(57)【要約】  本発明は、対象者、特に、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＦＬＤ）やＮＡＳＨに罹患した対象者の非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）及び／又は肝線維症ステータスを、僅か３つ以上の特定のバイオマーカのレベルに基づいて、診断する方法を提供する。本発明は、該方法を実施するのに好適なキット及び該方法の使用及び開示された方法に従って診断された患者を治療する方法をさらに提供する。
2020527716.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象者の非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）及び／又は肝線維症ステータスを診断する方法であって、
（Ｉ）対象者から得られた試料において、炎症誘発サイトカイン、ケモカイン及び細胞接着及び組織モデリングに寄与するグリコサミノグリカンである少なくとも３つのバイオマーカのレベルを測定し、
（ＩＩ）数理モデルにおいて、ステップ（Ｉ）で測定した前記少なくとも３つのバイオマーカのレベルを組み合わせ、
（ＩＩＩ）前記対象者がＮＡＳＨに罹患しているか、及び／又はその肝線維症ステータスを判断する、
方法。
【請求項２】
（ｉ）前記炎症誘発サイトカインは、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β１、ＩＬ−１β、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２及びＩＬ−１８からなる群から選択され、及び／又は
（ｉｉ）前記ケモカインは、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ１１からなる群から選択され、及び／又は
(ｉｉｉ）細胞接着及び組織モデリングに寄与する前記グリコサミノグリカンは、ヒアルロン酸（ＨＡ）、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン及びケラタン硫酸からなる群から選択される、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（Ｉ）において、前記バイオマーカＩＬ−８、ＣＸＣＬ１０及びＨＡの少なくともレベルを測定する、
請求項１又は２に記載の方法
【請求項４】
（ｉ）ステップ（Ｉ）において、前記対象者から得られた試料で、前記バイオマーカグレリン、ハプトグロビン及びプレＨＰ２の１つ以上のレベルを測定し、前記１つ以上のレベルを組み合わせステップ（ＩＩ）に含め、及び／又は
（ｉｉ）ステップ（Ｉ）において、肝硬度、年齢、性別、ＢＭＩ及び高血圧及び／又は血圧から選択される前記対象者の１つ以上のバイオマーカのレベルを測定し、前記１つ以上のバイオマーカを、組み合わせステップ（ＩＩ）に含めることをさらに含む、
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記数理モデルは、教師付き分類に適した数理モデルであり、例えば、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）、ランダムフォレスト、決定木、勾配ブースティング及びロジスティック回帰から選択され、好ましくは、ロジスティック回帰である、
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ロジスティック回帰の関数は、
【数１】
2020527716.tif 000058
であり、
式（１）のｙは
【数２】
2020527716.tif 000059
と定義される、
請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ｙはｙ１であり、
【数３】
2020527716.tif 000060
（ｉ）ＮＡＳＨを診断するための係数
ａ１は、−９〜１２の範囲に含まれ、
ａ２は、０〜２の範囲に含まれ、
ａ３は、−１〜２の範囲に含まれ、
ａ４は、−１〜１の範囲に含まれ、及び／又は
（ｉｉ）肝線維症ステータスを診断するための係数
ａ１は、−２０１２７〜−２の範囲に含まれ、
ａ２は、０〜１４５９の範囲に含まれ、
ａ３は、−１〜１２９の範囲に含まれ、
ａ４は、−２４〜１の範囲に含まれる、
請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ｙはｙ１０であり、
【数４】
2020527716.tif 000061
式（３）に用いる各バイオマーカについて、指示関数ｉｋ（ｋ＝５，…，１２）は１に等しく、用いないバイオマーカについては、指示関数ｉｋは、０に等しく、
（ｉ）ＮＡＳＨを診断するための係数
ａ１は、−９〜１２の範囲に含まれ、
ａ２は、０〜２の範囲に含まれ、
ａ３は、−１〜２の範囲に含まれ、
ａ４は、−１〜１の範囲に含まれ、
ａ５は、−１〜１の範囲に含まれ、
ａ６は、−１〜１の範囲に含まれ、
ａ７は、−１〜１の範囲に含まれ、
ａ８は、−１〜１の範囲に含まれ、
ａ９は、−１〜１の範囲に含まれ、
ａ１０は、−３〜２の範囲に含まれ、
ａ１１は、−１〜１の範囲に含まれ、
ａ１２は、−１〜１の範囲に含まれ、及び／又は
（ｉｉ）肝線維症ステータスを診断するための係数
ａ１は、−２０１２７〜２の範囲に含まれ、
ａ２は、０〜１４５９の範囲に含まれ、
ａ３は、−１〜１２９の範囲に含まれ、
ａ４は、−２４〜１の範囲に含まれる、
ａ５は、−１〜１１の範囲に含まれる、
ａ６は、−４〜４の範囲に含まれる、
ａ７は、−２９〜５の範囲に含まれる、
ａ８は、−１〜４６２の範囲に含まれる、
ａ９は、−１〜１の範囲に含まれる、
ａ１０は、−１〜０の範囲に含まれる、
ａ１１は、−１〜１の範囲に含まれる、
ａ１２は、−３２〜１１の範囲に含まれる、
請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
ａ）前記バイオマーカＩＬ−８、ＨＡ、ＣＸＣＬ１０及びグレリンのレベルは、ステップ（Ｉ）で測定され、ｙはｙ２であり、
【数５】
2020527716.tif 000062
（ｉ）ＮＡＳＨを診断するための係数
ａ１は、−９〜１２の範囲に含まれ、
ａ２は、０〜２の範囲に含まれ、
ａ３は、−１〜２の範囲に含まれ、
ａ４は、−１〜１の範囲に含まれ、及び／又は
（ｉｉ）肝線維症ステータスを診断するための係数
ａ１は、−２０１２７〜−２の範囲に含まれ、
ａ２は、０〜１４５９の範囲に含まれ、
ａ３は、−１〜１２９の範囲に含まれ、
ａ４は、−２４〜１の範囲に含まれ、
ａ６は、−１〜１１の範囲に含まれ
又は、
ｂ）前記バイオマーカＩＬ−８、ＨＡ、ＣＸＣＬ１０及びプレＨＰ２のレベルは、ステップ（Ｉ）で測定され、ｙはｙ３であり、
【数６】
2020527716.tif 000063
（ｉ）ＮＡＳＨを診断するための係数
ａ１は、−９〜１２の範囲に含まれ、
ａ２は、０〜２の範囲に含まれ、
ａ３は、−１〜２の範囲に含まれ、
ａ４は、−１〜１の範囲に含まれ、
ａ５は、−１〜１の範囲に含まれ、及び／又は
（ｉｉ）肝線維症ステータスを診断するための係数
ａ１は、−２０１２７〜−２の範囲に含まれ、
ａ２は、０〜１４５９の範囲に含まれ、
ａ３は、−１〜１２９の範囲に含まれ、
ａ４は、−２４〜１の範囲に含まれ、
ａ５は、−４〜４の範囲に含まれ、
又は、
ｃ）前記バイオマーカＩＬ−８、ＨＡ、ＣＸＣＬ１０及び肝硬度のレベルは、ステップ（Ｉ）で測定され、ｙはｙ４であり、
【数７】
2020527716.tif 000064
（ｉ）ＮＡＳＨを診断するための係数
ａ１は、−９〜１２の範囲に含まれ、
ａ２は、０〜２の範囲に含まれ、
ａ３は、−１〜２の範囲に含まれ、
ａ４は、−１〜１の範囲に含まれ、
ａ５は、−１〜１の範囲に含まれ、及び／又は
（ｉｉ）肝線維症ステータスを診断するための係数
ａ１は、−２０１２７〜−２の範囲に含まれ、
ａ２は、０〜１４５９の範囲に含まれ、
ａ３は、−１〜１２９の範囲に含まれ、
ａ４は、−２４〜１の範囲に含まれ、
ａ５は、−１〜４６２の範囲に含まれ、
又は、
ｄ）前記バイオマーカＩＬ−８、ＨＡ、ＣＸＣＬ１０、グレリン及びプレＨＰ２のレベルは、ステップ（Ｉ）で測定され、ｙはｙ５であり、
【数８】
2020527716.tif 000065
（ｉ）ＮＡＳＨを診断するための係数
ａ１は、−９〜１２の範囲に含まれ、
ａ２は、０〜２の範囲に含まれ、
ａ３は、−１〜２の範囲に含まれ、
ａ４は、−１〜１の範囲に含まれ、
ａ５は、−１〜１の範囲に含まれ、
ａ６は、−１〜１の範囲に含まれ、及び／又は
（ｉｉ）肝線維症ステータスを診断するための係数
ａ１は、−２０１２７〜−２の範囲に含まれ、
ａ２は、０〜１４５９の範囲に含まれ、
ａ３は、−１〜１２９の範囲に含まれ、
ａ４は、−２４〜１の範囲に含まれ、
ａ５は、−１〜１１の範囲に含まれ、
ａ６は、−４〜４の範囲に含まれ、
又は、
ｅ）前記バイオマーカＩＬ−８、ＨＡ、ＣＸＣＬ１０、グレリン及び肝硬度のレベルは、ステップ（Ｉ）で測定され、ｙはｙ６であり、
【数９】
2020527716.tif 000066
（ｉ）ＮＡＳＨを診断するための係数
ａ１は、−９〜１２の範囲に含まれ、
ａ２は、０〜２の範囲に含まれ、
ａ３は、−１〜２の範囲に含まれ、
ａ４は、−１〜１の範囲に含まれ、
ａ５は、−１〜１の範囲に含まれ、
ａ６は、−１〜１の範囲に含まれ、及び／又は
（ｉｉ）肝線維症ステータスを診断するための係数
ａ１は、−２０１２７〜−２の範囲に含まれ、
ａ２は、０〜１４５９の範囲に含まれ、
ａ３は、−１〜１２９の範囲に含まれ、
ａ４は、−２４〜１の範囲に含まれ、
ａ５は、−１〜１１の範囲に含まれ、
ａ６は、−１〜４６２の範囲に含まれ、
又は、
ｆ）前記バイオマーカＩＬ−８、ＨＡ、ＣＸＣＬ１０、プレＨＰ２及び肝硬度のレベルは、ステップ（Ｉ）で測定され、ｙはｙ７であり、
【数１０】
2020527716.tif 000067
（ｉ）ＮＡＳＨを診断するための係数
ａ１は、−９〜１２の範囲に含まれ、
ａ２は、０〜２の範囲に含まれ、
ａ３は、−１〜２の範囲に含まれ、
ａ４は、−１〜１の範囲に含まれ、
ａ５は、−１〜１の範囲に含まれ、
ａ６は、−１〜１の範囲に含まれ、及び／又は
（ｉｉ）肝線維症ステータスを診断するための係数
ａ１は、−２０１２７〜−２の範囲に含まれ、
ａ２は、０〜１４５９の範囲に含まれ、
ａ３は、−１〜１２９の範囲に含まれ、
ａ４は、−２４〜１の範囲に含まれ、
ａ５は、−４〜４の範囲に含まれ、
ａ６は、−１〜４６２の範囲に含まれ、
又は、
ｇ）前記バイオマーカＩＬ−８、ＨＡ、ＣＸＣＬ１０、グレリン、プレＨＰ２及び肝硬度のレベルは、ステップ（Ｉ）で測定され、ｙはｙ８であり、
【数１１】
2020527716.tif 000068
（ｉ）ＮＡＳＨを診断するための係数
ａ１は、−９〜１２の範囲に含まれ、
ａ２は、０〜２の範囲に含まれ、
ａ３は、−１〜２の範囲に含まれ、
ａ４は、−１〜１の範囲に含まれ、
ａ５は、−１〜１の範囲に含まれ、
ａ６は、−１〜１の範囲に含まれ、及び／又は
（ｉｉ）肝線維症ステータスを診断するための係数
ａ１は、−２０１２７〜−２の範囲に含まれ、
ａ２は、０〜１４５９の範囲に含まれ、
ａ３は、−１〜１２９の範囲に含まれ、
ａ４は、−２４〜１の範囲に含まれ、
ａ５は、−１〜１１の範囲に含まれ、
ａ６は、−４〜４の範囲に含まれ、
ａ７は、−１〜４６２の範囲に含まれ、
又は、
ｈ）前記バイオマーカＩＬ−８、ＨＡ、ＣＸＣＬ１０、グレリン、プレＨＰ２、ハプトグロビン、肝硬度、年齢、性別、ＢＭＩ及び高血圧（又は血圧）のレベルは、ステップ（Ｉ）で測定され、ｙはｙ９であり、
【数１２】
2020527716.tif 000069
（ｉ）ＮＡＳＨを診断するための係数
ａ１は、−９〜１２の範囲に含まれ、
ａ２は、０〜２の範囲に含まれ、
ａ３は、−１〜２の範囲に含まれ、
ａ４は、−１〜１の範囲に含まれ、
ａ５は、−１〜１の範囲に含まれ、
ａ６は、−１〜１の範囲に含まれ、
ａ７は、−１〜１の範囲に含まれ、
ａ８は、−１〜１の範囲に含まれ、
ａ９は、−１〜１の範囲に含まれ、
ａ１０は、−３〜２の範囲に含まれ、
ａ１１は、−１〜１の範囲に含まれ、
ａ１２は、−１〜１の範囲に含まれ、及び／又は
（ｉｉ）肝線維症ステータスを診断するための係数
ａ１は、−２０１２７〜−２の範囲に含まれ、
ａ２は、０〜１４５９の範囲に含まれ、
ａ３は、−１〜１２９の範囲に含まれ、
ａ４は、−２４〜１の範囲に含まれ、
ａ５は、−１〜１１の範囲に含まれ、
ａ６は、−４〜４の範囲に含まれ、
ａ７は、−２９〜５の範囲に含まれ、
ａ８は、−１〜４６２の範囲に含まれ、
ａ９は、−１〜１の範囲に含まれ、
ａ１０は、−１〜０の範囲に含まれ、
ａ１１は、−１〜１の範囲に含まれ、
ａ１２は、−３２〜１１の範囲に含まれる、
請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
（ｉ）ＮＡＳＨを診断するための前記係数ａｋで得られた前記スコアｆが、＞値ｔ＿ＮＡＳＨのとき、前記対象者はＮＡＳＨに罹患されていると判断され、そうでなく、ｆ≦ｔ＿ＮＡＳＨの場合は、前記対象者はＮＡＳＨに罹患していないと判断され、
ｔ＿ＮＡＳＨは、範囲［０，１］に含まれる値、好ましくは、表４ａ及び４ｂに「Ｒａｎｇｅ＿Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＿ｒｏｕｎｄｅｄ＿ｇｌｏｂａｌ」で示される範囲に含まれる値、より好ましくは、表４ａ及び４ｂに「Ｒａｎｇｅ＿Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ」又は「Ｒａｎｇｅ＿Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＿ｒｏｕｎｄｅｄ」で示される範囲に含まれる値、さらにより好ましくは、表４ａ及び４ｂに「Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ」で示される範囲に含まれる値を有し、例えば、ｙがｙ９又はｙ１０のとき、ｔ＿ＮＡＳＨは、０．６５の値を有し、
（ｉｉ）線維症ステージ判断のための前記係数ａｋで得られた前記スコアｆが、＞ｔ＿ｆｉｂｒｏｓｉｓのとき、線維症スコアＦ≧３に対応する前記対象者の肝線維症ステータスは進行性線維症と判断され、そうでなく、ｆ≦ｔ＿ｆｉｂｒｏｓｉｓの場合は、前記対象者の前記肝線維症ステータスは、線維症スコアＦ＜３に対応すると判断され、
ｔ＿ｆｉｂｒｏｓｉｓは、範囲［０，１］に含まれる値、好ましくは、表５ａ及び５ｂに「Ｒａｎｇｅ＿Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＿ｒｏｕｎｄｅｄ＿ｇｌｏｂａｌ」で示される範囲に含まれる値、より好ましくは、表５ａ及び５ｂに「Ｒａｎｇｅ＿Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ」又は「Ｒａｎｇｅ＿Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＿ｒｏｕｎｄｅｄ」で示される範囲に含まれる値、さらにより好ましくは、表５ａ及び５ｂに「Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ」で示される範囲に含まれる値を有し、例えば、ｙがｙ９又はｙ１０のとき、０．５である、
請求項６〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
（ｉ）前記肝線維症ステータスが、ＮＡＳＨを罹患した対象者において判断される、及び／又は
（ｉｉ）ＮＡＳＨ診断及び／又は前記肝線維症ステータスの判断が、
ａ）肝疾患、特に、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＦＬＤ）又はＮＡＳＨの罹患が疑われる患者において、及び／又は
ｂ）肝疾患、特に、ＮＡＦＬＤがあると以前に診断された対象者において、及び／又は
ｃ）肥満の対象者、又は心血管疾患又は糖尿病のような肝病変を引き起こす代謝異常を罹患した、又は罹患が疑われる対象者において、なされ、及び／又は
（ｉｉｉ）前記試料は、血液試料、例えば、血清又は血漿試料、又はＣＳＦ又は尿の試料である、
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
対象者、好ましくは、肝疾患に罹患した対象者、より好ましくは、ＮＡＳＨ又はＮＡＳＨに罹患した対象者のＮＡＳＨ及び／又は肝線維症ステータスを診断するキットであって、
（ｉ）対象者から得られた試料において、好ましくは請求項２又は３に記載の炎症誘発サイトカイン、ケモカイン及び細胞接着及び組織モデリングに寄与するグリコサミノグリカンである少なくとも３つのバイオマーカのレベルを測定するための試薬と、
（ｉｉ）
（ａ）数理モデルにおいて、前記バイオマーカのレベルを組み合わせ、
（ｂ）前記数理モデルからスコアを得、
（ｃ）診断を行い、
（ｄ）前記バイオマーカレベルを、前記バイオマーカの閾値レベルと比較し、
（ｅ）ステップ（ｄ）で行った比較に基づいて、ＮＡＳＨの診断を行う
ための指示と、
を具備するキット。
【請求項１３】
対象者から得られた試料において、前記バイオマーカ、グレリン、ハプトグロビン及びプレＨＰ２のうち１つ以上のレベルを測定するための試薬をさらに含む、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
（ｉ）バイオマーカの前記レベルの測定は、ＥＬＩＳＡ、ルミネックスマルチプレクス技術、マイクロアレイ又は臨床現場即時検査により行われ、及び／又は
（ｉｉ）前記試料は、血液試料、例えば、血清又は血漿試料、又はＣＳＦ又は尿の試料である、
請求項１２又は１３に記載のキット。
【請求項１５】
対象者の非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）及び／又は肝線維症ステータスを診断する方法であって、
（Ｉ）対象者から得られた試料において、炎症誘発サイトカイン、ケモカイン及び細胞接着及び組織モデリングに寄与するグリコサミノグリカンである少なくとも３つのバイオマーカのレベルを測定し、
（ＩＩ）前記少なくとも３つのバイオマーカの測定レベルを、少なくとも３つのバイオマーカのそれぞれについての特定の閾値と比較し、
（ＩＩＩ）前記少なくとも３つのバイオマーカのそれぞれについての特定の閾値と比較した、少なくとも３つのバイオマーカのそれぞれのレベルに基づいて、すなわち、特定のバイオマーカの測定レベルが、そのバイオマーカの特定の閾値より高いか低いかによって、対象者が、ＮＡＳＨに罹患しているか、及び／又は肝線維症ステータスを判断する、
方法。
【請求項１６】
（ｉ）前記炎症誘発サイトカインは、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β１、ＩＬ−１、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２及びＩＬ−１８からなる群から選択され、及び／又は
（ｉｉ）前記ケモカインは、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ１１からなる群から選択され、及び／又は
(ｉｉｉ）細胞接着及び組織モデリングに寄与する前記グリコサミノグリカンは、ヒアルロン酸（ＨＡ）、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン及びケラタン硫酸からなる群から選択される、
請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ステップ（Ｉ）において、前記バイオマーカＩＬ−８、ＣＸＣＬ１０及びＨＡの少なくともレベルを測定する、
請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
（ｉ）ステップ（Ｉ）において、前記対象者から得られた試料で、前記バイオマーカグレリン、ハプトグロビン及びプレＨＰ２の１つ以上のレベルを測定し、前記１つ以上のバイオマーカの前記測定レベルを、前記１つ以上のバイオマーカの閾値レベルと比較し、及び／又は
（ｉｉ）ステップ（Ｉ）において、肝硬度、年齢、性別、ＢＭＩ及び高血圧及び／又は血圧から選択される前記対象者の１つ以上のバイオマーカのレベルを測定し、前記１つ以上のバイオマーカを、組み合わせステップ（ＩＩ）に含めることをさらに含む、
請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜１１又は１５〜１８のいずれか１項に記載の方法における、
請求項１２〜１４のいずれか１項に記載のキットの使用。
【請求項２０】
ＮＡＳＨと診断された対象者を治療する方法であって、
（ａ）請求項１〜１１又は１５〜１８のいずれか１項に規定された方法に従って、対象者のＮＡＳＨを診断し、
（ｂ）ＮＡＳＨの前記対象者を治療する、
方法。
【請求項２１】
前記方法は、ロジグリタゾンやピログリタゾンのようなグリタソンを単体又はビタミンＥと組み合わせて、ＧＳ−９６７４、ＬＪＮ−４５２（トロピフェキソール）、ＥＤＰ−３０５及びオベチコール酸のようなＦＸＲアゴニスト、エラフィブラノール、サログリタザール、ＩＶＡ−３３７のようなＰＰＡＲα及びＰＰＡＲβ（ＰＰＡＲδとしても知られている）及び／又はＰＰＡＲγアゴニスト、ＮＧＭ−２８２のようなＦＧＦ−１９類似体、ＰＦ−０５２３１０２３のようなＦＧＦ２１類似体（ＣＶＸ−３４３）、アラムコールのようなＳＤＤ１阻害剤、リラグルチドのようなＧＬＰ−１類似体、ノル−ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、ビタミンＥのような酸化防止剤、ＧＳ−４９９７（ｓｅｌｅｏｎｓｅｒｔｉｂ）のようなＡＳＫ１阻害剤、ＰＸＳ−４７２８Ａ（４−［（Ｅ）−２−（アミノメチル）−３−フルオロプロ−２−ペンオキシ］−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルベンズアミド）のようなＶＡＰ−１阻害剤、セニクリビオクのようなＣＣＲ２／ＣＣＲ５アンタゴニスト、ＶＬＸ−１０３（イセチオン酸ペンタミジン）のようなペンタミジン、エムリカサンのようなカスパーゼ阻害剤、シンツズマブのようなＬＯＸＬ２阻害剤、及び／又はガラクトアラビノラムノガラクツロン酸（ＧＲ−ＭＤ−０２）のようなガレクチン−３プロテイン阻害剤を、ＮＡＳＨ及び／又は肝線維症と診断された対象者に投与することを含む、
請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記方法は、
（ａ）約５０ｍｇ／ｄ〜約１２０ｍｇ／ｄの量のエラフィブラノール、
（ｂ）約４ｍｇ／ｄ〜約２０ｍｇ／ｄの量のサログリタザール、
（ｃ）約１０ｍｇ／ｄ〜約２５ｍｇ／ｄの量のオベチコール酸、
（ｄ）約２ｍｇ／ｄ〜約２０ｍｇ／ｄの量のＬＮＪ４５２（トロピフェキソール）、
（ｅ）約１ｍｇ／ｄ〜約６ｍｇ／ｄの量のＮＧＭ２８２（ＭＲＤＳＳＰＬＶＨＹＧＷＧＤＰＩ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、
（ｆ）約４００ｍｇ〜約６００ｍｇの量のアラムコリン、
（ｇ）約６ｍｇ／ｄ〜約４０ｍｇ／ｄの量のＧＳ−４９９７（ｓｅｌｏｎｓｅｒｔｉｂ）単体又は１週間毎又は２週間毎に約１２５ｍｇの量のｓｉｍｔｕｚｕｍａｂとの組み合わせ、
（ｈ）約６ｍｇ／ｄ〜約４０ｍｇ／ｄの量のＧＳ−４９９７（ｓｅｌｏｎｓｅｒｔｉｂ）単体又は約３０ｍｇ／ｄ〜約２００ｍｇ／ｄの量のフェノフィブラートとの組み合わせ、
（ｉ）約７５ｍｇ／日〜約１５０ｍｇ／ｄの量のセニクリビロク、
（ｊ）約５ｍｇ／ＢＩＤ〜約５０ｍｇ／ＢＩＤの量のエミカサン、
（ｋ）１週間毎又は２週間毎に約７５ｍｇ〜約７００ｍｇ及び／又は１週間毎又は２週間毎に約７５ｍｇ〜約２００ｍｇの量のシンツズマブ、
（ｌ）隔週で約２ｍｇ／ｄ〜１０ｍｇ／ｋｇ徐脂肪体重の量のＧＲ−ＭＤ−０２（ガラクトアラビノラムノガラクツロン酸）、
（ｍ）約３０ｍｇ／ｄの量のピオグリタゾン単体又は約８００ＩＵ／ｄの量のビタミンＥとの組み合わせ、
（ｎ）約４５ｍｇ／ｄの量のピオグリタゾン、
（ｏ）約１００ｍｇ／ｄ〜約３００ｍｇ／ｄの量のアラムコール、
（ｐ）約１．８ｍｇ／ｄの量のリラグルチド、
（ｑ）約５ｍｇ／ｄ〜約５０ｍｇ／日の量で皮下投与されるＢＭＳ  １３０  ０４５（ＢＭＳ  ９８６０３６、ＰＥＧ化ＦＧＦ２１（ＣＡＳ登録番号１９６６９７７−７０−７）、
（ｒ）約５ｍｇ／ｓ〜約５０ｍｇ／ｄの量のＥＤＰ−３０５、
（ｓ）１日３回までで約３００ｍｇ〜約１５００ｍｇの量のＩＭＭ−１２４Ｅ（抗ＬＰＳ抗体で強化されたカプセル化高免疫ウシ初乳）、
（ｔ）約２００ｍｇ／ｄ〜約１２００ｍｇ／ｄ又は約４００ｍｇ／ｄの量のＩＶＡ３３７（ｌａｎｉｆｉｂｒａｎｏｒ）、
（ｕ）約５ｍｇ／ｄ〜約７５０ｍｇ／ｄの量のＬＭＢ７６３、
（ｖ）約１００ｍｇ／ｄ〜約３００ｍｇ／ｄの量のＬＩＫ０６６（ｌｉｃｏｇｌｉｆｌｏｚｉｎ）、
（ｗ）約６０ｍｇ／ｄ〜約１００ｍｇ／ｄの量のＭＧＬ−３１９６（Ｃａｓ登録番号９２０５０９−３２−６）、
（ｘ）約５０ｍｇ／ｄ〜約３００ｍｇ／ｄの量のＭＳＤＣ  ０６０２Ｋ（ＣＡＳ登録番号１１３３８１９−８７−０）、
（ｙ）約２ｍｇ／ｄ〜約６０ｍｇ／ｄの量のＰＦ−０５２２１３０４（ＣＡＳ登録番号１３０１２１４−４７−０）、
（ｚ）皮下注射により１日１回投与で約２０マイクログラム〜約３０マイクログラムの量のＳＡＲ４２５８９９、
（ａａ）各活性剤について約１５ｍｇ／ｄ〜約３０ｍｇ／ｄの量のＳｅｌｏｎｓｅｒｔｉｂ＋ＧＳ−０９７６＋ＧＳ−９６７４、
（ｂｂ）１日１回皮下投与で約０．１ｍｇ〜約０．５ｍｇの量のセマグルチド、又は
（ｃｃ）約５ｍｇ／ｄ〜約５０ｍｇ／ｄの量のｖｏｌｉｘｉｂａｔ
の投与を含む、
請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対象者、特に、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＦＬＤ）やＮＡＳＨに罹患した対象者の非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）及び／又は肝線維症ステータスを、僅か３つ以上の特定のバイオマーカのレベルに基づいて、診断し、任意で、ＮＡＳＨと診断された対象者を治療する方法を提供する。本発明は、該方法を実施するのに好適なキット及び該方法の使用をさらに提供する。
【背景技術】
【０００２】
非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、メタボリックシンドロームの肝臓での発症と考えられている。ＮＡＦＬＤは、世界で有病率しているため、重要な公衆衛生問題となっている。定期健康診断のデータによれば、ＮＡＦＬＤは、現在、全年齢層について生じる最多慢性肝疾患であり、一般人口の１４〜３０％に及ぶ（非特許文献１）。ＮＡＦＬＤは、西側諸国で最も一般的な肝障害であり、１７〜４６％の成人が影響を受けていて、診断方法、年齢、性別及び民族に応じて差がある（非特許文献２）。ＮＡＦＬＤは、非アルコール性脂肪性肝（ＮＡＦＬ）と非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）という予後の異なる２つの病理学的に別の状態を有する。ＮＡＳＨは、ＮＡＦＬＤの場合の１０〜２０％観察され、ＮＡＳＨの推定有病率は、１〜７％である（非特許文献３）。
【０００３】
ＮＡＦＬは、目視される細胞間トリグリセリドを含む、肝臓の肝細胞の５％以上に過剰の脂肪が蓄積したものか、男性だと１日３０ｇ以下（３単位）のアルコール、女性だと１日２０ｇ以下（２単位）のアルコールを消費する、患者の肝臓体積又は重量の少なくとも５％に影響する脂肪症と定義される（非特許文献１）。ＮＡＳＨは、メタボリック肝疾患の形態であり、脂肪蓄積（脂肪症）が、小葉内炎症及び肝線維症の有無に関わりなく、肝細胞障害に関連するものである。典型的には、無症状であるが、肝硬変や肝細胞癌等の重度の肝障害につながる。
【０００４】
肥満は、ＮＡＦＬの最も重要な危険因子であり、肥満人口のうちＮＡＦＬＤの有病率は４．６倍の有病率を持ち、肥満者の７４％が脂肪肝である（非特許文献４）。体重減少のための減量手術を受けた病的肥満患者のうち、８４％〜９６％がＮＡＦＬであり、２％〜１２％が重症の線維症や肝硬変である（非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８）。脂肪症の程度は、ボディマス指数（ＢＭＩ）と相関していると考えられる（非特許文献９、非特許文献１０）。ＮＡＦＬはまた、関連危険因子の有無に関わらず、又は持たない痩せた人、特に、女性、若年層の通常の肝臓酵素を持つ人の５〜２９％にも存在している。肝疾患は、それにも関わらず進行性である（非特許文献１１、非特許文献１２）。
【０００５】
公衆におけるＮＡＦＬＤスクリーニングの必要性は、試験の直接及び間接コストが高いこと、無侵襲性の既存の試験の予測値が低いこと、肝生検に関連するリスク、そして、有効な治療がないという点で疑問視されてきた。（非特許文献１３）。しかしながら、ＮＡＦＬＤ（すなわち、ＮＡＳＨ）の進行形、特に、進行性線維症に関連するときは、危険な状態にある患者で確認し（年齢＞５０歳、２型糖尿病又はメタボリックシンドローム）、肝臓関連の転帰を改善したり、関連死亡率を減少させる（非特許文献１４）。
【０００６】
ＮＡＦＬ／ＮＡＳＨ診断
ＮＡＦＬの診断は、次の３つの基準に基づくものである。画像処理か組織学による、非アルコールステータス、脂肪症の検出＞５％、及びその他の肝疾患の適切な排除、例えば、アルコール性脂肪肝疾患（ＡＦＬＤ）、薬物誘発性脂肪肝疾患、ＨＣＶ−関連脂肪肝疾患（ｇｅｎｏｔｙｐｅ  ３）、自己免疫性肝炎、セリアック病やウィルソン病（非特許文献１４、非特許文献１５、非特許文献１６、非特許文献１７、非特許文献１８、非特許文献１９）。ＮＡＦＬＤの進行性であるＮＡＳＨは、線維症の有無に関わらず、脂肪症、バルーニング及び小葉内炎症の共存に基づいて、組織学的に診断される。その他の一般的に観察される特徴としては、マロリー硝子体、門脈周囲肝細胞における空砲化核、小葉脂肪肉芽腫、過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）−ジアスターゼ抵抗性クッパー細胞及び細胞周囲線維症（線維症又は肝硬変の進行期のもの）（非特許文献２０、非特許文献２１、非特許文献２２）。肝生検は、ＮＡＳＨ診断に必須であり、ＮＡＦＬとＮＡＳＨを信頼性良く区別する唯一の手段である。生検評価は、明確な診断の「ゴールドスタンダード」と考えられるが、肝生検にはいくつか欠点がある。高価で侵襲的な手順であること、病理学者の解釈において変動が大きい可能性があり、サンプリングエラーの可能性が大きいことが挙げられる（非特許文献２３）。さらに、ＮＡＦＬＤの非常に高い有病率を考慮すると、肝生検は、一般集団におけるＮＡＳＨのスクリーニング試験としてあまり向いていない。
【０００７】
血清アミノトランスフェラーゼレベル及び超音波、コンピュータ断層撮影や磁気共鳴などの画像形成試験は、ＮＡＦＬＤの患者について、脂肪性肝炎や線維症に信頼性良く特異的に評価しない。従って、ＮＡＦＬＤの患者の脂肪性肝炎を確認するための臨床予測ルール及び無侵襲性バイオマーカの開発に大きな関心が集められた。メタボリックシンドロームであることは、ＮＡＳＨであることの強力な予測因子であり、肝生検の恩恵を受ける異常肝生化学の患者を確認するのに役立つ。（非特許文献２４、非特許文献２５、非特許文献２６、非特許文献２７）。
【０００８】
脂肪肝指数（ＦＬＩ）（非特許文献２８）、ＮＡＦＬＤ肝臓脂肪スコア、肝脂肪症指数（ＨＩＳ）（非特許文献２９）及びＳｔｅａｔｏＴｅｓｔ（ＳＴ）（非特許文献３０）をはじめとする肝臓の脂肪変化を診断するために、様々な指標が提案されてきた。全て、一般集団やグレード３の肥満の人において、外的に有効であり、代謝、肝臓、心血管転帰／死亡を可変的に予測するものであった。これらのスコアは、インスリン抵抗性（ＩＲ）と関連しており、脂肪症かどうかを、重症度ではなく、予測する（非特許文献３１）。いくつかの画像形成技術も、ＮＡＦＬＤの無侵襲性診断試験として提案されてきた（非特許文献３２）。超音波検査は、感度に限界があり、＜２０％だと脂肪症を信頼性良く検出しない（非特許文献３３、非特許文献３４）。超音波検査は、ＮＡＦＬＤの画像形成のための好ましい最前線の診断手順である。画像形成ツールが利用可能又は実現可能でないときは常に、血清ブックマーカ及びスコアは、脂肪症の診断の許容できる代替である（非特許文献１４）。これまで、ＮＡＳＨの診断のための無侵襲性試験に有効なものがなく、ゴールドスタンダードは、線維症の有無に関わらず、脂肪症、肝細胞バルーニング及び小葉内炎症を報告する肝生検に変わりない。
【０００９】
ＮＡＦＬＤの進行線維症の無侵襲性評価は、いくつかのバイオマーカ及びスコアリングシステムを用いることで可能である。ＮＡＦＬＤ線維症スコア（ＮＦＳ）は、６つの容易に評価可能な臨床変数（年齢、ボディマス指数（ＢＭＩ）、高血糖症、血小板数、アルブミン及びアスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ）／アラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ）比に基づく、線維症の重度を予測するための広く認められたスコアリングシステムである（非特許文献３５）。９つの無侵襲性試験を比較する最近の研究に記載されている通り、多くの血清ブックマーカは、受信者操作特性（ＡＵＲＯＣ）＞０．８での領域により定義されるように、許容される診断精度を示している（すなわち、Ｈｅｐａｓｃｏｒｅ（登録商標）、ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒ−ＮＡＦＬＤ（登録商標））（非特許文献３６）。トランジエントエストログラフィー（フィブリオスキャン（登録商標））による肝硬度測定（ＬＳＭ）は、肝線維症の評価について、期待できる結果を示し、進行性線維症よりも肝硬変に対する性能が良い。しかしながら、これらの態様は、尚高価であり、広範に利用可能でなく、高ＢＭＩだったり、胸郭が厚いと、望ましくない結果となる。大きな非選択欧州系列において、試験の２０％までが、主に、ＮＡＬＬＤの肥満患者において、結果に信頼性がない（非特許文献３７）、（非特許文献３８）。フィブリオスキャン（登録商標）のＸＬプローブ（肥満患者にも使用できる）をこれらの患者に用いて、尚高い（３５％）の故障率を減じる（非特許文献３９）。
【００１０】
ＮＡＳＨに含まれる生物学的プロセス及び鍵分子
ＮＡＦＬＤの病因は、主に、ＩＲシンドロームと酸化ストレスに関連すると考えられている。後者は、ミトコンドリア脂肪酸酸化と核内因子カッパＢ（ＮＦｋａｐｐａＢ）依存炎症性サイトカイン発現によるものである。さらに、アディポサイトカインは、肝細胞障害、炎症、線維症及び進行性肝疾患を促進させる恐れがある（非特許文献４０、非特許文献４１）。アディポサイトカイン及び脂肪組織に浸透する炎症細胞により部分的に生成されるその他認識されたサイトカインは、複雑かつ相互作用する傍分泌及び内分泌機構によって、ＩＲ及びＮＡＦＬＤの病因において重要な役割を演じると報告されている（非特許文献４２）。ＮＡＦＬＤ、循環レプチン及びアディポネクチンレベル間の関連は、十分文書化されており、ＮＡＦＬＤの重症度が増大すると、レプチンレベルは増大し、アディポネクチンレベルは減少する（非特許文献４３、非特許文献４４、非特許文献４５、非特許文献４６）。組織学的に確認済みのＮＡＦＬＤ集団における他のアディポカインに関するデータは、決定的でない（非特許文献４７）。炎症は、組織損傷や感染の限界応答であり、サイトカインやケモカインのような分泌メディエーターが、細胞防御や組織修復を調整する。これは、概して、全身応答であるため、ＮＡＳＨの肝臓に作用したり浸透する炎症が、肝臓外で生じる可能性がある。当該部位は、脂肪組織、特に、ＮＡＦＬＤで膨張する内臓脂肪組織である（非特許文献４８、非特許文献４９、非特許文献５０）。内臓脂肪組織は、本来、炎症誘発性である（非特許文献５１）が、炎症は、肥満のストレスを受けた脱分化皮下脂肪組織でも生じる。重要な結果として、マクロファージケモカイン、サイトキン及びインターロイキン、特に、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン１０（ＣＸＣＬ１０又はＩＰ１０）、インターロイキン８（ＩＬ−８）、マクロファージ走化性プロテイン１（ＭＣＰ−１）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）及びインターロイキン−１β（ＩＬ−１β）の放出が挙げられる（非特許文献５２、非特許文献５３）。内臓脂肪組織は、脂肪肝やＮＡＳＨの原因となる危険因子となる証拠が増えている。肝線維症のマーカは、ＮＡＦＬＤの進化の道筋を予測する助けとなる。線維症のいくつかの無侵襲性マーカは、ＮＡＦＬＤ線維症スコア、ＡＰＲＩ、ＦＩＢ−４スコア及びＢＡＲＤをはじめとするＮＡＦＬＤスコアに用いられてきた。これらのマーカは、肝臓関連の合併症や死を招く最高リスクの患者を確認する助けとなる（非特許文献５４、非特許文献５５、非特許文献５６）。
【００１１】
肝線維症は、慢性肝臓病の大半のタイプについて特徴的なグリコサミノグリカン、特に、ＨＡのような細胞外マトリックス（ＥＣＭ）プロテインや分子の蓄積に伴う肝臓への慢性損傷の結果である。ＨＡは、ＥＣＭ、特に、軟結合組織にある高分子量多糖類である。糖類をポリマーの還元末端に付加することにより、線維芽細胞及びその他細胞の血漿膜で合成される。非還元端は、細胞周辺空間に突出する。ＨＡ生成は、増殖細胞において増大し、ポリマーは、有糸分裂において役割を演じる（非特許文献５７）。ハプトグロビンは、ヘモグロビンを結合する肝臓により生成される免疫グロブリン様血漿プロテインである。ハプトグロビン−ヘモグロビン錯体は、マクロファージにより血漿から除去され、ヘモグロビンは、異化される。ハプトグロビンは、遊離ヘモグロビンをスカベンジして、酸化活性を抑制し、血清や血漿ハプトグロビン濃度を増大することが知られており、慢性疾患における急性期反応として生じる。ＨＡ及びハプトグロビンは、周知された線維症及び酸化マーカである。
【００１２】
ＮＡＳＨの病因としては、インスリン抵抗性及び炎症の増大が挙げられ、例えば、ＴＮＦ−α、ＭＣＰ−１／ＣＣＬ２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７、特に、ＩＬ−８などの炎症誘発性サイトカインで見られる規制されない血中濃度による。インターロイキン−８（ＩＬ−８、ＣＸＣＬ８）は、好中球のための効能のあるかがく誘引物質であり、急性肝炎に寄与する。ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ１６、ＣＣＬ５、特に、ＣＸＣＬ１０等のケモカインの血中濃度もまた規制されない（非特許文献５８）。ＣＸＣＬ１０はまた、ＩＰ−１０としても知られており、小さい、誘導性Ｂ１０は、ＣＸＣケモカイン系列に属するサイトカインである。ＣＸＣＬ１０は、ＣＸＣＲ３レセプターに結合して、走化性、アポトーシス、細胞成長及び血管うっ血を引き起こす。ＣＸＣＬ１０発現レベルにおける変更は、感染症、免疫機能不全や海洋形成をはじめとする炎症性疾患に関連している（非特許文献５９）。
【００１３】
ＮＡＦＬＤの発生は、肥満、ＩＲ及びメタボリックシンドロームや規制されないアディポカインのその他態様に強く関連している。ＩＲ、糖尿病及び肥満に関連するホルモンの制御されない血中濃度は、ＮＡＳＨ患者、すなわち、アディポカイン、レプチン及びアディポネクチン、特に、グレリンにおいて報告されている。グレリンは、小さなペプチドで、主に、胃や膵臓、また、脂肪組織でも生成され、食欲を刺激し、レセプター、成長ホルモン分泌促進レセプタの強い促進剤である。グレリンは、グレリン−グレリンＯ−アシルトランスフェラーゼ（ＧＯＡＴ）系により触媒される３位のセリンでの独特なアシル化を行う（非特許文献６０）。
【００１４】
腸透過性の増大は、アレルギー、炎症及び自己免疫疾患の病因において共通の基本的な機構として認識されており、ＮＡＦＬＤに関係している。新たな調査によれば、肝損傷や炎症の初期は、腸管バリアにおいてこれが始まる、ということが示されている（非特許文献６１）。腸透過性の唯一の既知の調節物質として、発生期のハプトグロビン２（プレハプトグロビン２又はプレＨＰ２）の生化学的な役割は確認されている。さらに、高レベルの血清プレＨＰ２は、セリアック病やＩ型糖尿病をはじめとする多くの状態で検出されており、腸管バリアの調節不全に一部因るものと考えられている。プレＨＰ２は、微生物転座のバイオカーカである。
【００１５】
数年で市場に出ることが予測され、ＮＡＬＦＤ患者の管理を大幅に変更する新たな治療によって、肝疾患重症度が、患者管理を決めるため、ＮＡＳＨや肝線維症の正確な診断が重大になる。ｉ）肝病変は温和で予後が良好であるため、ＮＡＦＬは、特別な管理を必要としない、ｉｉ）ＮＡＳＨは、肝線維症進行のリスクが大きく、糖尿病や心血管系イベントが高発症率である疾病の攻撃的な形態であるため、早期ＮＡＳＨは、綿密なフォローアップが必要である、ｉｉｉ）線維性ＮＡＳＨは、肝硬変の進行を止めるために薬理学的治療を必要とする、ｉｖ）肝硬変は、肝硬変の合併症を止めるための薬理学的治療を必要とし、そして、この段階で、肝細胞癌及び大きな食道静脈瘤のスクリーニングが必須である。
【００１６】
無侵襲性バイオマーカを組み合わせたモデルは、ＮＡＦＬＤ、心血管疾患や糖尿病のような肝病変を引き起こす代謝異常の患者の中でもＮＡＳＨ患者を正確かつ即時に診断し、さらに、肝線維症の重症度が、臨床的必要性に適合していないままであることをさらに予測するものである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Ａｂｄ  Ｅｌ−Ｋａｄｅｒ、Ｓ．Ｍ．及びＥ．Ｍ．Ｅｌ−Ｄｅｎ  Ａｓｈｍａｗｙ、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ、２０１５．７（６）：８４６−５８
【非特許文献２】Ｖｅｒｎｏｎ、Ｇ．、Ａ．Ｂａｒａｎｏｖａ、及びＺ．Ｍ．Ｙｏｕｎｏｓｓｉ、Ａｌｉｍｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ、２０１１．３４（３）：２７４−８５
【非特許文献３】Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ、Ｅ．、Ｍ．Ｔａｎｉａｉ及びＫ．Ｔｏｋｕｓｈｉｇｅ、Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ、２０１３．２８  Ｓｕｐｐｌ  ４：６４−７０
【非特許文献４】Ａｎｇｕｌｏ、Ｐ．及びＫ．Ｄ．Ｌｉｎｄｏｒ、Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ、２００２．１７  Ｓｕｐｐｌ：Ｓ１８６−９０
【非特許文献５】Ｂｅｙｍｅｒ、Ｃ．ら、Ａｒｃｈ  Ｓｕｒｇ、２００３．１３８（１１）：１２４０−４
【非特許文献６】Ｃｒｅｓｐｏ、Ｊ．ら、Ｏｂｅｓ  Ｓｕｒｇ、２００１．１１（３）：２５４−７
【非特許文献７】Ｄｉｘｏｎ、Ｊ．Ｂ．、Ｐ．Ｓ．Ｂｈａｔｈａｌ、及びＰ．Ｅ．Ｏ'Ｂｒｉｅｎ、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、２００１．１２１（１）：９１−１００
【非特許文献８】Ｇｈｏｌａｍ、Ｐ．Ｍ．、Ｄ．Ｐ．Ｋｏｔｌｅｒ、及びＬ．Ｊ．Ｆｌａｎｃｂａｕｍ、Ｏｂｅｓ  Ｓｕｒｇ、２００２．１２（１）：４９−５１
【非特許文献９】Ｍｏｒｅｔｔｏ、Ｍ．ら、Ｏｂｅｓ  Ｓｕｒｇ、２００３．１３（４）：６２２−４
【非特許文献１０】Ｈｓｉａｏ、Ｐ．Ｊ．ら、Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ、２００７．２２（１２）：２１１８−２３
【非特許文献１１】Ｆｒａｃａｎｚａｎｉ、Ａ．Ｌ．ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、２００８．４８（３）：７９２−８
【非特許文献１２】Ａｎｇｕｌｏ、Ｐ．ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、１９９９．３０（６）：１３５６−６２
【非特許文献１３】Ｃｈａｌａｓａｎｉ、Ｎ．ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、２０１２．１４２（７）：１５９２−６０９
【非特許文献１４】Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｌｉｖｅｒ、Ｏｂｅｓ  Ｆａｃｔｓ、２０１６．９（２）：６５−９０
【非特許文献１５】Ｃｈａｌａｓａｎｉ、Ｎ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ、２０１２．１０７（６）：８１１−２６
【非特許文献１６】Ｆａｒｒｅｌｌ、Ｇ．Ｃ．ら、Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ、２００７．２２（６）：７７５−７
【非特許文献１７】Ｌｕｄｗｉｇ、Ｊ．ら、Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒｏｃ、１９８０．５５（７）：４３４−８
【非特許文献１８】Ｒａｔｚｉｕ、Ｖ．ら、Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ、２０１０．５３（２）：３７２−８４
【非特許文献１９】Ｓａｎｙａｌ、Ａ．Ｊ．及びＡ．  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、２００２．１２３（５）：１７０５−２５
【非特許文献２０】Ｂｅｄｏｓｓａ、Ｐ．及びＦ．Ｐ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、２０１４．６０（２）：５６５−７５
【非特許文献２１】Ｋｌｅｉｎｅｒ、Ｄ．Ｅ．及びＥ．Ｍ．Ｂｒｕｎｔ、Ｓｅｍｉｎ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓ、２０１２．３２（１）：３−１３
【非特許文献２２】Ｋｌｅｉｎｅｒ、Ｄ．Ｅ．ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、２００５．４１（６）：１３１３−２１
【非特許文献２３】Ｒａｔｚｉｕ、Ｖ．ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、２００５．１２８（７）：１８９８−９０６
【非特許文献２４】Ｖｕｐｐａｌａｎｃｈｉ、Ｒ．及びＮ．Ｃｈａｌａｓａｎｉ、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、２００９．４９（１）：３０６−１７
【非特許文献２５】Ｍｕｓｓｏ、Ｇ．ら、Ａｎｎ  Ｍｅｄ、２０１１．４３（８）：６１７−４９
【非特許文献２６】Ｒｙａｎ、Ｍ．Ｃ．ら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ、２００５．２８（５）：１２２２−４
【非特許文献２７】Ｍａｒｃｈｅｓｉｎｉ、Ｇ．ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、２００３．３７（４）：９１７−２３
【非特許文献２８】Ｂｅｄｏｇｎｉ、Ｇ．ら、ＢＭＣ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ、２００６．６：３３
【非特許文献２９】Ｌｅｅ、Ｊ．Ｈ．ら、Ｄｉｇ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓ、２０１０．  ４２（７）：５０３−８
【非特許文献３０】Ｐｏｙｎａｒｄ、Ｔ．ら、Ｃｏｍｐ  Ｈｅｐａｔｏｌ、２００５．４：１０
【非特許文献３１】Ｆｅｄｃｈｕｋ、Ｌ．ら、Ａｌｉｍｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ、２０１４．４０（１０）：１２０９−２２
【非特許文献３２】Ｋｏｐｌａｙ、Ｍ．ら、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ、２０１５．７（５）：７６９−７６
【非特許文献３３】Ｆｉｓｈｂｅｉｎ、Ｍ．ら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ、２００５．３９（７）：６１９−２５
【非特許文献３４】Ｓａａｄｅｈ、Ｓ．ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、２００２．１２３（３）：７４５−５０
【非特許文献３５】Ａｎｇｕｌｏ、Ｐ．ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、２００７．４５（４）：８４６−５４
【非特許文献３６】Ｂｏｕｒｓｉｅｒ、Ｊ．ら、Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ、２０１６．６５（３）：５７０−８
【非特許文献３７】Ｃａｓｔｅｒａ、Ｌ．ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、２０１０．５１（３）：８２８−３５
【非特許文献３８】Ｗｏｎｇ、Ｖ．Ｗ．ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、２０１０．５１（２）：４５４−６２
【非特許文献３９】Ｗｏｎｇ、Ｖ．Ｗ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ、２０１２．１０７（１２）：１８６２−７１
【非特許文献４０】Ｐｏｌｙｚｏｓ、Ｓ．Ａ．、Ｊ．Ｋｏｕｎｔｏｕｒａｓ及びＣ．Ｚａｖｏｓ、Ｃｕｒｒ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ、２００９．９（３）：２９９−３１４
【非特許文献４１】Ｔｉｌｇ、Ｈ．、Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ、２０１０．１６（１７）：１８９３−５
【非特許文献４２】Ｓｃｈａｆｆｌｅｒ、Ａ．、Ｊ．Ｓｃｈｏｌｍｅｒｉｃｈ及びＣ．Ｂｕｃｈｌｅｒ、Ｎａｔ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒａｃｔ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ、２００５．２（６）：２７３−８０
【非特許文献４３】Ｊａｍａｌｉ、Ｒ．ら、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ、２０１６．２２（２１）：５０９６−１０３
【非特許文献４４】Ｃｕｓｉ、Ｋ．ら、Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ、２０１４．６０（１）：１６７−７４
【非特許文献４５】Ｇｒｉｇｏｒｅｓｃｕ、Ｍ．ら、Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、２０１２．６３（４）：３４７−５３
【非特許文献４６】Ｐｉｒｖｕｌｅｓｃｕ，Ｉ．，ら、Ｃｈｉｒｕｒｇｉａ（Ｂｕｃｕｒ）、２０１２．１０７（６）：７７２−９
【非特許文献４７】Ｐｏｌｙｚｏｓ、Ｓ．Ａ．、Ｊ．Ｋｏｕｎｔｏｕｒａｓ及びＣ．Ｓ．Ｍａｎｔｚｏｒｏｓ、Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、２０１５
【非特許文献４８】Ｌａｒｔｅｒ、Ｃ．Ｚ．ら、Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ、２０１０．２５（４）：６７２−９０
【非特許文献４９】Ｐａｒｋ、Ｓ．Ｈ．ら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｎｕｔｒ、２００７．２６（４）：３２１−６
【非特許文献５０】Ｐａｒｋ、Ｂ．Ｊ．ら、Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ、２００８．２３（６）：９００−７
【非特許文献５１】Ｈａｒｒｉｓ、Ｒ．Ｂ．及びＲ．Ｌ．Ｌｅｉｂｅｌ、Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ、２００８．７（５）：３５９−６１
【非特許文献５２】Ｚｈａｎｇ、Ｘ．ら、Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ、２０１４．６１（６）：１３６５−７５
【非特許文献５３】ｄｕ  Ｐｌｅｓｓｉｓ、Ｊ．ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、２０１５．１４９（３）：６３５−４８  ｅ１４
【非特許文献５４】Ｓｈａｈ、Ａ．Ｇ．ら、Ｃｌｉｎ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ、２００９．７（１０）：１１０４−１２
【非特許文献５５】Ａｎｇｕｌｏ、Ｐ．ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、２０１３．１４５（４）：７８２−９  ｅ４
【非特許文献５６】Ｙｏｎｅｄａ、Ｍ．ら、Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ、２０１３．４８（９）：１０５１−６０
【非特許文献５７】Ｌａｕｒｅｎｔ、Ｔ．Ｃ．ら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ、１９９２．６（７）：２３９７−４０４
【非特許文献５８】Ｍｕｓｓｏ、Ｇ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、２０１６．１５、２４９〜２７４
【非特許文献５９】Ｌｉｕ、Ｍ．ら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ、２０１１．２２（３）：１２１〜１３０
【非特許文献６０】Ｚａｎｇ、Ｓ．Ｒ．ら、ＷＪＧ、２０１５．２１（１１）：３２１４−２２２
【非特許文献６１】Ｒａｙ、Ｋ．、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｈｅｐａｔ．、２０１５．１２（３）：１２３
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１８】
単純な無侵襲性スコアリングシステム（僅か３〜１１又は３〜１２のバイオマーカに依拠）を用いて、ＮＡＦＬＤ、心血管疾患や糖尿病のような肝病変を引き起こす代謝異常の患者のＮＡＳＨを診断し、さらに、進行性肝線維症の有無によるＮＡＳＨ患者、すなわち、線維症スコアがそれぞれ、Ｆ≧３又はＦ＜３のＮＡＳＨ患者を区別できることを知見した。ＮＡＳＨと診断された対象者は、下記に示したＮＡＳＨ及び／又は肝線維症について治療することができる。
【００１９】
このように、本発明は、脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を診断する２つの方法を提供する。これらの方法は、「数理モデル」及び「閾値法」と呼ばれる。２つの開示された方法のいずれかを用いてＮＡＳＨと診断された対象者もまた、本明細書に開示された通りにして治療することができる。
【００２０】
数理モデル
本発明は、ＮＡＳＨを診断する以下の方法を提供する（「数理モデル」と呼ぶ）。
（１）非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を診断する方法であって、
（Ｉ）対象者から得られた試料において、炎症誘発サイトカイン、ケモカイン及び細胞接着及び組織モデリングに寄与するグリコサミノグリカンである少なくとも３つのバイオマーカのレベルを測定し、
（ＩＩ）数理モデルにおいて、ステップ（Ｉ）で測定した前記少なくとも３つのバイオマーカのレベルを組み合わせ、
（ＩＩＩ）対象者が、ＮＡＳＨに罹患しているか判断する、方法。
（２）上記（１）に記載のステップ（Ｉ）及び（ＩＩ）を含む方法において、対象者の肝線維症ステータスを代わりに、又は加えて、代替又は追加のステップ（ＩＩＩ）'で判断する。上記（１）及び（２）の方法は、「数理モデル」と呼ばれる。
（３）対象者のＮＡＳＨ及び／又は肝線維症ステータスを診断するキットであって、上記（１）に記載された少なくとも３つのバイオマーカのレベルを測定する試薬と、数理モデルにおいて、ステップ（Ｉ）で測定されたレベルを組み合わせ、数理モデルから得られたスコアに基づいて決断するための指示とを含む、キット。
（４）上記（１）及び／又は（２）に記載の方法において上記（３）に記載されたキットの使用。
（５）上記（１）及び／又は（２）に記載された、ＮＡＳＨと診断された対象者の治療。
【００２１】
上記（１）及び／又は（２）に記載の方法、（３）に記載のキット、又は（４）に記載の使用の特定の実施形態において、肝疾患、特に、ＮＡＦＬＤやＮＡＳＨに罹患していると疑われる対象者、又は肝疾患、特に、ＮＡＦＬＤに罹患している（すなわち、以前にそれと診断された）対象者に、ＮＡＳＨ診断及び／又は肝線維症ステータスの判断がなされる。あるいは、特定の実施形態において、心血管疾患や糖尿病のような肝病変を引き起こす代謝異常を罹患した、又は罹患していると疑われる肥満の対象者に、肝線維症ステータスのＮＡＳＨ診断及び／又は判断がなされる。（２）に記載された方法、（３）に記載のキット又は（４）に記載の使用における特定の実施形態において、肝線維症ステータスが、ＮＡＳＨに罹患した対象者において判断される。
【００２２】
追加又は代替実施形態において、炎症誘発サイトカインは、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β１、ＩＬ−１、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２及びＩＬ−１８からなる群から選択され、好ましくは、ＩＬ−８である。
【００２３】
さらなる追加又は代替実施形態において、ケモカインは、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ１１からなる群から選択され、好ましくはＣＸＣＬ１０である。
【００２４】
さらに他の追加又は代替実施形態において、細胞接着及び組織モデリングに寄与するグリコサミノグリカンは、ヒアルノナン、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩（ＨＡ）、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン及びケラタン硫酸からなる群から選択され、好ましくはＨＡである。
【００２５】
好ましい実施形態において、少なくとも、バイオマーカＩＬ−８、ＣＸＣＬ１０及びＨＡのレベルを測定する。
【００２６】
上述の方法、キット及び使用のいずれかの特定の実施形態において、グレリン、プレハプトグロビン２（ｐｒｅ−ＨＰ２）、ハプトグロビン、肝硬度、年齢、性別、ＢＭＩ、高血圧及び血圧）からなる群から選択される１〜９の追加のバイオマーカのレベル（又は値）を測定（又は判断）する。
【００２７】
従って、特定の実施形態において、４つのバイオマーカの少なくともレベルをステップ（Ｉ）で測定する。好ましくは、
ＩＬ−８、ＨＡ、ＣＸＣＬ１０及びグレリン、又は
ＩＬ−８、ＨＡ、ＣＸＣＬ１０及びｐｒｅ−ＨＰ２、又は
ＩＬ−８、ＨＡ、ＣＸＣＬ１０及び肝硬度。
【００２８】
他の特定の実施形態において、５つのバイオマーカの少なくともレベルをステップ（Ｉ）で測定する。好ましくは、
ＩＬ−８、ＨＡ、ＣＸＣＬ１０、グレリン及びプレＨＰ２、又は
ＩＬ−８、ＨＡ、ＣＸＣＬ１０、グレリン及び肝硬度、又は
ＩＬ−８、ＨＡ、ＣＸＣＬ１０、プレＨＰ２及び肝硬度。
【００２９】
他の特定の実施形態において、バイオマーカＩＬ−８、ＨＡ、ＣＸＣＬ１０、グレリン、プレＨＰ２及び肝硬度の少なくともレベルをステップ（Ｉ）で測定する。
【００３０】
他の特定の実施形態において、バイオマーカＩＬ−８、ＨＡ、ＣＸＣＬ１０、グレリン、プレＨＰ２、ハプトグロビン、肝硬度、年齢、性別、ＢＭＩ 及び高血圧（及び／又は血圧）の少なくともレベルが、ステップ（Ｉ）で測定される。特定の実施形態において、用いた数理モデルは、教師付き分類法に適した数理モデル、例えば、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）、ランダムフォレスト、決定木、ｍＲＯＣ、勾配ブースティング及びロジスティック回帰から選択される数理モデル、好ましくは、ロジスティック回帰である。
【００３１】
上記（１）に記載した方法の特定の好ましい実施形態において、方法は、
（Ｉ）対象者から得られた試料において、少なくともバイオマーカＩＬ−８、ＣＸＣＬ１０及びＨＡのレベルを測定し、
（ＩＩ）ロジスティック回帰式において、ステップ（Ｉ）で測定したＩＬ−８、ＣＸＣＬ１０及びＨＡの少なくともレベルを組み合わせ、
（ＩＩＩ）対象者が、ＮＡＳＨに罹患しているか判断する。上記（２）に記載した方法の特定の好ましい実施形態において、
（Ｉ）ＮＡＳＨに罹患した対象者から得られた試料において、少なくともバイオマーカＩＬ−８、ＣＸＣＬ１０及びＨＡのレベルを測定し、
（ＩＩ）ロジスティック回帰式において、ステップ（Ｉ）で測定したＩＬ−８、ＣＸＣＬ１０及びＨＡの少なくともレベルを組み合わせ、
（ＩＩＩ）' 対象者の肝線維症ステータスが、Ｆ＜３かＦ≧３判断する。
【００３２】
閾値法
さらなる実施形態において、本発明は、ＮＡＳＨを診断する以下の方法を提供する（「閾値モデル」と呼ぶ）。
（１）非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を診断する方法であって、
（Ｉ）対象者から得られた試料において、炎症誘発サイトカイン、ケモカイン及び細胞接着及び組織モデリングに寄与するグリコサミノグリカンである少なくとも３つのバイオマーカのレベルを測定し、
（ＩＩ）前記少なくとも３つのバイオマーカの測定レベルを、少なくとも３つのバイオマーカのそれぞれについての特定の閾値と比較し、
（ＩＩＩ）前記少なくとも３つのバイオマーカのそれぞれについての特定の閾値と比較した、少なくとも３つのバイオマーカのそれぞれのレベルに基づいて（すなわち、特定のバイオマーカの測定レベルが、そのバイオマーカの特定の閾値より高いか低いか）、対象者が、ＮＡＳＨに罹患しているか判断する、方法。
（２）上記（１）に記載のステップ（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩ）を含む方法において、対象者の肝線維症ステータスを代わりに、又は加えて、代替又は追加のステップ（ＩＩＩ）'で判断する。上記（１）及び（２）の方法は、「閾値法」と呼ばれる。
（３）対象者のＮＡＳＨ及び／又は肝線維症ステータスを診断するキットであって、上記（１）に記載された少なくとも３つのバイオマーカのレベルを測定する試薬と、ステップ（Ｉ）で測定されたレベルを、少なくとも３つのバイオマーカの閾値レベルと比較し、対象者からの試料に存在するバイオマーカの量に基づいて、対象者においてＮＡＳＨが存在するか診断するための指示とを含む、キット。
（４）上記（１）及び／又は（２）に記載の方法において上記（３）に記載されたキットの使用。
（５）上記（１）及び／又は（２）に記載された、ＮＡＳＨと診断された対象者の治療。
【００３３】
閾値法において測定された炎症誘発サイトカインは、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β１、ＩＬ−１、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２及びＩＬ−１８からなる群から選択され、好ましくは、ＩＬ−８である。閾値法において測定されたケモカインは、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ１１からなる群から選択され、好ましくは、ＣＸＣＬ１０である。閾値法で測定された細胞接着及び組織モデリングに寄与するグリコサミノグリカンは、ヒアルノナン、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩（ＨＡ）、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン及びケラタン硫酸からなる群から選択され、好ましくは、ＨＡである。好ましい実施形態において、バイオマーカＩＬ−８、ＣＸＣＬ１０及びＨＡの少なくともレベルは、閾値法で測定される。
【００３４】
本明細書に規定される他の実施形態において、閾値法は、測定された（又は決定された）グレリン、プレハプトグロビン２（プレＨＰ２）、ハプトグロビン、肝硬度、年齢、性別、ＢＭＩ、高血圧 及び血圧からなる群から選択される１〜９の追加のバイオマーカのレベル（又は値）を測定し、前記１〜９の追加のバイオマーカの閾値レベルと比較する。
【００３５】
従って、特定の実施形態において、４つのバイオマーカの少なくともレベルを、閾値法のステップ（Ｉ）で測定する。好ましくは、
−ＩＬ−８、ＨＡ、ＣＸＣＬ１０及びグレリン、又は
−ＩＬ−８、ＨＡ、ＣＸＣＬ１０及びプレＨＰ２、又は
ＩＬ−８、ＨＡ、ＣＸＣＬ１０及び肝硬度。
【００３６】
他の特定の実施形態において、５つのバイオマーカの少なくともレベルをステップ（Ｉ）で測定する。好ましくは、
ＩＬ−８、ＨＡ、ＣＸＣＬ１０、グレリン及びプレＨＰ２、又は
ＩＬ−８、ＨＡ、ＣＸＣＬ１０、グレリン及び肝硬度、又は
ＩＬ−８、ＨＡ、ＣＸＣＬ１０、プレＨＰ２及び肝硬度。
【００３７】
他の特定の実施形態において、バイオマーカＩＬ−８、ＨＡ、ＣＸＣＬ１０、グレリン、プレＨＰ２及び肝硬度を、閾値法のステップ（Ｉ）で測定する。
【００３８】
他の特定の実施形態において、バイオマーカＩＬ−８、ＨＡ、ＣＸＣＬ１０、グレリン、プレＨＰ２、ハプトグロビン、肝硬度、年齢、性別、ＢＭＩ及び高血圧（及び／又は血圧）の少なくともレベルを、閾値法のステップ（Ｉ）で測定する。
【００３９】
上述した診断方法（「数理モデル」又は「閾値法」）のいずれかにおいて、ＮＡＳＨと診断された対象者は、ＮＡＳＨ及び／又は肝線維症について治療することができる。本発明のこの態様において、開示された診断方法は、ＮＡＳＨと診断された個人の治療をさらに含む。特定の実施形態において、数理モデルか閾値法のいずれかによりＮＡＳＨと診断された患者は、ロジグリタゾンやピログリタゾンのようなグリタソンを単体又はビタミンＥと組み合わせて、ＧＳ−９６７４、ＬＪＮ−４５２、ＥＤＰ−３０５及びオベチコール酸のようなＦＸＲアゴニスト、エラフィブラノール、サログリタザール、ＩＶＡ−３３７のようなＰＰＡＲα及びＰＰＡＲβ（ＰＰＡＲδ）及び／又はＰＰＡＲγアゴニスト、ＮＧＭ−２８２のようなＦＧＦ−１９類似体、ＰＦ−０５２３１０２３のようなＦＧＦ２１類似体（（ＣＶＸ−３４３）、長時間作用型ＦＧＦ２１類似体、マレイミド−アゼチジノンリンカーを介して、ヒト化ＩｇＧ１κ  ｍＡｂ骨格に共有結合した［ｄｅｓ−Ｈｉｓ１、Ａｌａ１２９Ｃｙｓ］ＦＧＦ２１２分子から構成される、Ｇｉｒａｇｏｓｓｉａｎら、２０１５、Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ、４３（６）：８０３−８１１、全内容が参考文献としてここに組み込まれる）、アラムコールのようなＳＤＤ１阻害剤、リラグルチドのようなＧＬＰ−１類似体、ノル−ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、ビタミンＥのような酸化防止剤、ＧＳ−４９９７のようなＡＳＫ１阻害剤、セニクリビオクのようなＣＣＲ２／ＣＣＲ５アンタゴニスト、ＶＬＸ−１０３のようなペンタミジン、エムリカサンのようなカスパーゼ阻害剤、シンツズマブのようなＬＯＸＬ２阻害剤、及び／又はガラクトアラビノラムノガラクツロン酸（ＧＲ−ＭＤ−０２）のようなガレクチン−３プロテイン阻害剤を投与することにより治療したり、全内容が参考文献としてここに組み込まれるＦｒｉｅｄｍａｎら、２０１８、Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ＮＡＦＬＤ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２４：９０８−９２２に開示されたその他の治療により治療することができる。数理モデル又は閾値法を用いて、ＮＡＳＨと診断された個人についてのその他の治療については表１０及び１１に記載してある。  
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１Ａ】ＮＡＳＨとＮＡＦＬを区別するバイオマーカ（ＣＸＣＬ１０）の一変量分析の箱ひげ図である。
【図１Ｂ】ＮＡＳＨとＮＡＦＬを区別するバイオマーカ（ＩＬ−８）の一変量分析の箱ひげ図である。
【図１Ｃ】ＮＡＳＨとＮＡＦＬを区別するバイオマーカ（グレリン）の一変量分析の箱ひげ図である。
【図２Ａ】小葉内炎症（ＮＡＳスコア）の組織学的グレードとＣＸＣＬ１０を区別するバイオマーカの一変量分析の箱ひげ図である。
【図２Ｂ】小葉内炎症（ＮＡＳスコア）の組織学的グレードとＡＬＡＳＴを区別するバイオマーカの一変量分析の箱ひげ図である。
【図２Ｃ】小葉内炎症（ＮＡＳスコア）の組織学的グレードとＡＳＡＴを区別するバイオマーカの一変量分析の箱ひげ図である。
【図３Ａ】肝細胞バルーニング（ＮＡＳスコア）の組織学的グレードとＣＸＣＬ１０を区別するバイオマーカの一変量分析の箱ひげ図である。
【図３Ｂ】肝細胞バルーニング（ＮＡＳスコア）の組織学的グレードとＩＬ−８を区別するバイオマーカの一変量分析の箱ひげ図である。
【図４Ａ】ＮＡＳＨ患者におけるＦ＜３及びＦ≧３の繊維症ステージとＨＡを区別するバイオマーカの一変量分析の箱ひげ図である。
【図４Ｂ】ＮＡＳＨ患者におけるＦ＜３及びＦ≧３の繊維症ステージとＩＬ−８を区別するバイオマーカの一変量分析の箱ひげ図である。
【図４Ｃ】ＮＡＳＨ患者におけるＦ＜３及びＦ≧３の繊維症ステージとＣＸＣＬ１０を区別するバイオマーカの一変量分析の箱ひげ図である。
【図５】ＮＡＳＨ診断のための３マーカ機能の箱ひげ図である。
【図６】線維症ステージ判断のための３マーカ機能の箱ひげ図である。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本発明は、上述した通り、本明細書に記載した特定のバイオマーカのレベル及び数理モデル又は閾値法に基づいて、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を診断する方法、並びに、任意で、ＮＡＳＨと診断された対象者を治療する方法を提供する。
【００４２】
まず第１に、本明細書で用いる「バイオマーカ」は、体液中の分子を循環させるものを指す。好ましいバイオマーカは、インターロイキン、サイトカイン、特に、炎症誘発サイトカイン、ケモカイン、ホルモン及び炭水化物、特に、グリコサミノグリカンである。本発明において特に該当するバイオマーカは、ＩＬ−８、ＨＡ、ＣＸＣＬ１０、グレリン、プレＨＰ２及びハプトグロビンである。さらに、バイオマーカという用語はまた、フィブリオスキャン（登録商標）のような線維症のステージを判断する無侵襲性技術により得られる患者特性（例えば、肝硬度）のことを指したり、年齢、性別、ＢＭＩ、高血圧及び血圧のような臨床変数を指すのにも用いられる。
【００４３】
特定の実施形態において、「プレＨＰ２」は、ゾヌリンと等価である。本明細書で用いる「ＮＡＳＨ」は、メタボリックシンドロームの肝臓での発症である非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の進行形のことを指す。たいていの場合、ＮＡＳＨの特性は、脂肪蓄積（脂肪症）が、小葉内炎症及び肝線維症のある、又はない肝細胞障害に関連するものである。ＮＡＳＨは、２型糖尿病、インスリン抵抗性及びメタボリックシンドロームに関連する非常に一般的な疾病である。過度に肥満の患者の５０％以上に２型糖尿病がある。２型糖尿病であると、肝臓罹患率や死亡率が増大するばかりでなく、心血管疾患にも関連する。
【００４４】
上述した方法のステップ（Ｉ）におけるレベルの「測定」とは、バイオマーカの任意の検出や定量を指す。好ましい実施形態において、バイオマーカに特異的に結合する抗体、天然又は組換えプロテインのようなリガンドを検出に用い、定量は、リガンドへの標識共役により得られるシグナルに基づいている。かかる標識についての例を挙げると、蛍光標識、ビオチンやペロキシダーゼがある。シグナル強度は増幅することができる。バイオマーカの定量に用いることのできる技術としては、例えば、多重化技術（例えば、ルミネックスマルチプレクス技術）、マイクロアレイ、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）や臨床現場即時検査がある。肝硬度、年齢、性別、ＢＭＩ、高血圧及び血圧のような追加のバイオマーカのレベルは、当業者に知られた手段により測定される。特定の実施形態において、肝硬度は、フィブリオスキャン（登録商標）を用いて測定される。高血圧のレベルを測定するには、通常、対象者の収縮期血圧と拡張期血圧の両方を測定する必要がある。特定の実施形態において、対象者の収縮期血圧が、１４０水銀柱ミリメートル（ｍｍＨｇ）以上である、又は拡張期血圧が９０ｍｍＨｇ以上であるとき、高血圧であるとされ、対象者の収縮期血圧が、１４０ｍｍＨｇ未満であり、かつ拡張期血圧が９０ｍｍＨｇ未満であるとき、高血圧ではないとされる。
【００４５】
特定の実施形態において、本明細書に開示した数理モデルにおいてバイオマーカ高血圧の代わりに、又はこれに加えて、バイオマーカ血圧を組み合わせる。収縮期血圧のレベル及び／又は拡張期血圧のレベルを、例えば、ｍｍＨｇで測定する。収縮期血圧のレベルと拡張期血圧のレベルの両方を測定したら、本明細書に開示した数理モデルで１つか両方のレベルを組み合わせることができる。
【００４６】
循環分子であるバイオマーカのレベル測定は、ヒトである対象者、そして、肝疾患、特に、ＮＡＦＬＤやＮＡＳＨへの罹患が疑われる患者である「対象者」から得られる試料で行われる。あるいは、本方法が、上記（２）に記載した肝線維症ステータスを判断することを目的とする特定の実施形態においては、対象者は、ＮＡＳＨに罹患していることが分かっている。あるいは、特定の実施形態において、対象者は、肥満の患者、心血管疾患や糖尿病のような肝病変を引き起こす代謝異常に罹患している、又は罹患が疑われる患者、又はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ、例えば、ＨＩＶ−１やＨＩＶ−２）や肝炎ウイルス（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス、ＨＣＶ）のような血液ウイルスに罹患している、又は罹患が疑われる患者である。
【００４７】
循環分子のレベルが測定される「試料」としては、血液、脳脊髄液（ＣＳＦ）や尿のようなあらゆる種類の体液が含まれる。好ましい実施形態において、試料は、血液試料、より好ましくは、血清又は血漿試料、最も好ましくは、血清試料である。
【００４８】
バイオマーカのレベルの「組み合わせ」は、数理モデルによりなされる。この目的で用いられる「数理モデル」は、例えば、回帰式、好ましくは、ロジスティック回帰であるが、ＳＶＭ、ランダムフォレスト、決定木、ｍＲＯＣ、勾配ブースティング又は教師付き分類で用いられるその他方法とすることもできる。
【００４９】
本明細書で用いる単数は、特に断りのない限り、複数も含むものとする。さらに、「含む」、「有する」、「持つ」又は類似用語に関して、詳細な説明や請求項で用いる場合、包括的「含む（comprising）」を意味する。移行句である「含む（comprising）」（及び類似用語）には、「から実質的になる（consisting essentially of）」及び「からなる（consisting）」が含まれ、明細書全体にわたって置き換えることができる。「から実質的になる」という句は、請求項が、特定の材料やステップを含む実施形態を含むものであり、クレームの基本かつ新規な特性に実質的に影響しない。
【００５０】
ＮＡＳＨの治療をする対象者に処方される組成物について、「約」という用語は、記載した値の０〜１０％の変動が含まれるものとする（Ｘ±１０％）。また、範囲での記載は、その長さを規定するものではなく、範囲内の全ての値を述べているものとする。範囲内の適切な値を、適宜、上限値、下限値又は範囲の終点で選択することができる。例えば、０．１〜１．０の範囲は、０．１と１．０の終点値、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９の中間値、及び０．１〜１．０に含まれる全中間範囲、例えば、０．２〜０．５、０．２〜０．８、０．７〜１．０等を表す。
【００５１】
本明細書で用いる「治療」、「緩和」及び「改善」という用語（及び類似用語）は、区別なく用いられ、治療効果に限られるものではないが、有益な所望の結果が得られうるアプローチを指す。治療効果は、ＮＡＳＨに関連する１つ以上の生理的な症状が根絶又は改善することであり、患者が尚、ＮＡＳＨやＮＡＦＬＤに罹患していたとしても、改善が見られることである。
【００５２】
「有効量」又は「治療有効量」という用語は、対象者を治療するのに十分な治療薬の量であることを指す。
【００５３】
「対象者」は、動物、例えば、ほ乳類、ヒトを指す。本明細書に記載した方法は、ヒトとヒト以外の動物の両方に有用である。ある実施形態において、対象者はほ乳類であり（疾病の動物モデル）、ある実施形態においては、対象者はヒトである。
【００５４】
「処方」（及び類似用語）は、治療薬の対象者への経口、皮下、腹腔、静脈内又は筋肉内投与を指す。
【００５５】
本発明において、当該ロジスティック回帰モデルは、下式（１）及び（２）で示される。
【数１】
2020527716.tif 000003
式（１）のｙは次のように定義される。
【数２】
2020527716.tif 000004
【００５６】
診断スコアは、［０，１］の区間を含む値であり、式（１）、すなわち、決定関数ｆにより得られる。
【００５７】
特定の実施形態において、臨床決定閾値（例えば、表４ａ、４ｂ、５ａ及び５ｂに定義）をセットして、患者をＮＡＳＨかＮＡＦＬとして分類する、又は進行性線維症ステージ（それぞれ、Ｆ≧３又はＦ＜３）である、又はそうではないＮＡＳＨ患者として分類する。臨床決定閾値の値は、［０，１］の区間を含む。
【００５８】
「区間に含まれる」や「範囲に含まれる」とは、示された境界が、その区間／範囲に含まれることを意味する。
【００５９】
本発明の実施に用いることのできる好適な回帰式を、表４ａ及び４ｂ（ＮＡＳＨ診断）及び表５ａ及び５ｂ（線維症ステージ）の１行目にそれぞれ示す。回帰式は、上記式（２）に対応しており、各式の特定の係数ａｋは、式（２）のａｋに対応している。特定の係数は、各表に示す診断に用いたマーカの数に応じるものである。表において、実施例に示した１０回の交差検証プロセス中、観察された係数とセットされた閾値の範囲を、それぞれ、「Ｒａｎｇｅ＿ａｋ」及び「Ｒａｎｇｅ  Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ」と表示する。さらに、これらの範囲を、「四捨五入（ｒｏｕｎｄｅｄ）」したものが表示され（それぞれ「Ｒａｎｇｅ＿ａｋ＿ｒｏｕｎｄｅｄ」及び「Ｒａｎｇｅ＿閾値＿ｒｏｕｎｄｅｄ」）、それぞれ、上限と下限について床（最大先行整数）及び天井（最小後続整数）関数である。さらに、記載したバイオマーカ及び各診断（ＮＡＳＨ又は線維症）のそれぞれ１つに対して、係数のグローバル範囲及び閾値のグローバル範囲を、四捨五入した範囲に従って、関連する係数及び閾値について定義した。各表において、それぞれ「Ｒａｎｇｅ＿ａｋ＿ｒｏｕｎｄｅｄ＿ｇｌｏｂａｌ」及び「ｒａｎｇｅ＿ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＿ｒｏｕｎｄｅｄ＿ｇｌｏｂａｌ」で示されるこれらの範囲は、特定のバイオマーカの係数又は閾値について観察された全四捨五入範囲の最小及び最大値で構成される。一例を挙げると、バイオマーカプレＨＰ２は、表に開示されたＮＡＳＨ診断で選択された９つのシグネチャー（シグネチャーｙ１〜ｙ９）の５の要素である。ＮＡＳＨ診断で、プレＨＰ２に関連する５つの四捨五入範囲のうち、最低値は−１、最大値は１であり、プレＨＰ２に関わる係数の許容値が、範囲［−１、１］となる。四捨五入範囲を用いると、あるシグネチャーにおいて、各係数及び閾値の値から想定されるよりも広く定義することができる。あるいは、表４ｂ及び５ｂの最後の列（ｙ９）に対応する下式（３）を、測定したバイオマーカの変数、すなわち、３〜１１のバイオマーカで用いることができる。
【数３】
2020527716.tif 000005
【００６０】
式（３）で用いる各バイオマーカについて、指示関数ｉｋ（ｋ＝５，…，１２）は１に等しく、用いないバイオマーカについては、指示関数ｉｋは０に等しい。
【００６１】
従って、特定の実施形態において、（３）式は、式（ｉ５〜ｉ１２＝１）で示す１１のバイオマーカで用いられる。すなわちｙ１０はｙ９である。
【数４】
2020527716.tif 000006
【００６２】
３〜６のバイオマーカの組み合わせを用いる式（３）の他の変形例を表４及び５にｙ１〜ｙ８（それぞれ［式（５）］〜［式（１２）］）で示す。
【００６３】
特定の実施形態において、ｙ１〜ｙ９の係数ａｋは、それぞれ、表４ａ及び４ｂ（ＮＡＳＨ診断）及び表５ａ及び５ｂ（線維症ステージ）において、「ａｋ」として示される値を有する。
【００６４】
さらに、特定の実施形態において、ｙ１〜ｙ９の係数ａｋは、それぞれ、表４ａ及び４ｂ（ＮＡＳＨ診断）及び表５ａ及び５ｂ（線維症ステージ）において、「Ｒａｎｇｅ＿ａｋ」又は「Ｒａｎｇｅ＿ａｋ＿ｒｏｕｎｄｅｄ」として示される範囲に含まれる値を有する。
【００６５】
さらに、特定の実施形態において、係数ａｋは、それぞれ、表４ａ及び４ｂ（ＮＡＳＨ診断）及び表５ａ及び５ｂ（線維症ステージ）において、「Ｒａｎｇｅ＿ａｋ＿ｒｏｕｎｄｅｄ＿ｇｌｏｂａｌ」として示される範囲に含まれる値を有する。
【００６６】
特定の実施形態において、式（３）の係数ａｋは、それぞれ、表４ａ及び４ｂ（ＮＡＳＨ診断）及び表５ａ及び５ｂ（線維症ステージ）において、ｙ９の「ａｋ」として示される値を有する。
【００６７】
特定の実施形態において、式（３）の係数ａｋは、それぞれ、表４ａ及び４ｂ（ＮＡＳＨ診断）及び表５ａ及び５ｂ（線維症ステージ）において、「Ｒａｎｇｅ＿ａｋ」、」Ｒａｎｇｅ＿ａｋ＿ｒｏｕｎｄｅｄ」又は「Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＿ｒｏｕｎｄｅｄ＿ｇｌｏｂａｌ」としてｙ９に示される範囲に含まれる値を有する。
【００６８】
従って、ＮＡＳＨの診断のための特定の実施形態において、式（３）を、以下の係数ａｋで用いる。
【表１】
2020527716.tif 000007
【００６９】
線維症ステージ判断のための特定の実施形態において、式（３）を以下の係数ａｋで用いる。
【表２】
2020527716.tif 000008
【００７０】
ＮＡＳＨの診断のための特定の実施形態において、係数ａｋで得られたスコアｆが、閾値ｔ＿ＮＡＳＨ（ｔ＿ＮＡＳＨは、範囲［０，１」に含まれる値を有する）より大きいとき、対象者はＮＡＳＨに罹患されていると判断される。そうでなく、ｆがｔ＿ＮＡＳＨ以下の場合は、対象者はＮＡＳＨに罹患していないと判断される。特定の実施形態において、ｔ＿ＮＡＳＨは、表４ａ及び４ｂに「Ｒａｎｇｅ＿Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＿ｒｏｕｎｄｅｄ＿ｇｌｏｂａｌ」で示される範囲に含まれる値を有する。さらに特定の実施形態において、ｔ＿ＮＡＳＨは、表４ａ及び４ｂに「Ｒａｎｇｅ＿Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ」又は「Ｒａｎｇｅ＿Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＿ｒｏｕｎｄｅｄ」で示される範囲に含まれる値を有する。さらに特定の実施形態において、ｔ＿ＮＡＳＨは、表４ａ及び４ｂに「Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ」で示される範囲に含まれる値を有する。すなわち、値は、
ｙがｙ１のとき、０．４９９７（又は０．５０）、
ｙがｙ２のとき、０．４８０５（又は０．４８）、
ｙがｙ３のとき、０．５８２５（又は０．５８）、
ｙがｙ４のとき、０．５０４５（又は０．５０）、
ｙがｙ５のとき、０．５０７６（又は０．５１）
ｙがｙ６のとき、０．３７１５（又は０．３７）、
ｙがｙ７のとき、０．５０４５（又は０．５０）、
ｙがｙ８のとき、０．５２１９（又は０．５２）、及び
ｙがｙ９又はｙ１０のとき、０．６４５９（又は０．６５）。
【００７１】
線維症ステージ判断のための特定の実施形態において、係数ａｋで得られたスコアｆが、閾値ｔ＿ｆｉｂｒｏｓｉｓ（ｔ＿ｆｉｂｒｏｓｉｓは、範囲［０，１」に含まれる値を有する）より大きいとき、対象者の肝線維症ステータスは進行性線維症（線維症スコアＦ≧３に対応する）と判断される。そうでなく、ｆがｔ＿ｆｉｂｒｏｓｉｓ以下の場合は、対象者の肝線維症ステータスは、線維症スコアＦ＜３に対応すると判断される。特定の実施形態において、ｔ＿ｆｉｂｒｏｓｉｓは、表５ａ及び５ｂに「Ｒａｎｇｅ＿Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＿ｒｏｕｎｄｅｄ＿ｇｌｏｂａｌ」で示される範囲に含まれる値を有する。さらに特定の実施形態において、ｔ＿ｆｉｂｒｏｓｉｓは、表５ａ及び５ｂに「Ｒａｎｇｅ＿Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ」又は「Ｒａｎｇｅ＿Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＿ｒｏｕｎｄｅｄ」で示される範囲に含まれる値を有する。さらに特定の実施形態において、ｔ＿ｆｉｂｒｏｓｉｓは、表５ａ及び５ｂに「Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ」で示される範囲に含まれる値を有する。すなわち、値は、
ｙがｙ１のとき、０．１９５３（又は０．２０）、
ｙがｙ２のとき、０．１２５３（又は０．１３）、
ｙがｙ３のとき、０．６８０４（又は０．６８）、
ｙがｙ４のとき、０．５７３９（又は０．５７）、
ｙがｙ５のとき、０．６５６９（又は０．６６）、
ｙがｙ７、ｙ８、ｙ９又はｙ１０のとき、０．５である。
【００７２】
特定の実施形態において、式（３）を用い、ｔ＿ＮＡＳＨ及びｔ＿線維症は、それぞれ、表４ａ及び４ｂ（ＮＡＳＨ診断）及び表５ａ及び５ｂ（線維症ステージ）の「Ｒａｎｇｅ＿Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ」、」Ｒａｎｇｅ＿Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＿ｒｏｕｎｄｅｄ」又は「Ｒａｎｇｅ＿Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＿ｒｏｕｎｄｅｄ＿ｇｌｏｂａｌ」として、ｙ９について示された範囲に含まれる値を有する。
【００７３】
上記（２）に定義された本発明の方法は、対象者、特に、ＮＡＦＬＤやＮＡＳＨに罹患した対象者の肝線維症ステータスについて判断するのに好適である。肝線維症ステータスとは、肝線維症のステージ及び重症度を指し、どの治療を施すか医師の決定に対して非常に重要なものである。特定の実施形態において、本明細書で参照する肝線維症ステータスは、Ｂｒｕｎｔスコア（Ｂｒｕｎｔ、Ｅ．Ｍ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ、１９９９．９４（９）：ｐ．２４６７−７４）、Ｍｅｔａｖｉｒスコア（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．１９９６  Ａｕｇ；２４（２）：２８９−９３）、Ｋｌｅｉｎｅｒスコア（Ｋｌｅｉｎｅｒ、Ｄ．Ｅ．ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、２００５．４１（６）：ｐ．１３１３−２１）又はＳＡＦスコア（非特許文献２０）のいずれかに対応する。本発明の方法は、ＮＡＦＬＤに罹患していることが分かっている患者において、ＮＡＳＨ及び／又はＮＡＳＨの重症度を診断するのに特に向いているが、本方法は、同様に、例えば、心血管疾患、糖尿病、肥満、又はＨＩＶ（例えば、ＨＩＶ−１やＨＩＶ−２）や肝炎ウイルス（例えば、ＨＣＶ）のような血液ウイルスによる感染のような、他の併存疾患のある患者のＮＡＳＨ及び／又はＮＡＳＨの重症度を診断するのにも向いている。
【００７４】
上述した通り、開示された方法はさらに、開示された方法に従って、ＮＡＳＨと診断された対象者を治療することを含む（すなわち、「数理モデル」又は「閾値法」）。特定の実施形態において、ＮＡＳＨと診断された患者は、ロジグリタゾンやピログリタゾンのようなグリタソンを単体又はビタミンＥと組み合わせて、ＧＳ−９６７４、ＬＪＮ−４５２、ＥＤＰ−３０５及びオベチコール酸のようなＦＸＲアゴニスト、エラフィブラノール、サログリタザール、ＩＶＡ−３３７のようなＰＰＡＲα及びＰＰＡＲβ（ＰＰＡＲδ）及び／又はＰＰＡＲγアゴニスト、ＮＧＭ−２８２のようなＦＧＦ−１９類似体、ＰＦ−０５２３１０２３のようなＦＧＦ２１類似体（（ＣＶＸ−３４３）、長時間作用型ＦＧＦ２１類似体、マレイミド−アゼチジノンリンカーを介して、ヒト化ＩｇＧ１κ  ｍＡｂ骨格に共有結合した［ｄｅｓ−Ｈｉｓ１、Ａｌａ１２９Ｃｙｓ］ＦＧＦ２１２分子から構成される、Ｇｉｒａｇｏｓｓｉａｎら、２０１５、Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ、４３（６）：８０３−８１１、全内容が参考文献としてここに組み込まれる）、アラムコールのようなＳＤＤ１阻害剤、リラグルチドのようなＧＬＰ−１類似体、ノル−ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、ビタミンＥのような酸化防止剤、ＧＳ−４９９７のようなＡＳＫ１阻害剤、セニクリビオクのようなＣＣＲ２／ＣＣＲ５アンタゴニスト、ＶＬＸ−１０３のようなペンタミジン、エムリカサンのようなカスパーゼ阻害剤、シンツズマブのようなＬＯＸＬ２阻害剤、及び／又はガラクトアラビノラムノガラクツロン酸（ＧＲ−ＭＤ−０２）のようなガレクチン−３プロテイン阻害剤を投与することにより治療したり、全内容が参考文献としてここに組み込まれるＦｒｉｅｄｍａｎら、２０１８、Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ＮＡＦＬＤ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２４：９０８−９２２に開示されたその他の治療により治療することができる。
【００７５】
本発明を限定するものとは解釈されない以下の実施例により、本発明をさらに説明する。
【００７６】
実施例
材料及び方法
１．患者数：特徴のよく分かった生検で確認されたＮＡＦＬ又はＮＡＳＨの計８４名のＮＡＦＬＤ患者を、適合血清試料により、実験を行った。引き続き、生検患者を、ペサック病院（フランス、ボルドー）で、２０１１〜２０１４年の間フォローした。実験は、地元の倫理委員会に認可されたものであり、１９７５年のヘルシンキ宣言において立証されたものであった。全員の患者から書面によるインフォームドコンセントを受け取った。各患者について、５ｍｌの静脈血を、標準乾燥チューブに集めた。チューブに、患者、サンプリング日時を識別するコードを付けた。全グループからの血清試料（１ｍｌ）を遠心分離し、バイオマーカ評価のために、−８０℃で保管した。ヒト試料で、全バイオマーカ分析を、予備知識のないオペレータにより行った。
【００７７】
ＮＡＦＬＤの臨床診断は、次の基準に基づくものであった。上昇アミノ基転移酵素（ＡＳＴ及び／又はＡＬＴ）、少なくとも５％の肝細胞が脂肪症を示す肝生検、及びアルコール誘発性や薬物誘発性肝疾患、自己免疫疾患、ウイルス性疾患をはじめとするその他病因による肝疾患の適切な排除。患者は全員、週間エタノール消費量が女性で＜１４０ｇ及び男性で＜２１０ｇの、エタノール乱用履歴がネガティブであった。
【００７８】
肝生検の診断と同日に、臨床及び実験データを集めた。含まれる患者の臨床特徴を、表１に示す。ＢＭＩは、体重（キログラム）／（身長（メートル）2）で計算した。高血圧は、血圧測定をし、ｍｍＨｇでの読み取った。収縮期血圧が≧１４０ｍｍＨｇ又は拡張期血圧が≧９０ｍｍＨｇのとき、高血圧とする。実験評価は、ルーチンの肝臓生化学（ＡＬＴ及びＡＳＴレベル、ガンマグルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）、血小板、ＨＤＬコレステロール、合計トリグリセリド及び空腹時血糖）を含んでいた。ＮＡＦＬ／ＮＡＳＨの診断は、Ｋｌｅｉｎｅｒ、Ｄ．Ｅ．ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、２００５．４１（６）：１３１３−２１による肝生検及びＮＡＳスコアリングシステムに基づいていた。この探究的コホートは、８４名のＮＡＦＬＤ患者を含んでおり、内４４名がＮＡＳＨ患者と診断された。
【００７９】
２．肝臓組織学（ＮＡＳＨ、線維症）：ＮＡＳＨの重症度を、ＮＡＳスコアリングシステム（Ｋｌｅｉｎｅｒ、Ｄ．Ｅ．ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、２００５．４１（６）：１３１３−２１）に従って評価し、ＮＡＳの各コンポーネントのスコアを、脂肪症（０〜３）、小葉内炎症（０〜３）及びバルーニング（０〜２）で計算した。最終スコアを、３つのコンポーネント≦２（ＮＡＳＨ無し）、３−４（境界線）及び≧５（ＮＡＳＨ）のスコアの合計で計算した。調査した人口及びＮＡＳスコアリングシステムによれば、４４名の患者が、ＮＡＳＨと診断され、４０名の患者がＮＡＦＬ（ＮＡＳＨ無し＋境界線の患者）と診断された。
【００８０】
線維症の肝生検を、Ｂｒｕｎｔスコア（Ｂｒｕｎｔ、Ｅ．Ｍ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ、１９９９．９４（９）：２４６７−７４）に従って評価した。Ｆ０＝線維症なし、Ｆ１＝小葉中心型類洞周囲線維症、Ｆ２＝小葉中心型類洞周囲線維症及び／又は門脈周囲性線維症、Ｆ３＝架橋線維症、Ｆ４＝肝硬変。重症の線維症はＦ≧２、進行性線維症はＦ≧３、肝硬変はＦ４と定義された。最新のＥＡＳＬガイドライン（非特許文献１４）に推奨される通り、進行性線維症（Ｆ≧３）のＮＡＳＨ患者を、主要診断ターゲットとして選んだ。調査人口のうち、Ｂｒｕｎｔスコアに従えば、４名の患者が、Ｆ０ステージ、２０名の患者がＦ１、２５名の患者がＦ２、２４名の患者がＦ３及び１１名の患者がＦ４と評価された。
【００８１】
３．肝硬度測定：フィブリオスキャン（登録商標）による肝硬度測定（ＬＳＭ）を、手順に慣れていて、患者データは見られない専門看護師により、標準Ｍ又はＸＬプローブを用いて行った。ＬＳＭは、空腹状態で、肝生検日又はその前後３か月以内に行った。検査条件は、メーカー（Ｃａｓｔｅｒａ、Ｌ．、Ｘ．Ｆｏｒｎｓ、及びＡ．Ａｌｂｅｒｔｉ、Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ、２００８．４８（５）：８３５−４７）に推奨されるものであった。１０の有効な測定結果が記録されたらＬＳＭを停止し、結果を有効な測定結果の中央値として表した。ＬＳＭ失敗は、有効な測定結果のないＬＳＭ（０％成功率）又はデバイスにより計算された四分位範囲（ＩＱＲ）のない１つのみの有効な測定結果のあるＬＳＭと定義された。
【００８２】
４．線維症の生物学的スコア：空腹血液試料を、肝生検の前日又は１週間以内に採取した。最新の式、指示及びカットオフ値に従って、６つの血液線維症試験を計算した。Ｆｉｂｒｏｔｅｓｔ（登録商標）（性別、年齢、α２−マクログロブリン、ハプトグロビン、ＧＧＴ、アポリポプロテインＡ１及びビリルビン）（Ｉｍｂｅｒｔ−Ｂｉｓｍｕｔ、Ｆ．ら、Ｌａｎｃｅｔ、２００１．３５７（９２６２）：１０６９−７５）、Ｈｅｐａｓｃｏｒｅ（登録商標）（年齢、性別、α２−マクログロブリ、ヒアルロン酸、ガンマグルタミルトランスフェラーゼ及びビリルビン）（Ａｄａｍｓ、Ｌ．Ａ．ら、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ、２００５．５１（１０）：１８６７−７３）、Ｆｏｒｎ'ｓスコア（年齢、血小板数、ＧＧＴ及びコレステロール）（Ｆｏｒｎｓ，Ｘ．ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、２００２．３６：９８６−９２）、ＡＰＲＩ（ＡＳＴ  ｔｏ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｒａｔｉｏ  ｉｎｄｅｘ）（Ｗａｉ、Ｃ．Ｔ．ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、２００３．３８（２）：５１８−２６）、ＦＩＢ−４（年齢、ＡＳＴ及びＡＬＴレベル及び血小板数）（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、Ｒ．Ｋ．ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、２００６．４３（６）：１３１７−２５）、ＮＡＦＬＤ線維症スコア（年齢、ＢＭＩ、空腹時血糖異常（ＩＦＧ）、ＡＳＴ／ＡＬＴ比、血小板、アルブミン）（非特許文献３５）。ＮＡＦＬＤ線維症スコアは、ＮＡＦＬＤにおける肝線維症評価のために特別に開発されたが、他の５つの試験は、慢性ウイルス性肝炎の患者に開発されたものであった。
【００８３】
５．バイオマーカの血清レベルの測定（ＥＬＩＳＡ及びＢｉｏｐｌｅｘ／Ｌｕｍｉｎｅｘ）：合計６つのバイオマーカを、全ての患者の血清で定量した。ヒアルノナン（ＨＡ）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン１０（ＣＸＣＬ１０又はＩＰ１０）、インターロイキン８（ＩＬ−８）、グレリン、プレＨＰ２及びハプトグロビン。メーカーの指示に従って、４つのバイオマーカの血清濃度を、市販又は手製ＥＬＩＳＡにより、２つを市販のＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｂｉｏｐｌｅｘパネル（２７−ｐｌｅｘ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ及び１０−ｐｌｅｘ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｐａｎｅｌｓ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＵＳＡ）により、測定した。各実験を２回実施した。
【００８４】
ＥＬＩＳＡアッセイ：ＣＸＣＬ１０の血清レベルを、ヒトＣＸＣＬ１０／ＩＰ１０について、ＤＩＰ１００  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙを用いて測定した（プレート間又はプレート内変動係数は、それぞれ、３．４±１．９％及び４．４±２．１％であった。Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＵＳＡ）。ＨＡの血清レベルを、ＤＨＹＡＬ０  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（３．９±１．９％及び４．８±３．２％；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＵＳＡ）を用いて測定した。血清インターロイキン８（ＩＬ−８）濃度を、ヒトＩＬ−８ ＥＬＩＳＡキット、ＫＨＣ００８１、４．１±３．８％及び３．４±２．８％  ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＵＳＡ）を用いて測定した。血清プレＨＰ２濃度を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｈｏｍｅ−ｍａｄｅ  ＥＬＩＳＡ（７．０±５．１％及び９．０±８．７，％；Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＵＳＡ）（Ｆｌａｎａｇａｎ、Ｊ．Ｊ．ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０１４．４０６：ｐ．３４−４２）を用いて測定した。血清ハプトグロビン濃度を、Ｈｕｍａｎ  Ｈａｐｔｏｇｌｏｂｉｎ  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡＫｉｔ、（ＤＨＡＰＧ０；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて測定した。
【００８５】
Ｂｉｏｐｌｅｘ／Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイ：ターゲットプロテインに特異的なモノクローナル抗体と抱合した染色マイクロスフェアを含む、多重化生体識別ＥＬＩＳＡベースのイムノアッセイを、メーカーの指示に従って用いた（Ｂｉｏｐｌｅｘ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＵＳＡ）。可溶性分子を、ｉ）２７プレックスパネル内ＣＸＣＬ１０及びｉｉ）１０プレックスパネル内グレリンの２つの市販のキットを用いて測定した。
【００８６】
簡潔に述べると、３０μｌ血清試料を、好適なバッファで１：４に希釈し、抗体結合ビーズでインキュベートした。錯体をまず、洗ってから、サイトカイン濃度力価を評価する前に、ビオチン化検出抗体と、最後は、ストレプトアビジン−フィコエリスリンの両方によってインキュベートした。濃縮ヒト組換えサイトカインが、ベンダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＵＳＡ）により供給された。広範囲の１．９５１−３２，０００ｐｇ／ｍｌの標準を用いて、標準曲線を確立して、アッセイの感度及びダイナミックレンジを最大化した。全プロテインの血清レベルを、超少量流体容積の９６ウェルプレートで多重化イムノアッセイを定量化するＢｉｏ−Ｐｌｅｘアレイリーダー（Ｌｕｍｉｎｅｘ、Ａｕｓｔｉｎ、ＵＳＡ）を用いて判断した。分析物の濃度を、標準曲線を用いて、メーカーにより提供されたソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ  Ｍａｎａｇｅｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）で計算した。
【００８７】
６．統計分析：本実験で用いた統計分析や図面の全てについて、「Ｒ  ｖ３．２．１」統計オープンソースソフトウェア（ウェブサイトR-project.org/を参照）を用いた。全てのデータ（バイオマーカ濃度及び臨床変数）を、単変量層別解析により評価した。ウィルコクソン試験を適用して、患者グループ間の大きな違いを判断した。各バイオマーカについて、次の統計情報を与える。平均±標準偏差（ＳＤ）、適用試験のｐ値、ｑ値（「ｍｕｌｔｔｅｓｔ」Ｒパッケージで実施されたＢｅｎｊａｍｉｎｉ及びＨｏｃｈｂｅｒｇアプローチ（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ、Ｄ．ａ．Ｈ．、Ｙ．、Ｊ  Ｒｏｙ  Ｓｔａｔｉｓｔ  Ｓｏｃ  Ｓｅｒ  Ｂ  １９９５．５７：２８９−３００）による複数試験について補正されたｐ値）、ｎ倍中央値（ＮＡＳＨ/ＮＡＦＬ中央比）及びＡＵＣ（Ａｒｅａ  Ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  ＲＯＣ  Ｃｕｒｖｅ）.
【００８８】
単変量解析に加えて、ロジスティック回帰法（Ｈｏｓｍｅｒ、Ｄ．Ｗ．及びＬｅｍｅｓｈｏｗ、Ｓ．、Ａｐｐｌｉｅｄ  ロジスティック回帰．  Ｗｉｌｅｙ  Ｓｅｒｉｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ  及びＭａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ、２０００）を用いた潜在的な改善を評価するために、バイオマーカの全ての組み合わせを試験した。ロジスティック回帰モデルは、上記式（１）及び（２）に示されている。
【００８９】
バイオマーカの各組み合わせの診断性能は、以下の基準により評価される。患者の総数により除算された真陽性（ＴＰ）及び真陰性（ＴＮ）の合計である、正確又は良好な分類率、「病理学的」な母集団を検出する能力を表す感度（Ｓｅ）（本ケースにおいては、「ＮＡＳＨ」又は「Ｆ≧３」）、Ｓｅ＝ＴＰ／（ＴＰ＋ＦＮ）、「コントロール」の母集団を検出する能力を表す特異性（Ｓｐ）（本ケースにおいては、ＮＡＦＬ又は「Ｆ＜３」）、Ｓｐ＝ＴＮ／（ＴＮ＋ＦＰ）、陽性的中率（ＰＰＶ）ＰＰＶ＝ＴＰ／（ＴＰ＋ＦＰ）、陰性的中率（ＮＰＶ）ＮＰＶ＝ＴＮ／（ＴＮ＋ＦＮ）、ＲＯＣ曲線が、様々な閾値についての試験のＳｅとＳｐの間の相関性のグラフによる可視化であるＡＵＣ。ＡＵＣが１に近づけば近づくほど、バイオマーカ又はバイオマーカの組み合わせは、２つの母集団、すなわち、ＮＡＳＨ／ＮＡＳＨ無し、或いは線維症スコアがＦ≧３かＦ＜３であるかを区別することができる。それぞれ選択したシグネチャーについて、上述した性能に加えロジスティック回帰モデル及び選択した閾値のパラメータが示される。閾値は、Ｙｏｕｄｅｎ基準（Ｙｏｕｄｅｎ、Ｗ．Ｊ．、Ｃａｎｃｅｒ、１９５０．３（１）：３２−５）に従って選択される。すなわち、Ｓｅ＋Ｓｐ−１を最大化するものである。
【００９０】
過剰適合を避けるために、バイオマーカの組み合わせを、１０回交差検証法（Ｈａｓｔｉｅ、Ｔ．Ｔ．、Ｒ．  及びＦｒｉｅｄｍａｎ、Ｊ．  Ｈ．、Ｔｈｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ：  Ｄａｔａ  Ｍｉｎｉｎｇ、Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ、及びＰｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｍｅｄｉａ、２００１）により評価した。モデル化は母集団の９０％で実現し、予測は残りの１０％である。
各試料が、「トレーニングセット」と「テストセット」で交互になるように（より正確には、トレーニングセットにおいては、各試料が９回、テストセットでは一回）手順を１０回う。両トレーニング及びテストセットで得られた性能を示す。各シグネチャーについて、１０のモデルを１０のトレーニングセットで構築し、これらトレーニングセットで得られたＡＵＣの平均、最小及び最大、Ｓｅ及びＳｐを示す（これらは、ＡＵＣトレーニング、Ｓｅトレーニング及びＳｐトレーニングと呼ばれる）。試料が試験セットであるとき、結果は、残りの試料（トレーニングセット）かにより構築されたモデルから推定され、最後に、全ての試料についての推定が全て得られるように集められる（各試料は、推定結果が得られたモデルからは排除される）。テストセットのＡＵＣ、Ｓｅ及びＳｐもまた示される（これらは、ＡＵＣテスト、Ｓｅテスト及びＳｐテストと呼ばれる）。
【００９１】
区別の点で、最良の指針（「ＮＡＳＨスコア」及び「線維症スコア」）を定義すると、独立因子を組み合わせたロジスティック回帰関数であった。ロジスティック関数は、各パラメータの相対的重みを組み合わせることにより得られる。
【００９２】
このようにして得られた回帰式を、それぞれ、表４ａ及び４ｂ（ＮＡＳＨ診断）及び表５ａ及び５ｂ（線維症ステージ）の１行目に示す。診断に用いたマーカの数に応じて、特性係数ａｋを本明細書に開示した各表に示す。
【００９３】
結果
１．患者人口の特徴：Ｐｅｓｓａｃ  Ｂｏｒｄｅａｕｘ病院の生検により確定診断された８４名のＮＡＦＬＤ患者が調査に含まれていた。ＮＡＳＨとＮＡＦＬの患者間の臨床人口統計及び実験室データの比較を表１に示す。中央値（±ＳＤ）ＮＡＳスコアは、ＮＡＦＬグループで３．５（±０．９）及びＮＡＳＨグループで５．０（±０．６）であった。血清ＡＬＴ、ＡＳＴの増加及び肝脂肪症の上昇は、ＮＡＳＨの存在の可能性の増加に独立して関連していた（表１）。予測通り、組織学的に重症な線維症ステージ（Ｆ３、Ｆ４）の有病率は、ＮＡＳＨ対ＮＡＦＬグループで、それぞれ５０％及び３２．５％と優勢であった。
【００９４】
２．単変量解析：
ＮＡＳＨバイオマーカ：６つの調査した循環バイオマーカのうち、ＣＸＣＬ１０が最良のバイオマーカであり、ＮＡＳＨとＮＡＦＬのグループをｐ＝０．００１及びＡＵＣ＝０．７２１で区別できた（図１Ａ及び表２ａ）。血清グレリンの減少もまた、ＮＡＳＨの存在の可能性の増加に関連しており、ＮＡＦＬ及びＮＡＳＨグループにおける平均は、それぞれ、１０５１（±６３４）ｐｇ／ｍｌ及び７６８（±５２１）ｐｇ／ｍｌであった（図１Ｃ及び表２ａ）。
【００９５】
ＮＡＳスコアリングシステムによる、脂肪症、小葉内炎症及び肝細胞バルーニングのバイオマーカ。６つの調査した循環バイオマーカのうち、３つのバイオマーカが、小葉内炎症（ＮＡＳスコアリングシステム）によれば、大幅に外れていた。ＣＸＣＬ１０、ＩＬ−８及びプレＨＰ２は、有意なｐ値＜０．０５を有していた（表３）。最良のバイオマーカは、ｐ値＝０．００００４のＣＸＣＬ１０であった（図２Ａ及び表３）.
【００９６】
ＣＸＣＬ１０及びＩＬ−８は肝細胞バルーニング（ＮＡＳスコアリングシステム）を測定するのに有意であり、ｐ値＜０．０５（図３及び表３）であった。
【００９７】
６つのバイオマーカのうち脂肪症を測定するのに有意なものはなかった（表３）。
【００９８】
線維症バイオマーカ：ＨＡ、ＩＬ−８及びＣＸＣＬ１０は、有意なｐ値≦０．０５で、ＮＡＳＨ中、進行した線維症（Ｆ≧３）において外れていなかったことが分かった。特に、ＨＡでは、ＢｒｕｎｔスコアＦ≧３とＢｒｕｎｔスコアＦ＜３との区別が最良であり、ｐ＝０．０００１、ＡＵＣ＝０．９２４（図４Ａ及び表２ｂ）。
【００９９】
２．モデル構築−ＮＡＳＨと進行性線維症評価の１つで２役の診断
ＮＡＳＨ患者のＮＡＳＨ診断と線維症評価について得られた結果に基づいて、１８の数学アルゴリズムによりグローバルスコアリングシステムを設計し、進行性線維症の有無そしてＮＡＳＨの有無について患者を同時に区別した。
【０１００】
最良の単変量結果によれば、ＨＡ、ＣＸＣＬ１０及びＩＬ−８で構成されたバイオマーカのコアを識別し、ＮＡＳＨとＮＡＦＬ間にある大きな差、そして、ＢｒｕｎｔスコアＦ≧３及びＢｒｕｎｔスコアＦ＜３（「ＮＡＳＨ」及び「線維症」）に対応する肝線維症ステータスが得られる。このコアを表すバイオマーカの全ての組み合わせを評価した。表４ａ、４ｂ、５ａ及び５ｂに示した１８のシグネチャーを選択し、ＮＡＳＨの有意診断及びＮＡＳＨ患者の線維症ステージ判断を可能とした。
【０１０１】
「ＮＡＳＨ」アルゴリズムにより得られた診断性能は次の通りである。ＡＵＣ＝［０．７９４−０．８８１］、精度＝［０．７５−０．８２］、Ｓｅ＝［０．５８−０．９７］、Ｓｐ＝［０．６４−０．９２］、ＰＰＶ＝［０．７７−０．８８］、ＮＰＶ＝［０．６８−０．９４］。診断性能は、市販又は無料の無侵襲性線維症試験で得られるものより良い（最良は、ＡＰＲＩ、ＡＵＣ＝０．６５３、精度＝０．６８、Ｓｅ＝０．７６、Ｓｐ＝０．５９、ＰＰＶ＝０．６７及びＮＰＶ＝０．７）（表６）。
【０１０２】
「線維症」アルゴリズムにより得られる診断性能は、次のような範囲の値であった。ＡＵＣ＝［０．９７１−１］、精度＝［０．８９−１］、Ｓｅ＝［０．９５−１］、Ｓｐ＝［０．７９−１］、ＰＰＶ＝［０．８３−１］、ＮＰＶ＝［０．９３−１］。診断性能は、市販又は無料の無侵襲性線維症試験で得られるものより良い（最良は、フィブリオスキャン（登録商標）、ＡＵＣ＝０．９０３、精度＝０．８７、Ｓｅ＝０．９５、Ｓｐ＝０．７６、ＰＰＶ＝０．８３及びＮＰＶ＝０．９３）（表７）。
【０１０３】
性能は、データ全体から得られた。過剰適合のリスクを評価するために、交差検証分析を行った。結果を表４ａ、４ｂ、５ａ及び５ｂに示す。１０回の交差検証アプローチを、「ＮＡＳＨ」及び「線維症」における性能評価に用いた。テスト（データ全体）及びトレイン（交差検証）セットからの性能（ＡＵＣ、Ｓｅ、Ｓｐ）を表４ａ、４ｂ、５ａ及び５ｂに示す。トレインセットで得られた性能を、平均と間隔［最小−最大］でまとめてある。全体的に、交差検証データセットで得られた診断性能は、データ全体で得られたロバスト性を確認したが、予想通り、テストセット性能では僅かな減少が観察されている。表４ａ及び４ｂに、表４ａ及び４ｂのシグネチャーに対応する全てのロジスティック回帰モデルの係数範囲が記載されている。
【０１０４】
一例を挙げると、ＮＡＳＨ診断及び線維症評価について提案された１８のアルゴリズムのうち（表４及び５）、ＩＬ−８、ＨＡ及びＣＸＣＬ１０を含む３つの一般的なバイオマーカレベルに基づくＮＡＳＨの診断のための回帰式は次の通りである。
【数５】
2020527716.tif 000009
式中、ｆ１(ＮＡＳＨ）は、
【数６】
2020527716.tif 000010
及び
【数７】
2020527716.tif 000011
【数８】
2020527716.tif 000012
式中、それぞれ
【０１０５】
Ｙｏｕｄｅｎ法のカットオフとして定義される閾値に従って（「ＮＡＳＨ」については０．４９９７、「線維症」についてｈ０．１９５３）、ＮＡＳＨについての試験の診断精度は、７６％、Ｓｅ６９％、Ｓｐ８４％、ＰＰＶ８２％及びＮＰＶ７２％（表４）であった。ＮＡＳＨ患者における進行性線維症評価について、テストの最良の診断精度は９２％、Ｓｅ１００％、Ｓｐ８４％、ＰＰＶ８７％、ＮＰＶ１００％であった（表５）。
【０１０６】
本例において、ｆ１(ＮＡＳＨ）＞０．４９９７のとき、患者はＮＡＳＨと診断され、ｆ１(ＮＡＳＨ）≦０．４９９７のとき、患者はＮＡＦＬと診断された（表４）。
【０１０７】
同様に、ｆ１(線維症）＞０．１９５３のとき、患者の肝線維症のステージは、進行性であり（Ｆ≧３）、ｆ１（線維症）≦０．１９５３のとき、患者の肝線維症のステージは早期中程度と判断される（Ｆ＜３）（表５）。
【０１０８】
表８及び９（それぞれ、ＮＡＳＨ診断及び線維症ステージ判断）において、同じ性能（精度、Ｓｅ、Ｓｐ、ＰＰＶ及びＮＰＶ）は、いくつかの閾値（０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８及び０．９）についてリストしてある。ＡＵＣは、選択した閾値から独立している。
【０１０９】
【表３】
2020527716.tif 000013
【表４】
2020527716.tif 000014
【表５】
2020527716.tif 000015
【表６】
2020527716.tif 000016
【表７】
2020527716.tif 000017
【表８】
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【表９】
2020527716.tif 000019
【表１０】
2020527716.tif 000020
【表１１】
2020527716.tif 000021
【表１２】
2020527716.tif 000022
【表１３】
2020527716.tif 000023
【表１４】
2020527716.tif 000024
【表１５】
2020527716.tif 000025
【表１６】
2020527716.tif 000026
【表１７】
2020527716.tif 000027
【表１８】
2020527716.tif 000028
【表１９】
2020527716.tif 000029
【表２０】
2020527716.tif 000030
【表２１】
2020527716.tif 000031
【表２２】
2020527716.tif 000032
【表２３】
2020527716.tif 000033
【表２４】
2020527716.tif 000034
【表２５】
2020527716.tif 000035
【表２６】
2020527716.tif 000036
【表２７】
2020527716.tif 000037
【表２８】
2020527716.tif 000038
【表２９】
2020527716.tif 000039
【表３０】
2020527716.tif 000040
【表３１】
2020527716.tif 000041
【表３２】
2020527716.tif 000042
【表３３】
2020527716.tif 000043
【表３４】
2020527716.tif 000044
【表３５】
2020527716.tif 000045
【表３６】
2020527716.tif 000046
【表３７】
2020527716.tif 000047
【表３８】
2020527716.tif 000048
【表３９】
2020527716.tif 000049
【表４０】
2020527716.tif 000050
【表４１】
2020527716.tif 000051
【表４２】
2020527716.tif 000052
【表４３】
2020527716.tif 000053
【表４４】
2020527716.tif 000054
【表４５】
2020527716.tif 000055
【表４６】
2020527716.tif 000056
【表４７】
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【図１Ａ】
2020527716.tif 000070
【図１Ｂ】
2020527716.tif 000071
【図１Ｃ】
2020527716.tif 000072
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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2020527716.tif 000084
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