(57)【要約】  本発明は、光学顕微鏡（４０）での使用に供される細胞培養装置（１）に関し、細胞培養装置（１）は、顕微鏡（４０）の対物レンズ（４１）の正面の顕微鏡（４０）のステージに載置されるように構成されたハウジング（１０）であって、ハウジング（１０）は、ハウジング（１０）の内部空間（１１）を閉囲する、ハウジング（１０）と、生きた生体細胞を含む細胞培養（ＣＣ）の収容に供される内部空間（２０）を閉囲する着脱可能なフローチャンバ（２）と、フローチャンバ（２）を通して誘導される上記の液体培地（Ｍ）を加熱する、ハウジング（１０）の内部空間（１１）内に配置されたヒータ（３）と、上記のヒータ（３）を介して上記の液体培地（Ｍ）をフローチャンバ（２）に向けて誘導する、ハウジング（１０）の内部空間（１１）内に配置された第１のフロー経路（Ｐ１）、及び上記の液体培地（Ｍ）をフローチャンバ（２）から遠ざかるほうへ誘導する、ハウジング（１０）の内部空間（１１）内に配置された第２のフロー経路（Ｐ２）と、フローチャンバ（２）がハウジング（１０）の内部空間（１１）に挿入されると、上記の液体培地（Ｍ）を、第１のフロー経路（Ｐ１）を通してフローチャンバ（２）の内部空間（２０）内へ、そして第２のフロー経路（Ｐ２）を通してフローチャンバ（２）の内部空間（２０）外へポンプ輸送するポンプ（４）とを備える。
2020518290.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光学顕微鏡での使用に供される細胞培養装置（１）であって、
光学顕微鏡の対物レンズの正面の前記光学顕微鏡のステージに載置されるように構成されたハウジング（１０）であって、前記ハウジングは前記ハウジング（１０）の内部空間（１１）を閉囲し、前記ハウジング（１０）は、さらに、窓（１３）を有する天壁（１２）と、対向する底壁（１４）とを有する、ハウジング（１０）と、
生きた生体細胞を含む細胞培養（ＣＣ）の収容に供される内部空間（２０）を閉囲する着脱可能なフローチャンバ（２）であって、前記フローチャンバ（２）は、前記フローチャンバ（２）内に前記細胞培養を配置するために、前記ハウジング（１０）の前記内部空間（１１）に挿入されるように、及び前記ハウジング（１０）から取り外されるように、構成されており、前記フローチャンバ（２）は、さらに、前記フローチャンバ（２）の前記内部空間（２０）を通して液体培地（Ｍ）のフローを、前記液体培地（Ｍ）が前記細胞培養（ＣＣ）に接触して前記細胞培養（ＣＣ）に沿って流れることができるように誘導する構成であり、前記フローチャンバ（２）は、さらに、前記フローチャンバ（２）の前記内部空間（２０）内に配置された前記細胞培養（ＣＣ）の観察に供される第１の透明壁領域及び第２の透明壁領域（２１，２２）を有し、前記フローチャンバ（２）が前記ハウジング（１０）の前記内部空間（１１）に挿入されると、前記透明壁領域（２１，２２）が前記窓（１３）に対向する、フローチャンバ（２）と、
前記液体培地（Ｍ）を、前記フローチャンバ（２）を通して誘導されるように加熱する、前記ハウジング（１０）の前記内部空間（１１）内に配置されたヒータ（３）と、
前記ヒータ（３）を介して前記液体培地（Ｍ）を前記フローチャンバ（２）に向けて誘導する、前記ハウジング（１０）の前記内部空間（１１）内に配置された第１のフロー経路（Ｐ１）、及び前記液体培地（Ｍ）を前記フローチャンバ（２）から遠ざかるほうへ誘導する、前記ハウジング（２）の前記内部空間（１１）内に配置された第２のフロー経路（Ｐ２）と、
前記フローチャンバ（２）が前記ハウジング（１０）の前記内部空間（１１）に挿入されると、前記液体培地（Ｍ）を、前記第１のフロー経路（Ｐ１）を通して前記フローチャンバ（２）の前記内部空間（２０）内へ、そして前記第２のフロー経路（Ｐ２）を通して前記フローチャンバ（２）の前記内部空間（２０）外へポンプ輸送するポンプ（４）とを備える、細胞培養装置。
【請求項２】
前記細胞培養装置（１）は、さらに、前記ハウジング（１０）の前記内部空間（１１）内に配置された温度センサ（５）を備え、前記温度センサ（５）は、前記第１のフロー経路（Ｐ１）を通して誘導された前記液体培地（Ｍ）と熱接触して前記液体培地（Ｍ）の前記温度を測定するようになっていることを特徴とする、請求項１に記載の細胞培養装置。
【請求項３】
前記細胞培養装置（１）は、さらに、前記温度センサ（５）で測定された前記液体培地（Ｍ）の前記温度の実際の値が前記液体培地（Ｍ）の前記温度の所望の値に近付くように前記ヒータ（３）を制御するように構成された制御ユニット（６）を備えることを特徴とする、請求項１又は２に記載の細胞培養装置。
【請求項４】
前記細胞培養装置（１）は、さらに、前記液体培地（Ｍ）のフローレートを判定するフローセンサ（７）を備えることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
【請求項５】
前記制御ユニット（６）は、前記フローセンサ（７）で測定された前記液体培地の前記フローレートの実際の値が前記液体培地（Ｍ）の前記フローレートの所望の値に近付くように前記ポンプ（４）を制御するように構成されていることを特徴とする、請求項３又は４に記載の細胞培養装置。
【請求項６】
前記ポンプ（４）は前記ハウジング（１０）の前記内部空間（１１）内に配置されている、又は前記ポンプ（４）は前記ハウジング（１０）の前記内部空間（１１）外に配置されている外部のポンプであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
【請求項７】
前記ハウジング（１０）は、前記フローチャンバ（２）を前記ハウジング（１０）の前記内部空間（１１）に挿入するための凹部（１５）を備えることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
【請求項８】
前記ハウジング（１０）は、前記天壁（１２）を前記ハウジング（１０）の前記底壁（１４）に接続している側壁（１６）を備え、前記凹部（１５）は、前記ハウジング（１０）の前記底壁（１４）及び前記側壁（１６）の中に形成されていることを特徴とする、請求項７に記載の細胞培養装置。
【請求項９】
前記フローチャンバ（２）は、前記フローチャンバ（２）を前記ハウジング（１０）の前記内部空間（１１）に挿入するために前記凹部（１５）内へ摺動させるように構成されており、かつ前記ハウジング（１０）の前記内部空間（１１）から前記フローチャンバ（２）を取り外すために前記凹部（１５）外へ摺動させるように構成されていることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
【請求項１０】
前記フローチャンバ（２）は、少なくとも２つのガイドレール（２３）を含み、前記ガイドレール（２３）は、それぞれ、前記フローチャンバ（２）を前記凹部（１５）内へ、及び前記凹部（１５）外へ摺動させるときに前記フローチャンバ（２）を誘導する、前記ハウジング（１０）内に形成された関連する溝（１７）に係合するように構成されていることを特徴とする、請求項７〜９のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
【請求項１１】
前記フローチャンバ（２）は、前記フローチャンバ（２）の本体（２６）にヒンジ留めされているドア（２４）を有し、前記フローチャンバ（２）の前記本体（２６）は、前記フローチャンバ（２）の前記内部空間（２０）を形成する、内部に形成された凹部（２０）を有し、特に、前記ドア（２４）は前記第１の透明壁領域（２１）を有し、特に、前記フローチャンバ（２）の前記本体（２６）は、前記第２の透明壁領域（２２）を有し、又は形成し、特に、前記フローチャンバ（２）が前記ハウジング（１０）の前記内部空間（１１）に挿入されると、前記ドア（２４）は、前記ハウジング（１０）の前記底面（１４）と同一面上にあることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
【請求項１２】
前記フローチャンバ（２）は、前記フローチャンバ（２）内に前記液体培地（Ｍ）を注入するための取入れポート（２００）と、前記フローチャンバ（２）から前記液体培地（Ｍ）を放出するための取出しポート（２０１）とを有することを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
【請求項１３】
前記フローチャンバ（２）は、前記取入れポート（２００）及び前記取出しポート（２０１）を前向きにして前記凹部（１５）内へ摺動させるように構成されており、これにより、前記取入れポート（２００）が前記第１のフロー経路（Ｐ１）のコネクタ（２０４）に係合すると共に前記取出しポート（２０１）が前記第２のフロー経路（Ｐ２）のコネクタ（２０５）に係合し、前記フローチャンバ（２）が前記ハウジング（１０）の前記内部空間（１１）に挿入されると、前記取入れポート（２００）と前記第１のフロー経路（Ｐ１）との間と前記取出しポート（２０１）と前記第２のフロー経路（Ｐ２）との間とのフロー接続が確立されることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
【請求項１４】
前記ハウジングの高さ（Ｈ）は２５ｍｍ以下であり、及び／又は幅（Ｂ）は１６０ｍｍ以下であり、及び／又は深さ（Ｄ）は１１０ｍｍ以下であることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
【請求項１５】
前記細胞培養装置（１）は、前記液体培地（Ｍ）から気相の泡を除去する構成である気泡トラップ（５０）を備えることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
【請求項１６】
前記気泡トラップ（５０）は第１の容積及び第２の容積（５１，５２）を有し、前記第１の容積と前記第２の容積と（５１，５２）は、前記液体培地（Ｍ）に対して非透過性であるが前記気相には透過性である半透過膜（５３）によって離隔されていることを特徴とする、請求項１５に記載の細胞培養装置。
【請求項１７】
前記第１の容積（５１）は前記第１のフロー経路（Ｐ１）の部分を形成することを特徴とする、請求項１６に記載の細胞培養装置。
【請求項１８】
前記第１の容積（５１）は、前記ヒータ（３）の取出し口（３４）に接続された取入れ口（５１ａ）を含み、及び／又は前記第１の容積（５１）は、前記コネクタ（２０４）に接続された取出し口（５１ｂ）を含むことを特徴とする、請求項１３及び１７に記載の細胞培養装置。
【請求項１９】
前記第２の容積（５２）は前記第１の容積（５１）よりも小さいことを特徴とする、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
【請求項２０】
前記第２の容積（５２）は、前記第１の容積（５１）よりも小さい圧力を有することを特徴とする、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
【請求項２１】
前記気泡トラップ（５０）の前記第２の容積（５２）は、前記気泡トラップ（５０）から前記気相を除去するための取出し口（５２ａ）を含むことを特徴とする、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の細胞培養装置（１）と顕微鏡（４０）とを使用して細胞培養（ＣＣ）を観察する方法であって、前記フローチャンバ（２）内に細胞培養（ＣＣ）を配置し、前記フローチャンバ（２）を前記細胞培養装置（１）の前記ハウジング（１０）の前記内部空間（１１）に挿入し、特に、前記細胞培養装置（１）の前記ハウジング（１０）を、前記顕微鏡（４０）の対物レンズ（４１）の正面の前記顕微鏡（４０）のステージ（４３）上に配置する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
体外の生きた細胞を使用する研究は、実験条件が、実験対象となる体外系の実験条件に類似するという仮定に依存している。
【０００３】
この仮定は、明らかなことであるが、調査対象となる現象に関連する全ての実験パラメータについて当てはまらなければならない。
【０００４】
内皮細胞などの、これらの細胞のいくつかについて、それらの細胞の適切な機能が機械的刺激に依存することが示されている。これらの細胞を研究するには、体外モデルが、体温及び代謝などの基本的条件を再現するのみならず、信頼できるデータを生成するために機械的要因を再現することも必要である。これを行うために、細胞を、フローチャンバ、フローセル、パーフージョンセル、又はバイオリアクタと称する装置内に配置し、ポンプシステム、典型的には蠕動ポンプによって生成されるフローにさらす。機械的刺激のレベルは、せん断応力、歪み、及び圧力として表現され、フローチャンバのフローレート又はディメンジョンを調整することによって変化させる。
【０００５】
しかしながら、光学顕微鏡を使用する観察にこのような細胞培養を用意することは、特に、細胞培養を別の細胞培養に取り換えたいとき、及び／又は細胞培養を観察のために顕微鏡に移すことが必要であるときに、面倒な作業であることが多い。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記に基づき、本発明の根底をなす課題は、前述した類の細胞培養を容易かつ効率的に観察することを可能にする、改善された細胞培養を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この課題は、請求項１の特徴を有する細胞培養装置によって解決される。好ましい実施形態が、下位請求項で述べられ、以下に記載される。
【０００８】
請求項１によれば、光学顕微鏡での使用に供される細胞培養装置であって、
特に、光学顕微鏡の対物レンズの下方及び／又は上方の（すなわち顕微鏡の光路における）光学顕微鏡のステージに載置されるように構成されたハウジングであって、ハウジングはハウジングの内部空間を閉囲し、ハウジングは、さらに、窓を有する天壁と、天壁に対向する底壁とを有する、ハウジングと、
生きた生体細胞を含む細胞培養の収容に供される内部空間を閉囲する着脱可能なフローチャンバであって、フローチャンバは、フローチャンバ内に細胞培養を配置するために、ハウジングの内部空間に（例えば、手動又は自動で）挿入されるように、及びハウジングから（例えば、手動又は自動で）取り外されるように、構成されており、フローチャンバは、さらに、フローチャンバの内部空間を通して液体培地（例えば、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ、又は人工ＣＳＦなど）のフローを、液体培地が細胞培養に接触して細胞培養に沿って流れることができるように誘導する構成であり、フローチャンバは、さらに、フローチャンバの内部空間内に配置された細胞培養の観察に供される第１の透明壁領域及び第２の透明壁領域を有し、フローチャンバがハウジングの内部空間に挿入されると、透明壁領域が上記の窓に対向する、フローチャンバと、
上記の液体培地を、フローチャンバを通して誘導されるように加熱する、ハウジングの内部空間内に配置されたヒータと、
上記のヒータを介して上記の液体培地をフローチャンバに向けて誘導する、ハウジングの内部空間内に配置された第１のフロー経路、及び上記の液体培地をフローチャンバから遠ざかるほうへ誘導する、ハウジングの内部空間内に配置された第２のフロー経路と、
フローチャンバがハウジングの内部空間に挿入されると、液体培地を、第１のフロー経路を通してフローチャンバの内部空間内へ、そして第２のフロー経路を通してフローチャンバの内部空間外へポンプ輸送するポンプとを備える細胞培養装置が開示される。
【０００９】
特に、フローチャンバが（例えば、手動又は自動で）ハウジングに挿入できる、又はハウジングから取り外せるということは、フローチャンバの設置又は取外しが工具の使用なしに、又は非破壊的に遂行できることを意味する。したがって、フローチャンバは、ハウジングに多大な影響を与えずに何度もハウジング内に配置でき、及びハウジングから取り外せる。
【００１０】
したがって、有利なことに、本発明は、単一のハウジングに統合された重要な機能性を提供するのみならず、特に、典型的な顕微鏡ステージの寸法である、例えば１１０ｍｍ×１６０ｍｍ×２５ｍｍほどに小型であり得る実施形態における、標準の顕微鏡ステージ上に適合することも可能であり、したがって、体外実験での常時観察を可能にするのみならず、特に工具不要の方法で（例えば、手動又は自動で）、細胞培養装置のハウジングからフローチャンバを取り外すことによって、細胞培養を容易に交換できるようにもするフローチャンバシステムを提供する。このため、フローチャンバは、細胞培養装置のハウジング内へ、及びハウジング外へ摺動させるように簡易に設計され得る（下記も参照）。
【００１１】
第１のフロー経路及び第２のフロー経路は、導管、特に、ハウジングの内部空間内に配置された可撓性を有する導管を有することができる。特に、ヒータは、第１のフロー経路の部分を形成し、ヒータは、上記の液体培地が上記の部分を通過するときに、上記の液体培地を加熱するように構成されている。
【００１２】
実施形態によれば、ヒータは、複数の並列の加熱プレートを有する。特に、各加熱プレートは導体を有する。それぞれの導体は、特に、それぞれの加熱プレートの被覆によって覆われており、この被覆は、好ましくは、生体適合材料、例えばシリコーンから形成されている。さらに、それぞれの導体は、特に、蛇行形状を有し、導体の両端に電圧が印加されるとジュール熱を発生する（オーム加熱）。特に、それぞれの導体は、金属フォイル、特に、レーザ切断によってブランクから切断され得るＮｉＣｒフォイルによって形成されている。特に、上記の電圧は、導体に並列に印加される。導体中を流れる電流は、導体から到来する電流が経由して流れるトランジスタ、特にＭＯＳＦＥＴトランジスタを制御し得る制御ユニット（下記も参照）によって制御される。特に、トランジスタは、トランジスタを通過する電流の量、したがって加熱プレートを加熱する導体によって発生されるジュール熱を調整することを可能にする。
【００１３】
さらに、特に、加熱プレートは、各２つの隣り合う加熱プレート間にギャップが設けられるように、互いに離間しており、ヒータによって形成された、第１のフロー経路の部分が、上記の液体培地をヒータ内に供給するためのヒータの取入れ口において始端し、ギャップ中を延在し、ヒータの取出し口において終端し、取出し口からフローチャンバの取入れ口へ向けて液体培地が誘導される（下記も参照）。
【００１４】
本発明の実施形態によれば、細胞培養装置は、さらに、ハウジングの内部空間内に配置された温度センサを備え、温度センサは、第１のフロー経路を通して誘導された液体培地と熱接触して液体培地の温度を測定するようになっている。
【００１５】
実施形態において、細胞培養装置は、また、特に液体培地のフロー経路に沿った異なる位置に配置された、複数の温度センサを備えてもよい。いくつかのこのようなセンサを使用することで、制御ユニットをより高速に／より頑強にすることができる。
【００１６】
特に、温度センサは、第１のフロー経路に沿って、ヒータの下流とフローチャンバの上流とに配置される。
【００１７】
さらに、本発明の実施形態によれば、細胞培養装置は、さらに、温度センサで測定された液体培地の温度の実際の値が液体培地の温度の所望の値に近付くように、（例えば、例えば上述した上記のトランジスタを介して、ヒータを通して流れる電流を制御することによって）ヒータを制御するように構成された制御ユニットを備える。
【００１８】
さらに、本発明の実施形態によれば、細胞培養装置は、さらに、液体培地のフローレートを判定するフローセンサを備える。特に、フローセンサは、第２のフロー経路におけるフローチャンバの下流に配置できる。
【００１９】
特に、制御ユニットは、フローセンサで測定された液体培地のフローレートの実際の値が液体培地のフローレートの所望の値に近付くように上記のポンプを制御するように構成されている。
【００２０】
さらに、本発明の実施形態によれば、ポンプは、ハウジングの内部空間内に（例えば、第１のフロー経路又は第２のフロー経路に）、配置されている。これに代わるものとして、ポンプは、ハウジングの上記の内部空間外に配置されている外部のポンプである。その場合に、特に、ポンプは、液体培地が経由して細胞培養装置の取入れ口に誘導される導管に接続していてもよい。
【００２１】
さらに、本発明の実施形態によれば、ハウジングは、フローチャンバをハウジングの内部空間に挿入するための凹部を備える。
【００２２】
特に、ハウジングは、天壁をハウジングの底壁に接続している側壁を備え、凹部は、ハウジングの底壁及び側壁の中に形成されている。
【００２３】
さらに、本発明の実施形態によれば、フローチャンバは、フローチャンバをハウジングの内部空間に挿入するために凹部内へ摺動させるように構成されており、かつハウジングの内部空間からフローチャンバを取り外すために凹部外へ摺動させるように構成されている。したがって、有利なことに、フローチャンバは、単純な直線的な摺動移動によって、フローチャンバの動作位置に、及び動作位置から運べる。
【００２４】
さらに、上記の摺動移動を容易にするために、フローチャンバは、さらなる実施形態による少なくとも２つのガイドレールを有し、このガイドレールは、それぞれ、ハウジング内に形成された関連する溝に係合するように構成されており、これにより、フローチャンバを上記の溝内へ、及び上記の溝外に摺動させるときに、ガイドレールによってフローチャンバを誘導することができる。したがって、特に、ガイドレールは、摺動方向に沿って長手方向に延在する。
【００２５】
さらに、本発明の実施形態によれば、フローチャンバは、フローチャンバの（例えば、透明な）本体に、特に本体の第１の側面にヒンジ留めされているドアを有し、フローチャンバの本体は、（閉じられた）ドアに対向する側面上に内部に形成された凹部であって、フローチャンバの上記の内部空間を形成し、かつ上記のドアで閉じられて封止できる、凹部を有する。特に、上記のドアは上記の第１の透明壁領域を有し、特に、フローチャンバの上記の本体は、上記の第２の透明壁領域を有し、又は形成している。さらに、特に、フローチャンバがハウジングの内部空間に挿入されると、ドアは、ハウジングの底面と同一面上にある。特に、底面は、細胞培養装置が顕微鏡のステージ上に上記の対物レンズに対して配置されると、顕微鏡の対物レンズから遠ざかるほうを向く。ハウジングの上面上の窓と２つの透明壁領域とが配置されていることから、フローチャンバ内にある細胞培養を上記の顕微鏡で適切に観察するために、フローチャンバ（及び細胞培養装置のハウジング）を覗き込むことが可能である。
【００２６】
特に、少なくとも２つのガイドレールのうちの一方は、フローチャンバの上記の本体の上記の第１の側面から突出する一方、少なくとも２つのガイドレールのうちの他方は、上記の本体の第２の側面から突出し、第２の側面は第１の側面から遠ざかるほうを向く。
【００２７】
また、上記のドアは、実施形態によるドアを閉鎖する留め具を有し、この留め具は、特に、本体に形成された凹部に係合してドアを閉鎖し（及び特に、また、フローチャンバの内部空間を封止し）、上記の凹部は本体の上記の第２の側面内に形成されている。
【００２８】
さらに、本発明の実施形態によれば、フローチャンバは、フローチャンバ内に上記の液体培地を注入するための取入れポートと、フローチャンバから上記の液体培地を放出するための取出しポートとを有する。特に、上記の取入れポート及び上記の取出しポートは、フローチャンバの上記の本体の背面上に配置されており、この背面は、上記の第１の側面を、フローチャンバの本体の上記の第２の側面に接続している。
【００２９】
さらに、本発明の実施形態によれば、フローチャンバは、さらに、フローチャンバから泡を流し出す機構を有する。
【００３０】
実施形態において、フローチャンバは、フローチャンバに液体培地を充填する第１の一方弁と、フローチャンバから、液体培地と、さらには液体培地に含まれる泡とを流し出す第２の一方弁とを有する。
【００３１】
さらに、本発明の実施形態によれば、フローチャンバは、取入れポート及び取出しポートを前向きにして上記の凹部内へ摺動させるように構成されており、これにより、取入れポートは第１のフロー経路のコネクタに係合し、フローチャンバを適切にハウジングの内部空間に挿入し／内部空間内へ摺動させると、取入れポートと第１のフロー経路との間と取出しポートと第２のフロー経路との間とのフロー接続が確立される。
【００３２】
また、本発明の実施形態において、第１のフロー経路はハウジング上、特にハウジングの天壁上に配置された取入れ口に接続されている一方、第２のフロー経路は、特に、ハウジング上、特にハウジングの天壁上に配置された取出し口に接続されている。さらに、特に、取入れ口は、上記の液体培地を、上記の取入れ口を介して第１のフロー経路内へ誘導する第１の導管に接続されるように構成されている一方、取出し口は、特に、フローチャンバから到来する上記の液体培地を第２のフロー経路外に放出する第２の導管に接続されるように構成されている。
【００３３】
実施形態によれば、第１の導管は、上記の液体培地を貯蔵する容器に接続してもよい一方、第２の導管は、液体培地を廃棄する廃棄ビンに接続してもよい。これに代えて、液体培地を再利用するために両方の導管が上記の容器に接続してもよく、すなわち、液体培地は、第１のフロー経路を介してフローチャンバの内部空間内へ、そしてフローチャンバの内部空間から第２のフロー経路を介して容器内へ戻るように、ポンプ輸送される。特に、ポンプは、ハウジングの内部空間内で第１のフロー経路又は第２のフロー経路に、又は細胞培養装置のハウジング外で第１の導管に対して、配置できる。
【００３４】
さらに、本発明のさらに他の実施形態によれば、ハウジングの高さは、２５ｍｍ以下である。このことにより、細胞培養装置を、通常の光学顕微鏡のステージ上に適合させることが可能になる。したがって、有利なことに、本発明は、標準の顕微鏡で使用でき、フローチャンバ内にある細胞培養の観察に、専用の光学器具を必要としない。
【００３５】
さらに、実施形態において、ハウジングの幅は１６０ｍｍ以下である。さらに、実施形態において、ハウジングの深さは１１０ｍｍ以下である。
【００３６】
また、本発明による細胞培養装置の実施形態によれば、細胞培養装置は、液体培地から気相の泡（例えば、空気又は空気の成分）を除去する構成である気泡トラップを備える。
【００３７】
特に、実施形態によれば、気泡トラップは、第１の容積及び第２の容積を有し、第１の容積と第２の容積とは、液体培地に対して非透過性であるが上記の気相には透過性である半透過膜によって離隔されており、これにより、気相の泡が第１の容積から生じ、膜を介して第２の容積内へ移ることにより、液体培地から泡を除去することができる。特に、膜はＰＴＦＥを有してもよい。
【００３８】
また、実施形態によれば、第１の容積は、第１のフロー経路の部分を形成しており、これにより、第１のフロー経路における、すなわちヒータの下流であってフローチャンバの上流において、液体培地から気泡が除去される。
【００３９】
さらに、実施形態によれば、気泡トラップの第１の容積は、ヒータの取出し口に接続された取入れ口を含む。また、実施形態によれば、第１の容積は、第１のフロー経路の上記のコネクタに接続された取出し口を有し、このコネクタを介してフローチャンバを第１のフロー経路に接続することができる。したがって、液体培地を、ヒータから気泡トラップの第１の容積へ、そして第１の容積からフローチャンバへ通すことができ、液体培地が第１の容積を通過すると、上記の気相の泡は、第１の容積から生じ、膜を介して第２の容積内へ移ることにより、液体培地／第１のフロー経路から泡を除去することができる。
【００４０】
また、実施形態によれば、気泡トラップの第２の容積は第１の容積よりも小さい。
【００４１】
さらに、実施形態によれば、気泡トラップの第２の容積は、第１の容積よりも小さい圧力を有する。特に、第２の（例えば、より小さい）容積は真空下にあり、したがって、半透過膜を通過することができる気体（例えば、空気）の量が増加する。
【００４２】
さらに、実施形態によれば、気泡トラップの第２の容積は、気泡トラップから上記の気相を除去するための取出し口を有する。特に、実施形態によれば、上記の取出し口にポンプ、特に真空ポンプが接続されており、ポンプを介して上記の泡を除去する。
【００４３】
また、本発明のさらに他の態様によれば、本発明による細胞培養装置と顕微鏡とを使用して細胞培養を観察する方法であって、フローチャンバ内に細胞培養を配置し、フローチャンバを細胞培養装置のハウジングの内部空間に挿入し、細胞培養装置のハウジングを、顕微鏡の対物レンズの下方及び／又は正面の顕微鏡のステージ上に配置する、方法が開示される。また、特に、液体培地は、細胞培養装置のハウジングの内部空間内に配置されたフローチャンバを通して誘導され、特に、温度が所望の値に調整され、及び／又はフローレートが所望の値に調整される。
【００４４】
本発明のさらなる特徴及び実施形態は、図面を参照して以下に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】挿入されたフローチャンバを備える本発明による細胞培養装置の斜視図を示し、装置のハウジングの内部空間を可視化するために、装置のハウジングの外周側壁の一部及び天壁が省略されている。
【図２Ａ】温度センサ及び制御ユニットなどの取り付けられた構成要素を併せてハウジングの図を示し、制御ユニットに電気接触するコネクタが見えるように制御ユニットが示されておらず、また、フローチャンバを通して誘導された液体培地のフロー経路を表している。
【図２Ｂ】温度センサ及び制御ユニットなどの取り付けられた構成要素を併せてハウジングの図を示し、挿入された制御ユニットを併せてハウジングを示している。
【図３】本発明による細胞培養装置のハウジングの底壁上に向かう平面図を示す。
【図４】ハウジングの側壁上に向かう側面図を示し、側壁は、底壁と共に、フローチャンバをハウジングの内部空間に挿入するための凹部を有する。
【図５】ヒータ及びフローチャンバなどの、上記の内部空間内に配置された構成要素を示すために天壁が除去された、本発明による細胞培養装置のハウジングの天壁上に向かう平面図を示す。
【図６】フローチャンバの斜視図を示す。
【図７】フローチャンバの斜視断面図を示す。
【図８】フローチャンバの（フローチャンバの本体の背面上に向かう）側面図を示す。
【図９】本発明による細胞培養装置のヒータの斜視図を示す。
【図１０】ヒータの斜視断面図を示す。
【図１１】ヒータの上面図を示し、ヒータの上部加熱プレートのオーム加熱に供される導体が表されている。
【図１２】図１１に示すヒータの加熱プレートを示す。
【図１３】顕微鏡のステージ上に配置された細胞培養装置のハウジングの側面図を示す。
【図１４】図１３に示す細胞培養装置及び顕微鏡の正面図を示す。
【図１５】フローチャンバが細胞培養装置のハウジングに挿入される、又はハウジングから取り外されるところを示す。
【図１６】細胞培養装置の内部のポンプを示す。
【図１７】細胞培養装置が気泡トラップを有する実施形態を示す。
【図１８】図１７の気泡トラップの側面図を示す。
【図１９】図１７及び図１８に示す気泡トラップの斜視図を示す。
【図２０】本発明による細胞培養装置に記録された、２０倍に拡大した初代神経細胞を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
図１は、図２Ａ及び図２Ｂと図３〜図１６とに関連して、光学顕微鏡４０での使用に供される細胞培養装置１を示す。図１によれば、細胞培養装置１は、光学顕微鏡４０のステージ４３に載置されるように構成されたハウジング１０を備え、ハウジング１０は、図１３及び図１４に概略的に示すように、顕微鏡４０の光路Ｌに（すなわち、顕微鏡４０の対物レンズ４１の正面に）配置されている。ハウジング１０は、顕微鏡４０の対物レンズ４１の下方に配置されてもよい。これに代えて、対物レンズ４１が、また、図１１において破線で表すように、ハウジング１０の下方に配置されてもよい。
【００４７】
ハウジング１０は内部空間１１を閉囲し、ハウジング１０は、さらに、着脱可能なフローチャンバの観察に供される窓１３を有する天壁１２（図１に示さず）と、対向する底壁１４とを備える（図１４を参照）。着脱可能なフローチャンバ２（特に、図６〜図８を参照）は、生きた生体細胞（例えば、内皮細胞、上皮細胞、グリア細胞、神経細胞、共培養、すなわち、同時に培養されたいくつかの細胞種、例えば、神経細胞及びグリア細胞、内皮細胞及び線維芽細胞など）を含む細胞培養ＣＣと、さらには液体培地Ｍ（上記も参照）のフローとの収容に供される内部空間２０を閉囲し、フローチャンバ２は、フローチャンバ２内に調べる細胞培養ＣＣを配置するために、ハウジング１０の内部空間１１に挿入されるように、及びハウジング１０から取り外されるように、構成されている。細胞培養ＣＣを適切な条件に維持するために、フローチャンバ２は、さらに、フローチャンバ２の内部空間２０を通して液体培地Ｍの上記のフローを、液体培地Ｍが細胞培養ＣＣに接触して細胞培養ＣＣに沿って流れることができるように誘導する構成である。特に、これにより、細胞培養ＣＣの体外条件をより正確に再現するために、細胞培養に規定の力／圧力を加える狙いがある。さらに、フローチャンバ２は、フローチャンバ２の内部空間２０内に配置された細胞培養ＣＣの観察に供される第１の透明壁領域２１及び第２の透明壁領域２２を有し、フローチャンバ２が上記のハウジング１０の内部空間２０に挿入されると、透明壁領域２１，２２が上記の窓１３に対向し、これにより、適切な照明を、例えば、下方から第１の壁領域２１（例えば、図３）を介して当てることができると同時に、窓１３及び第２の透明壁領域２２を通して細胞培養ＣＣを適切に観察することができる。図１に示すようなディメンジョンＨ×Ｄ×Ｂは、好ましくは、ハウジング１０が通常の顕微鏡４０のステージ４３上に（また、同時に、上記の顕微鏡４０の対物レンズ４１の下方及び／又は正面に）適合するように選択される。したがって、例において、上記のディメンジョンＨ×Ｄ×Ｂは、２５ｍｍ×１１０ｍｍ×１１６ｍｍ以下であり得る。
【００４８】
さらに、液体培地Ｍの温度を所望の値に調整するために、装置１は、さらに、ハウジング１０の上記の内部空間１１内に配置されたヒータ３を備える。ヒータ３は、ハウジング１０の内部空間１１内に配置された第１のフロー経路Ｐ１（図２Ａを参照）の一部を形成して、上記の液体培地Ｍを（上記のヒータ３を介して）フローチャンバ２に向けて誘導する。装置１は、さらに、上記の液体培地Ｍをフローチャンバ２から遠ざかるように誘導する、ハウジング２の内部空間１１内に配置された第２のフロー経路Ｐ２（図２Ａを参照）を備える。上記のフロー経路Ｐ１，Ｐ２は、導管、特に、（例えば、ヒータ３及びフローチャンバ２外の、図２Ａ又は図１６の破線に沿って）ハウジング１０の上記の内部空間１１内に配置された可撓性を有する導管を備えてもよい。
【００４９】
さらに、装置１は、フローチャンバ２がハウジング１０の内部空間１１に挿入されると、液体培地Ｍを、第１のフロー経路Ｐ１を通してフローチャンバ２の内部空間２０内へ、及び第２のフロー経路Ｐ２を通してフローチャンバ２の内部空間２０外へポンプ輸送する（内部又は外部の）ポンプ４を備える。特に、液体培地Ｍは、循環フローとしてポンプ輸送でき、上記のヒータ３及びフローチャンバ２を通して連続的に再利用される。特に、図１６に示すように、ポンプ４は、ハウジング１０の内部空間１１内に配置でき、第２のフロー経路Ｐ２の一部を形成してもよい。特に、ポンプ４は、フローチャンバ２の下流に配置されてもよい。
【００５０】
液体培地Ｍの温度を制御する（例えば、閉ループ）ために、細胞培養装置１は、さらに、ハウジング１０の内部空間１１内に配置された温度センサ５を備えてもよく、温度センサ５は、第１のフロー経路Ｐ１を通して誘導された液体培地Ｍに熱接触して液体培地Ｍの温度を測定するようになっている。特に、温度センサ５は、第１のフロー経路Ｐ１に沿って、ヒータ３の下流とフローチャンバ２の上流とに配置されており、これにより、温度センサ５は、液体培地Ｍがヒータ３を離れるときに液体培地Ｍの実際の温度を測定することができる。
【００５１】
この閉ループ制御は、温度センサ５で測定される液体培地Ｍの温度の実際の値が液体培地Ｍの温度の所望の値に近付くようにヒータ３を制御するように構成された制御ユニット６によって行われる。制御ユニットは、したがって、入力として、温度センサ５から（又はいくつかの温度センサから）液体培地Ｍの現在の温度を受け取る。
【００５２】
図２Ａは、装置１の内部空間１１から取り外された制御ユニット６の回路基板６ａを有する細胞培養装置１の上面図を、プリント回路基板６ａ／制御ユニット６のコネクタ６０が見えるように示す。図２Ｂは、回路基板６ａ及び制御ユニット６が搭載された装置１を示し、回路基板６ａは、また、例えば選択された所望の温度（又は液体培地の所望のフローレートなどの、他の選択された所望の量）を表示する、ディスプレイ６１と、さらには、（例えば、所望の温度又は所望のフローレートなどの所望の量を選択するために）制御ユニット６を手動で操作するための操作要素（例えば、ボタン６２）とを備える。
【００５３】
液体培地Ｍのオーム加熱のために、ヒータ３は、例えば生体適合材料から形成された被覆３１ｃを有する、図９〜図１２に示すような複数の並列の加熱プレート３０を有してもよい。それぞれの加熱プレート３０の上記の被覆３１ｃに導体３１が埋め込まれており、それぞれの導体３１は、特に、図１１及び図１２に表すように蛇行形状を有し、それぞれの導体３１の両端又は接点３１ａ，３１ｂに電圧（例えば、直流電圧、例えば１９Ｖ）が印加されると、ジュール熱を発生する（オーム加熱）。特に、それぞれの導体３１は、レーザ切断によってブランクから切断され得る金属フォイル、特にＮｉＣｒフォイルによって形成されている。特に、上記の電圧は、導体３１に並列に印加される。導体３１を通して流れる電流は、上述した制御ユニット６によって制御され、制御ユニット６は、トランジスタ、特にＭＯＳＦＥＴトランジスタを制御してもよく、このトランジスタを介して、導体３１から到来する電流が流れる。特に、トランジスタによって、トランジスタを通過する電流の量、したがって、加熱プレート３０を加熱する導体３１によって発生されるジュール熱を調整することが可能になる。特に、図１２は、上記の被覆３１ｃと上記の被覆３１ｃによって被覆されている導体３１とを表す加熱プレート３０のうちの１つを示す。さらに、上記の接点３１ａ，３１ｂは、接点３１ａ，３１ｂに電流が供給され得るように、上記の被覆３１ａから突出している。また、図１２に表すように、加熱プレート３０は、第１のフロー経路Ｐ１の一部を形成する凹部を有する（図１０も参照）。
【００５４】
図９及び図１０で分かるように、加熱プレート３０は、各２つの隣り合う加熱プレート３０間にギャップ３２が設けられるように、互いに離間しており、ヒータ３によって形成された、第１のフロー経路Ｐ１の部分は、上記の液体培地Ｍをヒータ３内に供給するためのヒータ３の取入れ口３３において始端し、図１０において破線に沿って、積層されたギャップ３２を通って延在し、ヒータ３の取出し口３４において終端し（例えば図９を参照）、取出し口３４から、図６及び図８に詳細に示すフローチャンバ２の取入れ口２００へ向けて液体培地Ｍが誘導される。
【００５５】
また、細胞培養装置１は、さらに、液体培地Ｍのフローレートを判定するフローセンサ７を備える（図１を参照）。このようなフローセンサ７は、フローチャンバ２の上流及び／又は下流に配置できる。ここでは、例として、フローセンサ７は、ハウジング１０の内部空間１１における、フローチャンバ２の下流の第２のフロー経路Ｐ２に配置されている。フローレートを判定することで、流れている培地Ｍを介して細胞培養ＣＣに作用するせん断力を高精度に調整することが可能になる。このため、制御ユニット６は、フローセンサ７で測定された液体培地Ｍのフローレートの実際の値が液体培地Ｍのフローレートの所望の値に近付くように上記のポンプ４を制御するように構成されている。
【００５６】
図１５にフローチャンバの摺動を示すが、フローチャンバをハウジング１０の内部空間１１内へ、及び内部空間１１外へ摺動させるために、ハウジング１０は、特に、例えば、例えば図４及び図１５に表すように、対向する天壁１２と底壁１４とを接続しているハウジングの側壁１６内に、さらには底壁１４内に形成された、凹部１５を備える。
【００５７】
フローチャンバ２の容易な摺動のために、例えば図６に示すように、フローチャンバ２は少なくとも２つのガイドレール２３を備える。ガイドレール２３は、以下でより詳細に記載する留め具２７などの他の構成要素によって中断できる。各ガイドレール２３は、ハウジング１０内に形成された溝１７内に係合するように構成されており（図４を参照）、これにより、ガイドレール２３と溝１７とを係合させることによって、誘導される摺動移動が容易になる。
【００５８】
特に、図６によれば、フローチャンバ２は、フローチャンバ２の本体２６の第１の側面２６ａ上に単一のガイドレール２３を、さらには、上記の本体２６の第２の側面２６ｂ上に２つの平行な（中断された）ガイドレール２３を備えてもよく、第２の側面２６ｂは、第１の側面２６ａから離れるほうを向いている。図７に示すように、上記の本体２６は、本体２６の側面上に、フローチャンバ２の内部空間２０を形成する凹部２０を備え、凹部２０は、本体２６の上記の第１の側面２６ａに（ヒンジ２５によって）ヒンジ留めされ得るドア２４に対向している。ドア２４は、上記の留め具２７を使用して（例えば、内部空間２０を封止するように）閉鎖でき、留め具２７は、ドア２４を閉鎖してフローチャンバ２の内部空間２０を封止するために、第２の側面２６ｂ内に形成された凹部２８に係合するように構成されている。
【００５９】
特に、フローチャンバ２の内部空間２０内にある細胞培養ＣＣを観察するために、ドア２４は、（例えば、ドア２４の窓の形態をなす）上記の第１の透明壁領域２１を有する一方、フローチャンバ２の対向する本体２６は、上記の第２の透明壁領域２２を有する、又は形成する。特に、本体２６全体が透明であり得る。
【００６０】
さらに、特に、ドア２４を閉鎖してフローチャンバ２を凹部１５内へ摺動させると、ドア２４は、ハウジング１０の底面１４と同一面上にあり、又は底面１４に対して僅かに窪む。
【００６１】
さらに、既に上述したように、フローチャンバ２は、上記の液体培地Ｍをフローチャンバ２内に注入するための取入れポート２００と、フローチャンバ２から上記の液体培地Ｍを放出するための取出しポート２０１とを有し、特に、上記のポート２００，２０１は、上記の本体２６の背面２６ｃ上に配置されており、この背面２６ｃは、上記の第１の側面２６ａを、フローチャンバ２の本体２６の上記の第２の側面２６ｂに接続する（図６及び図８を参照）。
【００６２】
さらに、図６及び図８に表すように、フローチャンバ２は、本体２６ａの背面２６ｃ上に、（例えば、フローチャンバ２から気泡を押し出すための）第１の一方弁２０２及び第２の一方弁２０３を備える。特に、第１の弁２０２は、フローチャンバ２内に液体培地を充填させるように作用してもよく、第２の弁２０３は、フローチャンバ２外へ液体培地を流し出し、続いてフローチャンバ２外へ気泡を押し出すように作用してもよい。
【００６３】
フローチャンバ（２）の内部空間２０と、細胞培養装置１のハウジング１０の内部空間１１内の第１のフロー経路Ｐ１及び第２のフロー経路Ｐ２との間のフロー接続を確立するために、フローチャンバ２は、さらに、取入れポート２００及び取出しポート２０１を前向きにして凹部１５内へ摺動させ、これにより、取入れポート２００が第１のフロー経路Ｐ１のコネクタ２０４に係合すると共に取出しポート２０１が第２のフロー経路Ｐ２のコネクタ２０５に係合し（例えば、図１及び図６を参照）、フローチャンバ２を凹部１５内へ完全に摺動させると、取入れポート２００と第１のフロー経路Ｐ１との間と取出しポート２０１と第２のフロー経路Ｐ２との間とのフロー接続が確立される。
【００６４】
また、図２Ａに表すように、第１のフロー経路Ｐ１は、ハウジング１０上、特にハウジング１０の天壁１２上に配置された取入れ口１８に接続されているのに対して、第２のフロー経路Ｐ２は、ハウジング１０上、特にハウジング１０の天壁１２上に配置された取出し口１９に接続されている。ここで、取入れ口１８は、上記の液体培地Ｍを第１のフロー経路Ｐ１内へ誘導する第１の導管に接続されるように構成されている一方、取出し口１９は、フローチャンバ２から到来する上記の液体培地Ｍを第２のフロー経路Ｐ２外へ放出する第２の導管に接続されるように構成されている。
【００６５】
第１の導管は、上記の液体培地Ｍを貯蔵する容器に接続してもよい一方、第２の導管は、液体培地を廃棄する廃棄ビンに接続してもよい。これに代えて、液体培地を再利用するために両方の導管が上記の容器に接続してもよく、すなわち、液体培地Ｍは、第１のフロー経路Ｐ１を介してフローチャンバ２の内部空間２０内へ、そしてフローチャンバ２の内部空間２０から第２のフロー経路Ｐ２を介して容器内へ戻るように、ポンプ輸送される。特に、ポンプ４は、ハウジング１０の内部空間１１内の、又は内部空間１１外の、第１のフロー経路Ｐ１又は第２のフロー経路Ｐ２に配置できる。
【００６６】
また、図１７〜図１９に示すように、細胞培養装置１は、ハウジング１０の内部空間１１内に配置された、かつ液体培地Ｍから気相Ｇの泡を除去する構成である、気泡トラップ５０を備えることができる。
【００６７】
気泡トラップ５０は、上記の内部空間１１内に配置された、かつ、特に、第１の容積５１と第１の容積５１の上の隣接する第２の容積５２とを備える、離隔気泡トラップハウジングを備えてもよく、第１の容積５１と第２の容積５２とは、液体培地Ｍに対して非透過性であるが上記の気相Ｇには透過性である半透過膜５３によって離隔されており、気相Ｇの泡は、第１の容積５１から生じ、膜５３を介して第２の容積５２内へ移ることができ、こうして液体培地Ｍから除去される。
【００６８】
図１７から分かるように、気泡トラップ５０の第１の容積５１は、第１のフロー経路Ｐ１の部分を形成している。
【００６９】
特に、第１の容積５１は、ヒータ３の取出し口３４に接続された取入れ口５１ａと、さらにはコネクタ２０４に接続された取出し口５１ｂとを備え、これにより、液体培地Ｍは、ヒータ３から気泡トラップ５０の第１の容積５１へ、そして第１の容積５１からフローチャンバ２へと通すことができ、上記の気相Ｇの泡は、第１の容積５１から生じ、膜を介して第２の容積５２内へ移り、これにより、液相の培地Ｍが膜５３によって保持される間、第１のフロー経路から泡を除去する。
【００７０】
さらに、第２の容積５２は、特に、第１の容積５１よりも小さく、特に、細胞培養装置１の動作中、第１の容積５１よりも小さい圧力を有する。特に、第２の容積５２は真空下にあり、したがって、半透過膜５３を通過することができる気体（例えば、空気）の量が増加する。さらに、気泡トラップ５０の第２の容積５２から気相Ｇを除去するために、第２の容積は、気泡トラップ５０から上記の気相Ｇを除去するための取出し口５２ａを有する。特に、上記の取出し口５２ａにポンプを接続することができ、これにより、泡／気相Ｇはポンプによって除去できる。
【００７１】
最後に、例として、図２０は、２．５ｄｙｎ／ｃｍ2のせん断応力に曝露されている間に本発明による細胞培養装置を使用して記録された、２０倍に拡大した初代神経細胞を示す。示されているのは、８００秒のせん断曝露後の、相コントラスト画像（Ａ）、ＧＦＰ信号（Ｂ）、及び両方の重ね合せ（Ｃ）である。解離海馬神経細胞培養は、Ｃ５７Ｂ６／ＪｊＲｊ（Ｊａｎｖｉｅｒ  Ｌａｂｓ、フランス）マウスから取得された。一定時間交配させたマウスを、妊娠１６．５日目で安楽死させ（Ｅ１６．５）、胎児、胎児の脳、及びその場合の海馬を、無菌条件下で解剖し、ＴｒｙｐＬＥ（登録商標）  Ｓｅｌｅｃｔ試薬（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））を使用して、３７℃で２５分、温浸した。得られた海馬神経細胞を、ポリ−Ｄ−リジン（１００μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ（登録商標））が塗布されたスライドガラス上で、２％のＧｉｂｃｏ  Ｂ−２７が追加されたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｇｉｂｃｏ）内で、５０，０００／ｃｍ2の密度で平板培養した。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【国際調査報告】
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