(57)【要約】  例えばＣＡＲ−Ｔ細胞枯渇を減少させることによってＣＡＲ−Ｔ細胞機能を増強するＣＤ２８の細胞質ドメインの変異型を有する共刺激シグナル伝達領域を含む、癌を標的化し、殺傷するために養子細胞移入と共に使用することができるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドを本明細書に開示する。これらのＣＡＲを発現するように操作された、例えば、Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの免疫エフェクター細胞もまた開示される。従って、開示されたＣＡＲを発現するように操作された開示された免疫エフェクター細胞の養子移入を含む、腫瘍関連抗原発現癌を有する対象において抗腫瘍免疫を提供する方法も開示される。
2020530269.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、および共刺激シグナル伝達領域を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドであって、前記共刺激シグナル伝達領域が、ＣＡＲ−Ｔ細胞融合を増強するＣＤ２８の細胞質ドメインの変異型を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチド。
【請求項２】
前記共刺激シグナル伝達領域が、ＹＭＮＭサブドメインを欠くか、または前記ＹＭＮＭサブドメインにヌル変異を有するＣＤ２８の細胞質ドメインを含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記共刺激シグナル伝達領域が、ＰＲＲＰサブドメインを欠くか、または前記ＰＲＲＰサブドメインにヌル変異を有するＣＤ２８の細胞質ドメインを含む、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記共刺激シグナル伝達領域が、ＰＹＡＰサブドメインを欠くか、または前記ＰＹＡＰサブドメインにヌル変異を有するＣＤ２８の細胞質ドメインを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記ＣＡＲポリペプチドが式：
ＳＰ−ＴＡＡ−ＨＧ−ＴＭ−ＣＳＲ−ＩＳＤ；または
ＳＰ−ＴＡＡ−ＨＧ−ＴＭ−ＩＳＤ−ＣＳＲ
（式中、「ＳＰ」は、シグナルペプチドを表し、
「ＴＡＡ」は、腫瘍関連抗原結合領域を表し、
「ＨＧ」は、任意選択のヒンジドメインを表し、
「ＴＭ」は、膜貫通ドメインを表し、
「ＣＳＲ」は、前記共刺激シグナル伝達領域を表し、
「ＩＳＤ」は、細胞内シグナル伝達ドメインを表し、
「−」は、二価リンカーを表す）
によって定義される、請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記細胞内シグナル伝達ドメインがＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）シグナル伝達ドメインを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記ＣＤ２８の細胞質ドメインの前記変異型がＣＡＲ−Ｔ細胞枯渇を減少させる、請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の組換えポリペプチドをコードする単離された核酸配列。
【請求項９】
請求項８に記載の単離された核酸配列を含むベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載のベクターを含む細胞。
【請求項１１】
前記細胞が、αβＴ細胞、γδＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、Ｂ細胞、先天性リンパ系細胞（ＩＬＣ）、サイトカイン誘導キラー（ＣＩＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞、調節性Ｔ細胞、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１０に記載の細胞。
【請求項１２】
前記ＣＡＲの抗原結合ドメインがＴＡＡに結合する場合、細胞が抗腫瘍免疫を示す、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１３】
ＴＡＡ発現癌を有する対象において抗腫瘍免疫を提供する方法であって、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＣＡＲポリペプチドを発現するように遺伝子改変された有効量の免疫エフェクター細胞を前記対象に投与し、それによって哺乳動物において抗腫瘍免疫を提供することを含む方法。
【請求項１４】
前記免疫エフェクター細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、および調節性Ｔ細胞からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
チェックポイント阻害剤を前記対象に投与することをさらに含む、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年７月７日に出願された米国仮特許出願第６２／５２９，９１９号の利益を主張し、該出願の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、２０１８年７月７日に作成された「３２０８０３−２１６０  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５」という名称のＡＳＣＩＩ．ｔｘｔファイルとして電子形式で出願された配列表を含む。この配列表の内容は、その全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
手術、放射線療法、および化学療法は、白血病、固形腫瘍、および転移を含む癌の治療のための標準的な受け入れられたアプローチである。癌を縮小または根絶するために身体の免疫系を直接的または間接的に使用する免疫療法（生物学的療法、生物療法、または生物学的応答調節療法と呼ばれることもある）が、従来の癌治療の補助として長年研究されてきた。ヒト免疫系は、癌治療のための未開拓の資源であり、免疫系の成分が適切に利用されると、有効な治療が開発され得ると考えられる。
【０００４】
抗癌Ｔ細胞治療の主な進歩は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のシグナル伝達ドメインに融合した抗体に由来する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である（Ｄａｖｉｌａ，Ｍ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１２．１（９）：１５７７−１５８３）。第１世代ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＣＤ３ζのみを含むが、第２世代ＣＡＲは、ＣＤ２８または４１ＢＢなどの共刺激ドメインも含む。これらの第２世代ＣＡＲドメインは、マウスにおける非常に有効な腫瘍死滅を支持し、患者におけるＣＡＲ  Ｔ細胞治療の臨床評価を導いた。ＣＤ１９標的ＣＡＲ  Ｔ細胞の可能性は、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）の患者について９０％の完全寛解率の報告によって確認された（Ｄａｖｉｌａ，Ｍ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ，２０１４．６（２２４）：２２４ｒａ２５；Ｍａｕｄｅ，Ｓ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，２０１４．３７１（１６）：１５０７−１７）。しかしながら、貧弱なＣＡＲ  Ｔ細胞持続性および過剰なＴ細胞活性化は、それぞれ、再発および重篤な毒性に寄与し、ＣＡＲ  Ｔ細胞生物学を理解する重要な必要性を示唆する（Ｇａｎｇａｄｈａｒ，Ｔ．Ｃ．ａｎｄ  Ｒ．Ｈ．Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ，２０１４．１１（２）：９１−９）。さらに、再発および毒性は、全ての第二世代ＣＡＲで見られ、ＣＡＲへの共刺激ドメインの追加が生物学的合併症を犠牲にして、効力を改善したことを示唆する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本明細書中に開示されるように、ＣＤ２８共刺激ドメインを有するＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＭ細胞において低レベルの緊張性シグナル伝達および枯渇表現型を生じやすく、特定のＣＤ２８サブドメインを変異させることは、ＣＡＲシグナル伝達またはサイトカイン産生を排除しない。従って、第２世代ＣＡＲ  Ｔ細胞機能の改良は、ＣＤ２８共刺激を調節することによって達成され得る。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本明細書に開示されるのは、癌を標的化し、殺傷するために養子細胞移入と共に使用され得るキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドである。開示されるＣＡＲは、ＣＡＲ−Ｔ細胞機能を増強するＣＤ２８の細胞質ドメインの変異型を含む共刺激シグナル伝達領域を含む。いくつかの実施形態において、変異型は、ＣＡＲ−Ｔ細胞枯渇を減少させる。ＣＤ２８ドメインは、ＴＣＲ刺激後のシグナル伝達経路を調節する３つの細胞内サブドメイン（ＹＭＮＭ（配列番号１）、ＰＲＲＰ（配列番号２）、およびＰＹＡＰ（配列番号３））を含む。いくつかの実施形態において、開示されるＣＡＲは、ＣＡＲ−Ｔ細胞機能を増強する、例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞枯渇を減少させる、これらのサブドメインの１つ以上の変異または欠失を含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲポリペプチドは、ＣＡＲ  Ｔ細胞機能を増強するＣＤ３ゼータおよび／または４１ＢＢにおける１つ以上の欠失または変異をさらに含む。
【０００７】
他のＣＡＲと同様に、開示されるＣＡＲポリペプチドは、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を発現する癌細胞に結合し得る薬剤のようなリガンド結合ドメインを外部ドメインに含む。開示されるポリペプチドはまた、免疫エフェクター細胞を活性化し得る膜貫通ドメインおよびエンドドメインを含み得る。例えば、エンドドメインは、細胞内シグナル伝達ドメイン、および任意選択で１つ以上の共刺激シグナル伝達領域を含み得る。
【０００８】
リガンド結合ドメイン、例えば抗ＴＡＡ結合剤は、いくつかの実施形態では、ＴＡＡに特異的に結合する抗体断片である。例えば、抗原結合ドメインは、ＴＡＡに特異的に結合する抗体のＦａｂまたは単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であり得る。抗ＴＡＡ結合剤は、いくつかの実施形態では、ＴＡＡに特異的に結合するアプタマーである。例えば、抗ＴＡＡ結合剤は、ＴＡＡに結合するその能力に基づいてランダム配列プールから選択されるペプチドアプタマーであり得る。抗ＴＡＡ結合剤はまた、ＴＡＡの天然リガンド、またはＴＡＡに結合することができるその改変体および／もしくは断片であり得る。
【０００９】
いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）シグナル伝達ドメインである。いくつかの場合では、共刺激シグナル伝達領域は、１つ以上の細胞内シグナル伝達分子の１、２、３、または４つの細胞質ドメインを含む。
【００１０】
開示されるＣＡＲポリペプチドをコードする単離された核酸配列、これらの単離された核酸を含むベクター、およびこれらのベクターを含む細胞もまた開示される。例えば、細胞は、アルファ−ベータＴ細胞、ガンマ−デルタＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、Ｂ細胞、先天性リンパ系細胞（ＩＬＣ）、サイトカイン誘導キラー（ＣＩＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞、および調節性Ｔ細胞からなる群から選択される免疫エフェクター細胞であり得る。
【００１１】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲの抗原結合ドメインが腫瘍上のＴＡＡに結合する場合、細胞は抗腫瘍免疫を示す。
【００１２】
変異ＣＤ２８共刺激ドメインを含む開示されたＴＡＡ特異的ＣＡＲで遺伝子改変された有効量の免疫エフェクター細胞を対象に投与することを含む、ＴＡＡ発現癌を有する対象における抗腫瘍免疫を提供する方法も開示される。
【００１３】
本発明の１以上の実施形態の詳細は、添付の図面および以下の記載に示される。本発明の他の特徴、目的、および利点は、これらの記載および図面ならびに特許請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、抗マウスＣＤ１９  ＣＡＲ構築物の概略図である。レトロウイルス構築物は、ＣＤ８ヒンジ（Ｈ）および膜貫通ドメイン（ＴＭ）、続いてＣＤ２８（ｍ１９２８ｚ）または４１ＢＢ（ｍ１９−ｍｕｓＢＢｚ）およびＣＤ３ζまたはＣＤ３ζ単独（ｍ１９ｚ）を有する抗ｍＣＤ１９  ｓｃＦｖ（ＶＨ／ＶＬ）を含む。陰性対照ＣＡＲは、シグナル伝達ドメインを含まない（ｍ１９Δｚ）。Ｇ／Ｓは、グリシンセリンリンカーである。ＣＡＲは、蛍光タンパク質レポーター（ＧＦＰまたはチェリー）にタグ付けされる。ＬＴＲは、長末端反復ＳＤは、スプライスドナーであり、ＳＡは、スプライスアクセプターであり、ｙは、パッケージングシグナルである。
【図２Ａ】図２Ａは、Ｎｕｒ７７ＧＦＰ由来ＣＡＲ  Ｔ細胞におけるＣＡＲシグナル伝達を支持するＣＤ２８サブドメイン変異の概略図である。ＹＭＮＭ（配列番号１）、ＰＲＲＰ（配列番号２）、およびＰＹＡＰ（配列番号３）配列がＡＡＡ（配列番号４）で置換されて示されている。
【図２Ｂ】図２Ｂは、３Ｔ３−ｍＣＤ１９で刺激されたＮｕｒ７７ＧＦＰ（パーセントＧＦＰ＋）ＣＤ１９標的ＣＡＲ  Ｔ細胞を示す棒グラフである。Ｎｕｒ７７ＧＦＰ刺激の２４時間後に、フローサイトメトリーによって評価した。
【図３Ａ】図３Ａおよび図３Ｂは、マウスＣＤ１９（３Ｔ３−ｍＣＤ１９）を発現する３Ｔ３細胞でＣＤ２８サブドメイン変異体ＣＤ１９標的ＣＡＲ  Ｔ細胞を刺激した後のＩＦＮ−γ（図３Ａ）およびＩＬ−２（図３Ｂ）分泌を示す棒グラフである。
【図３Ｂ】同上。
【図３Ｃ】図３Ｃおよび図３Ｄは、フローサイトメトリーによって評価されたＣＭおよびＥＭサブセットを示す棒グラフである。
【図３Ｄ】同上。
【図４】図４は、ＣＤ２８変異ＣＡＲ  Ｔ細胞および非変異ＣＡＲ  Ｔ細胞の生存率を示すプロットである。ＣＡＲ  Ｔ細胞を野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスから産生し、細胞生存率を自動細胞カウンター（ＢＩＯ−ＲＡＤ）でのトリパンブルー染色によって測定した。
【図５】図５は、ＣＤ２８変異体ＣＡＲ  Ｔ細胞および非変異体ＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖を示すプロットである。ＣＡＲ  Ｔ細胞を、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスから産生し、増殖を、初期細胞数から５日目の最終細胞収率への倍数変化によって評価した。
【図６−１】図６Ａ〜図６Ｄは、変異および非変異ＣＡＲ  Ｔ細胞によって産生されたＩＦＮ−γ（図６Ａ）、ＩＬ−６（図６Ｂ）、ＩＬ−１２（図６Ｃ）、およびＴＮＦ−α（図６Ｄ）を示す棒グラフである。ＣＡＲ  Ｔ細胞を３Ｔ３−ｍＣＤ１９細胞で１０：１の比で活性化した。２４時間後、上清を回収し、サイトカインをＬｕｍｉｎｅｘキットによって測定した。
【図６−２】同上。
【図７Ａ】図７Ａおよび図７Ｂは、３Ｔ３−ｍＣＤ１９標的細胞と１０：１または１：６の比で共培養された、ＣＤ２８変異および非変異ＣＡＲ  Ｔ細胞による標的細胞殺傷を示すグラフである。標的細胞の死滅をＲＴＣＡによって監視した。
【図７Ｂ】同上。
【図８−１】図８Ａ〜図８Ｈは、インビボでのＢ細胞死滅（図８Ａ、８Ｃ、８Ｅ、８Ｇ）およびＣＡＲ  Ｔ細胞数（図８Ｂ、８Ｄ、８Ｆ、８Ｈ）を示すプロットである。１ｘ１０６ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＣＤ３＋  ＣＡＲ＋）を、サイトキサン（３００ｍｇ／ｋｇ）前処理野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに静脈注射した。１週目（図８Ａ、８Ｂ）、２週目（図８Ｃ、８Ｄ）、４週目（図８Ｅ、８Ｆ）、および６週目（図８Ｇ、８Ｈ）に、マウスから採血し、Ｂ細胞およびＣＡＲ  Ｔ細胞数をフローサイトメトリーによって分析した。
【図８−２】同上。
【図８−３】同上。
【図８−４】同上。
【図９−１】図９Ａ〜図９Ｄは、骨髄（図９Ａおよび９Ｂ）および脾臓（図９Ｃおよび９Ｄ）におけるＢ細胞死滅（図９Ａおよび９Ｃ）およびＣＡＲ  Ｔ細胞数（図９Ｂおよび９Ｄ）を示すプロットである。１ｘ１０６  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＣＤ３＋  ＣＡＲ＋）をサイトキサン（３００ｍｇ／ｋｇ）前処理野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに静脈注射した。８週目に、骨髄（ＢＭ）および脾臓を回収し、Ｂ細胞およびＣＡＲ  Ｔ細胞数をフローサイトメトリーによって分析した。
【図９−２】同上。
【図１０】図１０は、ＣＡＲ  Ｔ細胞で処理した後のＥｕ−ＡＬＬ腫瘍を有するマウスの生存を示すグラフである。Ｅｕ−ＡＬＬ細胞を野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに注射して６日後にサイトキサン（３００ｍｇ／ｋｇ）をｉ．ｐ．注射し、１日後に３ｘ１０５のＣＡＲ  Ｔ細胞を静脈注射した。
【図１１】図１１Ａおよび図１１Ｂは、ＣＤ２８変異および非変異ＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖（図１１Ａ）および生存率（図１１Ｂ）を示すプロットである。ＣＡＲ  Ｔ細胞を正常ドナーＰＢＭＣから産生し、細胞生存率を自動細胞カウンター（ＢＩＯ−ＲＡＤ）でのトリパンブルー染色によって測定した。増殖を、初期細胞数から５日目の最終細胞収率への倍数変化によって評価した。
【図１２】図１２は、インビトロでのヒトＣＡＲ  Ｔ細胞増殖を示すグラフである。１ｘ１０５ヒトＣＡＲ  Ｔ細胞を、５日目に１０：１の比で３Ｔ３‐ｈＣＤ１９細胞と共培養し、細胞数を１０日間測定した。
【図１３】図１３は、ヒトｍｕｔ０６  ＣＡＲ  Ｔ細胞の死滅および非変異ＣＡＲ  Ｔ細胞を示すグラフである。ＣＡＲ  Ｔ細胞を３Ｔ３−ｈＣＤ１９標的細胞と５：１の比で共培養した。標的細胞の死滅をＲＴＣＡによって監視した。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
ＣＡＲ−Ｔ細胞枯渇を減少させるＣＤ２８の細胞質ドメインの変異型を含む癌上の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を特異的に認識することができるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を本明細書に開示する。これらのＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）もまた開示される。従って、開示されたＣＡＲを発現するように操作された開示された免疫エフェクター細胞の養子移入を含むＴＡＡ発現癌を有する対象において抗腫瘍免疫を提供するための方法も開示される。
【００１６】
変異ＣＤ２８ドメインを有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
ＣＡＲは、一般に、リンパ球活性化に関与する膜貫通シグナル伝達モチーフを有するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）由来の抗原認識ドメインを組み込む（Ｓａｄｅｌａｉｎ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００３  ３：３５-４５）。癌に対する抗腫瘍活性を増強するために免疫エフェクター細胞中で発現させることができるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が本明細書に開示される。
【００１７】
開示されるＣＡＲは、一般に、３つのドメイン：外部ドメイン、膜貫通ドメイン、およびエンドドメインから構成される。外部ドメインは、ＴＡＡ結合領域を含み、抗原認識に関与する。外部ドメインはまた、ＣＡＲがグリコシル化され、免疫エフェクター細胞の細胞膜に固定され得るように、シグナルペプチド（ＳＰ）を任意選択で含む。膜貫通ドメイン（ＴＤ）は、その名前が示唆するように、細胞によって発現される場合、外部ドメインをエンドドメインに連結し、細胞膜内に存在する。エンドドメインは、抗原認識後に活性化シグナルを免疫エフェクター細胞に伝達するＣＡＲのビジネスエンドである。例えば、エンドドメインは、細胞内シグナル伝達ドメイン（ＩＳＤ）および共刺激シグナル伝達領域（ＣＳＲ）を含むことができる。
【００１８】
開示されるＣＡＲは、ＣＡＲ−Ｔ細胞枯渇を減少させるＣＤ２８の変異型を含むＣＳＲを有する。ＣＤ２８ドメインは、ＴＣＲ刺激後のシグナル伝達経路を調節する３つの細胞内サブドメイン（ＹＭＮＭ（配列番号１）、ＰＲＲＰ（配列番号２）、およびＰＹＡＰ（配列番号３））を含む。いくつかの実施形態において、開示されるＣＡＲは、これらのサブドメインの１つ以上の変異または欠失を含む。
【００１９】
いくつかの実施形態では、開示されるＣＡＲは、以下の式によって定義される：
ＳＰ−ＴＡＡ−ＨＧ−ＴＭ−ＣＳＲ−ＩＳＤ；
式中、「ＳＰ」は、任意選択のシグナルペプチドを表し、
「ＴＡＡ」は、ＴＡＡ結合領域を表し、
「ＨＧ」は、任意選択のヒンジドメインを表し、
「ＴＭ」は、膜貫通ドメインを表し、
「ＣＳＲ」は、共刺激シグナル伝達領域を表し、
「ＩＳＤ」は、細胞内シグナル伝達ドメインを表し、
「−」は、ペプチド結合またはリンカーを表す。
【００２０】
さらなるＣＡＲ構築物は、例えば、Ｆｒｅｓｎａｋ  ＡＤ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ：  ｔｈｅ  ｐｒｏｍｉｓｅ  ａｎｄ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ．２０１６  Ａｕｇ  ２３；１６（９）：５６６−８１（これは、これらのＣＡＲモデルの教示のために、その全体が参照により組み込まれる。）に記載されている。
【００２１】
例えば、ＣＡＲは、ＴＲＵＣＫ、ユニバーサルＣＡＲ、自己駆動ＣＡＲ、武装化（Ａｒｍｏｒｅｄ）ＣＡＲ、自己破壊ＣＡＲ、条件付きＣＡＲ、マーキングされたＣＡＲ、ＴｅｎＣＡＲ、二重ＣＡＲ、またはｓＣＡＲであり得る。
【００２２】
ＴＲＵＣＫ（ユニバーサルサイトカイン殺傷のために再指向されるＴ細胞）は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および抗腫瘍サイトカインを共発現する。サイトカイン発現は、構成的であり得るか、またはＴ細胞活性化によって誘導され得る。ＣＡＲ特異性によって標的化されると、炎症誘発性サイトカインの局所的産生は、腫瘍部位に内因性免疫細胞を動員し、抗腫瘍応答を増強し得る。
【００２３】
ユニバーサル同種ＣＡＲ  Ｔ細胞は、もはや内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）および／または主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子を発現しないように操作され、それによって、それぞれ、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）または拒絶を予防する。
【００２４】
自己駆動ＣＡＲは、腫瘍リガンドに結合するＣＡＲおよびケモカイン受容体を共発現し、それによって腫瘍ホーミングを増強する。
【００２５】
免疫抑制に耐性であるように操作されたＣＡＲ  Ｔ細胞（武装化ＣＡＲ）は、免疫チェックポイントスイッチ受容体を用いて、もはや種々の免疫チェックポイント分子（例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）またはプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１））を発現しないように遺伝子改変され得るか、または免疫チェックポイントシグナル伝達を遮断するモノクローナル抗体と共に投与され得る。
【００２６】
自己破壊ＣＡＲは、ＣＡＲをコードするためにエレクトロポレーションによって送達されるＲＮＡを使用して設計され得る。あるいは、Ｔ細胞の誘導性アポトーシスが遺伝子改変リンパ球におけるチミジンキナーゼへのガンシクロビル結合、または小分子ダイメライザーによるヒトカスパーゼ９の活性化のより最近記載された系に基づいて達成され得る。
【００２７】
条件付きＣＡＲ  Ｔ細胞は、デフォルトでは、回路を完成させるための小分子の添加まで応答しないか、または「オフ」に切り換えられ、シグナル１およびシグナル２の両方の完全な形質導入を可能にし、それによってＣＡＲ  Ｔ細胞を活性化する。あるいは、Ｔ細胞が標的抗原に指向される続いて投与される二次抗体に対する親和性を有するアダプター特異的受容体を発現するように操作され得る。
【００２８】
マーキングされたＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＡＲと、既存のモノクローナル抗体剤が結合する腫瘍エピトープと、を発現する。耐えられない有害作用の設定において、モノクローナル抗体の投与は、ＣＡＲ  Ｔ細胞を除去し、さらなるオフ腫瘍効果を伴わずに症状を軽減する。
【００２９】
タンデムＣＡＲ（ＴａｎＣＡＲ）Ｔ細胞は、細胞内共刺激ドメインおよびＣＤ３ζドメインに融合された異なる親和性を有する２つの連結された単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）からなる単一のＣＡＲを発現する。ＴａｎＣＡＲ  Ｔ細胞活性化は、標的細胞が両方の標的を共発現する場合にのみ達成される。
【００３０】
二重ＣＡＲ  Ｔ細胞は、異なるリガンド結合標的を有する２つの別々のＣＡＲを発現する；一方のＣＡＲは、ＣＤ３ζドメインのみを含み、他方のＣＡＲは、共刺激ドメインのみを含む。二重ＣＡＲ  Ｔ細胞活性化は、腫瘍上の両方の標的の共発現を必要とする。
【００３１】
安全性ＣＡＲ（ｓＣＡＲ）は、細胞内阻害ドメインに融合された細胞外ｓｃＦｖからなる。標準ＣＡＲを共発現するｓＣＡＲ  Ｔ細胞は、標準ＣＡＲ標的を有するがｓＣＡＲ標的を欠く標的細胞に遭遇する場合にのみ活性化される。
【００３２】
開示されるＣＡＲの抗原認識ドメインは、通常、ｓｃＦｖである。しかしながら、多くの代替物が存在する。天然Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファおよびベータ単鎖からの抗原認識ドメインは、単純な外部ドメイン（例えば、ＨＩＶ感染細胞を認識するためのＣＤ４外部ドメイン）および連結サイトカイン（これは、サイトカイン受容体を有する細胞の認識を導く）のような、よりエキゾチックな認識成分を有するように記載されている。実際、所与の標的に高い親和性で結合するほとんど全てのものを、抗原認識領域として使用することができる。
【００３３】
エンドドメインは、抗原認識後に免疫エフェクター細胞にシグナルを伝達し、免疫エフェクター細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも１つを活性化するＣＡＲのビジネスエンドである。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、サイトカインの分泌を含む細胞溶解活性またはヘルパー活性であり得る。従って、エンドドメインは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の「細胞内シグナル伝達ドメイン」および任意選択の共受容体を含み得る。通常、細胞内シグナル伝達ドメイン全体を使用することができるが、多くの場合、鎖全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切断部分が使用される限り、このような切断部分は、エフェクター機能シグナルを伝達する限り、無傷鎖の代わりに使用され得る。
【００３４】
刺激様式で作用するＴＣＲ複合体の一次活性化を調節する細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）として知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。細胞質シグナル伝達配列を含むＩＴＡＭの例には、ＣＤ８、ＣＤ３ζ、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ε、ＣＤ３２（ＦｃガンマＲＩＩａ）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＦｃγＲＩγ、ＦｃγＲＩＩＩγ、ＦｃεＲＩβ（ＦＣＥＲＩＢ）、およびＦｃεＲＩγ（ＦＣＥＲＩＧ）に由来するものが含まれる。
【００３５】
特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）（ＴＣＲゼータ、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｎｏ．ＢＡＧ３６６６４．１）に由来する。Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）鎖（Ｔ細胞受容体Ｔ３ゼータ鎖またはＣＤ２４７（分化クラスター２４７）としても知られる）は、ヒトにおいてＣＤ２４７遺伝子によってコードされるタンパク質である。
【００３６】
第一世代ＣＡＲは、典型的には、内因性ＴＣＲからのシグナルの主要な伝達物質であるＣＤ３ζ鎖からの細胞内ドメインを有していた。第２世代ＣＡＲは、種々の共刺激タンパク質受容体（例えば、ＣＤ２８、４１ＢＢ、ＩＣＯＳ）由来の細胞内シグナル伝達ドメインをＣＡＲのエンドドメインに付加して、Ｔ細胞にさらなるシグナルを提供する。前臨床試験は、ＣＡＲ設計の第２世代がＴ細胞の抗腫瘍活性を改善することを示した。より最近では、第３世代ＣＡＲは、複数のシグナル伝達ドメインを組み合わせて、効力をさらに増大させる。これらのＣＡＲで移植されたＴ細胞は、共刺激受容体／リガンド相互作用に依存しない改善された拡大、活性化、持続性、および腫瘍根絶効率を実証した（Ｉｍａｉ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ２００４  １８：６７６-８４；Ｍａｈｅｒ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００２  ２０：７０-５）。
【００３７】
例えば、ＣＡＲのエンドドメインは、それ自体で、または本発明のＣＡＲの文脈において有用な任意の他の所望の細胞質ドメインと組み合わされて、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むように設計され得る。例えば、ＣＡＲの細胞質ドメインは、ＣＤ３ζ鎖部分および共刺激シグナル伝達領域を含み得る。共刺激シグナル伝達領域は、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの一部を指す。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要とされる、抗原受容体またはそれらのリガンド以外の細胞表面分子である。このような分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ならびにＣＤ８３、ＣＤ８、ＣＤ４、ｂ２ｃ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＭｙＤ８８、ＢＴＮＬ３およびＮＫＧ２Ｄと特異的に結合するリガンドが挙げられる。従って、ＣＡＲは、主として、共刺激シグナル伝達要素としてＣＤ２８を用いて例示されるが、他の共刺激要素は、単独で、または他の共刺激シグナル伝達要素と組み合わせて使用され得る。
【００３８】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ヒンジ配列を含む。ヒンジ配列は、抗体の柔軟性を促進するアミノ酸の短い配列である（例えば、Ｗｏｏｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４（２）：  ８９−９９（２００４）を参照のこと）。ヒンジ配列は、抗原認識部分と膜貫通ドメインとの間に位置し得る。ヒンジ配列は、任意の適切な分子に由来するか、または任意の適切な分子から得られる任意の適切な配列であり得る。いくつかの実施形態では、例えば、ヒンジ配列は、ＣＤ８ａ分子またはＣＤ２８分子に由来する。
【００３９】
膜貫通ドメインは、天然または合成源のいずれかに由来し得る。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。例えば、膜貫通領域は、以下に由来し得る（即ち、少なくとも以下のものの膜貫通領域を含む）。Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８β（例えば、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ）、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、またはＣＤ１５４、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒ  α、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、およびＰＡＧ／Ｃｂｐ。あるいは、膜貫通ドメインは合成であってもよく、その場合、膜貫通ドメインは主にロイシンおよびバリンのような疎水性残基を含むであろう。いくつかの場合では、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンのトリプレットが、合成膜貫通ドメインの各末端に見出されるであろう。２〜１０アミノ酸長のような短いオリゴまたはポリペプチドリンカーは、ＣＡＲの膜貫通ドメインと小胞体ドメインとの間の連結を形成し得る。
【００４０】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、同じ膜貫通ドメインの反復であり得るか、または異なる膜貫通ドメインであり得る、２つ以上の膜貫通ドメインを有する。
【００４１】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、国際公開第２０１５／０３９５２３号（この教示のために参照により組み込まれる）に記載されているように、多鎖ＣＡＲである。多鎖ＣＡＲは、異なる膜貫通ポリペプチド中に別々の細胞外リガンド結合ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含み得る。シグナル伝達ドメインは、最適なシグナル伝達を付与する、天然の受容体により近い柔軟な構造を形成する膜近傍位置に集合するように設計することができる。例えば、多鎖ＣＡＲは、ＦＣＥＲＩアルファ鎖の一部およびＦＣＥＲＩベータ鎖の一部を含むことができ、その結果、ＦＣＥＲＩ鎖は、一緒に自然に二量体化してＣＡＲを形成する。
【００４２】
以下の表および２は、ＴＡＡ結合領域、共刺激シグナル伝達領域、および開示されたＣＡＲにおいて生じ得る細胞内シグナル伝達ドメインのいくつかの組み合わせの例を提供する。
【００４３】
【表１】
2020530269.tif 000003
【００４４】
【表２】
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【００４５】
いくつかの実施形態では、抗ＴＡＡ結合剤は、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）抗体である。抗ＴＡＡ  ｓｃＦｖの親和性／特異性は、主に、重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）における相補性決定領域（ＣＤＲ）内の特異的配列によって駆動される。ＶＨおよびＶＬ配列のそれぞれは、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）を有する。
【００４６】
いくつかの場合では、抗ＴＡＡ結合剤は、親和性成熟ｓｃＦｖである。いくつかの場合では、抗ＴＡＡは、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２５ｎＭ、２０ｎＭ、１５ｎＭ、または１０ｎＭ未満のＴＡＡに対する解離定数（ＫＤ）を有する。
【００４７】
いくつかの実施形態では、抗ＴＡＡ結合剤は、モノクローナル抗体などの天然抗体に由来する。いくつかの場合では、抗体は、ヒトである。いくつかの場合では、抗体は、ヒトに投与された場合、それをより免疫原性にしないようにするための改変を受けている。例えば、改変は、キメラ化、ヒト化、ＣＤＲグラフティング、脱免疫化、および最も近いヒト生殖系列配列に対応するフレームワークアミノ酸の変異からなる群から選択される１つ以上の技術を含む。
【００４８】
腫瘍抗原は、免疫応答、特にＴ細胞媒介免疫応答を誘発する腫瘍細胞によって産生されるタンパク質である。さらなる抗原結合ドメインは、腫瘍抗原の抗体または天然リガンドであり得る。さらなる抗原結合ドメインの選択は、治療される癌の特定の型に依存するであろう。腫瘍抗原は、当該技術分野で周知であり、例えば、神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＩＬ−ｌｌＲａ、ＩＬ−１３Ｒａ、ＥＧＦＲ、ＦＡＰ、Ｂ７Ｈ３、Ｋｉｔ、ＣＡ  ＬＸ、ＣＳ−１、ＭＵＣ１、ＢＣＭＡ、ｂｃｒ−ａｂｌ、ＨＥＲ２、β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＡＬＫ、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、サイクリンＢｌ、レクチン反応性ＡＦＰ、Ｆｏｓ関連抗原１、ＡＤＲＢ３、チログロブリン、ＥｐｈＡ２、ＲＡＧＥ−１、ＲＵ１、ＲＵ２、ＳＳＸ２、ＡＫＡＰ−４、ＬＣＫ、ＯＹ−ＴＥＳ１、ＰＡＸ５、ＳＡＲＴ３、ＣＬＬ−１、フコシルＧＭ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＭＮ−ＣＡ  ＩＸ、ＥＰＣＡＭ、ＥＶＴ６−ＡＭＬ、ＴＧＳ５、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、プリシアル（ｐｌｙｓｉａｌｉｃ）酸、ＰＬＡＣ１、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、ルイスＹ、ｓＬｅ、ＬＹ６Ｋ、ｍｕｔ  ｐｈｓ７０−２、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ−２、ＣＹＰＩＢＩ、ＢＯＲＩＳ、プロスターゼ（ｐｒｏｓｔａｓｅ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）ＰＡＸ３、ＰＡＸ３、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−ｌａ、ＬＭＰ２、ＮＣＡＭ、ｐ５３、ｐ５３変異体、Ｒａｓ変異体、ｇｐｌＯＯ、プロステイン、ＯＲ５１Ｅ２、ＰＡＮＸ３、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｈＴＥＲＴ、ＨＭＷＭＡＡ、ＨＡＶＣＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＰＤＧＦＲ−ベータ、サバイビンおよびテロメラーゼ、レグマイン、ＨＰＶ  Ｅ６、Ｅ７、精子タンパク質１７、ＳＳＥＡ−４、チロシナーゼ、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、前立腺癌腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１）、ＭＬ−ＩＡＰ、ＭＡＧＥ、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＭＡＤ−ＣＴ−２、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ  １、ＸＡＧＥ１、ＥＬＦ２Ｍ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、好中球エラスターゼ、肉腫転移切断点、ＮＹ−ＢＲ−１、ｅｐｈｎｎＢ２、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ９７、ＣＤ１７１、ＣＤ１７９ａ、アンドロゲン受容体、ＦＡＰ、インスリン増殖因子（ＩＧＦ）−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−Ｉ受容体、ＧＤ２、ｏ−アセチル−ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ３、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＧＰＲ２０、ＣＸＯＲＦ６１、葉酸受容体（ＦＲａ）、葉酸受容体ベータ、ＲＯＲ１、Ｆｌｔ３、ＴＡＧ７２、ＴＮ  Ａｇ、Ｔｉｅ  ２、ＴＥＭ１、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＴＳＨＲ、ＵＰＫ２、およびメソテリンを含む。好ましい実施形態において、腫瘍抗原は、葉酸受容体（ＦＲａ）、メソテリン、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＩＬ−１３Ｒａ、ＣＤ１２３、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＢＣＭＡ、ＧＤ２、ＣＬＬ−１、ＣＡ−ＩＸ、ＭＵＣｌ、ＨＥＲ２、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【００４９】
腫瘍抗原の非限定的な例としては、以下が挙げられる：分化抗原、例えばチロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、および腫瘍特異的多系列抗原、例えばＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ｐｉ  ５；過剰発現された胚性抗原、例えばＣＥＡ；過剰発現された癌遺伝子および変異した腫瘍抑制遺伝子、例えばｐ５３、Ｒａｓ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ；染色体転座から生じる独特の腫瘍抗原、例えばＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ；ならびにウイルス抗原、例えばＥｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒウイルス抗原ＥＢＶＡおよびヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６およびＥ７。他の大きなタンパク質ベースの抗原には、ＴＳＰ１８０、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ、ｐｌ８５ｅｒｂＢ２、ｐｌ８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｎｍ２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＣＡ  １９−９、ＣＡ  ７２−４、ＣＡＭ  １７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、ベータ−カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ−１、ｐ  １５、ｐ  １６、４３−９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、アルファ−フェトプロテイン、ベータ−ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ  １２５、ＣＡ  １５−３＼ＣＡ  ２７．２９＼ＢＣＡＡ、ＣＡ−１９５、ＣＡ−２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼Ｐ１、ＣＯ−０２９、ＦＧＦ−５、Ｇ２５０、Ｇ７３３＼ＥｐＣＡＭ、ＨＴｇｐ−１７５、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ−７０Ｋ、ＮＹ−ＣＯ−１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１  ６、ＴＡ−９０＼Ｍａｃ−２結合タンパク質＼シクロフィルム（ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｍ）Ｃ関連タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、ＴＰＳ、ＧＰＣ３、ＭＵＣ１６、ＬＭＰ１、ＥＢＭＡ−１、ＢＡＲＦ−１、ＣＳ１、ＣＤ３１９、ＨＥＲ１、Ｂ７Ｈ６、Ｌ１ＣＡＭ、ＩＬ６、およびＭＥＴが含まれる。
【００５０】
核酸およびベクター
開示される免疫エフェクター細胞におけるＣＡＲの発現を可能にする、開示されるＣＡＲをコードするポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドベクターもまた開示される。
【００５１】
開示されるＣＡＲおよびその領域をコードする核酸配列は、当該技術分野で公知の組換え方法を用いて、例えば、遺伝子を発現する細胞からライブラリーをスクリーニングすることによって、その遺伝子を含むことが公知のベクターから遺伝子を誘導することによって、または標準的な技術を用いて、その遺伝子を含む細胞および組織から直接単離することによって、得ることができる。あるいは、目的の遺伝子は、クローニングされるのではなく合成的に産生され得る。
【００５２】
ＣＡＲをコードする核酸の発現は、典型的には、ＣＡＲポリペプチドをコードする核酸をプロモーターに作動可能に連結し、構築物を発現ベクターに組み込むことによって達成される。典型的なクローニングベクターは、転写および翻訳ターミネーター、開始配列、ならびに所望の核酸配列の発現の調節に有用なプロモーターを含む。
【００５３】
開示される核酸は、多数の型のベクターにクローニングされ得る。例えば、核酸は、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス、およびコスミドを含むがこれらに限定されないベクターにクローニングすることができる。特に興味深いベクターには、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、および配列決定ベクターが含まれる。
【００５４】
さらに、発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に提供され得る。ウイルスベクター技術は、当該技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、ならびに他のウイルス学および分子生物学マニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、およびレンチウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。一般に、適切なベクターは、少なくとも１つの生物において機能的な複製起点、プロモーター配列、便利な制限エンドヌクレアーゼ部位、および１つ以上の選択マーカーを含む。いくつかの実施形態（ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｓ）において、ポリヌクレオチドベクターは、レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである。
【００５５】
哺乳動物細胞への遺伝子導入のために、多くのウイルスベースの系が開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達系のための便利なプラットフォームを提供する。選択された遺伝子は、ベクターに挿入され得、当該技術分野で公知の技術を使用してレトロウイルス粒子にパッケージングされ得る。次いで、組換えウイルスを単離し、インビボまたはエクスビボのいずれかで対象の細胞に送達することができる。
【００５６】
適切なプロモーターの一例は、即時初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに作動可能に連結された任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動し得る強力な構成的プロモーター配列である。適切なプロモーターの別の例は、伸長成長因子−１α（ＥＦ−１α）である。しかしながら、非限定的にサルウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、ＭＮＤ（骨髄増殖性肉腫ウイルス）プロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス即時初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびにヒト遺伝子プロモーター、例えば、非限定的にアクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、およびクレアチンキナーゼプロモーターを含む、他の構成的プロモーター配列もまた使用され得る。あるいは、プロモーターは誘導性プロモーターであり得る。誘導性プロモーターの例としては、メタロチオニンプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、およびテトラサイクリンプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５７】
さらなるプロモーターエレメント、例えばエンハンサーは、転写開始の頻度を調節する。典型的には、これらは開始部位から３０〜１１０ｂｐ上流の領域に位置するが、多数のプロモーターが最近、同様に開始部位の下流に機能的エレメントを含有することが示されている。プロモーターエレメント間の間隔は、しばしば、柔軟であり、その結果、プロモーター機能は、エレメントが反転されるか、または互いに対して移動される場合に保存される。
【００５８】
ＣＡＲポリペプチドまたはその一部の発現を評価するために、細胞に導入される発現ベクターはまた、ウイルスベクターを介してトランスフェクトまたは感染されることが求められる細胞の集団からの発現細胞の同定および選択を容易にするために、選択マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子のいずれか、またはその両方を含み得る。他の態様において、選択マーカーは、別個のＤＮＡ片上に担持され得、共トランスフェクション手順において使用され得る。選択マーカーおよびレポーター遺伝子の両方は、宿主細胞における発現を可能にするために、適切な調節配列に隣接し得る。有用な選択マーカーとしては、例えば、抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。
【００５９】
レポーター遺伝子は、潜在的にトランスフェクトされた細胞を同定するため、および調節配列の機能性を評価するために使用される。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物もしくは組織中に存在しないか、またはレシピエント生物もしくは組織によって発現されず、その発現がいくつかの容易に検出可能な特性（例えば、酵素活性）によって示されるポリペプチドをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡがレシピエント細胞に導入された後の適切な時間でアッセイされる。適切なレポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌アルカリホスファターゼ、または緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする遺伝子が挙げられ得る。適切な発現系は周知であり、公知の技術を使用して調製され得るか、または商業的に入手され得る。一般に、レポーター遺伝子の発現の最高レベルを示す最小５’隣接領域を有する構築物は、プロモーターとして同定される。このようなプロモーター領域は、レポーター遺伝子に連結され得、プロモーター駆動転写を調節する能力について薬剤を評価するために使用され得る。
【００６０】
遺伝子を細胞に導入し、発現させる方法は、当該技術分野で公知である。発現ベクターの文脈において、ベクターは、当該技術分野の任意の方法によって宿主細胞、例えば哺乳動物、細菌、酵母、または昆虫細胞に容易に導入され得る。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的、または生物学的手段によって宿主細胞に移入され得る。
【００６１】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための物理的方法としては、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子衝撃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどが挙げられる。ベクターおよび／または外因性核酸を含む細胞を産生するための方法は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照のこと。
【００６２】
目的のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための生物学的方法としては、ＤＮＡベクターおよびＲＮＡベクターの使用が挙げられる。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物、例えばヒト細胞に遺伝子を挿入するために最も広く使用されている方法となっている。
【００６３】
宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための化学手段には、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズなどのコロイド分散系、および水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む脂質ベースの系が含まれる。インビトロおよびインビボで送達ビヒクルとして使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。
【００６４】
非ウイルス送達系が利用される場合、例示的な送達ビヒクルはリポソームである。別の態様では、核酸は脂質と関連され得る。脂質に関連する核酸は、リポソームの水性内部にカプセル化され、リポソームの脂質二重層内に散在され、リポソームおよびオリゴヌクレオチドの両方に関連する連結分子を介してリポソームに付着され、リポソームに捕捉され、リポソームと複合体化され、脂質を含有する溶液中に分散され、脂質と混合され、脂質と組み合わされ、脂質中に懸濁液として含有され、ミセルに含有されまたは複合体化され、あるいは他の方法で脂質と関連され得る。脂質、脂質／ＤＮＡまたは脂質／発現ベクター関連組成物は、溶液中のいかなる特定の構造にも限定されない。例えば、それらは、ミセルとして二重層構造で、または「潰れた」構造で存在してもよい。それらはまた、単に溶液中に散在されてもよく、おそらく、サイズまたは形状が均一でない凝集体を形成する。脂質は、天然に存在する脂質または合成脂質であり得る脂肪物質である。例えば、脂質は、細胞質中に天然に存在する脂肪滴、ならびに長鎖脂肪族炭化水素およびそれらの誘導体、例えば、脂肪酸、エチルアルコール、アミン、アミノエチルアルコール、およびアルデヒドを含む化合物のクラスを含む。使用に適した脂質は、商業的供給源から得ることができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）はＳｉｇｍａ、セントルイス、Ｍｏから入手することができ；リン酸ジセチル（「ＤＣＰ」）はＫ＆Ｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（プレインビュー、ＮＹ）から入手することができ；コレステロール（「Ｃｈｏｉ」）はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇから入手することができ；ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）および他の脂質はＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．（バーミンガム、Ａｌａ）から入手することができる。
【００６５】
免疫エフェクター細胞
開示されるＣＡＲ（本明細書で「ＣＡＲ−Ｔ細胞」とも呼ばれる。）を発現するために操作された免疫エフェクター細胞も開示される。これらの細胞は、治療される対象から入手することが好ましい（即ち、自己）。しかしながら、いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞株またはドナーエフェクター細胞（同種異系）が使用される。免疫エフェクター細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含む多くの供給源から得ることができる。免疫エフェクター細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）分離のような、当業者に公知の任意の数の技術を使用して、対象から収集された血液から得ることができる。例えば、個体の循環血液由来の細胞は、アフェレーシスによって得ることができる。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、赤血球を溶解し、単球を枯渇させることによって、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配を通した遠心分離によって、または向流遠心分離エルトリエーションによって、末梢血リンパ球から単離される。免疫エフェクター細胞の特定の亜集団は、陽性または陰性選択技術によってさらに単離され得る。例えば、免疫エフェクター細胞は、例えば、所望の免疫エフェクター細胞の陽性選択のために十分な期間、抗体結合ビーズとインキュベートすることによって、陽性選択された細胞に独特の表面マーカーに対する抗体の組み合わせを使用して単離され得る。あるいは、免疫エフェクター細胞集団の富化は、陰性に選択された細胞に独特の表面マーカーに対する抗体の組み合わせを使用する陰性選択によって達成され得る。
【００６６】
いくつかの実施形態において、免疫エフェクター細胞は、感染性疾患および異物に対して身体を防御することに関与する任意の白血球を含む。例えば、免疫エフェクター細胞は、リンパ球、単球、マクロファージ、樹状（ｄｅｎｔｒｉｔｉｃ）細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。例えば、免疫エフェクター細胞は、Ｔリンパ球を含み得る。
【００６７】
Ｔ細胞またはＴリンパ球は、細胞表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在によって、Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）などの他のリンパ球と区別することができる。Ｔ細胞と呼ばれるのは、胸腺で成熟するからである（扁桃でも成熟するものもあるが）。Ｔ細胞のいくつかのサブセットが存在し、それぞれが異なる機能を有する。
【００６８】
Ｔヘルパー細胞（ＴＨ細胞）は、Ｂ細胞の形質細胞および記憶Ｂ細胞への成熟、ならびに細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージの活性化を含む免疫学的プロセスにおいて他の白血球を補助する。これらの細胞は、それらの表面にＣＤ４糖タンパク質を発現するため、ＣＤ４＋  Ｔ細胞としても知られている。ヘルパーＴ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に発現されるＭＨＣクラスＩＩ分子によってペプチド抗原が提示されると活性化される。いったん活性化されると、それらは急速に分裂し、活性免疫応答を調節または補助するサイトカインと呼ばれる小さなタンパク質を分泌する。これらの細胞は、異なる型の免疫反応を促進するために異なるサイトカインを分泌する、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ１７、ＴＨ９、またはＴＦＨを含む、いくつかのサブタイプのうちの１つに分化し得る。
【００６９】
細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＣ細胞、またはＣＴＬ）は、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を破壊し、移植拒絶にも関与する。これらの細胞は、表面にＣＤ８糖タンパク質を発現しているため、ＣＤ８＋Ｔ細胞としても知られている。これらの細胞は、全ての有核細胞の表面に存在するＭＨＣクラスＩ分子に関連する抗原に結合することによって、それらの標的を認識する。ＩＬ−１０、アデノシン、および調節性Ｔ細胞によって分泌される他の分子を介して、ＣＤ８＋細胞は、自己免疫疾患を予防するアネルギー状態に不活性化され得る。
【００７０】
記憶Ｔ細胞は、感染が消散した後に長期間持続する抗原特異的Ｔ細胞のサブセットである。それらは、それらの同族抗原への再曝露時に、多数のエフェクターＴ細胞に急速に拡大し、従って、過去の感染に対する「記憶」を免疫系に提供する。記憶細胞は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋のいずれかであり得る。記憶Ｔ細胞は、典型的には細胞表面タンパク質ＣＤ４５ＲＯを発現する。
【００７１】
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）は、以前はサプレッサーＴ細胞として知られていたが、免疫学的寛容の維持に極めて重要である。それらの主要な役割は、免疫反応の終わりに向かってＴ細胞媒介免疫を遮断し、胸腺における陰性選択のプロセスから逃れた自己反応性Ｔ細胞を抑制することである。ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の２つの主要なクラス−天然に存在するＴｒｅｇ細胞および適応Ｔｒｅｇ細胞−が記載されている。
【００７２】
ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞（ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞と混同するべきではない）は、適応免疫系を先天性免疫系と橋渡しする。主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子によって提示されるペプチド抗原を認識する従来のＴ細胞とは異なり、ＮＫＴ細胞は、ＣＤ１ｄと呼ばれる分子によって提示される糖脂質抗原を認識する。
【００７３】
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋細胞の混合物を含む。別の実施形態では、Ｔ細胞は、細胞表面発現に基づいて、１つ以上のサブセットについて濃縮される。例えば、いくつかの場合、Ｔは細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔリンパ球を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、α鎖およびβ鎖の代わりに１つのγ鎖および１つのδ鎖を有する別個のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するγδ  Ｔ細胞を含む。
【００７４】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、ウイルス感染および形質転換細胞を死滅させることができ、先天性免疫系の重要な細胞サブセットを構成するＣＤ５６＋ＣＤ３−大顆粒リンパ球である（Ｇｏｄｆｒｅｙ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｌｅｕｋ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ２０１２  ５３：１６６６-１６７６）。細胞傷害性ＣＤ８＋  Ｔリンパ球とは異なり、ＮＫ細胞は事前の感作を必要とせずに腫瘍細胞に対して細胞傷害性を発揮し、ＭＨＣ−Ｉ陰性細胞を根絶することもできる（Ｎａｒｎｉ−Ｍａｎｃｉｎｅｌｌｉ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１１  ２３：４２７-４３１）。ＮＫ細胞はサイトカインストーム（Ｍｏｒｇａｎ  ＲＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２０１０  １８：８４３-８５１）、腫瘍溶解症候群（Ｐｏｒｔｅｒ  ＤＬ，ｅｔ  ａｌ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０１１  ３６５：７２５-７３３）、およびオンターゲット、オフ腫瘍効果の潜在的に致死的な合併症を回避し得るので、より安全なエフェクター細胞である。ＮＫ細胞は癌細胞の殺傷剤として周知の役割を有し、ＮＫ細胞障害はＭＭの進行に重要であると広く報告されているが（Ｇｏｄｆｒｅｙ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｌｅｕｋ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ２０１２  ５３：１６６６-１６７６；Ｆａｕｒｉａｔ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ２００６  ２０：７３２-７３３）、ＮＫ細胞媒介抗ＭＭ活性を増強し得る手段は、開示されるＣＡＲの前にほとんど研究されていない。
【００７５】
治療方法
開示されるＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞は、ＴＡＡ発現癌細胞に対する抗腫瘍免疫応答を誘発することができる。開示されるＣＡＲ修飾免疫エフェクター細胞によって誘発される抗腫瘍免疫応答は、能動免疫応答でも受動免疫応答でもよい。さらに、ＣＡＲ媒介免疫応答は、ＣＡＲ修飾免疫エフェクター細胞がＴＡＡに特異的な免疫応答を誘導する養子免疫療法アプローチの一部であり得る。
【００７６】
キメラ抗原受容体を発現する免疫エフェクター細胞の養子移入は、有望な抗癌治療である。患者の免疫エフェクター細胞の収集に続いて、細胞は、開示されたＣＡＲを発現するように遺伝子操作され得、次いで、患者に注入されて戻され得る。
【００７７】
開示されるＣＡＲ修飾免疫エフェクター細胞は、単独で、または希釈剤および／もしくは他の成分、例えばＩＬ−２、ＩＬ−１５、もしくは他のサイトカインもしくは細胞集団と組み合わせた医薬組成物として投与することができる。簡潔には、医薬組成物は、本明細書に記載される標的細胞集団を、１つ以上の薬学的または生理学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて含み得る。このような組成物は、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水などの緩衝液；グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールなどの炭水化物；タンパク質；ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸；酸化防止剤；ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；および防腐剤を含み得る。開示された方法において使用するための組成物は、いくつかの実施形態では、静脈内投与のために製剤化される。医薬組成物は、ＭＭを治療するのに適した任意の様式で投与することができる。投与の量および頻度は、患者の状態、および患者の疾患の重篤度のような因子によって決定されるが、適切な投薬量は臨床試験によって決定され得る。
【００７８】
「免疫学的有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍阻害有効量」、または「治療量」が示される場合、投与されるべき本発明の組成物の正確な量は、患者（対象）の年齢、体重、腫瘍サイズ、感染または転移の程度、および状態における個体差を考慮して、医師によって決定され得る。本明細書に記載されるＴ細胞を含む医薬組成物は、１０４〜１０９細胞／ｋｇ体重の用量、例えば１０５〜１０６細胞／ｋｇ体重の用量で、それらの範囲内の全ての整数値を含めて投与することができると一般に述べることができる。Ｔ細胞組成物はまた、これらの投薬量で複数回投与され得る。細胞は免疫療法において一般的に公知である注入技術を使用することによって投与され得る（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ．３１９：１６７６，１９８８を参照のこと）。特定の患者のための最適な投薬量および治療レジメンは、疾患の徴候について患者を監視し、それに応じて治療を調節することによって、医学の当業者によって容易に決定され得る。
【００７９】
特定の実施形態では、活性化されたＴ細胞を対象に投与し、その後、血液を再採取し（またはアフェレーシスを実施し）、開示された方法に従ってそこからＴ細胞を活性化し、これらの活性化および増殖されたＴ細胞を患者に再注入することが所望され得る。このプロセスは、数週間毎に複数回実施することができる。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、１０ｃｃ〜４００ｃｃの採血から活性化され得る。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃ、または１００ｃｃの採血から活性化される。この複数の採血／複数の再注入プロトコルを使用することは、Ｔ細胞の特定の集団を選択するのに役立ち得る。
【００８０】
開示される組成物の投与は、注射、輸血、または移植を含む、任意の便利な様式で実施され得る。本明細書に記載の組成物は、皮下、皮内、腫瘍内、結節内、髄内、筋肉内、静脈内（ＩＶ）注射、または腹腔内で患者に投与することができる。いくつかの実施形態において、開示される組成物は、皮内注射または皮下注射によって患者に投与される。いくつかの実施形態において、開示される組成物は、静脈注射によって投与される。組成物はまた、腫瘍、リンパ節、または感染部位に直接注射され得る。
【００８１】
特定の実施形態では、開示されるＣＡＲ修飾免疫エフェクター細胞は、サリドマイド、デキサメタゾン、ボルテゾミブ、およびレナリドミドを含むがこれらに限定されない、任意の数の関連する治療様式と併せて（例えば、前、同時または後に）患者に投与される。さらなる実施形態では、ＣＡＲ修飾免疫エフェクター細胞は、化学療法、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸塩、およびＦＫ５０６などの免疫抑制剤、抗体、またはＣＡＭ  ＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体もしくは他の抗体療法などの他の免疫除去剤、サイトキシン、フルダリビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン、および照射と組み合わせて使用され得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ修飾免疫エフェクター細胞は、骨髄移植、フルダラビンなどの化学療法剤、外照射療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミド、またはＯＫＴ３もしくはＣＡＭＰＡＴＨなどの抗体のいずれかを使用するＴ細胞切除療法と併せて、（例えば、前、同時または後に）患者に投与される。別の実施形態では、本発明の細胞組成物は、ＣＤ２０と反応する薬剤、例えばリツキサンのようなＢ細胞切除療法の後に投与される。例えば、いくつかの実施形態では、対象は、高用量化学療法、続いて末梢血幹細胞移植による標準的な治療を受け得る。特定の実施形態では、移植後、対象は、本発明の増殖した免疫細胞の注入を受ける。さらなる実施形態では、増殖した細胞は、手術の前または後に投与される。
【００８２】
開示される方法の癌は、調節されていない増殖、浸潤、または転移を受けている対象における任意のＴＡＡ発現細胞であり得る。いくつかの態様において、癌は、放射線療法が現在使用されている任意の新生物または腫瘍であり得る。あるいは、癌は、標準的な方法を使用する放射線療法に対して十分に感受性でない新生物または腫瘍であり得る。従って、癌は、肉腫、リンパ腫、白血病、癌腫、芽腫、または胚細胞腫瘍であり得る。開示された組成物が治療するために使用され得る癌の代表的であるが非限定的なリストは、リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉症、ホジキン病、骨髄性白血病、膀胱癌、脳癌、神経系癌、頭頸部癌、頭頸部扁平上皮癌、腎臓癌、肺癌、例えば小細胞肺癌および非小細胞肺癌、神経芽細胞腫／神経膠芽腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、皮膚癌、肝臓癌、黒色腫、口腔、喉頭、喉頭および肺の扁平上皮癌、子宮内膜癌、子宮頸癌（ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、子宮頸癌（ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、乳癌、上皮癌、腎癌、尿生殖器癌、肺癌、食道癌、頭頸部癌、大腸癌、造血器癌、精巣癌、結腸および直腸癌、前立腺癌、ならびに膵癌を含む。
【００８３】
開示されるＣＡＲは、細胞毒性または細胞増殖抑制効果を有する任意の化合物、部分または基と組み合わせて使用され得る。薬物部分には、微小チューブリン阻害剤、有糸分裂阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、またはＤＮＡインターカレーターとして機能し得る化学療法剤、特に癌治療法に使用されるものが含まれる。
【００８４】
開示されるＣＡＲは、チェックポイント阻害剤と組み合わせて使用することができる。２つの既知の阻害チェックポイント経路は、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原−４（ＣＴＬＡ−４）およびプログラム死１（ＰＤ−１）受容体を介するシグナル伝達を含む。これらのタンパク質は、Ｔ細胞機能の全ての段階にわたって重要な役割を果たす共シグナル伝達分子のＣＤ２８−Ｂ７ファミリーのメンバーである。ＰＤ−１受容体（ＣＤ２７９としても知られる）は、活性化されたＴ細胞の表面上で発現される。そのリガンドであるＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１；ＣＤ２７４）およびＰＤ−Ｌ２（Ｂ７−ＤＣ；ＣＤ２７３）は、樹状細胞またはマクロファージなどのＡＰＣの表面上で発現される。ＰＤ−Ｌ１は優勢なリガンドであるが、ＰＤ−Ｌ２は、はるかに限定された発現パターンを有する。リガンドがＰＤ−１に結合すると、阻害シグナルがＴ細胞に伝達され、サイトカイン産生が減少し、Ｔ細胞増殖が抑制される。チェックポイント阻害剤には、ＰＤ−１（ニボルマブ（ＢＭＳ−９３６５５８またはＭＤＸ１１０６）、ＣＴ−０１１、ＭＫ−３４７５）、ＰＤ−Ｌ１（ＭＤＸ−１１０５（ＢＭＳ−９３６５５９）、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ）、ＰＤ−Ｌ２（ｒＨＩｇＭ１２Ｂ７）、ＣＴＬＡ−４（イピリムマブ（ＭＤＸ−０１０）、トレメリムマブ（ＣＰ−６７５，２０６））、ＩＤＯ、Ｂ７−Ｈ３（ＭＧＡ２７１）、Ｂ７−Ｈ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ−３（ＢＭＳ−９８６０１６）を遮断する抗体が含まれるが、これらに限定されない。
【００８５】
プログラムされた死亡１（ＰＤ−１）に対するヒトモノクローナル抗体、および抗ＰＤ−１抗体を単独で、または他の免疫療法薬と組み合わせて使用して癌を治療するための方法は、米国特許第８，００８，４４９号に記載されており、これは、これらの抗体について参照により組み込まれる。抗ＰＤ−Ｌ１抗体およびその使用は米国特許第８，５５２，１５４号に記載されており、これは、これらの抗体について参照により組み込まれる。抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む抗癌剤は米国特許第８，６１７，５４６号に記載されており、これは、これらの抗体について参照により組み込まれる。
【００８６】
いくつかの実施形態では、ＰＤＬ１阻害剤は、ＰＤＬ１に特異的に結合する抗体、例えばＢＭＳ−９３６５５９（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）またはＭＰＤＬ３２８０Ａ（Ｒｏｃｈｅ）を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ１阻害剤は、ラムブロリズマブ（Ｍｅｒｃｋ）、ニボルマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、またはＭＥＤＩ４７３６（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）などのＰＤ１に特異的に結合する抗体を含む。ＰＤ−１に対するヒトモノクローナル抗体、および抗ＰＤ−１抗体を単独で、または他の免疫治療薬と組み合わせて使用して癌を治療するための方法は、米国特許第８，００８，４４９号に記載されており、これは、これらの抗体について参照により組み込まれる。抗ＰＤ−Ｌ１抗体およびその使用は、米国特許第８，５５２，１５４号に記載されており、これは、これらの抗体について参照により組み込まれる。抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む抗癌剤は、米国特許第８，６１７，５４６号に記載されており、これは、これらの抗体について参照により組み込まれる。
【００８７】
開示されるＣＡＲは、他の癌免疫療法と組み合わせて使用され得る。免疫療法には２つの異なるタイプがある：受動免疫療法は、患者において免疫応答を必ずしも開始することなく、癌細胞に対する標的化された細胞傷害活性を指向するために免疫系の成分を使用する一方、能動免疫療法は、内因性免疫応答を能動的に誘発する。受動的戦略は、特定の抗原に応答してＢ細胞によって産生されるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の使用を含む。１９７０年代のハイブリドーマ技術の開発および腫瘍特異的抗原の同定は、免疫系による破壊のために腫瘍細胞を特異的に標的化し得るｍＡｂの医薬開発を可能にした。これまでのところ、ｍＡｂは免疫療法の最大の成功例であり、２０１２年に最も売れている抗癌剤の上位３つはｍＡｂであった。これらの中にはリツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）があり、これは非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）のようなＢ細胞悪性腫瘍の表面上で高度に発現されるＣＤ２０タンパク質に結合する。リツキシマブは、化学療法と組み合わせたＮＨＬおよび慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）の治療のためにＦＤＡによって承認されている。別の重要なｍＡｂはトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）であり、これは、ＨＥＲ２の発現を標的化することによって、ＨＥＲ２（ヒト上皮増殖因子受容体２）陽性乳癌の治療を革命させた。
【００８８】
最適な「キラー」ＣＤ８  Ｔ細胞応答の生成はまた、Ｔ細胞受容体活性化＋共刺激を必要とし、これは、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）および４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）を含む腫瘍壊死因子受容体ファミリーメンバーの連結を介して提供され得る。ＯＸ４０は、活性化（アゴニスト）抗ＯＸ４０  ｍＡｂでの治療がＴ細胞分化および細胞溶解機能を増大させ、種々の腫瘍に対する抗腫瘍免疫の増強をもたらすので、特に興味深い。
【００８９】
いくつかの実施形態では、そのような追加の治療薬は、代謝拮抗物質、例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、フルダラビン、５−フルオロウラシル、デカルバジン、ヒドロキシ尿素、アスパラギナーゼ、ゲムシタビンまたはクラドリビンから選択することができる。
【００９０】
いくつかの実施形態では、そのような追加の治療薬は、メクロレタミン、チオエパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、プロカルバジン、マイトマイシンＣ、シスプラチン、およびカルボプラチンなどの他の白金誘導体などのアルキル化剤から選択されてもよい。
【００９１】
いくつかの実施形態では、そのような追加の治療薬は、抗有糸分裂薬、例えばタキサン、例えばドセタキセル、およびパクリタキセル、ならびにビンデシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、およびビノレルビンなどのビンカアルカロイドから選択されてもよい。
【００９２】
いくつかの実施形態では、そのような追加の治療薬は、トポテカンもしくはイリノテカンなどのトポイソメラーゼ阻害剤、またはエトポシドおよびテニポシドなどの細胞増殖抑制薬から選択することができる。
【００９３】
いくつかの実施形態では、そのような追加の治療薬は、成長因子阻害剤、例えば、ＥｒｂＢ１（ＥＧＦＲ）の阻害剤（例えば、ＥＧＦＲ抗体、例えば、ザルツムマブ、セツキシマブ、パニツムマブもしくはニモツズマブ、または他のＥＧＦＲ阻害剤、例えば、ゲフィチニブもしくはエルロチニブ）、別のＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）の阻害剤（例えば、ＨＥＲ２抗体、例えば、トラスツズマブ、トラスツズマブ−ＤＭ１またはペルツズマブ）、またはＥＧＦＲおよびＨＥＲ２の両方の阻害剤、例えば、ラパチニブから選択されてもよい）。
【００９４】
いくつかの実施形態では、そのような追加の治療薬は、イマチニブ（Ｇｌｉｖｅｃ、Ｇｌｅｅｖｅｃ  ＳＴＩ５７１）またはラパチニブなどのチロシンキナーゼ阻害剤から選択されてもよい。
【００９５】
従って、いくつかの実施形態において、開示される抗体は、オファツムマブ、ザノリムマブ、ダラツムマブ、ラニビズマブ、ニモツズマブ、パニツムマブ、ｈｕ８０６、ダクリズマブ（Ｚｅｎａｐａｘ）、バシリキシマブ（Ｓｉｍｕｌｅｃｔ）、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）、アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ）、ナタリズマブ（Ｔｙｓａｂｒｉ）、オマリズマブ（Ｘｏｌａｉｒ）、エファリズマブ（Ｒａｐｔｉｖａ）、および／またはリツキシマブと組み合わせて使用される。
【００９６】
いくつかの実施形態において、上記の障害を治療するためのＣＡＲと組み合わせて使用するための治療剤は、抗癌サイトカイン、ケモカイン、またはそれらの組み合わせであり得る。適切なサイトカインおよび増殖因子の例としては、ＩＦＮｙ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８ａ、ＩＬ−２８ｂ、ＩＬ−２９、ＫＧＦ、ＩＦＮａ（例えば、ＩＮＦａ２ｂ）、ＩＦＮ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＤ４０Ｌ、Ｆｌｔ３リガンド、幹細胞因子、アンセスチム、およびＴＮＦａが挙げられる。適切なケモカインは、ヒトＣＸＣおよびＣ−Ｃケモカインファミリー由来のＧｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（ＥＬＲ）負ケモカイン、例えばＩＰ−１０、ＭＣＰ−３、ＭＩＧ、およびＳＤＦ−１ａを含み得る。適切なサイトカインには、サイトカイン誘導体、サイトカイン改変体、サイトカイン断片、およびサイトカイン融合タンパク質が含まれる。
【００９７】
いくつかの実施形態において、上記の障害を治療するためのＣＡＲと組み合わせて使用するための治療剤は、細胞周期制御／アポトーシス調節因子（または「調節剤」）であり得る。細胞周期制御／アポトーシス調節因子は、（ｉ）ｃｄｃ−２５（例えば、ＮＳＣ  ６６３２８４）、（ｉｉ）細胞周期を過剰刺激するサイクリン依存性キナーゼ（例えば、フラボピリドール（Ｌ８６８２７５、ＨＭＲ１２７５）、７−ヒドロキシスタウロスポリン（ＵＣＮ−０１、ＫＷ−２４０１）、およびロスコビチン（Ｒ−ロスコビチン、ＣＹＣ２０２））、ならびに（ｉｉｉ）テロメラーゼ調節因子（例えば、ＢＩＢＲ１５３２、ＳＯＴ−０９５、ＧＲＮ１６３、ならびに例えば、米国特許第６，４４０，７３５号および米国特許第６，７１３，０５５号に記載される組成物）などの細胞周期制御／アポトーシス調節因子を標的化および調節する分子を含み得る。アポトーシス経路を妨害する分子の非限定的な例としては、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）／アポトーシス−２リガンド（Ａｐｏ−２Ｌ）、ＴＲＡＩＬ受容体を活性化する抗体、ＩＦＮ、およびアンチセンスＢｃｌ−２が挙げられる。
【００９８】
いくつかの実施形態において、上記の障害を治療するためのＣＡＲと組み合わせて使用するための治療剤は、ホルモン調節剤、例えば抗アンドロゲンおよび抗エストロゲン治療法に有用な薬剤であり得る。そのようなホルモン調節剤の例は、タモキシフェン、イドキシフェン、フルベストラント、ドロロキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ジエチルスチルベストロール、エチニルエストラジオール／エスチニル、抗アンドロゲン（例えば、フルタミンデ（ｆｌｕｔａｍｉｎｄｅ）／ユーレキシン）、プロゲスチン（例えば、ヒドロキシプロゲステロンカプロエート、メドロキシプロゲステロン／プロベラ、メゲストロールアセテート／メガセ）、アドレノコルチコステロイド（例えば、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン）、黄体形成ホルモン放出ホルモン（およびその類似体、ならびにブセレリンおよびゴセレリンのような他のＬＨＲＨアゴニスト）、アロマターゼ阻害剤（例えば、アナストラゾール／アリミデックス、アミノグルテチミド／シトレーデン、エキセメスタン）またはホルモン阻害剤（例えば、オクトレオチド／サンドスタチン）である。
【００９９】
いくつかの実施形態において、上記の障害を治療するためのＣＡＲと組み合わせて使用するための治療剤は、抗癌核酸または抗癌阻害性ＲＮＡ分子であり得る。
【０１００】
上記のような併用投与は、同時、別々、または連続であり得る。共投与のために、薬剤は、必要に応じて、１つの組成物として、または別々の組成物として投与され得る。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、開示されるＣＡＲは、放射線療法と組み合わせて投与される。放射線療法は、患者への放射線または関連する放射性医薬品の投与を含むことができる。放射線源は、治療される患者の体外または体内のいずれであってもよい（放射線治療は、例えば、体外ビーム放射線療法（ＥＢＲＴ）または近接照射療法（ＢＴ）の形態であってもよい）。このような方法を実施する際に使用することができる放射性元素には、例えば、ラジウム、セシウム−１３７、イリジウム−１９２、アメリシウム−２４１、金−１９８、コバルト−５７、銅−６７、テクネチウム−９９、ヨウ化物−１２３、ヨウ化物−１３１、およびインジウム−１１１が含まれる。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、開示されるＣＡＲは、手術と組み合わせて投与される。
【０１０３】
ＣＡＲ−Ｔ細胞は、腫瘍細胞毒性および特異性を増強し、腫瘍免疫抑制を回避し、宿主拒絶を回避し、それらの治療半減期を延長するいくつかの方法で設計され得る。例えばＴＲＵＣＫ（ユニバーサルサイトカイン殺傷のために再指向されるＴ細胞）Ｔ細胞はＣＡＲを有するが、腫瘍殺傷を促進するＩＬ−１２のようなサイトカインを放出するように操作される。これらの細胞はいったん腫瘍環境に局在化したＣＡＲの活性化時に分子ペイロードを放出するように設計されているので、これらのＣＡＲ−Ｔ細胞は時に「武装化ＣＡＲ」とも呼ばれる。癌治療法としてのいくつかのサイトカインは、前臨床的および臨床的の両方で研究されており、また、同様にＣＡＲ−Ｔ治療法のＴＲＵＣＫ形態に組み込まれる場合に有用であることが証明され得る。これらの中には、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＴＲＡＩＬ、ＦＬＴ３リガンド、リンホタクチン、およびＴＧＦ−β（Ｄｒａｎｏｆｆ  ２００４）が含まれる。「自己駆動」または「ホーミング」ＣＡＲ−Ｔ細胞は、それらのＣＡＲに加えてケモカイン受容体を発現するように操作される。特定のケモカインが腫瘍においてアップレギュレートされ得るので、ケモカイン受容体の取り込みは、養子Ｔ細胞への腫瘍輸送およびそれによる浸潤を補助し、それによってＣＡＲ−Ｔの特異性および機能性の両方を増強する（Ｍｏｏｎ  ２０１１）。ユニバーサルＣＡＲ−Ｔ細胞もＣＡＲを有するが、それらが内因性ＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）またはＭＨＣ（主要組織適合性複合体）タンパク質を発現しないように操作される。養子Ｔ細胞療法のシグナル伝達レパートリーからのこれら２つのタンパク質の除去は、それぞれ、移植片対宿主病および拒絶を予防する。武装化ＣＡＲ−Ｔ細胞は、腫瘍免疫抑制および腫瘍誘発ＣＡＲ−Ｔ機能低下を回避するそれらの能力のために、さらにそのように命名される。これらの特定のＣＡＲ−ＴはＣＡＲを有し、チェックポイント阻害剤を発現しないように操作され得る。あるいは、これらのＣＡＲ−Ｔは、チェックポイントシグナル伝達を遮断するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）と共投与され得る。抗ＰＤＬ１抗体の投与は、ＣＡＲ  ＴＩＬ（腫瘍浸潤リンパ球）の殺傷能力を有意に回復させた。ＰＤ１−ＰＤＬ１およびＣＴＬＡ−４−ＣＤ８０／ＣＤ８６シグナル伝達経路が研究されているが、ＬＡＧ−３、Ｔｉｍ−３、ＩＤＯ−１、２Ｂ４、およびＫＩＲを含む武装化ＣＡＲ−Ｔの設計において、他の免疫チェックポイントシグナル伝達分子を標的とすることが可能である。ＴＩＬの他の細胞内阻害剤としては、ホスファターゼ（ＳＨＰ１）、ユビキチンリガーゼ（即ち、ｃｂｌ−ｂ）、およびキナーゼ（即ち、ジアシルグリセロールキナーゼ）が挙げられる。武装化ＣＡＲ−Ｔはまた、腫瘍分泌サイトカインの効果に対してそれらを保護するか、またはそれらを耐性にするタンパク質または受容体を発現するように操作され得る。例えば、二重負形態のＴＧＦ−β受容体で形質導入されたＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球）は、リンパ腫分泌ＴＧＦ−βによる免疫抑制に抵抗性である。これらの形質導入された細胞は、それらの対照対応物と比較した場合、インビボで顕著に増加した抗腫瘍活性を示した。
【０１０４】
タンデムおよび二重ＣＡＲ−Ｔ細胞は、２つの異なる抗原結合ドメインを有する点で独特である。タンデムＣＡＲは、細胞内共刺激および刺激ドメインに連結された細胞外環境に面する２つの連続した抗原結合ドメインを含む。二重ＣＡＲは、１つの細胞外抗原結合ドメインが細胞内共刺激ドメインに連結され、第２の別個の細胞外抗原結合ドメインが細胞内刺激ドメインに連結されるように操作される。刺激ドメインおよび共刺激ドメインは、２つの別々の抗原結合ドメインの間で分割されるので、二重ＣＡＲはまた、「分割ＣＡＲ」とも呼ばれる。タンデムおよび二重ＣＡＲ設計の両方において、両方の抗原結合ドメインの結合は、Ｔ細胞におけるＣＡＲ回路のシグナル伝達を可能にするために必要である。これらの２つのＣＡＲ設計は、異なる別個の抗原に対する結合親和性を有するので、それらは「二重特異性」ＣＡＲとも呼ばれる。
【０１０５】
「生きている治療薬」の形態としてのＣＡＲ−Ｔ細胞に関する１つの主要な関心事は、インビボでのそれらの操作性およびそれらの潜在的な免疫刺激副作用である。ＣＡＲ−Ｔ治療法をより良く制御し、望ましくない副作用を防止するために、オフスイッチ、安全機構、および条件付き制御機構を含む様々な特徴が設計されてきた。例えば、自己破壊およびマーキングされた／タグ化されたＣＡＲ−Ｔ細胞の両方は、ＣＡＲ発現Ｔ細胞のクリアランスを促進する「オフスイッチ」を有するように操作される。自己破壊ＣＡＲ−ＴはＣＡＲを含むが、外因性分子の投与時に誘導可能なアポトーシス促進自殺遺伝子または「排除遺伝子」を発現するようにも操作される。ＨＳＶ−ＴＫ（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）、Ｆａｓ、ｉＣａｓｐ９（誘導性カスパーゼ９）、ＣＤ２０、ＭＹＣタグ、および切断型ＥＧＦＲ（内皮増殖因子受容体）を含む、種々の自殺遺伝子がこの目的のために使用され得る。例えば、ＨＳＫはプロドラッグガンシクロビル（ＧＣＶ）をＧＣＶ−三リン酸に変換し、ＧＣＶ−三リン酸はそれ自体を複製ＤＮＡに組み込み、最終的に細胞死をもたらす。ｉＣａｓｐ９は小分子ＡＰ１９０３に結合するＦＫ５０６結合タンパク質の成分を含むキメラタンパク質であり、カスパーゼ９の二量体化およびアポトーシスをもたらす。しかしながら、マーキングされた／タグ付けされたＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＡＲを有するが、選択マーカーを発現するように操作されたものである。この選択マーカーに対するｍＡｂの投与は、ＣＡＲ−Ｔ細胞のクリアランスを促進する。切断されたＥＧＦＲは、抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂによるそのような標的化可能な抗原の１つであり、セツキシマブの投与は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の排除を促進するように働く。これらの特徴を有するように作製されたＣＡＲは、「切り替え可能なＣＡＲ」の場合はｓＣＡＲ、「調整可能なＣＡＲ」の場合はＲＣＡＲとも呼ばれる。「阻害ＣＡＲ」（ｉＣＡＲ）としても知られる「安全ＣＡＲ」は、２つの抗原結合ドメインを発現するように操作される。これらの細胞外ドメインの１つは、腫瘍関連抗原に対するものであり、細胞内共刺激および刺激ドメインに結合している。しかしながら、第２の細胞外抗原結合ドメインは正常組織に特異的であり、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、またはＣＤ４５などの細胞内チェックポイントドメインに結合する。ｉＣＡＲへの複数の細胞内阻害ドメインの組み込みも可能である。これらの阻害ドメインを提供し得るいくつかの阻害分子には、Ｂ７−Ｈ１、Ｂ７−１、ＣＤ１６０、ＰＩＨ、２Ｂ４、ＣＥＡＣＡＭ（ＣＥＡＣＡＭ−１．ＣＥＡＣＡＭ−３、および／またはＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ−３、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡ、ＬＡＩＲ１、およびＴＧＦβ−Ｒが含まれる。正常組織の存在下で、この第２の抗原結合ドメインの刺激は、ＣＡＲを阻害するように働く。この二重抗原特異性のために、ｉＣＡＲはまた、二重特異性ＣＡＲ−Ｔ細胞の形態であることに注意すべきである。安全なＣＡＲ−Ｔエンジニアリングは、腫瘍組織に対するＣＡＲ−Ｔ細胞の特異性を増強し、特定の正常組織が、標準的なＣＡＲ（Ｍｏｒｇａｎ  ２０１０）を用いてオフターゲット効果を導く非常に低いレベルの腫瘍関連抗原を発現し得る状況において有利である。条件付きＣＡＲ−Ｔ細胞は、細胞内共刺激ドメインおよび別個の細胞内共刺激因子に連結された細胞外抗原結合ドメインを発現する。共刺激および刺激ドメイン配列は、外因性分子の投与の際に、得られるタンパク質が細胞内で一緒になってＣＡＲ回路を完成するように操作される。このようにして、ＣＡＲ−Ｔ活性化を調節することができ、場合によっては、特定の患者に「微調整」またはパーソナライズすることさえできる。二重ＣＡＲ設計と同様に、刺激および共刺激ドメインは条件付きＣＡＲにおいて不活性である場合に物理的に分離され、この理由のために、これらもまた「分割ＣＡＲ」と呼ばれる。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、これらの設計された特徴のうちの２つ以上を組み合わせて、強化された多機能ＣＡＲ−Ｔを作製することができる。例えば、ＴＲＵＣＫのようなサイトカインも放出する二重または条件付きＣＡＲ設計のいずれかを有するＣＡＲ−Ｔ細胞を作製することが可能である。いくつかの実施形態では、二重条件付きＣＡＲ−Ｔ細胞は、それぞれが対応する共刺激ドメインに結合する、２つの別個の癌抗原に対する２つの別個の抗原結合ドメインを有する２つのＣＡＲを発現するように作製され得る。共刺激ドメインは活性化分子が投与された後にのみ、刺激ドメインと共に機能的になる。このＣＡＲ−Ｔ細胞が有効であるためには、癌は癌抗原の両方を発現しなければならず、活性化分子を患者に投与しなければならない；この設計は、それによって二重および条件付きＣＡＲ−Ｔ細胞の両方の特徴を組み込む。
【０１０７】
典型的には、ＣＡＲ−Ｔ細胞はα−βＴ細胞を使用して作製されるが、γ−δＴ細胞もまた使用され得る。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ−Ｔ細胞を生成するために使用される、記載されるＣＡＲ構築物、ドメイン、および操作された特徴は、ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞、Ｂ細胞、肥満細胞、骨髄由来食細胞、およびＮＫＴ細胞を含む、他の型のＣＡＲ発現免疫細胞の生成において同様に使用され得る。あるいは、ＣＡＲ発現細胞はＴ細胞およびＮＫ細胞の両方の特性を有するように作製され得る。さらなる実施形態において、ＣＡＲで形質導入されたものは、自己由来であっても同種異系であってもよい。
【０１０８】
レトロウイルス形質導入（γ−レトロウイルスを含む）、レンチウイルス形質導入、トランスポゾン／トランスポザーゼ（Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ＢｅａｕｔｙおよびＰｉｇｇｙＢａｃ系）、およびメッセンジャーＲＮＡ転移媒介遺伝子発現を含む、ＣＡＲ発現のためのいくつかの異なる方法が使用され得る。遺伝子編集（遺伝子挿入または遺伝子欠失／破壊）は、ＣＡＲ−Ｔ細胞を操作する可能性に関してもますます重要になってきている。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９、ＺＦＮ（ジンクフィンガーヌクレアーゼ）、およびＴＡＬＥＮ（転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ）系は、ＣＡＲ−Ｔ細胞を作製することができる３つの潜在的な方法である。
【０１０９】
定義
用語「アミノ酸配列」は、アミノ酸残基を表す略語、文字、符号または単語のリストを指す。本明細書で使用されるアミノ酸の略語は、アミノ酸についての通常の１文字コードであり、以下のように表される：Ａ、アラニン；Ｂ、アスパラギンまたはアスパラギン酸；Ｃ、システイン；Ｄ、アスパラギン酸；Ｅ、グルタメート、グルタミン酸；Ｆ、フェニルアラニン；Ｇ、グリシン；Ｈ、ヒスチジン；Ｉ、イソロイシン；Ｋ、リジン；Ｌ、ロイシン；Ｍ、メチオニン；Ｎ、アスパラギン；Ｐ、プロリン；Ｑ、グルタミン；Ｒ、アルギニン；Ｓ、セリン；Ｔ、トレオニン；Ｖ、バリン；Ｗ、トリプトファン；Ｙ、チロシン；Ｚ、グルタミンまたはグルタミン酸。
【０１１０】
用語「抗体」は、免疫グロブリン、特異的結合能力を維持するその誘導体、および免疫グロブリン結合ドメインと相同または大部分が相同である結合ドメインを有するタンパク質を指す。これらのタンパク質は、天然の供給源に由来し得るか、または部分的にもしくは完全に合成的に産生され得る。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得る。抗体は、ヒトクラス：ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥのいずれかを含む、任意の種由来の任意の免疫グロブリンクラスのメンバーであり得る。例示的な実施形態では、本明細書に記載の方法および組成物と共に使用される抗体は、ＩｇＧクラスの誘導体である。無傷な免疫グロブリン分子に加えて、用語「抗体」には、それらの免疫グロブリン分子の断片またはポリマー、および標的抗原に選択的に結合する免疫グロブリン分子のヒトまたはヒト化バージョンも含まれる。
【０１１１】
用語「アプタマー」は、特定の標的分子に結合するオリゴ核酸またはペプチド分子を指す。これらの分子は一般に、ランダム配列プールから選択される。選択されたアプタマーは、独特の三次構造を適応させ、高い親和性および特異性で標的分子を認識することができる。「核酸アプタマー」はそのコンホメーションを介して標的分子に結合し、それによってそのような分子の機能を阻害または抑制するＤＮＡまたはＲＮＡオリゴ核酸である。核酸アプタマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの組み合わせによって構成され得る。「ペプチドアプタマー」は、定常足場タンパク質内に挿入された可変ペプチド配列を有するコンビナトリアルタンパク質分子である。ペプチドアプタマーの同定は、典型的にはストリンジェントな酵母ジハイブリッド条件下で行われ、これは選択されたペプチドアプタマーが安定に発現され、細胞内状況において正確に折り畳まれる確率を増強する。
【０１１２】
用語「担体」は、化合物または組成物と組み合わされた場合に、その意図された使用または用途のための化合物または組成物の調製、貯蔵、投与、送達、有効性、選択性、または任意の他の特色を補助または促進する、化合物、組成物、物質、または構造を意味する。例えば、担体は、活性成分の任意の分解を最小限にし、対象における任意の有害な副作用を最小限にするように選択することができる。
【０１１３】
用語「キメラ分子」は、天然の状態で別々に存在する２つ以上の分子を連結することによって作製される単一の分子を指す。単一のキメラ分子は、その構成分子の全ての所望の機能性を有する。キメラ分子の１つのタイプは、融合タンパク質である。
【０１１４】
用語「融合タンパク質」は、１つのポリペプチドのアミノ末端と別のポリペプチドのカルボキシル末端との間に形成されるペプチド結合を介して２つ以上のポリペプチドを連結することによって形成されるポリペプチドを指す。融合タンパク質は、構成ポリペプチドの化学的カップリングによって形成され得るか、または単一の連続する融合タンパク質をコードする核酸配列から単一のポリペプチドとして発現され得る。単鎖融合タンパク質は、単一の連続するポリペプチド骨格を有する融合タンパク質である。融合タンパク質は分子生物学における従来の技術を使用して調製され得、２つの遺伝子をインフレームで単一の核酸に連結し、次いで、融合タンパク質が産生される条件下で適切な宿主細胞において核酸を発現する。
【０１１５】
用語「同一性」は、２つの核酸分子またはポリペプチド間の配列同一性を指す。同一性は、比較の目的で整列され得る各配列における位置を比較することによって決定され得る。比較された配列中の位置が同じ塩基によって占められる場合、分子はその位置で同一である。核酸配列またはアミノ酸配列間の類似性または同一性の程度は、核酸配列によって共有される位置における同一または一致するヌクレオチドの数の関数である。ＧＣＧ配列分析パッケージ（ウィスコンシン大学、ウィスコンシン州マディソン）の一部として入手可能なＦＡＳＴＡまたはＢＬＡＳＴを含む、２つの配列間の同一性を計算するために、種々のアラインメントアルゴリズムおよび／またはプログラムが使用され得、例えば、デフォルト設定で使用され得る。例えば、本明細書に記載される特定のポリペプチドに対して少なくとも７０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有し、好ましくは実質的に同じ機能を示すポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが意図される。特に断らない限り、類似性スコアは、ＢＬＯＳＵＭ６２の使用に基づく。ＢＬＡＳＴＰを使用する場合、類似性パーセントはＢＬＡＳＴＰ陽性スコアに基づき、配列同一性パーセントはＢＬＡＳＴＰ同一性スコアに基づく。ＢＬＡＳＴＰ「同一性」は同一である高スコアリング配列対中の全残基の数および分率を示し；ＢＬＡＳＴＰ「陽性」はアラインメントスコアが陽性値を有し、互いに類似する残基の数および分率を示す。本明細書に開示されるアミノ酸配列に対して、これらの程度の同一性もしくは類似性または任意の中間程度の同一性もしくは類似性を有するアミノ酸配列が意図され、本開示によって包含される。類似のポリペプチドのポリヌクレオチド配列は、遺伝コードを用いて推定され、従来の手段、特に遺伝コードを用いてそのアミノ酸配列を逆翻訳することによって得ることができる。
【０１１６】
用語「核酸」は、１つのヌクレオチドの３’位でリン酸基によって別のヌクレオチドの５’末端に連結された単一のヌクレオチドまたは２つ以上のヌクレオチドを含む、天然または合成分子を指す。核酸は長さによって限定されず、従って、核酸はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含むことができる。
【０１１７】
用語「作動可能に連結された」は、核酸と別の核酸配列との機能的関係を指す。プロモーター、エンハンサー、転写および翻訳停止部位、ならびに他のシグナル配列は、他の配列に作動可能に連結された核酸配列の例である。例えば、転写制御エレメントへのＤＮＡの作動可能な連結は、ＤＮＡとプロモーターとの間の物理的および機能的関係を指し、その結果、このようなＤＮＡの転写はＤＮＡを特異的に認識し、結合し、転写するＲＮＡポリメラーゼによってプロモーターから開始される。
【０１１８】
用語「ペプチド」、「タンパク質」、および「ポリペプチド」は、１つのアミノ酸のカルボキシル基によって別のアミノ酸のαアミノ基に連結された２つ以上のアミノ酸を含む天然または合成分子を指すために互換的に使用される。
【０１１９】
用語「薬学的に許容される」は、健全な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または合理的な利益／リスク比に相応する他の問題もしくは合併症なしに、ヒトおよび動物の組織と接触して使用するのに適している化合物、材料、組成物、および／または剤形を指す。
【０１２０】
用語「タンパク質ドメイン」は、タンパク質の一部、タンパク質の部分、または構造的完全性を示すタンパク質全体を指し、この決定は、タンパク質の一部、タンパク質の部分、またはタンパク質全体のアミノ酸組成に基づき得る。
【０１２１】
本明細書中で使用される「スペーサー」は、融合タンパク質を含むタンパク質を連結するペプチドを指す。一般に、スペーサーは、タンパク質を連結するか、またはそれらの間のいくらかの最小距離もしくは他の空間的関係を保存する以外に、特定の生物学的活性を有さない。しかしながら、スペーサーの構成アミノ酸は、分子のフォールディング、正味電荷、または疎水性などの分子のいくつかの特性に影響を及ぼすように選択することができる。
【０１２２】
本明細書中で使用される用語「特異的に結合する」は、ポリペプチド（抗体を含む）または受容体を指す場合、タンパク質および他の生物学的製剤の異種集団におけるタンパク質またはポリペプチドまたは受容体の存在を決定する結合反応を指す。従って、指定された条件（例えば、抗体の場合のイムノアッセイ条件）下で、特定のリガンドまたは抗体は、サンプル中に存在する他のタンパク質に、またはリガンドもしくは抗体が生物中で接触し得る他のタンパク質に有意な量で結合しない場合、その特定の「標的」に「特異的に結合する」（例えば、抗体は、内皮抗原に特異的に結合する）。一般に、第二の分子に「特異的に結合する」第一の分子は、その第二の分子と約１０５Ｍ−１より大きい（例えば、１０６Ｍ−１、１０７Ｍ−１、１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１、および１０１２Ｍ−１以上）親和性定数（Ｋａ）を有する。
【０１２３】
本明細書で使用される用語「特異的に送達する」は、特定の標的分子またはマーカーを有する細胞または組織との（その標的分子を欠く細胞または組織とではない）分子の優先的関連を指す。もちろん、ある程度の非特異的相互作用が、分子と非標的細胞または組織との間で生じ得ることが認識される。それにもかかわらず、特異的送達は、標的分子の特異的認識によって媒介されるものとして区別され得る。典型的には、特異的送達は、送達された分子と標的分子を有する細胞との間の関連を、送達された分子と標的分子を欠く細胞との間の関連よりもはるかに強くする。
【０１２４】
用語「対象」は、投与または治療の標的である任意の個体を指す。対象は、脊椎動物、例えば哺乳動物であり得る。従って、対象はヒトまたは獣医学的患者であり得る。用語「患者」は、臨床医、例えば医師の治療下にある対象を指す。
【０１２５】
用語「治療的に有効な」は、使用される組成物の量が疾患または障害の１つ以上の原因または症状を改善するのに十分な量であることを指す。このような改善は減少または改変のみを必要とし、必ずしも排除する必要はない。
【０１２６】
用語「形質転換」および「トランスフェクション」は、核酸、例えば発現ベクターのレシピエント細胞への導入を意味し、該細胞の染色体ＤＮＡへの核酸の導入を含む。
【０１２７】
用語「治療」は、疾患、病的状態、または障害を治癒、改善、安定化、または予防することを意図した患者の医学的管理を指す。この用語は能動的治療、即ち、疾患、病的状態、または障害の改善に特に向けられた治療を含み、また、因果的治療、即ち、関連する疾患、病的状態、または障害の原因の除去に向けられた治療も含む。さらに、この用語は緩和的治療、即ち、疾患、病的状態、または障害の治癒よりもむしろ症状の軽減のために設計された治療；予防的治療、即ち、関連する疾患、病的状態、または障害の発生を最小限にするか、または部分的にもしくは完全に阻害することに向けられた治療；および支持的治療、即ち、関連する疾患、病的状態、または障害の改善に向けられた別の特定の治療法を補うために使用される治療を含む。
【０１２８】
用語「改変体」は、保存的アミノ酸置換、非保存的アミノ酸置換（即ち、縮重改変体）、アミノ酸をコードする各コドン（即ち、ＤＮＡおよびＲＮＡ）のウォブル位置内の置換、ペプチドのＣ末端に付加されたアミノ酸、または参照配列に対して６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するペプチドを指す。
【０１２９】
用語「ベクター」は、ベクター配列が連結されている別の核酸を細胞内に輸送することができる核酸配列を指す。用語「発現ベクター」は、細胞による発現に適した形態（例えば、転写制御エレメントに連結された）の遺伝子構築物を含む任意のベクター（例えば、プラスミド、コスミドまたはファージ染色体）を含む。
【０１３０】
本発明の多くの実施形態が記載されている。それにもかかわらず、様々な修正が本発明の精神および範囲から逸脱することなく行われることは理解されるであろう。従って、他の態様は下記の特許請求の範囲の範囲内にある。
【実施例】
【０１３１】
実施例１：
完全マウス抗マウスＣＤ１９構築物を開発して、ＣＤ１９標的ＣＡＲ  Ｔ細胞に対する標的としてＢ−ＡＬＬを検証した（Ｄａｖｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ８：ｅ６１３３８）。これは、ＣＤ２８共刺激ドメインを含む第２世代ｍ１９２８ｚ  ＣＡＲを含んでいた（図１）。ＣＡＲ  Ｔ細胞において使用されるＣＤ２８共刺激ドメインは内因性酵素活性を有さないが、Ｔ細胞シグナル伝達を調節するサブドメインまたはモチーフを含む、ＣＤ２８の細胞質尾部に由来する。ＹＭＮＭ（配列番号１）モチーフはＰＩ３ｋのｐ８５サブユニットに対する結合部位であり、ＣＤ２８共刺激は細胞周期進行、抗アポトーシス、および細胞代謝をもたらすＰＩ３ｋ活性化を支持する（Ｒｕｄｄ  ａｎｄ  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，２００３  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３：５４４−５５６；Ｓａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：１０４０−１０４６；Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｒｕｄｄ，２００８  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １８：４８６−４９３）。変異ＹＭＮＭ（配列番号１）ドメインを有するマウスの研究は、他の関連するインビボ欠損なしにＰＩ３ｋシグナル伝達を排除する（Ｄｏｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。ＣＤ２８のＰＹＡＰ（配列番号３）モチーフはＬＣＫに結合し、Ｔ細胞活性化およびＩＬ２産生を生じる（Ｈｏｌｄｏｒｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９０：３７５−３８４；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３：２９６−３０１）。Ｆｙｎ、Ｇｒｂ２およびＧＡＤＳを含むＳＨ３ドメインを有する他の分子もまた、ＰＹＡＰ（配列番号３）およびＰＲＲＰ（配列番号２）モチーフに結合する（Ｅｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０００  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６４：５８０５−５８１４；Ｏｋｋｅｎｈａｕｇ  ａｎｄ  Ｒｏｔｔａｐｅｌ，１９９８  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３：２１１９４−２１２０２）。ＰＹＡＰ（配列番号３）ドメインに変異を有するマウスは、ＣＤ２８依存性増殖、サイトカイン分泌、および適応免疫を著しく損なう（Ｂｕｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６６：５３３１−５３３５；Ｄｏｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２９：３７１０−３７２１；Ｆｒｉｅｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００６  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０３：２１２１−２１３３）。まとめると、これらの結果は、ＣＤ２８サブドメインが異なるシグナル伝達および機能経路を媒介し、Ｔ細胞機能に差次的に必要とされることを実証する。さらに、ＣＤ２８は低レベルのＴＣＲシグナルを増幅することが知られており（Ａｃｕｔｏ  ａｎｄ  Ｍｉｃｈｅｌ，２００３  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３：９３９−９５１）、データは低レベルの緊張性ＣＡＲシグナル伝達がＣＤ２８によって増幅され、インビボでＣＡＲ  Ｔ細胞枯渇をもたらすモデルを支持する。これらのサブドメインおよびそれらのシグナル伝達経路がどのようにＣＡＲ−Ｔ細胞機能を調節するかは不明であったので、実験を行って、それらの役割を定義し、ヒト翻訳のための最適なシグナル伝達構築物を設計した。従って、ＹＭＮＭ（配列番号１）、ＰＲＲＰ（配列番号２）、またはＰＹＡＰ（配列番号３）サ���ドメインにおける一連の７つの変異体を設計した（図２Ａ）。これらのＣＡＲ構築物は、単一のサブドメインのヌル変異（Ｍｕｔ０１−Ｍｕｔ０３）または単一の機能的サブドメインのみを残す２つの変異サブドメイン（Ｍｕｔ０４−Ｍｕ０６）のいずれかを含む。三重変異体（Ｍｕｔ０７）もまた、３つのサブドメイン全てが変異した状態で作製した。ＣＤ２８Ｍｕｔ  ＣＡＲはＮｕｒ７７ＧＦＰマウス由来のＴ細胞で評価され、支持されている全てのＣＡＲシグナル伝達が決定されたが、二重変異体（Ｍｕｔ０４−Ｍｕｔ０６）は第１世代ｍ１９ｚ  ＣＡＲと類似したレベルでＮｕｒ７７ＧＦＰが低かった（図１４Ｂ）。これらのＣＤ２８変異体および他の新規ＣＡＲ設計を使用して、ＣＡＲ  Ｔ細胞枯渇のメカニズムをＣＤ２８共刺激によって評価し、枯渇を減少させて持続性を増強する方法を同定した。
【０１３２】
ＣＤ１９標的ＣＡＲ  Ｔ細胞のインビトロおよびインビボ機能に対するＣＤ２８共刺激サブドメインの調節的役割を決定するために、各サブドメインがＣＡＲ  Ｔ細胞機能にどのように寄与するかを、ＣＤ２８変異体を用いて定義した（図２Ａ）。ＣＤ２８変異体ＣＡＲ  Ｔ細胞のサイトカイン産生および記憶サブセットを評価したところ、二重変異体（Ｍｕｔ０４−０６）は、単一変異体（Ｍｕｔ０１−０３）と比較してＩＦＮγ分泌が増強されているが、全てのＣＤ２８変異体は、同様に低下したレベルのＩＬ２を産生することが実証された（図３Ａ−Ｂ）。ＣＭおよびＥＭ  ＣＡＲ  Ｔ細胞サブセットは、大部分保存されていたが、Ｍｕｔ０４がＣＭを減少させ、ＥＭサブセットを増加させるなど、様々な効果があった（図３Ｃ−Ｄ）。これらの結果は、ＡＰ１、ＮＦＡＴ、またはＮＦＫＢのような転写経路の示差的誘導に関連し得るＣＤ２８変異体における示差的結果を実証する。これらの修飾は、反応率を改善し、再発関連を減少させ、最も重要なことに、治療抵抗性癌を有する患者の生存を改善するためのＣＡＲ設計の改良として役立つことができる。
【０１３３】
実施例２：
ＣＤ２８変異ＣＡＲ細胞のインビトロおよびインビボ機能をさらに評価するために、Ｔ細胞マウスＴ細胞をＣＡＲで修飾し、生存率（図４）および増殖（図５）に対するそれらの影響を決定した。分泌されたサイトカイン産生はまた、正常な野生型マウスからＣＡＲ  Ｔ細胞を作製し、３Ｔ３−ｍＣＤ１９と一晩インキュベートし、次いで分泌されたサイトカインレベルを測定することによって特徴付けられた。Ｍｕｔ０６  ＣＡＲ  Ｔ細胞は非変異１９２８ｚと比較して有意に少ないサイトカインを産生するが、第一世代ＣＡＲと比較して有意に多いサイトカインを産生する（図６Ａ〜６Ｄ）。標的細胞毒性はまた、正常野生型マウスからＣＡＲ  Ｔ細胞を作製し、３Ｔ３−ｍＣＤ１９とインキュベートし、１週間にわたってＲＴＣＡによる標的死滅を測定することによって特徴付けられた。ＣＤ２８変異ＣＡＲ  Ｔ細胞は、非変異ＣＡＲ  Ｔ細胞と同様に殺傷するが、低Ｅ：Ｔ比では、ｍｕｔ０６死滅が優位である（図７Ａおよび７Ｂ）。１ｘ１０６  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＣＤ３＋  ＣＡＲ＋）をシトキサン（３００ｍｇ／ｋｇ）前処理野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに静脈注射した後、血液のシリアルフローサイトメトリーによりＢ細胞死滅およびＣＡＲ  Ｔ細胞残存を監視した。１週目（図８Ａ、８Ｂ）、２週目（図８Ｃ、８Ｄ）、４週目（図８Ｅ、８Ｆ）、および６週目（図８Ｇ、８Ｈ）において、マウスＭｕｔ０６および１９２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、インビボで類似のＢ細胞殺傷およびＣＡＲ  Ｔ細胞数を示す（図８Ａ〜８Ｈ、９Ａ〜９Ｄ）。種々のＣＤ１９標的ＣＡＲ  Ｔ細胞による白血病のインビボ殺傷も比較した。Ｅｕ−ＡＬＬ細胞を野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに注射して６日後にシトキサン（３００ｍｇ／ｋｇ）をｉ．ｐ．投与した後、１日後に３ｘ１０５のＣＡＲ  Ｔ細胞を経静脈投与した。Ｅｕ−ＡＬＬ腫瘍を有するマウスは、ｍｕｔ０６  ＣＡＲ  Ｔ細胞を与えた場合、１９２８ｚ  ＣＲＡ  Ｔ細胞と比較して有意に長い生存を有する（図１０）。これらの観察はまた、ヒトＣＤ２８変異、ヒトＣＤ１９標的ＣＡＲ  Ｔ細胞にも拡張された。健康なドナーから得られ、ヒトＣＤ１９標的化ＣＡＲ  Ｔ細胞構築物で修飾されたＴ細胞を用いて、生存率、増殖、および細胞毒性を評価した。ＣＤ２８変異ヒトＣＡＲ  Ｔ細胞の生存率および増殖は、トリパンブルー細胞計数によってアッセイした場合、産生の終わりに非変異ＣＡＲ  Ｔ細胞に類似している（図１１Ａおよび１１Ｂ）。また、全てのヒトＣＡＲ  Ｔ細胞は、ヒトＣＤ１９を発現する３Ｔ３細胞での刺激後、インビトロで同様の増殖を示した（図１２）。非変異ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して、ヒトｍｕｔ０６  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＲＴＣＡによって測定した場合、同様に３Ｔ３−ヒトＣＤ１９細胞を死滅させる（図１３）。
【０１３４】
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、開示される発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に引用される刊行物およびそれらが引用される材料は、参照により特に組み込まれる。
【０１３５】
当業者は、定型的な実験のみを用いて、本明細書に説明した発明の特定の実施形態についての多くの等価物を認識しまたは確認することができる。このような等価物は以下の特許請求項の範囲に包含されるものとする。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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