(57)【要約】本開示は、標的遺伝子の発現を条件的に調節するためのシステム、方法、および組成物を提供する。本開示の態様は、細胞内シグナル伝達経路を利用して、遺伝子（例えば、導入遺伝子、外因性遺伝子、内因性遺伝子）の発現を調節する。一局面では、細胞における第１の標的遺伝子の発現を調節するためのシステムが提供され、このシステムは、第１のリガンド結合ドメインおよび第１のシグナル伝達ドメインを含む第１の膜貫通受容体であって、第１のリガンドが前記第１のリガンド結合ドメインに結合すると、前記第１のシグナル伝達ドメインが前記細胞の第１のシグナル伝達経路を活性化する、第１の膜貫通受容体と、第１のプロモーターの制御下に置かれた第１の遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）をコードする核酸配列を含む第１の発現カセットとを含む。
2020530309.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞における第１の標的遺伝子の発現を調節するためのシステムであって、
第１のリガンド結合ドメインおよび第１のシグナル伝達ドメインを含む第１の膜貫通受容体であって、第１のリガンドが前記第１のリガンド結合ドメインに結合すると、前記第１のシグナル伝達ドメインが前記細胞の第１のシグナル伝達経路を活性化する、第１の膜貫通受容体と、
第１のプロモーターの制御下に置かれた第１の遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）をコードする核酸配列を含む第１の発現カセットであって、前記第１のＧＭＰが第１のアクチュエータ部分を含み、前記第１のリガンドが前記第１のリガンド結合ドメインに結合すると、前記第１のプロモーターが活性化されて前記第１のＧＭＰの発現を駆動する、第１の発現カセットとを含み、
発現された前記第１のＧＭＰが前記第１の標的遺伝子の発現を調節する、システム。
【請求項２】
第２のリガンド結合ドメインおよび第２のシグナル伝達ドメインを含む第２の膜貫通受容体であって、第２のリガンドが前記第２のリガンド結合ドメインに結合すると、前記第２のシグナル伝達ドメインが前記細胞の第２のシグナル伝達経路を活性化する、第２の膜貫通受容体をさらに含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
（ｉ）前記第１のリガンドが前記第１のリガンド結合ドメインに結合し、かつ／または（ｉｉ）前記第２のリガンドが前記第２のリガンド結合ドメインに結合すると、前記第１のプロモーターが活性化されて前記第１のＧＭＰの発現を駆動する、請求項２に記載のシステム。
【請求項４】
第２のプロモーターの制御下に置かれた第２の遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）をコードする核酸配列を含む第２の発現カセットであって、前記第２のＧＭＰが第２のアクチュエータ部分を含み、前記第２のリガンドが前記第２のリガンド結合ドメインに結合すると、前記第２のプロモーターが活性化されて前記第２のアクチュエータ部分の発現を駆動する、第２の発現カセットをさらに含む、請求項２に記載のシステム。
【請求項５】
前記第２のＧＭＰが、前記細胞における第２の標的遺伝子の発現を調節する、請求項４に記載のシステム。
【請求項６】
（ｉ）前記第１のプロモーターが、前記第１のリガンドが前記第１のリガンド結合ドメインに結合すると活性化される第１の内因性プロモーターを含み、かつ／または（ｉｉ）前記第２のプロモーターが、前記第２のリガンドが前記第２のリガンド結合ドメインに結合すると活性化される第２の内因性プロモーターを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項７】
（ｉ）前記第１のＧＭＰをコードする前記核酸配列が、前記第１の内因性プロモーターに作動可能に連結され、かつ／または（ｉｉ）前記第２のＧＭＰをコードする前記核酸配列が、前記第２の内因性プロモーターに作動可能に連結される、請求項６に記載のシステム。
【請求項８】
（ｉ）前記第１の発現カセットが、第１の内因性タンパク質をコードする第１の遺伝子を含み、前記第１の遺伝子が、前記第１のＧＭＰをコードする前記核酸配列の上流に位置し、前記第１の内因性タンパク質の発現が、前記第１の内因性プロモーターによって駆動され、かつ／または（ｉｉ）前記第２の発現カセットが、第２の内因性タンパク質をコードする第２の遺伝子を含み、前記第２の遺伝子が、前記第２のＧＭＰをコードする前記核酸配列の上流に位置し、前記第２の内因性タンパク質の発現が、前記第２の内因性プロモーターによって駆動される、請求項６に記載のシステム。
【請求項９】
（ｉ）前記第１の遺伝子と前記第１のＧＭＰをコードする前記核酸配列とが、第１のペプチドリンカーをコードする核酸配列によって結合されており、かつ／または（ｉｉ）前記第２の遺伝子と前記第２のＧＭＰをコードする前記核酸配列とが、第２のペプチドリンカーをコードする核酸配列によって結合されている、請求項８に記載のシステム。
【請求項１０】
前記第１のペプチドリンカーおよび／または前記第２のペプチドリンカーが、プロテアーゼ認識配列を含む、請求項９に記載のシステム。
【請求項１１】
前記第１のペプチドリンカーおよび／または前記第２のペプチドリンカーが、自己切断セグメントを含む、請求項９に記載のシステム。
【請求項１２】
前記自己切断セグメントが、２Ａペプチドを含む、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１３】
前記２Ａペプチドが、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＦ２Ａである、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１４】
（ｉ）前記第１の遺伝子と前記第１のＧＭＰをコードする前記核酸配列とが、第１の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む核酸配列によって結合されており、かつ／または（ｉｉ）前記第２の遺伝子と前記第２のＧＭＰをコードする前記核酸配列とが、第２のＩＲＥＳを含む核酸配列によって結合されている、請求項８に記載のシステム。
【請求項１５】
（ｉ）前記第１のプロモーターが、前記第１のリガンドが前記第１のリガンド結合ドメインに結合すると活性化される第１の外因性プロモーターを含み、かつ／または（ｉｉ）前記第２のプロモーターが、前記第２のリガンドが前記第２のリガンド結合ドメインに結合すると活性化される第２の外因性プロモーターを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１６】
（ｉ）前記第１の外因性プロモーターが合成プロモーター配列を含み、かつ／または（ｉｉ）前記第２の外因性プロモーターが合成プロモーター配列を含む、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１７】
（ｉ）前記第１のＧＭＰをコードする前記核酸配列が前記第１の外因性プロモーターに作動可能に連結されており、かつ／または（ｉｉ）前記第２のＧＭＰをコードする前記核酸配列が前記第２の外因性プロモーターに作動可能に連結されている、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１８】
（ｉ）前記第１の膜貫通受容体が内因性受容体を含み、かつ／または（ｉｉ）前記第２の膜貫通受容体が内因性受容体を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１９】
（ｉ）前記第１の膜貫通受容体が合成受容体を含み、かつ／または（ｉｉ）前記第２の膜貫通受容体が合成受容体を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項２０】
（ｉ）前記第１の膜貫通受容体が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、インテグリン受容体、もしくはＮｏｔｃｈ受容体を含み、かつ／または（ｉｉ）前記第２の膜貫通受容体が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、インテグリン受容体、もしくはＮｏｔｃｈ受容体を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項２１】
（ｉ）前記第１の膜貫通受容体がＧＰＣＲを含み、かつ／または（ｉｉ）前記第２の膜貫通受容体がＧＰＣＲを含む、請求項２０に記載のシステム。
【請求項２２】
（ｉ）前記第１の膜貫通受容体がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含み、かつ／または（ｉｉ）前記第２の膜貫通受容体がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、請求項２０に記載のシステム。
【請求項２３】
前記ＣＡＲの前記リガンド結合ドメインが、Ｆａｂ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、細胞外受容体ドメイン、およびＦｃ結合ドメインのうちの少なくとも１つを含む、請求項２２に記載のシステム。
【請求項２４】
前記ＣＡＲの前記シグナル伝達ドメインが、免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含む、請求項２２または２３に記載のシステム。
【請求項２５】
前記ＣＡＲの前記シグナル伝達ドメインが、免疫受容体抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を含む、請求項２２または２３に記載のシステム。
【請求項２６】
前記ＣＡＲの前記シグナル伝達ドメインが共刺激ドメインを含む、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項２７】
前記第１のＧＭＰの前記アクチュエータ部分および／または前記第２のＧＭＰの前記アクチュエータ部分がＲＮＡ誘導型アクチュエータ部分であり、前記システムが、前記ＲＮＡ誘導型アクチュエータ部分と複合体を形成するガイドＲＮＡをさらに含む、先行する請求項のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項２８】
前記ＲＮＡ誘導型アクチュエータ部分がＣａｓ９である、請求項２７に記載のシステム。
【請求項２９】
Ｃａｓ９が、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９である、請求項２８に記載のシステム。
【請求項３０】
Ｃａｓ９が、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  Ｃａｓ９である、請求項２８に記載のシステム。
【請求項３１】
Ｃａｓ９が、ヌクレアーゼ活性を実質的に欠如する、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項３２】
前記ＲＮＡ誘導型アクチュエータ部分がＣｐｆ１である、請求項２７に記載のシステム。
【請求項３３】
Ｃｐｆ１が、ヌクレアーゼ活性を実質的に欠如する、請求項３２に記載のシステム。
【請求項３４】
前記第１のＧＭＰおよび／または前記第２のＧＭＰが、核局在化配列（ＮＬＳ）を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項３５】
前記第１のＧＭＰおよび／または前記第２のＧＭＰが、転写活性化因子または転写抑制因子を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項３６】
前記第１のプロモーターおよび／または前記第２のプロモーターが、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＲＦ４、ＮＲ４Ａ１、ＰＲＤＭ１、ＴＢＸ２１、ＣＤ６９、ＣＤ２５、およびＧＺＭＢプロモーターから選択される、先行する請求項のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項３７】
前記第１の標的遺伝子および／または前記第２の標的遺伝子が、サイトカイン、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、または免疫チェックポイント阻害剤をコードする、先行する請求項のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項３８】
前記第１の標的遺伝子および／または前記第２の標的遺伝子が、免疫チェックポイント阻害剤をコードする、請求項３７に記載のシステム。
【請求項３９】
前記免疫チェックポイント阻害剤が、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ−３、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＩＤＯ、ＫＩＲ、またはＶＩＳＴＡである、請求項３８に記載のシステム。
【請求項４０】
前記細胞が、免疫細胞、造血前駆細胞、または造血幹細胞である、先行する請求項のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項４１】
前記細胞が免疫細胞である、請求項４０に記載のシステム。
【請求項４２】
前記免疫細胞がリンパ球である、請求項４１に記載のシステム。
【請求項４３】
前記リンパ球がＴ細胞である、請求項４２に記載のシステム。
【請求項４４】
前記リンパ球がナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、請求項４２に記載のシステム。
【請求項４５】
細胞における標的遺伝子の発現を調節するためのシステムであって、
第１のリガンド結合ドメインおよび第１のシグナル伝達ドメインを含む第１の膜貫通受容体であって、第１のリガンドが前記第１のリガンド結合ドメインに結合すると、前記第１のシグナル伝達ドメインが前記細胞の第１のシグナル伝達経路を活性化する、第１の膜貫通受容体と
第２のリガンド結合ドメインおよび第２のシグナル伝達ドメインを含む第２の膜貫通受容体であって、第２のリガンドが前記第２のリガンド結合ドメインに結合すると、前記第２のシグナル伝達ドメインが前記細胞の第２のシグナル伝達経路を活性化する、第２の膜貫通受容体と、
第１のプロモーターの制御下に置かれた第１の部分的遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）をコードする核酸配列を含む第１の発現カセットであって、前記第１の部分的ＧＭＰがアクチュエータ部分の第１の部分を含み、前記第１のリガンドが前記第１のリガンド結合ドメインに結合すると、前記第１のプロモーターが活性化されて前記第１の部分的ＧＭＰの発現を駆動する、第１の発現カセットと、
第２のプロモーターの制御下に置かれた第２の部分的遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）をコードする核酸配列を含む第２の発現カセットであって、前記第２の部分的ＧＭＰがアクチュエータ部分の第２の部分を含み、前記第２のリガンドが前記第２のリガンド結合ドメインに結合すると、前記第２のプロモーターが活性化されて前記第２の部分的ＧＭＰの発現を駆動する、第２の発現カセットとを含み、
前記アクチュエータ部分の前記第１および第２の部分が複合体を形成して、機能的アクチュエータ部分を含む再構成されたＧＭＰを形成し、前記再構成されたＧＭＰが前記標的遺伝子の発現を調節する、システム。
【請求項４６】
前記機能的アクチュエータ部分がＲＮＡ誘導型アクチュエータ部分を含み、前記システムが、前記ＲＮＡ誘導型アクチュエータ部分と複合体を形成するガイドＲＮＡをさらに含む、請求項４５に記載のシステム。
【請求項４７】
前記ＲＮＡ誘導型アクチュエータ部分がＣａｓ９である、請求項４６に記載のシステム。
【請求項４８】
Ｃａｓ９が、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９である、請求項４７に記載のシステム。
【請求項４９】
Ｃａｓ９が、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  Ｃａｓ９である、請求項４７に記載のシステム。
【請求項５０】
Ｃａｓ９が、ヌクレアーゼ活性を実質的に欠如する、請求項４７〜４９のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項５１】
前記ＲＮＡ誘導型アクチュエータ部分がＣｐｆ１である、請求項４６に記載のシステム。
【請求項５２】
Ｃｐｆ１が、ヌクレアーゼ活性を実質的に欠如する、請求項５１に記載のシステム。
【請求項５３】
前記第１の部分的ＧＭＰおよび前記第２の部分的ＧＭＰのうちの少なくとも１つが核局在化配列（ＮＬＳ）を含む、請求項４５〜５２のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項５４】
遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）の発現を誘導する方法であって、
（ａ）リガンド結合ドメインおよびシグナル伝達ドメインを有する膜貫通受容体を発現する細胞を提供するステップと、
（ｂ）リガンドを、前記膜貫通受容体の前記リガンド結合ドメインに結合させるステップであって、前記結合が、前記細胞のシグナル伝達経路を活性化し、次いで、前記ＧＭＰをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターが活性化される、ステップと、
（ｃ）前記プロモーターが活性化されると、前記ＧＭＰを発現するステップと
を含む、方法。
【請求項５５】
細胞における標的遺伝子の発現を調節する方法であって、
リガンドを、リガンド結合ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む膜貫通受容体に接触させるステップであって、接触すると、前記シグナル伝達ドメインが前記細胞のシグナル伝達経路を活性化する、ステップと、
アクチュエータ部分を含む遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）を、プロモーターの制御下に置かれた前記ＧＭＰをコードする核酸配列を含む発現構築物から発現させるステップであって、前記リガンドが前記リガンド結合ドメインに結合すると、前記プロモーターが活性化されて前記ＧＭＰの発現を駆動する、ステップと、
発現された前記ＧＭＰの結合を介して前記標的遺伝子の発現を増加または減少させ、それによって前記標的遺伝子の発現を調節するステップと
を含む、方法。
【請求項５６】
前記膜貫通受容体が内因性受容体を含む、請求項５４または５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記膜貫通受容体が合成受容体を含む、請求項５４または５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記膜貫通受容体が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、インテグリン受容体、またはＮｏｔｃｈ受容体を含む、請求項５４または５５に記載の方法。
【請求項５９】
前記膜貫通受容体がＧＰＣＲを含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記膜貫通受容体がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
前記ＣＡＲの前記リガンド結合ドメインが、Ｆａｂ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、細胞外受容体ドメイン、およびＦｃ結合ドメインのうちの少なくとも１つを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記ＣＡＲの前記シグナル伝達ドメインが、免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含む、請求項６０または６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記ＣＡＲのシグナル伝達ドメインが、免疫受容体抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を含む、請求項６０または６１に記載の方法。
【請求項６４】
前記ＣＡＲの前記シグナル伝達ドメインが共刺激ドメインを含む、請求項６０〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記アクチュエータ部分がＲＮＡ誘導型アクチュエータ部分である、請求項５４〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記ＲＮＡ誘導型アクチュエータ部分がＣａｓ９である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
Ｃａｓ９が、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
Ｃａｓ９が、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  Ｃａｓ９である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
Ｃａｓ９が、ヌクレアーゼ活性を実質的に欠如する、請求項６６〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記ＲＮＡ誘導型アクチュエータ部分がＣｐｆ１である、請求項６５に記載の方法。
【請求項７１】
Ｃｐｆ１が、ヌクレアーゼ活性を実質的に欠如する、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記ＧＭＰが核局在化配列（ＮＬＳ）を含む、請求項５４〜７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記ＧＭＰが転写活性化因子または転写抑制因子を含む、請求項５４〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
前記細胞が、免疫細胞、造血前駆細胞、または造血幹細胞である、請求項５４〜７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記細胞が免疫細胞である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記免疫細胞がリンパ球である、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記リンパ球がＴ細胞である、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記リンパ球がナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、請求項７６に記載の方法。
【請求項７９】
アクチュエータ部分を含む遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）をコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットであって、リガンドが膜貫通受容体に結合することによって活性化されている前記膜貫通受容体を発現する細胞に前記発現カセットが存在する場合、前記プロモーターが活性化されて前記発現カセットからの前記ＧＭＰの発現を駆動することを特徴とする発現カセット。
【請求項８０】
膜貫通受容体がシグナル伝達ドメインを含み、前記膜貫通受容体が活性化されると、前記シグナル伝達ドメインが前記細胞のシグナル伝達経路を活性化する、請求項７９に記載の発現カセット。
【請求項８１】
前記膜貫通受容体の前記シグナル伝達ドメインが、免疫細胞シグナル伝達経路を活性化する、請求項８０に記載の発現カセット。
【請求項８２】
前記細胞の活性化された前記シグナル伝達経路の転写因子が、前記プロモーターに結合し、それによって前記プロモーターを活性化させて、前記発現カセットからの前記ＧＭＰの発現を駆動する、請求項８０に記載の発現カセット。
【請求項８３】
前記プロモーターが内因性プロモーター配列を含む、請求項７９に記載の発現カセット。
【請求項８４】
前記プロモーターが合成プロモーター配列を含む、請求項７９に記載の発現カセット。
【請求項８５】
前記アクチュエータ部分がＲＮＡ誘導型アクチュエータ部分である、請求項７９に記載の発現カセット。
【請求項８６】
前記ＲＮＡ誘導型アクチュエータ部分がＣａｓ９である、請求項８５に記載の発現カセット。
【請求項８７】
Ｃａｓ９が、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９である、請求項８６に記載の発現カセット。
【請求項８８】
Ｃａｓ９が、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  Ｃａｓ９である、請求項８６に記載の発現カセット。
【請求項８９】
Ｃａｓ９が、ヌクレアーゼ活性を実質的に欠如する、請求項８６〜８８のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項９０】
前記ＲＮＡ誘導型アクチュエータ部分がＣｐｆ１である、請求項８５に記載の発現カセット。
【請求項９１】
Ｃｐｆ１が、ヌクレアーゼ活性を実質的に欠如する、請求項９０に記載の発現カセット。
【請求項９２】
前記プロモーターが、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＲＦ４、ＮＲ４Ａ１、ＰＲＤＭ１、ＴＢＸ２１、ＣＤ６９、ＣＤ２５、またはＧＺＭＢプロモーターである、請求項７９〜９１のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項９３】
前記ＧＭＰが核局在化配列（ＮＬＳ）を含む、請求項７９〜９２のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項９４】
前記ＧＭＰが、転写活性化因子または転写抑制因子を含む、請求項７９〜９３のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項９５】
細胞ゲノムに組み込まれる、請求項７９〜９４に記載の発現カセット。
【請求項９６】
レンチウイルスを介して前記細胞ゲノムに組み込まれる、請求項９５に記載の発現カセット。
【請求項９７】
セーフハーバー部位を含む領域で前記細胞ゲノムに組み込まれる、請求項９５に記載の発現カセット。
【請求項９８】
第１９染色体のＡＡＶＳ１部位に組み込まれる、請求項９５に記載の発現カセット。
【請求項９９】
第３染色体のＣＣＲ５部位に組み込まれる、請求項９５に記載の発現カセット。
【請求項１００】
前記細胞ゲノムにプログラム可能なヌクレアーゼを介して組み込まれる、請求項９５に記載の発現カセット。
【請求項１０１】
前記プログラム可能なヌクレアーゼが、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＮＦ）、または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である、請求項１００に記載の発現カセット。
【請求項１０２】
（ｉ）遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）をコードする核酸配列と、（ｉｉ）発現カセットの細胞ゲノムへの組込みを容易にする少なくとも１つの組込み配列とを含む発現カセットであって、前記ＧＭＰがアクチュエータ部分を含み、前記発現カセットが前記少なくとも１つの組込み配列を介して前記細胞ゲノムに組み込まれている場合に、リガンドが膜貫通受容体に結合することによって前記膜貫通受容体を活性化すると、プロモーターを活性化して前記発現カセットからの前記ＧＭＰの発現を駆動することを特徴とする発現カセット。
【請求項１０３】
前記少なくとも１つの組込み配列が、前記細胞ゲノムの領域への前記発現カセットの組込みを容易にし、それによって前記ＧＭＰをコードする前記核酸配列が内因性プロモーターに作動可能に連結される、請求項１０２に記載の発現カセット。
【請求項１０４】
前記少なくとも１つの組込み配列が、前記細胞ゲノムの領域への前記発現カセットの組込みを容易にし、それによって前記ＧＭＰをコードする前記核酸配列が、（ｉ）内因性プロモーターに作動可能に連結され、（ｉｉ）内因性タンパク質をコードする遺伝子の下流に位置し、細胞における前記内因性タンパク質の発現が前記内因性プロモーターによって駆動される、請求項１０３に記載の発現カセット。
【請求項１０５】
前記ＧＭＰをコードする前記核酸配列が、ペプチドリンカーをコードする核酸配列によって前記遺伝子に結合される、請求項１０４に記載の発現カセット。
【請求項１０６】
前記ＧＭＰをコードする前記核酸配列が、前記遺伝子にインフレームで結合される、請求項１０５に記載の発現カセット。
【請求項１０７】
前記ペプチドリンカーがプロテアーゼ認識配列を含む、請求項１０５に記載の発現カセット。
【請求項１０８】
前記ペプチドリンカーが自己切断セグメントを含む、請求項１０５に記載の発現カセット。
【請求項１０９】
前記自己切断セグメントが２Ａペプチドを含む、請求項１０８に記載の発現カセット。
【請求項１１０】
前記２Ａペプチドが、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＦ２Ａである、請求項１０９に記載の発現カセット。
【請求項１１１】
前記ＧＭＰをコードする前記核酸配列が、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む核酸配列によって前記遺伝子に結合される、請求項１０４に記載の発現カセット。
【請求項１１２】
前記少なくとも１つの組込み配列が、相同配列を含み、前記発現カセットが、相同性修復（ＨＤＲ）を介して前記細胞ゲノムに組み込まれる、請求項１０２〜１１１のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項１１３】
２つの組込み配列が、遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）をコードする前記核酸配列の両端に存在し、２つの各々の組込み配列が相同配列を含む、請求項１１２に記載の発現カセット。
【請求項１１４】
前記相同配列が、前記細胞ゲノムの標的化領域への前記発現カセットの組込みを容易にする、請求項１１２または１１３に記載の発現カセット。
【請求項１１５】
遺伝子モジュレーティングポリペプチドをコードする前記核酸配列が、前記発現カセットの組込み後に前記プロモーターの下流に位置する、請求項１０２〜１１４のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項１１６】
請求項１〜５３のいずれか一項に記載のシステムを含む細胞。
【請求項１１７】
造血細胞、造血前駆細胞、または造血幹細胞である、請求項１１６に記載の細胞。
【請求項１１８】
前記細胞が造血細胞であり、前記造血細胞が、リンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、マクロファージ、または樹状細胞（ＤＣ）である、請求項１１７に記載の細胞。
【請求項１１９】
前記システムの発現カセットが、プラスミドの一部として前記細胞に存在する、請求項１１６に記載の細胞。
【請求項１２０】
前記システムの発現カセットが、細胞ゲノムに組み込まれる、請求項１１６に記載の細胞。
【請求項１２１】
前記システムの前記発現カセットが、ゲノムのセーフハーバー部位を含む領域で前記細胞ゲノムに組み込まれる、請求項１２０に記載の細胞。
【請求項１２２】
前記システムの前記発現カセットが、第１９染色体のＡＡＶＳ１部位に組み込まれる、請求項１２０に記載の細胞。
【請求項１２３】
前記システムの前記発現カセットが、第３染色体のＣＣＲ５部位に組み込まれる、請求項１２０に記載の細胞。
【請求項１２４】
前記発現カセットが、前記細胞ゲノムにプログラム可能なヌクレアーゼを介して組み込まれる、請求項１２０に記載の細胞。
【請求項１２５】
前記プログラム可能なヌクレアーゼが、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＮＦ）、または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である、請求項１２４に記載の細胞。
【請求項１２６】
請求項７９〜１１５のいずれか一項に記載の発現カセットを含む細胞。
【請求項１２７】
細胞における標的遺伝子の発現を調節するためのシステムであって、
リガンド結合ドメイン、シグナル伝達ドメイン、および遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）を含む膜貫通受容体であって、前記ＧＭＰが切断認識部位に連結されたアクチュエータ部分を含み、リガンドが前記リガンド結合ドメインに結合すると、前記シグナル伝達ドメインが前記細胞のシグナル伝達経路を活性化する、膜貫通受容体と、
切断部分をコードする核酸配列を含む発現カセットであって、前記核酸配列が、前記リガンドが前記リガンド結合ドメインに結合すると、前記シグナル伝達経路によって活性化されて前記切断部分の発現を駆動するプロモーターの制御下に置かれる、発現カセットとを含み、
発現された前記切断部分が、前記切断認識部位の近位に存在する場合、前記切断認識部位を切断して前記アクチュエータ部分を放出し、放出された前記アクチュエータ部分が標的遺伝子の発現を調節する、システム。
【請求項１２８】
細胞における標的遺伝子の発現を調節するためのシステムであって、
リガンド結合ドメイン、シグナル伝達ドメイン、および切断部分を含む膜貫通受容体であって、リガンドが前記リガンド結合ドメインに結合すると、前記シグナル伝達ドメインが前記細胞のシグナル伝達経路を活性化する、膜貫通受容体と、
核外輸送シグナルペプチドに連結された遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）を含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含む発現カセットであって、前記ＧＭＰが切断認識部位に連結されたアクチュエータ部分を含み、前記核酸配列が、前記リガンドが前記リガンド結合ドメインに結合すると、前記シグナル伝達経路によって活性化されて前記融合タンパク質の発現を駆動するプロモーターの制御下に置かれる、発現カセットとを含み、
前記融合タンパク質が前記切断部分の近位に存在する場合、前記切断部分が前記融合タンパク質の前記切断認識部位を切断して、前記アクチュエータ部分を放出し、放出された前記アクチュエータ部分が標的遺伝子の発現を調節する、システム。
【請求項１２９】
前記切断部分が、前記膜貫通受容体の細胞内領域に連結されている、請求項１２８に記載のシステム。
【請求項１３０】
細胞における標的遺伝子の発現を調節するためのシステムであって、
リガンド結合ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む膜貫通受容体であって、リガンドが前記リガンド結合ドメインに結合すると、前記シグナル伝達ドメインが前記細胞のシグナル伝達経路を活性化する、膜貫通受容体と、
切断部分をコードする核酸配列を含む発現カセットであって、前記核酸配列が、前記リガンドが前記リガンド結合ドメインに結合すると、前記シグナル伝達経路によって活性化されて前記切断部分の発現を駆動するプロモーターの制御下に置かれる、発現カセットとを含み、
発現された前記切断部分が、核外輸送シグナルペプチドに連結された遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）を含む融合タンパク質の切断認識部位を切断し、前記ＧＭＰが前記切断認識部位に連結されたアクチュエータ部分を含み、前記切断認識部位の切断が前記アクチュエータ部分を放出し、放出された前記アクチュエータ部分が標的遺伝子の発現を調節する、システム。
【請求項１３１】
前記核外輸送シグナルペプチドに連結された前記遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）を含む前記融合タンパク質をさらに含む、請求項１３０に記載のシステム。
【請求項１３２】
細胞における標的遺伝子の発現を調節するためのシステムであって、
リガンド結合ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む膜貫通受容体であって、リガンドが前記リガンド結合ドメインに結合すると、前記シグナル伝達ドメインが前記細胞のシグナル伝達経路を活性化する、膜貫通受容体と、
核外輸送シグナルペプチドに連結された遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）を含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含む発現カセットであって、前記ＧＭＰが切断認識配列に連結されたアクチュエータ部分を含み、前記核酸配列が、前記リガンドが前記リガンド結合ドメインに結合すると、前記シグナル伝達経路によって活性化されて前記融合タンパク質の発現を駆動するプロモーターの制御下に置かれる、発現カセットとを含み、
前記切断認識部位での切断部分による切断を介して前記アクチュエータ部分が放出されると、放出された前記アクチュエータ部分が標的遺伝子の発現を調節する、システム。
【請求項１３３】
切断部分をさらに含む、請求項１３２に記載のシステム。
【請求項１３４】
前記切断部分が、前記切断認識部位の近位に存在する場合、発現された前記融合タンパク質の前記切断認識部位を切断する、請求項１３２に記載のシステム。
【請求項１３５】
細胞における標的遺伝子の発現を調節するためのシステムであって、
リガンド結合ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む膜貫通受容体であって、リガンドが前記リガンド結合ドメインに結合すると、前記シグナル伝達ドメインが前記細胞のシグナル伝達経路を活性化する、膜貫通受容体と、
核外輸送シグナルペプチドに連結された遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）を含む融合タンパク質をコードする第１の核酸配列を含む第１の発現カセットであって、前記ＧＭＰが切断認識配列に連結されたアクチュエータ部分を含み、前記第１の核酸配列が、前記リガンドが前記リガンド結合ドメインに結合すると、前記シグナル伝達経路によって活性化されて前記融合タンパク質の発現を駆動する第１のプロモーターの制御下に置かれる、第１の発現カセットと、
切断部分をコードする第２の核酸配列を含む第２の発現カセットであって、前記第２の核酸配列が、前記リガンドが前記リガンド結合ドメインに結合すると、前記シグナル伝達経路によって活性化されて前記切断部分の発現を駆動する第２のプロモーターの制御下に置かれる、第２の発現カセットとを含み；
発現された前記切断部分が、前記切断認識部位の近位に存在する場合、発現された前記融合タンパク質の前記切断認識部位を切断してアクチュエータ部分を放出し、放出された前記アクチュエータ部分が標的遺伝子の発現を調節する、システム。
【請求項１３６】
細胞における標的遺伝子の発現を調節するためのシステムであって、
リガンド結合ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む膜貫通受容体であって、リガンドが前記リガンド結合ドメインに結合すると、前記シグナル伝達ドメインが前記細胞のシグナル伝達経路を活性化する、膜貫通受容体と、
第１の部分的遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）をコードする第１の核酸配列を含む第１の発現カセットであって、前記第１の部分的ＧＭＰが、アクチュエータ部分の第１の部分を含み、前記第１の核酸配列が、前記リガンドが前記リガンド結合ドメインに結合すると、前記シグナル伝達経路によって活性化されて前記第１の部分的ＧＭＰの発現を駆動する第１のプロモーターの制御下に置かれる、第１の発現カセットと；
第２の部分的遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）をコードする第２の核酸配列を含む第２の発現カセットであって、前記第２の部分的ＧＭＰが、アクチュエータ部分の第２の部分を含み、前記第２の核酸配列が、前記リガンドが前記リガンド結合ドメインに結合すると、前記シグナル伝達経路によって活性化されて前記第２の部分的ＧＭＰの発現を駆動する第２のプロモーターの制御下に置かれる、第２の発現カセットとを含み、
前記第１の部分的ＧＭＰおよび前記第２の部分的ＧＭＰが複合体を形成して再構成されたアクチュエータ部分を形成し、前記再構成されたアクチュエータ部分が前記標的遺伝子の発現を調節する、システム。
【請求項１３７】
細胞における標的遺伝子の発現を調節するためのシステムであって、
リガンド結合ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む膜貫通受容体であって、リガンドが前記リガンド結合ドメインに結合すると、前記シグナル伝達ドメインが前記細胞のシグナル伝達経路を活性化する、膜貫通受容体と、
第１の部分的切断部分をコードする第１の核酸配列を含む第１の発現カセットであって、前記第１の核酸配列が、前記リガンドが前記リガンド結合ドメインに結合すると、前記シグナル伝達経路によって活性化されて前記第１の部分的切断部分の発現を駆動する第１のプロモーターの制御下に置かれる、第１の発現カセットと、
第２の部分的切断部分をコードする第２の核酸配列を含む第２の発現カセットであって、前記第２の核酸配列が、前記リガンドが前記リガンド結合ドメインに結合すると、前記シグナル伝達経路によって活性化されて前記第２の部分的切断部分の発現を駆動する第２のプロモーターの制御下に置かれる、第２の発現カセットとを含み、
前記第１の部分的切断部分および前記第２の部分的切断部分が複合体を形成して、再構成された切断部分を形成し、前記再構成された切断部分によって切断認識部位で切断されると、核外輸送シグナルペプチドからアクチュエータ部分を放出し、前記アクチュエータ部分が前記標的遺伝子の発現を調節する、システム。
【請求項１３８】
前記切断認識部位を介して前記アクチュエータ部分に連結された核外輸送シグナルペプチドを含む融合ポリペプチドをさらに含む、請求項１３７に記載のシステム。
【請求項１３９】
細胞における標的遺伝子の発現を調節するためのシステムであって、
リガンド結合ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む膜貫通受容体であって、リガンドが前記リガンド結合ドメインに結合すると、前記シグナル伝達ドメインが前記細胞のシグナル伝達経路を活性化する、膜貫通受容体と、
（ｉ）切断部分および（ｉｉ）核外輸送シグナルペプチドに連結された遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）を含む融合タンパク質のうちの一方または両方をコードする核酸を含む発現カセットであって、前記ＧＭＰが切断認識部位に連結されたアクチュエータ部分を含む、発現カセットとを含み、
前記切断部分および前記融合タンパク質のうちの前記一方または両方の発現が、リガンドが前記リガンド結合ドメインに結合すると、前記シグナル伝達経路によって活性化されるプロモーターによって駆動され、前記アクチュエータ部分が、前記切断部分によって前記切断認識部位が切断されると放出され、放出された前記ＧＭＰが標的ポリヌクレオチドの発現を調節する、システム。
【請求項１４０】
前記膜貫通受容体が、内因性受容体または合成受容体を含む、請求項１２７〜１３９のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１４１】
前記膜貫通受容体が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、インテグリン受容体、またはＮｏｔｃｈ受容体を含む、請求項１２７〜１４０のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１４２】
前記アクチュエータ部分がポリヌクレオチド誘導型エンドヌクレアーゼを含む、請求項１２７〜１４１のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１４３】
前記ポリヌクレオチド誘導型エンドヌクレアーゼがＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼである、請求項１４２に記載のシステム。
【請求項１４４】
前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼがＣａｓタンパク質である、請求項１４３に記載のシステム。
【請求項１４５】
前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９である、請求項１４４に記載のシステム。
【請求項１４６】
Ｃａｓ９が、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９である、請求項１４５に記載のシステム。
【請求項１４７】
Ｃａｓ９が、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  Ｃａｓ９である、請求項１４５に記載のシステム。
【請求項１４８】
前記Ｃａｓタンパク質が、ヌクレアーゼ活性を実質的に欠如する、請求項１４４に記載のシステム。
【請求項１４９】
前記Ｃａｓタンパク質がＣｐｆ１である、請求項１４４に記載のシステム。
【請求項１５０】
Ｃｐｆ１が、ヌクレアーゼ活性を実質的に欠如する、請求項１４９に記載のシステム。
【請求項１５１】
前記アクチュエータ部分が転写活性化因子に連結されている、請求項１２７〜１５０のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１５２】
前記アクチュエータ部分が転写抑制因子に連結されている、請求項１２７〜１５０のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１５３】
前記プロモーターが、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＲＦ４、ＮＲ４Ａ１、ＰＲＤＭ１、ＴＢＸ２１、ＣＤ６９、ＣＤ２５、およびＧＺＭＢプロモーターから選択される、請求項１２７〜１５２のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１５４】
前記細胞が、免疫細胞、造血前駆細胞、または造血幹細胞である、請求項１２７〜１５３のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１５５】
前記細胞が免疫細胞である、請求項１５４に記載のシステム。
【請求項１５６】
前記免疫細胞がリンパ球である、請求項１５５に記載のシステム。
【請求項１５７】
前記リンパ球がＴ細胞である、請求項１５６に記載のシステム。
【請求項１５８】
前記リンパ球がナチュラルキラー（ＮＫ細胞）である、請求項１５６に記載のシステム。
【請求項１５９】
細胞における標的遺伝子の発現を調節する方法であって、
リガンドを、リガンド結合ドメイン、シグナル伝達ドメイン、および遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）を含む膜貫通受容体に接触させるステップであって、前記ＧＭＰが、切断認識部位に連結されたアクチュエータ部分を含み、前記リガンドが前記リガンド結合ドメインに接触すると、前記シグナル伝達ドメインが前記細胞のシグナル伝達経路を活性化する、ステップと、
切断部分を、前記切断部分をコードする核酸配列を含む発現カセットから発現させるステップであって、前記核酸配列が、前記リガンドが前記リガンド結合ドメインに結合すると、前記シグナル伝達経路によって活性化されて前記切断部分の発現を駆動するプロモーターの制御下に置かれる、ステップと、
前記切断部分によって前記切断認識部位を切断して、前記膜貫通受容体から前記アクチュエータ部分を放出するステップとを含み、
放出された前記アクチュエータ部分が前記標的遺伝子の発現を調節する、方法。
【請求項１６０】
細胞における標的遺伝子の発現を調節する方法であって、
リガンドを、リガンド結合ドメイン、シグナル伝達ドメイン、および切断部分を含む膜貫通受容体に接触させるステップであって、前記リガンドが前記リガンド結合ドメインに接触すると、前記シグナル伝達ドメインが前記細胞のシグナル伝達経路を活性化するステップと、
核外輸送シグナルペプチドに連結された遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）を含む融合タンパク質を、核酸配列を含む発現カセットから発現させるステップであって、前記ＧＭＰが切断認識部位に連結されたアクチュエータ部分を含み、前記核酸配列が、前記リガンドが前記リガンド結合ドメインに結合すると、前記シグナル伝達経路によって活性化されて前記融合タンパク質の発現を駆動するプロモーターの制御下に置かれる、ステップと、
前記切断部分によって前記切断認識部位を切断して、前記アクチュエータ部分を放出するステップとを含み、
放出された前記アクチュエータ部分が標的遺伝子の発現を調節する、方法。
【請求項１６１】
前記切断部分が、前記膜貫通受容体の細胞内領域に連結されている、請求項１６０に記載の方法。
【請求項１６２】
細胞における標的遺伝子の発現を調節する方法であって、
リガンドを、リガンド結合ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む膜貫通受容体に接触させるステップであって、前記リガンドが前記リガンド結合ドメインに接触すると、前記シグナル伝達ドメインが前記細胞のシグナル伝達経路を活性化するステップと、
切断部分を、前記切断部分をコードする核酸配列を含む発現カセットから発現させるステップであって、前記核酸配列が、前記リガンドが前記リガンド結合ドメインに結合すると、前記シグナル伝達経路によって活性化されて前記切断部分の発現を駆動するプロモーターの制御下に置かれる、ステップと、
前記切断部分によって、核外輸送シグナルペプチドに連結された遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）を含む融合タンパク質の切断認識部位を切断するステップであって、前記ＧＭＰが、前記切断認識部位に連結されたアクチュエータ部分を含み、切断されると、前記アクチュエータ部分が放出されるステップとを含み、
放出された前記アクチュエータ部分が標的遺伝子の発現を調節する、方法。
【請求項１６３】
細胞における標的遺伝子の発現を調節する方法であって、
リガンドを、リガンド結合ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む膜貫通受容体に接触させるステップであって、前記リガンドが前記リガンド結合ドメインに接触すると、前記シグナル伝達ドメインが前記細胞のシグナル伝達経路を活性化するステップと、
核外輸送シグナルペプチドに連結された遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）を含む融合タンパク質を、前記融合タンパク質をコードする核酸配列を含む発現カセットから発現させるステップであって、前記ＧＭＰが、切断認識配列に連結されたアクチュエータ部分を含み、前記核酸配列が、前記リガンドが前記リガンド結合ドメインに結合すると、前記シグナル伝達経路によって活性化されて前記融合タンパク質の発現を駆動するプロモーターの制御下に置かれる、ステップと、
切断部分によって前記融合タンパク質の前記切断認識部位を切断して、前記アクチュエータ部分を放出するステップとを含み、
放出された前記アクチュエータ部分が標的遺伝子の発現を調節する、方法。
【請求項１６４】
前記切断部分が、前記切断認識部位の近位に存在する場合、発現された前記融合タンパク質の前記切断認識部位を切断する、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１６５】
細胞における標的遺伝子の発現を調節する方法であって、
リガンドを、リガンド結合ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む膜貫通受容体に接触させるステップであって、前記リガンドが前記リガンド結合ドメインに接触すると、前記シグナル伝達ドメインが前記細胞のシグナル伝達経路を活性化する、ステップと、
核外輸送シグナルペプチドに連結された遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）を含む融合タンパク質を、前記融合タンパク質をコードする第１の核酸配列を含む第１の発現カセットから発現させるステップであって、前記ＧＭＰが切断認識配列に連結されたアクチュエータ部分を含み、前記核酸配列が、前記リガンドが前記リガンド結合ドメインに結合すると、前記シグナル伝達経路によって活性化されて前記融合タンパク質の発現を駆動する第１のプロモーターの制御下に置かれる、ステップと、
切断部分を、前記切断部分をコードする核酸配列を含む第２の発現カセットから発現させるステップであって、核酸が、前記リガンドが前記リガンド結合ドメインに結合すると、前記シグナル伝達経路によって活性化されて前記切断部分の発現を駆動する第２のプロモーターの制御下に置かれる、ステップと、
発現された前記切断部分を使用して、発現された前記融合タンパク質の前記切断認識部位を切断して、前記アクチュエータ部分を放出するステップとを含み、
放出された前記アクチュエータ部分が標的遺伝子の発現を調節する、方法。
【請求項１６６】
細胞における標的遺伝子の発現を調節する方法であって、
リガンドを、リガンド結合ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む膜貫通受容体に接触させるステップであって、前記リガンドが前記リガンド結合ドメインに接触すると、前記シグナル伝達ドメインが前記細胞のシグナル伝達経路を活性化する、ステップと、
第１の部分的遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）を、前記第１の部分的ＧＭＰをコードする第１の核酸配列を含む第１の発現カセットから発現させるステップであって、前記第１の部分的ＧＭＰが、アクチュエータ部分の第１の部分を含み、前記第１の核酸配列が、前記リガンドが前記リガンド結合ドメインに結合すると、前記シグナル伝達経路によって活性化されて前記第１の部分的ＧＭＰの発現を駆動する第１のプロモーターの制御下に置かれる、ステップと、
第２の部分的遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）を、前記第２の部分的ＧＭＰをコードする第２の核酸配列を含む第２の発現カセットから発現させるステップであって、前記第２の部分的ＧＭＰが、アクチュエータ部分の第２の部分を含み、前記第２の核酸配列が、前記リガンドが前記リガンド結合ドメインに結合すると、前記シグナル伝達経路によって活性化されて前記第２の部分的ＧＭＰの発現を駆動する第２のプロモーターの制御下に置かれる、ステップと、
前記第１の部分的ＧＭＰおよび前記第２の部分的ＧＭＰの複合体を形成して、再構成されたアクチュエータ部分を形成するステップとを含み、
前記再構成されたアクチュエータ部分が前記標的遺伝子の発現を調節する、方法。
【請求項１６７】
細胞における標的遺伝子の発現を調節する方法であって、
リガンドを、リガンド結合ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む膜貫通受容体に接触させるステップであって、前記リガンドが前記リガンド結合ドメインに結合すると、前記シグナル伝達ドメインが前記細胞のシグナル伝達経路を活性化する、ステップと、
第１の部分的切断部分を、前記第１の部分的切断部分をコードする第１の核酸配列を含む第１の発現カセットから発現させるステップであって、前記第１の核酸配列が、前記リガンドが前記リガンド結合ドメインに結合すると、前記シグナル伝達経路によって活性化されて前記第１の部分的切断部分の発現を駆動する第１のプロモーターの制御下に置かれる、ステップと、
第２の部分的切断部分を、前記第２の部分的切断部分をコードする第２の核酸配列を含む第２の発現カセットから発現させるステップであって、前記第２の核酸配列が、前記リガンドが前記リガンド結合ドメインに結合すると、前記シグナル伝達経路によって活性化されて前記第２の部分的切断部分の発現を駆動する第２のプロモーターの制御下に置かれる、ステップと、
前記第１および前記第２の部分的切断部分の複合体を形成して、再構成された切断部分を生じるステップと、
前記再構成された切断部分によって切断認識部位を切断して、前記再構成された切断部分を使用して核外輸送シグナルペプチドからアクチュエータ部分を放出するステップとを含み、
放出された前記アクチュエータ部分が前記標的遺伝子の発現を調節する、方法。
【請求項１６８】
細胞における標的遺伝子の発現を調節する方法であって、
リガンドを、リガンド結合ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む膜貫通受容体に接触させるステップであって、前記リガンドが前記リガンド結合ドメインに接触すると、前記シグナル伝達ドメインが前記細胞のシグナル伝達経路を活性化する、ステップと、
（ｉ）切断部分および（ｉｉ）核外輸送シグナルペプチドに連結された遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）を含む融合タンパク質のうちの一方または両方を、（ｉ）および（ｉｉ）のうちの一方または両方をコードする核酸配列を含む発現カセットから発現させるステップであって、前記ＧＭＰが、切断認識部位に連結されたアクチュエータ部分を含み、前記核酸配列が、リガンドが前記リガンド結合ドメインに結合すると、前記シグナル伝達経路によって活性化されるプロモーターの制御下に置かれる、ステップと、
前記切断部分によって前記切断認識部位が切断されると、前記アクチュエータ部分を放出するステップとを含み、
放出された前記アクチュエータ部分が標的ポリヌクレオチドの発現を調節する、方法。
【請求項１６９】
前記膜貫通受容体が、内因性受容体または合成受容体を含む、請求項１５９〜１６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７０】
前記膜貫通受容体が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、インテグリン受容体、またはＮｏｔｃｈ受容体を含む、請求項１５９〜１６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７１】
前記アクチュエータ部分がポリヌクレオチド誘導型エンドヌクレアーゼを含む、請求項１５９〜１７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７２】
前記ポリヌクレオチド誘導型エンドヌクレアーゼがＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼである、請求項１７１に記載の方法。
【請求項１７３】
前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼがＣａｓタンパク質である、請求項１７２に記載の方法。
【請求項１７４】
前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９である、請求項１７３に記載の方法。
【請求項１７５】
Ｃａｓ９が、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９である、請求項１７４に記載の方法。
【請求項１７６】
Ｃａｓ９が、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  Ｃａｓ９である、請求項１７４に記載の方法。
【請求項１７７】
前記Ｃａｓタンパク質が、ヌクレアーゼ活性を実質的に欠如する、請求項１７３に記載の方法。
【請求項１７８】
前記Ｃａｓタンパク質がＣｐｆ１である、請求項１７３に記載の方法。
【請求項１７９】
Ｃｐｆ１が、ヌクレアーゼ活性を実質的に欠如する、請求項１７８に記載の方法。
【請求項１８０】
前記アクチュエータ部分が転写活性化因子に連結されている、請求項１５９〜１７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８１】
前記アクチュエータ部分が転写抑制因子に連結されている、請求項１５９〜１７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８２】
前記プロモーターが、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＲＦ４、ＮＲ４Ａ１、ＰＲＤＭ１、ＴＢＸ２１、ＣＤ６９、ＣＤ２５、およびＧＺＭＢプロモーターから選択される、請求項１５９〜１８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８３】
前記細胞が、免疫細胞、造血前駆細胞、または造血幹細胞である、請求項１５９〜１８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８４】
前記細胞が免疫細胞である、請求項１８３に記載の方法。
【請求項１８５】
前記免疫細胞がリンパ球である、請求項１８４に記載の方法。
【請求項１８６】
前記リンパ球がＴ細胞である、請求項１８５に記載の方法。
【請求項１８７】
前記リンパ球がナチュラルキラー（ＮＫ細胞）である、請求項１８５に記載の方法。
【請求項１８８】
前記標的遺伝子がサイトカインをコードする、請求項１５９〜１８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８９】
前記標的遺伝子が、免疫チェックポイント阻害剤をコードする、請求項１５９〜１８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９０】
前記免疫チェックポイント阻害剤が、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ−３、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ４、ＩＤＯ、ＫＩＲ、またはＶＩＳＴＡである、請求項１８９に記載の方法。
【請求項１９１】
前記標的遺伝子が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ、ベータ、デルタ、またはガンマ鎖をコードする、請求項１５９〜１８７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、その全内容の全体が参照により本明細書に組み入れられる、２０１７年７月１２日に提出された米国特許仮出願第６２／５３１，７５２号および２０１７年１１月１７日に提出された米国特許仮出願第６２／５８７，６６８号の恩典を主張する。
【背景技術】
【０００２】
受容体は、細胞の外部からの生化学シグナルを受けることができるタンパク質分子である。一部の例では、受容体は、細胞の生化学経路に直接または間接的に連結され、受容体にリガンドが結合すると（例えば、生化学シグナル）、受容体が関連する生化学経路を活性化または阻害することができる。細胞受容体とリガンドとの相互作用は、環境の合図の感知および細胞外刺激の細胞内シグナル伝達への変換において中心的な役割を果たすことができる。細胞内シグナル伝達は、遺伝子発現の転写活性化および細胞挙動を制御するための新規タンパク質合成を含む生化学プロセスの調節をもたらしうる。
【０００３】
環境の合図によって条件的に制御することができる特徴を有する細胞を操作することは、細胞応答を調整するために、ならびに遺伝子および細胞治療適用にとっても有用でありうる。条件的遺伝子発現システムは、１つまたは複数の標的遺伝子の条件的調節を可能にする。条件的遺伝子発現システム、例えば薬物誘導型の遺伝子発現システムは、薬物の存在などの刺激に応答した遺伝子発現の活性化および／または非活性化を可能にする。しかし、現在利用可能なシステムは、不正確な制御、不十分な誘導レベル（例えば、遺伝子発現の活性化および／または非活性化）、および特異性の欠如により、限定されうる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
前述を考慮すると、遺伝子発現の条件的調節を実行するための代替の方法およびシステムが相当に必要である。
【０００５】
一態様では、本開示は、細胞における標的遺伝子の発現を調節するためのシステムであって、（ａ）リガンド結合ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む膜貫通受容体であって、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、シグナル伝達ドメインが細胞のシグナル伝達経路を活性化する、膜貫通受容体と、（ｂ）プロモーターの制御下に置かれた遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）をコードする核酸配列を含む発現カセットであって、ＧＭＰがアクチュエータ部分を含み、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、プロモーターが活性化されてＧＭＰの発現を駆動する発現カセットとを含み、発現されたＧＭＰが標的遺伝子の発現を調節する、システムを提供する。
【０００６】
一部の実施形態では、プロモーターは、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると活性化される内因性プロモーターを含む。一部の実施形態では、ＧＭＰをコードする核酸は、内因性プロモーターに作動可能に連結される。一部の実施形態では、発現カセットは、内因性タンパク質をコードする遺伝子を含み、遺伝子はＧＭＰをコードする核酸配列の上流に位置し、内因性タンパク質の発現は、内因性プロモーターによって駆動される。一部の実施形態では、遺伝子とＧＭＰをコードする核酸配列とは、ペプチドリンカーをコードする核酸配列によって結合される。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、プロテアーゼ認識配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、自己切断セグメントを含む。一部の実施形態では、自己切断セグメントは、２Ａペプチドを含む。一部の実施形態では、２Ａペプチドは、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＦ２Ａである。一部の実施形態では、遺伝子とＧＭＰをコードする核酸配列とは、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む核酸配列によって結合される。一部の実施形態では、プロモーターは、ＩＬ−２プロモーター、ＩＦＮ−γプロモーター、ＩＲＦ４プロモーター、ＮＲ４Ａ１プロモーター、ＰＲＤＭ１プロモーター、ＴＢＸ２１プロモーター、ＣＤ６９プロモーター、ＣＤ２５プロモーター、またはＧＺＭＢプロモーターを含む。
【０００７】
一部の実施形態では、プロモーターは、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると活性化される外因性プロモーターを含む。一部の実施形態では、外因性プロモーターは、合成プロモーター配列またはその断片を含む。一部の実施形態では、ＧＭＰをコードする核酸配列（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）は、外因性プロモーターに作動可能に連結される。
【０００８】
一部の実施形態では、膜貫通受容体は、内因性受容体、合成受容体、またはそのいずれかの断片を含む。一部の実施形態では、膜貫通受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、インテグリン受容体、またはＮｏｔｃｈ受容体を含む。一部の実施形態では、膜貫通受容体は、ＧＰＣＲまたはそのバリアントを含む。一部の実施形態では、膜貫通受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲのリガンド結合ドメインは、Ｆａｂ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、細胞外受容体ドメイン、およびＦｃ結合ドメインのうちの少なくとも１つを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｍｏｔｉｆ）（ＩＴＡＭ）を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、免疫受容体抑制性チロシンモチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｍｏｔｉｆ）（ＩＴＩＭ）を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、共刺激ドメインを含む。
【０００９】
一部の実施形態では、アクチュエータ部分は、ＲＮＡ誘導型アクチュエータ部分であり、システムは、ＲＮＡ誘導型アクチュエータ部分と複合体を形成するガイドＲＮＡをさらに含む。一部の実施形態では、ＲＮＡ誘導型アクチュエータ部分は、Ｃａｓ９である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  Ｃａｓ９である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、ヌクレアーゼ活性を実質的に欠如する。一部の実施形態では、ＲＮＡ誘導型アクチュエータ部分は、Ｃｐｆ１である。一部の実施形態では、Ｃｐｆ１は、ヌクレアーゼ活性を実質的に欠如する。一部の実施形態では、ＧＭＰは、少なくとも１つの標的化ペプチド、例えば核局在化配列（ＮＬＳ）を含む。一部の実施形態では、ＧＭＰは、転写活性化因子または転写抑制因子を含む。
【００１０】
一部の実施形態では、標的遺伝子は、サイトカインをコードする。一部の実施形態では、標的遺伝子は、免疫チェックポイント阻害剤をコードする。一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ−３、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＩＤＯ、ＫＩＲ、またはＶＩＳＴＡである。
【００１１】
一部の実施形態では、標的遺伝子は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ、ベータ、ガンマ、および／またはデルタ鎖をコードする。
【００１２】
一部の実施形態では、細胞は、免疫細胞、造血前駆細胞、または造血幹細胞である。一部の実施形態では、細胞は免疫細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞はリンパ球である。一部の実施形態では、リンパ球はＴ細胞である。一部の実施形態では、リンパ球は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。
【００１３】
一態様では、本開示は細胞における標的遺伝子の発現を調節するためのシステムであって、（ａ）第１のリガンド結合ドメインおよび第１のシグナル伝達ドメインを含む第１の膜貫通受容体であって、第１のリガンドが第１のリガンド結合ドメインに結合すると、第１のシグナル伝達ドメインが細胞の第１のシグナル伝達経路を活性化する、第１の膜貫通受容体と、（ｂ）第２のリガンド結合ドメインおよび第２のシグナル伝達ドメインを含む第２の膜貫通受容体であって、第２のリガンドが第２のリガンド結合ドメインに結合すると、第２のシグナル伝達ドメインが細胞の第２のシグナル伝達経路を活性化する、第２の膜貫通受容体と、（ｃ）プロモーターの制御下に置かれた遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）をコードする核酸配列を含む発現カセットであって、ＧＭＰがアクチュエータ部分を含み、（ｉ）第１のリガンドが第１のリガンド結合ドメインに結合し、かつ／または（ｉｉ）第２のリガンドが第２のリガンド結合ドメインに結合すると、プロモーターが活性化されてＧＭＰの発現を駆動する、発現カセットとを含み、ＧＭＰが標的遺伝子の発現を調節する、システムを提供する。
【００１４】
一部の実施形態では、プロモーターは、第１のリガンドが第１のリガンド結合ドメインに結合すると活性化される内因性プロモーターを含む。一部の実施形態では、プロモーターは、第２のリガンドが第２のリガンド結合ドメインに結合すると活性化される内因性プロモーターを含む。一部の実施形態では、ＧＭＰをコードする核酸配列は、内因性プロモーターに作動可能に連結される。一部の実施形態では、発現カセットは、内因性タンパク質をコードする遺伝子を含み、遺伝子は、ＧＭＰをコードする核酸配列の上流に位置し、内因性タンパク質の発現は、内因性プロモーターによって駆動される。一部の実施形態では、遺伝子とＧＭＰをコードする核酸配列とは、ペプチドリンカーをコードする核酸配列によって結合される。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、プロテアーゼ認識配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、自己切断セグメントを含む。一部の実施形態では、自己切断セグメントは、２Ａペプチドを含む。一部の実施形態では、２Ａペプチドは、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＦ２Ａである。一部の実施形態では、遺伝子とＧＭＰをコードする核酸配列とは、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む核酸配列によって結合される。一部の実施形態では、プロモーターは、ＩＬ−２プロモーター、ＩＦＮ−γプロモーター、ＩＲＦ４プロモーター、ＮＲ４Ａ１プロモーター、ＰＲＤＭ１プロモーター、ＴＢＸ２１プロモーター、ＣＤ６９プロモーター、ＣＤ２５プロモーター、またはＧＺＭＢプロモーターである。
【００１５】
一部の実施形態では、プロモーターは、第１のリガンドが第１のリガンド結合ドメインに結合すると活性化される外因性プロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、第２のリガンドが第２のリガンド結合ドメインに結合すると活性化される外因性プロモーターである。一部の実施形態では、外因性プロモーターは、合成プロモーター配列またはその断片を含む。一部の実施形態では、ＧＭＰをコードする核酸配列は、外因性プロモーターに作動可能に連結される。
【００１６】
一部の実施形態では、第１および第２の膜貫通受容体のうちの少なくとも１つは、内因性受容体、合成受容体、またはそのいずれかの断片を含む。一部の実施形態では、第１および第２の膜貫通受容体のうちの少なくとも１つは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、インテグリン受容体、またはＮｏｔｃｈ受容体を含む。一部の実施形態では、第１および第２の膜貫通受容体のうちの少なくとも１つは、ＧＰＣＲまたはそのバリアントを含む。一部の実施形態では、第１および第２の膜貫通受容体のうちの少なくとも１つは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲのリガンド結合ドメインは、Ｆａｂ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、細胞外受容体ドメイン、およびＦｃ結合ドメインのうちの少なくとも１つを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、免疫受容体抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、共刺激ドメインを含む。
【００１７】
一部の実施形態では、アクチュエータ部分は、ＲＮＡ誘導型アクチュエータ部分であり、システムは、ＲＮＡ誘導型アクチュエータ部分と複合体を形成するガイドＲＮＡをさらに含む。一部の実施形態では、ＲＮＡ誘導型アクチュエータ部分は、Ｃａｓ９である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  Ｃａｓ９である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、ヌクレアーゼ活性を実質的に欠如する。一部の実施形態では、ＲＮＡ誘導型アクチュエータ部分は、Ｃｐｆ１である。一部の実施形態では、Ｃｐｆ１は、ヌクレアーゼ活性を実質的に欠如する。一部の実施形態では、ＧＭＰは、少なくとも１つの標的化ペプチド、例えば核局在化配列（ＮＬＳ）を含む。一部の実施形態では、ＧＭＰは、転写活性化因子または転写抑制因子を含む。
【００１８】
一部の実施形態では、標的遺伝子は、サイトカインをコードする。一部の実施形態では、標的遺伝子は、免疫チェックポイント阻害剤をコードする。一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ−３、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＩＤＯ、ＫＩＲ、またはＶＩＳＴＡである。
【００１９】
一部の実施形態では、標的遺伝子は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ、ベータ、ガンマ、および／またはデルタ鎖をコードする。
【００２０】
一部の実施形態では、細胞は、免疫細胞、造血前駆細胞、または造血幹細胞である。一部の実施形態では、細胞は免疫細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞はリンパ球である。一部の実施形態では、リンパ球はＴ細胞である。一部の実施形態では、リンパ球は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。
【００２１】
一態様では、本開示は、細胞における２つの標的遺伝子の発現を調節するためのシステムであって、（ａ）第１のリガンド結合ドメインおよび第１のシグナル伝達ドメインを含む第１の膜貫通受容体であって、第１のリガンドが第１のリガンド結合ドメインに結合すると、第１のシグナル伝達ドメインが細胞の第１のシグナル伝達経路を活性化する、第１の膜貫通受容体と、（ｂ）第２のリガンド結合ドメインおよび第２のシグナル伝達ドメインを含む第２の膜貫通受容体であって、第２のリガンドが第２のリガンド結合ドメインに結合すると、第２のシグナル伝達ドメインが細胞の第２のシグナル伝達経路を活性化する、第２の膜貫通受容体と、（ｃ）第１のプロモーターの制御下に置かれた第１の遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）をコードする核酸配列を含む第１の発現カセットであって、第１のＧＭＰが第１のアクチュエータ部分を含み、第１のリガンドが第１のリガンド結合ドメインに結合すると、第１のプロモーターが活性化されて第１のＧＭＰの発現を駆動する第１の発現カセットと、（ｄ）第２のプロモーターの制御下に置かれた第２の遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）をコードする核酸配列を含む第２の発現カセットであって、第２のＧＭＰが第２のアクチュエータ部分を含み、第２のリガンドが第２のリガンド結合ドメインに結合すると、第２のプロモーターが活性化されて第２のＧＭＰの発現を駆動する、第２の発現カセットとを含み、（ｉ）第１のＧＭＰが第１の標的遺伝子の発現を調節し、および（ｉｉ）第２のＧＭＰが第２の標的遺伝子の発現を調節する、システムを提供する。
【００２２】
一部の実施形態では、第１のプロモーターは、第１のリガンドが第１のリガンド結合ドメインに結合すると活性化される第１の内因性プロモーターを含む。一部の実施形態では、第２のプロモーターは、第２のリガンドが第２のリガンド結合ドメインに結合すると活性化される第２の内因性プロモーターを含む。一部の実施形態では、第１のＧＭＰをコードする核酸配列は、第１の内因性プロモーターに作動可能に連結される。一部の実施形態では、第２のＧＭＰをコードする核酸配列は、第２の内因性プロモーターに作動可能に連結される。一部の実施形態では、第１の発現カセットは、第１の内因性タンパク質をコードする第１の遺伝子を含み、第１の遺伝子は、第１のＧＭＰをコードする核酸配列の上流に位置し、第１の内因性タンパク質の発現は、第１の内因性プロモーターによって駆動される。一部の実施形態では、第２の発現カセットは、第２の内因性タンパク質をコードする第２の遺伝子を含み、第２の遺伝子は、第２のＧＭＰをコードする核酸配列の上流に位置し、第２の内因性タンパク質の発現は、第２の内因性プロモーターによって駆動される。一部の実施形態では、第１の遺伝子と第１のＧＭＰをコードする核酸配列とは、ペプチドリンカーをコードする核酸配列によって結合される。一部の実施形態では、第２の遺伝子と第２のＧＭＰをコードする核酸配列とは、ペプチドリンカーをコードする核酸配列によって結合される。一部の実施形態では、第１の遺伝子と第１のＧＭＰコード配列とを結合するペプチドリンカー、および／または第２の遺伝子と第２のＧＭＰコード配列とを結合するペプチドリンカーは、プロテアーゼ認識配列を含む。一部の実施形態では、第１の遺伝子と第１のＧＭＰコード配列とを結合するペプチドリンカー、および／または第２の遺伝子と第２のＧＭＰコード配列とを結合するペプチドリンカーは、自己切断セグメントを含む。一部の実施形態では、自己切断セグメントは２Ａペプチドを含む。一部の実施形態では、２Ａペプチドは、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＦ２Ａである。一部の実施形態では、第１の遺伝子と第１のＧＭＰをコードする核酸配列とは、第１の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む核酸配列によって結合される。一部の実施形態では、第２の遺伝子と第２のＧＭＰをコードする核酸配列とは、第２の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む核酸配列によって結合される。一部の実施形態では、第１のプロモーターは、ＩＬ−２プロモーター、ＩＦＮ−γプロモーター、ＩＲＦ４プロモーター、ＮＲ４Ａ１プロモーター、ＰＲＤＭ１プロモーター、ＴＢＸ２１プロモーター、ＣＤ６９プロモーター、ＣＤ２５プロモーター、またはＧＺＭＢプロモーターである。一部の実施形態では、第２のプロモーターは、ＩＬ−２プロモーター、ＩＦＮ−γプロモーター、ＩＲＦ４プロモーター、ＮＲ４Ａ１プロモーター、ＰＲＤＭ１プロモーター、ＴＢＸ２１プロモーター、ＣＤ６９プロモーター、ＣＤ２５プロモーター、またはＧＺＭＢプロモーターである。
【００２３】
一部の実施形態では、第１のプロモーターは、第１のリガンドが第１のリガンド結合ドメインに結合すると活性化される第１の外因性プロモーターを含む。一部の実施形態では、第２のプロモーターは、第２のリガンドが第２のリガンド結合ドメインに結合すると活性化される第２の外因性プロモーターを含む。一部の実施形態では、第１の外因性プロモーターは、合成プロモーター配列またはそのいずれかの断片を含む。一部の実施形態では、第２の外因性プロモーターは、合成プロモーター配列またはそのいずれかの断片を含む。一部の実施形態では、第１のＧＭＰをコードする核酸配列は、第１の外因性プロモーターに作動可能に連結されている。一部の実施形態では、第２のＧＭＰをコードする核酸配列は、第２の外因性プロモーターに作動可能に連結されている。
【００２４】
一部の実施形態では、第１および第２の膜貫通受容体のうちの少なくとも１つは、内因性受容体、合成受容体、またはその断片を含む。一部の実施形態では、第１および第２の膜貫通受容体のうちの少なくとも１つは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、インテグリン受容体、またはＮｏｔｃｈ受容体を含む。一部の実施形態では、第１および第２の膜貫通受容体のうちの少なくとも１つは、ＧＰＣＲまたはそのバリアントを含む。一部の実施形態では、第１および第２の膜貫通受容体のうちの少なくとも１つは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲのリガンド結合ドメインは、Ｆａｂ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、細胞外受容体ドメイン、およびＦｃ結合ドメインのうちの少なくとも１つを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、免疫受容体抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、共刺激ドメインを含む。
【００２５】
一部の実施形態では、第１のＧＭＰおよび第２のＧＭＰのうちの少なくとも１つのアクチュエータ部分は、ＲＮＡ誘導型アクチュエータ部分であり、システムは、ＲＮＡ誘導型アクチュエータ部分と複合体を形成するガイドＲＮＡをさらに含む。一部の実施形態では、ＲＮＡ誘導型アクチュエータ部分はＣａｓ９である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  Ｃａｓ９である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、ヌクレアーゼ活性を実質的に欠如する。一部の実施形態では、ＲＮＡ誘導型アクチュエータ部分は、Ｃｐｆ１である。一部の実施形態では、Ｃｐｆ１は、ヌクレアーゼ活性を実質的に欠如する。一部の実施形態では、第１のＧＭＰおよび第２のＧＭＰのうちの少なくとも１つは、少なくとも１つの標的化ペプチド、例えば核局在化配列（ＮＬＳ）を含む。一部の実施形態では、第１のＧＭＰおよび第２のＧＭＰのうちの少なくとも１つは、転写活性化因子または転写抑制因子を含む。
【００２６】
一部の実施形態では、第１および／または第２の標的遺伝子は、サイトカインをコードする。一部の実施形態では、第１および／または第２の標的遺伝子は、免疫チェックポイント阻害剤をコードする。一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ−３、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＩＤＯ、ＫＩＲ、またはＶＩＳＴＡである。
【００２７】
一部の実施形態では、標的遺伝子は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ、ベータ、ガンマ、および／またはデルタ鎖をコードする。
【００２８】
一部の実施形態では、細胞は、免疫細胞、造血前駆細胞、または造血幹細胞である。一部の実施形態では、細胞は免疫細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞はリンパ球である。一部の実施形態では、リンパ球はＴ細胞である。一部の実施形態では、リンパ球は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。
【００２９】
一態様では、本開示は、細胞における標的遺伝子の発現を調節するためのシステムであって、（ａ）第１のリガンド結合ドメインおよび第１のシグナル伝達ドメインを含む第１の膜貫通受容体であって、第１のリガンドが第１のリガンド結合ドメインに結合すると、第１のシグナル伝達ドメインが細胞の第１のシグナル伝達経路を活性化する、第１の膜貫通受容体と、（ｂ）第２のリガンド結合ドメインおよび第２のシグナル伝達ドメインを含む第２の膜貫通受容体であって、第２のリガンドが第２のリガンド結合ドメインに結合すると、第２のシグナル伝達ドメインが細胞の第２のシグナル伝達経路を活性化する、第２の膜貫通受容体と、（ｃ）第１のプロモーターの制御下に置かれた第１の部分的遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）をコードする核酸を含む第１の発現カセットであって、第１の部分的ＧＭＰがアクチュエータ部分の第１の部分を含み、第１のリガンドが第１のリガンド結合ドメインに結合すると、第１のプロモーターが活性化されて第１の部分的ＧＭＰの発現を駆動する第１の発現カセットと、（ｃ）第２のプロモーターの制御下に置かれた第２の部分的遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）をコードする核酸を含む第２の発現カセットであって、第２の部分的ＧＭＰがアクチュエータ部分の第２の部分を含み、第２のリガンドが第２のリガンド結合ドメインに結合すると、第２のプロモーターが活性化されて第２の部分的ＧＭＰの発現を駆動する、第２の発現カセットとを含み、アクチュエータ部分の第１および第２の部分が複合体を形成して、機能的アクチュエータ部分を含む再構成されたＧＭＰを形成し、再構成されたＧＭＰが標的遺伝子の発現を調節する、システムを提供する。
【００３０】
一部の実施形態では、第１のプロモーターは、第１のリガンドが第１のリガンド結合ドメインに結合すると活性化される第１の内因性プロモーターを含む。一部の実施形態では、第２のプロモーターは、第２のリガンドが第２のリガンド結合ドメインに結合すると活性化される第２の内因性プロモーターを含む。一部の実施形態では、第１の部分的ＧＭＰをコードする核酸配列は、第１の内因性プロモーターに作動可能に連結される。一部の実施形態では、第２の部分的ＧＭＰをコードする核酸配列は、第２の内因性プロモーターに作動可能に連結される。一部の実施形態では、第１の発現カセットは、第１の内因性タンパク質をコードする第１の遺伝子を含み、第１の遺伝子は、第１の部分的ＧＭＰをコードする核酸配列の上流に位置し、第１の内因性タンパク質の発現は、第１の内因性プロモーターによって駆動される。一部の実施形態では、第２の発現カセットは、第２の内因性タンパク質をコードする第２の遺伝子を含み、第２の遺伝子は、第２の部分的ＧＭＰをコードする核酸配列の上流に位置し、第２の内因性タンパク質の発現は、第２の内因性プロモーターによって駆動される。一部の実施形態では、第１の遺伝子と第１の部分的ＧＭＰをコードする核酸配列とは、ペプチドリンカーをコードする核酸配列によって結合される。一部の実施形態では、第２の遺伝子と第２の部分的ＧＭＰをコードする核酸配列とは、ペプチドリンカーをコードする核酸配列によって結合される。一部の実施形態では、第１の遺伝子と第１の部分的ＧＭＰコード配列とを結合するペプチドリンカー、および／または第２の遺伝子と第２の部分的ＧＭＰコード配列とを結合するペプチドリンカーは、プロテアーゼ認識配列を含む。一部の実施形態では、第１の遺伝子と第１の部分的ＧＭＰコード配列とを結合するペプチドリンカー、および／または第２の遺伝子と第２のＧＭＰコード配列とを結合するペプチドリンカーは、自己切断セグメントを含む。一部の実施形態では、自己切断セグメントは２Ａペプチドを含む。一部の実施形態では、２Ａペプチドは、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＦ２Ａである。一部の実施形態では、第１の遺伝子と第１の部分的ＧＭＰをコードする核酸配列とは、第１の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む核酸配列によって結合される。一部の実施形態では、第２の遺伝子と第２の部分的ＧＭＰをコードする核酸配列とは、第２の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む核酸配列によって結合される。一部の実施形態では、第１のプロモーターは、ＩＬ−２プロモーター、ＩＦＮ−γプロモーター、ＩＲＦ４プロモーター、ＮＲ４Ａ１プロモーター、ＰＲＤＭ１プロモーター、ＴＢＸ２１プロモーター、ＣＤ６９プロモーター、ＣＤ２５プロモーター、またはＧＺＭＢプロモーターである。一部の実施形態では、第２のプロモーターは、ＩＬ−２プロモーター、ＩＦＮ−γプロモーター、ＩＲＦ４プロモーター、ＮＲ４Ａ１プロモーター、ＰＲＤＭ１プロモーター、ＴＢＸ２１プロモーター、ＣＤ６９プロモーター、ＣＤ２５プロモーター、またはＧＺＭＢプロモーターである。
【００３１】
一部の実施形態では、第１のプロモーターは、第１のリガンドが第１のリガンド結合ドメインに結合すると活性化される第１の外因性プロモーターを含む。一部の実施形態では、第２のプロモーターは、第２のリガンドが第２のリガンド結合ドメインに結合すると活性化される第２の外因性プロモーターを含む。一部の実施形態では、第１の外因性プロモーターは、合成プロモーター配列またはそのいずれかの断片を含む。一部の実施形態では、第２の外因性プロモーターは、合成プロモーター配列またはそのいずれかの断片を含む。一部の実施形態では、第１の部分的ＧＭＰをコードする核酸配列は、第１の外因性プロモーターに作動可能に連結される。一部の実施形態では、第２の部分的ＧＭＰをコードする核酸配列は、第２の外因性プロモーターに作動可能に連結される。
【００３２】
一部の実施形態では、第１および第２の膜貫通受容体のうちの少なくとも１つは、内因性受容体、合成受容体、またはその断片を含む。一部の実施形態では、第１および第２の膜貫通受容体のうちの少なくとも１つは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、インテグリン受容体、またはＮｏｔｃｈ受容体を含む。一部の実施形態では、第１および第２の膜貫通受容体のうちの少なくとも１つは、ＧＰＣＲまたはそのバリアントを含む。一部の実施形態では、第１および第２の膜貫通受容体のうちの少なくとも１つは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲのリガンド結合ドメインは、Ｆａｂ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、細胞外受容体ドメイン、およびＦｃ結合ドメインのうちの少なくとも１つを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、免疫受容体抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、共刺激ドメインを含む。
【００３３】
一部の実施形態では、機能的アクチュエータ部分は、ＲＮＡ誘導型アクチュエータ部分を含み、システムは、ＲＮＡ誘導型アクチュエータ部分と複合体を形成するガイドＲＮＡをさらに含む。一部の実施形態では、ＲＮＡ誘導型アクチュエータ部分はＣａｓ９である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  Ｃａｓ９である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、ヌクレアーゼ活性を実質的に欠如する。一部の実施形態では、ＲＮＡ誘導型アクチュエータ部分は、Ｃｐｆ１である。一部の実施形態では、Ｃｐｆ１は、ヌクレアーゼ活性を実質的に欠如する。一部の実施形態では、第１の部分的ＧＭＰおよび第２の部分的ＧＭＰのうちの少なくとも１つは、少なくとも１つの標的化ペプチド、例えば核局在化配列（ＮＬＳ）を含む。一部の実施形態では、第１の部分的ＧＭＰおよび第２の部分的ＧＭＰのうちの少なくとも１つは、転写活性化因子または転写抑制因子を含む。
【００３４】
一部の実施形態では、標的遺伝子は、サイトカインをコードする。一部の実施形態では、標的遺伝子は、免疫チェックポイント阻害剤をコードする。一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ−３、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＩＤＯ、ＫＩＲ、またはＶＩＳＴＡである。
【００３５】
一部の実施形態では、標的遺伝子は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ、ベータ、ガンマ、および／またはデルタ鎖をコードする。
【００３６】
一部の実施形態では、細胞は、免疫細胞、造血前駆細胞、または造血幹細胞である。一部の実施形態では、細胞は免疫細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞はリンパ球である。一部の実施形態では、リンパ球はＴ細胞である。一部の実施形態では、リンパ球は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。
【００３７】
一態様では、本開示は、遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）の発現を誘導する方法であって、（ａ）リガンド結合ドメインおよびシグナル伝達ドメインを有する膜貫通受容体を発現する細胞を提供するステップと、（ｂ）リガンドを、膜貫通受容体のリガンド結合ドメインに結合させるステップであって、結合が細胞のシグナル伝達経路を活性化し、次いで、ＧＭＰをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターが活性化される、ステップと、（ｃ）プロモーターが活性化されるとＧＭＰを発現するステップとを含む方法を提供する。
【００３８】
一態様では、本開示は、細胞における標的遺伝子の発現を調節する方法であって、（ａ）リガンドに、リガンド結合ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む膜貫通受容体を接触させるステップであって、接触すると、シグナル伝達ドメインが細胞のシグナル伝達経路を活性化する、ステップと、（ｂ）アクチュエータ部分を含む遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）を、プロモーターの制御下に置かれたＧＭＰをコードする核酸配列を含む発現構築物から発現させるステップであって、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、プロモーターが活性化されてＧＭＰの発現を駆動する、ステップと、（ｃ）発現されたＧＭＰの結合を介して標的遺伝子の発現を増加または減少させ、それによって標的遺伝子の発現を調節するステップとを含む方法を提供する。
【００３９】
本明細書に開示の方法の様々な実施形態では、膜貫通受容体は内因性受容体を含む。本明細書に開示の方法の様々な実施形態では、膜貫通受容体は合成受容体を含む。本明細書に開示の方法の様々な実施形態では、膜貫通受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、インテグリン受容体、またはＮｏｔｃｈ受容体を含む。
【００４０】
本明細書に開示の方法の様々な実施形態では、膜貫通受容体は、ＧＰＣＲまたはそのバリアントを含む。一部の実施形態では、膜貫通受容体は、天然または操作されたＴＣＲを含む。本明細書に開示の方法の様々な実施形態では、膜貫通受容体は、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、黒色腫関連抗原４（ＭＡＧＥ−Ａ４）、黒色腫関連抗原１０（ＭＡＧＥ−Ａ１０）、またはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）複合体と複合体を形成したＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質由来ペプチドのＴＣＲを含む。本明細書に開示の方法の様々な実施形態では、膜貫通受容体はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲのリガンド結合ドメインは、Ｆａｂ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、細胞外受容体ドメイン、およびＦｃ結合ドメインのうちの少なくとも１つを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、免疫受容体抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、共刺激ドメインを含む。
【００４１】
一部の実施形態では、アクチュエータ部分は、ＲＮＡ誘導型アクチュエータ部分である。一部の実施形態では、ＲＮＡ誘導型アクチュエータ部分はＣａｓ９である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９はＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９はＳ．ａｕｒｅｕｓ  Ｃａｓ９である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、ヌクレアーゼ活性を実質的に欠如する。一部の実施形態では、ＲＮＡ誘導型アクチュエータ部分はＣｐｆ１である。一部の実施形態では、Ｃｐｆ１は、ヌクレアーゼ活性を実質的に欠如する。一部の実施形態では、ＧＭＰは核局在化配列（ＮＬＳ）を含む。一部の実施形態では、ＧＭＰは、転写活性化因子または転写抑制因子を含む。
【００４２】
一部の実施形態では、細胞は、免疫細胞、造血前駆細胞、または造血幹細胞である。一部の実施形態では、細胞は免疫細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞はリンパ球である。一部の実施形態では、リンパ球はＴ細胞である。一部の実施形態では、リンパ球は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。
【００４３】
一態様では、本開示は、アクチュエータ部分を含む遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）をコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットであって、リガンドが膜貫通受容体に結合することによって活性化されている膜貫通受容体を発現する細胞に発現カセットが存在する場合、プロモーターが活性化されて発現カセットからのＧＭＰの発現を駆動することを特徴とする発現カセットを提供する。
【００４４】
一部の実施形態では、膜貫通受容体は、シグナル伝達ドメインを含み、シグナル伝達ドメインは、膜貫通受容体が活性化されると、細胞のシグナル伝達経路を活性化する。一部の実施形態では、膜貫通受容体のシグナル伝達ドメインは、免疫細胞シグナル伝達経路を活性化する。
【００４５】
一部の実施形態では、細胞の活性化されたシグナル伝達経路の転写因子は、プロモーターに結合し、それによってプロモーターを活性化させて、発現カセットからのＧＭＰの発現を駆動する。一部の実施形態では、プロモーターは内因性プロモーター配列を含む。一部の実施形態では、プロモーターは、合成プロモーター配列を含む。一部の実施形態では、プロモーターは、ＩＬ−２プロモーター、ＩＦＮ−γプロモーター、ＩＲＦ４プロモーター、ＮＲ４Ａ１プロモーター、ＰＲＤＭ１プロモーター、ＴＢＸ２１プロモーター、ＣＤ６９プロモーター、ＣＤ２５プロモーター、またはＧＺＭＢプロモーターである。一部の実施形態では、第２のプロモーターは、ＩＬ−２プロモーター、ＩＦＮ−γプロモーター、ＩＲＦ４プロモーター、ＮＲ４Ａ１プロモーター、ＰＲＤＭ１プロモーター、ＴＢＸ２１プロモーター、ＣＤ６９プロモーター、ＣＤ２５プロモーター、またはＧＺＭＢプロモーターである。
【００４６】
一部の実施形態では、アクチュエータ部分は、ＲＮＡ誘導型アクチュエータ部分である。一部の実施形態では、ＲＮＡ誘導型アクチュエータ部分はＣａｓ９である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９はＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９はＳ．ａｕｒｅｕｓ  Ｃａｓ９である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、ヌクレアーゼ活性を実質的に欠如する。一部の実施形態では、ＲＮＡ誘導型アクチュエータ部分はＣｐｆ１である。一部の実施形態では、Ｃｐｆ１は、ヌクレアーゼ活性を実質的に欠如する。一部の実施形態では、ＧＭＰは核局在化配列（ＮＬＳ）を含む。一部の実施形態では、ＧＭＰは、転写活性化因子または転写抑制因子を含む。
【００４７】
一部の実施形態では、発現カセットは、細胞ゲノムに組み込まれる。一部の実施形態では、発現カセットは、レンチウイルスを介して細胞ゲノムに組み込まれる。一部の実施形態では、発現カセットは、細胞ゲノムにプログラム可能なヌクレアーゼを介して組み込まれる。一部の実施形態では、プログラム可能なヌクレアーゼは、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＮＦ）、または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である。
【００４８】
一部の実施形態では、発現カセットは、セーフハーバー部位を含む領域で細胞ゲノムに組み込まれる。一部の実施形態では、発現カセットは、第１９染色体のＡＡＶＳ１部位に組み込まれる。一部の実施形態では、発現カセットは、第３染色体のＣＣＲ５部位に組み込まれる。
【００４９】
一態様では、本開示は、（ｉ）遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）をコードする核酸配列と、（ｉｉ）細胞ゲノムへの発現カセットの組込みを容易にする少なくとも１つの組込み配列とを含む発現カセットであって、ＧＭＰがアクチュエータ部分を含み、発現カセットが少なくとも１つの組込み配列を介して細胞ゲノムに組み込まれている場合に、リガンドの膜貫通受容体との結合による膜貫通受容体の活性化が、プロモーターを活性化して発現カセットからのＧＭＰの発現を駆動することを特徴とする、発現カセットを提供する。
【００５０】
一部の実施形態では、少なくとも１つの組込み配列は、細胞ゲノムの領域への発現カセットの組込みを容易にし、それによってＧＭＰをコードする核酸配列は内因性プロモーターに作動可能に連結される。
【００５１】
一部の実施形態では、少なくとも１つの組込み配列は、細胞ゲノムの領域への発現カセットの組込みを容易にし、それによってＧＭＰをコードする核酸配列は、（ｉ）内因性プロモーターに作動可能に連結され、（ｉｉ）内因性タンパク質をコードする遺伝子の下流に位置し、細胞における内因性タンパク質の発現は内因性プロモーターによって駆動される。
【００５２】
一部の実施形態では、ＧＭＰをコードする核酸配列は、ペプチドリンカーをコードする核酸配列によって遺伝子に結合される。一部の実施形態では、ＧＭＰをコードする核酸配列は、遺伝子にインフレームで結合される。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、プロテアーゼ認識配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは自己切断セグメントを含む。一部の実施形態では、自己切断セグメントは２Ａペプチドを含む。一部の実施形態では、２Ａペプチドは、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＦ２Ａである。一部の実施形態では、ＧＭＰをコードする核酸配列は、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む核酸配列によって遺伝子に結合される。
【００５３】
一部の実施形態では、少なくとも１つの組込み配列は、相同配列を含み、発現カセットは、相同性修復（ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｒｅｐａｉｒ）（ＨＤＲ）を介して細胞ゲノムに組み込まれる。一部の実施形態では、２つの組込み配列が遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）をコードする核酸配列の両端に存在し、２つの各々の組込み配列は相同配列を含む。一部の実施形態では、相同配列は、細胞ゲノムの標的化領域への発現カセットの組込みを容易にする。一部の実施形態では、遺伝子モジュレーティングポリペプチドをコードする核酸配列は、発現カセットの組込み後、プロモーターの下流に位置する。
【００５４】
一態様では、本開示は、本明細書に開示のいずれかのシステムまたは発現カセットを含む細胞を提供する。一部の実施形態では、細胞は、造血細胞、造血前駆細胞、または造血幹細胞である。一部の実施形態では、細胞は造血細胞であり、造血細胞は、リンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、マクロファージ、または樹状細胞（ＤＣ）である。
【００５５】
一部の実施形態では、システムの発現カセットは、プラスミドの一部として細胞に存在する。一部の実施形態では、システムの発現カセットは、細胞ゲノムに組み込まれる。一部の実施形態では、発現カセットは、細胞ゲノムにプログラム可能なヌクレアーゼを介して組み込まれる。一部の実施形態では、プログラム可能なヌクレアーゼは、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＮＦ）、または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である。
【００５６】
一部の実施形態では、システムの発現カセットは、ゲノムのセーフハーバー部位を含む領域で細胞ゲノムに組み込まれる。一部の実施形態では、システムの発現カセットは、第１９染色体のＡＡＶＳ１部位に組み込まれる。一部の実施形態では、システムの発現カセットは、第３染色体のＣＣＲ５部位に組み込まれる。
【００５７】
一態様では、本開示は、細胞における標的遺伝子の発現を調節するためのシステムであって、（ａ）リガンド結合ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む膜貫通受容体であって、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、シグナル伝達ドメインが細胞のシグナル伝達経路を活性化する、膜貫通受容体と、（ｂ）遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）をコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットであって、ＧＭＰがアクチュエータ部分を含み、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、プロモーターが活性化されてＧＭＰの発現を駆動する発現カセットとを含み、発現されたＧＭＰが標的遺伝子の発現を調節する、システムを提供する。
【００５８】
一態様では、本開示は、細胞における標的遺伝子の発現を調節するためのシステムを提供する。システムは、（ａ）リガンド結合ドメイン、シグナル伝達ドメイン、および遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）を含む膜貫通受容体であって、ＧＭＰが、切断認識部位に連結されたアクチュエータ部分を含み、リガンドがリガンド結合ドメインに結合するとシグナル伝達ドメインが細胞のシグナル伝達経路を活性化する、膜貫通受容体と、（ｂ）切断部分をコードする核酸配列を含む発現カセットであって、核酸配列が、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、シグナル伝達経路によって活性化されて切断部分の発現を駆動するプロモーターの制御下に置かれる、発現カセットとを含み、発現された切断部分が、切断認識部位の近位に存在する場合、切断認識部位を切断してアクチュエータ部分を放出し、放出されたアクチュエータ部分が標的遺伝子の発現を調節する。
【００５９】
一態様では、本開示は、細胞における標的遺伝子の発現を調節するためのシステムを提供する。システムは、（ａ）リガンド結合ドメイン、シグナル伝達ドメイン、および切断部分を含む膜貫通受容体であって、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、シグナル伝達ドメインが細胞のシグナル伝達経路を活性化する、膜貫通受容体と、（ｂ）核外輸送シグナルペプチドに連結された遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）を含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含む発現カセットであって、ＧＭＰが、切断認識部位に連結されたアクチュエータ部分を含み、核酸配列が、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、シグナル伝達経路によって活性化されて融合タンパク質の発現を駆動するプロモーターの制御下に置かれる、発現カセットとを含み、融合タンパク質が切断部分の近位に存在する場合に、切断部分が融合タンパク質の切断認識部位を切断してアクチュエータ部分を放出し、放出されたアクチュエータ部分が標的遺伝子の発現を調節する。一部の実施形態では、切断部分は、膜貫通受容体の細胞内領域に連結されている。
【００６０】
一態様では、本開示は、細胞における標的遺伝子の発現を調節するためのシステムを提供する。システムは、（ａ）リガンド結合ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む膜貫通受容体であって、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、シグナル伝達ドメインが細胞のシグナル伝達経路を活性化する、膜貫通受容体と、（ｂ）切断部分をコードする核酸配列を含む発現カセットであって、核酸配列が、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、シグナル伝達経路によって活性化されて切断部分の発現を駆動するプロモーターの制御下に置かれる、発現カセットとを含み、発現された切断部分が、核外輸送シグナルペプチドに連結された遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）を含む融合タンパク質の切断認識部位を切断し、ＧＭＰが切断認識部位に連結されたアクチュエータ部分を含み、切断認識部位の切断が、アクチュエータ部分を放出し、放出されたアクチュエータ部分が標的遺伝子の発現を調節する。一部の実施形態では、システムは、核外輸送シグナルペプチドに連結された遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）を含む融合タンパク質を含む。
【００６１】
一態様では、本開示は、細胞における標的遺伝子の発現を調節するためのシステムを提供する。システムは、（ａ）リガンド結合ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む膜貫通受容体であって、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、シグナル伝達ドメインが細胞のシグナル伝達経路を活性化する、膜貫通受容体と、（ｂ）核外輸送シグナルペプチドに連結された遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）を含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含む発現カセットであって、ＧＭＰが、切断認識配列に連結されたアクチュエータ部分を含み、核酸配列が、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、シグナル伝達経路によって活性化されて融合タンパク質の発現を駆動するプロモーターの制御下に置かれる、発現カセットとを含み、切断認識部位で切断部分による切断を介してアクチュエータ部分が放出されると、放出されたアクチュエータ部分が標的遺伝子の発現を調節する。一部の実施形態では、システムは、切断部分をさらに含む。一部の実施形態では、切断部分は、切断認識部位の近位に存在する場合、発現された融合タンパク質の切断認識部位を切断する。
【００６２】
一態様では、本開示は、細胞における標的遺伝子の発現を調節するためのシステムを提供する。システムは、（ａ）リガンド結合ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む膜貫通受容体であって、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、シグナル伝達ドメインが細胞のシグナル伝達経路を活性化する、膜貫通受容体と、（ｂ）核外輸送シグナルペプチドに連結された遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）を含む融合タンパク質をコードする第１の核酸配列を含む第１の発現カセットであって、ＧＭＰが、切断認識配列に連結されたアクチュエータ部分を含み、第１の核酸配列が、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、シグナル伝達経路によって活性化されて融合タンパク質の発現を駆動する第１のプロモーターの制御下に置かれる、第１の発現カセットと、（ｃ）切断部分をコードする第２の核酸配列を含む第２の発現カセットであって、第２の核酸配列が、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、シグナル伝達経路によって活性化されて切断部分の発現を駆動する第２のプロモーターの制御下に置かれる、第２の発現カセットとを含み、発現された切断部分が、切断認識部位の近位に存在する場合、発現された融合タンパク質の切断認識部位を切断してアクチュエータ部分を放出し、放出されたアクチュエータ部分が標的遺伝子の発現を調節する。
【００６３】
一態様では、本開示は、細胞における標的遺伝子の発現を調節するためのシステムを提供する。システムは、（ａ）リガンド結合ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む膜貫通受容体であって、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、シグナル伝達ドメインが細胞のシグナル伝達経路を活性化する、膜貫通受容体と、（ｂ）第１の部分的遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）をコードする第１の核酸配列を含む第１の発現カセットであって、第１の部分的ＧＭＰがアクチュエータ部分の第１の部分を含み、第１の核酸配列が、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、シグナル伝達経路によって活性化されて第１の部分的ＧＭＰの発現を駆動する第１のプロモーターの制御下に置かれる、第１の発現カセットと、（ｃ）第２の部分的遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）をコードする第２の核酸配列を含む第２の発現カセットであって、第２の部分的ＧＭＰがアクチュエータ部分の第２の部分を含み、第２の核酸配列が、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、シグナル伝達経路によって活性化されて第２の部分的ＧＭＰの発現を駆動する第２のプロモーターの制御下に置かれる、第２の発現カセットとを含み、第１の部分的ＧＭＰおよび第２の部分的ＧＭＰが複合体を形成して、再構成されたアクチュエータ部分を形成し、再構成されたアクチュエータ部分が標的遺伝子の発現を調節する。
【００６４】
一態様では、本開示は、細胞における標的遺伝子の発現を調節するためのシステムを提供する。システムは、（ａ）リガンド結合ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む膜貫通受容体であって、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、シグナル伝達ドメインが細胞のシグナル伝達経路を活性化する、膜貫通受容体と、（ｂ）第１の部分的切断部分をコードする第１の核酸配列を含む第１の発現カセットであって、第１の核酸配列が、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、シグナル伝達経路によって活性化されて第１の部分的切断部分の発現を駆動する第１のプロモーターの制御下に置かれる、第１の発現カセットと、（ｃ）第２の部分的切断部分をコードする第２の核酸配列を含む第２の発現カセットであって、第２の核酸配列が、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、シグナル伝達経路によって活性化されて第２の部分的切断部分の発現を駆動する第２のプロモーターの制御下に置かれる、第２の発現カセットとを含み、第１の部分的切断部分および第２の部分的切断部分が複合体を形成して、再構成された切断部分を形成し、再構成された切断部分によって切断認識部位で切断されると、核外輸送シグナルペプチドからアクチュエータ部分を放出し、アクチュエータ部分が標的遺伝子の発現を調節する。一部の実施形態では、システムは、切断認識部位を介してアクチュエータ部分に連結された核外輸送シグナルペプチドを含む融合ポリペプチドをさらに含む。
【００６５】
一態様では、本開示は、細胞における標的遺伝子の発現を調節するためのシステムを提供する。システムは、（ａ）リガンド結合ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む膜貫通受容体であって、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、シグナル伝達ドメインが細胞のシグナル伝達経路を活性化する、膜貫通受容体と、（ｂ）（ｉ）切断部分および（ｉｉ）核外輸送シグナルペプチドに連結された遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）を含む融合タンパク質のうちの一方または両方をコードする核酸を含む発現カセットであって、ＧＭＰが切断認識部位に連結されたアクチュエータ部分を含み、切断部分および融合タンパク質のうちの一方または両方の発現が、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、シグナル伝達経路によって活性化されるプロモーターによって駆動され、アクチュエータ部分が、切断部分によって切断認識部位が切断されると放出され、放出されたＧＭＰが標的ポリヌクレオチドの発現を調節する。
【００６６】
一部の実施形態では、膜貫通受容体は、内因性受容体または合成受容体を含む。一部の実施形態では、膜貫通受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、インテグリン受容体、またはＮｏｔｃｈ受容体を含む。
【００６７】
一部の実施形態では、アクチュエータ部分は、ポリヌクレオチド誘導型エンドヌクレアーゼを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド誘導型エンドヌクレアーゼは、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼである。一部の実施形態では、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質である。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  Ｃａｓ９である。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ヌクレアーゼ活性を実質的に欠如する。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃｐｆ１である。一部の実施形態では、Ｃｐｆ１は、ヌクレアーゼ活性を実質的に欠如する。
【００６８】
一部の実施形態では、アクチュエータ部分は、転写活性化因子に連結されている。一部の実施形態では、アクチュエータ部分は転写抑制因子に連結されている。
【００６９】
一部の実施形態では、プロモーターは、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＲＦ４、ＮＲ４Ａ１、ＰＲＤＭ１、ＴＢＸ２１、ＣＤ６９、ＣＤ２５、およびＧＺＭＢプロモーターから選択される。
【００７０】
一部の実施形態では、細胞は、免疫細胞、造血前駆細胞、または造血幹細胞である。一部の実施形態では、細胞は免疫細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞はリンパ球である。一部の実施形態では、リンパ球はＴ細胞である。一部の実施形態では、リンパ球は、ナチュラルキラー（ＮＫ細胞）である。
【００７１】
一態様では、本開示は、細胞における標的遺伝子の発現を調節する方法を提供する。方法は、（ａ）リガンドを、リガンド結合ドメイン、シグナル伝達ドメイン、および遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）を含む膜貫通受容体に接触させるステップであって、ＧＭＰが切断認識部位に連結されたアクチュエータ部分を含み、リガンドがリガンド結合ドメインに接触すると、シグナル伝達ドメインが細胞のシグナル伝達経路を活性化する、ステップと、（ｂ）切断部分を、切断部分をコードする核酸配列を含む発現カセットから発現させるステップであって、核酸配列が、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、シグナル伝達経路によって活性化されて切断部分の発現を駆動するプロモーターの制御下に置かれる、ステップと、（ｃ）切断部分によって切断認識部位を切断して、膜貫通受容体からアクチュエータ部分を放出するステップとを含み、放出されたアクチュエータ部分が標的遺伝子の発現を調節する。
【００７２】
一態様では、本開示は、細胞における標的遺伝子の発現を調節する方法を提供する。方法は、（ａ）リガンドを、リガンド結合ドメイン、シグナル伝達ドメイン、および切断部分を含む膜貫通受容体に接触させるステップであって、リガンドがリガンド結合ドメインに接触すると、シグナル伝達ドメインが細胞のシグナル伝達経路を活性化する、ステップと、（ｂ）核外輸送シグナルペプチドに連結された遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）を含む融合タンパク質を、核酸配列を含む発現カセットから発現させるステップであって、ＧＭＰが、切断認識部位に連結したアクチュエータ部分を含み、核酸配列が、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、シグナル伝達経路によって活性化されて融合タンパク質の発現を駆動するプロモーターの制御下に置かれる、ステップと、（ｃ）切断部分によって切断認識部位を切断してアクチュエータ部分を放出するステップとを含み、放出されたアクチュエータ部分が標的遺伝子の発現を調節する。一部の実施形態では、切断部分は、膜貫通受容体の細胞内領域に連結されている。
【００７３】
一態様では、本開示は、細胞における標的遺伝子の発現を調節する方法を提供する。方法は、（ａ）リガンドを、リガンド結合ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む膜貫通受容体に接触させるステップであって、リガンドがリガンド結合ドメインに接触すると、シグナル伝達ドメインが細胞のシグナル伝達経路を活性化する、ステップと、（ｂ）切断部分を、切断部分をコードする核酸配列を含む発現カセットから発現させるステップであって、核酸配列が、リガンドがリガンド結合ドメインに結合するとシグナル伝達経路によって活性化されて切断部分の発現を駆動するプロモーターの制御下に置かれる、ステップと、（ｃ）切断部分によって、核外輸送シグナルペプチドに連結された遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）を含む融合タンパク質の切断認識部位を切断するステップであって、ＧＭＰが切断認識部位に連結されたアクチュエータ部分を含み、切断されるとアクチュエータ部分が放出されるステップとを含み、放出されたアクチュエータ部分が標的遺伝子の発現を調節する。
【００７４】
一態様では、本開示は、細胞における標的遺伝子の発現を調節する方法を提供する。方法は、（ａ）リガンドを、リガンド結合ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む膜貫通受容体に接触させるステップであって、リガンドがリガンド結合ドメインに接触すると、シグナル伝達ドメインが細胞のシグナル伝達経路を活性化するステップと、（ｂ）核外輸送シグナルペプチドに連結された遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）を含む融合タンパク質を、融合タンパク質をコードする核酸配列を含む発現カセットから発現させるステップであって、ＧＭＰが、切断認識配列に連結されたアクチュエータ部分を含み、核酸配列が、リガンドがリガンド結合ドメインに結合するとシグナル伝達経路によって活性化されて融合タンパク質の発現を駆動するプロモーターの制御下に置かれる、ステップと、（ｃ）切断部分によって融合タンパク質の切断認識部位を切断して、アクチュエータ部分を放出するステップとを含み、放出されたアクチュエータ部分が標的遺伝子の発現を調節する。一部の実施形態では、切断部分は、切断認識部位の近位に存在する場合、発現された融合タンパク質の切断認識部位を切断する。
【００７５】
一態様では、本開示は、細胞における標的遺伝子の発現を調節する方法を提供する。方法は、（ａ）リガンドを、リガンド結合ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む膜貫通受容体に接触させるステップであって、リガンドがリガンド結合ドメインに接触すると、シグナル伝達ドメインが細胞のシグナル伝達経路を活性化する、ステップと、（ｂ）核外輸送シグナルペプチドに連結された遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）を含む融合タンパク質を、融合タンパク質をコードする第１の核酸配列を含む第１の発現カセットから発現させるステップであって、ＧＭＰが、切断認識配列に連結されたアクチュエータ部分を含み、核酸配列が、リガンドがリガンド結合ドメインに結合するとシグナル伝達経路によって活性化されて融合タンパク質の発現を駆動する第１のプロモーターの制御下に置かれる、ステップと、（ｃ）切断部分を、切断部分をコードする核酸配列を含む第２の発現カセットから発現させるステップであって、核酸が、リガンドがリガンド結合ドメインに結合するとシグナル伝達経路によって活性化されて切断部分の発現を駆動する第２のプロモーターの制御下に置かれる、ステップと、（ｄ）発現された切断部分を使用して発現された融合タンパク質の切断認識部位を切断して、アクチュエータ部分を放出するステップとを含み、放出されたアクチュエータ部分が標的遺伝子の発現を調節する。
【００７６】
一態様では、本開示は、細胞における標的遺伝子の発現を調節する方法を提供する。方法は、（ａ）リガンドを、リガンド結合ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む膜貫通受容体に接触させるステップであって、リガンドがリガンド結合ドメインに接触すると、シグナル伝達ドメインが細胞のシグナル伝達経路を活性化する、ステップと、（ｂ）第１の部分的遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）を、第１の部分的ＧＭＰをコードする第１の核酸配列を含む第１の発現カセットから発現させるステップであって、第１の部分的ＧＭＰが、アクチュエータ部分の第１の部分を含み、第１の核酸配列が、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、シグナル伝達経路によって活性化されて第１の部分的ＧＭＰの発現を駆動する第１のプロモーターの制御下に置かれる、ステップと、（ｃ）第２の部分的遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）を、第２の部分的ＧＭＰをコードする第２の核酸配列を含む第２の発現カセットから発現させるステップであって、第２の部分的ＧＭＰがアクチュエータ部分の第２の部分を含み、第２の核酸配列が、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、シグナル伝達経路によって活性化されて第２の部分的ＧＭＰの発現を駆動する第２のプロモーターの制御下に置かれる、ステップと、（ｄ）第１の部分的ＧＭＰおよび第２の部分的ＧＭＰの複合体を形成して、再構成されたアクチュエータ部分を形成するステップとを含み、再構成されたアクチュエータ部分が標的遺伝子の発現を調節する。
【００７７】
一態様では、本開示は、細胞における標的遺伝子の発現を調節する方法を提供する。方法は、（ａ）リガンドを、リガンド結合ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む膜貫通受容体に接触させるステップであって、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、シグナル伝達ドメインが細胞のシグナル伝達経路を活性化する、ステップと、（ｂ）第１の部分的切断部分を、第１の部分的切断部分をコードする第１の核酸配列を含む第１の発現カセットから発現させるステップであって、第１の核酸配列が、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、シグナル伝達経路によって活性化されて第１の部分的切断部分の発現を駆動する第１のプロモーターの制御下に置かれる、ステップと、（ｃ）第２の部分的切断部分を、第２の部分的切断部分をコードする第２の核酸配列を含む第２の発現カセットから発現させるステップであって、第２の核酸配列が、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、シグナル伝達経路によって活性化されて第２の部分的切断部分の発現を駆動する第２のプロモーターの制御下に置かれる、ステップと、（ｄ）第１および第２の部分的切断部分の複合体を形成して、再構成された切断部分を生じるステップと、（ｅ）再構成された切断部分によって、切断認識部位を切断し、再構成された切断部分を使用して核外輸送シグナルペプチドからアクチュエータ部分を放出するステップとを含み、放出されたアクチュエータ部分が標的遺伝子の発現を調節する。
【００７８】
一態様では、本開示は、細胞における標的遺伝子の発現を調節する方法を提供する。方法は、（ａ）リガンドを、リガンド結合ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む膜貫通受容体に接触させるステップであって、リガンドがリガンド結合ドメインに接触すると、シグナル伝達ドメインが細胞のシグナル伝達経路を活性化する、ステップと、（ｂ）（ｉ）切断部分および（ｉｉ）核外輸送シグナルペプチドに連結された遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）を含む融合タンパク質のうちの一方または両方を、（ｉ）および（ｉｉ）のうちの一方または両方をコードする核酸配列を含む発現カセットから発現させるステップであって、ＧＭＰが、切断認識部位に連結したアクチュエータ部分を含み、核酸配列が、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、シグナル伝達経路によって活性化されるプロモーターの制御下に置かれる、ステップと、（ｃ）切断部分によって切断認識部位が切断されると、アクチュエータ部分を放出するステップとを含み、放出されたアクチュエータ部分が標的ポリヌクレオチドの発現を調節する。
【００７９】
一部の実施形態では、膜貫通受容体は、内因性受容体または合成受容体を含む。一部の実施形態では、膜貫通受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、インテグリン受容体、またはＮｏｔｃｈ受容体を含む。
【００８０】
一部の実施形態では、アクチュエータ部分は、ポリヌクレオチド誘導型エンドヌクレアーゼを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド誘導型エンドヌクレアーゼは、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼである。一部の実施形態では、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質である。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  Ｃａｓ９である。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ヌクレアーゼ活性を実質的に欠如する。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃｐｆ１である。一部の実施形態では、Ｃｐｆ１は、ヌクレアーゼ活性を実質的に欠如する。
【００８１】
一部の実施形態では、アクチュエータ部分は、転写活性化因子に連結されている。一部の実施形態では、アクチュエータ部分は転写抑制因子に連結されている。
【００８２】
一部の実施形態では、プロモーターは、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＲＦ４、ＮＲ４Ａ１、ＰＲＤＭ１、ＴＢＸ２１、ＣＤ６９、ＣＤ２５、およびＧＺＭＢプロモーターから選択される。
【００８３】
一部の実施形態では、細胞は、免疫細胞、造血前駆細胞、または造血幹細胞である。一部の実施形態では、細胞は免疫細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞はリンパ球である。一部の実施形態では、リンパ球はＴ細胞である。一部の実施形態では、リンパ球はナチュラルキラー（ＮＫ細胞）である。一部の実施形態では、標的遺伝子は、サイトカインをコードする。一部の実施形態では、標的遺伝子は、免疫チェックポイント阻害剤をコードする。一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ−３、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ４、ＩＤＯ、ＫＩＲ、またはＶＩＳＴＡである。一部の実施形態では、標的遺伝子は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ、ベータ、デルタ、またはガンマ鎖をコードする。
【００８４】
参照による組み入れ
本明細書で言及した全ての刊行物、特許、および特許出願は、各々の個々の刊行物、特許、または特許出願が、具体的におよび個々に参照により組み入れられていると示されているのと同程度に参照により本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
本開示の新規特徴は、特に、添付の特許請求の範囲と共に記載される。本開示の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理を利用する、例示的実施形態を記載する以下の詳細な説明、および添付の図面を参照することによって得られるであろう。
【００８６】
【図１】図１は、１つの膜貫通受容体を含む、本明細書に提供されるシステムの概略図を提供する。
【００８７】
【図２】図２は、２つの膜貫通受容体を含む、本明細書に提供されるシステムの概略図を提供する。
【００８８】
【図３−１】図３Ａは、本明細書に開示されるシステムを使用した、Ｊｕｒｋａｔ由来細胞系におけるレポーター遺伝子発現の調節を図示する。図３Ｂ〜Ｅは、リガンド依存的シグナルカスケードによるＧＦＰレポーター遺伝子の条件的発現を示す。図３Ｂは、ｄＣａｓ９−ＶＰＲおよびｓｇＲＮＡを介して様々なプロモーターにより間接的に駆動されるＧＦＰ発現のヒストグラムを提供する。図３Ｃおよび図３Ｄは、図３Ｂの結果を定量する。図３Ｅは、ＧＦＰ発現のリガンド−受容体相互作用依存的誘導（例えば、ＣＡＲの存在または非存在）を示す。
【図３−２】図３Ａは、本明細書に開示されるシステムを使用した、Ｊｕｒｋａｔ由来細胞系におけるレポーター遺伝子発現の調節を図示する。図３Ｂ〜Ｅは、リガンド依存的シグナルカスケードによるＧＦＰレポーター遺伝子の条件的発現を示す。図３Ｂは、ｄＣａｓ９−ＶＰＲおよびｓｇＲＮＡを介して様々なプロモーターにより間接的に駆動されるＧＦＰ発現のヒストグラムを提供する。図３Ｃおよび図３Ｄは、図３Ｂの結果を定量する。図３Ｅは、ＧＦＰ発現のリガンド−受容体相互作用依存的誘導（例えば、ＣＡＲの存在または非存在）を示す。
【図３−３】図３Ａは、本明細書に開示されるシステムを使用した、Ｊｕｒｋａｔ由来細胞系におけるレポーター遺伝子発現の調節を図示する。図３Ｂ〜Ｅは、リガンド依存的シグナルカスケードによるＧＦＰレポーター遺伝子の条件的発現を示す。図３Ｂは、ｄＣａｓ９−ＶＰＲおよびｓｇＲＮＡを介して様々なプロモーターにより間接的に駆動されるＧＦＰ発現のヒストグラムを提供する。図３Ｃおよび図３Ｄは、図３Ｂの結果を定量する。図３Ｅは、ＧＦＰ発現のリガンド−受容体相互作用依存的誘導（例えば、ＣＡＲの存在または非存在）を示す。
【００８９】
【図４】図４Ａおよび図４Ｂは、安定な細胞系中でのリガンド依存的シグナルカスケードによるＧＦＰレポーター遺伝子の条件的発現を示す。図４Ａは、安定な細胞系中での様々なプロモーターによるＧＦＰレポーター発現の誘導を示す。図４Ｂは、選別された安定な細胞系を使用した、リガンドまたは受容体特異的様式でのＧＺＭＢプロモーターの活性化を示す。
【００９０】
【図５Ａ】図５Ａおよび図５Ｂは、ＣＡＲシグナル伝達経路を介する誘導的合成プロモーターによる、内因性遺伝子を含む複数の遺伝子の発現の同時的誘導を示す。図５Ａは、ＧＦＰレポーター遺伝子発現の上方調節を示す。図５Ｂは、ＣＤ９５内因性遺伝子発現の上方調節を示す。
【図５Ｂ】図５Ａおよび図５Ｂは、ＣＡＲシグナル伝達経路を介する誘導的合成プロモーターによる、内因性遺伝子を含む複数の遺伝子の発現の同時的誘導を示す。図５Ａは、ＧＦＰレポーター遺伝子発現の上方調節を示す。図５Ｂは、ＣＤ９５内因性遺伝子発現の上方調節を示す。
【００９１】
【図６】図６は、遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）に連結された膜貫通受容体を含む、本明細書に提供されるシステムの概略図を提供する。
【００９２】
【図７】図７は、切断部分に連結された膜貫通受容体を含む、本明細書に提供されるシステムの概略図を提供する。
【００９３】
【図８】図８は、切断部分を発現カセットから発現させることができる、本明細書に提供されるシステムの概略図を提供する。
【００９４】
【図９】図９は、核外輸送シグナルペプチド（ＮＥＳ）に連結された遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）を含む融合ポリペプチドを、発現カセットから発現させることができる、本明細書に提供されるシステムの概略図を提供する。
【００９５】
【図１０】図１０は、切断部分と、核外輸送シグナルペプチド（ＮＥＳ）に連結された遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）を含む融合ポリペプチドとの両方を、１つまたは複数の発現カセットから発現させることができる、本明細書に提供されるシステムの概略図を提供する。
【００９６】
【図１１】図１１Ａおよび図１１Ｂは、ＣＭＶを、ＣＡＲシグナル伝達経路を介して誘導することができることを示す。
【００９７】
【図１２】図１２は、本明細書に開示されるシステムにおけるリガンド依存的シグナルカスケードによるＧＦＰレポーター遺伝子の条件的発現を示す。
【００９８】
【図１３】図１３は、本明細書に開示されるシステムにおけるリガンド依存的シグナルカスケードによるＧＦＰレポーター遺伝子の条件的発現を示す。
【００９９】
【図１４】図１４は、誘導的プロモーターＮＦＡＴＲＥおよびＧＺＭＢにより制御されるｄＣａｓ９−ＫＲＡＢを用いたＰＤ−１発現の抑制を示す。
【０１００】
【図１５】図１５は、複数の受容体と、シグナル伝達経路との組合せの活性化が、バクテリオファージタンパク質ＭＣＰおよびＰＣＰのＲＮＡ結合能力を利用して、異なる標的遺伝子の発現を同時に条件的に上方調節または下方調節することができる、本明細書に提供されるシステムの概略図を提供する。
【０１０１】
【図１６】図１６は、複数の受容体と、シグナル伝達経路との組合せの活性化が、ＰＵＦタンパク質のＲＮＡ結合能力を利用して、異なる標的遺伝子の発現を同時に条件的に上方調節または下方調節することができる、本明細書に提供されるシステムの概略図を提供する。
【発明を実施するための形態】
【０１０２】
本明細書に開示の幾つかの方法の実施は、特に示していない限り、当業者の技能の範囲内である、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクス、および組換えＤＮＡの通常の技術を使用する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （２０１２）；ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．  Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ．）；ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．）、ＰＣＲ  ２：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  （Ｍ．Ｊ．  ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，  Ｂ．Ｄ．  Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｇ．Ｒ．  Ｔａｙｌｏｒ  ｅｄｓ．（１９９５））、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，  ｅｄｓ．  （１９８８）  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ａｎｄ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：  Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ａｎｄ  Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  ６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｒ．Ｉ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  ｅｄ．（２０１０））を参照されたい。
【０１０３】
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、本文が明らかにそれ以外であることを示していない限り、複数の指示物を含む。例えば、用語「膜貫通受容体（ａ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）」は、複数の膜貫通受容体を含みうる。
【０１０４】
用語「約」または「およそ」は、当業者によって決定される特定の値に関して許容される誤差範囲内を意味するが、値が測定または決定される方法、すなわち測定システムの限界に部分的に依存する。例えば、「約」は、当技術分野における実施毎に１標準偏差以内または１標準偏差より大きい値以内を意味しうる。あるいは、「約」は、所定の値の最大２０％、最大１０％、最大５％、または最大１％の範囲を意味しうる。あるいは、特に生物システムまたはプロセスに関する場合、用語は、１桁以内、好ましくはある値の５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味しうる。特定の値が本出願および特許請求の範囲に記載されているが、特に示していない限り、用語「約」は、特定の値の許容される誤差範囲内を意味すると仮定すべきである。
【０１０５】
本明細書で使用される場合、「細胞」は、生物学的な細胞を指しうる。細胞は、生きている生物の基本の構造的、機能的、および／または生物学的単位でありうる。細胞は、１つまたは複数の細胞を有する任意の生物を起源とすることができる。一部の非制限的な例には、原核細胞、真核細胞、細菌細胞、古細菌細胞、単細胞真核生物の細胞、原虫細胞、植物からの細胞（例えば、植物の農作物、果実、野菜、穀類、大豆、トウモロコシ（ｃｏｒｎ）、トウモロコシ（ｍａｉｚｅ）、小麦、種子、トマト、コメ、キャッサバ、サトウキビ、カボチャ、干し草、ジャガイモ、ワタ、カンナビス、タバコ、顕花植物、針葉樹、裸子植物、シダ、ヒカゲノカズラ、ツノゴケ、苔類、コケからの細胞）、藻類の細胞、（例えば、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｒａｕｎｉｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｇａｄｉｔａｎａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ、Ｓａｒｇａｓｓｕｍ  ｐａｔｅｎｓ  Ｃ．Ａｇａｒｄｈ等）、海藻（例えば、ケルプ）、真菌細胞（例えば、酵母細胞、キノコの細胞）、動物細胞、無脊椎動物（例えば、ミバエ、刺胞動物、棘皮動物、線虫等）の細胞、脊椎動物（例えば、魚類、両生類、は虫類、鳥類、哺乳動物）の細胞、哺乳動物（例えば、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、齧歯類、ラット、マウス、非ヒト霊長類、ヒト等）の細胞、およびその他が挙げられる。時に、細胞は、天然の生物を起源としない（例えば、細胞は、合成により作製することができ、時に人工細胞と呼ばれる）。
【０１０６】
本明細書で使用される場合、用語「抗原」は、選択的結合剤が結合することが可能である分子またはその断片（例えば、リガンド）を指す。一例として、抗原は受容体などの選択的結合剤が結合することができるリガンドでありうる。別の例として、抗原は、免疫学的タンパク質（例えば、抗体）などの選択的結合剤が結合することができる抗原性分子でありうる。抗原はまた、その抗原に結合することが可能である抗体を産生するために、動物において使用することが可能である分子またはその断片も指しうる。
【０１０７】
本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、免疫グロブリン様機能を有するタンパク質様結合分子を指す。用語抗体は、抗体（例えば、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体）ならびにそのバリアントを含む。抗体には、異なるクラス（すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ）およびサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２等）の免疫グロブリン（Ｉｇ）が挙げられるがこれらに限定されない。バリアントは、対応する抗体の結合特異性（例えば、完全および／または部分的）を保持する機能的誘導体または断片を指しうる。抗原結合性断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、可変断片（Ｆｖ）、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、およびシングルドメイン抗体（「ｓｄＡｂ」または「ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）」または「ラクダ科（ｃａｍｅｌｉｄ）」）が挙げられる。用語抗体は、最適化されている、操作されている、または化学的にコンジュゲートされている抗体および抗体の抗原結合性断片を含む。最適化されている抗体の例は、親和性成熟抗体を含む。操作されている抗体の例は、Ｆｃ最適化抗体（例えば、結晶化可能領域断片において最適化されている抗体）および多特異性抗体（例えば、二特異性抗体）を含む。
【０１０８】
本明細書で使用される場合、用語「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、一般的に抗体のＦｃ領域に結合することができる受容体またはそのいずれかのバリアントを指す。ある特定の実施形態では、ＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体、ＦｃガンマＲ）に結合する受容体であり、ＦｃガンマＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃガンマＲＩＩ（ＣＤ３２）、およびＦｃガンマＲＩＩＩ（ＣＤ１６）サブクラスの受容体を含み、これらの受容体の対立遺伝子バリアントおよび選択的スプライシング型を含む。ＦｃガンマＲＩＩ受容体は、ＦｃガンマＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃガンマＲＩＩＢ（「阻害性受容体」）を含み、これらは主にその細胞質ドメインが異なる類似のアミノ酸配列を有する。用語「ＦｃＲ」はまた、新生児受容体、すなわち母親ＩｇＧの胎児への移行の原因であるＦｃＲｎも含む。
【０１０９】
本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオチド」は、一般的に塩基−糖−ホスフェートの組合せを指す。ヌクレオチドは、合成ヌクレオチドを含みうる。ヌクレオチドは、合成ヌクレオチドアナログを含みうる。ヌクレオチドは、核酸配列の単量体単位（例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ））でありうる。用語ヌクレオチドは、リボヌクレオシド三リン酸、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、シトシン三リン酸（ＣＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）およびデオキシリボヌクレオシド三リン酸、例えばｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、またはその誘導体を含みうる。そのような誘導体は、例えば［αＳ］ｄＡＴＰ、７−デアザ−ｄＧＴＰおよび７−デアザ−ｄＡＴＰ、およびそれを含有する核酸分子に対してヌクレアーゼ耐性を付与するヌクレオチド誘導体を含みうる。本明細書で使用される場合、用語ヌクレオチドは、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）およびその誘導体を指しうる。ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸の実例には、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ、およびｄｄＴＴＰが挙げられうるがこれらに限定されない。ヌクレオチドは、非標識でありうるか、または周知の技術によって検出可能に標識することができる。標識はまた、量子ドットによって実行することができる。検出可能な標識には、例えば、放射性同位体、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、および酵素標識が挙げられうる。ヌクレオチドの蛍光標識には、フルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、２’７’−ジメトキシ−４’５−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、ローダミン、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、４−（４’ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、カスケードブルー、オレゴングリーン、テキサスレッド、シアニン、および５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）が挙げられるがこれらに限定されない。蛍光標識ヌクレオチドの特定の例には、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆから入手可能な［Ｒ６Ｇ］ｄＵＴＰ、［ＴＡＭＲＡ］ｄＵＴＰ、［Ｒ１１０］ｄＣＴＰ、［Ｒ６Ｇ］ｄＣＴＰ、［ＴＡＭＲＡ］ｄＣＴＰ、［ＪＯＥ］ｄｄＡＴＰ、［Ｒ６Ｇ］ｄｄＡＴＰ、［ＦＡＭ］ｄｄＣＴＰ、［Ｒ１１０］ｄｄＣＴＰ、［ＴＡＭＲＡ］ｄｄＧＴＰ、［ＲＯＸ］ｄｄＴＴＰ、［ｄＲ６Ｇ］ｄｄＡＴＰ、［ｄＲ１１０］ｄｄＣＴＰ、［ｄＴＡＭＲＡ］ｄｄＧＴＰ、および［ｄＲＯＸ］ｄｄＴＴＰ；Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ、Ｉｌｌから入手可能なＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋデオキシヌクレオチド、ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ  Ｃｙ３−ｄＣＴＰ、ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ  Ｃｙ５−ｄＣＴＰ、ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ  Ｆｌｕｏｒ  Ｘ−ｄＣＴＰ、ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ  Ｃｙ３−ｄＵＴＰ、およびＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ  Ｃｙ５−ｄＵＴＰ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉ��ｄから入手可能なフルオレセイン−１５−ｄＡＴＰ、フルオレセイン−１２−ｄＵＴＰ、テトラメチルローダミン−６−ｄＵＴＰ、ＩＲ７７０−９−ｄＡＴＰ、フルオレセイン−１２−ｄｄＵＴＰ、フルオレセイン−１２−ＵＴＰ、およびフルオレセイン−１５−２’−ｄＡＴＰ；ならびにＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇから入手可能な染色体標識ヌクレオチド、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−１４−ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−４−ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ−１４−ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ−１４−ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲ−１４−ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲ−１４−ｄＵＴＰ、カスケードブルー−７−ＵＴＰ、カスケードブルー−７−ｄＵＴＰ、フルオレセイン−１２−ＵＴＰ、フルオレセイン−１２−ｄＵＴＰ、オレゴングリーン４８８−５−ｄＵＴＰ、ローダミングリーン−５−ＵＴＰ、ローダミングリーン−５−ｄＵＴＰ、テトラメチルローダミン−６−ＵＴＰ、テトラメチルローダミン−６−ｄＵＴＰ、テキサスレッド−５−ＵＴＰ、テキサスレッド−５−ｄＵＴＰ、およびテキサスレッド−１２−ｄＵＴＰが挙げられうる。ヌクレオチドはまた、化学修飾によって標識または印をつけることもできる。化学修飾された１つのヌクレオチドは、ビオチン−ｄＮＴＰでありうる。ビオチン化ｄＮＴＰのそのような非制限的な例には、ビオチン−ｄＡＴＰ（例えば、ｂｉｏ−Ｎ６−ｄｄＡＴＰ、ビオチン−１４−ｄＡＴＰ）、ビオチン−ｄＣＴＰ（例えば、ビオチン−１１−ｄＣＴＰ、ビオチン−１４−ｄＣＴＰ）、およびビオチン−ｄＵＴＰ（例えば、ビオチン−１１−ｄＵＴＰ、ビオチン−１６−ｄＵＴＰ、ビオチン−２０−ｄＵＴＰ）が挙げられうる。
【０１１０】
用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、および「核酸」は、互換的に使用され、一本鎖、二本鎖、または多重鎖型の、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、またはそのアナログの任意の長さのいずれかのヌクレオチドのポリマー型を指す。ポリヌクレオチドは、細胞に対して外因性または内因性でありうる。ポリヌクレオチドは、無細胞環境に存在することができる。ポリヌクレオチドは、遺伝子またはその断片でありうる。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡでありうる。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡでありうる。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有することができ、公知または未知の任意の機能を実施することができる。ポリヌクレオチドは、１つまたは複数のアナログ（例えば変化した骨格、糖、またはヌクレオ塩基）を含みうる。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾を、ポリマーのアセンブリの前または後に付与することができる。アナログの一部の非制限的な例には、５−ブロモウラシル、ペプチド核酸、異種核酸、モルフォリノ、ロックド核酸、グリコール核酸、トレオース核酸、ジデオキシヌクレオチド、コルジセピン、７−デアザ−ＧＴＰ、フルオロフォア（例えば、糖に連結されたローダミンまたはフルオレセイン）、チオール含有ヌクレオチド、ビオチン連結ヌクレオチド、蛍光塩基アナログ、ＣｐＧアイランド、メチル−７−グアノシン、メチル化ヌクレオチド、イノシン、チオウリジン、シュードウリジン（ｐｓｅｕｄｏｕｒｄｉｎｅ）、ジヒドロウリジン、ケオシン、およびワイオシンが挙げられる。ポリヌクレオチドの非制限的な例には、遺伝子または遺伝子断片のコード領域または非コード領域、連鎖解析から定義された複数の遺伝子座（１つの遺伝子座）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロ−ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）および無細胞ＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ）を含む無細胞ポリヌクレオチド、核酸プローブ、ならびにプライマーが挙げられる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されうる。
【０１１１】
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子」は、核酸（例えば、ＤＮＡ、例えばゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡ）、およびＲＮＡ転写物のコードに関与するその対応するヌクレオチド配列を指す。本明細書でゲノムＤＮＡを参照して使用される用語は、介在する非コード領域、ならびに調節領域を含み、５’および３’末端を含みうる。一部の使用では、用語は、５’および３’非翻訳領域（５’−ＵＴＲおよび３’−ＵＴＲ）、エクソン、およびイントロンを含む、転写される配列を包含する。一部の遺伝子では、転写される領域は、ポリペプチドをコードする「オープンリーディングフレーム」を含有する。用語の一部の使用では、「遺伝子」は、ポリペプチドをコードするために必要なコード配列（例えば、「オープンリーディングフレーム」または「コード領域」）のみを含む。一部の例では、遺伝子は、ポリペプチドをコードしない、例えばリボソームＲＮＡ遺伝子（ｒＲＮＡ）およびトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）遺伝子である。一部の例では、用語「遺伝子」は、転写された配列のみならず、それに加えて上流および下流の調節領域、エンハンサー、およびプロモーターを含む非転写領域も含む。遺伝子は、生物のゲノムのその天然の位置における「内因性遺伝子」またはネイティブ遺伝子を指しうる。遺伝子は、「外因性遺伝子」または非ネイティブ遺伝子を指しうる。非ネイティブ遺伝子は、宿主生物において通常見出されないが、遺伝子移入によって宿主生物に導入されている遺伝子（例えば、導入遺伝子）を指しうる。非ネイティブ遺伝子はまた、変異、挿入、および／または欠失を含む天然に存在する核酸またはポリペプチド配列（例えば、非ネイティブ配列）も指しうる。
【０１１２】
本明細書で使用される場合、用語「上流」および「下流」は、二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ分子のフォワード鎖に対して定義される位置を指す。「上流の」配列は、フォワード鎖の３’末端により近い（したがってリバース鎖の５’末端にもより近い）「下流の」配列より、フォワード鎖の５’末端により近い（したがってリバース鎖の３’末端により近い）位置で見出される。
【０１１３】
本明細書で使用される場合、用語「標的ポリヌクレオチド」および「標的核酸」は、本開示のアクチュエータ部分によって標的とされる核酸またはポリヌクレオチドを指す。標的ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ（例えば、内因性または外因性）でありうる。ＤＮＡは、ｍＲＮＡ転写物および／またはＤＮＡ鋳型からｍＲＮＡの転写を調節する様々な調節領域を生成するための鋳型を指しうる。標的ポリヌクレオチドは、より大きいポリヌクレオチドの一部、例えば染色体または染色体の領域でありうる。標的ポリヌクレオチドは、染色体外配列（例えば、エピソーム配列、ミニサークル配列、ミトコンドリア配列、葉緑体配列等）、または染色体外配列の領域を指しうる。標的ポリヌクレオチドは、ＲＮＡでありうる。ＲＮＡは、例えばタンパク質をコードする鋳型としての役目を果たすことができるｍＲＮＡでありうる。ＲＮＡを含む標的ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡ鋳型からのタンパク質の翻訳を調節する様々な調節領域を含みうる。標的ポリヌクレオチドは、遺伝子産物（例えば、ＲＮＡ転写物をコードするＤＮＡ、またはタンパク質産物をコードするＲＮＡ）をコードしうるか、または遺伝子産物の発現を調節する調節配列を含みうる。一般的に、用語「標的配列」は、標的核酸の一本鎖上の核酸配列を指す。標的配列は、遺伝子の一部、調節配列、ゲノムＤＮＡ、ｃｆＤＮＡおよび／またはｃｆＲＮＡを含む無細胞核酸、ｃＤＮＡ、融合遺伝子、ならびにｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｒＲＮＡ、およびその他を含むＲＮＡでありうる。標的ポリヌクレオチドは、アクチュエータ部分によって標的化されると、変化した遺伝子発現および／または活性をもたらしうる。標的ポリヌクレオチドは、アクチュエータ部分によって標的化されると、編集された核酸配列をもたらしうる。標的核酸は、１ヌクレオチド置換によって、核酸試料中の他のいずれの配列にも関連しない核酸配列を含みうる。標的核酸は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチド置換によって核酸試料中の他のいずれの配列にも関連しない核酸配列を含みうる。一部の実施形態では、置換は、標的核酸の５’末端の５、１０、１５、２０、２５、３０、または３５ヌクレオチド以内では起こらない可能性がある。一部の実施形態では、置換は、標的核酸の３’末端の５、１０、１５、２０、２５、３０、３５ヌクレオチド以内では起こらない可能性がある。
【０１１４】
用語「トランスフェクション」または「トランスフェクトされた」は、非ウイルスまたはウイルスに基づく方法による細胞への核酸の導入を指す。核酸分子は、完全なタンパク質またはその機能的部分をコードする遺伝子配列でありうる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  １８．１−１８．８８を参照されたい。
【０１１５】
用語「発現」は、それによってポリヌクレオチドがＤＮＡ鋳型から（例えばｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ転写物へと）転写される１つもしくは複数のプロセスおよび／またはそれによって転写されたｍＲＮＡが、次にペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質へと翻訳されるプロセスを指す。転写物およびコードされるポリペプチドを、集合的に「遺伝子産物」と呼ぶことができる。ポリヌクレオチドが、ゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含みうる。発現に関して「上方調節された」とは、一般的に、野生型状態でのその発現レベルと比較したポリヌクレオチド（例えばＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ）および／またはポリペプチド配列の発現レベルの増加を指すが、「下方調節された」は、一般的に、野生型状態でのその発現と比較したポリヌクレオチド（例えばＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ）および／またはポリペプチド配列の発現レベルの減少を指す。
【０１１６】
本明細書で使用される場合、用語「発現カセット」は、コード配列およびコード配列の発現にとって必要な配列などのヌクレオチド配列を含む核酸を指す。用語発現カセットは、ゲノム編集技術によって編集されている領域を含む、ゲノムの領域を含む。用語発現カセットはまた、細胞のゲノムから離れている核酸（例えば、プラスミドまたは線形のポリペプチドとして存在する）も含む。発現カセットは、ゲノム配列、例えば天然のゲノム配列（例えば、内因性プロモーター配列、内因性遺伝子等）および非天然の配列（例えば、ＧＭＰコード配列、合成プロモーター配列等）を含みうる。発現カセットは、ウイルス性または非ウイルス性でありうる。発現カセットは、宿主細胞に導入されると、ＲＮＡまたはポリペプチドのそれぞれの、転写および／または翻訳をもたらす核酸構築物を含む。翻訳されないまたは翻訳することができないアンチセンス構築物またはセンス構築物が、この定義に明白に含まれる。当業者は、挿入されたポリヌクレオチド配列が同一である必要はなく、それが由来する遺伝子の配列と実質的に類似であるだけでよいことを認識するであろう。
【０１１７】
本明細書で使用される場合、「プラスミド」は、一般的に非ウイルス性の発現ベクター、例えば遺伝子をコードする核酸分子、および／または遺伝子の発現にとって必要な調節エレメントを指す。本明細書で使用される場合、「ウイルスベクター」は、一般的に別の核酸を細胞に輸送することが可能であるウイルス由来の核酸を指す。ウイルスベクターは、それが適切な環境に存在する場合に、ベクターが有する１つまたは複数の遺伝子によってコードされる１つのタンパク質または複数のタンパク質の発現を方向付けることが可能である。ウイルスベクターの例には、レトロウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、およびアデノ随伴ウイルスベクターが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１１８】
本明細書で使用される場合、用語「プロモーター」は、細胞におけるコード配列の転写を駆動することが可能なポリヌクレオチド配列を指す。このように、本開示のプロモーターは、遺伝子の転写のタイミングおよび／または速度の調節またはモジュレートに関与するシス作用型転写制御エレメントおよび調節配列を含む。例えば、プロモーターは、転写の調節に関与する、エンハンサー、プロモーター、転写ターミネーター、複製開始点、染色体組込み配列、５’および３’非翻訳領域、またはイントロン配列を含むシス作用型転写制御エレメントでありうる。これらのシス作用型配列は、典型的にタンパク質または他の生物分子と相互作用して、遺伝子転写を実行する（オン／オフにする、調節する、モジュレートする等）。「構成的プロモーター」は、一般的にほぼ全ての組織タイプおよび多様な細胞条件で転写を開始することが可能なプロモーターを指す。「誘導型プロモーター」は、一般的に特定の細胞条件、環境条件、発生条件、または薬物もしくは化学的条件下に限って転写を開始するプロモーターを指す。「組織特異的プロモーター」は、１つまたは幾つかの特定の組織タイプに限って転写を開始するプロモーターを指す。
【０１１９】
本明細書で使用される場合、用語「相補体」、「複数の相補体」、「相補的な」、および「相補性」は、一般的に所定の配列と完全に相補的でハイブリダイズ可能である配列を指す。一部の例では、所定の核酸とハイブリダイズした配列は、所定の領域におけるその塩基の配列が、例えばＡ−Ｔ、Ａ−Ｕ、Ｇ−Ｃ、およびＧ−Ｕ塩基対が形成されるように、その結合パートナーの配列に相補的に結合することが可能である場合、所定の分子の「相補体」または「逆相補体」と呼ばれる。一般的に、第２の配列にハイブリダイズ可能である第１の配列は、第２の配列または第２の配列の組に対するハイブリダイゼーションが、ハイブリダイゼーション反応の間に非標的配列とのハイブリダイゼーションより好ましい（例えば、所定の組の条件、例えば当技術分野で一般的に使用されるストリンジェントな条件下で熱力学的により安定な）ように、第２の配列に特異的または選択的にハイブリダイズ可能である。典型的には、ハイブリダイズ可能な配列は、そのそれぞれの長さの全体または一部にわたって少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、および１００％の配列相補性を含む２５％〜１００％の間の相補性などの配列相補性の程度を共有する。例えば、パーセント相補性を評価する目的のためなどの配列同一性は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈのアルゴリズム（例えば、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｎｅｅｄｌｅ／ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ．ｈｔｍｌで入手可能な、必要に応じてデフォルト設定でのＥＭＢＯＳＳ  Ｎｅｅｄｌｅ  ａｌｉｇｎｅｒを参照されたい）、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（例えば、ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉで入手可能な、必要に応じてデフォルト設定でのＢＬＡＳＴアライメントツールを参照されたい）、またはＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（例えば、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｗａｔｅｒ／ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ．ｈｔｍｌで入手可能な、必要に応じてデフォルト設定でのＥＭＢＯＳＳ  Ｗａｔｅｒ  ａｌｉｇｎｅｒを参照されたい）を含むがこれらに限定されない任意の適したアライメントアルゴリズムによって測定することができる。最適なアライメントは、デフォルトパラメーターを含む、選択したアルゴリズムの任意の適したパラメーターを使用して評価することができる。
【０１２０】
相補性は、完璧または実質的／十分でありうる。２つの核酸の間の完璧な相補性は、２つの核酸が、二重鎖におけるあらゆる塩基がワトソン−クリックの対形成によって相補的塩基に結合した二重鎖を形成することができることを意味する。実質的または十分な相補性は、１つの鎖の配列が、反対の鎖における配列と完全におよび／または完璧に相補的ではないが、ハイブリダイゼーション条件の組（例えば、塩濃度および温度）において２つの鎖の塩基の間に十分な結合が起こって安定なハイブリッド複合体を形成することを意味しうる。そのような条件は、配列および標準的な数学的計算を使用してハイブリダイズした鎖のＴｍを予測することによって、または通例の方法を使用することによるＴｍの経験的決定によって予測することができる。
【０１２１】
本明細書で使用される場合、発現または活性に関連する用語「調節する」は、発現または活性のレベルを変化させることを指す。調節は、転写レベル、転写後レベル、翻訳レベル、および／または翻訳後レベルで起こりうる。
【０１２２】
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」は、本明細書において互換的に使用され、ペプチド結合によって結合した少なくとも２つのアミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、ポリマーの特定の長さを暗示しているのではなく、ペプチドが組換え技術、化学もしくは酵素合成を使用することによって産生されたか、または天然に存在するかを含意または識別することも意図していない。用語は、天然に存在するアミノ酸ポリマーならびに少なくとも１つの修飾アミノ酸を含むアミノ酸ポリマーに当てはまる。一部の例では、ポリマーは、非アミノ酸によって中断されうる。用語は、完全長のタンパク質、ならびに二次構造および／または三次構造（例えば、ドメイン）を有するまたは有しないタンパク質を含む、任意の長さのアミノ酸鎖を含む。用語はまた、例えばジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化、酸化、および標識成分とのコンジュゲーションなどの他の任意の操作によって修飾されているアミノ酸ポリマーも包含する。本明細書で使用される場合、用語「アミノ酸」および「複数のアミノ酸」は、一般的に、天然アミノ酸、ならびに修飾アミノ酸およびアミノ酸アナログを含むがこれらに限定されない非天然アミノ酸を指す。修飾アミノ酸は、アミノ酸に天然では存在しない基または化学部分を含むように化学修飾されている天然アミノ酸および非天然アミノ酸を含みうる。アミノ酸アナログは、アミノ酸誘導体を指しうる。用語「アミノ酸」は、Ｄ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸の両方を含む。
【０１２３】
本明細書でポリペプチドを参照して使用する場合の用語「バリアント」は、野生型ポリペプチドに関連するが、例えばアミノ酸配列、構造（例えば、二次構造および／または三次構造）、活性（例えば、酵素活性）、および／または機能のいずれかのために野生型ポリペプチドと同一ではないポリペプチドを指す。バリアントは、野生型ポリペプチドと比較して１つまたは複数のアミノ酸の変動（例えば、変異、挿入、および欠失）、トランケーション、修飾、またはその組合せを含むポリペプチドを含む。バリアントはまた、野生型ポリペプチドの誘導体および野生型ポリペプチドの断片も含む。
【０１２４】
本明細書で使用される場合、用語「パーセント（％）同一性」は、配列を整列させ、必要に応じて最大のパーセント同一性を達成するためにギャップを導入した後に（すなわち、最適なアライメントのために候補配列および参照配列のうちの一方または両方にギャップを導入することができ、非相同配列を比較目的のために無視することができる）参照配列のアミノ酸（または核酸）残基と同一である候補配列のアミノ酸（または核酸）残基のパーセンテージを指す。パーセント同一性を決定する目的でのアライメントは、当業者の技能の範囲内である様々な方法で、例えば公開されているコンピューターソフトウェア、例えばＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを使用して達成することができる。２つの配列のパーセント同一性は、ＢＬＡＳＴを使用して試験配列を比較配列と整列させるステップ、比較配列の同じ位置でのアミノ酸またはヌクレオチドと同一である、整列された試験配列におけるアミノ酸またはヌクレオチドの数を決定するステップ、および同一のアミノ酸またはヌクレオチドの数を、比較配列におけるアミノ酸またはヌクレオチドの数によって除算するステップによって計算することができる。
【０１２５】
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子モジュレーティングポリペプチド」、または「ＧＭＰ」は、遺伝子の発現もしくは活性を調節するおよび／または核酸配列を編集することが可能な少なくとも１つのアクチュエータ部分を含むポリペプチドを指す。ＧＭＰは、遺伝子発現のモジュレートに直接関与しない追加のペプチド配列、例えば標的化配列、ポリペプチドフォールディングドメイン等を含みうる。
【０１２６】
本明細書で使用される場合、用語「アクチュエータ部分」は、外因性であるか内因性であるかによらず、遺伝子の発現もしくは活性を調節することができ、および／または核酸配列を編集することができる部分を指す。アクチュエータ部分は、遺伝子の発現を、転写レベル、転写後レベル、翻訳レベル、および／または翻訳後レベルで調節することができる。アクチュエータ部分は、例えば染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡなどのＤＮＡからのｍＲＮＡの産生を調節することによって、転写レベルで遺伝子発現を調節することができる。一部の実施形態では、アクチュエータ部分は、特定のＤＮＡ配列に結合する少なくとも１つの転写因子を動員し、それによってＤＮＡからの遺伝情報をｍＲＮＡに転写する速度を制御する。アクチュエータ部分は、それ自身ＤＮＡに結合し、物理的障害によって、例えばＲＮＡポリメラーゼなどのタンパク質、および他の関連タンパク質がＤＮＡ鋳型上でアセンブルするのを防止することによって、転写を調節することができる。アクチュエータ部分は、例えばｍＲＮＡ鋳型からのタンパク質の産生を調節することによって、翻訳レベルで遺伝子の発現を調節することができる。一部の実施形態では、アクチュエータ部分は、ｍＲＮＡ転写物の安定性に影響を及ぼすことによって、転写後レベルで遺伝子発現を調節する。一部の実施形態では、アクチュエータ部分は、新たに合成されたタンパク質のグリコシル化などの、ポリペプチド修飾を変化させることによって、翻訳後レベルで遺伝子発現を調節する。一部の実施形態では、アクチュエータ部分は、核酸配列（例えば、ゲノムの領域）を編集することによって遺伝子の発現を調節する。一部の実施形態では、アクチュエータ部分は、ｍＲＮＡ鋳型を編集することによって遺伝子の発現を調節する。核酸配列の編集は、一部の例では、遺伝子発現のための基礎となる鋳型を変化させることができる。
【０１２７】
本明細書において言及されるＣａｓタンパク質は、あるタイプのタンパク質またはポリペプチドでありうる。Ｃａｓタンパク質は、ヌクレアーゼを指しうる。Ｃａｓタンパク質は、エンドリボヌクレアーゼを指しうる。Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓタンパク質のいずれかの改変された（例えば、短縮した、変異した、長くなった）ポリペプチド配列またはホモログを指しうる。Ｃａｓタンパク質は、コドン最適化されうる。Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓタンパク質のコドン最適化ホモログでありうる。Ｃａｓタンパク質は、酵素的に不活性、部分的に活性、構成的に活性、完全に活性、誘導により活性、および／またはより（例えば、タンパク質またはポリペプチドの野生型ホモログより）活性でありうる。Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９でありうる。Ｃａｓタンパク質は、Ｃｐｆ１でありうる。Ｃａｓタンパク質は、Ｃ２ｃ２でありうる。Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ１３ａでありうる。Ｃａｓタンパク質（例えば、バリアント、変異型、酵素的に不活性および／または条件的に酵素的に不活性な部位特異的ポリペプチド）は、標的核酸に結合することができる。Ｃａｓタンパク質（例えば、バリアント、変異型、酵素的に不活性および／または条件的に酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼ）は、標的ＲＮＡまたはＤＮＡに結合することができる。
【０１２８】
本明細書で使用される場合、用語「ｃｒＲＮＡ」は、一般的に野生型の例示的なｃｒＲＮＡ（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ等のｃｒＲＮＡ）と、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の配列同一性および／または配列類似性を有する核酸を指しうる。ｃｒＲＮＡは、一般的に野生型の例示的なｃｒＲＮＡ（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ等のｃｒＲＮＡ）と、多くて約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の配列同一性および／または配列類似性を有する核酸を指しうる。ｃｒＲＮＡは、欠失、挿入、もしくは置換などのヌクレオチド変化を含みうるｃｒＲＮＡの改変型、バリアント、変異、またはキメラを指しうる。ｃｒＲＮＡは、少なくとも６連続ヌクレオチドのストレッチにわたって、野生型の例示的なｃｒＲＮＡ（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ等のｃｒＲＮＡ）配列と少なくとも約６０％の配列同一性を有する核酸でありうる。例えば、ｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも６連続ヌクレオチドのストレッチにわたって、野生型の例示的なｃｒＲＮＡ配列（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ等のｃｒＲＮＡ）と少なくとも約６０％同一、少なくとも約６５％同一、少なくとも約７０％同一、少なくとも約７５％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、または１００％同一でありうる。
【０１２９】
本明細書で使用される場合、用語「ｔｒａｃｒＲＮＡ」は、一般的に野生型の例示的なｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ等のｔｒａｃｒＲＮＡ）と、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の配列同一性および／または配列類似性を有する核酸を指しうる。ｔｒａｃｒＲＮＡは、野生型の例示的なｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ等のｔｒａｃｒＲＮＡ）と、多くて約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の配列同一性および／または配列類似性を有する核酸を指しうる。ｔｒａｃｒＲＮＡは、欠失、挿入、もしくは置換などのヌクレオチド変化を含みうるｔｒａｃｒＲＮＡの改変型、バリアント、変異、またはキメラを指しうる。ｔｒａｃｒＲＮＡは、少なくとも６連続ヌクレオチドのストレッチにわたって、野生型の例示的なｔｒａｃｒＲＮＡ（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ等のｔｒａｃｒＲＮＡ）配列と、少なくとも約６０％同一でありうる核酸を指しうる。例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも６連続ヌクレオチドのストレッチにわたって、野生型の例示的なｔｒａｃｒＲＮＡ（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ等のｔｒａｃｒＲＮＡ）配列と、少なくとも約６０％同一、少なくとも約６５％同一、少なくとも約７０％同一、少なくとも約７５％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、または１００％同一でありうる。
【０１３０】
本明細書で使用される場合、「ガイド核酸」は、別の核酸とハイブリダイズすることができる核酸を指しうる。ガイド核酸はＲＮＡでありうる。ガイド核酸はＤＮＡでありうる。ガイド核酸は、核酸の配列に部位特異的に結合するようにプログラムすることができる。標的とされる核酸または標的核酸は、ヌクレオチドを含みうる。ガイド核酸はヌクレオチドを含みうる。標的核酸の一部は、ガイド核酸の一部と相補的でありうる。ガイド核酸と相補的でハイブリダイズする二本鎖標的ポリヌクレオチドの鎖を相補鎖と呼ぶことができる。相補鎖と相補的であり、したがってガイド核酸とは相補的でない二本鎖標的ポリヌクレオチドの鎖を、非相補鎖と呼ぶことができる。ガイド核酸は、１つのポリヌクレオチド鎖を含むことができ、「シングルガイド核酸」と呼ばれうる。ガイド核酸は、２つのポリヌクレオチド鎖を含むことができ、「ダブルガイド核酸」と呼ばれうる。特に明記されていなければ、用語「ガイド核酸」は、包括的でありえ、シングルガイド核酸およびダブルガイド核酸の両方を指す。
【０１３１】
ガイド核酸は、「核酸標的化セグメント」または「核酸標的化配列」と呼ぶことができるセグメントを含みうる。核酸標的化セグメントは、「タンパク質結合セグメント」または「タンパク質結合配列」、または「Ｃａｓタンパク質結合セグメント」と呼ぶことができるサブセグメントを含みうる。
【０１３２】
本明細書でペプチドを参照して使用される場合、用語「切断認識配列」および「切断認識部位」は、化学結合、例えばペプチド結合またはジスルフィド結合を切断することができるペプチドの部位を指す。切断は、様々な方法によって達成することができる。ペプチド結合の切断は、例えばプロテアーゼなどの酵素によって容易となりうる。
【０１３３】
本明細書で使用される場合、用語「標的化配列」は、細胞内位置への、例えば細胞膜または所定のオルガネラの膜、核、細胞質ゾル、ミトコンドリア、小胞体（ＥＲ）、ゴルジ体、葉緑体、アポプラスト、ペルオキシソーム、または他のオルガネラへのタンパク質の局在（または貯留）を媒介する標的化ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列を指す。例えば、標的化配列は、核移行シグナル（ＮＬＳ）を利用して核へと；核外輸送シグナル（ＮＥＳ）を利用して細胞の核の外部、例えば細胞質へと；ミトコンドリア標的化シグナルを利用してミトコンドリアへと；小胞体保留シグナルを利用して小胞体（ＥＲ）へと；ペルオキシソーム標的化シグナルを利用してペルオキシソームへと；膜移行シグナルを利用して細胞膜へと；またはその組合せへとタンパク質（例えば、ＧＭＰ）を方向付けることができる。
【０１３４】
本明細書で使用される場合、「融合体」は、１つまたは複数の非ネイティブ配列（例えば、部分）を含むタンパク質および／または核酸を指しうる。融合体は、１つまたは複数の同じ非ネイティブ配列を含みうる。融合体は、１つまたは複数の異なる非ネイティブ配列を含みうる。融合体はキメラでありうる。融合体は、核酸アフィニティータグを含みうる。融合体はバーコードを含みうる。融合体は、ペプチドアフィニティータグを含みうる。融合体は、部位特異的ポリペプチド（例えば、核への標的化のための核移行シグナル（ＮＬＳ）、ミトコンドリアへの標的化のためのミトコンドリア移行シグナル、葉緑体への標的化のための葉緑体移行シグナル、小胞体（ＥＲ）保留シグナル等）の細胞内局在を提供しうる。融合体は、追跡または精製するために使用することができる非ネイティブ配列（例えば、アフィニティータグ）を提供しうる。融合体は、ビオチンなどの小型分子またはＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ色素、シアニン３色素、シアニン５色素などの色素でありうる。
【０１３５】
融合体は、機能的効果を有する任意のタンパク質を指しうる。例えば、融合タンパク質は、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポサーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性もしくはグリコシラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、リモデリング活性、プロテアーゼ活性、オキシドレダクターゼ活性、トランスフェラーゼ活性、ヒドロラーゼ活性、リアーゼ活性、イソメラーゼ活性、シンターゼ活性、シンテターゼ活性、または脱ミリストイル化活性を含みうる。エフェクタータンパク質は、ゲノム遺伝子座を改変することができる。融合タンパク質は、Ｃａｓタンパク質の融合体でありうる。融合タンパク質は、Ｃａｓタンパク質における非ネイティブ配列でありうる。
【０１３６】
本明細書で使用される場合、「非ネイティブ」は、ネイティブの核酸またはタンパク質に見出されない核酸またはポリペプチド配列を指しうる。非ネイティブは、アフィニティータグを指しうる。非ネイティブは、融合体を指しうる。非ネイティブは、変異、挿入、および／または欠失を含む天然に存在する核酸またはポリペプチド配列を指しうる。非ネイティブ配列は、非ネイティブ配列が融合される核酸および／またはポリペプチド配列も示すことができる活性（例えば、酵素活性、メチルトランスフェラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、キナーゼ活性、ユビキチン化活性等）を示しうるおよび／またはコードしうる。非ネイティブの核酸またはポリペプチド配列は、遺伝子操作によって天然に存在する核酸またはポリペプチド配列（またはそのバリアント）に連結され、キメラ核酸および／またはポリペプチド配列をコードするキメラ核酸および／またはポリペプチドを生成しうる。
【０１３７】
用語「被験体」、「個体」、および「患者」は、本明細書において互換的に使用され、脊椎動物、好ましくはヒトなどの哺乳動物を指す。哺乳動物には、ネズミ、サル、ヒト、農場動物、競技用動物、およびペットが挙げられるがこれらに限定されない。ｉｎ  ｖｉｖｏで得たまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養した生物学的実体の組織、細胞、およびその子孫もまた包含される。
【０１３８】
本明細書で使用される場合、用語「処置」および「処置する」は、治療利益および／または予防利益を含むがこれらに限定されない有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチを指す。例えば、処置は、本明細書に開示のシステムまたは細胞集団を投与するステップを含みうる。治療利益とは、処置による、１つまたは複数の疾患、状態、または症状に対するいずれかの治療的に関連する改善または効果を意味する。予防利益の場合、組成物を、特定の疾患、状態、もしくは症状を発症するリスクを有する被験体、またはたとえ疾患、状態、もしくは症状が発現していない場合であっても、疾患の生理学的症状の１つもしくは複数を報告する被験体に投与することができる。
【０１３９】
用語「有効量」または「治療有効量」は、それを必要とする被験体に投与した場合に所望の活性をもたらすために十分である、組成物、例えば本開示のシステムを含むリンパ球（例えば、Ｔリンパ球および／またはＮＫ細胞）などの免疫細胞を含む組成物の量を指す。本開示の文脈では、用語「治療的に有効」は、本開示の方法によって処置した障害の発現を遅らせる、進行を停止させる、その少なくとも１つの症状を和らげるまたは緩和するために十分である組成物のその量を指す。
【０１４０】
一態様では、本開示は、細胞における標的遺伝子の発現を調節するためのシステムを提供する。システムは、（ａ）リガンド結合ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む膜貫通受容体であって、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、シグナル伝達ドメインが細胞のシグナル伝達経路を活性化する、膜貫通受容体と、（ｂ）プロモーターの制御下に置かれた遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）をコードする核酸配列を含む発現カセットであって、ＧＭＰがアクチュエータ部分を含み、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、プロモーターが活性化されてＧＭＰの発現を駆動する発現カセットとを含み、発現されたＧＭＰが標的遺伝子の発現を調節する。一部の実施形態では、プロモーターは、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、活性化されてＧＭＰの発現を優先的に駆動する。一部の実施形態では、プロモーターは、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、活性化されてＧＭＰの発現を主として駆動する。一部の実施形態では、プロモーターは、リガンドがリガンド結合ドメインに結合する場合に限って、活性化されてＧＭＰの発現を駆動する。
【０１４１】
本発明のシステムの膜貫通受容体は、細胞外領域、膜貫通領域、および細胞内領域を含みうる。細胞外領域は、リガンドの結合にとって適したリガンド結合ドメインを含みうる。細胞内領域は、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、細胞のシグナル伝達経路を活性化するシグナル伝達ドメインを含みうる。膜貫通領域、または細胞膜を貫通する受容体の領域は、細胞外領域を細胞内領域に連結または結合させることができる。
【０１４２】
本発明のシステムの膜貫通受容体は、内因性受容体、合成受容体、またはそのバリアントを含みうる。内因性受容体は、細胞において天然に見出される受容体を含む。外因性受容体は、細胞に外因性に導入された受容体を含む。外因性受容体は、細胞において天然に見出される配列を含有しうる。別の例では、外因性の受容体は、異なる生物または種の受容体でありうる。外因性の受容体はまた、いかなる生物においても天然に存在しない合成受容体も含む。外因性の受容体は、キメラ受容体を含み、これは異なる分子（例えば、異なるタンパク質、相同タンパク質、オルトログタンパク質等）の領域（例えば、細胞外、膜貫通、細胞内等）を結合させることによって構築された受容体を指す。
【０１４３】
本発明のシステムの合成膜貫通受容体は、少なくとも１つの細胞外領域、膜貫通領域、および細胞内領域を有するキメラ受容体を含みうる。細胞外領域は、リガンドに結合することが可能なリガンド結合ドメインを含みうる。一部の例では、リガンド結合ドメインは、内因性の受容体のリガンド結合ドメインである。一部の例では、リガンド結合ドメインは、特定のリガンドに対する結合特異性および結合親和性などの、しかしこれらに限定されないある特定の特性を有するようにｉｎ  ｖｉｔｒｏで操作されている合成または人工のリガンド結合ドメインである。膜貫通領域は、アルファヘリックスおよびベータバレルを含む多様な三次元構造のいずれかを形成しうる。細胞内領域は、細胞のシグナル伝達経路を活性化することが可能なシグナル伝達ドメインを含みうる。合成膜貫通受容体の細胞外、膜貫通、および細胞内領域を、所望の特性を有するキメラ受容体を作製するために選択することができる。例えば、特定のリガンドに対する結合特異性および親和性を有する受容体を生成するために、合成膜貫通受容体を構築することができる。さらなる例として、細胞の１つまたは複数のシグナル伝達経路を活性化する受容体を生成するために、合成受容体を構築することができる。一部の実施形態では、膜貫通受容体は、最小の細胞内領域を有するか、または細胞内領域を有さず、膜貫通領域および／または膜貫通−近位領域はシグナル伝達ドメインとして機能する。
【０１４４】
異なる分子からの様々な領域またはドメインの結合に起因する合成膜貫通受容体は、ドメインが由来する分子とは、例えば構造的および機能的に異なりうる。しかし、個々のドメインは、一部の例では、ネイティブの構造および／または活性を保持することができる。例えば、個々のドメインは、ネイティブの構造および／または活性の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％を保持しうる。例えば、リガンド結合ドメインを含む細胞外領域は、細胞外領域が由来する分子の結合親和性の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％を保持することができる。さらなる例として、シグナル伝達ドメインを含む細胞内領域は、細胞内領域が由来する分子と比較して細胞のシグナル伝達経路を活性化する能力の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％を保持することができる。
【０１４５】
一部の実施形態では、膜貫通受容体は、内因性受容体を含む。任意の適した内因性受容体を、細胞における標的遺伝子の発現を調節するために本発明のシステムにおいて使用することができる。膜貫通受容体は、Ｎｏｔｃｈ受容体；Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）；インテグリン受容体；カドヘリン受容体；酵素活性を保有する受容体、および固有の酵素活性を保有するのではなく、非共有結合によって会合した酵素（例えば、キナーゼ）を刺激することによって作用する受容体を含む触媒受容体；腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーのメンバーなどの細胞死受容体；免疫受容体、例えばＴ細胞受容体（ＴＣＲ）；またはそのいずれかのバリアントを含みうる。一部の実施形態では、本システムの膜貫通受容体はＧＰＣＲを含む。一部の実施形態では、本システムの膜貫通受容体は、インテグリンサブユニットを含む。
【０１４６】
一部の実施形態では、本発明のシステムの膜貫通受容体は、外因性受容体を含む。一部の実施形態では、外因性受容体は合成受容体である。一部の実施形態では、合成受容体はキメラ受容体である。膜貫通受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、合成インテグリン受容体、合成Ｎｏｔｃｈ受容体、または合成ＧＰＣＲ受容体を含みうる。
【０１４７】
一部の実施形態では、膜貫通受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。ＣＡＲのリガンド結合ドメイン（例えば、細胞外領域）は、Ｆａｂ、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、内因性受容体（例えば、ＧＰＣＲ、インテグリン受容体、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体等）の細胞外領域、またはＦｃ結合ドメインを含みうる。ＣＡＲは、受容体を細胞膜（例えば、細胞膜、オルガネラ膜等）に配置する膜貫通ドメインを含みうる。一部の実施形態では、ＣＡＲのシグナル伝達ドメイン（例えば、細胞内領域）は、少なくとも１つの免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲのシグナル伝達ドメイン（例えば、細胞内領域）は、少なくとも１つの免疫受容体抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、ＩＴＡＭモチーフおよびＩＴＩＭモチーフの両方を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、少なくとも１つの共刺激ドメインを含む。
【０１４８】
リガンドが膜貫通受容体のリガンド結合ドメインに結合すると、内因性膜貫通受容体であるか外因性膜貫通受容体（例えば、合成受容体、例えばキメラ受容体）であるかによらず、受容体のシグナル伝達ドメインは、細胞の少なくとも１つのシグナル伝達経路を活性化することができる。シグナル伝達経路およびその関連タンパク質は、細胞応答（例えば翻訳の調節、転写の調節、ならびにエピジェネティック改変（メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、リボシル化、およびシトルリン化の調節を含む）を介した遺伝子発現のプログラムされた変化）の調節（例えば、活性化および／または非活性化）に関係しうる。
【０１４９】
一部の例では、シグナル伝達経路の活性化に起因する細胞応答は、転写調節を介しての遺伝子発現の変化を含む。シグナル伝達経路の活性化に起因する細胞応答は、転写調節を介する遺伝子の発現の増加でありうる。あるいは、シグナル伝達経路の活性化に起因する細胞応答は、転写の調節を介する遺伝子の発現の減少でありうる。単一のシグナル伝達経路の活性化は、一部の例では、複数の遺伝子の発現レベルの変化をもたらしうる。変化は、異なる遺伝子の発現の増加、発現の減少、または増加と減少の組合せでありうる。一部の例では、少なくとも１つの転写因子がプロモーターに動員され、そこで遺伝子の発現を増加または減少させることができる。一部の例では、複数のシグナル伝達経路は、１つの遺伝子の発現レベルを調節することができる。
【０１５０】
シグナル伝達経路の活性化に応答した転写の調節を本明細書に提供するシステムにおいて利用して、遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）を発現させることができる。ＧＭＰをコードする核酸配列またはＧＭＰコード配列を、リガンド受容体結合に応答して細胞において活性化されるシグナル伝達経路に応答するプロモーターの制御下に置くことができる。
【０１５１】
一部の例では、プロモーターは、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると（例えば、細胞のシグナル伝達経路の活性化）活性化される内因性プロモーターである。内因性プロモーターは、細胞ゲノムに天然に見出されるプロモーター配列を含む。内因性プロモーターはまた、細胞ゲノムにおいて天然に見出されるがゲノムにおけるその天然の位置には存在しない内因性プロモーター配列も含む。一部の例では、システムのプロモーターは、遺伝子の発現を調節し、所定のリガンドと受容体対の間の相互作用によって特異的に活性化される内因性プロモーターである。例えば、遺伝子の発現は、所定のリガンド−受容体対が相互作用すると（結合すると）検出することができる。一部の例では、システムのプロモーターは、所定のリガンドと受容体対の間の相互作用によって優先的に活性化される。一部の例では、システムのプロモーターは、所定のリガンドと受容体対の間の相互作用によって主として活性化される。例えば、遺伝子の発現は、所定のリガンド−受容体対が相互作用する（例えば、結合する）と主として検出される。一部の例では、システムのプロモーターは、所定のリガンドと受容体対の間で相互作用する場合に限って活性化される。例えば、遺伝子の発現は、所定のリガンド受容体対が相互作用する（例えば、結合する）場合に限って検出される。
【０１５２】
一部の実施形態では、細胞において活性化されるシグナル伝達経路は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路である。一部の実施形態では、膜貫通受容体は、受容体チロシンキナーゼ、インテグリン、Ｂ細胞受容体、Ｔ細胞受容体、サイトカイン受容体、またはＧタンパク質共役受容体を含み、プロモーターは、ＰＲＫＣＥ、ＩＴＧＡＭ、ＩＴＧＡ５、ＩＲＡＫ１、ＰＲＫＡＡ２、ＥＩＦ２ＡＫ２、ＰＴＥＮ、ＥＩＦ４Ｅ、ＰＲＫＣＺ、ＧＲＫ６、ＭＡＰＫ１、ＴＳＣ１、ＰＬＫ１、ＡＫＴ２、ＩＫＢＫＢ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＣＤＫ８、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＮＦＫＢ２、ＢＣＬ２、ＰＩＫ３ＣＢ、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＭＡＰＫ８、ＢＣＬ２Ｌ１、ＭＡＰＫ３、ＴＳＣ２、ＩＴＧＡ１、ＫＲＡＳ、ＥＩＦ４ＥＢＰ１、ＲＥＬＡ、ＰＲＫＣＤ、ＮＯＳ３、ＰＲＫＡＡ１、ＭＡＰＫ９、ＣＤＫ２、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＩＭ１、ＩＴＧＢ７、ＹＷＨＡＺ、ＩＬＫ、ＴＰ５３、ＲＡＦ１、ＩＫＢＫＧ、ＲＥＬＢ、ＤＹＲＫ１Ａ、ＣＤＫＮ１Ａ、ＩＴＧＢ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＪＡＫ１、ＡＫＴ１、ＪＡＫ２、ＰＩＫ３Ｒ１、ＣＨＵＫ、ＰＤＰＫ１、ＰＰＰ２Ｒ５Ｃ、ＣＴＮＮＢ１、ＭＡＰ２Ｋ１、ＮＦＫＢ１、ＰＡＫ３、ＩＴＧＢ３、ＣＣＮＤ１、ＧＳＫ３Ａ、ＦＲＡＰ１、ＳＦＮ、ＩＴＧＡ２、ＴＴＫ、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＢＲＡＦ、ＧＳＫ３Ｂ、ＡＫＴ３、ＦＯＸＯ１、ＳＧＫ、ＨＳＰ９０ＡＡ１、またはＲＰＳ６ＫＢ１の発現を調節する。
【０１５３】
一部の実施形態では、細胞において活性化されるシグナル伝達経路は、ＥＲＫ／ＭＡＰＫ経路である。一部の実施形態では、膜貫通受容体は、ＥＧＦＲ、Ｔｒｋ  Ａ／Ｂ、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）、または血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）を含み、プロモーターは、ＰＲＫＣＥ、ＩＴＧＡＭ、ＩＴＧＡ５、ＨＳＰＢ１、ＩＲＡＫ１、ＰＲＫＡＡ２、ＥＩＦ２ＡＫ２、ＲＡＣ１、ＲＡＰ１Ａ、ＴＬＮ１、ＥＩＦ４Ｅ、ＥＬＫ１、ＧＲＫ６、ＭＡＰＫ１、ＲＡＣ２、ＰＬＫ１、ＡＫＴ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＣＤＫ８、ＣＲＥＢ１、ＰＲＫＣＩ、ＰＴＫ２、ＦＯＳ、ＲＰＳ６ＫＡ４、ＰＩＫ３ＣＢ、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＰＩＫ３Ｃ３、ＭＡＰＫ８、ＭＡＰＫ３、ＩＴＧＡ１、ＥＴＳ１、ＫＲＡＳ、ＭＹＣＮ、ＥＩＦ４ＥＢＰ１、ＰＰＡＲＧ、ＰＲＫＣＤ、ＰＲＫＡＡ１、ＭＡＰＫ９、ＳＲＣ、ＣＤＫ２、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＩＭ１、ＰＩＫ３Ｃ２Ａ、ＩＴＧＢ７、ＹＷＨＡＺ、ＰＰＰ１ＣＣ、ＫＳＲ１、ＰＸＮ、ＲＡＦ１、ＦＹＮ、ＤＹＲＫ１Ａ、ＩＴＧＢ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＰＡＫ４、ＰＩＫ３Ｒ１、ＳＴＡＴ３、ＰＰＰ２Ｒ５Ｃ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＰＡＫ３、ＩＴＧＢ３、ＥＳＲ１、ＩＴＧＡ２、ＭＹＣ、ＴＴＫ、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＣＲＫＬ、ＢＲＡＦ、ＡＴＦ４、ＰＲＫＣＡ、ＳＲＦ、ＳＴＡＴ１、またはＳＧＫの発現を調節する。
【０１５４】
一部の実施形態では、細胞において活性化されるシグナル伝達経路は、糖質コルチコイド受容体シグナル伝達経路である。一部の実施形態では、膜貫通受容体は、糖質コルチコイド受容体を含み、プロモーターは、ＲＡＣ１、ＴＡＦ４Ｂ、ＥＰ３００、ＳＭＡＤ２、ＴＲＡＦ６、ＰＣＡＦ、ＥＬＫ１、ＭＡＰＫ１、ＳＭＡＤ３、ＡＫＴ２、ＩＫＢＫＢ、ＮＣＯＲ２、ＵＢＥ２Ｉ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＣＲＥＢ１、ＦＯＳ、ＨＳＰＡ５、ＮＦＫＢ２、ＢＣＬ２、ＭＡＰ３Ｋ１４、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＰＩＫ３ＣＢ、ＰＩＫ３Ｃ３、ＭＡＰＫ８、ＢＣＬ２Ｌ１、ＭＡＰＫ３、ＴＳＣ２２Ｄ３、ＭＡＰＫ１０、ＮＲＩＰ１、ＫＲＡＳ、ＭＡＰＫ１３、ＲＥＬＡ、ＳＴＡＴ５Ａ、ＭＡＰＫ９、ＮＯＳ２Ａ、ＰＢＸ１、ＮＲ３Ｃ１、ＰＩＫ３Ｃ２Ａ、ＣＤＫＮ１Ｃ、ＴＲＡＦ２、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＮＣＯＡ３、ＭＡＰＫ１４、ＴＮＦ、ＲＡＦ１、ＩＫＢＫＧ、ＭＡＰ３Ｋ７、ＣＲＥＢＢＰ、ＣＤＫＮ１Ａ、ＭＡＰ２Ｋ２、ＪＡＫ１、ＩＬ８、ＮＣＯＡ２、ＡＫＴ１、ＪＡＫ２、ＰＩＫ３Ｒ１、ＣＨＵＫ、ＳＴＡＴ３、ＭＡＰ２Ｋ１、ＮＦＫＢ１、ＴＧＦＢＲ１、ＥＳＲ１、ＳＭＡＤ４、ＣＥＢＰＢ、ＪＵＮ、ＡＲ、ＡＫＴ３、ＣＣＬ２、ＭＭＰ１、ＳＴＡＴ１、ＩＬ６、またはＨＳＰ９０ＡＡ１の発現を調節する。
【０１５５】
一部の実施形態では、細胞において活性化されるシグナル伝達経路は、Ｂ細胞受容体シグナル伝達経路である。一部の実施形態では、膜貫通受容体はＢ細胞受容体を含み、プロモーターは、ＲＡＣ１、ＰＴＥＮ、ＬＹＮ、ＥＬＫ１、ＭＡＰＫ１、ＲＡＣ２、ＰＴＰＮ１１、ＡＫＴ２、ＩＫＢＫＢ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＣＲＥＢ１、ＳＹＫ、ＮＦＫＢ２、ＣＡＭＫ２Ａ、ＭＡＰ３Ｋ１４、ＰＩＫ３ＣＢ、ＰＩＫ３Ｃ３、ＭＡＰＫ８、ＢＣＬ２Ｌ１、ＡＢＬ１、ＭＡＰＫ３、ＥＴＳ１、ＫＲＡＳ、ＭＡＰＫ１３、ＲＥＬＡ、ＰＴＰＮ６、ＭＡＰＫ９、ＥＧＲ１、ＰＩＫ３Ｃ２Ａ、ＢＴＫ、ＭＡＰＫ１４、ＲＡＦ１、ＩＫＢＫＧ、ＲＥＬＢ、ＭＡＰ３Ｋ７、ＭＡＰ２Ｋ２、ＡＫＴ１、ＰＩＫ３Ｒ１、ＣＨＵＫ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＮＦＫＢ１、ＣＤＣ４２、ＧＳＫ３Ａ、ＦＲＡＰ１、ＢＣＬ６、ＢＣＬ１０、ＪＵＮ、ＧＳＫ３Ｂ、ＡＴＦ４、ＡＫＴ３、ＶＡＶ３、またはＲＰＳ６ＫＢ１の発現を調節する。
【０１５６】
一部の実施形態では、細胞において活性化されるシグナル伝達経路は、インテグリンシグナル伝達経路である。一部の実施形態では、膜貫通受容体は、インテグリンまたはインテグリンサブユニットを含み、プロモーターは、ＡＣＴＮ４、ＩＴＧＡＭ、ＲＯＣＫ１、ＩＴＧＡ５、ＲＡＣ１、ＰＴＥＮ、ＲＡＰ１Ａ、ＴＬＮ１、ＡＲＨＧＥＦ７、ＭＡＰＫ１、ＲＡＣ２、ＣＡＰＮＳ１、ＡＫＴ２、ＣＡＰＮ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴＫ２、ＰＩＫ３ＣＢ、ＰＩＫ３Ｃ３、ＭＡＰＫ８、ＣＡＶ１、ＣＡＰＮ１、ＡＢＬ１、ＭＡＰＫ３、ＩＴＧＡ１、ＫＲＡＳ、ＲＨＯＡ、ＳＲＣ、ＰＩＫ３Ｃ２Ａ、ＩＴＧＢ７、ＰＰＰ１ＣＣ、ＩＬＫ、ＰＸＮ、ＶＡＳＰ、ＲＡＦ１、ＦＹＮ、ＩＴＧＢ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＰＡＫ４、ＡＫＴ１、ＰＩＫ３Ｒ１、ＴＮＫ２、ＭＡＰ２Ｋ１、ＰＡＫ３、ＩＴＧＢ３、ＣＤＣ４２、ＲＮＤ３、ＩＴＧＡ２、ＣＲＫＬ、ＢＲＡＦ、ＧＳＫ３Ｂ、またはＡＫＴ３の発現を調節する。
【０１５７】
一部の実施形態では、細胞において活性化されるシグナル伝達経路は、インスリン受容体シグナル伝達経路である。一部の実施形態では、膜貫通受容体は、インスリン受容体を含み、プロモーターは、ＰＴＥＮ、ＩＮＳ、ＥＩＦ４Ｅ、ＰＴＰＮ１、ＰＲＫＣＺ、ＭＡＰＫ１、ＴＳＣ１、ＰＴＰＮ１１、ＡＫＴ２、ＣＢＬ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＲＫＣＩ、ＰＩＫ３ＣＢ、ＰＩＫ３Ｃ３、ＭＡＰＫ８、ＩＲＳ１、ＭＡＰＫ３、ＴＳＣ２、ＫＲＡＳ、ＥＩＦ４、ＥＢＰ１、ＳＬＣ２Ａ４、ＰＩＫ３Ｃ２Ａ、ＰＰＰ１ＣＣ、ＩＮＳＲ、ＲＡＦ１、ＦＹＮ、ＭＡＰ２Ｋ２、ＪＡＫ１、ＡＫＴ１、ＪＡＫ２、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＤＰＫ１、ＭＡＰ２Ｋ１、ＧＳＫ３Ａ、ＦＲＡＰ１、ＣＲＫＬ、ＧＳＫ３Ｂ、ＡＫＴ３、ＦＯＸＯ１、ＳＧＫ、またはＲＰＳ６ＫＢ１の発現を調節する。
【０１５８】
一部の実施形態では、細胞において活性化されるシグナル伝達経路は、Ｔ細胞受容体シグナル伝達経路である。一部の実施形態では、膜貫通受容体は、Ｔ細胞受容体を含み、プロモーターは、ＲＡＣ１、ＥＬＫ１、ＭＡＰＫ１、ＩＫＢＫＢ、ＣＢＬ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＯＳ、ＮＦＫＢ２、ＰＩＫ３ＣＢ、ＰＩＫ３Ｃ３、ＭＡＰＫ８、ＭＡＰＫ３、ＫＲＡＳ、ＲＥＬＡ、ＰＩＫ３Ｃ２Ａ、ＢＴＫ、ＬＣＫ、ＲＡＦ１、ＩＫＢＫＧ、ＲＥＬＢ、ＦＹＮ、ＭＡＰ２Ｋ２、ＰＩＫ３Ｒ１、ＣＨＵＫ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＮＦＫＢ１、ＩＴＫ、ＢＣＬ１０、ＪＵＮ、またはＶＡＶ３の発現を調節する。
【０１５９】
一部の実施形態では、細胞において活性化されるシグナル伝達経路は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）シグナル伝達経路である。一部の実施形態では、膜貫通受容体はＧＰＣＲを含み、プロモーターは、ＰＲＫＣＥ、ＲＡＰ１Ａ、ＲＧＳ１６、ＭＡＰＫ１、ＧＮＡＳ、ＡＫＴ２、ＩＫＢＫＢ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＣＲＥＢ１、ＧＮＡＱ、ＮＦＫＢ２、ＣＡＭＫ２Ａ、ＰＩＫ３ＣＢ、ＰＩＫ３Ｃ３、ＭＡＰＫ３、ＫＲＡＳ、ＲＥＬＡ、ＳＲＣ、ＰＩＫ３Ｃ２Ａ、ＲＡＦ１、ＩＫＢＫＧ、ＲＥＬＢ、ＦＹＮ、ＭＡＰ２Ｋ２、ＡＫＴ１、ＰＩＫ３Ｒ１、ＣＨＵＫ、ＰＤＰＫ１、ＳＴＡＴ３、ＭＡＰ２Ｋ１、ＮＦＫＢ１、ＢＲＡＦ、ＡＴＦ４、ＡＫＴ３、またはＰＲＫＣＡの発現を調節する。
【０１６０】
一部の例では、プロモーターは、所望のレベルの発現を駆動する内因性プロモーター配列の断片を含む。例えば、完全長の対応物と比較してサイズがより小さいが、なおもある特定のレベルの活性（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の活性）を維持する最小プロモーターエレメントを使用することができる。
【０１６１】
一部の実施形態では、プロモーターは、インターロイキン２（ＩＬ−２）プロモーター配列、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）プロモーター配列、インターフェロン調節因子４（ＩＲＦ４）プロモーター配列、核内受容体サブファミリー４グループＡメンバー１（ＮＲ４Ａ１、神経成長因子ＩＢ（ＮＧＦＩＢ）としても公知）プロモーター配列、ＰＲドメインジンクフィンガータンパク質１（ＰＲＤＭ１）プロモーター配列、Ｔ−ボックス転写因子（ＴＢＸ２１）プロモーター配列、ＣＤ６９プロモーター配列、ＣＤ２５プロモーター配列、またはグランザイムＢ（ＧＺＭＢ）プロモーター配列である。
【０１６２】
発現カセットは、内因性プロモーター配列に作動可能に連結されるＧＭＰコード配列を含みうる。一部の例では、発現カセットは、細胞ゲノムに組み込まれない。発現カセットは、非組込みプラスミドの一部として細胞に供給されうる。一部の例では、発現カセットは、細胞ゲノムに組み込まれる。細胞ゲノムへの組込みは、標的化されても標的化されなくてもよい（例えば、ランダム組込み）。一部の実施形態では、発現カセットは、レンチウイルスによって細胞ゲノムに組み込まれる。
【０１６３】
一部の例では、ＧＭＰコード配列は、ＧＭＰコード配列が細胞においてプロモーターによって制御される内因性遺伝子を置き換えるように、ゲノムに組み込まれうる。一部の例では、ＧＭＰコード配列は、内因性遺伝子を置き換えない。ＧＭＰコード配列は、ＧＭＰをコードする配列が内因性遺伝子の上流に位置するようにゲノムに組み込まれうる。ＧＭＰコード配列は、ＧＭＰコード配列が内因性遺伝子の下流に位置するようにゲノムに組み込まれうる。
【０１６４】
内因性遺伝子がＧＭＰコード配列の上流に位置する一部の例では、ＧＭＰコード配列と内因性遺伝子とは、ペプチドリンカーをコードする核酸配列によって結合されうる。ＧＭＰをコードする配列は、翻訳されたペプチド配列が適切なアミノ酸配列を有するように、内因性遺伝子にインフレームで結合されうる。一部の例では、リンカーは、切断認識部位、例えばプロテアーゼ認識部位を有し、内因性遺伝子によってコードされるタンパク質とＧＭＰとを、ペプチドリンカーの切断、例えばプロテアーゼ切断によって分離させることができる。一部の例では、リンカーは、「自己切断」セグメント、例えば２Ａペプチドを有する。ピコルナウイルスにおいて最初に発見された２Ａペプチドは、複数の遺伝子（例えば、少なくとも２つの遺伝子）を同じｍＲＮＡから発現させることができる、通常約２０アミノ酸長のペプチド配列を指す。２Ａペプチドは、２ＡエレメントのＣ末端でのペプチド結合の合成をリボソームにスキップさせて、２Ａ配列の末端と下流の次のペプチドとの間で分離することによって機能すると考えられている。「切断」は、典型的に、Ｃ末端で見出されるグリシンとプロリン残基の間で起こる。一般的に、上流の遺伝子またはシストロンは、幾つかの追加の残基が末端に付加されているが、下流の遺伝子またはシストロンは、プロリン残基で始まる。例示的な２Ａペプチドは、Ｔ２Ａ（ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ）、Ｐ２Ａ（ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ）、Ｅ２Ａ（ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ）、およびＦ２Ａ（ＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ）を含む。
【０１６５】
内因性遺伝子がＧＭＰコード配列の上流に位置する一部の例では、ＧＭＰコード配列と内因性遺伝子とは、非コード性である核酸配列によって結合されうる。内因性遺伝子とＧＭＰコード配列とを結合する非コード核酸配列は、ｍＲＮＡの内部領域からの翻訳の開始を可能にする配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含みうる。ＩＲＥＳエレメントは、別のリボソーム動員部位として作用し、それによって単一のｍＲＮＡから２つのタンパク質の同時発現をもたらすことができる。ＩＲＥＳエレメントは、長さが約３００〜１０００ｂｐの間（例えば、長さ約４００〜９００ｂｐ、５００〜８００ｂｐ、または６００〜７００ｂｐの間）でありうる。
【０１６６】
一部の例では、プロモーターは、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると活性化される（例えば、細胞のシグナル伝達経路の活性化）外因性プロモーターである。外因性プロモーター配列は、細胞ゲノムに天然に見出されないプロモーター配列、例えば異なる種からのプロモーター配列を含む。別の例では、外因性プロモーターは、いかなる生物においても天然に存在しない合成プロモーター配列を含みうる。一部の例では、外因性プロモーターは、内因性プロモーター配列、合成プロモーター配列、およびその組合せの複数のコピーを含みうる。
【０１６７】
一部の例では、プロモーターは、所望の発現レベルを駆動する合成プロモーター配列の断片を含む。例えば、完全長の対応物と比較してサイズがより小さいが、それでもなおある特定のレベルの活性（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の活性）を維持する最小プロモーターエレメントを使用することができる。
【０１６８】
発現カセットは、外因性プロモーターに作動可能に連結されるＧＭＰコード配列を含みうる。一部の例では、発現カセットは、細胞ゲノムに組み込まれる。一部の実施形態では、発現カセットは、レンチウイルスによって細胞ゲノムに組み込まれる。組込みは、標的化されても標的化されなくてもよい（例えば、ランダム組込み）。一部の例では、発現カセットは、細胞ゲノムに組み込まれない。発現カセットは、非組込みプラスミドの一部として細胞に供給されうる。
【０１６９】
ＧＭＰの発現レベルは、プロモーターおよび／またはシステムに利用されるシグナル伝達経路に依存しうる。一部の例では、ＧＭＰは、プロモーターによって制御される内因性遺伝子と比較して高レベルで発現されうる。一部の例では、ＧＭＰは、プロモーターによって制御される内因性遺伝子と比較して中等度のレベルで発現されうる。一部の例では、ＧＭＰは、プロモーターによって制御される内因性遺伝子と比較して低レベルで発現されうる。一部の例では、ＧＭＰは、プロモーターによって制御される内因性遺伝子と類似のレベルで発現されうる。ＧＭＰ発現の特異性はまた、プロモーターおよび／またはシステムに利用されるシグナル伝達経路にも依存しうる。一部の例では、ＧＭＰは、膜貫通受容体がリガンドに結合すると、優先的に発現される。一部の例では、ＧＭＰは、膜貫通受容体がリガンドに結合すると、主として発現される。一部の例では、ＧＭＰは、膜貫通受容体がリガンドに結合する場合に限って発現される。
【０１７０】
得られた発現されたＧＭＰはアクチュエータ部分を含み、細胞における標的遺伝子の発現を調節することができる。アクチュエータ部分は、標的ポリヌクレオチドに結合して標的遺伝子の発現および／または活性を調節することができる。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドはゲノムＤＮＡを含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、プラスミドの領域、例えば外因性遺伝子を有するプラスミドの領域を含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドはＲＮＡ、例えばｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、内因性遺伝子または遺伝子産物を含む。
【０１７１】
アクチュエータ部分は、ヌクレアーゼ（例えば、ＤＮＡヌクレアーゼおよび／またはＲＮＡヌクレアーゼ）、ヌクレアーゼ欠損であるかもしくは野生型ヌクレアーゼと比較してヌクレアーゼ活性が低減された改変ヌクレアーゼ（例えば、ＤＮＡヌクレアーゼおよび／またはＲＮＡヌクレアーゼ）、またはそのバリアントを含みうる。アクチュエータ部分は、遺伝子の発現もしくは活性を調節する、および／または核酸（例えば、遺伝子および／または遺伝子産物）の配列を編集することができる。一部の実施形態では、アクチュエータ部分は、標的ＤＮＡ配列のゲノム編集を誘導するためにＤＮＡヌクレアーゼ、例えば操作された（例えば、プログラム可能なまたは標的化可能な）ＤＮＡヌクレアーゼを含む。一部の実施形態では、アクチュエータ部分は、標的ＲＮＡ配列の編集を誘導するためにＲＮＡヌクレアーゼ、例えば操作された（例えば、プログラム可能なまたは標的化可能な）ＲＮＡヌクレアーゼを含む。一部の実施形態では、アクチュエータ部分は、低減されたまたは最小のヌクレアーゼ活性を有する。低減されたまたは最小のヌクレアーゼ活性を有するアクチュエータ部分は、標的ポリヌクレオチドの物理的障害によって、または標的ポリヌクレオチドの発現を抑制もしくは増強するために有効な追加の因子の動員によって遺伝子の発現および／または活性を調節することができる。アクチュエータ部分は、標的ポリヌクレオチドを物理的に障害するか、または標的ポリヌクレオチドの発現を抑制もしくは増強するために有効な追加の因子を動員することができる。一部の実施形態では、アクチュエータ部分は、標的ポリヌクレオチドの発現を増加させるために有効な転写活性化因子を含む。一部の実施形態では、アクチュエータ部分は、標的ポリヌクレオチドの発現を減少させるために有効な転写抑制因子を含む。一部の実施形態では、アクチュエータ部分は、標的ＤＮＡ配列の転写活性化または抑制を誘導することができるＤＮＡヌクレアーゼに由来するヌクレアーゼヌルＤＮＡ結合タンパク質を含む。一部の実施形態では、アクチュエータ部分は、標的ＲＮＡ配列の転写活性化または抑制を誘導することができるＲＮＡヌクレアーゼに由来するヌクレアーゼヌルＲＮＡ結合タンパク質を含む。一部の実施形態では、アクチュエータ部分は、核酸誘導型アクチュエータ部分である。一部の実施形態では、アクチュエータ部分は、ＤＮＡ誘導型アクチュエータ部分である。一部の実施形態では、アクチュエータ部分は、ＲＮＡ誘導型アクチュエータ部分である。アクチュエータ部分は、遺伝子の発現もしくは活性を調節することができ、および／または外因性であるか内因性であるかによらず、核酸配列を編集することができる。
【０１７２】
任意の適したヌクレアーゼを使用することができる。適したヌクレアーゼには、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチド、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチド、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチド、ＩＶ型ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチド、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチド、およびＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチドを含むＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質またはＣａｓヌクレアーゼ；ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）；転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）；メガヌクレアーゼ；ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）；ＣＲＩＳＰＲ関連ＲＮＡ結合タンパク質；リコンビナーゼ；フリッパーゼ；トランスポサーゼ；アルゴノート（Ａｇｏ）タンパク質（例えば、原核細胞アルゴノート（ｐＡｇｏ）、古細菌アルゴノート（ａＡｇｏ）、および真核細胞アルゴノート（ｅＡｇｏ））；ならびにそのいずれかのバリアントが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１７３】
任意の標的遺伝子を、ＧＭＰによって調節することができる。本明細書に記載の遺伝子の遺伝的ホモログが含まれると企図される。例えば、遺伝子は、本明細書に開示の遺伝子に対してある特定の同一性および／または相同性を示しうる。したがって、５０％、５５％、６０％、６５％，７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性（核酸レベルまたはタンパク質レベルで）を示すまたはこれらのおよその値の相同性を示す遺伝子の発現を調節することができると企図される。同様に、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性（核酸レベルまたはタンパク質レベルで）を示すまたはこれらのおよその値の同一性を示す遺伝子の発現を調節することができると企図される。
【０１７４】
一部の実施形態では、標的遺伝子は、サイトカインをコードする。サイトカインの非制限的な例には、４−１ＢＢＬ、アクチビンβＡ、アクチビンβＢ、アクチビンβＣ、アクチビンβＥ、アルテミン（ａｒｔｅｍｉｎ）（ＡＲＴＮ）、ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ／ＴＮＦＳＦ１３８、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、骨形成タンパク質１（ＢＭＰ１）、ＣＣＬ１／ＴＣＡ３、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２／ＭＣＰ−５、ＣＣＬ１３／ＭＣＰ−４、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７／ＴＡＲＣ、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２／ＭＤＣ、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＣＬ３、ＣＣＬ３Ｌ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ４Ｌ１／ＬＡＧ−１、ＣＣＬ５、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９、ＣＤ１５３／ＣＤ３０Ｌ／ＴＮＦＳＦ８、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ１５４／ＴＮＦＳＦ５、ＣＤ４０ＬＧ、ＣＤ７０、ＣＤ７０／ＣＤ２７Ｌ／ＴＮＦＳＦ７、ＣＬＣＦ１、ｃ−ＭＰＬ／ＣＤ１１０／ＴＰＯＲ、ＣＮＴＦ、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ１７、ＣＸＣＬ２／ＭＩＰ−２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７／Ｐｐｂｐ、ＣＸＣＬ９、ＥＤＡ−Ａ１、ＦＡＭ１９Ａ１、ＦＡＭ１９Ａ２、ＦＡＭ１９Ａ３、ＦＡＭ１９Ａ４、ＦＡＭ１９Ａ５、Ｆａｓリガンド／ＦＡＳＬＧ／ＣＤ９５Ｌ／ＣＤ１７８、ＧＤＦ１０、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ１５、ＧＤＦ２、ＧＤＦ３、ＧＤＦ４、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、増殖分化因子１（ＧＤＦ１）、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１３、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５／ＩＦＮａＧ、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＢ１、ＩＦＮＥ、ＩＦＮＧ、ＩＦＮＺ、ＩＦＮω／ＩＦＮＷ１、ＩＬ１１、ＩＬ１８、ＩＬ１８ＢＰ、ＩＬ１Ａ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ１Ｆ１０、ＩＬ１Ｆ３／ＩＬ１ＲＡ、ＩＬ１Ｆ５、ＩＬ１Ｆ６、ＩＬ１Ｆ７、ＩＬ１Ｆ８、ＩＬ１Ｆ９、ＩＬ１ＲＬ２、ＩＬ３１、ＩＬ３３、ＩＬ６、ＩＬ８／ＣＸＣＬ８、インヒビン−Ａ、インヒビン−Ｂ、レプチン、ＬＩＦ、ＬＴＡ／ＴＮＦＢ／ＴＮＦＳＦ１、ＬＴＢ／ＴＮＦＣ、ニュールツリン（ＮＲＴＮ）、ＯＳＭ、ＯＸ−４０Ｌ／ＴＮＦＳＦ４／ＣＤ２５２、パーセフィン（ＰＳＰＮ）、ＲＡＮＫＬ／ＯＰＧＬ／ＴＮＦＳＦ１１（ＣＤ２５４）、ＴＬ１Ａ／ＴＮＦＳＦ１５、ＴＮＦＡ、ＴＮＦ−アルファ／ＴＮＦＡ、ＴＮＦＳＦ１０／ＴＲＡＩＬ／ＡＰＯ−２Ｌ（ＣＤ２５３）、ＴＮＦＳＦ１２、ＴＮＦＳＦ１３、ＴＮＦＳＦ１４／ＬＩＧＨＴ／ＣＤ２５８、ＸＣＬ１、およびＸＣＬ２が挙げられる。一部の実施形態では、標的遺伝子は、免疫チェックポイント阻害剤をコードする。そのような免疫チェックポイント阻害剤の非制限的な例には、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ−３、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＩＤＯ、ＫＩＲ、およびＶＩＳＴＡが挙げられる。一部の実施形��では、標的遺伝子は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ、ベータ、ガンマ、および／またはデルタ鎖をコードする。
【０１７５】
一態様では、本開示は、２つの膜貫通受容体を含む細胞における標的遺伝子の発現を調節するためのシステムを提供する。システムは、（ａ）第１のリガンド結合ドメインおよび第１のシグナル伝達ドメインを含む第１の膜貫通受容体であって、第１のリガンドが第１のリガンド結合ドメインに結合すると、第１のシグナル伝達ドメインが細胞の第１のシグナル伝達経路を活性化する、第１の膜貫通受容体と、（ｂ）第２のリガンド結合ドメインおよび第２のシグナル伝達ドメインを含む第２の膜貫通受容体であって、第２のリガンドが第２のリガンド結合ドメインに結合すると、第２のシグナル伝達ドメインが細胞の第２のシグナル伝達経路を活性化する、第２の膜貫通受容体と、（ｃ）プロモーターの制御下に置かれた遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）をコードする核酸配列を含む発現カセットであって、ＧＭＰがアクチュエータ部分を含み、（ｉ）第１のリガンドが第１のリガンド結合ドメインに結合し、かつ／または（ｉｉ）第２のリガンドが第２のリガンド結合ドメインに結合すると、プロモーターが活性化されてＧＭＰの発現を駆動する、発現カセットとを含む。
【０１７６】
第１および第２の膜貫通受容体は、各々個々に内因性受容体、合成受容体、またはそのいずれかのバリアントを含みうる。第１および第２の膜貫通受容体の各々は、Ｎｏｔｃｈ受容体；Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）；インテグリン受容体；カドヘリン受容体；酵素活性を保有する受容体、および固有の酵素活性を保有するのではなく、非共有結合によって会合した酵素（例えば、キナーゼ）を刺激することによって作用する受容体を含む触媒受容体；腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーのメンバーなどの細胞死受容体；免疫受容体、例えばＴ細胞受容体（ＴＣＲ）；またはそのいずれかのバリアントを含みうる。一部の実施形態では、システムの膜貫通受容体は、ＧＰＣＲを含む。第１および第２の膜貫通受容体の各々は、外因性受容体、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、合成インテグリン受容体、合成Ｎｏｔｃｈ受容体、または合成ＧＰＣＲ受容体を含む合成受容体を含みうる。一部の例では、第１および第２の膜貫通受容体は、同じタイプの受容体（例えば、ともにＧＰＣＲ、合成ＧＰＣＲ、インテグリン、合成インテグリン等）でありうる。一部の例では、第１および第２の膜貫通受容体は、異なるタイプの受容体である。例えば、第１の受容体は、ＧＰＣＲを含みうるが、第２の受容体はＣＡＲを含む。さらなる例として、第１の受容体は、インテグリンサブユニットを含みうるが、第２の受容体はＮｏｔｃｈを含む。受容体の任意の所望の組合せを使用することができる。
【０１７７】
第１および第２の膜貫通受容体は、異なるリガンドに結合することができる。第１および第２の膜貫通受容体は、異なる親和性で異なるリガンドに結合することができる。一部の例では、第１および第２の膜貫通受容体は、類似の結合親和性で異なるリガンドに結合する。第１および第２の膜貫通受容体は、リガンドに結合すると、細胞の異なるシグナル伝達経路を活性化することができる。一部の例では、２つのシグナル伝達経路は重なり合う。一部の例では、２つのシグナル伝達経路は重なり合わない。
【０１７８】
一部の例では、第１および第２の膜貫通受容体のうちの少なくとも１つはＧＰＣＲを含む。一部の実施形態では、第１および第２の膜貫通受容体のうちの少なくとも１つはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。本明細書で既に記載したように、ＣＡＲのリガンド結合ドメイン（例えば、細胞外領域）は、Ｆａｂ、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、内因性受容体（例えば、ＧＰＣＲ、インテグリン受容体、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体等）の細胞外領域、またはＦｃ結合ドメインを含みうる。ＣＡＲは、受容体を細胞膜（例えば、細胞膜、オルガネラの膜等）に配置する膜貫通ドメインを含みうる。一部の実施形態では、ＣＡＲのシグナル伝達ドメイン（例えば、細胞内領域）は、免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲのシグナル伝達ドメイン（例えば、細胞内領域）は、免疫受容体抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、ＩＴＡＭモチーフおよびＩＴＩＭモチーフの両方を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、少なくとも１つの共刺激ドメインを含む。
【０１７９】
第１のリガンドが第１のリガンド結合ドメインに結合すると、第２のリガンドが第２のリガンド結合ドメインに結合すると、または両方のリガンド結合ドメインがリガンドに結合すると、受容体のシグナル伝達ドメインは、細胞の少なくとも１つのシグナル伝達経路を活性化することができる。シグナル伝達経路およびその関連タンパク質は、細胞応答（例えば翻訳の調節、転写の調節、ならびにメチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、リボシル化、およびシトルリン化の調節を含むエピジェネティック改変を介した遺伝子発現のプログラムされた変化）の調節（例えば、活性化および／または非活性化）に関与しうる。
【０１８０】
１つの膜貫通受容体を含むシステムにおいて記載されるように、シグナル伝達経路の活性化に応答した転写の調節を利用して、遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）を発現させることができる。ＧＭＰをコードする核酸配列またはＧＭＰコード配列を、リガンド受容体結合に応答して細胞において活性化される第１のシグナル伝達経路、第２のシグナル伝達経路、または第１および第２のシグナル伝達経路の両方に応答するプロモーターの制御下に置くことができる。
【０１８１】
一部の例では、プロモーターは、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると活性化される内因性プロモーターである（例えば、細胞のシグナル伝達経路の活性化）。一部の例では、プロモーターは、所望の発現レベルを駆動する内因性プロモーター配列の断片を含む。例えば、完全長の対応物と比較してサイズがより小さいが、それでもなおある特定の活性（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の活性）レベルを維持する最小プロモーターエレメントを使用することができる。
【０１８２】
一部の実施形態では、プロモーターは、インターロイキン２（ＩＬ−２）プロモーター配列、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）プロモーター配列、インターフェロン調節因子４（ＩＲＦ４）プロモーター配列、核内受容体サブファミリー４グループＡメンバー１（ＮＲ４Ａ１、神経成長因子ＩＢ（ＮＧＦＩＢ）としても公知）プロモーター配列、ＰＲドメインジンクフィンガータンパク質１（ＰＲＤＭ１）プロモーター配列、Ｔボックス転写因子（ＴＢＸ２１）プロモーター配列、ＣＤ６９プロモーター配列、ＣＤ２５プロモーター配列、またはグランザイムＢ（ＧＺＭＢ）プロモーター配列である。
【０１８３】
発現カセットは、内因性プロモーター配列に作動可能に連結されるＧＭＰコード配列を含みうる。一部の例では、発現カセットは、細胞ゲノムに組み込まれない。発現カセットは、非組込みプラスミドの一部として細胞に供給されうる。一部の例では、発現カセットは、細胞ゲノムに組み込まれる。組込みは、標的化されても標的化されなくてもよい（例えば、ランダム組込み）。一部の実施形態では、発現カセットは、レンチウイルスによって細胞ゲノムに組み込まれる。
【０１８４】
内因性遺伝子がＧＭＰコード配列の上流に位置する一部の例では、ＧＭＰコード配列と内因性遺伝子とは、ペプチドリンカーをコードする核酸配列によって結合されうる。ＧＭＰをコードする配列は、翻訳されたペプチド配列が適切なアミノ酸配列を有するように、内因性遺伝子にインフレームで結合されうる。一部の例では、リンカーは、切断認識部位、例えばプロテアーゼ認識部位を有し、内因性遺伝子によってコードされるタンパク質とＧＭＰとを、ペプチドリンカーの切断、例えばプロテアーゼ切断によって分離させることができる。一部の例では、リンカーは、「自己切断」セグメント、例えば２Ａペプチドを有する。例示的な２Ａペプチドは、Ｔ２Ａ（ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ）、Ｐ２Ａ（ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ）、Ｅ２Ａ（ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ）、およびＦ２Ａ（ＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ）を含む。
【０１８５】
内因性遺伝子がＧＭＰコード配列の上流に位置する一部の例では、ＧＭＰコード配列と内因性遺伝子とは、非コード性である核酸配列によって結合されうる。内因性遺伝子とＧＭＰコード配列とを結合する非コード核酸配列は、ｍＲＮＡの内部領域からの翻訳の開始を可能にする配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含みうる。
【０１８６】
一部の例では、プロモーターは、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると活性化される（例えば、細胞のシグナル伝達経路の活性化）外因性プロモーターである。外因性プロモーター配列は、細胞ゲノムに天然に見出されないプロモーター配列、例えば異なる種からのプロモーター配列を含む。外因性プロモーターは、いかなる生物においても天然に存在しない合成プロモーター配列を含みうる。一部の例では、外因性プロモーターは、内因性プロモーター配列、合成プロモーター配列、およびその組合せの複数のコピーを含みうる。
【０１８７】
一部の例では、プロモーターは、所望の発現レベルを駆動する合成プロモーター配列の断片を含む。例えば、完全長の対応物と比較してサイズがより小さいが、それでもなおある特定のレベルの活性（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の活性）を維持する最小プロモーターエレメントを使用することができる。
【０１８８】
発現カセットは、外因性プロモーターに作動可能に連結されたＧＭＰコード配列を含みうる。一部の例では、発現カセットは、細胞ゲノムに組み込まれる。一部の実施形態では、発現カセットは、レンチウイルスによって細胞ゲノムに組み込まれる。組込みは、標的化されても標的化されなくてもよい（例えば、ランダム組込み）。一部の例では、発現カセットは、細胞ゲノムに組み込まれない。発現カセットは、非組込みプラスミドの一部として細胞に供給されうる。
【０１８９】
得られた発現されたＧＭＰはアクチュエータ部分を含み、細胞における標的遺伝子の発現を調節することができる。アクチュエータ部分は、標的ポリヌクレオチドに結合して標的遺伝子の発現および／または活性を調節することができる。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドはゲノムＤＮＡを含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、プラスミドの領域、例えば外因性遺伝子を有するプラスミドの領域を含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドはＲＮＡ、例えばｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、内因性遺伝子または遺伝子産物を含む。
【０１９０】
アクチュエータ部分は、ヌクレアーゼ（例えば、ＤＮＡヌクレアーゼおよび／またはＲＮＡヌクレアーゼ）、ヌクレアーゼ欠損であるかもしくは野生型ヌクレアーゼと比較してヌクレアーゼ活性が低減された改変ヌクレアーゼ（例えば、ＤＮＡヌクレアーゼおよび／またはＲＮＡヌクレアーゼ）、またはそのバリアントを含みうる。アクチュエータ部分は、遺伝子の発現もしくは活性を調節する、および／または核酸（例えば、遺伝子および／または遺伝子産物）の配列を編集することができる。一部の実施形態では、アクチュエータ部分は、標的ＤＮＡ配列のゲノム編集を誘導するためにＤＮＡヌクレアーゼ、例えば操作された（例えば、プログラム可能なまたは標的化可能な）ＤＮＡヌクレアーゼを含む。一部の実施形態では、アクチュエータ部分は、標的ＲＮＡ配列の編集を誘導するためにＲＮＡヌクレアーゼ、例えば操作された（例えば、プログラム可能なまたは標的化可能な）ＲＮＡヌクレアーゼを含む。一部の実施形態では、アクチュエータ部分は、低減されたまたは最小のヌクレアーゼ活性を有する。低減されたまたは最小のヌクレアーゼ活性を有するアクチュエータ部分は、標的ポリヌクレオチドの物理的障害によって、または標的ポリヌクレオチドの発現を抑制もしくは増強するために有効な追加の因子の動員によって遺伝子の発現および／または活性を調節することができる。アクチュエータ部分は、標的ポリヌクレオチドを物理的に障害するか、または標的ポリヌクレオチドの発現を抑制もしくは増強するために有効な追加の因子を動員することができる。一部の実施形態では、アクチュエータ部分は、標的ポリヌクレオチドの発現を増加させるために有効な転写活性化因子を含む。一部の実施形態では、アクチュエータ部分は、標的ポリヌクレオチドの発現を減少させるために有効な転写抑制因子を含む。一部の実施形態では、アクチュエータ部分は、標的ＤＮＡ配列の転写活性化または抑制を誘導することができるＤＮＡヌクレアーゼに由来するヌクレアーゼヌルＤＮＡ結合タンパク質を含む。一部の実施形態では、アクチュエータ部分は、標的ＲＮＡ配列の転写活性化または抑制を誘導することができるＲＮＡヌクレアーゼに由来するヌクレアーゼヌルＲＮＡ結合タンパク質を含む。一部の実施形態では、アクチュエータ部分は、核酸誘導型アクチュエータ部分である。一部の実施形態では、アクチュエータ部分は、ＤＮＡ誘導型アクチュエータ部分である。一部の実施形態では、アクチュエータ部分は、ＲＮＡ誘導型アクチュエータ部分である。アクチュエータ部分は、遺伝子の発現もしくは活性を調節することができ、および／または外因性であるか内因性であるかによらず、核酸配列を編集することができる。
【０１９１】
任意の適したヌクレアーゼを２受容体システムにおいて使用することができる。適したヌクレアーゼには、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチド、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチド、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチド、ＩＶ型ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチド、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチド、およびＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチドを含むＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質またはＣａｓヌクレアーゼ；ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）；転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）；メガヌクレアーゼ；ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）；ＣＲＩＳＰＲ関連ＲＮＡ結合タンパク質；リコンビナーゼ；フリッパーゼ；トランスポサーゼ；アルゴノート（Ａｇｏ）タンパク質（例えば、原核細胞アルゴノート（ｐＡｇｏ）、古細菌アルゴノート（ａＡｇｏ）、および真核細胞アルゴノート（ｅＡｇｏ））；ならびにそのいずれかのバリアントが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１９２】
任意の標的遺伝子を、２受容体システムのＧＭＰによって調節することができる。本明細書に記載の遺伝子の遺伝的ホモログが含まれると企図される。例えば、遺伝子は、本明細書に開示の遺伝子に対してある特定の同一性および／または相同性を示しうる。したがって、５０％、５５％、６０％、６５％，７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の相同性（核酸レベルまたはタンパク質レベルで）を示すまたはこれらのおよその値の相同性を示す遺伝子の発現を調節することができると企図される。同様に、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性（核酸レベルまたはタンパク質レベルで）を示すまたはこれらのおよその値の同一性を示す遺伝子の発現を調節することができると企図される。
【０１９３】
一部の実施形態では、標的遺伝子は、サイトカインをコードする。サイトカインの非制限的な例には、４−１ＢＢＬ、アクチビンβＡ、アクチビンβＢ、アクチビンβＣ、アクチビンβＥ、アルテミン（ＡＲＴＮ）、ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ／ＴＮＦＳＦ１３８、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、骨形成タンパク質１（ＢＭＰ１）、ＣＣＬ１／ＴＣＡ３、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２／ＭＣＰ−５、ＣＣＬ１３／ＭＣＰ−４、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７／ＴＡＲＣ、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２／ＭＤＣ、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＣＬ３、ＣＣＬ３Ｌ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ４Ｌ１／ＬＡＧ−１、ＣＣＬ５、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９、ＣＤ１５３／ＣＤ３０Ｌ／ＴＮＦＳＦ８、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ１５４／ＴＮＦＳＦ５、ＣＤ４０ＬＧ、ＣＤ７０、ＣＤ７０／ＣＤ２７Ｌ／ＴＮＦＳＦ７、ＣＬＣＦ１、ｃ−ＭＰＬ／ＣＤ１１０／ＴＰＯＲ、ＣＮＴＦ、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ１７、ＣＸＣＬ２／ＭＩＰ−２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７／Ｐｐｂｐ、ＣＸＣＬ９、ＥＤＡ−Ａ１、ＦＡＭ１９Ａ１、ＦＡＭ１９Ａ２、ＦＡＭ１９Ａ３、ＦＡＭ１９Ａ４、ＦＡＭ１９Ａ５、Ｆａｓリガンド／ＦＡＳＬＧ／ＣＤ９５Ｌ／ＣＤ１７８、ＧＤＦ１０、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ１５、ＧＤＦ２、ＧＤＦ３、ＧＤＦ４、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、増殖分化因子１（ＧＤＦ１）、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１３、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５／ＩＦＮａＧ、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＢ１、ＩＦＮＥ、ＩＦＮＧ、ＩＦＮＺ、ＩＦＮω／ＩＦＮＷ１、ＩＬ１１、ＩＬ１８、ＩＬ１８ＢＰ、ＩＬ１Ａ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ１Ｆ１０、ＩＬ１Ｆ３／ＩＬ１ＲＡ、ＩＬ１Ｆ５、ＩＬ１Ｆ６、ＩＬ１Ｆ７、ＩＬ１Ｆ８、ＩＬ１Ｆ９、ＩＬ１ＲＬ２、ＩＬ３１、ＩＬ３３、ＩＬ６、ＩＬ８／ＣＸＣＬ８、インヒビン−Ａ、インヒビン−Ｂ、レプチン、ＬＩＦ、ＬＴＡ／ＴＮＦＢ／ＴＮＦＳＦ１、ＬＴＢ／ＴＮＦＣ、ニュールツリン（ＮＲＴＮ）、ＯＳＭ、ＯＸ−４０Ｌ／ＴＮＦＳＦ４／ＣＤ２５２、パーセフィン（ＰＳＰＮ）、ＲＡＮＫＬ／ＯＰＧＬ／ＴＮＦＳＦ１１（ＣＤ２５４）、ＴＬ１Ａ／ＴＮＦＳＦ１５、ＴＮＦＡ、ＴＮＦ−アルファ／ＴＮＦＡ、ＴＮＦＳＦ１０／ＴＲＡＩＬ／ＡＰＯ−２Ｌ（ＣＤ２５３）、ＴＮＦＳＦ１２、ＴＮＦＳＦ１３、ＴＮＦＳＦ１４／ＬＩＧＨＴ／ＣＤ２５８、ＸＣＬ１、およびＸＣＬ２が挙げられる。一部の実施形態では、標的遺伝子は、免疫チェックポイント阻害剤をコードする。そのような免疫チェックポイント阻害剤の非制限的な例には、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ−３、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＩＤＯ、ＫＩＲ、およびＶＩＳＴＡが挙げられる。一部の実施形態では、標的遺伝子��、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ、ベータ、ガンマ、および／またはデルタ鎖をコードする。
【０１９４】
細胞における標的遺伝子の発現の調節に加えて、２つの膜貫通受容体を含むシステムを利用して、細胞における２つの標的遺伝子の発現を調節することができる。一態様では、本開示は、２つの膜貫通受容体を含む細胞における２つの標的遺伝子の発現を調節するためのシステムを提供する。システムは、（ａ）第１のリガンド結合ドメインおよび第１のシグナル伝達ドメインを含む第１の膜貫通受容体であって、第１のリガンドが第１のリガンド結合ドメインに結合すると、第１のシグナル伝達ドメインが細胞の第１のシグナル伝達経路を活性化する、第１の膜貫通受容体と、（ｂ）第２のリガンド結合ドメインおよび第２のシグナル伝達ドメインを含む第２の膜貫通受容体であって、第２のリガンドが第２のリガンド結合ドメインに結合すると、第２のシグナル伝達ドメインが細胞の第２のシグナル伝達経路を活性化する、第２の膜貫通受容体と、（ｃ）第１の遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）をコードする核酸配列を含む第１の発現カセットであって、第１のＧＭＰが第１のアクチュエータ部分を含み、第１のリガンドが第１のリガンド結合ドメインに結合すると、第１のプロモーターが活性化されて第１のＧＭＰの発現を駆動する第１の発現カセットと、（ｄ）第２の遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）をコードする核酸配列を含む第２の発現カセットであって、第２のＧＭＰが第２のアクチュエータ部分を含み、第２のリガンドが第２のリガンド結合ドメインに結合すると、第２のプロモーターが活性化されて第２のＧＭＰの発現を駆動する、第２の発現カセットとを含み、（ｉ）第１のＧＭＰが第１の標的遺伝子の発現を調節し、および（ｉｉ）第２のＧＭＰが第２の標的遺伝子の発現を調節する。２つの膜貫通受容体および２つの発現カセットを含むシステムは、２つの標的遺伝子の直交性調節を可能にしうる。
【０１９５】
本明細書において既に記載したように、第１および第２の膜貫通受容体は、各々個々に内因性受容体、合成受容体、またはそのいずれかのバリアントを含みうる。第１および第２の膜貫通受容体の各々は、Ｎｏｔｃｈ受容体；Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）；Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）；インテグリン受容体；カドヘリン受容体；酵素活性を保有する受容体、および固有の酵素活性を保有するのではなく、非共有結合によって会合した酵素（例えば、キナーゼ）を刺激することによって作用する受容体を含む触媒受容体；腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーのメンバーなどの細胞死受容体；免疫受容体；またはそのいずれかのバリアントを含みうる。一部の実施形態では、システムの膜貫通受容体は、ＧＰＣＲを含む。第１および第２の膜貫通受容体の各々は、外因性受容体、例えばキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、合成インテグリン受容体、合成Ｎｏｔｃｈ受容体、または合成ＧＰＣＲ受容体を含む合成受容体を含みうる。一部の例では、第１および第２の膜貫通受容体は、同じタイプの受容体（例えば、ともにＧＰＣＲ、合成ＧＰＣＲ、インテグリン、合成インテグリン等）でありうる。一部の例では、第１および第２の膜貫通受容体は、異なるタイプの受容体である。例えば、第１の受容体は、ＧＰＣＲを含みうるが、第２の受容体はＣＡＲを含む。さらなる例として、第１の受容体は、インテグリンサブユニットを含みうるが、第２の受容体はＮｏｔｃｈを含む。受容体の任意の所望の組合せを使用することができる。
【０１９６】
第１および第２の膜貫通受容体は、異なるリガンドに結合することができる。第１および第２の膜貫通受容体は、リガンドに結合すると、細胞の異なるシグナル伝達経路を活性化することができる。一部の例では、２つのシグナル伝達経路は重なり合う。一部の例では、２つのシグナル伝達経路は重なり合わない。
【０１９７】
第１および第２のＧＭＰは、各々個々にヌクレアーゼを含むアクチュエータ部分を含みうる。適したヌクレアーゼには、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチド、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチド、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチド、ＩＶ型ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチド、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチド、およびＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチドを含むＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質またはＣａｓヌクレアーゼ；ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）；転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）；メガヌクレアーゼ；ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）；ＣＲＩＳＰＲ関連ＲＮＡ結合タンパク質；リコンビナーゼ；フリッパーゼ；トランスポサーゼ；アルゴノート（Ａｇｏ）タンパク質（例えば、原核細胞アルゴノート（ｐＡｇｏ）、古細菌アルゴノート（ａＡｇｏ）、および真核細胞アルゴノート（ｅＡｇｏ））；ならびにそのいずれかのバリアントが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１９８】
第１および第２のＧＭＰのアクチュエータ部分は、本明細書に開示の任意の適したアクチュエータ部分でありうる。一部の例では、第１および第２のＧＭＰのアクチュエータ部分は同じである。例えば、第１および第２のＧＭＰの両方が、Ｃａｓタンパク質、例えばＣａｓ９タンパク質を含む。一部の例では、第１および第２のＧＭＰの両方がＣｐｆ１を含む。しかし、第１および第２のＧＭＰのアクチュエータ部分は異なりうる。
【０１９９】
一部の実施形態では、第１の標的遺伝子および第２の標的遺伝子の両方が上方調節される。一部の実施形態では、第１の標的遺伝子および第２の標的遺伝子の両方が下方調節される。一部の実施形態では、第１の標的遺伝子が上方調節され、第２の標的遺伝子が下方調節される。一部の実施形態では、第１の標的遺伝子が下方調節され、第２の標的遺伝子が上方調節される。
【０２００】
一部の例では、アクチュエータ部分を２つまたはそれより多くの部分に分割することができる。アクチュエータ部分の２つまたはそれより多くの部分は、発現されると複合体を形成して機能的アクチュエータ部分を形成することができる。一部の例では、２つの膜貫通受容体を含むシステムを使用して、分割したアクチュエータ部分の２つの部分を発現させることができる。一態様では、本開示は、細胞における標的遺伝子の発現を調節するためのシステムであって、（ａ）第１のリガンド結合ドメインおよび第１のシグナル伝達ドメインを含む第１の膜貫通受容体であって、第１のリガンドが第１のリガンド結合ドメインに結合すると、第１のシグナル伝達ドメインが細胞の第１のシグナル伝達経路を活性化する、第１の膜貫通受容体と、（ｂ）第２のリガンド結合ドメインおよび第２のシグナル伝達ドメインを含む第２の膜貫通受容体であって、第２のリガンドが第２のリガンド結合ドメインに結合すると、第２のシグナル伝達ドメインが細胞の第２のシグナル伝達経路を活性化する、第２の膜貫通受容体と、（ｃ）第１のプロモーターの制御下に置かれた第１の部分的遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）をコードする核酸配列を含む第１の発現カセットであって、第１の部分的ＧＭＰがアクチュエータ部分の第１の部分を含み、第１のリガンドが第１のリガンド結合ドメインに結合すると、第１のプロモーターが活性化されて第１の部分的ＧＭＰの発現を駆動する第１の発現カセットと、（ｄ）第２のプロモーターの制御下に置かれた第２の部分的遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）をコードする核酸配列を含む第２の発現カセットであって、第２の部分的ＧＭＰがアクチュエータ部分の第２の部分を含み、第２のリガンドが第２のリガンド結合ドメインに結合すると、第２のプロモーターが活性化されて第２の部分的ＧＭＰの発現を駆動する、第２の発現カセットとを含み、アクチュエータ部分の第１および第２の部分が複合体を形成して、機能的アクチュエータ部分を含む再構成されたＧＭＰを形成し、再構成されたＧＭＰが標的遺伝子の発現を調節する、システムを提供する。
【０２０１】
本明細書に提供されるアクチュエータ部分の任意の１つを、２つまたはそれより多くの部分に分割することができる。アクチュエータ部分の分割位置は、例えば結晶構造データに基づいて当技術分野で通常の技術を使用して選択されうる。一部の例では、最適な分割位置は、タンパク質の異なる部分で分割されたアクチュエータ部分のライブラリを生成してスクリーニングすることによって決定される。これらの分割されたアクチュエータ部分を、２つまたはそれより多くの部分が再構成する能力、結合親和性の保持、結合特異性の保持、酵素活性等などの特徴に関してスクリーニングしてもよい。部分的アクチュエータ部分を生成する場合には、構造化されていない（ｕｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ）領域が分割位置として好ましい場合がある。
【０２０２】
２つまたはそれより多くの部分は、２つまたはそれより多くの部分が近位に存在する場合、自発的に複合体を形成することによって機能的アクチュエータ部分を再構成することができる。一部の例では、２つまたはそれより多くの部分の複合体形成は、二量体形成剤の助けを借りて起こる。
【０２０３】
分割したアクチュエータ部分の２つまたはそれより多くの部分を複合体形成することによって形成された機能的アクチュエータ部分は、非分割部分の活性の一部を保持しうる。例えば、アクチュエータ部分の２つまたはそれより多くの部分を含む機能的アクチュエータ部分は、非分割（単一部分）のアクチュエータ部分の活性の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％を有しうる。活性は、アクチュエータ部分の天然に存在する任意の特性、例えば結合親和性、結合特異性、酵素活性等を指しうる。活性は、標的ポリヌクレオチドを標的とするおよび／または結合する能力を含む。
【０２０４】
一部の例では、機能的アクチュエータ部分を含む再構成されたＧＭＰは、少なくとも２つの異なるＧＭＰの複合体でありうる。少なくとも２つの異なるＧＭＰが近位に存在する場合、少なくとも２つの異なるＧＭＰは、再構成されたＧＭＰへと自発的に複合体を形成することができる。一部の例では、少なくとも２つの異なるＧＭＰの再構成されたＧＭＰへの複合体形成は、複合体形成剤（例えば、オリゴヌクレオチド）の助けを借りて起こる。
【０２０５】
一部の例では、再構成されたＧＭＰの第１の部分的ＧＭＰは、第１のＧＭＰの少なくとも一部および／またはバリアントであり、再構成されたＧＭＰの第２の部分的ＧＭＰは、第２のＧＭＰの少なくとも一部および／またはバリアントであり、第１のＧＭＰおよび第２のＧＭＰは異なる。一部の例では、ガイドＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ）は、第１の部分的ＧＭＰおよび第２の部分的ＧＭＰと複合体を形成して、機能的アクチュエータ部分を含む再構成されたＧＭＰを形成しうる。第１の部分的ＧＭＰ、第２の部分的ＧＭＰ、およびガイドＲＮＡを含む複合体は、遺伝子モジュレーティングユニット（ＧＭＵ）でありうる。ガイドＲＮＡは、（ｉ）第１の部分的ＧＭＰの少なくとも１つの結合配列および（ｉｉ）第２の部分的ＧＭＰの少なくとも１つの結合配列を含みうる。ガイドＲＮＡは、（ｉ）第１の部分的ＧＭＰの少なくとも１、２、３、４、５個またはそれより多くの結合配列、および（ｉｉ）第２の部分的ＧＭＰの少なくとも１、２、３、４、５個またはそれより多くの結合配列を含みうる。このように、ガイドＲＮＡは、（ｉ）第１の部分的ＧＭＰの少なくとも１つ、および（ｉｉ）第２の部分的ＧＭＰの少なくとも１つと複合体を形成してＧＭＵを形成することができる。ガイドＲＮＡは、（ｉ）第１の部分的ＧＭＰの少なくとも１、２、３、４、５個またはそれより多く、および（ｉｉ）第２の部分的ＧＭＰの少なくとも１、２、３、４、５個またはそれより多くと複合体を形成して、ＧＭＵを形成することができる。
【０２０６】
一部の例では、第１の部分的ＧＭＰはＣａｓタンパク質である。Ｃａｓタンパク質を、変異させておよび／または改変して、ヌクレアーゼ欠損タンパク質、または野生型Ｃａｓタンパク質と比較して減少したヌクレアーゼ活性を有するタンパク質を生じることができる。一部の例では、第２の部分的ＧＭＰは、ＲＮＡ結合タンパク質および転写調節因子（例えば、活性化因子または抑制因子）を含む融合タンパク質である。融合タンパク質は、ＲＮＡ結合タンパク質と転写調節因子との間にペプチドリンカーを含みうる。一部の例では、融合タンパク質のＲＮＡ結合タンパク質は、ウイルスからのタンパク質の少なくとも一部（例えば、コートタンパク質）である。一部の例では、ウイルスはＲＮＡウイルスである。一部の例では、ＲＮＡウイルスは、ＲＮＡバクテリオファージである。ＲＮＡバクテリオファージの例には、ｆ２、ＭＳ２、Ｒ１７、ｆｒ、Ｍ１２、Ｑβ、およびＰＰ７が挙げられる。ＲＮＡバクテリオファージのタンパク質の例には、ＭＣＰ（ＭＳ２から）およびＰＣＰ（ＰＰ７から）が挙げられる。一部の例では、融合タンパク質のＲＮＡ結合タンパク質は、非ウイルスタンパク質の少なくとも一部である。一部の例では、非ウイルスタンパク質は、ＲＮＡ調節タンパク質である。一部の例では、非ウイルスタンパク質は、ＰＵＦタンパク質ファミリー（Ｐｕｍｉｌｉｏおよびｆｅｍ−３結合因子（ＦＢＦ））に由来する。ＰＵＦタンパク質の例には、野生型ＰＵＦ、ＰＵＦａ、ＰＵＦｂ、ＰＵＦｃ、ＰＵＦｗ、ＰＵＦ（３−２）、およびＰＵＦ（６−２／７−２）が挙げられる。
【０２０７】
標的遺伝子の発現を調節するための本明細書のシステムの一部の実施形態では、アクチュエータ部分は、標的ポリヌクレオチドに一時的に近づくことができない。例えば、アクチュエータ部分は、標的遺伝子に対応する標的ポリヌクレオチドの位置とは異なる細胞の位置に、アクチュエータ部分を隔離するペプチド局在化配列に連結されうる。一部の例では、アクチュエータ部分は、阻害性ペプチド配列またはアクチュエータ部分が標的ポリヌクレオチドに作用するのを防止する他の修飾に連結されうる。システムに存在する切断部分は、切断認識部位を切断して、ペプチド局在化配列または阻害性配列からアクチュエータ部分を放出することができ、このように、アクチュエータ部分が標的ポリヌクレオチドに作用することを可能する。
【０２０８】
一態様では、本開示は、細胞における標的遺伝子の発現を調節するためのシステムであって、リガンド結合ドメイン、シグナル伝達ドメイン、および遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）を含む膜貫通受容体であって、ＧＭＰが切断認識部位に連結されたアクチュエータ部分を含み、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、シグナル伝達ドメインが細胞のシグナル伝達経路を活性化する、膜貫通受容体と、切断部分をコードする核酸配列を含む発現カセットであって、核酸配列が、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、シグナル伝達経路によって活性化されて、切断部分の発現を駆動するプロモーターの制御下に置かれ、発現された切断部分が切断認識部位を切断してアクチュエータ部分を放出し、放出されたアクチュエータ部分が、標的ポリヌクレオチド、例えば標的遺伝子の発現を調節する、発現カセットとを含む、システムを提供する。一部の実施形態では、切断部分は、切断認識部位の近位に存在する場合、切断認識部位を切断する。一部の例では、膜貫通受容体は、Ｎ末端からＣ末端の順に、リガンド結合ドメイン、膜貫通領域、シグナル伝達ドメイン、切断認識部位、およびアクチュエータ部分を含む。リガンド結合ドメインは、細胞の細胞外領域に位置しうる。シグナル伝達ドメイン、切断認識部位、およびアクチュエータ部分は、細胞の細胞内領域に位置しうる。
【０２０９】
図６を参照して、膜貫通受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含みうる。キメラ膜貫通受容体は、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を含む細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通領域、細胞内領域にある少なくとも１つのシグナル伝達ドメイン、および遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）を有しうる。一部の例では、ＧＭＰは、切断認識配列（例えば、ＴＥＶ切断配列、ＴＣＳ）に連結されたアクチュエータ部分（例えば、ｄＣａｓ９）を含む。一部の例では、アクチュエータ部分は、転写活性化因子（例えば、ＶＰ６４−ｐ６５−Ｒｔａ（ＶＰＲ））または転写抑制因子（例えば、Ｋｒｕｅｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ））に連結されていてもよい。シグナル伝達ドメインは、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、細胞の固有のシグナル伝達経路を活性化することができる。シグナル伝達経路は、細胞に存在する発現カセットからの切断部分の発現を駆動することができる。一部の例では、切断部分はＴＥＶプロテアーゼである。発現されたＴＥＶプロテアーゼは、ＴＥＶ切断配列（ＴＣＳ）を切断し、受容体からアクチュエータ部分を放出することができる。１つまたは複数のガイド核酸（例えば、ｓｇＲＮＡ）がｄＣａｓ９と複合体を形成することができ、次に標的遺伝子の発現を調節することができる。図６は、非制限的な例のシステムを提供し、受容体、遺伝子モジュレーティングポリペプチド、アクチュエータ部分、切断部分、切断認識配列、発現カセット、プロモーター等の様々な組合せが本開示において企図される。例えば、一部の例では、膜貫通受容体はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含みうる。
【０２１０】
一態様では、本開示は、細胞における標的遺伝子の発現を調節するためのシステムであって、リガンド結合ドメイン、シグナル伝達ドメイン、および切断部分を含む膜貫通受容体であって、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、シグナル伝達ドメインが細胞のシグナル伝達経路を活性化する、膜貫通受容体と、核外輸送シグナルペプチドに連結された遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）を含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含む発現カセットであって、ＧＭＰが切断認識部位に連結されたアクチュエータ部分を含み、核酸配列が、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、シグナル伝達経路によって活性化されて融合タンパク質の発現を駆動するプロモーターの制御下に置かれる、発現カセットとを含み、切断部分が、融合タンパク質の切断認識部位を切断してアクチュエータ部分を放出し、放出されたアクチュエータ部分が標的ポリヌクレオチド、例えば標的遺伝子の発現を調節する、システムを提供する。一部の実施形態では、切断部分は、切断認識部位の近位に存在する場合、切断認識部位を切断する。一部の実施形態では、切断部分は、膜貫通受容体の細胞内領域に連結されている。一部の例では、膜貫通受容体は、Ｎ末端からＣ末端の順に、リガンド結合ドメイン、膜貫通領域、シグナル伝達ドメイン、および切断部分を含む。リガンド結合ドメインは、細胞の細胞外領域に位置しうる。シグナル伝達ドメインおよび切断部分は、細胞の細胞内領域に位置しうる。
【０２１１】
図７を参照して、膜貫通受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含みうる。キメラ膜貫通受容体は、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を含む細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通領域、細胞内領域における少なくとも１つのシグナル伝達ドメイン、および切断部分を有しうる。一部の例では、切断部分はＴＥＶプロテアーゼである。シグナル伝達ドメインは、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、細胞の固有のシグナル伝達経路を活性化することができる。シグナル伝達経路は、細胞に存在する発現カセットからの核外輸送シグナルペプチド（ＮＥＳ）に連結されたＧＭＰを含む融合ポリペプチドの発現を駆動することができる。ＧＭＰは、切断認識配列（例えば、ＴＥＶ切断配列、ＴＣＳ）に連結されたアクチュエータ部分、例えばｄＣａｓ９を含みうる。一部の例では、アクチュエータ部分を、転写活性化因子（例えば、ＶＰＲ）または転写抑制因子（例えば、ＫＲＡＢ）に連結することができる。ＴＥＶプロテアーゼは、ＴＥＶ切断配列（ＴＣＳ）を切断し、ＮＥＳからアクチュエータ部分を放出することができる。１つまたは複数のガイド核酸（例えば、ｓｇＲＮＡ）が、放出されたｄＣａｓ９と複合体を形成することができ、次いで標的遺伝子の発現を調節することができる。図７は、非制限的な例としてのシステムを提供し、受容体、遺伝子モジュレーティングポリペプチド、アクチュエータ部分、切断部分、切断認識配列、発現カセット、プロモーター等の様々な組合せが本開示で企図される。例えば、一部の例では、膜貫通受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を含みうる。
【０２１２】
一部の態様では、本開示は、細胞における標的遺伝子の発現を調節するためのシステムであって、リガンド結合ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む膜貫通受容体であって、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、シグナル伝達ドメインが細胞のシグナル伝達経路を活性化する、膜貫通受容体と、切断部分をコードする核酸配列を含む発現カセットであって、核酸配列が、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、シグナル伝達経路によって活性化されて切断部分の発現を駆動するプロモーターの制御下に置かれる、発現カセットとを含み、発現された切断部分が、核外輸送シグナルペプチドに連結された遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）を含む融合タンパク質の切断認識部位を切断し、ＧＭＰが切断認識部位に連結されたアクチュエータ部分を含む、システムを提供する。切断認識部位の切断は、アクチュエータ部分を放出することができ、放出されたアクチュエータ部分は、標的ポリヌクレオチド、例えば標的遺伝子の発現を調節することができる。一部の実施形態では、切断部分は、切断認識部位の近位に存在する場合、切断認識部位を切断する。一部の実施形態では、システムは、核外輸送シグナルペプチドに連結されたＧＭＰを含む融合タンパク質を含む。一部の例では、膜貫通受容体は、Ｎ末端からＣ末端の順に、リガンド結合ドメイン、膜貫通領域、およびシグナル伝達ドメインを含む。リガンド結合ドメインは、細胞の細胞外領域に位置しうる。シグナル伝達ドメインは、細胞の細胞内領域に位置しうる。一部の例では、核外輸送シグナルペプチドは、そのＣ末端で切断認識部位に連結され、次に、そのＣ末端でアクチュエータ部分に連結されている。
【０２１３】
図８を参照して、膜貫通受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含みうる。キメラ膜貫通受容体は、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を含む細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通領域、および細胞内領域にある少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを有しうる。シグナル伝達ドメインは、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると細胞の固有のシグナル伝達経路を活性化することができる。シグナル伝達経路は、細胞に存在する発現カセットからの切断部分の発現を駆動することができる。一部の例では、切断部分は、ＴＥＶプロテアーゼである。核外輸送シグナルペプチド（ＮＥＳ）に連結されたＧＭＰを含む融合ポリペプチドもまた、システムに存在しうる。ＧＭＰは、切断認識配列（例えば、ＴＥＶ切断配列、ＴＣＳ）に連結されたアクチュエータ部分、例えばｄＣａｓ９を含みうる。一部の例では、アクチュエータ部分は、転写活性化因子（例えば、ＶＰＲ）または転写抑制因子（例えば、ＫＲＡＢ）に連結されうる。発現されたＴＥＶプロテアーゼは、ＴＥＶ切断配列（ＴＣＳ）を切断し、ＮＥＳからアクチュエータ部分を放出することができる。１つまたは複数のガイド核酸（例えば、ｓｇＲＮＡ）は、ｄＣａｓ９と複合体を形成し、これが次に標的遺伝子の発現を調節することができる。図８は、非制限的な例としてのシステムを提供し、受容体、遺伝子モジュレーティングポリペプチド、アクチュエータ部分、切断部分、切断認識配列、発現カセット、プロモーター等の様々な組合せが本開示において企図される。例えば、一部の例では、膜貫通受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を含みうる。
【０２１４】
一態様では、本開示は、細胞における標的遺伝子の発現を調節するためのシステムであって、リガンド結合ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む膜貫通受容体であって、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、シグナル伝達ドメインが細胞のシグナル伝達経路を活性化する、膜貫通受容体と、核外輸送シグナルペプチドに連結された遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）を含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含む発現カセットであって、ＧＭＰが、切断認識配列に連結されたアクチュエータ部分を含み、核酸配列が、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、シグナル伝達経路によって活性化されて融合タンパク質の発現を駆動するプロモーターの制御下に置かれる、発現カセットとを含み、切断認識部位での切断部分による切断を介してアクチュエータ部分が放出されると、放出されたアクチュエータ部分が標的ポリヌクレオチド、例えば標的遺伝子の発現を調節する、システムを提供する。一部の実施形態では、切断部分は、切断認識部位の近位に存在する場合、切断認識部位を切断する。一部の実施形態では、システムは切断部分を含む。一部の例では、膜貫通受容体は、Ｎ末端からＣ末端の順に、リガンド結合ドメイン、膜貫通領域、およびシグナル伝達ドメインを含む。リガンド結合ドメインは、細胞の細胞外領域に位置しうる。シグナル伝達ドメインは、細胞の細胞内領域に位置しうる。一部の例では、核外輸送シグナルペプチドは、そのＣ末端で切断認識部位に連結され、次に、そのＣ末端でアクチュエータ部分に連結されている。
【０２１５】
図９を参照して、膜貫通受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含みうる。キメラ膜貫通受容体は、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を含む細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通領域、および細胞内領域にある少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを有しうる。シグナル伝達ドメインは、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、細胞の固有のシグナル伝達経路を活性化することができる。シグナル伝達経路は、細胞に存在する発現カセットからの、核外輸送シグナルペプチド（ＮＥＳ）に連結されたＧＭＰを含む融合ポリペプチドの発現を駆動することができる。ＧＭＰは、切断認識配列（例えば、ＴＥＶ切断配列、ＴＣＳ）に連結されたアクチュエータ部分、例えばｄＣａｓ９を含みうる。アクチュエータ部分は、一部の例では、転写活性化因子（例えば、ＶＰＲ）または転写抑制因子（例えば、ＫＲＡＢ）に連結されうる。切断部分、例えばＴＥＶプロテアーゼもまたシステムに存在しうる。ＴＥＶプロテアーゼは、ＴＥＶ切断配列（ＴＣＳ）を切断して、ＮＥＳからアクチュエータ部分を放出することができる。１つまたは複数のガイド核酸（例えば、ｓｇＲＮＡ）は、ｄＣａｓ９と複合体を形成することができ、次にこれが標的遺伝子の発現を調節することができる。図９は、非制限的な例としてのシステムを提供し、受容体、遺伝子モジュレーティングポリペプチド、アクチュエータ部分、切断部分、切断認識配列、発現カセット、プロモーター等の様々な組合せが本開示において企図される。例えば、一部の例では、膜貫通受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を含みうる。
【０２１６】
一態様では、本開示は、細胞における標的遺伝子の発現を調節するためのシステムであって、リガンド結合ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む膜貫通受容体であって、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、シグナル伝達ドメインが、細胞のシグナル伝達経路を活性化する、膜貫通受容体と、核外輸送シグナルペプチドに連結された遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）を含む融合タンパク質をコードする第１の核酸配列を含む第１の発現カセットであって、ＧＭＰが切断認識配列に連結されたアクチュエータ部分を含み、第１の核酸配列が、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、シグナル伝達経路によって活性化されて融合タンパク質の発現を駆動する第１のプロモーターの制御下に置かれる、第１の発現カセットと、切断部分をコードする核酸配列を含む第２の発現カセットであって、第２の核酸配列が、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、シグナル伝達経路によって活性化されて切断部分の発現を駆動する第２のプロモーターの制御下に置かれる、第２の発現カセットとを含み、発現された切断部分が切断認識部位を切断してアクチュエータ部分を放出し、放出されたアクチュエータ部分が、標的ポリヌクレオチド、例えば標的遺伝子の発現を調節する、システムを提供する。一部の実施形態では、切断部分は、切断認識部位の近位に存在する場合、切断認識部位を切断する。一部の例では、膜貫通受容体は、Ｎ末端からＣ末端の順に、リガンド結合ドメイン、膜貫通領域、およびシグナル伝達ドメインを含む。リガンド結合ドメインは、細胞の細胞外領域に位置しうる。シグナル伝達ドメインは、細胞の細胞内領域に位置しうる。一部の例では、核外輸送シグナルペプチドは、そのＣ末端で切断認識部位に連結され、次にそのＣ末端でアクチュエータ部分に連結されている。
【０２１７】
図１０を参照して、膜貫通受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含みうる。キメラ膜貫通受容体は、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を含む細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通領域、および細胞内領域にある少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを有しうる。シグナル伝達ドメインは、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、細胞の固有のシグナル伝達経路を活性化することができる。シグナル伝達経路は、細胞に存在する発現カセットからの、核外輸送シグナルペプチド（ＮＥＳ）に連結されたＧＭＰを含む融合ポリペプチドの発現を駆動することができる。一部の例では、ＧＭＰは、切断認識配列（例えば、ＴＥＶ切断配列、ＴＣＳ）に連結されたアクチュエータ部分、例えばｄＣａｓ９を含む。一部の例では、アクチュエータ部分は、転写活性化因子（例えば、ＶＰＲ）または転写抑制因子（例えば、ＫＲＡＢ）に連結されうる。シグナル伝達経路は、細胞に存在する発現カセットからの切断部分の発現を駆動することができる。切断部分はＴＥＶプロテアーゼでありうる。融合ポリペプチドおよび切断部分は、同じまたは異なる発現カセットに存在しうる。ＴＥＶプロテアーゼは、ＴＥＶ切断配列（ＴＣＳ）を切断し、ＮＥＳからアクチュエータ部分を放出することができる。１つまたは複数のガイド核酸（例えば、ｓｇＲＮＡ）は、ｄＣａｓ９と複合体を形成することができ、これは次に標的遺伝子の発現を調節することができる。図１０は、非制限的な例としてのシステムを提供し、受容体、遺伝子モジュレーティングポリペプチド、アクチュエータ部分、切断部分、切断認識配列、発現カセット、プロモーター等の様々な組合せが本開示において企図される。例えば、一部の例では、膜貫通受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を含みうる。
【０２１８】
一態様では、本開示は、細胞における標的遺伝子の発現を調節するためのシステムであって、リガンド結合ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む膜貫通受容体であって、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、シグナル伝達ドメインが細胞のシグナル伝達経路を活性化する、膜貫通受容体と、第１の部分的遺伝子モジュレーティング（ＧＭＰ）をコードする第１の核酸配列を含む第１の発現カセットであって、第１の部分的ＧＭＰがアクチュエータ部分の第１の部分を含み、第１の核酸配列が、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、シグナル伝達経路によって活性化されて第１の部分的ＧＭＰの発現を駆動する第１のプロモーターの制御下に置かれる、第１の発現カセットと、第２の部分的遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）をコードする第２の核酸配列を含む第２の発現カセットであって、第２の部分的ＧＭＰがアクチュエータ部分の第２の部分を含み、第２の核酸配列が、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、シグナル伝達経路によって活性化されて第２の部分的ＧＭＰの発現を駆動する第２のプロモーターの制御下に置かれる、第２の発現カセットとを含み、第１の部分的ＧＭＰおよび第２の部分的ＧＭＰが複合体を形成して、再構成されたアクチュエータ部分を形成し、再構成されたアクチュエータ部分が標的遺伝子の発現を調節する、システムを提供する。一部の例では、膜貫通受容体は、Ｎ末端からＣ末端の順に、リガンド結合ドメイン、膜貫通領域、およびシグナル伝達ドメインを含む。リガンド結合ドメインは、細胞の細胞外領域に位置しうる。シグナル伝達ドメインは、細胞の細胞内領域に位置しうる。
【０２１９】
一態様では、本開示は、細胞における標的遺伝子の発現を調節するためのシステムであって、リガンド結合ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む膜貫通受容体であって、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、シグナル伝達ドメインが細胞のシグナル伝達経路を活性化する、膜貫通受容体と、第１の部分的切断部分をコードする第１の核酸配列を含む第１の発現カセットであって、第１の核酸配列が、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、シグナル伝達経路によって活性化されて第１の部分的切断部分の発現を駆動する第１のプロモーターの制御下に置かれる、第１の発現カセットと、第２の部分的切断部分をコードする第２の核酸配列を含む第２の発現カセットであって、第２の核酸配列が、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、シグナル伝達経路によって活性化されて第２の部分的切断部分の発現を駆動する第２のプロモーターの制御下に置かれる、第２の発現カセットとを含み、第１の部分的切断部分および第２の部分的切断部分が複合体を形成して、再構成された切断部分を形成し、再構成された切断部分によって切断認識部位で切断されると、核外輸送シグナルペプチドからアクチュエータ部分を放出し、アクチュエータ部分が標的ポリヌクレオチド、例えば標的遺伝子の発現を調節する、システムを提供する。一部の実施形態では、システムは、切断認識部位を介してアクチュエータ部分に連結された核外輸送シグナルペプチドを含む融合ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、切断部分は、切断認識部位の近位に存在する場合、切断認識部位を切断する。一部の例では、膜貫通受容体は、Ｎ末端からＣ末端の順に、リガンド結合ドメイン、膜貫通領域、およびシグナル伝達ドメインを含む。リガンド結合ドメインは、細胞の細胞外領域に位置しうる。シグナル伝達ドメインは、細胞の細胞内領域に位置しうる。一部の例では、核外輸送シグナルペプチドは、そのＣ末端で切断認識部位に連結され、次にそのＣ末端でアクチュエータ部分に連結されている。
【０２２０】
一態様では、本開示は、細胞における標的遺伝子の発現を調節するためのシステムであって、リガンド結合ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む膜貫通受容体であって、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、シグナル伝達ドメインが細胞のシグナル伝達経路を活性化する、膜貫通受容体と、（ｉ）切断部分および（ｉｉ）核外輸送シグナルペプチドに連結された遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）を含む融合タンパク質のうちの一方または両方をコードする核酸を含む発現カセットであって、ＧＭＰが、切断認識部位に連結されたアクチュエータ部分を含み、切断部分および融合タンパク質のうちの一方または両方の発現が、リガンドがリガンド結合に結合すると、シグナル伝達経路によって活性化されるプロモーターによって駆動される発現カセットとを含み、切断部分によって切断認識部位が切断されると、アクチュエータ部分が放出され、放出されたＧＭＰが標的ポリヌクレオチドの発現を調節する、システムを提供する。
【０２２１】
本明細書に記載の実施形態のアクチュエータ部分は、任意の適したアクチュエータ部分でありえ、その非制限的な例を本明細書に提供する。本明細書に記載の態様の様々な実施形態では、アクチュエータ部分は、ポリヌクレオチド誘導型エンドヌクレアーゼでありうる。エンドヌクレアーゼは、野生型タンパク質またはその変異体でありうる。その変異体は、野生型タンパク質と比較して異なる特性を有することができ、例えば、変異体は、減少したヌクレアーゼ活性を有しうる。一部の例では、ポリヌクレオチド誘導型エンドヌクレアーゼは、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼであり、システムはガイドＲＮＡをさらに含む。
【０２２２】
本明細書に記載の態様の様々な実施形態では、膜貫通受容体は、内因性受容体を含む。内因性受容体の非制限的な例には、Ｎｏｔｃｈ受容体；Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）；インテグリン受容体；カドヘリン受容体；酵素活性を保有する受容体、および固有の酵素活性を保有するのではなく、非共有結合によって会合した酵素（例えば、キナーゼ）を刺激することによって作用する受容体を含む触媒受容体；腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーのメンバーなどの細胞死受容体；ならびに免疫受容体、例えばＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が挙げられる。
【０２２３】
本明細書に記載の態様の様々な実施形態では、膜貫通受容体は、外因性受容体を含む。一部の例では、外因性受容体は、異なる生物または種の受容体である。一部の例では、外因性受容体は、細胞において天然に見出されない合成受容体を含みうる。一部の実施形態では、合成膜貫通受容体は、異なる分子（例えば、異なるタンパク質、相同なタンパク質、オルトログタンパク質等）からの複数のドメイン（例えば、細胞外、膜貫通、細胞内等）を結合させることによって構築されるキメラ受容体である。
【０２２４】
本発明のシステムのキメラ膜貫通体は、内因性受容体、またはそのいずれかのバリアントを含みうる。キメラ膜貫通受容体は、例えばリガンド結合ドメインを介して、少なくとも１つのリガンドに特異的に結合することができる。リガンド結合ドメインは、一般的に、膜貫通受容体の細胞外領域の一部を形成し、細胞外リガンドを感知することができる。リガンド結合に応答して、キメラ膜貫通受容体の細胞内領域は、細胞のシグナル伝達経路を活性化することができる。一部の例では、受容体のシグナル伝達ドメインは、細胞のシグナル伝達経路を活性化する。
【０２２５】
一部の実施形態では、膜貫通受容体は、Ｎｏｔｃｈ受容体、またはそのいずれかのバリアント（例えば、合成またはキメラ受容体）を含む。Ｎｏｔｃｈ受容体は、細胞−細胞接触シグナル伝達を媒介し、発生および細胞−細胞伝達、例えば２つの接触する細胞（受信細胞および送信細胞）間の伝達に関する他の態様において中心的な役割を果たす膜貫通タンパク質である。受信細胞において発現されるＮｏｔｃｈ受容体は、送信細胞上で発現されるそのリガンド（デルタファミリータンパク質）を認識する。これらの接触細胞におけるｎｏｔｃｈおよびデルタの係合によって、ｎｏｔｃｈ受容体の２段階タンパク質分解が起こり、最終的に、膜からの受容体の細胞内部分の細胞質への放出を引き起こす。
【０２２６】
一部の実施形態では、膜貫通受容体は、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、およびＮｏｔｃｈ４、そのいずれかのホモログ、およびそのいずれかのバリアントから選択されるＮｏｔｃｈ受容体を含む。一部の実施形態では、キメラ受容体は、Ｎｏｔｃｈ受容体またはそのいずれかのバリアントの少なくとも１つの細胞外領域（例えば、リガンド結合ドメイン）を含む。一部の実施形態では、キメラ受容体は、Ｎｏｔｃｈまたはそのいずれかのバリアントの少なくとも１つの膜貫通領域を含む。一部の実施形態では、キメラ受容体は、Ｎｏｔｃｈまたはそのいずれかのバリアントの少なくとも１つの細胞内領域（例えば、細胞質ドメイン）を含む。Ｎｏｔｃｈまたはそのいずれかのバリアントを含むキメラ受容体ポリペプチドは、Ｎｏｔｃｈリガンドに結合することができる。一部の実施形態では、Ｎｏｔｃｈまたはそのいずれかのバリアントを含むキメラ受容体にリガンドが結合すると、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の活性化をもたらす。
【０２２７】
一部の実施形態では、膜貫通受容体は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、またはそのいずれかのバリアント（例えば、合成またはキメラ受容体）を含む。ＧＰＣＲは、一般的に７回膜貫通αヘリックスによって特徴付けられ、バレルに類似する三次構造で配置することができ、７回膜貫通ヘリックスが、細胞膜内で腔を形成し、これがリガンド結合ドメインとしての役目を果たす。リガンドはまた、他の場所で、ＧＰＣＲ、例えば細胞外ループおよび／またはＮ末端テールに結合することもできる。リガンドが結合すると、関連するＧタンパク質を活性化し、次にこれが様々なシグナル伝達経路において機能する。このシグナル伝達を非活性化するために、ＧＰＣＲを最初にリン酸化によって化学修飾することができる。次に、リン酸化が、更なるシグナル伝達のために共アダプタータンパク質（例えば、アレスチンタンパク質）を動員することができる。
【０２２８】
一部の実施形態では、膜貫通受容体は、クラスＡオーファン；クラスＢオーファン；クラスＣオーファン；味覚受容体、１型；味覚受容体、２型；５−ヒドロキシトリプタミン受容体；アセチルコリン受容体（ムスカリン性）；アデノシン受容体；接着クラスＧＰＣＲ；アドレノセプター；アンジオテンシン受容体；アペリン受容体；胆汁酸受容体；ボンベシン受容体；ブラジキニン受容体；カルシトニン受容体；カルシウム感知受容体；カンナビノイド受容体；ケメリン受容体；ケモカイン受容体；コレシストキニン受容体；クラスＦｒｉｚｚｌｅｄＧＰＣＲ（例えば、Ｗｎｔ受容体）；補体ペプチド受容体；コルチコトロピン放出因子受容体；ドーパミン受容体；エンドセリン受容体；Ｇタンパク質共役エストロゲン受容体；ホルミルペプチド受容体；遊離脂肪酸受容体；ＧＡＢＡＢ受容体；ガラニン受容体；グレリン受容体；グルカゴン受容体ファミリー；糖タンパク質ホルモン受容体；性腺刺激ホルモン放出ホルモン受容体；ＧＰＲ１８、ＧＰＲ５５およびＧＰＲ１１９；ヒスタミン受容体；ヒドロキシカルボン酸受容体；キスペプチン受容体；ロイコトリエン受容体；リゾリン脂質（ＬＰＡ）受容体；リゾリン脂質（Ｓ１Ｐ）受容体；メラニン凝集ホルモン受容体；メラノコルチン受容体；メラトニン受容体；代謝型グルタミン酸受容体；モチリン受容体；ニューロメジンＵ受容体；ニューロペプチドＦＦ／ニューロペプチドＡＦ受容体；ニューロペプチドＳ受容体；ニューロペプチドＷ／ニューロペプチドＢ受容体；ニューロペプチドＹ受容体；ニューロテンシン受容体；オピオイド受容体；オレキシン受容体；オキソグルタル酸受容体；Ｐ２Ｙ受容体；副甲状腺ホルモン受容体；血小板活性化因子受容体；プロキネチシン（ｐｒｏｋｉｎｅｔｉｃｉｎ）受容体；プロラクチン放出ペプチド受容体；プロスタノイド受容体；プロテイナーゼ活性化受容体；ＱＲＦＰ受容体；リラキシンファミリーペプチド受容体；ソマトスタチン受容体；コハク酸受容体；タキキニン受容体；サイロトロピン放出ホルモン受容体；微量アミン受容体；ウロテンシン受容体；バソプレシンおよびオキシトシン受容体；ＶＩＰおよびＰＡＣＡＰ受容体から選択されるＧＰＣＲを含む。
【０２２９】
一部の実施形態では、膜貫通受容体は、５−ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体１Ａ（ＨＴＲ１Ａ）、５−ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体１Ｂ（ＨＴＲ１Ｂ）、５−ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体１Ｄ（ＨＴＲ１Ｄ）、５−ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体１Ｅ（ＨＴＲ１Ｅ）、５−ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体１Ｆ（ＨＴＲ１Ｆ）、５−ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体２Ａ（ＨＴＲ２Ａ）、５−ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体２Ｂ（ＨＴＲ２Ｂ）、５−ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体２Ｃ（ＨＴＲ２Ｃ）、５−ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体４（ＨＴＲ４）、５−ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体５Ａ（ＨＴＲ５Ａ）、５−ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体５Ｂ（ＨＴＲ５ＢＰ）、５−ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体６（ＨＴＲ６）、５−ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体７、アデニル酸シクラーゼ共役（ＨＴＲ７）、コリン作動性受容体、ムスカリン性１（ＣＨＲＭ１）、コリン作動性受容体、ムスカリン性２（ＣＨＲＭ２）、コリン作動性受容体、ムスカリン性３（ＣＨＲＭ３）、コリン作動性受容体、ムスカリン性４（ＣＨＲＭ４）、コリン作動性受容体、ムスカリン性５（ＣＨＲＭ５）、アデノシンＡ１受容体（ＡＤＯＲＡ１）、アデノシンＡ２ａ受容体（ＡＤＯＲＡ２Ａ）、アデノシンＡ２ｂ受容体（ＡＤＯＲＡ２Ｂ）、アデノシンＡ３受容体（ＡＤＯＲＡ３）、接着Ｇタンパク質共役受容体Ａ１（ＡＤＧＲＡ１）、接着Ｇタンパク質共役受容体Ａ２（ＡＤＧＲＡ２）、接着Ｇタンパク質共役受容体Ａ３（ＡＤＧＲＡ３）、接着Ｇタンパク質共役受容体Ｂ１（ＡＤＧＲＢ１）、接着Ｇタンパク質共役受容体Ｂ２（ＡＤＧＲＢ２）、接着Ｇタンパク質共役受容体Ｂ３（ＡＤＧＲＢ３）、カドヘリンＥＧＦ型ＬＡＧ７回膜貫通Ｇ型受容体１（ＣＥＬＳＲ１）、カドヘリンＥＧＦ型ＬＡＧ７回膜貫通Ｇ型受容体２（ＣＥＬＳＲ２）、カドヘリンＥＧＦ型ＬＡＧ７回膜貫通Ｇ型受容体３（ＣＥＬＳＲ３）、接着Ｇタンパク質共役受容体Ｄ１（ＡＤＧＲＤ１）、接着Ｇタンパク質共役受容体Ｄ２（ＡＤＧＲＤ２）、接着Ｇタンパク質共役受容体Ｅ１（ＡＤＧＲＥ１）、接着Ｇタンパク質共役受容体Ｅ２（ＡＤＧＲＥ２）、接着Ｇタンパク質共役受容体Ｅ３（ＡＤＧＲＥ３）、接着Ｇタンパク質共役受容体Ｅ４（ＡＤＧＲＥ４Ｐ）、接着Ｇタンパク質共役受容体Ｅ５（ＡＤＧＲＥ５）、接着Ｇタンパク質共役受容体Ｆ１（ＡＤＧＲＦ１）、接着Ｇタンパク質共役受容体Ｆ２（ＡＤＧＲＦ２）、接着Ｇタンパク質共役受容体Ｆ３（ＡＤＧＲＦ３）、接着Ｇタンパク質共役受容体Ｆ４（ＡＤＧＲＦ４）、接着Ｇタンパク質共役受容体Ｆ５（ＡＤＧＲＦ５）、接着Ｇタンパク質共役受容体Ｇ１（ＡＤＧＲＧ１）、接着Ｇタンパク質共役受容体Ｇ２（ＡＤＧＲＧ２）、接着Ｇタンパク質共役受容体Ｇ３（ＡＤＧＲＧ３）、接着Ｇタンパク質共役受容体Ｇ４（ＡＤＧＲＧ４）、接着Ｇタンパク質共役受容体Ｇ５（ＡＤＧＲＧ５）、接着Ｇタンパク質共役受容体Ｇ６（ＡＤＧＲＧ６）、接着Ｇタンパク質共役受容体Ｇ７（ＡＤＧＲＧ７）、接着Ｇタンパク質共役受容体Ｌ１（ＡＤＧＲＬ１）、接着Ｇタンパク質共役受容体Ｌ２（ＡＤＧＲＬ２）、接着Ｇタンパク質共役受容体Ｌ３（ＡＤＧＲＬ３）、接着Ｇタンパク質共役受容体Ｌ４（ＡＤＧＲＬ４）、接着Ｇタンパク質共役受容体Ｖ１（ＡＤＧＲＶ１）、アドレノセプターアルファ１Ａ（ＡＤＲＡ１Ａ）、アドレノセプターアルファ１Ｂ（ＡＤＲＡ１Ｂ）、アドレノセプターアルファ１Ｄ（ＡＤＲＡ１Ｄ）、アドレノセプターアルファ２Ａ（ＡＤＲＡ２Ａ）、アドレノセプターアルファ２Ｂ（ＡＤＲＡ２Ｂ）、アドレノセプターアルファ２Ｃ（ＡＤＲＡ２Ｃ）、アドレノセプターベータ１（ＡＤＲＢ１）、アドレノセプターベータ２（ＡＤＲＢ２）、アドレノセプターベータ３（ＡＤＲＢ３）、アンジオテンシンＩＩ受容体タイプ１（ＡＧＴＲ１）、アンジオテンシンＩＩ受容体タイプ２（ＡＧＴＲ２）、アペリン受容体（ＡＰＬＮＲ）、Ｇタンパク質共役胆汁酸受容体１（ＧＰＢＡＲ１）、ニューロメジンＢ受容体（ＮＭＢＲ）、ガストリン放出ペプチド受容体（ＧＲＰＲ）、ボンベシン様受容体３（ＢＲＳ３）、ブラジキニン受容体Ｂ１（ＢＤＫＲＢ１）、ブラジキニン受容体Ｂ２（ＢＤＫＲＢ２）、カルシトニン受容体（ＣＡＬＣＲ）、カルシトニン受容体様受容体（ＣＡＬＣＲＬ）、カルシウム感知受容体（ＣＡＳＲ）、Ｇタンパク質共役受容体、クラスＣ（ＧＰＲＣ６Ａ）、カンナビノイド受容体１（脳）（ＣＮＲ１）、カンナビノイド受容体２（ＣＮＲ２）、ケメリンケモカイン様受容体１（ＣＭＫＬＲ１）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体１（ＣＣＲ１）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体２（ＣＣＲ２）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体３（ＣＣＲ３）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体４（ＣＣＲ４）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体５（遺伝子／偽遺伝子）（ＣＣＲ５）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体６（ＣＣＲ６）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体７（ＣＣＲ７）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体８（ＣＣＲ８）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体９（ＣＣＲ９）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体１０（ＣＣＲ１０）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体１（ＣＸＣＲ１）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体２（ＣＸＣＲ２）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体３（ＣＸＣＲ３）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体４（ＣＸＣＲ４）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体５（ＣＸＣＲ５）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体６（ＣＸＣＲ６）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ３−Ｃモチーフ）受容体１（ＣＸ３ＣＲ１）、ケモカイン（Ｃモチーフ）受容体１（ＸＣＲ１）、異型ケモカイン受容体１（ダッフィ血液型）（ＡＣＫＲ１）、異型ケモカイン受容体２（ＡＣＫＲ２）、異型ケモカイン受容体３（ＡＣＫＲ３）、異型ケモカイン受容体４（ＡＣＫＲ４）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体様  ２（ＣＣＲＬ２）、コレシストキニンＡ受容体（ＣＣＫＡＲ）、コレシストキニンＢ受容体（ＣＣＫＢＲ）、Ｇタンパク質共役受容体１（ＧＰＲ１）、ボンベシン様受容体３（ＢＲＳ３）、Ｇタンパク質共役受容体３（ＧＰＲ３）、Ｇタンパク質共役受容体４（ＧＰＲ４）、Ｇタンパク質共役受容体６（ＧＰＲ６���、Ｇタンパク質共役受容体１２（ＧＰＲ１２）、Ｇタンパク質共役受容体１５（ＧＰＲ１５）、Ｇタンパク質共役受容体１７（ＧＰＲ１７）、Ｇタンパク質共役受容体１８（ＧＰＲ１８）、Ｇタンパク質共役受容体１９（ＧＰＲ１９）、Ｇタンパク質共役受容体２０（ＧＰＲ２０）、Ｇタンパク質共役受容体２１（ＧＰＲ２１）、Ｇタンパク質共役受容体２２（ＧＰＲ２２）、Ｇタンパク質共役受容体２５（ＧＰＲ２５）、Ｇタンパク質共役受容体２６（ＧＰＲ２６）、Ｇタンパク質共役受容体２７（ＧＰＲ２７）、Ｇタンパク質共役受容体３１（ＧＰＲ３１）、Ｇタンパク質共役受容体３２（ＧＰＲ３２）、Ｇタンパク質共役受容体３３（遺伝子／偽遺伝子）（ＧＰＲ３３）、Ｇタンパク質共役受容体３４（ＧＰＲ３４）、Ｇタンパク質共役受容体３５（ＧＰＲ３５）、Ｇタンパク質共役受容体３７（エンドセリン受容体タイプＢ様）（ＧＰＲ３７）、Ｇタンパク質共役受容体３７様１（ＧＰＲ３７Ｌ１）、Ｇタンパク質共役受容体３９（ＧＰＲ３９）、Ｇタンパク質共役受容体４２（遺伝子／偽遺伝子）（ＧＰＲ４２）、Ｇタンパク質共役受容体４５（ＧＰＲ４５）、Ｇタンパク質共役受容体５０（ＧＰＲ５０）、Ｇタンパク質共役受容体５２（ＧＰＲ５２）、Ｇタンパク質共役受容体５５（ＧＰＲ５５）、Ｇタンパク質共役受容体６１（ＧＰＲ６１）、Ｇタンパク質共役受容体６２（ＧＰＲ６２）、Ｇタンパク質共役受容体６３（ＧＰＲ６３）、Ｇタンパク質共役受容体６５（ＧＰＲ６５）、Ｇタンパク質共役受容体６８（ＧＰＲ６８）、Ｇタンパク質共役受容体７５（ＧＰＲ７５）、Ｇタンパク質共役受容体７８（ＧＰＲ７８）、Ｇタンパク質共役受容体７９（ＧＰＲ７９）、Ｇタンパク質共役受容体８２（ＧＰＲ８２）、Ｇタンパク質共役受容体８３（ＧＰＲ８３）、Ｇタンパク質共役受容体８４（ＧＰＲ８４）、Ｇタンパク質共役受容体８５（ＧＰＲ８５）、Ｇタンパク質共役受容体８７（ＧＰＲ８７）、Ｇタンパク質共役受容体８８（ＧＰＲ８８）、Ｇタンパク質共役受容体１０１（ＧＰＲ１０１）、Ｇタンパク質共役受容体１１９（ＧＰＲ１１９）、Ｇタンパク質共役受容体１３２（ＧＰＲ１３２）、Ｇタンパク質共役受容体１３５（ＧＰＲ１３５）、Ｇタンパク質共役受容体１３９（ＧＰＲ１３９）、Ｇタンパク質共役受容体１４１（ＧＰＲ１４１）、Ｇタンパク質共役受容体１４２（ＧＰＲ１４２）、Ｇタンパク質共役受容体１４６（ＧＰＲ１４６）、Ｇタンパク質共役受容体１４８（ＧＰＲ１４８）、Ｇタンパク質共役受容体１４９（ＧＰＲ１４９）、Ｇタンパク質共役受容体１５０（ＧＰＲ１５０）、Ｇタンパク質共役受容体１５１（ＧＰＲ１５１）、Ｇタンパク質共役受容体１５２（ＧＰＲ１５２）、Ｇタンパク質共役受容体１５３（ＧＰＲ１５３）、Ｇタンパク質共役受容体１６０（ＧＰＲ１６０）、Ｇタンパク質共役受容体１６１（ＧＰＲ１６１）、Ｇタンパク質共役受容体１６２（ＧＰＲ１６２）、Ｇタンパク質共役受容体１７１（ＧＰＲ１７１）、Ｇタンパク質共役受容体１７３（ＧＰＲ１７３）、Ｇタンパク質共役受容体１７４（ＧＰＲ１７４）、Ｇタンパク質共役受容体１７６（ＧＰＲ１７６）、Ｇタンパク質共役受容体１８２（ＧＰＲ１８２）、Ｇタンパク質共役受容体１８３（ＧＰＲ１���３）、ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役受容体４（ＬＧＲ４）、ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役受容体５（ＬＧＲ５）、ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役受容体６（ＬＧＲ６）、ＭＡＳ１癌原遺伝子（ＭＡＳ１）、ＭＡＳ１癌原遺伝子様（ＭＡＳ１Ｌ）、ＭＡＳ関連ＧＰＲファミリーメンバーＤ（ＭＲＧＰＲＤ）、ＭＡＳ関連ＧＰＲファミリーメンバーＥ（ＭＲＧＰＲＥ）、ＭＡＳ関連ＧＰＲファミリーメンバーＦ（ＭＲＧＰＲＦ）、ＭＡＳ関連ＧＰＲファミリーメンバーＧ（ＭＲＧＰＲＧ）、ＭＡＳ関連ＧＰＲファミリーメンバーＸ１（ＭＲＧＰＲＸ１）、ＭＡＳ関連ＧＰＲファミリーメンバーＸ２（ＭＲＧＰＲＸ２）、ＭＡＳ関連ＧＰＲファミリーメンバーＸ３（ＭＲＧＰＲＸ３）、ＭＡＳ関連ＧＰＲファミリーメンバーＸ４（ＭＲＧＰＲＸ４）、オプシン３（ＯＰＮ３）、オプシン４（ＯＰＮ４）、オプシン５（ＯＰＮ５）、プリン作動性受容体Ｐ２Ｙ（Ｐ２ＲＹ８）、プリン作動性受容体Ｐ２Ｙ（Ｐ２ＲＹ１０）、微量アミン関連受容体２（ＴＡＡＲ２）、微量アミン関連受容体３（遺伝子／偽遺伝子）（ＴＡＡＲ３）、微量アミン関連受容体４（ＴＡＡＲ４Ｐ）、微量アミン関連受容体５（ＴＡＡＲ５）、微量アミン関連受容体６（ＴＡＡＲ６）、微量アミン関連受容体８（ＴＡＡＲ８）、微量アミン関連受容体９（遺伝子／偽遺伝子）（ＴＡＡＲ９）、Ｇタンパク質共役受容体１５６（ＧＰＲ１５６）、Ｇタンパク質共役受容体１５８（ＧＰＲ１５８）、Ｇタンパク質共役受容体１７９（ＧＰＲ１７９）、Ｇタンパク質共役受容体、クラスＣ（ＧＰＲＣ５Ａ）、Ｇタンパク質共役受容体、クラスＣ（ＧＰＲＣ５Ｂ）、Ｇタンパク質共役受容体、クラスＣ（ＧＰＲＣ５Ｃ）、Ｇタンパク質共役受容体、クラスＣ（ＧＰＲＣ５Ｄ）、ｆｒｉｚｚｌｅｄクラス受容体１（ＦＺＤ１）、ｆｒｉｚｚｌｅｄクラス受容体２（ＦＺＤ２）、ｆｒｉｚｚｌｅｄクラス受容体３（ＦＺＤ３）、ｆｒｉｚｚｌｅｄクラス受容体４（ＦＺＤ４）、ｆｒｉｚｚｌｅｄクラス受容体５（ＦＺＤ５）、ｆｒｉｚｚｌｅｄクラス受容体６（ＦＺＤ６）、ｆｒｉｚｚｌｅｄクラス受容体７（ＦＺＤ７）、ｆｒｉｚｚｌｅｄクラス受容体８（ＦＺＤ８）、ｆｒｉｚｚｌｅｄクラス受容体９（ＦＺＤ９）、ｆｒｉｚｚｌｅｄクラス受容体１０（ＦＺＤ１０）、スムーズンド、ｆｒｉｚｚｌｅｄクラス受容体（ＳＭＯ）、補体成分３ａ受容体１（Ｃ３ＡＲ１）、
補体成分５ａ受容体１（Ｃ５ＡＲ１）、補体成分５ａ受容体２（Ｃ５ＡＲ２）、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン受容体１（ＣＲＨＲ１）、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン受容体２（ＣＲＨＲ２）、ドーパミン受容体Ｄ１（ＤＲＤ１）、ドーパミン受容体Ｄ２（ＤＲＤ２）、ドーパミン受容体Ｄ３（ＤＲＤ３）、ドーパミン受容体Ｄ４（ＤＲＤ４）、ドーパミン受容体Ｄ５（ＤＲＤ５）、エンドセリン受容体タイプＡ（ＥＤＮＲＡ）、エンドセリン受容体タイプＢ（ＥＤＮＲＢ）、ホルミルペプチド受容体１（ＦＰＲ１）、ホルミルペプチド受容体２（ＦＰＲ２）、ホルミルペプチド受容体３（ＦＰＲ３）、遊離脂肪酸受容体１（ＦＦＡＲ１）、遊離脂肪酸受容体２（ＦＦＡＲ２）、遊離脂肪酸受容体３（ＦＦＡＲ３）、遊離脂肪酸受容体４（ＦＦＡＲ４）、Ｇタンパク質共役受容体４２（遺伝子／偽遺伝子）（ＧＰＲ４２）、ガンマ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）Ｂ受容体、１（ＧＡＢＢＲ１）、ガンマ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）Ｂ受容体、２（ＧＡＢＢＲ２）、ガラニン受容体１（ＧＡＬＲ１）、ガラニン受容体２（ＧＡＬＲ２）、ガラニン受容体３（ＧＡＬＲ３）、成長ホルモン分泌促進物質受容体（ＧＨＳＲ）、成長ホルモン放出ホルモン受容体（ＧＨＲＨＲ）、胃酸分泌抑制ポリペプチド受容体（ＧＩＰＲ）、グルカゴン様ペプチド１受容体（ＧＬＰ１Ｒ）、グルカゴン様ペプチド２受容体（ＧＬＰ２Ｒ）、グルカゴン受容体（ＧＣＧＲ）、セクレチン受容体（ＳＣＴＲ）、卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）、黄体形成ホルモン／絨毛性ゴナドトロピン受容体（ＬＨＣＧＲ）、甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）、ゴナドトロピン放出ホルモン受容体（ＧＮＲＨＲ）、ゴナドトロピン放出ホルモン受容体２（偽遺伝子）（ＧＮＲＨＲ２）、Ｇタンパク質共役受容体１８（ＧＰＲ１８）、Ｇタンパク質共役受容体５５（ＧＰＲ５５）、Ｇタンパク質共役受容体１１９（ＧＰＲ１１９）、Ｇタンパク質共役エストロゲン受容体１（ＧＰＥＲ１）、ヒスタミン受容体Ｈ１（ＨＲＨ１）、ヒスタミン受容体Ｈ２（ＨＲＨ２）、ヒスタミン受容体Ｈ３（ＨＲＨ３）、ヒスタミン受容体Ｈ４（ＨＲＨ４）、ヒドロキシカルボン酸受容体１（ＨＣＡＲ１）、ヒドロキシカルボン酸受容体２（ＨＣＡＲ２）、ヒドロキシカルボン酸受容体３（ＨＣＡＲ３）、ＫＩＳＳ１受容体（ＫＩＳＳ１Ｒ）、ロイコトリエンＢ４受容体（ＬＴＢ４Ｒ）、ロイコトリエンＢ４受容体２（ＬＴＢ４Ｒ２）、システイニルロイコトリエン受容体１（ＣＹＳＬＴＲ１）、システイニルロイコトリエン受容体２（ＣＹＳＬＴＲ２）、オキソエイコサノイド（ＯＸＥ）受容体１（ＯＸＥＲ１）、ホルミルペプチド受容体２（ＦＰＲ２）、リゾホスファチジン酸受容体１（ＬＰＡＲ１）、リゾホスファチジン酸受容体２（ＬＰＡＲ２）、リゾホスファチジン酸受容体３（ＬＰＡＲ３）、リゾホスファチジン酸受容体４（ＬＰＡＲ４）、リゾホスファチジン酸受容体５（ＬＰＡＲ５）、リゾホスファチジン酸受容体６（ＬＰＡＲ６）、スフィンゴシン−１−リン酸受容体１（Ｓ１ＰＲ１）、スフィンゴシン−１−リン酸受容体２（Ｓ１ＰＲ２）、スフィンゴシン−１−リン酸受容体３（Ｓ１ＰＲ３）、スフィンゴシン−１−リン酸受容体４（Ｓ１ＰＲ４）、スフィンゴシン−１−リン酸受容体５（Ｓ１ＰＲ５）、メラニン凝集ホルモン受容体１（ＭＣＨＲ１）、メラニン凝集ホルモン受容体２（ＭＣＨＲ２）、メラノコルチン１受容体（アルファメラノサイト刺激ホルモン受容体）（ＭＣ１Ｒ）、メラノコルチン２受容体（副腎皮質刺激ホルモン）（ＭＣ２Ｒ）、メラノコルチン３受容体（ＭＣ３Ｒ）、メラノコルチン４受容体（ＭＣ４Ｒ）、メラノコルチン５受容体（ＭＣ５Ｒ）、メラトニン受容体１Ａ（ＭＴＮＲ１Ａ）、メラトニン受容体１Ｂ（ＭＴＮＲ１Ｂ）、グルタミン酸受容体、代謝型１（ＧＲＭ１）、グルタミン酸受容体、代謝型２（ＧＲＭ２）、グルタミン酸受容体、代謝型３（ＧＲＭ３）、グルタミン酸受容体、代謝型４（ＧＲＭ４）、グルタミン酸受容体、代謝型５（ＧＲＭ５）、グルタミン酸受容体、代謝型６（ＧＲＭ６）、グルタミン酸受容体、代謝型７（ＧＲＭ７）、グルタミン酸受容体、代謝型８（ＧＲＭ８）、モチリン受容体（ＭＬＮＲ）、ニューロメジンＵ受容体１（ＮＭＵＲ１）、ニューロメジンＵ受容体２（ＮＭＵＲ２）、ニューロペプチドＦＦ受容体１（ＮＰＦＦＲ１）、ニューロペプチドＦＦ受容体２（ＮＰＦＦＲ２）、ニューロペプチドＳ受容体１（ＮＰＳＲ１）、ニューロペプチドＢ／Ｗ受容体１（ＮＰＢＷＲ１）、ニューロペプチドＢ／Ｗ受容体２（ＮＰＢＷＲ２）、ニューロペプチドＹ受容体Ｙ１（ＮＰＹ１Ｒ）、ニューロペプチドＹ受容体Ｙ２（ＮＰＹ２Ｒ）、ニューロペプチドＹ受容体Ｙ４（ＮＰＹ４Ｒ）、ニューロペプチドＹ受容体Ｙ５（ＮＰＹ５Ｒ）、ニューロペプチドＹ受容体Ｙ６（偽遺伝子）（ＮＰＹ６Ｒ）、ニューロテンシン受容体１（高親和性）（ＮＴＳＲ１）、ニューロテンシン受容体２（ＮＴＳＲ２）、オピオイド受容体、デルタ１（ＯＰＲＤ１）、オピオイド受容体、カッパ１（ＯＰＲＫ１）、オピオイド受容体、ミュー１（ＯＰＲＭ１）、オピエート受容体様１（ＯＰＲＬ１）、ヒポクレチン（オレキシン）受容体１（ＨＣＲＴＲ１）、ヒポクレチン（オレキシン）受容体２（ＨＣＲＴＲ２）、Ｇタンパク質共役受容体１０７（ＧＰＲ１０７）、Ｇタンパク質共役受容体１３７（ＧＰＲ１３７）、嗅覚受容体ファミリー５１サブファミリーＥメンバー１（ＯＲ５１Ｅ１）、膜貫通タンパク質、脂肪細胞関連１（ＴＰＲＡ１）、Ｇタンパク質共役受容体１４３（ＧＰＲ１４３）、Ｇタンパク質共役受容体１５７（ＧＰＲ１５７）、オキソグルタル酸（アルファ−ケトグルタル酸）受容体１（ＯＸＧＲ１）、プリン作動性受容体Ｐ２Ｙ（Ｐ２ＲＹ１）、プリン作動性受容体Ｐ２Ｙ（Ｐ２ＲＹ２）、ピリミジン作動性受容体Ｐ２Ｙ（Ｐ２ＲＹ４）、ピリミジン作動性受容体Ｐ２Ｙ（Ｐ２ＲＹ６）、プリン作動性受容体Ｐ２Ｙ（Ｐ２ＲＹ１１）、プリン作動性受容体Ｐ２Ｙ（Ｐ２ＲＹ１２）、プリン作動性受容体Ｐ２Ｙ（Ｐ２ＲＹ１３）、プリン作動性受容体Ｐ２Ｙ（Ｐ２ＲＹ１４）、副甲状腺ホルモン１受容体（ＰＴＨ１Ｒ）、副甲状腺ホルモン２受容体（ＰＴＨ２Ｒ）、血小板活性化因子受容体（ＰＴＡＦＲ）、プロキネチシン受容体１（ＰＲＯＫＲ１）、プロキネチシン受容体２（ＰＲＯＫＲ２）、プロラクチン放出ホルモン受容体（ＰＲＬＨＲ）、プロスタグランジンＤ２受容体（ＤＰ）（ＰＴＧＤＲ）、プロスタグランジンＤ２受容体２（ＰＴＧＤＲ２）、プロスタグランジンＥ受容体１（ＰＴＧＥＲ１）、プロスタグランジンＥ受容体２（ＰＴＧＥＲ２）、プロスタグランジンＥ受容体３（ＰＴＧＥＲ３）、プロスタグランジンＥ受容体４（ＰＴＧＥＲ４）、プロスタグランジンＦ受容体（ＰＴＧＦＲ）、プロスタグランジンＩ２（プロスタサイクリン）受容体（ＩＰ）（ＰＴＧＩＲ）、トロンボキサンＡ２受容体（ＴＢＸＡ２Ｒ）、凝固因子ＩＩトロンビン受容体（Ｆ２Ｒ）、Ｆ２Ｒ様トリプシン受容体１（Ｆ２ＲＬ１）、凝固因子ＩＩトロンビン受容体様２（Ｆ２ＲＬ２）、Ｆ２Ｒ様トロンビン／トリプシン受容体３（Ｆ２ＲＬ３）、ピログルタミル化ＲＦアミドペプチド受容体（ＱＲＦＰＲ）、リラキシン／インスリン様ファミリーペプチド受容体１（ＲＸＦＰ１）、リラキシン／インスリン様ファミリーペプチド受容体２（ＲＸＦＰ２）、リラキシン／インスリン様ファミリーペプチド受容体３（ＲＸＦＰ３）、リラキシン／インスリン様ファミリーペプチド受容体４（ＲＸＦＰ４）、ソマトスタチン受容体１（ＳＳＴＲ１）、ソマトスタチン受容体２（ＳＳＴＲ２）、ソマトスタチン受容体３（ＳＳＴＲ３）、ソマトスタチン受容体４（ＳＳＴＲ４）、ソマトスタチン受容体５（ＳＳＴＲ５）、コハク酸受容体１（ＳＵＣＮＲ１）、タキキニン受容体１（ＴＡＣＲ１）、タキキニン受容体２（ＴＡＣＲ２）、タキキニン受容体３（ＴＡＣＲ３）、味覚１受容体メンバー１（ＴＡＳ１Ｒ１）、味覚１受容体メンバー２（ＴＡＳ１Ｒ２）、味覚１受容体メンバー３（ＴＡＳ１Ｒ３）、味覚２受容体メンバー１（ＴＡＳ２Ｒ１）、味覚２受容体メンバー３（ＴＡＳ２Ｒ３）、味覚２受容体メンバー４（ＴＡＳ２Ｒ４）、味覚２受容体メンバー５（ＴＡＳ２Ｒ５）、味覚２受容体メンバー７（ＴＡＳ２Ｒ７）、味覚２受容体メンバー８（ＴＡＳ２Ｒ８）、味覚２受容体メンバー９（ＴＡＳ２Ｒ９）、味覚２受容体メンバー１０（ＴＡＳ２Ｒ１０）、味覚２受容体メンバー１３（ＴＡＳ２Ｒ１３）、味覚２受容体メンバー１４（ＴＡＳ２Ｒ１４）、味覚２受容体メンバー１６（ＴＡＳ２Ｒ１６）、味覚２受容体メンバー１９（ＴＡＳ２Ｒ１９）、味覚２受容体メンバー２０（ＴＡＳ２Ｒ２０）、味覚２受容体メンバー３０（ＴＡＳ２Ｒ３０）、味覚２受容体メンバー３１（ＴＡＳ２Ｒ３１）、味覚２受容体メンバー３８（ＴＡＳ２Ｒ３８）、味覚２受容体メンバー３９（ＴＡＳ２Ｒ３９）、味覚２受容体メンバー４０（ＴＡＳ２Ｒ４０）、味覚２受容体メンバー４１（ＴＡＳ２Ｒ４１）、味覚２受容体メンバー４２（ＴＡＳ２Ｒ４２）、味覚２受容体メンバー４３（ＴＡＳ２Ｒ４３）、味覚２受容体メンバー４５（ＴＡＳ２Ｒ４５）、味覚２受容体メンバー４６（ＴＡＳ２Ｒ４６）、味覚２受容体メンバー５０（ＴＡＳ２Ｒ５０）、味覚２受容体メンバー６０（ＴＡＳ２Ｒ６０）、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン受容体（ＴＲＨＲ）、微量アミン関連受容体１（ＴＡＡＲ１）、ウロテンシン２受容体（ＵＴＳ２Ｒ）、アルギニンバソプレシン受容体１Ａ（ＡＶＰＲ１Ａ）、アルギニンバソプレシン受容体１Ｂ（ＡＶＰＲ１Ｂ）、アルギニンバソプレシン受容体２（ＡＶＰＲ２）、オキシトシン受容体（ＯＸＴＲ）、アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド１（下垂体）受容体Ｉ型（ＡＤＣＹＡＰ１Ｒ１）、血管作動性腸管ペプチド受容体１（ＶＩＰＲ１）、血管作動性腸管ペプチド受容体２（ＶＩＰＲ２）、ならびにそのいずれかのバリアントからなる群より選択されるＧＰＣＲを含む。
【０２３０】
一部の実施形態では、キメラ受容体は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、またはそのいずれかのバリアントを含む。一部の実施形態では、キメラ受容体は、ＧＰＣＲまたはそのいずれかのバリアントの少なくとも１つの細胞外領域（例えば、リガンド結合ドメイン）を含む。一部の実施形態では、キメラ受容体は、ＧＰＣＲまたはそのいずれかのバリアントの少なくとも１つの膜貫通領域を含む。一部の実施形態では、キメラ受容体は、ＧＰＣＲまたはそのいずれかのバリアントの少なくとも１つの細胞内領域（例えば、細胞質ドメイン）を含む。ＧＰＣＲまたはそのいずれかのバリアントを含むキメラ受容体は、ＧＰＣＲリガンドに結合することができる。一部の実施形態では、ＧＰＣＲまたはそのいずれかのバリアントを含むキメラ受容体にリガンドが結合すると、ＧＰＣＲシグナル伝達経路の活性化をもたらす。
【０２３１】
一部の実施形態では、膜貫通受容体は、インテグリン受容体、インテグリン受容体サブユニット、またはそのいずれかのバリアント（例えば、合成またはキメラ受容体）を含む。インテグリン受容体は、細胞−細胞および細胞−細胞外マトリクス（ＥＣＭ）相互作用の架橋として機能することができる膜貫通受容体である。インテグリン受容体は、一般的に、非共有結合により会合するαサブユニットおよびβサブユニットからなるヘテロ二量体として形成される。少なくとも１８種のαサブユニットおよび少なくとも８種のβサブユニットが存在する。各々のサブユニットは一般的に、細胞外領域（例えば、リガンド結合ドメイン）、膜貫通領域、および細胞内領域（例えば、細胞質ドメイン）を含む。
【０２３２】
一部の実施形態では、膜貫通受容体は、α１、α２、α３、α４、α５、α６、α７、α８、α９、α１０、α１１、αＶ、αＬ、αＭ、αＸ、αＤ、αＥ、およびαＩＩｂからなる群より選択されるインテグリン受容体αサブユニットまたはそのいずれかのバリアントを含む。一部の実施形態では、膜貫通受容体は、β１、β２、β３、β４、β５、β６、β７、およびβ８からなる群より選択されるインテグリン受容体βサブユニットまたはそのいずれかのバリアントを含む。αサブユニット、βサブユニット、またはそのいずれかのバリアントを含む本発明のシステムの膜貫通受容体は、ヘテロ二量体を形成して（例えば、αサブユニットがβサブユニットと二量体を形成する）、インテグリン受容体、またはそのいずれかのバリアントを形成することができる。インテグリン受容体の非制限的な例には、α１β１、α２β１、α３β１、α４β１、α５β１、α６β１、α７β１、α８β１、α９β１、α１０β１、αＶβ１、αＬβ１、αＭβ１、αＸβ１、αＤβ１、αＩＩｂβ１、αＥβ１、α１β２、α２β２、α３β２、α４β２、α５β２、α６β２、α７β２、α８β２、α９β２、α１０β２、αＶβ２、αＬβ２、αＭβ２、αＸβ２、αＤβ２、αＩＩｂβ２、αＥβ２、α１β３、α２β３、α３β３、α４β３、α５β３、α６β３、α７β３、α８β３、α９β３、α１０β３、αＶβ３、αＬβ３、αＭβ３、αＸβ３、αＤβ３、αＩＩｂβ３、αＥβ３、α１β４、α２β４、α３β４、α４β４、α５β４、α６β４、α７β４、α８β４、α９β４、α１０β４、αＶβ４、αＬβ４、αＭβ４、αＸβ４、αＤβ４、αＩＩｂβ４、αＥβ４、α１β５、α２β５、α３β５、α４β５、α５β５、α６β５、α７β５、α８β５、α９β５、α１０β５、αＶβ５、αＬβ５、αＭβ５、αＸβ５、αＤβ５、αＩＩｂβ５、αＥβ５、α１β６、α２β６、α３β６、α４β６、α５β６、α６β６、α７β６、α８β６、α９β６、α１０β６、αＶβ６、αＬβ６、αＭβ６、αＸβ６、αＤβ６、αＩＩｂβ６、αＥβ６、α１β７、α２β７、α３β７、α４β７、α５β７、α６β７、α７β７、α８β７、α９β７、α１０β７、αＶβ７、αＬβ７、αＭβ７、αＸβ７、αＤβ７、αＩＩｂβ７、αＥβ７、α１β８、α２β８、α３β８、α４β８、α５β８、α６β８、α７β８、α８β８、α９β８、α１０β８、αＶβ８、αＬβ８、αＭβ８、αＸβ８、αＤβ８、αＩＩｂβ８、およびαＥβ８受容体が挙げられる。
【０２３３】
一部の実施形態では、キメラ受容体は、インテグリンサブユニット（例えば、αサブユニットまたはβサブユニット）、またはそのいずれかのバリアントの少なくとも１つの細胞外領域（例えば、リガンド結合ドメイン）を含む。一部の実施形態では、キメラ受容体は、インテグリンサブユニット（例えば、αサブユニットまたはβサブユニット）、またはそのいずれかのバリアントの少なくとも１つの膜貫通領域を含む。一部の実施形態では、キメラ受容体は、インテグリンサブユニット（例えば、αサブユニットまたはβサブユニット）、またはそのいずれかのバリアントの少なくとも１つの細胞内領域（例えば、細胞質ドメイン）を含む。インテグリンサブユニットまたはそのいずれかのバリアントを含むキメラ受容体は、インテグリンリガンドに結合することができる。一部の実施形態では、インテグリンサブユニットまたはそのいずれかのバリアントを含むキメラ受容体にリガンドが結合すると、インテグリンシグナル伝達経路の活性化をもたらす。
【０２３４】
一部の実施形態では、膜貫通受容体は、カドヘリン分子またはそのいずれかのバリアント（例えば、合成またはキメラ受容体）を含む。リガンドおよび受容体の両方として機能することができるカドヘリン分子は、細胞接着の媒介に関与するある特定のタンパク質を指す。カドヘリン分子は、一般的に、５個のタンデム反復細胞外ドメイン、１つの膜貫通セグメント、および細胞質領域からなる。Ｅ−カドヘリンまたはＣＤＨ１は、例えば細胞外ドメインにおける５個の反復配列、１つの膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインからなる。Ｅ−カドヘリンが、細胞内ドメインの領域でリン酸化されると、アダプタータンパク質、例えばベータ−カテニンおよびｐ１２０−カテニンが受容体に結合することができる。
【０２３５】
一部の実施形態では、膜貫通受容体は、古典的カドヘリン、デスモソームカドヘリン、プロトカドヘリン、および非定型カドヘリン（ｕｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  ｃａｄｈｅｒｉｎ）から選択される、カドヘリンまたはそのいずれかのバリアントを含む。一部の実施形態では、膜貫通受容体は、ＣＤＨ１（Ｅ−カドヘリン、上皮）、ＣＤＨ２（Ｎ−カドヘリン、神経）、ＣＤＨ１２（カドヘリン１２、タイプ２、Ｎ−カドヘリン２）、およびＣＤＨ３（Ｐ−カドヘリン、胎盤）から選択される古典的カドヘリンまたはそのいずれかのバリアントを含む。一部の実施形態では、膜貫通受容体は、デスモグレイン（ＤＳＧ１、ＤＳＧ２、ＤＳＧ３、ＤＳＧ４）およびデスモコリン（ＤＳＣ１、ＤＳＣ２、ＤＳＣ３）から選択されるデスモソームカドヘリン、またはそのいずれかのバリアントを含む。一部の実施形態では、膜貫通受容体は、ＰＣＤＨ１、ＰＣＤＨ１０、ＰＣＤＨ１１Ｘ、ＰＣＤＨ１１Ｙ、ＰＣＤＨ１２、ＰＣＤＨ１５、ＰＣＤＨ１７、ＰＣＤＨ１８、ＰＣＤＨ１９、ＰＣＤＨ２０、ＰＣＤＨ７、ＰＣＤＨ８、ＰＣＤＨ９、ＰＣＤＨＡ１、ＰＣＤＨＡ１０、ＰＣＤＨＡ１１、ＰＣＤＨＡ１２、ＰＣＤＨＡ１３、ＰＣＤＨＡ２、ＰＣＤＨＡ３、ＰＣＤＨＡ４、ＰＣＤＨＡ５、ＰＣＤＨＡ６、ＰＣＤＨＡ７、ＰＣＤＨＡ８、ＰＣＤＨＡ９、ＰＣＤＨＡＣ１、ＰＣＤＨＡＣ２、ＰＣＤＨＢ１、ＰＣＤＨＢ１０、ＰＣＤＨＢ１１、ＰＣＤＨＢ１２、ＰＣＤＨＢ１３、ＰＣＤＨＢ１４、ＰＣＤＨＢ１５、ＰＣＤＨＢ１６、ＰＣＤＨＢ１７、ＰＣＤＨＢ１８、ＰＣＤＨＢ２、ＰＣＤＨＢ３、ＰＣＤＨＢ４、ＰＣＤＨＢ５、ＰＣＤＨＢ６、ＰＣＤＨＢ７、ＰＣＤＨＢ８、ＰＣＤＨＢ９、ＰＣＤＨＧＡ１、ＰＣＤＨＧＡ１０、ＰＣＤＨＧＡ１１、ＰＣＤＨＧＡ１２、ＰＣＤＨＧＡ２、ＰＣＤＨＧＡ３、ＰＣＤＨＧＡ４、ＰＣＤＨＧＡ５、ＰＣＤＨＧＡ６、ＰＣＤＨＧＡ７、ＰＣＤＨＧＡ８、ＰＣＤＨＧＡ９、ＰＣＤＨＧＢ１、ＰＣＤＨＧＢ２、ＰＣＤＨＧＢ３、ＰＣＤＨＧＢ４、ＰＣＤＨＧＢ５、ＰＣＤＨＧＢ６、ＰＣＤＨＧＢ７、ＰＣＤＨＧＣ３、ＰＣＤＨＧＣ４、ＰＣＤＨＧＣ５、ＦＡＴ、ＦＡＴ２、およびＦＡＴ）から選択されるプロトカドヘリンまたはそのいずれかのバリアントを含む。一部の実施形態では、膜貫通受容体は、ＣＤＨ４（Ｒ−カドヘリン、網膜）、ＣＤＨ５（ＶＥ−カドヘリン、血管内皮）、ＣＤＨ６（Ｋ−カドヘリン、腎臓）、ＣＤＨ７（カドヘリン７、タイプ２）、ＣＤＨ８（カドヘリン８、タイプ２）、ＣＤＨ９（カドヘリン９、タイプ２、Ｔ１−カドヘリン）、ＣＤＨ１０（カドヘリン１０、タイプ２、Ｔ２−カドヘリン）、ＣＤＨ１１（ＯＢ−カドヘリン、骨芽細胞）、ＣＤＨ１３（Ｔ−カドヘリン、Ｈ−カドヘリン、心臓）、ＣＤＨ１５（Ｍ−カドヘリン、筋小管）、ＣＤＨ１６（ＫＳＰ−カドヘリン）、ＣＤＨ１７（ＬＩカドヘリン、肝臓−腸管）、ＣＤＨ１８（カドヘリン１８、タイプ２）、ＣＤＨ１９（カドヘリン１９、タイプ２）、ＣＤＨ２０（カドヘリン２０、タイプ２）、ＣＤＨ２３（カドヘリン２３、神経感覚上皮）、ＣＤＨ２４、ＣＤＨ２６、ＣＤＨ２８、ＣＥＬＳＲ１、ＣＥＬＳＲ２、ＣＥＬＳＲ３、ＣＬＳＴＮ１、ＣＬＳＴＮ２、ＣＬＳＴＮ３、ＤＣＨＳ１、ＤＣＨＳ２、ＬＯ���３８９１１８、ＰＣＬＫＣ、ＲＥＳＤＡ１、およびＲＥＴから選択される非定型カドヘリンを含む。
【０２３６】
一部の実施形態では、キメラ受容体は、カドヘリン分子またはそのいずれかのバリアントを含む。一部の実施形態では、キメラ受容体は、カドヘリンまたはそのいずれかのバリアントの少なくとも１つの細胞外領域を含む。一部の実施形態では、キメラ受容体は、カドヘリン、またはそのいずれかのバリアントの少なくとも１つの膜貫通領域を含む。一部の実施形態では、キメラ受容体は、カドヘリンまたはそのいずれかのバリアントの少なくとも１つの細胞内領域（例えば、細胞質ドメイン）を含む。カドヘリンまたはそのいずれかのバリアントを含むキメラ受容体ポリペプチドは、カドヘリンリガンドに結合することができる。一部の実施形態では、カドヘリンまたはそのいずれかのバリアントを含むキメラ受容体にリガンドが結合すると、カドヘリンシグナル伝達経路の活性化をもたらす。
【０２３７】
一部の実施形態では、膜貫通受容体は、触媒受容体、またはそのいずれかのバリアント（例えば、合成またはキメラ受容体）を含む。触媒受容体の例には、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）および受容体スレオニン／セリンキナーゼ（ＲＴＳＫ）が挙げられるがこれらに限定されない。触媒受容体、例えばＲＴＫおよびＲＴＳＫは、ある特定の酵素活性を保有する。例えば、ＲＴＫは、チロシン残基上の基質タンパク質をリン酸化することができ、これが次にアダプタータンパク質の結合部位として作用することができる。ＲＴＫは、一般的にＮ末端細胞外リガンド結合メイン、１回膜貫通αヘリックス、およびタンパク質チロシンキナーゼ活性を有する細胞質ゾルＣ末端ドメインを含む。一部のＲＴＫは、単一のポリペプチドからなるが、一部のＲＴＫはポリペプチド鎖の２つのペア、例えばインスリン受容体および一部の関連する受容体からなる二量体である。これらの受容体の細胞外ドメインにリガンドが結合すると、細胞質ゾルキナーゼドメインを活性化して、受容体そのものおよび細胞内標的タンパク質の両方のリン酸化をもたらすことができ、リガンドの結合によって開始されるシグナルを伝播する。一部のＲＴＫでは、リガンド結合は、受容体の二量体形成を誘導する。一部のリガンド（例えば、ＰＤＧＦおよびＮＧＦなどの増殖因子）は、それ自身２つの同一のポリペプチド鎖からなる二量体である。これらの増殖因子は、２つの異なる受容体分子に同時に結合することによって二量体形成を直接誘導することができる。他の増殖因子（例えば、ＥＧＦなど）は、単量体であるが、受容体を架橋することができる２つの異なる受容体結合部位を有する。リガンド誘導二量体形成は、二量体形成ポリペプチド鎖が互いに交叉リン酸化する、受容体の自己リン酸化をもたらしうる。一部の受容体は、多量体形成することができる。
【０２３８】
一部の実施形態では、膜貫通受容体は、クラスＩ  ＲＴＫ（例えば、ＥＧＦＲを含む上皮増殖因子（ＥＧＦ）受容体ファミリー；ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３、およびＥｒｂＢ−４を含むＥｒｂＢファミリー）、クラスＩＩ  ＲＴＫ（例えば、ＩＮＳＲ、ＩＧＦ−１Ｒ、およびＩＲＲを含むインスリン受容体ファミリー）、クラスＩＩＩ  ＲＴＫ（例えば、ＰＤＧＦＲ−α、ＰＤＧＦＲ−β、ＣＳＦ−１Ｒ、ＫＩＴ／ＳＣＦＲ、およびＦＬＫ２／ＦＬＴ３を含む血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）受容体ファミリー）、クラスＩＶ  ＲＴＫ（例えば、ＦＧＦＲ−１、ＦＧＦＲ−２、ＦＧＦＲ−３、およびＦＧＦＲ−４を含む線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）受容体ファミリー）、クラスＶ  ＲＴＫ（例えば、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、およびＶＥＧＦＲ３を含む血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体ファミリー）、クラスＶＩ  ＲＴＫ（例えば、肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ／ＭＥＴ）およびＲＯＮを含む肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）受容体ファミリー）、クラスＶＩＩ  ＲＴＫ（例えば、ＴＲＫＡ、ＴＲＫＢ、およびＴＲＫＣを含むトロポミオシン受容体キナーゼ（Ｔｒｋ）受容体ファミリー）、クラスＶＩＩＩ  ＲＴＫ（例えば、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ４、ＥＰＨＡ５、ＥＰＨＡ６、ＥＰＨＡ７、ＥＰＨＡ８、ＥＰＨＢ１、ＥＰＨＢ２、ＥＰＨＢ３、ＥＰＨＢ４、ＥＰＨＢ５、およびＥＰＨＢ６を含むエフリン（Ｅｐｈ）受容体ファミリー）、クラスＩＸ  ＲＴＫ（例えば、ＡＸＬ、ＭＥＲ、およびＴＲＹＯ３などのＡＸＬ受容体ファミリー）、クラスＸ  ＲＴＫ（例えば、ＬＴＫおよびＡＬＫなどのＬＴＫ受容体ファミリー）、クラスＸＩ  ＲＴＫ（例えば、ＴＩＥおよびＴＥＫなどのＴＩＥ受容体ファミリー）、クラスＸＩＩ  ＲＴＫ（例えば、ＲＯＲ受容体ファミリーＲＯＲ１およびＲＯＲ２）、クラスＸＩＩＩ  ＲＴＫ（例えば、ＤＤＲ１およびＤＤＲ２などのジスコイジンドメイン受容体（ＤＤＲ）ファミリー）、クラスＸＩＶ  ＲＴＫ（例えば、ＲＥＴなどのＲＥＴ受容体ファミリー）、クラスＸＶ  ＲＴＫ（例えば、ＰＴＫ７を含むＫＬＧ受容体ファミリー）、クラスＸＶＩ  ＲＴＫ（例えば、Ｒｙｋを含むＲＹＫ受容体ファミリー）、クラスＸＶＩＩ  ＲＴＫ（例えば、ＭｕＳＫなどのＭｕＳＫ受容体ファミリー）、またはそのいずれかのバリアントを含む。
【０２３９】
一部の実施形態では、キメラ受容体は、ＲＴＫまたはそのいずれかのバリアントなどの触媒受容体の少なくとも１つの細胞外領域（例えば、リガンド結合ドメイン）を含む。一部の実施形態では、キメラ受容体は、ＲＴＫまたはそのいずれかのバリアントなどの触媒受容体の少なくとも１つの膜貫通領域を含む。一部の実施形態では、キメラ受容体は、ＲＴＫまたはそのいずれかのバリアントなどの触媒受容体の少なくとも１つの細胞内領域（例えば、細胞質ゾルドメイン）を含む。ＲＴＫまたはそのいずれかのバリアントを含むキメラ受容体は、ＲＴＫリガンドに結合することができる。一部の実施形態では、ＲＴＫまたはそのいずれかのバリアントを含むキメラ受容体にリガンドが結合すると、ＲＴＫシグナル伝達経路の活性化をもたらす。
【０２４０】
一部の実施形態では、キメラ受容体は、ＲＴＳＫまたはそのいずれかのバリアントなどの触媒受容体の少なくとも１つの細胞外領域（例えば、リガンド結合ドメイン）を含む。一部の実施形態では、キメラ受容体は、ＲＴＳＫまたはそのいずれかのバリアントなどの触媒受容体の少なくとも１つの膜貫通領域を含む。一部の実施形態では、キメラ受容体は、ＲＴＳＫまたはそのいずれかのバリアントなどの触媒受容体の少なくとも１つの細胞内領域（例えば、細胞質ゾルドメイン）を含む。ＲＴＳＫまたはそのいずれかのバリアントを含むキメラ受容体は、ＲＴＳＫリガンドに結合することができる。一部の実施形態では、ＲＴＳＫまたはそのいずれかのバリアントを含むキメラ受容体にリガンドが結合すると、ＲＴＳＫシグナル伝達経路の活性化をもたらす。
【０２４１】
一部の実施形態では、ＲＴＳＫまたはそのいずれかのバリアントを含む膜貫通受容体は、セリンおよび／またはスレオニン残基で基質をリン酸化することができ、コンセンサス配列に基づいて特異的残基を選択してもよい。膜貫通受容体は、Ｉ型ＲＴＳＫ、ＩＩ型ＲＴＳＫ、またはそのいずれかのバリアントを含みうる。一部の実施形態では、Ｉ型受容体セリン／スレオニンキナーゼを含む膜貫通受容体は、ＩＩ型受容体と複合体を形成しなければ不活性である。一部の実施形態では、ＩＩ型受容体セリン／スレオニンを含む膜貫通受容体は、Ｉ型受容体と複合体を形成すると、Ｉ型受容体をリン酸化して活性化することができる構成的に活性なキナーゼドメインを含む。ＩＩ型受容体セリン／スレオニンキナーゼは、Ｉ型パートナーのキナーゼドメインをリン酸化することができ、タンパク質パートナーの置換を引き起こす。
【０２４２】
タンパク質パートナーの置換は、他のタンパク質、例えばＳＭＡＤファミリーのある特定のメンバーの結合およびリン酸化を可能にしうる。膜貫通受容体は、ＡＬＫ１（ＡＣＶＲＬ１）、ＡＬＫ２（ＡＣＶＲ１Ａ）、ＡＬＫ３（ＢＭＰＲ１Ａ）、ＡＬＫ４（ＡＣＶＲ１Ｂ）、ＡＬＫ５（ＴＧＦβＲ１）、ＡＬＫ６（ＢＭＰＲ１Ｂ）、およびＡＬＫ７（ＡＣＶＲ１Ｃ）からなる群より選択されるＩ型受容体またはそのいずれかのバリアントを含みうる。膜貫通受容体は、ＴＧＦβＲ２、ＢＭＰＲ２、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＣＶＲ２Ｂ、およびＡＭＨＲ２（ＡＭＨＲ）からなる群より選択されるＩＩ型受容体またはそのいずれかのバリアントを含みうる。
【０２４３】
一部の実施形態では、膜貫通受容体は、固有の酵素活性を保有するのではなく、Ｓｒｃキナーゼ（例えば、ｃ−Ｓｒｃ、Ｙｅｓ、Ｆｙｎ、Ｆｇｒ、Ｌｃｋ、Ｈｃｋ、Ｂｌｋ、Ｌｙｎ、およびＦｒｋ）またはＪＡＫキナーゼ（例えば、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、およびＴＹＫ２）などの非共有結合により会合する細胞内キナーゼを刺激する受容体、またはそのいずれかのバリアントを含む。これらは、サイトカインおよびポリペプチドホルモンの受容体などのサイトカイン受容体スーパーファミリーを含む。サイトカイン受容体は、一般的にＮ末端細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通αヘリックス、およびＣ末端細胞質ゾルドメインを含有する。サイトカイン受容体の細胞質ゾルドメインは、一般的にいかなる公知の触媒活性も欠如している。その代わりに、サイトカイン受容体は、非受容体キナーゼ（例えば、チロシンキナーゼまたはスレオニン／セリンキナーゼ）に会合して機能することができ、これは受容体にリガンドが結合した結果として活性化されうる。
【０２４４】
一部の実施形態では、キメラ受容体は、細胞内キナーゼに非共有結合により会合する触媒受容体（例えば、サイトカイン受容体）またはそのいずれかのバリアントの少なくとも１つの細胞外領域（例えば、リガンド結合ドメイン）を含む。一部の実施形態では、キメラ受容体は、細胞内キナーゼに非共有結合により会合する触媒受容体（例えば、サイトカイン受容体）またはそのいずれかのバリアントの少なくとも１つの膜貫通領域を含む。一部の実施形態では、キメラ受容体は、細胞内キナーゼに非共有結合により会合する触媒受容体（例えば、サイトカイン受容体）またはそのいずれかのバリアントの少なくとも１つの細胞内領域（例えば、細胞質ゾルドメイン）を含む。細胞内キナーゼに非共有結合により会合する触媒受容体またはそのいずれかのバリアントを含むキメラ受容体は、リガンドに結合することができる。一部の実施形態では、細胞内キナーゼに非共有結合により会合する触媒受容体またはそのいずれかのバリアントを含むキメラ受容体にリガンドが結合すると、シグナル伝達経路の活性化をもたらす。
【０２４５】
サイトカイン受容体は、一般的にＮ末端細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通αヘリックス、およびＣ末端細胞質ゾルドメインを含む。サイトカイン受容体の細胞質ゾルドメインは、一般的に任意の公知の触媒活性を欠如している。その代わりに、サイトカイン受容体は、非受容体キナーゼ（例えば、チロシンキナーゼ、またはスレオニン／セリンキナーゼ）に会合して機能することができ、これは、リガンドが受容体に結合した結果として活性化されうる。
【０２４６】
一部の実施形態では、膜貫通受容体は、サイトカイン受容体、例えばＩ型サイトカイン受容体またはＩＩ型サイトカイン受容体、またはそのいずれかのバリアントを含む。一部の実施形態では、膜貫通受容体は、インターロイキン受容体（例えば、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−３Ｒ、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−５Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−７Ｒ、ＩＬ−９Ｒ、ＩＬ−１１Ｒ、ＩＬ−１２Ｒ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−２１Ｒ、ＩＬ−２３Ｒ、ＩＬ−２７Ｒ、およびＩＬ−３１Ｒ）、コロニー刺激因子受容体（例えば、エリスロポエチン受容体、ＣＳＦ−１Ｒ、ＣＳＦ−２Ｒ、ＧＭ−ＣＳＦＲ、およびＧ−ＣＳＦＲ）、ホルモン受容体／ニューロペプチド受容体（例えば、成長ホルモン受容体、プロラクチン受容体、およびレプチン受容体）、またはそのいずれかのバリアントを含む。一部の実施形態では、膜貫通受容体は、ＩＩ型サイトカイン受容体、またはそのいずれかのバリアントを含む。一部の実施形態では、膜貫通受容体は、インターフェロン受容体（例えば、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２、およびＩＦＮＧＲ）、インターロイキン受容体（例えば、ＩＬ−１０Ｒ、ＩＬ−２０Ｒ、ＩＬ−２２Ｒ、およびＩＬ−２８Ｒ）、組織因子受容体（同様に血小板組織因子とも呼ばれる）、またはそのいずれかのバリアントを含む。
【０２４７】
一部の実施形態では、膜貫通受容体は、細胞死受容体、デスドメインを含む受容体、またはそのいずれかのバリアントを含む。細胞死受容体はしばしば、アポトーシスおよび炎症の調節に関与している。細胞死受容体は、ＴＮＦＲ１、Ｆａｓ受容体、ＤＲ４（ＴＲＡＩＬ受容体１またはＴＲＡＩＬＲ１としても公知）およびＤＲ５（ＴＲＡＩＬ受容体２またはＴＲＡＩＬＲ２としても公知）などのＴＮＦ受容体ファミリーのメンバーを含む。
【０２４８】
一部の実施形態では、キメラ受容体は、細胞死受容体またはそのいずれかのバリアントの少なくとも１つの細胞外領域（例えば、リガンド結合ドメイン）を含む。一部の実施形態では、キメラ受容体は、細胞死受容体、またはそのいずれかのバリアントの少なくとも１つの膜貫通領域を含む。一部の実施形態では、キメラ受容体は、細胞死受容体またはそのいずれかのバリアントの少なくとも１つの細胞内領域（例えば、細胞質ゾル）ドメインを含む。細胞死受容体、またはそのいずれかのバリアントを含むキメラ受容体は、リガンドの結合に応答して受容体のオリゴマー化を受けることができ、次に特化したアダプタータンパク質の動員およびカスパーゼカスケードなどのシグナル伝達カスケードの活性化をもたらしうる。
【０２４９】
一部の実施形態では、膜貫通受容体は、免疫受容体、またはそのいずれかのバリアントを含む。免疫受容体は、免疫グロブリンと構造特徴、例えば免疫グロブリンドメインまたはフォールドとして公知のドメインを共有する免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）のメンバーを含む。ＩｇＳＦメンバーには、免疫系の細胞表面抗原受容体、共受容体および共刺激分子、およびリンパ球への抗原提示に関与する分子が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２５０】
一部の実施形態では、キメラ受容体は、免疫受容体またはそのいずれかのバリアントを含む。一部の実施形態では、キメラ受容体は、免疫受容体またはそのいずれかのバリアントの少なくとも１つの細胞外領域（例えば、リガンド結合ドメイン）を含む。一部の実施形態では、キメラ受容体は、免疫受容体またはそのいずれかのバリアントの少なくとも１つの膜貫通領域を含む。一部の実施形態では、キメラ受容体は、免疫受容体またはそのいずれかのバリアントの少なくとも１つの細胞内領域（例えば、細胞質ドメイン）を含む。免疫受容体またはそのいずれかのバリアントを含むキメラ受容体は、結合パートナーを動員することができる。一部の実施形態では、免疫受容体またはそのいずれかのバリアントを含むキメラ受容体にリガンドが結合すると、免疫細胞シグナル伝達経路の活性化をもたらす。
【０２５１】
一部の実施形態では、膜貫通受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、またはそのいずれかのバリアントなどの細胞表面抗原受容体を含む。Ｔ細胞受容体は、一般的に２つの鎖、ＴＣＲ−アルファおよび−ベータ鎖、またはＴＣＲ−デルタおよび−ガンマ鎖のいずれかを含む。ＴＣＲまたはそのいずれかのバリアントを含む膜貫通受容体は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）タンパク質に結合することができる。Ｂ細胞受容体は、一般的に膜結合免疫グロブリンおよびシグナル伝達部分を含む。ＢＣＲまたはそのいずれかのバリアントを含む膜貫通受容体は、同族のＢＣＲ抗原に結合することができる。
【０２５２】
一部の実施形態では、膜貫通受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。ＣＡＲのリガンド結合ドメインは、任意のリガンドに結合することができる。一部の例では、リガンドは、抗原と呼ばれる。リガンド結合ドメインは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはその機能的バリアントを含んでもよく、これらは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ミニボディ、ダイアボディ、およびシングルドメイン抗体、例えば重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、およびラクダ科由来ナノボディの可変ドメイン（ＶＨＨ）を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、リガンド結合ドメインは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、およびｓｃＦｖのうちの少なくとも１つを含む。一部の実施形態では、リガンド結合ドメインは、抗体模倣体（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｉｍｅｔｉｃ）を含む。抗体模倣体は、抗体と同等の親和性で標的分子に結合することができる分子を指し、これは一本鎖結合分子、チトクロームｂ５６２に基づく結合分子、フィブロネクチンまたはフィブロネクチン様タンパク質足場（例えば、アドネクチン）、リポカリン足場、カリックスアレーン足場、Ａドメイン、および他の足場を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲドメインのリガンド結合ドメインは、膜貫通受容体またはそのいずれかのバリアントを含む。例えば、リガンド結合ドメインは、膜貫通受容体の少なくとも１つのリガンド結合ドメインを含みうる。
【０２５３】
一部の実施形態では、リガンド結合ドメインはヒト化抗体を含む。ヒト化抗体は、ＣＤＲ移植、ベニヤリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）、またはリサーフェシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）、鎖シャッフリング、および他の技術を含むがこれらに限定されない多様な技術を使用して産生することができる。軽鎖および重鎖を含むヒト可変ドメインは、ヒト化抗体の免疫原性を低減するように選択することができる。一部の実施形態では、キメラ膜貫通受容体のリガンド結合ドメインは、高い親和性で抗原に結合し、低減されたおよび／または最小の免疫原性などの他の好ましい生物特性を保有するヒト化抗体の断片を含む。ヒト化抗体または抗体断片は、対応する非ヒト化抗体と類似の抗原特異性を保持しうる。
【０２５４】
一部の実施形態では、リガンド結合ドメインは、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。ｓｃＦｖ分子は、ポリペプチドリンカーなどの可撓性リンカーを使用して免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）領域を共に連結することによって産生することができる。ｓｃＦｖは、様々な方法に従って調製することができる。
【０２５５】
一部の実施形態では、リガンド結合ドメインは、特異的標的抗原に結合するように操作されている。例えば、リガンド結合ドメインは、操作されたｓｃＦｖでありうる。ｓｃＦｖを含むリガンド結合ドメインは、ファージディスプレイライブラリ、酵母ディスプレイライブラリ、細胞ベースのディスプレイライブラリ（例えば、哺乳動物細胞）、タンパク質−核酸融合、リボソームディスプレイライブラリ、および／またはＥ．ｃｏｌｉペリプラスムディスプレイライブラリなどのディスプレイライブラリを含むがこれらに限定されない多様な方法を使用して操作することができる。一部の実施形態では、操作されるリガンド結合ドメインは、類似の抗体または操作を受けていない抗体より高い親和性で抗原に結合しうる。
【０２５６】
一部の実施形態では、リガンド結合ドメインは、複数のリガンド（例えば、抗原）、例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の抗原に結合する。リガンド結合ドメインは、２つの関連抗原、例えばボツリヌス毒素の２つのサブタイプ（例えば、ボツリヌス神経毒素サブタイプＡ１およびサブタイプＡ２）に結合することができる。リガンド結合ドメインは、２つの無関係なタンパク質、例えば受容体チロシンキナーゼｅｒｂＢ−２（Ｎｅｕ、ＥＲＢＢ２、およびＨＥＲ２とも呼ばれる）および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に結合することができる。２つの抗原に結合することが可能なリガンド結合ドメインは、抗体の別個の、しかし重なり合う部位で２つの無関係なタンパク質標的に結合するように操作された抗体を含みうる。一部の実施形態では、複数の抗原に結合するリガンド結合ドメインは、二特異性抗体分子を含む。二特異性抗体分子は、第１のエピトープに対して結合特異性を有する第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列および第２のエピトープに対して結合特異性を有する第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列を含みうる。一部の実施形態では、第１および第２のエピトープは、同じ抗原、例えば同じタンパク質（または多量体タンパク質のサブユニット）上に存在する。第１および第２のエピトープは重なり合うことができる。一部の実施形態では、第１および第２のエピトープは、重なり合わない。一部の実施形態では、第１および第２のエピトープは、異なる抗原、例えば異なるタンパク質（または多量体タンパク質の異なるサブユニット）上に存在する。一部の実施形態では、二特異性抗体分子は、第１のエピトープに対して結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列および軽鎖可変ドメイン配列、ならびに第２のエピトープに対して結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列および軽鎖可変ドメイン配列を含む。一部の実施形態では、二特異性抗体分子は、第１のエピトープに対して結合特異性を有する半抗体（ｈａｌｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）および第２のエピトープに対して結合特異性を有する半抗体を含む。一部の実施形態では、二特異性抗体分子は、第１のエピトープに対して結合特異性を有する半抗体またはその断片、および第２のエピトープに対して結合特異性を有する半抗体またはその断片を含む。
【０２５７】
一部の実施形態では、キメラ膜貫通受容体の細胞外領域は、複数のリガンド結合ドメイン、例えば少なくとも２つのリガンド結合ドメイン（例えば、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、または１０個のリガンド結合ドメイン）を含む。複数のリガンド結合ドメインは、同じまたは異なる抗原に対する結合を示すことができる。一部の実施形態では、細胞外領域は、少なくとも２つのリガンド結合ドメイン、例えばタンデムに連結された少なくとも２つのｓｃＦｖを含む。一部の実施形態では、２つのｓｃＦｖ断片は、ペプチドリンカーによって連結される。
【０２５８】
キメラ膜貫通受容体の細胞外領域のリガンド結合ドメインは、膜結合抗原、例えば細胞（例えば、標的細胞）の細胞外表面上の抗原に結合することができる。一部の実施形態では、リガンド結合ドメインは、膜に結合していない（例えば、非膜結合）抗原、例えば細胞（例えば、標的細胞）によって分泌される細胞外抗原、または細胞（例えば、標的細胞）の細胞質に位置する抗原に結合する。抗原（例えば、膜結合および非膜結合）は、ウイルス、細菌、および／もしくは寄生生物感染症；炎症および／もしくは自己免疫疾患；または新生物、例えばがんおよび／もしくは腫瘍などの疾患に関連しうる。本発明のシステムのキメラ膜貫通受容体ポリペプチドのリガンド結合ドメインが結合することができる抗原の非制限的な例には、１−４０−β−アミロイド、４−１ＢＢ、５ＡＣ、５Ｔ４、７０７−ＡＰ、Ａキナーゼアンカータンパク質４（ＡＫＡＰ−４）、アクチビン受容体タイプ２Ｂ（ＡＣＶＲ２Ｂ）、アクチビン受容体様キナーゼ１（ＡＬＫ１）、腺癌抗原、アジポフィリン、アドレノセプターβ３（ＡＤＲＢ３）、ＡＧＳ−２２Ｍ６、α葉酸受容体、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＡＩＭ−２、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）、アンドロゲン受容体、アンジオポエチン２、アンジオポエチン３、アンジオポエチン結合細胞表面受容体２（Ｔｉｅ２）、炭疽菌毒素、ＡＯＣ３（ＶＡＰ−１）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ炭疽、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）、Ｂリンパ腫細胞、骨髄間質細胞抗原２（ＢＳＴ２）、Ｂｒｏｔｈｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  Ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ  Ｓｉｔｅｓ（ＢＯＲＩＳ）、Ｃ２４２抗原、Ｃ５、ＣＡ−１２５、がん抗原１２５（ＣＡ−１２５またはＭＵＣ１６）、がん／精巣抗原１（ＮＹ−ＥＳＯ−１）、がん／精巣抗原２（ＬＡＧＥ−１ａ）、炭酸脱水酵素９（ＣＡ−ＩＸ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、心臓ミオシン、ＣＣＣＴＣ結合因子（ＣＴＣＦ）、ＣＣＬ１１（エオタキシン−１）、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＤ１１、ＣＤ１２３、ＣＤ１２５、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１４７（ベイシジン）、ＣＤ１５、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ１７１、ＣＤ１７９ａ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２、ＣＤ２０、ＣＤ２００、ＣＤ２２、ＣＤ２２１、ＣＤ２３（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ２４、ＣＤ２５（ＩＬ−２受容体のα鎖）、ＣＤ２７、ＣＤ２７４、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ３ε、ＣＤ３０、ＣＤ３００分子様ファミリーメンバーｆ（ＣＤ３００ＬＦ）、ＣＤ３１９（ＳＬＡＭＦ７）、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４０  リガンド、ＣＤ４１、ＣＤ４４  ｖ７、ＣＤ４４  ｖ８、ＣＤ４４  ｖ６、ＣＤ５、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ６、ＣＤ７０、ＣＤ７２、ＣＤ７４、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ９７、ＣＥＡ関連抗原、ＣＦＤ、ｃｈ４Ｄ５、第Ｘ染色体オープンリーディングフレーム６１（ＣＸＯＲＦ６１）、クローディン１８．２（ＣＬＤＮ１８．２）、クローディン６（ＣＬＤＮ６）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、凝集因子Ａ、ＣＬＣＡ２、コロニー刺激因子１受容体（ＣＳＦ１Ｒ）、ＣＳＦ２、ＣＴＬＡ−４、Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡ（ＣＬＥＣ１２Ａ）、Ｃ型レクチン様分子−１（ＣＬＬ−１またはＣＬＥＣＬ１）、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン受容体タイプ４、サイクリンＢ１、チトクロームＰ４５０１Ｂ１（ＣＹＰ１Ｂ１）、ｃｙｐ−Ｂ、サイトメガロウイルス、サイトメガロウイルス糖タンパク質Ｂ、ダビガトラン、ＤＬＬ４、ＤＰＰ４、ＤＲ５、Ｅ．ｃｏｌｉ志賀毒素１型、Ｅ．ｃｏｌｉ志賀毒素２型、ｅｃｔｏ−ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ４（ＡＲＴ４）、ＥＧＦ様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様２（ＥＭＲ２）、ＥＧＦ様多重ドメイン（ＥＧＦ−ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ）７（ＥＧＦＬ７）、変異型伸長因子２（ＥＬＦ２Ｍ）、エンドトキシン、エフリンＡ２、エフリンＢ２、エフリンＡ型受容体２、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮増殖因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、エピシアリン、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、上皮糖タンパク質２（ＥＧＰ−２）、上皮糖タンパク質４０（ＥＧＰ−４０）、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥＲＧ（膜貫通プロテアーゼ、セリン２（ＴＭＰＲＳＳ２）ＥＴＳ融合遺伝子）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、第１２ｐ染色体に位置するＥＴＳ転座バリアント遺伝子６（ＥＴＶ６−ＡＭＬ）、ＲＳウイルスのＦタンパク質、ＦＡＰ、ＩｇＡ受容体のＦｃ断片（ＦＣＡＲまたはＣＤ８９）、Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５）、胎児アセチルコリン受容体、フィブリンＩＩβ鎖、線維芽細胞活性化タンパク質α（ＦＡＰ）、フィブロネクチンエクストラドメイン−Ｂ、ＦＧＦ−５、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）、葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、葉酸ヒドロラーゼ、葉酸受容体１、葉酸受容体α、葉酸受容体β、Ｆｏｓ関連抗原１、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体、フコシルＧＭ１、Ｇ２５０、Ｇタンパク質共役受容体２０（ＧＰＲ２０）、Ｇタンパク質共役受容体クラスＣグループ５、メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ＧＤ３ガングリオシド、糖タンパク質１００（ｇｐ１００）、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ＧＭＣＳＦ受容体α−鎖、ＧＰＮＭＢ、ＧｎＴ−Ｖ、増殖分化因子８、ＧＵＣＹ２Ｃ、熱ショックタンパク質７０−２変異型（ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２）、血液凝集素、Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体１（ＨＡＶＣＲ１）、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｂ型肝炎ウイルス、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ｇｌｏｂｏＨグリコセラミドの六糖部分（ＧｌｏｂｏＨ）、ＨＧＦ、ＨＨＧＦＲ、高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）、ヒストン複合体、ＨＩＶ−１、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＮＧＦ、Ｈｓｐ９０、ＨＳＴ−２（ＦＧＦ６）、ヒト乳頭腫ウイルスＥ６（ＨＰＶ  Ｅ６）、ヒト乳頭腫ウイルスＥ７（ＨＰＶ  Ｅ７）、ヒト細胞分散因子受容体キナーゼ（ｈｕｍａｎ  ｓｃａｔｔｅｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｋｉｎａｓｅ）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、ヒトＴＮＦ、ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）、ｉＣＥ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩｇＥ、ＩｇＥ  Ｆｃ領域、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−１受容体、ＩＧＨＥ、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、ＩＬ−１β、ＩＬ−２０、ＩＬ��２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−３１、ＩＬ−３１ＲＡ、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−６受容体、ＩＬ−９、免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド１（ＩＧＬＬ１）、インフルエンザＡ血液凝集素、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ−Ｉ受容体）、インスリン様増殖因子２（ＩＬＧＦ２）、インテグリンα４β７、インテグリンβ２、インテグリンα２、インテグリンα４、インテグリンα５β１、インテグリンα７β７、インテグリンαＩＩｂβ３、インテグリンαｖβ３、インターフェロンα／β受容体、インターフェロンγ誘導タンパク質、インターロイキン１１受容体α（ＩＬ−１１Ｒα）、インターロイキン１３受容体サブユニットα−２（ＩＬ−１３Ｒａ２もしくはＣＤ２１３Ａ２）、腸管カルボキシルエステラーゼ、キナーゼドメイン領域（ＫＤＲ）、ＫＩＲ２Ｄ、ＫＩＴ（ＣＤ１１７）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１−ＣＡＭ）、レグマイン（ｌｅｇｕｍａｉｎ）、白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＡメンバー２（ＬＩＬＲＡ２）、白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）、ルイス−Ｙ抗原、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ）、ＬＩＮＧＯ−１、リポテイコ酸、ＬＯＸＬ２、Ｌ−セレクチン（ＣＤ６２Ｌ）、リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｋ９（ＬＹ６Ｋ）、リンパ球抗原７５（ＬＹ７５）、リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ（ＬＣＫ）、リンフォトキシン−α（ＬＴ−α）、または腫瘍壊死因子−β（ＴＮＦ−β）、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦまたはＭＭＩＦ）、Ｍ−ＣＳＦ、乳腺分化抗原（ＮＹ−ＢＲ−１）、ＭＣＰ−１、黒色腫がん精巣抗原−１（ＭＡＤ−ＣＴ−１）、黒色腫がん精巣抗原−２（ＭＡＤ−ＣＴ−２）、黒色腫アポトーシス阻害剤（ＭＬ−ＩＡＰ）、黒色腫関連抗原１（ＭＡＧＥ−Ａ１）、メソテリン、ムチン１、細胞表面関連（ＭＵＣ１）、ＭＵＣ−２、ムチンＣａｎＡｇ、ミエリン関連糖タンパク質、ミオスタチン、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ（ＮＡ１７）、ＮＣＡ−９０（顆粒球抗原）、神経成長因子（ＮＧＦ）、神経アポトーシス調節プロテイナーゼ１、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、神経突起伸長阻害剤（例えば、ＮＯＧＯ−Ａ、ＮＯＧＯ−Ｂ、ＮＯＧＯ−Ｃ）、ニューロピリン−１（ＮＲＰ１）、Ｎ−グリコリルノイラミン酸、ＮＫＧ２Ｄ、Ｎｏｔｃｈ受容体、ｏ−アセチル−ＧＤ２ガングリオシド（ＯＡｃＧＤ２）、嗅覚受容体５１Ｅ２（ＯＲ５１Ｅ２）、癌胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、ブレークポイントクラスター領域（ＢＣＲ）およびエーベルソンマウス白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ１（Ａｂｌ）からなる癌遺伝子融合タンパク質（ｂｃｒ−ａｂｌ）、Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ、ＯＸ−４０、ｏｘＬＤＬ、ｐ５３変異体、ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ−３（ＰＡＸ３）、ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ−５（ＰＡＸ５）、パネキシン３（ＰＡＮＸ３）、リン酸ナトリウム共輸送体、ホスファチジルセリン、胎盤特異的１（ＰＬＡＣ１）、血小板由来増殖因子受容体α（ＰＤＧＦ−Ｒα）、血小板由来増殖因子受容体β（ＰＤＧＦＲ−β）、ポリシアル酸、プロアクロシン結合タンパク質ｓｐ３２（ＯＹ−ＴＥＳ１）、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン（ｋｅｘｉｎ）９型（ＰＣＳＫ９）、プロスターゼ（ｐｒｏｓｔａｓｅ）、前立腺癌腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１またはガレクチン８）、Ｔ細胞によって認識される黒色腫抗原１（ＭｅｌａｎＡまたはＭＡＲＴ１）、Ｐ１５、Ｐ５３、ＰＲＡＭＥ、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）、前立腺癌細胞、プロステイン（ｐｒｏｓｔｅｉｎ）、プロテアーゼセリン２１（テスチシン（ｔｅｓｔｉｓｉｎ）またはＰＲＳＳ２１）、プロテアソーム（プロソーム、マクロペイン）サブユニット、β型、９（ＬＭＰ２）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、狂犬病ウイルス糖タンパク質、ＲＡＧＥ、ＲａｓホモログファミリーメンバーＣ（ＲｈｏＣ）、核内因子カッパＢリガンドの受容体活性化因子（ＲＡＮＫＬ）、終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ−１）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、腎ユビキタス１（ＲＵ１）、腎ユビキタス２（ＲＵ２）、ＲＳウイルス、Ｒｈ血液型Ｄ抗原、Ｒｈ因子、肉腫転座ブレークポイント（ｓａｒｃｏｍａ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ）、スクレロスチン（ＳＯＳＴ）、セレクチンＰ、シアリルルイス接着分子（ｓＬｅ）、精子タンパク質１７（ＳＰＡ１７）、スフィンゴシン−１−リン酸、Ｔ細胞によって認識される扁平上皮癌抗原１、２、および３（ＳＡＲＴ１、ＳＡＲＴ２、およびＳＡＲＴ３）、ステージ特異的胎児抗原−４（ＳＳＥＡ−４）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、ＳＴＥＡＰ１、サーバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎｇ）、シンデカン１（ＳＤＣ１）＋Ａ３１４、ＳＯＸ１０、サーバイビン、サーバイビン２Ｂ、滑膜肉腫、Ｘブレークポイント２（ＳＳＸ２）、Ｔ細胞受容体、ＴＣＲΓ代替リーディングフレームタンパク質（ＴＡＲＰ）、テロメラーゼ、ＴＥＭ１、テナシンＣ、ＴＧＦ−β（例えば、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３）、甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）、組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）、Ｔｎ抗原（（Ｔｎ  Ａｇ）または（ＧａｌＮＡｃα−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ））、ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーＢ細胞成熟（ＢＣＭＡ）、ＴＮＦ−α、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＧ、トランスグルタミナーゼ５（ＴＧＳ５）、腫瘍抗原ＣＴＡＡ１６．８８、腫瘍
内皮マーカー１（ＴＥＭ１／ＣＤ２４８）、腫瘍内皮マーカー７関連（ＴＥＭ７Ｒ）、腫瘍タンパク質  ｐ５３（ｐ５３）、ＭＵＣ１の腫瘍特異的グリコシル化、腫瘍関連カルシウムシグナル伝達因子２、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）＋Ａ３２７、ＴＷＥＡＫ受容体、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質１（ＴＹＲＰ１または糖タンパク質７５）、チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＹＲＰ２）、ウロプラキン２（ＵＰＫ２）、血管内皮増殖因子（例えば、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＰＩＧＦ）、血管内皮増殖因子受容体１（ＶＥＧＦＲ１）、血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、ビメンチン、ｖ−ｍｙｃトリ骨髄球腫症ウイルス癌遺伝子神経芽腫由来ホモログ（ＭＹＣＮ）、フォンヴィルブランド因子（ＶＷＦ）、ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）、Ｘ抗原ファミリー、メンバー１Ａ（ＸＡＧＥ１）、β−アミロイド、およびκ−軽鎖が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２５９】
一部の実施形態では、リガンド結合ドメインは、７０７−ＡＰ、ビオチン化分子、ａ−アクチニン−４、ａｂｌ−ｂｃｒ  ａｌｂ−ｂ３（ｂ２ａ２）、ａｂｌ−ｂｃｒ  ａｌｂ−ｂ４（ｂ３ａ２）、アジポフィリン、ＡＦＰ、ＡＩＭ−２、アネキシンＩＩ、ＡＲＴ−４、ＢＡＧＥ、ｂ−カテニン、ｂｃｒ−ａｂｌ、ｂｃｒ−ａｂｌ  ｐ１９０（ｅ１ａ２）、ｂｃｒ−ａｂｌ  ｐ２１０（ｂ２ａ２）、ｂｃｒ−ａｂｌ  ｐ２１０（ｂ３ａ２）、ＢＩＮＧ−４、ＣＡＧ−３、ＣＡＩＸ、ＣＡＭＥＬ、カスパーゼ−８、ＣＤ１７１、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ−４、ＣＥＡ、ＣＬＣＡ２、Ｃｙｐ−Ｂ、ＤＡＭ−１０、ＤＡＭ−６、ＤＥＫ−ＣＡＮ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＥＬＦ２、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ｅｒｂ−Ｂ２、ｅｒｂ−Ｂ３、ｅｒｂ−Ｂ４、ＥＳ−ＥＳＯ−１ａ、ＥＴＶ６／ＡＭＬ、ＦＢＰ、胎児アセチルコリン受容体、ＦＧＦ−５、ＦＮ、Ｇ２５０、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ−７Ｂ、ＧＡＧＥ−８、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧｎＴ−Ｖ、Ｇｐ１００、ｇｐ７５、Ｈｅｒ−２、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１−Ｒ１７０Ｉ、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＨＳＰ７０−２  Ｍ、ＨＳＴ−２（ＦＧＦ６）、ＨＳＴ−２／ｎｅｕ、ｈＴＥＲＴ、ｉＣＥ、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ＫＤＲ、ＫＩＡＡ０２０５、Ｋ−ＲＡＳ、Ｌ１細胞接着分子、ＬＡＧＥ−１、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、ルイスＹ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−１０、ＭＡＧＥ−１２、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−６、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ｂ１、ＭＡＧＥ−Ｂ２、リンゴ酸酵素、マンマグロビン−Ａ、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ＭＡＲＴ−２、ＭＣ１Ｒ、Ｍ−ＣＳＦ、メソテリン、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ２、ＭＵＭ−１、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、ミオシン、ＮＡ８８−Ａ、Ｎｅｏ−ＰＡＰ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＰＭ／ＡＬＫ、Ｎ−ＲＡＳ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＯＡ１、ＯＧＴ、癌胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、ＯＳ−９、Ｐポリペプチド、Ｐ１５、Ｐ５３、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＡ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＰＴＰＲＫ、ＲＡＧＥ、ＲＯＲ１、ＲＵ１、ＲＵ２、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−２、ＳＡＲＴ−３、ＳＯＸ１０、ＳＳＸ−２、サーバイビン、サーバイビン−２Ｂ、ＳＹＴ／ＳＳＸ、ＴＡＧ−７２、ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ＴＧＦａＲＩＩ、ＴＧＦｂＲＩＩ、ＴＰ１、ＴＲＡＧ−３、ＴＲＧ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＴＲＰ−２／ＩＮＴ２、ＴＲＰ−２−６ｂ、チロシナーゼ、ＶＥＧＦ−Ｒ２、ＷＴ１、α−葉酸受容体、およびκ−軽鎖からなる群より選択される抗原に結合する。一部の実施形態では、リガンド結合ドメインは、腫瘍関連抗原に結合する。
【０２６０】
一部の実施形態では、リガンド結合ドメインは、抗体、例えば、細胞表面タンパク質またはポリペプチドに結合する抗体を含む抗原に結合する。抗体が結合する細胞表面上のタンパク質またはポリペプチドは、ウイルス、細菌、および／または寄生生物感染症などの疾患；炎症および／もしくは自己免疫疾患；またはがんおよび／もしくは腫瘍などの新生物に関連する抗原を含みうる。一部の実施形態では、抗体は、腫瘍関連抗原（例えば、タンパク質またはポリペプチド）に結合する。一部の実施形態では、本明細書に開示のキメラ膜貫通受容体のリガンド結合ドメインは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ミニボディ、ダイアボディ、およびラクダ科由来ナノボディの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、および可変ドメイン（ＶＨＨ）などのシングルドメイン抗体が挙げられるがこれらに限定されないその機能的バリアントに結合することができる。一部の実施形態では、リガンド結合ドメインは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ、Ｆｖ、およびｓｃＦｖのうちの少なくとも１つに結合することができる。一部の実施形態では、リガンド結合ドメインは、抗体のＦｃドメインに結合する。
【０２６１】
一部の実施形態では、リガンド結合ドメインは、２０−（７４）−（７４）（ミラツズマブ；ベルツズマブ）、２０−２ｂ−２ｂ、３Ｆ８、７４−（２０）−（２０）（ミラツズマブ；ベルツズマブ）、８Ｈ９、Ａ３３、ＡＢ−１６Ｂ５、アバゴボマブ、アブシキシマブ、アビツズマブ、ＡＢＰ４９４（セツキシマブバイオシミラー）、アブリルマブ、ＡＢＴ−７００、ＡＢＴ−８０６、アクチマブ−Ａ（アクチニウムＡｃ−２２５リンツズマブ）、アクトクスマブ、アダリムマブ、ＡＤＣ−１０１３、ＡＤＣＴ−３０１、ＡＤＣＴ−４０２、アデカツムマブ、アデュカヌマブ、アフェリモマブ、ＡＦＭ１３、アフツズマブ、ＡＧＥＮ１８８４、ＡＧＳ１５Ｅ、ＡＧＳ−１６Ｃ３Ｆ、ＡＧＳ６７Ｅ、アラシズマブペゴル、ＡＬＤ５１８、アレムツズマブ、アリロクマブ、ペンテト酸アルツモマブ、アマツキシマブ、ＡＭＧ２２８、ＡＭＧ８２０、アナツモマブマフェナトックス、アネツマブラブタンシン、アニフロルマブ、アンルキンズマブ、ＡＰＮ３０１、ＡＰＮ３１１、アポリズマブ、ＡＰＸ００３／ＳＩＭ−ＢＤ０８０１（セバシズマブ）、ＡＰＸ００５Ｍ、アルシツモマブ、ＡＲＸ７８８、アスクリンバクマブ、アセリズマブ、ＡＳＧ１５ＭＥ、アテゾリズマブ、アチヌマブ、ＡＴＬ１０１、アトリズマブ（トシリズマブとも呼ばれる）、アトロリムマブ、アベルマブ、Ｂ−７０１、バピネウズマブ、バシリキシマブ、バビツキシマブ、ＢＡＹ１１２９９８０、ＢＡＹ１１８７９８２、ベクツモマブ、ベゲロマブ、ベリムマブ、ベンラリズマブ、ベルチリムマブ、ベシレソマブ、ベタルチン（１７７Ｌｕ−テトラキセタン−テツロマブ）、ベバシズマブ、ＢＥＶＺ９２（ベバシズマブバイオシミラー）、ベズロトクスマブ、ＢＧＢ−Ａ３１７、ＢＨＱ８８０、ＢＩ８３６８８０、ＢＩ−５０５、ビシロマブ、ビマグルマブ、ビメキズマブ、ビバツズマブメルタンシン、ＢＩＷ−８９６２、ブリナツモマブ、ブロソズマブ、ＢＭＳ−９３６５５９、ＢＭＳ−９８６０１２、ＢＭＳ−９８６０１６、ＢＭＳ−９８６１４８、ＢＭＳ−９８６１７８、ＢＮＣ１０１、ボコシズマブ、ブレンツキシマブベドチン、ＢｒｅｖａＲｅｘ、ブリアキヌマブ、ブロダルマブ、ブロルシズマブ、ブロンチクツズマブ、Ｃ２−２ｂ−２ｂ、カナキヌマブ、カンツズマブメルタンシン、カンツズマブラブタンシン、カプラシズマブ、カプロマブペンデチド、カルルマブ、カツマキソマブ、ＣＢＲ９６−ドキソルビシンイムノコンジュゲート、ＣＢＴ１２４（ベバシズマブ）、ＣＣ−９０００２、ＣＤＸ−０１４、ＣＤＸ−１４０１、セデリズマブ、セルトリズマブペゴル、セツキシマブ、ＣＧＥＮ−１５００１Ｔ、ＣＧＥＮ−１５０２２、ＣＧＥＮ−１５０２９、ＣＧＥＮ−１５０４９、ＣＧＥＮ−１５０５２、ＣＧＥＮ−１５０９２、Ｃｈ．１４．１８、シタツズマブボガトクス、シクスツムマブ、クラザキズマブ、クレノリキシマブ、クリバツズマブテトラキセタン、ＣＭ−２４、コドリツズマブ、コルツキシマブラブタンシン、コナツムマブ、コンシズマブ、Ｃｏｔａｒａ（ヨウ素Ｉ−１３１デルロツキシマブビオチン）、ｃＲ６２６１、クレネズマブ、ＤＡ−３１１１（トラスツズマブバイオシミラー）、ダセツズマブ、ダクリズマブ、ダロツズマブ、ダピロリズマブペゴル、ダラツムマブ、ダラツムマブエンハンゼ（Ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ  Ｅｎｈａｎｚｅ）（ダラツムマブ）、ダルロイキン（Ｄａｒｌｅｕｋｉｎ）、デクトレクマブ、デムシズマブ、デニンツズマブマフォドチン、デノスマブ、デパツキシズマブ、デパツキシズマブマフォドチン、デルロツキシマブビオチン、デツモマブ、ＤＩ−Ｂ４、ジヌツキシマブ、ジリダブマブ、ＤＫＮ−０１、ＤＭＯＴ４０３９Ａ、ドルリモマブアリトクス、ドロジツマブ、ＤＳ−１１２３、ＤＳ−８８９５、デュリゴツマブ、デュピルマブ、デュルバルマブ、デュシギツマブ、エクロメキシマブ、エクリズマブ、エドバコマブ、エドレコロマブ、エファリズマブ、エフングマブ、エルデルマブ、エルゲムツマブ、エロツズマブ、エルシリモマブ、エマクツズマブ、エミベツズマブ、エナバツズマブ、エンフォルツマブベドチン、エンリモマブペゴル、エノブリツズマブ、エノキズマブ、エノチクマブ、エンシツキシマブ、エピツモマブシツキセタン、エプラツズマブ、エルリズマブ、エルツマキソマブ、エタラシズマブ、エトロリズマブ、エビナクマブ、エボロクマブ、エクスビビルマブ、ファノレソマブ、ファラリモマブ、ファルレツズマブ、ファシヌマブ、ＦＢＴＡ０５、フェルビズマブ、フェザキヌマブ、ＦＦ−２１１０１、ＦＧＦＲ２抗体薬物コンジュゲート、フィブロムン（Ｆｉｂｒｏｍｕｎ）、フィクラツズマブ、フィギツムマブ、フィリブマブ、フランボツマブ、フレチクマブ、フォントリズマブ、フォラルマブ、フォラビルマブ、ＦＰＡ１４４、フレソリムマブ、ＦＳ１０２、フルラヌマブ、フツキシマブ、ガリキシマブ、ガニツマブ、ガンテネルマブ、ガビリモマブ、ゲムツズマブオゾガミシン、ゲリリムズマブ、ゲボキズマブ、ギレンツキシマブ、グレムバツムマブベドチン、ＧＮＲ−００６、ＧＮＲ−０１１、ゴリムマブ、ゴミリキシマブ、ＧＳＫ２８４９３３０、ＧＳＫ２８５７９１６、ＧＳＫ３１７４９９８、ＧＳＫ３３５９６０９、グセルクマブ、Ｈｕ１４．１８Ｋ３２２Ａ  ＭＡｂ、ｈｕ３Ｓ１９３、Ｈｕ８Ｆ４、ＨｕＬ２Ｇ７、ＨｕＭａｂ−５Ｂ１、イバリズマブ、イブリツモマブチウキセタン、イクルクマブ、イダルシズマブ、ＩＧＮ００２、ＩＧＮ５２３、イゴボマブ、ＩＭＡＢ３６２、ＩＭＡＢ３６２（クラウジキシマブ）、イマルマブ、ＩＭＣ−ＣＳ４、ＩＭＣ−Ｄ１１、イムシロマブ、イムガツズマブ、ＩＭＧＮ５２９、ＩＭＭＵ−１０２（イットリウムＹ−９０エプラツズマブテトラキセタン）、ＩＭＭＵ−１１４、ＩｍｍｕＴｕｎｅ  ＩＭＰ７０１アンタゴニスト抗体、ＩＮＣＡＧＮ１８７６、インクラクマブ、ＩＮＣＳＨＲ１２１０、インダツキシマブラブタンシン、インデュサツマブベドチン、インフリキシマブ、イノリモマブ、イノツズマブオゾガミシン、インテツムマブ、イパフリセプト、ＩＰＨ４１０２、イピリムマブ、イラツムマブ、イサツキシマブ、イスチラツマブ、イトリズマブ、イキセキズマブ、ＪＮＪ−５６０２２４７３、ＪＮＪ−６１６１０５８８、ケリキシマブ、ＫＴＮ３３７９、Ｌ１９ＩＬ２／Ｌ１９ＴＮＦ、ラベツズマブ、ラベツズマブゴビテカン（Ｌａｂｅｔｕｚｕｍａｂ  Ｇｏｖｉｔｅｃａｎ）、ＬＡＧ５２５、ラムブロリズマブ、ラムパ���ズマブ、Ｌ−ＤＯＳ４７、レブリキズマブ、レマレソマブ、レンジルマブ、レルデリムマブ、ロイコツキシマブ、レキサツムマブ、リビビルマブ、リファスツズマブベドチン、リゲリズマブ、リロトマブサテトラキセタン、リンツズマブ、リリルマブ、ＬＫＺ１４５、ロデルシズマブ、ロキベトマブ、ロルボツズマブメルタンシン、ルカツムマブ、ルリズマブペゴル、ルミリキシマブ、ルムレツズマブ、ＬＹ３１６４５３０、マパツムマブ、マルゲツキシマブ、マスリモマブ、マツズマブ、マブリリムマブ、ＭＢ３１１、ＭＣＳ−１１０、ＭＥＤＩ０５６２、ＭＥＤＩ−０６３９、ＭＥＤＩ０６８０、ＭＥＤＩ−３６１７、ＭＥＤＩ−５５１（イネビリズマブ）、ＭＥＤＩ−５６５、ＭＥＤＩ６４６９、メポリズマブ、メテリムマブ、ＭＧＢ４５３、ＭＧＤ００６／Ｓ８０８８０、ＭＧＤ００７、ＭＧＤ００９、ＭＧＤ０１１、ミラツズマブ、ミラツズマブ−ＳＮ−３８、ミンレツモマブ、ミルベツキシマブソラブタンシン、ミツモマブ、ＭＫ−４１６６、ＭＭ−１１１、ＭＭ−１５１、ＭＭ−３０２、モガムリズマブ、ＭＯＲ２０２、ＭＯＲ２０８、ＭＯＲＡｂ−０６６、モロリムマブ、モタビズマブ、モキセツモマブパスドトクス、ムロモマブ−ＣＤ３、ナコロマブタフェナトクス、ナミルマブ、ナプツモマブエスタフェナトクス、ナルナツマブ、ナタリズマブ、ネバクマブ、ネシツムマブ、ネモリズマブ、ネレリモマブ、ネスバクマブ、ニモツズマブ、ニボルマブ、ノフェツモマブメルペンタン、ＮＯＶ−１０、オビルトキサキシマブ、オビヌツズマブ、オカラツズマブ、オクレリズマブ、オデュリモマブ、オファツムマブ、オララツマブ、オロキズマブ、オマリズマブ、ＯＭＰ−１３１Ｒ１０、ＯＭＰ−３０５Ｂ８３、オナルツズマブ、オンツキシズマブ、オピシヌマブ、オポルツズマブモナトクス、オレゴボマブ、オルチクマブ、オテリキシズマブ、オトレルツズマブ、ＯＸ００２／ＭＥＮ１３０９、オキセルマブ、オザネズマブ、オゾラリズマブ、パギバキシマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、パンコマブ、パンコマブ−ＧＥＸ、パノバクマブ、パルサツズマブ、パスコリズマブ、パソツキシズマブ、パテクリズマブ、パトリツマブ、ＰＡＴ−ＳＣ１、ＰＡＴ−ＳＭ６、ペンブロリズマブ、ペムツモマブ、ペラキズマブ、ペルツズマブ、ペキセリズマブ、ＰＦ−０５０８２５６６（ウトミルマブ）、ＰＦ−０６６４７２６３、ＰＦ−０６６７１００８、ＰＦ−０６８０１５９１、ピジリズマブ、ピナツズマブベドチン、ピンツモマブ、プラクルマブ、ポラツズマブベドチン、ポネズマブ、プリリキシマブ、プリトキサキシマブ、プリツムマブ、ＰＲＯ１４０、プロキシニウム、ＰＳＭＡ  ＡＤＣ、クイリズマブ、ラコツモマブ、ラドレツマブ、ラフィビルマブ、ラルパンシズマブ、ラムシルマブ、ラニビズマブ、ラキシバクマブ、レファネズマブ、レガビルマブ、ＲＥＧＮ１４００、ＲＥＧＮ２８１０／ＳＡＲ４３９６８４、レスリズマブ、ＲＦＭ−２０３、ＲＧ７３５６、ＲＧ７３８６、ＲＧ７８０２、ＲＧ７８１３、ＲＧ７８４１、ＲＧ７８７６、ＲＧ７８８８、ＲＧ７９８６、リロツムマブ、リヌクマブ、リツキシマブ、ＲＭ−１９２９、ＲＯ７００９７８９、ロバツムマブ、ロレデュマブ、ロモソズマブ、ロ��タリズマブ、ロベリズマブ、ルプリズマブ、サシツズマブゴビテカン、サマリズマブ、ＳＡＲ４０８７０１、ＳＡＲ５６６６５８、サリルマブ、ＳＡＴ０１２、サツモマブペンデチド、ＳＣＴ２００、ＳＣＴ４００、ＳＥＡ−ＣＤ４０、セクキヌマブ、セリバンツマブ、セトキサキシマブ、セビルマブ、ＳＧＮ−ＣＤ１９Ａ、ＳＧＮ−ＣＤ１９Ｂ、ＳＧＮ−ＣＤ３３Ａ、ＳＧＮ−ＣＤ７０Ａ、ＳＧＮ−ＬＩＶ１Ａ、シブロツズマブ、シファリムマブ、シルツキシマブ、シムツズマブ、シプリズマブ、シルクマブ、ソフィツズマブベドチン、ソラネズマブ、ソリトマブ、ソネプシズマブ、ソンツズマブ、スタムルマブ、スレソマブ、スビズマブ、ＳＹＤ９８５、ＳＹＭ００４（フツキシマブおよびモドツキシマブ）、Ｓｙｍ０１５、ＴＡＢ０８、タバルマブ、タカツズマブテトラキセタン、タドシズマブ、タリズマブ、タネズマブ、タニビルマブ、タプリツモマブパプトクス、タレクスツマブ、ＴＢ−４０３、テフィバズマブ、テロイキン、テリモマブアリトクス、テナツモマブ、テネリキシマブ、テプリズマブ、テプロツムマブ、テシドルマブ、テツロマブ（ｔｅｔｕｌｏｍａｂ）、ＴＧ−１３０３、ＴＧＮ１４１２、トリウム−２２７−エプラツズマブコンジュゲート、チシリムマブ、チガツズマブ、チルドラキズマブ、チソツマブベドチン、ＴＮＸ−６５０、トシリズマブ、トラリズマブ、トサトクスマブ、トシツモマブ、トベツマブ、トラロキヌマブ、トラスツズマブ、トラスツズマブエムタンシン、ＴＲＢＳ０７、ＴＲＣ１０５、トレガリズマブ、トレメリムマブ、トレボグルマブ、ＴＲＰＨ  ０１１、ＴＲＸ５１８、ＴＳＲ−０４２、ＴＴＩ−２００．７、ツコツズマブセルモロイキン、ツビルマブ、Ｕ３−１５６５、Ｕ３−１７８４、ウブリツキシマブ、ウロクプルマブ、ウレルマブ、ウルトキサズマブ、ウステキヌマブ、バダスツキシマブタリリン、バンドルツズマブベドチン、バンチクツマブ、バヌシズマブ、バパリキシマブ、バルリルマブ、バテリズマブ、ＶＢ６−８４５、ベドリズマブ、ベルツズマブ、ベパリモマブ、ベセンクマブ、ビシリズマブ、ボロシキシマブ、ボルセツズマブマフォドチン、ボツムマブ、ＹＹＢ−１０１、ザルツムマブ、ザノリムマブ、ザツキシマブ、ジラリムマブ、およびゾリモマブアリトクスからなる群より選択される抗体に結合する。ある特定の実施形態では、リガンド結合ドメインは、前述の抗体のＦｃドメインに結合
する。
【０２６２】
一部の実施形態では、リガンド結合ドメインは、抗体に結合し、次に１−４０−β−アミロイド、４−１ＢＢ、５ＡＣ、５Ｔ４、アクチビン受容体様キナーゼ１、ＡＣＶＲ２Ｂ、腺癌抗原、ＡＧＳ−２２Ｍ６、アルファ−フェトプロテイン、アンジオポエチン２、アンジオポエチン３、炭疽菌毒素、ＡＯＣ３（ＶＡＰ−１）、Ｂ７−Ｈ３、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ炭疽、ＢＡＦＦ、ベータ−アミロイド、Ｂ−リンパ腫細胞、Ｃ２４２抗原、Ｃ５、ＣＡ−１２５、Ｃａｎｉｓ  ｌｕｐｕｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓＩＬ３１、炭酸脱水酵素９（ＣＡ−ＩＸ）、心臓ミオシン、ＣＣＬ１１（エオタキシン−１）、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＤ１１、ＣＤ１８、ＣＤ１２５、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１４７（ベイシジン）、ＣＤ１５、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ１９、ＣＤ２、ＣＤ２０、ＣＤ２００、ＣＤ２２、ＣＤ２２１、ＣＤ２３（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ２５（ＩＬ−２受容体のα鎖）、ＣＤ２７、ＣＤ２７４、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ＣＤ４１、ＣＤ４４  ｖ６、ＣＤ５、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ６、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ８０、ＣＥＡ、ＣＥＡ関連抗原、ＣＦＤ、ｃｈ４Ｄ５、ＣＬＤＮ１８．２、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、凝集因子Ａ、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＳＦ２、ＣＴＬＡ−４、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン受容体タイプ４、サイトメガロウイルス、サイトメガロウイルス糖タンパク質Ｂ、ダビガトラン、ＤＬＬ４、ＤＰＰ４、ＤＲ５、Ｅ．ｃｏｌｉ志賀毒素１型、Ｅ．ｃｏｌｉ志賀毒素２型、ＥＧＦＬ７、ＥＧＦＲ、エンドトキシン、ＥｐＣＡＭ、エピシアリン、ＥＲＢＢ３、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、ＲＳウイルスのＦタンパク質、ＦＡＰ、フィブリンＩＩベータ鎖、フィブロネクチンエクストラドメイン−Ｂ、葉酸ヒドロラーゼ、葉酸受容体１、葉酸受容体アルファ、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体、ガングリオシドＧＤ２、ＧＤ２、ＧＤ３ガングリオシド、グリピカン３、ＧＭＣＳＦ受容体α−鎖、ＧＰＮＭＢ、増殖分化因子８、ＧＵＣＹ２Ｃ、血液凝集素、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｂ型肝炎ウイルス、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＧＦ、ＨＨＧＦＲ、ヒストン複合体、ＨＩＶ−１、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＮＧＦ、Ｈｓｐ９０、ヒト細胞分散因子受容体キナーゼ、ヒトＴＮＦ、ヒトベータ−アミロイド、ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＩｇＥ、ＩｇＥ  Ｆｃ領域、ＩＧＦ−１受容体、ＩＧＦ−１、ＩＧＨＥ、ＩＬ１７Ａ、ＩＬ１７Ｆ、ＩＬ２０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−１β、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−３１ＲＡ、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−６受容体、ＩＬ−９、ＩＬＧＦ２、インフルエンザＡ血液凝集素、インフルエンザＡウイルス血液凝集素、インスリン様増殖因子Ｉ受容体、インテグリンα４β７、インテグリンα４、インテグリンα５β１、インテグリンα７β７、インテグリンαＩＩｂβ３、インテグリンαｖβ３、インターフェロンα／β受容体、インターフェロンガンマ誘導タンパク質、ＩＴＧＡ２、ＩＴＧＢ２（ＣＤ１８）、ＫＩＲ２Ｄ、ルイス−Ｙ抗原、ＬＦＡ−１（ＣＤ��１ａ）、ＬＩＮＧＯ−１、リポテイコ酸、ＬＯＸＬ２、Ｌ−セレクチン（ＣＤ６２Ｌ）、ＬＴＡ、ＭＣＰ−１、メソテリン、ＭＩＦ、ＭＳ４Ａ１、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ１、ムチンＣａｎＡｇ、ミエリン関連糖タンパク質、ミオスタチン、ＮＣＡ−９０（顆粒球抗原）、神経アポトーシス調節プロテイナーゼ１、ＮＧＦ、Ｎ−グリコリルノイラミン酸、ＮＯＧＯ−Ａ、Ｎｏｔｃｈ受容体、ＮＲＰ１、Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ、ＯＸ−４０、ｏｘＬＤＬ、ＰＣＳＫ９、ＰＤ−１、ＰＤＣＤ１、ＰＤＧＦ−Ｒα、リン酸ナトリウム共輸送体、ホスファチジルセリン、血小板由来増殖因子受容体ベータ、前立腺癌細胞、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、狂犬病ウイルス糖タンパク質、ＲＡＮＫＬ、ＲＳウイルス、ＲＨＤ、Ｒｈ因子、ＲＯＮ、ＲＴＮ４、スクレロスチン、ＳＤＣ１、セレクチンＰ、ＳＬＡＭＦ７、ＳＯＳＴ、スフィンゴシン−１−リン酸、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、ＳＴＥＡＰ１、ＴＡＧ−７２、Ｔ細胞受容体、ＴＥＭ１、テナシンＣ、ＴＦＰＩ、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、腫瘍抗原ＣＴＡＡ１６．８８、ＭＵＣ１の腫瘍特異的グリコシル化、腫瘍関連カルシウムシグナル伝達因子２、ＴＷＥＡＫ受容体、ＴＹＲＰ１（糖タンパク質７５）、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ビメンチン、およびＶＷＦからなる群より選択される抗原に結合する。
【０２６３】
一部の実施形態では、リガンド結合ドメインは、抗体模倣体に結合することができる。本明細書において他所で記載される抗体模倣体は、抗体と同等の親和性で標的分子に結合することができる。一部の実施形態では、リガンド結合ドメインは、本明細書において他所で記載されるヒト化抗体に結合することができる。一部の実施形態では、キメラ膜貫通受容体のリガンド結合ドメインは、ヒト化抗体の断片に結合することができる。一部の実施形態では、リガンド結合ドメインは、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）に結合することができる。
【０２６４】
一部の実施形態では、リガンド結合ドメインは、適した哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、またはサル）の免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、またはＩｇＥ）のＦｃ部分に結合する。適したＦｃ結合ドメインは、哺乳動物Ｆｃ受容体などの天然に存在するタンパク質、またはある特定の細菌タンパク質（例えば、プロテインＡおよびプロテインＧ）に由来しうる。加えて、Ｆｃ結合ドメインは、所望の親和性および特異性で本明細書に記載のＩｇ分子のいずれかのＦｃ部分に結合するように特異的に操作された合成ポリペプチドでありうる。例えば、そのようなＦｃ結合ドメインは、免疫グロブリンのＦｃ部分に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片でありうる。例には、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ドメイン抗体、およびナノボディが挙げられるがこれらに限定されない。あるいは、Ｆｃ結合ドメインは、Ｆｃ部分に特異的に結合する合成ペプチド、例えばクニッツドメイン、低分子モジュール性免疫薬（ＳＭＩＰ）、アドネクチン、アビマー（ａｖｉｍｅｒ）、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）、ＤＡＲＰｉｎ、またはアンチカリンでありえ、これらは、Ｆｃに対する結合活性に関して、ペプチドライブラリをスクリーニングすることによって同定されうる。
【０２６５】
一部の実施形態では、リガンド結合ドメインは、哺乳動物Ｆｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメインを含むＦｃ結合ドメインを含む。Ｆｃ受容体は、一般的に、多くの免疫細胞（Ｂ細胞、樹状細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、好中球、肥満細胞、および好酸球を含む）の表面上に発現される細胞表面受容体であり、抗体のＦｃドメインに対して結合特異性を示す。一部の例では、抗体のＦｃ部分にＦｃ受容体が結合すると、抗体依存的細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）効果を誘発することができる。本明細書に記載のキメラ膜貫通受容体ポリペプチドを構築するために使用されるＦｃ受容体は、天然に存在する多型バリアント、例えば野生型対応物と比較してＦｃドメインに対して変化した（例えば、増加または減少した）親和性を有しうるバリアントでありうる。あるいは、Ｆｃ受容体は、Ｉｇ分子のＦｃ部分に対する結合親和性を変化させる１つまたは複数の変異（例えば、最大１０アミノ酸残基の置換）を有する、野生型対応物の機能的バリアントでありうる。一部の実施形態では、変異は、Ｆｃ受容体のグリコシル化パターンを変化させ、このようにＦｃドメインに対する結合親和性を変化させうる。
【０２６６】
表１は、Ｆｃ受容体細胞外ドメインの複数の例示的な多型を記載する（例えば、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｅｖｏｌ．５３：１−９，  ２００１を参照されたい）。
【表１】
2020530309.tif 000003
【０２６７】
Ｆｃ受容体は、一般的に、それが結合することができる抗体のアイソタイプに基づいて分類されうる。例えば、Ｆｃ−ガンマ受容体（ＦｃγＲ）は、一般的にＩｇＧ抗体（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４）に結合し；Ｆｃ−アルファ受容体（ＦｃαＲ）は、一般的にＩｇＡ抗体に結合し；およびＦｃ−イプシロン受容体（ＦｃεＲ）は、一般的にＩｇＥ抗体に結合する。一部の実施形態では、リガンド結合ドメインは、Ｆｃγ受容体またはそのいずれかのバリアントを含む。一部の実施形態では、リガンド結合ドメインは、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩｂ、ＦｃγＲＩｃ、アロタイプＨ１３１およびＲ１３１を含むＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＢ−１およびＦｃγＲＩＩＢ−２を含むＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２）、アロタイプＶ１５８およびＦ１５８を含むＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）、アロタイプＦｃγＲＩＩＩｂ−ＮＡ１およびＦｃγＲＩＩＩｂ−ＮＡ２を含むＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）、ならびにそのいずれかのバリアントから選択されるＦｃＲを含むＦｃ結合ドメインを含む。ＦｃγＲは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、およびサルを含むがこれらに限定されない任意の生物に由来しうる。マウスＦｃγＲは、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、およびＦｃγＲＩＩＩ−２（ＣＤ１６−２）を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、リガンド結合ドメインは、Ｆｃε受容体またはそのいずれかのバリアントを含む。一部の実施形態では、リガンド結合ドメインは、ＦｃεＲＩ、ＦｃεＲＩＩ（ＣＤ２３）、およびそのいずれかのバリアントから選択されるＦｃＲを含む。一部の実施形態では、リガンド結合ドメインは、Ｆｃα受容体またはそのいずれかのバリアントを含む。一部の実施形態では、リガンド結合ドメインは、ＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）、Ｆｃα／μＲ、およびそのいずれかのバリアントから選択されるＦｃＲを含む。一部の実施形態では、リガンド結合ドメインは、ＦｃＲｎ、およびそのいずれかのバリアントから選択されるＦｃＲを含む。キメラ膜貫通受容体において使用するためのＦｃ受容体のリガンド結合ドメインの選択は、Ｆｃ結合ドメインの結合が望ましい抗体のアイソタイプおよび結合相互作用の所望の親和性などの様々な要因に依存しうる。
【０２６８】
一部の実施形態では、リガンド結合ドメインは、Ｆｃドメインに対する親和性をモジュレートすることができる天然に存在する多型を組み入れうるＣＤ１６の細胞外リガンド結合ドメインを含む。一部の実施形態では、リガンド結合ドメインは、１５８位（例えば、バリンまたはフェニルアラニン）で多型を組み入れるＣＤ１６の細胞外リガンド結合ドメインを含む。一部の実施形態では、リガンド結合ドメインは、そのグリコシル化状態およびＦｃドメインに対するその親和性を変化させる条件下で産生される。一部の実施形態では、リガンド結合ドメインは、それを組み入れるキメラ膜貫通受容体ポリペプチドを、ＩｇＧ抗体のサブセットに対して特異的にする改変を組み入れるＣＤ１６の細胞外リガンド結合ドメインを含む。
【０２６９】
例えば、ＩｇＧサブタイプ（例えば、ＩｇＧ１）に対する親和性を増加または減少させる変異を組み入れてもよい。一部の実施形態では、リガンド結合ドメインは、Ｆｃドメインに対する親和性をモジュレートしうる天然に存在する多型を組み入れうるＣＤ３２の細胞外リガンド結合ドメインを含む。一部の実施形態では、リガンド結合ドメインは、それを組み入れるキメラ膜貫通受容体ポリペプチドを、ＩｇＧ抗体のサブセットに対して特異的にする改変を組み入れるＣＤ３２の細胞外リガンド結合ドメインを含む。例えば、ＩｇＧサブタイプ（例えば、ＩｇＧ１）に対する親和性を増加または減少させる変異を組み入れてもよい。
【０２７０】
一部の実施形態では、リガンド結合ドメインは、Ｆｃドメインに対する親和性をモジュレートしうる天然に存在する多型を組み入れうるＣＤ６４の細胞外リガンド結合ドメインを含む。一部の実施形態では、リガンド結合ドメインは、そのグリコシル化状態およびＦｃドメインに対するその親和性を変化させる条件下で産生される。一部の実施形態では、リガンド結合ドメインは、それを組み入れるキメラ膜貫通受容体ポリペプチドを、ＩｇＧ抗体のサブセットに対して特異的にする改変を組み入れるＣＤ６４の細胞外リガンド結合ドメインを含む。例えば、ＩｇＧサブタイプ（例えば、ＩｇＧ１）に対する親和性を増加または減少させる変異を組み入れてもよい。
【０２７１】
他の実施形態では、リガンド結合ドメインは、ＩｇＧ分子、またはそのいずれかのバリアント（例えば、プロテインＡ、プロテインＧ）のＦｃ部分に結合することが可能な天然に存在する細菌タンパク質を含む。一部の実施形態では、リガンド結合ドメインは、プロテインＡ、またはそのいずれかのバリアントを含む。プロテインＡは、細菌Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの細胞壁に当初見出された４２ｋＤａ表面タンパク質を指す。これは、各々が３つのヘリックスバンドルにそれぞれフォールディングし、ほとんどの抗体のＦｃ領域との相互作用を通してＩｇＧに結合することができる５つのドメイン、ならびにヒトＶＨ３ファミリー抗体のＦａｂ領域で構成される。一部の実施形態では、リガンド結合ドメインは、プロテインＧ、またはそのいずれかのバリアントを含む。プロテインＧは、哺乳動物ＩｇＧのＦａｂおよびＦｃ領域の両方に結合する、ＣおよびＧ群連鎖球菌細菌において発現されるおよそ６０ｋＤａのタンパク質を指す。ネイティブのプロテインＧもまた、アルブミンに結合するが、アルブミンに結合しない組換えバリアントが作出されている。
【０２７２】
リガンド結合ドメインはまた、コンビナトリアルバイオロジーまたは定向進化法を使用してｄｅ  ｎｏｖｏで作製することもできる。タンパク質足場（例えば、ＩｇＧに由来するｓｃＦｖ、クニッツ型プロテアーゼ阻害剤に由来するクニッツドメイン、アンキリンリピート、プロテインＡからのＺドメイン、リポカリン、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン、ＦｙｎからのＳＨ３ドメイン、またはその他）から開始して、表面上の残基の組に関するアミノ酸側鎖を、バリアント足場の大きいライブラリを作製するためにランダムに置換してもよい。大きいライブラリから、最初に結合に関して選択することによってＦｃドメインのような標的に対する親和性を有するバリアントを単離し、その後にファージ、リボソーム、または細胞ディスプレイによる増幅を行うことが可能である。選択および増幅の繰り返しラウンドを使用して、標的に対して最高の親和性を有するタンパク質を単離することができる。例示的なＦｃ結合ペプチドは、ＥＴＱＲＣＴＷＨＭＧＥＬＶＷＣＥＲＥＨＮ、ＫＥＡＳＣＳＹＷＬＧＥＬＶＷＣＶＡＧＶＥ、またはＤＣＡＷＨＬＧＥＬＶＷＣＴのアミノ酸配列を含みうる。
【０２７３】
本明細書に記載のＦｃ結合体のいずれかは、抗体のＦｃドメインに対して適した結合親和性を有しうる。結合親和性は、見かけの結合定数またはＫＡを指す。ＫＡは、解離定数ＫＤの逆数である。本明細書に記載のキメラ膜貫通受容体ポリペプチドのＦｃ受容体ドメインの細胞外リガンド結合ドメインは、抗体のＦｃ部分に関して少なくとも１０−５、１０−６、１０−７、１０−８、１０−９、１０−１０Ｍ、またはそれより低い結合親和性ＫＤを有しうる。一部の実施形態では、抗体のＦｃ部分に結合するリガンド結合ドメインは、別の抗体、抗体のアイソタイプ、またはそのサブタイプに対するリガンド結合ドメインの結合親和性と比較して、抗体、抗体のアイソタイプ、またはそのサブタイプに対して高い結合親和性を有する。
【０２７４】
一部の実施形態では、Ｆｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、別の抗体、抗体のアイソタイプ、またはそのサブタイプに対するＦｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメインの結合と比較して、ある抗体、抗体のアイソタイプ、またはそのサブタイプに対して特異性を有する。比較的高い親和性結合を有するＦｃγ受容体は、ＣＤ６４Ａ、ＣＤ６４Ｂ、およびＣＤ６４Ｃを含む。比較的低い親和性結合を有するＦｃγ受容体は、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂ、ＣＤ１６Ａ、およびＣＤ１６Ｂを含む。比較的高い親和性結合を有するＦｃε受容体は、ＦｃεＲＩを含み、ならびに比較的低い親和性結合を有するＦｃε受容体は、ＦｃεＲＩＩ／ＣＤ２３を含む。
【０２７５】
Ｆｃ受容体、またはそのいずれかのバリアント、またはＦｃ結合ドメインを含むキメラ膜貫通受容体に対する結合親和性または結合特異性は、平衡透析、平衡結合、ゲル濾過、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴、および分光法を含む多様な方法によって決定することができる。
【０２７６】
一部の実施形態では、Ｆｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメインを含むリガンド結合ドメインは、天然に存在するＦｃγ受容体、Ｆｃα受容体、Ｆｃε受容体、またはＦｃＲｎの細胞外リガンド結合ドメインのアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより高く）同一であるアミノ酸配列を含む。２つのアミノ酸配列の「パーセント同一性」または「％同一性」は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：５８７３−７７，  １９９３によって改作されたＫａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７：２２６４−６８，  １９９０のアルゴリズムを使用して決定することができる。そのようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０，  １９９０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み入れられている。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で実施して本開示のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得ることができる。２つの配列間にギャップが存在する場合、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２，  １９９７に記載されるように利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを使用することができる。
【０２７７】
一部の実施形態では、リガンド結合ドメインは、Ｆｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメインのバリアントを含むＦｃ結合ドメインを含む。一部の実施形態では、Ｆｃ受容体のバリアント細胞外リガンド結合ドメインは、基準の細胞外リガンド結合ドメインのアミノ酸配列と比較して最大１０個のアミノ酸残基の変動（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個）を含みうる。一部の実施形態では、バリアントは、遺伝子多型による天然に存在するバリアントでありうる。他の実施形態では、バリアントは、天然に存在しない改変分子でありうる。例えば、Ｆｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメインに変異を導入して、そのグリコシル化パターンを変化させ、このように対応するＦｃドメインに対するその結合親和性を変化させることができる。
【０２７８】
一部の例では、リガンド結合ドメインは、本明細書に記載のＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂ、ＣＤ３２Ｃ、ＣＤ６４Ａ、ＣＤ６４Ｂ、ＣＤ６４Ｃ、またはそのバリアントから選択されるＦｃ受容体を含むＦｃ結合を含む。Ｆｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、本明細書に記載のＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂ、ＣＤ３２Ｃ、ＣＤ６４Ａ、ＣＤ６４Ｂ、ＣＤ６４Ｃの細胞外リガンド結合ドメインのアミノ酸配列と比較して最大１０個のアミノ酸残基の変動（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個）を含みうる。Ｆｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメインのアミノ酸残基の変異は、変異を含まないＦｃ受容体ドメインと比較して抗体、抗体のアイソタイプ、またはそのサブタイプに結合するＦｃ受容体ドメインの結合親和性の増加をもたらしうる。例えば、Ｆｃ−ガンマ受容体ＣＤ１６Ａの残基１５８の変異は、抗体のＦｃ部分に対するＦｃ受容体の結合親和性の増加をもたらしうる。一部の実施形態では、変異は、Ｆｃγ受容体ＣＤ１６Ａの残基１５８でのフェニルアラニンのバリンへの置換である。抗体などの分子のＦｃ部分に対する結合親和性を増強または低減しうる、様々な適した代替のまたは追加の変異を、Ｆｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメインに行ってもよい。
【０２７９】
リガンド結合ドメインを含む細胞外領域は、例えば膜貫通セグメントによって細胞内領域に連結することができる。一部の実施形態では、膜貫通セグメントは、ポリペプチドを含む。キメラ膜貫通受容体の細胞外領域と細胞内領域とを連結する膜貫通ポリペプチドは、任意の適したポリペプチド配列を有しうる。一部の例では、膜貫通ポリペプチドは、内因性または野生型膜貫通タンパク質の膜貫通部分のポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、膜貫通ポリペプチドは、内因性または野生型膜貫通タンパク質の膜貫通部分と比較して少なくとも１つ（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれより多く）のアミノ酸置換、欠失、および挿入を有するポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、膜貫通ポリペプチドは、非天然のポリペプチド配列、例えばポリペプチドリンカーの配列を含む。ポリペプチドリンカーは、可撓性でも剛性でもよい。ポリペプチドリンカーは、構造化されていても構造化されていなくてもいい。一部の実施形態では、膜貫通ポリペプチドは、受容体の細胞外領域から細胞内領域へのシグナル、例えばリガンド結合を示すシグナルを伝達する。
【０２８０】
ＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、免疫細胞シグナル伝達ドメインを含みうる。免疫細胞シグナル伝達ドメインは、免疫細胞のシグナル伝達に関与する任意のシグナル伝達ドメインまたはそのバリアントを含みうる。例えば、シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲ複合体の一次活性化の刺激性または阻害性の調節に関与する。一次シグナル伝達ドメインは、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）、Ｆｃε受容体（ＦｃεＲ）、Ｆｃα受容体（ＦｃαＲ）、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）、ＣＤ３、ＣＤ３ζ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３  ε、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２８、ＣＤ３２、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）、ＣＤ４５、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳとしても公知）、ＣＤ２４７ζ、ＣＤ２４７η、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＦＹＮ、ＬＡＴ、Ｌｃｋ、ＭＡＰＫ、ＭＨＣ複合体、ＮＦＡＴ、ＮＦ−κＢ、ＰＬＣ−γ、ｉＣ３ｂ、Ｃ３ｄｇ、Ｃ３ｄ、およびＺａｐ７０のシグナル伝達ドメインを含みうる。一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、免疫受容体活性化チロシンモチーフまたはＩＴＡＭを含む。ＩＴＡＭを含む一次シグナル伝達ドメインは、６〜８アミノ酸によって隔てられ、各ｘが独立した任意のアミノ酸であるアミノ酸配列ＹｘｘＬ／Ｉの２つの反復配列を含み、保存されたモチーフＹｘｘＬ／Ｉｘ（６−８）ＹｘｘＬ／Ｉを産生しうる。ＩＴＡＭを含む一次シグナル伝達ドメインは、リガンド結合ドメインが抗原に結合する場合に、例えばリン酸化によって改変されうる。リン酸化されたＩＴＡＭは、他のタンパク質、例えば様々なシグナル伝達経路に関与するタンパク質のためのドッキング部位として機能することができる。一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、改変されたＩＴＡＭドメイン、例えばネイティブＩＴＡＭドメインと比較して変化した（例えば、増加または減少した）活性を有する、変異した、トランケートされた、および／または最適化されたＩＴＡＭドメインを含む。
【０２８１】
一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、ＦｃγＲシグナル伝達ドメイン（例えば、ＩＴＡＭ）を含む。ＦｃγＲシグナル伝達ドメインは、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）、およびＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）から選択されうる。一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、ＦｃεＲシグナル伝達ドメイン（例えば、ＩＴＡＭ）を含む。ＦｃεＲシグナル伝達ドメインは、ＦｃεＲＩおよびＦｃεＲＩＩ（ＣＤ２３）から選択されうる。一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、ＦｃαＲシグナル伝達ドメイン（例えば、ＩＴＡＭ）を含む。ＦｃαＲシグナル伝達ドメインは、ＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）およびＦｃα／μＲから選択されうる。一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζのＩＴＡＭを含む。
【０２８２】
一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、免疫受容体抑制性チロシンモチーフまたはＩＴＩＭを含む。ＩＴＩＭを含むシグナル伝達ドメインは、免疫系の一部の阻害性受容体の細胞質テールに見出されるアミノ酸の保存された配列（Ｓ／Ｉ／Ｖ／ＬｘＹｘｘＩ／Ｖ／Ｌ）を含みうる。ＩＴＩＭを含むシグナル伝達ドメインは、改変されうる、例えばＳｒｃキナーゼファミリーメンバー（例えば、Ｌｃｋ）などの酵素によってリン酸化されうる。リン酸化後、酵素を含む他のタンパク質をＩＴＩＭに動員することができる。これらの他のタンパク質には、ホスホチロシンホスファターゼＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２、ＳＨＩＰと呼ばれるイノシトールホスファターゼ、および１つまたは複数のＳＨ２ドメインを有するタンパク質（例えば、ＺＡＰ７０）などの酵素が挙げられるがこれらに限定されない。シグナル伝達ドメインは、ＢＴＬＡ、ＣＤ５、ＣＤ３１、ＣＤ６６ａ、ＣＤ７２、ＣＭＲＦ３５Ｈ、ＤＣＩＲ、ＥＰＯ−Ｒ、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２）、Ｆｃ受容体様タンパク質２（ＦＣＲＬ２）、Ｆｃ受容体様タンパク質３（ＦＣＲＬ３）、Ｆｃ受容体様タンパク質４（ＦＣＲＬ４）、Ｆｃ受容体様タンパク質５（ＦＣＲＬ５）、Ｆｃ受容体様タンパク質６（ＦＣＲＬ６）、タンパク質Ｇ６ｂ（Ｇ６Ｂ）、インターロイキン４受容体（ＩＬ４Ｒ）、免疫グロブリンスーパーファミリー受容体転座関連１（ＩＲＴＡ１）、免疫グロブリンスーパーファミリー受容体転座関連２（ＩＲＴＡ２）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体２ＤＬ１（ＫＩＲ２ＤＬ１）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体２ＤＬ２（ＫＩＲ２ＤＬ２）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体２ＤＬ３（ＫＩＲ２ＤＬ３）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体２ＤＬ４（ＫＩＲ２ＤＬ４）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体２ＤＬ５（ＫＩＲ２ＤＬ５）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体３ＤＬ１（ＫＩＲ３ＤＬ１）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体３ＤＬ２（ＫＩＲ３ＤＬ２）、白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー１（ＬＩＲ１）、白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー２（ＬＩＲ２）、白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー３（ＬＩＲ３）、白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー５（ＬＩＲ５）、白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー８（ＬＩＲ８）、白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ−１）、肥満細胞機能関連抗原（ＭＡＦＡ）、ＮＫＧ２Ａ、天然細胞傷害誘発受容体２（ＮＫｐ４４）、ＮＴＢ−Ａ、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）、ＰＩＬＲ、ＳＩＧＬＥＣＬ１、シアル酸結合Ｉｇ様レクチン２（ＳＩＧＬＥＣ２またはＣＤ２２）、シアル酸結合Ｉｇ様レクチン３（ＳＩＧＬＥＣ３またはＣＤ３３）、シアル酸結合Ｉｇ様レクチン５（ＳＩＧＬＥＣ５またはＣＤ１７０）、シアル酸結合Ｉｇ様レクチン６（ＳＩＧＬＥＣ６）、シアル酸結合Ｉｇ様レクチン７（ＳＩＧＬＥＣ７）、シアル酸結合Ｉｇ様レクチン１０（ＳＩＧＬＥＣ１０）、シアル酸結合Ｉｇ様レクチン１１（ＳＩＧＬＥＣ１１）、シアル酸結合Ｉｇ様レクチン４（ＳＩＧＬＥＣ４）、シアル酸結合Ｉｇ様レクチン８（ＳＩＧＬＥＣ８）、シアル���結合Ｉｇ様レクチン９（ＳＩＧＬＥＣ９）、血小板および内皮細胞接着分子１（ＰＥＣＡＭ−１）、シグナル調節タンパク質（ＳＩＲＰ２）、およびシグナル伝達閾値調節膜貫通アダプター１（ＳＩＴ）のシグナル伝達ドメイン（例えば、ＩＴＩＭ）を含みうる。一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、改変されたＩＴＩＭドメイン、例えばネイティブＩＴＩＭドメインと比較して変化した（例えば、増加または減少した）活性を有する、変異した、トランケートされた、および／または最適化されたＩＴＩＭドメインを含む。
【０２８３】
一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、少なくとも２つのＩＴＡＭドメイン（例えば、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、または１０個のＩＴＡＭドメイン）を含む。一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、少なくとも２つのＩＴＩＭドメイン（例えば、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、または１０個のＩＴＩＭドメイン）（例えば、少なくとも２つの一次シグナル伝達ドメイン）を含む。一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、ＩＴＡＭおよびＩＴＩＭドメインの両方を含む。キメラ膜貫通受容体の細胞内領域にあるシグナル伝達ドメインは、共刺激ドメインを含みうる。一部の実施形態では、例えば共刺激分子からの共刺激ドメインは、例えば免疫細胞の活性化および／または非活性化のために、ＩＴＡＭおよび／またはＩＴＩＭドメインからのシグナル伝達などの免疫細胞シグナル伝達のための共刺激シグナルを提供することができる。一部の実施形態では、共刺激ドメインは、免疫細胞における増殖および／または生存シグナルを調節するために作動可能である。一部の実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＭＨＣクラスＩタンパク質、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、またはＴｏｌｌリガンド受容体のシグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、共刺激ドメインは、２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４、４−１ＢＢ／ＴＮＦＳＦ９／ＣＤ１３７、Ｂ７−１／ＣＤ８０、Ｂ７−２／ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ１／ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ６、Ｂ７−Ｈ７、ＢＡＦＦ  Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＢＬＡＭＥ／ＳＬＡＭＦ８、ＢＴＬＡ／ＣＤ２７２、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ１０３、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｄ、ＣＤ１５０、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２、ＣＤ２００、ＣＤ２２９／ＳＬＡＭＦ３、ＣＤ２７リガンド／ＴＮＦＳＦ７、ＣＤ２７／ＴＮＦＲＳＦ７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ２Ｆ−１０／ＳＬＡＭＦ９、ＣＤ３０リガンド／ＴＮＦＳＦ８、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、ＣＤ３００ａ／ＬＭＩＲ１、ＣＤ４、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５、ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５、ＣＤ４８／ＳＬＡＭＦ２、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９Ｄ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５３、ＣＤ５８／ＬＦＡ−３、ＣＤ６９、ＣＤ７、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ８２／Ｋａｉ−１、ＣＤ８４／ＳＬＡＭＦ５、ＣＤ９０／Ｔｈｙ１、ＣＤ９６、ＣＤＳ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＡＣＣ／ＳＬＡＭＦ７、ＣＲＴＡＭ、ＣＴＬＡ−４、ＤＡＰ１２、デクチン−１／ＣＬＥＣ７Ａ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６、ＤＲ３／ＴＮＦＲＳＦ２５、ＥｐｈＢ６、ＧＡＤＳ、Ｇｉ２４／ＶＩＳＴＡ／Ｂ７−Ｈ５、ＧＩＴＲリガンド／ＴＮＦＳＦ１８、ＧＩＴＲ／ＴＮＦＲＳＦ１８、ＨＬＡクラスＩ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＶＥＭ／ＴＮＦＲＳＦ１４、ＩＡ４、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、イカロス、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、インテグリンα４／ＣＤ４���ｄ、インテグリンα４β１、インテグリンα４β７／ＬＰＡＭ−１、ＩＰＯ−３、ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＡＤ、ＩＴＧＡＥ、ＩＴＧＡＬ、ＩＴＧＡＭ、ＩＴＧＡＸ、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＢ２、ＩＴＧＢ７、ＫＩＲＤＳ２、ＬＡＧ−３、ＬＡＴ、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、ＬＴＢＲ、Ｌｙ１０８、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、リンフォトキシン−α／ＴＮＦ−β、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＴＢ−Ａ／ＳＬＡＭＦ６、ＯＸ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ４、ＯＸ４０／ＴＮＦＲＳＦ４、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＰＤ−１、ＰＤＣＤ６、ＰＤ−Ｌ２／Ｂ７−ＤＣ、ＰＳＧＬ１、ＲＥＬＴ／ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１）、ＳＬＡＭ／ＣＤ１５０、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ）、ＳＬＡＭＦ７、ＳＬＰ−７６、ＴＡＣＩ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＴＣＬ１Ａ、ＴＣＬ１Ｂ、ＴＩＭ−１／ＫＩＭ−１／ＨＡＶＣＲ、ＴＩＭ−４、ＴＬ１Ａ／ＴＮＦＳＦ１５、ＴＮＦ  ＲＩＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＴＮＦ−α、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＴＳＬＰ、ＴＳＬＰ  Ｒ、ＶＬＡ１、およびＶＬＡ−６からなる群より選択される分子のシグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、複数の共刺激ドメイン、例えば少なくとも２つ、例えば、少なくとも３、４、または５つの共刺激ドメインを含む。
【０２８４】
ＧＰＣＲを含む膜貫通受容体、またはその任意のバリアント（例えば、ＧＰＣＲ細胞外、膜貫通、および細胞内ドメインのうちの少なくとも１つを含む合成またはキメラ受容体）は、任意の好適なＧＰＣＲリガンド、またはその任意のバリアントを含むリガンドに結合することができる。ＧＰＣＲによって結合され得るリガンドの非限定例としては、（−）−アドレナリン、（−）−ノルアドレナリン、（リゾ）リン脂質メディエータ、［ｄｅｓ−Ａｒｇ１０］カリジン、［ｄｅｓ−Ａｒｇ９］ブラジキニン、［ｄｅｓ−Ｇｌｎ１４］グレリン、［Ｈｙｐ３］ブラジキニン、［Ｌｅｕ］エンケファリン、［Ｍｅｔ］エンケファリン、１２−ヒドロキシヘプタデカトリエン酸、１２Ｒ−ＨＥＴＥ、１２Ｓ−ＨＥＴＥ、１２Ｓ−ＨＰＥＴＥ、１５Ｓ−ＨＥＴＥ、１７β−エストラジオール、２０−ヒドロキシ−ＬＴＢ４、２−アラキドノイルグリセロール、２−オレオイル−ＬＰＡ、３−ヒドロキシオクタン酸、５−ヒドロキシトリプタミン、５−オキソ−１５−ＨＥＴＥ、５−オキソ−ＥＴＥ、５−オキソ−ＥＴｒＥ、５−オキソ−ＯＤＥ、５Ｓ−ＨＥＴＥ、５Ｓ−ＨＰＥＴＥ、７α，２５−ジヒドロキシコレステロール、アセチルコリン、ＡＣＴＨ、アデノシン二リン酸、アデノシン、アドレノメジュリン２／インターメジン、アドレノメジュリン、アミリン、アナンダミド、アンギオテンシンＩＩ、アンギオテンシンＩＩＩ、アネキシンＩ、アペリン受容体初期内因性リガンド、アペリン−１３、アペリン−１７、アペリン−３６、アスピリン誘発性リポキシンＡ４、アスピリン誘発性レゾルビンＤ１、ＡＴＰ、ベータ−ディフェンシン４Ａ、ビッグダイノルフィン、ウシ副腎髄質ペプチド８−２２、ブラジキニン、Ｃ３ａ、Ｃ５ａ、Ｃａ２＋、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、カルシトニン、カテプシンＧ、ＣＣＫ−３３、ＣＣＫ−４、ＣＣＫ−８、ＣＣＬ１、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ケメリン、ケノデオキシコール酸、コール酸、コルチコトロフィン放出ホルモン、ＣＳＴ−１７、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２α、ＣＸＣＬ１２β、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、システイニル−ロイコトリエン（ＣｙｓＬＴ）、ウラシルヌクレオチド、デオキシコール酸、ジヒドロスフィンゴシン−１−リン酸、ジオレオイルホスファチジン酸、ドーパミン、ダイノルフィンＡ、ダイノルフィンＡ−（１−１３）、ダイノルフィンＡ−（１−８）、ダイノルフィンＢ、エンドモルフィン−１、エンドセリン−１、エンドセリン−２、エンドセリン−３、Ｆ２Ｌ、遊離脂肪酸、ＦＳＨ、ＧＡＢＡ、ガラニン、ガラニン様ペプチド、胃抑制性ポリペプチド、ガストリン−１７、ガストリン放出ペプチド、グレリン、ＧＨＲＨ、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド１−（７−３６）アミド、グルカゴン様ペプチド１−（７−３７）、グルカゴン様ペプチド２���グルカゴン様ペプチド２−（３−３３）、ＧｎＲＨＩ、ＧｎＲＨＩＩ、ＧＲＰ−（１８−２７）、ｈＣＧ、ヒスタミン、ヒューマニン、ＩＮＳＬ３、ＩＮＳＬ５、カリジン、キスペプチン−１０、キスペプチン−１３、キスペプチン−１４、キスペプチン−５４、キヌレン酸、ラージニューロメジンＮ、ラージニューロテンシン、Ｌ−グルタミン酸、ＬＨ、リトコール酸、Ｌ−乳酸、長鎖カルボン酸、ＬＰＡ、ＬＴＢ４、ＬＴＣ４、ＬＴＤ４、ＬＴＥ４、ＬＸＡ４、Ｌｙｓ−［Ｈｙｐ３］−ブラジキニン、リゾホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルセリン、中鎖脂肪酸、メラニン凝集ホルモン、メラトニン、メチルカルバミルＰＡＦ、Ｍｇ２＋、モチリン、Ｎ−アラキドノイルグリシン、ニューロキニンＡ、ニューロキニンＢ、ニューロメジンＢ、ニューロメジンＮ、ニューロメジンＳ−３３、ニューロメジンＵ−２５、ニューロノスタチン、神経ペプチドＡＦ、神経ペプチドＢ−２３、神経ペプチドＢ−２９、神経ペプチドＦＦ、神経ペプチドＳ、神経ペプチドＳＦ、神経ペプチドＷ−２３、神経ペプチドＷ−３０、神経ペプチドＹ、神経ペプチドＹ−（３−３６）、ニューロテンシン、ノシセプチン／オーファニンＦＱ、Ｎ−オレオイルエタノールアミド、オベスタチン、オクトパミン、オレキシン−Ａ、オレキシン−Ｂ、オキシステロール、オキシトシン、ＰＡＣＡＰ−２７、ＰＡＣＡＰ−３８、ＰＡＦ、膵ポリペプチド、ペプチドＹＹ、ＰＧＤ２、ＰＧＥ２、ＰＧＦ２α、ＰＧＩ２、ＰＧＪ２、ＰＨＭ、ホスファチジルセリン、ＰＨＶ、プロキネチシン−１、プロキネチシン−２、プロキネチシン−２β、プロサポシン、ＰｒＲＰ−２０、ＰｒＲＰ−３１、ＰＴＨ、ＰＴＨｒＰ、ＰＴＨｒＰ−（１−３６）、ＱＲＦＰ４３、リラキシン、リラキシン−１、リラキシン−３、レゾルビンＤ１、レゾルビンＥ１、ＲＦＲＰ−１、ＲＦＲＰ−３、Ｒ−スポンジン、セクレチン、セリンプロテアーゼ、スフィンゴシン１−リン酸、スフィンゴシルホスホリルコリン、ＳＲＩＦ−１４、ＳＲＩＦ−２８、サブスタンスＰ、コハク酸、トロンビン、トロンボキサンＡ２、ＴＩＰ３９、Ｔ−キニン、ＴＲＨ、ＴＳＨ、チラミン、ＵＤＰ−グルコース、ウリジン二リン酸、ウロコルチン１、ウロコルチン２、ウロコルチン３、ウロテンシンＩＩ関連ペプチド、ウロテンシン−ＩＩ、バソプレッシン、ＶＩＰ、Ｗｎｔ、Ｗｎｔ−１、Ｗｎｔ−１０ａ、Ｗｎｔ−１０ｂ、Ｗｎｔ−１１、Ｗｎｔ−１６、Ｗｎｔ−２、Ｗｎｔ−２ｂ、Ｗｎｔ−３、Ｗｎｔ−３ａ、Ｗｎｔ−４、Ｗｎｔ−５ａ、Ｗｎｔ−５ｂ、Ｗｎｔ−６、Ｗｎｔ−７ａ、Ｗｎｔ−７ｂ、Ｗｎｔ−８ａ、Ｗｎｔ−８ｂ、Ｗｎｔ−９ａ、Ｗｎｔ−９ｂ、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２、Ｚｎ２＋、α−ＣＧＲＰ、α−ケトグルタル酸、α−ＭＳＨ、α−ネオエンドルフィン、β−アラニン、β−ＣＧＲＰ、β−Ｄ−ヒドロキシ酪酸、β−エンドルフィン、β−ＭＳＨ、β−ネオエンドルフィン、β−フェニルエチルアミン、およびγ−ＭＳＨが挙げられる。
【０２８５】
インテグリンサブユニットを含む膜貫通受容体、またはその任意のバリアント（例えば、インテグリン細胞外、膜貫通、および細胞内ドメインのうちの少なくとも１つを含む合成またはキメラ受容体）は、任意の好適なインテグリンリガンド、またはその任意のバリアントを含むリガンドに結合することができる。インテグリン受容体によって結合され得るリガンドの非限定例としては、アデノウイルスペントン塩基タンパク質、ベータ−グルカン、骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、コラーゲン（ＣＮ、例えば、ＣＮＩ−ＩＶ）、サイトタクチン／テナシン−Ｃ、デコルシン、変性コラーゲン、ディスインテグリン、Ｅ−カドヘリン、エコーウイルス１受容体、エピリグリン（ｅｐｉｌｉｇｒｉｎ）、第Ｘ因子、ＦｃエプシロンＲＩＩ（ＣＤ２３）、フィブリン（Ｆｂ）、フィブリノゲン（Ｆｇ）、フィブロネクチン（Ｆｎ）、ヘパリン、ＨＩＶ  Ｔａｔタンパク質、ｉＣ３ｂ、細胞間接着分子（例えば、ＩＣＡＭ−１，２，３，４，５）、インベイシン、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１−ＣＡＭ）、ラミニン、リポ多糖（ＬＰＳ）、ＭＡｄＣＡＭ−１、マトリクスメタロプロテイナーゼ−２（ＭＭＰｅ）、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、オステオポンチン（ＯＰまたはＯＰＮ）、プラスミノゲン、プロトロンビン、精子ファーチリン、トロンボスポンジン（ＴＳＰ）、血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ−１）、ビトロネクチン（ＶＮまたはＶＴＮ）、およびフォンヴィルブランド因子（ｖＷＦ）が挙げられる。
【０２８６】
カドヘリンを含む膜貫通受容体、またはその任意のバリアント（例えば、カドヘリン細胞外、膜貫通、および細胞内ドメインのうちの少なくとも１つを含む合成またはキメラ受容体）は、任意の好適なカドヘリンリガンド、またはその任意のバリアントを含むリガンドに結合することができる。カドヘリンリガンドは、例えば、別のカドヘリン受容体（例えば、細胞のカドヘリン受容体）を含んでもよい。
【０２８７】
ＲＴＫを含む膜貫通受容体、またはその任意のバリアント（例えば、ＲＴＫ細胞外、膜貫通、および細胞内ドメインのうちの少なくとも１つを含む合成またはキメラ受容体）は、任意の好適なＲＴＫリガンド、またはその任意のバリアントを含むリガンドに結合することができる。ＲＴＫリガンドの非限定例としては、増殖因子、サイトカイン、およびホルモンが挙げられる。増殖因子としては、例えば、上皮増殖因子ファミリーのメンバー（例えば、上皮増殖因子またはＥＧＦ、ヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子またはＨＢ−ＥＧＦ、トランスフォーミング増殖因子−αまたはＴＧＦ−α、アンフィレグリンまたはＡＲ、エピレグリンまたはＥＰＲ、エピゲン、ベータセルリンまたはＢＴＣ、ニューレグリン−１またはＮＲＧ１、ニューレグリン−２またはＮＲＧ２、ニューレグリン−３またはＮＲＧ３、およびニューレグリン−４またはＮＲＧ４）、線維芽細胞増殖因子ファミリーのメンバー（例えば、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１５／１９、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、およびＦＧＦ２３）、血管内皮増殖因子ファミリーのメンバー（例えば、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、およびＰＩＧＦ）、ならびに血小板由来増殖因子ファミリーのメンバー（例えば、ＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦＢ、ＰＤＧＦＣ、およびＰＤＧＦＤ）が挙げられる。ホルモンとしては、例えば、インスリン／ＩＧＦ／リラキシンファミリーのメンバー（例えば、インスリン、インスリン様増殖因子、リラキシン１、リラキシン２、リラキシン３を含むリラキシンファミリーペプチド、Ｌｅｙｄｉｇ細胞特異的インスリン様ペプチド（ＩＮＳＬ３遺伝子）、早期胎盤インスリン様ペプチド（ＥＬＩＰ）（ＩＮＳＬ４遺伝子）、インスリン様ペプチド５（ＩＮＳＬ５遺伝子）、およびインスリン様ペプチド６）が挙げられる。
【０２８８】
サイトカイン受容体を含む膜貫通受容体、またはその任意のバリアント（例えば、サイトカイン受容体細胞外、膜貫通、および細胞内ドメインのうちの少なくとも１つを含む合成またはキメラ受容体）は、任意の好適なサイトカイン受容体リガンド、またはその任意のバリアントを含むリガンドに結合することができる。サイトカイン受容体リガンドの非限定例としては、インターロイキン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、およびＩＬ−３１）、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ）、コロニー刺激因子（例えば、エリスロポエチン、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子またはＧＭ−ＣＳＦ、および顆粒球コロニー刺激因子またはＧ−ＣＳＦ）、ならびにホルモン（例えば、プロラクチンおよびレプチン）が挙げられる。
【０２８９】
細胞死受容体を含む膜貫通受容体、またはその任意のバリアント（例えば、細胞死受容体細胞外、膜貫通、および細胞内ドメインのうちの少なくとも１つを含む合成またはキメラ受容体）は、細胞死受容体の任意の好適なリガンド、またはその任意のバリアントを含むリガンドに結合することができる。細胞死受容体によって結合されるリガンドの非限定例としては、ＴＮＦα、Ｆａｓリガンド、およびＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）が挙げられる。
【０２９０】
キメラ抗原受容体を含む膜貫通受容体は、膜結合型リガンド（例えば、抗原）を含むリガンド、例えば、細胞（例えば、標的細胞）の細胞外表面に結合したリガンドに結合することができる。一部の実施形態では、リガンドは、非膜結合型、例えば、細胞（例えば、標的細胞）によって分泌される細胞外リガンドではない。リガンド（例えば、膜結合型および非膜結合型）は、抗原性であってもよく（例えば、免疫応答を惹起する）、ウイルス、細菌、および／もしくは寄生生物感染症などの疾患；炎症および／もしくは自己免疫疾患；またはがんおよび／もしくは腫瘍などの新生物と関連してもよい。がん抗原は、例えば、免疫応答、特に、Ｔ細胞媒介性免疫応答を惹起することができる腫瘍細胞によって産生されるタンパク質である。キメラ受容体ポリペプチドの抗原結合部分の選択は、標的化しようとするがん抗原の特定の型に依存してもよい。一部の実施形態では、腫瘍抗原は、悪性腫瘍と関連する１つまたは複数の抗原性がんエピトープを含む。悪性腫瘍は、免疫攻撃のための標的抗原として働き得るいくつかのタンパク質を発現し得る。抗原相互作用ドメインは、細胞表面シグナル、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）、パラクリンシグナル、ジャクスタクリンシグナル、エンドクリンシグナル、オートクリンシグナル、細胞中の遺伝子プログラムを誘発もしくは制御することができるシグナル、またはそれらの任意の組合せに結合することができる。一部の実施形態では、組換えキメラ受容体ポリペプチドに結合する細胞シグナル間の相互作用は、細胞間相互作用、細胞−可溶性化学物質相互作用、および細胞−マトリクスまたは微小環境相互作用を含む。
【０２９１】
本明細書の態様の様々な実施形態では、リガンドの膜貫通受容体への結合は、細胞のシグナル伝達経路を活性化する。シグナル伝達経路の活性化は、プロモーター配列への転写因子または複数の転写因子の動員をもたらし、次いで、遺伝子発現レベルの増加または減少をもたらし得る。
【０２９２】
細胞の様々なシグナル伝達経路が利用可能である。表２は、例示的なシグナル伝達経路およびシグナル伝達経路と関連する遺伝子を提供する。本明細書に提供される実施形態における膜貫通受容体に結合するリガンドにより活性化されるシグナル伝達経路は、表２に提供されるもののいずれか１つであってもよい。提供される実施形態における膜貫通受容体のリガンド結合ドメインにリガンドが結合するとＧＭＰの発現を駆動するように活性化されるプロモーターは、表２に提供される遺伝子のいずれかを駆動するプロモーター配列、そのプロモーター配列の任意のバリアント、または任意の部分的プロモーター配列（例えば、最小プロモーター配列）を含んでもよい。
【表２−１】
2020530309.tif 000004
【表２−２】
2020530309.tif 000005
【表２−３】
2020530309.tif 000006
【表２−４】
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【表２−５】
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【表２−６】
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【表２−７】
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【表２−８】
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【表２−９】
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【表２−１０】
2020530309.tif 000013
【表２−１１】
2020530309.tif 000014
【０２９３】
一部の実施形態では、プロモーターは、インターロイキン２（ＩＬ−２）プロモーター配列、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）プロモーター配列、インターフェロン調節因子４（ＩＲＦ４）プロモーター配列、核内受容体サブファミリー４グループＡメンバー１（ＮＲ４Ａ１、神経増殖因子ＩＢ  ＮＧＦＩＢとしても公知）プロモーター配列、ＰＲドメインジンクフィンガータンパク質１（ＰＲＤＭ１）プロモーター配列、Ｔボックス転写因子（ＴＢＸ２１）プロモーター配列、ＣＤ６９プロモーター配列、ＣＤ２５プロモーター配列、またはグランザイムＢ（ＧＺＭＢ）プロモーター配列のうちの少なくとも１つを含む。
【０２９４】
本開示の方法および組成物と共に使用することができるプロモーターとしては、例えば、真核細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞またはヒト細胞中で活性なプロモーターが挙げられる。プロモーターは、誘導的プロモーターまたは構成的に活性なプロモーターであってもよい。あるいは、またはさらに、プロモーターは、組織または細胞特異的であってもよい。
【０２９５】
好適な真核プロモーター（すなわち、真核細胞中で機能的なプロモーター）の非限定例としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルスに由来する長い末端反復（ＬＴＲ）、ヒト伸長因子−１プロモーター（ＥＦ１）、ニワトリベータ活性プロモーター（ＣＡＧ）に融合したサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーを含むハイブリッド構築物、マウス幹細胞ウイルスプロモーター（ＭＳＣＶ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１遺伝子座プロモーター（ＰＧＫ）およびマウスメタロチオネイン−Ｉに由来するものが挙げられる。プロモーターは、真菌プロモーターであってもよい。プロモーターは、植物プロモーターであってもよい。植物プロモーターのデータベースを見出すことができる（例えば、ＰｌａｎｔＰｒｏｍ）。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位と、転写ターミネーターとを含有してもよい。発現ベクターはまた、発現を増幅するための適切な配列を含んでもよい。
【０２９６】
本明細書の態様の一部の実施形態では、アクチュエータ部分は、天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された規則的な配置の短い回文配列リピート）／Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）系において機能する、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質またはＣａｓヌクレアーゼを含む。細菌では、この系は、外来ＤＮＡに対する適応免疫を提供することができる（Ｂａｒｒａｎｇｏｕ，  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ，  “ＣＲＩＳＰＲ  ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｉｎ  ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ，”  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （２００７）  ３１５：  １７０９−１７１２；  Ｍａｋａｒｏｖａ，  Ｋ．Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ，  “Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ，”  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  （２０１１）  ９：４６７−  ４７７；  Ｇａｒｎｅａｕ，  Ｊ．  Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ，  “Ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｃｌｅａｖｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ａｎｄ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ，”  Ｎａｔｕｒｅ  （２０１０）  ４６８：６７−７１；  Ｓａｐｒａｎａｕｓｋａｓ，  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ，  “Ｔｈｅ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，”  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  （２０１１）  ３９：  ９２７５−９２８２）。
【０２９７】
多様な哺乳動物、動物、植物、および酵母を含む様々な生物において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（例えば、改変および／または非改変）を、ゲノム操作手段として使用することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、遺伝子発現および／もしくは活性の標的化された調節または核酸編集のための、Ｃａｓタンパク質と複合体化したガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）などのガイド核酸を含んでもよい。ＲＮＡ誘導型Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼなどのＣａｓヌクレアーゼ）は、配列依存的様式で標的ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）に特異的に結合することができる。Ｃａｓタンパク質は、ヌクレアーゼ活性を有している場合、ＤＮＡを切断することができ（Ｇａｓｉｕｎａｓ，  Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ，  “Ｃａｓ９−ｃｒＲＮＡ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＤＮＡ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｆｏｒ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａ，”  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  （２０１２）  １０９：  Ｅ２５７９−Ｅ２  ８６；  Ｊｉｎｅｋ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ，  “Ａ  ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  ｄｕａｌ−ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ＤＮＡ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ，”  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （２０１２）  ３３７：８１６−８２１；  Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ，  Ｓ．  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ，  “ＤＮＡ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｃａｓ９，”  Ｎａｔｕｒｅ  （２０１４）  ５０７：６２；  Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ，  Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ，  “ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｒａｎｓ−ｅｎｃｏｄｅｄ  ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ｈｏｓｔ  ｆａｃｔｏｒ  ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ，”  Ｎａｔｕｒｅ  （２０１  １）  ４７１  ：６０２−６０７）、様々な生物およびモデル系においてプログラミング可能なゲノム編集のために広く使用されてきた（Ｃｏｎｇ，  Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ，  “Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ，”  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （２０１３）  ３３９：８１９−８２３；  Ｊｉａｎｇ，  Ｗ．，  ｅｔ  ａｌ，  “ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｇｅｎｏｍｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ，”  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  （２０１３）  ３１  ：  ２３３−２３９；  Ｓａｎｄｅｒ，  Ｊ．  Ｄ．  ＆  Ｊｏｕｎｇ，  Ｊ．  Ｋ，  “ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｅｄｉｔｉｎｇ，  ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｇｅｎｏｍｅｓ，”  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  （２０１４）  ３２：３４７−３５５）。
【０２９８】
一部の場合、Ｃａｓタンパク質は、ヌクレアーゼ欠損タンパク質または野生型Ｃａｓタンパク質と比較してヌクレアーゼ活性が低下したタンパク質を得るために変異および／または改変される。ヌクレアーゼ欠損タンパク質は、ＤＮＡに結合する能力を保持し得るが、核酸切断活性を欠如しているか、またはそれが低下していてもよい。Ｃａｓヌクレアーゼを含むアクチュエータ部分（例えば、野生型ヌクレアーゼ活性を保持している、ヌクレアーゼ活性が低下している、および／またはヌクレアーゼ活性を欠如している）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系において機能して、標的遺伝子またはタンパク質のレベルおよび／または活性を調節することができる（例えば、減少、増加、または除去）。Ｃａｓタンパク質は、標的ポリヌクレオチドに結合し、物理的障害により転写を防止するか、または非機能的遺伝子産物を得るように核酸配列を編集することができる。
【０２９９】
一部の実施形態では、アクチュエータ部分は、ガイドＲＮＡなどのガイド核酸との複合体を形成するＣａｓタンパク質を含む。一部の実施形態では、アクチュエータ部分は、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）などの、シングルガイド核酸との複合体を形成するＣａｓタンパク質を含む。一部の実施形態では、アクチュエータ部分は、必要に応じて、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成することができる、ガイドＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ）などの、ガイド核酸と複合体化した、ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）を含む。
【０３００】
一部の実施形態では、アクチュエータ部分は、標的ＤＮＡ配列の転写活性化または抑制を誘導することができるＤＮＡヌクレアーゼに由来するヌクレアーゼヌルＤＮＡ結合タンパク質を含む。一部の実施形態では、アクチュエータ部分は、標的ＲＮＡ配列の転写活性化または抑制を誘導することができるＲＮＡヌクレアーゼに由来するヌクレアーゼヌルＲＮＡ結合タンパク質を含む。例えば、アクチュエータ部分は、切断活性を欠如しているＣａｓタンパク質を含んでもよい。
【０３０１】
任意の好適なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を、様々な命名系を使用して言及することができる。例示的な命名系は、Ｍａｋａｒｏｖａ，  Ｋ．Ｓ．  ｅｔ  ａｌ，  “Ａｎ  ｕｐｄａｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ，”  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  （２０１５）  １３：７２２−７３６およびＳｈｍａｋｏｖ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ，  “Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｉｖｅｒｓｅ  Ｃｌａｓｓ  ２  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，”  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  （２０１５）  ６０：１−１３に提供されている。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＶＩ型系、または他の任意の好適なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系であってもよい。本明細書で使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、クラス１、クラス２、または他の任意の好適に分類されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系であってもよい。クラス１またはクラス２の決定は、エフェクターモジュールをコードする遺伝子に基づくものであってもよい。クラス１系は一般に、マルチサブユニットｃｒＲＮＡ−エフェクター複合体を有するが、クラス２系は一般に、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、またはｃｒＲＮＡ−エフェクター複合体などの単一のタンパク質を有する。クラス１  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、複数のＣａｓタンパク質の複合体を使用して、調節を行うことができる。クラス１  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、例えば、Ｉ型（例えば、Ｉ、ＩＡ、ＩＢ、ＩＣ、ＩＤ、ＩＥ、ＩＦ、ＩＵ）、ＩＩＩ型（例えば、ＩＩＩ、ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢ、ＩＩＩＣ、ＩＩＩＤ）、およびＩＶ型（例えば、ＩＶ、ＩＶＡ、ＩＶＢ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ型を含んでもよい。クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、単一の大きいＣａｓタンパク質を使用して、調節を行うことができる。クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、例えば、ＩＩ型（例えば、ＩＩ、ＩＩＡ、ＩＩＢ）およびＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ型を含んでもよい。ＣＲＩＳＰＲ系は、互いに相補的であってよく、および／またはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座標的化を容易にするために機能的ユニットをトランスにしてもよい。
【０３０２】
Ｃａｓタンパク質を含むアクチュエータ部分は、クラス１またはクラス２  Ｃａｓタンパク質であってもよい。Ｃａｓタンパク質は、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型  Ｃａｓタンパク質、またはＶＩ型  Ｃａｓタンパク質であってもよい。Ｃａｓタンパク質は、１つまたは複数のドメインを含んでもよい。ドメインの非限定例としては、ガイド核酸認識および／または結合ドメイン、ヌクレアーゼドメイン（例えば、ＤＮａｓｅまたはＲＮａｓｅドメイン、ＲｕｖＣ、ＨＮＨ）、ＤＮＡ結合ドメイン、ＲＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、タンパク質間相互作用ドメイン、ならびに二量体化ドメインが挙げられる。ガイド核酸認識および／または結合ドメインは、ガイド核酸と相互作用することができる。ヌクレアーゼドメインは、核酸切断のための触媒活性を含んでもよい。ヌクレアーゼドメインは、核酸切断を防止するように触媒活性を欠如してもよい。Ｃａｓタンパク質は、他のタンパク質またはポリペプチドに融合されたキメラＣａｓタンパク質であってもよい。Ｃａｓタンパク質は、例えば、異なるＣａｓタンパク質に由来するドメインを含む、様々なＣａｓタンパク質のキメラであってもよい。
【０３０３】
Ｃａｓタンパク質の非限定例としては、ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（ＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１またはＣｓｘｌ２）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃａｓ１３ａ、ＣａｓｌＯ、ＣａｓｌＯｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｐｆ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（ＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（ＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（ＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（ＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘｌ７、Ｃｓｘｌ４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘｌ６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘｌ５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、およびＣｕｌ９６６、ならびにそのホモログまたは改変バージョンが挙げられる。
【０３０４】
Ｃａｓタンパク質は、任意の好適な生物に由来するものであってよい。非限定例としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ  ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｒｉｓｔｉｎａｅ  ｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏ  ｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ、ＡｌｉｃｙｃｌｏｂａｃＨｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ  ｍａｒｉｎａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ  ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ  ｗａｔｓｏｎｉｉ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ  ａｒａｂａｔｉｃｕｍ、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ  ｄｅｇｅｎｓｉｉ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ  ｂｅｃｓｃｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ  ｍａｇｎａ、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｕｓ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ  ｖｉｎｏｓｕｍ、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｗａｔｓｏｎｉ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｒａｃｅｍｉｆｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ  ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ  ｓｐｕｍｉｇｅｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｍａｘｉｍａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｓｐ．、Ｌｙｎｇｂｙａ  ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ  ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ  ｓｐ．、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ  ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ  ａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｍａｒｉｎａ、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｓｈａｈｉｉ、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｗａｄｅｉｉ、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｗａｄｅｉｉ  Ｆ０２７９���Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  ＳＢ１００３、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｒ１２１、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  ＤＥ４４２、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＮＫ４Ａ１７９、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＭＡ２０２０、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｍｉｎｏｐｈｉｌｕｍ  ＤＳＭ１０７１０、Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｇｅｎｅｓ  ＷＢ４、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ  ＤＭＳ４８４７、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ  ＤＳＭ４８４７、およびＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａが挙げられる。一部の態様では、生物は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）である。一部の態様では、生物は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）である。一部の態様では、生物は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）である。
【０３０５】
Ｃａｓタンパク質は、限定されるものではないが、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ  ａｔｙｐｉｃａｌ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ  ａｌｏｃｉｓ、Ｓｏｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｏｏｒｅｉ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｔｕｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｅｒｄｅｎｉｉ、Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｉｔｓｕｏｋａｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ  ＦＳＬ  Ｒ９０３１７、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ  ＦＳＬ  Ｍ６０６３５、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ、Ｏｌｓｅｎｅｌｌａ  ｕｌｉ、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｉｔａｈａｒａｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ  ｍａｇｎａ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｍｏｂｉｌｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｏｖｉｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃａｎｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｙｎｏｖｉａｅ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｏｌｉｃｈｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  Ｔｏｒｑｕｅｎｓ、Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ  ｐｏｌｙｔｒｏｐｕｓ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ａｌｂｕｓ、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ、Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、Ｅｌｕｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｍｉｎｕｔｕｍ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ  ｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ  ｇｌｏｂｕｓ、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ  ｓｕｂｓｐ．  Ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｏｃｈｒａｃｅａ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｍｉｃａｎｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｒｕｍｉｎｉｃｏｌａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｏｌｕｍｎａｒｅ、Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓ  ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｕｎｉｃｅｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｍａｒｉｎｕｍ、Ｖｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｅｉｓｅｎｉａｅ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｙｚｙｇｉｉ、Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ  ｓｈｉｂａｅ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｈａｍｂｕｒｇｅｎｓｉｓ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅ��ｕｎｉ  ｓｕｂｓｐ．  Ｊｅｊｕｎｉ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｍｕｓｔｅｌａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｅｂｒｅｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ  ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ  ｓｕｂｓｐ．  Ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ  ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ、ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｐａｒａｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ  ｅｘｃｒｅｍｅｎｔｉｈｏｍｉｎｉｓ、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、およびＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａを含む様々な細菌種に由来するものであってもよい。
【０３０６】
本明細書で使用されるＣａｓタンパク質は、野生型または改変型のＣａｓタンパク質であってもよい。Ｃａｓタンパク質は、野生型または改変型Ｃａｓタンパク質の活性バリアント、不活性バリアント、または断片であってもよい。Ｃａｓタンパク質は、野生型バージョンのＣａｓタンパク質と比較して、欠失、挿入、置換、バリアント、変異、融合、キメラ、またはその任意の組合せなどのアミノ酸変化を含んでもよい。Ｃａｓタンパク質は、野生型の例示的Ｃａｓタンパク質に対する少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性または配列類似性を有するポリペプチドであってもよい。Ｃａｓタンパク質は、野生型の例示的Ｃａｓタンパク質に対する多くても約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％の配列同一性および／または配列類似性を有するポリペプチドであってもよい。バリアントまたは断片は、野生型または改変型Ｃａｓタンパク質またはその一部に対する少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性または配列類似性を含んでもよい。バリアントまたは断片を、核酸切断活性を欠如していながら、ガイド核酸との複合体中の核酸遺伝子座に標的化することができる。
【０３０７】
Ｃａｓタンパク質は、ＤＮａｓｅドメインなどの、１つまたは複数のヌクレアーゼドメインを含んでもよい。例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインおよび／またはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインを含んでもよい。ＲｕｖＣおよびＨＮＨドメインは、それぞれ二本鎖ＤＮＡの異なる鎖をカットして、ＤＮＡにおける二本鎖切断を生じさせることができる。Ｃａｓタンパク質は、ただ１つのヌクレアーゼドメインを含んでもよい（例えば、Ｃｐｆ１は、ＲｕｖＣドメインを含むが、ＨＮＨドメインを欠く）。
【０３０８】
Ｃａｓタンパク質は、野生型Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼドメイン（例えば、ＲｕｖＣドメイン、ＨＮＨドメイン）に対する少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性または配列類似性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。
【０３０９】
Ｃａｓタンパク質を改変して、遺伝子発現の調節を最適化することができる。Ｃａｓタンパク質を、核酸結合親和性、核酸結合特異性、および／または酵素活性が増大または低減するように改変することができる。Ｃａｓタンパク質を、安定性などの、タンパク質の任意の他の活性または特性が変化するように改変することもできる。例えば、Ｃａｓタンパク質の１つまたは複数のヌクレアーゼドメインを改変するか、欠失させるか、もしくは不活化することができるか、またはＣａｓタンパク質を、タンパク質の機能に必須ではないドメインを取り除くため、もしくは遺伝子発現を調節するためにＣａｓタンパク質の活性を最適化する（例えば、増強するか、または低下させる）ためにトランケートすることができる。
【０３１０】
Ｃａｓタンパク質は、融合タンパク質であってもよい。例えば、Ｃａｓタンパク質を、切断ドメイン、エピジェネティック改変ドメイン、転写活性化ドメイン、または転写抑制因子ドメインと融合することができる。Ｃａｓタンパク質を、安定性の増大または低減をもたらす異種ポリペプチドと融合することもできる。融合したドメインまたは異種ポリペプチドは、Ｃａｓタンパク質のＮ末端、Ｃ末端、または内部に位置し得る。
【０３１１】
一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、非機能性（ｄｅａｄ）Ｃａｓタンパク質である。非機能性Ｃａｓタンパク質は、核酸切断活性を欠如しているタンパク質であってもよい。
【０３１２】
Ｃａｓタンパク質は、改変型の野生型Ｃａｓタンパク質を含んでもよい。改変型の野生型Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓタンパク質の核酸切断活性を低下させるアミノ酸変化（例えば、欠失、挿入、または置換）を含んでもよい。例えば、改変型のＣａｓタンパク質は、野生型Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来Ｃａｓ９）の核酸切断活性の９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満を有してもよい。改変型のＣａｓタンパク質は、実質的な核酸切断活性を有しなくてもよい。Ｃａｓタンパク質が実質的な核酸切断活性を有しない改変型である場合、それを、酵素的に不活性な、および／または「非機能性」（「ｄ」と省略される）と呼ぶことができる。非機能性Ｃａｓタンパク質（例えば、ｄＣａｓ、ｄＣａｓ９）は、標的ポリヌクレオチドに結合することはできるが、標的ポリヌクレオチドを切断することはできない。一部の態様では、非機能性Ｃａｓタンパク質は、非機能性Ｃａｓ９タンパク質である。
【０３１３】
ｄＣａｓ９ポリペプチドは、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と会合して、標的ＤＮＡの転写を活性化または抑制することができる。ｓｇＲＮＡを、本明細書に開示されるシステムを発現する細胞中に導入することができる。一部の場合、そのような細胞は、同じ核酸を標的とする１つまたは複数の異なるｓｇＲＮＡを含有する。他の場合、ｓｇＲＮＡは、細胞中の異なる核酸を標的とする。ガイドＲＮＡによって標的化される核酸は、免疫細胞などの細胞中で発現される任意のものであってもよい。標的化される核酸は、免疫細胞調節に関与する遺伝子であってもよい。一部の実施形態では、核酸は、がんと関連する。がんと関連する核酸は、細胞周期遺伝子、細胞応答遺伝子、アポトーシス遺伝子、またはファゴサイトーシス遺伝子であってもよい。組換えガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲタンパク質、ヌクレアーゼヌルＣＲＩＳＰＲタンパク質、およびそのバリアントによって認識され得る。
【０３１４】
酵素的に不活性とは、配列特異的様式でポリヌクレオチド中の核酸配列に結合することができるが、標的ポリヌクレオチドを切断することはできないポリペプチドを指してもよい。酵素的に不活性な部位特異的ポリペプチドは、酵素的に不活性なドメイン（例えば、ヌクレアーゼドメイン）を含んでもよい。酵素的に不活性とは、活性がないことを指してもよい。酵素的に不活性とは、実質的に活性がないことを指してもよい。酵素的に不活性とは、本質的に活性がないことを指してもよい。酵素的に不活性とは、野生型の例示的活性（例えば、核酸切断活性、野生型Ｃａｓ９活性）と比較して、１％未満、２％未満、３％未満、４％未満、５％未満、６％未満、７％未満、８％未満、９％未満、または１０％未満の活性を指してもよい。
【０３１５】
Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼドメイン（例えば、ＲｕｖＣ、ＨＮＨ）の１つまたは複数を欠失させるかまたは変異させ、その結果、もはや機能的でなくなるか、または低下したヌクレアーゼ活性を含むようにすることができる。例えば、少なくとも２個のヌクレアーゼドメインを含むＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）では、ヌクレアーゼドメインの一方が欠失または変異された場合、ニッカーゼとして公知である、得られるＣａｓタンパク質は、二本鎖切断ではなく、二本鎖ＤＮＡ内のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）認識配列において一本鎖切断を生成することができる。そのようなニッカーゼは、相補鎖または非相補鎖を切断することができるが、その両方を切断することはできない。Ｃａｓタンパク質の全てのヌクレアーゼドメイン（例えば、Ｃａｓ９タンパク質中のＲｕｖＣとＨＮＨヌクレアーゼドメインの両方；Ｃｐｆ１タンパク質中のＲｕｖＣヌクレアーゼドメイン）が欠失または変異された場合、得られるＣａｓタンパク質は、二本鎖ＤＮＡの両方の鎖を切断する能力が低下しているか、またはその能力を有しなくてもよい。Ｃａｓ９タンパク質をニッカーゼに変換することができる変異の例は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９のＲｕｖＣドメインにおけるＤ１０Ａ（Ｃａｓ９の１０位におけるアスパラギン酸からアラニンへの）変異である。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９のＨＮＨドメインにおけるＨ９３９Ａ（アミノ酸８３９位におけるヒスチジンからアラニンへ）またはＨ８４０Ａ（アミノ酸８４０位におけるヒスチジンからアラニンへ）により、Ｃａｓ９をニッカーゼに変換することができる。Ｃａｓ９タンパク質を非機能性Ｃａｓ９に変換することができる変異の例は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９のＲｕｖＣドメインにおけるＤ１０Ａ（Ｃａｓ９の１０位におけるアスパラギン酸からアラニンへの）変異およびＨＮＨドメインにおけるＨ９３９Ａ（アミノ酸８３９位におけるヒスチジンからアラニンへ）またはＨ８４０Ａ（アミノ酸８４０位におけるヒスチジンからアラニンへ）変異である。
【０３１６】
非機能性Ｃａｓタンパク質は、野生型バージョンのタンパク質と比較して１つまたは複数の変異を含んでもよい。変異は、野生型Ｃａｓタンパク質の複数の核酸切断ドメインのうちの１つまたは複数において、９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満の核酸切断活性をもたらしてもよい。変異は、標的核酸の相補鎖を切断する能力を保持するが、標的核酸の非相補鎖を切断するその能力を低下させる複数の核酸切断ドメインのうちの１つまたは複数をもたらしてもよい。変異は、標的核酸の非相補鎖を切断する能力を保持するが、標的核酸の相補鎖を切断するその能力を低下させる複数の核酸切断ドメインのうちの１つまたは複数をもたらしてもよい。変異は、標的核酸の相補鎖と非相補鎖を切断する能力を欠く複数の核酸切断ドメインのうちの１つまたは複数をもたらしてもよい。ヌクレアーゼドメイン中で変異させようとする残基は、ヌクレアーゼの１つまたは複数の触媒残基に対応してもよい。例えば、Ａｓｐ１０、Ｈｉｓ８４０、Ａｓｎ８５４およびＡｓｎ８５６などの、野生型の例示的なＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９ポリペプチド中の残基を変異させて、複数の核酸切断ドメイン（例えば、ヌクレアーゼドメイン）のうちの１つまたは複数を不活化することができる。Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼドメイン中で変異させようとする残基は、例えば、配列および／または構造アライメントによって決定された場合、野生型Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９ポリペプチド中のＡｓｐ１０、Ｈｉｓ８４０、Ａｓｎ８５４およびＡｓｎ８５６残基に対応してもよい。
【０３１７】
非限定例として、Ｄ１０、Ｇ１２、Ｇ１７、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、Ｈ９８２、Ｈ９８３、Ａ９８４、Ｄ９８６、および／またはＡ９８７残基（またはＣａｓタンパク質のいずれかの対応する変異）を変異させることができる。例えば、Ｄ１０Ａ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１７Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、Ｈ９８２Ａ、Ｈ９８３Ａ、Ａ９８４Ａ、および／またはＤ９８６Ａである。アラニン置換以外の変異が好適であり得る。
【０３１８】
Ｄ１０Ａ変異を、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＮ８５６Ａ変異のうちの１つまたは複数と組み合わせて、ＤＮＡ切断活性を実質的に欠くＣａｓ９タンパク質（例えば、非機能性Ｃａｓ９タンパク質）を産生することができる。Ｈ８４０Ａ変異を、Ｄ１０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＮ８５６Ａ変異のうちの１つまたは複数と組み合わせて、ＤＮＡ切断活性を実質的に欠く部位特異的ポリペプチドを産生することができる。Ｎ８５４Ａ変異を、Ｈ８４０Ａ、Ｄ１０Ａ、またはＮ８５６Ａ変異のうちの１つまたは複数と組み合わせて、ＤＮＡ切断活性を実質的に欠く部位特異的ポリペプチドを産生することができる。Ｎ８５６Ａ変異を、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＤ１０Ａ変異のうちの１つまたは複数と組み合わせて、ＤＮＡ切断活性を実質的に欠く部位特異的ポリペプチドを産生することができる。
【０３１９】
一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、クラス２のＣａｓタンパク質である。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＩＩ型のＣａｓタンパク質である。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質、改変バージョンのＣａｓ９タンパク質であるか、またはＣａｓ９タンパク質に由来する。例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、切断活性を欠如している。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９タンパク質（例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ９９ＺＷ２）である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに由来するＣａｓ９タンパク質（例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｊ７ＲＵＡ５）である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓまたはＳ．Ａｕｒｅｕｓに由来する改変バージョンのＣａｓ９タンパク質である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓまたはＳ．Ａｕｒｅｕｓに由来するＣａｓ９タンパク質に由来する。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓまたはＳ．ＡｕｒｅｕｓのＣａｓ９タンパク質は、切断活性を欠如している。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃｐｆ１である。
【０３２０】
Ｃａｓ９は、一般に、野生型の例示的Ｃａｓ９ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９）に対する少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％の配列同一性および／または配列類似性を有するポリペプチドを指してもよい。Ｃａｓ９は、野生型の例示的Ｃａｓ９ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来する）に対する多くても約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％の配列同一性および／または配列類似性を有するポリペプチドを指してもよい。Ｃａｓ９は、欠失、挿入、置換、バリアント、変異、融合、キメラ、またはその任意の組合せなどのアミノ酸変化を含んでもよい野生型または改変型のＣａｓ９タンパク質を指してもよい。
【０３２１】
本明細書の態様の様々な実施形態では、本開示は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系における使用のためのガイド核酸を提供する。ガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、Ｃａｓタンパク質に結合し、Ｃａｓタンパク質を、標的ポリヌクレオチド内の特定の位置に標的化することができる。ガイド核酸は、核酸標的化セグメントと、Ｃａｓタンパク質結合セグメントとを含んでもよい。
【０３２２】
ガイド核酸は、別の核酸、例えば、細胞のゲノム中の標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができる核酸を指してもよい。ガイド核酸は、ＲＮＡ、例えば、ガイドＲＮＡであってもよい。ガイド核酸は、ＤＮＡであってもよい。ガイド核酸は、ＤＮＡとＲＮＡとを含んでもよい。ガイド核酸は、一本鎖であってもよい。ガイド核酸は、二本鎖であってもよい。ガイド核酸は、ヌクレオチドアナログを含んでもよい。ガイド核酸は、改変ヌクレオチドを含んでもよい。ガイド核酸を、核酸の配列に部位特異的に結合するようにプログラムまたは設計することができる。
【０３２３】
ガイド核酸は、核酸に新しい、または増強された特徴を提供する１つまたは複数の改変を含んでもよい。ガイド核酸は、核酸アフィニティータグを含んでもよい。ガイド核酸は、合成ヌクレオチド、合成ヌクレオチドアナログ、ヌクレオチド誘導体、および／または改変ヌクレオチドを含んでもよい。
【０３２４】
ガイド核酸は、例えば、５’末端または３’末端に、またはその近くに、標的ポリヌクレオチド中のプロトスペーサー配列と相補的である、核酸標的化領域（例えば、スペーサー領域）を含んでもよい。ガイド核酸のスペーサーは、ハイブリダイゼーション（すなわち、塩基対形成）により配列特異的様式でプロトスペーサーと相互作用することができる。プロトスペーサー配列は、標的ポリヌクレオチド中のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５’または３’に位置してもよい。スペーサー領域のヌクレオチド配列は、変化してもよく、ガイド核酸が相互作用することができる標的核酸内の位置を決定する。ガイド核酸のスペーサー領域を、標的核酸内の任意の所望の配列にハイブリダイズするように設計または改変することができる。
【０３２５】
ガイド核酸は、ダブルガイド核酸と呼ぶことができる、２つの別々の核酸分子を含んでもよい。ガイド核酸は、シングルガイド核酸（例えば、ｓｇＲＮＡ）と呼ぶことができる、単一の核酸分子を含んでもよい。一部の実施形態では、ガイド核酸は、融合ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含むシングルガイド核酸である。一部の実施形態では、ガイド核酸は、ｃｒＲＮＡを含むシングルガイド核酸である。一部の実施形態では、ガイド核酸は、ｃｒＲＮＡを含むが、ｔｒａｃＲＮＡを欠くシングルガイド核酸である。一部の実施形態では、ガイド核酸は、非融合ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含むダブルガイド核酸である。例示的なダブルガイド核酸は、ｃｒＲＮＡ様分子と、ｔｒａｃｒＲＮＡ様分子とを含んでもよい。例示的なシングルガイド核酸は、ｃｒＲＮＡ様分子を含んでもよい。例示的なシングルガイド核酸は、融合ｃｒＲＮＡ様分子およびｔｒａｃｒＲＮＡ様分子を含んでもよい。
【０３２６】
ｃｒＲＮＡは、ガイド核酸の核酸標的化セグメント（例えば、スペーサー領域）と、ガイド核酸のＣａｓタンパク質結合セグメントの二本鎖二重鎖の一方の半分を形成し得るヌクレオチドのストレッチとを含んでもよい。
【０３２７】
ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｇＲＮＡのＣａｓタンパク質結合セグメントの二本鎖二重鎖の他方の半分を形成するヌクレオチドのストレッチを含んでもよい。ｃｒＲＮＡのヌクレオチドのストレッチは、ｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチドのストレッチと相補的であり、それとハイブリダイズして、ガイド核酸のＣａｓタンパク質結合ドメインの二本鎖二重鎖を形成することができる。
【０３２８】
ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとは、ハイブリダイズして、ガイド核酸を形成することができる。ｃｒＲＮＡはまた、標的核酸認識配列（例えば、プロトスペーサー）にハイブリダイズする一本鎖核酸標的化セグメント（例えば、スペーサー領域）を提供することもできる。スペーサー領域を含むｃｒＲＮＡ、またはｔｒａｃｒＲＮＡ分子の配列を、ガイド核酸を使用しようとする種に特異的であるように設計することができる。
【０３２９】
一部の実施形態では、ガイド核酸の核酸標的化領域は、１８〜７２ヌクレオチド長であってよい。ガイド核酸の核酸標的化領域（例えば、スペーサー領域）は、約１２ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの長さを有してもよい。例えば、ガイド核酸の核酸標的化領域（例えば、スペーサー領域）は、約１２ヌクレオチド（ｎｔ）〜約８０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約２５ｎｔ、約１２ｎｔ〜約２０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約１９ｎｔ、約１２ｎｔ〜約１８ｎｔ、約１２ｎｔ〜約１７ｎｔ、約１２ｎｔ〜約１６ｎｔ、または約１２ｎｔ〜約１５ｎｔの長さを有してもよい。あるいは、ＤＮＡ標的化セグメントは、約１８ｎｔ〜約２０ｎｔ、約１８ｎｔ〜約２５ｎｔ、約１８ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１８ｎｔ〜約３５ｎｔ、約１８ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１８ｎｔ〜約４５ｎｔ、約１８ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１８ｎｔ〜約６０ｎｔ、約１８ｎｔ〜約７０ｎｔ、約１８ｎｔ〜約８０ｎｔ、約１８ｎｔ〜約９０ｎｔ、約１８ｎｔ〜約１００ｎｔ、約２０ｎｔ〜約２５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約４０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約４５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約５０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約６０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約７０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約８０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約９０ｎｔ、または約２０ｎｔ〜約１００ｎｔの長さを有してもよい。核酸標的化領域の長さは、少なくとも５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０ヌクレオチドまたはそれより多いヌクレオチドであってもよい。核酸標的化領域の長さは、（例えば、スペーサー配列）は、多くても５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０ヌクレオチドまたはそれより多いヌクレオチドであってもよい。
【０３３０】
一部の実施形態では、ガイド核酸の核酸標的化領域（例えば、スペーサー）は、２０ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ガイド核酸の核酸標的化領域は、１９ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ガイド核酸の核酸標的化領域は、１８ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ガイド核酸の核酸標的化領域は、１７ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ガイド核酸の核酸標的化領域は、１６ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ガイド核酸の核酸標的化領域は、２１ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ガイド核酸の核酸標的化領域は、２２ヌクレオチド長である。
【０３３１】
標的核酸のヌクレオチド配列（標的配列）と相補的であるガイド核酸のヌクレオチド配列は、例えば、少なくとも約１２ｎｔ、少なくとも約１５ｎｔ、少なくとも約１８ｎｔ、少なくとも約１９ｎｔ、少なくとも約２０ｎｔ、少なくとも約２５ｎｔ、少なくとも約３０ｎｔ、少なくとも約３５ｎｔ、または少なくとも約４０ｎｔの長さを有してもよい。標的核酸のヌクレオチド配列（標的配列）と相補的であるガイド核酸のヌクレオチド配列は、約１２ヌクレオチド（ｎｔ）〜約８０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約４５ｎｔ、約１２ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約３５ｎｔ、約１２ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約２５ｎｔ、約１２ｎｔ〜約２０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約１９ｎｔ、約１９ｎｔ〜約２０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約２５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約３５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約４５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約６０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約２５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約４０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約４５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約５０ｎｔ、または約２０ｎｔ〜約６０ｎｔの長さを有してもよい。
【０３３２】
プロトスペーサー配列を、目的の領域内のＰＡＭを同定すること、およびＰＡＭの上流または下流の所望のサイズの領域をプロトスペーサーとして選択することによって同定することができる。対応するスペーサー配列を、プロトスペーサー領域の相補配列を決定することによって設計することができる。
【０３３３】
スペーサー配列を、コンピュータプログラム（例えば、機械で読み取り可能なコード）を使用して同定することができる。コンピュータプログラムは、予測される融解温度、二次構造形成、および予測されるアニーリング温度、配列同一性、ゲノムコンテクスト、クロマチン接近可能性、ＧＣ％、ゲノム出現頻度、メチル化状態、ＳＮＰの存在などの変数を使用することができる。
【０３３４】
核酸標的化配列（例えば、スペーサー配列）と標的核酸（例えば、プロトスペーサー）との間のパーセント相補性は、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であってよい。核酸標的化配列と、標的核酸との間のパーセント相補性は、約２０個の連続するヌクレオチドにわたって、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であってよい。
【０３３５】
ガイド核酸のＣａｓタンパク質結合セグメントは、互いと相補的な２つのヌクレオチドのストレッチ（例えば、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ）を含んでもよい。互いに相補的な２つのヌクレオチドのストレッチ（例えば、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ）を、介在ヌクレオチド（例えば、シングルガイド核酸の場合、リンカー）によって共有結合的に連結することができる。互いに相補的な２つのヌクレオチドのストレッチ（例えば、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ）は、ハイブリダイズして、Ｃａｓタンパク質結合セグメントの二本鎖ＲＮＡ二重鎖またはヘアピンを形成し、かくして、ステムループ構造をもたらすことができる。ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとを、ｃｒＲＮＡの３’末端およびｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端を介して共有結合的に連結することができる。あるいは、ｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡとを、ｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端およびｃｒＲＮＡの３’末端を介して共有結合的に連結することができる。
【０３３６】
ガイド核酸のＣａｓタンパク質結合セグメントは、約１０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、例えば、約１０ヌクレオチド（ｎｔ）〜約２０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３０ｎｔ、約３０ｎｔ〜約４０ｎｔ、約４０ｎｔ〜約５０ｎｔ、約５０ｎｔ〜約６０ｎｔ、約６０ｎｔ〜約７０ｎｔ、約７０ｎｔ〜約８０ｎｔ、約８０ｎｔ〜約９０ｎｔ、または約９０ｎｔ〜約１００ｎｔの長さを有してもよい。例えば、ガイド核酸のＣａｓタンパク質結合セグメントは、約１５ヌクレオチド（ｎｔ）〜約８０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約３０ｎｔまたは約１５ｎｔ〜約２５ｎｔの長さを有してもよい。
【０３３７】
ガイド核酸のＣａｓタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖は、約６塩基対（ｂｐ）〜約５０ｂｐの長さを有してもよい。例えば、タンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖は、約６ｂｐ〜約４０ｂｐ、約６ｂｐ〜約３０ｂｐ、約６ｂｐ〜約２５ｂｐ、約６ｂｐ〜約２０ｂｐ、約６ｂｐ〜約１５ｂｐ、約８ｂｐ〜約４０ｂｐ、約８ｂｐ〜約３０ｂｐ、約８ｂｐ〜約２５ｂｐ、約８ｂｐ〜約２０ｂｐまたは約８ｂｐ〜約１５ｂｐの長さを有してもよい。例えば、Ｃａｓタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖は、約８ｂｐ〜約１０ｂｐ、約１０ｂｐ〜約１５ｂｐ、約１５ｂｐ〜約１８ｂｐ、約１８ｂｐ〜約２０ｂｐ、約２０ｂｐ〜約２５ｂｐ、約２５ｂｐ〜約３０ｂｐ、約３０ｂｐ〜約３５ｂｐ、約３５ｂｐ〜約４０ｂｐ、または約４０ｂｐ〜約５０ｂｐの長さを有してもよい。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖は、３６塩基対の長さを有してもよい。ハイブリダイズして、タンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖を形成するヌクレオチド配列間のパーセント相補性は、少なくとも約６０％であってもよい。例えば、ハイブリダイズして、タンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖を形成するヌクレオチド配列間のパーセント相補性は、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％であってもよい。一部の場合、ハイブリダイズして、タンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖を形成するヌクレオチド配列間のパーセント相補性は、１００％である。
【０３３８】
リンカー（例えば、シングルガイド核酸中のｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとを連結する）は、約３ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの長さを有してもよい。例えば、リンカーは、約３ヌクレオチド（ｎｔ）〜約９０ｎｔ、約３ヌクレオチド（ｎｔ）〜約８０ｎｔ、約３ヌクレオチド（ｎｔ）〜約７０ｎｔ、約３ヌクレオチド（ｎｔ）〜約６０ｎｔ、約３ヌクレオチド（ｎｔ）〜約５０ｎｔ、約３ヌクレオチド（ｎｔ）〜約４０ｎｔ、約３ヌクレオチド（ｎｔ）〜約３０ｎｔ、約３ヌクレオチド（ｎｔ）〜約２０ｎｔまたは約３ヌクレオチド（ｎｔ）〜約１０ｎｔの長さを有してもよい。例えば、リンカーは、約３ｎｔ〜約５ｎｔ、約５ｎｔ〜約１０ｎｔ、約１０ｎｔ〜約１５ｎｔ、約１５ｎｔ〜約２０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約２５ｎｔ、約２５ｎｔ〜約３０ｎｔ、約３０ｎｔ〜約３５ｎｔ、約３５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約４０ｎｔ〜約５０ｎｔ、約５０ｎｔ〜約６０ｎｔ、約６０ｎｔ〜約７０ｎｔ、約７０ｎｔ〜約８０ｎｔ、約８０ｎｔ〜約９０ｎｔ、または約９０ｎｔ〜約１００ｎｔの長さを有してもよい。一部の実施形態では、ＤＮＡ標的化ＲＮＡのリンカーは、４ｎｔである。
【０３３９】
ガイド核酸は、追加的な望ましい特徴（例えば、改変または調節された安定性；細胞内標的化；蛍光標識を用いた追跡；タンパク質またはタンパク質複合体の結合部位など）をもたらす改変または配列を含んでもよい。そのような改変の例としては、例えば、５’キャップ（例えば、７−メチルグアニル酸キャップ（ｍ７Ｇ））；３’ポリアデニル化テール（すなわち、３’ポリ（Ａ）テール）；リボスイッチ配列（例えば、安定性の調節ならびに／またはタンパク質および／もしくはタンパク質複合体による接近可能性の調節を可能にするため）；安定性制御配列；ｄｓＲＮＡ二重鎖（すなわち、ヘアピン）を形成する配列；ＲＮＡを細胞内の場所（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体など）に標的化する改変または配列；追跡をもたらす改変または配列（例えば、蛍光分子との直接コンジュゲーション、蛍光検出を容易にする部分とのコンジュゲーション、蛍光検出を可能にする配列など）；タンパク質（例えば、転写活性化因子、転写抑制因子、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストン脱アセチル化酵素などを含めたＤＮＡに作用するタンパク質）の結合部位をもたらす改変または配列；およびこれらの組合せが挙げられる。
【０３４０】
ガイド核酸は、核酸に新しい、または増強された特徴（例えば、改善された安定性）を提供する１つまたは複数の改変（例えば、塩基改変、骨格改変）を含んでもよい。ガイド核酸は、核酸アフィニティータグを含んでもよい。ヌクレオシドは、塩基−糖の組合せであってもよい。ヌクレオシドの塩基部分は、複素環式塩基であってもよい。そのような複素環式塩基の２つの最も一般的なクラスは、プリンおよびピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合的に連結されたリン酸基をさらに含むヌクレオシドであってもよい。ペントフラノシル糖を含むこれらのヌクレオシドについては、リン酸基を、糖の２’、３’、または５’ヒドロキシル部分に連結することができる。ガイド核酸を形成させる際に、リン酸基を、隣接するヌクレオシドに互いに共有結合的に連結して、線状ポリマー化合物を形成させることができる。順に、この線状ポリマー化合物のそれぞれの末端をさらに連結して、環状化合物を形成させることができる；しかしながら、一般的には、線状化合物が好適である。さらに、線状化合物は、内部ヌクレオチド塩基相補性を有してもよく、したがって、完全または部分的に二本鎖の化合物を産生するような様式でフォールディングしてもよい。ガイド核酸内で、リン酸基は一般に、ガイド核酸のヌクレオシド間骨格を形成すると言うことができる。ガイド核酸の結合または骨格は、３’から５’へのホスホジエステル結合であってもよい。
【０３４１】
ガイド核酸は、改変骨格および／または改変ヌクレオシド間結合を含んでもよい。改変骨格は、骨格中にリン原子を保持するもの、および骨格中にリン原子を有しないものを含んでもよい。
【０３４２】
リン原子を中に含有する好適な改変ガイド核酸骨格は、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび他のアルキルホスホネート、例えば、３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネート、キラルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、ホスホロジアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート、および通常の３’−５’結合を有するボラノホスフェート、２’−５’結合アナログ、ならびに１つまたは複数のヌクレオチド間結合が３’−３’、５’−５’または２’−２’結合である逆転した極性を有するものを含んでもよい。逆転した極性を有する好適なガイド核酸は、最も３’側のヌクレオチド間結合に単一の３’−３’結合を含んでもよい（すなわち、核酸塩基が失われているか、またはその代わりにヒドロキシル基を有する単一の逆転ヌクレオシド残基）を含んでもよい。様々な塩（例えば、塩化カリウムまたは塩化ナトリウム）、混合塩、および遊離酸形態を含有させることもできる。
【０３４３】
ガイド核酸は、１つまたは複数のホスホロチオエートおよび／またはヘテロ原子ヌクレオシド間結合、特に、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−（すなわち、メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格）、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−および−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−（式中、ネイティブのホスホジエステルヌクレオチド間結合は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−ＣＨ２−と表される）を含んでもよい。
【０３４４】
ガイド核酸は、モルホリノ骨格構造を含んでもよい。例えば、核酸は、リボース環の代わりに６員のモルホリノ環を含んでもよい。これらの実施形態の一部では、ホスホロジアミデートまたは他の非ホスホジエステルヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合に取って代わる。
【０３４５】
ガイド核酸は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１つもしくは複数の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式ヌクレオシド間結合によって形成されるポリヌクレオチド骨格を含んでもよい。これらとしては、モルホリノ結合（一部ヌクレオシドの糖部分から形成される）；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；リボアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびに混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２構成部分を有するその他のものを有するものが挙げられる。
【０３４６】
ガイド核酸は、核酸模倣体を含んでもよい。用語「模倣体」は、フラノース環のみ、またはフラノース環とヌクレオチド間結合との両方が、非フラノース基と置き換えられるポリヌクレオチドを含むことを意図してもよく、フラノース環のみの置き換えを、糖代用物と呼ぶこともできる。複素環式塩基部分または改変複素環式塩基部分を、適切な標的核酸とのハイブリダイゼーションのために維持することができる。１つのそのような核酸は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）であってもよい。ＰＮＡでは、ポリヌクレオチドの糖骨格を、アミド含有骨格、特に、アミノエチルグリシン骨格と置き換えることができる。ヌクレオチドを保持することができ、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合する。ＰＮＡ化合物中の骨格は、ＰＮＡおよびアミド含有骨格を与える２つまたはそれより多い連結されたアミノエチルグリシン単位を含んでもよい。複素環式塩基部分を、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合することができる。
【０３４７】
ガイド核酸は、モルホリノ環に複素環式塩基が結合した、連結されたモルホリノ単位（すなわち、モルホリノ核酸）を含んでもよい。連結基は、モルホリノ核酸中のモルホリノ単量体単位を連結することができる。非イオン性モルホリノに基づくオリゴマー化合物は、細胞タンパク質との望ましくない相互作用が少ない可能性がある。モルホリノに基づくポリヌクレオチドは、ガイド核酸の非イオン性模倣体であってもよい。モルホリノクラス内の様々な化合物を、異なる連結基を使用して結合することができる。さらなるクラスのポリヌクレオチド模倣体を、シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）と呼ぶことができる。核酸分子中に通常存在するフラノース環を、シクロヘキセニル環と置き換えることができる。ＣｅＮＡ  ＤＭＴ保護されたホスホルアミダイト単量体を調製し、ホスホルアミダイト化学を使用するオリゴマー化合物合成のために使用することができる。ＣｅＮＡ単量体の核酸鎖への組込みは、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの安定性を増大させることができる。ＣｅＮＡオリゴアデニレートは、天然の複合体と類似する安定性で核酸相補体と複合体を形成することができる。さらなる改変は、２’−ヒドロキシル基が糖環の４’炭素原子に連結され、それによって、２’−Ｃ，４’−Ｃ−オキシメチレン結合を形成し、それによって、二環式糖部分を形成する、ロックド核酸（ＬＮＡ）を含んでもよい。この結合は、２’酸素原子と４’炭素原子とを架橋する、メチレン（−ＣＨ２−）基（式中、ｎは１または２である）であってもよい。ＬＮＡおよびＬＮＡアナログは、相補的核酸との非常に高い二重鎖熱安定性（Ｔｍ＝＋３〜＋１０℃）、３’−エキソヌクレアーゼによる分解に対する安定性および良好な溶解度特性を示し得る。
【０３４８】
ガイド核酸は、１つまたは複数の置換された糖部分を含んでもよい。好適なポリヌクレオチドは、ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキル（式中、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換または非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであってよい）から選択される糖置換基を含んでもよい。特に好適なものは、Ｏ（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ（（ＣＨ２）ｎＣＨ３）２（式中、ｎおよびｍは、１〜約１０である）である。糖置換基を、Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリルまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、挿入剤、ガイド核酸の薬物動態特性を改善するための基、またはガイド核酸の薬力学特性を改善するための基、および類似する特性を有する他の置換基から選択することができる。好適な改変は、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥ、すなわち、アルコキシアルコキシ基としても公知である、２’−Ｏ−ＣＨ２  ＣＨ２ＯＣＨ３）を含んでもよい。さらなる好適な改変は、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ（すなわち、２’−ＤＭＡＯＥとしても知られる、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基）、および２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（２’−Ｏ−ジメチル−アミノ−エトキシ−エチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても公知である）、すなわち、２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２を含んでもよい。
【０３４９】
他の好適な糖置換基は、メトキシ（−Ｏ−ＣＨ３）、アミノプロポキシ（−−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、アリル（−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、−Ｏ−アリル（−−Ｏ−−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）およびフルオロ（Ｆ）を含んでもよい。２’−糖置換基は、アラビノ（上）位またはリボ（下）位にあってもよい。好適な２’−アラビノ改変は、２’−Ｆである。オリゴマー化合物上の他の位置、特に、３’末端ヌクレオシド上または２’−５’結合ヌクレオチド中の糖の３’位および５’末端ヌクレオチドの５’位にも同様の改変を行うことができる。オリゴマー化合物は、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣体を有してもよい。
【０３５０】
ガイド核酸はまた、核酸塩基（単に「塩基」と呼ばれることが多い）改変または置換を含んでもよい。本明細書で使用される場合、「非改変」または「天然」核酸塩基は、プリン塩基（例えば、アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ））、ならびにピリミジン塩基（例えば、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ））を含んでもよい。改変核酸塩基としては、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニル（−Ｃ＝Ｃ−ＣＨ３）ウラシルおよびシトシン、およびピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に、５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンなどの他の合成および天然核酸塩基が挙げられる。改変核酸塩基は、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド（５，４−ｂ）（１，４）ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド（５，４−ｂ）（１，４）ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）などの三環式ピリミジン、置換フェノキサジンシチジン（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド（５，４−（ｂ）（１，４）ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド（４，５−ｂ）インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈピリド（３’，２’：４，５）ピロロ（２，３−ｄ）ピリミジン−２−オン）などのＧ−クランプを含んでもよい。
【０３５１】
複素環式塩基部分としては、プリンまたはピリミジン塩基が他の複素環、例えば、７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジンおよび２−ピリドンで置き換えられたものが挙げられる。核酸塩基は、ポリヌクレオチド化合物の結合親和性を増大させるのに有用であり得る。これらは、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジンならびに２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンを含む、Ｎ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリンを含んでもよい。５−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖安定性を０．６〜１．２℃増大させ、好適な塩基置換であり得る（例えば、２’−Ｏ−メトキシエチル糖改変と組み合わせた場合）。
【０３５２】
ガイド核酸の改変は、ガイド核酸に、ガイド核酸の活性、細胞分布または細胞取込みを増強することができる１つまたは複数の部分またはコンジュゲートを化学的に連結することを含んでもよい。これらの部分またはコンジュゲートは、一級ヒドロキシル基（ｐｒｉｍａｒｙ  ｈｙｄｒｏｘｙｌ  ｇｒｏｕｐ）または二級ヒドロキシル基（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｈｙｄｒｏｘｙｌ  ｇｒｏｕｐ）などの官能基に共有結合的に結合したコンジュゲート基を含んでもよい。コンジュゲート基としては、限定されるものではないが、挿入剤、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学特性を増強する基、およびオリゴマーの薬物動態特性を増強できる基が挙げられる。コンジュゲート基としては、限定されるものではないが、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、フォレート、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、および染料が挙げられる。薬力学特性を増強する基としては、取込みを改善する、分解に対する耐性を増強する、および／または標的核酸との配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する基が挙げられる。薬物動態特性を増強することができる基としては、核酸の取込み、分布、代謝または排出を改善する基が挙げられる。コンジュゲート部分としては、限定されるものではないが、コレステロール部分、コール酸、チオエーテル（例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール）、チオコレステロール、脂肪鎖（例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基）、リン脂質（例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖、またはアダマンタン酢酸、パルミチル部分、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分などの脂質部分が挙げられる。
【０３５３】
改変は、「タンパク質形質導入ドメイン」または「ＰＴＤ」（すなわち、細胞透過ペプチド（ＣＰＰ））を含んでもよい。ＰＴＤは、脂質二重層、ミセル、細胞膜、オルガネラ膜、または小胞膜を横断するのを容易にするポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、または有機もしくは無機化合物を指してもよい。ＰＴＤは、小さい極性分子から、大きい高分子および／またはナノ粒子までの範囲にあり得る別の分子に結合させることができ、分子が膜を横断する、例えば、細胞外空間から細胞内空間へと進む、または細胞質ゾルからオルガネラ内へと進むのを容易にすることができる。ＰＴＤを、ポリペプチドのアミノ末端に共有結合的に連結することができる。ＰＴＤを、ポリペプチドのカルボキシル末端に共有結合的に連結することができる。ＰＴＤを、核酸に共有結合的に連結することができる。例示的なＰＴＤとしては、限定されるものではないが、最小ペプチドタンパク質形質導入ドメイン；細胞に直接進入するのに十分な数のアルギニンを含むポリアルギニン配列（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０〜５０個のアルギニン）、ＶＰ２２ドメイン、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａタンパク質形質導入ドメイン、トランケート型ヒトカルシトニンペプチド、ポリリシン、およびトランスポータン、３個のアルギニン残基から５０個のアルギニン残基までのアルギニンホモポリマーが挙げられる。ＰＴＤは、活性化可能なＣＰＰ（ＡＣＰＰ）であってもよい。ＡＣＰＰは、切断性リンカーを介してマッチするポリアニオン（例えば、Ｇｌｕ９または「Ｅ９」）に接続されたポリカチオン性ＣＰＰ（例えば、Ａｒｇ９または「Ｒ９」）を含んでもよく、正味の電荷をほぼゼロまで低下させることによって、接着および細胞への取込みを阻害することができる。リンカーの切断時に、ポリアニオンが放出され、ポリアルギニンおよびその固有の接着性を局所的に曝露し、かくして、ＡＣＰＰを「活性化」して、膜を横断させることができる。
【０３５４】
ガイド核酸は、任意の形態で提供することができる。例えば、ガイド核酸を、２個の分子（例えば、別々のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ）として、または１個の分子（例えば、ｓｇＲＮＡ）として、ＲＮＡの形態で提供することができる。ガイド核酸を、Ｃａｓタンパク質との複合体の形態で提供することができる。また、ガイド核酸を、ＲＮＡをコードするＤＮＡの形態で提供することもできる。ガイド核酸をコードするＤＮＡは、シングルガイド核酸（例えば、ｓｇＲＮＡ）または別々のＲＮＡ分子（例えば、別々のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードしていてもよい。後者の場合、ガイド核酸をコードするＤＮＡは、それぞれ、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡをコードする別々のＤＮＡ分子として提供することができる。
【０３５５】
ガイド核酸をコードするＤＮＡを細胞のゲノムに安定に組み込み、必要に応じて、細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結することができる。ガイド核酸をコードするＤＮＡを、発現構築物中でプロモーターに作動可能に連結することができる。
【０３５６】
ガイド核酸を、任意の好適な方法によって調製することができる。例えば、ガイド核酸を、例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写によって調製することができる。ガイド核酸は、化学合成によって調製された合成的に産生された分子であってもよい。
【０３５７】
ガイド核酸は、安定性を増大させるための配列を含んでもよい。例えば、ガイド核酸は、転写ターミネーターセグメント（すなわち、転写終結配列）を含んでもよい。転写ターミネーターセグメントは、約１０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、例えば、約１０ヌクレオチド（ｎｔ）〜約２０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３０ｎｔ、約３０ｎｔ〜約４０ｎｔ、約４０ｎｔ〜約５０ｎｔ、約５０ｎｔ〜約６０ｎｔ、約６０ｎｔ〜約７０ｎｔ、約７０ｎｔ〜約８０ｎｔ、約８０ｎｔ〜約９０ｎｔ、または約９０ｎｔ〜約１００ｎｔの全長を有してもよい。例えば、転写ターミネーターセグメントは、約１５ヌクレオチド（ｎｔ）〜約８０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約３０ｎｔまたは約１５ｎｔ〜約２５ｎｔの長さを有してもよい。転写終結配列は、真核細胞または原核細胞中で機能的であってもよい。
【０３５８】
一部の実施形態では、アクチュエータ部分は、「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」または「ＺＦＮ」を含む。ＺＦＮとは、ＦｏｋＩの切断ドメインなどの切断ドメインと、ＤＮＡおよびＲＮＡなどのポリヌクレオチドに結合することができる少なくとも１個のジンクフィンガーモチーフ（例えば、少なくとも２、３、４、または５個のジンクフィンガーモチーフ）との融合物を指す。ある特定の向きおよび間隔での２個の個々のＺＦＮのポリヌクレオチド中のある特定の位置でのヘテロ二量体化は、ポリヌクレオチドの切断をもたらし得る。例えば、ＤＮＡに結合するＺＦＮは、ＤＮＡにおける二本鎖切断を誘導し得る。２個の切断ドメインが二量体化し、ＤＮＡを切断するために、２個の個々のＺＦＮは、ある特定の距離離れたそれらのＣ末端でＤＮＡの反対の鎖に結合することができる。一部の場合、ジンクフィンガードメインと、切断ドメインとの間のリンカー配列は、それぞれの結合部位の５’端が約５〜７塩基対隔てられていることを必要とし得る。一部の場合、切断ドメインは、それぞれのジンクフィンガードメインのＣ末端に融合される。例示的なＺＦＮとしては、限定されるものではないが、Ｕｒｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ２０１０，  １１：６３６−６４６；  Ｇａｊ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ２０１２，  ９（８）：８０５−７；米国特許第６，５３４，２６１号；第６，６０７，８８２号；第６，７４６，８３８号；第６，７９４，１３６号；第６，８２４，９７８号；第６，８６６，９９７号；第６，９３３，１１３号；第６，９７９，５３９号；第７，０１３，２１９号；第７，０３０，２１５号；第７，２２０，７１９号；第７，２４１，５７３号；第７，２４１，５７４号；第７，５８５，８４９号；第７，５９５，３７６号；第６，９０３，１８５号；第６，４７９，６２６号；ならびに米国特許出願公開第２００３／０２３２４１０号および第２００９／０２０３１４０号に記載されたものが挙げられる。
【０３５９】
一部の実施形態では、ＺＦＮを含むアクチュエータ部分は、ＤＮＡなどの、標的ポリヌクレオチド中に二本鎖切断を生成することができる。ＤＮＡ中の二本鎖切断は、遺伝子改変（例えば、核酸編集）の導入を可能にするＤＮＡ切断修復をもたらし得る。ＤＮＡ切断修復は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同性修復（ＨＤＲ）によって生じ得る。ＨＤＲでは、標的ＤＮＡの部位を挟む相同アームを含有するドナーＤＮＡ修復鋳型を提供することができる。一部の実施形態では、ＺＦＮは、部位特異的一本鎖ＤＮＡ切断またはニックを誘導し、かくして、ＨＤＲをもたらす、ジンクフィンガーニッカーゼである。ジンクフィンガーニッカーゼの説明は、例えば、Ｒａｍｉｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，  ２０１２，  ４０（１２）：５５６０−８；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ，  ２０１２，  ２２（７）：１３２７−３３に見出される。一部の実施形態では、ＺＦＮは、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）に結合するが、ポリヌクレオチドを切断することはできない。
【０３６０】
一部の実施形態では、ＺＦＮを含むアクチュエータ部分の切断ドメインは、改変型の野生型切断ドメインを含む。改変型の切断ドメインは、切断ドメインの核酸切断活性を低下させるアミノ酸変化（例えば、欠失、挿入、または置換）を含んでもよい。例えば、改変型の切断ドメインは、野生型切断ドメインの核酸切断活性の９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満を有してもよい。改変型の切断ドメインは、実質的な核酸切断活性を有しなくてもよい。一部の実施形態では、切断ドメインは、酵素的に不活性である。
【０３６１】
一部の実施形態では、アクチュエータ部分は、「ＴＡＬＥＮ」または「ＴＡＬ−エフェクターヌクレアーゼ」を含む。ＴＡＬＥＮとは、一般に、ＤＮＡ結合タンデムリピートの中央ドメインと、切断ドメインとを含有する操作された転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼを指す。ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合させることによって、ＴＡＬＥＮを産生することができる。一部の場合、ＤＮＡ結合タンデムリピートは、３３〜３５アミノ酸長を含み、１２位および１３位に２個の超可変的アミノ酸残基を含有し、少なくとも１つの特異的ＤＮＡ塩基対を認識することができる。転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質を、野生型もしくは変異型ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼまたはＦｏｋＩの触媒ドメインなどのヌクレアーゼに融合することができる。例えば、切断特異性または活性を改善する、ＦｏｋＩに対するいくつかの変異が、ＴＡＬＥＮにおけるその使用のために作製されている。そのようなＴＡＬＥＮを、任意の所望のＤＮＡ配列に結合するように操作することができる。ＴＡＬＥＮを使用して、標的ＤＮＡ配列中で二本鎖切断を創出し、次いで、ＮＨＥＪまたはＨＤＲを受けることによって、遺伝子改変（例えば、核酸配列編集）を生成することができる。一部の場合、一本鎖ドナーＤＮＡ修復鋳型が、ＨＤＲを促進するために提供される。ＴＡＬＥＮおよび遺伝子編集におけるそれらの使用の詳細な説明は、例えば、米国特許第８，４４０，４３１号；第８，４４０，４３２号；第８，４５０，４７１号；第８，５８６，３６３号；および第８，６９７，８５３号；Ｓｃｈａｒｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，  ２０１３，  １３（４）：２９１−３０３；Ｇａｊ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ２０１２，  ９（８）：８０５−７；Ｂｅｕｒｄｅｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ，  ２０１３，  ４：１７６２；およびＪｏｕｎｇ  ａｎｄ  Ｓａｎｄｅｒ，  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，  ２０１３，  １４（１）：４９−５５に見出される。
【０３６２】
一部の実施形態では、ＴＡＬＥＮは、ヌクレアーゼ活性の低下のために操作される。一部の実施形態では、ＴＡＬＥＮのヌクレアーゼドメインは、改変型の野生型ヌクレアーゼドメインを含む。改変型のヌクレアーゼドメインは、ヌクレアーゼドメインの核酸切断活性を低下させるアミノ酸変化（例えば、欠失、挿入、または置換）を含んでもよい。例えば、改変型のヌクレアーゼドメインは、野生型ヌクレアーゼドメインの核酸切断活性の９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満を有してもよい。改変型のヌクレアーゼドメインは、実質的な核酸切断活性を有しなくてもよい。一部の実施形態では、ヌクレアーゼドメインは、酵素的に不活性である。
【０３６３】
一部の実施形態では、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質は、転写をモジュレートすることができるドメインに融合され、ヌクレアーゼを含まない。一部の実施形態では、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質は、転写活性化因子として機能するように設計される。一部の実施形態では、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質は、転写抑制因子として機能するように設計される。例えば、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質のＤＮＡ結合ドメインを、１つもしくは複数の転写活性化ドメインに、または１つもしくは複数の転写抑制ドメインに融合（例えば、連結）することができる。転写活性化ドメインの非限定例としては、単純ヘルペスＶＰ１６活性化ドメインおよびＶＰ１６活性化ドメインの四量体リピート、例えば、ＶＰ６４活性化ドメインが挙げられる。転写抑制ドメインの非限定例としては、Ｋｒｕｅｐｐｅｌ関連ボックスドメインが挙げられる。
【０３６４】
一部の実施形態では、アクチュエータ部分は、メガヌクレアーゼを含む。メガヌクレアーゼは、一般に、高度に特異的であり得る、レアカットエンドヌクレアーゼ（ｒａｒｅ−ｃｕｔｔｉｎｇ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）またはホーミングエンドヌクレアーゼを指す。メガヌクレアーゼは、少なくとも１２塩基対の長さ、例えば、１２〜４０塩基対、１２〜５０塩基対、または１２〜６０塩基対の長さの範囲のＤＮＡ標的部位を認識することができる。メガヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼの少なくとも１つの触媒ドメインと、核酸標的配列を特定する少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインまたはタンパク質とを含む任意の融合タンパク質などのモジュラーＤＮＡ結合ヌクレアーゼであってよい。ＤＮＡ結合ドメインは、一本鎖または二本鎖ＤＮＡを認識する少なくとも１個のモチーフを含有してもよい。メガヌクレアーゼは、単量体または二量体であってもよい。一部の実施形態では、メガヌクレアーゼは、天然に存在する（天然に見出される）か、または野生型であり、他の例では、メガヌクレアーゼは、非天然、人工、操作された、合成、合理的に設計された、または人造のものである。一部の実施形態では、本開示のメガヌクレアーゼは、Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼ、Ｉ−ＣｅｕＩメガヌクレアーゼ、Ｉ−ＭｓｏＩメガヌクレアーゼ、Ｉ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼ、およびそのバリアントを含む。有用なメガヌクレアーゼおよび遺伝子編集におけるそれらの適用の詳細な説明は、例えば、Ｓｉｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，  ２０１１，  １１（１）：１１−２７；  Ｚａｓｌａｖｏｓｋｉｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，  ２０１４，  １５：１９１；  Ｔａｋｅｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  ２０１４，  １１１（１１）：４０６１−４０６６、ならびに米国特許第７，８４２，４８９号；第７，８９７，３７２号；第８，０２１，８６７号；第８，１６３，５１４号；第８，１３３，６９７号；第８，０２１，８６７号；第８，１１９，３６１号；第８，１１９，３８１号；第８，１２４，３６号；および第８，１２９，１３４号に見出される。
【０３６５】
一部の実施形態では、メガヌクレアーゼのヌクレアーゼドメインは、改変型の野生型ヌクレアーゼドメインを含む。改変型のヌクレアーゼドメインは、ヌクレアーゼドメインの核酸切断活性を低下させるアミノ酸変化（例えば、欠失、挿入、または置換）を含んでもよい。例えば、改変型のヌクレアーゼドメインは、野生型ヌクレアーゼドメインの核酸切断活性の９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満を有してもよい。改変型のヌクレアーゼドメインは、実質的な核酸切断活性を有しなくてもよい。一部の実施形態では、ヌクレアーゼドメインは、酵素的に不活性である。一部の実施形態では、メガヌクレアーゼは、ＤＮＡに結合することができるが、ＤＮＡを切断することはできない。
【０３６６】
一部の実施形態では、アクチュエータ部分は、アクチュエータ部分の、細胞の特定の領域への輸送を方向付ける少なくとも１つの標的化配列を含む。標的化配列を使用して、標的化配列が連結されたポリペプチドの、細胞の特定の領域への輸送を方向付けることができる。例えば、標的化配列は、アクチュエータ部分を、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を使用して細胞核に、核外輸送シグナル（ＮＥＳ）を使用して核外に（例えば、細胞質）、ミトコンドリア、小胞体（ＥＲ）、ゴルジ体、葉緑体、アポプラスト、ペルオキシソーム、細胞膜、または細胞の様々なオルガネラの膜に方向付けることができる。一部の実施形態では、標的化配列は、核外輸送シグナル（ＮＥＳ）を含み、核外のアクチュエータ部分を、例えば、細胞の細胞質に方向付ける。標的化配列は、様々な核外輸送シグナルを使用して、アクチュエータ部分を細胞質に方向付けることができる。核外輸送シグナルは一般に、核輸送を使用する核膜孔複合体を介した細胞核から細胞質への輸送のためのタンパク質を標的とする、疎水性残基の短いアミノ酸配列（例えば、少なくとも約２、３、４、または５個の疎水性残基）である。全てのＮＥＳ基質が、核から構成的に輸送され得るわけではない。一部の実施形態では、標的化配列は、核局在化シグナル（ＮＬＳ、例えば、ＳＶ４０  ＮＬＳ）を含み、ポリペプチドを細胞核に方向付ける。標的化配列は、様々な核局在化シグナル（ＮＬＳ）を使用して、アクチュエータ部分を細胞核に方向付けることができる。ＮＬＳは、一部分配列または二部分配列であってもよい。
【０３６７】
ＮＬＳの非限定例およびそれに由来するＮＬＳ配列としては、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶを有する、ＳＶ４０ウイルスラージＴ抗原のＮＬＳ；核質に由来するＮＬＳ（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫを有する核質二部分ＮＬＳ）；アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤまたはＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰを有するｃ−ｍｙｃ  ＮＬＳ；配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹを有するｈＲＮＰＡ１  Ｍ９  ＮＬＳ；インポーチン−アルファに由来するＩＢＢドメインの配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ；筋腫Ｔタンパク質の配列ＶＳＲＫＲＰＲＰおよびＰＰＫＫＡＲＥＤ；ヒトｐ５３の配列ＰＱＰＫＫＫＰＬ；マウスｃ−ａｂ１  ＩＶの配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ；インフルエンザウイルスＮＳ１の配列ＤＲＬＲＲおよびＰＫＱＫＫＲＫ；デルタ肝炎ウイルス抗原の配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ；マウスＭｘ１タンパク質の配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ；ヒトポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼの配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ；ならびにステロイドホルモン受容体（ヒト）糖質コルチコイドの配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫが挙げられる。
【０３６８】
一部の実施形態では、アクチュエータ部分は、膜標的化ペプチドを含み、アクチュエータ部分を、細胞膜または細胞オルガネラの膜に方向付ける。膜標的化配列は、アクチュエータ部分の、細胞表面膜または他の細胞膜への輸送を提供することができる。細胞膜と結合する分子は、膜結合を容易にするある特定の領域を含有し、そのような領域を、膜標的化配列に組み込むことができる。例えば、一部のタンパク質は、アシル化されたＮ末端またはＣ末端の配列を含有し、これらのアシル部分は、膜結合を容易にする。そのような配列は、アシルトランスフェラーゼによって認識され、特定の配列モチーフに一致することが多い。ある特定のアシル化モチーフを、単一のアシル部分（次いで、陰イオン性脂質頭部基との結合を改善するためのいくつかの正に荷電した残基（例えば、ヒトｃ−Ｓｒｃ）があることが多い）で改変することができ、他のものを複数のアシル部分で改変することができる。例えば、タンパク質チロシンキナーゼＳｒｃのＮ末端配列は、単一のミリストイル部分を含んでもよい。二重アシル化領域は、Ｓｒｃファミリーメンバーのサブセット（例えば、Ｙｅｓ、Ｆｙｎ、Ｌｃｋ）およびＧタンパク質アルファサブユニットなどの、ある特定のタンパク質キナーゼのＮ末端領域内に位置する。そのような二重アシル化領域は、そのようなタンパク質の最初の１８個のアミノ酸の中に位置することが多く、配列モチーフＭｅｔ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ｃｙｓ（配列番号５６）（式中、Ｍｅｔは切断され、ＧｌｙはＮ−アシル化され、一方のＣｙｓ残基はＳ−アシル化される）に一致する。Ｇｌｙは、ミリストイル化されることが多く、Ｃｙｓはパルミトイル化されていてもよい。Ｇタンパク質ガンマサブユニットおよび他のタンパク質のＣ末端に由来する、Ｃ１５またはＣ１０イソプレニル部分で改変することができる、配列モチーフＣｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｘａａ（いわゆる「ＣＡＡＸボックス」）に一致するアシル化領域を使用することもできる。これらのおよび他のアシル化モチーフとしては、例えば、Ｇａｕｔｈｉｅｒ−Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ  １５：  ２２０５−２２１７  （２００４）；  Ｇｌａｂａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ３０３：  ６９７−７００  （１９９４）  およびＺｌａｋｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１０：  ６７３−６７９  （１９９７）で考察されたものが挙げられ、膜局在化を誘導するために標的化配列中に組み込むことができる。
【０３６９】
ある特定の実施形態では、アシル化モチーフを含有するタンパク質に由来するネイティブ配列が、標的化配列中に組み込まれる。例えば、一部の実施形態では、Ｌｃｋ、ＦｙｎもしくはＹｅｓまたはＧタンパク質アルファサブユニットのＮ末端部分、例えば、そのようなタンパク質に由来する最初の２５個のＮ末端アミノ酸またはそれより少ないアミノ酸（例えば、必要に応じた変異を含むネイティブ配列の約５〜約２０個のアミノ酸、約１０〜約１９個のアミノ酸、または約１５〜約１９個のアミノ酸）を、キメラポリペプチドのＮ末端内に組み込むことができる。ある特定の実施形態では、ＣＡＡＸボックスモチーフ配列を含有するＧタンパク質ガンマサブユニットに由来する約２５個のアミノ酸またはそれ未満のアミノ酸のＣ末端配列（例えば、必要に応じた変異を含むネイティブ配列の約５〜約２０個のアミノ酸、約１０〜約１８個のアミノ酸、または約１５〜約１８個のアミノ酸）を、キメラポリペプチドのＣ末端に連結することができる。
【０３７０】
任意の膜標的化配列を使用することができる。一部の実施形態では、そのような配列としては、限定されるものではないが、ミリストイル化標的化配列、パルミトイル化標的化配列、プレニル化配列（すなわち、ファルネシル化、ゲラニル−ゲラニル化、ＣＡＡＸボックス）、タンパク質間相互作用モチーフまたは受容体に由来する膜貫通配列（シグナルペプチドを使用する）が挙げられる。例としては、例えば、ｔｅｎ  Ｋｌｏｏｓｔｅｒ，  Ｊ．Ｐ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ  （２００７）  ９９，  １−１２；  Ｖｉｎｃｅｎｔ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２１：９３６−４０，  １０９８  （２００３）に考察されたものが挙げられる。
【０３７１】
様々な膜におけるタンパク質保持を増加させることができるさらなるタンパク質ドメインが存在する。例えば、約１２０アミノ酸のプレクストリン相同（ＰＨ）ドメインは、２００種を超えるヒトタンパク質に見出され、典型的には、細胞内シグナル伝達に関与する。ＰＨドメインは、膜内の様々なホスファチジルイノシトール（ＰＩ）脂質（例えば、ＰＩ（３，４，５）−Ｐ３、ＰＩ（３，４）−Ｐ２、ＰＩ（４，５）−Ｐ２）に結合することができ、かくして、タンパク質を異なる膜または細胞内コンパートメントに動員するのに重要な役割を果たし得る。ＰＩ脂質のリン酸化状態は、ＰＩ−３キナーゼまたはＰＴＥＮなどによって調節されることが多く、かくして、膜とＰＨドメインとの相互作用は、アシル脂質によるほど安定でなくてもよい。
【０３７２】
一部の実施形態では、アクチュエータ部分を細胞膜に方向付ける標的化配列は、膜固定化シグナル配列を使用することができる。様々な膜固定化配列が利用可能である。例えば、様々な膜結合型タンパク質の膜固定化シグナル配列を使用することができる。配列は、１）ＩＬ−２受容体ベータ鎖およびインスリン受容体ベータ鎖などのクラスＩ内在性膜タンパク質；２）中性エンドペプチダーゼなどのクラスＩＩ内在性膜タンパク質；３）ヒトチトクロームＰ４５０  ＮＦ２５などのＩＩＩ型タンパク質；ならびに４）ヒトＰ−糖タンパク質などのＩＶ型タンパク質に由来するものを含んでもよい。
【０３７３】
一部の実施形態では、アクチュエータ部分は、タンパク質フォールディングを補助することができるポリペプチドフォールディングドメインに連結されている。一部の実施形態では、アクチュエータ部分は、細胞透過性ドメインに連結されている。例えば、細胞透過性ドメインは、ＨＩＶ−１  ＴＡＴタンパク質、ヒトＢ型肝炎ウイルス由来のＴＬＭ細胞透過性モチーフ、ＭＰＧ、Ｐｅｐ−１、ＶＰ２２、単純ヘルペスウイルス由来の細胞透過性ペプチド、またはポリアルギニンペプチド配列に由来してよい。細胞透過性ドメインは、アクチュエータ部分のＮ末端、Ｃ末端、またはアクチュエータ部分内の任意の場所に位置し得る。
【０３７４】
一部の実施形態では、アクチュエータ部分は、１つまたは複数の転写抑制因子ドメイン、活性化因子ドメイン、エピジェネティックドメイン、リコンビナーゼドメイン、トランスポザーゼドメイン、フリッパーゼドメイン、ニッカーゼドメイン、またはその任意の組合せに融合される。活性化因子ドメインは、酵素のカルボキシル末端に位置する１つまたは複数のタンデム活性化ドメインを含んでもよい。他の場合、アクチュエータ部分は、タンパク質のカルボキシル末端に位置する１つまたは複数のタンデム抑制因子ドメインを含む。活性化ドメインの非限定例としては、ＧＡＬ４、単純ヘルペス活性化ドメインＶＰ１６、ＶＰ６４（単純ヘルペス活性化ドメインＶＰ１６の四量体）、ＮＦ−κＢ  ｐ６５サブユニット、エプスタイン・バーウイルスＲトランス活性化因子（Ｒｔａ）が挙げられ、Ｃｈａｖｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ２０１５，  １２（４）：３２６−３２８および米国特許出願公開第２０１４００６８７９７号に記載されている。抑制ドメインの非限定例としては、Ｋｏｘ１のＫＲＡＢ（Ｋｒｕｅｐｐｅｌ関連ボックス）ドメイン、Ｍａｄ  ｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ）、ＥＲＦ抑制因子ドメイン（ＥＲＤ）が挙げられ、Ｃｈａｖｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ２０１５，  １２（４）：３２６−３２８および米国特許出願公開第２０１４００６８７９７号に記載されている。アクチュエータ部分を、安定性の増大または低減をもたらす異種ポリペプチドと融合することもできる。融合したドメインまたは異種ポリペプチドは、アクチュエータ部分のＮ末端、Ｃ末端、または内部に位置し得る。
【０３７５】
アクチュエータ部分は、蛍光タンパク質、精製タグ、またはエピトープタグなどの追跡または精製をしやすくするための異種ポリペプチドを含んでもよい。蛍光タンパク質の例としては、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ−２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｅＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎｌ）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗｌ）、青色蛍光タンパク質（例えば、ｅＢＦＰ、ｅＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａｌ、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ−ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ｅＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎｌ、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄｌ、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）、オレンジ蛍光タンパク質（ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）、および任意の他の好適な蛍光タンパク質が挙げられる。タグの例としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、タンデムアフィニティ精製（ＴＡＰ）タグ、ｍｙｃ、ＡｃＶ５、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｅ、ＥＣＳ、Ｅ２、ＦＬＡＧ、赤血球凝集素（ＨＡ）、ｎｕｓ、Ｓｏｆｔａｇ１、Ｓｏｆｔａｇ３、Ｓｔｒｅｐ、ＳＢＰ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、ＨＳＶ、ＫＴ３、Ｓ、ＳＩ、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ−Ｇ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、ビオチンカルボキシル担体タンパク質（ＢＣＣＰ）、およびカルモジュリンが挙げられる。
【０３７６】
一部の実施形態では、ＧＭＰは、発現される場合、別のタンパク質に連結される。ＧＭＰと他のタンパク質とを結合するペプチドリンカーは、切断認識配列、例えば、プロテアーゼ認識配列を含有してもよい。様々なプロテアーゼおよびその対応するプロテアーゼ認識配列を使用することができる。一部のプロテアーゼは、様々なタンパク質基質が加水分解されるように高度に雑多なものであってよい。一部のプロテアーゼは、高度に特異的であってよく、ある特定の配列、例えば、切断認識配列またはペプチド切断ドメインを有する基質だけを切断する。一部の実施形態では、切断認識配列は、複数の切断認識配列を含み、それぞれの切断認識配列は、同じか、または異なる切断部分によって認識され得る。切断部分として使用することができる配列特異的プロテアーゼとしては、限定されるものではないが、スーパーファミリーＣＡプロテアーゼ、例えば、パパイン（Ｃａｒｉｃａ  ｐａｐａｙａ）、ブロメライン（Ａｎａｎａｓ  ｃｏｍｏｓｕｓ）、カテプシンＫ（苔類）およびカルパイン（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）を含む、ファミリーＣ１、Ｃ２、Ｃ６、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１６、Ｃ１９、Ｃ２８、Ｃ３１、Ｃ３２、Ｃ３３、Ｃ３９、Ｃ４７、Ｃ５１、Ｃ５４、Ｃ５８、Ｃ６４、Ｃ６５、Ｃ６６、Ｃ６７、Ｃ７０、Ｃ７１、Ｃ７６、Ｃ７８、Ｃ８３、Ｃ８５、Ｃ８６、Ｃ８７、Ｃ９３、Ｃ９６、Ｃ９８、およびＣ１０１；スーパーファミリーＣＤプロテアーゼ、例えば、カスパーゼ−１（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）およびセパラーゼ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの、ファミリーＣ１１、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ２５、Ｃ５０、Ｃ８０、およびＣ８４；スーパーファミリーＣＥプロテアーゼ、例えば、アデナイン（ヒトアデノウイルス２型）を含む、ファミリーＣ５、Ｃ４８、Ｃ５５、Ｃ５７、Ｃ６３、およびＣ７９；スーパーファミリーＣＦプロテアーゼ、例えば、ピログルタミル−ペプチダーゼＩ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）を含むファミリーＣ１５；スーパーファミリーＣＬプロテアーゼ、例えば、ソルターゼＡ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）を含む、ファミリーＣ６０およびＣ８２；スーパーファミリーＣＭプロテアーゼ、例えば、Ｃ型肝炎ウイルスペプチダーゼ２（Ｃ型肝炎ウイルス）を含むファミリーＣ１８；スーパーファミリーＣＮプロテアーゼ、例えば、シンドビスウイルス型ｎｓＰ２ペプチダーゼ（シンドビスウイルス）を含むファミリーＣ９；スーパーファミリーＣＯプロテアーゼ、例えば、ジペプチジルペプチダーゼＶＩ（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）を含むファミリーＣ４０；スーパーファミリーＣＰプロテアーゼ、例えば、ＤｅＳＩ−１ペプチダーゼ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）を含むファミリーＣ９７；スーパーファミリーＰＡプロテアーゼ、例えば、ＴＥＶプロテアーゼ（タバコエッチウイルス）を含むファミリーＣ３、Ｃ４、Ｃ２４、Ｃ３０、Ｃ３７、Ｃ６２、Ｃ７４およびＣ９９；スーパーファミリーＰＢプロテアーゼ、例えば、アミドホスホリボシルトランスフェラーゼ前駆体（ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）を含むファミリーＣ４４、Ｃ４５、Ｃ５９、Ｃ６９、Ｃ���９、およびＣ９５；スーパーファミリーＰＣプロテアーゼ、例えば、γ−グルタミルヒドロラーゼ（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）を含むファミリーＣ２６およびＣ５６；スーパーファミリーＰＤプロテアーゼ、例えば、ヘッジホッグタンパク質（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）を含むファミリーＣ４６；スーパーファミリーＰＥプロテアーゼ、例えば、ＤｍｐＡアミノペプチダーゼ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ａｎｔｈｒｏｐｉ）を含むファミリーＰ１；その他のプロテアーゼ、例えば、ファミリーＣ７、Ｃ８、Ｃ２１、Ｃ２３、Ｃ２７、Ｃ３６、Ｃ４２、Ｃ５３およびＣ７５が挙げられる。さらなるプロテアーゼとしては、セリンプロテアーゼ、例えば、スーパーファミリーＳＢのもの、例えば、スブチリシン（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）を含むファミリーＳ８およびＳ５３；スーパーファミリーＳＣのもの、例えば、プロリルオリゴペプチダーゼ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）を含むファミリーＳ９、Ｓ１０、Ｓ１５、Ｓ２８、Ｓ３３およびＳ３７；スーパーファミリーＳＥのもの、例えば、Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−ＡｌａペプチダーゼＣ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）を含むファミリーＳ１１、Ｓ１２、およびＳ１３；スーパーファミリーＳＦのもの、例えば、シグナルペプチダーゼＩ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）を含むファミリーＳ２４およびＳ２６；スーパーファミリーＳＪのもの、例えば、ｌｏｎＡペプチダーゼ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）を含むＳ１６、Ｓ５０およびＳ６９；スーパーファミリーＳＫのもの、例えば、Ｃｌｐプロテアーゼ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）を含むファミリーＳ１４、Ｓ４１およびＳ４９；スーパーファミリーＳＯのもの、例えば、ファージＫ１ＦエンドシアリダーゼＣＩＭＣＤ自己切断タンパク質（腸内細菌ファージＫ１Ｆ）を含むファミリーＳ７４；スーパーファミリーＳＰのもの、例えば、ヌクレオポリン１４５（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）を含むファミリーＳ５９；スーパーファミリーＳＲのもの、例えば、ラクトフェリン（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）を含むファミリーＳ６０；スーパーファミリーＳＳのもの、例えば、ムレインテトラペプチダーゼＬＤ−カルボキシペプチダーゼ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）を含むファミリーＳ６６；スーパーファミリーＳＴのもの、例えば、ロンボイド−１（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）を含むファミリーＳ５４；スーパーファミリーＰＡのもの、例えば、キモトリプシンＡ（Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ）を含むファミリーＳ１、Ｓ３、Ｓ６、Ｓ７、Ｓ２９、Ｓ３０、Ｓ３１、Ｓ３２、Ｓ３９、Ｓ４６、Ｓ５５、Ｓ６４、Ｓ６５、およびＳ７５；スーパーファミリーＰＢのもの、例えば、ペニシリンＧアシラーゼ前駆体（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）を含むファミリーＳ４５およびＳ６３；スーパーファミリーＰＣのもの、例えば、ジペプチダーゼＥ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）を含むファミリーＳ５１；スーパーファミリーＰＥのもの、例えば、ＤｍｐＡアミノペプチダーゼ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ａｎｔｈｒｏｐｉ）を含むファミリーＰ１；割り当てられないもの、例えば、ファミリー���４８、Ｓ６２、Ｓ６８、Ｓ７１、Ｓ７２、Ｓ７９、およびＳ８１のトレオニンプロテアーゼ、例えば、スーパーファミリーＰＢクランのもの、例えば、古細菌プロテアソーム、β成分（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）を含むファミリーＴ１、Ｔ２、Ｔ３およびＴ６；ならびにスーパーファミリーＰＥクランのもの、例えば、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を含むファミリーＴ５；アスパラギン酸プロテアーゼ、例えば、ＢＡＣＥ１、ＢＡＣＥ２；カテプシンＤ；カテプシンＥ；キモシン；ナプシン−Ａ；ネペンテシン；ペプシン；プラスメプシン；プレセニリン；レニン；およびＨＩＶ−１プロテアーゼ、ならびにメタロプロテイナーゼ、例えば、エキソペプチダーゼ、メタロエキソペプチダーゼ；エンドペプチダーゼ、およびメタロエンドペプチダーゼが挙げられる。切断認識配列（例えば、ポリペプチド配列）は、本明細書に開示される任意のプロテアーゼによって認識され得る。
【０３７７】
一部の実施形態では、切断認識配列は、アクロモペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、アンクロッド、アンジオテンシン変換酵素、ブロメライン、カルパイン、カルパインＩ、カルパインＩＩ、カルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＢ、カルボキシペプチダーゼＧ、カルボキシペプチダーゼＰ、カルボキシペプチダーゼＷ、カルボキシペプチダーゼＹ、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、カスパーゼ１１、カスパーゼ１２、カスパーゼ１３、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＧ、カテプシンＨ、カテプシンＬ、キモパパイン、キマーゼ、キモトリプシン、クロストリパイン、コラゲナーゼ、補体Ｃ１ｒ、補体Ｃ１ｓ、補体因子Ｄ、補体因子Ｉ、ククミシン、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ、エラスターゼ（白血球）、エラスターゼ（膵臓）、エンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、エンテロキナーゼ、第Ｘａ因子、フィシン、フリン、グランザイムＡ、グランザイムＢ、ＨＩＶプロテアーゼ、ＩＧアーゼ、カリクレイン組織、ロイシンアミノペプチダーゼ（一般）、ロイシンアミノペプチダーゼ（細胞質ゾル）、ロイシンアミノペプチダーゼ（ミクロソーム）、マトリクスメタロプロテアーゼ、メチオニンアミノペプチダーゼ、ニュートラーゼ、パパイン、ペプシン、プラスミン、プロリダーゼ、プロナーゼＥ、前立腺特異的抗原、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ由来アルカリ性プロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来プロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓａｉｔｏｉ由来プロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ由来プロテアーゼ、プロテアーゼ（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（アルカリまたはアルカラーゼ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ由来プロテアーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ由来プロテアーゼ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｐ．由来プロテアーゼ、プロテアーゼＳ、プロテアソーム、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来プロテイナーゼ、プロテイナーゼ３、プロテイナーゼＡ、プロテイナーゼＫ、プロテインＣ、ピログルタミン酸アミノペプチダーゼ、レンニン、レンニン、ストレプトキナーゼ、スブチリシン、サーモリシン、トロンビン、組織プラスミノゲン活性化因子、トリプシン、トリプターゼおよびウロキナーゼからなる群より選択されるプロテアーゼの基質である。
【０３７８】
表３は、本開示のシステムにおいて使用することができる例示的なプロテアーゼおよび関連する認識配列を列挙する。
【表３−１】
2020530309.tif 000015
【表３−２】
2020530309.tif 000016
【表３−３】
2020530309.tif 000017
【０３７９】
切断部分としての使用のために選択されるプロテアーゼを、ペプチド結合選択性、ある特定のｐＨでの活性、分子量などの所望の特徴に基づいて選択することができる。
【０３８０】
様々な標的遺伝子の発現を、本明細書に提供される実施形態において発現されるＧＭＰによって調節することができる。細胞の任意の標的遺伝子を、ＧＭＰによって調節することができる。
【０３８１】
対象となるシステムのアクチュエータ部分は、標的ポリヌクレオチドに結合して、標的ポリヌクレオチドの物理的障害または標的ポリヌクレオチドの発現を抑制もしくは増強するのに有効なさらなる因子の動員によって、標的遺伝子の発現および／または活性を調節することができる。一部の実施形態では、アクチュエータ部分は、標的ポリヌクレオチドの発現を増加させるのに有効な転写活性化因子を含む。アクチュエータ部分は、標的ポリヌクレオチドの発現を減少させるのに有効な転写抑制因子を含んでもよい。
【０３８２】
本明細書の態様の様々な実施形態の標的ポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）であってもよい。標的ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であってもよい。標的ポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡであってもよい。標的ポリヌクレオチドは、細胞にとって内因性または外因性の任意のポリヌクレオチドであってもよい。例えば、標的ポリヌクレオチドは、真核細胞の核に存在するポリヌクレオチドであってもよい。標的ポリヌクレオチドは、遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードする配列または非コード配列（例えば、調節ポリヌクレオチド）であってもよい。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、プラスミド、例えば、外因性遺伝子を担持するプラスミドの領域を含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、内因性遺伝子または遺伝子産物を含む。
【０３８３】
標的ポリヌクレオチドは、いくつかの疾患関連遺伝子およびポリヌクレオチドならびにシグナル伝達生化学経路関連遺伝子およびポリヌクレオチドを含んでもよい。標的ポリヌクレオチドの例としては、シグナル伝達生化学経路と関連する配列、例えば、シグナル伝達生化学経路関連遺伝子またはポリヌクレオチドが挙げられる。標的ポリヌクレオチドの例としては、疾患関連遺伝子またはポリヌクレオチドが挙げられる。「疾患関連」遺伝子またはポリヌクレオチドとは、非疾患対照の組織または細胞と比較して、疾患に罹患した組織に由来する細胞中で異常なレベルの、または異常な形態の転写または翻訳産物をもたらす任意の遺伝子またはポリヌクレオチドを指す。一部の実施形態では、それは、異常に高レベルで発現されるようになる遺伝子である。一部の実施形態では、それは、異常に低レベルで発現されるようになる遺伝子である。発現の変化は、疾患の出現および／または進行と相関してもよい。疾患関連遺伝子はまた、疾患の直接の原因となるか、または疾患の病因に対する応答である遺伝子との連鎖不均衡にある変異または遺伝子変化を有する遺伝子も指す。転写または翻訳された産物は、公知または未知のものであってよく、正常または異常レベルであってもよい。
【０３８４】
疾患関連遺伝子およびポリヌクレオチドの例は、ワールドワイドウェブ上で利用可能な、ＭｃＫｕｓｉｃｋ−Ｎａｔｈａｎｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍｄ．）およびＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．）から利用可能である。ある特定の疾患および障害と関連する例示的遺伝子は、表４および表５に提供される。
【０３８５】
これらの遺伝子および経路における変異は、不適切なタンパク質の産生または機能に影響する不適切な量のタンパク質の産生をもたらし得る。
【表４−１】
2020530309.tif 000018
【表４−２】
2020530309.tif 000019
【表５−１】
2020530309.tif 000020
【表５−２】
2020530309.tif 000021
【表５−３】
2020530309.tif 000022
【表５−４】
2020530309.tif 000023
【０３８６】
一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、２０ヌクレオチド長のプロトスペーサー配列（すなわち、ガイド核酸のスペーサー領域によって認識される配列）を含んでもよい。プロトスペーサーは、２０ヌクレオチド長未満であってもよい。プロトスペーサーは、少なくとも５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０ヌクレオチド長またはそれより多いヌクレオチド長であってもよい。プロトスペーサー配列は、多くても５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０ヌクレオチド長またはそれより多いヌクレオチド長であってもよい。プロトスペーサー配列は、ＰＡＭの最初のヌクレオチドのすぐ５’側の１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３塩基であってもよい。プロトスペーサー配列は、ＰＡＭ配列の最後のヌクレオチドのすぐ３’側の１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３塩基であってもよい。プロトスペーサー配列は、ＰＡＭ配列の最初のヌクレオチドのすぐ５’側の２０塩基であってもよい。プロトスペーサー配列は、ＰＡＭの最後のヌクレオチドのすぐ３’側の２０塩基であってもよい。標的核酸配列は、ＰＡＭの５’または３’であってもよい。
【０３８７】
プロトスペーサー配列は、ガイド核酸の核酸標的化セグメントが結合することができる標的ポリヌクレオチド中に存在する核酸配列を含んでもよい。例えば、プロトスペーサー配列は、ガイド核酸が相補性を有するように設計された配列を含んでもよい。プロトスペーサー配列は、例えば、細胞の核もしくは細胞質内、またはミトコンドリアもしくは葉緑体などの細胞のオルガネラ内に位置し得る任意のポリヌクレオチドを含んでもよい。プロトスペーサー配列は、Ｃａｓタンパク質の切断部位を含んでもよい。プロトスペーサー配列は、Ｃａｓタンパク質の切断部位に隣接していてもよい。
【０３８８】
Ｃａｓタンパク質は、ガイド核酸の核酸標的化配列が結合することができる配列の内部または外部の部位で標的ポリヌクレオチドに結合することができる。結合部位は、Ｃａｓタンパク質が一本鎖切断または二本鎖切断をもたらし得る核酸の位置を含んでもよい。
【０３８９】
Ｃａｓタンパク質による標的核酸の部位特異的結合は、ガイド核酸と標的核酸との間の塩基対相補性によって決定される位置で生じてもよい。Ｃａｓタンパク質による標的核酸の部位特異的結合は、標的核酸中の、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる、短いモチーフによって決定される位置で生じてもよい。ＰＡＭは、例えば、プロトスペーサー配列の３’末端で、プロトスペーサーを挟んでもよい。例えば、Ｃａｓ９の結合部位は、ＰＡＭ配列の約１〜約２５塩基対、または約２〜約５塩基対、または約１９〜約２３塩基対（例えば、３塩基対）上流または下流であってよい。Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）の結合部位は、ＰＡＭ配列の３塩基対上流であってもよい。Ｃａｓ（例えば、Ｃｐｆ１）の結合部位は、（＋）鎖上の１９塩基および（−）鎖上の２３塩基であってもよい。
【０３９０】
異なる生物は、異なるＰＡＭ配列を含んでもよい。異なるＣａｓタンパク質は、異なるＰＡＭ配列を認識することができる。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓでは、ＰＡＭは、配列５’−ＸＲＲ−３’（配列中、Ｒは、ＡまたはＧであってよく、Ｘは任意のヌクレオチドであり、Ｘは、スペーサー配列によって標的化される標的核酸配列のすぐ３’側にある）を含んでもよい。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９（ＳｐｙＣａｓ９）のＰＡＭ配列は、５’−ＸＧＧ−３’（配列中、Ｘは任意のＤＮＡヌクレオチドであり、標的ＤＮＡの非相補鎖のプロトスペーサー配列のすぐ３’側にある）であってもよい。Ｃｐｆ１のＰＡＭは、５’−ＴＴＸ−３’（配列中、Ｘは任意のＤＮＡヌクレオチドであり、ＣＲＩＳＰＲ認識配列のすぐ５’側にある）であってもよい。
【０３９１】
ガイド核酸のための標的配列を、例えば、ＰＡＭ配列に隣接する標的配列内の配列を突き止める、バイオインフォマティクス手法によって同定することができる。ガイド核酸のための最適な標的配列を、例えば、最も高いオンターゲット活性および最も低いオフターゲット活性を有する配列を同定するためにいくつかのガイド核酸配列を試験する、実験的手法によって同定することができる。標的配列の位置を、所望の実験結果によって決定することができる。例えば、標的プロトスペーサーを、プロモーター中に配置して、標的遺伝子を活性化または抑制することができる。標的プロトスペーサーは、５’で構成的に発現されるエクソンまたは公知のドメインをコードする配列などの、コード配列内にあってもよい。標的プロトスペーサーは、オフターゲット効果を軽減するためのゲノム内のユニークな配列であってもよい。潜在的な標的プロトスペーサーを決定し、順位付けるための多くの公共的に利用可能なアルゴリズムが、当該分野で公知であり、使用することができる。
【０３９２】
標的核酸は、１つまたは複数のガイド核酸と少なくとも部分的に相補的である１つまたは複数の配列を含んでもよい。標的核酸は、他の核酸実体のうちでも、遺伝子の一部もしくは全部、遺伝子の５’末端、遺伝子の３’末端、調節エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー）、偽遺伝子、非コードＤＮＡ、マイクロサテライト、イントロン、エクソン、染色体ＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、センスＤＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、核様体（ｎｕｃｌｅｏｉｄ）ＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡ、またはＲＮＡであってもよい。標的核酸は、プラスミドＤＮＡの一部または全部であってもよい。プラスミドＤＮＡまたはその一部は、負にスーパーコイル化されていてもよい。標的核酸は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏであってもよい。
【０３９３】
標的核酸は、低いＧＣ含量の領域内の配列を含んでもよい。標的核酸は、負にスーパーコイル化されていてもよい。非限定例により、標的核酸は、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、もしくは６５％の、またはそれより高いＧＣ含量を含んでもよい。標的核酸は、多くても約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、もしくは６５％の、またはそれより高いＧＣ含量を含んでもよい。
【０３９４】
特定のＧＣ含量を含む領域は、ガイド核酸とハイブリダイズする標的核酸の長さであってもよい。ＧＣ含量を含む領域は、ガイド核酸とハイブリダイズする領域の長さよりも長い、または短いものであってもよい。ＧＣ含量を含む領域は、ガイド核酸とハイブリダイズする領域の長さよりも少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０もしくは１００個のヌクレオチドまたはそれより多いヌクレオチド長い、または短い可能性がある。ＧＣ含量を含む領域は、ガイド核酸とハイブリダイズする領域の長さよりも多くても３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０もしくは１００個のヌクレオチドまたはそれより多いヌクレオチド長い、または短い可能性がある。
【０３９５】
本明細書の態様の様々な実施形態では、対象となるシステムを、宿主細胞中の標的核酸の転写を選択的にモジュレートする（例えば、減少または増加）ために使用することができる。標的核酸の転写の選択的モジュレーションは、標的核酸の転写を減少または増加させることができるが、非標的核酸またはオフターゲット核酸の転写を実質的にモジュレートすることができない、例えば、非標的核酸の転写を、ガイド核酸／酵素的に不活性な、または酵素的に減少したＣａｓタンパク質複合体などの、アクチュエータ部分の非存在下での非標的核酸の転写レベルと比較して、１％未満、５％未満、１０％未満、２０％未満、３０％未満、４０％未満、または５０％未満モジュレートすることができる。例えば、標的核酸の転写の選択的モジュレーション（例えば、減少または増加）は、ガイド核酸／酵素的に不活性な、または酵素的に減少したＣａｓタンパク質複合体などの、アクチュエータ部分の非存在下での標的核酸の転写レベルと比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または９０％より高く標的核酸の転写を減少させるか、または増加させることができる。
【０３９６】
一部の実施形態では、本開示は、標的核酸の転写を増加させるための方法を提供する。標的核酸の転写は、ガイド核酸／酵素的に不活性な、または酵素的に減少したＣａｓタンパク質複合体などの、アクチュエータ部分の非存在下での標的ＤＮＡの転写レベルと比較して、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７０倍、または少なくとも約１００倍増加してもよい。標的核酸の転写の選択的増加は、標的核酸の転写を増加させるが、非標的ＤＮＡの転写を実質的に増加させなくてもよく、例えば、非標的核酸の転写は、仮にあったとしても、ガイド核酸／酵素的に不活性な、または酵素的に減少したＣａｓタンパク質複合体などの、アクチュエータ部分の非存在下での非標的ＤＮＡの転写レベルと比較して、約５倍未満、約４倍未満、約３倍未満、約２倍未満、約１．８倍未満、約１．６倍未満、約１．４倍未満、約１．２倍未満、または約１．１倍未満増加する。
【０３９７】
一部の実施形態では、本開示は、標的核酸の転写を減少させるための方法を提供する。標的核酸の転写は、ガイド核酸／酵素的に不活性な、または酵素的に減少したＣａｓタンパク質複合体などの、アクチュエータ部分の非存在下での標的ＤＮＡの転写レベルと比較して、約１．１分の１以下、約１．２分の１以下、約１．３分の１以下、約１．４分の１以下、約１．５分の１以下、約１．６分の１以下、約１．７分の１以下、約１．８分の１以下、約１．９分の１以下、約２分の１以下、約２．５分の１以下、約３分の１以下、約３．５分の１以下、約４分の１以下、約４．５分の１以下、約５分の１以下、約６分の１以下、約７分の１以下、約８分の１以下、約９分の１以下、約１０分の１以下、約１２分の１以下、約１５分の１以下、約２０分の１以下、約５０分の１以下、約７０分の１以下、または約１００分の１以下に減少してもよい。標的核酸の転写の選択的減少は、標的核酸の転写を減少させるが、非標的ＤＮＡの転写を実質的に減少させなくてもよく、例えば、非標的核酸の転写は、仮にあったとしても、ガイド核酸／酵素的に不活性な、または酵素的に減少したＣａｓタンパク質複合体などの、アクチュエータ部分の非存在下での非標的ＤＮＡの転写レベルと比較して、約５分の１超、約４分の１超、約３分の１超、約２分の１超、約１．８分の１超、約１．６分の１超、約１．４分の１超、約１．２分の１超、または約１．１分の１超に減少する。
【０３９８】
酵素的に不活性なＣａｓタンパク質などのアクチュエータ部分を、異種配列に融合することによって、転写調節を達成することができる。異種配列は、好適な融合パートナー、例えば、標的核酸に対して直接作用するか、または標的核酸と結合したポリペプチド（例えば、ヒストンもしくは他のＤＮＡ結合タンパク質）に対して作用することによって、転写を間接的に増加させる、減少させる、または他の方法でモジュレートする活性を提供するポリペプチドであってもよい。好適な融合パートナーの非限定例としては、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、または脱ミリストイル化活性を提供するポリペプチドが挙げられる。
【０３９９】
好適な融合パートナーは、標的核酸の転写の増加を直接もたらすポリペプチドを含んでもよい。例えば、転写活性化因子もしくはその断片、転写活性化因子を動員するタンパク質もしくはその断片、または低分子／薬物応答性転写調節因子である。好適な融合パートナーは、標的核酸の転写の減少を直接もたらすポリペプチドを含んでもよい。例えば、転写抑制因子もしくはその断片、転写抑制因子を動員するタンパク質もしくはその断片、または低分子／薬物応答性転写調節因子である。
【０４００】
異種配列または融合パートナーを、アクチュエータ部分、例えば、非機能性Ｃａｓタンパク質のＣ末端、Ｎ末端、または内部部分（すなわち、ＮもしくはＣ末端以外の部分）に融合することができる。融合パートナーの非限定例としては、転写活性化因子、転写抑制因子、ヒストンリシンメチルトランスフェラーゼ（ＫＭＴ）、ヒストンリシンデメチラーゼ、ヒストンリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＫＡＴ）、ヒストンリシンデアセチラーゼ、ＤＮＡメチラーゼ（アデノシンまたはシトシン改変）、ＣＴＣＦ、末梢動員エレメント（例えば、ラミンＡ、ラミンＢ）、およびタンパク質ドッキングエレメント（例えば、ＦＫＢＰ／ＦＲＢ）が挙げられる。
【０４０１】
転写活性化因子の非限定例としては、ＧＡＬ４、ＶＰ１６、ＶＰ６４、およびｐ６５サブドメイン（ＮＦカッパＢ）が挙げられる。
【０４０２】
転写抑制因子の非限定例としては、Ｋｒｕｉｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢまたはＳＫＤ）、Ｍａｄ  ｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ）、およびＥＲＦ抑制因子ドメイン（ＥＲＤ）が挙げられる。
【０４０３】
ヒストンリシンメチルトランスフェラーゼ（ＫＭＴ）の非限定例としては、ＫＭＴ１ファミリー（例えば、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、Ｇ９Ａ、ＥＳＥＴ／ＳＥＴＤＢ１、Ｃｌｒ４、Ｓｕ（ｖａｒ）３−９）、ＫＭＴ２ファミリーメンバー（例えば、ｈＳＥＴ１Ａ、ｈＳＥＴ１Ｂ、ＭＬＬ１〜５、ＡＳＨ１、およびホモログ（Ｔｒｘ、Ｔｒｒ、Ａｓｈ１））、ＫＭＴ３ファミリー（ＳＹＭＤ２、ＮＳＤ１）、ＫＭＴ４（ＤＯＴ１Ｌおよびホモログ）、ＫＭＴ５ファミリー（Ｐｒ−ＳＥＴ７／８、ＳＵＶ４−２０Ｈ１、およびホモログ）、ＫＭＴ６（ＥＺＨ２）、ならびにＫＭＴ８（例えば、ＲＩＺ１）に由来するメンバーが挙げられる。
【０４０４】
ヒストンリシンデメチラーゼ（ＫＤＭ）の非限定例としては、ＫＤＭ１ファミリー（ＬＳＤ１／ＢＨＣ１１０、Ｓｐｌｓｄ１／Ｓｗｍ１／Ｓａｆ１１  ０、Ｓｕ（ｖａｒ）３−３）、ＫＤＭ３ファミリー（ＪＨＤＭ２ａ／ｂ）、ＫＤＭ４ファミリー（ＪＭＪＤ２Ａ／ＪＨＤＭ３Ａ、ＪＭＪＤ２Ｂ、ＪＭＪＤ２Ｃ／ＧＡＳＣ１、ＪＭＪＤ２Ｄ、およびホモログ（Ｒｐｈ１））、ＫＤＭ５ファミリー（ＪＡＲＩＤ１Ａ／ＲＢＰ２、ＪＡＲＩＤ１Ｂ／ＰＬＵ−１、ＪＡＲＩＤＩＣ／ＳＭＣＸ、ＪＡＲＩＤ１Ｄ／ＳＭＣＹ、およびホモログ（Ｌｉｄ、Ｊｈｎ２、Ｊｍｊ２））、ならびにＫＤＭ６ファミリー（例えば、ＵＴＸ、ＪＭＪＤ３）に由来するメンバーが挙げられる。
【０４０５】
ＫＡＴの非限定例としては、ＫＡＴ２ファミリー（ｈＧＣＮ５、ＰＣＡＦ、およびホモログ（ｄＧＣＮ５／ＰＣＡＦ、Ｇｃｎ５））、ＫＡＴ３ファミリー（ＣＢＰ、ｐ３００、およびホモログ（ｄＣＢＰ／ＮＥＪ））、ＫＡＴ４、ＫＡＴ５、ＫＡＴ６、ＫＡＴ７、ＫＡＴ８、およびＫＡＴ１３のメンバーが挙げられる。
【０４０６】
一部の実施形態では、非機能性Ｃａｓタンパク質または非機能性Ｃａｓ融合タンパク質を含むアクチュエータ部分は、ガイド核酸によって標的核酸中の特定の位置（すなわち、配列）に標的化され、ＲＮＡポリメラーゼがプロモーターに結合するのを遮断すること（例えば、転写活性化因子機能を選択的に阻害することができる）、および／または局部クロマチン状態を改変すること（例えば、標的核酸を改変することができるか、もしくは標的核酸と結合したポリペプチドを改変する融合配列が使用される場合）などの、遺伝子座特異的調節を行う。一部の場合、変化は一過的である（例えば、転写抑制または活性化）。一部の場合、変化は、遺伝性である（例えば、エピジェネティック改変が、標的ＤＮＡに対して、または標的ＤＮＡと結合したタンパク質、例えば、ヌクレオソームヒストンに対して為される場合）。
【０４０７】
一部の実施形態では、ガイド核酸は、異種ポリペプチドを、標的核酸に動員して、標的核酸の転写をモジュレートするタンパク質結合セグメントを含んでもよい。異種ポリペプチドの非限定例としては、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、または脱ミリストイル化活性を提供するポリペプチドが挙げられる。ガイド核酸は、転写活性化因子、転写抑制因子、またはその断片を動員するタンパク質結合セグメントを含んでもよい。
【０４０８】
一部の実施形態では、遺伝子発現のモジュレーションは、標的核酸の調節エレメント、例えば、転写応答エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー）、上流活性化配列（ＵＡＳ）、および／または標的ＤＮＡの発現を制御することができると考えられる未知もしくは既知の機能の配列を標的化するように設計されたガイド核酸を使用することによって達成される。
【０４０９】
対象となるシステムを、様々な細胞に導入することができる。様々な細胞を、対象となる方法およびシステムにおいて使用することができる。細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏであってもよい。細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏであってもよい。細胞は、ｅｘ  ｖｉｖｏであってもよい。細胞は、単離された細胞であってもよい。細胞は、生物の内部の細胞であってもよい。細胞は、生物であってもよい。細胞は、細胞培養物中の細胞であってもよい。細胞は、細胞収集物のうちの１つであってもよい。細胞は、哺乳動物細胞であるか、または哺乳動物細胞に由来するものであってもよい。細胞は、齧歯類細胞であるか、または齧歯類細胞に由来するものであってもよい。細胞は、ヒト細胞であるか、またはヒト細胞に由来するものであってもよい。細胞は、原核細胞であるか、または原核細胞に由来するものであってもよい。細胞は、細菌細胞であるか、または細菌細胞に由来するものであってもよい。細胞は、古細菌細胞であるか、または古細菌細胞に由来するものであってもよい。細胞は、真核細胞であるか、または真核細胞に由来するものであってもよい。細胞は、多能性幹細胞であってもよい。細胞は、植物細胞であるか、または植物細胞に由来するものであってもよい。細胞は、動物細胞であるか、または動物細胞に由来するものであってもよい。細胞は、無脊椎動物細胞であるか、または無脊椎動物細胞に由来するものであってもよい。細胞は、脊椎動物細胞であるか、または脊椎動物細胞に由来するものであってもよい。細胞は、微生物細胞であるか、または微生物細胞に由来するものであってもよい。細胞は、真菌細胞であるか、または真菌細胞に由来するものであってもよい。細胞は、特定の臓器または組織に由来するものであってもよい。
【０４１０】
細胞は、幹細胞であるか、または前駆細胞であってもよい。細胞は、幹細胞（例えば、成体幹細胞、胚性幹細胞、ｉＰＳ細胞）および前駆細胞（例えば、心臓前駆細胞、神経前駆細胞など）を含んでもよい。細胞は、齧歯類幹細胞、齧歯類前駆細胞、ヒト幹細胞、ヒト前駆細胞などを含む、哺乳動物幹細胞および前駆細胞を含んでもよい。クローン細胞は、細胞の子孫を含んでもよい。細胞は、標的核酸を含んでもよい。細胞は、生きている生物中にあってもよい。細胞は、遺伝的に改変された細胞であってもよい。細胞は、宿主細胞であってもよい。
【０４１１】
細胞は、全能性幹細胞であってもよいが、本開示の一部の実施形態では、用語「細胞」を使用してもよいが、全能性幹細胞を指さなくてもよい。細胞は、植物細胞であってもよいが、本開示の一部の実施形態では、用語「細胞」を使用してもよいが、植物細胞を指さなくてもよい。細胞は、多能性細胞であってもよい。例えば、細胞は、造血細胞系列中の他の細胞に分化することができるが、他の任意の非造血細胞に分化することはできない多能性造血細胞であってもよい。細胞は、造血前駆細胞であってもよい。細胞は、造血幹細胞であってもよい。細胞は、完全な生物に発生することができてもよい。細胞は、完全な生物に発生することができても、またはできなくてもよい。細胞は、完全な生物であってもよい。
【０４１２】
細胞は、初代細胞であってもよい。例えば、初代細胞の培養物を、０回、１回、２回、４回、５回、１０回、１５回、またはそれより多く継代することができる。細胞は、単細胞生物であってもよい。細胞を、培養物中で増殖させることができる。
【０４１３】
細胞は、疾患細胞であってもよい。疾患細胞は、代謝、遺伝子発現、および／または形態学的特徴が変化していてもよい。疾患細胞は、がん細胞、糖尿病細胞、およびアポトーシス細胞であってもよい。疾患細胞は、疾患を有する被験体に由来する細胞であってもよい。例示的な疾患としては、血液障害、がん、代謝障害、眼障害、臓器障害、骨格筋障害、心疾患などが挙げられる。
【０４１４】
細胞が初代細胞である場合、それらを任意の方法によって個体から収穫することができる。例えば、白血球を、アフェレーシス、白血球アフェレーシス、密度勾配分離などによって収穫することができる。皮膚、筋肉、骨髄、脾臓、肝臓、膵臓、肺、腸、胃などの組織に由来する細胞を、生検によって収穫することができる。収穫した細胞の分散または懸濁のために、適切な溶液を使用することができる。そのような溶液は、一般に、低濃度の許容される緩衝剤と共に、ウシ胎仔血清または他の天然に存在する因子を都合良く添加した、平衡塩溶液（例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ハンクス平衡塩溶液など）であってもよい。緩衝剤としては、ＨＥＰＥＳ、リン酸緩衝剤、乳酸緩衝剤などが挙げられる。細胞をすぐに使用するか、またはそれらを保存してもよい（例えば、凍結により）。凍結した細胞を解凍し、再使用することができる。細胞を、ＤＭＳＯ、血清、培地緩衝剤（例えば、１０％ＤＭＳＯ、５０％血清、４０％緩衝化培地）、および／または凍結温度で細胞を保存するために使用されるその他の一部のそのような一般的な溶液中で凍結することができる。
【０４１５】
対象となるシステムを使用することができる細胞の非限定例としては、限定されるものではないが、Ｂ細胞、Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、調節性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞）、ナチュラルキラー細胞、サイトカイン誘導性キラー（ＣＩＫ）細胞（例えば、ＵＳ２００８０２４１１９４を参照されたい）などのリンパ系細胞；顆粒球（好塩基性顆粒球、好酸性顆粒球、好中性顆粒球／過分葉好中球）、単球／マクロファージ、赤血球（網状赤血球）、肥満細胞、血小板／巨核球、樹状細胞などの骨髄性細胞；甲状腺（甲状腺上皮細胞、傍濾胞細胞）、副甲状腺（副甲状腺主細胞、好酸性細胞）、副腎（クロム親和性細胞）、松果体（松果体細胞）細胞を含む、内分泌系に由来する細胞；グリア細胞（アストロサイト、ミクログリア）、巨細胞性神経分泌細胞、星細胞、ベッチェル細胞、および下垂体（性腺刺激ホルモン産生細胞、副腎皮質刺激ホルモン産生細胞、甲状腺刺激ホルモン産生細胞、ソマトトロピン産生細胞、プロラクチン産生細胞）を含む、神経系の細胞；肺細胞（Ｉ型肺細胞、ＩＩ型肺細胞）、クララ細胞、杯細胞、じん埃細胞を含む、呼吸器系の細胞；心筋細胞、周皮細胞を含む、循環系の細胞；胃（胃主細胞、壁細胞）、杯細胞、パネート細胞、Ｇ細胞、Ｄ細胞、ＥＣＬ細胞、Ｉ細胞、Ｋ細胞、Ｓ細胞を含む、消化系の細胞；腸クロム親和性細胞、ＡＰＵＤ細胞、肝臓（肝細胞、クッパー細胞）、軟骨／骨／筋肉を含む、腸内分泌細胞；骨芽細胞、骨細胞、破骨細胞、歯（セメント芽細胞、エナメル芽細胞）を含む骨細胞；軟骨芽細胞、軟骨細胞を含む軟骨細胞；トリコサイト、ケラチノサイト、メラノサイト（母斑細胞）を含む皮膚細胞；心筋細胞を含む筋肉細胞；有足細胞、傍糸球体細胞、糸球体内メサンギウム細胞／糸球体外メサンギウム細胞、腎臓近位尿細管刷子縁細胞、緻密斑細胞を含む泌尿系細胞；精子、セルトリ細胞、ライディッヒ細胞、卵を含む生殖系の細胞；ならびに脂肪細胞、線維芽細胞、腱細胞、表皮ケラチノサイト（分化している表皮細胞）、表皮基底細胞（幹細胞）、指爪および足爪のケラチノサイト、爪床基底細胞（幹細胞）、毛髄質細胞（Ｍｅｄｕｌｌａｒｙ  ｈａｉｒ  ｓｈａｆｔ  ｃｅｌｌ）、毛皮質細胞（Ｃｏｒｔｉｃａｌ  ｈａｉｒ  ｓｈａｆｔ  ｃｅｌｌ）、クチクラ毛幹細胞、クチクラ毛根鞘細胞、ハックスレー層の毛根鞘細胞、ヘンレー層の毛根鞘細胞、外毛根鞘細胞（Ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｈａｉｒ  ｒｏｏｔ  ｓｈｅａｔｈ  ｃｅｌｌ）、毛母細胞（幹細胞）、湿性重層バリア上皮細胞、角膜、舌、口腔、食道、肛門管、遠位尿道および膣の重層扁平上皮の表面上皮細胞、角膜、舌、口腔、食道、肛門管、遠位尿道および膣の上皮の基底細胞（幹細胞）、尿路上皮細胞（膀胱および尿管を裏打ちする）、外分泌上皮細胞、唾液腺粘液細胞（多糖類に富む分泌）、唾液腺漿液細胞（糖タンパク質酵素に富む分泌）、舌のフォン・エブネル腺細胞（味蕾を洗浄する）、乳腺細胞（乳汁分泌）、涙腺細胞（涙分泌）、耳における耳道腺細胞（耳垢分泌）、エクリン汗腺暗細胞（糖タンパク質分泌）、エクリン汗腺明細胞（低分子分泌）、アポクリン汗腺細胞（発香性分泌物、性ホルモン感受性）、まぶたのモル腺細胞（特殊化された汗腺）、皮脂腺細胞（���質に富む皮脂分泌）、鼻のボーマン腺細胞（嗅上皮を洗浄する）、十二指腸のブルンナー腺細胞（酵素およびアルカリ粘液）、精嚢細胞（泳いでいる精子のためのフルクトースを含む、精液成分を分泌する）、前立腺細胞（精液成分を分泌する）、尿道球腺細胞（粘液分泌）、バルトリン腺細胞（膣液分泌）、リトル腺細胞（粘液分泌）、子宮内膜細胞（炭水化物分泌）、気道および消化管の単離された杯細胞（粘液分泌）、胃内膜粘液細胞（粘液分泌）、胃腺酵素原細胞（ペプシノゲン分泌）、胃腺酸分泌細胞（塩酸分泌）、膵腺房細胞（重炭酸塩および消化酵素分泌）、小腸のパネート細胞（リゾチーム分泌）、肺のＩＩ型肺細胞（界面活性物質分泌）、肺のクララ細胞、ホルモン分泌細胞、下垂体前葉細胞、ソマトトロピン産生細胞、プロラクチン産生細胞、甲状腺刺激ホルモン産生細胞、性腺刺激ホルモン産生細胞、副腎皮質刺激ホルモン分泌細胞、下垂体中葉細胞、巨細胞性神経分泌細胞、腸管および気道の細胞、甲状腺細胞、甲状腺上皮細胞、傍濾胞細胞、副甲状腺細胞、副甲状腺主細胞、好酸性細胞、副腎細胞、クロム親和性細胞、精巣のライディッヒ細胞、卵胞の内膜細胞、破裂した卵胞の黄体細胞、顆粒膜黄体細胞、卵胞膜黄体細胞、傍糸球体細胞（レニン分泌）、腎臓の緻密斑細胞、代謝および貯蔵細胞、バリア機能細胞（肺、腸、外分泌腺および尿生殖路）、腎臓、Ｉ型肺細胞（肺の気腔の内膜）、膵管細胞（房心細胞）、ひだのない管の細胞（ｎｏｎｓｔｒｉａｔｅｄ  ｄｕｃｔ  ｃｅｌｌ）（汗腺、唾液腺、乳腺のものなど）、管細胞（精嚢、前立腺のものなど）、閉鎖した内部体腔の内側の上皮細胞、推進機能を有する繊毛細胞、細胞外マトリクス分泌細胞、収縮性細胞；骨格筋細胞、幹細胞、心筋細胞、血液および免疫系の細胞、エリスロサイト（赤血球）、巨核球（血小板前駆体）、単球、結合組織マクロファージ（様々な型）、表皮ランゲルハンス細胞、破骨細胞（骨における）、樹状細胞（リンパ系組織における）、ミクログリア細胞（中枢神経系における）、好中性顆粒球、好酸性顆粒球、好塩基性顆粒球、肥満細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、網状赤血球、血液および免疫系の幹細胞および系統決定された前駆細胞（様々な型）、多能性幹細胞、全能性幹細胞、誘導多能性幹細胞、成体幹細胞、感覚変換細胞、自律神経ニューロン細胞、感覚器官および末梢ニューロン支持細胞、中枢神経系ニューロンおよびグリア細胞、水晶体細胞、色素細胞、メラノサイト、網膜色素上皮細胞、生殖細胞、卵原細胞／卵母細胞、精子細胞、精母細胞、精原細胞（精母細胞の幹細胞）、精子、栄養細胞、卵胞細胞、セルトリ細胞（精巣における）、胸腺上皮細胞、間質細胞、および間質腎臓細胞を含む他の細胞が挙げられる。
【０４１６】
本明細書の態様の様々な実施形態では、対象となるシステムは、細胞または細胞集団中で発現される。細胞、例えば、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞およびＮＫ細胞を含むリンパ球）を、被験体から取得することができる。被験体の非限定例としては、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、およびそのトランスジェニック種が挙げられる。細胞を誘導することができる被験体由来試料の例としては、限定されるものではないが、皮膚、心臓、肺、腎臓、骨髄、乳房、膵臓、肝臓、筋肉、平滑筋、膀胱、胆嚢、結腸、腸、脳、前立腺、食道、甲状腺、血清、唾液、尿、胃液および消化液、涙、糞便、精液、膣液、腫瘍性組織に由来する間質液、眼液（ｏｃｕｌａｒ  ｆｌｕｉｄ）、汗、粘液、耳垢、油、腺分泌物、髄液、毛髪、指爪、血漿、鼻スワブもしくは鼻咽頭洗浄液、髄液、脳脊髄液、組織、咽喉スワブ、生検、胎盤液、羊水、臍帯血、エンファティック液（ｅｍｐｈａｔｉｃ  ｆｌｕｉｄ）、体腔液、痰、膿、微生物叢、胎便、母乳、および／または他の排泄物もしくは体組織が挙げられる。
【０４１７】
本明細書の態様の様々な実施形態では、免疫細胞は、リンパ球を含む。一部の実施形態では、リンパ球は、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）である。一部の実施形態では、リンパ球は、Ｔ細胞である。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、脾臓組織、臍帯血、および腫瘍を含むいくつかの供給源から取得することができる。一部の実施形態では、利用可能ないくつものＴ細胞系を使用することができる。リンパ球（例えば、細胞傷害性リンパ球）などの免疫細胞は、好ましくは、自己細胞であってよいが、異種細胞を使用することもできる。Ｔ細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ分離などのいくつもの技術を使用して、被験体から収集された血液単位から取得することができる。個体の循環血に由来する細胞を、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスによって取得することができる。アフェレーシス産物は、典型的には、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球、および血小板を含むリンパ球を含有する。アフェレーシスによって収集された細胞を洗浄して、血漿画分を除去し、その後のプロセシングステップのために、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの適切な緩衝剤または媒体中に細胞を入れることができる。洗浄後、細胞を、Ｃａ非含有、Ｍｇ非含有ＰＢＳなどの、様々な生体適合性緩衝剤中に再懸濁することができる。あるいは、アフェレーシス試料の望ましくない成分を除去し、細胞を培養培地中に直接的に再懸濁することができる。試料を、被験体によって直接的に、または試料収集サービス提供者もしくは医療提供者（例えば、医師もしくは看護師）などの、１つもしくは複数の仲介者によって間接的に提供することができる。一部の実施形態では、末梢血白血球からのＴ細胞の単離は、赤血球を溶解すること、および例えば、ＰＥＲＣＯＬ（商標）勾配による遠心分離によって、単球から末梢血白血球を分離することを含んでもよい。
【０４１８】
ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞などの、Ｔ細胞の特異的部分集団を、陽性または陰性選択技術によってさらに単離することができる。Ｔ細胞集団の陰性選択を、例えば、陰性選択される細胞にとってユニークな表面マーカーに対する抗体の組合せを用いて達成することができる。１つの好適な技術は、陰性選択される細胞上に存在する細胞表面マーカーに指向されるモノクローナル抗体のカクテルを使用する、陰性磁気免疫接着による細胞選別を含む。例えば、ＣＤ４＋細胞を単離するために、モノクローナル抗体カクテルは、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１ｌｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ−ＤＲ、およびＣＤ８に対する抗体を含んでもよい。陰性選択のプロセスを使用して、主として均質である所望のＴ細胞集団を産生することができる。一部の実施形態では、組成物は、２つまたはそれより多い（例えば、２、３、４、５つ、またはそれより多い）異なる種類のＴ細胞の混合物を含む。
【０４１９】
一部の実施形態では、免疫細胞は、富化された細胞集団のメンバーである。１つまたは複数の所望の細胞型を、任意の好適な方法によって富化することができ、その非限定例としては、拡大増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）および／または所望の細胞型への分化を誘発するための細胞集団の処置、望ましくない細胞集団の増殖を停止させる処置、望ましくない細胞型を殺傷または溶解するための処置、所望の細胞型の精製（例えば、１つまたは複数の細胞表面マーカーに基づく望ましい、または望ましくない細胞型を保持するための親和性カラム上での精製）が挙げられる。一部の実施形態では、富化された細胞集団は、細胞傷害性Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔリンパ球、ＣＴＬ、Ｔキラー細胞、細胞溶解性Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびキラーＴ細胞として様々に公知でもある）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、およびリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞から選択される細胞傷害性リンパ球が富化された細胞集団である。
【０４２０】
陽性または陰性選択による所望の細胞集団の単離のために、細胞および表面（例えば、ビーズなどの粒子）の濃度を変化させてもよい。ある特定の実施形態では、細胞とビーズとの最大接触を確保するために、ビーズと細胞とが一緒に混合される体積を有意に減少させる（すなわち、細胞の濃度を増加させる）ことが望ましいことがあり得る。例えば、２０億個の細胞／ｍＬの濃度を使用することができる。一部の実施形態では、１０億個の細胞／ｍＬの濃度を使用する。一部の実施形態では、１億個の細胞／ｍＬより高い濃度を使用する。１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万、または５０００万個の細胞／ｍＬの細胞濃度を使用することができる。さらに別の実施形態では、７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万、または１億個の細胞／ｍＬの細胞濃度を使用することができる。さらなる実施形態では、１億２５００万または１億５０００万個の細胞／ｍＬの濃度を使用することができる。高濃度の使用は、細胞収量、細胞活性化、および細胞拡大増殖の増加をもたらし得る。
【０４２１】
細胞、例えば、免疫細胞に、１つまたは複数の本明細書に記載のベクターを一過的または非一過的にトランスフェクトすることができる。細胞を、それが被験体中に天然に存在する通りにトランスフェクトすることができる。細胞を、被験体から採取するか、または誘導し、トランスフェクトすることができる。細胞を、細胞系などの、被験体から採取した細胞から誘導することができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の本明細書に記載のベクターをトランスフェクトした細胞を使用して、１つまたは複数のベクター由来配列を含む新しい細胞系を樹立する。一部の実施形態では、対象となるシステムの様々な成分を一過的にトランスフェクトされ（１つもしくは複数のベクターの一過的トランスフェクション、またはＲＮＡのトランスフェクションなどによる）、ＣＲＩＳＰＲ複合体の活性によって改変された細胞を使用して、改変を含有するが、他の任意の外因性配列を欠く細胞を含む新しい細胞系を樹立する。
【０４２２】
細胞中に導入された対象となるシステムを、標的ポリヌクレオチドの発現（例えば、遺伝子発現）を調節するために使用することができる。本明細書の態様の様々な実施形態の発現されたＧＭＰは、標的遺伝子の発現を調節するのに有用である。ある態様では、本開示は、遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）の発現を誘導する方法を提供する。方法は、（ａ）リガンド結合ドメインと、シグナル伝達ドメインとを有する膜貫通受容体を発現する細胞を提供するステップと、（ｂ）リガンドを、膜貫通受容体のリガンド結合ドメインに結合させるステップであって、結合が、細胞のシグナル伝達経路を活性化し、次いで、ＧＭＰをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターが活性化される、ステップと、（ｃ）プロモーターが活性化されると、ＧＭＰを発現するステップとを含む。
【０４２３】
リガンドの膜貫通受容体への結合は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏで生じてもよい。リガンドの膜貫通受容体への結合は、受容体を、リガンドと接触させることを含んでもよい。リガンドは、膜結合型タンパク質または非膜結合型タンパク質であってもよい。リガンドは、一部の場合、細胞の膜に結合する。
【０４２４】
一部の実施形態では、ＧＭＰは、リガンドが膜貫通受容体に結合する時に優先的に発現される。一部の実施形態では、ＧＭＰは、リガンドが膜貫通受容体に結合する時に主として発現される。一部の実施形態では、ＧＭＰは、リガンドが膜貫通受容体に結合する時にのみ発現される。
【０４２５】
ＧＭＰコード配列に作動可能に連結されるプロモーターは、プラスミド、例えば、非組込みベクターの一部として細胞中に存在してもよい。一部の場合、ＧＭＰコード配列は、ゲノム中に組み込まれている。ＧＭＰコード配列を、それが内因性プロモーターに作動可能に連結されるようにゲノム中に組み込むことができる。ＧＭＰコード配列を、それが内因性プロモーターによって調節される内因性タンパク質をコードする遺伝子の下流になるようにゲノム中に組み込むことができる。ＧＭＰコード配列は、遺伝子にインフレームで結合することができる。あるいは、ＧＭＰコード配列を、ＩＲＥＳを含む核酸配列を介して遺伝子に連結することができる。一部の場合、ＧＭＰをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットが、ゲノム中に組み込まれる。一部の場合、この発現カセットは、ゲノム中にランダムに組み込まれる。
【０４２６】
ある態様では、本開示は、細胞における標的遺伝子の発現を調節する方法であって、（ａ）リガンドを、リガンド結合ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む膜貫通受容体に接触させるステップであって、接触すると、シグナル伝達ドメインが細胞のシグナル伝達経路を活性化する、ステップと、（ｂ）アクチュエータ部分を含む遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）を、プロモーターの制御下に置かれた、ＧＭＰをコードする核酸配列を含む発現構築物から発現させるステップであって、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、プロモーターが活性化されてＧＭＰの発現を駆動する、ステップと、（ｃ）発現されたＧＭＰの結合によって標的遺伝子の発現を増加または減少させることによって、標的遺伝子の発現を調節するステップとを含む方法を提供する。
【０４２７】
ある態様では、本開示は、細胞における標的遺伝子の発現を調節する方法であって、リガンドを、リガンド結合ドメイン、シグナル伝達ドメイン、および切断認識部位に連結されたアクチュエータ部分を含む遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）を含む膜貫通受容体に接触させるステップであって、リガンドがリガンド結合ドメインに接触すると、シグナル伝達ドメインが細胞のシグナル伝達経路を活性化する、ステップと、切断部分をコードする核酸配列を含む発現カセットから切断部分を発現させるステップであって、核酸配列が、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、シグナル伝達経路によって活性化されて切断部分の発現を駆動するプロモーターの制御下に置かれる、ステップと、切断部分によって、切断認識部位を切断して、膜貫通受容体からアクチュエータ部分を放出するステップであって、放出されたアクチュエータ部分が標的ポリヌクレオチド、例えば、標的遺伝子の発現を調節する、ステップとを含む方法を提供する。一部の実施形態では、切断部分は、切断認識部位の近くにある場合、切断認識部位を切断する。一部の場合、膜貫通受容体は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、シグナル伝達ドメイン、切断認識部位、およびアクチュエータ部分を含む。リガンド結合ドメインは、細胞の細胞外領域に位置してもよい。シグナル伝達ドメイン、切断認識部位、およびアクチュエータ部分は、細胞の細胞内領域に位置してもよい。
【０４２８】
ある態様では、本開示は、細胞中の標的遺伝子の発現を調節する方法であって、リガンドを、リガンド結合ドメイン、シグナル伝達ドメイン、および切断部分を含む膜貫通受容体に接触させるステップであって、リガンドがリガンド結合ドメインに接触すると、シグナル伝達ドメインが細胞のシグナル伝達経路を活性化する、ステップと、融合タンパク質をコードする核酸配列を含む発現カセットから核外輸送シグナルペプチドに連結された遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）を含む融合タンパク質を発現させるステップであって、ＧＭＰが、切断認識部位に連結されたアクチュエータ部分を含み、核酸配列が、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、シグナル伝達経路によって活性化されて、融合タンパク質の発現を駆動するプロモーターの制御下に置かれる、ステップと、切断部分によって切断認識部位を切断して、アクチュエータ部分を放出するステップであって、放出されたアクチュエータ部分が標的ポリヌクレオチド、例えば、標的遺伝子の発現を調節する、ステップとを含む方法を提供する。一部の実施形態では、切断部分は、切断認識部位の近くにある場合、切断認識部位を切断する。一部の場合、膜貫通受容体は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、リガンド結合ドメイン、膜貫通領域、シグナル伝達ドメイン、および切断部分を含む。リガンド結合ドメインは、細胞の細胞外領域に位置してもよい。シグナル伝達ドメイン、切断認識部位、およびアクチュエータ部分は、細胞の細胞内領域に位置してもよい。
【０４２９】
ある態様では、本開示は、細胞中の標的遺伝子の発現を調節する方法であって、リガンドを、リガンド結合ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む膜貫通受容体と接触させるステップであって、リガンドがリガンド結合ドメインに接触すると、シグナル伝達ドメインが細胞のシグナル伝達経路を活性化する、ステップと、切断部分をコードする核酸配列を含む発現カセットから切断部分を発現させるステップであって、核酸配列が、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、シグナル伝達経路によって活性化されて、切断部分の発現を駆動するプロモーターの制御下に置かれる、ステップと、切断部分によって、核外輸送シグナルペプチドに連結された遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）を含む融合タンパク質の切断認識部位を切断するステップであって、ＧＭＰが、切断認識部位に連結されたアクチュエータ部分を含み、切断されると、アクチュエータ部分が放出され、放出されたアクチュエータ部分が標的ポリヌクレオチド、例えば、標的遺伝子の発現を調節する、ステップとを含む方法を提供する。一部の実施形態では、切断部分は、切断認識部位の近位に存在する場合、切断認識部位を切断する。一部の場合、膜貫通受容体は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、リガンド結合ドメイン、膜貫通領域、およびシグナル伝達ドメインを含む。リガンド結合ドメインは、細胞の細胞外領域に位置してもよい。シグナル伝達ドメインは、細胞の細胞内領域に位置してもよい。
【０４３０】
ある態様では、本開示は、細胞中の標的遺伝子の発現を調節する方法であって、リガンドを、リガンド結合ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む膜貫通受容体に接触させるステップであって、リガンドがリガンド結合ドメインに接触すると、シグナル伝達ドメインが細胞のシグナル伝達経路を活性化する、ステップと、融合タンパク質をコードする核酸配列を含む発現カセットから核外輸送シグナルペプチドに連結された遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）を含む融合タンパク質を発現させるステップであって、ＧＭＰが、切断認識配列に連結されたアクチュエータ部分を含み、核酸配列が、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、シグナル伝達経路によって活性化されて、融合タンパク質の発現を駆動するプロモーターの制御下に置かれる、ステップと、切断部分によって融合タンパク質の切断認識部位を切断して、アクチュエータ部分を放出するステップであって、放出されたアクチュエータ部分が標的ポリヌクレオチド、例えば、標的遺伝子の発現を調節する、ステップとを含む方法を提供する。一部の実施形態では、切断部分は、切断認識部位の近位に存在する場合、切断認識部位を切断する。一部の場合、膜貫通受容体は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、リガンド結合ドメイン、膜貫通領域、およびシグナル伝達ドメインを含む。リガンド結合ドメインは、細胞の細胞外領域に位置してもよい。シグナル伝達ドメインは、細胞の細胞内領域に位置してもよい。
【０４３１】
ある態様では、本開示は、細胞中の標的遺伝子の発現を調節する方法であって、リガンドを、リガンド結合ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む膜貫通受容体に接触させるステップであって、リガンドがリガンド結合ドメインに接触すると、シグナル伝達ドメインが細胞のシグナル伝達経路を活性化する、ステップと、融合タンパク質をコードする第１の核酸配列を含む第１の発現カセットから核外輸送シグナルペプチドに連結された遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）を含む融合タンパク質を発現させるステップであって、ＧＭＰが、切断認識配列に連結されたアクチュエータ部分を含み、核酸配列が、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、シグナル伝達経路によって活性化されて、融合タンパク質の発現を駆動する第１のプロモーターの制御下に置かれる、ステップと、切断部分をコードする核酸配列を含む第２の発現カセットから切断部分を発現させるステップであって、核酸が、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、シグナル伝達経路によって活性化されて、切断部分の発現を駆動する第２のプロモーターの制御下に置かれる、ステップと、発現された切断部分によって発現された融合タンパク質の切断認識部位を切断して、アクチュエータ部分を放出するステップであって、放出されたアクチュエータ部分が標的遺伝子の発現を調節する、ステップとを含む方法を提供する。一部の実施形態では、切断部分は、切断認識部位の近位に存在する場合、切断認識部位を切断する。一部の場合、膜貫通受容体は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、リガンド結合ドメイン、膜貫通領域、およびシグナル伝達ドメインを含む。リガンド結合ドメインは、細胞の細胞外領域に位置してもよい。シグナル伝達ドメインは、細胞の細胞内領域に位置してもよい。
【０４３２】
ある態様では、本開示は、細胞中の標的遺伝子の発現を調節する方法であって、リガンドを、リガンド結合ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む膜貫通受容体に接触させるステップであって、リガンドがリガンド結合ドメインに接触すると、シグナル伝達ドメインが細胞のシグナル伝達経路を活性化する、ステップと、第１の部分的遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）をコードする第１の核酸配列を含む第１の発現カセットから第１の部分的ＧＭＰを発現させるステップであって、第１の部分的ＧＭＰが、アクチュエータ部分の第１の部分を含み、第１の核酸配列が、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、シグナル伝達経路によって活性化されて、第１の部分的ＧＭＰの発現を駆動する第１のプロモーターの制御下に置かれる、ステップと、第２の部分的遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）をコードする第２の核酸配列を含む第２の発現カセットから第２の部分的ＧＭＰを発現させるステップであって、第２の部分的ＧＭＰが、アクチュエータ部分の第２の部分を含み、第２の核酸配列が、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、シグナル伝達経路によって活性化されて、第２の部分的ＧＭＰの発現を駆動する第２のプロモーターの制御下に置かれる、ステップと、第１の部分的ＧＭＰおよび第２の部分的ＧＭＰの複合体を形成して、再構成されたアクチュエータ部分を形成するステップとを含み、再構成されたアクチュエータ部分が標的ポリヌクレオチド、例えば、標的遺伝子の発現を調節する、方法を提供する。一部の場合、膜貫通受容体は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、リガンド結合ドメイン、膜貫通領域、およびシグナル伝達ドメインを含む。リガンド結合ドメインは、細胞の細胞外領域に位置してもよい。シグナル伝達ドメインは、細胞の細胞内領域に位置してもよい。
【０４３３】
ある態様では、本開示は、細胞中の標的遺伝子の発現を調節する方法であって、リガンドを、リガンド結合ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む膜貫通受容体に接触させるステップであって、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、シグナル伝達ドメインが細胞のシグナル伝達経路を活性化する、ステップと、第１の部分的切断部分をコードする第１の核酸配列を含む第１の発現カセットから第１の部分的切断部分を発現させるステップであって、第１の核酸配列が、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、シグナル伝達経路によって活性化されて第１の部分的切断部分の発現を駆動する第１のプロモーターの制御下に置かれる、ステップと、第２の部分的切断部分をコードする第２の核酸配列を含む第２の発現カセットから第２の部分的切断部分を発現させるステップであって、第２の核酸配列が、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、シグナル伝達経路によって活性化されて、第２の部分的切断部分の発現を駆動する第２のプロモーターの制御下に置かれる、ステップと、第１および第２の部分的切断部分の複合体を形成して、再構成された切断部分を生じるステップと、再構成された切断部分によって切断認識部位を切断して、核外輸送シグナルペプチドからアクチュエータ部分を放出するステップとを含み、放出されたアクチュエータ部分が標的ポリヌクレオチド、例えば、標的遺伝子の発現を調節する、方法を提供する。一部の実施形態では、切断部分は、切断認識部位の近位に存在する場合、切断認識部位を切断する。一部の場合、膜貫通受容体は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、リガンド結合ドメイン、膜貫通領域、およびシグナル伝達ドメインを含む。リガンド結合ドメインは、細胞の細胞外領域に位置してもよい。シグナル伝達ドメインは、細胞の細胞内領域に位置してもよい。
【０４３４】
ある態様では、本開示は、細胞中の標的遺伝子の発現を調節する方法であって、リガンドを、リガンド結合ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む膜貫通受容体に接触させるステップであって、リガンドがリガンド結合ドメインに接触すると、シグナル伝達ドメインが細胞のシグナル伝達経路を活性化する、ステップと、（ｉ）切断部分と、（ｉｉ）核外輸送シグナルペプチドに連結された遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）を含む融合タンパク質のうちの一方または両方を発現させるステップであって、ＧＭＰが、（ｉ）および（ｉｉ）のうちの一方または両方をコードする核酸配列を含む発現カセットに由来する、切断認識部位に連結されたアクチュエータ部分を含み、核酸配列が、リガンドがリガンド結合ドメインに結合すると、シグナル伝達経路によって活性化されるプロモーターの制御下に置かれる、ステップと、切断部分によって切断認識部位が切断されると、アクチュエータ部分を放出するステップとを含み、放出されたアクチュエータ部分が標的ポリヌクレオチド、例えば、標的遺伝子の発現を調節する、方法を提供する。
【０４３５】
リガンドと、膜貫通受容体との接触は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏで行うことができる。リガンドと、膜貫通受容体との接触は、受容体を、リガンドと接触させることを含んでもよい。リガンドは、膜結合型タンパク質または非膜結合型タンパク質であってもよい。リガンドは、一部の場合、細胞の膜に結合する。リガンドは、一部の場合、細胞の膜に結合しない。リガンドの存在下で対象となるシステムを発現する細胞を培養することによって、細胞と、リガンドとの接触をｉｎ  ｖｉｔｒｏで行うことができる。例えば、対象となるシステムを発現する細胞を、接着細胞として、または懸濁物中で培養し、リガンドを細胞培養培地に添加することができる。一部の場合、リガンドは、標的細胞によって発現され、曝露は、対象となるシステムを発現する細胞と、リガンドを発現する標的細胞とを同時培養することを含んでもよい。細胞を、例えば、補充物質、増殖因子、イオンなどと共に、様々な好適な型の細胞培養培地中で同時培養することができる。対象となるシステムを発現する細胞の、標的細胞（例えば、抗原を発現する標的細胞）への曝露を、ｉｎ  ｖｉｖｏで、一部の場合、細胞を、被験体、例えば、ヒト被験体に投与すること、および循環系によって細胞を標的細胞に局在化させることによって達成することができる。
【０４３６】
接触を、任意の好適な長さの時間にわたって、例えば、少なくとも１分間、少なくとも５分間、少なくとも１０分間、少なくとも３０分間、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも７時間、少なくとも８時間、少なくとも１２時間、少なくとも１６時間、少なくとも２０時間、少なくとも２４時間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも１カ月間、またはそれより長く実施することができる。
【０４３７】
一部の実施形態では、ＧＭＰは、リガンドが膜貫通受容体に結合する時に優先的に発現される。一部の実施形態では、ＧＭＰは、リガンドが膜貫通受容体に結合する時に主として発現される。一部の実施形態では、ＧＭＰは、リガンドが膜貫通受容体に結合する時にのみ発現される。一部の実施形態では、第１の部分的ＧＭＰは、リガンドが膜貫通受容体に結合する時に優先的に発現される。一部の実施形態では、第１のＧＭＰは、リガンドが膜貫通受容体に結合する時に主として発現される。一部の実施形態では、第１の部分的ＧＭＰは、リガンドが膜貫通受容体に結合する時にのみ発現される。一部の実施形態では、第２の部分的ＧＭＰは、リガンドが膜貫通受容体に結合する時に優先的に発現される。一部の実施形態では、第２の部分的ＧＭＰは、リガンドが膜貫通受容体に結合する時に主として発現される。一部の実施形態では、第２の部分的ＧＭＰは、リガンドが膜貫通受容体に結合する時にのみ発現される。
【０４３８】
一部の実施形態では、切断部分は、リガンドが膜貫通受容体に結合する時に優先的に発現される。一部の実施形態では、切断部分は、リガンドが膜貫通受容体に結合する時に主として発現される。一部の実施形態では、切断部分は、リガンドが膜貫通受容体に結合する時にのみ発現される。一部の実施形態では、第１の部分的切断部分は、リガンドが膜貫通受容体に結合する時に優先的に発現される。一部の実施形態では、第１の部分的切断部分は、リガンドが膜貫通受容体に結合する時に主として発現される。一部の実施形態では、第１の部分的切断部分は、リガンドが膜貫通受容体に結合する時にのみ発現される。一部の実施形態では、第２の部分的切断部分は、リガンドが膜貫通受容体に結合する時に優先的に発現される。一部の実施形態では、第２の部分的切断部分は、リガンドが膜貫通受容体に結合する時に主として発現される。一部の実施形態では、第２の部分的切断部分は、リガンドが膜貫通受容体に結合する時にのみ発現される。
【０４３９】
膜貫通受容体をリガンドと接触させる際に、プロモーターは、活性化されて、ＧＭＰの発現を駆動する。本明細書に以前に記載されたように、発現されたＧＭＰは、アクチュエータ部分を介して標的遺伝子の発現を増加または減少させることによって、標的遺伝子の発現を調節することができる。アクチュエータ部分は、遺伝子の発現もしくは活性を調節する、および／または核酸（例えば、遺伝子および／もしくは遺伝子産物）の配列を編集することができる。
【０４４０】
アクチュエータ部分は、ヌクレアーゼ（例えば、ＤＮＡヌクレアーゼおよび／またはＲＮＡヌクレアーゼ）、ヌクレアーゼ欠損であるかもしくは野生型ヌクレアーゼと比較してヌクレアーゼ活性が低減された改変ヌクレアーゼ（例えば、ＤＮＡヌクレアーゼおよび／またはＲＮＡヌクレアーゼ）、またはそのバリアントを含みうる。一部の実施形態では、アクチュエータ部分は、標的ＤＮＡ配列のゲノム編集を誘導するためにＤＮＡヌクレアーゼ、例えば操作された（例えば、プログラム可能なまたは標的化可能な）ＤＮＡヌクレアーゼを含む。一部の実施形態では、アクチュエータ部分は、標的ＲＮＡ配列のゲノム編集を誘導するためにＲＮＡヌクレアーゼ、例えば操作された（例えば、プログラム可能なまたは標的化可能な）ＲＮＡヌクレアーゼを含む。一部の実施形態では、アクチュエータ部分は、低減されたまたは最小のヌクレアーゼ活性を有する。低減されたまたは最小のヌクレアーゼ活性を有するアクチュエータ部分は、標的ポリヌクレオチドの物理的障害によって、または標的ポリヌクレオチドの発現を抑制もしくは増強するために有効な追加の因子の動員によって遺伝子の発現および／または活性を調節することができる。一部の実施形態では、アクチュエータ部分は、標的ＤＮＡ配列の転写活性化または抑制を誘導することができるＤＮＡヌクレアーゼに由来するヌクレアーゼヌルＤＮＡ結合タンパク質を含む。一部の実施形態では、アクチュエータ部分は、標的ＲＮＡ配列の転写活性化または抑制を誘導することができるＲＮＡヌクレアーゼに由来するヌクレアーゼヌルＲＮＡ結合タンパク質を含む。一部の実施形態では、アクチュエータ部分は、核酸誘導型アクチュエータ部分である。アクチュエータ部分は、遺伝子の発現もしくは活性を調節することができ、および／または外因性であるか内因性であるかによらず、核酸配列を編集することができる。例えば、アクチュエータ部分は、切断活性を欠如しているＣａｓタンパク質を含んでもよい。
【０４４１】
本開示はまた、発現カセットも提供する。
【０４４２】
ある態様では、本開示は、アクチュエータ部分を含む遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）をコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットであって、発現カセットが膜貫通受容体を発現する細胞中に存在する場合に、プロモーターが活性化されて、発現カセットからのＧＭＰの発現を駆動し、膜貫通受容体が、リガンドの膜貫通受容体への結合によって活性化されていることを特徴とする、発現カセットを提供する。
【０４４３】
一部の実施形態では、発現カセットは、プラスミドの一部として細胞に供給される。プラスミドは、非組込みベクターであってもよい。発現カセットを担持するプラスミドは、複製性または非複製性であってもよい。プラスミドを、電気穿孔、微量注射、遺伝子銃、静水圧、およびリポフェクションを含む、様々な方法によって細胞に送達することができる。プラスミドを、ポリマー担体を使用して送達することもできる。
【０４４４】
一部の実施形態では、発現カセットは、細胞ゲノム中に組み込まれる。様々なゲノム編集技術を、発現カセットの組込みのために使用することができる。一部の実施形態では、発現カセットは、ウイルスベクターの一部として細胞に供給される。ウイルスは、遺伝物質を細胞ゲノム中に挿入することができる。発現カセットのウイルスにより媒介される送達は、発現カセットの細胞ゲノム中への挿入または組込みを容易にすることができる。レトロウイルスなどのウイルスは、長い末端反復（ＬＴＲ）配列およびＬＴＲ特異的インテグラーゼを使用して、核酸配列を細胞ゲノム中に組み込むことができる。一部の実施形態では、本明細書で提供される発現カセットは、ウイルス媒介性核酸組込みにとって有用な少なくとも１つの長い末端反復（ＬＴＲ）を含む。
【０４４５】
一部の実施形態では、発現カセットは、セーフハーバー部位を含むゲノムの領域中に組み込まれる。セーフハーバー部位とは、一般的にはオープンクロマチン構成を有する転写活性領域であるゲノムの領域を指し、導入遺伝子挿入は、全体的な、および局所的な遺伝子発現に対する効果を有しないか、または最小限の効果しか有しないことが以前に示されている。例示的なセーフハーバー部位としては、第１９染色体のＡＡＶＳ１部位および第３染色体のＣＣＲ５部位が挙げられる。一部の場合、発現カセットの、ＡＡＶＳ１部位への組込みは、遺伝子ホスファターゼ１調節因子サブユニット１２ｃ（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）を破壊する。
【０４４６】
一部の実施形態では、発現カセットは、操作されたヌクレアーゼを使用して細胞ゲノム中に挿入される。ゲノム編集のためのヌクレアーゼは、ゲノムの標的化されていないまたは標的化された（例えば、プログラム可能な）領域に部位特異的二本鎖切断を創出することができる。例示的なヌクレアーゼとしては、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系が挙げられる。次いで、ヌクレアーゼ誘導性二本鎖切断を、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同性修復（ＨＤＲ）（例えば、相同組換え（ＨＲ））によって修復することができる。これらの二本鎖切断を修復する際に、核酸配列をゲノム中に挿入するか、または組み込むことができる。
【０４４７】
一部の実施形態では、ゲノムの標的化された領域または標的化されていない領域での二本鎖切断の生成後に、ＮＨＥＪまたはＨＤＲによって発現カセットを細胞ゲノム中に組み込むことができる。ＮＨＥＪは、様々な酵素を使用して、二本鎖切断中のＤＮＡ末端を直接結合する。ＧＭＰコード配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを、ＮＨＥＪの間に二本鎖切断の部位でゲノム中に組み込むことができる。ＨＤＲでは、相同配列が、切断点での失われているＤＮＡ配列の再生のための鋳型として使用される。二本鎖切断の部位と相同な配列を有する核酸配列を、この修復プロセスの間にゲノム中に組み込むことができる。一部の実施形態では、発現カセットは、プロモーターと、ゲノム中の目的の部位で相同組換えを行うＧＭＰコード配列とを挟む相同配列を含む。
【０４４８】
ゲノム中に組み込まれると、発現カセットのプロモーターを、細胞の１つまたは複数のシグナル伝達経路によって活性化して、ＧＭＰの発現を駆動することができる。次いで、発現されたＧＭＰは、標的遺伝子の発現を調節することができる。ＧＭＰがＲＮＡ誘導型アクチュエータ部分である場合、発現されたＧＭＰは、ガイドＲＮＡと複合体を形成し、標的遺伝子の発現を調節するように動作することができる。
【０４４９】
ある態様では、本開示は、（ｉ）遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）をコードする核酸配列と、（ｉｉ）発現カセットの細胞ゲノムへの組込みを容易にする少なくとも１つの組込み配列とを含む発現カセットであって、ＧＭＰがアクチュエータ部分を含み、発現カセットが少なくとも１つの組込み配列を介して細胞ゲノム中に組み込まれている場合に、リガンドが膜貫通受容体に結合することによって膜貫通受容体を活性化すると、プロモーターを活性化して発現カセットからのＧＭＰの発現を駆動することを特徴とする、発現カセットを提供する。一部の実施形態では、発現カセットが細胞ゲノム中に組み込まれている場合のみ、リガンドが膜貫通受容体に結合することによって膜貫通受容体を活性化すると、プロモーターを活性化して発現カセットからのＧＭＰの発現を駆動する。
【０４５０】
発現カセットの少なくとも１つの組込み配列は、細胞ゲノム中の発現カセットの組込みを媒介することができる。
【０４５１】
一部の場合、組込み配列は、長い末端反復（ＬＴＲ）を含み、発現カセットは、ウイルスベクターの一部として細胞に供給される。発現カセットのウイルス媒介性送達は、発現カセットの細胞ゲノム中への組込みを容易にする（例えば、ＬＴＲインテグラーゼによる）。
【０４５２】
一部の実施形態では、組込み配列は、相同性修復（ＨＤＲ）によって組込みを媒介する相同配列を含む。一部の場合、２つの相同配列が、ＧＭＰコード配列を挟み、相同性修復によるゲノム組込みを容易にする。一部の場合、組込みは、ヌクレアーゼ、例えば、プログラム可能なヌクレアーゼによって行われる。例示的なプログラム可能なヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）などのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを含む。ＧＭＰコード配列を挟む相同配列は、内因性プロモーターの下流の部位で相同組換えを行うことができる。ＧＭＰコード配列は、細胞ゲノム中に組み込まれる場合、内因性プロモーターに作動可能に連結することができる。
【０４５３】
一部の場合、ＧＭＰコード配列を挟む相同配列は、内因性プロモーターの制御下で、内因性タンパク質をコードする遺伝子の下流の部位で相同組換えを行うことができる。本明細書の以前に記載されたように、ＧＭＰコード配列を、ペプチドリンカーをコードする核酸配列によって遺伝子に結合することができる。ペプチドリンカーは、一部の場合、プロテアーゼ認識配列を含み、プロテアーゼによって切断され得る。ペプチドリンカーは、一部の場合、２Ａペプチド（例えば、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、およびＦ２Ａ）などの自己切断セグメントを有する。一部の場合、複数の自己切断セグメントが存在する。一部の場合、ＧＭＰコード配列は、ＩＲＥＳを含む核酸配列によって遺伝子に結合される。
【０４５４】
本開示の発現カセットは、プラスミドの一部（例えば、非組込みベクター）として細胞中に存在してもよい。一部の実施形態では、発現カセットは、例えば、プログラム可能なヌクレアーゼを使用するウイルス組込みまたはゲノム編集によって、細胞ゲノム中に組み込まれる。発現カセットを、細胞ゲノム中にランダムに組み込むことができるか、または一部の場合、ゲノムの特定の領域に標的化する。プロモーターに作動可能に連結されたＧＭＰコード配列を含む発現カセットを、セーフハーバー部位を含むゲノムの領域中に組み込むことができる。発現カセットを、例えば、第１９染色体のＡＡＶＳ１部位または第３染色体のＣＣＲ５部位に組み込むことができる。
【０４５５】
本開示の組成物および分子（例えば、システムのポリペプチドおよび／またはシステムのポリペプチドをコードする核酸）を宿主細胞中に導入するために、任意の好適な送達方法を使用することができる。組成物（例えば、発現カセット、ＧＭＰコード配列、内因性／外因性プロモーター配列、ガイド核酸など）を、同時的に、または時間的に分離して送達することができる。送達方法の選択は、形質転換される細胞の型および／または形質転換が起こる環境（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、もしくはｉｎ  ｖｉｖｏ）に依存し得る。
【０４５６】
送達方法は、標的ポリヌクレオチドを、本開示の組成物をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＧＭＰコード配列、外因性プロモーター配列、ガイド核酸など）を含む１つまたは複数の核酸と接触させること、または細胞（もしくは細胞集団）中に、前記核酸を導入することを含んでもよい。本開示の組成物をコードするヌクレオチド配列を含む好適な核酸は、発現ベクターを含んでもよく、本開示の１つまたは複数の組成物をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＧＭＰコード配列、外因性プロモーター配列、ガイド核酸など）を含む発現ベクターは、組換え発現ベクターである。
【０４５７】
送達方法または形質転換の非限定例としては、例えば、ウイルスまたはバクテリオファージ感染、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、電気穿孔、リン酸カルシウム沈降、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介性トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、リポソーム媒介性トランスフェクション、粒子銃技術、リン酸カルシウム沈降、直接微量注射、細胞浸透性ペプチドの使用、およびナノ粒子媒介性核酸送達が挙げられる。
【０４５８】
一部の態様では、本開示は、１つもしくは複数のポリヌクレオチド、または本明細書に記載の１つもしくは複数のオリゴヌクレオチド、または本明細書に記載のベクター、または１つもしくは複数のその転写物、および／またはそれから転写されたもの、もしくはタンパク質を、宿主細胞に送達することを含む方法を提供する。一部の態様では、本開示は、そのような方法によって産生された細胞、およびそのような細胞を含む、またはそれから産生された生物（動物、植物、もしくは真菌など）をさらに提供する。
【０４５９】
本明細書に開示されるポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドを、コドン最適化することができる。コドン最適化は、同じタンパク質をコードしながら、意図される宿主生物または細胞のコドン優先度を模倣する外来（例えば、組換え）ＤＮＡの変異を伴ってもよい。かくして、コドンを変化させることができるが、コードされるタンパク質は未変化のままである。例えば、意図される標的細胞がヒト細胞であった場合、ヒトコドン最適化されたポリヌクレオチドを、好適なＣａｓタンパク質を産生するために使用することができる。別の非限定例として、意図される宿主細胞がマウス細胞であった場合、Ｃａｓタンパク質をコードするマウスコドン最適化されたポリヌクレオチドは、好適なＣａｓタンパク質であり得る。アクチュエータ部分などのポリペプチド（例えば、Ｃａｓタンパク質）をコードするポリヌクレオチドを、目的の多くの宿主細胞のためにコドン最適化することができる。宿主細胞は、任意の生物に由来する細胞（例えば、細菌細胞、古細菌細胞、単細胞真核生物の細胞、植物細胞、藻類細胞、例えば、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｒａｕｎｉｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｇａｄｉｔａｎａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ、Ｓａｒｇａｓｓｕｍ  ｐａｔｅｎｓ  Ｃ．Ａｇａｒｄｈなど、真菌細胞（例えば、酵母細胞）、動物細胞、無脊椎動物（例えば、ミバエ、刺胞動物、棘皮動物、線虫など）に由来する細胞、脊椎動物（例えば、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物）に由来する細胞、哺乳動物（例えば、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、齧歯類、ラット、マウス、非ヒト霊長類、ヒトなど）に由来する細胞など）であってもよい。一部の場合、コドン最適化を必要としなくてもよい。一部の例では、コドン最適化が好ましいことがある。
【０４６０】
従来のウイルスおよび非ウイルスに基づく遺伝子導入法を使用して、核酸を哺乳動物細胞または標的組織に導入することができる。そのような方法を使用して、本開示の組成物をコードする核酸を、培養物中、または宿主生物中の細胞に投与することができる。非ウイルスベクター送達系は、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡ（例えば、本明細書に記載のベクターの転写物）、ネイキッド核酸、およびリポソームなどの、送達ビヒクルと複合体化した核酸を含んでもよい。ウイルスベクター送達系は、細胞への送達後に、エピソーム性ゲノムまたは組み込まれたゲノムを有してもよい、ＤＮＡおよびＲＮＡウイルスを含んでもよい。
【０４６１】
核酸の非ウイルス送達の方法は、リポフェクション、ヌクレオフェクション、微量注射、微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、およびＤＮＡの薬剤増強性取込みを含んでもよい。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションにとって好適である陽イオン性および中性脂質を使用することができる。送達は、細胞（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｅｘ  ｖｉｖｏでの投与）または標的組織（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏでの投与）に対するものであってもよい。免疫脂質複合体などの、標的化リポソームを含む、脂質：核酸複合体の調製を使用することができる。
【０４６２】
ＲＮＡまたはＤＮＡウイルスに基づく系を使用して、体内の特定の細胞を標的化し、ウイルスペイロードを細胞の核に輸送することができる。ウイルスベクターを直接投与することができる（ｉｎ  ｖｉｖｏ）か、またはそれらを使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞を処置し、改変された細胞を、必要に応じて投与することができる（ｅｘ  ｖｉｖｏ）。ウイルスに基づく系は、遺伝子導入のためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよび単純ヘルペスウイルスベクターを含んでもよい。宿主ゲノム中への組込みは、挿入される導入遺伝子の長期的発現をもたらし得る、レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ随伴ウイルス遺伝子導入法を用いて行うことができる。多くの異なる細胞型および標的組織中で、高い形質導入効率を観察することができる。
【０４６３】
外来エンベロープタンパク質を組み込むこと、標的細胞の潜在的な標的集団を拡大増殖することによって、レトロウイルスの指向性を変化させることができる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞に形質導入または感染し、高いウイルス力価をもたらすことができるレトロウイルスベクターである。レトロウイルス遺伝子導入系の選択は、標的組織に依存してもよい。レトロウイルスベクターは、最大で６〜１０ｋｂの外来配列のためのパッケージング能力を示すｃｉｓ作用性の長い末端反復を含んでもよい。治療遺伝子を標的細胞中に組み込んで、永続的な導入遺伝子発現をもたらすために使用することができる、ベクターの複製およびパッケージングのためには、最小限のｃｉｓ作用性ＬＴＲで十分であり得る。レトロウイルスベクターは、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびそれらの組合せに基づくものを含んでもよい。
【０４６４】
アデノウイルスに基づく系を使用することができる。アデノウイルスに基づく系は、導入遺伝子の一過的発現をもたらすことができる。アデノウイルスに基づくベクターは、細胞中で高い形質導入効率を有してもよく、細胞分裂を必要としなくてもよい。アデノウイルスに基づくベクターを用いれば、高い力価および発現レベルを得ることができる。アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターを使用して、例えば、核酸およびペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの産生において、ならびにｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏでの遺伝子療法手順のために、細胞を標的核酸で形質導入することができる。
【０４６５】
パッケージング細胞を使用して、宿主細胞に感染することができるウイルス粒子を形成させることができる。そのような細胞としては、２９３細胞（例えば、アデノウイルスをパッケージングするため）、およびＰｓｉ２細胞またはＰＡ３１７細胞（例えば、レトロウイルスをパッケージングするため）が挙げられる。核酸ベクターをウイルス粒子中にパッケージングする細胞系を産生することによって、ウイルスベクターを生成することができる。ベクターは、パッケージングおよびその後の宿主への組込みにとって必要とされる最小限のウイルス配列を含有してもよい。ベクターは、発現させようとするポリヌクレオチドのための発現カセットによって置き換えられる他のウイルス配列を含有してもよい。失われているウイルス機能を、パッケージング細胞系によってｔｒａｎｓに供給することができる。例えば、ＡＡＶベクターは、パッケージングおよび宿主ゲノムへの組込みにとって必要とされるＡＡＶゲノムに由来するＩＴＲ配列を含んでもよい。ＩＴＲ配列を欠きながら、他のＡＡＶ遺伝子、すなわち、ｒｅｐおよびｃａｐをコードするヘルパープラスミドを含有してもよい細胞系中にウイルスＤＮＡをパッケージングすることができる。細胞系はまた、ヘルパーとしてのアデノウイルスに感染させることもできる。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製およびヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進することができる。アデノウイルスによる汚染を、例えば、アデノウイルスがＡＡＶよりも感受性である熱処理によって低減させることができる。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２００３００８７８１７に記載されたような、核酸の細胞への送達のためのさらなる方法を使用することができる。
【０４６６】
宿主細胞に、１つまたは複数の本明細書に記載のベクターを一過的または非一過的にトランスフェクトすることができる。細胞を、それが被験体中に天然に存在する通りにトランスフェクトすることができる。細胞を、被験体から採取するか、または誘導し、トランスフェクトすることができる。細胞を、細胞系などの、被験体から採取した細胞から誘導することができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の本明細書に記載のベクターをトランスフェクトした細胞を使用して、１つまたは複数のベクター由来配列を含む新しい細胞系を樹立する。一部の実施形態では、本開示の組成物を一過的にトランスフェクトされ（１つもしくは複数のベクターの一過的トランスフェクション、またはＲＮＡのトランスフェクションなどによる）、ＣＲＩＳＰＲ複合体などのアクチュエータ部分の活性によって改変された細胞を使用して、改変を含有するが、他の任意の外因性配列を欠く細胞を含む新しい細胞系を樹立する。
【０４６７】
宿主細胞と適合する任意の好適なベクターを、本開示の方法と共に使用することができる。真核宿主細胞のためのベクターの非限定例としては、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（商標））、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ（商標））が挙げられる。
【０４６８】
一部の実施形態では、ガイド核酸および／またはＣａｓタンパク質もしくはキメラをコードするヌクレオチド配列は、制御エレメント、例えば、プロモーターなどの転写制御エレメントに作動可能に連結されている。転写制御エレメントは、真核細胞、例えば、哺乳動物細胞、または原核細胞（例えば、細菌もしくは古細菌細胞）中で機能的であってよい。一部の実施形態では、ガイド核酸および／もしくはＣａｓタンパク質またはキメラをコードするヌクレオチド配列は、原核および／または真核細胞中でガイド核酸および／またはＣａｓタンパク質もしくはキメラをコードするヌクレオチド配列の発現を可能にする複数の制御エレメントに作動可能に連結されている。
【０４６９】
使用される宿主／ベクター系に応じて、構成的および誘導的プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含む、いくつかの好適な転写および翻訳制御エレメントのいずれかを、発現ベクター中で使用することができる（例えば、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーターなど；上記を参照されたい）（例えば、Ｂｉｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  １５３：５１６−５４４を参照されたい）。
【０４７０】
一部の実施形態では、本開示の組成物（例えば、ＧＭＰ、例えば、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓキメラ、キメラ受容体、ガイド核酸などのアクチュエータ部分）を、ＲＮＡとして提供することができる。そのような場合、本開示の組成物（例えば、ＧＭＰ、例えば、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓキメラ、キメラ受容体、ガイド核酸などのアクチュエータ部分）を、直接化学合成によって産生することができるか、またはＤＮＡからｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写してもよい。本開示の組成物（例えば、ＧＭＰ、例えば、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓキメラ、キメラ受容体、ガイド核酸などのアクチュエータ部分）を、ＲＮＡポリメラーゼ酵素（例えば、Ｔ７ポリメラーゼ、Ｔ３ポリメラーゼ、ＳＰ６ポリメラーゼなど）を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成することができる。一度合成されたら、ＲＮＡは、標的ＤＮＡと直接接触することができるか、または核酸を細胞中に導入するための任意の好適な技術（例えば、微量注射、電気穿孔、トランスフェクションなど）を使用して細胞中に導入することができる。
【０４７１】
ガイド核酸（ＤＮＡもしくはＲＮＡとして導入される）および／またはＣａｓタンパク質もしくはキメラ（ＤＮＡもしくはＲＮＡとして導入される）をコードするヌクレオチドを、好適なトランスフェクション技術を使用して細胞に提供することができる；例えば、Ａｎｇｅｌ  ａｎｄ  Ｙａｎｉｋ  （２０１０）  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ５（７）：  ｅ１１７５６、ならびに商業的に入手可能なＱｉａｇｅｎからのＴｒａｎｓＭｅｓｓｅｎｇｅｒ（登録商標）試薬、ＳｔｅｍｇｅｎｔからのＳｔｅｍｆｅｃｔ（商標）ＲＮＡ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、およびＭｉｒｕｓ  Ｂｉｏ  ＬＬＣからのＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）−ｍＲＮＡ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを参照されたい。また、Ｂｅｕｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｉｎ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｂｙ  ｄｉｒｅｃｔ  ｅｍｂｒｙｏ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．  ＰＮＡＳ  １０５（５０）：１９８２１−１９８２６も参照されたい。本開示の組成物（例えば、ＧＭＰ、例えば、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓキメラ、キメラ受容体、ガイド核酸などのアクチュエータ部分）をコードする核酸を、ＤＮＡベクターまたはオリゴヌクレオチド上で提供することができる。核酸を標的細胞中に導入するのに有用な、多くのベクター、例えば、プラスミド、コスミド、ミニサークル、ファージ、ウイルスなどが利用可能である。核酸を含むベクターを、エピソームで、例えば、プラスミド、ミニサークルＤＮＡ、サイトメガロウイルス、アデノウイルスなどのウイルスなどとして維持するか、またはそれらを、相同組換えもしくはランダム組込み、例えば、ＭＭＬＶ、ＨＩＶ−１、およびＡＬＶなどのレトロウイルス由来ベクターを介して、標的細胞ゲノムに組み込むことができる。
【０４７２】
本開示の組成物（例えば、ＧＭＰ、例えば、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓキメラ、キメラ受容体、ガイド核酸などのアクチュエータ部分）は、核酸またはポリペプチドとして導入されるかどうかに関係なく、約３０分から約２４時間まで、例えば、１時間、１．５時間、２時間、２．５時間、３時間、３．５時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、１２時間、１６時間、１８時間、２０時間、または約３０分から約２４時間までの任意の他の期間にわたって、細胞に提供することができ、ほぼ毎日から約４日毎まで、例えば、１．５日毎、２日毎、３日毎の頻度で、またはほぼ毎日から約４日毎までの任意の他の頻度で繰り返すことができる。組成物を、１回または複数回、例えば、１回、２回、３回、または３回より多く、対象となる細胞に提供し、それぞれの接触事象の後、いくらかの時間量、例えば、１６〜２４時間にわたって、細胞を薬剤と共にインキュベートした後、培地を新鮮な培地と置き換え、細胞をさらに培養することができる。
【０４７３】
２つまたはそれより多い異なる標的化複合体が細胞に提供される場合（例えば、同じか、または異なる標的ＤＮＡ内の異なる配列と相補的である２つの異なるガイド核酸）、複合体を同時に提供する（例えば、２つのポリペプチドおよび／もしくは核酸として）か、または同時に送達することができる。あるいは、それらを、連続的に提供する、例えば、標的化複合体を最初に提供した後、第２の標的化複合体などを提供する、またはその逆も同様である。
【０４７４】
本開示の組成物（例えば、ＧＭＰ、例えば、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓキメラ、キメラ受容体、ガイド核酸などのアクチュエータ部分）の有効量を、標的ＤＮＡまたは細胞に提供することができる。有効量は、例えば、陰性対照、例えば、空のベクターまたは無関係のポリペプチドと接触させた細胞と比較して、２つの相同配列間で観察される標的調節の量の少なくとも約２倍の変化（増加もしくは減少）またはそれより大きい変化を誘導する量であってもよい。有効量または有効用量は、例えば、標的遺伝子調節の約２倍の変化、約３倍の変化、約４倍の変化、約７倍、約８倍の増加、約１０倍、約５０倍、約１００倍、約２００倍、約５００倍、約７００倍、約１０００倍、約５０００倍、または約１００００倍の変化を誘導することができる。標的遺伝子調節の量を、任意の好適な方法によって測定することができる。
【０４７５】
細胞と、組成物との接触は、任意の培養培地中で、また、細胞の生存を促進する任意の培養条件下で行ってもよい。例えば、細胞を、ウシ胎仔血清または熱不活化ヤギ血清（約５〜１０％）、Ｌ−グルタミン、チオール、特に、２−メルカプトエタノール、および抗生物質、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンを添加した、Ｉｓｃｏｖｅの改変ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ１６４０などの、都合のよい任意の適切な栄養培地中に懸濁することができる。培養物は、細胞が反応する増殖因子を含有してもよい。本明細書で定義される増殖因子は、膜貫通受容体に対する特異的効果を介して、培養物またはインタクトな組織中で、細胞の生存、増殖および／または分化を促進することができる分子である。増殖因子は、ポリペプチドおよび非ポリペプチド因子を含んでもよい。
【０４７６】
多くの実施形態では、選択される送達系は、特定の組織または細胞型に標的化される。一部の場合、送達系の組織または細胞標的化は、送達系を、細胞表面タンパク質などの、組織または細胞特異的マーカーに結合させることによって達成される。ウイルスおよび非ウイルス送達系を、目的の組織または細胞型を標的とするようにカスタマイズすることができる。
【０４７７】
本開示は、本明細書に記載のシステムまたは発現カセット（例えば、核酸、プラスミド、ポリペプチド、ガイドＲＮＡなどの、例えば、分子）を含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤をさらに含んでもよい。本明細書に記載のシステムまたは発現カセットを含む医薬組成物を、予防的および／または治療的処置のために投与することができる。治療適用においては、組成物を、疾患または状態に既に罹患している被験体に、疾患もしくは状態の症状を治癒させるか、もしくは少なくとも部分的に停止させるか、または状態を治癒させる、癒やす、改良する、もしくは改善するのに十分な量で投与することができる。この使用にとって有効な量は、疾患または状態の重症度および経過、以前の療法、被験体の健康状態、体重、および薬物に対する応答、ならびに処置する医師の判断に基づいて変化してもよい。
【０４７８】
複数の治療剤を、任意の順序で、または同時に投与することができる。同時に投与する場合、複数の治療剤を、単一の統一された形態、または複数の形態で、例えば、複数の別々の丸剤として提供することができる。分子を、単一のパッケージまたは複数のパッケージ中に、一緒に、または別々に包装することができる。１つまたは全部の治療剤を、複数の用量で与えることができる。同時に投与しない場合、複数用量間のタイミングは、約１カ月ほどの期間まで変化してもよい。
【０４７９】
本明細書に記載の分子を、疾患または状態の出現の前、その間、またはその後に投与してもよく、化合物を含有する組成物を投与するタイミングは変化してもよい。例えば、医薬組成物を予防剤として使用し、状態または疾患に対する傾向を有する被験体に継続的に投与して、疾患または状態の発生を防止することができる。分子および医薬組成物を、症状の開始中に、または開始後できるだけ早く被験体に投与することができる。分子の投与を、症状の開始の最初の４８時間以内、症状の開始の最初の２４時間以内、症状の開始の最初の６時間以内、または症状の開始の３時間以内に開始することができる。初期投与は、本明細書に記載の任意の製剤を使用する本明細書に記載の任意の経路によるなど、実行できる任意の経路によるものであってもよい。疾患または状態の開始が検出されたか、または疑われた後、できるだけ早く、かつ例えば、約１カ月〜約３カ月などの、疾患の処置にとって必要な時間の長さにわたって、分子を投与することができる。処置の長さは、それぞれの被験体について変化してもよい。
【０４８０】
分子を、生物学的コンパートメント中にパッケージングすることができる。分子を含む生物学的コンパートメントを、被験体に投与することができる。生物学的コンパートメントとしては、限定されるものではないが、ウイルス（レンチウイルス、アデノウイルス）、ナノスフェア、リポソーム、量子ドット、ナノ粒子、マイクロ粒子、ナノカプセル、ベシクル、ポリエチレングリコール粒子、ヒドロゲル、およびミセルが挙げられる。
【０４８１】
例えば、生物学的コンパートメントは、リポソームを含んでもよい。リポソームは、それぞれ、反対に配向された両親媒性脂質分子を含有する２つの単層を含んでもよい、１つまたは複数の脂質二重層を含む自己集合性構造であってもよい。両親媒性脂質は、１つまたは２つまたはそれより多い非極性（疎水性）アシルまたはアルキル鎖に共有結合的に連結された極性（親水性）頭部基を含んでもよい。疎水性アシル鎖と、周囲の水性媒体との間のエネルギー的に好ましくない接触は、極性頭部基を二重層の表面に配向させ、アシル鎖を二重層の内部に配向させ、水性環境との接触からアシル鎖を有効に遮蔽することができるように、両親媒性脂質分子がそれ自身で整列するように誘導する。
【０４８２】
リポソーム中で使用される好ましい両親媒性化合物の例としては、ホスホグリセリドおよびスフィンゴ脂質が挙げられ、その代表例として、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジリノレオイルホスファチジルコリンおよび卵スフィンゴミエリン、またはそれらの任意の組合せが挙げられる。
【０４８３】
生物学的コンパートメントは、ナノ粒子を含んでもよい。ナノ粒子は、約４０ナノメートル〜約１．５マイクロメートル、約５０ナノメートル〜約１．２マイクロメートル、約６０ナノメートル〜約１マイクロメートル、約７０ナノメートル〜約８００ナノメートル、約８０ナノメートル〜約６００ナノメートル、約９０ナノメートル〜約４００ナノメートル、約１００ナノメートル〜約２００ナノメートルの直径を含んでもよい。
【０４８４】
一部の例では、ナノ粒子のサイズが増大するにつれて、放出速度を減速させるか、または延長することができ、ナノ粒子のサイズが減少するにつれて、放出速度を増加させることができる。
【０４８５】
ナノ粒子中のアルブミンの量は、約５％〜約８５％のアルブミン（ｖ／ｖ）、約１０％〜約８０％、約１５％〜約８０％、約２０％〜約７０％のアルブミン（ｖ／ｖ）、約２５％〜約６０％、約３０％〜約５０％、または約３５％〜約４０％の範囲であってもよい。医薬組成物は、最大で３０、４０、５０、６０、７０または８０％またはそれより多いナノ粒子を含んでもよい。一部の例では、本開示の核酸分子を、ナノ粒子の表面に結合させることができる。
【０４８６】
生物学的コンパートメントは、ウイルスを含んでもよい。ウイルスは、本開示の医薬組成物のための送達系であってもよい。例示的なウイルスとしては、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスＩまたはＩＩ、パルボウイルス、細網内皮症ウイルス、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）が挙げられる。
【０４８７】
本開示の医薬組成物を、ウイルスを使用して細胞に送達することができる。ウイルスは、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞に感染し、形質導入することができる。ｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの送達においては、形質導入された細胞を、療法を必要とする被験体に投与することができる。医薬組成物を、ウイルス送達系中にパッケージングすることができる。例えば、組成物を、ＨＳＶ−１ヘルパーウイルスを含まないパッケージング系によってビリオン中にパッケージングすることができる。
【０４８８】
ウイルス送達系（例えば、本開示の医薬組成物を含むウイルス）を、直接注射、定位注射によって、脳室内に、ミニポンプ輸注系によって、対流、カテーテル、静脈内、非経口、腹腔内、および／もしくは皮下注射によって、それを必要とする被験体の細胞、組織、または臓器に投与することができる。一部の例では、細胞を、ウイルス送達系を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏに形質導入することができる。形質導入された細胞を、疾患を有する被験体に投与することができる。例えば、幹細胞を、医薬組成物を含むウイルス送達系を用いて形質導入し、幹細胞を患者に埋め込んで、疾患を処置することができる。一部の例では、被験体に与えられる形質導入された細胞の用量は、単回用量中の、約１×１０５細胞／ｋｇ、約５×１０５細胞／ｋｇ、約１×１０６細胞／ｋｇ、約２×１０６細胞／ｋｇ、約３×１０６細胞／ｋｇ、約４×１０６細胞／ｋｇ、約５×１０６細胞／ｋｇ、約６×１０６細胞／ｋｇ、約７×１０６細胞／ｋｇ、約８×１０６細胞／ｋｇ、約９×１０６細胞／ｋｇ、約１×１０７細胞／ｋｇ、約５×１０７細胞／ｋｇ、約１×１０８細胞／ｋｇ、またはそれより多くてもよい。
【０４８９】
生物学的コンパートメントの細胞中への導入は、ウイルスまたはバクテリオファージ感染、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、電気穿孔、リン酸カルシウム沈降、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介性トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、リポソーム媒介性トランスフェクション、粒子銃技術、リン酸カルシウム沈降、直接微量注射、ナノ粒子媒介性核酸送達などによって行うことができる。
【０４９０】
本明細書の態様の様々な実施形態では、本開示の方法は、被験体中で実施される。被験体は、ヒトであってもよい。被験体は、哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウシ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ウマ）であってもよい。被験体は、脊椎動物または無脊椎動物であってもよい。被験体は、実験動物であってもよい。被験体は、患者であってもよい。被験体は、疾患に罹患していてもよい。被験体は、疾患の症状を示してもよい。被験体は、疾患の症状を示さないが、依然として疾患を有してもよい。被験体は、介護者の医療下にあってもよい（例えば、被験体は入院し、医師によって処置される）。被験体は、植物または作物であってもよい。
【実施例】
【０４９１】
以下の実施例は、本発明の様々な実施形態を例示する目的で与えられるものであり、いかなる様式でも本発明を限定することを意味しない。当業者であれば、この中での変化および他の使用を想到するであろう。
【０４９２】
（実施例１：１つの膜貫通受容体を含むシステム）
本実施例は、少なくとも１つの標的遺伝子の発現を調節するのに有用な膜貫通受容体を含む例示的なシステムを記載する。図１に示されるように、リガンドが、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ、例えば、ｓｃＦｖ−ＣＡＲ）を含む合成受容体に結合すると、内在性シグナル伝達経路が活性化され、少なくとも１つの細胞性転写因子の、その天然の遺伝子座にある内因性遺伝子（シグネチャー遺伝子）のプロモーター領域への動員をもたらす。ＧＭＰコード配列をゲノムに組み込み、シグネチャー遺伝子のプロモーターの制御下に置く。プロモーターの転写活性化は、ＶＰＲ（例えば、転写活性化因子）またはＫＲＡＢ（例えば、転写抑制因子）に連結されたｄＣａｓ（例えば、ｄＣａｓ９）を含む遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）の発現をもたらす。発現されたＧＭＰは、構成的に発現されるガイドＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡａ、ｓｇＲＮＡｂ）と複合体を形成すると、選択された標的遺伝子（例えば、遺伝子Ａ、遺伝子Ｂ）の発現を調節する（活性化する、または抑制する）ことができる。
【０４９３】
（実施例２：２つの膜貫通受容体を含むシステム）
本実施例は、少なくとも１つの標的遺伝子の発現を調節するのに有用な２つの膜貫通受容体を含む例示的なシステムを記載する。図２に例示されるように、抗原の、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ、例えば、ｓｃＦｖ−ＣＡＲ）との結合は、内在性シグナル伝達経路１を活性化し、ｄｓｐＣａｓ９−ＶＰＲ（ＶＰＲに連結された非機能性Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９）の合成、次いで、遺伝子ＡおよびＢの活性化をもたらす。リガンドと、ＧＰＣＲ受容体との結合は、シグナル経路２を活性化し、ｄｓａＣａｓ９−ＫＲＡＢ（ＫＲＡＢに連結された非機能性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  Ｃａｓ９）の合成、次いで、遺伝子Ｃの発現の抑制をもたらす。あるいは、シグナル経路２を使用して、ＣＡＲ発現またはシグナル出力の条件的制御のためのシグナル経路１の同じ標的遺伝子を調節することもできる。
【０４９４】
（実施例３：リガンド依存的シグナルカスケードによるＧＦＰレポーター遺伝子の条件的発現）
本実施例では、安定なＪｕｒｋａｔレポーター細胞系（「２ｓｇ＆ＣＡＲ」）を、以下の成分：（１）抗ＣＤ１９  ＣＡＲ発現カセット；（２）ＴＲＥ３Ｇプロモーター駆動性ＧＦＰ発現カセット（プロモーターは７個のｓｇＲＮＡ結合部位を有する）；（３）ＴＲＥ３Ｇプロモーターを標的とするｓｇＲＮＡ；および（４）ＣＸＣＲ４プロモーターを標的とするｓｇＲＮＡ、をコードする２つのレンチウイルスベクターの形質導入によって生成した。図３Ａに例示されるように、Ｊｕｒｋａｔ細胞表面上に存在する抗ＣＤ１９  ＣＡＲが、Ｒａｊｉ細胞の表面上に発現されるＣＤ１９に結合すると、シグナル伝達のために抗ＣＤ１９  ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインが活性化され、ｄＣａｓ９−ＶＰＲ発現を駆動する試験プロモーターの転写活性化をもたらす。新しく合成されたｄＣａｓ９−ＶＰＲタンパク質は、細胞核に移行し、ＴＲＥ３Ｇ  ｓｇＲＮＡと複合体を形成することができる。ＲＮＡ誘導型ｄＣａｓ９−ＶＰＲは、ＴＲＥ３Ｇプロモーターを活性化して、ＧＦＰ発現を駆動することができる。一部の場合、ｄＣａｓ９−ＶＰＲは、ＴＲＥ３Ｇ  ｓｇＲＮＡと複合体を形成した後、細胞核に移行することができる。
【０４９５】
Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞に、内因性プロモーター配列を含む７つの試験プロモーター（表６）のうちの１つをコードするプラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。
【表６】
2020530309.tif 000024
【０４９６】
試験プロモーターを、ｄＣａｓ９−ＶＰＲをコードする核酸配列に作動可能に連結した。トランスフェクションの１時間後、細胞を等分し、同数のＲａｊｉ細胞を、トランスフェクトされたレポーター細胞の一部に添加した。１日後、細胞を、フローサイトメーター中でＧＦＰ発現について評価した。Ｒａｊｉ細胞を含むＪｕｒｋａｔレポーター細胞を、抗ＣＤ１９−ＰＥおよび抗ＣＤ３−ＡＰＣについて染色した後、ＧＦＰ発現を評価した。図３Ｂは、刺激されていない、およびＲａｊｉ細胞で刺激されたＪｕｒｋａｔレポーター細胞中でのＧＦＰ発現レベルを示す。示されるプロットを、生きている（Ｒａｊｉを含まない）または生きているＣＤ１９−ＣＤ３＋（Ｒａｊｉを含む）細胞上でゲート処理する。
【０４９７】
図３Ｃおよび図３Ｄは、図３Ｂの結果を定量する。図３Ｃにおいては、２つの独立したトランスフェクションの平均ＧＦＰ＋％値を示す。エラーバーは、標準偏差を表す。＊スチューデントのｔ検定、ｐ＜０．０５。プロモーター１（ＩＲＦ４（Ｌ））については、ＧＦＰ＋細胞はほとんど存在せず、Ｒａｊｉで処置した、またはＲａｊｉで処置しなかった細胞の間で差異はない。プロモーター１−ｄＣａｓ９−ＶＰＲ構築物を、この実験における陰性対照構築物と見なすことができる。ＰＧＫプロモーターについては、Ｒａｊｉで処置した、またはＲａｊｉで処置しなかった両方のレポーター細胞において、ほぼ２５％のＧＦＰ＋％細胞が検出され、これは、ＰＧＫプロモーターがＴ細胞中で構成的遺伝子発現を駆動するという見解と一致する。試験プロモーター２〜７については、Ｒａｊｉ細胞と共にインキュベートしたＪｕｒｋａｔ細胞において、Ｒａｊｉ細胞と共にインキュベートしなかった場合と比較して、ＧＦＰ＋％細胞の有意な増加が検出されたが、これは、レポーター遺伝子発現のリガンド依存的条件的上方調節が、これらの６つの内因性プロモーターを使用して達成されることを示唆している。
【０４９８】
図３Ｄにおいては、Ｒａｊｉで刺激された試料中のＧＦＰ＋％細胞の値を、Ｒａｊｉで処置していない細胞中での値で除算した。試験したプロモーターのうちの１つを使用して、Ｒａｊｉで処置したレポーター細胞と、Ｒａｊｉで処置していないレポーター細胞との間でＧＦＰ＋％細胞の１ｌｏｇより大きい差が検出されたが、これは、本明細書に開示されるシステムが入力シグナルを増幅することができることを示唆している。
【０４９９】
比較のために、（１）ＴＲＥ３Ｇプロモーターにより駆動されるＧＦＰ発現カセット（このプロモーターは７個のｓｇＲＮＡ結合部位を有する）ならびに（２）ＴＲＥ３Ｇプロモーターを標的とするｓｇＲＮＡおよびＣＸＣＲ４遺伝子を標的とする別のｓｇＲＮＡをコードするレンチウイルスの形質導入によって生成された対照細胞系を生成した。対照細胞系は、ＣＤ１９−ＣＡＲ（「２ｓｇ」）を欠いていた。対照細胞（２ｓｇ）および２ｓｇ＆ＣＡＲ細胞系を、本実施例において上と同様に処置した。２ｓｇおよび２ｓｇ＆ＣＡＲ細胞に、７つの試験プロモーター−ＣＤ１９Ｌ（長いバージョンのプロモーター）、ＩＬ２Ｓ（短いバージョンのプロモーター）、ＩＲＦ４Ｌ（長いバージョンのプロモーター）、ＩＲＦ４Ｓ（短いバージョンのプロモーター）、ＮＲ４Ａ１ｖ３（ｍＲＮＡバリアント３のプロモーター）、ＧＺＭＢＬ（長いバージョンのプロモーター）、またはＰＧＫのうちの１つをコードするプラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。図３Ｅに示されるように、誘導性ＧＦＰ発現は、短いＩＬ２、短いＩＲＦ４、ＮＲ４Ａ１ｖ３、または長いＧＺＭＢプロモーターによって駆動されたｄＣａｓ９ＶＰＲ構築物で処置された２ｓｇ＆ＣＡＲ細胞系においては検出されたが、２ｓｇ細胞系においては検出されず、これは、ＧＦＰレポーター遺伝子発現の条件的上方調節が、ＣＤ１９とＣＤ１９ＣＡＲの相互作用、例えば、リガンドと受容体の相互作用（例えば、抗原とｓｃＦｖの相互作用）に依存することを示唆している。
【０５００】
（実施例４：本明細書で提供されるシステムおよび方法における使用のためのプロモーター）
ＴＣＲシグナル伝達経路のための本明細書に開示されるシステムにおける使用のための潜在的なプロモーターの一覧を、表７に提供する。これらのプロモーターの実験的評価は、治療および／または研究目的のための所望の特徴を有する少なくとも１つのプロモーターを同定することができる。
【表７】
2020530309.tif 000025
【０５０１】
（実施例５：安定な細胞系中でのリガンド依存的シグナルカスケードによるＧＦＰレポーター遺伝子の条件的発現）
図３Ｅに示されるように、ＣＤ１９−ＣＡＲ（２ｓｇ）を有しない、またはＣＤ１９−ＣＡＲ（２ｓｇ＆ＣＡＲもしくは２ｓｇ＋ＣＡＲもしくは２ｓｇ−ＣＡＲ）を有するＪｕｒｋａｔレポーター細胞系に、低い、または高いレンチウイルス用量でレンチウイルスベクターを形質導入した。レンチウイルスベクターは、短いＩＬ２プロモーター、長いＩＬ２プロモーター、短いＣＤ４５プロモーター、短いＣＤ２５プロモーター、長いＣＤ６９プロモーター、短いＩＲＦプロモーター、または長いＧＺＭＢプロモーターの制御下に、ｄＣａｓ９−ＶＰＲ導入遺伝子を含有する。少なくとも２週間後、樹立された安定細胞系を、処置しなかったか、またはＲａｊｉ細胞との同時培養によって刺激した。２日間の同時培養後、細胞を、フローサイトメトリーによってＧＦＰ発現について評価した。Ｒａｊｉ細胞で刺激したＪｕｒｋａｔレポーター細胞を、抗ＣＤ１９−ＰＥおよび抗ＣＤ３−ＡＰＣについて染色した後、評価した。図４Ａにおいては、示されるプロットを、生きている（Ｒａｊｉを含まない）または生きているＣＤ１９−ＣＤ３＋（Ｒａｊｉを含む）細胞上でゲート処理する。ＧＦＰ高発現細胞の増加％を、以下の式：増加％＝（Ｒａｊｉを用いた場合のＧＦＰ−ｈｉ％−Ｒａｊｉを用いない場合のＧＦＰ−ｈｉ％）／Ｒａｊｉを用いない場合のＧＦＰ−ｈｉ％×１００％を使用して算出した。２つの処置された試料の平均値を示す。エラーバーは、標準偏差を表す。示された全ての試験したプロモーターに関する２ｓｇ−ＣＡＲ細胞系の増加％は、２ｓｇ細胞系と比較して統計的に有意である（ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定）。様々な試験したプロモーターについて、ＣＤ１９ＣＡＲ活性化依存的ＧＦＰ発現が観察された。これらのプロモーターのうち、ＧＺＭＢプロモーターは、使用したレンチウイルスの初期量に関係なく、最も強い誘導を示した。
【０５０２】
図４Ｂは、ＧＺＭＢプロモーター−ｄＣａｓ９−ＶＰＲ構築物が安定に組み込まれた選別された細胞中でのＣＡＲ依存的シグナル伝達を示す。ＧＦＰレポーター発現の誘導は、ＣＤ１９−ＣＡＲとＧＺＭＢプロモーターにより駆動されるｄＣａｓ９−ＶＰＲとの両方を安定に発現する細胞系中で観察された。ＣＤ１９ＣＡＲまたはＧＺＭＢプロモーターにより駆動されるｄＣＡＳ９ＶＰＲのいずれかを発現する細胞系中では、最小限の発現が検出された。このデータは、安定細胞系におけるリガンド−受容体相互作用特異的様式でのレポーター遺伝子発現の誘導を示している。
【０５０３】
（実施例６：ＣＡＲシグナル伝達経路を介する誘導的合成プロモーターによる、内因性遺伝子を含む複数の遺伝子の発現の同時的誘導）
２ｓｇ−ＣＡＲ  Ｊｕｒｋａｔ由来細胞系、ＧＦＰレポーター遺伝子を含有し、６つのｓｇＲＮＡ（上方調節のためのＣＤ９５遺伝子を標的とする３つのｓｇＲＮＡ、ＣＸＣＲ４遺伝子を標的とする２つのｓｇＲＮＡ、およびＧＦＰレポーター遺伝子のためのＴＲＥ３Ｇプロモーターを標的とする１つのｓｇＲＮＡ）を安定に発現するＪｕｒｋａｔ由来細胞系（６ｓｇ）、ならびにＣＤ１９−ＣＡＲ導入遺伝子を形質導入され、活性化Ｔ細胞の合成核因子応答エレメント（ＮＦＡＴ−ＲＥ）プロモーターにより駆動されるｄＣａｓ９−ＶＰＲ構築物を一過的にトランスフェクトした６ｓｇ−ＣＡＲ細胞系を、Ｒａｊｉ細胞（ＣＤ１９＋およびＣＤ２２＋）を用いて、または用いずに同時培養した。２日間の同時培養後、細胞を、抗ＣＤ９５−ＰＥおよび抗ＣＤ２２−ＡＰＣによる染色後に、フローサイトメトリーによって、ＧＦＰおよびＣＤ９５発現について評価した。図５Ａにおいては、示されるプロットを、生きたＣＤ２２−Ｊｕｒｋａｔ由来細胞上でゲート処理する。ＧＦＰ発現の誘導は、ＣＤ１９−ＣＡＲ導入遺伝子を含む細胞系中で観察されたが、これは、合成ＮＦＡＴ−ＲＥプロモーターにより駆動されるｄＣａｓ９ＶＰＲの誘導を使用して、リガンド−受容体相互作用依存的様式でＧＦＰ発現を制御することができることを示唆している。
【０５０４】
図５Ｂは、Ｒａｊｉ刺激によって、６ｓｇ−ＣＡＲ細胞系中で内因性ＣＤ９５遺伝子発現も同時に上方調節されたことを示す。Ｒａｊｉで処置しなかった６ｓｇ−ＣＡＲ細胞系と比較して、Ｒａｊｉで処置した細胞は、より多くのＣＤ９５＋％の細胞を有していた（１４．６７％対１．１７％）。Ｒａｊｉで処置した２ｓｇ−ＣＡＲ細胞系中でもＣＤ９５発現の上方調節が観察されたが（図５Ｂ、下）、これは、内因性ＣＤ９５発現が、ＣＡＲ活性化Ｔ細胞系中で上方調節され得ることを示唆している。しかしながら、６ｓｇ−ＣＡＲ細胞系中で、より高いＣＤ９５発現が観察され（図５Ｂ、下）、これは、ＣＤ９５発現のさらなる上方調節が、６ｓｇ−ＣＡＲ細胞系中でＣＤ９５を標的化するｓｇＲＮＡの存在の結果生じることを示唆している。このデータは、誘導的プロモーター系を使用して、複数の遺伝子を同時に調節することができることを示す。
【０５０５】
（実施例７：ＣＭＶは、ＣＡＲシグナル伝達経路を介する誘導的プロモーターである）
図１１Ａおよび図１１Ｂにおいては、Ｊｕｒｋａｔ細胞またはＣＤ１９−ＣＡＲ導入遺伝子（ＣＡＲ）を含有するＪｕｒｋａｔ由来細胞系に、Ｎｅｏｎ−１０μｌヌクレオフェクションキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、様々な量のＣＭＶプロモーターにより駆動されるＧＦＰ発現プラスミドを一過的にトランスフェクトした。次いで、細胞を、Ｒａｊｉ（ＣＤ１９＋）細胞で刺激した。１日後、細胞を、フローサイトメトリーによってＧＦＰ発現について評価した。Ｒａｊｉ刺激をしない場合と比較して、使用したプラスミドのより低用量で、Ｒａｊｉで刺激されたＪｕｒｋａｔ−ＣＡＲ細胞系において、より多くのＧＦＰ−ｈｉｇｈ％細胞が検出された（図１１Ａ）。ＧＦＰ−ｈｉｇｈ細胞を定義するためのゲートの選択に起因して導入される偏りを回避するために、全ての生きたＪｕｒｋａｔ由来細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）も定量した（図１１Ｂ）。再度、ＧＦＰ発現はＲａｊｉ刺激によって誘導されたが、これは、ＣＭＶプロモーターが通常は構成的プロモーターであると考えられるとしても、ＣＭＶプロモーターをＣＡＲシグナル伝達経路によって誘導することができることを示唆している。
【０５０６】
（実施例８：リガンド依存的シグナルカスケードによるＧＦＰレポーター遺伝子の条件的発現）
ＣＤ１９−ＣＡＲ導入遺伝子を含有するＪｕｒｋａｔ由来細胞系（ＣＡＲ）およびＣＤ１９−ＣＡＲ−ＴＥＶ導入遺伝子を含有するＪｕｒｋａｔ由来細胞系（ＣＡＲ−Ｔｅｖ）に、Ｎｅｏｎ−１０μｌヌクレオフェクションキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、０．５μｇ（０．５）または１．０μｇ（１．０）のプラスミドを用いて、様々なプロモーターにより駆動される４ＮＥＳ−ｔｃｓ−ｄＣａｓ９−ＶＰＲ（短いものについては４ＮＥＳ−ｄＣａｓ９）構築物を一過的にトランスフェクトした。ＣＤ１９−ＣＡＲ−ＴＥＶは、タバコエッチウイルス核封入体ａエンドペプチダーゼ（すなわち、ＴＥＶプロテアーゼ）に融合したＣＤ１９−ＣＡＲである。４ＮＥＳは、４つの核外輸送シグナル配列が構築物中に組み込まれたことを示す。Ｔｃｓは、Ｔｅｖ切断部位／配列である。次いで、細胞を、Ｒａｊｉ（ＣＤ１９＋）細胞で刺激した、または刺激しなかった。２日間の同時培養後、細胞を、フローサイトメトリーによってＧＦＰ発現について評価した（図１２）。より多くのＧＦＰ−ｈｉｇｈ％細胞が、Ｒａｊｉで刺激したＣＡＲ−Ｔｅｖ細胞系中で検出された。この結果は、４ＮＥＳ−ｔｃｓ−ｄＣａｓ９−ＶＰＲ発現が、Ｒａｊｉ刺激によって誘導され、次いで、４ＮＥＳ部分がＣＡＲ−Ｔｅｖによって切断除去されて、ｄＣａｓ９−ＶＰＲを細胞核に移行させ、ＧＦＰレポーター遺伝子発現を活性化したことを示唆する。ｄＣａｓ９は、プロテアーゼによる切断の前に、それと同時に、またはその後に、ｓｇＲＮＡに結合し得る。
【０５０７】
図１２は、本明細書に記載のシステムによって調節されるＧＦＰ発現レベルを示す。図７に示されるように、リガンドが、その受容体、天然の受容体またはＴＥＶなどのプロテアーゼと融合したキメラ抗原受容体などの合成受容体に結合すると、内在性シグナル伝達経路を活性化し、細胞転写因子のプロモーター領域への動員をもたらすことができる。プロモーターのそのような転写活性化は、導入遺伝子、ＴＥＶ切断部位（ｔｃｓ）を介して核外輸送シグナルペプチド（ＮＥＳ）と融合したｄＣａｓ９−ＶＰＲまたはｄＣａｓ９−ＫＲＡＢタンパク質などの遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）の発現をもたらすことができる。ＮＥＳ−ｔｃｓ−ｄＣａｓ９−ＶＰＲ／ＫＲＡＢタンパク質は、ｔｃｓでＴＥＶによって切断されるまで、細胞質中に残存し得る。次いで、切断されたｄＣａｓ９−ＶＰＲまたはｄＣａｓ９−ＫＲＡＢタンパク質は、核に移行し、標的遺伝子の発現を調節する（活性化する、または抑制する）ことができる。
【０５０８】
（実施例９：リガンド依存的シグナルカスケードによるＧＦＰレポーター遺伝子の条件的発現）
Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＣＡＲなし）およびＣＤ１９−ＣＡＲ導入遺伝子を含有するＪｕｒｋａｔ由来細胞系（ＣＡＲ）に、様々なプロモーターにより駆動される４ＮＥＳ−ｔｃｓ−ｄＣａｓ９−ＶＰＲ（短いものについては４ＮＥＳ−ｄＣａｓ９）構築物および様々なプロモーターにより駆動されるＴＥＶを一過的にトランスフェクトした。次いで、細胞を、Ｒａｊｉ（ＣＤ１９＋）細胞を用いる、または用いない同時培養によって刺激した。２日後、細胞を、フローサイトメトリーによってＧＦＰ発現について評価した。Ｒａｊｉ刺激を用いない場合と比較して、（ＣＭＶ−Ｔｅｖ＋ＰＧＫ−４ＮＥＳ−ｔｃｓ−ｄＣａｓ９−ＶＰＲ）または（ＣＭＶ−Ｔｅｖ＋ＣＭＶ−４ＮＥＳ−ｔｃｓ−ｄＣａｓ９−ＶＰＲ）をトランスフェクトした、Ｒａｊｉで刺激したＣＡＲ細胞系において、より多くのＧＦＰ−ｈｉｇｈ％細胞が検出されたが、これは、Ｔｅｖのみ、またはＴｅｖと４ＮＥＳ−ｔｃｓ−ｄＣａｓ９−ＶＰＲの両方の誘導的発現が、ＧＦＰ遺伝子発現を調節することができることを示唆している（図１３）。
【０５０９】
図６に示されるように、リガンドが、その受容体、天然の受容体またはキメラ抗原受容体などの合成受容体に結合すると、内在性シグナル伝達経路を活性化し、細胞転写因子のプロモーター領域への動員をもたらすことができる。プロモーターのそのような転写活性化は、導入遺伝子、ＴＥＶなどのプロテアーゼの発現をもたらすことができる。ＴＥＶは、ＴＥＶ切断部位（ＴＣＳ）を介して核外輸送シグナルペプチド（ＮＥＳ）と融合したｄＣａｓ９−ＶＰＲまたはｄＣａｓ９−ＫＲＡＢタンパク質などの遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）からなる融合タンパク質を切断することができる。ＮＥＳ−ｔｃｓ−ｄＣａｓ９−ＶＰＲ／ＫＲＡＢタンパク質は、ＴＥＶによって切断されるまで、細胞質中に留まることができる。次いで、切断されたｄＣａｓ９−ＶＰＲまたはｄＣａｓ９−ＫＲＡＢタンパク質は、核に移行し、標的遺伝子の発現を調節する（活性化する、または抑制する）ことができる。
【０５１０】
図１０に示されるように、リガンドが、その受容体、天然の受容体またはキメラ抗原受容体などの合成受容体に結合すると、内在性シグナル伝達経路を活性化し、細胞転写因子のプロモーター領域への動員をもたらすことができる。プロモーターのそのような転写活性化は、導入遺伝子、ＴＥＶ切断部位（ｔｃｓ）を介して核外輸送シグナルペプチド（ＮＥＳ）と融合したｄＣａｓ９−ＶＰＲまたはｄＣａｓ９−ＫＲＡＢタンパク質などの遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）の発現をもたらすことができる。ＴＥＶなどのプロテアーゼ導入遺伝子の発現もまた、同じか、または異なるシグネチャー遺伝子のプロモーターの制御下にあってもよい。ＮＥＳ−ｔｃｓ−ｄＣａｓ９−ＶＰＲ／ＫＲＡＢタンパク質は、遊離ＴＥＶによって切断されるまで、細胞質中に留まることができる。次いで、切断されたｄＣａｓ９−ＶＰＲまたはｄＣａｓ９−ＫＲＡＢタンパク質は、核に移行して、標的遺伝子の発現を調節する（活性化する、または抑制する）ことができる。
【０５１１】
（実施例１０：リガンド依存的シグナルカスケードによるＰＤ−１発現の減少）
ＣＤ１９−ＣＡＲ導入遺伝子を含有するＪｕｒｋａｔ由来細胞系（ＣＡＲ）に、（ｉ）ＰＤ−１または対照ｓｇＲＮＡおよび（ｉｉ）様々なプロモーターにより駆動されるｄＣａｓ９−ＫＲＡＢを一過的にトランスフェクトした。構成的プロモーター（例えば、伸長因子１α（ＥＦ１ａ））または誘導的プロモーター（例えば、ＮＦＡＴＲＥもしくはＧＺＭＢ  Ｐ）のいずれかを使用した。ＧＺＭＢ  Ｐは、図３Ｅで考察されるように、長いバージョンのプロモーター、ＧＺＭＢ  Ｌよりも短いＧＺＭＢプロモーターのバリアントであってもよい。細胞を２日間培養した後、Ｒａｊｉ（ＣＤ１９＋）細胞を用いる同時培養によって刺激した。さらに２日後、細胞を、ＰＥコンジュゲート化抗ＰＤ−１モノクローナル抗体およびＡＰＣコンジュゲート化抗ＣＤ２２モノクローナル抗体で染色し、フローサイトメトリーによってＰＤ−１表面発現について評価した。ＣＤ２２を、Ｒａｊｉ細胞マーカーとして使用した。ＣＡＲ細胞系に、対照ｓｇＲＮＡよりもＰＤ−１  ｓｇＲＮＡをトランスフェクトした場合に、Ｒａｊｉで刺激したＣＡＲ細胞系において、より高い割合のＰＤ−１陰性（ＰＤ−１−）細胞が検出されたが、これは、ＰＤ−１  ｓｇＲＮＡと共に、ｄＣａｓ９−ＫＲＡＢの構成的発現または誘導的発現のいずれかが、ＰＤ−１遺伝子発現を下方調節することができることを示唆している（図１４）。
【０５１２】
（実施例１１：１、２、または３つの膜貫通受容体と、複数の核酸結合タンパク質とを含むシステム）
図１５に示されるように、リガンドが、その受容体、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）などの天然の受容体またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ、例えば、ｓｃＦｖ−ＣＡＲ）などの合成受容体に結合すると、内在性シグナル伝達経路を活性化し、細胞転写因子の対応するプロモーター領域への動員をもたらすことができる。プロモーターのそのような転写活性化は、（１）遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）ｄＣａｓ９、（２）遺伝子活性化ドメインを含有する融合タンパク質ＭＣＰ−ＶＰＲ、または（３）遺伝子抑制ドメインを含有する融合タンパク質ＰＣＰ−ＫＲＡＢなどの、対応する導入遺伝子の発現をもたらすことができる。ＭＣＰは、ＭＳ２バクテリオファージコートタンパク質であってよく、ＰＣＰは、ＰＰ７バクテリオファージコートタンパク質であってよい。一部の場合、他のＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）を使用することができる。ｄＣａｓ９の結合配列と、ＭＣＰまたはＰＣＰの少なくとも１つの結合配列とを含むｓｇＲＮＡは、それぞれ、（ｉ）＿ｄＣａｓ９および（ｉｉ）ＭＣＰ−ＶＰＲまたはＰＣＰ−ＫＲＡＢと複合体を形成することができる。次いで、得られるｄＣａｓ９−ｓｇＲＮＡ−ＭＣＰ−ＶＰＲまたはｄＣａｓ９−ｓｇＲＮＡ−ＰＣＰ−ＫＲＡＢ複合体は、それぞれ、対応する標的遺伝子の発現を上方または下方調節することができる。同じか、または異なる（例えば、１、２、３つまたはそれより多い）受容体およびプロモーターを使用することができる。ＭＣＰ−ＫＲＡＢ／ＰＣＰ−ＶＰＲの組合せまたは他の組合せを使用することもできる。図１５を参照すると、ｓｃＦｖ−ＣＡＲは、シグナル経路１を誘導する第１の受容体であり、ＧＰＣＲ（または他の受容体）は、シグナル経路２を誘導する第２の受容体である。さらに、シグナル経路３を誘導する第３の受容体が存在してもよい。
【０５１３】
図１６に示されるように、リガンドが、その受容体、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）などの天然の受容体またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ、例えば、ｓｃＦｖ−ＣＡＲ）などの合成受容体に結合すると、内在性シグナル伝達経路を活性化し、細胞転写因子の対応するプロモーター領域への動員をもたらすことができる。プロモーターのそのような転写活性化は、（１）遺伝子モジュレーティングポリペプチド（ＧＭＰ）ｄＣａｓ９、（２）遺伝子活性化ドメインを含有する融合タンパク質ＰＵＦａ−ＶＰＲ、または（３）遺伝子抑制ドメインを含有する融合タンパク質ＰＵＦｂ−ＫＲＡＢなどの、対応する導入遺伝子の発現をもたらすことができる。ＰＵＦａおよびＰＵＦｂは、Ｐｕｍｉｌｉｏ／ＦＢＦ（ＰＵＦ）ＲＮＡ結合ドメインを含有する操作されたタンパク質であってよい。一部の場合、野生型ＰＵＦ、ＰＵＦ（３−２）、ＰＵＦ（６−２／７−２）、ＰＵＦｗ、またはＰＵＦｃなどのＰＵＦタンパク質の他のバリアントを使用することができる。ｄＣａｓ９の結合配列と、異なるＲＢＰ（例えば、ＰＵＧａまたはＰＵＦｂ）の少なくとも１つの結合配列とを含むｓｇＲＮＡは、（ｉ）ｄＣａｓ９および（ｉｉ）ＰＵＦａ−ＶＰＲまたはＰＵＦｂ−ＫＲＡＢと複合体を形成することができる。次いで、得られるｄＣａｓ９−ｓｇＲＮＡ−ＦＵＦａ−ＶＰＲまたはｄＣａｓ９−ｓｇＲＮＡ−ＰＵＦｂ−ＫＲＡＢ複合体は、それぞれ、対応する標的遺伝子の発現を上方または下方調節することができる。同じか、または異なる（例えば、１、２、３つまたはそれより多い）受容体およびプロモーターを使用することができる。一部の場合には、ＰＵＦｂ−ＶＰＲ／ＰＵＦａ−ＫＲＡＢの組合せまたは他の組合せを使用することもできる。図１６を参照すると、ｓｃＦｖ−ＣＡＲは、シグナル経路１を誘導する第１の受容体であり、ＧＰＣＲ（または他の受容体）は、シグナル経路２を誘導する第２の受容体である。さらに、シグナル経路３を誘導する第３の受容体が存在してもよい。
【０５１４】
本発明の好ましい実施形態を本明細書に示し、説明してきたが、そのような実施形態は、ほんの一例として提供されることが当業者には明らかであろう。当業者であれば、本発明から逸脱することなく、いくつかの変形形態、変化および置換を想到するであろう。本明細書に記載の本発明の実施形態に対する様々な代替手段を、本発明の実施において使用することができることが理解されるべきである。以下の特許請求の範囲は、本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲にある方法および構造ならびにそれらの等価物がそれによって包含されることが意図される。
【図１】
2020530309.tif 000026
【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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