(57)【要約】一部の態様では、ＦｃＲｎへの結合の増大およびｉｎ  ｖｉｖｏにおける投与後の半減期の増大を示す変異体またはバリアントＦｃドメインが提供される。Ｆｃドメインをグリコシル化抗体または非グリコシル化抗体に含めることができる。変異体もしくはバリアントＦｃドメインまたは変異体もしくはバリアントＦｃドメインを含むポリペプチドを使用するための方法も提供される。一局面において、酸性ｐＨにおいてヒトＦｃＲｎに結合することができる変異体またはバリアントヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインを含むポリペプチドが提供され、上記Ｆｃドメインは、（ｉ）３０９位におけるアスパラギン酸（Ｌ／Ｖ３０９Ｄ）；（ｉｉ）３１１位におけるヒスチジン（Ｑ３１１Ｈ）；および（ｉｉｉ）４３４位における置換変異（Ｎ４３４）の置換変異を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸性ｐＨにおいてヒトＦｃＲｎに結合することができる変異体またはバリアントヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインを含むポリペプチドであって、前記Ｆｃドメインが、
（ｉ）３０９位におけるアスパラギン酸（Ｌ／Ｖ３０９Ｄ）；
（ｉｉ）３１１位におけるヒスチジン（Ｑ３１１Ｈ）；および
（ｉｉｉ）４３４位における置換変異（Ｎ４３４）
の置換変異を有する、ポリペプチド。
【請求項２】
前記４３４位における置換変異が、セリン（Ｎ４３４Ｓ）またはチロシン（Ｎ４３４Ｙ）である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記４３４位における置換変異が、セリン（Ｎ４３４Ｓ）である、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記４３４位における置換変異が、チロシン（Ｎ４３４Ｙ）である、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記Ｆｃドメインが、グリコシル化されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記Ｆｃドメインが、野生型と比較して実質的に等しい、基本的に同じ、ほぼ同じ、または同じであるＦｃγＲへの結合を有する、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記Ｆｃドメインが、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩのうちの１つ、２つ、または全てに対して野生型と比較して実質的に等しい、基本的に同じである、ほぼ同じである、同じである、または等しい結合能を有する、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記Ｆｃドメインが、ＦｃＲｎに酸性ｐＨにおいて野生型よりも高い親和性で結合する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記Ｆｃドメインが、中性ｐＨではＦｃＲｎに検出可能もしくは選択的には結合しない、またはＦｃＲｎへの結合を示さないもしくは基本的に示さない、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記Ｆｃドメインが、ＦｃＲｎに対して、野生型と比較して、（ｉ）ｐＨ５．８では結合の増強を示し、かつ（ｉｉ）ｐＨ７．４では結合の低減を示すまたは検出可能な結合を示さない、請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記Ｆｃドメインが、非グリコシル化されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記Ｆｃドメインが、２６４位におけるグルタミン酸の置換変異（Ｖ２６４Ｅ）を有する、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記ＩｇＧが、ＩｇＧ１である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記ＩｇＧが、ＩｇＧ２である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
前記ＩｇＧが、ＩｇＧ３である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前記ＩｇＧが、ＩｇＧ４である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
前記Ｆｃドメインが、以下：
ＥＤＨＳ（配列番号５；Ｖ２６４Ｅ；Ｌ３０９Ｄ；Ｑ３１１Ｈ；Ｎ４３４Ｓ）、
ＥＤＨＹ（配列番号６；Ｖ２６４Ｅ；Ｌ３０９Ｄ；Ｑ３１１Ｈ；Ｎ４３４Ｙ）、
ＤＨＳ（配列番号７；Ｌ３０９Ｄ；Ｑ３１１Ｈ；Ｎ４３４Ｓ）、
ＤＨＹ（配列番号８；Ｌ３０９Ｄ；Ｑ３１１Ｈ；Ｎ４３４Ｙ）、
ＩｇＧ２−ＤＨＳ（配列番号９；Ｖ３０９Ｄ；Ｑ３１１Ｈ；Ｎ４３４Ｓ）、
ＩｇＧ３−ＤＨＳ（配列番号１０；Ｌ３０９Ｄ；Ｑ３１１Ｈ；Ｎ４３４Ｓ）、または
ＩｇＧ４−ＤＨＳ（配列番号１１；Ｌ３０９Ｄ；Ｑ３１１Ｈ；Ｎ４３４Ｓ）
を含む、またはそれからなる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
前記Ｆｃドメインが、ＤＨＳ（配列番号７；Ｌ３０９Ｄ；Ｑ３１１Ｈ；Ｎ４３４Ｓ）またはＤＨＹ（配列番号８；Ｌ３０９Ｄ；Ｑ３１１Ｈ；Ｎ４３４Ｙ）を含む、またはそれからなる、請求項１７に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
前記Ｆｃドメインが、ＦｃＲｎに約５５０ｎＭ未満のＫＤ値で結合する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
前記Ｆｃドメインが、ＦｃＲｎに約２５０ｎＭ未満のＫＤ値で結合する、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
前記Ｆｃドメインが、ＦｃＲｎに約１２５ｎＭ未満のＫＤ値で結合する、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
非Ｆｃ受容体（非ＦｃＲ）結合ドメインをさらに含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
前記非ＦｃＲ結合ドメインが、Ｉｇ可変ドメインである、請求項２２に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
全長抗体である、請求項２３に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
前記抗体が、アゴニスト抗体である、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
前記抗体が、アンタゴニスト抗体である、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
前記抗体が、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＣＤ２０、ＣＤ４０、ＩＬ−１０、４−１ＢＢ、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４ＯＸ４０、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ６Ｒ、ＴＮＦα、ＲＡＮＫＬ、ＥＧＦＲ、ｃ−Ｍｅｔ、ＣＤ１１ａ、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、Ｃ５、またはインテグリン−α４に選択的に結合する、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
前記抗体が、毒素に化学的にコンジュゲートしているまたは共有結合している、請求項１〜２７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
前記非ＦｃＲ結合領域が、抗体の抗原結合部位ではない、請求項２２に記載のポリペプチド。
【請求項３０】
前記非ＦｃＲ結合領域が、細胞表面タンパク質に結合する、請求項２２に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
前記非ＦｃＲ結合領域が、可溶性タンパク質に結合する、請求項２２に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
請求項１〜３１に記載のポリペプチドのいずれかをコードする核酸。
【請求項３３】
ＤＮＡセグメントである、請求項３２に記載の核酸。
【請求項３４】
発現ベクターである、請求項３２に記載の核酸。
【請求項３５】
請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項３６】
前記核酸を発現する、請求項３５に記載の宿主細胞。
【請求項３７】
ポリペプチドを調製するための方法であって、
ａ）請求項３６に記載の宿主細胞を得るステップと、
ｂ）非グリコシル化ポリペプチドの発現を促進するための条件下で、培養において前記宿主細胞をインキュベートするステップと、
ｃ）前記宿主細胞から、発現された前記ポリペプチドを精製するステップと
を含む、方法。
【請求項３８】
前記宿主細胞が原核細胞または哺乳動物細胞である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
薬学的に許容される担体中に、請求項１〜３１のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の核酸を含む医薬品製剤。
【請求項４０】
対象に抗体を与えるステップを含む、対象においてタンパク質を結合させる方法であって、前記抗体が、前記タンパク質に結合し、かつ請求項１〜３１のいずれか一項に記載のＦｃドメインを含む、方法。
【請求項４１】
前記抗体が、ヒトＦｃＲｎに約５００ｎＭ未満のＫＤで特異的に結合することができる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記抗体が、ヒトＦｃＲｎに約２５０ｎＭ未満のＫＤで特異的に結合することができる、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記抗体が、ヒトＦｃＲｎに約１２５ｎＭ未満のＫＤで特異的に結合することができる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記抗体が、グリコシル化されており、かつ前記Ｆｃドメインが、野生型と比較してほぼ同等または同等のＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩへの結合を有する、請求項４０〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記抗体が、グリコシル化治療抗体である、請求項４０〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記抗体が、非グリコシル化バージョンの治療抗体である、請求項４０〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
疾患を有する対象を処置する方法であって、有効量の請求項３９に記載の製剤を前記対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項４８】
抗体依存性細胞傷害を誘導する、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記疾患が、がん、感染、または自己免疫疾患である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記対象が、ヒト患者である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
前記製剤が、腫瘍内に、静脈内に、皮内に、動脈内に、腹腔内に、病巣内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に、胸膜内に、気管内に、眼内に、鼻腔内に、硝子体内に、膣内に、直腸内に、筋肉内に、皮下に、結膜下、小胞内に、粘膜に、心膜内に、臍帯内に、経口によって、吸入によって、注射によって、注入によって、持続注入によって、標的細胞を直接浸す局在化灌流によって、カテーテルにより、または洗浄により投与される、請求項４７に記載の方法。
【請求項５２】
前記疾患ががんであり、少なくとも第２の抗がん療法を前記対象に投与するステップをさらに含む、請求項４７〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記第２の抗がん療法が、外科療法、化学療法、放射線療法、寒冷療法、ホルモン療法、免疫療法またはサイトカイン療法である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
疾患の処置における使用のための、請求項１〜３１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５５】
前記疾患が、がん、感染、または自己免疫疾患である、請求項５４に記載のポリペプチド。
【請求項５６】
前記疾患が、細菌感染またはウイルス感染である、請求項５４に記載のポリペプチド。
【請求項５７】
がん、感染、細菌感染、ウイルス感染、または自己免疫疾患等の疾患の処置のための医薬の調製における、請求項１〜３１のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項５８】
請求項１〜３１のいずれか一項に記載のポリペプチドおよび薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的に許容される組成物。
【請求項５９】
疾患の処置を必要とする対象において疾患を処置する方法における使用のための組成物であって、請求項１〜３１のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む組成物。
【請求項６０】
前記疾患が、がん、感染、細菌感染、ウイルス感染、または自己免疫疾患である、請求項５９に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１７年８月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／５４４，６２２号の利益を主張しており、その全体は参考として本明細書中に援用される。
【０００２】
本発明は、全般的には、タンパク質工学の分野に関する。より詳細には、本発明は、ＦｃＲｎへのｐＨ依存性結合の増強を付与するＦｃ抗体ドメインの改善された血清中半減期に関係する。
【背景技術】
【０００３】
現在、上位２５種の市販の組換え治療抗体は、＄４３５億／年をはるかに上回る売上高を有し、これは、２０１０年から２０１５年にかけて９．２％の予想年間成長率であり、２０１５年までに＄６２７億／年まで増加する見通しである（Elvin et al., 2013）。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、現在診療所にある組換えタンパク質の大部分を構成し、１０６４種の製品が、米国またはＥＵにおいて会社出資の臨床治験を受けており、そのうち１６４種が第ＩＩＩ相にある（Elvinet al., 2013）。治療上の焦点の観点から、ｍＡｂ市場は、腫瘍学および炎症性障害に大きな焦点が置かれており、これらの治療分野内の製品は、予想期間にわたって重要な成長推進力であり続けることになる。遺伝子操作されたｍＡｂはグループとしてみると一般に、小分子薬物よりも高い、ＦＤＡ承認成功の確率を有する。少なくとも５０社のバイオテクノロジー会社およびあらゆる主要な製薬会社で、抗体発見プログラムを積極的に実施している。ｍＡｂの単離および産生のための本来の方法は、最初にMilsteinおよびKohlerによって１９７５年に報告され（Kohlerand Milstein 1975）、これには、マウスハイブリドーマを生じるマウスリンパ球および骨髄腫細胞の融合が関与した。治療用マウスｍＡｂは、１９８０年代初期に臨床研究に入った；しかし、患者がヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）を産生することによる、有効性の欠如および急速なクリアランスに伴う問題が明らかとなった。これらの課題と共に、本技術に関して時間と費用がかかることが、ｍＡｂ産生技術の進化の推進力となった。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、免疫化した動物のリンパ球から直接のモノクローナル抗体遺伝子のクローニングおよび細菌における抗体断片のコンビナトリアルライブラリーの発現が容易になった（Orlandiet al., 1989）。より最近のライブラリーは、再編成された相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を有するナイーブ遺伝子を使用して、完全にｉｎ  ｖｉｔｒｏクローニング技法によって作製された（Griffthsand Duncan 1998; Hoogenboom et al., 1998）。結果として、所望の特異性を有する抗体断片の単離はもはや、対応する抗原の免疫原性に依存しない。これらの利点により、小分子化合物（ハプテン）（Hoogenboomamd Winter, 1992）、分子複合体（Chames et al., 2000）、不安定な化合物（Kjaer et al., 1998）および細胞表面タンパク質（Desaiet al., 1998）を含む多数の特有の抗原に対する抗体断片の開発が容易になった。
【０００４】
抗体の大きなコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングして、リガンドに所望の親和性で結合するクローンを同定するための１つの方法は、細菌細胞、より詳細にはＥ．ｃｏｌｉの表面上での抗体断片または全長抗体の発現およびディスプレイを伴うものである。抗体または抗体断片をディスプレイする細胞を蛍光標識されたリガンドの溶液と一緒にインキュベートし、それらの表面上にディスプレイされた抗体によって前記リガンドに結合する細胞をフローサイトメトリーにより単離する。特に、繋留型ペリプラズム発現（ＡＰＥｘ）は、Ｅ．ｃｏｌｉの内膜のペリプラズム面（ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ  ｆａｃｅ）における抗体断片の繋留に続く、外膜の破壊、蛍光標識された標的とのインキュベーションおよびスフェロプラストの選別に基づく（米国特許第７，０９４，５７１号、Harvey et al., 2004; Harvey et al., 2006）。
ヒト血清タンパク質の中で、アルブミンおよび免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）は、ヒトにおける他の血清タンパク質よりも長い血清中半減期（約３週間）を有する。新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）は、リサイクリングおよびトランスサイトーシスプロセス等の多数の重要な生物学的機能を果たし、それにより、ヒトにおけるＩｇＧの異常に長い約２１日間の血清中持続を導くことが公知である（Challa et al., 2014）。かかるＩｇＧの細胞間輸送によりその恒常性が調節され得、その結果、ＩｇＧ細胞内分解が防止されることによってクリアランスの低減およびｉｎ  ｖｉｖｏ半減期の増大がもたらされる（Oberet al., 2004; Ward et al., 2015）。ほとんど全ての細胞型において、ＦｃＲｎは、主に初期およびリサイクリングエンドソーム等の細胞内小胞ならびに選別細管（ｓｏｒｔｉｎｇ  ｔｕｂｕｌｅ）に局在しており、ＦｃＲｎの発現レベルは細胞表面上に限定される（Oberet al., 2004）。さらに、ＩｇＧ−ＦｃＲｎ相互作用は酸性ｐＨでは最適であるが、中性ｐＨでは失われる。したがって、一般に認められているＦｃＲｎ媒介性ＩｇＧリサイクリングモデルは、血液中でＩｇＧの高い血清中レベルが維持されるように、ＩｇＧが非特異的ピノサイトーシスによって内部移行し、酸性エンドソーム（約ｐＨ６．０）においてＩｇＧがＦｃＲｎに結合し、回収されて細胞表面（生理的ｐＨ７．４）に戻るというものである（Ghetieet al., 1996; Ghetie and Ward, 2000; Israel et al., 1996; Kim et al., 1999;Martin et al., 2001; Roopenian and Akilesh, 2007; Roopenian et al., 2003）。しかし、細胞表面においてＦｃＲｎから解離しないＩｇＧは、輸送からリソソームに回収されるかまたは受容体ターンオーバーの間に異化されるので、リソソーム分解されることになる（Ganet al., 2009）。
ＦｃＲｎへのＦｃ結合の生理的重要性および治療抗体を用いたＦｃＲｎへのＦｃ結合の重要性に起因して、ＦｃＲｎへのｐＨ依存性結合の増強によって血清中半減期が増大した新しいＦｃドメインの明白な必要性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第７，０９４，５７１号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｅｌｖｉｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．（２０１３）４４０：８３〜９８
【非特許文献２】ＲｏｏｐｅｎｉａｎおよびＡｋｉｌｅｓｈ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，（２００７年８月１７日）７（９）：７１５〜２５
【非特許文献３】Ｒｏｏｐｅｎｉａｎら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００３）１７０（７）  ３５２８〜３５３３
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一部の態様では、本発明は、ＦｃＲｎに対するｐＨ依存性親和性の増強を示すＦｃドメインバリアントを提供することによって先行技術における限界を克服する。下の例に示される通り、どちらも酸性ｐＨにおいてＦｃＲｎにヒトＩｇＧ野生型の親和性をはるかに超える親和性で結合する操作された変異体ＩｇＧ  Ｆｃドメインが提供され、一部の態様では、変異体Ｆｃドメインが生理的ｐＨ（生理的ｐＨ７．４）ではＦｃＲｎへの非常に低い〜無視できるまたは検出不可能な結合を有することがさらに観察された。かかるＦｃＲｎに対する親和性の高ｐＨ選択性は、血清中半減期の増大のために非常に望ましい。
【０００８】
本発明の一部の態様では、ＦｃＲｎに対して酸性ｐＨにおける増強された親和性およびｐＨ選択性を示す抗体Ｆｃドメインを単離するための方法が提供される。本発明の別の態様では、ｐＨ選択的結合および／またはＦｃＲｎに対する親和性の増大をもたらし得るＩｇＧ１  Ｆｃドメインにおける特定の変異および変異の組合せが提供される。
【０００９】
より詳細には、一部の実施形態では、対応する野生型Ｆｃドメインと比較して、ＦｃＲｎに対して（ｉ）ｐＨ５．８では結合の増強を示し、かつ（ｉｉ）ｐＨ７．４では結合の低減を示すまたは検出可能な結合を示さない変異体またはバリアントヒトＦｃドメインが提供される。変異体またはバリアントＦｃドメインは、変異体またはバリアントＩｇＧドメインであり得る。変異体またはバリアントＦｃドメインは、抗体等のポリペプチドに含まれ得る。一部の実施形態では、変異体またはバリアントＦｃドメインは、治療抗体、例えば、アゴニスト抗体またはアンタゴニスト抗体等に含まれ得る。一部の実施形態では、ヒトＩｇＧ１−４抗体（「抗体Ｆｃドメイン」）に由来する変異体またはバリアントＦｃドメインを有するポリペプチドが関与する組成物が存在する。変異体Ｆｃドメインは、野生型ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメイン（配列番号１）のバリアントであり得、ここで、変異体またはバリアントＦｃドメインは、ＦｃＲｎに、酸性ｐＨでは増大した親和性で結合することができるが、中性ｐＨでは結合することができない。一部の実施形態では、操作されたＦｃドメインは、ＦｃＲｎに対して、例えば、グリコシル化された野生型Ｆｃドメインよりも約５倍増大した親和性を呈し得る。さらなる実施形態では、他の全ての野生型ＩｇＧサブクラス（ヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４）の変異体ヒトＦｃドメインが提供され、これらは、ＦｃＲｎに酸性ｐＨでは増大した親和性で結合することができるが、中性ｐＨでは結合することができない。変異体またはバリアントＦｃとＦｃＲｎの結合を酸性ｐＨ（例えば、ｐＨ５．８）では増大させ、しかし生理的ｐＨ（ｐＨ７．４）では増大させないために、変異体またはバリアントＦｃドメインは、野生型ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ（配列番号１）、ヒトＩｇＧ２  Ｆｃ（配列番号２）、ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ（配列番号３）、またはヒトＩｇＧ４  Ｆｃ（配列番号４）と比べて、変異（Ｌ／Ｖ３０９Ｄ、Ｑ３１１Ｈ、Ｎ４３４Ｓ／Ｙ）、および必要に応じて（Ｖ２６４Ｅ）を含有し得る。例えば、変異（Ｌ／Ｖ３０９Ｄ、Ｑ３１１Ｈ、Ｎ４３４Ｓ）をヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４において作製し、その結果、それぞれ配列番号７、配列番号９、配列番号１０、および配列番号１１をもたらした。上記の通り、これらの酸性ｐＨにおけるＦｃＲｎへの結合の変化により、タンパク質の薬物動態を改善することおよび／または血清中半減期を増大させることができる。下の例で観察される通り、操作されたＦｃドメインは、ヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウスモデルにおいて血清中半減期の増強を呈することが観察された。
【００１０】
一部の態様では、ＦｃＲｎに対する親和性およびｐＨ選択性の増大を示す抗体Ｆｃドメインを単離するための方法が提供される。抗体Ｆｃドメインは、例えば、ＦｃドメインのＦｃＲｎに対する選択的かつ親和性が増大した結合に影響を及ぼすために本明細書に記載されている特定の置換変異の１つもしくは複数または置換変異の組合せを含み得る。
【００１１】
一部の実施形態では、ヒトＩｇＧ１抗体由来のＦｃドメイン（「抗体Ｆｃドメイン」）を有するポリペプチドが関与する組成物が存在する。追加的な実施形態では、Ｆｃドメインは、ＦｃＲｎに対する増大したまたはｐＨ選択的結合を呈し得るヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメイン（配列番号１）のバリアントまたは変異体である。一部の実施形態では、操作されたＦｃドメインのアミノ酸置換（変異Ｌ／Ｖ３０９Ｄ、Ｑ３１１Ｈ、およびＮ４３４Ｓ／Ｙ；ならびに必要に応じてＶ２６４Ｅ）が他のＩｇＧサブクラス（ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４）に導入されると、酸性ｐＨにおける（ｉ）ＦｃＲｎへのｐＨ選択的結合および（ｉｉ）ＦｃＲｎへの増強された結合の両方がもたらされる。一部の実施形態では、本明細書に提供されている操作されたＦｃドメインは、野生型Ｆｃドメインを有するポリペプチドと比較して３倍〜５倍またはそれよりも大きく増大したＦｃＲｎに対する親和性（例えば、少なくとも２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、または５．５倍に増強されたＦｃＲｎに対するＫＤ）を呈し得る。
【００１２】
抗体Ｆｃドメインは、ＩｇＧ抗体のＦｃドメインまたはそのバリアントであり得る。さらに、抗体Ｆｃドメインは、ヒトＦｃドメインとして規定することができる。ある特定の態様では、Ｆｃドメインは、抗ＨＥＲ２抗体のＦｃドメイン等のＩｇＧ１  Ｆｃドメインであり得る。ポリペプチドは、抗体分子に由来しないポリペプチドに融合された、本明細書に開示されている操作されたＦｃドメインの融合体を含み得ることも企図される。
【００１３】
一部の実施形態では、抗体Ｆｃドメインを含むポリペプチドは、特定のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、以下の一覧からの１つよりも多くのポジションに多数のアミノ酸置換が存在する：（２６４、３０９、３１１、および４３４）；（３０９、３１１、および４３４）。一部の実施形態では、操作されたＦｃドメインは、これらのポジションの２つ、３つ、４つまたは全てに置換変異を有し得る。Ｆｃドメインはグリコシル化されていてもよく、非グリコシル化されていてもよい。例えば、２６４位に変異を含めること（例えば、Ｖ２６４Ｅ）により、非グリコシル化Ｆｃドメインがもたらされ得る。一部の実施形態では、ＩｇＧ１の抗体Ｆｃドメインは、アミノ酸３０９におけるアスパラギン酸による置換（Ｌ３０９Ｄ）、アミノ酸３１１におけるヒスチジンへの置換（Ｑ３１１Ｈ）、アミノ酸４３４におけるセリンまたはチロシンへの置換（Ｎ４３４Ｓ／Ｙ）、またはこれらの置換の組合せであり得る。必要に応じて、ＦｃドメインＩｇＧ１は、アミノ酸２６４におけるグルタミン酸への置換（Ｖ２６４Ｅ）をさらに含み得る。他の好ましい実施形態では、抗体Ｆｃドメイン（例えば、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のＦｃドメイン等）は、アミノ酸３０９におけるアスパラギン酸による置換（Ｖ３０９Ｄ）、アミノ酸３１１におけるヒスチジンへの置換（Ｑ３１１Ｈ）、アミノ酸４３４におけるセリンまたはチロシンへの置換（Ｎ４３４Ｓ／Ｙ）、またはこれらの置換の組合せを含み得る。必要に応じて、ＦｃドメインＩｇＧ１は、アミノ酸２６４におけるグルタミン酸への置換（Ｖ２６４Ｅ）をさらに含み得る。
【００１４】
本発明のある態様は、酸性ｐＨにおいてヒトＦｃＲｎに結合することができる変異体またはバリアントヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインを含むポリペプチドであって、Ｆｃドメインが、（ｉ）３０９位におけるアスパラギン酸（Ｌ／Ｖ３０９Ｄ）；（ｉｉ）３１１位におけるヒスチジン（Ｑ３１１Ｈ）；および（ｉｉｉ）４３４位における置換変異（Ｎ４３４）の置換変異を有する、ポリペプチドに関する。４３４位における置換変異は、セリン（Ｎ４３４Ｓ）またはチロシン（Ｎ４３４Ｙ）であり得る。Ｆｃドメインは、グリコシル化されていてよい。一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、野生型と比較して実質的に等しい、基本的に同じ、ほぼ同じ、または同じであるＦｃγＲへの結合を有する。一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩのうちの１つ、２つ、または全てに対して野生型と比較して実質的に等しい、基本的に同じである、ほぼ同じである、同じである、または等しい結合能を有する。Ｆｃドメインは、ＦｃＲｎに酸性ｐＨにおいて野生型よりも高い親和性で結合し得る。一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、中性ｐＨではＦｃＲｎに検出可能もしくは選択的には結合しない、またはＦｃＲｎへの結合を示さないもしくは基本的に示さない。一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＦｃＲｎに対して、野生型と比較して、（ｉ）ｐＨ５．８では結合の増強を示し、かつ（ｉｉ）ｐＨ７．４では結合の低減を示すまたは検出可能な結合を示さない。Ｆｃドメインは、非グリコシル化されていてよい。例えば、一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、２６４位におけるグルタミン酸の置換変異（Ｖ２６４Ｅ）を有する。ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４であり得る。一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＥＤＨＳ（Ｖ２６４Ｅ、Ｌ３０９Ｄ、Ｑ３１１Ｈ、およびＮ４３４Ｓ；例えば、配列番号５）、ＥＤＨＹ（Ｖ２６４Ｅ、Ｌ３０９Ｄ、Ｑ３１１Ｈ、およびＮ４３４Ｙ；例えば、配列番号６）、ＤＨＳ（Ｌ３０９Ｄ、Ｑ３１１Ｈ、およびＮ４３４Ｓ；例えば、配列番号７）、ＤＨＹ（Ｌ３０９Ｄ、Ｑ３１１Ｈ、およびＮ４３４Ｙ；例えば、配列番号８）、ＩｇＧ２−ＤＨＳ（Ｖ３０９Ｄ、Ｑ３１１Ｈ、およびＮ４３４Ｓ；配列番号９）、ＩｇＧ３−ＤＨＳ（Ｌ３０９Ｄ、Ｑ３１１Ｈ、およびＮ４３４Ｓ；配列番号１０）、またはＩｇＧ４−ＤＨＳ（Ｌ３０９Ｄ、Ｑ３１１Ｈ、およびＮ４３４Ｓ；配列番号１１）を含む、またはそれからなる。一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＤＨＳ（Ｌ３０９Ｄ、Ｑ３１１Ｈ、およびＮ４３４Ｓ；例えば、配列番号７）またはＤＨＹ（Ｌ３０９Ｄ、Ｑ３１１Ｈ、およびＮ４３４Ｙ；例えば、配列番号８）を含む、またはそれからなる。一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＦｃＲｎに約５５０ｎＭ未満、約５２５ｎＭ未満、約５００ｎＭ未満、約４７５ｎＭ未満、約４５０ｎＭ未満、約４２５ｎＭ未満、約４００ｎＭ未満、約３７５ｎＭ未満、約３５０ｎＭ未満、約３２５ｎＭ未満、約３００ｎＭ未満、約２７５ｎＭ未満、約２５０ｎＭ未満、約２２５ｎＭ未満、約２００ｎＭ未満、約１７５ｎＭ未満、約１５０ｎＭ未満、約１２５ｎＭ未満、または約１００ｎＭ未満のＫＤ値で結合する（例えば、ｐＨ��．８で）。ポリペプチドは、非Ｆｃ受容体（非ＦｃＲ）結合ドメインをさらに含み得る。非ＦｃＲ結合ドメインはＩｇ可変ドメインであり得る。ポリペプチドは全長抗体であり得る。一部の実施形態では、抗体は、アゴニスト抗体またはアンタゴニスト抗体である。一部の実施形態では、抗体は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＣＤ２０、ＣＤ４０、ＩＬ−１０、４−１ＢＢ、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４ＯＸ４０、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ６Ｒ、ＴＮＦα、ＲＡＮＫＬ、ＥＧＦＲ、ｃ−Ｍｅｔ、ＣＤ１１ａ、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、Ｃ５、またはインテグリン（Ｉｎｔｅｇｒａｉｎ）−α４に選択的に結合する。抗体は、毒素に化学的にコンジュゲートされ得るかまたは共有結合され得る。一部の実施形態では、非ＦｃＲ結合領域は、抗体の抗原結合部位ではない。一部の実施形態では、非ＦｃＲ結合領域は、細胞表面タンパク質に結合する。一部の実施形態では、非ＦｃＲ結合領域は、可溶性タンパク質に結合する。
【００１５】
本発明の別の態様は、本発明のまたは上記のポリペプチドのいずれかをコードする核酸に関する。核酸は、ＤＮＡセグメントであり得る。一部の実施形態では、核酸は、発現ベクターである。
【００１６】
本発明のさらに別の態様は、本発明のまたは上記の核酸を含む宿主細胞に関する。細胞は、核酸を発現し得る。
【００１７】
本発明の別の態様は、ポリペプチドを調製するための方法であって、ａ）本発明のまたは上記の宿主細胞を得るステップと、ｂ）非グリコシル化ポリペプチドの発現を促進するための条件下で、培養において宿主細胞をインキュベートするステップと、ｃ）宿主細胞から、発現されたポリペプチドを精製するステップとを含む方法に関する。一部の実施形態では、宿主細胞は、原核細胞または哺乳動物細胞である。
【００１８】
本発明のさらに別の態様は、薬学的に許容される担体中に、本発明のもしくは上記のポリペプチド、または本発明のもしくは上記の核酸を含む医薬品製剤に関する。
【００１９】
本発明の別の態様は、対象に抗体を与えるステップを含む、対象においてタンパク質を結合させる方法であって、抗体が、タンパク質に結合し、かつ本発明のまたは上記のＦｃドメインを含む、方法に関する。一部の実施形態では、抗体は、ヒトＦｃＲｎに約５５０ｎＭ未満、約５２５ｎＭ未満、約５００ｎＭ未満、約４７５ｎＭ未満、約４５０ｎＭ未満、約４２５ｎＭ未満、約４００ｎＭ未満、約３７５ｎＭ未満、約３５０ｎＭ未満、約３２５ｎＭ未満、約３００ｎＭ未満、約２７５ｎＭ未満、約２５０ｎＭ未満、約２２５ｎＭ未満、約２００ｎＭ未満、約１７５ｎＭ未満、約１５０ｎＭ未満、約１２５ｎＭ未満、または約１００ｎＭ未満のＫＤで特異的に結合することができる。一部の実施形態では、抗体はグリコシル化されており、かつ、Ｆｃドメインは、野生型と比較してほぼ同等または同等のＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩへの結合を有する。一部の実施形態では、抗体は、グリコシル化治療抗体である。一部の実施形態では、抗体は、非グリコシル化バージョンの治療抗体である。
【００２０】
本発明のさらに別の態様は、疾患を有する対象を処置する方法であって、有効量の本発明のまたは上記の製剤を対象に投与するステップを含む方法に関する。方法により、抗体依存性細胞傷害を誘導することができる。一部の実施形態では、疾患は、がん、感染、または自己免疫疾患（例えば、関節リウマチ）である。対象はヒト患者であり得る。製剤は、腫瘍内に、静脈内に、皮内に、動脈内に、腹腔内に、病巣内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に、胸膜内に、気管内に、眼内に、鼻腔内に、硝子体内に、膣内に、直腸内に、筋肉内に、皮下に、結膜下、小胞内に、粘膜に、心膜内に、臍帯内に、経口によって、吸入によって、注射によって、注入によって、持続注入によって、標的細胞を直接浸す局在化灌流によって、カテーテルにより、または洗浄により投与することができる。一部の実施形態では、疾患はがんであり、方法は、少なくとも第２の抗がん療法を対象に投与するステップをさらに含む。第２の抗がん療法は、外科療法、化学療法、放射線療法、寒冷療法、ホルモン療法、免疫療法またはサイトカイン療法であり得る。疾患は、腫瘍、例えば、固形腫瘍または血液学的腫瘍等を含み得る。
【００２１】
一実施形態では、疾患（例えば、がん、感染、自己免疫疾患、細菌感染、またはウイルス感染）の処置における使用のための、本実施形態のバリアントＦｃドメインまたは本実施形態のバリアントＦｃドメインをコードする核酸を含む組成物が提供される。疾患の処置は、治療効果（例えば、毒素の結合、またはアゴニスト抗体での受容体の刺激等の結果生じるもの）が達成される一方で、免疫活性化の低減または補体依存性細胞傷害の低減が生じるように選択タンパク質を結合させることを伴い得る。一部の態様では、疾患は、がん、自己免疫疾患、炎症性疾患、または感染症であり得る。別の実施形態では、がん等の疾患の処置のための医薬の製造における、本実施形態によるポリペプチドまたは本実施形態によるポリペプチドをコードする核酸の使用が提供される。
【００２２】
一部の実施形態では、本発明に係るまたは上記のポリペプチドおよび薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的に許容される組成物が提供される。一部の実施形態では、それを必要とする対象において疾患を処置する方法における使用のための組成物であって、本発明に係るまたは上記のポリペプチドを含む組成物が提供される。疾患は、がん、感染、細菌感染、ウイルス感染、または自己免疫疾患であり得る。
【００２３】
バリアントＦｃドメインポリペプチド（変異体または操作されたＦｃドメインとも称される）は、無改変ポリペプチド（例えば、野生型ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、またはヒト野生型ＩｇＧ  Ｆｃドメイン等の野生型Ｆｃドメインポリペプチド）または本明細書に開示されているいずれかのポリペプチド配列と比較して、ある特定のパーセンテージの同一性を有すると特徴付けることができる。パーセンテージ同一性は、改変されたポリペプチドの無改変部分（すなわち、いかなる指定された置換も除外する、改変されたポリペプチドの配列）および対応する野生型ポリペプチドの間で、おおよそ少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％（またはそこから導くことができるいずれかの範囲）であり得る。例えば、バリアントＦｃドメインは、指定された置換変異（例えば、Ｌ／Ｖ３０９Ｄ、Ｑ３１１Ｈ、およびＮ４３４Ｓ／Ｙ；ならびに必要に応じてＶ２６４Ｅ）を除外するバリアントＦｃドメインの領域に関して、野生型Ｆｃドメイン（例えば、配列番号１〜４のいずれか１つ等の野生型ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメイン）と比較して、例えば、少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有し得る。バリアントＦｃドメインは、野生型Ｆｃドメインと比較して、変異体Ｆｃドメインにおける指定された置換変異に加えて、追加的な変異も含み得る。上記の同一性のパーセンテージが、野生型Ｆｃドメイン（例えば、ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメイン）と比較した、バリアントＦｃドメインポリペプチドの全体に関係し得ることも企図される。例えば、野生型Ｆｃドメインに対し少なくとも９０％の同一性を有すると特徴付けられるバリアントＦｃドメインポリペプチドは、そのバリアントポリペプチドにおけるアミノ酸の少なくとも９０％が、野生型ポリペプチドにおけるアミノ酸と同一であることを意味する。
【００２４】
抗体Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ抗体の変異体またはバリアントＦｃドメインであり得る（例えば、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４  Ｆｃドメインであり得る）。ポリペプチドが、抗体分子に由来しないポリペプチドに融合された、本明細書に開示されている操作されたバリアントＦｃドメインの融合体を含み得ることも企図される。一部の実施形態では、本発明の操作されたＦｃドメインは、アゴニスト抗体、例えば、ＣＤ４０、細胞死受容体５（ＤＲ５）、ＰＤ−１、またはＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）分子を標的とする抗体等に含まれる。
【００２５】
本明細書に記載されているバリアントＦｃドメインを含むポリペプチドは、一部の実施形態では、リンカーを含み得る。さらなる実施形態では、リンカーは、コンジュゲート可能なリンカーである。一部の実施形態では、ポリペプチドは、抗体に由来するＦｃドメインを含有する。これは、別の結合ドメイン等、抗体由来の他の領域を含有し得る。一部の実施形態では、追加的な結合ドメインは、ＦｃＲ結合ドメインでなくてもよい。一部の実施形態では、ポリペプチドは、抗体由来の可変領域の全部または部分等、抗体由来の抗原結合部位またはドメインを含有し得る。ポリペプチドは、抗体由来のＦｃドメインおよび非ＦｃＲ結合ドメインである別の結合ドメインを含有し得る。一部の実施形態では、非Ｆｃ結合領域は、抗体の抗原結合部位ではなく、細胞表面タンパク質または可溶性タンパク質に特異的に結合する。一部の場合では、非Ｆｃ結合領域が認識する細胞表面タンパク質は、受容体、例えば、細胞表面上に発現される受容体等である。
【００２６】
他のポリペプチドは、Ｆｃドメインバリアント（例えば、酸性ｐＨではＦｃＲｎポリペプチドに増強された結合をすることができるが、生理的または中性ｐＨではＦｃＲｎへの結合の低減を示すまたは検出可能な結合を示さない）と、非Ｆｃ受容体結合ドメインである第２の結合ドメインとを有するポリペプチドを含み、第２の結合ドメインは、細胞表面分子または可溶性タンパク質に特異的に結合することができる。一部の実施形態では、第２の結合ドメインは、抗体の抗原結合ドメイン（「Ｉｇ可変ドメイン」）である。一部の態様では、ポリペプチドは、全長抗体であり得る。一部の場合では、第２の結合ドメインは、抗体抗原結合ドメインではない。一部の実施形態では、第２の結合ドメインは、タンパク質またはタンパク質性分子である細胞表面分子に特異的に結合することができる。一部の態様では、第２の結合ドメインは、可溶性タンパク質に特異的に結合することができる。
【００２７】
一部の態様は、本明細書に記すポリペプチドのいずれかをコードする核酸に関係する。核酸は、単離することができ、そして／または組換体であり得る。これは、単離され、そして／または組換体である核酸セグメントであり得る。一部の実施形態では、核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡである。一部の実施形態では、核酸は、ＤＮＡセグメントである。一部の実施形態では、核酸は、ＦｃγＲｎに特異的に結合する１個または複数の置換を有するＦｃ結合ドメインを有するポリペプチドのいずれかを発現することができる発現ベクターである。核酸は、ある特定の変異が存在するかしないか、ならびにポリペプチドが産生される仕方に応じてグリコシル化されていてもされていなくてもよい、本明細書の１種または複数のポリペプチドをコードし得る。
【００２８】
一部の実施形態では、核酸は、本明細書に記載されているＦｃＲｎにｐＨ選択的に結合することができるバリアントまたは変異体Ｆｃドメインを含む、またはそれからなるポリペプチドをコードする。核酸は、非グリコシル化バージョンのポリペプチド等のポリペプチドを発現することができる宿主細胞に入れること（例えば、トランスフェクトまたは形質転換すること）ができる。宿主細胞は、細菌細胞等の原核細胞であり得る。あるいは、宿主細胞は、哺乳動物細胞等の真核細胞であり得る。一部の実施形態では、宿主細胞は、第１の発現ベクターを含有するが、同様に第２の発現ベクターも含み得る。一部の抗体は、複数のポリペプチドで構成されているため、一部の実施形態では、ポリペプチドを発現させるために必要な発現ベクター（複数可）を含有する宿主細胞を利用することができる。一部の実施形態では、宿主細胞は、免疫グロブリン重鎖（例えば、ＦｃＲｎに酸性ｐＨでは増強された親和性で結合するが、中性ｐＨでは結合しないバリアントまたは変異体Ｆｃドメインを含有する）を含む、またはそれからなるポリペプチドをコードする第１の発現ベクターを発現する。一部の実施形態では、宿主細胞は、免疫グロブリン軽鎖を含む、またはそれからなるポリペプチドをコードする第２の発現ベクターを含む。宿主細胞は、例えば、重鎖および軽鎖を含む抗体の発現を可能にするために１つまたは２つの発現ベクターを含み得る。
【００２９】
一部の態様では、宿主細胞の集団であって、異なるＦｃドメインを有するポリペプチドを発現する複数の宿主細胞を含有する集団が提供される。任意の２種の異なるＦｃドメインのアミノ酸配列が、同一性が２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、またはそれ未満異なり得ることが企図される。
【００３０】
一部の態様では、本明細書に記載されているポリペプチド（例えば、ＦｃＲｎに酸性ｐＨでは増強された親和性で結合するが、中性ｐＨでは結合しないＦｃ領域を有するポリペプチド）を作製する方法ならびにこれらのポリペプチドを使用する方法が提供される。本明細書に記載されているまたは当業者に公知の方法は、本明細書に記載されているポリペプチドのいずれかを作製または使用するためのものであり得ることが予測される。
【００３１】
一部の実施形態では、方法は、上清からポリペプチドを精製することを伴う。これは、上清からのポリペプチドを、濾過、ＨＰＬＣ、陰イオンもしくは陽イオン交換、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、アフィニティークロマトグラフィーまたはこれらの組合せに供することを伴い得る。一部の実施形態では、方法は、ＩｇＧ  Ｆｃ領域に結合するブドウ球菌プロテインＡを使用するアフィニティークロマトグラフィーを伴う。他の精製方法は当業者に周知である。
【００３２】
一部の実施形態では、薬学的に許容される担体中に本実施形態のポリペプチドもしくは核酸を含む医薬品製剤、または賦形剤を含む医薬調製物が提供される。
【００３３】
一部の実施形態では、対象に抗体を与えるまたは投与する（例えば、静脈内に等）ステップを含む方法であって、抗体が、本明細書に記載されているＦｃＲｎに酸性ｐＨでは増強された親和性で結合するが、中性ｐＨまたは生理的ｐＨでは結合しないＦｃドメインを含む、方法により、対象において免疫応答を誘導することができる。
【００３４】
さらなる実施形態では、がん、感染、自己免疫性のまたは炎症性疾患を、本明細書に記載されている、ＦｃＲｎに酸性ｐＨでは増強された親和性で結合するが、中性ｐＨまたは生理的ｐＨでは結合しないバリアントまたは変異体Ｆｃドメインを含む治療用ポリペプチドを投与することによって処置することができる。本明細書に記載されている変異体またはバリアントＦｃドメインを含むポリペプチドは、野生型ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域を含むポリペプチドによって誘導される補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）と比較して同様のＣＤＣを示し得ることが構想される。なおさらなる実施形態では、本発明に係るポリペプチドは、野生型ヒトＩｇＧ抗体と比較して同様のＡＤＣＣまたはＡＤＣＰを示し得る。
【００３５】
本明細書で使用される場合、「ＦｃＲｎへのｐＨ選択的結合」または「ＦｃＲｎにｐＨ選択的に結合する」は、Ｆｃドメイン（例えば、変異体またはバリアントＩｇＧ  Ｆｃドメイン）等のポリペプチドの、ＦｃＲｎに酸性ｐＨ（例えば、ｐＨ５．８）で結合する能力を有する特性を指し、ポリペプチドまたはＦｃドメインは、酸性ｐＨにおいて野生型Ｆｃドメイン（例えば、野生型Ｆｃ  ＩｇＧドメイン）と比較して増大したＦｃＲｎへの結合を示す能力を有することが好ましい。一部の実施形態では、ＦｃＲｎにｐＨ選択的に結合するＦｃドメインまたはポリペプチドはまた、生理的ｐＨでは野生型（例えば、野生型ＩｇＧ  Ｆｃドメイン）と比較して低減したＦｃＲｎへの結合を示すまたは生理的ｐＨではＦｃＲｎへの検出可能な結合を示さない。
【００３６】
本明細書において使用する場合、「を基本的に含まない」は、指定された構成成分に関して、指定された構成成分のいずれも、組成物において意図的に製剤化されていない、および／またはそれが単なる夾雑物としてもしくは微量で存在することを意味するように本明細書で使用されている。組成物のいずれかの意図されない混入に起因する指定された構成成分の総量は、したがって、０．０５％をはるかに下回り、好ましくは０．０１％を下回る。指定された構成成分の量を標準分析方法により検出することができない組成物が最も好ましい。
【００３７】
本明細書において使用する場合、用語「親和性」は、２種の作用物質の可逆的結合の平衡定数を指し、ＫＤとして表現される。その標的に対する結合ドメインの親和性は、例えば、約１００ナノモル濃度（ｎＭ）〜約０．１ｎＭ、約１００ｎＭ〜約１ピコモル濃度（ｐＭ）または約１００ｎＭ〜約１フェムトモル濃度（ｆＭ）であり得；あるいは、これは、１００ｎＭ〜１ｎＭの間または０．１ｎＭ〜１０ｎＭの間であり得る。さらに、２種の作用物質の間に上に記す親和性範囲内の親和性が存在する場合、作用物質同士が特異的に結合することが企図される。
【００３８】
本明細書において使用する場合、核酸に関連する用語「コードする」または「コード化すること」は、当業者が本発明を容易に理解できるようにするために使用され；しかし、これらの用語は、それぞれ「を含む」または「を含むこと」と互換的に使用することができる。
【００３９】
本明細書において、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、１または複数を意味することができる。本明細書の請求項（単数または複数）において使用する場合、単語「を含む（comprising）」と併せて使用される場合、単語「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、１または２以上を意味することができる。
【００４０】
特許請求の範囲における用語「または」の使用は、選択肢のみを指すことまたは選択肢が相互排他的であることを明確に示さない限り、「および／または」を意味するように使用されているが、本開示は、選択肢のみおよび「および／または」を指す規定を支持する。本明細書において使用する場合、「別の」は、少なくとも第２のまたはそれを超える数のものを意味することができる。
【００４１】
本願全体を通して、用語「約」は、値が、変量の測定に使用される装置、値の決定に用いられる方法に固有の誤差変動、または研究対象の間に存在する変動を含むことを示すように使用されている。
本発明の他の目的、特色および利点は、次の詳細な説明から明らかである。しかし、本発明の精神および範囲内の様々な変更および修正が、この詳細な説明から当業者に明らかであり得るため、詳細な説明および具体例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、単なる例示として提示されていることを理解されたい。
以下の図は本明細書の一部を形成し、本発明のある特定の態様をさらに実証するために含まれる。本発明は、これらの図の１つまたは複数を本明細書で提示されている特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて参照することによって、よりよく理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１Ａ〜Ｂは、トラスツズマブ軽鎖（図１Ａ）およびトラスツズマブ重鎖（図１Ｂ）の細菌ペリプラズムディスプレイのための２つのプラスミド系の簡単な図である。
【図２】図２は、ＦｃＲｎ−β２ｍを有するＩｇＧ１のＦｃドメインの複合体構造を示す図である。ＦｃＲｎの近く（＜７Å）のＦｃドメインの隣接する残基がＦｃＲｎ−Ｆｃ複合体構造に基づいて強調表示されている（ＰＤＢ  ＩＤ：４Ｎ０Ｕ）（Oganesyan V. et al., 2014）。ＦｃＲｎに対するＦｃドメイン内の隣接する残基の側鎖が強調表示された構造で示されている。ＦｃＲｎに対するＦｃドメイン内の隣接する残基を、縮重コドンを含有するプライマーを用いてランダム化する。ＩｇＧ１−Ｆｃドメイン（左）、ＦｃＲｎ−β２ｍ（右）。
【図３−１】図３Ａ〜Ｂは、Ｆｃライブラリーのスクリーニング戦略および結果である。図３Ａ、ＩｇＧをディスプレイするスフェロプラストを、ｐＨ５．８において単鎖ＦｃＲｎ（ｓｃＦｃＲｎ）−ＡＰＣで標識し、次いで、ｐＨ７．４において二量体ＦｃＲｎ−ＦＩＴＣで標識した。図３Ｂ、Ｆｃライブラリーを、ＦｃＲｎを用いて５ラウンドスクリーニングし、得られたＦｃＲｎ結合活性を示した。
【図３−２】図３Ａ〜Ｂは、Ｆｃライブラリーのスクリーニング戦略および結果である。図３Ａ、ＩｇＧをディスプレイするスフェロプラストを、ｐＨ５．８において単鎖ＦｃＲｎ（ｓｃＦｃＲｎ）−ＡＰＣで標識し、次いで、ｐＨ７．４において二量体ＦｃＲｎ−ＦＩＴＣで標識した。図３Ｂ、Ｆｃライブラリーを、ＦｃＲｎを用いて５ラウンドスクリーニングし、得られたＦｃＲｎ結合活性を示した。
【図３−３】図３Ａ〜Ｂは、Ｆｃライブラリーのスクリーニング戦略および結果である。図３Ａ、ＩｇＧをディスプレイするスフェロプラストを、ｐＨ５．８において単鎖ＦｃＲｎ（ｓｃＦｃＲｎ）−ＡＰＣで標識し、次いで、ｐＨ７．４において二量体ＦｃＲｎ−ＦＩＴＣで標識した。図３Ｂ、Ｆｃライブラリーを、ＦｃＲｎを用いて５ラウンドスクリーニングし、得られたＦｃＲｎ結合活性を示した。
【図４】図４は、単離されたＦｃバリアントのＦＡＣＳ解析である。Ｆｃバリアントを発現するＥ．ｃｏｌｉスフェロプラストを、ｐＨ５．８において１０ｎＭのｓｃＦｃＲｎ−ＦＩＴＣでまたはｐＨ７．４において５０ｎＭのｄＦｃＲｎ−ＡＰＣで標識した。
【図５−１】図５Ａ〜Ｆは、ハーセプチン（図４Ａ）、および選択されたＩｇＧバリアント、ＥＤＨ（図４Ｂ）、ＥＤＨＹ（図４Ｃ）、ＥＤＨＳ（図４Ｄ）、ハーセプチン−ＬＳ（図４Ｅ）、ハーセプチン−ＹＴＥ（図４Ｆ）の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーグラムである。各抗体をＣＭ５チップ上に固定化し、ｐＨ５．８のＰＢＳ中に段階的に希釈したｓｃＦｃＲｎタンパク質をＣＭ５チップに注入した。
【図５−２】図５Ａ〜Ｆは、ハーセプチン（図４Ａ）、および選択されたＩｇＧバリアント、ＥＤＨ（図４Ｂ）、ＥＤＨＹ（図４Ｃ）、ＥＤＨＳ（図４Ｄ）、ハーセプチン−ＬＳ（図４Ｅ）、ハーセプチン−ＹＴＥ（図４Ｆ）の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーグラムである。各抗体をＣＭ５チップ上に固定化し、ｐＨ５．８のＰＢＳ中に段階的に希釈したｓｃＦｃＲｎタンパク質をＣＭ５チップに注入した。
【図６】図６は、ｐＨ７．４におけるｄＦｃＲｎとの抗体バリアントの結合活性である。各抗体を９６ウェルにコーティングし、ｄＦｃＲｎの結合活性を抗ＧＳＴ  ＨＲＰによって検出した。
【図７−１】図７Ａ〜Ｆは、野生型ハーセプチンおよび選択されたＩｇＧバリアントハーセプチン−ＥＤＨＳの、ＦｃγＲ；単量体ＦｃγＲＩ（図７Ａ）、二量体ＦｃγＲＩＩＡＨ１３１（図７Ｂ）、二量体ＦｃγＲＩＩＡＲ１３１（図７Ｃ）、二量体ＦｃγＲＩＩＢ（図７Ｄ）二量体ＦｃγＲＩＩＩＡＶ１５７（図７Ｅ）、および二量体ＦｃγＲＩＩＩＡＦ１５７（図７Ｆ）に対するＥＬＩＳＡ結果である。
【図７−２】図７Ａ〜Ｆは、野生型ハーセプチンおよび選択されたＩｇＧバリアントハーセプチン−ＥＤＨＳの、ＦｃγＲ；単量体ＦｃγＲＩ（図７Ａ）、二量体ＦｃγＲＩＩＡＨ１３１（図７Ｂ）、二量体ＦｃγＲＩＩＡＲ１３１（図７Ｃ）、二量体ＦｃγＲＩＩＢ（図７Ｄ）二量体ＦｃγＲＩＩＩＡＶ１５７（図７Ｅ）、および二量体ＦｃγＲＩＩＩＡＦ１５７（図７Ｆ）に対するＥＬＩＳＡ結果である。
【図８】図８は、ハーセプチン−ＤＨＳの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーグラムである。抗体をＣＭ５チップ上に固定化し、ｐＨ５．８のＰＢＳ中に段階的に希釈したｓｃＦｃＲｎタンパク質をＣＭ５チップに注入した。
【図９】図９は、ｐＨ７．４における二量体ＦｃＲｎ（ｄＦｃＲｎ）との抗体バリアントの結合活性である。各抗体を９６ウェルにコーティングし、ｄＦｃＲｎの結合活性を抗ＧＳＴ  ＨＲＰによって検出した。
【図１０−１】図１０Ａ〜Ｆは、野生型ハーセプチンおよび選択されたＩｇＧバリアントハーセプチン−ＤＨＳの、ＦｃγＲ；単量体ＦｃγＲＩ（図１０Ａ）、二量体ＦｃγＲＩＩＡＨ１３１（図１０Ｂ）、二量体ＦｃγＲＩＩＡＲ１３１（図１０Ｃ）、二量体ＦｃγＲＩＩＢ（図１０Ｄ）二量体ＦｃγＲＩＩＩＡＶ１５７（図１０Ｅ）、および二量体ＦｃγＲＩＩＩＡＦ１５７（図１０Ｆ）に対するＥＬＩＳＡ結果である。
【図１０−２】図１０Ａ〜Ｆは、野生型ハーセプチンおよび選択されたＩｇＧバリアントハーセプチン−ＤＨＳの、ＦｃγＲ；単量体ＦｃγＲＩ（図１０Ａ）、二量体ＦｃγＲＩＩＡＨ１３１（図１０Ｂ）、二量体ＦｃγＲＩＩＡＲ１３１（図１０Ｃ）、二量体ＦｃγＲＩＩＢ（図１０Ｄ）二量体ＦｃγＲＩＩＩＡＶ１５７（図１０Ｅ）、および二量体ＦｃγＲＩＩＩＡＦ１５７（図１０Ｆ）に対するＥＬＩＳＡ結果である。
【図１０−３】図１０Ａ〜Ｆは、野生型ハーセプチンおよび選択されたＩｇＧバリアントハーセプチン−ＤＨＳの、ＦｃγＲ；単量体ＦｃγＲＩ（図１０Ａ）、二量体ＦｃγＲＩＩＡＨ１３１（図１０Ｂ）、二量体ＦｃγＲＩＩＡＲ１３１（図１０Ｃ）、二量体ＦｃγＲＩＩＢ（図１０Ｄ）二量体ＦｃγＲＩＩＩＡＶ１５７（図１０Ｅ）、および二量体ＦｃγＲＩＩＩＡＦ１５７（図１０Ｆ）に対するＥＬＩＳＡ結果である。
【図１１】図１１Ａ〜Ｂは、ハーセプチン−ＤＨＳ媒介性ＡＤＣＣおよびＡＤＣＰアッセイである。各アッセイについて、抗体をＨｅｒ２陽性ＳＫ−ＢＲ３細胞およびＰＢＭＣまたはマクロファージと一緒にインキュベートした。
【図１２】図１２は、３つの異なる密度のｓｃＦｃＲｎとのハーセプチン、ハーセプチン−ＤＨＳ、ハーセプチン−ＬＳ、およびハーセプチン−ＹＴＥの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーグラムである。ｓｃＦｃＲｎをＣＭ５チップ上に３つの異なるレベル、５００ＲＵ、２０００ＲＵ、および４０００ＲＵで固定化し、ｐＨ７．４のＰＢＳ中に段階的に希釈した抗体タンパク質をＣＭ５チップに注入した。
【図１３−１】図１３Ａ〜Ｃは、３つの異なる密度のｓｃＦｃＲｎとのハーセプチン、ハーセプチン−ＤＨＳ、ハーセプチン−ＬＳ、およびハーセプチン−ＹＴＥの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーグラムである。ｓｃＦｃＲｎをＣＭ５チップ上に３つの異なるレベル、５００ＲＵ、２０００ＲＵ、および４０００ＲＵで固定化し、多様なｐＨの１μＭの抗体タンパク質をＣＭ５チップに注入した。
【図１３−２】図１３Ａ〜Ｃは、３つの異なる密度のｓｃＦｃＲｎとのハーセプチン、ハーセプチン−ＤＨＳ、ハーセプチン−ＬＳ、およびハーセプチン−ＹＴＥの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーグラムである。ｓｃＦｃＲｎをＣＭ５チップ上に３つの異なるレベル、５００ＲＵ、２０００ＲＵ、および４０００ＲＵで固定化し、多様なｐＨの１μＭの抗体タンパク質をＣＭ５チップに注入した。
【図１４】図１４は、ヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウスにおける抗体の薬物動態である。
【図１５−１】図１５Ａ〜Ｆは、ＩｇＧ２（図１５Ａ）、ＩｇＧ２−ＤＨＳ（図１５Ｂ）、ＩｇＧ３（図１５Ｃ）、ＩｇＧ３−ＤＨＳ（図１５Ｄ）、ＩｇＧ４（図１５Ｅ）およびＩｇＧ４−ＤＨＳ（図１５Ｆ）の、ｓｃＦｃＲｎに対する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイである。
【図１５−２】図１５Ａ〜Ｆは、ＩｇＧ２（図１５Ａ）、ＩｇＧ２−ＤＨＳ（図１５Ｂ）、ＩｇＧ３（図１５Ｃ）、ＩｇＧ３−ＤＨＳ（図１５Ｄ）、ＩｇＧ４（図１５Ｅ）およびＩｇＧ４−ＤＨＳ（図１５Ｆ）の、ｓｃＦｃＲｎに対する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイである。
【図１５−３】図１５Ａ〜Ｆは、ＩｇＧ２（図１５Ａ）、ＩｇＧ２−ＤＨＳ（図１５Ｂ）、ＩｇＧ３（図１５Ｃ）、ＩｇＧ３−ＤＨＳ（図１５Ｄ）、ＩｇＧ４（図１５Ｅ）およびＩｇＧ４−ＤＨＳ（図１５Ｆ）の、ｓｃＦｃＲｎに対する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイである。
【図１６−１】図１６Ａ〜Ｃは、ＩｇＧ２−ＤＨＳ、ＩｇＧ３−ＤＨＳ、およびＩｇＧ４−ＤＨＳのＥＬＩＳＡアッセイである。ＩｇＧバリアントの、それらの野生型ＩｇＧと比較したＦｃγＲ結合活性。４００ｎＭ、８０ｎＭ、１６ｎＭ、３．２ｎＭのＦｃγＲを、ＩｇＧバリアントを用いてアッセイした。
【図１６−２】図１６Ａ〜Ｃは、ＩｇＧ２−ＤＨＳ、ＩｇＧ３−ＤＨＳ、およびＩｇＧ４−ＤＨＳのＥＬＩＳＡアッセイである。ＩｇＧバリアントの、それらの野生型ＩｇＧと比較したＦｃγＲ結合活性。４００ｎＭ、８０ｎＭ、１６ｎＭ、３．２ｎＭのＦｃγＲを、ＩｇＧバリアントを用いてアッセイした。
【図１７】図１７は、ヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウスにおける抗体の薬物動態である。
【図１８−１】図１８は、抗体バリアントのＳＰＲ解析である。各抗体をＣＭ５チップ上に固定化し、段階的に希釈したＦｃγＲまたはＣ１ｑを３０μｌ／分で注射した。全ての実験を独立して３回繰り返し、各抗体の動態値を表１２に提示する。
【図１８−２】図１８は、抗体バリアントのＳＰＲ解析である。各抗体をＣＭ５チップ上に固定化し、段階的に希釈したＦｃγＲまたはＣ１ｑを３０μｌ／分で注射した。全ての実験を独立して３回繰り返し、各抗体の動態値を表１２に提示する。
【図１９】図１９は、ヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウスにおける抗体の薬物動態である。
【図２０】図２０は、抗体バリアントについてのリウマチ因子結合アッセイである。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
ＦｃＲｎへの改善されたｐＨ依存性結合を呈する操作された抗体Ｆｃドメインを有するポリペプチドが関与する方法および組成物が、本明細書に提供されている。一部の好ましい態様では、変異体Ｆｃドメインは、哺乳動物の対象への投与後にｉｎ  ｖｉｖｏで半減期の改善または分解の低減を示し得る。下の例に示されている通り、これらのＦｃＲｎ結合の改善は、種々の抗体の種類（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）のグリコシル化抗体または非グリコシル化抗体に存在し得る変異体Ｆｃドメインにおいて観察されている。一部の例では、非グリコシル化抗体にはいくらかのリスク（例えば、免疫原性、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける安定性が乏しいこと、または好ましくない薬物動態）が伴うので、一部の実施形態では、変異体Ｆｃドメインをグリコシル化抗体に含めることが望ましい場合がある。それにもかかわらず、非グリコシル化抗体を種々の有用なまたは治療的な手法に使用することができ、したがって、変異体Ｆｃドメインを非グリコシル化抗体に含めることによっても、利益、例えば、非グリコシル化抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期の改善をもたらすことができる。一部の実施形態では、変異体Ｆｃドメインは、酸性ｐＨではＦｃＲｎに結合し、中性ｐＨではＦｃＲｎに結合せず、また、野生型Ｆｃドメインと同等のＦｃγＲ結合能を有する。例えば、ポリペプチドは、ＦｃＲｎにｐＨ選択的に結合すると同時に、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、および／またはＦｃγＲＩＩＩへの結合に関して野生型と同等の結合能を有する変異体またはバリアントＦｃドメインを含み得る。
【００４４】
Ｉ．抗体Ｆｃドメイン
新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）は、哺乳動物における血清ＩｇＧレベルの調節において中心的な役割を果たすことが周知である（Ghetie, V., and Ward, E. S. 2000）。Ｆｃ結合ＦｃＲｎは、β２−ミクログロブリン（β２ｍ）および主要組織適合性遺伝子複合体クラスＩ（ＭＨＣクラスＩ）分子の鎖に関連する膜繋留鎖を含むヘテロ二量体である。ＩｇＧ−ＦｃＲｎ相互作用は、わずかに酸性ｐＨにおける強力なものから中性および塩基性ｐＨにおける弱いものまで変動する顕著なｐＨ依存性を示す（Rodewald,R. 1976 and Raghavan, M. et al., 1995）。一般に認められているＦｃＲｎ媒介性ＩｇＧリサイクリング機構は、以下の手順である１）ピノサイトーシスによるＩｇＧの内部移行、２）エンドソームの酸性化（初期エンドソーム：約ｐＨ６．０、後期エンドソーム：約ｐＨ４．５）およびＩｇＧとＦｃＲｎの相互作用、３）ＩｇＧのエキソサイトーシスおよびＦｃＲｎからの解離、４）エンドサイトーシスによって放出されなかったＩｇＧの再内部移行、５）リソソーム融合およびＩｇＧの分解。結果として、リサイクリングされるＩｇＧは、他の血清タンパク質と比較して有意に延長された血清中半減期を示す（Ghetie,V. et al., 1996 and Borvak, J. et al., 1998）。中性ｐＨにおいてＦｃＲｎへの有意な結合を維持するＩｇＧは、血清持続が有意に低下している（Dall'Acqua,W. F. et al., 2003）。
【００４５】
血清中半減期がより長い治療抗体は、持続的な血清中濃度、投与の頻度の減少および／または費用の低減に起因して有効性が増大する場合に有益である。血漿中半減期を延長するためにはＦｃ−ＦｃＲｎ相互作用を操作することが理にかなっていると思われるが、ＦｃＲｎのＩｇＧを輸送する役割に伴う潜在的な生物学的結果が多く周知である。特に、この機能としては、ヒト胎盤（Firan et al., 2001）および腸（Israel et al., 1997 and Dickinson et al., 1999）を通じたＩｇＧのトランスサイトーシスならびにヒト腎臓におけるＩｇＧの再吸収（Haymannet al., 2000）が挙げられる。
【００４６】
ＦｃＲｎ媒介性恒常性に基づいて、血清中半減期を増強するためのＦｃ操作は、通常、酸性ｐＨにおけるＦｃのＦｃＲｎに対する親和性を増強すること、および元のｐＨ依存的結合特徴を維持することに焦点が当てられる。Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ（ＬＳ）またはＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ（ＹＴＥ）アミノ酸置換を含有するＦｃドメイン等、ＦｃＲｎに対する多くの操作されたＦｃバリアントが開発されており、ＬＳおよびＹＴＥは、エンドソームｐＨにおいて野生型ＩｇＧ１（ＷＴ）と比較して１０〜２０倍に増強された親和性を示し、ｐＨ７．４では有意な親和性は示さず、その結果、トランスジェニックヒトＦｃＲｎ（ｈＦｃＲｎ）マウス、霊長類および／またはヒトにおいて血清中半減期の増強がもたらされる（Acqua et al., 2002; Zalevsky et al., 2010; Ko et al., 2014; Deng etal., 2010; Hinton et al., 2004 and 2006; Yeung et al., 2009 and 2010; Borrok etal., 2015; Robbie et al., 2013）。特に、「ＹＴＥ」バリアントを有する抗体がいくつかの臨床試験で評価されている。「ＹＴＥ」変異を有する抗体は、３カ月という長さの血清中半減期を有することが示されており、この特性により、投与を実質的に減少させることができ、より良好な患者のコンプライアンスおよびより良好な治療有効性が可能になる。しかし、酸性ｐＨにおけるＦｃＲｎ親和性が高いことは血清中半減期の増強と明白には相関せず、また、酸性ｐＨにおけるＦｃＲｎ結合特徴が同様にまたはより良好に改善された一部の操作されたバリアントは、予測されたｉｎ  ｖｉｖｏ半減期の増大を示すことができなかった（Borroket al., 2015、Datta-Mannan et al., 2007 and 2012, and Zheng et al., 2011）。他方では、中性ｐＨにおける抗体の親和性は酸性ｐＨにおけるものよりも良好にＰＫと相関することが示された（Cooperet al., 2014 and Wang et al., 2011）。ＦｃＲｎリサイクリング機構に基づいて、ｐＨ７．４におけるＩｇＧの親和性は抗体リサイクリングの重大な因子である。中性ｐＨにおける抗体の親和性の正確かつ的確な測定が非常に重大である。最近、ｐＨ７．４におけるＦｃＲｎに対する抗体の親和性を、非常に高いレベルの固定化ＦｃＲｎを使用し、ＳＰＲによって測定するための試みが報告された。ＹＴＥバリアントは、高密度ＦｃＲｎを用いた動態解析により、ｐＨ７．４において野生型ＩｇＧ１よりも約５７倍高い親和性を示し、これは、低密度ＦｃＲｎを用いたアッセイでは示されなかった（Walterset al., 2016）。
【００４７】
ある特定の実施形態では、ネイティブまたは野生型タンパク質と比べて改変されたタンパク質性分子を含む組成物が存在する。一部の実施形態では、このタンパク質性化合物は、アミノ酸残基が欠失されている；他の実施形態では、タンパク質性化合物のアミノ酸残基は、置き換えられている；一方、なおさらなる実施形態では、タンパク質性化合物におけるアミノ酸残基の欠失および置き換えの両方がなされている。さらに、タンパク質性化合物は、２個以上のポリペプチド実体を含むアミノ酸分子を含むことができる。本明細書において使用する場合、「タンパク質性分子」、「タンパク質性組成物」、「タンパク質性化合物」、「タンパク質性鎖」または「タンパク質性材料」は、約２００アミノ酸を超えるタンパク質もしくは遺伝子から翻訳された全長内在性配列；１００アミノ酸もしくはそれを超えるポリペプチド；および／または３〜１００アミノ酸のペプチドを一般に指すが、これらに限定されない。上述のあらゆる「タンパク質性」用語は、本明細書において互換的に使用することができる；しかし、実施形態が、ポリペプチド等、特定の種類のタンパク質性化合物に限定され得ることが特に企図される。さらに、これらの用語は、融合タンパク質またはタンパク質コンジュゲートにも同様に適用することができる。タンパク質は、２個以上のポリペプチドを含むことができる。例えば、ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合により互いに繋がれた２本の重鎖ポリペプチドおよび２本の軽鎖ポリペプチドを有する。
【００４８】
本明細書において使用する場合、タンパク質またはペプチドは、約２００アミノ酸を超えるタンパク質から、遺伝子から翻訳された全長配列まで；約１００アミノ酸を超えるポリペプチド；および／または約３〜約１００アミノ酸のペプチドを一般に指すが、これらに限定されない。便宜上、用語「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において互換的に使用される。
【００４９】
本明細書において使用する場合、「アミノ酸残基」は、当業者に公知であろういずれかのアミノ酸、アミノ酸誘導体またはアミノ酸模倣物を指す。ある特定の実施形態では、タンパク質性分子の残基は、アミノ酸残基の配列を中断するいかなる非アミノ酸残基も含まず連続的である。他の実施形態では、配列は、１個または複数の非アミノ酸部分を含むことができる。特定の実施形態では、タンパク質性分子の残基の配列は、１個または複数の非アミノ酸部分で中断されていてよい。
【００５０】
本明細書において使用する場合、「別個のＦｃドメイン」は、別のＦｃと僅か１個のアミノ酸が異なるドメインとして規定することができる。別個の抗体Ｆｃドメインまたは抗体をコードする核酸のライブラリーを作製するための方法は、本技術分野で周知である。例えば、場合によっては、Ｆｃドメインは、エラープローンＰＣＲによって増幅することができる。さらに、ある特定の事例において、複数の抗体Ｆｃドメインは、ランダム化されたひと続き（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれを超える）のアミノ酸を含むことができる。ある特定の事例において、特異的変異が、Ｆｃドメインに操作され得る。例えば、一部の態様では、抗体Ｆｃドメインにおける正常にグリコシル化された残基が変異されていてよい。さらに、ある特定の態様では、正常にグリコシル化された残基（または隣接する残基）は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれを超えるアミノ酸の挿入のための部位として使用することができる。
【００５１】
ポリペプチドは、ＦｃＲポリペプチドに結合することができる変異体またはバリアント抗体Ｆｃドメインを含み得る。一部の態様では、Ｆｃドメインは、生理的条件下でＦｃＲポリペプチドに対して特異的な親和性を有するとさらに規定することができる。例えば、Ｆｃドメインは、生理的条件下で約１０−６Ｍ〜約１０−９Ｍの間の平衡解離定数を有し得る。さらに、一部の態様では、非グリコシル化Ｆｃドメインは、ヒト野生型配列等の野生型配列と比べて１つまたは複数のアミノ酸置換または挿入を含むと規定することができる。Ｆｃドメインはグリコシル化または非グリコシル化され得る。
【００５２】
かかるポリペプチドを調製する手段は、参照により本明細書に組み込むＰＣＴ公開ＷＯ２００８／１３７４７５に記される手段を含む。あるいは、例えば、公知のＦｃバックグラウンドに選択されたアミノ酸置換または挿入を導入することによる等、遺伝子工学技法によって直接的にかかるポリペプチドを調製することができ、挿入または置換は、上に記す通り、非グリコシル化Ｆｃ領域に改善されたＦｃＲ結合能をもたらす。一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、１種または複数の特異的なＦｃ受容体に結合するように操作されている。その上またはそれに代えて、Ｆｃドメインは、１種または複数の特異的なＦｃ受容体に特異的に結合しないように、操作され得る。
【００５３】
一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒトＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩｂ、ＦｃαＲＩ等のＦｃＲに対する、またはＣ１ｑに対する特異的な結合親和性を含む。一部の実施形態では、抗体は、野生型抗体についてのＦｃＲ結合と、例えば、対応するＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体と比較して同様であるか、基本的に同じであるか、または同じであるＦｃＲ結合を呈するグリコシル化抗体である。一部の実施形態では、抗体は、グリコシル化されている。一部の実施形態では、抗体は、非グリコシル化抗体である。抗体Ｆｃまたは他の結合タンパク質の結合親和性は、例えば、Munson and Pollard (1980)のスキャッチャード解析によって決定することができる。あるいは、結合親和性は、表面プラズモン共鳴またはタンパク質：タンパク質相互作用の動態および平衡定数を決定するための他のいずれかの周知の方法によって決定することができる。単離されたＩｇＧバリアントを以下の表１に提示する。種々の実施形態では、変異をＩｇＧ１  Ｆｃドメイン（例えば、配列番号５〜８）に導入することができる、または、所望の通りＩｇＧ２  Ｆｃドメイン（例えば、配列番号９）、ＩｇＧ３  Ｆｃドメイン（例えば、配列番号１０）、もしくはＩｇＧ４  Ｆｃドメイン（例えば、配列番号１１）に対応する変異を生じさせることができる。
表１：単離されたＩｇＧバリアント（配列ナンバリングは、Ｋａｂａｔに基づき、変異は以下に指定されている）
ＥＤＨＳ（Ｖ２６４Ｅ、Ｌ３０９Ｄ、Ｑ３１１Ｈ、Ｎ４３４Ｓ；配列番号５）、
ＥＤＨＹ（Ｖ２６４Ｅ、Ｌ３０９Ｄ、Ｑ３１１Ｈ、Ｎ４３４Ｙ；配列番号６）、
ＤＨＳ（Ｌ３０９Ｄ、Ｑ３１１Ｈ、Ｎ４３４Ｓ；配列番号７）、
ＤＨＹ（Ｌ３０９Ｄ、Ｑ３１１Ｈ、Ｎ４３４Ｙ；配列番号８）、
ＩｇＧ２−ＤＨＳ（Ｖ３０９Ｄ、Ｑ３１１Ｈ、Ｎ４３４Ｓ；配列番号９）、
ＩｇＧ３−ＤＨＳ（Ｌ３０９Ｄ、Ｑ３１１Ｈ、Ｎ４３４Ｓ；配列番号１０）、
ＩｇＧ４−ＤＨＳ（Ｌ３０９Ｄ、Ｑ３１１Ｈ、Ｎ４３４Ｓ；配列番号１１）
【００５４】
本明細書において使用される「ポジション」とは、タンパク質の配列中の位置を意味する。ポジションは、連続的に、または確立されたフォーマット、例えば、抗体ナンバリングのためのＥＵ指標に従ってナンバリングすることができる。
【００５５】
本発明に記す全ポジションに関して、ナンバリングは、ＥＵ指標に従う。「ＥＵ指標」または「ＫａｂａｔにおけるＥＵ指標」または「ＥＵナンバリングスキーム」は、ＥＵ抗体のナンバリングを指す（Edelman et al., 1969; Kabat et al., 1991;どちらもその全体を参照により本明細書に組み込む）。
【００５６】
ある特定の実施形態では、少なくとも１種のＦｃポリペプチドタンパク質性分子のサイズは、およそまたは少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２７５、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００またはそれを超えるアミノ分子残基、およびそこから導くことができるいずれかの範囲を含み得るが、これらに限定されない。化合物は、配列番号１〜４（ヒトＩｇＧ１〜４  Ｆｃポリペプチド）または配列番号５〜１１由来の上述の数の連続アミノ酸を含み得、これらは、野生型ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインに対するパーセント配列同一性または相同性（例えば、配列番号１〜４のいずれか１つに対するパーセント配列同一性）を有するとさらに認定することができる。
【００５７】
Ａ．改変されたタンパク質およびポリペプチド
一部の実施形態は、改変されたタンパク質およびポリペプチド、特に、無改変バージョンに匹敵する少なくとも１種の機能活性を示す改変されたタンパク質またはポリペプチドに関係し、さらに、改変されたタンパク質またはポリペプチドは、Ｂ細胞活性化を抑制すること、産生がより容易もしくはより安価であること、より少ない副作用を誘発すること、および／またはより優れたまたはより長い有効性もしくは生物学的利用能を有すること等、無改変バージョンを上回る追加的な利点を保有する。したがって、本願が、「改変されたタンパク質」または「改変されたポリペプチド」の機能または活性について言う場合、当業者であれば、これが、例えば、１）無改変タンパク質またはポリペプチドと同じ活性のうち少なくとも１種を実行する、または同じ特異性のうち少なくとも１種を有するが、別の活性または特異性の異なるレベルを有し得；２）無改変タンパク質またはポリペプチドを上回る追加的な利点を保有するタンパク質またはポリペプチドを含むことを理解するであろう。活性の決定は、特に、タンパク質の活性に関する、当業者によく知られたアッセイを使用して達成することができ、比較目的で、例えば、改変または無改変タンパク質またはポリペプチドのいずれかのネイティブおよび／または組換えバージョンの使用を含めることができる。具体的には、「改変されたタンパク質」に関係する実施形態を、「改変されたポリペプチド」に関して実行することができ、逆もまた同じであることが企図される。本明細書に記す改変されたタンパク質およびポリペプチドに加えて、実施形態には、特に参照により本明細書に組み込むＰＣＴ公開ＷＯ２００８／１３７４７５に記載されているドメイン、ポリペプチド、およびタンパク質が関与し得る。
【００５８】
改変されたタンパク質は、アミノ酸の欠失および／または置換を保有することができ；よって、欠失を有するタンパク質、置換を有するタンパク質ならびに欠失および置換を有するタンパク質は、改変されたタンパク質である。一部の実施形態では、これらの改変されたタンパク質は、例えば、融合タンパク質またはリンカーを有するタンパク質による等、挿入または付加されたアミノ酸をさらに含むことができる。これは、標的化ペプチドもしくはポリペプチドまたは単に単一残基の挿入を含むことができる。融合タンパク質と呼ばれる末端付加については、下に記す。
【００５９】
「改変された欠失されたタンパク質」は、ネイティブタンパク質の１個または複数の残基を欠くが、ネイティブタンパク質の特異性および／または活性を保有する。「改変された欠失されたタンパク質」は、低下した免疫原性または抗原性を有することもできる。改変された欠失されたタンパク質の例は、少なくとも１種の抗原性領域（すなわち、改変されたタンパク質を投与され得る生物の種類等、特定の生物において抗原性であると決定されたタンパク質の領域）からアミノ酸残基を欠失したタンパク質である。
【００６０】
置換または置き換えバリアントは典型的には、タンパク質内の１個または複数の部位においてあるアミノ酸から別のアミノ酸への交換を含有し、ポリペプチドの１種または複数の特性、特に、そのエフェクター機能および／またはバイオアベイラビリティをモジュレートするように設計することができる。置換は、保存的であってもそうでなくてもよい、つまり、あるアミノ酸が、同様の形状および電荷のアミノ酸に置き換えられる。保存的置換は、本技術分野で周知であり、例えば、次の変化を含む：アラニンからセリン；アルギニンからリシン；アスパラギンからグルタミンまたはヒスチジン；アスパラギン酸からグルタミン酸；システインからセリン；グルタミンからアスパラギン；グルタミン酸からアスパラギン酸；グリシンからプロリン；ヒスチジンからアスパラギンまたはグルタミン；イソロイシンからロイシンまたはバリン；ロイシンからバリンまたはイソロイシン；リシンからアルギニン；メチオニンからロイシンまたはイソロイシン；フェニルアラニンからチロシン、ロイシンまたはメチオニン；セリンからスレオニン；スレオニンからセリン；トリプトファンからチロシン；チロシンからトリプトファンまたはフェニルアラニン；およびバリンからイソロイシンまたはロイシン。
【００６１】
用語「生物学的に機能的等価」は、本技術分野で十分に理解されており、本明細書で詳細にさらに規定されている。したがって、タンパク質の生物学的活性が維持されるのであれば、ネイティブポリペプチドのアミノ酸と同一または機能的に等価なアミノ酸の約７０％〜約８０％の間または約８１％〜約９０％の間またはさらには約９１％〜約９９％の間を有する配列が含まれる。改変されたタンパク質は、そのネイティブ対応物と生物学的に機能的に等価であり得る。
【００６２】
配列が、タンパク質発現が関係する生物学的タンパク質活性の維持を含む、上に表記されている基準を満たす限りにおいて、アミノ酸および核酸配列が、追加的なＮもしくはＣ末端アミノ酸または５’もしくは３’配列等、追加的な残基を含み、依然として基本的に、本明細書に開示されている配列の１種に表記される通りのものであることも理解されるであろう。末端配列の付加は、特に、例えば、コード領域の５’もしくは３’部分のいずれかに隣接する様々な非コード配列を含むことができる、または様々な内部配列、すなわち、遺伝子内で生じることが公知のイントロンを含むことができる、核酸配列に適用される。
【００６３】
次に、等価なまたはさらには改善された第二世代分子を作製するためのタンパク質のアミノ酸の変化に基づく記述を示す。例えば、ある特定のアミノ酸は、例えば、基質分子への結合部位等の構造との相互作用的結合能の認識できる損失を伴いまたは伴うことなく、タンパク質構造における他のアミノ酸に代えて置換することができる。タンパク質の生物学的機能活性を規定するのは、そのタンパク質の相互作用的能力および性質であるため、タンパク質配列およびその根底にあるＤＮＡコード配列においてある特定のアミノ酸置換をなすことができ、そうであるにもかかわらず、同様の特性を有するタンパク質を産生することができる。よって、下に記す通り、その生物学的有用性または活性の認識できる損失を伴うことなく、遺伝子のＤＮＡ配列において様々な変化をなすことができることが企図される。次の「相同性基準」のうち１つが満たされる場合、タンパク質性分子は、第２のタンパク質性分子と「相同性」を有する、またはそれと「相同」であると考慮される：１）タンパク質性分子の少なくとも３０％が、第２のタンパク質性分子と同じポジションにおいて配列同一性を有する；２）第２のタンパク質性分子と同じポジションにおいてある程度の配列同一性があり、非同一残基において、その少なくとも３０％が、第２のタンパク質性分子に対して、本明細書に記載されている保存的な差である；または３）タンパク質性分子の少なくとも３０％が、第２のタンパク質性分子と配列同一性を有するが、同一残基の間に非同一残基のギャップがあり得る。本明細書において使用する場合、用語「相同」は、分子全体の代わりに、タンパク質性分子の領域に等しく適用することができる。用語「相同性」または「相同」が、数、例えば、「５０％相同性」または「５０％相同」によって認定される場合、１）、２）および３）に関する相同性基準は、「少なくとも３０％」から「少なくとも５０％」に調整される。よって、２種のタンパク質性分子またはタンパク質性分子の部分の間に、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれを超える相同性が存在し得ることが企図される。
【００６４】
あるいは、改変されたポリペプチドは、本明細書に記載されている変異体またはバリアントＦｃドメインまたは配列（例えば、配列番号５〜１１）のいずれかを含む、無改変ポリペプチドまたは本明細書に開示されているいずれかのポリペプチド配列に対し、ある特定のパーセンテージの同一性を有すると特徴付けることができる。パーセンテージ同一性は、２種のタンパク質性分子またはタンパク質性分子の部分の間で、多くてもまたは少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％（またはそこから導くことができるいずれかの範囲）であり得る。上記の同一性のパーセンテージが、ポリペプチドの無改変領域と比較して、ポリペプチドの特定の領域に関係し得ることが企図される。例えば、ポリペプチドは、同じ種由来の無改変または変異体Ｆｃドメインに対する改変されたまたは変異体Ｆｃドメインのアミノ酸配列の同一性に基づいて特徴付けることができる改変されたまたは変異体Ｆｃドメインを含み得る。例えば、無改変Ｆｃドメインに対して９０％同一性を有すると特徴付けされた改変されたまたは変異体ヒトＦｃドメインは、そのドメインのアミノ酸の９０％が無改変ヒトＦｃドメイン（例えば、配列番号１〜４）のアミノ酸と同一であることを意味する。
【００６５】
かかる変化を生じる際に、アミノ酸の疎水性親水性指標（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｉｎｄｅｘ）を考慮することができる。タンパク質における相互作用的生物学的機能の付与における疎水性親水性アミノ酸指標の重要性は、本技術分野で一般に理解される（KyteおよびDoolittle、１９８２年）。アミノ酸の相対的疎水性親水性特徴が、その結果得られるタンパク質の二次構造に寄与し、続いてこれが、他の分子、例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原等とのタンパク質の相互作用を規定することが受け入れられる。
【００６６】
本技術分野において、同様のアミノ酸の置換を親水性に基づいて有効になすことができることも理解される。参照により本明細書に組み込む米国特許第４，５５４，１０１号は、その隣接アミノ酸の親水性によって支配されるタンパク質の最大局所的平均親水性が、タンパク質の生物学的特性と相関することを記述する。米国特許第４，５５４，１０１号に詳述される通り、次の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられた：アルギニン（＋３．０）；リシン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。あるアミノ酸を、同様の親水性値を有する別のアミノ酸に代えて置換し、生物学的に等価かつ免疫学的に等価なタンパク質を依然として産生することができることが理解される。かかる変化において、その親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるものが特に好ましく、±０．５以内であるものがさらにより特に好ましい。
【００６７】
上に概要を述べる通り、アミノ酸置換は一般に、アミノ酸側鎖置換基、例えば、その疎水性、親水性、電荷、サイズ等の相対的類似性に基づく。様々な前述の特徴を考慮に入れる例示的な置換は、当業者に周知であり、次のものを含む：アルギニンおよびリシン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシンおよびイソロイシン。
【００６８】
Ｂ．異種領域により改変された抗体およびタンパク質性化合物
Ｆｃドメインが単離されると、分子を少なくとも１種の作用物質に連結して、この分子の有用性を増強するためのコンジュゲートを形成することが望ましいことがある。例えば、診断または治療用作用物質としてのＦｃドメインまたは抗体分子の有効性を増加させるために、従来、少なくとも１種の所望の分子または部分を連結または共有結合または複合体形成させる。かかる分子または部分は、少なくとも１種のエフェクターまたはレポーター分子であってよいがこれらに限定されない。エフェクター分子は、所望の活性、例えば、細胞傷害活性を有する分子を含む。抗体に取り付けられたエフェクター分子の非限定例として、毒素、抗腫瘍剤、治療用酵素、放射標識ヌクレオチド、抗ウイルス剤、キレート剤、サイトカイン、増殖因子およびオリゴまたはポリヌクレオチドが挙げられる。対照的に、レポーター分子は、アッセイを使用して検出され得るいずれかの部分として規定される。抗体にコンジュゲートされたレポーター分子の非限定例として、酵素、放射標識、ハプテン、蛍光標識、リン光分子、化学発光分子、発色団、発光分子、光親和性分子、着色粒子またはビオチン等のリガンドが挙げられる。別のかかる例は、細胞傷害性または抗細胞剤に連結された抗体を含むコンジュゲートの形成であり、「免疫毒素」と命名することができる。かかる分子を標識するための技法は、当業者に公知であり、本明細書に上述されている。
【００６９】
次いで、本発明に従って調製されたＦｃドメイン等、標識されたタンパク質を、例えば、タンパク質（単数または複数）、ポリペプチド（単数または複数）またはペプチド（単数または複数）等、生物学的構成成分を結合、精製、除去、定量化および／または他の仕方で一般に検出するための免疫検出方法において用いることもできる。一部の免疫検出方法は、いくつか挙げると、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫放射線アッセイ、フルオロイムノアッセイ、化学発光アッセイ、生物発光アッセイおよびウエスタンブロットを含む。様々な有用な免疫検出方法のステップは、例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込むDoolittleおよびBen-Zeev、１９９９年；GulbisおよびGaland、１９９３年；ならびにDe  Jagerら、１９９３年等、科学文献に記載されている。
【００７０】
抗体を含むＦｃドメイン分子は、例えば、免疫組織化学検査（ＩＨＣ）による研究のために調製された新鮮凍結したおよび／またはホルマリン固定し、パラフィン包埋した組織ブロックの両方と併せて使用することができる。このような粒子状検体から組織ブロックを調製する方法は、様々な予後因子の以前のＩＨＣ研究において首尾よく使用された、および／または当業者に周知である（Abbondanzoら、１９９０年）。
【００７１】
一部の実施形態は、２種以上の天然起源またはネイティブポリペプチドまたはタンパク質由来のアミノ酸配列を含むことができるＦｃポリペプチドタンパク質性化合物に関係する。上に記す実施形態は、本セクションへの適用が企図され、逆もまた同じである。例えば、改変された抗体は、抗原結合ドメインを有する改変されたＦｃドメインを含有する抗体である。さらに、抗体は、２本の重鎖のそれぞれにおける異なる領域等、２個の異なる抗原結合領域を有することができる。それに代えてまたはその上、一部の実施形態では、複数の異種ペプチドおよび／またはポリペプチドを含むポリペプチドが存在する（「異種」は、これらが同じポリペプチドに由来しないことを意味する）。タンパク質性化合物または分子は、例えば、抗体に由来しないタンパク質結合領域を有する改変されたＦｃドメインを含むことができる。一部の実施形態では、細胞表面受容体に結合するタンパク質結合領域を有する改変されたＦｃドメインを含むポリペプチドが存在する。複数の機能ドメインを含むこれらのタンパク質性分子は、互いに化学的にコンジュゲートされた２個もしくはそれを超えるドメインであり得る、または同じ核酸分子によってコードされた２個もしくはそれを超えるポリペプチドの融合タンパク質であり得る。タンパク質またはポリペプチドが、２個またはそれを超える異種ポリペプチドの全体または部分を含むことができることが企図される。
【００７２】
よって、マルチポリペプチドタンパク質性化合物は、第１のポリペプチドの全体または部分と、第２のポリペプチド、第３のポリペプチド、第４のポリペプチド、第５のポリペプチド、第６のポリペプチド、第７のポリペプチド、第８の（eight）ポリペプチド、第９のポリペプチド、第１０のポリペプチドまたはさらに高次のポリペプチドの全体または部分とで構成され得る。
【００７３】
選択的に切断可能なリンカー、合成リンカーまたは他のアミノ酸配列等、アミノ酸を使用して、タンパク質性部分を分離することができる。
【００７４】
抗体の抗原結合ドメインまたは領域および変異体またはバリアントＦｃドメインを有するポリペプチドまたはタンパク質（抗体を含む）は、次の標的リストに属するタンパク質、サブユニット、ドメイン、モチーフ、および／またはエピトープが挙げられるがこれらに限定されない、いずれかの抗原またはエピトープに対して使用することができる：１７−ＩＡ、４−１ＢＢ、４Ｄｃ、６−ケト−ＰＧＦ１ａ、８−イソ−ＰＧＦ２ａ、８−オキソ−ｄＧ、Ａ１アデノシン受容体、Ａ３３、ＡＣＥ、ＡＣＥ−２、アクチビン、アクチビンＡ、アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＲＩＡ、アクチビンＲＩＡ  ＡＬＫ−２、アクチビンＲＩＢ  ＡＬＫ−４、アクチビンＲＩＩＡ、アクチビンＲＩＩＢ、ＡＤＡＭ、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭ１５、ＡＤＡＭ１７／ＴＡＣＥ、ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭＴＳ、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴＳ５、アドレシン、ａＦＧＦ、ＡＬＣＡＭ、ＡＬＫ、ＡＬＫ−１、ＡＬＫ−７、アルファ−１−アンチトリプシン、アルファ−Ｖ／ベータ−１  アンタゴニスト、ＡＮＧ、Ａｎｇ、ＡＰＡＦ−１、ＡＰＥ、ＡＰＪ、ＡＰＰ、ＡＰＲＩＬ、ＡＲ、ＡＲＣ、ＡＲＴ、アルテミン、抗Ｉｄ、ＡＳＰＡＲＴＩＣ、心房性ナトリウム利尿因子、ａｖ／ｂ３インテグリン、Ａｘｌ、ｂ２Ｍ、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−Ｈ、Ｂリンパ球刺激因子（ＢｌｙＳ）、ＢＡＣＥ、ＢＡＣＥ−１、Ｂａｄ、ＢＡＦＦ、ＢＡＦＦ−Ｒ、Ｂａｇ−１、ＢＡＫ、Ｂａｘ、ＢＣＡ−１、ＢＣＡＭ、Ｂｃｌ、ＢＣＭＡ、ＢＤＮＦ、ｂ−ＥＣＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＩＤ、Ｂｉｋ、ＢＩＭ、ＢＬＣ、ＢＬ−ＣＡＭ、ＢＬＫ、ＢＭＰ、ＢＭＰ−２  ＢＭＰ−２ａ、ＢＭＰ−３オステオゲニン、ＢＭＰ−４  ＢＭＰ−２ｂ、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６  Ｖｇｒ−１、ＢＭＰ−７（ＯＰ−１）、ＢＭＰ−８（ＢＭＰ−８ａ、ＯＰ−２）、ＢＭＰＲ、ＢＭＰＲ−ＩＡ（ＡＬＫ−３）、ＢＭＰＲ−ＩＢ（ＡＬＫ−６）、ＢＲＫ−２、ＲＰＫ−１、ＢＭＰＲ−ＩＩ（ＢＲＫ−３）、ＢＭＰｓ、ｂ−ＮＧＦ、ＢＯＫ、ボンベシン、骨由来神経栄養因子、ＢＰＤＥ、ＢＰＤＥ−ＤＮＡ、ＢＴＣ、補体因子３（Ｃ３）、Ｃ３ａ、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ５ａ、Ｃ１０、ＣＡ１２５、ＣＡＤ−８、カルシトニン、ｃＡＭＰ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、癌関連抗原、カテプシンＡ、カテプシンＢ、カテプシンＣ／ＤＰＰＩ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＨ、カテプシンＬ、カテプシンＯ、カテプシンＳ、カテプシンＶ、カテプシンＸ／ＺＩＰ、ＣＢＬ、ＣＣＩ、ＣＣＫ２、ＣＣＬ、ＣＣＬ１、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９／１０、ＣＣＲ、ＣＣＲ１、ＣＣＲ１０、ＣＣＲ１０、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ３２、ＣＤ３３（ｐ６７タンパク質）、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４９ａ、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ＣＤ６４、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ７４、ＣＤ８０（Ｂ７−１）、ＣＤ８９、ＣＤ９５、ＣＤ１２３、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、ＣＤ１４８、ＣＤ１５２、ＣＤ１６４、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＦＴＲ、ｃＧＭＰ、ＣＩＮＣ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ毒素、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ毒素、ＣＫｂ８−１、ＣＬＣ、ＣＭＶ、ＣＭＶ  ＵＬ、ＣＮＴＦ、ＣＮＴＮ−１、ＣＯＸ、Ｃ−Ｒｅｔ、ＣＲＧ−２、ＣＴ−１、ＣＴＡＣＫ、ＣＴＧＦ、ＣＴＬＡ−４、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＸＣＬ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＲ、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６、サイトケラチン腫瘍関連抗原、ＤＡＮ、ＤＣＣ、ＤｃＲ３、ＤＣ−ＳＩＧＮ、崩壊促進因子、ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−１）、Ｄｈｈ、ジゴキシン、ＤＮＡＭ−１、ＤＮａｓｅ、Ｄｐｐ、ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６、Ｄｔｋ、ＥＣＡＤ、ＥＤＡ、ＥＤＡ−Ａ１、ＥＤＡ−Ａ２、ＥＤＡＲ、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ−１）、ＥＭＡ、ＥＭＭＰＲＩＮ、ＥＮＡ、エンドセリン受容体、エンケファリナーゼ、ｅＮＯＳ、Ｅｏｔ、エオタキシン１、ＥｐＣＡＭ、エフリンＢ２／ＥｐｈＢ４、ＥＰＯ、ＥＲＣＣ、Ｅ−セレクチン、ＥＴ−１、第ＩＩａ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩｃ因子、第ＩＸ因子、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、Ｆａｓ、ＦｃＲ１、ＦＥＮ−１、フェリチン、ＦＧＦ、ＦＧＦ−１９、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ−８、ＦＧＦＲ、ＦＧＦＲ−３、フィブリン、ＦＬ、ＦＬＩＰ、Ｆｌｔ−３、Ｆｌｔ−４、卵胞刺激ホルモン、フラクタルカイン、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、ＦＺＤ１０、Ｇ２５０、Ｇａｓ  ６、ＧＣＰ−２、ＧＣＳＦ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＤＦ、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−３（Ｖｇｒ−２）、ＧＤＦ−５（ＢＭＰ−１４、ＣＤＭＰ−１）、ＧＤＦ−６（ＢＭＰ−１３、ＣＤＭＰ−２）、ＧＤＦ−７（ＢＭＰ−１２、ＣＤＭＰ−３）、ＧＤＦ−８（ミオスタチン）、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１５（ＭＩＣ−１）、ＧＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＧＦＡＰ、ＧＦＲａ−１、ＧＦＲ−アルファ１、ＧＦＲ−アルファ２、ＧＦＲ−アルファ３、ＧＩＴＲ、グルカゴン、Ｇｌｕｔ４、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ（ＧＰ  ＩＩｂ／ＩＩＩａ）、ＧＭ−ＣＳＦ、ｇｐ１３０、ｇｐ７２、ＧＲＯ、成長ホルモン放出因子、ハプテン（ＮＰ−ｃａｐまたはＮＩＰ−ｃａｐ）、ＨＢ−ＥＧＦ、ＨＣＣ、ＨＣＭＶ  ｇＢ  エンベロープ糖タンパク質、ＨＣＭＶ）ｇＨエンベロープ糖タンパク質、ＨＣＭＶ  ＵＬ��造血性増殖因子（ＨＧＦ）、Ｈｅｐ  Ｂ  ｇｐ１２０、ヘパラナーゼ、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（ＥｒｂＢ−２）、Ｈｅｒ３（ＥｒｂＢ−３）、Ｈｅｒ４（ＥｒｂＢ−４）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ｇＢ糖タンパク質、ＨＳＶ  ｇＤ糖タンパク質、ＨＧＦＡ、高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷ−ＭＭ）、ＨＩＶ  ｇｐ１２０、ＨＩＶ  ＩＩＩＢ  ｇｐ１２０  Ｖ３  ループ、ＨＬＡ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＭ１．２４、ＨＭＦＧ  ＰＥＭ、ＨＲＧ、Ｈｒｋ、ヒト心筋ミオシン、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、ＨＶＥＭ、Ｉ−３０９、ＩＡＰ、ＩＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−３、ＩＣＥ、ＩＣＯＳ、ＩＦＮｇ、Ｉｇ、ＩｇＡ受容体、ＩｇＥ、ＩＧＦ、ＩＧＦ結合タンパク質、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＧＦＢＰ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＬ、ＩＬ−１、ＩＬ−１Ｒ、ＩＬ−２、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−４、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−５、ＩＬ−５Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−１８Ｒ、ＩＬ−２３、インターフェロン（ＩＮＦ）−アルファ、ＩＮＦ−ベータ、ＩＮＦ−ガンマ、インヒビン、ｉＮＯＳ、インスリンＡ−鎖、インスリンＢ−鎖、インスリン様増殖因子１、インテグリンアルファ２、インテグリンアルファ３、インテグリンアルファ４、インテグリンアルファ４／ベータ１、インテグリンアルファ４／ベータ７、インテグリンアルファ５（アルファＶ）、インテグリンアルファ５／ベータ１、インテグリンアルファ５／ベータ３、インテグリンアルファ６、インテグリンベータ１、インテグリンベータ２、インターフェロンガンマ、ＩＰ−１０、Ｉ−ＴＡＣ、ＪＥ、カリクレイン２、カリクレイン５、カリクレイン６、カリクレイン１１、カリクレイン１２、カリクレイン１４、カリクレイン１５、カリクレインＬ１、カリクレインＬ２、カリクレインＬ３、カリクレインＬ４、ＫＣ、ＫＤＲ、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、ラミニン５、ＬＡＭＰ、ＬＡＰ、ＬＡＰ（ＴＧＦ−１）、潜在型ＴＧＦ−１、潜在型ＴＧＦ−１  ｂｐ１、ＬＢＰ、ＬＤＧＦ、ＬＥＣＴ２、レフティー、ルイス−Ｙ抗原、ルイス−Ｙ関連抗原、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−３、Ｌｆｏ、ＬＩＦ、ＬＩＧＨＴ、リポタンパク質、ＬＩＸ、ＬＫＮ、Ｌｐｔｎ、Ｌ−セレクチン、ＬＴ−ａ、ＬＴ−ｂ、ＬＴＢ４、ＬＴＢＰ−１、肺サーファクタント、黄体形成ホルモン、リンホトキシンベータ受容体、Ｍａｃ−１、ＭＡｄＣＡＭ、ＭＡＧ、ＭＡＰ２、ＭＡＲＣ、ＭＣＡＭ、ＭＣＡＭ、ＭＣＫ−２、ＭＣＰ、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＤＣ、Ｍｅｒ、メタロプロテアーゼ、ＭＧＤＦ受容体、ＭＧＭＴ、ＭＨＣ（ＨＬＡ−ＤＲ）、ＭＩＦ、ＭＩＧ、ＭＩＰ、ＭＩＰ−１−アルファ、ＭＫ、ＭＭＡＣ１、ＭＭＰ、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−１０、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１４、ＭＭＰ−１５、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−２４、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＰＩＦ、Ｍｐｏ、ＭＳＫ、ＭＳＰ、ムチン（Ｍｕｃ１）、ＭＵＣ１８、ミュラー管阻害物質、Ｍｕｇ、ＭｕＳＫ、ＮＡＩＰ、ＮＡＰ、ＮＣＡＤ、Ｎ−カドヘリン、ＮＣＡ９０、ＮＣＡＭ、ＮＣＡＭ、ネプリライシン、ニューロトロフィン−３、−４、または−６、ニュールツリン、神経増殖因子（ＮＧＦ）、ＮＧＦＲ、ＮＧＦ−ベータ、ｎＮＯＳ、ＮＯ、ＮＯＳ、Ｎｐｎ、ＮＲＧ−３、ＮＴ、ＮＴＮ、ＯＢ、ＯＧＧ１、ＯＰＧ、ＯＰＮ、ＯＳＭ、ＯＸ４０Ｌ、ＯＸ４０Ｒ、ｐ１５０、ｐ９５、ＰＡＤＰｒ、副甲状腺ホルモン、ＰＡＲＣ、ＰＡＲＰ、ＰＢＲ、ＰＢＳＦ、ＰＣＡＤ、Ｐ−カドヘリン、ＰＣＮＡ、ＰＤＧＦ、ＰＤＧＦ、ＰＤＫ−１、ＰＥＣＡＭ、ＰＥＭ、ＰＦ４、ＰＧＥ、ＰＧＦ、ＰＧＩ２、ＰＧＪ２、ＰＩＮ、ＰＬＡ２、胎盤アルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）、ＰＩＧＦ、ＰＬＰ、ＰＰ１４、プロインスリン、プロレラキシン、プロテインＣ、ＰＳ、ＰＳＡ、ＰＳＣＡ、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＰＴＥＮ、ＰＴＨｒｐ、Ｐｔｋ、ＰＴＮ、Ｒ５１、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫＬ、ＲＡＮＴＥＳ、ＲＡＮＴＥＳ、リラキシンＡ−鎖、リラキシンＢ−鎖、レニン、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆ、ＲＳＶ  Ｆｇｐ、Ｒｅｔ、リウマチ因子、ＲＬＩＰ７６、ＲＰＡ２、ＲＳＫ、Ｓ１００、ＳＣＦ／ＫＬ、ＳＤＦ−１、ＳＥＲＩＮＥ、血清アルブミン、ｓＦＲＰ−３、Ｓｈｈ、ＳＩＧＩＲＲ、ＳＫ−１、ＳＬＡＭ、ＳＬＰＩ、ＳＭＡＣ、ＳＭＤＦ、ＳＭＯＨ、ＳＯＤ、ＳＰＡＲＣ、Ｓｔａｔ、ＳＴＥＡＰ、ＳＴＥＡＰ−ＩＩ、ＴＡＣＥ、ＴＡＣＩ、ＴＡＧ−７２（腫瘍関連糖タンパク質−７２）、ＴＡＲＣ、ＴＣＡ−３、Ｔ細胞受容体（例えば、Ｔ細胞受容体  アルファ／ベータ）、ＴｄＴ、ＴＥＣＫ、ＴＥＭ１、ＴＥＭ５、ＴＥＭ７、ＴＥＭ８、ＴＥＲＴ、精巣のＰＬＡＰ様アルカリホスファターゼ、ＴｆＲ、ＴＧＦ、ＴＧＦ−アルファ、ＴＧＦ−ベータ、ＴＧＦ−ベータＰａｎ特異的、ＴＧＦ−ベータＲＩ（ＡＬＫ−５）、ＴＧＦ−ベータＲＩＩ、ＴＧＦ−ベータＲＩＩｂ、ＴＧＦ−ベータＲＩＩＩ、ＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２、ＴＧＦ−ベータ３、ＴＧＦ−ベータ４、ＴＧＦ−ベータ５、トロンビン、胸腺Ｃｋ−１、甲状腺刺激ホルモン、Ｔｉｅ、ＴＩＭＰ、ＴＩＱ、組織因子、ＴＭＥＦＦ２、Ｔｍｐｏ、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＮＦ、ＴＮＦ−アルファ、ＴＮＦ−アルファベータ、ＴＮＦ−ベータ２、ＴＮＦｃ、ＴＮＦ−ＲＩ、ＴＮＦ−ＲＩＩ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ（ＴＲＡＩＬ  Ｒ１  Ａｐｏ−２、ＤＲ４）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ（ＴＲＡＩＬ  Ｒ２  ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＩＣＫ−２Ａ、ＴＲＩＣＫ−Ｂ）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ（ＴＲＡＩＬ  Ｒ３  ＤｃＲ１
、ＬＩＴ、ＴＲＩＤ）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ（ＴＲＡＩＬ  Ｒ４  ＤｃＲ２、ＴＲＵＮＤＤ）、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ（ＲＡＮＫ  ＯＤＦ  Ｒ、ＴＲＡＮＣＥ  Ｒ）、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ（ＯＰＧ  ＯＣＩＦ、ＴＲ１）、ＴＮＦＲＳＦ１２（ＴＷＥＡＫ  Ｒ  ＦＮ１４）、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ（ＴＡＣＩ）、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ（ＢＡＦＦ  Ｒ）、ＴＮＦＲＳＦ１４（ＨＶＥＭ  ＡＴＡＲ、ＨｖｅＡ、ＬＩＧＨＴ  Ｒ、ＴＲ２）、ＴＮＦＲＳＦ１６（ＮＧＦＲ  ｐ７５ＮＴＲ）、ＴＮＦＲＳＦ１７（ＢＣＭＡ）、ＴＮＦＲＳＦ１８（ＧＩＴＲ  ＡＩＴＲ）、ＴＮＦＲＳＦ１９（ＴＲＯＹ  ＴＡＪ、ＴＲＡＤＥ）、ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ（ＲＥＬＴ）、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ（ＴＮＦ  ＲＩ  ＣＤ１２０ａ、ｐ５５−６０）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ（ＴＮＦ  ＲＩＩ  ＣＤ１２０ｂ、ｐ７５−８０）、ＴＮＦＲＳＦ２６（ＴＮＦＲＨ３）、ＴＮＦＲＳＦ３（ＬＴｂＲ  ＴＮＦ  ＲＩＩＩ、ＴＮＦＣ  Ｒ）、ＴＮＦＲＳＦ４（ＯＸ４０  ＡＣＴ３５、ＴＸＧＰ１  Ｒ）、ＴＮＦＲＳＦ５（ＣＤ４０  ｐ５０）、ＴＮＦＲＳＦ６（Ｆａｓ  Ａｐｏ−１、ＡＰＴ１、ＣＤ９５）、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ（ＤｃＲ３  Ｍ６８、ＴＲ６）、ＴＮＦＲＳＦ７（ＣＤ２７）、ＴＮＦＲＳＦ８（ＣＤ３０）、ＴＮＦＲＳＦ９（４−１ＢＢ  ＣＤ１３７、ＩＬＡ）、ＴＮＦＲＳＦ２１（ＤＲ６）、ＴＮＦＲＳＦ２２（ＤｃＴＲＡＩＬ  Ｒ２  ＴＮＦＲＨ２）、ＴＮＦＲＳＴ２３（ＤｃＴＲＡＩＬ  Ｒ１  ＴＮＦＲＨ１）、ＴＮＦＲＳＦ２５（ＤＲ３  Ａｐｏ−３、ＬＡＲＤ、ＴＲ−３、ＴＲＡＭＰ、ＷＳＬ−１）、ＴＮＦＳＦ１０（ＴＲＡＩＬ  Ａｐｏ−２リガンド、ＴＬ２）、ＴＮＦＳＦ１１（ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫリガンド  ＯＤＦ、ＯＰＧリガンド）、ＴＮＦＳＦ１２（ＴＷＥＡＫ  Ａｐｏ−３リガンド、ＤＲ３リガンド）、ＴＮＦＳＦ１３（ＡＰＲＩＬ  ＴＡＬＬ２）、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ（ＢＡＦＦ  ＢＬＹＳ、ＴＡＬＬ１、ＴＨＡＮＫ、ＴＮＦＳＦ２０）、ＴＮＦＳＦ１４（ＬＩＧＨＴ  ＨＶＥＭリガンド、ＬＴｇ）、ＴＮＦＳＦ１５（ＴＬ１Ａ／ＶＥＧＩ）、ＴＮＦＳＦ１８（ＧＩＴＲリガンドＡＩＴＲリガンド、ＴＬ６）、ＴＮＦＳＦ１Ａ（ＴＮＦ−ａコネクチン、ＤＩＦ、ＴＮＦＳＦ２）、ＴＮＦＳＦ１Ｂ（ＴＮＦ−ｂ  ＬＴａ、ＴＮＦＳＦ１）、ＴＮＦＳＦ３（ＬＴｂ  ＴＮＦＣ、ｐ３３）、ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０リガンドｇｐ３４、ＴＸＧＰ１）、ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０リガンドＣＤ１５４、ｇｐ３９、ＨＩＧＭ１、ＩＭＤ３、ＴＲＡＰ）、ＴＮＦＳＦ６（ＦａｓリガンドＡｐｏ−１リガンド、ＡＰＴ１リガンド）、ＴＮＦＳＦ７（ＣＤ２７リガンドＣＤ７０）、ＴＮＦＳＦ８（ＣＤ３０リガンドＣＤ１５３）、ＴＮＦＳＦ９（４−１ＢＢリガンド  ＣＤ１３７リガンド）、ＴＰ−１、ｔ−ＰＡ、Ｔｐｏ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬ  Ｒ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＮＣＥ、トランスフェリン受容体（transferring receptor）、ＴＲＦ、Ｔｒｋ、ＴＲＯＰ−２、ＴＳＧ、ＴＳＬＰ、腫瘍関連抗原ＣＡ１２５、ルイスＹ関連炭水化物を発現する腫瘍関連抗原、ＴＷＥＡＫ、ＴＸＢ２、Ｕｎｇ、ｕＰＡＲ、ｕＰＡＲ−１、ウロキナーゼ、ＶＣＡＭ、ＶＣＡＭ−１、ＶＥＣＡＤ、ＶＥ−カドヘリン、ＶＥ−カドヘリン−２、ＶＥＦＧＲ−１（ｆｌｔ−１）、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ−３（ｆｉｔ−４）、ＶＥＧＩ、ＶＩＭ、ウイルス抗原、ＶＬＡ、ＶＬＡ−１、ＶＬＡ−４、ＶＮＲインテグリン、フォン・ヴィルブランド因子、ＷＩＦ−１、ＷＮＴ１、ＷＮＴ２、ＷＮＴ２Ｂ／１３、ＷＮＴ３、ＷＮＴ３Ａ、ＷＮＴ４、ＷＮＴ５Ａ、ＷＮＴ５Ｂ、ＷＮＴ６、ＷＮＴ７Ａ、ＷＮＴ７Ｂ、ＷＮＴ８Ａ、ＷＮＴ８Ｂ、ＷＮＴ９Ａ、ＷＮＴ９Ａ、ＷＮＴ９Ｂ、ＷＮＴ１０Ａ、ＷＮＴ１０Ｂ、ＷＮＴ１１、ＷＮＴ１６、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２、ＸＣＲ１、ＸＣＲ１、ＸＥＤＡＲ、ＸＩＡＰ、ＸＰＤ、ならびにホルモンおよび増殖因子の受容体。一部の実施形態では、ポリペプチドまたはタンパク質は、１種または複数の細胞表面腫瘍抗原またはＢ細胞抗原に特異的な抗原結合ドメインを有する。方法および組成物は、腫瘍細胞またはＢ細胞を標的にするために用いることができる。
【００７５】
抗体コンジュゲートの基盤として、十分な選択性、特異性、または親和性のいかなる抗体を用いてもよい。かかる特性は、当業者に公知の従来の免疫学的スクリーニング方法論を使用して評価することができる。抗体分子における生物学的活性分子への結合のための部位は、標準的な抗原結合部位に加えて、病原体、Ｂ細胞スーパー抗原、Ｔ細胞補助受容体ＣＤ４、およびＨＩＶ−１エンベロープに結合することができる可変ドメインに存在する部位を含む（Silverman, 1995; Cleary et al., 1994; Lenert et al., 1990; Berberianet al., 1993; Kreier et al., 1981）。加えて、可変ドメインは、抗体自己結合に関与し（Kang et al., 1988）、抗抗体によって認識されるエピトープ（イディオトープ）を含有する（Bhattacharyaet al., 1989）。
【００７６】
Ｆｃドメインは、ＦｃＲに結合することができるが、免疫応答の調節が、Ｆｃドメインを含有するポリペプチドにおける抗原結合ドメインによってだけではなく、他のいくつかのタンパク質結合ドメインによって方向づけられ得ることが企図される。したがって、一部の実施形態は、Ｆｃドメインおよび異種非抗原結合ドメインに関係し得る。ある特定の実施形態では、非抗原結合ドメインは、細胞表面に結合する。したがって、これらの作用物質は特異的標的細胞に結合することができる作用物質／タンパク質との化学的コンジュゲーションまたは融合のいずれかを必要とする。実施形態は、変異体またはバリアントＦｃドメインの全部または部分を、表２に収載されているタンパク質のいずれかの全部または部分に接続することをさらに含み得る。実施形態として、表２および本明細書の記載に提示されている例が挙げられるがこれらに限定されないことが企図される。
【００７７】
受容体のリガンドを用いて、リガンドの受容体をその表面において発現する細胞を標的とすることができる。リガンドは、例えば、ＣＤ９５リガンド、ＴＲＡＩＬ、ＴＮＦ（ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−β等）、ＶＥＧＦ等の上に記すものを含む増殖因子、およびインターフェロンまたはインターロイキン等のサイトカイン、ならびにこれらのバリアントも含む。ＶＥＧＦ受容体１（Ｆｌｔ−１）の第２の細胞外ドメインとＶＥＧＦ受容体２（ＫＤＲ／ＦＩＫ−１）の第３のドメインおよびＩｇＧ  Ｆｃ領域を含むＶＥＧＦ  Ｔｒａｐ融合タンパク質等、複数のドメインを有する実施形態も企図される。
【表２】
2020530296.tif 000002
【００７８】
Ｃ．抗体Ｆｃライブラリー
多様な抗体Ｆｃドメインおよび／またはかかるドメインを含む抗体の作製のための実施形態と併せて用いることができる技法の例は、米国特許第５，８２４，５２０号に記載されている免疫グロブリン重鎖ライブラリーの発現のための技法と同様の技法を用いることができる。以前に用いられたＦｃライブラリーは、特に参照により本明細書に組み込むＰＣＴ公開ＷＯ２００８／１３７４７５に記されている。
【００７９】
ＩＩ．抗体結合ポリペプチド
種々の抗体結合ドメイン（例えば、ＦｃＲポリペプチド）は、本技術分野で公知であり、本発明の方法および組成物において使用することができる。例えば、一部の態様では、ＦｃＲは、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥまたはＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）等、Ｉｇの特定の型または亜型に特異性を有することができる。よって、一部の実施形態では、抗体結合ドメインは、ＩｇＧ結合ドメインとして規定することができる。ＦｃＲポリペプチドは、真核生物、原核生物または合成ＦｃＲドメインを含むことができる。例えば、抗体Ｆｃ結合ドメインは、哺乳動物、細菌または合成結合ドメインとして規定することができる。本発明における使用のための一部のＦｃ結合ドメインとして、表３のポリペプチドのうち１種由来の結合ドメインが挙げられるがこれらに限定されない。例えば、Ｆｃ結合ポリペプチドは、ＦＣＧＲ２Ａ、ＦＣＧＲ２Ｂ、ＦＣＧＲ２Ｃ、ＦＣＧＲ３Ａ、ＦＣＧＲ３Ｂ、ＦＣＧＲ１Ａ、Ｆｃｇｒ１、ＦＣＧＲ２、ＦＣＧＲ２、Ｆｃｇｒ２、Ｆｃｇｒ２、ＦＣＧＲ３、ＦＣＧＲ３、Ｆｃｇｒ３、ＦＣＧＲ３、Ｆｃｇｒ３、ＦＣＧＲＴ、ｍｒｐ４、ｓｐａまたはｓｐｇ遺伝子によってコードされ得る。好ましくは、本発明に係る使用のためのＦｃＲポリペプチドは、ヒトＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂ、ＦｃαＲＩまたはＣ１ｑ由来のＦｃ結合領域であり得る。Ｆｃドメインが結合する種々のＦｃ受容体は、本技術分野で周知であり、受容体の一部の例を下表３に収載する。
【表３−１】
2020530296.tif 000003
【表３−２】
2020530296.tif 000004
【００８０】
ＩＩＩ．抗体Ｆｃドメインをスクリーニングするための方法
ある特定の態様では、標的リガンド（例えば、Ｆｃ受容体等の抗体結合ポリペプチド）に特異的な親和性を有する抗体Ｆｃドメインを同定するための方法が存在する。かかる方法は、本明細書、ならびにその全体を特に参照により本明細書に組み込むＰＣＴ公開ＷＯ２００８／１３７４７５に記載されている。例えば、当該方法を使用して、本明細書に開示されているＦｃドメイン置換変異に加えて（例えば、ヒトＩｇＧ  ＦｃドメインにおけるＬ３０９Ｄ、Ｑ３１１Ｈ、およびＮ４３４Ｓ／Ｙに加えて）変異体またはバリアントＦｃドメインまたは抗体にさらに含めることができる追加的な変異を識別することができる。追加的な変異を同定するための種々の方法が本技術分野で公知であり、本発明において使用することができる（例えば、米国特許第７０９４５７１号、同第７４１９７８３号、同第７６１１８６６号および米国特許公開第２００３／０２１９８７０号；Harvey et al., 2004; Harvey et al., 2006）。
【００８１】
ＩＶ．核酸に基づく発現系
核酸に基づく発現系は、本発明のある特定の実施形態では、組換えタンパク質の発現に使用を見出すことができる。例えば、本発明の一実施形態は、抗体Ｆｃドメインまたは好ましくは、複数の別個のＦｃドメインのコード配列によるグラム陰性細菌の形質転換が関与する。
【００８２】
Ａ．核酸送達方法
本発明のある特定の態様は、標的細胞（例えば、グラム陰性細菌）への核酸の送達を含むことができる。例えば、細菌宿主細胞は、ＦｃＲに結合する可能性がある候補Ｆｃドメインをコードする核酸により形質転換することができる。本発明の特定の実施形態では、細菌のペリプラズムへの発現を標的化することが望まれ得る。真核生物宿主細胞の形質転換は、同様に、標的リガンドに結合することができると識別される様々な候補分子の発現における使用を見出すことができる。
【００８３】
細胞の形質転換のための核酸送達に適した方法は本技術分野で周知である。一部の態様では、変異体またはバリアントＦｃドメインを核酸発現ベクターにコードさせ、これを、細菌細胞または真核細胞等の細胞を形質転換するために使用することができる。
【００８４】
用語「発現ベクター」は、転写され得る遺伝子産物の少なくとも部分をコードする核酸配列を含有するベクターを指す。発現ベクターは、特定の宿主生物における作動可能に連結されたコード配列の転写および場合により翻訳に必要な核酸配列を指す種々の「制御配列」を含有し得る。さらに、発現ベクターは、プロモーター、エンハンサー、開始シグナル、多重クローニング部位（ＭＣＳ）、終結シグナル、１つまたは複数の複製起点部位（「ｏｒｉ」と命名されることが多い）、選択可能および／またはスクリーニング可能マーカー（例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシン、もしくはヒスチジノール；またはＧＦＰまたはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）等のタンパク質に対する抵抗性を付与するため）を含み得る。
【００８５】
「プロモーター」は、転写の開始および速度が制御される核酸配列の領域である制御配列である。これは、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子等、調節タンパク質および分子が結合することができる遺伝的エレメントを含有することができる。語句「作動可能に配置される」、「作動可能に連結される」、「制御下にある」および「転写制御下にある」は、プロモーターが、核酸配列との関連において、この配列の転写開始および／または発現を制御するために、正確で機能的な位置および／または配向にあることを意味する。プロモーターは、核酸配列の転写活性化に関与するシス作用性調節配列を指す「エンハンサー」と併せて使用されても使用されなくてもよい。分子生物学分野の当業者は一般に、タンパク質発現のためのプロモーター、エンハンサーおよび細胞型組合せの使用についてよく知っており、例えば、参照により本明細書に組み込むSambrookら（１９８９年）を参照されたい。
【００８６】
Ｂ．宿主細胞
異種核酸配列の発現の文脈において、「宿主細胞」は、原核細胞を指し、ベクターを複製することができるおよび／またはベクターによってコードされた異種遺伝子を発現することができるいずれかの形質転換可能な生物を含む。宿主細胞は、ベクターのレシピエントとして使用することができ、そのように使用されてきた。宿主細胞は、「トランスフェクト」または「形質転換」することができ、これは、外因性核酸が宿主細胞に移入または導入されるプロセスを指す。形質転換された細胞は、初代対象細胞およびその後代を含む。
【００８７】
本発明の特定の実施形態では、宿主細胞は、グラム陰性細菌細胞である。これらの細菌は、内膜および外膜の間に細胞膜周辺腔を保有するという点において、本発明による使用に適しており、特に、上述の内膜は、ペリプラズムと細胞質との間にあり、これは、細胞膜としても公知である。したがって、かかる細胞膜周辺腔を有する他のいずれかの細胞を本発明に従って使用することができる。本発明による使用を見出すことができるグラム陰性細菌の例として、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｂｏｒｄｏｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉ、Ｅｒｗｉｎｉａ  ａｍｙｌｏｖｏｒａ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．を挙げることができるがこれらに限定されない。
【００８８】
適切な宿主は、ベクター骨格および所望の結果に基づき、当業者によって決定することができる。プラスミドまたはコスミドは、例えば、多くのベクターの複製のために原核生物宿主細胞に導入することができる。ベクター複製および／または発現のための宿主細胞として使用される細菌細胞は、ＤＨ５α、ＪＭ１０９およびＫＣ８、ならびにＳＵＲＥ（登録商標）コンピテント細胞およびＳＯＬＯＰＡＣＫ（商標）Ｇｏｌｄ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（登録商標）、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）等の多数の市販の細菌宿主を含む。あるいは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＬＥ３９２等の細菌細胞は、バクテリオファージの宿主細胞として使用することができる。
【００８９】
哺乳動物宿主細胞の例として、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１；ＡＴＣＣ  ＣＣＬ６１）、ラット下垂体細胞（ＧＨ１；ＡＴＣＣ  ＣＣＬ８２）、ＨｅＬａ  Ｓ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２．２）、ラットヘパトーマ細胞（Ｈ−４−ＩＩ−Ｅ；ＡＴＣＣＣＲＬ  １５４８）、ＳＶ４０形質転換サル腎臓細胞（ＣＯＳ−１；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５０）およびマウス胚細胞（ＮＩＨ−３Ｔ３；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５８）が挙げられる。前述は、本技術分野で公知の多くの可能な宿主生物の限定ではなく例示を目的とする。
【００９０】
ポリペプチドを発現する哺乳動物宿主細胞は、親細胞株の培養に典型的に用いられる条件下で培養される。一般に、細胞は、典型的には、５％〜１０％のウシ胎仔血清等の血清を補充した、標準ＲＰＭＩ、ＭＥＭ、ＩＭＥＭまたはＤＭＥＭ等、生理的な塩および栄養素を含有する標準培地において培養される。培養条件も標準であり、例えば、培養物は、所望のレベルのタンパク質が達成されるまで、静置または回転培養において３７℃でインキュベートされる。
【００９１】
様々な細胞型および生物由来の多くの宿主細胞を利用することができ、当業者に公知であろう。同様に、特に、ベクターの複製または発現に許容的なウイルスベクターを原核生物宿主細胞と併せて使用することができる。一部のベクターは、原核および真核細胞の両方におけるその複製および／または発現を可能にする制御配列を用いることができる。当業者であれば、上述の宿主細胞の全てをインキュベートして、これらを維持し、ベクターの複製を可能にするための条件をさらに理解するであろう。ベクターの大規模産生、ならびにベクターによってコードされる核酸およびその同族ポリペプチド、タンパク質またはペプチドの産生を可能にするであろう技法および条件も理解され公知である。
【００９２】
Ｃ．発現系
上に記す組成物の少なくとも部分または全部を含む、多数の発現系が存在する。かかる系は、例えば、特定のリガンドに結合することができると本発明に従って識別されたポリペプチド産物の産生に使用することができる。原核生物に基づく系は、本発明による使用に用いて、核酸配列またはその同族ポリペプチド、タンパク質およびペプチドを産生することができる。多くのかかる系は、市販されており、広く入手できる。発現系の他の例は、Ｔ７、Ｔａｃ、Ｔｒｃ、ＢＡＤ、ラムダｐＬ、テトラサイクリンまたはＬａｃプロモーター等、強い原核生物プロモーターを含有するベクター、ｐＥＴ発現系およびＥ．ｃｏｌｉ発現系を含む。
【００９３】
本発明のある特定の態様では、ポリペプチドをコードする核酸配列が開示される。いずれの発現系が使用されるかに応じて、従来方法に基づき核酸配列を選択することができる。例えば、ポリペプチドが、ヒトポリペプチドに由来し、Ｅ．ｃｏｌｉではめったに利用されない複数のコドンを含有する場合、これは、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現に干渉し得る。したがって、それぞれの遺伝子またはそのバリアントは、Ｅ．ｃｏｌｉ発現のためにコドン最適化することができる。様々なベクターを使用して、目的のタンパク質を発現させることもできる。例示的なベクターとして、プラスミドベクター、ウイルスベクター、トランスポゾンまたはリポソームに基づくベクターが挙げられるがこれらに限定されない。
【００９４】
Ｖ．タンパク質精製
タンパク質精製技法は、当業者に周知である。これらの技法には、あるレベルにおいて、細胞、組織、または器官のポリペプチドおよび非ポリペプチド画分へのホモジナイゼーションおよび粗分画が関与する。他に指定がなければ、目的のタンパク質またはポリペプチドは、クロマトグラフィーおよび電気泳動技法を使用してさらに精製して、部分的または完全な精製（または均一になるまで精製）を達成することができる。純粋なペプチドの調製に特に適する分析方法としては、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、逆相クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、イムノアフィニティークロマトグラフィー、および等電点電気泳動が挙げられる。ペプチドを精製する特に効率的な方法は、高速性能液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）またはさらには高速液体クロマトグラフィー（高圧液体クロマトグラフィーまたはＨＰＬＣとも称される）である。本技術分野で一般に知られている通り、種々の精製ステップの実施順序を変化させても、またはある特定のステップを省略しても、依然として、実質的に精製されたタンパク質またはペプチドの調製に適した方法をもたらすことができることが考えられる。
【００９５】
精製されたタンパク質またはペプチドは、他の構成成分から単離することができる組成物を指すことが意図され、タンパク質またはペプチドは、その天然に得ることができる状態と比べたいずれかの程度まで精製される。単離または精製されたタンパク質またはペプチドは、したがって、それが天然に生じ得る環境を含まないタンパク質またはペプチドも指す。一般に、「精製された」は、分画に付されて様々な他の構成成分が除去されたタンパク質またはペプチド組成物を指し、この組成物は、その発現された生物学的活性を実質的に保持するであろう。用語「実質的に精製された」が使用される場合、この命名は、タンパク質またはペプチドが、組成物中のタンパク質の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％またはそれ超を構成する等、組成物の主要な構成成分を形成する組成物を指し得る。
【００９６】
タンパク質またはペプチドの精製の程度を定量化するための種々の方法は、本開示を踏まえることにより当業者に公知である。これらの方法は、例えば、活性画分の比活性の決定、またはＳＤＳ／ＰＡＧＥ解析による画分内のポリペプチドの数の評価を含む。画分の純度を評価するための好ましい方法は、画分の比活性を計算し、初期抽出物の比活性とこれを比較し、これにより、「精製倍率数（ｆｏｌｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ）」によって評価される、その中の純度の程度を計算することである。活性の量を表すために使用される実際の単位は、当然ながら、精製を追跡するために選択された特定のアッセイ技法、および発現されたタンパク質またはペプチドが検出可能な活性を示すか否かに依存し得る。
【００９７】
タンパク質またはペプチドがその最も精製された状態で常に提供されることの一般要件はない。実際には、ある特定の実施形態では、実質的に精製度が低い産物が、有用性を有する場合があることが企図される。部分的な精製は、より少ない精製ステップを組み合わせて使用することにより、または同じ一般精製スキームの異なる形態を利用することにより達成することができる。例えば、ＨＰＬＣ装置を利用して行われたカチオン交換カラムクロマトグラフィーは、一般に、低圧クロマトグラフィー系を利用した同じ技法よりも大きい「倍数」の精製をもたらすことが認められる。より低い程度の相対的精製を示す方法は、タンパク質産物の総回収量または発現されたタンパク質の活性の維持において利点を有することができる。
【００９８】
ＶＩ．医薬組成物
ポリペプチドまたは抗体を含有する医薬組成物の臨床適用が行われる場合、意図される適用に適切な医薬または治療組成物を調製することが一般に有益であり得る。一般に、医薬組成物は、薬学的に許容される担体に溶解または分散された、有効量の１種または複数のポリペプチドまたは追加的な作用物質を含むことができる。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、例えば、少なくとも約０．１％のポリペプチドまたは抗体を含むことができる。他の実施形態では、ポリペプチドまたは抗体は、例えば約２％〜約７５％の間の重量の単位または約２５％〜約６０％の間、およびそこから導くことができるいずれかの範囲を含むことができる。各治療的に有用な組成物における活性化合物（単数または複数）の量は、いずれかの所定の単位用量の化合物の適した投与量が得られるような仕方で調製することができる。溶解度、バイオアベイラビリティ、生物学的半減期、投与経路、製品有効期間、ならびに他の薬理学的考察等の因子は、かかる医薬品製剤を調製する分野の当業者によって企図され、したがって、種々の投与量および処置レジメンが所望され得る。
【００９９】
語句「薬学的または薬理学的に許容される」は、必要に応じてヒト等の動物に投与されたときに、有害、アレルギーまたは他の不都合な反応を生じない分子実体および組成物を指す。参照により本明細書に組み込むRemington’s  Pharmaceutical  Sciences、第１８版、１９９０年によって例示される通り、抗体または追加的な活性成分を含む医薬組成物の調製は、本開示を踏まえることにより当業者に公知であろう。さらに、動物（例えば、ヒト）投与のため、調製物が、ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓによって要求される無菌性、発熱性、一般的安全性および純度標準を満たすべきであることが理解される。
【０１００】
さらに、本発明のある特定の態様に従って、投与に適した組成物は、不活性希釈剤ありまたはなしの薬学的に許容される担体中に提供することができる。担体は、同化可能となるべきであり、液体、半固体、すなわち、ペーストまたは固体担体を含む。担体または希釈剤の例として、脂肪、油、水、食塩溶液、脂質、リポソーム、樹脂、結合剤、フィラー等またはこれらの組合せが挙げられる。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、当業者に公知の通り、ありとあらゆる水性溶媒（例えば、水、アルコール／水溶液、エタノール、生理食塩水溶液、非経口的ビヒクル、例えば、塩化ナトリウム、リンゲルのデキストロース等）、非水性溶媒（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、および注射用有機エステル、例えば、オレイン酸エチル）、分散媒、コーティング（例えば、レシチン）、界面活性剤、抗酸化剤、保存料（例えば、抗細菌剤または抗真菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガス、パラベン（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール）、等張剤（例えば、糖、塩化ナトリウム）、吸収遅延剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン）、塩、薬物、薬物安定剤（例えば、緩衝液、アミノ酸、例えば、グリシンおよびリシン、炭水化物、例えば、デキストロース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ラクトース、スクロース、マルトース、ソルビトール、マンニトール等）、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、流体および栄養素補充薬、そのような材料およびこれらの組合せを含む。任意の従来の媒体、作用物質、希釈剤、または担体が、レシピエントまたはそれが含有される組成物の治療効果にとって有害である場合を除いて、本方法の実施における使用のための投与可能な組成物におけるその使用は適切である。医薬組成物におけるｐＨおよび種々の構成成分の正確な濃度は、周知のパラメータに従って調整される。本発明のある特定の態様に従って、組成物は、いずれかの簡便かつ実用的な様式で、すなわち、溶解、懸濁、乳化、混合、カプセル被包、吸収、粉砕等により、担体と組み合わされる。かかる手順は、当業者にとって慣用的なものである。
【０１０１】
本発明のある特定の実施形態は、固体、液体、またはエアロゾル形態で投与されるべきか、および注射等の投与経路のために無菌である必要があるかに応じて異なる種類の担体を含み得る。組成物は、当業者に公知の通り、静脈内、皮内、経皮、くも膜下腔内、動脈内、腹腔内、鼻腔内、膣内、直腸内、筋肉内、皮下、粘膜、経口、外用、局所的、吸入による（例えば、エアロゾル吸入）、注射による、注入による、持続注入による、標的細胞を直接浸す局在化灌流による、カテーテルによる、洗浄による、脂質組成物（例えば、リポソーム）における、または他の方法もしくは前述のいずれかの組合せによる投与のために製剤化することができる（例えば、参照により本明細書に組み込むRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990を参照されたい）。典型的には、かかる組成物は、液体の溶液または懸濁物のいずれかとして調製することができ；注射に先立つ液体の添加により溶液または懸濁物を調製するための使用に適した固体形態を調製することもでき；調製物を乳化することもできる。一部の実施形態では、変異体またはバリアントＦｃドメインを含む治療タンパク質を哺乳動物の対象（例えば、ヒト）に注射または静脈内投与によって投与する。
【０１０２】
ポリペプチドは、遊離塩基、中性または塩形態で組成物中に製剤化することができる。薬学的に許容される塩は、酸付加塩、例えば、タンパク質性組成物の遊離アミノ基により生成される塩、あるいは例えば、塩酸もしくはリン酸等の無機酸または酢酸、シュウ酸、酒石酸もしくはマンデル酸等の有機酸により生成される塩を含む。遊離カルボキシル基により生成された塩は、例えば、水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムもしくは第二鉄等、無機塩基；またはイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジンもしくはプロカイン等、有機塩基に由来することができる。
【０１０３】
さらなる実施形態では、本発明は、ポリペプチド、１種または複数の脂質および水性溶媒を含む医薬脂質媒体組成物の使用に関係することができる。本明細書において使用する場合、用語「脂質」は、水に特徴的に不溶性であり、有機溶媒で抽出することができる広範囲の物質のいずれかを含むと規定され得る。この広範なクラスの化合物は、当業者に周知であり、本明細書で用語「脂質」が使用される場合、いずれかの特定の構造に限定されない。例として、長鎖脂肪族炭化水素およびその誘導体を含有する化合物が挙げられる。脂質は、天然起源または合成（すなわち、人の手により設計または産生）であり得る。しかし、脂質は通常、生物学的物質である。生物学的脂質は、本技術分野で周知であり、例えば、中性脂肪、リン脂質、ホスホグリセリド、ステロイド、テルペン、リゾ脂質（lysolipid）、スフィンゴ糖脂質、糖脂質、スルファチド（sulphatide）、エーテルおよびエステル連結した脂肪酸を有する脂質、重合可能脂質ならびにこれらの組合せを含む。当然ながら、当業者によって脂質として理解されている、特に本明細書に記載されている以外の化合物も、本組成物および方法によって包含される。
【０１０４】
当業者であれば、脂質ビヒクル中への組成物の分散に用いることができる技法の範囲についてよく知っているであろう。例えば、ポリペプチドまたはその融合タンパク質は、脂質を含有する溶液中に分散させる、脂質により溶解させる、脂質により乳化する、脂質と混合する、脂質と組み合わせる、脂質に共有結合させる、脂質中に懸濁物として含有させる、ミセルもしくはリポソームと共に含有または複合体形成させる、または当業者に公知のいずれかの手段により他の仕方で脂質もしくは脂質構造と会合させることができる。分散によりリポソームの形成がもたらされてももたらされなくてもよい。一部の実施形態では、本明細書に記載されている変異体またはバリアントＦｃドメインを含む抗体を抗体−標的化リポソームに含めることができる。
【０１０５】
用語「単位用量」または「投与量」は、対象における使用に適した物理的に別々の単位を指し、各単位は、その投与、すなわち、適切な経路および処置レジメンに関連して上に記す所望の応答を生じると計算された治療組成物の既定の量を含有する。処置回数および単位用量の両方に従って投与するべき量は、所望の効果に依存する。患者または対象に投与される本実施形態の組成物の実際の投与量は、対象の体重、年齢、健康および性別、処置されている疾患の種類、疾患浸透の程度、以前のまたは同時発生的な治療介入、患者の特発性、投与経路、ならびに特定の治療用物質の効力、安定性および毒性等、身体的および生理的因子によって決定することができる。他の非限定例において、用量は、投与当たり約１マイクログラム／ｋｇ／体重、約５マイクログラム／ｋｇ／体重、約１０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約１００マイクログラム／ｋｇ／体重、約２００マイクログラム／ｋｇ／体重、約３５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５００マイクログラム／ｋｇ／体重、約１ミリグラム／ｋｇ／体重、約５ミリグラム／ｋｇ／体重、約１０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約１００ミリグラム／ｋｇ／体重、約２００ミリグラム／ｋｇ／体重、約３５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５００ミリグラム／ｋｇ／体重から約１０００ミリグラム／ｋｇ／体重またはそれ超およびそこから導くことができるいずれかの範囲を含むこともできる。ここに収載されている数から導くことができる範囲の非限定例において、約５ミリグラム／ｋｇ／体重〜約１００ミリグラム／ｋｇ／体重、約５マイクログラム／ｋｇ／体重〜約５００ミリグラム／ｋｇ／体重等の範囲を上述の数に基づき投与することができる。投与に責任がある医師は、いかなる場合でも、組成物における活性成分（単数または複数）の濃度および個々の対象に適切な用量（単数または複数）を決定し得る。
【０１０６】
本発明は、治療用調製物の特定の性質によって限定されることは意図されない。例えば、かかる組成物は、生理的に許容できる液体、ゲルまたは固体担体、希釈剤および賦形剤と一緒に製剤中に提供することができる。これらの治療用調製物は、飼育動物による等の獣医学的使用および他の治療剤と同様の様式でのヒトにおける臨床使用のために哺乳動物に投与することができる。一般に、治療有効性に必要とされる投与量は、使用の種類および投与機序、ならびに個々の対象の特定化された要件に応じて変動し得る。動物患者に投与される組成物の実際の投与量は、体重、状態の重症度、処置されている疾患の種類、以前のまたは同時発生的な治療介入、患者の特発性、および投与経路等、身体的および生理的因子によって決定することができる。投与量および投与経路に依存して、好まれる投薬量および／または有効量の投与の回数は、対象の応答に応じて変動し得る。投与に責任がある医師は、いかなる場合でも、組成物における活性成分（単数または複数）の濃度および個々の対象に適切な用量（単数または複数）を決定し得る。
【０１０７】
ＶＩＩ．処置方法
本発明のある特定の態様は、例えば、本明細書に記載されている変異体またはバリアントＦｃドメインを含む治療タンパク質または抗体を用いて腫瘍等の疾患を処置するためのポリペプチドを提供する。特に、ポリペプチドは、ヒトポリペプチド配列を有してよく、したがって、ヒト患者におけるアレルギー反応を防止し、反復投与を可能にし、治療有効性を増大させることができる。
【０１０８】
「処置」および「処置する」は、疾患または健康関連の状態の治療利益を得る目的で、対象への治療剤の投与もしくは適用、または対象における手順もしくはモダリティの実行を指す。例えば、処置は、がん細胞増殖を誘発することなくがん細胞にＣＤＣを標的化する、薬学的有効量の抗体の投与を含むことができる。
【０１０９】
「対象」および「患者」は、霊長類、哺乳動物および脊椎動物等、ヒトまたは非ヒトのいずれかを指す。特定の実施形態では、対象は、ヒトである。
【０１１０】
用語「治療利益」または「治療上有効」は、本願を通して使用される場合、この状態の医学的処置に関して対象の福祉を促進または増強する任意のものを指す。したがってこうしたものとしては、疾患の徴候または症状の頻度または重症度の低下が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、がんの処置は、例えば、腫瘍サイズの低下、腫瘍侵襲性の低下、がん成長速度の低下、または転移の防止が関与し得る。がんの処置は、がんを有する対象の生存延長を指すこともできる。
【０１１１】
本処置方法が有用な腫瘍は、固形腫瘍または血液学的腫瘍に見出されるもの等、任意の悪性細胞型を含む。例示的な固形腫瘍として、膵臓、結腸、盲腸、胃、脳、頭部、頸部、卵巣、腎臓、喉頭、肉腫、肺、膀胱、メラノーマ、前立腺および乳房からなる群から選択される臓器の腫瘍を挙げることができるがこれらに限定されない。例示的な血液学的腫瘍は、骨髄の腫瘍、ＴまたはＢ細胞悪性病変、白血病、リンパ腫、芽腫、骨髄腫等を含む。本明細書に提供されている方法を使用して処置することができるがんのさらなる例として、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、白血病、扁平上皮がん、肺がん（小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺の腺癌および肺の扁平上皮癌を含む）、腹膜のがん、肝細胞がん、胃（gastric）または胃（stomach）がん（胃腸管がんおよび胃腸管間質がんを含む）、膵がん、神経膠芽腫、子宮頸部がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎臓または腎がん、前立腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、様々な種類の頭頸部がん、メラノーマ、表在拡大型メラノーマ、悪性黒子メラノーマ、末端黒子型メラノーマ、結節性メラノーマおよびＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ；巨大腫瘤病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；およびワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症を含む）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、ヘアリー細胞白血病、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）ならびに慢性骨髄芽球性白血病が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１１２】
がんは、特に、次の組織学的な型のものであり得るが、これらに限定されない：新生物、悪性；癌腫；癌腫、未分化；巨細胞および紡錘細胞癌；小細胞癌；乳頭癌；扁平上皮癌；リンパ上皮癌；基底細胞癌；石灰化上皮（pilomatrix）癌；移行細胞癌；乳頭移行細胞癌；腺癌；ガストリノーマ、悪性；胆管細胞癌；肝細胞癌；肝細胞癌および胆管細胞癌の組合せ；線維柱帯腺癌；腺様嚢胞癌；腺腫性ポリープにおける腺癌；腺癌、家族性大腸ポリポーシス；固形癌；カルチノイド腫瘍、悪性；細気管支肺胞（branchiolo-alveolar）腺癌；乳頭腺癌；嫌色素性癌；好酸球癌；好酸性腺癌；好塩基球癌；明細胞腺癌；顆粒細胞癌；濾胞性腺癌；乳頭および濾胞性腺癌；非被包性硬化性癌；副腎皮質癌；類内膜（endometroid）癌；皮膚付属器癌；アポクリン腺癌；皮脂腺癌；耳道腺癌；粘膜表皮癌；嚢胞腺癌；乳頭嚢胞腺癌；乳頭漿液性嚢胞腺癌；粘液性嚢胞腺癌；粘液性腺癌；印環細胞癌；浸潤性乳管癌；髄様癌；小葉癌；炎症性癌；パジェット病、乳腺；腺房細胞癌；腺扁平上皮癌；腺癌ｗ／扁平上皮異形成；胸腺腫、悪性；卵巣間質腫瘍、悪性；莢膜細胞腫、悪性；顆粒膜細胞腫瘍、悪性；アンドロブラストーマ、悪性；セルトリ細胞癌；ライディッヒ細胞腫瘍、悪性；脂質細胞腫瘍、悪性；パラガングリオーマ、悪性；乳房外パラガングリオーマ、悪性；褐色細胞腫；血管球血管肉腫（glomangiosarcoma）；悪性メラノーマ；無色素性メラノーマ；表在拡大型メラノーマ；巨大色素性母斑における悪性メラノーマ；類上皮細胞メラノーマ；青色母斑、悪性；肉腫；線維肉腫；線維性組織球腫、悪性；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胚性横紋筋肉腫；肺胞横紋筋肉腫；間質肉腫；混合腫瘍、悪性；ミュラー管混合腫瘍；腎芽腫；肝芽腫；癌肉腫；間葉腫、悪性；ブレンナー腫瘍、悪性；葉状腫瘍、悪性；滑膜肉腫；中皮腫、悪性；未分化胚細胞腫；胚性癌；奇形腫、悪性；卵巣甲状腺腫、悪性；絨毛癌；中腎腫、悪性；血管肉腫；血管内皮腫、悪性；カポジ肉腫；血管外皮腫、悪性；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍骨性骨肉腫；軟骨肉腫；軟骨芽細胞腫、悪性；間葉性軟骨肉腫；骨の巨細胞腫瘍；ユーイング肉腫；歯原性腫瘍、悪性；エナメル上皮肉腫；アメロブラストーマ、悪性；エナメル芽細胞線維肉腫；松果体腫、悪性；脊索腫；神経膠腫、悪性；上衣腫；星状細胞腫；原形質星状細胞腫；線維性星状細胞腫；星状芽細胞腫；神経膠芽腫；乏突起神経膠腫；乏突起膠細胞芽腫（oligodendroblastoma）；原始神経外胚葉性；小脳肉腫；神経節芽細胞腫；ニューロブラストーマ；網膜芽細胞腫；嗅覚神経原性腫瘍；髄膜腫、悪性；神経線維肉腫；神経鞘腫、悪性；顆粒細胞腫瘍、悪性；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキン型；側肉芽腫；悪性リンパ腫、小リンパ球性；悪性リンパ腫、大細胞型、びまん性；悪性リンパ腫、濾胞性；菌状息肉腫；他の指定された非ホジキンリンパ腫；悪性組織球増殖症；多発性骨髄腫；マスト細胞肉腫；免疫増生性小腸性疾患；白血病；リンパ系白血病；形質細胞白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞白血病；骨髄性白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；マスト細胞白血病；巨核芽球性白血病；骨髄性肉腫；およびヘアリー細胞白血病。
【０１１３】
ポリペプチドは、本明細書において、腫瘍組織における補体活性化を誘発するためまたはそれが望ましいと考慮される場合に補体活性化を誘発するための、種々のモダリティにおける抗腫瘍剤として使用することができる。特定の実施形態では、本発明は、抗腫瘍剤としてポリペプチドを使用する方法を企図し、したがって、腫瘍細胞成長の阻害に十分な期間、腫瘍細胞の集団を治療有効量のポリペプチドと接触することを含む。
【０１１４】
一実施形態では、ｉｎ  ｖｉｖｏでの接触は、患者に本発明のポリペプチドを含む治療有効量の生理的に許容できる組成物を静脈内、腹腔内または腫瘍内注射により投与することにより達成される。ポリペプチドは、注射または時間をかけた漸進的注入により非経口的に投与することができる。ポリペプチドは、静脈内、腹腔内、経口、筋肉内、皮下、腔内、経皮、真皮投与することができ、蠕動手段によって送達することができる、または腫瘍細胞を含有する組織に直接注射することができる。
【０１１５】
ポリペプチドを含む治療組成物は従来、例えば単位用量の注射による等、静脈内投与される。用語「単位用量」は、治療組成物を参照して使用される場合、対象に対する単位投与量として適した物理的に別々の単位を指し、各単位は、要求される希釈剤、すなわち、担体またはビヒクルに関連して所望の治療効果を生じるように計算される既定の量の活性材料を含有する。
【０１１６】
組成物は、剤形と適合性の様式でかつ治療有効量で投与される。投与されるべき量は、処置されるべき対象、活性成分を利用する対象の系の能力、および所望の治療効果の程度に依存する。投与が必要とされる活性成分の正確な量は、医師の判断に依存し、各個体に特有である。しかし、全身性適用に適した投与量範囲は、本明細書に開示されており、投与経路に依存する。初回およびブースター投与に適したレジメンも企図され、初回投与に続く、その後の注射または他の投与による１または複数の時間間隔（ｈｏｕｒ  ｉｎｔｅｒｖａｌ）での反復用量によって典型的に表される。例示的な複数の投与は、本明細書に記載されており、ポリペプチドの連続的に高い血清および組織レベルの維持に特に好ましい。あるいは、ｉｎ  ｖｉｖｏ治療法に指定された範囲内の血中濃度の維持に十分な連続的静脈内注入が企図される。
【０１１７】
局所的に進行したまたは転移性がんを有するがん患者において、本発明のポリペプチドを全身または局所的に投与して、腫瘍細胞成長の阻害またはがん細胞の死滅等、疾患を処置することができることが企図される。これは、静脈内、くも膜下腔内および／または腹腔内投与することができる。これは、単独でまたは抗増殖薬と組み合わせて投与することができる。一実施形態では、これは、外科手術または他の手順に先立ち患者におけるがん負荷を低下するために投与することができる。あるいは、これは、いかなる残存するがん（例えば、外科手術が排除できなかったがん）も生存しないことを確実にするために、外科手術後に投与することができる。
【０１１８】
治療有効量のポリペプチドは、所望の効果を達成するように、すなわち、腫瘍組織においてＣＤＣを誘発し、これにより、腫瘍切除炎症促進性応答を媒介するように計算された既定の量である。よって、本発明のポリペプチドの投与の投与量範囲は、腫瘍細胞分裂および細胞周期進行の症状が低下する所望の効果を生じるのに十分な多さの投与量範囲である。投与量は、過粘稠度症候群、肺水腫、うっ血性心不全、神経学的効果等、有害副作用を引き起こすほどに多くなるべきではない。一般に、投与量は、患者の年齢、状態、性別および患者における疾患の程度と共に変動し、当業者によって決定することができる。何らかの合併症の場合には、投与量は、個々の医師によって調整することができる。
【０１１９】
ＶＩＩＩ．併用療法
ある特定の実施形態では、本実施形態の組成物および方法は、第２のまたは追加的な治療法と組み合わせたポリペプチドまたは抗体の投与が関与する。かかる治療法は、ＣＤＣに応答性のいずれかの疾患の処置において適用することができる。例えば、疾患は、がんであり得る。
【０１２０】
併用療法を含む方法および組成物は、治療もしくは保護効果を増強する、および／または別の抗がんもしくは抗過剰増殖療法の治療効果を増加する。治療および予防的な方法および組成物は、がん細胞の死滅および／または細胞過剰増殖の阻害等、所望の効果の達成に有効な組み合わせた量で提供することができる。このプロセスは、ポリペプチドまたは抗体および第２の治療法の投与が関与し得る。第２の治療法は、直接の細胞傷害性効果を有しても有さなくてもよい。例えば、第２の治療法は、直接の細胞傷害性効果がない、免疫系を上方調節する作用物質であり得る。組織、腫瘍または細胞は、作用物質（例えば、ポリペプチドまたは抗がん剤）のうち１種または複数を含む１種または複数の組成物または薬理学的製剤（単数または複数）に曝露することができ、あるいは組織、腫瘍および／または細胞を２種またはそれを超える別個の組成物または製剤に曝露することができ、１種の組成物が、１）ポリペプチドもしくは抗体、２）抗がん剤、または３）ポリペプチドもしくは抗体および抗がん剤の両方を提供する。また、かかる併用療法を、化学療法、放射線療法、外科療法または免疫療法と併せて使用することができることが企図される。
【０１２１】
用語「接触される」および「曝露される」は、細胞に適用される場合、治療用ポリペプチドもしくは抗体および化学療法もしくは放射線療法剤が標的細胞に送達される、または標的細胞と直接並立して設置されるプロセスを説明するように本明細書において使用される。細胞死滅を達成するために、例えば、両方の作用物質が、細胞の死滅またはその分裂の防止に有効な組み合わせた量で細胞に送達される。
【０１２２】
ポリペプチドまたは抗体は、抗がん処置と比べてその前に、その最中に、その後に、または様々な組合せで投与することができる。投与は、同時発生的から数分間から数日間から数週間に及ぶ間隔であり得る。ポリペプチドまたは抗体が、抗がん剤とは別々に患者に与えられる実施形態では、一般に、２種の化合物が依然として、患者に対して、有利に組み合わされた効果を発揮することができるように、各送達時の間でかなりの期間が経ち有効期限を越えてしまわなかったことを確実にするであろう。かかる場合、互いに約１２〜２４または７２時間以内に、より詳細には、互いに約６〜１２時間以内に、ポリペプチドおよび抗がん療法を患者に与えることができることが企図される。ある状況では、有意に処置の期間を延長することが望ましいことがあり、その場合、それぞれの投与間で数日間（２、３、４、５、６または７）から数週間（１、２、３、４、５、６、７または８）が経過する。
【０１２３】
ある特定の実施形態では、処置の経過は、１〜９０日間またはそれを超えて（このかかる範囲は、介在する日数を含む）持続し得る。１種の作用物質は、１日目から９０日目（このかかる範囲は、介在する日数を含む）のいずれかの日またはそのいずれかの組合せに与えることができ、別の作用物質は、１日目から９０日目（このかかる範囲は、介在する日数を含む）のいずれかの日またはそのいずれかの組合せに与えられることが企図される。１日間以内（２４時間期間）に、患者に、作用物質（単数または複数）の１回または複数回の投与を与えることができる。さらに、処置の経過後に、抗がん処置が投与されない期間を設けることが企図される。この期間は、その予後、強さ、健康等、患者の状態に依存して、１〜７日間および／または１〜５週間および／または１〜１２カ月間またはそれを超えて（このかかる範囲は、介在する日数を含む）持続することができる。必要に応じて処置サイクルが反復されることが予想される。
【０１２４】
様々な組合せを用いることができる。下の例に関して、ポリペプチドまたは抗体は「Ａ」であり、抗がん療法は「Ｂ」である：
A/B/A  B/A/B  B/B/A  A/A/B  A/B/B  B/A/A  A/B/B/B  B/A/B/B
B/B/B/A    B/B/A/B    A/A/B/B    A/B/A/B    A/B/B/A    B/B/A/A
B/A/B/A    B/A/A/B    A/A/A/B    B/A/A/A    A/B/A/A    A/A/B/A
【０１２５】
患者への本実施形態のいずれかのポリペプチドまたは治療法の投与は、作用物質の毒性があるとすればそれを考慮に入れつつ、かかる化合物の投与の一般プロトコールに従う。したがって、一部の実施形態では、併用療法に起因する毒性をモニタリングするステップが存在する。対象におけるがんの処置が関与する一部の実施形態では、第２の治療法は、例えば、化学療法、放射線療法、免疫療法、遺伝子療法、または外科手術であり得る。
【０１２６】
Ａ．化学療法
多種多様な化学療法剤を、本実施形態に従って使用することができる。用語「化学療法」は、がんを処置するための薬物の使用を指す。「化学療法剤」は、がんの処置において投与される化合物または組成物を暗示するように使用される。これらの作用物質または薬物は、細胞内におけるその活性機序によって、例えば、これが細胞周期に影響を与えるか否かおよびいずれのステージでそれが為されるかによってカテゴリー化される。あるいは、作用物質は、ＤＮＡを直接架橋する、ＤＮＡ内にインターカレートする、または核酸合成に影響を与えることにより染色体および有糸分裂異常を誘導するその能力に基づき特徴付けることができる。
【０１２７】
化学療法剤の例として、チオテパおよびシクロホスファミド（cyclosphosphamide）等のアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン（piposulfan）等のスルホン酸アルキル；ベンゾドパ（benzodopa）、カルボコン、メツレドパ（meturedopa）およびウレドパ（uredopa）等のアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド（trietylenephosphoramide）、トリエチレン（triethiylene）チオホスホラミドおよびトリメチロールメラミン（trimethylolomelamine）を含むエチレンイミンおよびメチロールメラミン（methylamelamine）；アセトゲニン（特に、ブラタシンおよびブラタシノン（bullatacinone））；カンプトテシン（合成アナログトポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン（callystatin）；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン（carzelesin）およびビセレシン合成アナログを含む）；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成アナログ、ＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン（pancratistatin）；サルコジクチイン（sarcodictyin）；スポンジスタチン（spongistatin）；クロラムブシル、クロルナファジン（chlornaphazine）、チョロホスファミド（cholophosphamide）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキサイド塩酸塩、メルファラン、ノベンビキン（novembichin）、フェネステリン（phenesterine）、プレドニムスチン、トロホスファミドおよびウラシルマスタード等のナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチンおよびラニムスチン（ranimnustine）等のニトロソウレア（nitrosurea）；エンジイン抗生物質（例えば、カリチアマイシン、特に、カリチアマイシンガンマｌＩおよびカリチアマイシンオメガＩ１）等の抗生物質；ジネマイシンＡを含むジネマイシン（dynemicin）；クロドロネート等のビスホスホネート；エスペラミシン；ならびにネオカルチノスタチン発色団および関連する色素タンパク質エンジイン抗生物質（antiobiotic）発色団、アクラシノマイシン（aclacinomysin）、アクチノマイシン、アントラマイシン（authrarnycin）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン（cactinomycin）、カルビシン（carabicin）、カルミノマイシン（carminomycin）、カルジノフィリン（carzinophilin）、クロモマイシン（chromomycinis）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン（detorubicin）、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（モルフォリノ−ドキソルビシン、シアノモルフォリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ（pyrrolino）−ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン（esorubicin）、イダルビシン、マルセロマイシン（marcellomycin）、マイトマイシンＣ等のマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（potfiromycin）、ピューロマイシン、クエラマイシン（quelamycin）、ロドルビシン（rodorubicin）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチンおよびゾルビシン；メトトレキセートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）等の代謝拮抗薬；デノプテリン、プテロプテリンおよびトリメトレキセート等の葉酸アナログ；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン（thiamiprine）およびチオグアニン等のプリンアナログ；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビンおよびフロクスウリジン等のピリミジンアナログ；カルステロン（calusterone）、ドロモスタノロンプロピオン酸塩、エピチオスタノール、メピチオスタンおよびテストラクトン等のアンドロゲン；ミトタンおよびトリロスタン等の抗副腎（anti-adrenals）；フロリン酸（frolinic  acid）等の葉酸補充薬；アセグラトン；アルドホスファミド（aldophosphamide）グリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル（bestrabucil）；ビサントレン（bisantrene）；エダトレキセート（edatraxate）；デフォファミン（defofamine）；デメコルチン；ジアジコン（diaziquone）；エルフォルミシン（elformithine）；エリプチニウム（elliptinium）酢酸塩；エポチロン；エトグルシド；ガリウム硝酸塩；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダイニン（lonidainine）；マイタンシンおよびアンサマイトシン（ansamitocin）等のマイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール（mopidanmol）；ニトラエリン（nitraerine）；ペントスタチン；フェナメット（phenamet）；ピラルビシン；ロソキサントロン（losoxantrone）；ポドフィリン酸（podophyllinic  acid）；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ多糖複合体；ラゾキサン；リゾキシン（rhizoxin）；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテシン（特に、Ｔ−２毒素、ベラキュリン（verracurin）Ａ、ロリジン（roridin）Ａおよびアングイジン（anguidine））；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（gacytosine）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；タキソイド、例えば、パクリタキセルおよびドセタキセルゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；シスプラチン、オキサリプラチンおよびカルボプラチン等の白金配位複合体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン（novantrone）；テニポシド；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；イリノテカン（例えば、ＣＰＴ−１１）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（difluorometlhylornithine）（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸等のレチノイド；カペシタビン；カルボプラチン、プロカルバジン、プリカマイシン（plicomycin）、ゲムシタビン（gemcitabien）、ナベルビン、ファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼ（tansferase）阻害剤、トランス白金（transplatinum）、ならびに上述のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体が挙げられる。
【０１２８】
Ｂ．放射線療法
ＤＮＡ損傷を生じる、広範に使用されてきた他の因子は、γ線、Ｘ線および／または腫瘍細胞への放射性同位元素の定方向送達として一般的に公知のものを含む。マイクロ波、陽子線照射（米国特許第５，７６０，３９５号および同第４，８７０，２８７号）およびＵＶ照射等、他の形態のＤＮＡ損傷因子も企図される。これらの因子の全てが、ＤＮＡ、ＤＮＡの前駆体、ＤＮＡの複製および修復、ならびに染色体のアセンブリおよび維持における広範囲の損傷に影響を与える可能性が最も高い。Ｘ線の線量範囲は、延長された期間にわたる（３〜４週間）５０〜２００レントゲンの一日線量から、２０００〜６０００レントゲンの単一線量に及ぶ。放射性同位元素の線量範囲は、広く変動し、同位元素の半減期、放射する放射線の強度および種類、ならびに新生物細胞による取込みに依存する。
【０１２９】
Ｃ．免疫療法
当業者であれば、本実施形態の方法と組み合わせてまたは併せて、免疫療法を使用することができることを理解されよう。がん処置の文脈において、免疫療法は、一般に、免疫細胞を標的にし、抑制する免疫エフェクター細胞および分子の使用に頼る。ブリナツモマブ（Ｂｌｉｎｃｙｔｏ（登録商標））は、かかる一例である。例えば、イピリムマブ等のチェックポイント阻害剤は、別のかかる例である。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面におけるあるマーカーに特異的な抗体であり得る。抗体は、単独で治療法のエフェクターとして機能させることもでき、細胞死滅に実際に影響を及ぼすように他の細胞を動員させることができる。抗体を薬物または毒素（化学療法薬、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素等）とコンジュゲートし、単に標的化作用物質として作用させることもできる。あるいは、エフェクターは、直接的または間接的のいずれかで、腫瘍細胞標的と相互作用する表面分子を有するリンパ球であり得る。種々のエフェクター細胞として、細胞傷害性Ｔ細胞およびＮＫ細胞が挙げられる。
【０１３０】
免疫療法の一態様では、腫瘍細胞は、標的することに受け入れられる、すなわち、他の細胞の大部分には存在しない、特定のマーカーを有する必要がある。多くの腫瘍マーカーが存在し、そのうちのいずれかが、本実施形態の文脈における標的化に適することができる。共通腫瘍マーカーは、ＣＤ２０、癌胎児性抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ−７２、ＨＭＦＧ、シアリルルイス抗原、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、ラミニン受容体、ｅｒｂ  Ｂおよびｐ１５５を含む。免疫療法の代替的な態様は、抗がん効果を免疫刺激効果と組み合わせることである。免疫刺激分子も存在し、次のものを含む：サイトカイン、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ガンマ−ＩＦＮ、ケモカイン、例えば、ＭＩＰ−１、ＭＣＰ−１、ＩＬ−８および増殖因子、例えば、ＦＬＴ３リガンド。
【０１３１】
現在研究中または使用されている免疫療法の例は、免疫アジュバント、例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、ジニトロクロロベンゼンおよび芳香族化合物（米国特許第５，８０１，００５号および同第５，７３９，１６９号；HuiおよびHashimoto、１９９８年；Christodoulidesら、１９９８年）；サイトカイン療法、例えば、インターフェロンα、βおよびγ、ＩＬ−１、ＧＭ−ＣＳＦならびにＴＮＦ（Bukowskiら、１９９８年；Davidsonら、１９９８年；Hellstrandら、１９９８年）；遺伝子療法、例えば、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２およびｐ５３（Qinら、１９９８年；Austin-WardおよびVillaseca、１９９８年；米国特許第５，８３０，８８０号および同第５，８４６，９４５号）；ならびにモノクローナル抗体、例えば、抗ＣＤ２０、抗ガングリオシドＧＭ２および抗ｐ１８５（Hollander、２０１２年；Hanibuchiら、１９９８年；米国特許第５，８２４，３１１号）である。１種または複数の抗がん療法を、本明細書に記載されている抗体療法と共に用いることができることが企図される。
【０１３２】
Ｄ．外科手術
がんを有する人のおよそ６０％は、予防的、診断的または進行度診断的、根治的および姑息的外科手術を含むある種の外科手術を受ける。根治的外科手術は、がん性組織の全体または部分が物理的に除去される、切り取られるおよび／または破壊される切除を含み、本実施形態の処置、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法および／または代替的治療法等、他の治療法と併せて使用することができる。腫瘍切除は、腫瘍の少なくとも部分の物理的除去を指す。腫瘍切除に加えて、外科手術による処置は、レーザー外科手術、凍結外科手術、電気外科手術および顕微鏡により制御された外科手術（モース外科手術）を含む。
【０１３３】
がん性細胞、組織または腫瘍の部分または全体を切り取ると、身体に腔が形成され得る。処置は、追加的な抗がん療法によるこの区域の灌流、直接注射または局所的適用により達成することができる。かかる処置は、例えば、１、２、３、４、５、６もしくは７日毎に、または１、２、３、４および５週毎に、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２カ月毎に反復することができる。これらの処置はまた、変動する投与量のものとなることもできる。
【０１３４】
Ｅ．他の作用物質
本実施形態のある特定の態様と組み合わせて他の作用物質を使用して、処置の治療有効性を改善することができることが企図される。これらの追加的な作用物質としては、細胞表面受容体およびＧＡＰ結合の上方調節に影響を与える作用物質、細胞増殖抑制および分化剤、細胞接着の阻害剤、アポトーシス誘導物質に対する過剰増殖細胞の感受性を増大させる作用物質、または他の生物学的作用物質が挙げられる。ＧＡＰ結合の数が増加することによる細胞間のシグナル伝達の増大により、隣接する過剰増殖細胞集団に対する抗過剰増殖効果が増大し得る。他の実施形態では、細胞増殖抑制または分化剤を本実施形態のある特定の態様と組み合わせて使用して、処置の抗過剰増殖有効性を改善することができる。細胞接着の阻害剤により、本実施形態の有効性が改善されることが企図される。細胞接着阻害剤の例は、接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤およびロバスタチンである。さらに、抗体ｃ２２５等の、アポトーシスに対する過剰増殖細胞の感度を増大させる他の作用物質を本実施形態のある特定の態様と組み合わせて使用して処置有効性を改善することができることが企図される。
【０１３５】
ＩＸ．キット
本発明のある特定の態様は、治療用キット等、キットを提供することができる。例えば、キットは、本明細書に記載されている１種または複数の医薬組成物と、任意選択で、その使用のための説明書とを含むことができる。キットは、かかる組成物の投与を達成するための１種または複数のデバイスを含むこともできる。例えば、対象キットは、医薬組成物と、がん性腫瘍への組成物の直接静脈内注射を達成するためのカテーテルとを含むことができる。他の実施形態では、対象キットは、送達装置による使用のための、任意選択で医薬品として製剤化されたまたは凍結乾燥されたポリペプチドの予め充填されたアンプルを含むことができる。
【０１３６】
キットは、ラベルを付けた容器を含むことができる。適した容器は、例えば、ボトル、バイアルおよび試験管を含む。容器は、ガラスまたはプラスチック等、種々の材料でできていてよい。容器は、上述のもの等、治療または非治療適用に有効なポリペプチドを含む組成物を保持することができる。容器のラベルは、組成物が、特異的な治療または非治療適用に使用されることを示すことができ、また、上述のもの等、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ使用のいずれかのための指示を示すこともできる。本発明のキットは、典型的には、上述の容器と、緩衝液、希釈剤、フィルター、針、注射器および使用説明書を有する添付文書を含む、商業的および使用者の観点から望ましい材料を含む１種または複数の他の容器とを含み得る。
【実施例】
【０１３７】
Ｘ．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例に開示されている技法は、本発明者により、本発明の実施においてよく機能することが発見された技法であり、したがって、それを実施するための好ましいモードを構成するとみなすことができることが当業者には理解されるべきである。しかし、当業者は、本開示に照らして、開示されている特定の実施形態に多くの変更を行うことができ、それでもなお、本発明の主旨および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果が得られることを理解するべきである。
【０１３８】
（実施例１）
ＩｇＧ１  Ｆｃドメインを単離するためのライブラリー構築戦略
Ｅ．ｃｏｌｉは、タンパク質グリコシル化機構をコードせず、したがって、Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズムにおいて発現されるＩｇＧのＦｃドメインはグリコシル化されておらず、通常はＦｃドメインのＮ２９７に付加されているグリカンを欠く。非グリコシル化Ｆｃドメインは、コンフォメーション上の柔軟性の程度が高く、その結果、エフェクターＦｃγＲ（ＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＢ）およびＣ１ｑへの結合が大きく減弱するか、または検出可能な結合が存在しないが（Jefferis et al., 2005; Borrok et al., 2012）、グリカンの喪失はＩｇＧのｐＨ依存性ＦｃＲｎ結合特性に影響を及ぼさない。ＦｃＲｎへの野生型ＩｇＧよりも増強された結合を可能にする変異を含有するＦｃドメインバリアントを単離するために、ＦｃドメインのＦｃＲｎへの結合部位をランダム化した。Ａｓｐ２４９、Ｔｈｒ２５０、Ｌｅｕ２５１、Ｍｅｔ２５２、Ｉｌｅ２５３、Ｓｅｒ２５４、Ａｒｇ２５５、Ｖａｌ３０８、Ｌｅｕ３０９、Ｇｌｎ３１１、Ａｓｐ３１２、Ｌｅｕ３１４、Ｇｌｕ４３０、Ｌｅｕ４３２、Ｔｙｒ４３６、およびＧｌｎ４３８にランダムなアミノ酸置換を導入した。８種のプライマー（配列番号１２〜１９）を設計し、以下の実施例２に記載の変異誘発のために使用した（表４）。
【表４】
2020530296.tif 000005
【０１３９】
（実施例２）
Ｆｃドメインを操作するためのライブラリーの構築
全てのプラスミドおよびプライマーを表４、１０および１１に記載する。プライマーは全て、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより合成されたものである。ＩｇＧポリペプチドを、ベクター：ｐＢＡＤ３０−ＰｅｌＢ−ＶＬ−Ｃｋ−ＮｌｐＡ−ＶＬ−Ｃｋ−Ｈｉｓ−ｃＭｙｃおよびｐＭｏｐａｃ１２−ｐｅｌＢ−ＩｇＧ−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＦＬＡＧを使用してＥ．ｃｏｌｉの内膜上に発現させ、ディスプレイさせた（Jung et al., 2012 and Lee et al., 2017）（図１〜２）。ＦｃドメインのＦｃＲｎ結合部位をランダム化するために、８種のプライマー（配列番号１２〜１９）を設計した（表４および図２）。８種のプライマーを用いてＩｇＧ１の重鎖遺伝子の４つの断片を増幅し、ＰＣＨＴ０１（配列番号１２）およびＰＣＨＴ０８（配列番号１９）との重複伸長によってひとまとめにした。Ｆｃライブラリー遺伝子を以下のサーモサイクリングプログラムを用いて増幅した：９４℃で５分を１サイクル；９４℃で１分、５５℃で１分、および７２℃で１．５分を３０サイクル；７２℃で５分を１サイクル。増幅された重鎖ライブラリー遺伝子を、ＳｆｉＩ消化したｐＭｏｐａｃ１２−ｐｅｌＢ−ＩｇＧ−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＦＬＡＧベクターにインフレームでライゲーションした。得られたプラスミドを、プラスミドｐＢＡＤ３０−ＰｅｌＢ−ＶＬ−Ｃｋ−ＮｌｐＡ−ＶＬ−Ｃｋ−Ｈｉｓ−ｃＭｙｃを含有するＥ．ｃｏｌｉ  ＪＵＤＥ−１細胞中に形質転換した（Junget al., 2010; Jung et al., 2012; Lee et al., 2017）。ライブラリーのサイズは１×１０８であった。
【０１４０】
（実施例３）
ヒトＦｃＲｎ−β２ｍ−ＧＳＴの調製
ＦｃＲｎの哺乳動物での発現のためのプラスミドを以前に記載されている通り構築した（Leeet al., 2017）。ＦｃＲｎ−β２ｍ−ＧＳＴを、ｐｃＤＮＡ３．４（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を使用したＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の一過性トランスフェクションによって作製した。トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｆ細胞を、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で５日間培養した。４，０００×ｇで１０分間遠心分離することによって上清を採取し、０．２２μｍのポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）メンブランフィルター（ＰＡＬＬ）を使用して濾過した。ＦｃＲｎ−β２ｍ−ＧＳＴを、グルタチオンセファロース（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）アフィニティーカラムを用い、製造者の指示に従って精製した。リポ多糖（ＬＰＳ）および非特異的に結合したタンパク質を除去するために、ＦｃＲｎ−β２ｍ−ＧＳＴ結合樹脂を、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するＰＢＳ、５０ｍＬ、およびＰＢＳ、５０ｍＬを用いて洗浄した。ＦｃＲｎ−β２ｍ−ＧＳＴを、１０ｍＭの還元型Ｌ−グルタチオンを含有するＰＢＳを用いて溶出した。溶出したＦｃＲｎ−β２ｍ−ＧＳＴの緩衝液を、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）ユニットを使用してＰＢＳと交換した。また、単鎖ＦｃＲｎ−β２ｍ−ｈｉｓ（ｓｃＦｃＲｎ）をＡｃｒｏ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入した（Ｃａｔ番号ＦＣＭ−Ｈ５２８６）。ヒトｓｃＦｃＲｎをＦＩＴＣ  Ｆａｓｔ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｂｃａｍ、Ｃａｔ番号ａｂ１８８２８５）を製造者の指示に従って使用して、ＦＩＴＣで標識した。さらに、ヒトＦｃＲｎ−β２ｍ−ＧＳＴをＥａｓｙＬｉｎｋ  Ｒ−ＰＥ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｂｃａｍ）を製造者の指示に従って使用してＲ−フィコエリトリン（Ｒ−ＰＥ）で標識した。
【０１４１】
ＦｃγＲの哺乳動物での発現のためのプラスミドを以前に記載されている通り構築した（Junget al., 2012 and Lee et al., 2017）。ＦｃγＲＩ−Ｈｉｓ、ＦｃγＲＩＩａ−Ｈ１３１−ＧＳＴ、ＦｃγＲＩＩａ−Ｒ１３１−ＧＳＴ、ＦｃγＲＩＩｂ−ＧＳＴ、ＦｃγＲＩＩＩａ−Ｖ１５８−ＧＳＴ、およびＦｃγＲＩＩＩａ−Ｆ１５８−ＧＳＴを、表１１に記載されているｐＭＡＺ−ＩｇＨ（米国特許第８，０４３，６２１号）由来の発現ベクターを使用してＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の一過性トランスフェクションによって作製した。詳細な手順は上の段落に記載した。ＦｃγＲＩ−Ｈｉｓを、Ｎｉ−ＮＴＡ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）アフィニティーカラムを用い、製造者の指示に従って精製した。２５０ｍＭのイミダゾールを含有するＰＢＳを用いてＦｃγＲＩ−Ｈｉｓを溶出した。ＦｃγＲ−ＧＳＴをＦｃＲｎ−β２ｍ−ＧＳＴと同じ方法で精製した。全ての溶出したＦｃγＲの緩衝液をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によってＰＢＳと交換した。
【０１４２】
（実施例４）
ＦｃＲｎに対するＦｃライブラリーのスクリーニング
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＵＤＥ−１細胞を、クロラムフェニコール（４０μｇ／ｍＬ）およびカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を伴うＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）中、３７℃、２５０ｒｐｍで一晩培養した。一晩育成させた後、細胞を、２種の抗生物質を伴う新鮮なＴＢ培地１００ｍＬ中、１：５０に希釈した。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＵＤＥ−１細胞を３７℃、２５０ｒｐｍでＯＤ６００がおよそ０．４の値に達するまで培養した。次いで、タンパク質の発現を容易にするために、１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）および２％Ｌ−アラビノース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）をＥ．ｃｏｌｉ  ＪＵＤＥ−１細胞に添加し、次いで、細胞を２５℃で２０時間さらにインキュベートした。培養物（培養体積８ｍＬ）を遠心分離によって収集し、氷で冷却した１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＬで２回洗浄した。洗浄した細胞を氷で冷却したＳＴＥ溶液（０．５Ｍのスクロース、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）、１ｍＬに再懸濁させ、３７℃で３０分インキュベートした。細胞を１３，０００ｒｐｍで１分遠心分離し、溶液Ａ（０．５Ｍのスクロース、２０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＭＯＰＳ、ｐＨ６．８）、１ｍＬで洗浄した。洗浄した細胞を、溶液Ａ、１ｍＬ中、１ｍｇ／ｍＬのニワトリ卵リゾチーム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と一緒に３７℃で１５分間インキュベートした。１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した後、ペレット化したスフェロプラストを冷たいＰＢＳ１ｍＬに再懸濁させた（Jung et al., 2010; Jung et al., 2012; Lee et al., 2017）。
【０１４３】
増強されたＦｃＲｎ結合ＩｇＧ１バリアントを単離するために、実施例１および２に記載のライブラリーを発現する細胞を１００ｎＭのＦｃＲｎ−β２ｍ−ＦＩＴＣで標識し、ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によってスクリーニングした。スクリーニングのＦＡＣＳの４ラウンドそれぞれについて、最も高い蛍光を示す集団の上位３％を回収し、これらの選別されたスフェロプラストを再選別して偽陽性をすぐに除去した。選別されたスフェロプラスト中の重鎖遺伝子を、５分間煮沸した後、２種のプライマー（ＰＣＨＴ０１およびＰＣＨＴ０８）を使用してＰＣＲによってレスキューし、ＳｆｉＩにより切断したｐＭｏｐａｃ１２ベクターにライゲーションした。ライゲーションしたプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ  ＪＵＤＥ−１細胞中に形質転換した。クロラムフェニコール含有培地およびカナマイシン含有培地において形質転換体を選択し、１００ｎＭのＦｃＲｎ−β２ｍ−ＦＩＴＣを使用して次のラウンドのスクリーニングのためにスフェロプラストを調製した（図３Ａ〜Ｂ）。ＦｃＲｎに対するｐＨ依存性結合ＩｇＧバリアントを単離するために、スフェロプラストをｐＨ５．８のＰＢＳで１００ｎＭの単鎖ＦｃＲｎ−β２ｍ−ＦＩＴＣを用いて標識し、次いで、ｐＨ７．４のＰＢＳでＦｃＲｎ−β２ｍ−ＧＳＴ−ＡＰＣと一緒にインキュベートした（図３Ａ）。次に、ＦＩＴＣ陽性およびＡＰＣ陰性シグナルを有するスフェロプラストを選別する（図３Ｂ）。
【０１４４】
（実施例５）
ＩｇＧバリアントのＦＡＣＳ解析
４種のＩｇＧバリアント、ＥＤＨ（Ｖ２６４Ｅ、Ｌ３０９Ｄ、およびＱ３１１Ｈ）、ＥＤＨＳ（配列番号５；Ｖ２６４Ｅ、Ｌ３０９Ｄ、Ｑ３１１Ｈ、およびＮ４３４Ｓ）、ＥＤＨＹ（配列番号６；Ｖ２６４Ｅ、Ｌ３０９Ｄ、Ｑ３１１Ｈ、およびＮ４３４Ｙ）、およびＴＥＤＨＹ（Ａ２３１Ｔ、Ｖ２６４Ｅ、Ｌ３０９Ｄ、Ｑ３１１Ｈ、およびＮ４３４Ｙ）を同定した。それぞれの遺伝子をＥ．ｃｏｌｉ  ＪＵＤＥ−１中に形質転換し、その細胞をスフェロプラスト化し、ｐＨ５．８のＰＢＳ中１０ｎＭのＦｃＲｎ−β２ｍ−ＦＩＴＣまたはｐＨ７．４のＰＢＳ中５０ｎＭのＦｃＲｎ−β２ｍ−ＧＳＴ−ＡＰＣを用いてＦＡＣＳによって解析した。図４に示されている通り、４種のＩｇＧバリアントでＦｃＲｎ−β２ｍ−ＦＩＴＣに関して野生型非グリコシル化ＩｇＧと比べて２．６〜５．１倍の平均蛍光強度（ＭＦＩ）値が示された。ｐＨ７．４のＰＢＳ中ＦｃＲｎ−β２ｍ−ＧＳＴ−ＡＰＣについては、ＥＤＨＹおよびＴＥＤＨＹが野生型ＩｇＧ１よりも有意に高い結合活性を示したが、ＥＤＨおよびＥＤＨＳは野生型ＩｇＧ１と比較して同様またはわずかに増大した結合活性を示した。
【０１４５】
（実施例６）
選択された変異体ＩｇＧバリアントの発現および精製
全てのプラスミドおよびプライマーを表４、１０および１１に記載する。４種の変異体Ｆｃ遺伝子をｐＭｏｐａｃ１２−ｐｅｌＢ−ＩｇＧ−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＦＬＡＧから２種の特異的なプライマー（ＴＨ０８３（配列番号２０）およびＴＨ０８４（配列番号２１））を使用して増幅した。ｐｃＤＮＡ３．４−ＩｇＨプラスミドを、２種の特異的なプライマー（ＴＨ０８１（配列番号２２）およびＴＨ０８２（配列番号２３））を使用して増幅した。４種のＦｃ遺伝子をｐｃＤＮＡ３．４にＧｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）クローニングキット（ＮＥＢ）を製造者の指示に従って使用してクローニングした（Lee et al., 2017）。Ｇｉｂｓｏｎによりアセンブルされた混合物をＥ．ｃｏｌｉ  ＪＵＤＥ−１細胞中に形質転換し、それらの配列を確認した。また、トラスツズマブのＦａｂを使用した。４種のトラスツズマブ−Ｆｃバリアントの重鎖遺伝子を、等質量の軽鎖プラスミドを用いてＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に一過性にトランスフェクトした。５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で６日間インキュベートした後、４，０００×ｇで１０分間遠心分離することによって上清を採取し、０．２２μｍのＰＥＳメンブランフィルター（ＰＡＬＬ）を使用して濾過した。濾過した上清を、プロテインＡ大容量アガロース樹脂（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を３回通過させた。ＬＰＳおよび非特異的に結合したタンパク質を除去するために、ＩｇＧ結合樹脂を０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するＰＢＳ、５０ｍＬおよびＰＢＳ、５０ｍＬで洗浄した。全てのＩｇＧバリアントを、１００ｍＭのグリシン緩衝液（ｐＨ３．０）を用いて溶出し、１Ｍのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いてすぐに中和した。溶出したトラスツズマブ−Ｆｃ抗体バリアントの全ての緩衝液をＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ−４（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によってＰＢＳと交換した。上記の通りＨＥＫ２９３細胞において発現させたトラスツズマブ−Ｆｃ抗体バリアントおよび真正（ｗ．ｔ．）トラスツズマブについての還元タンパク質または非還元タンパク質の純度を、還元条件下および非還元条件下で４％〜２０％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ＮｕＳｅｐ）によって評価した。
【０１４６】
（実施例７）
選択されたＩｇＧバリアントのヒトＦｃＲｎおよびＦｃγＲに対する結合特性
３種のＩｇＧバリアント、ＥＤＨ、ＥＤＨＳおよびＥＤＨＹのヒトＦｃＲｎに対する結合親和性を、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）および表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて評価した。
【０１４７】
ＳＰＲ測定：ＳＰＲ測定をＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）３０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）計器で実施した。ＣＭ５センサーチップの参照チャネルをいかなるタンパク質も固定化せずに閉じて緩衝液の影響および非特異的結合シグナルを差し引いた。臨床グレードのハーセプチン、ＥＤＨ、ＥＤＨＹ、およびＥＤＨＳをｐＨ５．０においてアミンカップリング法によってＣＭ５センサーチップ上に固定化した。ｐＨ５．８のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、１．８ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、２．７ｍＭのＫＣｌ、および１３７ｍＭのＮａＣｌ）中、段階的に希釈したＦｃＲｎ（４００〜２５ｎＭ）タンパク質をＣＭ５チップに３０μＬ／分で１分間注入した。各結合事象後に１０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）を接触時間１分で用いてチップを再生させた。得られたセンサーグラムを、Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ３．０ソフトウェアを使用し、１：１ラングミュアモデルを用いてフィッティングした（図５；表５）。対照群として、以前報告されたハーセプチン−ＬＳ（Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、Ｘｅｎｃｏｒ）およびハーセプチン−ＹＴＥ（Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ）を同じ方法によってＣＭ５センサーチップに固定化し、解析した。ハーセプチン−ＥＤＨは野生型ハーセプチンと比較して同様の親和性を示した（図５Ａ〜Ｂ；表５）。他方では、ハーセプチン−ＥＤＨＹおよびハーセプチン−ＥＤＨＳはそれぞれハーセプチンの１９．６倍および５．９倍に増強された親和性を示した（図５Ｃ〜Ｄ；表５）。ハーセプチン−ＬＳおよびハーセプチン−ＹＴＥは、それぞれハーセプチンの１０倍および２３．９倍に増強された親和性を示し、これらは、以前の報告と一致する結果であった（図５Ｅ〜Ｆ；表５）。
【表５】
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【０１４８】
ｈＦｃＲｎを用いたＩｇＧバリアントのＥＬＩＳＡ測定：ＥＤＨ、ＥＤＨＹ、ＥＤＨＳ、またはハーセプチンのそれぞれ１μｇを９６ウェルＥＩＡ／ＲＩＡプレート（Ｑｉａｇｅｎ）上に４℃で一晩にわたってコーティングし、プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（ＰＢＳＴ）を含有するＰＢＳで３回洗浄した。プレートを、ＰＢＳ中１×フィッシュゼラチンブロッキング溶液（Ｂｉｏｔｉｕｍ）を用いて室温で１時間にわたってブロッキングし、ＰＢＳＴで３回洗浄した。次いで、段階的に希釈した二量体ＦｃＲｎ−β２ｍ−ＧＳＴ（１００ｎＭ〜０．８１２５ｎＭ）をプレートに添加した。室温で１時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳＴで洗浄し、次いでそれを、１：５０００のヤギ抗ＧＳＴ  ＨＲＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を含有するＰＢＳ、５０μＬと一緒に１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、ウェル当たり５０μＬのＴＭＢ基質を添加し（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１ＭのＨ２ＳＯ４、５０μＬを添加して中和し、４５０ｎｍにおける吸光度を記録した。野生型ハーセプチン、ハーセプチン−ＥＤＨ、およびハーセプチン−ＥＤＨＳは生理的ｐＨ７．４において二量体ＦｃＲｎ−β２ｍ−ＧＳＴに対していかなる結合活性も示さなかった。他方では、ハーセプチン−ＬＳおよびハーセプチン−ＥＤＨＹは生理的ｐＨ７．４において二量体ＦｃＲｎ−β２ｍ−ＧＳＴに対して有意な結合活性を示した。
【０１４９】
特に、ＥＤＨＳは、ｐＨ５．８では５．９倍増強されたＫＤを示し、ｐＨ７．４ではＦｃＲｎに対する結合シグナルは示さなかった。
【０１５０】
ｈＦｃγＲを用いたＩｇＧバリアントのＥＬＩＳＡ測定：ＥＤＨＳのヒトＦｃγＲに対する結合特性をアッセイした。簡単に述べると、野生型ハーセプチンまたはハーセプチン−ＥＤＨＳそれぞれ１μｇを９６ウェルＥＩＡ／ＲＩＡプレート（Ｑｉａｇｅｎ）に４℃で一晩にわたってコーティングし、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。プレートを、ＰＢＳ中１％ＢＳＡを用いて室温で１時間ブロッキングし、ＰＢＳＴで３回洗浄した。次いで、段階的に希釈した単量体Ｈｉｓ−ＦｃγＲＩ、二量体ＧＳＴ−ＦｃγＲＩＩａＲ１３１、二量体ＧＳＴ−ＦｃγＲＩＩａＨ１３１、二量体ＧＳＴ−ＦｃγＲＩＩｂ、二量体ＧＳＴ−ＦｃγＲＩＩＩａＶ１５８、および二量体ＧＳＴ−ＦｃγＲＩＩＩａＦ１５８をプレートに添加した。室温で１時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳＴで洗浄し、１：５０００のヤギ抗Ｈｉｓまたは抗ＧＳＴ  ＨＲＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を含有するＰＢＳ、５０μＬと一緒に１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、ウェル当たり５０μＬのＴＭＢ基質を添加し（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１ＭのＨ２ＳＯ４、５０μＬを添加して中和し、４５０ｎｍにおける吸光度を記録した。ハーセプチン−ＥＤＨＳでは、全てのＦｃγＲに対して野生型ハーセプチンと比較して結合シグナルの有意な低減が示された（図７Ａ〜Ｆ）。
【０１５１】
（実施例８）
ＤＨＳ−Ｆｃバリアントの構築および特徴付け
ＦｃγＲによるエフェクター機能は、病原体を除去するために必須である、抗体に媒介される免疫応答である。ハーセプチン−ＥＤＨＳは、エフェクターＦｃγＲに結合することができなかった。ハーセプチン−ＥＤＨＳは、４つのアミノ酸置換、Ｖ２６４Ｅ、Ｌ３０９Ｄ、Ｑ３１１Ｈ、およびＮ４３４Ｓを含有する。Ｖ２６４Ｅにより、エフェクターＦｃＲへの結合のために重大であるＩｇＧのグリコシル化が損なわれる（Xiaojie Yu et al., 2013）。したがって、Ｖ２６４Ｅ変異を有さないハーセプチン−ＤＨＳ（配列番号７；Ｌ３０９Ｄ；Ｑ３１１Ｈ；Ｎ４３４Ｓ）を構築した。ＤＨＳのヒトＦｃＲｎおよびＦｃγＲへの結合親和性を酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）および表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）で評価した。
【０１５２】
ＳＰＲ測定：ＳＰＲ測定をＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）３０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）計器で実施した。ＣＭ５センサーチップの参照チャネルをいかなるタンパク質も固定化せずに閉じて緩衝液の影響および非特異的結合シグナルを差し引いた。ハーセプチン−ＤＨＳをｐＨ５．０においてＣＭ５センサーチップ上にアミンカップリング法によって固定化した（Lee et al., 2017）。ｐＨ５．８のＰＢＳ中、段階的に希釈したＦｃＲｎ（４００〜２５ｎＭ）タンパク質をＣＭ５チップに３０μＬ／分で１分間注入した。各結合事象後に１０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）を接触時間１分で用いてチップを再生させた。得られたセンサーグラムを、Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ３．０ソフトウェアを使用し、１：１ラングミュアモデルを用いてフィッティングした（図８）。ハーセプチン−ＤＨＳは、ハーセプチン−ＥＤＨＳと比較して、同様の親和性、１１１±２０ｎＭのＫＤを示した（図５および８；表５）。ハーセプチン−ＥＤＨＳからのＶ２６４Ｅの除去はＦｃＲｎ結合能に影響を及ぼさない。
【０１５３】
ｈＦｃＲｎを用いたＩｇＧバリアントのＥＬＩＳＡ測定：ハーセプチン−ＤＨＳそれぞれ１μｇを９６ウェルＥＩＡ／ＲＩＡプレート（Ｑｉａｇｅｎ）に４℃で一晩にわたってコーティングし、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。プレートを、ＰＢＳ中１×フィッシュゼラチンブロッキング溶液（Ｂｉｏｔｉｕｍ）を用いて室温で１時間ブロッキングし、ＰＢＳＴで３回洗浄した。次いで、段階的に希釈した二量体ＦｃＲｎ−β２ｍ−ＧＳＴ（１００ｎＭ〜０．８１２５ｎＭ）をプレートに添加した。室温で１時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳＴで洗浄し、次いでそれを１：５０００のヤギ抗ＧＳＴ  ＨＲＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を含有するＰＢＳ、５０μＬと一緒に１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、ウェル当たり５０μＬのＴＭＢ基質を添加し（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１ＭのＨ２ＳＯ４、５０μＬを添加して中和し、４５０ｎｍにおける吸光度を記録した。ハーセプチン−ＤＨＳは、野生型ハーセプチンと比較して、生理的ｐＨ７．４において二量体ＦｃＲｎ−β２ｍ−ＧＳＴに対していかなる結合活性も示さなかった。対照として、ハーセプチン−ＬＳおよびハーセプチン−Ｎ４３４Ｓを同時に試験した。
【０１５４】
ｈＦｃγＲを用いたＩｇＧバリアントのＥＬＩＳＡ測定：ＥＤＨＳのヒトＦｃγＲに対する結合特性を上記の通りアッセイした。簡単に述べると、野生型ハーセプチンまたはハーセプチン−ＥＤＨＳそれぞれ１μｇを９６ウェルＥＩＡ／ＲＩＡプレート（Ｑｉａｇｅｎ）に４℃で一晩にわたってコーティングし、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。プレートを、ＰＢＳ中１％ＢＳＡを用いて室温で１時間ブロッキングし、ＰＢＳＴで３回洗浄した。次いで、段階的に希釈した単量体Ｈｉｓ−ＦｃγＲＩ、二量体ＧＳＴ−ＦｃγＲＩＩａＲ１３１、二量体ＧＳＴ−ＦｃγＲＩＩａＨ１３１、二量体ＧＳＴ−ＦｃγＲＩＩｂ、二量体ＧＳＴ−ＦｃγＲＩＩＩａＶ１５８、および二量体ＧＳＴ−ＦｃγＲＩＩＩａＦ１５８をプレートに添加した。室温で１時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳＴで洗浄し、１：５０００のヤギ抗Ｈｉｓまたは抗ＧＳＴ  ＨＲＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を含有するＰＢＳ、５０μＬと一緒に１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、ウェル当たり５０μＬのＴＭＢ基質を添加し（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１ＭのＨ２ＳＯ４、５０μＬを添加して中和し、４５０ｎｍにおける吸光度を記録した。ハーセプチン−ＤＨＳは、全てのＦｃγＲに対して、野生型ハーセプチンと比較して同じ結合プロファイルを示した（図１０Ａ〜Ｆ）。
【０１５５】
ＳＰＲ測定：ＳＰＲ測定をＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）３０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）計器で実施した。ＣＭ５センサーチップの参照チャネルをいかなるタンパク質も固定化せずに閉じて緩衝液の影響および非特異的結合シグナルを差し引いた。野生型ハーセプチン、ハーセプチン−ＤＨＳ、ハーセプチン−ＬＳ、およびハーセプチン−ＹＴＥをｐＨ５．０においてアミンカップリング法によってＣＭ５センサーチップ上に固定化した。ｐＨ７．４のＨＢＳ−ＥＰ中、段階的に希釈したＦｃγＲまたはＣ１ｑ（４００〜２５ｎＭ）タンパク質をＣＭ５チップに３０μＬ／分で１分間注入した。各結合事象後に１０ｍＭのグリシン（ｐＨ５．０）を接触時間１分で用いてチップを再生させた。得られたセンサーグラムを、Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ３．０ソフトウェアを使用し、１：１ラングミュアモデルまたは等結合モデルを用いてフィッティングした（図１８および表１２）。Ｆｃ受容体についての動態解析の結果は、ＥＬＩＳＡ結果と一致した。ハーセプチン−ＤＨＳは、ＦｃγＲおよびＣ１ｑに対して、野生型ハーセプチンと比較して同等の動態値を示したが、ハーセプチン−ＬＳおよびハーセプチン−ＹＴＥでは、ＦｃγＲ結合能、特に、ＡＤＣＣに重要な受容体であるＦｃγＲＩＩＩａ結合能が有意に失われた（図１８および表１２）。
【０１５６】
結論として、Ｖ２６４Ｅの除去はハーセプチン−ＥＤＨＳのＦｃＲｎへのｐＨ依存性ＦｃＲｎ結合能に影響を及ぼさないが、ＦｃγＲに対する結合能力を回復させる。
【表１２−１】
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【表１２−２】
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【０１５７】
（実施例９）
ハーセプチン−ＤＨＳのエフェクター機能
ＡＤＣＣアッセイ：ＡＤＣＣアッセイの前日に、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を健康なドナー由来のヒト血液から単離した。ヒト血液５０ｍＬをヘパリン添加バイアル（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に採取し、チューブを数回穏やかに反転させることによって十分に混合した。血液２５ｍＬを５０ｍＬコニカルチューブ中の室温のフィコールＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）２５ｍＬ上に層状に重ねた。チューブを、スイングバケットローター中、ブレーキなしで、２，５００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。ヒトＰＢＭＣをｈｉｓｔｏｐａｑｕｅと培地との相間において吸引した。ヒトＰＢＭＣを赤血球（ＲＢＣ）溶解緩衝液（１５５ｍＭのＮＨ４Ｃｌ、１２ｍＭのＮａＨＣＯ３、および０．１ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁させ、ＰＢＳで２回洗浄した。単離されたヒトＰＢＭＣを、９６ウェルプレート中、カルセインＡＭ標識したＳＫ−ＢＲ３  Ｈｅｒ２陽性がん細胞および種々の濃度のＩｇＧバリアントと混合した。腫瘍対エフェクター細胞の比を１：１０とし、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベートした。腫瘍細胞溶解のパーセントを次式に従って計算した：１００×（Ｅ−Ｓ）／（Ｍ−Ｓ）（式中、Ｅは実験ウェルの蛍光であり、Ｓは抗体の非存在下での蛍光であり（腫瘍細胞を培地およびエフェクター細胞と一緒にインキュベートした）、Ｍは溶解緩衝液を用いた腫瘍細胞の蛍光である）。実施例８に記載の通り、ハーセプチン−ＤＨＳは、ＰＢＭＣでハーセプチンと比較して同等のＡＤＣＣ活性を示した。なぜなら、ハーセプチン−ＤＨＳがＦｃγＲに対してハーセプチンと比較して同じ親和性を有するからである（図１０Ａ〜Ｆおよび１１Ａ）。
【０１５８】
ＡＤＣＰアッセイ：ＣＤ１４陽性単球をＰＢＭＣからＣＤ１４  ＭｉｃｒｏＢｅａｄ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して精製した。次いで、単球を、１５％ＦＢＳおよび５０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦを含有するＲＰＭＩ培地で７日間培養することによってマクロファージに分化させ、その後、カルセインで標識したＳＫ−ＢＲ３細胞とエフェクター：腫瘍細胞比１０：１で組み合わせた。ＡＤＣＰアッセイのために、ＳＫ−ＢＲ３細胞を種々の濃度の抗体およびマクロファージと一緒にインキュベートした。３７℃で２時間後に、細胞を抗ＣＤ１１ｂ−ＡＰＣおよび抗ＣＤ１４−ＡＰＣで標識した。ファゴサイトーシスをＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）でＦＡＣＳによって評価し、試料中の腫瘍細胞の総数にわたる二重陽性細胞の分率として報告した。ハーセプチン−ＤＨＳはＰＢＭＣでハーセプチンと比較して同等のＡＤＣＣ活性を示した。なぜなら、ハーセプチン−ＤＨＳがＦｃγＲに対してハーセプチンと比較して同じ親和性を有するからである（図１０Ａ〜Ｆおよび１１Ｂ）。
【０１５９】
（実施例１０）
ハーセプチン−ＤＨＳのＦｃＲｎに対する結合特性
ハーセプチン−ＤＨＳの詳細なｐＨ依存性結合活性を調査するために、抗体を３つの異なる密度のｓｃＦｃＲｎを用いてまたは異なるｐＨ条件でＳＰＲによって評価した。
【０１６０】
ＳＰＲ測定：ＳＰＲ測定をＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）３０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）計器で実施した。ＣＭ５センサーチップの参照チャネルをいかなるタンパク質も固定化せずに閉じて緩衝液の影響および非特異的結合シグナルを差し引いた。ｓｃＦｃＲｎを、ｐＨ５．０において、アミンカップリング法によってＣＭ５センサーチップ上に３つの異なる固定化レベル（５００ＲＵ、２０００ＲＵ、および４０００ＲＵ）で固定化した。ｐＨ７．４のＰＢＳ中、段階的に希釈した抗体（４００〜２５ｎＭ）タンパク質をＣＭ５チップに３０μＬ／分で１分間注入した。各結合事象後に１０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）を接触時間１分で用いてチップを再生させた。得られたセンサーグラムを、Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ３．０ソフトウェアを使用し、１：１ラングミュアモデルを用いてフィッティングした（図１２および表６）。ハーセプチン−ＤＨＳおよび野生型ハーセプチンでは、低密度、中密度および高密度のｓｃＦｃＲｎを用いていかなる結合シグナルも示されなかった。ハーセプチン−ＬＳおよびハーセプチン−ＹＴＥでは、低密度のｓｃＦｃＲｎを用いるといかなる結合シグナルも示されなかったが、中密度および高密度で固定化されたｓｃＦｃＲｎに対しては有意な結合が示された（表６）。ハーセプチン−ＬＳのＫＤは、中密度のＦｃＲｎでは５８．７ｎＭであり、高密度のＦｃＲｎでは２２．７ｎＭである。ハーセプチン−ＹＴＥのＫＤは中密度のＦｃＲｎでは４．７３μＭであり、高密度のＦｃＲｎでは４．２９μＭである。
【表６】
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次に、抗体の詳細なｐＨ依存性結合活性を調査するために、抗体を多様なｐＨ条件でアッセイした。１μＭの野生型ハーセプチン、ハーセプチン−ＤＨＳ、ハーセプチン−ＬＳ、およびハーセプチン−ＹＴＥを、ｐＨ４．５〜８．５のＰＢＳ中、ＣＭ５チップに３０μＬ／分で１分間注入した。各結合事象後に１０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）を接触時間１分で用いてチップを再生させた。図１３Ａ〜Ｃに示されている通り、ハーセプチン−ＤＨＳは野生型ハーセプチンよりも良好な結合活性を示したが、ハーセプチン−ＤＨＳは３つの異なるＦｃＲｎ密度、ｐＨ６．２からｐＨ６．５までの条件下でＦｃＲｎ結合活性を有意に喪失した。また、ハーセプチン−ＤＨＳはｐＨ６．８においてＦｃＲｎ結合活性を完全に喪失した。
【０１６１】
（実施例１１）
ヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウスにおけるハーセプチン−ＤＨＳの薬物動態
改変されたＩｇＧの薬物動態を、マウスＦｃＲｎ欠損Ｂ６．１２９Ｘ１−Ｆｃｇｒｔｔｍ１Ｄｃｒ／ＤｃｒＪとｈＦｃＲｎ  ｃＤＮＡトランスジェニック系統Ｂ６．Ｃｇ−Ｆｃｇｒｔｔｍ１Ｄｃｒ  Ｔｇ（ＣＡＧ−ＦＣＧＲＴ）２７６  Ｄｃｒ／ＤｃｒＪのＦ１交配によって作製されたヘミ接合性ｈＦｃＲｎトランスジェニックマウス（２７６系統）において実施した（Roopenian et al., 2003 and Chaudhury et al., 2003）。０日目に、ｈＦｃＲｎマウスに２ｍｇ／ｋｇの抗体のボーラス静脈内（ＩＶ）用量を与えた。抗体当たり１１匹のマウスを使用した。２〜３週間の研究全体を通して異なる時点において血液試料を尾静脈からキャピラリーピペットを使用して得た。定量的ＥＬＩＳＡを使用して、試験した抗体の血清中濃度をモニタリングした。簡単に述べると、９６ウェルプレートを２μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）２断片特異的Ｆ（ａｂ’）２（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）でコーティングした。プレートを、ＰＢＳ中１％フィッシュゼラチン（ＡＭＲＥＳＣＯ−ｉｎｃ）を用いて１時間にわたってブロッキングし、次いで、適切に希釈した血清試料（前の時点では１：２００、および後の時点では１：５０または１：１００）と一緒にインキュベートした。抗カッパ軽鎖抗体−ＨＲＰ（Ａｂｃａｍ）を使用してヒト抗体を検出した（希釈１：５，０００）。ＴＭＢ基質（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を製造者の指示に従って発色させた後、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。１：１００の予め採血したマウス血清に希釈した各抗体バリアントについて標準曲線を作成した。次いで、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）で作成された標準曲線の直線部分を使用して血清試料中のヒトＩｇＧを定量化した。ＡＵＣｉｎｆ（無限大までの曲線下面積）を、対数線形台形法を使用して計算した。消失半減期（Ｔ１／２）を、測定可能な濃度を伴う少なくとも最後の３回の試料採取時点を含む濃度データの対数線形回帰を使用して計算した。血清クリアランスをＣＬ＝用量／ＡＵＣｉｎｆとして推定した。次いで、主要なＰＫパラメータについての記述統計を計算した。結果として、ハーセプチン−ＤＨＳは野生型ハーセプチンと比して６．８倍のベータ相血清中半減期の増大（β相Ｔ１／２＝３３６±２４．８時間）を示した（図１４および表７）。ハーセプチン−ＤＨＳはまた、野生型ハーセプチンと比して９．５分の１のクリアランス速度（０．０６１±０．００３ｍｌ／日／ｋｇ）、７．９倍に増強されたＡＵＣｉｎｆ（３２６．６±１７．９μｇ＊日／ｍｌ）、および３．９６分の１の組織分布（０．２８±０．０１ｍｌ／ｋｇ）も示した。
【表７】
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【０１６２】
（実施例１２）
ＩｇＧサブクラスにおけるＤＨＳ変異
ＩｇＧには４種のサブクラスメンバー、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４が存在する。ＩｇＧサブクラスにおけるＦｃＲｎ結合部位は高度に保存されており、したがって、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４はＩｇＧ１の血清中半減期に匹敵する血清中半減期を呈する。ＩｇＧの４３５番目の残基に２つの一塩基多型が存在する：ＩｇＧ３−Ｒ４３５は血清中半減期（約８日）が短いが、ＩｇＧ３−Ｈ４３５の半減期は他のＩｇＧサブクラスと比較して同様である（約２１日）。ＤＨＳ変異（Ｌ３０９Ｄ、Ｑ３１１Ｈ、およびＮ４３４Ｓ変異）により他のＩｇＧサブクラスのＦｃＲｎ結合活性を増強することができるかどうかを調査するために、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３−Ｈ４３５、およびＩｇＧ４の重鎖遺伝子にＤＨＳ変異を導入した。ＩｇＧ２−ＤＨＳ、ＩｇＧ３−ＤＨＳ、およびＩｇＧ４−ＤＨＳのＦｃ遺伝子をＩＤＴによって合成し、Ｆｃ遺伝子をｐｃＤＮＡ３．４にＧｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）クローニングキット（ＮＥＢ）を製造者の指示に従って使用してクローニングした（Lee et al., 2017）。Ｇｉｂｓｏｎによりアセンブルされた混合物をＥ．ｃｏｌｉ  ＪＵＤＥ−１細胞中に形質転換し、それらの配列を確認した。また、トラスツズマブのＦａｂを使用した。４種のトラスツズマブ−Ｆｃバリアントの重鎖遺伝子を、等質量の軽鎖プラスミドを用いてＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に一過性にトランスフェクトした。５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で６日間インキュベートした後、４，０００×ｇで１０分間遠心分離することによって上清を採取し、０．２２μｍのＰＥＳメンブランフィルター（ＰＡＬＬ）を用いて濾過した。濾過した上清を、プロテインＡ大容量アガロース樹脂（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を３回通過させた。ＬＰＳおよび非特異的に結合したタンパク質を除去するために、ＩｇＧ結合樹脂を０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するＰＢＳ、５０ｍＬおよびＰＢＳ、５０ｍＬで洗浄した。全てのＩｇＧバリアントを、１００ｍＭのグリシン緩衝液（ｐＨ３．０）を用いて溶出し、１Ｍのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いてすぐに中和した。溶出したトラスツズマブ−Ｆｃ抗体バリアントの全ての緩衝液をＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ−４（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によってＰＢＳと交換した。上記の通りＨＥＫ２９３細胞において発現させたトラスツズマブ−Ｆｃ抗体バリアントおよび真正（ｗ．ｔ．）トラスツズマブについての還元タンパク質または非還元タンパク質の純度を、還元条件下および非還元条件下で４％〜２０％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ＮｕＳｅｐ）によって評価した。
【０１６３】
ＳＰＲ測定：ＳＰＲ測定をＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）３０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）計器で実施した。ＣＭ５センサーチップの参照チャネルをいかなるタンパク質も固定化せずに閉じて緩衝液の影響および非特異的結合シグナルを差し引いた。野生型ＩｇＧ２、野生型ＩｇＧ３、野生型ＩｇＧ４、ＩｇＧ２−ＤＨＳ、ＩｇＧ３−ＤＨＳおよびＩｇＧ４−ＤＨＳをｐＨ５．０においてアミンカップリング法によってＣＭ５センサーチップ上に固定化した。ｐＨ５．８のＰＢＳ中、段階的に希釈したＦｃＲｎ（４００〜２５ｎＭ）タンパク質をＣＭ５チップに３０μＬ／分で１分間注入した。各結合事象後に１０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）を接触時間１分で用いてチップを再生させた。得られたセンサーグラムを、Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ３．０ソフトウェアを使用し、１：１ラングミュアモデルを用いてフィッティングした（図１５）。ＩｇＧ２−ＤＨＳはｓｃＦｃＲｎに対して野生型ＩｇＧ２と比較して５．７倍に増強されたＫＤ（３７７±２６ｎＭ）を示した（図１５Ａ〜Ｂ；表８）。ＩｇＧ３−ＤＨＳはｓｃＦｃＲｎに対して野生型ＩｇＧ３と比較して５．５倍に増強されたＫＤ（７３９±７５ｎＭ）を示した（図１５Ｃ〜Ｄ；表８）。ＩｇＧ４−ＤＨＳはｓｃＦｃＲｎに対して野生型ＩｇＧ４と比較して３．０倍に増強されたＫＤ（８３２±１６ｎＭ）を示した（図１５Ｅ〜Ｆ；表８）。
【表８】
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【０１６４】
ｈＦｃγＲを用いたＩｇＧバリアントのＥＬＩＳＡ測定：ＥＤＨＳのヒトＦｃγＲに対する結合特性をアッセイした。詳細な手順は、上の段落と同じであった。簡単に述べると、野生型ＩｇＧ２、ＩｇＧ２−ＤＨＳ、野生型ＩｇＧ３、ＩｇＧ３−ＤＨＳ、野生型ＩｇＧ４、およびＩｇＧ４−ＤＨＳそれぞれ１μｇを９６ウェルＥＩＡ／ＲＩＡプレート（Ｑｉａｇｅｎ）に４℃で一晩にわたってコーティングし、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。プレートを、ＰＢＳ中１％ＢＳＡを用いて室温で１時間ブロッキングし、ＰＢＳＴで３回洗浄した。次いで、段階的に希釈した単量体Ｈｉｓ−ＦｃγＲＩ、二量体ＧＳＴ−ＦｃγＲＩＩａＲ１３１、二量体ＧＳＴ−ＦｃγＲＩＩａＨ１３１、二量体ＧＳＴ−ＦｃγＲＩＩｂ、二量体ＧＳＴ−ＦｃγＲＩＩＩａＶ１５８、および二量体ＧＳＴ−ＦｃγＲＩＩＩａＦ１５８をプレートに添加した。室温で１時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳＴで洗浄し、１：５０００のヤギ抗Ｈｉｓまたは抗ＧＳＴ  ＨＲＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を含有するＰＢＳ、５０μＬと一緒に１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、ウェル当たり５０μＬのＴＭＢ基質を添加し（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１ＭのＨ２ＳＯ４、５０μＬを添加して中和し、４５０ｎｍにおける吸光度を記録した。ＩｇＧ２−ＤＨＳは全てのＦｃγＲに対して野生型ＩｇＧ２と比較して同じ結合活性を示した（図１６Ａ）。ＩｇＧ３−ＤＨＳは全てのＦｃγＲに対して野生型ＩｇＧ３と比較して同じ結合活性を示した（図１６Ｂ）。ＩｇＧ４−ＤＨＳは全てのＦｃγＲに対して野生型ＩｇＧ４と比較して同じ結合活性を示した（図１６Ｃ）。結論として、３つのアミノ酸置換はＩｇＧサブクラスのＦｃγＲ結合活性に影響を及ぼさない。
【０１６５】
ＰＫ研究：実施例１１と同じ方法を使用して、ＩｇＧ２−ＤＨＳおよびＩｇＧ４−ＤＨＳの薬物動態を評価した。結果として、ＩｇＧ２−ＤＨＳは、野生型ＩｇＧ２と比して２．９倍に増大したベータ相血清中半減期（β相Ｔ１／２＝１９９．８±４．９時間）を示した（図１７および表９）。ＩｇＧ２−ＤＨＳはまた、野生型ＩｇＧ２と比して１．９分の１のクリアランス速度（０．０６７±０．０１５ｍｌ／日／ｋｇ）、１．９倍に増強されたＡＵＣｉｎｆ（１４８．３±７．５μｇ＊日／ｍｌ）、および１．５分の１の組織分布（０．５７±０．０２ｍｌ／ｋｇ）も示した。また、ＩｇＧ４−ＤＨＳは、野生型ＩｇＧ４と比して３．６倍に増大したベータ相血清中半減期（β相Ｔ１／２＝２７７．４±１４．９時間）を示した（図１６および表９）。ＩｇＧ４−ＤＨＳはまた、野生型ＩｇＧ４と比して２．４分の１のクリアランス速度（０．０６７±０．０４８ｍｌ／日／ｋｇ）、２．４倍に増強されたＡＵＣｉｎｆ（１４９．２±６．３μｇ＊日／ｍｌ）、および１．７分の１の組織分布（０．５８±０．０３ｍｌ／ｋｇ）も示した。ＩｇＧ３−ＤＨＳは、野生型ＩｇＧ３と比して４．４倍に増大したベータ相血清中半減期（β相Ｔ１／２＝２８６．３±１４．６時間）を示した（図１９および表１３）。ＩｇＧ３−ＤＨＳはまた、野生型ＩｇＧ３と比して３．８分の１のクリアランス速度（０．０７６±０．００７ｍｌ／日／ｋｇ）、３．９倍に増強されたＡＵＣｉｎｆ（２６９．０±２２．４μｇ＊日／ｍｌ）、および２．１分の１の組織分布（０．４１±０．０５ｍｌ／ｋｇ）も示した（図１９および表１３）。
【表９】
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【表１３】
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【０１６６】
（実施例１３）
リウマチ因子結合特性
関節リウマチ（ＲＡ）を含めた自己免疫疾患を有する患者では、リウマチ因子（ＲＦ）が観察されることが多く、血清抗体が血液から除去されることによって治療抗体の治療有効性が弱まる恐れがある（Newkirk 2002, Ingegnoli et al., 2013、Maeda et al., 2017）。したがって、抗体バリアントのＲＦ結合能をＥＬＩＳＡによって試験した。
【０１６７】
リウマチ因子を用いたＩｇＧバリアントのＥＬＩＳＡ測定：ＤＨＳのＲＦに対する結合特性をアッセイした。簡単に述べると、リウマチ因子陽性血清（Ｌｅｅ  Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）５０μｌを９６ウェルＥＩＡ／ＲＩＡプレート（Ｑｉａｇｅｎ）に４℃で一晩にわたってコーティングし、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。プレートを、ＰＢＳ中１％ＢＳＡを用いて室温で１時間ブロッキングし、ＰＢＳＴで３回洗浄した。次いで、段階的に希釈したビオチン化抗体バリアントをプレートに添加した。室温で１時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳＴで洗浄し、１：５０００のストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含有するＰＢＳ、５０μＬと一緒に１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、ウェル当たり５０μＬのＴＭＢ基質を添加し（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１ＭのＨ２ＳＯ４、５０μＬを添加して中和し、４５０ｎｍにおける吸光度を記録した。ハーセプチン−ＤＨＳは野生型ハーセプチンと匹敵する結合応答レベルを示したが、ハーセプチン−ＹＴＥおよびハーセプチン−ＬＳは野生型ハーセプチンよりも強力な結合活性を示した（図２０）。
【表１０】
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【表１１−１】
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【表１１−２】
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【０１６８】
本明細書において開示され、特許請求されている方法は全て、本開示に照らして、過度な実験を伴わずに準備し実行することができる。本発明の組成物および方法は好ましい実施形態に関して記載されているが、本発明の概念、主旨および範囲から逸脱することなく本明細書に記載の方法および方法のステップまたは一連のステップに変形を適用することができることが当業者には明らかになろう。より詳細には、本明細書に記載の作用物質を化学的かつ生理的に関連するある特定の作用物質で置換することができるが、同じまたは同様の結果が実現されることが明らかになろう。当業者に対して明らかであるそのような同様の置換および改変は全て、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の主旨、範囲および概念の範囲内であるとみなされる。
参考文献
以下の参考文献は、本明細書に記載のものを補足する例示的な手続き上のまたは他の詳細をもたらすものである限りでは、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
米国特許第４，８７０，２８７号
米国特許第５，７３９，１６９号
米国特許第５，７６０，３９５号
米国特許第５，８０１，００５号
米国特許第５，８２４，３１１号
米国特許第５，８３０，８８０号
米国特許第５，８４６，９４５号
米国特許第７，０９４，５７１号
米国特許第７，４１９，７８３号
米国特許第７，６１１，８６６号
米国特許公開第２００３／０２１９８７０号
ＰＣＴ公開ＷＯ２００８／１３７４７５
【化１】
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【化２】
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【化３】
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【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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