(57)【要約】  本発明は、アトロロシンと呼ばれる新規の類の天然のアザフィロン色素、及びそれらの製造方法を提供する。アトロロシンの製造方法は、好ましくはタラロミセスアトロロセウス種（the species Talaromyces atroroseus）である、タラロミセス属（the genus Talaromyces）に属する真菌種を使用する発酵による製造を含む。食料品用及び／又は非食料品用及び化粧品用着色剤としての、新規のアトロロシン色素の使用。
2020518267.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の工程：
ａ．タラロミセス属（the genus Talaromyces）の種の菌糸又は胞子を提供すること、
ｂ．液体成長培地中で（ａ）の菌糸又は胞子を培養すること、
ｃ．工程ｂ）における前記培養の間に製造されるアトロロシン色素を回収すること、及び
ｄ．場合により、前記アトロロシン色素を単離すること、
を含む、発酵によるアトロロシン色素を製造する方法であって、
しかも、工程（ｂ）における成長培地のｐＨが、４〜６の間に維持され；
しかも、工程（ｂ）における前記液体成長培地中の唯一の窒素源が、単一のアミノ酸、ペプチド、アミノ糖、及び一級アミンから成る群から選択される１つの化合物であり、そして、
しかも、アトロロシン色素が、式Ｉの構造を有する、上記の製造方法：
【化Ｉ】
2020518267.tif 000014
上記の式中、Ｎ−Ｒは、アミノ酸、ペプチド、アミノ糖、及び一級アミンから成る群から選択され、そして、炭素２と炭素３との間の二重結合の配置は、ｃｉｓである。
【請求項２】
下記の追加の工程：
ａ’）予備液体成長培地中で（ａ）の菌糸又は胞子を培養することであって、しかも、唯一の窒素源が無機窒素源であり、ＮＯ３−の濃度が２０ｍＭ以下であり、そして、ＮＯ３−の濃度が５ｍＭ未満に枯渇するまで培養を続けること；
を含み、
しかも、前記工程（ａ’）の後が工程（ｂ）である、請求項１に記載の発酵によるアトロロシン色素を製造する方法。
【請求項３】
工程（ａ’）における唯一の窒素源が、ＫＮＯ３及びＮａＮＯ３から成る群から選択される無機窒素源である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｂ）における唯一の窒素源が、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパルテート、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタメート、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、及びＬ−オルニチン：から成る群から選択される単一のアミノ酸である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
種が、タラロミセスアトロロセウス（Talaromyces atroroseus）である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
予備液体成長培地及び液体成長培地が、合成のものであり、そして、塩、微量金属、及び炭素源を含み、
しかも、塩が、ＫＨ２ＰＯ４、ＮａＣｌ、ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、ＫＣｌ、及び、ＣａＣｌ２．Ｈ２Ｏであり、そして、微量金属が、ＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ、Ｎａ２Ｂ４Ｏ７．１０Ｈ２Ｏ、ＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、ＭｎＳＯ４．Ｈ２Ｏ、Ｎａ２ＭｏＯ４．２Ｈ２Ｏ、及びＺｎＳＯ４．７Ｈ２Ｏである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
炭素源が、グルコース、スクロース、マルトース、可溶性デンプン、ビートまたはサトウキビ糖蜜、モルト、及び、それらの少なくとも２つのいかなる組合せの中から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
発酵が、好気的条件下でバッチ又はフェッドバッチ発酵を使用して実施される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
工程（ｂ）における液体成長培地が、４．０〜５．５のｐＨの範囲内に維持される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
式Ｉの構造を有する、アトロロシン色素：
【化Ｉ】
2020518267.tif 000015
上記の式中、Ｎ−Ｒは、アミノ酸、ペプチド、アミノ糖、及び一級アミンから成る群から選択され、そして、炭素２と炭素３との間の二重結合の配置は、ｃｉｓであり、
しかも、アミノ酸が、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパルテート、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタメート、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、及びＬ−オルニチン：から成る群から選択される。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか１項の方法によって製造される、請求項１０に記載のアトロロシン色素。
【請求項１２】
食品用、非食品製品用、及び化粧品用のいずれか１つの着色剤としての、請求項１０又は１１に記載のアトロロシン色素の使用。
【請求項１３】
生成物が、食品、非食品製品、及び化粧品の中から選択される、請求項１０又は１１に記載のアトロロシン色素を含む生成物。
【請求項１４】
生成物を着色するためのキットであって、しかも、キットが、請求項９又は１０に記載の少なくとも１つのアトロロシン色素を含み、しかも、色素が容器中に供給されており、しかも、生成物が、食品、非食品製品、及び化粧品の中から選択される、前記のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、アトロロシンと呼ばれる新規の類の天然のアザフィロン色素、及びそれらの製造方法を提供する。アトロロシンの製造方法は、好ましくはタラロミセスアトロロセウス種（the species Talaromyces atroroseus）である、タラロミセス属（the genus Talaromyces）に属する真菌種を使用する発酵による製造を含む。食料品用及び／又は非食料品用及び化粧品用着色剤としての、新規のアトロロシン色素の使用、及びそれを含むキット。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
天然の食品着色料は、合成着色料の潜在的な有害な影響の高まりつつある消費者意識に起因した後、ますます求められている１，２。食事と健康との間のリンクの増加する認識に鑑みて、食品添加物産業は、天然着色料の代替を提供する上で新しいチャレンジに直面する。これまでほとんど産業上使用されている天然着色料は、天然の源、例えば、アントシアニン（ビートルートテンサイ（Beta vulgaris）抽出物）、リコピン（トマト（Solanum lycopersicum）抽出物）又はカルミン酸（雌の昆虫コチニールカイガラムシ（Dactylopius coccus３）から抽出される）から直接抽出される。それらの製造は、原材料の供給に高く依存しており、それは、質及び量の両方に関して季節的変動を受ける４。これらの制限は、微生物などの天然色素用の新しい源を調査することによって、克服できる５。菌類は、広範囲の色の範囲内の色素を含む多様な類の２次代謝産物を天然に生合成して排出することが、公知である６。
【０００３】
ベニコウジ（Ｍｏｎａｓｃｕｓ）は、アジア諸国で伝統的な食品の製造用に長く使用されてきた色素産生真菌属である７。ベニコウジからの色素は、「ベニコウジ色素」と呼ばれ、黄色、オレンジ色、及び赤色構成要素を含むアザフィロンの混合物である。
【０００４】
ベニコウジ色素の製造用にベニコウジの種を使用すると、色相の範囲を有する異なるベニコウジ色素のカクテルという結果になり８、その組成物は、制御が困難で、バッチ間で変動し得る。更に、ベニコウジの種は、シトリニンなどのマイコトキシンを生産することが公知であり９、それは、腎毒性、肝細胞毒性及び細胞毒性を含む多様な中毒作用を引き起こし、そして、西欧諸国では産業目的でのそれらの使用を排除する。産業上の展望から、発酵によって個別にこれらの成分色素を生産するのが極めて好ましいであろう。そこでは、生産される個別の種の色素は、マイコトキシンを含まず、その結果、色素は、複合的でおそらく複雑な精製工程の必要なしに、容易に抽出できて回収できる。食品添加物としての天然の色素の重要な用途の中で、水溶性色素が極めて望ましい。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の概要
第１の形態によれば、本発明は、下記の製造方法を提供する：
下記の工程：
ａ）タラロミセス属（the genus Talaromyces）の種の菌糸又は胞子を提供すること、
ｂ）液体成長培地中で（ａ）の菌糸又は胞子を培養すること、
ｃ）前記培養工程ｂ）の間に製造されるアトロロシン色素を回収すること、及び
ｄ）場合により、前記アトロロシン色素を単離すること、
を含む、発酵によるアトロロシン色素（好ましくは、単一の種のアトロロシン色素）を製造する方法であって、
しかも、工程（ｂ）における成長培地のｐＨが、４〜６の間に維持され；
しかも、工程（ｂ）における前記液体成長培地中の唯一の窒素源が、アミノ酸、ペプチド、アミノ糖、及び一級アミンから成る群から選択される１つの単一の化合物であり；そして、
しかも、アトロロシン色素が、式Ｉの構造を有する、上記の製造方法：
【化Ｉ】
2020518267.tif 000003
上記の式中、Ｎ−Ｒは、アミノ酸、ペプチド、アミノ糖、及び一級アミンから成る群から選択され、そして、炭素２と炭素３との間の二重結合の配置は、ｃｉｓである。
【０００６】
第１の形態による当該方法は、下記の追加の工程：
ａ’）予備液体成長培地中で（ａ）の菌糸又は胞子を培養することであって、しかも、唯一の窒素源が無機窒素源であり、ＮＯ３−の濃度が２０ｍＭ以下であり、そして、ＮＯ３−の濃度が５ｍＭ未満に枯渇するまで培養を続けること；
を更に含むことができ、
しかも、前記工程（ａ’）の後が工程（ｂ）である。
【０００７】
第２の形態によれば、本発明は、式Ｉの構造を有する、アトロロシン色素を提供する：
【化Ｉ】
2020518267.tif 000004
上記の式中、Ｎ−Ｒは、アミノ酸、ペプチド、アミノ糖、及び一級アミンから成る群から選択され、そして、炭素２と炭素３との間の二重結合の配置は、ｃｉｓであり、
しかも、前記アミノ酸が、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパルテート、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタメート、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、及びＬ−オルニチン：から成る群の１つから選択される。
【０００８】
第３の形態によれば、本発明は、本発明の方法によって製造される上記で定義されるような式Ｉの構造を有するアトロロシン色素を提供する。
【０００９】
第４の形態によれば、本発明は、食品用、非食品製品用、及び化粧品用のいずれか１つの着色剤としての、上記で定義されるような式Ｉの構造を有するアトロロシン色素の使用を提供する。
【００１０】
第５の形態によれば、本発明は、上記で定義されるような式Ｉの構造を有するアトロロシン色素を含む生成物を提供し、生成物が、食品、非食品製品、及び化粧品の中から選択される。
【００１１】
第６の形態によれば、本発明は、生成物を着色するためのキットを提供し、しかも、キットが、上記で定義されるような式Ｉの構造を有する少なくとも１つのアトロロシン色素を含み、しかも、色素が容器中に供給されており、しかも、生成物が、食品、非食品製品、及び化粧品の中から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
発明の記述
図面
【図１】図１は、アトロロシン色素の化学構造であり、しかも、Ｒは、アミノ酸、ペプチド、アミノ糖、及び一級アミンの中から選択され、そして、炭素２と炭素３との間の二重結合の配置は、ｃｉｓである。生体内で（Ｉｎ  ｖｉｖｏ）、それは、窒素含有分子を含む、イソクロメン含有アザフィロン前駆体、ｃｉｓ−ＰＰ−Ｏ及びｔｒａｎｓ−ＰＰ−Ｏの誘導体化によって、合成される。
【図２−１】図２は、精製アトロロシン色素及びそれらの対応する標準曲線の吸光度スペクトルのグラフによる提示である：純粋なＰＰ−Ｏの吸光度スペクトル、及び、方程式：ｙ＝５４．８６９ｘの４５０ｎｍでの対応する標準曲線。純粋なアトロロシン（例示のアトロロシン−Ｓ）の吸光度スペクトル、及び、方程式：ｙ＝９５．２４４ｘの５００ｎｍでの対応する標準曲線。
【図２−２】図２（続き）：図２−１と同じ。
【図３】図３は、唯一の窒素源として示される単一のアミノ酸（０．１Ｍ）又はＫＮＯ３（０．１Ｍ）が補足された時の、合成発酵培地中で振とうフラスコ中で培養された時の（例１．２を参照）、９６時間後にＴ．アトロロセウス（T. atroroseus）の１工程発酵によって製造される色素（ｇ／Ｌ）（■）及びバイオマス蓄積（棒グラフ）のグラフによる提示である。サンプルは、９６時間後に取り出された。データセットは、３回実施された振とうフラスコ発酵に基づく。
【図４】図４は、（例１．２で定義されるような）Ｔ．アトロロセウスの１工程発酵から誘導される発酵培養液から抽出される化合物のＵＶ−クロマトグラム（５２０±２０ｎｍで測定）を示す図表であり、ここで、成長培地（１００ｍｌ）には、０．１Ｍの濃度で唯一の窒素源として硝酸カリウム（ＫＮＯ３）、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、又はセリンのいずれかの形態で単一の窒素源が供給された。培地のｐＨは、水性ＮａＯＨ及びＨＣｌにて、ｐＨ５に調節された。培養は、回転振とう培養器中で１５０ｒｐｍ及び３０℃で邪魔板なしの振とうフラスコ中で実施された。サンプルは、９６時間後に取り出された。振とうフラスコ実験は、３回実施された。
【図５−１】図５は、唯一の窒素源としてセリン又は硝酸カリウム（ＫＮＯ３）及びセリンが供給されたＴ．アトロロセウスの１工程又は２工程発酵の間に経時的に検出されたスクロース及びＣＯ２、色素（ＰＰ−Ｏ及びアトロロシン−Ｓ）のレベル及びバイオマス蓄積（ＤＷ）のグラフによる提示である。Ａ）１０ｇ／ｌ  ＫＮＯ３を含む１工程発酵の時間経過；Ｂ）１０ｇ／ｌセリンを含む１工程発酵の時間経過；Ｃ）２工程発酵の時間経過；Ｄ）１０ｇ／ｌ  ＫＮＯ３を含む１工程発酵の発酵培地上澄み液のカラープロファイル；Ｅ）１０ｇ／ｌセリンを含む１工程発酵の発酵培地上澄み液のカラープロファイル；Ｆ）２工程発酵の発酵培地上澄み液のカラープロファイル；Ｇ）色素の混合物を示す、１０ｇ／ｌ  ＫＮＯ３を含む１工程培養での発酵培地上澄み液のＵＶクロマトグラム（５２０±１０ｎｍ）；Ｈ）アトロロシン−Ｓを示す、１０ｇ／ｌセリンを含む１工程培養での発酵培地上澄み液のＵＶクロマトグラム（５２０±１０ｎｍ）；及びＩ）ｃｉｓ−及びｔｒａｎｓ−ＰＰ−Ｏの両方が最初に形成して、その後のセリンの添加後には本質的に純粋なｃｉｓ−アトロロシン−Ｓが形成することを示す、２工程培養での発酵培地上澄み液からのＵＶクロマトグラム（５２０±１０ｎｍ）。
【図５−２】図５（続き）：図５−１と同じ。
【図５−３】図５（続き）：図５−１と同じ。
【図６】図６は、唯一の窒素源としての硝酸カリウム（ＫＮＯ３）と比較して、唯一のアミノ窒素源としてセリンが供給された時の、Ｔ．アトロロセウスの１工程発酵対２工程発酵から誘導される発酵培養液のサンプルのクロマトグラムと比較して、シトリニンの認証された標準のイオンクロマトグラム（ｍ／ｚ＝２５１．０２９０）を示す図表である。
【図７】図７は、ｃｉｓ−アトロロシン−Ｓの化学構造を示す図表である。
【図８】図８は、Ａ）アトロロシン−Ｓ及びモナスコルブラミン−Ｓ、及び、Ｂ）アトロロシン−Ｅ及びモナスコルブラミン−Ｅ、のｌｏｇＤ値を示す図表である。
【図９】図９は、硝酸塩試験紙を使用する比色硝酸塩測定である。左上：２工程培養から取り出されたサンプル。左下：５〜１００ｍｇの範囲に適合するように４０×希釈後の各サンプルで使用された硝酸塩試験紙。サンプル時点が、硝酸塩試験紙上に記録されている。
【図１０】図１０は、窒素源ＫＮＯ３で異なるｐＨでバイオリアクター中で培養されたタラロミセスアトロロセウス。Ａ）ｐＨの関数としての成長速度（μｍａｘ（ｈ−１））；Ｂ）ｐＨの関数としてのバイオマス（Ｙｓｘ■）及び合計の色素（Ｙｓｐ□）生産。
【００１３】
略語及び用語：
ＰＰ−Ｏ：は、化学式Ｃ２３Ｈ２４Ｏ７を有する色素であり、ｃｉｓ形又はｔｒａｎｓ形のいずれかであることができる。
アトロロシン：は、化学式Ｃ２３Ｈ２４Ｏ６ＮＲを有する色素であり、ここで、ＮＲは、アミノ酸などの一級アミンを含有する化合物であり、そして、炭素２と炭素３との間の二重結合の配置は、ｃｉｓである。
利用可能な無機窒素に本質的に欠けている成長培地：は、利用可能な窒素の欠乏に起因して、指数関数的な成長を制限して、微生物（真菌）成長を引き起こして、ラグ又は細胞死フェーズに入る、成長培地である。成長培地が０．５ｇ／Ｌ未満の窒素源（例えば、＜０．５ｇ／Ｌ  ＫＮＯ３又はＮａＮＯ３、例えば、＜５ｍＭ  ＮＯ３−）を含有する時、窒素源は枯渇して、何の利用可能な窒素も残らない。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
発明の詳細な記述
本発明は、好ましくはタラロミセスアトロロセウス種（the species Talaromyces atroroseus）である、タラロミセス属（the genus Talaromyces）に属する真菌種を使用する発酵による個別の種のアザフィロン色素の製造方法を提供する。タラロミセスの種は、最初に、生産生物として使用するのに潜在的に適切であるとして選択された。なぜなら、ベニコウジの種と共通して、それらは、固体培地上で培養した時に、明赤色の色を排出すると考えられたからである。
【００１５】
第１の形態によれば、本発明は、下記の製造方法を提供する：
下記の工程：
ａ）タラロミセス属（the genus Talaromyces）の種の菌糸又は胞子を提供すること、
ｂ）液体成長培地中で前記の菌糸又は胞子を培養すること、
ｃ）工程ｂ）における培養の間に製造されるアザフィロン色素を回収すること、及び
場合により、１つ以上の前記アザフィロン色素を単離すること、
を含む、１工程発酵手順を使用する個別の種のアザフィロン色素を製造する方法であって、
しかも、工程（ｂ）における前記液体成長培地中の唯一の窒素源が、アミノ酸、ペプチド、アミノ糖、及びいかなる他の一級アミンから成る群から選択される単一の化合物であり；そして、
しかも、アトロロシン色素が、式Ｉの構造を有する、上記の製造方法：
【化Ｉ】
2020518267.tif 000005
上記の式中、Ｎ−Ｒは、アミノ酸、ペプチド、アミノ糖、及び一級アミンから成る群から選択され、そして、炭素２と炭素３との間の二重結合の配置は、ｃｉｓである。
【００１６】
適切な唯一の窒素源は、グルコサミン又はガラクトサミンなどのアミノ糖を含み；そして、アントラニル酸、アニリン又はｐ−フェニレンジアミンなどの一級アミンを含む。
【００１７】
好ましくは、唯一の窒素源は、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパルテート、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタメート、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、及びＬ−オルニチン：から成る群の１つから選択される単一のアミノ酸である、
【００１８】
窒素源を含む液体成長培地は、塩、微量金属、及び炭素源を含む合成培地である。適切な炭素源は、グルコース、スクロース、マルトース、可溶性デンプン、ビートまたはサトウキビ糖蜜、モルト、及び、それらの少なくとも２つのいかなる組合せを含む。
【００１９】
成長培地は、好ましくは、下記の塩及び微量金属を含むか又はそれらから成る：ＫＨ２ＰＯ４（例えば、１ｇ／Ｌ）、ＮａＣｌ（例えば、１ｇ／Ｌ）、ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ（例えば、２ｇ／Ｌ）、ＫＣｌ（例えば、０．５ｇ／Ｌ）、ＣａＣｌ２．Ｈ２Ｏ（例えば、０．１ｇ／Ｌ）及び微量金属溶液（例えば、２ｍＬ／Ｌ）。微量金属溶液は、下記のものを含むことができるか又はそれらから成ることができる：ＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ（例えば、０．４ｇ／Ｌ）、Ｎａ２Ｂ４Ｏ７．１０Ｈ２Ｏ（例えば、０．０４ｇ／Ｌ）、ＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ（例えば、０．８ｇ／Ｌ）、ＭｎＳＯ４．Ｈ２Ｏ（例えば、０．８ｇ／Ｌ）、Ｎａ２ＭｏＯ４．２Ｈ２Ｏ（例えば、０．８ｇ／Ｌ）、ＺｎＳＯ４．７Ｈ２Ｏ（例えば、８ｇ／Ｌ）。成長培地中に唯一の窒素源を提供する化合物の濃度は、０．０５Ｍ〜１Ｍ、例えば、少なくとも０．０５、０．０７５、０．１０、０．１２５、０．１５、０．１７５、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、及び０．８Ｍであることができる。
【００２０】
工程（ｂ）の間に提供されて維持される成長培地のｐＨは、好ましくは４〜６の間；より好ましくは４．５〜５．５の間であり；ここで、ｐＨは、水性ＮａＯＨ又はＨＣｌの添加によって、調節できる。
【００２１】
工程（ｂ）における培養は、液体成長培地中にタラロミセス属の種の菌糸又は胞子を懸濁させることによって；又は、より好ましくは、液体成長培地中にタラロミセス属の種の菌糸又は胞子を浸すことによって、実施できる。
【００２２】
工程（ａ）における胞子は、タラロミセス属の種の胞子の水性懸濁液を含むことができる。好ましくは、タラロミセス属の種は、タラロミセスアトロロセウス種（例えば、菌株タラロミセスアトロロセウスＩＢＴ１１１８１）である。
【００２３】
第２の形態によれば、本発明は、２工程発酵手順と呼ばれる、１工程発酵手順の修正を使用する個別の種のアザフィロン色素を製造する方法を提供する。この修正によれば、工程（ａ）の後に、追加の工程（ａ’）が実施される。工程（ａ’）では、工程（ａ）で提供された胞子又は菌糸が、予備液体成長培地中で培養され、しかも、唯一の窒素源が無機窒素源であり、ＮＯ３−の濃度が２０ｍＭ以下である。無機窒素源は、ＫＮＯ３及びＮａＮＯ３から成る群から選択されることができる。
【００２４】
唯一の窒素源として無機窒素を含む予備液体成長培地は、塩、微量金属、及び炭素源を含む合成培地である。塩及び微量金属に関してこの合成培地の組成は、下記のものである：ＫＨ２ＰＯ４（例えば、１ｇ／Ｌ）、ＮａＣｌ（例えば、１ｇ／Ｌ）、ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ（例えば、２ｇ／Ｌ）、ＫＣｌ（例えば、０．５ｇ／Ｌ）、ＣａＣｌ２．Ｈ２Ｏ（例えば、０．１ｇ／Ｌ）及び微量金属溶液（例えば、２ｍＬ／Ｌ）。微量金属溶液は、下記のものを含むことができるか又はそれらから成ることができる：ＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ（例えば、０．４ｇ／Ｌ）、Ｎａ２Ｂ４Ｏ７．１０Ｈ２Ｏ（例えば、０．０４ｇ／Ｌ）、ＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ（例えば、０．８ｇ／Ｌ）、ＭｎＳＯ４．Ｈ２Ｏ（例えば、０．８ｇ／Ｌ）、Ｎａ２ＭｏＯ４．２Ｈ２Ｏ（例えば、０．８ｇ／Ｌ）、ＺｎＳＯ４．７Ｈ２Ｏ（例えば、８ｇ／Ｌ）。適切な炭素源は、グルコース、スクロース、マルトース、可溶性デンプン、ビートまたはサトウキビ糖蜜、モルト、及び、それらの少なくとも２つのいかなる組合せを含む。
【００２５】
２工程発酵法によれば、工程（ａ’）で生産されるタラロミセス培養液の培養は、その後、液体成長培地中での更なる培養工程（ｂ）に続く。工程（ｂ）における液体成長培地は、塩及び微量金属に関して予備液体成長培地と同じ組成物を有する合成培地である。しかし、工程（ｂ）における液体成長培地は、有機窒素の唯一の源として、アミノ酸、ペプチド、アミノ糖、及び一級アミンの１つから選択される化合物を含む。適切な有機窒素源は、アミノ酸、ペプチド、アミノ糖、及びいかなる他の一級アミンから成る群から選択され；そして、１工程発酵手順において液体成長培地中で使用される適切な源に対応する。無機窒素の源は、工程（ａ’）における予備液体成長培地の成分であるが；工程（ｂ）における液体成長培地中には何の追加の無機窒素源も含まれていない。しかし、その代わりに、無機窒素は、有機窒素の特定の源に置換えられる。
【００２６】
第２の形態による２工程発酵は、工程（ａ’）において予備液体成長培地中で胞子又は菌糸を培養することによって、及びその後、工程（ａ’）によって製造された培養液に、有機窒素の唯一の源を、工程（ｂ）において添加することによって、実施できる。予備液体成長培地の無機窒素含有量は、工程（ａ’）において真菌胞子又は菌糸の培養の間に枯渇し、その結果、成長培地は、工程（ａ’）の終わりに、利用可能な無機窒素に本質的に欠ける。予備液体成長培地の無機窒素含有量は、工程（ａ’）の終わりまでに完全な枯渇を確保するために、例えば、２ｇ／Ｌ以下、１．７５ｇ／Ｌ、１．５ｇ／Ｌ、１．２５ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ以下のＫＮＯ３又はＮａＮＯ３を提供することによって、例えば、２０ｍＭ以下、１７．５ｍＭ、１５ｍＭ、１２．５ｍＭ、１０ｍＭ以下のＮＯ３−を提供することによって、調節できる。予備液体成長培地中に存在する無機窒素のレベルが、０．５ｇ／Ｌ未満、０．４ｇ／Ｌ、０．３ｇ／Ｌ、０．２ｇ／Ｌ、０．１ｇ／Ｌ、又は０．０５ｇ／Ｌ未満の量のＫＮＯ３又はＮａＮＯ３に一旦枯渇すると、例えば、５ｍＭ未満、４ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ、０．５ｍＭ未満の量のＮＯ３−に一旦枯渇すると、その後、タラロミセス培養液の成長を支持することは、もはやできない。
【００２７】
代わりに、工程（ａ’）における予備液体成長培地は、更なる培養工程（ｂ）の開始と同時に、唯一の窒素源として上記で認識される有機窒素化合物を含む液体成長培地によって交換される。
【００２８】
工程（ａ’）において提供されてそして工程（ｂ）の間に維持される成長培地のｐＨは、好ましくは４〜６の間；好ましくは４．５〜５．５の間であり；ここで、ｐＨは、水性ＮａＯＨ又はＨＣｌの添加によって、調節できる。
【００２９】
１工程発酵及び２工程発酵の間の培養条件は、タラロミセス培養液における好気性代謝を支持する。好気性代謝は、十分な曝気に頼り、それは、液体培養液を振とうすることによって、又は、空気の源（例えば、酸素）を供給することによって、実現できる。
【００３０】
１工程発酵及び２工程発酵手順は、バイオリアクター中で実施できる。１工程発酵及び２工程発酵手順の両方において使用される（上記の）液体成長培地は、真菌培養液のバッチ、フェッドバッチ、又は連続培養のいずれかを促進するために、バイオリアクターに供給されることができる。
【００３１】
２工程発酵手順における培養工程（ａ’）及び（ｂ）の持続時間は、（バイオマスによって測定される）タラロミセス培養液の成長及びタラロミセス培養液によって製造されるアザフィロン色素の収率を最適化するように、選択される。培養工程（ａ’）は、好ましくは、少なくとも２８ｈ；例えば、３０ｈ〜４０ｈの間である。培養工程（ａ’）は、約３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、及び５４ｈの持続時間であることができる。工程（ａ’）に続く培養工程（ｂ）の持続時間は、好ましくは、少なくとも５０ｈ；例えば、５０ｈ〜８０ｈの間である。培養工程（ｂ）は、約５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７５、８０ｈの持続時間であることができる。
【００３２】
第１の形態又は第２の形態による、タラロミセス培養液の培養によって製造されるアザフィロン色素は、細胞外液であり、そして、その結果、液体培地から回収することができる。驚いたことに、アザフィロン色素合成の始まりは、１工程発酵手順と比較して、２工程発酵手順が使用される時、著しく少ない時間の培養後に、起こる（例３．２；図５を参照）。更に、アザフィロン色素収率によって判断されるような、２工程発酵手順の炭素経済は、優れている（例３．４−３．５；表３及び表４を参照）。
【００３３】
タラロミセスアトロロセウスの菌株は、黄色アザフィロン（ＰＰ−Ｙ）、及びオレンジアザフィロン（ＰＰ−Ｏ）のｃｉｓ−及びｔｒａｎｓ−異性体、及びバイオレットアザフィロン（ＰＰ−Ｖ）を含む、ベニコウジ色素の混合物を生産することが可能であると報告される。驚いたことに、本発明の第１の形態及び第２の形態による方法によって製造されるアザフィロン色素は、アトロロシン色素の単一の種であって、色素の混合物ではない（例２を参照）。２工程発酵手順の工程（ａ’）の間に窒素の唯一の源として、ＫＮＯ３又はＮａＮＯ３（少量、例えば、２ｇ／Ｌ（０．０２Ｍ  ＮＯ３−））が提供される時、これは、工程（ａ’）の間にオレンジ色アザフィロン色素（ＰＰ−Ｏ）のｃｉｓ形及びｔｒａｎｓ形の両方の少量の合成を、選択的に促進する。その後の工程（ｂ）において、有機窒素の源中に存在するアミノ基は、ＰＰ−Ｏアザフィロンコア異性体構造（ｃｉｓ−及びｔｒａｎｓ−ＰＰ−Ｏ）の中に組込まれて、本質的に純粋な形の特定のｃｉｓ−アトロロシン誘導体を形成する（図１）。こうして、当該方法によって製造される単一の種のアトロロシン色素は、複合的でおそらく複雑な精製工程の必要なしに、抽出されることができて、回収されることができる。更に、当該方法を使用する発酵の生成物は、いかなるマイコトキシンも含まず（例４を参照）、そして、その結果、人間への使用に安全である。
【００３４】
第３の形態によれば、本発明は、式Ｉを有する新規なアトロロシン色素を提供する：
【化Ｉ】
2020518267.tif 000006
上記の式中、Ｎ−Ｒは、アミノ酸、ペプチド、アミノ糖（例えば、グルコサミン又はガラクトサミン）及び一級アミン（例えば、アントラニル酸、アニリン又はｐ−フェニレンジアミン）の中から選択され、そして、炭素２と炭素３との間の二重結合の配置は、ｃｉｓである。
【００３５】
好ましい形態では、アトロロシン色素は、式Ｉを有し、ここで、Ｎ−Ｒは、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパルテート、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタメート、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、及びＬ−オルニチンから成る群の１つから選択されるアミノ酸である。
【００３６】
上記で定義されるような式Ｉを有するこの新規のアトロロシンは、本発明の第１の形態又は第２の形態による発酵手順によって製造される真菌培養液から回収されるアザフィロン色素である。この発酵手順を使用するこの新規のアトロロシンの収率は、真菌菌株が同じ条件下で培養されるが唯一の窒素源として無機窒素を含む合成培地が供給される時、生産される異なるアトロロシンの組み合わせた合計よりも、少なくとも４倍高い（例３．４を参照）。
【００３７】
式Ｉを有する新規のアトロロシンの重要な特性は、公知のベニコウジ色素と比較した時に、その増加した水溶性である。これは、アトロロシンの主鎖構造中のカルボン酸と、組込まれたアミノ含有部位によって与えられる極性とに、起因する（例６．１を参照）。
【００３８】
式Ｉを有するアトロロシンを抽出して検出する方法は、例２．１及び例２．２に詳細に記載される。式Ｉを有するアトロロシンの化学構造は、例５．１及び例５．２に記載されるように、核磁気共鳴分光法及び高分解能質量分析法及びダイオードアレイ検出法と結合した超高速液体クロマトグラフィーを用いて、決定できる。
【００３９】
式Ｉを有するアトロロシンは、食品生成物、非食品製品及び化粧品中に、着色剤として使用されることができる。食品生成物は、下記の食品の中から選択できる：パン類、ベーキングミックス、飲料及び飲料ベース、朝食用シリアル、チーズ、香辛料及び薬味、菓子及び艶消し、油脂、冷凍乳製品デザート及びミックス、ゼラチン、プディング及び詰め物、肉汁及びソース、ミルク製品、植物性タンパク質製品、果実加工品及び果汁、及びスナック食品。
【００４０】
非食品製品は、下記の非食料品の中から選択できる：繊維製品、綿織物、羊毛、絹、皮革、紙、塗料、ポリマー、プラスチック、インク、錠剤。
【００４１】
化粧品は、フリーパウ、液体で注がれた粉末又は圧縮粉、流動無水油性製品、身体及び／又は顔用のオイル、身体及び／又は顔用のローション、又は、ヘア製品の形態であることができる。
【００４２】
本発明は、生成物を着色するためのキットを提供し、しかも、キットが、本発明による式Ｉを有する少なくとも１つのアトロロシン色素を含み；しかも、色素が、（場合により、コロイド又は増粘剤などの調剤剤と組み合わせた）容器中に供給されており、しかも、生成物が、食品、非食品製品、及び化粧品の中から選択される。
【００４３】
例
例１．発酵による、新規の類のアザフィロン色素、アトロロシンの製造
１．１  菌株維持及び胞子製造：
真菌菌株タラロミセスアトロロセウスＩＢＴ１１１８１（ＩＢＴ  ＤＴＵ菌株保存）が、アトロロシンの製造のために使用された。Ｔ．アトロロセウスの胞子を、（70185 Sigma-Aldrichによって供給される）Czapek Dox Agar (CYA)寒天上のプレート上で増殖させて、そして、３０℃で７日間、培養させた。胞子は、０．９％塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）溶液で収穫された。懸濁物がミラクロスを通して濾過されて、菌糸から胞子を分離した。胞子溶液が、４℃で１０，０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離された。上澄み液が除去されて、そして、胞子ペレットが０．９％ＮａＣｌ溶液中で再懸濁された。胞子濃度は、Ｂｕｒｋｅｒ−Ｔｕｒｋカウンティング・チャンバーを使用することによって、決定された。全ての培養は、１０６胞子／ｍｌの初期胞子濃度を与えるように、接種された。
【００４４】
１．２  アトロロシンの製造用の１工程発酵手順
小規模製造：
アトロロシンが、下記の成分を含む発酵培地を使用する１工程発酵によって製造された：スクロース（７．５ｇ／Ｌ）、グルコース（０．３７５ｇ／Ｌ）、ＫＨ２ＰＯ４（１ｇ／Ｌ）、ＮａＣｌ（１ｇ／Ｌ）、ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ（２ｇ／Ｌ）、ＫＣｌ（０．５ｇ／Ｌ）、ＣａＣｌ２．Ｈ２Ｏ（０．１ｇ／Ｌ）及び微量金属溶液（２ｍＬ／Ｌ）。微量金属溶液は、ＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ（０．４ｇ／Ｌ）、Ｎａ２Ｂ４Ｏ７．１０Ｈ２Ｏ（０．０４ｇ／Ｌ）、ＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ（０．８ｇ／Ｌ）、ＭｎＳＯ４．Ｈ２Ｏ（０．８ｇ／Ｌ）、Ｎａ２ＭｏＯ４．２Ｈ２Ｏ（０．８ｇ／Ｌ）、ＺｎＳＯ４．７Ｈ２Ｏ（８ｇ／Ｌ）から成った。様々な窒素源が、下記のものから選択されるＬ−アミノ酸の０．１Ｍを提供することによって、供給された：Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパルテート、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタメート、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン及びＬ−オルニチン。培地のｐＨが、水性ＮａＯＨ及びＨＣｌで、ｐＨ５に調節された。１００ｍｌの容積中での発酵が、回転振とう培養器中で１５０ｒｐｍ及び３０℃で邪魔板なしの振とうフラスコ中で実施された。サンプルは９６時間後に取り出された。振とうフラスコ実験は、３回実施された。コントロール／ベンチマークとして、アミノ酸の代わりに窒素源としてＫＮＯ３（０．１Ｍ）が試験された。
【００４５】
大規模製造：
同じ培地を使用したが、培地が唯一の窒素源として２０ｇ／Ｌスクロース及びセリンを含んで４．５のｐＨという修正をした上で、１Ｌバイオリアクター中で１工程発酵によっても、アトロロシンが製造された。発酵は、３０℃、８００ｒｐｍ、及び１ｖｖｍで、実施された。バイオリアクター実験は、２回実施された。
【００４６】
１．３  発酵によって得られるＴ．アトロロセウスバイオマスの分析
発酵の間に蓄積されたＴ．アトロロセウスバイオマスが、事前計量済フィルターを使用して乾燥重量（ＤＷ）として測定された。フィルターは、マイクロウェーブ中で２０分間、事前乾燥され、デシケータ中で最低限１０分間維持され、そして、計量された。ＤＷ測定では、フィルターは、吸引濾過ポンプ中に置かれ、そして、約１０ｍｌの発酵培養液が添加された。その後、バイオマスを含むフィルターは、マイクロウェーブ中で２０分間乾燥され、そして、再計量される前にデシケータ中で最低限１０分間維持された。バイオマスの重量は、サンプル適用前後のフィルター重量の相違として決定された。１ｇ／Ｌの培養液密度を想定する。
【００４７】
１．４  発酵によって製造されるアトロロシンの定量分析
色素の吸光度値が、Ｓｙｎｅｒｇｙ２フォトスペクトル及び９６ウェルマイクロタイタープレートを使用して、決定された。窒素源として各アミノ酸を含む培地上での発酵から誘導される濾過された発酵培養液の１５０μｌサンプルが、２００−７００ｎｍの範囲でスキャンされ、そして、最大吸光度値が決定された。４９０ｎｍでの吸光度は、赤色色素の存在を示した。オレンジ色及び赤色色素の標準曲線が、培地中の濃度を計算するために、使用された（図２を参照）。
【００４８】
１．５  合成発酵培地上でのＴ．アトロロセウスの発酵によって製造されるアトロロシン色素及びバイオマス
１工程発酵の間のＴ．アトロロセウス及びバイオマス蓄積による色素の製造上でのアミノ窒素の源の本質的な役割が、小規模振とうフラスコ中で例１．２で定義されるような合成培地中で、２０の天然アミノ酸及び非タンパク質構成アミノ酸オルニチンの各々で評価された。対照として、唯一の窒素源としてＫＮＯ３を使用する合成培地中で、発酵が実施された。
【００４９】
各発酵で生産された色素の濃度が、全体の発酵培養液の５００ｎｍでの吸光度を測定することによって決定され、それらから、図２に示される標準曲線を使用して、色素濃度が計算された。
【００５０】
図３に見られるように、各々の天然のアミノ酸は、唯一の窒素源として供給された時は、成長を支持したが、いくつかのアミノ酸は、他のものよりもバイオマス蓄積に有利に働いた。バイオマス蓄積は、プロリン（６．０５＋０．３ｇ／Ｌ）で最も高く、その次に、アラニン（５．４８＋０．０１ｇ／Ｌ）及びオルニチン（４．８３＋０．０７ｇ／Ｌ）であった。アルギニン（４．４５＋０．０２ｇ／Ｌ）、アスパラギン（４．４＋０．０３ｇ／Ｌ）、アスパラギン酸（４．２６＋０．５ｇ／Ｌ）及びグルタミン酸（４．４９＋０．２４ｇ／Ｌ）も、高いバイオマス値につながる。窒素源としてＫＮＯ３が供給された対照は、収率２．７７±０．０６ｇ／Ｌであった。ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン及びチロシンは、２ｇ／Ｌ未満の低いバイオマス値を支持した。
【００５１】
色素製造に関して、最も高い収率を与えるアミノ窒素源は、収率０．３９ｇ／Ｌのグルタミン酸であった。他の高い収率のアミノ窒素源は、アスパラギン酸（０．２５ｇ／Ｌ）、ヒスチジン（０．１９ｇ／Ｌ）及びロイシン（０．１１ｇ／Ｌ）であり、その次に、セリン（０．０８ｇ／Ｌ）及びイソロイシン（０．０７ｇ／Ｌ）であった（図３参照）。
【００５２】
唯一のアミノ窒素源としてプロリンを提供すると、何の検出可能な色素製造も観察されなかった。これは、プロリン中の２級アミンに起因していると思われ、それは、色素のコア構造中へのその組込みを妨げる。他の１７の天然アミノ酸は、それらの一級アミンを介して組込まれる。色素形成なしで、Ｔ．アトロロセウスは、成長の炭素源としてプロリンを使用するとみられ、それは、バイオマスの高い蓄積の観察につながる。
【００５３】
グルタミン及びアスパラギンを含む培地中での比較的低い色素製造は、振とうフラスコ中の安定なｐＨを維持することの欠落によるものとされる。グルタミンを含む培地中での７２時間後の発酵培養液のｐＨは、ｐＨ３．８に低下したが、その一方で、グルタミン酸を含む培地は、最終のｐＨ６．１を有した（表１を参照）。
【００５４】
【表１】
2020518267.tif 000007
【００５５】
１工程法でのバイオリアクター実験は、発酵液のｐＨが色素及びバイオマス製造に極めて影響したことを、例証した。
【００５６】
図１０Ａは、タラロミセスアトロロセウスＩＢＴ１１１８１の成長速度は、（ｐＨ３−４．５）などの低いｐＨで培養すると、（ｐＨ５−７などの）高いｐＨと比較して、著しく高かったことを、示す。しかし、表２及び図１０Ｂに示されるように、発酵液のｐＨがｐＨ３に維持された時、これは、色素製造を完全に妨げた。（ｐＨ≧６などの）高いｐＨでも、本質的に何の色素製造も観察されなかった。ｐＨ制御を欠く振とうフラスコ培養液からすでに見られるように、バイオリアクター実験は、色素製造に有利な条件を維持するためのｐＨ制御の重要性を確認した。
【００５７】
【表２】
2020518267.tif 000008
【００５８】
例２．高純度の単一のアトロロシン色素が、合成発酵培地上でＴ．アトロロセウスの発酵によって得られる
発酵培養液から収集されたサンプルは、ＨＰＬＣ、吸光度及びＬＣ−ＭＳによるそれらの分析よりも前に、濾液からバイオマスを分離するために、孔径０．４５μｍを持つ無菌Ｓｔａｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍフィルターを通して、まず濾過された。合成発酵培地上でＴ．アトロロセウスの発酵によって製造されるアトロロシン精製のために、２つの方法が使用された。
【００５９】
２．１  発酵によって製造されるアトロロシンの抽出及び精製
方法Ｉ：
タラロミセスアトロロセウス（ＩＢＴ１１１８１）の培養から誘導される発酵培養液が、濾過され、遠心分離されて、そして、上澄み液が、ギ酸（ＦＡ）で調節されたｐＨ３の１：１酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）で２回、抽出された。有機抽出液が、真空で濃縮された。目的化合物が、Ｃ１８カラム材料上での水／メタノール勾配溶出を使用する、an Isolera One automated flash system (Biotage)上でのＥｔＯＡｃ抽出のフラッシュクロマトグラフィーによって、粗フラクション中にエンリッチされた。最終の単離が、５０ｐｐｍトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む水／アセトニトリル勾配を使用するＬＵＮＡ  ＩＩ  Ｃ１８カラム（２５０ｍｍ×１０ｍｍ、５μｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を備えている９９６フォトダイオードアレイ検出器を持つ半分取ＨＰＬＣ、a Waters 600 Controller上で、実施された。
【００６０】
方法ＩＩ：
タラロミセスアトロロセウス（ＩＢＴ１１１８１）の培養から誘導される発酵培養液が、濾過され、遠心分離されて、そして、濾液が、（ＦＡで調節された）ｐＨ３の１／３容積のＥｔＯＡｃで３回、抽出された。組み合わせたＥｔＯＡｃ相が、１００ｍＬに蒸発されて、そして、（水酸化アンモニウムで調節された）ｐＨ８のミリＱ水（１：１）で、２回、抽出された。水相が、ＦＡでｐＨ３に再調節されて、そして、ＥｔＯＡｃで２回抽出されて、その後に蒸発されて、高エンリッチ＞９５％色素フラクション（いくつかのアトロロシン及びＮ−アミノ酸モナスコルブラミンの混合物、比率＞１０：１）を生産した。色素が、水／アセトニトリル勾配を持つＬＵＮＡ  ＩＩ  Ｃ１８カラム（２５０ｍｍ×１０ｍｍ、５μｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を使用する、Ｇｉｌｓｏｎ１７２ダイオードアレイ検出器を備えているＧｉｌｓｏｎ３３２半分取ＨＰＬＣシステム上で、分離された。
【００６１】
２．２  発酵によって製造されるアトロロシンの定量分析
個別の色素溶液の吸光度値が、Ｓｙｎｅｒｇｙ２フォトスペクトル及び９６ウェルマイクロタイタープレートを使用して決定された。各アミノ酸−色素−溶液の１５０μｌのサンプル培養液が２００−７００ｎｍの範囲でスキャンされて、最大吸光度値が決定された。４９０ｎｍでの吸光度は、赤色色素の存在を示す。オレンジ色及び赤色色素の標準曲線が、培地中の濃度を計算するために、使用することができる（図２を参照）。
【００６２】
２．３  合成培地上で発酵されるＴ．アトロロセウスの発酵培養液中に検出される単一のアトロロシン色素
Ｔ．アトロロセウスの発酵によって製造される特定のアザフィロンの濃縮が、唯一の窒素源として単一のアミノ酸を提供することによって、極めて増加する（図４）。窒素源として０．１Ｍ硝酸カリウムでＴ．アトロロセウスが培養されると、過剰の異なるアザフィロン色素が検出され、その一方で、唯一の窒素源として単一のアミノ酸のみが供給されると、その構造中にこの特別なアミノ酸を組込んでいるアトロロシンに対応するたった１つの主要なＵＶ検出可能ピークが観察された（図４）。
【００６３】
例３．合成発酵培地上でのＴ．アトロロセウスの発酵による高純度の単一アトロロシン色素の大規模製造
３．１  アトロロシンの製造用２工程発酵手順
２工程培養：
２工程発酵が、１Ｌバイオリアクター中で実施された。発酵培地は、スクロース（２０ｇ／Ｌ）、グルコース（１ｇ／Ｌ）、ＫＨ２ＰＯ４（１０ｇ／Ｌ）、ＮａＣｌ（１ｇ／Ｌ）、ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ（２ｇ／Ｌ）、ＫＣｌ（０．５ｇ／Ｌ）、ＣａＣｌ２．Ｈ２Ｏ（０．１ｇ／Ｌ）及び微量金属溶液（２ｍＬ／Ｌ）を含有した。最初の工程では、培地は、唯一の窒素源として２ｇ／Ｌ（０．０２Ｍ）のＫＮＯ３を含んだ。５３ｈの培養後、アミノ酸誘導体の形成を引き起こすように、セリンが、１ｇ／Ｌ（０．０１Ｍ）の最終濃度に添加された。発酵条件は、３０℃、８００ｒｐｍ、１ｖｖｍ及びｐＨ４．５に維持された。
【００６４】
３．２  １工程発酵の代わりに２工程発酵手順を使用する、より速いアトロロシン製造
１工程発酵及び２工程発酵手順を使用するＴ．アトロロセウスによるバイオマス収率及び色素製造の両方が比較された。１工程発酵では、唯一の窒素源として０．１Ｍセリンが使用され、対照として０．１Ｍ  ＫＮＯ３が使用された。２工程発酵では、ｃｉｓ−及びｔｒａｎｓ−ＰＰ−Ｏ製造が、０．０２Ｍ  ＫＮＯ３によって最初に引き起こされ、それは、その後、成長培地からＫＮＯ３が枯渇した後、Ｌ−セリンの添加（最終濃度０．０１Ｍ）によって、ｃｉｓ−アトロロシン−Ｓに転化された。
【００６５】
１工程発酵の間に、発酵は、７５ｈ後に対照（唯一の窒素源としてＫＮＯ３）では炭素限界になり、そして、発酵の終わりに、０．３５ｇ／Ｌの混合色素及び５ｇ／Ｌのバイオマスの収率となった（図５Ａを参照）。培養の間に、炭素が枯渇した時、色素製造により、色がオレンジ色（ＰＰ−Ｏ）から赤色（アトロロシン及びベニコウジ色素の混合物）に変化した（図５Ａ＆Ｄ）。
【００６６】
唯一の窒素源としてＬ−セリンでの１工程発酵の間に、発酵は、１８０ｈ後に炭素限界になり、そして、発酵の終わりに、０．９ｇ／Ｌのｃｉｓ−アトロロシン−Ｓ及び６．５ｇ／Ｌのバイオマスの収率となった（図５Ｂを参照）。他の天然のアミノ酸で同様の結果が得られた（図４を参照）。発酵の全体の時間経過の間に、ｃｉｓ−アトロロシン−Ｓ製造は、真菌成長と共に増加し、そして、何のＰＰ−Ｏ異性体も観察されなかった（図５Ｂ＆Ｅ）。
【００６７】
２工程発酵手順では、窒素源として少量のＫＮＯ３（２０ｍＭ）が最初に供給され、オレンジ色色素ＰＰ−Ｏの生合成という結果になった（図５Ｃ＆Ｆ）。アミノ酸（この場合にはセリン）が濃度０．０１Ｍで５３ｈ発酵後に最初に添加され、それは、その後、ｃｉｓ−及びｔｒａｎｓ−ＰＰ−Ｏアザフィロンコア構造の中に組込まれ、赤色色素ｃｉｓ−アトロロシンＳの合成という結果になった（図１）。２工程培養が、０．９ｇ／ＬのアトロロシンＳだが６．５ｇ／Ｌと比較してより高いバイオマスの７．４ｇ／Ｌバイオマスの収率もあった一方で、これは、炭素限界の始まりで１００ｈ後にのみ得られた。
【００６８】
３．３  Ｔ．アトロロセウスの発酵によって製造されるアトロロシン色素の確認
唯一の窒素源としてＫＮＯ３又はセリンのいずれかを含む合成発酵培地上でＴ．アトロロセウスの１工程発酵によって製造されるアトロロシン色素のＵＶクロマトグラムプロファイル（５２０±２０ｎｍ）は、図５Ｇ＆図５Ｈに、それぞれ示され、その一方で、アミノ酸添加の直前後の２工程発酵の色素プロファイルは、図５Ｉに示される。
【００６９】
唯一の窒素源として０．１Ｍ  ＫＮＯ３を含む発酵は、色素の混合物を生産し（図５Ｇ）、その一方で、唯一の窒素源として０．１Ｍ  Ｌ−セリンを含む発酵は、最小限の不純物を含むｃｉｓ−アトロロシン−Ｓを生産した（図５Ｈ）。
【００７０】
２工程発酵では、第１の相（低いＫＮＯ３量）の間に２つの異性体のＰＰ−Ｏが生産され：第２の相では（セリンの添加後）、両方の異性体のＰＰ−Ｏが、ｃｉｓ−アトロロシン−Ｓに転化された。
【００７１】
クロマトグラムＨ及びＩの両方で８分で検出された主要なＵＶピークは、（質量分析法によって確認すると）アトロロシン−Ｓに対応し、クロマトグラムＩで１０分〜１１分の間に検出された２つのピークは、ＰＰ−Ｏのｃｉｓ−及びｔｒａｎｓ−異性体に対応する。
【００７２】
３．４  ２工程発酵の間の硝酸塩枯渇
５４時間後、バイオマス及びＣＯ２中の排気のプラトーに起因して、ＫＮＯ３が枯渇したと推定された（図５Ｃ）。これは、図９に示されるように、カント−固定硝酸塩ストリップを使用する半定量的推定によって、確認された。４２時間後にすでに、硝酸塩レベルは、発酵の早い時期と比較して低下し始めた；これは、２つの異性体の形の前駆体ＰＰ−Ｏが生産され始めた時に対応する（図５Ｃ）。より明白だったことは、窒素源としてセリンにスイッチ後、上澄み中の色素が鮮やかな赤色に変わり、そして、硝酸塩カント−ストリップによって明白なように、硝酸塩が枯渇したことである。
【００７３】
２工程発酵法によるＴ．アトロロセウスによる単一のアトロロシン色素の製造では、培地中の硝酸塩レベルが、アミノ酸の添加より前に（５ｍＭ未満に）枯渇することは、本質的である。
【００７４】
（＞０．０２Ｍなどの）高い硝酸塩濃度を含む発酵培地中でＴ．アトロロセウスを培養すると、色素の混合物が、硝酸塩枯渇より前に（図５Ａ及び図５Ｇに見られるように）生産され、そして、結果として、培養培地にアミノ酸が添加される時、単一の純粋なアトロロシン生成物を得ることは可能ではない。
【００７５】
（＜０．０２Ｍなどの）低い硝酸塩レベルを含む発酵培地中でＴ．アトロロセウスを培養して、そして、「あまりにも早く」、すなわち、硝酸塩枯渇より前に及びＰＰ−Ｏ蓄積の開始より前に、アミノ酸を培養培地に添加すると、単一のアトロロシン生成物は得られないが、むしろ色素の混合物が得られる。ＰＰ−Ｏ製造の開始より前に添加される時、アミノ酸は、細胞機能のために利用され、そして、アトロロシンの混合物という結果になる、（硝酸塩と比較して）過剰に存在しないであろう。
【００７６】
３．５  アトロロシン製造の炭素経済は、２工程発酵を使用して向上する（表３に言及される計算）
セリンが供給される１工程発酵手順では、Ｔ．アトロロセウスは２０ｇ／Ｌのスクロース及び１０ｇ／Ｌのセリンを使用し、０．９ｇ／Ｌのアトロロシン−Ｓを生産する。
【００７７】
２工程発酵手順では、Ｔ．アトロロセウスは２０ｇ／Ｌのスクロース及び２ｇ／Ｌのセリンを使用し、０．９ｇ／Ｌのアトロロシン−Ｓを生産する。
【００７８】
スクロースの分子量は、３２４．３ｇ／ｍｏｌである。プロセスの炭素利用のみを考慮すると、単位ｃ−モルが使用される。化学式Ｃ１２Ｈ２２Ｏ１１を有するスクロースは、その結果：
３２４．３ｇ／ｍｏｌは２８．５３ｇ／ｃ−モルに対応する。
【数１】
2020518267.tif 000009
２０ｇのスクロース相当（ｎ＝ｍ／ｃ−モル＝２０ｇ／２８．５３ｇ／ｃモル）＝０．７ｃ−モル。
同じ計算が、アトロロシン−Ｓ及びセリンで実施できる。
アトロロシン−Ｓ：Ｃ２６Ｈ２９ＮＯ９及び４９９．１８ｇ／ｍｏｌ。
セリン：Ｃ３Ｈ７ＮＯ３及び１０５．０９ｇ／ｍｏｌ。
【００７９】
【表３】
2020518267.tif 000010
【００８０】
１工程培養法は、炭素の４．８％をアトロロシン−Ｓに転化し、その一方で、対応する２工程培養では、アトロロシン−Ｓへの炭素の転化率は、６．４％に増加した（表４を参照）。窒素源としてＫＮＯ３が供給される時、色素の混合物への炭素の転化率は、ほんの１％であった（表４）。その結果、アザフィロン色素の製造での１工程発酵法及び２工程発酵法の炭素経済は、無機窒素に基づく伝統的な発酵方法よりも少なくとも４倍高い収率を達成する。
【００８１】
３．６  純粋なｃｉｓ−アトロロシン−Ｓの向上した収率は、１工程及び２工程発酵手順を使用してＴ．アトロロセウスによって製造される
無機窒素を含む成長培地に基づく伝統的な発酵方法を使用すると（表４を参照）、Ｔ．アトロロセウスは、炭素を、ほんの１％以下の炭素経済で、色素の混合物に転化する。対照的に、単一のアザフィロン色素の製造での１工程発酵法及び２工程発酵法の炭素経済は、少なくとも４倍高い収率を持つ。
【００８２】
【表４】
2020518267.tif 000011
【００８３】
例４．  １工程又は２工程発酵法によって製造されるＴ．アトロロセウスの生成物は、マイコトキシンを含まない
（ＫＮＯ３、セリン、又は、ＫＮＯ３及びセリンのいずれかが供給された）Ｔ．アトロロセウスの１工程又は２工程発酵から誘導される発酵培養液の分析は、いかなる３つの培養条件下でもマイコトキシンシトリニン（ｍ／ｚ＝２５１．０９２０）が生産されない（メビノリンも生産されない；示されていない）ことを、示す（図６）。
【００８４】
例５．  Ｔ．アトロロセウスの発酵によって製造される新規のアトロロシン色素の構造
１工程又は２工程発酵から誘導されるＴ．アトロロセウスの発酵培養液中のアトロロシン色素が、例２．１に記載されるように、抽出されて分離され；そして、その後、下記の方法を使用して分析された。
【００８５】
５．１  超高速液体クロマトグラフィー−高分解能質量分析法（ＵＨＰＬＣ−ＨＲＭＳ）
ダイオードアレイ検出器を備えているan Agilent Infinity 1290 UHPLCシステム（Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA）上で、ＵＨＰＬＣ−ＨＲＭＳが実施された。直線的勾配を持つan Agilent Poroshell １２０フェニル−ヘキシルカラム（２．１×２５０ｍｍ、２．７μｍ）上で、分離が得られ、それは、共に２０ｍＭギ酸で緩衝されている水（Ａ）及びアセトニトリル（Ｂ）から成り、１０％Ｂで開始して１５分で１００％に増加し、そこでは、それは２分間保持されて、０．１分で１０％に戻り、そして、３分間残った（０．３５ｍＬ／分、６０℃）。１μＬの注入容積が使用された。乾燥ガス温度２５０℃、ガス流８Ｌ／分、シースガス温度３００℃及び１２Ｌ／分の流れで、Agilent Dual Jet Streamエレクトロスプレーイオン源を備えているan Agilent 6545 QTOF MS上のポジティブ検出モードで、ＭＳ検出が実施された。毛細管電圧は４０００Ｖにセットされ、ノズル電圧は５００Ｖにセットされた。捕捉速度１０スペクトル／ｓで、ＭＳ／ＭＳモードでｍ／ｚ３０−１７００及びＭＳモードでｍ／ｚ８５−１７００で、重心データとして１０、２０及び４０ｅＶで、質量スペクトルが記録された。１：１００スプリッターを使用して１５μＬ／分の流れでエクストラＬＣポンプを使用して第２のスプレイヤー中に、７０：３０メタノール：水のロック質量溶液が、注がれた。溶液は、ロック質量として、１μＭトリブチルアミン（Sigma-Aldrich）及び１０μＭヘキサキス（２，２，３，３−テトラフルオロプロポキシ）ホスファゼン（Apollo Scientific Ltd., Cheshire, UK）を含有した。両方の化合物の［Ｍ＋Ｈ］＋イオン（それぞれ、ｍ／ｚ１８６．２２１６及び９２２．００９８）が、使用された。
【００８６】
５．２  核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法
the Department of Chemistry at the Technical University of Denmarkに位置するa Bruker Avance 800 MHz上で、又は、a Bruker Ascend 400 MHz (Bruker, Billerica, MA, USA)上のいずれかで、１Ｄ及び２Ｄ  ＮＭＲスペクトル（１Ｈ、ＤＱＦ−ＣＯＳＹ、ｅｄＨＳＱＣ、ＨＭＢＣ及びＮＯＥＳＹ）が、記録された。標準パルスシーケンスを使用してＮＭＲスペクトルが取得された。使用された溶媒は、ＣＤ３ＯＤ（δＨ＝３．３１ｐｐｍ及びδＣ＝４９．０ｐｐｍの参照）、又は、δＨ＝２．５０ｐｐｍ及びδＣ＝３９．５ｐｐｍのシグナルを持つ参照としても使用されたＤＭＳＯ−ｄ６のいずれかであった。TopSpin 3.5 (Bruker), MestReNova v.6.2.1-7569 (Mestrelab Research, Santiago de Compostela, Spain)及びACD NMR Workbook (Advanced Chemical Development, Inc., Toronto, Ontario, Canada)を使用して、データ処理及び分析がなされた。Ｊ−カップリングがヘルツ（Ｈｚ）で、化学シフトがｐｐｍ（δ）で報告される。
【００８７】
５．３  ｃｉｓ−アトロロシン−Ｓの構造決定
精製アトロロシン−Ｓは、暗赤色で、ほとんど黒色で、アモルファスの固体であった。ＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳは、分子式Ｃ２６Ｈ３０ＮＯ９（ＤＢＥ＝１３）に対応する、質量電荷比［Ｍ＋Ｈ］＋＝５００．１９１５Ｄａを与えた。
【００８８】
【表５−１】
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【００８９】
５２０ｎｍでＵＶｍａｘを持つ公知のモナスコルブラミンと同様のＵＶ吸収スペクトルを、Ｃｉｓ−アトロロシン−Ｓは有した。その構造を決定するために、１Ｄ及び２Ｄ  ＮＭＲ（表５にリストされたシフト）が、使用された。
【００９０】
１Ｈ−ＮＭＲ及びＨＳＱＣは、６．４３〜８．５７ｐｐｍの範囲内に５つのオレフィン系プロトン（２、３、５、７、及び１２）、及び、１．６７（９−ＣＨ３）及び０．８９ｐｐｍ（２２）に２つのメチル基を示した。更に、合計で７つのＣＨ２基が確認できた。これらの６つは、脂肪酸鎖（１６−２１）中で一緒にリンクしており、１つ（３’）は、５．１２ｐｐｍ（２’）でＣＨとリンクしている。
【００９１】
１３Ｃ−ＮＭＲ及びＨＭＢＣは、１１個の４級炭素：５つのカルボニル（１、１０、１３、１５、及び１’）、５つのアルケン炭素（４、６、８、１１、及び１４）、及び１つの４級アルカン（９）、を示した。
【００９２】
ＨＭＢＣは、３’をカルボニル１’にリンクする、アザフィロンスカフォードの範囲内の広範囲のＨ−Ｃ−カップリングを提供した。３’は、４とのカップリングも示した。１６及び１７は、１５との相関を有し、５及び１２は、６、１０及び１０との相関を有し、その一方で、７及び９−ＣＨ３は、８及び９とのカップリングを示した。更に、２及び３から１及び４へのカップリングが観察された。最終的に、２と３との間の結合定数は、二重結合のｃｉｓ配置を支持した。得られるスペクトルに基づき、アトロロシン−Ｓは、図７に示す構造を有することが、決定された。
【００９３】
５．４  アトロロシン−アミノ酸誘導体の構造決定
残りの１８のアトロロシン−アミノ酸誘導体の構造が、明らかにされ、それぞれのアミノ酸が、ｃｉｓ−アトロロシン−Ｓに関してコアアザフィロン構造の中に組込まれたことが、確認された（データは示されない）。ＮＭＲデータは、分子のイソキノリン部分に付いているアミノ酸部位中のｃｉｓ−アトロロシン−Ｓとの相違を示したのみである。全ての１８のアトロロシン−アミノ酸誘導体は、明赤色を有した。
【００９４】
例６  アトロロシン色素の物理的特性
６．１  （全てのアトロロシンにおけるような１位にカルボン酸のない）それぞれのモナスコルブラミンと比較したアトロロシン色素の親水性
ｌｏｇＰ及びｌｏｇＤ値は、２相の水／オクタノールシステム中の検体の溶解性の尺度である。当該値が低いほど、検体はより親水性であり、ｌｏｇＰ／Ｄ値０は、５０：５０分布に対応する。ｌｏｇＰは、イオン化していない種のみに言及し、それに対して、ｌｏｇＤは、イオン化種及びイオン化していない種の両方に言及しており、その結果、ｐＨによって変わる。
【００９５】
【表５−２】
2020518267.tif 000013
【００９６】
ＬｏｇＰ及びｌｏｇＤ値は、図８においてアトロロシン−Ｓ及びアトロロシン−Ｅについて提示され、それらがより可溶性であることを、例証する。
【００９７】
６．２  アトロロシン色素の比色値
ＣＩＥＬＡＢ表色系（１５）を使用して、アトロロシン色素の色の特徴が決定された。Ｌ＊、ａ＊、及びｂ＊の値が、ＣＩＥＬＡＢ表色系を持つＣＲ−３００比色計（Minolta Camera Co., Ltd., Osaka, Japan）によって、測定された。これらの値は、その後、彩度（Ｃ＊）及び色相角（ｈａｂ）値を計算するために、使用された。Ｌ＊は、０（黒）から１００（白）の明度を示す。ａ＊における正及び負は、それぞれ、赤色及び緑色を表すのに対し、ｂ＊における正及び負は、それぞれ、黄色及び青色を表す。彩度値は、色の飽和（彩度）又は純度を示す。同じＬ＊値で中央に近い値は、鈍色又は灰色を示すのに対して、周辺に近い値は、鮮明な色又は明るい色を表す。色相角値は、赤色では０、黄色では９０、緑色では１８０、そして、青色では２７０を表す。純粋な色素のＬ＊、ａ＊、及びｂ＊値が、それらの希釈濃度が４に調節された後に、得られた。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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