(57)【要約】  緑内障または病因性眼圧は、治療を必要とする眼にＷｎｔ５ａ阻害薬の製剤を局所投与することにより治療される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
緑内障または病因性眼圧を治療する方法であって、治療を必要とする眼にＷｎｔ５ａ阻害薬を局所投与する工程を含む方法。
【請求項２】
前記投与工程が、点眼剤による送達、または前房内注射、結膜下注射もしくは硝子体内注射による送達を含む、請求項１の方法。
【請求項３】
前記阻害薬が、抗体、ｓｉＲＮＡ、低分子干渉ペプチドおよび低分子阻害剤から選択される、請求項１または２の方法。
【請求項４】
前記投与が外用であり、前記阻害薬が、外用眼科用のゲル剤、軟膏剤、懸濁剤または液剤の形態で投与される、請求項１、２または３の方法。
【請求項５】
緑内障または病因性眼圧を治療するための、単位剤形の形態であるＷｎｔ５ａ特異的阻害薬の眼科用製剤であって、該Ｗｎｔ５ａ特異的阻害薬が、抗体、ｓｉＲＮＡ、低分子干渉ペプチドおよび低分子阻害剤から選択される、眼科用製剤。
【請求項６】
外用眼科用のゲル剤、軟膏剤、懸濁剤または液剤の形態である、請求項５の製剤。
【請求項７】
前記剤形が、前記阻害薬を含有するコンタクトレンズ、点眼剤、デポ剤またはボーラス剤である、請求項５または６の製剤。
【請求項８】
点眼剤ディスペンサーに充填されている、請求項５、６または７の製剤。
【請求項９】
前房内注射用、結膜下注射用または硝子体内注射用のシリンジに充填されている、請求項５、６、７または８の製剤。
【請求項１０】
眼への直接的な外用による送達に適した添加剤および特性をさらに含み、該添加剤および該特性が、眼科用に適した透明性、ｐＨ緩衝性、等張性、粘性、安定性および無菌性からなる群から選択される、請求項５、６、７、８または９の製剤。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本発明は、米国国立衛生研究所より交付された助成番号ＥＹ０１７３９２およびＥＹ０２８９９５の助成に基づき、米国政府の支援を受けてなされたものである。米国政府は、本発明に関し一定の権利を有する。
【０００２】
序論
緑内障は、米国国内で３００万人を超える人々、世界全体では６０００万人が罹患している大きな健康問題の１つである。２０４０年には、世界全体で１億１１８０万人が緑内障に罹患すると推定されている。緑内障の主要な危険因子の１つとして、眼圧上昇（ＩＯＰ）が挙げられる。眼圧上昇は視神経に障害を与える可能性があり、治療を行わなければ、永久的に失明することもある。現在、緑内障を治癒させる方法はない。既存の点眼薬または経口薬は、効果が限られており、多くの副作用を伴う。また、手術は、瘢痕化や線維化が生じて奏功しないことも多い。
【０００３】
房水は、前眼房および後眼房を満たす無色透明の液体である。房水は、後眼房の毛様体で産生され、前房隅角から線維柱帯とシュレム管を通る通常の経路で流出するとともに、ぶどう膜強膜流出路という副経路でも流出する。正常な眼では、房水の産生と流出の動的平衡が保たれ、ＩＯＰが正常範囲に維持されている。
【０００４】
シュレム管（ＳＣ）は、前眼房の虹彩角膜角に存在する輪状の管である。シュレム管は、通常の房水流出システムの一部をなしており、ヒトでは眼から流出する房水の７０〜９０％がシュレム管を通って流出する。シュレム管の内皮細胞からなる内層は、房水流出抵抗を示す主要な部位の１つで、ＩＯＰの主要な決定因子である。年齢とともに、あるいは病的な状況下でシュレム管の抵抗が増大すると、ＩＯＰが上昇し、不可逆的な視神経障害や視力喪失を伴う緑内障へと至る。したがって、シュレム管は緑内障治療の重要なターゲットである。我々は、最近、シュレム管が、リンパ管形成の主たる制御遺伝子であるＰｒｏｘ−１を発現していることを初めて証明した（Ｔｒｕｏｎｇ  ＴＮ，  Ｌｉ  Ｈ，  Ｈｏｎｇ  ＹＫ，  Ｃｈｅｎ  Ｌ．  Ｎｏｖｅｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｌｉｖｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  Ｓｃｈｌｅｍｍ’ｓ  ｃａｎａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  Ｐｒｏｘ−１．  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．  ２０１４；  ９（５）：ｅ９８２４５）。
【０００５】
Ｗｎｔ５ａはＷｎｔファミリーに属しており、Ｗｎｔファミリーには、哺乳動物で同定されている複数のリガンドや複数の受容体が含まれる。
【０００６】
本明細書にて、我々は、Ｗｎｔ５ａがシュレム管で発現していること、そしてその発現量がずり応力の変化に応じて制御されることを開示する。
【０００７】
さらに、Ｗｎｔ５ａを阻害することで、ｉｎ  ｖｉｖｏで効果的にＩＯＰを降下させることが可能であることも開示する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、緑内障または病因性眼圧を局所的に治療する方法および組成物を提供する。
【０００９】
一態様において、本発明は、緑内障または病因性眼圧を治療する方法であって、治療を必要とする眼にＷｎｔ５ａ阻害薬を局所投与する工程を含む方法を提供する。
【００１０】
いくつかの実施形態において、
【００１１】
−前記投与工程は、点眼剤による送達、または前房内注射、結膜下注射もしくは硝子体内注射による送達を含み、
【００１２】
−前記阻害薬は、抗体、ｓｉＲＮＡ、低分子干渉ペプチドおよび低分子阻害剤から選択され、
【００１３】
−前記阻害薬は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）またはレンチウイルスなどのウイルスベクターで送達され、かつ／または
【００１４】
−前記投与は外用であり、前記阻害薬は、外用眼科用のゲル剤、軟膏剤、懸濁剤または液剤の形態で投与される。
【００１５】
別の一態様において、本発明は、緑内障または病因性眼圧を治療するための、単位剤形の形態であるＷｎｔ５ａ特異的阻害薬の眼科用製剤であって、該Ｗｎｔ５ａ特異的阻害薬が抗体、ｓｉＲＮＡ、低分子干渉ペプチドおよび低分子阻害剤から選択される眼科用製剤を提供する。
【００１６】
いくつかの実施形態において、
【００１７】
−前記製剤は、眼科用潤滑剤などの外用眼科用のゲル剤、軟膏剤、懸濁剤または液剤の形態であり、
【００１８】
−前記剤形は、前記阻害薬を含有するコンタクトレンズ、点眼剤、デポ剤またはボーラス剤であり、
【００１９】
−前記製剤は、点眼剤ディスペンサーに充填されており、
【００２０】
−前記製剤は、前房内注射用、結膜下注射用または硝子体内注射用のシリンジに充填されており、かつ／または
【００２１】
−前記製剤は、眼への直接的な外用による送達に適した添加剤および／または特性をさらに含み、該添加剤および／または該特性は、眼科用に適した透明性、ｐＨ緩衝性、等張性、粘性、安定性および無菌性からなる群から選択される。
【００２２】
本発明には、本明細書に記載の個々の実施形態のすべての組み合わせが包含される。本発明の方法は、特定の実施形態を含む、開示されたあらゆる組成物を用いて実施してもよい。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本明細書に記載されている実施例および実施形態は、単に本発明を説明するためのものであり、これらの実施例および実施形態に基づいて、様々な改変または変更が可能であることは当業者には明らかであり、またそのような改変または変更は本発明に含まれるものである。当業者であれば、種々の重要でないパラメータについては、変更または改変しても本質的に同様の結果が得られることは理解できるであろう。本発明は、本明細書において必須の構成要素としては開示されてない化合物、成分、要素または工程を含まなくてもよく、また、これらが存在しない状態で実施されてもよい。以下の記載および本明細書全体を通して、別異に解される場合または別段の記載がある場合を除き、「ａ」および「ａｎ」という用語は、１以上を意味する。本明細書に引用されたすべての出版物、特許および特許出願、またこれらに記載の引用文献は、あらゆる目的のために、その全体が参照により本明細書に援用される。
【００２４】
本開示のＷｎｔ５ａ阻害方法は、遺伝子操作、および／または低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、抗体、低分子などの投与でありうる。低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、抗体、低分子などの多くは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ社（ＡＢＭ、ブリティッシュコロンビア州リッチモンド）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社などの供給者から市販されている。上記方法は、眼圧の降下および緑内障の予防もしくは治療を目的として単独で使用してもよく、かつ／または緑内障の予防もしくは治療を目的として、点眼剤、投薬、レーザー、移植デバイスおよび手術などの他の治療法などと組み合わせて使用してもよい。
【００２５】
典型的な実施例
【００２６】
Ｗｎｔ５ａは、培養したヒト初代ＳＣ細胞での発現、またｉｎ  ｖｉｖｏでもマウスのＳＣでの発現が確認されている。Ｗｎｔ５ａの発現は、ずり応力の変化に応じて制御されていることが、定量的リアルタイムＰＣＲアッセイによる解析で明らかになっている。また、我々は、Ｗｎｔ５ａに特異的なｓｉＲＮＡが、ヒトＳＣ細胞のＷｎｔ５ａ発現をダウンレギュレートする作用を有するとともに、ＳＣ細胞の機能にも影響を与えることを確認している。ＳＣ特異的にＷｎｔ５ａ遺伝子を欠損させた条件付ノックアウトマウスでは、その同腹子であるコントロールマウスと比べて、緑内障モデルで誘導されるＩＯＰの上昇が有意に抑制される。このノックアウトマウスと同腹子コントロールマウスとの間でベースラインのＩＯＰに有意差はなかった。同腹子コントロールマウスでは、すべての測定時点でＩＯＰの上昇が認められたが、Ｗｎｔ５ａノックアウトマウスでＩＯＰの上昇が認められたのは初期の時点（２４時間以内）のみであり、それ以降の時点ではＩＯＰの上昇は認められなかった。このことから、Ｗｎｔ５ａ介入により、ＩＯＰの上昇が持続できなくなることが示唆される。また、我々は、高眼圧症の制御において、ｗｎｔ５ａ介入が、網膜神経線維層の保護およびＳＣ透過性（上述した通常の流出システムによる水分移動を促進させるためのターゲット）の増加に有効であることも確認している（例えば、Ｔａｍら，  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ７：４０７１７，  ＤＯＩ：  １０．１０３８／ｓｒｅｐ４０７１７）。これらの実験は、Ｗｎｔ５ａが緑内障を制御するための有効な治療標的であることを示している。さらに、このような結果は、Ｈｕａｎｇら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，  ２０１７；  ８  （１）  ＤＯＩ：  １０．１０３８／ｓ４１４６７−０１７−００１４０−３）の方法を用いて行ったＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集によるＷｎｔ５ａの選択的阻害によっても示されている。
【００２７】
次に、我々は、Ｗｎｔ５ａ阻害薬としてのＷｎｔ５ａ  ｓｉＲＮＡの投与によるＩＯＰ降下効果を確認するための実験プロトコールを開発した。このプロトコールの実施に際して、Ｗｎｔ５ａ特異的ｓｉＲＮＡは市販のもの（ヒトＷＮＴ５Ａ  ｓｉＲＮＡ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社；Ａｎａｓｔａｓら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．２０１４，１２４，２８７７−２８９０）を入手した。１つのプロトコールでは、Ｙｕｅｎら（２０１４，  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．  ２０１４；５５：３３２０−３３２７）に記載の方法に従って、ｓｉＲＮＡを結膜下注射する。ｓｉＲＮＡまたはコントロールを投与するマウスをランダムに選択し、５μＬ（０．２ｌｇ／μＬ）の用量を、週２回、２週間結膜下注射する。別のプロトコールでは、Ｔａｍら（２０１７，  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ７，  ４０７１７）に記載の方法に従って、ｓｉＲＮＡを前房内注射する。マウスを腹腔内注射で麻酔して、瞳孔を拡大させる。まず、先端が平坦な引き伸ばしたガラス製マイクロ針で角膜に穴をあけて房水を抜く。穿孔後直ちに、先端が平坦な引き伸ばしたガラス製マイクロ針を１０μＬシリンジに取り付けて、穿孔した穴に挿入し、１μｇのｓｉＲＮＡを含むＰＢＳを前眼房に１．５μＬ注入する。反対側の眼には、同じ濃度のスクランブルｓｉＲＮＡを含むＰＢＳを同様に１．５μＬ注入する。これらの実験から、Ｗｎｔ５ａ阻害薬として結膜下注射または前房内注射により局所的に送達されたＷｎｔ５ａ特異的ｓｉＲＮＡが、病因性ＩＯＰの治療に有効であることが確認された。
【００２８】
点眼剤として送達されたｓｉＲＮＡがＩＯＰに与える効果を評価するために、我々は、Ｍａｒｔｉｎｅｚら（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．  ２０１４  Ｊａｎ；２２（１）：８１−９１）の方法に準じて、さらなるプロトコールを開発した。ニュージーランド白ウサギに、２０ｎｍｏｌ／日のｓｉＲＮＡまたはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を４日間連続で外用投与する。ｓｉＲＮＡを投与した眼では、ビヒクル投与群と比較してＩＯＰの有意な降下が認められる。ＩＯＰに対するｓｉＲＮＡの効果は、初回投与から２日後の時点で確認することができ、最終投与から２日後程度までベースラインレベルを下回るＩＯＰ値が維持される。また、我々は、緑内障で観察されるような病態におけるＷｎｔ５ａ  ｓｉＲＮＡのＩＯＰ降下効果を評価するために、ニュージーランド白ウサギで経口水過負荷モデルを作製した。まず、４種類の用量のｓｉＲＮＡ（１０ｎｍｏｌ、２０ｎｍｏｌ、４０ｎｍｏｌおよび６０ｎｍｏｌ／片眼／日）を、高眼圧を誘導する４８時間前、２４時間前および２時間前の合計３回投与する。いずれの投与も両眼に対して行い、ＩＯＰの測定は、高眼圧誘導前と経口過負荷後に行い、経口過負荷後の測定は２０分毎に１２０分後まで行う。結果を解析したところ、Ｗｎｔ５ａ  ｓｉＲＮＡは、投与したいずれの用量においてもＩＯＰの上昇を顕著に抑えることが示された。
【００２９】
ＩＯＰに対するＷｎｔ５ａ  ｓｉＲＮＡの効果および特異性を確認するために、１群の動物数を増やし、用量を４０ｎｍｏｌ／片眼／日として４日間連続で投与する。投与４日目に水負荷により高眼圧を誘導する。コントロールの結果から、ＰＢＳを投与した動物では、高眼圧誘導から初めの１時間の間に水負荷によってＩＯＰが上昇することが確認された。各測定時点でのＩＯＰ値を比較して解析したところ、ｓｉＲＮＡの投与により、初めの１時間の間に、ＰＢＳを投与した動物と比較してΔＩＯＰ値が有意に低下した。スクランブル配列ｓｉＲＮＡの投与はＩＯＰに何ら影響を与えなかったことから、この効果は特異的な効果である。
【００３０】
次に、我々は、Ｗｎｔ５ａ阻害薬としてのＷｎｔ５ａ特異的抗体の投与によるＩＯＰ降下効果を確認するための実験プロトコールを開発した。このプロトコールでは、ウサギ精製免疫グロブリンとして得られた抗ヒトＷＮＴ５Ａ抗体（緩衝水溶液）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ＳＡＢ１４１１３９６）と、マウスクローン６Ｆ２で産生された抗ヒトＷＮＴ５Ａモノクローナル抗体（腹水）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ＳＡＢ５３００１８３）の２種類の抗体を使用するが、その他のＷｎｔ５ａ抗体、例えばＨａｎａｋｉら，  Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  １１（２）  Ｆｅｂ  ２０１２；およびＨｅら，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．  ２００５，  ２４  （１８）：  ３０５４−３０５８に記載されている抗体も使用可能である。上記のマウスとウサギのモデルの両方を使用して行った実験から、Ｗｎｔ５ａ阻害薬として点眼剤の形態で局所的に送達されたＷｎｔ５ａ特異的抗体が、病因性ＩＯＰの治療に有効であることが確認された。
【００３１】
ＩＯＰおよび緑内障のその他のパラメータ、例えば、角膜浮腫、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）死、ＲＮＦＬ（網膜神経線維層）の菲薄化などに対するＷｎｔ５ａ中和抗体の治療効果を評価するために、例示的なモデルシステムにおいて、野生型正常マウスの右眼（ＯＤ）で高眼圧を誘導し、Ｗｎｔ５ａ中和抗体を投与した。コントロール群では各マウスの右眼のＩＯＰが有意に上昇したが、Ｗｎｔ５ａ抗体を投与した眼のＩＯＰはそれより有意に低く、ベースラインレベルに維持されていた。また、光干渉断層計（ＯＣＴ）を用いてｉｎ  ｖｉｖｏで中心角膜厚を測定したところ、Ｗｎｔ５ａ介入により、角膜浮腫が抑制されていた。ＩＯＰが上昇した後、コントロール群では角膜厚が増大したが、Ｗｎｔ５ａ抗体を投与した眼では角膜厚の増大は認められなかった。また、Ｗｎｔ５ａ抗体を投与した眼では、Ｗｎｔ５ａ介入により、ＲＧＣ死とともにＲＮＦＬ菲薄化も抑制された。ＲＧＣ死とＲＮＦＬ菲薄化の抑制は、それぞれ免疫染色とＯＣＴによって確認した。これらの結果から、緑内障マウスモデルにおいて、外用によるＷｎｔ５ａ抗体介入により、ＩＯＰが有意に降下し、角膜と網膜が保護されることが確認された。
【００３２】
次に、我々は、Ｗｎｔ５ａ特異的なアンタゴニストペプチドと低分子阻害剤との投与によるＩＯＰ降下効果を確認するための実験プロトコールをデザインした。このプロトコールでは、Ｗｎｔ５ａの強力なアンタゴニストとして作用する、ｔ−ブチルオキシカルボニル修飾Ｗｎｔ５ａ由来ヘキサペプチド（Ｂｏｘ５）（Ｊｅｎｅｉら，  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，  １０６  （４６），  １９４７３−８）と、比較的毒性が低く、安定性に優れた強力なＷＮＴ−５Ａ発現阻害剤である、６，７−ジヒドロ−１０α−ヒドロキシラジシコール（Ｓｈｉｎｏｎａｇａら，  Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．  ２００９  Ｊｕｌ  １；１７（１３）：４６２２−３５）とを使用する。この場合も、上記のマウスとウサギのモデルの両方を使用して行った実験から、Ｗｎｔ５ａ阻害薬として点眼剤の形態で局所的に送達された、Ｗｎｔ５ａ特異的な修飾ペプチドとＷｎｔ５ａ発現の低分子阻害剤が、病因性ＩＯＰの治療に有効であることが確認された。
【国際調査報告】
2020531581.tif 000002
2020531581.tif 000003