(57)【要約】  本発明は、バイオマーカーの使用を含む、心臓血管再生に対する応答の予測方法に関する。さらに、本発明は、心臓血管再生に対する応答の予測方法において使用するためのバイオマーカーの組み合わせ、本発明に係る方法を実行するためのコンピュータ装置および本発明の実施に適合された装置に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
心臓血管再生に対する応答の予測方法であって、
（ｉ）被験体のサンプル中の、成長因子、リンパ球アダプタータンパク質、糖タンパク質、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、循環内皮前駆細胞（ＥＰＣ）、循環内皮細胞（ＣＥＣ）、循環血小板、循環単核細胞および亜集団、ならびにＭＮＣ亜集団上の受容体／リガンド発現の群より選択される、バイオマーカーのそれぞれの量を測定すること、
（ii）測定された量をベースライン値および／または参照と比較すること、
（iii）比較結果に基づき、被験体における心臓血管修復への応答が期待されるか、期待されないか、または両価であるかを予測すること
を含む方法。
【請求項２】
予測精度の感度および特異性が約８０％超である請求項１記載の方法。
【請求項３】
成長因子が、好ましくはＶＥＧＦおよび／またはエリスロポエチンから選択され、リンパ球アダプタータンパク質が、好ましくはＳＨ２Ｂ３から選択され、糖タンパク質が、好ましくはビトロネクチンから選択され、および脳性ナトリウム利尿ペプチドが、好ましくはＮＴ−ｐｒｏＢＮＰから選択される請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
方法がさらなるバイオマーカーを使用し、さらなるバイオマーカーが、サイトカイン、インターロイキン、インターフェロン、インスリン様成長因子結合タンパク質、インスリン様成長因子、ケモカインタンパク質および／またはマルチタンパク質Ｅ３ユビキチンリガーゼ複合体の群から選択される請求項１、２または３記載の方法。
【請求項５】
サイトカインが、好ましくはＴＮＦから選択され、インターロイキンが、好ましくはＩＬ−６、ＩＬ−８、および／またはＩＬ−１０から選択され、インターフェロンが、好ましくはヒトインターフェロンガンマ誘導性タンパク質１０から選択され、インスリン様成長因子結合タンパク質が、好ましくはインスリン様成長因子結合タンパク質−２および／またはインスリン様成長因子結合タンパク質−３から選択され、インスリン様成長因子が、好ましくはＩＧＦ２から選択され、ケモカインタンパク質が、好ましくはＳＤＦ−１から選択され、および／またはマルチタンパク質Ｅ３ユビキチンリガーゼ複合体が、好ましくはＳＣＦから選択される請求項４記載の方法。
【請求項６】
方法が、心筋梗塞、脳卒中および末梢虚血性血管疾患を含む心臓血管疾患、心疾患および／または虚血性プレコンディショニングの、幹細胞治療に対する応答の術前予測および／または血管新生応答の誘導および／または組織修復のために使用される請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
サンプルが心疾患および／または動脈硬化症に罹患している被験体から採取される請求項１〜６のいずれか１項に記載の幹細胞治療に対する応答の予測のための方法。
【請求項８】
方法が、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれ以上の時点の比較の結果のプロファイリングを含む請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
予測精度の感度および特異性が９０％超である請求項８記載の方法。
【請求項１０】
方法が、臨床診断パラメータの使用をさらに含む請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
方法が、血管新生応答のプロファイリングのために使用される請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
方法が、診断指標を含む、ＲＮＡおよび／またはｍＲＮＡ配列および／またはマイクロＲＮＡおよび／またはノンコーディングＲＮＡなどの機能的ＲＮＡおよび／またはＳＮＰを分析することをさらに含む請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
方法が、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ配列分析および／またはネットワーク経路分析を用いた薬物動態学および薬理遺伝学データ分析をさらに含む請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
方法が、表現型の分析をさらに含む請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
幹細胞治療が、ＣＤ１３３陽性幹細胞の移植を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
被験体がヒトである、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
サンプルが、血液、血清および／または血漿サンプル、および／または組織生検サンプルおよび／またはＥＰＣなどの循環幹細胞のサンプルである請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
心臓血管再生に対する応答を予測するための方法における使用のための、成長因子、リンパ球アダプタータンパク質、糖タンパク質、循環内皮前駆細胞（ＥＰＣ）、循環内皮細胞（ＣＥＣ）、循環血小板、循環単核細胞（ＭＮＣ）および亜集団、ＭＮＣ亜集団上の受容体／リガンド発現および脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）の群から選択されるバイオマーカーの組み合わせ。
【請求項１９】
成長因子が、好ましくはＶＥＧＦおよび／またはエリスロポエチンから選択され、リンパ球アダプタータンパク質が、好ましくはＳＨ２Ｂ３から選択され、糖タンパク質が、好ましくはビトロネクチンから選択され、および脳性ナトリウム利尿ペプチドが、好ましくはＮＴ−ｐｒｏＢＮＰから選択される、心臓血管再生に対する応答の予測のための方法における使用のための請求項１８記載のバイオマーカーの組み合わせ。
【請求項２０】
前記組み合わせが、サイトカイン、インターロイキン、インターフェロン、インスリン様成長因子結合タンパク質、インスリン様成長因子、ケモカインタンパク質および／またはマルチタンパク質Ｅ３ユビキチンリガーゼ複合体の群から選択される１つまたは複数のバイオマーカーをさらに含む請求項１８または１９記載のバイオマーカーの組み合わせ。
【請求項２１】
サイトカインが、好ましくはＴＮＦから選択され、インターロイキンが、好ましくはＩＬ−６、ＩＬ−８および／またはＩＬ−１０から選択され、インターフェロンが、好ましくはヒトインターフェロンガンマ誘導性タンパク質１０から選択され、インスリン様成長因子結合タンパク質が、好ましくはインスリン様成長因子結合タンパク質２および／またはインスリン様成長因子結合タンパク質３から選択され、インスリン様成長因子が、好ましくは、ＩＧＦ２から選択され、ケモカインタンパク質が、好ましくはＳＤＦ−１から選択され、および／または、マルチタンパク質Ｅ３ユビキチンリガーゼ複合体が、好ましくはＳＣＦから選択される請求項２０記載のバイオマーカーの組み合わせ。
【請求項２２】
方法が、臨床診断データ、および／またはＲＮＡおよび／またはｍＲＮＡおよび／またはマイクロＲＮＡおよび／またはノンコーディングＲＮＡなどの機能的ＲＮＡおよび／またはＳＮＰの分析、および／または薬物動態学的データの分析、および／または表現型の分析をさらに含む、心臓血管再生に対する応答の予測のための方法における使用のための請求項１８〜２１のいずれか１項に記載のバイオマーカーの組み合わせ。
【請求項２３】
方法および／またはバイオマーカーが、幹細胞治療に対する応答の術前予測のために使用され、前記幹細胞治療が、冠状動脈バイパス移植（ＣＡＢＧ）を伴う請求項６または１７記載の方法または請求項１８〜２１のいずれか１項に記載のバイオマーカーの組み合わせ。
【請求項２４】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法を実行するために適合されたキットであって、前記被験体のサンプル中の、請求項１〜５のバイオマーカーの各々の量を測定するための検出試薬を含むキット。
【請求項２５】
プロセッサおよびプロセッサに結合された１つまたは複数の機械学習（ＭＬ）モデルをエンコードするメモリを含むコンピュータ装置であって、前記プログラムは、前記プロセッサに方法を実行させ、前記方法が、
（ｉ）請求項１〜５のいずれか１項に記載のバイオマーカーの測定量をベースライン値および／または参照と比較し、
（ii）比較の結果に基づいて、被験体における心臓血管再生への応答が、予想されるか、予想されないか、または両価であるかどうかを予測する
ことを含む、コンピュータ装置。
【請求項２６】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法を実行するように適合された装置であって、
（ｉ）被験体のサンプル中の、請求項１〜５のいずれか１項に記載のバイオマーカーの各々の量を測定するための分析ユニット、および
（ii）請求項２５記載のコンピュータ装置
を含む装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオマーカーの使用を含む心臓血管再生に対する応答の予測方法に関する。さらに、本発明は、心臓血管再生に対する応答の予測方法における使用のためのバイオマーカーの組み合わせ、本発明の方法を行うためのコンピュータ装置、ならびに本発明の方法を実行するために採用された装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
心臓組織の修復のための再生医療は、ここ１６年における前臨床および臨床開発の最先端である。種々のアプローチのうち、心臓組織中への骨髄性幹細胞の直接的な適用が２００１年の初めての人への適用および最初の有望な臨床試験以来、依然として、最も熱心に行われている臨床開発的治療である（Stamm C, Westphal B, Kleine HD, et al. Lancet. 2003; 361(9351):45-46; Tse HF, Kwong YL, Chan JK, Lo G, Ho CL, Lau CP. Lancet 2003; 361(9351):47-9; Stamm C, Kleine HD, Choi YH, et al. J Thorac Cardiovasc Surg 2007; 133(3):717-25）。しかし、これらの試験において、ＬＶＥＦ（左室駆動率）の臨床関連の改善ならびにノンレスポンシブ患者が、治療群およびプラセボ群の両方において観察することができた（Timothy D H, Lem M, Jay H T, Circulation Research 2016; 119:404-406; Nasseri B A, Ebell W, Dandel M, et al. Eur Heart J. 2014, 35(19):1263-74; Bartunek J, Terzic A, Davison B A et al. Eur Heart J. 2016 Dec 23. pii: ehw543. doi: 10.1093/eurheartj/ehw543）。
【０００３】
このことは、幹細胞適用からは独立した再生機序およびＣＤ３４+内皮前駆細胞（ＥＰＣ）に関連する血管修復の潜在的な抑制因子に対する誘発という問題を提起した（Werner N, Kosiol S, Schiegl T, et al. N Engl J Med. 2005; 353(10):999-1007）。最近発表された仮説に関して、ＣＤ１３３／ＣＤ３４+末梢循環ＥＰＣ細胞の極めて重要な役割が、心臓が再生しないことに関連付けられ得るかもしれないということが留意されるべきである（Taylor DA, Perin EC, Willerson JT, et al. Cell Transplant 2016;25(9):1675-1687; Bhatnagar A, Bolli R, Johnstone BH et al. Am Heart J 2016; 179:142-50; Contreras A, Orozco AF, Resende M, et al. Basic Res Cardiol 2017;112(1):3）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、心臓再生の機序および骨髄性幹細胞により調節された血管新生の役割は依然として未解決のままである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、今回、バイオマーカーの測定を含む心臓血管再生に対する応答の予測方法を明らかにした。本発明は、したがって、本願の請求項１に記載の、バイオマーカーの測定を含む、心臓血管再生に対する応答の予測方法に関する。さらに、本発明は、心臓血管再生に対する応答の予測方法における使用のためのバイオマーカーの組み合わせ、そのような方法を実行するためのコンピュータ装置および本発明の方法を実施するために適合させた装置に関する。
【０００６】
本発明は、したがって、心臓血管再生に対する応答の予測方法であって、
（ｉ）被験体のサンプル中の次のバイオマーカーのそれぞれの量を測定する工程であって、該バイオマーカーは、成長因子、リンパ球アダプタータンパク質、糖タンパク質、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、循環内皮前駆細胞（ＥＰＣ）、循環内皮細胞（ＣＥＣ）、循環血小板、循環単核細胞（ＭＮＣ）および亜集団、およびＭＮＣ亜集団上の受容体／リガンド発現の群より選択される、
（ii）測定された量をベースライン値および／または参照と比較すること、
（iii）比較結果に基づき、被験体における心臓血管修復への応答が期待されるか、期待されないか、またはであるかを予測すること
を含む方法に関する。
【０００７】
好ましくは、本発明の方法は、ｅｘ  ｖｉｖｏ法である。さらに、上記に明示した工程以外の工程を含んでいてもよい。例えば、さらなる工程は、サンプル前処理または本方法により得られる結果のさらなる評価もしくは使用に関してもよい。本方法は、手動で行ってもよく、自動化により支援されてもよい。好ましくは、工程（ｉ）は、全体または部分的に自動化、例えば適切なロボットや感覚設備により支援されてもよい。工程（ii）および／または（iii）は、それぞれの比較および／または予測を実施するデータ処理ユニットにより支援されてもよい。
【０００８】
有益には、本発明の方法を用いることにより、心臓血管再生に対する応答の予測精度は、約８０％超、より好ましくは、約８５％超、さらにより好ましくは、約９０％超に向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】レスポンダーおよびノンレスポンダーの末梢血液中でのSH2B3発現分析を示す図である。
【図２】教師なしＭＬを意味する三次元ｔ分布型確率的近傍埋め込み法（ｔ−ＳＮＥ）の計算を示す図である。
【図３】レスポンダーとノンレスポンダーとを区別するための臨床ならびに臨床および実験室データセットの術前および術後の時点についてＭＬ予測結果（０日〜１８０日）を示す図である。
【図４】ＰＥＲＦＥＣＴ試験のアウトカム結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本明細書において使用される用語「予測すること（predicting）」は、確からしさであって、それに基づいて被験体が、心臓幹細胞治療から恩恵を受ける（該心臓療法後に、本明細書のいずれかで詳細に定義されるように心臓血管系の機能改善がみられる）であろうという確からしさを評価することを意味する。
【００１１】
当該技術分野における当業者によって理解されるであろうように、このような評価は、通常、診断される被験体の１００％について正確であることは意図されない。しかしながら、この用語は、評価が統計的に有意な割合の被験体に対して正確であることを要件としている（例えばコホート研究におけるコホート）。割合が統計的に有意であるかどうかは、当該技術分野における当業者によって困難なしに、例えば信頼区間の決定、ｐ値の決定、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定などの様々な周知の統計評価ツールを用いて決定され得る。詳細は、Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983に見ることができる。好ましい信頼区間は、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％である。ｐ値は、好ましくは０．１、０．０５、０．０１、０．００５、または０．０００１である。
【００１２】
本明細書において使用される用語「心臓血管再生」は、再生および／または心臓血管系に関連した疾患の治療および／または改善を含む。
【００１３】
用語「バイオマーカー」は、その存在、不存在または量が、医学的な状態または素因と相関する分子を意味する。バイオマーカーは、被験体に生じるあらゆる分子および／または細胞またはそれらの亜集団とすることができる。典型的には、バイオマーカーは、タンパク質、ペプチド、小分子または核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、または細胞またはその亜集団である。本発明によれば、その用語は、好ましくはタンパク質およびペプチド、すなわちＶＥＧＦ、ＦＧＦまたはエリスロポエチンなどの成長因子、ＳＨ２Ｂ３などのリンパ球アダプタータンパク質、ビトロネクチンまたはＧＣＳＦなどの糖タンパク質、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰなどの脳性ナトリウム利尿ペプチド、ＴＮＦなどのサイトカイン、ＩＬ−６、ＩＬ−８またはＩＬ−１０などのインターロイキン、ヒトインターフェロンガンマ−誘導性タンパク質１０などのインターフェロン、インスリン様成長因子結合タンパク質２および／またはインスリン様成長因子結合タンパク質３などのインスリン様成長因子結合タンパク質（インスリン様成長因子は好ましくはＩＧＦ２から選択される）、ＳＤＦ−１などのケモカインタンパク質、およびＳＣＦなどのマルチタンパク質Ｅ３ユビキチンリガーゼ複合体を意味する。
【００１４】
さらに、本発明によれば、バイオマーカーは、細胞およびその亜集団、すなわち、例えばＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１８４、ＣＤ１３３および／またはＣＤ１４６などの分化抗原群（ＣＤ）をその表面に有するか、または有しない循環内皮前駆細胞（ＥＰＣ）、ＣＤ３１、ＣＤ１３３、ＣＤ１４６、ＣＤ１０５および／またはＣＤ３４をその表面に有するまたは有しない循環内皮細胞（ＣＥＣ）、循環血小板、循環単核球（ＭＮＣ）および亜集団、およびＣＤ１８４、ＣＤ３０９、細胞接着分子（ＣＡＭ）および／またはインテグリン受容体を有するか、または有さないＭＮＣ亜集団上の受容体／リガンド発現を意味する。
【００１５】
本明細書中で意味されるバイオマーカーの量の測定とは、量または濃度を、好ましくは、半定量的または定量的に、測定することに関連する。測定は、直接的または間接的に行われ得る。直接的な測定は、バイオマーカー自体から得られるシグナルに基づいてバイオマーカーの量または濃度、および、サンプル中に存在するバイオマーカーの分子の数に直接的に相関する強度を測定することに関する。このようなシグナル−本明細書においてしばしば強度シグナルとも称される−は、例えば、バイオマーカーの特定の物理的または化学的特性の強度値を測定することなどによって得られ得る。間接的な測定は、二次成分（すなわち、バイオマーカー自体ではない成分）または生物学的な読み出しシステム、例えば、計測可能な細胞応答、リガンド、ラベル、または酵素反応生成物などから得られるシグナルを測定することを含む。
【００１６】
本発明にしたがって、バイオマーカーの量を測定することは、サンプル中の、ペプチド、タンパク質、低分子、例えばＤＮＡもしくはＲＮＡなどの核酸、または細胞もしくはその亜集団の量を測定するための全ての公知の手段（means）によって達成され得る。該手段（means）は、免疫測定法および様々なサンドイッチアッセイ、競争的アッセイ、また他のアッセイのフォーマット中のラベルされた分子を利用し得る方法を含む。このようなアッセイは、好ましくは、測定されるバイオマーカーを特異的に認識する例えば抗体などの検出試薬に基づいている。検出試薬は、バイオマーカーの存在または非存在を示すシグナルを直接的または間接的のどちらかで生成することができるであろう。さらに、シグナル強度は、好ましくは、サンプル中に存在するバイオマーカーの量に直接的または間接的に（例えば反比例的に）相関し得る。さらなる適切な方法は、例えばその正確な分子量またはＮＭＲスペクトルなどのバイオマーカーに特異的な物理的または化学的特性を測定することを含んでいる。これらの方法は、好ましくは、バイオセンサー、免疫測定法、ＦＡＣＳ分析、バイオチップに連結された光学装置、例えば質量分析器、ＮＭＲ分析器またはクロマトグラフィー装置などの分析装置を含む。さらに、該方法は、マイクロプレートＥＬＩＳＡベースの方法、完全に自動化されたまたはロボティックな免疫測定法、酵素コバルト結合分析、およびラテックス凝集分析を含む。
【００１７】
好ましくは、バイオマーカーの量を測定することは、（ａ）細胞応答を引き出すことのでき、その強度が適切な時間のあいだバイオマーカーの量を示すことができる細胞を該バイオマーカーと接触させる工程、（ｂ）細胞応答を測定する工程を含む。細胞応答を測定するために、サンプルまたは処理されたサンプルが、好ましくは、細胞培養液へと添加され、そして、細胞内応答または細胞外応答が測定される。細胞応答としては、測定可能なレポーター遺伝子の発現、または、例えばペプチド、ポリペプチドまたは低分子などの物質の分泌が挙げられる。その発現または物質は、バイオマーカーの量と相関する強度シグナルを作製するであろう。
【００１８】
また好ましくは、バイオマーカーの量を測定することは、サンプル中の該バイオマーカーから得られ得る特異的なシグナルの強度を測定する工程を含む。上述されるように、このようなシグナルは、質量スペクトルにおいて観察されるバイオマーカーに特異的なｍ／ｚ変数で観察される、またはバイオマーカーに特異的なＮＭＲスペクトルで観察されるシグナル強度であり得る。
【００１９】
本明細書において使用される「量（amount）」との用語は、バイオマーカーの絶対量、バイオマーカーの相対量または濃度、および、それに相関するまたはそれから導かれ得る任意の値またはパラメータを包含する。このような値またはパラメータは、例えば、マススペクトルまたはＮＭＲスペクトルにおける強度値などの、直接的な測定によって該ペプチドから得られる、全ての特異的な物理的または化学的特性由来のシグナル強度値を含む。さらに、本明細書中で特定される、間接的な測定によって得られる全ての値またはパラメータ、例えば、ペプチドに応答して生物学的読み出しシステムから決定される応答レベル、または、特異的に結合したリガンドから得られるシグナル強度などが含まれる。上述の量またはパラメータに相関している値はまた、全ての標準的な数学的操作によって得られ得ること、および、次数なしに、例えば本明細書中で記載される評価システムなどにおいて、使用され得ることが理解されるであろう。
【００２０】
本明細書中で使用される用語「比較すること（comparing）」とは、分析されるサンプルに含まれるバイオマーカーの量を、本明細書中で特定される好適な参照源の量と比較することを包含する。本明細書中で使用される比較は、濃度が基準濃度と比較されるか、または試験サンプルから得られた強度信号が、参照サンプルの同じタイプの強度信号と比較されると同時に、対応するパラメータまたは値の比較、例えば、絶対量が絶対参照量と比較されることを意味することが理解されるべきである。しかしながら、本発明によれば、また、バイオマーカーの測定量に基づいて値を計算することが想定される。かかる値は、心臓幹細胞治療によって、事前に定義されたレスポンダーとノンレスポンダーを含む被験体の集団からの量について行われた多変量判別分析から導出された基準範囲と比較される。さらなる詳細は、以下に添付の実施例に見出すことができる。
【００２１】
本発明の方法において意味される比較は、手動で、またはコンピュータに支援されて実行され得る。コンピュータ支援の比較については、測定された量の値は、コンピュータプログラムによってデータベース内に保管されている適切な参照に対応する値と比較され得る。コンピュータプログラムは、さらに、比較の結果を評価し得る、すなわち、適切な出力フォーマットで所望の評価を自動的に提供し得る。好ましくは、このような評価は、機械学習（ＭＬ）によって行われる。測定値と参照値との比較に基づいて、例えば、心臓幹細胞治療後の心臓の機能改善などの心臓再生に対する応答を予測することが可能である。特には、高い確からしさ（すなわち被験体がレスポンダーであろうこと）または低い確からしさ（すなわち、被験体がノンレスポンダーであろうこと）があるのか、または被験体が両価であるのかを予測することが可能であろう。したがって、参照値は、比較される量のあいだの相違または類似性が、虚血性または非虚血性脳損傷のいずれかを有する急性炎症の症状を示す被験体の群に属するこれらの試験の被験体を同定することを可能とするように選択される。この方法は、（ｉ）虚血性脳損傷または（ii）非虚血性脳損傷を患う被験体として被験体を除く（ルールアウト（rule-out））か、同定する（ルールイン（rule-in））ことを可能にする。
【００２２】
本明細書中で使用される用語「参照（reference）」とは、被験体を、心臓治療から恩恵を受けることが期待され得る被験体の群または恩恵のある心臓治療が期待できない被験体の群のどちらかの群または両価である被験体へと振り分けることを可能にするバイオマーカーの量に基づいた値、閾値または差を意味する。
【００２３】
かかる参照は、これらの群を互いに分ける閾値量とすることができる。２つの群を分ける適切な閾値量は、心臓治療から恩恵を受けると知られている被験体または被験体の群、または前記治療から恩恵を受けないと知られている被験体または被験体の群、または両価であると知られている被験体のいずれかからのバイオマーカーの量に基づいて、本明細書中の他の場所に言及された統計的検定によってさらなる苦もなく計算することができる。
【００２４】
原則として、参照は、標準的な統計的方法を適用することによって、所与のバイオマーカーの平均または平均値に基づいて、上記で特定されるように、被験体のコホートについて計算することができる。特には、事象を診断すること、またはしないことを目的とする方法などの試験の精度は、その受信者動作特性（ＲＯＣ）によって最もよく説明されている（特に、Zweig 1993, Clin. Chem. 39:561-577参照）。したがって、本発明の前述の方法に使用される参照は、上述したような前記コホートのためのＲＯＣを確立し、それから閾値量を導出することによって生成することができる。診断方法に関する所望の感度および特異度に依存し、ＲＯＣプロットは、適切な閾値を導出することを可能にする。
【００２５】
用語「サンプル（sample）」とは、体液のサンプル、および、好ましくは、血液（全血）、血漿または血清のサンプルを意味する、しかしながら、該用語はまた、上述の全血、血漿または血清から、例えば部分精製などによって得られる例えば血液、血漿または血清の画分などの例えば前処理工程などによって得られる全てのサンプルを包含する。
【００２６】
本明細書で使用される用語「被験体（subject）」は、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを指す。被験体は、心臓治療が必要となることがある。好ましくは、心臓治療が必要な被験体は、例えば、心筋梗塞後に、心不全または冠動脈疾患などの心臓疾患を患うか、およびより好ましくは心不全を患う。
【００２７】
本発明の方法に従って作成された予測も、確率が高く、非検体における心臓系の機能改善が生じるかことが期待されるかどうか、または確率が治療の成功が両価であるようなものであるかどうか、または確率が低く、したがって、被験体における心臓系の機能改善が生じないことが期待されるかどうかを評価することを可能とする。
【００２８】
本発明はさらに、心臓血管再生への応答を予測するための方法における使用のための、成長因子、リンパ球アダプタータンパク質、糖タンパク質、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、循環内皮前駆細胞（ＥＰＣ）、循環内皮細胞（ＣＥＣ）、循環血小板、循環単核細胞および亜集団、およびＭＮＣの亜集団上での受容体／リガンド発現の群から選択されたバイオマーカーの組み合わせに関する。
【００２９】
また、本発明は、プロセッサおよびプロセッサに結合された１つ以上の機械学習（ＭＬ）モデルをエンコードするメモリを含むコンピュータ装置に関し、前記プログラムは、プロセッサに方法を実行させ、前記方法は、
（ｉ）本発明に係るバイオマーカーの測定された量をベースライン値および／または参照と比較し、
（ii）比較の結果に基づいて、被験体における心臓血管再生への応答が期待されるか、基体されないか、または両価であるかどうかを予測する
ことを含む。
【００３０】
また、本発明は、本発明の方法を実行するように適合された装置に関し、装置は、
（ｉ）被験体のサンプル中の本発明に係るバイオマーカーの各々の量を測定するための分析ユニット、および
（ii）本発明に係るコンピュータ装置（上述されたような）
を含む。
【００３１】
本明細書で使用する用語「装置（device）」は、本発明の方法に係る診断を可能にするように互いに作動可能に連結された上述の各ユニットを備えるシステムに関する。分析ユニットに用いることができる好ましい検出試薬（detection agent）は、本明細書の他の箇所に開示されている。好ましい検出試薬は、バイオマーカー（複数可）に特異的に結合し、検出可能な複合体を形成する、抗体または他のタンパク質である。分析ユニットは、好ましくは、その量が測定されるべきバイオマーカーを含むサンプルに接触させられる固体支持体上に固定化された形態で検出試薬を含む。また、分析ユニットは、バイオマーカー（複数可）に特異的に結合された検出試薬の量を測定する検出器をさらに含むことができる。測定された量は、評価ユニットに送信することができる。前記評価ユニットは、測定された量と適切な参照との間の比較を行うための実装アルゴリズムを備える、コンピュータ等のデータ処理要素を含む。適切な参照は、本明細書の他の箇所に上記されるように参照量の生成のために使用される被験体のサンプルに由来し得る。結果は、パラメトリック診断生データの出力として、好ましくは、絶対量または相対量として与えられてもよい。これらのデータは、臨床医による解釈を必要とすることが理解されるべきである。しかし、出力が、専門の臨床医による解釈を必要としない処理された診断生データを含むエキスパートシステム装置も想定される。
【００３２】
本発明のさらに好ましい態様は、以下の記載とともに従属クレームから導かれ、それにより、ある種のカテゴリーの特許クレームは異なるカテゴリーの従属クレームによって形成されてもよく、そして、種々の例の特徴は、新しい例と組み合わせてもよい。上記および下記でなされた用語の定義および説明は、本明細書および添付のクレーム中で記載される全ての実施形態に適切に適用されることが理解されるべきである。以下において、本発明の方法の具体的な実施形態がさらに特定される。
【００３３】
有利には、本発明による方法を実施することにより、予測精度の感度および特異性が，約８０％よりも高く、好ましくは約８５％より高く、より好ましくは約９０％より高くなり得る。したがって、本発明の方法は、心臓治療などの高価で煩雑な治療方針の適用に先立つ臨床医の下す決断を改善する。正しい決断を下すこと、すなわち、それが効果的である場合にのみその治療を適用することは、確かに個々の患者のためにも、そして費用結果を考慮すると、公衆衛生システム自体のためにも有益である。
【００３４】
心臓治療の前に該心臓治療を必要とする被験体、例えば心不全を患う被験体から採取されたサンプルにおけるバイオマーカーの組み合わせの量を分析することは、被験体がその治療から、心臓再生または心臓血管修復が治療後に改善されるという恩恵を受けるかどうかを予測することを可能にし、その場合、成長因子が、好ましくは、ＶＥＧＦおよび／またはエリスロポエチンから、および任意にはＦＧＦから選択され、リンパ球アダプタータンパク質が、好ましくはＳＨ２Ｂ３から選択され、糖タンパク質が、好ましくは、ビトロネクチンから、および任意にはＧＣＳＦから選択され、脳性ナトリウム利尿ペプチドが、好ましくはＮＴ−ｐｒｏＢＮＰから選択され、循環内皮前駆細胞（ＥＰＣ）が、好ましくはＣＤ４５+、Ｃ１１７+、ＣＤ１８４+、ＣＤ１３３+、ＣＤ１４６+細胞から選択され、循環内皮細胞（ＣＥＣ）が、好ましくはＣＤ１３３+、ＣＤ１４６+、ＣＤ１０５+、ＣＤ３４+細胞から選択され、循環血小板、循環単核細胞および亜集団、そしてＭＮＣ亜集団上の受容体／リガンド発現が、好ましくはＣＤ１８４+および／またはＣＤ３０９+細胞、細胞接着分子（ＣＡＭ）および／またはインテグリン受容体から選択される。個々のバイオマーカーの量を測定するための技術は全て、当技術分野でよく知られている。
【００３５】
機械学習（ＭＬ）を使用することによって、個々の比較をする必要がないため、方法は、好ましくは、さらに支援される。さらに、有利には、機械学習は、予測の信頼性をさらに向上させることができるように、パラメータのバランスをとり、そして重み付けするのに役立つ。したがって、本発明の有利な方法は、好ましくは、予測精度を容易にし、向上させるために機械学習によって支援される。本発明によれば、用語「機械学習」は、データから学び、データの予測を行うことが可能なアルゴリズムの研究および構築に関し、アルゴリズムは、これによって、サンプル入力からモデルを構築して、データ駆動型の予測や決定を行うことにより、厳密に静的なプログラム命令を克服する。
【００３６】
本発明の方法の好ましい実施形態では、かかる方法は、さらなるバイオマーカーを使用し、そのさらなるバイオマーカーは、好ましくは、サイトカイン、インターロイキン、インターフェロン、インスリン様成長因子結合タンパク質、インスリン様成長因子、ケモカインタンパク質および／またはマルチタンパク質Ｅ３ユビキチンリガーゼ複合体の群から選択される。
【００３７】
かかる方法によれば、サイトカインは、好ましくはＴＮＦから選択され、インターロイキンは、好ましくはＩＬ−６、ＩＬ−８および／またはＩＬ−１０から選択され、インターフェロンは、好ましくはヒトインターフェロンガンマ誘導性タンパク質１０から選択され、インスリン様成長因子結合タンパク質は、好ましくはインスリン様成長因子結合タンパク質−２および／またはインスリン様成長因子結合タンパク質−３から選択され、インスリン様成長因子は、好ましくはＩＧＦ２から選択され、ケモカインタンパク質は、好ましくはＳＤＦ−１から選択され、および／またはマルチタンパク質Ｅ３ユビキチンリガーゼ複合体は、好ましくはＳＣＦから選択される。
【００３８】
別の好ましい実施形態において、本方法は、心筋梗塞、脳卒中および末梢虚血性血管疾患などの心臓血管疾患、心臓疾患および／または虚血性プレコンディショニングという状況下での、幹細胞治療に対する応答、および／または血管新生応答の誘導および／または組織修復の術前予測のために使用される。かかる治療は、心臓血管インプラントまたはステント、心室の補助装置（ＶＡＤ）、ペースメーカーおよび／またはオクルダーまたは適切な閉鎖デバイスを使用する治療を含んでいてもよい。また、かかる治療は、糖尿病、腫瘍疾患、グルテン不耐症、リウマチ性疾患、感染症、敗血症および／または高血圧症の治療を含んでいてもよい。特に、この方法は、左心室心機能の改善、例えば、急性経皮的冠動脈介入（ＰＣＩ）および二次冠動脈バイパス移植（ＣＡＢＧ）血行再建術によって順次処置される急性ＳＴ上昇型心筋梗塞（ＳＴＥＭＩ）および冠動脈３枝病変後の左室駆動率（ＬＶＥＦ）の低下の後の左心室心機能の改善の術前予測のために使用される。
【００３９】
さらに別の好ましい実施形態では、心臓血管疾患の状況下での、心臓再生、特には、幹細胞治療に対する応答および／または血管新生応答の誘導および／または組織修復の予測のための方法は、心臓疾患および／または動脈硬化症に罹患している被験体から採取したサンプルを使用する。かかるサンプルは、特に狭心症、急性心筋損傷、細胞壊死、心筋肥大、心不全、好ましくは虚血性心不全、非虚血性心不全、心筋炎、心房細動、心室細動および／または動脈硬化を患っている被験体から採取してもよい。
【００４０】
好ましい実施形態によれば、方法は、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれより多くの時点での比較の結果のプロファイリング含む。有利には、かかる時点は、術前と、術後約１、３、１０、９０、および／または１８０日に採取したサンプルを含む。少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれより多くの時点でのサンプルを分析することにより、予測精度の特異性は、有益には９０％を超えて、好ましくは９１％、９２％、９３％、９４％、９５％を超え、およびそれより大きく増加させることができる。
【００４１】
有益な方法のさらなる実施形態は、臨床診断パラメータの使用を含む。特に、かかるパラメータは、コロニー形成単位（ＣＦＵ）ヒルアッセイ（Hill assay）、マトリゲルプラグアッセイ（Matrigel Plug assay）、重量および／または左室収縮末期容積（ＬＶＥＳＶ）から選択される。
【００４２】
次の好ましい実施形態によれば、この方法は、血管新生応答のプロファイリングのために使用される。
【００４３】
さらに別の好ましい実施形態は、診断の指標を含む、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡおよび／またはｍＲＮＡ配列および／またはマイクロＲＮＡおよび／またはノンコーディングＲＮＡなどの機能的ＲＮＡおよび／またはＳＮＰの解析をさらに含む、有利な方法を含む。本発明の文脈において、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡおよび／またはＳＮＰのかかる指標解析は、機械学習および／または経路解析によって実行され、および／または支持されてもよい。本発明の文脈において、経路解析は、経路内の関連するＲＮＡおよび／またはＤＮＡおよび／またはＳＮＰを同定するために使用されるか、または興味のあるＲＮＡ、ＤＮＡおよび／またはＳＮＰからデノボで経路を構築するために使用される。
【００４４】
また、さらなる好ましい実施形態によれば、有利な方法は、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ配列分析および／またはネットワーク経路分析を用いる薬物動態学的および薬理遺伝学的データの分析を含み得る。かかる薬物動態学的データは、特には、スタチン、アセチルサリチル酸（ＡＳＳ）、β遮断薬、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、アンジオテンシンII（ＡＴII）受容体拮抗薬、アルドステロン拮抗薬、利尿薬、カルシウム拮抗薬、抗不整脈薬、ジギタリス、マルクマール（Marcumar）、および／または硝酸塩から選択される群からの薬剤を投与された被験体から得られてもよい。
【００４５】
次の好ましい実施形態はさらに、体重の分析などの、被験体の表現型の分析を使用してもよい。
【００４６】
なおさらに好ましい実施形態によれば、心臓血管修復の予測のための方法は、ＣＤ１３３陽性幹細胞の移植を使用する幹細胞治療を含む。かかる幹細胞治療は、心臓再生の誘導に使用されるＣＡＢＧ血管再生および／またはＰＣＩと任意に組み合わせることができる。しかし、特に好ましい実施形態は、心臓幹細胞治療が冠状動脈バイパス移植手術をさらに含むものである。
【００４７】
有利なことに、心臓幹細胞治療後の心臓の再生および／または心臓の機能改善は、少なくとも５％のＬＶＥＦの増加を伴う。
【００４８】
前述の本発明の方法は、ヒト被験体のみに適用することに限定されるものではなく、動物を含んでいてもよい。しかしながら、ヒト被験体に適用する方法が好ましい。本発明によれば、このような被験体のサンプルは、血液、特には末梢血、および／または血清および／または血漿サンプルおよび／または組織生検サンプルおよび／または内皮前駆細胞（ＥＰＣ）などの循環（幹）細胞のサンプルに由来してもよい。
【００４９】
上に示したように、本発明はまた、心臓血管再生に対する応答を予測するための方法における使用のための、成長因子、リンパ球アダプタータンパク質、糖タンパク質、脳性ナトリウム利尿ペプチド、循環内皮前駆細胞、循環内皮細胞、循環血小板、循環単核細胞およびその亜集団、およびＭＮＣ亜集団上の受容体／リガンド発現の群から選択されるバイオマーカーの組み合わせに関する。有利なことに、この方法は、エクソビボ（ex vivo）またはインビトロ（in vitro）の方法である。
【００５０】
好ましくは、バイオマーカーは、心臓血管再生への応答を予測するための方法で使用され、該方法は
（ｉ）被験体のサンプルにおいてバイオマーカーの各々の量を測定し、
（ii）測定された量をベースライン値および／または参照と比較し、
（iii）比較の結果に基づいて、被験体において心臓血管修復への応答が期待されるか、期待されないか、または両価であるかどうかを予測する
ことを含む。
【００５１】
好ましい実施形態によれば、成長因子は、好ましくはＶＥＧＦおよび／またはエリスロポエチンから、および任意にはＦＧＦから選択され、リンパ球アダプタータンパク質は、好ましくはＳＨ２Ｂ３から選択され、糖タンパク質は、好ましくは、ビトロネクチンから、および任意にはＧＣＳＦから選択され、および脳性ナトリウム利尿ペプチドは、好ましくはＮＴ−ｐｒｏＢＮＰから選択される。
【００５２】
加えて、バイオマーカーの組み合わせは、好ましくは、サイトカイン、インターロイキン、インターフェロン、インスリン様成長因子結合タンパク質、ケモカインタンパク質および／またはマルチタンパク質Ｅ３ユビキチンリガーゼ複合体の群から選択されるさらなるバイオマーカーを含む。さらにより好ましくは、サイトカインはＴＮＦから選択され、インターロイキンは、ＩＬ−６、ＩＬ−８および／またはＩＬ−１０から選択され、インターフェロンは、ヒトインターフェロンガンマ誘導性タンパク質１０から選択され、インスリン様成長因子結合タンパク質はインスリン様成長因子結合タンパク質２および／またはインスリン様成長因子結合タンパク質３から選択され、インスリン様成長因子は、好ましくはＩＧＦ２から選択され、ケモカインタンパク質はＳＤＦ−１から選択され、および／または、マルチタンパク質Ｅ３ユビキチンリガーゼ複合体はＳＣＦから選択される。
【００５３】
本発明の好ましい実施形態によれば、上記バイオマーカーの組み合わせは、心臓血管再生に対する応答の予測のための方法で使用され、該方法は、臨床診断データ、および／またはＲＮＡおよび／またはｍＲＮＡ、および／またはマイクロＲＮＡおよび／またはノンコーディングＲＮＡなどの機能的ＲＮＡおよび／またはＳＮＰの分析、および／または薬物動態学的データの分析、および／または例えば体重などの表現型の分析をさらに含む。
【００５４】
さらにより好ましくは、有利な方法および／または上記バイオマーカーの有利な組み合わせは、幹細胞治療に対する応答の術前予測のために使用され、該幹細胞治療はＣＡＢＧを伴う。
【００５５】
本明細書で使用する用語「幹細胞治療」は、治療すべき被験体の心臓への外因性心筋細胞の移植を含むすべての治療アプローチを意味する。かかる心筋細胞は、心筋細胞に非心筋前駆細胞を再プログラム化することによって生成することができる。再プログラム化される細胞は、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、多能心臓前駆細胞、骨格筋芽細胞または骨髄由来幹細胞であってもよい。さらに、成熟心筋細胞はまた、特に、有糸分裂細胞周期へ再度入るように刺激した場合に使用することができる。より好ましくは、本発明に係る心臓幹細胞治療は、ＣＤ１３３陽性細胞、最も好ましくは、ＣＤ１３３陽性骨髄性単核細胞の移植を含む。細胞は、単離された単一細胞として、または組織工学プロセスによって形成された組織ブロックなどの予め形成された構成として移植されてもよい。好ましくは、細胞は、心筋内注入をすることにより、本発明に従って移植される。さらに、心臓幹細胞治療という用語はまた、移植プロセスまたは手術などの他の治療措置を伴う薬物療法などの追加治療手段を包含し得る。好ましくは、本発明による心臓幹細胞治療は、さらに、以下に添付の実施例に記載されるように、冠状動脈バイパス移植手術を含む。
【００５６】
本明細書で使用する用語「心臓の機能改善」は、被験体の治療前と後にＬＶＥＦを比較した場合に観察される心臓のＬＶＥＦの有意な増加を意味する。好ましくは、有意な増加とは、治療後に観察されるＬＶＥＦの５％以上の増加である。５％未満の増加は有意でないと見做される。機能改善を求める他に考慮され得るさらなるパラメータは、ＭＩＢＩ−ＳＰＥＣＴによって定量化されるような、灌流欠損サイズの１０％を超える減少、左心室端収縮期容積（ＬＶＥＳＶ）の１０％を超える減少、および、経胸壁心エコーにより測定されるピーク収縮期速度の１０％を超える増加である。
【００５７】
本明細書で使用される心不全は、左側不全、右側不全または両心室不全などの心臓の任意の機能障害を意味する。典型的には、本明細書において言うところの用語、心不全は、駆動率の低下、例えば有意なＬＶＥＦの低下を生じる左側不全である。心不全のさらなる症状は臨床医によく知られている。本明細書において言うところの心不全は、心不全の急性および慢性型、ならびに重症度の任意の段階、例えば左側不全については、ニューヨーク心臓協会（ＮＹＨＡ）分類システムのＮＹＨＡ  Ｉ〜IVによるすべての段階を包含する。
【００５８】
本明細書で使用する用語「血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）」は、血管新生、脈管形成および血管透過性を刺激する可溶性ポリペプチド成長因子を指す。それは、様々な細胞型によって産生される。５つの異なるＶＥＧＦポリペプチド、ＶＥＧＦ−Ａ、胎盤増殖因子（ＰＧＦ）、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄが存在する。本明細書で使用されるように、好ましくは、ＶＥＧＦ−Ａが想定される。ＶＥＧＦ−Ａに関して知られている選択的スプライシングから生じる様々なアイソフォームが存在する。最も顕著なものはＶＥＧＦ121、ＶＥＧＦ121ｂ、ＶＥＧＦ145、ＶＥＧＦ165、ＶＥＧＦ165ｂ、ＶＥＧＦ189、およびＶＥＧＦ206である。
【００５９】
好ましくは、ＶＥＧＦは、Tischer 1991, J. Biol. Chem. 266(18): 11947-11954（ＶＥＧＦ−Ａに関する最長のアイソフォームが開示されている）に記載されている、ヒトＶＥＧＦ−Ａを意味する。アミノ酸配列については、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ  受入番号ＮＰ＿００１０２０５３７．２，ＧＩ：７６７８１４８０（Ｇｅｎｂａｎｋは、ＮＣＢＩ、米国からwwww.ncbi.nlm.nih.gov/entrezで入手可能である）も参照されたい。この用語はまた、前述のヒトＶＥＧＦポリペプチドの変異体を包含する。かかる変異体は、前述のＶＥＧＦポリペプチドと少なくとも同じ本質的な生物学的および免疫学的特性を有する。特に、それらは、本明細書で言及される同じ特異的アッセイにより、例えば、前記ＶＥＧＦポリペプチドを特異的に認識するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を用いるＥＬＩＳＡアッセイにより検出可能である場合、同じ本質的な生物学的および免疫学的特性を共有する。さらに、本発明において言及される変異体は、少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失および／または付加により異なるアミノ酸配列を有し、その変異体のアミノ酸配列は依然として特定のＶＥＧＦポリペプチド、好ましくはヒトＶＥＧＦの全長にわたるアミノ酸配列と、それぞれ好ましくは少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一であるものとすることが理解されるべきである。２つのアミノ酸配列の同一性の程度は、当該技術分野で周知のアルゴリズムによって決定することができる。好ましくは、同一性の程度は、比較ウインドウに対して２つの最適に整列された配列を比較することによって決定され、ここで、最適なアラインメントのために（付加または欠失を含まない）参照配列と比較して、比較ウインドウ中のアミノ酸配列の断片は、付加または欠失（例えばギャップまたはオーバーハング）を含んでいてもよい。パーセンテージは、同一のアミノ酸残基が両方の配列に存在する位置の数を決定して、一致した位置の数を得て、一致した位置の数を比較のウインドウにおける位置の総数で割り、その結果に１００を乗算することによって配列同一性のパーセンテージを得ることにより計算される。比較のための配列の最適なアラインメントは、Smith 1981, Add. APL. Math. 2:482によって開示された局所相同性アルゴリズムによって、Needleman 1970, J. Mol. Biol. 48:443の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Pearson 1988, Proc. Natl. Acad Sci. (USA) 85:2444の類似性検索法によって、これらのアルゴリズム（GAP, BESTFIT, BLAST, FAST, PASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI）のコンピュータによる実施によって、または目視検査によって行うことができる。２つの配列が比較のために同定されているとすれば、ＧＡＰおよびＢＥＳＴＦＩＴがそれらの最適アライメントと、同一性の程度を決定するために好ましく使用される。好ましくは、ギャップウエイトに対して５．００およびギャップウエイト長さに対して０．３０のデフォルト値が使用される。上記の変異体は、対立遺伝子変異体または任意の他の種の特定のホモログ、パラログ、またはオルソログであってもよい。上記の変異体は、対立遺伝子変異体または任意の他の種の特定のホモログ、パラログ、またはオルソログであってもよい。さらに、本明細書において言及される変異体には、特定のＶＥＧＦポリペプチドまたは前述のタイプの変異体の断片またはサブユニットが、これらの断片が上述の本質的な免疫学的および生物学的特性を有する限り、含まれる。かかる断片は、例えば、ＶＥＧＦポリペプチドの分解産物であってもよい。変異体は、それらが、本明細書で言及される同じ特異的アッセイにより、例えば、前記ＶＥＧＦポリペプチドを特異的に認識するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を用いるＥＬＩＳＡアッセイによって検出可能である場合、それらは、同一の本質的な生物学的および免疫学的特性を共有すると見做される。好ましいアッセイは、添付の実施例に記載されている。さらに、リン酸化またはミリスチル化などの翻訳後修飾に起因して異なる変異体が含まれる。ＶＥＧＦは、結合または遊離形態で、またはサンプル中の総ＶＥＧＦ量として検出されてもよい。
【００６０】
本明細書で使用する用語「線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）」は、血管新生、創傷治癒、胚発生と、種々の内分泌シグナル伝達経路に関与するメンバーを有する、成長因子のファミリーを意味する。
【００６１】
本明細書で使用する用語「エリスロポエチン（ＥＰＯ）」は、サイトカインである可溶性ポリペプチドを意味する。これは、典型的には、低酸素条件下で、腎臓細胞によって産生される。
【００６２】
好ましくは、ＥＰＯは、例えば、Yanagawa 1984, J. Biol. Chem. 259(5): 2707-2710に記載されているようなヒトＩＬ−６を意味する。より好ましくは、ヒトＩＬ−６は、Ｇｅｎｂａｎｋ  受入番号ｐ０１５８８．１，ＧＩ：１１９５２６に示されるアミノ酸配列を有する。この用語はまた、前述のヒトＥＰＯポリペプチドの変異体を包含する。かかる変異体は、前述のＥＰＯポリペプチドと少なくとも同じ本質的な生物学的および免疫学的特性を有する。特に、それらは、本明細書で言及される同じ特異的アッセイにより、例えば、前記ＥＰＯポリペプチドを特異的に認識するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を用いるＥＬＩＳＡアッセイにより検出可能である場合、同じ本質的な生物学的および免疫学的特性を共有する。さらに、本発明において言及される変異体は、少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失および／または付加により異なるアミノ酸配列を有し、その変異体のアミノ酸配列は依然として特定のＩＬ−６のアミノ酸配列と、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一であるものとすることが理解されるべきである。変異体は、対立遺伝子変異体、スプライス変異体または任意の他の種の特定のホモログ、パラログ、またはオルソログであってもよい。さらに、本明細書で言及される変異体には、特定のＥＰＯまたは前述の種類の変異体の断片が、これらの断片が上述の本質的な免疫学的および生物学的特性を有するかぎり、含まれる。かかる断片は、例えば、ＥＰＯの分解産物であってもよい。変異体は、それらが、本明細書で言及される同じ特異的アッセイにより、例えば、前記ＥＰＯポリペプチドを特異的に認識するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を用いるＥＬＩＳＡアッセイによって検出可能である場合、それらは、同一の本質的な生物学的および免疫学的特性を共有すると見做される。好ましいアッセイは、添付の実施例に記載されている。さらに、リン酸化またはミリスチル化などの翻訳後修飾に起因して異なる変異体が含まれる。
【００６３】
本明細書で使用する用語「ＳＨ２Ｂアダプタータンパク質３（ＳＨ２Ｂ３）」は、リンパ球アダプタータンパク質（ＬＮＫ）を意味する。ＳＨ２Ｂ３は、ヒトでは、第１２染色体上のＳＨ２Ｂ３遺伝子によってエンコードされているタンパク質である。それは普遍的に多くの組織および細胞型で発現される（Li Y, He X, Schembri-king J, Jakes S, Hayashi J, May 2000. Journal of Immunology. 164(10):5199-206）。
【００６４】
本明細書で使用する用語「ビトロネクチン（ＶＴＮ）」は、血清、細胞外マトリックスおよび骨に豊富に見出されるヘモペキシンファミリーの糖タンパク質を意味する（Boron, Walter F. and Boulpaep, Emile L. "Medical Physiology". Sanders, 2012, p.1097）。ヒトでは、ビトロネクチンは、ＶＴＮ遺伝子によってエンコードされている。ビトロネクチンは、インテグリンアルファ−Ｖ  ベータ−３に結合し、したがって細胞接着および拡散を促進する。ビトロネクチンはまた、終末細胞溶解性補体経路（terminal cytolytic complement pathway）の膜損傷効果を阻害し、そしていくつかのセルピン（セリンプロテアーゼ阻害剤）に結合する。ビトロネクチンは、分泌タンパク質であり、一本鎖形態、またはジスルフィド結合によって結びつけられた、短縮二本鎖形態のいずれかで存在する。ビトロネクチンは止血および腫瘍の悪性度に関与すると推測されている。
【００６５】
コロニー刺激因子３（ＣＳＦ３）としても知られている用語「顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦまたはＧＣＳＦ）」は、骨髄を刺激して、顆粒球や幹細胞を生成し、血流中にそれらを放出する糖タンパク質である。機能的には、サイトカインおよびホルモン、コロニー刺激因子の一種であり、多くの異なる組織によって生成される。Ｇ−ＣＳＦはまた、好中球前駆体および成熟好中球の生存、増殖、分化、および機能を刺激する。
【００６６】
心室ナトリウム利尿ペプチドまたはナトリウム利尿ペプチドＢとも呼ばれる、用語「脳性ナトリウム利尿ペプチドまたはＢ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）」は、心臓筋肉細胞（心筋細胞）の過度の伸張に応答して、心臓の心室によって分泌される３２アミノ酸ポリペプチドである。ＢＮＰの放出は、カルシウムイオンによって調節される。ＢＮＰは、ヒトにおいては、主に心室で産生されるが、元々ブタ脳の抽出物において同定されたため、そのように命名されている。ＢＮＰは、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰと呼ばれるプロホルモン中の７６アミノ酸Ｎ末端断片に付着されて分泌される。一旦放出されると、ＢＮＰは、心房性ナトリウム利尿因子受容体（ＮＰＲＡ）に結合し、活性化させ、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）と同様の方法で、しかし１０倍低い親和性で、より少ない程度のＮＰＲＢに結合する。ＢＮＰの生物学的半減期は、しかしながら、ＡＮＰの半減期の２倍であり、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの半減期はさらに長く、これらのペプチドを診断血液検査についてＡＮＰよりも良い標的としている。
【００６７】
本明細書で使用する用語「インターロイキン６（ＩＬ−６）」は、炎症誘発性サイトカインおよび抗炎症ミオカインである可溶性ポリペプチドを意味する。ＩＬ−６は、Ｔ細胞およびマクロファージによって産生される。
【００６８】
好ましくは、ＩＬ−６は、例えば、Wong 1988, Behring Inst. Mitt 83: 40-47で説明されているようなヒトＩＬ−６を意味する。より好ましくは、ヒトＩＬ−６は、Ｇｅｎｂａｎｋ  受入番号ｐ０５２３１．１，ＧＩ：１２４３４７に示されるアミノ酸配列を有する。この用語はまた、前述のヒトＩＬ−６ポリペプチドの変異体を包含する。かかる変異体は、前述のＩＬ−６ポリペプチドと少なくとも同じ本質的な生物学的および免疫学的特性を有する。特に、それらは、本明細書で言及される同じ特異的アッセイにより、例えば、前記ＩＬ−６ポリペプチドを特異的に認識するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を用いるＥＬＩＳＡアッセイにより検出可能である場合、同じ本質的な生物学的および免疫学的特性を共有する。さらに、本発明において言及される変異体は、少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失および／または付加により異なるアミノ酸配列を有し、変異体のアミノ酸配列が依然として特定のＩＬ−６のアミノ酸配列と、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一であるものとすることが理解されるべきである。変異体は、対立遺伝子変異体、スプライス変異体または任意の他の種の特定のホモログ、パラログ、またはオルソログであってもよい。さらに、本明細書で言及される変異体には、特定のＩＬ−６または前述の種類の変異体の断片が、これらの断片が上記した本質的な免疫学的および生物学的特性を有するかぎり、含まれる。かかる断片は、例えば、ＩＬ−６の分解産物であってもよい。変異体は、それらは、本明細書で言及される同じ特異的アッセイにより、例えば、前記ＩＬ−６ポリペプチドを特異的に認識するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を用いるＥＬＩＳＡアッセイにより検出可能である場合、同じ本質的な生物学的および免疫学的特性を共有すると見做される。好ましいアッセイは、添付の実施例に記載されている。さらに、リン酸化またはミリスチル化などの翻訳後修飾に起因して異なる変異体が含まれる。
【００６９】
本明細書で用いられる用語「インターフェロンガンマ誘導性タンパク質１０（ＩＰ−１０）」は、ＣＸＣケモカインファミリーに属するサイトカインである可溶性ポリペプチドを意味する。ＩＰ−１０は、単球、内皮細胞および線維芽細胞によって産生される。
【００７０】
好ましくは、ＩＰ−１０は、例えば、Booth 2002, Biochemistry 41(33): 10418-10425に記載されるようなヒトＩＰ−１０を意味する。より好ましくは、ヒトＩＰ−１０は、Ｇｅｎｂａｎｋ  受入番号ｐ０２７７８．２，ＧＩ：２１５４２４５６に示されるアミノ酸配列を有する。この用語はまた、前述のＩＰ−１０ポリペプチドの変異体を包含する。かかる変異体は、前述のＩＰ−１０ポリペプチドと少なくとも同じ本質的な生物学的および免疫学的特性を有する。特に、それらが、本明細書で言及される同じ特異的アッセイにより、例えば、前記ＩＰ−１０ポリペプチドを特異的に認識するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を用いるＥＬＩＳＡアッセイにより検出可能である場合、それらは、同じ本質的な生物学的および免疫学的特性を共有する。さらに、本発明において言及される変異体は、少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失および／または付加により異なるアミノ酸配列を有し、変異体のアミノ酸配列が依然として特定のＩＰ−１０のアミノ酸配列と、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一であるものとすることが理解されるべきである。変異体は、対立遺伝子変異体、スプライス変異体または任意の他の種の特定のホモログ、パラログ、またはオルソログであってもよい。さらに、本明細書で言及された変異体には、特定のＩＰ−１０または前述の種類の変異体の断片が、これらの断片が上記した本質的な免疫学的および生物学的特性を有するかぎり、含まれる。かかる断片は、例えば、ＩＰ−１０の分解産物であってもよい。変異体は、それらが、本明細書で言及される同じ特異的アッセイにより、例えば、前記ＩＰ−１０ポリペプチドを特異的に認識するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を用いるＥＬＩＳＡアッセイによって検出可能である場合、それらは、同一の必須の生物学的および免疫学的特性を共有すると見做される。好ましいアッセイは、添付の実施例に記載されている。さらに、リン酸化またはミリスチル化などの翻訳後修飾に起因して異なる変異体が含まれる。
【００７１】
本明細書で用いられる用語「インスリン様成長因子結合タンパク質３（ＩＧＦＢＰ−３）」は、インスリン様成長因子のファミリーの成長因子である可溶性ポリペプチドを意味する。ＩＧＦＢＰは、様々な細胞によって産生される。
【００７２】
好ましくは、ＩＧＦＢＰ−３は、例えば、Thweatt 1993, DNA Seq 4(1): 43-46に記載されるようなヒトＩＧＦＢＰ−３を意味する。より好ましくは、ヒトＩＬ−６は、Ｇｅｎｂａｎｋ  受入番号ｐ１７９３６．１，ＧＩ：１４６３２７８２７に示されるアミノ酸配列を有する。この用語はまた、前述のヒトＩＧＦＢＰ−３ポリペプチドの変異体を包含する。かかる変異体は、前述のＩＧＦＢＰ−３ポリペプチドと少なくとも同じ本質的な生物学的および免疫学的特性を有する。特に、それらが、本明細書で言及される同じ特異的アッセイにより、例えば、前記ＩＧＦＢＰ−３ポリペプチドを特異的に認識するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を用いるＥＬＩＳＡアッセイにより検出可能である場合、それらは、同じ本質的な生物学的および免疫学的特性を共有する。さらに、本発明において言及される変異体は、少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失および／または付加により異なるアミノ酸配列を有し、変異体のアミノ酸配列が依然として特定のＩＧＦＢＰ−３のアミノ酸配列と、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一であるものとすることが理解されるべきである。変異体は、対立遺伝子変異体、スプライス変異体または任意の他の種の特定のホモログ、パラログ、またはオルソログであってもよい。さらに、本明細書で言及された変異体には、特定のＩＧＦＢＰ−３または前述の種類の変異体の断片は、これらの断片が上述した本質的な免疫学的および生物学的特性を有するかぎり、含まれる。かかる断片は、例えば、ＩＧＦＢＰ−３の分解産物であってもよい。変異体は、それらが、本明細書で言及される同じ特異的アッセイにより、例えば、前記ＩＧＦＢＰ−３ポリペプチドを特異的に認識するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を用いるＥＬＩＳＡアッセイにより検出可能である場合、それらは、同じ本質的な生物学的および免疫学的特性を共有すると見做される。好ましいアッセイは、添付の実施例に記載されている。さらに、リン酸化またはミリスチル化などの翻訳後修飾に起因して異なる変異体が含まれる。
【００７３】
本明細書で使用される用語「インスリン様成長因子（ＩＧＦ２）」は、インスリンに構造的類似性を共有する３つのタンパク質ホルモンの１つを意味する。ＩＦＧ２は、肝臓によって分泌され、血液中を循環すると考えられている。これは、成長調節活性、インスリン様活性および分裂促進活性を有する。成長因子は、完全にではないが主にソマトトロピンに依存する。ＩＧＦ２は、主要な胎児成長因子であると考えられている。
【００７４】
Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン１２（ＣＸＣＬ１２）としても知られている、用語「間質細胞由来因子１（ＳＤＦ１）」は、ヒトでは、第１０染色体上のＣＸＣＬ１２遺伝子によってエンコードされるケモカインタンパク質である。ＳＤＦ１は普遍的に多くの組織および細胞型で発現される。間質細胞由来因子１−アルファと１−ベータは、ケモカインファミリーに属する小型サイトカインであって、そのメンバーは、白血球を活性化し、多くの場合、リポ多糖、ＴＮＦ、またはＩＬ１などの炎症誘発性刺激剤によって誘導される。ケモカインは、２つのジスルフィド結合を形成する４つの保存されたシステインの存在によって特徴付けられる。
【００７５】
用語「ｓｋｐ・カリン・ｆ−ボックス含有複合体（skp, cullin, f-box containing complex）（またはＳＣＦ）」は、プロテアソーム（proteasomal）分解されることとなっているタンパク質のユビキチン化を触媒するマルチタンパク質Ｅ３ユビキチンリガーゼ複合体を意味する。ＳＣＦは、細胞周期に関与するタンパク質のユビキチン化において重要な役割を有し、破壊のために各種の他の細胞タンパク質に印を付ける。
【００７６】
バイオマーカーの量を測定することは、好ましくは、（ａ）バイオマーカーを特異的なリガンドと接触させる工程、（ｂ）（任意で）非結合リガンドを除去する工程、（ｃ）結合したリガンドの量を測定する工程を含んでもよい。結合リガンドは、強度シグナルを生成する。本発明に係る結合は共有結合および非共有結合の両方を含む。本発明によるリガンドは、例えば、ペプチド、ポリペプチド、核酸、または低分子化合物などの、本明細書に記載したペプチドまたはポリペプチドまたはタンパク質または核酸または細胞に結合する任意の化合物であり得る。好ましいリガンドは、抗体、核酸、ペプチドまたはポリペプチド（そのペプチドまたはポリペプチドに対する受容体または結合パートナーなど）およびそのペプチドに対する結合ドメインを含むそれらの断片、および例えば核酸またはペプチドアプタマーなどのアプタマーを含む。かかるリガンドを製造する方法は当該技術分野において周知である。例えば、好適な抗体またはアプタマーの同定および製造はまた、商業的供給業者によって提供される。当業者は、より高い親和性または特異性を有するそのようなリガンドの誘導体を開発する方法に精通している。例えば、ランダム突然変異を核酸、ペプチドまたはポリペプチドに導入することができる。これらの誘導体は、その後、当該技術分野で公知のスクリーニング手順、例えばファージディスプレイに従って、結合について試験することができる。本明細書において言及されるような抗体は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の両方、ならびにそれらの断片、例えば、抗原またはハプテンを結合することができるＦｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）2断片を含む。本発明はまた、一本鎖抗体、および所望の抗原特異性を示す非ヒトドナー抗体のアミノ酸配列がヒトアクセプター抗体の配列と組み合わせられるヒト化ハイブリッド抗体を含む。ドナー配列は、通常少なくともドナーの抗原結合アミノ酸残基を含むであろうが、同様に、ドナー抗体の他の構造的および／または機能的に関連するアミノ酸残基を含んでもよい。かかるハイブリッドは、当該技術分野で周知のいくつかの方法によって製造することができる。好ましくは、リガンドまたは試薬がペプチドまたはポリペプチドに特異的に結合する。本発明に係る特異的結合とは、リガンドまたは試薬が、分析されるサンプル中に存在する別のペプチド、ポリペプチドまたは物質に実質的に結合（「交差反応」）しないことを意味する。好ましくは、特異的に結合したペプチドまたはポリペプチドは、任意の他の関連ペプチドまたはポリペプチドより、少なくとも３倍高い、より好ましくは少なくとも１０倍高い、さらに好ましくは少なくとも５０倍高い親和性で結合すべきである。非特異的結合は、それが、例えば、ウェスタンブロット法（Weatern Blot）でその大きさに応じて、またはサンプル中にその量が相対的により多量に存在することによって、明確に区別されかつ測定され得る場合には、許容され得る。リガンドの結合は、当該技術分野で公知の任意の方法によって測定することができる。好ましくは、この方法は、半定量的または定量的である。バイオマーカーの測定のためのさらなる適切な技術は、以下に記載されている。
【００７７】
第一に、リガンドの結合は、例えばＮＭＲまたは表面プラズモン共鳴によって直接測定することができる。第二に、リガンドが、対象のバイオマーカーの酵素活性の基質としても機能する場合、酵素反応生成物を測定することができる（例えば、プロテアーゼの量は、例えば、ウェスタンブロット法で、切断された基質の量を測定することによって測定することができる）。あるいは、リガンドそれ自体が酵素特性を示してもよく、そしてバイオマーカーにより結合した「リガンド／ペプチドもしくはポリペプチド」複合体またはリガンドは、それぞれ、強度シグナルの発生によって検出を可能にする適切な基質と接触させることができる。酵素反応生成物の測定のために、好ましくは基質の量は飽和している。基質はまた、反応前に検出可能なラベルで標識することができる。好ましくは、サンプルは、適切な時間、基質と接触させられる。適切な時間は、検出可能な、好ましくは測定可能な生成物の量が生成されるのに必要な時間を意味する。生成物の量の測定の代わりに、生成物の所与の（例えば検出可能な）量の出現に必要な時間を測定することができる。第三に、リガンドは、リガンドの検出および測定を可能にするラベルに共有結合または非共有結合させることができる。標識することは、直接的または間接的な方法により行うことができる。直接標識は、リガンドに（共有結合または非共有結合で）直接ラベルを結合することを含む。間接標識は、二次リガンドを一次リガンドに（共有または非共有）結合することを含む。二次リガンドは、一次リガンドに特異的に結合すべきである。該二次リガンドは好適なラベルと結合されてもよく、および／または二次リガンドに結合する三次リガンドの標的（受容体）であってもよい。二次、三次またはさらに高次のリガンドの使用は、しばしばシグナルを増加させるために使用される。適切な二次および高次のリガンドは、抗体、二次抗体、および周知のストレプトアビジン−ビオチン系を含み得る。リガンドまたは基質はまた、当該技術分野で公知のように、１個以上のタグで「タグ付け」することができる。このようなタグは、より高次のリガンドの標的となり得る。適切なタグは、ビオチン、ジゴキシゲニン、Ｈｉｓタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ＦＬＡＧ、ＧＦＰ、ｍｙｃタグ、インフルエンザＡウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）、マルトース結合タンパク質などを含む。ペプチドまたはポリペプチドの場合は、タグはＮ末端および／またはＣ末端であることが好ましい。適当なラベルは、適当な検出方法により検出可能な任意のラベルである。典型的なラベルには、金粒子、ラテックスビーズ、アクリジンエステル、ルミノール、ルテニウム、酵素活性ラベル、放射性ラベル、磁気ラベル（常磁性および超常磁性ラベルを含む「例えば磁気ビーズ」）、および蛍光ラベルが挙げられる。酵素活性ラベルとしては、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、およびそれらの誘導体が挙げられる。検出に適した基質は、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、３，３’−５，５’−テトラメチルベンジジン、ＮＢＴ−ＢＣＩＰ（４−ニトロブルーテトラゾリウムクロリドおよび５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホスフェート）を含む。適切な酵素−基質の組み合わせは、（例えば、感光フィルムまたは好適なカメラシステムを使用して）当該技術分野で公知の方法に従って測定することができる着色反応生成物、蛍光または化学発光をもたらし得る。酵素反応の測定については、上記の基準が同様に適用される。典型的な蛍光ラベルとしては、蛍光タンパク質（ＧＦＰおよびその誘導体など）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、テキサスレッド、フルオレセイン、およびＡｌｅｘａ色素が挙げられる。さらなる蛍光ラベルは、モレキュラープローブス（Molecular Probes）社（オレゴン州）から入手可能である。また、蛍光ラベルとして量子ドットの使用が意図される。典型的な放射性ラベルとしては、35Ｓ、125Ｉ、32Ｐ、33Ｐなどが挙げられる。放射性ラベルは、任意の公知の適切な方法，例えば、感光性フィルムまたは蛍光イメージャーによって検出することができる。
【００７８】
バイオマーカーの量は、また、好ましくは、以下のように：（ａ）上記で特定されたバイオマーカーに対するリガンドを含む固体支持体を、バイオマーカーを含むサンプルと接触させ、および（ｂ）その支持体に結合しているバイオマーカーの量を測定することによって測定されてもよい。好ましくは核酸、ペプチド、ポリペプチド、抗体およびアプタマーからなる群より選択されるリガンドが、固定された形態で固体支持体上に存在することが好ましい。固体支持体を製造するための材料は、当該技術分野で周知であり、とりわけ、市販のカラム材料、ポリスチレンビーズ、ラテックスビーズ、磁気ビーズ、コロイド金属粒子、ガラスおよび／またはシリコンチップおよび表面、ニトロセルロースストリップ、膜、シート、デュラサイト（duracyte）、反応トレーのウェルおよび壁は、プラスチックチューブなどである。リガンドまたは試薬は、多くの異なる担体に結合されてもよい。周知の担体の例としては、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、デキストラン、ナイロン、アミロース、天然および変性セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、およびマグネタイトが挙げられる。担体の性質は、本発明の目的のために可溶性または不溶性のいずれであってもよい。前記リガンドを定着／固定化するための適切な方法は、よく知られており、イオン性相互作用、疎水性相互作用または共有結合相互作用などを含むがこれらに限定されるものではない。
【００７９】
本発明に係る好適な測定方法は、また、ＦＡＣＳ分析、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、サンドイッチ酵素免疫試験、電気化学発光サンドイッチイムノアッセイ（ＥＣＬＩＡ）、解離増強ランタニド蛍光免疫アッセイ（ＤＥＬＦＩＡ）、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）、または固相免疫試験を含む。ゲル電気泳動、二次元ゲル電気泳動、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、ウェスタンブロッティングおよび質量分析（ＭＳ）などの当該技術分野で公知のさらなる方法は、単独で、または上記のような標識化法または他の検出方法と組み合わせて使用することができる。
【００８０】
本発明の方法を実行するために、本発明の方法を実行するために適合されたキットが提供され、本発明のキットは、前記被験体のサンプルにおいて少なくとも１つの上記バイオマーカーの量を測定するための検出試薬を含む。かかるキットは、有利には、本発明の方法および／または本発明に係るバイオマーカーの測定（measurement）および／または決定（determination）の簡単な実行を可能にする。
【００８１】
本明細書で使用する用語「キット」は、前述の構成要素、好ましくは、別途提供されるか、または単一の容器内に提供される構成要素の集合を意味する。キットはまた、本発明の方法を実施するための取扱説明書を含んでいてもよい。これらの取扱説明書は、マニュアルの形態であってもよく、またはコンピュータまたはデータ処理装置に実装された際に本発明の方法において言及される比較を行うことが可能でそれに応じて診断を確立することができるコンピュータプログラムコードによって提供されてもよい。コンピュータプログラムコードは、記憶媒体（例えば、コンパクトディスク、ＵＳＢドライブまたは外付けハードディスク）などのデータ記憶媒体または装置に、または直接コンピュータまたはデータ処理装置に提供されていてもよい。また、キットは、好ましくは、本明細書の他の箇所で詳細に記載されるような参照量の標準を含んでいてもよい。
【００８２】
本発明のさらなる特徴は、クレームおよび図面と組み合わされて実施例から導き出される。単一の特徴は、特別な実施形態において、他の特徴と組み合わされて実行されてもよく、本発明の保護範囲を限定するものではない。本発明による以下の実施例の記載は、以下の図面に関連する。
【００８３】
図１は、レスポンダーおよびノンレスポンダーの末梢血液におけるＳＨ２Ｂ３発現分析を示す。全血サンプルが、冠動脈バイパスグラフト（ＣＡＢＧ）血管再生の前に２１人の患者から採取された。ＳＨ２Ｂ３の相対的な発現（ａ）および対応するΔＣＴ値（ｂ）が２-ΔΔCT法を用いて算出された。全ての値は、平均±ＳＥＭとして表し、ＧＡＰＤＨおよびＰＯＬＲ２Ａに対して正規化された。ｎ＝１３（レスポンダー）、ｎ＝８（ノンレスポンダー）。ΔＣＴ値：ｐ＝０．０７３。
【００８４】
図２は、教師なしＭＬを意味する三次元ｔ分布型確率的近傍埋め込み法（ｔ−ＳＮＥ）の計算を示す。この独立した方法は、所与のパラメータセット、例えば、バイオマーカープロファイルの次元を減少させ、従って、同様に患者を別個の群に分類するために使用される新たに計算された特徴を示す変数ｘ、ｙ、ｚを算出する。モデルは、その後、地理的プロファイルとしてｚ軸を可視化するように多項式（ｎ３）によって適合された。レスポンダー（黒色のドット）およびノンレスポンダー（グレーのドット）患者のための各色は、後に加えられた。分類された群は、黒とグレーの破線によって大まかにまとめられている。結果は、３０００回の繰り返しの後に得られる。レスポンダーとノンレスポンダーとの間の比率の計算は各円に対して示されている。ノンレスポンダー群がより小さなｚ値（ｚ＜２０、比＜４２％）により局在化するようである。レスポンダーは６９％を超える割合を含むライトグレーの領域（ｚ＞２０）内に濃縮される傾向がある。
【００８５】
図３は、レスポンダーとノンレスポンダーとを区別するための臨床ならびに臨床および実験室データセットの術前および術後の時点についてＭＬ予測結果（０日〜１８０日）を示す。グラフは、５つの独立した特徴で選択されたＭＬモデル（特徴選択のためのアダブースト（AdaBoost）および最終予測のためのランダムフォレスト（Random Forest）（ＲＦ））の真の陽性予測率を示す。エラーバーは、１００回の反復の後に得られた構築モデルのそれぞれの精度の標準偏差を示す。１００回のモデルの反復は、一方向ＡＮＯＶＡによる有意差である（ｐ＜０.００１）。
【００８６】
図４にＰＥＲＦＥＣＴ試験のアウトカム結果を示す。骨髄／血液ＣＤ１３３+、ＣＤ３４+、ＣＤ１１７+、ＥＰＣおよび血管形成応答に結び付けられた独特の術前末梢血液パラメータ指標による、ＰＥＲＦＥＣＴ試験における主要評価項目アウトカムレスポンダーの診断識別。
【実施例】
【００８７】
以下の実施例は、単に本発明を説明するものとする。実施例は、一切、その範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【００８８】
実施例１：臨床研究の設計と評価
心筋梗塞や虚血性心筋症後の心不全患者における心臓再生の誘導は、幹細胞治療を含む複数のアプローチを用いて標的にされてきた。これに関し、有効性の欠如と応答予測可能性の欠如は、治療の標準化と成功のための主な障害となってきた。
【００８９】
虚血性心不全かつ駆出率低下（failed ejection fraction）の患者が、幹細胞治療のための適切な候補であり、かつ高い心臓再生の確率をもって幹細胞治療から恩恵を受けることができるかどうかを評価するために臨床試験が行われた。臨床試験は、心臓回復においてレスポンダーとノンレスポンダーとの間で著しい差を示し、それは、末梢血中の血管新生因子の特定指標組成物と関連していた。臨床研究のコンダクタンスは以下に詳述される。
【００９０】
ロストック大学（Rostock University）心臓外科部門において始められた、制御され、前向きな、無作為化された、二重盲検多施設臨床試験（「冠動脈バイパスグラフト手術に加えた骨髄幹細胞の心筋内移植（Intra-myocardial Transplantation of Bone Marrow Stem Cells in Addition to Coronary Artery Bypass Graft Surgery）（ＰＥＲＦＥＣＴ）」）を伴う研究が実施された。試験は、左心室のＬＶＥＦ低下と局所的な運動／運動低下／低灌流領域の存在とを有する、心筋梗塞後の冠動脈疾患を患う患者における心筋内ＣＤ１３３+細胞注入の有効性および安全性を評価した。事前の結果は、いくつかの再生因子と治療（ＣＡＢＧまたはＣＡＢＧプラスＣＤ１３３+幹細胞注入）に対する患者の応答との間の密接な関係を明らかにした。ＭＲＩによって測定されたＬＶＥＦの最小５％の増加が、６〜１２ヶ月のフォローアップで機能改善を示すために選択された。５％を超えてＬＶＥＦを増加させた患者は、レスポンダーとして定義され、５％未満の増加、またはＬＶＥＦの減少は、ノンレスポンダーと定義する。
【００９１】
バイオマーカー
事前特定：明確な造血および内皮ＣＤ１３３+ＥＰＣの亜集団および血管新生能は、インビトロＣＦＵ−ＥＣ、ＣＦＵ−Ｈｉｌｌのおよびインビボマトリゲルプラグアッセイ（Matrigel plug assay）ならびにＥＰＣ（同時染色パネルＣＤ１３３、３４、１１７、１８４、３０９、１０５、４５）および循環内皮細胞（ＣＥＣ）（同時染色のパネル：ＣＤ３１、１４６、３４、４５、１０５、１８４、３０９）のパネル一覧を同時染色することに対して、４レーザーフローサイトメトリー法（ＬＳＲ  ＩＩ、ベクトン  デッキンソン、ハイデルベルク、ドイツ）を使用する共発現解析を施行した骨髄（ＢＭ）および末梢血（ＰＢ）における３９人の患者のコホートにおいて試験した。ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰならびにウイルス分析は、末梢血血清におけるＩｇＧおよび抗原分析により、エプスタイン−バール−ウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）およびパルボウイルスに関して行った。最終的なデータの閉鎖前に事後解析を、血清血管新生因子およびサイトカインについて行った。
事後分析：ＢＭ亜集団分析および末梢血（ＰＢ）におけるＳＨ２Ｂ３  ｍＲＮＡ  ＲＴ−ＰＣＲ：ＢＭ  ＣＤ１３３+およびＰＢＭＮＣサンプルを使用したサイトメトリービーズアレイ（ＣＢＡ）および酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびＲＴ−ＰＣＲにおいて研究されたバイオマーカーの方法と分析。
【００９２】
統計分析
サンプルサイズ計算では、センターによる一次解析の層化は無視された。一次解析に使用された共分散分析（ＡＮＣＯＶＡ）の代わりに、等分散を有する２標本ｔ検定のシナリオが検討された。サンプルサイズは、両側第１種の誤り（type I error）（α）５％、第２種の誤り（type II error）（β）１０％（すなわち、検定力９０％）と仮定して測定された。４〜５％の２つの治療アームの間における術後６ヶ月時でのＬＶＥＦの差のシナリオは、臨床的に適切な差とみなされた。４．５の差および７．５の標準偏差で、群あたり少なくともｎ＝６０の患者が必要とみなされ、そして、さらに１５％のドロップアウト率で、合計少なくとも１４２人の患者がランダム化されるべきであった。サンプルサイズは、市販のプログラムｎＱｕｅｒｙ  Ａｄｖｉｓｏｒ  ５．０、セクション８、表ＭＴＴ０−１（Hofmann WK, de Vos S, Elashoff D, et al., Lancet 2002; 359(9305):481-6）を用いて計算された。計算は、中心および非心ｔ分布を用いて実施され、非心パラメータは、√ｎ  δ／√２であり、δは、効果の大きさ｜μ１−μ２｜／σ（O'Brien R G, Muller K E, Signified power analysis for t-tests through multivariate hypothesis. In L K Edward (Ed.) Applied analysis of variance in behavioral science, 1993, New York, Marcel Dekker）として定義される。
【００９３】
統計分析、最終的なデータセットの計算、および作成は、ケーラー社（Koehler GmbH）の重要な特徴を同定する機械学習によるデータ解析により行われ、包括的な患者データの分類は、教師ありおよび教師なし機械学習（ＭＬ）ＭＬアルゴリズム（Kuhn M, J Statistical Software, 2008; 28(5):1-26）を使用することによって得られた。ベストプラクティスレコメンデーションに続く次元削減のために、低分散でかつ高相関の特徴を除去しながらデータが前処理された。欠測値には標準データ代入の実務において頻繁に使用されるようにゼロを入れた。以下の教師ありアルゴリズムを比較した：アダブースト、サポートベクターマシン（Support Vector Machine）（ＳＶＭ）およびランダムフォレスト（ＲＦ）（Forman G and Cohen I, 2004. “Learning from Little: Comparison of Classifiers Given Little Training” doi: 10.1007/978-3-540-30116-5_17）。小規模臨床データセットは、多くの場合、過学習する傾向がある。ほとんど訓練を与えられていない特徴の比較のための小さなデータセットにおける訓練に適している分類器であって、過学習に向けた精度およびロバスト性にしたがい最も適切なアルゴリズムを選択する分類器が採用された（Saeb AT, Al-Naqeb D. Scientifica (Cairo). 2016; 2016:2079704. doi:10.1155/2016/2079704. Epub 2016 May 30）。教師ありＭＬモデルは、１０倍の交差検証となっていた。特徴選択は、次に特徴の数をさらに２０未満に減らすためにアダブーストおよびＲＦから適用された。教師なし機械学習分類および非線形次元削減のために、ｔ分布型確率的近傍埋め込み法（ｔ−ＳＮＥ）を採用した（Maaten L V D & Hinton G, Visualizing Data using t-SNE. Journal of Machine Learning Research, 2008；9：2579-2605．Doi http://jmlr.org/papers/v9/vandermaaten08a.html）。
【００９４】
結果
安全性解析対象集団（safety set）の患者群（ＳＡＳ）とパー・プロトコル・セット（per-protocol set）の患者群（ＰＰＳ）における患者のベースライン特性の分析は、予め指定されたコホート分析の説明に従った、ＳＡＳ（ｎ＝７７）およびＰＰＳ（ｎ＝５８）プラセボ対ＣＤ１３３+。主要評価項目アウトカムに影響を与える要因を分析するために追加的に事後分析を実施した。このため、患者はレスポンダー（１８０日目でＬＥＶＦの増加＞５％）または、およびノンレスポンダー（１８０日目でＬＥＶＦの増加＜５％）として群分けされた。この事後解析によると、３５／５８（６０．３％）の患者が治療レスポンダーであり、そして２３／５８（３９．７％）でＬＥＶＦが改善しなかった。このレスポンダー／ノンレスポンダー（ＮＲ）比は、プラセボ群５７／４３％（Ｒ／ＮＲ：１７／１３患者（ｐｔ））およびＣＤ１３３+群６４／３６％（Ｒ／ＮＲ：１８／１０ｐｔ．）とそれぞれ同様であった（プラセボ対ＣＤ１３３+：ｐ＝０．３７３）。
【００９５】
有効性アウトカム分析
ＰＰＳ有効性分析群（ｎ＝５８）は、ベースラインＬＶＥＦ  ３３．５％、ＳＤ  ±６．２６％［最小−最大  ２５−４９］、ｎ＝５８でＭＩ後のポンプ機能低下（安静時ＭＲＩで測定）によって特徴付けられた。予め指定された主要評価項目：治療後６ヶ月の左心室機能は、＋９．６％±ＳＤ１１．３％［最小−最大  １３−４２］、ｐ＜０．００１（ｎ＝５８）のＬＶＥＦのかなりの増加を示した。ＣＡＢＧの血管再生による左心室機能の早い改善および遅い心筋逆リモデリングを判別するために、退院時の追加の中間ＭＲＩ分析が、サブ群の患者（ｎ＝２９）で利用可能であった。これにより、主に＋６．５％，ＳＤ  ±７．９２％［最小−最大  １１−２３］、ｐ＝０．００７（ｎ＝２９）のΔＬＶＥＦの遅い（１０〜１８０日）増加が明らかとなった。主要評価項目のＡＮＣＯＶＡ分析において、プラセボ群では、１８０日でベースラインＬＶＥＦが３３．５％から４２．３％に改善し（ΔＬＶＥＦ  ＋８．８％、ＳＥ  ±２．１７％［ＣＩ  ３８．０、４６．６］、ｐ＜０．００１；ｎ＝３０）、そしてＣＤ１３３+群のＬＶＥＦは、３３．５％から４３．９％に上昇した（ΔＬＶＥＦ  ＋１０．４％、ＳＥ  ±２．３３％［ＣＩ  ３９．０、４８．５］、ｐ＜０．００１；ｎ＝２８）。＋２．５８±ＳＥ  ３．１３％［ＣＩ  -３．７−８．９］、ｐ＝０．４１４でのＣＤ１３３+対プラセボの治療群差は、ＡＮＣＯＶＡ分析において統計的に有意ではなかった。ＣＤ１３３+幹細胞群は、プラセボコントロール群（１０〜１８０日  ΔＬＶＥＦ）＋４．３％、ＳＤ  ±８．８％［最小−最大  １１−２３］、ｐ＝０．０７７（ｎ＝１５）に対して、主に＋８．８％，ＳＤ  ±６．３８％［最小−最大  ４−１０］，ｐ＝０．００１（ｎ＝１４）の遅い相（１０〜１８０日  ΔＬＶＥＦ）においてΔＬＶＥＦの改善を示した。
【００９６】
レスポンダー（Ｒ）／ノンレスポンダー（ＮＲ）
事後主要評価項目の解析において、治療レスポンダーは、１８０日での対ベースラインΔＬＶＥＦが５％より高いものとして定義された。５８人の患者のコホートにおける３５人のレスポンダーの広がりという結果は、１８０ｄ／０での＋１７．１％；ＳＥ  ±２．０８％［ＣＩ  １２．９．；２１．３］、Ｒ対ＮＲ、ｐ＜０．０００１（１８０ｄ／０）、ｎ＝５８のＡＮＣＯＢＡにおけるΔＬＥＶＦの全体的な増加によって特徴付けられた。ＬＶＥＦの増加はＣＤ１３３+（＋１９．１％）対プラセボ（＋１３．９％）、ｐ＝０．０９９、ｎ＝３５（データは示さず）であった。対照的に、ノンレスポンダーは、１８０ｄ／０でのΔＬＶＥＦを０％、ＳＥ  ±５．７３％［ＣＩ  ２２．３；４４．８］ｐ＝０．２８７だけ示した（プラセボ／ＮＲ  ＋３．３％，ＣＤ１３３+／ＮＲ  −２．４％）。
【００９７】
事後二次評価項目：レスポンダーは、ノンレスポンダーと比較してＬＶ−体積（dimension）（ＬＶＥＤＶ  ｐ＝０．００８、ＬＶＥＳＶ  ｐ＝０．０００１）の有意な減少およびＮＴ−ｐｒｏ−ＢＮＰの減少、ｐ＝０．０００２を示した。これは６ＭＷＴ（ｐ＝０．８１１）の同様の改善によっては反映されなかった。心筋内の組織の回復が、瘢痕サイズＲ対ＮＲ  −８．１９ｇ  ＳＥ  ±３．５ｇ、ｐ＝０．０２３８の改善としてレスポンダーに見られた。ＣＤ１３３+処理されたＮＲも、瘢痕サイズ（ＣＤ１３３+ＮＲ  Δ瘢痕サイズ１８０ｄ／０：−１３．９ｇ、ＳＤ  ±２０．９ｇ  プラセボＮＲ  ＋１１．９、ＳＤ  ±１６．７ｇ、ｐ＝０．００８、ｎ＝２０）および非生存組織（non-viable tissue）（Δ非生存組織  １８０ｄ／０：ＣＤ１３３+ＮＲ  −１２．４ｇ、ＳＤ  ±１９．３ｇ対プラセボＮＲ  ＋１１．５ｇ、ＳＤ  ±１２．０ｇ、ｐ＝０．００４，ｎ＝１９）の減少を表示した（データは示さず）。この傾向は、レスポンダー：瘢痕サイズ（ＣＤ１３３+ＮＲ対プラセボＮＲ  −１．９，ＳＤ±１６．０ｇ  対プラセボ＋２．５，ＳＤ±１３．２ｇ，ｐ＝０．３９８，ｎ＝３３）および非生存組織（ＣＤ１３３+ＮＲ対プラセボＮＲ  −１．４、ＳＤ  ±１６．７ｇ  対プラセボ  ＋１．８、ＳＤ  ±１２．３ｇ、ｐ＝０．５４４、ｎ＝３２）では観察されなかった。長期生存：中期生存率は７６．９±３．３２カ月（Ｒ）対＋７２．３±５．０ヶ月（ＮＲ）、ＨＲ  ０．３［ＣＩ  ０．０７〜１．２］；ｐ＝０．０６７であった。
【００９８】
末梢血中の循環ＥＰＣ（ＣＤ１３３+／ＣＤ３４+／ＣＤ１１７+）は、治療前のＮＲ対Ｒにおいて２倍低減することが見出された。ＣＤ３４+ＭＮＣ亜集団では術前の血中レベルは、（Ｒ）：ＣＤ３４+  ０．０７２％、ＳＤ  ±０．０５％対（ＮＲ）０．０３９％、ＳＤ  ±０．０１７、Ｒ対ＮＲ  ｐ＝０．０２７であった。同様の差が、ＣＤ１３３+、ＣＤ１３３+およびＣＤ１１７+亜集団について術前に見られた（手術前  Ｒ対ＮＲ：ＣＤ１３３+  ０．０４８％、ＳＤ  ±０．０３１％対０．０２１％、ＳＤ  ±０．０１１％、ｐ＝０．００５；  ＣＤ１３３+ＣＤ１１７+  ０．０１９％、ＳＤ  ±０．０１６％対０．００７％、ＳＤ  ±０．００８％、ｐ＝０．０２４、ｎ＝２３）（表１参照）。この差は、プラセボとＣＤ１３３+との比較では見つからなかった（プラセボ対ＣＤ１３３+群：ＣＤ３４+  ｐ＝０．９７５；ＣＤ１３３+  ｐ＝０．９９５；ＣＤ１３３+ＣＤ１１７+  ｐ＝０．８９２；ｎ＝２４）（表１）。対照的に、ＣＤ１４６+ＣＥＣは、ノンレスポンダー対レスポンダーにおいてより高い術前レベルを示した（ｐ＝０．０５３）（表１）。
【００９９】
術後、ＮＲにおけるＥＰＣの減少は、術後のＥＰＯレベルの増加（ＮＲ術前：１６．９Ｕ／ｍｌ、ＳＤ  ±１４．１Ｕ／ｍｌ；、ＮＲ１０日目：４２．１Ｕ／ｍｌ、ＳＤ  ±２３．９Ｕ／ｍｌ；ｐ＝０．００６  術前／１０日目）およびＩＰ１０／ＣＸＣＬ１０の減少（ＮＲ術前：１５７．６ｐｇ／ｍｌ、ＳＤ  ±９４．５ｐｇ／ｍｌ；ＮＲ１０日目：９５．８ｐｇ／ｍｌ、ＳＤ  ±８５．２ｐｇ／ｍｌ；ｐ＝０．０１  術前／１０日目）にもかかわらず、退院まで有意なままであった：末梢血ＣＤ３４+（ＮＲ対Ｒ  ｐ＝０．２６  術前および１０日目）およびＣＤ１３３+ＣＤ１１７+（ＮＲ対Ｒ  ｐ＝０．０２４  術前および１０日目）。
【０１００】
治療レスポンダーは、ＶＥＧＦ（Ｐ＝０．０５６  Ｒ／ＮＲ）、ＥＰＯ（ｐ＝０．０２３  Ｒ／ＮＲ）、ＣＸＣＬ１０／ＩＰ１０（ｐ＝０．０７６  Ｒ／ＮＲ）などの血管新生促進因子の低い血清レベル、ＩＧＦＢＰ−３（ｐ＝０．０８９  Ｒ／ＮＲ）の高いレベル（表１）、ならびに治療介入後１０日目におけるＶＥＧＦの強い誘導（＋２６．６ｐｇ／ｍｌ、ｐ＝０．０１５  術前／１０日目）対ノンレスポンダー（＋１．２ｐｇ／ｍｌ、ｐ＝０．９１３  術前／１０日目）によって手術前に特徴付けられた（表１）。単離された骨髄ＣＤ１３３+細胞は、その血管新生能のために、ＣＦＵ−ＥＣによるインビトロでの、およびＭａｔｒｉｇｅｌ  ｐｌｕｇによるインビボでの検査で全て陽性であった（データは示さず）。
【０１０１】
血小板計数は、治療前、ＮＲにおいて術前に減少した（２０８×１０９／Ｌ、ＳＤ  ±５１．２  １０９／Ｌ［ＣＩ  ７３−３１１］、ｎ＝２３）対Ｒ（２５７×１０９／Ｌ、ＳＤ  ±８１．５  １０９／Ｌ［ＣＩ  １２３−６２０］、ｎ＝３５）（ＮＲ対Ｒ：ｐ＝０．００４、ｎ＝５８）。減少したＰＢ血小板およびＣＤ１３３+ＣＤ３４+ＥＰＣ計数を見出したことにより骨髄性幹細胞の抑制を疑い、直ちに凍結された血液サンプル中のＥＰＣおよび巨核球について造血幹細胞応答の抑制に関連付けられているＬＮＫアダプタータンパク質ＳＨ２Ｂ３をコードするＳＨ２Ｂ３  ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ遺伝子発現解析をテストした。２１人の患者の最初の分析は、ノンレスポンダーの末梢血中のｍＲＮＡ発現の増加傾向が明らかとなった（ｐ＝０．０７３）（表１、図１参照）。
【０１０２】
表１：血中の血管新生に関連するバイオマーカーの分析。レスポンダー対ノンレスポンダーおよびプラセボ対ＣＤ１３３+群が、術前（評価Ｉ）と術後１０日目（放出）との間の末梢血サンプルのバイオマーカーの変化について分析された。データは完全な分析（パー・プロトコル臨床データセットおよびバイオマーカー）を有する患者群（コホート）に由来する。このコホートでは、すべてのサンプルは、保管や輸送によるサンプルの任意の変化を避けるために直ちに処理された。データは平均値±標準偏差、時点０および１０日の間のＰ値、レスポンダー／ノンレスポンダー間のＰA値、各時点での幹細胞／コントロール（ＰＢ−末梢血、ＥＰＯ−エリスロポエチン）として表される。
【０１０３】
【表１】
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【０１０４】
Ｒ／ＮＲための診断応答指標を同定するために、我々は、心臓幹細胞治療とＣＡＢＧ手術後の機能改善を予測するためのツールとして、機械学習法を使用した。最初の分析は、特に小さな集団で過剰適合を除外するために行われた。次いで、ＰＥＲＦＥＣＴ臨床データベースからの盲検患者データを、教師なしＭＬによって調査し、近接した同様の患者をクラスタ化することができ、明確な群を明らかにした。基礎となるセグメンテーションを調べ、２つの異なる群に患者特性を分類するために、すべての時点でファーストライン教師ありＭＬ分析が行われた。計算は、独立して、＞５％の事前選択基準を確認する１８０日目のΔＬＶＥＦによって患者特性を割り当てた（表２、図２参照）。
【０１０５】
そして、機械学習アルゴリズムは、応答指標に対する決定的なパラメータを調査するために使用された。このため、基礎となるＰＥＲＦＥＣＴ臨床データセットとバイオマーカー研究室測定が、ＣＡＢＧ術前後のレスポンダーとノンレスポンダーについてのパラメータプロファイルの分類特異性を検証するために組み合わせ、分析された。特に、我々は特徴的な主要評価項目および二次的評価項目のパラメータだけでなく、血小板や白血球数も使用した。臨床パラメータ（ｎ＝１６０）分類のみの使用では、レスポンダーの特異性は、６３．３５％の平均精度（１８０日）を想定する結果となった（表２）。しかし、術前臨床データ（ｎ＝４９）とバイオマーカー実験室パラメータ（ｎ＝１４２）の組み合わせは、すでに術前に別の想定最大精度、８１．６４±ＳＥ０．５１％［ＣＩ  ８０．６５−８２．６５（ｎ＝３１）（表２）を有する末梢血における血管新生／ＥＰＣ／ＣＥＣ関連パラメータのより高い感度を示した。興味深いことに、１７／２０の関連パラメータは、血管新生パラメータ、骨髄ＥＰＣ／ＣＥＣ応答、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、および末梢血におけるＳＨ２Ｂ３遺伝子発現に関連していた（表２）。臨床およびバイオマーカーの両パラメータを使用した、レスポンダーの術前予測精度は、７９．３５％±ＳＥ  ０．２４％［ＣＩ  ７８．８７−７９．８４］（ｎ＝３１）であり、ノンレスポンダーについては８３．９５％±ＳＥ  ０．９３％［ＣＩ  ８２．１０−８５．８０］（ｎ＝３１）であった。１０日目の術後評価（ｎ＝３８２）は、８２．１２％±ＳＥ  ０．２８％［ＣＩ  ８１．５６−８２．６７］（ｎ＝３１）（Ｒ）および８５．８９％±ＳＥ  ０．６７％［ＣＩ  ８４．５６−８７．２２］（ｎ＝３１）（ＮＲ）の予測精度を示し、一方、０〜１８０日の組み合わされた臨床およびバイオマーカー分析（ｎ＝５２２）は、９４．７７％±ＳＥ  ０．４３％［ＣＩ  ９３．９２−９５．６３］（ｎ＝３１）（Ｒ）および９２．４４％±ＳＥ  ０．６０％［ＣＩ  ９１．２４  −９３．６４］（ｎ＝３１）（ＮＲ）の予測精度を可能にした（図３参照）。
【０１０６】
我々の機械学習手法に基づく特徴選択は、応答の欠如と心臓再生の誘導に関する決定的な因子の同定につながり、治療前の診断的Ｒ／ＮＲ選択および治療中のモニタリングのために使用することができる。末梢血における実験室診断のためのコア因子は、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、ＶＥＧＦ、エリスロポエチン、ビトロネクチン、循環ＥＰＣ／ＣＥＣ／血小板、ＳＨ２Ｂ３  ｍＲＮＡ発現、ＣＦＵ−Ｈｉｌｌアッセイ／末梢血のためのマトリゲルプラグ、ならびに体重（weight）およびＬＶＥＳＶ指数であった。我々は、繰り返し交差検証を用いたレスポンダーおよびノンレスポンダーの選択に関し、同定された因子と算出されたそれらの診断用途の統計学的相関を見出した（参照：図４）。
【０１０７】
実験室バイオマーカーサブセットは、ＭＬにより臨床試験の特定の特徴と一緒に選択された。計算的に選択された特徴およびバイオマーカーは、以下の表２に示される。予測の精度は８０％超と決定した。
【０１０８】
表２：レスポンダーとノンレスポンダーの診断識別のために機械学習が選択したパラメータ。
【０１０９】
【表２】
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【０１１０】
例示的に本明細書に適切に記載された発明は、本明細書に具体的に開示されている／いない任意の要素または複数の要素、限定または複数の限定の非存在下で実施することができる。したがって、例えば、本明細書中の各場合において、用語「含む（comprising）」、「から本質的になる（consisting essentially of）」と 「からなる（consisting of）」のいずれも、他の２つの用語のいずれかと置き換えることができる。使用されてきた用語および表現は、説明および非限定の用語として使用され、そして示されそして記載された特徴の任意の等価物またはその一部を排除するような用語および表現の使用の意図はないが、本発明の範囲内で種々の改変が可能であることが認識される。したがって、本発明は、特に好ましい実施形態および任意の特徴により開示されているが、本明細書に開示された概念の修正および変形が当業者によって講ぜられてもよく、そのような修正および変形が、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内にあると考えられることが理解されるべきである。
【０１１１】
本明細書で引用した全ての参考文献は、それらの全開示内容のすべておよび特に本明細書に記載された開示内容を参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０１１２】
略語
ＡＥ＝有害事象
ＡＥＳＩ＝特別に関心のある有害事象
ＡＨＡ＝アメリカ心臓協会
ＡＮＣＯＶＡ＝共分散の分析
ＢＭ＝骨髄
ＢＭＳＣ＝骨髄幹細胞
ＣＡＢＧ＝冠動脈バイパス移植
ＣＡＰ−ＥＰＣ＝濃縮周囲分子−内皮前駆細胞
ＣＢＡ＝サイトメトリービーズアレイ
ＣＣＳ＝カナダ心臓血管学会
ＣＣＴＲＮ＝心臓血管細胞療法研究ネットワーク
ＣＤ＝分化抗原群
ＣＥＣ＝循環内皮細胞、ＣＥＣパネル、ＰＢ中で測定されるＣＤ
ＣＦＵ＝コロニー形成単位
ＣＩ＝信頼区間
ＣＭＶ＝サイトメガロウイルス
ＥＡ＝早期抗原
ＥＢＮＡ１＝ＥＢＶ−核抗原
ＥＢＶ＝エプスタインバービールス
ＥＣ＝内皮細胞
ＥＣＧ＝心エコー
ＥＬＩＳＡ＝酵素結合免疫吸着アッセイ
ＥＰＣ＝内皮前駆細胞、ＥＰＣパネル、ＰＢ中で測定されるＣＤ
ＥＰＯ＝エリスロポエチン
ＧＭＰ＝適性製造基準
ＨＲ＝ハザード比
ＨＩＦ＝低酸素誘導因子、転写因子
ＩＣＨ  ＧＣＰ＝三者ガイドライン  良い臨床慣行のためのガイドライン
ＩＧＦ−１＝インスリン様成長因子１
ＩＧＦＢＰ２／３＝インスリン様成長因子−結合タンパク質２／３
ＩＨＧ＝ＩＳＨＡＧＥガイドラインに従って行われる分析
ＩＬ＝インターロイキン
ＩＰ−１０＝Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン１０（ＣＸＣＬ１０）としても知られている、インターフェロンガンマ誘導性タンパク質１０
ＬＭＣＡ＝左主冠状動脈
ＬＶＥＤＶ＝左室拡張終末期容積
ＬＶＥＦ＝左室駆動率
ＬＶＥＳＤ＝左室収縮終末期径
ＭＡＣＥ＝主要な有害な心臓血管事象
ＭＬ＝機械学習
ＭＮＣ＝単核細胞
ＭＲＩ＝核磁気共鳴画像法
６ＭＷＴ＝６分歩行テスト
ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ＝Ｂ−型脳性ナトリウム利尿ペプチド
ＰＢ＝末梢血
ＰＢＭＮＣ＝末梢血から単離された単核細胞
ＰＣＩ＝経皮的冠動脈介入
ＰＥＩ＝ポール・エーリッヒ研究所
ＰＰＳ＝パー・プロトコル・セットの患者群
ＳＡＥ＝重大有害事象
ＳＡＳ＝安全性解析対象集団の患者群
ＳＤＦ−１＝間質細胞由来因子1
ＳＨ２Ｂ３＝重要なアダプタ機能を有するＳＨ２含有タンパク質に属する
ＳＣＦ＝幹細胞因子
ＳＴＥＭＩ＝ＳＴセグメント上昇心筋梗塞
ＳＵＳＡＲ＝予期せぬ重篤な副作用の疑い
ＴＮＦ＝腫瘍壊死因子
ｔ−ＳＮＥ＝ｔ分布型確率的近傍埋め込み法
ＶＣＡ＝ビールス−カプシド−抗原
ＶＥＧＦ＝血管内皮増殖因子
ＶＥＧＦ  ｒｅｃ＝血管内皮増殖因子受容体
ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ＝血管内皮増殖因子受容体２／キナーゼ挿入ドメイン受容体
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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