(57)【要約】【課題】細胞ストレスの低減及び活性酸素の量の低減のための方法、システム、因子、および培地を提供する。【解決手段】本発明の実施形態において、ある阻害剤などの様々な分子を用いて細胞を処理することによって細胞ストレスが低減される。いくつかの実施形態において、スカベンジャーの使用によって細胞培地中の活性酸素の量を低減することができる。【選択図】図１
2020512830.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を別のタイプの細胞へ移行させる際の細胞ストレスを調和（mediating）する方法であって、以下の内の２つ以上を実行しつつ、前記細胞の前記移行を導く条件下において前記細胞を培養すること、を含む方法、
細胞の周囲の培地の中の利用可能な酸素を減少させること、
抗酸化剤を用いて細胞を処理すること、
細胞の細胞ストレス応答経路を阻害すること、
細胞の自然免疫応答を阻害すること、及び、
細胞内活性酸素の濃度を低下させる細胞経路を活性化すること。
【請求項２】
ヒト血液前駆細胞を血液細胞へ移行させる際の細胞ストレスを調和する方法であって、以下の内の１つ以上を実行しつつ、前記前駆細胞の血液細胞への前記移行を導く条件下において前記ヒト血液前駆細胞を培養すること、を含む方法、
ヒト血液前駆細胞の周囲の培地の中の利用可能な酸素を減少させること、
抗酸化剤を用いてヒト血液前駆細胞を処理すること、
ヒト血液前駆細胞の細胞ストレス応答経路を阻害すること、
ヒト血液前駆細胞の自然免疫応答を阻害すること、及び、
細胞内活性酸素の濃度を低下させる細胞経路を活性化すること。
【請求項３】
前記移行が、より決定された（committed）タイプの細胞への分化を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記移行が、細胞の誘導多能性幹細胞への転向を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞内活性酸素の濃度を低下させる細胞経路の活性化が、ｃＡＭＰシグナル伝達活性化因子を用いて細胞を処理することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
ｃＡＭＰシグナル伝達活性化因子がフォルスコリンまたはＩＢＭＸを含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記細胞の周囲の培地の中の利用可能な酸素の減少が、細胞を低酸素環境に置くことを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項８】
前記抗酸化剤が、アスコルビン酸、クエン酸、ビタミンＥ、セレン、メラトニン、ＮＡＣ、グルタチオン、チオレドキシン、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ及びクエン酸一水和物からなる群から選択される成分を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項９】
アスコルビン酸の濃度が、約０．０１１〜０．５５ｍｇ／ｍｌである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
クエン酸の濃度が約０．１１５〜１．１５ｍｇ／ｍｌである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞ストレス応答経路の阻害が、ミトコンドリアｐ５３媒介アポトーシスの阻害を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞ストレス応答経路の阻害が、ｐ３８媒介性老化の阻害を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１３】
前記ｐ３８媒介性老化の阻害が、約２０〜５００ｎＭの濃度範囲のＬＹ２２２８８２０を用いて細胞を処理することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞ストレス応答経路の阻害が、小胞体ストレスを阻害することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞ストレス応答経路の阻害が、非ミトコンドリアカルパイン媒介ストレスを阻害することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１６】
前記自然免疫応答の阻害が、ミエロペルオキシダーゼ阻害因子を用いてミエロペルオキシダーゼ産生を阻害することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１７】
前記ミエロペルオキシダーゼ阻害因子が、約１００μΜの濃度範囲の４−ＡＢＡＨを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞ストレス応答経路の阻害が、フィルトリン−μを用いてミトコンドリアｐ５３媒介アポトーシスを阻害することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞ストレス応答経路の阻害が、細胞の非ミトコンドリアカルパイン媒介アポトーシスを阻害することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項２０】
前記非ミトコンドリアカルパイン媒介アポトーシスの阻害が、約０．５〜２５μの濃度範囲のＭＤＬ２８１７０を用いて細胞を処理することを含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記利用可能な酸素の減少が、培養システム中の酸素の量を約４％に減らすことを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞が誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項２３】
以下の内の２つ以上を含む、ヒト血液細胞の新規生成のための培地、
抗酸化剤；
ミトコンドリアｐ５３媒介アポトーシスの阻害因子；
非ミトコンドリアカルパイン媒介アポトーシスの阻害因子；
小胞体ストレスの阻害因子；
自然免疫応答阻害因子；
ｐ３８媒介老化の阻害因子；及び
ｃＡＭＰシグナル伝達経路活性化因子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の一部は、Woods et al., “Reactive Oxygen Species Impair the Function of CD90+ Hematopoietic Progenitors Generated from Human Pluripotent Stem Cells,” Stem Cells 35(1): 197-206. (24 Oct 2016, online date 18 Sep 2016)において開示されている。
【０００２】
本出願は、血液細胞の生成の際に、細胞ストレス及び／又は活性酸素（reactive oxygen species :ROS）の存在を低減するための方法、システム、因子及び培地に関する。
【背景技術】
【０００３】
関連技術の説明
細胞を単離する、再プログラミングする、多能性（pluripotent and multipotent）細胞、組織及び器官を生成するための方法は、個人医療及び再生医療を含む種々の治療用途のために必要とされている。初期胚発生の間に単離された胚性幹細胞、成人間葉／間質細胞などの体性幹細胞及び造血幹細胞を含む、多種多様なヒト幹細胞および他のタイプの細胞が知られ、特徴づけられている。体細胞は、それぞれの系統のより原始的状態、異なる系統（異なる胚葉誘導体ですら）、又は特定の所望の機能を有する細胞に再プログラムすることができるし、又は複数のタイプの異なる細胞へ分化させることができる。
【０００４】
例えば、新生児からのヒト臍帯血は、この材料中に血液幹細胞が高い割合で存在することに起因して、何十年も血液疾患および悪性疾患を有する患者への移植のための造血幹細胞の供給源として使用されている。そのため、現在では、世界中の公的および民間資本蓄積バンクにおいて保存された数十万の臍帯血サンプルが存在しており、要求に応じて使用される準備状態にある。臍帯血細胞は、多能性幹細胞に再プログラムすることもできるし、多数のタイプの細胞に分化させることもできる。別の例において、細胞は羊水から単離することができる。この水性媒体は、例えば、機械的なバリアを提供すること、成長因子を提供すること、永久的な空気のスペースとなるものを画成するように肺の中の発達スペースを埋めることで肺の発達を助けること、によって、胎児を取り囲み、保護し、発育を助ける。細胞の回収および単離のための方法および装置に関するさらなる情報は、米国特許公開US2016/00030489（2015年9月14日出願）及び米国特許公開US2016/0068815（2015年9月14日出願）において見出すことができる。両文献はそれらの全体が引用によって本願に組み込まれる。
【０００５】
収集抽出、及び細胞物質、臍帯血、及び細胞を含む生物学的成分を単離するための利用可能な手法および装置が見つかり、その中に、それらの安全性、例えば、汚染の回避（例えば、空気、完全に満足できるものではなかったです捕集された材料、細胞収率、効率、および/または構成要素の破壊を回避する能力の汚染）。最近では、それは造血幹細胞の収集と研究室処理中の空気にも、短期間の曝露がその機能に有害な影響を持っていたことが示されました。
【０００６】
デノボ造血幹細胞および前駆細胞は、多数の方法からインビトロで生成することができる：多能性幹細胞の分化系、造血細胞またはその前駆体に向かって細胞の再プログラミング、および支持細胞および成長因子による造血幹細胞前駆体の誘導を介して。多能性幹細胞（胚性幹細胞、および人工多能性幹細胞）システム、造血幹細胞の模倣胚/胎児発育こと及び/又は因子が誘導または増強特定の発達段階への分化を造血幹細胞に向かって、実際に他のすべての使用を使用して区別することができます造血細胞を生成する手段は、空間的および時間的に多数の特定の発達因子を調節する制御された条件を必要とします。例えば、BMP4（骨形成タンパク質4）を効率よく分化形態の3日以内に、多能性幹細胞から中胚葉系統を指定する多能性幹細胞が要求されます。別の例は、それらが出てくるように、レチノイン酸シグナル伝達は、造血幹細胞の発生に必要とされることです。他の要因が特定されているが、血液を生成する役割を果たして、まだ同定されていない多数の追加要素がまだ可能性があります。発達プログラムがまだ正確にインビトロでミラーリングすることができないようにまた、in vitroでのin vivoでの血液のデノボ生成、及び血液の発生もおそらく異なるであろうが、また、より高い周波数の効率のための細胞の出発物質の有向分化を可能にすることができますin vitroでの血液細胞の生成。別の例は、それらが出てくるように、レチノイン酸シグナル伝達は、造血幹細胞の発生に必要とされることです。他の要因が特定されているが、血液を生成する役割を果たして、まだ同定されていない多数の追加要素がまだ可能性があります。発達プログラムがまだ正確にインビトロでミラーリングすることができないようにまた、in vitroでのin vivoでの血液のデノボ生成、及び血液の発生もおそらく異なるであろうが、また、より高い周波数の効率のための細胞の出発物質の有向分化を可能にすることができますin vitroでの血液細胞の生成。別の例は、それらが出てくるように、レチノイン酸シグナル伝達は、造血幹細胞の発生に必要とされることです。他の要因が特定されているが、血液を生成する役割を果たして、まだ同定されていない多数の追加要素がまだ可能性があります。発達プログラムがまだ正確にインビトロでミラーリングすることができないようにまた、in vitroでのin vivoでの血液のデノボ生成、及び血液の発生もおそらく異なるであろうが、また、より高い周波数の効率のための細胞の出発物質の有向分化を可能にすることができますin vitroでの血液細胞の生成。まだ血を生成する役割を果たしていることが確認されていない多数の追加要素がまだ可能性があります。発達プログラムがまだ正確にインビトロでミラーリングすることができないようにまた、in vitroでのin vivoでの血液のデノボ生成、及び血液の発生もおそらく異なるであろうが、また、より高い周波数の効率のための細胞の出発物質の有向分化を可能にすることができますin vitroでの血液細胞の生成。まだ血を生成する役割を果たしていることが確認されていない多数の追加要素がまだ可能性があります。発達プログラムがまだ正確にインビトロでミラーリングすることができないようにまた、in vitroでのin vivoでの血液のデノボ生成、及び血液の発生もおそら��異なるであろうが、また、より高い周波数の効率のための細胞の出発物質の有向分化を可能にすることができますin vitroでの血液細胞の生成。
【０００７】
デノボ血液の開発中に、活性酸素種のレベルが検討されていない生体内でも、それは、デノボ造血細胞、またはそれらを取り巻く環境（例えばそのニッチ）は、活性酸素種を規制する方法を理解されています。しかし、ROSのレベルが、造血幹細胞および新たに伝統的な供給源から単離された前駆細胞は比較的低いことが実証されている（骨髄、臍帯血、末梢血に動員しました）。興味深いことに、増殖培養の際、これらのヒト造血幹細胞は、ROSレベルの増加を示し、ひどく移植において活性を再増殖妥協します。ある研究では、酸化防止剤NACを使用することなどによって、文化の中でROSの濃度を低減することが細胞の再増殖活性を保存助けることができることを示しました。最も顕著なのは、in vitroでのde novo造血幹細胞および前駆細胞とそれらの前駆体の発達に対するROSの影響は研究されていないことです
【０００８】
上昇したROSレベルの直接的な効果のいくつかは、DNA、タンパク質および脂質に細胞ストレス及び酸化的損傷が増加します。変異の蓄積へと最終的に細胞のアポトーシスへのDNAのリードに酸化損傷。成人造血幹細胞は、細胞増殖および代謝活性によりin vitroで生成することができる上昇ROSレベルに敏感です。ROSレベルはまた、酸素レベル、および壊死組織などの細胞外条件によって影響されるが落ちます。ROSはまた、炎症応答、小胞体ストレス、およびアポトーシス応答に起因することができます。したがって、低下細胞ストレス及びROSの低下した濃度の条件下での細胞の生成のための改良された方法、システム、および媒体が必要とされています。
【発明の概要】
【０００９】
本発明の実施形態は、細胞ストレスおよび/またはROSの存在を低減するための方法、システム、および培地に関する。特に断らない限り細胞およびROSは、本明細書に記載の細胞またはROSの特定のタイプに限定されないことは、当業者によって理解されるであろう。
【００１０】
ある実施形態において、細胞を別のタイプの細胞へ移行させる際の細胞ストレスを調和（mediating）する方法は、以下の内の２つ以上を実行しつつ、前記細胞の前記移行を導く条件下において前記細胞を培養すること、を含む。
細胞の周囲の培地の中の利用可能な酸素を減少させること、
抗酸化剤を用いて細胞を処理すること、
細胞の細胞ストレス応答経路を阻害すること、
細胞の自然免疫応答を阻害すること、及び、
細胞内活性酸素の濃度を低下させる細胞経路を活性化すること。
【００１１】
いくつかの実施形態において、ヒト血液前駆細胞を血液細胞へ移行させる際の細胞ストレスを調和する方法は、以下の内の１つ以上を実行しつつ、前記前駆細胞の血液細胞への前記移行を導く条件下において前記ヒト血液前駆細胞を培養すること、を含む。
ヒト血液前駆細胞の周囲の培地の中の利用可能な酸素を減少させること、
抗酸化剤を用いてヒト血液前駆細胞を処理すること、
ヒト血液前駆細胞の細胞ストレス応答経路を阻害すること、
ヒト血液前駆細胞の自然免疫応答を阻害すること、及び、
細胞内活性酸素の濃度を低下させる細胞経路を活性化すること。
【００１２】
特定の実施形態において、移行が、より決定された（committed）タイプの細胞への分化を含む。移行が、細胞の誘導多能性幹細胞への転向を含む。細胞内活性酸素の濃度を低下させる細胞経路の活性化が、ｃＡＭＰシグナル伝達活性化因子を用いて細胞を処理することを含む。ｃＡＭＰシグナル伝達活性化因子がフォルスコリンまたはＩＢＭＸを含む。細胞の周囲の培地の中の利用可能な酸素の減少が、細胞を低酸素環境に置くことを含む。
【００１３】
特定の実施形態において、抗酸化剤が、アスコルビン酸、クエン酸、ビタミンＥ、セレン、メラトニン、ＮＡＣ、グルタチオン、チオレドキシン、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ及びクエン酸一水和物からなる群から選択される成分を含む。アスコルビン酸の濃度が、約０．０１１〜０．５５ｍｇ／ｍｌであり、クエン酸の濃度が約０．１１５〜１．１５ｍｇ／ｍｌである。細胞ストレス応答経路の阻害が、ミトコンドリアｐ５３媒介アポトーシスの阻害を含む。細胞ストレス応答経路の阻害が、ｐ３８媒介性老化の阻害を含む。
特定の実施形態において、ｐ３８媒介性老化の阻害が、約２０〜５００ｎＭの濃度範囲のＬＹ２２２８８２０を用いて細胞を処理することを含む。細胞ストレス応答経路の阻害が、非ミトコンドリアカルパイン媒介ストレスを阻害することを含む
特定の実施形態において、細胞ストレス応答経路の阻害が、非ミトコンドリアカルパイン媒介ストレスを阻害することを含む。自然免疫応答の阻害が、ミエロペルオキシダーゼ阻害因子を用いてミエロペルオキシダーゼ産生を阻害することを含む。特定の実施形態において、ミエロペルオキシダーゼ阻害因子が、約１００μΜの濃度範囲の４−ＡＢＡＨを含む。
【００１４】
細胞ストレス応答経路の阻害が、フィルトリン−μを用いてミトコンドリアｐ５３媒介アポトーシスを阻害することを含む。いくつかの実施形態において、細胞ストレス応答経路の阻害が、細胞の非ミトコンドリアカルパイン媒介アポトーシスを阻害することを含む。非ミトコンドリアカルパイン媒介アポトーシスの阻害が、約０．５〜２５μの濃度範囲のＭＤＬ２８１７０を用いて細胞を処理することを含む。いくつかの実施形態において、利用可能な酸素の減少が、培養システム中の酸素の量を約４％に減らすことを含む。いくつかの実施形態において、細胞が誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）である。
【００１５】
いくつかの実施形態において、以下の内の２つ以上を含む、ヒト血液細胞の新規生成のための培地が提供される。
抗酸化剤；
ミトコンドリアｐ５３媒介アポトーシスの阻害因子；
非ミトコンドリアカルパイン媒介アポトーシスの阻害因子；
小胞体ストレスの阻害因子；
自然免疫応答阻害因子；
ｐ３８媒介老化の阻害因子；及び
ｃＡＭＰシグナル伝達経路活性化因子。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
本発明の他の特徴および利点は、添付の図面と併せて本発明の以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
【００１７】
【図１】図1は、細胞ストレスおよび/またはROSの低減のための方法の実施形態を示す図です。
【００１８】
【図２Ａ】図2A-Fは上昇しROSレベルはHPSCの低減機能（ヒト多能性幹細胞）由来の造血前駆細胞をもたらすことを示す方法の実施形態を利用する実験の結果を示しています。
【図２Ｂ】図2A-Fは上昇しROSレベルはHPSCの低減機能（ヒト多能性幹細胞）由来の造血前駆細胞をもたらすことを示す方法の実施形態を利用する実験の結果を示しています。
【図２Ｃ】図2A-Fは上昇しROSレベルはHPSCの低減機能（ヒト多能性幹細胞）由来の造血前駆細胞をもたらすことを示す方法の実施形態を利用する実験の結果を示しています。
【図２Ｄ】図2A-Fは上昇しROSレベルはHPSCの低減機能（ヒト多能性幹細胞）由来の造血前駆細胞をもたらすことを示す方法の実施形態を利用する実験の結果を示しています。
【図２Ｅ】図2A-Fは上昇しROSレベルはHPSCの低減機能（ヒト多能性幹細胞）由来の造血前駆細胞をもたらすことを示す方法の実施形態を利用する実験の結果を示しています。
【図２Ｆ】図2A-Fは上昇しROSレベルはHPSCの低減機能（ヒト多能性幹細胞）由来の造血前駆細胞をもたらすことを示す方法の実施形態を利用する実験の結果を示しています。
【００１９】
【図３Ａ】図3A-FはROSloと濾紙HPSC由来の造血前駆細胞のコロニー形成能力を示す方法の実施形態の実験結果を示しています。
【図３Ｂ】図3A-FはROSloと濾紙HPSC由来の造血前駆細胞のコロニー形成能力を示す方法の実施形態の実験結果を示しています。
【図３Ｃ】図3A-FはROSloと濾紙HPSC由来の造血前駆細胞のコロニー形成能力を示す方法の実施形態の実験結果を示しています。
【図３Ｄ】図3A-FはROSloと濾紙HPSC由来の造血前駆細胞のコロニー形成能力を示す方法の実施形態の実験結果を示しています。
【図３Ｅ】図3A-FはROSloと濾紙HPSC由来の造血前駆細胞のコロニー形成能力を示す方法の実施形態の実験結果を示しています。
【図３Ｆ】図3A-FはROSloと濾紙HPSC由来の造血前駆細胞のコロニー形成能力を示す方法の実施形態の実験結果を示しています。
【００２０】
【図４Ａ】図4A-Gは、実験方法の実施形態の図面及びROS低減方策の組み合わせがROSlo CD90 +造血前駆細胞の増大した生成をもたらすことを実証するために使用される方法の実施形態を利用する実験に伴う結果を示します。
【図４Ｂ】図4A-Gは、実験方法の実施形態の図面及びROS低減方策の組み合わせがROSlo CD90 +造血前駆細胞の増大した生成をもたらすことを実証するために使用される方法の実施形態を利用する実験に伴う結果を示します。
【図４Ｃ】図4A-Gは、実験方法の実施形態の図面及びROS低減方策の組み合わせがROSlo CD90 +造血前駆細胞の増大した生成をもたらすことを実証するために使用される方法の実施形態を利用する実験に伴う結果を示します。
【図４Ｄ】図4A-Gは、実験方法の実施形態の図面及びROS低減方策の組み合わせがROSlo CD90 +造血前駆細胞の増大した生成をもたらすことを実証するために使用される方法の実施形態を利用する実験に伴う結果を示します。
【図４Ｅ】図4A-Gは、実験方法の実施形態の図面及びROS低減方策の組み合わせがROSlo CD90 +造血前駆細胞の増大した生成をもたらすことを実証するために使用される方法の実施形態を利用する実験に伴う結果を示します。
【図４Ｆ】図4A-Gは、実験方法の実施形態の図面及びROS低減方策の組み合わせがROSlo CD90 +造血前駆細胞の増大した生成をもたらすことを実証するために使用される方法の実施形態を利用する実験に伴う結果を示します。
【図４Ｇ】図4A-Gは、実験方法の実施形態の図面及びROS低減方策の組み合わせがROSlo CD90 +造血前駆細胞の増大した生成をもたらすことを実証するために使用される方法の実施形態を利用する実験に伴う結果を示します。
【００２１】
【図５Ａ】図5A-Cは、ROSの減少が高成長能力を有するHPSC由来のCD90 +造血前駆細胞の生成を増加させることを示す方法の実施形態の実験結果を示しています。
【図５Ｂ】図5A-Cは、ROSの減少が高成長能力を有するHPSC由来のCD90 +造血前駆細胞の生成を増加させることを示す方法の実施形態の実験結果を示しています。
【図５Ｃ】図5A-Cは、ROSの減少が高成長能力を有するHPSC由来のCD90 +造血前駆細胞の生成を増加させることを示す方法の実施形態の実験結果を示しています。
【００２２】
【図６Ａ】図6A-Dは、ROSの減少は、内皮細胞に影響を与えることなく、CD90 +造血前駆細胞の機能を維持することを示す方法の実施形態の実験結果を示しています。
【図６Ｂ】図6A-Dは、ROSの減少は、内皮細胞に影響を与えることなく、CD90 +造血前駆細胞の機能を維持することを示す方法の実施形態の実験結果を示しています。
【図６Ｃ】図6A-Dは、ROSの減少は、内皮細胞に影響を与えることなく、CD90 +造血前駆細胞の機能を維持することを示す方法の実施形態の実験結果を示しています。
【図６Ｄ】図6A-Dは、ROSの減少は、内皮細胞に影響を与えることなく、CD90 +造血前駆細胞の機能を維持することを示す方法の実施形態の実験結果を示しています。
【００２３】
【図７】図7A-Dは、cAMP活性化は、多能性幹細胞の分化培養物中のOSの細胞内レベルを減少させることを実証するための方法の実施形態の実験結果を示しています。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
特に定義しない限り、技術、表記および他の科学用語または専門用語の全ての用語は、本明細書に一般的に、本発明が関係する当業者によって理解される意味を有することが意図される使用します。いくつかの場合において、一般に理解される意味を有する用語は、明確にするために及び/又は準備参照のため本明細書中で定義され、そして本明細書にそのような定義の包含は、必ずしも当技術分野において一般に理解されているものの上に実質的な相違を表すと解釈されるべきではありません。技術および本明細書に記載または参照される手順の多くは、よく理解され、一般に、当業者によって従来の方法論を用いて使用されています。
【００２５】
本開示を通して、本発明の様々な態様が範囲形式で提示されています。範囲形式での記載は便宜と簡潔さのために過ぎず、本発明の範囲に柔軟性のない限定として解釈すべきではないことを理解すべきです。従って、範囲の記載は、具体的には、すべての可能な部分範囲ならびにその範囲内の個々の数値を開示していると考えるべきです。例えば、そのような1から6までのような範囲の説明は3から、2から6まで、2から4まで、1から5まで、1から4まで、例えば1〜3として具体的に開示された部分範囲を有するように考慮されるべきですその範囲内の6など、ならびに個々の数値、例えば、1、2、3、4、5、及び別の実施例6、週間で範囲の記述は、週のエンドポイント間の日数の開示を含んでいます。これは、範囲の幅に関係なく適用されます。
【００２６】
本明細書で使用される、「安全な」という用語は、母体及び/又は胎児害の有意な危険を提起しない任意の方法または装置を指すことを理解することができます。
【００２７】
としては、本明細書で使用される「単離された」とは、細胞または細胞を記載するために使用される場合、例えば、細胞が由来する被験者、から分離することによってなど、その天然の環境から分離された細胞または細胞を指します、患者、および/またはそのようなデブリ、組織、組織凝集体、および他の細胞などの自然環境の1つのまたは複数の他の成分から分離することによって。
【００２８】
としては、「胎児」は、本明細書で使用さ胚段階後出生前、ヒトなどの哺乳動物現像、由来する細胞または他の材料の特性を記述するために使用されます。本明細書で使用する場合、「乳児」は誕生から未熟児や新生児を含む年齢の1年間に、新生児や若い哺乳動物由来の細胞または他の材料の特性を記述するために使用されます。
【００２９】
本明細書で使用される、「多能性」は、例えば内胚葉、中胚葉、および外胚葉のために、3種の胚葉のいずれかの細胞型に分化する細胞の能力を指します。「多分化」とは、細胞内に2つの以上の系統に分化する細胞の能力が、系統の限定された数を意味します。
【００３０】
前駆体は、細胞または発生所望のセルの上流にある再プログラムされた細胞を記載するために使用される用語です。例えば、血液の造血前駆体は、造血内皮を含むことができます。
【００３１】
インビトロで分化プロセス、または再プログラムイベントに由来する細胞として理解されるべき造血幹細胞を含む造血細胞に由来する、または特定の因子又は特定の性質を有する細胞を用いた誘導システムからの変換、非造血幹細胞または前駆造血幹細胞または前駆細胞への細胞。典型的には、これは、それによってインビボで、造血細胞の前駆体は、造血転写プログラムの内皮転写プログラムとアップレギュレーションのダウンレギュレーションによってれる内皮細胞の移行に内皮細胞であると判定されたインビトロでの造血遷移に内皮が挙げられます血液。造血幹細胞または前駆細胞を生成する方法は、考えられる特定の前駆体を得るために、細胞を再プログラミングする、造血幹細胞の製造方法は、全ての態様または造血前駆細胞の分化のための既知の方法の数を含む場合、上記の方法を組み合わせることによって改善することができますまたは造血幹細胞そのもの、および前駆体からの造血幹細胞の誘導。方法の全てのこのような組み合わせおよび血液を生成する任意の将来の方法は、ROSの減少により、造血幹細胞の発生および機能の改善された効率を有することになるデノボ血液の任意のインビトロ因子基づいて生成対向オーバーライド問題として、本開示の範囲内でありますそして生成プロセスの間に細胞ストレス。ドナーからの伝統的収穫造血幹細胞は、膨張能力を有する細胞に再プログラムそれらは、例えばすることによって拡張されることを可能にする成長因子または再プログラミング因子に曝露されている場合、新規または確立因子および/または造血幹細胞の前駆体に、血液を生成するために使用され得ますその後、新規の造血幹細胞の拡大番号の生成を可能にする細胞。再びROSやストレス管理は、これらのメソッドを使用して機能的造血幹細胞の生成効率を向上させる必要があります。および/またはその後、新たに造血幹細胞の拡大番号の生成を可能とする造血幹細胞の前駆体へ。再びROSやストレス管理は、これらのメソッドを使用して機能的造血幹細胞の生成効率を向上させる必要があります。および/またはその後、新たに造血幹細胞の拡大番号の生成を可能とする造血幹細胞の前駆体へ。再びROSやストレス管理は、これらのメソッドを使用して機能的造血幹細胞の生成効率を向上させる必要があります。
【００３２】
句「幹細胞（単数または複数）」は本明細書を通じて使用されてもよいです。これは、「幹細胞（単数または複数）」は、成体幹細胞または胚性幹細胞およびヒトまたは動物の幹細胞を指すことができることは当業者によって理解されるであろう。例えば、このような幹細胞は皮膚線維芽細胞および他の細胞および組織を含む任意の成体細胞タイプから生成された人工多能性幹（IPS）細胞を含むことができます。Masipら、2010モルハムReprod 16（1）：856から868。高橋と山中、2006、セル126（4）：663-676。Yuら、2007、サイエンス318（5858）：1917年から1920年。幹細胞の様々な現在治療に使用又はそれぞれ神経及び血液疾患に使用するための、例えば間葉系幹/間質細胞、および造血幹細胞などの体細胞、、、を含む臨床試験での使用のために評価されます。
【００３３】
句は、明細書全体にわたって使用することができる「体細胞を再プログラミング」。体細胞の特定のタイプに限定されるものではなく、「体細胞を再プログラミング」、むしろ体細胞の任意の型を指すことができることは、当業者によって理解されるであろう。高橋と山中は、最初の「再プログラム」または「脱分化」に再プログラミング技術を説明への体細胞の多能性/胎児の状態のような、または他の細胞系統型に直接「再プログラム」体細胞です。高橋と山中、2006、セル126（4）：663-676。例えば、体細胞は、上皮、結合、神経、筋肉組織からreprogramed細胞を指すことができる再プログラム及び/又はそのような臍帯血のような、血液から。例えば、臍帯血は、内皮前駆細胞を再プログラミングするのに適している誘導されます。非体細胞（例えば生殖細胞）も再プログラムすることができます。そして、この発明に関連する由来の細胞へに関してそれらの使用は、体細胞再プログラムされた細胞と同等とみなされるべきです。
【００３４】
ここで提供される特定の実施形態の以下の説明では、本明細書の一部を形成する添付の図面に対してなされ、その中では本発明を実施することができる例示の特定の実施形態によって示されています。他の実施形態を使用することができ、構造的な変更が本発明の範囲から逸脱することなくなされ得ることが理解されるべきです。
【００３５】
例えば、成人造血幹細胞（HSC）、ヒトおよび動物の両方が、ROS媒介性酸化的損傷損なう自己再生および長期ROSの増加したレベルに非常に敏感であることが実証されている、幹細胞はこれらの細胞の（LT）生着能力。ROSは、DNA、タンパク質、及び脂質10、及び細胞周期停止をもたらす、早期老化を含む細胞の成分に酸化的損傷を引き起こし、非常に反応性であり、不対原子価殻電子に起因する、ことを分子酸素含有の総称であり、又はアポトーシス。表現型と老化のフリーラジカル理論によって主張として、老化やがんに関連した疾患への生体分子の寄与への酸化的損傷の蓄積。正常な細胞では、酸化的リン酸化を介して細胞代謝の副産物としてミトコンドリアからのROSの発信元の大半。ROSの細胞内レベルは、利用可能な栄養（例えば、ビタミンC、ビタミンE、およびセレンなど）の抗酸化剤、（グルタチオン、チオレドキシン、およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）共因子およびペプチドを還元、及び酸化防止剤を含む因子の複雑なシステムを介して調節されます酵素（スーパーオキシドジスムターゼは、カタラーゼ、およびグルタチオンペルオキシダーゼ）。
【００３６】
追加のメカニズムもニッチにおける隣接セルによる活性ROSの解毒、細胞の微小血管系増殖活性、先天性免疫によってニッチにおけるROSの放出セルの距離を含む細胞ROSに影響を及ぼすことが示されています細胞。制御された生理学的レベルでは、細胞は、増殖、分化、及び静止に関与するシグナル伝達経路において中心的なメディエーターとしてROSを用いて、シグナル伝達に必要なタンパク質の酸化的代謝回転のためにROSに依存します。したがって、増加したROSは、細胞の機能不全に寄与することができながら、適切なROSレベルは、生理学的細胞機能のために必要とされる携帯「レドックスウィンドウ」が存在し得ます病的な状態。酸素の濃度に応じて、OSは、自然酸化に起因することができます。さらに、このような顆粒球のような先天性免疫のエフェクター細胞は、酵素的に細胞外空間にROSを放出することができます。ストレスの原因であることに加えて、ROSは、アポトーシスまたは老化を意図細胞で産生されることが報告されている、活性なROS生成がp53活性化の下流として同定と、小胞体ストレス、およびp38媒介ストレス応答によって、指示ROSは、ストレスシグナル伝達の様々な古典的経路間の中心と共有機能です。インビトロで培養したときには、濾紙（ROS高い）表現型へROSlo（ROSロー）から速やかに通過臍帯血から（非培養）一次造血前駆細胞ことが実証されていますHSCのLTの生着能力に障害を引き起こします。したがって、生理学的ROSlo表現型は、成人HSCの機能のための主要な必要です。HPSC由来の造血細胞が持続的に成人および新生児のカウンターパート（骨髄および臍帯血前駆細胞）と比較して、増殖能の欠損を実証していることを考えると、HPSC由来の造血幹細胞（HSC）は、機能的に上昇しROSレベルの直接の結果として損なわれていると細胞増殖への影響に関連します。
【００３７】
としては、細胞内ROSの有意に上昇したレベルを示す血液細胞における多能性幹細胞の結果からデノボ血液のインビトロ生成において、上述しました。細胞内ROSレベルの上昇は、細胞ストレス、適切な細胞の生成と成長のための望ましくない状態を示しています。高められたROSは、より機能的な幹細胞のより低い周波数を生成、細胞のDNA損傷を増加させる能力をコロニー形成を減らす、および/または幹細胞の増殖能力を減少させることが示されています。また、例えば、造血幹細胞は、in vitroで培養する場合、そのLTの生着能力を失うことがよく知られており、それはへのROS、非培養し、機能HSCの特徴、レベルの低い細胞がなり、急速に輸送することが報告されていますサブカルチャー時に老師表現型。
【００３８】
このような幹細胞として加え、さらに細胞型、および体細胞を再プログラミング、負ROSレベルの上昇によって影響され得ます。そのような幹細胞および/または再プログラミング体細胞などの細胞を含む細胞ストレスの低減及び/又は細胞培養培地中のROS量のための方法、システム、およびメディアは、したがって、以下および本明細書を通して開示されています。
【００３９】
メソッド。システム、およびメディア図の要因1
図1は、細胞培養培地中でROSおよび/または細胞ストレスのレベルを減少させるための方法の実施形態を示し、幹細胞および/または再プログラミング体細胞を含む細胞培養培地。当業者によって理解されるように、幹細胞及び/又は培養にしながら体細胞が経時分化再プログラム。したがって、方法（複数可）の異なる要素は、本明細書に、このセクションに記載し、本明細書の他の箇所では、細胞培養中の異なる時点で適用されてもよいです。例えば、約時：0時間、2時間、12時間、24時間、2日、4日、8日、10日、12日、14日、18日以上より18日間。
【００４０】
図1に戻るが、未処理の状態2で、高ROSの存在は、幹細胞などの、細胞の機能を低減または体細胞を再プログラミングすることができます。しかしながら、特定の実施形態において、細胞および異なる因子および/または条件6とROSを含有する細胞培地の処理4は、細胞の高機能8につながる可能性があります。いくつかの実施形態において、本方法は、約4％まで、例えば、先天性免疫（炎症性）応答、細胞ストレス応答経路の阻害、及び酸素濃度の減少を、還元剤、酸化防止剤を用いて細胞培地を治療含んでもよいです。いくつかの実施形態では、酸素の濃度は、約0.5から10パーセント、1~6％、または2~4％であってもよいです。特定の実施形態では、酸素の濃度は、低酸素インキュベーターの使用によって、または他の適切な手段によって制御することができます。実施形態では、この方法は、さらに、そのような酸化ストレスなどのストレスに対する追加の保護を提供アップレギュレート遺伝子のような付加的細胞または媒体処置を含むことができます。特定の実施形態において、方法はさらに、（例えば、cAMPシグナル伝達活性化を介して）細胞内の活性酸素種を含むの濃度を減少させる細胞経路を活性化すること含むことができます。上または本明細書の他の箇所で説明した要素を組み合わせることの相乗効果が存在し得ることが当業者によって理解されるであろう。特定の実施形態では、有益であり得る等の方法の要素の2つの方法の要素の三、方法素子4とを組み合わせます。ROSとストレスの高レベルは、細胞へのダメージがより多くのストレス応答につながる、よりROSにつながる原因となる事象の悪循環につながる可能性があります。したがって、複数のメソッド要素の使用は、より大きな効果を有するように組み合わせることができます。
【００４１】
特定の実施形態では、幹細胞の治療または方法は、本明細書に、このセクションで説明または本明細書の他の箇所でより多くの機能細胞を生成する効率の増加を誘導することができるとともに、そのような造血細胞などの体細胞を、再プログラム。例えば、造血細胞の場合には、増殖能を有するCD90 +表現型を有する、より原始的な造血細胞を生成することができます。特定の実施形態では、より多くの機能細胞は、約倍、少なくとも5、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20または21倍の高効率で生成します。
【００４２】
特定の実施形態では、抗酸化剤は、アスコルビン酸（ビタミンC）、ビタミンE、クエン酸、セレン、N-アセチルシステイン（NAC）、メラトニン、補因子およびペプチドガルシノール、グルタチオン、グルタチオン、チオレドキシン、ニコチンアミドを還元を含んでいてもよいですアデニンジヌクレオチドリン酸、抗酸化酵素スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、DPI、アポシニン、NAC、MnTMPyP、GP9のLDS-TATペプチド、およびMitoTEMPOなど。いくつかの実施形態では、抗酸化剤治療は、上記の酸化防止剤のカクテルを含んでもよいです。0.75 mg / mlと、0.1±5ミリグラムml、または0.35mg / mLから約 - 0.05：酸化防止剤は、例えば、約0.01 -1 mg / mlと、約、種々の濃度で使用することができます。実施形態では、アスコルビン酸の量は、約0.378 mg / mlとすることができます。特定の実施形態では、クエン酸の量は、約範囲であってもよい：0.01から2 mg / mlと、。05から1 0.2 mg / mlと、0.1から0.8 mg / mlと、.125約 - 0.6 mg / mlと、0.15から0.2ミリグラム/ mlまたは0.158mg / ml〜約。特定の実施形態において、ガルシノールの濃度は、0.1から10μΜ（マイクロモル）、0.2から5μΜ、0.5から2μΜ約、または約1μΜからのものであってもよいです。500μΜ、50 - - 150μΜ、又は約100μΜをNACは、約10の濃度で提供されてもよいです。グルタチオンはμΜ、2-10μΜ、又は5μΜ約1~20程度の濃度で提供されてもよいです。メラトニンはμΜ、10-30μΜ、又はμΜ約20 -40〜約1の濃度で提供されてもよいです。2-10μΜ、または5μΜについて。メラトニンはμΜ、10-30μΜ、又はμΜ約20 -40〜約1の濃度で提供されてもよいです。2-10μΜ、または5μΜについて。メラトニンはμΜ、10-30μΜ、又はμΜ約20 -40〜約1の濃度で提供されてもよいです。
【００４３】
特定の実施形態では、細胞ストレス応答は、ミトコンドリアのp53媒介性アポトーシスに関連する経路、非ミトコンドリアカルパイン媒介アポトーシス、P38媒介老化、鉄誘起される酸化ストレス、および/または小胞体ストレスの阻害を介して抑制することができます。阻害経路は、上述と本明細書の他の箇所では、個別に抑制することができる、すべて一度に、または任意の可能な組み合わせで例えば、ミトコンドリアのp53媒介アポトーシスおよびp38媒介性の老化ではなく、他の経路の両方を阻害することにより、上記。
【００４４】
いくつかの実施形態において、ミトコンドリアのp53媒介性アポトーシスをpfilthrin-μによって阻害され得ます。20μΜ、5 - - 15μΜ、又はμΜ約10 Pfilthrinは-μは、1のような濃度で使用することができます。実施形態では、非ミトコンドリアカルパイン媒介アポトーシスはMDL28170によって阻害され得ます。MDL28170 1- 25μΜ、2-15μΜ、3-10μΜ約、または約5μΜの濃度で培養物に提供されてもよいです。いくつかの実施形態では、PD 150606、SJA6017、ABT-705253、及びSNJ-1945年、およびAK275は、代わりに、またはそれらの同じ濃度でMDL28170と組み合わせて使用することができます。ミトコンドリア媒介アポトーシスは10~300約μΜ、20~200μΜ、30-100μΜ、又はμΜ約60の濃度で培養物にタウロウルソデオキシコール酸（TUDCA）の添加によって阻害され得ます。
【００４５】
特定の実施形態では、細胞ストレス応答は約10 1000nmの、100〜800 nmであり、200〜600 nMの濃度でLY2228820阻害剤のp38 MAPKの使用を介して、例えば、P38媒介老化を阻害することによって阻害され得る、または500 nm程度。いくつかの実施形態において、Acumapimodバクチオール、バクチオールBMS-582949塩酸塩、ケレリトリン塩化Dehydrocorydaline塩化物、ドラマピモド、GNE-495、Losmapimod、Pamapimod、PH-797804、R1487（塩酸塩）、SB 202190、SB 203580、SB203580（RWJ 64809）、 SB 203580塩酸塩、SB 239063、及び/又はSB 242235の代わりに、またはLY2228820と組み合わせて使用することができます。
【００４６】
特定の実施形態では、鉄誘発性酸化ストレスは、デフェロキサミン、鉄キレート剤によって阻害され得ます。デフェロキサミンの濃度は、0.1から10、約μΜ、0.2から5μΜ、0.5から2μΜ、又は約1μΜであってもよいです。
【００４７】
いくつかの態様において、炎症反応はミエロペルオキシダーゼ産生および/または放出を遮断することによって減少させることができます。ミエロペルオキシダーゼは、4-アミノ安息香酸（4-ABAH）の添加によってブロックされてもよいです。200μΜ、 - 50 - 4 - ABAHは、約10の濃度で細胞培養物に提供されてもよい150μΜ、または100μΜに関する。実施形態では、4-ABAHは、本明細書に開示され、このセクションとして、または本明細書の他の箇所で8日目以降または他の任意の時点で培養物に添加してもよいです。
【００４８】
特定の実施形態において、ＳＲＴ１７２０は、酸化ストレスを保護する遺伝子を上方制御する方法で使用され得る。 ＳＲＴ１７２０は、約：０．１〜１０μΜ、０．２〜５μΜ、０．５〜２μΜ、または約１μΜの濃度で利用することができる。 いくつかの実施形態では、レスベラトロール（3,5,4'-トリヒドロキシ-トランス-スチルベン）、メトホルミン、オキサロ酢酸、SRT1720、SRT2104、SRT2379、オキサゾロ[4,5-b]ピリジン誘導体、イミダゾ[1,2-b]チアゾール 誘導体、または1,4-ジヒドロピリジン（DHP）誘導体は、同じまたは類似の濃度でSRT1720の代わりに、またはSRT1720と組み合わせて使用できます。
【００４９】
実施形態において、ラパマイシンは、細胞成長代謝を調節し、したがって酸化ストレスを調節する方法で使用され得る。 ラパマイシンは、約.000001-10μ1、.001-5μΜ、.01-1μΜ、または約.1μΜの濃度で細胞培養に加えられます。 ラパマイシンは、分化中のさまざまな時間、たとえば連続した2〜3日間8日で細胞培養物に加えられてもよい。
【００５０】
実施形態では、ラパマイシンは、したがって、酸化ストレスを調節、細胞増殖、代謝を調節する方法において使用することができます。10μΜ、0.001 - - 5μΜ、0.01から1μΜ、又は約0.1μΜラパマイシンは約0.000001の濃度で細胞培養物に添加してもよいです。ラパマイシンは、2~3日間連続して8日目に、例えば、分化中の様々な時点で細胞培養物に添加してもよいです。
【００５１】
特定の実施形態では、フォルスコリンおよびＩＢＭＸなどのｃＡＭＰシグナル伝達経路のアクチベーターを培養物に加えてもよい。 cAMPの活性化は、多能性幹細胞分化培養におけるROSの細胞内レベルを低下させることが示されています（以下の図7を参照）。 特定の実施形態では、フォルスコリンの濃度は、約1〜50、5〜40、10〜30、15〜25、または約10μΜまたは20μΜであり得る。 いくつかの実施形態では、ＩＢＭＸの濃度は、約１０〜１０００、５０〜９００、１００〜８００、２００〜７００、３００〜６００、または約４００〜５００μＭまたは５００μＭであってもよい。
【００５２】
いくつかの実施形態では、追加の構成要素が上記の方法で利用されてもよい。 例えば、亜セレン酸ナトリウムは、約10〜200nM、50〜150nM、または約100nMの濃度で培養物に添加されてもよい。 さらなる例として、ブテインは、約1〜20μΜ、5〜15μΜ、または約10μΜの濃度で培養物に添加されてもよい。
【実施例】
【００５３】
以下の実施例は、明示的または暗黙的に記述し、本発明の様々な態様を説明ではなく限界まで、いかなる方法においても本発明、形状、または形態の範囲が意図されています。
Experimental Procedure for Examples 1-4
【００５４】
実施例１〜４の実験手順
hPSCsは、日常的分化の開始までマウス胚性線維芽細胞（MEF）（メルクミリポア社、ダルムシュタット、ドイツ）上でコロニーとして維持しました。さらに、hPSCsは中胚葉のコミットメントのためにプライム彼らに、分化の開始前に48時間の期間中、3μΜCHIR99021（R＆Dシステムズ、マッキンリープレイス、MN、USA）で培養しました。使用される細胞株は、HIヒトES細胞株であったHUES 2、及び（材料移転契約の下で、それぞれ、WiCell、マディソン、WI、ハーバード大学から入手）HUES 3、及びiPS細胞ラインRB9-CB 1（臍帯由来しますOCT4、SOX2、LIN28、LF4、C-MYC）を発現TET誘導性レンチウイルスベクターで形質導入された血液内皮細胞。すべての多能性細胞株は、核型が正常であった以前の生体内奇形腫アッセイおよびポリメラーゼ連鎖反応（PCR）にすることによって多能性であることが実証されています。マイコプラズマテストは、すべての行は、汚染の自由だったことを保証するために、定期的に実施されました。血液への多能性幹細胞の分化のために使用される細胞のメディアはMesoTotal（Primorigen Biosciences社、マディソン、WI、USA）でした。hPSCsの分化コロニーの0日目に37℃でDMEM中の0.5mg / mlのディスパーゼ（Invitrogen）でインキュベートすることによってのMEFから分離した°Cで30分間。
【００５５】
独立したコロニーを、採取し、洗浄し、コロニーを形成した後、コーニングコースター超低接着プレート/皿（Sigma-Aldrich社、セントルイス、MO、USA）胚様体（EB）中に配置される前MesoTotalに再懸濁しました。一晩。1日目および分化の2にEBを収集し、洗浄し、そして完全な培地交換を受けました。日に使用MesoTotalの4,6の50％を新鮮な培地と交換しました。8日目にEBを回収し、マトリゲル（STEMCELL Technologies社、バンクーバー、BC、カナダ）でコーティングしたウェルに分配される前に、100％新鮮MesoTotalに再懸濁し、その後、EBを付着した細胞の層が普及し始めました。12、10日に、そしてMesoTotalの14 100％が置き換えられました。15日目に、メディアの唯一の90％は自由浮遊造血前駆細胞の限界損失に置き換えられました。16日目に培養物を分析のために回収しました。分化した細胞を21 G針を通過したのTrypLE（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いて単数化、PBSで洗浄し、そして30μιη滅菌カップFilicons（BD Biosciences）を用いて濾過される前にすべてのメディアを収集しました。次いで、細胞を再懸濁し、カウントする前に8分間350Gで遠心分離しました。CD34-富化臍帯血細胞の継代培養のために使用される増殖培地は、100ng / mlの以下のサイトカインの各々を補充し、臍帯血膨張媒体SFEM（STEMCELL Technologies）を標準化しました。hTPO、hSCF、およびhFLT3（PeproTech社、ロッキーヒル、NJ、USAからのすべて）。示された場合は、次の要因は、培地に添加した：L-アスコルビン酸（シグマ、セントルイス、MO、USA）mg / mlと0.378で、及びクエン酸一水和物（Acros Organics社/サーモフィッシャー、ニュージャージー、USA）0.158でMG / mlです。また、100μΜにおけるミエロペルオキシダーゼブロッカー4-アミノ安息香酸（シグマ）、及び500nmでLY2228820（Selleckchem、ヒューストン、TX、USA）阻害剤のp38 MAPは、培地に添加する前にDMSO（Sigma）中に溶解しました。DMSOをビヒクル対照として使用しました。
【００５６】
全ての細胞を、37℃で培養した°C、5％CO 2で。酸素レベルは、大気中濃度（21％）のいずれかであった、または低酸素インキュベーター（BINDER GmbH社、トットリンゲン、ドイツ）を用いて4％に保ちました。すべてのメディアは、細胞培養物に添加する前に8時間、インキュベートを事前にさせました。
【００５７】
分化した細胞は、21 G針を通過したのTrypLE（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いて単数化の前にPBS中で洗浄し、そして30μιη滅菌カップFilicons（BD Biosciences）を用いて濾過しました。細胞は、死細胞を排除するために7AADで処理しました。細胞は、以下の抗ヒト抗体を用いて染色しました。フルオレセインイソチオシアネート（FITC）結合CD45（eBioscience社、1 1-0459-42）及びCD43（BD Biosciences社、555475）、フィコエリトリン - シアニン（PE-Cy7の）はCD34（Biolegend、343516）、フィコエリトリン抱合（PE）共役CD90（Biolegend、3281 10）。CellROXディープレッド試薬（サーモフィッシャーサイエンティフィック、CI 0422）は、酸化ストレスを検出するために使用し、製造業者の指示に従って適用しました。細胞を暗所で37℃で20分間、CellROXディープレッド試薬、およびさらなる抗体とともにインキュベートしました。細胞は、FACS LSR II（BD Biosciences）で取得またはFACSアリアIII（BD Biosciences）を用いて選別しました。分析は、FlowJoソフト、バージョンX.0.7（FLOWJO LLC、アッシュランド、OR、USA）を用いて行きました。特に明記しない限り、すべてのFACSゲートは、蛍光マイナス1（FMO）コントロールに基づいています。
【００５８】
造血前駆細胞は、ウェルあたり500個の細胞の割合でファルコン組織培養6ウェルプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック）上の個々のウェルにメソカルトH4435（STEMCELL Technologies社）1.5mlでソートし、プレーティングしました。追加のサイトカインまたは化合物をメチルセルロースに添加しませんでした。培養物を、5％CO 2で37℃で標準加湿インキュベーター°Cで14日間インキュベートしました。コロニーを計数し、そして明視野顕微鏡を用いて、サイズによってスコア化しました。
【００５９】
造血前駆細胞を氷冷PBSに分類し、40℃の1％低いにキャストは、顕微鏡スライド（サーモフィッシャーサイエンティフィック）にアガロース（LONZA、ロックランド、ME、USA）ポイントメルト。細胞を暗所で4℃で一晩pHでNaOH溶液> 13で溶解しました。次いで、スライドをEASYCAST B Lゲルランナー（サーモフィッシャーサイエンティフィック）に浸漬に続いて、pHが12.3で、NaOHで2回洗浄し、同じ溶液を充填し、20V、50ミリアンペア（0.6 V / cmで）で25分間実行させ。次いで、スライドを、蒸留H 2 Oで洗浄し、15分間空気乾燥させられる前に70％エタノール中で5分間浸漬しました。10000倍SYBRグリーンI（Invitrogen社、ユージーン、OR、USA）およびすすぎH20、続いて30分間、空気乾燥の15分間暗所でインキュベートした：スライドを1とTE -buffer溶液に浸漬しました。次いで、スライドを直ちにDP72カメラ（OLYMPUS）を備えた1X70顕微鏡（OLYMPUS、新宿区、東京、日本）を用いて評価し、画像がソフトウェアcellSens標準1.6（OLYMPUS）を用いて捕捉しました。明るさとコントラストの調整は非偏っ前の画像解析にPhotoshopのCS6（アドビシステムズ社、サンノゼ、CA、USA）を使用して、すべての画像のために実施しました。自動コメット解析とOTMスコアは、以前公開されたImageJのプラグインImageJのためOpenComet 29（バージョン1.48）を用いて行きました。このプロトコルは、以前に公開されたアルカリ性コメットアッセイプロトコルの修正版です。明るさとコントラストの調整は非偏っ前の画像解析にPhotoshopのCS6（アドビシステムズ社、サンノゼ、CA、USA）を使用して、すべての画像のために実施しました。自動コメット解析とOTMスコアは、以前公開されたImageJのプラグインImageJのためOpenComet 29（バージョン1.48）を用いて行きました。このプロトコルは、以前に公開されたアルカリ性コメットアッセイプロトコルの修正版です。明るさとコントラストの調整は非偏っ前の画像解析にPhotoshopのCS6（アドビシステムズ社、サンノゼ、CA、USA）を使用して、すべての画像のために実施しました。自動コメット解析とOTMスコアは、以前公開されたImageJのプラグインImageJのためOpenComet 29（バージョン1.48）を用いて行きました。このプロトコルは、以前に公開されたアルカリ性コメットアッセイプロトコルの修正版です。
【００６０】
HSC細胞様細胞は、以下のメディアに分けました。IMDM（+ヘペス、グルタミン）（GEヘルスケアバイオサイエンス、リトルチャルフォント、英国）、20％熱不活性化FBS（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、IX L-グルタミン（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を10μg/ mlのペニシリン - ストレプトマイシンソリューション（GEヘルスケアバイオサイエンス）、以下のサイトカインを補いました。hSCF、hFLT3、hIL3、hTPO、ヒトGM-CSF（PeproTech社から全て）を10ng / mlの最終濃度で。細胞を、ウェル当たり4個の細胞と20のμl培地でヌンクMiniTrays（サーモフィッシャーサイエンティフィック）上のウェルに分配しました。次いで、プレートをメディア蒸発を防ぐために、PBSを含有する滅菌プラスチック箱の上昇に置きました。各ウェルを手動公平エリアカバレッジ推定続いて明視野顕微鏡を用いて撮影することにより1〜8時間、5日目、9日目、および13日後のソートで細胞増殖についてスコア化しました。
【００６１】
統計分析は、特に明記しない限り、た対応のないスチューデントt検定を用いて行い、結果はp値<0.05で統計的に有意であると考えられました。すべてのグラフは、平均値±SEMを示します。生物学的反復の数は、nの値によって示されます。グラフや統計的評価は、グラフパッドプリズム（GraphPad Software、サンディエゴ、CA、USA）を用いて行きました。
【００６２】
（実施例1）
hPSC-の機能低下と上昇反応性酸素種レベルの相関が造血前駆細胞を派生しました
図2Aに示しサイトメトリーは、非培養臍帯血、3日間継代培養臍帯血、及びHPSC由来の血液のための造血前駆体フラクション（CD43 / 45 + CD34 +）のROSレベルを表示ヒストグラム流れます。ゲーティング戦略を図3Aに詳述されています。下部パネルの棒グラフは、造血前駆細胞（N = 3）のROSloと濾紙ステータスを示します。図2BはROSloと濾紙HPSC由来の造血前駆細胞の代表的なアルカリ性コメットを示しています。図2CショーROSloと濾紙造血オリーブテールモーメント（OTM）で示される前駆体、非培養した臍帯血のための、及びHPSC由来の造血前駆細胞（N = 3）におけるDNA損傷のレベル。図2Dは500 ROSloまたは濾紙HPSC由来の造血前駆細胞から得られたCFUの数を示すグラフです。右のパネルは、示されているようのCFUのサイズ分布を示します。図2EショーHPSC由来のCD43 / 45 + CD34 + CD90 +造血前駆細胞集団のROSloと濾紙の画分についての代表的なFACSソートゲート。棒グラフはROSlo又は濾紙細胞（N = 3）の分布を示します。図2Fは、HPSC由来のCD43 / 45 + CD34 + CD90 +細胞の増殖能力を示すグラフです。代表的なサンプル群（ROSloと濾紙HPSC由来のCD43 / 45 + CD34 + CD90 +細胞）の上部パネルショー成長速度は、播種後18時間、5日目、9日目、および13日目にウェルの集密度で示さ。サブ培養の13日後、最初ROSlo又は濾紙細胞を播種下部パネルショー代表培養ウェル、（スケールバー=200μιη）。データ棒グラフはROSlo又は濾紙細胞（N = 3）の分布を示します。図2Fは、HPSC由来のCD43 / 45 + CD34 + CD90 +細胞の増殖能力を示すグラフです。代表的なサンプル群（ROSloと濾紙HPSC由来のCD43 / 45 + CD34 + CD90 +細胞）の上部パネルショー成長速度は、播種後18時間、5日目、9日目、および13日目にウェルの集密度で示さ。サブ培養の13日後、最初ROSlo又は濾紙細胞を播種下部パネルショー代表培養ウェル、（スケールバー=200μιη）。データ棒グラフはROSlo又は濾紙細胞（N = 3）の分布を示します。図2Fは、HPSC由来のCD43 / 45 + CD34 + CD90 +細胞の増殖能力を示すグラフです。代表的なサンプル群（ROSloと濾紙HPSC由来のCD43 / 45 + CD34 + CD90 +細胞）の上部パネルショー成長速度は、播種後18時間、5日目、9日目、および13日目にウェルの集密度で示さ。サブ培養の13日後、最初ROSlo又は濾紙細胞を播種下部パネルショー代表培養ウェル、（スケールバー=200μιη）。データ9日、および播種後13日。サブ培養の13日後、最初ROSlo又は濾紙細胞を播種下部パネルショー代表培養ウェル、（スケールバー=200μιη）。データ9日、および播種後13日。サブ培養の13日後、最初ROSlo又は濾紙細胞を播種下部パネルショー代表培養ウェル、（スケールバー=200μιη）。データ
平均±SEMを表しています。アスタリスクは有意差（* P <0.05、** P <0.01、*** P <0.001、**** p <0.0001、NS、有意ではない）を示しています。
【００６３】
オスロと老師HPSC由来造血前駆細胞のコロニー形成能
図3Aが示す総造血画分（CD43 / 45 +）のための非培養臍帯血、継代培養臍帯血（3日）、及びHPSC由来の血液細胞中の造血細胞を示す代表的なフローサイトメトリーのドットプロットを、造血前駆細胞画分（CD43 / 45 + CD34 +）。ゲイツ氏は、FMOのコントロール、およびダブレットの除外に基づいています。造血前駆細胞分画のためのROSレベルが表示されます。図3Bに示しサイトメトリー2.図3CショーROSloと濾紙造血前駆細胞のための代表的なソートゲートのiPS細胞株RB9-CB 1由来の非培養臍帯血からの造血前駆細胞のROSレベルを、表示、およびESライン色相に由来するヒストグラム流れ臍帯血サンプルに基づきます。図3Dは、ソートROSloと濾紙HPSC由来の造血前駆細胞（N = 3）を示す分布することを棒グラフです。コロニータイプ、およびサイズ（スケールバー= 100μηι）に基づいとして図3Eは、代表のCFUの顕微鏡写真を含んでいます。図3Fは、CFU-M、CFU-G、CFU-GM及びBFU-E（N = 2-3）のためのコロニー型分布を示す円グラフを示します。データは、平均±SEMとして表されます。
【００６４】
としては、本明細書において、このセクションに記載し、本明細書の他の箇所で、ROSは、マウスおよびヒトのHSCおよび前駆細胞の両方の機能を損なうことが示され、これらの初代細胞ので、場合インビトロ培養条件の標準、急速にシフトで培養された上昇しました濾紙状態にROSloから多能性幹細胞の分化システムにおけるROSのレベルは、造血細胞のインビトロ生成におけるROSの影響と機能を決定するために評価しました。多能性状態から分化の16日後、造血細胞画分として以下の、確立されたマーカーを用いて、それらの細胞表面表現型によって同定した：CD43 / 45 +（早期＆汎造血マーカーの併用）として識別総造血細胞画分31、CD43 / 45 + CD34 +造血前駆細胞画分、最も原始的な造血画分、以前として説明HSC様5、CD43 / 45 + CD34 + CD90 +です。我々は以前の大半ことが実証されているので、以前にCD34 +画分34,35内のHSC用負豊かにするような表面マーカーCD38は、含まれていませんでした
我々の分化プロトコルを用いて生成さCD43 / 45 + CD34 + CD90 +細胞は、細胞内ROSの存在に蛍光性になって、CD38 5.細胞透過性染料CellROXディープレッドについて陰性である、全ての細胞集団においてROSを測定するために使用しました。我々のHPSC対血液のプロトコルを使用して我々の分析と併せて、新たに単離したCD34-富化臍帯血細胞は、我々はROSlo（図2A、左上のパネル、図のように定義されたROSの生理学的レベルを示すための基準点として使用しました図3A、上パネル）。造血前駆指定培地中で3日間培養した同じ細胞は、急速に、我々は濾紙（図2A、上部中央のパネル、及び図3A、中央パネル）として定義ROSlo表現型を表示するいくつかの細胞を、ROSレベルを増加させました。我々のHPSC由来造血前駆細胞（CD34 +）におけるROSの分析は、濾紙表現型（図2A、右上のパネル、及び図3A、下部パネル）の大半を示しました。ROSの同様のレベルが異なるHPSC線（図3B）から生成された造血前駆細胞で観察されました。
【００６５】
iPS細胞由来の造血前駆細胞の機能に対するROSの影響を評価するために、細胞をROSloおよびROShi画分に分離した（図3C-D）。 ROSはDNA損傷を引き起こすことが知られているため、ROSloおよびROShi造血前駆細胞におけるDNA損傷の程度を直接評価しました。この目的のために、一本鎖および二本鎖切断の両方を測定できるアルカリコメットアッセイが使用されました。分類された造血前駆細胞の分析により、ROShi画分はROSlo画分と比較してDNA損傷が有意に高いことが示されました（図2B-C）。さらに、ROSloまたはROShiに分類されたhPSC由来の造血前駆細胞は、コロニー形成ユニット（CFU）アッセイでの成長および分化能力について評価されました。 CFUは、数、サイズ、およびタイプの観点から分析されました（図ID、図S 1E-F）。 ROSlo造血前駆細胞（CD34 +）は、ROShiのカウンターパートと比較してより多くのCFUを生成し（図I D、左パネル）、ROSlo細胞は非常に多くの中型および大型コロニーを多数生成し、優れた増殖能を示しました（図2D、右パネル）。 ROSレベルの違いは、異なるコロニータイプの頻度を変更しませんでしたが、ROS 37に敏感であることが知られている赤血球コロニーは、ROSlo前駆細胞由来CFUでのみ観察されました（図3F）。
【００６６】
成人造血幹細胞は、下流の造血階層３８、３９と比較して、ＲＯＳにより敏感であることが実証されている。異種移植アッセイで再増殖可能なhPSC分化培養からHSCを生成するのが困難であることを考えると、細胞機能特性を評価する代替アッセイを開発しました。 ROSの影響を評価するために、hPSC由来のCD43 / 45 + CD34 + CD90 +細胞をROSloまたはROShiのいずれかの表現型に分類し（図2E、左パネル）、13以上のいくつかの時点での成長を測定するために寺崎プレートに分配しました-日期間（図2F、上のパネル）。 ROShi細胞は非常に限られた細胞増殖を示し、老化を示す平坦な形態を示したが、ROSlo細胞は増殖し、造血細胞の大きなクラスターを生じさせ（図2F、下パネル）、<3％のROSlo細胞（図2E、右パネル）合計CD90 +前駆細胞画分の標準状態で生成されたこれらの細胞のすべての増殖能が含まれていました。これらの結果は、ROSloレベルがこれらのより原始的な造血細胞の拡大/増殖に必要であることを強く示しています（HSC機能の重要な特徴）。総合すると、iPS由来の造血分化システムにおける高いROSレベルは、それに関連するDNA損傷の増加とともに、より原始的な造血細胞の成長能力を著しく損ないます。
【００６７】
（実施例２）
【００６８】
ROS削減戦略は、特にROSlo造血前駆細胞およびHSC様細胞を増加させます
【００６９】
図4Aは、特定の実施形態において、ROSの減少のために使用することができる4つの要素の概略図を示します。図4Bは、で生成HPSC由来の造血前駆細胞の（GMFI）でROSを示す棒グラフである：酸化防止剤（アスコルビン酸+クエン酸）のカクテルによるROS捕捉、ミエロペルオキシダーゼ（MPO）4- ABAHによってブロッキング、のp38 MAP阻害LY2228820、21％から4％の酸素張力の減少、又は結合されたすべての要因（AFC）と、制御条件（DMSO）（N = 3）によります。統計はペアパラメトリックt検定に基づいています。非培養臍帯血（0に設定）と対照条件（100に設定）で生成された造血前駆細胞のROSレベルから造血前駆細胞の生理学的なROSレベルと比較してROSの減少の右y軸表示範囲。
上記の条件（n = 3）を用いて生成された培養物由来。図4DショーHPSC由来の総造血細胞（CD43 / 45 +）、造血前駆細胞（CD43 / 45 + CD34 +）、および対照条件で生成されたCD90 +造血前駆細胞（CD43 / 45 + CD34 + CD90 +）についての代表的なフローサイトメトリーのドットプロットをまたはAFCと。ゲイツ氏は、FMOのコントロールに基づいています。ダブレットの除外と死細胞の排除（7AAD）は、ゲートを適用する前に行われました。HSC-のような分数のためのROSレベルが表示されます。図4EはROSlo総造血細胞の頻度の倍数変化、ROSlo造血前駆細胞、およびROSlo CD90 +造血前駆細胞を示す棒グラフです。値が（1に設定）コントロール（N = 3）に正規化されます。図4FはROSlo CD43 / 45 + CD34 + CD90 +初期hPSCsの等量から生成されたセル（N = 3）の出力を示す棒グラフです。図4Gは、全体の周波数（ROSlo +濾紙）造血細胞、造血前駆細胞画分、及びCD90 +造血前駆細胞画分における倍数変化を示す棒グラフです。値が（1に設定）コントロール（N = 3）に正規化されます。データは、平均±SEMを表します。アスタリスクは有意差（* P <0.05、** P <0.01、*** P <0.001、NS、有意ではない）を示しています。
【００７０】
ｈＰＳＣ由来造血前駆細胞においてＲＯＳの生理学的レベルを促進する手段を特定するために、我々は４つの戦略を採用し、それぞれが別個のメカニズムによりＲＯＳを低減することを目的とした（図４Ａ）：１）抗酸化物質のカクテルによるＲＯＳ捕捉（アスコルビン酸およびクエン酸）、2）生来の免疫細胞媒介ROS放出を防ぐための4-アミノ安息香酸（4-ABAH）22によるミエロペルオキシダーゼ（MPO）の抑制、3）p38aマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）による抑制低分子LY2228820 26は、ストレス応答を介したROSの生成を制限し、4）培養中に酸素濃度を4％に減らすことでROSを減らします。個々に適用すると、各ROS削減戦略はROSを11から47％減少させ（図4B）、能動生理学的自然免疫、能動的ストレスシグナル伝達、および超生理学的酸素レベルによるROS形成の加速が集合的に観察されるROSに寄与することを示しています私たちの細胞。自然発生的および酵素的に生成されたROSの両方から幅広い保護を提供するために、All Factors Combined（AFC）が使用され、ROSレベルの最も強力な低下を促進し（図4B）、hPSC由来の制御条件および接近に比べて60％の低下に相当した非培養臍帯血のROSレベル。重要なことに、これらのROS低減戦略を使用して、細胞生存率は悪影響を受けませんでした（図4C）。ただし、全造血細胞（CD43 / 45 +）、造血前駆細胞（CD43 / 45 + CD34 +）、および前述のHSC様表面マーカー（CD43 / 45 + CD34 + CD90 +）を持つ細胞の頻度の分析（図4D）AFCはROSlo総血球の頻度を2倍、ROSlo前駆細胞の頻度を5倍増加させたことを示しました（図2E）。興味深いことに、AFC条件により、ROSlo CD43 / 45 + CD34 + CD90 +細胞の頻度が15倍増加しました（図4E）。さらに、同量の多能性出発物質から、AFC条件は標準条件と比較してROSlo CD43 / 45 + CD34 + CD90 +細胞の総生産量が18倍増加しました（図4F）。標準条件と比較して、総細胞数（ROSlo + ROShi）CD43 / 45 + CD34 + CD90 +細胞の頻度は、控えめな（1.5倍）でも統計的に有意な増加がありました（図4G）これらの結果は、いくつかの実施形態において、インビトロで培養された造血細胞におけるROSの増加は、複数のメカニズムによって寄与され、ROS減少方法の組み合わせにより、ROSの有意な減少が可能になり、ROSlo造血前駆細胞、およびより優先的に、より原始的なCD90 + HSCの増加を特に促進する-hPSCからの分数。
【００７１】
実施例3
ROS削減は力強い成長能力を持つROSlo CD90 +造血細胞を増加します
図5Aは、AFCの後に生成されたCD43 / 45 + CD34 + CD90 +細胞のROSloと濾紙画分をソートするための代表的なFACSゲートを示しています。棒グラフはROSloと濾紙細胞（N = 3）の分布を示します。左側のパネルは、1から8時間後にウェルの集密度（％）によって測定されるように、AFCで生成された代表サンプル群（ROSlo及び濾紙CD43 / 45 + CD34 + CD90 +細胞）の増殖速度を示すと図5Bが示す細胞の増殖速度を、 、5日、9日、および13日後に播種。右パネル棒グラフが示す13日目、図5Cに> 10％のウェル合流有するウェルの頻度はROSlo CD43 / 45 + CD34 + CD90 +制御に対して正規化としてAFCを使用して高い増殖能力を有する細胞の生成における倍数変化を示します条件（DMSO）。データは、平均±SEMを表します。アスタリスクは有意差（有意ではない* P <0.05、NSを）示しています。
【００７２】
機能を評価するために、増殖能力の点で、AFC状態で発生する細胞の、CD43 / 45 + CD34 + CD90 +細胞がROSloと濾紙画分に分離し、テラサキウェルに播種しました。ソートゲートを同時に分析臍帯血サンプルのROSプロファイルに基づいていました。これらHPSC由来細胞の約50％がROSlo表現型（図5A）を表示します。AFCで生成ROSlo CD43 / 45 + CD34 + CD90 +細胞を、濾紙画分の限られた性能（図5B、左パネル）と比較して、高い増殖能力を示しました。増殖可能なROSlo細胞の割合もまた、このようにROSが要因を低減ROSを減少させただけでなく、CD90 +前駆細胞画分（図3B、右パネル）の機能的増殖能を増大するだけでなくことを確認し、濾紙に比べて増加しました。また、堅牢な成長能力を有する生成ROSlo CD43 / 45 + CD34 + CD90 +細胞の総増加が標準状態（図5C）と比較して、AFCと高い22倍高かったです。これらの知見は、その高いROSレベルが最も原始的HPSC由来の造血前駆細胞における増殖の面で機能を制限し、そして私たちの戦略は大幅にROSを減らす成長能力を持つように造血前駆細胞の出力を増加させることを実証しています。
【００７３】
本研究では、我々はまた、当社の標準状態でまたはAFC条件を減らすROSのいずれかで生成された細胞の生着能力を評価しました。移植されたNSGマウスにおける移植の厳しい評価を用いて、我々は、ROSの60％の減少が、この研究で報告されたと私たちHPSC由来の造血細胞を付与するには不十分であったことを示し、ネガティブコントロールの上に識別可能ではなかったヒト造血細胞の非常に低いレベルを見て生着能力（データは示さず）。それにもかかわらず、減少のレベルは、HSC機能（細胞膨張）の特徴は、AFC条件下HPSC由来の細胞のために改善されたことを実証し、従って、機能的に関連する造血幹細胞のインビトロ生成がlkely ROSレベルの調節を必要とする実現しました。
【００７４】
実施例4
戦略を削減している内皮細胞の低ROS、及びROSは、具体的にROSを削減します
より原始的な造血細胞画分
図6AショーHPSC由来のCD90 +造血前駆細胞（CD43 / 45 + CD34 + CD90 +）および内皮細胞（CD43 / 45 CD34hiCD90hi）を示す代表的なフローサイトメトリードットプロット。ゲイツ氏は、FMOのコントロール、二重の排除、及び死細胞の排除に基づいています。図6Bは、DMSO対照（灰色）とAFC（緑）のための内皮人口のROSレベルを表示する代表的なヒストグラムプロットを示します。図6Cは、コントロール条件（DMSO）とAFC（N = 3）で生成+内皮細胞およびCD90造血前駆細胞画分のROS（GMFI）を示します。図6Dに示す制御条件とAFC（N = 4）で生成された内皮細胞およびCD90 +造血前駆細胞画分の頻度、。データは、平均±SEMを表しています。アスタリスクは有意差（* P <0.05、** P <0.01、NS、有意ではない）を示しています。
【００７５】
多能性幹細胞から分化中の胚発生の間、インビボおよびインビトロの両方での造血細胞の起源は、造血能力を有する内皮細胞から生じることが示されています。血液向かう分化培養物中に存在する他の細胞型においてROSのレベルを評価するために、CD43-CD34hiCD90hi内皮細胞画分におけるROSレベルは、（図6A-B）を評価しました。標準的な培養条件を用いたiPS由来する内皮細胞における細胞内ROSレベルは一様に低く、さらにAFC（図6C）の添加によって減少しませんでした。これは、AFCは、標準条件と比較して、細胞内ROSの有意な減少を容易同じウェル中の造血細胞のCD43 / 45 + CD34 + CD90 +画分とは対照的です。また、AFCが有意内皮細胞（図6D）の周波数を変化させなかったが、傾向は、CD43 / 45 + CD34 + CD90 + HSC様画分の1.5倍の増加と類似の周波数の変化を示唆しました。これらの観察は、彼らのROSレベルを調整するために分化システムにおけるセルタイプの異なる能力に大きな違いがあることを示唆しています。広い内皮細胞画分を効果的に造血前駆細胞は、培養中の低ROSプロファイルを維持することができないが、その細胞内ROSレベルを管理し、その結果、成長性の欠損を表示しています。CD34 +前駆細胞と比較して、CD90 +造血前駆細胞画分は、細胞の頻度および数の最大の増加をもたらす、AFCを用いてROSレベルにおける最大の減少を見て、
【００７６】
図7A-Dは、多能性幹細胞の分化培養物中のcAMP活性化によってROSの細胞内レベルを減少させる方法を用いた結果の実施例を示す図。サイクリックAMPの誘導は、CXCR4 HPSC由来の造血細胞における酸化ストレスおよび誘導を減少させることができます。パートAショーは、分化の14日目に分化HPSCツー造血細胞における活性酸素種（ROS）の検出のためのフローサイトメトリー分析を示します。代表的なフローサイトメトリープロット（バイエクスポネンシャルx軸）は、造血表面表現型におけるROSのレベルを示します。FMO制御、蛍光マイナスワン（コントロール染色）。（A）に示すようCellROX色素の幾何平均蛍光強度（GMFI）のパートBショー定量。データは、3つの独立した実験の平均±SEMを表しています。統計分析は、t検定を用いて行きました。有意性は、制御設定と比較示されています。*、P <0.05、**、pO.01、NS、重要ではありません。パートCは、指示された酸化還元状態調節genesinのPSC由来の造血細胞のQRT-PCR発現分析を示します。ハウスキーピング遺伝子ACTB（βアクチン）に対する各遺伝子の相対的発現を計算し、制御条件にそれぞれの平均倍率変化（1に設定）が示されています。データは、2つの独立した実験の平均±SEMを表しています。統計分析は、t検定を用いて行きました。有意性は、制御設定と比較示されています。*、P <0.05、**はp <0.01、NS、重要ではありません。パートDは、PSC由来の造血細胞で示さ酸化p38MAPK関連遺伝子の定量RT -PCR発現分析を示します。ハウスキーピング遺伝子ACTB（β-アクチン）に対する各遺伝子の相対的発現を計算し、制御条件にそれぞれの平均倍率変化（1に設定）が示されています。データは、2つの独立した実験の平均±SEMを表しています。統計分析は、t検定を用いて行きました。有意性は、制御設定と比較示されています。*、P <0.05、**はp <0.01、NS、重要ではありません。
【００７７】
この開示は特定の実施形態について説明したが、本開示に示され、記載された方法及び装置の多くの態様が異なる組み合わせおよび/またはさらなる実施形態、または許容されるを形成するように改変され得ることは、当業者によって理解されるであろう例。全てのそのような変更および変形は、本開示の範囲内に含まれることが意図されています。確かに、デザインやアプローチの多種多様な可能であり、本開示の範囲内です。本明細書で開示される何の特徴、構造、またはステップが必須または必須ではありません。例示的な実施形態が本明細書に記載されているがまた、任意の範囲及び全ての実施形態は、置換（例えば、多様な実施形態の態様の）等価の要素、改変、省略、組み合わせが有します適応及び/又は変更がように、本開示に基づいて当業者には理解されるであろう。特定の実施形態を説明したが、これらの実施形態は、例として提示したものであり、保護の範囲を限定するものではありません。
【００７８】
特徴、材料、特性、またはグループが特定の態様、実施形態、または実施例と併せて説明したが、他の態様に適用可能であることが理解されるべきである、実施形態または実施例は、このセクションで説明または本明細書の他の箇所に矛盾しない限り。開示されたような特徴のすべてが（任意の添付の特許請求の範囲、要約書および図面を含む）本明細書に開示されている、および/または任意の方法またはプロセスのステップの全て、そのような特徴の少なくともいくつかの組み合わせを除き、任意の組み合わせで組み合わせることができますおよび/またはステップは、相互に排他的です。保護は、任意の前述の実施形態の詳細に限定されません。保護は任意の新規なものに延び、または特徴の任意の新規な組み合わせは、（任意の添付の特許請求の範囲、要約書および図面を含む）本明細書に開示されています、
【００７９】
また、別の実施態様の文脈で、本開示に記載されている特定の特徴はまた、単一の実装に組み合わせて実施することができます。逆に、単一実施態様の文脈で説明されている様々な特徴はまた、別々に複数の実装または任意の適切なサブコンビネーションで実施することができます。特徴が特定の組合せで働くように上述されてもよい。また、請求された組み合わせからの1つのまたは複数の特徴は、いくつかの場合には、組み合わせから削除することができ、組み合わせはサブコンビネーション又はサブコンビネーションの変形例として記載してもよいです。
【００８０】
また、操作が特定の順序で図面に示され、または明細書に記載されてもよいが、このような動作が図示の特定の順序または順番で実行される必要はない、またはすべての操作を行うことが、望ましい結果を達成するために。図示または記載されていないその他の動作は、例示的な方法およびプロセスに組み込むことができます。例えば、1つのまたは複数の追加の操作が前に行うことができ、後に、同時に、または説明された動作のいずれかの間。さらに、操作は他の実装に再配置又は再順序付けされてもよいです。当業者は、いくつかの実施形態では、プロセスに取り込ま実際の手順が示され、および/または図面に示されたものと異なる場合があり開示されていることを理解するであろう。実施形態に応じて、ステップのいくつかは、上述の他のものを添加してもよいし、除去してもよいです。さらに、実施形態は上記に開示された特定の特徴および属性は、本開示の範囲内に入る全てが付加的な実施形態を形成するために異なる方法で組み合わせることができます。また、上述した実装における様々なシステムコンポーネントの分離は、すべての実装で、そのような分離を必要とすると理解されるべきではない、説明した構成要素及びシステムは、一般に、単一の製品に一緒に統合されるか、または複数の製品にパッケージすることができることを理解すべきです。これらの全ては、本開示の範囲内に入ります。また、上述した実装における様々なシステムコンポーネントの分離は、すべての実装で、そのような分離を必要とすると理解されるべきではない、説明した構成要素及びシステムは、一般に、単一の製品に一緒に統合されるか、または複数の製品にパッケージすることができることを理解すべきです。これらの全ては、本開示の範囲内に入ります。また、上述した実装における様々なシステムコンポーネントの分離は、すべての実装で、そのような分離を必要とすると理解されるべきではない、説明した構成要素及びシステムは、一般に、単一の製品に一緒に統合されるか、または複数の製品にパッケージすることができることを理解すべきです。
【００８１】
本開示の目的のために、特定の態様、利点、および新規な特徴については、本明細書に記載されています。必ずしも全てのこのような利点は、任意の特定の実施形態に従って達成され得ます。従って、例えば、当業者は、本開示の実施または必ずしもここに教示または示唆され得るような他の利点を達成することなく、本明細書に教示されるような一つの利点または利点のグループを達成する方法で行うことができることを認識するであろう。
【００８２】
このような具体的に別段の記載、または他の方法で使用されるような文脈の中で理解されない限り、「CAN」、「可能性」、「かもしれない」又は「可能性がある」、などの条件付き言語は、一般的に、特定の実施形態が含まれるが、搬送することが意図されています他の実施形態は、特定の特徴、要素、および/またはステップを含んでいません。したがって、そのような条件付き言語は、一般的に、特徴、要素、および/またはステップは、1つのまたは複数の実施形態のために必要な任意の方法であること、または1つのまたは複数の実施形態は、必ずしもユーザ入力またはプロンプトの有無にかかわらず、決定するためのロジックを含むことを意味することを意図していませんこれらの特徴、要素、および/またはステップが含まれるかされているかどうか、任意の特定の実施形態で実行されます。
【００８３】
そのような「X、Y、及びZの少なくとも一つに」という語句として論理積言語を具体的に別段の記載がない限り、などの項目、この用語は、いずれであってもよいことを伝えるために一般的に使用されるような文脈で理解されていますX、Y、またはZはしたがって、そのような連言言語は、一般的に特定の実施形態では、Xの少なくとも一つ、Yの少なくとも一つ、及びZの少なくとも1つ存在することを必要とすることを意味することを意図していません。
【００８４】
程度の言語が「一般」「約」「ほぼ」は、用語として、本明細書で使用されると、「実質的に」は、本明細書で使用される値、量、又は記載された値、量、または特性に近い特性を表しますすなわち、依然として所望の機能を実行する、または所望の結果を達成します。例えば、用語「約」、「一般に」、「約」及び「実質的に」内の、1％未満以内、5％未満の内、10％未満の範囲内である量を指すことができます以下の0.1％以上、述べられた量の0.01％未満以内。別の例として、特定の実施形態において、用語「ほぼ平行」と、「実質的に平行」の値を参照し、量
【００８５】
本開示の範囲は、このセクションで又は本明細書の他の箇所で好ましい実施形態の特定の開示によって限定されるものではなく、このセクションに提示として、または本明細書の他の箇所で、または提示される特許請求の範囲によって定義されてもよいです将来は。特許請求の範囲の言語は、言語の特許請求の範囲で使用され、例としては、非排他的と解釈すべきであり、本明細書において、又は出願の手続中に記載の実施例に限定されるものではないに基づいて広く解釈されるべきです。
【図１】
2020512830.tif 000003
【図２Ａ】
2020512830.tif 000004
【図２Ｂ】
2020512830.tif 000005
【図２Ｃ】
2020512830.tif 000006
【図２Ｄ】
2020512830.tif 000007
【図２Ｅ】
2020512830.tif 000008
【図２Ｆ】
2020512830.tif 000009
【図３Ａ】
2020512830.tif 000010
【図３Ｂ】
2020512830.tif 000011
【図３Ｃ】
2020512830.tif 000012
【図３Ｄ】
2020512830.tif 000013
【図３Ｅ】
2020512830.tif 000014
【図３Ｆ】
2020512830.tif 000015
【図４Ａ】
2020512830.tif 000016
【図４Ｂ】
2020512830.tif 000017
【図４Ｃ】
2020512830.tif 000018
【図４Ｄ】
2020512830.tif 000019
【図４Ｅ】
2020512830.tif 000020
【図４Ｆ】
2020512830.tif 000021
【図４Ｇ】
2020512830.tif 000022
【図５Ａ】
2020512830.tif 000023
【図５Ｂ】
2020512830.tif 000024
【図５Ｃ】
2020512830.tif 000025
【図６Ａ】
2020512830.tif 000026
【図６Ｂ】
2020512830.tif 000027
【図６Ｃ】
2020512830.tif 000028
【図６Ｄ】
2020512830.tif 000029
【図７】
2020512830.tif 000030
【誤訳訂正書】
【提出日】令和1年12月25日(2019.12.25)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［発明者又は共同発明者による先の開示の陳述］
本発明の一部は、Woods et al., “Reactive Oxygen Species Impair the Function of CD90+ Hematopoietic Progenitors Generated from Human Pluripotent Stem Cells,” Stem Cells 35(1): 197-206. (24 Oct 2016, online date 18 Sep 2016)において開示されている。
【０００２】
本出願は、血液細胞の生成の際の、細胞ストレス及び／又は活性酸素（reactive oxygen species :ROS）の存在を低減するための方法、システム、因子及び培地に関する。
【背景技術】
【０００３】
関連技術の説明
細胞を単離する、再プログラミングする、多能性（pluripotent and multipotent）細胞、組織及び器官を生成するための方法は、個人医療及び再生医療を含む種々の治療用途のために必要とされている。初期胚発生の間に単離された胚性幹細胞、成人間葉／間質細胞などの体性幹細胞及び造血幹細胞を含む、多種多様なヒト幹細胞および他のタイプの細胞が知られ、特徴づけられている。体細胞は、それぞれの系統のより原始的状態、異なる系統（異なる胚葉誘導体ですら）、又は特定の所望の機能を有する細胞に再プログラムすることができるし、又は複数のタイプの異なる細胞へ分化させることができる。
【０００４】
例えば、新生児からのヒト臍帯血は、この材料中に血液幹細胞が高い割合で存在することに起因して、何十年も血液疾患および悪性疾患を有する患者への移植のための造血幹細胞の供給源として使用されている。そのため、現在では、世界中の公的および民間資本蓄積バンクにおいて保存された数十万の臍帯血サンプルが存在しており、要求に応じて使用される準備状態にある。臍帯血細胞は、多能性幹細胞に再プログラムすることもできるし、多数のタイプの細胞に分化させることもできる。別の例において、細胞は羊水から単離することができる。この水性媒体は、例えば、メカニカルなバリアを提供すること、成長因子を提供すること、永久的な空気のスペースとなるものを画成するように肺の中の発達スペースを満たすことで肺の発達を助けること、によって、胎児を取り囲み、保護し、胎児の発育を助ける。細胞の回収および単離のための方法および装置に関するさらなる情報は、米国特許公開US2016/030489（2015年9月14日出願）及び米国特許公開US2016/068815（2015年9月14日出願）において見出すことができる。両文献はそれらの全体が引用によって本願に組み込まれる。
【０００５】
細胞材料、臍帯血及びその中で見出される細胞を含む生物学的な成分を収集、抽出及び単離するために利用可能なアプローチ及び装置は、例えば、それらの安全性、収集した材料の汚染の回避（例えば、空気汚染）、細胞産出量、効率、及び／又は成分の破壊を回避する能力において、全体的に満足のいくものではない。最近では、造血幹細胞の収集及び研究室での処理の間の短期間の空気に対する暴露でさえも、それらの機能に対する有害な影響を有することが示された。
【０００６】
新規（de novo）の造血幹細胞及び前駆細胞は、以下のいくつかの方法からインビトロで生成することができる：多能性幹細胞分化システム、造血細胞又は前駆細胞へ向かう細胞の再プログラミング、そして支持細胞及び成長因子による造血幹細胞前駆細胞の誘導。多能性幹細胞（胚性幹細胞及び誘導多能性幹細胞）は、造血幹細胞の胚性／胎性の発育を模倣するシステムを使用して、及び／又は造血幹細胞へ向かう間の特別な発育ステージへ向かう分化をガイド又は増強する因子を使用して分化させることができ、そして実際に造血細胞を生成する全ての他の手段は、空間的及び時間的な多数の特徴的な発達因子が制御されたコントロール状態（ないし条件）を必要とする。例えば、ＢＭＰ４（bone morphogenetic protein 4：骨形成タンパク質４）は、多能性幹細胞からの分化３日間の内に、多能性幹細胞から中胚葉性の系統を効率的に決定（specify）する必要がある。他の例として、レチノイン酸シグナリングは、造血幹細胞の発生段階において、その出現時に必要とされる。他の因子も同定されてはいるが、まだ同定されていないが血液の生成において役割を果たす多数の更なる因子もいまだに存在すると思われる。インビボにおける血液の新規生成に加えて、インビトロにおける血液の生成も発生上のプログラムと異なると思われ、インビトロで未だ正確に反映できていないが、インビトロにおける血液細胞生産のより高い頻度及び効率のために、出発細胞材料の方向づけられた分化も可能であり得よう。
【０００７】
新規の血液の発生の際のインビボにおける活性酸素のレベルは研究されておらず、新規の造血細胞又はそれらの周囲の環境（例えば、それらのニッチ）がどのように活性酸素を制御するかについても理解されていない。しかしながら、造血幹細胞及び前駆体の中では、それらの元々の供給源（骨髄、臍帯血、及び動員末梢血）から鮮度よく単離された時にはＲＯＳのレベルが相対的に低いことが実証されている。興味深いことに、カルチャー増殖の際に、これらのヒト造血幹細胞は増加したレベルのＲＯＳを示し、そして移植において重篤に害された再増殖能を示す。１つの研究において、抗酸化剤ＮＡＣを使用するなどによって培養液中のＲＯＳの濃度を低下させることは、細胞の再増殖能を保存することに役立ち得るであろうことが示された。最も着目すべきことに、インビトロでの新規の造血幹細胞及び前駆体、そしてそれらの前駆細胞の発生の際のＲＯＳの影響について研究されていない。
【０００８】
上昇したＲＯＳレベルの直接的な影響のいくつかは、ＤＮＡ、タンパク質及び脂質に対する増加した細胞ストレス及び酸化的ダメージである。ＤＮＡに対する酸化的ダメージは、突然変異の蓄積を導き、そして最終的に細胞のアポトーシスを導く。成体造血幹細胞は、細胞増殖及び代謝活動によってインビトロで生成され得る上昇したＲＯＳレベルに対して感受性である。ＲＯＳレベルは酸素レベルなどの細胞外の条件による影響も受け、壊死性組織が脱落する。ＲＯＳは、炎症性応答、小胞体ストレス及びアポトーシス応答の結果としても生じ得る。このように、より低い細胞ストレス及びより低い濃度のＲＯＳの条件下で細胞を生成するための改善された方法、システム、及び培地に関するニーズが存在する。
［先行技術文献］
［特許文献］
［特許文献１］ 
［特許文献２］
【発明の概要】
【０００９】
本発明の実施形態は、細胞ストレス及び／又はＲＯＳの存在を減少させる方法、システム及び培地に関連する。本願に記載の細胞及びＲＯＳは、他に特定されない限り特別なタイプの細胞又はＲＯＳに限定されないことは当業者に理解されるだろう。
【００１０】
ある実施形態において、細胞を別のタイプの細胞へ移行させる際の細胞ストレスを調和（mediating）する方法は、以下の内の２つ以上を実行しつつ、前記細胞の前記移行を導く条件下において前記細胞を培養すること、を含む：
細胞の周囲の培地の中の利用可能な酸素を減少させること、
抗酸化剤を用いて細胞を処理すること、
細胞の細胞ストレス応答経路を阻害すること、
細胞の自然免疫応答を阻害すること、及び、
細胞内活性酸素の濃度を低下させる細胞経路を活性化すること。
【００１１】
いくつかの実施形態において、ヒト血液前駆細胞を血液細胞へ移行させる際の細胞ストレスを調和する方法は、以下の内の１つ以上を実行しつつ、前記前駆細胞の血液細胞への前記移行を導く条件下において前記ヒト血液前駆細胞を培養すること、を含む：
ヒト血液前駆細胞の周囲の培地の中の利用可能な酸素を減少させること、
抗酸化剤を用いてヒト血液前駆細胞を処理すること、
ヒト血液前駆細胞の細胞ストレス応答経路を阻害すること、
ヒト血液前駆細胞の自然免疫応答を阻害すること、及び、
細胞内活性酸素の濃度を低下させる細胞経路を活性化すること。
【００１２】
特定の実施形態において、移行が、（分化が）より決定された（committed）タイプの細胞への分化を含む。移行は、細胞の誘導多能性幹細胞への転向を含み得る。細胞内活性酸素の濃度を低下させる細胞経路の活性化は、ｃＡＭＰシグナル伝達活性化因子を用いて細胞を処理することを含み得る。ｃＡＭＰシグナル伝達活性化因子は、フォルスコリンまたはＩＢＭＸを含み得る。ある実施形態において細胞の周囲の培地の中の利用可能な酸素の減少は、細胞を低酸素環境に置くことを含む。
【００１３】
特定の実施形態において、抗酸化剤は、アスコルビン酸、クエン酸、ビタミンＥ、セレン、メラトニン、ＮＡＣ、グルタチオン、チオレドキシン、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ及びクエン酸一水和物からなる群から選択される成分を含む。アスコルビン酸の濃度は約０．０１１〜０．５５ｍｇ／ｍｌであり得るし、クエン酸の濃度は約０．１１５〜１．１５ｍｇ／ｍｌであり得る。細胞ストレス応答経路の阻害が、ミトコンドリアｐ５３媒介アポトーシスの阻害を含み得る。細胞ストレス応答経路の阻害が、ｐ３８媒介性老化の阻害を含み得る。ある実施形態において、ｐ３８媒介性老化の阻害は、約２０〜５００ｎＭの濃度範囲のＬＹ２２２８８２０を用いて細胞を処理することを含む。細胞ストレス応答経路の阻害は、小包体ストレスを阻害することを含み得る。ある実施形態において、細胞ストレス応答経路の阻害は、非ミトコンドリアカルパイン媒介ストレスを阻害することを含む。自然免疫応答の阻害は、ミエロペルオキシダーゼ阻害因子を用いてミエロペルオキシダーゼ産生を阻害することを含み得る。ある実施形態において、ミエロペルオキシダーゼ阻害因子は、約１００μΜの濃度範囲の４−ＡＢＡＨを含む。
【００１４】
細胞ストレス応答経路の阻害は、フィルトリン−μを用いてミトコンドリアｐ５３媒介アポトーシスを阻害することを含み得る。ある実施形態において、細胞ストレス応答経路の阻害は、細胞の非ミトコンドリアカルパイン媒介アポトーシスを阻害することを含む。非ミトコンドリアカルパイン媒介アポトーシスの阻害は、約０．５〜２５μＭの濃度範囲のＭＤＬ２８１７０を用いて細胞を処理することを含み得る。ある実施形態において、利用可能な酸素の減少は、培養システム中の酸素の量を約４％に減らすことを含む。実施形態において、細胞が誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）であり得る。
【００１５】
実施形態において、以下の内の２つ以上を含む、ヒト血液細胞の新規生成のための培地が提供される：
抗酸化剤；
ミトコンドリアｐ５３媒介アポトーシスの阻害因子；
非ミトコンドリアカルパイン媒介アポトーシスの阻害因子；
小胞体ストレスの阻害因子；
自然免疫応答阻害因子；
ｐ３８媒介老化の阻害因子；及び
ｃＡＭＰシグナル伝達経路活性化因子。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
本発明の他の特徴および利点は、添付の図面と併せて本発明の以下の詳細な説明から明らかであろう。
【００１７】
【図１】図１は、細胞ストレス及び／又はＲＯＳを低減させる方法の一実施形態を示す。
【００１８】
【図２Ａ】図２Ａ〜Ｆは、上昇したＲＯＳレベルが、ｈＰＳＣ（human pluripotent stem cell：ヒト多能性幹細胞）に由来する造血前駆細胞の機能の低下を導くことを示す方法の一実施形態を利用した実験の結果を示す。
【図２Ｂ】図２Ａ〜Ｆは、上昇したＲＯＳレベルが、ｈＰＳＣに由来する造血前駆細胞（human pluripotent stem cell：ヒト多能性幹細胞）の機能の低下を導くことを示す方法の一実施形態を利用した実験の結果を示す。
【図２Ｃ】図２Ａ〜Ｆは、上昇したＲＯＳレベルが、ｈＰＳＣに由来する造血前駆細胞の機能の低下を導くことを示す方法の一実施形態を利用した実験の結果を示す。
【図２Ｄ】図２Ａ〜Ｆは、上昇したＲＯＳレベルが、ｈＰＳＣに由来する造血前駆細胞の機能の低下を導くことを示す方法の一実施形態を利用した実験の結果を示す。
【図２Ｅ】図２Ａ〜Ｆは、上昇したＲＯＳレベルが、ｈＰＳＣに由来する造血前駆細胞の機能の低下を導くことを示す方法の一実施形態を利用した実験の結果を示す。
【図２Ｆ】図２Ａ〜Ｆは、上昇したＲＯＳレベルが、ｈＰＳＣに由来する造血前駆細胞の機能の低下を導くことを示す方法の一実施形態を利用した実験結果を示す。
【００１９】
【図３Ａ】図３Ａ〜Ｆは、造血前駆細胞に由来する低ＲＯＳ（ROSlo）及び高ＲＯＳ（ROShi）のｈＰＳＣのコロニー形成キャパシティを示す方法の一実施形態の実験結果を示す。
【図３Ｂ】図３Ａ〜Ｆは、造血前駆細胞に由来する低ＲＯＳ及び高ＲＯＳのｈＰＳＣのコロニー形成キャパシティを示す方法の一実施形態の実験結果を示す。
【図３Ｃ】図３Ａ〜Ｆは、造血前駆細胞に由来する低ＲＯＳ及び高ＲＯＳのｈＰＳＣのコロニー形成キャパシティを示す方法の一実施形態の実験結果を示す。
【図３Ｄ】図３Ａ〜Ｆは、造血前駆細胞に由来する低ＲＯＳ及び高ＲＯＳのｈＰＳＣのコロニー形成キャパシティを示す方法の一実施形態の実験結果を示す。
【図３Ｅ】図３Ａ〜Ｆは、造血前駆細胞に由来する低ＲＯＳ及び高ＲＯＳのｈＰＳＣのコロニー形成キャパシティを示す方法の一実施形態の実験結果を示す。
【図３Ｆ】図３Ａ〜Ｆは、造血前駆細胞に由来する低ＲＯＳ及び高ＲＯＳのｈＰＳＣのコロニー形成キャパシティを示す方法の一実施形態の実験結果を示す。
【００２０】
【図４Ａ】図４Ａ〜Ｇは、ＲＯＳ低減法の組み合わせが、低ＲＯＳのＣＤ９０＋造血前駆細胞の増加した生成を導くことを実証するために使用した方法の一実施形態を利用した実験方法及びそれに伴う実験結果を示す図を示す。
【図４Ｂ】図４Ａ〜Ｇは、ＲＯＳ低減法の組み合わせが、低ＲＯＳのＣＤ９０＋造血前駆細胞の増加した生成を導くことを実証するために使用した方法の一実施形態を利用した実験方法及びそれに伴う実験結果を示す図を示す。
【図４Ｃ】図４Ａ〜Ｇは、ＲＯＳ低減法の組み合わせが、低ＲＯＳのＣＤ９０＋造血前駆細胞の増加した生成を導くことを実証するために使用した方法の一実施形態を利用した実験方法及びそれに伴う実験結果を示す図を示す。
【図４Ｄ】図４Ａ〜Ｇは、ＲＯＳ低減法の組み合わせが、低ＲＯＳのＣＤ９０＋造血前駆細胞の増加した生成を導くことを実証するために使用した方法の一実施形態を利用した実験方法及びそれに伴う実験結果を示す図を示す。
【図４Ｅ】図４Ａ〜Ｇは、ＲＯＳ低減法の組み合わせが、低ＲＯＳのＣＤ９０＋造血前駆細胞の増加した生成を導くことを実証するために使用した方法の一実施形態を利用した実験方法及びそれに伴う実験結果を示す図を示す。
【図４Ｆ】図４Ａ〜Ｇは、ＲＯＳ低減法の組み合わせが、低ＲＯＳのＣＤ９０＋造血前駆細胞の増加した生成を導くことを実証するために使用した方法の一実施形態を利用した実験方法及びそれに伴う実験結果を示す図を示す。
【図４Ｇ】図４Ａ〜Ｇは、ＲＯＳ低減法の組み合わせが、低ＲＯＳのＣＤ９０＋造血前駆細胞の増加した生成を導くことを実証するために使用した方法の一実施形態を利用した実験方法及びそれに伴う実験結果を示す図を示す。
【００２１】
【図５Ａ】図５Ａ〜Ｃは、ＲＯＳの低減が高い成長キャパシティを有するｈＰＳＣ由来のＣＤ９０＋造血前駆細胞の生成を増加させることを示す方法の一実施形態の実験結果を示す。
【図５Ｂ】図５Ａ〜Ｃは、ＲＯＳの低減が高い成長キャパシティを有するｈＰＳＣ由来のＣＤ９０＋造血前駆細胞の生成を増加させることを示す方法の一実施形態の実験結果を示す。
【図５Ｃ】図５Ａ〜Ｃは、ＲＯＳの低減が高い成長キャパシティを有するｈＰＳＣ由来のＣＤ９０＋造血前駆細胞の生成を増加させることを示す方法の一実施形態の実験結果を示す。
【００２２】
【図６Ａ】図６Ａ〜Ｄは、ＲＯＳの低減が、内皮細胞に対して影響を与えること無しに、ＣＤ９０＋造血前駆細胞の機能を保存することを示す方法の一実施形態の実験結果を示す。
【図６Ｂ】図６Ａ〜Ｄは、ＲＯＳの低減が、内皮細胞に対して影響を与えること無しに、ＣＤ９０＋造血前駆細胞の機能を保存することを示す方法の一実施形態の実験結果を示す。
【図６Ｃ】図６Ａ〜Ｄは、ＲＯＳの低減が、内皮細胞に対して影響を与えること無しに、ＣＤ９０＋造血前駆細胞の機能を保存することを示す方法の一実施形態の実験結果を示す。
【図６Ｄ】図６Ａ〜Ｄは、ＲＯＳの低減が、内皮細胞に対して影響を与えること無しに、ＣＤ９０＋造血前駆細胞の機能を保存することを示す方法の一実施形態の実験結果を示す。
【００２３】
【図７】図７Ａ〜Ｄは、ｃＡＭＰ活性が多能性幹細胞分化培養物におけるＲＯＳの細胞内レベルを減少させることを実証する方法の一実施形態の実験結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
他に定義されない限り、本願において使用したすべての用語、記載及び他の科学用語又は技術は、本発明に関連する分野の当業者によって共通して理解される意味を有することを意図する。いくつかのケースにおいて、共通して理解される意味を有する用語は本願において明確性及び／又は即時引照のために定義されるが、本願においてそのような定義を含むことは本発明の技術分野において一般的に理解されるものとの実質的な違いを表すと必ずしも解釈すべきではない。本願において記載又は引照した技術及び手法の多くは、本発明の技術分野における通常の知識を有する者によって良く理解され、従来の方法論を使用して共通して採用される。
【００２５】
当明細書の全体に渡って、本発明の様々な視点が範囲形式で記されている。範囲形式での記載は単に簡便性及び簡潔性のために過ぎないと理解されるべきであり、本発明の範囲の可変性のない限定として解釈されるべきではない。つまり、範囲の記載は、その範囲内の可能なサブレンジ（中範囲）及び個々の数値の全てを具体的に開示していると解釈されるべきである。例えば、１〜６などの範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などのサブレンジ、そしてこの範囲内の個々の数値、例えば、１、２、３、４、５及び６を具体的に開示していると解釈されるべきである。他の例において、週の範囲の記載は、週の始点、終点の間の日数の記載も含む。これは、範囲の幅に拘らず適用される。
【００２６】
本願において使用される用語「安全な（safe）」とは、母体及び／又は胎児に対する顕著なリスクの障害を引き起こさない方法又は装置を意味すると理解され得る。
【００２７】
本願において使用される「単離された（isolated）」は、細胞（単数又は複数）について記載するように使用される場合に、細胞が由来する被験者（例えば患者）からの分離、及び／又は、天然の環境の１以上の他の構成要素（デブリ、組織、組織集合体及び他の細胞など）からの分離を含む、それらの天然の環境から分離されている細胞（単数又は複数）を意味する。
【００２８】
本願において使用される「胎児の（fetal）」とは、胚性ステージの後でかつ分娩の前の発育中の哺乳類（ヒトなど）に由来する細胞又は他の材料（material）の特徴を記載することに使用される。本願において使用される、「幼児（infant）」とは、未熟児及び新生児を含む分娩から１歳までの新生又は若い哺乳類に由来する細胞又は他の材料の特徴を記載することに使用される。
【００２９】
本願において使用される「多能性の（pluripotent）」とは、三胚葉、例えば 内胚葉、中胚葉及び外胚葉のいずれかのタイプの細胞へ分化する細胞の能力を意味する。「多分化能（multipotent）」とは、２系統を上回る細胞へ分化する細胞の能力を意味するが、系統の数は限定されない。
【００３０】
前駆細胞（Precursor）とは、発生的に上流の所望の細胞又は再プログラムされた細胞を記載することに使用される。例えば、血液の造血前駆細胞は血液生成内皮（hemogenic endothelium）を含み得る。
【００３１】
造血幹細胞を含むインビトロ由来（derived）の造血細胞は、非造血幹細胞又はその前駆細胞を造血性幹細胞又はその前駆細胞（progenitor cell）へ変換する、分化プロセス又は再プログラミングイベントに由来する細胞、もしくはある因子又はある特徴を有する細胞を使用する誘導システムに由来する細胞として理解されるべきである。典型的には、これは内皮性のものから造血性のものへの移行によって例示される。ここで、インビボに及びインビトロにおいて造血細胞の前駆細胞は内皮細胞であり、内皮性転写プログラムの下方制御及び造血性転写プログラムの上方制御によって内皮細胞が血液へと移行することが決定されている。造血幹細胞又はその前駆細胞を生成するプロセスは、上記の方法を組み合わせることによって改善可能であると考えられる。ここで、造血幹細胞生成方法は、造血前駆細胞の分化、特別な前駆細胞又はＨＳＣｓそれ自身を得るための細胞の再プログラミング及び前駆細胞からの造血幹細胞の誘導に関する全て又はいくつかの既知の方法の視点を含む。そのような方法の全ての組み合わせ及び血液を生産する未来の方法は本願開示の範囲内である。なぜならば、インビトロの因子をベースにした新規の血液の生成に直面する最優先の問題は、生成プロセスの間にＲＯＳ及び細胞ストレスを減少させることによって造血幹細胞の生成効率及び機能を改善するからである。新規又は確立された因子は、血液を生成することに使用され得る。伝統的にドナーから採取した造血幹細胞は、成長因子又は増殖を可能にする再プログラミング因子に暴露された場合に、例えば増殖能力を有する細胞及び／又は造血幹細胞の前駆細胞への再プログラミングによって、拡大した数の新規の造血幹細胞の生成が可能になるだろう。繰り返すと、ＲＯＳ及びストレスのマネージメントは、これらの方法を使用して機能的な造血幹細胞の生成の効率を増加するために必要とされるだろう。
【００３２】
語句「幹細胞（単数又は複数）」は、明細書の全体に渡って使用され得る。「幹細胞（単数又は複数）」は、成体幹細胞又は胚性幹細胞及びヒト又は動物の幹細胞を意味し得ると当業者によって理解されるだろう。例えば、そのような幹細胞は、皮膚、繊維芽細胞及び他の細胞及び組織を含む大人の細胞タイプから生成された誘導多能性幹細胞（induced pluripotent stem：ｉＰＳ細胞）を含み得る。Masip et al., 2010, Mol Hum Reprod 16(1 1): 856-868; Takahashi and Yamanaka, 2006, Cell 126(4): 663-676; Yu et al., 2007, Science 318(5858): 1917-1920. 現在において多種多様な幹細胞が治療的に使用され、又は臨床治験における使用に関して評価されており、間葉幹／間質細胞、及び造血幹細胞など、例えば神経学的疾患及び血液性疾患の各々に使用される体細胞を含む。本願の目的のためには、間葉幹細胞及び間葉間質細胞は互換可能なように使用することができる。
【００３３】
語句「再プログラムされた体細胞（reprogrammed somatic cell）」は、明細書の全体に亘って使用され得る。「再プログラムされた体細胞」は、特定のタイプの体細胞に限定されず、任意のタイプの体細胞を意味し得ると当業者によって理解されるだろう。Takahashi and Yamanakaは、体細胞を多能性／胚性のような状態に「再プログラム」又は「脱分化」する、又は体細胞を直接的に他のタイプの細胞系統へ「再プログラム」する再プログラミング技術について最初に述べた。Takahashi and Yamanaka, 2006, Cell 126(4): 663-676.例えば、再プログラムされた体細胞は、上皮、結合、神経、筋肉組織及び／又は臍帯血などの血液から再プログラムされた細胞を意味し得る。例えば、臍帯血由来の内皮前駆細胞は、再プログラミングに適する。非体細胞（例えば 生殖細胞）も再プログラムされ得るし、本発明に適する使用においても、それらに由来する細胞は体細胞から再プログラムされた細胞と同等であると考えるべきである。
【００３４】
以下に記載される実施形態において添付図面が参照される。添付図面は実施形態の一部を構成し、そこでは本発明を実施可能な具体的な実施形態が模式的に示される。本発明の範疇から逸脱すること無く、他の実施形態を使用することができそして構造上の変更を行うことができることは理解されるだろう。
【００３５】
幹細胞、例えば、ヒト及び動物の両方の成体造血幹細胞（hematopoietic stem cells：ＨＳＣｓ）は、増加したレベルのＲＯＳに対して感受性が高いことが実証されており、ＲＯＳ媒介性酸化的ダメージはこれらの細胞の自己再生及び長期（long term：LT）生着（移植：engraft）キャパシティに障害をもたらす。ＲＯＳとは、酸素を含む分子についての総称であり、不対原子価殻電子に起因して反応性が高く、ＤＮＡ、タンパク質、及び脂質を含む細胞の構成要素に対して酸化的ダメージを与え、結果的に細胞周期同期、早期老化又はアポトーシスをもたらす。加齢に関するフリーラジカル理論によって議論されるように、バイオ分子に対する酸化的ダメージの蓄積は、加齢に関連する表現型及び病気そして癌に対して寄与する。正常な細胞において、大多数のＲＯＳは、酸化的リン酸化を介した細胞の代謝の副生成物としてミトコンドリアを起源とする。細胞内のＲＯＳレベルは、栄養学的に利用可能な抗酸化物質（ビタミンＣ、ビタミンＥ及びセレンなど）、還元補因子及びペプチド（グルタチオン、チオレドキシン及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）、及び抗酸化酵素（スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ及びグルタチオンペルオキシダーゼ）を含む因子による複雑なシステムを介して制御される。
【００３６】
細胞のＲＯＳに対して影響を与える更なるメカニズムも示されており、ニッチにおける近隣細胞による活性ＲＯＳの無毒化、細胞の微小血管増殖活性に対する細胞の距離、自然免疫細胞によるニッチでのＲＯＳ放出を含む。制御された生理学的なレベルでは、たんぱく質の酸化的ターンオーバーに関して細胞はＲＯＳに依存し、ＲＯＳは増殖、分化及び活動停止に関与するシグナリング経路におけるシグナル伝達において中心的介在物質として作用する。つまり、生理学的な細胞の機能のために適切なＲＯＳレベルが必要とされる細胞の「レドックス窓」が存在し得るが、その一方で増加したＲＯＳは細胞の機能障害及び病理学的な状態に寄与し得る。酸素の濃度に依存して、ＲＯＳは自発性の酸化から生成し得る。更に、顆粒（白血）球などの自然免疫のエフェクター細胞は、細胞外スペースへＲＯＳを酵素的に放出し得る。ストレスの原因であることに加えて、活性ＲＯＳの生成がｐ５３の活性化、小胞体ストレス及びｐ３８介在性ストレス応答によるものの下流で確認されていることから、アポトーシス又は老化を意図してＲＯＳが細胞内に生成されることも報告されており、ＲＯＳがストレスシグナリングの種々の古典的な経路の間で中心的でありかつ共有される特徴であることを示している。臍帯血からの原発性（非培養性）造血前駆細胞が、インビトロで培養された場合に低ＲＯＳ（ROSlo）から高ＲＯＳ（ROShi）の表現型に急速に移行して、ＨＳＣｓの長期生着キャパシティにおける障害を導くことが実証されている。つまり、生理学的な低ＲＯＳ（ROSlo）の表現型は、大人のＨＳＣｓの機能のための第１義的な／主要な（primary）必要条件である。ｈＰＳＣ由来の造血細胞が大人の及び新生児の対象物（骨髄及び臍帯血前駆体）と比較して増殖キャパシティの不足をいつも示していることから、上昇したＲＯＳレベルの直接的結果及びそれに関連した細胞増殖に対する結果としてｈＰＳＣ由来の造血幹細胞（ＨＳＣｓ）は機能的に障害を受けている。
【００３７】
上述のように、多能性幹細胞からの新規の血液のインビトロでの生成は、結果として細胞内ＲＯＳの顕著に上昇したレベルを示す血液細胞になる。上昇したレベルの細胞内ＲＯＳは、細胞ストレスを示し、適切な細胞生成及び成長に関して望ましくない状態である。上昇したＲＯＳは、細胞のＤＮＡダメージを増加させること、より機能的な幹細胞のより低い頻度を生じること、コロニー形成キャパシティを低減させること及び／又は幹細胞の増殖キャパシティを低減させることが示されている。更に、例えば、ＨＳＣｓは、インビトロで培養された場合にそれらの長期生着キャパシティを失うことが良く知られており、低いレベルのＲＯＳ（非培養の機能的なＨＳＣｓの特徴）を有する細胞が継続培養（subculture）の際に高ＲＯＳ（ROShi）表現型へ急速に移行するだろうと報告されている。
【００３８】
更に、更なるタイプの細胞（幹細胞及び再プログラムされた体細胞など）は上昇したレベルのＲＯＳによるネガティブな影響を受け得る。従って、下記及び明細書の全体に渡って、幹細胞及び／又は再プログラムされた体細胞などの細胞を含む細胞培養液における細胞ストレス及び／又はＲＯＳの量を減少させるための方法、システム、及び培地が開示される。
【００３９】
図１の方法、システム、因子及び培地
図１は、細胞培養液、幹細胞及び／又は再プログラムされた体細胞を含む細胞培養液におけるＲＯＳのレベル及び／又は細胞ストレスを減少させる方法の一実施形態を示す。幹細胞及び／又は再プログラムされた体細胞が培養液内で時間経過とともに分化することは当業者に理解されるだろう。従って、この節及び明細書における他の節に記載の方法の異なる要素が、細胞培養の間の異なる期間において適用され得る。例えば、約０時間、２時間、１２時間、２４時間、２日間、４日間、８日間、１０日間、１２日間、１４日間、１８日間又は１８日間を上回る。
【００４０】
図１に戻ると、未処理の状態２において、高いＲＯＳの存在は、幹細胞又は再プログラムされた体細胞などの細胞の機能を減少させ得る。しかしながら、ある実施形態において、異なる要素及び／又は条件６での細胞の処理４及びＲＯＳを含む細胞培養液は、増加した細胞の機能８を導き得る。いくつかの実施形態において、本方法は、抗酸化剤を用いて細胞培養液を処理すること、自然免疫の（炎症性の）応答を減少させること、細胞ストレス応答経路を阻害すること、及び酸素の濃度を例えば約４％に減少させることを含み得る。いくつかの実施形態において、酸素の濃度は、約０．５〜１０％、１〜６％又は２〜４％であり得る。ある実施形態において、酸素の濃度は、低酸素インキュベーター又は他の適切な手段を使用することによって制御され得る。いくつかの実施形態において、本方法は、酸化ストレスなどのストレスに対する追加の保護をもたらす遺伝子をアップレギュレートするなどの追加の細胞又は培地の処理を更に含み得る。あるいくつかの実施形態において、本方法は、細胞内活性酸素の濃度を低下させる細胞経路を活性化すること（例えば、ｃＡＭＰシグナル伝達活性化因子を介するもの）を更に含み得る。上記又は明細書における他の箇所に記載の要素を組み合わせることによるシナジスティックな効果が存在し得ることは当業者に理解されるだろう。ある実施形態（複数）において、２つの方法の要素、３つの方法の要素、４つの方法の要素などを組み合わせることが有益であり得る。高レベルのＲＯＳ及びストレスは、より多くのストレス応答及びより高いＲＯＳを導く細胞に対するダメージを生じさせる悪循環のイベントを導き得る。従って、複数の方法の要素の使用は、より大きな効果をもたすために組み合わせられ得る。
【００４１】
ある実施形態において、この節又は明細書における他の節に記載の方法を用いた幹細胞又は再プログラムされた体細胞（造血細胞など）の処理は、より機能的な細胞の生成効率の増加を誘導し得る。例えば、造血細胞の場合には、ＣＤ９０＋表現型を有するより原始的な造血細胞が、増殖能力を有しつつ生成され得る。ある実施形態（複数）において、より機能的な細胞は少なくとも約５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０又は２１倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、又は３０倍を上回る増加での、より機能的な細胞の生成における増加した効率で生成されるだろう。
【００４２】
ある実施形態（複数）において、抗酸化剤は、アスコルビン酸（ビタミンＣ）、ビタミンＥ、クエン酸、セレン、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）、メラトニン、還元性補因子及びペプチド、グラシノール、グルタチオン、チオレドキシン、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼなどの抗酸化酵素、ＤＰＩ、アポシニン、ＮＡＣ、MnTMPyP、gp91ds-tatペプチド、及びMitoTEMPOを含み得る。いくつかの実施形態において、抗酸化剤処理は、上記の抗酸化剤のカクテルを含み得る。抗酸化剤は、種々の濃度（例えば、約０．０１〜１ｍｇ／ｍＬ、約、０．０５〜０．７５ｍｇ／ｍＬ、０．１〜０．５ｍｇ／ｍＬ、又は約０．３５ｍｇ／ｍＬ）で使用され得る。実施形態（複数）において、アスコルビン酸の量はおよそ０．３７８ｍｇ／ｍＬであり得る。ある実施形態（複数）において、クエン酸の量は、約、０．０１〜２ｍｇ／ｍＬ、０．０５〜１．２ｍｇ／ｍＬ、０．１〜０．８ｍｇ／ｍＬ、約０．１２５〜０．６ｍｇ／ｍＬ、０．１５〜０．２ｍｇ／ｍＬの範囲又は約０．１５８ｍｇ／ｍＬであり得る。ある実施形態において、グラシノールの濃度は、約０．１〜１０μΜ（マイクロモーラー）、０．２〜５μΜ、０．５〜２μΜ、又は約１μΜであり得る。ＮＡＣは、約１０〜５００μΜ、５０〜１５０μΜ又は約１００μΜの濃度で提供され得る。グルタチオンは、約１〜２０μΜ、２〜１０μΜ又は約５μΜの濃度で提供され得る。メラトニンは、約１〜４０μΜ、１０〜３０μΜ、又は約２０μΜの濃度で提供され得る。
【００４３】
ある実施形態（複数）において、細胞ストレス応答は、ミトコンドリアｐ５３媒介アポトーシス、非ミトコンドリアカルパイン媒介アポトーシス、ｐ３８媒介性老化、鉄誘導性酸化的ストレス及び／又は小胞体ストレスに関連する経路の阻害を介して阻害され得る。上記又は明細書における他の箇所に記載の阻害経路は、個々に、全て一度に、又は上記の任意の組み合わせ（例えば、ミトコンドリアｐ５３媒介アポトーシス及びｐ３８媒介性老化を阻害するが他の経路は阻害しない）で阻害することができる。
【００４４】
いくつかの実施形態において、ミトコンドリアｐ５３媒介アポトーシスは、フィルトリン−μによって阻害され得る。フィルトリン−μは、１〜２０μΜ、５〜１５μΜ、又は約１０μΜなどの濃度で使用され得る。実施形態（複数）において、非ミトコンドリアカルパイン媒介アポトーシスは、ＭＤＬ２８１７０によって阻害され得る。ＭＤＬ２８１７０は、約１〜２５μΜ、２〜１５μΜ、３〜１０ μΜ又は約５μΜの濃度で培養液に対して供給され得る。いくつかの実施形態（複数）において、ＭＤＬ２８１７０の代わりに又はＭＤＬ２８１７０と組み合わせて、ＰＤ１５０６０６、ＳＪＡ６０１７、ＡＢＴ−７０５２５３、ＳＮＪ−１９４５及びＡＫ２７５がそれらの同一の濃度で使用され得る。ミトコンドリア媒介性アポトーシスは、培養液に対するタウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣＡ）の約１０〜３００μΜ、２０〜２００μΜ、３０〜１００μΜ、又は約６０μΜの濃度での添加によって阻害され得る。
【００４５】
ある実施形態（複数）において、細胞ストレス応答は、例えば約１０〜１０００ｎＭ、１００〜８００ｎＭ、２００〜６００ｎＭ、又は約５００ｎＭの濃度でのｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤ＬＹ２２２８８２０の使用を介して、ｐ３８媒介性老化の阻害によって阻害され得る。Acumapimod Bakuchiol, Bakuchiol BMS-582949 hydrochloride, Chelerythrine Chloride, Dehydrocorydaline chloride, Doramapimod, GNE- 495, Losmapimod, Pamapimod, PH-797804, R1487 (Hydrochloride), SB 202190, SB 203580, SB203580(RWJ 64809), SB 203580 hydrochloride, SB 239063, 及び／又は SB 242235がＬＹ２２２８８２０の代わりに又はＬＹ２２２８８２０と組み合わせて使用され得る。
【００４６】
ある実施形態（複数）において、鉄誘導性酸化ストレスは、デフェロキサミン、鉄キレート剤によって阻害され得る。デフェロキサミンの濃度は約０．１〜１０μΜ、０．２〜５μΜ、０．５〜２μΜ又は約１μΜであり得る。
【００４７】
いくつかの実施形態において、炎症性の応答は、ミエロペルオキシダーゼの生成及び／又は放出をブロックすることによって減少させることができる。ミエロペルオキシダーゼは、４−アミノ安息香酸（４−ＡＢＡＨ）の添加によってブロックされ得る。４−ＡＢＡＨは、約１０〜２００Μ、５０〜１５０μΜ、又は約１００μΜの濃度で細胞培養液に対して供給され得る。実施形態（複数）において、４−ＡＢＡＨは、８日間及びそれ以降又はこの節又は明細書における他の節において開示された任意の他の時期などにおいて培養液に添加され得る。
【００４８】
ある実施形態（複数）において、ＳＲＴ１７２０は、本方法において酸化的ストレスのアップレギュレート遺伝子保護のために使用され得る。ＳＲＴ１７２０は、約０．１〜１０μΜ、０．２〜５μΜ、０．５〜２μΜ又は約１μΜの濃度で利用され得る。いくつかの実施形態において、ＳＲＴ１７２０の代わりに又はＳＲＴ１７２０と組み合わせてResveratrol (3,5,4'-trihydroxy-trans-stilbene), metformin, Oxaloacetate, SRT1720, SRT2104, SRT2379, Oxazolo[4,5-b]pyridines derivative, Imidazo[1,2-b]thiazole derivative, 又は1,4- Dihydropyridine (DHP) derivativesが同一の又は類似の濃度で使用され得る。
【００４９】
実施形態（複数）において、本方法においてラパマイシンが細胞成長代謝を制御するために、従って酸化的ストレスを制御するために使用され得る。ラパマイシンは、およそ０．０００００１〜１０μΜ、０．００１〜５μΜ、０．０１〜１μΜ、又は約０．１μΜの濃度で細胞培養液に添加され得る。ラパマイシンは、分化の間の種々の時期、例えば連続する２〜３日間にわたって８日間、細胞培養液に対して添加され得る。
【００５０】
ある実施形態（複数）において、本方法においてＣＨＩＲ９９０２１が、Ｗｎｔシグナリング経路活性化因子として、中胚葉性及び造血性のシグナリングを調和（mediate）するために使用され得る。ＣＨＩＲ９９０２１は、０．１〜１０μΜ、０．２〜５μΜ、０．５〜２μΜ又は約１μΜの濃度で使用され得る。いくつかの実施形態において、ＢＩＯ（グリコーゲン合成酵素キナーゼ３阻害因子（Tocrisを参照）も）が使用され得る。
【００５１】
特定の実施形態（複数）において、フォルスコリン及びＩＢＭＸなどのｃＡＭＰシグナリング経路の活性化因子が培養液に対して添加され得る。ｃＡＭＰの活性化は、多能性幹細胞分化培養液におけるＲＯＳの細胞内レベルを減少させることが示されている（下記図７参照）。ある実施形態（複数）においてフォルスコリンの濃度は、約１〜５０、５〜４０、１０〜３０、１５〜２５又は約１０μΜ又は２０μΜであり得る。いくつかの実施形態において、ＩＢＭＸの濃度は、約１０〜１０００、５０〜９００、１００〜８００、２００〜７００、３００〜６００又は約４００〜５００μΜ又は５００μΜであり得る。
【００５２】
いくつかの実施形態において、追加の成分（組成）が上記の方法において利用され得る。例えば、亜セレン酸ナトリウムが約１０〜２００ｎＭ、５０〜１５０ｎＭ又は約１００ｎＭの濃度で培養液に対して添加され得る。更なる例として、Buteinが約１〜２０μΜ、５〜１５μΜ又は約１０ μΜの濃度で培養液に対して添加され得る。
【実施例】
【００５３】
以下の実施例は、本発明の種々の視点を更に記載する及び図示することを意図するものであり、明記されようがなかろうが、本発明の範囲をいずれかの様式、形状又は形態に限定するものではない。
【００５４】
実施例１〜４に関する実験手法
ｈＰＳＣｓは、分化の開始までネズミの胚性繊維芽細胞（ＭＥＦｓ）（Merck Millipore, Darmstadt, ドイツ国）上でコロニーとしてルーチン的に維持した。更に、ｈＰＳＣｓを３μΜのＣＨＩＲ９９０２１（R&D Systems, McKinley Place, MN, 米国）を用いて培養して、分化開始前の４８時間の間に中胚葉性決定（コミットメント）のためにそれらを刺激（プライム）した。使用した細胞系統は、ヒトＥＳ細胞系統のＨ１、ＨＵＥＳ２及びＨＵＥＳ３（それぞれ、材料譲渡契約の下でWiCell, Madison, WI及びハーバード大学から取得した）及びｉＰＳ細胞系統ＲＢ９−ＣＢ１（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８、ＫＬＦ４、Ｃ−ＭＹＣを発現するｔｅｔ−誘導性のレンチウイルスベクターを用いて形質転換した臍帯血内皮細胞に由来する）であった。全ての多能性細胞系統は、カリオタイプに関してノーマルであり、事前に（earlier）インビボにおけるテラトーマアッセイ及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって多能性であると実証されたものであった。全ての系統が汚染無しであることを保証するために、マイコプラズマテストをルーチン的に実行した。血液へ向かう多能性幹細胞の分化のために使用した細胞培養液は、MesoTotal（Primorigen Biosciences, Madison, WI,米国）であった。分化の０日目において、ｈＰＳＣｓのコロニーは、０．５ｍｇ／ｍＬのDispase（Invitrogen）を含むＤＭＥＭを用いた３７℃で３０分間のインキュベーションによってＭＥＦｓから分離した。
【００５５】
分離したコロニーは、Corning Costar Ultra-low attachment Plates/Dishes（Sigma- Aldrich, St. Louis, MO,米国)の中に置く前に、収集して洗浄し、そしてMesoTotalに再懸濁した。その後、コロニーは胚様体（Embryoid Bodies：EBs）をオーバーナイトで形成した。分化の１日目及び２日目において、ＥＢｓを収集して洗浄し、そしてすべての培地を交換した。４日目及び６日目において、使用したMesoTotalの５０％を新鮮な培地に置き換えた。８日目において、ＥＢｓは、Matrigel（STEMCELL Technologies, Vancouver, BC, カナダ）でコーティングされたウェルの中に分布させる前に、収集して１００％新鮮なMesoTotalの中に再懸濁した。その後ＥＢｓは定着し（attached)、細胞の層が広がり始めた。１０、１２及び１４日目において１００％のMesoTotalを置き換えた。１５日目に培地の９０％のみを置き換えて、自由浮動性の造血前駆細胞（free-floating hematopoietic progenitors）の喪失を制限した。１６日目に培養物を解析のために収集した。分化した細胞をＰＢＳで洗浄する前に全ての培地を収集し、TrypLE（Thermo Fisher Scientific）を用いてバラバラにし（単細胞化：singularized）、２１Ｇの針を通過させ、そして３０μｍ  sterile Cup Filicons（BD Biosciences）を使用して濾過（フィルトレーション）した。次に、再懸濁及びカウントする前に、細胞を３５０Ｇで８分間遠心分離した。ＣＤ３４エンリッチの臍帯血細胞のサブカルチャー（継続培養）のために使用した成長培地は、１００ｎｇ／ｍＬの以下のサイトカインの各々；ｈＴＰＯ、ｈＳＣＦ及びｈＦＬＴ３（全てPeproTech, Rocky Hill, NJ,米国から取得）を添加した標準化臍帯血増殖培地ＳＦＥＭ（STEMCELL Technologies）であった。以下の因子は、指示される場合に培地に対して添加した：０．３７８ｍｇ／ｍＬのＬ−アスコルビン酸（Sigma, St. Louis, MO, 米国）、及び０．１５８ｍｇ／ｍＬのクエン酸一水和物（ACROS Organics / Thermo Fisher, New Jersey, 米国）。培地に添加する前に、ミエロペルオキシダーゼブロッカーである１００μΜの４−アミノ安息香酸（Sigma）及びp３８ＭＡＰ阻害因子である５００ｎＭのＬＹ２２２８８２０（Selleckchem, Houston, TX, 米国）もＤＭＳＯ（Sigma）に溶解した。ＤＭＳＯは、ビヒクルコントロールとして使用した。
【００５６】
全ての細胞は、３７℃で５％ＣＯ２で培養した。酸素レベルは、大気濃度（２１％）又は低酸素インキュベーター（BINDER GmbH, Tuttlingen, ドイツ）の使用によって４％に維持のいずれかであった。全ての培地は、細胞培養物に添加する前に、８時間にわたってプレインキュベートした。
【００５７】
TrypLE（Thermo Fisher Scientific）を使用して単細胞にバラバラにする前に、分化した細胞をＰＢＳ中で洗浄し、２１Ｇの針を通過させ、そして３０μｍ  sterile Cup Filicons（BD Biosciences）を使用して濾過（フィルトレーション）した。細胞は７ＡＡＤで処理して、死んだ細胞を除外した。細胞は、以下の抗ヒト抗体を使用して染色した：フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−コンジュゲート型ＣＤ４５（eBioscience, 11-0459-42）及びＣＤ４３（BD Biosciences, 555475）フィコエリトリン−シアニン（PE-Cy7）−コンジュゲート型のＣＤ３４（Biolegend, 343516）、フィコエリトリン（PE）−コンジュゲート型のＣＤ９０（Biolegend, 328110）。酸化的ストレスを検出するために使用したCellROX Deep Red Reagent（Thermo Fisher Scientific, C10422）は、製造者の指示に従って適用した。細胞は、２０分間３７℃で暗所においてCellROX Deep Red Reagent及び追加の抗体と一緒にインキュベートした。細胞は、FACS LSR II（BD Biosciences）で取得するか、又はFACS Aria III（BD Biosciences）を使用してソートした。解析は、FlowJo, version X.0.7 (FLOWJO LLC, Ashland, OR, 米国)を使用して行った。全てのＦＡＣＳゲートは、他に記載されない限りfluorescence minus one (FMO) コントロールに基づく。
【００５８】
造血前駆細胞は、ソートして、ウェルあたりに５００個の細胞の割合でFalcon Tissue Culture six-well plates（Thermo Fisher Scientific）上の個々のウェルに、１．５ｍＬのMethoCult H4435（STEMCELL Technologies）を用いて蒔いた。メチルセルロースに対して追加のサイトカイン又は化合物を添加しなかった。培養液は、標準の加湿インキュベーターの中で３７℃で５％ＣＯ２で１４日間インキュベートした。明視野顕微鏡を使用してコロニーをカウントし、そしてサイズごとにスコア化した。
【００５９】
造血前駆細胞は氷冷ＰＢＳの中にソートし、そして顕微鏡スライドガラス（Thermo Fisher Scientific）上の４０℃の１％低融解点アガロース（LONZA, Rockland, ME, 米国）の中に配した（cast）。細胞は、オーバーナイトで４℃で暗所においてｐＨ＞１３のＮａＯＨ溶液内で溶解した。次に、スライドガラスをｐＨ１２．３のＮａＯＨで２回リンスし、続いて同一の溶液を満たしたEASYCAST B1 gel runner（Thermo Fisher Scientific）の中で水没させ、２５分間２０Ｖ、５０ｍＡ（０．６ｖ／ｃｍ）で泳動した。次にスライドガラスを蒸留したＨ２Ｏで洗浄し、続いて１５分間のエアドライの前に５分間７０％ＥｔＯＨの中に浸した。スライドガラスを１：１００００ＸのSYBR Green I（Invitrogen, Eugene, OR, 米国）を含むＴＥ−バッファ溶液の中に水没させて、３０分間暗所においてインキュベートし、続いてＨ２Ｏでのリンス及び１５分間のエアドライを行った。次に、ＤＰ７２カメラを備えた１Ｘ７０顕微鏡（OLYMPUS, 新宿, 東京, 日本）を使用してスライドガラスをすぐに評価し、ソフトウェアcellSens Standard 1.6（OLYMPUS）を使用して画像をキャプチャした。明るさ及びコントラスト調節は、画像解析の前に、バイアスがかからないようにPhotoshop CS6（Adobe Systems Inc., San Jose, CA, 米国）を使用して全ての画像に関して実行した。自動的なコメット解析及びＯＴＭスコアリングは、事前に公開されたImageJ plug-in OpenComet 29 for ImageJ（version 1.48）を使用して実行した。このプロトコルは、事前に公開されたアルカリンコメットアッセイプロトコルの改変バージョンである。
【００６０】
ＨＳＣ様の細胞（HSC-like cells）を以下の培地の中にソートした：IMDM (+Hepes, -Glutamine) (GE Healthcare Bio-Sciences, Little Chalfont, 英国), 20% heat-inactivated FBS (Thermo Fisher Scientific), 1X L-Glutamine (Thermo Fisher Scientific), 10μg/ml Penicillin-Streptomycin Solution (GE Healthcare Biosciences)、なお下記のサイトカインが最終濃度１０ｎｇ/ｍｌで添加された：ｈＳＣＦ、ｈＦＬＴ３、ｈＩＬ３、ｈＴＰＯ、ｈＧＭ−ＣＳＦ（全てPeproTechから取得）。細胞は、Nunc MiniTrays（Thermo Fisher Scientific）上のウェルの中に、ウェルあたりに４個の細胞で２０μＬの培地を用いて分配した。次にプレートを、培地の蒸発乾燥を防止するために、ＰＢＳを容れた無菌のプラスチックボックス内の突起上に置いた。各ウェルは、ソート後の１８時間、５日、９日及び１３日の時点での細胞成長に関して、明視野顕微鏡検査を使用した画像キャプチャリング、それに続く手動の非バイアス領域被覆測定（manual unbiased area coverage estimation）によってスコア化した。
【００６１】
統計的解析は他に記載しない限り、unpaired Student's t testを使用して実行し、結果はｐ値＜０．０５で統計的に有意（significant）であると考えた。全てのグラフは、平均±ＳＥＭを表す。生物学的複製物（レプリカ）の数はｎ値によって示される。グラフ及び統計的な評価は、GraphPad Prism（GraphPad Software, San Diego, CA, 米国）を使用して実行した。
【００６２】
［実施例１］
上昇した活性酸素レベルは、ｈＰＳＣに由来する造血前駆細胞の機能の減少と相関する
図２Ａは、非培養性臍帯血、３日間継続培養された臍帯血及びｈＰＳＣ由来の血液に関する造血前駆細胞分画（ＣＤ４３／４５＋ＣＤ３４＋）のＲＯＳレベルを表すフローサイトメトリーヒストグラムを示す。ゲート設定手法は図３Ａにおいて詳述される。下段の棒グラフパネルは、造血前駆細胞の低ＲＯＳ（ROSlo）及び高ＲＯＳ（ROShi）ステータスを示す（ｎ＝３）。図２Ｂは、低ＲＯＳ（ROSlo）及び高ＲＯＳ（ROShi）のｈＰＳＣに由来する造血前駆細胞の代表的なアルカリンコメットを示す。図２Ｃは、非培養性臍帯血及びｈＰＳＣに由来する造血前駆細胞に関する、オリーブテールモーメント（ＯＴＭ）によって示される低ＲＯＳ及び高ＲＯＳの造血前駆細胞におけるＤＮＡダメージのレベルを示す（ｎ＝３）。図２Ｄは、５００個の低ＲＯＳ又は高ＲＯＳのｈＰＳＣに由来する造血前駆細胞から取得されるＣＦＵの数を表すグラフである。右パネルは、図示されたＣＦＵのサイズ分布を示す。図２Ｅは、ｈＰＳＣ由来のＣＤ４３／４５＋ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋造血前駆細胞個体群の低ＲＯＳ及び高ＲＯＳ分画に関する代表的なＦＡＣＳソートゲートを示す。棒グラフは、低ＲＯＳ又は高ＲＯＳ細胞の分布を示す（ｎ＝３）。図２Ｆは、ｈＰＳＣ由来のＣＤ４３／４５＋ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞の成長キャパシティを示すグラフである。上段パネルは、播種後の１８時間、５日、９日及び１３日におけるウェル培養密度（well confluency）によって表される代表的サンプル群（低ＲＯＳ及び高ＲＯＳのｈＰＳＣ由来のＣＤ４３／４５＋ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞）の成長キネティックスを示す。下段パネルは、当初は低ＲＯＳ又は高ＲＯＳ細胞として蒔いたものを１３日間継続培養後した、代表的な培養ウェルを示す（スケールバー＝２００μｍ）。データは、平均±ＳＥＭを表す。アスタリスクは有意差を示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ｎ．ｓ．有意差無し）。
【００６３】
低ＲＯＳ及び高ＲＯＳのｈＰＳＣに由来する造血前駆細胞のコロニー形成キャパシティ
図３Ａは、全ての（total）造血性分画（ＣＤ４３／４５＋）及び造血前駆細胞分画（ＣＤ４３／４５＋ＣＤ３４＋）に関する、非培養性臍帯血、継続培養された臍帯血（３日間）及びｈＰＳＣ由来の血液細胞内の造血細胞を表す代表的なフローサイトメトリードットプロットを示す。ゲートはＦＭＯコントロール及び二細胞（ダブレット）排除に基づく。造血前駆細胞分画に関するＲＯＳレベルが示される。図３Ｂは、非培養性臍帯血、ｉＰＳ細胞系統ＲＢ９−ＣＢ１及びＥＳ系統ＨＵＥＳ２に由来する造血前駆細胞のＲＯＳレベルを表すフローサイトメトリーヒストグラムを示す。図３Ｃは、臍帯血サンプルに基づく、低ＲＯＳ及び高ＲＯＳの造血前駆細胞に関する代表的なソートゲートを示す。図３Ｄは、ソートされた低ＲＯＳ及び高ＲＯＳのｈＰＳＣに由来する造血前駆細胞の分布を示す棒グラフである（ｎ＝３）。図３Ｅは、コロニータイプ及びサイズに基づく代表的なＣＦＵｓの顕微鏡写真を含む（スケールバー＝１００μｍ）。図３Ｆは、ＣＦＵ−Ｍ、ＣＦＵ−Ｇ、ＣＦＵ−ＧＭ及びＢＦＵ−Ｅに関するコロニータイプの分布を示す円グラフを示す（ｎ＝２〜３）。データは、平均±ＳＥＭとして示される。
【００６４】
この節及び明細書における他の節に記載のように、上昇したＲＯＳは、ネズミ及びヒトＨＳＣｓの両方及びそれらの前駆体の機能に障害をもたらすことが示されており、標準のインビトロ培養条件において培養した場合にこれらの原発性細胞は急速に低ＲＯＳから高ＲＯＳ状態へシフトするので、多能性幹細胞分化ステムにおけるＲＯＳレベルをインビトロでの生成及び造血細胞の機能に対するＲＯＳの影響を決定するために評価した。多能性の状態からの１６日間の分化の後に、確立されたマーカーを使用して造血細胞分画をそれらの細胞表面の表現型によって以下のように規定した（identified）：全ての（total）造血細胞分画はＣＤ４３／４５＋（初期及び全造血性マーカー（early−& pan−hematopoietic markers）の組み合わせ使用）として規定し、造血前駆細胞分画はＣＤ４３／４５＋ＣＤ３４＋として規定し、そして最も原始的な造血性分画（以前にＨＳＣ様として記載される）はＣＤ４３／４５＋ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋として規定した。我々の分化プロトコルを用いて生成した大多数のＣＤ４３／４５＋ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞はＣＤ３８に関してネガティブであることを我々は以前に実証しているので、表面マーカーＣＤ３８（ＣＤ３４＋分画内のＨＳＣｓに関してはネガティブにエンリッチであることが以前に記されている）は含めなかった。細胞透過性染料であるCellROX Deep Red（細胞内ＲＯＳが存在する際に蛍光になる）は、全ての細胞集団においてＲＯＳを測定するために使用した。我々のｈＰＳＣから血液へのプロトコルを使用した我々の解析と組み合せて鮮度よく単離されたＣＤ３４エンリッチの臍帯血細胞を、生理学的なレベルのＲＯＳを示す基準点として使用した（我々は低ＲＯＳと定義した（図２Ａ左上パネル及び図３Ａ上段パネル））。造血前駆細胞専用培地の中で３日間培養した同一の細胞は、ＲＯＳレベルを急速に増加させ、ほとんどの細胞が低ＲＯＳ表現型を示さなかった（我々は高ＲＯＳと定義した（図２Ａ上中央パネル及び図３Ａ中段パネル））。我々のｈＰＳＣに由来する造血前駆細胞（ＣＤ３４＋）におけるＲＯＳの解析は、大多数が高ＲＯＳ表現型を有することを実証した（図２Ａ、右上パネル及び図３Ａ下段パネル）。 類似のレベルのＲＯＳが異なるｈＰＳＣから生成した造血前駆細胞において観察された（図３Ｂ）。
【００６５】
ｉＰＳ細胞に由来する造血前駆細胞の機能に対するＲＯＳの影響を評価するために、細胞を低ＲＯＳ分画と高ＲＯＳ分画とに区分した（図３Ｃ〜Ｄ）。ＲＯＳがＤＮＡダメージを生じることが知られているため、低ＲＯＳ及び高ＲＯＳの造血前駆細胞におけるＤＮＡダメージの程度を直接的に評価した。この目的のために、一本鎖切断及び二本鎖切断の両方の測定が可能なアルカリンコメットアッセイを使用した。ソートされた造血前駆細胞の解析は、低ＲＯＳ分画と比較して高ＲＯＳ分画が有意に高いＤＮＡダメージを有することを実証した（図２Ｂ〜Ｃ）。更に、低ＲＯＳ又は高ＲＯＳに関してソートされたｈＰＳＣに由来する造血前駆細胞を、コロニー形成ユニット（colony forming unit：ＣＦＵ）アッセイにおいて、それらの成長及び分化キャパシティに関して評価した。ＣＦＵｓは、数、サイズ及びタイプに関して解析した（図２Ｄ、図２Ｅ〜Ｆ）。低ＲＯＳの造血前駆細胞（ＣＤ３４＋）は、対照となる高ＲＯＳと比較してより多数のＣＦＵｓを生成し（図２Ｄ、左パネル）、そして低ＲＯＳ細胞は、中サイズ及び大サイズのコロニーを有意により多く生成し、より優れた増殖キャパシティを示した（図２Ｄ、右パネル）。ＲＯＳレベルの差は異なるコロニータイプの頻度を変えなかったが、ＲＯＳに対してより感受性であることが知られている赤血球コロニー（ＢＦＵ−Ｅ）は、低ＲＯＳ前駆体由来のＣＦＵｓにおいてのみ観察された（図３Ｆ）。
【００６６】
大人のＨＳＣｓは、下流の造血性ヒエラルキーと比較して、ＲＯＳに対してより感受性であることが実証されている。異種移植アッセイにおいて再増殖可能なｈＰＳＣ分化培養物からのＨＳＣｓの生成における困難性を考慮して、我々は細胞の機能的特徴を評価するために代わりのアッセイを開発した。ＲＯＳの影響を評価するために、ｈＰＳＣ由来のＣＤ４３／４５＋ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞を低ＲＯＳ又は高ＲＯＳ表現型のいずれかに関してソートし（図２Ｅ、左パネル）、そしてテラサキプレート上に分布させ、１３日間にわたるいくつかの時点におけるそれらの成長を測定した（図２Ｆ、上パネル）。高ＲＯＳ細胞が非常に限定された細胞成長を示し、かつ老化を表す平坦化された形状を示すのに対し、低ＲＯＳ細胞は、増殖して大きいクラスターの造血細胞まで成長し（図２Ｆ、下パネル）、全ＣＤ９０＋前駆体分画における＜３％の低ＲＯＳ細胞が標準の条件において生成されるこれらの細胞の全ての増殖ポテンシャルを含むことを示した（図２Ｅ、右パネル）。これらの結果は、低ＲＯＳレベルがこれらのより原始的な造血細胞の拡大（expansion）／増殖（ＨＳＣ機能のカギとなる特徴）のために必要とされることを強力に示す。ｉＰＳ由来の造血性分化システムにおける高ＲＯＳレベルは、ＤＮＡダメージの増加と関連して、より原始的な造血細胞の成長キャパシティを顕著に害することも併せて示す。
【００６７】
［実施例２］
【００６８】
ＲＯＳ低減化手法は、低ＲＯＳ造血前駆細胞及びＨＳＣ様（HSC-Like）細胞を特別に増加させる
【００６９】
図４Ａは、ある実施形態（複数）においてＲＯＳの低減のために使用され得る４つの要素の模式図を示す。図４Ｂは、抗酸化剤（アスコルビン酸＋クエン酸）のカクテルによるＲＯＳ除去（scavenging）、４−ＡＢＡＨによるミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）ブロッキング、ＬＹ２２２８８２０によるｐ３８ＭＡＰ阻害、２１％から４％への酸素分圧の低減、又はすべての要素の組み合わせ（ＡＦＣ）、及びコントロール条件（ＤＭＳＯ）を用いて生成したｈＰＳＣに由来する造血前駆細胞のＲＯＳ（ｇＭＦＩを測定）を示す棒グラフである（ｎ＝３）。統計は、対応ありｔ−テスト（paired parametric t-test）に基づく。右ｙ軸は、非培養性臍帯血からの造血前駆細胞の生理学的なＲＯＳレベル（０に設定）及びコントロール条件において生成した造血前駆細胞のＲＯＳレベル（１００に設定）と比較した際のＲＯＳの低減の程度を表す。図４Ｃは、上記の条件で生成したｈＰＳＣ由来の培養物の生存率（７ＡＡＤ−）を示す棒グラフである（ｎ＝３）。図４Ｄは、ｈＰＳＣ由来の全造血細胞（ＣＤ４３／４５＋）、造血前駆細胞（ＣＤ４３／４５＋ＣＤ３４＋）、及びＣＤ９０＋造血前駆細胞（ＣＤ４３／４５＋ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋）、コントロール条件での生成物又はＡＦＣでの生成物に関する代表的なフローサイトメトリードットプロットを示す。ゲートは、ＦＭＯコントロールに基づく。二細胞（ダブレット）排除及び死細胞排除（７ＡＡＤ）は、ゲートを適用する前に行った。ＨＳＣ様分画に関するＲＯＳレベルが示される。図４Ｅは、低ＲＯＳの全造血細胞、低ＲＯＳ造血前駆細胞、及び低ＲＯＳＣＤ９０＋造血前駆細胞の頻度の倍数変換値を示す棒グラフである。値はコントロール（１として設定）に対して規格化（normalized）されている（ｎ＝３）。図４Ｆは、同一量の当初（initial）ｈＰＳＣｓから生成した低ＲＯＳのＣＤ４３／４５＋ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞の産出量を示す棒グラフである（ｎ＝３）。図４Ｇは、全（低ＲＯＳ＋高ＲＯＳ）造血細胞、造血前駆細胞分画及びＣＤ９０＋造血前駆細胞分画の頻度の倍数変換値を示す棒グラフである。値は、コントロール（１として設定）に対して規格化されている（ｎ＝３）。データは、平均±ＳＥＭを表す。アスタリスクは有意差を示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、n．s．有意差無し）。
【００７０】
ｈＰＳＣに由来する造血前駆細胞におけるＲＯＳの生理学的なレベルを促進して得る（facilitate）手段を確認するために、我々は、各々別のメカニズムによってＲＯＳを減少させることを狙いとした４つの手法を採用した（図４Ａ）：１）抗酸化剤（アスコルビン酸及びクエン酸）のカクテルによるＲＯＳ除去、２）４−アミノ安息香酸（４−ＡＢＡＨ）を用いたミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）阻害によって自然免疫細胞媒介性ＲＯＳ放出を防止する、３）小分子ＬＹ２２２８８２０を用いたｐ３８αマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）阻害によってストレス応答媒介性ＲＯＳ生成を制限する、及び４）培養の間の酸素濃度を４％へ減少させることによってＲＯＳを減少させる。個々に適用した場合に、各々のＲＯＳ低減手法は、１１〜４７％の間でＲＯＳを減少させ（図４Ｂ）、このことは自然免疫の活性化、ストレスシグナリングの活性化及び超生理学的な酸素レベルに起因するＲＯＳ生成の加速が、共同（総合）して我々の細胞において観察された増加したＲＯＳに寄与することを示す。自発性及び酵素的に生成されるＲＯＳからの広義の（broad）保護を提供するために全ての要素の組み合わせ（ＡＦＣ）を使用した。最も強力なＲＯＳレベルの低減が促進され（図４Ｂ）、ｈＰＳＣ由来のコントロール条件と比較して６０％減少と同等であり、非培養性臍帯血のＲＯＳレベルに近づいた。重要なことに、これらのＲＯＳ低減手法を使用しても細胞の生存率はネガティブな影響を受けなかった（図４Ｃ）。しかしながら、全造血細胞（ＣＤ４３／４５＋）、造血前駆細胞（ＣＤ４３／４５＋ＣＤ３４＋）、及び以前に記載したＨＳＣ様表面マーカー（ＣＤ４３／４５＋ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋）を有する細胞の頻度の解析（図４Ｄ）は、ＡＦＣが低ＲＯＳの全血液細胞の頻度を２倍に有意に増加させ、そして低ＲＯＳ前駆体を５倍に有意に増加させることを実証した（図２Ｅ）。興味深いことに、ＡＦＣ条件は、低ＲＯＳのＣＤ４３／４５＋ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞の頻度を１５倍に増加させた（図４Ｅ）。更に、同一量の多能性の出発材料から、ＡＦＣ条件は、標準の条件と比較して、低ＲＯＳのＣＤ４３／４５＋ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞の全産出量において１８倍の増加をもたらした（図４Ｆ）。標準の条件と比較して、中程度（１．５倍）であるが統計的に有意な増加が全（低ＲＯＳ＋高ＲＯＳ）ＣＤ４３／４５＋ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞の頻度においても存在した（図４Ｇ）。これらの結果は協同して、いくつかの実施形態においてインビトロにおいて培養された造血細胞における増加したＲＯＳが複数のメカニズムに起因すること、ＲＯＳ低減方法の組み合わせがＲＯＳの顕著な減少を可能にすること、ｈＰＳＣｓからの低ＲＯＳ造血前駆細胞の増加、そして優先的に（preferentially）より原始的なＣＤ９０＋ＨＳＣ様分画の増加を特別に促進することを実証する。
【００７１】
［実施例３］
ＲＯＳの低減が強力な成長キャパシティを有する低ＲＯＳのＣＤ９０＋造血細胞を増加させる
図５Ａは、ＡＦＣの後に生成されるＣＤ４３／４５＋ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞の低ＲＯＳ及び高ＲＯＳ分画をソートするための代表的なＦＡＣＳゲートを示す。棒グラフは、低ＲＯＳ及び高ＲＯＳ細胞の分布を示す（ｎ＝３）。図５Ｂは、細胞の成長キネティックスを示す。左パネルは、播種後１８時間、５日間、９日間及び１３日間におけるウェルコンフルエンス（％）によって測定した際の、ＡＦＣで生成した代表的なサンプル群（低ＲＯＳ及び高ＲＯＳのＣＤ４３／４５＋ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞）の成長キネティックスを示す。右パネル棒グラフは、１３日目における＞１０％ウェルコンフルエンスを有するウェルの頻度を示す。図５Ｃは、ＡＦＣを用いた高い増殖キャパシティを有する低ＲＯＳのＣＤ４３／４５＋ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞の生成における倍数変換値を示し、コントロール条件（ＤＭＳＯ）に対して規格化されている。データは平均±ＳＥＭを示す。アスタリスクは有意差を示す（＊ｐ＜０．０５、n．s．有意差無し）。
【００７２】
ＡＦＣ条件において生成した細胞の成長キャパシティという意味合いにおける機能を評価するために、ＣＤ４３／４５＋ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞を低ＲＯＳ分画と高ＲＯＳ分画とに区分して、テラサキウェルに蒔いた。ソートゲートは、同時に解析した臍帯血サンプルのＲＯＳプロファイルに基づいた。これらのｈＰＳＣ由来の細胞のおよそ５０％は、低ＲＯＳ表現型を示した（図５Ａ）。ＡＦＣで生成された低ＲＯＳのＣＤ４３／４５＋ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞は、高ＲＯＳ分画の限定されたパフォーマンスと比較してより高い成長キャパシティを示した（図５Ｂ、左パネル）。増殖することが可能な低ＲＯＳの細胞の比率も、高ＲＯＳに比べて増加した。つまり、ＲＯＳ低減要素がＲＯＳを減少させるのみならず、ＣＤ９０＋前駆体分画の機能的な成長キャパシティも増加させることが確認された（図５Ｂ、右パネル）。さらに、ＡＦＣでは、標準の条件と比較した際に、強力な成長キャパシティを有する生成された低ＲＯＳのＣＤ４３／４５＋ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞におけるトータルの増加が２２倍高かった（図５Ｃ）。これらの発見は、高いＲＯＳレベルが最も原始的なｈＰＳＣに由来する造血前駆細胞において増殖という意義の機能を限定すること、及び我々のＲＯＳを低減させる手法がそのような成長キャパシティを有する造血前駆細胞の産出量を顕著に増加させることを実証する。
【００７３】
この研究において、我々は、我々の標準の条件又はＲＯＳを低減させるＡＦＣ条件のいずれかで生成した細胞の生着キャパシティについても評価した。移植ＮＳＧマウスにおける生着のストリンジェントな評価を使用した場合には、我々は非常に低レベルのヒト造血細胞しか見いだせず、ネガティブコントロールと識別できず、本研究において報告した６０％のＲＯＳ減少が我々のｈＰＳＣ由来の造血細胞に対して生着キャパシティを与えるのには不十分であったことを示した（データは示さず）。それにもかかわらず、達成されたレベルの減少が、ＡＦＣ条件下ではｈＰＳＣ由来の細胞に関してＨＳＣ機能の特徴（細胞の拡大（増殖：expansion））を改善することを実証し、そしてそれ故に機能的に適切な造血幹細胞のインビトロの生成がＲＯＳレベルの制御を必要とするだろうことを実証した。
【００７４】
［実施例４］
内皮細胞は低いＲＯＳを有し、そしてＲＯＳ低減手法はより原始的な造血細胞分画におけるＲＯＳを特別に減少させる
図６Ａは、ｈＰＳＣ由来のＣＤ９０＋造血前駆細胞（ＣＤ４３／４５＋ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋）及び内皮細胞（ＣＤ４３／４５−ＣＤ３４ｈｉＣＤ９０ｈｉ）を示す代表的なフローサイトメトリードットプロットを示す。ゲートは、ＦＭＯコントロール、二細胞（ダブレット）排除、及び死細胞排除に基づく。図６Ｂは、ＤＭＳＯコントロール（グレー）及びＡＦＣ（緑）に関する内皮の個体群のＲＯＳレベルを表す代表的なヒストグラムプロットを示す。図６Ｃは、コントロール条件（ＤＭＳＯ）及びＡＦＣで生成した内皮及びＣＤ９０＋造血前駆細胞分画のＲＯＳ（ｇＭＦＩ）を示す（ｎ＝３）。図６Ｄは、コントロール条件及びＡＦＣで生成した内皮及びＣＤ９０＋造血前駆細胞分画の頻度を示す（ｎ＝４）。データは、平均±ＳＥＭを示す。アスタリスクは、有意差を示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、n．s．有意差無し）。
【００７５】
インビボの胚発生の間及びインビトロの多能性幹細胞からの分化の間の両方において、造血細胞の起源は、造血ポテンシャルを有する内皮細胞から生じることが示されている。血液へ方向づけられた分化培養物において存在する別のタイプの細胞におけるＲＯＳのレベルを評価するために、ＣＤ４３−ＣＤ３４ｈｉＣＤ９０ｈｉ内皮細胞分画におけるＲＯＳレベルを評価した（図６Ａ〜Ｂ）。標準の培養条件を使用したｉＰＳに由来する内皮細胞における細胞内ＲＯＳレベルは均一に低く、そして、ＡＦＣの追加では更に減少しなかった（図６Ｃ）。これは、同一ウェルにおける造血細胞のＣＤ４３／４５＋ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋分画（ＡＦＣでは標準条件と比較して細胞内ＲＯＳの顕著な減少が促進される）と対照的である。さらに、ＡＦＣは内皮細胞の頻度を有意に変化させなかったが（図６Ｄ）、その一方でＣＤ４３／４５＋ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＨＳＣ様分画の１．５倍の増加と類似する頻度における変化の傾向が示唆された。これらの観察結果は、それらのＲＯＳレベルを制御する分化システムにおいて異なるタイプの細胞の能力に大きな差があること、つまり、広い（Broad）内皮細胞分画はその細胞内ＲＯＳレベルを効果的に管理するが、その一方で造血前駆細胞は培養液中で低いＲＯＳプロファイルを保持することができず結果として成長ポテンシャルにおける欠陥を示すこと、を示唆する。ＣＤ３４＋前駆体と比較して、ＡＦＣを使用した場合に最も大きなＲＯＳレベルの減少を表すＣＤ９０＋造血前駆細胞分画は細胞の頻度及び数における最も大きな増加をもたらし、結果として成長キャパシティを有する細胞の２１倍の増加をもたらす。このことは、図２Ｅの知見と合わせて、培養システム中の最も原始的な造血細胞がＲＯＳに対して最も感受性であり、ＲＯＳの低減手法から最も多くの利益を得ることができることを示す。
【００７６】
図７Ａ〜Ｄは、多能性幹細胞分化培養物におけるｃＡＭＰ活性化による細胞内のＲＯＳレベルを減少させる方法を使用した場合の結果の実施形態（複数）を示す。サイクリックＡＭＰの誘導は、ｈＰＳＣ由来の造血細胞における酸化的ストレスを減少させ、かつＣＸＣＲ４を誘導し得る。パートＡは、ｈＰＳＣから造血細胞への分化の１４日目における活性酸素（ＲＯＳ）の検出に関するフローサイトメトリック解析を示す。代表的なフローサイトメトリープロット（bi指数関数的なｘ軸）は、造血性の表面表現型におけるＲＯＳレベルを示す。ＦＭＯコントロール、蛍光マイナス−ｏｎｅ（染色コントロール）。パートＢは、（Ａ）において示したＣｅｌｌＲＯＸ染料の蛍光輝度（ｇＭＦＩ）の幾何学的な平均の定量化を示す。データは、３つの独立な実験の平均±ＳＥＭを示す。統計的な解析はｔ−テストを使用して行った。有意性は、コントロールセッティングと比較して示される。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、ｎ．ｓ．有意差無し。パートＣは、表記のレドックス状態（ＰＳＣ由来の造血細胞における遺伝子を制御）のｑＲＴ−ＰＣＲ発現解析を示す。ハウスキーピング遺伝子ＡＣＴＢ（β−アクチン）に対する各遺伝子の相対的な発現量を算出した。コントロール条件（１に設定）に対するそれぞれの平均倍数変換値を示す。データは、２つの独立な実験の平均±ＳＥＭを示す。統計的な解析は、ｔ−テストを使用して行った。有意性はコントロールセッティングと比較して示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、ｎ．ｓ．有意差無し。パートＤは、ＰＳＣ由来の造血細胞における、記載のｐ３８ＭＡＰＫ関連遺伝子のｑＲＴ−ＰＣＲ発現解析を示す。ハウスキーピング遺伝子ＡＣＴＢ（β−アクチン）に対する各遺伝子の相対的な発現量を算出した。コントロール条件（１に設定）に対するそれぞれの平均倍数変換値を示す。データは、２つの独立な実験の平均±ＳＥＭを示す。統計的な解析は、ｔ−テストを使用して行った。有意性はコントロールセッティングと比較して示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、ｎ．ｓ．有意差無し。
【００７７】
本願はある実施形態（複数）について記載しているが、本願において図示及び記載される方法及びデバイスの多くの視点・側面は、更なる実施形態又は許容可能な例を構成するように異なる様に組み合わされそして／又は変更され得ることが当業者には理解されるだろう。全てのそのような変更及びバリエーションがこの開示の範囲内で本願に含まれる。実際に、多種多様なデザイン及びアプローチが可能であり、この開示の範囲内である。本願に開示されるいずれの特徴、構造又はステップも必須又は必要不可欠ではない。さらに、例示的な実施形態（複数）が本願に記載されているが、いずれかの及び全ての実施形態の範囲は、均等の要素、修飾、省略、組み合わせ（例えば、種々の実施形態にわたる視点）、置換、適応及び／又は変形を有することが、本出願に基づく分野の当業者には評価されるだろう。ある実施形態（複数）が記載されているが、これらの実施形態は例示のみのために示されるに過ぎず、保護の範囲を限定することを意図するものではない。
【００７８】
特定の視点、実施形態又は実施例と組み合せて記載した特徴、材料、特性又はグループは、それらと矛盾しない限り、この節又はこの明細書の他の箇所に記載したいずれかの他の視点、実施形態又は実施例に対して適用可能であると理解される。この明細書（特許請求の範囲、要約書及び図面を含む）に開示された全ての特徴及び／又はいずれかの方法又はプロセスの全てのステップは、少なくともいくつかのそのよう特徴及び／又はステップが相互に排他的である組み合わせを除いて、任意に組み合わせられ得る。保護は、いずれかの上述の実施形態の詳細に制限されない。保護は、この明細書（特許請求の範囲、要約書及び図面を含む）に開示されたいずれかの新規のもの又はいずれかの新規の組み合わせまで、又は開示されたいずれかの方法又はプロセスのステップのいずれかの新規のもの又はいずれかの新規の組み合わせまで、及ぶ。
【００７９】
更に、個別の実施形態という文脈で本願に記載されたある特徴は、単一の実施形態における組み合わせとしても実施され得る。逆に、単一の実施形態という文脈で記載された種々の特徴は、複数の実施形態において別々に、又はいずれかの適切な部分的組合せにおいても実施され得る。さらに、特徴はある組み合わせにおいて役割を果たすと上述されたかもしれないが、請求の範囲に記載の組み合わせからの１以上の特徴が、いくつかのケースにおいて組み合わせから切り離され、部分的組合せ（subcombination）又は部分的組合せのバリエーションとして請求の範囲に記載され得る。
【００８０】
さらに、操作（operations）が図面又は明細書において特定の順番で記載されているかもしれないが、そのような操作は記載された特定の順番又は連続的な順番で実行しなければならないのではなく、望ましい結果を達成するように全ての操作が実行され得る。記載されない他の操作を実施例方法及びプロセスに組み込むことができる。例えば、１以上の追加の操作を、いずれかの記載した操作の前、後、同時に、又はその間に実行することができる。更に、操作は、他の実施形態において再編成又は順番の入れ替えを行うことができる。いくつかの実施形態において、記載されたプロセス中に行われる実際のステップは図面に記されたものとは異なり得ることを当業者は評価するだろう。実施形態に依存して、上述のステップのいくつかは除かれ得るし、その他は追加され得る。更に、上記の特定の実施形態の特徴及び特性は、異なる仕方で組み合わせて追加の実施形態を構成することができ、全て本出願の範疇内である。上記の実施形態における種々のシステムの構成要素の分離形態は、全ての実施形態においてそのような分離が必要であると理解されるべきではなく、記載した構成要素及びシステムが単一のものに一般的に統合される、又は複数のものにパッケージされると理解されるべきである。
【００８１】
本開示の目的のために、ある視点、利点、及び新規の特徴が記載される。全てのそのような利点がいずれかの特定の実施形態に従って達成され得る必要は無い。つまり、例えば、開示は本願に記された１つの利点又１グループの利点を達成する様式で構成又は実行され、本願に教示又は示唆された他の利点を達成する必要はないと当業者であれば認識するだろう。
【００８２】
「できる」（「can」、「could」）、「し得る」（「might」又は「may」）などの助動詞は、他に特別に記載されない限り、又は使用される文脈内で理解されない限り、ある実施形態がある特徴、要素及び／又はステップを含み他の実施形態は含まないことを言い表すように一般的に意図される。つまり、そのような助動詞は、特徴、要素及び／又はステップが１以上の実施形態に必須であること、又はこれらの特徴、要素及び／又はステップが含まれるか又はいずれかの特定の実施形態において実行されるか否かを、ユーザのインプット又は意図の有無に関わらず、決定するためのロジックを１以上の実施形態が必然的に含むことの暗示を一般的に意図するものではない。
【００８３】
語句「少なくともＸ、Ｙ、及びＺの１つ」などの接続詞（副詞：conjunctive）は、他に特別に記載されない限り、使用される文脈と共に、アイテム、用語などがＸ、Ｙ又はＺのいずれかであり得るという意味合いで他に理解される。つまり、そのような接続詞は、ある実施形態が少なくとも１つのＸ、少なくとも１つのＹ、及び少なくとも１つのＺの存在を必要とすることの示唆を一般的には意図しない。
【００８４】
本願において使用した度合いの用語（用語「およそ：approximately」、「約：about」、「一般的には：generally」及び「実質的には：substantially」など）は、値、量又は記載された値、量に近い特徴もしくは所望の機能又は所望の結果を達成する特徴を表す。例えば、用語「およそ」、「約」、「一般的には」、及び「実質的には」は、記載された量の１０％未満内、５％未満内、１％未満内、０．１％未満内、及び０．０１％未満内の量を意味し得る。他の例として、ある実施形態において、用語「一般的に平行」及び「実質的に平行」は、正確な平行から１５度、１０度、５度、３度、１度、０．１度、その他以下づつ逸脱した値、量又は特徴を意味する。
【００８５】
本出願の範囲が、この節又はこの明細書の他の箇所における好ましい実施形態の特定の開示によって限定されることを意図しておらず、この節又はこの明細書における他の箇所において記載されるように特許請求の範囲に記載されている、又は将来的に記載されるように定義され得る。特許請求の範囲の表現は、特許請求の範囲において採用された表現に基づいて広義に解釈され、当明細書に記載の例又は本願の審査の間に記載される例には限定されない。これらの例は排他的ではないものと解釈される。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】全図
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図１】
2020512830.tif 000031
【図２Ａ】
2020512830.tif 000032
【図２Ｂ】
2020512830.tif 000033
【図２Ｃ】
2020512830.tif 000034
【図２Ｄ】
2020512830.tif 000035
【図２Ｅ】
2020512830.tif 000036
【図２Ｆ】
2020512830.tif 000037
【図３Ａ】
2020512830.tif 000038
【図３Ｂ】
2020512830.tif 000039
【図３Ｃ】
2020512830.tif 000040
【図３Ｄ】
2020512830.tif 000041
【図３Ｅ】
2020512830.tif 000042
【図３Ｆ】
2020512830.tif 000043
【図４Ａ】
2020512830.tif 000044
【図４Ｂ】
2020512830.tif 000045
【図４Ｃ】
2020512830.tif 000046
【図４Ｄ】
2020512830.tif 000047
【図４Ｅ】
2020512830.tif 000048
【図４Ｆ】
2020512830.tif 000049
【図４Ｇ】
2020512830.tif 000050
【図５Ａ】
2020512830.tif 000051
【図５Ｂ】
2020512830.tif 000052
【図５Ｃ】
2020512830.tif 000053
【図６Ａ】
2020512830.tif 000054
【図６Ｂ】
2020512830.tif 000055
【図６Ｃ】
2020512830.tif 000056
【図６Ｄ】
2020512830.tif 000057
【図７】
2020512830.tif 000058
【手続補正書】
【提出日】令和2年3月5日(2020.3.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を別のタイプの細胞へ移行させる際の細胞ストレスを調和（mediating）する方法であって、以下の内の２つ以上を実行しつつ、前記細胞の前記移行を導く条件下において前記細胞を培養すること、を含む方法、
細胞の周囲の培地の中の利用可能な酸素を減少させること、
抗酸化剤を用いて細胞を処理すること、
細胞の細胞ストレス応答経路を阻害すること、
細胞の自然免疫応答を阻害すること、及び、
細胞内活性酸素の濃度を低下させる細胞経路を活性化すること。
【請求項２】
ヒト血液前駆細胞を血液細胞へ移行させる際の細胞ストレスを調和する方法であって、以下の内の１つ以上を実行しつつ、前記前駆細胞の血液細胞への前記移行を導く条件下において前記ヒト血液前駆細胞を培養すること、を含む方法、
ヒト血液前駆細胞の周囲の培地の中の利用可能な酸素を減少させること、
抗酸化剤を用いてヒト血液前駆細胞を処理すること、
ヒト血液前駆細胞の細胞ストレス応答経路を阻害すること、
ヒト血液前駆細胞の自然免疫応答を阻害すること、及び、
細胞内活性酸素の濃度を低下させる細胞経路を活性化すること。
【請求項３】
前記細胞内活性酸素の濃度を低下させる細胞経路の活性化が、ｃＡＭＰシグナル伝達活性化因子を用いて細胞を処理することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞の周囲の培地の中の利用可能な酸素の減少が、細胞を低酸素環境に置くことを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記抗酸化剤が、アスコルビン酸、クエン酸、ビタミンＥ、セレン、メラトニン、ＮＡＣ、グルタチオン、チオレドキシン、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ及びクエン酸一水和物からなる群から選択される成分を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞ストレス応答経路の阻害が、ミトコンドリアｐ５３媒介アポトーシスの阻害を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞ストレス応答経路の阻害が、ｐ３８媒介性老化の阻害を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞ストレス応答経路の阻害が、小胞体ストレスを阻害することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞ストレス応答経路の阻害が、非ミトコンドリアカルパイン媒介ストレスを阻害することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１０】
前記自然免疫応答の阻害が、ミエロペルオキシダーゼ阻害因子を用いてミエロペルオキシダーゼ産生を阻害することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞ストレス応答経路の阻害が、細胞の非ミトコンドリアカルパイン媒介アポトーシスを阻害することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１２】
前記利用可能な酸素の減少が、培養システム中の酸素の量を約４％に減らすことを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１３】
以下の内の２つ以上を含む、ヒト血液細胞の新規生成のための培地、
抗酸化剤；
ミトコンドリアｐ５３媒介アポトーシスの阻害因子；
非ミトコンドリアカルパイン媒介アポトーシスの阻害因子；
小胞体ストレスの阻害因子；
自然免疫応答阻害因子；
ｐ３８媒介老化の阻害因子；及び
ｃＡＭＰシグナル伝達経路活性化因子。
【国際調査報告】
2020512830.tif 000059
2020512830.tif 000060
2020512830.tif 000061