(57)【要約】  本発明は、水溶性抗癌剤であるオキサリプラチンを含む経口用薬物送達組成物及びその製造方法に関する。さらに詳しくは、経口吸収促進剤である胆汁酸誘導体とオキサリプラチンのイオン結合による複合体を形成し、これを水中油中水型（water-in-oil-in-water；ｗ／ｏ／ｗ）の多重乳化ナノエマルションの内部水相に含ませ、水溶性抗癌剤であるオキサリプラチンの経口生体利用率を向上させ、現在注射剤形のみで投与されているオキサリプラチンを経口投与が可能な剤形に製造し、注射剤の使用による不便と問題を軽減し、患者のコンプライアンスの改善及び医療費削減に寄与できる経口用薬物送達組成物に関するものである。
2020522580.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）オキサリプラチンに正電荷を帯びた胆汁酸誘導体を添加して、イオン結合複合体を形成する工程；
（ｂ）第１油相に第１界面活性剤と第１補助界面活性剤との混合物を添加する工程；
（ｃ）前記イオン結合複合体と前記工程（ｂ）の混合物とを混合して、油中水型（water-in-oil、ｗ／ｏ）第１ナノエマルションを製造する工程；
（ｄ）前記油中水型（ｗ／ｏ）第１ナノエマルションに、第２界面活性剤と第２補助界面活性剤との混合物を添加して、水中油中水型（water-in-oil-in-water、ｗ／ｏ／ｗ）第２ナノエマルションを製造する工程；
を含むことを特徴とするオキサリプラチンを含む経口用薬物送達組成物の製造方法。
【請求項２】
前記胆汁酸誘導体は、Ｎα−デオキシコリル−Ｌ−リシル−メチルエステル（ＤＣＫ）であることを特徴とする請求項１に記載のオキサリプラチンを含む経口用薬物送達組成物の製造方法。
【請求項３】
前記第１油相は、シリコーンオイル、エステル系オイル、ハイドロカーボン系オイル、プロピレングリコールモノカプリレート（Ｃａｐｒｙｏｌ  ９０）、プロピレングリコールジカプリロカプレート（Ｌａｂｒａｆａｃ  ＰＧ）、オレオイルマクロゴール−６グリセリド（Ｌａｂｒａｆｉｌ  Ｍ１９４４  ＣＳ）、ラウロイルマクロゴール−６グリセリド（Ｌａｂｒａｆｉｌ  Ｍ２１３０  ＣＳ）、リノレオイルマクロゴール−６グリセリド（Ｌａｂｒａｆｉｌ  Ｍ２１２５  ＣＳ）、重鎖トリグリセリド（Ｌａｂｒａｆａｃ）、オレイン酸、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリン（Ｃｏｍｐｒｉｔｏｌ  ８８８）、グリセロールモノステアレート及びヒマシ油からなる群から選択されるいずれか一つ又は１種以上であることを特徴とする請求項１に記載のオキサリプラチンを含む経口用薬物送達組成物の製造方法。
【請求項４】
前記第１及び第２界面活性剤は、互いに独立して、ポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）、カプリロカプリルマクロゴール−８グリセリド（Ｌａｂｒａｓｏｌ）、クレモフォール（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ）、グリセロールモノカプリロカプレート（Ｃａｐｍｕｌ  ＭＣＭ）、ラウロイルマクロゴール−３２グリセリド（Ｇｅｌｕｃｉｒｅ  ４４／１４）、ソルトロール（Ｓｏｌｕｔｒｏｌ）、ポリソルベート（Ｔｗｅｅｎ）及びソルビタンモノラウレート（Ｓｐａｎ）からなる群から選択されるいずれか一つ又は１種以上であることを特徴とする請求項１に記載のオキサリプラチンを含む経口用薬物送達組成物の製造方法。
【請求項５】
前記第１及び第２補助界面活性剤は、互いに独立して、ジエチレングリコールモノエチルエーテル（Ｔｒａｎｓｃｕｔｏｌ  ＨＰ）、ポリソルベート、ポリエチレングリコール、ブチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール及びイソプロパノールからなる群から選択されるいずれか一つ又は１種以上であることを特徴とする請求項１に記載のオキサリプラチンを含む経口用薬物送達組成物の製造方法。
【請求項６】
前記胆汁酸誘導体は、オキサリプラチン１モルに対して、０．５〜５モル含まれることを特徴とする請求項１に記載のオキサリプラチンを含む経口用薬物送達組成物の製造方法。
【請求項７】
前記ｗ／ｏ／ｗ第２ナノエマルション内油中水型（ｗ／ｏ）第１ナノエマルションは、組成物全重量に対して、１〜４０重量％含まれることを特徴とする請求項１に記載のオキサリプラチンを含む経口用薬物送達組成物の製造方法。
【請求項８】
前記第１界面活性剤と第１補助界面活性剤との混合物及び第２界面活性剤と第２補助界面活性剤との混合物は、組成物全重量に対して、５〜９０重量％含まれることを特徴とする請求項１に記載のオキサリプラチンを含む経口用薬物送達組成物の製造方法。
【請求項９】
前記第１及び第２補助界面活性剤は、それぞれ第１及び第２界面活性剤に対して、互いに独立して、１：０．１〜１：１０の重量比で混合されることを特徴とする請求項１に記載のオキサリプラチンを含む経口用薬物送達組成物の製造方法。
【請求項１０】
前記工程（ａ）において、単糖類、多糖類、食物繊維、ガム類、界面活性剤又はタンパク質から選択される凝集防止剤をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のオキサリプラチンを含む経口用薬物送達組成物の製造方法
【請求項１１】
前記凝集防止剤は、オキサリプラチン１重量部に対し、０．１〜１００重量部含まれることを特徴とする請求項１０に記載のオキサリプラチンを含む経口用薬物送達組成物の製造方法。
【請求項１２】
前記ｗ／ｏ第１ナノエマルションは、内部水相に５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）又はロイコボリンから選択される親水性有効成分をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のオキサリプラチンを含む経口用薬物送達組成物の製造方法。
【請求項１３】
前記工程（ｄ）において、ｗ／ｏ／ｗ第２ナノエマルションは、油相に難溶性抗癌剤、クルクミン、ケルセチン、クルクミン又はケルセチンを有効成分として含有する天然抽出物、及びこれらの混合物から選択される脂溶性有効成分をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のオキサリプラチンを含む経口用薬物送達組成物の製造方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３に記載の製造方法によって製造されたオキサリプラチンを含む経口用薬物送達組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水溶性活性物質であるオキサリプラチンと経口吸収促進剤である胆汁酸誘導体とのイオン結合による複合体を多重乳化ナノエマルションの内部水相に含む経口用薬物送達組成物及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
オキサリプラチン（ＯＸＡ）（oxaliplatin, cis-[(1R,2R)-1,2-cyclohexanediamine- N,N'][oxalato(2-)- O,O’]platinum）は、白金（Ｐｔ）と１，２−ジアミノシクロヘキサンで構成され、オキサラトリガンドを脱離基に有する有機錯化合物であり、第３世代白金錯体の抗癌化合物であり、核内ＤＮＡと付加体を形成して、ＤＮＡ複製及び転写機序を妨げることで抗癌効果を示す。Ｐｔ−ＤＮＡ付加体は、一般に白金−グアニン−グアニン結合形態を有し、核酸レベルでＤＮＡの修復機序又は死滅経路の一つを作動させる。
【０００３】
また、オキサリプラチンは、エロキサチン（登録商標）という商品名で進行性大腸癌及び転移性胃癌治療剤として市販されており、一般に、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）及びロイコボリン（ｌｅｕｃｏｖｏｒｉｎ）と共に併用投与されたりもする。特に、転移性大腸癌は、エロキサチン（登録商標）（オキサリプラチン）又はフォルフォックス（ＦＯＬＦＯＸ）（フルオロウラシル／ロイコボリン／オキサリプラチン併用）、フォルフィリ（ＦＯＬＦＩＲＩ）（フルオロウラシル／ロイコボリン／イリノテカン併用）等の化学療法を使用し、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ社製のアバスチン（登録商標）（ベバシズマブ）は、２００４年に米国のＦＤＡから承認された。
【０００４】
オキサリプラチンは、現在、注射剤のみで患者に投与されており、凍結乾燥製剤の形態で患者に投与する直前に、注射用水、グルコース溶液又は０．９％塩化ナトリウム溶液で希釈して使用しなければならない。しかし、凍結乾燥工程は、複雑、且つ製造コストが高く、さらに凍結乾燥された製品を使用するためには、再構成が必要とされる。このような再構成過程でオキサリプラチンの損失、沈殿の発生、再構成時の望ましくない粒子の生成、汚染への露出リスクなどの問題が発生する可能性がある。特に汚染問題は抗腫瘍物質の毒性のために非常に深刻である。
【０００５】
最近、経口投与による抗癌治療療法は、患者の病院訪問後、注射剤投与による不便を最小化し、家で対処することができるようになり、これにより、患者のコンプライアンス改善及び生活の質を向上させることができることから注目されている。また、長期間血中薬物濃度を維持させ、癌細胞に低い濃度の抗癌剤を長期間露出させることにより、薬物の効果を保持し、副作用を最小化することによって癌の再発及び転移を防止するための予防次元の慢性治療療法として抗癌剤の適用を容易にすることができる。
【０００６】
しかし、抗癌剤の経口薬物送達は、有効成分の物理化学的特性と生理学的障害により多くの制約がある。このような制約には、薬物の全身血移行前代謝過程、胃腸管での薬物不安定性、低溶解性、低腸管膜透過性、ｐ−糖タンパク質（ｐ−ｇｐ）による排出が含まれる。
【０００７】
特に、オキサリプラチンは、低腸管膜透過性により低経口生体利用率を示すため、経口用製剤の使用が制限される。現在まで、オキサリプラチンを経口用製剤に製造するための試みはよく知られていないが、オキサリプラチンの場合、大腸癌治療のために大腸局所部位への送達のための、ｐＨ敏感性で、且つ粘膜付着型高分子であるキトサンベースのアルギン酸微小粒子及びヒアルロン酸が結合したキトサンナノ粒子にオキサリプラチンをカプセル化した後、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｓ１００でコーティングした経口用剤形が提示されていた。５−フルオロウラシルの場合も、大腸部位局所送達のために、ペクチンとエチルセルロースでコーティングしたペレット形態の製剤及びＰＬＧＡ（poly(lactic-co-glycolic acid)）ナノ粒子形の経口用製剤が提示されていた。
【０００８】
そこで、本発明者らは、前記オキサリプラチンのような水溶性活性物質を経口投与用剤形に製造するために鋭意研究した結果、オキサリプラチンを経口吸収促進剤である胆汁酸誘導体とイオン結合による複合体を形成した後、これをｗ／ｏ／ｗ（water-in-oil-in-water）多重乳化ナノエマルションの内部水相に含ませれば、薬物の腸管膜透過度が増加し、経口投与用剤形に製造することができることを見出し、本発明を完成した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Journal of Nanoscience and Nanotechnology, 2016, Vol. 16, pp. 2061-2064.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、水溶性抗癌剤であるオキサリプラチンをｗ／ｏ／ｗ（water-in-oil-in-water）多重乳化ナノエマルションの内部水相に含ませ、薬物の腸管膜透過度を増加させることで、経口投与用剤形に製造することにより、注射剤使用による不便と問題点を改善し、患者のコンプライアンスの改善及び医療費用削減に寄与できるオキサリプラチンを含む経口用薬物送達組成物及びその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は前記目的を達成するために、
（ａ）オキサリプラチンに正電荷を帯びた胆汁酸誘導体を添加して、イオン結合複合体を形成する工程；（ｂ）第１油相に第１界面活性剤と第１補助界面活性剤との混合物を添加する工程；（ｃ）前記イオン結合複合体と前記工程（ｂ）の混合物とを混合して、油中水型（water-in-oil；ｗ／ｏ）第１ナノエマルションを製造する工程；（ｄ）前記ｗ／ｏ第１ナノエマルションに、第２界面活性剤と第２補助界面活性剤との混合物を添加して、水中油中水型（water-in-oil-in-water；ｗ／ｏ／ｗ）第２ナノエマルションを製造する工程；を含むオキサリプラチンを含む経口用薬物送達組成物の製造方法を提供する。
【００１２】
前記胆汁酸誘導体は、Ｎα−デオキシコリル−Ｌ−リシル−メチルエステル（ＤＣＫ）であり、オキサリプラチン１モルに対して、０．５〜５モル含まれることを特徴とする。
【００１３】
前記ｗ／ｏ第１ナノエマルション内の油相は、シリコーンオイル、エステル系オイル、ハイドロカーボン系オイル、プロピレングリコールモノカプリレート（Ｃａｐｒｙｏｌ  ９０）、プロピレングリコールジカプリロカプレート（Ｌａｂｒａｆａｃ  ＰＧ）、オレオイルマクロゴール−６グリセリド（Ｌａｂｒａｆｉｌ  Ｍ１９４４  ＣＳ）、ラウロイルマクロゴール−６グリセリド（Ｌａｂｒａｆｉｌ  Ｍ２１３０  ＣＳ）、リノレオイルマクロゴール−６グリセリド（Ｌａｂｒａｆｉｌ  Ｍ２１２５  ＣＳ）、重鎖トリグリセリド（Ｌａｂｒａｆａｃ）、オレイン酸、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリン（Ｃｏｍｐｒｉｔｏｌ  ８８８）、グリセロールモノステアレート及びヒマシ油からなる群から選択されるいずれか一つ又は１種以上であることを特徴とする。
【００１４】
前記ｗ／ｏ／ｗ第２ナノエマルション内の油相は、組成物全重量に対して、１〜４０重量％含まれることを特徴とする。
【００１５】
前記第１及び第２界面活性剤は、互いに独立して、ポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）、カプリロカプリルマクロゴール−８グリセリド（Ｌａｂｒａｓｏｌ）、クレモフォール（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ）、グリセロールモノカプリロカプレート（Ｃａｐｍｕｌ  ＭＣＭ）、ラウロイルマクロゴール−３２グリセリド（Ｇｅｌｕｃｉｒｅ  ４４／１４）、ソルトロール（Ｓｏｌｕｔｒｏｌ）、ポリソルベート（Ｔｗｅｅｎ）及びソルビタンモノラウレート（Ｓｐａｎ）からなる群から選択されるいずれか一つ又は１種以上であることを特徴とする。
【００１６】
前記第１及び第２補助界面活性剤は、互いに独立して、ジエチレングリコールモノエチルエーテル（Ｔｒａｎｓｃｕｔｏｌ  ＨＰ）、ポリソルベート、ポリエチレングリコール、ブチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール及びイソプロパノールからなる群から選択されるいずれか一つ又は１種以上であることを特徴とする。
【００１７】
前記第１界面活性剤と第１補助界面活性剤との混合物及び第２界面活性剤と第２補助界面活性剤との混合物は、組成物全重量に対して、５〜９０重量％含まれることを特徴とする。
【００１８】
前記第１及び第２補助界面活性剤は、それぞれ第１及び第２界面活性剤に対して、互いに独立して、１：０．１〜１：１０の重量比で混合されることを特徴とする。
【００１９】
前記工程（ａ）において、単糖類、多糖類、食物繊維、ガム類、界面活性剤又はタンパク質から選択される凝集防止剤をさらに含んでもよく、前記凝集防止剤は、オキサリプラチン１重量部に対して、０．１〜１００重量部含まれることを特徴とする。
【００２０】
前記ｗ／ｏ第１ナノエマルションは、内部水相に、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）又はロイコボリンから選択される親水性有効成分をさらに含むことを特徴とする。
【００２１】
前記工程（ｄ）において、ｗ／ｏ／ｗ第２ナノエマルションは、油相に、難溶性抗癌剤、クルクミン、ケルセチン、クルクミン又はケルセチンを有効成分として含有する天然抽出物、及びこれらの混合物から選択される脂溶性有効成分をさらに含むことを特徴とする。
【００２２】
また、本発明は前記製造方法により製造されたオキサリプラチンを含む経口用薬物送達組成物を提供する。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によるオキサリプラチンを含む経口用薬物送達組成物は水溶性抗癌剤であるオキサリプラチンを経口吸収促進剤である胆汁酸誘導体と結合させ、イオン結合複合体を形成し、これをｗ／ｏ／ｗ多重乳化ナノエマルションに担持することで、経口生体利用率を向上させ、経口投与が可能な剤形に製造することができ、これにより、従来の注射剤使用による不便と問題を改善し、患者のコンプライアンスを向上し、医療費削減に寄与することができる効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明の実施例３による（Ａ）Ｓｍｉｘ，１２：１、（Ｂ）Ｓｍｉｘ，１１：１、（Ｃ）Ｓｍｉｘ，１１：２に対するｗ／ｏ第１ナノエマルション領域の疑似３相ダイヤグラムである。
【図２】本発明の実施例４による（Ａ）Ｓｍｉｘ，２２：１、（Ｂ）Ｓｍｉｘ，２１：１,（Ｃ）Ｓｍｉｘ，２１：２に対するｗ／ｏ／ｗ第２ナノエマルション領域の疑似３相ダイヤグラムである。
【図３】本発明の実施例５による（Ａ）粉末Ｘ線回折パターン及び（Ｂ）示差走査熱量計サーモグラムである。
【図４】本発明の実施例６による（Ａ）ＯＸＡあるいは（Ｂ）ＯＸＡ／ＤＣＫイオン結合複合体を含むｗ／ｏ／ｗ第２ナノエマルション組成Ｅ（Ｓｍｉｘ，２１：１）内液滴の粒度分布図及びＴＥＭ像である。
【図５】本発明の実施例７による（Ａ）ＯＸＡ、（Ｂ）ＯＸＡ／ＤＣＫイオン結合複合体及び（Ｃ）ＯＸＡ／ＤＣＫイオン結合複合体の人工腸管膜透過度である。
【図６】本発明の実施例９によるｐＨ１．２の条件で（Ａ）ＯＸＡ、（Ｂ）ＯＸＡ／ＤＣＫイオン結合複合体及び（Ｃ）５−ＦＵの累積薬物放出と、ｐＨ６．８の条件で（Ｄ）ＯＸＡ、（Ｅ）ＯＸＡ／ＤＣＫイオン結合複合体及び（Ｆ）５−ＦＵの累積薬物放出を示す図である。
【図７】本発明の実施例１０によるラットの、（Ａ）ＯＸＡ静脈注入後の経時的な血中薬物濃度、（Ｂ）ＯＸＡ、ＯＸＡ／ＤＣＫイオン結合複合体及びＯＸＡ／ＤＣＫイオン結合複合体を含む第２ナノエマルションの経口投与後の経時的な血中薬物濃度、（Ｃ）５−ＦＵ静脈注入後、及び５−ＦＵ又は５−ＦＵを含む第２ナノエマルションの経口投与後の経時的な血中薬物濃度を示す図である。
【図８】本発明の実施例１１による、（Ａ）経時による癌組織の大きさ、（Ｂ）経時によるマウスの体重変化、（Ｃ）１８日投与後、摘出した癌組織の重量を示す図である。
【図９】本発明の実施例１１による摘出した癌組織切片を（Ａ）ＰＣＮＡと（Ｂ）ＴＵＮＥＬで染色した切断面イメージを示した図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下、本発明によるオキサリプラチンを含む経口用薬物送達組成物及びその製造方法について、具体的に説明する。
【００２６】
本発明によるオキサリプラチンを含む経口用薬物送達組成物の製造方法は、（ａ）オキサリプラチンに正電荷を帯びた胆汁酸誘導体を添加して、イオン結合複合体を形成する工程；（ｂ）第１油相に、第１界面活性剤と第１補助界面活性剤との混合物を添加する工程；（ｃ）前記イオン結合複合体と前記工程（ｂ）の混合物とを混合して、油中水型（water-in-oil；ｗ／ｏ）第１ナノエマルションを製造する工程；（ｄ）前記ｗ／ｏ第１ナノエマルションに、第２界面活性剤と第２補助界面活性剤との混合物を添加して、水中油中水型（water-in-oil-in-water；ｗ／ｏ／ｗ）第２ナノエマルションを製造する工程；を含む。
【００２７】
前記オキサリプラチンは、親水性、且つ負電荷を帯びた活性物質であり、オキサリプラチン水溶液に正電荷を帯びた経口吸収促進剤である胆汁酸誘導体を添加して、イオン結合による複合体を形成する。
【００２８】
前記胆汁酸誘導体は、水溶液中で正電荷を帯びた両親媒性物質であり、Ｌ−リシンとデオキシコール酸を化学的に結合したＮα−デオキシコリル−Ｌ−リシル−メチルエステル（ＤＣＫ）であることが好ましい。また、オキサリプラチン１モルに対して、０．５〜５モル含まれるのが好ましく、より好ましくは１〜２モル含まれてもよい。
【００２９】
前記ＤＣＫは、経口吸収促進剤の役割を果たし、水溶液状態で正電荷を帯び、負電荷を帯びた親水性有効成分とイオン結合によって複合体を形成することで、親水性薬物分子の親油性を増加させ、油相への分配を向上させることができる。デオキシコール酸は、疎水性α部分と親水性β部分からなる両親媒性分子であり、細胞脂質二重層の膜表面に垂直結合し、脂質マトリックスのアシル鎖を撹乱させ、腸管細胞膜の柔軟性及び膜に対する脂溶性薬物の溶解性を増加させることで、薬物の膜透過度を向上させることができる。また、薬物と結合した胆汁酸誘導体であるデオキシコール酸は、腸管膜表面に存在する胆汁酸再吸収送達体によって認識されてもよく、これは腸管粘膜表面で薬物の高濃度勾配を誘発し、腸管膜に対する薬物の受動拡散を増加させる。したがって、薬物と吸収促進剤のイオン結合複合体の胆汁酸再吸収送達体との選択的相互作用による吸収増進効果は、単純に物理的混合により添加される従来の吸収促進剤とは違い、投与後、胃腸管で吸収促進剤が胃腸管内に存在する流体により希釈され、その作用が減少することを最小化することができるため、最小使用で親水性薬物の胃腸管吸収率を増加させることができる。
【００３０】
水溶液状態で形成されたイオン結合複合体を固形の粉末状態に製造するために、熱風乾燥、凍結乾燥、噴霧乾燥などの追加的な乾燥過程を経てもよく、また、乾燥粉末形態のイオン結合複合体の水溶液状態での迅速な再分散のために、イオン結合複合体製造時、凝集防止剤がさらに添加されてもよい。
【００３１】
前記凝集防止剤は、単糖類、多糖類、食物繊維、ガム類、界面活性剤又はタンパク質から選択されてもよく、好ましくは、マンニトール、スクロース、ラクトース、グルコース、トレハロース、グリセロール、フルクトース、マルトース、デキストラン、シクロデキストリン、グリシン、ポロキサマー、ポリビニルピロリドン、アラニン又はリシンから選択されるものであってもよく、より好ましくは、ポロキサマー、ポリビニルピロリドン、シクロデキストリン、ラクトース又はマンニトールから選択されるものであってもよい。
【００３２】
また、前記凝集防止剤は、オキサリプラチン１重量部に対して、０．１〜１００重量部含まれることが好ましく、より好ましくは０．１〜１０重量部含まれてもよい。
【００３３】
前記ｗ／ｏ第１ナノエマルションは、内部水相に、イオン結合複合体と併用投与して、抗癌シナジー効果を示すことができる親水性有効成分をさらに含んでもよく、前記親水性有効成分は、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）又はロイコボリンから選択されてもよい。親水性有効成分をナノエマルション製剤に含ませることで、薬物の胃腸管吸収率を増進させ、経口生体利用率を向上させることができる。
【００３４】
前記ｗ／ｏ第１ナノエマルション製造時に用いる第１油相は、シリコーンオイル、エステル系オイル、ハイドロカーボン系オイル、プロピレングリコールモノカプリレート（Ｃａｐｒｙｏｌ  ９０）、プロピレングリコールジカプリロカプレート（Ｌａｂｒａｆａｃ  ＰＧ）、オレオイルマクロゴール−６グリセリド（Ｌａｂｒａｆｉｌ  Ｍ１９４４  ＣＳ）、ラウロイルマクロゴール−６グリセリド（Ｌａｂｒａｆｉｌ  Ｍ２１３０  ＣＳ）、リノレオイルマクロゴール−６グリセリド（Ｌａｂｒａｆｉｌ  Ｍ２１２５  ＣＳ）、重鎖トリグリセリド（Ｌａｂｒａｆａｃ）、オレイン酸、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリン（Ｃｏｍｐｒｉｔｏｌ  ８８８）、グリセロールモノステアレート及びヒマシ油からなる群から選択されるいずれか一つ又は１種以上であることが好ましい。
【００３５】
前記ｗ／ｏ／ｗ第２ナノエマルション内のｗ／ｏ第１ナノエマルション（油相）は、組成物全重量に対して、１〜４０重量％含まれるのが好ましく、より好ましくは１０〜３０重量％含まれてもよい。前記ｗ／ｏ第１ナノエマルション（油相）の含有量が１重量％未満のとき、内部水相に薬物を溶解させることができなく、３０重量％を超えると、ナノエマルションの粒子が大きくなり、乳化安定度に劣る恐れがある。このとき、ｗ／ｏ第１ナノエマルション（油相）の含有量は、エマルション安定化剤を含まず、第２外部水相を含むｗ／ｏ／ｗ第２ナノエマルション全重量中のｗ／ｏ第１ナノエマルション（油相）の全量を意味する。
【００３６】
前記工程（ｄ）において、ｗ／ｏ／ｗ第２ナノエマルションは、油相にイオン結合複合体の薬理学的治療効果を向上させることができる脂溶性有効成分をさらに含んでもよく、前記脂溶性有効成分は、パクリタキセル、ドセタキセル、ドキソルビシン等の難溶性抗癌剤とクルクミン、ケルセチン又はこれら有効成分を含有する天然抽出物及びこれらの混合物であってもよい。脂溶性有効成分は、ナノエマルション製剤の油相に含まれることで、有効成分を可溶化させ、胃腸管吸収率を増進させることによって経口生体利用率と薬理学的活性を向上させることができる。
【００３７】
前記第１及び第２界面活性剤は、イオン結合複合体が分散された内部水相が油相に分散されてもよく、ｗ／ｏ第１ナノエマルションが、ｗ／ｏ／ｗ第２ナノエマルションの外部水相によく分散されるようにする。前記第１及び第２界面活性剤は、互いに独立して、ポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）、カプリロカプリルマクロゴール−８グリセリド（Ｌａｂｒａｓｏｌ）、クレモフォール（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ）、グリセロールモノカプリロカプレート（Ｃａｐｍｕｌ  ＭＣＭ）、ラウロイルマクロゴール−３２グリセリド（Ｇｅｌｕｃｉｒｅ  ４４／１４）、ソルトロール（Ｓｏｌｕｔｒｏｌ）、ポリソルベート（Ｔｗｅｅｎ）及びソルビタンモノラウレート（Ｓｐａｎ）からなる群から選択されるいずれか一つ又は１種以上であるのが好ましい。
【００３８】
前記第１及び第２補助界面活性剤は、イオン結合複合体が分散された内部水相が界面活性剤により、油相に分散されるように表面エネルギーを減少させる役割を果たし、ｗ／ｏ第１ナノエマルションが界面活性剤により、ｗ／ｏ／ｗ第２ナノエマルションの外部水相によく分散されるようにする。前記第１及び第２補助界面活性剤は、互いに独立して、ジエチレングリコールモノエチルエーテル（Ｔｒａｎｓｃｕｔｏｌ  ＨＰ）、ポリソルベート、ポリエチレングリコール、ブチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール及びイソプロパノールからなる群から選択されるいずれか一つ又は１種以上であるのが好ましい。
【００３９】
前記第１界面活性剤と第１補助界面活性剤との混合物及び第２界面活性剤と第２補助界面活性剤との混合物は、組成物全重量に対して、５〜９０重量％含まれることが好ましく、より好ましくは２０〜８０重量％含まれてもよい。前記含有量が２０重量％未満のとき、エマルションの安定度が劣ることがあり、８０重量％を超えると、胃腸管粘膜に刺激を誘発することがある。このとき、第１界面活性剤と第１補助界面活性剤との混合物及び第２界面活性剤と第２補助界面活性剤との混合物の含有量は、第２外部水相を含むｗ／ｏ／ｗ第２ナノエマルション全重量中の第１及び第２界面活性剤と第１及び第２補助界面活性剤の全量を意味する。
【００４０】
また、前記第１及び第２補助界面活性剤は、それぞれ前記第１及び第２界面活性剤と混合して用いられてもよく、それぞれ第１及び第２界面活性剤に対して、互い独立して、１：０．１〜１：１０の重量比で混合されることが好ましく、より好ましくは１：０．５〜１：２の重量比で混合され得る。
【００４１】
また、本発明は、前記製造方法により製造されたオキサリプラチンを含む経口用薬物送達組成物を含む。
【００４２】
本発明によるオキサリプラチンと胆汁酸誘導体のイオン結合複合体の薬物送達体としてｗ／ｏ／ｗ多重乳化ナノエマルション形態を利用することができる。このシステム内の油相は、胃腸管内でイオン結合複合体を保護し、吸収促進剤の希釈効果を最小化するだけでなく、服用後、胃腸管内で両親媒性のイオン結合複合体の高い分散性を可能にする。また、多重乳化ナノエマルションは、胃腸管内で腸管膜の構造と流動性を変化させ、薬物の吸収を増進させることが知られている。特に、内部水相に、胆汁酸誘導体とイオン結合を形成し得ない親水性薬物である５−フルオロウラシルを共に担持する場合、薬物の腸管膜透過度と経口生体利用率は、多重乳化ナノエマルションにより向上され得る。
【００４３】
また、多重乳化ナノエマルションに使用される界面活性剤であるＬａｂｒａｓｏｌ（登録商標）とＣｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）ＥＬは、それぞれ第１内部水相を油相に分散させるか、ｗ／ｏ第１ナノエマルションをｗ／ｏ／ｗ第２ナノエマルションの外部水相に分散させるために使用され得る。Ｌａｂｒａｓｏｌは、Ｆ−アクチン（filamentous actin）とＺＯ−１（zonula occludens-1）と相互作用して、小腸上皮細胞間の密着結合（tight junction）を開くことができることが知られており、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬの場合、細胞膜の流動性を増加させるだけでなく、密着結合を緩くして吸収を促進させられることが確認された。したがって、小腸上皮細胞間結合の減少を誘導させる界面活性剤の適用により、細胞間経路を介して親水性有効成分である５−ＦＵの膜透過度が増加され得る。またＣｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬは、Ｐ−ｇｐの疎水性領域と結合することができ、これにより、Ｐ−ｇｐの形態変化がもたらされ、薬物の腸管内への排出を減少させ、５−ＦＵのようにＰ−ｇｐに排出される薬物の制限的な胃腸管吸収率が向上され得る。
【００４４】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。しかし、下記実施例は、本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらに制限されるものではない。
【００４５】
実施例１：胆汁酸誘導体の製造
経口吸収促進剤である胆汁酸誘導体はデオキシコール酸に正電荷を帯びたリシンを化学的に結合して、製造した。
【００４６】
デオキシコール酸２．６ｇをクロロギ酸エチル６．４ｍＬ、Ｎ−メチルモルホリン７．４ｍＬ及びテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）８００ｍＬの混合液に溶解した後、２．７％（ｗ／ｖ）Ｈ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＭｅ・ＨＣｌのＮ−メチルモルホリン溶液を添加した後、２時間還流させた。その後、室温で一晩撹拌した後、沈殿物をろ過し、溶媒を蒸発させ、乾燥した。得られた沈殿物をクロロホルムとメタノールの混合液を利用してカラムを通過させ、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）ＤＯＣＡを分離した。得られたＬｙｓ（Ｂｏｃ）ＤＯＣＡを再び氷浴で塩化エチルとメタノールの混合液に溶解した後、溶媒を完全に除去した。残渣を精製水に溶解した後、クロロホルムで洗浄した。水溶液層を回収した後、凍結乾燥して、粉末形態のデオキシコール酸−リシン誘導体（ＤＣＫ）を得た。
【００４７】
実施例２：ＯＸＡ／ＤＣＫイオン結合複合体の製造
重炭酸ナトリウムでｐＨ７．０に調整した精製水に、オキサリプラチン及び前記実施例１で製造されたＤＣＫをそれぞれ溶解した。前記オキサリプラチン水溶液を撹拌し、オキサリプラチン：ＤＣＫのモル割合が１：２になるようにＤＣＫ水溶液を徐々に添加して、イオン結合複合体を形成した。前記混合液を遠心分離した後、−７０℃で凍結乾燥し、粉末状態のＯＸＡ／ＤＣＫイオン結合複合体を製造した。
【００４８】
実施例３：ＯＸＡ／ＤＣＫイオン結合複合体及び５−ＦＵを含むｗ／ｏ第１ナノエマルションの製造
ｗ／ｏ／ｗ多重乳化ナノエマルションを製造するために、２段階の自発的多重乳化方法を用いており、１段階は以下の通りである。
【００４９】
ｗ／ｏ第１ナノエマルションは、第１油相Ｃａｐｒｙｏｌ  ９０、第１界面活性剤Ｌａｂｒａｓｏｌと第１補助界面活性剤Ｔｒａｎｓｃｕｔｏｌ  ＨＰの混合物（Ｓｍｉｘ，１）及び水相に、精製水をオイル滴定法によって製造した。
【００５０】
ｗ／ｏ第１ナノエマルションを肉眼で観察したとき、透明な液相が得られる領域を疑似３相ダイヤグラムで確認し、Ｓｍｉｘ，１の混合割合（２：１、１：１、１：２）によるｗ／ｏ第１ナノエマルション領域の疑似３相ダイヤグラムを図１に示した。前記領域から最も小さいサイズの内部水相液滴が形成され、内部水相含有量が最大である組成を最適のｗ／ｏ第１ナノエマルション組成として選定した：２１．４％水相、５０．０％第１界面活性剤と第１補助界面活性剤混合物（Ｓｍｉｘ，１；Ｌａｂｒａｓｏｌ：Ｔｒａｎｓｃｕｔｏｌ  ＨＰ＝１：２（ｗ／ｗ））、２８．６％油相。
【００５１】
図１に示したｗ／ｏ第１ナノエマルションの疑似３相ダイヤグラムは、Ｓｍｉｘ，１の割合が２：１、１：１及び１：２の条件でオイルＣａｐｒｙｏｌ  ９０、第１界面活性剤Ｌａｂｒａｓｏｌ及び第１補助界面活性剤Ｔｒａｎｓｃｕｔｏｌ  ＨＰを含むｗ／ｏシステムを示す。第１補助界面活性剤の量を第１界面活性剤の量よりも相対的に少なく添加した場合、例えば、Ｓｍｉｘ，１２：１の場合、ｗ／ｏ第１ナノエマルションの面積はＳｍｉｘ，１１：１であるときよりも小さいが、これは、Ｓｍｉｘ，１による油相の溶解度が相対的に低いことを意味する。Ｓｍｉｘ，１２：１を４２％添加したとき、油相に分散され得る最大水相の組成は、１３％と確認されたのに対し、Ｓｍｉｘ，１で補助界面活性剤の割合を１：２に増加させたＳｍｉｘ，１１：２でｗ／ｏ第１ナノエマルションが形成される領域は、Ｓｍｉｘ，１１：１と比較して、内部水相の量が増加する側に移動しており、概略５０％Ｓｍｉｘ，１１：２の油相に分散され得る水相の組成は２４％であった。
【００５２】
しかし、Ｓｍｉｘ，１で第１補助界面活性剤であるＴｒａｎｓｃｕｔｏｌ  ＨＰの割合を第１界面活性剤と比較して、さらに増加させると、かえってｗ／ｏ第１ナノエマルション形成領域が減少した。これは、Ｔｒａｎｓｃｕｔｏｌ  ＨＰにより液晶が形成され、与えられた量のＬａｂｒａｓｏｌにより安定化されないことを意味する。このような結果は、ナノエマルション製剤のＧｉｂｂｓ自由エネルギーが、第１界面活性剤及び第１補助界面活性剤がｗ／ｏ界面で受動的に界面張力を減少させる程度と界面の破壊エントロピーの変化に依存することを意味する。
【００５３】
前記Ｓｍｉｘ，１１：２で製造したナノエマルション領域で幾つかの組成を選定し、エマルション内の水相液滴直径と分散度（ＰＤＩ）、エマルション内水相の含有量及び薬物の人工腸管膜透過度を測定した結果から最適なｗ／ｏ第１ナノエマルション組成を決定した：２１．４％水相（２３．３６％ＯＸＡ又は６７．５２％ＯＸＡ／ＤＣＫイオン結合複合体と２３．３６％５−ＦＵ）、５０％Ｌａｂｒａｓｏｌ：Ｔｒａｎｓｃｕｔｏｌ  ＨＰの１：２（ｗ／ｗ）混合物及び２８．６％Ｃａｐｒｙｏｌ  ９０．
【００５４】
実施例４：ＯＸＡ／ＤＣＫイオン結合複合体及び５−ＦＵを含むｗ／ｏ／ｗ第２ナノエマルションの製造
ｗ／ｏ／ｗ第２ナノエマルションはｗ／ｏ第１ナノエマルションを油相とし、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬとＴｒａｎｓｃｕｔｏｌ  ＨＰの混合物を第２界面活性剤と第２補助界面活性剤の混合物（Ｓｍｉｘ，２）として、水相に油相を滴定する方法により製造した。
【００５５】
２３．３６％ＯＸＡ又は６７．５２％ＯＸＡ／ＤＣＫイオン結合複合体と２３．３６％５−ＦＵを水相に分散させた後、ｗ／ｏ第１ナノエマルションを製造した。また、Ｓｍｉｘ，２を２：１、１：１、１：２の割合で混合した混合物をそれぞれ前記製造したｗ／ｏ第１ナノエマルションに１：９〜９：１の重量比で混合した。それぞれの混合物に精製水を徐々に添加して、最終的なｗ／ｏ／ｗ第２ナノエマルションを製造した。各割合のＳｍｉｘ，２に対する疑似３相ダイヤグラムを図２に示した。
【００５６】
ｗ／ｏ／ｗ第２ナノエマルション形成領域は、第２界面活性剤の含有量の増加につれて、相対的に増加した。Ｓｍｉｘ，２１：１がＳｍｉｘ，２２：１よりもナノエマルション領域が増加し、２９％Ｓｍｉｘ，２１：１で外部水相に分散され得るｗ／ｏ第１ナノエマルションの最大組成は３５％と確認された。一方、補助界面活性剤の混合割合を界面活性剤と比較して増加させたＳｍｉｘ，２１：２の場合、Ｓｍｉｘ，２１：１と比較して、ナノエマルション領域が減少した。４７％Ｓｍｉｘ，２１：２で分散されたｗ／ｏ第１ナノエマルションの最大組成は２３％と確認された。これにより、第２補助界面活性剤の割合が第２界面活性剤と比較して増加した場合、ナノエマルションの形成領域が減少することを確認することができた。
【００５７】
実施例５：ＯＸＡ／ＤＣＫイオン結合複合体の形成確認
オキサリプラチン（ＯＸＡ）とデオキシコール酸−リシン誘導体（ＤＣＫ）との間のイオン結合複合体形成を確認するために、純粋なＯＸＡ、ＤＣＫ、ＯＸＡとＤＣＫの物理的混合物及びＯＸＡ／ＤＣＫイオン結合複合体を粉末Ｘ線回折分析器（ＰＸＲＤ）と示差走査熱量計（ＤＳＣ）により分析し、その結果を図３に示した。
【００５８】
ＰＸＲＤスペクトルの２θ範囲にわたって、純粋なＯＸＡは、１１．９５°、１５．７７°、１７．９２°、１９．５７°、２２．２５°、２３．９５°、２５．４２°、２６．０９°、３１．５７°、３１．６１°、３３．１５°、３６．７６°で結晶性回折ピークを示した。ＯＸＡとＤＣＫの物理的混合物においてもＯＸＡの特徴的な結晶性回折ピークが観察された。これは、ＯＸＡがＤＣＫとの混合物で、結晶形態で存在することを示す。一方、ＯＸＡ／ＤＣＫイオン結合複合体ではＯＸＡの結晶性を示す鋭い回折ピークが消失したことを確認することができた。
【００５９】
ＤＳＣ熱分析で、純粋なＯＸＡの吸熱ピークは２９２℃で観察されたが、ＯＸＡ／ＤＣＫイオン結合複合体ではＯＸＡの吸熱ピークが消失することを確認した。したがって、ＯＸＡは、ＤＣＫと分子レベルで分散し、イオン結合による複合体を形成した後、無定形で複合体内に存在することが分かった。
【００６０】
実施例６：ＯＸＡ／ＤＣＫイオン結合複合体及び５−ＦＵを含むｗ／ｏ／ｗ第２ナノエマルションの物理化学的性質の評価
図２に示した疑似３相ダイヤグラムから透明なナノエマルション領域を確認した後、この領域から選択された８個の組成を対象として物理化学的性質を評価した。ＯＸＡ／ＤＣＫイオン結合複合体及び５−ＦＵを含むｗ／ｏ／ｗ第２ナノエマルションに分散されたｗ／ｏ第１ナノエマルションの液滴直径、分散度（ＰＤＩ）及び表面電荷（ゼータ電位）を動的光散乱測定装置（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ９０；ＭａｌｖｅｒｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製、ＵＫ）で測定し、液滴形態を透過電子顕微鏡（ＪＥＭ−２００；ＪＥＯＬ社製、Ｊａｐａｎ）で観察し、これを下記の表１及び図４に示した。
【００６１】
多重散乱効果を最小化するために、各試料を精製水に１：２０の割合で希釈し、１分間分散させた後、２５℃で、動的光散乱測定装置で測定した。
【００６２】
また、各試料を精製水で１００倍に希釈した後、銅格子板に前記希釈液を一滴落とし、超過液を紙フィルターで除去した後、２％リンタングステン酸水溶液を添加して染色した後、超過液は紙フィルターで除去し、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）で測定した。
【００６３】
下記表１を参照すると、全ての組成でｗ／ｏ／ｗ第２ナノエマルション内のｗ／ｏ第１ナノエマルション液滴の大きさは、ＰＤＩ値が０．５９よりも低い均一な分布を示し、液滴の大きさは、１３．５ｎｍ〜２３２ｎｍの範囲であった。ｗ／ｏ／ｗ第２ナノエマルション内に分散したｗ／ｏ第１ナノエマルションの組成が最大である組成Ａで液滴の大きさが最大と評価された。それぞれのＳｍｉｘ，２の割合で油相であるｗ／ｏ第１ナノエマルションの組成が１０％から３０％に増加するにつれて、分散した液滴の大きさが急激に増加することが分かった。即ち、組成Ａと組成Ｃで液滴の大きさは、それぞれＳｍｉｘ，２２：１で６１．４±４．０６ｎｍ及び１８．１±０．３１ｎｍ、Ｓｍｉｘ，２１：１で１４６±１．１７ｎｍ及び１７．５±０．１５ｎｍ、Ｓｍｉｘ，２１：２で２３２±５．０６ｎｍ及び１９．０±１．０６ｎｍと評価された。このような結果は、ｗ／ｏ／ｗ第２ナノエマルション内のｗ／ｏ第１ナノエマルション液滴の大きさが剤形内のｗ／ｏ第１ナノエマルション（油相）の濃度に比例して増加することを示す。ｗ／ｏ第１ナノエマルション（油相）の組成が、２０％又は３０％のとき、第２界面活性剤の濃度が増加するにつれて、液滴の大きさが減少した。したがって、Ｓｍｉｘ，２１：２であり、３０％のｗ／ｏ第１ナノエマルション（油相）を含む組成Ａで液滴の大きさが最大になることが分かる。しかし、ｗ／ｏ第１ナノエマルション（油相）を１０％以下で含有する組成の場合、液滴の大きさは、Ｓｍｉｘ，２割合とその含有量に関係なく、２０ｎｍ以下と評価された。Ｓｍｉｘ，２１：１で製造したｗ／ｏ／ｗ第２ナノエマルションのうち組成Ｅで液滴の大きさと分散度（ＰＤＩ）は、それぞれ２０．３±０．２２ｎｍ及び０．１８±０．０１と評価されており、組成Ｈは、他の組成と比較して最も小さい大きさの液滴（１３．５±０．１４ｎｍ）に分散されることが分かった。
【００６４】
全てのｗ／ｏ／ｗ第２ナノエマルションの表面電荷（ゼータ電位）値は、−４．６５ｍＶ〜０．１４ｍＶ（中性）の範囲と評価された。これは、ｗ／ｏ第１ナノエマルションのオイル層脂肪酸とエステルがｗ／ｏ／ｗ第２ナノエマルションの第２界面活性剤と第２補助界面活性剤に囲まれて分散したことを意味する。
【００６５】
【表１】
2020522580.tif 000003
【００６６】
実施例７：ＯＸＡ／ＤＣＫイオン結合複合体及び５−ＦＵを含むｗ／ｏ／ｗ第２ナノエマルションの人工腸管膜透過度の測定
前記表１の組成で製造したＯＸＡ、ＯＸＡ／ＤＣＫイオン結合複合体又は５−ＦＵをそれぞれ含有したｗ／ｏ／ｗ第２ナノエマルションの膜透過性を人工腸管膜（ＰＡＭＰＡ；ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＳａｎＪｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）で評価した。対照群としてＯＸＡ、ＯＸＡ／ＤＣＫイオン結合複合体及び５−ＦＵ水溶液を用いた。その結果を図５に示した。
【００６７】
それぞれの試料を１２５．８μＭ  ＯＸＡ、１２５．８μＭ  ＯＸＡ／ＤＣＫイオン結合複合体、３８４．４μＭ  ５−ＦＵ濃度になるようにリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ６．８）で希釈した後、２００μＬずつＰＡＭＰＡプレートの各ウェルの供与体に添加し、それぞれの受容体に３００μＬのリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ６．８）を添加した後、供与体と受容体を結合させた。室温で５時間放置した後、ＰＡＭＰＡプレート各ウェルの供与体と受容体から試料を回収し、透過した薬物の濃度を以下のように測定した。
【００６８】
ＯＸＡ又はＯＸＡ／ＤＣＫイオン結合複合体の場合、４０℃でＣ１８カラム（４．６×２５０ｍｍ、５μｍ、１００Å；２０μＬ注入）を用い、ＨＰＬＣで分析した。移動相である水（ｐＨ３．０、リン酸で調整）とアセトニトリルの９９：１（ｖ／ｖ）混合液を０．８ｍＬ／分の流速で流して分析した。また、２１０ｎｍでＵＶ検出器を使用して測定した。
【００６９】
５−ＦＵの場合、Ｃ１８カラム（４．６×２５０ｍｍ、５μｍ、１００Å；２０μＬ注入）付きＨＰＬＣシステムに注入し、精製水（ｐＨ３．２、リン酸で調整）を移動相とし、０．８ｍＬ／分の流速で流して分析した。ＵＶ検出は２６０ｎｍで行った。
【００７０】
各薬物の有効透過度（Ｐｅ）は、下記式を用いて計算した。
Ｐｅ＝−ｌｎ［１−ＣＡ（ｔ）／Ｃｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ］／［Ａ×（１／ＶＤ＋１／ＶＡ）×ｔ］
（式中、Ｐｅ：透過度（ｃｍ／ｓ）；Ａ：有効フィルター面積（ｆ×０．３ｃｍ２；ｆ：フィルターの表面上の気孔（ｆ＝０．７６））；ＶＤ：供与体体積（０．２ｍＬ）；ＶＡ：受容体体積（０．３ｍＬ）；ｔ：透過時間（秒）；ＣＡ（ｔ）：時間ｔで受容体での薬物濃度；Ｃｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ：［ＣＤ（ｔ）×ＶＤ＋ＣＡ（ｔ）×ＶＡ］／（ＶＤ＋ＶＡ）；ＣＤ（ｔ）：時間ｔで供与体の残存薬物濃度）
【００７１】
その結果、ＯＸＡ、ＯＸＡ／ＤＣＫイオン結合複合体及び５−ＦＵの人工腸管膜を通した透過度は、全般的にｗ／ｏ／ｗ多重ナノエマルションの内相に含ませた後、有意に増加した。
【００７２】
ＯＸＡの場合、膜透過度は、第２界面活性剤と第２補助界面活性剤混合物の割合（Ｓｍｉｘ，２）と油相（第１ｗ／ｏナノエマルション）に対するＳｍｉｘ，２の割合に依存した。組成Ｈを除いて、Ｓｍｉｘ，２１：１で製造したＯＸＡｗ／ｏ／ｗ多重ナノエマルションの透過度は、同じ組成でＳｍｉｘ，２２：１及びＳｍｉｘ，２１：２ｗ／ｏ／ｗ多重ナノエマルションよりも相対的に増加した。１０％油相を含有するｗ／ｏ／ｗ多重ナノエマルションでＳｍｉｘ，２１：１の油相に対する重量比を２から６に増加させたとき（組成Ｃ〜Ｈ）、ＯＸＡの最大膜透過度は、組成Ｅ（油相：Ｓｍｉｘ，２１：１、１：３）で観察されたた。このとき、ＯＸＡの膜透過度（４．９９±０．５９（×１０−６ｃｍ／ｓ））は、ＯＸＡ水溶液の透過度（０．５４±０．１２（×１０−６ｃｍ／ｓ））よりも約９．２４倍増加した。
【００７３】
しかし、ＯＸＡ／ＤＣＫイオン結合複合体の透過性は、依然としてＯＸＡ水溶液とＯＸＡｗ／ｏ／ｗ多重ナノエマルション組成Ｅ（Ｓｍｉｘ，２１：１）よりもそれぞれ３７．４倍及び４．０２倍高かった。界面活性剤の割合が補助界面活性剤よりも大きいＳｍｉｘ，２２：１でＯＸＡ／ＤＣＫイオン結合複合体の人工腸管膜透過度は、油相（第１ｗ／ｏナノエマルション）の含有量が高いか低いナノエマルションの透過度よりも相対的に高かった。一方、同じ組成でＳｍｉｘ，２１：２を混合させたＯＸＡ／ＤＣＫイオン結合複合体の膜透過率は大きく増加しなかった。ｗ／ｏ／ｗ多重ナノエマルションＥ（Ｓｍｉｘ，２１：１）からＯＸＡ／ＤＣＫイオン結合複合体の人工腸管膜透過度は最大を示した。その透過度値は、水溶液状態及びｗ／ｏ／ｗ多重ナノエマルションＡ（Ｓｍｉｘ，２２：１）よりもそれぞれ２．８５倍及び１．４６倍向上した。また、組成Ｅ（Ｓｍｉｘ，２１：１）でのＯＸＡ／ＤＣＫイオン結合複合体膜透過度（５７．２±５．２３（×１０−６、ｃｍ／ｓ））はＯＸＡ水溶液（０．５４±０．１２（×１０−６，ｃｍ／ｓ））及び組成E（４．９９±０．５９（×１０−６，ｃｍ／ｓ））からのＯＸＡの透過度よりそれぞれ１０７倍及び１１．５倍向上した。
【００７４】
５−ＦＵの場合、組成Ｃ〜Ｈからの透過度は、油相の含有量が同じであり、液滴の大きさが似ていることから大きな差を示さなかった。５−ＦＵの膜透過度は、全てのＳｍｉｘ，２の割合で油相の量が減少するほど増加した。組成Ｅ（Ｓｍｉｘ，２１：１）から５−ＦＵの膜透過度（３．７８±０．２６（×１０−６，ｃｍ／ｓ））は、５−ＦＵ水溶液（１．２７±０．４６（×１０−６，ｃｍ／ｓ））と比較して３．０５倍増加した。
【００７５】
実施例８：ＯＸＡ／ＤＣＫイオン結合複合体及び５−ＦＵを含むｗ／ｏ／ｗ第２ナノエマルションのｉｎ  ｖｉｔｒｏ腸管細胞膜透過度の測定
前記表１の組成で製造されたＯＸＡ、ＯＸＡ／ＤＣＫイオン結合複合体又は５−ＦＵをそれぞれ含有したｗ／ｏ／ｗ第２ナノエマルションの膜透過性を、Ｃａｃｏ−２細胞単層膜を用いて評価した。対照群としてＯＸＡ、ＯＸＡ／ＤＣＫイオン結合複合体及び５−ＦＵ水溶液を用いた。その結果を下記の表２に示した。
【００７６】
Ｃａｃｏ−２細胞を１２−ウェルＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）（細孔径：０．４μｍ、表面積：１．１２cｍ２；Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）の各ウェル当たり３×１０５細胞を処理した。１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）と１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）培地は、４８時間毎に２１日から２９日間交換した。３５０Ω・ｃｍ２以上の経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を有するＣａｃｏ−２細胞膜をｉｎ  ｖｉｔｒｏ腸管細胞膜透過度試験に用いた。
【００７７】
まず、培養液を除去した後、３７℃で２０分間、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）０．５ｍＬで培養した後、ＨＢＳＳを除去し、ＨＢＳＳで１２５．８μＭ  ＯＸＡ、１２５．８μＭ  ＯＸＡ／ＤＣＫイオン結合複合体、３８４．４μＭ  ５−ＦＵで希釈した各試料０．５ｍＬと１．５ｍＬ  ＨＢＳＳをそれぞれの心尖部コンパートメント（apical compartment）と側底側コンパートメント（basolateral compartment）に添加した後、３７℃で培養した。試料を処理した後、０．５、１、２、３、４、５時間目に、各ウェルの側底側コンパートメントから１００μＬの試料を採取し、メンブランフィルターでろ過した後、前記実施例７と同じＨＰＬＣシステム及びＵＶ検出器を使用して腸管細胞膜を透過したＯＸＡ、ＯＸＡ／ＤＣＫイオン結合複合体及び５−ＦＵの濃度を測定した。またＯＸＡ、ＯＸＡ／ＤＣＫイオン結合複合体及び５−ＦＵの見かけ透過係数（Ｐａｐｐ）は、下記式により算出した。
Ｐａｐｐ＝ｄＱ／ｄｔ×１／（Ａ×Ｃ０）
【００７８】
（式中、ｄＱ／ｄｔ：単位時間当たり側底側コンパートメントへ透過された薬物の重量（μｍｏｌ／ｓ）、Ｃ０：心尖部コンパートメントでＯＸＡ、ＯＸＡ／ＤＣＫイオン結合複合体又は５−ＦＵの初期濃度（μｍｏｌ／ｍＬ）、Ａ：透過面積（ｃｍ２））
【００７９】
下記表２を参照すると、ＯＸＡをナノエマルションＥ（Ｓｍｉｘ，２１：１）に含ませた結果、ＯＸＡのＰａｐｐは、２．５０±１．９６（×１０−６，ｃｍ／ｓ）から７．０８±１．４２（×１０−６，ｃｍ／ｓ）に向上した。
【００８０】
また、ＯＸＡの透過度は、ＤＣＫとイオン結合複合体を形成させることで、ＯＸＡ水溶液と比較して大幅に増加した。ＯＸＡ／ＤＣＫイオン結合複合体をナノエマルションＥ剤形内に含ませたとき（１２．０±１．９１×１０−６，ｃｍ／ｓ）、ＯＸＡ／ＤＣＫイオン結合複合体のＰａｐｐは、ＯＸＡ（５．６３±３．０３×１０−６,ｃｍ／ｓ）及びＯＸＡ／ＤＣＫイオン結合複合体（２．５０±１．９６×１０−６，ｃｍ／ｓ）と比較してそれぞれ２．１３倍及び４．８０倍向上した。
【００８１】
また、５−ＦＵの膜透過度も５−ＦＵをナノエマルションに含ませた後、大幅に増加した。組成Ｅ（Ｓｍｉｘ，２１：１）から５−ＦＵの透過度（１４．９±３．０８×１０−６，ｃｍ／ｓ）は、５−ＦＵ水溶液（３．４６±１．２２×１０−６，ｃｍ／ｓ）と比較して４．３０倍増加した。
【００８２】
また、ナノエマルション剤形からＯＸＡ、ＯＸＡ／ＤＣＫイオン結合複合体及び５−ＦＵのＣａｃｏ−２細胞単層に対する透過度は、油相とＳｍｉｘ，２の重量比を１：１から１：３に増加させるにつれて増加する傾向を示したが、１：６の割合で急激に減少した。
【００８３】
【表２】
2020522580.tif 000004
【００８４】
実施例９：ＯＸＡ／ＤＣＫイオン結合複合体及び５−ＦＵを含むｗ／ｏ／ｗ第２ナノエマルションの薬物放出試験
溶出試験は、米国薬局方溶出試験法第１法（回転検体通法）で、１００ｒｐｍ、３７±０．２℃、０．１ＮＨＣｌ水溶液（ｐＨ１．２）培地又はリン酸塩緩衝液（ｐＨ６．８）５００ｍＬの条件で行った。
【００８５】
ＯＸＡ粉末１０ｍｇ又は５−ＦＵ粉末１０ｍｇを含有するＯＸＡ／ＤＣＫイオン結合複合体粉末３８．８ｍｇ（ＯＸＡ１０ｍｇに相当）又はこれらの薬物を含むｗ／ｏ／Ｓｍｉｘ，２（第２外部水相を除いたナノエマルション製剤Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ及びＨ）ナノエマルション８００ｍｇを００号硬質ゼラチンカプセルに充填した後、溶出試験を行った。溶出試験開始後、１５、３０、４５、６０、９０及び１２０分に各溶出試験液を１ｍＬずつ採取し、ろ過した後、放出された薬物の量を前記実施例７と同じＨＰＬＣ及びＵＶ検出方法で分析した。その結果を図６に示した。
【００８６】
図６（Ａ）及び（Ｂ）に示すように、ｐＨ１．２の条件でＯＸＡ又はＯＸＡ／ＤＣＫイオン結合複合体の９０％以上が１２０分以内にナノエマルションから放出された。しかし、ナノエマルションＧ及びＨからＯＸＡ又はＯＸＡ／ＤＣＫイオン結合複合体の放出速度は粉末状態及び他のナノエマルション組成と比較して遅延した。一方、図６（Ｃ）に示すように、５−ＦＵの場合、全てのカプセルで１５分以内に８５％以上の溶出率を示し、ｐＨ１．２で５−ＦＵの溶出速度はナノエマルションの組成に大きく影響されなかった。
【００８７】
図６（Ｄ）及び（Ｆ）に示すように、ｐＨ６．８の条件でＯＸＡ及び５−ＦＵはナノエマルションから１５分以内に９０％以上が放出された。粉末形態で充填されたＯＸＡ／ＤＣＫイオン結合複合体カプセルは、剤形Ｃを除いて、ナノエマルション剤形よりも薬物の放出が遅延しており、剤形Ｃを除いて、ナノエマルションからＯＸＡ／ＤＣＫイオン結合複合体は１５分以内に９０％の溶出率を示した。このような結果は、複合体内に存在するＤＣＫ分子の凝集（aggregation）と油相に対するＳｍｉｘ，２の低い組成比に起因したものと判断される。
【００８８】
実施例１０：ＯＸＡ／ＤＣＫイオン結合複合体及び５−ＦＵを含むｗ／ｏ／ｗ第２ナノエマルションのｉｎ  ｖｉｖｏ経口吸収率の評価
胆汁酸誘導体とのイオン結合複合体形成及びナノエマルション製剤によるＯＸＡ及び５−ＦＵの経口吸収改善を評価するために、ＯＸＡ又はＯＸＡ／ＤＣＫイオン結合複合体と５−ＦＵを含む水溶液及びこれを含むナノエマルション剤形（前記表１の組成Ｅ、Ｓｍｉｘ，２１：１）をラットに経口投与した。図７、下記表３及び表４は、ラットの血中薬物濃度−時間プロファイルとＯＸＡ及び５−ＦＵの薬物動態パラメーターを示す。
【００８９】
ラットに、ＯＸＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＯＸＡ／ＤＣＫイオン結合複合体（ＯＸＡ１０ｍｇ／ｋｇに相当）、５−ＦＵ（２０ｍｇ／ｋｇ）を水溶液状態でそれぞれ４００μＬずつ経口投与し、同様にＯＸＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）又はＯＸＡ／ＤＣＫイオン結合複合体（ＯＸＡ１０ｍｇ／ｋｇに相当）と５−ＦＵ（２０ｍｇ／ｋｇ）を含むナノエマルション希釈液を４００μＬずつ経口で投与した。また、経口生体利用率を評価するために、ＯＸＡ（５ｍｇ／ｋｇ）及び５−ＦＵ（５ｍｇ／ｋｇ）水溶液をラットにそれぞれ１５０μＬずつ尾静脈に注射した。
【００９０】
経口及び静脈投与後、一定時間の間隔でラットの眼窩部位毛細血管から２００μＬの血液を採取し、５０μＬの３．８％クエン酸ナトリウム水溶液と混合した後、遠心分離して（２，５００×ｇ、１５分、４℃）血漿試料を採取した後、分析する前まで−７０℃で冷凍保管した。
【００９１】
血漿中のＯＸＡの濃度は、分析するために、採取した血漿を硝酸５ｍＬで希釈後、６時間１００℃で加熱した後、原子吸光分光学法（ＡＡＳ）を使用して白金濃度を測定し、推定した。試料測定前、サンプルを３％硝酸水溶液１０ｍＬで希釈した後、ＡＡＳ分析のために炉に入れた。ＧＦＳ３５黒鉛炉とＧＦＳ３５Ｚオートサンプラー付きサーモフィッシャー・サイエンティフィックＣＥ３５００ＡＡＳ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）を用いて測定した。パージガスとしてアルゴンを２００ｍＬ／分で用いた。試料の注入量は２０μＬであった。白金濃度は、２６６ｎｍで、ゼーマンバックラウンド補正装置付き分光計で測定した。
【００９２】
また、５−ＦＵの血漿濃度を測定するために、１００μＬの標準液と血漿試料にそれぞれ２０μg／ｍＬの内部標準（ＩＳ、クロロウラシル）溶液５０μＬと飽和硫酸アンモニウム溶液１００μＬを添加した後、１分間混合した。希釈された血漿試料を２ｍＬのプロパノールとジエチルエーテルの８：２（ｖ／ｖ）混合溶媒で抽出した。混合液を１０分間、２，５００×ｇで遠心分離し、３７℃、窒素条件で蒸発させて、有機溶媒層を収集した。その後、乾燥残渣に１００μＬの移動相（ｐＨ６．８リン酸アンモニウム緩衝液とメタノールの９８：２（ｖ／ｖ）混合液）を添加して溶解し、１ｍＬ／分の流速でＣ８カラム（４．６×２５０ｍｍ、５μｍ）付きＨＰＬＣに、５０μＬの試料を注入し、２６０ｎｍで測定した。
【００９３】
その結果、ＯＸＡの経口吸収率もまたナノエマルションに含ませた後、大幅に増加した。ＣｍａｘとＡＵＣｌａｓｔは、それぞれＯＸＡ水溶液と比較して１．６６倍及び２．６７倍増加した。しかし、ＯＸＡの経口吸収率は、ＤＣＫとイオン結合複合体形成後、さらに増加した。ＯＸＡ／ＤＣＫイオン結合複合体のＣｍａｘとＡＵＣｌａｓｔ値は、ＯＸＡ水溶液と比較してそれぞれ３０６％と５４０％増加した。
【００９４】
また、図７に示すように、ＯＸＡ／ＤＣＫイオン結合複合体を含むナノエマルションのＣｍａｘとＡＵＣｌａｓｔ値は、ＯＸＡ／ＤＣＫイオン結合複合体水溶液よりもそれぞれ１．７７倍と１．７０倍増加した。ＯＸＡ水溶液と比較して５．４１倍及び９．１７倍向上した。また、下記表３を参照すると、ＯＸＡ／ＤＣＫイオン結合複合体を含むナノエマルション製剤の経口生体利用率は、ＤＣＫとイオン結合による複合体形成とナノエマルション形態に剤形化されることにより、単純なＯＸＡ水溶液の経口生体利用率よりも９．１９倍増加した。
【００９５】
【表３】
2020522580.tif 000005
【００９６】
（表３中、Ｔｍａｘ：Ｃｍａｘ到達時間；Ｔ１／２：血漿濃度半減期；Ｃｍａｘ：最大血漿濃度；ＡＵＣｌａｓｔ：最終測定可能な血漿濃度測定時間までの血漿濃度−時間曲線下の面積；ＡＵＣｉｎｆ：無限大までの血漿濃度−時間曲線下の面積）
【００９７】
下記表４に示すように、５−ＦＵを含むナノエマルションのＣｍａｘは、０．１６４±０．０４４μｇ／ｍＬと評価された。これは、５−ＦＵ水溶液のＣｍａｘ値（０．０９２±０．００８μｇ／ｍＬ）と比較して１．７８倍増加した。また、５−ＦＵを含むナノエマルションのＡＵＣｌａｓｔ値は、５−ＦＵ水溶液のＡＵＣｌａｓｔ値（０．２４２±０．０５８μｇｈ／ｍＬ）と比較して１．３９倍増加した。経口生体利用率もまた５−ＦＵ水溶液と比較して１３９％向上した。
【００９８】
【表４】
2020522580.tif 000006
【００９９】
（表４中、Ｔｍａｘ：Ｃｍａｘ到達時間；Ｔ１／２：血漿濃度半減期；Ｃｍａｘ：最大血漿濃度；ＡＵＣｌａｓｔ：最終測定可能な血漿濃度測定時間までの血漿濃度−時間曲線下の面積；ＡＵＣｉｎｆ：無限大までの血漿濃度−時間曲線下の面積）
【０１００】
実施例１１：ＯＸＡ／ＤＣＫイオン結合複合体及び５−ＦＵを含むｗ／ｏ／ｗ第２ナノエマルションのｉｎ  ｖｉｖｏ癌成長抑制効果の評価
ＣＴ２６マウス大腸癌細胞をＰＢＳ（ＰＨ７．４）に１×１０６細胞／１００μＬの濃度で分散させた後、ＢＡＬＢ／ｃマウスの背中部位に皮下注入した。１４日後、腫瘍の大きさが７０〜１００ｍｍ３のとき、無作為に１０匹ずつ下記５個の群に分けた。
【０１０１】
コトロール（無処置）；
ＯＸＡ−Ｓ（１０ｍｇ／ｋｇＯＸＡ水溶液、１日１回経口投与）；
ＯＸＡ／ＤＣＫ−S（１０ｍｇ／ｋｇＯＸＡに相当するＯＸＡ／ＤＣＫイオン結合複合体水溶液、１日１回経口投与）；
５−ＦＵ−Ｓ（１０ｍｇ／ｋｇ５−ＦＵ水溶液、１日１回経口投与）；
ＯＸＡ／ＤＣＫ−５ＦＵ−ＮＥ（１０ｍｇ／ｋｇＯＸＡに相当するＯＸＡ／ＤＣＫイオン結合複合体と１０ｍｇ／ｋｇ５−ＦＵを含むナノエマルション組成Ｅ（Ｓｍｉｘ、２１：１）、１日１回経口投与）
【０１０２】
１８日間、マウスは経口投与前４時間絶食した。投与後、２時間絶食した。３日間隔で腫瘍の大きさを測定した後、腫瘍の体積を下記式で計算し、マウスの体重も測定した。
腫瘍の大きさ＝ａ２×ｂ×０．５２（ａ＝幅、ｂ＝長さ）
【０１０３】
投与１８日目に腫瘍を摘出した後、重量を測定した。癌組織の成長阻害効果を評価するために、１０％ホルマリン溶液で固定した。摘出した癌組織内の増殖細胞及び死滅細胞の密度を評価するために、ＴＵＮＥＬ（fluorescent terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUPT nick end labeling）及びＰＣＮＡ（増殖した細胞核抗原染色）染色を行い、その結果を図９に示した。
【０１０４】
図８（Ａ）に示すように、癌細胞が移植されたマウスにＯＸＡ／ＤＣＫ−Sを１日１回経口投与した場合、癌組織の成長は無処置対照群及びＯＸＡ−Ｓ群と比較してそれぞれ６０．３％及び２１．４％抑制された。５−ＦＵ−S溶液を投与した群も対照群と比較して癌組織の成長が５７．９％遅延された。また、５−ＦＵ水溶液を経口で投与した群の癌成長は、ＯＸＡ／ＤＣＫ水溶液を経口投与した群と比較して癌組織成長抑制効果には差がなかった。一方、ＯＸＡ／ＤＣＫ−５ＦＵ−ＮＥ群は癌組織の成長が異なる群と比較して最大に抑制された（対照群と比較して７３．９％、ＯＸＡ−Ｓと比較して４８．５％、ＯＸＡ／ＤＣＫ−Ｓと比較して３４．４％、５−ＦＵ−Ｓと比較して３８．１％）．１８日間、薬物投与後、ＯＸＡ／ＤＣＫ−５ＦＵ−ＮＥ群から摘出した腫瘍の重量も対照群、ＯＸＡ−Ｓ、ＯＸＡ／ＤＣＫ−Ｓ、５−ＦＵ−Ｓと比較してそれぞれ４３．０％、２６．０％、１１．６％及び３２．０％減少したが、マウスの体重には大きな影響を及ぼさなかった（図８（Ｂ）及び（Ｃ））。
【０１０５】
図９に示すように、持続的なＯＸＡ／ＤＣＫ−５−ＦＵ−ＮＥ投与群は、対照群、ＯＸＡ−Ｓ、ＯＸＡ／ＤＣＫ−S、５−ＦＵ−Sと比較して増殖細胞の密度が顕著に減少しただけでなく、癌組織内死滅細胞も増加したことを確認することができる。このような結果は、ＯＸＡ／ＤＣＫイオン結合複合体と５−ＦＵを含むナノエマルション製剤の経口生体利用率の向上とこれらの薬物の癌成長抑制シナジー効果に起因したものと判断される。
【０１０６】
以上、本発明を例示的に説明した。本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者であれば、本発明の本質的な特性から逸脱しない範囲で多様な変形が可能である。したがって、本明細書に開示された実施例は、本発明を限定するためのものでなく説明するためのものであり、このような実施例によって本発明の思想と範囲が限定されるものではない。本発明の保護範囲は、以下の特許請求の範囲によって解釈されるべきであり、それと同等な範囲内にある全ての技術は、本発明の権利範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
【図１】
2020522580.tif 000007
【図２】
2020522580.tif 000008
【図３】
2020522580.tif 000009
【図４】
2020522580.tif 000010
【図５】
2020522580.tif 000011
【図６】
2020522580.tif 000012
【図７】
2020522580.tif 000013
【図８】
2020522580.tif 000014
【図９】
2020522580.tif 000015
【国際調査報告】
2020522580.tif 000016
2020522580.tif 000017
2020522580.tif 000018
2020522580.tif 000019
2020522580.tif 000020
2020522580.tif 000021