡＩＰ３、ＡＢＬ２、ＥＷＳＲ１、ＭＹＣＬ１、ＡＲＨＧＥＦ１２、ＪＡＫ２、ＴＰ５３、ＡＫＴ１、ＦＥＶ、ＭＹＣＮ、ＡＴＭ、ＭＡＰ２Ｋ４、ＴＳＣ１、ＡＫＴ２、ＦＧＦＲ１、ＮＣＯＡ４、ＢＣＬ１１Ｂ、ＭＤＭ４、ＴＳＣ２、ＡＴＦ１、ＦＧＦＲ１ＯＰ、ＮＦＫＢ２、ＢＬＭ、ＭＥＮ１、ＶＨＬ、ＢＣＬ１１Ａ、ＦＧＦＲ２、ＮＲＡＳ、ＢＭＰＲ１Ａ、ＭＬＨ１、ＷＲＮ、ＢＣＬ２、ＦＵＳ、ＮＴＲＫ１、ＢＲＣＡ１、ＭＳＨ２、ＷＴ１、ＢＣＬ３、ＧＯＬＧＡ５、ＮＵＰ２１４、ＢＲＣＡ２、ＮＦ１、ＢＣＬ６、ＧＯＰＣ、ＰＡＸ８、ＣＡＲＳ、ＮＦ２、ＢＣＲ、ＨＭＧＡ１、ＰＤＧＦＢ、ＣＢＦＡ２Ｔ３、ＮＯＴＣＨ１、ＢＲＡＦ、ＨＭＧＡ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＣＤＨ１、ＮＰＭ１、ＣＡＲＤ１１、ＨＲＡＳ、ＰＩＭ１、ＣＤＨ１１、ＮＲ４Ａ３、ＣＢＬＢ、ＩＲＦ４、ＰＬＡＧ１、ＣＤＫ６、ＮＵＰ９８、ＣＢＬＣ、ＪＵＮ、ＰＰＡＲＧ、ＳＭＡＤ４、ＰＡＬＢ２、ＣＣＮＤ１、ＫＩＴ、ＰＴＰＮ１１、ＣＥＢＰＡ、ＰＭＬ、ＣＣＮＤ２、ＫＲＡＳ、ＲＡＦ１、ＣＨＥＫ２、ＰＴＥＮ、ＣＣＮＤ３、ＬＣＫ、ＲＥＬ、ＣＲＥＢ１、ＲＢ１、ＣＤＸ２、ＬＭＯ２、ＲＥＴ、ＣＲＥＢＢＰ、ＲＵＮＸ１、ＣＴＮＮＢ１、ＭＡＦ、ＲＯＳ１、ＣＹＬＤ、ＳＤＨＢ、ＤＤＢ２、ＭＡＦＢ、ＳＭＯ、ＤＤＸ５、ＳＤＨＤ、ＤＤＩＴ３、ＭＡＭＬ２、ＳＳ１８、ＥＸＴ１、ＳＭＡＲＣＡ４、ＤＤＸ６、ＭＤＭ２、ＴＣＬ１Ａ、ＥＸＴ２、ＳＭＡＲＣＢ１、ＤＥＫ、ＭＥＴ、ＴＥＴ２、ＦＢＸＷ７、ＳＯＣＳ１、ＥＧＦＲ、ＭＩＴＦ、ＴＦＧ、ＦＨ、ＳＴＫ１１、ＥＬＫ４、ＭＬＬ、ＴＬＸ１、ＦＬＴ３、ＳＵＦＵ、ＥＲＢＢ２、ＭＰＬ、ＴＰＲ、ＦＯＸＰ１、ＳＵＺ１２、ＥＴＶ４、ＭＹＢ、ＵＳＰ６、ＧＰＣ３、ＳＹＫ、ＥＴＶ６、ＩＤＨ１、及び／またはＴＣＦ３が挙げられる。いくつかの実施形態では、アッセイは、ＡＫＴ１、ＡＰＣ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＴＮＮＢ１、ＦＢＸＷ７、ＦＧＦ２、ＧＮＡＳ、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳのうち１種または複数における遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）の検出を含む場合がある。いくつかの実施形態では、アッセイは、ＫＴ１、ＡＰＣ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２、ＣＴＮＮＢ１、ＦＢＸＷ７、ＦＧＦＲ２、ＧＮＡＳ、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＴＰ５３、ＰＴＥＮ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＥＧＦＲ、及びＮＲＡＳのうち１種または複数における遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）の検出を含む場合がある。いくつかの実施形態では、生体試料中のｃｔＤＮＡに存在する遺伝子バイオマーカーを検出することを含むアッセイが行われると、後続の検査またはモニタリング（例えば、本明細書中開示される様々なさらなる診断検査またはより詳しいモニタリング技法のいずれか）が行われる。いくつかの実施形態では、生体試料中のｃｔＤＮＡに存在する遺伝子バイオマーカーを検出することを含むアッセイが行われると、高い閾値でタンパク質バイオマーカーを検出することを含む第２のアッセイ（例えば、本明細書中記載される様々なタンパク質バイオマーカーのいずれかを検出すること、そのようなタンパク質バイオマーカーとして、炭水化物抗原１９−９（ＣＡ１９−９）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、オステオポンチン（ＯＰＮ）、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、フォリスタチン、Ｇ−ＣＳＦ、及びＣＡ１５−３、ならびにそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない）が行われ得る。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、腫瘍抑制遺伝子またはがん遺伝子の少なくとも２つのコドンまたは少なくとも２つのアンプリコンを検査することができる。いくつかの実施形態では、個別の腫瘍抑制遺伝子またはがん遺伝子の少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つ以上のコドンまたはアンプリコンをアッセイすることができる。いくつかの実施形態では、遺伝子に分布する変異が増えるほど、検査することが望ましくあり得るコドンまたはアンプリコンが増える。
【０１４９】
検査可能な腫瘍抑制遺伝子及びがん遺伝子のコドンの例として、制限なく、以下のコドン及びそれらの周囲のスプライス部位のうち１つまたは複数が挙げられる：ＡＫＴ１の１６〜１８番コドン、ＡＰＣの１３０４〜１３１１、１４５０〜１４５９番コドン、ＢＲＡＦの５９１〜６０２番コドン、ＣＤＫＮ２Ａの５１〜５８、７６〜８８番コドン、ＣＴＮＮＢ１の３１〜３９、３８〜４７番コドン、ＥＧＦＲの８５６〜８６８番コドン、ＦＢＸＷ７の３６１〜３７１、４６４〜４７３、４７３〜４８３、４９８〜５０７番コドン、ＦＧＦＲ２の２５０〜２５６番コドン、ＧＮＡＳの１９９〜２０８番コドン、ＨＲＡＳの７〜１９番コドン、ＫＲＡＳの７〜１４、５７〜６５、１４３〜１４８番コドン、ＮＲＡＳの３〜１５、５４〜６３番コドン、ＰＩＫ３ＣＡの８０〜９０、３４３〜３４８、５４１〜５５１、１０３８〜１０５０番コドン、ＰＰＰ２Ｒ１Ａの１７５〜１８７番コドン、ＰＴＥＮの９０〜９８、１２５〜１３２、１３３〜１４６、１４５〜１５４番コドン、及びＴＰ５３の１０〜２２、２５〜３２、３３〜４０、４０〜５２、５２〜６４、８２〜９４、９７〜１１０、１１２〜１２５、１２３〜１２５、１２６〜１３２、１３２〜１４２、１５０〜１６３、１６７〜１７７、１７５〜１８６、１８７〜１９５、１９５〜２０６、２０７〜２１９、２１９〜２２４、２２６〜２３７、２３２〜２４５、２４８〜２６１、２６１〜２６８、２７２〜２８３、２７９〜２９０、２９８〜３０７、３０７〜３１４、３２３〜３３１、３３３〜３４４、３４４〜３５５、３６７〜３７５、３７４〜３８６番コドン。これらの領域の全部または一部を検査することができる。いくつかの実施形態では、変異は、ＫＲＡＳにおいて、例えば、１２番コドンまたは６１番コドンにある可能性がある。他の実施形態において、変異は、ＫＲＡＳの他のコドンにある可能性がある。いくつかの実施形態では、変異は、ＣＤＫＮ２Ａにある可能性があり（例えば、実施例２において同定されるＣＤＫＮ２Ａ変異のいずれか）、いくつかの実施形態では、変異は、腫瘍抑制因子またはがん遺伝子にある場合があり、そのような腫瘍抑制因子またはがん遺伝子として、以下が挙げられるが、それらに限定されない：ＡＢＬ１、ＥＶＩ１、ＭＹＣ、ＡＰＣ、ＩＬ２、ＴＮＦＡＩＰ３、ＡＢＬ２、ＥＷＳＲ１、ＭＹＣＬ１、ＡＲＨＧＥＦ１２、ＪＡＫ２、ＴＰ５３、ＡＫＴ１、ＦＥＶ、ＭＹＣＮ、ＡＴＭ、ＭＡＰ２Ｋ４、ＴＳＣ１、ＡＫＴ２、ＦＧＦＲ１、ＮＣＯＡ４、ＢＣＬ１１Ｂ、ＭＤＭ４、ＴＳＣ２、ＡＴＦ１、ＦＧＦＲ１ＯＰ、ＮＦＫＢ２、ＢＬＭ、ＭＥＮ１、ＶＨＬ、ＢＣＬ１１Ａ、ＦＧＦＲ２、ＮＲＡＳ、ＢＭＰＲ１Ａ、ＭＬＨ１、ＷＲＮ、ＢＣＬ２、ＦＵＳ、ＮＴＲＫ１、ＢＲＣＡ１、ＭＳＨ２、ＷＴ１、ＢＣＬ３、ＧＯＬＧＡ５、ＮＵＰ２１４、ＢＲＣＡ２、ＮＦ１、ＢＣＬ６、ＧＯＰＣ、ＰＡＸ８、ＣＡＲＳ、ＮＦ２、ＢＣＲ、ＨＭＧＡ１、ＰＤＧＦＢ、ＣＢＦＡ２Ｔ３、ＮＯＴＣＨ１、ＢＲＡＦ、ＨＭＧＡ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＣＤＨ１、ＮＰＭ１、ＣＡＲＤ１１、ＨＲＡＳ、ＰＩＭ１、ＣＤＨ１１、ＮＲ４Ａ３、ＣＢＬＢ、ＩＲＦ４、ＰＬＡＧ１、ＣＤＫ６、ＮＵＰ９８、ＣＢＬＣ、ＪＵＮ、ＰＰＡＲＧ、ＳＭＡＤ４、ＰＡＬＢ２、ＣＣＮＤ１、ＫＩＴ、ＰＴＰＮ１１、ＣＥＢＰＡ、ＰＭＬ、ＣＣＮＤ２、ＫＲＡＳ、ＲＡＦ１、ＣＨＥＫ２、ＰＴＥＮ、ＣＣＮＤ３、ＬＣＫ、ＲＥＬ、ＣＲＥＢ１、ＲＢ１、ＣＤＸ２、ＬＭＯ２、ＲＥＴ、ＣＲＥＢＢＰ、ＲＵＮＸ１、ＣＴＮＮＢ１、ＭＡＦ、ＲＯＳ１、ＣＹＬＤ、ＳＤＨＢ、ＤＤＢ２、ＭＡＦＢ、ＳＭＯ、ＤＤＸ５、ＳＤＨＤ、ＤＤＩＴ３、ＭＡＭＬ２、ＳＳ１８、ＥＸＴ１、ＳＭＡＲＣＡ４、ＤＤＸ６、ＭＤＭ２、ＴＣＬ１Ａ、ＥＸＴ２、ＳＭＡＲＣＢ１、ＤＥＫ、ＭＥＴ、ＴＥＴ２、ＦＢＸＷ７、ＳＯＣＳ１、ＥＧＦＲ、ＭＩＴＦ、ＴＦＧ、ＦＨ、ＳＴＫ１１、ＥＬＫ４、ＭＬＬ、ＴＬＸ１、ＦＬＴ３、ＳＵＦＵ、ＥＲＢＢ２、ＭＰＬ、ＴＰＲ、ＦＯＸＰ１、ＳＵＺ１２、ＥＴＶ４、ＭＹＢ、ＵＳＰ６、ＧＰＣ３、ＳＹＫ、ＥＴＶ６、ＩＤＨ１、及びＴＣＦ３。検査は、増幅及び／または配列決定を含むことができる。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、高い精度での配列決定は、分析物が少量及び／または低い割合で存在する場合に、有利となる可能性がある。高い精度での配列決定は、内在性であるか外来性であるかに関わらず、オリゴヌクレオチドバーコードを利用する場合がある。オリゴヌクレオチドバーコードは、例えば、外来性バーコードの場合、増幅によりテンプレート分析物に導入することができる。あるいは、内在性オリゴヌクレオチドバーコードを、例えば、ライゲーション手法により、オリゴヌクレオチドアダプター分子をそれに結合させることにより使用することができる。アダプター分子は、ＤＮＡ合成用、及び／または固体表面とのハイブリダイゼーション用のプライミング部位を含有することができる。アダプターは、内在性バーコードと直接隣接する、または内在性バーコードとの間に、決まった個数のヌクレオチドを挟んで隣接することができる。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドバーコードは、プロセシング前、特に増幅前に、試料中の個別のテンプレート分子を標識化することを可能にする。例えば、ファミリーメンバー（同一オリゴヌクレオチドバーコードを有する）の全てまたは高い割合またはある閾値の割合が変異を呈示することを必要条件にすることにより、増幅及び／または他のＤＮＡ合成もしくはプロセシング中に生じる偽陽性変異を除外するまたは最小限にすることが可能である。例えば、Ｋｉｎｄｅ  Ｉ，Ｗｕ  Ｊ，Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓ  Ｎ，Ｋｉｎｚｌｅｒ  ＫＷ，＆  Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  Ｂ（２０１１）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｒｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０８（２３）：９５３０−９５３５を参照、この内容は、明示的に参照により援用される。これに加えてまたはこれに代えて、変異を変異と判定するための閾値は、２つの異なるファミリーで生じることを求める。この性質の複数のフィルターを適用することができる。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法を用いて、無細胞ＤＮＡに存在する循環腫瘍ＤＮＡにおける遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異（例えば、１つまたは複数の遺伝子変異）を検出することができ、無細胞ＤＮＡは、約１５００ｎｇ未満、例えば、約１４００ｎｇ未満、約１３００ｎｇ未満、約１２００ｎｇ未満、約１１００ｎｇ未満、約１０００ｎｇ未満、約９００ｎｇ未満、約８００ｎｇ未満、約７００ｎｇ未満、約６００ｎｇ未満、約５００ｎｇ未満、約４００ｎｇ未満、約３００ｎｇ未満、約２００ｎｇ未満、約１５０ｎｇ未満、約１００ｎｇ未満、約９５ｎｇ未満、約９０ｎｇ未満、約８５ｎｇ未満、約８０ｎｇ未満、約７５ｎｇ未満、約７０ｎｇ未満、約６５ｎｇ未満、約６０ｎｇ未満、約５５ｎｇ未満、約５０ｎｇ未満、約４５ｎｇ未満、約４０ｎｇ未満、約３５ｎｇ未満、約３０ｎｇ未満、約２５ｎｇ未満、約２０ｎｇ未満、約１５ｎｇ未満、約１０ｎｇ未満、または約５ｎｇ未満の量で存在する。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法を用いて、無細胞ＤＮＡに存在する循環腫瘍ＤＮＡにおける遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異（例えば、１つまたは複数の遺伝子変異）を検出することができ、循環腫瘍ＤＮＡは、無細胞ＤＮＡの１００％を占める。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法を用いて、無細胞ＤＮＡに存在する循環腫瘍ＤＮＡにおける遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異（例えば、１つまたは複数の遺伝子変異）を検出することができ、循環腫瘍ＤＮＡは、無細胞ＤＮＡの１００％未満、例えば無細胞ＤＮＡの約９５％、約９０％、約８５％、約８０％、約７５％、約７０％、約６５％、約６０％、約５５％、約５０％、約４５％、約４０％、約３５％、約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、約５％、約４％、約３％、約２％、約１％、約０．９５％、約０．９０％、約０．８５％、約０．８０％、約０．７５％、約０．７０％、約０．６５％、約０．６０％、約０．５５％、約０．５０％、約０．４５％、約０．４０％、約０．３５％、約０．３０％、約０．２５％、約０．２０％、約０．１５％、約０．１０％、約０．０９％、約０．０８％、約０．０７％、約０．０６％、約０．０５％、またはそれ以下を占める。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）に存在する１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー及び／または１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーを、対象（例えば、ヒト対象）から単離されたまたは得られた様々な生体試料から検査することができ、そのような生体試料として、血液、血漿、血清、尿、脳脊髄液、唾液、痰、気管支肺胞洗浄検査、胆汁、リンパ液、嚢胞液、糞便、腹水、及びそれららの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）に存在する１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー及び１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーを、同一試料から検査することができる。例えば、単一試料を対象から単離するまたは得ることができ、この単一試料を、無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）に存在する１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーについて、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーについて、または両方について検査することができる。無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）に存在する１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー及び１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーは、同じ時点でまたは異なる時点で試料から検査することができる。例えば、試料を、第１の時点で無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）に存在する１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーについて、第２の時点で１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーについて検査することができ、その逆もまた同様である。いくつかの実施形態では、試料は、将来の検査のために、冷蔵、冷凍、またはそれ以外で貯蔵することができる。いくつかの実施形態では、無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）に存在する１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー及び１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーは、異なる試料から検査することができる。例えば、対象から第１の試料を単離しまたは得て、無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）に存在する１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーについて検査することができ、対象から第２の試料を単離しまたは得て、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーについて検査することができる。第１の試料及び第２の試料は、同じ種類（例えば、血漿または血清）のものであることも、異なる種類のものであることも可能である。第１の試料及び／または第２の試料は、将来の検査のために、冷蔵、冷凍、またはそれ以外で貯蔵することができる。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、本明細書中開示される様々なアッセイのいずれも、繰り返して、変異検出の精度を上昇させることができる。アッセイは、例えば、２つ組または３つ組で行うことができる。いくつかの実施形態では、患者由来の同一の最初の試料で陽性アッセイを繰り返すことができる。これに加えてまたはこれに代えて、例えば、陽性結果が判明した場合、第２の試料を、後の時点で患者から得ることができる。ｃｔＤＮＡ、及び／またはタンパク質バイオマーカーを含む本明細書中開示される様々なアッセイのいずれも、並列反復試験で繰り返すまたは実行することができる。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、放射線技法、超音波検査技法、または他の技法を、変異が検出される任意の対象（例えば、ヒト対象）に適用することができる。そのような技法は、全身、単一臓器、または身体のある領域に対して施行することができる。そのような技法は、例えば、特定種のがんが存在することを確認するため、がんが存在することを確認するため、または身体中のがんの場所を同定するために、用いることができる。いくつかの実施形態では、そのような技法は、スキャンである。いくつかの実施形態では、スキャンは、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、ＣＴ血管造影法（ＣＴＡ）、食道造影図（バリウム飲み込み）、バリウム注腸、核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、ＰＥＴスキャン、超音波検査（例えば、超音波気管支内検査、超音波内視鏡検査）、Ｘ線、ＤＥＸＡスキャン、またはポジトロン断層撮影法及びコンピュータ断層撮影法（ＰＥＴ−ＣＴ）スキャンである。いくつかの実施形態では、そのような技法は、理学的検査、例えば、肛門鏡検査、気管支鏡検査（例えば、自己蛍光気管支鏡検査、白色光気管支鏡検査、誘導式気管支鏡検査）、大腸内視鏡検査、デジタル乳房トモシンセシス、内視鏡的逆行性胆道膵管造影（ＥＲＣＰ）、上部消化管内視鏡検査、マンモグラフィ、パップスメア、または婦人科内診であり、いくつかの実施形態では、そのような技法は、生検（例えば、骨髄穿刺、組織生検）である。いくつかの実施形態では、生検は、細針穿刺吸引により、または外科的切除により行われる。いくつかの実施形態では、そのような技法は、さらに、生体試料（例えば、組織試料、尿試料、血液試料、拭き取り検体、唾液試料、粘膜試料（例えば、痰、気管支分泌物）、乳頭吸引液、分泌物、または、排泄物など）を得ることを含む。いくつかの実施形態では、そのような技法は、エキソソームタンパク質（例えば、エキソソーム表面タンパク質（例えば、ＣＤ２４、ＣＤ１４７、ＰＣＡ−３））を特定することを含む（Ｓｏｕｎｇｅｔａｌ．（２０１７）Ｃａｎｃｅｒｓ９（１）：ｐｉｉ：Ｅ８）。いくつかの実施形態では、診断検査法は、オンコタイプＤＸ（登録商標）検査である（Ｂａｅｈｎｅｒ（２０１６）Ｅｃａｎｃｅｒｍｅｄｉｃａｌｓｃｉｅｎｃｅ  １０：６７５）。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、本明細書中記載される様々な方法を用いて、以下からなる群より選択されるがんを検出することができる：膵臓癌、結腸癌、食道癌、胃癌、卵巣癌、肝臓癌、肺癌、及び乳癌、ならびにそれらの組み合わせ。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法（例えば、対象から単離された生体試料において、無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）に存在する遺伝子バイオマーカー及び高閾値のタンパク質バイオマーカーを検出する方法）は、対象のための治療を選択するために使用することができる。例えば、本明細書中開示される様々な方法のいずれかにより、対象ががん（例えば、膵臓癌、結腸癌、食道癌、胃癌、卵巣癌、肝臓癌、肺癌、または乳癌）を有すると判定されたら、適切な治療（例えば、本明細書中記載される様々な治療介入のいずれか）を選択することができる。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法（例えば、対象から単離された生体試料において、無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）に存在する遺伝子バイオマーカー及び高閾値のタンパク質バイオマーカーを検出する方法）は、治療の対象を選択するために使用することができる。例えば、本明細書中開示される様々な方法のいずれかにより、対象ががん（例えば、膵臓癌、結腸癌、食道癌、胃癌、卵巣癌、肝臓癌、肺癌、または乳癌）を有すると判定されたら、その対象は、治療（例えば、本明細書中記載される様々な治療介入のいずれか）を受けるのにふさわしい対象として同定することができる。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法（例えば、対象から単離された生体試料において、無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）に存在する遺伝子バイオマーカー及び高閾値のタンパク質バイオマーカーを検出する方法）は、より詳しいモニタリングの対象を選択するために使用することができる。例えば、本明細書中開示される様々な方法のいずれかにより、対象ががん（例えば、膵臓癌、結腸癌、食道癌、胃癌、卵巣癌、肝臓癌、肺癌、または乳癌）を有すると判定されたら、その対象は、より詳しいモニタリング（例えば、本明細書中開示される様々なモニタリング技法のいずれか）を受けるのにふさわしい対象として同定することができる。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法（例えば、対象から単離された生体試料において、無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）に存在する遺伝子バイオマーカー及び高閾値のタンパク質バイオマーカーを検出する方法）は、さらなる診断検査の対象を選択するために使用することができる。例えば、本明細書中開示される様々な方法のいずれかにより、対象ががん（例えば、膵臓癌、結腸癌、食道癌、胃癌、卵巣癌、肝臓癌、肺癌、または乳癌）を有すると判定されたら、その対象は、さらなる診断検査（例えば、本明細書中記載される様々な診断技法のいずれか）を受けるのにふさわしい対象として同定することができる。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法を使用することで、対象が初期段階のがんであると診断される前の時点、及び／または対象ががんに関連した症候を呈示する前の時点で、がん（例えば、膵臓癌、結腸癌、食道癌、胃癌、卵巣癌、肝臓癌、肺癌、または乳癌）の存在を検出することができる。例えば、本明細書中提供される方法は、対象ががんと診断されていない場合、及び／または対象ががん細胞を保有することが知られていない場合に、使用することができる。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、ある特定のタンパク質バイオマーカーが、高閾値で検出されることにより、特定種のがんが検出される。例えば、高閾値のＣＡ１９−９が検出されることにより、膵臓癌の存在を示すことができる。これに加えてまたはこれに代えて、高閾値のＣＥＡが検出されることにより、例えば、結腸癌、胃癌、膵臓癌、肺癌、及び／または乳癌の存在を示すことができる。これに加えてまたはこれに代えて、高閾値のＣＡ−１２５が検出されることにより、例えば、卵巣癌の存在を示すことができる。これに加えてまたはこれに代えて、高閾値のＡＦＰが検出されることにより、肝臓癌の存在を示すことができる。これに加えてまたはこれに代えて、高閾値のプロラクチンが検出されることにより、例えば、卵巣癌、乳癌、及び／または肺癌の存在を示すことができる。これに加えてまたはこれに代えて、高閾値のＨＦＧが検出されることにより、例えば、食道癌、胃癌、及び／または肝臓癌の存在を示すことができる。これに加えてまたはこれに代えて、高閾値のＯＰＮが検出されることにより、例えば、卵巣癌、乳癌、及び／または肺癌の存在を示すことができる。これに加えてまたはこれに代えて、高閾値のＴＩＭＰ−１が検出されることにより、例えば、結腸癌及び／または膵臓癌の存在を示すことができる。これに加えてまたはこれに代えて、高閾値のフォリスタチンが検出されることにより、例えば、卵巣癌及び／または肺癌の存在を示すことができる。これに加えてまたはこれに代えて、高閾値のＧ−ＣＳＦが検出されることにより、例えば、卵巣癌の存在を示すことができる。これに加えてまたはこれに代えて、高閾値のＣＡ１５−３が検出されることにより、例えば、乳癌の存在を示すことができる。様々ながん種で検出されるタンパク質バイオマーカーの例を、実施例２に示す。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）についてのアッセイを、タンパク質バイオマーカー上昇についてのアッセイと併用することで、低いステージの膵臓癌についての血液検査の感度を向上させることができる。いくつかの実施形態では、そのようながんの５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上を、患者によっては予後良好な場合も含めて、この併用検査を通じて検出することができる。いくつかの実施形態では、そのようながんの６４％が、患者によっては予後良好な場合も含めて、この併用検査を通じて検出することができる。本明細書中提供されるある特定の研究の計画特徴の１つは、切除可能な膵臓癌である患者のみを含めるというものであり、進行した疾患（すなわち、ステージＩＩＩまたはＩＶ）の患者は除外するというものであった。この除外は、そうしなければ、ステージに関わらず全ての膵臓癌患者を評価することにより達成可能であった感度を低下させたものの、切除可能な症例は、スクリーニング技術の評価に関して、有利な臨床的関連性を持つ有望な群を表す。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法を用いることで、対象（例えば、ヒト対象）における全ての膵臓癌を検出することができる。
【０１６１】
ｃｔＤＮＡに存在する遺伝子バイオマーカーとタンパク質マーカーを組み合わせることで、どちらか単独に勝る感度の向上が可能になるかどうかは、本開示の以前は不明であった。実際、検出可能な循環タンパク質マーカーを有する同一患者が、循環中にＤＮＡを放出しているものと大幅に重複することは考え得ることであった。このことは、特に、初期段階のがん患者に対する懸念であった。なぜなら、ｃｔＤＮＡ及びタンパク質系マーカーは、両方とも、初期段階のがん患者と比べて進行癌の患者で大幅に高いことが既知だからである（Ｌｅｎｎｏｎ  ＡＭ  ＆  Ｇｏｇｇｉｎｓ  Ｍ（２０１０）Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｍａｒｋｅｒｓ．Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ），ｐｐ  ６７５−７０１、Ｌｏｃｋｅｒ  ＧＹ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）ＡＳＣＯ  ２００６  ｕｐｄａｔｅ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｉｎ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２４（３３）：５３１３−５３２７、Ｂｅｔｔｅｇｏｗｄａ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｅａｒｌｙ−  ａｎｄ  ｌａｔｅ−ｓｔａｇｅ  ｈｕｍａｎ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６（２２４）：２２４ｒａ２２４）。
【０１６２】
本明細書中提供される方法の実施形態のいくつかにおいて、非常に高い特異性（例えば、９９．５％：９５％  ＣＩ  ９７〜１００％）を達成することができる。例えば、本明細書中提示される試験において、平均年齢６４歳の１８２人の健康個体のうち偽陽性は１例しか観察されなかった。一般集団におけるがんの相対的希少性を考慮すると、膵臓癌に有用である可能性がある血液系スクリーニング検査の特異性は、その検査が何であれ、高いことが好ましく、例えば、好ましくは＞９９％である。そうでないと、偽陽性の数が、真の陽性の数を大幅に超えると思われる（すなわち、最適陽性的中率を下回る）（Ｌｅｎｎｏｎ  ＡＭ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｔｈｅ  Ｅａｒｌｙ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ：Ｗｈａｔ  Ｗｉｌｌ  Ｉｔ  Ｔａｋｅ  ｔｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｅ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔ  Ｃｕｒａｂｌｅ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｎｅｏｐｌａｓｉａ？Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７４（１３）：３３８１−３３８９）。スクリーニング検査についてのそのような厳密性は、既知のがんを持つ患者において疾患をモニタリングする検査には、典型的には必要とされない。モニタリングの場合、特異性は、より高い感度を得るという利益のためにいくぶん緩和させることができる。高い特異性は、少なくとも２つのやり方で、本明細書中開示される様々な方法で達成された。第１に、ｃｔＤＮＡを検査の構成要素の１つとして使用した。ＫＲＡＳ変異は、見事なまでに腫瘍に特異的であり、それらの特異性は、従来、生物学的要因ではなく技術的要因により制限されてきた。分子バーコーディングを本明細書中記載される様々なアッセイに組み込むことで（例えば、Ｓａｆｅ−ＳｅｑＳ技法を用いて）、従来、あらゆるｃｔＤＮＡ系アッセイが直面してきた大きな技術課題であった、配列決定の結果が偽陽性となることを最小限に抑えることができる。ＫＲＡＳ変異は、早期検出戦略に特に適している。なぜなら、ＫＲＡＳ変異は、年齢関連クローン性造血の間に生じるクローンではめったに見つからないからである。そのようなクローンは、骨髄形成異常症の初期型を表す場合もあるが、それらは、偽陽性ｃｔＤＮＡアッセイの原因となる可能性がある。そのような変異の圧倒的多数は、９つの遺伝子（ＤＮＭＴ３Ａ、ＴＥＴ２、ＪＡＫ２、ＡＳＸＬ１、ＴＰ５３、ＧＮＡＳ、ＰＰＭ１Ｄ、ＢＣＯＲＬ１、及びＳＦ３Ｂ１）内で生じ（４８−５０）、ｃｔＤＮＡ系アッセイにおいてバイオマーカーとしてこれらの遺伝子を利用することの障害となっている。第２に、タンパク質マーカーを陽性として採点するために高い閾値を使用した。これらの閾値は、文献の先行研究または独立した対照セットに基づくものであり、健康な患者の圧倒的多数で陽性スコアを回避することを可能にした（Ｋｉｍ  ＪＥ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｕｓｅｆｕｌｎｅｓｓ  ｏｆ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  １９−９  ａｓ  ａ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｔｅｓｔ  ｆｏｒ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  ａｎ  ａｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ  １９（２）：１８２−１８６）。いくつかの実施形態では、そのような高い閾値は、感度を全体的に低下させることなく使用可能である。なぜなら、ｃｔＤＮＡアッセイは、それ自体感度を与え、ｃｔＤＮＡ陽性の症例は、タンパク質バイオマーカー陽性の症例と部分的にしか重複していなかったからである（例えば、図９、図１０、及び実施例２を参照）。
【０１６３】
タンパク質バイオマーカーは、これまで、互いに組み合わせられることで、より高い感度を達成してきた（Ｄｏｎｇ  Ｔ，Ｌｉｕ  ＣＣ，Ｐｅｔｒｉｃｏｉｎ  ＥＦ，＆  Ｔａｎｇ  ＬＬ（２０１４）Ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｗｉｔｈ  ａｎｄ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｔｈｅ  ｌｉｍｉｔ  ｏｆ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｓｔａｔ  Ｍｅｄ  ３３（８）：１３０７−１３２）。例えば、ＣＡ１９−９とＴＩＭＰ−１を組み合わせることで、ＰＤＡＣの検出について、一方のバイオマーカー単独よりも高感度になることが示された（Ｚｈｏｕ  Ｗ，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｂｙ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｐｒｅｖ  ７（２）：１０９−１１２）。さらに最近では、ＣＡ１９−９、ＴＩＭＰ−１、及びＬＲＧ−１の組み合わせが、初期ＰＤＡＣの検出について、ＣＡ１９−９単独よりも高感度になることが示された（Ｄｏｎｇ  Ｔ，Ｌｉｕ  ＣＣ，Ｐｅｔｒｉｃｏｉｎ  ＥＦ，＆  Ｔａｎｇ  ＬＬ（２０１４）Ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｗｉｔｈ  ａｎｄ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｔｈｅ  ｌｉｍｉｔ  ｏｆ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｓｔａｔ  Ｍｅｄ  ３３（８）：１３０７−１３２０）。タンパク質バイオマーカーと超高感度ｃｔＤＮＡの併用は、本明細書中開示されるとおり、別物である。最近の研究では、膵臓癌に関してｃｔＤＮＡとＣＡ１９−９の併用が評価されたが、ＣＡ１９−９単独に勝るバイオマーカー併用の利点は見つからなかった。理論に固執するつもりはないが、ＫＲＡＳ変異の検出に使用された検査の感度が不適切だったためにこの結論が導かれた可能性がある（Ｌｅ  Ｃａｌｖｅｚ−Ｋｅｌｍ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．（２０１６）ＫＲＡＳ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｂｌｏｏｄ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ＤＮＡ：ａ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｃａｓｅ−ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ  ７（４８）：７８８２７−７８８４０）。そのうえさらに、その研究で達成されたｃｔＤＮＡについての特異性は、比較的低く、スクリーニングに対する適性を低下させていた。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法を用いて、大多数の患者において非侵襲性血液検査を通じて切除可能ながんを検出することができる。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、本明細書中開示される様々な方法のいずれかを用いて得られる結果は、早期検出の延命効果を過小評価する可能性がある。本明細書中試験された患者の大多数は、切除可能ながんを有していたが、症候性であり、患者のがんは、患者の症候によってのみ発見された。したがって、本明細書中記載されるコホート中の患者の７７％は、ステージＩＩＢであり、これらの患者における腫瘍寸法の中央値は、３ｃｍであった。いくつかの実施形態では、無症候性個体のスクリーニング試験において、より大きい割合のより初期段階の患者を、より小さな腫瘍で、本明細書中開示される様々な方法のいずれかにより発見することができる。いくつかの実施形態では、本明細書中開示される様々な方法のどれでも、全ての腫瘍は外科的に切除可能ではあるが、腫瘍の小さい患者よりも腫瘍の大きく予後のより不良な患者の検出に対してより高感度となり得る（例えば、図９Ｂ、及び実施例２を参照）。いくつかの実施形態では、ＫＲＡＳ変異は、膵臓癌以外の種類のがんを有する患者、主に肺癌を有する患者の循環において見つかる可能性があり（Ｈｅｒｂｓｔ  ＲＳ，Ｈｅｙｍａｃｈ  ＪＶ，＆  Ｌｉｐｐｍａｎ  ＳＭ（２００８）Ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５９（１３）：１３６７−１３８０）、そしてＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、及びＯＰＮ発現は、複数の他のがん種で上昇する可能性がある（Ｋｉｍ  ＪＥ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｕｓｅｆｕｌｎｅｓｓ  ｏｆ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  １９−９  ａｓ  ａ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｔｅｓｔ  ｆｏｒ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  ａｎ  ａｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ  １９（２）：１８２−１８６、Ｔｈｏｍａｓ  ＤＳ，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｒｕｍ  ＣＥＡ，ＣＹＦＲＡ２１−１  ａｎｄ  ＣＡ１２５  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅａｒｌｙ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｕｓｉｎｇ  ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓａｍｐｌｅｓ．Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １１３（２）：２６８−２７４、Ｄｉ  Ｒｅｎｚｏ  ＭＦ，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅｔ／ＨＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １（２）：１４７−１５４、Ｅｌ−Ｔａｎａｎｉ  ＭＫ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ  ｉｎ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ  １７（６）：４６３−４７４）。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書中開示される様々な方法のいずれかを用いて検査陽性であった患者は、腫瘍の所在を同定するために追加の適切な画像化調査を受けることができる。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、ＰＤＡＣのリスクが高い患者の評価及び早期検出戦略の実現の基盤を築く（Ｋａｌｉｎｉｃｈ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ａｎ  ＲＮＡ−ｂａｓｅｄ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｅｎａｂｌｅｓ  ｈｉｇｈ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １１４（５）：１１２３−１１２８）。例として、初発糖尿病は、膵臓癌のリスク上昇と関連することが既知である。年齢５０歳以上の糖尿病患者の約１％は、糖尿病の基準を最初に満たしてから３年以内に膵臓癌と診断される（Ｃｈａｒｉ  ＳＴ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｄｉａｂｅｔｅｓ：ａ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  ｓｔｕｄｙ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２９（２）：５０４−５１１）。発生率１％の場合、本明細書中開示されるある特定の併用アッセイのＰＰＶ／ＮＰＶは、この集団において、それぞれ、５４％及び９９．６％であることが予想され、これは、現在承認されているがんのスクリーニング検査の範囲内に十分収まっている。
【０１６７】
入手可能な証拠は、多くのがんが、それらの初期段階において、ｃｔＤＮＡ中に存在する検出可能な遺伝子バイオマーカーを有し、膵臓癌で観察されるよりも一般的にそうである場合が多いことを示す（Ｂｅｔｔｅｇｏｗｄａ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｅａｒｌｙ−  ａｎｄ  ｌａｔｅ−ｓｔａｇｅ  ｈｕｍａｎ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６（２２４）：２２４ｒａ２２４）。同様に、多数のタンパク質バイオマーカーが、すでに、多数のがん種の検出について記載されている（Ｌｉｏｔｔａ  ＬＡ  ＆  Ｐｅｔｒｉｃｏｉｎ  ＥＦ，３ｒｄ（２００３）Ｔｈｅ  ｐｒｏｍｉｓｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．Ｃｌｉｎ  Ａｄｖ  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｏｎｃｏｌ  １（８）：４６０−４６２）。こうしたタンパク質バイオマーカーは、本明細書中記載される様々な方法のいずれかに従って閾値を設定することができ、様々ながん種の検出にｃｔＤＮＡ−タンパク質の併用を用いることを可能にする（Ｂｅｔｔｅｇｏｗｄａ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｅａｒｌｙ−  ａｎｄ  ｌａｔｅ−ｓｔａｇｅ  ｈｕｍａｎ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６（２２４）：２２４ｒａ２２４）。
【０１６８】
ある特定の態様において、本明細書中提供されるのは、特異性を保持したまま感度の改善されたがんスクリーニング検査として使用可能なアッセイである。いくつかの実施形態では、アッセイは、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）に存在する遺伝子バイオマーカーの変異の検出と血漿中の閾値化されたタンパク質バイオマーカーの検出を併用する。いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカーの存在についてのｃｔＤＮＡ検査のみを行う。いくつかの実施形態では、タンパク質バイオマーカー検査のみを行う。いくつかの実施形態では、ｃｔＤＮＡに存在する遺伝子バイオマーカー及びタンパク質マーカーの併用は、いずれの単一マーカーよりも優れている可能性がある。例えば、いくつかの実施形態では、この併用は、外科的切除の時点では遠隔転移のエビデンスを有さない膵臓癌の約３分の２を検出することができる。いくつかの実施形態では、高い精度での配列決定は、分析物が少量及び／または低い割合で存在する場合に、有利となり得る。高い精度での配列決定は、内在性であるか外来性であるかに関わらず、オリゴヌクレオチドバーコードを利用する場合がある。オリゴヌクレオチドバーコードは、例えば、外来性バーコードの場合、増幅によりテンプレート分析物に導入することができる。あるいは、内在性オリゴヌクレオチドバーコードは、例えば、ライゲーション手法により、オリゴヌクレオチドアダプター分子をそれに結合させることにより使用可能である。アダプター分子は、ＤＮＡ合成用、及び／または固体表面とのハイブリダイゼーション用のプライミング部位を含有することができる。アダプターは、内在性バーコードと直接隣接する、または内在性バーコードとの間に、決まった個数のヌクレオチドを挟んで隣接することができる。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドバーコードは、プロセシング前、特に増幅前に、試料中の個別のテンプレート分子を標識化することを可能にする。例えば、ファミリーメンバー（同一オリゴヌクレオチドバーコードを有する）の全てまたは高い割合またはある閾値の割合が変異を呈示することを必要条件にすることにより、増幅及び／または他のＤＮＡ合成もしくはプロセシング中に生じる偽陽性変異を除外するまたは最小限にすることが可能である。例えば、Ｋｉｎｄｅ  Ｉ，Ｗｕ  Ｊ，Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓ  Ｎ，Ｋｉｎｚｌｅｒ  ＫＷ，＆  Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  Ｂ（２０１１）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｒｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０８（２３）：９５３０−９５３５を参照、この内容は、明示的に参照により援用される。これに加えてまたはこれに代えて、変異を変異と判定するための閾値は、２つの異なるファミリーで生じることを必要とする。この性質についての複数のフィルターを適用することができる。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法を用いて、無細胞ＤＮＡに存在する循環腫瘍ＤＮＡの遺伝子変異（例えば、１つまたは複数の遺伝子変異）を検出することができ、無細胞ＤＮＡは、約１５００ｎｇ未満、例えば、約１４００ｎｇ未満、約１３００ｎｇ未満、約１２００ｎｇ未満、約１１００ｎｇ未満、約１０００ｎｇ未満、約９００ｎｇ未満、約８００ｎｇ未満、約７００ｎｇ未満、約６００ｎｇ未満、約５００ｎｇ未満、約４００ｎｇ未満、約３００ｎｇ未満、約２００ｎｇ未満、約１５０ｎｇ未満、約１００ｎｇ未満、約９５ｎｇ未満、約９０ｎｇ未満、約８５ｎｇ未満、約８０ｎｇ未満、約７５ｎｇ未満、約７０ｎｇ未満、約６５ｎｇ未満、約６０ｎｇ未満、約５５ｎｇ未満、約５０ｎｇ未満、約４５ｎｇ未満、約４０ｎｇ未満、約３５ｎｇ未満、約３０ｎｇ未満、約２５ｎｇ未満、約２０ｎｇ未満、約１５ｎｇ未満、約１０ｎｇ未満、または約５ｎｇ未満の量で存在する。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法を用いて、無細胞ＤＮＡに存在する循環腫瘍ＤＮＡの遺伝子変異（例えば、１つまたは複数の遺伝子変異）を検出することができ、循環腫瘍ＤＮＡは、無細胞ＤＮＡの１００％を占める。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法を用いて、無細胞ＤＮＡに存在する循環腫瘍ＤＮＡの遺伝子変異（例えば、１つまたは複数の遺伝子変異）を検出することができ、循環腫瘍ＤＮＡは、無細胞ＤＮＡの１００％未満、例えば無細胞ＤＮＡの約９５％、約９０％、約８５％、約８０％、約７５％、約７０％、約６５％、約６０％、約５５％、約５０％、約４５％、約４０％、約３５％、約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、約５％、約４％、約３％、約２％、約１％、約０．９５％、約０．９０％、約０．８５％、約０．８０％、約０．７５％、約０．７０％、約０．６５％、約０．６０％、約０．５５％、約０．５０％、約０．４５％、約０．４０％、約０．３５％、約０．３０％、約０．２５％、約０．２０％、約０．１５％、約０．１０％、約０．０９％、約０．０８％、約０．０７％、約０．０６％、約０．０５％、またはそれ以下を占める。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、無細胞ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）における変異）の存在は、対象（例えば、ヒト対象）から単離されたまたは得られた様々な生体試料のいずれかから検査することができ、そのような生体試料として、血液、血漿、血清、尿、脳脊髄液、唾液、痰、気管支肺胞洗浄検査、胆汁、リンパ液、嚢胞液、糞便、腹水、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）に存在する１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー及び１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーは、同一試料から検査可能である。例えば、単一試料を対象から単離するまた得ることができ、この単一試料を、無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）に存在する遺伝子バイオマーカー、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカー、あるいはその両方について検査することができる。無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在及び１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの存在は、同一時点でまたは異なる時点で試料から検査可能である。例えば、試料を、第１の時点で無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在について検査することができ、第２の時点で１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの存在について検査することができ、この逆もまた同様である。いくつかの実施形態では、試料を、将来の検査のために、冷蔵、冷凍、またはそれ以外で貯蔵することができる。いくつかの実施形態では、無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在及び１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの存在は、異なる試料から検査することができる。例えば、対象から第１の試料を単離しまたは得て、無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在について検査することができ、対象から第２の試料を単離しまたは得て、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの存在について検査することができる。第１の試料及び第２の試料は、同じ種類（例えば、血漿または血清）のものであることも、異なる種類のものであることも可能である。第１の試料及び／または第２の試料は、将来の検査のために、冷蔵、冷凍、またはそれ以外で貯蔵することができる。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、本明細書中開示される様々なアッセイのいずれかを繰り返して、変異検出の精度を上昇させることができる。アッセイは、例えば、２つ組または３つ組で行うことができる。いくつかの実施形態では、患者由来の同一の最初の試料で陽性アッセイを繰り返すことができる。これに加えてまたはこれに代えて、例えば、陽性結果が判明した場合、第２の試料を、後の時点で患者から得ることができる。ｃｔＤＮＡ及び／またはタンパク質バイオマーカーを含む本明細書中開示される様々なアッセイのどれでも、並列反復試験で繰り返すまたは実行することができる。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、無細胞ＤＮＡにおける変異）は、腫瘍抑制遺伝子またはがん遺伝子にあることが可能である。例えば、遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）は、変異のホットスポット、例えば、腫瘍または他のがんで頻繁にミュートされる部位にあることが可能である。いくつかの実施形態では、変異は、ＫＲＡＳにあること、例えば、１２番コドンまたは６１番コドンにあることが可能である。他の実施形態において、遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）は、ＫＲＡＳの他のコドンにあることが可能である。いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）は、ＣＤＫＮ２Ａにあることが可能であり（例えば、実施例２で同定されるＣＤＫＮ２Ａ変異のいずれか）。いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）は、以下の腫瘍抑制遺伝子またはがん遺伝子にあることが可能であるが、それらに限定されない：ＡＢＬ１、ＥＶＩ１、ＭＹＣ、ＡＰＣ、ＩＬ２、ＴＮＦＡＩＰ３、ＡＢＬ２、ＥＷＳＲ１、ＭＹＣＬ１、ＡＲＨＧＥＦ１２、ＪＡＫ２、ＴＰ５３、ＡＫＴ１、ＦＥＶ、ＭＹＣＮ、ＡＴＭ、ＭＡＰ２Ｋ４、ＴＳＣ１、ＡＫＴ２、ＦＧＦＲ１、ＮＣＯＡ４、ＢＣＬ１１Ｂ、ＭＤＭ４、ＴＳＣ２、ＡＴＦ１、ＦＧＦＲ１ＯＰ、ＮＦＫＢ２、ＢＬＭ、ＭＥＮ１、ＶＨＬ、ＢＣＬ１１Ａ、ＦＧＦＲ２、ＮＲＡＳ、ＢＭＰＲ１Ａ、ＭＬＨ１、ＷＲＮ、ＢＣＬ２、ＦＵＳ、ＮＴＲＫ１、ＢＲＣＡ１、ＭＳＨ２、ＷＴ１、ＢＣＬ３、ＧＯＬＧＡ５、ＮＵＰ２１４、ＢＲＣＡ２、ＮＦ１、ＢＣＬ６、ＧＯＰＣ、ＰＡＸ８、ＣＡＲＳ、ＮＦ２、ＢＣＲ、ＨＭＧＡ１、ＰＤＧＦＢ、ＣＢＦＡ２Ｔ３、ＮＯＴＣＨ１、ＢＲＡＦ、ＨＭＧＡ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＣＤＨ１、ＮＰＭ１、ＣＡＲＤ１１、ＨＲＡＳ、ＰＩＭ１、ＣＤＨ１１、ＮＲ４Ａ３、ＣＢＬＢ、ＩＲＦ４、ＰＬＡＧ１、ＣＤＫ６、ＮＵＰ９８、ＣＢＬＣ、ＪＵＮ、ＰＰＡＲＧ、ＳＭＡＤ４、ＰＡＬＢ２、ＣＣＮＤ１、ＫＩＴ、ＰＴＰＮ１１、ＣＥＢＰＡ、ＰＭＬ、ＣＣＮＤ２、ＫＲＡＳ、ＲＡＦ１、ＣＨＥＫ２、ＰＴＥＮ、ＣＣＮＤ３、ＬＣＫ、ＲＥＬ、ＣＲＥＢ１、ＲＢ１、ＣＤＸ２、ＬＭＯ２、ＲＥＴ、ＣＲＥＢＢＰ、ＲＵＮＸ１、ＣＴＮＮＢ１、ＭＡＦ、ＲＯＳ１、ＣＹＬＤ、ＳＤＨＢ、ＤＤＢ２、ＭＡＦＢ、ＳＭＯ、ＤＤＸ５、ＳＤＨＤ、ＤＤＩＴ３、ＭＡＭＬ２、ＳＳ１８、ＥＸＴ１、ＳＭＡＲＣＡ４、ＤＤＸ６、ＭＤＭ２、ＴＣＬ１Ａ、ＥＸＴ２、ＳＭＡＲＣＢ１、ＤＥＫ、ＭＥＴ、ＴＥＴ２、ＦＢＸＷ７、ＳＯＣＳ１、ＥＧＦＲ、ＭＩＴＦ、ＴＦＧ、ＦＨ、ＳＴＫ１１、ＥＬＫ４、ＭＬＬ、ＴＬＸ１、ＦＬＴ３、ＳＵＦＵ、ＥＲＢＢ２、ＭＰＬ、ＴＰＲ、ＦＯＸＰ１、ＳＵＺ１２、ＥＴＶ４、ＭＹＢ、ＵＳＰ６、ＧＰＣ３、ＳＹＫ、ＥＴＶ６、ＩＤＨ１、及びＴＣＦ３。いくつかの実施形態では、タンパク質バイオマーカーは、対象（例えば、ヒト対象）から単離されたまたは得られた様々な生体試料のいずれかから検査することができ、そのような生体試料として、血液、血漿、血清、尿、脳脊髄液、唾液、痰、気管支肺胞洗浄検査、胆汁、リンパ液、嚢胞液、糞便、腹水、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。がんで大量に見つかるタンパク質バイオマーカーは、健康なヒト対象では生じない量のタンパク質バイオマーカーの量について検査することができる。タンパク質バイオマーカーの例として、そのうちの任意の１つ、２つ、３つ、または４つが検査され得るものとして、制限なく、炭水化物抗原１９−９（ＣＡ１９−９）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、及びオステオポンチン（ＯＰＮ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＣＡ１９−９の閾値は、少なくとも約１００Ｕ／ｍＬ（例えば、約１００Ｕ／ｍＬ）が可能である。いくつかの実施形態では、ＣＡ１９−９の閾値は、１００Ｕ／ｍＬが可能である。いくつかの実施形態では、ＣＥＡの閾値は、少なくとも約７．５ｎｇ／ｍＬ（例えば、約７．５ｎｇ／ｍＬ）が可能である。いくつかの実施形態では、ＣＥＡの閾値は、７．５ｎｇ／ｍＬが可能である。いくつかの実施形態では、ＨＧＦの閾値は、少なくとも約０．９２ｎｇ／ｍＬ（例えば、約０．９２ｎｇ／ｍＬ）が可能である。いくつかの実施形態では、ＨＧＦの閾値は、０．９２ｎｇ／ｍＬが可能である。いくつかの実施形態では、ＯＰＮの閾値は、少なくとも約１５８ｎｇ／ｍＬ（例えば、約１５８ｎｇ／ｍＬ）が可能である。いくつかの実施形態では、ＯＰＮの閾値は、１５８ｎｇ／ｍＬが可能である。いくつかの実施形態では、ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、及び／またはＯＰＮの閾値は、上記に列挙した閾値より５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、またはそれ以上に高い（例えば、ＣＡ−１９−９の１００Ｕ／ｍＬ、ＣＥＡの７．５ｎｇ／ｍＬ、ＨＧＦの０．９２ｎｇ／ｍＬ、及び／またはＯＰＮの１５８ｎｇ／ｍＬという閾値より高い）可能性がある。
【０１７４】
正常で健康なヒト対象では超えないが、がんを有するヒト対象では超える閾値が得られる場合に、当該分野で既知である任意のタンパク質バイオマーカーを使用することができる。そのようなタンパク質バイオマーカーの限定ではなく例として、翻訳伸長因子（ＥＥＦ１Ａ１）；グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）；アクチンガンマ（ＡＣＴＧ１）；フェリチン、重鎖ポリペプチド１（ＦＴＨ１）；真核生物翻訳伸長因子１ガンマ（ＥＥＦ１Ｇ）；リボソームタンパク質、大サブユニット、Ｐ０（ＲＰＬＰ０）；熱ショックタンパク質９０ｋＤａアルファ（細胞質）、クラスＢメンバー１（ＨＳＰ９０ＡＢ１）；ピルビン酸キナーゼ、筋肉（ＰＫＭ２）；フェリチン、軽鎖ポリペプチド（ＦＴＬ）；及びリボソームタンパク質Ｌ３（ＲＰＬ３）が挙げられる。血清で過剰発現することが既知であるタンパク質バイオマーカーとして、トランスフェリン、α−１アンチトリプシン、アポリポタンパク質１、補体ｃ３ａ、カベオリン−１、カリクレイン６、グルコース制御タンパク質−８、αデフェンシン−１、−２、−３、血清Ｃ−ペプチド、アルファ−２−ＨＳグリコールタンパク質、カテニン、デフェンシンα６、ＭＭＰ、サイクリンＤ、Ｓ１００Ｐ、ラミンＡ／Ｃ線維タンパク質、及びＴｘｌ−２、（チオレドキシン様タンパク質−２）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、アッセイは、遺伝子バイオマーカー（例えば、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）における変異）を検出せずに、生体試料（例えば、血漿など本明細書中開示される任意の生体試料）中の閾値化されたタンパク質バイオマーカーを検出することを含む。例えば、アッセイは、生体試料中のＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、及び／またはＯＰＮのうち１種または複数を検出することを含むことができる。いくつかの実施形態では、アッセイは、生体試料中のＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、及び／またはＯＰＮのうち１種または複数を、本明細書中開示される閾値のいずれかで検出することを含むことができる。いくつかの実施形態では、生体試料中の閾値化されたタンパク質バイオマーカーの検出を含むアッセイが行われたら、後続の検査またはモニタリングが行われる（例えば、本明細書中開示される様々なさらなる診断検査またはより詳しいモニタリング技法のいずれか）。いくつかの実施形態では、生体試料中の閾値化されたタンパク質バイオマーカーの検出を含むアッセイが行われたら、無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）に存在する１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーを検出することを含む第２のアッセイ（例えば、本明細書中記載されるとおり無細胞ＤＮＡまたはｃｔＤＮＡ中に存在する様々な遺伝子変異のいずれかを検出する）を、行うことができる。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、アッセイは、閾値化されたタンパク質バイオマーカーを検出せずに、生体試料（例えば、血漿など本明細書中開示される任意の生体試料）中の循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）に存在する１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーを検出することを含む。例えば、アッセイは、本明細書中開示される遺伝子のいずれかの１つまたは複数における遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）を検出することを含むことができ、そのような遺伝子として、制限なく、ＣＤＫＮ２Ａ、ＦＧＦ２、ＧＮＡＳ、ＡＢＬ１、ＥＶＩ１、ＭＹＣ、ＡＰＣ、ＩＬ２、ＴＮＦＡＩＰ３、ＡＢＬ２、ＥＷＳＲ１、ＭＹＣＬ１、ＡＲＨＧＥＦ１２、ＪＡＫ２、ＴＰ５３、ＡＫＴ１、ＦＥＶ、ＭＹＣＮ、ＡＴＭ、ＭＡＰ２Ｋ４、ＴＳＣ１、ＡＫＴ２、ＦＧＦＲ１、ＮＣＯＡ４、ＢＣＬ１１Ｂ、ＭＤＭ４、ＴＳＣ２、ＡＴＦ１、ＦＧＦＲ１ＯＰ、ＮＦＫＢ２、ＢＬＭ、ＭＥＮ１、ＶＨＬ、ＢＣＬ１１Ａ、ＦＧＦＲ２、ＮＲＡＳ、ＢＭＰＲ１Ａ、ＭＬＨ１、ＷＲＮ、ＢＣＬ２、ＦＵＳ、ＮＴＲＫ１、ＢＲＣＡ１、ＭＳＨ２、ＷＴ１、ＢＣＬ３、ＧＯＬＧＡ５、ＮＵＰ２１４、ＢＲＣＡ２、ＮＦ１、ＢＣＬ６、ＧＯＰＣ、ＰＡＸ８、ＣＡＲＳ、ＮＦ２、ＢＣＲ、ＨＭＧＡ１、ＰＤＧＦＢ、ＣＢＦＡ２Ｔ３、ＮＯＴＣＨ１、ＢＲＡＦ、ＨＭＧＡ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＣＤＨ１、ＮＰＭ１、ＣＡＲＤ１１、ＨＲＡＳ、ＰＩＭ１、ＣＤＨ１１、ＮＲ４Ａ３、ＣＢＬＢ、ＩＲＦ４、ＰＬＡＧ１、ＣＤＫ６、ＮＵＰ９８、ＣＢＬＣ、ＪＵＮ、ＰＰＡＲＧ、ＳＭＡＤ４、ＰＡＬＢ２、ＣＣＮＤ１、ＫＩＴ、ＰＴＰＮ１１、ＣＥＢＰＡ、ＰＭＬ、ＣＣＮＤ２、ＫＲＡＳ、ＲＡＦ１、ＣＨＥＫ２、ＰＴＥＮ、ＣＣＮＤ３、ＬＣＫ、ＲＥＬ、ＣＲＥＢ１、ＲＢ１、ＣＤＸ２、ＬＭＯ２、ＲＥＴ、ＣＲＥＢＢＰ、ＲＵＮＸ１、ＣＴＮＮＢ１、ＭＡＦ、ＲＯＳ１、ＣＹＬＤ、ＳＤＨＢ、ＤＤＢ２、ＭＡＦＢ、ＳＭＯ、ＤＤＸ５、ＳＤＨＤ、ＤＤＩＴ３、ＭＡＭＬ２、ＳＳ１８、ＥＸＴ１、ＳＭＡＲＣＡ４、ＤＤＸ６、ＭＤＭ２、ＴＣＬ１Ａ、ＥＸＴ２、ＳＭＡＲＣＢ１、ＤＥＫ、ＭＥＴ、ＴＥＴ２、ＦＢＸＷ７、ＳＯＣＳ１、ＥＧＦＲ、ＭＩＴＦ、ＴＦＧ、ＦＨ、ＳＴＫ１１、ＥＬＫ４、ＭＬＬ、ＴＬＸ１、ＦＬＴ３、ＳＵＦＵ、ＥＲＢＢ２、ＭＰＬ、ＴＰＲ、ＦＯＸＰ１、ＳＵＺ１２、ＥＴＶ４、ＭＹＢ、ＵＳＰ６、ＧＰＣ３、ＳＹＫ、ＥＴＶ６、ＩＤＨ１、及び／またはＴＣＦ３を挙げることができる。いくつかの実施形態では、アッセイは、ＫＲＡＳにおける（例えば、ＫＲＡＳの１２番コドンまたは６１番コドンにおける）遺伝子変異の検出を含むことができる。いくつかの実施形態では、生体試料中のｃｔＤＮＡに存在する１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの検出を含むアッセイが行われたら、後続の検査またはモニタリングが行われる（例えば、本明細書中開示される様々なさらなる診断検査またはより詳しいモニタリング技法のいずれか）。いくつかの実施形態では、生体試料中のｃｔＤＮＡに存在する１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの検出を含むアッセイが行われたら、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーを高閾値で検出することを含む第２のアッセイを行うことができる（例えば、本明細書中記載される様々なタンパク質バイオマーカーのいずれかを検出すること、そのようなタンパク質バイオマーカーとして、炭水化物抗原１９−９（ＣＡ１９−９）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、オステオポンチン（ＯＰＮ）、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない）。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）に存在する１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー及び／または１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーを、対象（例えば、ヒト対象）から単離されたまたは得られた様々な生体試料のいずれかから検査することができ、そのような生体試料として、血液、血漿、血清、尿、脳脊髄液、唾液、痰、気管支肺胞洗浄検査、胆汁、リンパ液、嚢胞液、糞便、腹水、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）に存在する１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー及び／または１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーを、同一試料から検査可能である。例えば、単一試料を対象から単離するまた得ることができ、この単一試料を、無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの存在、あるいはその両方について検査することができる。無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）に存在する遺伝子バイオマーカー及び１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーは、同一時点でまたは異なる時点で試料から検査可能である。例えば、試料を、第１の時点で無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在について検査することができ、第２の時点で１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの存在について検査することができ、この逆もまた同様である。いくつかの実施形態では、試料を、将来の検査のために、冷蔵、冷凍、またはそれ以外で貯蔵することができる。いくつかの実施形態では、無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在及び１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの存在は、異なる試料から検査することができる。例えば、対象から第１の試料を単離しまたは得て、無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在について検査することができ、対象から第２の試料を単離しまたは得て、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの存在について検査することができる。第１の試料及び第２の試料は、同じ種類（例えば、血漿または血清）のものであることも、異なる種類のものであることも可能である。第１の試料及び／または第２の試料は、将来の検査のために、冷蔵、冷凍、またはそれ以外で貯蔵することができる。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、腫瘍抑制遺伝子またはがん遺伝子の複数のコドンまたは遺伝子領域を検査して、遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を同定する場合がある。例えば、遺伝子中の少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、またはそれ以上のコドンまたは遺伝子領域を検査する場合がある。これに加えてまたはこれに代えて、複数種のがんまたは単一種内での複数のがんについてのアッセイの範囲を広げるために複数の遺伝子を検査する場合がある。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、放射線技法、超音波検査技法、または他の技法を、遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）が検出された任意の対象（例えば、ヒト対象）に適用することができる。そのような技法は、全身、単一臓器、または身体のある領域に対して施行することができる。そのような技法は、例えば、特定種のがんが存在することを確認するため、がんが存在することを確認するため、または身体中のがんの場所を同定するために、用いることができる。いくつかの実施形態では、そのような技法は、スキャンである。いくつかの実施形態では、スキャンは、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、ＣＴ血管造影法（ＣＴＡ）、食道造影図（バリウム飲み込み）、バリウム注腸、核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、ＰＥＴスキャン、超音波検査（例えば、超音波気管支内検査、超音波内視鏡検査）、Ｘ線、ＤＥＸＡスキャン、またはポジトロン断層撮影法及びコンピュータ断層撮影法（ＰＥＴ−ＣＴ）スキャンである。いくつかの実施形態では、そのような技法は、理学的検査、例えば、肛門鏡検査、気管支鏡検査（例えば、自己蛍光気管支鏡検査、白色光気管支鏡検査、誘導式気管支鏡検査）、大腸内視鏡検査、デジタル乳房トモシンセシス、内視鏡的逆行性胆道膵管造影（ＥＲＣＰ）、上部消化管内視鏡検査、マンモグラフィ、パップスメア、または婦人科内診であり、いくつかの実施形態では、そのような技法は、生検（例えば、骨髄穿刺、組織生検）である。いくつかの実施形態では、生検は、細針穿刺吸引により、または外科的切除により行われる。いくつかの実施形態では、そのような技法は、さらに、生体試料（例えば、組織試料、尿試料、血液試料、拭き取り検体、唾液試料、粘膜試料（例えば、痰、気管支分泌物）、乳頭吸引液、分泌物、または、排泄物など）を得ることを含む。いくつかの実施形態では、そのような技法は、エキソソームタンパク質（例えば、エキソソーム表面タンパク質（例えば、ＣＤ２４、ＣＤ１４７、ＰＣＡ−３））を特定することを含む（Ｓｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｃａｎｃｅｒｓ  ９（１）：ｐｉｉ：Ｅ８）。いくつかの実施形態では、診断検査法は、オンコタイプＤＸ（登録商標）検査である（Ｂａｅｈｎｅｒ（２０１６）Ｅｃａｎｃｅｒｍｅｄｉｃａｌｓｃｉｅｎｃｅ  １０：６７５）。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、本明細書中記載される様々な方法のいずれかによって、膵臓癌以外の臓器のがんを検出することができる。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法（例えば、対象から単離された生体試料において、無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在及び１つまたは複数の高閾値タンパク質バイオマーカーの存在を検出する方法）は、対象のための治療を選択するために使用することができる。例えば、本明細書中開示される様々な方法のいずれかにより、対象ががん（例えば、膵臓癌）を有すると判定されたら、適切な治療（例えば、本明細書中記載される様々な治療介入のいずれか）を選択することができる。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法（例えば、対象から単離された生体試料において、無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在及び１つまたは複数の高閾値タンパク質バイオマーカーの存在を検出する方法）は、治療の対象を選択するために使用することができる。例えば、本明細書中開示される様々な方法のいずれかにより、対象ががん（例えば、膵臓癌）を有すると判定されたら、その対象は、治療（例えば、本明細書中記載される様々な治療介入のいずれか）を受けるのにふさわしい対象として同定することができる。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法（例えば、対象から単離された生体試料において、無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在及び１つまたは複数の高閾値タンパク質バイオマーカーの存在を検出する方法）は、より詳しいモニタリングの対象を選択するために使用することができる。例えば、本明細書中開示される様々な方法のいずれかにより、対象ががん（例えば、膵臓癌）を有すると判定されたら、その対象は、より詳しいモニタリング（例えば、本明細書中開示される様々なモニタリング技法のいずれか）を受けるのにふさわしい対象として同定することができる。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法（例えば、対象から単離された生体試料において、無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在及び１つまたは複数の高閾値タンパク質バイオマーカーの存在を検出する方法）は、さらなる診断検査の対象を選択するために使用することができる。例えば、本明細書中開示される様々な方法のいずれかにより、対象ががん（例えば、膵臓癌）を有すると判定されたら、その対象は、さらなる診断検査（例えば、本明細書中記載される様々な診断技法のいずれか）を受けるのにふさわしい対象として同定することができる。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法を使用することで、対象が初期段階のがんであると診断される前の時点、及び／または対象ががんに関連した症候を呈示する前の時点で、がん（例えば、膵臓癌）の存在を検出することができる。例えば、本明細書中提供される方法は、対象ががんと診断されていない場合、及び／または対象ががん細胞を保有することが知られていない場合に、使用することができる。
【０１８３】
本明細書中記載される方法のいずれかの実施形態のいくつかにおいて、対象には、本明細書中記載される治療介入のいずれかの単回または複数用量（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回用量）を投与することができる。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）についてのアッセイを、タンパク質バイオマーカー上昇についてのアッセイと併用することで、低いステージの膵臓癌についての血液検査の感度を向上させることができる。いくつかの実施形態では、そのようながんの５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上を、患者によっては予後良好な場合も含めて、この併用検査を通じて検出することができる。いくつかの実施形態では、そのようながんの６４％が、患者によっては予後良好な場合も含めて、この併用検査を通じて検出することができる。本明細書中提供されるある特定の試験の設計上の特徴の１つは、切除可能な膵臓癌である患者のみを含めるというものであり、進行した疾患（すなわち、ステージＩＩＩまたはＩＶ）の患者は除外するというものであった。この除外は、そうしなければ、ステージに関わらず全ての膵臓癌患者を評価することにより達成可能であった感度を低下させたものの、切除可能な症例は、スクリーニング技術の評価に関して、有利な臨床的関連性を持つ有望な群を表す。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法を用いることで、対象（例えば、ヒト対象）における全ての膵臓癌を検出することができる。
【０１８５】
ｃｔＤＮＡに存在する遺伝子バイオマーカーとタンパク質バイオマーカーを組み合わせることで、どちらか単独に勝る感度の向上が可能になるかどうかは、本開示の以前は不明であった。実際、検出可能な循環タンパク質マーカーを有する同一患者が、循環中にＤＮＡを放出しているものと大幅に重複することは考え得ることであった。このことは、特に、初期段階のがん患者に対する懸念であった。なぜなら、ｃｔＤＮＡ及びタンパク質系マーカーは、両方とも、初期段階のがん患者と比べて進行癌の患者で大幅に高いことが既知だからである（Ｌｅｎｎｏｎ  ＡＭ  ＆  Ｇｏｇｇｉｎｓ  Ｍ（２０１０）Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｍａｒｋｅｒｓ．Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ），ｐｐ  ６７５−７０１、Ｌｏｃｋｅｒ  ＧＹ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）ＡＳＣＯ  ２００６  ｕｐｄａｔｅ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｉｎ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２４（３３）：５３１３−５３２７、Ｂｅｔｔｅｇｏｗｄａ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｅａｒｌｙ−  ａｎｄ  ｌａｔｅ−ｓｔａｇｅ  ｈｕｍａｎ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６（２２４）：２２４ｒａ２２４）。
【０１８６】
本明細書中提供される方法の実施形態のいくつかにおいて、非常に高い特異性（例えば、９９．５％：９５％  ＣＩ  ９７〜１００％）を達成することができる。例えば、本明細書中提示される試験において、平均年齢６４歳の１８２人の健康個体のうち偽陽性は１例しか観察されなかった。一般集団におけるがんの相対的希少性を考慮すると、膵臓癌に有用である可能性がある血液系スクリーニング検査の特異性は、その検査が何であれ、高いことが好ましく、例えば、好ましくは９９％超である。そうでないと、偽陽性の数が、真の陽性の数を大幅に超えると思われる（すなわち、最適陽性的中率を有下回る）（Ｌｅｎｎｏｎ  ＡＭ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｔｈｅ  Ｅａｒｌｙ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ：Ｗｈａｔ  Ｗｉｌｌ  Ｉｔ  Ｔａｋｅ  ｔｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｅ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔ  Ｃｕｒａｂｌｅ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｎｅｏｐｌａｓｉａ？Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７４（１３）：３３８１−３３８９）。スクリーニング検査についてのそのような厳密性は、既知のがんを持つ患者において疾患をモニタリングする検査には、典型的には必要とされない。モニタリングの場合、特異性は、より高い感度を得るという利益のためにいくぶん緩和させることができる。高い特異性は、少なくとも２つのやり方で、本明細書中開示される様々な方法で達成された。第１に、ｃｔＤＮＡを検査の構成要素の１つとして使用した。ＫＲＡＳ変異は、見事なまでに腫瘍に特異的であり、それらの特異性は、従来、生物学的要因ではなく技術的要因により制限されてきた。分子バーコーディングを本明細書中記載される様々なアッセイに組み込むことで（例えば、Ｓａｆｅ−ＳｅｑＳ技法を用いて）、従来、あらゆるｃｔＤＮＡ系アッセイが直面してきた大きな技術課題であった、配列決定の結果が偽陽性となることを最小限に抑えることができる。ＫＲＡＳ変異は、早期検出戦略に特に適している。なぜなら、ＫＲＡＳ変異は、年齢関連クローン性造血の間に生じるクローンではめったに見つからないからである。そのようなクローンは、骨髄形成異常症の初期型を表す場合もあるが、それらは、偽陽性ｃｔＤＮＡアッセイの原因となる可能性がある。そのような変異の圧倒的多数は、９つの遺伝子（ＤＮＭＴ３Ａ、ＴＥＴ２、ＪＡＫ２、ＡＳＸＬ１、ＴＰ５３、ＧＮＡＳ、ＰＰＭ１Ｄ、ＢＣＯＲＬ１、及びＳＦ３Ｂ１）内で生じ（４８−５０）、ｃｔＤＮＡ系アッセイにおいてバイオマーカーとしてこれらの遺伝子を利用することの障害となっている。第２に、タンパク質マーカーを陽性として採点するために高い閾値を使用した。これらの閾値は、文献の先行研究または独立した対照セットに基づくものであり、健康な患者の圧倒的多数で陽性スコアを回避することを可能にした（Ｋｉｍ  ＪＥ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｕｓｅｆｕｌｎｅｓｓ  ｏｆ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  １９−９  ａｓ  ａ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｔｅｓｔ  ｆｏｒ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  ａｎ  ａｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ  １９（２）：１８２−１８６）。いくつかの実施形態では、そのような高い閾値は、感度を全体的に低下させることなく使用可能である。なぜなら、ｃｔＤＮＡアッセイは、それ自体感度を与え、ｃｔＤＮＡ陽性の症例は、タンパク質バイオマーカー陽性の症例と部分的にしか重複していなかったからである（例えば、図９、図１０、及び実施例２を参照）。
【０１８７】
タンパク質バイオマーカーは、これまで、互いに組み合わせられることで、より高い感度を達成してきた（Ｄｏｎｇ  Ｔ，Ｌｉｕ  ＣＣ，Ｐｅｔｒｉｃｏｉｎ  ＥＦ，＆  Ｔａｎｇ  ＬＬ（２０１４）Ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｗｉｔｈ  ａｎｄ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｔｈｅ  ｌｉｍｉｔ  ｏｆ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｓｔａｔ  Ｍｅｄ  ３３（８）：１３０７−１３２０）。例えば、ＣＡ１９−９とＴＩＭＰ−１を組み合わせることで、ＰＤＡＣの検出について、いずれのバイオマーカー単独よりも高感度になることが示された（Ｚｈｏｕ  Ｗ，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｂｙ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｐｒｅｖ  ７（２）：１０９−１１２）。さらに最近では、ＣＡ１９−９、ＴＩＭＰ−１、及びＬＲＧ−１の組み合わせが、初期ＰＤＡＣの検出について、ＣＡ１９−９単独よりも高感度になることが示された（Ｃａｐｅｌｌｏ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｌｏｏｄ−Ｂａｓｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  Ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ  ｆｏｒ  Ｅａｒｌｙ−Ｓｔａｇｅ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ．Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  １０９（４））。タンパク質バイオマーカーと超高感度ｃｔＤＮＡの併用は、本明細書中開示されるとおり、別物である。最近の研究では、膵臓癌に関してｃｔＤＮＡとＣＡ１９−９の併用が評価されたが、ＣＡ１９−９単独に勝るバイオマーカー併用の利点は見つからなかった。理論に固執するつもりはないが、ＫＲＡＳ変異の検出に使用された検査の感度が不適切だったためにこの結論が導かれた可能性がある（Ｌｅ  Ｃａｌｖｅｚ−Ｋｅｌｍ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．（２０１６）ＫＲＡＳ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｂｌｏｏｄ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ＤＮＡ：ａ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｃａｓｅ−ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ  ７（４８）：７８８２７−７８８４０）。そのうえさらに、その研究で達成されたｃｔＤＮＡについての特異性は、比較的低く、スクリーニングに対する適性を低下させていた。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法を用いて、大多数の患者において非侵襲性血液検査を通じて切除可能な膵臓癌を検出することができる。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、本明細書中開示される様々な方法のいずれかを用いて得られる結果は、早期検出の延命効果を過小評価する可能性がある。本明細書中試験された患者の大多数は、切除可能ながんを有していたが、症候性であり、患者のがんは、患者の症候によってのみ発見された。したがって、本明細書中記載されるコホート中の患者の７７％は、ステージＩＩＢであり、これらの患者における腫瘍寸法の中央値は、３ｃｍであった。いくつかの実施形態では、無症候性個体のスクリーニング試験において、より大きい割合のより初期段階の患者を、より腫瘍で、本明細書中開示される様々な方法のいずれかにより発見することができる。いくつかの実施形態では、本明細書中開示される様々な方法のどれでも、全ての腫瘍は外科的に切除可能ではあるが、腫瘍の小さい患者よりも腫瘍の大きく予後のより不良な患者の検出に対してより高感度となり得る（例えば、図９Ｂ、及び実施例２を参照）。いくつかの実施形態では、ＫＲＡＳ変異は、膵臓癌以外の種類のがんを有する患者、主に肺癌を有する患者の循環において見つかる可能性があり（Ｈｅｒｂｓｔ  ＲＳ，Ｈｅｙｍａｃｈ  ＪＶ，＆  Ｌｉｐｐｍａｎ  ＳＭ（２００８）Ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５９（１３）：１３６７−１３８０）、そしてＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、及びＯＰＮ発現は、複数の他のがん種で上昇する可能性がある（Ｋｉｍ  ＪＥ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｕｓｅｆｕｌｎｅｓｓ  ｏｆ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  １９−９  ａｓ  ａ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｔｅｓｔ  ｆｏｒ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  ａｎ  ａｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ  １９（２）：１８２−１８６、Ｔｈｏｍａｓ  ＤＳ，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｒｕｍ  ＣＥＡ，ＣＹＦＲＡ２１−１  ａｎｄ  ＣＡ１２５  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅａｒｌｙ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｕｓｉｎｇ  ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓａｍｐｌｅｓ．Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １１３（２）：２６８−２７４、Ｄｉ  Ｒｅｎｚｏ  ＭＦ，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅｔ／ＨＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １（２）：１４７−１５４、Ｅｌ−Ｔａｎａｎｉ  ＭＫ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ  ｉｎ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ  １７（６）：４６３−４７４）。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書中開示される様々な方法のいずれかを用いて検査陽性であった患者は、腫瘍の所在を同定するために追加の適切な画像化調査を受けることができる。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、ＰＤＡＣのリスクが高い患者の評価及び早期検出戦略の実現の基盤を築く（Ｋａｌｉｎｉｃｈ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ａｎ  ＲＮＡ−ｂａｓｅｄ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｅｎａｂｌｅｓ  ｈｉｇｈ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １１４（５）：１１２３−１１２８）。例として、初発糖尿病は、膵臓癌のリスク上昇と関連することが既知である。年齢５０歳以上の糖尿病患者の約１％は、糖尿病の基準を最初に満たしてから３年以内に膵臓癌と診断される（Ｃｈａｒｉ  ＳＴ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｄｉａｂｅｔｅｓ：ａ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  ｓｔｕｄｙ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２９（２）：５０４−５１１）。発生率１％の場合、本明細書中開示されるある特定の併用アッセイのＰＰＶ／ＮＰＶは、この集団において、それぞれ、５４％及び９９．６％であることが予想され、これは、現在承認されているがんのスクリーニング検査の範囲内に十分収まっている。
【０１９１】
入手可能な証拠は、多くのがんが、それらの初期段階において、検出可能なｃｔＤＮＡを有し、膵臓癌で観察されるよりも一般的にそうである場合が多いことを示す（Ｂｅｔｔｅｇｏｗｄａ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｅａｒｌｙ−  ａｎｄ  ｌａｔｅ−ｓｔａｇｅ  ｈｕｍａｎ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６（２２４）：２２４ｒａ２２４）。同様に、多数のタンパク質バイオマーカーが、すでに、多数のがん種の検出について記載されている（Ｌｉｏｔｔａ  ＬＡ  ＆  Ｐｅｔｒｉｃｏｉｎ  ＥＦ，３ｒｄ（２００３）Ｔｈｅ  ｐｒｏｍｉｓｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．Ｃｌｉｎ  Ａｄｖ  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｏｎｃｏｌ  １（８）：４６０−４６２）。こうしたタンパク質バイオマーカーは、本明細書中記載される様々な方法のいずれかに従って閾値を設定することができ、様々ながん種の検出にｃｔＤＮＡ−タンパク質の併用を用いることを可能にする（Ｂｅｔｔｅｇｏｗｄａ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｅａｒｌｙ−  ａｎｄ  ｌａｔｅ−ｓｔａｇｅ  ｈｕｍａｎ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６（２２４）：２２４ｒａ２２４）。
【０１９２】
遺伝子バイオマーカーと異数性との併用
１つの態様において、本明細書中提供されるのは、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出するための方法及び物質である。別の態様において、本明細書中提供されるのは、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することにより、対象における疾患の存在を診断または同定する（例えば、対象を、がんを有すると同定する）ための方法及び物質である。別の態様において、本明細書中提供されるのは、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することにより、対象を、疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があるとして同定するための方法及び物質である。別の態様において、本明細書中提供されるのは、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することにより、疾患（例えば、がん）を有すると診断または同定された、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された対象を治療するための方法及び物質である。別の態様において、本明細書中提供されるのは、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することにより、疾患（例えば、がん）を有すると診断または同定された、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された対象の治療を同定するための方法及び物質である。別の態様において、本明細書中提供されるのは、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することにより、治療に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象を同定するための方法及び物質である。別の態様において、本明細書中提供されるのは、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することにより、さらなる診断検査の候補として対象を同定するための方法及び物質である。別の態様において、本明細書中提供されるのは、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することにより、より詳しいモニタリングの候補として対象を同定するための方法及び物質である。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法は、がんの検出または診断において高い感度を提供する（例えば、対象ががんを有すると正確に同定する頻度または発生率が高い）。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法は、がんの検出または診断においてある感度を提供し（例えば、対象ががんを有すると正確に同定する頻度または発生率が高い）、その感度は、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在または異数性の存在を別々に検出することにより提供される感度よりも高い。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法及び物質は、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、またはそれより高い感度を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法及び物質は、単一種のがんの検出に高い感度を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法及び物質は、２種以上のがんの検出に高い感度を提供する。様々ながん種類のどれでも、本明細書中提供される方法及び物質を用いて検出することができる（例えば、「がん」とタイトルのついたセクションを参照）。いくつかの実施形態では、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法及び物質を用いて検出可能ながんには、膵臓癌が含まれる。いくつかの実施形態では、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法及び物質を用いて検出可能ながんには、肝臓癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、結腸直腸癌、肺癌、または乳癌が含まれる。いくつかの実施形態では、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法及び物質を用いて検出可能ながんには、女性生殖管の癌（例えば、子宮頸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、または卵管癌）が含まれる。いくつかの実施形態では、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法及び物質を用いて検出可能ながんには、膀胱癌または上部尿路上皮癌が含まれる。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法は、がんの検出または診断において高い特異性を提供する（例えば、対象ががんを有さない場合に、その対象ががんを有すると間違って同定する頻度または発生率が低い）。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法は、がんの検出または診断においてある特異性を提供し（例えば、対象ががんを有すると正確に同定する頻度または発生率が高い）、この特異性は、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在または異数性の存在を別々に検出することにより提供される特異性よりも高い。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法及び物質は、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、またはそれより高い特異性を提供する。当業者には当然のことながら、９９％の特異性は、がんを有さない対象の１％のみが、がんを有すると間違って同定されることを意味する。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法及び物質は、単一のがんの検出において高い特異性を提供する（例えば、対象がその単一のがん種を有すると間違って同定される可能性が低い）。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法及び物質は、２種以上のがんの検出において高い特異性を提供する（例えば、対象がそれら２種以上のがん種を有するとして間違って同定される可能性が低い）。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法は、以下の存在を検出することを含む：１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、及び／またはＣＤＫＮ２Ａ、ならびに２）異数性の存在。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法は、以下の存在を検出することを含む：１）以下の遺伝子それぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、及びＣＤＫＮ２Ａ、ならびに２）異数性の存在。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法が、以下の存在：１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、及び／またはＣＤＫＮ２Ａ、ならびに２）異数性の存在、を検出することを含む実施形態のいくつかにおいて、対象は、以下の種類のがんのうち１種を有すると判定される（例えば、有すると診断される）、あるいは、有するまたは発症するリスクが高いと判定される（例えば、リスクが高いと診断される）：子宮頸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、または卵管癌。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下の存在を検出することを含む：１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及び／またはＶＨＬ、２）ＴＥＲＴプロモーター変異（例えば、ＴＥＲＴプロモーターにおける遺伝子バイオマーカー）の存在、ならびに３）異数性の存在。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法は、以下の存在を検出することを含む：１）以下の遺伝子それぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及びＶＨＬ、２）ＴＥＲＴプロモーター変異（例えば、ＴＥＲＴプロモーターにおける遺伝子バイオマーカー）の存在、ならびに３）異数性の存在。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法が、以下の存在：１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー：ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及び／またはＶＨＬ、２）ＴＥＲＴプロモーター変異（例えば、ＴＥＲＴプロモーターにおける遺伝子バイオマーカー）の存在、ならびに３）異数性の存在、を検出することを含む実施形態のいくつかにおいて、対象は、以下の種類のがんのうち１種を有すると判定される（例えば、有すると診断される）、あるいは、有するまたは発症するリスクが高いと判定される（例えば、リスクが高いと診断される）：膀胱癌または上部尿路上皮癌。
【０１９７】
対象から得られる試料は、本明細書中記載される、ＤＮＡ（例えば、血液中のｃｔＤＮＡ、または膀胱、子宮頸部、子宮内膜、もしくは子宮試料中に存在するＤＮＡ）及び／またはタンパク質を含有する様々な試料のどれでも可能である。いくつかの実施形態では、対象から得られた試料中のＤＮＡ（例えば、無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）、または膀胱、子宮頸部、子宮内膜、もしくは子宮試料中に存在するＤＮＡ）及び／またはタンパク質は、腫瘍細胞に由来する。いくつかの実施形態では、対象から得られた試料中のＤＮＡ（例えば、無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ））は、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーまたは異数体ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、対象から得られた試料中のタンパク質は、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーを含む。遺伝子バイオマーカー及び／またはタンパク質バイオマーカー及び／または異数性が検出可能な試料の限定ではない例として、血液試料、血漿試料、血清試料、尿試料、子宮内膜試料、子宮頸部試料、及び子宮試料が挙げられる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在及び異数性の存在は、対象から得られた単一試料で検出される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在は、対象から得られた第１の試料で検出され、異数性の存在は、対象から得られた第２の試料で検出される。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、対象が、がんを有すると判定される（例えば、有すると診断される）、あるいは、がんを有するまたは発症するリスクが高いと判定される（例えば、リスクが高いと診断される）場合（例えば、１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在：ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、及び／またはＣＤＫＮ２Ａ、ならびに２）異数性の存在、を検出することにより）、その対象は、さらなる診断検査（例えば、本明細書中記載される様々なさらなる診断検査方法のいずれか）の候補として選択され（例えば、さらなる診断検査に選択され）、その対象は、より詳しいモニタリング（例えば、本明細書中記載される様々なより詳しいモニタリング方法のいずれか）の候補として選択され（例えば、より詳しいモニタリングに選択され）、その対象は、治療（例えば、本明細書中記載される様々な治療介入のいずれか）に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象として同定され、その対象は、治療の候補として選択され（例えば、治療に選択され）、治療（例えば、本明細書中記載される様々な治療介入のいずれか）は、対象に合わせて選択され、及び／または治療（例えば、本明細書中記載される様々な治療介入のいずれか）は、対象に実施される。いくつかの実施形態では、対象が、がんを有すると判定される（例えば、有すると診断される）、あるいは、がんを有するまたは発症するリスクが高いと判定される（例えば、リスクが高いと診断される）場合（例えば、１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在：ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及び／またはＶＨＬ、２）ＴＥＲＴプロモーター変異（例えば、ＴＥＲＴプロモーターにおける遺伝子バイオマーカー）の存在、ならびに３）異数性の存在、を検出することにより）、その対象は、さらなる診断検査（例えば、本明細書中記載される様々なさらなる診断検査方法のいずれか）の候補として選択され（例えば、さらなる診断検査に選択され）、その対象は、より詳しいモニタリング（例えば、本明細書中記載される様々なより詳しいモニタリング方法のいずれか）の候補として選択され（例えば、より詳しいモニタリングに選択され）、その対象は、治療（例えば、本明細書中記載される様々な治療介入のいずれか）に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象として同定され、その対象は、治療の候補として選択され（例えば、治療に選択され）、治療（例えば、本明細書中記載される様々な治療介入のいずれか）は、対象に合わせて選択され、及び／または治療（例えば、本明細書中記載される様々な治療介入のいずれか）は、対象に実施される。例えば、対象が、がんを有すると判定された（例えば、有すると診断された）、あるいは、がんを有するまたは発症するリスクが高いと判定された（例えば、リスクが高いと診断された）場合、その対象は、さらなる診断検査を受けることができ、さらなる診断検査は、その対象におけるがんの存在を確認することができる。これに加えてまたはこれに代えて、その対象は、より高い頻度でモニタリングを受けることができる。がんを有すると判定された（例えば、有すると診断された）、あるいは、がんを有するまたは発症するリスクが高いと判定された（例えば、リスクが高いと診断された）対象が、さらなる診断検査及び／またはより詳しいモニタリングを受ける実施形態のいくつかにおいて、その対象は、追加で、治療介入を実施される可能性がある。いくつかの実施形態では、対象が治療介入を実施された後、その対象は、追加のさらなる診断検査（例えば、以前に行われたものと同じ種類のさらなる診断検査及び／または異なる種類のさらなる診断検査）及び／または継続したより詳しいモニタリング（例えば、以前に行われたものと同じ頻度または異なる頻度でのより詳しいモニタリング）を受ける。複数の実施形態において、対象が治療介入を実施され、追加のさらなる診断検査及び／または追加のより詳しいモニタリングを受けた後、その対象は、別の治療介入（例えば、以前に実施されたものと同じ治療介入及び／または異なる治療介入）を実施される。いくつかの実施形態では、対象が治療介入を実施された後、その対象は、１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在：ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、及び／またはＣＤＫＮ２Ａ、ならびに２）異数性の存在、について検査される。いくつかの実施形態では、対象が治療介入を実施された後、その対象は、１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在：ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及び／またはＶＨＬ、２）ＴＥＲＴプロモーター変異（例えば、ＴＥＲＴプロモーターにおける遺伝子バイオマーカー）の存在、ならびに３）異数性の存在、について検査される。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法は、さらに、対象から得られた１つまたは複数の試料（例えば、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在の一方または両方を検出するのに使用された同一試料、あるいは異なる試料）中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む。様々なタンパク質バイオマーカーのどれでも、検出可能である（例えば、本明細書中記載される様々なタンパク質バイオマーカー及び／またはタンパク質バイオマーカーパネルのいずれか）。
【０２００】
本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在：ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、及び／またはＣＤＫＮ２Ａ、ならびに２）異数性の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、本方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在の一方または両方を検出するのに使用された同一試料、あるいは異なる試料）中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下の遺伝子それぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在：ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、及びＣＤＫＮ２Ａ、ならびに２）異数性の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、本方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在の一方または両方を検出するのに使用された同一試料、あるいは異なる試料）中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在：ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、及び／またはＣＤＫＮ２Ａ、２）異数性の存在、ならびに３）タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在、のうち１つまたは複数の存在、を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、対象は、以下の種類のがんのうち１種を有すると判定される（例えば、有すると診断される）、あるいは、有するまたは発症するリスクが高いと判定される（例えば、リスクが高いと診断される）：子宮頸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、または卵管癌。
【０２０１】
本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在：ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及び／またはＶＨＬ、２）ＴＥＲＴプロモーター変異（例えば、ＴＥＲＴプロモーターにおける遺伝子バイオマーカー）の存在、ならびに３）異数性の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、本方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在の一方または両方を検出するのに使用された同一試料、あるいは異なる試料）中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下の遺伝子それぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在：ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及びＶＨＬ、２）ＴＥＲＴプロモーター変異（例えば、ＴＥＲＴプロモーターにおける遺伝子バイオマーカー）の存在、ならびに３）異数性の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、本方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在の一方または両方を検出するのに使用された同一試料、あるいは異なる試料）中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在：ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及び／またはＶＨＬ、２）ＴＥＲＴプロモーター変異（例えば、ＴＥＲＴプロモーターにおける遺伝子バイオマーカー）の存在、３）異数性の存在、ならびに４）タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在、を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、対象は、以下の種類のがんのうち１種を有すると判定される（例えば、有すると診断される）、あるいは、有するまたは発症するリスクが高いと判定される（例えば、リスクが高いと診断される）：膀胱癌または上部尿路上皮癌。
【０２０２】
本明細書中提供される、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８）が、さらに検出可能である：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、及び／またはミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）。本明細書中提供される、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、以下のタンパク質バイオマーカーそれぞれが、さらに検出可能である：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、及びミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）。
【０２０３】
本明細書中提供される、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１）が、さらに検出可能である：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、フォリスタチン、Ｇ−ＣＳＦ、及び／またはＣＡ１５−３。本明細書中提供される、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、以下のタンパク質バイオマーカーそれぞれが、さらに検出可能である：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、フォリスタチン、Ｇ−ＣＳＦ、及びＣＡ１５−３。
【０２０４】
本明細書中提供される、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、または９）が、さらに検出可能である：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、及び／またはＣＡ１５−３。本明細書中提供される、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、以下のタンパク質バイオマーカーそれぞれが、さらに検出可能である：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、及びＣＡ１５−３。
【０２０５】
本明細書中提供される、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、または４）が、さらに検出可能である：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、及び／またはＯＰＮ。本明細書中提供される、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、以下のタンパク質バイオマーカーそれぞれが、さらに検出可能である：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、及びＯＰＮ。
【０２０６】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む様々な方法のどれでも、さらに、１つまたは複数の追加のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む。そのような追加のバイオマーカークラスの限定ではない例として、以下が挙げられる：コピー数変化、ＤＮＡメチル化変化、他の核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、ｍｔＤＮＡ、テロメアＤＮＡ、転座、及びゲノム再編成）、ペプチド、及び／または代謝産物。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、１種または複数の追加のバイオマーカークラスは、代謝産物バイオマーカーを含む。いくつかの実施形態では、生体試料が、がんを示す代謝産物を１つまたは複数含有する場合に、対象は、がんを有するまたは発症するリスクが高いと判定される。いくつかの実施形態では、生体試料が、がんを示す代謝産物を１つまたは複数含有する場合に、対象は、がんを有すると判定される。がんを示す代謝産物の限定ではない例として、以下が挙げられる：５−メチルチオアデノシン（ＭＴＡ）、グルタチオン還元型（ＧＳＨ）、Ｎ−アセチルグルタミン酸塩、ラクトース、Ｎ−アセチルノイラミン酸塩、ＵＤＰ−アセチルグルコサミン、ＵＤＰ−アセチルガラクトサミン、ＵＤＰ−グルクロン酸塩、パントテン酸塩、アラキドン酸塩（２０：４ｎ６）、コリン、シチジン５’−ジホスホコリン、ジホモ−リノレン酸塩（２０：３ｎ３）、ドコサペンタエン酸塩（ＤＰＡ２２：５ｎ３）、エイコサペンタエン酸塩（ＥＰＡ２０：５ｎ３）、グリセロホスホリルコリン（ＧＰＣ）、ドコサヘキサエン酸塩（ＤＨＡ２２：６ｎ３）、リノール酸塩（１８：２ｎ６）、シチジン５’−一リン酸（５’−ＣＭＰ）、ガンマ−グルタミルグルタミン酸塩、Ｘ−１４５７７、Ｘ−１１５８３、イソバレリルカルニチン、ホスホクレアチン、２−アミノアジピン酸、グルコン酸、Ｏ−アセチルカルニチン、アスパラギン酸、デアミド−ＮＡＤ＋、グルタミン酸、イソブチリルカルニチン、カルニチン、ピリドキサール、クエン酸、アデノシン、ＡＴＰ、バリン、ＸＣ００６１、イソロイシン、γ−ブチロベタイン、乳酸、アラニン、フェニルアラニン、グルコノラクトン、ロイシン、グルタチオン（ＧＳＳＧ）＿二価型、チロシン、ＮＡＤ＋、ＸＣ００１６、ＵＴＰ、クレアチン、テオブロミン、ＣＴＰ、ＧＴＰ、３−メチルヒスチジン、コハク酸、グリセロール３−リン酸、グルタミン、５−オキソプロリン、チアミン、ブチリルカルニチン、４−アセトアミドブタン酸、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−ガラクトース、トレオニン、Ｎ−アセチルグリシン、プロリン、ＡＤＰ、コリン、リンゴ酸、Ｓ−アデノシルメチオニン、パントテン酸、システインスルフィン酸、６−アミノヘキサン酸、ホモシステイン酸、ヒドロキシプロリン、メチオニンスルホキシド、３−グアニジノプロピオン酸、グルコース６−リン酸、フェナセツル酸、トレオン酸、トリプトファン、ピリドキシン、Ｎ−アセチルアスパラギン酸、４−グアニジノ酪酸、セリン、シトルリン、ベタイン、Ｎ−アセチルアスパラギン、２−ヒドロキシグルタル酸、アルギニン、グルタチオン（ＧＳＨ）、クレアチニン、ジヒドロキシアセトンリン酸、ヒスチジン、グリシン、グルコース１−リン酸、Ｎ−ホルミルグリシン、ケトプロフェン、リシン、ベータ−アラニン、Ｎ−アセチルグルタミン酸、２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール、オルニチン、ホスホリルコリン、グリセロホスホコリン、テレフタル酸、グリセルアルデヒド３−リン酸、Ｇｌｙ−Ａｓｐ、タウリン、フルクトース１，６−ビスリン酸、３−アミノイソ酪酸、スペルミジン、ＧＡＢＡ、トリエタノールアミン、グリセロール、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−アセチルオ���ニチン、ジエタノールアミン、ＡＭＰ、システイングルタチオンジスルフィド、ストレプトマイシン硫酸塩＋Ｈ２Ｏ二価型、ｔｒａｎｓ−グルタコン酸、ニコチン酸、イソブチルアミン、ベタインアルデヒド＋Ｈ２Ｏ、ウロカニン酸、１−アミノシクロプロパン−１−カルボン酸ホモセリンラクトン、５−アミノ吉草酸、３−ヒドロキシ酪酸、エタノールアミン、イソ吉草酸、Ｎ−メチルグルタミン酸、シスタチオニン、スペルミン、カルノシン、１−メチルニコチンアミド、Ｎ−アセチルノイラミン酸、サルコシン、ＧＤＰ、Ｎ−メチルアラニン、パルミチン酸、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−ｒａｃ−グリセロールコレステロール５α、６αエポキシドラノステロール、リグノセリン酸、１オレオイル＿ｒａｃ＿ＧＬ、コレステロール＿エポキシド、エルカ酸、Ｔ−ＬＣＡ、オレオイル−Ｌ−カルニチン、オレアノール酸、３−ホスホグリセリン酸、５−ヒドロキシノルバリン、５−メトキシトリプタミン、アデノシン−５−一リン酸、アルファ−ケトグルタル酸塩、アスパラギン、安息香酸、ヒポキサンチン、マルトース、マルトトリオース、メチオニンスルホキシド、ノルニコチン、フェノール、ホスホエタノールアミン、ピロリン酸塩、ピルビン酸、キナ酸、タウリン、尿酸、イノシン、乳酸アミド、５−ヒドロキシノルバリンＮＩＳＴ、コレステロール、デオキシペンチトール、２−ヒドロキシエストロン、２−ヒドロキシエストラジオール、２−メトキシエストロン、２−メトキシエストラジオール、２−ヒドロキシエストロン−３−メチルエーテル、４−ヒドロキシエストロン、４−メトキシエストロン、４−メトキシエストラジオール、１６アルファ−ヒドロキシエストロン、１７−エピエストリオール、エストリオール、１６−ケトエストラジオール、１６−エピエストリオール、アシルカルニチンＣ１８：１、アミノ酸類のシトルリン及びｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリン、グリセロリン脂質類のＰＣａａＣ２８：１、ＰＣａｅＣ３０：０、及びＰＣａｅＣ３０：２、ならびにスフィンゴ脂質ＳＭ（ＯＨ）Ｃ１４：１。例えば、Ｈａｌａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  ｃｏｌｏｎ  ａｎｄ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｎｉｃｈｅ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｇｌｙｃａｎ  ａｎｄ  ｌｉｐｉｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ｖｏｌｕｍｅ  ７，Ａｒｔｉｃｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ：３９９９９（２０１７）、Ｈｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ  ｔｈｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｏｆ  ｌｉｖｅｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ＣＤ１３３，Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．，７：４５５５７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ４５５５７，（２０１７）、Ｅｌｉａｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕｒｉｎａｒｙ  Ｅｓｔｒｏｇｅｎｓ  ａｎｄ  Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ  ａｎｄ  Ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ  Ｒｉｓｋ  ｏｆ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  ａｍｏｎｇ  Ｐｒｅｍｅｎｏｐａｕｓａｌ  Ｗｏｍｅｎ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、７２（３）、６９６−７０��（２０１１）、Ｇａｎｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ：ａ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ−ｂａｓｅｄ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｈｉｇｈｌｙ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｎｇ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，Ｆｅｂ  ２、７（５）：５８１５−５８２９（２０１６）、Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｒｕｍ  ａｎｄ  Ｐｌａｓｍａ  Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，１３（６）：２０２−２０８，ｄｏｉ：１０．６０２６／９７３２０６３００１３２０２（２０１７）、Ｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｅ−ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｉｓｋ  ｉｎ  １０７７  ｃａｓｅｓ  ａｎｄ  １０７７  ｍａｔｃｈｅｄ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  Ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，ＢＭＣ  Ｍｅｄ．，１５：１２２，ｄｏｉ：１０．１１８６／ｓ１２９１６−０１７−０８８５−６（２０１７）、を参照、これらはそれぞれ、その全体が本明細書中参照により援用される。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、１種または複数の追加のバイオマーカークラスとして、ペプチド（例えば、１つまたは複数の方法において有用であると本明細書中記載される様々なタンパク質バイオマーカーとは異なるペプチド）が挙げられる。いくつかの実施形態では、生体試料が、がんを示すペプチドを１種または複数含有する場合に、対象は、がんを有するまたは発症するリスクが高いと判定される。いくつかの実施形態では、生体試料が、がんを示すペプチドを１種または複数含有する場合に、対象は、がんを有すると判定される。いくつかの実施形態では、ペプチドは、タンパク質に由来する（例えば、ペプチドは、タンパク質バイオマーカーまたは異なるタンパク質に存在するアミノ酸配列を含む）。がんを示すペプチドの限定ではない例として、以下のペプチド及び以下のタンパク質に由来するペプチドが挙げられる：ＣＥＡＣＡＭ、ＣＹＦＲＡ２１−１、ＣＡ１２５、ＰＫＬＫ、ＰｒｏＧＲＰ、ＮＳＥ、ＴＰＡ６、ＴＰＡ７、ＴＰＡ８、ＮＲＧ、ＮＲＧ１００、ＣＮＤＰ、ＡＰＯВ１００、ＳＣＣ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＨＥＲ２、ＢＲＡＦ、ＲＯＳ、ＲＥＴ、ＮＲＡＳ、ＭＥＴ、ＭＥＫ１、ＨＥＲ２、Ｃ４．４Ａ、ＰＳＦ３、ＦＡＭ８３Ｂ、ＥＣＤ、ＣＴＮＮＢ、ＶＩＭ、Ｓ１００Ａ４、Ｓ１００Ａ７、ＣＯＸ２、ＭＵＣ１、ＫＬＫＢ１、ＳＡＡ、ＨＰ−β鎖、Ｃ９、Ｐｇｒｍｃ１、Ｃｉｚ１、トランスフェリン、α−１アンチトリプシン、アポリポタンパク質１、補体ｃ３ａ、カベオリン−１、カリクレイン６、グルコース調節タンパク質−８、αディフェンシン−１、−２、−３、血清Ｃ−ペプチド、アルファ−２−ＨＳグリコールタンパク質、トリプシンＫＲＴ８ペプチド、血漿グリコールタンパク質、カテニン、ディフェンシンα６、ＭＭＰ、サイクリンＤ、Ｓ１００Ｐ、ラミンＡ／Ｃ線維タンパク質、熱ショックタンパク質、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、Ｔｘｌ−２、（チオレドキシン様タンパク質−２）、Ｐ５３、ｎｍ２３、ｕ−ＰＡ、ＶＥＧＦ、ＥｐｈＢ４、ＣＲＡＢＰ２、ＷＴ−１、Ｒａｂ−３Ｄ、メソテリン、ＥＲα、ＡＮＸＡ４、ＰＳＡＴ１、ＳＰＢ５、ＣＥＡ５、ＣＥＡ６、Ａ１ＡＴ、ＳＬＰＩ、ＡＰＯＡ４、ＶＤＢＰ、ＨＥ４、ＩＬ−１、−６、−７、−８、−１０、−１１、−１２、−１６、−１８、−２１、−２３、−２８Ａ、−３３、ＬＩＦ、ＴＮＦＲ１−２、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４）、ＩＬ１Ｒ−ａ、ＩＬ１Ｒ−ｂ、ＩＬ−２Ｒ、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＩＰ−１ａ、ＴＮＦ−α、ＣＤ４０、ＲＡＮＴＥＳ、ＣＤ４０Ｌ、ＭＩＦ、ＩＦＮ−β、ＭＣＰ−４（ＣＣＬ１３）、ＭＩＧ（ＣＸＣＬ９）、ＭＩＰ−１δ（ＣＣＬ１５）、ＭＩＰ３ａ（ＣＣＬ２０）、ＭＩＰ−４（ＣＣＬ１８）、ＭＰＩＦ−１、ＳＤＦ−１ａ＋ｂ（ＣＸＣＬ１２）、ＣＤ１３７／４−１ＢＢ、リンホタクチン（ＸＣＬ１）、エオタキシン−１（ＣＣＬ１１）、エオタキシン−２（ＣＣＬ２４）、６Ｃｋｉｎｅ／ＣＣＬ２１）、ＢＬＣ（ＣＸＣＬ１３）、ＣＴＡＣＫ（ＣＣＬ２７）、ＢＣＡ−１（ＣＸＣＬ１３）、ＨＣＣ４（ＣＣＬ１６）、ＣＴＡＰ−３（ＣＸＣＬ７）、ＩＧＦ１、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ３、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＣＴＧＦ、ＰＤＧＦ  ＡＡ、ＢＢ、ＰＤＧＦＲｂ、ｂＦＧＦ、ＴＧＦ���ＲＩＩＩ、β−セルリン、ＩＧＦＢＰ１−４、６、ＢＤＮＦ、ＰＥＤＦ、アンジオポエチン−２、レニン、リゾホスファチジン酸、β２−ミクログロブリン、シアリルＴＮ、ＡＣＥ、ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＣＡ１５−３、ＣＡ−５０、ＣＡ７２−４、ＯＶＸ１、メソテリン、シアリルＴＮ、ＭＭＰ−２、−３、−７、−９、ＶＡＰ−１、ＴＩＭＰ１−２、テネイシンＣ、ＶＣＡＭ−１、オステオポンチン、ＫＩＭ−１、ＮＣＡＭ、テトラネクチン、ナイドジェン−２、カテプシンＬ、プロスタシン、マトリプターゼ、カリクレイン２、６、１０、シスタチンＣ、クローディン、スポンジン２、ＳＬＰＩ、ｂＨＣＧ、尿中ゴナドトロピンペプチド、インヒビン、レプチン、アディポネクチン、ＧＨ、ＴＳＨ、ＡＣＴＨ、ＰＲＬ、ＦＳＨ、ＬＨ、コルチゾール、ＴＴＲ、オステオカルシン、インスリン、グレリン、ＧＩＰ、ＧＬＰ−１、アミリン、グルカゴン、ペプチドＹＹ、フォリスタチン、ヘプシジン、ＣＲＰ、アポＡ１、ＣＩＩＩ、Ｈ、トランスサイレチン、ＳＡＡ、ＳＡＰ、補体Ｃ３、４、補体因子Ｈ、アルブミン、セルロプラスミン、ハプトグロビン、β−ヘモグロビン、トランスフェリン、フェリチン、フィブリノーゲン、トロンビン、フォン・ヴィルブランド因子、ミオグロビン、免疫抑制酸性タンパク質、脂質関連シアル酸、Ｓ１００Ａ１２（ＥＮ−ＲＡＧＥ）、フェチュインＡ、クラスタリン、α１−アンチトリプシン、ａ２−マクログロブリン、セルピン１（ヒトプラスミノーゲン活性化因子インヒビター−１）、Ｃｏｘ−１、Ｈｓｐ２７、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ８０、Ｈｓｐ９０、レクチン型酸化型ＬＤＬ受容体１、ＣＤ１４、リポカリン２、ＩＴＩＨ４、ｓＦａｓＬ、Ｃｙｆｒａ２１−１、ＴＰＡ、パーフォリン、ＤｃＲ３、ＡＧＲＰ、クレアチンキナーゼ−ＭＢ、ヒト乳脂肪球１−２、ＮＴ−Ｐｒｏ−ＢＮＰ、神経特異的エノラーゼ、ＣＡＳＡ、ＮＢ／７０Ｋ、ＡＦＰ、アファミン、コラーゲン、プロヒビチン、ケラチン−６、ＰＡＲＣ、Ｂ７−Ｈ４、ＹＫ−Ｌ４０、ＡＦＰ−Ｌ３、ＤＣＰ、ＧＰＣ３、ＯＰＮ、ＧＰ７３、ＣＫ１９、ＭＤＫ、Ａ２、５−ＨＩＡＡ、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、ＣＡ２７．２９、ＣＡ７２−４、カルシトニン、ＣＧＡ、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ、ＢＡＰ、ＢＣＴ−ＡＢＬ融合タンパク質、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＰＳＡ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ＮＭＰ２２、ＰＡＩ−１、ｕＰＡ、フィブリンＤ−二量体、Ｓ１００、ＴＰＡ、サイログロブリン、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ４４、ＲＳ／ＤＪ−１、ｐ５３、アルファ−２−ＨＳ−糖タンパク質、リポフィリンＢ、ベータ−グロビン、ヘモペキシン、ＵＢＥ２Ｎ、ＰＳＭＢ６、ＰＰＰ１ＣＢ、ＣＰＴ２、ＣＯＰＡ、ＭＳＫ１／２、Ｐｒｏ−ＮＰＹ、セセルニン−１、ビンクリン、ＮＡＡＡ、ＰＴＫ７、ＴＦＧ、ＭＣＣＣ２、ＴＲＡＰ１、ＩＭＰＤＨ２、ＰＴＥＮ、ＰＯＳＴＮ、ＥＰＬＩＮ、ｅＩＦ４Ａ３、ＤＤＡＨ１、ＡＲＧ２、ＰＲＤＸ３＆４、Ｐ４ＨＢ、ＹＷＨＡＧ、エノイルＣｏＡヒドラーゼ、ＰＨＢ、ＴＵＢＢ、ＫＲＴ２、ＤＥＳ、ＨＳＰ７１、ＡＴＰ５Ｂ、ＣＫＢ、ＨＳＰＤ１、ＬＭＮＡ、ＥＺＨ２、ＡＭＡＣＲ、ＦＡＢＰ５、ＰＰＡ２、ＥＺＲ、ＳＬＰ２、ＳＭ２２、Ｂａｘ、Ｓｍａｃ／Ｄｉａｂｌｏホスホリル化Ｂｃｌ２、ＳＴＡＴ３及びＳｍａｃ／Ｄｉａｂｌｏ発現、ＰＨＢ、ＰＡＰ、ＡＭＡＣＲ、ＰＳＭＡ、ＦＫＢＰ４、ＰＲＤＸ４、ＫＲＴ７／８／１８、ＧＳＴＰ１、ＮＤＰＫ１、ＭＴＸ２、ＧＤＦ１５、ＰＣａ−２４、カベオリン−２、プロトロンビン、アンチトロンビン−ＩＩＩ、ハプトグロビン、血清アミロイドＡ−１タンパク質、ＺＡＧ、ＯＲＭ２、ＡＰＯＣ３、ＣＡＬＭＬ５、ＩＧＦＢＰ２、ＭＵＣ５ＡＣ、ＰＮＬＩＰ、ＰＺＰ、ＴＩＭＰ１、ＡＭＢＰ、インター−アルファ−トリプシンインヒビター重鎖Ｈ１、インター−アルファ−トリプシンインヒビター重鎖Ｈ２、インター−アルファ−トリプシンインヒビター重鎖Ｈ３、Ｖ型プロトンＡＴＰアーゼサブユニットＢ、腎臓アイソフォーム、肝細胞増殖因子様タンパク質、血清アミロイドＰ成分、アシルグリセロールキナーゼ、ロイシンリッチリピート含有タンパク質９、ベータ−２−糖タンパク質１、血漿プロテアーゼＣ１インヒビター、リポキシゲナーゼ相同ドメイン含有タンパク質１、プロトカドヘリンアルファ−１３。例えば、Ｋｕｐｐｕｓａｍｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｏｌｕｍｅ  ２４，Ｉｓｓｕｅ  ６，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２０１７，Ｐａｇｅｓ  １２１２−１２２１、Ｅｌｚｅｋ  ａｎｄ  Ｒｏｄｌａｎｄ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ．２０１５  Ｍａｒ；３４（１）：８３−９６、Ｎｏｅｌ  ａｎｄ  Ｌｏｋｓｈｉｎ，Ｆｕｔｕｒｅ  Ｏｎｃｏｌ．２０１２  Ｊａｎ；８（１）：５５−７１、Ｔｓｕｃｈｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２０１５  Ｏｃｔ  ７；２１（３７）：１０５７３−１０５８３、Ｌｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｒｋ  Ｃａｎｃｅｒ．２０１７；９：１−９、Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１７  Ｊｕｎ  ２７；８（２６）：４２７６１−４２７７１、Ｓａｒａｓｗａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｄ．２０１７  Ｊｕｌ；６（７）：１７３８−１７５１、Ｚａｍａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒｓ（Ｂａｓｅｌ）．２０１７  Ｎｏｖ；９（１１）：１５５、Ｔａｎａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１７  Ｍａｒ  １４；８（１１）：１８４９７−１８５１２を参照、これらはそれぞれ、その全体が本明細書中参照として援用される。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、１種または複数の追加のバイオマーカークラスとして、核酸損傷または変型（例えば、１つまたは複数の方法において有用であると本明細書中記載される様々な遺伝子バイオマーカーとは異なる核酸損傷または変型）が挙げられる。いくつかの実施形態では、生体試料が、がんを示す核酸損傷または変型を１種または複数含有する場合に、対象は、がんを有するまたは発症するリスクが高いと判定される。いくつかの実施形態では、生体試料が、がんを示す核酸損傷または変型を１種または複数含有する場合に、対象は、がんを有すると判定される。核酸損傷または変型の限定ではない例として、コピー数変化、ＤＮＡメチル化変化、及び／または他の核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、ｍｔＤＮＡ、テロメアＤＮＡ、転座、及びゲノム再編成）が挙げられる。転座及びゲノム再編成は、様々ながん（例えば、前立腺癌、神経膠腫、肺癌、非小細胞肺癌、メラノーマ、及び甲状腺癌）と相関するとされてきており、長年にわたりバイオマーカーとして使用されている（例えば、Ｄｅｍｅｕｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｓｕｒｇ．，３８：１２９６−３０５、Ｈｏｇｅｎｂｉｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，１１３：Ｅ３６４９−５６、Ｇａｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，６：ｅ１６３３２、Ｏｇｉｗａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２７：４７８８−９７、米国特許第９，７４５，６３２号、及び米国特許第６，５７６，４２０号）。また、コピー数の変化が、様々ながんのバイオマーカーとして使用されてきており、そのようながんとして、制限なく、頭頚部扁平上皮癌、リンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫）、及び結腸直腸癌が挙げられる（Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７，Ｔｕｍｏｕｒ  Ｂｉｏｌ，３９：１０１０４２８３１７７４０２９６、Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７，Ｔｕｍｏｕｒ  Ｂｉｏｌ．，３９：１０１０４２８３１７７３６６４３、Ｈｅｎｒｉｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．，１４：４１９−２２、及び米国特許第９，８１６，１３９号）。ＤＮＡメチル化及びＤＮＡメチル化の変化（例えば、低メチル化、高メチル化）も、がんのバイオマーカーとして使用されている。例えば、低メチル化は、肝細胞癌（例えば、Ｈｅｎｒｉｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．，１４：４１９−２２を参照）、食道癌発生（例えば、Ａｌｖａｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ．，７：ｅ１００１３５６を参照）、ならびに胃癌及び肝臓癌（例えば、米国特許第８，７２８，７３２号を参照）に関連するとされており、高メチル化は、結腸直腸癌に関連するとされている（例えば、米国特許第９，９５７，５７０号を参照）。ゲノム規模でのメチル化の変化に加えて、特定遺伝子内での特異的メチル化変化が、特定のがんを示すものとなり得る（例えば、米国特許第８，１５０，６２６号を参照）。Ｌｉら（２０１２，Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．，２２：３８４−９４）は、多数のがん（例えば、乳癌、膀胱癌、胃癌、肺癌、前立腺癌、頭頚部扁平細胞癌、及び上咽頭癌）と異常なメチル化の間の関連について総説を提供している。これに加えてまたはこれに代えて、さらなる種類の核酸または核酸の特徴が、様々ながんと関連するとされている。そのような核酸または核酸の特徴の限定ではない例として、様々なマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の有無が挙げられ、この有無は、結腸癌、前立腺癌、結腸直腸癌、及び卵巣癌の診断に使用されてきている（例えば、Ｄ’Ｓｏｕｚａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８，ＰＬｏｓ  Ｏｎｅ，１３：ｅ０１９４２６８、Ｆｕｋａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７，Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．，１０８：８８６−９６、Ｇｉｒａｌｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１７６８：４５９−７４、米国特許第８，３４３，７１８号、同第９，４１０，９５６号、及び同第９，０７４，２０６号を参照）。ｍｉＲ−２２とがんの特異的関連性の総説については、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．，５０：３４５−５５）を参照。長鎖非翻訳ＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）の異常発現も、前立腺癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、メラノーマ、非小細胞肺癌、胃癌、子宮内膜癌、及び肝細胞癌などのがんのバイオマーカーとして使用されている（例えば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，８：５８５７７０８６、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ，１７：１１０、Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８，Ｅｕｒ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，２２：４８１２−９、Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８，Ｅｕｒ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，２２：９９３−１００２、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８，Ｅｕｒ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，２２：４８２０−７、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８，Ｅｕｒ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，２２：２３０４−９、Ｘｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８，ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ，３３：５７−６７、及び米国特許第９，４１０，２０６号を参照）。環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）の有無は、肺癌、乳癌、胃癌、結腸直腸癌、及び肝臓癌（例えば、Ｇｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８，Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．，１１：９８）、ならびにメラノーマ（例えば、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８，Ｏｎｃｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１６：１２１９−２５）のバイオマーカーとして使用されてきている。テロメアＤＮＡの変化（例えば、長さまたはヘテロ接合性の変化）またはセントロメアＤＮＡの変化（例えば、セントロメア遺伝子の発現の変化）も、がんと関連するとされている（例えば、前立腺癌、乳癌、肺癌、リンパ腫、及びユーイング肉腫）（例えば、Ｂａｒｅｔｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５４：４４７２−８０、Ｌｉｓｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８０：８２１−６、Ｐｒｏｃｔｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１７９２：２６０−７４、及びＳｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１３９：８９９−９０７を参照）。ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の様々な変異（例えば、欠失）、再��成、及び／またはコピー数変化が、さまざまながん（例えば、前立腺癌、メラノーマ、乳癌、肺癌、及び結腸直腸癌）について予後及び診断に使用されている。例えば、Ｍａｒａｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｍａｒｋ．，１５：７６３−７３、Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ，１０：６２−６８、Ｈｏｓｇｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎ．，３１：８４７−９、Ｔｈｙａｇａｒａｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ＆  Ｐｒｅｖ．，２１：１５７４−８１、及び米国特許第９，７４５，６３２号を参照。またメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の異常な存在、不在、または量も、様々ながんとの相関が見つかっており、そのようながんとして、制限なく、乳癌、ウィルムス腫瘍、及び子宮頸癌が挙げられる（例えば、Ｇｕｅｔｓｃｈｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌｙ．Ｃｈｅｍ．，４０４：３９９−４０６、Ｓｃｈｗｉｅｎｂａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６０：１５２１−５、及びＮｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｉｔｏｕｒｉｎ  Ｍｅｄ．，７３：５４−８を参照）。これらの引用は、それぞれ、その全体が本明細書中参照により援用される。
【０２１０】
ある特定の態様において、本明細書中提供されるのは、対象（例えば、ヒト）における疾患の検出方法である。本明細書中開示される様々な方法は、対象におけるがん（例えば、子宮内膜癌または卵巣癌などであるが、これらに限定されない）の非侵襲的検出に幅広く応用可能なアプローチを提供する。本明細書中開示される様々な方法は、対象におけるがん（例えば、子宮内膜癌または卵巣癌などであるが、これらに限定されない）の非侵襲的検出後に、がんを有するまたは有することが疑われる対象の治療に幅広く応用可能なアプローチを提供する。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、対象から得られた試料（例えば、子宮頸部または子宮内膜試料）中に存在する細胞由来の１つまたは複数の遺伝子において、遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を検出することを含む。例えば、本明細書中提供される方法を使用して、以下：ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、及びＣＤＫＮ２Ａからなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在を検出することができ、１つまたは複数の遺伝子における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在は、対象に卵巣癌または子宮内膜癌が存在することを示す。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、対象から得られた試料において異数性（例えば、モノソミーまたはトリソミー）の存在を検出することを含み、異数性の存在は、対象に卵巣癌または子宮内膜癌が存在することを示す。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、対象から得られた試料において、１つまたは複数の遺伝子（例えば、ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、及び／またはＣＤＫＮ２Ａ）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在及び異数性（例えば、モノソミーまたはトリソミー）の存在のそれぞれを検出することを含む。いくつかの実施形態では、対象から得られた試料において、１つまたは複数の遺伝子（例えば、ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、及び／またはＣＤＫＮ２Ａ）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在及び異数性（例えば、モノソミーまたはトリソミー）の存在のそれぞれを検出することを含む方法は、いずれかの態様を個別に検査する方法よりも良好に、対象ががん（例えば、子宮内膜癌または卵巣癌）を有することを示す。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、がん（例えば、卵巣癌または子宮内膜癌）の存在を検出するための試料は、Ｐａｐブラシを使用して採取することができる。本明細書中提供される様々な方法のいずれかの実施形態のいくつかにおいて、がん（例えば、卵巣癌または子宮内膜癌）の存在を検出するための試料は、Ｔａｏブラシを使用して採取することができる。
【０２１３】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、さらに、対象から得られた試料（例えば、血漿試料）を、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）として存在する核酸中の遺伝子バイオマーカーについて検査することを含む。例えば、試料（例えば、血漿試料）は、以下の遺伝子の１つまたは複数において１つまたは複数の変異を保有する核酸中の遺伝子バイオマーカーを検出するために検査することができる：ＡＫＴ１、ＡＰＣ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＴＮＮＢ１、ＥＧＦＲ、ＦＢＸＷ７、ＦＧＦＲ２、ＧＮＡＳ、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＰＴＥＮ、及び／またはＴＰ５３。
【０２１４】
本明細書中提供される、対象から得られた試料（例えば、子宮頸部または子宮内膜試料）に存在する細胞中の遺伝子における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を検出する方法の様々な実施形態において、ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、及び／またはＣＤＫＮ２Ａのうち１つまたは複数における遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を検出することができる。いくつかの実施形態では、これらの遺伝子のうち１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を検出することができる。いくつかの実施形態では、これら１８の遺伝子全てにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を検出することができる。いくつかの実施形態では、これらの遺伝子における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）は、表１５に示す変異が可能である。いくつかの実施形態では、これらの遺伝子における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）は、表１６に示す変異が可能である。いくつかの実施形態では、これらの遺伝子における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）は、表１７に示す変異が可能である。いくつかの実施形態では、これらの遺伝子における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）は、表１５に示す遺伝子における変異が可能である。いくつかの実施形態では、これらの遺伝子における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）は、表１６に示す遺伝子における変異が可能である。いくつかの実施形態では、これらの遺伝子における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）は、表１７に示す遺伝子における変異が可能である。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、以下の遺伝子：ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰＦ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、及び／またはＣＤＫＮ２Ａのうち１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在を検出することにより、卵巣癌または子宮内膜癌の存在を検出する方法は、異数性の検出、ｃｔＤＮＡに存在する遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の検出、またはその両方と組み合わせることができる。いくつかの実施形態では、異数性の検出、ｃｔＤＮＡに存在する遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の検出、またはその両方と組み合わせることは、卵巣癌または子宮内膜癌の検出の特異性及び／または感度を上昇させる可能性がある。いくつかの実施形態では、試料は、Ｐａｐブラシを使用して採取される。いくつかの実施形態では、試料は、Ｔａｏブラシを使用して採取される。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法を使用して、子宮内膜癌の存在を検出することができる。例えば、本明細書中提供される方法を使用して、以下の遺伝子：ＰＴＥＮ、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＣＴＮＮＢ１、ＫＲＡＳ、ＦＧＦＲ２、ＰＯＬＥ、ＡＰＣ、ＦＢＸＷ７、ＲＮＦ４３、及び／またはＰＰＰ２Ｒ１Ａのうち１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在を検出することができ、１つまたは複数の遺伝子における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在は、対象に子宮内膜癌が存在することを示す。いくつかの実施形態では、これらの遺伝子のうち１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を検出することができる。いくつかの実施形態では、これら１２の遺伝子全てにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を検出することができる。いくつかの実施形態では、これらの遺伝子における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）は、本明細書中記載される任意の変異が可能である（例えば、表１５、表１６、または表１７のいずれか１つに示されるとおりの変異）。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、以下の遺伝子：ＰＴＥＮ、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＣＴＮＮＢ１、ＫＲＡＳ、ＦＧＦＲ２、ＰＯＬＥ、ＡＰＣ、ＦＢＸＷ７、ＲＮＦ４３、及び／またはＰＰＰ２Ｒ１Ａのうち１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在を検出することにより、子宮内膜癌の存在を検出する方法は、異数性の検出、ｃｔＤＮＡに存在する遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の検出、またはその両方と組み合わせることができる。いくつかの実施形態では、異数性の検出、ｃｔＤＮＡに存在する遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の検出、またはその両方と組み合わせることは、子宮内膜癌の検出の特異性及び／または感度を上昇させる可能性がある。いくつかの実施形態では、試料は、Ｐａｐブラシを使用して採取される。いくつかの実施形態では、試料は、Ｔａｏブラシを使用して採取される。
【０２１６】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法を使用して、卵巣癌の存在を検出することができる。例えば、本明細書中提供される方法を使用して、ＴＰ５３における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在を検出することができ、１つまたは複数の遺伝子における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在は、対象に卵巣癌が存在することを示す。いくつかの実施形態では、ＴＰ５３における遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を検出することにより検出される卵巣癌は、グレードの高い卵巣癌の可能性がある。いくつかの実施形態では、ＴＰ５３における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）は、本明細書中記載される任意のＴＰ５３変異（例えば、表１５、表１６、または表１７のいずれか１つに示されるとおりのＴＰ５３変異）が可能である。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、ＴＰ５３における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在を検出することにより子宮内膜癌の存在を検出する方法は、異数性の検出、ｃｔＤＮＡに存在する遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の検出、またはその両方と組み合わせることができる。いくつかの実施形態では、異数性の検出、ｃｔＤＮＡに存在する変異の検出、またはその両方と組み合わせることは、卵巣癌の検出の特異性及び／または感度を上昇させる可能性がある。いくつかの実施形態では、試料は、Ｐａｐブラシを使用して採取される。いくつかの実施形態では、試料は、Ｔａｏブラシを使用して採取される。
【０２１７】
本明細書中記載される遺伝子の１つまたは複数における遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）は、本明細書中記載される変異の検出技法の例のいずれかにより検出可能である。そのうえ、当業者なら、これらの遺伝子における遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を検出するのに適した他の方法に気づくだろう。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法（例えば、本明細書中記載される遺伝子のいずれかにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の検出、異数性の検出、またはその両方を含む方法）は、さらに、対象から得られた試料（例えば、血漿試料）を、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）として存在する核酸中の遺伝子バイオマーカーについて検査することを含む。いくつかの実施形態では、試料は、１つまたは複数の遺伝子（例えば、ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、及び／またはＣＤＫＮ２Ａ）中に遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を１つまたは複数保有する核酸を含み、これらの核酸は、本明細書中開示される様々な方法のいずれかによりアッセイすることができる。いくつかの実施形態では、血漿試料は、１つまたは複数の遺伝子（例えば、ＡＫＴ１、ＡＰＣ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＴＮＮＢ１、ＥＧＦＲ、ＦＢＸＷ７、ＦＧＦＲ２、ＧＮＡＳ、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＰＴＥＮ、及び／またはＴＰ５３）中に遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を１つまたは複数保有する核酸を含み、これらの核酸は、本明細書中開示される様々な方法のいずれかによりアッセイすることができる。いくつかの実施形態では、表１５に列挙される遺伝子における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在を、試料（例えば、血漿試料）において検出することができる。いくつかの実施形態では、表１５に列挙される遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在を、試料（例えば、血漿試料）において検出することができる。いくつかの実施形態では、表１６に列挙される遺伝子における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在を、試料（例えば、血漿試料）において検出することができる。いくつかの実施形態では、表１６に列挙される１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在を、試料（例えば、血漿試料）において検出することができる。いくつかの実施形態では、表１７に列挙される遺伝子における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在を、試料（例えば、血漿試料）において検出することができる。いくつかの実施形態では、表１７に列挙される１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在を、試料（例えば、血漿試料）において検出することができる。当業者ならわかるだろうが、そのようなｃｔＤＮＡは、がん細胞（例えば、子宮頸癌細胞、子宮内膜癌細胞、卵巣癌細胞、及び／または卵管癌細胞）から脱落した核酸であることが可能であり、そのため、本明細書中提供される様々な方法のいずれかを使用してアッセイすることにより、対象におけるがんの存在を判定することができる。いくつかの実施形態では、ｃｔＤＮＡにおける１つまたは複数の変異の存在を検出するための試料は、血液（例えば、全血、血清、または血漿）、羊膜、組織、尿、脳脊髄液、唾液、痰、気管支肺胞洗浄検査、胆汁、リンパ液、嚢胞液（例えば、卵巣嚢胞液）、糞便、腹水、パップスメア、腹水、腹膜灌流、子宮灌流、及びそれらの組み合わせであるか、あるいはそれらを含むことができる。ｃｔＤＮＡにおける変異は、本明細書中記載される変異検出技法の例のいずれかにより検出可能である。そのうえ、当業者なら、ｃｔＤＮＡにおける変異を検出するのに適した他の方法に気づくだろう。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、対象から得られた試料（例えば、子宮頸部または子宮内膜試料）において、１つまたは複数の遺伝子（例えば、ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、及び／またはＣＤＫＮ２Ａ）中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）及び／または異数性（例えば、モノソミーまたはトリソミー）の存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、試料は、子宮頸部試料である。いくつかの実施形態では、試料は、子宮内膜試料である。いくつかの実施形態では、試料は、子宮頸部及び子宮内膜それぞれに由来する組織または細胞を含む。いくつかの実施形態では、試料は、Ｐａｐブラシを用いて得られる。いくつかの実施形態では、試料は、Ｔａｏブラシを用いて得られる。いくつかの実施形態では、方法は、試料の残部から細胞を単離することを含む。例えば、細胞を、試料の他成分から完全に分離することも可能であるし、単離細胞が試料由来の他の物質を少量しか含まないようにある程度分離することも可能である。いくつかの実施形態では、試料から単離された細胞中に存在する核酸は、本明細書中提供される様々な方法のいずれかを用いてアッセイすることができる。例えば、試料由来の細胞中に存在する核酸は、単離及びアッセイすることが可能である。
【０２２０】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、対象から得られた試料（例えば、子宮頸部または子宮内膜試料）において、以下の遺伝子：ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、及び／またはＣＤＫＮ２Ａのうち１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在を検出することを含み、遺伝子バイオマーカーのうち少なくとも１つ（例えば、変異のうち少なくとも１つ）は、試料中に低い頻度で存在する。例えば、本明細書中提供される方法は、遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）が、試料中の細胞の０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、または１％以下にしか存在しない場合でも、遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を検出することができる。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）が、試料中に存在する全核酸の０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、または１％未満にしか存在しない場合でも、遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を検出することができる。
【０２２１】
本明細書中開示される、１つまたは複数の遺伝子（例えば、ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、及び／またはＣＤＫＮ２Ａ）中に１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在及び／または異数性（例えば、モノソミーまたはトリソミー）の存在の、様々な方法のいずれかの実施形態のいくつかにおいて、細胞診断を、本方法と併用してまたは本方法とは別個に行うことができる。例えば、細胞診断を、本明細書中開示される様々な方法のいずれかと併用して行うことにより、対象おけるがん（例えば、卵巣癌または子宮内膜癌）の検出を改善することができる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の遺伝子（例えば、ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、及び／またはＣＤＫＮ２Ａ）中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在及び／または異数性（例えば、モノソミーまたはトリソミー）の存在の検出と併用して細胞診断を行うことで、アッセイ感度が上昇する（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、またはそれ以上）。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の遺伝子（例えば、ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、及び／またはＣＤＫＮ２Ａ）中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在及び／または異数性（例えば、モノソミーまたはトリソミー）の存在の検出と併用して細胞診断を行うことで、アッセイ特異性が上昇する（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、またはそれ以上）。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の遺伝子（例えば、ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、及び／またはＣＤＫＮ２Ａ）中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在及び／または異数性（例えば、モノソミーまたはトリソミー）の存在の検出と併用して細胞診断を行うことで、そうしなければ検出不可と思われるがんまたは細胞診断のみではめったに検出されないがん（例えば、グレードの低い腫瘍）の検出が可能になる。別の例として、がん（例えば、卵巣癌または子宮内膜癌）の存在が、１つまたは複数の遺伝子（例えば、ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、及び／またはＣＤＫＮ２Ａ）中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）及び／または異数性（例えば、モノソミーまたはトリソミー）の存在を検出することにより判定された場合に、細胞診断を別個で行うことで、がんの存在を確認することができる。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、１つまたは複数の遺伝子（例えば、ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、及び／またはＣＤＫＮ２Ａ）中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在及び異数性（例えば、モノソミーまたはトリソミー）の存在それぞれを検出すること、ならびに細胞診断を行うことを含む。
【０２２２】
いくつかの実施形態では、本明細書中開示される様々な方法のどれでも、以前にがん（例えば、卵巣癌または子宮内膜癌）治療を受けたことがある対象で行うことができる。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法を用いて、治療の有効性を判定することができる。例えば、卵巣癌または子宮内膜癌を有する対象に治療（本明細書中、「治療介入」とも称する）を実施することができ、その後、１つまたは複数の遺伝子（例えば、ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、及び／またはＣＤＫＮ２Ａ）中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在及び／または異数性（例えば、モノソミーまたはトリソミー）の存在を検出することにより、がんが継続して存在するかどうかまたはがんの量（あるいはそれらがないこと）を判定する。
【０２２３】
ある特定の態様において、本明細書中提供されるのは、対象（例えば、ヒト）において疾患を検出する方法である。本明細書中開示される様々な方法は、がん（例えば、膀胱癌または上部尿路上皮癌（ＵＴＵＣ）などの初期段階のがんであるが、これらに限定されない）の非侵襲的検出に幅広く応用可能なアプローチを提供する。いくつかの実施形態では、検出される疾患は、がんである。いくつかの実施形態では、検出されるがんは、悪性である。いくつかの実施形態では、検出される疾患は、尿路に関連する。いくつかの実施形態では、検出される疾患は、尿路を患部とするがんである。いくつかの実施形態では、検出される疾患は、膀胱癌である。いくつかの実施形態では、検出される疾患は、腎盂に関連する。いくつかの実施形態では、検出される疾患は、腎盂を患部とするがんである。いくつかの実施形態では、検出される疾患は、ＵＴＵＣである。
【０２２４】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、対象から得られた試料（例えば、尿試料）において、１つまたは複数の遺伝子中の変異を検出することを含む。例えば、本明細書中提供される方法を用いて、以下の遺伝子：ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及び／またはＶＨＬのうち１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の変異）の存在を検出することができる。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、対象から得られた試料においてＴＥＲＴプロモーター中の少なくとも１つの遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、対象から得られた試料において異数性（例えば、モノソミーまたはトリソミー）の存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、対象から得られた試料において、以下のうち２つ以上を検出することを含む：１つまたは複数の遺伝子（例えば、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及び／またはＶＨＬ）中の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）、異数性（例えば、モノソミーまたはトリソミー）の存在、及びＴＥＲＴプロモーター中の少なくとも１つの遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、対象から得られた試料において、１つまたは複数の遺伝子（例えば、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及び／またはＶＨＬ）中の遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の変異）の存在、異数性（例えば、モノソミーまたはトリソミー）の存在、及びＴＥＲＴプロモーター中の少なくとも１つの遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在のそれぞれを検出することを含む。いくつかの実施形態では、対象から得られた試料において、１つまたは複数の遺伝子（例えば、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及び／またはＶＨＬ）中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在、異数性（例えば、モノソミーまたはトリソミー）の存在、及びＴＥＲＴプロモーター中の少なくとも１つの遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在のそれぞれを検出することを含む方法は、これら３つ全部より少ないパラメーターを検査する方法よりも良好に、対象ががん（例えば、膀胱癌またはＵＴＵＣ）を有するとする指標を提供する。いくつかの実施形態では、対象から得られた試料において、１つまたは複数の遺伝子（例えば、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及び／またはＶＨＬ）中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在、異数性（例えば、モノソミーまたはトリソミー）の存在、及びＴＥＲＴプロモーター中の少なくとも１つの遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在のそれぞれを検出することを含む方法は、卵巣癌または子宮内膜癌（例えば、膀胱癌またはＵＴＵＣ）を検出する特異性及び／または感度を上昇させる可能性がある。
【０２２５】
本明細書中提供される、対象から得られた試料（例えば、尿試料）における、遺伝子中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の変異）を検出する方法の様々な実施形態において、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及び／またはＶＨＬのうち１つまたは複数における遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を、検出することができる。いくつかの実施形態では、これらの遺伝子のうち１、２、３、４、５、６、７、８、または９つにおける遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を、検出することができる。いくつかの実施形態では、これらの遺伝子のうち１０全部における遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を、検出することができる。いくつかの実施形態では、これらの遺伝子における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）は、本明細書中開示される任意の変異が可能である。例えば、これらの遺伝子における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）は、表１９または表２９に示される変異が可能である。いくつかの実施形態では、ＴＲ５３またはＦＧＦＲ３の１つにおける少なくとも１つの遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）が検出される。いくつかの実施形態では、ＴＲ５３またはＦＧＦＲ３のそれぞれにおける少なくとも１つの遺伝子バイオマーカー（例えば、少なくとも１つの変異）が検出される。
【０２２６】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、対象から得られた試料（例えば、尿試料）において、ＴＥＲＴプロモーター中の少なくとも１つの遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在を検出することを含む。本明細書中開示されるＴＥＲＴプロモーター中の任意の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を、検出することができる。例えば、表２６または表３０に示される様々なＴＥＲＴプロモーター遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）のどれでも、本明細書中提供される方法を用いて検出することができる。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される様々な方法により検出可能なＴＥＲＴプロモーター遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）として、ｇ．１２９５２２８  Ｃ＞Ｔ変異及び／またはｇ．１２９５２５０  Ｃ＞Ｔ変異が挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される様々な方法により検出可能なＴＥＲＴプロモーター遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）として、位置ｈｇ１２９５２２８及び／またはｈｇ１２９５２５０での変異が挙げられ、これらはそれぞれ、転写開始位置から６６ｂｐ及び８８ｂｐ上流である。いくつかの実施形態では、ＴＥＲＴプロモーター中の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）は、シングルプレックスＰＣＲアッセイを用いて同定される。いくつかの実施形態では、ＴＥＲＴプロモーター中の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）は、マルチプレックスＰＣＲアッセイを用いて同定される。いくつかの実施形態では、単一増幅プライマーを用いて、がん（例えば、膀胱癌またはＵＴＵＣ）において遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を保有することが知られているＴＥＲＴプロモーターの領域を含有するセグメントを増幅させることができる。
【０２２７】
本明細書中使用される場合、「ＴＥＲＴ」という用語は、その遺伝子及び／またはその遺伝子によりコードされるタンパク質を示し、このタンパク質は、テロメラーゼ逆転写酵素、すなわち、テロメラーゼＲＮＡ構成要素（ＴＥＲＣ）と一緒になって、テロメラーゼ複合体の最も重要なユニットを構成する酵素テロメラーゼの触媒サブユニットである。ＴＥＲＴ遺伝子の上流プロモーターにおける活性化変異は、高い割合で、ＢＣの多数ならびに他のがん種において見つかる。ＴＥＲＴプロモーター変異は、一般的に、２つのホットスポット：ｇ．１２９５２２８  Ｃ＞Ｔ及びｇ．１２９５２５０  Ｃ＞Ｔに影響を及ぼす。これらの変異は、ＣＣＧＧＡＡ／ＴまたはＧＧＡＡ／Ｔモチーフを生成させ、ＥＴＳ転写因子の結合部位を改変して、その結果ＴＥＲＴプロモーター活性の上昇を招く。ＴＥＲＴプロモーター変異は、膀胱及び上部尿路の浸潤性尿路上皮癌のうち最高８０％ならびにその組織学的変異型のいくつかにおいて、発生する。そのうえ、ＴＥＲＴプロモーター変異は、ＢＣ前駆体の６０〜８０％で発生し、そのようなＢＣ前駆体として、悪性可能性の低い乳頭状尿路上皮腫瘍、非浸潤性低異形度乳頭状尿路上皮癌、非浸潤性高異形度乳頭状尿路上皮癌、及び「平坦状」上皮内癌（ＣＩＳ）、ならびにこれらの患者のサブセットに由来する尿中細胞が挙げられる。このため、ＴＥＲＴプロモーター変異は、ＢＣの共通遺伝子変異として確立されている。ヒトＴＥＲＴプロモーター配列は、当該分野で既知である。
【０２２８】
本明細書中記載される遺伝子の１つまたは複数における遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）は、本明細書中記載される変異の検出技法の例のいずれかにより検出可能である。そのうえ、当業者なら、これらの遺伝子における遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を検出するのに適した他の方法に気づくだろう。
【０２２９】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、対象から得られた試料（例えば、尿試料）において、以下の遺伝子：ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及び／またはＶＨＬのうち１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の変異）の存在、ＴＥＲＴプロモーター中の少なくとも１つの遺伝子バイオマーカー（例えば、少なくとも１つの変異）の存在、またはその両方を検出することを含む。いくつかの実施形態では、試料は、尿試料である。本明細書中提供される実施形態のいくつかにおいて、本方法は、試料の残部からそのような細胞を単離することを含む。例えば、細胞を、試料の他成分から完全に分離することも可能であるし、単離細胞が試料由来の他の物質（複数可）を少量しか含まないようにある程度分離することも可能である。いくつかの実施形態では、試料から単離された細胞中に存在する核酸における遺伝子バイオマーカーの存在及び／または試料から単離された細胞中の異数性の存在は、本明細書中提供される様々な方法のいずれかを用いてアッセイすることができる。例えば、試料由来の細胞中に存在する核酸は、単離して、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在及び／または異数性の存在についてアッセイすることができる。いくつかの実施形態では、細胞の核酸を分析用に単離する前に、その細胞を試料から単離することはしない。いくつかの実施形態では、試料は、１つまたは複数の遺伝子（例えば、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及び／またはＶＨＬ）中に１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を保有する核酸、ＴＥＲＴプロモーター中の少なくとも１つの遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）、及び／または異数性（例えば、モノソミーまたはトリソミー）を含み、この核酸は、本明細書中開示される様々な方法のいずれかによりアッセイされる。当業者ならわかるだろうが、そのような核酸は、がん細胞（例えば、膀胱癌細胞またはＵＴＵＣ由来細胞）から脱落した核酸であることが可能であり、そのため、本明細書中提供される様々な方法のいずれかを使用してアッセイすることにより、対象におけるがんの存在を判定することができる。
【０２３０】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、対象から得られた試料（例えば、尿試料）において、以下の遺伝子：ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及び／またはＶＨＬのうち１つまたは複数における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在、ＴＥＲＴプロモーター中の少なくとも１つの遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在、またはその両方を検出することを含み、遺伝子バイオマーカーのうち少なくとも１つ（例えば、変異の少なくとも１つ）は、試料中に低い頻度で存在する。例えば、本明細書中提供される方法は、遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）が、試料中の細胞の０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、またはそれ以下で存在する場合に、遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を検出することができる。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）が、試料中の細胞の０．０３％以下で存在する場合、遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を検出することができる。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）が、試料中に存在する全核酸の０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、または１％未満で存在する場合、遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を検出することができる。
【０２３１】
本明細書中開示される、１つまたは複数の遺伝子（例えば、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及び／またはＶＨＬ）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在、異数性（例えば、モノソミーまたはトリソミー）の存在、及び／またはＴＥＲＴプロモーター中の少なくとも１つの遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在を検出する様々な方法のいずれかの実施形態のいくつかにおいて、細胞診断を、本方法と併用してまたは本方法とは別個に行うことができる。例えば、細胞診断を、本明細書中開示される様々な方法のいずれかと併用して行うことにより、対象におけるがん（例えば、膀胱癌またはＵＴＵＣ）の検出を改善することができる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の遺伝子（例えば、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及び／またはＶＨＬ）中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在、異数性（例えば、モノソミーまたはトリソミー）の存在、及び／またはＴＥＲＴプロモーター中の少なくとも１つの遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在の検出と併用して細胞診断を行うことで、細胞診断単独に比べてアッセイ感度が上昇する（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、またはそれ以上）。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の遺伝子（例えば、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及び／またはＶＨＬ）中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在、異数性（例えば、モノソミーまたはトリソミー）の存在、及び／またはＴＥＲＴプロモーター中の少なくとも１つの遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在の検出と併用して細胞診断を行うことで、細胞診断単独に比べてアッセイ特異性が上昇する（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、またはそれ以上）。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の遺伝子（例えば、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及び／またはＶＨＬ）中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在、異数性（例えば、モノソミーまたはトリソミー）の存在、及び／またはＴＥＲＴプロモーター中の少なくとも１つの遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在の検出と併用して細胞診断を行うことで、そうしなければ検出不可と思われるがんまたは細胞診断単独ではめったに検出されないがん（例えば、グレードの低い腫瘍）の検出が可能になる。別の例として、がん（例えば、膀胱癌またはＵＴＵＣ）の存在が、１つまたは複数の遺伝子（例えば、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及び／またはＶＨＬ）中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在、異数性（例えば、モノソミーまたはトリソミー）の存在、及び／またはＴＥＲＴプロモーター中の少なくとも１つの遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在を検出することにより判定された場合に、細胞診断を別個で行うことで、がんの存在を確認することができる。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、１つまたは複数の遺伝子（例えば、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及び／またはＶＨＬ）中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在、異数性（例えば、モノソミーまたはトリソミー）の存在、及び／またはＴＥＲＴプロモーター中の少なくとも１つの遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在それぞれを検出すること、ならびに細胞診断を行うことを含む。
【０２３２】
いくつかの実施形態では、本明細書中開示される様々な方法のどれでも、以前にがん（例えば、膀胱癌またはＵＴＵＣ）治療を受けている対象で行うことができる。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法を用いて、治療の有効性を判定することができる。例えば、膀胱癌またはＵＴＵＣを有する対象に治療（本明細書中、「治療介入」とも称する）を実施することができ、その後、１つまたは複数の遺伝子（例えば、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及び／またはＶＨＬ）中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在、異数性（例えば、モノソミーまたはトリソミー）の存在、及び／またはＴＥＲＴプロモーター中の少なくとも１つの遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在を検出することにより、がんが継続して存在するかどうかまたはがんの量（あるいはそれらがないこと）を判定する。
【０２３３】
本明細書中提供される方法の実施形態のいくつかは、細胞学的検体をがんについて検査することを含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の細胞診は、診断またはスクリーニングのために用いる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の細胞診は、がんの診断のために用いる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の細胞診は、がんのスクリーニングのために用いる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の細胞診は、疾患または状態を分類するために用いる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の細胞診は、がんを分類するために用いる。
【０２３４】
試料を採取するために様々な方法を用いることができ、そのような方法として、吸引細胞診断（例えば細針穿刺吸引）、剥離細胞診断（例えば、圧片塗抹標本及び組織擦過）、膀胱鏡検査が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２３５】
いくつかの実施形態では、細胞診は、肉眼検査を含む。いくつかの実施形態では、細胞診は、組織検査を含む。いくつかの実施形態では、細胞診は、凍結切片検査を含む。いくつかの実施形態では、細胞診は、別の方法または検査と合わせて実施される。いくつかの実施形態では、別の方法または検査は、組織化学染色を含む。いくつかの実施形態では、別の方法または検査は、免疫組織化学染色を含む。いくつかの実施形態では、別の方法または検査は、電子顕微鏡検査を含む。いくつかの実施形態では、別の方法または検査は、フローサイトメトリーを含む。いくつかの実施形態では、別の方法または検査は、細胞画像解析を含む。いくつかの実施形態では、別の方法または検査は、遺伝子検査を含む。例えば、遺伝子検査として、細胞遺伝学的検査、蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）検査、及び／または分子遺伝学的検査を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０２３６】
いくつかの実施形態では、分子遺伝学的検査を、細胞学的試料（例えば、その試料で細胞診断も行われる）で行い、ＰＴＥＮ、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＣＴＮＮＢ１、ＫＲＡＳ、ＦＧＦＲ２、ＰＯＬＥ、ＡＰＣ、ＦＢＸＷ７、ＲＮＦ４３、及び／またはＰＰＰ２Ｒ１Ａ中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在を検出する。いくつかの実施形態では、分子遺伝学的検査を、細胞学的試料（例えば、その試料で細胞診断も行われる）で行い、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及び／またはＶＨＬ中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在を検出する。いくつかの実施形態では、分子遺伝学的検査を、細胞学的試料（例えば、その試料で細胞診断も行われる）で行い、ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、またはＣＤＫＮ２Ａ中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在を検出する。いくつかの実施形態では、分子遺伝学的検査を、細胞学的試料（例えば、その試料で細胞診断も行われる）で行い、ＴＰ５３中の１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在を検出する。
【０２３７】
タンパク質バイオマーカーと異数性との併用
１つの態様において、本明細書中提供されるのは、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出するための方法及び物質である。別の態様において、本明細書中提供されるのは、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することにより、対象における疾患の存在を診断または同定する（例えば、対象を、がんを有すると同定する）ための方法及び物質である。別の態様において、本明細書中提供されるのは、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することにより、対象を、疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があるとして同定するための方法及び物質である。別の態様において、本明細書中提供されるのは、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することにより、疾患（例えば、がん）を有すると診断または同定された、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された対象を治療するための方法及び物質である。別の態様において、本明細書中提供されるのは、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することにより、疾患（例えば、がん）を有すると診断または同定された、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定された対象の治療を同定するための方法及び物質である。別の態様において、本明細書中提供されるのは、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することにより、治療に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象を同定するための方法及び物質である。別の態様において、本明細書中提供されるのは、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することにより、さらなる診断検査の候補として対象を同定するための方法及び物質である。別の態様において、本明細書中提供されるのは、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することにより、より詳しいモニタリングの候補として対象を同定するための方法及び物質である。
【０２３８】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法は、がんの検出または診断に高い感度を提供する（例えば、対象ががんを有すると正確に同定する頻度または発生率が高い）。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法は、がんの検出または診断に、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在または異数性の存在を別々に検出することにより提供される感度よりも高い感度を提供する（例えば、対象ががんを有すると正確に同定する頻度または発生率が高い）。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法及び物質は、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、またはそれより高い感度を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法及び物質は、単一種のがんの検出に高い感度を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法及び物質は、２種以上のがんの検出に高い感度を提供する。様々ながん種類のどれでも、本明細書中提供される方法及び物質を用いて検出することができる（例えば、「がん」とタイトルのついたセクションを参照）。いくつかの実施形態では、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法及び物質を用いて検出可能ながんには、膵臓癌が含まれる。いくつかの実施形態では、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法及び物質を用いて検出可能ながんには、肝臓癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、結腸直腸癌、肺癌、または乳癌が含まれる。いくつかの実施形態では、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法及び物質を用いて検出可能ながんには、女性生殖管の癌（例えば、子宮頸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、または卵管癌）が含まれる。いくつかの実施形態では、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法及び物質を用いて検出可能ながんには、膀胱癌または上部尿路上皮癌が含まれる。
【０２３９】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法は、がんの検出または診断に高い特異性を提供する（例えば、対象ががんを有さない場合に、対象ががんを有すると間違って同定する頻度または発生率が低い）。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法は、がんの検出または診断に、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在または異数性の存在を別々に検出することにより提供される特異性よりも高い特異性を提供する（例えば、対象ががんを有すると正確に同定する頻度または発生率が高い）。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法及び物質は、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、またはそれより高い特異性を提供する。当業者には当然のことながら、９９％の特異性は、がんを有さない対象の１％のみが、がんを有すると間違って同定されることを意味する。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法及び物質は、単一のがんの検出において高い特異性を提供する（例えば、対象がその単一のがん種を有するとして間違って同定される可能性が低い）。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法及び物質は、２種以上のがんの検出において高い特異性を提供する（例えば、対象がそれら２種以上のがん種を有するとして間違って同定される可能性が低い）。
【０２４０】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法は、以下の存在を検出することを含む：１）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８）：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、及び／またはミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、ならびに２）異数性の存在。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法は、以下の存在を検出することを含む：１）以下のタンパク質バイオマーカーそれぞれ：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、及びミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、ならびに異数性の存在。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法が、以下の存在：１）以下のタンパク質バイオマーカーのうちの１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８）：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、及び／またはミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、ならびに２）異数性の存在、を検出することを含む実施形態のいくつかにおいて、対象は、以下の種類のがんのうち１種を有すると判定される（例えば、有すると診断される）、あるいは、有するまたは発症するリスクが高いと判定される（例えば、リスクが高いと診断される）：肝臓癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、結腸直腸癌、肺癌、及び／または乳癌。
【０２４１】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法は、以下の存在を検出することを含む：１）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１）：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、フォリスタチン、Ｇ−ＣＳＦ、及び／またはＣＡ１５−３、ならびに２）異数性の存在。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法は、以下の存在を検出することを含む：１）以下のタンパク質バイオマーカーそれぞれ：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、フォリスタチン、Ｇ−ＣＳＦ、及びＣＡ１５−３、ならびに２）異数性の存在。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法が、以下の存在：１）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１）：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、フォリスタチン、Ｇ−ＣＳＦ、及び／またはＣＡ１５−３、ならびに２）異数性の存在、を検出することを含む実施形態のいくつかにおいて、対象は、以下の種類のがんのうち１種を有すると判定される（例えば、有すると診断される）、あるいは、有するまたは発症するリスクが高いと判定される（例えば、リスクが高いと診断される）：肝臓癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、結腸直腸癌、肺癌、及び／または乳癌。
【０２４２】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を含む方法は、以下の存在を検出することを含む：１）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、または９）：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、及び／またはＣＡ１５−３、ならびに２）異数性の存在。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及びタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下の存在を検出することを含む：１）以下のタンパク質バイオマーカーそれぞれ：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、及びＣＡ１５−３、ならびに２）異数性の存在。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法が、以下の存在：１）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、または９）：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、及び／またはＣＡ１５−３、ならびに２）異数性の存在、を検出することを含む実施形態のいくつかにおいて、対象は、以下の種類のがんのうち１種を有すると判定される（例えば、有すると診断される）、あるいは、有するまたは発症するリスクが高いと判定される（例えば、リスクが高いと診断される）：肝臓癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、結腸直腸癌、肺癌、及び／または乳癌。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法は、以下の存在を検出することを含む：１）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、または４）：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、及び／またはＯＰＮ、ならびに２）異数性の存在。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法は、以下の存在を検出することを含む：１）以下のタンパク質バイオマーカーそれぞれ：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、及びＯＰＮ、ならびに２）異数性の存在。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法が、以下の存在：１）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、または４）：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、及び／またはＯＰＮ、ならびに２）異数性の存在、を検出することを含む実施形態のいくつかにおいて、対象は、膵臓癌を有すると判定される（例えば、有すると診断される）、あるいは、有するまたは発症するリスクが高いと判定される（例えば、リスクが高いと診断される）。
【０２４４】
対象から得られる試料は、本明細書中記載される、ＤＮＡ（例えば、血液中のｃｔＤＮＡ、または膀胱、子宮頸部、子宮内膜、もしくは子宮試料中に存在するＤＮＡ）及び／またはタンパク質を含有する様々な試料のどれでも可能である。いくつかの実施形態では、対象から得られた試料中のＤＮＡ（例えば、無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）、または膀胱、子宮頸部、子宮内膜、もしくは子宮試料中に存在するＤＮＡ）及び／またはタンパク質は、腫瘍細胞に由来する。いくつかの実施形態では、対象から得られた試料中のＤＮＡ（例えば、無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡ）は、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー及びまたは異数体ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、対象から得られた試料中のタンパク質は、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーを含む。遺伝子バイオマーカー及び／またはタンパク質バイオマーカー及び／または異数性が検出可能な試料の限定ではない例として、血液試料、血漿試料、血清試料、尿試料、子宮内膜試料、子宮頸部試料、及び子宮試料が挙げられる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの存在及び異数性の存在は、対象から得られた単一試料で検出される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの存在は、対象から得られた第１の試料で検出され、異数性の存在は、対象から得られた第２の試料で検出される。
【０２４５】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバー（例えば、タンパク質バイオマーカーパネルの各メンバー）の存在及び異数性の存在を検出することを含む方法では、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの上昇したレベルが検出され得る。例えば、タンパク質バイオマーカーの上昇したレベルは、参照レベルより高いレベルであり得る。参照レベルは、がんの存在とは関連しないタンパク質バイオマーカーの任意レベルであり得る。例えば、タンパク質バイオマーカーの参照レベルは、がんを有していない、またはがん細胞を保有していない参照対象において存在するレベルであり得る。タンパク質バイオマーカーの参照レベルは、がんを有していない、またはがん細胞を保有していない複数の参照対象において存在する平均レベルであり得る。がんを有すると判定された対象におけるタンパク質バイオマーカーの参照レベルとして、がんの発症前にその対象において存在したレベルであり得る。いくつかの実施形態では、パネルの１つまたは複数のメンバーが上昇したレベルで存在するタンパク質バイオマーカーパネルは、以下のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または以下のそれぞれ）を含む：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、及び／またはミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）。いくつかの実施形態では、パネルの１つまたは複数のメンバーが上昇したレベルで存在するタンパク質バイオマーカーパネルは、以下のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または以下のそれぞれ）を含む：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、フォリスタチン、Ｇ−ＣＳＦ、及び／またはＣＡ１５−３。いくつかの実施形態では、パネルの１つまたは複数のメンバーが上昇したレベルで存在するタンパク質バイオマーカーパネルは、以下のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、または以下のそれぞれ）を含む：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、及び／またはＣＡ１５−３。いくつかの実施形態では、パネルの１つまたは複数のメンバーが上昇したレベルで存在するタンパク質バイオマーカーパネルは、以下のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、または以下のそれぞれ）を含む：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、及び／またはＯＰＮ。
【０２４６】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバー（例えば、タンパク質バイオマーカーパネルの各メンバー）の存在及び異数性の存在を検出することを含む方法では、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの低下したレベルが検出され得る。例えば、タンパク質バイオマーカーの低下したレベルは、参照レベルより低いレベルであり得る。参照レベルは、がんの存在とは関連しないタンパク質バイオマーカーの任意レベルが可能であり得る。例えば、タンパク質バイオマーカーの参照レベルは、がんを有していない、またはがん細胞を保有していない参照対象において存在するレベルであり得る。タンパク質バイオマーカーの参照レベルは、がんを有していない、またはがん細胞を保有していない複数の参照対象において存在する平均レベルであり得る。がんを有すると判定された対象におけるタンパク質バイオマーカーの参照レベルとして、がんの発症前にその対象において存在したレベルであり得る。いくつかの実施形態では、パネルの１つまたは複数のメンバーが低下したレベルで存在するタンパク質バイオマーカーパネルは、以下のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または以下のそれぞれ）を含む：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、及び／またはミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）。いくつかの実施形態では、パネルの１つまたは複数のメンバーが低下したレベルで存在するタンパク質バイオマーカーパネルは、以下のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または以下のそれぞれ）を含む：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、フォリスタチン、Ｇ−ＣＳＦ、及び／またはＣＡ１５−３。いくつかの実施形態では、パネルの１つまたは複数のメンバーが低下したレベルで存在するタンパク質バイオマーカーパネルは、以下のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、または以下のそれぞれ）を含む：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、及び／またはＣＡ１５−３。いくつかの実施形態では、パネルの１つまたは複数のメンバーが低下したレベルで存在するタンパク質バイオマーカーパネルは、以下のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、または以下のそれぞれ）を含む：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、及び／またはＯＰＮ。
【０２４７】
いくつかの実施形態では、対象が、がんを有すると判定される（例えば、有すると診断される）、あるいは、がんを有するまたは発症するリスクが高いと判定される（例えば、リスクが高いと診断される）場合（例えば、：１）異数性の存在、ならびに２）異数性の存在と併用して有用であると本明細書中記載されるパネルのいずれかにおける１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの存在、を検出することにより）、その対象は、さらなる診断検査（例えば、本明細書中記載される様々なさらなる診断検査方法のいずれか）の候補として選択され（例えば、さらなる診断検査に選択され）、その対象は、より詳しいモニタリング（例えば、本明細書中記載される様々なより詳しいモニタリング方法のいずれか）の候補として選択され（例えば、より詳しいモニタリングに選択され）、その対象は、治療（例えば、本明細書中記載される様々な治療介入のいずれか）に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象として同定され、その対象は、治療の候補として選択され（例えば、治療に選択され）、治療（例えば、本明細書中記載される様々な治療介入のいずれか）が、対象に合わせて選択され、及び／または治療（例えば、本明細書中記載される様々な治療介入のいずれか）は、対象に実施される。例えば、対象が、がんを有すると判定された（例えば、有すると診断された）、あるいは、がんを有するまたは発症するリスクが高いと判定された（例えば、リスクが高いと診断された）場合、その対象は、さらなる診断検査を受けることができ、さらなる診断検査は、その対象におけるがんの存在を確認することができる。これに加えてまたはこれに代えて、その対象は、より高い頻度でモニタリングを受けることができる。がんを有すると判定された（例えば、有すると診断された）、あるいは、がんを有するまたは発症するリスクが高いと判定された（例えば、リスクが高いと診断された）対象が、さらなる診断検査及び／またはより詳しいモニタリングを受ける実施形態のいくつかにおいて、その対象は、追加で、治療介入を実施される可能性がある。いくつかの実施形態では、対象が治療介入を実施された後、その対象は、追加のさらなる診断検査（例えば、以前に行われたものと同じ種類のさらなる診断検査及び／または異なる種類のさらなる診断検査）及び／または継続したより詳しいモニタリング（例えば、以前に行われたものと同じ頻度または異なる頻度でのより詳しいモニタリング）を受ける。複数の実施形態において、対象が治療介入を実施され、追加のさらなる診断検査及び／または追加のより詳しいモニタリングを受けた後、その対象は、別の治療介入（例えば、以前に実施されたものと同じ治療介入及び／または異なる治療介入）を実施される。いくつかの実施形態では、対象が治療介入を実施された後、その対象は、１）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８）の存在：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、及び／またはミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、ならびに２）異数性の存在、について検査される。いくつかの実施形態では、対象が治療介入を実施された後、その対象は、１）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１）の存在：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、フォリスタチン、Ｇ−ＣＳＦ、及び／またはＣＡ１５−３、ならびに２）異数性の存在、について検査される。いくつかの実施形態では、対象が治療介入を実施された後、その対象は、１）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、または９）の存在：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、及び／またはＣＡ１５−３、ならびに２）異数性の存在、について検査される。いくつかの実施形態では、対象が治療介入を実施された後、その対象は、１）以下のタンパク質バイオマーカーの１つまたは複数（例えば、１、２、３、または４）の存在：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、及び／またはＯＰＮ、ならびに２）異数性の存在、について検査される。
【０２４８】
本明細書中提供される、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、本方法は、さらに、対象から得られた１つまたは複数の試料（例えば、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在の一方または両方を検出するのに使用された同一試料、あるいは異なる試料）中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む。様々な遺伝子バイオマーカーのどれでも、検出可能である（例えば、本明細書中記載される様々な遺伝子バイオマーカー及び／または遺伝子バイオマーカーパネルのいずれか）。
【０２４９】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８）の存在：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、及び／またはミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、ならびに２）異数性の存在を検出することを含む方法では、本方法は、さらに、対象から得られた１つまたは複数の試料（例えば、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在の一方または両方を検出するのに使用された同一試料、あるいは異なる試料）中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下のタンパク質バイオマーカーそれぞれの存在：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、及びミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、ならびに異数性の存在を検出することを含む方法では、本方法は、さらに、対象から得られた１つまたは複数の試料（例えば、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在の一方または両方を検出するのに使用された同一試料、あるいは異なる試料）中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下のタンパク質バイオマーカーのうちの１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８）：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、及び／またはミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）の存在、２）異数性の存在、ならびに３）遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在、を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、対象は、以下の種類のがんのうち１種を有すると判定される（例えば、有すると診断される）、あるいは、有するまたは発症するリスクが高いと判定される（例えば、リスクが高いと診断される）：肝臓癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、結腸直腸癌、肺癌、及び／または乳癌。
【０２５０】
本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１）の存在：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、フォリスタチン、Ｇ−ＣＳＦ、及び／またはＣＡ１５−３、ならびに２）異数性の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、本方法は、さらに、対象から得られた１つまたは複数の試料（例えば、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在の一方または両方を検出するのに使用された同一試料、あるいは異なる試料）中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下のタンパク質バイオマーカーそれぞれの存在：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、フォリスタチン、Ｇ−ＣＳＦ、及びＣＡ１５−３、ならびに２）異数性の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、本方法は、さらに、対象から得られた１つまたは複数の試料（例えば、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在の一方または両方を検出するのに使用された同一試料、あるいは異なる試料）中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１）の存在：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、フォリスタチン、Ｇ−ＣＳＦ、及び／またはＣＡ１５−３、２）異数性の存在、ならびに３）遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、対象は、以下の種類のがんのうち１種を有すると判定される（例えば、有すると診断される）、あるいは、有するまたは発症するリスクが高いと判定される（例えば、リスクが高いと診断される）：肝臓癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、結腸直腸癌、肺癌、及び／または乳癌。
【０２５１】
本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、または９）の存在：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、及び／またはＣＡ１５−３、ならびに２）異数性の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、本方法は、さらに、対象から得られた１つまたは複数の試料（例えば、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在の一方または両方を検出するのに使用された同一試料、あるいは異なる試料）中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下のタンパク質バイオマーカーそれぞれの存在：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、及びＣＡ１５−３、ならびに２）異数性の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、本方法は、さらに、対象から得られた１つまたは複数の試料（例えば、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在の一方または両方を検出するのに使用された同一試料、あるいは異なる試料）中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、または９）の存在：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、及び／またはＣＡ１５−３、２）異数性の存在、ならびに３）遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、対象は、以下の種類のがんのうち１種を有すると判定される（例えば、有すると診断される）、あるいは、有するまたは発症するリスクが高いと判定される（例えば、リスクが高いと診断される）：肝臓癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、結腸直腸癌、肺癌、及び／または乳癌。
【０２５２】
本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、または４）の存在：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、及び／またはＯＰＮ、ならびに２）異数性の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、本方法は、さらに、対象から得られた１つまたは複数の試料（例えば、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在の一方または両方を検出するのに使用された同一試料、あるいは異なる試料）中の遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下のタンパク質バイオマーカーそれぞれの存在：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、及びＯＰＮ、ならびに２）異数性の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつか。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料において、以下：１）以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、または４）の存在：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、及び／またはＯＰＮ、２）異数性の存在、ならびに３）遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、対象は、膵臓癌を有すると判定される（例えば、有すると診断される）、あるいは、有するまたは発症するリスクが高いと判定される（例えば、リスクが高いと診断される）。
【０２５３】
本明細書中提供される、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーが、さらに検出可能である：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳ。本明細書中提供される、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、以下の遺伝子それぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーが、さらに検出可能である：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及びＧＮＡＳ。
【０２５４】
本明細書中提供される、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、または４）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーが、さらに検出可能である：ＫＲＡＳ（例えば、１２番コドン及び／または６１番コドンの遺伝子バイオマーカー）、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、及び／またはＳＭＡＤ４。本明細書中提供される、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、以下の遺伝子それぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーが、さらに検出可能である：ＫＲＡＳ（例えば、１２番コドン及び／または６１番コドンの遺伝子バイオマーカー）、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、及びＳＭＡＤ４。
【０２５５】
本明細書中提供される、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、以下の遺伝子の１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーが、さらに検出可能である：ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及び／またはＶＨＬ。本明細書中提供される、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、以下の遺伝子それぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーが、さらに検出可能である：ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及びＶＨＬ。
【０２５６】
本明細書中提供される、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーが、さらに検出可能である：ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、及び／またはＣＤＫＮ２Ａ。本明細書中提供される、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、以下の遺伝子それぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーが、さらに検出可能である：ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、及びＣＤＫＮ２Ａ。
【０２５７】
本明細書中提供される、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーが、さらに検出可能である：ＰＴＥＮ、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＣＴＮＮＢ１、ＫＲＡＳ、ＦＧＦＲ２、ＰＯＬＥ、ＡＰＣ、ＦＢＸＷ７、ＲＮＦ４３、及び／またはＰＰＰ２Ｒ１Ａ。本明細書中提供される、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、以下の遺伝子それぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーが、さらに検出可能である：ＰＴＥＮ、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＣＴＮＮＢ１、ＫＲＡＳ、ＦＧＦＲ２、ＰＯＬＥ、ＡＰＣ、ＦＢＸＷ７、ＲＮＦ４３、及びＰＰＰ２Ｒ１Ａ。
【０２５８】
本明細書中提供される、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーが、さらに検出可能である：ＡＫＴ１、ＡＰＣ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＴＮＮＢ１、ＥＧＦＲ、ＦＢＸＷ７、ＦＧＦＲ２、ＧＮＡＳ、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＰＴＥＮ、及び／またはＴＰ５３。本明細書中提供される、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む方法の実施形態のいくつかにおいて、以下の遺伝子それぞれにおける１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーが、さらに検出可能である：ＡＫＴ１、ＡＰＣ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＴＮＮＢ１、ＥＧＦＲ、ＦＢＸＷ７、ＦＧＦＲ２、ＧＮＡＳ、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＰＴＥＮ、及びＴＰ５３。
【０２５９】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中のタンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在及び異数性の存在を検出することを含む様々な方法のどれでも、さらに、１つまたは複数の追加のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む。そのような追加のバイオマーカークラスの限定ではない例として、以下が挙げられる：コピー数変化、ＤＮＡメチル化変化、他の核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、ｍｔＤＮＡ、テロメアＤＮＡ、転座、及びゲノム再編成）、ペプチド、及び／または代謝産物。
【０２６０】
いくつかの実施形態では、１種または複数の追加のバイオマーカークラスは、代謝産物バイオマーカーを含む。いくつかの実施形態では、生体試料が、がんを示す代謝産物を１つまたは複数含有する場合に、対象は、がんを有するまたは発症するリスクが高いと判定される。いくつかの実施形態では、生体試料が、がんを示す代謝産物を１つまたは複数含有する場合に、対象は、がんを有すると判定される。がんを示す代謝産物の限定ではなく例として、以下が挙げられる：５−メチルチオアデノシン（ＭＴＡ）、グルタチオン還元型（ＧＳＨ）、Ｎ−アセチルグルタミン酸塩、ラクトース、Ｎ−アセチルノイラミン酸塩、ＵＤＰ−アセチルグルコサミン、ＵＤＰ−アセチルガラクトサミン、ＵＤＰ−グルクロン酸塩、パントテン酸塩、アラキドン酸塩（２０：４ｎ６）、コリン、シチジン５’−ジホスホコリン、ジホモ−リノレン酸塩（２０：３ｎ３）、ドコサペンタエン酸塩（ＤＰＡ２２：５ｎ３）、エイコサペンタエン酸塩（ＥＰＡ２０：５ｎ３）、グリセロホスホリルコリン（ＧＰＣ）、ドコサヘキサエン酸塩（ＤＨＡ２２：６ｎ３）、リノール酸塩（１８：２ｎ６）、シチジン５’−一リン酸（５’−ＣＭＰ）、ガンマ−グルタミルグルタミン酸塩、Ｘ−１４５７７、Ｘ−１１５８３、イソバレリルカルニチン、ホスホクレアチン、２−アミノアジピン酸、グルコン酸、Ｏ−アセチルカルニチン、アスパラギン酸、デアミド−ＮＡＤ＋、グルタミン酸、イソブチリルカルニチン、カルニチン、ピリドキサール、クエン酸、アデノシン、ＡＴＰ、バリン、ＸＣ００６１、イソロイシン、γ−ブチロベタイン、乳酸、アラニン、フェニルアラニン、グルコノラクトン、ロイシン、グルタチオン（ＧＳＳＧ）＿二価型、チロシン、ＮＡＤ＋、ＸＣ００１６、ＵＴＰ、クレアチン、テオブロミン、ＣＴＰ、ＧＴＰ、３−メチルヒスチジン、コハク酸、グリセロール３−リン酸、グルタミン、５−オキソプロリン、チアミン、ブチリルカルニチン、４−アセトアミドブタン酸、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−ガラクトース、トレオニン、Ｎ−アセチルグリシン、プロリン、ＡＤＰ、コリン、リンゴ酸、Ｓ−アデノシルメチオニン、パントテン酸、システインスルフィン酸、６−アミノヘキサン酸、ホモシステイン酸、ヒドロキシプロリン、メチオニンスルホキシド、３−グアニジノプロピオン酸、グルコース６−リン酸、フェナセツル酸、トレオン酸、トリプトファン、ピリドキシン、Ｎ−アセチルアスパラギン酸、４−グアニジノ酪酸、セリン、シトルリン、ベタイン、Ｎ−アセチルアスパラギン、２−ヒドロキシグルタル酸、アルギニン、グルタチオン（ＧＳＨ）、クレアチニン、ジヒドロキシアセトンリン酸、ヒスチジン、グリシン、グルコース１−リン酸、Ｎ−ホルミルグリシン、ケトプロフェン、リシン、ベータ−アラニン、Ｎ−アセチルグルタミン酸、２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール、オルニチン、ホスホリルコリン、グリセロホスホコリン、テレフタル酸、グリセルアルデヒド３−リン酸、Ｇｌｙ−Ａｓｐ、タウリン、フルクトース１，６−ビスリン酸、３−アミノイソ酪酸、スペルミジン、ＧＡＢＡ、トリエタノールアミン、グリセロール、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−アセチルオ���ニチン、ジエタノールアミン、ＡＭＰ、システイングルタチオンジスルフィド、ストレプトマイシン硫酸塩＋Ｈ２Ｏ二価型、ｔｒａｎｓ−グルタコン酸、ニコチン酸、イソブチルアミン、ベタインアルデヒド＋Ｈ２Ｏ、ウロカニン酸、１−アミノシクロプロパン−１−カルボン酸ホモセリンラクトン、５−アミノ吉草酸、３−ヒドロキシ酪酸、エタノールアミン、イソ吉草酸、Ｎ−メチルグルタミン酸、シスタチオニン、スペルミン、カルノシン、１−メチルニコチンアミド、Ｎ−アセチルノイラミン酸、サルコシン、ＧＤＰ、Ｎ−メチルアラニン、パルミチン酸、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−ｒａｃ−グリセロールコレステロール５α、６αエポキシドラノステロール、リグノセリン酸、１オレオイル＿ｒａｃ＿ＧＬ、コレステロール＿エポキシド、エルカ酸、Ｔ−ＬＣＡ、オレオイル−Ｌ−カルニチン、オレアノール酸、３−ホスホグリセリン酸、５−ヒドロキシノルバリン、５−メトキシトリプタミン、アデノシン−５−一リン酸、アルファ−ケトグルタル酸塩、アスパラギン、安息香酸、ヒポキサンチン、マルトース、マルトトリオース、メチオニンスルホキシド、ノルニコチン、フェノール、ホスホエタノールアミン、ピロリン酸塩、ピルビン酸、キナ酸、タウリン、尿酸、イノシン、乳酸アミド、５−ヒドロキシノルバリンＮＩＳＴ、コレステロール、デオキシペンチトール、２−ヒドロキシエストロン、２−ヒドロキシエストラジオール、２−メトキシエストロン、２−メトキシエストラジオール、２−ヒドロキシエストロン−３−メチルエーテル、４−ヒドロキシエストロン、４−メトキシエストロン、４−メトキシエストラジオール、１６アルファ−ヒドロキシエストロン、１７−エピエストリオール、エストリオール、１６−ケトエストラジオール、１６−エピエストリオール、アシルカルニチンＣ１８：１、アミノ酸類のシトルリン及びｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリン、グリセロリン脂質類のＰＣａａＣ２８：１、ＰＣａｅＣ３０：０、及びＰＣａｅＣ３０：２、ならびにスフィンゴ脂質ＳＭ（ＯＨ）Ｃ１４：１。例えば、Ｈａｌａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  ｃｏｌｏｎ  ａｎｄ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｎｉｃｈｅ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｇｌｙｃａｎ  ａｎｄ  ｌｉｐｉｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ｖｏｌｕｍｅ  ７，Ａｒｔｉｃｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ：３９９９９（２０１７）、Ｈｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ  ｔｈｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｏｆ  ｌｉｖｅｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ＣＤ１３３，Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．，７：４５５５７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ４５５５７，（２０１７）、Ｅｌｉａｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕｒｉｎａｒｙ  Ｅｓｔｒｏｇｅｎｓ  ａｎｄ  Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ  ａｎｄ  Ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ  Ｒｉｓｋ  ｏｆ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  ａｍｏｎｇ  Ｐｒｅｍｅｎｏｐａｕｓａｌ  Ｗｏｍｅｎ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、７２（３）、６９６−７０��（２０１１）、Ｇａｎｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ：ａ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ−ｂａｓｅｄ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｈｉｇｈｌｙ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｎｇ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，Ｆｅｂ  ２、７（５）：５８１５−５８２９（２０１６）、Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｒｕｍ  ａｎｄ  Ｐｌａｓｍａ  Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，１３（６）：２０２−２０８，ｄｏｉ：１０．６０２６／９７３２０６３００１３２０２（２０１７）、Ｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｅ−ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｉｓｋ  ｉｎ  １０７７  ｃａｓｅｓ  ａｎｄ  １０７７  ｍａｔｃｈｅｄ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  Ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，ＢＭＣ  Ｍｅｄ．，１５：１２２，ｄｏｉ：１０．１１８６／ｓ１２９１６−０１７−０８８５−６（２０１７）を参照、これらはそれぞれ、その全体が本明細書中参照により援用される。
【０２６１】
いくつかの実施形態では、１種または複数の追加のバイオマーカークラスとして、ペプチド（例えば、１つまたは複数の方法において有用であると本明細書中記載される様々なタンパク質バイオマーカーとは異なるペプチド）が挙げられる。いくつかの実施形態では、生体試料が、がんを示すペプチドを１種または複数含有する場合に、対象は、がんを有するまたは発症するリスクが高いと判定される。いくつかの実施形態では、生体試料が、がんを示すペプチドを１種または複数含有する場合に、対象は、がんを有すると判定される。いくつかの実施形態では、ペプチドは、タンパク質に由来する（例えば、ペプチドは、タンパク質バイオマーカーまたは異なるタンパク質に存在するアミノ酸配列を含む）。がんを示すペプチドの限定ではない例として、以下のペプチド及び以下のタンパク質に由来するペプチドが挙げられる：ＣＥＡＣＡＭ、ＣＹＦＲＡ２１−１、ＣＡ１２５、ＰＫＬＫ、ＰｒｏＧＲＰ、ＮＳＥ、ＴＰＡ６、ＴＰＡ７、ＴＰＡ８、ＮＲＧ、ＮＲＧ１００、ＣＮＤＰ、ＡＰＯВ１００、ＳＣＣ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＨＥＲ２、ＢＲＡＦ、ＲＯＳ、ＲＥＴ、ＮＲＡＳ、ＭＥＴ、ＭＥＫ１、ＨＥＲ２、Ｃ４．４Ａ、ＰＳＦ３、ＦＡＭ８３Ｂ、ＥＣＤ、ＣＴＮＮＢ、ＶＩＭ、Ｓ１００Ａ４、Ｓ１００Ａ７、ＣＯＸ２、ＭＵＣ１、ＫＬＫＢ１、ＳＡＡ、ＨＰ−β鎖、Ｃ９、Ｐｇｒｍｃ１、Ｃｉｚ１、トランスフェリン、α−１アンチトリプシン、アポリポタンパク質１、補体ｃ３ａ、カベオリン−１、カリクレイン６、グルコース調節タンパク質−８、αディフェンシン−１、−２、−３、血清Ｃ−ペプチド、アルファ−２−ＨＳグリコールタンパク質、トリプシンＫＲＴ８ペプチド、血漿グリコールタンパク質、カテニン、ディフェンシンα６、ＭＭＰ、サイクリンＤ、Ｓ１００Ｐ、ラミンＡ／Ｃ線維タンパク質、熱ショックタンパク質、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、Ｔｘｌ−２、（チオレドキシン様タンパク質−２）、Ｐ５３、ｎｍ２３、ｕ−ＰＡ、ＶＥＧＦ、ＥｐｈＢ４、ＣＲＡＢＰ２、ＷＴ−１、Ｒａｂ−３Ｄ、メソテリン、ＥＲα、ＡＮＸＡ４、ＰＳＡＴ１、ＳＰＢ５、ＣＥＡ５、ＣＥＡ６、Ａ１ＡＴ、ＳＬＰＩ、ＡＰＯＡ４、ＶＤＢＰ、ＨＥ４、ＩＬ−１、−６、−７、−８、−１０、−１１、−１２、−１６、−１８、−２１、−２３、−２８Ａ、−３３、ＬＩＦ、ＴＮＦＲ１−２、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４）、ＩＬ１Ｒ−ａ、ＩＬ１Ｒ−ｂ、ＩＬ−２Ｒ、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＩＰ−１ａ、ＴＮＦ−α、ＣＤ４０、ＲＡＮＴＥＳ、ＣＤ４０Ｌ、ＭＩＦ、ＩＦＮ−β、ＭＣＰ−４（ＣＣＬ１３）、ＭＩＧ（ＣＸＣＬ９）、ＭＩＰ−１δ（ＣＣＬ１５）、ＭＩＰ３ａ（ＣＣＬ２０）、ＭＩＰ−４（ＣＣＬ１８）、ＭＰＩＦ−１、ＳＤＦ−１ａ＋ｂ（ＣＸＣＬ１２）、ＣＤ１３７／４−１ＢＢ、リンホタクチン（ＸＣＬ１）、エオタキシン−１（ＣＣＬ１１）、エオタキシン−２（ＣＣＬ２４）、６Ｃｋｉｎｅ／ＣＣＬ２１）、ＢＬＣ（ＣＸＣＬ１３）、ＣＴＡＣＫ（ＣＣＬ２７）、ＢＣＡ−１（ＣＸＣＬ１３）、ＨＣＣ４（ＣＣＬ１６）、ＣＴＡＰ−３（ＣＸＣＬ７）、ＩＧＦ１、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ３、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＣＴＧＦ、ＰＤＧＦ  ＡＡ、ＢＢ、ＰＤＧＦＲｂ、ｂＦＧＦ、ＴＧＦ���ＲＩＩＩ、β−セルリン、ＩＧＦＢＰ１−４、６、ＢＤＮＦ、ＰＥＤＦ、アンジオポエチン−２、レニン、リゾホスファチジン酸、β２−ミクログロブリン、シアリルＴＮ、ＡＣＥ、ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＣＡ１５−３、ＣＡ−５０、ＣＡ７２−４、ＯＶＸ１、メソテリン、シアリルＴＮ、ＭＭＰ−２、−３、−７、−９、ＶＡＰ−１、ＴＩＭＰ１−２、テネイシンＣ、ＶＣＡＭ−１、オステオポンチン、ＫＩＭ−１、ＮＣＡＭ、テトラネクチン、ナイドジェン−２、カテプシンＬ、プロスタシン、マトリプターゼ、カリクレイン２、６、１０、シスタチンＣ、クローディン、スポンジン２、ＳＬＰＩ、ｂＨＣＧ、尿中ゴナドトロピンペプチド、インヒビン、レプチン、アディポネクチン、ＧＨ、ＴＳＨ、ＡＣＴＨ、ＰＲＬ、ＦＳＨ、ＬＨ、コルチゾール、ＴＴＲ、オステオカルシン、インスリン、グレリン、ＧＩＰ、ＧＬＰ−１、アミリン、グルカゴン、ペプチドＹＹ、フォリスタチン、ヘプシジン、ＣＲＰ、アポＡ１、ＣＩＩＩ、Ｈ、トランスサイレチン、ＳＡＡ、ＳＡＰ、補体Ｃ３、４、補体因子Ｈ、アルブミン、セルロプラスミン、ハプトグロビン、β−ヘモグロビン、トランスフェリン、フェリチン、フィブリノーゲン、トロンビン、フォン・ヴィルブランド因子、ミオグロビン、免疫抑制酸性タンパク質、脂質関連シアル酸、Ｓ１００Ａ１２（ＥＮ−ＲＡＧＥ）、フェチュインＡ、クラスタリン、α１−アンチトリプシン、ａ２−マクログロブリン、セルピン１（ヒトプラスミノーゲン活性化因子インヒビター−１）、Ｃｏｘ−１、Ｈｓｐ２７、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ８０、Ｈｓｐ９０、レクチン型酸化型ＬＤＬ受容体１、ＣＤ１４、リポカリン２、ＩＴＩＨ４、ｓＦａｓＬ、Ｃｙｆｒａ２１−１、ＴＰＡ、パーフォリン、ＤｃＲ３、ＡＧＲＰ、クレアチンキナーゼ−ＭＢ、ヒト乳脂肪球１−２、ＮＴ−Ｐｒｏ−ＢＮＰ、神経特異的エノラーゼ、ＣＡＳＡ、ＮＢ／７０Ｋ、ＡＦＰ、アファミン、コラーゲン、プロヒビチン、ケラチン−６、ＰＡＲＣ、Ｂ７−Ｈ４、ＹＫ−Ｌ４０、ＡＦＰ−Ｌ３、ＤＣＰ、ＧＰＣ３、ＯＰＮ、ＧＰ７３、ＣＫ１９、ＭＤＫ、Ａ２、５−ＨＩＡＡ、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、ＣＡ２７．２９、ＣＡ７２−４、カルシトニン、ＣＧＡ、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ、ＢＡＰ、ＢＣＴ−ＡＢＬ融合タンパク質、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＰＳＡ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ＮＭＰ２２、ＰＡＩ−１、ｕＰＡ、フィブリンＤ−二量体、Ｓ１００、ＴＰＡ、サイログロブリン、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ４４、ＲＳ／ＤＪ−１、ｐ５３、アルファ−２−ＨＳ−糖タンパク質、リポフィリンＢ、ベータ−グロビン、ヘモペキシン、ＵＢＥ２Ｎ、ＰＳＭＢ６、ＰＰＰ１ＣＢ、ＣＰＴ２、ＣＯＰＡ、ＭＳＫ１／２、Ｐｒｏ−ＮＰＹ、セセルニン−１、ビンクリン、ＮＡＡＡ、ＰＴＫ７、ＴＦＧ、ＭＣＣＣ２、ＴＲＡＰ１、ＩＭＰＤＨ２、ＰＴＥＮ、ＰＯＳＴＮ、ＥＰＬＩＮ、ｅＩＦ４Ａ３、ＤＤＡＨ１、ＡＲＧ２、ＰＲＤＸ３＆４、Ｐ４ＨＢ、ＹＷＨＡＧ、エノイルＣｏＡヒドラーゼ、ＰＨＢ、ＴＵＢＢ、ＫＲＴ２、ＤＥＳ、ＨＳＰ７１、ＡＴＰ５Ｂ、ＣＫＢ、ＨＳＰＤ１、ＬＭＮＡ、ＥＺＨ２、ＡＭＡＣＲ、ＦＡＢＰ５、ＰＰＡ２、ＥＺＲ、ＳＬＰ２、ＳＭ２２、Ｂａｘ、Ｓｍａｃ／Ｄｉａｂｌｏホスホリル化Ｂｃｌ２、ＳＴＡＴ３及びＳｍａｃ／Ｄｉａｂｌｏ発現、ＰＨＢ、ＰＡＰ、ＡＭＡＣＲ、ＰＳＭＡ、ＦＫＢＰ４、ＰＲＤＸ４、ＫＲＴ７／８／１８、ＧＳＴＰ１、ＮＤＰＫ１、ＭＴＸ２、ＧＤＦ１５、ＰＣａ−２４、カベオリン−２、プロトロンビン、アンチトロンビン−ＩＩＩ、ハプトグロビン、血清アミロイドＡ−１タンパク質、ＺＡＧ、ＯＲＭ２、ＡＰＯＣ３、ＣＡＬＭＬ５、ＩＧＦＢＰ２、ＭＵＣ５ＡＣ、ＰＮＬＩＰ、ＰＺＰ、ＴＩＭＰ１、ＡＭＢＰ、インター−アルファ−トリプシンインヒビター重鎖Ｈ１、インター−アルファ−トリプシンインヒビター重鎖Ｈ２、インター−アルファ−トリプシンインヒビター重鎖Ｈ３、Ｖ型プロトンＡＴＰアーゼサブユニットＢ、腎臓アイソフォーム、肝細胞増殖因子様タンパク質、血清アミロイドＰ成分、アシルグリセロールキナーゼ、ロイシンリッチリピート含有タンパク質９、ベータ−２−糖タンパク質１、血漿プロテアーゼＣ１インヒビター、リポキシゲナーゼ相同ドメイン含有タンパク質１、プロトカドヘリンアルファ−１３。例えば、Ｋｕｐｐｕｓａｍｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｏｌｕｍｅ  ２４，Ｉｓｓｕｅ  ６，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２０１７，Ｐａｇｅｓ  １２１２−１２２１、Ｅｌｚｅｋ  ａｎｄ  Ｒｏｄｌａｎｄ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ．２０１５  Ｍａｒ；３４（１）：８３−９６、Ｎｏｅｌ  ａｎｄ  Ｌｏｋｓｈｉｎ，Ｆｕｔｕｒｅ  Ｏｎｃｏｌ．２０１２  Ｊａｎ；８（１）：５５−７１、Ｔｓｕｃｈｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２０１５  Ｏｃｔ  ７；２１（３７）：１０５７３−１０５８３、Ｌｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｒｋ  Ｃａｎｃｅｒ．２０１７；９：１−９、Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１７  Ｊｕｎ  ２７；８（２６）：４２７６１−４２７７１、Ｓａｒａｓｗａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｄ．２０１７  Ｊｕｌ；６（７）：１７３８−１７５１、Ｚａｍａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒｓ（Ｂａｓｅｌ）．２０１７  Ｎｏｖ；９（１１）：１５５、Ｔａｎａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１７  Ｍａｒ  １４；８（１１）：１８４９７−１８５１２を参照、これらはそれぞれ、その全体が本明細書中参照により援用される。
【０２６２】
いくつかの実施形態では、１種または複数の追加のバイオマーカークラスとして、核酸損傷または変型（例えば、１つまたは複数の方法において有用であると本明細書中記載される様々な遺伝子バイオマーカーとは異なる核酸損傷または変型）が挙げられる。いくつかの実施形態では、生体試料が、がんを示す核酸損傷または変型を１種または複数含有する場合に、対象は、がんを有するまたは発症するリスクが高いと判定される。いくつかの実施形態では、生体試料が、がんを示す核酸損傷または変型を１種または複数含有する場合に、対象は、がんを有すると判定される。核酸損傷または変型の限定ではない例として、コピー数変化、ＤＮＡメチル化変化、及び／または他の核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、ｍｔＤＮＡ、テロメアＤＮＡ、転座、及びゲノム再編成）が挙げられる。転座及びゲノム再編成は、様々ながん（例えば、前立腺、神経膠腫、肺癌、非小細胞肺癌、メラノーマ、及び甲状腺癌）と相関するとされており、長年にわたりバイオマーカーとして使用されている（例えば、Ｄｅｍｅｕｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｓｕｒｇ．，３８：１２９６−３０５、Ｈｏｇｅｎｂｉｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，１１３：Ｅ３６４９−５６、Ｇａｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，６：ｅ１６３３２、Ｏｇｉｗａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２７：４７８８−９７、米国特許第９，７４５，６３２号、及び米国特許第６，５７６，４２０号）。また、コピー数の変化も、様々ながんのバイオマーカーとして使用されており、そのようながんとして、特に制限なく、頭頚部扁平上皮癌、リンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫）、及び結腸直腸癌が挙げられる（Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７，Ｔｕｍｏｕｒ  Ｂｉｏｌ，３９：１０１０４２８３１７７４０２９６、Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７，Ｔｕｍｏｕｒ  Ｂｉｏｌ．，３９：１０１０４２８３１７７３６６４３、Ｈｅｎｒｉｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．，１４：４１９−２２、及び米国特許第９，８１６，１３９号）。ＤＮＡメチル化及びＤＮＡメチル化の変化（例えば、低メチル化、高メチル化）も、がんのバイオマーカーとして使用される。例えば、低メチル化は、肝細胞癌（例えば、Ｈｅｎｒｉｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．，１４：４１９−２２を参照）、食道癌発生（例えば、Ａｌｖａｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ．，７：ｅ１００１３５６を参照）、ならびに胃癌及び肝臓癌（例えば、米国特許第８，７２８，７３２号を参照）に関連するとされており、高メチル化は、結腸直腸癌に関連するとされている（例えば、米国特許第９，９５７，５７０号を参照）。ゲノム規模でのメチル化の変化に加えて、特定遺伝子内での特異的メチル化変化が、特定のがんを示すものとなり得る（例えば、米国特許第８，１５０，６２６号を参照）。Ｌｉら（２０１２，Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．，２２：３８４−９４）は、多数のがん（例えば、乳癌、膀胱癌、胃癌、肺癌、前立腺癌、頭頚部扁平細胞癌、及び上咽頭癌）と異常なメチル化の間の関連について総説を提供している。これに加えてまたはこれに代えて、さらなる種類の核酸または核酸の特徴が、様々ながんと関連するとされている。そのような核酸または核酸の特徴の限定ではない例として、様々なマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の有無が挙げられ、この有無は、結腸癌、前立腺癌、結腸直腸癌、及び卵巣癌の診断に使用されている（例えば、Ｄ’Ｓｏｕｚａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８，ＰＬｏｓ  Ｏｎｅ，１３：ｅ０１９４２６８、Ｆｕｋａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７，Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．，１０８：８８６−９６、Ｇｉｒａｌｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１７６８：４５９−７４、米国特許第８，３４３，７１８号、同第９，４１０，９５６号、及び同第９，０７４，２０６号を参照）。ｍｉＲ−２２とがんの特異的関連性の総説については、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．，５０：３４５−５５）を参照。長鎖非翻訳ＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）の異常発現も、前立腺癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、メラノーマ、非小細胞肺癌、胃癌、子宮内膜癌、及び肝細胞癌などのがんのバイオマーカーとして使用されている（例えば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，８：５８５７７０８６、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ，１７：１１０、Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８，Ｅｕｒ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，２２：４８１２−９、Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８，Ｅｕｒ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，２２：９９３−１００２、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８，Ｅｕｒ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，２２：４８２０−７、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８，Ｅｕｒ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，２２：２３０４−９、Ｘｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８，ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ，３３：５７−６７、及び米国特許第９，４１０，２０６号を参照）。環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）の有無は、肺癌、乳癌、胃癌、結腸直腸癌、及び肝臓癌（例えば、Ｇｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８，Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．，１１：９８）、ならびにメラノーマ（例えば、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８，Ｏｎｃｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１６：１２１９−２５）のバイオマーカーとして使用されてきている。テロメアＤＮＡの変化（例えば、長さまたはヘテロ接合性の変化）またはセントロメアＤＮＡの変化（例えば、セントロメア遺伝子の発現の変化）も、がんと関連するとされている（例えば、前立腺、乳房、肺、リンパ腫、及びユーイング肉腫）（例えば、Ｂａｒｅｔｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５４：４４７２−８０、Ｌｉｓｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８０：８２１−６、Ｐｒｏｃｔｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１７９２：２６０−７４、及びＳｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１３９：８９９−９０７を参照）。ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の様々な変異（例えば、欠失）、再編成、及び／または��ピー数変化が、さまざまながん（例えば、前立腺癌、メラノーマ、乳癌、肺癌、及び結腸直腸癌）について予後及び診断に使用されている。例えば、Ｍａｒａｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｍａｒｋ．，１５：７６３−７３、Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ，１０：６２−６８、Ｈｏｓｇｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎ．，３１：８４７−９、Ｔｈｙａｇａｒａｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ＆  Ｐｒｅｖ．，２１：１５７４−８１、及び米国特許第９，７４５，６３２号を参照。またメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の異常な存在、不在、または量も、様々ながんとの相関が見つかってきており、そのようながんとして、特に制限なく、乳癌、ウィルムス腫瘍、及び子宮頸癌が挙げられる（例えば、Ｇｕｅｔｓｃｈｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌｙ．Ｃｈｅｍ．，４０４：３９９−４０６、Ｓｃｈｗｉｅｎｂａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６０：１５２１−５、及びＮｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｉｔｏｕｒｉｎ  Ｍｅｄ．，７３：５４−８を参照）。これらの引用は、それぞれ、その全体が本明細書中参照により援用される。
【０２６３】
単一バイオマーカークラスまたは異数性
１つの態様において、本明細書中提供されるのは、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在または異数性の存在を検出するための方法及び物質である。別の態様において、本明細書中提供されるのは、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在または異数性の存在を検出することにより、対象における疾患の存在を診断または同定する（例えば、その対象を、がんを有するとして同定する）ための方法及び物質である。別の態様において、本明細書中提供されるのは、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在または異数性の存在を検出することにより、対象を、疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があるとして同定するための方法及び物質である。別の態様において、本明細書中提供されるのは、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在または異数性の存在を検出することにより、疾患（例えば、がん）を有すると診断されたまたは同定されている、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定されている対象を治療するための方法及び物質である。別の態様において、本明細書中提供されるのは、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在または異数性の存在を検出することにより、疾患（例えば、がん）を有すると診断されているまたは同定されている、あるいは疾患（例えば、がん）を有するまたは発症するリスク（例えば、高いリスク）があると同定されている対象の治療を同定するための方法及び物質である。別の態様において、本明細書中提供されるのは、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在または異数性の存在を検出することにより、治療に反応すると思われるまたは反応する可能性が高い対象を同定するための方法及び物質である。別の態様において、本明細書中提供されるのは、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在または異数性の存在を検出することにより、さらなる診断検査の候補として対象を同定するための方法及び物質である。別の態様において、本明細書中提供されるのは、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在または異数性の存在を検出することにより、より詳しいモニタリングの候補として対象を同定するための方法及び物質である。
【０２６４】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在または異数性の存在を検出することを含む方法は、がんの検出または診断に高い感度を提供する（例えば、対象ががんを有すると正確に同定する頻度または発生率が高い）。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在または異数性の存在を検出することを含む方法は、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、またはそれより高い感度を提供する。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在または異数性の存在を検出することを含む方法は、単一種のがんの検出に高い感度を提供する。本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在または異数性の存在を検出することを含む方法は、２種以上のがんの検出に高い感度を提供する。様々ながん種類のどれでも、本明細書中提供される方法及び物質を用いて検出することができる（例えば、「がん」とタイトルのついたセクションを参照）。いくつかの実施形態では、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在または異数性の存在を検出することを含む方法及び物質を用いて検出可能ながんには、肝臓癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、結腸直腸癌、肺癌、または乳癌が含まれる。いくつかの実施形態では、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在または異数性の存在を検出することを含む方法及び物質を用いて検出可能ながんには、膵臓癌が含まれる。いくつかの実施形態では、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在または異数性の存在を検出することを含む方法を用いて検出可能ながんには、女性生殖管の癌（例えば、子宮頸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、または卵管癌）が含まれる。いくつかの実施形態では、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在または異数性の存在を検出することを含む方法を用いて検出可能ながんには、膀胱癌または上部尿路上皮癌が含まれる。
【０２６５】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカータンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在または異数性の存在を検出することを含む方法
【０２６６】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在または異数性の存在を検出することを含む方法は、がんの検出または診断において高い特異性を提供する（例えば、対象ががんを有さない場合に、対象ががんを有すると間違って同定する頻度または発生率が低い）。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在または異数性の存在を検出することを含む方法は、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、またはそれより高い特異性を提供する。当業者には当然のことながら、９９％の特異性は、がんを有さない対象の１％のみが、がんを有すると間違って同定されることを意味する。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在または異数性の存在を検出することを含む方法は、単一のがんの検出において高い特異性を提供する（例えば、対象がその単一のがん種を有するとして間違って同定される可能性が低い）。いくつかの実施形態では、対象から得られた１つまたは複数の試料中の単一のバイオマーカークラス（例えば、遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカー）の１つまたは複数のメンバーの存在または異数性の存在を検出することを含む方法は、２種以上のがんの検出において高い特異性を提供する（例えば、対象がそれら２種以上のがん種を有するとして間違って同定される可能性が低い）。
【０２６７】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、単一のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む。
【０２６８】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの存在を検出することを含む：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及び／またはＧＮＡＳ。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下の遺伝子それぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーを検出することを含む：ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及びＧＮＡＳ。
【０２６９】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、または４）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーを検出することを含む：ＫＲＡＳ（例えば、１２番コドン及び／または６１番コドンの遺伝子バイオマーカー）、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、及び／またはＳＭＡＤ４。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下の遺伝子それぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーを検出することを含む：ＫＲＡＳ（例えば、１２番コドン及び／または６１番コドンの遺伝子バイオマーカー）、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、及びＳＭＡＤ４。
【０２７０】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーを検出することを含む：ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、及び／またはＣＤＫＮ２Ａ。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下の遺伝子それぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーを検出することを含む：ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、及びＣＤＫＮ２Ａ。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーを検出することを含む：ＰＴＥＮ、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＣＴＮＮＢ１、ＫＲＡＳ、ＦＧＦＲ２、ＰＯＬＥ、ＡＰＣ、ＦＢＸＷ７、ＲＮＦ４３、及び／またはＰＰＰ２Ｒ１Ａ。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下の遺伝子それぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーを検出することを含む：ＰＴＥＮ、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＣＴＮＮＢ１、ＫＲＡＳ、ＦＧＦＲ２、ＰＯＬＥ、ＡＰＣ、ＦＢＸＷ７、ＲＮＦ４３、及びＰＰＰ２Ｒ１Ａ。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、ＴＰ５３における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーを検出することを含む。
【０２７１】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）における１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーを検出することを含む：ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及び／またはＶＨＬ。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、遺伝子バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下の遺伝子それぞれにおける１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーを検出することを含む：ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及びＶＨＬ。
【０２７２】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８）を検出することを含む：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、及び／またはミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下のタンパク質バイオマーカーそれぞれを検出することを含む：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、及びミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１）を検出することを含む：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、フォリスタチン、Ｇ−ＣＳＦ、及び／またはＣＡ１５−３。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下のタンパク質バイオマーカーそれぞれを検出することを含む：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、フォリスタチン、Ｇ−ＣＳＦ、及びＣＡ１５−３。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下のタンパク質バイオマーカーのうち１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、または９）を検出することを含む：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、及び／またはＣＡ１５−３。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下のタンパク質バイオマーカーそれぞれを検出することを含む：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、及びＣＡ１５−３。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下のタンパク質バイオマーカーの１つまたは複数（例えば、１、２、３、または４）を検出することを含む：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、及び／またはＯＰＮ。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、タンパク質バイオマーカーパネルの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、以下のタンパク質バイオマーカーそれぞれを検出することを含む：ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、及びＯＰＮ。
【０２７３】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、異数性の存在を検出することを含む方法は、染色体腕５ｑ、８ｑ、及び／または９ｐの１つまたは複数における異数性を検出することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、異数性の存在を検出することを含む方法は、染色体腕４ｐ、７ｑ、８ｑ、及び／または９ｑの１つまたは複数における異数性を検出することを含む。
【０２７４】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される、単一のバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含む方法は、あるバイオマーカークラスの１つまたは複数のメンバーの存在を検出することを含み、そのようなバイオマーカーとして、制限なく、以下が挙げられる：コピー数変化、ＤＮＡメチル化変化、他の核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、ｍｔＤＮＡ、テロメアＤＮＡ、転座、及びゲノム再編成）、ペプチド、または代謝産物。
【０２７５】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、１つまたは複数の代謝産物の存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、生体試料が、がんを示す代謝産物を１つまたは複数含有する場合に、対象は、がんを有するまたは発症するリスクが高いと判定される。いくつかの実施形態では、生体試料が、がんを示す代謝産物を１つまたは複数含有する場合に、対象は、がんを有すると判定される。がんを示す代謝産物の限定ではない例として、以下が挙げられる：５−メチルチオアデノシン（ＭＴＡ）、グルタチオン還元型（ＧＳＨ）、Ｎ−アセチルグルタミン酸塩、ラクトース、Ｎ−アセチルノイラミン酸塩、ＵＤＰ−アセチルグルコサミン、ＵＤＰ−アセチルガラクトサミン、ＵＤＰ−グルクロン酸塩、パントテン酸塩、アラキドン酸塩（２０：４ｎ６）、コリン、シチジン５’−ジホスホコリン、ジホモ−リノレン酸塩（２０：３ｎ３）、ドコサペンタエン酸塩（ＤＰＡ２２：５ｎ３）、エイコサペンタエン酸塩（ＥＰＡ２０：５ｎ３）、グリセロホスホリルコリン（ＧＰＣ）、ドコサヘキサエン酸塩（ＤＨＡ２２：６ｎ３）、リノール酸塩（１８：２ｎ６）、シチジン５’−一リン酸（５’−ＣＭＰ）、ガンマ−グルタミルグルタミン酸塩、Ｘ−１４５７７、Ｘ−１１５８３、イソバレリルカルニチン、ホスホクレアチン、２−アミノアジピン酸、グルコン酸、Ｏ−アセチルカルニチン、アスパラギン酸、デアミド−ＮＡＤ＋、グルタミン酸、イソブチリルカルニチン、カルニチン、ピリドキサール、クエン酸、アデノシン、ＡＴＰ、バリン、ＸＣ００６１、イソロイシン、γ−ブチロベタイン、乳酸、アラニン、フェニルアラニン、グルコノラクトン、ロイシン、グルタチオン（ＧＳＳＧ）＿二価型、チロシン、ＮＡＤ＋、ＸＣ００１６、ＵＴＰ、クレアチン、テオブロミン、ＣＴＰ、ＧＴＰ、３−メチルヒスチジン、コハク酸、グリセロール３−リン酸、グルタミン、５−オキソプロリン、チアミン、ブチリルカルニチン、４−アセトアミドブタン酸、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−ガラクトース、トレオニン、Ｎ−アセチルグリシン、プロリン、ＡＤＰ、コリン、リンゴ酸、Ｓ−アデノシルメチオニン、パントテン酸、システインスルフィン酸、６−アミノヘキサン酸、ホモシステイン酸、ヒドロキシプロリン、メチオニンスルホキシド、３−グアニジノプロピオン酸、グルコース６−リン酸、フェナセツル酸、トレオン酸、トリプトファン、ピリドキシン、Ｎ−アセチルアスパラギン酸、４−グアニジノ酪酸、セリン、シトルリン、ベタイン、Ｎ−アセチルアスパラギン、２−ヒドロキシグルタル酸、アルギニン、グルタチオン（ＧＳＨ）、クレアチニン、ジヒドロキシアセトンリン酸、ヒスチジン、グリシン、グルコース１−リン酸、Ｎ−ホルミルグリシン、ケトプロフェン、リシン、ベータ−アラニン、Ｎ−アセチルグルタミン酸、２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール、オルニチン、ホスホリルコリン、グリセロホスホコリン、テレフタル酸、グリセルアルデヒド３−リン酸、Ｇｌｙ−Ａｓｐ、タウリン、フルクトース１，６−ビスリン酸、３−アミノイソ酪酸、スペルミジン、ＧＡＢＡ、トリエタノールアミン、グリセロール、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−アセチ���オルニチン、ジエタノールアミン、ＡＭＰ、システイングルタチオンジスルフィド、ストレプトマイシン硫酸塩＋Ｈ２Ｏ二価型、ｔｒａｎｓ−グルタコン酸、ニコチン酸、イソブチルアミン、ベタインアルデヒド＋Ｈ２Ｏ、ウロカニン酸、１−アミノシクロプロパン−１−カルボン酸ホモセリンラクトン、５−アミノ吉草酸、３−ヒドロキシ酪酸、エタノールアミン、イソ吉草酸、Ｎ−メチルグルタミン酸、シスタチオニン、スペルミン、カルノシン、１−メチルニコチンアミド、Ｎ−アセチルノイラミン酸、サルコシン、ＧＤＰ、Ｎ−メチルアラニン、パルミチン酸、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−ｒａｃ−グリセロールコレステロール５α、６αエポキシドラノステロール、リグノセリン酸、１オレオイル＿ｒａｃ＿ＧＬ、コレステロール＿エポキシド、エルカ酸、Ｔ−ＬＣＡ、オレオイル−Ｌ−カルニチン、オレアノール酸、３−ホスホグリセリン酸、５−ヒドロキシノルバリン、５−メトキシトリプタミン、アデノシン−５−一リン酸、アルファ−ケトグルタル酸塩、アスパラギン、安息香酸、ヒポキサンチン、マルトース、マルトトリオース、メチオニンスルホキシド、ノルニコチン、フェノール、ホスホエタノールアミン、ピロリン酸塩、ピルビン酸、キナ酸、タウリン、尿酸、イノシン、乳酸アミド、５−ヒドロキシノルバリンＮＩＳＴ、コレステロール、デオキシペンチトール、２−ヒドロキシエストロン、２−ヒドロキシエストラジオール、２−メトキシエストロン、２−メトキシエストラジオール、２−ヒドロキシエストロン−３−メチルエーテル、４−ヒドロキシエストロン、４−メトキシエストロン、４−メトキシエストラジオール、１６アルファ−ヒドロキシエストロン、１７−エピエストリオール、エストリオール、１６−ケトエストラジオール、１６−エピエストリオール、アシルカルニチンＣ１８：１、アミノ酸類のシトルリン及びｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリン、グリセロリン脂質類のＰＣａａＣ２８：１、ＰＣａｅＣ３０：０、及びＰＣａｅＣ３０：２、ならびにスフィンゴ脂質ＳＭ（ＯＨ）Ｃ１４：１。例えば、Ｈａｌａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  ｃｏｌｏｎ  ａｎｄ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｎｉｃｈｅ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｇｌｙｃａｎ  ａｎｄ  ｌｉｐｉｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ｖｏｌｕｍｅ  ７，Ａｒｔｉｃｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ：３９９９９（２０１７）、Ｈｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ  ｔｈｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｏｆ  ｌｉｖｅｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ＣＤ１３３，Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．，７：４５５５７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ４５５５７，（２０１７）、Ｅｌｉａｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕｒｉｎａｒｙ  Ｅｓｔｒｏｇｅｎｓ  ａｎｄ  Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ  ａｎｄ  Ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ  Ｒｉｓｋ  ｏｆ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  ａｍｏｎｇ  Ｐｒｅｍｅｎｏｐａｕｓａｌ  Ｗｏｍｅｎ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、７２（３）、６９６−��０６（２０１１）、Ｇａｎｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ：ａ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ−ｂａｓｅｄ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｈｉｇｈｌｙ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｎｇ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，Ｆｅｂ  ２、７（５）：５８１５−５８２９（２０１６）、Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｒｕｍ  ａｎｄ  Ｐｌａｓｍａ  Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，１３（６）：２０２−２０８，ｄｏｉ：１０．６０２６／９７３２０６３００１３２０２（２０１７）、Ｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｅ−ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｉｓｋ  ｉｎ  １０７７  ｃａｓｅｓ  ａｎｄ  １０７７  ｍａｔｃｈｅｄ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  Ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，ＢＭＣ  Ｍｅｄ．，１５：１２２，ｄｏｉ：１０．１１８６／ｓ１２９１６−０１７−０８８５−６（２０１７）を参照、これらはそれぞれ、その全体が本明細書中参照により援用される。
【０２７６】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、１つまたは複数のペプチド（例えば、１つまたは複数の方法において有用であると本明細書中記載される様々なタンパク質バイオマーカーとは異なる１つまたは複数のペプチド）の存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、生体試料が、がんを示すペプチドを１種または複数含有する場合に、対象は、がんを有するまたは発症するリスクが高いと判定される。いくつかの実施形態では、生体試料が、がんを示すペプチドを１種または複数含有する場合に、対象は、がんを有すると判定される。いくつかの実施形態では、ペプチドは、タンパク質に由来する（例えば、ペプチドは、タンパク質バイオマーカーまたは異なるタンパク質に存在するアミノ酸配列を含む）。がんを示すペプチドの限定ではない例として、以下のペプチド及び以下のタンパク質に由来するペプチドが挙げられる：ＣＥＡＣＡＭ、ＣＹＦＲＡ２１−１、ＣＡ１２５、ＰＫＬＫ、ＰｒｏＧＲＰ、ＮＳＥ、ＴＰＡ６、ＴＰＡ７、ＴＰＡ８、ＮＲＧ、ＮＲＧ１００、ＣＮＤＰ、ＡＰＯВ１００、ＳＣＣ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＨＥＲ２、ＢＲＡＦ、ＲＯＳ、ＲＥＴ、ＮＲＡＳ、ＭＥＴ、ＭＥＫ１、ＨＥＲ２、Ｃ４．４Ａ、ＰＳＦ３、ＦＡＭ８３Ｂ、ＥＣＤ、ＣＴＮＮＢ、ＶＩＭ、Ｓ１００Ａ４、Ｓ１００Ａ７、ＣＯＸ２、ＭＵＣ１、ＫＬＫＢ１、ＳＡＡ、ＨＰ−β鎖、Ｃ９、Ｐｇｒｍｃ１、Ｃｉｚ１、トランスフェリン、α−１アンチトリプシン、アポリポタンパク質１、補体ｃ３ａ、カベオリン−１、カリクレイン６、グルコース調節タンパク質−８、αディフェンシン−１、−２、−３、血清Ｃ−ペプチド、アルファ−２−ＨＳグリコールタンパク質、トリプシンＫＲＴ８ペプチド、血漿グリコールタンパク質、カテニン、ディフェンシンα６、ＭＭＰ、サイクリンＤ、Ｓ１００Ｐ、ラミンＡ／Ｃ線維タンパク質、熱ショックタンパク質、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、Ｔｘｌ−２、（チオレドキシン様タンパク質−２）、Ｐ５３、ｎｍ２３、ｕ−ＰＡ、ＶＥＧＦ、ＥｐｈＢ４、ＣＲＡＢＰ２、ＷＴ−１、Ｒａｂ−３Ｄ、メソテリン、ＥＲα、ＡＮＸＡ４、ＰＳＡＴ１、ＳＰＢ５、ＣＥＡ５、ＣＥＡ６、Ａ１ＡＴ、ＳＬＰＩ、ＡＰＯＡ４、ＶＤＢＰ、ＨＥ４、ＩＬ−１、−６、−７、−８、−１０、−１１、−１２、−１６、−１８、−２１、−２３、−２８Ａ、−３３、ＬＩＦ、ＴＮＦＲ１−２、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４）、ＩＬ１Ｒ−ａ、ＩＬ１Ｒ−ｂ、ＩＬ−２Ｒ、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＩＰ−１ａ、ＴＮＦ−α、ＣＤ４０、ＲＡＮＴＥＳ、ＣＤ４０Ｌ、ＭＩＦ、ＩＦＮ−β、ＭＣＰ−４（ＣＣＬ１３）、ＭＩＧ（ＣＸＣＬ９）、ＭＩＰ−１δ（ＣＣＬ１５）、ＭＩＰ３ａ（ＣＣＬ２０）、ＭＩＰ−４（ＣＣＬ１８）、ＭＰＩＦ−１、ＳＤＦ−１ａ＋ｂ（ＣＸＣＬ１２）、ＣＤ１３７／４−１ＢＢ、リンホタクチン（ＸＣＬ１）、エオタキシン−１（ＣＣＬ１１）、エオタキシン−２（ＣＣＬ２４）、６Ｃｋｉｎｅ／ＣＣＬ２１）、ＢＬＣ（ＣＸＣＬ１３）、ＣＴＡＣＫ（ＣＣＬ２７）、ＢＣＡ−１（ＣＸＣＬ１３）、ＨＣＣ４（ＣＣＬ１６）、ＣＴＡＰ−３（ＣＸＣＬ７）、ＩＧＦ１、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ３、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＣＴＧＦ、ＰＤＧＦ  ＡＡ、ＢＢ、ＰＤＧ���Ｒｂ、ｂＦＧＦ、ＴＧＦｂＲＩＩＩ、β−セルリン、ＩＧＦＢＰ１−４、６、ＢＤＮＦ、ＰＥＤＦ、アンジオポエチン−２、レニン、リゾホスファチジン酸、β２−ミクログロブリン、シアリルＴＮ、ＡＣＥ、ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＣＡ１５−３、ＣＡ−５０、ＣＡ７２−４、ＯＶＸ１、メソテリン、シアリルＴＮ、ＭＭＰ−２、−３、−７、−９、ＶＡＰ−１、ＴＩＭＰ１−２、テネイシンＣ、ＶＣＡＭ−１、オステオポンチン、ＫＩＭ−１、ＮＣＡＭ、テトラネクチン、ナイドジェン−２、カテプシンＬ、プロスタシン、マトリプターゼ、カリクレイン２、６、１０、シスタチンＣ、クローディン、スポンジン２、ＳＬＰＩ、ｂＨＣＧ、尿中ゴナドトロピンペプチド、インヒビン、レプチン、アディポネクチン、ＧＨ、ＴＳＨ、ＡＣＴＨ、ＰＲＬ、ＦＳＨ、ＬＨ、コルチゾール、ＴＴＲ、オステオカルシン、インスリン、グレリン、ＧＩＰ、ＧＬＰ−１、アミリン、グルカゴン、ペプチドＹＹ、フォリスタチン、ヘプシジン、ＣＲＰ、アポＡ１、ＣＩＩＩ、Ｈ、トランスサイレチン、ＳＡＡ、ＳＡＰ、補体Ｃ３、４、補体因子Ｈ、アルブミン、セルロプラスミン、ハプトグロビン、β−ヘモグロビン、トランスフェリン、フェリチン、フィブリノーゲン、トロンビン、フォン・ヴィルブランド因子、ミオグロビン、免疫抑制酸性タンパク質、脂質関連シアル酸、Ｓ１００Ａ１２（ＥＮ−ＲＡＧＥ）、フェチュインＡ、クラスタリン、α１−アンチトリプシン、ａ２−マクログロブリン、セルピン１（ヒトプラスミノーゲン活性化因子インヒビター−１）、Ｃｏｘ−１、Ｈｓｐ２７、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ８０、Ｈｓｐ９０、レクチン型酸化型ＬＤＬ受容体１、ＣＤ１４、リポカリン２、ＩＴＩＨ４、ｓＦａｓＬ、Ｃｙｆｒａ２１−１、ＴＰＡ、パーフォリン、ＤｃＲ３、ＡＧＲＰ、クレアチンキナーゼ−ＭＢ、ヒト乳脂肪球１−２、ＮＴ−Ｐｒｏ−ＢＮＰ、神経特異的エノラーゼ、ＣＡＳＡ、ＮＢ／７０Ｋ、ＡＦＰ、アファミン、コラーゲン、プロヒビチン、ケラチン−６、ＰＡＲＣ、Ｂ７−Ｈ４、ＹＫ−Ｌ４０、ＡＦＰ−Ｌ３、ＤＣＰ、ＧＰＣ３、ＯＰＮ、ＧＰ７３、ＣＫ１９、ＭＤＫ、Ａ２、５−ＨＩＡＡ、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、ＣＡ２７．２９、ＣＡ７２−４、カルシトニン、ＣＧＡ、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ、ＢＡＰ、ＢＣＴ−ＡＢＬ融合タンパク質、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＰＳＡ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ＮＭＰ２２、ＰＡＩ−１、ｕＰＡ、フィブリンＤ−二量体、Ｓ１００、ＴＰＡ、サイログロブリン、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ４４、ＲＳ／ＤＪ−１、ｐ５３、アルファ−２−ＨＳ−糖タンパク質、リポフィリンＢ、ベータ−グロビン、ヘモペキシン、ＵＢＥ２Ｎ、ＰＳＭＢ６、ＰＰＰ１ＣＢ、ＣＰＴ２、ＣＯＰＡ、ＭＳＫ１／２、Ｐｒｏ−ＮＰＹ、セセルニン−１、ビンクリン、ＮＡＡＡ、ＰＴＫ７、ＴＦＧ、ＭＣＣＣ２、ＴＲＡＰ１、ＩＭＰＤＨ２、ＰＴＥＮ、ＰＯＳＴＮ、ＥＰＬＩＮ、ｅＩＦ４Ａ３、ＤＤＡＨ１、ＡＲＧ２、ＰＲＤＸ３＆４、Ｐ４ＨＢ、ＹＷＨＡＧ、エノイルＣｏＡヒドラーゼ、ＰＨＢ、ＴＵＢＢ、ＫＲＴ２、ＤＥＳ、ＨＳＰ７１、ＡＴＰ５Ｂ、ＣＫＢ、ＨＳＰＤ１、ＬＭＮＡ、ＥＺＨ２、ＡＭＡＣＲ、ＦＡＢＰ５、ＰＰＡ２、ＥＺＲ、ＳＬＰ２、ＳＭ２２、Ｂａｘ、Ｓｍａｃ／Ｄｉａｂｌｏホスホリル化Ｂｃｌ２、ＳＴＡＴ３及びＳｍａｃ／Ｄｉａｂｌｏ発現、ＰＨＢ、ＰＡＰ、ＡＭＡＣＲ、ＰＳＭＡ、ＦＫＢＰ４、ＰＲＤＸ４、ＫＲＴ７／８／１８、ＧＳＴＰ１、ＮＤＰＫ１、ＭＴＸ２、ＧＤＦ１５、ＰＣａ−２４、カベオリン−２、プロトロンビン、アンチトロンビン−ＩＩＩ、ハプトグロビン、血清アミロイドＡ−１タンパク質、ＺＡＧ、ＯＲＭ２、ＡＰＯＣ３、ＣＡＬＭＬ５、ＩＧＦＢＰ２、ＭＵＣ５ＡＣ、ＰＮＬＩＰ、ＰＺＰ、ＴＩＭＰ１、ＡＭＢＰ、インター−アルファ−トリプシンインヒビター重鎖Ｈ１、インター−アルファ−トリプシンインヒビター重鎖Ｈ２、インター−アルファ−トリプシンインヒビター重鎖Ｈ３、Ｖ型プロトンＡＴＰアーゼサブユニットＢ、腎臓アイソフォーム、肝細胞増殖因子様タンパク質、血清アミロイドＰ成分、アシルグリセロールキナーゼ、ロイシンリッチリピート含有タンパク質９、ベータ−２−糖タンパク質１、血漿プロテアーゼＣ１インヒビター、リポキシゲナーゼ相同ドメイン含有タンパク質１、プロトカドヘリンアルファ−１３。例えば、Ｋｕｐｐｕｓａｍｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｏｌｕｍｅ  ２４，Ｉｓｓｕｅ  ６，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２０１７，Ｐａｇｅｓ  １２１２−１２２１、Ｅｌｚｅｋ  ａｎｄ  Ｒｏｄｌａｎｄ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ．２０１５  Ｍａｒ；３４（１）：８３−９６、Ｎｏｅｌ  ａｎｄ  Ｌｏｋｓｈｉｎ，Ｆｕｔｕｒｅ  Ｏｎｃｏｌ．２０１２  Ｊａｎ；８（１）：５５−７１、Ｔｓｕｃｈｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２０１５  Ｏｃｔ  ７；２１（３７）：１０５７３−１０５８３、Ｌｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｒｋ  Ｃａｎｃｅｒ．２０１７；９：１−９、Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１７  Ｊｕｎ  ２７；８（２６）：４２７６１−４２７７１、Ｓａｒａｓｗａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｄ．２０１７  Ｊｕｌ；６（７）：１７３８−１７５１、Ｚａｍａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒｓ（Ｂａｓｅｌ）．２０１７  Ｎｏｖ；９（１１）：１５５、Ｔａｎａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１７  Ｍａｒ  １４；８（１１）：１８４９７−１８５１２を参照、これらはそれぞれ、その全体が本明細書中参照により援用される。
【０２７７】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法は、１つまたは複数の核酸損傷または変型（例えば、１つまたは複数の方法において有用であると本明細書中記載される様々な遺伝子バイオマーカーとは異なる１つまたは複数の核酸損傷または変型）の存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、生体試料が、がんを示す核酸損傷または変型を１つまたは複数含有する場合に、対象は、がんを有するまたは発症するリスクが高いと判定される。いくつかの実施形態では、生体試料が、がんを示す核酸損傷または変型を１つまたは複数含有する場合に、対象は、がんを有すると判定される。核酸損傷または変型の限定ではない例として、コピー数変化、ＤＮＡメチル化変化、及び／または他の核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、ｍｔＤＮＡ、テロメアＤＮＡ、転座、及びゲノム再編成）が挙げられる。転座及びゲノム再編成は、様々ながん（例えば、前立腺、神経膠腫、肺癌、非小細胞肺癌、メラノーマ、及び甲状腺癌）と相関するとされており、長年にわたりバイオマーカーとして使用されている（例えば、Ｄｅｍｅｕｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｓｕｒｇ．，３８：１２９６−３０５、Ｈｏｇｅｎｂｉｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，１１３：Ｅ３６４９−５６、Ｇａｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，６：ｅ１６３３２、Ｏｇｉｗａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２７：４７８８−９７、米国特許第９，７４５，６３２号、及び米国特許第６，５７６，４２０号）。また、コピー数の変化も、様々ながんのバイオマーカーとして使用されてきており、そのようながんとして、制限なく、頭頚部扁平上皮癌、リンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫）、及び結腸直腸癌が挙げられる（Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７，Ｔｕｍｏｕｒ  Ｂｉｏｌ，３９：１０１０４２８３１７７４０２９６、Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７，Ｔｕｍｏｕｒ  Ｂｉｏｌ．，３９：１０１０４２８３１７７３６６４３、Ｈｅｎｒｉｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．，１４：４１９−２２、及び米国特許第９，８１６，１３９号）。ＤＮＡメチル化及びＤＮＡメチル化の変化（例えば、低メチル化、高メチル化）も、がんのバイオマーカーとして使用される。例えば、低メチル化は、肝細胞癌（例えば、Ｈｅｎｒｉｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．，１４：４１９−２２を参照）、食道癌発生（例えば、Ａｌｖａｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ．，７：ｅ１００１３５６を参照）、ならびに胃癌及び肝臓癌（例えば、米国特許第８，７２８，７３２号を参照）に関連するとされており、高メチル化は、結腸直腸癌に関連するとされている（例えば、米国特許第９，９５７，５７０号を参照）。ゲノム規模でのメチル化の変化に加えて、特定遺伝子内での特異的メチル化変化が、特定のがんを示すものとなり得る（例えば、米国特許第８，１５０，６２６号を参照）。Ｌｉら（２０１２，Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．，２２：３８４−９４）は、多数のがん（例えば、乳癌、膀胱癌、胃癌、肺癌、前立腺癌、頭頚部扁平細胞癌、及び上咽頭癌）と異常なメチル化の間の関連について総説を提供している。これに加えてまたはこれに代えて、さらなる種類の核酸または核酸の特徴が、様々ながんと関連するとされている。そのような核酸または核酸の特徴の限定ではない例として、様々なマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の有無が挙げられ、この有無は、結腸癌、前立腺癌、結腸直腸癌、及び卵巣癌の診断に使用されている（例えば、Ｄ’Ｓｏｕｚａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８，ＰＬｏｓ  Ｏｎｅ，１３：ｅ０１９４２６８、Ｆｕｋａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７，Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．，１０８：８８６−９６、Ｇｉｒａｌｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１７６８：４５９−７４、米国特許第８，３４３，７１８号、同第９，４１０，９５６号、及び同第９，０７４，２０６号を参照）。ｍｉＲ−２２とがんの特異的関連性の総説については、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．，５０：３４５−５５）を参照。長鎖非翻訳ＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）の異常発現も、前立腺癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、メラノーマ、非小細胞肺癌、胃癌、子宮内膜癌、及び肝細胞癌などのがんのバイオマーカーとして使用されている（例えば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，８：５８５７７０８６、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ，１７：１１０、Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８，Ｅｕｒ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，２２：４８１２−９、Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８，Ｅｕｒ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，２２：９９３−１００２、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８，Ｅｕｒ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，２２：４８２０−７、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８，Ｅｕｒ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，２２：２３０４−９、Ｘｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８，ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ，３３：５７−６７、及び米国特許第９，４１０，２０６号を参照）、環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）の有無は、肺癌、乳癌、胃癌、結腸直腸癌、及び肝臓癌（例えば、Ｇｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８，Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．，１１：９８）、ならびにメラノーマ（例えば、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８，Ｏｎｃｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１６：１２１９−２５）のバイオマーカーとして使用されている。テロメアＤＮＡの変化（例えば、長さまたはヘテロ接合性の変化）またはセントロメアＤＮＡの変化（例えば、セントロメア遺伝子の発現の変化）も、がんと関連するとされている（例えば、前立腺、乳房、肺、リンパ腫、及びユーイング肉腫）（例えば、Ｂａｒｅｔｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５４：４４７２−８０、Ｌｉｓｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８０：８２１−６、Ｐｒｏｃｔｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１７９２：２６０−７４、及びＳｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１３９：８９９−９０７を参照）。ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の様々な変異（例えば、欠失）、��編成、及び／またはコピー数変化が、さまざまながん（例えば、前立腺癌、メラノーマ、乳癌、肺癌、及び結腸直腸癌）について予後及び診断に使用されている。例えば、Ｍａｒａｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｍａｒｋ．，１５：７６３−７３、Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ，１０：６２−６８、Ｈｏｓｇｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎ．，３１：８４７−９、Ｔｈｙａｇａｒａｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ＆  Ｐｒｅｖ．，２１：１５７４−８１、及び米国特許第９，７４５，６３２号を参照。またメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の異常な存在、不在、または量も、様々ながんとの相関が見つかっており、そのようながんとして、特に制限なく、乳癌、ウィルムス腫瘍、及び子宮頸癌が挙げられる（例えば、Ｇｕｅｔｓｃｈｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌｙ．Ｃｈｅｍ．，４０４：３９９−４０６、Ｓｃｈｗｉｅｎｂａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６０：１５２１−５、及びＮｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｉｔｏｕｒｉｎ  Ｍｅｄ．，７３：５４−８を参照）。これらの引用は、それぞれ、その全体が本明細書中参照により援用される。
【０２７８】
検出された遺伝子バイオマーカーの検証
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法を用いて、無細胞ＤＮＡに存在する循環腫瘍ＤＮＡで検出された遺伝子バイオマーカーが、対象における癌細胞の存在を示すものであることを検証することができる。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される方法を用いて、無細胞ＤＮＡに存在する循環腫瘍ＤＮＡで検出された遺伝子変異（例えば、１つまたは複数の遺伝子変異）が、対象における癌細胞の存在を示すものであることを検証することができる。例えば、癌細胞に存在するある特定の遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）は、体内の他の非癌細胞にも生じる。そのような非癌細胞として、特に制限なく、加齢に関連したクローン性造血（例えば、クローン性造血拡大（不確定潜在性クローン性造血、すなわちＣＨＩＰとしても知られる）または骨髄形成異常症）中に生じる白血球細胞クローンが挙げられる。結果として、そのようなクローンは、骨髄形成異常症の初期型を表す場合があり、それらは、偽陽性ｃｔＤＮＡアッセイの原因となる可能性がある。そのような場合、無細胞ＤＮＡにおいて遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）が検出されると、がんの誤診を招く可能性がある。なぜなら、遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）は、がん（例えば、固形腫瘍）に由来するのではなく、造血性白血球細胞に由来するからである。本明細書中提供される方法は、そのようながんの誤診を減少させるまたは排除することができる。
【０２７９】
本明細書中提供される方法は、無細胞ＤＮＡで検出された１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）が、がん細胞ではなく造血性白血球細胞に由来するかどうかを判定することにより、がんの誤診を減少させるまたは排除することができる。例えば、対象の白血球細胞からＤＮＡを単離するまたは得ることができ、このＤＮＡを検査して、対象由来の無細胞ＤＮＡで同定された遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）の有無を判定することができ、この遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）は、がんに関連する。いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）が、白血球細胞由来のＤＮＡで同定された場合、無細胞ＤＮＡで同定された遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）は、白血球細胞に由来したものであり、対象に存在するがん細胞に由来するものではなかったことを示す。いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）が、白血球細胞由来のＤＮＡで同定されなかった場合、無細胞ＤＮＡで同定された遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）は、対象に存在するがん細胞に由来したものであり、白血球細胞に由来するものではなかったことを示す。遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）が対象中のがん細胞に由来するかどうかを判定する目的で、白血球細胞から単離されたまたは得られたＤＮＡを、がんに関連した遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）の有無について検査する方法は、本明細書中、概して「白血球細胞に対して遺伝子変異を検証すること」、「白血球細胞由来のＤＮＡに対して遺伝子変異を検証すること」、「白血球細胞検証」、及び同様な表現で記載される。
【０２８０】
がんに関連した任意の遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）を、本明細書中記載される方法を用いて検証することができる。がんに関連した遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異を有する遺伝子）の例として、制限なく、ＡＢＣＡ７、ＡＢＬ１、ＡＢＬ２、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＪＵＢＡ、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＬＢ、ＡＬＤＯＢ、ＡＬＫ、ＡＭＢＲＡ１、ＡＭＥＲ１、ＡＭＯＴ、ＡＮＫＲＤ４６、ＡＰＣ、ＡＲ、ＡＲＨＧＡＰ３５、ＡＲＨＧＥＦ１２、ＡＲＩＤ１Ａ、ＡＲＩＤ１Ｂ、ＡＲＩＤ２、ＡＲＩＤ４Ｂ、ＡＲＬ１５、ＡＲＭＣＸ１、ＡＳＸＬ１、ＡＳＸＬ２、ＡＴＡＤ２、ＡＴＦ１、ＡＴＧ１４、ＡＴＧ５、ＡＴＭ、ＡＴＲＸ、ＡＴＸＮ２、ＡＸＩＮ１、Ｂ２Ｍ、ＢＡＰ１、ＢＣＬ１１Ａ、ＢＣＬ１１Ｂ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ３、ＢＣＬ６、ＢＣＬ９、ＢＣＬＡＦ１、ＢＣＯＲ、ＢＣＲ、ＢＩＲＣ６、ＢＩＲＣ８、ＢＬＭ、ＢＬＶＲＡ、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＲＡＦ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＢＲＤ７、ＢＲＥ、ＢＲＷＤ３、ＢＴＢＤ７、ＢＴＲＣ、Ｃ１１ｏｒｆ７０、Ｃ１２ｏｒｆ５７、Ｃ２ＣＤ５、Ｃ３ｏｒｆ６２、Ｃ８ｏｒｆ３４、ＣＡＭＫＶ、ＣＡＰＧ、ＣＡＲＤ１１、ＣＡＲＳ、ＣＡＳＰ８、ＣＢＦＡ２Ｔ３、ＣＢＦＢ、ＣＢＬＣ、ＣＢＸ４、ＣＣＡＲ１、ＣＣＤＣ１１７、ＣＣＤＣ８８Ａ、ＣＣＭ２、ＣＣＮＣ、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＤ３、ＣＣＲ３、ＣＤ１Ｄ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤＣ７３、ＣＤＣＰ１、ＣＤＨ１、ＣＤＨ１１、ＣＤＫ１２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＸ２、ＣＥＢＰＡ、ＣＥＬＦ１、ＣＥＮＰＢ、ＣＥＰ１２８、ＣＨＤ２、ＣＨＤ４、ＣＨＤ８、ＣＨＥＫ２、ＣＨＲＤＬ１、ＣＨＵＫ、ＣＩＣ、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＣＭＴＲ２、ＣＮＮ２、ＣＮＯＴ１、ＣＮＯＴ４、ＣＯＬ１１Ａ１、ＣＯＰＳ４、ＣＯＸ７Ｂ２、ＣＲＥＢ１、ＣＲＥＢＢＰ、ＣＳＤＥ１、ＣＳＭＤ３、ＣＴＣＦ、ＣＴＤＮＥＰ１、ＣＴＮＮＢ１、ＣＵＬ１、ＣＵＬ２、ＣＹＢ５Ｂ、ＣＹＬＤ、ＤＡＣＨ１、ＤＣＨＳ１、ＤＣＵＮ１Ｄ１、ＤＤＢ２、ＤＤＩＴ３、ＤＤＸ３Ｘ、ＤＤＸ５、ＤＤＸ６、ＤＥＫ、ＤＨＸ１５、ＤＨＸ１６、ＤＩＣＥＲ１、ＤＩＲＣ２、ＤＩＳ３、ＤＩＸＤＣ１、ＤＫＫ２、ＤＮＡＪＢ５、ＤＮＥＲ、ＤＮＭ１Ｌ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＥＥＤ、ＥＧＦＲ、ＥＩＦ１ＡＸ、ＥＩＦ２ＡＫ３、ＥＩＦ２Ｓ２、ＥＩＦ４Ａ１、ＥＩＦ４Ａ２、ＥＬＦ３、ＥＬＫ４、ＥＭＧ１、ＥＭＲ３、ＥＰ３００、ＥＰＢ４１Ｌ４Ａ、ＥＰＨＡ２、ＥＰＳ８、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＥＲＲＦＩ１、ＥＴＶ４、ＥＴＶ６、ＥＶＩ１、ＥＷＳＲ１、ＥＸＯ５、ＥＸＴ１、ＥＸＴ２、ＥＺＨ２、Ｆ５、ＦＡＮＣＭ、ＦＡＴ１、ＦＢＮ２、ＦＢＸＷ７、ＦＣＥＲ１Ｇ、ＦＥＶ、ＦＧＦ２、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ１ＯＰ、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＨ、ＦＬＴ３、ＦＮ１、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＰ１、ＦＵＢＰ１、ＦＵＳ、ＧＡＬＮＴＬ５、ＧＡＴＡ３、ＧＧＣＴ、ＧＩＧＹＦ２、ＧＫ２、ＧＬＩＰＲ２、ＧＮＡＳ、ＧＮＰＴＡＢ、ＧＮＲＨＲ、ＧＯＬＧＡ５、ＧＯＬＭ１、ＧＯＰＣ、ＧＯＴ２、ＧＰＣ３、ＧＰＳ２、ＧＰＸ７、ＧＲＫ１、ＧＳＥ１、ＧＺＭＡ、ＨＤＡＣ１、ＨＥＲＣ１、ＨＥＲＣ４、ＨＧＦ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＯ、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＭＣＮ１、ＨＭＧＡ１、ＨＭＧＡ２、ＨＮＲＮＰＡ１、ＨＲＡＳ、ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＩＤ３、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＩＦＮＧＲ２、ＩＦＴ８８、ＩＫＺＦ２、ＩＬ２、ＩＮＯ８０Ｃ、ＩＮＰＰ４Ａ、ＩＮＰＰＬ１、ＩＲＦ４、ＩＷＳ１、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＵＮ、ＫＡＮＳＬ１、ＫＡＴ８、ＫＡＴＮＡＬ１、ＫＢＴＢＤ７、ＫＣＮＭＢ４、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ６Ａ、ＫＥＡＰ１、ＫＩＡＡ１４６７、ＫＩＴ、ＫＬＦ４、ＫＭＴ２Ａ、ＫＭＴ２Ｂ、ＫＭＴ２Ｃ、ＫＭＴ２Ｄ、ＫＭＴ２Ｅ、ＫＲＡＳ、ＫＲＴ１５、ＬＡＭＴＯＲ１、ＬＡＲＰ４Ｂ、ＬＣＫ、ＬＭＯ２、ＬＰＡＲ２、ＬＹＮ、ＭＡＦ、ＭＡＦＢ、ＭＡＭＬ２、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＭＡＰ２Ｋ４、ＭＡＰ３Ｋ１、ＭＡＰ４Ｋ３、ＭＡＰＫ１、ＭＡＸ、ＭＢ２１Ｄ２、ＭＢＤ１、ＭＢＤ６、ＭＢＮＬ１、ＭＢＮＬ３、ＭＤＭ２、ＭＤＭ４、ＭＥＤ１２、ＭＥＤ２３、ＭＥＮ１、ＭＥＴ、ＭＧＡ、ＭＩＴＦ、ＭＫＬＮ１、ＭＬＨ１、ＭＬＬ、ＭＬＬＴ４、ＭＯＡＰ１、ＭＯＲＣ４、ＭＰＬ、ＭＳ４Ａ１、ＭＳＨ２、ＭＳＩ１、ＭＴＯＲ、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ＭＹＤ８８、ＭＹＬ６、ＭＹＯ１Ｂ、ＭＹＯ６、ＮＡＡ１５、ＮＡＡ２５、ＮＡＰ１Ｌ２、ＮＡＰ１Ｌ４、ＮＣＯＡ２、ＮＣＯＡ４、ＮＣＯＲ１、ＮＥＫ９、ＮＦ１、ＮＦ２、ＮＦＥ２Ｌ２、ＮＦＥ２Ｌ３、ＮＦＫＢ２、ＮＩＰＢＬ、ＮＩＴ１、ＮＫＸ３−１、ＮＭＥ４、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＰＭ１、ＮＲ４Ａ３、ＮＲＡＳ、ＮＳＤ１、ＮＴＲＫ１、ＮＵＰ２１４、ＮＵＰ９８、ＰＡＬＢ２、ＰＡＸ８、ＰＢＲＭ１、ＰＣＢＰ１、ＰＣＯＬＣＥ２、ＰＤＧＦＢ、ＰＨＦ６、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３ＣＢ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＩＭ１、ＰＬＡＧ１、ＰＭＬ、ＰＯＬＡ２、ＰＯＴ１、ＰＰＡＲＤ、ＰＰＡＲＧ、ＰＰＭ１Ｄ、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＰＰＰ６Ｃ、ＰＲＫＡＣＡ、ＰＲＫＣＩ、ＰＲＰＦ４０Ａ、ＰＳＩＰ１、ＰＴＥＮ、ＰＴＨ２、ＰＴＭＳ、ＰＴＮ、ＰＴＰＮ１１、ＲＡＢ１８、ＲＡＣ１、ＲＡＦ１、ＲＡＮＢＰ３Ｌ、ＲＡＰＧＥＦ６、ＲＡＳＡ１、ＲＢ１、ＲＢＢＰ６、ＲＢＭ１０、ＲＢＭ２６、ＲＣ３Ｈ２、ＲＥＬ、ＲＥＲＥ、ＲＥＴ、ＲＦＣ４、ＲＨＥＢ、ＲＨＯＡ、ＲＩＭＳ２、ＲＩＴ１、ＲＮＦ１１１、ＲＮＦ４３、ＲＯＳ１、ＲＰＬ１１、ＲＰＬ５、ＲＱＣＤ１、ＲＲＡＳ２、ＲＵＮＸ１、ＲＸＲＡ、ＳＡＲＭ１、ＳＣＡＦ１１、ＳＤＨＢ、ＳＤＨＤ、ＳＥＣ２２Ａ、ＳＥＮＰ３、ＳＥＮＰ８、ＳＥＴＤ１Ｂ、ＳＥＴＤ２、ＳＦ３Ａ３、ＳＦ３Ｂ１、ＳＦＰＱ、ＳＩＮ３Ａ、ＳＫＡＰ２、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＲＣＡ４、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＭＡＲＣＣ２、ＳＭＯ、ＳＮＣＢ、ＳＯＣＳ１、ＳＯＳ１、ＳＯＸ４、ＳＯＸ９、ＳＰ３、ＳＰＥＮ、ＳＰＯＰ、ＳＰＳＢ２、ＳＳ１８、ＳＴＡＧ２、ＳＴＫ１１、ＳＴＫ３１、ＳＵＦＵ、ＳＵＦＵ、ＳＵＺ１２、ＳＹＫ、ＴＡＦ１Ａ、ＴＡＲＤＢＰ、ＴＡＳ２Ｒ３０、ＴＢＬ１ＸＲ１、ＴＢＸ３、ＴＣＦ１２、ＴＣＦ３、ＴＣＦ７Ｌ２、ＴＣＬ１Ａ、ＴＥＴ２、ＴＥＸ１１、ＴＦＤＰ２、ＴＦＧ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＨＲＡＰ３、ＴＬＸ１、ＴＭ９ＳＦ１、ＴＭＣＯ２、ＴＭＥＤ１０、ＴＭＥＭ１０７、ＴＭＥＭ３０Ａ、ＴＭＰＯ、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＮＲＣ６Ｂ、ＴＰ５３、ＴＰ５３ＢＰ１、ＴＰＲ、ＴＲＡＦ３、ＴＲＩＭ８、ＴＲＩＰ１２、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＴＴＫ、ＴＴＲ、ＴＵＢＡ３Ｃ、Ｕ２ＡＦ１、ＵＢＥ２Ｄ３、ＵＢＲ５、ＵＮＣ１３Ｃ、ＵＮＫＬ、ＵＰＰ１、ＵＳＯ１、ＵＳＰ２８、ＵＳＰ６、ＵＳＰ９Ｘ、ＶＨＬ、ＶＮ１Ｒ２、ＶＰＳ３３Ｂ、ＷＡＣ、ＷＤＲ３３、ＷＤＲ４７、ＷＲＮ、ＷＴ１、ＷＷＰ１、ＸＰＯ１、ＹＯＤ１、ＺＣ３Ｈ１３、ＺＤＨＨＣ４、ＺＦＨＸ３、ＺＦＰ３６Ｌ１、ＺＦＰ３６Ｌ２、ＺＧＲＦ１、ＺＭＹＭ３、ＺＭＹＭ４、ＺＮＦ２３４、ＺＮＦ２６８、ＺＮＦ２９２、ＺＮＦ３１８、ＺＮＦ３４５、ＺＮＦ６００、ＺＮＦ７５０、及び／またはＺＮＦ８００が挙げられる。いくつかの実施形態では、対象から単離されたまたは得られた白血球細胞ＤＮＡに対して検証可能な、がんに関連した遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異を有する遺伝子）として、腫瘍抑制遺伝子またはがん遺伝子が挙げられる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のコドン及び／またはそれらの周囲のスプライス部位を、本明細書中開示される方法により検査することができる。検査可能な腫瘍抑制遺伝子及びがん遺伝子のコドンの例として、制限なく、以下のコドン及び／またはそれらの周囲のスプライス部位のうち１つまたは複数を挙げることができる：ＡＫＴ１の１６〜１８番コドン、ＡＰＣの１３０４〜１３１１、１４５０〜１４５９番コドン、ＢＲＡＦの５９１〜６０２番コドン、ＣＤＫＮ２Ａの５１〜５８、７６〜８８番コドン、ＣＴＮＮＢ１の３１〜３９、３８〜４７番コドン、ＥＧＦＲの８５６〜８６８番コドン、ＦＢＸＷ７の３６１〜３７１、４６４〜４７３、４７３〜４８３、４９８〜５０７番コドン、ＦＧＦＲ２の２５０〜２５６番コドン、ＧＮＡＳの１９９〜２０８番コドン、ＨＲＡＳの７〜１９番コドン、ＫＲＡＳの７〜１４、５７〜６５、１４３〜１４８番コドン、ＮＲＡＳの３〜１５、５４〜６３番コドン、ＰＩＫ３ＣＡの８０〜９０、３４３〜３４８、５４１〜５５１、１０３８〜１０５０番コドン、ＰＰＰ２Ｒ１Ａの１７５〜１８７番コドン、ＰＴＥＮの９０〜９８、１２５〜１３２、１３３〜１４６、１４５〜１５４番コドン、及びＴＰ５３の１０〜２２、２５〜３２、３３〜４０、４０〜５２、５２〜６４、８２〜９４、９７〜１１０、１１２〜１２５、１２３〜１２５、１２６〜１３２、１３２〜１４２、１５０〜１６３、１６７〜１７７、１７５〜１８６、１８７〜１９５、１９５〜２０６、２０７〜２１９、２１９〜２２４、２２６〜２３７、２３２〜２４５、２４８〜２６１、２６１〜２６８、２７２〜２８３、２７９〜２９０、２９８〜３０７、３０７〜３１４、３２３〜３３１、３３３〜３４４、３４４〜３５５、３６７〜３７５、３７４〜３８６番コドン。いくつかの実施形態では、対象から単離されたまたは得られた白血球細胞ＤＮＡに対して検証可能な、がんに関連した遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異を有する遺伝子）として、表１１または表１２において同定される遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）の１つまたは複数が挙げられる。白血球細胞から単離されたまたは得られたＤＮＡの検査は、そのようなＤＮＡの増幅及び／または配列決定を含むことができる（例えば、本明細書中記載される方法のいずれかを用いて、そのような方法として、特に制限なく、Ｓａｆｅ−ＳｅｑＳ法が挙げられる）。Ｓａｆｅ−ＳｅｑＳなどの技法の使用により、白血球細胞から単離されたまたは得られたＤＮＡを検査する場合に、対象から得られた無細胞ＤＮＡを検査する場合にその技法が提供するのに相当する利点が得られる。
【０２８１】
いくつかの実施形態では、単一遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）を、白血球細胞から単離されたまたは得られたＤＮＡに対して検証する。いくつかの実施形態では、１つより多い遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）を、白血球細胞から単離されたまたは得られたＤＮＡに対して検証する。例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）を、本明細書中記載される方法を用いて、白血球細胞から単離されたまたは得られたＤＮＡに対して検証するすることができる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）を、白血球細胞から単離されたまたは得られた複数の試料を用いて、白血球細胞から単離されたまたは得られたＤＮＡに対して検証する。例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）を、対象から単離されたまたは得られた２つの白血球細胞試料からＤＮＡを単離することにより白血球細胞から単離されたまたは得られたＤＮＡに対して検証することができる。複数の試料を用いて、遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）を、白血球細胞から単離されたまたは得られたＤＮＡに対して検証することにより、検査の感度が向上し、その結果、より正確な診断を導くことができる。
【０２８２】
いくつかの実施形態では、追加の診断検査法を用いずに、白血球細胞から単離されたまたは得られたＤＮＡに対して遺伝子バイオマーカー（複数可）（例えば、遺伝子変異（複数可））を検証することにより、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）が、対象中のがん細胞に由来する（または由来しない）と判定することができる。いくつかの実施形態では、追加の診断検査法を併用して、白血球細胞から単離されたまたは得られたＤＮＡに対して遺伝子バイオマーカー（複数可）（例えば、遺伝子変異（複数可））を検証することにより、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）が、対象中のがん細胞に由来する（または由来しない）と判定することができる。いくつかの実施形態では、そのような追加の診断検査法として、本明細書中記載される診断検査法の１つまたは複数を含むことができる。いくつかの実施形態では、そのような追加の診断検査法として、タンパク質バイオマーカー（例えば、本明細書中開示されるタンパク質バイオマーカーの１つまたは複数）の検査を含むことができる。いくつかの実施形態では、そのような追加の診断検査法として、ある特定閾値でのタンパク質バイオマーカー（例えば、本明細書中開示されるタンパク質バイオマーカーの１つまたは複数）の検査を含むことができる。白血球細胞検証と併用可能なタンパク質バイオマーカーの例として、特に制限なく、炭水化物抗原１９−９（ＣＡ１９−９）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、オステオポンチン（ＯＰＮ）、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、フォリスタチン、Ｇ−ＣＳＦ、及びＣＡ１５−３が挙げられる。本明細書中開示されるそのようなタンパク質バイオマーカーの様々な閾値のどれでも、無細胞ＤＮＡで見つかる遺伝子バイオマーカー（複数可）（例えば、遺伝子変異（複数可））の白血球細胞検証と併用することができる。ある特定のタンパク質バイオマーカーの閾値の限定ではない例として、以下が挙げられる：ＣＡ１９−９（＞９２Ｕ／ｍｌ）、ＣＥＡ（＞７，５０７ｐｇ／ｍｌ）、ＣＡ１２５（＞５７７Ｕ／ｍｌ）、ＡＦＰ（＞２１，３２１ｐｇ／ｍｌ）、プロラクチン（＞１４５，３４５ｐｇ／ｍｌ）、ＨＧＦ（＞８９９ｐｇ／ｍｌ）、ＯＰＮ（＞１５７，７７２ｐｇ／ｍｌ）、ＴＩＭＰ−１（＞１７６，９８９ｐｇ／ｍｌ）、フォリスタチン（＞１，９７０ｐｇ／ｍｌ）、Ｇ−ＣＳＦ（＞８００ｐｇ／ｍｌ）、及びＣＡ１５−３（＞９８Ｕ／ｍｌ）。いくつかの実施形態では、タンパク質バイオマーカーの閾値は、本明細書中記載される例示の閾値より高い（例えば、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、またはそれより高い）ことが可能である。いくつかの実施形態では、タンパク質バイオマーカーの閾値は、本明細書中記載される例示の閾値より低い（例えば、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、またはそれより低い）ことが可能である。ある特定の実施形態において、単一タンパク質バイオマーカーの検査が、無細胞ＤＮＡで見つかった遺伝子バイオマーカー（複数可）（例えば、遺伝子変異（複数可）））の白血球細胞検証と併用される。ある特定の実施形態において、１つより多いタンパク質バイオマーカー（２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、またはそれ以上のタンパク質バイオマーカー）の検査が、無細胞ＤＮＡで見つかった遺伝子バイオマーカー（複数可）（例えば、遺伝子変異（複数可）））の白血球細胞検証と併用される。
【０２８３】
いくつかの実施形態では、複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子バイオマーカーパネル）が、白血球細胞から単離されたまたは得られたＤＮＡに対して検証される。いくつかの実施形態では、白血球細胞から単離されたまたは得られたＤＮＡに対して検証される複数の遺伝子バイオマーカーは、ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、またはＧＮＡＳのうち１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、白血球細胞から単離されたまたは得られたＤＮＡに対して検証される複数の遺伝子バイオマーカーは、ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、及びＧＮＡＳのそれぞれを含む。いくつかの実施形態では、ＮＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、またはＧＮＡＳのうち１つまたは複数（例えば、それぞれ）を含む１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）は、追加の診断検査法を併用して、白血球細胞から単離されたまたは得られたＤＮＡに対して遺伝子バイオマーカー（複数可）を検証することにより、対象中のがん細胞に由来する（または由来しない）と判定することができる。そのような追加の診断検査法として、制限なく、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの存在及び／または異数性の存在についての検査が挙げられる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーは、ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、またはミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）のうち１つまたは複数（例えば、それぞれ）であることが可能である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーは、ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、またはＣＡ１５−３のうち１つまたは複数（例えば、それぞれ）であることが可能である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーは、ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、ＯＰＮ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、プロラクチン、ＴＩＭＰ−１、フォリスタチン、Ｇ−ＣＳＦ、またはＣＡ１５−３のうち１つまたは複数（例えば、それぞれ）であることが可能である。
【０２８４】
いくつかの実施形態では、白血球細胞から単離されたまたは得られたＤＮＡに対して検証される複数の遺伝子バイオマーカーは、ＫＲＡＳ、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、またはＳＭＡＤ４のうち１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、白血球細胞から単離されたまたは得られたＤＮＡに対して検証される複数の遺伝子バイオマーカーは、ＫＲＡＳ、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、及びＳＭＡＤ４のそれぞれを含む。いくつかの実施形態では、ＫＲＡＳ、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、またはＳＭＡＤ４のうち１つまたは複数（例えば、それぞれ）を含む１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）は、追加の診断検査法を併用して、白血球細胞から単離されたまたは得られたＤＮＡに対して遺伝子バイオマーカー（複数可）を検証することにより、対象中のがん細胞に由来する（または由来しない）と判定することができる。そのような追加の診断検査法として、特に制限なく、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの存在及び／または異数性の存在についての検査が挙げられる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーは、ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＨＧＦ、またはＯＰＮのうち１つまたは複数（例えば、それぞれ）であることが可能である。
【０２８５】
いくつかの実施形態では、白血球細胞から単離されたまたは得られたＤＮＡに対して検証される複数の遺伝子バイオマーカーは、ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、またはＣＤＫＮ２Ａのうち１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、白血球細胞から単離されたまたは得られたＤＮＡに対して検証される複数の遺伝子バイオマーカーは、ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、及びＣＤＫＮ２Ａのそれぞれを含む。いくつかの実施形態では、ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ２、ＫＲＡＳ、ＰＯＬＥ、ＡＫＴ１、ＴＰ５３、ＲＮＦ４３、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、またはＣＤＫＮ２Ａのうち１つまたは複数（例えば、それぞれ）を含む１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）は、追加の診断検査法を併用して、白血球細胞から単離されたまたは得られたＤＮＡに対して遺伝子バイオマーカー（複数可）を検証することにより、対象中のがん細胞に由来する（または由来しない）と判定することができる。そのような追加の診断検査法として、特に制限なく、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの存在及び／または異数性の存在（例えば、がんの存在に関連した、１つまたは複数の染色体または染色体腕における異数性）についての検査が挙げられる。いくつかの実施形態では、異数性の存在は、染色体腕４ｐ、７ｑ、８ｑ、または９ｑの１つまたは複数で検出される可能性がある。
【０２８６】
いくつかの実施形態では、白血球細胞から単離されたまたは得られたＤＮＡに対して検証される複数の遺伝子バイオマーカーは、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、またはＶＨＬのうち１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、白血球細胞から単離されたまたは得られたＤＮＡに対して検証される複数の遺伝子バイオマーカーは、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、及びＶＨＬのそれぞれを含む。いくつかの実施形態では、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＫＲＡＳ、ＥＲＢＢ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＬ、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、またはＶＨＬＣＤＫＮ２Ａのうち１つまたは複数（例えば、それぞれ）を含む１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）は、追加の診断検査法を併用して、白血球細胞から単離されたまたは得られたＤＮＡに対して遺伝子バイオマーカー（複数可）を検証することにより、対象中のがん細胞に由来する（または由来しない）と判定することができる。そのような追加の診断検査法として、特に制限なく、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーの存在及び／または異数性の存在（例えば、がんの存在に関連した、１つまたは複数の染色体または染色体腕における異数性）についての検査が挙げられる。いくつかの実施形態では、異数性の存在は、染色体腕５ｑ、８ｑ、または９ｐの１つまたは複数で検出される可能性がある。
【０２８７】
いくつかの実施形態では、白血球細胞ＤＮＡを単離するまたは得るために使用される、対象から単離されたまたは得られた試料は、無細胞ＤＮＡ中の遺伝子バイオマーカー及び／またはタンパク質バイオマーカーを検査するために使用される、対象から単離されたまたは得られた試料と同一であることが可能である。例えば、試料は、血液試料（例えば、全血）であることが可能であり、この血液試料は、引き続き、血漿画分及び白血球細胞画分に分離される。そのような分離は、例えば、密度勾配遠心により達成することができ、密度勾配遠心では、血漿は、白血球細胞と分離され、白血球細胞は典型的にはバフィーコート中に見られる。そのような分離後、バフィーコート中の白血球細胞由来のＤＮＡを単離及び検査することができ、一方で血漿画分由来の無細胞ＤＮＡ中の遺伝子バイオマーカーも、単離及び検査することができる。いくつかの実施形態では、血清画分を得る目的で、血漿画分を凝固させることができる。いくつかの実施形態では、試料は、検査及び／または分画の前及び／または後に、冷凍、冷蔵、またはその他で貯蔵される。いくつかの実施形態では、試料から得られた１つまたは複数の画分を、検査の前及び／または後に、冷凍、冷蔵、またはその他で貯蔵される。
【０２８８】
いくつかの実施形態では、白血球細胞ＤＮＡを単離するまたは得るために使用される、対象から単離されたまたは得られた試料は、無細胞ＤＮＡ中の遺伝子バイオマーカー及び／またはタンパク質バイオマーカーを検査するために使用される、対象から単離されたまたは得られた試料と異なるものであることが可能である。例えば、第１の試料を対象から単離するまたは得ることができ、この第１の試料は、無細胞ＤＮＡ中の遺伝子バイオマーカー及び／またはタンパク質バイオマーカーを検査するために使用される。第１の試料が単離されるまたは得られる前、同時、またはその後、第２の試料を対象から単離するまたは得ることができ、この第２の試料は、無細胞ＤＮＡにおいて同定された１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）を検証するため、白血球細胞からＤＮＡを単離するまたは得るために使用される。第２の試料は、本明細書中記載されるとおりに分画することができる（例えば、密度勾配遠心により）。いくつかの実施形態では第１の試料及び／または第２の試料（またはその画分）は、検査及び／または分画の前及び／または後に、冷凍、冷蔵、またはその他で貯蔵することができる。
【０２８９】
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）が白血球細胞から単離されたまたは得られたＤＮＡに対して検証され、その遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）が、白血球細胞から単離されたＤＮＡに存在しないと判定されたら（例えば、遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）が、対象中のがん細胞に由来すると判定されたら）、その対象は、さらなる診断検査またはより詳しいモニタリングを受けることができる（例えば、本明細書中開示される診断検査及び／またはモニタリング法の１つまたは複数を用いて）。いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）が白血球細胞から単離されたまたは得られたＤＮＡに対して検証され、その遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）が、白血球細胞から単離されたＤＮＡに存在しないと判定されたら（例えば、遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）が、対象中のがん細胞に由来すると判定されたら）、その対象は、治療介入（例えば、本明細書中開示される治療介入の１つまたは複数）を受けることができる。
【０２９０】
試料分類
本開示は、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカー（例えば、全血または血漿中のタンパク質濃度）に基づいて、対象におけるがんの存在を同定する方法を提供する。様々な方法を用いて、対象ががんを有するかどうか及び／または対象ががんを有する可能性を判定することができる。こうした方法には、本明細書中記載される様々な種類の統計技法及び手法が関与し、そのような統計技法及び手法として、例えば、回帰モデル、ロジスティック回帰モデル、ニューラルネットワーク、クラスタリングモデル、主成分分析、相関成分分析、最近傍分類器分析、線形判別分析、二次判別分析、サポートベクターマシン、決定木、ランダムフォレスト、遺伝的アルゴリズム、バギングを用いる分類器最適化、ブースティングを用いる分類器最適化、ランダム部分空間法を用いる分類器最適化、射影追跡、ならびに遺伝的プログラミング及び重み付き投票などが挙げられる。
【０２９１】
いくつかの実施形態では、回帰分析を用いて、対象ががんを有するかどうか判定することができる。回帰分析は、タンパク質バイオマーカーパネル、遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）パネル、及び／またはタンパク質バイオマーカー及び遺伝子バイオマーカー両方を含むパネルで行うことができる。いくつかの実施形態では、回帰分析は、１つまたは複数の変異（例えば、首位の変異）のΩスコア及び／またはタンパク質バイオマーカーパネルで行われる。
【０２９２】
いくつかの実施形態では、回帰分析は、以下の形式を有する数学モデルに基づいて行われる：
Ｖ＝α＋Σβｉｆ（Ｘｉ）
【０２９３】
この形のモデルでは、Ｖは、対象ががんを有する尤度スコアを示す値である。いくつかの実施形態では、尤度スコアは、検査対象ががんを有する可能性の指標である。Ｘｉは、各バイオマーカーの値（例えば、Ωスコア、血漿中のタンパク質濃度など）を表す。βｉは、ｆ（Ｘｉ）の係数であり、これは、バイオマーカーの値に対応した変数である。関数ｆ（ｘ）は、ｘに対応した値を与える関数である。いくつかの実施形態では、ｆ（ｘ）＝ｘである。すなわち、この数学モデルは、Ｖ＝α＋ΣβｉＸｉという形式を有することができる。一部のその他の実施形態では、ｆ（ｘ）は、正規化または標準化関数の場合がある。いくつかの実施形態では、この式は、年齢、性別、及び人種分類を考慮するための追加パラメーターを含む場合がある。
【０２９４】
いくつかの実施形態では、Ｖは、対象ががんを有する尤度スコアを示す値である。いくつかの実施形態では、Ｖは、実際の確率である（０〜１の範囲で変化する数）。他の実施形態において、Ｖは確率を導出することができる値である。
【０２９５】
いくつかの実施形態では、数学モデルは、回帰モデル、例えば、ロジスティック回帰モデルまたは線形回帰モデルである。回帰モデルを用いて、様々なバイオマーカーのセットを検定することができる。
【０２９６】
線形回帰モデルの場合、モデルを用いて、検定対象の発現データを分析し、及び検定対象の定量的尺度、例えば、対象ががんを有する尤度などを示す結果を提供することができる。
【０２９７】
一般に、線形回帰式は、以下のとおり表される
Ｙ＝α＋β１Ｘ１＋β２Ｘ２＋．．．＋βｋＸｋ＋ε
【０２９８】
Ｙは、従属変数であり、生物学的特徴（例えば、がんを有するまたは有さない尤度）の定量的尺度を示す。従属変数Ｙは、ｋ個の説明変数（バイオマーカーについて測定された特性値）、及び様々な規定されていない省略された因子を包含する誤差項によって決まる。上記で特定されるモデルにおいて、パラメーターβ１は、従属変数Ｙに対する第１の説明変数Ｘ１の効果の大きさを指定する。β２は、Ｙに対する説明変数Ｘ２の効果を指定する。
【０２９９】
ロジスティック回帰モデルは、線形回帰を非線形変換したものである。ロジスティック回帰モデルは、「ロジット」モデルと称することが多く、以下のとおり表すことができ、
ｌｎ［ｐ／（１−ｐ）］＝α＋β１Ｘ１＋β２Ｘ２＋．．．＋βｋＸｋ＋ε
式中、
αは、定数であり、
εは、誤差項であり、
ｌｎは、自然対数、ｌｏｇ（ｅ）であり、ｅ＝２．７１８２８．．．であり、
ｐは、事象Ｙが起こる確率であり、
ｐ／（１−ｐ）は、「オッズ」であり、
ｌｎ［ｐ／（１−ｐ）］は、ｌｏｇ（オッズ）、すなわち「ロジット」である。
【０３００】
当業者ならわかるだろうが、α及びεは、単一の定数にまとめて、αとして表すことができる。いくつかの実施形態では、単一項αを使用し、εを省略する。「ロジスティック」分布とは、Ｓ字分布関数である。ロジット分布は、推定確率（ｐ）が、０〜１になるように制約する。
【０３０１】
いくつかの実施形態では、ロジスティック回帰モデルは、以下のとおり表される
Ｙ＝α＋ΣβｉＸｉ
【０３０２】
ここで、Ｙは、所定の対象に関するバイオマーカーセットが、対照群（例えば、がんのない対象の群）ではなく、症例群（例えば、がんのある対象の群）に分類されるべきかどうかを示す値（例えば、尤度スコア）である。バイオマーカーセットが、対照群ではなく症例群に分類されるものである確率、すなわち対象ががんを有する確率は、Ｙから導出することができる。スコアが高いほど、対象ががんを有する確率が高い。
【０３０３】
Ｘｉは、ｉ番目のバイオマーカーの値である。いくつかの実施形態では、これは、血漿中のタンパク質濃度、性別、年齢、または遺伝的マーカーから導出されたスコア（例えば、Ωスコア）であることが可能である。βｉは、バイオマーカーのロジスティック回帰式係数であり、αは、０になり得るロジスティック回帰式定数であり、βｉ及びαは、症例群及び対照群にロジスティック回帰分析を当てはめた結果である。
【０３０４】
いくつかの実施形態では、ロジスティック回帰モデルは、最尤推定法（ＭＬＥ）により当てはめられる。係数（例えば、α、β１、β２、．．．）は、最尤度により決定される。尤度とは、条件付き確率である（例えば、Ｐ（Ｙ｜Ｘ）、すなわち、Ｘが与えられた場合のＹの確率）。尤度関数（Ｌ）は、試料データセットで生じる従属変数の値の特定セット（Ｙ１、Ｙ２、．．．、Ｙｎ）が観察される確率の尺度である。いくつかの実施形態では、これは、Ｙ１、Ｙ２、．．．、Ｙｎを観察する確率の積として表現される：
Ｌ＝Ｐｒｏｂ（Ｙ１、Ｙ２、．．．、Ｙｎ）＝Ｐｒｏｂ（Ｙ１）＊Ｐｒｏｂ（Ｙ２）＊．．．Ｐｒｏｂ（Ｙｎ）
【０３０５】
尤度関数が高いほど、試料においてＹが観察される確率が高い。ＭＬＥは、尤度関数のｌｏｇ（ＬＬ＜０）を可能な限り大きくする、または尤度関数のｌｏｇの−２倍（−２ＬＬ）を可能な限り小さくする係数（α、β１、β２、．．．）を見出すことを含む。ＭＬＥでは、パラメーターα、β１、β２、などについていくつかの初期推定値が決定される。次いで、これらのパラメーター推定値を前提としてデータの尤度を計算する。パラメーター推定値を改善し、データの尤度を再計算する。このプロセスを、パラメーター推定値が実質的に不変になるまで繰り返す（例えば、変化が０．０１または０．００１未満）。ロジスティック回帰及びロジスティック回帰モデルの当てはめの例は、Ｈａｓｔｉｅ，Ｔｈｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎ．Ｙ．，２００１，ｐｐ．９５−１００に見られる。
【０３０６】
ロジスティック回帰式係数及びロジスティック回帰式定数が決定されたら、容易にモデルを検定対象に適用してＹを得ることができる。いくつかの実施形態では、Ｙを用いて、関数Ｙ＝ｌｎ（ｐ／（１−ｐ））を解くことにより、確率（ｐ）を計算することができる。
【０３０７】
いくつかの実施形態では、説明変数を正規化または標準化してから、モデルにあてはめる。標準化係数（またはベータ係数）とは、従属変数及び説明変数の分散が１であるように標準化された回帰分析に由来する推定値である。したがって、標準化係数は、説明変数における標準偏差の増加当たり、従属変数が、標準偏差の何倍変化するかを表す。単変量回帰の場合、標準化係数の絶対値は、相関係数に等しい。係数の標準化は、通常、複数の回帰分析において説明変数のどれが従属変数により大きい効果を有するかを特定するために行われる。いくつかの実施形態では、変数を標準化または正規化してから、ロジスティック回帰モデルに当てはめる。標準化ロジスティック回帰係数（または標準化ベータ係数）とは、標準化された変数でロジスティック回帰分析を行なって得られる推定値である。いくつかの実施形態では、説明変数のみを標準化し、一部のその他の実施形態では、従属変数のみを標準化する。さらに、いくつかの実施形態では、説明変数及び説明変数を、両方とも標準化する。いくつかの実施形態では、標準化回帰係数は、対応する非標準化係数にｓｔｄ（Ｘｉ）／ｓｔｄ（Ｙ）の比を乗じたものに等しく、式中、「ｓｔｄ」は、標準偏差を示す。
【０３０８】
いくつかの実施形態では、オメガスコア（例えば、首位の変異のオメガスコア）を、ロジスティック回帰における説明変数として使用することができる。いくつかの実施形態では、ロジスティック回帰は、１つまたは複数の他の説明変数（例えば、タンパク質濃度）を含むことができる。いくつかの実施形態では、タンパク質バイオマーカーは、マン・ホイットニー・ウィルコクソン検定に基づいて選択することができる。いくつかの実施形態では、選択されたタンパク質バイオマーカーは、がん試料において、正常試料におけるよりも高い中央値を有する。いくつかの実施形態では、変数増加法を用いて、全てのバイオマーカー（遺伝子バイオマーカー及びタンパク質バイオマーカーを含む）から、説明変数を選択する。
【０３０９】
数学モデルをデータに適用することで、１つまたは複数の分類器を発生させることができる。分類器は、適切なパラメーター（例えば、回帰モデルにおけるβ係数）を有する数学モデルである。これらのパラメーターは、数学モデルを学習データセット、例えば、対照群及びがんを有する対象の群両方を含むデータセットに適用することにより、決定できる。
【０３１０】
分類器は、当業者に既知の方法を用いて、その分類器が持つ、データセット（例えば、学習データセットまたは検証データセット）中の各対象を適切に特性決定する能力について評価することができる。様々な統計的基準が使用可能であり、例えば、曲線下面積（ＡＵＣ）、正確な予測のパーセンテージ、感度、及び／または特異性などがある。いくつかの実施形態では、分類器は、交差検証、１つ抜き（Ｌｅａｖｅ  Ｏｎｅ  ＯＵＴ）交差検証（ＬＯＯＣＶ）、ｎ重交差検証、及びジャックナイフ分析により評価される。いくつかの実施形態では、各分類器は、その分類器が持つ、分類器の発生に使用されなかったデータセット（「検定データセット」）中の対象を適切に特性決定する能力について評価される
【０３１１】
いくつかの実施形態では、分類器が有する、データセット中の各対象を適切に特性決定する能力について評価するのに使用される方法は、分類器の感度（真陽性率）及び１−特異性（真陰性率）を評価する方法である。いくつかの実施形態では、分類子を検定するのに使用される方法は、受信者動作特性（ＲＯＣ）であり、これは、複数のパラメーターを提供して、発生した方程式の結果の感度及び特異性を両方とも評価する。いくつかの実施形態では、ＲＯＣ面積（曲線下面積）を用いて、方程式を評価する。０．５、０．６、０．７、０．８、０．９より大きいＲＯＣ面積が好ましい。１．０という完全なＲＯＣ面積スコアは、１００％の感度及び１００％の特異性両方を示す。いくつかの実施形態では、分類器は、評価スコアに基づいて選択される。いくつかの実施形態では、使用される評価採点システムは、ＲＯＣ曲線の曲線下面積により決定される受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線スコアである。いくつかの実施形態では、０．９５、０．９、０．８５、０．８、０．７、０．６５、０．６、０．５５、または０．５を超えるスコアを有する分類器が選択される。分類器の使用に特異性が重要である実施形態のいくつかにおいて、感度閾値を設定することができ、特異性に基づいてランクづけされた分類器が選択される。例えば、０．９５、０．９、０．８５、０．８、０．７、０．６５、０．６、０．５５、０．５、または０．４５を超える特異性でカットオフされた分類器が選択可能である。同様に、特異性閾値を設定することができ、感度に基づいて（例えば、０．９５、０．９、０．８５、０．８、０．７、０．６５、０．６、０．５５０．５、または０．４５超）ランクづけされた分類器が選択可能である。このように、いくつかの実施形態では、上位１０の分類器、上位２０の分類器、または上位１００の分類器のみが選択される。ＲＯＣ曲線は、様々な統計的手段により計算することができ、そのような手段として、統計分析システム（ＳＡＳ（登録商標））、Ｒ、及びＣＯＲＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）統計分析ソフトウェアが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３１２】
当業者には当然のことと思われるが、数学モデルにより決定された組み合わせ及び分類器の有用性は、モデルに入力するためのデータを発生させるのに使用した集団のいくつかの特性（例えば、人種、年齢集団、性別、病歴）に左右されることになる。個別に同定されたバイオマーカーまたは個別に同定された遺伝子のサブセットを選択することができ、選択されたバイオマーカーの全ての可能な組み合わせを検定して、有用なバイオマーカーセットの組み合わせを同定することができる。
【０３１３】
いくつかの実施形態では、対象の尤度スコア（例えば、ロジスティック回帰におけるＹ値）を用いて、対象ががんを有する可能性が高いかどうかを判定することができる。したがって、尤度スコアがあらかじめ定められた参照閾値より高ければ、その対象はがんを有する可能性が高い。いくつかの実施形態では、尤度スコアが参照閾値より低ければ、対象は、がんを有する可能性は高くない。当業者ならわかるだろうが、各分類器に対する適切な参照閾値は異なる可能性があり、様々な統計学的尺度（例えば、感度、特異性、正確な予測のパーセンテージ）に合わせて最適化することができる。いくつかの実施形態では、参照閾値は、実験により、または臨床試験において決定される。
【０３１４】
いくつかの実施形態では、所定の目的を満たす複数の分類器が作成される（例えば、全てが十分なＡＵＣ及び／または感度及び／または特異性を有する）。いくつかの実施形態では、１つより多い分類器を利用する式を生成させる。例えば、分類器を順次に利用する式を生成させることができる。分類器の他の可能な組み合わせ及び重み付けも理解の範疇にあり、本明細書に包含される。
【０３１５】
いくつかの実施形態では、対象ががんを有する確率は、尤度スコアから導出することができる。すなわち、確率が、あらかじめ定められた参照閾値、例えば、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９より高い場合、対象は、がん治療を実施されることになる。いくつかの実施形態では、確率が、あらかじめ定められた参照閾値、例えば、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９より低い場合、対象は、がん治療を実施されないことになる。いくつかの実施形態では、治療するためのあらかじめ定められた閾値は、０．４、０．５、または０．６であり、治療しないとする、もしくは治療を中止するためのあらかじめ定められた閾値は、０．４、０．５、または０．６である。いくつかの実施形態では、あらかじめ定められた閾値は、実験により、または臨床試験において決定される。
【０３１６】
当業者なら同じくわかるだろうが、方法の感度及び特異性は、参照閾値（すなわちカットオフ点）に左右される。参照閾値を上げた場合、感度は低下することになるが、特異性は上昇することになる。いくつかの実施形態では、参照閾値は、感度、特異性、または正確な予測のパーセンテージに合わせて最適化することができる。
【０３１７】
組織の起源の判定
本開示は、がんの種類、またはがん細胞もしくは腫瘍細胞の起源を判定する方法を提供する。数理モデルは、本明細書に記載の様々なバイオマーカーに適用可能である（例えば、様々なバイオマーカーのタンパク質濃度、様々なバイオマーカーの遺伝子変異）。
【０３１８】
本開示に基づいた有用な数理モデルには、教師あり学習法と教師なし学習法の両方を使用するものが含まれる。いくつかの実施形態では、選択された数理モデルは、教師あり学習をトレーニングデータセットと組み合わせて使用し、可能性のあるバイオマーカーの各組み合わせを評価する。様々な数理モデルが使用可能であり、例えば、回帰モデル、ロジスティック回帰モデル、ニューラルネットワーク、クラスタリングモデル、主成分分析、相関成分分析、最近傍分類器分析、線形判別分析、二次判別分析、サポートベクターマシン、決定木、ランダムフォレスト、遺伝的アルゴリズム、バギングを用いる分類器最適化、ブースティングを用いる分類器最適化、ランダム部分空間法を用いる分類器最適化、射影追跡、ならびに遺伝的プログラミング及び重み付き投票などである。
【０３１９】
いくつかの実施形態では、教師あり学習モデルを使用して、がん細胞または腫瘍細胞の起源を判定する。教師あり学習モデルとは、入出力ペアの例に基づいて、入力を出力にマッピングする関数を学習するモデルを指す。トレーニング例のセットで構成されるラベル付きのトレーニングデータから関数を推測することができる。教師あり学習では、各例は、入力オブジェクト（通常はベクター、例えばタンパク質バイオマーカーのベクター）及び目的の出力値（教師信号とも呼ばれる、例えばがんの種類または組織の起源）で構成されるペアである。教師あり学習アルゴリズムは、トレーニングデータを分析し、推定関数（これは試験対象から得られたバイオマーカーのマッピングに使用可能である）を作成する。多くの教師あり機械学習法が使用可能である。本方法としては、サポートベクターマシン、回帰分析、線形回帰、ロジスティック回帰、単純ベイズ、線形判別分析、決定木、ｋ最近傍アルゴリズム、ニューラルネットワーク（例えば、多層パーセプトロン）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３２０】
いくつかの実施形態では、教師なし学習モデルを使用して、がん細胞または腫瘍細胞の起源を判定する。教師なし機械学習とは、「ラベル付けされていない」データ（つまり、分類または類別されていないデータ）の構造を記述する関数を推定する機械学習タスクを指す。これは、試料が同じ起源であれば、関連するバイオマーカーの類似性がより高いという仮定の下で実施される。教師なし機械学習は、これらの共通の特性を同定して、これらのモデルを試験対象から得られたバイオマーカーに適用することができ、これにより、対象におけるがん細胞または腫瘍細胞の起源を判定する。多くの教師なし機械学習方法が使用可能である。本方法としては、クラスタリング（例えば、ｋ平均クラスタリング、混合モデルクラスタリング、及び階層的クラスタリングなど）、異常検知、教師なしニューラルネットワーク（例えば、オートエンコーダー、ディープビリーフネット、ヘブ学習則、敵対的生成ネットワーク、及び自己組織化マップなど）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３２１】
いくつかの実施形態では、ランダムフォレストが使用される。ランダムフォレストは、分類、回帰、及び他のタスクの学習方法を指し、トレーニング時に多数の決定木を構築し、個々の木のクラス（分類）または平均予測（回帰）のモードであるクラスを出力することにより動作する。Ｒａｎｄｏｍ  Ｆｏｒｅｓｔは、例えば、Ｒａｎｄｏｍ  Ｆｏｒｅｓｔパッケージ（Ｌｉａｗ，Ａｎｄｙ，ａｎｄ  Ｍａｔｔｈｅｗ  Ｗｉｅｎｅｒ．”Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｒａｎｄｏｍＦｏｒｅｓｔ．”Ｒ  ｎｅｗｓ  ２．３（２００２）：１８−２２）などの様々なプログラムによって実施することができる。いくつかの実施形態では、ランダムフォレストは、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカー（例えば、全血または血漿中のタンパク質濃度）に基づいて、対象のがんの存在を同定する。いくつかの実施形態では、１０回以上の１０分割交差検証を実施可能である。
【０３２２】
いくつかの実施形態では、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）を使用して、組織の起源を判定することができる。ＳＶＭはトレーニング例のセットによって始まり、それぞれが２つのカテゴリ（がんの種類など）のいずれかに属するとマークされる。ＳＶＭトレーニングアルゴリズムは、新しい例を１つのカテゴリまたは他のカテゴリに割り当てるモデルを構築し、非確率的なバイナリ線形分類器（特定の起源のがん、及び特定の起源からではないがんなど）にする。ＳＶＭモデルは、空間内にポイントとして打たれた例を表したものであり、別々のカテゴリの例ができるだけ広い明確なギャップで区別されるようにマッピングする。
【０３２３】
これらの数理モデルは、がん細胞の起源を判定するために、本明細書に記載されるように、様々なバイオマーカーまたはバイオマーカーのパネル（例えば、タンパク質バイオマーカー）に適用可能である。いくつかの実施形態では、これらの方法は、がんを有すると予測された対象にのみ適用される。
【０３２４】
いくつかの実施形態では、対象が、がんを有すると判定された、またはがんを有する可能性があると判定された場合、図６８に示すようにがんの組織の起源を判定する。例えば、図６８に示すツリーの各ブランチで判定を行うことができ、末端に到達すると（例えば、これ以上判定を行うことができない）、起源の組織は、図のように予測または判定され得る。図６８に示すツリーは、実務者が、がん（乳癌、結腸直腸癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、及び胃腸癌など）の組織の起源を予測または判定するためのフレームワークを提供する。
【０３２５】
図６８に示されているツリーは例示であり、非限定的である。例えば、いくつかの決定点で、タンパク質バイオマーカーのレベル（例えば、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカー）を判定することができ（例えば、対象から採取した試料に存在するタンパク質バイオマーカーのレベル）、そのタンパク質バイオマーカー（複数可）のレベルは、図６８に示すツリー上に示されるレベルと比較することができる。いくつかの実施形態では、タンパク質バイオマーカーのレベル（例えば、対象から採取した試料に存在するタンパク質バイオマーカーのレベル）が判定され、そのタンパク質バイオマーカーのレベルは、図６８に示すツリー上に示されるレベルとは異なるレベルと比較される。いくつかの実施形態では、図６８に示すツリー上のタンパク質バイオマーカー（例えば、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカー）の異なるレベルは、図６８に示すツリー上に１つまたは複数の決定点で示されるそのタンパク質バイオマーカーのレベルとは、約１０％異なる（例えば、約１０％より大きい、または１０％より小さい）、約１５％異なる（例えば、約１５％より大きい、または１５％より小さい）、約２０％異なる（例えば、約２０％より大きい、または２０％より小さい）、約２５％異なる（例えば、約２５％より大きい、または２５％より小さい）、約３０％異なる（例えば、約３０％より大きい、または３０％より小さい）、約３５％異なる（例えば、約３５％より大きい、または３５％より小さい）、約４０％異なる（例えば、約４０％より大きい、または４０％より小さい）、約４５％異なる（例えば、約４５％より大きい、または４５％より小さい）、約５０％異なる（例えば、約５０％より大きい、または５０％より小さい）。いくつかの決定点で、対象の性別（例えば、生物学的性別）が判定され、図６８に示すツリー上に示される１つまたは複数の決定点で性別を比較する。いくつかの決定点で、対象は女性であると判定することができる。いくつかの決定点で、対象は男性であると判定することができる。
【０３２６】
いくつかの実施形態では、対象が、がんを有すると判定された、またはがんを有する可能性があると判定された場合、図６９及び以下の表に示す法則のリストにしたがって、がんの組織の起源を判定する。例えば、タンパク質バイオマーカーのレベル（例えば、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカー）を判定することができ（例えば、対象から採取した試料に存在するタンパク質バイオマーカーのレベル）、そのタンパク質バイオマーカー（複数可）のレベルは、図６９及び以下の表に示す規則に示されるレベルと比較することができる。１つの非限定的な例として、規則［条件＝ＣＡ１２５＞１０２．７６＆ｓＦａｓ＜＝８３０．３４５＆ｇｅｎｄｅｒ％ｉｎ％  ｃ（’Ｆ’）、予測＝卵巣］は、女性（％ｉｎ％  ｃ（’Ｆ’））が、ＣＡ１２５＞１０２．７６及びｓＦａｓ＜＝８３０．３４５を有する場合、当該女性は卵巣癌を有するか、卵巣癌を有すると予測されることを意味する。当業者は、対象における１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーのレベルを検出し、及び／または対象の性別（例えば、生物学的性別）を判定し、対象が図６９に列挙されている種類のがんを有するか、または有する可能性が高いことを判定することができる。いくつかの実施形態では、対象が、がんを有すると判定された、またはがんを有する可能性があると判定された場合、がんの組織の起源は、対象における１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーのレベル及び／または対象の性別（例えば、生物学的性別）が図６９及び以下の表に示す特定の規則のいずれにも従わない場合、結腸直腸癌であると判定される。いくつかの実施形態では、タンパク質バイオマーカーのレベル（例えば、対象から採取した試料に存在するタンパク質バイオマーカーのレベル）が判定され、そのタンパク質バイオマーカーのレベルが、図６９及び以下の表に示す規則に示されるレベルとは異なるレベルと比較される。いくつかの実施形態では、図６９に示す規則のタンパク質バイオマーカー（例えば、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカー）の異なるレベルは、図６９及び以下の表に示す規則の１つまたは複数の決定点で示されるそのタンパク質バイオマーカーのレベルとは、約１０％異なる（例えば、約１０％より大きい、または１０％より小さい）、約１５％異なる（例えば、約１５％より大きい、または１５％より小さい）、約２０％異なる（例えば、約２０％より大きい、または２０％より小さい）、約２５％異なる（例えば、約２５％より大きい、または２５％より小さい）、約３０％異なる（例えば、約３０％より大きい、または３０％より小さい）、約３５％異なる（例えば、約３５％より大きい、または３５％より小さい）、約４０％異なる（例えば、約４０％より大きい、または４０％より小さい）、約４５％異なる（例えば、約４５％より大きい、または４５％より小さい）、約５０％異なる（例えば、約５０％より大きい、または５０％より小さい）。いくつかの実施形態では、対象の性別（例えば、生物学的性別）が判定され、図６９及び以下の表に示す１つまたは複数の規則における性別と比較される。いくつかの実施形態では、対象は女性であると判定することができる（例えば、「ｇｅｎｄｅｒ  ％ｉｎ％  ���（’Ｆ’）」）。いくつかの実施形態では、対象は男性であると判定することができる（例えば、「ｇｅｎｄｅｒ  ％ｉｎ％  ｃ（’Ｍ’）」）。以下の表では、例示的かつ非限定的な規則及びがんの種類の予測が示される。「その他」は、他の例示的な規則のいずれも満たされない場合、がんが結腸直腸癌であると予測できることを示す。
2020530290.tif 000002
【０３２７】
図６８及び図６９及び上記の表における特定のタンパク質バイオマーカーの単位が以下の記号表に示される。
2020530290.tif 000003
【０３２８】
遺伝子バイオマーカーの検出
様々な手法のいずれかを使用して、対象から採取した試料（例えば、子宮頸部、子宮内膜、尿、唾液、ｃｔＤＮＡ、血液、血清、及び／または血漿試料）に存在する１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在を検出することができる。そのような技術の非限定的な例としては、ＰＣＲベースのマルチプレックスアッセイ、デジタルＰＣＲアッセイ、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）アッセイ、ＰＣＲベースのシングルプレックスＰＣＲアッセイ、サンガーシークエンシングアッセイ、次世代シークエンシングアッセイ、定量的ＰＣＲアッセイ、ライゲーションアッセイ、及びマイクロアレイアッセイが挙げられる。当業者であれば、対象から採取した試料に存在する１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在を検出するための他の適切な手法を知っているであろう。
【０３２９】
本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、対象から採取した試料（例えば、子宮頸部、子宮内膜、尿、唾液、ｃｔＤＮＡ、血液、血清、及び／または血漿試料）に存在する１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在は、エラー削減手法により超並列シークエンシング機器の感度を向上させることができる方法を使用して検出される。例えば、そのような技術により、１００〜１，０００，０００の野生型鋳型（例えば、５００〜１，０００，０００の野生型鋳型）の中から１つの変異鋳型の範囲で、まれな変異アレルの検出が可能になる。いくつかの実施形態では、そのような技術により、まれな変異アレルが、鋳型の総数の低い割合として存在する場合（例えば、まれな変異アレルが、全鋳型の約１％未満、約０．１％未満、約０．０１％未満、約０．００１％未満、約０．００００１％未満、もしくはそれ以下の割合、またはこれらの例示的な割合の間の任意の割合で存在する場合）、その検出が可能になる。いくつかの実施形態では、対象から採取した試料に存在する１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在は、ＤＮＡ（例えば、試料中の細胞から得られたＤＮＡまたは無細胞ＤＮＡ）を増幅してアンプリコンのファミリーを形成することによって検出される（ファミリーの各メンバーは無細胞ＤＮＡの単一の鋳型分子に由来し、ファミリーの各メンバーは共通のオリゴヌクレオチドバーコードでマークされ、各ファミリーは異なるオリゴヌクレオチドバーコードでマークされる）。例えば、対象から採取した試料に存在する１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在は、各鋳型分子に固有識別子（ＵＩＤ）を分子的に割り当て、固有にタグ付けした各鋳型分子を増幅してＵＩＤファミリーを作製し、増幅産物を重複してシークエンシングすることにより検出することができる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドバーコードは、複数のオリゴヌクレオチドバーコードを集合的に含むプライマーの集団によって増幅するステップにより、鋳型分子に導入される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドバーコードは鋳型分子に内因性であり、ＤＮＡ合成プライミング部位を含むアダプターは、オリゴヌクレオチドバーコードに隣接する鋳型分子の末端にライゲートされる。例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＫｉｎｄｅ  Ｉ，Ｗｕ  Ｊ，Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓ  Ｎ，Ｋｉｎｚｌｅｒ  ＫＷ，Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  Ｂ（２０１１）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｒｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０８：９５３０−９５３５を参照のこと。
【０３３０】
本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、対象から採取した試料（例えば、子宮頸部、子宮内膜、または血漿試料）に存在する１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在は、シークエンシング技術（例えば、次世代シークエンシング技術）を使用して検出される。様々なシークエンシング技術が当技術分野において既知である。例えば、無細胞ＤＮＡ中の循環腫瘍ＤＮＡの検出及び特性評価のための様々な技術は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＨａｂｅｒ  ａｎｄ  Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ，Ｂｌｏｏｄ−Ｂａｓｅｄ  Ａｎａｌｙｓｅｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ：Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｔｕｍｏｒ  ＤＮＡ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖ．，Ｊｕｎ；４（６）：６５０−６１．ｄｏｉ：１０．１１５８／２１５９−８２９０．ＣＤ−１３−１０１４，２０１４に記載される。そのような技術の非限定的な例としては、それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＳａｆｅＳｅｑｓ（Ｋｉｎｄｅ  ｅｔ．ａｌ，Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｒｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ；１０８，９５３０−５，２０１１）、ＯｎＴａｒｇｅｔ（Ｆｏｒｓｈｅｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｂｙ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｅｅｐ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｐｌａｓｍａ  ＤＮＡ，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ；４：１３６ｒａ６８，２０１２）、及びＴａｍＳｅｑ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｗｉｎｎｏｗｉｎｇ  ＤＮＡ  ｆｏｒ  ｒａｒｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：ｈｉｇｈｌｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｂａｓｅｄ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，７：ｅ３１５９７，２０１２）が挙げられる。いくつかの実施形態では、対象から採取した試料に存在する１つまたは複数の変異の存在は、変異検出の感度が高いことが知られているドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を使用して検出される。いくつかの実施形態では、対象から採取した試料に存在する１つまたは複数の変異の存在は、他のシークエンシング技術を用いて検出され、そのような技術には、これらに限定されないが、チェーンターミネーション技術、ショットガン技術、合成によるシークエンシング法、マイクロ流体技術を利用する方法、他の捕捉技術、または試料中の少量のＤＮＡ（例えば、無細胞ＤＮＡ試料中のｃｔＤＮＡ）の検出に有用な当技術分野で既知の他のシークエンシング技法のいずれかを含む。
【０３３１】
いくつかの実施形態では、対象から採取した試料（例えば、子宮頸部、子宮内膜、尿、唾液、ｃｔＤＮＡ、血液、血清、及び／または血漿試料）に存在する１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在は、アレイベースの方法を使用して検出される。例えば、無細胞ＤＮＡの遺伝子変異（例えば、１つまたは複数の遺伝子変異）を検出するステップは、ＤＮＡマイクロアレイを使用して実施することができる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡマイクロアレイは、複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、がん細胞の変異）の１つまたは複数を検出可能である。いくつかの実施形態では、無細胞ＤＮＡは、遺伝子バイオマーカー（例えば、遺伝子変異）を検出する前に増幅される。本明細書に記載の方法のいずれかで使用可能なアレイベースの方法の非限定的な例には、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）マイクロアレイ（Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏａｌｌｉｅｄ  Ｓｃｉ．４（１）：２１−２６；Ｌａｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５１２：７１−９８；Ｍａｃｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２：２６８０−２６８８；Ａｌｉｚａｄｅｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１４：４５７−４６０）、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２７（３）：３９２−４０４；Ｌｏｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ４（７）：ｅ６２２９）、細菌性人工染色体（ＢＡＣ）クローンチップ（Ｃｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１４（１）：１８８−１９６；Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１５（１２）：１８３１−１８３７）、一塩基多型（ＳＮＰ）マイクロアレイ（Ｍａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ８（４）：２１９−２２８；Ｊａｓｍｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ７（２）：ｅ３１９６８）、マイクロアレイベースの比較ゲノムハイブリダイゼーションアレイ（アレイＣＧＨ）（Ｂｅｅｒｓ  ａｎｄ  Ｎｅｄｅｒｌｏｆ（２００６）Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．８（３）：２１０；Ｐｉｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３７：Ｓ１１−Ｓ１７；Ｍｉｃｈｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｄ．９：５７４−５８４）、分子反転プローブ（ＭＩＰ）アッセイ（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅｔ  ２０５（７−８）：３４１−５５；Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １１：７１２）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡマイクロアレイは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイ（Ｉｒｉｚａｒｒｙ（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３１：ｅ１５；Ｄａｌｍａ−Ｗｅｉｓｚｈａｕｓｚ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．４１０：３−２８）、ＮｉｍｂｌｅＧｅｎマイクロアレイ（Ｗｅｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３６（９）：２９２６−２９３８；Ａｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４：９０３−９０５）、Ａｇｉｌｅｎｔマイクロアレイ（Ｈｕｇｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９（４）：３４２−３４７）、またはＢｅａｄＡｒｒａｙアレイ（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｂｉｏｓｅｎｓ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ  ９２：５９６−６０１）である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドマイクロアレイは、ＤＮＡタイリングアレイである（Ｍｏｃｋｌｅｒ  ａｎｄ  Ｅｃｋｅｒ（２００５）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ８５（１）：１−１５；Ｂｅｒｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  １６（２）：２７１−２８１）。他の好適なアレイベースの方法は、当該分野で既知である。
【０３３２】
いくつかの実施形態では、対象ががん（例えば、卵巣癌、子宮内膜癌、膀胱癌、またはＵＴＵＣ）を有すると判定された場合、対象は追加でモニタリングされ得る、またはモニタリングの強化のために選択され得る。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、従来技術が対象を早期がんと診断することができる期間の前の時点において、モニタリングを強化する対象を選択するために使用することができる。例えば、モニタリングを強化するための対象を選択するために本明細書で提供される方法は、対象が従来の方法によってがんと診断されていない場合、及び／または対象ががんに罹患することが知られていない場合に使用することができる。いくつかの実施形態では、モニタリングの強化のために選択された対象は、モニタリングの強化のために選択されていない対象と比較して、頻度を増やして診断検査（例えば、本明細書に開示された診断検査のいずれか）を受けることができる。例えば、モニタリングの強化のために選択された対象は、１日２回、毎日、隔週、毎週、隔月、毎月、四半期、半年ごと、毎年、または任意の頻度で診断検査を受けることができる。いくつかの実施形態では、モニタリングの強化のために選択された対象は、モニタリングの強化のために選択されていない対象と比較して、１つまたは複数のさらなる診断検査を受けることができる。例えば、モニタリングの強化のために選択された対象は２つの診断検査を受けることができるが、モニタリングの強化のために選択されていない対象は１つの診断検査のみを受ける（または診断検査は実施しない）。いくつかの実施形態では、モニタリングの強化のために選択された対象は、さらなる診断検査のために選択されることも可能である。がん細胞の存在が同定される場合（例えば、本明細書に開示されている様々な方法のいずれかによって）、対象は、強化したモニタリング（例えば、対象の腫瘍またはがんの進行を評価する、及び／またはさらなる遺伝子バイオマーカー（例えば、がん細胞変異）及び／または異数性の発生を評価するため）、及びさらなる診断検査（例えば、がん細胞を有する腫瘍のサイズ及び／または正確な位置を判定するため）の両方を受けることが有益であり得る。いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、がん細胞変異）及び／または異数性が検出された後、モニタリングの強化のために選択された対象は治療的介入を受ける。本明細書に開示されているか、または当技術分野で既知の治療的介入のいずれかを受けることができる。例えば、モニタリングの強化のために選択された対象は、さらにモニタリングされることができ、強化したモニタリング期間にわたって、がん細胞の存在が維持される場合、治療的介入を受けることができる。これに加えてまたはこれに代えて、モニタリングの強化のために選択された対象は、治療的介入を受けることができ、治療的介入が進むにつれてさらにモニタリングされることができる。いくつかの実施形態では、モニタリングの強化のために選択された対象が治療的介入を受けた後、モニタリングの強化により、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数のさらなるがん細胞変異）及び／または異数性が明らかとなる。いくつかの実施形態では、そのような１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数のさらなるがん細胞変異）及び／または異数性は、異なる治療介入を受ける要因となる（例えば、治療介入中にがん細胞に耐性変異が生じる可能性があり、その耐性変異を有するがん細胞は、元の治療的介入に対して耐性である）。
【０３３３】
いくつかの実施形態では、対象ががん（例えば、卵巣癌、子宮内膜癌、膀胱癌、またはＵＴＵＣ）を有すると判定された場合、対象は、さらなる検査を受け得る、またはさらなる診断検査のために選択され得る。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、従来技術が対象を早期がんと診断することができる期間の前の時点において、さらなる診断検査のための対象を選択するために使用することができる。例えば、さらなる診断検査のための対象を選択するために本明細書で提供される方法は、対象が従来の方法によってがんと診断されていない場合、及び／または対象ががんに罹患することが知られていない場合に使用することができる。いくつかの実施形態では、さらなる診断検査のために選択された対象は、さらなる診断検査のために選択されていない対象と比較して、頻度を増やして診断検査（例えば、本明細書に開示された診断検査のいずれか）を受けることができる。例えば、さらなる診断検査のために選択された対象は、１日２回、毎日、隔週、毎週、隔月、毎月、四半期、半年ごと、毎年、または任意の頻度で診断検査を受けることができる。いくつかの実施形態では、さらなる診断検査のために選択された対象は、さらなる診断検査のために選択されていない対象と比較して１つまたは複数のさらなる診断検査を受けることができる。例えば、さらなる診断検査のために選択された対象は２つの診断検査を受けることができるが、さらなる診断検査のために選択されていない対象は１つの診断検査のみを受ける（または診断検査は実施しない）。いくつかの実施形態では、診断検査法では、初期に検出されたがんと同じ種類のがんの存在を判定することができる。これに加えてまたはこれに代えて、診断検査法では、初期に検出されたがんと異なる種類のがんの存在を判定することができる。いくつかの実施形態では、診断検査法は、スキャンである。いくつかの実施形態では、スキャンは、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、ＣＴ血管造影法（ＣＴＡ）、食道造影図（バリウム飲み込み）、バリウム注腸、核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、ＰＥＴスキャン、超音波検査（例えば、超音波気管支内検査、超音波内視鏡検査）、Ｘ線、ＤＥＸＡスキャンである。いくつかの実施形態では、診断検査法は、例えば、肛門鏡検査、気管支鏡検査（例えば、自家蛍光気管支鏡検査、白色光気管支鏡検査、誘導式気管支鏡検査）、大腸内視鏡検査、デジタル乳房トモシンセシス、内視鏡的逆行性胆道膵管造影（ＥＲＣＰ）、上部消化管内視鏡検査、マンモグラフィ、パップスメア、婦人科内診、ポジトロン断層撮影法、及びコンピュータ断層撮影法（ＰＥＴ−ＣＴ）スキャンなどの理学的検査である。いくつかの実施形態では、さらなる診断検査のために選択された対象は、モニタリングの強化のために選択することも可能である。がん細胞の存在が同定される場合（例えば、本明細書に開示されている様々な方法のいずれかによって）、対象は、強化したモニタリング（例えば、対象の腫瘍またはがんの進行を評価する、及び／またはさらなる遺伝子バイオマーカー（例えば、さらなるがん細胞変異）及び／または異数性の発生を評価するため）、及びさらなる診断検査（例えば、がん細胞を有する腫瘍のサイズ及び／または正確な位置を判定するため）の両方を受けることが有益であり得る。いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、がん細胞変異）及び／または異数性が検出された後、さらなる診断検査のために選択された対象は治療的介入を受ける。本明細書に開示されているか、または当技術分野で既知の治療的介入のいずれかを受けることができる。例えば、さらなる診断検査のために選択された対象は、さらなる診断検査を受けることができ、がん細胞の存在が確認される場合、治療的介入を受けることができる。これに加えてまたはこれに代えて、さらなる診断検査のために選択された対象は、治療的介入を受けることができ、治療的介入が進むにつれて、さらにモニタリングされることができる。いくつかの実施形態では、さらなる診断検査のために選択された対象が治療的介入を受けた後、さらなる診断検査により、１つまたは複数のさらなる遺伝子バイオマーカー（例えば、がん細胞変異）及び／または異数性が明らかとなる。いくつかの実施形態では、そのような１つまたは複数のさらなる遺伝子バイオマーカー（例えば、がん細胞変異）及び／または異数性は、異なる治療介入を受ける要因となる（例えば、治療介入中にがん細胞に耐性変異が生じる可能性があり、その耐性変異を有するがん細胞は、元の治療的介入に対して耐性である）。
【０３３４】
いくつかの実施形態では、対象から採取した試料（例えば、子宮頸部、子宮内膜、尿、唾液、ｃｔＤＮＡ、血液、血清、及び／または血漿試料）に存在する１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在は、参照によりその内容が全体として本明細書に組み込まれる国際特許出願公開番号第ＷＯ２０１７／１３２４３８号に記載の様々なボトルネックシークエンシングシステム方法のいずれかを使用して検出される。ボトルネックシークエンシングシステム（ＢｏｔＳｅｑＳ）は、ミトコンドリア及び核のゲノム全体にわたってまれな体細胞点変異を同時に定量化する次世代のシークエンシング方法である。ＢｏｔＳｅｑＳは、ライブラリ増幅の直前に、分子バーコーディングと単純な希釈ステップを組み合わせている。ＢｏｔＳｅｑＳを使用して、まれな変異の年齢及び組織依存性の蓄積を示すことができ、正常組織の体細胞変異負荷が生物学的及び環境的要因に応じて数桁変動する可能性があることを実証することができる。ＢｏｔＳｅｑＳは、正常組織のミトコンドリア及び核のゲノムの変異パターン間の大きな違いを示すために使用される。ＢｏｔＳｅｑＳにより、正常組織の変異スペクトルが、互いに異なっていたが、それらに生じたがんのスペクトルに類似していることが示された。
【０３３５】
ＢｏｔＳｅｑＳのいくつかの実施形態によれば、ＤＮＡの配列を得るための方法が提供される。アダプターは、ＤＮＡ集団のランダムフラグメントの末端にライゲートされてアダプターライゲートフラグメントのライブラリを形成し、これにより、アダプターライゲートフラグメントのライブラリ内のフラグメントの増幅時にフラグメントの各末端が明確な末端を持つようになる。アダプターライゲートフラグメントのライブラリを希釈して、希釈したアダプターライゲートフラグメントを形成する。希釈したアダプターライゲートフラグメントの少なくとも一部を増幅し、アダプターライゲートフラグメントの一本鎖からファミリーを形成する。ファミリーメンバーをシークエンシングしてアダプターライゲートフラグメントの複数のファミリーメンバーのヌクレオチド配列を得る。
【０３３６】
ＢｏｔＳｅｑＳのいくつかの実施形態によれば、ＤＮＡをシークエンシングする方法が提供される。アダプターは、断片化された二本鎖ＤＮＡ分子の集団の末端にライゲートされてアダプターライゲートフラグメントのライブラリを形成し、これにより、アダプターライゲートフラグメントのライブラリ内のフラグメントの増幅時にフラグメントの各末端が明確な末端を持つようになる。アダプターライゲートフラグメントのライブラリを希釈して、希釈したアダプターライゲートフラグメントを形成する。希釈したアダプターライゲートフラグメントの少なくとも一部を増幅し、アダプターライゲートフラグメントの一本鎖からファミリーを形成する。ファミリーメンバーをシークエンシングしてアダプターライゲートフラグメントの複数のファミリーメンバーのヌクレオチド配列を得る。第１のファミリーのメンバーのヌクレオチド配列は、参照配列にアラインメントされる。第１のファミリーのメンバーと参照配列の差が同定される。この差は、アダプターライゲートフラグメントの一本鎖の反対の鎖の第２のファミリーにおいて見つかった場合、潜在的でまれな変異または潜在的で非クローン性変異として同定される。
【０３３７】
ＢｏｔＳｅｑＳのいくつかの実施形態によれば、ＤＮＡをシークエンシングする方法が提供される。試料に由来する二本鎖ＤＮＡ集団をランダムに断片化し、フラグメントのライブラリを形成する。アダプターは、フラグメントの末端にライゲートされてアダプターライゲートフラグメントのライブラリを形成し、これにより、アダプターライゲートフラグメントのライブラリ内のフラグメントの増幅時にフラグメントの各末端が明確な末端を持つようになる。アダプターライゲートフラグメントのライブラリを希釈して、希釈したアダプターライゲートフラグメントを形成する。希釈したアダプターライゲートフラグメントの少なくとも一部を増幅し、アダプターライゲートフラグメントの一本鎖からファミリーを形成する。ファミリーメンバーをシークエンシングしてアダプターライゲートフラグメントの複数のファミリーメンバーのヌクレオチド配列を得る。第１のファミリーのメンバーのヌクレオチド配列は、参照配列にアラインメントされる。第１のファミリーのメンバーと参照配列の差が同定される。この差は、アダプターライゲートフラグメントの一本鎖の反対の鎖の第２のファミリーにおいて見つかった場合、潜在的でまれな変異または潜在的で非クローン性変異として同定される。
【０３３８】
対象から採取した試料（例えば、子宮頸部、子宮内膜、尿、唾液、ｃｔＤＮＡ、血液、血清、及び／または血漿試料）に存在する１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在を検出するいくつかの実施形態では、まれな体細胞点変異は、ミトコンドリア及び核ゲノム全体にわたって定量化される。そのような方法の１つまたは複数の実施形態は、非公式にはＢｏｔＳｅｑＳと呼ばれ、これはボトルネックシークエンシングシステムの略である。ライブラリ増幅の直前に、分子バーコーディング（外因性または内因性）及び単純な希釈ステップを使用して、該方法は、例えば、正常組織の年齢または組織型に基づいて変異負荷を判定することを可能にする。本明細書に記載される様々なＢｏｔＳｅｑＳ方法を使用して、変異原、及び変異率に対する環境障害の影響を示すことができる。本明細書に記載される様々なＢｏｔＳｅｑＳ方法は、分子的にバーコード化されたライブラリ内のまれな点変異を完全に公平な方法で正確に検出するように設計される。
【０３３９】
ＢｏｔＳｅｑＳは、例えば、Ｋｉｎｄｅ，Ｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｒｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０８，９５３０−９５３５（２０１１）に記載の内因性位置画定バーコード、及び外因的に追加された一致バーコード（Ｋｉｎｄｅ，Ｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｒｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０８，９５３０−９５３５（２０１１）；Ｊａｂａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｃｕｒａｔｅ  ｓａｍｐｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｅｅｐ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＨＩＶ−１  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｐｒｉｍｅｒ  ＩＤ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０８，２０１６６−２０１７１（２０１１）；Ｓｃｈｍｉｔｔ，Ｍ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｌｔｒａ−ｒａｒｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｂｙ  ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０９，１４５０８−１４５１３（２０１２）；Ｈｉａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｉｎｇｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｐｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔｅｄ，ｈｉｇｈ−ａｃｃｕｒａｃｙ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｏｗ−ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ．Ｇｅｎｏｍｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２３，８４３−８５４（２０１３）；Ｋｉｖｉｏｊａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ａｂｓｏｌｕｔｅ  ｎｕｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｕｎｉｑｕｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ９，７２−７４（２０１２）；Ｋｉｎｄｅ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｐａｐａｎｉｃｏｌａｏｕ  ｔｅｓｔ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔ  ｏｖａｒｉａｎ  ａｎｄ  ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ  ｃａｎｃｅｒｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５，１６７ｒａｌ６４（２０１３）；Ｋｕｍａｒ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｅｐ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｇｌｉａｌ  ｔｕｍｏｒｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｓｐａｔｉａｌ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｆｏｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ  ｒｅｌｅｖａｎｔ  ｇｅｎｅｓ．Ｇｅｎｏｍｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ  １５，５３０（２０１４）；Ｋｅ��ｓ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｉｍｅｒ  ＩＤ  Ｉｎｆｏｒｍｓ  Ｎｅｘｔ−Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｐｌａｔｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｒｅｖｅａｌｓ  Ｐｒｅｅｘｉｓｔｉｎｇ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＨＩＶ−１  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｃｏｄｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎ．ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ  Ｈｕｍ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ３１，６５８−６６８（２０１５））など、任意の分子バーコーディング戦略で使用可能であった。いくつかの実施形態では、ＢｏｔＳｅｑＳは、完全に公平な方法でゲノム全体で非常にまれな変異を測定するが、ＳａｆｅＳｅｑＳは、事前定義された標的遺伝子座における比較的頻繁ではあるが非クローン性変異（つまり「サブクローン」）を測定する。
【０３４０】
概念的には、ＢｏｔＳｅｑＳは、低カバレッジのランダムにサンプリングされたゲノム遺伝子座を得るものと想定され得るが、Ｓａｆｅ−ＳｅｑＳは、超高カバレッジの標的遺伝子座を処理する。
【０３４１】
本明細書に記載の様々なＢｏｔＳｅｑＳ方法の特徴として見ることができる低いゲノムカバレッジは、まれな変異がそのゲノム位置でシグナルの大部分を構成し、方法の感度に寄与することを可能にする。そのような方法の用途は様々である。それらは非常にまれな体細胞変異の測定に使用することができる。それらは、体細胞モザイク、細胞系列の発達、老化に関する理論、環境発がん物質への曝露、及びがんリスクの評価に使用することができる。これらの用途の多くは、本明細書の実施例で実証されている。
【０３４２】
様々なＢｏｔＳｅｑＳシークエンシング方法で生成されたデータに様々なフィルターが適用可能である。適用可能なフィルターの１つは、ｍｔＤＮＡのみ、Ｗａｔｓｏｎ及びＣｒｉｃｋ複製ファミリーのみであり、高頻度の変異を含む鋳型（つまり、鋳型あたり１つより多くの変異のホモポリマー）、及びｒｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒにマッピングされる鋳型を除外する。適用可能な別のフィルターは、核のＤＮＡのみ、Ｗａｔｓｏｎ及びＣｒｉｃｋ複製ファミリーのみであり、高頻度の変異を含む鋳型（つまり、鋳型あたり１つより多くの変異のホモポリマー）、及び反復ＤＮＡまたは構造変異型にマッピングされる鋳型を除外する。適用できる別のフィルターは、ｍｔＤＮＡのみ、一塩基置換のみ、３０以上の平均品質スコア、Ｒｅａｄ１＞＝２  ９０％以上の変異率のみを持つＷａｔｓｏｎ複製、Ｒｅａｄ２＞＝２  ９０％以上の変異率のみを持つＣｒｉｃｋ複製、ＷＧＳでコールされる全変異型を除外、ｄｂＳＮＰ１４２の全変異型を除外、ｒｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒにマッピングされるコールを除外、視覚的アーティファクト及び高頻度の変異（つまり、サイクル６及び７、鋳型あたり１つより多くの変化、変化あたり１つより多くの鋳型のホモポリマー）を除外、である。適用できるさらに別のフィルターは、核ＤＮＡのみ、一塩基置換のみ、３０以上の平均品質スコア、Ｒｅａｄ１＞＝２  ９０％以上の変異率のみを持つＰＣＲ複製、Ｒｅａｄ２＞＝２  ９０％以上の変異率のみを持つＰＣＲ複製、ＷＧＳでコールされる全変異型を除外、ｄｂＳＮＰ１３０及びｄｂＳＮＰ１４２の全変異型を除外、反復ＤＮＡまたは構造変異型にマッピングされるコールを除外、視覚的アーティファクト及び高頻度の変異（つまり、サイクル６及び７、鋳型あたり１つより多くの変化のホモポリマー）を除外、である。
【０３４３】
様々なデータベースを使用して、ｄｂＳＮＰ  ｂｕｉｌｄ  １３０、Ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｖａｒｉａｎｔｓ、Ｓｅｇｍｅｎｔａｌ  Ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｅｄ  Ｒｅｐｅａｔｓ、Ｓｉｍｐｌｅ  Ｔａｎｄｅｍ  Ｒｅｐｅａｔｓ、Ｒｅｐｅａｔ  Ｍａｓｋｅｒ、ｄｂＳＮＰ  ｂｕｉｌｄ  １４２、最新のＤａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｖａｒｉａｎｔｓ、最新のＤａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｖａｒｉａｎｔｓ、最新のＳｅｇｍｅｎｔａｌ  Ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、最新のＦｒａｇｍｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｅｄ  Ｒｅｐｅａｔｓ、最新のＳｉｍｐｌｅ  Ｔａｎｄｅｍ  Ｒｅｐｅａｔｓ、最新のＲｅｐｅａｔ  Ｍａｓｋｅｒを含むデータをアラインメント及びフィルタリングした。ＵＳＣＳ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  ＢｒｏｗｓｅｒのＧＲＣｈ３７／ｈｇｌ９ゲノムアセンブリを使用した。
【０３４４】
二本鎖ＤＮＡのフラグメントは、酵素消化、超音波処理、及びせん断を含むがこれらに限定されない当該分野で既知の任意の技術を使用して、より長い鎖のポリマーから作製することができる。あるいは、一部の供給源のＤＮＡはすでに適切なサイズで断片化されている。このような供給源には、唾液、喀痰、尿、血漿、及び便が含まれるが、これらに限定されない。その供給源のＤＮＡがすでに適切なサイズである場合、その後、フラグメントをさらに断片化する必要はない。望ましくは、断片化プロセスは、内因性であろうとヒトの操作であろうとランダムである。フラグメントの望ましいサイズは、シークエンシングリードの長さに依存し得る。フラグメントは、２ｋｂｐ未満、１５００ｂｐ未満、１ｋｂｐ未満、５００ｂｐ未満、４００ｂｐ未満、２００ｂｐ未満、または１００ｂｐ未満であり得る。フラグメントは、例えば、リード長の２倍よりも長いことが望ましい場合がある。フラグメントは、例えば、少なくとも５０ｂｐ、少なくとも１００ｂｐ、少なくとも１５０ｂｐ、少なくとも２００ｂｐ、少なくとも３００ｂｐ、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐであり得る。
【０３４５】
いくつかの実施形態では、フラグメントはアダプターにライゲートされる。いくつかの実施形態では、フラグメントの各末端には異なるアダプターを有する。これは困難なプロセスになり得、両端に２つの異なるアダプターを有するフラグメントを得るために多くのスクリーニング及びプロセシングを必要とする場合がある。この目標を達成するための１つの方法は、Ｗａｔｓｏｎ鎖及びＣｒｉｃｋ鎖に対する非相補配列の配列を含むか、または含むようにプロセシングすることができるＹ、Ｕ、またはヘアピン型アダプターを使用することである。アダプター内に非相補的な領域がある場合、アダプターライゲートフラグメントの増幅は、増幅時に各鎖に由来するフラグメント上で異なるアダプター配向を有する二本鎖フラグメントを生成する。
【０３４６】
アダプターライゲートフラグメントのライブラリの希釈は、供給源に適した任意のレベルの希釈を使用して実施することができる。低濃縮度の試料ほど希釈が少なく、高濃縮度の試料ほどより希釈される。試料の複合性も望ましい希釈度に影響する。例えば、２倍希釈、５倍希釈、１０倍希釈など、任意の希釈系列を所望により使用してよい。いくつかの実施形態では、アダプターライゲートフラグメントあたり約５〜１０のファミリーメンバーが得られる希釈レベルが選択される。これは、シークエンシングされるフラグメント数に影響される。例えば、ある特定の希釈では、２，０００万クラスターをシークエンシングすると１〜４のメンバーが得られるが、７，５００万のクラスターをシークエンシングすると５〜１０得られる（図５５を参照）。シークエンシングされる分子が多いほど、ファミリーあたりの見つかるメンバーの数が多くなる。希釈されたアダプターライゲートフラグメントに由来するファミリーメンバーをシークエンシングすると、望ましくは、アダプターライゲートフラグメントの４〜１００ファミリーメンバーのヌクレオチド配列を得る。
【０３４７】
有利なことに、希釈によりゲノムのカバレッジが比較的低くなることがある。すなわち、網羅的かつ反復的にシークエンシングするのではなく、ゲノムをサンプリングしてもよい。いくつかの実施形態では、核ＤＮＡの１０未満のファミリーが非アダプター部分において２０以上の重複ヌクレオチドを含むように、希釈が十分なされる。いくつかの実施形態では、核ＤＮＡの５未満のファミリーが非アダプター部分において２０以上の重複ヌクレオチドを含むように、希釈が十分なされる。いくつかの実施形態では、１０未満のファミリーが、試験配列と参照配列間で検出される潜在的でまれな差異または潜在的で非クローン性の差異を含むように、希釈が十分なされる。いくつかの実施形態では、５未満のファミリーが、試験配列と参照配列間で検出される潜在的でまれな差異または潜在的で非クローン性の差異を含むように、希釈が十分なされる。
【０３４８】
いくつかの実施形態では、希釈は３つの特徴を実現する。第１に、希釈により、１つまたは少数の分子に対する代表的な遺伝子座のカバレッジを低くして、まれな変異を「発見」することができる。第２に、希釈により、初期分子の両方の鎖が重複して配列される可能性を高めることができる。第３に、希釈により、最小限のシークエンシングでゲノムのランダムサンプリングを容易にすることができる。
【０３４９】
増幅は、当該分野で公知の任意の技術によって実施され得る。典型的には、ポリメラーゼ連鎖反応が使用される。線形であろうと対数であろうと、他の手法を使用してもよい。
【０３５０】
典型的には、プライマーは、アダプター配列に相補的な増幅に使用される。
【０３５１】
シークエンシングは、当該技術分野において任意の公知の技術により実施可能である。次世代シークエンシング方法を使用してもよい。フラグメントの配列は、参照配列にアラインメント可能である。それらは、内因性または外因性のバーコードに基づいてファミリーにグループ分けされ得る。内因性バーコードは通常、アダプターに隣接するＮ個のヌクレオチドを含む。Ｎの値は、所望により、十分な多様性／複合性をもたらすように選択することができる。外因性バーコードは、増幅プライマーにより、別のライゲーションステップで追加するか、または外因性バーコードはアダプターの一部であってもよい。いくつかの実施形態では、バーコードはランダムである。いくつかの実施形態では、２〜１０００のファミリーメンバーがシークエンシングされる。いくつかの実施形態では、シークエンシングされるファミリーメンバーは１００未満である。いくつかの実施形態では、少なくとも４のファミリーメンバーがシークエンシングされる。いくつかの実施形態では、４〜１０のファミリーメンバーがシークエンシングされる。
【０３５２】
本明細書に記載の様々な方法によると、核ゲノム及びミトコンドリアゲノムを物理的に分離したり、別々に分析する必要はない。これにより、同じ細胞内の２つのゲノムの割合を比較することができる。
【０３５３】
外因性バーコードを使用して、個々のフラグメント、試料、組織、患者などを識別してもよい。本明細書に提供される例では内因性バーコードを使用したが、これは、外因性バーコードによって補完または置換され得る。いくつかの実施形態では、バーコード集団の複合性は、バーコードが特定のフラグメントを表すようにバーコーディングされるフラグメントの集団の複合性よりも大きい。バーコードは、これらに限定されるものではないが、増幅またはライゲーションによるもの、またはライゲーションにより付加されるアダプター分子の一部としてを含む、当該分野で公知の任意の技術を使用して、フラグメントの集団に付加され得る。判定されたヌクレオチド配列と参照ヌクレオチド配列の間で検出できる差異には、これらに限定されるものではないが、例えば、点変異、インデル（例えば、１〜６塩基の挿入または欠失）、及び／または置換などの変異が含まれる。２つの異なるファミリーで同じ変異が見つかった場合、より高い確実性がそれに結び付けられる（例えば、実験過程ではなく、生体試料において生じた可能性が高くなる）。２つのファミリーは、二本鎖フラグメントに由来する同一の配列を有することができるが、アダプター配列に関して異なる配向を有することができる。より高い確実性を実現するには、２つのファミリーのそれぞれの少なくとも２つのメンバーに配列差異がある必要があり得る。より高い確実性を実現するには、ファミリーのメンバーの９０％以上に配列差異がある必要があり得る。
【０３５４】
生殖系列またはクローン性変異を除外する手段として、増幅されておらず、同じ試料に由来するフラグメントのライブラリをシークエンシングすることができる。生殖系列及びクローン性変異は、繰り返し発生するため、検査から明らかになる。
【０３５５】
ＢｏｔＳｅｑＳ方法は、実施が容易なＮＧＳベースのアプローチであり、公平なゲノムワイドな方法でまれな点変異を正確に測定することができる。ＢｏｔＳｅｑＳを使用して、いくつかの重要なこと：（ｉ）ゲノム全体にわたる、まれな変異頻度の推定値の定義、（ｉｉ）同じ細胞集団の核及びミトコンドリアの両方のゲノムにおける、まれな変異の同時評価、（ｉｉｉ）年齢、ＤＮＡ修復能力、または曝露歴の異なる個々の様々な正常組織間でのまれな変異頻度の比較、及び（ｉｖ）正常組織のまれな変異のスペクトルを同定し、がんのクローン性変異のスペクトルとの比較を可能にすること、が実現した。
【０３５６】
本明細書に提示されたデータは、変異が年齢とともに増加することを示しており、その結果は文献とほぼ一致している（Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ｓ．Ｒ．，Ｌｏｅｂ，Ｌ．Ａ．＆Ｈｅｒｒ，Ａ．Ｊ．Ｓｏｍａｔｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａｇｉｎｇ，ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｍｅｃｈ  Ａｇｅｉｎｇ  Ｄｅｖ  １３３，１１８−１２６（２０１２）；Ｖｉｊｇ，Ｊ．Ｓｏｍａｔｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ，ｇｅｎｏｍｅ  ｍｏｓａｉｃｉｓｍ，ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ａｇｉｎｇ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ＆ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２６，１４１−１４９（２０１４）。おそらく、結腸及び腎臓の両方が成人の生涯を通じて自己複製組織である一方で脳はそうではないため、変異の増加率は、脳においては、結腸または腎臓ほど大きくない。一方、前頭前皮質の主要な細胞型は一般に有糸分裂後と考えられていることを踏まえると、変異の頻度が幼少期以降に増加したという事実は驚くべきことであった（Ｓｐａｌｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｂｉｒｔｈ  ｄａｔｉｎｇ  ｏｆ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ．Ｃｅｌｌ  １２２，１３３−１４３（２００５））。特定の理論に束縛されるものではないが、この増加にはいくつかの可能性のある説明が存在する。ニューロンまたはグリアよりも活発に複製している少数の細胞が増加の原因である可能性がある。そのような細胞には、ミクログリアまたは浸潤リンパ球または他の炎症細胞が含まれる可能性がある。あるいは、これらの変異は、ＤＮＡ複製とは無関係の自然発生的なＤＮＡ損傷の結果を表す可能性がある。ヒトニューロンの最近の単一細胞シークエンシング研究では、転写中に自然発生的な損傷が発生することが示唆された（Ｌｏｄａｔｏ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｏｍａｔｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｉｎｇｌｅ  ｈｕｍａｎ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｔｒａｃｋｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｈｉｓｔｏｒｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５０，９４−９８（２０１５））。しかしながら、単一細胞シークエンシングとは対照的に、ＢｏｔＳｅｑＳは、両方の鎖で見つかった変異を測定する。したがって、自然発生的なＤＮＡ損傷の説明が信頼に値するためには、ＢｏｔＳｅｑＳによって同定された変異がＤＮＡ修復の対象となっていたことが必要となる。この可能性と一致して、ＤＮＡ修復プロセスは、有糸分裂後のニューロン及びグリアにおいて活発であることが知られている（Ｍａｄａｂｈｕｓｈｉ，Ｒ．，Ｐａｎ，Ｌ．＆Ｔｓａｉ，Ｌ．Ｈ．ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｌｉｎｋｓ  ｔｏ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｎｅｕｒｏｎ  ８３，２６６−２８２（２０１４））。
【０３５７】
第３の可能性は、これらの変異が、それらを検出するために使用した手順のアーティファクトであることである。変異が、研究した組織の１つの細胞のみで見つかった可能性が高く、その細胞由来のＤＮＡは、その後の評価に使用できなくなるために、この公式な可能性を除外することは本質的に不可能であると言うことは興味深い。加えて、本明細書に記載の様々なＢｏｔＳｅｑＳ方法によって実現される感度で、そのような変異の観察に利用可能な他の技術はない。この感度は現在、プロジェクト専用のシークエンシング量によってのみ制限される。ＨｉＳｅｑ（商標）２５００フローセルのごく一部を使用して、ｂｐあたり６×１０−８で発生する変異を検出するのは簡単である。フローセル全体を使用して、ｂｐあたり１０−９未満で変異を検出できると推定されている。この感度に近づく他の唯一の方法は、Ｌｏｅｂとその同僚によって記載されている（Ｓｃｈｍｉｔｔ，Ｍ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｌｔｒａ−ｒａｒｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｂｙ  ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０９，１４５０８−１４５１３（２０１２）；Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ｓ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｕｌｔｒａｌｏｗ−ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｂｙ  Ｄｕｐｌｅｘ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ９，２５８６−２６０６（２０１４））が、これはゲノムの事前定義された領域（−０．００１％）にのみ適用される。直接的な確証がない場合、本明細書に記載の技術の精度をサポートするために、相関関係及び他のアプローチを使用せざるを得ない。これらの相関関係には、表５１に詳細が示されているとおり、同じ試料の異なるＤＮＡアリコートで同定された類似の変異頻度及びスペクトル、ほぼ同じ年齢の異なる個体の同じ組織で同定された類似の変異頻度及びスペクトル、年齢とともに予想される変異頻度の増加、変異頻度の年齢依存性の増加における組織特異的な差異、ミスマッチ修復を欠くか、または環境変異原に曝露した正常組織におけるより高い変異頻度、及び同じ組織のがんにおいて以前に観察されたものと一致する正常組織の変異スペクトルが含まれる。ＢｏｔＳｅｑＳの精度を評価するために使用される他のインシリコ及び実験的アプローチは、実施例７で説明される。
【０３５８】
同じ組織のミトコンドリア及び核ゲノムの変異頻度を比較することも可能であった。変異原への曝露がない通常の個体では、変異頻度は、核ゲノムよりもミトコンドリアではるかに高かった（中央値比２６．２）。これは、核ゲノムと比較してミトコンドリアのＤＮＡ修復効率が比較的低いことと一致している。しかしながら、同様に重要なことは、タバコの煙またはＡＡに曝露された個体の正常な腎臓において、ミトコンドリア対核の変異頻度の比が非常に低かった（中央値１．３）ことである。この発見は、ミトコンドリア内のＤＮＡの既知の低効率の修復と一致していない。さらに、ＡＡに曝露された個体の正常な腎臓の核ＤＮＡにおいてはＡＡ変異シグネチャー、Ａ：ＴからＴ：Ａへの塩基転換があったが、ｍｔＤＮＡにおいてはほとんどなかった。特定の理論に束縛されるものではないが、１つの可能性は、ｍｔＤＮＡにおけるより高い変異率が、ミトコンドリアゲノムに対する環境変異原の影響を、核ゲノムに対するその影響と比較して遮蔽し得ることである。別の可能性は、これらの変異原がこれらの２つの小器官でＤＮＡ損傷を引き起こす方法において予想外の顕著な差異があることである。
【０３５９】
本明細書に提示されたデータの別の新たな発見は、既知の変異原への曝露がない場合でも、正常組織間で変異スペクトルが異なるという発見である。そのような差異が、未だに同定されていない一般的に出くわす変異原への曝露の変化を表しているのか、組織特異的な修復プロセスを表しているのかは知られていない。いくつかの実施形態では、正常組織のまれな変異スペクトルは、がんに見られるクローン性変異に類似していることが判明した。がんの様々な変異スペクトルは、がん特異的なプロセスに起因することが多いが、本明細書に提示されたデータは、これらの変異の少なくとも１つのサブセットが実際に組織特異的なプロセスを表していることを示唆する。この概念は、がんに見られる変異のかなりの部分が正常な幹細胞で発生するという考えと一致している（Ｔｏｍａｓｅｔｔｉ，Ｃ．＆Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．Ｃａｎｃｅｒ  ｅｔｉｏｌｏｇｙ．Ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｉｓｋ  ａｍｏｎｇ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ｃａｎ  ｂｅ  ｅｘｐｌａｉｎｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｄｉｖｉｓｉｏｎｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４７，７８−８１（２０１５）；Ｔｏｍａｓｅｔｔｉ，Ｃ，Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．＆Ｐａｒｍｉｇｉａｎｉ，Ｇ．Ｈａｌｆ  ｏｒ  ｍｏｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒｓ  ｏｆ  ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗｉｎｇ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ｏｒｉｇｉｎａｔｅ  ｐｒｉｏｒ  ｔｏ  ｔｕｍｏｒ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １１０，１９９９−２００４（２０１３）。本明細書に記載の様々なＢｏｔＳｅｑＳアプローチは、対象となる任意の組織または細胞型における非常にまれな変異を容易に測定することができ、幅広い生物医学的関心のある問題に適用可能である。
【０３６０】
いくつかの実施形態では、対象から採取した試料（例えば、子宮頸部、子宮内膜、尿、唾液、ｃｔＤＮＡ、血液、血清、及び／または血漿試料）に存在する１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在は、参照によりその内容が全体として本明細書に組み込まれる米国特許出願第９，４７６，０９５号に記載の様々な方法のいずれかを使用して検出される。ＤＮＡ鋳型のごく一部に存在する変異の同定は、生物医学研究のいくつかの分野での進歩に有利である。超並列シークエンシング機器は原則としてこのタスクに適しているが、そのような機器のエラー率は一般的に高すぎるため、まれな変異型を確実に同定することができない。本明細書では、この目的のために超並列シークエンシング機器の感度を大幅に高めることができるアプローチを提供する。「Ｓａｆｅ−ＳｅｑＳ」（Ｓａｆｅ−Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）と呼ばれる本アプローチの一例には、（ｉ）各鋳型分子への固有識別子（ＵＩＤ）の割り当て、（ｉｉ）それぞれ固有にタグ付けした鋳型分子を増幅してＵＩＤファミリーを作製すること、及び（ｉｉｉ）増幅産物を重複してシークエンシングすること、が含まれる。同じＵＩＤを持つＰＣＲフラグメントは、それらの９５％以上が同一の変異を含む場合、真の変異体（「超変異体」）である。本アプローチは、例えば、ポリメラーゼの忠実度、インビトロで合成されたオリゴヌクレオチドの精度、ならびに正常細胞の核及びミトコンドリアゲノムにおける変異率を判定するために有用である。
【０３６１】
本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、対象から採取した試料（例えば、子宮頸部、子宮内膜、尿、唾液、ｃｔＤＮＡ、血液、血清、及び／または血漿試料）に存在する１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在は、複数の分析対象核酸フラグメントのそれぞれの第１の末端に結合して固有に同定された分析対象核酸フラグメントを形成する固有識別子（ＵＩＤ）核酸配列を使用して検出され、固有に同定された分析対象核酸フラグメントのヌクレオチド配列は重複して判定され、ＵＩＤを共有する判定されたヌクレオチド配列はメンバーのファミリーを形成し、ファミリーメンバーの少なくとも１％が当該配列を含む場合、ヌクレオチド配列は分析対象核酸フラグメントを正確に表すものとして同定される。
【０３６２】
本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、対象から採取した試料（例えば、子宮頸部、子宮内膜、尿、唾液、ｃｔＤＮＡ、血液、血清、及び／または血漿試料）に存在する１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在は、第１及び第２プライマーによる少なくとも２サイクルの増幅を使用して複数の分析対象ＤＮＡフラグメントのそれぞれの第１の末端に結合して固有に同定された分析対象ＤＮＡフラグメントを形成する固有識別コード配列（ＵＩＤ）を使用して検出される。かかる実施形態において、ＵＩＤは、増幅中に分析対象ＤＮＡフラグメントを超える場合があり、第１のプライマーは、所望のアンプリコンに相補的な第１のセグメント、ＵＩＤを含む第２のセグメント、及び、その後の増幅のためのユニバーサルプライミング部位を含む第３のセグメントを含むことができ、第２のプライマーは、その後の増幅のためのユニバーサルプライミング部位を含むことができ、増幅の各サイクルは１つのユニバーサルプライミング部位を鎖に結合させることができ、固有に同定された分析対象ＤＮＡフラグメントは、増幅して固有に同定された各分析対象ＤＮＡフラグメントから固有に同定された分析対象ＤＮＡフラグメントのファミリーを形成することができ、ファミリーの複数のメンバーのヌクレオチド配列を判定することができる。
【０３６３】
本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、対象から採取した試料（例えば、子宮頸部、子宮内膜、尿、唾液、ｃｔＤＮＡ、血液、血清、及び／または血漿試料）に存在する１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在は、内因性固有識別子（ＵＩＤ）を使用して検出される。例えば、合計３０〜２０００塩基のフラグメントを含む断片化された分析対象ＤＮＡを得ることができる。フラグメントの各末端は、フラグメントの内因性ＵＩＤを形成することができる。アダプターオリゴヌクレオチドをフラグメントの末端に結合させて、アダプテッドフラグメント（ａｄａｐｔｅｄ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）を形成することができる。１つまたは複数の選択された遺伝子を表すフラグメントは、分析対象ＤＮＡの選択された遺伝子に相補的な捕捉オリゴヌクレオチドを使用してフラグメントのサブセットを捕捉するか、選択された遺伝子に相補的なフラグメントを増幅することにより、任意に濃縮することができる。アダプテッドフラグメントは、アダプターオリゴヌクレオチドに相補的なプライマーを使用して増幅し、アダプテッドフラグメントのファミリーを形成することができる。ヌクレオチド配列は、ファミリーの複数のメンバーについて判定することができる。ファミリーの複数のメンバーのヌクレオチド配列を比較することができる。ファミリーのメンバーの少なくとも１％が配列を含む場合、ヌクレオチド配列は分析対象ＤＮＡフラグメントを正確に表すものとして同定することができる。
【０３６４】
いくつかの実施形態では、本明細書では、プライマー対の集団を含む組成物が提供され、各対は、遺伝子または遺伝子部分を増幅及び同定するための第１及び第２のプライマーを含む。第１のプライマーは、遺伝子または遺伝子部分に相補的な第１の部分（例えば、１０〜１００ヌクレオチド）、及び第３のプライマーへのハイブリダイゼーションのための部位を含む第２の部分（例えば、１０〜１００ヌクレオチド）を含むことができる。第２のプライマーは、遺伝子または遺伝子部分に相補的な第１の部分（例えば、１０〜１００ヌクレオチド）、及び第４のプライマーへのハイブリダイゼーションのための部位を含む第２の部分（例えば、１０〜１００ヌクレオチド）を含むことができる。いくつかの実施形態では、第２のプライマーの第１の部分と第２の部分の間に挿入されるのは、固有識別子（ＵＩＤ）を形成する２〜４０００のヌクレオチドからなる第３の部分である。集団内の固有識別子は、少なくとも４つの異なる配列を有することができる。第１及び第２のプライマーは、遺伝子または遺伝子部分の反対の鎖に相補的であり得る。キットは、プライマーの集団、ならびに第１及び第２のプライマーのそれぞれの第２の部分に相補的な第３及び第４のプライマーを含み得る。
【０３６５】
本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、対象から採取した試料（例えば、子宮頸部、子宮内膜、尿、唾液、ｃｔＤＮＡ、血液、血清、及び／または血漿試料）に存在する１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）の存在は、「Ｓａｆｅ−ＳｅｑＳ」（Ｓａｆｅ−Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）を使用して検出される。一実施形態では、Ｓａｆｅ−ＳｅｑＳには２つの基本ステップ：第１のステップは、分析される各核酸鋳型分子への固有識別子（ＵＩＤ）の割り当てであり、第２のステップは、固有にタグ付けした各鋳型を増幅して同一の配列を有する多くの娘分子を生成すること（ＵＩＤファミリーとして定義される）、が含まれる（図６１）。増幅に使用する鋳型分子に変異がすでに存在する場合、その変異は、そのＵＩＤを含む娘分子の特定の割合または全てにさえ存在する必要がある（後続の複製またはシークエンシングエラーがない限り）。全てのファミリーメンバー（または特定の所定の割合）が同一の変異を有するＵＩＤファミリーは、「超変異体」と呼ばれる。元の鋳型に発生しない変異、例えば、増幅ステップ中またはベースコールのエラーにより発生するものなどは、超変異体を発生させることはできない（例えば、ＵＩＤファミリーにおいて所定の頻度では存在しない）。いくつかの実施形態では、増幅は必要ない。
【０３６６】
非常に高レベルの精度及び感度が配列データから得られることが望まれる場合、様々なＳａｆｅ−ＳｅｑＳアプローチのいずれもあらゆる目的に使用することができる。本明細書で記載のとおり、本アプローチを使用して、ポリメラーゼの忠実度、インビトロで合成された核酸合成の精度、及び正常細胞の核またはミトコンドリア核酸における変異率を評価することができる。本アプローチは、モザイク及び体細胞変異を検出及び／または定量化するために使用してもよい。
【０３６７】
本明細書で提供されるＳａｆｅ−ＳｅｑＳアプローチのいくつかの実施形態では、核酸のフラグメントは、核酸を機械的せん断、超音波処理、または他の物理的もしくは化学的ストレスに曝すなどのランダムフラグメント形成技術を使用して得てもよい。一部の部位は他の部位よりもストレスの影響を受けやすいため、フラグメントは厳密にはランダムではない場合がある。ランダムにまたは特異的に断片化するエンドヌクレアーゼもまたフラグメントの生成に使用してもよい。様々なＳａｆｅ−ＳｅｑＳアプローチのいずれかのいくつかの実施形態では、核酸のフラグメントは、ランダムなフラグメントにならない技術を使用して得てもよい。フラグメントのサイズは様々であり得るが、望ましくは３０〜５，０００塩基対、１００〜２，０００、１５０〜１，０００の範囲、またはこれらのエンドポイントの異なる組み合わせの範囲内である。核酸は、例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。ＲＮＡまたはＤＮＡの修飾形態も使用され得る。
【０３６８】
本明細書で提供されるＳａｆｅ−ＳｅｑＳアプローチのいくつかの実施形態では、分析対象核酸フラグメントへの外因性ＵＩＤの結合は、酵素的、化学的、または生物学的などの当技術分野で公知の任意の手段によって実施され得る。１つの手段は、ポリメラーゼ連鎖反応を使用する。別の手段は、リガーゼ酵素を使用する。酵素は、例えば哺乳動物または細菌のものであってもよい。Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントなどの他の酵素を使用して結合する前に、フラグメントの末端を修復してもよい。結合に使用され得る他の酵素は、他のポリメラーゼ酵素である。ＵＩＤは、フラグメントの片端または両端に付加され得る。ＵＩＤは、他の意図された機能のための他の領域を含む核酸分子内に含まれ得る。例えば、後の増幅を可能にするために、ユニバーサルプライミング部位を付加してもよい。別の付加部位は、分析対象核酸中の特定の領域または遺伝子に相補的な領域であり得る。ＵＩＤの長さは、例えば２〜４，０００、１００〜１０００、４〜４００の塩基長であり得る。いくつかの実施形態では、ＵＩＤは、長さが２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００ヌクレオチドまたはより長い、またはこれらの長さの間の任意の長さであり得る。２つ以上のＵＩＤが使用される実施形態では、ＵＩＤは同じ長さでも異なる長さでもよい。
【０３６９】
本明細書で提供されるＳａｆｅ−ＳｅｑＳアプローチのいくつかの実施形態では、ＵＩＤは、ヌクレオチドのランダム付加を使用して作成され、識別子として使用される短い配列を形成し得る。付加の各位置で、４つのデオキシリボヌクレオチドのうちの１つからの選択が使用され得る。あるいは、３つ、２つ、または１つのデオキシリボヌクレオチドのうちの１つからの選択が使用され得る。したがって、ＵＩＤは、特定の位置で完全にランダム、幾分ランダム、または非ランダムになり得る。ＵＩＤを作製する別の方法では、チップ上に組み立てられた所定のヌクレオチドを利用する。このような作成方法で、計画的に複合性が実現される。いくつかの実施形態では、フラグメントの各末端にＵＩＤを結合させると、フラグメント上のＵＩＤ集団の複合性が増すため、有利な場合がある。
【０３７０】
外因性ＵＩＤを付加するためのポリメラーゼ連鎖反応のサイクルは、二本鎖分子の熱変性、得られた一本鎖への第１プライマーのハイブリダイゼーション、元の一本鎖にハイブリダイズした新たな第２鎖を形成するプライマーの伸長を指す。第２のサイクルは、元の１本鎖からの新たな第２鎖の変性、新たな第２鎖への第２プライマーのハイブリダイゼーション、及び新たな第２鎖にハイブリダイズした新たな第３鎖を形成するための第２プライマーの伸長を指す。例えば、分析対象が希釈されている場合、または阻害物質が存在する場合、効率を高めるために複数のサイクルを使用してもよい。
【０３７１】
内因性ＵＩＤの場合、ライゲーションを含むがこれに限定されない様々な方法のいずれかにより、フラグメントの末端にアダプターを付加することができる。いくつかの実施形態では、分析対象フラグメントの複合性は、固相または液相ステップのいずれかでの捕捉ステップにより低減することができる。いくつかの実施形態では、捕捉ステップでは、目的の遺伝子または遺伝子セットを表すプローブへのハイブリダイゼーションを使用する。いくつかの実施形態では、固相上にある場合、非結合フラグメントは結合フラグメントから分離される。当該分野で公知の好適な固相には、フィルター、膜、ビーズ、カラムなどが含まれる。いくつかの実施形態では、液相の場合、例えば、ビオチン−アビジン型相互作用を介してプローブに結合する捕捉試薬を付加することができる。捕捉後、目的のフラグメントは、さらなる処理のために溶出され得る。アダプターの付加及び捕捉の順序は重要ではない。分析対象フラグメントの複合性を低減する別の非限定的な手段は、１つまたは複数の特定の遺伝子または領域の増幅を伴う。これを達成する１つの例示的な方法は、逆ＰＣＲを使用することである。遺伝子特異的であるプライマーを使用して、ライブラリを形成しながら濃縮することができる。任意で、遺伝子特異的プライマーは、超並列シークエンシングプラットフォームへの後続の結合のためのグラフト配列を含むことができる。
【０３７２】
なぜなら、いくつかの実施形態では、内因性ＵＩＤは、フラグメントサイズ及びシークエンシングリード長に応じて限られた数の固有の可能性しか提供せず、内因性ＵＩＤ及び外因性ＵＩＤの組み合わせを使用することができる。いくつかの実施形態では、増幅時に追加の配列を導入すると、利用可能なＵＩＤの増加が増幅し、これにより感度が向上する。例えば、増幅前に、鋳型を９６ウェルに分割し、増幅中に９６種類のプライマーを使用することができる。同じ内因性ＵＩＤを持つ最大９６鋳型を区別することができるため、これにより利用可能なＵＩＤが事実上９６倍に増加する。この手法は、各ウェルのプライマーが、増幅産物に固有で十分に特異的な配列を付加し、まれな鋳型の検出の特異性もまた改善できるように、外因性ＵＩＤでも使用することができる。
【０３７３】
本明細書で提供されるＳａｆｅ−ＳｅｑＳアプローチのいくつかの実施形態では、ＵＩＤを含むフラグメントの増幅は、フラグメントのファミリーを生成するための公知の技術にしたがって実施することができる。ポリメラーゼ連鎖反応を使用してもよい。所望により、他の増幅方法を使用してもよい。ローリングサークル増幅と同様に、逆ＰＣＲを使用してもよい。フラグメントの増幅は、通常、ＵＩＤと同時にフラグメントに結合するプライミング部位に相補的であるプライマーを使用して行われる。いくつかの実施形態では、プライミング部位はＵＩＤより遠位にあるため、増幅にはＵＩＤが含まれる。いくつかの実施形態では、増幅はフラグメントのファミリーを形成し、ファミリーの各メンバーは同じＵＩＤを共有する。ＵＩＤの多様性は、通常、フラグメントの多様性を大きく超えるため、各ファミリーは分析対象物中の単一のフラグメント分子に由来する必要がある。増幅に使用されるプライマーは、エキソヌクレアーゼに対する耐性を高めるために化学的に修飾され得る。このような修飾の非限定的な例には、１つまたは複数の３’ヌクレオチドとボラノホスフェート間のホスホロチオエート結合の使用が含まれる。
【０３７４】
本明細書で提供されるＳａｆｅ−ＳｅｑＳアプローチのいくつかの実施形態では、ファミリーのメンバーは、ファミリー内のあらゆる相違を識別するためにシークエンシングされ、比較される。いくつかの実施形態では、シークエンシングは、大部分が市販されている超並列シークエンシングプラットフォームで実施される。シークエンシングプラットフォームが「グラフティング」（すなわち、シークエンシングデバイスへの結合）のための配列を使用する場合、そのような配列は、ＵＩＤまたはアダプターの付加中に、または個別に付加することができる。グラフト配列は、ＵＩＤプライマー、ユニバーサルプライマー、遺伝子標的特異的プライマー、ファミリーの作成に使用される増幅プライマーの一部であるか、または別個であってもよい。重複シークエンシングとは、単一のファミリーの複数のメンバーのシークエンシングを指す。
【０３７５】
分析対象中の遺伝子バイオマーカー（例えば、変異）を識別するための閾値を設定することができる。「変異」がファミリーの全てのメンバーに現れる場合、分析対象物に由来する。全てではないメンバーに現れた場合、分析中に導入された可能性がある。変異をコールするための閾値は、例えば１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、または１００％に設定され得る。閾値は、シークエンシングしたファミリーのメンバー数ならびに特定の目的及び状況に基づいて設定することができる。
【０３７６】
本明細書で提供されるＳａｆｅ−ＳｅｑＳアプローチのいくつかの実施形態では、プライマー対の集団は、外因性ＵＩＤを結合するために使用される。例えば、第１のプライマーは、遺伝子または遺伝子部分に相補的な第１の部分（例えば、１０〜１００ヌクレオチド）、及び第３のプライマーへのハイブリダイゼーションのための部位を含む第２の部分（例えば、１０〜１００ヌクレオチド）を含むことができる。いくつかの実施形態では、第１のプライマーの第１の部分及び／または第２の部分は、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００ヌクレオチド長、またはその間の任意の長さである。第２のプライマーは、遺伝子または遺伝子部分に相補的な第１の部分（例えば、１０〜１００ヌクレオチド）、及び第４のプライマーへのハイブリダイゼーションのための部位を含む第２の部分（例えば、１０〜１００ヌクレオチド）を含むことができる。いくつかの実施形態では、第２のプライマーの第１の部分及び／または第２の部分は、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００ヌクレオチド長、またはその間の任意の長さである。いくつかの実施形態では、第２のプライマーの第１の部分と第２の部分の間に挿入されるのは、固有識別子（ＵＩＤ）を形成する第３の部分（例えば、２〜４，０００ヌクレオチドのうちの、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００ヌクレオチド、またはこれらの値の間の任意の数のヌクレオチド）である。いくつかの実施形態では、第１及び第２のプライマーの両方の第１部分と第２部分の間に挿入されるのは、第３の部分（例えば、２〜４，０００ヌクレオチドのうちの、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００ヌクレオチド、またはこれらの値の間の任意の数のヌクレオチド）であり、それぞれ固有識別子（ＵＩＤ）を形成する。いくつかの実施形態では、第１のプライマーの第３の部分は、第２のプライマーの第３の部分と同じ長さである。いくつかの実施形態では、第１のプライマーの第３の部分は、第２のプライマーの第３の部分とは異なる長さである。いくつかの実施形態では、集団内の固有識別子は、少なくとも４、少なくとも１６、少なくとも６４、少なくとも２５６、少なくとも１，０２４、少なくとも４，０９６、少なくとも１６，３８４、少なくとも６５，５３６、少なくとも２６２，１４４、少なくとも１，０４８，５７６、少なくとも４，１９４，３０４、少なくとも１６，７７７，２１６、または少なくとも６７，１０８，８６４の異なる配列を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のプライマーは、遺伝子または遺伝子部分の反対の鎖に相補的である。外因性ＵＩＤを結合させるためのプライマー及び増幅プライマー、すなわち第１及び第２のプライマーのそれぞれの第２の部分に相補的な第３及び第４のプライマー、の両方を含むキットが作成可能である。第３及び第４のプライマーは、追加のグラフトまたはインデックス配列を任意に含むことができる。ＵＩＤには、ランダムに選択された配列、事前定義されたヌクレオチド配列、またはランダムに選択された配列と事前定義されたヌクレオチドの両方が含まれ得る。両方の場合、これらはブロック単位で一緒に結合するか、点在し得る。
【０３７７】
本明細書で提供されるＳａｆｅ−ＳｅｑＳアプローチのいくつかの実施形態では、分析方法は配列の定量化及び判定に使用することができる。例えば、本明細書に記載の方法を使用して、２つの分析対象ＤＮＡフラグメントの相対的な量を比較することができる。
【０３７８】
本明細書に記載の結果は、Ｓａｆｅ−ＳｅｑＳアプローチが超並列シークエンシングの精度を大幅に改善できることを示す（表５２及び５３）。Ｓａｆｅ−ＳｅｑＳは、内因または外因的に導入されたＵＩＤのいずれか（またはその両方）によって実施することができ、実質的にあらゆる試料調製ワークフローまたはシークエンシングプラットフォームに適用可能である。本明細書に示されるように、Ｓａｆｅ−ＳｅｑＳは、ＤＮＡ鋳型の集団内のまれな変異体の同定、ポリメラーゼエラー率の測定、及びオリゴヌクレオチド合成の信頼性の判断に容易に使用することができる。この戦略の利点の１つは、分析された鋳型の数、及び変異型塩基を含む鋳型の割合が得られることである。少数の鋳型分子を検出するための以前に説明されたインビトロの方法（例えば、Ｄｒｅｓｓｍａｎ  Ｄ，Ｙａｎ  Ｈ，Ｔｒａｖｅｒｓｏ  Ｇ，Ｋｉｎｚｌｅｒ  Ｋ  Ｗ，＆Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  Ｂ（２００３）Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｓｉｎｇｌｅ  ＤＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｉｎｔｏ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００：８８１７−８８２２；Ｌｉ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｒｅｐｌａｃｉｎｇ  ＰＣＲ  ｗｉｔｈ  ＣＯＬＤ−ＰＣＲ  ｅｎｒｉｃｈｅｓ  ｖａｒｉａｎｔ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｄｅｆｉｎｅｓ  ｔｈｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｔｅｓｔｉｎｇ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １４：５７９−５８４）により、変異鋳型の割合を判定することができるが、元の試料の変異鋳型及び通常鋳型の数を判定することができない。
【０３７９】
次世代シークエンシングのエラーを低減するために、Ｓａｆｅ−ＳｅｑＳを他のアプローチと比較することは関心が持たれる。ベースコールの精度を高める高度なアルゴリズムが開発されている（例えば、（Ｅｒｌｉｃｈ  Ｙ，Ｍｉｔｒａ  Ｐ，ｄｅｌａＢａｓｔｉｄｅ  Ｍ，ＭｃＣｏｍｂｉｅ  Ｗ  Ｒ，＆  Ｈａｎｎｏｎ  Ｇ  Ｊ（２００８）Ａｌｔａ−Ｃｙｃｌｉｃ：ａ  ｓｅｌｆ−ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ  ｂａｓｅ  ｃａｌｌｅｒ  ｆｏｒ  ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５：６７９−６８２；Ｒｏｕｇｅｍｏｎｔ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ  ｂａｓｅ  ｃａｌｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｓｏｌｅｘａ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｄａｔａ．ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ９：４３１；Ｄｒｕｌｅｙ  Ｔ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｒｅ  ａｌｌｅｌｉｃ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｆｒｏｍ  ｐｏｏｌｅｄ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６：２６３−２６５；Ｖａｌｌａｎｉａ  Ｆ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｒａｒｅ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｌａｒｇｅ  ｃｏｈｏｒｔｓ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  ２０：１７１１−１７１８））。これらは確かに偽陽性コールを低減することができるが、その感度は、ライブラリ調製に必要なＰＣＲステップ中に発生するアーティファクトの変異及び（低減した数の）ベースコールエラーによって依然として制限される。例えば、現在の研究で採用されているアルゴリズムは、ベースコールに非常に厳しい基準を使用し、短いリード長へと適用したが、エラー率を平均２．０×１０−４エラー／ｂｐ未満に低減することは依然としてできなかった。このエラー頻度は、少なくとも他のアルゴリズムで報告されるエラー頻度と同程度の低さである。感度をさらに向上させるため、これらのベースコールの改善は、Ｓａｆｅ−ＳｅｑＳとともに使用可能である。Ｔｒａｖｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．は、エラーを低減するための別の強力な戦略について説明した（Ｅｉｄ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｆｒｏｍ  ｓｉｎｇｌｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２３：１３３−１３８）。この技術により、各鋳型分子の両方の鎖は、いくつかの分離用酵素ステップの後に重複してシークエンシングされる。しかしながら、本アプローチは、特定の機器でのみ実施可能である。さらに、多くの臨床応用に関して、初期試料には鋳型分子が比較的少なく、感度を得るためにはほとんど全ての鋳型分子の評価が必要である。いくつかの実施形態では、外因的に導入されたＵＩＤを採用する本明細書に記載のアプローチ（図６３）は、ＵＩＤ割り当てステップを、ほとんど分子が失われない後続の増幅と結合することにより、この懸念に対処する。
【０３８０】
現在の研究の従来の分析で同定された変異が、元の鋳型の真の変異ではなくアーティファクトを表すという事実を裏付ける強力な証拠は、１つの実験を除く全ての変異率が類似している（２．０×１０−４〜２．４×１０−４変異／ｂｐ）という観察からもたらされる（表５２及び５３）。例外は、ホスホロアミダイトから合成されたオリゴヌクレオチドによる実験であり、この合成プロセスのエラーは、厳密なベースコール基準で使用された場合、従来のＩｌｌｕｍｉｎａ分析のエラー率より明らかに高かった。対照的に、Ｓａｆｅ−ＳｅｑＳの変異率は、鋳型及び実験に応じて、０．０〜１．４×１０−５変異／ｂｐの範囲で、より大きく変動した。さらに、ポリメラーゼ忠実度が測定された最も制御された実験においてＳａｆｅ−ＳｅｑＳによって測定された変異率（表５３Ａ）は、生物学的アッセイによってポリメラーゼ忠実度が測定された従来の実験から予測されたものとほぼ同一であった。本明細書で提供される正常細胞のＤＮＡにおける変異率の測定は、いくつかの従来の実験データと一致している。しかしながら、これらの変異率の推定値は大きな幅があり、分析される細胞型及び配列に依存し得る（ＳＩテキストを参照）。したがって、Ｓａｆｅ−ＳｅｑＳによって明らかとなった少数の変異は、元のＤＮＡ鋳型に存在する真の変異ではなく、シークエンシングプロセス中に発生したエラーを表しているとは断言できない。Ｓａｆｅ−ＳｅｑＳプロセスの潜在的なエラー原因は、ＳＩテキストにおいて説明される。
【０３８１】
Ｓａｆｅ−ＳｅｑＳのもう１つの潜在的な用途は、ＰＣＲ汚染の最小化であり、これは臨床検査室にとって重大な問題である。内因性または外因性ＵＩＤ割り当てを使用して、変異体鋳型のＵＩＤを以前の実験で同定されたものと単純に比較することができ、２つの独立した試料の同じ変異が異なる実験で同じＵＩＤを持ち得る可能性は、変異がまれな場合は僅かである。加えて、外因性ＵＩＤを使用した、同じ鋳型を使用するがＵＩＤ割り当てＰＣＲサイクルを使用しない対照実験（図６３）により、その鋳型調製物にＤＮＡ汚染が存在しないことを確認することができ、ＵＩＤ割り当てサイクルがない場合は鋳型が増幅されず、したがって、適切なサイズのＰＣＲ産物は観察されない。
【０３８２】
外因性ＵＩＤ戦略を使用して、単一のアンプリコンを詳細に分析できることが実証された。この技術は、限られた数の鋳型が含まれる試料から複数のアンプリコンを分析する必要がある状況には適用できない場合がある。ＵＩＤ割り当てサイクル（図６３）の多重化は、この課題に対する解決策を提供し得る。２つ目の潜在的な懸念は、臨床試料にこのステップの効率を低下させる阻害物質が含まれている可能性があることである。この問題は、分析される鋳型数の判定が複雑になる可能性はあるが、ＵＩＤ割り当てＰＣＲステップ（図６３）で３サイクル以上を実施することでおそらく克服することができる。Ｓａｆｅ−ＳｅｑＳの特異性は現在、ＵＩＤ割り当てＰＣＲステップで使用されるポリメラーゼの忠実度によって制限されている、つまり、現在の２サイクルでの実施では８．８×１０−７変異／ｂｐである。ＵＩＤ割り当てＰＣＲステップのサイクル数を５に増やすと、全体的な特異性が約２×１０−６変異／ｂｐに低下する。しかしながら、この特異性は、変異の同定に複数の超変異体を必要とすることで高めることができ、同じアーティファクト変異を２、３回導入する確率は非常に低くなる（それぞれ［２×１０−６］２または［２×１０−６］３）。要するに、Ｓａｆｅ−ＳｅｑＳバリエーション及び分析バリエーションを実施して特定の実験ニーズを実現するいくつかの簡単な方法がある。
【０３８３】
Ｌｕｒｉａ及びＤｅｌｂｒｕｃｋは、１９４３年の古典的論文にて、「予測を直接検証することはできない。なぜなら、培養液中の耐性菌の数を数える際に我々が観察しているのは、発生した変異の数ではなく、変異したものの増殖によって生じた耐性菌の数であり、増殖量は変異がどれくらい前に発生したかに依存するからである。」と述べた。ポリメラーゼの忠実性に関する実験で述べたように、本明細書で説明する様々なＳａｆｅ−ＳｅｑＳ手順は、各変異の数及び発生時間をデータから推定できるため、このような予測を検証することができる。インビトロのポリメラーゼにより生成された鋳型に加えて、同様のアプローチは、細菌、ウイルス、及び哺乳類細胞由来のＤＮＡに適用できる。したがって、この戦略により、様々な重要な生物医学的問題に対する明確な答えが得られることが期待される。
【０３８４】
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１８／０２０８９９９号に記載されている様々な方法のいずれかを使用して検出される。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、ウイルスなどの病原体の核酸を含む、例えば、血漿ＤＮＡ及び血清ＤＮＡなどの無細胞核酸の数、断片化パターン、及びサイズの分析を含むことができる。様々な実施形態は、ウイルスなどの病原体の核酸を含む、例えば、血漿ＤＮＡ及び血清ＤＮＡなどの無細胞核酸の数、断片化パターン、及びサイズの分析の応用（例えば、生体試料の分類）に関する。本出願のいくつかの実施形態は、対象が特定の状態を有するかどうかを判定することができる。例えば、方法は、対象が、がんまたは腫瘍、または他の病変を有するかどうかを判定することができる。別の応用の実施形態を使用して、状態の段階、または経時的な状態の進行を評価することができる。例えば、方法は、対象のがんの段階、または対象の経時的ながんの進行を判定するために使用してもよい（例えば、異なる時期に対象から採取した試料を使用して）。一実施形態によれば、無細胞核酸分子の混合物のシークエンシングから得られた配列リードを使用して、ウイルスに対応する参照ゲノムにアラインメントする配列リードの量を判定することができる。参照ゲノムへアラインメントする配列リードの量を、カットオフ値と比較して病変についてスクリーニングすることができる。別の実施形態によれば、ウイルス核酸分子のサイズ（例えば、ウイルスに対応する参照ゲノムにアラインメントするもの）を使用することができる。ウイルスの核酸分子のサイズ分布の統計値を判定することができる。対象の病変のレベルは、カットオフ値に対して統計値を処理することによって判定することができる。別の実施形態によれば、ウイルスに対応する参照ゲノムの１つまたは複数の第１のウィンドウ内で終わる無細胞核酸分子の第１の量が判定される。各第１のウィンドウは、ウイルスに関連するがん（または他の病変）を有する対象において第１の閾値を超える割合で無細胞核酸分子の末端が存在する第１のゲノム位置のセットの少なくとも１つを含む。相対存在量は、第２の量の無細胞核酸分子を使用して第１の量を正規化することで計算することができ、これには、第１のゲノム位置のセットを含む１つまたは複数の第１のウィンドウの外側の第２のゲノム位置のセットで終わる無細胞核酸分子が含まれる。対象のがんのレベルは、カットオフ値に対して相対存在量を処理することで判定することができる。実施形態は、様々な技術を組み合わせることができる。例えば、第１のアッセイは、カウントベース、サイズベース、またはフラグメントベースにすることができる。第２のアッセイは、他の手法の１つであることができる。例として、両方の手法で、多数決を使用したり、カットオフ値を判定したりして、特定のレベルの病変に対応する２つの手法からデータポイントのセットを判定することができる。
【０３８５】
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１８／０２０３９７４号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、プロセッサ及びコンピュータ可読媒体を含むコンピュータでデータセットを受信することを伴うコンピュータ実装方法を含むことができ、コンピュータ可読媒体は、プロセッサによって実行される場合、コンピュータに、例えば、生物学的試験試料における体細胞変異を同定させ、体細胞変異を含む体細胞変異プロファイルを生成させる命令を含み、変異シグネチャーの曝露量に基づいて、患者のがんの存在を検出する。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、非負値行列因子分解（ＮＭＦ）アプローチを使用して、患者の潜在的なシグネチャーを同定するために使用できるシグネチャー行列を構築することを含むことができる。他の実施形態では、方法は、主成分分析（ＰＣＡ）またはベクトル量子化（ＶＱ）アプローチを使用してシグネチャー行列を構築してもよい。一例において、患者試料は、無細胞核酸試料である（例えば、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）及び／または無細胞ＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ））。非負値行列因子分解を使用したシグネチャー行列の構築は、がんの検出及び／または分類に関連する複数の機能に一般化できる。いくつかの実施形態では、シグネチャー行列は、複数の特徴のそれぞれの発生確率を表す複数のシグネチャーを含む。関連する特徴の例としては、塩基置換変異の上流配列コンテキスト、塩基置換変異の下流配列コンテキスト、挿入、欠失、体細胞コピー数変化（ＳＣＮＡ）、転座、ゲノムメチル化状態、クロマチンステート、シークエンシングのカバレッジ深度、初期対後期複製領域、センス対アンチセンス鎖、変異間距離、変異型アレル頻度、フラグメント開始／停止、フラグメント長、及び遺伝子発現状態、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、上流及び／または下流配列コンテキストは、塩基置換変異の配列コンテキストの、約２〜約４０ｂｐ、例えば約３〜約３０ｂｐ、例えば約３〜約２０ｂｐ、または例えば約２〜約１０ｂｐの長さの範囲の核酸の領域を含むことができる。一実施形態では、上流及び／または下流の配列コンテキストは、塩基置換変異の、トリプレット配列コンテキスト、クアドラプレット配列コンテキスト、クインティプレット配列コンテキスト、セクスタプレット配列コンテキスト、またはセプタプレット配列コンテキストであってもよい。いくつかの実施形態では、上流及び／または下流の配列コンテキストは、塩基置換変異のトリプレット配列コンテキストであり得る。一実施形態では、本方法は、がんの早期発見のために、対象（例えば、無症候性対象）のｃｆＤＮＡ試料の潜在的な体細胞変異シグネチャーを同定するために使用される。別の実施形態では、本方法は、患者のｃｆＤＮＡ試料において同定された潜在的な変異シグネチャーに基づいて、患者のがんの起源の組織を推定するために使用される。さらに別の実施形態では、本方法は、異なるタイプの治療に患者を分類するために使用可能な患者のｃｆＤＮＡ試料内の潜在的な変異シグネチャーを同定するために使用される。さらに別の実施形態では、非負値行列因子分解は、体細胞変異型（変異）コールアッセイにおいてエラーモードを学習するために適用される。例えば、アッセイの根底にある系統的エラー（例えば、ライブラリ調製、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーションキャプチャ、及び／またはシークエンシング中に発生するエラー）を特定し、真の体細胞変異型と、アッセイの技術的プロセスから生じるアーティファクト変異型の寄与を区別するために使用可能な固有のシグネチャーを割り当てることができる。さらに別の実施形態では、非負値行列因子分解を使用して、健康な老化に関連する変異のシグネチャーを同定することができる。加齢に関連する変異プロセスには、患者の年齢に関連する健康な体細胞変異と、患者のがんプロセスが寄与し、それを示唆する体細胞変異とを区別するために使用可能な変異シグネチャーが割り当てられる。別の実施形態では、１つまたは複数の変異シグネチャーを経時的にモニタリングし、がんの診断、モニタリング、及び／または分類に使用することができる。例えば、２つまたはそれ以上の時点で患者試料由来のｃｆＤＮＡにおいて観察された変異プロファイルを評価することができる。いくつかの実施形態では、２つまたはそれ以上の変異シグネチャープロセスは、異なる変異シグネチャーの組み合わせとして評価することができる。さらに別の実施形態では、治療レジメンまたは他のがん治療の有効性をモニタリングするために、１つまたは複数の変異シグネチャーを経時的に（例えば複数の時点で）モニタリングすることができる。がんゲノムにおける体細胞変異（すなわち、ドライバー変異及びパッセンジャー変異）は、通常、ＤＮＡ損傷及び修復の１つまたは複数の変異プロセスの累積的な結果である。理論に束縛されるものではないが、各変異プロセス（例えば、環境要因及びＤＮＡ修復プロセスなど）への曝露の強度及び期間は、対象（例えば、がん患者など）の体細胞変異の固有のプロファイルをもたらすと考えられている。これらの変異タイプの固有の組み合わせは、がん患者の固有の「変異シグネチャー」を形成する。さらに、当技術分野で周知であるように、体細胞変異、または変異プロファイルは、変異の特定の配列コンテキストに依存し得る。例えば、ＵＶ損傷は通常、（−Ｔ｜Ｃ｜−）Ｃ（Ａ｜Ｔ｜Ｃ｜Ｇ）の配列コンテキスト内で塩基変化が起こると、ＣからＴへの塩基変化を引き起こす。この例では、Ｃは変異した塩基であり、Ｃの上流（ＴまたはＣ）及び下流（Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＧ）の塩基は、ＵＶ照射下での変異の確率に影響を与える。別の例では、５−メチルシトシンの自発的な脱アミノ化は、通常、（Ａ｜Ｔ｜Ｃ｜Ｇ）Ｃ（−｜−｜−｜Ｇ）の配列コンテキスト内で塩基変化が起こると、ＣからＴへの塩基変化を引き起こす。したがって、一実施形態において、同定された変異の配列コンテキストは、がんの検出及び／または分類における体細胞変異を分析するための機能として利用することができる。
【０３８６】
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＰ．Ｃ．Ｔ．公開番号ＷＯ２０１８／１１９３９９に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、ライブラリ調製の変換効率を高めるために１つまたは複数の部分的にライゲートされたＤＮＡフラグメントを救済するための方法を含む、ＤＮＡ含有試験試料からシークエンシングライブラリを調製する方法を含むことができる。本方法はさらに、二本鎖ＤＮＡからのデュプレックス配列情報のリカバリーを改善するために使用することができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、二本鎖ＤＮＡシークエンシングライブラリを調製するための方法を含むことができ、該方法は以下のステップ：（ａ）フォワード鎖及びリバース鎖を含む、複数の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）フラグメントを含む試験試料を得ることと、（ｂ）二本鎖ＤＮＡアダプターをｄｓＤＮＡフラグメントの両端にライゲートすることと、（ｃ）ｄｓＤＮＡフラグメントのライゲーションしていない３’末端をＤＮＡポリメラーゼにより伸長させてｄｓＤＮＡフラグメントアダプター鋳型を作成し、シークエンシングライブラリを作製することと、を含む。いくつかの実施形態では、ｄｓＤＮＡフラグメントアダプター鋳型は、シークエンシングの前にさらに増幅される。他の実施形態では、本方法の１つまたは複数のステップは、単一の反応ステップにおいて実施してもよい。例えば、ステップ（ｂ）〜（ｃ）は、ｄｓＤＮＡアダプター、リガーゼ、ポリメラーゼ（任意で、鎖置換活性を有する）、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼの第１セット、及びｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはプライマー（例えば、シークエンシングアダプター及び／またはユニバーサルプライマーを含む）の第２セットを含む反応混合物を利用する単一の反応チューブで実施され得る。任意で、ライゲーションステップ（ｂ）の前に、ｄｓＤＮＡ分子を試験試料から精製し、任意で断片化することができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、二本鎖ＤＮＡシークエンシングライブラリを調製するための方法を含むことができ、該方法は以下のステップ：（ａ）フォワード鎖及びリバース鎖を含む、複数の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）フラグメントを含む試験試料を得ることと、（ｂ）二本鎖アダプターをｄｓＤＮＡフラグメントに付加し、二本鎖アダプターをｄｓＤＮＡフラグメントの両端にライゲートすることと、（ｃ）ｄｓフラグメントのライゲーションしていない３’末端をポリメラーゼにより伸長させてｄｓＤＮＡフラグメントアダプター鋳型を作製することであって、該ポリメラーゼが鎖置換活性をさらに含む、ことと、（ｄ）ｄｓＤＮＡフラグメントアダプター鋳型の３’末端にポリアデニンテールを付加することと、（ｅ）ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチド（またはプライマー）のセットを付加し、ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドをｄｓＤＮＡフラグメントアダプター鋳型にハイブリダイズすることと、（ｆ）ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドのセットを伸長させて、ｄｓＤＮＡシークエンシングライブラリを作製することと、を含む。いくつかの実施形態では、本方法の１つまたは複数のステップは、単一の反応ステップにおいて実施してもよい。例えば、ステップ（ｂ）〜（ｆ）は、ｄｓＤＮＡアダプター、リガーゼ、ポリメラーゼ（任意で、鎖置換活性を有する）、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼの第１セット、及びｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはプライマー（例えば、シークエンシングアダプター及び／またはユニバーサルプライマーを含む）の第２セットを含む反応混合物を利用する単一の反応チューブで実施され得る。任意で、ライゲーションステップ（ｂ）の前に、ｄｓＤＮＡ分子を試験試料から精製し、任意で断片化することができる。
【０３８７】
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＰ．Ｃ．Ｔ．公開番号ＷＯ２０１８／１１９４３８に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、シークエンシングデータを分析して核酸試料中のＣＮＶを検出する方法を含むことができる。ヒト対象から採取した核酸試料中のＣＮＶの検出は、対象におけるがんの存在を判定するために有益であり得る。一実施形態では、ヒト対象から採取した核酸試料中のＣＮＶの検出は、対象のがんの早期発見に使用することができる。様々な実施形態では、本方法は、標的シークエンシングリードから判定された個々のヌクレオチド塩基でのカバレッジを判定する。カバレッジの変動の原因は、塩基レベルで修正可能である。標的遺伝子パネルの各遺伝子について、各遺伝子のＣＮＶをより効果的に検出するために、遺伝子の塩基にわたって判定された塩基レベルのカバレッジを考慮することができる。一般的に、各塩基位置に存在するベースラインカバレッジバイアスは、健康な個体から収集したトレーニングデータを使用してモデル化することができる。したがって、対象から採取した試験試料を分析する場合、塩基レベルのカバレッジは、モデリングを通じて得られる予想カバレッジバイアスを考慮して、各塩基位置に対して判定することができる。具体的には、対象から採取した試験試料の塩基位置でのカバレッジバイアスが、モデリングを通じて得られる予想カバレッジバイアスと異なる場合、カバレッジバイアスは正規化して削除できる。標的遺伝子パネルの遺伝子の場合、遺伝子の塩基位置にわたる塩基レベルのカバレッジを分析し、健康な個体から収集したトレーニングデータを使用して、遺伝子のカバレッジが以前に判定された遺伝子のカバレッジの予想レベルと異なるかどうかを判定する。その場合、ＣＮＶをコールすることができる。ＣＮＶのコールは、対象にがんが存在すること、または対象ががんを発症する可能性が高くなりやすいことを示すことができる。
【０３８８】
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＰ．Ｃ．Ｔ．公開番号ＷＯ２０１８／１１１８７２に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、逆転写酵素、例えば、ＭＭＬＶ  ＲＴの末端トランスフェラーゼ活性によって導入されたポリＣテールにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドによって分子をタグ付けすることによりタグ付け及び増幅される複数のＲＮＡ分子に基づいてシークエンシングライブラリを調製することと、リガーゼ、例えばＴ４  ＲＮＡリガーゼを使用してオリゴヌクレオチドをＲＮＡ分子へライゲートすることと、ｍＲＮＡ及び鎖置換逆転写酵素、例えばＭＭＬＶ  ＲＴに基づいてｃＤＮＡ分子を生成することと、シークエンシングのためのｄｓＤＮＡライブラリを生成するために第２のｃＤＮＡ鎖を生成することと、を含むことができる。いくつかの実施形態では、本方法は、試験試料（例えば、対象の生体試料）のシークエンシングデータまたは配列リードを得るためにシークエンシングライブラリの少なくとも一部をシークエンシングすることを含む。一実施形態では、ＲＮＡを含む試験試料からシークエンシングライブラリを調製する方法は、以下のステップ：（ａ）ＲＮＡ配列を含む試験試料を得て、該試験試料からＲＮＡ配列を精製することと、（ｂ）ＲＮＡ配列及び相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）鎖のＣテーリング３’末端に基づいて、第１のｃＤＮＡ鎖を合成することと、（ｃ）相補的鋳型スイッチングオリゴヌクレオチドをｃＤＮＡのＣテールにアニーリングして、相補的鋳型スイッチングオリゴヌクレオチドをＲＮＡ配列の５’末端にライゲーションしてＲＮＡ鋳型を生成することと、（ｄ）鎖置換逆転写酵素を使用してＲＮＡ鋳型から複数のｃＤＮＡ鎖を合成することと、を含む。いくつかの実施形態では、本方法の１つまたは複数のステップは、単一の反応ステップにおいて実施してもよい。例えば、ステップ（ｂ）〜（ｄ）は、ＲＮＡプライマー（例えば、ランダムヘキサマーＲＮＡプライマー、ポリＴプライマー、またはこれらの組み合わせ）、鎖置換逆転写酵素（例えば、ＭＭＬＶ逆転写酵素）、ＲＮＡリガーゼ（例えば、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ）、及び任意で、ポリヌクレオチドキナーゼ（例えば、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ）を含む反応混合物を利用する単一の反応チューブで実施され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡを含む試験試料からシークエンシングライブラリを調製する方法は、以下のステップ：（ａ）１つまたは複数のＲＮＡ配列を含む試験試料を得て、該試験試料から１つまたは複数のＲＮＡ配列を精製することと、（ｂ）１つまたは複数のＲＮＡ配列に第１のＲＮＡプライマーをアニールすることと、（ｃ）逆転写及び末端トランスフェラーゼ活性を含む逆転写酵素を用いた第１の核酸伸長反応において第１のＲＮＡプライマーを伸長させて、１つまたは複数のＲＮＡ鋳型に相補的な複数のＤＮＡ配列を生成することであって、該相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列がさらにｃＤＮＡ配列の３’末端に複数の非鋳型塩基を含む、ことと、（ｄ）ｃＤＮＡ配列の３’末端の非鋳型塩基に対して相補���核酸配列をアニールすることであって、該相補的核酸配列がさらに、固有の分子識別子（ＵＭＩ）または固有の配列タグを含む、ことと、（ｅ）１つまたは複数のＲＮＡ配列の５’末端に対して相補的核酸配列をライゲーションして、１つまたは複数のＲＮＡ鋳型を生成することであって、該１つまたは複数のＲＮＡ鋳型が、ＵＭＩまたは固有の配列タグを含む相補的核酸配列に共有結合した元の１つまたは複数のＲＮＡ配列を含む、ことと、（ｆ）１つまたは複数の第２のＲＮＡプライマーを１つまたは複数のＲＮＡ鋳型にアニールすることと、（ｇ）鎖置換逆転写酵素を用いた第２の核酸伸長反応において１つまたは複数の第２のＲＮＡプライマーを伸長させて、１つまたは複数のＲＮＡ鋳型に相補的な複数のＤＮＡ配列を生成することであって、該複数の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列がそれぞれ、相補的ＤＮＡ配列及びＵＭＩまたは固有の配列タグを含む、ことと、を含む。いくつかの実施形態では、本方法の１つまたは複数のステップは、単一の反応ステップにおいて実施してもよい。例えば、いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）〜（ｇ）は、ＲＮＡプライマー（例えば、ランダムヘキサマーＲＮＡプライマー、ポリＴプライマー、またはこれらの組み合わせ）、鎖置換逆転写酵素（例えば、ＭＭＬＶ逆転写酵素）、ＲＮＡリガーゼ（例えば、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ）、及び任意で、ポリヌクレオチドキナーゼ（例えば、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ）を含む反応混合物を利用する単一の反応チューブで実施され得る。一実施形態では、本方法は、ＲＮＡ分子を含む試験試料からシークエンシングライブラリを調製することを含み、該方法は以下のステップ：（ａ）１つまたは複数のＲＮＡ配列を含む試験試料を得て該試験試料から１つまたは複数のＲＮＡ配列を精製することと、（ｂ）１つまたは複数のＲＮＡ配列に第１のＲＮＡプライマーをアニールすることと、（ｃ）逆転写及び末端トランスフェラーゼ活性を含む逆転写酵素を用いた第１の核酸伸長反応において第１のＲＮＡプライマーを伸長させて、１つまたは複数のＲＮＡ配列に相補的な複数のＤＮＡ配列を生成することであって、該末端トランスフェラーゼ活性が、該相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列の３’末端にシトシン（Ｃ）テールを付加する、ことと、（ｄ）鋳型スイッチングオリゴヌクレオチドをｃＤＮＡ配列の３’−シトシンテールにアニールすることであって、該鋳型スイッチングオリゴヌクレオチドが、固有の分子識別子（ＵＭＩ）または固有の配列タグを含む、ことと、（ｅ）鋳型スイッチングオリゴヌクレオチドをＴ４  ＲＮＡリガーゼにより１つまたは複数のＲＮＡ配列の５’末端にライゲーションして、１つまたは複数のＲＮＡ鋳型を生成することであって、該１つまたは複数のＲＮＡ鋳型が、鋳型スイッチングオリゴヌクレオチド及びＵＭＩまたは固有の配列タグに共有結合した元の１つまたは複数のＲＮＡ配列を含む、ことと、（ｆ）複数の第２のＲＮＡプライマーを１つまたは複数のＲＮＡ鋳型にアニールすることと、（ｇ）鎖置換逆転写酵素を用いた第２の核酸伸長反応において複数の第２のＲＮＡプライマーを伸長させて、１つまたは複数のＲＮＡ鋳型に相補的な複数のＤＮＡ配列を生成することであって、該複数の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）がそれぞれ、相補的ＤＮＡ配列及びＵＭＩまたは固有の配列タグを含む、ことと、を含む。いくつかの実施形態では、方法の１つまたは複数のステップを単一の反応ステップで実施することができる。例えば、ステップ（ｂ）〜（ｇ）は、ＲＮＡプライマー（例えば、ランダムヘキサマーＲＮＡプライマー、ポリＴプライマー、またはこれらの組み合わせ）、鎖置換逆転写酵素（例えば、ＭＭＬＶ逆転写酵素）、ＲＮＡリガーゼ（例えば、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ）、及び任意で、ポリヌクレオチドキナーゼ（例えば、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ）を含む反応混合物を利用する単一の反応チューブで実施され得る。
【０３８９】
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＰ．Ｃ．Ｔ．公開番号ＷＯ２０１８／０８５８６２に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、がんを有することが知られている、またはがんを有することが疑われる患者のがんを検出、診断、モニタリング、及び／または分類するための体細胞変異シグネチャーを同定するための方法及びシステムを含むことができる。様々な実施形態では、本方法は、がんの検出及び分類のために、非負値行列因子分解（ＮＭＦ）アプローチを使用して、患者試料の潜在的なシグネチャーを同定するために使用できるシグネチャー行列を構築することができる。他の実施形態では、方法は、主成分分析（ＰＣＡ）またはベクトル量子化（ＶＱ）アプローチを使用してシグネチャー行列を構築してもよい。一例において、患者試料は、無細胞核酸試料である（例えば、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）及び／または無細胞ＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ））。非負値行列因子分解を使用したシグネチャー行列の構築は、がんの検出及び／または分類に関連する複数の機能に一般化できる。いくつかの実施形態では、シグネチャー行列は、複数の特徴のそれぞれの発生確率を表す複数のシグネチャーを含む。関連する特徴の例としては、塩基置換変異の上流配列コンテキスト、塩基置換変異の下流配列コンテキスト、挿入、欠失、体細胞コピー数変化（ＳＣＮＡ）、転座、ゲノムメチル化状態、クロマチンステート、シークエンシングのカバレッジ深度、初期対後期複製領域、センス対アンチセンス鎖、変異間距離、変異型アレル頻度、フラグメント開始／停止、フラグメント長、及び遺伝子発現状態、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、上流及び／または下流配列コンテキストは、塩基置換変異の配列コンテキストの、約２〜約４０ｂｐ、例えば約３〜約３０ｂｐ、例えば約３〜約２０ｂｐ、または例えば約２〜約１０ｂｐの長さの範囲の核酸の領域を含むことができる。一実施形態では、上流及び／または下流の配列コンテキストは、塩基置換変異の、トリプレット配列コンテキスト、クアドラプレット配列コンテキスト、クインティプレット配列コンテキスト、セクスタプレット配列コンテキスト、またはセプタプレット配列コンテキストであってもよい。いくつかの実施形態では、上流及び／または下流の配列コンテキストは、塩基置換変異のトリプレット配列コンテキストであり得る。一実施形態では、本方法は、がんの早期発見のために、対象（例えば、無症候性対象）のｃｆＤＮＡ試料の潜在的な体細胞変異シグネチャーを同定するために使用される。別の実施形態では、本方法は、患者のｃｆＤＮＡ試料において同定された潜在的な変異シグネチャーに基づいて、患者のがんの起源の組織を推定するために使用される。さらに別の実施形態では、本方法は、異なるタイプの治療に患者を分類するために使用可能な患者のｃｆＤＮＡ試料内の潜在的な変異シグネチャーを同定するために使用される。さらに別の実施形態では、非負値行列因子分解は、体細胞変異型（変異）コールアッセイにおいてエラーモードを学習するために適用される。例えば、アッセイの根底にある系統的エラー（例えば、ライブラリ調製、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーションキャプチャ、及び／またはシークエンシング中に発生するエラー）を特定し、真の体細胞変異型と、アッセイの技術的プロセスから生じるアーティファクト変異型の寄与を区別するために使用可能な固有のシグネチャーを割り当てることができる。さらに別の実施形態では、非負値行列因子分解を使用して、健康な老化に関連する変異のシグネチャーを同定することができる。加齢に関連する変異プロセスには、患者の年齢に関連する健康な体細胞変異と、患者のがんプロセスが寄与し、それを示唆する体細胞変異とを区別するために使用可能な変異シグネチャーが割り当てられる。別の実施形態では、１つまたは複数の変異シグネチャーを経時的にモニタリングし、がんの診断、モニタリング、及び／または分類に使用することができる。例えば、２つまたはそれ以上の時点で患者試料由来のｃｆＤＮＡにおいて観察された変異プロファイルを評価することができる。いくつかの実施形態では、２つまたはそれ以上の変異シグネチャープロセスは、異なる変異シグネチャーの組み合わせとして評価することができる。さらに別の実施形態では、治療レジメンまたは他のがん治療の有効性をモニタリングするために、１つまたは複数の変異シグネチャーを経時的に（例えば複数の時点で）モニタリングすることができる。一実施形態では、同定された変異の配列コンテキストは、がんの検出及び／または分類における体細胞変異を分析するための機能として利用することができる。
【０３９０】
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１８／０１６３２０１号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、複数のＲＮＡ分子を含むシークエンシングライブラリを調製する方法を含むことができる。一実施形態では、ＲＮＡを含む試験試料からシークエンシングライブラリを調製する方法は、以下のステップ：（ａ）ＲＮＡ配列を含む試験試料を得て、該試験試料からＲＮＡ配列を精製することと、（ｂ）ＲＮＡ配列及び相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）鎖のＣテーリング３’末端に基づいて、第１のｃＤＮＡ鎖を合成することと、（ｃ）相補的鋳型スイッチングオリゴヌクレオチドをｃＤＮＡのＣテールにアニーリングして、相補的鋳型スイッチングオリゴヌクレオチドをＲＮＡ配列の５’末端にライゲーションしてＲＮＡ鋳型を生成することと、（ｄ）鎖置換逆転写酵素を使用してＲＮＡ鋳型から複数のｃＤＮＡ鎖を合成することと、を含む。いくつかの実施形態では、本方法の１つまたは複数のステップは、単一の反応ステップにおいて実施してもよい。例えば、ステップ（ｂ）〜（ｄ）は、ＲＮＡプライマー（例えば、ランダムヘキサマーＲＮＡプライマー、ポリＴプライマー、またはこれらの組み合わせ）、鎖置換逆転写酵素（例えば、ＭＭＬＶ逆転写酵素）、ＲＮＡリガーゼ（例えば、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ）、及び任意で、ポリヌクレオチドキナーゼ（例えば、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ）を含む反応混合物を利用する単一の反応チューブで実施され得る。一実施形態では、本方法は以下のステップ：（ａ）１つまたは複数のＲＮＡ配列を含む試験試料を得て、該試験試料から１つまたは複数のＲＮＡ配列を精製することと、（ｂ）１つまたは複数のＲＮＡ配列に第１のＲＮＡプライマーをアニールすることと、（ｃ）逆転写及び末端トランスフェラーゼ活性を含む逆転写酵素を用いた第１の核酸伸長反応において第１のＲＮＡプライマーを伸長させて、１つまたは複数のＲＮＡ鋳型に相補的な複数のＤＮＡ配列を生成することであって、該相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列がさらに、ｃＤＮＡ配列の３’末端に複数の非鋳型塩基を含む、ことと、（ｄ）ｃＤＮＡ配列の３’末端の非鋳型塩基に対して相補的核酸配列をアニールすることであって、該相補的核酸配列がさらに、固有の分子識別子（ＵＭＩ）または固有の配列タグを含む、ことと、（ｅ）１つまたは複数のＲＮＡ配列の５’末端に対して相補的核酸配列をライゲーションして、１つまたは複数のＲＮＡ鋳型を生成することであって、該１つまたは複数のＲＮＡ鋳型が、ＵＭＩまたは固有の配列タグを含む相補的核酸配列に共有結合した元の１つまたは複数のＲＮＡ配列を含む、ことと、（ｆ）１つまたは複数の第２のＲＮＡプライマーを１つまたは複数のＲＮＡ鋳型にアニールすることと、（ｇ）鎖置換逆転写酵素を用いた第２の核酸伸長反応において１つまたは複数の第２のＲＮＡプライマーを伸長させて、１つまたは複数のＲＮＡ鋳型に相補的な複数のＤＮＡ配列を生成することであって、該複数の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列がそれぞれ、相補的ＤＮＡ配列���びＵＭＩまたは固有の配列タグを含む、ことと、を含む。いくつかの実施形態では、本方法の１つまたは複数のステップは、単一の反応ステップにおいて実施してもよい。例えば、いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）〜（ｇ）は、ＲＮＡプライマー（例えば、ランダムヘキサマーＲＮＡプライマー、ポリＴプライマー、またはこれらの組み合わせ）、鎖置換逆転写酵素（例えば、ＭＭＬＶ逆転写酵素）、ＲＮＡリガーゼ（例えば、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ）、及び任意で、ポリヌクレオチドキナーゼ（例えば、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ）を含む反応混合物を利用する単一の反応チューブで実施され得る。一実施形態では、方法は、ＲＮＡ分子を含む試験試料からシークエンシングライブラリを調製することを含み、該方法は以下のステップ：（ａ）１つまたは複数のＲＮＡ配列を含む試験試料を得て、該試験試料から１つまたは複数のＲＮＡ配列を精製することと、（ｂ）１つまたは複数のＲＮＡ配列に第１のＲＮＡプライマーをアニールすることと、（ｃ）逆転写及び末端トランスフェラーゼ活性を含む逆転写酵素を用いた第１の核酸伸長反応において第１のＲＮＡプライマーを伸長させて、１つまたは複数のＲＮＡ配列に相補的な複数のＤＮＡ配列を生成することであって、該末端トランスフェラーゼ活性が、該相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列の３’末端にシトシン（Ｃ）テールを付加する、ことと、（ｄ）鋳型スイッチングオリゴヌクレオチドをｃＤＮＡ配列の３’−シトシンテールにアニールすることであって、該鋳型スイッチングオリゴヌクレオチドが、固有の分子識別子（ＵＭＩ）または固有の配列タグを含む、ことと、（ｅ）鋳型スイッチングオリゴヌクレオチドをＴ４  ＲＮＡリガーゼにより１つまたは複数のＲＮＡ配列の５’末端にライゲーションして、１つまたは複数のＲＮＡ鋳型を生成することであって、該１つまたは複数のＲＮＡ鋳型が、鋳型スイッチングオリゴヌクレオチド及びＵＭＩまたは固有の配列タグに共有結合した元の１つまたは複数のＲＮＡ配列を含む、ことと、（ｆ）複数の第２のＲＮＡプライマーを１つまたは複数のＲＮＡ鋳型にアニールすることと、（ｇ）鎖置換逆転写酵素を用いた第２の核酸伸長反応において複数の第２のＲＮＡプライマーを伸長させて、１つまたは複数のＲＮＡ鋳型に相補的な複数のＤＮＡ配列を生成することであって、該複数の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）がそれぞれ、相補的ＤＮＡ配列及びＵＭＩまたは固有の配列タグを含む、ことと、を含む。いくつかの実施形態では、方法の１つまたは複数のステップを単一の反応ステップで実施することができる。例えば、ステップ（ｂ）〜（ｇ）は、ＲＮＡプライマー（例えば、ランダムヘキサマーＲＮＡプライマー、ポリＴプライマー、またはこれらの組み合わせ）、鎖置換逆転写酵素（例えば、ＭＭＬＶ逆転写酵素）、ＲＮＡリガーゼ（例えば、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ）、及び任意で、ポリヌクレオチドキナーゼ（例えば、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ）を含む反応混合物を利用する単一の反応チューブで実施され得る。
【０３９１】
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＰ．Ｃ．Ｔ．公開番号ＷＯ２０１８／０８１１３０に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、対象から第１の生体試料を採取することを含む方法を含むことができ、該第１の生体試料は対象の無細胞核酸、潜在的に病原体由来の無細胞核酸を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、第１の生体試料中の病原体由来の無細胞核酸のコピー数を測定することを含む第１のアッセイを実施することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、対象から第２の生体試料を採取することを含み、該第２の生体試料は対象の無細胞核酸、潜在的に病原体由来の無細胞核酸を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、第２の生体試料中の無細胞核酸の超並列シークエンシングを含む第２のアッセイを実施して、配列リードを生成することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、病原体の参照ゲノムにアラインメントする配列リードの量を判定することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、所定の範囲内のサイズを有し、超並列シークエンシングに基づいて病原体の参照ゲノムにアラインメントする無細胞核酸分子の量を判定することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、配列リードを生成するために、第１の生体試料中の病原体由来の無細胞核酸のコピー数を測定することを含む第１のアッセイの実施、及び第２の生体試料の無細胞核酸の超並列シークエンシングを含む第２のアッセイの実施に基づく腫瘍のスクリーニングを含む。いくつかの実施形態では、第１の生体試料と第２の生体試料は同じである。いくつかの実施形態では、本方法は、病原体の参照ゲノムにアラインメントする配列リ−ドの割合を判定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、病原体の参照ゲノムにアラインメントする配列リ−ドの割合をカットオフ値と比較することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、所定の範囲内のサイズを有する病原体の参照ゲノムにアラインメントする第２の生体試料の無細胞核酸分子の第１の割合と、所定の範囲内のサイズを有する対象の参照ゲノムにアラインメントする第２の生体試料の無細胞核酸分子の第２の割合とのサイズ比を判定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、サイズ比の逆であるサイズインデックスを判定することと、該サイズインデックスを第２のカットオフ値と比較することとをさらに含む。いくつかの実施形態では、腫瘍は鼻咽頭癌である。いくつかの実施形態では、病原体はエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）である。いくつかの実施形態では、第１の生体試料中の病原体由来の無細胞核酸のコピー数の測定には、増幅を含む。いくつかの実施形態では、増幅にはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が含まれる。いくつかの実施形態では、ＰＣＲは、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を含む。いくつかの実施形態では、第１の生体試料及び第２の生体試料は血漿である。いくつかの実施形態では、本方法は、対象から第１の生体試料を採取することを含み、該第１の生体試料は対象の無細胞核酸、潜在的に病原体由来の無細胞核酸を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、第１の生体試料中の病原体由来の無細胞核酸のコピー数を測定することを含む第１のアッセイを実施することを含み、該第１のアッセイは、対象における腫瘍の存在に関する陽性反応適中率を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、対象の第２の生体試料に対して第２のアッセイを実施することを含み、該第２の生体試料は、対象の無細胞核酸、潜在的に病原体由来の無細胞核酸を含み、第１のアッセイ及び第２のアッセイの対象における腫瘍の存在に関する陽性反応適中率は、第１のアッセイの陽性反応適中率より少なくとも５倍大きい。いくつかの実施形態では、第１のアッセイ及び第２のアッセイの対象における腫瘍の存在に関する陽性反応適中率は、第１のアッセイの陽性反応適中率よりも少なくとも７．５倍大きい。いくつかの実施形態では、第１のアッセイ及び第２のアッセイの対象における腫瘍の存在に関する陽性的中率は、少なくとも１５％である。いくつかの実施形態では、第１のアッセイ及び第２のアッセイの対象における腫瘍の存在に関する陽性的中率は、少なくとも２５％である。いくつかの実施形態では、第１の生体試料と第２の生体試料は同じである。いくつかの実施形態では、第１の生体試料及び第２の生体試料は血漿である。いくつかの実施形態では、腫瘍は鼻咽頭癌である。いくつかの実施形態では、病原体はエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）である。いくつかの実施形態では、第１の生体試料中の病原体由来の無細胞核酸のコピー数の測定には、増幅を含む。いくつかの実施形態では、増幅にはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が含まれる。いくつかの実施形態では、ＰＣＲは、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を含む。いくつかの実施形態では、第２のアッセイは、配列リードを生成するための第２の生体試料中の無細胞核酸の超並列シークエンシングを含む。いくつかの実施形態では、第２のアッセイは、病原体の参照ゲノムにアラインメントする配列リードの量を判定することを含む。いくつかの実施形態では、第２のアッセイは、所定の範囲内のサイズを有し、病原体の参照ゲノムにアラインメントする第２の生体試料中の無細胞核酸分子の量を判定することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、対象から第１の生体試料を採取することを含み、該第１の生体試料は対象の無細胞核酸、潜在的に病原体由来の無細胞核酸を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、第１の生体試料中の病原体由来の無細胞核酸のコピー数を測定することを含む第１のアッセイを実施することを含み、該第１のアッセイは、対象における腫瘍の存在に関する偽陽性率を有する。いくつかの実施形態では、本方法は、対象の第２の生体試料に対して第２のアッセイを実施することを含み、該第２の生体試料は、対象の無細胞核酸、潜在的に病原体由来の無細胞核酸を含み、第１のアッセイ及び第２のアッセイの対象における腫瘍の存在に関する陽性反応適中率は、第１のアッセイの偽陽性率より少なくとも５倍低い。いくつかの実施形態では、第１のアッセイ及び第２のアッセイの対象における腫瘍の存在に関する偽陽性率は、第１のアッセイの偽陽性率よりも少なくとも１０倍低い。いくつかの実施形態では、第１のアッセイ及び第２のアッセイの対象における腫瘍の存在の偽陽性率は１％未満である。いくつかの実施形態では、第１の生体試料と第２の生体試料は同じである。いくつかの実施形態では、第１の生体試料及び第２の生体試料は血漿である。いくつかの実施形態では、腫瘍は鼻咽頭癌である。いくつかの実施形態では、病原体はエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）である。いくつかの実施形態では、第１の生体試料中の病原体由来の無細胞核酸のコピー数の測定には、増幅を含む。いくつかの実施形態では、増幅にはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が含まれる。いくつかの実施形態では、ＰＣＲは、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を含む。いくつかの実施形態では、第２のアッセイは、配列リードを生成するための第２の生体試料中の無細胞核酸の超並列シークエンシングを含む。いくつかの実施形態では、第２のアッセイは、病原体の参照ゲノムにアラインメントする配列リードの量を判定することを含む。いくつかの実施形態では、第２のアッセイは、所定の範囲内のサイズを有し、病原体の参照ゲノムにアラインメントする第２の生体試料中の無細胞核酸分子の量を判定することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、無細胞核酸分子の混合物を含む生体試料を分析して、生体試料が得られる対象の病変のレベルを判定することを含み、該混合物は対象の核酸分子、及び潜在的に病原体の核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、対象の生体試料の第１の複数の無細胞核酸分子を分析することを含み、該分析は、第１の複数の無細胞核酸の少なくとも一端に対応する参照ゲノム内のゲノム位置を判定することを含み、該参照ゲノムは病原体に対応する。いくつかの実施形態では、本方法は、第１のウィンドウの１つ内で終わる第１の複数の無細胞核酸分子の第１の量を判定することを含み、各第１のウィンドウは、病原体に関連する病変を有する対象において、無細胞核酸分子の末端が第１の閾値を超える割合で存在する第１のゲノム位置のセットの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、生体試料の第２の量の第１の複数の無細胞核酸分子を使用して第１の量を正規化することにより、第１のウィンドウの１つ内で終わる第１の複数の無細胞核酸分子の相対存在量を計算することを含み、該第２の量の第１の複数の無細胞核酸分子は、第１のゲノム位置のセットを含む第１のウィンドウの外側の第２のゲノム位置のセットで終わる無細胞核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、１つまたは複数のカットオフ値に対して相対存在量を処理することにより、対象の病変のレベルを判定することを含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のカットオフ値に対する相対存在量は、相対存在量が１つまたは複数のカットオフ値より大きいかどうかを判定することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、第２のウィンドウの１つ内で終わる第１の複数の無細胞核酸分子の第２の量を判定することをさらに含み、各第２のウィンドウは、病原体に関連する病変を持たない対象において、無細胞核酸分子の末端が第２の閾値を超える割合で存在する第２のゲノム位置のセットの少なくとも１つを含み、第１の量を正規化することは、第１の量及び第２の量を使用して相対存在量を計算することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、第２のゲノム位置のセットを同定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、同定は、コンピュータシステムによって、病変を持たない参照対象由来の参照試料の無細胞核酸分子を分析することを含む。いくつかの実施形態では、複数の無細胞核酸分子のそれぞれを分析することは、無細胞核酸分子の少なくとも一端に対応する参照ゲノム中のゲノム位置を判定することを含む。いくつかの実施形態では、参照対象は健康である。いくつかの実施形態では、相対存在量は、第１の量と第２の量の比率を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、無細胞核酸分子の末端が第１の閾値を超える割合で生じる第１のゲノム位置のセットを同定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、第１のゲノム位置のセットを識別することは、コンピュータシステムによって、少なくとも１つの第１の追加試料の第２の複数の無細胞核酸分子を分析して、第２の複数の無細胞核酸分子の終了位置を同定することを含み、該少なくとも１つの第１の追加試料は、病原体に関連する病変を持つことが知られており、生体試料と同じ試料タイプである。いくつかの実施形態では、本方法は、複数のゲノムウィンドウの各ゲノムウィンドウについて、ゲノムウィンドウで終結する第２の複数の無細胞核酸分子の対応する数を計算することと、対応する数を参照値と比較してゲノムウィンドウ内の１つまたは複数のゲノム位置で終結する無細胞核酸分子の割合が第１の閾値を超えているかどうかを判定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、複数のゲノムウィンドウの第１のゲノムウィンドウは、少なくとも１つのゲノム位置の幅を有し、第１のゲノムウィンドウ内の各ゲノム位置は、対応する数が基準値を超える場合に第１の閾値を超えたゲノム位置で終結する無細胞核酸分子の割合を有するものとして同定される。いくつかの実施形態では、第１のゲノム位置のセットは、対応する番号に対して最高のＮ値を持ち、Ｎは少なくとも１００である。
【０３９２】
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１８０１１９２１６号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、二本鎖ＤＮＡ（例えば、二本鎖ｃｆＤＮＡ）試料から一本鎖シークエンシングライブラリを調製及び分析する方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、試料には、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）分子、及び損傷したｄｓＤＮＡ（例えば、ニックの入ったｄｓＤＮＡ）分子が含まれる。いくつかの実施形態では、試料には一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）分子が含まれる。本方法は、試料内のｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、及び損傷したＤＮＡ（例えば、ニックの入ったＤＮＡ）分子からの、鎖対形成及び連結性情報を含む情報の収集を容易にし、これにより、従来の方法を使用して準備したシークエンシングライブラリと比較して、向上した診断情報を提供する。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、シークエンシングのための一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ライブラリの調製を含むことができる。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、二本鎖ＤＮＡフラグメントのフォワード（センス）及びリバース（アンチセンス）鎖の両方が、ｄｓＤＮＡ分子の相補鎖の同定及び分析を可能にする、同一または実質的に同一な固有の配列タグ（例えば、パーティション特異的なバーコードまたはＵＭＩ）によってタグ付けされる、ｓｓＤＮＡライブラリの調製を使用することを含むことができる。一実施形態では、本方法は、シークエンシングのために一本鎖ＤＮＡライブラリを調製することを含み、該方法は以下のステップ：（ａ）二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を含む試験試料を得て、該試験試料からｄｓＤＮＡを単離することと、（ｂ）ｄｓＤＮＡ試料を複数の個別の反応区画に分割することと、（ｃ）個々の反応区画のそれぞれに、固有の配列タグを含む複数のオリゴヌクレオチドを含む反応混合物を付加することと、（ｄ）ｄｓＤＮＡを変性して一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）フラグメントを生成することと、（ｅ）固有の配列タグをｓｓＤＮＡフラグメントにライゲートすることと、を含む。別の実施形態では、シークエンシングのための無細胞ＤＮＡライブラリの調製方法が提供され、該方法は以下のステップ：（ａ）無細胞二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を含む試験試料を得て、該試験試料からｄｓＤＮＡを単離することと、（ｂ）ｄｓＤＮＡ試料を複数の個々の反応液滴に分割することと、（ｃ）複数のＤＮＡ捕捉ビーズを含む反応混合物を個々の液滴のそれぞれに付加することであって、各ＤＮＡ捕捉ビーズが固有の配列タグを含む複数の結合オリゴヌクレオチドを含む、ことと、（ｄ）液滴を加熱してｄｓＤＮＡを変性するか、またはｄｓＤＮＡを化学的に変性して一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）フラグメントを生成し、ビーズから固有の配列タグを放出することと、（ｅ）ｓｓＤＮＡフラグメントの３’末端に固有の配列タグをライゲートすることと、を含む。いくつかの実施形態では、ビーズは、ストレプトアビジン被覆ビーズ、固相可逆固定（ＳＰＲＩ）ビーズ、及び磁気ビーズを含む群から選択される。別の実施形態では、シークエンシングのための一本鎖ＤＮＡライブラリの調製方法が提供され、該方法は以下のステップ：（ａ）複数のパーティションを提供することであって、複数のパーティションの個々のパーティションが、（ｉ）１つまたは複数の個体から単離された、例えば損傷した及び／または損傷のない二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を含む試験試料の一部、（ｉｉ）パーティション特異的なバーコードを含む複数のオリゴヌクレオチド、を含む、ことと、（ｂ）二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに変性するのに適した条件下でパーティションをインキュベートすることと、（ｃ）一本鎖ＤＮＡをオリゴヌクレオチドにライゲートすることであって、該ライゲーションが、パーティション特異的なバーコードを一本鎖ＤＮＡに共有結合し、パーティション特異的なバーコード付加一本鎖ＤＮＡを生成する、ことと、を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、複数のパーティションを結合することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、オリゴヌクレオチドプライマーをパーティション特異的なバーコード付加一本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせ、プライマーを伸長させることをさらに含み、これにより、パーティション特異的なバーコード付加二本鎖ＤＮＡを生成する。いくつかの実施形態では、本方法は、パーティション特異的なバーコード付加一本鎖ＤＮＡ及び／またはパーティション特異的なバーコード付加二本鎖ＤＮＡを増幅することを含む。いくつかの実施形態では、本方法はさらに、１つまたは複数の個体から単離された二本鎖ＤＮＡを脱リン酸化することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、１つまたは複数の個体から単離された二本鎖ＤＮＡを脱リン酸化し、次いで１つまたは複数の個体から単離された二本鎖ＤＮＡを分割することを含み、これにより、複数のパーティションが提供される。
【０３９３】
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１８／００８７１０５号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、混合無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）試料からシークエンシングライブラリを調製及び分析する方法を含むことができ、該混合試料には、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、損傷したｄｓＤＮＡ（例えば、ニックの入ったｄｓＤＮＡ）、及び一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）分子が含まれる。主題の方法は、試料中のｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、及び損傷したＤＮＡ（例えば、ニックの入ったＤＮＡ）分子からの情報の収集を容易にし、これにより、ｄｓＤＮＡのみから調製したライブラリのシークエンシングと比較して、向上した診断情報が提供される。いくつかの実施形態では、本方法は、混合無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）試料から、混合ｃｆＤＮＡ試料内の少なくとも１つの一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）分子に固有の配列タグを含むユニバーサルアダプターをライゲートすることと、ユニバーサルアダプターを伸長させて、ｓｓＤＮＡ由来の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）分子を生成することと、ｓｓＤＮＡ由来のｄｓＤＮＡ分子から結合したｃｆＤＮＡシークエンシングライブラリを生成することによって、結合したｃｆＤＮＡシークエンシングライブラリを調製することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、結合したｃｆＤＮＡシークエンシングライブラリを生成する前に、シークエンシングＹアダプターをｓｓＤＮＡ由来のｄｓＤＮＡ分子にライゲートすることをさらに含む。いくつかの実施形態では、シークエンシングＹアダプターは、固有の配列タグを含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２の固有の配列タグは異なる。いくつかの実施形態では、本方法は、第２のシークエンシングＹアダプターを伸長させて、第２のニック由来ｄｓＤＮＡ分子を生成することと、第３のシークエンシングＹアダプターを第２のニック由来ｄｓＤＮＡ分子にライゲートすることと、第１及び第２のニック由来ｄｓＤＮＡ分子から、結合したｃｆＤＮＡシークエンシングライブラリを生成することと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、混合ｃｆＤＮＡ試料から結合ｃｆＤＮＡシークエンシングライブラリを調製する方法は、混合ｃｆＤＮＡ試料中の、ニックの入った鎖及びニックのない鎖を含むニックの入ったｄｓＤＮＡ分子の第１の末端に、第１のシークエンシングＹアダプターをライゲートすることと、混合ｃｆＤＮＡ試料中のニックの入ったｄｓＤＮＡ分子の第２の末端に第２のシークエンシングＹアダプターをライゲートすることと、シークエンシングＹアダプターライゲーションしたニックの入ったｄｓＤＮＡ分子を変性して、ニックのない鎖に由来する第１のｓｓＤＮＡ分子、ニックの入った鎖に由来する第２のｓｓＤＮＡ分子、及びニックの入った鎖に由来する第３のｓｓＤＮＡ分子を生成することと、第２のシークエンシングＹアダプターを伸長させて、第１のニック由来ｄｓＤＮＡ分子を生成することと、第３のシークエンシングＹアダプターを第１のニック由来ｄｓＤＮＡ分子にライゲートすることと、第１のニック由来ｄｓＤＮＡ分子から結合したｃｆＤＮＡシークエンシングライブラリを生成すること、を含む。いくつかの実施形態では、第１のシークエンシングＹアダプターは第１の固有の配列タグを含み、第２のシークエンシングＹアダプターは第２の固有の配列タグを含み、第３のシークエンシングＹアダプターは第３の固有の配列タグを含む。いくつかの実施形態では、第１、第２、及び第３の固有の配列タグは同じである。いくつかの実施形態では、第１、第２、及び第３の固有の配列タグは異なる。いくつかの実施形態では、第１及び第２の固有の配列タグは同じであり、第３の固有の配列タグは異なる。いくつかの実施形態では、第１及び第３の固有の配列タグは同じであり、第２の固有の配列タグは異なる。いくつかの実施形態では、第２及び第３の固有の配列タグは同じであり、第１の固有の配列タグは異なる。
【０３９４】
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１８／０００２７４９号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、単一供給源の試料のＲＮＡ及びＤＮＡの両方をシークエンシングするための方法、組成物、反応混合物、キット、及びシステムを含むことができる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、同じ試料に由来するＤＮＡ配列からＲＮＡ配列を識別するように処理される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及びＤＮＡは無細胞ポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、本方法は、変異（例えば、まれな配列変異型）の同定におけるシークエンシング手法の感度及び／または塩基コーリング精度を向上させる。いくつかの実施形態では、本方法は、（ａ）ＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含む試料を得ることと、（ｂ）ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド分子を生成することと、（ｃ）ハイブリッド分子のＲＮＡを分解して、一本鎖ｃＤＮＡを生成することと、（ｄ）一本鎖ＤＮＡリガーゼを含む反応において、タグ配列を含むタグオリゴヌクレオチドを一本鎖ｃＤＮＡに優先的に結合して、タグ付けしたｃＤＮＡを生成することと、（ｅ）ＤＮＡ及びタグ付けしたｃＤＮＡをシークエンシングすることであって、該逆転写、優先的な結合、及びシークエンシングが、ＤＮＡの存在下で実施される、ことを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及びＤＮＡは無細胞核酸である。核酸（無細胞核酸を含む）は、血液、血液分画（例えば、血清または血漿など）、尿、及び他の体液などの様々な供給源のいずれかから単離することができる。いくつかの実施形態では、逆転写は、ランダム配列（例えば、１つまたは複数の位置で２つ以上の異なるヌクレオチドのセットからランダムに選択された１つまたは複数のヌクレオチドであって、１つまたは複数の位置で選択された異なるヌクレオチドのそれぞれは、ランダム配列を含むオリゴヌクレオチドのプールで表される）を含むプライマーの伸長を含む。いくつかの実施形態では、逆転写は、ユニバーサルスイッチプライマー配列を含み得る、鋳型スイッチオリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）に沿ったハイブリッドのｃＤＮＡの伸長を含む。いくつかの実施形態では、タグオリゴヌクレオチドは、一本鎖ｃＤＮＡの３’末端に結合する。いくつかの実施形態では、タグオリゴヌクレオチドは、プライマー結合配列を含む。いくつかの実施形態では、シークエンシングは、タグ付けしたｃＤＮＡを増幅して、二本鎖のタグ付けしたｃＤＮＡを生成することを含む。いくつかの実施形態では、タグ付けしたｃＤＮＡを増幅することは、プライマー結合配列にハイブリダイズしたプライマーを伸長させることを含む。いくつかの実施形態では、シークエンシングは、タグ付けしたｃＤＮＡ及びＤＮＡにシークエンシングアダプターを結合することを含む。いくつかの実施形態では、タグオリゴヌクレオチドは、固有の分子識別子（ＵＭＩ）を含み、複数のタグ付けしたｃＤＮＡ分子のそれぞれは、ＵＭＩに基づいて（例えば、ＵＭＩの配列によって判定される（任意にはｃＤＮＡの配列と組み合わせて））複数のタグ付けしたｃＤＮＡ分子中の他のものと区別可能である。いくつかの実施形態では、試料は、血液、血液画分、血漿、血清、唾液、喀痰、尿、精液、経膣液、脳脊髄液、または便である。いくつかの実施形態では、試料は、血液または血液分画（例えば、血清または血漿）である。いくつかの実施形態では、本方法は、タグ配列、またはタグ配列の相補体の有無に基づいて、プロセッサを使用してＲＮＡ由来配列をＤＮＡ由来配列とは別にグループ分けすることをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ＲＮＡ由来の配列及びＤＮＡ由来の配列に基づいて対象の状態（例えば、がん）の有無を同定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ＲＮＡ由来の配列及びＤＮＡ由来の配列に基づいて対象を治療することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、（ａ）ＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含む試料を得ることと、（ｂ）ＲＮＡリガーゼを含む反応において、タグ配列を含むタグオリゴヌクレオチドをＲＮＡに結合して、タグ付けしたＲＮＡを生成することと、（ｃ）タグ付けしたＲＮＡを逆転写してタグ付けしたｃＤＮＡを生成することと、（ｄ）ＤＮＡ及びタグ付けしたｃＤＮＡをシークエンシングすることであって、該結合、逆転写、及びシークエンシングが、ＤＮＡの存在下で実施される、ことを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及びＤＮＡは無細胞核酸である。いくつかの実施形態では、本方法は、タグ配列を結合する前に、ＲＮＡを断片化して断片化ＲＮＡを生成することをさらに含む。いくつかの実施形態では、断片化されたＲＮＡは、所定の範囲内の平均サイズを有する（例えば、平均長もしくは中央値の長さが約１０〜約１，０００ヌクレオチド長、例えば、１０〜８００、１０〜５００、５０〜５００、９０〜２００、もしくは５０〜１５０ヌクレオチドなど、または平均長もしくは中央値の長さが１５００、１０００、７５０、５００、４００、３００、２５０、またはそれ以下のヌクレオチド長）。いくつかの実施形態では、ＲＮＡの断片化は、ＲＮＡ及びＤＮＡを優先的にＲＮＡを断片化する条件にさせることを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡの断片化には、超音波処理、化学的断片化、または加熱が含まれる。いくつかの実施形態では、本方法は、断片化されたＲＮＡの３’末端を脱リン酸化することをさらに含む。いくつかの実施形態では、タグオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡの３’末端に結合する。いくつかの実施形態では、タグオリゴヌクレオチドは、プライマー結合配列を含む。いくつかの実施形態では、逆転写は、プライマー結合配列にハイブリダイズしたプライマーを伸長させることを含む。いくつかの実施形態では、逆転写は、鋳型スイッチオリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）に沿ったタグ付けしたｃＤＮＡの伸長を含み、これはユニバーサルスイッチプライマー配列を含み得る。いくつかの実施形態では、シークエンシングは、タグ付けしたｃＤＮＡを増幅して、二本鎖のタグ付けしたｃＤＮＡを生成することを含む。いくつかの実施形態では、シークエンシングは、タグ付けしたｃＤＮＡ及びＤＮＡにシークエンシングアダプターを結合することを含む。いくつかの実施形態では、タグオリゴヌクレオチドは、固有の分子識別子（ＵＭＩ）を含み、複数のタグ付けしたｃＤＮＡ分子のそれぞれは、ＵＭＩに基づいて（例えば、ＵＭＩの配列によって判定される（任意にはｃＤＮＡの配列と組み合わせて））複数のタグ付けしたｃＤＮＡ分子中の他のものと区別可能である。いくつかの実施形態では、試料は、血液、血液画分、血漿、血清、唾液、喀痰、尿、精液、経膣液、脳脊髄液、または便である。いくつかの実施形態では、試料は、血液または血液分画（例えば、血清または血漿）である。いくつかの実施形態では、逆転写は、ランダム配列を含むプライマーの伸長を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、タグ配列、またはタグ配列の相補体の有無に基づいて、プロセッサを使用してＲＮＡ由来配列をＤＮＡ由来配列とは別にグループ分けすることをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ＲＮＡ由来の配列及びＤＮＡ由来の配列に基づいて対象の状態（例えば、がん）の有無を同定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ＲＮＡ由来の配列及びＤＮＡ由来の配列に基づいて対象を治療することをさらに含む。
【０３９５】
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＰ．Ｃ．Ｔ．公開番号ＷＯ２０１７／２１８５１２に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、試料中の複数の標的核酸を濃縮する方法を含むことができ、該方法は、エンドヌクレアーゼシステムを提供することであって、該複数の標的核酸のそれぞれが、第１の変異型及び第２の変異型を含み、該エンドヌクレアーゼシステムが、複数のクラスター化され、規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）またはその誘導体を含み、各ｃｒＲＮＡが、標的配列、及び複数のＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質、またはその変異型を含み、各Ｃａｓタンパク質が、標的核酸上のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）部位に結合することができ、各標的核酸の第１の変異型が、ｃｒＲＮＡ標的配列に相補的な領域に隣接するＰＡＭ部位を含み、そして第２の変異型が、ＰＡＭ部位を含まない、またはＰＡＭ部位に隣接するｃｒＲＮＡ標的配列に相補的な領域を含まない、ことと、該試料を該エンドヌクレアーゼシステムと接触させ、それにより、試料中の複数の標的核酸のそれぞれの第１の変異型を枯渇させ、第２の変異型を濃縮することを含む。いくつかの実施形態では、各標的核酸の第１の変異型は、ｃｒＲＮＡ標的配列に相補的な領域に隣接するＰＡＭ部位を含み、第２の変異型はＰＡＭ部位を含まない。いくつかの実施形態では、各標的核酸の第１の変異型は、ｃｒＲＮＡ標的配列に相補的な領域に隣接するＰＡＭ部位を含み、第２の変異型は、ＰＡＭ部位に隣接するｃｒＲＮＡ標的配列に相補的な領域を含まない。いくつかの実施形態では、各標的核酸の第１の変異型は、ｃｒＲＮＡ標的配列に相補的な領域に隣接するＰＡＭ部位を含み、第２の変異型は、ｃｒＲＮＡ標的配列に相補的な領域を含まない。いくつかの実施形態では、本方法は、複数の標的核酸の濃縮された第２の変異型を増幅して、濃縮されたシークエンシングライブラリを生成することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、濃縮シークエンシングライブラリをシークエンシングして、試料中の標的核酸の構造的再編成または変異を検出することを含む。
【０３９６】
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＰ．Ｃ．Ｔ．公開番号ＷＯ２０１７／１２７７４１に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、まれな核酸変異型の高忠実度シークエンシング及び同定のための方法及びシステムを含むことができる。該システム及び方法を使用して、正常なゲノム核酸の大部分を含む試料の中で腫瘍特異的変異などの、無細胞核酸試料中のまれな変異型を同定することができる。該システム及び方法により、試料内で１：１０，０００未満の頻度で発生する変異を確実に同定することができる。このようなまれな変異型の同定は、シークエンシングプロセスのいくつかのステップの最適化と、それに続くアンサンブルと呼ばれるアラインされたリードペアに基づいたシークエンシングリードの分析からもたらされる。該システム及び方法は、望ましいレベルのパフォーマンスまたは感度のためのシークエンシング最適化など、まれな変異型の同定以外の応用を見出す場合がある。本方法には、核酸のシークエンシングが含まれる。本方法のステップには、核酸のシークエンシングリードの取得、共有開始座標及びリード長を持つ２つ以上のシークエンシングリードを含むアンサンブルの同定、アンサンブルに含まれるシークエンシング分子の数の判定、アンサンブルの候補変異型の同定、ならびに尤度推定モデル及び測定された配列された分子の数を使用して、候補変異型が真の変異型である尤度を判定することを含み得る。ある特定の実施形態では、シークエンシングリードを得るステップは、核酸からシークエンシングライブラリを調製し、シークエンシングライブラリを増幅し、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）を使用してシークエンシングライブラリをシークエンシングすることをさらに含み得る。ある特定の実施形態では、アダプターは、アダプターがスタッキングできるように構成された条件下で核酸にライゲートされ得る。シークエンシングライブラリの調製は、約１６時間の反応時間を使用して、約１６℃の温度で核酸にアダプターをライゲートすることを含み得る。増幅ステップはＰＣＲ増幅を含み得、該方法は、インシリコモデルを使用して試料中の特定の濃度で変異型を検出するために必要な過剰増幅因子及びＰＣＲサイクル数を選択することをさらに含み得る。様々な実施形態では、本方法には、グアニン−シトシン（ＧＣ）含量、標的集団の変異頻度、及び配列の固有性を含む因子に基づいてゲノム領域を標的とするハイブリッド捕捉パネルを設計し、シークエンシングステップ前にハイブリッド捕捉パネルを使用して増幅された核酸を捕捉することを含む。捕捉ステップは、標的遺伝子座のセンス鎖を標的とする第１のハイブリッド捕捉パネル、及び標的遺伝子座のアンチセンス鎖を標的とする第２のハイブリッド捕捉パネルを使用することを含み得る。ある特定の実施形態では、対照配列、対照スパイク・イン、または陽性対照とも呼ばれる合成核酸対照は、シークエンシングライブラリの増幅前に核酸に追加され、合成核酸対照のシークエンシングリードを使用してエラー率が判定され得る。合成核酸対照は、該核酸が由来する種にわたって多様性が低い既知の配列を含み得、該既知の配列に対して複数の自然に発生しないミスマッチを有し、ある特定の実施形態では、複数の自然に発生しないミスマッチは４であり得る。合成核酸対照は、ハイブリッド捕捉パネルの標的遺伝子座を表すグアニン−シトシン（ＧＣ）含量分布を含み得る、またはハイブリッド捕捉パネルのプルダウンプローブとの様々なオーバーラップを含む複数の核酸を含み得る。エラー率または候補変異型頻度は、合成核酸対照のシークエンシングリードを使用して判定され得る。
【０３９７】
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，９０２，９９２号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、ａ）対象の身体試料から細胞外ポリヌクレオチドをシークエンシングすることであって、該細胞外ポリヌクレオチドのそれぞれが、固有のバーコードに任意で結合している、ことと、ｂ）設定閾値を満たさないリードを除外することと、ｃ）ステップ（ａ）から取得した配列リードを参照配列にマッピングすることと、ｄ）参照配列の２つ以上の所定の領域でマッピングされたリードを定量化／カウントすることと、ｅ）（ｉ）所定の領域でのリード数を相互に正規化する、及び／または所定の領域での固有のバーコード数を相互に正規化すること、ならびに（ｉｉ）ステップ（ｉ）で得られた正規化数を、対照試料から得られた正規化数と比較することにより、１つまたは複数の所定の領域でのコピー数多型を判定すること、を含むコピー数多型を検出する方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、対象から採取した無細胞または実質的に無細胞の試料中のまれな変異を検出する方法を含むことができ、該方法は、ａ）対象の身体試料から細胞外ポリヌクレオチドをシークエンシングすることであって、該細胞外ポリヌクレオチドのそれぞれが、複数のシークエンシングリードを生成することと、ｂ）対象の身体試料から細胞外ポリヌクレオチドをシークエンシングすることであって、該細胞外ポリヌクレオチドのそれぞれが、複数のシークエンシングリードを生成する、こと、対象の身体試料から細胞外ポリヌクレオチドをシークエンシングすることであって、該細胞外ポリヌクレオチドのそれぞれが、複数のシークエンシングリードを生成することと、ｃ）設定閾値を満たさないリードを除外することと、ｄ）シークエンシングからのシークエンシングリードを参照配列にマッピングすることと、ｅ）マッピング可能な各塩基位置で参照配列の変異型とアラインメントするマッピングされた配列リードのサブセットを同定することと、ｆ）マッピング可能な各塩基位置について、（ａ）参照配列と比較した変異型を含むマッピングされた配列リード数と、（ｂ）マッピング可能な各塩基位置の合計配列リード数との比率を計算することと、ｇ）マッピング可能な各塩基位置の分散の比率または頻度を正規化し、潜在的でまれな変異型（複数可）または変異（複数可）を判定することと、ｈ）潜在的でまれな変異型（複数可）または変異（複数可）を有する各領域の得られた数を、参照試料から同様に導出された数と比較することと、を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、対象における異常状態の不均一性を特徴付ける方法を含むことができ、該方法は、対象における細胞外ポリヌクレオチドの遺伝的プロファイルを生成することを含み、該遺伝的プロファイルは、コピー数多型及び／または他のまれな変異（例えば、遺伝子改変）分析から生じる複数のデータを含む。いくつかの実施形態では、対象において同定された各まれな変異型の有病率／濃度が同時に報告及び定量化される。他の実施形態では、対象のまれな変異型の有病率／濃度に関する信頼性スコアが報告される。いくつかの実施形態では、細胞外ポリヌクレオチドはＤＮＡを含む。他の実施形態では、細胞外ポリヌクレオチドはＲＮＡを含む。ポリヌクレオチドは、フラグメントであるか、または単離後に断片化されている場合がある。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、循環核酸の単離及び抽出のための方法が含まれる場合がある。いくつかの実施形態では、細胞外ポリヌクレオチドは、血液、血漿、血清、尿、唾液、粘膜排出物、喀痰、便、及び涙からなる群から選択され得る身体試料から単離される。いくつかの実施形態では、本方法はまた、身体試料中のコピー数多型または他のまれな遺伝子改変（例えば、配列変異型）を有する配列の割合を判定するステップを含む。いくつかの実施形態では、該身体試料中のコピー数多型を有する配列の割合は、所定の閾値を上回るまたは下回るポリヌクレオチドの量を有する所定の領域の割合を計算することにより判定される。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、対象から採取した無細胞または実質的に無細胞の試料中のまれな変異を検出する方法を含むことができ、該方法は、ａ）対象の身体試料から細胞外ポリヌクレオチドをシークエンシングすることであって、該細胞外ポリヌクレオチドのそれぞれが、複数のシークエンシングリードを生成することと、ｂ）設定閾値を満たさないリードを除外することと、ｃ）シークエンシングに由来する配列リードを参照配列にマッピングすることと、ｄ）マッピング可能な各塩基位置で参照配列の変異型とアラインメントするマッピングされた配列リードのサブセットを同定することと、ｅ）マッピング可能な各塩基位置について、（ａ）参照配列と比較した変異型を含むマッピングされた配列リード数と、（ｂ）マッピング可能な各塩基位置の合計配列リード数との比率を計算することと、ｆ）マッピング可能な各塩基位置の分散の比率または頻度を正規化し、潜在的でまれな変異型（複数可）または他の遺伝子改変（複数可）を判定することと、ｇ）各領域の得られた数を比較することと、を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、ａ．タグ付けした親ポリヌクレオチドの少なくとも１つのセットを提供することと、タグ付けした親ポリヌクレオチドの各セットに対して、ｂ．そのセット内のタグ付けした親ポリヌクレオチドを増幅して、増幅された子孫ポリヌクレオチドの対応するセットを生成することと、ｃ．増幅された子孫ポリヌクレオチドのセットのサブセット（適切なサブセットを含む）をシークエンシングし、シークエンシングリードのセットを生成することと、ｄ．シークエンシングリードのセットを折りたたみ、コンセンサス配列のセットを生成することであって、各コンセンサス配列は、タグ付けした親ポリヌクレオチドのセットの中で固有のポリヌクレオチドに対応する、ことと、を含む方法を含むことができる。ある特定の実施形態では、本方法は、さらに、ｅ．タグ付けした親分子の各セットのコンセンサス配列のセットの分析を含む。
【０３９８】
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＰ．Ｃ．Ｔ．公開番号ＷＯ２０１８／０６４６２９に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、ゲノムの１つまたは複数のヌクレオソーム関連領域を選択的に濃縮する１つまたは複数のベイトセットを含むベイトセットパネルを含むことができ、該ヌクレオソーム関連領域は、異なるヌクレオソーム占有率で１つまたは複数のゲノム塩基位置を有するゲノム領域を含み、該異なるヌクレオソーム占有率は、細胞または組織タイプの起源または疾患状態の特徴を示す。いくつかの実施形態では、ベイトセットパネルの１つまたは複数のヌクレオソーム関連領域のそれぞれは、以下：（ｉ）ヌクレオソーム位置のばらつきを含む著しい構造変化であって、該構造変化が、挿入、欠失、転座、遺伝子再編成、メチル化状態、マイクロサテライト、コピー数多型、コピー数関連構造変化、または分化を示す他の変化からなる群から選択される、構造変化と、（ｉｉ）ゲノムのヌクレオソームマップ破壊の１つまたは複数の位置を示すゲノム分割マップの１つまたは複数の著しい変動またはピークを含む不安定性、のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、ベイトセットパネルの１つまたは複数のベイトセットは、（ｉ）１つまたは複数の疾患状態及び１つまたは複数の非疾患状態と関連する、（ｉｉ）ＳＮＶ、ＣＮＶ、インデル、または再編成などの既知の体細胞変異に関連する、及び／または（ｉｉｉ）差次的発現パターンに関連する、複数の参照ヌクレオソーム占有率プロファイルの機能に基づいて、ゲノムのヌクレオソーム関連領域を捕捉するように構成されている。一実施形態では、ベイトセットパネルの１つまたは複数のベイトセットは、無細胞デオキシリボ核酸（ｃｆＤＮＡ）試料の１つまたは複数のヌクレオソーム関連領域を選択的に濃縮する。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、（ａ）核酸試料をベイトセットパネルと接触させることであって、該ベイトセットパネルが、ゲノムの１つまたは複数のヌクレオソーム関連領域を選択的に濃縮する１つまたは複数のベイトセットを含む、ことと、（ｂ）ゲノムの１つまたは複数のヌクレオソーム関連領域の核酸試料を濃縮することと、を含む、ゲノムのヌクレオソーム関連領域の核酸試料を濃縮する方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、ベイトセットを生成する方法を含むことができ、該方法は、（ａ）ヌクレオソームプロファイルに関連するゲノムの１つまたは複数の領域を同定することと、（ｂ）ベイトセットを選択して領域を選択的に捕捉することと、を含む。一実施形態では、ベイトセットパネルのベイトセットは、無細胞デオキシリボ核酸試料の１つまたは複数のヌクレオソーム関連領域を選択的に濃縮する。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、複数のゲノム領域を濃縮する方法を含むことができ、該方法は、所定量の核酸試料を、（ｉ）第１のベイトセットの飽和点未満である第１の濃度比で提供される、核酸試料の第１セットのゲノム領域に選択的にハイブリダイズする第１のベイトセットと、（ｉｉ）第２のベイトセットの飽和点に関連する第２の濃度比で提供される、核酸試料の第２セットのゲノム領域に選択的にハイブリダイズする第２ベイトセットとを含む、ベイトパネルと接触させることと、第１のセットのゲノム領域及び第２のセットのゲノム領域の核酸試料を濃縮することと、を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、対象の身体試料中の無細胞デオキシリボ核酸（ｃｆＤＮＡ）分子に由来する複数の配列リードからの挿入または欠失（インデル）の検出精度を改善する方法であって、その複数の配列リードが核酸シークエンシングによって生成される、方法を含むことができ、該方法は、（ａ）無細胞ＤＮＡ分子に関連する複数の配列リードのそれぞれについて、複数の配列リードの１つまたは複数の配列リードにおいて検出されたインデルの予め定められた期待値と、１つまたは複数の配列リードにおいてインデルが検出された場合に検出されたインデルが無細胞ＤＮＡ分子の所与の無細胞ＤＮＡ分子に存在する真のインデルであるという予め定められた期待値と、１つまたは複数の配列リードにおいてインデルが検出された場合に検出されたインデルが非生物学的エラーによって導入されたという予め定められた期待値と、を提供することと、（ｂ）核酸シークエンシングによって生成された配列リードに特徴的な１つまたは複数のモデルパラメーターの定量的測定値を提供することと、（ｃ）無細胞ＤＮＡ分子に関連する複数の配列リードにおいて１つまたは複数の候補インデルを検出することと、（ｄ）各候補インデルについて、１つまたは複数のモデルパラメーターを使用して仮説検定を実施し、候補インデルを真のインデルまたは導入インデルとして分類し、これにより、インデルの検出精度が向上することを含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、（ａ）所定量のＤＮＡを含む試料と、（ｂ）（ｉ）第１のベイトセットの飽和点未満である第１の濃度比で提供される、所定量のＤＮＡを含む核酸試料の第１セットのゲノム領域に選択的にハイブリダイズする第１のベイトセットと、（ｉｉ）第２のベイトセットの飽和点に関連する第２の濃度比で提供される、核酸試料の第２セットのゲノム領域に選択的にハイブリダイズする第２ベイトセットと、を含むベイトセットパネルと、を含むキットを含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、複数のゲノム領域を濃縮する方法を含むことができ、該方法は、（ａ）試料に由来する所定量の核酸を、（ｉ）第１のベイトセットの飽和点未満である第１の濃度で提供される、試料に由来する核酸の第１セットのゲノム領域に選択的にハイブリダイズする第１のベイトセットと、（ｉｉ）第２のベイトセットの飽和点に関連する第２の濃度で提供される、核酸試料の第２セットのゲノム領域に選択的にハイブリダイズする第２のベイトセットとを含むベイト混合物と接触させることと、（ｂ）第１のセットのゲノム領域及び第２のセットのゲノム領域の核酸試料を濃縮することと、を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、複数のゲノム領域を濃縮する方法を含むことができ、該方法は、（ａ）試料に由来する所定量の核酸を、（ｉ）第１のベイトセットの飽和点未満である第１の濃度で提供される、試料に由来する核酸の第１セットのゲノム領域に選択的にハイブリダイズする第１のベイトセットと、（ｉｉ）第２のベイトセットの飽和点またはそれを超える第２の濃度で提供される、試料に由来する核酸の第２セットのゲノム領域に選択的にハイブリダイズする第２ベイトセットとを含むベイト混合物と接触させることと、（ｂ）第１のセットのゲノム領域及び第２のセットのゲノム領域の試料に由来する核酸を濃縮し、それにより、濃縮された核酸を生成することと、を含む。
【０３９９】
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，７９０，５５９号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、コピー数多型を検出する方法を含むことができ、該方法は、ａ）対象の身体試料から細胞外ポリヌクレオチドをシークエンシングすることであって、該細胞外ポリヌクレオチドのそれぞれが、固有のバーコードに任意で結合している、ことと、ｂ）設定閾値を満たさないリードを除外することと、ｃ）ステップ（ａ）から取得した配列リードを参照シークエンシングにマッピングすることと、ｄ）参照配列の２つ以上の所定の領域でマッピングされたリードを定量化／カウントすることと、ｅ）（ｉ）所定の領域でのリード数を相互に正規化する、及び／または所定の領域での固有のバーコード数を相互に正規化すること、ならびに（ｉｉ）ステップ（ｉ）で得られた正規化数を、対照試料から得られた正規化数と比較することにより、１つまたは複数の所定の領域でのコピー数多型を判定することと、を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、対象から採取した無細胞または実質的に無細胞の試料中のまれな変異を検出する方法を含むことができ、該方法は、ａ）対象の身体試料から細胞外ポリヌクレオチドをシークエンシングすることであって、該細胞外ポリヌクレオチドのそれぞれが、複数のシークエンシングリードを生成することと、ｂ）対象の身体試料から細胞外ポリヌクレオチドをシークエンシングすることであって、該細胞外ポリヌクレオチドのそれぞれが、複数のシークエンシングリードを生成する、こと、対象の身体試料から細胞外ポリヌクレオチドをシークエンシングすることであって、該細胞外ポリヌクレオチドのそれぞれが、複数のシークエンシングリードを生成することと、ｃ）設定閾値を満たさないリードを除外することと、ｄ）シークエンシングからのシークエンシングリードを参照シークエンシングにマッピングすることと、ｅ）マッピング可能な各塩基位置で参照配列の変異型とアラインメントするマッピングされた配列リードのサブセットを同定することと、ｆ）マッピング可能な各塩基位置について、（ａ）参照配列と比較した変異型を含むマッピングされた配列リード数と、（ｂ）マッピング可能な各塩基位置の合計配列リード数との比率を計算することと、ｇ）マッピング可能な各塩基位置の分散の比率または頻度を正規化し、潜在的でまれな変異型（複数可）または変異（複数可）を判定することと、ｈ）潜在的でまれな変異型（複数可）または変異（複数可）を有する各領域の得られた数を、参照試料から同様に導出された数と比較することと、を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、対象における異常状態の不均一性を特徴付ける方法を含むことができ、該方法は、対象における細胞外ポリヌクレオチドの遺伝的プロファイルを生成することを含み、該遺伝的プロファイルは、コピー数多型及び／または他のまれな変異（例えば、遺伝子改変）分析から生じる複数のデータを含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、以下のステップ：ゲノム内の所定領域の選択、所定領域の配列リード数の列挙、所定領域全体の配列リード数の正規化、及び所定領域内のコピー数多型の割合の判定、を実施するためのコンピュータ可読媒体を備えるシステムを含むことができる。いくつかの実施形態では、ゲノム全体、または少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％のゲノムが分析される。いくつかの実施形態では、コンピュータ可読媒体は、血漿または血清中のがんＤＮＡまたはＲＮＡの割合でデータをエンドユーザーに提供する。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、対象から採取した無細胞または実質的に無細胞の試料中のまれな変異を検出する方法を含むことができ、該方法は、ａ）対象の身体試料から細胞外ポリヌクレオチドをシークエンシングすることであって、該細胞外ポリヌクレオチドのそれぞれが、複数のシークエンシングリードを生成することと、ｂ）設定閾値を満たさないリードを除外することと、ｃ）シークエンシングに由来する配列リードを参照配列にマッピングすることと、ｄ）マッピング可能な各塩基位置で参照配列の変異型とアラインメントするマッピングされた配列リードのサブセットを同定することと、ｅ）マッピング可能な各塩基位置について、（ａ）参照配列と比較した変異型を含むマッピングされた配列リード数と、（ｂ）マッピング可能な各塩基位置の合計配列リード数との比率を計算することと、ｆ）マッピング可能な各塩基位置の分散の比率または頻度を正規化し、潜在的でまれな変異型（複数可）または他の遺伝子改変（複数可）を判定することと、ｇ）各領域の得られた数を比較することと、を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、ａ．タグ付けした親ポリヌクレオチドの少なくとも１つのセットを提供することと、タグ付けした親ポリヌクレオチドの各セットに対して、ｂ．そのセット内のタグ付けした親ポリヌクレオチドを増幅して、増幅された子孫ポリヌクレオチドの対応するセットを生成することと、ｃ．増幅された子孫ポリヌクレオチドのセットのサブセット（適切なサブセットを含む）をシークエンシングし、シークエンシングリードのセットを生成することと、ｄ．シークエンシングリードのセットを折りたたみ、コンセンサス配列のセットを生成することであって、各コンセンサス配列は、タグ付けした親ポリヌクレオチドのセットの中で固有のポリヌクレオチドに対応する、ことと、を含む方法を含むことができる。ある特定の実施形態では、本方法は、さらに、ｅ．タグ付けした親分子の各セットのコンセンサス配列のセットの分析を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、ａ．タグ付けした親ポリヌクレオチドの少なくとも１つのセットを提供することと、タグ付けした親ポリヌクレオチドの各セットに対して、ｂ．そのセット内のタグ付けした親ポリヌクレオチドを増幅して、増幅された子孫ポリヌクレオチドの対応するセットを生成することと、ｃ．増幅された子孫ポリヌクレオチドのセットのサブセット（適切なサブセットを含む）をシークエンシングし、シークエンシングリードのセットを生成することと、ｄ．シークエンシングリードのセットを折りたたみ、コンセンサス配列のセットを生成することであって、各コンセンサス配列は、タグ付けした親ポリヌクレオチドのセットの中で固有のポリヌクレオチドに対応する、ことと、ｅ．コンセンサス配列の中から、品質閾値を満たしていないものを除外することを含む方法を含むことができる。一実施形態では、品質閾値は、コンセンサス配列へと折りたたまれた増幅した子孫ポリヌクレオチド由来の多くの配列リードの数を考慮する。別の実施形態では、品質閾値は、コンセンサス配列へと折りたたまれた増幅した子孫ポリヌクレオチド由来の多くの配列リードの数を考慮する。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、ａ．タグ付けした親ポリヌクレオチドの少なくとも１つのセットを提供することであって、各セットは１つまたは複数のゲノム内の異なる参照配列にマップされ、タグ付けした親ポリヌクレオチドの各セットに対して、ｉ．第１のポリヌクレオチドを増幅して、増幅されたポリヌクレオチドのセットを生成し、ｉｉ．増幅したポリヌクレオチドのセットのサブセットをシークエンシングして、配列リードのセットを生成し、ｉｉｉ．１．増幅した子孫ポリヌクレオチドからシークエンシングした配列リードをファミリーへと群化することにより配列リードを折りたたむことであって、各ファミリーは同じタグ付けした親ポリヌクレオチドから増幅される、こと、を含む方法を含むことができる。一実施形態では、折りたたむことは、２．各ファミリーの配列リードの定量的尺度を判定すること、をさらに含む。別の実施形態では、本方法は、ｂ．固有のファミリーの定量的尺度を判定することと、ｃ．（１）固有の家族の定量的尺度と、（２）セット内の固有のタグ付けした親ポリヌクレオチドの尺度を推測する、各群の配列リードの定量的尺度に基づくことと、をさらに含む（ａを含むａ）を含む）。別の実施形態では、推論は、統計的モデルまたは確率的モデルを使用して実施される。別の実施形態では、本方法は、２つのセットの間の増幅バイアスまたは表示バイアス（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌ  ｂｉａｓ）について訂正するために対照または対照試料のセットを使用することをさらに含む。別の実施形態では、本方法は、セット間のコピー数多型を判定することをさらに含む。別の実施形態では、本方法は、ｄ．ファミリーの間の多型の形態の定量的尺度を判定することと、ｅ．多型の形態の判定された定量的尺度に基づいて、推論されるタグ付けした固有親ポリヌクレオチドの数における多型の形態の定量的尺度を推論することとをさらに含む（ａ、ｂ、ｃを含む）。別の実施形態では、多型の形態には、置換、挿入、欠失、逆位、マイクロサテライトの変化、転換、転座、融合、メチル化、過剰メチル化、ヒドロキシメチル化、アセチル化、エピジェネティックな変異型、制御関連変異型またはタンパク質結合部位が含まれるがこれらに限定されない。セットが共通の試料に由来する別の実施形態では、本方法は、ａ．複数の参照配列の各々にマッピングする、各セット内のタグ付けした親ポリヌクレオチドの推論される数の比較に基づいて、複数のセットに対してコピー数多型を���論することをさらに含む。別の実施形態では、各セット内のポリヌクレオチドの元の数が、さらに推論される。これに加えてまたはこれに代えて、本開示は、前述の方法を実施するためのコンピュータ可読媒体を備えるシステムも含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、少なくとも１つの個々のポリヌクレオチド分子に関する配列情報を通信する方法を含むことができ、該方法は、ａ．少なくとも１つの個々のポリヌクレオチド分子を提供することと、ｂ．その少なくとも１つの個々のポリヌクレオチド分子における配列情報を符号化することにより、信号を生成することと、ｃ．その信号の少なくとも一部をチャネルに通して、少なくとも１つの個々のポリヌクレオチド分子に関するヌクレオチド配列情報を含む受信信号を生成することであって、該受信信号は、ノイズ及び／または歪みを含む、ことと、ｄ．受信信号を解読して、少なくとも１つの個々のポリヌクレオチド分子に関する配列情報を含むメッセージを生成することであって、解読は、メッセージ内のノイズ及び／または歪みを減少させる、ことと、ｅ．そのメッセージをレシピエントに提供することと、を含む。一実施形態では、ノイズは、誤ったヌクレオチドコールを含む。別の実施形態では、歪みは、他の個々のポリヌクレオチド分子と比較して、個々のポリヌクレオチド分子の不均一な増幅を含む。別の実施形態では、歪みは、増幅バイアスまたはシークエンシングバイアスに起因する。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、対象から採取した無細胞または実質的に無細胞の試料中のまれな変異を検出する方法を含むことができ、該方法は、ａ）対象の身体試料から細胞外ポリヌクレオチドをシークエンシングすることであって、該細胞外ポリヌクレオチドのそれぞれが、複数のシークエンシングリードを生成することと、ｂ）濃縮が実施されない場合、領域のマルチプレックスシークエンシングまたは全ゲノムシークエンシングを実施することと、ｃ）設定閾値を満たさないリードを除外することと、ｄ）シークエンシングからのシークエンシングリードを参照シークエンシングにマッピングすることと、ｅ）マッピング可能な各塩基位置で参照配列の変異型とアラインメントするマッピングされた配列リードのサブセットを同定することと、ｆ）マッピング可能な各塩基位置について、（ａ）参照配列と比較した変異
型を含むマッピングされた配列リード数と、（ｂ）マッピング可能な各塩基位置の合計配列リード数との比率を計算することと、ｇ）マッピング可能な各塩基位置の分散の比率または頻度を正規化し、潜在的でまれな変異型（複数可）または変異（複数可）を判定することと、ｈ）潜在的でまれな変異型（複数可）または変異（複数可）を有する各領域の得られた数を、参照試料から同様に導出された数と比較することと、を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、対象における異常状態の不均一性を特徴付ける方法を含むことができ、該方法は、対象における細胞外ポリヌクレオチドの遺伝的プロファイルを生成することを含み、該遺伝的プロファイルは、コピー数多型及びまれな変異分析から生じる複数データを含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、マルチプレックスシークエンシングを使用して、対象から採取した無細胞または実質的に無細胞の試料において、コピー数多型を判定すること、またはまれな変異分析を実施することを含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、ａ）タグ付けした親ポリヌクレオチドの少なくとも１つのセットを提供することと、タグ付けした親ポリヌクレオチドの各セットに対して、ｂ）そのセット内のタグ付けした親ポリヌクレオチドを増幅して、増幅された子孫ポリヌクレオチドの対応するセットを生成することと、ｃ）増幅された子孫ポリヌクレオチドのセットのサブセット（適切なサブセットを含む）をシークエンシングし、シークエンシングリードのセットを生成することと、ｄ）シークエンシングリードのセットを折りたたみ、コンセンサス配列のセットを生成することであって、各コンセンサス配列は、タグ付けした親ポリヌクレオチドのセットの中で固有のポリヌクレオチドに対応する、ことと、ｅ）コンセンサス配列の中から、品質閾値を満たしていないものを除外することを含む方法を含むことができる。
【０４００】
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，７００，２８６号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、遺伝子増幅及び遺伝子過剰発現の反映であるがん患者の血漿／血清中の特定の遺伝子のＤＮＡ及びＲＮＡの量を追加及び比較することによる血漿／血清測定におけるがん検出アッセイを含むことができる。したがって、遺伝子増幅（より多くのＤＮＡで見られる）及び遺伝子過剰発現（より多くのＲＮＡ）がリンクされている。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、がん細胞中で増幅及び過剰発現される任意の遺伝子において、がんに罹患していると疑われる患者の体液中の遺伝子過剰発現（ＲＮＡ）及び遺伝子増幅（ＤＮＡ）を一緒に測定し、健康な対照と比較することを含む、がんの診断またはがんの進化の経過観察のための方法を含むことができる。より詳細には、ＲＮＡ及びＤＮＡを、血漿、血清、喀痰、唾液などの体液から抽出し、精製及び増幅し、過剰発現したＲＮＡ及び増幅したＤＮＡを分析し、固有のハウスキーピング遺伝子と比較する。いくつかの実施形態では、核酸は、逆転写酵素連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって増幅され、ゲル染色、放射性免疫学的手法（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着試験（ＥＬＩＳＡ）、またはマイクロチップ試験（遺伝子アレイ）によって分析され、場合により、核酸定量化のための任意の方法によって定量化する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及びＤＮＡの定量化は、「ＴＡＱＭＡＮ（商標）」などのリアルタイムＰＣＲ、またはキャピラリー「ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（商標）」、またはあらゆる企業のリアルタイムＰＣＲ及びＲＴ  ＰＣＲによって実施される。いくつかの実施形態では、分析した遺伝子は、固有のハウスキーピング遺伝子の発現（ＲＮＡ）及び量（ＤＮＡ）に対応する参照核酸抽出物（ＤＮＡ及びＲＮＡ）、もしくはハウスキーピングコーディング遺伝子の発現に対応する参照ＲＮＡ、もしくは固有の遺伝子に対応する参照ＤＮＡと比較され得る、または細胞株の核酸で得られた標準曲線を参照して推定され得る。
【０４０１】
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１８／０１９５１３１号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、融合遺伝子を検出する方法を含むことができ、これはがんなどの疾患を検出するために使用され得る。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、がんなどの疾患に関連し得る融合遺伝子を検出及び特性決定するためなどに、ブレークポイントフラグメントを濃縮する方法が含まれる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、がんを有する、またはがんを有すると疑われる対象に診断的または治療的介入を提供する方法を含むことができ、該方法は、（ａ）対象の無細胞核酸分子を含む生体試料を提供することと、（ｂ）プローブ捕捉ポリヌクレオチドを生成するのに十分なハイブリダイゼーション条件下で、生体試料の無細胞核酸分子をプローブセットと接触させることであって、プローブセットが複数のポリヌクレオチドプローブを含み、複数のポリヌクレオチドプローブのそれぞれが、（ｉ）融合遺伝子との配列相補性、及び（ｉｉ）融合遺伝子と相補的な配列を有するかつ非改変ヌクレオチドのみを含むポリヌクレオチドよりも大きい融合遺伝子に対する親和性、を有する、ことと、（ｃ）プローブ捕捉ポリヌクレオチドを混合物から単離し、融合遺伝子のブレークポイントフラグメントを含む単離されたポリヌクレオチドが豊富な試料を生成することと、（ｄ）単離されたポリヌクレオチドをシークエンシングして配列を生成することと、（ｅ）配列に基づいて融合遺伝子のブレークポイントを含むポリヌクレオチドを検出することと、（ｆ）ブレークポイントフラグメントの検出に基づいて診断または治療介入を提供することと、を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、融合遺伝子のブレークポイントフラグメントを捕捉する方法を含むことができ、該方法は、（ａ）融合遺伝子のブレークポイントフラグメントを含む無細胞核酸分子を含む、または含むと疑われる生体試料を提供することと、（ｂ）（ｉ）混合物中のプローブ捕捉ポリヌクレオチドを提供するために、ポリヌクレオチドプローブ及びブレークポイントフラグメントの間のハイブリダイゼーションを可能にすることであって、該ポリヌクレオチドプローブが、ブレークポイントフラグメントとの配列相補性を有し、融合遺伝子と相補的な配列を有するかつ非改変ヌクレオチドのみを含むポリヌクレオチドよりも大きい融合遺伝子に対する親和性を有する、ことと、（ｉｉ）混合物のプローブ捕捉ポリヌクレオチドの濃縮または単離であって、該ポリヌクレオチドプローブがブレークポイントフラグメントと配列相補性を有する、ことに十分な条件下で生体試料をポリヌクレオチドプローブと接触させることと、を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、複数のポリヌクレオチドプローブを含むプローブセットを含むことができ、ポリヌクレオチドプローブのそれぞれは、（ｉ）無細胞核酸分子の一部としての融合遺伝子との配列相補性、及び（ｉｉ）融合遺伝子と相補的な配列を有するかつ非改変ヌクレオチドのみを含むポリヌクレオチドよりも大きい融合遺伝子に対する親和性を有する。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、無細胞核酸分子中の融合遺伝子に関連する核酸配列に特異的にハイブリダイズするように構成された配列を含む高親和性ポリヌクレオチドを含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、融合遺伝子に特異的にハイブリダイズするように構成された高親和性ポリヌクレオチドを含むことができる。一実施形態では、高親和性ポリヌクレオチドは、１つまたは複数のロックド核酸ヌクレオチドを含む。別の実施形態では、高親和性ポリヌクレオチドは、天然ヌクレオチドのみを含む同じ配列を有するポリヌクレオチドよりも少なくとも１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、１０℃、１５℃、または２０℃のいずれか高い融解温度を有する。別の実施形態では、高親和性ポリヌクレオチドは、天然ヌクレオチドのみを含む同じ配列を有するポリヌクレオチドよりも少なくとも２％、４％、６％、８％、または１０％のいずれか高い融解温度を有する。別の実施形態では、高親和性ポリヌクレオチドは、がん融合遺伝子に特異的にハイブリダイズするように構成されている。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、融合遺伝子に特異的にハイブリダイズするように構成された高親和性ポリヌクレオチドを含む高親和性ポリヌクレオチドプローブを含むことができる。一実施形態では、高親和性ポリヌクレオチドは、１つまたは複数のロックド核酸ヌクレオチドを含む。別の実施形態では、プローブは、検出可能な標識、結合部分、または固体支持体から選択される機能を備える。別の実施形態では、プローブは、融合遺伝子のブレークポイントフラグメントにハイブリダイズするように構成されている。別の実施形態では、ブレークポイントフラグメントの長さは約１４０ヌクレオチド〜約１８０ヌクレオチドである。別の実施形態では、フラグメントは無細胞デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはゲノムＤＮＡである。別の実施形態では、高親和性ポリヌクレオチドは固体支持体に結合している。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、融合遺伝子のブレークポイントフラグメントを捕捉する方法を含むことができ、該方法は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でブレークポイントフラグメントを高親和性ポリヌクレオチドプローブと接触させ、ハイブリダイゼーションさせることであって、該ポリヌクレオチドプローブは固体支持体に結合し、該ポリヌクレオチドプローブはブレークポイントフラグメントのヌクレオチド配列に実質的または完全に相補的なヌクレオチド配列を有する、ことを含む。一実施形態では、高親和性ポリヌクレオチドは、１つまたは複数のロックド核酸ヌクレオチドを含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、融合遺伝子のブレークポイントを含むポリヌクレオチドの試料を濃縮する方法を含むことができ、該方法は、ａ）請求項２０に記載のプローブセットをハイブリダイゼーション条件下でポリヌクレオチドの混合物と接触させて、プローブ捕捉ポリヌクレオチドを生成することと、ｂ）プローブ捕捉ポリヌクレオチドを混合物から単離し、融合遺伝子のブレークポイントフラグメントを含むポリヌクレオチドが豊富な試料を生成することと、を含む。一実施形態では、高親和性ポリヌクレオチドは、１つまたは複数のロックド核酸ヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、無細胞ＤＮＡまたは断片化されたゲノムＤＮＡを含む。別の実施形態では、本方法は、捕捉されたポリヌクレオチドをプローブから単離することをさらに含む。別の実施形態では、本方法は、単離されたポリヌクレオチドをシークエンシングすることをさらに含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、対象のがんを診断する方法を含むことができ、該方法は、ａ）対象のポリヌクレオチドを含む試料を提供することと、ｂ）試料に由来する無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）をハイブリダイゼーション条件下で請求項２０のプローブセットと接触させて、プローブ捕捉ポリヌクレオチドを生成することと、ｃ）プローブ捕捉ポリヌクレオチドを混合物から単離し、融合遺伝子のブレークポイントフラグメントを含むポリヌクレオチドが豊富な試料を生成することと、ｄ）単離されたポリヌクレオチドをシークエンシングして配列を生成することと、ｅ）配列に基づいて融合遺伝子のブレークポイントを含むポリヌクレオチドを検出することと、ｆ）ブレークポイントフラグメントの検出に基づいてがんを診断することと、を含む。一実施形態では、高親和性ポリヌクレオチドは、１つまたは複数のロックド核酸ヌクレオチドを含む。
【０４０２】
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１８／０１２０２９１号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、対象の病状を分析する方法を含むことができ、該方法は、（ａ）遺伝分析装置を使用して、（ｉ）２つ以上の時点、または（ｉｉ）実質的に同じ時点、で得られた対象の生体試料中の核酸分子から遺伝子データを生成することであって、該遺伝子データは対象の遺伝情報に関連し、該生体試料は無細胞生体試料を含む、ことと、（ｂ）遺伝分析装置から遺伝子データを受信することと、（ｃ）１つまたは複数のプログラムされたコンピュータプロセッサとともに、遺伝子データを使用して、対象の遺伝情報の特性評価において調整した試験結果を生成することと、（ｄ）調整した試験結果をコンピュータメモリに出力することと、を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子データは、現在の配列リード及び以前の配列リードを含み、（ｃ）は、現在の配列リードを以前の配列リードと比較し、対象の遺伝情報の特性評価に関して診断信頼性指標を適宜更新することを含み、該診断信頼性指標は、対象の生体試料の１つまたは複数の遺伝的変化を同定する確率を示す。いくつかの実施形態では、本方法は、後続の特性評価を得ること、及びｄｅ  ｎｏｖｏ情報の後続の特性評価における診断信頼性指標をそのまま残すことをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、遺伝子データに含まれる配列リードのコレクションにおいて検出された１つまたは複数の遺伝的変異型の頻度を判定し、２つ以上の時点で１つまたは複数の遺伝的変異型の頻度を比較することにより少なくとも部分的に調整した試験結果を生成することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、遺伝子データに含まれる配列リードのコレクションにおいて検出された１つまたは複数の遺伝子座でコピー数多型の量を判定し、２つ以上の時点での量を比較することにより少なくとも部分的に調整した試験結果を生成することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、調整した試験結果を使用して、（ｉ）治療的介入、または（ｉｉ）対象に健康または疾患の診断を提供することをさらに含む。いくつかの実施形態では、遺伝子データは、遺伝子データの第１セット及び遺伝子データの第２セットを含み、該遺伝子データの第１セットは検出閾値、またはそれ以下であり、遺伝子データの第２セットは検出閾値を超える。いくつかの実施形態では、検出閾値はノイズ閾値である。いくつかの実施形態では、本方法は、複数のサンプリングインスタンスまたは時点で、遺伝子データの第１セット及び遺伝子データの第２セットで同じ遺伝的変異型が検出された場合、（ｃ）において、対象の診断を陰性または不確実から陽性に調整することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、同じ遺伝的変異型が、より早い時点で遺伝子データの第１セットで検出され、より後の時点で遺伝子データの第２セットで検出された場合、（ｃ）において、より早い時点の特性評価において対象の診断を陰性または不確実から陽性に調整することをさらに���む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、対象の生体試料中のがんポリヌクレオチドの量の傾向を経時的に検出する方法を含むことができ、該方法は、１つまたは複数のプログラムされたコンピュータプロセッサを使用して、複数の時点のそれぞれでのがんポリヌクレオチドの頻度を判定することと、複数の時点のそれぞれにおける頻度の誤差範囲を判定して、第１の時点で少なくとも第１の誤差範囲、及び第１の時点に続く第２の時点で第２の誤差範囲を提供することと、（１）第１の誤差範囲が第２の誤差範囲と重複するかどうか（その重複は複数の時点でのがんポリヌクレオチドの頻度の安定性を示す）と、（２）第２の誤差範囲が第１の誤差範囲より大きいかどうか（それにより複数の時点でのがんポリヌクレオチドの頻度の増加を示す）と、または（３）第２の誤差範囲が第１の誤差範囲より小さいかどうか（それにより複数の時点でのがんポリヌクレオチドの頻度の減少を示す）と、を決定することと、を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、対象の１つまたは複数の遺伝的変異及び／または遺伝的変異の量を検出する方法を含むことができ、該方法は、遺伝子分析装置を用いて対象の無細胞核酸試料中の核酸分子をシークエンシングし、第１の時点で配列リードの第１セットを生成することと、配列リードの第１セットと、第１の時点より前の少なくとも第２の時点で得られた配列リードの少なくとも第２セットとを比較して、配列リードの第１セットと配列リードの少なくとも第２セットとの比較を行うことと、どの診断信頼性指標が対象の無細胞核酸試料中の１つまたは複数の遺伝的変異型を同定する確率を示しているかを比較を使用して診断信頼性指標を適宜更新することと、診断信頼性指標に基づいて対象の無細胞核酸試料中の核酸分子における１つまたは複数の遺伝的変化の有無及び／または遺伝的変化の量を検出することと、を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、無細胞核酸を得ることをさらに含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、対象の無細胞核酸試料中の変異を検出する方法を含むことができ、該方法は、（ａ）遺伝子分析装置から得られた現在の配列リードを、比較を行うために以前の期間から得られた以前の配列リードと比較することによってコンセンサス配列を判定し、該比較に基づいて診断信頼性指標を更新することであって、該各コンセンサス配列は、無細胞核酸試料に由来するタグ付けした親ポリヌクレオチドのセットの中の固有のポリヌクレオチドに対応する、ことと、（ｂ）診断的信頼性に基づいて、対象における細胞外ポリヌクレオチドの遺伝的プロファイルを生成することであって、該遺伝的プロファイルがコピー数多型または変異分析から得られるデータを含む、ことと、を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、異常な細胞活動を検出する方法を含むことができ、該方法は、対象の生体試料に由来するタグ付けした親ポリヌクレオチドの少なくとも1セットを提供することと、セット内のタグ付けした親ポリヌクレオチドを増幅して、増幅した子孫ポリヌクレオチドの対応するセットを生成することと、遺伝子分析装置を使用して増幅した子孫ポリヌクレオチドのセットのサブセットをシークエンシングし、配列リードのセットを生成することと、配列リードのセットを折りたたみ、現在の配列リードを少なくとも1つの以前の期間の以前の配列リードと比較することによりコンセンサス配列のセットを生成し、診断信頼性指標を適宜更新することであって、該診断信頼性指標が、対象の生体試料の１つまたは複数の遺伝的変化を同定する確率を示し、各コンセンサス配列が、タグ付けした親ポリヌクレオチドのセットの中で固有のポリヌクレオチドに対応する、ことと、を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、対象の無細胞または実質的に無細胞の試料中の変異を検出する方法を含むことができ、該方法は、（ａ）遺伝子分析装置を用いて対象の身体試料から細胞外ポリヌクレオチドをシークエンシングすることと、（ｂ）細胞外ポリヌクレオチドのそれぞれについて、複数の配列リードを生成することと、（ｃ）設定閾値を満たさないリードを除外することと、（ｄ）シークエンシングからのシークエンシングリードを参照シークエンシングにマッピングすることと、（ｅ）マッピング可能な各塩基位置で参照配列の変異型とアラインメントするマッピングされた配列リードのサブセットを同定することと、（ｆ）マッピング可能な各塩基位置について、（ｉ）参照配列と比較した変異型を含むマッピングされた配列リード数と、（ｉｉ）マッピング可能な各塩基位置の合計配列リード数との比率を計算することと、（ｇ）１つまたは複数のプログラムされたコンピュータプロセッサを使用して、配列リードを少なくとも１つ前の時点の他の配列リードと比較し、診断信頼性指標を適宜更新することであって、該診断信頼性指標が、変異型を同定する確率を示す、ことと、を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、遺伝子試験装置の操作を含むことができ、該方法は、対象から採取した身体試料から得られた初期出発遺伝物質を提供することと、二本鎖ポリヌクレオチド分子を最初の出発遺伝物質から少なくとも１セットの固有ではないタグ付けした親ポリヌクレオチドに変換することであって、セット内の各ポリヌクレオチドが参照配列にマッピング可能である、ことと、タグ付けした親ポリヌクレオチドの各セットに対して、（ｉ）セット内のタグ付けした親ポリヌクレオチドを増幅して、増幅した子孫ポリヌクレオチドの対応するセットを生成することと、（ｉｉ）増幅した子孫ポリヌクレオチドのセットをシークエンシングして、シークエンシングリードのセットを生成することと、（ｉｉｉ）シークエンシングリードのセットを折りたたみ、コンセンサスシークエンシングのセットを生成することであって、該折りたたみはタグからの配列情報と、（１）配列リードの開始領域の配列情報、（２）配列リードの末端領域、及び（３）配列リードの長さ（コンセンサス配列のセットの各コンセンサス配列は、タグ付けした親ポリヌクレオチドのセットの中のポリヌクレオチド分子に対応する）のうちの少なくとも１つを使用する、ことと、（ｉｖ）タグ付けした親分子の各セットのコンセンサス配列のセットを分析することと、（ｖ）現在の配列リードを、少��くとも１つの他の時点の以前の配列リードと比較することと、（ｖｉ）診断信頼性指標を適宜更新することであって、該診断信頼性指標が、対象の身体試料の１つまたは複数の遺伝的変化を同定する確率を示す、ことと、を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、対象の１つまたは複数の遺伝的変異型を検出する方法を含むことができ、該方法は、（ａ）対象の１つまたは複数の無細胞生体試料から核酸分子を得ることと、（ｂ）核酸分子をアッセイして、遺伝子データの第１セット及び遺伝子データの第２セットを生成することであって、該遺伝子データの第１セット及び／または遺伝子データの第２セットが検出閾値内である、ことと、（ｃ）遺伝子データの第１セットを遺伝子データの第２セットと比較して、遺伝子データの第１セットまたは遺伝子データの第２セットにおける１つまたは複数の遺伝的変異型を同定することと、（ｄ）（ｃ）で同定された１つまたは複数の遺伝的変異型に基づいて、１つまたは複数のプログラムされたコンピュータプロセッサを使用して、対象の無細胞生体試料中の１つまたは複数の遺伝的変異型を識別する診断信頼性指標を更新することと、を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、対象の無細胞デオキシリボース核酸（ｃｆＤＮＡ）の遺伝的変異型をコールする方法を含むことができ、該方法は、（ａ）ＤＮＡシークエンシングシステムを使用して、第１の時点で対象から採取した試料に由来するｃｆＤＮＡをシークエンシングすることと、（ｂ）シークエンシングしたｃｆＤＮＡの遺伝的変異型を第１の時点から検出することであって、該遺伝的変異型が診断限界未満のレベルで検出される、ことと、（ｃ）ＤＮＡシークエンシングシステムを使用して、１つまたは複数の後続の時点で対象から採取した試料に由来するｃｆＤＮＡをシークエンシングすることと、（ｄ）１つまたは複数の後続の時点からシークエンシングしたｃｆＤＮＡの遺伝的変異型を検出することであって、該遺伝的変異型が診断限界未満のレベルで検出される、ことと、（ｅ）複数の時点で採取した試料における診断限界未満の遺伝的変異型の検出に基づいて、試料を遺伝的変異型の陽性としてコールすること、を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、対象の無細胞デオキシリボース核酸（ｃｆＤＮＡ）の遺伝的変異型をコールする方法を
含むことができ、該方法は、（ａ）デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）シークエンシングシステムを使用して、対象の試料に由来するｃｆＤＮＡをシークエンシングすることと、（ｂ）シークエンシングしたｃｆＤＮＡの遺伝的変異型を検出することであって、該遺伝的変異型が診断限界未満のレベルで検出される、ことと、（ｃ）ＤＮＡシークエンシングシステムを使用して、対象から採取した試料に由来するｃｆＤＮＡをシークエンシングすることであって、該試料が１または複数回、再シークエンシングされる、ことと、（ｄ）１つまたは複数の再シークエンシング試料からシークエンシングしたｃｆＤＮＡの遺伝的変異型を検出することであって、該遺伝的変異型が診断限界未満のレベルで検出される、ことと、（ｅ）再シークエンシング試料における診断限界未満の遺伝的変異型の検出に基づいて、試料を遺伝的変異型の陽性としてコールすること、を含む。
【０４０３】
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１７／０２４０９７２号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、融合染色体ＤＮＡ分子の少なくとも一部のシークエンシングデータを含む融合リードを判定することにより遺伝子融合を判定し、融合リードの少なくとも１つのマッピング部分が所定のポイント（ブレークポイント）でクリップされたゲノム上の所定のポイントを判定し、２つのブレークポイント（ブレークポイントペア）から２つのマッピングリード部分を潜在的な融合候補として同定し、ブレークポイントペアに基づいて１つまたは複数の融合セットを作成して該融合セットを１つまたは複数の融合クラスターへとクラスタリングし、所定の基準を満たす各融合クラスターを遺伝子融合として同定するためのシステム及び方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、試料に由来する遺伝子配列リードデータを処理するための方法を含むことができ、該方法は、融合染色体ＤＮＡ分子の少なくとも一部のシークエンシングデータを含む融合リードを判定することと、融合リードの少なくとも１つのマッピング部分が所定のポイント（ブレークポイント）でクリップされたゲノム上の所定のポイントを判定することと、２つのブレークポイント（ブレークポイントペア）から２つのマッピングリード部分を潜在的な融合候補として同定することと、ブレークポイントペアに基づいて１つまたは複数の融合セットを作成して該融合セットを１つまたは複数の融合クラスターへとクラスタリングすることと、所定の基準を満たす各融合クラスターを、遺伝子融合として同定することと、を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、固有の分子またはリード識別子（リードＩＤ）を各リードへと割り当てることを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、リードの各マッピング部分を、片側または両側からクリップすることを含む。いくつかの実施形態では、ブレークポイントは、同一性においてリードから独立しており、符号、染色体、及び位置により同定される。いくつかの実施形態では、ブレークポイントは、ブレークポイントでクリップされるか、または分割された多数のリード及び分子と、ブレークポイントを通り越す多数の野生型リード及び分子とを含む統計を保持する。いくつかの実施形態では、本方法は、適切な符号を伴う２つのブレークポイントに属する共通のリードＩＤを伴うあらゆる２つのマッピングリード部分を、潜在的な融合候補として選択することを含む。いくつかの実施形態では、マッピング前の元のリード内の潜在的な融合候補の場所は、該リード部分を、元々互いに隣接して位置するものとして示す。いくつかの実施形態では、本方法は、リード部分が、１つの鎖にマッピングされる場合、ブレークポイントの符号の差違についてチェックすることを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、融合セット統計を追跡するステップを含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、ＤＮＡシーケンサー、該ＤＮＡシーケンサーに接続されたプロセッサ、コンピュータコードを実行して試料からの遺伝子配列リードデータを処理するプロセッサ、融合染色体ＤＮＡ分子の一部のシークエンシングデータを含む融合リードを判定し、融合リードの少なくとも１つのマッピング部分が所定のポイント（ブレークポイント）でクリップされたゲノム上の少なくとも１つの所定のポイントを判定し、２つのブレークポイント（ブレークポイントペア）から２つのマッピングリード部分を潜在的な融合候補として同定し、ブレークポイントペアに基づいて１つまたは複数の融合セットを作製して該融合セットを１つまたは複数の融合クラスターへとクラスタリングし、所定の基準を満たす各融合クラスターを遺伝子融合として同定する指示を含むコンピュータコード、を含む遺伝情報を分析するシステムを含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、ＤＮＡシーケンサーでＤＮＡ分子をシークエンシングして、配列のコレクションを生成することと、配列のコレクションを参照ゲノムにマッピングすることと、マッピングされたコレクションから融合リードを同定することであって、融合リードが部分配列を含み、第１の部分配列が第１の遺伝子座にマップされ、第２の部分配列が第２の異なる遺伝子座にマップされる、ことと、各融合リードについて、第１の遺伝子座の第１のブレークポイント及び第２の遺伝子座の第２のブレークポイントを同定することであって、ブレークポイントは融合リードの配列がクリップされる参照ゲノム上のポイントであり、該第１及び第２のブレークポイントがブレークポイントペアを形成する、ことと、融合リードのセットを生成することであって、各セットが同じブレークポイントペアを有する融合リードを含む、ことと、融合リードのセットをクラスタリングすることであって、各クラスターが、第１の所定のヌクレオチド距離内に第１のブレークポイントを有し、第２の所定のヌクレオチド距離内に第２のブレークポイントを有する融合リードのセットから形成される、ことと、１つまたは複数のクラスターの遺伝子融合を判定することであって、クラスターの遺伝子融合が、第１の融合遺伝子ブレークポイントとしてクラスター内の第１のブレークポイントから選択されたブレークポイントを有し、第２の融合遺伝子ブレークポイントとしてクラスター内の第２のブレークポイントから選択されたブレークポイントを有し、該第１及び第２の融合遺伝子ブレークポイントが、選択基準に基づいてそれぞれ選択される、ことを含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、ＤＮＡシーケンサーで複数のＤＮＡ分子をシークエンシングすることと、複数の配列分子のそれぞれに識別子をタグ付けすることと、タグ付けした各配列を参照ゲノムにマッピングすることと、クリップされたリードをマッピングしたタグ付け配列から同定することであって、クリップされたリードが、マッピング部分及びクリップ部分を含むタグ付けした配列であり、マッピング部分は遺伝子座にマッピングされ、クリップ部分は遺伝子座にマッピングされない、ことと、各クリップされたリードのブレークポイントを判定することであって、ブレークポイントが、クリップされたリードの配列がクリップされる参照ゲノム上のポイントである、ことと、ブレークポイントセットを作成することであって、各ブレークポイントセットは、同じブレークポイントを有するクリップされたリードの識別子を含む、ことと、ブレークポイントセットのペアを比較して、ブレークポイントペアのセットを作成することであって、ブレークポイントペアの各セットが、ブレークポイントセットの比較されたペアの両方のメンバーに存在する識別子を含む、ことと、ブレークポイントペアのセットをクラスタリングすることであって、各クラスターが、第１の所定の遺伝的距離内にペアの第１のブレークポイントを有し、第２の所定の遺伝的距離内にペアの第２のブレークポイントを有するブレークポイントペアのセットを含む、ことと、１つまたは複数のクラスターの遺伝子融合を判定することであって、クラスターの遺伝子融合が、第１の融合遺伝子ブレークポイントとしてクラスター内の第１のブレークポイントから選択されたブレークポイントを有し、第２の融合遺伝子ブレークポイントとしてクラスター内の第２のブレークポイントから選択されたブレークポイントを有し、該第１及び第２の融合遺伝子ブレークポイントが、選択基準に基づいてそれぞれ選択される、ことを含む方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、選択基準には、クラスター内で最も融合されたリードを有するブレークポイントが含まれる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、融合遺伝子ブレークポイントを同定する方法を含むことができ、該方法は、融合染色体ＤＮＡ分子の少なくとも一部のシークエンシングデータを含む融合リードを判定することと、融合リードの少なくとも１つのマッピング部分が所定のポイント（ブレークポイント）でクリップされたゲノム上の所定のポイントを判定し、２つのブレークポイント（ブレークポイントペア）から２つのマッピングリード部分を潜在的な融合候補として同定し、ブレークポイントペアに基づいて１つまたは複数の融合セットを作成して該融合セットを１つまたは複数の融合クラスターへとクラスタリングし、所定の基準を満たす各融合クラスターを遺伝子融合として同定し、遺伝子融合のブレークポイントを融合遺伝子のブレークポイントとして同定することと、を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、対象の状態を診断する方法を含むことができ、該方法は、融合染色体ＤＮＡ分子の少なくとも一部のシークエンシングデータを含む融合リードを判定することと、融合リードの少なくとも１つのマッピング部分が所定のポイント（ブレークポイント）でクリップされたゲノム上の所定のポイントを判定することと、２つのブレークポイント（ブレークポイントペア）から２つのマッピングリード部分を潜在的な融合候補として同定することと、ブレークポイントペアに基づいて１つまたは複数の融合セットを作成して該融合セットを１つまたは複数の融合クラスターへとクラスタリングすることと、所定の基準を満たす各融合クラスターを遺伝子融合として同定することであって、該遺伝子融合が状態を示す、ことと、を含む。
【０４０４】
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１７／０２４０９７３号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、（ａ）対象の無細胞体液試料のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子のシークエンシングリードを得ることと、（ｂ）配列リードから、複数の遺伝子座における遺伝子座毎にシークエンシングリードカバレッジ（「リードカバレッジ」）に関連する定量的尺度を含む第１のデータセットを生成することと、（ｃ）飽和平衡補正及びプローブ効率補正を実施することにより、第１のデータセットを補正することと、（ｄ）第１のデータセットについてベースラインリードカバレッジを判定することであって、ベースラインリードカバレッジが、飽和平衡及びプローブ効率に関連する、ことと、（ｅ）ベースラインリードカバレッジと比べた複数の遺伝子座における遺伝子座毎のコピー数状態を判定することを含む方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、第１のデータセットは、複数の遺伝子座における遺伝子座毎に、（ｉ）遺伝子座のグアニン−シトシン含量（「ＧＣ含量」）に関連する定量的尺度を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、（ｃ）に先立ち、第１のデータセットから、高変動遺伝子座である遺伝子座を除去することを含み、除去することは、（ｉ）グアニン−シトシン含量に関連する定量的尺度及び遺伝子座のシークエンシングリードカバレッジの定量的尺度に関連するモデルを適合させることと、（ｉｉ）遺伝子座から、遺伝子座の少なくとも１０％を除去することであって、この遺伝子座を除去することは、モデルと最も異なる遺伝子座を除去し、これにより、ベースライン化遺伝子座の第１のデータセットを提供することを含む、ことと、を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、遺伝子座の少なくとも４５％を除去することを含む。いくつかの実施形態では、コピー数状態の判定は、遺伝子座のリードカバレッジをベースラインリードカバレッジと比較することを含む。いくつかの実施形態では、無細胞体液は、血清、血漿、尿、及び脳脊髄液からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、リードカバレッジは、シークエンシングリードを参照ゲノムにマッピングすることにより判定される。いくつかの実施形態では、シークエンシングリードを得ることは、対象由来の無細胞体液由来のＤＮＡ分子にアダプターをライゲートすることを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ分子は、二重鎖ＤＮＡ分子であり、各アダプターが、ＤＮＡ分子の相補鎖を異なる形でタグ付けして、タグ付けされた鎖を提供するように、アダプターは、二重鎖ＤＮＡ分子にライゲートされる。いくつかの実施形態では、遺伝子座に由来するＤＮＡの鎖が、シークエンシングリード内に表される確率に関連する定量的尺度を判定することは、シークエンシングリードを、ペアリードと非ペアリードにソートすることを含み、（ｉ）各ペアリードは、セットにおける二本鎖ポリヌクレオチド分子に由来する第１のタグ付けされた鎖及び第２の異なる形でタグ付けされた相補鎖から生成された配列リードに対応し、（ｉｉ）各非ペアリードは、該配列リードのセットにおける該配列リード中に表される二本鎖ポリヌクレオチド分子に由来する第２の異なる形でタグ付けされた相補鎖を有しない第１のタグ付けされた鎖を表す。いくつかの実施形態では、本方法は、１つまたは複数の遺伝子座のそれぞれにマッピングする、（ｉ）ペアリードリード及び（ｉｉ）非ペアリードの定量的尺度を判定して、各遺伝子座にマッピングするペアリード及び非ペアリードに関連する定量的尺度に基づき、１つまたは複数の遺伝子座のそれぞれにマッピングする、試料における総二本鎖ＤＮＡ分子に関連する定量的尺度を判定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、アダプターは、バーコード配列を含む。いくつかの実施形態では、リードカバレッジの判定は、参照ゲノムへのシークエンシングリードのマッピングの位置及びバーコード配列に基づきシークエンシングリードを折りたたむことを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子座は、１つまたは複数のがん遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、方法は、対象の生殖系列ゲノムがヘテロ接合性であるベースライン化遺伝子座内の変異型の相対量を判定することにより、ベースライン化遺伝子座の少なくともサブセットが、対象の腫瘍細胞においてコピー数変化を受けたことを判定することを含む。いくつかの実施形態では、変異型の相対量は、ほぼ等しいわけではない。いくつかの実施形態では、変異型の相対量がほぼ等しいわけではないベースライン化遺伝子座は、ベースライン化遺伝子座から除去され、これにより、アレル頻度補正されたベースライン化遺伝子座を提供する。いくつかの実施形態では、アレル頻度補正されたベースライン化遺伝子座は、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法におけるベースライン化遺伝子座として使用される。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、メモリに、対象の無細胞体液試料のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子のシークエンシングリードを受け取ることと、コンピュータプロセッサを用いてコードを実施して、次のステップ：配列リードから、複数の遺伝子座における遺伝子座毎にシークエンシングリードカバレッジ（「リードカバレッジ」）に関連する定量的尺度を含む第１のデータセットを生成することと、飽和平衡補正及びプローブ効率補正を実施することにより、第１のデータセットを補正することと、第１のデータセットについてベースラインリードカバレッジを判定することであって、ベースラインリードカバレッジが、飽和平衡及びプローブ効率に関連する、ことと、ベースラインリードカバレッジと比べた複数の遺伝子座における遺伝子座毎のコピー数状態を判定することと、を遂行することと、を含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、ネットワークと、ネットワークに接続された核酸（例えば、ＤＮＡ）配列データを記憶するように構成されたコンピュータメモリを含むデータベースと、コンピュータメモリ及び１または複数のコンピュータプロセッサを含むバイオインフォマティクスコンピュータであって、ネットワークに接続されたコンピュータとを含むシステムを含むことができ、該コンピュータは、１または複数のコンピュータプロセッサによって実施される際に、データベースに記憶された核酸（例えば、ＤＮＡ）配列データをコピーし、コピーされたデータを、バイオインフォマティクスコンピュータにおけるメモリに書き出し、核酸（例えば、ＤＮＡ）配列データから、複数の遺伝子座における遺伝子座毎にシークエンシングリードカバレッジ（「リードカバレッジ」）に関連する定量的尺度を含む第１のデータセットを生成することと、飽和平衡補正及びプローブ効率補正を実施することにより、第１のデータセットを補正することと、第１のデータセットについてベースラインリードカバレッジを判定することであって、ベースラインリードカバレッジが、飽和平衡及びプローブ効率に関連する、ことと、ベースラインリードカバレッジと比べた複数の遺伝子座における遺伝子座毎のコピー数状態を判定することと、を含むステップを遂行する、機械実行可能なコードをさらに含む。いくつかの実施形態では、データベースは、ＤＮＡシーケンサーに接続される。
【０４０５】
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１７／０２６０５９０号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、（ａ）対象の生体試料由来のがん細胞由来のポリヌクレオチドのシークエンシングと、（ｂ）ポリヌクレオチドの体細胞変異を同定し、定量化することと、（ｃ）ポリヌクレオチドの複数の体細胞変異の存在及び相対量を示す対象の腫瘍不均一性のプロファイルを作成することであって、異なる相対量が腫瘍不均一性を示す、ことと、（ｄ）腫瘍の不均一性を示すがんの治療的介入を判定することであって、治療的介入が、判定された腫瘍の不均一性のプロファイルを有するがんに対して有効である、ことを含む方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、がん細胞は空間的に異なる。いくつかの実施形態では、治療的介入は、体細胞変異の全てではなくいずれか１つを呈するがんに対するよりも、複数の体細胞変異を呈するがんに対してより効果的である。いくつかの実施形態では、本方法はさらに、（ｅ）経時的に対象の腫瘍の不均一性の変化を監視し、変化に基づいて経時的に異なる治療的介入を判定することを含む。いくつかの実施形態では、本方法はさらに、（ｅ）治療的介入を表示することを含む。いくつかの実施形態では、本方法はさらに、（ｅ）治療的介入を実施することを含む。いくつかの実施形態では、本方法はさらに、（ｅ）腫瘍プロファイルに基づいて腫瘍進化の系統を生成することであって、治療的介入の判定は系統を考慮に入れる、ことを含む。いくつかの実施形態では、判定は、コンピュータ実行アルゴリズムを使用して実施する。いくつかの実施形態では、シークエンシングによって生成された配列リードは、同定及び定量化前にノイズ低減の対象となる。いくつかの実施形態では、ノイズ低減には、試料内の単一のポリヌクレオチドから生成された配列の分子トラッキングを含む。いくつかの実施形態では、治療的介入の判定には、腫瘍関連の遺伝子変化の相対度数を考慮する。いくつかの実施形態では、治療的介入は、複数の薬物を組み合わせて、または連続して投与することを含み、各薬物は、異なる相対度数で発生する体細胞変異の異なる１つを示すがんに対して比較的効果的である。いくつかの実施形態では、より高い相対度数で発生する体細胞変異を呈するがんに対して比較的有効な薬物は、より多くの量で投与される。いくつかの実施形態では、薬物は、ＤＮＡの変異型の相対量を反映するように層別した用量で送達される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝的変異型を呈するがんは、少なくとも１つの薬物に耐性がある。いくつかの実施形態では、治療的介入の判定には、がんの起源の組織が考慮される。いくつかの実施形態では、治療的介入は、各体細胞変異を特徴とする腫瘍の不均一性を有するがんを治療することが示されている介入のデータベースに基づいて判定される。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、腫瘍の不均一性が推測され得る腫瘍プロファイルを有するがんを有する対象に治療的介入を提供することを含む方法を含むことができ、該治療的介入は腫瘍プロファイルを有するがんに対して有効である。いくつかの実施形態では、腫瘍プロファイルは、複数のより多くの体細胞変異の相対度数を示す。いくつかの実施形態では、本方法は、経時的に対象の相対度数の変化を監視し、その変化に基づいて経時的に異なる治療的介入を判定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、治療的介入は、体細胞変異の全てではなくいずれか１つを呈するがんに対するよりも、体細胞変異のそれぞれを呈するがんに対してより効果的である。いくつかの実施形態では、治療的介入は、複数の薬物を組み合わせて、または連続して投与することを含み、各薬物は、異なる相対度数で発生する体細胞変異の異なる１つを示すがんに対して比較的効果的である。いくつかの実施形態では、より高い相対度数で発生する体細胞変異を呈するがんに対して比較的有効な薬物は、より多くの量で投与される。いくつかの実施形態では、薬物は、ＤＮＡの変異型の相対量を反映するように層別した用量で送達される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝的変異型を呈するがんは、少なくとも１つの薬物に耐性がある。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、コンピュータプロセッサによって実行される際に、以下の方法：（ａ）メモリに、遺伝子座にマッピングされたポリヌクレオチドの配列リードを受け取ることと、（ｂ）上記配列リードのうち、遺伝子座にマッピングされる配列リードの総数の遺伝子座での参照配列の塩基とは異なる塩基の同一性を判定することと、（ｃ）判定された塩基の同一性及び相対量、ならびにゲノム内のそれらの位置を報告することと、（ｄ）（ｃ）の情報に基づいて特定の試料の不均一性を推測することとを遂行する、機械実行可能なコードを含む、コンピュータ可読媒体を備えるシステムを含むことができる。いくつかの実施形態では、実施される方法は、複数の異なる時点で試料に由来する配列リードをメモリに受け取り、２つの試料間の複数の塩基の相対量の差及び同一性を計算することをさらに含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、（ａ）対象の疾患細胞（例えば、空間的に異なる疾患細胞など）からの生体分子ポリマーの生体分子分析の実施と、（ｂ）生体分子高分子における生体分子変異型を同定及び定量化することと、（ｃ）生体分子高分子における複数の変異型の存在及び相対量を示す、対象における疾患細胞不均一性のプロファイルを展開することであって、異なる相対量が、疾患細胞不均一性を示す、ことと、（ｄ）疾患細胞不均一性を示す疾患のための治療介入を判定することであって、治療介入が、判定された疾患細胞不均一性のプロファイルを有する疾患に対して有効であること、を含む方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、疾患細胞は、空間的に異なる疾患細胞である。いくつかの実施形態では、治療的介入は、各体細胞変異を特徴とする腫瘍の不均一性を有するがんを治療することが示されている介入のデータベースに基づいて判定される。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、対象の疾患細胞不均一性を検出する方法を含むことができ、該方法は、ａ）対象由来の試料からのポリヌクレオチドにおける複数の遺伝子座のそれぞれに配列変異型を有するポリヌクレオチドを定量化することであって、試料が、体細胞及び疾患細胞由来のポリヌクレオチドを含むことと、ｂ）各遺伝子座について、配列変異型を有するポリヌクレオチドのためのコピー数多型（ＣＮＶ）の測定値を判定することと、ｃ）各遺伝子座について、遺伝子座におけるＣＮＶの関数として、遺伝子座に配列変異型を有するポリヌクレオチドの量の重み付きされた測定値を判定することと、ｄ）複数の遺伝子座のそれぞれにおける重み付きされた測定値を比較することであって、異なる重み付きされた測定値が、疾患細胞不均一性を示すことと、を含む。いくつかの実施形態では、疾患細胞は腫瘍細胞である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはｃｆＤＮＡを含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、試料において細胞分裂を行っている細胞由来のＤＮＡの負荷の測定値を推定する方法であって、細胞の複製起点への１つまたは複数のゲノム遺伝子座の近接によって誘導されるコピー数多型を測定することを含み、ＣＮＶ増加が、細胞分裂を行っている細胞を示す方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、負荷は、無細胞ＤＮＡにおいて測定される。いくつかの実施形態では、負荷の測定値は、試料における腫瘍細胞のフラクションまたは腫瘍細胞由来のＤＮＡのゲノム当量に関連する。いくつかの実施形態では、複製起点に近接していることによるＣＮＶは、対照試料または細胞株のセットから推定される。いくつかの実施形態では、隠れマルコフモデル、回帰モデル、主成分分析に基づくモデル、または遺伝子型修飾モデルを使用して、複製起点に起因する変異を模倣する。いくつかの実施形態では、負荷の測定値は、細胞分裂を行っている細胞の存在または非存在である。いくつかの実施形態では、近接は、複製起点の１ｋｂ以内である。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、複製起点に近接していることに起因する多型の影響を和らげることにより、遺伝子関連のコピー数多型を判定する感度及び／または特異性を高める方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、本方法は、遺伝子座におけるＣＮＶを測定し、遺伝子座が複製起点に近接していることに起因するＣＮＶの量を判定し、例えば、細胞分裂に起因し得るＣＮＶの量を減算することにより、ゲノムＣＮＶを反映するように測定されたＣＮＶを補正することを含む。いくつかの実施形態では、ゲノムデータは、無細胞ＤＮＡから得られる。いくつかの実施形態では、負荷の測定値は、試料における腫瘍細胞のフラクションまたはＤＮＡのゲノム当量に関連する。いくつかの実施形態では、複製起点による多型は、対照試料または細胞株のセットから推定される。いくつかの実施形態では、隠れマルコフモデル、回帰モデル、主成分分析に基づくモデル、または遺伝子型修飾モデルを使用して、複製起点に起因する変異を模倣する。
【０４０６】
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１７／００６１０７２号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、体細胞及び生殖細胞由来の核酸分子の混合物など、対象の無細胞生体試料の体細胞供給源由来の単一ヌクレオチド変異（ＳＮＶ）の検出のための方法及びシステムを含むことができる。いくつかの実施形態では、本システム及び方法は、クラスラベル付きトレーニングデータを生成することと、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、及びチミン（Ｔ）の各ベースコールごとに１つの出力を有する機械学習ユニットを形成することと、生体試料のトレーニングセットで機械学習ユニットをトレーニングすることと、機械学習ユニットを適用して、無細胞生物試料中の体細胞供給源からＳＮＶを検出することであって、該無細胞生物試料が、体細胞及び生殖細胞供給源由来の核酸分子（例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ））の混合物、例えば、体細胞変異及び生殖細胞系ＤＮＡを含む細胞を含み得る、ことにより、対象の無細胞生体試料の体細胞供給源から単一ヌクレオチド変異（ＳＮＶ）を検出する。
【０４０７】
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１７／００５８３３２号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、体細胞または生殖細胞系変異型を検出する方法を含むことができ、該方法は、アッセイ混合物に所定のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を提供し、遺伝子アナライザーを使用して対象の試料の遺伝情報をキャプチャし、遺伝情報から遺伝的変異型を検出することと、を含み、変異型を、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）由来分子よりも長い長さを有するｇＤＮＡ由来の分子において存在する場合に生殖系列供給源由来として分類する。いくつかの実施形態では、ｇＤＮＡのフラグメント長は約２００塩基超である。いくつかの実施形態では、ｇＤＮＡのフラグメント長は、少なくとも４００塩基または少なくとも５００塩基である。いくつかの実施形態では、ｇＤＮＡのフラグメント長は、ｃｆＤＮＡフラグメント長の分布よりも長くなっている。いくつかの実施形態では、ｇＤＮＡは、アッセイ混合物に添加される。いくつかの実施形態では、ｇＤＮＡは、濾過操作後、アッセイ混合物中に残る。いくつかの実施形態では、ｇＤＮＡは、遠心分離操作後、アッセイ混合物中に残る。いくつかの実施形態では、約１％〜５％のｇＤＮＡがアッセイ混合物に添加される。いくつかの実施形態では、少なくとも１％のｇＤＮＡがアッセイ混合物に添加される。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、対象由来のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）と無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の両方を含む試料を提供することと、対象のｇＤＮＡ由来の生殖細胞系遺伝子型の少なくとも１つの遺伝子座を判定することと、ｃｆＤＮＡの各遺伝子座で少なくとも１つの遺伝的変異型の定量的測定値を判定することと、遺伝的変異型の定量的測定値が生殖細胞系遺伝子型と一致しているかどうかを判定することと、定量的測定値が生殖細胞系遺伝子型と一致する場合、遺伝的変異型を生殖細胞系変異型としてコールするか、または定量的測定値が生殖細胞系遺伝子型と一致しない場合、体細胞変異体としてコールする、ことと、を含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、対象由来の無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）において検出された遺伝的変異型の定量的測定を判定することと、測定が対象のヘテロ接合性遺伝子型と一致していると判定することと、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）由来の遺伝子座の対象の推定遺伝子型を判定することと、ｇＤＮＡ由来の遺伝子座の遺伝子型をｃｆＤＮＡにおいて検出された変異型と比較することと、ｃｆＤＮＡで検出された変異型がｇＤＮＡ由来の遺伝子座の遺伝子型と一致しない場合、その変異型を体細胞変異としてコールすることと、を含む方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、ｇＤＮＡ由来の遺伝子座の遺伝子型がホモ接合性であると判断された場合、その変異型を体細胞変異としてコールする。いくつかの実施形態では、ｇＤＮＡ由来の遺伝子座の遺伝子型が、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％からなる群から選択された信頼度でヘテロ接合性であると判断された場合、その変異型を体細胞変異としてコールする。いくつかの実施形態では、遺伝的変異型の定量的測定値を判定することは、ｃｆＤＮＡのシークエンシングを含む。いくつかの実施形態では、対象の推定遺伝子型を判定することは、対象由来のゲノムＤＮＡをシークエンシングすることを含む。いくつかの実施形態では、配列は、標的シークエンシング、単一分子リアルタイムシークエンシング、エクソンシークエンシング、電子顕微鏡に基づくシークエンシング、パネルシークエンシング、トランジスタ媒介性シークエンシング、直接シークエンシング、ランダムショットガンシークエンシング、サンガージデオキシ終結シークエンシング、全ゲノムシークエンシング、ハイブリダイゼーションによるシークエンシング、パイロシークエンシング、キャピラリー電気泳動、ゲル電気泳動、デュプレックスシークエンシング、サイクルシークエンシング、一塩基伸長シークエンシング、固相シークエンシング、ハイスループットシークエンシング、超並列シグネチャーシークエンシング、エマルションＰＣＲ、低変性温度ＰＣＲ（ＣＯＬＤ−ＰＣＲ）での共増幅、マルチプレックスＰＣＲ、可逆的ダイターミネーターによるシークエンシング、ペアエンドシークエンシング、ニアターム（ｎｅａｒ−ｔｅｒｍ）シークエンシング、エキソヌクレアーゼシークエンシング、ライゲーションによるシークエンシング、ショートリードシークエンシング、単一分子シークエンシング、合成によるシークエンシング法、リアルタイムシークエンシング、リバースターミネーターシークエンシング、ナノポアシークエンシング、４５４シークエンシング、Ｓｏｌｅｘａ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒシークエンシング、ＳＯＬｉＤ（商標）シークエンシング、ＭＳ−ＰＥＴシークエンシング、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【０４０８】
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＰ．Ｃ．Ｔ．公開番号ＷＯ２０１８／１１９４５２に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、及び一本鎖ＲＮＡから選択される少なくとも２つの形態の核酸を含む核酸集団を分析するための方法、組成物、及びシステムを含むことができる。いくつかの実施形態では、本方法は、（ａ）核酸の少なくとも１つの形態を少なくとも１つのタグ核酸と連結して、その形態を互いに区別することと、（ｂ）少なくとも１つが少なくとも１つの核酸タグに連結されている核酸の形態を増幅することであって、該核酸及び連結された核酸タグが、存在する場合、増幅され、増幅核酸を生成し、そのうち少なくとも１つの形態から増幅されたものがタグ付けされる、ことと、（ｃ）少なくとも一部がタグ付けされた増幅核酸の配列データをアッセイすることと、（ｄ）増幅核酸のタグ核酸分子を解読して、集団内の核酸の形態を明らかにし、配列データがアッセイされたタグ核酸分子に連結された増幅核酸の元の鋳型を提供することと、を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、１つまたは複数の他の形態に対して少なくとも１つの形態を濃縮することをさらに含む。いくつかの実施形態では、集団内の核酸の各形態の分子の少なくとも７０％がステップ（ｂ）で増幅される。いくつかの実施形態では、少なくとも３つの形態の核酸が集団に存在し、少なくとも２つの形態が、３つの形態のそれぞれを互いに区別する異なるタグ核酸形態に連結される。いくつかの実施形態では、集団内の少なくとも３つの形態の核酸のそれぞれは、異なるタグに連結される。いくつかの実施形態では、同じ形態の各分子は、同じ識別情報タグを含むタグ（例えば、同じまたは同じ配列を含むタグ）に連結される。いくつかの実施形態では、同じ形態の分子は、異なる種類のタグに連結される。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）は、集団内のＲＮＡから生成されたｃＤＮＡに組み込まれるタグ付けしたプライマーを用いて集団を逆転写に供することを含む。いくつかの実施形態では、逆転写は配列特異的である。いくつかの実施形態では、逆転写はランダムである。いくつかの実施形態では、本方法は、ｃＤＮＡへと二本鎖化したＲＮＡを分解することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、二本鎖ＤＮＡから一本鎖ＤＮＡを分離し、核酸タグを二本鎖ＤＮＡにライゲートすることをさらに含む。いくつかの実施形態では、一本鎖ＤＮＡは、１つまたは複数の捕捉プローブへのハイブリダイゼーションによって分離される。いくつかの実施形態では、本方法はさらに、一本鎖核酸上で機能するリガーゼを使用して一本鎖タグで一本鎖ＤＮＡを、及び二本鎖核酸上で機能するリガーゼを使用して二本鎖アダプターで二本鎖ＤＮＡを、別個にタグ付けすることを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、アッセイの前に、異なる形態の核酸を含むタグ付けした核酸をプールすることをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、個々のアッセイで分割されたＤＮＡのプールを別々に分析することをさらに含む。アッセイは、同じでも、実質的に類似でも、同等でも、または異なっていてもよい。上記の方法のいずれにおいても、配列データは、体細胞もしくは生殖細胞系変異型、またはコピー数多型もしくは単一ヌクレオチド変異、またはインデルもしくは遺伝子融合の存在を示すことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、修飾の程度が異なる核酸を含む核酸集団を分析する方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、疾患に関連する特性（例えば、５’メチルシトシンなど）のスクリーニング方法を含むことができる。本方法は、核酸集団を、修飾を有する核酸に優先的に結合する物質（例えば、メチル結合ドメインまたはタンパク質など）と接触させることと、該物質に結合した核酸の第１のプールを、該物質に結合していない核酸の第２のプールから分離することであって、核酸の第１のプールが修飾に対して過剰に提示され、第２のプール内の核酸が修飾に対して過少に提示される、ことと、第１のプール及び／または第２のプール内の核酸を、第１のプール及び第２のプール内の核酸を区別する１つまたは複数の核酸タグに連結して、タグ付けした核酸の集団を生成する、ことと、核酸及び連結タグが増幅されるタグ付けした核酸を増幅することと、増幅核酸及び連結タグの配列データをアッセイすることと、タグをデコードして、配列データがアッセイされた核酸が第１または第２のプールの鋳型から増幅されたかどうかを明らかにすることと、を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、核酸の少なくとも一部が１つまたは複数の修飾シトシン残基を含む核酸集団を分析する方法を含むことができる。本方法は、例えばビオチンなどの捕捉部分を集団内の核酸に連結して、増幅のための鋳型として機能させることと、増幅反応を実施して鋳型から増幅産物を生成することと、増幅産物から捕捉部分に連結された鋳型を分離することと、バイサルファイトシークエンシングにより、捕捉部分に連結された鋳型の配列データをアッセイすることと、増幅産物の配列データをアッセイすることと、を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、５−メチルシトシンの程度が異なる核酸を含む核酸集団を分析する方法を含むことができる。本方法は、（ａ）核酸集団を、５−メチル化核酸に優先的に結合する物質と接触させることと、（ｂ）該物質に結合した核酸の第１のプールを、該物質に結合していない核酸の第２のプールから分離することであって、核酸の第１のプールが５−メチルシトシンに対して過剰に提示され、第２のプール内の核酸が５−メチルシトシンに過少に提示される、ことと、（ｃ）第１のプール及び／または第２のプール内の核酸を、第１のプール及び第２のプール内の核酸を区別する１つまたは複数の核酸タグに連結することであって、該核酸タグが捕捉部分（例えば、ビオチン）を含む第１のプール内の核酸に連結される、ことと、（ｄ）核酸及び連結タグが増幅される標識核酸を増幅することと、（ｅ）捕捉部分を持たない増幅核酸から捕捉部分を持つ増幅核酸を分離することと、（ｆ）分離され、増幅された核酸の配列データをアッセイすることと、を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、及び一本鎖ＲＮＡから選択される少なくとも２つの形態の核酸を含む核酸集団を分析する方法を含むことができ、少なくとも２つの形態のそれぞれが複数の分子を含む該方法は、少なくとも１つの核酸の形態を少なくとも１つのタグ核酸と連結して、形態を互いに区別することと、少なくとも１つが少なくとも１つの核酸タグに連結されている核酸の形態を増幅することであって、該核酸及び連結された核酸タグが増幅され、増幅核酸を生成し、そのうち少なくとも１つの形態から増幅されたものがタグ付けされる、ことと、少なくとも一部がタグ付けされた増幅核酸の配列データをアッセイすることであって、該アッセイが、集団内の核酸の形態を明らかにして配列データがアッセイされたタグ核酸分子に連結した増幅核酸の元の鋳型を提供するために、増幅核酸のタグ核酸分子を解読するのに十分な配列情報を得ることと、を含む。一実施形態では、本方法は、集団内の核酸の形態を明らかにして配列データがアッセイされたタグ核酸分子に連結した増幅核酸の元の鋳型を提供するために、増幅核酸のタグ核酸分子を解読するステップをさらに含む。別の実施形態では、本方法は、１つまたは複数の他の形態に対して少なくとも１つの形態を濃縮することをさらに含む。別の実施形態では、集団内の核酸の各形態の分子の少なくとも７０％が増幅される。別の実施形態では、少なくとも３つの形態の核酸が集団に存在し、少なくとも２つの形態が、３つの形態のそれぞれを互いに区別する異なるタグ核酸形態に連結される。別の実施形態では、集団内の少なくとも３つの形態の核酸のそれぞれは、異なるタグに連結される。別の実施形態では、同じ形態の各分子は、同じタグ情報を含むタグに連結される。別の実施形態では、同じ形態の分子は、異なる種類のタグに連結される。別の実施形態では、本方法は、集団内のＲＮＡから生成されたｃＤＮＡに組み込まれるタグ付けしたプライマーを用いて集団を逆転写に供することをさらに含む。別の実施形態では、逆転写は配列特異的である。別の実施形態では、逆転写はランダムである。別の実施形態では、本方法は、ｃＤＮＡへと二本鎖化したＲＮＡを分解することをさらに含む。別の実施形態では、本方法は、二本鎖ＤＮＡから一本鎖ＤＮＡを分離し、核酸タグを二本鎖ＤＮＡにライゲートすることをさらに含む。別の実施形態では、一本鎖ＤＮＡは、１つまたは複数の捕捉プローブへのハイブリダイゼーションによって分離される。別の実施形態では、本方法は、ｃｉｒｃｌｉｇａｓｅで一本鎖ＤＮＡを環状化し、核酸タグを二本鎖ＤＮＡにライゲートすることをさらに含む。別の実施形態では、本方法は、アッセイの前に、異なる形態の核酸を含むタグ付けした核酸をプールすることを含む。別の実施形態では、核酸集団は体液試料に由来する。別の実施形態では、体液試料は、血液、血清、または血漿である。別の実施形態では、核酸集団は、無細胞核酸集団である。別の実施形態では、体液試料は、がんを有する疑いのある対象由来のものである。別の実施形態では、配列データは、体細胞または生殖細胞系変異型の存在を示す。別の実施形態では、配列データは、コピー数多型の存在を示す。別の実施形態では、配列データは、単一ヌクレオチド変異（ＳＮＶ）、インデル、または遺伝子融合の存在を示す。別の実施形態では、配列データは、単一ヌクレオチド変異（ＳＮＶ）、インデル、または遺伝子融合の存在を示す。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、対象の身体試料から採取した核酸分子の集団を提供することと、１つまたは複数の特性に基づいて核酸分子の集団を分別して、核酸分子の複数の群を生成することであって、該複数の群のそれぞれの核酸分子が、別個の識別子を含む、ことと、核酸分子の複数の群をプールすることと、プールされた核酸分子の複数の群をシークエンシングして、複数セットの配列リードを生成することと、識別子に基づいて配列リードを分別することと、を含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、無細胞ＤＮＡの断片化パターンを分析する方法を含むことができ、該方法は、生体試料から無細胞ＤＮＡの集団を提供することと、無細胞ＤＮＡの集団を分別し、これにより無細胞ＤＮＡの亜集団を生成することと、無細胞ＤＮＡの少なくとも１つの亜集団をシークエンシングし、これにより配列リードを生成することと、配列リードを参照ゲノムにアラインメントすることと、参照ゲノムの各塩基位置へマッピングされる各配列リードの長さ、配列リードの長さに応じて参照ゲノムの塩基位置へマッピングされる配列リードの数、参照ゲノムの各塩基位置で始まる配列リードの数、または、参照ゲノムの各塩基位置で終わる配列リードの数のいずれかの数を分析することにより、各亜集団の無細胞ＤＮＡの断片化パターンを判定することと、を含む。別の実施形態では、１つまたは複数の特性は、メチル化、ヒドロキシメチル化、ホルミル化、アセチル化、及びグリコシル化からなる群から選択される化学修飾を含む。
【０４０９】
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＰ．Ｃ．Ｔ．公開番号ＷＯ２０１８／００９７２３に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、無細胞核酸（例えば、ｃｆＤＮＡなど）を使用してヌクレオソームプロファイリングを実施するための方法、システム、及び組成物を含むことができる。これを使用して、新たなドライバー遺伝子を同定すること、コピー数多型（ＣＮＶ）を判定すること、体細胞変異ならびに融合及びインデルなどの構造多型を同定すること、ならびに上記の多型のいずれかを検出するための多重アッセイにおいて使用可能な領域を同定することができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、無細胞核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなど）の様々な使用を含むことができる。そのような使用には、疾患（例えば、がん）などの健康状態を有する、または有する疑いのある対象の治療を検出、モニタリング、及び判定することが含まれる。提供する方法は、起源組織、疾患、進行などを表すことができるフラグメントームプロファイルを評価するために、体細胞変異型情報を伴うまたは伴うことなく、配列情報をマクロスケールで包括的に使用し得る。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、対象から採取した無細胞ＤＮＡ由来のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）フラグメントにおける遺伝子異常の存在または非存在を判定するためのコンピュータ実装方法を含むことができ、該方法は、（ａ）コンピュータにより、ゲノム内の複数の塩基位置にわたるＤＮＡフラグメントのマルチパラメトリック分布を構築することと、（ｂ）対象の第１の遺伝子座における遺伝子異常の存在または非存在を判定するために、第１の遺伝子座における各塩基位置の塩基同一性を考慮に入れることなく、マルチパラメトリック分布を使用することと、を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子異常は配列異常を含む。いくつかの実施形態では、配列異常は単一ヌクレオチド変異型（ＳＮＶ）を含む。いくつかの実施形態では、配列異常は、挿入もしくは欠失（インデル）、または遺伝子融合を含む。いくつかの実施形態では、配列異常は、（ｉ）単一ヌクレオチド変異型（ＳＮＶ）、（ｉｉ）挿入または欠失（インデル）、及び（ｉｉｉ）遺伝子融合からなる群から選択される２つまたはそれより多くの異なるメンバーを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子異常は、コピー数多型（ＣＮＶ）を含む。いくつかの実施形態では、マルチパラメトリック分布は、ゲノム内の複数の塩基位置のそれぞれとアライメントするＤＮＡフラグメントの長さを示すパラメータを含む。いくつかの実施形態では、マルチパラメトリック分布は、ゲノム内の複数の塩基位置のそれぞれとアライメントするＤＮＡフラグメントの数を示すパラメータを含む。いくつかの実施形態では、マルチパラメトリック分布は、ゲノム内の複数の塩基位置のそれぞれで開始または終止するＤＮＡフラグメントの数を示すパラメータを含む。いくつかの実施形態では、マルチパラメトリック分布は、（ｉ）ゲノム内の複数の塩基位置のそれぞれとアラインメントするＤＮＡフラグメントの長さ、（ｉｉ）ゲノム内の複数の塩基位置のそれぞれとアラインメントするＤＮＡフラグメントの数、及び（ｉｉｉ）ゲノム内の複数の塩基位置のそれぞれで開始または終止するＤＮＡフラグメントの数のうちの２つまたはそれより多くを示すパラメータを含む。いくつかの実施形態では、マルチパラメトリック分布は（ｉ）ゲノム内の複数の塩基位置のそれぞれとアラインメントするＤＮＡフラグメントの長さ、（ｉｉ）ゲノム内の複数の塩基位置のそれぞれとアラインメントするＤＮＡフラグメントの数、及び（ｉｉｉ）ゲノム内の複数の塩基位置のそれぞれで開始または終止するＤＮＡフラグメントの数を示すパラメータを含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、対象が臨床的意義の１つまたは複数のクラスに属する可能性を判定するための分類器を作成する方法を含むことができ、該方法は、ａ）１つまたは複数の臨床的意義の各クラスについて、臨床的意義のクラスに属する種の複数の各対象及び臨床的意義のクラスに属していない種の複数の各対象由来の無細胞ＤＮＡの集団を含むトレーニングセットを提供することと、ｂ）無細胞ＤＮＡの集団由来の無細胞ＤＮＡフラグメントをシークエンシングして、複数のＤＮＡ配列を生成することと、ｃ）無細胞ＤＮＡの各集団について、複数のＤＮＡ配列を種の参照ゲノムの１つまたは複数の各ゲノム領域にマッピングすることであって、各ゲノム領域が複数の遺伝子座を含む、ことと、ｄ）無細胞ＤＮＡの各集団について、複数の遺伝子座のそれぞれについて、トレーニングセットを得るための、（ｉ）遺伝子座にマッピングされるＤＮＡ配列、（ｉｉ）遺伝子座で開始するＤＮＡ配列、及び（ｉｉｉ）遺伝子座で終止するＤＮＡ配列から選択される少なくとも１つの特性の定量的尺度を示す値を含むデータセットを準備することと、ｅ）トレーニングセットでコンピュータベースの機械学習システムをトレーニングすることにより、対象が臨床的意義の１つまたは複数のクラスに属する可能性を判定するための分類器を作成することと、を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、対象における異常な生物学的状態を判定する方法を含むことができ、該方法は、ａ）対象の無細胞ＤＮＡから無細胞ＤＮＡフラグメントをシークエンシングして、ＤＮＡ配列を生成することと、ｂ）対象の種の参照ゲノム中の１つまたは複数のゲノム領域のそれぞれにＤＮＡ配列をマッピングすることであって、各ゲノム領域が複数の遺伝子座を含む、ことと、ｃ）複数の各遺伝子座について、（ｉ）遺伝子座にマッピングされるＤＮＡ配列、（ｉｉ）遺伝子座で開始するＤＮＡ配列、及び（ｉｉｉ）遺伝子座で終止するＤＮＡ配列から選択される少なくとも１つの特徴の定量的測定値を示す値を含むデータセットを準備することと、ｄ）データセットに基づいて、異常な生物学的状態の可能性を判定することと、を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、対象から採取した無細胞ＤＮＡ由来のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）フラグメントにおける遺伝子異常の存在または非存在を示す出力を生成するためのコンピュータ実装方法を含むことができ、該方法は、（ａ）コンピュータにより、無細胞ＤＮＡ由来のＤＮＡフラグメントの分布を、ゲノムの複数の塩基位置にわたって構築することと、（ｂ）コンピュータにより、１つまたは複数の各遺伝子座について、（１）１つまたは複数の遺伝子座の遺伝子座に関連するジヌクレオソーム保護されたＤＮＡフラグメントの数と、（２）遺伝子座に関連するモノヌクレオソーム保護されたＤＮＡフラグメントの数、またはその逆の比率を示す定量的尺度を計算することと、（ｃ）１つまたは複数の各遺伝子座についての定量的尺度を使用して、対象の１つまたは複数の遺伝子座における遺伝子異常の存在または非存在を示す出力を判定することと、を含む。いくつかの実施形態では、分布は、１つまたは複数のマルチパラメトリック分布を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、対象から採取した無細胞ＤＮＡ由来のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）フラグメントの分布をデコンボリューションするためのコンピュータ実装方法を含むことができ、該方法は、（ａ）コンピュータにより、無細胞ＤＮＡ由来のＤＮＡフラグメントのカバレッジの分布を、ゲノムの複数の塩基位置にわたって構築することと、（ｂ）１つまたは複数の各遺伝子座について、コンピュータにより、カバレッジの分布をデコンボリューションし、これにより、コピー数（ＣＮ）成分、細胞クリアランス成分、及び遺伝子発現成分からなる群から選択される１つまたは複数のメンバーに関連する寄与率を生成することと、を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、試験対象から採取した無細胞ＤＮＡ由来のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）フラグメントを使用して試験対象の遺伝子異常を判定するためのコンピュータ実装分類器を含むことができ、該方法は、（ａ）複数の対象のそれぞれから採取した無細胞ＤＮＡの１つまたは複数の集団のそれぞれの分布スコアのセットの入力であって、各分布スコアが、（ｉ）ゲノム内の複数の塩基位置のそれぞれとアラインメントするＤＮＡフラグメントの長さ、（ｉｉ）ゲノム内の複数の塩基位置のそれぞれとアラインメントするＤＮＡフラグメントの数、及び（ｉｉｉ）ゲノム内の複数の塩基位置のそれぞれで開始または終止するＤＮＡフラグメントの数のうちの少なくとも１つまたは複数に基づいて生成される、入力と、（ｂ）試験対象の１つまたは複数の遺伝子異常の分類器の出力と、を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、トレーニングした分類器を作成するためのコンピュータ実装方法を含むことができ、該方法は、（ａ）複数の異なるクラスを提供することであって、各クラスが共通の特性を有する対象のセットを表す、ことと、（ｂ）各クラスから採取した複数の無細胞ＤＮＡ集団のそれぞれについて、無細胞デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）集団由来の無細胞ＤＮＡフラグメントを表すマルチパラメトリックモデルを提供し、これによりトレーニングデータセットを提供することと、（ｃ）コンピュータにより、トレーニングデータセットの学習アルゴリズムをトレーニングして、１つまたは複数のトレーニングされた分類器を作成することであって、各トレーニングされた分類器は、試験対象由来の無細胞ＤＮＡの試験集団を１つまたは複数の複数の異なるクラスに分類するように構成される、ことと、を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、対象由来の試験試料を分類する方法を含むことができ、該方法は、（ａ）対象由来の無細胞ＤＮＡの試験集団由来の無細胞デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）フラグメントを表すマルチパラメトリックモデルを提供することと、（ｂ）トレーニングされた分類器を使用して、無細胞ＤＮＡの試験集団を分類することと、を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、コンピュータ実装方法を含むことができ、該方法は、（ａ）コンピュータにより、対象由来の無細胞ＤＮＡフラグメントから配列情報を生成することと、（ｂ）コンピュータにより、配列情報に基づいて無細胞ＤＮＡフラグメントを参照ゲノムにマッピングすることと、（ｃ）コンピュータにより、マッピングされた無細胞ＤＮＡフラグメントを分析し、参照ゲノム内の複数の塩基位置のそれぞれで、（ｉ）塩基位置にマッピングされた無細胞ＤＮＡフラグメントの数、（ｉｉ）塩基位置にマッピングされた各無細胞ＤＮＡフラグメントの長さ、（ｉｉｉ）無細胞ＤＮＡフラグメントの長さに応じて塩基位置にマッピングされた無細胞ＤＮＡフラグメントの数、（ｉｖ）塩基位置で開始する無細胞ＤＮＡフラグメントの数、（ｖ）塩基位置で終止する無細胞ＤＮＡフラグメントの数、（ｖｉ）長さに応じて塩基位置で開始する無細胞ＤＮＡフラグメントの数、（ｖｉｉ）長さに応じて塩基位置で終止する無細胞ＤＮＡフラグメントの数からなる群から選択される複数の測定値を判定することと、を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、対象から採取した無細胞ＤＮＡ由来のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）フラグメントの分布をデコンボリューションするためのコンピュータ実装方法を含むことができ、該方法は、（ａ）コンピュータにより、無細胞ＤＮＡ由来のＤＮＡフラグメントのカバレッジの分布を、ゲノムの複数の塩基位置にわたって構築することと、（ｂ）１つまたは複数の各遺伝子座について、コンピュータにより、カバレッジの分布をデコンボリューションし、これにより、コピー数（ＣＮ）成分、細胞クリアランス成分、及び遺伝子発現成分からなる群から選択される１つまたは複数のメンバーに関連する寄与率を生成することと、
を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、寄与率の少なくとも一部に基づいて、遺伝子異常の存在または非存在を示す出力を生成することをさらに含む。
【０４１０】
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＰ．Ｃ．Ｔ．公開番号ＷＯ２０１７／１８１１４６に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、早期がん検出に使用され得る方法及びシステムを含むことができる。いくつかの実施形態では、本方法は、（ａ）対象由来のｃｆＤＮＡを含む試料を提供することであって、該対象ががんを検出可能に示さない、ことと、（ｂ）シークエンシングパネルに覆われた試料のｃｆＤＮＡ分子を捕捉することであって、該シークエンシングパネルが、複数の異なる遺伝子のそれぞれの１つまたは複数の領域を含み、（ｉ）該シークエンシングパネルが、５０，０００ヌクレオチド以下であり、（ｉｉ）異なる遺伝子のいずれかにおける腫瘍マーカーの存在が、対象ががんを有することを示し、（ｉｉｉ）がんを有する対象の少なくとも８０％が、複数の異なる遺伝子の少なくとも１つに存在する腫瘍マーカーを有する、ことと、（ｃ）捕捉されたｃｆＤＮＡ分子を、０．０１％という低い試料内の頻度で腫瘍マーカーを検出するのに十分な読み取り深度までシークエンシングすることと、を含む。いくつかの実施形態では、腫瘍マーカーは、一塩基置換、コピー数多型、インデル、遺伝子融合、塩基転換、転座、逆位、欠失、異数性、部分異数性、倍数性、染色体不安定性、染色体構造変化、染色体融合、遺伝子切断、遺伝子増幅、遺伝子複製、染色体損傷、ＤＮＡ損傷、核酸化学修飾の異常変化、エピジェネティックパターンの異常変化、及び核酸メチル化の異常変化からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、がんを有する対象の少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％が、複数の異なる遺伝子の少なくとも１つに存在する腫瘍マーカーを有する。いくつかの実施形態は、捕捉されたｃｆＤＮＡ分子を、０．００５％、０．００１％または０．０００５％という低い試料内の頻度で腫瘍マーカーを検出するのに十分な読み取り深度までシークエンシングすることを含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、ａ．対象由来の無細胞核酸（ｃｆＮＡ）分子を含む試料を提供することであって、該対象ががんを検出可能に示さない、ことと、ｂ．シークエンシングパネルに覆われた試料のｃｆＤＮＡ分子を捕捉することであって、該シークエンシングパネルが、複数の異なる遺伝子のそれぞれの１つまたは複数の領域を含み、ｉ．該シークエンシングパネルが５０，０００ヌクレオチド以下であり、ｉｉ．異なる遺伝子のいずれかにおける腫瘍マーカーの存在は対象ががんを有することを示し、ｉｉｉ．がんを有する対象の少なくとも８０％が複数の異なる遺伝子の少なくとも１つに存在する腫瘍マーカーを有する、ことと、ｃ．捕捉されたｃｆＤＮＡ分子を、１．０％、０．７５％、０．５％、０．２５％、０．１％、０．０７５％、０．０５％、０．０２５％、０．０１％、または０．００５％という低い試料内の頻度で腫瘍マーカーを検出するのに十分な読み取り深度までシークエンシングすることと、を含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、対象のがんを検出するための方法を含むことができ、該方法は、がんに関連する１つまたは複数の遺伝的変異型を検出するために、１塩基あたり少なくとも５０，０００リードの深さで対象由来の循環無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）をシークエンシングすることと、を含む。いくつかの実施形態では、シークエンシングは、１塩基あたり少なくとも１００，０００リードの深さである。いくつかの実施形態では、シークエンシングは、１塩基あたり約１２０，０００リードの深さである。いくつかの実施形態では、シークエンシングは、１塩基あたり約１５０，０００リードの深さである。いくつかの実施形態では、シークエンシングは、１塩基あたり約２００，０００リードの深さである。いくつかの実施形態では、１塩基あたりのリードは、少なくとも５，０００の元の核酸分子、少なくとも１０，０００の元の核酸分子、少なくとも２０，０００の元の核酸分子、少なくとも３０，０００の元の核酸分子、少なくとも４０，０００の元の核酸分子、または少なくとも５０，０００の元の核酸分子を表す。いくつかの実施形態では、本方法は、ｃｆＤＮＡの配列情報を、健康な個体のコホート、がん患者のコホート、または対象由来の生殖細胞系ＤＮＡから得られた配列情報と比較することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、シークエンシングの前にｃｆＤＮＡを増幅すること、及びシークエンシングから得られた配列リードからコンセンサス配列を判定して増幅またはシークエンシングからのエラーを低減することをさらに含む。いくつかの実施形態では、コンセンサス配列の判定は、分子ごとに実施される。いくつかの実施形態では、コンセンサス配列の判定は、塩基ごとに実施される。いくつかの実施形態では、コンセンサス配列の検出は、観測されたシークエンシング出力、ならびに個々の試料、試料のバッチ、または試料の参照セットのシークエンシング及び増幅エラープロファイル特性に基づいて潜在的ヌクレオチドのそれぞれの可能性を評価することに基づく。いくつかの実施形態では、コンセンサス配列の判定は、対象に由来する個々のｃｆＤＮＡ分子にタグを付加する分子バーコードを使用して実施する。いくつかの実施形態では、ヒト参照から逸脱したコンセンサス配列を有する分子のセットを、実験室で処理された他の試料で観察されたものと比較して、潜在的な汚染事象を判定し、除外した。いくつかの実施形態では、コンセンサス配列の判定は、コンセンサス配列を健康な個体のコホート、がん患者のコホート、または対象由来の生殖細胞系ＤＮＡから得られた配列情報と比較することにより最適化した。いくつかの実施形態では、本方法は、対象に由来する試料中のｃｆＤＮＡの少なくとも２０％がタグ付けされるように、ｃｆＤＮＡ分子にバーコードをタグ付けすることをさらに含む。いくつかの実施形態では、タグ付けは、バーコードを含むアダプターを結合させることによって実施する。いくつかの実施形態では、アダプターは、平滑末端アダプター、制限酵素オーバーハングアダプター、または単一ヌクレオチドオーバーハングを有するアダプターのいずれか、またはその全てを含む。いくつかの実施形態では、単一ヌクレオチドオーバーハングを有するアダプターは、Ｃテールアダプター、Ａテールアダプター、Ｔテールアダプター、及び／またはＧテールアダプターを含む。いくつかの実施形態では、タグ付けは、バーコードを有するプライマーを使用したＰＣＲ増幅によって実施する。いくつかの実施形態では、バーコードは一本鎖である。いくつかの実施形態では、バーコードは二本鎖である。いくつかの実施形態では、本方法は、ｃｆＤＮＡをパーティションに分割することをさらに含む。いくつかの実施形態では、各パーティション内のｃｆＤＮＡは、各パーティションごとに固有にタグ付けされる。いくつかの実施形態では、各パーティション内のｃｆＤＮＡは、各パーティションごとに非固有にタグ付けされる。いくつかの実施形態では、各パーティションのｃｆＤＮＡはタグ付けされない。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、がんを有する、またはがんを有すると疑われる対象において腫瘍を検出する方法を含むことができ、該方法は、（ａ）対象から採取した無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）試料に由来する無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）分子のシークエンシングと、（ｂ）シークエンシングに由来する配列リードを分析して、（ｉ）ｃｆＤＮＡ分子中での循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）及び（ｉｉ）ｃｆＤＮＡにおける１つまたは複数のドライバー変異、を同定することと、（ｃ）ｃｔＤＮＡ分子内の１つまたは複数のドライバー変異の存在、非存在、または量に関する情報を使用して、（ｉ）対象の腫瘍及び（ｉｉ）対象によって採られる腫瘍の治療のためのアクションを同定することと、を含む。本方法は、少なくとも８５％の感度、少なくとも９９％の特異性、及び少なくとも９９％の診断精度で対象の腫瘍を検出する。
【０４１１】
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＰ．Ｃ．Ｔ．公開番号ＷＯ２０１７／１３６６０３に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、がんの進化を検出またはモニタリングするための方法及びシステムを含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、コンピュータ実装方法を含むことができ、該方法は、（ａ）第１の時点において、がんを有する複数の対象に関する情報を得ることであって、該情報が、複数の対象のそれぞれの対象について、少なくとも、無細胞体液からの核酸のジェノタイピングを行うことによって得られた腫瘍の遺伝子プロファイル及び第１の時点の前に対象に提供された任意の処置を含む、ことと、第１の状態のセットを生成するために第１の時点での情報に基づいて複数の対象のそれぞれの第１の状態を判定することと、（ｂ）第１の時点よりも後の１つまたは複数の第２の時点において、複数の対象に関する情報を得て、１つまたは複数の第２の時点のうちの所与の一時点における情報に基づいて、後続状態のセットを生成する、１つまたは複数の第２の時点のそれぞれにおける複数の対象のそれぞれの第２の状態を判定することと、（ｃ）（ａ）の第１の状態のセット及び（ｂ）の後続状態のセットを使用することであって、所与の第１の状態が、所与の第１の状態よりも後の後期時点における状態のセットの中で、第２の状態をもたらす確率を判定するように構成される予測アルゴリズムを生成することと、を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、（ｄ）早期時点における状態のセットの中での所与の第１の状態に関して、所与の第１の状態が、後期時点における状態のセットの中で第２の状態をもたらす確率を判定することと、（ｅ）（ｄ）において判定された確率を示す電子出力を生成することとをさらに含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、コンピュータ実装方法を含むことができ、該方法は、（ａ）第１の時点において、がんを有する複数の対象に関する情報を得ることであって、該情報が、複数の対象のそれぞれの対象について、少なくとも５０個の遺伝子のジェノタイピングを行うことによって得られた腫瘍の遺伝子プロファイル及び第１の時点の前に対象に提供された任意の処置を含む、ことと、第１の状態のセットを生成するために第１の時点での情報に基づいて複数の対象のそれぞれの第１の状態を判定することと、（ｂ）第１の時点よりも後の１つまたは複数の第２の時点において、複数の対象に関する情報を得て、１つまたは複数の第２の時点のうちの所与の一時点における情報に基づいて、後続状態のセットを生成する、１つまたは複数の第２の時点のそれぞれにおける複数の対象のそれぞれの第２の状態を判定することと、（ｃ）（ａ）の第１の状態のセット及び（ｂ）の後続状態のセットを使用することであって、所与の第１の状態が、所与の第１の状態よりも後の後期時点における状態のセットの中で、第２の状態をもたらす確率を判定するように構成される予測アルゴリズムを生成することと、を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、（ｄ）早期時点における状態のセットの中での所与の第１の状態に関して、所与の第１の状態が、後期時点における状態のセットの中で第２の状態をもたらす確率を判定することと、（ｅ）（ｄ）において判定された確率を示す電子出力を生成することとをさらに含む。いくつかの実施形態では、情報を得ることは、複数の対象由来の無細胞デオキシリボ核酸（ｃｆＤＮＡ）をシークエンシングすることと、任意選択で、複数の対象のそれぞれの問診を実施することと、を含む。いくつかの実施形態では、処置は、第１の時点の前に対象に提供された。いくつかの実施形態では、本方法は、１つまたは複数の決定木を生成することを含み、それぞれの決定木が、ルートノード、１つまたは複数の決定ブランチ、１つまたは複数の決定ノード、及び１つまたは複数の終端ノードを含み、ルートノードにおける状態が、第１の時点を表し、１つまたは複数の決定ブランチが、代替処置を表し、１つまたは複数の決定ノード及び１つまたは複数の終端ノードが、後続状態を表す。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の決定ブランチは、複数の決定ブランチを含む。いくつかの実施形態では、後続状態は、対象が生きているかまたは死んでいるかを示す対象の生存状態（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、後続状態は、対象生存率を含む。いくつかの実施形態では、第１の状態のそれぞれは、１つまたは複数の体細胞変異の共通のセットを含む。いくつかの実施形態では、情報は、対象のプロファイルをさらに含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、（ａ）第１の時点において、がんを有する対象に関する情報を得ることであって、該情報が、患者プロファイル、腫瘍プロファイル、または処置から対象の少なくとも１つの特徴を含む、ことと、（ｂ）第１の時点における情報に基づいて、対象の初期状態を判定することと、（ｃ）対象の初期状態に基づいて、１つまたは複数の後続時点のそれぞれにおいて、複数の後続状態のそれぞれの確率を判定し、それにより状態の転帰に関する確率のセットを提供することと、（ｄ）状態の転帰に関する確率のセットに少なくとも部分的に基づいて、対象が特定の転帰を得る確率を最適化する、がんの処置の推奨を作成することと、（ｅ）（ｄ）において作成された推奨を示す電子出力を生成することと、を含む方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、確率は、少なくとも部分的に、複数の処置選択肢の中からの処置選択の関数である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の後続時点は、複数の後続時点を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、複数の後続時点において、確率を判定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、時点は、少なくとも３つの時点を含む。いくつかの実施形態では、時点は、少なくとも４つの時点を含む。いくつかの実施形態では、第１の時点は、対象が処置を受ける前であり、後続時点は、対象が処置を受けた後である。いくつかの実施形態では、第２の処置が、後続時点における後続状態に基づいて、後続時点の後に投与される。いくつかの実施形態では、対象の少なくとも１つの特徴は、患者プロファイルからであり、年齢、性別、遺伝子プロファイル、酵素レベル、器官機能、生活の質、医療介入の頻度、寛解の状況、及び患者の転帰からなる群から選択される。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、（ａ）通信ネットワーク上で、１つまたは複数の医療サービス提供者との１つまたは複数の通信リンクを確立することと、（ｂ）通信ネットワーク上で、１つまたは複数の医療サービス提供者から、１つまたは複数の対象に関する医療情報を受信することと、（ｃ）医療サービス提供者から、１つまたは複数の対象のそれぞれに由来する無細胞デオキシリボ核酸（ｃｆＤＮＡ）を含む１つまたは複数の試料を受け取ることと、（ｄ）ｃｆＤＮＡをシークエンシングし、ｃｆＤＮＡに存在する１つまたは複数の遺伝的変異型を同定することと、（ｅ）１つまたは複数の対象のそれぞれについての情報を有するデータベースを作成または供給することであって、該情報が、同定された遺伝的変異型及び受信された医療情報の両方を含む、ことと、（ｆ）データベース及びコンピュータにより実装されるアルゴリズムを使用して、対象の初期状態に基づいて、複数の異なる治療介入のそれぞれについて、後続状態の確率を予測する、少なくとも１つの予測モデルを生成することと、を含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、１つまたは複数のコンピュータプロセッサによって実行される際に、以下の方法：（ａ）第１の時点において、がんを有する複数の対象に関する情報を得ることであって、該情報が、複数の対象のそれぞれの対象について、少なくとも、無細胞体液からの核酸のジェノタイピングを行うことによって得られた腫瘍の遺伝子プロファイル及び第１の時点の前に対象に提供された任意の処置を含む、ことと、第１の状態のセットを生成するために第１の時点での情報に基づいて複数の対象のそれぞれの第１の状態を判定することと、（ｂ）第１の時点よりも後の１つまたは複数の第２の時点において、複数の対象に関する情報を得て、１つまたは複数の第２の時点のうちの所与の一時点における情報に基づいて、後続状態のセットを生成する、１つまたは複数の第２の時点のそれぞれにおける複数の対象のそれぞれの第２の状態を判定することと、（ｃ）（ａ）の第１の状態のセット及び（ｂ）の後続状態のセットを使用することであって、所与の第１の状態が、所与の第１の状態よりも後の後期時点における状態のセットの中で、第２の状態をもたらす確率を判定するように構成される予測アルゴリズムを生成することと、を遂行する、機械実行可能なコードを含む、非一時的なコンピュータ可読媒体を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出には、（ａ）対象に関する、少なくとも、腫瘍の遺伝子プロファイル及び対象に以前提供されていたかまたは現在提供されている処置があればそれを含む、情報を得て、該情報に基づいて、対象の初期状態を判定することと、（ｂ）決定木を提供することであって、ルートノードが、初期対象状態を表し、決定ブランチが、対象に利用可能な代替処置を表し、機会ノードが、不確実性の点を表し、決定ノードまたは終端ノードが、後続状態を表す、ことと、（ｃ）対象が終端ノードにおいて生存している状態を達成する確率を最大化する、対象の処置過程を提供することと、（ｄ）処置過程を対象に投与することと、を含む方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、本方法は、（ｅ）初期状態よりも後の第２の時点において、対象に関する、少なくとも、腫瘍の遺伝子プロファイル及び対象に以前提供されていたかまたは現在提供されている処置があればそれを含む、情報を得て、該情報に基づいて、複数の後続状態の中から、対象の第２の状態を判定することと、（ｆ）第２の状態に基づいて、対象が終端ノードにおいて生存している状態を達成する確率を最大化する、対象の後続の処置過程を提供することと、（ｇ）後続の処置過程を対象に投与することと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、（ｅ）初期状態よりも後の第２の時点において、対象に関する、少なくとも、腫瘍の遺伝子プロファイル及び対象に以前提供されていたかまたは現在提供されている処置があればそれを含む、情報を得て、該情報に基づいて、複数の後続状態の中から、対象の第２の状態を判定することと、（ｆ）第２の状態に基づいて、対象が終端ノードにおいて生存している状態を達成する確率を最大化する、対象の後続の処置過程を提供することと、（ｇ）後続の処置過程を対象に投与することと、をさらに含む。
【０４１２】
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第１０，０１７，７５９号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、核酸フラグメントのライブラリを調製する方法、より具体的には、例えば次世代ＤＮＡシークエンシングを含む様々な用途のためのプロテアーゼを使用して単一チューブ内で核酸フラグメントのライブラリを調製する方法を含むことができる。加えて、（ａ）細胞集団を溶解試薬と直接接触させて細胞溶解液を生成することであって、該溶解試薬は１つまたは複数のプロテアーゼを有し、該細胞溶解液は標的核酸を含む、ことと、（ｂ）１つまたは複数のプロテアーゼを不活性化して不活性化された細胞溶解液を形成することと、（ｃ）標的核酸及びトランスポゾン末端組成物が転位反応を受けて混合物を生成する条件下で、少なくとも１つのトランスポザーゼ及び転移鎖を含む少なくとも１つのトランスポゾン末端組成物を不活性化細胞溶解液に直接適用することであって、（ｉ）該標的核酸を断片化して複数の標的核酸フラグメントを生成し、（ｉｉ）トランスポゾン末端組成物の転移鎖を複数の標的核酸フラグメントのそれぞれの５’末端に結合して、複数の５’タグ付けした標的核酸フラグメントを生成する、ことと、を含むタグ付けした核酸フラグメントのライブラリを調製する方法である。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）は、単一の反応混合物、例えばチューブ内で実施される。いくつかの実施形態では、細胞の集団は、細胞の最小集団である。いくつかの実施形態では、細胞の最小集団には、１、２、３、４、または５個の細胞が含まれる。いくつかの実施形態では、標的核酸は二本鎖ＤＮＡであり、該標的核酸は、ステップ（ｃ）でトランスポザーゼ及びトランスポゾン末端組成物を適用する前に二本鎖ＤＮＡのままである。いくつかの実施形態では、標的核酸はゲノムＤＮＡである。いくつかの実施形態では、標的核酸は染色体ＤＮＡまたはそのフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸には、ゲノムまたは部分ゲノムが含まれる。いくつかの実施形態では、本方法は、（ｄ）３’タグが５’タグ付けした標的核酸フラグメントに結合して複数の二重タグ付けした（ｄｉ−ｔａｇｇｅｄ）標的核酸フラグメントを生成する条件下で、ステップ（ｃ）の混合物を、少なくとも１つの核酸修飾酵素と直接インキュベートすることをさらに含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、及び（ｄ）は単一の反応チューブで実施される。いくつかの実施形態では、本方法は、（ｅ）１つまたは複数の二重タグ付けした標的核酸フラグメントを増幅して、二重タグ付けした核酸フラグメントの５’末端及び／または３’末端に追加配列を有するタグ付けした核酸フラグメントのライブラリを生成することをさらに含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、及び（ｅ）は単一の反応チューブで実施される。いくつかの実施形態では、増幅には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅反応、ローリングサークル増幅反応、リガーゼ連鎖反応、転写媒介増幅反応、またはループ媒介増幅反応の１つまたは複数の使用を含む。いくつかの実施形態では、増幅には、二重タグ付けした標的ＤＮＡフラグメントの３’タグに相補的な単一のプライマーを使用したＰＣＲを含む。いくつかの実施形態では、増幅は、第１及び第２のプライマーを使用するＰＣＲを含み、第１のプライマーの少なくとも３’末端部分は、二重タグ付け標的核酸フラグメントの３’タグの少なくとも一部に相補的であり、第２のプライマーの少なくとも３’末端部分は、二重タグ付けした標的核酸フラグメントの５’タグの少なくとも一部の配列を示す。いくつかの実施形態では、第１のプライマーの５’末端部分は、二重タグ付けした標的核酸フラグメントの３’タグに対して非相補的であり、第２のプライマーの５’末端部分は、二重タグ付けした標的核酸フラグメントの５’タグの少なくとも一部の配列を示さない。いくつかの実施形態では、第１のプライマーは第１のユニバーサル配列を含み、及び／または第２のプライマーは第２のユニバーサル配列を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、タグ付けした核酸フラグメントをシークエンシングすることをさらに含む。いくつかの実施形態では、タグ付けした核酸フラグメントのシークエンシングには、合成によるシークエンシング法、ブリッジＰＣＲ、連鎖停止シークエンシング、ハイブリダイゼーションによるシークエンシング、ナノポアシークエンシング、及びライゲーションによるシークエンシングの１つまたは複数の使用を含む。いくつかの実施形態では、タグ付けした核酸フラグメントのシークエンシングには、次世代シークエンシングの使用を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、コピー数多型を分析することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、単一ヌクレオチド変異を分析することをさらに含む。
【０４１３】
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，９４４，９２４号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、次世代シークエンシングにおける特定用途向け捕捉プライマーの使用を含むことができる。固定化された捕捉プライマーを改変する方法には、以下：ａ）ｉ）特定用途向け捕捉領域を含む３’部分及びｉｉ）ユニバーサル捕捉領域を含む５’部分を含む、固定化された特定用途向け捕捉プライマーを有する固体支持体を提供することと、ｂ）固定化された特定用途向けポリヌクレオチドを生成するためにハイブリダイゼーションに十分な条件下で特定用途向けポリヌクレオチドを特定用途向け捕捉プライマーと接触させることと、ｃ）特定用途向けポリヌクレオチドにハイブリダイズしていない特定用途向け捕捉プライマーの特定用途向け捕捉領域を取り除き、ハイブリダイズされていない特定用途向け捕捉プライマーをユニバーサル捕捉プライマーに変換することと、を含むことができる。いくつかの実施形態では、特定用途向け捕捉領域の一部が取り除かれる。いくつかの実施形態では、特定用途向け捕捉プライマーは、複数の異なる特定用途向け固定化捕捉プライマーを含む。いくつかの実施形態では、特定用途向けポリヌクレオチドは、複数の異なる特定用途向けポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、特定用途向け捕捉領域は標的特異的な捕捉領域を含み、特定用途向けポリヌクレオチドは標的ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、特定用途向け捕捉領域はトランスポゾン末端（ＴＥ）領域を含み、特定用途向けポリヌクレオチドはＴＥオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ステップｃ）の実行前に、特定用途向け捕捉プライマーのユニバーサル捕捉領域とのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションに十分な条件下でオリゴヌクレオチドを適用して、二本鎖ＤＮＡ領域を生成することをさらに含む。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドはＰ５またはＰ７オリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、本方法は、ステップｃ）の実行前に、特定用途向け捕捉プライマーの特定用途向け捕捉領域とのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションに十分な条件下でオリゴヌクレオチドを適用して、二本鎖ＤＮＡ領域を生成することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、特定用途向け捕捉プライマーをヌクレアーゼと接触させることをさらに含み、特定用途向けポリヌクレオチドとハイブリダイズしない特定用途向け捕捉プライマーの特定用途向け捕捉領域はヌクレアーゼによって除去される。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼはエキソヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、エキソヌクレアーゼはエキソヌクレアーゼＩである。いくつかの実施形態では、エキソヌクレアーゼはエキソヌクレアーゼＩＩＩである。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼはエンドヌクレアーゼである。
【０４１４】
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，９９２５９８号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、アンプリコン調製のための方法を含むことができる。本方法は、（ａ）複数の標的ポリヌクレオチドを含む核酸試料を、ハイブリダイゼーションにとって十分な条件下で少なくとも１つのプライマーと接触させることであって、該少なくとも１つのプライマーはアダプターを含む、ことと、（ｂ）複数のアンプリコンを生成するために、複数の標的ポリヌクレオチドをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅することと、（ｃ）固体支持体に固定化した複数の標的特異的捕捉プライマーを、ハイブリダイゼーションに十分な条件下で該複数のアンプリコンと直接的に接触させて、第１の複数の固定化アンプリコンを生成することであって、該固体支持体はさらに、複数のユニバーサル捕捉プライマーを含む、ことと、（ｄ）該複数の標的特異的捕捉プライマーを伸長させて、標的ポリヌクレオチドに対し相補的な複数の固定化伸長生成物を生成することと、（ｅ）該複数の固定化伸長生成物に対して複数のユニバーサル捕捉プライマーをアニールすることと、（ｆ）ＰＣＲにより該複数の固定化伸長生成物を増幅し、第２の複数の固定化アンプリコンを生成することであって、該固定化アンプリコンの集団は８５％以上の均一性を備える、ことと、を含む。本方法は、１０ｎｇ以下の入力核酸とともに使用することが可能であり、さらに、第２の複数の固定化アンプリコンのシークエンシングを含むことが可能である。本方法はまた、がん関連遺伝子を含む、障害または疾患に関連した遺伝子の存在を判定するために使用可能である。無細胞ＤＮＡも本方法で用いることが可能である。加えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、核酸配列変異型の検出感度を高める方法を含むことができ、該方法は、（ａ）複数の標的ポリヌクレオチドを含む核酸試料を、ハイブリダイゼーションに十分な条件下で遺伝子特異的フォワードプライマー及びリバースプライマーと接触させることであって、該遺伝子特異的フォワードプライマーの各種は固有の配列インデックス及びアダプターを含む、ことと、（ｂ）複数のアンプリコンを生成するために、複数の標的ポリヌクレオチドをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅することと、（ｃ）固体支持体に固定化した複数の標的特異的捕捉プライマーを、ハイブリダイゼーションに十分な条件下で該複数のアンプリコンと直接的に接触させて、第１の複数の固定化アンプリコンを生成することであって、該固体支持体はさらに、複数のユニバーサル捕捉プライマーを含む、ことと、（ｄ）該複数の標的特異的捕捉プライマーを伸長させて、標的ポリヌクレオチドに対し相補的な複数の固定化伸長生成物を生成することと、（ｅ）該複数の固定化伸長生成物に対して複数のユニバーサル捕捉プライマーをアニールすることと、（ｆ）ＰＣＲにより該複数の固定化伸長生成物を増幅し、第２の複数の固定化アンプリコンを生成することであって、該第２の複数の固定化アンプリコンは８５％以上の均一性を備える、ことと、（ｇ）該第２の複数の固定化アンプリコンをシークエンシングすることと、（ｈ）標的ポリヌクレオチド種に関して、変異型位置にある３つ以上のヌクレオチド配列を比較することにより、１つまたは複数の標的ポリヌクレオチドに関するランダムな配列エラーを解消することであって、該標的ポリヌクレオチド種を固有の配列インデックスにより同定し、これにより１つまたは複数の標的ポリヌクレオチドにおける真のヌクレオチド配列変異型を判定する、ことと、を含む。本方法は、変異型ヌクレオチド位置について０．３％以下のミスマッチ率を検出することが可能である。
【０４１５】
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，８７９，３１２号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出には、核酸の選択的濃縮法を含むことができる。いくつかの実施形態は、標的核酸を含む長い核酸の選択的濃縮を含む。いくつかの実施形態は、ＰＣＲ産物の選択的濃縮を含む。上記方法のいくつかの実施形態は、（ａ）核酸の集団をニッカーゼと接触させ、これにより、ニックの入った核酸の集団を生成することと、（ｂ）ニックの入った核酸の集団をエキソヌクレアーゼと接触させ、これにより、一本鎖部分を有する核酸が生成され、該一本鎖部分が標的の少なくとも一部を含む、ことと、（ｃ）捕捉プローブを標的の少なくとも一部に接触させ、該プローブが標的にハイブリダイズする、ことと、（ｄ）捕捉プローブに結合していない核酸から捕捉プローブにハイブリダイズした核酸を分離することと、を含む。他の実施形態では、本方法は、（ａ）集団内の核酸の少なくともいくつかが標的を含む、核酸の集団を得ることと、（ｂ）核酸の集団をニッカーゼと接触させ、これにより、ニックの入った核酸の集団を生成することと、（ｃ）ニックの入った核酸の集団をエキソヌクレアーゼと接触させ、これにより、一本鎖部分を有する核酸が生成され、該一本鎖部分が標的の少なくとも一部を含む、ことと、（ｄ）捕捉プローブを標的の少なくとも一部に接触させ、該プローブが標的にハイブリダイズする、ことと、（ｅ）捕捉プローブに結合していない核酸から捕捉プローブにハイブリダイズした核酸を分離することと、を含む。本方法のいくつかの実施形態は、捕捉プローブからハイブリダイズした核酸を放出するステップも含む。他の実施形態はまた、標的を増幅することを含む。なおさらなる実施形態は、標的の少なくとも一部をシークエンシングすることをさらに含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のプロセスステップ、例えばステップ（ａ）は、二本鎖核酸の集団をニッカーゼのアイソシゾマーを含むＩＩ型制限エンドヌクレアーゼと接触させることと、個々の核酸の分子内再循環を促進する条件下で、切断された二本鎖核酸を再循環させることもまた含むことができる。かかる実施形態において、様々なＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ、またはＩＩ型制限エンドヌクレアーゼの組み合わせを使用することができる。いくつかの実施形態では、例えば、制限エンドヌクレアーゼにはＢｂｖＣＩを含む。他の実施形態では、ニッカーゼはＮｂ．ＢｂｖＣＩ及びＮｔ．ＢｂｖＣＩを含む。上記方法のいくつかの実施形態では、プローブは捕捉部分を含む。一部のそのような実施形態では、捕捉部分はビオチンまたはストレプトアビジンを含む。いくつかの実施形態では、捕捉プローブに結合していない核酸から捕捉プローブにハイブリダイズした核酸を分離するステップは、ハイブリダイズした標的及びプローブを結合部分に接触させることも含む。いくつかの実施形態では、結合部分は、アビジン及びストレプトアビジンを含む。いくつかの実施形態では、結合部分はまた、ビーズ、ミクロスフェア、または他の粒子を含む。方法の実施形態は、プロセスの１つまたは複数のステップを繰り返すことも含む。ある特定の実施形態では、方法の全てのステップは繰り返される。上記方法のいくつかの実施形態では、標的は第１の捕捉部分を含み、プローブは第２の捕捉部分を含む。一部のそのような実施形態はまた、第１の捕捉部分を第１の結合部分に接触させ、それにより、標的の濃縮をもたらすことと、第２の捕捉部分を第２の結合部分に接触させ、それにより、プローブの濃縮をもたらすことと、を含む。上記に加えて、前述の方法のいくつかの実施形態は、以下のステップ：（ａ）核酸の集団を提供することであって、集団中の少なくとも一部の核酸が捕捉プローブとハイブリダイズした標的を含む、ことと、（ｂ）ハイブリダイズしたプローブを標的にロックさせることと、（ｃ）プローブにロックされた核酸を、プローブにロックされていない核酸から分離することを含む核酸の選択的濃縮ももたらす。他の実施形態では、本方法は、（ａ）集団内の核酸の少なくとも一部が標的を含む、核酸の集団を得ることと、（ｂ）標的を捕捉プローブとハイブリダイズさせることと、（ｃ）プローブハイブリダイズしたプローブを標的にロックすることと、（ｄ）プローブにロックされた核酸を、プローブにロックされていない核酸から分離することと、を含む。上記に加えて、本方法のいくつかの実施形態は、核酸の選択的濃縮のための以下の方法：（ａ）集団内の核酸の少なくとも一部が、核酸の５’末端の一部及び核酸の３’末端の一部を含む標的を含む、核酸の集団を提供することであって、該標的は一緒にアニールされた第１及び第２のオリゴヌクレオチドを含むセレクタープローブにハイブリダイズされ、第１のオリゴヌクレオチドは、核酸の５’末端の少なくとも一部に相補的であり、第２のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部に相補的であり、第２のオリゴヌクレオチドは、核酸の３’末端の少なくとも一部に相補的である、ことと、（ｂ）セレクタープローブを標的に結合することと、（ｃ）セレクタープローブに結合した核酸を、セレクタープローブに結合していない核酸から分離する、ことも含む。濃縮方法の他の実施形態は、以下のステップ：（ａ）集団内の核酸の少なくとも一部が標的を含む、核酸の集団を得ることであって、該標的が核酸の５’末端の一部及び核酸の３’末端の一部を含む、ことと、（ｂ）一緒にアニールされた第１及び第２のオリゴヌクレオチドを含むセレクタープローブを得ることであって、第１のオリゴヌクレオチドは核酸の５’末端の少なくとも一部に相補的であり、第２のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部に相補的であり、第２のオリゴヌクレオチドは、核酸の３’末端の少なくとも一部に相補的である、ことと、（ｃ）セレクタープローブを標的に接触させることであって、該プローブは標的にハイブリダイズする、ことと、（ｄ）セレクタープローブを標的に結合させることと、（ｅ）セレクタープローブに結合した核酸を、セレクタープローブに結合していない核酸から分離することと、を含む。上記に加えて、本方法のいくつかの実施形態は、核酸の選択的濃縮のための以下の方法：（ａ）集団内の核酸の少なくとも一部が、核酸の５’末端及び核酸の３’末端を含む標的を含む、一本鎖核酸の集団を提供することであって、該標的は一緒にアニールされた第１及び第２のオリゴヌクレオチドを含むセレクタープローブにハイブリダイズされ、第１のオリゴヌクレオチドは、核酸の３’末端に相補的な５’部分、スペーサー部分、及び核酸の５’末端に相補的な３’部分を含み、第２のオリゴヌクレオチドは、スペーサー部分に相補的である、ことと、（ｂ）セレクタープローブを標的に結合することと、（ｃ）セレクタープローブに結合した核酸を、セレクタープローブに結合していない核酸から分離する、ことも含む。上記方法の他の実施形態は、（ａ）集団内の核酸の少なくとも一部が標的を含む、一本鎖核酸の集団を得ることであって、該標的が核酸の５’末端及び核酸の３’末端を含む、ことと、（ｂ）一緒にアニールされた第１及び第２のオリゴヌクレオチドを含むセレクタープローブを得ることであって、第１のオリゴヌクレオチドは、核酸の３’末端に相補的な５’部分、スペーサー部分、及び核酸の５’末端に相補的な３’部分を含み、第２オリゴヌクレオチドは、スペーサー部分に相補的である、ことと、（ｃ）セレクタープローブを標的に接触させることであって、該プローブは標的にハイブリダイズする、ことと、（ｄ）セレクタープローブを標的に結合させることと、（ｅ）セレクタープローブに結合した核酸を、セレクタープローブに結合していない核酸から分離することと、を含む。いくつかの実施形態は、オリゴヌクレオチドの第１の集団の捕捉部分を欠くオリゴヌクレオチドに対する捕捉部分を含むオリゴヌクレオチドの比率を有するオリゴヌクレオチドの第１の集団を選択することを含む増幅核酸を正規化する方法と、オリゴヌクレオチドの第２集団を得る方法と、オリゴヌクレオチドの第１及び第２集団を有する標的核酸を増幅する方法と、組み込まれたオリゴヌクレオチド捕捉部分を欠く増幅標的から捕捉部分を含む組み込まれたオリゴヌクレオチドを有する増幅標的を分離する方法と、を含むことができる。いくつかの実施形態では、分離するステップは、ハイブリダイズした標的及びプローブを結合部分に接触させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、結合部分はアビジン及びストレプトアビジンを含む。いくつかの実施形態では、結合部分はまた、ビーズ、ミクロスフェア、または他の粒子を含む。
【０４１６】
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，８２８，６７２号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、シデロフォアを含む核酸調製用の試薬を含むことができる。いくつかの実施形態では、シデロフォアは細菌のシデロフォアである。いくつかの実施形態では、シデロフォアはデスフェリオキサミンＢ（ＤＦＯ−Ｂ）メシレート塩である。いくつかの実施形態では、試薬はＤＮＡポリメラーゼを含み得る。いくつかの実施形態では、試薬はｄＮＴＰを含み得る。いくつかの実施形態では、試薬はＥＤＴＡを含まない。いくつかの実施形態は、核酸ライブラリを調製する方法を提供し、試料由来の複数の核酸分子を提供することと、シデロフォアを含む核酸調製用試薬において複数の核酸分子を操作することと、を含む。いくつかの実施形態では、複数の核酸分子を操作することは、複数の核酸分子を複数のオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズさせることを含む。いくつかの実施形態では、複数の核酸分子及び／または複数のオリゴヌクレオチドプローブは、担体上に固定化されている。いくつかの実施形態では、複数の核酸分子及び／または複数のオリゴヌクレオチドプローブは、結合パートナーペアを介して担体に固定化される。いくつかの実施形態では、担体は磁気ビーズである。いくつかの実施形態では、複数の核酸分子を操作することは、複数の核酸分子に特異的に結合していないオリゴヌクレオチドプローブを除去することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、複数の核酸分子に特異的に結合したオリゴヌクレオチドプローブを修飾することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、複数の核酸分子を断片化することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、複数の核酸分子にアダプターを追加することを含む。いくつかの実施形態では、アダプターは、増幅によって複数の核酸分子に追加される。いくつかの実施形態は核酸分子への酸化的損傷を低減する方法を提供し、その方法は、ＥＤＴＡの非存在下で核酸分子を調製することを含む。いくつかの実施形態では、核酸分子の調製は、シデロフォアの存在下で核酸分子を調製することを含む。いくつかの実施形態では、シデロフォアは細菌のシデロフォアである。いくつかの実施形態では、シデロフォアはデスフェリオキサミンＢ（ＤＦＯ−Ｂ）メシレート塩である。いくつかの実施形態では、核酸分子の調製は、核酸分子をＦｅ（ＩＩＩ）に曝露することを含む。いくつかの実施形態では、核酸分子の調製は、核酸分子を磁気ビーズに曝露することを含む。いくつかの実施形態では、酸化的損傷は、核酸分子の点突然変異を含む。いくつかの実施形態では、点突然変異はＣからＡへの塩基転換である。いくつかの実施形態は、シークエンシング反応のＱ（ｐｈｒｅｄ）スコアを増加させる方法を提供し、該方法は、ＥＤＴＡの非存在下で核酸分子を調製することを含む。いくつかの実施形態では、核酸分子の調製は、シデロフォアの存在下で核酸分子を調製することを含む。いくつかの実施形態では、シデロフォアは細菌のシデロフォアである。いくつかの実施形態では、シデロフォアはデスフェリオキサミンＢ（ＤＦＯ−Ｂ）メシレート塩である。いくつかの実施形態では、Ｑスコアは約３４より大きい。いくつかの実施形態では、Ｑスコアは約３８より大きい。いくつかの実施形態では、Ｑスコアは約４２より大きい。いくつかの実施形態では、シークエンシング反応は、ディープシークエンシングアプリケーションである。いくつかの実施形態では、ディープシークエンシングアプリケーションは、がん関連のディープシークエンシングアプリケーションである。いくつかの実施形態では、本方法は、ＥＤＴＡの非存在下で核酸分子をシークエンシングすることを含む。いくつかの実施形態は、少なくとも１つの容器手段を含むキットを提供し、少なくとも１つの容器手段は、シデロフォアを含む核酸調製用の試薬を含む。いくつかの実施形態では、シデロフォアはデスフェリオキサミンＢ（ＤＦＯ−Ｂ）メシレート塩である。いくつかの実施形態では、試薬はＥＤＴＡを含まない。
【０４１７】
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，７０８，６５５号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、ナノポアに固定または隣接するテザーを使用して事象を検出するための組成物、システム、及び方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、組成物は、第１の側面、第２の側面、ならびに第１及び第２の側面に広がる開口部を含むナノポアと、ヘッド領域、テール領域、及びそれらの間に配置された細長い本体を含む永久テザーと、を含む。ヘッド領域は、ナノポアの第１の側面または第２の側面に固定するか、または隣接させることができる。レポーター領域を含む細長い本体は、ナノポアの第１の側面に隣接して発生する第１の事象に応じて開口内で移動可能にすることができる。１つの非限定的な例では、ヘッド領域は、ナノポアの第１の側面または第２の側面に配置されたタンパク質などの分子に固定することができる。いくつかの実施形態では、方法は、第１の側面、第２の側面、ならびに第１及び第２の側面に広がる開口部を含むナノポアを提供することと、ヘッド領域、テール領域、及びそれらの間に配置された細長い本体を含む永久テザーを提供することと、を含む。ヘッド領域は、ナノポアの第１または第２の側面に固定するか、または隣接させることができ、細長い本体はレポーター領域を含むことができる。本方法は、ナノポアの第１の側面に隣接して発生する第１の事象に応じてレポーターを開口内で移動させることを含むことができる。いくつかの実施形態では、レポーター領域は、第１の事象に応じて開口内で並進移動可能である。これに加えてまたはこれに代えて、レポーター領域は、第１の事象に応じて開口内で回転運動可能であり得る。これに加えてまたはこれに代えて、レポーター領域は、第１の事象に応じて開口内で立体構造的に移動可能であり得る。いくつかの実施形態では、ヘッド領域は、共有結合を介してナノポアの第１の側面または第２の側面に固定されるか、または隣接する。ヘッド領域は、ナノポアの第１の側面に固定され得る。テール領域は、ナノポアの第２の側面に向かって自由に伸長可能である。いくつかの実施形態では、レポーター領域は、第１の事象に応じてナノポアの第１の側面に向かって並進移動可能である。レポーター領域は、第１の事象の後、第２の側面に向かって並進移動可能であり得る。レポーター領域はさらに、ナノポアの第１の側面に隣接して発生する第２の事象に応じて第１の側面に向かって並進移動可能であり得、第２の事象は第１の事象の後にある。レポーター領域はさらに、第２の事象の後、第２の側面に向かって並進移動可能であり得る。いくつかの実施形態では、第１の事象は、第１のヌクレオチドをポリヌクレオチドに追加することを含む。第２の事象を含む実施形態では、第２の事象は、ポリヌクレオチドに第２のヌクレオチドを追加することを含むことができる。レポーター領域の電気的または流束遮断特性は、細長い本体の別の領域の電気的または流束遮断特性とは異なり得る。いくつかの実施形態では、システムは、開口部を通る第１の電流または流束を測定するか、またはレポーター領域が第１の事象に応じて移動する間に第１の光信号を測定するように構成された構成及び測定回路を含むことができる。
【０４１８】
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，６７０，５３０号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、ゲノムＤＮＡの高分子量セグメントを含むＤＮＡ試料のハプロタイプまたは部分的ハプロタイプを判定する方法を含むことができる。このような方法は、次の操作：（ａ）ＤＮＡ試料を処理して、第１のハプロタイプ由来の複数のアレルを有する第１の高分子量セグメント由来のＤＮＡが濃縮された濃縮ＤＮＡ試料を生成することと、（ｂ）濃縮ＤＮＡ試料中のＤＮＡをシークエンシングして、第１の高分子量セグメントよりも長さが短い複数の配列リードを生成することであって、該配列リードの一方には、第１のハプロタイプの第１のアレルが含まれ、該配列リードの他方には、第１のハプロタイプの第２のアレルが含まれる、ことと、（ｃ）配列リードを参照ゲノムにアラインメントして、アラインメントリードを生成することであって、第１の高分子量セグメント由来のアラインメントリードは、参照ゲノム上の島にクラスター化する傾向がある、ことと、（ｄ）参照ゲノム上の隣接するアラインメントリード間の分離距離を判定することであって、隣接するアラインメントリード間の分離距離が、分離距離の大きさで区別可能な少なくとも２つの群に分類される、ことと、（ｅ）カットオフ値よりも小さい、隣接するアラインメントリードまでの分離距離を有するアライメントリードの第１の群を選択し、それにより、より大きな分離距離を有するアラインメントリードを除外し、該アラインメントリードの第１の群の少なくとも一部が、参照ゲノム上の同じ島に属する、ことと、（ｆ）アラインメントリードの第１の群のアレルを使用して、第１のハプロタイプまたは第１の部分ハプロタイプを定義することと、を特徴とし得る。いくつかの実施形態では、本方法には、第１の部分ハプロタイプ及び他の部分ハプロタイプから完全なハプロタイプを判定するという追加の操作がある。いくつかの実施形態では、アラインメントリードの第１の群の選択は、カットオフ値の判定を含む一例として、カットオフ値の判定は、（ｉ）隣接するアラインメントリード間の分離距離から混合モデルを作成することであって、該混合モデルが２つの分布を分離距離に適合させる、ことと、（ｉｉ）２つの分布の少なくとも１つのプロパティからカットオフ値を判定することと、を含む。場合によっては、２つの分布のそれぞれは、それ自体の中心傾向（例えば、ガウス分布の平均など）を含む。ある特定の実施形態では、アラインメントリードの第１の群の選択は、カットオフ値の判定を含む一例として、カットオフ値の判定は、（ｉ）隣接するアラインメントリード間の分離距離から混合モデルを作成することであって、該混合モデルが２つの分布を分離距離に適合させる、ことと、（ｉｉ）２つの分布の少なくとも１つのプロパティからカットオフ値を判定することと、を含む。場合によっては、２つの分布のそれぞれは、それ自体の中心傾向（例えば、ガウス分布の平均など）を含む。ある特定の実施形態では、混合モデルの生成は、隣接するアラインメントリード間の分離距離に期待値最大化手順を適用することを含む。一部の実施では、カットオフ値の判定は、短い分離距離を含む分布の確率質量の割合を特定する操作を含む。例えば、短い分離距離を含む分布の確率質量の割合は、約８０％以上になる場合がある。
【０４１９】
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，５８７，２７３号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、複合混合物から核酸配列の代表試料を選択する方法を含むことができる。本方法は、（ａ）複合混合物に集合的に存在する配列の所定の部分を含む１つまたは複数の核酸に相補的な捕捉プローブの集団とハイブリダイゼーションに十分な条件下で核酸の複合混合物を接触させて、１つまたは複数の核酸とプローブの集団のハイブリダイゼーション複合体を形成することであって、該捕捉プローブの集団が固体支持体に結合している、ことと、（ｂ）複合混合物の１０％未満で０．００１％を超える複合性を有する核酸の代表試料を選択するために非ハイブリダイズ核酸を除去することであって、該代表試料は、コピー中の他の全ての配列に対するコピー中の各配列の割合が、複合混合物内の１つまたは複数の核酸の所定部分の配列の割合と実質的に同じである核酸コピーを含む、ことと、を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、完全なゲノムからゲノム配列の代表的な試料を選択する方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、本方法は、複合混合物の１０％未満で０．００１％を超える複合性を有する代表試料を含む核酸集団をさらに提供し、該代表試料は、コピー中の他の全ての配列に対するコピー中の各配列の割合が、複合混合物内の１つまたは複数の核酸に集合的に存在する所定部分の配列の割合と実質的に同じである核酸コピーを含む。
【０４２０】
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，５７４，２３４号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、核酸配列を分析するための方法及び組成物を含むことができる。いくつかの実施形態では、本方法は、ビーズ上に捕捉したＤＮＡボールなどのクローンオブジェクトを利用する。いくつかの実施形態は、ビーズ及び１つのクローンオブジェクトを有する組成物を提供し、該クローンオブジェクトは、例えば、親和性結合パッチまたはハイブリダイゼーションパッチなど、ビーズの表面上のパッチを通じてビーズに親和性結合またはハイブリダイズされる。一部の態様では、パッチは、ビーズの表面上の単一の領域に結合した複数のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態は、親和性結合またはハイブリダイズしたクローンオブジェクトを有するビーズの集団もまた提供する。特定の実施形態では、クローンオブジェクトのそれぞれは、親和性結合パッチまたはハイブリダイゼーションパッチなど、各ビーズの表面上のパッチを通じてビーズに親和性結合またはハイブリダイズする。集団内の結合またはハイブリダイズしたクローンオブジェクトに対するビーズの比率は１：１であり得る。特定の実施形態では、集団内の特定のビーズに結合またはハイブリダイズされるクローンオブジェクトは１つだけである。これらの方法を使用して、ビーズ及び１つのクローンオブジェクトが、ビーズの表面上のパッチへの結合を通じて互いに親和性結合またはハイブリダイズされる組成物を作製することができる。いくつかの実施形態は、複数の捕捉部分を有するビーズを提供することと、複数の捕捉−補体部分を有する固体表面を提供することであって、該捕捉−補体部分が、切断可能な部分及び親和性リガンドをさらに含む、ことと、捕捉部分を捕捉−補体部分に特異的に結合し、これにより固体表面上に固定化ビーズを形成することと、ビーズ上の親和性リガンドを保持するために切断可能な部分を切断し、これによりビーズ上に親和性結合パッチを作製することによりビーズ上に親和性結合パッチを作製する方法を提供することができる。特定の実施形態では、捕捉部分または捕捉−補体部分またはその両方は、ポリヌクレオチドの捕捉配列を含む。したがって、いくつかの実施形態は、ビーズの表面に結合した複数の第１のポリヌクレオチドを有するビーズを提供することであって、該第１のポリヌクレオチドがそれぞれ、捕捉配列を有する、ことと、固体表面に結合した複数の第２のポリヌクレオチドを有する固体表面を提供することであって、該第２のポリヌクレオチドがそれぞれ、捕捉−補体配列、切断可能部分、及び親和性リガンドを有する、ことと、第１のポリヌクレオチドの捕捉配列を第２のポリヌクレオチドの捕捉−補体配列にハイブリダイズさせ、これにより、固体表面上に固定化ビーズを形成することと、第２の複数のポリヌクレオチド上の親和性リガンドを保持するために切断可能部分で第２のポリヌクレオチドを切断し、これによりビーズ上に親和性結合パッチを作製することにより、ビーズ上に親和性結合パッチを作製する方法を提供することができる。一部の態様では、本方法は、親和性リガンドを結合剤と接触させることにより、親和性結合パッチに結合した１つのクローンオブジェクトを作製することであって、該結合剤は２つ以上の結合部位を有する、ことと、単一のタンデムに繰り返される標的核酸分子を有する、クローンオブジェクト上の第２の親和性リガンドを通じて、１つのクローンオブジェクトを結合剤に結合し、これにより親和性結合パッチに結合された１つのクローンオブジェクトを作製することと、をさらに含む。いくつかの実施形態は、複数の第１の捕捉部分を有するビーズを提供することと、表面上のパッチにパターン形成された複数の第２の捕捉部分を有する固体表面を提供することであって、該第２の捕捉部分がそれぞれ切断可能な部分を有し、１つのクローンオブジェクトが１つまたは複数の第２の捕捉部分を介して表面上の１つのパッチに結合し、１つのクローンオブジェクトが単一のタンデムに繰り返される標的核酸分子を有する、ことと、第１の捕捉部分をクローンオブジェクトに特異的に結合し、これにより、固体表面上に固定化ビーズを形成することと、クローンオブジェクトを保持するために切断可能部分を切断し、これにより、１つのクローンオブジェクトを有するビーズを作製することにより、１つのクローンオブジェクトを有するビーズを作製する方法を提供することができる。特定の実施形態では、捕捉部分はポリヌクレオチドを含む。したがって、いくつかの実施形態は、複数の第１のポリヌクレオチドを有するビーズを提供することと、表面上のパッチにパターン形成された複数の第２のポリヌクレオチドを有する固体表面を提供することであって、該第２のポリヌクレオチドがそれぞれ切断可能な部分を有し、１つのクローンオブジェクトが表面の１つのポリヌクレオチドパッチにハイブリダイズし、１つのクローンオブジェクトが単一のタンデムに繰り返される標的核酸分子を有する、ことと、第１のポリヌクレオチドをクローンオブジェクトにハイブリダイズし、これにより、固体表面上に固定化ビーズを形成することと、クローンオブジェクトを保持するために切断可能部分で第２のポリヌクレオチドを切断し、これにより、１つのクローンオブジェクトを有するビーズを作製することにより、１つのクローンオブジェクトを有するビーズを作製する方法を提供することができる。いくつかの実施形態は、ビーズの表面に結合した複数の第１のポリヌクレオチドを有するビーズを提供することであって、該第１のポリヌクレオチドがそれぞれ第１の捕捉配列を有する、ことと、固体表面に結合した複数の第２のポリヌクレオチドを有する固体表面を提供することであって、該第２のポリヌクレオチドがそれぞれ、第１の捕捉−補体配列及び第２の捕捉−補体配列を有する、ことと、第１のポリヌクレオチドの第１の捕捉配列を第２のポリヌクレオチドの第１の捕捉−補体配列にハイブリダイズさせ、これにより、固体表面上に固定化ビーズを形成することと、鋳型として第２の捕捉−補体配列を使用して固定化ビーズの第１のポリヌクレオチドを伸長させ、これにより、第２の捕捉配列を有する、ビーズ上に伸長された第１のポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションパッチを作製することにより、ビーズ上に親和性結合パッチを作製する方法を提供することができる。一部の態様では、本方法は、第２の捕捉−補体配列を有するクローンオブジェクトを提供することによりビーズ上のパッチに結合された１つのクローンオブジェクトを作製することと、クローンオブジェクトの第２の捕捉−補体配列をビーズの第２の捕捉配列にハイブリダイズさせ、これにより、ビーズ上のパッチに結合された１つのクローンオブジェクトを作製することと、をさらに含む。本方法の一部の態様では、第１のポリヌクレオチドの伸長方法は、親和性リガンドを有する１つまたは複数のヌクレオシド三リン酸を追加し、これによりビーズ上に親和性結合パッチを作製することを含む。いくつかの実施形態は、標的核酸分子を増幅する方法を含む。いくつかの実施形態は、親和性結合またはハイブリダイズしたクローンオブジェクトを有するビーズの組成物または集団をマイクロウェルを有する固体表面上に配置することにより標的核酸分子を増幅する方法であって、１つのビーズのみが１つのマイクロウェルに空間的に適合することができる、方法と、マイクロウェル内の該標的核酸を増幅し、これによりアンプリコンを形成する方法と、を提供する。一部の態様では、本方法は、合成によるシークエンシング法、ライゲーションによるシークエンシング、またはハイブリダイゼーションによるシークエンシングなどの方法を使用して、増幅された標的核酸分子をシークエンシングし、それにより、標的核酸分子の核酸配列を判定することをさらに含む。
【０４２１】
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つまたは複数の遺伝子バイオマーカー）の検出には、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，４５３，２５８号に記載された任意の様々な方法を含み得る。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、最小限の色素セット、最小限の励起光源、及び最小限の発光フィルターを使用して、シークエンシング反応において４つ全てのヌクレオチドの取り込みを区別しながら、例えば、核酸配列などの配列の判定を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、ポリヌクレオチドへの３つの異なるタイプの検出可能なヌクレオチドコンジュゲートの取り込みをシークエンシング反応で検出することと、ポリヌクレオチドへの３つの異なるタイプの検出可能なヌクレオチドの検出パターンに基づいて第４のタイプのヌクレオチドの取り込みを判定し、これによりポリヌクレオチドの配列を判定することと、を含むポリヌクレオチドの配列を判定する方法であって、該３つの異なるタイプの検出可能なヌクレオチドコンジュゲートの取り込みがシグナル状態から検出され、第４のタイプのヌクレオチドの取り込みが暗状態から判定される、方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、４つの修飾ヌクレオチド種を含む溶液をシークエンシングするためにポリヌクレオチド試料に適用することであって、３つの修飾ヌクレオチド種は１つまたは複数の検出部分、及びヌクレオチドと１つまたは複数の検出部分の間に位置する１つまたは複数のリンカーにコンジュゲートし、第４のヌクレオチド種は検出部分がない、ことと、シークエンシング反応において該修飾ヌクレオチドの取り込みのパターンを検出し、それにより第１の検出可能なパターンを捕捉する、ことと、１つまたは複数の組成物をシークエンシング反応に適用し、それにより第１の検出可能なパターンを変更することと、第２の検出可能なパターンを検出することと、検出可能なパターンに基づいてポリヌクレオチド試料の配列を判定することと、を含む、ポリヌクレオチドの配列を判定する方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、シークエンシングのためのポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸、修飾デオキシリボ核酸、リボ核酸、及び修飾リボ核酸のうちの１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、シークエンシングのためのポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡライブラリ調製物である。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドコンジュゲートは、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、またはそれらの非天然ヌクレオチド類似体からなる群から選択されるヌクレオチド種を含む。いくつかの実施形態では、非天然ヌクレオチド類似体は、可逆的ターミネーター部分を含み、ｒｂＡＴＰ、ｒｂＴＴＰ、ｒｂＣＴＰ、ｒｂＵＴＰ、及びｒｂＧＴＰからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドの取り込みは、合成による配列、ライゲーションによる配列、及びハイブリダイゼーションによる配列、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、蛍光部分を検出することにより、３つのヌクレオチド種コンジュゲートが検出される。いくつかの実施形態では、蛍光部分は３つのヌクレオチドコンジュゲートと同じであるが、他の実施形態では、蛍光部分は１つまたは複数の異なる蛍光部分である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の異なる蛍光成分が同じ発光フィルターにより検出される。いくつかの実施形態では、蛍光部分は、蛍光共鳴エネルギー移動システム部分を含む。いくつかの実施形態では、第４のヌクレオチドの取り込みは、検出の欠如によって判定される。いくつかの実施形態では、検出可能な核酸コンジュゲートは蛍光によって検出される。いくつかの実施形態では、蛍光は、第１及び第２のイメージング事象によって検出され、さらなる実施形態では、第１及び第２のイメージング事象は時間的に分離される。いくつかの実施形態では、第１のイメージング事象は、第２のイメージング事象により検出された蛍光のパターンとは異なる蛍光のパターンを検出する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のヌクレオチドの取り込みは、第１及び第２のイメージング事象間の蛍光パターンの違いによって判定される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のヌクレオチド種コンジュゲートは１つまたは複数のリンカー配列をさらに含み、さらなる実施形態では、１つまたは複数のリンカー配列は切断可能なリンカー及びスペーサーリンカーの１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、ジスルフィド、ジオール、ジアゾ、エステル、スルホン、アジド、アリル、及びシリルエーテルからなる群から選択される１つまたは複数の切断可能な連結基を含むが、好ましい実施形態では切断可能な連結基はジスルフィドである。いくつかの実施形態では、スペーサーリンカーは、１つまたは複数の、ポリエチレングリコールまたはそのコンカテマー及び２−｛２−［３−（２−アミノ−エチルカルボルニル）−フェノキシ］−１−アジド−エトキシ｝−エトキシ−酢酸である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のスペーサーリンカーは１つまたは複数の切断可能な連結基をさらに含み、切断可能な連結基は、ジスルフィド、ジオール、ジアゾ、エステル、スルホン、アジド、アリル、及びシリルエーテルからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、スペーサーリンカーは、ポリエチレングリコールまたはそのコンカテマーであるが、他の実施形態では、スペーサーリンカーは、２−｛２−［３−（２−アミノ−エチルカルボルニル）−フェノキシ］−１−アジド−エトキシ｝−エトキシ−酢酸である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のヌクレオチドコンジュゲートは、ハプテン及び蛍光部分をさらに含んでも含まなくてもよい、ポリエチレングリコールリンカー及び２−｛２−［３−（２−アミノ−エチルカルボニル）フェノキシ］−１−アジド−エトキシ｝エトキシ−酢酸リンカーを含む。いくつかの実施形態では、ハプテンは、ビオチン、ジゴキシゲニン、及びジニトロフェノールからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のヌクレオチドコンジュゲートは、ストレプトアビジン−蛍光部分コンジュゲートを含むが、他の実施形態では、１つまたは複数のヌクレオチドコンジュゲートは、抗ジゴキシゲニン及び抗ジニトロフェノールからなる群から選択される抗ハプテン抗体−蛍光部分コンジュゲートを含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドコンジュゲートは、２つの蛍光部分をさらに含む、ポリエチレングリコールリンカー及び２−｛２−［３−（２−アミノ−エチルカルボルニル）−フェノキシ］−１−アジド−エトキシ｝−エトキシ−酢酸リンカーを含む。いくつかの実施形態では、２つの蛍光部分は、蛍光共鳴エネルギー移動システムを構成する。
【０４２２】
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つ以上の遺伝子バイオマーカー）の検出は、米国特許第９，４４１，２６７号に記載された任意の様々な方法を含み得、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、標的配列の検出位置でヌクレオチドの同一性を決定する方法を含む。これらの方法は、当該標的配列と、基材表面でのミクロスフェアに共有結合した捕捉プローブとを含むハイブリダイゼーション複合体を提供することを含む。これらの方法は、当該検出位置で、当該ヌクレオチドを決定することを含む。当該ハイブリダイゼーション複合体は、捕捉プローブ、捕捉伸長プローブ、及び、標的配列を含むことができる。加えて、当該標的配列は、外因性アダプター配列を含み得る。追加の態様では、当該方法は、当該ミクロスフェアを、それぞれが、測定位置での固有のヌクレオチドと、検出可能な固有の標識を含む複数の検出プローブとを接触させることを含む。当該検出可能な標識の少なくとも１つに由来するシグナルを検出して、当該検出位置でのヌクレオチドを同定する。追加の態様では、当該検出プローブは、検出標識を含まないが、例えば、質量分析を介して、その特徴的な質量に基づいて同定をする。加えて、当該検出プローブは、その特徴的な質量に基づいて検出される固有の標識を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、当該標的配列が、当該検出位置に対して直接に５’で隣接する第１の標的ドメインを含む方法を含むことができる。当該ハイブリダイゼーション複合体は、当該標的配列、捕捉プローブ、及び、当該標的配列の第１の標的ドメインにハイブリダイズした伸長プライマーを含む。当該決定ステップは、当該ミクロスフェアを、ポリメラーゼ酵素、及び、それぞれが共有結合した検出可能な標識を含む複数のＮＴＰと接触させることを含み、同接触は、当該ＮＴＰの１つが、当該検出位置で当該塩基と塩基対を形成すると、当該伸長プライマーが、当該酵素の作用を受けて伸長して当該標識を取り込むという条件下で行う。当業者に公知の通り、ｄＮＴＰ、及び、ｄｄＮＴＰは、ＤＮＡポリメラーゼにとって好ましい基材である。ＮＴＰは、ＲＮＡポリメラーゼにとって好ましい基材である。次に、当該検出位置での塩基を同定する。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、当該標的配列が、当該検出位置に対して直接に５’で隣接する第１の標的ドメインを含み、当該捕捉プローブは、伸長プライマーとして機能し、かつ、当該標的配列の第１の標的ドメインにハイブリダイズする方法を含むことができる。当該決定ステップは、当該ミクロスフェアを、ポリメラーゼ酵素、及び、それぞれが共有結合した検出可能な標識を含む複数のＮＴＰと接触させることを含み、同接触は、当該ＮＴＰの１つが、当該検出位置で当該塩基と塩基対を形成すると、当該伸長プライマーが、当該酵素の作用を受けて伸長して当該標識を取り込むという条件下で行う。これにより、当該検出位置での塩基を同定する。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、当該標的配列が、（５’から３’に向けて）、当該検出位置に少なくともヌクレオチドを含む重複ドメインを含む第１の標的ドメインと、当該検出位置に隣接する第２の標的ドメインを含む方法を含むことができる。当該ハイブリダイゼーション複合体は、当該第１の標的ドメインに対してハイブリダイズした第１のプローブ、及び、当該第２の標的ドメインに対してハイブリダイズした第２のプローブを含む。当該第２のプローブは、当該標的配列に対してハイブリダイズしない検出配列と、検出可能な標識とを含む。当該第２のプローブが、当該検出位置に対して完全に相補的である塩基を含む場合に、開裂構造を形成する。この方法は、当該ハイブリダイゼーション複合体を、当該シグナル伝達プローブ由来の検出配列を開裂する開裂酵素と接触させ、次いで、当該検出配列を有するアッセイ複合体、基材の表面でミクロスフェアに共有結合した捕捉プローブ、及び、少なくとも１つの標識を形成すること、をさらに含む。これにより、当該検出位置での塩基を同定する。
【０４２３】
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つ以上の遺伝子バイオマーカー）の検出は、米国特許第７，０６０，４３１号に記載された任意の様々な方法を含み得、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、不連続な部位を含む表面を備えた基材を含むアレイ構成を含むことができる。当該構成は、少なくとも第１及び第２の亜集団；それぞれの亜集団は、生物活性剤を含み；及び、デコーダー結合リガンドに結合して生物活性剤の同一性を解明する識別子結合リガンドを含む、ミクロスフェアの集団をさらに含むことができる。これらのミクロスフェアは、表面に分布している。いくつかの実施形態は、不連続な部位を含む表面を有する基材と、少なくとも第１及び第２の亜集団を含むミクロスフェアの集団とを含むアレイ構成を提供する。それぞれの亜集団は、生物活性剤を含み、そして、光学的シグネチャーを含まない。いくつかの実施形態は、上記に概説したアレイ構成を作製する方法を提供する。これらの方法は、基材上に個々の部位を含む表面を形成し、及び、当該個々の部位がミクロスフェアを含むように、当該当該表面にミクロスフェアを分布させることを含む。これらのミクロスフェアは、少なくとも第１及び第２の亜集団を含み、それぞれの亜集団は、生物活性剤を含み、そして、光学的シグネチャーを含まない。いくつかの実施形態は、基材での個々の部位を含む表面を形成し、及び、当該個々の部位が、ミクロスフェアを含むように表面にミクロスフェアを分布させること、を含む組成物の製造方法を提供する。これらのミクロスフェアは、少なくとも第１及び第２の亜集団を含み、それぞれの亜集団は、生物活性剤と、デコーダー結合リガンドに結合して、生物活性剤の実体を明らかにする識別子結合リガンドとを含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、上記で概説したアレイ構成を提供し、及び、複数のデコーダー結合リガンドを当該アレイ構成に対して加えて、少なくとも複数の生物活性剤の位置を同定すること、を含むアレイ構成を解読する方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、試料での標的分析物の存在を決定する方法を含むことができる。これらの方法は、上記で概説したように、当該試料をアレイ構成と接触させ、そして、当該標的分析物の有無を決定することを含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、少なくとも第１及び第２の亜集団を含むミクロスフェアの集団を含むアレイ構成を提供すること、それぞれの亜集団が、生物活性剤、及び、少なくとも第１及び第２の解読属性を含み、及び、当該第１及び第２の解読属性のそれぞれを検出して、当該生物活性剤のそれぞれを識別すること、を含む方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、解読ステップで得た情報を増やす方法を含むことができる。この方法は、ＤＢＬ−ＩＢＬの組合せで、縮退プローブを使用することを含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、ビーズに関する複数の解読属性の使用を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、解読の信頼性を高める方法を含むことができる。この方法は、品質管理手段として解読を使用することを含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、少なくとも５０個の亜集団を含むミクロスフェアの集団を含むアレイ構成を提供することであって、それぞれの亜集団は、生物活性剤を含む、提供すること、ミクロスフェアの当該集団に対して、複数の当該デコーダー結合リガンドを加えて、少なくとも５０個の当該生物活性剤を識別することを含む、アレイ構成を解読する方法を含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、試料での標的分析物の存在を決定する方法を含むことができ、当該方法は、当該試料を、少なくとも５０個の亜集団を含むミクロスフェアの集団を含む組成物と接触させることであって、それぞれの亜集団は、生物活性剤を含む、接触させること、ミクロスフェアの当該集団に対して、複数の当該デコーダー結合リガンドを加えて、少なくとも５０個の当該生物活性剤を識別すること、及び当該標的分析物の有無を決定することを含む。
【０４２４】
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つ以上の遺伝子バイオマーカー）の検出は、米国特許第７，０６０，４３１号に記載された任意の様々な方法を含み得、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、試料での標的分析物の検出のためのマイクロ流体機器を含む。これらの機器は、試料入口ポートと、ウェル入口ポートとウェル出口ポートとを含む少なくとも１つの試料操作ウェルとを含む、いずれかの個数のモジュールを有する固体支持体を含む。当該機器は、一般的に、当該試料入口ポートと当該試料取り扱いウェルとの間の流体接触を可能にする第１のマイクロチャネルをさらに含む。また、当該機器は、不連続な部位を含む表面を有する基材を含む検出モジュール、及び、少なくとも第１及び第２の亜集団を含むミクロスフェアの集団を含み、それぞれの亜集団は、生物活性剤を含む。これらのミクロスフェアは、当該表面に分布している。当該検出モジュールは、試料を受け入れるための検出入口ポートも含む。また、機器は、当該試料処理ウェルと当該検出入口ポートとの間の流体接触を可能にする第２のマイクロチャネルも含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、マイクロ流体機器に検出器を組み込む方法を含むことができる。この方法は、試料入口ポートと試料処理ウェルとの間の流体接触を可能にする第１のマイクロチャネル、当該試料処理ウェルと検出入口ポートとの間の流体接触を可能にする第２のマイクロチャネル、及び、不連続な部位を含む表面を備えた基材を含む検出モジュールを含む機器を提供することを含む。この方法は、基材全体に対して流体を流す、ことをさらに含む。この流体は、少なくとも第１及び第２の亜集団を含むミクロスフェアの集団を含み、それぞれの亜集団は、生物活性剤を含み、それにより、ビーズが、当該不連続な部位を横切るようにして流れ、そして、当該不連続な部位にランダムに堆積する。この方法は、流体の流れを逆にすること、をさらに含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、マイクロ流体機器に検出器を組み込む方法を含むことができる。この方法は、複数の第１のマイクロチャネルと、マイクロチャネル内のミクロスフェアの集団とを含むマイクロ流体機器を提供することを含む。当該機器は、当該マイクロチャネルに接続した受け入れチャンバーをさらに含む。この方法は、当該ミクロスフェアを、当該マイクロチャネルを通じて、当該受け入れチャンバーに流し込む、ことをさらに含む。
【０４２５】
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つ以上の遺伝子バイオマーカー）の検出は、米国特許第９，２２２，１３４号に記載された任意の様々な方法を含み得、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、分子を検出するための方法、システム、及び、組成物を含む。特に、固体支持体での複数のタイプの分子を検出するための方法、システム、及び、組成物。いくつかの実施形態は、分子を検出する方法に関する。いくつかの実施形態では、そのような方法は、（ａ）検出ステップの間に当該分子を集合体で検出する、固体支持体での部位に関連する分子を含む固体支持体を提供するステップであって、当該部位は少なくとも２つの異なるタイプの分子を含む、ステップ；（ｂ）当該部位での分子の集合体に対応するシグナルを検出するステップ；（ｃ）当該部位での異なるタイプの分子の割合を推定すること、または、当該部位での異なるタイプの分子に対応するシグナルの量を推定するステップ；（ｄ）割合推定値を使用して、当該部位での異なるタイプの分子に対応するシグナル量を計算し、それにより、シグナル推定値を取得するステップ、または、当該シグナル推定値を使用して当該部位での異なるタイプの分子の割合を計算し、それにより、割合推定値を得るステップ；及び、（ｅ）推定値が収束するまで、割合推定値とシグナル推定値を繰り返し更新し、それにより、当該部位に関連する分子を検出するステップを含む。上記した方法のいくつかの実施形態では、提供するステップは、分子の混合物を、当該固体支持体に提供すること、をさらに含む。その他の実施形態では、当該提供するステップは、当該分子を当該部位に関連付ける、ことをさらに含む。さらにその他の実施形態では、当該提供するステップは、当該部位で分子を付着させること、をさらに含む。上記した方法のいくつかの実施形態では、当該推定ステップは、当該部位での異なるタイプの分子の割合を推測し、あるいは、当該部位での異なるタイプの分子に対応するシグナルの量を推測して行う。その他の実施形態では、当該推定ステップは、主成分分析（ＰＣＡ）を行う、ことを含む。上記した方法のいくつかの実施形態では、更新ステップは、数値最適化アルゴリズムを行う、ことを含む。一部のそのような方法では、当該数値最適化アルゴリズムは、反復マップ検索に基づく。一部のそのような実施形態では、当該数値最適化アルゴリズムは、フィエナップの反復マップに基づく。上記した方法のいくつかの実施形態では、１つ以上の分子の配列データを得る。一部のそのような方法では、合成によるシークエンシングプロセスで配列データを得る。ある特定の実施形態では、当該合成によるシークエンシングプロセスは、パイロシーケンシングプロセスを含む。上記した方法のいくつかの実施形態では、当該固体支持体は、ビーズを含む。一部のその他の実施形態では、当該固体支持体は、フローセルを含む。上記した方法の好ましい実施形態では、当該分子は、核酸を含む。一部のそのような方法では、当該核酸は、その部位に付着する。いくつかの実施形態では、当該核酸は、核酸の第１の亜集団と、核酸の第２の亜集団とを含み、当該第１の亜集団の核酸は、それぞれが、同一の標的領域を有しており、かつ、当該第２の亜集団の核酸は、それぞれが、当該標的領域の変異型である同一の領域を有する。いくつかの実施形態では、当該第１の亜集団の核酸の標的領域のヌクレオチド配列は、当該第２の亜集団の核酸の標的領域の変異型のヌクレオチド配列と比較して異なる少なくとも１つのヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、当該第１の亜集団の核酸の標的領域のヌクレオチド配列は、当該第２の亜集団の核酸の標的領域の変異型のヌクレオチド配列と比較して異なる少なくとも３つのヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、当該第１の亜集団の核酸での標的領域と、当該第２の亜集団の核酸での標的領域の変異型との間のヌクレオチド配列の差異は、突然変異、多型、挿入、欠失、置換、単純なタンデムリピート多型、及び、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）からなる群から選択した少なくとも１つの差異を含む。いくつかの実施形態では、当該核酸は、倍数体生物由来の遺伝子座のアレルを含む。一部のその他の実施形態では、当該核酸は、核酸の選択的スプライシング形態を含む。さらにその他の実施形態では、当該核酸は、二倍体生物由来の遺伝子座のアレルを含む。また、分子検出システムについても説明をする。当該分子検出システムは、分子が集合的に検出されるように、固体支持体での部位に関連付けた分子を含む当該固体支持体を含むことができ、当該分子は、少なくとも２つの異なるタイプの分子を含み、そして、検出器は、当該部位と関連付けた分子を検出するように構成する。いくつかの実施形態では、当該分子は、その部位に付着している。好ましい実施形態では、当該分子は、核酸を含む。当該分子検出システムのいくつかの実施形態では、部位は、約２〜約１０１１個の分子、約２〜約１０１０個の分子、約２〜約１０９個の分子、約２〜約１０８個の分子、約２〜約１０７個の分子、約２〜約１０６個の分子、約２〜約１０５個の分子、約２〜約１０４個の分子を含む。いくつかの実施形態では、これらの分子は、当該部位に関連している。その他の実施形態では、当該分子は、その部位に付着している。ある特定の実施形態では、当該分子は、核酸を含む。上記した分子検出システムのいくつかの実施形態は、当該部位に対して流体を提供するように構成した流体処理システムをさらに含むことができる。上記した分子検出システムのその他の実施形態は、当該部位に対して励起ビームを提供するように構成した光源をさらに含むことができる。上記した分子検出システムのいくつかの実施形態は、当該部位での異なるタイプの分子の割合、または、当該部位での異なるタイプの分子に対応するシグナルの量を推定するように構成した第１のデータ処理モジュールをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、当該第１のデータ処理モジュールは、推定に関連する変動を決定するためにも使用する。その他の実施形態では、当該決定ステップは、別個のデータ処理モジュールを使用して行う。そのようなシステムのいくつかの実施形態では、当該システムは、割合推定値を使用して、当該部位での異なるタイプの分子に対応するシグナルの量を計算する、または、シグナル推定値を使用して、当該部位での異なるタイプの分子の割合を計算するように構成した第２のデータ処理モジュールをさらに含むことができる。そのようなシステムのその他の実施形態では、当該システムは、割合推定値、及び、シグナル推定値を繰り返し更新するように構成した第３のデータ処理モジュールをさらに含むことができる。上記した分子検出システムのいくつかの実施形態では、それらのシステムは、核酸の標的領域のヌクレオチド配列を同定するように構成する。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、核酸の標的領域を同定する方法を含むことができる。これらの方法は、（ａ）核酸の第１の亜集団を、固体支持体での部位に関連付けさせることであって、当該第１の亜集団の核酸は、同一の標的領域を含む、関連付けさせること；（ｂ）核酸の第２の亜集団を、固体支持体での部位に関連付けさせることであって、当該第２の亜集団の核酸は、当該第１の亜集団の核酸の標的領域の変異型である同一の標的領域を含む、関連付けさせること；（ｃ）第１の亜集団核酸の標的領域の１つ以上のヌクレオチド、及び、第２の亜集団核酸の標的領域の変異型の１つ以上のヌクレオチドに対応するシグナルを検出すること；（ｄ）当該部位に関連する第１の亜集団核酸、及び、第２の亜集団核酸の割合を推定すること、または、当該部位に関連する第１の亜集団核酸、及び、第２の亜集団核酸に対応するシグナルの量を推定すること；（ｅ）当該割合推定値を使用して、当該部位に関連する第１の亜集団核酸、及び、第２の亜集団核酸の割合に対応するシグナルの量を計算すること、または、当該シグナル推定値を使用して、当該部位に関連する第１の亜集団核酸、及び、第２の亜集団核酸の割合に対応するシグナルの量を計算すること；及び、（ｆ）当該推定値が収束するまで、割合推定値とシグナル推定値とを繰り返し更新し、それにより、核酸の標的領域を同定すること、を含むことができる。上記した方法のいくつかの実施形態では、ステップ（ａ）は、第１の亜集団核酸、及び、第２の亜集団核酸を、当該固体支持体に付着させること、を含む。上記した方法のいくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）は、主成分分析（ＰＣＡ）を行う、ことを含む。上記した方法のいくつかの実施形態では、ステップ（ｆ）は、数値最適化アルゴリズムを行う、ことを含む。一部のそのような実施形態では、当該数値最適化アルゴリズムは、反復マップ検索に基づく。一部のそのような実施形態では、当該数値最適化アルゴリズムは、フィエナップの反復マップに基づく。上記した方法のいくつかの実施形態では、配列データを、第１、及び、第２の亜集団核酸の両方から得る。一部のそのような実施形態では、合成によるシークエンシングプロセスで、配列データを得る。いくつかの実施形態では、当該合成によるシークエンシングプロセスは、パイロシーケンシングプロセスを含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、バイオシグネチャーを同定するための方法を含むことができる。この方法は、（ａ）複数の対象から得た試料の提供を行うステップであって、当該試料は、分子を含む、ステップ；（ｂ）当該試料に由来する分子にタグを付けて、それぞれの試料の由来となる対象を同定するステップ；（ｃ）当該試料に由来する分子を固体支持体での部位と関連付けして、検出ステップの間に分子を集合体として検出を行うステップであって、当該部位は、少なくとも２つの異なるタイプの分子を含む、ステップ；（ｄ）当該部位に関連する分子のバイオシグネチャーを：ｉ）当該部位での分子の集合体に対応するシグナルを検出すること、ｉｉ）当該部位での異なるタイプの分子の割合、または、当該部位での異なるタイプの分子に対応するシグナルの量を推定すること、ｉｉｉ）割合推定値を使用して、当該部位での異なるタイプの分子に対応するシグナルの量を計算すること、または、当該シグナル推定値を使用して、当該部位での異なるタイプの分子の割合を計算すること、及び、ｉｖ）推定値が収束するまで、割合推定値とシグナル推定値とを反復して更新し、それにより、当該部位での分子のバイオシグネチャーを得ること、で当該バイオシグネチャーを得るステップ；及び、（ｅ）ステップ（ｄ）で得たバイオシグネチャーを、参照バイオシグネチャーと比較して、それにより、当該バイオシグネチャーを同定するステップを含むことができる。好ましい実施形態では、当該分子は、その部位に付着する。上記した方法の好ましい実施形態では、当該分子は、核酸を含む。一部のそのような実施形態では、当該核酸は、病原体由来のマーカーを含む。ある特定の実施形態では、当該病原体は、ウイルス、細菌、及び、真核細胞からなる群から選択する病原体を含む。いくつかの実施形態では、当該真核細胞を、がん細胞とすることができる。上記した方法のいくつかの実施形態では、当該試料は、異常な細胞型を含む。上記した方法のいくつかの実施形態では、当該試料を、がん患者から得る。固体支持体での部位に関連した核酸の集団を含む固体支持体も記載されており、同支持体は、核酸の集団での核酸を集合体で検出するものであり、核酸の当該集団は、第１の亜集団と第２の亜集団とを含み、当該第１の亜集団の核酸は、同一の標的領域を含み、そして、当該第２の亜集団の核酸は、当該標的領域の変異型である同一の領域を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、競合分子がハイブリダイズした捕捉核酸の第１亜集団、及び、相補分子のハイブリダイゼーションを可能にする領域を含む捕捉核酸の第２亜集団を含むビーズを含むことができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、縮退
タグを含む増幅核酸とハイブリダイズした捕捉核酸を含むビーズを含むことができ、当該縮退タグは、捕捉核酸に対してハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、当該ビーズは、基材のチャネルに存在する。その他の実施形態では、当該ビーズは、マルチウェル基材のウェルに存在する。好ましい実施形態では、当該ウェルを、増幅した核酸がハイブリダイズした単一のビーズを保持するように構成する。
【０４２６】
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つ以上の遺伝子バイオマーカー）の検出は、米国特許第９，１６３，２８３号に記載された任意の様々な方法を含み得、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、複数の核酸を含む組成物を含むことができ、それぞれの核酸は、不変配列、可変配列、及び、標識を含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、アレイ構成を解読する方法を含むことができる。この方法は、不連続な部位を含む表面と、第１及び第２の亜集団を含むミクロスフェアの集団とを含む基材を含むアレイ構成を提供することを含み、それぞれの亜集団は、プライマー配列と解読配列とを含む同定核酸配列を含む。この方法は、プライミング配列、少なくとも１つの解読ヌクレオチド、及び、標識を含む第１のセットの組合せ解読プローブを、当該アレイに対して加えること、そして、当該標識の存在を検出すること、をさらに含む。
【０４２７】
いくつかの実施形態では、遺伝子バイオマーカー（例えば、１つ以上の遺伝子バイオマーカー）の検出は、米国特許第９，０４５，７９６号に記載された任意の様々な方法を含み得、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。例えば、遺伝子バイオマーカーの検出は、所定のゲノムに含まれる１つ、または、幾つかの型決定可能な遺伝子座を検出する方法を含むことができ、当該方法は、そのような型決定可能な遺伝子座を有する増幅した代表的なゲノム断片の集団を提供するステップ、プローブ−断片ハイブリッドを形成する条件下で、型決定可能な遺伝子座に対応する配列を有する複数の核酸プローブと、当該ゲノム断片とを接触させるステップ；及び、当該プローブ−断片ハイブリッドの型決定可能な遺伝子座を検出するステップを含む。特定の実施形態では、これらの核酸プローブは、最大で１２５ヌクレオチド長である。しかしながら、以下に詳述するように、あらゆる様々な長さ、または、配列を有するプローブを使用することができる。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、ゲノムの型決定可能な遺伝子座を検出する方法を含むことができ、同方法は、そのような型決定可能な遺伝子座を有する増幅したゲノム断片の代表的な集団を提供するステップ、プローブ−断片ハイブリッドを形成する条件下で、型決定可能な遺伝子座に対応する配列を有する複数の核酸プローブと、当該ゲノム断片とを接触させるステップ；及び、当該プローブ−断片ハイブリッドの型決定可能な遺伝子座を直接に検出するステップを含む。これに加えてまたはこれに代えて、遺伝子バイオマーカーの検出は、ゲノムの型決定可能な遺伝子座を検出する方法を含むことができ、同方法は、型決定可能な遺伝子座を有する増幅したゲノム断片の代表的な集団を提供するステップ；固定化プローブ−断片ハイブリッドを形成する条件下で、当ꧨ늂菣ꂃ雦螉苣膀黥몱껥꾏菨ꪁ臩鶼귥Ꞻ臣뺯뿥馁苣超裥銂鳦馁苣螤闦꺁鯥骮賥뢠藩鞃菣벃菣ꢁ軦ꚧ臣鮁苣릂菣莃菣鮼鯥骮賥鞁臣鞃菣벃菣銈雦螉菣ꒂ菣ꪃ菣覃苣릔ꓥ馁苣릂菣莃菣鮼迥뎁胣릔ꓥ鞁臣鞃菣벃菣뺁臣꾁雦螉苣鲤蟥鞁胣鶁苣ꮁ苣誂胣鎽ꧨ늂菣ꂃ臣讞뇦骮迥붃臣몁볤邭뫥銂ꓦ몇臣讂苣蚃菣鞃苣ꮐ苣芀臣貂臣ꂊ臣ꚁ臣龁臣鎁苣ꮁ믤袁臣膀臩鶼귥邃苣ꪂ菣벃苣벃臣鲤蟥꾁胣袼뷯覼ꓨ낕臣늂菣ꂃ雦螉苣邏뻤馁苣릂菣莃菣ꞁ臣ꎁ臣膀뷥늩ꓨ낕臣늂菣ꂃ雦螉臣膀냥ꪁ臣ꢁ苣醼苣겂菣벃苣꺁ꓨ醛뫥銂鳦馁苣醰臣辁臣节볯邼볯閽뷯꺁볯꺼볯銂鳦鞁臣蒁苣膀苣蚃菣鞃볯袼뷯覼뷥늩ꓨ낕臣늂菣ꂃ雦螉苣膀ꓨ낕臣낕臣讂鯥骮賥뢠藩鞃菣벃菣ꢁ軦ꚧ臣鮁苣릂菣莃菣ꞁ臣ꎁ臣膀냥ꪁ臣ꢁ苣閼볯邼臣낕臣讂ꃦ뢅菣궃菣隃臣膀뷥늩苣躃菣궖觧ꢁ菣ꒂ菣ꪃ菣ꒂ苣鞁臣膀菣궃菣隃雦螉菣ꒂ菣ꪃ菣覃苣ꊽ裦馁苣膀苣蚃菣鞃볯誏臣膀볯莽볯鞃菣벃菣銈雦螉臣较苣隃菣莃菣꺁黥몱껥꾏菨ꪁ臩鶼귥Ꞻ苣鲤蟥馁苣릂菣莃菣銂郥肂雦閳苣ꮐ苣鎁臣貁臣趁苣芀臣貂臣ꂊ臣ꚁ臣龁臣鎁苣ꮁ믤袁臣膀臩鶼귥邃苣ꪂ菣벃苣벃臣鲤蟥꾁胣袼뷯覼ꓨ낕臣늂菣ꂃ雦螉苣邏뻤馁苣릂菣莃菣ꞁ臣ꎁ臣膀뷥늩ꓨ낕臣늂菣ꂃ雦螉臣膀냥ꪁ臣ꢁ苣醼苣겂菣벃苣꺁ꓨ醛뫥銂鳦馁苣醰臣辁臣节볯閽뷯込뷯貽臣莿뫥꺁볯꺼볯銂鳦鞁臣蒁苣膀苣蚃菣鞃볯袼뷯覼뷥늩ꓨ낕臣늂菣ꂃ雦螉苣膀ꓨ낕臣낕臣讂鯥骮賥뢠藩鞃菣벃菣ꢁ軦ꚧ臣鮁苣릂菣莃菣ꞁ臣ꎁ臣膀냥ꪁ臣ꢁ苣閼볯邼臣낕臣讂ꃦ뢅菣궃菣隃臣膀뷥늩苣躃菣궖觧ꢁ菣ꒂ菣ꪃ菣ꒂ苣鞁臣膀菣궃菣隃雦螉菣ꒂ菣ꪃ菣覃苣ꊽ裦馁苣膀苣蚃菣鞃볯誏臣膀볯莽볯鞃菣벃菣銈雦螉臣较苣隃菣莃菣꺁黥몱껥꾏菨ꪁ臩鶼귥Ꞻ苣鲤蟥馁苣릂菣莃菣节郥肂臣ꢁ臣ꞁ臣讂雦閳苣ꮐ苣鎁臣貁臣趁苣芀臣貂臣ꂊ臣ꚁ臣龁臣鎁苣ꮁ믤袁臣膀臩鶼귥邃苣ꪂ菣벃苣벃臣鲤蟥꾁胣颍鯩鞁臣貺鳦階苣躃菣꒼볯ꆼ苣邏뻤馁苣릂菣莃菣膀뫤겜軩늂菣ꂃ볯꺼볯銂胣讃菣궂菣낂觥ꢁ軦ꚧ臣鮁臣讃菣꾂臣ꖅ臣龁볯꺼볯銂铧邈臣讂苣蚃菣鞃胣鎁臣讃菣꾂臣ꖅ臣龁볯꺼볯銂胣階뷧鮏菣ꪃ菣ꦃ菣벂胣誏臣膀ꓨ낕臣鞃菣ꒂ菣벃臣ꖎ꟨閁臣ꚁ胣늂菣ꂃ볯꺼볯銂ꋥ薹臣讂苣蚃菣鞃苣ꮐ苣膀苣躃菣꒼볯ꆼ苣鞢맥馁苣릖돦貁郥肂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣鎁苣ꮁ諥袁臣뺁臣꾁臣貂臣ꎻ臣ꚁ胣몁볤邭菣ꒂ苣麃菣ꮂ菣꺁ꓦ몇臣膀苣躃菣꺁黥몱껥꾏菨ꪁ臩鶼귥Ꞻ苣鲤蟥馁苣릖돦銂郥肂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣鎁臣릖돦꾁胣袼뷯覼ꓨ낕臣鞢맥鞁臣螽볯꺼볯궖觧銂苣뎃菣袃菣ꞁ믨馆臣膀臣貂臣袂苣膀苣躃菣늼볯ꆼ볯螽볯꺼볯覼雦螉苣鞾苣릂菣莃菣鮼볯芽볯讞뇦骮迥붃臣몁볤邭뫥ꮁ꿥鲿臣讂藩鞈苣覜臣讂ꓨ낕臣뢠藩鞃菣벃菣ꢁ胣鎽ꧨ螽볯꺼볯궖觧ꢁ苣较苣隃菣肃苣몂臣讂苣蚃菣鞃볯誏臣膀볯莽볯鎽ꧨ鞃菣벃菣ꮁ菣ꒂ菣ꪃ菣ꒂ苣馁苣螽볯꺼볯궖觧꺁黥몱껥꾏菨ꪁ臩鶼귥Ꞻ苣鲤蟥馁苣릂菣莃菣銂郥肂胣鎁苣ꮁ諥袁臣뺁臣꾁臣貂臣ꎻ臣ꚁ胣몁볤邭菣ꒂ苣麃菣ꮂ菣꺁ꓦ몇臣膀ꓨ醛臣貁냥閁臣膀臩鶼귥Ꞻ觧낕髧ꪁ胣鞢맥鞁臣늂菣ꂃ雦螉臣ꎻꇨ蒚臣蚛鯥銂铧邈臣讂雦閳苣ꮐ苣鎁臣貁臣趁苣芀臣꺁雦閳臣膀볯膽볯螤闦꺁菣뎃菣ꂃ菣ꦃ苣麃菣ꞁ胣趃苣蚃苣隃苣躃菣銂ꓨ붣臣膀臣貂臣袂苣膀苣躃菣궖觧꺁ꋥ薹臣龁믤ꢡ髧ꪁ鯩ꎛ苣龔裦馁苣릂菣莃菣鮼볯芽볯螤闦꺁闧ꪁ苣몁볤邭뫥릉闧蒚菣ꦃ苣麃菣銂铧蒁臣膀苣躃菣궖觧꺁ꋥ薹臣龁믤ꢡ髧ꪁ鯩ꎛ臣鲺鯩ꎛ苣螤ꏨ鞁胣鶁苣ꮁ苣誂胣몁볤邭뫥릉闧蒚臣膀ꋥ薹臣龁苣躃菣궖觧꺁믤ꢡ髧ꪁ鯩ꎛ苣龔裦馁苣릂菣莃菣鮼迥뎁胣袼뷯覼뫤蚛鯥銂跥ꊛ臣膀臣貂臣袂苣膀ꓨ醛臣貁냥閁臣膀臩鶼귥Ꞻ觧낕髧ꪁ胣鞢맥鞁臣늂菣ꂃ雦螉臣ꎻꇨ蒚臣蚛鯥銂铧邈臣讂苣蚃菣鞃苣ꮐ苣鎁臣貁臣趁苣芀臣貂臣ꂊ臣ꚁ臣龁臣鎁苣ꮁ믤袁臣膀臩鶼귥邃苣ꪂ菣벃苣벃臣鲤蟥꾁胣鞃菣ꒂ菣벃볤랕苣莃苣ꒂ臣誁臣讂菣궃菣隃臣낕触Ꞁ볤랕苣뮘껥馁苣릖돦銂郥肂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣鎁臣릖돦꾁胣袼뷯覼菣궃菣隃裢馨髧较苣隃菣莃菣銂뷥邈臣讂鷦뚻룤ꞁ胣螤闦꺁菣궃菣隃ꃦ뢅苣膀ꓨ낕臣馨髧뢠藩ꢁ軦ꚧ臣鮁苣릂菣莃菣鮼볯芽볯鞃菣벃菣銈闧肉胦뢼闩뮘껥ꒉ菣ꒂ菣ꪃ菣覃苣ꊽ裦馁苣ꆝ믤许臣膀ꓨ낕臣鞃菣벃菣뢠藩銂胣낕触Ꞁ볤랕飩뎮觥ꢁ軦ꚧ臣鮁苣릂菣莃菣鮼迥뎁볯莽볯鞃菣벃菣銈闧肉胦뢼闩뮘껥ꒉ菣ꒂ菣ꪃ菣覃臣鞃菣벃菣ꢁ꿦莼臣ꚁ胣鞃菣벃菣銈꣦蒚菣ꒂ菣ꪃ菣覃臣鞃菣벃菣銂臩麊髧ꮁ铦覤臣讂苣蚃菣鞃苣ꮐ苣芀臣貂臣ꂊ臣ꚁ臣龁臣鎁苣ꮁ믤袁臣膀臩鶼귥邃苣ꪂ菣벃苣벃臣鲤蟥꾁胣袼뷯覼鯥骮賥鞃菣벃菣銈雦螉菣ꒂ菣ꪃ菣覃苣ꊽ裦馁苣ꆝ믤许臣膀ꓨ낕臣늂菣ꂃ雦螉苣膀ꓨ낕臣낕臣讂鯥骮賥뢠藩鞃菣벃菣ꢁ軦ꚧ臣鮁苣릂菣莃菣鮼볯芽볯鎽ꧨ늂菣ꂃ雦螉臣较苣隃菣肃苣몂臣ꪁ臣覂胣鎽ꧨ몛껥隌菣궃菣隃苣릔ꓥ鞁胣鶁苣ꮁ苣誂胣릔ꓥ鞁臣몛껥隌菣궃菣隃苣ꊽ裦馁苣릂菣莃菣鮼볯莽볯鎽ꧨ鞃菣벃菣銈雦螉菣ꒂ菣ꪃ菣覃铧ꖝ臣鎽ꧨ늂菣ꂃ雦螉苣꒙軥馁苣릂菣莃菣鮼迥뎁胣袼뷯覼苣躃菣궖觧銂駩뮎臣龁뻥ꮁ胣鎽ꧨ릔ꓥ鞁臣몛껥隌菣궃菣隃苣鲤蟥鞁胣鶁苣ꮁ苣誂胣鎽ꧨ늂菣ꂃ雦螉臣讞뇦骮迥붃臣몁볤邭뫥銂ꓦ몇臣讂苣蚃菣鞃苣ꮐ苣릖돦銂郥肂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣鎁苣ꮁ諥袁臣뺁臣꾁臣貂臣ꎻ臣ꚁ胣몁볤邭菣ꒂ苣麃菣ꮂ菣꺁ꓦ몇臣膀볯膽볯趃苣蚃苣隃苣躃菣銂蛥뺏髧ꮁꋥ薹臣讂苣蚃菣鞃臣芁臣ꚁ胣讞뇦骮迥붃臣몁볤邭뫥銂鳦馁苣늂菣ꂃ雦螉臣鞢맥鞁臣ꎻꇨ蚛鯥銂귧ꦸ鷦뚻룤ꞁ铧邈臣讂胣릂菣莃菣鮼볯芽볯鎽ꧨ늂菣ꂃ雦螉苣膀菣궃菣隃裢궖觧较苣隃菣莃菣銂뷥邈臣讂鷦뚻룤ꞁ胣讞뇦骮迥붃臣몁볤邭뫥ꮁ꿥鲿臣讂藩鞈苣覜臣讂ꓨ낕臣뢠藩鞃菣벃菣ꢁ軦ꚧ臣鮁苣릂菣莃菣鮼迥뎁胣袼뷯覼菣궃菣隃裢궖觧꺁菣ꒂ菣ꪃ菣覃臣讞뇦骮迥붃臣몁볤邭뫥銂ꓦ몇臣讂胣릂菣莃菣銂郥肂雦閳苣ꮐ苣鎁臣貁臣趁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣邼볯銼볯醀⼼䥄㹖 蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣꾁胣몁볤邭菣ꒂ苣麃菣ꮂ菣袼뻤袁臣膀볯ꒁ믤誸臣몁볤邭菣ꒂ苣麃菣ꮂ菣覼臣鲤蟥꾁胣뎱鯥릉꣨견볯貼볯隼볯貼볯醼볯랏臣風볨閁苣龁믤辄臣颧胣ꪁ雦閳苣ꮐ臣鞾胣芏藧ꮁ苣誂臣꺁藥鎽臣겜飦내鯦ꮁ뗧뾁뻨뺁苣讂胣设臣낁胣몁볤邭菣ꒂ苣麃菣ꮂ菣꺁ꓦ몇臣膀菣궃菣뎃藩ꦡ臣鲤蟥꺁臣膂臣릖돦膀迥뎁胣랂苣蚃菣銂郥肂臣ꢁ臣ꞁ臣膀臣貂苣꾁胣颍诧ꞁ胣뺁臣꾁胣醃苣궃苣벃苣뎃苣뎃苣ꪁ臣꺁臣꺁믤꺁諦鎡臣蒵臣袐苣鮁臣뾽铧馁苣鎁臣貁臣趁苣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꞁ臣膀臣꺁苣蚁臣릖돦膀迥뎁胣랂苣蚃菣꾁胣邃菣꾂苣ꦃ苣뎃菣銂諦袁臣貁苣膀菣궃菣뎃藩ꦡ臣鲤蟥銂迥붃臣馁苣芀臣貂臣ꂊ臣ꚁ臣龁臣鎁苣ꮁ믤袁臣膀臩鶼귥邃苣ꪂ菣벃苣벃臣鲤蟥꾁胣邃菣꾂苣ꦃ苣뎃菣銂諦袁臣貁苣膀ꃦ뢅臣醃苣궃苣벃苣뎃苣뎃苣꺁臣膂臣릖돦膀迥뎁胣랂苣蚃菣銂郥肂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣鎁苣ꮁ諥袁臣뺁臣꾁臣貂臣ꎻ臣ꚁ胣몁볤邭菣ꒂ苣麃菣ꮂ菣꺁ꓦ몇臣膀菣궃菣뎃藩ꦡ臣鲤蟥銂臩뚻臣鮁苣릖돦銂郥肂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣鎁臣릖돦꾁胣钃菣ꪃ菣뢅ꇥ醇뇥ꒂ苣뎃냥階觥銂迦鮾臣讂苣蚃菣鞃胣鎽ꧨ醇뇥ꒂ苣뎃냥階觥꺁귥ꢜ룤ꞁ菣궃菣뎃藩ꦡ苣龔裦鞁胣鶁苣ꮁ苣誂胣钃菣ꪃ菣뢅ꇥ銂迥蚀髧ꮁ냥階臣讂苣蚃菣鞃胣鎽ꧨ钃菣ꪃ菣뢅ꇥ銂胣鎽ꧨ醇뇥ꒂ苣뎃냥階觥讁苣뺔蟥馁苣릂菣莃菣膀迥뎁胣钃菣ꪃ菣뢅ꇥ銂ꓦ몇臣讂苣蚃菣鞃苣ꮐ苣鎁臣貁臣趁苣芀臣貂臣ꂊ臣ꚁ臣龁臣鎁苣ꮁ믤袁臣膀臩鶼귥邃苣ꪂ菣벃苣벃臣鲤蟥꾁胣뢠藩銂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†볯閼볯膀菣ꆂ菣ꪃ菣꺁臣貂臣貂臣ꆃ菣邃菣꺁苣ꪃ菣꾂苣袃菣뎃菣銂苣벃苣ꢂ菣랂菣낂ꏨ꺽臣견볯꺁菣벃菣ꮁ铧ꖝ臣讂藩鞈볯ꦼ뷯貽뷯趽뷯躽뷯₁膽뷯膽뷯钽뷯銽†볯鞼볯膀臣뾁臣鞁臣蒁苣袼鯥閼볯覼胣ꊼ뷯钽볯薽뷯뎼臣誁臣ꚁ뷦ꢜ髧ꪁꓥ낕臣뾁臣馁臣꾁胣꾃菣붂菣閃苣龃菣벃菣뎃菣벃臣蚁臣꺁觢馼볯薼迥뎁苣ꪃ菣꾂菣ꆂ菣ꪃ菣ꆃ菣邃菣꺁臣ꆁ臣꞉볯邼볯ꮁ臣蒁臣貐룤超裥覤賥貁ꫨ膂苣貂胣鶁苣麁苣꺁菣ꆂ菣ꪃ菣貁냥ꪁ臣ꢁ苣銼臣꺁菣뎃菣벃臣讧裦閁苣ꚁ臣讂臣ꢁ臣薿ꛨꢁ臣讂胣鶁苣麁苣醼볯邼ꇥ몟臣骃苣ꢂ菣覃菣벃菣銂铧蒁臣ꦃ菣莃菣ꦃ菣ꊃ菣覃臣ꦼ뷯貽뷯趽뷯躽뷯₁ꢼ뷯뎼뷯醽†볯閼볯邼ꏨ꺽苣뾽铧鞁臣ꊼ뷯钽볯薽뷯뎼菣ꒂ菣ꦃ菣銂꟨邞臣龁胣ꦃ苣隃菣ꪃ臣龁苣궸ꓥꞁ볯邼駧螸볯궼볯꺁苣ꦃ苣뾂菣袼菣ꒂ菣ꦃ菣芁臣誂볯鞼胣醼볯颼볯꺁苣ꦃ苣뾂菣꺁꿧늛胣ꢡ볯鎼볯貁꣦隺髧ꪁ볯貽뷯閽뷯覽뷯膽鏥ꪳ菣ꎂ菣뾂菣銂胩躁臣龁胣ં䐼噉邀볯邼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†볯辽뷯뎼뷯醽볯螃菣뾂蟥蚐菣ꒂ菣ꦃ苣뎃戼㹲 ꊼ뷯钽볯薽뷯뎼菣ꒂ菣ꦃ苣뎃臣꺛髧꾁胣貸냥ꪁ뷤내菨릂ꓥ낕苣ꎭꋧꮁ郥骮臣ꚁ胣ꚩ雦궸臣誁臣讂臣貂苣覤闧꺁ꃩꚺ苣袨껧馁苣鎁臣ꞁ臣ꎁ臣芀臣꺁鯧蒚臣龁苣ꮁ菣벃苣銂蟥蚐臣讂臣膂臣膀볯늼볯袽볯鞼볯袽뷯醼볯銃菣ꪃ菣ꆂ菣뎃苣늂菣ꂃ臣麃菣钃菣낂臣鮁苣ꖼ볯ꆼ볯꒼뷯銼苣ꢔ臣ꚁ胣ꦼ뷯貽뷯趽뷯躽뷯꺁뫤ꆬ꟨邞菣莃苣벃苣袼볯ꆼ볯ꆼ볯ꆼ†볯躼볯覼臣龔苣벃苣ꢂ菣랂菣낂菣벃苣銂藥鮊臣龁胣ꊼ뷯钽볯薽뷯뎼菣ꒂ菣ꦃ苣뎃臣ꎧ黦ꢔ臣颫鏥ꪳ臣ꪃ菣覃苣뢁諦馁苣鎁臣ꮁ苣誂雩讧臣讂볯ꦉ돨誏臣릖돦銂迥ꞅ臣鎁臣覼胣ꆬ臣膀菣벃苣銂胣鶁苣麁苣꺁볯辽뷯뎼뷯醽볯ꦃ苣隃菣ꪃ铧꺁볯ꒁ臣蚃菣隃菣膀볯覽볯ꪃ菣ꆂ菣뎃苣超裥ꮁ铧ꖝ臣讂藥ꚁ臣꺷闧銂裥馌臣讂胣覤賥趀菣벃菣ꮃ胣誏臣膀볯覽뷯覼藥ꚁ臣閃苣龃菣벃苣鞈賦馁苣몛鳦蚈귥蚃菣隃菣膀臣ꢷ裦鞁臣芀蟩膦臣鎁臣ꮁ胣鶁苣麁苣꺁菣벃菣ꮃ臣릂菣ꦃ菣覃菦놠苣ꮐ鳦鞁臣蒁苣袼臣貂臣貂臣ꊼ뷯钽볯薽뷯뎼菣ꒂ菣ꦃ菣ꮁ铧ꖝ臣讂鯥覜裥邭臣蚁臣꺁臣벁跥낕볯궸ꓥ钼볯薼胣颼볯鲀볯銼볯꺁꿧늛볯貁胣螃菣뾂苣莃菣薆臣몤臣貂臣꾃菣붂菣릂菣ꦃ菣覃臣꾂菣莃苣릂菣ꦃ菣覃臣ꆸ雦銂鳦鞁臣蒁臣覼臣ꢁ臣袂苣膀뛧辁ꓥ낕꟨邞臣誁臣讂觧낕뫥貁뿤벨臣貂臣蒁苣芀鯦ꮁ胣뮁臣鎂臣꺁볯辽뷯뎼뷯醽볯ꦃ苣隃菣ꪃ볯钼볯꺁臣ꆁ臣鎼볯覼臣閼胣銼볯꺁룤꺤闦꺁菣ꆂ菣ꪃ菣ꆃ菣邃菣銂鳦鞁臣誁苣袼鯥閼볯覼胣ꦃ苣隃菣ꪃ臣蚠ꫨꪁ菣袃菣趃菣꾂賥銂迥醁臣蒁苣鎁臣貁鯦ꮁ껥벨臣貂臣芀㰊䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 貸냥ꪁ뷤내菨覤闧銂郥骮臣讂臣膂臣꾁胣ꊼ뷯钽볯薽뷯뎼菣벃苣讁苣龔껦내菨뮳ꓥ낕黥誏臣꾂菣벃菣覤闧讞苣꒙軥馁苣鎁臣貁뿥膦臣芁臣龁볯겜駧躘胨覂臣膀苣궃菣뎃ꓥ낕黥銂胣銼臣ꖻ룤꺁诩讞裥邭臣ꆸ雦꺁苣袃菣뎃菣薆臣颭鳥馁苣覤闧讞臣骮뻧鞁臣覼胣겜駧躘胨覂臣膀鳦ꚩ꣩ꮁ臣醁苣鎼볯趐臣讀뷤꺁臣ꆁ臣鎼볯趐臣膀郥肸볯꺼볯ꚩ雦膀臣龁臣膀볯辽뷯뎼뷯醽볯ꢔ臣貸蟩閁苣ꚁ臣龁郥肸菣ꒂ菣ꦃ菣膀臣ꢅ苣躃菣랂菣꾂苣뎃苣뎃苣袼볯Ꞽ볯覼苣龮雦鞁臣袼ꇨ钼볯覼胣议苣꺁볯ꒁ臣讀뷤袼볯꾼볯銼볯颼迥뎁볯꾼볯銼볯馼볯ꮁ臣蒁臣꾁苣뎃苣벃苣벃苣ꢂ菣랂菣낂苣龮雦鞁臣꾂菣벃菣覤闧讞苣꒙軥鞁臣貁胣ꊼ뷯钽볯薽뷯뎼臣랼볯뎼臣薿ꃩꞁ臣ꪁ臣鎁臣貁껥벨臣貂臣芀菣莃菣鞁臣랼볯뎼菣벃苣뮂菣袃臣覂껥鎘臣貐껥꾏菨ꞁ臣誂胣Ꞥꓥ낕볯궸ꓥ馼볯薼胣颼볯鲀볯钼볯꺁꿧늛볯꺁ꓥ낕黥貁铧隮듧麃돧ꞁ臣讂臣ꢁ臣ꒈ飦鞁臣芀鳦몙飦薀苣꾁胣꾂菣벃菣Ꞁ臣ꂊ臣ꚁ胣ꦁ裥ꮁ菣莃菣뎃苣閁苣龁뷤꺽臣ꒁ臣ꚁ臣뾁胨龯苣財臣鎁臣ꮁ苣誂胣뺁臣鶁臣隻臣閃苣ꮃ苣벃苣뾽铧馁苣鎁臣ꮁ苣誂胣鲽鳥蒚臣ꊂ菣膃菣ꆂ苣袃苣꒙軥鞁臣袼ꇨ钼볯鲀ꇨ钼볯膀臣覂臣ꮁ胣ꦉ돨誏臣릖돦覼胣ꆸ雦꺁苣袃菣뎃菣誸臣覤闧銂귥ꢜ臣鮁苣ꢁ臣蚁鷦뚻臣膀臣꺁菣ꎂ菣뾂菣貁臣蒁臣膀볯Ꞽ볯ꦃ苣隃菣ꪃꫨ붣臣誁臣ꚁ苣벃菣閃苣꾂菣銂ꓧ馁臣ꢁ臣ꖟ苣貂臣蒁苣骤闦꺁볯麼볯ꦡ鿥ꊻ迦袼鯥閼볯覼臣颭鳥鞁臣鞁臣蚁臣ꢁ臣覂胣龮髩꺁臣鎁苣薿ꛨꞁ臣ꎁ臣袼뻤袁臣膀볯辽뷯钽뷯貽뷯辽†뷯钽†뷯貽볯貼볯邼볯鎼†볯閽뷯貽뷯覽뷯₃膽뷯覽뷯鎽†뷯薽뷯薽뷯銽뷯袽†볯醼볯薽볯鞼苣芏藧꺁臣ꢁ볯芀볯趐臣讀뷤꺁귦뢸볯꺼볯袼볯ꖼ볯馼볯覼苣ꖈ臣讀뷤꺁귦뢸볯꺼볯袼볯ꖼ볯馼볯覼臣銼臣꺁闧ꪁ苣钯軧ꞁ럦袐臣讂臣ꢁ臣袂苣膀胣릂菣ꒂ苣ꒂ菣趀ꋧ趪껥鎨苣뒛臣龮雦鞁臣芀볯辽뷯뎼뷯醽볯銂뷤ꢔ臣讂臣膀鯧蒚臣醼볯趀럥낕臣袺룦閁苣龁苣ꦃ菣薆臣誁臣ꚁ胣躽苣醃苣꾂苣뎃臣颫苣醃苣꾂苣뎃臣鎖臣鞼볯钼胥꺁ꃩꚺ럥ꞁ胣ꆸ雦꺁ꧨ首룤ꮁ臣醁苣낼볯꺼볯鎼觧낕髧뎼볯낼苣鲤蟥馁苣鎁臣貁迥붃臣芁臣龁볯ꦉ돨誏臣릖돦銂迥ꞅ臣鎁臣覼胣ં䐼噉邀볯邼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†볯钼臣ꊼ뷯钽볯薽뷯뎼菣ꒂ菣ꦃ菣讁苣膀뷯钽볯꺼볯薆臣뢠볯꺼볯薆臣鶁苣麁苣ꮁ臣醁苣膀郥袨臣隼볯隼臣颼볯隼臣貸냥鎽듧麃苧覤闧貁郥骮臣貂臣袼ꇨ钼볯誏臣ꢡ볯邼볯芀藥ꚁ臣貸냥覤闧貁鯧隦ꓦ뮟苣骀臩鞁胣떂菣뮂菣袃苣떂菣겂菣랂菣꾂苣뎃苣鞁臣膀ꓥ낕臣龔껦내菨뮳臣꾁臣蒁臣ꢁ胣뺁臣꾁胣閩뻤鞁臣ꚩ雦궸臣覤闧貁ꓥ辁ꫨ膂苣貂臣蒁苣鎁臣銂ꋧ趪臣龁볯ꦉ돨誏臣릖돦銂迥ꞅ臣鎁臣覼胣鎁苣뺁臣꺁ꧨ鎨臣覂뫤겸臣貂苣ꢁ臣誂胣銼볯趐臣뺯藧讀뷤ꮁ臣醁苣趽뷯꒼볯ꆼ臣릂ꓥ낕ꃩꚺ볯醼볯钼볯슐醼볯銼볯쎙醼볯㲐畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢裢閼⼼畳㹰臣覤闧込뷯邽胣뎹鷥슇鎽볯蒽볯覼臣膀ꃦ꒼볯ꆼ臣릂ꓥ낕ꃩꚺ볯閼볯銼볯슓鎼볯钼볯쎗醼볯㲐畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢裢鞼⼼畳㹰볯袂苣节鳦辄臣颫臣ꎁ臣袼룤뒁뷯鲤껥膀볯鲼볯躼볯邼볯醼胣ꢡ볯醼볯芀볯躼볯颼韃볯邼猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰銈볯銼⼼畳㹰臣북駩Ꞁ軧銂軦骮臣讂臣膂臣肸蟨鞁臣蒁铧隮듧麃돧颃菣궃軦袐胦뎂菣ꮃ苣뾽铧鞁臣膀볯辽뷯뎼뷯醽볯꺁觧낕뫥銂鯦ꮁ룦骮臣龁볯ꦉ돨誏臣릖돦銂迥ꞅ臣鎁臣覼胣ં䐼噉邀볯邼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†ꓥ낕ꃩꚺ臣꒼볯ꆼ뿤ꦾ菨誏臣몙臣鎂胦ꦉ돨鶛鳩ꮁ苣ꎁ臣覤賥馁苣㲋牢ਾ†볯辽뷯뎼뷯醽볯貁菣릂菣莃菣꺿뻥ꂬ郦讀뷤꺁귦뢸뗧钹蛥ꮁ臣醁苣颫菣馃菣꺁ꓥ낕苣鲤蟥ꞁ臣讂臣ꦁ臣讁苣肜裥ꮁꋧ趪臣龁胣龃苣麃菣膃뿤ꦾꧦ讧蛥ꮁ菣ꒂ苣것菣趸듦隌铧隮듧麃돧覤闧銂鳦馁苣讀뷤꾁胣ꎭ룥蒵맧ꢁ藨趘뗧钹臣ꆸ雦ꮁ臣蒁臣袂苣颫臣것菣ꮃ臣覤闧銂ꓧ馁볯设臣낁胣낼뷯銽뷯辽뷯鎽†뷯钽†뷯貽볯貼볯馼볯閼†볯莽뷯薽뷯莽뷯₅銼볯颼볯鞼볯颼裢鞼볯邼볯誏臣뎼뷯貽뷯薽뷯₎薽뷯ₔ膽뷯躼볯銼볯醼볯ₕ꺼뷯钽뷯銽뷯₅螽뷯躽뷯钽뷯莽뷯ₓ钼볯骼볯閼볯銈볯隼볯銂迥ꞅ臣鎁臣覼胣鶁苣蚂臣膀볯辽뷯钽裢궼뷯覽뷯钽뷯莽†볯薽뷯銽뷯螽뷯钽뷯辽뷯₎銼볯낼볯뎼볯覼臩鶼귥薆臣邃苣ꊂ菣ꮃ룤뮴賥龔껦내菨뮳ꓥ낕苣覜臣讂胥鎽볯ꎼ볯겼볯鎼볯誏臣ꎼ볯겼볯鎼볯覼臣ꎭ룥邵藨誸髧ꮁ铧ꖝ臣讂볯꺼볯銂ꓦ뮟臣龁胣ꊼ뷯钽볯薽뷯뎼苣뾽铧馁苣ꢁ胣鎁苣覂볯趐臣貐菨薆臣誁臣讂ꃦ꒼볯ꆼ臣뎹鷥覤闧뮠뫥袼볯躼볯鎼뇂볯躼볯鞼韃볯邼猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰銈볯㲕猯灵꺁ꓥ낕볯芽뷯膀맥ꊽ胣醼볯뎭迥뎁볯颼귦覼臣膀蓥貂臣龃苣麃菣膃뿤ꦾ苣覜臣讂ꇩ벼臣龁맥ꊽ臣讀뷤薆臣誁臣讂ꃦ꒼볯ꆼ臣뎹鷥覤闧뮠뫥袼볯꾼볯銼볯閼胣ꎼ볯겼볯鎼볯膀볯꾼볯銼볯鞼胣ꎼ볯겼볯鞼볯ꮁ臣醁苣膀볯躼볯鎼뇂볯躼볯鎼韃볯邼猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰銈볯㲗猯灵膀맥螝맥ꊽ볯钼귦覼苣誂苣覜蓦ꮁꯩ蒁臣ꢁ臣讦蟥閁苣龁볯ꆸ臥钽ꓦ骮胣낼볯邼볯邼볯膀鯥閼볯膽볯芀ꃦ覤闧뮠뫥꺁臣꺁볯銼볯趀臣鞢諥꾁胣낼볯뎼볯㲒畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯込볯㲋猯灵뎂菣벃菣ꢁ볯궼볯銼猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰銈볯銈⼼畳㹰苣鮃菣袃臣鎖臣誁臣讂ꃦ覤闧릂菣꾂菣ꮃ臣覜蓦ꪁ럥낕臣ꊖ胩鞁臣蒁臣袼菣ꎂ菣랂菣벃臣ꎭꋧ몢軧鲤껥膀볯鶼볯躼볯钼胣뎛볯鎼뷯覼胣ં䐼噉邀볯邼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†볯辽뷯뎼뷯醽볯貁鋧莢룤꺁駧貁苣Ꞁ觧ꪳ臣鶛鳩閁苣龁胥鎽臣ꎭ룥蒵맧薆臣誁臣讂ꓥ낕臣覤闧銂郥骮臣趁苣讁臣蚁臣ꮁ臣蒁臣节ꧨ鎨苣財臣龁胣誸菩뾰럨誸髧貙臣늂菣ꂃ菣ꒂ菣랂菣꾂苣뎃苣뎃苣貁臣貂臣ꞁ臣龮雦閁苣ꚁ臣誂胣貁苣꺁苣ꒂ菣貁苣ꪃ苣袃菣궂苣뢅볯ꆼ볯覼臣꺁鯦늜臣龁臣ꮖ藧ꮁ雩ꎀ臣ꚁ臣讂臣ꢁ苣몤臣ꚁ臣讂볯设臣낁胣ꢼ뷯膽뷯螽†뷯钽†뷯貽볯貼볯邼볯鎼†볯莽뷯薽뷯莽뷯₅钽뷯膽뷯鎽뷯膽뷯覽뷯躽뷯貽†뷯薽뷯覽뷯覽뷯薽†볯骼볯馼볯銽뷯醼볯銼苣芏藧꺁臣ꢁ볯芀볯ꆼ臣ꂊ臣ꚁ苣邃苣꺁藧ꮁ郥뺁苣讂ꓥ낕軥꾁귦뢸藨꺚돨薆臣ꎻ골閁苣ꚁ볯꺼볯颻諥鎽苣龔裦馁苣袼뻤袁臣膀볯辽뷯躽뷯₇薽뷯ₔ膽뷯躼볯銼볯醼볯ₓ뎼뷯覽뷯躽뷯薽†뷯銽뷯躽뷯貽뷯钽뷯辽뷯膽뷯₌趽뷯蒽뷯莽뷯躽뷯₅閼볯醼볯鞼뷯膽볯邼볯鮼迥뎁볯膽뷯蒽뷯銽뷯钽뷯₈薽뷯ₔ膽뷯躼볯醼볯颼볯ₙꪼ뷯閽뷯躽뷯貽†뷯蚽†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†뷯閽뷯膽뷯覽뷯躽뷯ₓ覽뷯₎薽뷯蒽뷯趽뷯钽뷯覽뷯貽†뷯膽뷯莽뷯銽†뷯貽뷯莽뷯蒽뷯钽뷯鎽†뷯₁躽뷯隽뷯貽†뷯薽뷯袽뷯躽뷯鎽뷯₍蚽뷯銽†뷯薽뷯閽뷯膽뷯覽뷯躽†뷯蚽†볯뒼볯꺼†뷯銽뷯钽뷯覽뷯₎鎽뷯膽뷯覽뷯覽뷯馽볯ꎼ뷯躽뷯薽뷯ₒ꒼뷯鎽뷯辽뷯ₖ醼볯醼볯邼裢醼볯閼볯銼볯醼볯覼볯㲎牢ਾ菣ꎼ뷯膽뷯讽뷯銈볯薽뷯銽뷯辽뷯₎꒼볯袼볯邼볯馼볯ꎼ뷯覽뷯覽뷯膽뷯₌邽뷯膽뷯钽뷯莽뷯躼볯莽뷯薽뷯躽뷯躽뷯₇蚽뷯銽†뷯隽뷯銽뷯膽뷯₎莽뷯躽뷯薽뷯躼볯₮ꖼ뷯螽뷯₌ꪼ†볯薽뷯₄鎼볯醼볯銼볯骼볯鞼볯銈볯鞼볯躼戼㹲뮃볯辽뷯趽뷯鎽†뷯钽†뷯貽볯貼볯袽뷯銽뷯邽뷯銈볯薽뷯膽뷯薽뷯₄ꎼ뷯辽뷯膽뷯₌ꢼ뷯趽뷯钽뷯邽뷯覽뷯鎽뷯鎽†뷯躽†볯膽뷯覽뷯躽뷯鎽†뷯覽뷯袽†볯辽뷯銈뷯薽뷯膽뷯辽뷯辽뷯覽뷯₃ꎼ뷯躽뷯薽뷯鎽†볯鎽†볯辽뷯趽뷯躽†뷯躽뷯₄ꆼ뷯鎽뷯莽뷯膽뷯薽뷯₄鞽뷯钽뷯₈ꆼ뷯隽뷯銽뷯薽†볯貽뷯躽뷯莽뷯貽†볯閽뷯莽뷯趽뷯鎽볯ꎼ뷯貽뷯₌뎼뷯薽뷯₍ꎼ뷯貽뷯貼볯銼볯醼볯覼볯㲎牢ਾ菣ꎼ뷯鞽뷯躽†볯겼볯뎼뷯銽뷯躽뷯薽뷯ₒ뎼볯꺼뷯閽뷯薽뷯₎꒼볯뒼뷯袽뷯銽뷯₉꒼볯Ꞽ뷯躽뷯銽†볯貼볯薽뷯蒽뷯骽뷯₁늼뷯蒽뷯覽뷯閽뷯骽†볯ꆼ볯랼뷯躽뷯₇림볯ꮼ뷯躽뷯薽†볯貼볯薽뷯₌ꎼ뷯銽뷯薽뷯₎늼뷯蒽뷯覽뷯閽뷯骽†볯薽뷯膽†볯貼볯膽뷯蒽뷯躽볯閽뷯鎽뷯袽뷯₅ꎼ볯貼볯貽뷯辽뷯₎궼볯貼볯閽뷯袽뷯₁ꦼ볯ꚼ뷯誽뷯钽뷯₁ꮼ볯ꖼ뷯钽뷯馽†볯貼볯覽뷯骽뷯薽뷯ₒꮼ볯ꊼ뷯隽뷯貽뷯莽뷯閽뷯₁뒼볯낼뷯邽뷯蒽뷯邽뷯閽뷯辽뷯ₓ꺼볯뚼뷯螽뷯貽뷯钽뷯覽뷯₎ꊼ볯꺼뷯钽뷯辽†볯ꪼ볯銼볯醼볯覼볯薽뷯薽뷯钽뷯辽뷯₎辽뷯₆뒼볯늼볯₴邽뷯辽뷯辽뷯薽뷯ₒ趽뷯钽뷯钽뷯辽뷯鎽†뷯躽†뷯銽뷯趽뷯銽뷯ₙ膽뷯薽뷯辽뷯膽뷯莽뷯躽뷯趽뷯₁辽뷯₆钽뷯薽†뷯銽뷯躽뷯銽뷯ₙ芽뷯膽뷯蒽뷯銽볯ꢼ뷯趽†볯膽뷯袽뷯貽†볯鎼볯颼裢醼볯躼戼㹲뮃볯膽뷯覽뷯ₓ늼볯ꪼ뷯躽뷯鎽†볯뎼볯ꊼ뷯銽뷯莽뷯鎽†볯ꆼ볯ꎼ뷯鎽뷯貽뷯₅ꖼ볯貼볯膽뷯螽†볯ꮼ볯겼뷯隽뷯覽뷯貽뷯薽†볯ꪼ볯궼뷯鎽뷯覽뷯螽†볯궼볯궼뷯貽뷯薽뷯ₒ뎼볯貼볯薽뷯薽뷯鎽뷯躽†볯ꎼ볯뒼뷯銽뷯₋뒼볯貼볯薽뷯钽뷯薽뷯₌랼볯ꆼ뷯薽뷯覽뷯膽뷯₎떼뷯辽뷯辽뷯覽뷯膽뷯₌ꆼ뷯鎽뷯莽뷯膽뷯覽뷯躽볯銼볯醼볯覼볯覽뷯螽뷯辽뷯覽뷯貼뷯隽뷯貽뷯膽뷯覽뷯躽†뷯躽뷯₄蚽뷯貽뷯辽뷯銈뷯邽†뷯蚽†뷯鎽뷯趽뷯钽뷯趽뷯钽뷯莽†뷯覽뷯銽뷯袽뷯趽뷯钽뷯銽뷯膽볯ꆼ볯ꢼ볯覽뷯₎膽뷯閽뷯钽뷯骼볯떼볯₡螽뷯覽뷯薽뷯覽뷯薽볯ꪼ†볯銽뷯貽†볯颼볯骼볯钼볯鎼裢銼볯颼볯躼戼㹲뮃볯膽뷯鎽뷯躽†볯ꪼ볯薽뷯ₔ膽뷯躼볯銼볯醼볯覼볯躽뷯貽뷯鎽뷯鎽†뷯蚽†뷯覽뷯莽뷯貽뷯钽뷯躽뷯₇钽뷯趽뷯銽†볯꺼볯₡钽뷯₏趽뷯躽뷯钽뷯銽†뷯薽뷯膽뷯钽뷯钽뷯莽†뷯銽뷯膽뷯钽†뷯膽뷯莽뷯銽볯꺼†볯躽뷯貽†볯₪궼뷯蒽†볯隼볯袼볯鎼볯骼볯醼볯馼裢醼볯邼볯躼戼㹲뮃볯覽†볯薽뷯骽뷯₏궼볯貼뷯钽†뷯貽볯袼볯馼볯閼볯꾼뷯薽뷯薽뷯邽뷯薽뷯鎽뷯辽뷯₎膽뷯蒽†뷯趽뷯貽뷯蚽뷯莽뷯钽뷯辽뷯₎辽뷯₆钽뷯薽†뷯薽뷯込볯Ꞽ볯₦銽뷯莽뷯邽뷯辽뷯ₒ螽뷯躽뷯₅蒽뷯銽뷯躽뷯₇钽뷯薽†뷯銽뷯螽뷯薽뷯鎽뷯辽뷯₎辽뷯₆莽뷯貽뷯銽뷯莽뷯膽뷯₌莽뷯躽뷯薽뷯躼볯貽뷯躽†볯膽뷯莽뷯銽†볯薽뷯ₓ醼볯銼볯骼볯钼볯銈볯閼볯躼戼㹲뮃볯覽†볯薽뷯骽뷯₏궼볯貼볯辽뷯貽뷯辽뷯₍늼볯꾼뷯覽뷯薽뷯辽†볯貼볯辽뷯辽뷯貽뷯辽†볯궼볯蚼†볯薽뷯辽뷯躽뷯₅꺼볯袼볯馼볯閼볯ꖼ뷯邽뷯薽뷯鎽뷯辽뷯₎辽뷯₆钽뷯薽†볯薽뷯込뷯薽뷯膽뷯辽뷯馽뷯薽†뷯銽뷯鞽뷯袽†뷯膽뷯钽뷯銽†뷯薽뷯薽뷯钽뷯銽†뷯躽†뷯閽뷯膽뷯₎邽뷯躽뷯銽뷯膽뷯覽뷯₃莽뷯躽뷯薽뷯躼볯膽뷯莽뷯銽†볯薽뷯ₓ閼볯袼볯覼볯醼볯銼볯銈볯醼볯颼볯㲎牢ਾ菣꒼뷯趽뷯鎽뷯讽뷯薽뷯₈ꢼ볯랼뷯貽뷯蚽†볯ꪼ볯뎼뷯覽뷯袽†볯궼볯ꢼ뷯閽뷯薽뷯ₒ낼볯貼볯覽뷯钽뷯銽뷯ₔ낼볯貼볯膽뷯螽†볯袼볯邼볯鎼볯ꖼ뷯膽뷯閽뷯钽뷯辽뷯₎辽뷯₆閽뷯辽뷯馽뷯覽뷯躽†뷯躽뷯₄莽뷯钽뷯貽뷯螽뷯ₙ蚽뷯銽†뷯貽뷯蒽뷯薽뷯ₒ莽뷯躽뷯薽뷯ₒ蒽뷯钽뷯莽뷯覽뷯躽볯膽†뷯钽뷯蒽뷯ₙ辽뷯₆醼볯鎼볯ₕ邽뷯覽뷯薽뷯₄閽뷯覽뷯薽†뷯膽뷯邽뷯薽뷯ₓ鞽뷯钽뷯₈莽뷯覽뷯覽뷯膽뷯₌膽뷯蒽†뷯覽뷯钽뷯貽뷯螽뷯莽†뷯辽뷯銽뷯貽뷯钽뷯辽뷯躼볯膽뷯莽뷯銽†볯馽뷯辽뷯膽뷯袽뷯貽†볯銼볯骼볯馼볯銈볯馼볯躼戼㹲뮃볯辽뷯螽†볯貼볯覽뷯ₕꎼ볯貼볯薽뷯銽뷯莽뷯覽뷯₎ꖼ볯貼볯₆뒼뷯躽뷯₇겼볯袼볯邼볯钼볯ꎼ뷯趽뷯覽뷯覽뷯螽†뷯膽뷯讽뷯銽뷯ₓ鞽뷯钽뷯₈膽뷯蒽†뷯覽뷯袽뷯閽뷯ₔ钽뷯薽†뷯覽뷯覽뷯ₔ辽뷯₆蒽뷯钽뷯莽뷯覽뷯躽볯뎼뷯膽뷯ₔ궼뷯蒽†볯鎼볯颼볯骼볯鎼볯鞼裢醼볯銼볯躼戼㹲뮃볯銽뷯鎽뷯趽뷯躽†볯貼볯膽뷯₎ꢼ볯뒼뷯膽뷯薽뷯鎽뷯₏Ꞽ볯ꮼ뷯躽뷯貽뷯銽†볯랼볯蚼†볯辽뷯薽뷯鎽뷯薽뷯躽†볯袼볯邼볯鎼볯뒼뷯膽뷯鎽뷯辽뷯趽뷯躽뷯₇鎽뷯躽뷯貽뷯₅꒼볯ꆼ†뷯辽뷯薽뷯閽뷯薽뷯ₓ覽뷯钽뷯₏蚽뷯閽뷯銽뷯鎽뷯薽뷯钽†뷯膽뷯躽뷯钽뷯莽†뷯膽뷯钽뷯莽뷯薽뷯ₓ蚽뷯銽†뷯薽뷯薽뷯钽뷯辽뷯₎膽뷯蒽†뷯躽뷯趽뷯銽뷯钽뷯辽뷯₎辽뷯₆螽뷯躽뷯钽뷯莽†뷯膽뷯覽뷯钽뷯辽뷯鎽볯낼뷯辽뷯₃꺼뷯钽뷯₌ꆼ뷯膽뷯₄뎼뷯覽†볯₵뎼†볯₡醼볯邼볯醼볯覼볯颼볯醼볯銈볯颼볯銼볯㲎牢ਾ菣꒼뷯ₙꞼ볯貼뷯钽†뷯貽볯袼볯邼볯馼볯겼뷯躽뷯銈뷯薽뷯趽†뷯閽뷯隽뷯隽뷯銽뷯ₓ辽뷯₆趽뷯钽뷯鎽뷯膽뷯覽뷯₃莽뷯貽뷯銽뷯莽뷯膽뷯₌莽뷯躽뷯薽뷯ₒ钽뷯薽뷯钽뷯蒽†뷯覽뷯袽†뷯馽뷯钽뷯趽뷯莽†뷯袽뷯趽뷯钽뷯薽뷯膽뷯馽†뷯貽뷯躽뷯骼뷯₁꺼뷯銽뷯袽†볯薽뷯钽뷯膽뷯₌ꎼ뷯躽뷯薽뷯ₒ뒼뷯薽뷯钽뷯薽뷯钽†볯銽뷯閽뷯ₐ銽뷯隽뷯薽뷯ₗ辽뷯₆鎼볯醼볯ₑ邽뷯钽뷯薽뷯钽뷯貼볯邼볯钼볯躼볯貽뷯躽†볯辽뷯辽뷯薽뷯钽뷯貽†볯膽뷯莽뷯銽†볯袼볯覼볯颼볯銈볯鎼볯㲎牢ਾ菣ꖼ뷯讽뷯銽뷯ₔ薽뷯ₔ膽뷯躼볯Ꞽ뷯躽뷯趽뷯莽뷯ₓ辽뷯₆꾼뷯膽뷯覽뷯躽†볯膽뷯莽뷯銽†볯銽뷯螽뷯薽뷯鎽뷯辽뷯₎늼뷯隽뷯膽뷯鎽†볯覽뷯薽뷯鎽뷯₅궼뷯钽뷯鎽뷯膽뷯覽뷯₃뒼뷯膽뷯薽뷯钽뷯銽뷯薽뷯ₓꦼ뷯莽뷯閽뷯覽뷯螽†볯躽뷯銽뷯薽뷯覽뷯袽뷯貽뷯膽뷯₌궼뷯钽뷯鎽뷯膽뷯覽뷯ₓ钽뷯₏钽뷯薽†볯膽뷯貽뷯邽뷯膽뷯₎뒼뷯芽뷯躼볯膽뷯莽뷯銽†볯覽뷯莽뷯隽†볯貼볯鎼볯銼裢醼볯閼볯袼볯邼볯隼볯躼戼㹲뮃볯螽뷯鞽뷯₁뎼볯薽뷯ₔ膽뷯躼볯銼볯邼볯覼볯貽뷯躽뷯莽뷯邽뷯钽뷯辽뷯辽뷯覽뷯膽뷯₌膽뷯邽뷯莽뷯鎽†뷯蚽†뷯趽뷯貽뷯₌邽뷯躽뷯銽뷯膽뷯覽뷯₃莽뷯躽뷯薽뷯躼볯膽뷯莽뷯薽뷯鎽†볯颼볯鎼볯骼볯鎼볯銈볯钼볯躼戼㹲뮃볯貽뷯覽뷯螽뷯銽†볯貼볯閽뷯貽뷯銽†볯ꎼ볯꒼뷯薽뷯銽뷯莽뷯₈꒼볯銼볯醼볯覼볯邽뷯螽뷯躽뷯钽뷯莽†뷯覽뷯趽뷯銽뷯薽뷯鎽†뷯躽†뷯袽뷯₅芽뷯辽뷯蒽†뷯蚽†뷯膽뷯覽뷯躽뷯鎽†뷯覽뷯袽†뷯銽뷯貽뷯螽뷯莽뷯貽†뷯膽뷯覽뷯躽뷯躽뷯覽뷯鎽볯ꖼ뷯邽뷯銽뷯ₔ늼뷯隽†볯辽뷯₌꒼뷯膽뷯躽†볯閼볯閼볯閼裢閼볯隼볯㲎牢ਾ菣ꖼ뷯銈볯膽뷯膽뷯覽†볯ꮼ볯薽뷯ₔ膽뷯躼볯銼볯邼볯覼볯袽뷯₅銽뷯螽뷯貽뷯钽뷯辽뷯₎膽뷯蒽†뷯辽뷯薽†뷯蚽†뷯鎽뷯薽뷯邽뷯躽뷯覽뷯₎覽뷯₎趽뷯貽뷯螽뷯膽뷯钽†뷯銽뷯躽뷯蚽뷯銽뷯膽뷯覽뷯躽†뷯躽뷯₄莽뷯躽뷯薽뷯躼볯馽뷯辽뷯覽뷯薽†볯銽뷯鞽뷯袽†볯膽뷯钽뷯銽†볯薽뷯ₖ醼볯袼볯覼볯钼볯鎼裢钼볯钼볯㲎牢ਾ菣ꖼ뷯覽뷯讽뷯辽뷯₎薽뷯ₔ膽뷯躼볯꒼뷯钽뷯莽뷯覽뷯躽†뷯蚽†뷯辽뷯膽뷯覽뷯₃뒼볯閼볯ₓ趽뷯钽뷯钽뷯辽뷯鎽†뷯躽†뷯膽뷯邽뷯躽뷯ₓ辽뷯₆邽뷯钽뷯薽뷯钽뷯ₓ鞽뷯钽뷯₈袽뷯螽뷯銈뷯銽뷯蒽뷯₅鎽뷯銽뷯閽뷯ₓ辽뷯膽뷯覽뷯躽†뷯膽뷯莽뷯銽볯꾼뷯鎽뷯薽뷯銽뷯莽뷯ₓ膽뷯蒽†뷯馽뷯薽뷯辽뷯辽뷯馽†볯銼볯貼볯颼볯銈볯颼볯袼볯邼볯钼볯躼戼㹲뮃볯覽뷯袽뷯膽뷯₎薽뷯ₔ膽뷯躼볯뒼뷯薽†뷯辽뷯薽†뷯蚽†뷯貽뷯銽뷯鎽뷯閽뷯蒽†뷯隽뷯貽뷯膽뷯覽뷯躽†뷯躽†뷯袽뷯₅蒽뷯钽뷯莽뷯覽뷯躽†뷯蚽†뷯膽뷯貽뷯銈뷯钽뷯螽뷯₅薽뷯覽뷯袽뷯貽뷯膽뷯₌辽뷯膽뷯覽뷯躽†뷯膽뷯莽뷯銽볯ꆼ뷯₍ꪼ†볯芽뷯钽뷯钽†볯馽뷯薽뷯辽뷯₌醼볯銼볯醼볯醼볯銈볯銼볯醼볯蒽뷯鎽뷯閽뷯鎽뷯辽뷯₎醼볯銼볯銈볯銼볯銼볯銼볯邼볯覼볯㲎牢ਾ菣ꚼ뷯銽뷯薽뷯ₓ薽뷯ₔ膽뷯躼볯ꎼ볯뎼볯ꦼ볯骼뷯辽뷯膽뷯覽뷯₃莽뷯躽뷯薽뷯ₒ螽뷯躽뷯钽뷯莽뷯ₓ膽뷯ₔ袽뷯螽뷯銈뷯薽뷯辽뷯閽뷯覽뷯躽볯꺼뷯莽뷯薽뷯莽†볯莽뷯蒽뷯ₓ늼뷯鎽†볯閼볯꒼볯鞼볯銈볯鞼볯鎼볯銼볯醼볯覼볯㲎牢ਾ菣ꚼ뷯銽뷯袽뷯鞽†볯貼뷯钽†뷯貽볯袼볯邼볯銼볯꺼뷯躽뷯躽뷯膽뷯覽뷯薽†뷯蒽뷯躽뷯覽뷯覽뷯膽뷯覽뷯躽†뷯躽뷯₄趽뷯躽뷯钽뷯銽뷯躽뷯₇辽뷯₆莽뷯躽뷯薽뷯ₒ趽뷯钽뷯钽뷯辽뷯鎽†뷯馽†뷯膽뷯螽뷯钽뷯蒽†뷯薽뷯邽†뷯薽뷯閽뷯躽뷯覽뷯螽†뷯蚽†뷯貽뷯鎽뷯膽†볯꺼볯躼볯莽뷯薽뷯莽뷯₅钽뷯膽뷯鎽뷯膽뷯覽뷯躽뷯貽†뷯薽뷯覽뷯覽뷯薽†볯袼볯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趽뷯銽†뷯覽뷯趽뷯銽뷯薽뷯鎽†뷯辽뷯ₒ钽뷯薽†뷯薽뷯薽뷯钽뷯辽뷯₎辽뷯₆辽뷯膽뷯覽뷯躽†뷯膽뷯莽뷯躽뷯趽뷯₁覽뷯₎邽뷯钽뷯薽뷯钽뷯ₓ鞽뷯钽뷯₈膽†뷯薽뷯隽뷯莽†뷯膽뷯鎽볯Ꞽ뷯躽뷯莽뷯貽뷯螽뷯莽†뷯躽뷯辽뷯辽뷯馽†볯邼볯貼볯邼볯銈볯邼볯袼볯邼볯颼볯躼戼㹲뮃볯辽뷯薽뷯貼볯莽뷯薽뷯躽뷯躽뷯₇蚽뷯銽†뷯隽뷯銽뷯膽뷯₎莽뷯躽뷯薽뷯骼볯躼볯躼볯銽뷯隽뷯躽뷯覽뷯薽†볯薽뷯隽뷯莽뷯鎽†볯膽뷯讽†볯辽뷯莽뷯₅銽뷯膽뷯蚽뷯銽뷯膽뷯覽뷯躽†뷯薽뷯辽뷯趽뷯躽뷯膽뷯覽뷯躽†뷯钽뷯钽뷯趽뷯躽뷯躼볯躽뷯膽뷯鎽†뷯蚽†뷯躽뷯薽뷯躽뷯貽†뷯薽뷯覽뷯覽뷯薽†볯閼볯貼볯邼볯銈볯邼볯袼볯邼볯銼볯躼戼㹲뮃볯躼볯膽뷯莽뷯銽†볯薽뷯辽뷯薽†볯钽뷯膽뷯ₓ늼뷯鎽뷯膽뷯莽뷯貼볯躽뷯薽뷯銽뷯钽뷯蒽†뷯薽뷯辽뷯覽뷯₃膽뷯膽뷯馽뷯薽뷯ₓ辽뷯₆辽뷯膽뷯覽뷯躽†뷯膽뷯莽뷯躽뷯趽뷯躼볯膽뷯閽뷯薽†볯鞼볯貼볯邼볯銈볯醼볯袼볯邼볯醼볯躼戼㹲뮃볯膽뷯銽†뷯钽†뷯貽볯貼볯薽뷯辽뷯覽뷯₃ꆼ뷯膽뷯馽뷯覽뷯ₓ辽뷯₆떼뷯薽뷯覽뷯薽†볯膽뷯膽뷯薽†볯貽뷯覽뷯₄꒼뷯钽뷯莽뷯鎽†볯膽뷯貽뷯ₙꖼ뷯蒽뷯趽뷯钽뷯覽뷯貽†볯膽뷯莽뷯銽뷯ₓ膽뷯蒽†볯薽뷯薽뷯貽뷯ₓ膽†볯銽뷯隽뷯貽뷯躽뷯ₔ겼뷯躽뷯鎽뷯膽뷯薽†뷯蚽†볯銽뷯隽뷯銽†볯閽뷯膽뷯覽뷯躽뷯ₓ覽뷯₎랼뷯趽뷯躽†뷯覽뷯袽뷯閽뷯ₔꢼ뷯鎽뷯辽뷯膽뷯袽뷯貽뷯螽뷯莽†볯隽뷯蒽뷯躽뷯薽†뷯蚽†볯膽뷯莽뷯銽볯ꆼ†볯銽뷯鎽뷯薽뷯钽뷯隽뷯₅ꎼ뷯辽뷯鎽裢뎼뷯莽뷯覽뷯躽뷯貽†볯钽뷯蒽뷯躼볯겼뷯뎼†볯薽뷯₄醼볯貼뷯醼볯邼볯銼볯隼볯銼볯醼볯覼볯㲎牢ਾ菣꺼뷯骽뷯覽†볯貼볯辽뷯蒽뷯螽†볯꒼볯뒼뷯躽뷯閽뷯₇뒼볯ꮼ뷯銽†볯貼볯₆ꮼ뷯馽뷯膽뷯₋ꖼ볯銼볯邼볯覼볯袽뷯₅蒽뷯膽뷯躽뷯鎽뷯覽뷯₃覽뷯邽뷯銽뷯膽뷯莽뷯₅辽뷯₆ꎼ볯ꆼ†뷯躽뷯₄ꎼ볯₡醼볯銈볯ₙ蚽뷯銽†뷯袽뷯₅薽뷯銽뷯馽†뷯覽뷯螽뷯辽뷯覽뷯ₓ辽뷯₆邽뷯躽뷯銽뷯膽뷯覽뷯₃莽뷯銽뷯覽뷯辽뷯膽볯ꢼ뷯邽뷯钽뷯螽뷯鎽뷯銽뷯薽뷯钽뷯銽뷯貽뷯螽뷯ₙ钼볯袼볯隼볯骼볯鞼볯邼裢醼볯閼볯躼戼㹲뮃볯薽뷯钽뷯₏Ꞽ볯袼볯邼볯醼볯궼뷯貽뷯莽뷯貽뷯銽†뷯覽뷯趽뷯銽뷯薽뷯鎽†뷯躽†뷯銽뷯钽뷯薽뷯覽뷯貽†뷯膽뷯莽뷯躽뷯趽뷯₁辽뷯₆钽뷯薽†뷯貽뷯蒽뷯薽뷯骼뷯銽뷯₅鞽뷯₅钽뷯薽뷯薽†뷯薽뷯龼볯꺼뷯钽†볯薽뷯ₖ떼뷯辽뷯₌馼볯钼볯銈볯醼볯㲎牢ਾ菣꺼뷯钽뷯辽†볯ꪼ볯銼볯醼볯覼볯貽뷯躽뷯莽뷯貽†뷯邽뷯貽뷯莽뷯钽뷯辽뷯鎽†뷯蚽†뷯薽뷯薽뷯钽†뷯辽뷯薽뷯閽뷯膽뷯ₒ膽뷯隽뷯躽뷯薽뷯ₓ覽뷯₎閽뷯辽뷯辽뷯覽뷯₃趽뷯貽뷯螽뷯膽뷯莽뷯薽뷯骼†뷯辽†뷯辽뷯螽뷯銽†뷯袽뷯鎽뷯躽뷯₇膽†胢趽뷯銽뷯螽뷯鶀볯躼볯蒽뷯ₖꆼ뷯膽뷯ₔ낼뷯钽뷯辽뷯₌銼볯骼볯鞼볯銈볯邼볯躼戼㹲뮃볯薽뷯钽뷯₏Ꞽ볯貼볯邽뷯钽뷯覽뷯₎ꪼ볯袼볯邼볯邼볯뒼뷯薽뷯膽뷯辽뷯钽뷯莽†뷯躽뷯₄邽뷯辽뷯躽뷯鎽뷯覽뷯₃芽뷯辽뷯膽뷯讽뷯銽뷯骼뷯薽뷯辽뷯覽뷯₃膽뷯邽뷯覽뷯膽뷯覽뷯躽뷯ₓ覽뷯₎閽뷯辽뷯辽뷯覽뷯膽뷯₌趽뷯貽뷯螽뷯膽뷯莽뷯薽뷯躼볯膽뷯袽뷯貽뷯螽뷯ₙ钼볯骼볯颼볯銈볯馼볯躼戼㹲뮃볯薽뷯钽뷯₏Ꞽ볯貼볯膽뷯薽†볯ꪼ볯銼볯醼볯覼볯趽뷯銽뷯覽뷯螽†볯貽뷯蒽뷯薽뷯ₒꎼ뷯躽뷯薽뷯ₒꊼ뷯辽뷯膽뷯讽뷯銽뷯ₓ膽뷯蒽†볯膽뷯螽뷯钽뷯ₓ辽뷯₆뒼뷯薽뷯膽뷯馽볯떼뷯辽뷯₌ꎼ뷯覽뷯₎꺼뷯銽뷯袽†볯趽†볯鎼볯隼볯銈볯隼볯㲎牢ਾ菣꺼뷯₇薽뷯ₔ膽뷯躼볯뎼뷯螽뷯覽뷯覽뷯膽뷯莽뷯₅辽뷯₆薽뷯蒽뷯趽뷯钽뷯覽뷯貽†뷯薽뷯貽뷯ₓ覽뷯₎钽뷯薽†뷯薽뷯薽뷯钽뷯辽뷯₎辽뷯₆薽뷯蒽뷯趽뷯钽뷯覽뷯貽†뷯膽뷯莽뷯躽뷯趽뷯₁膽뷯蒽†뷯钽뷯ₓ邽뷯薽뷯閽뷯鎽뷯銽뷯躼볯莽뷯膽†뷯馽뷯辽뷯辽뷯覽뷯膽†볯颼볯鎼볯隼裢鎼볯醼볯醼볯鞼볯覼볯㲎牢ਾ菣꺼뷯閽뷯薽뷯₎꒼볯뒼뷯袽뷯銽뷯₉꒼볯뎼뷯銽뷯躽뷯薽뷯ₒ뎼볯ꎼ뷯鞽뷯躽†볯貼볯閽뷯薽뷯ₒꞼ볯궼뷯躽뷯辽뷯膽†볯辽뷯銽뷯螽뷯薽뷯ₚ궼볯貼볯膽뷯螽†볯貼볯覽뷯蒽뷯₅ꦼ볯뚼뷯躽뷯薽뷯ꊼ뷯鎽뷯莽뷯薽†볯ꪼ볯꾼뷯鎽뷯躽†볯뒼볯늼뷯莽뷯銽뷯辽†볯ꚼ볯ꎼ뷯躽뷯膽†볯貼볯閽뷯覽뷯膽†볯貼볯銽뷯辽뷯ₙ꒼볯ꮼ뷯躽뷯貽뷯銽†볯랼볯ꊼ뷯隽뷯貽뷯莽뷯閽뷯₁뒼볯貼볯膽뷯膽뷯辽뷯辽뷯貽뷯鎽†볯貼볯辽뷯薽뷯鎽뷯薽뷯躽†볯貼볯薽뷯钽뷯₏Ꞽ볯袼볯邼볯隼볯ꢼ뷯螽뷯₈邽뷯薽뷯膽뷯薽뷯莽뷯₅辽뷯₆뒼볯늼볯₴邽뷯辽뷯辽뷯薽뷯ₒ趽뷯钽뷯钽뷯辽뷯鎽†뷯躽†뷯覽뷯銽뷯邽뷯邽뷯貽뷯膽뷯馽†뷯銽뷯钽뷯薽뷯覽뷯貽†뷯膽뷯莽뷯躽뷯趽뷯躼볯覽뷯莽뷯辽뷯鎽†볯銽뷯袽†볯隼볯骼볯銼볯銈볯鎼볯躼戼㹲뮃볯馀볯銽뷯薽뷯₎꒼볯貼뷯钽†뷯貽볯袼볯邼볯閼볯뎼뷯銽뷯趽†볯ꆼ볯馼裢馼†뷯鎽†뷯覽뷯躽뷯蚽뷯莽뷯躽뷯貽뷯ₙ閽뷯銽뷯螽뷯貽뷯钽뷯蒽†뷯邽†뷯辽†볯ₒ馽뷯膽뷯鎽†뷯薽뷯辽뷯薽†뷯覽뷯螽뷯辽뷯覽뷯ₓ鞽뷯钽뷯₈邽뷯躽뷯銽뷯膽뷯覽뷯₃莽뷯躽뷯薽뷯骼뷯趽뷯貽뷯莽뷯钽뷯辽뷯鎽†뷯辽뷯ₒ薽뷯銽뷯馽†뷯覽뷯薽뷯鎽뷯₅蒽뷯钽뷯莽뷯覽뷯躽볯ꎼ뷯覽뷯₎ꎼ뷯躽뷯薽뷯ₒ늼뷯鎽†볯醼볯鎼볯骼볯銼볯銈볯鎼볯躼戼㹲뮃볯膽뷯辽†뷯钽†뷯貽볯貼볯薽뷯覽뷯貽†뷯鎽뷯薽뷯鎽뷯薽뷯钽†뷯蚽†뷯閽뷯膽뷯₎钽뷯趽뷯銽†뷯閽뷯蒽뷯躽뷯ₓ覽뷯₎趽뷯莽뷯₅芽뷯ₙ钽뷯薽†뷯躽뷯貽뷯鎽뷯鎽†뷯蚽†뷯覽뷯莽뷯貽뷯钽뷯躽뷯₇꒼볯ꆼ볯ꎼ뷯躽뷯薽뷯ₒ銽뷯鎽뷯膽뷯莽뷯₈隼볯貼볯鎼볯钼裢馼볯鞼볯袼볯邼볯鞼볯躼戼㹲뮃볯膽뷯覽뷯₂겼볯薽뷯ₔ膽뷯躼볯銼볯醼볯覼볯銽뷯誽뷯莽뷯覽뷯螽†뷯膽뷯莽뷯銽†뷯躽뷯覽뷯薽뷯莽뷯₅膽뷯蒽†뷯薽뷯钽뷯鎽†뷯辽†볯邼볯邼볯钽뷯薽†뷯躽뷯颽뷯薽뷯钽뷯蒽†뷯閽뷯蒽뷯躽†뷯蚽†뷯袽뷯銽뷯覽뷯貼뷯覽뷯薽뷯貼뷯躽뷯₄邽뷯躽뷯銽뷯膽뷯ₓ莽뷯躽뷯薽뷯鎽†뷯躽†뷯袽뷯₅떼뷯覽뷯薽뷯₄뎼뷯膽뷯薽뷯躼볯膽뷯莽뷯銽†볯薽뷯ₓ鞼볯袼볯醼볯骼볯馼볯鎼裢銼볯銼볯躼戼㹲뮃볯膽뷯貽뷯₁ꊼ볯뎼뷯薽뷯袽뷯躽†볯貼볯薽뷯貽뷯銽†볯貼볯覽뷯钽뷯覽뷯袽†볯貼볯銽뷯鎽뷯覽뷯躽뷯薽뷯₎Ꞽ볯ꪼ뷯躽뷯₇ꮼ볯銼볯醼볯覼볯閽뷯貽뷯覽뷯₃膽뷯覽뷯銈뷯膽뷯薽뷯₄芽뷯辽뷯膽뷯讽뷯銽뷯ₓ覽뷯₎芽뷯蒽뷯ₙ蚽뷯閽뷯蒽뷯ₓ辽뷯₆邽뷯钽뷯薽뷯钽뷯ₓ鞽뷯钽뷯₈閽뷯辽뷯辽뷯覽뷯₃趽뷯貽뷯螽뷯膽뷯莽뷯薽뷯躼볯銽뷯钽†볯薽뷯ₖꎼ뷯覽뷯₎겼뷯芽†볯莽뷯₉閼볯骼볯邼볯銈볯鎼볯躼戼㹲뮃볯辽뷯銽뷯螽뷯薽뷯ₚ낼뷯躽뷯₁궼볯ꎼ볯뒼뷯薽뷯躽뷯螽뷯₏ꆼ볯貼볯覽뷯袽†볯겼볯뎼뷯銽뷯躽뷯薽뷯ₒ뎼볯랼뷯躽뷯₇림볯뒼뷯袽뷯銽뷯₉꒼볯ꖼ뷯钽뷯馽†볯貼볯閽뷯覽뷯膽†볯貼볯薽뷯薽뷯銽뷯₁뎼볯貼볯閽뷯袽뷯₁ꦼ볯貼볯膽뷯邽뷯貽뷯覽뷯覽†볯늼볯림뷯ₕ겼볯ꊼ뷯隽뷯貽뷯莽뷯閽뷯₁뒼볯貼볯膽뷯膽뷯辽뷯辽뷯貽뷯鎽†볯貼볯覽뷯骽뷯薽뷯ₒꮼ볯貼볯辽뷯薽뷯鎽뷯薽뷯躽†볯貼볯薽뷯钽뷯₏Ꞽ볯袼볯邼볯鞼볯뎼뷯薽뷯钽뷯閽뷯₍辽뷯₆螽뷯躽뷯钽뷯莽†뷯閽뷯膽뷯覽뷯躽뷯ₓ覽뷯₎蒽뷯₅躽뷯隽뷯₏낼볯꺼볯궼볯₰辽뷯₆钽뷯薽†뷯銽뷯躽뷯銽뷯ₙ芽뷯膽뷯蒽뷯銽볯뚼뷯銽뷯袽뷯鞽뷯ₓꆼ뷯莽뷯躼戼㹲뮃볯馽뷯躽†볯낼볯ꢼ뷯躽뷯₇뒼볯貼볯₆ꊼ뷯銽뷯薽뷯鎽뷯ₙ꺼볯銼볯醼볯覼볯膽뷯莽뷯薽뷯钽뷯莽†뷯蒽뷯躽뷯莽뷯銽뷯覽뷯辽뷯膽볯꺼†볯躽뷯貽†볯₪궼뷯蒽†볯鞼볯袼볯銼볯骼볯醼볯邼裢銼볯钼볯躼戼㹲뮃볯膽뷯讽뷯鎽†볯뎼볯ꊼ뷯誽뷯銽뷯躽†볯ꚼ볯늼뷯閽뷯薽뷯ₒ뚼볯貼볯薽뷯銽†볯랼볯꺼뷯钽뷯辽†볯貼볯袽뷯躽뷯₇몼볯貼볯莽뷯閽뷯钽뷯ₚ낼볯貼볯辽뷯蒽뷯躽裢ꎼ뷯銽뷯辽†볯貼볯莽뷯薽뷯ₒꢼ볯袼볯馼볯閼볯낼뷯辽뷯躽뷯鎽뷯覽뷯₃隽뷯貽뷯薽†뷯蚽†뷯閼볯ₓ躽뷯莽뷯薽뷯銽†뷯隽뷯銽뷯颽뷯銽뷯鎽뷯覽뷯躽†뷯躽†뷯膽뷯覽뷯躽뷯鎽†뷯覽뷯袽†뷯躽뷯膽뷯覽뷯薽†뷯貽뷯蒽뷯薽뷯ₒ莽뷯躽뷯薽뷯ₒ钽뷯薽뷯钽뷯蒽†뷯覽뷯袽†뷯薽뷯膽뷯誽뷯隽뷯躽뷯ₔ궼볯ꆼ볯躼볯₪ꎼ뷯覽뷯₎꾼뷯莽뷯貽†볯鎼볯醼볯颼볯銈볯鎼볯邼볯㲎牢ਾ菣뎼뷯銽뷯覽뷯ₓꆼ볯貼볯膽뷯芽뷯螽뷯覽†볯貼볯辽뷯蒽뷯躽裢ꎼ뷯銽뷯辽†볯貼볯薽뷯膽뷯薽뷯₄ꪼ볯몼뷯膽뷯螽†볯ꚼ볯뎼뷯薽뷯躽뷯薽뷯蒽†볯貼볯膽뷯銽†볯늼볯ꢼ뷯銽뷯ₒꢼ볯貼볯薽뷯钽뷯銽†볯ꖼ볯醼볯馼볯覼볯鎽뷯辽뷯覽뷯钽뷯辽뷯₎辽뷯₆낼볯鎼†뷯閽뷯貽뷯膽뷯ₒ辽뷯薽뷯薽뷯邽뷯薽뷯鎽뷯辽뷯₎膽뷯蒽†뷯閽뷯辽뷯ₒ邽뷯辽뷯銽뷯鎽뷯覽뷯躽†뷯躽†뷯膽뷯莽뷯躽뷯趽뷯₁覽뷯₎鎽뷯钽뷯ₕ辽뷯₆钽뷯薽†뷯貽뷯蒽뷯薽뷯躼볯₪떼뷯辽뷯₌醼볯銼볯鎼볯颼裢鎼볯銼볯㲎牢ਾ菣뎼뷯銽뷯覽뷯ₓꆼ볯貼볯膽뷯芽뷯螽뷯覽†볯貼볯辽뷯蒽뷯躽裢ꎼ뷯銽뷯辽†볯貼볯袽뷯躽뷯₇몼볯貼볯袽뷯覽뷯蚽뷯貽뷯₄ꪼ볯ꚼ뷯覽뷯ₒ랼볯貼볯薽뷯銽†볯랼볯늼뷯閽뷯薽뷯ₒ뚼볯袼볯馼볯鎼볯꺼뷯莽뷯薽뷯銽†뷯隽뷯銽뷯颽뷯銽뷯鎽뷯覽뷯躽†뷯蚽†뷯閼볯ₓ邽뷯辽뷯薽뷯躽†뷯躽†뷯銽뷯躽뷯覽뷯覽뷯躽뷯貽†뷯薽뷯貽†뷯貽뷯蒽뷯薽뷯ₒ莽뷯銽뷯覽뷯辽뷯膽볯膽†뷯膽뷯讽뷯銽†뷯辽뷯ₒ蒽뷯鎽뷯膽뷯薽†뷯銽뷯螽뷯薽뷯鎽뷯辽뷯躼볯₪꺼뷯钽뷯₌ꎼ뷯躽뷯薽뷯ₒꦼ뷯鎽뷯ₔ颼볯骼볯鎼裢閼볯躼戼㹲뮃볯膽뷯辽뷯蒽뷯ₙ궼볯貼볯膽뷯躽†볯늼볯몼뷯蚽뷯薽뷯ₒ궼볯貼볯辽뷯薽†볯늼볯ꊼ뷯銽뷯覽뷯₎ꪼ볯ꆼ뷯膽뷯膽†볯꾼볯ꪼ뷯躽뷯骽†볯貼볯銽뷯蒽뷯薽†볯ꆼ볯ꪼ뷯袽뷯躽뷯鎽뷯躽†볯겼볯낼뷯銽뷯辽뷯鎽†볯겼볯Ꞽ뷯芽뷯辽뷯₎ꪼ볯袼볯邼볯隼볯떼뷯薽†뷯蚽†뷯₁趽뷯貽뷯覽뷯膽뷯螽뷯钽†뷯貽뷯辽뷯薽뷯莽뷯躽뷯薽†뷯躽†뷯覽뷯閽†뷯馽뷯銽뷯蒽뷯骽뷯钽뷯辽뷯₎膽뷯鎽뷯馽†뷯辽†뷯覽뷯螽뷯辽뷯薽†뷯貽뷯蒽뷯薽뷯ₒ莽뷯躽뷯薽뷯ₒ覽뷯₎邽뷯钽뷯薽뷯钽뷯ₓ鞽뷯钽뷯₈袽뷯趽뷯钽뷯銽뷯膽볯ꪼ†볯銽뷯貽†볯鞼볯骼볯钼裢钼볯躼戼㹲뮃볯莽뷯躽뷯钽뷯ₚ薽뷯ₔ膽뷯躼볯ꎼ뷯覽뷯覽뷯膽뷯₌鎽뷯螽뷯覽뷯覽뷯膽뷯莽뷯₅辽뷯₆膽뷯馽뷯覽뷯膽뷯₌螽뷯膽뷯蒽뷯貽뷯銽†뷯薽뷯貽뷯ₓ辽뷯₎莽뷯銽뷯覽뷯膽뷯₌莽뷯钽뷯貽뷯螽뷯躼볯芽뷯钽뷯钽뷯覽뷯鎽†뷯躽뷯₄螽뷯躽뷯莽뷯貽뷯螽뷯ₙ醼볯鞼볯鞼볯醼裢鞼볯颼볯銼볯邼볯覼볯㲎牢ਾ菣뎼뷯辽뷯钽†볯ꆼ볯겼뷯閽뷯袽뷯覽뷯₎뒼볯貼볯辽뷯袽뷯薽뷯螽†볯Ꞽ볯銼볯醼볯覼볯閽뷯膽뷯覽뷯躽뷯ₓ辽뷯₆钽뷯薽†볯ꖼ볯뒼†뷯銽뷯趽뷯钽뷯銽†뷯銽뷯₅莽뷯趽뷯辽뷯₎覽뷯₎芽뷯鎽뷯貽†뷯薽뷯貽†뷯膽뷯莽뷯躽뷯趽뷯₁膽뷯蒽†뷯醽뷯膽뷯辽뷯鎽†뷯薽뷯貽†뷯膽뷯莽뷯躽뷯趽뷯躼볯辽뷯₄낼뷯钽뷯辽뷯₌銼볯骼볯醼볯銈볯銼볯躼戼㹲뮃볯薽뷯銽뷯蒽†볯ꪼ볯ꚼ뷯袽뷯躽뷯₉ꆼ볯貼볯辽뷯螽†볯림볯蚼†볯袽뷯钽뷯覽†볯낼볯銼볯醼볯覼볯躽뷯薽뷯銽뷯钽뷯躽뷯₇ꎼ뷯薽뷯辽뷯袽뷯銽뷯邽뷯ₙ覽뷯钽뷯₏钽뷯薽†볯膽뷯膽뷯薽뷯薽뷯钽†뷯蚽†볯貽뷯螽뷯趽뷯钽뷯鎽뷯膽뷯覽뷯₃ꎼ뷯貽뷯銽뷯莽뷯膽뷯₌ꎼ뷯躽뷯薽뷯骼볯隽뷯蒽뷯躽뷯薽裢ꊼ뷯鎽뷯蒽†볯邽뷯銽뷯膽뷯袽†볯鎽뷯躽뷯₇ꎼ뷯覽뷯覽뷯膽뷯₌뒼뷯覽뷯貽†볯覽뷯蒽뷯躽뷯鎽볯ꆼ뷯躽†볯閽뷯螽†볯躽뷯辽뷯₌銼볯ₒ뎼뷯邽뷯貽†볯骼볯颼볯閼裢颼볯銼볯㲎牢ਾ菣뎼뷯銽뷯骽뷯鞽뷯₁늼볯貼볯膽뷯蚽뷯覽뷯薽뷯ₒ떼볯뎼뷯薽뷯薽뷯₎ꮼ볯겼뷯趽†볯랼볯뎼뷯袽뷯覽뷯蒽뷯貽†볯貼볯莽뷯閽뷯ₚꪼ볯ꢼ뷯躽뷯薽뷯₎ꆼ볯貼볯辽뷯躽†볯貼볯閽뷯蒽뷯薽뷯螽†볯袼볯邼볯邼볯ꦼ뷯钽뷯螽뷯膽뷯薽뷯₄螽뷯躽뷯钽뷯莽†뷯躽뷯₄薽뷯覽뷯薽뷯薽뷯覽뷯₃膽뷯膽뷯馽뷯覽뷯ₓ辽뷯₆芽뷯膽뷯蒽뷯銽†뷯膽뷯莽뷯銽†뷯薽뷯薽뷯貽뷯ₓ膽뷯₎膽뷯蒽뷯钽뷯隽뷯₅蒽뷯膽뷯躽뷯鎽뷯覽뷯₃隽뷯貽뷯薽†뷯蚽†볯Ꞽ볯늼볯ₓ趽뷯钽뷯钽뷯辽뷯鎽†뷯躽뷯₄袽뷯邽뷯銽뷯薽뷯袽뷯貽뷯钽뷯辽뷯₎薽뷯薽뷯钽뷯躼볯躽뷯ₔꪼ†볯膽뷯莽뷯銽볯㲎牢ਾ菣뎼뷯膽뷯趽뷯₁薽뷯ₔ膽뷯躼볯늼뷯鎽뷯₋辽뷯₆薽뷯覽뷯袽뷯貽뷯膽뷯₌辽뷯膽뷯覽뷯躽†뷯膽뷯莽뷯銽†뷯躽†뷯鎽뷯趽뷯钽뷯趽뷯钽뷯莽†뷯辽뷯薽뷯₎鞽뷯钽뷯₈閽뷯钽뷯膽뷯辽뷯躽뷯銈뷯薽뷯薽뷯钽뷯蒽†뷯隽뷯銽뷯膽뷯₎趽뷯鎽뷯薽뷯骼뷯₁邽뷯辽뷯邽뷯莽뷯覽뷯薽†뷯辽뷯辽뷯钽†뷯钽뷯蒽뷯ₙ鞽뷯钽뷯覽뷯₎钽뷯薽†볯ꮼ†뷯辽뷯貽뷯芽뷯銽뷯钽뷯隽뷯₅钽뷯覽뷯貽†뷯蚽†뷯隽뷯銽뷯膽뷯₎莽뷯躽뷯薽뷯ₒ鎽뷯銽뷯薽뷯覽뷯螽볯떼볯ꎼ볯꾼볯뎼볯躼볯貽뷯銽뷯鎽뷯閽뷯蒽†볯芽뷯钽뷯钽†볯馽뷯薽뷯辽뷯₌钼볯貼볯鎼볯銈볯钼볯袼볯邼볯銼볯躼戼㹲뮃볯覽뷯螽뷯貽†볯겼볯궼뷯貽뷯薽뷯ₒꮼ볯貼볯薽뷯膽뷯₌ꆼ볯銼볯醼볯覼볯膽뷯莽뷯銽†볯钽뷯钽뷯鎽뷯覽뷯鎽볯銼볯醼볯躼볯ꆼ†볯膽뷯莽뷯銽†볯₪ꎼ뷯覽뷯₎隼볯骼볯銈볯邼戼㹲뮃볯覽뷯膽뷯薽뷯躽뷯₁薽뷯ₔ膽뷯躼볯ꦼ뷯钽뷯螽뷯膽뷯覽뷯螽†뷯覽뷯閽뷯蒽†뷯覽뷯邽뷯覽뷯鎽†뷯躽뷯辽†뷯袽뷯₅趽뷯躽뷯螽뷯趽뷯躽뷯ₔ辽뷯₆莽뷯躽뷯薽뷯躼볯膽뷯ₔ늼뷯隽†볯貽뷯躽†볯躽뷯辽뷯₌醼볯貼볯鎼볯銈볯钼볯袼볯邼볯鞼볯躼戼㹲뮃볯讽뷯莽뷯貽†볯貼볯膽뷯趽뷯ₙ궼볯ꊼ뷯膽뷯躽뷯銽뷯₄ꪼ볯貼볯薽뷯钽뷯馽†볯꒼볯ꊼ뷯鎽뷯辽뷯钽뷯₉ꎼ볯貼볯覽뷯閽†볯뎼볯낼뷯辽뷯辽뷯ₐꞼ볯貼볯辽뷯薽뷯ₓꪼ볯貼볯貽뷯袽뷯讽뷯銽†볯貼볯覽뷯邽뷯₅ꎼ볯貼볯閽뷯芽뷯ₓ늼볯袼볯邼볯鎼볯궼뷯貽뷯覽뷯膽뷯螽뷯钽†뷯貽뷯辽뷯薽뷯莽뷯躽뷯薽†뷯躽†뷯覽뷯閽†뷯馽뷯銽뷯蒽뷯骽뷯钽뷯辽뷯₎膽뷯鎽뷯馽†뷯薽뷯薽뷯钽뷯ₓ钽뷯膽뷯鎽뷯钽뷯辽뷯膽뷯₌莽뷯貽뷯₌莽뷯銽뷯覽뷯辽뷯膽†뷯躽†뷯袽뷯₅趽뷯誽뷯銽뷯钽뷯ₙ辽뷯₆邽뷯钽뷯薽뷯钽뷯ₓ鞽뷯钽뷯₈芽뷯膽뷯蒽뷯銽†뷯膽뷯莽뷯銽†뷯躽뷯₄膽뷯馽뷯覽뷯膽뷯₌辽뷯ₒ躽뷯螽뷯钽뷯隽뷯₅閽뷯覽뷯薽†뷯馽뷯辽뷯辽뷯馽볯ꪼ†볯銽뷯貽†볯隼볯骼볯醼볯醼裢銼볯邼볯躼戼㹲뮃볯辽뷯螽†뷯钽†뷯貽볯貼볯銽뷯螽뷯辽뷯钽뷯莽†뷯膽뷯钽뷯銽뷯ₓ覽뷯₎鞽뷯趽뷯躽†뷯覽뷯袽†뷯馽뷯莽뷯銽뷯躽뷯閽뷯ₓ薽뷯蒽뷯趽뷯钽뷯覽뷯貽†뷯躽뷯₄辽뷯膽뷯覽뷯躽†뷯膽뷯莽뷯銽뷯躼볯躽뷯ₔꪼ†볯馽뷯薽뷯辽뷯₌ꎼ뷯躽뷯薽뷯ₒ銼볯貼볯銼볯銈볯銼볯袼볯邼볯钼볯躼戼㹲뮃볯邽뷯覽뷯螽뷯銽†볯貼뷯钽†뷯貽볯袼볯邼볯閼볯ꆼ†볯辽뷯芽뷯躽뷯钽뷯辽뷯₎辽뷯₆궼뷯貽뷯莽뷯貽뷯銽†볯膽뷯讽뷯銽뷯ₓ膽뷯蒽†볯貽뷯躽뷯莽뷯貽†볯薽뷯钽뷯銽뷯鎽†볯趽뷯銽뷯隽뷯₅钽뷯薽†볯貽뷯鎽뷯覽뷯覽뷯膽뷯覽뷯躽†뷯蚽†볯膽뷯莽뷯薽뷯钽뷯莽†볯馽뷯钽뷯躼볯膽뷯钽뷯辽뷯躽뷯薽뷯辽뷯辽뷯馽†볯钼볯袼볯覼볯醼볯邼볯銈볯閼볯邼볯㲎牢ਾ菣뎼뷯薽뷯躽뷯趽뷯₁薽뷯ₔ膽뷯躼볯ꎼ뷯辽뷯膽뷯₌袽뷯趽뷯钽뷯邽뷯覽뷯鎽뷯鎽†뷯蚽†뷯躽뷯薽뷯薽뷯趽뷯躽뷯钽뷯₅邽뷯钽뷯躽뷯覽뷯貽†뷯躽뷯₄覽뷯鎽†뷯覽뷯钽뷯躽뷯钽뷯辽뷯₎蚽뷯辽뷯₍趽뷯薽뷯辽뷯馽뷯邽뷯膽뷯钽뷯莽†뷯馽뷯蒽뷯辽뷯薽뷯躼볯貽뷯辽뷯₄醼볯隼볯馼裢醼볯袼볯邼볯閼볯躼戼㹲뮃볯钽뷯銽뷯₎ꪼ볯貼볯袽뷯辽뷯辽뷯薽뷯莽뷯ₕ꒼볯뚼뷯螽뷯貽뷯钽뷯覽뷯₎ꊼ볯낼뷯邽뷯蒽뷯邽뷯閽뷯辽뷯ₓ꺼볯ꎼ뷯莽뷯₈뒼볯袼볯邼볯閼볯궼뷯钽뷯钽뷯辽뷯₎辽뷯₆钽뷯薽†볯ꖼ볯뒼†뷯銽뷯趽뷯钽뷯銽볯鎽뷯覽뷯莽뷯₈钽뷯₏膽뷯钽뷯隽뷯₅莽뷯銽뷯趽뷯钽뷯躽볯膽뷯蒽†뷯辽뷯辽뷯貽뷯薽뷯覽뷯₃뒼볯늼볯₴薽뷯邽뷯薽뷯鎽뷯辽뷯₎覽뷯₎趽뷯貽뷯覽뷯貽뷯₅莽뷯躽뷯薽뷯鎽볯Ꞽ뷯躽뷯鎽†볯薽뷯ₖ銼볯骼볯銼볯馼裢銼볯銼볯躼戼㹲뮃볯膽뷯膽뷯膽뷯袽뷯₉뒼볯ꢼ뷯芽뷯莽뷯覽†볯貼볯膽뷯薽뷯覽†볯貼볯覽뷯鎽뷯趽뷯銽뷯₉ꮼ볯ꆼ뷯膽뷯₏뒼볯뒼뷯銽뷯莽뷯覽†볯貼볯辽뷯袽뷯蒽뷯₁꾼볯醼볯馼볯覼볯貽뷯躽뷯貽†뷯躽뷯₄莽뷯銽뷯躽뷯貽뷯螽뷯莽뷯貽†뷯薽뷯薽뷯覽뷯₃膽뷯膽뷯馽뷯覽뷯ₓ辽뷯₆趽뷯貽뷯覽뷯辽뷯膽뷯₌莽뷯躽뷯薽뷯鎽†뷯蚽†뷯袽뷯₅芽뷯膽뷯蒽뷯銽†뷯躽뷯₄閽뷯邽뷯銽†뷯銽뷯躽뷯銽뷯ₙ钽뷯膽뷯钽볯ꎼ뷯躽뷯薽뷯ₒ늼뷯鎽†볯颼볯閼볯鎼볯銈볯颼볯醼볯㲎牢ਾ菣뒼뷯辽볯꒼뷯銽뷯莽뷯ₔ覽뷯钽뷯膽뷯钽뷯銽뷯躽뷯₅鎽뷯趽뷯貽뷯躽뷯骼뷯袽뷯₅ꦼ볯궼볯₣ꖼ뷯蒽뷯趽뷯钽뷯覽뷯貽†볯膽뷯邽뷯薽뷯躼볯覽뷯螽뷯辽뷯钽뷯莽†뷯馽뷯辽뷯膽뷯袽뷯貽뷯螽뷯ₙ醼볯貼볯閼볯銈볯閼볯袼볯馼볯鞼볯躼戼㹲뮃볯袽뷯趽뷯鎽†볯뎼볯薽뷯ₔ膽뷯躼볯銼볯醼볯覼볯隽뷯貽뷯膽뷯覽뷯躽†뷯蚽†뷯薽뷯閽뷯₍ꎼ볯ꆼ볯ꎼ볯ꚼ볯ꆼ볯醼裢醼†뷯躽뷯₄ꎼ볯醼볯閼†뷯辽뷯ₒ钽뷯薽†뷯膽뷯貽뷯ₙ蒽뷯钽뷯莽뷯覽뷯躽†뷯蚽†뷯辽뷯辽뷯薽뷯钽뷯貽†뷯膽뷯莽뷯銽†뷯鎽뷯躽뷯₇貽뷯躽뷯覽뷯閽뷯覽뷯膽뷯₌邽뷯薽뷯貽뷯躽뷯莽뷯貽†뷯膽뷯邽뷯薽뷯躼볯銽†볯₪ꎼ뷯躽뷯薽뷯ₒ醼볯鎼볯銼볯骼볯隼볯銈볯鞼볯躼戼㹲뮃볯袽뷯銽뷯薽†볯꒼볯薽뷯ₔ膽뷯躼볯銼볯邼볯覼볯蚽뷯薽뷯钽뷯ₓ辽뷯₆芽뷯辽뷯蒽†뷯辽뷯貽뷯莽뷯覽뷯躽†뷯辽뷯蒽뷯钽뷯辽뷯鎽†뷯躽†뷯隽뷯銽뷯膽뷯₎莽뷯躽뷯薽뷯ₒ鎽뷯銽뷯趽†뷯膽뷯讽뷯銽뷯躼볯겼뷯뎼†볯躽뷯₅銼볯醼볯覼볯薽볯銼볯醼볯㲎牢ਾ菣뒼뷯閽뷯袽뷯馽뷯₁늼볯薽뷯ₔ膽뷯躼볯醼볯颼볯覼볯辽뷯貽뷯莽뷯覽뷯薽†뷯薽뷯覽뷯鞽†뷯蚽†뷯趽뷯貽뷯₌莽뷯銽뷯覽뷯辽뷯膽뷯ₓ辽뷯₆钽뷯薽†뷯膽뷯莽뷯薽뷯鎽볯ꆼ뷯躽†볯閽뷯螽†볯邼볯袼볯覼볯鞼볯銈볯醼볯㲎牢ਾ菣떼뷯貽뷯躽†볯貼뷯钽†뷯貽볯袼볯邼볯閼볯낼뷯辽뷯薽뷯趽뷯莽뷯躼볯覽뷯鎽뷯薽裢芽뷯鎽뷯蒽†뷯膽뷯ₐ辽뷯₆钽뷯薽†뷯閽뷯膽뷯₎邽뷯辽뷯薽뷯趽뷯躼볯莽뷯薽뷯莽뷯₅鎼볯鞼볯隼볯銼볯覼볯醼볯隼볯钼볯馼볯㲎牢ਾ菣뚼뷯螽뷯貽뷯钽뷯覽뷯₎ꊼ†볯₆ꮼ뷯躽뷯貽뷯銽†볯랼볯醼볯馼볯覼볯覽뷯覽뷯膽뷯₌낼볯늼볯낼뷯辽뷯₃꺼뷯钽뷯₌ꆼ뷯膽뷯₄뎼뷯覽†볯₵뎼†볯₡馼볯袼볯隼볯骼볯銼볯隼裢馼볯钼볯躼戼㹲뮃볯辽뷯薽뷯鎽뷯薽뷯躽†볯貼볯膽뷯膽뷯辽뷯辽뷯貽뷯鎽†볯貼볯薽뷯莽뷯貽뷯鎽뷯閽†볯ꖼ볯몼뷯辽뷯ₕ뎼볯꒼뷯膽뷯ₚ겼볯貼볯銽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