(57)【要約】手術中に溶血を濾過せずに患者にシトルリンを投与して、心肺バイパスによって誘発される肺傷害につながる、ｅＮＯＳ酵素二量体の脱共役を低減する方法。本発明は、内皮型一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）の共役を維持して、心肺バイパス中の患者におけるフリーラジカル生成による、心肺バイパスによって誘発される肺傷害の発生率または重症度を低減する方法であって、患者に有効量のシトルリンを投与することを含む方法を提供する。有効量のシトルリンは、手術中または手術後に患者に投与してよい。有効量のシトルリンは、手術中および手術後に患者に投与してよい。有効量のシトルリンは、手術前、手術中、および手術後に患者に投与してよい。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
内皮型一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）の共役を維持して、心肺バイパス中の患者におけるフリーラジカル生成による、心肺バイパスによって誘発される肺傷害の発生率または重症度を低減する方法であって、該患者に有効量のシトルリンを投与することを含む方法。
【請求項２】
前記有効量のシトルリンが、前記手術中または該手術後に前記患者に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記有効量のシトルリンが、前記手術中および該手術後に前記患者に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記有効量のシトルリンが、前記手術前、該手術中、および該手術後に前記患者に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記有効量のシトルリンが、内皮型一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）の脱共役を低減するのに十分な量である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記有効量のシトルリンが、フリーラジカルの生成を低減するのに十分な量である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記有効量のシトルリンが、心肺バイパスによって誘発される肺傷害の発生率または重症度を低減するのに十分な量である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記シトルリンが、前記手術より前に前記患者に投与される、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記シトルリンが、前記手術の約１２時間前に投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記シトルリンが、前記手術の開始時に前記患者に投与される、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記シトルリンが、前記手術中に前記患者に投与される、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記シトルリンが、前記手術後に前記患者に投与される、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記手術が、心臓欠陥を矯正するためのものである、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記心臓欠陥が、過剰な肺血流と関連付けられる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記心臓欠陥が心房中隔欠損である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記心房中隔欠損が、大きい心房中隔欠損である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記心臓欠陥が心室中隔欠損である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記心室中隔欠損が、非限定的な大きい心室中隔欠損（ＶＳＤ）である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記心臓欠陥が単心室病変である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記単心室病変が、グレンおよびフォンタン法によって修復される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記心臓欠陥が、大動脈弁狭窄（ＡＶＳ）、心房中隔欠損（ＡＳＤ）、大動脈縮窄（ＣｏＡ）、完全房室管欠損（ＣＡＶＣ）、ｄ−大血管転位、エブスタイン奇形、Ｉ−大血管転位、動脈管開存（ＰＤＡ）、肺動脈弁狭窄、単心室欠損、ファロー四徴症、総肺静脈還流異常（ＴＡＰＶＣ）、総動脈幹症、または心室中隔欠損（ＶＳＤ）である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２２】
前記手術が動脈スイッチ手順である、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記心肺バイパスが、部分的または完全な房室中隔欠損（ＡＶＳＤ）を修復するためのものである、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記心肺バイパスが、一次孔心房中隔欠損（ｐｒｉｍｕｍ  ＡＳＤ）を修復するためのものである、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記手術の開始時に投与される前記シトルリンが、約１００〜５００ｍｇ／ｋｇのシトルリンである、請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記手術開始時のシトルリンのボーラスが、約１００〜３００ｍｇ／ｋｇのシトルリンである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記手術開始時のシトルリンのボーラスが、約１５０ｍｇ／ｋｇのシトルリンである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記手術の開始時に投与される前記シトルリンが、約１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００ｍｇ／ｋｇのシトルリンである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記手術中に投与される前記シトルリンが濾過に加えられる、請求項１から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記手術中に投与される前記シトルリンが、血液濃縮置換液に加えられる、請求項１から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記シトルリンが、約１００〜５００μｍｏｌ／Ｌで加えられる、請求項１から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記シトルリンが、約１００〜３００μｍｏｌ／Ｌで加えられる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記シトルリンが、約１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００μｍｏｌ／Ｌで加えられる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記シトルリンが、約２００μｍｏｌ／Ｌで加えられる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
シトルリンボーラスが、前記手術から約５〜６０分後に投与される、請求項１から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
シトルリンボーラスが、前記手術から約１５〜４５分後に投与される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記シトルリンボーラスが、前記手術から約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、または６０分後に投与される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
シトルリンボーラスが、前記手術から約３０分後に投与される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記シトルリンボーラスが、約５〜５０ｍｇ／ｋｇのシトルリンである、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
前記シトルリンボーラスが、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ｍｇ／ｋｇのシトルリンである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記シトルリンボーラスが、約２０ｍｇ／ｋｇのシトルリンである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
シトルリンボーラスが、心肺バイパスカニューレ抜管から約３０分後に投与される、請求項１から４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
シトルリンが、手術後に約１２〜４８時間かけて前記患者に投与される、請求項１から４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記シトルリンが、手術後に約１２、２４、３６、または４８時間かけて前記患者に投与される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
手術後のシトルリンが、約４８時間かけて前記患者に注入される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記シトルリンが、約３〜１２ｍｇ／ｋｇ／時間での注入によって投与される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記シトルリンが、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２ｍｇ／ｋｇ／時間での注入によって投与される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記注入が約９ｍｇ／ｋｇ／時間である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
シトルリンが静脈内投与される、請求項１から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
シトルリンが周術期に投与される、請求項１から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
シトルリンのボーラスが、外科的手順の冒頭に投与される、請求項１から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記シトルリンが、経口、静脈内、吸入、またはこれらを組み合わせて投与される、請求項１から５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記シトルリンボーラスが、約１５０ｍｇ／ｋｇである、請求項１から５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記シトルリンが、前記手術中に利用される濾過および血液濃縮液に、約２００μｍｏｌ／Ｌで加えられる、請求項１から５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
約２０ｍｇ／ｋｇのシトルリンのボーラスが、心肺バイパスのカニューレ抜管後に投与される、請求項１から５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
心肺バイパスからのカニューレ抜管後、シトルリンの９ｍｇ／ｋｇ／時間の持続注入が、必要に応じて約４８時間かけて施される、請求項１から５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
１５０ｍｇ／ｋｇのシトルリンのボーラスが、手術の冒頭に投与され、続いて手術後から４時間、シトルリンが９ｍｇ／ｋｇ／時間で持続注入され得る、請求項１から５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記患者において、ＣＰＳＩ遺伝子におけるＴ１４０５Ｎ遺伝子型が、ＣＣ、ＡＣ、ＡＡ、またはその組合せである、請求項１から５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記患者において、ＣＰＳＩ遺伝子におけるＴ１４０５Ｎ遺伝子型がＣＣである、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記患者の血漿シトルリンレベルが、約３７、５０、１００、１５０、または２００μｍｏｌ／Ｌを超えて上昇する、請求項１から５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記患者の血漿シトルリンレベルが、術後、約３７、５０、１００、１５０、または２００μｍｏｌ／Ｌを超えて上昇する、請求項１から５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記患者の血漿シトルリンレベルが、約１００μｍｏｌ／Ｌを超えて上昇する、請求項１から５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記患者の血漿シトルリンレベルが、術後、約１００μｍｏｌ／Ｌを超えて上昇する、請求項１から５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記患者の血漿シトルリンレベルが、術後、約３７〜２００μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは、術後、１００〜２００μｍｏｌ／Ｌに上昇する、請求項１から５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記患者の血漿シトルリンレベルが、約３７μｍｏｌ／Ｌ〜２．５ｍＭに上昇する、請求項１から５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記患者の血漿シトルリンレベルが、約３７μｍｏｌ／Ｌ〜２００μｍｏｌ／Ｌ、１００μｍｏｌ／Ｌ〜１ｍＭ／Ｌ、１５０μｍｏｌ／Ｌ〜５００μｍｏｌ／Ｌの間まで上昇する、請求項１から５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記患者の血漿シトルリンレベルが、術後少なくとも１２〜４８時間にかけて上昇する、請求項１から６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記患者の血漿シトルリンレベルが、術後４８時間を超えて上昇する、請求項１から６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記患者が、新生児、思春期直前の子供、青年、または成人である、請求項１から６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記患者が約６才未満である、請求項１から６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
前記患者が約１０日齢未満である、請求項１から６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記患者が早期産児である、請求項１から６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記患者の集中治療室（ＩＣＵ）滞在が短縮される、好ましくは２７日未満になる、請求項１から７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
前記患者が、急性右心不全、三尖弁閉鎖不全、全身性低血圧、心筋虚血、および気道抵抗の増大のリスクにある、請求項１から７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記患者が、新生児遷延性肺高血圧（ＰＰＨＮ）のリスクにある、請求項１から７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
シトルリンの前記有効量が、ｅＮＯＳの脱共役を防ぐのに十分である、請求項１から７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記患者が、急性肺傷害のリスクにある、請求項１から７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記患者が急性肺傷害を有する、請求項１から７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記患者が、術後肺高血圧のリスクにある、請求項１から７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
前記患者が術後肺高血圧を有する、請求項１から７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
心肺バイパス手術中および術後に、患者における、心肺バイパスによって誘発される肺傷害の後遺症の発生率を低減させる、請求項１から７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
心肺バイパス手術中および術後に、患者における、心肺バイパスによって誘発される肺傷害の後遺症の重症度を軽減させる、請求項１から７９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、患者に有効量のシトルリンを投与することを含む、心肺バイパス中の患者におけるフリーラジカル生成による、心肺バイパスによって誘発される肺傷害の発生率または重症度を低減するために、内皮型一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）の共役を維持する分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
心肺バイパスによって誘発される肺傷害の後遺症
先天性心臓病変を修復する手術を受けた小児は、手術直後の期間中、肺血管抵抗の突然または持続性の増大に対して非常に脆弱である。手術の後、肺血管系の反応性が増大する結果、血管攣縮性の刺激によって、肺動脈圧および抵抗が突然増大する場合がある。こうしたことは、ひいては、急性右心不全、三尖弁閉鎖不全、全身性低血圧、心筋虚血、および気道抵抗の増大につながりかねない。このような肺高血圧クリーゼは、最も悪化した形態では、致命的となりかねない。より軽い刺激事象では、より長く続き、集中発生するより軽いクリーゼに陥る結果、集中治療室（ＩＣＵ）における滞在が長引く場合がある。AdatiaおよびBeghetti（２００９年）Cardiol  Young１９巻（４号）：３１５〜３１９頁。
【０００３】
心肺バイパス（ＣＰＢ）によって誘発される傷害は、バイパス術の過程によって誘発された主に体液性の全身性炎症応答の結果として生じる。Seghaye（２００３年）Cardiol  Young１３巻（３号）：２２８〜２３９頁；DayおよびTaylor（２００５年）Int  J  Surg３巻（２号）：１２９〜１４０頁；JaggersおよびLawson（２００６年）Ann  Thorac  Surg８１巻（６号）：Ｓ２３６０〜２３６６頁；KozikおよびTweddell（２００６年）Ann  Thorac  Surg８１巻（６号）：Ｓ２３４７〜２３５４頁；Warrenら（２００９年）J  Cardiothorac  Vasc  Anesth２３巻（２号）：２２３〜２３１頁；Warrenら（２００９年）J  Cardiothorac  Vasc  Anesth２３巻（３号）：３８４〜３９３頁。肺および他の組織が受ける損傷は、結果として、本明細書に記載する重度の臨床状態をもたらす。
ＣＰＢを受けている小児がＣＰＢに対して肺傷害後遺症を発症する割合
【０００４】
心肺バイパスを受けている若年患者の約５分の１から３分の１が、心肺バイパスによって誘発される肺傷害の後遺症に見舞われる。急性術後肺高血圧は、心肺バイパスによって誘発される肺傷害の後遺症を示唆する重要な特徴であると考えられる。Ｒｕｓｓｅｌｌは、臨床上重大な肺高血圧の基準を、（Ａ）平均肺動脈圧が平均全身動脈圧の５０％以上となった場合、または（Ｂ）心エコーデータから同程度の肺高血圧が示された場合のいずれかとして提示している。Russellら（１９９８年）Anesth  Analg８７巻（１号）：４６〜５１頁。これにより、先天性心臓修復手術（congenital  heart  repair  surgery）を受けている患者の３６人中１３人、または３６％が、心肺バイパスによって誘発される肺傷害の後遺症に見舞われるという数字が得られる。
【０００５】
別の手法では、Ｌｉｎｄｂｅｒｇが、重症術後肺高血圧を、平均肺動脈圧が平均全身動脈圧のレベルに等しいまたはそれを超えるとして定義することにより、重症の肺高血圧に注目した。Lindbergら（２００２年）J  Thorac  Cardiovasc  Surg１２３巻（６号）：１１５５〜１１６３頁。全体として、１３４９人の患者について、その集団の２％が、この厳格な基準に適合した。Ｌｉｎｄｂｅｒｇは、肺高血圧の中程度の症例の存在について論じてはいるが、こうした症例を詳細に数量化していない。しかし、全カルテ審査について適格となった患者が、ＩＣＵにおいて肺動脈カテーテルが取り付けられ、４日を超えて機械的換気で過ごし、または死亡していた。臨床上重大な肺高血圧があったと思われるこうした患者の数は、総計で、集団の１７％に相当する２２４人であった。同文献。
【０００６】
いくつかの研究が、同様の数字を挙げている。Ｂａｎｄｏは、より最近では低下していることを指摘しながら、歴史的には、患者の約３０％が肺高血圧を発症していたことに言及しているが、論文のデータは、約１７％の比率を示している。Bandoら（１９９６年）J  Thorac  Cardiovasc  Surg１１２巻（６号）：１６００〜１６０７頁。Ｃｈｅｃｃｈｉａは、心臓手術を受けている小児における肺高血圧の正確な発生率は、不確かなままであると述べた。Checchiaら（２０１２年）Pediatr  Cardiol３３巻（４号）：４９３〜５０５頁。Ｃｈｅｃｃｈｉａは、２０人のうち１１人の乳児が術後肺高血圧を発症した、１件だけの研究に言及しており、偶発性肺高血圧症例も含めたとき、割合は、７５％に上昇した。同文献。
術後肺高血圧を発症する小児の運命
【０００７】
Ｂｒｏｗｎによる研究では、術後肺高血圧を発症する小児の運命を調べ、それを、臨床的に重要な期間および経済的に重要な期間に構成した（framed）。入院期間についての考えられるすべての危険因子が、いくつかの多変量モデルにおいて調べられている。肺高血圧を始めとする最も強い因子は、合併症スコアに組み入れられている。術後モデルと、合併症スコアの一部としての最終モデルの両方において、肺高血圧は、入院期間長期化の強い予知因子であった。入院期間長期化は、主要な経済的帰結である。入院期間について第９５百分位数より上位になった小児は、病床日数の３０％を占め、死亡率は、第９５百分位数より下位になった小児の３倍であった。１つの施設において、７．１％の患者が、全集中治療日数の５０．１％、全技術資源の４７．７％を使用していた。特に、１２％の患者は、１４日またはこれより長期間のＩＣＵ滞在が必要であった。全患者では、滞在中央値は、３日であった。対照的に、第９５百分位数またはこれより上位の患者のＩＣＵ滞在中央値は、２７日であった。これと一致して、第９５百分位数またはこれより上位の患者についての機械的換気の継続期間中央値は、２３日であった。Brownら（２００３年）Crit  Care  Med３１巻（１号）：２８〜３３頁。
ＣＰＢによって誘発された肺傷害後遺症に対する現行療法
【０００８】
Ｌａｎｄｉｓは、成人肺バイパス術において術後肺高血圧の処置に使用されている種々の戦略の証拠に基づく検討を行って、一酸化窒素吸入およびことによると補体阻害薬だけが、真の価値をもたらすと結論付けた。Landisら（２０１４年）J  Extra  Corpor  Technol４６巻（３号）：１９７〜２１１頁。他の研究は、小児の心臓手術に注目していた。Apostolakisら（２０１０年）J  Cardiothorac  Surg５巻：１頁；Barstら（２０１０年）Pediatr  Cardiol３１巻（５号）：５９８〜６０６頁；FraisseおよびWessel（２０１０年）Pediatr  Crit  Care  Med１１巻（補遺２）：Ｓ３７〜４０頁；TaylorおよびLaussen（２０１０年）Pediatr  Crit  Care  Med１１巻（補遺２）：Ｓ２７〜２９頁;BronickiおよびChang（２０１１年）Crit  Care  Med３９巻（８号）：１９７４〜１９８４頁；Fraisseら（２０１１年）Intensive  Care  Med３７巻（３号）：５０２〜５０９頁；Checchiaら（２０１２年）Pediatr  Cardiol３３巻（４号）：４９３〜５０５頁；Brunnerら（２０１４年）Pulm  Circ４巻（１号）：１０〜２４頁。現行療法の主力は、依然として一酸化窒素吸入（ｉＮＯ）である。一酸化窒素は、他の療法のほとんどと同じく、療法を開始できる前に、まず第１に、患者が心肺バイパスの呼吸器合併症を発症している必要がある、リアクティブ療法である。その上、一酸化窒素吸入は、（Ａ）一酸化窒素吸入は、中断すると、著しいリバウンド現象を伴い、（Ｂ）一酸化窒素は、ヘモグロビンと錯化すると、メトヘモグロビン血症をもたらすという、２つの主要な欠点を有する。一酸化窒素吸入のリバウンドを鈍らせるのに、シルデナフィルなどのホスホジエステラーゼ５阻害薬が使用されているが、結果は、まちまちとなっている。
したがって、患者において、ＣＰＢによって誘発される肺傷害の後遺症を、術中および術後に軽減するのにより有効な方法が当該技術分野で求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】AdatiaおよびBeghetti（２００９年）Cardiol  Young１９巻（４号）：３１５〜３１９頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、内皮型一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）の共役を維持して、心肺バイパス中の患者におけるフリーラジカル生成による、心肺バイパスによって誘発される肺傷害の発生率または重症度を低減する方法であって、患者に有効量のシトルリンを投与することを含む方法を提供する。有効量のシトルリンは、手術中または手術後に患者に投与してよい。有効量のシトルリンは、手術中および手術後に患者に投与してよい。有効量のシトルリンは、手術前、手術中、および手術後に患者に投与してよい。
【００１１】
多くの実施形態では、シトルリンの有効量は、内皮型一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）の脱共役を低減するのに十分な量でよい。多くの実施形態では、シトルリンの有効量は、フリーラジカルの生成を低減するのに十分な量でよい。多くの実施形態では、シトルリンの有効量は、心肺バイパスによって誘発される肺傷害の発生率または重症度を低減するのに十分な量でよい。多くの実施形態では、シトルリンは、手術より前に患者に投与してよい。多くの実施形態では、シトルリンは、手術の約１２時間前に投与してよい。多くの実施形態では、シトルリンは、手術の開始時に患者に投与してよい。多くの実施形態では、シトルリンは、手術中に患者に投与してよい。多くの実施形態では、シトルリンは、手術後に患者に投与してよい。
【００１２】
この方法は、手術によって心臓欠陥が矯正されうるときに使用することができる。この方法は、心臓欠陥を、過剰な肺血流と関連付けることができるとき、使用することができる。特定の実施形態では、心臓欠陥は、心房中隔欠損である場合がある。特定の実施形態では、心房中隔欠損は、大きい心房中隔欠損（arterial  septal  defect）である場合がある。特定の実施形態では、心臓欠陥は、心室中隔欠損である場合がある。特定の実施形態では、心室中隔欠損は、非限定的な大きい心室中隔欠損（ＶＳＤ）である場合がある。特定の実施形態では、心臓欠陥は、単心室病変である場合がある。特定の実施形態では、単心室病変は、グレンおよびフォンタン法によって修復され得る。多くの実施形態では、心臓欠陥は、大動脈弁狭窄（ＡＶＳ）、心房中隔欠損（ＡＳＤ）、大動脈縮窄（ＣｏＡ）、完全房室管欠損（ＣＡＶＣ）、ｄ−大血管転位（d-Transposition  of  the  great  artery）、エブスタイン奇形、Ｉ−大血管転位、動脈管開存（Patent  Ductus  Arteriosis）（ＰＤＡ）、肺動脈弁狭窄、単心室欠損、ファロー四徴症、総肺静脈還流異常（ＴＡＰＶＣ）、総動脈幹症（Truncus  Arteriosus）、または心室中隔欠損（ＶＳＤ）である場合がある。特定の実施形態では、手術は、動脈スイッチ手順である場合がある。特定の実施形態では、心肺バイパスは、部分的または完全な房室中隔欠損（ＡＶＳＤ）を修復するためのものであり得る。特定の実施形態では、心肺バイパスは、一次孔心房中隔欠損（ｐｒｉｍｕｍ  ＡＳＤ）を修復するためのものであり得る。
【００１３】
手術の開始時に投与され得るシトルリンは、約１００〜５００ｍｇ／ｋｇのシトルリンであり得る。好ましくは、手術開始時のシトルリンのボーラスは、約１００〜３００ｍｇ／ｋｇのシトルリンであり得る。好ましくは、手術開始時のシトルリンのボーラスは、約１５０ｍｇ／ｋｇのシトルリンであり得る。好ましくは、手術の開始時に投与されるシトルリンは、約１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００ｍｇ／ｋｇのシトルリンであり得る。好ましくは、手術中に投与されるシトルリンは、濾過に加えてよい。より好ましくは、手術中に投与されるシトルリンは、血液濃縮置換液（hemoconcentration  replacement  fluid）に加えてよい。
【００１４】
多くの実施形態では、シトルリンは、約１００〜５００μｍｏｌ／Ｌで加えてよい。多くの実施形態では、シトルリンは、約１００〜３００μｍｏｌ／Ｌで加えてよい。多くの実施形態では、シトルリンは、約１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００μｍｏｌ／Ｌで加えてよい。多くの実施形態では、シトルリンは、約２００μｍｏｌ／Ｌで加えてよい。
【００１５】
シトルリンボーラスは、手術から約５〜６０分後に投与してよい。多くの実施形態では、シトルリンボーラスは、手術から約１５〜４５分後に投与してよい。多くの実施形態では、シトルリンボーラスは、手術から約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、または６０分後に投与してよい。多くの実施形態では、シトルリンボーラスは、手術から約３０分後に投与してよい。
【００１６】
多くの実施形態では、シトルリンボーラスは、約５〜５０ｍｇ／ｋｇのシトルリンであってよい。多くの実施形態では、シトルリンボーラスは、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ｍｇ／ｋｇのシトルリンであってよい。特定の実施形態では、シトルリンボーラスは、約２０ｍｇ／ｋｇのシトルリンであってよい。
【００１７】
シトルリンボーラスは、心肺バイパスカニューレ抜管から約３０後に投与してよい。
【００１８】
多くの実施形態では、シトルリンは、手術後に約１２〜４８時間かけて患者に投与してよい。多くの実施形態では、シトルリンは、手術後に約１２、２４、３６、または４８時間かけて患者に投与してよい。多くの実施形態では、手術後にシトルリンは、約４８時間かけて患者に注入してよい。多くの実施形態では、シトルリンは、約３〜１２ｍｇ／ｋｇ／時間での注入によって投与してよい。多くの実施形態では、シトルリンは、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２ｍｇ／ｋｇ／時間での注入によって投与してよい。多くの実施形態では、注入は、約９ｍｇ／ｋｇ／時間であり得る。
【００１９】
多くの実施形態では、シトルリンは、静脈内投与してよい。多くの実施形態では、シトルリンは、周術期に（perioperatively）投与してよい。多くの実施形態では、シトルリンのボーラスは、外科的手順の冒頭に投与してよい。
【００２０】
多くの実施形態では、シトルリンは、経口、静脈内、吸入、またはこれらを組み合わせて投与してよい。
【００２１】
多くの実施形態では、シトルリンボーラスは、約１５０ｍｇ／ｋｇであり得る。
【００２２】
多くの実施形態では、シトルリンは、手術中に利用される濾過および血液濃縮液に、約２００μｍｏｌ／Ｌで加えてよい。
【００２３】
多くの実施形態では、約２０ｍｇ／ｋｇのシトルリンのボーラスが、心肺バイパスからのカニューレ抜管後に投与してよい。
【００２４】
多くの実施形態では、心肺バイパスからのカニューレ抜管後、シトルリンの９ｍｇ／ｋｇ／時間の持続注入が、必要に応じて約４８時間かけて施行され得る。
【００２５】
多くの実施形態では、１５０ｍｇ／ｋｇのシトルリンのボーラスが、手術の冒頭に投与され、続いて手術後から４時間、シトルリンが９ｍｇ／ｋｇ／時間で持続注入され得る。
【００２６】
多くの実施形態では、患者は、ＣＰＳＩ遺伝子におけるＴ１４０５Ｎ遺伝子型がＣＣ、ＡＣ、ＡＡ、またはその組合せであり得る。特定の実施形態では、患者は、ＣＰＳＩ遺伝子におけるＴ１４０５Ｎ遺伝子型がＣＣであり得る。
【００２７】
多くの実施形態では、患者の血漿シトルリンレベルは、約３７、５０、１００、１５０、または２００μｍｏｌ／Ｌを超えて上昇し得る。多くの実施形態では、患者の血漿シトルリンレベルは、術後、約３７、５０、１００、１５０、または２００μｍｏｌ／Ｌを超えて上昇し得る。多くの実施形態では、患者の血漿シトルリンレベルは、約１００μｍｏｌ／Ｌを超えて上昇し得る。多くの実施形態では、患者の血漿シトルリンレベルは、術後、約１００μｍｏｌ／Ｌを超えて上昇し得る。多くの実施形態では、患者の血漿シトルリンレベルは、術後、約３７〜２００μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは、術後、１００〜２００μｍｏｌ／Ｌに上昇し得る。多くの実施形態では、患者の血漿シトルリンレベルは、約３７μｍｏｌ／Ｌ〜２．５ｍＭに上昇し得る。多くの実施形態では、患者の血漿シトルリンレベルは、約３７μｍｏｌ／Ｌ〜２００μｍｏｌ／Ｌ、１００μｍｏｌ／Ｌ〜１ｍＭ／Ｌ、１５０μｍｏｌ／Ｌ〜５００μｍｏｌ／Ｌの間まで上昇し得る。
【００２８】
特定の一実施形態では、患者の血漿シトルリンレベルは、術後少なくとも１２〜４８時間にかけて上昇し得る。多くの実施形態では、患者の血漿シトルリンレベルは、術後４８時間を超えても上昇し得る。
【００２９】
特定の実施形態では、患者は、新生児、思春期直前の子供（pre-adolescent）、青年、または成人であってよい。多くの実施形態では、患者は、約６才未満であってよい。多くの実施形態では、患者は、約１０日齢未満であってよい。多くの実施形態では、患者は、早期産児であってよい。
【００３０】
多くの実施形態では、患者の集中治療室（ＩＣＵ）滞在は、短縮される、好ましくは２７日未満であり得る。
【００３１】
多くの実施形態では、患者は、急性右心不全、三尖弁閉鎖不全、全身性低血圧、心筋虚血、および気道抵抗の増大のリスクがある場合がある。
【００３２】
多くの実施形態では、患者は、新生児遷延性肺高血圧（ＰＰＨＮ）のリスクがある場合がある。
【００３３】
多くの実施形態では、シトルリンの有効量は、ｅＮＯＳの脱共役を防ぐのに十分であり得る。
【００３４】
多くの実施形態では、患者は、急性肺傷害のリスクがある場合がある。特定の一実施形態では、患者は、急性肺傷害を有する場合がある。
【００３５】
多くの実施形態では、患者は、術後肺高血圧のリスクがある場合がある。特定の一実施形態では、患者は、術後肺高血圧を有する場合がある。
【００３６】
多くの実施形態では、方法によって、心肺バイパス手術中および術後に、患者における、心肺バイパスによって誘発される肺傷害の後遺症の発生率を低減させることができる。
【００３７】
本発明の方法の多くの実施形態では、方法によって、心肺バイパス手術中および術後に、患者における、心肺バイパスによって誘発される肺傷害の後遺症の重症度を軽減させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１は、肝臓の尿素回路を示す。
【００３９】
【図２】図２は、ＣＰＳＩ多型（ＣＣ、ＡＣ、およびＡＡ）の遺伝子型が血漿アルギニンおよびシトルリンレベルに及ぼす影響を示す。これらは、Ｔ１４０５Ｎ遺伝子型を生じるＣＰＳＩ多型である。
【００４０】
【図３】図３は、手術中および術後に、患者においてＣＰＢによって誘発される肺傷害の後遺症を処置するための典型的なプロトコールの流れ図を示す。
【００４１】
【図４】図４は、新生児遷延性肺高血圧（ＰＰＨＮ）を有する患者における、ＮＯおよびＮＯ前駆体である、アルギニンおよびシトルリンの減少を示す。
【００４２】
【図５】図５は、心肺バイパス（ＣＰバイパス）からの血漿アルギニンレベルの低下を示す。ＣＰバイパスによって、患者の血漿アルギニンレベルは低下する。
【００４３】
【図６】図６Ａ〜Ｂは、心肺バイパスからの血漿（図６Ａ）および血清（図６Ｂ）シトルリンレベルの低下を示す。ＣＰバイパスによって、患者の血漿および血清シトルリンレベルは低下する。
【００４４】
【図７】図７は、心肺バイパスからの血漿一酸化窒素（ＮＯ）レベルの低下を示す。ＣＰバイパスによって、血漿ＮＯレベルは低下する。
【００４５】
【図８】図８は、肺血管緊張の増大を伴うおよび伴わない（ＰＶＴ−およびＰＶＴ＋）患者における、術前、術後、ならびに術後１２、２４、および４８時間のアルギニンレベルの低下を示す。
【００４６】
【図９】図９Ａ〜Ｃは、シトルリンのボーラスが投与されたおよび投与されていない患者における血漿シトルリンレベルを示す。図９Ａは、患者６と８の平均を示す。図９Ｂは、患者９と１０の平均を示す。図９Ｃは、患者１３〜１６の平均を示す。患者には、シトルリンの用量（５０、１００、または１５０ｍｇ／ｋｇ）が術前および術後に与えられた。
【００４７】
【図１０】図１０Ａ〜Ｂは、ＰＫモデル（図１０Ａ）およびＰＫパラメーター（図１０Ｂ）を示す。
【００４８】
【図１１】図１１Ａ〜Ｂは、静脈内シトルリン（「ＩＶシトルリン」）が投与されたおよび投与されていない乳児における、６０時間にわたる平均シトルリンおよびアルギニンレベルを示す。図１１Ａは、乳児における平均シトルリンレベルの低下を６０時間にわたって示す。図１１Ｂは、乳児における平均アルギニンレベルの低下を６０時間にわたって示す。
【００４９】
【図１２】図１２は、シトルリンの用量（５０、１００、または１５０ｍｇ／ｋｇ）が術後に投与された患者における、１２時間にわたる血漿シトルリンレベルを示す。
【００５０】
【図１３】図１３は、術後にシトルリンの用量（５０、１００、または１５０ｍｇ／ｋｇ）が投与された患者であって、シトルリンの静脈内注入（９ｍｇ／ｋｇ／時間）を組み合わせて投与された患者における、１６時間にわたる血漿シトルリンレベルを示す。
【００５１】
【図１４】図１４Ａ〜Ｂは、乳児における６０時間にわたる平均シトルリンレベル（図１４Ａ）、および９人の個々の乳児の６０時間にわたる平均シトルリンレベル（図１４Ｂ）を示す。
【００５２】
【図１５】図１５は、異なる用量のシトルリンを用いた術後換気の長さを示す。
【００５３】
【図１６】図１６は、先天性心臓修復手術における、シトルリンの呼吸転帰に対する効果を示す。ＮＢ：単一のデータ点が軸境界外にある（プラセボ、６７２時間）。Ｐ＝０．１９１１  Ｓａｔｔｅｒｈｗａｉｔｅ  ｔ検定、ｎ＝２０人の使用可の患者
【００５４】
【図１７】図１７は、シトルリンが与えられた処置された患者（シトルリン）対シトルリンなしの患者（プラセボ）の平均変力物質スコアを示す。
【００５５】
【図１８】図１８Ａ〜Ｂは、シトルリンが与えられた患者（シトルリン）対シトルリンなしの患者（プラセボ）の収縮期および拡張期血圧ならびに平均動脈圧を示す。図１８Ａは、収縮期および拡張期血圧を示す。シトルリンが与えられた患者の収縮期および拡張期血圧に有意な変化なし。図１８Ｂは、シトルリンが与えられた患者（シトルリン）対シトルリンなしの患者（プラセボ）の平均動脈圧を示す。シトルリンが与えられた患者の平均動脈圧に有意な変化なし。
【００５６】
【図１９】図１９は、術前ボーラス、周術期、および術後のシトルリンが与えられた患者におけるメジアン血漿シトルリンレベルを示す。
【００５７】
【図２０】図２０は、侵襲的な機械的換気の継続期間の、手術の終わりから最後の抜管までのカプラン・マイヤー生存分析である。（再挿管を除外、打ち切り）。シトルリンが与えられた患者では、機械的換気の継続期間の短縮が示された。機械的換気の差は、ウィルコクソンの順位和検定（ｐ＝０．０２２２）および分散分析ｔ検定（ｐ＝０．０３１７）によって統計的に有意であった。
【００５８】
【図２１】図２１は、変力物質依存時間の長さ（length  of  time  on  inotrope）のカプラン・マイヤー生存分析を示す。単変量分析（ｐ値）：ウィルコクソンの順位和検定（０．０７２７）、Ｔ検定（０．０９７）。
【００５９】
【図２２】図２２は、変力物質依存時間の長さのカプラン・マイヤー生存分析を示す。単変量分析（ｐ値）：ウィルコクソンの順位和検定（０．０７２７）、Ｔ検定（０．０９８７）。
【００６０】
【図２３】図２３は、内皮細胞におけるアルギニン、シトルリン、およびヒスタミンによる一酸化窒素（ＮＯ）産生の比較を示す。アルギニンは、ＮＯ産生においてシトルリンと同等でない。
【００６１】
【図２４】図２４Ａ〜Ｂは、プラセボおよびシトルリンが与えられた患者における、メジアン血漿アルギニンレベル（図２４Ａ）およびメジアン血漿一酸化窒素（ＮＯ）レベル（図２４Ｂ）を示す。
【００６２】
【図２５】図２５Ａ〜Ｂは、プラセボおよびシトルリンが与えられた患者における、再挿管時間を含めた、侵襲的な機械的換気の継続期間を示す。図２５Ａ、こうした患者についての術後の機械的換気の継続期間をゼロに設定し、換気時間がゼロであるすべての患者を打ち切りにした。図２５Ｂでは、換気時間がゼロである患者を打ち切りにしなかった。両方の分析によって、シトルリンが与えられた患者についての侵襲的な機械的換気を用いた時間の統計的に有意な短縮が示されている。
【００６３】
【図２６】図２６Ａ〜Ｂは、１人の患者における侵襲的な機械的換気の継続期間を示す（再挿管時間を除外）。結果から、侵襲的な機械的換気を用いた時間の統計的に有意な短縮における、シトルリンのプラセボ処置に比べて有益な効果が確立される。
【００６４】
【図２７】図２７Ａ〜Ｂは、シトルリンが与えられた患者において、呼吸補助の必要がプラセボに比べて減ったことを示す、カプラン・マイヤー生存プロットを示す。
【００６５】
【図２８】図２８Ａ〜Ｂは、（静脈内（ｉ．ｖ．）変力物質使用の期間がゼロである患者を省いて）カプラン・マイヤー分析を示す。図２８Ａは、追加の打ち切りなしであり、図２８Ｂは、ゼロを打ち切りとしている。図２８Ａ〜Ｂは、シトルリンが与えられた患者では、プラセボが与えられた患者より変力物質スコアが低いことを示している。
【００６６】
【図２９】図２９は、プラセボが与えられた患者対シトルリンが与えられた患者を比較する、経時的な平均変力物質スコアを示す。
【００６７】
【図３０】図３０Ａ〜Ｂは、打ち切りになっているすべての患者（図３０Ａ）についておよび打ち切られた血管作動性薬物療法使用なしの患者（図３０Ｂ）について、血管作動性薬物療法の合計継続期間に関するカプラン・マイヤープロットを示す。
【００６８】
【図３１】図３１は、シトルリンが与えられた患者対プラセボが与えられた患者についての小児集中治療室（ＰＩＣＵ）滞在の合計継続期間を示す。
【００６９】
【図３２】図３２Ａ〜Ｂは、機械的換気、静脈内変力物質使用、または血管拡張薬使用の最長継続期間に基づく集中治療室（ＩＣＵ）滞在の合計継続期間を示す。図３２Ａは、追加の打ち切りのないすべての患者を示す。図３２Ｂは、再挿管を除外し、追加の打ち切りのない、すべての患者を示す。
【００７０】
【図３３】図３３Ａ〜Ｂは、機械的換気の継続期間および変力物質使用の継続期間の最長の長さである複合評価項目を示す。図３３Ａは、再挿管を含め、追加の打ち切りのないすべての患者を示す。図３３Ｂは、再挿管を除外し、追加の打ち切りのないすべての患者を示す。この複合的な値は、変力物質使用の継続期間が４８時間となり、機械的換気が４８時間より短かった場合、打ち切りとした。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
本発明では、心肺バイパス手術中および術後に、患者において、血漿シトルリンレベルを維持することにより、心肺バイパスによって誘発される肺傷害の後遺症の軽減が実現される。３７μｍｏｌ／Ｌより高い手術時血漿シトルリンレベルの、術後４８時間までの持続を、本明細書に記載の方法によって実現することができる。好ましくは、１００μｍｏｌ／Ｌより高い手術時血漿シトルリンレベルの、術後４８時間までの持続を、本明細書に記載の方法によって実現することができる。これにより、心肺バイパス手術中および術後に、患者において、心肺バイパスによって誘発される肺傷害の後遺症の発生率および／または重症度が低減される。
【００７２】
本発明者らは、驚いたことに、静脈内シトルリン補充によって、術後血漿アルギニンレベルが上昇し、ｅＮＯＳの脱共役が低減されることにより、心肺バイパスによって誘発される肺傷害の後遺症が予防されることを発見した。心肺バイパス手術中および術後に、患者において、心肺バイパスによって誘発される肺傷害の後遺症の発生率および／または重症度を低減させることで、コストが削減され、人員および設備が他の使用のために特別の制限を受けない。本明細書に記載する方法では、先天性心臓欠陥の手術を受けている小児患者において、心肺バイパスによって誘発される肺傷害の後遺症を予防するために、静脈内シトルリンを使用する。
【００７３】
心肺バイパスは、臨床的には心血管および肺機能の急性の障害を特徴とする全身性炎症応答を引き起こす。Apostolakisら（２０１０年）Journal  of  Cardiac  Surgery２５巻（１号）：４７〜５５頁；HuffmyerおよびGroves（２０１５年）「Pulmonary  Complications  of  Cardiopulmonary  Bypass」、Best  Practice  &  Research  Clinical  Anesthesiology。しかし、先天性心臓欠陥の外科的修復の間にＣＰＢを受ける小児患者は、いくつかの医学的および生理学的理由のため、成人患者よりこのカスケードに影響されやすく、それからの医学的リスクがより大きくなる。KozikおよびTweddell（２００６年）The  Annals  of  Thoracic  Surgery８１巻（６号）：Ｓ２３４７〜Ｓ２３５４頁；Shekerdemian（２００９年）Heart９５巻（１５号）：１２８６〜１２９６頁；Schure（２０１０年）Southern  African  Journal  of  Anesthesia  and  Analgesia１６巻（１号）：４６〜５１頁。ＣＰＢによって誘発される急性肺傷害の重要な徴候の減少、すなわち、機械的換気および変力療法の術後の必要性の低減は、臨床的有効性の測定に使用することができる。
脱共役されたｅＮＯＳによる酸化的損傷
【００７４】
本発明者らは、患者が心肺バイパス（ＣＰＢ）を受けるとき、血漿シトルリンレベルの低下のせいで全身性炎症応答が誘発されることを発見した。血漿シトルリンのこの低下は、ｅＮＯＳの脱共役およびラジカル酸素種の産生をもたらす。結果として生じる酸化的損傷が、ＣＰＢと関連する肺傷害につながる。
【００７５】
いくつもの観察および臨床研究によって、先天性心手術（congenital  cardiac  surgery）のための心肺バイパス後４８時間までの間、シトルリンおよびアルギニンの血漿レベルが急激に低下し、回復しないことが示されている。細胞内輸送機序および細胞内プロセシングにより、シトルリンは、一酸化窒素の内因性産生のための最終的な基質である。Barrら（２００３年）The  Journal  of  Pediatrics１４２巻（１号）：２６〜３０頁；Smithら（２００６年）The  Journal  of  Thoracic  and  Cardiovascular  Surgery１３２巻（１号）：５８〜６５頁；Barrら（２００７年）The  Journal  of  Thoracic  and  Cardiovascular  Surgery１３４巻（２号）：３１９〜３２６頁。
【００７６】
内皮型一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）は、十分に機能しうるとき、たとえば、アルギニンを一酸化窒素（ＮＯ）とシトルリンに変換しているとき、二量体である。ｅＮＯＳの二量体形態を維持するには、有効なレベルのシトルリンが必要である。シトルリンが閾値レベルを下回るとき、ｅＮＯＳ二量体は、脱共役される。脱共役されたｅＮＯＳは、依然として基質を結合するが、ＮＯではなくフリーラジカルを産生する。フリーラジカルは、炎症という損傷の一因となって、心肺バイパスの傷害後遺症をもたらす。脱共役されたｅＮＯＳによる不十分なＮＯ産生によって、肺血管抵抗がより高くなり、その結果、肺高血圧が促進される。
【００７７】
様々な先天性心臓欠陥が修復された後の肺の肺傷害後遺症の病態生理は、ひいてはｅＮＯＳ酵素の脱共役につながる血漿シトルリンレベルの低下（たとえば、３７μｍｏｌ／Ｌ未満）を含む。脱共役されたｅＮＯＳ酵素は、心肺バイパス後の後遺症の一部となりうる肺の肺傷害（pulmonary  lung  injury）の根底にある酸化的損傷を引き起こす、酸素ラジカルを産生する。アルギニンは、ｅＮＯＳの脱共役の防止、および結果としての、脱共役されたｅＮＯＳによる酸化的損傷の予防という役割を果たすことができないため、アルギニンパラドックスは、臨床上重要である。
アルギニンパラドックス
【００７８】
無細胞系を使用した初期の研究によって、一酸化窒素（ＮＯ）がアルギニンから産生されることが示唆された。１９９０年代初頭、科学者らは、一酸化窒素産生が、ＮＯ合成酵素によってプロセシングされた遊離アルギニンに左右されると考えていた。シトルリンは、この時点では、この過程のけん引役というより副産物であると考えられていた。実際に、当時、シトルリンは、ＮＯ産生の副産物であると誤って考えられていたため、ＮＯ産生の指標として使用されていた。たとえば、MoncadaおよびHiggs  N.  Engl.  J.  Med.３２９巻（２７号）２００２〜２０１２頁（１９９３年）およびStamlerら、Science２５８巻（５０９０号）１８９８〜１９０２頁（１９９２年）を参照されたい。しかし、この初期の理解は、後に生理的条件下で行われ、発表された研究と相容れず、そうした後の研究によって、「アルギニンパラドックス」が記載されている。「アルギニンパラドックス」は、血漿アルギニンレベルが変化しないにもかかわらず、ＮＯ産生が増加することによって明らかになる。
【００７９】
研究によって、ｅＮＯＳについての半飽和アルギニン濃度は、１０μＭ未満であることが示されている。細胞内アルギニン濃度が、内皮細胞培養物において０．１〜０．８ｍＭの範囲にあることも、学術誌において報告されている。したがって、ｅＮＯＳの活性部位は、こうした細胞中の細胞内アルギニンによって飽和されることが予想され、細胞外アルギニンを増加させても、ＮＯ産生の増加は期待されないことになる。この所見は、Fikeら、Am  J  Physiol  Lung  Cell  Mol  Physiol２７４巻：Ｌ５１７〜Ｌ５２６頁（１９９８年）によって報告された。
【００８０】
しかし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ研究では、生理的条件下での内皮細胞によるＮＯ産生が、飽和状態の細胞内アルギニン濃度にもかかわらず、細胞外アルギニンによって増加しうることが示されている。一方、内皮細胞におけるアルギニンの細胞内濃度は、一酸化窒素（ＮＯ）産生の変化なしに、１００倍を超えて変動し得る。この所見、すなわち、細胞外アルギニン投与によって、細胞内アルギニンが超過して利用可能であるときでさえ、ＮＯ産生が推し進められることは、「アルギニンパラドックス」と呼ばれる。McDonaldら（１９９７年）The  Journal  of  Biological  Chemistry２７２巻（５０号）：３１２１３〜３１２１６、３１２１３頁。加えて、生理系においては外因性アルギニンによってＮＯ産生が増加しないことも、この時期の間に見出された。たとえば、Blumら、Circulation１０１巻（１８号）：２１６０〜２１６４頁（２０００年）、およびChin-Dustingら、J.Am.Coll.Cardiol：２７巻（５号）：１２０７〜１２１３頁（１９９６年）を参照されたい。
【００８１】
現在、シトルリンは、飽和レベルのアルギニンの存在下でさえ、一酸化窒素（ＮＯ）産生を刺激しうると理解されている。さらに、細胞外シトルリンは、細胞内アルギニンレベルに影響を及ぼさない。そのため、ＮＯ産生は、実際には、外因性のアルギニン供給ではなく、内部中間体としてのアルギニノコハク酸およびアルギニンとの酵素複合体に入る、尿素回路によって産生または再利用されるシトルリンの使用に左右される。Dioguardi（２０１１年）J  Nutrigenet  Nutrigenomics４巻：９０〜９８頁。したがって、妥当な血漿レベルのシトルリンによって、心肺バイパスによって誘発される肺傷害の後遺症の重症度および発生率は、低減される。
心肺バイパスによって誘発される肺傷害の後遺症
【００８２】
いくつかの要素によって、ＣＰＢ中に肺が傷害のリスクに曝される。中でも、主要な要素は、特に、好中球および他の白血球、補体、およびサイトカイン（炎症性および抗炎症性）の表面活性化、ならびに関連する全身性炎症カスケードである。Apostolakisら（２０１０年）Journal  of  Cardiac  Surgery２５巻（１号）：４７〜５５頁；Schure（２０１０年）Southern  African  Journal  of  Anesthesia  and  Analgesia１６巻（１号）：４６〜５１頁。体外循環の際の白血球の接触活性化によって媒介される炎症応答によって肺が損傷を受ける度合いは、臨床的帰結のない顕微鏡的変化から、毛細管漏出症候群、または、最悪の場合では、急性呼吸不全まで、重症度が様々となりうる。
【００８３】
肺傷害は、幾通りかの方法で顕在化し、実質と血管両方の肺組織を巻き込む場合がある。ＣＰＢの実質への影響は、肺コンプライアンスの変化に反映され、最も一般的には、肺水分の増加と関係付けられる。これによって患者が受ける影響は、換気補助の強化の必要、および肺がガス交換の機能を果たす能力の低下である。血管への影響は、ひいては右心室の機能に影響を及ぼす、肺血管抵抗の変化によって顕在化する。この状態は、事実上、肺動脈高血圧をなす。肺は、循環において独特な位置にあり、したがって、異なる傷害機序に対して脆弱であり得る。ＣＰＢ装置において表面と接触後、またはＣＰＢ機器による直接の損傷によって炎症メディエーターを作り出す循環白血球は、肺において起こりうる炎症性の損傷の一部を占めるに過ぎない。Clark（２００６年）Perfusion２１巻（４号）：２２５〜２２８頁。肺は、炎症細胞の重要な供給源でもあることに加えて、そうした同じ細胞による損傷のターゲットにもなる。肺に対する機械的および炎症性の影響の帰結は、機能的残気量の減少、コンプライアンスの低下、およびガス交換の障害である。こうした変化は、最終的に、肺血管抵抗および肺動脈圧の増加と関連する。
【００８４】
ＣＰＢによって誘発される急性肺傷害は、重大な心肺の問題をもたらす。炎症応答は、肺および全身の脈管構造の収縮につながる。収縮の結果、右心室および左心室の仕事量が増加する。炎症応答は、肺水腫ならびに肺コンプライアンスおよび術後肺機能の低下にもつながる。こうした術後合併症の標準処置には、肺機能が正常に戻るまでの機械的換気、ならびに肺および全身の血管緊張が正常に戻って、最終的に右心室および左心室の仕事量が減少するまでの変力支持（inotropic  support）が含まれる。機械的換気および変力支持は、ＣＰＢによって誘発される急性肺傷害の有効なバイオマーカーとして働くことができる療法である。加えて、機械的換気の長期化は、ひいては、人工呼吸器関連肺傷害、人工呼吸器関連肺炎（ＶＡＰ）、中心ライン関連血流感染症（ＣＬＡＢＳＩ）、およびより一層長期化した集中治療室滞在を始めとする、他の病的状態にも往々にしてつながりかねない。したがって、心肺バイパスによって誘発される肺傷害の後遺症の予防は、望ましい治療目標である。
小児ＣＨＤ患者
【００８５】
先天性心臓欠陥の手術を受ける小児は、炎症応答の年齢による違いのため、未熟な臓器系では傷害に対する感受性が高いため、また小児と成人のＣＰＢには明確な違いがあるために、ＣＰＢによって誘発される急性肺傷害を特に発症しやすい。KozikおよびTweddell（２００６年）The  Annals  of  Thoracic  Surgery８１巻（６号）：Ｓ２３４７〜Ｓ２３５４頁。新生児および乳児は、相対的に大きい体外回路サイズ、血液プライム、および流量増加要求の結果として、血液が外来表面により多く曝されるため、特に影響を受ける。Schure（２０１０年）Southern  African  Journal  of  Anesthesia  and  Analgesia１６巻（１号）：４６〜５１頁。
【００８６】
先天性心手術のために、体外回路は、１．５ｋｇの未熟児から１００ｋｇを超える青年または成人までの、広範な年齢群およびサイズ変化に合わせて調整しなければならない。乳児および小児は、循環血液量がより少なく、酸素消費速度がより速く、多くの場合、肺血管床の反応性がより高い。加えて、新生児および乳児は、体温調節が不安定であり、臓器系が未熟であり、虚血耐性および炎症応答に対する複数の影響を伴う。多くの複雑な修復には、無血手術野が必要となるが、心内または心外短絡、大動脈肺動脈側副血行路、または別な形での肺静脈還流の増加の存在下でこれを得ることは、困難な場合がある。Schure（２０１０年）Southern  African  Journal  of  Anesthesia  and  Analgesia１６巻（１号）：４６〜５１頁。
【００８７】
成人ＣＰＢと小児ＣＰＢの違いを表１に示す。
【表１】
2020503326.tif 000003
【００８８】
肺血管床の機能および構造の状態は、先天性心血管疾患を有する小児の症状発現（presentation）および転帰に中心的に関与する。しかし、このような小児患者が、心肺バイパスによって誘発される肺傷害の後遺症に対して最も脆弱であるのは、手術直後の期間においてである。心肺バイパスによって誘発される肺傷害の後遺症は、患者の術前の状態（重要な点で、修復時の年齢、病変のタイプ、および症候群の存在）と、心臓手術の結果として起こる内分泌および血管作動性ペプチド環境における不可避の崩壊との間の複雑な相互作用を表わす。血管収縮の増強につながる重要な要素は、心肺バイパス、低体温法、およびある程度の虚血を伴う循環停止である。残存心臓病変、ならびにストレス応答、低酸素症、代謝性および呼吸性アシドーシスの後遺症はすべて、肺血管収縮に有利である付加的不均衡の一因となりうる。ＣＰＢと関連する急性肺傷害の顕在化の多くは、内皮機能障害によって完全または部分的に説明をつけることができ、これによって、考えられる統一的な仮説と潜在的な治療ターゲットが直ちに提示される。ＣＰＢと関連する急性肺傷害は、重要な有害心臓後遺症をもたらす場合もある。ＣＨＤの手術後の炎症応答は、異常な心室−血管相互作用、全身性血管収縮および後負荷の上昇、ならびに収縮期および拡張期機能の障害を伴う心筋傷害と一般に関連付けられる。一定割合の患者において、こうした血行力学の顕在化は、少ない心拍出量という深刻な帰結につながりかねない。Shekerdemian（２００９年）Heart９５巻（１５号）：１２８６〜１２９６頁。
【００８９】
肺傷害の重度の後遺症は、転帰にとって臨床上重要である。こうした後遺症は、集中治療室滞在（intensive  care  stay）の長期化、および死の危険因子である。肺血管緊張の不安定性は、ＣＨＤの手術後の新生児および乳児においては一般的である。これは、術前の制限のない肺流量（大きい中隔欠損、共通動脈幹（common  arterial  trunk））または肺静脈高血圧（閉塞性異常肺静脈ドレナージ（obstructed  anomalous  pulmonary  venous  drainage））を有する患者における両室修復後に最も問題となりうる。肺血管抵抗の不安定性は、ノーウッド型手術、全身から肺への動脈短絡、または肺動脈絞扼を始めとする、機能的な単心室循環を有する患者における対症的な手術の後にも一般的である。多くの治療介入では、心筋および全身の脈管構造に対するその直接の影響によって、全身への酸素送達が最適化されるが、肺血管緊張の操作も、心疾患の手術を受ける小児の循環の最適化において重要な役割を果たしうる。Shekerdemian（２００９年）Heart９５巻（１５号）：１２８６〜１２９６頁。
【００９０】
シトルリンは、その作用機序により、心肺バイパスによって誘発される肺傷害の後遺症を発症するリスクを低減し、したがって、先天性心臓欠陥の手術を受ける小児患者の術後回復にプラスの影響を及ぼすための予防的な処置として企図される。
【００９１】
先天性心臓欠陥を含む心臓欠陥として、限定はしないが、過剰な肺血流と関連する心臓欠陥が挙げられる。心臓欠陥は、心房中隔欠損、たとえば、大きい心房中隔欠損である場合がある。心臓欠陥は、心室中隔欠損、たとえば、非限定的な大きい心室中隔欠損（ＶＳＤ）である場合がある。心臓欠陥は、単心室病変である場合がある。単心室病変は、グレンおよびフォンタン法によって修復され得る。心臓欠陥は、大動脈弁狭窄（ＡＶＳ）、心房中隔欠損（ＡＳＤ）、大動脈縮窄（ＣｏＡ）、完全房室管欠損（ＣＡＶＣ）、ｄ−大血管転位、エブスタイン奇形、Ｉ−大血管転位、動脈管開存（ＰＤＡ）、肺動脈弁狭窄、単心室欠損、ファロー四徴症、総肺静脈還流異常（ＴＡＰＶＣ）、総動脈幹症、または心室中隔欠損（ＶＳＤ）である場合がある。患者は、新生児、若年、青年、または成人である場合がある。
シトルリンとアルギニンは、機序および効果が異なる
【００９２】
アルギニンとシトルリンは、両方とも尿素回路の産物であるが、回路における段階が異なる。窒素を浄化する細胞中では、アルギニンは、アルギナーゼによって尿素にプロセシングされるが、一酸化窒素を産生する細胞中では、アルギニンは、一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）によるプロセシングを受けて、一酸化窒素とシトルリンを生じる。細胞外のアルギニンは、血管内皮細胞における刺激によるまたは刺激によらない一酸化窒素産生を有意に増加させることにおいて有効でない。Surdackiら、Wien  Klin  Wochenschr.（１９９４年）１０６巻（１６号）：５２１〜６頁も参照されたい。対照的に、シトルリンは、ＮＯ産生の強力な刺激因子である。
【００９３】
図２３は、作用物質（agent）なし（陰性対照）、アルギニン、シトルリン、およびヒスタミン（陽性対照）に曝したヒト血管内皮細胞による一酸化窒素の産生を測定する実験を示すものである。これらの作用物質を、アセチルコリンで刺激した培養ヒト血管内皮細胞に投与した。一酸化窒素の測定は、Ｓｅｉｖｅｒの硝酸／亜硝酸系によって行った。実験は、アルギニンが、ヒト血管内皮細胞による一酸化窒素の産生に対して効果を示さないことをはっきりと証明している。内皮細胞に直接適用されたアルギニンは、非常に高い濃度（１０ｍＭ）でさえ、ＮＯ産生の増加の徴候をほとんど示さない。一方、内皮細胞にシトルリンを細胞外から加えると、こうした細胞によるＮＯの産生は増加する。さらに、本発明者らは、シトルリンの（ＳＮＡＴ１輸送体を介した）輸送を遮断すると、正常および低酸素条件下での一酸化窒素産生が有意に減少することも見出した。
【００９４】
この所見は、ある程度は、関与する酵素が複合体を形成し、シトルリンだけしか入ることのできない基質トンネルを生じることに起因する。基質のチャネリングを超えても、アルギニンの細胞への輸送は不十分である。これは、アルギニンが全細胞系において一酸化窒素産生の直接のエフェクターとして作用しないアルギニンパラドックスの根底にある原理である。たとえば、Summarら、Mol.Genet.Metab.２００４年；８１巻、補遺１：Ｓ１２〜９頁を参照されたい。
【００９５】
シトルリンは、生理的条件下では、飽和レベルのアルギニンの存在下でさえ、一酸化窒素（ＮＯ）産生を刺激しうる。さらに、細胞外シトルリンは、細胞内アルギニンレベルに影響を及ぼさない。したがって、ＮＯ産生は、実際には、外因性のアルギニン供給ではなく、内部中間体としてのアルギニノコハク酸およびアルギニンとの酵素複合体に入る、尿素回路によって産生または再利用されるシトルリンの使用に左右される。Dioguardi（２０１１年）J  Nutrigenet  Nutrigenomics４巻：９０〜９８頁。
【００９６】
アルギニン分子とシトルリン分子は、たとえば、一酸化窒素の産生の点で異なる。シトルリンによって、新規タンパク質産生などの役割を始めとする、身体におけるアルギニンの役割のすべてを代用することができると考えるための証拠または理由は存在しない。アルギニンとシトルリンは、生物学的同等物ではない。
【００９７】
アルギニンは、一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）が、副産物のシトルリンを伴って一酸化窒素（ＮＯ）を生成するための基質である。シトルリンは、シトルリン−ＮＯ回路を構成するアルギニノコハク酸合成酵素（arginiosuccinic  synthetase）（ＡＳＳ）およびアルギニノコハク酸リアーゼ（arginiosuccinic  lysase）（ＡＳＬ）によって再びアルギニンに戻って再利用される。アルギニンは、この回路の酵素によってインサイチュで産生され、アルギニンの細胞外および外因性供給源によって、アルギニン欠乏は補充されない。たとえば、Erezら（２０１１年）Nature  Medicine１７巻（１２号）：１６１９〜１６２６頁を参照されたい。さらに、ｅＮＯＳは、酵素二量体を形成し、（活性）二量体形態のままでいるには十分なアルギニンが必要である。Ｅｒｅｚが指摘しているとおり、シトルリンには、アルギニンのインサイチュの産生が必要であり、アルギニンの外因性供給源は、ＮＯＳがＮＯ産生のために必要とするアルギニンを提供するのに不十分である。低酸素状態の間のように、アルギニンレベルが低下すると、二量体は、脱共役し、フリーラジカル酸素と  ペルオキシナイトライトを産生し始める。高レベルの循環シトルリンによって、組織における酸化的損傷に対するいくらかの保護を提供することが実証されている。たとえば、GrisafiらLung（２０１２年）１９０巻（４号）：４１９〜３０頁を参照されたい。
【００９８】
本発明者らは、生理系における外因性アルギニンは、ＮＯ産生を増加させないことを見出した。たとえば、Chin-Dustingら、J.  Am.  Coll.  Cardiol：２７巻（５号）：１２０７〜１２１３頁（１９９６年）を参照されたい。心肺手術およびその後の術後期間中のように、アルギニンレベルが低下すると、ＮＯＳ二量体、すなわち酵素は、脱共役し、フリーラジカル酸素ラジカル（Ｏ●）を産生し始める。加えて、ＮＡＤＰＨオキシダーゼなどの、ｅＮＯＳ以外の酵素供給源から、スーパーオキシド産生が増加することもありうる。Liuら、Am  J  Physiol  Lung  Cell  Mol  Physiol（２００６年）２９０巻：Ｌ２〜Ｌ１０頁。この過剰なスーパーオキシド産生は、ＮＯと直接に相互作用して、その局所産生を減少させる可能性がある。この場合に、妥当な血漿シトルリンレベルを維持することで、ｅＮＯＳ酵素を二量体として維持するのに十分なＮＯ産生、および酸素ラジカルの産生を防ぐことが可能になる。
シトルリンは、血液濾過および透析によって意図せずに除去され得る。
【００９９】
先天性心手術を受ける小児の大規模前向き観察研究において、血漿シトルリンおよびアルギニンレベルは、手術後に有意に低下し、４８時間までの間、術前のベースラインレベルに戻らなかった。
【０１００】
肺血管緊張（ＰＶＴ）の増大は、先天性心手術を受ける小児において、術前には重症肺動脈高血圧の重大なリスクがあると考えられなかった患者についてでさえ、周術期の重要な問題となりうる。経口および静脈内シトルリンが、先天性心臓欠陥の修復を受ける乳児および小児において、有害な副作用なしに十分に耐容性があったことを示す、臨床的安全性および薬物動態研究を行った。後続のシトルリンの小規模無作為化プラセボ対照試験では、シトルリンが、有害事象なしに十分に耐容性があったが、しかし、一部の患者では、心肺バイパスの間に行われた血液濾過および透析中に重大なシトルリンの除去が起こっていたことが明らかになった。ＰＶＴ増大の潜在的な遺伝的危険因子についての以前の研究では、主要な尿素回路酵素であるカルバミルリン酸合成酵素１の重要な多型の遺伝子型（ＣＰＳＩ  Ｔ１４０５Ｎ）が、先天性心臓欠陥の外科的修復を受ける乳児および小児、ならびに術後肺高血圧（ＰＰＨＮ）のリスクのある新生児における肺血管緊張増大のリスクに影響を及ぼすことが言及された。加えて、多型遺伝子型にかかわらず、すべての患者に、シトルリンおよびアルギニンを始めとする主要な尿素回路中間体の血漿レベルの有意な低下があったことが言及された。こうした関連付けに促されて、本発明者らは、シトルリンの周術期の補充を研究するに至った。
【０１０１】
最初の補充試験では、心肺バイパスの前、手術直後、および手術後に４８時間継続して１２時間毎に、経口シトルリンを１．９ｇ／ｋｇの用量で利用した。経口シトルリンは、重大な有害事象（全身性低血圧など）のエビデンスなしに十分に耐容性があった。加えて、１２時間の血漿シトルリンレベルが３７ｕｍｏｌ／Ｌ（正常レベルの上限）を超えていた患者は、ＰＶＴの増加を生じなかったことも示された。
【０１０２】
残念なことに、経口シトルリンを与えられるすべての患者が、こうしたレベルに達したわけではない。こうした発見は、静脈内シトルリンでの後続の研究の設計において役立った。１００μｍｏｌ／Ｌ程度の持続的血漿レベルを目標とする用量漸増研究において、本発明者らは、静脈内シトルリンが、かなり短い半減期を有することを確認した。この問題に対処するために、本発明者らは、組合せのボーラスおよび持続注入薬物送達プロトコールを開発した。手術冒頭の１５０ｍｇ／ｋｇのボーラスに続く、手術から４時間後の９ｍｇ／ｋｇ／時間の持続注入からなる組み合わせプロトコールによって、およそ１００μｍｏｌ／Ｌの持続的血漿シトルリンレベルが得られた。有害な副作用は確認されなかった。
【０１０３】
ヴァンダービルト大では、７７人の患者が、このプロトコールで処置を受けていた。この研究は、より大規模な多施設無作為化プラセボ対照試験に備えて中止された。こうした７７人の患者からのデータを分析すると、シトルリンが与えられた大多数は、主として、以前は知られていなかった、心肺バイパスの間に行われる濾過および血液濃縮によるシトルリンの除去のせいで、約１００μｍｏｌ／Ｌの治療的持続性目標血漿シトルリンレベル（therapeutic  sustained  target  plasma  citrulline  level）に達していなかったことが明らかになった。
シトルリンと心肺バイパス
【０１０４】
周術期のシトルリン静脈内補充によって、術後血漿アルギニンレベルが増加し、ｅＮＯＳの脱共役が回避される結果、心肺バイパスによって誘発される傷害の後遺症は減少する。本発明者らは、心肺バイパス（ＣＰＢ）の開始時に、１５０ｍｇ／ｋｇの静脈内シトルリンボーラスを投与し、心肺バイパス中に利用される濾過または血液濃縮置換液に、２００μｍｏｌ／Ｌの濃度でＬ−シトルリンを加え、ＣＰＢカニューレ抜管から３０分後の２０ｍｇ／ｋｇのシトルリンボーラスの後直ちに、４８時間にわたる９ｍｇ／ｋｇ／時間の持続注入を開始することを含む、手術中および手術後に肺血管緊張を維持するための改良されたプロトコールを開発した。一酸化窒素（ＮＯ）吸入は、他の療法のほとんどと同じく、療法を開始できる前に、まず第１に、患者が心肺バイパスの呼吸器合併症を発症している必要がある、リアクティブ療法である。これは、心肺バイパスによって誘発される肺傷害の後遺症の発症を予防すると思われるシトルリンとは著しく対照的である。
【０１０５】
この修正されたプロトコールは、治療的な持続血漿シトルリンレベルを、心肺バイパスの開始から、手術の間ずっと、および手術後約４８時間までの間、約１００〜２００μｍｏｌ／Ｌの目標閾値より高く維持するように設計されている。
【０１０６】
シトルリンには、別個の静脈内アクセスの必要がない。シトルリン製剤は、等張性であり、末梢静脈内または中心静脈カテーテルのいずれかによって送ることができる。シトルリンは、アミノ酸であり、したがって、互換性の目的で、非経口栄養のように扱ってもよい。加えて、シトルリンは、心肺バイパス中に濾過または血液濃縮に使用される流体と適合する。
【０１０７】
図３を参照して、例示的な流れ図は、手術中および手術後に患者にシトルリンを投与することを含む、妥当な血漿シトルリンレベルを維持する方法を示している。
【０１０８】
図３に関して、術前段階の間には、１５０ｍｇ／ｋｇのシトルリンボーラスを患者に投与することができる１００。手術の間には、手術中に利用される濾過または血液濃縮置換液に、シトルリンを２００μｍｏｌ／Ｌの濃度で投与することができる２００。術後段階の間には、２０ｍｇ／ｋｇのシトルリンボーラスを投与することができ３００、続いて、９ｍｇ／ｋｇ／時間の持続注入を４８時間かけて行うことができる４００。
シトルリン製剤
【０１０９】
シトルリン（２−アミノ−５−（カルバモイルアミノ）ペンタン酸）［Ｃ６Ｈ１３Ｎ３Ｏ３］は、アミノ酸である。静脈内投与用のシトルリン溶液は、当該技術で公知の方法によって製造することができる。たとえば、Kakimotoら（１９７１年）Appl  Microbiol２２巻（６号）：９９２〜９９９頁を参照されたい。
使用方法
【０１１０】
シトルリンは、外科的手順の前に投与してよい。適切な投薬は、心肺バイパスの開始時における１５０ｍｇ／ｋｇの静脈内シトルリンボーラスを含んでよい。シトルリンは、外科的手順の間に投与してよい。適切な投薬は、心肺バイパス中に利用される濾過および血液濃縮液への、シトルリンの２００μｍｏｌ／Ｌの濃度での添加であり得る。シトルリンは、外科的手順の後に投与してよい。心肺バイパスからのカニューレ抜管から３０分後の２０ｍｇ／ｋｇのシトルリンボーラスの後直ちに、４８時間にわたる９ｍｇ／ｋｇ／時間の持続注入。本明細書に記載する方法を使用して、患者の血漿シトルリンレベルを約３７μｍｏｌ／Ｌより高く維持することができる。濾過または血液濃縮置換液は、シトルリンが２００μｍｏｌ／Ｌのシトルリン濃度になるように加えられている標準液、たとえば、Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ（登録商標）（非発熱性滅菌等張液）として提供され得る。用量は、麻酔が導入された後に配置される中心静脈内カテーテルによって、またはバイパス回路を介して与えてよい。
【０１１１】
シトルリンは、血漿シトルリンレベルを維持するために、静脈内経路によって患者に注入してよい。手術中の血漿シトルリンの妥当な供給を維持するためのプロトコールは、心肺バイパス（ＣＰＢ）の開始時に、静脈内シトルリンボーラス（たとえば、１５０ｍｇ／ｋｇ）の投与、手術中、必要に応じて、心肺バイパス中に利用される濾過または血液濃縮置換液への、シトルリンの（たとえば、２００μｍｏｌ／Ｌの濃度での）添加、ＣＰＢカニューレ抜管から３０分後のシトルリンボーラス（たとえば、２０ｍｇ／ｋｇ）の後直ちに、４８時間にわたる持続注入（たとえば、９ｍｇ／ｋｇ／時間）を開始することを含み得る。
【０１１２】
心肺バイパス（ＣＰＢ）開始時の静脈内シトルリンボーラスは、約１００〜３００ｍｇ／ｋｇであってよい。心肺バイパス（ＣＰＢ）開始時の静脈内シトルリンボーラスは、約１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、または３００ｍｇ／ｋｇであってよい。好ましい一形態では、心肺バイパス（ＣＰＢ）開始時の静脈内シトルリンボーラスは、約１５０ｍｇ／ｋｇであり得る。
【０１１３】
シトルリンは、必要に応じて心肺バイパスを含む手術中に利用される濾過または血液濃縮置換液に、約１００〜３００μｍｏｌ／Ｌの濃度で加えてよい。シトルリンは、手術中、必要に応じて、心肺バイパス中に利用される濾過または血液濃縮置換液に、約１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、または３００μｍｏｌ／Ｌの濃度で加えてよい。好ましい一形態では、シトルリンは、手術中、必要に応じて、心肺バイパス中に利用される濾過または血液濃縮置換液に、約２００μｍｏｌ／Ｌの濃度で加えてよい。たとえば、手術の経過中終始約２００μｍｏｌ／Ｌのシトルリン濃度を維持するために、手術中に加えられるまたは除去されるいかなる流体も考慮に入れなければならない。
【０１１４】
カニューレ抜管、通常は心肺バイパスから３０分後に投与されるシトルリンボーラスは、約１０〜３０ｍｇ／ｋｇであってよい。約１０、１５、２０、２５、または３０ｍｇ／ｋｇのシトルリンボーラスが、心肺バイパスを終えた後すぐに、通常は、カニューレ抜管から約３０分後に投与してよい。好ましい一形態では、約２０ｍｇ／ｋｇのシトルリンボーラスが、心肺バイパス後のカニューレ抜管から通常は３０分後に投与してよい。
【０１１５】
持続注入は、約５〜１５ｍｇ／ｋｇ／時間のシトルリン、すなわち、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５ｍｇ／ｋｇ／時間のシトルリンでなされ得る。持続注入は、約９ｍｇ／ｋｇ／時間のシトルリンでなされ得る。
【０１１６】
シトルリンは、約５〜１５ｇ／ｋｇ、すなわち、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５ｇ／ｋｇのシトルリンという投与量で経口投与してよい。シトルリンの経口投与量は、約９ｇ／ｋｇのシトルリンであってよい。
【０１１７】
血漿シトルリンの目標レベルは、約３７μｍｏｌ／Ｌ〜２．５ｍＭで維持され得る。たとえば、患者の血漿シトルリンレベルは、約３７、４０、４５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、または３００μｍｏｌ／Ｌより高く維持され得る。患者の血漿シトルリンレベルは、約３７、１００、または２００μｍｏｌ／Ｌより高く維持され得る。本明細書に記載する方法を使用して、患者の血漿シトルリンレベルを、約３７μｍｏｌ／Ｌ〜２００μｍｏｌ／Ｌ、１００μｍｏｌ／Ｌ〜１ｍＭ／Ｌ、１５０μｍｏｌ／Ｌ〜５００μｍｏｌ／Ｌの間のシトルリンに保つことができる。
【０１１８】
シトルリンは、用量単位形態で提供され得る。たとえば、シトルリンは、注射用に製剤された３００ｍｇの滅菌シトルリンを含有する容器に入って提供され得る。使用するには、これを、６ｍＬの滅菌水を使用して復元し、およそ５．９ｍＬの欧州薬局方０．９％滅菌ＮａＣｌ溶液でさらに希釈して、総体積を１２ｍＬ、濃度を３００ｍｇ／１２ｍＬ（すなわち、２５ｍｇ／ｍＬ）とすることができる。シトルリンは、１０〜４０ｍｇ／ｍＬ、たとえば、１０、１５、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、または４０ｍｇ／ｍＬの濃度で注射用に製剤することができる。シトルリンは、滅菌水１０ｍＬ中に注射用滅菌シトルリン５００ｍｇの薬物製品として提供され得る。これは、欧州薬局方０．９％塩化ナトリウムを使用して、患者への注入に使用することができる。
【０１１９】
一実施形態では、手術当日、患者に、１５０ｍｇ／ｋｇのシトルリンボーラスが投与され、濾過および血液濃縮液には、シトルリンが２００μｍｏｌ／Ｌで加えられる。手術から約３０分後、２０ｍｇ／ｋｇのシトルリンボーラスが投与され、ボーラスの後（たとえば、ボーラスの投与後５〜１０分以内、好ましくは、ボーラスの投与直後に）、９ｍｇ／ｋｇ／時間でのシトルリンの持続静脈内注入が開始され、６〜４８時間、好ましくは、４８時間維持される。
【０１２０】
たとえば、心肺バイパス（ＣＰＢ）の開始時に、１５０ｍｇ／ｋｇのＬ−シトルリンボーラスを投与することができ、ＣＰＢ中に利用される濾過および血液濃縮液には、２００μｍｏｌ／Ｌの濃度でシトルリンが加えられ、ＣＰＢからのカニューレ抜管から３０分後に、２０ｍｇ／ｋｇのＬ−シトルリンボーラスを投与した後直ちに、９ｍｇ／ｋｇ／時間でのＬ−シトルリンの持続注入を４８時間行うことができる。用量は、麻酔が導入された後に据え付け得る中心静脈内カテーテルによって、またはバイパス回路を介して投与することができる。この薬物投与には、別個の静脈内アクセスの必要がない。シトルリンは、等張性であり、末梢静脈内または中心静脈カテーテルのいずれかによって送ることができる。シトルリン（Ｌ−シトルリン）は、アミノ酸であり、したがって、互換性の目的で、薬物製品は、非経口栄養のように扱われる。加えて、シトルリンは、ＣＰＢ中に濾過または血液濃縮に使用される流体と適合する。
術後パラメーター
【０１２１】
静脈内シトルリンで処置された患者の臨床転帰は、術後の機械的換気の必要性および期間、心エコー図による術後ＰＶＴ発生率の増加、血清クレアチニンおよび肝臓酵素レベル、変力物質スコア、胸腔チューブドレナージの期間および体積、ＩＣＵ滞在の期間、入院の期間、および／または生存率によって評価することができる。
【０１２２】
術後の機械的換気：術後の侵襲的な機械的換気の継続期間は、心肺バイパスからの分離から気管内抜管までの時間単位の所要時間（the  time  in  hours）である。術後の侵襲的な機械的換気に費やされる時間の減少は、肯定的な術後転帰である。
【０１２３】
心エコー図による術後ＰＶＴ発生率の増加：ＰＶＴの増加は、右室（ＲＶ）圧が全身動脈圧の１／２より大きいことであると定義される。術後ＰＶＴが対照群に比べて変化しないままである場合、これは、肯定的な術後転帰である。
【０１２４】
血清クレアチニンおよび肝臓酵素：血清電解質、クレアチニン、およびＣＢＣレベルは、ＰＣＣＵへの入院からＰＣＣＵ退院まで毎日記録することができる。加えて、肝臓酵素は、ベースライン、２４時間、および２８日／退院期間の間に取得することができる。血清電解質、クレアチニン、およびＣＢＣレベルが対照群に匹敵する場合、これは、肯定的な術後転帰となる。
【０１２５】
変力物質スコア：変力物質用量は、次のスコア記入システムを使用して、ＰＣＣＵ入院時から術後にかけてモニターすべきである。
ドーパミン（ｍｃｇ／ｋｇ／分）×１
＋ドブタミン（ｍｃｇ／ｋｇ／分）×１
＋ミルリノン（ｍｃｇ／ｋｇ／分）×１０
＋エピネフリン（アドレナリン）（ｍｃｇ／ｋｇ／分）×１００
＋フェニレフリン（ｍｃｇ／ｋｇ／分）×１００
＋ノルエピネフリン（ノルアドレナリン）（ｍｃｇ／ｋｇ／分）×１００
＝合計変力物質スコア
たとえば、Hoffmanら、Circulation（２００３年）１０７巻：９９６〜１００２頁を参照されたい。変力物質スコアの減少は、肯定的な術後転帰となる。
【０１２６】
胸腔チューブ使用期間：外科チームによって胸腔チューブが中止される前の、時間単位の合計術後期間および胸腔チューブドレナージのｃｃ単位の合計容量を記録することができる。胸腔チューブドレナージの術後期間および／または合計体積が、比較群に比べて減少すれば、肯定的な術後転帰となる。
【０１２７】
集中治療室（ＩＣＵ）滞在期間：ＩＣＵ滞在期間は、（１）患者に、非ＩＣＵ区域に移せる状態になっていると医師チームが許可を与えるまで、ＩＣＵまたはＩＣＵステップダウンベッドで過ごした合計術後日数として、および（２）患者が、機械式人工呼吸器または継続的な静脈内変力物質もしくは血管拡張薬補助のいずれかを必要とした合計術後時間数としての２つの方法で算出され得る。これらいずれかの尺度によるＩＣＵ滞在期間の短縮は、肯定的な術後転帰となる。
【０１２８】
入院期間：入院期間は、病院を退院するまでの合計術後日数として算出することができる。入院期間の短縮は、肯定的な術後転帰となる。
【０１２９】
生存：術後２８日の生存と、病院を退院して家に戻る生存の両方を記録することができる。手術から２８日後の生存の増加は、肯定的な術後転帰となる。
【０１３０】
血行力学的改善：心拍数、全身動脈血圧、Ｏ２飽和度、ＣＶＰ、およびＰＡＰを含む血行力学的データは、血漿シトルリンレベルの低下によりｅＮＯＳが脱共役される結果としての、心肺バイパスによって誘発される肺傷害の重症度または発生率の指標としてモニターすることができる。
【０１３１】
加えて、血行力学的改善および術後肺血管緊張（ＰＶＴ）は、患者の状態の改善、たとえば、血漿シトルリンレベルの低下によりｅＮＯＳが脱共役される結果としての心肺バイパスによって誘発される肺傷害の重症度または発生率が低減していること、の指標として使用することができる。脂質過酸化（perodixation）最終産物およびタンパク質カルボニル基は、酸化的損傷の尺度として使用することができる。さらに、尿を始めとする体液中の過酸化水素を使用して、酸化的損傷を検出することもできる。たとえば、HalliwellおよびWhiteman  British  Journal  of  Pharmacology（２００４年）１４２巻：２３１〜２５５頁を参照されたい。
【０１３２】
本発明者らは、驚いたことに、静脈内シトルリン送達によって、先天性心臓欠陥の修復を受ける小児対象における機械的換気および変力療法の術後の必要の減少によって証明されるとおり、心肺バイパスによって誘発される肺傷害の後遺症が緩和されることを発見した。
【０１３３】
たとえば、シトルリンが与えられた患者では、プラセボが与えられた患者に比べて、機械的換気の継続期間が短縮され、心拍出量を補助するための変力物質の使用期間が短縮され、血管作動性薬物療法併用による処置の継続期間が短縮され、全般的な呼吸器補助の必要が少なくなった。本明細書に記載の方法に従ってシトルリンが与えられた患者は、陽圧換気と変力療法の複合継続期間が、プラセボが与えられた患者より短くなった。本明細書に記載の方法に従ってシトルリンが与えられた患者は、プラセボが与えられた患者より早めに集中治療室（ＩＣＵ）を退院できる状態になっていた。さらに、全体の病院滞在期間も、シトルリンで処置された患者では、プラセボで処置された患者に比べて短かった。
【０１３４】
理解を明確にする目的で、本発明について、説明および例によって多少詳しく述べてきたとはいえ、添付の請求項の範囲内で、ある特定の変更および改変を行ってもよいと理解すべきである。上記の開示を考慮して理解され、または本発明の日常的慣行または履行によって、外科学、生化学、医学、生理学、および／または関連分野の当業者に明白となる、本発明を実施するための上記の形態の改変は、以下の請求項の範囲内にあるものとする。
【０１３５】
本明細書において言及するすべての刊行物（たとえば、非特許文献）、特許、特許出願公開、および特許出願は、本発明が属する分野の当業者の技量のレベルを示すものである。そのようなすべての刊行物（たとえば、非特許文献）、特許、特許出願公開、および特許出願は、個々の各刊行物、特許、特許出願公開、または特許出願について、参照により援用されることが詳細かつ個別に示されたかのように、同じ程度に参照により本明細書に援用される。
【０１３６】
本明細書に含まれる実施例は、説明のためのものであって、いかなる限定の目的もなく提供される。
【実施例】
【０１３７】
（実施例１）
アルギニン、シトルリン、および血漿ニトレートレベルならびにＰＰＨＮのリスク
ＰＰＨＮを発症した新生児は、ＰＰＨＮのない乳児に比べて、アルギニン、シトルリン、および血漿ニトレートレベルが低かった。１０人の新生児において、変法Ｇｒｉｅｓｓ反応を使用して血漿ＮＯ代謝産物（ＮＯｘ）を測定しており、５人がＰＰＨＮ＋であり、５人がＰＰＨＮ−であった。ＰＰＨＮ＋症例の方が、平均ＮＯｘレベルが有意に低かった（ｐ＝０．００６）（図４）。ＰＰＨＮを有する新生児の方が、アミノ酸分析において、血漿アルギニンおよびシトルリンレベルが有意に低かった（図４）。この２群間の他の個々のいかなるアミノ酸のレベルにも有意差はなかった。対象の数が少なすぎたため、ＮＯｘおよびアミノ酸レベルと遺伝子型との間の関係を評価することはできなかった。このデータは、ＰＰＨＮを有する乳児では、尿素回路中間体および産物が減少していることを示している。
（実施例２）
先天性心臓欠陥を矯正するための心肺バイパスを受けた乳児および小児における尿素回路機能
【０１３８】
心臓手術を受けた乳児および小児における術後肺血管緊張の増大および尿素回路機能の状態の有病率を研究した。先天性心臓欠陥を矯正するために６種の特定の外科的手順のうちの１つが必要となった１６９人の乳児および小児を、２０か月間にわたって前向き研究を行った。表１を参照されたい。親の同意を得た後、すべての患者から、手術前に、遺伝子型用に血液を採取し、５つの異なる時点（術前、手術直後、術後１２時間、２４時間、および４８時間）で、アミノ酸分析用に血液を集めた。ステージＩノーウッド（Stage  I  Norwood）を受けた患者を除くすべての患者を、２０ｍｍＨｇを超える平均ＰＡ圧力であると定義される術後肺血管緊張増大（ＰＶＴ＋）についてモニターした。ステージＩノーウッドを受けた乳児は、妥当な全身圧で６０％未満の動脈血飽和度に利用されるＮＯ吸入の臨床的必要があった場合、ＰＶＴ＋であると定義した。
【０１３９】
表２に、６種の手順それぞれについての平均年齢および心肺バイパス曝露の期間を示す。１６９人の患者のうち５６人（３３．１％）に、術後肺血管緊張増大の臨床的証拠が現れた（ＰＶＴ＋）。こうした患者の多くは、鎮静、麻痺、および過換気を含めて、臨床的介入を必要とした。３３人の患者は、ＮＯ吸入によって処置された（ＮＯ＋）。
【表２】
2020503326.tif 000004
【０１４０】
心臓手術を受けた乳児および小児は、術後肺血管緊張の増大および尿素回路機能の状態を示した。
【０１４１】
心肺バイパスが尿素回路機能に及ぼす影響
【０１４２】
心肺バイパスによって尿素回路機能およびＮＯ利用能が低下するかどうかを試験するため、周術期の尿素回路中間体および血漿一酸化窒素代謝産物を分析した。周術期の５時点で、１６９人の患者それぞれから血漿試料を集め、Ｂｅｃｋｍａｎｎ  ７３００アミノ酸分析器（Ｂｅｃｋｍａｎｎ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）を使用する、陽イオン交換クロマトグラフィーによって分析した。アルギニンおよびシトルリンを尿素回路フラックスの一次マーカーとして使用した。Ｇｒｉｅｓｓ変法試薬を用いた比色アッセイを利用して、血漿一酸化窒素代謝産物レベルを、ＮＯ利用能の間接的な尺度として使用し、５４０ｎｍでの吸光度を読み取った。すべての患者に、自身の心臓欠陥を矯正するための心肺バイパスが必要であった。研究集団内では、心肺バイパスによって、すべての術後時点における平均アルギニンレベルが、術前レベルに比べて有意に低下した（図５）。平均シトルリンレベルにおいても同様の低下が認められた（図６Ａ〜Ｂ）。血漿ＮＯ代謝産物レベルも、手術直後には低下したが、１２および２４時間の時点で部分的なリバウンドを示した後、４８時間の時点で術前レベルに戻った（図７）。対照的に、尿素回路に関与しない総アミノ酸に対するバイパス術の影響はなかった。尿素回路に関与しないアミノ酸には影響が及ばなかったため、このデータからは、尿素回路機能およびＮＯ基質合成に対する影響が、手術後約４８時間まで存続しうることが示唆される。
【０１４３】
術後ＰＶＴ増大（ＰＶＴ＋）をその後生じた患者では、ＰＶＴ増大なし（ＰＶＴ−）の患者に比べて、血漿アルギニンレベルの低下が確認された。図８。シトルリンおよびＮＯ代謝産物については、同様の所見が確認されなかった。
【０１４４】
線形回帰を使用したところ、心肺バイパスの期間は、術後時点のいずれにおいても、血漿シトルリンおよびアルギニン、ＮＯ代謝産物レベルに対していかなる影響も示さなかった。
臨床的結果の概要
【０１４５】
この研究は、先天性心臓欠陥の矯正に使用される心肺バイパスによって、尿素回路機能の有意な低下が引き起こされ、一酸化窒素合成の前駆体の利用能も大きく低下することを示している。先天性心臓欠陥の外科的矯正に使用される心肺バイパスによって、尿素回路における一酸化窒素前駆体の利用能、および血漿ＮＯ代謝産物によって間接的に測定される一酸化窒素レベルの、かなり有意な低下が引き起こされた。尿素回路に関与しないアミノ酸には影響が及ばなかったため、尿素回路機能およびＮＯ基質合成に対する影響は、手術後４８時間まで存続しうる。術後肺血管緊張が増大している患者は、正常な緊張の患者より、アルギニンレベルが有意に低下していた。
【０１４６】
別の研究からは、術後肺血管緊張の増大のリスクが、ＣＰＳＩ  Ｔ１４０５Ｎ遺伝子型の影響下にあったことが示された。手術から４８時間後、アルギニンレベルは、ＣＰＳＩ  Ｔ１４０５Ｎ遺伝子型の間で有意に異なっていた。
（実施例３）
静脈内シトルリン補充によって、血漿アルギニンレベルは上昇する
【０１４７】
静脈内シトルリンの安全性および血清アルギニンレベルに対するその効果を、子ブタにおいて評価することを目標とした。目標最小体重が４ｋｇである５〜２１日齢の合計９頭のＤｕｒｏｃブタを利用した。すべての子ブタに、麻酔を導入し、気管開口術を施した。中心線を大腿動脈および大腿静脈に置き、血行力学を継続的にモニターした。シトルリン（静脈内６００ｍｇ／ｋｇ）を５頭の子ブタに投与した。対照動物には食塩水を与えた。シトルリン投与の前、および投与からの各時間後に、血清アミノ酸を採取した。
【０１４８】
血清アルギニンレベルは、静脈内シトルリン投与後１〜２時間の時点でピークに達し、その後３時間ベースラインを上回って維持したままとなり、すべての時点で、対照に比べて有意性が得られた（ｐ＜０．００１）。血行力学的不安定性は観察されなかった。表３〜４を参照されたい。
【表３】
2020503326.tif 000005
【表４】
2020503326.tif 000006
【０１４９】
したがって、シトルリンを静脈内投与すると、血漿シトルリンおよびアルギニンレベルの上昇が持続する。これは、心肺バイパスによって誘発される肺傷害の後遺症の発症を予防することにおいて有益となる。
（実施例４）
先天性心手術を受ける小児における周術期の経口シトルリン補充
【０１５０】
この研究の目的は、吸収を評価し、静脈内シトルリンへの潜在的代替手段としての経口シトルリンの安全性を実証することであった。上で明らかにした５つの外科的診断の１つを有する４０人の患者を無作為化して、プラセボに対して、５用量の経口シトルリン（１．９グラム／ｋｇ）を与えた。１回目の用量は、手術の直前に投与し、２回目の用量は、手術後小児ＩＣＵに到着して直ちに投与し、続いて３回分の用量を１２時間毎に投与した。血漿シトルリンレベルは、シトルリン群において有意に高く（２６μｍｏｌ／Ｌに対して３６μｍｏｌ／Ｌ、ｐ＝０．０１３）、妥当な吸収が証明された。
【表５】
2020503326.tif 000007
【０１５１】
本研究は、術後肺高血圧（ＰＨＴＮ）の発生率への影響を検出するために十分な検出力がなかったが、しかし、血漿シトルリンレベルが３７μｍｏｌ／／Ｌを超える患者は、肺高血圧を発症しなかった。これは、心肺バイパスによって誘発される肺傷害の後遺症の発症を予防することにおいて有益となる。
（実施例５）
手術中のシトルリンの投与
【０１５２】
最初の目標は、特定の先天性心臓欠陥の外科的修復を受ける小児における３種の用量の静脈内シトルリンの安全性および薬物動態を試験することであった。静脈内シトルリン投与には、理論上、全身性動脈低血圧のリスクがあった。平均動脈圧の有害な低下を、ベースラインからの２０パーセントを超える低下であると定義した。ベースラインの術後平均動脈血圧は、術後の投与または注入の施行直前の３０分間に５分毎に集めた平均動脈血圧測定値の平均として算出した。次いで、４８時間の研究期間のいずれかの時点でその２０％の低下に達した場合にアラームを発するよう、ベッドサイドモニターを設定した。
【０１５３】
選択された当初の用量は、先行動物研究からのデータに基づき、２００、４００、および６００ｍｇ／ｋｇであった。当初の研究デザインは、３種の用量およびプラセボ対照を使用する４群研究であった。５人の患者が参加し、データ安全性および監視委員会（ＤＳＭＢ）モニターは、有害作用は確認されなかったものの、これらの用量で得られる血漿レベルが非常に高いことを即座に指摘した。その後、その研究デザインを、５０ｍｇ／ｋｇから始めて用量を５０ｍｇ／ｋｇきざみで漸増させる非盲検用量漸増試験に変更した。各患者に、心肺バイパスの開始後に手術室で１用量と、４時間後に集中治療室で１用量の、２用量を与えた。データを図９Ａ〜Ｃに要約する。
【０１５４】
患者６および８は、５０ｍｇ／ｋｇの静脈内シトルリンが与えられ、ピークシトルリンレベルがおよそ２２０μｍｏｌ／Ｌであり、４時間のトラフレベルが４０μｍｏｌ／Ｌであった。有害な副作用は確認されなかった。このトラフは、８０〜１００μｍｏｌ／Ｌの目標範囲を下回っており、その後用量を増やした。患者９および１０は、１００ｍｇ／ｋｇの静脈内シトルリンが与えられ、ピークシトルリンレベルが３７５μｍｏｌ／Ｌであり、４時間のトラフが５０μｍｏｌ／Ｌであった。ここでも、有害な副作用は確認されなかった。このトラフも、８０〜１００μｍｏｌ／Ｌの目標範囲を下回っており、その後用量を増やした。患者１３〜１６は、１５０ｍｇ／ｋｇの静脈内シトルリンが与えられ、ピークシトルリンレベルが６６０μｍｏｌ／Ｌであり、４時間のトラフが８０μｍｏｌ／Ｌであった。この４時間トラフは、８０〜１００μｍｏｌ／Ｌの目標範囲にあり、これ以上の用量漸増は行わなかった。これら３種の用量のシトルリンの薬物動態プロファイルを図１０に要約する。
【０１５５】
半減期は、およそ８５分になると算出されたが、これは、間欠的投与を進めるには短すぎた。薬物動態モデリング後、その研究デザインを変更して、心肺バイパス時に手術室で投与される１５０ｍｇ／ｋｇのボーラス用量に続き、４時間後に、９ｍｇ／ｋｇ／時間の持続注入を４８時間行うことにした。別の９人の患者が参加した。観察的コホートにおける患者（−静脈内シトルリン）と比較した、研究患者（＋静脈内シトルリン）におけるシトルリンおよびアルギニンの平均血漿レベルを、図１１Ａ〜Ｂに示す。
【０１５６】
１件の重大な有害事象があったが、静脈内シトルリンの使用とは関係がなかった。その患者は、ＡＶＳＤ修復からおよそ８時間後に、全身性低血圧より前に起こったのでない徐脈性停止（bradycardic  arrest）に陥った。この患者は、４８時間の緊急ＥＣＭＯ支援を必要とし、その後完全に回復し、入院２２日目に自宅へと退院した。ＤＳＭＢは、この症例を再調査し、重大な有害事象は、シトルリン投与と関係がないようであると判定した。
【０１５７】
このデータに基づき、静脈内シトルリンが安全であること、および心肺バイパスにおいて手術の冒頭で投与される１５０ｍｇ／ｋｇのボーラスに続き、４時間後に９ｍｇ／ｋｇ／時間の持続注入を行う組合せによって、術後の肺血管緊張および血漿シトルリンの十分な供給を維持できることが確認された。
（実施例６）
先天性心手術を受ける小児における周術期の静脈内Ｌ−シトルリン薬物動態
【０１５８】
静脈内シトルリンの単回ボーラス用量のクリアランスおよび最適な投与頻度を確認するために、５０、１００、および１５０ｍｇ／ｋｇの３種の濃度の静脈内シトルリンを使用する用量漸増設計を利用した。シトルリンの用量は、手術室において、カニューレ挿入および心肺バイパス開始直後に投与した。全体としての目標は、最初の用量から４時間後まで、１００μｍｏｌ／Ｌまたはこれより高い持続シトルリンレベルを実現することであった。４時間の時点は、外科的手順の完了を可能にし、術後、患者がさらなる投薬の前に集中治療室（ＩＣＵ）に戻れるように選択した。複合的なシトルリンデータを図１２に示す。
【０１５９】
このデータから、４時間のレベルが１００μｍｏｌ／Ｌに近くなったため、１５０ｍｇ／ｋｇが最適な用量であることが確認された。静脈内シトルリンのいずれの濃度の投与からも、低血圧を始めとする有害作用はなかった。
【０１６０】
しかし、上のデータから、静脈内シトルリンのボーラス用量の半減期が、およそ６０〜９０分であり、ＩＣＵ環境においてでも実際的でない、少なくとも４時間の投薬が必要となることも明らかになった。薬物動態モデリングから、およそ１００μｍｏｌ／Ｌの持続シトルリンレベルは、心肺バイパスが開始された後に手術の冒頭で投与される１５０ｍｇ／ｋｇのボーラス用量の静脈内シトルリンに続き、４時間後に９ｍｇ／ｋｇ／時間の持続注入を行うことによって実現できることが示唆された。このレジメンのＰＫモデリングを図１３に示す。
【０１６１】
次いで、ＣＰＢの際の手術室での１５０ｍｇ／ｋｇのボーラス用量と、初回ボーラス用量から４時間後にＰＩＣＵにおいて術後に開始される９ｍｇ／ｋｇ／時間の持続注入を組み合わせた、この改訂したプロトコールを使用する患者が登録された。シトルリンデータは、９人の患者から入手可能であり、図１４Ａ〜Ｂに示している。ここには、血漿シトルリンの妥当な供給の維持が示されている。
（実施例７）
静脈内シトルリン研究
【０１６２】
実施した静脈内シトルリン研究は、主要な臨床転帰を、２つの処置群間（シトルリン対プラセボ）の術後の機械的換気の期間、第２には、術後肺高血圧の発生率とした、無作為化プラセボ対照二重盲検研究であった。
【０１６３】
ヴァンダービルト小児病院（Ｖａｎｄｅｒｂｉｌｔ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）において、合計７７人の患者が登録された。患者は、手術スケジュールに基づきスクリーニングされた。このスケジュールに基づき、この研究に含まれる計画された５種の心臓手術の１つを受ける患者をスクリーニングした（ＤＳＭＢの勧告で、ノーウッド手順を受ける患者を今回は除外した）。
【０１６４】
この研究は、より大規模な多施設無作為化プラセボ対照試験に備えて中止された。こうした７７人の患者からのデータを分析すると、シトルリンが与えられた大多数は、主として、心肺バイパス中に行われる血液濾過によるシトルリンの除去のせいで、１００μｍｏｌ／Ｌの治療的持続性目標血漿シトルリンレベルに達していなかったことが明らかになった。こうした血液濾過技術は、研究中に変更されており、研究者らは、こうした変更を承知していなかった。
（実施例８）
心臓手術のためのシトルリン投与のプロトコール
【０１６５】
当初の薬物動態モデルは、閉鎖系を想定していた。手術中に有意な代謝および尿量が存在しない中で、モデルは、当初のシトルリンボーラスによって得られる治療的レベルが、手術の継続期間中維持されるものと想定していた。しかし、研究過程における早期の不明な時点で、潅流手法が変わって、手術の間終始、積極的な限外濾過および晶質交換が組み込まれた。これは、限外濾過によって、循環からシトルリンが効果的に除去された結果、シトルリンレベルを再調査すると、治療的な薬物レベルを達成していた患者が事実上存在しなかったことを意味した。
【０１６６】
限外濾過および晶質置換にもかかわらず治療的なシトルリンレベルを実現し、維持するように設計された、改訂した投薬プロトコールを試験するために、この実施例における研究に着手した。この薬物動態評価項目は、達成されていたようであるが、このデータ提示は、二次的評価項目として評価された有効性パラメーターに注目している。研究には、１１人の等しい数の患者として、それぞれプラセボ群とシトルリン群に無作為化された、２２人の患者が補充された。
結果
【０１６７】
研究過程の早期に、２箇所の参加施設の一方が、すべての患者から、心肺バイパスを中止した後直ちに、手術室において型通りに抜管していたことが認められた。これによって、機械的換気の継続期間を評価項目として使用することが不可能になった。その代わりとして、すべての形態の換気補助の継続期間を可能な評価項目として使用して、事後分析を適用した。図１５は、プラセボ対照群において、人工呼吸器時間の分布が概ね二峰形であり、幾人かの小児が、長時間呼吸補助を受けたままであることを示している。対照的に、シトルリンで処置された小児は、１つのアウトライアーを除き、単峰形の分布を示し、呼吸補助継続期間が短縮された。プラセボ群とシトルリン群間の差に、有意性は得られなかったが、Ｓａｔｔｅｒｔｈｗａｉｔｅ検定を適用すると、強い傾向（strong  trend）が示された。対照的に、図１６に示す分割表分析では、境界線上の有意性が得られた。全体として、結果は、強い傾向を表していると考えられる。
【表６】
2020503326.tif 000008
【０１６８】
心血管パラメーターからは、さらなる識見が得られる。図１７は、シトルリン患者が、予想外に、特にＩＣＵ入院後１５〜１８時間以降、著しくより良好な変力物質スコアを示したことを示している。収縮期血圧は、シトルリン群において、バイパス術中止からおよそ２０時間後に始まる緩やかな一過性の上昇を示したが、拡張期圧は、２群間で本質的に同一であった。図１８Ａ。平均動脈圧は、シトルリン群において、図１８Ｂにおいて示されるとおり、収縮期圧の変化を反映する、わずかな一過性の上昇を示した。収縮期血圧上昇および動脈圧上昇の一過性の性質を考えると、収縮期血圧の上昇によって、変力物質が必要になる可能性は予想されるよりも低いことが示唆される。
【０１６９】
全呼吸補助の継続期間は、先天性心臓手術修復の合併症となる急性肺高血圧を予防するためのシトルリンの研究にとって、実行可能な評価項目であるようである。血行力学的パラメーターに対する有害作用は認められなかった。
（実施例９）
シトルリン製剤
【０１７０】
滅菌シトルリンは、アルギニンの細菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）発酵に続く分離および抽出ステップからなる工程を利用して、まず非滅菌バルク粉末として製造することができる。次いで、非滅菌バルク粉末を復元し、内毒素低減および滅菌濾過ステップに続いて、無菌環境中での結晶化、乾燥、および微粒子化にかける。次いで、滅菌バルク粉末を、「原料」としてガラスバイアルへの無菌充填に使用して、使用前に滅菌希釈剤で復元される最終薬物製品が製造される。
【０１７１】
注射用シトルリンの各滅菌バイアルは、約３００ｍｇの滅菌シトルリン粉末を含有してよい。各バイアルは、６ｍＬのＵＳＰ注射用滅菌水で復元することができ、約５．９ｍＬのＵＳＰ０．９％塩化ナトリウムでさらに希釈して、１２ｍＬの体積、かつ３００ｍｇ／１２ｍＬ＝２５ｍｇ／１ｍＬの濃度に等しいものが作られる。典型的な患者注入物は、約２５ｍｇ／ｍＬの濃度で投与される、０．９％塩化ナトリウムＵＳＰ中のものであり得る。
（実施例１０）
先天性心臓欠陥の外科的修復のために心肺バイパス（ＣＰＢ）を受ける小児および乳児への静脈内Ｌ−シトルリン投与の薬物動態（ＰＫ）および安全性
【０１７２】
先天性心臓欠陥の外科的修復のために心肺バイパス（ＣＰＢ）を受ける小児および乳児への静脈内Ｌ−シトルリン投与の薬物動態（ＰＫ）および安全性を確認するために、多施設フェーズＩＢ単盲検無作為化プラセボ対照研究を実施した。
【０１７３】
研究の主たる目標は、心房中隔欠損（ＡＳＤ）および／または心室中隔欠損（ＶＳＤ）または部分的もしくは完全な房室中隔欠損（ＡＶＳＤ）の外科的修復を受ける小児における経過観察の間に、周術期に与えられる静脈内（ＩＶ）Ｌ−シトルリン送達の改訂したプロトコールによって、シトルリンが投与される群において１００μｍｏｌ／Ｌを超える血漿シトルリンレベルが実現されたかどうかを確認すること、およびそれをプラセボ群におけるシトルリンレベルと比較することであった。
【０１７４】
安全性目標は、シトルリンの安全性プロファイルをさらに分析することであり、二次的な目標は、術後の臨床転帰に対するシトルリンの影響を確立することであった。
【０１７５】
２２人の患者が登録し、処置を受けた。患者は、ＣＰＢの開始時に始める固定投薬プロトコールに従って、術後４８時間まで、または動脈ラインの除去まで、研究薬物またはプラセボの注入を受けた。研究への参加は、退院時または２８日目のどちらか先に訪れる時点で終了した。投薬レジメンは、長期の血液濾過にもかかわらず血漿シトルリンレベルが維持されるように設計された。
【０１７６】
２２人の患者が登録され、処置を受けた。ＣＰＢの開始時に、患者に１５０ｍｇ／ｋｇの静脈内シトルリンボーラスまたはプラセボを与えたのに続き、ＣＰＢ中に使用される濾過または血液濃縮置換液に、２００μｍｏｌ／Ｌの濃度のＬ−シトルリンまたはプラセボを加えた。ＣＰＢからのカニューレ抜管から３０分後に２０ｍｇ／ｋｇのシトルリンボーラスを投与したのに続き、直ちに、９ｍｇ／ｋｇ／時間のシトルリンまたはプラセボの持続注入を４８時間行った。研究への参加は、退院時または２８日目のどちらか先に訪れる時点で終了した。
【０１７７】
血漿シトルリン濃度レベルを一次ＰＫ変数とし、これらを、周術期の７時点において集めた血液試料で評価した。二次ＰＫ変数を、同じ試料セットにおけるアルギニンおよび一酸化窒素（ＮＯ）代謝産物の濃度とした。ＰＫ値を群間で比較した。
【０１７８】
ＣＰＢの開始時に、対象に１５０ｍｇ／ｋｇの静脈内シトルリンボーラスまたはプラセボを与えたのに続き、ＣＰＢ中に使用される濾過または血液濃縮置換液に、２００μｍｏｌ／Ｌの濃度のＬ−シトルリンまたはプラセボを加えた。ＣＰＢからのカニューレ抜管から３０分後に２０ｍｇ／ｋｇのシトルリンボーラスを投与したのに続き、直ちに、９ｍｇ／ｋｇ／時間のシトルリンまたはプラセボの持続注入を４８時間行った。
【０１７９】
主要な安全性評価には、年齢別制限（age-specific  limit）を使用して臨床上有意な低血圧を同定するための血行力学的モニタリングを含めた。有害事象情報を集め、術後の出血を記録した。
【０１８０】
さらなる安全性評価、検査室評価、および臨床評価をベースラインから退院まで行い、二次的な臨床変数に、術後の機械的換気、全呼吸補助の継続期間、血行力学的改善、心エコー図による術後ＰＶＴ、血清クレアチニンおよび肝臓酵素、変力物質スコア、胸腔チューブ使用期間、集中治療室滞在期間、入院期間、および生存を含めた。
【０１８１】
研究結果の分析は、現在最終段階にあるが、すべての品質管理が完了していないわけではなく、このことは、以下のデータに軽微な変更が加えられる可能性があることを意味する。
【０１８２】
やはり、以下で詳述する分析では、こうしたパラメーターそれぞれの長い方の継続期間から構成される複合的な変数を、集中治療室での滞在期間の代理手段として使用することがどちらかというと好ましいということが示された。ＩＣＵ滞在の実際の継続期間は、とりわけ、時刻やベッドの利用可能性などの、無関係の変数による影響を受ける場合があるというのがこの、この好ましさの理由である。研究薬物が与えられた患者は、プラセボが与えられた患者より、機械的換気および変力療法の複合的な継続期間が短かった。すなわち、複合的な代理手段マーカー変数によって評価されるとおり、研究薬物が与えられた患者は、プラセボが与えられた患者より早めに、ＩＣＵから退院できる状態になっていた。図１９において下方に示されるとおり、改訂した投薬プロトコールによって、１００μｍｏｌ／Ｌの目標レベルを一貫して上回る血漿シトルリンレベルが実現された。図２０において示されるとおり、シトルリンが与えられた患者では、機械的換気の継続期間が短縮された。
【０１８３】
機械的換気に関しては、現場間で、臨床診療に一部の差が確認された。一方の現場では、患者の抜管を、手術室において、そのような患者の抜管時間を記録せずに行う傾向があった。分析の目的で、そうした患者については、術後の機械的換気の継続期間をゼロに設定した。こうした患者を処置によって層別化すると、プラセボ群では６人のうち２人の患者（３３％）だけであったのに比べて、静脈内Ｌ−シトルリンが与えられた６人全員の患者（１００％）が、手術室で抜管されていたことが示された。
【０１８４】
機械的換気の時間の長さと同様に、変力療法の継続期間でも、図２１において示されるとおり、２つの処置群間に著しい差が示された。
【０１８５】
図２１において、データは、変力物質の使用開始時間と終了時間の間の時間として定義される。最初に測定されたスコアより前のすべての欠落または０の合計変力物質スコアは、０に設定され、したがって、変力物質に支えられているとはみなされない。ドーパミン、ドブタミン、ミルリノン、エピネフリン、フェニレフリン、およびノルエピネフリンに基づいて算出される合計変力物質スコアが考慮に入れられる。変力物質を使用していない患者の変力物質依存時間の長さは、０時間に設定される（打ち切りにしない）。
【０１８６】
以前に言及したとおり、機械的換気の中止および変力療法の中止は、集中治療室を出られる状態になっていたことの２つの主な決定要因である。（各対象について）２つのパラメーター、すなわち、機械的換気または変力療法の継続期間の長い方から構成される複合的な変数は、集中治療室滞在期間の有効かつ正確な代理手段となりうる。図２２は、シトルリン群とプラセボ群を比較する場合の複合的な変数の差を示すものである。研究薬物が与えられた患者は、プラセボが与えられた患者より、機械的換気および変力療法の複合的な継続期間が短かった。すなわち、複合的な代理手段マーカー変数によって評価されるとおり、研究薬物が与えられた患者は、プラセボが与えられた患者より早めに、ＰＩＣＵから退院できる状態になっていた。より短いＰＩＣＵ時間が示されることに加えて、機械的換気時間がより短いと、身体的な傷害の副次的リスクも低くなる。
【０１８７】
この研究では、目標とされる血漿シトルリンレベルを実現することに加えて、２２人の対象からなる小さい群における処置群と対照群間で、機械的換気および変力療法の継続期間に、シトルリン処置依存的な差を示す、統計的に有意およびほぼ有意な結果も得られた。
【０１８８】
術後の侵襲的な機械的換気の継続期間は、心肺バイパスからの分離から気管内抜管までの時間による期間として得られた。抜管後２４時間以内に患者に再挿管が必要となった場合、主分析では、再挿管時間を追加した。副分析には、再挿管時間を含めなかった。
【０１８９】
再挿管時間を含めて、侵襲的な機械的換気の平均継続期間は、シトルリン処置群よりプラセボ群において明らかに長く、シトルリン処置患者には、平均で５時間の侵襲的換気しか必要でなかったが、プラセボ処置患者では３７時間が必要であった（表８）。この差には、十中八九、プラセボ群における継続時間のばらつきが大きいことから、分散分析検定で統計的有意性が得られなかった。しかし、再挿管時間を除外すると、群間の差は依然として著しく、分散分析で統計的有意性が得られた（ｐ＝０．０３１７）。ウィルコクソンの順位和検定によって、両方の分析についての統計的有意性が示された。
【０１９０】
陽圧換気および変力療法の中止は、集中治療室を出られる状態になっていたことの２つの主な決定要因である。まとめると、これらは、陽圧換気補助または変力療法の継続期間の長い方から構成される複合的な変数として、集中治療室滞在期間の有効な代理手段として働きうる。この後者の変数は、ベッドの利用可能性の欠如など、集中治療室滞在期間を偶発的に延長する場合がある、交絡因子の影響を受け易い。
【０１９１】
要約すると、この研究からのデータは、施行された投薬レジメンによって薬物動態評価項目が達成されたことを示している。さらに、研究の試料サイズにもかかわらず、この研究では、機械的換気および変力療法の継続期間について、処置群と対照群間に、シトルリンに有利な、明らかな処置依存的な差が実証された。結果は、複合的な変数として組み合わせると、集中治療室を退院する時間について、シトルリンの臨床的に意義のある治療有効性を示している。したがって、この研究の結果から、静脈内シトルリン投与が、心肺バイパスによって誘発される肺傷害の臨床的な後遺症を予防することにおいて有益な役割を果たしうることが示される。
（実施例１０Ａ）
薬物動態分析
【０１９２】
ＣＰＢ手順の間および後のシトルリン濃度レベルは、この研究における目的のＰＫパラメーターであった。静脈内シトルリンで処置された患者における目標レベルは、ＣＰＢ直後の経過観察期間の間、１００μｍｏｌ／Ｌを超える血漿シトルリンレベルであった。血漿血収集は、周術期の７時点、すなわち、手術前のベースライン時、ＣＰＢ中（ボーラス１後）、ならびに０時間（ボーラス２前）、６時間、１２時間、２４時間、および４８時間の時点の手術／ＣＰＢ後に行った。
【０１９３】
各々の時点における平均およびメジアンシトルリン濃度を、表７において処置群ごとに要約する。データが入手可能であるすべての試料採取時間にわたって、シトルリン処置群における平均シトルリン濃度が、指定の１００μｍｏｌ／Ｌという下限を超えていたのに対し、プラセボ群における平均シトルリン濃度は、分析したすべての時点で、この閾値を下回っていた。注目されるのは、シトルリン群における高い平均ベースライン値（２００．９μｍｏｌ／Ｌ）である。この群における１人の患者（０２−００４）が、１９１９μｍｏｌ／Ｌのベースラインシトルリンレベルを、すなわち、静脈内シトルリン処置前に示した。なぜベースラインシトルリンレベルがこの患者でそれほど高かったのかについて、入手可能な情報は存在しない。入手可能なデータは、ベースライン試料が、シトルリンでの最初の処置より前に採取されたことを示している。この群の他のすべての患者におけるベースラインシトルリン値は、それより著しく低く、８〜４２μｍｏｌ／Ｌの範囲にあった。
【表７】
2020503326.tif 000009
【０１９４】
したがって、経時的なシトルリン濃度の変化を示すには、メジアンシトルリン値の方が適切である。術後と比較した、ＣＰＢ手順中およびベースライン時のメジアンシトルリン値を、図１９においてグラフで示す。シトルリン処置群におけるメジアンシトルリンレベルが、プラセボ群と比較して著しく上昇したことを、すべてのＣＰＢ後経過観察時点で認めることができる。
【０１９５】
シトルリン処置群において採取された（ベースライン試料を除く）合計５９の試料のうち５つだけが、１００μｍｏｌ／Ｌ以下の血漿シトルリンレベルを示した（表８）。比較すると、プラセボ処置患者から採取されたすべての試料において、シトルリンレベルは１００μｍｏｌ／Ｌ以下であった。シトルリン濃度のこの差は、統計的有意性が高かった（ｐ＝０．０００６）。
【表８】
2020503326.tif 000010
【０１９６】
シトルリンは、アルギニンと一酸化窒素の前駆体である。試料採取時点それぞれにおけるアルギニン値および一酸化窒素値の概要を表９に示す。
【表９】
2020503326.tif 000011
【０１９７】
メジアン値は、図２４Ａおよび図２４Ｂにもグラフで示している。シトルリンと異なり、シトルリン処置患者における血漿アルギニンは、最初のシトルリンボーラスの直後には、わずかしか上昇しなかった。アルギニンレベルのこの上昇の遅れは、おそらく、シトルリンがアルギニンの合成に利用可能になるのに必要となった時間を反映している。その結果として、ボーラス２前の時点では、シトルリン処置患者において、プラセボ処置患者と比較して顕著なアルギニンの上昇が示される。手術後、シトルリン群におけるアルギニンレベルは、６０μｍｏｌ／Ｌ付近で上昇したままであったが、プラセボ群では約３０μｍｏｌ／Ｌに低下した。
【０１９８】
血漿一酸化窒素レベルは、処置群それぞれにおいて、試料採取時点にわたって、程度の差はあるが変化しないままであった。この結果は、一酸化窒素の産生が局所的な現象であるため、意外ではないといえる。シトルリンを加えると、局所的な厳格に調節されたＮＯ産生が改善されることが予想されるが、しかし、増加は、モル基準では血流中に現れないことはほぼ確実である。
（実施例１０Ｂ）
術後の侵襲的な機械的換気
【０１９９】
術後の侵襲的な機械的換気の継続期間は、心肺バイパスからの分離から気管内抜管までの時間による期間として得られた。抜管後２４時間以内に患者に再挿管が必要となった場合、主分析では、再挿管時間を追加した。副分析には、再挿管時間を含めなかった。
【０２００】
プラセボ群における１人の患者だけに、再挿管が必要となった。この患者（０２−０１１）は、ＣＰＢの終了後４日目に最初に抜管されたが、翌日再挿管され、さらに６日間挿管されたままとなった。
【０２０１】
再挿管時間を含めて、侵襲的な機械的換気の平均継続期間は、シトルリン処置群よりプラセボ群において明らかに長く、シトルリン処置患者には、平均で５時間の侵襲的換気しか必要でなかったが、プラセボ処置群では３７時間が必要であった（表１０）。この差には、十中八九、プラセボ群における継続時間のばらつきが大きいことから、分散分析検定で統計的有意性が得られなかった。しかし、再挿管時間を除外すると、群間の差は依然として著しく、分散分析で統計的有意性が得られた（ｐ＝０．０３１７）。ウィルコクソンの順位和検定によって、両方の分析についての統計的有意性が示された。
【表１０】
2020503326.tif 000012
【０２０２】
カプラン・マイヤー生存分析によって、シトルリン群において、侵襲的な機械的換気の継続期間がプラセボ群に比べて短縮されたことが確認された。図２５Ａ〜Ｂは、２つの処置群についての機械的換気の継続期間を、再挿管時間を含めて示すものである。現場０２では、患者の抜管を手術室（ＯＲ）において行う傾向があり、そうした患者について抜管の時間を一般に記録していなかった。興味深いことに、現場０２においてＯＲで抜管された８人の患者のうち６人がシトルリン処置を受けており、プラセボが与えられていたのは２人だけであった。最初の分析では、こうした患者についての術後の機械的換気の継続期間をゼロに設定し、換気時間がゼロであるすべての患者を打ち切りにした（図２５Ａ）。副分析では、換気時間がゼロである患者を打ち切りにしなかった（図２５Ｂ）。両方の分析において、ログランク検定に基づいて、処置群間の統計的有意差が示された（それぞれ、ｐ＝０．０４９８およびｐ＝０．００８９）。
【０２０３】
１人の患者における再挿管時間を除外した、侵襲的な機械的換気の継続期間についてのカプラン・マイヤー曲線を、図２６Ａ〜Ｂに示す。結果によって、シトルリンがプラセボ処置に優っていることが確認され、両方の分析において、シトルリンに有利な統計的有意性が示された。
（実施例１０Ｃ）
全呼吸補助
【０２０４】
全呼吸補助の分析は、研究期間中に必要となった、侵襲的および非侵襲的ないずれの呼吸補助も含む。シトルリン処置群における呼吸補助の平均合計継続期間は、プラセボ処置群における継続期間の半分より短く、その差は、統計的に有意であった（表１１）。
【表１１】
2020503326.tif 000013
【０２０５】
シトルリンがプラセボ処置に優っていることを確認するカプラン・マイヤー生存プロットを、すべての患者（打ち切りなし）について、また打ち切りにされた呼吸補助なしの患者について、図２７Ａ〜Ｂに示す。
（実施例１０Ｄ）
変力物質依存時間の長さおよび変力物質スコア
【０２０６】
静脈内変力物質依存時間の長さは、手術後に最初に使用した時間から、４８時間の時点で研究薬物療法が完了するまで記録に残され、すなわち、変力物質使用期間は、この分析においては最長４８時間であった。手術後４８時間目で依然として変力物質が与えられていた患者は、打ち切りとした。静脈内（ＩＶ）変力物質の平均使用期間は、シトルリン群において、プラセボ群より明らかに短かった（表１２）。しかし、処置間の差について、統計的有意性は得られなかった。
【表１２】
2020503326.tif 000014
【０２０７】
静脈内（ＩＶ）変力物質依存時間の長さについての生存分析プロットを、図２８Ａ〜Ｂに示す。主カプラン・マイヤー分析では、４８時間目で依然として変力物質を使用している患者を打ち切りとしたが、追加の打ち切りは適用しなかった（図２７Ａ）。副分析では、変力物質使用なし、すなわち、変力物質時間＝０の患者も打ち切りとした（図２７Ｂ）。両方の分析において、シトルリン群とプラセボ群間で、変力物質使用期間に著しい差が示された。シトルリン処置がプラセボ処置に優っていることは、いかなる追加の打ち切りもない主分析において、統計的に有意であった（ｐ＝０．０３５１、ログランク検定）。
【０２０８】
第３のカプラン・マイヤー分析は、静脈内変力物質使用期間がゼロである患者を省いて行った。結果は、時間＝０を打ち切りとした集団全体についての結果と同一であった。術後のすべての静脈内（ＩＶ）変力物質の使用を集約する合計変力物質スコアは、シトルリン群において、プラセボ群に比べて著しく低かった（表１３）。変力物質スコアの差は、分析した全手術後時間にかけて明白であった（図２９）。合計変力物質スコアに基づく、変力物質使用におけるシトルリンの優位性は、反復測定分散分析において統計的に有意であった（ｐ＝０．０４３８）。
【表１３】
2020503326.tif 000015
（実施例１０Ｅ）
血管作動性薬物療法
【０２０９】
ニトログリセリン、ニトロプルシド、およびバソプレシンを含む血管作動性薬物療法依存合計時間数を、手術の終わりから、血管作動性薬物療法の中止または研究薬物療法の終了（４８時間目）のどちらかが先に生じる時点まで算出した。表１４では、シトルリン処置群とプラセボ処置群について、血管作動性薬物療法依存時間の長さが比較される。併用血管作動性処置の全体としての継続期間は、シトルリン処置患者の方がプラセボ処置患者より短かったが、その差は、統計的に有意でなかった。合計血管作動性スコアについても、同様の結果が示されている。しかし、図３０において示されるとおり、シトルリンが与えられた患者が示した血管作動性薬物療法の合計継続期間は、実際に、より短かった。
【表１４】
2020503326.tif 000016
（実施例１０Ｆ）
ＩＣＵ滞在期間
【０２１０】
ＩＣＵ滞在期間は、ＩＣＵで過ごした合計術後時間数として１回、患者に術後の機械式人工呼吸器または継続的な静脈内変力物質もしくは血管拡張薬補助が必要となった合計術後時間数として１回分析した。後者のパラメーターの組合せは、ＩＣＵ滞在の別の代理手段評価項目を表わす。
【０２１１】
どちらの定義を使用しても、プラセボで処置した患者では、シトルリンで処置した患者より、ＩＣＵ滞在期間が明らかに長かった（表１５）。プラセボ群における１人の患者について、再挿管の時間を除外しても、シトルリン処置患者におけるＩＣＵ滞在期間は、プラセボ処置患者の期間の約半分程度の長さでしかなかった。処置間の差の統計的有意性が、ウィルコクソン検定において示された。
【表１５】
2020503326.tif 000017
【０２１２】
最長継続期間の定義に従う、合計ＰＩＣＵ滞在期間ならびにＩＣＵ滞在期間のカプラン・マイヤープロットを、図３１および図３２Ａ〜Ｂに示す。特に、ＩＣＵ滞在の最長継続期間定義の生存分析によって、シトルリンがプラセボに優ることが確認され、両方の分析において統計的有意性が示された。
（実施例１０Ｇ）
複合評価項目
【０２１３】
陽圧換気および変力療法の中止は、集中治療室を出られる状態になっていたことの２つの主な決定要因である。これらを複合的な変数として組み合わせると、ＩＣＵ滞在期間についての追加の有効な代理手段評価項目として働く。
【０２１４】
複合評価項目は、陽圧換気補助または変力療法の継続期間の長い方を含むものとした。変力物質使用は、手術後４８時間目（研究薬物療法処置の終わり）までしか記録が残されなかったため、４８時間目まで変力物質使用が続けられ、機械的換気継続期間が４８時間以下である患者を、この時点で打ち切りとした。機械的換気が４８時間の時点を超えて継続された場合、機械的換気のその継続時間を分析において使用した。
【０２１５】
表１６に、追加の機械的換気のために再挿管を必要としたプラセボ群における１人の患者についての再挿管時間を含めるおよび除外する複合評価項目についての結果を要約する。侵襲的な機械的換気と変力物質要求の組合せについても、シトルリンがプラセボ処置に比べて明らかに優っていた。処置間の差は、ウィルコクソンの順位和検定において統計的に有意であった。
【表１６】
2020503326.tif 000018
【０２１６】
再挿管時間を含めたおよび除外したこの複合評価項目のカプラン・マイヤープロットを図３３に示す。両方の分析において、変力物質使用が４８時間の時点でもなお続いており、機械的換気が４８時間未満である患者を打ち切りとした。両方の分析において、シトルリン処置患者には、プラセボ処置患者より統計的に有意に少ない機械的換気または変力物質しか必要とならなかった。
（実施例１０Ｈ）
入院期間
【０２１７】
入院期間は、病院を退院するまでの合計術後日数として算出した。平均入院期間は、シトルリンの方がプラセボ処置群より短かったが、しかし、その差は統計的に有意でなかった（表１７）。
【表１７】
2020503326.tif 000019
実施例１０Ａ〜１０Ｈについての薬物動態および臨床転帰
【０２１８】
実施例１０Ａ〜１０ＨにおけるＰＫおよび臨床転帰分析の結果は、統計的に有意な結果を示し、または本明細書に記載のプロトコールを使用して、血漿シトルリンレベルを維持し、その結果として、心肺バイパス肺傷害の発生率および重症度を低減できることを裏付ける強い傾向として示された。本明細書に記載の方法によって、シトルリンが与えられた患者において１００μｍｏｌ／Ｌを超える目標血漿シトルリンレベルが実現された。機械的換気の継続期間は、シトルリンが与えられた患者において、プラセボが与えられた患者に比べて短縮された。心拍出量を補助するための変力物質の使用期間は、シトルリンが与えられた患者において、プラセボが与えられた患者に比べて短縮された。併用血管作動性薬物療法を伴う処置の全体としての継続期間は、シトルリン処置患者の方がプラセボ処置患者より短かった。全般的な呼吸補助の必要は、シトルリン処置群では、プラセボ処置群に比べて低かった。研究薬物が与えられた患者は、プラセボが与えられた患者より、陽圧換気および変力療法の複合的な継続期間が短かいことが示された。すなわち、複合的な代理手段マーカー変数によって評価されるとおり、シトルリンが与えられた患者は、プラセボが与えられた患者より早めに、ＩＣＵから退院できる状態になっていた。これは、ＩＣＵ滞在期間の分析、ならびに機械的換気、静脈内変力物質使用、または血管拡張薬使用の最長継続期間の分析においても示された。同様に、全体の入院期間も、シトルリン処置患者では、プラセボ処置患者に比べて短かった。
【０２１９】
周術期に与えられる静脈内Ｌ−シトルリン送達の施行を含む本明細書に記載の方法によって、心房中隔欠損（ＡＳＤ）および／または心室中隔欠損（ＶＳＤ）または部分的もしくは完全な房室中隔欠損（ＡＶＳＤ）の外科的修復を受けている小児における経過観察の間に、１００μｍｏｌ／Ｌを超える血漿シトルリンレベルを実現する。加えて、シトルリン処置によって、予想外にＰＶＴが低下し、その結果として、先天性心臓病変の外科的修復と関連する術後の侵襲的な機械的換気の延長の必要が低減される。
【０２２０】
結果は、投与された用量（ボーラスおよび注入）の静脈内シトルリンによって、目標レベルを上回る高い血漿シトルリンレベルの持続が実現されたことを示している。分析したすべての試料採取時点にわたって、シトルリン処置群における平均シトルリン濃度が、指定の１００μｍｏｌ／Ｌという下限を超えていたのに対し、プラセボ群における平均シトルリン濃度は、分析したすべての時点で、この閾値を下回っていた。シトルリン濃度が目標レベルを上回った試料の数の差には、シトルリン処置に有利な高い統計的有意性（ｐ＝０．０００６）があった。
【０２２１】
本明細書に記載の方法に従ってシトルリンが与えられた患者は、機械的換気と変力療法の複合的な継続期間も、プラセボが与えられた患者より短かいことが示された。すなわち、複合的な代理手段マーカー変数によって評価されるとおり、研究薬物が与えられた患者は、プラセボが与えられた患者より早めに、ＩＣＵを退院できる状態になっていた。
【０２２２】
一酸化窒素（ＮＯ）のレベルは、シトルリンまたはプラセボ処置の間、著しくは変化しなかった。この発見は、一酸化窒素の産生が非常に局所的であることによって説明をつけることができる。シトルリン処置は、局所的な厳格に調節されたＮＯ産生を改善することが予想されるが、血流中でのＮＯの変化は記録できない可能性がある。
【０２２３】
研究において収集された安全性データから、Ｌ−シトルリン投与が安全であり、この処置において、予想外のＡＥおよび／またはＳＡＥが起こらないことが示された。シトルリン群のすべての患者（１００％）およびプラセボ群の患者の７３％が、処置中に出現したＡＥを少なくとも１回経験した。シトルリンで処置された患者において、最も頻繁なＡＥは、胸水（３６％）、頻呼吸（２７％）、高血圧（２７％）、および低血圧（２７％）であった。プラセボ群における最も頻繁なＡＥは、胸水（４５％）、高血圧（３６％）、結節調律（２７％）、および嘔吐（２７％）であった。死に至ったＡＥ、ＳＡＥ、および中止につながったＡＥは、報告されなかった。
【０２２４】
胸腔チューブドレナージの長さおよび体積から示されるとおり、術後出血には、２つの処置群間で差がなかった。研究処置は、安全性の理由で調査された検査室パラメーターの大部分に対して、明らかな影響を有さなかった。処置開始後２４時間までに、ＡＳＴレベルならびに総ビリルビン濃度が、両方の処置群において少なくとも２倍になったが、平均ＡＬＫＰレベル。ＢＵＮは、プラセボ群では安定したままであったが、シトルリン群では、ベースラインから２日目にかけて増加した（ｐ＝０．０１１１）。
【０２２５】
心拍数は、プラセボ群において、一貫してシトルリン群より高かった。酸素飽和度または全身動脈血圧に対して、処置が及ぼす注目すべき影響はなかった。全体として、この研究の結果は、本明細書に記載の方法に従うシトルリンの静脈内投与が、手術中にｅＮＯＳ酵素の脱共役を防ぐことにより、ＣＰＢによって誘発される肺傷害の臨床的後遺症を予防することにおいて、有益な役割を果たしうることを示している。
【０２２６】
前述の本発明について、この好ましい実施形態に関連して記載してきたが、本発明は、それによって限定されず、以下の請求項の範囲によってのみ限定される。
【図１】
2020503326.tif 000020
【図２】
2020503326.tif 000021
【図３】
2020503326.tif 000022
【図４】
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【図５】
2020503326.tif 000024
【図６】
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【図７】
2020503326.tif 000026
【図８】
2020503326.tif 000027
【図９】
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【図１０】
2020503326.tif 000029
【図１１】
2020503326.tif 000030
【図１２】
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【図１３】
2020503326.tif 000032
【図１４】
2020503326.tif 000033
【図１５】
2020503326.tif 000034
【図１６】
2020503326.tif 000035
【図１７】
2020503326.tif 000036
【図１８】
2020503326.tif 000037
【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
2020503326.tif 000041
【図２３】
2020503326.tif 000042
【図２４】
2020503326.tif 000043
【図２５】
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【図２６】
2020503326.tif 000045
【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
2020503326.tif 000049
【図３１】
2020503326.tif 000050
【図３２】
2020503326.tif 000051
【図３３】
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【国際調査報告】
2020503326.tif 000053
2020503326.tif 000054