(57)【要約】  本発明は癌または感染症を治療するのに使用するためのネオスポラ・カニナム株に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌または慢性感染症を治療するのに使用するためのネオスポラ・カニナム（Ｎｅｏｓｐｏｒａ  ｃａｎｉｎｕｍ）株であって、前記慢性感染症は慢性ウイルス感染および慢性細菌感染から選択されることを特徴とするネオスポラ・カニナム株。
【請求項２】
ネオスポラ・カニナムは野生型株である、請求項１に記載のネオスポラ・カニナム株。
【請求項３】
ネオスポラ・カニナムは、ＧＲＡ１５タンパク質の過剰発現および／またはＲＯＰ１６タンパク質の過小発現によって特徴づけられる突然変異株である、請求項１に記載のネオスポラ・カニナム株。
【請求項４】
前記ネオスポラ・カニナム株はタキゾイト段階にある、請求項１〜３のいずれか１項に記載のネオスポラ・カニナム株。
【請求項５】
前記癌は固形腫瘍、好ましくは卵巣癌、膵臓癌または黒色腫である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のネオスポラ・カニナム株。
【請求項６】
前記慢性感染症は免疫抑制に関連しているかそれを誘導し、かつ結核およびＨＩＶからなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載のネオスポラ・カニナム株。
【請求項７】
慢性ウイルス感染および慢性細菌感染から選択される癌または慢性感染症を治療するのに使用するための組成物であって、賦形剤と混合した請求項１〜６のいずれか１項に記載のネオスポラ・カニナム株を含む組成物。
【請求項８】
前記組成物は医薬組成物であり、かつ少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
慢性ウイルス感染および慢性細菌感染から選択される癌または慢性感染症を治療するのに使用するためのワクチン組成物であって、請求項１〜６のいずれか１項に記載のネオスポラ・カニナム株または請求項７または請求項８に記載の組成物を含み、好ましくはアジュバントを含むワクチン組成物。
【請求項１０】
前記株、組成物またはワクチンは皮下、皮内もしくは腫瘍内経路を介して前記対象に投与される、請求項１〜６のいずれか１項に記載のネオスポラ・カニナム株、請求項７または請求項８に記載の組成物あるいは請求項９に記載のワクチン組成物。
【請求項１１】
前記対象に投与されるネオスポラ・カニナムの細胞の量は約１０４〜約１０１１の範囲である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のネオスポラ・カニナム株、組成物またはワクチン組成物。
【請求項１２】
ＧＲＡ１５タンパク質の過剰発現および／またはＲＯＰ１６タンパク質の過小発現によって特徴づけられるネオスポラ・カニナムの突然変異株。
【請求項１３】
好ましくは、前記組成物は医薬組成物であり、かつ少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項１２に記載のネオスポラ・カニナムの突然変異株を含む組成物。
【請求項１４】
好ましくはアジュバントを含む、請求項１２に記載のネオスポラ・カニナムの突然変異株を含むワクチン組成物。
【請求項１５】
Ｔ細胞をネオスポラ・カニナム株と接触させることを含む、Ｔ細胞を活性化させるためのエクスビボ方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は特に、それを必要とする対象における癌または感染症を治療するためのネオスポラ・カニナムの少なくとも１種の株またはその突然変異株の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌を治療するための外科手術、化学療法および放射線を使用するかなりの進歩にも関わらず、多くの癌の５年生存率は未だに非常に低い。癌細胞に対する免疫応答は癌の発生を制限することができる。しかし腫瘍媒介免疫抑制は多くの場合、これらの抗腫瘍応答を阻止する。従って、癌を治療するために提案されている新規な選択肢は、腫瘍細胞に対する有効な免疫応答を促進することである。
【０００３】
当該技術分野において、多くの抗癌免疫療法における強力なアジュバントとして微生物を使用する可能性が認められている。最近の研究により、癌を治療するためのウイルス、細菌および寄生虫を含む弱毒化微生物を使用する有用性に脚光が当てられた。例えば、腫瘍細胞を標的にするように遺伝子改変されたＧＭ−ＣＳＦを発現する弱毒化ヘルペスウイルスが転移性黒色腫の治療のためにＦＤＡによって認可された（Ａｍｇｅｎ社、ＩＭＬＹＧＩＣ（登録商標））。さらに、別の医薬に関連づけられた弱毒化微生物が臨床評価中である。例えば、弱毒化細菌リステリア・モノサイトゲネスに関連づけられたオプジーボ（登録商標）（ニボルマブ、ＩｇＧ４抗ＰＤ１）が非小細胞肺癌に対する免疫療法として臨床評価中である。ヒトの乳頭腫ウイルスＨＰＶ１６（ＴＧ４００１）からの抗原Ｅ６およびＥ７を発現するように修正された弱毒化ウイルスとアベルマブ（ＩｇＧ１抗ＰＤ−Ｌ１）との組み合わせは、ＨＰＶ陽性の頭頚部癌の治療における第１〜２相臨床試験で評価されている。ペンブロリズマブ（ＩｇＧ４抗ＰＤ−１）に関連づけられたメソテリン（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎｅ）（ＣＲＳ−２０７）を発現するリステリア・モノサイトゲネスは胃癌の治療のために第１相臨床試験で評価されている。
【０００４】
ネオスポラ・カニナムはウシのネオスポラ症の原因となる細胞内絶対寄生性原生動物である。トキソプラズマ原虫に分類学的に近いにも関わらず、ネオスポラ・カニナムはこの寄生性原生動物とは著しい違いを示す。特に、ネオスポラ・カニナムはヒトに感染しない。ネオスポラ・カニナムの生活環は、２つの異なる相、すなわち（ｉ）蓄積時に除去されるオーシスト、すなわちスポロゾイトの容器の生成をもたらす最終宿主（イヌ科および特にイヌ）における有性相、および（ｉｉ）タキゾイトおよび次いでブラディゾイトを含むシストの形成をもたらす中間宿主（例えば、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ科など）における有性相を特徴とする。ネオスポラ・カニナムによる宿主細胞への侵入プロセスは、その中で寄生虫が増殖して成長する寄生体胞の形成をもたらすいくつかの段階を含む。活性な侵入および寄生体胞形成は、桿小体（ＲＯＰ）および密顆粒（ＧＲＡ）を含む寄生虫分泌細胞小器官の協調的分泌により生じる。これらの細胞小器官の内容物は溶菌サイクル中に連続的に放出され、かつ宿主と寄生虫との相互作用において重要な役割を担う。
【０００５】
本発明者らは驚くべきことに、ネオスポラ・カニナムの少なくとも１種の株を対象に投与することにより、特に腫瘍に対して強い免疫応答が誘導されることを証明した。従って本発明は、ネオスポラ・カニナムの使用に基づく癌または感染症のための新しい治療を提供することを目的とする。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、癌または感染症を治療するのに使用するためのネオスポラ・カニナムの少なくとも１種の株に関する。一実施形態では、感染症は慢性のものである。一実施形態では、前記慢性感染症は慢性ウイルス感染および慢性細菌感染から選択される。別の実施形態では、前記慢性感染症は慢性寄生虫感染である。
【０００７】
一実施形態では、ネオスポラ・カニナム株は野生型株である。
【０００８】
別の実施形態では、ネオスポラ・カニナム株は、ＧＲＡ１５タンパク質の過剰発現および／またはＲＯＰ１６タンパク質の過小発現によって特徴づけられる突然変異株である。
【０００９】
一実施形態では、ネオスポラ・カニナム株はタキゾイト段階にある。
【００１０】
一実施形態では、ネオスポラ・カニナム株は癌を治療するのに使用するためのものであり、ここでは癌は固形腫瘍、好ましくは卵巣癌、膵臓癌または黒色腫である。
【００１１】
別の実施形態では、ネオスポラ・カニナム株は感染症、好ましくは慢性感染症を治療するのに使用するためのものであり、ここでは前記感染症、好ましくは前記慢性感染症は、免疫除去または免疫抑制に関連しているかそれらを誘導し、かつ好ましくは結核、ＨＩＶおよびマラリア感染、好ましくはＨＩＶまたは結核からなる群から選択される。
【００１２】
本発明はさらに、賦形剤と混合したネオスポラ・カニナム株を含む癌または感染症を治療するのに使用するための組成物に関する。一実施形態では、感染症は慢性のものである。一実施形態では、前記慢性感染症は慢性ウイルス感染および慢性細菌感染から選択される。別の実施形態では、前記慢性感染症は慢性寄生虫感染である。
【００１３】
一実施形態では、本組成物は医薬組成物であり、かつ少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。
【００１４】
一実施形態では、本組成物はネオスポラ・カニナムの少なくとも１種の株を含む癌または感染症を治療するのに使用するためのワクチン組成物であり、好ましくは本ワクチン組成物はアジュバントを含む。一実施形態では、感染症は慢性のものである。一実施形態では、前記慢性感染症は慢性ウイルス感染および慢性細菌感染から選択される。別の実施形態では、前記慢性感染症は慢性寄生虫感染である。
【００１５】
一実施形態では、本発明に記載されているように使用するための本ネオスポラ・カニナム株、本組成物または本ワクチン組成物は、皮下、皮内もしくは腫瘍内経路を介して対象に投与することができる。
【００１６】
一実施形態では、対象に投与されるネオスポラ・カニナム株の量は約１０４〜約１０１１の範囲である。
【００１７】
本発明はさらに、ＧＲＡ１５タンパク質の過剰発現および／またはＲＯＰ１６タンパク質の過小発現によって特徴づけられるネオスポラ・カニナムの突然変異株に関する。
【００１８】
本発明は、ネオスポラ・カニナムの突然変異株を含む組成物にも関する。
【００１９】
本発明はさらに、少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤と混合したネオスポラ・カニナムの突然変異株を含む医薬組成物に関する。
【００２０】
本発明は、ネオスポラ・カニナムの突然変異株を含むワクチン組成物であって、好ましくはアジュバントを含むワクチン組成物に関する。
【００２１】
本発明はさらに、Ｔ細胞を活性化させるためのエクスビボ方法であって、Ｔ細胞をネオスポラ・カニナム株と接触させることを含む方法に関する。
【００２２】
定義
本発明では、以下の用語は以下の意味を有する。
【００２３】
「治療」とは、治療処置および予防処置の両方を指し、その目的は、標的とされる病的状態または疾患を予防するか遅らせる（和らげる）ことである。治療を必要とするものとしては、既に疾患に罹患しているものならびに疾患に罹患しやすいものまたは疾患が予防されるべきものが挙げられる。対象は、治療量の本明細書に記載されているネオスポラ・カニナム株が投与された後に、当該対象が観察可能および／または測定可能な改善、すなわち病原性細胞数の減少、総病原性細胞の割合の減少、標的とされる病的状態または疾患に付随する１つ以上の症状のある程度の緩和、罹患率および死亡率の低下、および／または生活の質の問題の改善のうちの１つ以上を示す場合に標的とされる病的状態または疾患に対する「治療が成功となる」。治療の成功をおよび疾患の改善を評価するための上記パラメータは、医師が精通している日常的な手順によって容易に測定可能である。
【００２４】
「治療的有効量」とは、標的に対して重大なマイナスまたは有害な副作用を引き起こすことなく、（１）標的とされる病的状態または疾患の発症を遅らせるか予防する、（２）標的とされる病的状態または疾患の１つ以上の症状の進行、増悪または悪化を遅らせるか停止する、（３）標的とされる病的状態または疾患の症状の寛解をもたらす、（４）標的とされる病的状態または疾患の重症度または発生率を低下させる、または（５）標的とされる病的状態または疾患を治癒させることを目的とした薬剤のレベルまたは量を指す。予防処置のために、標的とされる病的状態または疾患の発症前に有効量を投与してもよい。代わりまたは追加として、治療処置のために標的とされる病的状態または疾患の開始後に有効量を投与してもよい。
【００２５】
「薬学的に許容される賦形剤」とは、動物、好ましくはヒトに投与した場合に副作用、アレルギー反応または他の有害反応を生じさせない賦形剤を指す。これは、ありとあらゆる分散媒および溶媒、被覆剤、等張剤および吸収遅延剤、添加剤、防腐剤および安定化剤などを含む。ヒトへの投与のために、製剤は例えばＦＤＡ局またはＥＭＡなどの規制当局によって要求される無菌性、発熱性、一般的な安全性および純度基準を満たすものでなければならない。
【００２６】
「対象」とは、哺乳類、好ましくはヒトを指す。一実施形態では、対象は、医療的ケアを受けるのを待っているか受けている、あるいは過去に医療処置の対象であったか現在対象であるか今後対象になる、あるいは疾患の発生について観察されている「患者」、すなわち温血動物、より好ましくはヒトであってもよい。一実施形態では、対象は成人（例えば１８歳以上の対象）である。別の実施形態では、対象は小児（例えば１８歳未満の対象）である。一実施形態では、対象は男性である。別の実施形態では、対象は女性である。
【００２７】
数字の前の「約」は前記数字の値の±１０％を意味する。
【００２８】
「ワクチン」とは、例えば癌細胞すなわち腫瘍に対するか、例えば結核菌、ＨＩＶもしくはマラリア原虫感染細胞などの細胞内病原体で感染させた細胞に対して対象において免疫応答を誘導することを目的とした物質または物質群を含むあらゆる調製物を指す。本明細書で使用される「ワクチン」という用語は、予防ワクチンおよび治療ワクチンの両方を指す。予防ワクチンは対象を疾患または病気（例えば癌または感染症）の発生から予防したり、ワクチンが投与された対象が疾患または病気の軽度の症状のみを発現するように疾患または病気の重症度を制限したりするために使用される。治療ワクチンは、対象における標的とされる疾患または病気、例えば癌または感染症、例えば結核、ＨＩＶもしくはマラリア感染などを治療することを目的としている。
【００２９】
「免疫除去」または「免疫抑制」とは、免疫系の欠陥、すなわち１つ以上の細胞系が存在しないか欠損している免疫系を指す。
【００３０】
「活性化された細胞」とは、免疫細胞、特に検出可能な細胞応答を誘導するように十分に刺激されたＴ細胞の状態を指す。活性化はサイトカイン産生または抑制活性などの検出可能なエフェクター機能に関連づけることもできる。
【００３１】
「自己由来」とは、後でそれが再導入される同じ個体に由来するあらゆる材料を指す。
【００３２】
「同種異系」とは、その材料が導入される個体と同じ生物種の異なる個体に由来するあらゆる材料を指す。１つ以上の遺伝子座における遺伝子が同一でない場合に２人（匹）以上の個体は互いに同種異系であると言われる。いくつかの態様では、同じ生物種の個体からの同種異系の材料は抗原的に相互作用するのに十分に遺伝的に異なっていてもよい。
【００３３】
「実質的に精製された」とは、本質的に他の細胞型または生物（例えば他の原生動物）を含まない細胞（例えば、ネオスポラ・カニナム株）を指す。一実施形態では、実質的に精製された株とは、他の細胞型または生物を少なくとも約７５％含まない、８０％含まないまたは８５％含まない、好ましくは約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％含まない株を指す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明は、それを必要とする対象における癌または感染症を治療するのに使用するためのネオスポラ・カニナム株に関する。
【００３５】
実際には、本発明者らは、ネオスポラ・カニナム株の投与により、例えば腫瘍または細胞内病原体に感染した細胞に対する免疫応答を誘導することができ、それにより疾患または病気の治療を可能にすることを実証した。
【００３６】
ネオスポラ・カニナムは、ヒトにおいて非感染性であるという利点を与える。さらに、ネオスポラ・カニナムは、何年かの治療後に予測不可能な副作用を生じさせ得るシスト形成のリスクを与えない。
【００３７】
ネオスポラ・カニナムのいくつかの株が当該技術分野において記載されており、かつ周知である。本発明で使用することができるネオスポラ・カニナム株の例としては、限定されるものではないが、ネオスポラ・カニナム１（ＮＣ−１）、ネオスポラ・カニナムＬｉｖｅｒｐｏｏｌ、ＢＰＡ１、ＢＰＡ６、ＮＣ−Ｂｅｅｆ、ＮＣ−Ｉｌｌｉｎｏｉｓ、ＮＣ−ＬｉｖＢ１、ＮＣ−ＬｉｖＢ２、ＮＣ−ＳｗｅＢ１、ＪＡＰ１、ＮＣ−ＧＥＲ１、ＮＣ−ＧＥＲ２、ＮＣ−ＧＥＲ３、ＮＣ−ＧＥＲ４、ＮＣ−ＧＥＲ５、ＮＣ−ＧＥＲ６、ＮＣ−ＧＥＲ８、ＮＣ−ＧＥＲ９、ＮＣ−Ｂａｈｉａ、ＮＣ−Ｎｏｗｒａ、ＷＡ−Ｋ９、ＮｃＮＺ１、ＮｃＮＺ２、ＮｃＮＺ３およびＮｃＩｓ４９１が挙げられる。一実施形態では、ネオスポラ・カニナム株はネオスポラ・カニナム１（ＮＣ−１）である。
【００３８】
一実施形態では、ネオスポラ・カニナム株は野生型株である。
【００３９】
別の実施形態では、ネオスポラ・カニナム株は突然変異株である。
【００４０】
本明細書で使用される「突然変異」株は、それが由来する野生型株と比較して少なくとも１つの突然変異を含む株を意味することが意図されており、ここでは「突然変異」という用語は、限定されるものではないが、点突然変異、挿入、欠失、増幅または遺伝子重複を指してもよい。
【００４１】
本発明の一実施形態によれば、突然変異株は、それが由来する野生型ネオスポラ・カニナム株のゲノムと少なくとも約７０％の同一性、好ましくは少なくとも約８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するゲノムを含む。
【００４２】
本発明の意味の範囲内で「同一性」という用語は、２つ以上のヌクレオチド配列間の関係において使用する場合、２つ以上の塩基からなる鎖間の一致数によって決定されるこれらのヌクレオチド配列間の関係の程度を指す。本発明によれば、「同一性」は２つ以上の配列間の同一性の割合に対応している。この割合は、当該配列が最適にアラインメントされている場合にその塩基が同一である位置の数を２つの配列のより短い方の塩基の総数で割ったものとして定める。これらの配列間の違いはランダムかつ全てのそれらの長さにわたって分散されていてもよい。同一性の割合が最大である場合に２つの配列は最適にアラインメントされていると言われる。さらに当業者には明らかであるように、２つの配列間の最適アラインメントを得るために、ギャップの追加に頼ることが必要な場合がある。従って２つの核酸配列間の同一性の割合は、比較される核酸配列がこれらの２つの配列間の最適アラインメントのために参照配列と比較される追加または欠失を含み得る最適にアラインメントされたこれらの２つの配列を比較することによって比較することができる。次いで、これらの２つの配列間でそのヌクレオチドが同一である同一の位置の数を決定し、この同一の位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で割り、かつこれらの２つの配列間の同一性の割合を得るために得られた結果に１００を掛けることによって同一性の割合を計算する。好ましくは、同一性を決定するための方法は、比較される配列間で最大で可能な一致を与えるように設計されている。同一性の割合は特定の数学的モデルまたはコンピュータプログラム（一般に「アルゴリズム」という用語で表される）で決定することができる。ヌクレオチド配列間の同一性を計算するための方法は当業者に周知である。そのような方法の非限定的な例としては、以下の文献：コンピュータ分子生物学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク，１９８８；バイオコンピューティング：情報科学およびゲノムプロジェクト（Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ），Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク，１９９３；配列データのコンピュータ解析、パート１（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ  Ｐａｒｔ  １），Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ニュージャージー，１９９４；分子生物学における配列解析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７；配列解析プライマー（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ），Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク，１９９１；およびＣａｒｉｌｌｏら，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，４８，１０７３（１９８８）に記載されているものが挙げられる。同一性を決定するための方法は、公衆がアクセス可��なコンピュータプログラムに記述されている。コンピュータプログラムを用いる方法の好ましい例としては、それらに限定されるものではないが、ＧＡＰを含むＧＣＧソフトウェア（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１２，３８７（１９８４）；ジェネティクスコンピュータグループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ），ウィスコンシン大学，ウィスコンシン州マディソン），ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０（１９９０））が挙げられる。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）および他の提供源（ＢＬＡＳＴマニュアル，Ａｌｔｓｃｈｕｌら，ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ，メリーランド州ベセズダ，２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌら，上記）から公的に入手可能である。当業者に周知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用して２つの配列間の同一性の割合を決定することもできる。
【００４３】
一実施形態では、ネオスポラ・カニナムの突然変異株はＧＲＡ１５を過剰発現する。
【００４４】
本明細書で使用される「ＧＲＡ１５タンパク質」という用語は、ネオスポラ・カニナムの「密顆粒タンパク質１５」を指す。ＧＲＡ１５タンパク質はネオスポラ・カニナムの分泌区画（密顆粒と呼ばれる）に貯蔵されており、宿主細胞への侵入後に液胞の中に分泌される。一実施形態では、ＧＲＡ１５とは、トキソプラズマ原虫のＧＲＡ１５遺伝子のネオスポラ・カニナムにおける相同体（受入番号：遺伝子ＩＤ：７８９５８５６、遺伝子座タグＴＧＭＥ４９＿２７５４７０を有する）を指す。
【００４５】
本明細書で使用される「過剰発現」という用語は、例えば、参照発現レベルの１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％または１０００％またはそれ以上よりも高いか同等の発現レベルなどの、参照発現レベルと比較して増加した発現レベルを指す。
【００４６】
タンパク質を過剰発現する細胞を得るための方法は当該技術分野において周知である。例えば、タンパク質の過剰発現はこのタンパク質をコードする遺伝子の「ノックイン」を構築することによって得てもよい。ノックインを構築するための方法の例としては、限定されるものではないが、電気穿孔法、リポフェクションおよびリン酸カルシウム形質移入などが挙げられる。
【００４７】
本明細書で使用される「発現レベル」という用語は二者択一的に、遺伝子の転写レベル（すなわち、発現はＲＮＡレベルで測定される）または遺伝子の翻訳レベル（すなわち、発現はタンパク質レベルで測定される）を指すことができる。
【００４８】
遺伝子の転写レベルを評価するための方法は先行技術において周知である。そのような方法の例としては、限定されるものではないが、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＴ−ｑＰＣＲ、ノーザンブロット、例えばマイクロアレイの使用などのハイブリダイゼーション法、およびそれらの組み合わせ、例えば限定されるものではないが、ＲＴ−ＰＣＲによって得られた単位複製配列のハイブリダイゼーション、例えば次世代ＤＮＡシーケンシング（ＮＧＳ）またはＲＮＡ−ｓｅｑ（「全トランスクリプトームショットガンシーケンシング」としても知られている）などのシークエンシングが挙げられる。
【００４９】
試料中のタンパク質レベルを決定するための方法は当該技術分野において周知である。そのような方法の例としては、限定されるものではないが、免疫組織化学、マルチプレックス法（Ｌｕｍｉｎｅｘ）、ウェスタンブロット、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、サンドイッチＥＬＩＳＡ、固相蛍光免疫測定法（ＦＬＩＳＡ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）およびフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）などが挙げられる。
【００５０】
一実施形態では、参照発現レベル（これは上に記載されている参照タンパク質発現レベルまたは参照ｍＲＮＡ発現レベルに対応してもよい）は、参照ネオスポラ・カニナム株、好ましくはネオスポラ・カニナム野生型株で測定される発現レベルに対応している。
【００５１】
別の実施形態では、ネオスポラ・カニナムの突然変異株はＲＯＰ１６を過小発現し、好ましくはこの突然変異株はＲＯＰ１６タンパク質を発現しない。例えば、ネオスポラ・カニナムの突然変異株は、ＲＯＰ１６タンパク質をコードする遺伝子のノックアウト突然変異株（ＲＯＰ１６ＫＯ）である。
【００５２】
本明細書で使用される「ＲＯＰ１６タンパク質」という用語とは、「桿小体タンパク質１６」を指す。一実施形態では、ＲＯＰ１６とは、トキソプラズマ原虫のＲＯＰ１６遺伝子のネオスポラ・カニナムにおける相同体（受入番号：遺伝子ＩＤ：７８９４７８２を有する）を指す。
【００５３】
本明細書で使用される「過小発現」（または下方発現）という用語は、例えば参照発現レベル、好ましくは野生型ネオスポラ・カニナム株において測定される発現レベルの９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％またはそれ以下よりも低いか同等の発現レベルなどの、参照発現レベルと比較して減少した発現レベルを指す。
【００５４】
本明細書で使用される「遺伝子のノックアウト」という用語は、前記遺伝子によってコードされるタンパク質の機能喪失および／または発現の喪失において生じる遺伝子突然変異を意味する。一実施形態では、前記遺伝子突然変異は目的の遺伝子の全てまたは一部の破壊、好ましくは当該遺伝子の全破壊に対応している。好ましくは、その欠失は欠失した遺伝子の開始コドンの位置またはその前で開始し、かつ欠失した遺伝子の終止コドンの位置またはその後で終了する。遺伝子突然変異の他の例としては、限定されるものではないが、置換、欠失または挿入が挙げられる。
【００５５】
一実施形態では、ＲＯＰ１６タンパク質のノックアウトは、そのコード配列を選択可能なマーカーをコードする核酸分子で置き換えること、そのコード配列を外来タンパク質をコードする核酸分子で置き換えること、そのプロモーターをもはやネオスポラ・カニナム転写タンパク質によって認識することができない突然変異したプロモーター（すなわちプロモーター突然変異）で置き換えることなどによって達成することができる。
【００５６】
一実施形態では、ネオスポラ・カニナムの突然変異株はＧＲＡ１５を過剰発現し、かつＲＯＰ１６を過小発現する。
【００５７】
一実施形態では、ネオスポラ・カニナム株は単離されたものであり、特にその自然環境から単離されたものである。
【００５８】
一実施形態では、ネオスポラ・カニナム株は実質的に精製されている。
【００５９】
一実施形態では、ネオスポラ・カニナムの生きている株が本発明で使用される。
【００６０】
一実施形態では、ネオスポラ・カニナム株はタキゾイトである。「タキゾイト」とは、ネオスポラ・カニナムの急速に増殖する形態を意味する。タキゾイトは通常は三日月形を有し、かつ可変サイズ、例えば約５〜８×２〜３μｍのサイズを有する。当該寄生虫の先端部は、その寄生虫が宿主細胞の中に進入するのに関与するコノイドを含む。ミクロネーム、桿小体および密顆粒はタキゾイトの３つの主要な細胞小器官を構成し、これは核、アピコプラスト、ゴルジ装置、小胞体、およびミトコンドリアと同様の細胞小器官も含む。
【００６１】
一実施形態では、ネオスポラ・カニナム株はネオスポラ・カニナム−１（ＮＣ−１）からのタキゾイトである。
【００６２】
ネオスポラ・カニナムの生きている株、特にタキゾイトを得て維持するための方法は当業者に周知である。ネオスポラ・カニナム株を維持するための方法の例は以下に示されている。
【００６３】
ネオスポラ・カニナムのＮＣ−１株のタキゾイトは、感染させたヒトの包皮線維芽細胞（例えば、１０％熱不活性化されたＦＣＳ、５０Ｕ／ｍｌのペニシリン／５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび１％ＨＥＰＥＳが添加されたＤＭＥＭ中の単層において培養されたＨｓ  ２７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６３４）など）から回収する。ヒトの包皮線維芽細胞の単層を完全に溶解したらネオスポラ・カニナムタキゾイトを回収することができる。
【００６４】
一実施形態では、ネオスポラ・カニナムは癌を治療するためのものである。
【００６５】
一実施形態では、ネオスポラ・カニナムは腫瘍、好ましくは固形腫瘍を治療するためのものである。実際には本発明者らは、ネオスポラ・カニナムの投与によりマウスにおける腫瘍体積の減少が誘導されることを証明した（実施例を参照）。従って一実施形態では、ネオスポラ・カニナムは、それを必要とする対象における腫瘍体積の減少を誘導するため、および／または腫瘍体積の増加を防止するためのものである。
【００６６】
一実施形態では、癌はあらゆる固形腫瘍であってもよい。固形腫瘍の例としては、限定されるものではないが、胆管癌（例えば、周囲癌、遠位胆管癌、肝内胆管癌）、膀胱癌、骨癌（例えば、骨芽細胞腫、骨軟骨腫、血管腫、軟骨粘液線維腫、骨肉腫、軟骨肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、骨巨細胞腫、脊索腫、リンパ腫、多発性骨髄腫）、脳および中枢神経系の癌（例えば、髄膜腫、星状細胞腫、乏突起膠腫、上衣腫、神経膠腫、髄芽腫、神経節膠腫、神経鞘腫、胚細胞腫、頭蓋咽頭腫）、乳癌（例えば、非浸潤性乳管癌、浸潤性乳管癌、浸潤性小葉癌、非浸潤性小葉癌、女性化乳房）、キャッスルマン病（例えば、巨大リンパ節過形成、血管胞状リンパ節過形成（ａｎｇｉｏ  ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ  ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ））、子宮頸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌（例えば、子宮内膜腺癌、腺棘細胞癌、乳頭状漿液性腺癌、明細胞）、食道癌、胆嚢癌（例えば、粘液癌、小細胞癌）、消化管カルチノイド腫瘍（例えば、絨毛癌、破壊性絨毛腺腫）、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、腎臓癌（例えば、腎細胞癌）、喉頭および下咽頭癌、肝癌（例えば、血管腫、肝細胞腺腫、限局性結節性過形成、肝細胞癌）、肺癌（例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌）、中皮腫、形質細胞腫、鼻腔および副鼻腔癌（例えば、鼻腔神経芽細胞腫（ｅｓｔｈｅｓｉｏｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ）、正中線肉芽腫）、上咽頭癌、神経芽腫、口腔および中咽頭癌、卵巣癌、膵臓癌、陰茎癌、下垂体癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫（例えば、胎児性横紋筋肉腫、胞巣状横紋筋肉腫、多形性横紋筋肉腫）、唾液腺癌、皮膚癌（例えば、黒色腫、非黒色腫皮膚癌）、胃癌、精巣癌（例えば、精上皮腫、非精上皮腫胚細胞癌）、胸腺癌、甲状腺癌（例えば、濾胞腺癌、未分化癌、低分化癌、甲状腺髄様癌、甲状腺リンパ腫）、膣癌、外陰癌および子宮癌（例えば子宮平滑筋肉腫）が挙げられる。
【００６７】
一実施形態では、癌は卵巣癌、膵臓癌および黒色腫から選択される。
【００６８】
一実施形態では、癌は神経膠腫である。
【００６９】
一実施形態では、ネオスポラ・カニナムは転移性癌を治療するためのものである。一実施形態では、ネオスポラ・カニナムはそれを必要とする対象における転移の発生を防止するため、および／または転移の数を減少させるためのものである。
【００７０】
一実施形態では、ネオスポラ・カニナムは血液癌を治療するためのものである。
【００７１】
一実施形態では、ネオスポラ・カニナムは感染症を治療するためのものである。
【００７２】
一実施形態では、前記感染症は、慢性感染症、すなわち病原体（例えば、寄生虫、細菌（特にマイコバクテリア）およびウイルスを含む）による対象の体への長期的および持続的侵入による疾患である。
【００７３】
一実施形態では、前記感染症は、例えばＨＩＶ感染などの慢性ウイルス感染である。
【００７４】
一実施形態では、前記感染症は、例えば結核菌による感染などの慢性細菌感染症である。
【００７５】
一実施形態では、前記感染症は、例えばマラリア原虫による感染などの寄生虫による慢性感染である。
【００７６】
一実施形態では、前記慢性感染症は、例えば細胞内ウイルス、細胞内細菌または細胞内寄生虫などの細胞内病原体の存在によって引き起こされる。
【００７７】
一実施形態では、前記感染症は、免疫除去または免疫抑制に関連しているか免疫除去または免疫抑制を誘導する慢性感染症である。
【００７８】
免疫除去または免疫抑制に関連しているか免疫除去または免疫抑制を誘導する慢性感染症の例としては、限定されるものではないが、結核、ＨＩＶまたはマラリア感染が挙げられる。
【００７９】
一実施形態では、前記感染症は、クリプトスポリジウム科のアピコンプレクサ類に起因するものではない。一実施形態では、前記感染症はクリプトスポリジウム症ではない。一実施形態では、前記感染症はネオスポラ症ではない。
【００８０】
一実施形態では、対象はヒトである。
【００８１】
一実施形態では、対象は免疫抑制されており、すなわち免疫系の障害を示す。一実施形態では、対象の免疫系は癌または感染症と戦う能力が損なわれている。
【００８２】
一実施形態では、対象は癌を有する。一実施形態では、対象は癌であると診断されるか既に診断されている。
【００８３】
一実施形態では、癌は初期または末期の癌である。
【００８４】
一実施形態では、対象は以前に癌のための別の治療で治療されなかった（すなわち、本発明の方法は第一選択治療である）。
【００８５】
別の実施形態では、対象は以前に癌のための１種、２種またはそれ以上の他の治療を受けた（すなわち、本発明の方法は第二、第三またはそれ以上の選択治療である）。一実施形態では、対象は以前に癌のための１種以上の他の治療を受けたが、これらの治療に反応を示さなかったか適切に反応せず、これはこれらの治療によって誘導される治療効果がないか非常に低いことを意味する。
【００８６】
別の実施形態では、対象は癌を発生するリスクがある。癌を発生させる危険因子の例としては、限定されるものではないが、癌の家族歴、遺伝的素因または発癌性物質への曝露が挙げられる。
【００８７】
別の実施形態では、対象は感染症、好ましくは慢性感染症を有する。一実施形態では、対象は免疫除去または免疫抑制に関連しているかそれらを誘導する感染症（好ましくは慢性感染症）を有する。一実施形態では、対象は細胞内病原体によって引き起こされる慢性感染症を有する。一実施形態では、対象は結核感染を有する。別の実施形態では、対象はＨＩＶ感染を有する。別の実施形態では、対象はマラリア感染を有する。
【００８８】
一実施形態では、対象は以前に前記感染のための別の治療で治療されなかった（すなわち、本発明の方法は第一選択治療である）。
【００８９】
別の実施形態では、対象は以前に前記感染のための１種、２種またはそれ以上の他の治療を受けた（すなわち、本発明の方法は第二、第三またはそれ以上の選択治療である）。別の実施形態では、対象は以前に前記感染のための１種以上の他の治療を受けたが、これらの治療に反応を示さなかった適切に反応せず、これはこれらの治療によって誘導される治療効果がないか非常に低いことを意味する。
【００９０】
一実施形態では、対象はクリプトスポリジウム症に罹患していない。
【００９１】
本発明はさらに、本明細書の上に記載されているネオスポラ・カニナムの少なくとも１種の株またはその突然変異株を含むか、それからなるか本質的にそれからなる、それを必要とする対象における癌または感染症を治療するのに使用するための組成物に関する。
【００９２】
組成物に関して本明細書で使用される「本質的に〜からなる」とは、本発明のネオスポラ・カニナムの少なくとも１種の株またはその突然変異株が前記組成物内でたった１種の治療薬すなわち生物活性を有する薬剤であることを意味する。
【００９３】
本発明の別の目的は、本明細書の上に記載されているネオスポラ・カニナムの少なくとも１種の株またはその突然変異株および少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤を含むか、それからなるか本質的にそれからなる、それを必要とする対象における癌または感染症を治療するのに使用するための医薬組成物である。
【００９４】
薬学的に許容される賦形剤の例としては、限定されるものではないが、媒体、溶媒、被覆剤、等張剤、吸収遅延剤、添加剤、安定化剤、防腐剤、界面活性剤、酵素分解を阻害する物質、アルコール、ｐＨ調節剤および噴射剤が挙げられる。
【００９５】
薬学的に許容される媒体の例としては、限定されるものではないが、水、リン酸緩衝生理食塩水、通常生理食塩水または他の生理的緩衝食塩水、あるいはグリコール、グリセリンおよび油（オリーブ油など）または注射可能な有機エステルなどの他の溶媒が挙げられる。薬学的に許容される媒体はリポソームまたはミセルも含有することができ、かつポリペプチドまたはペプチド抗原を界面活性剤およびグリコシドと混合することによって調製された免疫刺激複合体を含有することができる。
【００９６】
被覆材料の例としては、限定されるものではないが、レシチンが挙げられる。
【００９７】
等張剤の例としては、限定されるものではないが、糖および塩化ナトリウムなどが挙げられる。吸収を遅らせる薬剤の例としては、限定されるものではないが、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンが挙げられる。
【００９８】
添加剤の例としては、限定されるものではないが、マンニトール、デキストラン、糖、グリシン、ラクトースまたはポリビニルピロリドン、あるいはインビボ投与に適した抗酸化剤すなわち不活性ガス、安定化剤すなわち組換えタンパク質（例えば、ヒトの血清アルブミン）などの他の添加剤が挙げられる。
【００９９】
好適な安定化剤の例としては、限定されるものではないが、スクロース、ゼラチン、ペプトン、ＮＺ−アミンまたはＮＺ−アミンＡＳなどの消化タンパク質抽出物が挙げられる。
【０１００】
本発明の別の目的は、本明細書に記載されているネオスポラ・カニナムの少なくとも１種の株またはその突然変異株を含むか、それからなるか本質的にそれからなる、それを必要とする対象における癌または感染症を治療するのに使用するための薬である。
【０１０１】
本発明の別の目的は、本明細書に記載されているネオスポラ・カニナムの少なくとも１種の株またはその突然変異株を含むか、それからなるか本質的にそれからなる、それを必要とする対象における癌または感染症を治療するのに使用するためのワクチン組成物である。一実施形態では、本発明のワクチンは予防ワクチンである。別の実施形態では、本発明のワクチンは治療ワクチンである。
【０１０２】
一実施形態では、本ワクチン組成物は少なくとも１種のアジュバントをさらに含む。
【０１０３】
本明細書で使用される「アジュバント」という用語は、ネオスポラ・カニナム株によって誘導される宿主の免疫応答を強化、増大または増強する物質を指す。
【０１０４】
本ワクチン組成物に使用することができるアジュバントの例としては、限定されるものではないが、ＩＳＡ５１；ＣＦＡ、ＭＦ５９、モンタナイド（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ）、ＡＳ０３およびＡＦ０３などの乳濁液；ミョウバン、リン酸カルシウム、鉄塩、ジルコニウム塩およびＡＳ０４などの無機塩；ＴＬＲ２リガンド（細胞表層タンパク質ＡまたはＯｓｐＡなど）、ＴＬＲ３リガンド（ポリＩ：Ｃなど）、ＴＬＲ４リガンド（ＭＰＬおよびＧＬＡなど）、ＴＬＲ５リガンド、ＴＬＲ７／８リガンド（イミキモドなど）、ＴＬＲ９リガンド（ＣｐＧ  ＯＤＮなど）などのＴＬＲリガンド；キチン、キトサン、α−グルカン、β−グルカン、フルクタン、マンナン、デキストラン、レンチナン、イヌリン系アジュバント（γイヌリンなど）などの多糖；ＴＬＲ９ならびにＫ３  ＣｐＧおよびｃＧＡＭＰなどのＳＴＩＮＧリガンドが挙げられる。
【０１０５】
本発明のネオスポラ・カニナム株、組成物、医薬組成物、薬またはワクチン組成物は、経口、非経口、腹膜内投与で、吸入スプレーによって、局所的、直腸内、経鼻、口腔内、膣内に投与してもよく、あるいは埋込型容器を介して投与してもよい。
【０１０６】
一実施形態では、本発明のネオスポラ・カニナム株、組成物、医薬組成物、薬またはワクチン組成物を注射（注入）する。注射（注入）の例としては、限定されるものではないが、腫瘍内、皮内、皮下、静脈内、筋肉内、リンパ管内、関節内、関節滑液嚢内、胸骨内、クモ膜下腔内、膀胱内、肝内、病巣内および頭蓋内注射もしくは注入技術が挙げられる。
【０１０７】
一実施形態では、ネオスポラ・カニナム株を皮下に投与する。一実施形態では、ネオスポラ・カニナム株を皮内に投与する。一実施形態では、ネオスポラ・カニナム株を腫瘍内に投与する。
【０１０８】
一実施形態では、本発明の株、組成物、医薬組成物、薬またはワクチン組成物は、経口投与に適した形態である。第１の実施形態によれば、経口投与に適した形態は、錠剤、丸剤、カプセル、軟ゼラチンカプセル、糖衣剤、口腔内崩壊錠（ｏｒｏｄｉｓｐｅｒｓｉｎｇ  ｔａｂｌｅｔ）、発泡錠または他の固体を含む群から選択される固体の形態である。第２の実施形態によれば、経口投与に適した形態は、例えば、飲用溶液、口腔内スプレーおよびリポソーム形態などの液体形態である。
【０１０９】
別の実施形態では、本発明の株、組成物、医薬組成物、薬またはワクチン組成物は、直腸内もしくは膣内投与のために製剤化し、かつ坐薬、腟坐剤、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、泡またはスプレーとして提供してもよい。
【０１１０】
別の実施形態では、本発明の株、組成物、医薬組成物、薬またはワクチン組成物は、非経口投与に適した形態である。非経口投与に適した形態としては、限定されるものではないが、無菌の等張性水性もしくは非水性溶液、分散液、懸濁液または乳濁液、あるいは使用直前に無菌の注射溶液または分散液に再構成することができる無菌の粉末が挙げられる。
【０１１１】
別の実施形態では、本発明の株、組成物、医薬組成物、薬またはワクチン組成物は、経鼻および呼吸経路を介した局所送達に適した形態である。経鼻もしくは呼吸投与に適した製剤の例としては、限定されるものではないが、点鼻液、スプレー、エアロゾルおよび吸入薬が挙げられる。
【０１１２】
別の実施形態では、本発明の株、組成物、医薬組成物、薬またはワクチン組成物は局所投与に適した形態である。局所投与に適した製剤の例としては、限定されるものではないが、軟膏、ペースト、点眼薬、クリーム、パッチ（例えば経皮パッチなど）、ゲルおよびリポソーム形態などが挙げられる。
【０１１３】
一実施形態では、本発明の組成物または製剤は、単位用量または複数回用量の密封容器、例えばアンプルおよびバイアルで提供してもよく、かつ使用直前に無菌の液体賦形剤、例えば注射用水の添加のみを必要とする凍結乾燥条件で貯蔵してもよい。即席注射溶液および懸濁液は無菌の粉末、顆粒および錠剤から調製してもよい。
【０１１４】
投与のための正確な用量は、治療を必要とする対象に関係する因子を考慮して当業者によって決定することができる。投与量を調整して十分なレベルの本組成物を提供するか、あるいは標的とされる病的状態または疾患の徴候または症状を減らすか標的とされる病的状態または疾患の重症度を低下させるという所望の効果を維持する。考慮に入れることができる因子としては、病状の重症度（例えば腫瘍体積または感染細胞数）、疾患の予後、腫瘍への局在化または到達性、対象の健康状態、対象の年齢、体重および性別、食事、投与の時間および頻度、薬物の組み合わせ、反応感受性ならびに治療法への寛容性／応答が挙げられる。
【０１１５】
一実施形態では、治療的有効量の本発明の株、組成物、医薬組成物、薬またはワクチン組成物を対象に投与する（または投与することができる）。
【０１１６】
本発明の一実施形態では、本ネオスポラ・カニナム株または本組成物、本医薬組成物、本薬または本ワクチン組成物は、プライム／ブーストモードに従って、日、週または月の間隔で少なくとも１回、好ましくは少なくとも２回、より好ましくは少なくとも３回、さらにより好ましくは少なくとも４回投与する。
【０１１７】
本発明の一実施形態では、１回の投与ごとに投与される本明細書の上に記載されているネオスポラ・カニナム株（好ましくはタキゾイト）の量は、約１０４〜約１０１１、好ましくは約１０５〜約１０１０、より好ましくは約１０６〜約１０９、さらにより好ましくは約１０７〜約１０８の範囲である。
【０１１８】
本発明の一実施形態では、１日に投与される本明細書の上に記載されているネオスポラ・カニナム株（好ましくはタキゾイト）の１日量は、１日当たり約１０４〜約１０１１、好ましくは約１０５〜約１０１０／日、より好ましくは約１０６〜約１０９／日、さらにより好ましくは約１０７〜約１０８／日の範囲である。
【０１１９】
本発明はさらに、対象に治療的有効量のネオスポラ・カニナム株またはその突然変異株を投与することを含む、それを必要とする対象における癌または感染症を治療するための方法に関する。
【０１２０】
一実施形態では、本発明の方法は、腫瘍体積を減少させるため、および／または腫瘍体積のあらゆる増加を防止するための方法である。
【０１２１】
一実施形態では、本発明の方法は転移の発生を防止するため、および／または転移の数を減少させるためのものである。
【０１２２】
本発明は、それを必要とする対象における癌細胞、腫瘍もしくは感染細胞、好ましくは例えば結核菌、ＨＩＶまたはマラリア原虫などの細胞内病原体に感染した細胞に対する免疫応答を誘導するための方法に関する。一実施形態では、免疫応答は非特異的応答である。一実施形態では、免疫応答はＩＦＮ−γの分泌によって特徴づけられる。
【０１２３】
本明細書で使用される「免疫応答」は検出可能な免疫応答、例えばＴ細胞免疫応答すなわち抗体産生である。Ｔ細胞免疫応答を測定するための方法は当業者によって周知であり、限定されるものではないが、ＩＦＮ−γの産生の監視が挙げられる。
【０１２４】
本発明者らは、ネオスポラ・カニナム株の対象への投与により細胞性および体液性免疫応答を誘導することができることを本明細書において証明する。実際には本発明者らは、ネオスポラ・カニナムおよびネオスポラ・カニナムに対する特異的ＩｇＧの投与後のＩＦＮ−γの４倍増の分泌がネオスポラ・カニナムの投与後の血清中で検出されることを証明する（実施例を参照）。
【０１２５】
従って本発明は、ネオスポラ・カニナム株の少なくとも１つの細胞を対象に投与することを含む、対象において細胞性および／または体液性免疫応答を誘導するための方法に関する。
【０１２６】
本発明は、ネオスポラ・カニナム株の少なくとも１つの細胞を対象に投与することを含む、腫瘍体積の減少、好ましくは少なくとも２５％、好ましくは少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上の腫瘍体積の減少を誘導するための方法に関する。
【０１２７】
実際には本発明者らは、ネオスポラ・カニナム株の投与により腫瘍体積が減少することを本明細書において証明する。より具体的には、腫瘍周囲への投与後に腫瘍体積の３倍の減少が観察される（実施例を参照）。
【０１２８】
本発明はさらに、細胞、好ましくはヒトの細胞、より好ましくはＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）、さらにより好ましくはＴ細胞を本発明に記載されているネオスポラ・カニナム株と接触させることを含む、細胞を活性化させるためのエクスビボ方法に関する。
【０１２９】
従って本発明はさらに、細胞、好ましくはヒトの細胞、より好ましくはＰＢＭＣ、さらにより好ましくはＴ細胞をエクスビボで活性化させるための本発明に記載されているネオスポラ・カニナム株の使用であって、前記細胞を前記ネオスポラ・カニナム株と接触させることを特徴とする使用に関する。
【０１３０】
一実施形態では、前記細胞を癌または感染症を有する患者から採取する。一実施形態では、細胞を患者から採取する工程は本発明の方法の一部ではない。
【０１３１】
一実施形態では、活性化された細胞を癌または感染症を有する患者に投与し、それにより癌または感染症を治療することができる。一実施形態では、活性化された細胞は患者の自己由来の細胞である。別の実施形態では、活性化された細胞は患者の細胞に同種異系である。
【０１３２】
本発明はさらに、それを必要とする対象における癌または感染症を治療するための方法であって、
好ましくは以前に前記対象から採取された細胞、好ましくはＰＢＭＣ、より好ましくはＴ細胞を本発明に記載されているネオスポラ・カニナム株と接触させる工程と、
活性化された細胞を対象に投与し、それにより癌または感染症を治療する工程と
を含む方法に関する。
【０１３３】
本発明の別の目的は、ＧＲＡ１５を過剰発現し、かつ／またはＲＯＰ１６を過小発現するネオスポラ・カニナムの突然変異株である。
【０１３４】
突然変異株を得ることができるネオスポラ・カニナム株の例としては、限定されるものではないが、ネオスポラ・カニナム１（ＮＣ−１）、ネオスポラ・カニナムＬｉｖｅｒｐｏｏｌ、ＢＰＡ１、ＢＰＡ６、ＮＣ−Ｂｅｅｆ、ＮＣ−Ｉｌｌｉｎｏｉｓ、ＮＣ−ＬｉｖＢ１、ＮＣ−ＬｉｖＢ２、ＮＣ−ＳｗｅＢ１、ＪＡＰ１、ＮＣ−ＧＥＲ１、ＮＣ−ＧＥＲ２、ＮＣ−ＧＥＲ３、ＮＣ−ＧＥＲ４、ＮＣ−ＧＥＲ５、ＮＣ−ＧＥＲ６、ＮＣ−ＧＥＲ８、ＮＣ−ＧＥＲ９、ＮＣ−Ｂａｈｉａ、ＮＣ−Ｎｏｗｒａ、ＷＡ−Ｋ９、ＮｃＮＺ１、ＮｃＮＺ２、ＮｃＮＺ３およびＮｃＩｓ４９１が挙げられる。一実施形態では、ネオスポラ・カニナムの突然変異株は野生型ネオスポラ・カニナム−１（ＮＣ−１）に由来する。別の実施形態では、ネオスポラ・カニナムの突然変異株は野生型ネオスポラ・カニナムＬｉｖｅｒｐｏｏｌに由来する。
【０１３５】
本発明の一実施形態では、突然変異株は、それが由来するネオスポラ・カニナムの野生型株のゲノムと７０％超の同一性、好ましくは８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％超の同一性を有するゲノムを含む。
【０１３６】
一実施形態では、ネオスポラ・カニナムの突然変異株はＧＲＡ１５を過剰発現する。
【０１３７】
別の実施形態では、ネオスポラ・カニナムの突然変異株はＲＯＰ１６を過小発現し、好ましくは突然変異株はＲＯＰ１６タンパク質を発現しない。例えばネオスポラ・カニナムの突然変異株は、ＲＯＰ１６タンパク質をコードする遺伝子のノックアウト突然変異株（ＲＯＰ１６ＫＯ）である。
【０１３８】
一実施形態では、ＲＯＰ１６タンパク質のノックアウトは、そのコード配列を選択可能なマーカーをコードする核酸分子で置き換えること、そのコード配列を外来タンパク質をコードする核酸分子で置き換えること、そのプロモーターをもはやネオスポラ・カニナム転写タンパク質によって認識することができない突然変異したプロモーター（すなわちプロモーター突然変異）で置き換えることなどによって達成することができる。
【０１３９】
一実施形態では、ネオスポラ・カニナムの突然変異株はＧＲＡ１５を過剰発現し、かつＲＯＰ１６を過小発現する。
【０１４０】
本発明の別の目的は、本明細書の上に記載されているネオスポラ・カニナムの少なくとも１種の突然変異株を含むか、それからなるか本質的にそれからなる組成物である。
【０１４１】
本発明の別の目的は、本明細書の上に記載されているネオスポラ・カニナムの少なくとも１種の突然変異株および少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤を含むか、それからなるか本質的にそれからなる医薬組成物である。
【０１４２】
薬学的に許容される賦形剤の例は本明細書に記載されている。
【０１４３】
本発明の別の目的は、本明細書の上に記載されているネオスポラ・カニナムの少なくとも１種の突然変異株を含むか、それからなるか本質的にそれからなる薬である。
【０１４４】
本発明の別の目的は、本明細書の上に記載されているネオスポラ・カニナムの少なくとも１種の突然変異株を含むか、それからなるか本質的にそれからなるワクチン組成物である。
【０１４５】
一実施形態では、本ワクチン組成物は少なくとも１種のアジュバントをさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
【図１】異なる用量のネオスポラ・カニナム−１（ＮＣ−１）の野生型株の投与後のマウスの生存率を示す用量反応曲線である。
【図２】マウスにおける異なる用量のネオスポラ・カニナム−１（ＮＣ−１）の野生型株の投与後２日目または８日目のセリック（ｓｅｒｉｃ）ＩＦＮ−γの産生を示すヒストグラムである。
【図３】マウスにおける異なる用量のネオスポラ・カニナム−１（ＮＣ−１）の野生型株の投与後のネオスポラ・カニナムに対する特異的ＩｇＧの産生を示すドットプロットである。
【図４】腫瘍のみが接種された未治療のマウス（対照）と比較した腫瘍細胞が接種され、かつネオスポラ・カニナム−１（ＮＣ−１）の野生型株で治療されたマウスの腫瘍体積を示す曲線である。
【図５】２５日目に、腫瘍のみが接種された未治療のマウス（対照）と比較した、腫瘍細胞が接種され、かつネオスポラ・カニナム−１（ＮＣ−１）の野生型株で治療されたマウスの腫瘍体積を示すドットプロットである。＊＊：Ｐ値＜０．０１（Ｋｒｕｓｋａｌｌ  Ｗａｌｌｉｓ試験）。
【図６】腫瘍が埋め込まれたマウスにおけるネオスポラ・カニナム−１の野生型株で感染させる前または感染後４日目（４ＤＰＩ）のＩＦＮ−γの血清中レベルを示すドットプロットである。
【図７】ネオスポラ・カニナム−１（ＮＣ−１）の野生型株で治療されたマウスまたは未治療（対照）であり、かつコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）で刺激されたマウスから採取した脾臓リンパ球によるインビトロでのＩＦＮ−γ産生を示すドットプロットである。
【図８】ＧＲＡ１５ＩＩタンパク質の発現（抗Ｔａｇ  ＨＡによって可視化される）を示す免疫ブロットである。黒色の矢印は６０ｋＤａの分子量におけるＧＲＡ１５ＩＩタンパク質の期待されるバンドを示す。レーン１：ＧＲＡ１５ＩＩをコードするプラスミドを電気穿孔したネオスポラ・カニナム寄生虫。レーン２：形質導入されていないネオスポラ・カニナム寄生虫。レーン３：分子量（ＭＷ）基準：１７、２６、４２、５５、７２、９５および１４０ｋＤａ。
【実施例】
【０１４７】
実施例１：ネオスポラ・カニナムのインビボでの効果
【０１４８】
材料および方法
マウス
８週齢の雌の近交系Ｃ５７ＢＬ／６マウスを病原体が存在しない条件下に維持する。
【０１４９】
ネオスポラ・カニナム−１株
ネオスポラ・カニナムのＮＣ−１株のタキゾイトを、熱不活性化された１０％ＦＣＳ、５０Ｕ／ｍｌのペニシリン／５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび１％ＨＥＰＥＳが添加されたＤＭＥＭ中の単層において培養した感染させたヒトの包皮線維芽細胞Ｈｓ  ２７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６３４）から回収する。ヒトの包皮線維芽細胞の単層を完全に溶解したらネオスポラ・カニナムタキゾイトを回収することができる。
【０１５０】
腫瘍細胞
ＥＧ７細胞（ニワトリアルブミンｃＤＮＡでトランスフェストしたＥＬ４−ＯＶＡ胸腺腫細胞）を、例えば５×１０５Ｍの２−メルカプトエタノール、５０ＵＩ／ｍＬのペニシリンおよび５０ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ培地で培養する。
【０１５１】
腫瘍細胞の接種
１×１０５の生のＥＧ７細胞をマウスの右脇腹の皮内に接種する。腫瘍直径を１週間に３回測定し、腫瘍直径が２５．０００ｍｍ３に到達したらマウスを安楽死させる。
【０１５２】
ネオスポラ・カニナム−１（ＮＣ−１）の投与
４日目および再び７日目にマウスの右脇腹に５×１０６の新しく単離されたネオスポラ・カニナムのＮＣ−１株のタキゾイトを皮下注射する。
【０１５３】
細胞の培養条件およびサイトカインの定量化
脾臓を回収し、ステンレス鋼メッシュに押し通す。組織デブリを除去するためのナイロンメッシュによる濾過によって単細胞懸濁液を得る。脾臓赤血球を低浸透圧ショックによって溶解し、脾臓の単細胞を、５％ＦＣＳ、ＨＥＰＥＳ（２５ｍＭ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、β−メルカプトエタノール（５×１０−５Ｍ）およびペニシリン（５０Ｕ／ｍｌ）／ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を添加したＲＰＭＩ１６４０に再懸濁する。単独またはコンカナバリンＡ（１０μｇ／ｍｌ）を含有する２００μｌの培養培地において１つのウェル当たり５×１０５個の細胞で脾臓細胞を９６ウェルプレート中で培養する。これらのプレートを５％ＣＯ２中３７℃で７２時間インキュベートする。細胞培養上澄みを回収して−２０℃で維持する。脾臓リンパ球の上澄みに対するＥＬＩＳＡアッセイによってＩＦＮ−γの定量化を行う。
【０１５４】
結果
ネオスポラ・カニナム感染は非常に高い接種量において致死的である
ネオスポラ・カニナム株のチャレンジ研究により、５×５×１０６、５×１０５、５×１０４および５×１０３のＮＣ−１タキゾイトで免疫した全てマウスが２５日まで生存することを明らかにする。５×１０７のＮＣ−１タキゾイトで感染させた３匹のマウスのうちの１匹が５日目に死亡する（図１）。
【０１５５】
ネオスポラ・カニナムは体液性および細胞性免疫応答を誘導する
注射されたＮＣ−１タキゾイトの用量に関わらず、感染後８日目に高レベルのセリックＩＦＮ−γ（約２０００ｐｇ／ｍＬ）を得る。感染後２日目のＩＦＮ−γ分泌は、５×１０７および５×１０６のＮＣ−１タキゾイトで感染させたマウスの血清中でのみ観察される（図２）。
【０１５６】
感染後２１日目に全ての感染させたマウスがネオスポラ特異的体液性免疫応答を生じる。図３に示すように、５×１０７および５×１０６のＮＣ−１タキゾイト（１／５０希釈で約０．８）で感染させたマウスにおいて最も高いレベルの体液性抗体を達成する（図３）。
【０１５７】
用量と抗ネオスポラ免疫応答との相関を示すこれらの結果に従って、次の実験では５×１０６のＮＣ−１タキゾイトの濃度に焦点を当てることを決定した。
【０１５８】
ネオスポラ・カニナム治療は確立された固形腫瘍の発生を抑制および／または消失させる
ＥＧ７細胞が接種されたマウスは転移後２５日目に大きな腫瘍（８０９０±５０７ｍｍ３）を生じる。対照的に、ＮＣ−１タキゾイトによる前処置は腫瘍体積を有意に減少させ（１８１６±４６５ｍｍ３）、これはＮＣ−１タキゾイトが胸腺腫瘍の発生を抑制することを実証している（図４および図５）。
【０１５９】
ネオスポラ・カニナムは腫瘍発生に対する防御免疫応答を誘導する
未治療のマウスのＩＦＮ−γの血清中レベルと比較してネオスポラ治療マウスにおいて腫瘍の生着後８日目であって第１のネオスポラ用量の接種後４日目（４ＤＰＩ）にＩＦＮ−γの血清中レベルの増加が観察される（図６）。
【０１６０】
未治療のマウス（対照）から採取された刺激された脾臓リンパ球と比較してネオスポラ治療マウス（ＮＣ−１）から採取され、かつコンカナバリンＡで刺激された脾臓リンパ球によるＩＦＮ−γ産生の増加がインビトロで観察される。この結果は、腫瘍発生時に脾臓免疫抑制を解除することによってネオスポラ・カニナムが治療的抗腫瘍免疫応答を生じることを示唆している（図７）。
【０１６１】
実施例２：ネオスポラ・カニナムはＧＲＡ１５ＩＩを過剰発現する
【０１６２】
ＧＲＡ１５を過剰発現するネオスポラ・カニナム株を得るために、Ｃ末端にＨＡ−Ｔａｇを含むＧＲＡ１５ＩＩをコードする配列（Ｍｅ４９株、ＴｏｘｏＤＢ配列、遺伝子ＩＤ：７８９５８５６、ＴＧＭＥ４９＿２７５４７０）をＰｍｅＩ部位にあるベクターｐＵＣ８においてクローン化させた。ベクターｐＵＣ８は２つの発現カセットを含む。１つの発現カセットはｐＴＵＢ５プロモーターの制御下でＧＦＰタンパク質に融合されたクロラムフェニコール耐性遺伝子をコードする。第２の発現カセットは、その配列がＫｏｚａｋ配列、翻訳開始コドンおよび終止コドンを含むｐＴＵＢ８プロモーターの制御下で目的のタンパク質、すなわちＧＲＡ１５ＩＩをコードする。
【０１６３】
次いで、３ｍＭのＡＴＰおよび３ｍＭのグルタチオンを含むＣｙｔｏｍｉｘ培地（１２０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、２５ｍＭのＨｅｐｅｓ、１０ｍＭのＫ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．６）、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．１５ｍＭのＣａＣｌ２（ＫＯＨでｐＨ７．６に調整））に吸収されたネオスポラ・カニナムＮＣ−１寄生虫（１０７の寄生虫）を以前にＰｃｉＩ制限酵素で線形化された５０μｇの組換え型プラスミドｐＵＣ８  ＧＲＡ１５ＩＩで電気穿孔した。
【０１６４】
次いで、ヒトの包皮線維芽細胞（ＨＦＦ細胞）上で培養された寄生虫をクロラムフェニコールを含有する培地と共に選択した。選択から８週間後にＧＲＡ１５ＩＩタンパク質の発現を可視化するための免疫ブロット法によってクロラムフェニコール耐性寄生虫を解析した。
【０１６５】
電気泳動（１ウェル当たり５×１０６の寄生虫）およびその後のニトロセルロース膜への転写によってＧＲＡ１５ＩＩタンパク質の発現を解析した。簡単に言うと、寄生虫をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）試料緩衝液に懸濁させ、超音波処理し、１００℃で３分間加熱し、かつポリアクリルアミドゲル上で分離させた。電気泳動後に、タンパク質をニトロセルロース膜上に転写させ、これを抗ＨＡ  Ｔａｇポリクローナル抗体（７１−５５００−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で検出した。結合した抗体を抗ウサギ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ、全分子）−アルカリホスファターゼ結合体（Ａ３６８７−Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を用いて検出した。５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）液体基質系（Ｓ３７７１−Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてアルカリホスファターゼ活性を検出した。分子量基準（予め染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ基準、（ＰｒｏＳｉｅｖｅ  ＱｕａｄＣｏｌｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍａｒｋｅｒｓ，Ｌｏｎ００１９３８３７−Ｏｚｙｍｅ））を使用した。
【０１６６】
当該タンパク質は６０ｋＤａの分子量において期待される。黒色の矢印によって示されるバンドは、６０ｋＤａにおいてバンドを示さないレーン２の電気穿孔されていないネオスポラ・カニナム（図８）と比較して、レーン１では約６０ｋＤａにおいて可視化されており（図８）、これはＰＵＣ８  ＧＲＡ１５ＩＩプラスミドで電気穿孔されたネオスポラ・カニナムにおけるＧＲＡ１５ＩＩタンパク質の発現を示している。示されているＭＷを超えて可視化されているバンドはＧＲＡ１５ＩＩタンパク質の二量体化形態に対応していてもよい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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