(57)【要約】  本発明は、細菌性莢膜多糖、より具体的には、グラム陰性菌の莢膜多糖の精製のための改善されたプロセスに関する。当該プロセスは、採集物の濃縮及びダイアフィルトレーション、アニオン性界面活性剤及び強アルカリによる処理、それに続く遠心分離、ダイアフィルトレーション及び細菌性多糖類のカチオン性界面活性剤での沈殿を含む。当該プロセスにより、エンドトキシン、タンパク質及び核酸の不純物が大幅に減少し、それによって、所望のＯ−アセチルレベルの莢膜多糖の回収率が向上する。前記プロセスは、拡張可能であり、非酵素的であり、及び精製工程がより少ない。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的サンプルから多糖類を単離する方法であって、当該方法は、以下の：
ａ）粗多糖類溶液とアニオン性界面活性剤を混合する工程；
ｂ）アルカリを溶液に加える工程；
ｃ）溶液のｐＨを中和する工程；
ｄ）溶液をアルコールベースの沈殿に供し、次いで遠心分離及び上清の保持を行う工程；
ｅ）前記上清中の界面活性剤を除去する工程；
ｆ）多糖類の濃縮及びダイアフィルトレーションを行う工程、
を含み、ここで、得られた精製多糖類の回収率は、６０〜８０％であり； 最適なＯ−アセチル化レベル、及びエンドトキシン、タンパク質及び核酸を含む最小限の不純物を有する、方法。
【請求項２】
前記方法が、さらに以下の：
ｇ）多糖類溶液とカチオン性界面活性剤を混合する工程；
ｈ）溶液を遠心分離に供し、ペレットを回収する工程；
ｉ）ペレットのアルコールへの溶解、次いで多糖類の塩ベースの沈殿に供する工程、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１に記載のアニオン性界面活性剤が、アルキル硫酸塩、ドデシル硫酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、ドデシルスルホン酸ナトリウム、ｓ−アルキル硫酸ナトリウム、脂肪族ナトリウムアルコールポリオキシエチレンエーテル硫酸塩、オレイル硫酸ナトリウム、Ｎ−オレイルポリ（アミノ酸）ナトリウム、アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、α−オレフィンスルホン酸ナトリウム、アルキルスルホン酸ナトリウム、α−スルホモノカルボン酸エステル、脂肪酸スルホアルキルエステル、コハク酸スルホネート、アルキルナフタレンスルホン酸、アルカンスルホン酸ナトリウム、リグニンスルホン酸ナトリウム、及びアルキルグリセリルエーテルスルホン酸ナトリウム、を含む群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記アニオン性界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
アニオン性界面活性剤（ＳＤＳ）の最終濃度が、０．１〜４．０％、好ましくは、１％未満である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
アルカリが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、ヒドロキシルアミン、トリエチルアミン及び水酸化リチウムを含む群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
アルカリが、水酸化ナトリウムである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
溶液中のアルカリの最終濃度が、５〜５０ｍＭの範囲、好ましくは５〜２０ｍＭの範囲、及び最も好ましくは８〜１５ｍＭの範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
アルカリを加えた後の前記溶液のｐＨが、ｐＨ９〜１１の範囲であり、好ましくはｐＨ１０．５である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
マイルドな有機酸を加えることにより、溶液が中和（ｐＨ７．０）される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記マイルドな有機酸が、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸のうちの１つであり、好ましくは酢酸である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記界面活性剤の除去が、カリウム塩処理、ゲル濾過、エタノール処理、及びイオン交換樹脂／アンバーライトカラムの少なくとも１つ以上を使用して実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記界面活性剤の除去が、カリウム塩を使用した界面活性剤の沈殿により行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
カリウム塩が、塩化カリウム、酢酸カリウム、硫酸カリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、リン酸カリウム、リン酸水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硝酸カリウム、及び他のカリウム塩のうちの１つ、又はそれらの２つ以上の組み合わせである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
カリウム塩が、塩化カリウムである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記溶液中の前記カリウム塩の最終濃度が、前記アニオン性界面活性剤が十分に沈殿される濃度以上である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記溶液中のカリウム塩の最終濃度が、３００ｍＭ未満、好ましくは１００ｍＭである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記多糖類が、生物学的原料に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記多糖類が、グラム陰性菌に由来する、請求項１及び１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記多糖類が、シアル酸残基のポリマーである、請求項１及び１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記多糖類が、ナイセリア・メニンギティディスに由来する、請求項１、及び１８〜２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記多糖類が、ナイセリア・メニンギティディス血清型Ｂ、ナイセリア・メニンギティディス血清型Ｃ、ナイセリア・メニンギティディス血清型Ｗ、ナイセリア・メニンギティディス血清型Ｙに由来する、請求項１、及び１８〜２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記カチオン性界面活性剤が、セチルトリメチルアンモニウム塩、テトラブチルアンモニウム塩、ミリスチルトリメチルアンモニウム塩及び臭化ヘキサジメトリンのうちの１つ、又はそれら２つ以上の組み合わせである、請求項２に記載の方法。
【請求項２４】
前記カチオン性界面活性剤が、セチルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＣＴＡＢ）である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記カチオン性界面活性剤の濃度が、３％未満、好ましくは１％である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記アルコールが、親水性アルコールである、請求項１及び２に記載の方法。
【請求項２７】
親水性アルコールが、メタノール、エタノール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、アセトン、ｔ−ブチルアルコールのうちの１つ、又はそれら２つ以上の組み合わせ、及びその濃度が、６５％未満又は９５％超である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
アルコールが、エタノールである、１及び２に記載の方法。
【請求項２９】
前記多糖類の濃縮及びダイアフィルトレーションが、１００ｋＤａ ＭＷＣＯ膜を用いた接線流濾過を使用して行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
沈殿に使用される塩が、塩化ナトリウム、塩化アンモニウム、塩化カリウムのうちの１つ、又はそれらの２つ以上の組み合わせである、請求項２に記載の方法。
【請求項３１】
沈殿に使用される塩が、塩化ナトリウムである、請求項２又は３０に記載の方法。
【請求項３２】
塩の濃度が、０．２５Ｍ〜２Ｍの範囲である、請求項２及び３０〜３１に記載の方法。
【請求項３３】
多糖類の単離方法であって、以下の：
ａ）粗多糖類溶液とアニオン性界面活性剤を混合する工程；
ｂ）ＥＤＴＡ及び酢酸ナトリウムを溶液に加える工程；
ｃ）溶液をアルコール沈殿に供した後、遠心分離し、上清を保持する工程；
ｄ）前記上清に存在する界面活性剤を除去する工程；
ｅ）細菌性多糖類の濃縮及びダイアフィルトレーションする工程；
を含み、ここで、得られた精製多糖類の回収率は、６０〜８０％であり； 最適なＯ−アセチル化プロファイル、及び最小限のエンドトキシン、タンパク質及び核酸を含む不純物を示す、方法。
【請求項３４】
前記方法が、さらに以下の：
ａ）細菌性多糖類溶液とカチオン性界面活性剤を混合する工程；
ｂ）溶液を遠心分離に供し、ペレットを回収する工程；
ｃ）ペレットのアルコールへの溶解、その後、塩ベースの沈殿に供する工程；
を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
界面活性剤が、アニオン性界面活性剤である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
アニオン性界面活性剤が、硫酸アルキル、ドデシル硫酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、ドデシルスルホン酸ナトリウム、ｓ−アルキル硫酸ナトリウム、脂肪族アルコールポリオキシエチレンエーテル硫酸ナトリウム、オレイル硫酸ナトリウム、Ｎ−オレオイルポリ（アミノ酸）ナトリウム、アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、α−オレフィンスルホン酸ナトリウム、アルキルスルホン酸ナトリウム、α−スルホモノカルボン酸エステル、脂肪酸スルホアルキルエステル、コハク酸スルホネート、アルキルナフタレンスルホン酸、アルカンスルホン酸ナトリウム、リグニンスルホン酸ナトリウム、アルキルグリセリルエーテルスルホン酸ナトリウム、及び他のアニオン性界面活性剤のうちの１つ、又はそれら２つ以上の組み合わせである、請求項３５に記載のアニオン性界面活性剤。
【請求項３７】
前記アニオン性界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の最終濃度が、０．１〜４．０％の範囲であり、好ましくは、１％未満である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記界面活性剤の除去が、少なくとも１つ以上のカリウム塩処理、ゲル濾過、エタノール処理、及びイオン交換樹脂／アンバーライトカラムを使用して実行される、請求項３３に記載の方法。
【請求項４０】
前記界面活性剤の除去が、カリウム塩を使用した界面活性剤の沈殿によって実行される、請求項３３に記載の方法。
【請求項４１】
前記溶液中のカリウム塩の最終濃度が、アニオン性界面活性剤が十分に沈殿する濃度以上である、請求項３３に記載の方法。
【請求項４２】
カリウム塩が、塩化カリウム、酢酸カリウム、硫酸カリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、リン酸カリウム、リン酸水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硝酸カリウム、及び他のカリウム塩のうちの１つ、又はそれら２つ以上の組み合わせである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記カチオン性界面活性剤が、セチルトリメチルアンモニウム塩、テトラブチルアンモニウム塩、ミリスチルトリメチルアンモニウム塩、及び臭化ヘキサジメトリンのうちの１つ； 又はそれらの２つ以上の組み合わせである、請求項３４に記載の方法。
【請求項４４】
前記カチオン性界面活性剤が、セチルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＣＴＡＢ）である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記ＣＴＡＢの最終濃度が、０．５％〜３．０％の範囲、好ましくは１％未満である、請求項３５に記載の方法。
【請求項４６】
多糖類が、ヘリコバクター・ピロリ、クラミジア・ニューモニエ、クラミジア・トラコマチス、ウレアプラズマ・ウレアリチカム、マイコプラズマ・ニューモニエ、スタフィロコッカスｓｐｐ．、スタフィロコッカス・アウレウス、ストレプトコッカスｓｐｐ．、グループＡストレプトコッカス、グループＢストレプトコッカスＩａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖ、ＶＩ、又はＶＩＩＩ； グループＣストレプトコッカス、ストレプトコッカス・ピオゲネス、ストレプトコッカス・アガラクチア、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ、ストレプトコッカス・ニューモニエ、ストレプトコッカス・ヴィリダンス、エンテロコッカス・フェカリス、ナイセリア・メニンギティディス、ナイセリア・ゴノレア、バシルス・アントラシス、サルモネラｓｐｐ．、サルモネラ・チフィ、サルモネラ・パラチフス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｐａｒａｔｈｙｐｈｉ）、ビブリオ・コレラエ、パスツレラ・ペスティス、シュードモナス・エルギノーサ、カンピロバクターｓｐｐ．、カンピロバクター・ジェジュニ、クロストリジウムｓｐｐ．、クロストリジウム・ディフィシル、マイコバクテリウムｓｐｐ．、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、トレポネーマｓｐｐ．、ボレリアｓｐｐ．、ボレリア・ブルグドルフェリ、レプトスピラｓｐｐ．、ヘモフィルス・デュクレイ、コリネバクテリウム・ジフテリア、ボルデテラ・パータシス、ボルデテラ・パラパータシス、ボルデテラ・ブロンキセプチカ、ヘモフィルス・インフルエンザ、エシェリキア・コリ、シゲラｓｐｐ．、エーリキアｓｐｐ．、及びリケッチアｓｐｐ．ストレプトコッカス・ニューモニエ型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ａ、９Ｆ、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ｆ、１９Ａ、２０、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂ、３８及び４５の多糖類； ナイセリア・メニンギティディス血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｗ１３５、Ｘ、Ｙ、Ｚ、及び２９Ｅの多糖類； Ｈ．インフルエンザｂ型を含む群に由来する、上記請求項の何れか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記多糖類が、生物学的供給源に由来する、上記請求項の何れか１項に記載の方法。
【請求項４８】
上記請求項の何れか１項に記載の方法によって得られた多糖類。
【請求項４９】
前記多糖類が、莢膜多糖、サブ莢膜多糖（ｓｕｂ−ｃａｐｓｕｌａｒ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）、菌体外多糖である、上記請求項の何れか１項に記載の多糖類。
【請求項５０】
化学的又は機械的手段によってサイズ分けに供される、請求項４８に記載の多糖類。
【請求項５１】
上記請求項の何れか１項に記載の方法により得られた多糖類抗原を含むワクチン。
【請求項５２】
キャリアタンパク質にコンジュゲートされる上記請求項の何れか１項に記載の多糖類であって、ここで、キャリアタンパク質が、ＣＲＭ１９７、ニューモコッカル表面付着因子A（ＰｓａＡ）、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、破傷風トキソイドのフラグメントＣ、百日咳トキソイド、Ｈ．インフルエンザのＤタンパク質、Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＴ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＳＴ、シュードモナス・エルギノーサ由来の外毒素Ａ、外膜複合体ｃ（ＯＭＰＣ）、ポリン、トランスフェリン結合タンパク質、ニューモリシン、ニューモコッカル表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）、ニューモコッカル表面付着タンパク質（ＰｓａＡ）、ニューモコッカルＰｈｔＤ、ニューモコッカル表面タンパク質ＢＶＨ−３、ＢＶＨ−１１、バチルス・アントラシスの防御抗原（ＰＡ）、解毒浮腫因子（ＥＦ）、バチルス・アントラシスの致死因子（ＬＦ）、オボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ツベルクリンの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）； 特にＣＲＭ１９７、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド及び／又はＰｓａＡのうちの１つである、多糖類。
【請求項５３】
還元的アミノ化、シアニル化、又はカルボジイミド化学を使用してキャリアタンパク質にコンジュゲートされる、上記請求項の何れか１項に記載の多糖類。
【請求項５４】
前記コンジュゲートが、血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、２９Ｅ及びＷ−１３５から選択されるナイセリア・メニンギティディス（Ｎ．メニンギティディス）の莢膜多糖を含む、上記請求項の何れか１項に記載に従って得られる免疫原性組成物。
【請求項５５】
ａ）（ｉ）ナイセリア・メニンギティディス血清型Ａの莢膜多糖及び（ｉｉ）破傷風トキソイドのコンジュゲート；
ｂ）（ｉ）ナイセリア・メニンギティディス血清型Ｃの莢膜多糖及び（ｉｉ）ＣＲＭ１９７のコンジュゲート；
ｃ）（ｉ）ナイセリア・メニンギティディス血清型Ｙの莢膜多糖及び（ｉｉ）ＣＲＭ１９７のコンジュゲート；
ｄ）（ｉ）ナイセリア・メニンギティディス血清型Ｗ１３５の莢膜多糖及び（ｉｉ）ＣＲＭ１９７のコンジュゲート；
ｅ）（ｉ）ナイセリア・メニンギティディス血清型Ｘの莢膜多糖及び（ｉｉ）破傷風トキソイドのコンジュゲート、
の少なくとも１つを含む免疫原性組成物。
【請求項５６】
請求項５４及び５５に記載される免疫原性組成物であって、前記組成物が、以下：
ａ）少なくとも１つの多糖類−タンパク質コンジュゲート；
ｂ）約３％ ｗ／ｖの濃度のスクロース； 及び
ｃ）約０．５％ ｗ／ｖの濃度のクエン酸ナトリウム、
を含み、ここで、前記多糖類が、上記請求項の何れか１項に記載の方法により精製される、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、広くバイオテクノロジー分野に属し、具体的には、細菌莢膜多糖の精製のための採集及び下流処理に関する。
【背景技術】
【０００２】
ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）（髄膜炎菌）は、脳及び脊髄を取り巻く膜（髄膜）及び脳脊髄液（ＣＳＦ）の感染の主な原因であり、世界中で死亡及び障害を引き起こす。
【０００３】
髄膜炎菌（メニンゴコッカス）（ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ）としても知られるナイセリア・メニンギティディスは、グラム陰性菌である。多糖類の莢膜の構造によれば、髄膜炎菌の１３の血清型が同定されており、そのうち６の血清型（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ、Ｘ及びＹ）が流行を引き起こす可能性がある（参照： Ｌｅｅ Ｈａｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ ２０１１）。
【０００４】
髄膜炎は、世界中の小さなクラスターで発生し、流行性の細菌性髄膜炎の様々な比率で季節的に発生する。髄膜炎性疾患の最大の負担は、アフリカ大陸、特に髄膜炎ベルトとしても知られるサハラ以南のアフリカで観察される。「疾病管理予防センター（ＣＤＣ）」及び「世界保健機関」は、２０００年に世界中で髄膜炎菌性疾患が、１７１，０００人の死亡を引き起こしたと推定している。また、ＣＤＣ報告書は、髄膜炎及び敗血症の主な原因として、米国の小児及び若年成人のナイセリア・メニンギティディスの発生を確認している。従って、ナイセリア・メニンギティディスは、先進国及び途上国の両方での公衆衛生の問題であり続けている。
【０００５】
１９９６〜１９９７年において、ナイセリア・メニンギティディス血清型Ａによる流行は、２５０，０００を超える疾患の事例及び２５，０００人を超える死亡が報告された； アフリカでのグループＡ髄膜炎の流行を撲滅するワクチンの開発を固く約束するように世界保健コミュニティに要請した。
【０００６】
２０１０年において、髄膜炎菌Ａ多糖類コンジュゲートワクチン、すなわちＭｅｎａｆｒｉｖａｃが、アフリカ大陸に首尾よく導入され、ナイセリア・メニンギティディス血清型Ａによって引き起こされた流行がほぼ消失した。ナイセリア・メニンギティディス血清型Ａの影響の減少に伴い、Ｍｅｎ−Ｃ、Ｍｅｎ−Ｗ、Ｍｅｎ−Ｘ及びＭｅｎ−Ｙ等の他の髄膜炎菌性の影響が増加している。この劇的な影響に対抗するために、上記の血清型を含む一価及び多価ワクチンが開発されかつ、販売されている。多価Ａ、Ｃ、Ｙ及びＷコンジュゲートワクチンは、カナダ、アメリカ合衆国、ヨーロッパにおいて子供及び大人で使用するために２００５年からライセンスされている（Ｍｅｎａｃｔｒａ（登録商標）、Ｍｅｎｖｅｏ（登録商標））； それらは市場では非常に高いコストで入手可能であるため、世界の他のコミュニティにとっては、手が出ない。
【０００７】
血清型Ａの莢膜は、Ｏ−アセチル化（α１−６）結合Ｎ−アセチル−マンノサミン−１−リン酸の繰り返し単位で構成される。血清型Ｂ、Ｃ、Ｗ、及びＹ由来の莢膜多糖は、シアル酸誘導体で構成される； 血清型Ｂ及びＣは、（α２−８）及び（α２−９）結合シアル酸ホモポリマーを発現し、ｄ−ガラクトース又はｄ−グルコース及びシアル酸の交互配列は、血清型Ｗ及びＹによって発現される。発酵ブロス（ｂｒｏｔｈ）中の汚染物質は、莢膜多糖上に存在する繰り返し部分と別様に相互作用する。従って、異なる血清型由来の異なる細菌性莢膜多糖の分離のために、これらの違いを活用するプロセスが必要である。
【０００８】
髄膜炎菌性コンジュゲートワクチンに関するＷＨＯテクニカルレポートシリーズによると、単離された多糖類は、以下の仕様を満たす必要がある：
【表１】
2020518707.tif 000002
【０００９】
ワクチンに使用される細菌の莢膜ＰＳの典型的な精製プロセスは、エタノール及び／又はカチオン性界面活性剤によるいくつかの選択的沈殿、それに続くフェノールによる連続遠心分離、超遠心分離及び除タンパク質を含む。
【００１０】
血清型Ａ、Ｂ及びＣ由来のナイセリア・メニンギティディス多糖類の分離に関する最初の文献は、Ｇｏｔｓｃｈｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ（１９６９）によって発表された。Ｇｏｔｓｃｈｌｉｃｈ達は、カチオン性界面活性剤セタブロン（ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド）を使用して、全培養物から負に帯電した多糖類を迅速に沈殿させ、続いて０．９Ｍ ＣａＣｌ２抽出及び遠心分離を使用して界面活性剤−多糖類複合体を解離させ、エタノール沈殿法が核酸を除去するために用いられ、それに対し、タンパク質は、多糖類を酢酸ナトリウムで処理した後、クロロホルム含有ブタノールで均質化して除去され、また、高温フェノール−水混合物の代替的使用も報告されている。最終精製方法では、エタノール（４〜５回）及びアセトンによる多糖類の沈殿が行われた。この方法は、クロロホルムと大量のエタノールを使用するという不便さが伴う（参照： T.P. Pato, Master’s thesis, Instituto de Quimica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2003, p. 95.）。
【００１１】
Ｔａｎｉｚａｋｉ達は、ナイセリア・メニンギティディスＣ多糖類の精製プロセスを報告し、ここで、フェノール抽出は、プロテイナーゼＫ、ナガルス、及びトリプシンの混合物を使用したプロテイナーゼ消化に置き換えられ； 超遠心分離の代わりに、中空繊維１００ｋＤａカットオフでの接線限外濾過； その後、低分子量タンパク質及びリポ多糖（ＬＰＳ）を除去するために、１００ｋＤａカットオフ膜を使用したダイアフィルトレーションが０．５％デオキシコール酸を含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で行われた。上記の改変法を用いたのにも関わらず、単離された多糖類調製物は、それぞれ、２％（ｗ／ｗ）及び１．５％（ｗ／ｗ）のタンパク質及び核酸値を含んでいた（参照： Tanizaki et al; Journal of Microbiological Methods Volume 27, Issue 1, September 1996, Pages 19-23 & Goncalves et al 2007;Formatex; Communicating Current Research and Educational Topics and Trends in Applied Microbiology）。
【００１２】
ＴＰ Ｐａｔｏ ｅｔ ａｌ（２００６）は、細胞を除去するための培養物の連続流遠心分離； 接線濾過（１００ｋＤａカットオフ）による上清濃縮； ０．５％ ＤＯＣの添加、３０分間の５５℃への加熱及び接線濾過（１００ｋＤａカットオフ）； 陰イオン交換クロマトグラフィー（ソース１５Ｑ）及びサイズ排除クロマトグラフィー（セファロースＣＬ−４８）を含むナイセリア・メニンギティディスＣ多糖類の改変精製プロセスを開示した（T.P. Pato et al. / J. Chromatogr. B 832 (2006) 262-267）。
【００１３】
ＵＳ７４９１５１７Ｂ２は、ナイセリア・メニンギティディスＣ多糖類の精製中の不純物を除去するためのＣＴＡＢ、エタノール、プロテイナーゼＫ、活性炭及びゲル濾過の仕様を開示する。しかしながら、この多段階プロセスにより、多糖類の回収が損なわれ、活性炭を使用すると、望ましくない進出物が生じる可能性がある。
【００１４】
ＷＯ２０１７００６３４９は、Ｎ．メニンギティディスから採取した抽出物からタンパク質混入物を除去するための酢酸亜鉛／硫酸アンモニウム／クエン酸ナトリウムの仕様を開示する。また、残留タンパク質及び／又は核酸物質の分解のためのベンゾナーゼ、プロテイナーゼＫ又はナルガーゼのような酵素の使用、その後のクロマトグラフィー精製についても開示する。
【００１５】
ＷＯ２０１５１２８７９８Ａ１は、ナイセリア・メニンギティディスＣ多糖類から不純物を除去するプロセスを開示する。当該プロセスは、デオキシコール酸又はＨＥＰＥＳ等のアニオン性界面活性剤の存在下で５０〜６０℃でのインキュベーション、５０℃で０．５〜１．５Ｍ ＮａＯＨを使用した３０分〜１０時間の粗多糖類の脱アセチル化、及びダイアフィルトレーション及び疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によるさらなる精製を採用する。
【００１６】
Ｔｉａｎ達は、ＣＴＡＢ、エタノール、ＤＯＣ、Ｃａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅ（マルチモーダル陰イオン交換クロマトグラフィー）、Ｃａｐｔｏ ＤＥＡＥ（弱アニオン性）及びＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５の使用を含むナイセリア・メニンギティディス血清型Ｃ、Ｗ及びＹ多糖類の精製プロセスを開示し、ここで、エンドトキシン含有量は、２５ＥＵ／ｍｇ未満、タンパク質含有量は、１０ｍｇ／ｇ未満、核酸含有量は、１〜７ｍｇ／ｇの間である（参照： Tian et al 2013 GE Healthcare; Application note, 29216880 AA）。
【００１７】
多段階プロセスであるＧｏｔｓｃｈｌｉｃｈの手順は、産物回収の大幅な損失、言い換えると、約３７％の損失をもたらす。また、フェノールのような化学物質を使用すると、多糖類又はタンパク質担体に不要な構造変化が生じ、望ましくないフェノール系毒性廃棄物が生じる可能性もある。
【００１８】
ＵＳ７４９１５１７Ｂ２、ＷＯ２０１７００６３４９及びＴＰ Ｐａｔｏ ｅｔ ａｌ（２００６）の手順では、タンパク質及び核酸混入物の分解に役立つ酵素を使用している、しかしながら、酵素及び加水分解物の除去は、困難な作業であり、目的の産物が失われる可能性がある。さらに、規制当局は、プリオンによる感染のリスクがあるため、人間向け製品での動物酵素の使用を制限している。酵素の使用は、高いコストという事実に加えて、ｃＧＭＰフレームワークにより多くの規制上の問題、例えば、酵素の由来（動物又は組換え由来）、異なるベンダー及びロット間の酵素活性の変動等をもたらす。
【００１９】
ＷＯ２０１７００６３４９及びＵＳ４６８６１０２Ａは、タンパク質及び核酸汚染物質の沈殿のために硫酸アンモニウムの使用を開示する。しかしながら、時々、莢膜多糖も沈殿し、結果として全多糖類が失われる。
【００２０】
デオキシコール酸ナトリウム（ＤＯＣ）は、マイルドな界面活性剤であり、多糖類精製で最も一般的に使用される界面活性剤の１つである。コアステロイド構造を有するデオキシコール酸ナトリウムは、変性が少なく、可溶化強度が制限され、化学王増に影響を与えることなくエンドトキシンを破壊する。従って、デオキシコール酸ナトリウムを除去すると、エンドトキシンは、生物活性を回復する。また、ＤＯＣベースの手順は、多糖類、特にシアル酸含有多糖類からの汚染物質の除去には効率的に機能しない。これは、下流処理中に形成されるリポ多糖−タンパク質結合に対するＤＯＣの界面活性剤活性が弱いためであり、最終的に単離された多糖に高レベルのエンドトキシン及びタンパク質が含まれる可能性がある。さらに、動物由来の製品であるデオキシコール酸ナトリウムは、最終産物に残留していても、規制当局及び特定の宗教団体による製品の不承認につながる可能性がある。
【００２１】
サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー等のクロマトグラフィー技術は、タンパク質及び核酸汚染物質を効果的に除去する細菌性多糖類の単離に使用されている。ＷＨＯの仕様による細菌性多糖類の単離に成功したにも関わらず、クロマトグラフィー技術の使用には、多段階の労力及び時間のかかるサンプル調製が含まれ、スケーラビリティの問題も含み、莢膜多糖類の回収率が大幅に損なわれるため、工業規模での下流処理に適した低コストの選択肢ではない。
【００２２】
生物学的調製物の下流処理は、総生産コストの２０％〜８０％を占めるため根本原因となり（Ansejo and Patrick, 1990）、新規下流手順の開発は、生産コストを削減し、公衆衛生システムによって全人口に対しワクチンを配布できるようにするために不可欠である。
【００２３】
現在、それらの精製された形態の多糖類を得るために使用される方法は、エタノール等の有機溶媒を使用した界面活性剤処理と採集ブロスの異なる沈殿のいくつかの工程が含まれる。
【００２４】
しかしながら、次の２つの主な制約により、代替の精製方法を探す必要がある。
【００２５】
現在、不純物（タンパク質、核酸及びエンドトキシン）の除去の最初のステップとして、アニオン性界面活性剤デオキシコール酸ナトリウム（ＤＯＣ）が採用されている。ＤＯＣは、コアステロイド構造を有する動物由来の胆汁界面活性剤である。その扱い難い構造により、生体高分子の可溶化強度が制限され、変性能力が低下する。加えて、必要な規制認証を安定的に満たすには、単一の製造供給元／供給者に限定される。
【００２６】
エタノールを大量に消費し、余計な工程（炭濾過）を含めるとプロセスは、面倒で時間と費用がかかる。
【００２７】
より高い多糖類回収率を得るために、細菌の多糖類を精製するための代替の、シンプルで、拡張性があり、費用対効果の高い方法の大きな必要性が残っている。本発明は、細菌性莢膜多糖の単離のための堅牢で手ごろな下流精製プロセスを提供し、ここで、前記プロセスは、エンドトキシン、タンパク質及び核酸不純物の有意な減少をもたらし、それによって、多糖類の高い回収を可能にするとともに、ＷＨＯの仕様に従って所望のＯ−アセチルレベルを維持する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】Ｍｅｎ−Ｃ多糖類のＮＭＲスペクトルを示す。
【図２】Ｍｅｎ−Ｙ多糖類のＮＭＲスペクトルを示す。
【図３】Ｍｅｎ−Ｗ多糖類のＮＭＲスペクトルを示す。
【図４】Ｍｅｎ−Ａ多糖類のＮＭＲスペクトルを示す。
【図５】Ｍｅｎ−Ｘ多糖類のＮＭＲスペクトルを示す。
【発明の概要】
【００２９】
本発明は、細菌の莢膜多糖、より具体的にはＮ．メニンギティディスの莢膜多糖の代替精製プロセスに関する。
【００３０】
当該プロセスは、１００ｋＤａ接線流濾過による収集物の濃縮及びダイアフィルトレーション、それに続く、タンパク質、核酸及びリポ多糖の変性のためのアニオン性界面活性剤及び強アルカリを加えることを含む。生物学的抽出物は、後に細菌性多糖類の遠心分離、ダイアフィルトレーション及びＣＴＡＢベースの沈殿に供される。このプロセスにより、多糖類の回収率が向上し、スケーラブルで非酵素的であり、費用対効果が高く、精製工程の数が少なくなる。前記プロセスは、エンドトキシン、タンパク質及び核酸不純物の有意な減少をもたらし、それによって、多糖類の高い回収率を可能にし、並びに所望のＯ−アセチルレベルを維持する。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
発明の説明
本発明の一般的な態様によれば、目的の細菌血清型の１つは、適切な培地で増殖され、ホルムアルデヒド又は先行技術で一般的に知られている何れかの方法を使用して不活性化され、精製された莢膜多糖の単離のためにさらに下流処理に供される。本発明の目的の莢膜多糖の単離の目的の細菌は、限定されないが、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）等を含む属から選択されるグラム陰性菌から入手され； より好ましくは、莢膜多糖は、ナイセリア・メニンギティディスの血清型によって発現される。本発明の他の態様において、多糖類は、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、クラミジア・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、ウレアプラズマ・ウレアリチカム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）、マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、スタフィロコッカスｓｐｐ．（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、ストレプトコッカスｓｐｐ．（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、グループＡストレプトコッカス（Ｇｒｏｕｐ Ａ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、グループＢストレプトコッカスＩａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖ、ＶＩ、又はＶＩＩＩ（Ｇｒｏｕｐ Ｂ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ Ｉａ, Ｉｂ, ＩＩ, ＩＩＩ, Ｖ, ＶＩ, ｏｒ ＶＩＩＩ）； グループＣストレプトコッカス（Ｇｒｏｕｐ Ｃ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ストレプトコッカス・ヴィリダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｖｉｒｉｄａｎｓ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、ナイセリア・メニンギティディス、ナイセリア・ゴノレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、バシルス・アントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、サルモネラｓｐｐ．（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）、サルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、ビブリオ・コレラエ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、パスツレラ・ペスティス（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｐｅｓｔｉｓ）、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、カンピロバクターｓｐｐ．（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、クロストリジウムｓｐｐ．（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｐ．）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、マイ���バクテリウムｓｐｐ．（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、トレポネーマｓｐｐ．（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｓｐｐ．）、ボレリアｓｐｐ．（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｓｐｐ．）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、レプトスピラｓｐｐ．（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｓｐｐ．）、ヘモフィルス・デュクレイ（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ）、コリネバクテリウム・ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）、ボルデテラ・パータシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ボルデテラ・パラパータシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、シゲラｓｐｐ．（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ．）、エーリキアｓｐｐ．（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｓｐｐ．）、及びリケッチアｓｐｐ．（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｓｐｐ．）ストレプトコッカス・ニューモニエ型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ａ、９Ｆ、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ｆ、１９Ａ、２０、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂ、３８及び４５の多糖類； ナイセリア・メニンギティディス血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｗ１３５、Ｘ、Ｙ、Ｚ、及び２９Ｅの多糖類； Ｈ．インフルエンザｂ型を含む群から誘導され得る。
【００３２】
実験中に使用された生物学的材料は以下の通りである：
多糖類は以下のように単離された：
【表２】
2020518707.tif 000003
【００３３】
非コンジュゲートキャリアタンパク質、すなわち、ＣＲＭ１９７又はＴＴ．ＣＲＭ１９７は、Ｐｆｅｎｅｘ ＵＳＡ製のシュードモナス・フルオレッセンスの組換え株ＣＳ４６３−００３（ＭＢ１０１）に由来する。ＴＴは、インドのヒマーチャルプラデーシュ、カサウリにある国家管理機関のＣＲＩから入手したクロストリジウム・テタニ（ハーバードＮｏ４９２０５）から得られた。ＣＲＩは、オランダのＮＶＩからこの株を入手した。
【００３４】
本発明の第１の実施形態によれば、細菌性莢膜多糖類は、遠心分離を使用して不活性化された採集物から清澄化され、そしてその上清は、１００ｋＤ接線流濾過ユニットを用いてダイアフィルトレーションに供される。当業者は、細菌性莢膜多糖類を濃縮するための遠心分離及びダイアフィルトレーションの代わりに、他の何れかの適切な方法を使用できることを十分に理解している。この実施形態の好ましい態様の１つにおいて、莢膜多糖類は、ナイセリア・メニンギティディス血清型Ａ、Ｃ、Ｗ、Ｙ及びＸに由来する。
【００３５】
本発明の第２の実施形態によれば、第１の実施形態で得られた保持液（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）は、アニオン性界面活性物質／界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ／ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）による処理に供された。アニオン性界面活性剤は、硫酸アルキル、ドデシル硫酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、ドデシルスルホン酸ナトリウム、ｓ−アルキル硫酸ナトリウム、脂肪族ナトリウムアルコールポリオキシエチレンエーテル硫酸塩、オレイル硫酸ナトリウム、Ｎ−オレオイルポリ（アミノ酸）ナトリウム、アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、α−オレフィンスルホン酸ナトリウム、アルキルスルホン酸ナトリウム、α−スルホモノカルボン酸エステル、脂肪酸スルホアルキルエステル、コハク酸塩、アルキルナフタレンスルホン酸、アルカンスルホン酸ナトリウム、リグニンスルホン酸ナトリウム、及びアルキルグリセリルエーテルスルホン酸ナトリウムを含む群から選択される。
【００３６】
好ましくは、前記アニオン性界面活性剤は、アルキル硫酸塩であり、より好ましくは、０．１％〜４％の範囲の最終濃度、より好ましくは１％のドデシル硫酸ナトリウムが保持液に加えられ、室温で２時間攪拌される。ＳＤＳの両親媒性は、タンパク質を破壊するだけではなく、それらを可溶化する強力なカオトロピック剤になる。
【００３７】
第２の実施形態の他の態様において、不活化された採集物は、アニオン性界面活性剤で直接処理され、さらに莢膜多糖類の濃縮に供され、それにより不純物が十分に減少するため、カチオン性界面活性剤を使用する後続の工程が不要となる。
【００３８】
本発明の第３の実施形態によれば、強アルカリが、上記の実施形態から得られた混合物に加えられ、室温１時間連続で攪拌しながらｐＨが９〜１１の間に調整された。前記強アルカリは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、ヒドロキシルアミン、トリエチルアミン及び水酸化リチウムからなる群から選択された。
【００３９】
本発明の第３の実施形態の好ましい態様によれば、前記強アルカリ、すなわち水酸化ナトリウムは、上記実施形態から得られた混合物に５〜２０Ｍの最終濃度で加えられ、室温１時間連続で攪拌しながらｐＨが１０．５に調整された。
【００４０】
本発明の第３の実施形態の他の好ましい態様において、アルカリの代わりに、ＥＤＴＡ及び酢酸ナトリウムが、第２の実施形態から得られた混合物に加えられ、室温１時間連続で攪拌された。
【００４１】
本発明の第４の実施形態によれば、上記実施形態から得られた溶液は、マイルドな有機酸を加えることにより中和された（ｐＨ７．０）。前記マイルドな有機酸は、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸等を含む１つ以上の酸の組み合わせである。中和された混合物に、親水性アルコール、好ましくはエタノールが、３０〜３５％の最終濃度で加えられ、室温にて連続で攪拌しながら数時間インキュベートされた。親水性アルコールは、メタノール、エタノール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、アセトン、ｔ−ブチルアルコールの何れか１つ； 又はそれらの２つ以上の組み合わせから選択され； その濃度は、６５％未満〜９５％超である。
【００４２】
本発明の第５の実施形態によれば、過剰のアニオン性界面活性剤は、溶液から除去された。上記実施形態から得られた溶液は、遠心分離に供され上清が回収された。０．１Ｍカリウム塩が、上清と混合され、溶解後、混合物は、２〜８℃で３時間超インキュベートされた。カリウム塩は、塩化カリウム、酢酸カリウム、硫酸カリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、リン酸カリウム、リン酸水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硝酸カリウム、及び他のカリウム塩の１つ、又はそれらの２つ以上の組み合わせから選択される。この工程は、ドデシル硫酸カリウムの低い溶解度を利用する。カルシウム塩、好ましくはＫＣｌを加えると、溶液中のＳＤＳは、ドデシル硫酸カリウムに変換され、溶解性が低く、沈殿しやすく、結果ＳＤＳが完全に除去される。当業者によって所望の結果を得るために、ＫＣｌの濃度を変更することができることは、非常によく理解されている。本発明のこの実施形態で言及されたプロトコルは、当業者によって要件ごとに修正され得る。
【００４３】
第５の実施形態の他の態様において、ゲル濾過、エタノール沈殿、及びイオン交換樹脂／アンバーライトカラムを使用して、過剰なアニオン性界面活性剤が溶液から除去され得る。
【００４４】
本発明の第６の実施形態によれば、上記実施形態から得られた溶液は、遠心分離に供され、上清が回収された。上清は、０．２μフィルターに通され、保持液は、１００ｋＤａの接線流濾過を介してダイアフィルトレーションされた。
【００４５】
本発明の第７の実施形態によれば、上記実施形態から得られた保持水は、最終濃度２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を使用して、ダイアフィルトレーションされた。その後、カチオン性界面活性剤が、１〜２％の最終濃度まで加えられ、室温、連続で攪拌しながら１時間インキュベートされた。カチオン性界面活性剤は、セチルトリメチルアンモニウム塩、テトラブチルアンモニウム塩、ミリスチルトリメチルアンモニウム塩、及びヘキサジメトリンブロマイドの何れか１つ： 又はそれらの２つ以上の組み合わせから選択される。カチオン性界面活性剤の濃度は、当業者による所望の結果を得るために、０．１％〜０．４％の範囲で変化し得ることがよく理解されている。好ましくは、カチオン性界面活性剤は、ＣＴＡＢである。
【００４６】
本発明の第８の実施形態によれば、上記実施形態から得られた溶液は、遠心分離に供され、沈殿したＣＴＡＢ−多糖類が回収され、３０〜６４％エタノールに溶解された。沈殿した混合物は、溶解していない残留物を除去するためにさらに遠心分離に供され得る。
【００４７】
本発明の第９の実施形態によれば、上記実施形態から得られた上清に、ＮａＣｌが、連続攪拌下で０．１Ｍの最終濃度まで加えられた。沈殿した多糖類は回収され、１Ｍ ＮａＣｌに溶解された後、アルコール沈殿（３０〜６４％）に供された。
【００４８】
本発明の第１０の実施形態によれば、上記実施形態から得られた溶液は、１００ｋＤａの接線流濾過を使用してＷＦＩ（注射用の水）により広範囲に透析濾過され、０．２μフィルターで通され、最終バルクとして−２０℃以下で保存された。
【００４９】
本発明の第１１の実施形態によれば、Ｎ．メニンギティディス血清型Ｃ、Ｗ及びＹの精製莢膜多糖類は、以下の手順によって得られた：
・Ｎ．メニンギティディス血清型Ｃ、Ｗ及びＹのそれぞれは、適切な培地で増殖され、ホルムアルデヒドを使用して不活化された；
・ドデシル硫酸ナトリウムが、この不活化採集物に最終濃度１％まで加えられ、室温で２時間攪拌された；
・水酸化ナトリウムが、最終濃度５〜２０ｍＭになるまで加えられ、室温１時間、連続で攪拌しながらｐＨ１０．５に調整された；
・上記工程より得られた溶液は、マイルドな有機酸、すなわち酢酸を加えることによって中和された；
・この中和溶液に、エタノールが、最終濃度３０〜３５％になるように加えられ、連続攪拌で数時間インキュベートされた；
・上記工程で得られた溶液は、遠心分離され、上清が回収された；
・０．１Ｍ ＫＣＬが前記上清に加えられ、２〜８℃で３時間以上インキュベートされた。
・上記工程で得られた溶液は、遠心分離に供され、上清が回収された。上清は、０．２μフィルターに通されＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を使用して１００ｋＤａＭＷＣＯフィルター接線流濾過により保持液がダイアフィルトレーションされた。
・上記の工程で得られた保持液を保持するために、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液が、最終濃度２５ｍＭまで加えられた。さらに、ＣＴＡＢが、最終濃度２％まで加えられ、室温で１時間以上インキュベートされた。
・上記工程から得られた溶液は遠心分離され、沈殿物が回収され、３０〜６４％エタノールに溶解された。溶解した混合物はさらに、溶解していない残留物を除去するために遠心分離に供された。
・上記工程から得られた上清に、ＮａＣｌが、最終濃度０．１〜０．３Ｍまで加えられた。沈殿したＰＳは、１Ｍ ＮａＣｌも溶解され、その後、３０〜６４％のアルコール沈殿が行われた。
・上記工程で得られた溶液は、１００ｋＤａ接線流濾過を使用してＷＦＩに対して広範囲にダイアフィルトレーションされ、０．２μフィルターに通され、最終バルクとして−２０℃で保存された。
【００５０】
本発明の第１２の実施形態によれば、第１１の実施形態で言及した精製プロセスは、以下を提供する：
・回収率６０〜８０％でのＮ．メニンギティディス血清型Ｃ多糖類、ここで、エンドトキシン含有量は、５０ＥＵ／ｍｇ未満、タンパク質含有量は、０．５０％未満、核酸含有量は、０．２０％未満である。
・回収率６０〜８０％でのＮ．メニンギティディス血清型Ｙ多糖類、ここで、エンドトキシン含有量は、５０ＥＵ／ｍｇ未満、タンパク質含有量は、０．５０％未満、核酸含有量は、０．３０％未満である。
・回収率６０〜８０％でのＮ．メニンギティディス血清型Ｗ多糖類、ここで、エンドトキシン含有量は、５０ＥＵ／ｍｇ未満、タンパク質含有量は、０．５０％未満、核酸含有量は、０．２０％未満である。
【００５１】
本発明の第１３の実施形態によれば、Ｎ．メニンギティディス血清型Ａ及びＸの精製莢膜多糖は、以下の手順に従って得られた：
・Ｎ．メニンギティディス血清型Ａ及びＸは、それぞれ適切な培地で増殖され、ホルムアルデヒドを用いて不活化された；
・ドデシル硫酸ナトリウムが、この不活化採集物に最終濃度１％まで加えられ、室温で２時間攪拌された；
・ＥＤＴＡ及び酢酸ナトリウムが、不活化された採集物に最終濃度１％まで加えられ、室温で２時間攪拌された；
・エタノールが、最終濃度３０〜３５％まで加えられ、連続で攪拌しながら数時間インキュベートされた。
・上記工程から得られた溶液を遠心分離し、上清が回収された。
・０．１Ｍ ＫＣＬが上清に加えられ、２〜８℃で３時間超インキュベートされた。
・上記工程から得られた溶液を遠心分離し、上清が回収された。上清が０．２μフィルターに通され、保持液が、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを用いて１００ｋＤａ ＭＷＣＯ接線流濾過で濃縮及びダイアフィルトレーションされた。
・ＣＴＡＢが、最終濃度１〜２％まで加えられ； 室温で１時間以上インキュベートされた。
・上記工程から得られた溶液を遠心分離し、沈殿物が回収され、３０〜６４エタノールに溶解された。溶解された混合物は、さらに、溶解していない残留物を除去するために遠心分離に供された。
・上記工程から得られた上清に、ＮａＣｌを最終濃度０．１〜０．３Ｍまで加えた。沈殿したＰＳは、１Ｍ ＮａＣｌに溶解され、３０〜６４％のアルコールによる沈殿が行われた。
・上記工程から得られた溶液は、１００ｋＤａ接線流濾過を用いてＷＦＩに対して広範囲にダイアフィルトレーションされ、０．２μフィルターに通され、最終バルクとして−２０℃以下で保存された。
【００５２】
本発明の第１４の実施形態によれば、第１３の実施形態で言及した精製プロセスは、以下を提供する：
・回収率６０〜８０％でのＮ．メニンギティディス血清型Ａ多糖類、ここで、エンドトキシン含有量は、５０ＥＵ／ｍｇ未満、タンパク質含有量は、０．５０％未満、核酸含有量は、０．２０％未満である。
・回収率６０〜８０％でのＮ．メニンギティディス血清型Ｘ多糖類、ここで、エンドトキシン含有量は、５０ＥＵ／ｍｇ未満、タンパク質含有量は、０．５０％未満、核酸含有量は、０．３０％未満である。
【００５３】
本発明の第１５の実施形態によれば、前記精製された多糖類は、キャリアタンパク質にコンジュゲートされた。多糖類とコンジュゲーションに使用されるキャリアタンパク質は、当業者の要件により当該技術分野で知られている何れかのキャリアタンパク質であり得ることが非常によく理解されている。キャリアタンパク質の非特定の例は、限定されないが、ＣＲＭ１９７、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、百日咳トキソイド、Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＴ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＳＴ、シュードモナス・エルギノーサ由来の外毒素Ａ、外膜複合体ｃ（ＯＭＰＣ）、ポリン、トランスフェリン結合タンパク質、ニューモリシン、ニューモコッカル表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）、ニューモコッカル付着タンパク質（ＰｓａＡ）、ニューモコッカル表面タンパク質ＢＶＨ−３及びＢＶＨ−１１、バチルス・アントラシスの防御抗原（ＰＡ）、解毒浮腫因子（ＥＦ）、バチルス・アントラシスの致死因子（ＬＦ）、オボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及びツベルクリンの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）の群由来のキャリアタンパク質を含む。
【００５４】
第１５の実施形態の他の態様において、コンジュゲーション前に、本方法により精製された多糖類は、限定されないが、超音波、マイクロ波、オゾン分解、電離放射線、高圧細胞破壊、ホモジナイザー、マイクロフルイダイザー、酢酸ナトリウム、メタ過ヨウ素ナトリウム、真空加熱等を含む、化学的又は機械的手段によりサイズ調整された。
【００５５】
第１５の実施形態の他の態様において、本方法により精製された多糖類は、還元アミノ化、シアニル化、カルボジイミドコンジュゲーション化学を使用して担体タンパク質にコンジュゲートされ得る。
【００５６】
本発明の第１６の実施形態によれば、免疫原性組成物が調製された。当該組成物は、以下を含む：
（ａ）（ｉ）ナイセリア・メニンギティディス血清型Ａの莢膜多糖及び（ｉｉ）破傷風トキソイドのコンジュゲート；
（ｂ）（ｉ）ナイセリア・メニンギティディス血清型Ｃの莢膜多糖及び（ｉｉ）ＣＲＭ１９７のコンジュゲート；
（ｃ）（ｉ）ナイセリア・メニンギティディス血清型Ｙの莢膜多糖及び（ｉｉ）ＣＲＭ１９７のコンジュゲート；
（ｄ）（ｉ）ナイセリア・メニンギティディス血清型Ｗ１３５の莢膜多糖及び（ｉｉ）ＣＲＭ１９７のコンジュゲート；
（ｅ）（ｉ）ナイセリア・メニンギティディス血清型Ｘの莢膜多糖及び（ｉｉ）破傷風トキソイドのコンジュゲート。
【００５７】
本発明の第１７の実施形態によれば、エンドトキシン含有量は、「カイネティック濁度滴定アッセイ（Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｔｕｒｂｉｄｏｍｅｔｒｉｃ Ａｓｓａｙ）（ＫＴＡ）」又はウサギ発熱性試験により測定され得； タンパク質含有量は、ローリー法により測定され得； 及び核酸含有量は、分光光度法により測定され得る。エンドトキシン、タンパク質、及び核酸含有量の定量に、他の何れかの適切な方法が使用され得ることが、十分に理解されている。
【００５８】
第１７の実施形態の他の態様において、ナイセリア・メニンギティディス血清型Ａ、Ｃ、Ｗ、Ｙ及びＸの精製多糖類の分子サイズの配分は、サイズ除去高速液体クロマトグラフィーを使用して行われ得る。
【００５９】
第１６の実施形態の他の態様において、Ｏアセチル含有量は、比色分析へストリンアッセイを使用して測定され得る。
【実施例】
【００６０】
実施例１： 細菌性多糖類の生産（Ｎ．メニンギティディス血清型Ｃの上流プロセス）
下記の発酵プロセスを使用して、多糖類が生産された。
発酵スケール： ３００リットル
・発酵槽の定置洗浄（ＣＩＰ）、圧力保持試験及び定置滅菌（ＳＩＰ）が実施された。
・ＳＩＰの完了後、滅菌発酵培地が、無菌的に発酵槽に移された。
・培地組成
血清型Ｃ発酵培地
【表３】
2020518707.tif 000004
【００６１】
血清型Ｃフィード培地（ｆｅｅｄ ｍｅｄｉａ）
【表４】
2020518707.tif 000005
【００６２】
・溶存酸素レベルが、望ましいレベルに調整された。
・発酵培地に培養用生物が接種された。発酵槽は、１１〜１４時間、フェドバッチモードで操作された。
・培養液が５９０ｎｍで目的のＯＤに達した後、ホルムアルデヒドを使用して発酵槽の培養液が不活化された。
・インキュベーションの完了後、温度が、１０±５℃に設定され、遠心分離を使用して細胞が分離された。
・上清が回収され、深層濾過に供された； 清澄化された収集物は、０．２μフィルターで濾過され、精製のために移された。
【００６３】
結果：
【表５】
2020518707.tif 000006
【００６４】
実施例２： 莢膜多糖の生産（Ｎ．メニンギティディス血清型Ａ、Ｗ、Ｘ及びＹの上流プロセス）
実施例１で言及したプロトコルを使用して、Ｎ．メニンギティディス血清型Ａ、Ｗ、Ｘ及びＹの莢膜多糖が生産された。
【００６５】
血清型Ｙ発酵培地
【表６】
2020518707.tif 000007
【００６６】
血清型Ｙフィード培地
【表７】
2020518707.tif 000008
【００６７】
血清型Ｗ発酵培地
【表８】
2020518707.tif 000009
【００６８】
血清型Ｗフィード培地
【表９】
2020518707.tif 000010
【００６９】
結果
【表１０】
2020518707.tif 000011
【００７０】
１〜６ｇｍ／ｌのＰＳ（多糖類）含有量の試験で得られた清澄化された収穫物が、得られた。清澄化された収穫物は、さらに精製に供された。
【００７１】
実施例３： ＳＤＳを使用した莢膜多糖の精製（Ｎ．メニンギティディス血清型Ｃの下流プロセス）及びそれに続くエタノール沈殿。
実施例１に従って得られた粗多糖類は、さまざまな濃度のＳＤＳと混合された。次いで、エタノールが加えられ、多糖類が沈殿し始める濃度よりも１０％低い最終濃度にした。これは、さらに濾過に供された。
【００７２】
試験されたＳＤＳ濃度：
０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％及び１０％。
上記の濃度のＳＤＳは全て、不純物の低減に関して有効性を示した。４％ＳＤＳを超えると、不純物プロファイルに有意な差は観察されなかった。
【００７３】
最適な不純物の減少、特にタンパク質の減少は、１％ＳＤＳで観察された。
【００７４】
精製された多糖類は、ＷＨＯの制限が、１００ＥＵ／μｇ未満であるのに対し、１００ＥＵ／μｇ超の多糖類エンドトキシン不純物を含んでいた。
【００７５】
実施例４： 莢膜多糖の精製（Ｎ．メニンギティディス血清型Ｃの下流プロセス）
プロトコル：
５リットル及び３００リットルの発酵スケールの２つの異なるセットの実験が実施された。
下記の精製プロセスを使用して、多糖類が精製された。
・実施例１に従って得られた粗多糖類が、容器に入れられた。
・１００ｋＤａカセットを使用したＴＦＦにより、粗多糖類が、３〜６倍濃縮された。
・ドデシル硫酸ナトリウムが、この不活化収集物に最終濃度１％まで加えられ、室温で２時間攪拌された；
・水酸化ナトリウムが、最終濃度８〜２０ｍＭまで加えられ、室温で１時間連続的に攪拌しながらｐＨ１０．５に調整された。
・上記工程で得られた溶液は、酢酸を加えることにより中和された。
・この中和液に、エタノールが、最終濃度３３％まで加えられ、連続的に攪拌しながら数時間インキュベートされた。
・上記工程で得られた溶液は、遠心分離され、上清が回収された。
・エタノール濃度が、４０％に上げられた。
・０．１Ｍ ＫＣＬが上清に加えられ、２〜８℃で３時間インキュベートされた。
・上記工程で得られた溶液が、遠心分離に供され、上清が回収された。エタノール濃度を最終濃度６５％に上げると多糖類が沈殿した。
・多糖類ペレットが、１Ｍ ＮａＣｌに溶解された。上清が、０．２μフィルターに通され、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を使用して１００ｋＤａの接線流濾過で保持液をダイアフィルトレーションし、精製多糖類を得た（ステージＩ）。
・ＣＴＡＢを最終濃度２％で追加し、室温で１時間インキュベートされた。
・上記工程で得られた溶液が遠心分離され、沈殿物が回収され、９６％エタノールに溶解された。溶解した混合物はさらに、溶解していない残留物を除去するために遠心分離に供された。
・上記工程で得られた上清に、ＮａＣｌが、最終濃度０．２Ｍまで加えられた。沈殿したＰＳは、１Ｍ ＮａＣｌに溶解され、その後、６５％アルコールを使用してＰＳ沈殿を行った。
・上記工程で得られた溶液が、０．５Ｍ ＮａＣｌに対して広範囲にダイアフィルトレーションされ、次いでＷＦＩに対して１００ｋＤの接線流濾過を使用し、０．２μフィルターに通され、最終バルクとして−２０℃で保存された。
【００７６】
結果：
【表１１】
2020518707.tif 000012
【００７７】
５リットル及び３００リットルの発酵スケールの２つの異なるセットの実験が実施された。
【００７８】
アニオン性界面活性剤とアルカリの併用は、不純物プロファイルの減少に大きな影響を与えることが観察された。精製ステージＩ及びステージＩＩの不純物レベルは、Ｍｅｎ−ｃ多糖類のＷＨＯ仕様の制限を大きく下回っている。
【００７９】
５リットル及び３００リットルスケールでは、タンパク質不純物（％）＝１％未満； 核酸不純物（％）＝０．３％未満； エンドトキシン不純物（ＰＳのＥＵ／μｇ）＝４０ ＰＳのＥＵ／μｇ未満である。
【００８０】
スケール及び精製ステージＩ及びステージＩＩの両方で、精製多糖類の回収率は、粗サンプルと比較して６０％を超えた。
【００８１】
実施例５： 莢膜多糖の精製（Ｎ．メニンギティディス血清型Ｗ及びＹの下流プロセス）
プロトコル：
５リットル及び３００リットルの発酵スケールの２つの異なるセットの実験が実施された。
【００８２】
下記の精製プロセスを使用して、多糖類が精製された。
・実施例２に従って得られた粗多糖類が容器に入れられた。
・１００ｋＤａカセットを使用したＴＦＦにより、粗多糖類が３〜６倍濃縮された。
・ドデシル硫酸ナトリウムが、この不活性化採集物に最終濃度１％まで加えられ、室温で２時間攪拌された；
・水酸化ナトリウムが、最終濃度８〜２０ｍＭまで加えられ、室温で１時間連続的に攪拌しながらｐＨ１０．５に調整された。
・上記工程で得られた溶液は、酢酸を加えることにより中和された。
・この中和液に、エタノールが、最終濃度３３％まで加えられ、連続的に攪拌しながら数時間インキュベートされた。
・上記工程で得られた溶液は、遠心分離され、上清が回収された。
・０．１Ｍ ＫＣＬが上清に加えられ、２〜８℃で約８時間インキュベートされた。
・上記工程で得られた溶液が、遠心分離に供され、上清が回収された。
・上清が、０．２μフィルターに通され、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を使用して１００ｋＤａの接線流濾過で保持液をダイアフィルトレーションし、精製多糖類を得た（ステージＩ）。
・ＣＴＡＢを最終濃度２％で追加し、室温で１時間インキュベートされた。
・上記工程で得られた溶液が遠心分離され、沈殿物が回収され、９６％エタノールに溶解された。溶解した混合物はさらに、溶解していない残留物を除去するために遠心分離に供された。
・上記工程で得られた上清に、ＮａＣｌが、最終濃度０．２５Ｍまで加えられた。沈殿したＰＳは、１Ｍ ＮａＣｌに溶解され、その後、６５％アルコールを使用してＰＳ沈殿を行った。
・上記工程で得られた溶液が、１００ｋＤａ接線流濾過を使用してＷＦＩに対して広範囲にダイアフィルトレーションされ、０．２μフィルターに通され、最終バルクとして−２０℃で保存された（ステージＩＩ）。
【００８３】
結果：
【表１２】
2020518707.tif 000013
【００８４】
【表１３】
2020518707.tif 000014
【００８５】
５リットル及び３００リットルの発酵スケールの２つの異なるセットの実験が実施された。
【００８６】
比較すると、精製ステージＩ及びステージＩＩの不純物のレベルは、Ｍｅｎ−Ｙ及びＭｅｎ−Ｗ多糖類のＷＨＯの仕様の限界を大幅に下回っている。
【００８７】
アニオン性界面活性剤とアルカリの併用は、不純物プロファイルの減少に大きな影響を与えることが観察された。精製ステージＩ及びステージＩＩの不純物レベルは、Ｍｅｎ−Ｃ多糖類のＷＨＯの仕様の限界を大幅に下回っている。
【００８８】
５リットル及び３００リットルスケールでは、タンパク質不純物（％）＝３．５％未満； 核酸不純物（％）＝１．５％未満； エンドトキシン不純物（ＰＳのＥＵ／μｇ）＝６０ ＰＳのＥＵ／μｇ未満である。
【００８９】
スケール及び精製ステージＩ及びステージＩＩの両方で、精製多糖類の回収率は、粗サンプルと比較して６０％を超えた。
【００９０】
実施例６： 莢膜多糖の精製（Ｎ．メニンギティディス血清型Ａ及びＸの下流プロセス）
プロトコル：
５リットル及び３００リットルの発酵スケールの２つの異なるセットの実験が実施された。
【００９１】
下記の精製プロセスを使用して、多糖類が精製された。
・実施例２に従って得られた粗多糖類が容器に入れられた。
・１００ｋＤａカセットを使用したＴＦＦにより、粗多糖類が３〜６倍濃縮された。
・ドデシル硫酸ナトリウムが、この不活性化採集物に最終濃度１％まで加えられ、室温で２時間攪拌された；
・室温で１時間連続的に攪拌しながら、酢酸ナトリウム、ＥＤＴＡ及びドデシル硫酸ナトリウムが、それぞれ、６％、２ｍＭ及び１％の最終濃度まで加えられた。
・上記工程で得られた溶液が遠心分離され、上清が回収された。
・０．１Ｍ ＫＣＬが上清に加えられ、２〜８℃で約３時間インキュベートされた。
・上記工程で得られた溶液が遠心分離に供され、上清が回収された。
・上清が、０．２μフィルターに通され、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を使用して１００ｋＤａの接線流濾過で保持液をダイアフィルトレーションし、精製多糖類を得た（ステージＩ）。
・ＣＴＡＢを最終濃度２％で追加し、室温で１時間インキュベートした。
・上記工程で得られた溶液が遠心分離され、沈殿物が回収され、９６％エタノールに溶解された。溶解した混合物はさらに、溶解していない残留物を除去するために遠心分離に供された。
・上記工程で得られた上清に、ＮａＣｌが、最終濃度０．２Ｍまで加えられた。沈殿したＰＳは、１Ｍ ＮａＣｌに溶解され、その後、６５％アルコールを使用してＰＳ沈殿を行った。
・上記工程で得られた溶液が、１００ｋＤａ接線流濾過を使用してＷＦＩに対して広範囲にダイアフィルトレーションされ、０．２μフィルターに通され、最終バルクとして−２０℃で保存された（ステージＩＩ）。
【００９２】
結果：
【表１４】
2020518707.tif 000015
【００９３】
【表１５】
2020518707.tif 000016
【００９４】
比較すると、精製ステージI及びステージIIの不純物レベルは、Ｍｅｎ−Ａ及びＭｅｎ−Ｘ多糖類のＷＨＯの仕様の限界を大幅に下回っている。
【００９５】
アニオン性界面活性剤の使用は、不純物プロファイルの減少に大きな影響を与えることが観察された。精製ステージＩ及びＩＩの不純物レベルは、Ｍｅｎ−Ａ及びＭｅｎ−Ｃ多糖類のＷＨＯの仕様の限界を大幅に下回っている。
【００９６】
３００リットルスケールでは、タンパク質不純物（％）＝２．５％未満； 核酸不純物（％）＝１％未満； エンドトキシン不純物（ＰＳ中のＥＵ／μｇ）＝４０ ＰＳ中のＥＵ／μｇ未満である。
【００９７】
スケール並びに精製ステージＩ及びステージＩＩの両方で粗サンプルと比較して、血清型Ｘの精製多糖類の回収率は、６０％を超え、血清型Ａの多糖類回収率は５０％を超えた。
【００９８】
実施例７：
単離された多糖類（ＰＳ）の構造的完全性
ＮＭＲスペクトルについては、図１〜５を参照。
【００９９】
Ｎ．メニンギティディス血清型Ａ、Ｃ、Ｗ、Ｙ及びＸの単離された多糖類の構造的完全性は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）を使用して検証された。
【０１００】
記録されたＮＭＲスペクトルは、同等であり、血清型Ａ、Ｃ、Ｗ、及びＹの部分的にＯ−アセチル化された髄膜炎菌性の多糖類; 及び血清型ＸのＮ−アセチル化多糖としての同一性を確認した。
【０１０１】
実施例８
デオキシコール酸ナトリウム（ＤＯＣ）ベースの精製プロセス及び請求項の多糖類の精製プロセスの比較分析
デオキシコール酸ナトリウム（ＤＯＣ）ベースのプロセス「髄膜炎菌性の多糖類の精製の改良法、Ｔａｎｉｚａｋｉ ｅｔ ａｌ（Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ａｎｄ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ Ｖａｃｃｉｎｅｓ， Ｐｏｓｔｅｒ ７９， ｈｔｔｐ：／／ｎｅｉｓｓｅｒｉａ．ｏｒｇ／ｉｐｎｃ／１９９６／Ｎｅｉｓ１９９６−ｃｈａｐ４．ｐｄｆ）」が以下のように最適化された：
１００ｋＤ収集物； ＤＯＣ＋ＥＤＴＡ＋ＮａＯＡｃ+エタノール（４０％）処理； 遠心分離、上清の回収及び０．２μ濾過； 濃縮及びダイアフィルトレーション； 室温でのＣＴＡＢ（３％）処理； ＣＴＡＢ−ＰＳペレットの遠心分離及び回収； ９６％エタノールでのＣＴＡＢ−ＰＳペレットの溶解及び０．１Ｍ ＮａＣｌによる沈降； 沈殿物の４０％エタノールでの溶解及び１Ｍ ＮａＣｌの添加（２〜８℃）； 遠心分離及び上清の回収； カーボン濾過； エタノール濃度の増加によるＰＳの沈殿； ＷＦＩでのＰＳペレットの溶解、ＷＦＩでの濃縮及びダイアフィルトレーション、０．２μ濾過後の−２０℃での保存。
【０１０２】
ＤＯＣベースのプロセスは、ワクチン抗原として使用される多糖類の精製のために、業界全体で広く使用されている。
【０１０３】
ＤＯＣベースの方法によって得られた多糖類の不純物プロファイルは、本発明の請求項のプロセスと比較された。
【０１０４】
結果
【表１６】
2020518707.tif 000017
【０１０５】
ＳＤＳベースの本発明の方法及びＤＯＣベースの方法は、血清型Ａ及びＣで同様の結果を示したが、血清型Ｗ、Ｙ及びＸのＳＤＳ方法は、ＤＯＣ方法と比較して向上した最終回収率を示した。
【０１０６】
上記結果からわかるように、修正されたＳＤＳプロセスは、操作の容易さだけではなくＤＯＣが動物由来の構成でありＨＡＬＡＬに準拠していない等のいくつかの他の利点に関しての両方での明確な利点を有する。ＤＯＣは、世界中の単一のベンダーによって製造及び供給されているが、ＳＤＳは合成界面活性剤であり、ＨＡＬＡＬ認定を受けており、世界中で複数のサプライヤーが利用可能である。ＤＯＣは、化学組成に影響を与えることなくエンドトキシンを分解し、界面活性が除去されると生物学的活性を取り戻すことが可能であるが、ＳＤＳは両親媒性の性質及び高い凝集数によりタンパク質を変性及び可溶化し、また、エンドトキシンを不可逆的にモノマー単位まで破壊する。
【０１０７】
ＳＤＳを使用することで、化学物質及び消耗品（エタノール、限外濾過フィルター、カーボンフィルター等）の消費量を削減できるという明確な利点がある。さらに、ＳＤＡの代替品としての使用は、多糖類の構造的完全性に対して非侵襲的であった。
【０１０８】
実施例９：
以下に示す免疫原性組成物が調製され、免疫原性について試験された。
組成物は以下を含む：
（ａ）（ｉ）ナイセリア・メニンギティディス血清型Ａ及び（ｉｉ）破傷風トキソイドのコンジュゲート；
（ｂ）（ｉ）ナイセリア・メニンギティディス血清型Ｃ及び（ｉｉ）ＣＲＭ１９７のコンジュゲート；
（ｃ）（ｉ）ナイセリア・メニンギティディス血清型Ｙ及び（ｉｉ）ＣＲＭ１９７のコンジュゲート；
（ｄ）（ｉ）ナイセリア・メニンギティディス血清型Ｗ１３５及び（ｉｉ）ＣＲＭ１９７のコンジュゲート； 及び
（ｅ）（ｉ）ナイセリア・メニンギティディス血清型Ｘ及び（ｉｉ）破傷風トキソイドのコンジュゲート。
【０１０９】
結果：
免疫原性組成物は、免疫原性であることが見出された。
【０１１０】
本発明の利点：
当該プロセスにより、エンドトキシン、タンパク質及び核酸の不純物が大幅に減少し、それによって、所望のＯ−アセチルレベルの莢膜多糖の回収率が向上する。上記結果からわかるように、請求項のプロセスには、操作の容易さという点、並びに以下に示す他のいくつかの利点等の明確な利点を有する。
・規制の問題： ＤＯＣは、動物由来の成分であり、ＨＡＬＡＬに準拠していない。ＳＤＳは、合成界面活性剤であり、ＨＡＬＡＬ認定を受けており、複数のサプライヤーが世界中で利用可能である。
・機能上の問題： ＤＯＣは、化学組成に影響を与えることなくエンドトキシンを分解し、界面活性剤が除去されると生物学的活性を取り戻すことが可能であるが、ＳＤＳは両親媒性の性質及び高い凝集数によりタンパク質を変性及び可溶化し、また、エンドトキシンを不可逆的にモノマー単位まで破壊する。
・ＳＤＳを使用することで、化学物質及び消耗品（エタノール、限外濾過フィルター、カーボンフィルター等）の消費量を削減できるという明確な利点がある。
・本特許出願の発明プロセスにより、他の細胞不純物が大幅に減少する。さらに、当該プロセスにより、上流及び下流の処理中に使用された試薬を効果的に除去できる。
・さらに、本特許出願の発明プロセスは、多糖類の構造的完全性に非侵襲的であり、それによって、免疫原性を維持する。
【０１１１】
開示された発明の原理が適用され得る多くの取り得る実施形態に鑑みて、図示された実施形態は、本発明の好ましい例に過ぎず、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではないことを認識されたい。
【図１】
2020518707.tif 000018
【図２】
2020518707.tif 000019
【図３】
2020518707.tif 000020
【図４】
2020518707.tif 000021
【図５】
2020518707.tif 000022
【国際調査報告】
2020518707.tif 000023
2020518707.tif 000024
2020518707.tif 000025
2020518707.tif 000026