(57)【要約】  本開示は、抗体の等電点を改変する方法に関する。本方法は、抗体を提供することと、ここで抗体が、重鎖可変領域を含む第１のポリペプチドと、重鎖可変領域を含む第２のポリペプチドとを含み；抗体の第１及び第２のポリペプチドのうちの少なくとも１つにおいて、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って、７、９、１１、１４、４１、７０、７４、８２ａ、８４及び１１３位における重鎖可変領域（ＶＨ）の１つ以上のアミノ酸残基を置換することと、ここで置換することが、抗体の等電点を上昇又は低下させる；を含む。
2020522573.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体の等電点を改変する方法であって、
抗体を提供することと、
ここで前記抗体が、
重鎖可変領域を含む第１のポリペプチドと、
重鎖可変領域を含む第２のポリペプチドと、を含み；
前記抗体の前記第１及び第２のポリペプチドのうちの少なくとも１つにおいて、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って７、９、１１、１４、４１、７０、７４、８２ａ、８４及び１１３位における重鎖可変領域（ＶＨ）の１つ以上のアミノ酸残基を置換することと、
ここで前記置換することが前記抗体の前記等電点を上昇又は低下させる；
を含む、方法。
【請求項２】
７、９、１１、１４、４１、７４、８４及び１１３位（Ｋａｂａｔ番号付け）における前記ＶＨの前記１つ以上のアミノ酸残基が、中性に帯電したアミノ酸残基である場合、前記置換することが、
前記１つ以上の中性に帯電したアミノ酸残基を、１つ以上の正に帯電したアミノ酸残基と交換して、前記抗体の前記等電点を上昇させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
７、９、１１、１４、４１、７４、８４及び１１３位（Ｋａｂａｔ番号付け）における前記ＶＨの前記１つ以上のアミノ酸残基が負に帯電したアミノ酸残基である場合、前記置換することが、
前記１つ以上の負に帯電したアミノ酸残基を、１つ以上の中性又は正に帯電したアミノ酸残基と交換して、前記抗体の前記等電点を上昇させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
９、７０、７４、８２ａ及び８４位（Ｋａｂａｔ番号付け）における前記ＶＨの前記１つ以上のアミノ酸残基が中性に帯電したアミノ酸残基である場合、前記置換することが、
前記１つ以上の中性に帯電したアミノ酸残基を、１つ以上の負に帯電したアミノ酸残基と交換して、前記抗体の前記等電点を低下させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
９、７０、７４、８２ａ及び８４位（Ｋａｂａｔ番号付け）における前記ＶＨの前記１つ以上のアミノ酸残基が正に帯電したアミノ酸残基である場合、前記置換することが、
前記１つ以上の正に帯電したアミノ酸残基を、１つ以上の中性又は負に帯電したアミノ酸残基と交換して、前記抗体の前記等電点を低下させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体が多重特異性抗体であり、前記第１及び第２のポリペプチドが異なる重鎖可変領域を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記置換することが前記第１又は第２のポリペプチドのうちの１つのみにおいて行われる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記置換することが前記第１又は第２のポリペプチドの両方において行われる、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記第１のポリペプチドの前記１つ以上のアミノ酸残基置換が、前記第２のポリペプチドの前記１つ以上のアミノ酸残基置換とは異なる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記置換することが、
前記第１又は第２のポリペプチドのうちの少なくとも１つにおいて、７４位（Ｋａｂａｔ番号付け）の前記ＶＨアミノ酸残基を、負に帯電したアミノ酸残基と交換することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記置換することが、
前記第１又は第２のポリペプチドのうちの少なくとも１つにおいて、８２ａ位（Ｋａｂａｔ番号付け）の前記ＶＨアミノ酸残基を、負に帯電したアミノ酸残基と交換することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記置換することが、
前記第１又は第２のポリペプチドのうちの少なくとも１つにおいて、８４位（Ｋａｂａｔ番号付け）の前記ＶＨアミノ酸残基を、負に帯電したアミノ酸残基と交換することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記置換することが、
前記第１又は第２のポリペプチドのうちの少なくとも１つにおいて、７４、８２ａ及び８４位（Ｋａｂａｔ番号付け）から選択される位置のうちの少なくとも２ヶ所で前記ＶＨアミノ酸残基を、負に帯電したアミノ酸残基と交換することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記置換することが、
前記第１又は第２のポリペプチドのうちの少なくとも１つにおいて、７４、８２ａ及び８４位（Ｋａｂａｔ番号付け）の３つ全ての位置の前記ＶＨアミノ酸残基を、負に帯電したアミノ酸残基と交換することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体がＩｇＧ抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１に記載の方法により製造される改変された等電点を有する抗体。
【請求項１８】
二重特異性抗体の、その２つの親抗体からの分離を増強する方法であって、
第１及び第２の親抗体を提供することと、
ここで各親抗体は重鎖可変領域を含み；
前記第１及び第２の親抗体のうちの少なくとも１つにおいて、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによる７、９、１１、１４、４１、７０、７４、８２ａ、８４及び１１３位の重鎖可変領域（ＶＨ）中の１つ以上のアミノ酸残基を置換することと、
ここで前記置換することが、前記第２の親抗体に対する前記第１の親抗体の前記等電点を上昇又は低下させ；
前記置換することの後に、前記２つの親抗体から前記二重特異性抗体を製造することと；
前記製造された二重特異性抗体をその２つの親抗体から分離することと、
ここで前記分離することが前記置換することの結果として増強される；
を含む、方法。
【請求項１９】
前記第１の親抗体の７、９、１１、１４、４１、７４、８４及び１１３位（Ｋａｂａｔ番号付け）における前記ＶＨの前記１つ以上のアミノ酸残基が、中性に帯電したアミノ酸残基である場合、前記置換することが、
前記１つ以上の中性に帯電したアミノ酸残基を、１つ以上の正に帯電したアミノ酸残基と交換して、前記第１の親抗体の前記等電点を上昇させることを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１の親抗体の７、９、１１、１４、４１、７４、８４及び１１３位（Ｋａｂａｔ番号付け）における前記ＶＨの前記１つ以上のアミノ酸残基が負に帯電したアミノ酸残基である場合、前記置換することが、
前記１つ以上の負に帯電したアミノ酸残基を、１つ以上の中性又は正に帯電したアミノ酸残基と交換して、前記第１の親抗体の前記等電点を上昇させることを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記第１の親抗体の９、７０、７４、８２ａ及び８４位（Ｋａｂａｔ番号付け）における前記ＶＨの前記１つ以上のアミノ酸残基が中性に帯電したアミノ酸残基である場合、前記置換することが、
前記１つ以上の中性に帯電したアミノ酸残基を、１つ以上の負に帯電したアミノ酸残基と交換して、前記第１の親抗体の前記等電点を低下させることを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１の親抗体の９、７０、７４、８２ａ及び８４位（Ｋａｂａｔ番号付け）における前記ＶＨの前記１つ以上のアミノ酸残基が正に帯電したアミノ酸残基である場合、前記置換することが、
前記１つ以上の正に帯電したアミノ酸残基を、１つ以上の中性又は負に帯電したアミノ酸残基と交換して、前記第１の親抗体の前記等電点を低下させることを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記置換することが、
前記第１の親抗体における７４位（Ｋａｂａｔ番号付け）の前記ＶＨアミノ酸残基を、負に帯電したアミノ酸残基と交換して、前記第１の親抗体の前記等電点を低下させることを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記置換することが、
前記第１の親抗体における８２ａ位（Ｋａｂａｔ番号付け）の前記ＶＨアミノ酸残基を、負に帯電したアミノ酸残基と交換して、前記第１の親抗体の前記等電点を低下させることを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
前記置換することが、
前記第１の親抗体における８４位（Ｋａｂａｔ番号付け）の前記ＶＨアミノ酸残基を、負に帯電したアミノ酸残基と交換して、前記第１の親抗体の前記等電点を低下させることを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
前記置換することが、
前記第１の親抗体における７４、８２ａ及び８４位（Ｋａｂａｔ番号付け）から選択される位置のうちの少なくとも２ヶ所の前記ＶＨアミノ酸残基を、負に帯電したアミノ酸残基と交換して、前記第１の親抗体の前記等電点を低下させることを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２７】
前記置換することが、
前記第１の親抗体における７４、８２ａ及び８４位（Ｋａｂａｔ番号付け）の３つ全ての位置の前記ＶＨアミノ酸残基を、負に帯電したアミノ酸残基と交換して、前記第１の親抗体の前記等電点を低下させることを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２８】
多重特異性抗体であって、
重鎖可変領域を含む第１のポリペプチドと、
重鎖可変領域を含む第２のポリペプチドと、を含み、前記第１のポリペプチドの等電点が、前記第２のポリペプチドの等電点より低く、前記第１のポリペプチドの前記重鎖可変領域の９、７０、７４、８２ａ及び８４位（Ｋａｂａｔ番号付け）における１つ以上のアミノ酸残基が、中性又は負に帯電したアミノ酸残基を含み、前記第２のポリペプチドの前記重鎖可変領域の対応する位置における１つ以上のアミノ酸残基が、前記第１のポリペプチドと比較して差次的に帯電したアミノ酸残基を含む、多重特異性抗体。
【請求項２９】
前記第２のポリペプチドの前記重鎖可変領域の７、９、１１、１４、４１、７４、８４及び１１３位における１つ以上のアミノ酸残基が、中性又は正に帯電したアミノ酸残基を含み、前記第１のポリペプチドの前記重鎖可変領域の対応する位置における１つ以上のアミノ酸残基が、前記第２のポリペプチドと比較して、差次的に帯電したアミノ酸残基を含む、請求項２８に記載の多重特異性抗体。
【請求項３０】
１つ以上の位置９、７０、７４、８２ａ及び８４位（Ｋａｂａｔ番号付け）における前記中性又は負に帯電したアミノ酸残基がアミノ酸置換である、請求項２８に記載の多重特異性抗体。
【請求項３１】
多重特異性抗体であって、
重鎖可変領域を含む第１のポリペプチドと、
重鎖可変領域を含む第２のポリペプチドと、を含み、前記第１のポリペプチドの等電点が、前記第２のポリペプチドの等電点より高く、前記第１のポリペプチドの前記重鎖可変領域の７、９、１１、１４、４１、７４、８４及び１１３位（Ｋａｂａｔ番号付け）における１つ以上のアミノ酸残基が中性又は正に帯電したアミノ酸残基を含み、前記第２のポリペプチドの前記重鎖可変領域の対応する位置における１つ以上のアミノ酸残基が、前記第１のポリペプチドと比較して差次的に帯電したアミノ酸残基を含む、多重特異性抗体。
【請求項３２】
前記第２のポリペプチドの前記重鎖可変領域の９、７０、７４、８２ａ及び８４位（Ｋａｂａｔ番号付け）における１つ以上のアミノ酸残基が中性又は負に帯電したアミノ酸残基を含み、前記第１のポリペプチドの前記重鎖可変領域の対応する位置における１つ以上のアミノ酸残基が、前記第２のポリペプチドと比較して差次的に帯電したアミノ酸残基を含む、請求項３０に記載の多重特異性抗体。
【請求項３３】
１つ以上の位置７、９、１１、１４、４１、７４、８４及び１１３位（Ｋａｂａｔ番号付け）における前記中性又は正に帯電したアミノ酸残基がアミノ酸置換である、請求項３１に記載の多重特異性抗体。
【請求項３４】
前記多重特異性抗体が、二重特異性抗体である、請求項２８〜３３のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（配列表）
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出される配列表を含み、その全内容は全て参照により本明細書に組み込まれている。２０１８年５月１６日に作成されたＡＳＣＩＩテキストファイルは、ファイル名がＪＢＩ５１００ＷＯＰＣＴＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴであり、サイズは１８キロバイトである。
【０００２】
（発明の分野）
本開示は、二重特異性抗体製造を増強するために表面電荷を工学的に操作する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
抗体ベースの治療薬は、癌及び自己免疫／炎症性疾患を含む様々な疾患を治療するために成功裏に使用されてきた。しかし、特に臨床的有効性を高めるために、この種類の薬物への改良が依然として必要とされている。探求されている１つの手段は、単一の免疫グロブリン分子が２つの異なる抗原と共係合するように、追加及び新規抗原結合部位を抗体系薬物へ工学的に操作することである。２つの異なる抗原に係合する、かかる代替抗体フォーマットは、二重特異性抗体と呼ばれることが多い。
【０００４】
それらの特有の作用機序により、二重特異性抗体は、生物治療候補として益々注目を集めている。従来、ＩｇＧタイプ二重特異性抗体の製造は、４つの核酸分子、例えば、所与の抗原に特異的な第１の抗体の重鎖及び軽鎖ポリペプチドをコードする核酸分子、並びに異なる抗原に特異的な第２の抗体の重鎖及び軽鎖ポリペプチドをコードする核酸分子の細胞への導入を含んでいた。この系では、２つの重鎖及び２つの軽鎖をコードする核酸分子の発現、並びに２つの異なる重鎖間及び重鎖と軽鎖との間の一般的にランダムな会合は、重鎖と軽鎖との所望の組み合わせを有するわずかな割合の製造された抗体をもたらした。このようにして製造された１０個の抗体のうちの１つのみが、対象とする二重特異性抗体を生成するために適切なＨＣ及びＬＣ対形成を達成する。この問題に対処するために、２つの異なるＨＣのヘテロ二量化、及び所望の二重特異性を形成するためのそれらのＬＣパートナーとのＨＣの適切な対形成が想到された。このような戦略は、電荷、疎水性、立体障害、又はこれらの組み合わせの導入の結果として、望ましくない対形成を不利にする突然変異を導入した。このような種類のアプローチは、二重特異性抗体の割合を大幅に増加させたが、他の望ましくない抗体種は残っていた。これらの望ましくない不純物は、所望の産物に密接に関連しているため、除去するのが困難であり得る。
【０００５】
２００６年３月１６日、Ｈｕａｎｇら（国際特許出願公開第２００６／０２８９３６号）は、所望の抗体ヘテロ多量体の精製を容易にするために、抗体のうちの１つ以上のＣＤＲ又はフレームワークにおける選択的置換を行うことにより、第１のポリペプチド対と第２のポリペプチド対との間の等電点（ｐＩ）における差異を操作することが望ましい場合があることを示唆している。Ｉｇａｗａらによる後続の仕事（米国特許出願公開第２００９０２６３３９２号及び同第２０１１００７６２７５号）は、二重特異性抗体を含む半抗体の一方又は両方を異なるｐＩを有するように工学的に操作することを伴う二重特異性抗体製造の過程で形成された、望ましくない単特異性ホモ二量体副生成物の除去を強化するための方法を開示した。ｐＩの変化は、抗体の定常領域及び／又は可変領域における１つ以上の特定のアミノ酸置換を導入することによって工学的に操作される。半抗体の一方又は両方のｐＩの変化の結果として、所望の二重特異性抗体は、カチオン交換を用いて親単特異性ホモ二量体抗体からより容易に精製することができる。同様に、Ｍｏｏｒｅらへの米国特許公開第２０１４０２９４８２３号は、親抗体の１つの重鎖定常領域における特定のアミノ酸置換がヘテロ二量体抗体を生成し、ここで２つの重鎖は異なる等電点（ｐＩ）を有する、同様のアプローチを記載した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
これらの努力にもかかわらず、二重特異性抗体の精製のための更なる方法が依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示の一態様は、抗体の等電点を改変する方法を目的とする。本方法は、抗体を提供することと、ここで抗体が、重鎖可変領域を含む第１のポリペプチドと、重鎖可変領域を含む第２のポリペプチドとを含み；抗体の第１及び第２のポリペプチドのうちの少なくとも１つにおいて、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って７、９、１１、１４、４１、７０、７４、８２ａ、８４及び１１３位における重鎖可変領域（ＶＨ）の１つ以上のアミノ酸残基を置換することと、ここで置換することが抗体の等電点を上昇又は低下させる；を含む。
【０００８】
本開示の第２の態様は、本明細書に記載される方法により製造される改変された等電点を有する抗体を目的とする。
【０００９】
本開示の第３の態様は、二重特異性抗体の、その２つの親抗体からの分離を増強する方法を目的とする。この方法は、第１及び第２の親抗体を提供することと、ここで各親抗体は重鎖可変領域を含み、第１及び第２の親抗体のうちの少なくとも１つにおいて、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによる７、９、１１、１４、４１、７０、７４、８２ａ、８４及び１１３位の重鎖可変領域（ＶＨ）中の１つ以上のアミノ酸残基を置換することと、ここで置換することが、第２の親抗体に対する第１の親抗体の等電点を上昇又は低下させる。この方法は、置換することの後に２つの親抗体から二重特異性抗体を製造することと；製造された二重特異性抗体をその２つの親抗体から分離することと、ここで二重特異性抗体の分離が置換の結果として増強される；を更に含む。
【００１０】
本開示の第４の態様は、多重特異性抗体であって、重鎖可変領域を含む第１のポリペプチドと、重鎖可変領域を含む第２のポリペプチドと、を含み、第１のポリペプチドの等電点が、第２のポリペプチドの等電点より低い、多重特異性抗体を目的とする。この態様によれば、第１のポリペプチドの重鎖可変領域の９、７０、７４、８２ａ及び８４位（Ｋａｂａｔ番号付け）における１つ以上のアミノ酸残基が、中性又は負に帯電したアミノ酸残基を含み、第２のポリペプチドの重鎖可変領域の対応する位置における１つ以上のアミノ酸残基が、第１のポリペプチドと比較して差次的に帯電したアミノ酸残基を含む。
【００１１】
本開示の第５の態様は、多重特異性抗体であって、重鎖可変領域を含む第１のポリペプチドと、重鎖可変領域を含む第２のポリペプチドと、を含み、第１のポリペプチドの等電点が、第２のポリペプチドの等電点より高い、多重特異性抗体を目的とする。この態様によれば、第１のポリペプチドの重鎖可変領域の７、９、１１、１４、４１、７４、８４及び１１３位（Ｋａｂａｔ番号付け）における１つ以上のアミノ酸残基が中性又は正に帯電したアミノ酸残基を含み、第２のポリペプチドの重鎖可変領域の対応する位置における１つ以上のアミノ酸残基が、第１のポリペプチドと比較して差次的に帯電したアミノ酸残基を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】ＣＮＴＯ１４８抗体単一置換変異体のヒトＴＮＦα結合ＥＬＩＳＡのグラフである。図１Ａは、野生型（１４８ＷＴ及びＣＮＴＯ１４８）と比較した、Ｓ７５Ｄ及びＮ８４Ｄ抗体変異体のＴＮＦα結合を示す。図１Ｂは、野生型と比較したＡ８８Ｄ抗体変異体のＴＮＦα結合を示す。図１Ｃは、野生型と比較したＧ９Ｅ及びＳ７１Ｅ抗体変異体のＴＮＦα結合を示す。ＴＮＦαに結合するＣＮＴＯ９５抗体は陰性対照として示される。
【図１Ｂ】ＣＮＴＯ１４８抗体単一置換変異体のヒトＴＮＦα結合ＥＬＩＳＡのグラフである。図１Ａは、野生型（１４８ＷＴ及びＣＮＴＯ１４８）と比較した、Ｓ７５Ｄ及びＮ８４Ｄ抗体変異体のＴＮＦα結合を示す。図１Ｂは、野生型と比較したＡ８８Ｄ抗体変異体のＴＮＦα結合を示す。図１Ｃは、野生型と比較したＧ９Ｅ及びＳ７１Ｅ抗体変異体のＴＮＦα結合を示す。ＴＮＦαに結合するＣＮＴＯ９５抗体は陰性対照として示される。
【図１Ｃ】ＣＮＴＯ１４８抗体単一置換変異体のヒトＴＮＦα結合ＥＬＩＳＡのグラフである。図１Ａは、野生型（１４８ＷＴ及びＣＮＴＯ１４８）と比較した、Ｓ７５Ｄ及びＮ８４Ｄ抗体変異体のＴＮＦα結合を示す。図１Ｂは、野生型と比較したＡ８８Ｄ抗体変異体のＴＮＦα結合を示す。図１Ｃは、野生型と比較したＧ９Ｅ及びＳ７１Ｅ抗体変異体のＴＮＦα結合を示す。ＴＮＦαに結合するＣＮＴＯ９５抗体は陰性対照として示される。
【図２Ａ】ＣＮＴＯ１４８の単一置換変異体の分析サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）分析を示す。特に、図２Ａは、ＣＮＴＯ１４８野生型抗体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図２Ｂは、Ｎ８４Ｄ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図２Ｃは、Ｓ７５Ｄ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示す。
【図２Ｂ】ＣＮＴＯ１４８の単一置換変異体の分析サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）分析を示す。特に、図２Ａは、ＣＮＴＯ１４８野生型抗体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図２Ｂは、Ｎ８４Ｄ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図２Ｃは、Ｓ７５Ｄ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示す。
【図２Ｃ】ＣＮＴＯ１４８の単一置換変異体の分析サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）分析を示す。特に、図２Ａは、ＣＮＴＯ１４８野生型抗体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図２Ｂは、Ｎ８４Ｄ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図２Ｃは、Ｓ７５Ｄ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示す。
【図３Ａ】ＣＮＴＯ１４８野生型及びＡ８８Ｄ変異体の分析ＳＥ−ＨＰＬＣ分析を示す。特に、図３Ａは、ＣＮＴＯ１４８野生型抗体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図２Ｂは、Ａ８８Ｄ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示す。
【図３Ｂ】ＣＮＴＯ１４８野生型及びＡ８８Ｄ変異体の分析ＳＥ−ＨＰＬＣ分析を示す。特に、図３Ａは、ＣＮＴＯ１４８野生型抗体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図２Ｂは、Ａ８８Ｄ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示す。
【図４Ａ】ＣＮＴＯ１４８野生型、Ｇ９Ｅ及びＳ７１Ｅ変異体の分析ＳＥ−ＨＰＬＣ分析を示す。特に、図４Ａは、ＣＮＴＯ１４８野生型抗体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図４Ｂは、Ｇ９Ｅ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図４Ｃは、Ｓ７１Ｅ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示す。
【図４Ｂ】ＣＮＴＯ１４８野生型、Ｇ９Ｅ及びＳ７１Ｅ変異体の分析ＳＥ−ＨＰＬＣ分析を示す。特に、図４Ａは、ＣＮＴＯ１４８野生型抗体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図４Ｂは、Ｇ９Ｅ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図４Ｃは、Ｓ７１Ｅ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示す。
【図４Ｃ】ＣＮＴＯ１４８野生型、Ｇ９Ｅ及びＳ７１Ｅ変異体の分析ＳＥ−ＨＰＬＣ分析を示す。特に、図４Ａは、ＣＮＴＯ１４８野生型抗体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図４Ｂは、Ｇ９Ｅ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図４Ｃは、Ｓ７１Ｅ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示す。
【図５Ａ】ＣＮＴＯ１４８の単一置換変異体の凝集（コロイド安定性）分析の開始を示すグラフである。図５Ａは、６３．９℃で発生するＣＮＴＯ１４８野生型の凝集の開始を示し、図５Ｂは、６６．８℃で発生するＳ７５Ｄ変異体抗体の凝集の開始を示し、図５Ｃは、６５．８℃で発生するＮ８４Ｄ変異体に対する凝集の開始を示す。
【図５Ｂ】ＣＮＴＯ１４８の単一置換変異体の凝集（コロイド安定性）分析の開始を示すグラフである。図５Ａは、６３．９℃で発生するＣＮＴＯ１４８野生型の凝集の開始を示し、図５Ｂは、６６．８℃で発生するＳ７５Ｄ変異体抗体の凝集の開始を示し、図５Ｃは、６５．８℃で発生するＮ８４Ｄ変異体に対する凝集の開始を示す。
【図５Ｃ】ＣＮＴＯ１４８の単一置換変異体の凝集（コロイド安定性）分析の開始を示すグラフである。図５Ａは、６３．９℃で発生するＣＮＴＯ１４８野生型の凝集の開始を示し、図５Ｂは、６６．８℃で発生するＳ７５Ｄ変異体抗体の凝集の開始を示し、図５Ｃは、６５．８℃で発生するＮ８４Ｄ変異体に対する凝集の開始を示す。
【図６Ａ】ＣＮＴＯ１４８野生型及びＡ８８Ｄ変異体の凝集（コロイド安定性）分析の開始を示すグラフである。図６Ａは、野生型について凝集の開始が６７．６℃で生じることを示し、図６Ｂは、Ａ８８Ｄ変異体について凝集の開始が６６．９℃で生じることを示す。
【図６Ｂ】ＣＮＴＯ１４８野生型及びＡ８８Ｄ変異体の凝集（コロイド安定性）分析の開始を示すグラフである。図６Ａは、野生型について凝集の開始が６７．６℃で生じることを示し、図６Ｂは、Ａ８８Ｄ変異体について凝集の開始が６６．９℃で生じることを示す。
【図７Ａ】ＣＮＴＯ１４８野生型、Ｇ９Ｅ及びＳ７１Ｅ変異体の凝集（コロイド安定性）分析の開始を示すグラフである。図７Ａは、野生型について凝集の開始が６８．６℃で生じることを示し、図７Ｂは、６５．７℃でＧ９Ｅ変異体の凝集の開始示し、図７Ｃは、Ｓ７１Ｅ変異体について凝集の開始が６９．５℃で生じることを示す。
【図７Ｂ】ＣＮＴＯ１４８野生型、Ｇ９Ｅ及びＳ７１Ｅ変異体の凝集（コロイド安定性）分析の開始を示すグラフである。図７Ａは、野生型について凝集の開始が６８．６℃で生じることを示し、図７Ｂは、６５．７℃でＧ９Ｅ変異体の凝集の開始示し、図７Ｃは、Ｓ７１Ｅ変異体について凝集の開始が６９．５℃で生じることを示す。
【図７Ｃ】ＣＮＴＯ１４８野生型、Ｇ９Ｅ及びＳ７１Ｅ変異体の凝集（コロイド安定性）分析の開始を示すグラフである。図７Ａは、野生型について凝集の開始が６８．６℃で生じることを示し、図７Ｂは、６５．７℃でＧ９Ｅ変異体の凝集の開始示し、図７Ｃは、Ｓ７１Ｅ変異体について凝集の開始が６９．５℃で生じることを示す。
【図８Ａ】ＣＮＴＯ１４８の単一置換変異体のアンフォールディング（立体配座安定性）分析の温度を示すグラフである。図８Ａは、野生型についてのアンフォールディング温度が６３．９℃で生じることを示し、図８Ｂは、Ｓ７５Ｄ変異体についてのアンフォールディング温度６７．３℃で生じることを示し、図８Ｃは、Ｎ８４Ｄ変異体についてのアンフォールディング温度が６５．３℃で生じることを示す。
【図８Ｂ】ＣＮＴＯ１４８の単一置換変異体のアンフォールディング（立体配座安定性）分析の温度を示すグラフである。図８Ａは、野生型についてのアンフォールディング温度が６３．９℃で生じることを示し、図８Ｂは、Ｓ７５Ｄ変異体についてのアンフォールディング温度６７．３℃で生じることを示し、図８Ｃは、Ｎ８４Ｄ変異体についてのアンフォールディング温度が６５．３℃で生じることを示す。
【図８Ｃ】ＣＮＴＯ１４８の単一置換変異体のアンフォールディング（立体配座安定性）分析の温度を示すグラフである。図８Ａは、野生型についてのアンフォールディング温度が６３．９℃で生じることを示し、図８Ｂは、Ｓ７５Ｄ変異体についてのアンフォールディング温度６７．３℃で生じることを示し、図８Ｃは、Ｎ８４Ｄ変異体についてのアンフォールディング温度が６５．３℃で生じることを示す。
【図９Ａ】ＣＮＴＯ１４８野生型及びＡ８８Ｄ変異体のアンフォールディング（立体配座安定性）分析の温度を示すグラフである。図９Ａは、野生型のアンフォールディング温度が６７．３℃で生じることを示し、図９Ｂは、Ａ８８Ｄ変異体のアンフォールディング温度が６６．９℃で生じることを示す。
【図９Ｂ】ＣＮＴＯ１４８野生型及びＡ８８Ｄ変異体のアンフォールディング（立体配座安定性）分析の温度を示すグラフである。図９Ａは、野生型のアンフォールディング温度が６７．３℃で生じることを示し、図９Ｂは、Ａ８８Ｄ変異体のアンフォールディング温度が６６．９℃で生じることを示す。
【図１０Ａ】ＣＮＴＯ１４８野生型、Ｇ９Ｅ及びＳ７１Ｅ変異体のアンフォールディング（立体配座安定性）分析の温度を示すグラフである。図１０Ａは、野生型についてのアンフォールディング温度が６８．８℃で生じることを示し、図１０Ｂは、Ｇ９Ｅ変異体についてのアンフォールディング温度が６５．８℃で生じることを示し、図１０Ｃは、Ｓ７１Ｅ変異体についてのアンフォールディング温度が６９．５℃で生じることを示す。
【図１０Ｂ】ＣＮＴＯ１４８野生型、Ｇ９Ｅ及びＳ７１Ｅ変異体のアンフォールディング（立体配座安定性）分析の温度を示すグラフである。図１０Ａは、野生型についてのアンフォールディング温度が６８．８℃で生じることを示し、図１０Ｂは、Ｇ９Ｅ変異体についてのアンフォールディング温度が６５．８℃で生じることを示し、図１０Ｃは、Ｓ７１Ｅ変異体についてのアンフォールディング温度が６９．５℃で生じることを示す。
【図１０Ｃ】ＣＮＴＯ１４８野生型、Ｇ９Ｅ及びＳ７１Ｅ変異体のアンフォールディング（立体配座安定性）分析の温度を示すグラフである。図１０Ａは、野生型についてのアンフォールディング温度が６８．８℃で生じることを示し、図１０Ｂは、Ｇ９Ｅ変異体についてのアンフォールディング温度が６５．８℃で生じることを示し、図１０Ｃは、Ｓ７１Ｅ変異体についてのアンフォールディング温度が６９．５℃で生じることを示す。
【図１１】ＣＮＴＯ９５抗体単一置換変異体のヒトαＶβ３結合ＥＬＩＳＡのグラフである。図１１は、ＣＮＴＯ９５野生型と比較した、Ｓ７Ｒ、Ｇ９Ｒ、Ｖ１１Ｒ、Ｐ１４Ｒ、Ｐ４１Ｒ、Ｓ７１Ｋ、Ａ８８Ｒ及びＳ１１９Ｒ抗体変異体のαＶβ３結合を示す。αＶβ３に結合するＣＮＴＯ１４８抗体を陰性対照として示す。
【図１２Ａ】ＣＮＴＯ９５単一置換変異体の分析サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）分析を示す。特に、図１２Ａは、ＣＮＴＯ９５野生型抗体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１２Ｂは、Ｓ７Ｒ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１２Ｃは、Ｇ９Ｒ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１２Ｄは、Ｖ１１Ｒ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示す。図１２Ｅは、Ｐ１４Ｒ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１２Ｆは、Ｐ４１Ｒ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１２Ｇは、Ｓ７１Ｋ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１２Ｈは、Ａ８８Ｒ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１２Ｉは、Ｓ１１９Ｒ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣ変異体を示す。
【図１２Ｂ】ＣＮＴＯ９５単一置換変異体の分析サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）分析を示す。特に、図１２Ａは、ＣＮＴＯ９５野生型抗体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１２Ｂは、Ｓ７Ｒ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１２Ｃは、Ｇ９Ｒ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１２Ｄは、Ｖ１１Ｒ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示す。図１２Ｅは、Ｐ１４Ｒ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１２Ｆは、Ｐ４１Ｒ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１２Ｇは、Ｓ７１Ｋ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１２Ｈは、Ａ８８Ｒ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１２Ｉは、Ｓ１１９Ｒ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣ変異体を示す。
【図１２Ｃ】ＣＮＴＯ９５単一置換変異体の分析サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）分析を示す。特に、図１２Ａは、ＣＮＴＯ９５野生型抗体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１２Ｂは、Ｓ７Ｒ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１２Ｃは、Ｇ９Ｒ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１２Ｄは、Ｖ１１Ｒ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示す。図１２Ｅは、Ｐ１４Ｒ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１２Ｆは、Ｐ４１Ｒ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１２Ｇは、Ｓ７１Ｋ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１２Ｈは、Ａ８８Ｒ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１２Ｉは、Ｓ１１９Ｒ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣ変異体を示す。
【図１２Ｄ】ＣＮＴＯ９５単一置換変異体の分析サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）分析を示す。特に、図１２Ａは、ＣＮＴＯ９５野生型抗体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１２Ｂは、Ｓ７Ｒ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１２Ｃは、Ｇ９Ｒ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１２Ｄは、Ｖ１１Ｒ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示す。図１２Ｅは、Ｐ１４Ｒ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１２Ｆは、Ｐ４１Ｒ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１２Ｇは、Ｓ７１Ｋ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１２Ｈは、Ａ８８Ｒ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１２Ｉは、Ｓ１１９Ｒ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣ変異体を示す。
【図１２Ｅ】ＣＮＴＯ９５単一置換変異体の分析サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）分析を示す。特に、図１２Ａは、ＣＮＴＯ９５野生型抗体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１２Ｂは、Ｓ７Ｒ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１２Ｃは、Ｇ９Ｒ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１２Ｄは、Ｖ１１Ｒ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示す。図１２Ｅは、Ｐ１４Ｒ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１２Ｆは、Ｐ４１Ｒ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１２Ｇは、Ｓ７１Ｋ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１２Ｈは、Ａ８８Ｒ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１２Ｉは、Ｓ１１９Ｒ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣ変異体を示す。
【図１２Ｆ】ＣＮＴＯ９５単一置換変異体の分析サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）分析を示す。特に、図１２Ａは、ＣＮＴＯ９５野生型抗体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１２Ｂは、Ｓ７Ｒ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１２Ｃは、Ｇ９Ｒ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１２Ｄは、Ｖ１１Ｒ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示す。図１２Ｅは、Ｐ１４Ｒ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１２Ｆは、Ｐ４１Ｒ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１２Ｇは、Ｓ７１Ｋ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１２Ｈは、Ａ８８Ｒ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１２Ｉは、Ｓ１１９Ｒ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣ変異体を示す。
【図１２Ｇ】ＣＮＴＯ９５単一置換変異体の分析サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）分析を示す。特に、図１２Ａは、ＣＮＴＯ９５野生型抗体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１２Ｂは、Ｓ７Ｒ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１２Ｃは、Ｇ９Ｒ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１２Ｄは、Ｖ１１Ｒ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示す。図１２Ｅは、Ｐ１４Ｒ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１２Ｆは、Ｐ４１Ｒ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１２Ｇは、Ｓ７１Ｋ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１２Ｈは、Ａ８８Ｒ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１２Ｉは、Ｓ１１９Ｒ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣ変異体を示す。
【図１２Ｈ】ＣＮＴＯ９５単一置換変異体の分析サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）分析を示す。特に、図１２Ａは、ＣＮＴＯ９５野生型抗体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１２Ｂは、Ｓ７Ｒ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１２Ｃは、Ｇ９Ｒ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１２Ｄは、Ｖ１１Ｒ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示す。図１２Ｅは、Ｐ１４Ｒ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１２Ｆは、Ｐ４１Ｒ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１２Ｇは、Ｓ７１Ｋ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１２Ｈは、Ａ８８Ｒ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１２Ｉは、Ｓ１１９Ｒ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣ変異体を示す。
【図１２Ｉ】ＣＮＴＯ９５単一置換変異体の分析サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）分析を示す。特に、図１２Ａは、ＣＮＴＯ９５野生型抗体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１２Ｂは、Ｓ７Ｒ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１２Ｃは、Ｇ９Ｒ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１２Ｄは、Ｖ１１Ｒ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示す。図１２Ｅは、Ｐ１４Ｒ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１２Ｆは、Ｐ４１Ｒ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１２Ｇは、Ｓ７１Ｋ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１２Ｈは、Ａ８８Ｒ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１２Ｉは、Ｓ１１９Ｒ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣ変異体を示す。
【図１３Ａ】ＣＮＴＯ９５の単一置換変異体の凝集（コロイド安定性）分析の開始を示すグラフである。図１３Ａは、ＣＮＴＯ９５野生型について凝集の開始が６８．２℃で生じることを示し、図１３Ｂは、Ｓ７Ｒ変異体抗体について凝集の開始が６７．２℃で生じることを示し、図１３Ｃは、Ｇ９Ｒ変異体について凝集の開始が５７．９℃で生じることを示し、図１３Ｄは、Ｖ１１Ｒ変異体について凝集の開始が６３．９℃で生じることを示し、図１３Ｅは、Ｐ１４Ｒ変異体について凝集の開始が６３．５℃で生じることを示し、図１３Ｆは、Ｐ４１Ｒ変異体について凝集の開始が６６．４℃で生じることを示し、図１３Ｇは、Ｓ７１Ｋ変異体について凝集の開始が６４．９℃で生じることを示し、図１３Ｈは、Ａ８８Ｒ変異体について凝集の開始が６７．６℃で生じることを示し、図１３Ｉは、Ｓ１１９Ｒ変異体について凝集の開始が６６．７℃で生じることを示す。
【図１３Ｂ】ＣＮＴＯ９５の単一置換変異体の凝集（コロイド安定性）分析の開始を示すグラフである。図１３Ａは、ＣＮＴＯ９５野生型について凝集の開始が６８．２℃で生じることを示し、図１３Ｂは、Ｓ７Ｒ変異体抗体について凝集の開始が６７．２℃で生じることを示し、図１３Ｃは、Ｇ９Ｒ変異体について凝集の開始が５７．９℃で生じることを示し、図１３Ｄは、Ｖ１１Ｒ変異体について凝集の開始が６３．９℃で生じることを示し、図１３Ｅは、Ｐ１４Ｒ変異体について凝集の開始が６３．５℃で生じることを示し、図１３Ｆは、Ｐ４１Ｒ変異体について凝集の開始が６６．４℃で生じることを示し、図１３Ｇは、Ｓ７１Ｋ変異体について凝集の開始が６４．９℃で生じることを示し、図１３Ｈは、Ａ８８Ｒ変異体について凝集の開始が６７．６℃で生じることを示し、図１３Ｉは、Ｓ１１９Ｒ変異体について凝集の開始が６６．７℃で生じることを示す。
【図１３Ｃ】ＣＮＴＯ９５の単一置換変異体の凝集（コロイド安定性）分析の開始を示すグラフである。図１３Ａは、ＣＮＴＯ９５野生型について凝集の開始が６８．２℃で生じることを示し、図１３Ｂは、Ｓ７Ｒ変異体抗体について凝集の開始が６７．２℃で生じることを示し、図１３Ｃは、Ｇ９Ｒ変異体について凝集の開始が５７．９℃で生じることを示し、図１３Ｄは、Ｖ１１Ｒ変異体について凝集の開始が６３．９℃で生じることを示し、図１３Ｅは、Ｐ１４Ｒ変異体について凝集の開始が６３．５℃で生じることを示し、図１３Ｆは、Ｐ４１Ｒ変異体について凝集の開始が６６．４℃で生じることを示し、図１３Ｇは、Ｓ７１Ｋ変異体について凝集の開始が６４．９℃で生じることを示し、図１３Ｈは、Ａ８８Ｒ変異体について凝集の開始が６７．６℃で生じることを示し、図１３Ｉは、Ｓ１１９Ｒ変異体について凝集の開始が６６．７℃で生じることを示す。
【図１３Ｄ】ＣＮＴＯ９５の単一置換変異体の凝集（コロイド安定性）分析の開始を示すグラフである。図１３Ａは、ＣＮＴＯ９５野生型について凝集の開始が６８．２℃で生じることを示し、図１３Ｂは、Ｓ７Ｒ変異体抗体について凝集の開始が６７．２℃で生じることを示し、図１３Ｃは、Ｇ９Ｒ変異体について凝集の開始が５７．９℃で生じることを示し、図１３Ｄは、Ｖ１１Ｒ変異体について凝集の開始が６３．９℃で生じることを示し、図１３Ｅは、Ｐ１４Ｒ変異体について凝集の開始が６３．５℃で生じることを示し、図１３Ｆは、Ｐ４１Ｒ変異体について凝集の開始が６６．４℃で生じることを示し、図１３Ｇは、Ｓ７１Ｋ変異体について凝集の開始が６４．９℃で生じることを示し、図１３Ｈは、Ａ８８Ｒ変異体について凝集の開始が６７．６℃で生じることを示し、図１３Ｉは、Ｓ１１９Ｒ変異体について凝集の開始が６６．７℃で生じることを示す。
【図１３Ｅ】ＣＮＴＯ９５の単一置換変異体の凝集（コロイド安定性）分析の開始を示すグラフである。図１３Ａは、ＣＮＴＯ９５野生型について凝集の開始が６８．２℃で生じることを示し、図１３Ｂは、Ｓ７Ｒ変異体抗体について凝集の開始が６７．２℃で生じることを示し、図１３Ｃは、Ｇ９Ｒ変異体について凝集の開始が５７．９℃で生じることを示し、図１３Ｄは、Ｖ１１Ｒ変異体について凝集の開始が６３．９℃で生じることを示し、図１３Ｅは、Ｐ１４Ｒ変異体について凝集の開始が６３．５℃で生じることを示し、図１３Ｆは、Ｐ４１Ｒ変異体について凝集の開始が６６．４℃で生じることを示し、図１３Ｇは、Ｓ７１Ｋ変異体について凝集の開始が６４．９℃で生じることを示し、図１３Ｈは、Ａ８８Ｒ変異体について凝集の開始が６７．６℃で生じることを示し、図１３Ｉは、Ｓ１１９Ｒ変異体について凝集の開始が６６．７℃で生じることを示す。
【図１３Ｆ】ＣＮＴＯ９５の単一置換変異体の凝集（コロイド安定性）分析の開始を示すグラフである。図１３Ａは、ＣＮＴＯ９５野生型について凝集の開始が６８．２℃で生じることを示し、図１３Ｂは、Ｓ７Ｒ変異体抗体について凝集の開始が６７．２℃で生じることを示し、図１３Ｃは、Ｇ９Ｒ変異体について凝集の開始が５７．９℃で生じることを示し、図１３Ｄは、Ｖ１１Ｒ変異体について凝集の開始が６３．９℃で生じることを示し、図１３Ｅは、Ｐ１４Ｒ変異体について凝集の開始が６３．５℃で生じることを示し、図１３Ｆは、Ｐ４１Ｒ変異体について凝集の開始が６６．４℃で生じることを示し、図１３Ｇは、Ｓ７１Ｋ変異体について凝集の開始が６４．９℃で生じることを示し、図１３Ｈは、Ａ８８Ｒ変異体について凝集の開始が６７．６℃で生じることを示し、図１３Ｉは、Ｓ１１９Ｒ変異体について凝集の開始が６６．７℃で生じることを示す。
【図１３Ｇ】ＣＮＴＯ９５の単一置換変異体の凝集（コロイド安定性）分析の開始を示すグラフである。図１３Ａは、ＣＮＴＯ９５野生型について凝集の開始が６８．２℃で生じることを示し、図１３Ｂは、Ｓ７Ｒ変異体抗体について凝集の開始が６７．２℃で生じることを示し、図１３Ｃは、Ｇ９Ｒ変異体について凝集の開始が５７．９℃で生じることを示し、図１３Ｄは、Ｖ１１Ｒ変異体について凝集の開始が６３．９℃で生じることを示し、図１３Ｅは、Ｐ１４Ｒ変異体について凝集の開始が６３．５℃で生じることを示し、図１３Ｆは、Ｐ４１Ｒ変異体について凝集の開始が６６．４℃で生じることを示し、図１３Ｇは、Ｓ７１Ｋ変異体について凝集の開始が６４．９℃で生じることを示し、図１３Ｈは、Ａ８８Ｒ変異体について凝集の開始が６７．６℃で生じることを示し、図１３Ｉは、Ｓ１１９Ｒ変異体について凝集の開始が６６．７℃で生じることを示す。
【図１３Ｈ】ＣＮＴＯ９５の単一置換変異体の凝集（コロイド安定性）分析の開始を示すグラフである。図１３Ａは、ＣＮＴＯ９５野生型について凝集の開始が６８．２℃で生じることを示し、図１３Ｂは、Ｓ７Ｒ変異体抗体について凝集の開始が６７．２℃で生じることを示し、図１３Ｃは、Ｇ９Ｒ変異体について凝集の開始が５７．９℃で生じることを示し、図１３Ｄは、Ｖ１１Ｒ変異体について凝集の開始が６３．９℃で生じることを示し、図１３Ｅは、Ｐ１４Ｒ変異体について凝集の開始が６３．５℃で生じることを示し、図１３Ｆは、Ｐ４１Ｒ変異体について凝集の開始が６６．４℃で生じることを示し、図１３Ｇは、Ｓ７１Ｋ変異体について凝集の開始が６４．９℃で生じることを示し、図１３Ｈは、Ａ８８Ｒ変異体について凝集の開始が６７．６℃で生じることを示し、図１３Ｉは、Ｓ１１９Ｒ変異体について凝集の開始が６６．７℃で生じることを示す。
【図１３Ｉ】ＣＮＴＯ９５の単一置換変異体の凝集（コロイド安定性）分析の開始を示すグラフである。図１３Ａは、ＣＮＴＯ９５野生型について凝集の開始が６８．２℃で生じることを示し、図１３Ｂは、Ｓ７Ｒ変異体抗体について凝集の開始が６７．２℃で生じることを示し、図１３Ｃは、Ｇ９Ｒ変異体について凝集の開始が５７．９℃で生じることを示し、図１３Ｄは、Ｖ１１Ｒ変異体について凝集の開始が６３．９℃で生じることを示し、図１３Ｅは、Ｐ１４Ｒ変異体について凝集の開始が６３．５℃で生じることを示し、図１３Ｆは、Ｐ４１Ｒ変異体について凝集の開始が６６．４℃で生じることを示し、図１３Ｇは、Ｓ７１Ｋ変異体について凝集の開始が６４．９℃で生じることを示し、図１３Ｈは、Ａ８８Ｒ変異体について凝集の開始が６７．６℃で生じることを示し、図１３Ｉは、Ｓ１１９Ｒ変異体について凝集の開始が６６．７℃で生じることを示す。
【図１４Ａ】ＣＮＴＯ９５の単一置換変異体のアンフォールディング（立体配座安定性）分析の温度を示すグラフである。図１４Ａは、野生型についてのアンフォールディング温度が６８．８℃で生じることを示し、図１４Ｂは、Ｓ７Ｒ変異体についてのアンフォールディング温度が６７．９℃で生じることを示し、図１４Ｃは、Ｇ９Ｒ変異体についてのアンフォールディング温度が５９．４℃で生じることを示し、図１４Ｄは、Ｖ１１Ｒ変異体についてのアンフォールディング温度が６４．８℃で生じることを示し、図１４Ｅは、Ｐ１４Ｒ変異体についてのアンフォールディング温度が６４．３℃で生じることを示し、図１４Ｆは、Ｐ４１Ｒ変異体についてのアンフォールディング温度が６６．８℃で生じることを示し、図１４Ｇは、Ｓ７１Ｋ変異体についてのアンフォールディング温度が６５．８℃で生じることを示し、図１４Ｈは、Ａ８８Ｒ変異体についてのアンフォールディング温度が６８．０℃で生じることを示し、図１４Ｉは、Ｓ１１９Ｒ変異体についてのアンフォールディング温度が６７．６℃で生じることを示す。
【図１４Ｂ】ＣＮＴＯ９５の単一置換変異体のアンフォールディング（立体配座安定性）分析の温度を示すグラフである。図１４Ａは、野生型についてのアンフォールディング温度が６８．８℃で生じることを示し、図１４Ｂは、Ｓ７Ｒ変異体についてのアンフォールディング温度が６７．９℃で生じることを示し、図１４Ｃは、Ｇ９Ｒ変異体についてのアンフォールディング温度が５９．４℃で生じることを示し、図１４Ｄは、Ｖ１１Ｒ変異体についてのアンフォールディング温度が６４．８℃で生じることを示し、図１４Ｅは、Ｐ１４Ｒ変異体についてのアンフォールディング温度が６４．３℃で生じることを示し、図１４Ｆは、Ｐ４１Ｒ変異体についてのアンフォールディング温度が６６．８℃で生じることを示し、図１４Ｇは、Ｓ７１Ｋ変異体についてのアンフォールディング温度が６５．８℃で生じることを示し、図１４Ｈは、Ａ８８Ｒ変異体についてのアンフォールディング温度が６８．０℃で生じることを示し、図１４Ｉは、Ｓ１１９Ｒ変異体についてのアンフォールディング温度が６７．６℃で生じることを示す。
【図１４Ｃ】ＣＮＴＯ９５の単一置換変異体のアンフォールディング（立体配座安定性）分析の温度を示すグラフである。図１４Ａは、野生型についてのアンフォールディング温度が６８．８℃で生じることを示し、図１４Ｂは、Ｓ７Ｒ変異体についてのアンフォールディング温度が６７．９℃で生じることを示し、図１４Ｃは、Ｇ９Ｒ変異体についてのアンフォールディング温度が５９．４℃で生じることを示し、図１４Ｄは、Ｖ１１Ｒ変異体についてのアンフォールディング温度が６４．８℃で生じることを示し、図１４Ｅは、Ｐ１４Ｒ変異体についてのアンフォールディング温度が６４．３℃で生じることを示し、図１４Ｆは、Ｐ４１Ｒ変異体についてのアンフォールディング温度が６６．８℃で生じることを示し、図１４Ｇは、Ｓ７１Ｋ変異体についてのアンフォールディング温度が６５．８℃で生じることを示し、図１４Ｈは、Ａ８８Ｒ変異体についてのアンフォールディング温度が６８．０℃で生じることを示し、図１４Ｉは、Ｓ１１９Ｒ変異体についてのアンフォールディング温度が６７．６℃で生じることを示す。
【図１４Ｄ】ＣＮＴＯ９５の単一置換変異体のアンフォールディング（立体配座安定性）分析の温度を示すグラフである。図１４Ａは、野生型についてのアンフォールディング温度が６８．８℃で生じることを示し、図１４Ｂは、Ｓ７Ｒ変異体についてのアンフォールディング温度が６７．９℃で生じることを示し、図１４Ｃは、Ｇ９Ｒ変異体についてのアンフォールディング温度が５９．４℃で生じることを示し、図１４Ｄは、Ｖ１１Ｒ変異体についてのアンフォールディング温度が６４．８℃で生じることを示し、図１４Ｅは、Ｐ１４Ｒ変異体についてのアンフォールディング温度が６４．３℃で生じることを示し、図１４Ｆは、Ｐ４１Ｒ変異体についてのアンフォールディング温度が６６．８℃で生じることを示し、図１４Ｇは、Ｓ７１Ｋ変異体についてのアンフォールディング温度が６５．８℃で生じることを示し、図１４Ｈは、Ａ８８Ｒ変異体についてのアンフォールディング温度が６８．０℃で生じることを示し、図１４Ｉは、Ｓ１１９Ｒ変異体についてのアンフォールディング温度が６７．６℃で生じることを示す。
【図１４Ｅ】ＣＮＴＯ９５の単一置換変異体のアンフォールディング（立体配座安定性）分析の温度を示すグラフである。図１４Ａは、野生型についてのアンフォールディング温度が６８．８℃で生じることを示し、図１４Ｂは、Ｓ７Ｒ変異体についてのアンフォールディング温度が６７．９℃で生じることを示し、図１４Ｃは、Ｇ９Ｒ変異体についてのアンフォールディング温度が５９．４℃で生じることを示し、図１４Ｄは、Ｖ１１Ｒ変異体についてのアンフォールディング温度が６４．８℃で生じることを示し、図１４Ｅは、Ｐ１４Ｒ変異体についてのアンフォールディング温度が６４．３℃で生じることを示し、図１４Ｆは、Ｐ４１Ｒ変異体についてのアンフォールディング温度が６６．８℃で生じることを示し、図１４Ｇは、Ｓ７１Ｋ変異体についてのアンフォールディング温度が６５．８℃で生じることを示し、図１４Ｈは、Ａ８８Ｒ変異体についてのアンフォールディング温度が６８．０℃で生じることを示し、図１４Ｉは、Ｓ１１９Ｒ変異体についてのアンフォールディング温度が６７．６℃で生じることを示す。
【図１４Ｆ】ＣＮＴＯ９５の単一置換変異体のアンフォールディング（立体配座安定性）分析の温度を示すグラフである。図１４Ａは、野生型についてのアンフォールディング温度が６８．８℃で生じることを示し、図１４Ｂは、Ｓ７Ｒ変異体についてのアンフォールディング温度が６７．９℃で生じることを示し、図１４Ｃは、Ｇ９Ｒ変異体についてのアンフォールディング温度が５９．４℃で生じることを示し、図１４Ｄは、Ｖ１１Ｒ変異体についてのアンフォールディング温度が６４．８℃で生じることを示し、図１４Ｅは、Ｐ１４Ｒ変異体についてのアンフォールディング温度が６４．３℃で生じることを示し、図１４Ｆは、Ｐ４１Ｒ変異体についてのアンフォールディング温度が６６．８℃で生じることを示し、図１４Ｇは、Ｓ７１Ｋ変異体についてのアンフォールディング温度が６５．８℃で生じることを示し、図１４Ｈは、Ａ８８Ｒ変異体についてのアンフォールディング温度が６８．０℃で生じることを示し、図１４Ｉは、Ｓ１１９Ｒ変異体についてのアンフォールディング温度が６７．６℃で生じることを示す。
【図１４Ｇ】ＣＮＴＯ９５の単一置換変異体のアンフォールディング（立体配座安定性）分析の温度を示すグラフである。図１４Ａは、野生型についてのアンフォールディング温度が６８．８℃で生じることを示し、図１４Ｂは、Ｓ７Ｒ変異体についてのアンフォールディング温度が６７．９℃で生じることを示し、図１４Ｃは、Ｇ９Ｒ変異体についてのアンフォールディング温度が５９．４℃で生じることを示し、図１４Ｄは、Ｖ１１Ｒ変異体についてのアンフォールディング温度が６４．８℃で生じることを示し、図１４Ｅは、Ｐ１４Ｒ変異体についてのアンフォールディング温度が６４．３℃で生じることを示し、図１４Ｆは、Ｐ４１Ｒ変異体についてのアンフォールディング温度が６６．８℃で生じることを示し、図１４Ｇは、Ｓ７１Ｋ変異体についてのアンフォールディング温度が６５．８℃で生じることを示し、図１４Ｈは、Ａ８８Ｒ変異体についてのアンフォールディング温度が６８．０℃で生じることを示し、図１４Ｉは、Ｓ１１９Ｒ変異体についてのアンフォールディング温度が６７．６℃で生じることを示す。
【図１４Ｈ】ＣＮＴＯ９５の単一置換変異体のアンフォールディング（立体配座安定性）分析の温度を示すグラフである。図１４Ａは、野生型についてのアンフォールディング温度が６８．８℃で生じることを示し、図１４Ｂは、Ｓ７Ｒ変異体についてのアンフォールディング温度が６７．９℃で生じることを示し、図１４Ｃは、Ｇ９Ｒ変異体についてのアンフォールディング温度が５９．４℃で生じることを示し、図１４Ｄは、Ｖ１１Ｒ変異体についてのアンフォールディング温度が６４．８℃で生じることを示し、図１４Ｅは、Ｐ１４Ｒ変異体についてのアンフォールディング温度が６４．３℃で生じることを示し、図１４Ｆは、Ｐ４１Ｒ変異体についてのアンフォールディング温度が６６．８℃で生じることを示し、図１４Ｇは、Ｓ７１Ｋ変異体についてのアンフォールディング温度が６５．８℃で生じることを示し、図１４Ｈは、Ａ８８Ｒ変異体についてのアンフォールディング温度が６８．０℃で生じることを示し、図１４Ｉは、Ｓ１１９Ｒ変異体についてのアンフォールディング温度が６７．６℃で生じることを示す。
【図１４Ｉ】ＣＮＴＯ９５の単一置換変異体のアンフォールディング（立体配座安定性）分析の温度を示すグラフである。図１４Ａは、野生型についてのアンフォールディング温度が６８．８℃で生じることを示し、図１４Ｂは、Ｓ７Ｒ変異体についてのアンフォールディング温度が６７．９℃で生じることを示し、図１４Ｃは、Ｇ９Ｒ変異体についてのアンフォールディング温度が５９．４℃で生じることを示し、図１４Ｄは、Ｖ１１Ｒ変異体についてのアンフォールディング温度が６４．８℃で生じることを示し、図１４Ｅは、Ｐ１４Ｒ変異体についてのアンフォールディング温度が６４．３℃で生じることを示し、図１４Ｆは、Ｐ４１Ｒ変異体についてのアンフォールディング温度が６６．８℃で生じることを示し、図１４Ｇは、Ｓ７１Ｋ変異体についてのアンフォールディング温度が６５．８℃で生じることを示し、図１４Ｈは、Ａ８８Ｒ変異体についてのアンフォールディング温度が６８．０℃で生じることを示し、図１４Ｉは、Ｓ１１９Ｒ変異体についてのアンフォールディング温度が６７．６℃で生じることを示す。
【図１５】抗ＴＩＭ３抗体単一置換変異体のヒトＴＩＭ３結合ＥＬＩＳＡを示す。
【図１６Ａ】抗ＴＩＭ３単一置換変異体の分析ＳＥ−ＨＰＬＣ分析を示す。図１６Ａは、ＴＩＭ３  Ｓ７５Ｄ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１６Ｂは、ＴＩＭ３野生型のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１６Ｃは、ＴＩＭ３  Ｎ８４Ｄ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１６Ｄは、ＴＩＭ３  Ａ８８Ｄ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣ変異体を示す。
【図１６Ｂ】抗ＴＩＭ３単一置換変異体の分析ＳＥ−ＨＰＬＣ分析を示す。図１６Ａは、ＴＩＭ３  Ｓ７５Ｄ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１６Ｂは、ＴＩＭ３野生型のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１６Ｃは、ＴＩＭ３  Ｎ８４Ｄ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１６Ｄは、ＴＩＭ３  Ａ８８Ｄ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣ変異体を示す。
【図１６Ｃ】抗ＴＩＭ３単一置換変異体の分析ＳＥ−ＨＰＬＣ分析を示す。図１６Ａは、ＴＩＭ３  Ｓ７５Ｄ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１６Ｂは、ＴＩＭ３野生型のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１６Ｃは、ＴＩＭ３  Ｎ８４Ｄ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１６Ｄは、ＴＩＭ３  Ａ８８Ｄ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣ変異体を示す。
【図１６Ｄ】抗ＴＩＭ３単一置換変異体の分析ＳＥ−ＨＰＬＣ分析を示す。図１６Ａは、ＴＩＭ３  Ｓ７５Ｄ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１６Ｂは、ＴＩＭ３野生型のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１６Ｃは、ＴＩＭ３  Ｎ８４Ｄ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１６Ｄは、ＴＩＭ３  Ａ８８Ｄ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣ変異体を示す。
【図１７Ａ】抗ＴＩＭ３単一置換変異体の凝集（コロイド安定性）分析の開始を示す。図１７Ａは、Ｓ７５Ｄ変異体について凝集の開始が６７．５℃で生じることを示し、図１７Ｂは、Ｎ８４Ｄ変異体の凝集の開始が６８．２℃で生じることを示し、図１７Ｃは、Ａ８８Ｄ変異体について凝集の開始が６６．７℃で生じることを示し、図１７Ｄは、野生型について凝集の開始が６８．５℃で生じることを示す。
【図１７Ｂ】抗ＴＩＭ３単一置換変異体の凝集（コロイド安定性）分析の開始を示す。図１７Ａは、Ｓ７５Ｄ変異体について凝集の開始が６７．５℃で生じることを示し、図１７Ｂは、Ｎ８４Ｄ変異体の凝集の開始が６８．２℃で生じることを示し、図１７Ｃは、Ａ８８Ｄ変異体について凝集の開始が６６．７℃で生じることを示し、図１７Ｄは、野生型について凝集の開始が６８．５℃で生じることを示す。
【図１７Ｃ】抗ＴＩＭ３単一置換変異体の凝集（コロイド安定性）分析の開始を示す。図１７Ａは、Ｓ７５Ｄ変異体について凝集の開始が６７．５℃で生じることを示し、図１７Ｂは、Ｎ８４Ｄ変異体の凝集の開始が６８．２℃で生じることを示し、図１７Ｃは、Ａ８８Ｄ変異体について凝集の開始が６６．７℃で生じることを示し、図１７Ｄは、野生型について凝集の開始が６８．５℃で生じることを示す。
【図１７Ｄ】抗ＴＩＭ３単一置換変異体の凝集（コロイド安定性）分析の開始を示す。図１７Ａは、Ｓ７５Ｄ変異体について凝集の開始が６７．５℃で生じることを示し、図１７Ｂは、Ｎ８４Ｄ変異体の凝集の開始が６８．２℃で生じることを示し、図１７Ｃは、Ａ８８Ｄ変異体について凝集の開始が６６．７℃で生じることを示し、図１７Ｄは、野生型について凝集の開始が６８．５℃で生じることを示す。
【図１８】ＳＰＲによって決定される、抗ＰＤ１単一置換変異体のＰＤ１結合動態を示す。
【図１９Ａ】抗ＰＤ１抗体単一置換変異体の分析ＳＥ−ＨＰＬＣ分析を示す。図１９Ａは、ＰＤ１  Ｓ７５Ｄ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１９Ｂは、ＰＤ１野生型のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１９Ｃは、ＰＤ１  Ｓ８４Ｄ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１９Ｄは、ＰＤ１  Ｓ８８Ｄ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣ変異体を示す。
【図１９Ｂ】抗ＰＤ１抗体単一置換変異体の分析ＳＥ−ＨＰＬＣ分析を示す。図１９Ａは、ＰＤ１  Ｓ７５Ｄ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１９Ｂは、ＰＤ１野生型のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１９Ｃは、ＰＤ１  Ｓ８４Ｄ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１９Ｄは、ＰＤ１  Ｓ８８Ｄ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣ変異体を示す。
【図１９Ｃ】抗ＰＤ１抗体単一置換変異体の分析ＳＥ−ＨＰＬＣ分析を示す。図１９Ａは、ＰＤ１  Ｓ７５Ｄ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１９Ｂは、ＰＤ１野生型のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１９Ｃは、ＰＤ１  Ｓ８４Ｄ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１９Ｄは、ＰＤ１  Ｓ８８Ｄ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣ変異体を示す。
【図１９Ｄ】抗ＰＤ１抗体単一置換変異体の分析ＳＥ−ＨＰＬＣ分析を示す。図１９Ａは、ＰＤ１  Ｓ７５Ｄ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１９Ｂは、ＰＤ１野生型のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１９Ｃは、ＰＤ１  Ｓ８４Ｄ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図１９Ｄは、ＰＤ１  Ｓ８８Ｄ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣ変異体を示す。
【図２０Ａ】抗ＰＤ１単一置換変異体の凝集（コロイド安定性）分析の開始を示す。図２０Ａは、Ｓ７５Ｄ変異体について凝集の開始が６６．６℃で生じることを示し、図２０Ｂは、Ｓ８４Ｄ変異体について凝集の開始が６６．１℃で生じることを示し、図２０Ｃは、Ｓ８８Ｄ変異体について凝集の開始が６６．５℃で生じることを示し、図２０Ｄは、野生型について凝集の開始が６５．７℃で生じることを示す。
【図２０Ｂ】抗ＰＤ１単一置換変異体の凝集（コロイド安定性）分析の開始を示す。図２０Ａは、Ｓ７５Ｄ変異体について凝集の開始が６６．６℃で生じることを示し、図２０Ｂは、Ｓ８４Ｄ変異体について凝集の開始が６６．１℃で生じることを示し、図２０Ｃは、Ｓ８８Ｄ変異体について凝集の開始が６６．５℃で生じることを示し、図２０Ｄは、野生型について凝集の開始が６５．７℃で生じることを示す。
【図２０Ｃ】抗ＰＤ１単一置換変異体の凝集（コロイド安定性）分析の開始を示す。図２０Ａは、Ｓ７５Ｄ変異体について凝集の開始が６６．６℃で生じることを示し、図２０Ｂは、Ｓ８４Ｄ変異体について凝集の開始が６６．１℃で生じることを示し、図２０Ｃは、Ｓ８８Ｄ変異体について凝集の開始が６６．５℃で生じることを示し、図２０Ｄは、野生型について凝集の開始が６５．７℃で生じることを示す。
【図２０Ｄ】抗ＰＤ１単一置換変異体の凝集（コロイド安定性）分析の開始を示す。図２０Ａは、Ｓ７５Ｄ変異体について凝集の開始が６６．６℃で生じることを示し、図２０Ｂは、Ｓ８４Ｄ変異体について凝集の開始が６６．１℃で生じることを示し、図２０Ｃは、Ｓ８８Ｄ変異体について凝集の開始が６６．５℃で生じることを示し、図２０Ｄは、野生型について凝集の開始が６５．７℃で生じることを示す。
【図２１】ＣＮＴＯ１４８抗体置換組み合わせ変異体のヒトＴＮＦ結合ＥＬＩＳＡを示す。
【図２２Ａ】ＣＮＴＯ１４８の組み合わせ変異体の分析サイズ排除クロマトグラフィー分析を示す。図２２Ａは、ＣＮＴＯ１４８野生型のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図２２Ｂは、ＣＮＴＯ１４８  Ｎ８４Ｄ／Ａ８８Ｄ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図２２Ｃは、ＣＮＴＯ１４８  Ｓ７５Ｄ／Ａ８８Ｄ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図２２Ｄは、ＣＮＴＯ１４８  Ｎ７５Ｄ／Ｎ８４Ｄ／Ａ８８Ｄ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣ変異体を示し、図２２Ｅは、ＣＮＴＯ１４８  Ｓ７５Ｄ／Ｎ８４Ｄ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示す。
【図２２Ｂ】ＣＮＴＯ１４８の組み合わせ変異体の分析サイズ排除クロマトグラフィー分析を示す。図２２Ａは、ＣＮＴＯ１４８野生型のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図２２Ｂは、ＣＮＴＯ１４８  Ｎ８４Ｄ／Ａ８８Ｄ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図２２Ｃは、ＣＮＴＯ１４８  Ｓ７５Ｄ／Ａ８８Ｄ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図２２Ｄは、ＣＮＴＯ１４８  Ｎ７５Ｄ／Ｎ８４Ｄ／Ａ８８Ｄ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣ変異体を示し、図２２Ｅは、ＣＮＴＯ１４８  Ｓ７５Ｄ／Ｎ８４Ｄ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示す。
【図２２Ｃ】ＣＮＴＯ１４８の組み合わせ変異体の分析サイズ排除クロマトグラフィー分析を示す。図２２Ａは、ＣＮＴＯ１４８野生型のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図２２Ｂは、ＣＮＴＯ１４８  Ｎ８４Ｄ／Ａ８８Ｄ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図２２Ｃは、ＣＮＴＯ１４８  Ｓ７５Ｄ／Ａ８８Ｄ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図２２Ｄは、ＣＮＴＯ１４８  Ｎ７５Ｄ／Ｎ８４Ｄ／Ａ８８Ｄ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣ変異体を示し、図２２Ｅは、ＣＮＴＯ１４８  Ｓ７５Ｄ／Ｎ８４Ｄ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示す。
【図２２Ｄ】ＣＮＴＯ１４８の組み合わせ変異体の分析サイズ排除クロマトグラフィー分析を示す。図２２Ａは、ＣＮＴＯ１４８野生型のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図２２Ｂは、ＣＮＴＯ１４８  Ｎ８４Ｄ／Ａ８８Ｄ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図２２Ｃは、ＣＮＴＯ１４８  Ｓ７５Ｄ／Ａ８８Ｄ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図２２Ｄは、ＣＮＴＯ１４８  Ｎ７５Ｄ／Ｎ８４Ｄ／Ａ８８Ｄ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣ変異体を示し、図２２Ｅは、ＣＮＴＯ１４８  Ｓ７５Ｄ／Ｎ８４Ｄ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示す。
【図２２Ｅ】ＣＮＴＯ１４８の組み合わせ変異体の分析サイズ排除クロマトグラフィー分析を示す。図２２Ａは、ＣＮＴＯ１４８野生型のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図２２Ｂは、ＣＮＴＯ１４８  Ｎ８４Ｄ／Ａ８８Ｄ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図２２Ｃは、ＣＮＴＯ１４８  Ｓ７５Ｄ／Ａ８８Ｄ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図２２Ｄは、ＣＮＴＯ１４８  Ｎ７５Ｄ／Ｎ８４Ｄ／Ａ８８Ｄ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣ変異体を示し、図２２Ｅは、ＣＮＴＯ１４８  Ｓ７５Ｄ／Ｎ８４Ｄ変異体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示す。
【図２３Ａ】ＣＮＴＯ１４８の組み合わせ変異体の凝集（コロイド安定性）分析の開始を示す。図２３Ａは、ＣＮＴＯ１４８  Ｎ８４Ｄ／Ａ８８Ｄ変異体について凝集の開始６６．８℃で生じることを示し、図２３Ｂは、ＣＮＴＯ１４８  Ｓ７５Ｄ／Ａ８８Ｄ変異体について凝集の開始が６６．８℃で生じることを示し、図２３Ｃは、Ｓ７５Ｄ／Ｎ８４Ｄ／Ａ８８Ｄ変異体について凝集の開始が６７．２℃で生じることを示し、図２３は、Ｓ７５Ｄ／Ｎ８４Ｄ変異体について凝集の開始が６７．１℃で生じることを示す。図２３Ｅは、野生型について凝集の開始が６６．５℃で生じることを示す。
【図２３Ｂ】ＣＮＴＯ１４８の組み合わせ変異体の凝集（コロイド安定性）分析の開始を示す。図２３Ａは、ＣＮＴＯ１４８  Ｎ８４Ｄ／Ａ８８Ｄ変異体について凝集の開始６６．８℃で生じることを示し、図２３Ｂは、ＣＮＴＯ１４８  Ｓ７５Ｄ／Ａ８８Ｄ変異体について凝集の開始が６６．８℃で生じることを示し、図２３Ｃは、Ｓ７５Ｄ／Ｎ８４Ｄ／Ａ８８Ｄ変異体について凝集の開始が６７．２℃で生じることを示し、図２３は、Ｓ７５Ｄ／Ｎ８４Ｄ変異体について凝集の開始が６７．１℃で生じることを示す。図２３Ｅは、野生型について凝集の開始が６６．５℃で生じることを示す。
【図２３Ｃ】ＣＮＴＯ１４８の組み合わせ変異体の凝集（コロイド安定性）分析の開始を示す。図２３Ａは、ＣＮＴＯ１４８  Ｎ８４Ｄ／Ａ８８Ｄ変異体について凝集の開始６６．８℃で生じることを示し、図２３Ｂは、ＣＮＴＯ１４８  Ｓ７５Ｄ／Ａ８８Ｄ変異体について凝集の開始が６６．８℃で生じることを示し、図２３Ｃは、Ｓ７５Ｄ／Ｎ８４Ｄ／Ａ８８Ｄ変異体について凝集の開始が６７．２℃で生じることを示し、図２３は、Ｓ７５Ｄ／Ｎ８４Ｄ変異体について凝集の開始が６７．１℃で生じることを示す。図２３Ｅは、野生型について凝集の開始が６６．５℃で生じることを示す。
【図２３Ｄ】ＣＮＴＯ１４８の組み合わせ変異体の凝集（コロイド安定性）分析の開始を示す。図２３Ａは、ＣＮＴＯ１４８  Ｎ８４Ｄ／Ａ８８Ｄ変異体について凝集の開始６６．８℃で生じることを示し、図２３Ｂは、ＣＮＴＯ１４８  Ｓ７５Ｄ／Ａ８８Ｄ変異体について凝集の開始が６６．８℃で生じることを示し、図２３Ｃは、Ｓ７５Ｄ／Ｎ８４Ｄ／Ａ８８Ｄ変異体について凝集の開始が６７．２℃で生じることを示し、図２３は、Ｓ７５Ｄ／Ｎ８４Ｄ変異体について凝集の開始が６７．１℃で生じることを示す。図２３Ｅは、野生型について凝集の開始が６６．５℃で生じることを示す。
【図２３Ｅ】ＣＮＴＯ１４８の組み合わせ変異体の凝集（コロイド安定性）分析の開始を示す。図２３Ａは、ＣＮＴＯ１４８  Ｎ８４Ｄ／Ａ８８Ｄ変異体について凝集の開始６６．８℃で生じることを示し、図２３Ｂは、ＣＮＴＯ１４８  Ｓ７５Ｄ／Ａ８８Ｄ変異体について凝集の開始が６６．８℃で生じることを示し、図２３Ｃは、Ｓ７５Ｄ／Ｎ８４Ｄ／Ａ８８Ｄ変異体について凝集の開始が６７．２℃で生じることを示し、図２３は、Ｓ７５Ｄ／Ｎ８４Ｄ変異体について凝集の開始が６７．１℃で生じることを示す。図２３Ｅは、野生型について凝集の開始が６６．５℃で生じることを示す。
【図２４Ａ】ＣＮＴＯ１４８の多置換変異体のアンフォールディング（立体配座安定性）分析の温度を示すグラフである。図２４Ａは、野生型についてのアンフォールディング温度が６６．４℃で生じることを示、図２４Ｂは、Ｎ８４Ｄ／Ａ８８Ｄ変異体についてのアンフォールディング温度が６７．１℃で生じること示し、図２４Ｃは、Ｓ７５Ｄ／Ａ８８Ｄ変異体についてのアンフォールディング温度が６６．８℃で生じることを示し、図２４Ｄは、Ｓ７５Ｄ／Ｎ８４Ｄ／Ａ８８Ｄ変異体についてのアンフォールディング温度が６６．９℃で生じることを示し、図２４Ｅは、Ｓ７５Ｄ／Ｎ８４Ｄ変異体についてのアンフォールディング温度が６７．３℃で生じることを示す。
【図２４Ｂ】ＣＮＴＯ１４８の多置換変異体のアンフォールディング（立体配座安定性）分析の温度を示すグラフである。図２４Ａは、野生型についてのアンフォールディング温度が６６．４℃で生じることを示、図２４Ｂは、Ｎ８４Ｄ／Ａ８８Ｄ変異体についてのアンフォールディング温度が６７．１℃で生じること示し、図２４Ｃは、Ｓ７５Ｄ／Ａ８８Ｄ変異体についてのアンフォールディング温度が６６．８℃で生じることを示し、図２４Ｄは、Ｓ７５Ｄ／Ｎ８４Ｄ／Ａ８８Ｄ変異体についてのアンフォールディング温度が６６．９℃で生じることを示し、図２４Ｅは、Ｓ７５Ｄ／Ｎ８４Ｄ変異体についてのアンフォールディング温度が６７．３℃で生じることを示す。
【図２４Ｃ】ＣＮＴＯ１４８の多置換変異体のアンフォールディング（立体配座安定性）分析の温度を示すグラフである。図２４Ａは、野生型についてのアンフォールディング温度が６６．４℃で生じることを示、図２４Ｂは、Ｎ８４Ｄ／Ａ８８Ｄ変異体についてのアンフォールディング温度が６７．１℃で生じること示し、図２４Ｃは、Ｓ７５Ｄ／Ａ８８Ｄ変異体についてのアンフォールディング温度が６６．８℃で生じることを示し、図２４Ｄは、Ｓ７５Ｄ／Ｎ８４Ｄ／Ａ８８Ｄ変異体についてのアンフォールディング温度が６６．９℃で生じることを示し、図２４Ｅは、Ｓ７５Ｄ／Ｎ８４Ｄ変異体についてのアンフォールディング温度が６７．３℃で生じることを示す。
【図２４Ｄ】ＣＮＴＯ１４８の多置換変異体のアンフォールディング（立体配座安定性）分析の温度を示すグラフである。図２４Ａは、野生型についてのアンフォールディング温度が６６．４℃で生じることを示、図２４Ｂは、Ｎ８４Ｄ／Ａ８８Ｄ変異体についてのアンフォールディング温度が６７．１℃で生じること示し、図２４Ｃは、Ｓ７５Ｄ／Ａ８８Ｄ変異体についてのアンフォールディング温度が６６．８℃で生じることを示し、図２４Ｄは、Ｓ７５Ｄ／Ｎ８４Ｄ／Ａ８８Ｄ変異体についてのアンフォールディング温度が６６．９℃で生じることを示し、図２４Ｅは、Ｓ７５Ｄ／Ｎ８４Ｄ変異体についてのアンフォールディング温度が６７．３℃で生じることを示す。
【図２４Ｅ】ＣＮＴＯ１４８の多置換変異体のアンフォールディング（立体配座安定性）分析の温度を示すグラフである。図２４Ａは、野生型についてのアンフォールディング温度が６６．４℃で生じることを示、図２４Ｂは、Ｎ８４Ｄ／Ａ８８Ｄ変異体についてのアンフォールディング温度が６７．１℃で生じること示し、図２４Ｃは、Ｓ７５Ｄ／Ａ８８Ｄ変異体についてのアンフォールディング温度が６６．８℃で生じることを示し、図２４Ｄは、Ｓ７５Ｄ／Ｎ８４Ｄ／Ａ８８Ｄ変異体についてのアンフォールディング温度が６６．９℃で生じることを示し、図２４Ｅは、Ｓ７５Ｄ／Ｎ８４Ｄ変異体についてのアンフォールディング温度が６７．３℃で生じることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本開示は、概して、多重特異性抗体の製造及び精製を増強するために表面電荷を工学的に操作する方法に関する。
【００１４】
本開示はまた、本発明の方法を用いて生成された抗体にも関する。本開示はまた、本明細書で生成される抗ＰＤ１及び抗ＴＩＭ３抗体及び二重特異性ＰＤ−１ｘＴＩＭ３抗体、並びにそれらを作製及び使用する方法にも関する。生成された抗ＰＤ−１、抗ＴＩＭ３、及び二重特異性ＰＤ−１ｘＴＩＭ３抗体は、診断及び治療薬として有用である。
【００１５】
したがって、本発明の一態様は、抗体の等電点を改変する方法を目的とする。この方法は、重鎖可変領域を含む第１のポリペプチドと重鎖可変領域を含む第２のポリペプチドとを含む抗体を提供することを含む。本方法は、抗体の第１及び第２のポリペプチドのうちの少なくとも１つにおいて、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによる７、９、１１、１４、４１、７０、７４、８２ａ、８４及び１１３位における重鎖可変領域（ＶＨ）の１つ以上のアミノ酸残基を置換することを更に含み、置換することは、抗体の等電点を上昇又は低下させる。
【００１６】
用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体及びそれに由来するより小さい分子を含む）及びポリクローナル抗体を特に網羅する。用語「抗体」はまた、一価及び多価抗体、例えば、二価抗体、三価抗体、及び四価抗体も包含する。用語「抗体」はまた、単特異性及び多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体も包含する。多重特異性抗体は、同じ抗原の２つ以上の異なる抗原又は２つの異なるエピトープに結合することができる抗体である。したがって、本明細書に記載される抗体の等電点を改変する方法は、多様な抗体に適用可能である。
【００１７】
一実施形態では、本明細書に記載の方法に従って修飾された抗体は、免疫グロブリン（Ｉｇ）分子であり、少なくとも２つのポリペプチド鎖、すなわち、２つの重（Ｈ）鎖を含む。５種類の哺乳類Ｉｇ重鎖、α、δ、ε、γ、及びμは既知であり、重鎖の種類は、抗体のクラス（アイソタイプ）を定義する。本開示の抗体は、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＡ）、及びサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）であり得る。重鎖は、可変領域（ＶＨ）のみ、又は可変領域及び定常領域（ＣＨ）を含んでもよい。
【００１８】
本明細書に記載の方法に従って修飾された抗体は、２つの軽（Ｌ）鎖を更に含み得る。重鎖と同様に、軽鎖（すなわち、ラムダ（λ）及びカッパ（κ）軽鎖）は、可変領域（ＶＬ）のみ、又は可変領域及び定常領域（ＣＬ）を含んでもよい。
【００１９】
別の実施形態では、抗体は、一緒に融合して、Ｆｃ部分（すなわち、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、例えば、ミニボディ）を有する単鎖可変ドメイン抗体（ｓｃＦｖ）又は単鎖可変ドメインを形成する重鎖及び軽鎖可変領域を含む。別の実施形態では、抗体断片は、二価の単鎖可変断片であり、２つのｓｃＦｖｓを、タンデムに（すなわち、タンデムｓｃＦｖ）、又は二量体化してディアボディを形成するように、のいずれかで連結することにより工学的に操作される。更に別の実施形態では、抗体は、三価の単鎖可変断片であり、３つのｓｃＦｖｓを、タンデム又はトリアボディを形成する三量体形成のいずれかで一緒に連結することによって工学的に操作される。別の実施形態では、抗体は、四重鎖単鎖可変断片である。別の実施形態では、抗体は、一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む抗体である「直鎖抗体」である（ＺａｐａｔａらＰｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ、８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５）を参照されたい、その全内容が参照により本明細書に組み込まれている）。
【００２０】
本明細書に記載される方法はまた、キメラ抗体（すなわち、重鎖及び軽鎖のそれぞれのアミノ酸配列の１つの部分が、特定の種に由来するか又は特定のクラスに属する抗体中の対応する配列に相同であり、各鎖の残りのセグメントは、別の種又はクラスの対応する配列に相同である抗体）が、ＣＤＲグラフト化抗体（すなわち、ＣＤＲ領域のうちの１つ以上が別の種のＣＤＲ領域に置換されている、１つの種の重鎖及び軽鎖可変領域を含む抗体）、及びヒト化抗体の等電点を改変するのにも好適である。
【００２１】
本明細書に開示される方法に従って改変するのに好適な抗体は、上記に述べたように、好ましくはヒト抗体又はヒト化抗体（完全又は部分的にヒト化）である。あるいは、抗体は、限定するものではないが、鳥抗体、フカ抗体、鯨抗体、又は非霊長類抗体（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、リャマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、マウスなど）又は非ヒト霊長類抗体（例えば、サル、チンパンジーなど）を含む哺乳類抗体などの動物抗体であり得る。
【００２２】
本明細書に記載される方法は、抗体の等電点を改変することを含む。抗体の等電点（ｐＩ）は、抗体が正味電荷を担持しないｐＨである。抗体又は任意のポリペプチドの等電点は、そのアミノ酸組成によって決定される。例えば、多数の塩基性アミノ酸残基を有するポリペプチドは、高いｐＩを有するのに対し、多数の酸性アミノ酸残基を有するポリペプチドは、低いｐＩを有する。したがって、本発明の方法は、そのｐＩを改変するために抗体のアミノ酸組成を改変することを含む。より具体的には、本明細書に記載の方法は、抗体の少なくとも１つの重鎖可変領域内の１つ以上のアミノ酸残基を修飾して、抗体のｐＩを改変することを含む。
【００２３】
抗体の重鎖可変領域のアミノ酸組成は、アミノ酸挿入、欠失、又は置換によって改変され得る。アミノ酸「置換」は、ポリペプチド配列中の特定の位置におけるアミノ酸残基の異なるアミノ酸での置換を包含する。一実施形態では、置換は、その生物内又は任意の生物内で天然に存在しない、特定の位置で天然に存在しないアミノ酸残基の置換を含む。あるいは、１つ以上の置換は、例えば、同一の種からの他の抗体からの配列に頻繁に生じる保存されたアミノ酸残基など、同一の生物中の類似の関連するポリペプチド配列中の残基に頻繁に存在するアミノ酸残基であってもよい。例えば、ヒト配列などの同一の種からの天然に存在する配列からの保存された残基による置換は、１つ以上の置換を保有しているポリペプチドの抗原性の増加の可能性を低減することができる。加えて、同じ生物内の関連するポリペプチドからの配列と比較して、電荷の保存（例えば、同じ正に帯電した、負に帯電した、又は帯電していない種の比較的高い頻度）もまた、置換のためのアミノ酸残基の選択を行う際に考慮される。これらの電荷の考慮事項は、１つ以上のアミノ酸置換を含む抗体の構造及び／又は安定性を維持することに影響を及ぼし得る。抗体のｐＩを改変する目的で、アミノ酸置換は、中性電荷を有するアミノ酸残基で正電荷又は負電荷を有するアミノ酸残基を置換すること又はその逆を含む。例示的な置換としては、（１）ｐＩを上昇させるための、正に帯電したアミノ酸に対する中性に帯電したアミノ酸の置換、（２）ｐＩを上昇させるための、中性又は正に帯電したアミノ酸に対する負に帯電したアミノ酸の置換、（３）ｐＩを低下させるための、負に帯電したアミノ酸に対する中性に帯電したアミノ酸の置換、及び（４）ｐＩを低下させるための、正に帯電したアミノ酸に対する中性又は負に帯電したアミノ酸の置換が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２４】
アミノ酸「欠失」は、抗体の等電点を改変するための１つ以上のアミノ酸残基の除去を含み、一方、アミノ酸「挿入」は、抗体の等電点を改変するための１つ以上のアミノ酸残基の添加を含む。例示的な欠失としては、ｐＩを上昇させるための負に帯電したアミノ酸残基の欠失、又はｐＩを低下させるための正に帯電したアミノ酸残基の欠失が挙げられるが、これらに限定されない。好適なアミノ酸付加としては、抗体のｐＩを上昇させるための正のアミノ酸残基の添加、又は抗体のｐＩを低下させるための負のアミノ酸残基の添加が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２５】
当技術分野において既知の正電荷を保有するアミノ酸残基としては、塩基性側鎖、例えば、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、及びヒスチジン（Ｈ）を有するものが挙げられるが、これらに限定されない。当該技術分野において既知の負電荷を保有するアミノ酸残基としては、酸性側鎖、例えば、グルタミン酸（Ｅ）及びアスパラギン酸（Ｄ）を有するものが挙げられるが、これらに限定されない。帯電していない側鎖を有するアミノ酸残基は、中性の、例えば、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンであると考えられる。
【００２６】
このような置換、挿入、又は欠失は、多くの場合、対象とするアミノ酸残基をコードするコドンを生成するために、少なくとも１つのヌクレオチドを挿入、欠失、又は置換することによって修飾されるポリペプチドをコードする元の核酸分子を修飾する遺伝子操作又は突然変異誘発を伴う。より具体的には、元のアミノ酸残基をコードするコドンは、修飾により導入されるアミノ酸残基をコードするコドンにより置換される。このような核酸修飾は、部位特異的突然変異誘発又はＰＣＲ突然変異誘発などの周知の技術を用いて、当業者によって実施することができる。
【００２７】
本明細書に記載される方法によると、アミノ酸置換、挿入、又は欠失は、対象とする抗体の重鎖ポリペプチドの１つ以上に導入される。特に、アミノ酸置換、挿入、又は欠失は、対象とする抗体の重鎖可変領域に導入される。重鎖の可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる、超変動性の領域に細分される。重鎖の可変領域における３つのＣＤＲは、可変領域のそれぞれについてＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３と呼ばれる。ＣＤＲには、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が組み入れられている。これらのＦＲ領域は、抗体の結合能力の大部分に関与するＣＤＲの接触アミノ酸残基を適切な空間構成に配置することに特異的である。各ＶＨは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順で並ぶ、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲからなる。これらのＣＤＲの正確な境界は、異なるシステムに従って異なって定義されている。Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９８７）及び（１９９１）、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）によって記載されたシステムは、重鎖可変領域の残基に言及するときに本明細書において使用されるが、抗体の任意の可変領域に適用可能な明白な残基番号付けシステムを提供するだけでなく、３つのＣＤＲを定義する正確な残基境界も提供する。これらのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲと呼ばれる。
【００２８】
本明細書に記載の方法によると、抗体の等電点は、抗体の重鎖可変領域のうちの少なくとも１つにおいて、重鎖可変領域におけるアミノ酸残基が７、９、１１、１４、４１、７０、７４、８２ａ、８４及び／又は１１３位（Ｋａｂａｔ番号付け）にある少なくとも１つのアミノ酸残基を置換することによって改変される。修飾を受けるアミノ酸残基の数は、特に限定されない。例えば、一実施形態では、１つのアミノ酸置換が、抗体の等電点を十分に改変する。別の実施形態では、２つのアミノ酸置換が、抗体の等電点を十分に改変する。別の実施形態では、抗体の等電点を十分に改変するために、３つ、４つ、又は５つ、又は６つ、又は７つ、又は８つ、又は９つ、又は１０個のアミノ酸置換が必要である。
【００２９】
一実施形態では、７、９、１１、１４、４１、７４、８４及び／又は１１３位（Ｋａｂａｔ番号付け）におけるＶＨの１つ以上のアミノ酸残基は中性に帯電したアミノ酸残基であり、置換工程は、１つ以上の電荷的に帯電したアミノ酸残基を１つ以上の正に帯電したアミノ酸残基と交換することを含む。この置換は、非修飾状態（すなわち、親又は野生型抗体）における抗体に対して抗体の等電点を上昇させる。
【００３０】
別の実施形態では、７、９、１１、１４、４１、７４、８４及び／又は１１３位（Ｋａｂａｔ番号付け）におけるＶＨの１つ以上のアミノ酸残基は負に帯電したアミノ酸残基であり、置換工程は、当該１つ以上の負に帯電したアミノ酸残基を１つ以上の中性又は正に帯電したアミノ酸残基と交換することを含む。この置換はまた、非修飾状態における抗体の等電点に対して抗体の等電点を上昇させる。
【００３１】
更なる実施形態では、９、７０、７４、８２ａ及び８４位（Ｋａｂａｔ番号付け）におけるＶＨの１つ以上のアミノ酸残基は中性に帯電したアミノ酸残基であり、置換工程は、当該１つ以上の中性に帯電したアミノ酸残基を１つ以上の負に帯電したアミノ酸残基と交換することを含む。この置換は、非修飾の親抗体の等電点に対して抗体の等電点を低下させる。
【００３２】
更に別の実施形態では、９、７０、７４、８２ａ及び８４位（Ｋａｂａｔ番号付け）におけるＶＨの１つ以上のアミノ酸残基は正に帯電したアミノ酸残基であり、置換は、当該１つ以上の正に帯電したアミノ酸残基を、１つ以上の中性又は負に帯電したアミノ酸残基と交換することを含む。この置換は、非修飾の親抗体の等電点に対して抗体の等電点を低下させる。
【００３３】
上記のアミノ酸残基の全てを交換する必要はない。上記のように、重鎖可変領域内の特定された残基の１、２、３、４、６、７、８、９又は１０にアミノ酸置換を導入することができる。導入されるアミノ酸置換の数は、所望される等電点における変化又は差の大きさ、すなわち、０．１ｐＨ単位変化、０．２ｐＨ単位変化、０．３ｐＨ単位変化、０．４ｐＨ単位変化、０．５ｐＨ単位変化、０．６ｐＨ単位変化、０．７ｐＨ単位変化、０．８ｐＨ単位変化、０．９ｐＨ単位変化、１．０ｐＨ単位変化、又は１．０ｐＨ超の単位変化に依存する。改変された抗体の等電点における変化又は差異は、等電点電気泳動法を用いて観察することができる。等電点電気泳動法は、それらの等電点によってタンパク質を分離する電気泳動技術である。タンパク質は、固定ｐＨ勾配を含有するポリアクリルアミドゲル（ＩＥＦゲル）又は固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ストリップに適用することができる。電界が印加され、タンパク質がｐＨ勾配を通って移動し、それらが特定のｐＩに近づくにつれてｐＨ勾配で固定化される。あるいは、理論的な等電点は、遺伝子及びアミノ酸配列解析ソフトウェア（ＧＥＮＥＴＹＸなど）を使用して決定することができる。これは、例えば、親抗体から二重特異性抗体を十分に分離するために、等電点の相当な改変が必要である場合に有用である。
【００３４】
一実施形態では、置換は、抗体の第１又は第２の重鎖ポリペプチドのうちの少なくとも１つにおいて、７４位（Ｋａｂａｔ番号付け）のＶＨアミノ酸残基を、負に帯電したアミノ酸残基と交換することを含む。
【００３５】
別の実施形態では、置換は、抗体の第１又は第２の重鎖ポリペプチドのうちの少なくとも１つにおいて、８２ａ位（Ｋａｂａｔ番号付け）のＶＨアミノ酸残基を、負に帯電したアミノ酸残基と交換することを含む。
【００３６】
更なる実施形態では、置換は、抗体の第１又は第２の重鎖ポリペプチドのうちの少なくとも１つにおいて、８４位（Ｋａｂａｔ番号付け）のＶＨアミノ酸残基を、負に帯電したアミノ酸残基と交換することを含む。
【００３７】
更に別の実施形態では、置換は、抗体の第１又は第２の重鎖ポリペプチドのうちの少なくとも１つにおいて、位置７４、８２ａ及び８４位（Ｋａｂａｔ番号付け）から選択される位置のうちの少なくとも２ヶ所のＶＨアミノ酸残基を、負に帯電したアミノ酸残基と交換することを含む。
【００３８】
別の実施形態では、置換は、抗体の第１又は第２の重鎖ポリペプチドのうちの少なくとも１つにおいて、７４、８２ａ及び８４位（Ｋａｂａｔ番号付け）の３つの位置全てにおいてＶＨアミノ酸残基を、負に帯電したアミノ酸残基と交換することを含む。
【００３９】
本明細書に記載される方法を実施する際、その等電点を改変するために抗体になされるアミノ酸置換は、その抗原結合能力を変化させない、すなわち、修飾された抗体は、修飾されていない野生型又は親抗体の抗原結合活性を保持する。本明細書で使用するとき、「抗原結合活性を保持する」とは、抗体が、修飾前の抗体の抗原結合活性の少なくとも７５％、少なくとも８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、すなわち９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％を維持することを意味する。抗原への結合のための十分な結合活性が、抗体の機能を発揮するために保持され得る限り、生理学的条件下で３７℃で決定される親和性は、例えば、１００ｎＭ以下、好ましくは５０ｎＭ以下、より好ましくは１０ｎＭ以下、更により好ましくは１ｎＭ以下であり得る。本明細書に記載の方法によって得られる改変された等電点を有する抗体可変領域を含むポリペプチドが抗原結合活性を保持するかどうかを、Ｂｉａｃｏｒｅ（分子間相互作用分析）、細胞増殖アッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）、及び蛍光免疫測定法などが挙げられるが、これらに限定されない、当業者に周知の方法を使用して試験することができる。
【００４０】
本明細書に記載の方法を実施する際、その等電点を改変するために抗体になされるアミノ酸置換は、抗体の安定性、例えば、その立体構造安定性を変化させない。換言すれば、修飾された抗体は、修飾されていない野生型又は親抗体の実質的に同じ安定性を示す。本明細書で使用するとき、「実質的に同じ安定性」とは、修飾されたタンパク質が安定性の２５％未満の変化、安定性の２０％未満の変化、安定性の１５％未満の変化、安定性の１０％未満の変化、安定性の５％、４％、３％、２％又は１％未満の変化を有することを意味する。抗体安定性の指標として測定することができるパラメータとしては、アンフォールディング転移温度、凝集開始温度、及び凝集率が挙げられるが、これらに限定されない。測定され得る抗体安定性の他のパラメータとしては、インビトロでの血清安定性、分解レベル、生物活性、ｐＨ、色、透明度、化学的安定性、及び物理的安定性が挙げられる。
【００４１】
一実施形態では、改変された等電点を有する抗体は、単特異性抗体である。本実施形態によれば、親単特異性抗体の重鎖可変領域をそれぞれ含む第１及び第２のポリペプチドは、同一であり、１つ以上の同定されたアミノ酸残基位置（すなわち、残基７、９、１１、１４、４１、７０、７４、８２ａ、８４及び／又は１１３）への置換が、第１及び第２の重鎖ポリペプチドの両方においてなされ、親抗体の等電点とは異なる等電点を有する変異体抗体を生成する。
【００４２】
本明細書に記載される方法は、当該技術分野において既知の、又は開発される、実質的に任意の単特異性抗体の等電点を改変するために利用することができる。あくまで一例として、本明細書に記載の方法を使用して修飾された単特異性抗体は、ＣＮＴＯ１４８として知られるＴＮＦαと結合するモノクローナル抗体である。本明細書に記載されるように、ＣＮＴＯ１４８抗体の重鎖可変領域は、それぞれ配列番号１（以下に示す）の残基７５、８４及び８８に対応するＫａｂａｔ残基７４、８２ａ及び８４で改変されて、その等電点を低下させた。
【００４３】
【化１】
2020522573.tif 000003
【００４４】
特に、配列番号１の７５位のセリン残基をアスパラギン酸残基（Ｓ７５Ｄ）で置換し、配列番号１の８４位のアスパラギン残基をアスパラギン酸残基（Ｎ８４Ｄ）で置換し、配列番号１の８８位のアラニン残基をアスパラギン酸残基（Ａ８８Ｄ）で置換して、ＣＮＴＯ１４８抗体の等電点を低下させた。これらのアミノ酸置換は、ＣＮＴＯ１４８抗体の抗原結合能力に影響を及ぼさなかった（図１Ａ、１Ｂ及び１Ｃを参照されたい）。
【００４５】
本明細書に記載の方法を使用して修飾された別の単特異性抗体は、ＴＩＭＢ３３７として知られるＴＩＭ３（ＣＤ３６６）に結合するモノクローナル抗体である。本明細書に記載されるように、ＴＩＭＢ３３７抗体の重鎖可変領域（ＴＭ３Ｈ２４  ＨＣ）を、それぞれ配列番号２（以下に示す）の残基７５、８４及び８８に対応するＫａｂａｔ残基７４、８２ａ及び８４で改変して、その等電点を低下させた。ＴＩＭＢ３３７は、配列番号５の軽鎖可変領域を含む。
【００４６】
【化２】
2020522573.tif 000004
【００４７】
【化３】
2020522573.tif 000005
【００４８】
特に、配列番号２の７５位のセリン残基をアスパラギン酸残基（Ｓ７５Ｄ）で置換し、配列番号２の８４位のアスパラギン残基をアスパラギン酸残基（Ｎ８４Ｄ）で置換し、配列番号２の８８位のアラニン残基をアスパラギン酸残基（Ａ８８Ｄ）で置換し、ＴＩＭＢ３３７抗体の等電点を低下させた。これらのアミノ酸置換は、ＴＩＭＢ３３７抗体の抗原結合能力に影響を及ぼさなかった（図１５を参照）。ＴＩＭＢ３３７  ＶＨ変異体のアミノ酸配列を下に示す。
【００４９】
【化４】
2020522573.tif 000006
【００５０】
【化５】
2020522573.tif 000007
【００５１】
【化６】
2020522573.tif 000008
【００５２】
本明細書に記載の方法を使用して修飾された別の単特異性抗体は、ＰＤ１Ｂ２４４として既知のＰＤ−１（ＣＤ２７９）に結合するモノクローナル抗体である。本明細書に記載されるように、ＰＤ１Ｂ２４４抗体の重鎖可変領域（ＰＤ１Ｈ１７０  ＨＣ）を、それぞれ配列番号３（以下に示す）の残基７５、８４及び８８に対応するＫａｂａｔ残基７４、８２ａ及び８４で修飾して、その等電点を低下させた。ＰＤ１Ｂ２２４４は、配列番号９の軽鎖可変領域を含む。
【００５３】
【化７】
2020522573.tif 000009
【００５４】
【化８】
2020522573.tif 000010
【００５５】
特に、配列番号３の７５位のセリン残基をアスパラギン酸残基（Ｓ７５Ｄ）で置換し、配列番号３の８４位のセリン残基をアスパラギン酸残基（Ｓ８４Ｄ）で置換し、配列番号３の８８位のセリン残基をアスパラギン酸残基（Ｓ８８Ｄ）で置換して、ＰＤ１Ｂ２４４抗体の等電点を低下させた。これらのアミノ酸置換は、ＰＤ１Ｂ２４４抗体の抗原結合能力に影響を及ぼさなかった（図１８を参照されたい）。ＰＤ１Ｂ２４４  ＶＨ変異体のアミノ酸配列を下に示す。
【００５６】
【化９】
2020522573.tif 000011
【００５７】
【化１０】
2020522573.tif 000012
【００５８】
【化１１】
2020522573.tif 000013
【００５９】
別の実施形態では、改変された等電点を有する抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。本実施形態によると、多重特異性抗体の重鎖可変領域を含む第１及び第２のポリペプチドは異なる。本実施形態によると、本明細書に開示されるアミノ酸置換は、重鎖可変領域のうちの１つのみに存在し得る。あるいは、アミノ酸置換は、重鎖可変領域の両方で行われてもよく、これらの置換は、修飾の目的に応じて同一であっても異なっていてもよい。例えば、多重特異性抗体の半減期／クリアランス速度を変更するために等電点改変が行われる場合、両方の重鎖可変領域における同様の置換が、抗体のｐＩを上昇又は低下させるように行われ得る。あるいは、抗体のｐＩを上昇又は低下させるために、両方の重鎖可変領域に異なるアミノ酸置換を行ってもよい。
【００６０】
別の実施形態では、アミノ酸置換は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体の１つの重鎖可変領域のみに存在する。このアプローチは、二重特異性抗体が、類似のｐＩを有する２つの親抗体から生成されるときに望ましい。同じ又は類似の等電点を有する２つの親抗体を利用して二重特異性抗体を生成する場合、標準的な細胞組換え及び発現技術を使用して生成された二重特異性抗体の分離及び精製がひどく妨害される。したがって、それらの間のｐＩの差を増加させる親抗体の改変は、その親抗体からより容易に分離され、区別され得る二重特異性抗体の製造をもたらし、それによって二重特異性抗体製造の収率及び純度が増加する。
【００６１】
したがって、本開示の別の態様は、その２つの親抗体からの二重特異性抗体の分離を増強する方法を目的とする。この方法は、第１及び第２の親抗体を提供することを含み、各親抗体は重鎖可変領域を含む。本方法は、第１及び第２の親抗体のうちの少なくとも１つにおいて、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによる７、９、１１、１４、４１、７０、７４、８２ａ、８４及び１１３位の重鎖可変領域（ＶＨ）中の１つ以上のアミノ酸残基を置換することを更に含み、置換することは、第２の親抗体に対して第１の親抗体の等電点を上昇又は低下させる。本方法は、当該置換することの後に２つの親抗体から二重特異性抗体を製造することと、その２つの親抗体から製造された二重特異性抗体を分離することと、を更に含み、その２つの親抗体からの二重特異性抗体の分離は、当該置換することの結果として強化される。
【００６２】
この態様によると、第１の親抗体の７、９、１１、１４、４１、７４、８４及び１１３位（Ｋａｂａｔ番号付け）におけるＶＨ領域の１つ以上のアミノ酸残基が中性に帯電しているアミノ酸残基である場合、これらのアミノ酸残基のうちの１つ以上は、１つ以上の正に帯電したアミノ酸残基で置換され得る。この置換は、第２の親抗体の等電点に対して第１の親抗体の等電点を上昇させる。あるいは、第１の親抗体の７、９、１１、１４、４１、７４、８４及び１１３位（Ｋａｂａｔ番号付け）におけるＶＨ領域の１つ以上のアミノ酸残基が負に帯電したアミノ酸残基である場合、アミノ酸残基は、１つ以上の負に帯電したアミノ酸残基を１つ以上の中性又は正に帯電したアミノ酸残基と交換することによって置換されてもよい。この置換はまた、第２の親抗体に対して第１の親抗体の等電点を上昇させる。
【００６３】
別の実施形態では、第１の親抗体の９、７０、７４、８２ａ及び８４位（Ｋａｂａｔ番号付け）におけるＶＨ領域の１つ以上のアミノ酸残基が中性に帯電しているアミノ酸残基である場合、これらのアミノ酸残基のうちの１つ以上は、当該１つ以上の中性に帯電したアミノ酸残基を１つ以上の負に帯電したアミノ酸残基と交換することによって置換されてもよい。この置換は、第２の親抗体に対して第１の親抗体の等電点を低下させることになる。更なる実施形態では、第１の親抗体の９、７０、７４、８２ａ及び８４位（Ｋａｂａｔ番号付け）におけるＶＨ領域の１つ以上のアミノ酸残基が正に帯電したアミノ酸残基である場合、これらのアミノ酸残基のうちの１つ以上は、当該１つ以上の正に帯電したアミノ酸残基を１つ以上の中性又は負に帯電したアミノ酸残基と交換することによって置換されてもよい。この置換はまた、第２の親抗体に対して第１の親抗体の等電点を減少させる。
【００６４】
上述のように、第１又は第２の親抗体において修飾又は置換されるアミノ酸残基の数は限定されない。一実施形態では、第２の親抗体に対する第１の親抗体の等電点における０．１ｐＨ単位、０．２ｐＨ単位、０．３ｐＨ単位、０．４ｐＨ単位、又は０．５ｐＨ単位、０．６ｐＨ単位、０．７ｐＨ単位、０．８ｐＨ単位、０．９ｐＨ単位、１．０ｐＨ単位変化を生成する置換が行われる。別の実施形態では、第２の親抗体に対する第１の親抗体の等電点における＞１．０ｐＨ単位変化を生成する置換が行われる。これらの変化は、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０のアミノ酸置換により達成することができる。上記のアミノ酸残基置換は、第１又は第２の親抗体のいずれか１つのＶＨ領域、あるいは第１又は第２の親抗体の両方において行われてもよい。アミノ酸置換が第１の親抗体及び第２の親抗体の両方に行われるとき、第１の親抗体のＶＨ領域における１つ以上のアミノ酸置換は、第１の親抗体の等電点を低下させ、第２の親抗体のＶＨ領域における１つ以上のアミノ酸置換は、第２の親抗体の等電点を上昇させるであろう。第１及び第２の親抗体の両方に行われるアミノ酸置換は、同一のアミノ酸残基位置（異なる置換であっても）で行われてもよく、又は異なるアミノ酸残基位置で行われてもよい。
【００６５】
一実施形態では、第１の親抗体の７４位（Ｋａｂａｔ番号付け）におけるＶＨアミノ酸残基は、第２の親抗体に対して第１の親抗体の等電点を低下させるために、負に帯電したアミノ酸残基と交換される。
【００６６】
別の実施形態では、第１の親抗体の８２ａ位（Ｋａｂａｔ番号付け）におけるＶＨアミノ酸残基は、第２の親抗体に対して第１の親抗体の等電点を低下させるために、負に帯電したアミノ酸残基と交換される。
【００６７】
別の実施形態では、第１の親抗体の８４位（Ｋａｂａｔ番号付け）におけるＶＨアミノ酸残基は、第２の親抗体に対して第１の親抗体の等電点を低下させるために、負に帯電したアミノ酸残基と交換される。
【００６８】
更なる実施形態では、第１の親抗体における７４、８２ａ及び８４位（Ｋａｂａｔ番号付け）から選択される位置のうちの少なくとも２ヶ所のＶＨアミノ酸残基は、第２の親抗体に対して第１の親抗体の等電点を低下させるために、負に帯電したアミノ酸残基と交換される。
【００６９】
更に別の実施形態では、第１の親抗体における７４、８２ａ及び８４位の３つ全ての位置におけるＶＨアミノ酸残基（Ｋａｂａｔ番号付け）は、第２の親抗体に対して第１の親抗体の等電点を低下させるために、負に帯電したアミノ酸残基と交換される。
【００７０】
上述のように、第１及び第２の親抗体の等電点の改変は、親抗体のそれぞれとは異なる等電点を有する二重特異性抗体の製造をもたらす。したがって、対象とする二重特異性抗体の分離及び最終的な回収は、イオン交換クロマトグラフィー法を用いて有意に増強される。
【００７１】
二重特異性抗体の作製方法は当該技術分野において既知であり、本開示の方法は概して、二重特異性抗体の分離及び精製を強化するために、これらの既知の方法のいずれかに組み込まれ得る。全長二重特異性抗体の従来の製造は、２つの免疫グロブリン重鎖軽鎖対の共発現に基づくものであり、２つの鎖は異なる特異性を有する（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７−５３９（１９８３）、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のランダムな組み合わせ及び組換えの結果、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は１０種の異なる抗体分子の可能な混合物を生成し、これらのうち１種のみが正しい二重特異的構造を有する。本明細書に開示される方法を使用して、親抗体の等電点の差を増加させることにより、親抗体及び他の副生成物からの、所望の二重特異性抗体の分離及び精製を著しく向上させる。
【００７２】
二重特異性抗体を作製するための他の方法としては、米国特許第８，２１６，８０５号（Ｃａｒｔｅｒ）に記載されるような、ヘテロ二量体形成を有利にホモ二量体形成に不利なように立体的影響を生じさせるアミノ酸工学を伴う「ノブ及びホール」技術が挙げられるが、これらに限定されない（Ｒｉｄｇｗａｙら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ９（７）：６１７（１９９６）、及びＡｔｗｅｌｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、１９９７  ２７０：２６も参照されたい、これらの全ては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。加えて、Ｍｅｒｃｈａｎｔら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ１６：６７７（１９９８）に記載されている（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）ように、これらの「ノブ及びホール」変異は、ジスルフィド結合と組み合わされて、ヘテロ二量化への形成を歪曲することができる。
【００７３】
二重特異性抗体を生成するために使用される追加の技術は、Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ２８５（２５）：１９６３７（２０１０）に記載されるように「静電的操舵」又は「電荷対」と呼ばれることが多い（その全内容が参照により本明細書に組み込まれている）。この方法では、静電気を使用して、形成物を所望のヘテロ二量体化に向けて歪ませる。
【００７４】
親抗体から二重特異性抗体を分離することは、当該技術分野において既知の標準的な分離技術を用いて行われる。例えば、イオン交換クロマトグラフィーは、二重特異性抗体をその親抗体と分離するために一般的に使用される。簡潔に言えば、親抗体及び二重特異性抗体の混合物は、ローディングバッファを使用して陽イオン交換材料（又は、あるいは陰イオン交換材料）に結合され、ローディングバッファは、第１の導電性及びｐＨにある。陽イオン交換材料は、イオン交換材料から汚染物質（すなわち、親抗体）を溶出するように、ローディングバッファよりも高い第２の導電性及び／又はｐＨの中間緩衝液で洗浄される。陽イオン交換材料を、中間緩衝液よりも低い第３の導電性及び／又はｐＨである洗浄緩衝液で洗浄し、次いで、中間緩衝液よりも高い第４の導電性及び／又はｐＨの溶出緩衝液で洗浄して、イオン交換材料から所望の二重特異性抗体を溶出させる。
【００７５】
二重特異性抗体の分離及び精製はまた、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除／ゲル濾過クロマトグラフィー、及びＦＰＬＣ及びＨＰＬＣなどのシステムを使用して大気圧又は高圧で実施される逆相クロマトグラフィーなどの他のクロマトグラフィー技術を使用して達成することもできる。精製方法としては、電気泳動、等電点電気泳動法、免疫学的、沈殿、透析、及びクロマトオフ分画技術も挙げられる。タンパク質濃度と共に限外濾過及びダイアフィルトレーション技術も有用である。好適な精製技術における一般的なガイダンスについては、例えば、ＲＯＢＥＲＴ  ＳＣＯＰＥＳ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、３ｒｄ  Ｅｄ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  １９９４）を参照されたい。この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００７６】
抗体のｐＩを増加又は減少させるのに好適な１つ以上のアミノ酸置換を含有する本明細書に記載の抗体は、抗体の表面電荷及びｐＩを改変するのに有用であると以前に同定された１つ以上の追加のアミノ酸置換を更に含んでもよく、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１４０２９４８２３号（Ｍｏｏｒｅ）及び米国特許出願公開第２００９０２６３３９２号（Ｉｇａｗａら）において特定されたアミノ酸置換が挙げられるが、これらに限定されない。同様に、本明細書に記載される抗体は、ＦｃγＲ結合及び／又はＦｃＲｎ結合などの様々な追加の機能性を変更することが知られているＦｃ領域における追加のアミノ酸置換を更に含んでもよい。最適化されたＦｃ変異体は、当該技術分野において既知であり、例えば、米国特許第８，１８８，２３１号（Ｌａｚａｒ）、米国特許第９，０４０，０４１号（Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓら）、及び米国特許第８，８０２，８２０号（Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎら）を参照されたい（これらの全ては参照により本明細書に組み込まれる）。
【００７７】
上記のように、本明細書に記載の抗体は、単離されたポリヌクレオチド、ベクター、及び宿主細胞を使用した様々な技術のいずれかによって調製することができる。一般に、抗体は、抗体の製造を可能にするために、従来技術又は抗体遺伝子、重鎖及び／若しくは軽鎖の好適な細菌又は哺乳類細胞宿主へのトランスフェクションを介したモノクローナル抗体の生成を含む細胞培養技術によって製造することができ、抗体は組換えであってもよい。標準的な分子生物学技術を使用して、組換え発現ベクターを調製し、宿主細胞を形質移入し、形質転換体を選択し、宿主細胞を培養し、培養培地から抗体を回収する。宿主細胞を形質移入することは、外来性ＤＮＡを原核又は真核宿主細胞内に導入するのに一般的に使用される幅広い技法、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなどを用いて実施することができる。原核又は真核宿主細胞のいずれでも本発明の抗体を発現させることが可能ではあるが、真核細胞（特に哺乳類細胞）は、原核細胞よりも、適切に折り畳まれ免疫学的に活性な抗体を構築しかつ分泌する可能性が高いため、そのような真核細胞における抗体の発現が好ましいことがあり、哺乳類宿主細胞における抗体の発現が好ましいことがある。
【００７８】
本発明の組換え抗体を発現させるための例示的な哺乳類宿主細胞としては、（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＵｒｌａｕｂ及びＣｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：４２１６−４２２０号（１９８０）に記載のｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む）チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）が挙げられる。他の好適な哺乳類宿主細胞としては、限定するものではないが、ＮＳ０骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞、及びＳＰ２細胞が挙げられる。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを哺乳類宿主細胞に導入すると、抗体は、宿主細胞において抗体を発現させるのに十分な時間、あるいは、より好ましくは、宿主細胞が増殖する培地へ抗体を分泌させるのに十分な時間にわたって、宿主細胞を培養することにより製造される。
【００７９】
本開示はまた、本明細書に記載される方法によって製造される改変された等電点を有する抗体を目的とする。上記に述べたように、抗体が可変重質領域を含む限り、実質上任意の抗体の等電点を本明細書に記載の方法を用いて改変することができる。
【００８０】
本開示の第４の態様は、重鎖可変領域を含む第１のポリペプチドと重鎖可変領域を含む第２のポリペプチドとを含み、第１のポリペプチドの重鎖可変領域の９、７０、７４、８２ａ及び８４位（Ｋａｂａｔ番号付け）の１つ以上のアミノ酸残基が中性又は負に帯電したアミノ酸残基を含み、第２のポリペプチドの重鎖可変領域の対応する位置にある１つ以上のアミノ酸残基が第１のポリペプチドと比較して、差次的に帯電したアミノ酸残基を含む結果として、第１のポリペプチドの等電点が第２のポリペプチドの等電点よりも小さい、多重特異性抗体を目的とする。
【００８１】
抗体を製造する方法、並びにアミノ酸置換を行う形態が上述されている。一実施形態では、第１のポリペプチドの９、７０、７４、８２ａ及び８４位における中性又は負に帯電したアミノ酸残基は、アミノ酸置換によって第１のポリペプチドに導入される。
【００８２】
本開示のこの態様によると、本明細書に開示される例示的な二重特異性抗体は、ＴＮＦα及びαＶβ３と結合する抗体である。この抗体は、軽鎖と共にＴＮＦα（ＣＮＴＯ１４８）に結合する重鎖可変領域を含む第１のポリペプチドを有する。この第１の重鎖ポリペプチドの等電点は、抗体の第２の重鎖ポリペプチドの等電点よりも低く、その軽鎖と一緒にαＶβ３に結合する。
【００８３】
一実施形態では、第１のポリペプチド重鎖可変領域は、配列番号１のアミノ酸配列を含み、７５位の残基（Ｋａｂａｔ残基７４に対応する）は、アスパラギン酸残基（ＣＮＴＯ１４８  Ｓ７５Ｄ）などの負に帯電したアミノ酸残基である。あるいは、重鎖可変領域は、配列番号１のアミノ酸配列を含み、８４位のアミノ酸残基（Ｋａｂａｔ残基８２ａに対応する）は、アスパラギン酸残基（ＣＮＴＯ１４８  Ｎ８４Ｄ）などの負に帯電したアミノ酸残基である。更に別の実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１のアミノ酸配列を含み、８８位のアミノ酸残基（Ｋａｂａｔ残基８４に対応する）は、アスパラギン酸残基（ＣＮＴＯ１４８  Ａ８８Ｄ）などの負に帯電したアミノ酸残基である。
【００８４】
更に別の実施形態では、重鎖可変領域は、二重特異性抗体のｐＩを低下させる、２つ以上のアミノ酸置換を含む。具体的には、一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１のアミノ酸配列を含み、８４及び８８位としてのアミノ酸残基（Ｋａｂａｔ残基８２ａ及び８４に対応する）は、アスパラギン酸残基（ＣＮＴＯ１４８  Ｎ８４Ｄ及びＡ８８Ｄ）などの負に帯電したアミノ酸残基である。別の実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１のアミノ酸配列を含み、７５及び８８位としてのアミノ酸残基（Ｋａｂａｔ残基７４及び８４に対応する）は、アスパラギン酸残基（ＣＮＴＯ１４８  Ｓ７５Ｄ及びＡ８８Ｄ）などの負に帯電したアミノ酸残基である。別の実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１のアミノ酸配列を含み、７５及び８４位としてのアミノ酸残基（Ｋａｂａｔ残基７４及び８２ａに対応する）は、アスパラギン酸残基（ＣＮＴＯ１４８  Ｓ７５Ｄ及びＮ８４Ｄ）などの負に帯電したアミノ酸残基である。更に別の実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１のアミノ酸配列を含み、７５、８４及び８８位としてのアミノ酸残基（Ｋａｂａｔ残基７４、８２ａ及び８４に対応する）は、アスパラギン酸残基（ＣＮＴＯ１４８  Ｓ７５Ｄ、Ｎ８４Ｄ及びＡ８８Ｄ）などの負に帯電したアミノ酸残基である。
【００８５】
上記のように、この例示的な二重特異性抗体は、軽鎖と共にαＶβ３に結合する重鎖可変領域を含む第２のポリペプチドを有する。この第２のポリペプチドは、配列番号４（以下に示す）のアミノ酸配列を有するＣＮＴＯ９５抗体の重鎖可変領域を含む。一実施形態では、この重鎖可変領域の７、９、１１、１４、４１、７４、８４及び１１３位における１つ以上のアミノ酸残基は、中性又は正に帯電したアミノ酸残基を含むように置換される。
【００８６】
【化１２】
2020522573.tif 000014
【００８７】
本明細書に開示される別の例示的な二重特異性抗体は、ＴＩＭ３（ＣＤ３６６）及びＰＤ−１（ＣＤ２７９）と結合する抗体である。この抗体は、その軽鎖と共にＴＩＭ３に結合する可変領域を有する重鎖（ＴＭ３Ｈ２４）を含む第１のポリペプチドを有する。一実施形態では、この第１の重鎖ポリペプチドの等電点は、抗体の第２の重鎖ポリペプチドの等電点よりも小さく、その軽鎖と共に、ＰＤ−１に結合する。この実施形態によると、この重鎖可変領域は、配列番号２のアミノ酸配列を含み、７５位の残基（Ｋａｂａｔ残基７４に対応する）は、アスパラギン酸残基（ＴＭ３Ｈ２４  Ｓ７５Ｄ）などの負に帯電したアミノ酸残基である。あるいは、重鎖可変領域は、配列番号２のアミノ酸配列を含み、８４位のアミノ酸残基（Ｋａｂａｔ残基８２ａに対応する）は、アスパラギン酸残基（ＴＭ３Ｈ２４  Ｎ８４Ｄ）などの負に帯電したアミノ酸残基である。更に別の実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号２のアミノ酸配列を含み、８８位のアミノ酸残基（Ｋａｂａｔ残基８４に対応する）は、アスパラギン酸残基（ＴＭ３Ｈ２４  Ａ８８Ｄ）などの負に帯電したアミノ酸残基である。
【００８８】
あるいは、可変領域（ＰＤ１Ｈ１７０）を有する重鎖を含む第２のポリペプチドは、その軽鎖と共に、ＰＤ−１に結合し、ＴＭ３Ｈ２４重鎖のｐＩ及び二重特異性抗体の過剰ｐＩに対してそのｐＩを低下させるように修飾される。この実施形態によると、ＰＤ１Ｈ１７０重鎖可変領域は、配列番号３のアミノ酸配列を含み、７５位の残基（Ｋａｂａｔ残基７４に対応する）は、アスパラギン酸残基（ＰＤ１Ｈ１７０  Ｓ７５Ｄ）などの負に帯電したアミノ酸残基である。あるいは、重鎖可変領域は、配列番号３のアミノ酸配列を含み、８４位のアミノ酸残基（Ｋａｂａｔ残基８２ａに対応する）は、アスパラギン酸残基（ＰＤ１Ｈ１７０  Ｓ８４Ｄ）などの負に帯電したアミノ酸残基である。更に別の実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号３のアミノ酸配列を含み、８８位のアミノ酸残基（Ｋａｂａｔ残基８４に対応する）は、アスパラギン酸残基（ＰＤ１Ｈ１７０  Ｓ８８Ｄ）などの負に帯電したアミノ酸残基である。
【００８９】
本開示の別の態様は、重鎖可変領域を含む第１のポリペプチドと重鎖可変領域を含む第２のポリペプチドとを含み、第１のポリペプチドの重鎖可変領域の７、９、１１、１４、４１、７４、８４及び１１３位（Ｋａｂａｔ番号付け）の１つ以上のアミノ酸残基が中性又は正に帯電したアミノ酸残基を含み、第２のポリペプチドの重鎖可変領域の対応する位置における１つ以上のアミノ酸残基が、第１のポリペプチドと比較して、差次的に帯電したアミノ酸残基（すなわち、それぞれ負又は中性に帯電したアミノ酸残基）を含む結果として、第１のポリペプチドの等電点が、第２のポリペプチドの等電点よりも高い、多重特異性抗体を目的とする。
【００９０】
一実施形態では、第２のポリペプチドの重鎖可変領域の９、７０、７４、８２ａ及び８４位（Ｋａｂａｔ番号付け）における１つ以上のアミノ酸残基は、中性又は負に帯電したアミノ酸残基を含み、第１のポリペプチドの重鎖可変領域の対応する位置における１つ以上のアミノ酸残基は、第１のポリペプチドと比較して、差次的に帯電したアミノ酸残基（すなわち、それぞれ負又は中性に帯電した残基）を含む。
【００９１】
一実施形態では、第１の重鎖ポリペプチドの７、９、１１、１４、４１、７４、８４及び１１３位の１つ以上の位置における中性又は正に帯電したアミノ酸残基は、アミノ酸置換によって第１のポリペプチドに導入される。同様に、第２の重鎖ポリペプチド中の１つ以上の中性又は負に帯電したアミノ酸残基は、アミノ酸置換によって第２のポリペプチドに導入される。
【００９２】
本発明は、配列番号６、７又は８の重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号５の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗ＴＩＭ３抗体も提供する。本発明は、配列番号６のＶＨ及び配列番号５のＶＬを含む抗ＴＩＭ３抗体も提供する。本発明は、配列番号７のＶＨ及び配列番号５のＶＬを含む抗ＴＩＭ３抗体も提供する。本発明は、配列番号８のＶＨ及び配列番号５のＶＬを含む抗ＴＩＭ３抗体も提供する。
【００９３】
本発明は、配列番号１０、１１又は１２の重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号９の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗ＰＤ−１抗体も提供する。本発明は、配列番号１０の重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号９の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗ＰＤ−１抗体も提供する。本発明は、配列番号１１の重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号９の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗ＰＤ−１抗体も提供する。本発明は、配列番号１２の重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号９の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗ＰＤ−１抗体も提供する。
【００９４】
本発明はまた、ＰＤ−１に結合する第１のドメインと、ＴＩＭ３に結合する第２のドメインと、を含む二重特異性ＰＤ１ｘＴＩＭ３抗体を提供し、第１のドメインは、配列番号１０、１１又は１２のＶＨ及び配列番号９のＶＬを含み、第２のドメインは、配列番号６、７又は８のＶＨ及び配列番号５のＶＬを含む。
【００９５】
いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１、抗ＴＩＭ３、又は二重特異性ＰＤ−１ｘＴＩＭ３抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプである。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１、抗ＴＩＭ３、又は二重特異性ＰＤ−１ｘＴＩＭ３抗体は、ＩｇＧ２アイソタイプである。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１、抗ＴＩＭ３、又は二重特異性ＰＤ−１ｘＴＩＭ３抗体は、ＩｇＧ３アイソタイプである。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１、抗ＴＩＭ３、又は二重特異性ＰＤ−１ｘＴＩＭ３抗体は、ＩｇＧ４アイソタイプである。
【００９６】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）への抗体結合を調節する抗体Ｆｃにおける少なくとも１つの変異を含む。いくつかの実施形態では、ＦｃＲはＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩ又はＦｃＲｎである。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗体はＳ２２８Ｐ変異を含む。
【００９７】
例示的なＩｇＧ４定常ドメインは、配列番号１３（Ｓ２２８Ｐ変異を有するＩｇＧ４）に示される。
【００９８】
【化１３】
2020522573.tif 000015
【００９９】
二重特異性ＰＤ−１／ＴＩＭ３抗体は、国際特許出願公開第２０１１／１３１７４６号に記載の方法に従って、２つの単一特異性ホモ二量体抗体のＣＨ３領域に非対称な変異を導入し、ジスルフィド結合を異性化させる還元条件下で、２つの親単一特異性ホモ二量体抗体から二重特異性ヘテロ二量体抗体を形成することによって、セルフリー環境においてインビトロで生成されてもよい。この方法において、第１の単一特異性二価抗体及び第２の単一特異性二価抗体は、ヘテロ二量体の安定性を促進するＣＨ３ドメインにおいてある特定の置換を有するように改変されるが、これらの抗体は、ヒンジ領域におけるシステインがジスルフィド結合を異性化させるのに十分な還元条件下において共にインキュベートされ、それにより、Ｆａｂアーム交換により二重特異性抗体が生成される。使用され得る置換は、ＩｇＧ１抗体における、１つの重鎖においてＦ４０５Ｌ、もう１つの重鎖においてＫ４０９Ｒである。ＩｇＧ４抗体において、一方の野生型重鎖及び他方の重鎖におけるＦ４０５Ｌ／Ｒ４０９Ｋ変異を使用し得る。インキュベート条件は、最適には、非還元条件に戻され得る。使用され得る例示的な還元剤は、２−メルカプトエチルアミン（２−ＭＥＡ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリスリトール（ＤＴＥ）、グルタチオン、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、Ｌ−システイン、及びβ−メルカプトエタノールである。例えば、少なくとも２０℃の温度で、少なくとも２５ｍＭの２−ＭＥＡの存在下又は少なくとも０．５ｍＭのジチオスレイトールの存在下で、ｐＨ５〜８、例えばｐＨ７．０又はｐＨ７．４で、少なくとも９０分間のインキュベートを用いることができる。
【０１００】
いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１、抗ＴＩＭ３、及び二重特異性ＰＤ−１ｘＴＩＭ３抗体は、アンタゴニスト抗体である。本明細書で提供されるアンタゴニスト抗体によって誘導される典型的な生物活性は、抗原特異的ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化である。様々な読み出しを使用して、抗原特異的ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞によるインターフェロン（ＩＦＮ）、ＩＬ−１７  ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、又はＧＭ−ＣＳＦの増強された増殖又は強化された製造など、本明細書に提供される抗体の拮抗的性質を評価することができる。例示的なアッセイでは、同種異系樹状細胞又は破傷風トキソイド又はＣＭＶなどの特定の抗原によって刺激される、正常ドナーからのＴ細胞に対する抗体の効果が使用される。この設定では、Ｔ細胞活性化の上清サイトカインレベル又はマーカーを測定することにより、抗体処理によるＴ細胞機能の変化を検出することができる。例示的なアッセイでは、ＣＭＶ抗原に対して反応性であると判定されたＰＢＭＣは、抗原特異的ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞の供給源として使用される。１．５×１０６細胞／ｍＬ又は２×１０６細胞／ｍＬのＣＭＶ反応性ＰＢＭＣを培養プレートに播種し、μ培養物に０．１〜０．２ｇ／ｍＬのＣＭＶペプチドを添加する。ＣＭＶペプチドは、例えば、ＪＰＴ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入することができる。試験抗体を１０μｇ／ｍＬの単用量で添加し、プレートを６日間インキュベートし、１μＣｉ／ウェルのメチル−３Ｈ−チミジン（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）の添加により６時間し細胞増殖を評価し、各試料中で放射能を測定する。あるいは、細胞によるサイトカイン産生は、ＥＬＩＳＡ又は既知の多重アッセイを使用して測定される。「アンタゴニスト」又は「拮抗」は、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３又は両方に結合すると、ＰＤ−１及び／又はＴＩＭ−３配位子によって媒介される少なくとも１つの生物活性を抑制する抗体を指す。抗体は、少なくとも１つの生物活性が、アンタゴニストの非存在下（例えば、陰性対照）でよりも、少なくとも約２０％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは１００％多く抑制されるとき、又はアンタゴニストの非存在下における抑制と比較して抑制が統計的に有意であるとき、アンタゴニストである。例示的なＴＩＭ−３配位子はガレクチン−９である。ＰＤ−Ｌ１は、ＰＤ−１の配位子である。
【０１０１】
本発明はまた、抗ＰＤ−１、抗ＴＩＭ３、及び本発明の二重特異性ＰＤ−１ｘＴＩＭ３抗体、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物も提供する。治療用途では、本発明の抗体は、医薬的に許容される担体中に活性成分として有効量の抗体を含有する医薬組成物として調製することができる。「担体」は、本発明の抗体と一緒に投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、又はビヒクルを指す。このようなビヒクルは、水、及び石油、動物、植物、又は合成物由来のものを含む油、例えば、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの液体であってよい。例えば、０．４％生理食塩水及び０．３％グリシンを用いてよい。これらの溶液は滅菌され、一般には粒子状物質を含まない。これらは、通常の周知の滅菌技術（例えば、濾過）によって滅菌することができる。組成物は、生理学的条件に近づけるために必要とされる医薬的に許容される補助物質、例えば、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、安定化剤、増粘剤、潤滑剤及び着色剤などを含有し得る。このような医薬製剤中の本発明の抗体又はその抗原結合断片の濃度は、約０．５重量％未満から、通常は少なくとも約１重量％まで、最大で１５又は２０重量％まで変動し得、また、選択される具体的な投与方法に従って、必要とされる用量、流体体積、粘度などに主に基づいて選択され得る。好適なビヒクル、及び他のヒトタンパク質、例えばヒト血清アルブミンを含む製剤は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔｒｏｙ，Ｄ．Ｂ．ｅｄ．，Ｌｉｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ  ２００６，Ｐａｒｔ  ５，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ｐｐ６９１−１０９２に記載され、特にｐｐ．９５８〜９８９を参照されたい。
【０１０２】
本発明の抗体は、インビトロ及びインビボにおいて、診断上の有用性、並びに治療及び予防上の有用性を有する。例えば、本発明の抗体を、培養中の細胞にインビトロ若しくはエクスビボで投与して、又は対象に投与して、癌及び感染性疾患などの様々な疾患を治療、予防及び／若しくは診断することができる。
【０１０３】
また、本発明の方法は、免疫応答を増強する方法であって、免疫応答を改変するのに十分な時間、本発明の抗体又はその抗原結合断片を対象に投与することを含む、方法を提供する。
【０１０４】
「免疫応答」は、Ｔ細胞媒介性及び／又はＢ細胞媒介性免疫応答を含む。例示的な免疫応答としては、Ｔ細胞応答、例えば、サイトカイン産生及び細胞毒性が挙げられる。更に、免疫応答という用語は、Ｔ細胞活性化、例えば、抗体製造（体液性応答）及びサイトカイン応答性細胞（例えばマクロファージ）の活性化によって間接的に影響を受ける免疫応答を含む。
【０１０５】
「増強（enhance）」又は「増強する（enhancing）」又は「亢進（upmodulate）」又は「亢進させる（upmodulation）」は、対象における免疫応答のレベルの、治療又は化合物の非存在下での応答のレベルと比較して、及び／又は、そうでなければ同一であるが未治療の対象における応答のレベルと比較した、検出可能な増加を指す。
【０１０６】
一部の実施形態では、対象はヒトである。
【０１０７】
本発明の抗体は、Ｔ細胞媒介性免疫応答などの免疫応答を増強することによって治療され得る障害を有する対象を治療するのに好適である。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、対象は、癌又はウイルス感染を有する。
【０１０９】
本発明はまた、癌を治療する方法であって、治療有効量の本明細書で提供される単離された抗体又は抗原結合断片を、癌を治療するのに十分な時間にわたって対象に投与することを含む、癌を治療する方法を提供する。
【０１１０】
「治療する」又は「治療」という用語は、治療的処置及び予防的又は防止的措置の両方を指すものであり、その目的は、望ましくない生理学的変化又は障害を予防又は遅延（緩和）することにある。有益な又は所望の臨床結果としては、検出可能であろうと又は検出不可能であろうと、症状の緩和、疾患の程度の軽減、安定した（すなわち、悪化しない）疾患状態、疾患の進行の遅延又は鈍化、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解（部分的であろうと又は全体的であろうと）が挙げられる。「治療」はまた、対象が治療を受けていない場合に予想される生存期間と比較して、生存期間を延長させることを意味し得る。治療を要する者には、既に状態若しくは疾患を有している者、及び、状態若しくは疾患を有しやすい者、又は状態若しくは疾患を予防しようとする者が含まれる。
【０１１１】
「治療有効量」は、必要な投薬量及び期間で所望の治療結果を得るための有効量を指す。治療有効量は、個体の病態、年齢、性別、及び体重などの要因、並びに個体において所望の応答を引き出す治療薬又は治療薬の組み合わせの能力によって様々であり得る。例えば、患者の改善された健康を含む、有効な治療薬又は治療薬の組み合わせの例示的な指標。
【０１１２】
癌は、過剰増殖状態又は障害、固体腫瘍、血液悪性疾患、軟組織腫瘍、又は転移病変であってもよい。
【０１１３】
「癌」は、病理学的な種類又は侵襲性の段階に関係なく、全ての種類の癌性成長又は発癌プロセス、転移組織又は悪性腫瘍形質転換細胞、組織、又は器官を含むことを意味する。癌の例としては、固形腫瘍、血液悪性腫瘍、軟組織腫瘍、及び転移性病変が挙げられる。例示的な固形腫瘍としては、肝臓、肺、乳房、リンパ系、胃腸（例えば結腸）、生殖器系（例えば腎、尿上皮細胞）、前立腺及び咽頭に影響を及ぼすものなどの様々な臓器系の悪性腫瘍、例えば非上皮性悪性腫瘍、及び上皮性悪性腫瘍（腺癌及び扁平上皮癌を含む）、などの悪性腫瘍が挙げられる。腺癌には、最も結腸癌、直腸癌、腎細胞癌、肝臓癌、肺の非小細胞癌、小腸の癌、及び食道の癌などの悪性腫瘍が挙げられる。扁平上皮癌としては、例えば、肺、食道、皮膚、頭及び頸部領域、口腔、肛門、及び子宮頸部の悪性腫瘍が挙げられる。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、癌は黒色腫である。
【０１１５】
癌の転移性病変は、本明細書に記載される本発明の方法及び抗体を使用して治療又は予防されてもよい。
【０１１６】
本発明の抗体を使用して増殖が阻害又は低減され得る例示的な癌としては、免疫療法に応答し得る癌が挙げられる。例示的なかかる癌としては、黒色腫、腎癌、前立腺癌、乳癌、結腸癌、消化管癌、胃癌、食道癌、肺癌、転移性悪性黒色腫、透明細胞癌、ホルモン不応性前立腺腺癌、非小細胞肺癌又は頭部頸部癌が挙げられる。難治性又は再発性悪性腫瘍は、本明細書に記載される本発明の抗体を使用して治療され得る。
【０１１７】
本発明の抗体で治療され得る例示的な他の癌は、肛門癌、基底細胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脳及びＣＮＳ癌、卵管の癌、膣癌、外陰部癌、皮膚又は眼内悪性黒色腫、経食道癌、精巣癌、卵巣癌、膵臓癌、直腸癌、子宮癌、原発性ＣＮＳリンパ腫；中枢神経系（ＣＮＳ）の腫瘍、子宮頸癌、絨毛癌、直腸癌、結合組織癌、消化器系の癌、子宮内膜癌、眼癌；上皮内腫瘍、腎臓癌、喉頭癌、肝癌；小細胞肺癌、神経芽腫、口腔癌（例えば、唇、舌、口、及び咽頭）、鼻咽頭癌、網膜芽腫、横紋筋肉腫、呼吸器系の癌、肉腫、甲状腺癌、泌尿器系の癌、肝癌、肛門領域の癌、肛門の癌、卵管の癌、膣癌、外陰部癌、小腸癌、内分泌系癌、副甲状腺の癌、副腎の癌、軟組織の肉腫、尿道の癌、ペニスの癌、小児の固形腫瘍、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、メルケル細胞癌、上皮細胞癌、扁平上皮癌、アスベストによって誘導されるものを含む環境誘導性癌、並びに他の癌腫及び肉腫、並びに当該癌の組み合わせが挙げられる。
【０１１８】
本発明の抗体で治療され得る例示的な血液悪性腫瘍としては、白血病、リンパ腫、及び骨髄腫、例えば前駆Ｂ細胞リンパ芽球性白血病／リンパ腫及びＢ細胞非ホジキンリンパ腫、急性前骨髄球性白血病、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、Ｂ細胞急性リンパ球性白血病、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）（低グレード、中間グレード及び高グレードＦＬ、皮膚濾胞中心リンパ腫、辺縁領域Ｂ細胞リンパ腫（ＭＡＬＴ型、ノード及び脾臓型）、毛状細胞白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、形質細胞腫、多発性骨髄腫（ＭＭ）、形質細胞白血病、移植後リンパ増殖性疾患、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、形質細胞疾患、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、Ｔ細胞急性リンパ球性白血病、原発性全身性アミロイドーシス（例えば、軽鎖アミロイドーシス）、前リンパ球／骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、大顆粒リンパ球（ＬＧＬ）白血病、ＮＫ細胞白血病、及びホジキンリンパ腫が挙げられる。
【０１１９】
「形質細胞疾患」は、クローン性形質細胞によって特徴付けられる疾患を指し、多発性骨髄腫、軽鎖アミロイドーシス、及びワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症を含む。軽鎖アミロイドーシス及びワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症は、多発性骨髄腫とは無関係に発症し得る。これらはまた、多発性骨髄腫と同時に存在し、多発性骨髄腫の進行より前又はそれより後のいずれかに進行し得る。
【０１２０】
例示的なＢ細胞非ホジキンリンパ腫は、リンパ腫様肉芽腫症、原発性滲出性リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、重鎖病（γ、μ、及びα病を含む）、免疫抑制剤による療法によって誘発されるリンパ腫、例えばシクロスポリン誘発性リンパ腫及びメトトレキサート誘発性リンパ腫である。
【０１２１】
ＰＤ−Ｌ１を発現する転移性癌を含む癌を有する患者は、本発明の抗体で治療され得る。癌は、黒色腫、腎細胞癌、扁平上皮非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、非扁平上皮ＮＳＣＬＣ、大腸直腸癌、性腺摘除抵抗性前立腺癌、卵巣癌、胃癌、腺癌（ＡＣＡ）、扁平上皮細胞癌（ＳＣＣ）、肝細胞癌（ＨＣＣ）、膵臓癌、頭部及び頸部の扁平上皮細胞癌、食道、消化管及び乳房の癌であり得る。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、対象は、ＰＤ−Ｌ１を発現する腫瘍を有する。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、対象は、ＰＤ−Ｌ１抗体による治療後に難治性及び／又は再発性である。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１抗体は、アベルマブチ、デュルバルマブ、又はアテゾリズマブである。様々な定性的及び／又は定量的方法が、疾患の再発又は難治性を決定するために使用され得る。再発又は耐性に関連し得る症状は、例えば、患者の健康状態の低下若しくはプラトー状態、固体腫瘍に関連する様々な症状の復元若しくは悪化、及び／又は１つの場所から他の臓器、組織若しくは細胞への体内の癌性細胞の拡がりである。
【０１２４】
本発明はまた、ウイルス感染を治療する方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の本明細書で提供される単離された抗体又は抗原結合断片を、ウイルス感染を治療するのに十分な時間にわたって投与することを含む、方法を提供する。
【０１２５】
本発明の抗体により治療可能であり得る例示的なウイルス感染としては、ＨＩＶ、肝炎（Ａ、Ｂ、又はＣ）、ヘルペスウイルス（例えば、ＶＺＶ、ＨＳＶ−１、ＨＡＶ−６、ＨＳＶ−ＩＩ、及びＣＭＶ、エプスタインバーウイルス）、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コルノウイルス（cornovirus）、呼吸器合胞体ウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウウイルス、ＨＴＬＶウイルス、デンググウイルス、パピローマウイルス、軟属腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルス、及びアルボウイルス脳炎ウイルスが挙げられる。
【０１２６】
本発明の更なる実施形態
本明細書の他の箇所の開示に従う、本発明の特定の更なる実施形態を以下に記載する。本明細書に開示される本発明に関連するものとして上述された本発明の実施形態の特徴は、これらの番号付けされた更なる実施形態のうちの１つ１つにもまた関係する。
【０１２７】
実施形態１。配列番号６、７又は８の重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号５の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗ＴＩＭ３抗体。
【０１２８】
実施形態２。配列番号６のＶＨ、及び配列番号５のＶＬを含む抗ＴＩＭ３抗体。
【０１２９】
実施形態３。配列番号７のＶＨ、及び配列番号５のＶＬを含む抗ＴＩＭ３抗体。
【０１３０】
実施形態４。配列番号８のＶＨ、及び配列番号５のＶＬを含む抗ＴＩＭ３抗体。
【０１３１】
実施形態５。配列番号１０、１１又は１２のＶＨ、及び配列番号９のＶＬを含む抗ＰＤ−１抗体。
【０１３２】
実施形態６。配列番号１０のＶＨ、及び配列番号９のＶＬを含む抗ＰＤ−１抗体。
【０１３３】
実施形態９。配列番号１１のＶＨ、及び配列番号９のＶＬを含む抗ＰＤ−１抗体。
【０１３４】
実施形態１０。配列番号１２のＶＨ、及び配列番号９のＶＬを含む抗ＰＤ−１抗体。
【０１３５】
実施形態１１。ＰＤ−１に結合する第１のドメイン及びＴＩＭ３に結合する第２のドメインを含む二重特異性ＰＤ−１ｘＴＩＭ３抗体であって、第１のドメインが、配列番号１０、１１又は１２のＶＨ及び配列番号９のＶＬを含み、第２のドメインが、配列番号６、７又は８のＶＨ及び配列番号５のＶＬを含む、二重特異性ＰＤ−１ｘＴＩＭ３抗体。
【０１３６】
実施形態１２。第１のドメインが、配列番号１０のＶＨ及び配列番号９のＶＬを含み、第２のドメインが配列番号６のＶＨ及び配列番号５のＶＬを含む、実施形態１１に記載の二重特異性ＰＤ−１ｘＴＩＭ３抗体。
【０１３７】
実施形態１３。第１のドメインが、配列番号１１のＶＨ及び配列番号９のＶＬを含み、第２のドメインが配列番号６のＶＨ及び配列番号５のＶＬを含む、実施形態１１に記載の二重特異性ＰＤ−１ｘＴＩＭ３抗体。
【０１３８】
実施形態１４。第１のドメインが、配列番号１２のＶＨ及び配列番号９のＶＬを含み、第２のドメインが配列番号６のＶＨ及び配列番号５のＶＬを含む、実施形態１１に記載の二重特異性ＰＤ−１ｘＴＩＭ３抗体。
【０１３９】
実施形態１５。第１のドメインが、配列番号１０のＶＨ及び配列番号９のＶＬを含み、第２のドメインが配列番号７のＶＨ及び配列番号５のＶＬを含む、実施形態１１に記載の二重特異性ＰＤ−１ｘＴＩＭ３抗体。
【０１４０】
実施形態１６。第１のドメインが、配列番号１１のＶＨ及び配列番号９のＶＬを含み、第２のドメインが配列番号７のＶＨ及び配列番号５のＶＬを含む、実施形態１１に記載の二重特異性ＰＤ−１ｘＴＩＭ３抗体。
【０１４１】
実施形態１７。第１のドメインが、配列番号１２のＶＨ及び配列番号９のＶＬを含み、第２のドメインが配列番号７のＶＨ及び配列番号５のＶＬを含む、実施形態１１に記載の二重特異性ＰＤ−１ｘＴＩＭ３抗体。
【０１４２】
実施形態１８。第１のドメインが、配列番号１０のＶＨ及び配列番号９のＶＬを含み、第２のドメインが配列番号８のＶＨ及び配列番号５のＶＬを含む、実施形態１１に記載の二重特異性ＰＤ−１ｘＴＩＭ３抗体。
【０１４３】
実施形態１９。第１のドメインが、配列番号１１のＶＨ及び配列番号９のＶＬを含み、第２のドメインが配列番号８のＶＨ及び配列番号５のＶＬを含む、実施形態１１，に記載の二重特異性ＰＤ−１ｘＴＩＭ３抗体。
【０１４４】
実施形態２０。第１のドメインが、配列番号１２のＶＨ及び配列番号９のＶＬを含み、第２のドメインが配列番号８のＶＨ及び配列番号５のＶＬを含む、実施形態１１に記載の二重特異性ＰＤ−１ｘＴＩＭ３抗体。
【０１４５】
実施形態２１。抗体がＩｇＧ４アイソタイプである、実施形態１〜２０のいずれか１つに記載の抗体。
【０１４６】
実施形態２２。配列番号１３の野生型ＩｇＧ４と比較して、Ｓ２２８Ｐ変異を含む、実施形態１−２１のいずれか１つに記載の抗体。
【０１４７】
実施形態２３。抗体がアンタゴニスト抗体である、実施形態１〜２２のいずれか１つに記載の抗体。
【０１４８】
実施形態２４。実施形態１〜２３のいずれか１つに記載の抗体を含む医薬組成物。
【０１４９】
実施形態２５。治療において使用するための、実施形態１〜２３のいずれか１つに記載の抗体又は実施形態２４に記載の医薬組成物。
【０１５０】
実施形態２４。癌を有する対象を治療する際に使用するための、実施形態１〜２３のいずれか１つに記載の抗体又は実施形態２４に記載の医薬組成物。
【０１５１】
実施形態２５．癌が固形腫瘍又は血液悪性疾患である、実施形態２４に記載の使用のための抗体又は医薬組成物。
【実施例】
【０１５２】
以下の実施例は、本発明の実施形態を例示するために提供されるが、その範囲を限定することを意図するものではない。
【０１５３】
実施例１−モノクローナル及び二重特異性抗ＴＮＦα抗体の等電点改変
表面電荷を増加又は減少させるように置換され得る可変領域の表面内のアミノ酸残基を同定するために、ＣＮＴＯ１４８抗体を用いた。ＣＮＴＯ１４８は、ＴＮＦαと結合するモノクローナル抗体である。抗体結晶構造は利用可能である。ＣＮＴＯ１４８抗体の等電点は〜９である。９、７０、７４、８２ａ及び８４（Ｋａｂａｔ番号付け）（配列番号１のアミノ酸位置９、７１、７５、８４及び８８に対応する）における可変重鎖領域におけるアミノ酸置換を最初に試験して、ＣＮＴＯ１４８抗体の等電点（ｐＩ）を低下させる能力を決定した。これらの置換は、重鎖可変領域をコードする核酸分子の修飾を介して、単独で又は組み合わせて導入した（実施例４を参照のこと）。変異体は、Ｅｘｐｉ２９３細胞を使用して発現させた。
【０１５４】
【表１】
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【０１５５】
変異体は、キャピラリー等電点電気泳動法（ｃＩＥＦ）、ドデシル硫酸ナトリウム電気泳動法（ｃＳＤＳ）又はドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、及びサイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）を使用して特徴付けられた。製造元のプロトコルに従ってＰｒｏｔｅｉｎ  Ｓｉｍｐｌｅ社のｉＣＥ３分析器を使用して、ｐＨ８〜１０．５のアンホライトと組み合わせて、ｐＨ５〜８又はｐＨ３〜１０でｉＣＥＦを行った。Ｃａｌｉｐｅｒ社のＬａｂ  Ｃｈｉｐ  ＧＸＩＩで、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓチップ及びＨＴ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔを使用して、ｃＳＤＳを行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、Ｎｏｖｅｘ  ＮｕＰＡＧＥ  １−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＳｅｅＢｌｕｅ  Ｐｌｕｓ２  Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（１Ｘ）、及び１Ｘ  ＭＥＳ  Ｒｕｎｎｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒを使用して行った。ＳＥ−ＨＰＬＣは、ＴＯＳＯＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｉｏａｓｓｉｓｔ  Ｇ３５Ｗ、内径７．８ｍｍ、３０ｃｍカラムを使用してＷａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅで行った。
【０１５６】
変異体はまた、抗原結合の変化について特徴付けられた。抗原結合は、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈからＦ（ａｂ’）２断片ロバ抗ヒトＦｃでコーティングされたＭａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ）を使用して測定し、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（Ｐｉｅｒｃｅ）でブロッキングした。次いで、変異体の連続希釈物をプレートに添加し、結合させた。ＴＮＦに結合するＣＮＴＯ１４８を測定するために、ビオチン化ヒトＴＮＦを加え、続いてストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を加え、ＴＭＢ基質（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ）を用いて結合されたＴＮＦを検出した。
【０１５７】
サンプルのアンフォールディング温度（Ｔｍ）及び凝集開始温度（Ｔａｇｇ）もまた、Ａｃｔｉｖａ  Ｏｐｔｉｍ  ２、又は更新されたＵＮＣＬＥ器具のいずれかを使用して分析した。これらの機器は、凝集開始の指標として温度を上昇させたタンパク質のアンフォールディング及び光散乱の指標として、温度を上昇させて固有蛍光を測定する。タンパク質がアンフォールディング又は凝集し始める温度は、その構造的安定性を示すことができる。この分析のために、毎分０．３℃で２０℃〜８５℃の温度ステップを使用した。
【０１５８】
結果
ＣＮＴＯ１４８変異体の特性評価を以下の表２に要約する。ＣＮＴＯ１４８  Ｓ７５Ｄ及びＮ８４Ｄ変異体の実験的に測定されたｐＩは、９．１のｐＩを有する野生型（ＷＴ）と比較して、それぞれ８．９及び９．０であった。別個の実験において、ＣＮＴＯ１４８  Ａ８８Ｄ変異体のｐＩは、９．２．のｐＩを有するＷＴと比較して９．１であった。更に別の実験では、ＣＮＴＯ１４８  Ｇ９Ｅ及びＳ７１Ｅ変異体のｐＩは、８．９のｐＩを有するＷＴと比較してそれぞれ８．７及び８．７であった。実験間のＷＴ  ＣＮＴＯ１４８のｐＩの差は、通常の日間変動性及び電解質の組成のわずかな変化に起因している可能性が高い。少なくとも野生型対照と同様にＴＮＦαと結合したＳ７５Ｄ、Ｎ８４Ｄ、Ａ８８Ｄ、Ｇ９Ｅ及びＳ７１Ｅ変異体では、図１Ａは、野生型（１４８ＷＴ及びＣＮＴＯ１４８）と比較して、Ｓ７５Ｄ及びＮ８４Ｄ変異体の結合を示し、図１Ｂは、野生型ＣＮＴＯ１４８とＡ８８Ｄ変異体を比較し、図１Ｃは、Ｇ９Ｅ及びＳ７１Ｅ変異体の結合をＷＴ  ＣＮＴＯ１４８と比較する。ＣＮＴＯ９５を陰性対照として使用した。変異体はまた、ＷＴと非常に類似したＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルをもたらした。図２Ａ〜２Ｃは、ＣＮＴＯ１４８野生型（図２Ａ）、Ｎ８４Ｄ（図２Ｂ）、及びＳ７５Ｄ（図２Ｃ）のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示し、図３Ａ〜３Ｂは、ＣＮＴＯ１４８野生型（図３Ａ）及びＡ８８Ｄ変異体（図３Ｂ）のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルの比較を示す。図４Ａ〜４Ｃは、ＣＮＴＯ１４８野生型（図４Ａ）、Ｇ９Ｅ（図４Ｂ）、及びＳ７１Ｅ（図４Ｃ）のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルの比較を示す。
【０１５９】
【表２】
2020522573.tif 000017
【０１６０】
凝集開始時の温度を、コロイド安定性の指標として測定した。Ｓ７５Ｄ変異体及びＮ８４Ｄ変異体の凝集の開始（Ｔａｇｇ）は、６６．８℃及び６５．８℃で発生し（それぞれ図５Ｂ及び５Ｃを参照されたい）、これは、この実験で６３．９℃で発生した野生型ＣＮＴＯ１４８の凝集の開始よりもそれほど高くない場合に類似していた（図５Ａを参照のこと）。別の実験では、Ａ８８Ｄ変異体の凝集の開始は６６．９℃（図６Ｂ）で発生すことが見出され、これは６７．６℃（図６Ａ）での野生型コンストラクトと同様であった。別の実験では、６８．６℃（図７Ａ）での野生型ＣＮＴＯ１４８と比較して、Ｇ９Ｅ変異体及びＳ７１Ｅ変異体についての凝集開始が、６５．７℃（図７Ｂ）及び６９．５℃（図７Ｃ）でそれぞれ発生することが出された。
【０１６１】
アンフォールディング温度は、立体配座安定性の指標として測定された。Ｓ７５Ｄ変異体及びＮ８４Ｄ変異体のアンフォールディング温度（Ｔ）は、６７．３℃（図８Ｂ）及び６５．３℃（図８Ｃ）でそれぞれ生じ、これは６３．９℃で発生した野生型ＣＮＴＯ１４８のアンフォールディング温度と同様であった（図８Ａ）。別個の実験では、Ａ８８Ｄ変異体のアンフォールディング温度は６６．９℃（図９Ｂ）で生じ、れは６７．３℃で生じた実験における野生型コンストラクトと類似していた（図９Ａ）。更に別の実験では、６８．８℃で生じたこの実験の野生型ＣＮＴＯ１４８（図１０Ａ）と比較して、Ｇ９Ｅ変異体及びＳ７１Ｅ変異体のアンフォールディング温度は、６５．８℃（図１０Ｂ）及び６９．６℃（図１０Ｃ）で生じることが見出された。Ｔｍ及びＴａｇｇにおいて２℃を超える低下を示した変異体は、安定性の低下を有すると見なされた。これらの変異体のうち、Ｇ９Ｅ変異体のみが、ＷＴと比較して結合の低減を示し、Ｔｍが３℃低く、凝集の開始が２．９℃低かった。
【０１６２】
実施例２−モノクローナル及び二重特異性抗αＶβ３抗体の等電点改変
表面電荷を増加又は減少させるように置換され得る可変領域の表面内のアミノ酸残基を同定するために、ＣＮＴＯ９５抗体を用いた。ＣＮＴＯ９５は、αＶβ３と結合するモノクローナル抗体である。結晶構造は利用可能である。ＣＮＴＯ９５抗体の等電点は約９である。７、９、１１、１４、４１、７４、８４及び１１３位（Ｋａｂａｔ番号付け）（配列番号４のアミノ酸位置７、９、１１、１４、４１、７１、８８及び１１９に対応する）における可変重鎖領域におけるアミノ酸置換を最初に試験して、ＣＮＴＯ９５抗体の等電点（ｐＩ）を低下させる能力を決定した。これらの置換は、重鎖可変領域をコードする核酸分子の修飾を介して単独で又は組み合わせて導入した。変異体は、Ｅｘｐｉ２９３を用いて発現させた。
【０１６３】
【表３】
2020522573.tif 000018
【０１６４】
変異体は、キャピラリー等電点電気泳動法（ｃＩＥＦ）、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、及びサイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）を使用して特徴付けられた。ｃＩＥＦは、製造元のプロトコルに従って、ｐＨ３〜１０及びｐＨ８〜１０．５のアンホライトを用いて、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｉｍｐｌｅ社のｉＣＥ３分析器を使用して行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、Ｎｏｖｅｘ  ＮｕＰＡＧＥ  １−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＳｅｅＢｌｕｅ  Ｐｌｕｓ２  Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（１Ｘ）、及び１Ｘ  ＭＥＳ  Ｒｕｎｎｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒを使用して行った。ＳＥ−ＨＰＬＣは、ＴＯＳＯＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｉｏａｓｓｉｓｔ  Ｇ３５Ｗ、内径７．８ｍｍ、３０ｃｍカラムを使用してＷａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅで行った。
【０１６５】
変異体はまた、抗原結合の変化について特徴付けられた。抗原結合は、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈのＦ（ａｂ’）２断片ロバ抗ヒトＦｃでコーティングされたＭａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ）を使用して測定し、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（Ｐｉｅｒｃｅ）でブロッキングした。次いで、変異体の連続希釈物をプレートに添加し、結合させた。αＶβ３に結合するＣＮＴＯ９５を測定するために、ビオチン化ヒトαＶβ３を添加し、続いてストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を加え、ＴＭＢ基質（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ）を用いて結合αＶβ３を検出した。
【０１６６】
サンプルはまた、更新されたＵＮＣＬＥ器具を使用して分析された。この機器は、凝集開始の指標として温度を上昇させたタンパク質のアンフォールディング及び光散乱の指標として、温度を上昇させて固有蛍光を測定する。タンパク質がアンフォールディング又は凝集し始める温度は、その構造的安定性を示すことができる。この分析のために、毎分０．３℃で２０℃〜８５℃の温度ステップを使用した。
【０１６７】
結果
ＣＮＴＯ９５変異体の特性評価を以下の表４に要約する。ＣＮＴＯ９５  Ｓ７Ｒ、Ｇ９Ｒ、Ｖ１１Ｒ、Ｐ１４Ｒ、Ｐ４１Ｒ、Ｓ７１Ｋ、Ａ８８Ｒ及びＳ１１９Ｒ変異体のｐＩは、９．０５．のｐＩを有するＣＮＴＯ９５野生型と比較して、それぞれ９．２、９．２、９．２、９．２、９．２、９．１、９．２及び９．２であった。全ての変異体は、少なくとも野生型対照と同様にαＶβ３に結合した。図１１は、野生型（ＣＮＴＯ９５）と比較した上記変異体の結合を示す。陰性対照として、ＣＮＴＯ１４８を用いた。変異体はまた、ＷＴと非常に類似したＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルをもたらした。図１２Ａ〜１２Ｉは、ＣＮＴＯ９５野生型（図１２Ａ）、Ｓ７Ｒ（図１２Ｂ）、Ｇ９Ｒ（図１２Ｃ）、Ｖ１１Ｒ（図１２Ｄ）、Ｐ１４Ｒ（図１２Ｅ）、Ｐ４１Ｒ（図１２Ｆ）、Ｓ７１Ｋ（図１２Ｇ）、Ａ８８Ｒ（図１２Ｈ）及びＳ１１９Ｒ（図１２Ｉ）のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示す。
【０１６８】
【表４】
2020522573.tif 000019
【０１６９】
Ｓ７Ｒ、Ｇ９Ｒ、Ｖ１１Ｒ、Ｐ１４Ｒ、Ｐ４１Ｒ、Ｓ７１Ｋ、Ａ８８Ｒ及びＳ１１９Ｒ変異体についての凝集の開始（Ｔａｇｇ）は、６８．２℃で発生した野生型ＣＮＴＯ９５についての凝集の開始（図１３Ａを参照）と比較して、６７．２℃（図１３Ｂ）、５７．９℃（図１３Ｃ）、６３．９℃（図１３Ｄ）、６３．５℃（図１３Ｅ）、６６．４℃（図１３Ｆ）、６４．９℃（図１３Ｇ）、６７．６℃（図１３Ｈ）、及び６６．７℃（図１３Ｉ）で発生した。
【０１７０】
Ｓ７Ｒ、Ｇ９Ｒ、Ｖ１１Ｒ、Ｐ１４Ｒ、Ｐ４１Ｒ、Ｓ７１Ｋ、Ａ８８Ｒ及びＳ１１９Ｒ変異体のアンフォールディング温度（Ｔｍ）は、６８．８℃（図１４Ａ）で発生した野生型ＣＮＴＯ９５のアンフォールディング温度と比較して、それぞれ６７．９℃（図１４Ｂ、５９．４℃（図１４Ｃ、６４．８℃（図１４Ｄ）６４．３℃（図１４Ｅ）６６．８℃（図１４Ｆ）６５．８℃（図１４Ｇ）６８．０℃（図１４Ｈ）、及び６７．６℃（図１４Ｉ）で発生した。Ｔｍ及びＴａｇｇの２℃低下を示した変異体は、安定性が低下したと見なされ、５℃を超える低下を示した変異体は、安定性が大幅に低下したと見なされた。これらの変異体のうち、Ｇ９Ｒ変異体のみが安定性を大幅に低下させ、９．４℃低いＴｍ及び、１０．３℃凝集の開始を有した。Ｖ１１Ｒ、Ｐ１４Ｒ、Ｐ４１Ｒ及びＳ７１Ｋ変異体は、安定性の低下を示した。これらは、それぞれ４℃、４．５℃、２℃、及び３℃低いＴｍを有し、それぞれ４．３℃、４．７℃、１．８℃、及び３．２℃低いＴａｇｇを有した。
【０１７１】
実施例３−モノクローナル及び二重特異性抗ＴＩＭ３及び抗ＰＤ１抗体の等電点改変
重鎖可変領域におけるＫａｂａｔ位置７４、８２ａ及び８４位における等電点を改変するためのアミノ酸置換の有用性を更に調べるために、２つの追加抗体、抗ＴＩＭ３及び抗ＰＤ１抗体の変異体を試験した。ＴＩＭＢ３３７は、ＴＩＭ３に結合するモノクローナル抗体（ＣＤ３６６）であり、ＰＤ１Ｂ２４４は、ＰＤ−１に結合するモノクローナル抗体（ＣＤ２７９）である。ＴＩＭＢ３３７及びＰＤ１Ｂ２４４のｐＩは、７．２６及び７．０６（ＩｇＧ４バージョンについて）であり、したがって、これら２つのホモ二量体とこれら２つを組み合わせて形成される二重特異性との間のｐＩの差は、０．１単位未満である。これは、解像度が０．１．であることが観察されたＣＥＸカラムで反射された。
【０１７２】
７４、８２ａ位及び８４位（Ｋａｂａｔ番号付け）（それぞれ、配列番号２及び配列番号３のアミノ酸位置７５、８４及び８８に対応）でのＴＩＭ３３７及びＰＤ１Ｂ２４４の重鎖可変領域におけるアミノ酸置換を最初に試験して、これらの抗体の等電点（ｐＩ）を低下させる能力を決定した（表５及び６を参照されたい）。これらの置換は、重鎖可変領域をコードする核酸分子の修飾を介して単独で又は組み合わせて導入した。この変異体を、２４ウェルプレート中のＥｘｐｉ２９３細胞を用いて発現させた。
【０１７３】
【表５】
2020522573.tif 000020
【０１７４】
【表６】
2020522573.tif 000021
【０１７５】
ＴＩＭＢ３７７及びＰＤ１Ｂ２４４変異体を２４ウェルプレートで発現させ、精製した。ＣＮＴＯ１４８変異体の特性評価に使用される方法と同じパネルを使用して、ｃＳＤＳ、ＳＥ−ＨＰＬＣ、ｃＩＥＦを含み、ＴＩＭＢ３７７及びＰＤ１Ｂ２４４変異体を分析した。この場合、ｃＩＥＦは、ｐＨ３〜１０及びｐＨ５〜８のアンホライトで行った。安定性は、前のように、Ａｃｔｉｖａ  Ｏｐｔｉｍ２を使用して測定した。抗原結合もＰＯＣ抗体のそれぞれについて測定した。ＥＬＩＳＡを使用してＴＩＭ３結合を測定した。簡潔に述べると、Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ）をストレプトアビジンでコーティングし、次いで、０．４％ＢＳＡのＰＢＳでブロッキングした。次いで、０．４％ＢＳＡのＰＢＳ中１ｕｇ／ｍＬの濃度で、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓのビオチン化ヒトＴＩＭ３−Ｆｃ融合物を結合させた。次いで、変異体の連続希釈物を添加し、結合させた。次に、０．４％ＢＳＡのＰＢＳへの１：５０００希釈でペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトカッパ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を添加した（ＴＩＭ３−Ｆｃ融合物の結合を回避するために抗ＦＣを使用しなかった）。最後に、ＴＭＢ基質（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ）を使用して、検出を行った。
【０１７６】
ＰＤ１に対する電荷変異体の結合を測定するために、Ｐｒｏｔｅｏｎ  ＳＰＲ器具を使用した。このため、ＧＬＣ型センサチップは、全ての６つのチャネル（約５０００ＲＵ）のフローセル上でヤギ抗ヒト／抗マウスＦｃ抗体（酢酸Ｎａ（ｐＨ４．５）中）を共有結合的に固定することによって調製した。次に、抗ＰＤ１  ｍＡｂｓをＰＢＳＴＥで０．００１ｍｇ／ｍＬに希釈し、全ての配位子チャネル（約１８０ＲＵ）にわたって捕捉した。最後に、ヒトＰＤ１抗原（ＰＢＳＴＥの４倍希釈で１００ｎＭ〜０．４ｎＭ）を抗ＰＤ１ｍＡｂ捕捉チャネルの上に注入し、会合／解離プロファイルをそれぞれ４及び３０分間モニターした。０．８５％Ｈ３ＰＯ４を用いて、各滴定サイクルの終了時に再生を行った。データを分析して、捕捉及び結合相互作用を確認した。
【０１７７】
結果
ＴＩＭＢ３７７変異体の分析は、野生型と同様に全ての挙動を示した（表７を参照されたい）。３つのＳ７５Ｄ  Ｎ８４Ｄ及びＡ８８Ｄ変異体全てのｐＩは、８．７のｐＩを有するＷＴと比較して８．５であった。３つの変異体の全ては、少なくともＷＴと同様にＴＩＭ３に結合し（図１５）、それぞれは、ＷＴと非常に類似したＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルをもたらした（図１６Ａ〜１６Ｄ）。加えて、６７．５℃、６８．２℃及び６６．７℃でのＳ７５Ｄ、Ｎ８４Ｄ及びＡ８８Ｄ変異体の凝集の開始は、６８．５℃でのＷＴ開始と同様であった（図１７Ａ〜１７Ｄ）。
【０１７８】
【表７】
2020522573.tif 000022
【０１７９】
ＰＤ１Ｂ２４４単一置換変異体特性評価結果を以下の表８に示す。これらの実験では、野生型抗ＰＤ１は、ＳＥ−ＨＰＬＣにより証明されるように凝集する傾向を示し、これは、置換が凝集に影響を及ぼすかどうかを判定することを困難にした。ＳＥ−ＨＰＬＣによる野生型純度は７８％モノマーであったが、単一の変異体は５１％〜９５％モノマーの範囲であった。ＰＤ−１抗体を特徴付ける、以前の実験は、この抗体の凝集が温度及びｐＨに敏感であり、したがって、モノマーの割合の変動は、試料の処理中の実験条件の違いに起因し得ることを示した。このため、一部の変異体に見られるモノマーの可変割合は、更なる評価からこれらの置換を除外する有効な基準とは見なされず、％モノマーは、ＰＤ−１抗体変異体の最終分析に含まれなかった。しかしながら、更なる研究は、プロセスの最適化を通して、このような凝集を大幅に最小限に抑えることができ、現在記載されている実験を、このような最適化なしにＰＢＳ中で実施したことを示した。
【０１８０】
Ｓ７５Ｄ、Ｓ８４Ｄ及びＳ８８Ｄ変異体のｐＩは、８．９のｐＩを有するＷＴと比較して、８．６、８．６及び８．７であった。３つの変異体は全て、ＷＴと類似したＫＤでヒトＰＤ１に結合した（図１８）。これらはまた、ＷＴと非常に類似したＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルをもたらした。この場合、ＷＴ抗ＰＤ１抗体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルは、推定モノマーピークよりも早く溶出したいくつかのバンドを含んでいた。これらのピークの数及び外観は、電荷置換によって影響を受けなかった（図１９Ａ〜１９Ｄ）。加えて、６６．６℃、６６．１℃及び６６．５℃でのＳ７５Ｄ、Ｓ８４Ｄ及びＳ８８Ｄ変異体の凝集の開始は、６５．７℃でのＷＴ開始と類似していた（図２０Ａ〜２０Ｄ）。モノマー％についての可変ＳＥ−ＨＰＬＣ結果とは別に、他の全てのデータは、試験した３つの単一変異が全てＷＴ様であったことを示す。
【０１８１】
【表８】
2020522573.tif 000023
【０１８２】
実施例４−ＣＮＴＯ１４８複数置換変異体特性評価
Ｓ７５Ｄ、Ｎ８４Ｄ又はＡ８８Ｄからなる４つの複数置換ＣＮＴＯ１４８変異体のｐＩを、以下の表９に示す。ＣＮＴＯ１４８抗体については、置換の２つを組み合わせて、０．２５〜０．３１ｐＨ単位のｐＩの低下をもたらした。３つ全てを組み合わせると、０．４５ｐＨ単位が減少した。
【０１８３】
【表９】
2020522573.tif 000024
【０１８４】
図２１に示されるように、全ての組み合わせ変異体は、野生型ＣＮＴＯ１４８と同様にＴＮＦに結合している。これらはまた、ＷＴと非常に類似したＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルをもたらした（図２２Ａ〜２２Ｅ）。加えて、変異体の立体構造及びコロイド安定性の両方は、ＷＴと類似していた（下記の表１０、図２３Ａ〜２３Ｅ及び図２４Ａ〜２４Ｅ）。変異体（Ｔｍ）の立体配座安定性は、ＷＴの０．５℃以内であり、コロイド安定性（凝集開始）は、ＷＴの０．７℃以内であった。
【０１８５】
【表１０】
2020522573.tif 000025
【０１８６】
好ましい実施形態を本明細書で詳細に描写及び説明するが、本発明の趣旨から逸脱することなく様々な修正、追加、置換などを行うことができ、したがって、これらは以下の特許請求の範囲に定義される本発明の範囲内であると考えられることは、当業者には明らかであろう。
【図１Ａ】
2020522573.tif 000026
【図１Ｂ】
2020522573.tif 000027
【図１Ｃ】
2020522573.tif 000028
【図２Ａ】
2020522573.tif 000029
【図２Ｂ】
2020522573.tif 000030
【図２Ｃ】
2020522573.tif 000031
【図３Ａ】
2020522573.tif 000032
【図３Ｂ】
2020522573.tif 000033
【図４Ａ】
2020522573.tif 000034
【図４Ｂ】
2020522573.tif 000035
【図４Ｃ】
2020522573.tif 000036
【図５Ａ】
2020522573.tif 000037
【図５Ｂ】
2020522573.tif 000038
【図５Ｃ】
2020522573.tif 000039
【図６Ａ】
2020522573.tif 000040
【図６Ｂ】
2020522573.tif 000041
【図７Ａ】
2020522573.tif 000042
【図７Ｂ】
2020522573.tif 000043
【図７Ｃ】
2020522573.tif 000044
【図８Ａ】
2020522573.tif 000045
【図８Ｂ】
2020522573.tif 000046
【図８Ｃ】
2020522573.tif 000047
【図９Ａ】
2020522573.tif 000048
【図９Ｂ】
2020522573.tif 000049
【図１０Ａ】
2020522573.tif 000050
【図１０Ｂ】
2020522573.tif 000051
【図１０Ｃ】
2020522573.tif 000052
【図１１】
2020522573.tif 000053
【図１２Ａ】
2020522573.tif 000054
【図１２Ｂ】
2020522573.tif 000055
【図１２Ｃ】
2020522573.tif 000056
【図１２Ｄ】
2020522573.tif 000057
【図１２Ｅ】
2020522573.tif 000058
【図１２Ｆ】
2020522573.tif 000059
【図１２Ｇ】
2020522573.tif 000060
【図１２Ｈ】
2020522573.tif 000061
【図１２Ｉ】
2020522573.tif 000062
【図１３Ａ】
2020522573.tif 000063
【図１３Ｂ】
2020522573.tif 000064
【図１３Ｃ】
2020522573.tif 000065
【図１３Ｄ】
2020522573.tif 000066
【図１３Ｅ】
2020522573.tif 000067
【図１３Ｆ】
2020522573.tif 000068
【図１３Ｇ】
2020522573.tif 000069
【図１３Ｈ】
2020522573.tif 000070
【図１３Ｉ】
2020522573.tif 000071
【図１４Ａ】
2020522573.tif 000072
【図１４Ｂ】
2020522573.tif 000073
【図１４Ｃ】
2020522573.tif 000074
【図１４Ｄ】
2020522573.tif 000075
【図１４Ｅ】
2020522573.tif 000076
【図１４Ｆ】
2020522573.tif 000077
【図１４Ｇ】
2020522573.tif 000078
【図１４Ｈ】
2020522573.tif 000079
【図１４Ｉ】
2020522573.tif 000080
【図１５】
2020522573.tif 000081
【図１６Ａ】
2020522573.tif 000082
【図１６Ｂ】
2020522573.tif 000083
【図１６Ｃ】
2020522573.tif 000084
【図１６Ｄ】
2020522573.tif 000085
【図１７Ａ】
2020522573.tif 000086
【図１７Ｂ】
2020522573.tif 000087
【図１７Ｃ】
2020522573.tif 000088
【図１７Ｄ】
2020522573.tif 000089
【図１８】
2020522573.tif 000090
【図１９Ａ】
2020522573.tif 000091
【図１９Ｂ】
2020522573.tif 000092
【図１９Ｃ】
2020522573.tif 000093
【図１９Ｄ】
2020522573.tif 000094
【図２０Ａ】
2020522573.tif 000095
【図２０Ｂ】
2020522573.tif 000096
【図２０Ｃ】
2020522573.tif 000097
【図２０Ｄ】
2020522573.tif 000098
【図２１】
2020522573.tif 000099
【図２２Ａ】
2020522573.tif 000100
【図２２Ｂ】
2020522573.tif 000101
【図２２Ｃ】
2020522573.tif 000102
【図２２Ｄ】
2020522573.tif 000103
【図２２Ｅ】
2020522573.tif 000104
【図２３Ａ】
2020522573.tif 000105
【図２３Ｂ】
2020522573.tif 000106
【図２３Ｃ】
2020522573.tif 000107
【図２３Ｄ】
2020522573.tif 000108
【図２３Ｅ】
2020522573.tif 000109
【図２４Ａ】
2020522573.tif 000110
【図２４Ｂ】
2020522573.tif 000111
【図２４Ｃ】
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【図２４Ｄ】
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【図２４Ｅ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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