(57)【要約】  合成ＨＩＶエンベロープ抗原および他のＨＩＶ抗原をコードするポックスウイルスベクター、ならびにそのようなポックスウイルスベクターを含有する組成物およびＨＩＶに対する改善した免疫を提供するワクチンとしてのそのようなポックスウイルスベクターの使用が提供される。１つまたは複数のＨＩＶ抗原、および１つまたは複数の単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドをコードする開示したポックスウイルスベクター、アデノウイルスベクターを含有するワクチン組合せ物、ならびにＨＩＶに対する改善した免疫を提供するワクチン組合せ物を使用する方法も提供される。
2020527029.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む第１のＨＩＶエンベロープ（Ｅｎｖ）抗原；
（ｂ）前記第１のＨＩＶ  Ｅｎｖ抗原とは異なる第２のＨＩＶ  Ｅｎｖ抗原；
（ｃ）２つの異なるＨＩＶ  Ｇａｇ抗原である第３の抗原および第４の抗原；ならびに、
（ｄ）２つの異なるＨＩＶ  Ｐｏｌ抗原である第５の抗原および第６の抗原
をコードする核酸を含むポックスウイルスベクター。
【請求項２】
前記第２のＨＩＶ  Ｅｎｖ抗原が配列番号５のアミノ酸配列を含み、
前記第３および第４の抗原が、それぞれ配列番号１および配列番号２のアミノ酸配列を含み；ならびに
前記第５および第６の抗原が、それぞれ配列番号３および配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポックスウイルスベクター。
【請求項３】
前記第３および第５の抗原が融合されて、配列番号２８のアミノ酸配列を含む第１のＧａｇ−Ｐｏｌ融合抗原となっており、前記第４および第６の抗原が融合されて、配列番号２９のアミノ酸配列を含む第２のＧａｇ−Ｐｏｌ融合抗原になっている、請求項１または請求項２に記載のポックスウイルスベクター。
【請求項４】
前記第１のＨＩＶ  Ｅｎｖ抗原が配列番号４１によってコードされる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポックスウイルスベクター。
【請求項５】
前記第１のＨＩＶ  Ｅｎｖ抗原が配列番号４１によってコードされ；
前記第２のＨＩＶ  Ｅｎｖ抗原が配列番号３９によってコードされ；
前記第１のＧａｇ−Ｐｏｌ融合抗原が配列番号３８によってコードされ；および
前記第２のＧａｇ−Ｐｏｌ融合抗原が配列番号４０によってコードされる、請求項３に記載のポックスウイルスベクター。
【請求項６】
前記ポックスウイルスベクターが組換え改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）ベクターである、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポックスウイルスベクター。
【請求項７】
前記ＭＶＡベクターが、ＭＶＡ−ＢＮまたはその誘導体を含む、請求項６に記載のポックスウイルスベクター。
【請求項８】
前記第１のＧａｇ−Ｐｏｌ融合抗原および前記第２のＥｎｖ抗原が、ＭＶＡゲノムの遺伝子間領域（ＩＧＲ）４４／４５に挿入され、前記第２のＧａｇ−Ｐｏｌ融合抗原および前記第１のＥｎｖ抗原が、ＭＶＡゲノムのＩＧＲ８８／８９に挿入されている、請求項６または７に記載のポックスウイルスベクター。
【請求項９】
前記第１のＧａｇ−Ｐｏｌ融合抗原および前記第２のＧａｇ−Ｐｏｌ融合抗原がそれぞれ、別個のＰｒ１３．５プロモーターの制御下にあり、前記第１のＥｎｖ抗原および前記第２のＥｎｖ抗原がそれぞれ、別個のＰｒＨｙｂプロモーターの制御下にある、請求項６〜８のいずれか一項に記載のポックスウイルスベクター。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のポックスウイルスベクターおよび薬学的に許容される担体を含むワクチン。
【請求項１１】
（ａ）請求項１〜９のいずれか一項に記載の、免疫学的有効量のポックスウイルスベクターを含む第１のワクチン組成物と、
（ｂ）（ｉ）１つまたは複数の第１、第２、第３、第４、第５、および第６の抗原をコードする免疫学的有効量の１つまたは複数のアデノウイルスベクターを含む第２のワクチン組成物；および、
（ｂ）（ｉｉ）免疫学的有効量の単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドを含む１つまたは複数のポリペプチドを含む第３のワクチン組成物
の少なくとも１つとを含み、第１の組成物ならびに第２および／または第３の組成物が同じ組成物、または１つもしくは複数の異なる組成物中に存在するワクチン組合せ物。
【請求項１２】
前記第２のワクチン組成物が、合わせて、配列番号１８、５、１、２、３、および４をコードする組換えＡｄ２６ベクターを含む、請求項１１に記載のワクチン組合せ物。
【請求項１３】
前記第３のワクチン組成物における１つまたは複数の単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドが、
（ｉ）配列番号７のアミノ酸配列の残基３０〜７０８を含むポリペプチド、または
（ｉｉ）配列番号３６の残基３０〜７２４を含むポリペプチド、または
（ｉｉｉ）ポリペプチド（ｉ）と（ｉｉ）の両方
を含む、請求項１１または１２に記載のワクチン組合せ物。
【請求項１４】
それを必要とする対象においてヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する免疫応答を誘導する方法であって、請求項１０に記載のワクチンまたは請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のワクチン組合せ物を前記対象に投与するステップを含む方法。
【請求項１５】
それを必要とする対象において、ヒト免疫不全ウイルスに対する免疫応答を誘導する方法であって、
（ａ）配列番号１、２、３、４、５および１８の１つまたは複数をコードする１つまたは複数の組換えアデノウイルスベクター、好ましくはＡｄ２６ベクターを含む第１のワクチン；および
（ｂ）請求項１〜９のいずれか一項に記載のポックスウイルスベクターを含む第２のワクチン；
を前記対象に投与するステップを含み、ここで前記第１のワクチンがプライムワクチンであり、前記第２のワクチンがブーストワクチンであり、または前記第２のワクチンがプライムワクチンであり前記第１のワクチンがブーストワクチンである、方法。
【請求項１６】
前記ブーストワクチンとほぼ同時に、１つまたは複数の単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドを対象に投与するステップをさらに含み、前記１つまたは複数のＨＩＶ抗原性ポリペプチドが、好ましくは、
（ｉ）配列番号７のアミノ酸配列の残基３０〜７０８を含むポリペプチド；または
（ｉｉ）配列番号３６の残基３０〜７２４を含むポリペプチド；または
（ｉｉｉ）ポリペプチド（ｉ）と（ｉｉ）の両方
を含み、前記１つまたは複数の単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドが、前記ブーストワクチンと同じ組成物中、または前記ブーストワクチンとは別の組成物中にある、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記対象が、ＨＩＶが感染している対象である、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法１１９条（ｅ）に従って、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１７年６月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／５２０，０７９号の優先権を主張する。
【０００２】
電子出願された配列表の参照
本出願は、作成日２０１７年６月７日、サイズ１７４．４ＫＢのファイル名「６８８０９７−３３１ＷＯ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｌｉｓｔｉｎｇ」であるＡＳＣＩＩフォーマットされた配列表としてＥＦＳ−Ｗｅｂにより電子的に提出される配列表を含有する。ＥＦＳ−Ｗｅｂによって提出される配列表は、明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は、世界中で数百万人の人々を冒し、有効なワクチンによるＨＩＶの予防は、抗レトロウイルス処置が普及した時代であってさえも、優先順位が非常に高いままである。ＨＩＶ−１は、ウイルスの最も一般的な病原性株であり、９０％より多くのＨＩＶ／ＡＩＤＳの症例が、ＨＩＶ−１のグループＭによる感染に由来する。Ｍグループは、クレードまたはサブタイプにさらに細分される。有効なワクチンは、理想的には、強力な細胞応答と異なるクレード由来のＨＩＶ−１株を中和することができる広範な中和抗体の両方を引き出すことができる。
【０００４】
ＨＩＶ−１の高い遺伝的変動により、ＨＩＶ−１ワクチンの開発は前例のない難題となっている。潜在的なＴ細胞エピトープの適用範囲を改善し、細胞応答を改善するため、ＨＩＶ群抗原（Ｇａｇ）、ポリメラーゼ（Ｐｏｌ）、およびエンベロープ（Ｅｎｖ）タンパク質に由来する、「モザイク」ＨＩＶ−１  Ｇａｇ、ＰｏｌおよびＥｎｖ抗原が他に記載され、潜在的なＴ細胞エピトープの最大適用範囲を提供する試みで開発された（例えば、Barouch et al, Nat Med 2010, 16: 319-323）。モザイク抗原は、野生型、自然に発生するＨＩＶ−１抗原と、長さおよびドメイン構造が類似している。
【０００５】
例えば、記載され、ワクチンで使用されるモザイクＨＩＶ抗原は、上記のBarouch et alおよび国際公開第２０１０／０５９７３２号パンフレットに記載のもの、例えば、
（ａ）以下を含むＧａｇモザイク抗原：
（ａ）（ｉ）配列番号１で本明細書に記載されるアミノ酸配列を有する第１のモザイクＧａｇ配列（「ｍｏｓ１Ｇａｇ」）、および
（ａ）（ｉｉ）配列番号２で本明細書に記載されるアミノ酸配列を有する第２のモザイクＧａｇ配列（「ｍｏｓ２Ｇａｇ」）、
（ｂ）以下を含むＰｏｌモザイク抗原：
（ｂ）（ｉ）配列番号３で本明細書に記載されるアミノ酸配列を有する第１のモザイクＰｏｌ配列（「ｍｏｓ１Ｐｏｌ」）、および
（ｂ）（ｉｉ）配列番号４で本明細書に記載されるアミノ酸配列を有する第２のモザイクＰｏｌ配列（「ｍｏｓ２Ｐｏｌ」）、ならびに
（ｃ）以下を含むＥｎｖモザイク抗原：
（ｃ）（ｉ）配列番号５で本明細書に記載されるアミノ酸配列を有する第１のモザイクＥｎｖ配列（「ｍｏｓ１Ｅｎｖ」）、および
（ｃ）（ｉｉ）配列番号６で本明細書に記載されるアミノ酸配列を有する第２のモザイクＥｎｖ配列（「ｍｏｓ２Ｅｎｖ」）
を含む。
【０００６】
これらの抗原をコードする配列は、ベクター、例えば組換えアデノウイルスベクターなど、例えば組換えアデノウイルス血清型２６（ｒＡｄ２６）にクローニングされており、これらの組換えベクターは、抗原に免疫応答を生じるワクチンとして以前に使用された（例えば、上記のBarouch et alおよび国際公開第２０１０／０５９７３２号パンフレット参照）。例えば、ｍｏｓ１Ｇａｇおよびｍｏｓ１Ｐｏｌモザイク抗原配列は、典型的には、ＧａｇおよびＰｏｌの融合タンパク質に結合され（「ｍｏｓ１ＧａｇＰｏｌ」）、そのコード配列は第１のＡｄ２６ベクターにクローニングされ（「ｒＡｄ２６．ｍｏｓ１ＧａｇＰｏｌ」）、ｍｏｓ２Ｇａｇおよびｍｏｓ２Ｐｏｌ抗原配列はＧａｇおよびＰｏｌの別の融合タンパク質に結合され（「ｍｏｓ２ＧａｇＰｏｌ」）、そのコード配列は第２のＡｄ２６ベクターにクローニングされる（「ｒＡｄ２６．ｍｏｓ２ＧａｇＰｏｌ」）。ｍｏｓ１Ｅｎｖおよびｍｏｓ２Ｅｎｖをコードする構築物は、典型的には別個のＡｄ２６ベクターにクローニングされる（それぞれ「ｒＡｄ２６．ｍｏｓ１Ｅｎｖ」および「ｒＡｄ２６．ｍｏｓ２Ｅｎｖ」）。
【０００７】
上記のそのようなモザイク抗原のセットは、グループＭのＨＩＶ−１単離株の良好な全体的な適用範囲を与え、モザイク１抗原配列をコードするｒＡｄ２６ベクター（例えば、ｒＡｄ２６．ｍｏｓ１ＧａｇＰｏｌおよびｒＡｄ２６．ｍｏｓ１Ｅｎｖ）は、クレードＢおよびＣＲＦ０１  ＨＩＶ−１サブタイプを好み、モザイク２抗原配列をコードするｒＡｄ２６ベクター（例えば、ｒＡｄ２６．ｍｏｓ２ＧａｇＰｏｌおよびｒＡｄ２６．ｍｏｓ２Ｅｎｖ）は、クレードＣ株を好む。ｒＡｄ２６ベクターで発現されるモザイクＨＩＶ−１  Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびＥｎｖ抗原は、コンセンサスまたは天然の配列のＨＩＶ−１抗原と比較した場合、細胞性と液性応答の両方の大きさを損なうことなく、アカゲザルにおける抗原特異的Ｔリンパ球応答の幅と深さの両方を改善するために使用される（上記のBarouch et alおよび国際公開第２０１０／０５９７３２号パンフレット）。
【０００８】
しかしながら、上記のワクチン成分のさらなる開発努力において、ｒＡｄ２６．ｍｏｓ２Ｅｎｖは、非最適な細胞表面発現および非ヒト霊長類における免疫応答を示すことが見出され、しかしさらに、他のｒＡｄ２６ベクター、例えばｒＡｄ２６．ｍｏｓ１Ｅｎｖと比較して、製造工程中にこれまでに報告されていない、予期しない、および予測できない非最適な遺伝的安定性を示した。したがって、ｍｏｓ２Ｅｎｖモザイク抗原がクレードＣのＨＩＶ−１サブタイプを好むため、ｒＡｄ２６．ｍｏｓ２Ｅｎｖを含有するワクチンは、クレードＣのＨＩＶ−１サブタイプに対して非最適な免疫応答をもたらす。したがって、ＨＩＶ−１クレードＣに対する免疫応答の改善を誘導するために使用されるＨＩＶに対するワクチンにおけるｍｏｓ２Ｅｎｖ抗原に代わるものが必要とされている。
【０００９】
ポックスウイルスベクター、例えば改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）は、ワクチン接種目的のための目的の抗原をコードするために使用され得る。当技術分野において、ＨＩＶ１抗原の新規の組合せをコードするポックスウイルスベクターの必要性がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、先に記載したｍｏｓ２Ｅｎｖ抗原および合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする核酸配列を含む新規のポックスウイルスベクターと比較して、細胞表面発現および遺伝的安定性が改善した合成ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）エンベロープタンパク質に関する。本発明はまた、組成物、ならびに好ましくは他のＨＩＶ抗原と組み合わせて使用する場合、ＨＩＶ−１、特にＨＩＶ−１  クレードＣおよびＢに対する免疫応答の増加を誘導するために合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする核酸配列を含むそのような新規のポックスウイルスベクターを使用する方法にも関する。
【００１１】
特定の態様では、本発明は、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする核酸を含み、好ましくはさらなるＨＩＶ抗原をコードする核酸配列を含む、ポックスウイルスベクター、好ましくは改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）ベクターに関する。
【００１２】
一般的な一態様では、本発明は、配列番号８のアミノ酸配列を含む合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする核酸に関する。合成ＨＩＶエンベロープタンパク質は、シグナル配列、例えば配列番号９〜１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するシグナル配列をさらに含み得る。一実施形態では、シグナル配列は、配列番号９のアミノ酸配列を有する。
【００１３】
特定の実施形態では、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質は、膜貫通ドメイン、好ましくは配列番号１３のアミノ酸配列を有する膜貫通ドメインをさらに含む。特定の実施形態では、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質は、細胞質ドメイン、好ましくは配列番号１４のアミノ酸配列、またはそのＮ末端アミノ酸１〜４（すなわち、ＮＲＶＲ）を含む細胞質ドメインの断片をさらに含む。合成ＨＩＶエンベロープタンパク質が、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインの断片をさらに含む実施形態では、タンパク質は、配列番号８のカルボキシル末端（Ｃ末端）および膜貫通領域のアミノ末端（Ｎ末端）に融合されている配列番号３７のアミノ酸配列も含むことが好ましい。
【００１４】
最も好ましい実施形態では、本発明は、配列番号１７、配列番号１８、もしくは配列番号１９のａａ１〜６８６のアミノ酸配列を含む合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする核酸配列を含むポックスウイルスベクターに関する。最も好ましくは、核酸によってコードされる合成ＨＩＶエンベロープタンパク質は、配列番号１８のアミノ酸配列を含むまたはからなる。
【００１５】
好ましい実施形態では、ポックスウイルスベクターは、上記のように合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする核酸、および少なくとも１つのさらなるＨＩＶ抗原を含む。好ましい実施形態では、ポックスウイルスベクターは、改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）ベクターである。最も好ましくは、ＭＶＡベクターは、ＭＶＡ−ＢＮまたはその誘導体を含む。
【００１６】
好ましい一実施形態では、ポックスウイルスベクターは、（ａ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む第１のＨＩＶエンベロープ（Ｅｎｖ）抗原をコードする核酸を含み、好ましくは、（ｂ）第１のＨＩＶ  Ｅｎｖ抗原とは異なる第２のＨＩＶ  Ｅｎｖ抗原、（ｃ）２つの異なるＨＩＶ  Ｇａｇ抗原である第３の抗原および第４の抗原、ならびに（ｄ）２つの異なるＨＩＶ  Ｐｏｌ抗原である第５の抗原および第６の抗原を、コードする核酸をさらに含む。特定の好ましい実施形態では、（ｂ）第２のＨＩＶ  Ｅｎｖ抗原は配列番号５のアミノ酸配列を含み、（ｃ）第３および第４の抗原は、それぞれ配列番号１および配列番号２のアミノ酸配列を含み、ならびに（ｄ）第５および第６の抗原は、それぞれ配列番号３および配列番号４のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、第３および第５の抗原は融合されて、好ましくは配列番号２８を含む第１のＧａｇ−Ｐｏｌ融合抗原になっており、第４および第６抗原は融合されて、好ましくは配列番号２９を含む第２のＧａｇ−Ｐｏｌ融合抗原になっている。ある特定の実施形態では、第１のＨＩＶ  Ｅｎｖ抗原は配列番号４１によってコードされる。１つまたは複数の特定の実施形態では、第２のＨＩＶ  Ｅｎｖ抗原は配列番号３９によってコードされ、第１のＧａｇ−Ｐｏｌ融合抗原は配列番号３８によってコードされ、第２のＧａｇ−Ｐｏｌ融合抗原は配列番号４０によってコードされる。
【００１７】
ポックスウイルスベクターがＭＶＡベクター、例えばＭＶＡ−ＢＮまたはその誘導体を含むＭＶＡベクターである実施形態では、第１のＧａｇ−Ｐｏｌ融合抗原および第２のＥｎｖ抗原は、好ましくは、ＭＶＡゲノムの遺伝子間領域（ＩＧＲ）４４／４５に挿入され、第２のＧａｇ−Ｐｏｌ融合抗原および第１のＥｎｖ抗原は、好ましくは、ＭＶＡゲノムのＩＧＲ８８／８９に挿入されている。より好ましくは、第１のＧａｇ−Ｐｏｌ融合抗原および第２のＧａｇ−Ｐｏｌ融合抗原はそれぞれ、別個のプロモーター、好ましくはＰｒ１３．５プロモーターの制御下にあり、第１のＥｎｖ抗原および第２のＥｎｖ抗原はそれぞれ、別個のプロモーター、好ましくはＰｒＨｙｂプロモーターの制御下にある。
【００１８】
本発明の別の一般的な態様は、本発明の実施形態による合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする核酸配列を含み、好ましくは、１つまたは複数のさらなるＨＩＶ抗原をコードする核酸配列および合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする核酸がプロモーター配列に操作可能に連結されている担体をさらに含む、免疫原的有効量のポックスウイルスベクターを含む、組成物、好ましくはワクチン組成物に関する。一実施形態では、組成物は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードするアデノウイルスベクター、好ましくはアデノウイルス２６ベクターをさらに含む。特定の実施形態では、組成物は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする、好ましくはＨＩＶ抗原をさらにコードするポックスウイルスベクター、好ましくはＭＶＡベクターを含む。特定の実施形態では、本発明の組成物は、さらなるＨＩＶ抗原および／または単離されたＨＩＶ抗原ポリペプチドをコードするさらなる発現ベクターをさらに含む。
【００１９】
別の一般的な態様では、本発明は、それを必要とする対象において、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する免疫応答を誘導するためのワクチン組合せ物に関する。一実施形態では、ワクチン組合せ物は、
（ａ）（ｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む合成ＨＩＶエンベロープタンパク質である第１のＨＩＶエンベロープ（Ｅｎｖ）タンパク質をコードする免疫原的有効量のベクター、好ましくはポックスウイルスベクター、より好ましくはＭＶＡベクターを含み、好ましくは（ｉｉ）第１のＨＩＶ  Ｅｎｖ抗原とは異なる第２のＨＩＶ  Ｅｎｖ抗原、（ｉｉｉ）２つの異なるＨＩＶ  Ｇａｇ抗原である第３の抗原および第４の抗原、ならびに（ｉｖ）２つの異なるＨＩＶ  Ｐｏｌ抗原である第５の抗原および第６の抗原をコードする核酸をさらに含む第１のワクチン組成物と、
（ｂ）（ｉ）１つまたは複数の、第１の、第２の、第３の、第４の、第５の、および第６のＨＩＶ抗原をコードする、好ましくは、配列番号１〜５、１８、２８、および２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む１つまたは複数のＨＩＶ抗原をコードする、免疫原的有効量の１つまたは複数のベクター、好ましくは１つまたは複数のアデノウイルスベクター、より好ましくは１つまたは複数のアデノウイルス２６ベクターを含む第２のワクチン組成物、および／または、
（ｂ）（ｉｉ）免疫原的有効量の単離されたＨＩＶ抗原ポリペプチドを含む１つまたは複数のポリペプチド、例えば、配列番号７のアミノ酸配列の残基３０〜７０８を含むポリペプチド、および／または配列番号３６の残基３０〜７２４を含むポリペプチドを含む第３のワクチン組成物
の少なくとも１つとを含み、第１の組成物ならびに第２および／または第３の組成物が同じ組成物、または１つもしくは複数の異なる組成物中に存在する。
【００２０】
ワクチン組合せ物が第２のワクチン組成物を含む一実施形態では、第２のワクチン組成物は、配列番号１〜５、１８、２８、および２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、より好ましくは、合わせて、配列番号１、２、３、４、５、および１８をコードする２つ、３つ、または４つの組換えアデノウイルス２６ベクターを含む１つまたは複数の抗原をコードする１つまたは複数の組換えアデノウイルス２６ベクターを含む。
【００２１】
本発明のさらに別の一般的な態様は、それを必要とする対象においてヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する免疫応答を誘導する方法であって、本発明の実施形態による組成物、例えばワクチン組成物、またはワクチン組合せ物を対象に投与するステップを含む方法に関する。本発明は、ＨＩＶに対する免疫応答を誘導する方法であって、本発明の実施形態による組成物またはワクチン組合せ物を使用する免疫応答をプライミングおよびブーストするステップを含む方法にも関する。
【００２２】
特定の実施形態では、それを必要とする対象においてＨＩＶに対する免疫応答を誘導する方法は、
（ａ）配列番号１、２、３、４、５、および１８の１つまたは複数をコードする、１つまたは複数の組換えアデノウイルスベクター、好ましくはＡｄ２６ベクターを含む第１のワクチン、および
（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む合成ＨＩＶエンベロープタンパク質である第１のＨＩＶエンベロープ（Ｅｎｖ）タンパク質をコードする、および好ましくは、さらなるＨＩＶ抗原、好ましくは第１のＨＩＶ  Ｅｎｖ抗原とは異なる第２のＨＩＶ  Ｅｎｖ抗原、２つの異なるＨＩＶ  Ｇａｇ抗原である第３の抗原および第４の抗原、ならびに２つの異なるＨＩＶ  Ｐｏｌ抗原である第５の抗原および第６の抗原、より好ましくは配列番号１〜５、２８、および２９からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする１つまたは複数のＨＩＶ抗原をコードするポックスウイルスベクター、好ましくはＭＶＡベクターを含む第２のワクチン
を対象に投与するステップを含み、第１のワクチンがプライムワクチンであり、第２のワクチンがブーストワクチンである、または第２のワクチンがプライムワクチンであり、第１のワクチンがブーストワクチンである。特定の実施形態では、好ましくは免疫原的有効量の単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチド、例えば配列番号７のアミノ酸配列の残基３０〜７０８を含むポリペプチド、および／または配列番号３６の残基３０〜７２４を含むポリペプチドを含む１つまたは複数の単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドは、ブーストワクチンとして同じ組成物中で、またはブーストワクチンとは別個の組成物中で、ブーストワクチンとほぼ同時に対象に投与される。
【００２３】
本発明の別の態様は、本発明の実施形態によるベクターを含む、細胞、好ましくは単離された細胞に関する。
【００２４】
前述の概要、ならびに以下の本発明の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むとより理解されるであろう。本発明は図面に示されるものと寸分たがわない実施形態に限定されないと理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ＨＩＶエンベロープタンパク質の構造の概略図である。図１Ａは、全長ＨＩＶエンベロープタンパク質を示す。図１Ｂは、膜貫通ドメイン（ＴＭ）がＧＣＮ４三量体化ドメインと置き換えられ、フューリン切断部位が変異されている、本発明の実施形態による可溶性一本鎖ＨＩＶエンベロープタンパク質の構造を示す（ｓＣ４）。図１Ｃは、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインの断片を含む、本発明の実施形態による膜結合ＨＩＶエンベロープタンパク質の構造を示す（Ｃ４Ｄ７）。
【図２】本発明の実施形態による、さらなるＣ末端三量体化ドメインを有するｍｏｓ２Ｅｎｖモザイク抗原配列、および可溶性合成ＨＩＶエンベロープタンパク質（ｓＣ４）に基づく、可溶性ｓＣ１  ＨＩＶエンベロープタンパク質の発現レベルを示す図である。発現は、ｇｐ１２０に対するポリクローナル抗体を使用する定量的ウェスタンブロットによって測定された。ｓＣ１またはｓＣ４をコードするプラスミドは、２回一過的に発現され、各トランスフェクションはデンシトメトリーによって２回定量された。ｓＣ１タンパク質は、比較的高い発現レベルを示すｓＣ４合成ＨＩＶエンベロープタンパク質と比較して、非常に低い発現レベルを示した。
【図３】ＥＬＩＳＡアッセイによって決定された可溶性ＣＤ４の存在（ライトグレー）および非存在（ダークグレー）下での、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質のモノクローナル抗体１７ｂ（ｍＡｂ１７ｂ）との結合を示す図である。図３Ａは、ｓＣ１の結合を示す。図３Ｂは、ｓＣ４の結合を示す。
【図４】ｓＣ１タンパク質、およびｓＣ４合成ＨＩＶエンベロープタンパク質の未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動からのウェスタンブロットの画像である。
【図５】抗ｇｐ１２０ポリクローナル抗体（ＧＰ１２０）を使用するこれらのタンパク質を発現する細胞のＦＡＣＳ分析による、ならびに四次構造依存的であり、正しく折りたたまれたＥｎｖ三量体に優先的に結合する広範な中和抗体ＰＧ９（ＰＧ９）およびＰＧ１６（ＰＧ１６）への結合による、膜結合Ｃ１、Ｃ１Ｄ７、Ｃ４、およびＣ４Ｄ７合成ＨＩＶエンベロープタンパク質の相対細胞表面発現レベルを示す図である。
【図６】複数回のウイルス継代後の全長Ｃ４（ＦＬＣ４）、Ｃ４Ｄ７、およびｓＣ４を含む本発明の合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする配列を含有するアデノウイルスベクターの安定性のグラフ表示である。組換えアデノウイルス２６ベクターは、ＰＥＲ．Ｃ６細胞で生成された。トランスフェクションおよびプラーク精製のための最初の３回の継代後、５つのプラークが選択され、Ｔ２５フォーマットでの１０回継代にスケールアップし、合計ウイルス継代数（ｖｐｎ）１３にした。 Ｅ１導入遺伝子カセットポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって決定されたｖｐｎ３、５、１０、および１３後の安定性を示す。例えば、３／５は、試験した５つのプラークのうち３つのプラークが安定であったことを意味し、５／５は、試験した５つのプラークのうち５つのプラークが安定であったことを意味する。
【図７】ウサギでのＴＺＭ−ｂ１細胞ベースの中和アッセイにおいて、ＨＩＶ−１エンベロープ偽型ウイルス粒子（ＥＶＰ）に対するウイルス中和力価を示す図である。アデノウイルスベクター高投与群のｌｏｇ１０変換したＩＣ５０値は、１、８、１４、および２０週目にＥＶＰ  ＶＳＶ−Ｇ（陰性対照）およびＭＷ９６５．２６（Ｔｉｅｒ１Ａ  クレードＣ）に対して測定された。各点は、個々のウサギのｌｏｇ１０変換したＩＣ５０値を表し、群平均は水平線で示す。ＨＤ：試験した最高希釈（上の実線）、ＬＤ：試験した最低希釈（下の実線）、ＬＯＢ：バックグラウンドの限界、収集した陰性試料の９５パーセンタイル値（点線）、ＬＤまたはＨＤ閾値を超えるＬｏｇ１０  ＩＣ５０値は、対応する線で設定された。ジョイントランキングのＤｕｎｎ法を使用する対照との一元配置ノンパラメトリック比較が各時点で行われた。統計的に有意な差をグラフに示す。＊＝Ｐ＜０．０５、＊＊＝Ｐ＜０．０１、および＊＊＊＝Ｐ＜０．００１。図７Ａは、ＶＳＶ−Ｇ（陰性対照）による結果を示す。図７Ｂは、ＭＷ９６５．２６（Ｔｉｅｒ１Ａ  クレードＣ）による結果を示す。
【図８】ベクターＭＶＡ−ｍＢＮ４１４のための、ＭＶＡゲノムの特定の位置への挿入のグラフ表示である。Ｐｒ１３．５およびＰｒＨｙｂはプロモーター配列である。ＩＧＲは遺伝子間領域である。
【図９】単独またはＭＶＡ−ｍＢＮ４１４（図９Ａ〜図９Ｃでは「ＭＶＡ」と省略）、クレードＣ  ｇｐ１４０（ＧＰ１４０と省略）またはその組合せと併せてのいずれかで、Ａｄ２６．Ｍｏｓ．ＨＩＶ（Ａｄ２６と省略）によって免疫後８５日目にウサギに生じる免疫応答を示す図である。雄（Ｍ）および雌（Ｆ）は別々に示す。図９Ａおよび図９Ｂは、それぞれクレードＣ  ｇｐ１４０およびモザイクｇｐ１４０−特異的ＥＬＩＳＡ力価を示す。各点は、個々のウサギのｌｏｇ１０変換した相対効力値（ｌｏｇ１０  ＥＵ／ｍｌ）を表し、群平均は水平線で示す。ＵＬＯＱ、定量の上限（上の実線）、ＬＬＯＱ、定量の下限（下の実線）、ＬＯＢ、バックグラウンドの限界（点線）、ＬＯＢより下の全ての値は、ＬＯＢレベルで設定された。性別間Ｔｏｂｉｔモデルからなる統計分析、群１、２、および３の比較のため、Ｔｕｋｅｙ補正が適用された。統計的に有意な差をグラフに示す。＊＝Ｐ＜０．０５、＊＊＝Ｐ＜０．０１、＊＊＊＝Ｐ＜０．００１。図９Ｃは、ウサギ血清を使用するＴＺＭ−ｂ１細胞ベースの中和アッセイにおいてＨＩＶ−１  ＢａＬエンベロープ偽型ウイルス粒子に対するウイルス中和力価を示す。各点は、個々のウサギのｌｏｇ１０変換したＩＣ５０値を表し、群平均は水性線で示す。ＨＤ：試験した最高希釈（上の実線）、ＬＤ：試験した最低希釈（下の実線）、ＬＯＢ：バックグラウンドの限界、収集した陰性試料の９５パーセンタイル値（点線）、ＤまたはＨＤ閾値を超えるＬｏｇ１０ＩＣ５０値は、相当する線で設定された。性別間Ｔｏｂｉｔモデルからなる統計分析、群１、２、および３の比較のため、Ｔｕｋｅｙ補正が適用された。統計的に有意な差をグラフに示す。＊＝Ｐ＜０．０５、＊＊＝Ｐ＜０．０１、＊＊＊＝Ｐ＜０．００１。
【図１０】Ａｄ２６．Ｍｏｓ４．ＨＩＶ（Ａｄ２６と省略）によるプライミングのみ（５週目）またはプライム−ブースト（７週目）、続いてＭＶＡ−ｍＢＮ４１４プライム−ブーストまたは同種ＭＶＡ−ｍＢＮ４１４（図１０Ａ〜図１０Ｅでは「ＭＶＡ」と省略）プライム−ブースト付与後にマウスで生じる免疫応答を示す図である。群１および２は、０週目にそれぞれ、２．５×１０９または２．５×１０８ｖｐのＡｄ２６．Ｍｏｓ４．ＨＩＶによってプライミングされ、５週目にそれぞれ、２．８×１０６または２．８×１０５ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ−ｍＢＮ４１４によってブーストされた。群３および４は、０週目および５週目にそれぞれ、２．８×１０６または２．８×１０５ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ−ｍＢＮ４１４によって免疫された。群５（対照）は、２．５×１０９のＡｄ２６．Ｅｍｐｔｙによってプライミングされ、２．８×１０６ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ−ＢＮ−ｅｍｐｔｙによってブーストされた。図１０Ａおよび図１０Ｂは、モザイクｇｐ１４０特異的ＥＬＩＳＡ力価を示す。各点は、個々のマウスのｌｏｇ１０変換したエンドポイント力価を表し、群平均は水平線で示した。ＵＤ、希釈の上限、ＬＤ、最低希釈、ＬＤより下の全ての値は、ＬＤレベルで設定された。用量間のＴｏｂｉｔモデルからなる統計分析、統計的に有意な差をグラフに示す。＊＝Ｐ＜０．０５、＊＊＝Ｐ＜０．０１、＊＊＊＝Ｐ＜０．００１。図１０Ｃ〜図１０Ｅは、研究の７週目のインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）ＥＬＩＳＰＯＴデータを示す。各点は、個々のマウスの脾細胞１０６個当たりの、スポット形成細胞（ＳＦＣ）数を表し、群平均は水平線で示す。ＬＯＤ：検出の限界、収集した未刺激の対照の９５パーセンタイル値（点線）、Ｅｎｖ−、Ｇａｇ−、およびＰｏｌ−特異的応答は、それぞれ免疫ドメインＥｎｖ−、Ｇａｇ−、およびＰｏｌ−ペプチド、ＩＨＩＧＰＧＲＡＦＹＴＡＧＤＩ（配列番号４４）、ＡＭＱＭＬＫＥＴＩ（配列番号４５）、およびＹＹＤＰＳＫＤＬＩ（配列番号４６）による刺激によって決定された。統計的に有意な差をグラフに示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
様々な論文、記事および特許が、背景および本明細書全体にわたって引用または記載される。これらの参照のそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれる文書、行為、材料、装置、記事などの議論は、本発明の文脈を提供する目的のためである。そのような議論は、これらの事項のいずれかまたは全てが、開示または請求された任意の発明に関して先行技術の一部を形成することを認めない。
【００２７】
他に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術および科学用語は、本発明が属する当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。そうでなければ、本明細書で使用する特定の用語は、本明細書に記載した意味を有する。本明細書で引用した全ての特許、公開された特許明細書、および刊行物は、本明細書に完全に記載されたように参照により組み込まれる。本明細書および添付の請求項で使用する場合、単数形の「１つの（ａ）」「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が他にはっきりと指定しない限り、複数の参照を含む。
【００２８】
本明細書および続く請求項全体にわたって、文脈が他に必要としない限り、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、ならびに「含む（ｃｏｎｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、記載した整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群の包含を意味すると理解されるが、任意の他の整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群の除外ではない。本明細書で使用する場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、用語「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」で置き換えられ、時には用語「有する（ｈａｖｉｎｇ）」が本明細書で使用される。
【００２９】
本明細書で使用する場合、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、請求項の要素に指定されない任意の要素、ステップ、または成分を除外する。本明細書で使用する場合、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、請求項の基本のおよび新規の特徴に実質的に影響しない材料またはステップを除外しない。前述の用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」のいずれも、本発明の態様または実施形態の文脈中、本明細書で使用する場合はいつでも、用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」で置き換えられ、本開示の範囲を変えることができる。
【００３０】
本明細書で使用する場合、複数の列挙された要素間の接続語「および／または」は、個々と組み合わせたオプションの両方を包含すると理解される。例えば、２つの要素が「および／または」によって結合される場合、第１のオプションは、第２の要素無しでの第１の要素の適用性を指す。第２のオプションは、第１の要素無しでの第１の要素の適用性を指す。第３のオプションは、第１の要素と第２の要素を合わせた適用性を指す。これらのオプションのいずれか１つは、その意味に該当し、したがって本明細書で使用する場合、用語「および／または」の要件を満たす。１つより多くのオプションの同時適用性はまた、その意味に該当し、したがって用語「および／または」の要件を満たす。
【００３１】
本明細書で使用する場合、「対象」は、本発明の実施形態によるベクター、組成物またはワクチン組合せ物を投与される、または投与された任意の動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを意味する。本明細書で使用する場合、用語「哺乳動物」は、任意の哺乳動物を包含する。哺乳動物の例としては、限定はされないが、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル、ヒト等が挙げられ、より好ましくはヒトである。
【００３２】
本発明は一般に、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする合成ＨＩＶエンベロープタンパク質、核酸、およびベクター、ならびに合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする、および任意選択でさらなるＨＩＶ抗原をコードするベクターによって、単独で、または１つもしくは複数のさらなるＨＩＶ抗原をコードする１つまたは複数のさらなるベクターと組み合わせて、および／または１つもしくは複数のさらなる単離されたＨＩＶ抗原ポリペプチドと組み合わせてＨＩＶに対して免疫応答を誘導する方法に関する。
【００３３】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は、レトロウイルス科の一部であるレンチウイルス属のメンバーである。ＨＩＶの２つの種：ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２がヒトに感染する。ＨＩＶ−１はＨＩＶウイルスの最も一般的な株であり、ＨＩＶ−２よりもより病原性であることが公知である。本明細書で使用する場合、用語「ヒト免疫不全ウイルス」および「ＨＩＶ」は、限定はされないが、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２を指す。
【００３４】
ＨＩＶは、高度な遺伝的分岐によって複数のクレードに分類される。本明細書で使用する場合、用語「ＨＩＶクレード」または「ＨＩＶサブタイプ」は、それらの遺伝子相同性の程度によって分類される、関連ヒト免疫不全ウイルスを指す。現在、ＨＩＶ−１単離株の３つのグループがある：Ｍ、ＮおよびＯ。グループＭ（主系統株）は少なくとも１０のクレード、ＡからＪからなる。グループＯ（境界外株）は、同様の数のクレードからなる。グループＮは、グループＭまたはＯのいずれにも分類されない新しいＨＩＶ−１単離株である。
【００３５】
本明細書で使用する場合、用語「ＨＩＶ抗原性ポリペプチド」、「ＨＩＶ抗原性タンパク質」、「ＨＩＶ抗原」、および「ＨＩＶ免疫原」は、免疫応答、例えば、対象におけるＨＩＶに対する液性および／または細胞性媒介応答を誘導することができるポリペプチドを指す。抗原性ポリペプチドまたは抗原はＨＩＶのタンパク質、その断片もしくはエピトープ、または免疫応答を誘導もしくは免疫、例えば対象におけるＨＩＶに対する保護免疫を生じさせることができる複数のＨＩＶタンパク質またはその部分の組合せであってよい。
【００３６】
好ましくは、抗原性ポリペプチドまたは抗原は、宿主において、保護免疫応答を生じ、例えばウイルス疾患もしくは感染に対して免疫応答を誘導する、および／またはウイルス疾患もしくは感染に対して対象において免疫を生じさせる（すなわちワクチン接種）ことができ、ウイルス疾患または感染に対して対象を保護する。例えば、抗原性ポリペプチドまたは抗原は、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）またはＨＩＶ由来のタンパク質もしくはその断片、例えばＨＩＶまたはＳＩＶエンベロープｇｐ１６０タンパク質、ＨＩＶまたはＳＩＶマトリックス／キャプシドタンパク質、ならびにＨＩＶまたはＳＩＶｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子産物を含み得る。
【００３７】
ＨＩＶ抗原性ポリペプチドまたは抗原は、任意のＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２抗原もしくはその断片であってよい。ＨＩＶ抗原の例としては、限定はされないが、構造タンパク質および必須酵素をコードするｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子産物が挙げられる。ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子産物は、複数の他のタンパク質産物にさらにプロセシングされるポリタンパク質として合成される。ｇａｇ遺伝子の主なタンパク質産物は、ウイルス構造タンパク質ｇａｇポリタンパク質であり、ＭＡ、ＣＡ、ＳＰ１、ＮＣ、ＳＰ２、およびＰ６タンパク質産物にさらにプロセシングされる。ｐｏｌ遺伝子は、ウイルス酵素（Ｐｏｌ、ポリメラーゼ）をコードし、主なタンパク質産物は、ＲＴ、ＲＮａｓｅＨ、ＩＮ、およびＰＲタンパク質産物にさらにプロセシングされる。ｅｎｖ遺伝子は、構造タンパク質、特にビリオンエンベロープの糖タンパク質をコードする。ｅｎｖ遺伝子の主なタンパク質産物はｇｐ１６０であり、ｇｐ１２０およびｇｐ４１にさらにプロセシングされる。ＨＩＶ抗原の他の例としては、遺伝子制御タンパク質ＴａｔおよびＲｅｖ、アクセサリータンパク質Ｎｅｆ、Ｖｐｒ、ＶｉｆおよびＶｐｕ、キャプシドタンパク質、ヌクレオキャプシドタンパク質、およびｐ２４ウイルスタンパク質が挙げられる。
【００３８】
特定の実施形態では、ＨＩＶ抗原性ポリペプチドまたは抗原は、ＨＩＶ  Ｇａｇ、Ｅｎｖ、もしくはＰｏｌ抗原、または任意の抗原性部分もしくはエピトープもしくはその組合せ、好ましくはＨＩＶ−１  Ｇａｇ、Ｅｎｖ、もしくはＰｏｌ抗原または任意の抗原性部分もしくはエピトープもしくはその組合せを含む。
【００３９】
ＨＩＶ抗原性ポリペプチドはまた、モザイクＨＩＶ抗原でもよい。本明細書で使用する場合、「モザイク抗原」は、天然の配列の断片からアセンブルした組換えタンパク質を指す。モザイク抗原は、天然の抗原に似ているが、天然の配列で見出される潜在的なＴ細胞エピトープの適用範囲を最大にするために最適化され、免疫応答の幅および適用範囲を改善する。本発明による使用のためのモザイクＨＩＶ抗原は、好ましくはモザイクＧａｇ、Ｐｏｌ、および／またはＥｎｖ抗原であり、より好ましくはモザイクＨＩＶ−１  Ｇａｇ、Ｐｏｌ、および／またはＥｎｖ抗原である。本明細書で使用する場合、「モザイクＨＩＶ  Ｇａｇ、Ｐｏｌ、および／またはＥｎｖ抗原」は、特に、ＨＩＶのＧａｇ、Ｐｏｌ、および／またはＥｎｖポリタンパク質配列の１つまたは複数に由来する複数のエピトープを含むモザイク抗原を指す。
【００４０】
一実施形態では、本発明による使用のためのモザイクＨＩＶ抗原は、ｇａｇ遺伝子産物の配列（例は、配列番号１、２で提供される）に由来するエピトープを有するモザイクＨＩＶ  Ｇａｇ抗原、ｐｏｌ遺伝子産物の配列（例は、配列番号３、４で提供される）に由来するエピトープを有するモザイクＨＩＶ  Ｐｏｌ抗原、またはｅｎｖ遺伝子産物の配列（例は、配列番号５、６で提供される。また、本発明の合成抗原、例えば配列番号８、１７、１８、１９もモザイクＨＩＶ  Ｅｎｖ抗原と考えられる）に由来するエピトープを有するモザイクＨＩＶ  Ｅｎｖ抗原である。特定の実施形態では、本発明による使用のためのモザイクＨＩＶ抗原は、ｇａｇ、ｐｏｌ、および／またはｅｎｖ遺伝子産物の配列に由来するエピトープの組合せを含む。例示的な、および非限定的な例としては、ｅｎｖおよびｐｏｌ遺伝子産物の配列に由来するエピトープを有するモザイクＥｎｖ−Ｐｏｌ抗原、ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子産物の配列（例は、配列番号２８、２９で提供される）に由来するエピトープを有するモザイクＧａｇ−Ｐｏｌ抗原、ならびにｇａｇおよびｅｎｖ遺伝子産物の配列に由来するエピトープを有するモザイクＧａｇ−Ｅｎｖ抗原が挙げられる。ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子産物の配列は、１つまたは複数のクレードに由来してよい。
【００４１】
本発明で使用されるモザイクＨＩＶ  Ｇａｇ、Ｐｏｌ、および／またはＥｎｖ抗原の例としては、例えば米国特許出願公開第２０１２００７６８１２号明細書、Barouch et al., Nat Med 2010, 16:319-323およびBarouch et al., Cell 155:1-9, 2013に記載のものが挙げられ、その全ては、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。好ましくは、本発明による使用のためのモザイクＨＩＶ  Ｇａｇ、Ｐｏｌ、および／またはＥｎｖ抗原としては、限定はされないが、ｍｏｓ１Ｇａｇ（配列番号１）、ｍｏｓ２Ｇａｇ（配列番号２）、ｍｏｓ１Ｐｏｌ（配列番号３）、ｍｏｓ２Ｐｏｌ（配列番号４）、ｍｏｓ１Ｅｎｖ（配列番号５）、ｍｏｓ２Ｅｎｖ（配列番号６）、ｍｏｓ１ＧａｇＰｏｌ（配列番号２８）、ｍｏｓ２ＧａｇＰｏｌ（配列番号２９）、およびその組合せが挙げられる。
【００４２】
本明細書で使用する場合、各用語「ＨＩＶエンベロープタンパク質」、「ｅｎｖタンパク質」、および「Ｅｎｖ」は、ＨＩＶビリオンのエンベロープに発現される、ＨＩＶをＨＩＶ感染細胞の細胞膜に標的化および結合させるタンパク質、またはそれを必要とする対象においてＨＩＶに対する免疫応答を誘導するまたは免疫を生じさせることができるその断片もしくは誘導体を指す。ＨＩＶ  ｅｎｖ遺伝子は、前駆体タンパク質ｇｐ１６０をコードし、２つの成熟エンベロープ糖タンパク質、ｇｐ１２０およびｇｐ４１にタンパク質分解性に切断される。切断反応は、宿主細胞のプロテアーゼ、フューリンによって、レトロウイルスのエンベロープ糖タンパク質前駆体において高度に保存されている配列で、媒介される。より具体的には、ｇｐ１６０は（ｇｐ１６０）３に三量体化され、次いで２つの非共有結合したｇｐ１２０とｇｐ４１への切断が起こる。ウイルスの侵入は、続いてｇｐ１２０／ｇｐ４１ヘテロ二量体の三量体によって媒介される。ｇｐ１２０は、受容体結合断片であり、受容体を有する標的細胞、例えばヘルパーＴ細胞などのＣＤ４受容体に結合する。ｇｐ１２０に非共有結合するｇｐ４１は、融合断片であり、ＨＩＶが細胞に侵入する第２のステップを提供する。ｇｐ４１は、本来、ウイルスエンベロープ内に埋め込まれるが、ｇｐ１２０がＣＤ４受容体に結合すると、ｇｐ１２０はその構造を変化させｇｐ４１を暴露させ、宿主細胞との融合を補助することができる。ｇｐ１４０は、三量体ｇｐ１６０、すなわち（ｇｐ１６０）３の未切断の外部ドメインであり、切断されたウイルススパイクの天然状態の代わりとして使用されている。
【００４３】
本発明の実施形態により、「ＨＩＶエンベロープタンパク質」は、ｇｐ１６０、ｇｐ１４０、ｇｐ１２０、ｇｐ４１タンパク質、その組合せ、融合、トランケーションまたは誘導体であってよい。例えば、「ＨＩＶエンベロープタンパク質」は、ｇｐ４１タンパク質と非共有結合したｇｐ１２０タンパク質を含み得る。ｇｐ１４０の三量体を安定化する三量体化ドメインを有するまたは含むように改変される、安定化された三量体ｇｐ１４０タンパク質も含み得る。三量体化ドメインの例としては、限定はされないが、Ｔ４フィブリチン「フォールドン」三量体化ドメイン、ＧＣＮ４由来のコイルドコイル三量体化ドメイン、および三量体タグとして大腸菌（E.coli）アスパラギン酸トランスカルバモイラーゼの触媒サブユニットが挙げられる。「ＨＩＶエンベロープタンパク質」は、限定はされないが、外部ドメインにＣ末端トランケーション（すなわち、細胞外空間へ伸びたドメイン）、ｇｐ４１におけるトランケーション、例えばｇｐ４１の膜貫通ドメインにおけるトランケーション、またはｇｐ４１の細胞質ドメインにおけるトランケーションを含むエンベロープタンパク質を含むトランケートされたＨＩＶエンベロープタンパク質であってもよい。「ＨＩＶエンベロープタンパク質」は、さらに、配列変異、例えばフューリン切断部位、および／またはいわゆるＳＯＳＩＰ変異を有する天然に存在するＨＩＶエンベロープタンパク質の誘導体であってよい。
【００４４】
好ましくは、「ＨＩＶエンベロープタンパク質」は「合成ＨＩＶエンベロープタンパク質」である。本明細書で使用する場合、用語「合成ＨＩＶエンベロープタンパク質」は、それを必要とする対象において１つまたは複数の天然に存在するＨＩＶ株に対して免疫応答を誘導するまたは免疫を生じさせるために最適化される天然に存在しないＨＩＶエンベロープタンパク質を指す。モザイクＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質は、合成ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質の例であり、本発明は、合成ＨＩＶ  Ｅｎｖ抗原、例えば、配列番号８、１７、１８または１９を含むものを提供する。
【００４５】
本明細書で使用する場合、「ＴＣＩＤ５０」は、ＴＣＩＤ５０として与えられる組織培養感染量５０を指す。ＴＣＩＤ５０は、当業者に公知の様々な方法、例えば組織培養感染量５０（ＴＣＩＤ５０）アッセイを使用して決定される。ＴＣＩＤ５０アッセイは、国際公開第０３／０５３４６３号パンフレットの実施例２に記載されるように、９６ウェルフォーマットでの１０倍希釈を使用する、改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）ベクターの感染力を力価測定する方法である。ポックスウイルス、例えばＭＶＡの感染力は、例えばフローサイトメトリーベースのアッセイまたは組織培養感染量５０（ＴＣＩＤ５０）アッセイにより、当業者に公知の様々な方法を使用して決定される。例示的な一態様では、ＭＶＡの力価測定は、９６ウェルフォーマットの１０倍希釈を使用するＴＣＩＤ５０ベースのアッセイで実施される。アッセイのエンドポイントでは、感染細胞は、抗ワクシニアウイルス抗体および適切な染色溶液を使用して可視化される。初代ＣＥＦ細胞は、所与の密度で２〜３日間Ｔ−フラスコを使用して、１０％血清および１％ゲンタマイシンを含むＲＰＭＩ中で調整および培養され、トリプシン処理後、７％血清を含むＲＰＭＩを使用して１×１０５個の細胞／ｍＬの密度で９６ウェルプレートに播種される。試料の予想される力価は、１０倍段階希釈の数を指示し、カラム１から例えば１０まで、次のウェルに移す１００μＬを使用して深ウェルプレートで行われる。希釈後、９６ウェルプレートのウェルあたり１００μＬが播種される。細胞は、３４〜３８℃、および４〜６％ＣＯ２で５日間インキュベートされ、感染およびウイルス複製を可能にする。
【００４６】
感染の５日後、細胞はＭＶＡ特異的抗体で染色される。特異的抗体の検出のため、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合二次抗体が使用される。ＭＶＡ特異的抗体は、例えば、抗ワクシニアウイルス抗体、ウサギポリクローナル、またはＩｇＧ画分（Ｑｕａｒｔｅｔｔ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ  ＃９５０３〜２０５７）であってよい。二次抗体は、例えば、抗ウサギＩｇＧ抗体、またはＨＲＰ結合ヤギポリクローナル（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ、＃Ｗ４０１１）であってよい。二次抗体は、沈殿するＴＭＢ基質を使用して可視化される。色素反応に陽性である細胞を含む全てのウェルは、ＴＣＩＤ５０の計算に陽性であるとマークされる。力価は、計算のＳｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｅｒｂｅｒ方法を使用することによって計算される。データは、Ｔ＝０時点から任意の所与の時点の相対的な差であるウイルス力価のｌｏｇとしても表される。
【００４７】
ウイルス濃度の定量の代わりの方法は、ウイルスプラークアッセイにより、感染量に関してウイルス濃度を決定する、当業者に周知の標準的な方法である。簡単に述べると、宿主細胞のコンフルエントな単層に、様々な希釈でウイルスを感染させ、半固体培地で覆う。細胞単層中の細胞にウイルスが感染すると、ウイルスプラークが形成され、希釈因子と組み合わせてプラークの数が数えられ、試料容積あたりのプラーク形成単位（ｐｆｕ／ｍＬ）の数を計算することができる。ｐｆｕ／ｍＬは、試料内の感染性粒子の数を表す。アッセイ方法および原理における明確な違いにより、ＴＣＩＤ５０およびｐｆｕ／ｍＬまたは他の感染性アッセイ結果は、必ずしも等価ではない。ＭＶＡに関して、両方法（ＴＣＩＤ５０およびウイルスプラークアッセイ）が使用され、通常、ヒトへの臨床投与のためのＭＶＡベクターの投与量は、ｐｆｕ、またはＴＣＩＤ５０で提供される。アデノウイルスベクターの投与量もまた、ｐｆｕまたはＴＣＩＤ５０で与えられる。ヒトへの投与のため、通常、アデノウイルスベクターの投与量はウイルス粒子（ｖｐ）で与えられ、濃度はｖｐ／ｍＬで表される。
【００４８】
合成ＨＩＶエンベロープタンパク質およびそのコード配列
本発明の実施形態は、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする核酸配列を含む、および好ましくはさらなるＨＩＶ抗原をコードする核酸配列を含む、新規のポックスウイルスベクター、好ましくはＭＶＡベクターに関する。
【００４９】
一実施形態では、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質は配列番号８、または（ｉ）Ｉ５２９Ｐ、（ｉｉ）Ｋ４８０Ｅ、および（ｉｉｉ）ＥＫ４７９−４８０ＲＲＲＲ、Ｉ５２９Ｐ、Ａ４７１ＣおよびＴ５７５Ｃの組合せからなる群から選択される１つまたは複数の変異を有する配列番号８のアミノ酸配列を含む。配列番号８は、合成成熟ｇｐ１２０および膜貫通領域も細胞質ドメインも無い合成トランケートｇｐ４１を含む。配列番号８は、ｍｏｓ２Ｅｎｖモザイク抗原（配列番号６）、および他のＨＩＶエンベロープタンパク質配列由来の配列のキメラを含む天然に存在しない配列である。配列番号８を含む合成Ｅｎｖ抗原の配列は、広範な適用範囲およびＨＩＶクレードＣに対するＴ細胞応答の増強を提供するように最適化される（ｍｏｓ２Ｅｎｖ抗原（配列番号６）と比較した場合）。特定の実施形態では、さらなるアミノ酸が配列番号８または本明細書に定義したその変異体の１つに添加され得る。
【００５０】
特定の実施形態では、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質は、シグナル配列をさらに含む。合成ＨＩＶエンベロープタンパク質は、小胞体（ＥＲ）の内腔へのその輸送中に新生ポリペプチド鎖から切断されるシグナル配列により合成される。原則として、任意の公知のシグナル配列が使用され得る。好ましくは、ＨＩＶ  Ｅｎｖシグナル配列またはその変異体が使用される。異なるシグナル配列が、ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質に当技術分野で使用された（例えば国際公開第２０１４／１０７７４４号パンフレット参照）。特定の実施形態では、シグナル配列は配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、または配列番号１２を含む。好ましい一実施形態では、シグナル配列は配列番号９を含む。
【００５１】
特定の実施形態では、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質は膜貫通ドメインをさらに含む。膜貫通ドメインは、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をＥＲ膜にアンカーし、ＨＩＶエンベロープの膜集合および機能に寄与する。好ましくは、膜貫通ドメインは配列番号１３を含む。
【００５２】
別の実施形態では、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質は、トランケートした細胞質ドメインを有するｇｐ４１を含む。ｇｐ４１は、そのカルボキシル末端に通常ではない長い細胞質ドメイン、典型的には約１５０アミノ酸を有する（Edwards et al., J. Virology, 2002, 76:2683-2691）。細胞質ドメインのトランケーションは、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖタンパク質の外部ドメインの保存領域の暴露を誘導することが報告されている（同上）。本発明の合成ＨＩＶエンベロープのトランケートした細胞質ドメインは、１から約１４０アミノ酸の範囲であり、例えば、全長細胞質ドメインの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、または１４０アミノ酸であってよい。特定の実施形態では、Ｃ末端までの所与のアミノ酸の後のトランケーションにより、トランケートした細胞質ドメインは配列番号１７のアミノ酸７０４〜８６２に由来する（すなわち、本発明のＣ４分子の細胞質ドメインに由来する）。好ましい実施形態では、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質は、ＨＩＶ  ｇ４１細胞質ドメインの１〜１０アミノ酸残基、より好ましくは４〜８アミノ酸残基、および最も好ましくは７アミノ酸残基を有するトランケートした細胞質ドメインを含む。合成ＨＩＶエンベロープタンパク質の細胞質ドメインまたはその断片は、細胞外ドメイン（外部ドメイン）のＣ末端に位置し、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質が膜貫通ドメインを含む場合も、細胞質ドメインまたはその断片は膜貫通ドメインのＣ末端に位置する。例えば、図１Ａおよび図１Ｃ参照。特定の実施形態では、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質は、配列番号１４またはその断片、例えばその１〜４残基（すなわちＮＲＶＲ）のアミノ酸配列を有するトランケートした細胞質ドメインを有するｇｐ４１を含む。他のトランケートした細胞質ドメインが記載され、使用され得る（例えば、Schiernle et al., PNAS 1997; Abrahamyan et al., J Virol 2005）。
【００５３】
合成ＨＩＶエンベロープタンパク質が膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインの断片をさらに含む実施形態では、タンパク質は、配列番号１８の残基６５５〜６８２を含有する配列番号３７のアミノ酸配列も含みことが好ましく、ここで、配列番号３７のアミノ酸配列は配列番号８のＣ末端および膜貫通ドメインのＮ末端に融合されている。
【００５４】
本発明の特に好ましい実施形態では、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質は、膜貫通ドメイン、例えば配列番号１３のアミノ酸配列を有するもの、ならびにトランケートした細胞質ドメインまたは細胞質ドメインの断片、例えば配列番号１４または配列番号１４の残基１〜４（すなわちＮＲＶＲ）のアミノ酸配列を有するものをさらに含む。最も好ましくは、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質は、シグナル配列有りまたは無しで配列番号１８のアミノ酸配列を含むまたはからなる（すなわち配列番号１８のアミノ酸残基１〜２９）。
【００５５】
別の実施形態では、合成エンベロープタンパク質は、Ｅｎｖ膜貫通領域を置換する三量体化ドメインを含む。三量体化ドメインは、Ｅｎｖ三量体構造の安定性を増加する。好ましくは、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質は、ｇｐ１４０の三量体を安定化する三量体化ドメインを含むように改変されるｇｐ１４０ポリペプチドを含む。三量体化ドメインの例としては、限定はされないが、Ｔ４−フィブリチン「フォールドン」三量体化ドメイン、例えば配列番号１６のアミノ酸配列を含むもの、ＧＣＮ４由来のコイルドコイル三量体化ドメイン、例えば配列番号１５のアミノ酸配列を含むもの、三量体タグとして大腸菌（E.Coli）アスパラギン酸トランスカルバモイラーゼの触媒サブユニットが、またはマトリリンベースの三量体化モチーフが挙げられる。存在する場合、三量体化ドメインは、典型的には細胞外ドメインのＣ末端に位置する（図１Ｂ参照）。合成ＨＩＶエンベロープタンパク質が三量体化ドメインを含む特定の好ましい実施形態では、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質は、シグナル配列有りまたは無しで配列番号１９のアミノ酸配列を含む（すなわち、配列番号１９のアミノ酸残基１〜２９）。三量体化ドメインのこれらの実施形態は、主に合成ＨＩＶエンベロープタンパク質の可溶性外部ドメイン変異体に有用である。本発明のそのような可溶性変異体の特定の実施形態では、フューリン切断部位を変異させ（例えば、配列番号８の４８０位でＬｙｓからＧｌｕへの変異）、この切断部位を不活性化することが可能であり、そのため、タンパク質は一本鎖であり、これは三量体化ドメイン、特に配列番号１９のＧＣＮ４三量体化ドメインとよく結合する。
【００５６】
三量体化ドメインを使用しない合成ＨＩＶエンベロープタンパク質のそのような可溶性外部ドメイン変異体の代替のバージョンも本発明の実施形態であり、フューリン切断部位を最適化する変異（例えば、４７９〜４８０位でＧｌｙ−Ｌｙｓジペプチドを４つのＡｒｇ残基によって置換する）、ならびにいわゆるＳＯＳＩＰ変異（例えば５２９位でのＩからＰへの変異、および配列番号８のその位置でそれぞれＡｌａおよびＴｈｒのＣｙｓ残基との置換によって４７１位と５７５位の間にジスルフィド結合の導入）を組み合わせることによって、配列番号８から調製され得る。これは、以下の変異の組合せ、ＥＫ４７９−４８０ＲＲＲＲ、Ｉ５２９Ｐ、Ａ４７１ＣおよびＴ５７５Ｃを有する配列番号８のアミノ酸配列を有するタンパク質を産生する。
【００５７】
本発明の合成ＨＩＶエンベロープタンパク質（配列番号８を含む）の三量体含量をさらに増加するための可能な一改変は、５２９位でのＩｌｅからＰｒｏへの改変である。これは、可溶性および膜結合変異体の両方に有効であり得る。
【００５８】
ベクター
一般的な一態様では、本発明は、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする核酸配列を含む、および好ましくは少なくとも１つのさらなるＨＩＶ抗原をコードする核酸配列を含むベクターに関する。本発明の実施形態により、ベクターは、本明細書に記載の合成ＨＩＶエンベロープタンパク質のいずれかを含み得る。本発明の特定の実施形態では、ベクターは、配列番号８、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９のアミノ酸配列、およびより好ましくは配列番号１８または配列番号１８のアミノ酸残基３０〜７１１を含む合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする核酸を含む、ポックスウイルスベクター、好ましくはＭＶＡベクターである。
【００５９】
本発明の実施形態により、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする核酸配列はプロモーターに操作可能に連結されており、核酸はプロモーターの制御下にあることを意味している。プロモーターは、同種プロモーター（すなわち、ベクターと同じ遺伝子源に由来する）または異種プロモーター（すなわち、異なるベクターまたは遺伝子源に由来する）であってよい。アデノウイルスベクターの好適なプロモーターの非限定的な例としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターが挙げられる。好ましくは、プロモーターは、発現カセット内の核酸の上流に位置する。合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする核酸配列に操作可能に連結される例示的なＣＭＶプロモーター配列は、配列番号２４に示す。
【００６０】
ポックスウイルスベクターの好適なプロモーターの非限定的な例としては、３０Ｋプロモーター、Ｉ３プロモーター、ＰｒＳプロモーター、ＰｒＳ５Ｅプロモーター、Ｐｒ７．５Ｋ、Ｐｒ１３．５ロングプロモーター、ＰｒＨｙｂプロモーター、４０Ｋプロモーター、ＭＶＡ−４０Ｋプロモーター、ＦＰＶ  ４０Ｋプロモーター、３０ｋプロモーター、ＰｒＳｙｎＩＩＭプロモーター、およびＰｒＬＥ１プロモーターが挙げられる。さらなるプロモーターは、参照により本明細書に完全に組み込まれる、国際公開第２０１０／０６０６３２号パンフレット、国際公開第２０１０／１０２８２２号パンフレット、国際公開第２０１３／１８９６１１号パンフレット、および国際公開第２０１４／０６３８３２号パンフレットにさらに記載される。より好ましい実施形態では、本発明によりポックスウイルスベクターの一部として組み込まれる場合、ＨＩＶ抗原は、Ｐｒ１３．５ロングプロモーター（配列番号４２）および／またはＰｒＨｙｂプロモーター（配列番号４３）に操作可能に連結される。
【００６１】
本発明の実施形態により、ベクターは発現ベクターであってよい。発現ベクターとしては、限定はされないが、組換えタンパク質発現のためのベクターおよび対象の組織での発現のための対象への核酸の送達のためのベクター、例えばウイルスベクターが挙げられる。本発明による使用に好適なウイルスベクターの例としては、限定はされないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ＭＶＡベクター、腸管系ウイルスベクター、ベネズエラウマ脳炎ウイルスベクター、セムリキ森林ウイルスベクター、タバコモザイクウイルスベクター、レンチウイルスベクター等が挙げられる。ベクターは、非ウイルスベクターであってもよい。非ウイルスベクターの例としては、限定はされないが、プラスミド、バクテリア人工染色体、イースト人工染色体、バクテリオファージ等が挙げられる。
【００６２】
本発明の特定の実施形態では、ベクターはアデノウイルスベクターである。本発明によるアデノウイルスは、アデノウイルス科に属し、好ましくはマストアデノウイルス属に属するものである。それはヒトアデノウイルスであってよいが、限定はされないが、ウシアデノウイルス（例えばウシアデノウイルス３、ＢＡｄＶ３）、イヌアデノウイルス（例えばＣＡｄＶ２）、ブタアデノウイルス（例えばＰＡｄＶ３または５）、またはサル（simian）アデノウイルス（サル（monkey）アデノウイルスおよび霊長類アデノウイルス、例えばチンパンジーアデノウイルスまたはゴリラアデノウイルスを含む）を含む他の種に感染するアデノウイルスであってもよい。好ましくは、アデノウイルスはヒトアデノウイルス（ＨＡｄＶ、もしくはＡｄＨｕ）またはサルアデノウイルス、例えばチンパンジーもしくはゴリラアデノウイルス（ＣｈＡｄ、ＡｄＣｈ、またはＳＡｄＶ）、またはアカゲザルアデノウイルス（ＲｈＡｄ）である。本発明では、ヒトアデノウイルスは、種の指定なくＡｄと呼ばれる場合を意味し、例えば簡潔な表記「Ａｄ２６」は、ヒトアデノウイルス血清型２６である、ＨＡｄＶ２６と同じ意味である。また、本明細書で使用する場合、表記「ｒＡｄ」は、組換えアデノウイルスを意味し、例えば「ｒＡｄ２６」は組換えヒトアデノウイルス２６を指す。
【００６３】
ほとんどの先進的な研究は、ヒトアデノウイルスを使用して行われ、ヒトアデノウイルスは、本発明の特定の態様により好まれる。特定の好ましい実施形態では、本発明による組換えアデノウイルスはヒトアデノウイルスに基づく。好ましい実施形態では、組換えアデノウイルスはヒトアデノウイルス血清型５、１１、２６、３４、３５、４８、４９、５０、５２等に基づく。本発明の特に好ましい実施形態により、アデノウイルスは血清型２６のヒトアデノウイルスである。これらの血清型の利点は、低い血清有病率および／またはヒト集団における低い既存の中和抗体力価、ならびに臨床試験におけるヒト対象での使用の経験である。
【００６４】
サルアデノウイルスも、一般的に、低い血清有病率および／またはヒト集団における低い既存の中和抗体力価を有し、相当量の研究がチンパンジーアデノウイルスベクターを使用して報告されている（例えば、米国特許第６０８３７１６号明細書、国際公開第２００５／０７１０９３号パンフレット、国際公開第２０１０／０８６１８９号パンフレット、国際公開第２０１００８５９８４号パンフレット、Farina et al, 2001, J Virol 75: 11603-13、Cohen et al, 2002, J Gen Virol 83: 151-55、Kobinger et al, 2006, Virology 346: 394-401、Tatsis et al., 2007, Molecular Therapy 15: 608-17、Bangari and Mittal, 2006, Vaccine 24: 849-62によるレビュー、ならびにLasaro and Ertl, 2009, Mol Ther 17: 1333-39によるレビューも参照）。したがって、他の実施形態では、本発明による組換えアデノウイルスは、サルアデノウイルス、例えばチンパンジーアデノウイルスに基づく。特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、サルアデノウイルス１、７、８、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７．１、２８．１、２９、３０、３１．１、３２、３３、３４、３５．１、３６、３７．２、３９、４０．１、４１．１、４２．１、４３、４４、４５、４６、４８、４９、５０またはＳＡ７Ｐ型に基づく。
【００６５】
好ましくは、アデノウイルスベクターは、複製欠損組換えウイルスベクター、例えばｒＡｄ２６、ｒＡｄ３５、ｒＡｄ４８、ｒＡｄ５ＨＶＲ４８等である。
【００６６】
本発明の好ましい実施形態では、アデノウイルスベクターは、Ａｄ２６を含む希少な血清型由来のキャプシドタンパク質を含む。典型的な実施形態では、ベクターはｒＡｄ２６ウイルスである。「アデノウイルスキャプシドタンパク質」は、特定のアデノウイルスの血清型および／または向性の決定に関与するアデノウイルスのキャプシドのタンパク質（例えば、Ａｄ２６、Ａｄ３５、ｒＡｄ４８、ｒＡｄ５ＨＶＲ４８ベクター）を指す。アデノウイルスのキャプシドタンパク質は、典型的には線維、ペントンおよび／またはヘキソンタンパク質を含む。本明細書で使用する場合、特定のアデノウイルスの「キャプシドタンパク質」、例えば「Ａｄ２６キャプシドタンパク質」は、例えば、Ａｄ２６キャプシドタンパク質の少なくとも一部を含むキメラキャプシドタンパク質であってよい。特定の実施形態では、キャプシドタンパク質はＡｄ２６の全キャプシドタンパク質である。特定の実施形態では、ヘキソン、ペントンおよび線維はＡｄ２６のものである。
【００６７】
当業者は、複数の血清型由来の要素が単一の組換えアデノウイルスベクターに合わせられることを理解する。したがって、異なる血清型からの所望の特性を合わせるキメラアデノウイルスが産生され得る。したがって、いくつかの実施形態では、本発明のキメラアデノウイルスは、第１の血清型の既存の免疫の不在と、温度安定性、アセンブリー、アンカリング、産生率、再指示または改善された感染、標的細胞におけるＤＮＡの安定性などとを合わせることができる。
【００６８】
特定の実施形態では、本発明で有用な組換えアデノウイルスベクターは、主にまたは完全にＡｄ２６に由来する（すなわち、ベクターはｒＡｄ２６）。いくつかの実施形態では、アデノウイルスは、例えば、ゲノムのＥ１領域に欠失を含有するため、複製欠損である。グループＣではないアデノウイルス、例えばＡｄ２６またはＡｄ３５に由来するアデノウイルスに関して、アデノウイルスのＥ４−ｏｒｆ６コード配列の、Ａｄ５などヒトサブグループＣのアデノウイルスのＥ４−ｏｒｆ６との交換は典型的である。これは、例えば２９３細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞など、Ａｄ５のＥ１遺伝子を発現する周知の補完細胞系におけるそのようなアデノウイルスの増殖を可能にする（例えば、Havenga, et al., 2006, J Gen Virol 87: 2135-43、国際公開第０３／１０４４６７号パンフレット参照）。しかしながら、そのようなアデノウイルスは、Ａｄ５のＥ１遺伝子を発現しない非補完細胞において複製できない。
【００６９】
組換えアデノウイルスベクターの調製は、当技術分野で周知である。ｒＡｄ２６ベクターの調製は、例えば国際公開第２００７／１０４７９２号パンフレットおよびAbbink et al., (2007) Virol 81(9): 4654-63に記載される。Ａｄ２６の例示的なゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＥＦ１５３４７４および国際公開第２００７／１０４７９２号パンフレットの配列番号１に見出される。本発明に有用なベクターの例は、例えば、その開示の全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１２／０８２９１８号パンフレットに記載されるものを含む。
【００７０】
典型的には、本発明で有用なベクターは、組換えアデノウイルスゲノム全体を含む核酸を使用して産生される（例えば、プラスミド、コスミド、またはバキュロウイルスベクター）。したがって、本発明は、本発明のアデノウイルスベクターをコードする単離された核酸分子も提供する。本発明の核酸分子は、ＲＮＡの形態またはクローニングによって得られたもしくは合成により産生されたＤＮＡの形態であってよい。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であってよい。
【００７１】
本発明で有用なアデノウイルスベクターは、典型的には複製欠損である。これらの実施形態では、ウイルスは、ウイルスの複製に重要な領域、例えばＥ１領域の欠失もしくは不活性化によって複製欠損にされる。領域は、例えば対象の遺伝子、例えば領域内の合成ＨＩＶエンベロープタンパク質（通常プロモーターに連結する）をコードする遺伝子、またはＨＩＶ抗原ポリペプチド（通常プロモーターに連結する）をコードする遺伝子を挿入することによって実質的に欠失または不活性化される。いくつかの実施形態では、本発明のベクターは、他の領域、例えばＥ２、Ｅ３もしくはＥ４領域に欠失、またはこれらの領域の１つまたは複数内にプロモーターに連結する異種遺伝子の挿入を含有し得る。Ｅ２−および／またはＥ４−変異アデノウイルスに関しては、通常Ｅ２−および／またはＥ４−補完細胞系を使用して、組換えアデノウイルスを生成する。アデノウイルスのＥ３領域の変異は、Ｅ３が複製に必要とされないため、細胞系によって補完される必要はない。
【００７２】
パッケージング細胞系は、典型的には、本発明での使用に十分な量のアデノウイルスベクターを産生するために使用される。パッケージング細胞は、複製欠損ベクターにおいて欠失または不活性化されたそれらの遺伝子を含む細胞であり、したがってウイルスを細胞内で複製させる。Ｅ１領域に欠失を有するアデノウイルスの好適なパッケージング細胞系としては、例えばＰＥＲ．Ｃ６、９１１、２９３、およびＥ１  Ａ５４９が挙げられる。
【００７３】
本発明の好ましい実施形態では、ベクターはアデノウイルスベクターであり、より好ましくはｒＡｄ２６ベクター、最も好ましくはアデノウイルスゲノムのＥ１領域に少なくとも１つの欠失を有するｒＡｄ２６ベクターであり、例えば、参照により本明細書に組み込まれるAbbink, J Virol, 2007. 81(9): p. 4654-63に記載される。典型的には、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質および／または他のＨＩＶ抗原をコードする核酸配列は、アデノウイルスゲノムのＥ１および／またはＥ３領域にクローニングされる。
【００７４】
本発明の好ましい態様では、本明細書に記載の合成ＨＩＶ抗原をコードするベクターは、ポックスウイルスベクターである。特に好ましい態様では、ベクターは改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）ベクターである。さらなる好ましい実施形態では、ＭＶＡウイルスベクターはＭＶＡ−ＢＮまたはその誘導体である。
【００７５】
ＭＶＡは、トルコのアンカラのワクチン接種研究所で長年に渡って維持され、ヒトへのワクチン接種の主成分として使用されてきた、皮膚ワクシニア株アンカラ（漿尿膜ワクシニアウイルスアンカラウイルス、ＣＶＡ、検討にはMayr et al. (1975) Infection 3, 6-14を参照）のニワトリ胚線維芽細胞で５７０回を超える連続継代によって生成される。弱毒化されたＣＶＡウイルスＭＶＡ（改変ワクシニアウイルスアンカラ）は、初代ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）でのＣＶＡの連続増殖（５７０継代より多く）によって得られた。
【００７６】
しかしながら、ワクシニアウイルスに関連したワクチン接種後の合併症が重症であることが多いため、より弱毒化された、より安全なワクチンを生成するいくつかの試みがあった。ＭＶＡを弱毒化するために使用された継代の結果として、ＣＥＦ細胞で行われた継代数によって多くの異なる株または単離株がある。より安全な製品、例えばワクチンまたは医薬品の開発のため、強化された安全性プロファイルを有するＭＶＡの株が、例えばＢａｖａｒｉａｎ  Ｎｏｒｄｉｃによって開発された。ＭＶＡは、Ｂａｖａｒｉａｎ  Ｎｏｒｄｉｃによってさらに継代され、ＭＶＡ−ＢＮと命名されている。ＭＶＡ−ＢＮの代表的な試料は、２０００年８月３０日に、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）で登録番号Ｖ０００８３００８の下に受託された。ＭＶＡ−ＢＮは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第０２／４２４８０号（パンフレット例えば、米国特許第６，７６１，８９３号明細書および米国特許第６，９１３，７５２号明細書および米国特許出願公開第２００３／０２０６９２６号明細書も参照）および国際公開第０３／０４８１８４号パンフレット（米国特許出願公開第２００６／０１５９６９９号明細書）にさらに記載される。ＭＶＡならびにＭＶＡ−ＢＮは、祖先ＣＶＡウイルスと比較してゲノムの約１５％（６つの領域から３１ｋｂ）を欠損している。この欠失は、多くの病原性および宿主範囲遺伝子、ならびにＡ型封入体の遺伝子に影響を与える。
【００７７】
様々な実施形態では、ＭＶＡまたは本発明に好適な組換え体を生成するために使用されるＭＶＡは、ＭＶＡ−５７２、ＭＶＡ−５７５、ＭＶＡ−Ｉ７２１であり、ＡＴＣＣ（登録商標）ＶＲ−１５０８（商標）として受託されたＭＶＡ、ＡＴＣＣ（登録商標）ＶＲ−１５６６（商標）として受託されたＭＶＡ、ＡＣＡＭ３０００ＭＶＡ、ＭＶＡ−ＢＮ、または任意の同様の弱毒化ＭＶＡ株である。好ましい実施形態では、組換え体を生成するために使用されるＭＶＡは、ＭＶＡ−５７５、ＡＴＣＣ（登録商標）ＶＲ−１５０８（商標）として受託されたＭＶＡ、ＡＴＣＣ（登録商標）ＶＲ−１５６６（商標）として受託されたＭＶＡ、ＡＣＡＭ３０００ＭＶＡ、ＭＶＡ−ＢＮである。より好ましくは、組換え体を生成するために使用されるＭＶＡはＭＶＡ−ＢＮである。
【００７８】
ＭＶＡ−５７２は、１９９４年１月２７日にＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ、Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｐｏｒｔｏｎ  Ｄｏｗｎ、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ、Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ  ＳＰ４  ０ＪＧ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）で受託番号ＥＣＡＣＣ  Ｖ９４０１２７０７で受託された。ＭＶＡ−５７５は、２０００年１２月７日にＥＣＡＣＣ  Ｖ００１２０７０７の下に受託された。Ａｃａｍ３０００  ＭＶＡは、２００３年３月２７日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）で登録番号ＰＴＡ５０９５の下で受託された（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ  ２０１１０−２２０９、ＵＳＡ）。ＭＶＡ−Ｉ７２１は、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＰａｓｔｅｕｒでＣＮＣＭ  Ｉ７２１として受託された。ＭＶＡ−ＢＮは、２０００年８月３０日にＥＣＡＣＣで番号Ｖ０００８３００８の下で受託された。ＭＶＡ−ＢＮは、国際公開第０２／０４２４８０号パンフレットに記載されている。
【００７９】
本発明によって包含されるものはまた、本明細書に記載のＭＶＡウイルスまたはＭＶＡ−ＢＮのいずれかの誘導体または変異体である。ＭＶＡまたはＭＶＡ−ＢＮの「誘導体」または「変異体」は、ＭＶＡまたはＭＶＡ−ＢＮと基本的に同じ複製特徴を示すが、それらのゲノムの１つまたは複数の部分で相違を示すＭＶＡまたはＭＶＡ−ＢＮウイルスを指す。受託されたウイルスと同じ「複製特徴」を有するウイルスは、ＣＥＦ細胞および細胞系ＨａＣａｔ（Boukamp et al. (1988), J Cell Biol 106: 761-771)、ヒトの骨の骨肉腫細胞系１４３Ｂ（ＥＣＡＣＣ番号９１１１２５０２）、ヒト胚性腎臓細胞系２９３（ＥＣＡＣＣ番号８５１２０６０２）、およびヒト頸部腺癌細胞系ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−２）において受託された株と類似の増幅率で複製するウイルスである。ＭＶＡ、その誘導体および変異体のこれらの特性を決定する試験およびアッセイは、例えば国際公開第０２／４２４８０号パンフレットに記載される細胞系の許容度（permissivity）アッセイなど、当業者に周知である。例示的な細胞系許容度アッセイでは、哺乳動物細胞系に、細胞あたりの感染の低い多重度、すなわち細胞当たり０．０５感染性単位（５×１０４ＴＣＩＤ５０）で、親および誘導体または変異体ＭＶＡウイルスを感染させる。１時間の吸収後、ウイルス種菌が除去され、細胞が３回洗浄され、残りの吸収されなかったウイルスが除去される。３％  ＦＣＳを補足した新鮮な培地が添加され、感染は、合計４日間置かれ（３７℃、５％ＣＯ２で）、ウイルス抽出物が調製される。感染は、−８０℃で３回プレートを凍結することによって停止する。ウイルス増殖および細胞変性効果（ＣＰＥ）は、続いて、Carroll and Moss (1997), Virology 238, 198-211に記載のものなど当業者に周知の方法を使用して、ＣＥＦ細胞において決定される。
【００８０】
より具体的には、ＭＶＡ−ＢＮまたはＭＶＡ−ＢＮの誘導体もしくは変異体は、好ましくはニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）においてリプロダクティブに複製する能力を有するが、ヒトケラチノサイト細胞系ＨａＣａｔ（Boukamp et al (1988), J. Cell Biol. 106:761-771）、ヒトの骨の骨肉腫細胞系１４３Ｂ（ＥＣＡＣＣ受託番号９１１１２５０２）、ヒト胚性腎臓細胞系２９３（ＥＣＡＣＣ受託番号８５１２０６０２）、およびヒト頸部腺癌細胞系ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ−２）においてはリプロダクティブに複製する能力を有さない。さらに、ＭＶＡ−ＢＮの誘導体または変異体は、Ｈｅｌａ細胞およびＨａＣａＴ細胞系におけるＭＶＡ−５７５よりも少なくとも２倍少ない、より好ましくは３倍少ないウイルス増幅率を有する。ＭＶＡ変異体のこれらの特性の試験およびアッセイは、国際公開第０２／４２４８０号パンフレットまたは上記の例示的な細胞系許容度アッセイに記載される。
【００８１】
用語「リプロダクティブに複製する能力を有さない」または「リプロダクティブに複製する能力がない」は、例えば国際公開第０２／４２４８０号パンフレットに記載され、上記のような所望の特性を有するＭＶＡを得る方法も教示する。その用語は国際公開第０２／４２４８０号パンフレットまたは米国特許第６，７６１，８９３号明細書に記載のアッセイを使用して、１よりも少ない感染４日後のウイルス増幅率を有するウイルスに適用する。
【００８２】
用語「リプロダクティブな複製の失敗」は、１よりも少ない感染４日後のウイルス増幅率を有するウイルスを指す。国際公開第０２／４２４８０号パンフレットまたは米国特許第６，７６１，８９３号明細書に記載のアッセイは、ウイルス増幅率の決定に適用できる。
【００８３】
ウイルスの増幅または複製は、通常、「増幅率」と呼ばれる、最初に細胞に感染させるために元々使用した量（入力値）に対する感染細胞から産生されたウイルス（出力値）の比率として表される。増幅率「１」は、感染細胞から産生されたウイルスの量が、細胞に感染させるために最初に使用した量と同じである増幅状態を定義し、感染細胞がウイルスの感染およびリプロダクションを許容することを意味する。対照的に、１より少ない増幅率、すなわち、入力レベルと比較した出力の減少は、リプロダクティブ複製の欠如、したがってウイルスの弱毒化を示す。
【００８４】
本明細書で提供される組換えポックスウイルスベクターは、当技術分野で公知の通常の方法によって生成され得る。組換えポックスウイルスを得るための、または外来コード配列をポックスウイルスゲノムに挿入するための方法は、当業者に周知である。例えば、標準的な分子生物学技術のための方法、例えば、ＤＮＡのクローニング、ＤＮＡおよびＲＮＡの単離、ウェスタンブロット分析、ＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲ増幅技術は、Molecular Cloning, A laboratory Manual (2nd Ed.) [J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]に記載され、ウイルスを取り扱うおよび操作するための技術は、Virology Methods Manual [B.W.J. Mahy et al. (eds.), Academic Press (1996)]に記載されている。同様に、ＭＶＡの取り扱い、操作、および遺伝子操作のための技術およびノウハウは、Molecular Virology: A Practical Approach [A.J. Davison & R.M. Elliott (Eds.), The Practical Approach Series, IRL Press at Oxford University Press, Oxford, UK (1993)（例えばChapter 9: Expression of genes by Vaccinia virus vectorsを参照）]およびCurrent Protocols in Molecular Biology [John Wiley & Son, Inc. (1998)（例えば、Chapter 16, Section IV: Expression of proteins in mammalian cells using vaccinia viral vectorを参照）]に記載されている。
【００８５】
本明細書に開示される様々な組換えポックスウイルスの生成のために、異なる方法が適用可能である。ウイルスに挿入されるＤＮＡ配列は、ポックスウイルスのＤＮＡのセクションに相同的なＤＮＡが挿入されている大腸菌（E.Coli）プラスミド構築物内に配置されてもよい。別に、挿入されるＤＮＡ配列は、プロモーターに連結されてもよい。プロモーター−遺伝子結合が、非必須遺伝子座を含有するポックスウイルスＤＮＡの領域に隣接するＤＮＡ配列に相同的なＤＮＡが両端で隣接するように、プロモーター−遺伝子結合を、プラスミド構築物中に位置させてもよい。結果として生じるプラスミド構築物は、大腸菌（E.Coli）中での増殖によって増幅させ、単離することができる。挿入されるＤＮＡ遺伝子配列を含有する単離されたプラスミドを、例えば、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）の細胞培養物にトランスエフェクトし、同時に培養物にポックスウイルスを感染させる。プラスミドにおける相同的ポックスウイルスＤＮＡとウイルスゲノムとの間の組換えは、外来ＤＮＡ配列の存在によって改変されたポックスウイルスを生成できる。
【００８６】
好ましい実施形態により、好適な細胞培養物の細胞、例えばＣＥＦ細胞にポックスウイルスを感染させることができる。続いて、好ましくは、ポックスウイルス発現制御要素の転写制御下に、外来または異種遺伝子（単数または複数）、例えば本開示で提供される核酸をコードする１つまたは複数のＨＩＶ抗原を含む第１のプラスミドベクターを感染細胞にトランスフェクトすることができる。上で説明したように、プラスミドベクターはまた、ポックスウイルスゲノムの選択された部分への外来配列の挿入を指示することができる配列も含む。任意選択で、プラスミドベクターはまた、ポックスウイルスプロモーターに操作可能に連結されたマーカーおよび／または選択遺伝子を含むカセットも含有する。好適なマーカーまたは選択遺伝子は、例えば、緑色蛍光タンパク質、β−ガラクトシダーゼ、ネオマイシン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ、または他のマーカーをコードする遺伝子である。選択またはマーカーカセットの使用は、生成された組換えポックスウイルスの同定および単離を単純化する。しかしながら、組換えポックスウイルスは、ＰＣＲ技術によっても同定することができる。その後、さらなる細胞に、上述のように得られた組換えポックスウイルスを感染させ、第２の外来または異種遺伝子（単数または複数）を含む第２のベクターをトランスフェクトすることができる。この場合、この遺伝子はポックスウイルスゲノムの異なる挿入部位に導入することができ、第２のベクターもまた、ポックスウイルスのゲノムへの第２の外来遺伝子（単数または複数）の組込みを指示するポックスウイルス−相同配列において異なる。相同組換えが起こった後、２つまたはそれ以上の外来または異種遺伝子を含む組換えウイルスを単離することができる。組換えウイルスにさらなる外来遺伝子を導入するために、前のステップで感染のために単離された組換えウイルスを使用することによって、およびトランスフェクションのためのさらなる外来遺伝子（単数または複数）を含むさらなるベクターを使用することによって、感染およびトランスフェクションのステップを繰り返すことができる。
【００８７】
代わりに、上記の感染およびトランスフェクションのステップは入れ替え可能である、すなわち、好適な細胞に、最初に外来遺伝子を含むプラスミドベクターをトランスフェクトし、次いでポックスウイルスを感染させることができる。さらなる代替として、各外来遺伝子を異なるウイルスに導入し、１つの細胞に、得られた全ての組換えウイルスを同時感染させ、全ての外来遺伝子を含む組換えについてスクリーニングすることも可能である。３つ目の代替は、ＤＮＡゲノムと外来配列のｉｎ  ｖｉｔｒｏでのライゲーション、およびヘルパーウイルスを使用する組換えワクシニアウイルスＤＮＡゲノムの再構成である。４つ目の代替は、細菌人工染色体（ＢＡＣ）としてクローニングしたポックスウイルスゲノムと、ワクシニアウイルスゲノム内の所望の組込み部位に隣接する配列に相同的なＤＮＡ配列と隣接する直鎖状外来配列との間の、大腸菌（E.Coli）または別の細菌種における相同組換えである。
【００８８】
本発明の実施形態による少なくとも１つのＨＩＶ抗原をコードする１つまたは複数の核酸配列は、ポックスウイルスまたはポックスウイルスベクターの任意の好適な部分に挿入され得る。好ましい態様では、本発明に使用するポックスウイルスはＭＶＡウイルスを含む。本開示の１つまたは複数の核酸が挿入され得るＭＶＡウイルスの好適な部分は、ＭＶＡウイルスの非必須部分を含む。
【００８９】
ＭＶＡウイルスは、ＭＶＡゲノムの非必須部分が遺伝子間領域またはＭＶＡゲノムの公知の欠失部位１〜６であってよい。代わりにまたはさらに、組換えＭＶＡの非必須部分は、ウイルス増殖に非必須であるＭＶＡゲノムのコード領域であってよい。しかしながら、本明細書に記載のように抗原および核酸および任意の付随するプロモーターが、少なくとも１つの細胞培養システム、例えばニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ細胞）において増幅および増殖できる組換え体を得ることが可能である限り、ウイルスゲノムのどこにでも挿入され得ることは本発明の範囲内であるため、挿入部位は、ＭＶＡゲノムのこれらの好ましい挿入部位に限定されない。
【００９０】
好ましくは、本発明の核酸は、ＭＶＡの１つまたは複数の遺伝子間領域（ＩＧＲ）に挿入される。用語「遺伝子間領域」および「ＩＧＲ」は、好ましくはＭＶＡゲノムの２つの隣接するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）間に位置するウイルスゲノムの部分、好ましくはＭＶＡウイルスゲノムの２つの必須なＯＲＦ間を指す。ＭＶＡに関して、特定の実施形態では、ＩＧＲは、ＩＧＲ０７／０８、ＩＧＲ４４／４５、ＩＧＲ６４／６５、ＩＧＲ８８／８９、ＩＧＲ１３６／１３７、およびＩＧＲ１４８／１４９から選択される。より好ましい実施形態では、本発明の核酸はＩＧＲ４４／４５およびＩＧＲ８８／８９領域に挿入される。
【００９１】
本発明の実施形態により、および上記のように、本明細書に記載の任意の合成ＨＩＶエンベロープタンパク質および／またはＨＩＶ抗原は、本発明のベクターで発現される。遺伝子コードの縮重を考慮して、当業者は、当技術分野で完全に通常の方法によって、いくつかの核酸配列が同じタンパク質をコードするように設計されることをよく理解する。合成ＨＩＶエンベロープタンパク質および／またはＨＩＶ抗原をコードする核酸は、任意選択でコドン最適化され、処置された宿主（例えば、ヒト）での正しい発現を確実にする。コドン最適化は当技術分野で広く適用される技術である。本発明の合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする配列のいくつかの非限定的な例は、配列番号２６（実施例のアデノウイルスベクターに使用される）、および４１（実施例のＭＶＡベクターに使用される）に提供され、本発明での使用のためのさらなるＨＩＶ抗原をコードする配列のいくつかの非限定的な例は、配列番号２０〜２２（実施例のアデノウイルスベクターに使用される）、および３８〜４０（実施例のＭＶＡベクターに使用される）に提供される。
【００９２】
本発明はまた、本明細書に記載のいずれかのベクターを含む細胞、好ましくは単離された細胞も提供する。細胞は組換えタンパク質の製造、またはウイルス粒子の製造に使用され得る。
【００９３】
また、合成ＨＩＶ抗原ポリペプチドを作成する方法も開示される。本方法は、プロモーターに操作可能に連結された合成ＨＩＶ抗原ポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクトするステップ、合成ＨＩＶ抗原ポリペプチドの発現に好適な条件下でトランスフェクトした細胞を増殖させるステップ、および細胞から合成ＨＩＶ抗原ポリペプチドを単離するステップを含む。合成ＨＩＶ抗原ポリペプチドは、アフィニティークロマトグラフィー等を含む当技術分野で公知の任意の方法によって細胞から単離または回収され得る。組換えタンパク質発現に使用される技術は、本開示に照らして当業者に周知である。
【００９４】
本発明はまた、本発明の合成ＨＩＶ抗原ポリペプチドをコードするベクターを製造する方法にも関し、本方法は、ベクターを含む細胞を培養し、前記培養中にベクターを増殖させ増やすステップ、ならびに細胞培養物から、例えば細胞から、培養培地、または両方から本発明の合成ＨＩＶ抗原ポリペプチドをコードするベクターを単離するステップを含む。ベクターは、当技術分野で公知の方法によってさらに精製される。
【００９５】
特定の実施形態では、本発明は、合成ＨＩＶ抗原をコードする核酸配列を含むポックスウイルスベクター、好ましくはＭＶＡベクター、例えばＭＶＡ−ＢＮベクターを提供する。ポックスウイルスベクターは、本発明による、例えば配列番号１８のアミノ酸配列を含む合成ＨＩＶエンベロープ（Ｅｎｖ）抗原をコードする核酸配列を含み、任意選択で少なくとも１つのさらなるＨＩＶ抗原をコードする核酸配列をさらに含む。好ましい実施形態では、ポックスウイルスベクターおよびより好ましくはＭＶＡベクターは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む合成ＨＩＶ  Ｅｎｖ抗原である第１のＨＩＶ  Ｅｎｖ抗原、および少なくとも１つのさらなるＨＩＶ抗原、例えばＧａｇ、Ｐｏｌ、および／またはＥｎｖ抗原、好ましくは配列番号１〜５、２８、および２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む１つまたは複数のさらなるＨＩＶ抗原をコードする核酸配列を含む。
【００９６】
例えば、特定の実施形態では、ポックスウイルスベクターは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む第１のＨＩＶ  Ｅｎｖ抗原、第１のＨＩＶ  Ｅｎｖ抗原とは異なる第２のＨＩＶ  Ｅｎｖ抗原、２つの異なるＨＩＶ  Ｇａｇ抗原である第３の抗原および第４の抗原、ならびに２つの異なるＨＩＶ  Ｐｏｌ抗原である第５の抗原および第６の抗原をコードする核酸を含み得る。ＧａｇおよびＰｏｌ抗原は融合されて、第１のＧａｇ−Ｐｏｌ融合抗原および第２のＧａｇ−Ｐｏｌ融合抗原、例えば配列番号２８または配列番号２９のアミノ酸配列を含むＧａｇ−Ｐｏｌ融合抗原になっていてもよい。
【００９７】
例示的な特定の実施形態では、ポックスウイルスベクターは、配列番号１〜５、１８、２８、および２９からなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸配列をコードする核酸を含む。１つまたは複数の特定の実施形態では、ポックスウイルスベクターは、配列番号１〜５、および１８、より好ましくは配列番号５、１８、２８、および２９のアミノ酸配列をコードする核酸を含む。
【００９８】
他の特定の例示的な実施形態では、ベクターは、配列番号２５、２６、および２７、好ましくは配列番号２６からなる群から選択される核酸配列を含むアデノウイルスベクターである。さらなる例示的な実施形態は、他のＨＩＶ抗原をコードするアデノウイルスベクターを含み、そのようなアデノウイルスベクターは、配列番号２０、２１、および２２からなる群から選択される１つまたは複数の核酸配列を含む。他の特定の実施形態では、ベクターは、ポックスウイルスベクター、好ましくはＭＶＡベクター、より好ましくはＭＶＡ−ＢＮ、配列番号３８、３９、４０、および４１からなる群から選択される１つまたは複数の核酸配列を含むベクターである。１つまたは複数の特定の実施形態では、ポックスウイルスベクターは配列番号３８、３９、４０、および４１を含む。
【００９９】
１つまたは複数のＨＩＶ抗原をコードする核酸配列は、本明細書に記載のように、ポックスウイルスベクターゲノムの任意の適切な挿入部位に挿入され得る。ポックスウイルスベクターが、１つまたは複数のＧａｇ−Ｐｏｌ融合抗原をコードするＭＶＡベクター、例えばＭＶＡ−ＢＮまたはその誘導体である特定の実施形態では、第１のＧａｇ−Ｐｏｌ融合抗原をコードする核酸配列はＭＶＡゲノムの遺伝子間領域（ＩＧＲ）４４／４５に挿入され、第２のＧａｇ−Ｐｏｌ融合抗原をコードする核酸配列はＭＶＡゲノムのＩＧＲ８８／８９に挿入され得る。さらに、ＨＩＶ  Ｅｎｖ抗原をコードする核酸配列は、ＭＶＡゲノムのＩＧＲ４４／４５および／またはＩＧＲ８８／８９に挿入され得る。１つまたは複数の特定の実施形態では、ポックスウイルスベクターは、配列番号２８を含むＧａｇ−Ｐｏｌ融合抗原をコードする核酸配列およびＭＶＡゲノムのＩＧＲ４４／４５に配列番号５を含むＨＩＶ  Ｅｎｖ抗原をコードする核酸配列および／または配列番号２９を含むＧａｇ−Ｐｏｌ融合抗原をコードする核酸配列およびＭＶＡゲノムのＩＧＲ８８／８９に配列番号１８を含むＨＩＶ  Ｅｎｖ抗原をコードする核酸配列を含む。好ましくは、Ｇａｇ−Ｐｏｌ融合抗原はそれぞれ別個のプロモーター、好ましくはＰｒ１３．５プロモーター、例えば配列番号４２に示すものの制御下にあり、および／またはＥｎｖ抗原はそれぞれ別個のプロモーター、好ましくはＰｒＨｙｂプロモーター、例えば配列番号４３に示すものの制御下にある。
【０１００】
組成物
別の一般的な態様では、本発明は合成ＨＩＶエンベロープタンパク質および担体をコードする核酸を含むベクターを含む組成物に関する。好ましくは、組成物はワクチン組成物であり、以下により詳細に記載される。本発明の実施形態により、本明細書に記載の任意のベクターが組成物に含まれる。好ましくは、ベクターは、ウイルスベクター、より好ましくはアデノウイルスまたはポックスウイルスベクター、およびさらにより好ましくはアデノウイルス２６ベクターまたはＭＶＡベクターであってよい。
【０１０１】
一実施形態では、本発明の組成物は、配列番号８、配列番号１８、または配列番号１９のアミノ酸配列、より好ましくは配列番号１８のアミノ酸配列を含む合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする核酸配列を含むポックスウイルスベクター、好ましくはＭＶＡベクターを含む。特定の好ましい実施形態では、ベクターはＭＶＡ−ＢＮベクター、またはその誘導体である。１つまたは複数の特定の実施形態では、本発明の組成物は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む少なくとも第１のＨＩＶ  エンベロープ抗原をコードする核酸を含む、ポックスウイルスベクター、ＭＶＡベクター、またはＭＶＡ−ＢＮベクターを含む。最も好ましくは、そのようなベクターは、（ｂ）第１のＨＩＶ  Ｅｎｖ抗原とは異なる第２のＨＩＶ  Ｅｎｖ抗原、（ｃ）２つの異なるＨＩＶ  Ｇａｇ抗原である第３の抗原および第４の抗原、ならびに（ｄ）２つの異なるＨＩＶ  Ｐｏｌ抗原である第５の抗原および第６の抗原をコードする核酸配列をさらに含む。好ましい実施形態では、第２のＨＩＶ  Ｅｎｖ抗原は配列番号５のアミノ酸配列を含み、第３および第４の抗原はそれぞれ配列番号１および配列番号２のアミノ酸配列を含み、第５および第６の抗原はそれぞれ配列番号３および配列番号４のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、第３および第５の抗原は融合されて、配列番号２８のアミノ酸配列を含む第１のＧａｇ−Ｐｏｌ融合抗原になっており、第４および第６の抗原は融合されて、配列番号２９のアミノ酸配列を含む第２のＧａｇ−Ｐｏｌ融合抗原になっている。
【０１０２】
本発明の実施形態により、本発明によるポックスウイルスベクターを含む組成物は、１つまたは複数のさらなるＨＩＶ抗原、および／または１つもしくは複数の単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドをコードする１つまたは複数のさらなるベクターと一緒に使用され得る。さらなるベクターおよび／またはＨＩＶ抗原性ポリペプチドは、同じ組成物または１つもしくは複数の異なる組成物に存在し得る。好ましくは、１つまたは複数のさらなるベクターはウイルスベクター、例えばアデノウイルスベクター、より好ましくはアデノウイルス２６ベクター、またはポックスウイルスベクター、より好ましくはＭＶＡベクターである。１つまたは複数のさらなるベクターは、本開示に照らして当業者に公知の任意のＨＩＶ抗原をコードし得る。より好ましくは、１つまたは複数のさらなるベクターは、配列番号１〜５、１８、２８、および２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む１つまたは複数のＨＩＶ抗原をコードするアデノウイルスベクター、好ましくはアデノウイルス２６ベクターである。
【０１０３】
一態様では、本発明は、（ａ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む合成ＨＩＶエンベロープタンパク質、（ｂ）好ましくは配列番号５のアミノ酸配列を含む第２のＨＩＶエンベロープタンパク質、（ｃ）２つの異なるＨＩＶ  Ｇａｇ抗原であり、好ましくはそれぞれ配列番号１および２のアミノ酸配列を含む第３の抗原および第４の抗原、ならびに（ｄ）２つの異なるＨＩＶ  Ｐｏｌ抗原であり、好ましくはそれぞれ配列番号３および４のアミノ酸配列を含む、第５の抗原および第６の抗原をコードする核酸配列を含む１つまたは複数のベクターを一緒に含むワクチン組合せ物を提供する。１つまたは複数の特定の実施形態では、第３および第５の抗原は融合されて、好ましくは配列番号２８のアミノ酸配列を含む第１のＧａｇ−Ｐｏｌ融合抗原になっており、第４および第６の抗原は融合されて、配列番号２９のアミノ酸配列を含む第２のＧａｇ−Ｐｏｌ融合抗原になっている。ベクターは、それぞれ別個の組成物であってよく、またはそれらは単一の組成物に組み合わされてよい。ベクターの多様な核酸は、１つの対象に投与されることを意図し、いずれかのベクター単独の投与時に得られる免疫応答よりも広範であるＨＩＶに免疫応答を生じる。多様な核酸配列はまた、１つの単一のベクターに存在してもよい。
【０１０４】
本発明の実施形態により、１つまたは複数のベクターは、アデノウイルスベクター、好ましくはアデノウイルス２６ベクター、および／またはポックスウイルスベクター、好ましくはＭＶＡベクターであってよい。アデノウイルスおよび／またはポックスウイルスベクターを含む組成物は、任意選択で１つまたは複数の単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドをさらに含んでもよい。任意の単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドは、本開示に照らして本発明の組成物で使用され得る。特定の好ましい実施形態では、１つまたは複数の単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列の残基３０〜７０８を含むポリペプチド、配列番号３６の残基３０〜７２４を含むポリペプチド、またはその組合せを含む。
【０１０５】
１つまたは複数の特定の実施形態では、組合せは、好ましくは配列番号１〜５、１８、２８、および２９からなる群から選択される１つまたは複数のＨＩＶ抗原をコードする核酸を含むアデノウイルスベクター、好ましくはアデノウイルス２６ベクター、ならびに好ましくは配列番号１〜５、１８、２８、および２９からなる群から選択される１つまたは複数のＨＩＶ抗原をコードする核酸を含むポックスウイルスベクター、好ましくはＭＶＡベクターを含む。好ましくは、１つまたは複数のアデノウイルスベクター、好ましくはアデノウイルス２６ベクターは、合わせて、配列番号１〜５および１８をコードし、ポックスウイルスベクター、好ましくはＭＶＡベクターは配列番号１〜５および１８をコードする。ベクターは、１つの組成物、または１つもしくは複数の異なる組成物に存在してもよい。
【０１０６】
本発明の特定の実施形態により、組成物、例えばワクチン組成物は、免疫原的有効量のベクター、例えばウイルスベクターを含む。本明細書で使用する場合、「免疫原的有効量」または「免疫学的有効量」は、それを必要とする対象において所望の免疫効果または免疫応答を誘導するのに十分な組成物の量を意味する。一実施形態では、免疫原的有効量は、それを必要とする対象において免疫応答を誘導するのに十分な量を意味する。別の実施形態では、免疫原的有効量は、それを必要とする対象において免疫を生じさせる、例えば、ウイルス感染などの疾患に対する保護効果を提供するのに十分な量を意味する。免疫原的有効量は、様々な因子、例えば対象の健康状態、年齢、体重、健康等、免疫応答を誘導するか、または保護免疫を提供するかの特定の適用、投与される特定の組換えベクター、投与される組換えベクターによってコードされる免疫原または抗原性ポリペプチド、投与される特定の抗原性ポリペプチド、および免疫が望まれる特定の疾患、例えばウイルス感染に応じて変化し得る。免疫原的有効量は本開示の観点で当業者によって容易に決定され得る。
【０１０７】
一般的ガイダンスとして、組換えウイルスベクター、例えばアデノウイルスベクターと関連して使用される場合、免疫原的有効量は、例えば約１０８ウイルス粒子から１０１２ウイルス粒子、例えば１０８、１０９、１０１０、１０１１、または１０１２ウイルス粒子であり得る。特定の実施形態でのヒトへの投与のためのアデノウイルスベクターの単回用量は、１０９ウイルス粒子と１０１１ウイルス粒子の間である。組換えウイルスベクター、例えばポックスウイルスベクターと関連して使用される場合、免疫原的有効量は、例えば約１０４から１０１１ＴＣＩＤ５０、１０５から１０１０ＴＣＩＤ５０、１０６から１０９ＴＣＩＤ５０、または１０７から１０８ＴＣＩＤ５０、例えば１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、または１０１１ＴＣＩＤ５０であり得る。対象（好ましくはヒト）のための好ましい用量は、１０５ＴＣＩＤ５０、１０６ＴＣＩＤ５０、１０７ＴＣＩＤ５０、１０８ＴＣＩＤ５０、１０９ＴＣＩＤ５０、または１０１０ＴＣＩＤ５０の用量を含む、１０５から１０１０ＴＣＩＤ５０を含む。ポックスウイルスベクター、例えばＭＶＡベクターの免疫原的有効量は、代わりにおよび便利にプラーク形成単位（ｐｆｕ）で表され、例えば約１０５から１０１１ｐｆｕ、例えば約１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、または１０１１ｐｆｕ、好ましくは約１０７から１０９ｐｆｕ、およびより好ましくは約１０８ｐｆｕ、例えば約０．５×１０８、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、または５×１０８ｐｆｕであり得る。特定の実施形態では、ヒト対象に投与される本発明によるＭＶＡベクターの免疫原的有効量は、好ましくは０．１ｍＬから１ｍＬ、例えば０．５ｍＬ中、約１×１０７から１０９ｐｆｕ、好ましくは約１×１０８ｐｆｕである。
【０１０８】
免疫原的有効量のベクター、例えばＭＶＡベクターおよび／またはアデノウイルスベクターは、単一組成物で、または複数の組成物、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０組成物（例えば錠剤、カプセルまたは注射剤）で投与され、複数のカプセルまたは注射の投与は合わせて、免疫原的有効量を対象に提供する。いわゆるプライム−ブーストレジメンにおいて、免疫原的有効量を対象に投与し、続いて免疫原的有効量の別の用量を同じ対象に投与することも可能である。さらなるブースト投与は、必要に応じて任意選択でレジメンに追加され得る。プライム−ブーストレジメンのこの一般的な概念は、ワクチン分野の当業者に周知であり、以下により詳細に記載される。
【０１０９】
本発明の組成物は担体をさらに含み得る。担体は、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤、例えば結合剤、崩壊剤、膨張剤、懸濁剤、乳化剤、湿潤剤、滑剤、フラボラント、甘味料、防腐剤、色素、溶解剤、およびコーティング剤を含み得る。担体または他の材料の正確な性質は、投与の経路、例えば筋肉内、皮下、経口、静脈内、皮膚、粘膜内（例えば消化管）、鼻腔内または腹腔内経路に応じ得る。液体の注射可能製剤、例えば懸濁剤および溶液に関して、好適な担体および添加物は、水、グリコール、オイル、アルコール、防腐剤、カラーリング剤等を含む。固体の経口製剤に関して、例えば、粉末、カプセル、カプレット、ジェルキャップ、および錠剤、好適な担体および添加物は、デンプン、糖、希釈剤、造粒剤、滑剤、結合剤、崩壊剤等を含む。点鼻薬／吸入混合物に関しては、好適な担体および添加剤として、水溶液／懸濁液が、水、グリコール、オイル、軟化剤、安定剤、湿潤剤、防腐剤、芳香、フレーバー等を含み得る。
【０１１０】
本発明の組成物は、限定はされないが、経口（経腸）投与および非経口注射を含む、投与を促進し、効果を改善する対象への投与に好適な任意の物質で製剤化される。非経口注射は、静脈内注射または点滴、動脈内注射、皮下注射、筋肉内注射、および関節内注射を含む。本発明の組成物はまた、経粘膜、目、直腸、長期にわたる移植、舌下投与、舌下、口腔粘膜、門脈循環のバイパス、吸入、または鼻腔内を含む投与の他の経路のために製剤化される。
【０１１１】
本発明の特定の実施形態により、組成物は、免疫原的有効量の精製したまたは部分的に精製したベクター、例えばアデノウイルス２６ベクターなどのアデノウイルスベクター、またはＭＶＡもしくはＭＶＡ−ＢＮなどのポックスウイルスベクター、本発明の合成ＨＩＶエンベロープタンパク質および任意選択で１つまたは複数のさらなるＨＩＶ抗原をコードする核酸を含むベクターを含む。前記組成物は、当技術分野で周知の方法によってワクチンとして製剤化される（「免疫原性組成物」とも呼ばれる）。
【０１１２】
本発明の特定の実施形態では、組成物は、免疫原的有効量の単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドを含む１つまたは複数のポリペプチドをさらに含み得る。一般的に、ポリペプチド、例えば単離された抗原性ポリペプチドに関連して使用される場合、免疫原的有効量は、例えば約０．３から約３０００マイクログラム（μｇ）、例えば１〜１０００μｇ、例えば１０〜５００μｇ、例えば約５０または２５０μｇの範囲であり得る。非限定的な例としては、本発明の合成ＨＩＶ  Ｅｎｖ抗原（例えば、配列番号１８を有する）および任意選択で１つまたは複数のさらなるＨＩＶ抗原（例えば配列番号１〜５、２８、および／または２９）をコードする１つまたは複数のベクターの投与と単離されたＨＩＶ  Ｅｎｖポリペプチド、例えば、２５０μｇの配列番号７のアミノ酸３０〜７０８を有するＨＩＶクレードＣ  Ｅｎｖ三量体タンパク質または２５０μｇの配列番号３６のアミノ酸３０〜７０８を有するＨＩＶモザイクＥｎｖ三量体タンパク質の投与を組み合わせることが可能である。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、任意選択で免疫応答を増強するためのアジュバントをさらに含み得る。用語「アジュバント」および「免疫刺激」は、本明細書で交換可能に使用され、免疫系の刺激を引き起こす１つまたは複数の物質として定義される。この文脈では、アジュバントは、本発明の合成ＨＩＶエンベロープタンパク質および任意選択で１つまたは複数のさらなるＨＩＶ抗原をコードするベクターおよび／または本発明の合成ＨＩＶエンベロープタンパク質および任意選択で１つまたは複数のさらなるＨＩＶ抗原をコードするベクターと組み合わせて使用されるＨＩＶ抗原性ポリペプチドに対する免疫応答を増強するために使用される。
【０１１４】
本発明による使用に好適なアジュバントは、潜在的に安全であり、良好に忍容性であり、ヒトに有効であるもの、例えば、ＱＳ−２１、Ｄｅｔｏｘ−ＰＣ、ＭＰＬ−ＳＥ、ＭｏＧＭ−ＣＳＦ、ＴｉｔｅｒＭａｘ−Ｇ、ＣＲＬ−１００５、ＧＥＲＢＵ、ＴＥＲアミド、ＰＳＣ９７Ｂ、Ａｄｊｕｍｅｒ、ＰＧ−０２６、ＧＳＫ−Ｉ、ＧｃＭＡＦ、Ｂ−アレチン、ＭＰＣ−０２６、Ａｄｊｕｖａｘ、ＣｐＧ  ＯＤＮ、Ｂｅｔａｆｅｃｔｉｎ、アルミニウム塩（例えばＡｄｊｕＰｈｏｓ）、Ａｄｊｕｐｌｅｘ、およびＭＦ５９であるべきである。製剤の各成分の最適な比率は本開示に照らして当業者に周知の技術によって決定され得る。
【０１１５】
好ましい実施形態では、アジュバントはアルミニウム塩、例えばリン酸アルミニウム、例えばＡｄｊｕＰｈｏｓである。特定の実施形態では、リン酸アルミニウムは、好ましくは、単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチド、例えばｇｐ１４０を含む組成物中に存在するまたはともに投与される。
【０１１６】
免疫原性組成物の調製および使用は、当業者に周知である。液体医薬組成物は、一般的には液体担体、例えば水、石油、動物または植物油、鉱物油または合成油を含む。生理食塩水溶液、デキストロースまたは他のサッカライド溶液またはグリコール、例えばエチレングリコール、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコールも含まれ得る。
【０１１７】
例えば、組換えアデノウイルスベクターは、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｗｏｒｌｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄにも使用される緩衝液中で保存されてよい（Hoganson et al., 2002,  Bioprocessing J 1: 43-8）：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５％グリセロール。ヒトへの投与に好適な別の有用なアデノウイルス製剤緩衝液は、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、スクロース１０％  ｗ／ｖ、ポリソルベート−８０  ０．０２％  ｗ／ｖである。組換えアデノウイルスに好適な別の製剤緩衝液は、１０〜２５ｍＭのクエン酸緩衝液  ｐＨ５．９〜６．２、４〜６％（ｗ／ｗ）ヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン（ＨＢＣＤ）、７０〜１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１８〜０．０３５％（ｗ／ｗ）ポリソルベート−８０、および任意選択で０．３〜０．４５％（ｗ／ｗ）エタノールを含む。明らかに、多くの他の緩衝液が使用され、精製したベクターの保存のためおよび薬学的投与のための好適な製剤のいくつかの例が公知である。
【０１１８】
ＭＶＡおよびＭＶＡ−ＢＮを含む、ポックスウイルスベクターの例示的な調整および保存は、例えば、Stickl, H. et al., Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392 (1974)に記載されるように、天然痘に対するワクチン接種のために使用されるポックスウイルスワクチンの調製における経験に基づき得る。
【０１１９】
例示的な実施形態では、精製したポックスウイルスは、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．７中で製剤化された５×１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌの力価で−８０℃で保存される。ワクチン注射の調製のため、例えばウイルスの１０２〜１０８粒子は、アンプル、好ましくはガラスアンプル内で２％ペプトンおよび１％ヒトアルブミン存在下のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）中で凍結乾燥され得る。代わりに、ワクチン注射は、段階的に、製剤中のウイルスの凍結乾燥によって調製され得る。特定の実施形態では、製剤は、さらなる添加物、例えばマンニトール、デキストラン、糖、グリシン、ラクトース、ポリビニルピロリドン、または、例えば、限定はされないが、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に好適な抗酸化剤または不活性ガス、安定剤または組換えタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン）を含む他の添加物を含有する。次いで、アンプルは密封され、好適な温度、例えば４℃と室温の間で数ヵ月間保存され得る。しかしながら、必要がない限り、アンプルは好ましくは−２０℃未満の温度で保存される。
【０１２０】
ワクチン接種または治療を含む様々な実施形態では、凍結乾燥物は０．１〜０．５ｍｌの水溶液、好ましくは生理食塩水またはＴｒｉｓ緩衝液に溶解され、全身または局所的のいずれかで、すなわち、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、鼻腔内、皮内、または当業者に公知の投与の任意の他の経路によって投与される。投与の形態、用量、および投与の数の最適化は当業者の技術および知識内である。
【０１２１】
ベクター、またはベクターの組合せが、配列番号１８および５を含む両方のＨＩＶ抗原をコードする実施形態の利点は、免疫応答の幅の増加である（クレードＢおよびＣ由来の株をカバーする）。
【０１２２】
特定の実施形態では、本発明の組成物またはワクチン組合せ物は、同じまたは他のベクターに、配列番号２８（ｍｏｓ１ＧａｇＰｏｌ）および／または配列番号２９（ｍｏｓ２ＧａｇＰｏｌ）のアミノ酸配列を含むＨＩＶ抗原性ポリペプチドをコードする核酸をさらに含む。
【０１２３】
特定の実施形態では、本発明の組成物またはワクチン組合せ物は、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＩＶ抗原をコードする第１のアデノウイルスベクター、好ましくはアデノウイルス２６ベクターを含み、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＩＶ抗原をコードする第２のアデノウイルスベクター、好ましくはアデノウイルス２６ベクター、ならびに配列番号２８または配列番号２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む１つまたは複数のＨＩＶ抗原をコードする１つまたは複数のさらなるアデノウイルスベクター、好ましくはアデノウイルス２６ベクターをさらに含む。例えば、本発明の実施形態による組成物またはワクチン組合せ物は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする第１のベクター、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＩＶ抗原をコードする第２のベクター；配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＩＶ抗原をコードする第３のベクター、および配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＩＶ抗原をコードする第４のベクターの、４つのアデノウイルスベクター、好ましくはアデノウイルス２６ベクターを含み得る。好ましくは、本発明のポックスウイルスベクターは、それらのアデノウイルスベクターとのワクチン組合せ物の一部であり得る。そのようなポックスウイルスベクター、好ましくはＭＶＡベクター、例えばＭＶＡ−ＢＮベクターは、好ましい実施形態では、配列番号１８、５、２８および２９のそれぞれをコードする。
【０１２４】
本発明の特に好ましい実施形態では、組成物またはワクチン組合せ物は、６つの異なるＨＩＶ抗原、主に配列番号１８（ｍｏｓ２Ｓ  Ｅｎｖ）、配列番号５（ｍｏｓ１  Ｅｎｖ）、配列番号１（ｍｏｓ１  Ｇａｇ）、配列番号２（ｍｏｓ２  Ｇａｇ）、配列番号３（ｍｏｓ１  Ｐｏｌ）、および配列番号４（ｍｏｓ２  Ｐｏｌ）によってコードされる抗原をコードする核酸配列を含むポックスウイルスベクター、好ましくはＭＶＡベクター、好ましくはＭＶＡ−ＢＮを含み、ここで配列番号１および３は任意選択で融合され（配列番号２８；ｍｏｓ１ＧａｇＰｏｌ）ならびに配列番号２および４は任意選択で融合されている（配列番号２９：ｍｏｓ２ＧａｇＰｏｌ）。利点は、これら６つのＨＩＶ抗原を投与するため、単一のベクターのみが製造、精製、製剤化、試験、保存、輸送、および投与される必要があることである。また、ポックスウイルスベクター、例えばＭＢＡ−ＢＮを含むＭＶＡは、それにコードされる抗原に対する良好な免疫応答を提供することが公知である。さらに、それらは典型的には、他のベクタープラットフォーム、例えばプライム−ブーストレジメンにおいてアデノウイルス、例えばＡｄ２６ベクターと一緒に有利に使用され、さらに改善された免疫応答を生成する。例えば、配列番号１〜５および１８によってコードされる６つの異なるＨＩＶ抗原をコードする核酸配列を含むポックスウイルスベクターは、配列番号１〜５、および１８によってコードされる１つまたは複数のＨＩＶ抗原をコードする１つまたは複数のアデノウイルスベクター、好ましくはアデノウイルス２６ベクターと一緒に使用され、好ましくは１つまたは複数のアデノウイルスベクターはともに配列番号１〜５および１８をコードする。
【０１２５】
上記のように、いくつかの実施形態では、組成物またはワクチン組合せ物は、１つまたは複数の単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドをさらに含む。本開示の観点で当業者に公知の任意のＨＩＶ抗原性ポリペプチドは、本発明の組成物またはワクチン組合せ物にさらに含まれ、限定はされないが、ＨＩＶエンベロープタンパク質（例えば、ｇｐ１６０、ｇｐ１４０、ｇｐ１２０、またはｇｐ４１）、好ましくは安定化した三量体ｇｐ１４０タンパク質、例えば安定化したクレードＣまたはクレードＡ  ｇｐ１４０タンパク質を含む。好ましい実施形態では、単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドは安定化したＨＩＶクレードＣ三量体ｇｐ１４０タンパク質、例えば配列番号７のアミノ酸配列の残基３０〜７０８を含むものである（配列番号７の残基１〜２９はシグナル配列にある）。クレードＣ  ｇｐ１４０タンパク質に追加してまたは単独で使用される代わりのまたはさらなるＨＩＶ  Ｅｎｖポリペプチドは、例えば配列番号３６のアミノ酸３０〜７２４に開示されるアミノ酸配列を有するモザイクＥｎｖ三量体タンパク質である（国際公開第２０１４／１０７７４４号パンフレットの配列番号２に相当し、配列番号３６の残基１〜２９はシグナル配列にある）。特定の実施形態では、ＨＩＶ抗原性ポリペプチドは、（ｉ）配列番号７のアミノ酸残基３０〜７０８を含むクレードＣ  ｇｐ１４０タンパク質、および（ｉｉ）配列番号３６のアミノ酸残基３０〜７２４を含むモザイクｇｐ１４０タンパク質の両方を含む。
【０１２６】
本発明はまた、本発明の組成物またはワクチン組合せ物を産生する方法にも関する。本発明の実施形態により、組成物または組合せを産生する方法は、本発明の合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする核酸を含むベクターと担体、ならびに任意選択で１つまたは複数のさらなるＨＩＶ抗原性ポリペプチドおよび／または１つまたは複数の単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドをコードする１つまたは複数のさらなるベクターを組み合わせるステップを含む。当業者は、そのような組成物を調整するために使用される従来の技術に精通している。
【０１２７】
ワクチンおよびワクチン組合せ物
本発明の他の一般的な態様は、ワクチンおよびワクチン組合せ物に関する。特定の実施形態では、本明細書に記載される本発明の組成物はワクチンである。本明細書で使用する場合、用語「ワクチン」は、本発明の合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードするおよび任意選択で対象に保護免疫または保護免疫応答を提供する、または対象にワクチン接種することができる１つまたは複数のさらなるＨＩＶ抗原をさらにコードする、免疫学的有効量の発現ベクター、好ましくはウイルスベクターを含む組成物を指す。本発明の実施形態により、対象への組成物の投与時に、発現ベクターはコードされた合成ＨＩＶエンベロープタンパク質および任意選択でさらにコードされたＨＩＶ抗原を発現し、発現された合成ＨＩＶエンベロープタンパク質および任意選択でさらにコードされたＨＩＶ抗原は対象の免疫系に提示され、それにより免疫を生じさせるのに必要な応答を誘導し、または免疫応答を誘導する。
【０１２８】
したがって、別の一般的な態様では、本発明は、対象におけるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する免疫応答を誘導するためのワクチンを提供する。本発明の実施形態により、ワクチンは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする免疫原的有効量の発現ベクターを含む組成物を含む。好ましくは、発現ベクターはウイルスベクター、より好ましくは、アデノウイルスベクター、例えばアデノウイルス２６ベクター、および最も好ましくは、ポックスウイルスベクター、例えばＭＶＡまたはＭＶＡ−ＢＮベクターである。
【０１２９】
本発明の実施形態により、ワクチン組成物は、例えば１つまたは複数のさらなるＨＩＶ抗原性ポリペプチドおよび／または１つまたは複数の単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドをコードする１つまたは複数のさらなるベクター、例えばウイルスベクター、例えばアデノウイルスベクター、好ましくはアデノウイルス２６ベクターをさらに含み得る。合成ＨＩＶエンベロープタンパク質、さらなるベクターおよび／または１つもしくは複数の単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドは、ワクチンにおいて同じ組成物または１つもしくは複数の異なる組成物中で製剤化され得る。
【０１３０】
本発明は、１つまたは複数のベクター、任意選択で単離された抗原性ポリペプチドと組合せて使用し、それを必要とする対象において１つまたは複数のＨＩＶクレードに対する免疫応答をプライミングおよびブーストするためのワクチン組合せ物にも関する。したがって、別の一般的な態様では、本発明は、
（ａ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む第１のＨＩＶ  Ｅｎｖ抗原をコードする核酸配列を含み、任意選択でさらなるＨＩＶ抗原、好ましくは配列番号１〜５、２８、および２９から選択されるアミノ酸配列を含む１つまたは複数のＨＩＶ抗原をコードする核酸配列をさらに含む免疫学的有効量のポックスウイルスベクターを含む第１のワクチン組成物と、
（ｂ）（ｉ）配列番号１〜５、２８、および２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む１つまたは複数のＨＩＶ抗原をコードする免疫原的有効量の１つまたは複数のアデノウイルスベクターを含む第２のワクチン組成物、ならびに
（ｂ）（ｉｉ）免疫原的有効量の単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドを含む１つまたは複数のポリペプチドを含む第３のワクチン組成物
の少なくとも１つとを含み、ここで第１の組成物、ならびに第２および／または第３の組成物が同じ組成物中または１つもしくは複数の異なる組成物中に存在する、
対象においてＨＩＶに対する免疫応答を誘導するためのワクチン組合せ物を提供する。
【０１３１】
その特定の実施形態では、第１のワクチン組成物は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む第１のＨＩＶ  Ｅｎｖ抗原、配列番号５のアミノ酸配列を含む第２のＨＩＶ  Ｅｎｖ抗原、それぞれ配列番号１および配列番号２のアミノ酸配列を含む第３および第４のＨＩＶ  Ｇａｇ抗原、それぞれ配列番号３および配列番号４のアミノ酸配列を含む第５および第６のＨＩＶ  Ｐｏｌ抗原をコードするＭＶＡベクターを含む。特定の実施形態では、配列番号１および３のＧａｇおよびＰｏｌ抗原は組み合わされ、配列番号２８を含むＧａｇ−Ｐｏｌ融合抗原として存在し、ならびに／または配列番号２および４のＧａｇおよびＰｏｌ抗原は組み合わされ、配列番号２９を含むＧａｇ−Ｐｏｌ融合抗原として存在する。
【０１３２】
その特定の実施形態では、第２のワクチン組成物は、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＩＶ抗原をコードするＡｄ２６ベクター、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＩＶ抗原をコードするＡｄ２６ベクター、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＩＶ抗原をコードするＡｄ２６ベクター、配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＩＶ抗原をコードするＡｄ２６ベクターを含む。
【０１３３】
本発明の特定の実施形態では、ワクチン組合せ物は、免疫原的有効量の単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドを含む１つまたは複数のポリペプチドを含む。好ましくは、単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドは配列番号７のアミノ酸配列の残基３０〜７０８、または配列番号３６の残基３０〜７２４を含む。特定の実施形態では、２つの単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチド、例えば、配列番号７のアミノ酸配列の残基３０〜７０８を含む第１の単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドと配列番号３６の残基３０〜７２４を含む第２の単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドは、１つの組成物中で一緒に投与される。単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドは、第３の組成物中または第１および／または第２の組成物中に存在し得る。第１または第２の組成物は、１つまたは複数の単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチド、好ましくはｇｐ１４０と一緒に、プライムおよび／またはブースト投与のために投与され得る。
【０１３４】
本明細書で使用する場合、用語「同時送達」、「同時投与」、または「と一緒に投与される」は、例えば、ウイルス発現ベクターおよび単離された抗原性ポリペプチド、または複数のウイルス発現ベクターなど、２つまたはそれ以上の成分の同時投与を指す。「同時投与」は、少なくとも同日内の２つまたはそれ以上の成分の投与であり得る。２つの成分が「と一緒に投与される」場合、それらは、短期間のうちに、例えば２４、２０、１６、１２、８または４時間、または１時間以内、例えば本質的に同時に別個の組成物で順に投与され、または同時に単一の組成物で投与され得る。
【０１３５】
本発明の別の一般的な態様は、本発明の実施形態によるワクチン組合せ物を含むキットに関する。
【０１３６】
本発明のワクチン組合せ物で使用され得る合成ＨＩＶエンベロープタンパク質、発現ベクター、さらなる発現ベクター、発現ベクターによってコードされるＨＩＶ抗原、および単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチド等の他の実施形態は、上記および以下の例示的な実施形態で詳細に議論される。
【０１３７】
ＨＩＶ感染に対する保護免疫を誘導する方法
本発明はまた、それを必要とする対象において１つまたは複数のＨＩＶクレードに対する免疫応答を誘導する方法にも関する。本明細書に記載の方法は、任意選択で１つまたは複数の単離された抗原性ポリペプチドと組み合わせて、１つまたは複数の発現ベクターを使用する免疫応答をプライミングおよびブーストする方法を含む。
【０１３８】
本発明の実施形態により、本明細書に記載の方法および組成物と関連して使用される場合、「免疫応答を誘導する」は、予防目的のため、感染、例えばＨＩＶ感染に対して対象に保護免疫を提供するステップおよび／またはワクチン接種するステップ、ならびに治療目的、すなわち治療的ワクチン接種のため、感染、例えばＨＩＶ感染に対してそれを必要とする対象に所望の免疫応答または効果を引き起こすステップを包含する。「免疫応答を誘導する」はまた、病原体、すなわちＨＩＶに対する処置のための治療免疫を提供するステップも包含する。典型的には、予防的ワクチン接種では、組成物およびワクチンは、以前にＨＩＶが感染していない対象に投与されるが、治療的ワクチン接種では、組成物およびワクチンは、すでにＨＩＶが感染している対象に投与される。免疫応答は細胞性免疫応答および／または液性免疫応答であってよい。
【０１３９】
本明細書で使用する場合、用語「保護免疫」または「保護免疫応答」は、ワクチン接種した対象が、それに対してワクチン接種が行われた病原体による感染を制御できることを意味する。通常、「保護免疫応答」が発生した対象は、軽度から中程度の臨床症状のみを発生し、または全く症状を発生しない。通常、特定の病原体に対する「保護免疫応答」または「保護免疫」を有する対象は、前記病原体による感染の結果として死なないであろう。
【０１４０】
本明細書で使用する場合、用語「治療免疫」または「治療免疫応答」は、ＨＩＶが感染したワクチン接種した対象が、それに対してワクチン接種が行われた病原体、すなわちＨＩＶによる感染を制御できることを意味する。典型的には、本発明の実施形態によるプライムおよびブーストワクチン組成物の投与は、ＨＩＶ感染またはＨＩＶ感染の特徴である症状の発症後にＨＩＶに対する免疫応答を生成する治療目的を有する。好ましくは、本発明の方法は、治療目的のため、例えば治療的ワクチン接種のためであり、本明細書に記載の組成物およびワクチンは、すでにＨＩＶが感染した対象に投与される。したがって、本明細書に記載の本発明の方法による処置のための患者集団は、好ましくはＨＩＶが感染した対象であり、より好ましくはＨＩＶが感染したヒト対象である。本明細書で使用する場合、用語「ＨＩＶ感染」および「ＨＩＶが感染した」は、ＨＩＶによるヒト宿主への侵入である。本明細書で使用する場合、「ＨＩＶが感染した対象」は、ＨＩＶが侵入し、続いて宿主内で複製および増殖し、それに起因して、宿主がＨＩＶの感染を受ける、またはＨＩＶ感染またはその症状を有することになった対象を指す。
【０１４１】
一般的な一態様では、対象においてヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する免疫応答を誘導する方法は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする、および好ましくは本明細書に記載のさらなるＨＩＶ抗原をコードする核酸配列を含む、免疫原的有効量の発現ベクター、好ましくはポックスウイルスベクター（例えばＭＶＡまたはＭＶＡ−ＢＮ）を含む組成物を対象に投与するステップを含む。本明細書に記載のいずれの組成物も、対象においてＨＩＶに対する免疫応答を誘導する方法に使用され得る。組成物は、同じまたは１つもしくは複数のさらなるＨＩＶ抗原および／または１つもしくは複数のさらなる単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドをコードする、１つまたは複数のさらなるベクター、例えばアデノウイルスをさらに含み得る。配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＩＶエンベロープタンパク質をコードするベクターと同じベクターに１つまたは複数のさらなる単離されたＨＩＶ抗原をコードすることもできる。これは、本明細書に示すように、ポックスウイルスベクター、例えばＭＶＡ−ＢＮを含むＭＶＡに特に好適である。
【０１４２】
別の一般的な態様では、対象においてヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する免疫応答を誘導する方法は、
（ａ）配列番号１、２、３、４、５、１８、２８および２９の１つまたは複数をコードする、１つまたは複数の組換えアデノウイルスベクター、好ましくはＡｄ２６ベクターを含む第１のワクチン、および
（ｂ）配列番号１８をコードする、および好ましくは配列番号１〜５、２８、および２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む１つまたは複数のＨＩＶ抗原をさらにコードするポックスウイルスベクター、好ましくはＭＶＡベクターを含む第２のワクチン
を対象に投与するステップを含み、ステップ（ａ）および（ｂ）は、プライム免疫のためのステップの１つおよびブースト免疫のための他のステップによりいずれかの順で実施される。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、免疫応答を誘導する方法は、１つまたは複数の単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチド、好ましくは（ｉ）配列番号７のアミノ酸配列の残基３０〜７０８を含むポリペプチド、または（ｉｉ）配列番号３６の残基３０〜７２４を含むポリペプチド、または（ｉｉｉ）ポリペプチド（ｉ）と（ｉｉ）の両方を含む１つまたは複数のＨＩＶ抗原性ポリペプチドを対象に投与するステップをさらに含む。１つまたは複数の単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドは、第１および／または第２の組成物と同じ組成物に、ならびに１つまたは複数のさらなる組成物に存在し得る。好ましい実施形態では、１つまたは複数の単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドは、ブースト免疫のために使用される組成物とほぼ同時に投与される。特定の実施形態では、１つまたは複数の単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドは、ブーストワクチンとして同じ組成物に存在する。他の実施形態では、１つまたは複数の単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドは、ブーストワクチンとは別の組成物に存在する。特定の実施形態では、単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドは、アジュバント、例えばリン酸アルミニウムを含む組成物中にある。
【０１４４】
本発明による免疫応答を誘導する方法の特定の実施形態では、第１の組成物は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードするアデノウイルスベクター、好ましくはアデノウイルス２６ベクター、および配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＩＶ抗原をコードする第２のアデノウイルスベクター、好ましくはアデノウイルス２６ベクターを含み、第２の組成物は、配列番号１８のアミノ酸を含む合成ＨＩＶ抗原をコードする核酸を含む本発明によるポックスウイルスベクター、好ましくはＭＶＡベクター、例えばＭＶＡ−ＢＮベクターを含み、好ましくは配列番号１〜５、２８、および２９のアミノ酸配列を含む１つまたは複数のＨＩＶ抗原、より好ましくは配列番号５、２８、および２９のアミノ酸配列を含むＨＩＶ抗原をコードする核酸配列をさらに含み、ここで、第１の組成物は、プライム免疫のために１または複数回対象に投与され、第２の組成物は、ブースト免疫のために１または複数回対象に投与され、または、第１の組成物は、ブースト免疫のために１または複数回対象に投与され、第２の組成物はプライム免疫のために１または複数回対象に投与される。好ましい実施形態では、第１の組成物は、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＩＶ抗原性ポリペプチドをコードする第３のアデノウイルスベクター、好ましくはＡｄ２６ベクター、および配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＩＶ抗原性ポリペプチドをコードする第４のアデノウイルスベクター、好ましくはＡｄ２６ベクターをさらに含む。
【０１４５】
免疫応答を誘導する方法の別の特定の実施形態では、第１の組成物は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする第１のアデノウイルスベクター、好ましくはアデノウイルス２６ベクター、および配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＩＶ抗原性ポリペプチドをコードする第２のアデノウイルスベクター、好ましくはアデノウイルス２６ベクターを含み、第２の組成物は、配列番号１〜５および１８、より好ましくは配列番号５、１８、２８、および２９、ならびにその組合せのアミノ酸配列を含むＨＩＶ抗原をコードする核酸配列を含むポックスウイルスベクター、好ましくはＭＶＡベクター、より好ましくはＭＶＡ−ＢＮを含み、ここで、任意選択で１つまたは複数の単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドと一緒に、第１の組成物が、プライム免疫のために１または複数回対象に投与され、第２の組成物が、ブースト免疫のために１または複数回対象に投与され、または、任意選択で１つまたは複数の単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドと一緒に、第２の組成物が、プライム免疫のために１または複数回対象に投与され、第１の組成物が、ブースト免疫のために１または複数回対象に投与される。好ましい実施形態では、第１の組成物は、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＩＶ抗原性ポリペプチドをコードする第３のアデノウイルスベクター、好ましくはＡｄ２６ベクター、および配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＩＶ抗原性ポリペプチドをコードする第４のアデノウイルスベクター、好ましくはＡｄ２６ベクターをさらに含む。
【０１４６】
発現ベクターおよび／または抗原性ポリペプチドを含む免疫原性組成物の投与は、典型的には、筋肉内、皮内、または皮下である。しかしながら、投与の他の形態、例えば静脈内、直腸、皮膚、経口、経鼻等も予想され得る。免疫原性組成物の筋肉内投与は、発現ベクター、例えば、アデノウイルスベクター、および／または抗原性ポリペプチドの懸濁液を注射するための針を使用して達成され得る。代替え案は、組成物を投与するための針無し注射装置（例えば、Ｂｉｏｊｅｃｔｏｒ（商標）を使用する）またはワクチンを含有する凍結乾燥粉末の使用である。
【０１４７】
筋肉内、静脈内、皮膚もしくは皮下注射、または苦痛の部位での注射のため、ベクターは、パイロゲンフリーであり、好適なｐＨ、等張性および安定性を有する、非経口的に許容される水溶液の形態である。同様に、単離された抗原性ポリペプチドは、好適なｐＨ、等張性、および安定性を有する非経口的に許容される溶液の形態である。当業者は、例えば塩化ナトリウム注射液、リンゲル液、乳酸化リンゲル液などの等張性ビヒクルを使用する好適な溶液をよく調整できる。必要であれば、保存剤、安定化剤、緩衝剤、抗酸化剤および／または他の添加剤が含まれ得る。緩効性製剤もまた、用いられ得る。
【０１４８】
典型的には、本発明の実施形態によるワクチン組成物野投与は、感染または症状の発症後に、ＨＩＶ抗原に対する免疫応答を生成する治療目的を有する。他の実施形態では、発現ベクター、例えばアデノウイルスベクターおよび／またはポックスウイルスベクター、および／またはＨＩＶ抗原性ポリペプチドは、感染または症状の発症前に予防目的のために投与され得る。
【０１４９】
発現ベクター、例えばアデノウイルスベクターおよび／またはポックスウイルスベクターを含有する免疫原性組成物、および／または抗原性ポリペプチドは対象に投与され、対象において抗ＨＩＶ免疫応答を生じる。検出可能な免疫応答を誘導するのに十分な組成物の量は、「免疫原的有効用量」または「免疫原的有効量」であると定義される。本発明の典型的な実施形態では、免疫応答は治療免疫応答である。
【０１５０】
投与される実際の量、ならびに投与の速さおよびタイムコースは、処置されるものの性質および重症度による。処置の処方、例えば投与量の決定等は、一般開業医および他の医師の責任であり、獣医の文脈では獣医であり、典型的には、開業医に公知の処置される障害、個々の患者の状態、送達部位、投与の方法および他の因子を考慮に入れる。上述の技術およびプロトコールの例は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. ed., 1980に見出され得る。
【０１５１】
アデノウイルスベクターおよび／またはポックスウイルスベクター、例えばＭＶＡベクターの産生、ならびにそのような粒子の組成物への任意選択による製剤化後、ベクターは個体、特にヒトまたは他の霊長類に投与される。非ヒト哺乳動物への送達は、治療目的のためである必要はなく、実験の文脈で、例えば、本発明のアデノウイルスベクターおよび／またはポックスウイルスベクターによって発現される合成ＨＩＶエンベロープタンパク質および他のＨＩＶ抗原への免疫応答のメカニズムの調査における使用のためであり得る。
【０１５２】
開示した方法の一実施形態では、本明細書に開示の１つまたは複数のＨＩＶ抗原をコードする１つまたは複数のアデノウイルスベクターが免疫応答のプライミングに使用される。１つまたは複数の単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドは、プライム免疫のための１つまたは複数のアデノウイルスベクターと一緒に使用され得る。別の実施形態では、１つまたは複数のポックスウイルスベクター、好ましくはＭＶＡまたはＭＶＡ−ＢＮ、本発明の１つまたは複数のＨＩＶ抗原をコードするポックスウイルスベクターは、免疫応答のプライミングに使用される。１つまたは複数の単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドは、プライム免疫のための１つまたは複数のポックスウイルスベクターと一緒に使用され得る。プライム免疫は、１回のみ投与され得るが、任意選択で複数回、例えば、時間０での最初のプライム投与、続いて最初のプライム投与約１〜２４週後に別のプライム投与も投与され得る。１つまたは複数の単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドを、任意選択で１つまたは複数のさらなるＨＩＶ抗原をコードする１つまたは複数のさらなるアデノウイルスまたはポックスウイルスベクターと共に使用して、免疫応答をブーストすることができる。
【０１５３】
プライム投与後、本発明の１つまたは複数のアデノウイルスベクターまたは本発明のポックスウイルスベクターは、１または複数回のブースト免疫に使用され得る。ブースト免疫はまた、１回または複数回、例えば、まず、最初のプライム投与後約４〜５２週間、任意選択で続いて例えば最初のプライム投与後約８〜１００週で別のブースト投与で投与され得る。特定の他の実施形態では、本発明の１つまたは複数のアデノウイルスベクターは、プライムおよび／またはブースト免疫のために本発明の１つまたは複数のポックスウイルスベクターと一緒に投与される。免疫によって誘導される免疫応答がモニターされる。
【０１５４】
プライム−ブーストレジメンは、一般的に、強い免疫応答の生成に好まれる。同じベクターを複数回投与することが可能であり、同種プライム−ブーストと呼ばれる。この文脈では、プライミングおよびブーストするベクターが異なることを示す異種プライム−ブーストレジメンを適用することが本発明により典型的には好まれる。特定のそのような異種プライム−ブーストレジメン実施形態では、例えば、プライミングはアデノウイルスベクター、例えばＡｄ２６により、ブーストはポックスウイルスベクター、例えばＭＶＡ、例えばＭＶＡ−ＢＮによる。他のそのような異種プライム−ブーストレジメン実施形態では、例えば、プライミングはポックスウイルスベクター、例えばＭＶＡ，例えばＭＶＡ−ＢＮにより、ブーストはアデノウイルスベクター、例えばＡｄ２６による。任意選択で、プライム−ブーストレジメンでは、単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチド、例えばｇｐ１４０は、そのようなアデノウイルスまたはポックスウイルスベクターのプライムもしくはブースト投与とほぼ同時に投与され得る。
【０１５５】
一例示的なおよび非限定的な実施形態では、対象は、合わせて、配列番号５、１８、２８および２９を含むＨＩＶ抗原をコードする４つの異なるアデノウイルス２６ベクターを投与され、ここでベクターは１：１：１：１の比で存在し、０および１２週で筋肉注射によって０．５ｍＬ中５×１０１０個のウイルス粒子の総用量で投与され、続いて２４および４８週で筋肉内に投与される０．５ｍＬ注射液あたり約１０８個のプラーク形成単位の用量で、配列番号５、１８、２８および２９を含むＨＩＶ抗原をコードするＭＶＡベクターが投与される。
【０１５６】
プライムおよびブースト投与のレジメンが投与後の測定された免疫応答に基づいて調整され得ることは、当業者に容易に理解される。例えば、ブースト組成物は、一般的に、プライム組成物の投与の数週間または数ヵ月または数年後でさえも投与される。
【０１５７】
本発明の実施形態により、アジュバントは、プライムおよび／またはブースト免疫の一部として単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドと一緒に投与され得る。任意のアジュバントが、本開示の観点で単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドと一緒に使用され、特定の実施形態では、アジュバントはアンモニウム塩、例えばリン酸アルミニウムである。
【０１５８】
本発明の好ましい実施形態では、本明細書に開示の方法で使用されるアデノウイルスベクターはｒＡｄ２６ベクターを含み、本明細書に開示の方法で使用されるポックスウイルスベクターはＭＶＡベクターを含む。
【０１５９】
例示的な一実施形態では、配列番号１８のアミノ酸配列を含む合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードするｒＡｄ２６ベクターは、配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＩＶ抗原をコードするｒＡｄ２６ベクターと組み合わせて免疫応答をプライミングするために使用される。配列番号１〜４、２８および２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する１つまたは複数のさらなるＨＩＶ抗原をコードする１つまたは複数のさらなるｒＡｄ２６ベクターも、免疫応答をプライミングするために他のｒＡｄ２６ベクターと一緒に投与され得る。特定の実施形態では、プライム投与は、任意のブースト免疫が投与される前に再投与され得る。配列番号１８のアミノ酸配列を含む合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする、および配列番号５、２８、および２９をさらにコードするＭＶＡベクターは、これらの実施形態における免疫応答をブーストするために使用される。任意選択で、単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチド、例えば配列番号７のアミノ酸配列の残基３０〜７０８を含むもの、または配列番号３６のアミノ酸配列の残基３０〜７２４を含むもの、またはそのような単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドの少なくとも２つの組合せが、免疫応答をブーストするためにＭＶＡベクターと一緒に投与される。好ましくは、アジュバントは、ブースト免疫において単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドを伴って、さらに投与される。
【０１６０】
別の例示的な実施形態では、配列番号１８のアミノ酸配列を含む合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする、ならびに配列番号５、２８、および２９をさらにコードするＭＶＡまたはＭＶＡ−ＢＮベクターは、免疫応答をプライミングするために使用される。特定の実施形態では、プライム投与は、任意のブースト免疫が投与される前に再投与される。プライム投与に続いて、１つまたは複数のブースト免疫が投与され、ブースト免疫は、配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＩＶ抗原をコードするｒＡｄ２６ベクターと組み合わせて、配列番号１８のアミノ酸配列を含む合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードするｒＡｄベクターを含む。配列番号１〜４、２８および２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する１つまたは複数のさらなるＨＩＶ抗原性ポリペプチドをコードする１つまたは複数のさらなるｒＡｄ２６ベクターは、好ましくは他のｒＡｄ２６ベクターと一緒にも投与され、免疫応答をブーストする。任意選択で、単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチド、例えば配列番号７のアミノ酸配列の残基３０〜７０８を含むもの、または配列番号３６のアミノ酸配列の残基３０〜７２４を含むもの、またはそのような単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドの少なくとも２つの組合せがｒＡｄ２６ベクターと一緒に投与され、免疫応答をブーストする。
【０１６１】
特に例示的な実施形態では、免疫応答は、アデノウイルスベクター、好ましくはｒＡｄ２６ベクターにコードされる４つのＨＩＶ抗原の投与によってプライミングされ、コードされる４つの抗原は：（ｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む合成ＨＩＶエンベロープタンパク質、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＩＶ  Ｅｎｖ抗原、（ｉｉｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を有するＨＩＶ  Ｇａｇ−Ｐｏｌ融合抗原、および（ｉｖ）配列番号２９のアミノ酸配列を有するＨＩＶ  Ｇａｇ−Ｐｏｌ融合抗原である。これら４つの抗原のそれぞれは、別個のアデノウイルスベクター、好ましくはｒＡｄ２６ベクターにコードされ、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０×１０１０個のウイルス粒子（ｖｐ）、例えば約５×１０１０ｖｐ（全てのベクター一緒に）の総用量で投与され得る。ベクターは、例えば１：１：１：１の比であらかじめ混合され得る。アデノウイルスベクターの投与は、好ましくは、筋肉内注射を介する。プライム投与は、最初のプライム投与後に再投与され得る。この実施形態では、免疫応答は、１０５〜１０１１ｐｆｕの投与量、例えば１０７ｐｆｕ、１０８ｐｆｕ、もしくは１０９ｐｆｕの用量、または１０５〜１０１０ＴＣＩＤ５０の投与量、例えば１０７、１０８もしくは１０９ＴＣＩＤ５０で、配列番号１８、配列番号５、配列番号２８、および配列番号２９を含む４つのＨＩＶ抗原をコードするＭＶＡまたはＭＶＡ−ＢＮベクターの投与によってブーストされる。好ましくは、投与量は、２×１０５〜５×１０８ｐｆｕである。好ましくは、ヒトのための用量は、少なくとも５×１０７ｐｆｕ、例えば少なくとも１×１０８ｐｆｕ、または代わりに少なくとも２×１０７ＴＣＩＤ５０、少なくとも３×１０７ＴＣＩＤ５０、少なくとも５×１０７ＴＣＩＤ５０、例えば少なくとも１×１０８ＴＣＩＤ５０、または少なくとも２×１０８ＴＣＩＤ５０を含む。免疫応答をブーストするためのＭＶＡまたはＭＶＡ−ＢＮ投与は、最初のプライム投与後の任意の時間で実施され得る。ブースト投与は、最初のブースト投与後に繰り替えされ得る。本実施形態によるＭＶＡの全ての投与は、例えば筋肉内または皮下経路を介して実施され得る。
【０１６２】
代わりに、ＭＶＡベクターはプライム投与のために使用され、ブースト投与のためにはＡｄ２６ベクターが使用され、アデノウイルスおよびポックスウイルスベクター型の投与の逆の順序以外は、全て本質的に上記に示した通りである。任意選択で、単離されたｇｐ１４０タンパク質はブースト投与と一緒に投与される。例えば、単離されたＥｎｖ  ｇｐ１４０タンパク質、例えばクレードＣ  ｇｐ１４０タンパク質（配列番号７のアミノ酸配列の残基３０〜７０８を含む）、またはモザイクｇｐ１４０タンパク質（配列番号３６のアミノ酸配列の残基３０〜７２４を含む）、またはクレードＣ  ｇｐ１４０タンパク質およびモザイクｇｐ１４０タンパク質は、総用量約５０〜３００μｇタンパク質、例えば５０もしくは２５０マイクログラムのクレードＣ  ｇｐ１４０タンパク質、または例えば５０もしくは２５０マイクログラムのモザイクｇｐ１４０タンパク質、または例えば５０もしくは２５０マイクログラムのクレードＣ  ｇｐ１４０タンパク質とモザイクｇｐ１４０タンパク質の組合せ（例えば、１：１の比で、一緒に混合されるかまたは別々に投与されるかのいずれか）で、ブースト免疫のためのポックスウイルスベクターと一緒に投与され得る。好ましくは、ｇｐ１４０タンパク質は、アジュバント、例えばリン酸アルミニウムと一緒に投与される。
【０１６３】
特定の実施形態では、本発明による免疫応答を誘導する方法は、潜伏ウイルスリザーバー除去剤（latent viral reservoir purging agent）を投与するステップをさらに含む。ＨＩＶが潜伏感染した細胞は、転写的にサイレントである組み込まれたウイルスを有し、これは、処置される対象においてＨＩＶ感染を効果的に根絶することを困難にしている。本明細書で使用する場合、「リザーバー除去剤」および「潜伏ウイルスリザーバー除去剤」は、ＨＩＶリザーバーを再活性化することによって、例えば、静止状態のＨＩＶの発現を誘導することによって、ＨＩＶの潜伏プールを減らす物質を指す。本発明による使用に好適な潜伏ウイルスリザーバー除去剤の例としては、限定はされないが、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤およびトール様受容体（例えばＴＬＲ７）のモジュレーター、例えばその全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１６／００７７６５号パンフレットおよび国際公開第２０１６／１７７８３３号パンフレットに記載のものが挙げられる。潜伏ウイルスリザーバー除去剤は、本明細書に記載のプライムおよびブースト免疫の１つまたは複数の前、後、または同時に投与され得る。プライムとして、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびＥｎｖ抗原をコードするアデノウイルス２６ベクター、続いてブーストとしてそのような抗原をコードするＭＶＡベクターの組合せのワクチン接種は、ＴＬＲ７刺激との組合せで、ウイルス学的制御の改善およびアカゲザルモデル試験での抗レトロウイルス療法の中断後のウイルスリバウンドの遅延をもたらし、ＨＩＶ感染の機能的な治療を狙う、先天的な免疫刺激と組み合わせた治療ワクチンの能力を実証する（Borducchi E.N., et al, 2016, Nature 540: 284-287 (doi: 10/1038/nature20583)）。
【０１６４】
本発明の特定の実施形態では、免疫応答を誘導するための本明細書に記載のプライムおよびブースト免疫は、標準的な処置、例えば抗レトロウイルス療法（ＡＲＴ）と組み合わせられ得る。本発明のプライム／ブースト免疫によって処置される対象は、本開示の観点で当技術分野で公知の任意の抗レトロウイルス薬によるＡＲＴも受けることができる。ＡＲＴは、ＨＩＶを処置する薬物治療であるが、薬物はウイルスを死滅または治療しない。しかしながら、組み合わせて接種する場合、それらはウイルスの増殖を防ぐことができる。ウイルスが減速されると、ＨＩＶ疾患も減速される。抗レトロウイルス薬はＡＲＶと呼ばれる。組合せＡＲＶ療法（ｃＡＲＴ）は、高度に活性なＡＲＴ（ＨＡＡＲＴ）と呼ばれる。当業者は、本発明のプライム／ブースト免疫の投与と対応するように、適切な抗レトロウイルス処置、投与の頻度、ＡＲＴの投与量等を決定することができる。
【０１６５】
ＡＲＴのために使用される抗レトロウイルス薬の例としては、限定はされないが、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ、その非限定的な例としては、ジドブジン、ジダノシン、スタブジン、ラミブジン、アバカビル、テノホビル、コンビビル［ジドブジンとラミブジンの組合せ］、トリジビル［ジドブジン、ラミブジン、およびアバカビルの組合せ］、エムトリシタビン、ツルバダ［エムトリシタビンとテノホルビルの組合せ］、ならびにエプジコム［アバカビルとラミブジンの組合せ］）、非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ、その非限定的な例としては、ネビラピン、デラビルジン、エファビレンツ、エトラビリン、およびリルピビリンが挙げられる）、プロテアーゼ阻害剤（ＰＩ、その非限定的な例としては、サキナビル、インジナビル、リトナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル、ロピナビル／リトナビル、アタザナビル、ホスアンプレナビル、チプラナビル、ダルナビルが挙げられる）、インテグラーゼ阻害剤（ＩＮＳＴＩ、非限定的な例としては、ランテグラビル、エルビテグラビルおよびドルテグラビルが挙げられる）、ならびに融合阻害剤、侵入阻害剤および／またはケモカイン受容体アンタゴニスト（ＦＩ、ＣＣＲ５アンタゴニスト；非限定的な例としては、エンフビルチド、アプラビロク、マラビロク、ビクリビロク、およびセニクリビロク）が挙げられる。
【０１６６】
他の実施形態では、対象は、本発明の実施形態によるプライム／ブースト免疫の完了後、ＡＲＴの中断（中止とも呼ばれ、本明細書で交換可能に使用される）が行われる。いくつかの実施形態では、対象は、本発明の実施形態によるプライム、ブースト免疫の完了後、抗レトロウイルス分析的処置中断（ＡＲＶ  ＡＴＩ）が行われ得る。本発明で使用される場合、「抗レトロウイルス分析的処置中断」および「ＡＲＴ  ＡＴＩ」は、継続するＡＲＴの非存在下でのウイルス抑制およびウイルス血症制御を評価するための抗レトロウイルス薬による処置の中止を指す。典型的には、対象が、少なくとも約５２週間で５０コピー／ｍＬよりも少ない血漿ＨＩＶ  ＲＮＡレベルを有する場合、対象はＡＲＶ  ＡＴＩが行われる、すなわち中止され得るが、ＡＲＴ  ＡＴＩの直前のスクリーニングが５０コピー／ｍｌより少ない血漿ＨＩＶ  ＲＮＡを示す限り、対象が期間内に５０コピー／ｍｌより多く、２００コピー／ｍｌより少ない血漿ＨＩＶ  ＲＮＡの１つまたは複数のブリップ（すなわち、実例）を有する場合でさえも、対象はＡＲＶ  ＡＴＩを依然として受けることができる。
【０１６７】
本発明の実施形態により、ＡＲＴは、最後のブーストワクチンが投与される約４〜２０週後に停止され得る。特定の実施形態では、非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）ベースのＡＲＴ中の対象は、ＮＮＲＴＩ耐性を発生するリスクを減らすため、ＡＲＴを中止する前に約１〜２週間ＮＮＲＴＩの代わりにブーストされたプロテアーゼ阻害剤が投与され得る。ＡＴＩステージ中に活性剤（例えばヒストンデアセチラーゼ阻害剤またはＴＬＲ７モジュレーター）を投与し、任意の（例えば潜伏性の）ＨＩＶリザーバーを活性化し、それにより免疫応答を改善することも可能である。
【０１６８】
ＡＲＴ  ＡＶＩが行われる対象は、例えば、血漿ＨＩＶレベルを測定することによってモニターされ得る。例えば、ＡＲＶ  ＡＴＩの開始後のモニターは、リバウンドウイルス血症が最も起こりやすい最初の６週間、週当たり最大２回まで行われる。「リバウンドウイルス血症」は、ＡＲＴ  ＡＴＩ後に１０００コピー／ｍｌよりも多い血漿ＨＩＶ  ＲＮＡレベルとして定義される。ＡＲＴは、リバウンドウイルス血症を示す対象で再始動され得る。好ましくは、本発明の方法に従って処置された対象は、ＡＲＴ中断後にウイルス血症制御を維持するであろう。本明細書で使用する場合、「ウイルス血症制御を維持する」は、ＡＲＶ  ＡＴＩ後に５０コピー／ｍＬより少ない血漿ＨＩＶ  ＲＮＡで少なくとも２４週間と定義される。「維持されたウイルス血症制御」基準は、対象が、少なくとも１週間あけた２連続判定において１０００コピー／ｍｌを超える血漿ＨＩＶ  ＲＮＡレベルを持たない限り、５０コピー／ｍｌより多く、１０００コピー／ｍｌより少ない血漿ＨＩＶ  ＲＮＡの１つまたは複数の実例がある場合、依然として満たされるとみなされる。
【０１６９】
典型的には（本発明の方法を使用しない）、ヒトＨＶ感染対象は、ＡＲＴ中断の２〜３週間後にウイルス血症が戻る。いずれの理論にも縛られることを望まないが、ＨＩＶが完全に抑制された個体間で、本発明の実施形態によるプライム／ブースト免疫は、測定可能な免疫応答を生じ、少なくとも特定の個体においてＡＲＶ  ＡＴＩ後のウイルス血症制御を維持すると考えられる。いくつかの実施形態では、対象は、本発明の方法によって処置された後にＡＲＴを中止することができる。ＡＲＴの中止は、長期間にわたり得る（例えば、少なくとも２４週間、好ましくはより長く、例えば少なくとも約２８、３２、３６、４０、４４、４８、５２週間、１６ヵ月、１８、２０、２２、２４ヵ月、またはさらに長く）。ＡＲＴが停止または中止されるそのような期間は、「休暇」または「ＡＲＴ休暇」または「処置休暇」と呼ばれる。他の実施形態では、本発明の方法によるワクチン療法は、ＨＩＶ寛解をもたらすことができ、ＡＲＴの非存在下でウイルス抑制が維持されることを意味している。
【０１７０】
実施形態
実施形態１は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする核酸を含むポックスウイルスベクターである。
【０１７１】
実施形態２は、
（ａ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む第１のＨＩＶエンベロープ（Ｅｎｖ）抗原、
（ｂ）第１のＨＩＶ  Ｅｎｖ抗原とは異なる第２のＨＩＶ  Ｅｎｖ抗原、
（ｃ）２つの異なるＨＩＶ  Ｇａｇ抗原である第３の抗原および第４の抗原、ならびに、
（ｄ）２つの異なるＨＩＶ  Ｐｏｌ抗原である第５の抗原および第６の抗原
をコードする核酸を含むポックスウイルスベクターである。
【０１７２】
実施形態３は、第２のＨＩＶ  Ｅｎｖ抗原が配列番号５のアミノ酸配列を含み、第３および第４の抗原が、それぞれ配列番号１および配列番号２のアミノ酸配列を含み、ならびに第５および第６の抗原が、それぞれ配列番号３および配列番号４のアミノ酸配列を含む、実施形態２のポックスウイルスベクターである。
【０１７３】
実施形態４は、第３および第５の抗原が融合されて、配列番号２８のアミノ酸配列を含む第１のＧａｇ−Ｐｏｌ融合抗原になっており、第４および第６の抗原が融合されて、配列番号２９のアミノ酸配列を含む第２のＧａｇ−Ｐｏｌ融合抗原になっている、実施形態２または３のポックスウイルスベクターである。
【０１７４】
実施形態５は、第１のＨＩＶ  Ｅｎｖ抗原が配列番号４１によってコードされる、実施形態１〜４のいずれか１つのポックスウイルスベクターである。
【０１７５】
実施形態６は、第１のＨＩＶ  Ｅｎｖ抗原が配列番号４１によってコードされ、第２のＨＩＶ  Ｅｎｖ抗原が配列番号３９によってコードされ、第１のＧａｇ−Ｐｏｌ融合抗原が配列番号３８によってコードされ；および第２のＧａｇ−Ｐｏｌ融合抗原が配列番号４０によってコードされる、実施形態４〜５のいずれか１つのポックスウイルスベクターである。
【０１７６】
実施形態７は、抗原をコードする核酸がプロモーター配列に操作可能に連結されている、実施形態１〜６のいずれか１つのポックスウイルスベクターである。
【０１７７】
実施形態８は、ポックスウイルスベクターが、組換え改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）ベクターである、実施形態１〜７のいずれか１つのポックスウイルスベクターである。
【０１７８】
実施形態９は、ＭＶＡベクターが、ＭＶＡ−ＢＮまたはその誘導体を含む、実施形態８のポックスウイルスベクターである。
【０１７９】
実施形態１０は、第１のＧａｇ−Ｐｏｌ融合抗原および第２のＥｎｖ抗原が、ＭＶＡゲノムの遺伝子間領域（ＩＧＲ）４４／４５に挿入され、第２のＧａｇ−Ｐｏｌ融合抗原および第１のＥｎｖ抗原が、ＭＶＡゲノムのＩＧＲ８８／８９に挿入されている、実施形態８または９のポックスウイルスベクターである。
【０１８０】
実施形態１１は、第１のＧａｇ−Ｐｏｌ融合抗原および第２のＧａｇ−Ｐｏｌ融合抗原がそれぞれ、別個のＰｒ１３．５プロモーターの制御下にあり、第１のＥｎｖおよび第２のＥｎｖ抗原がそれぞれ、別個のＰｒＨｙｂプロモーターの制御下にある、実施形態７〜１０のいずれか１つのポックスウイルスベクターである。
【０１８１】
実施形態１２は、実施形態１〜１１のいずれか１つのポックスウイルスベクターを含む単離された細胞である。
【０１８２】
実施形態１３は、実施形態１〜１１のいずれか１つのベクター、および担体を含む組成物である。
【０１８３】
実施形態１４は、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載の免疫原的有効量のポックスウイルスベクター、および薬学的に許容される担体を含むワクチンである。
【０１８４】
実施形態１５は、
（ａ）実施形態１〜１１のいずれか１つに記載の、免疫原的有効量のポックスウイルスベクター、好ましくはＭＶＡベクターを含む第１のワクチン組成物と、
（ｂ）（ｉ）１つまたは複数のＨＩＶ抗原、好ましくは、配列番号１〜５、１８、２８、および２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む１つまたは複数のＨＩＶ抗原をコードする、免疫原的有効量の１つまたは複数のアデノウイルスベクター、好ましくはアデノウイルス２６ベクターを含む第２のワクチン組成物、および、
（ｂ）（ｉｉ）免疫原的有効量の単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドを含む１つまたは複数のポリペプチドを含み、任意選択でアジュバント、好ましくはリン酸アルミニウムをさらに含む第３のワクチン組成物
の少なくとも１つとを含み、第１の組成物ならびに第２および／または第３の組成物が同じ組成物、または１つもしくは複数の異なる組成物中に存在するワクチン組合せ物である。
【０１８５】
実施形態１６は、第３のワクチン組成物における１つまたは複数の単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドが、（ｉ）配列番号７のアミノ酸配列の残基３０〜７０８を含むポリペプチド、または（ｉｉ）配列番号３６のアミノ酸配列の残基３０〜７２４を含むポリペプチド、または（ｉｉｉ）ポリペプチド（ｉ）と（ｉｉ）の両方を含む、実施形態１５に記載のワクチン組合せ物である。
【０１８６】
実施形態１７は、第２のワクチン組成物が、合わせて、配列番号１〜５、および１８をコードする組換えアデノウイルス２６ベクターを含み、好ましくは配列番号１および３が配列番号２８として互いに融合され、および／または配列番号２および４が配列番号２９として互いに融合されている、実施形態１５〜１６のいずれか１つのワクチン組合せ物である。
【０１８７】
実施形態１８は、第２のワクチン組成物が４つの組換えＡｄ２６ベクター、配列番号５をコードする第１の組換えＡｄ２６ベクター、配列番号１８をコードする第２の組換えＡｄ２６ベクター、配列番号１および３、好ましくは配列番号２８をコードする第３の組換えＡｄ２６ベクター、ならびに配列番号２および４、好ましくは配列番号２９をコードする第４の組換えＡｄ２６ベクターを含む、実施形態１７のワクチン組合せ物である。
【０１８８】
実施形態１９は、それを必要とする対象においてヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する免疫応答を誘導する方法であって、実施形態１３の組成物、実施形態１４のワクチン、または実施形態１５〜１８のいずれか１つのワクチン組合せ物を対象に投与するステップを含む方法である。
【０１８９】
実施形態２０は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する免疫応答を誘導するステップにおける使用のための実施形態１３の組成物、実施形態１４のワクチン、または実施形態１５〜１８のいずれか１つのワクチン組合せ物である。
【０１９０】
実施形態２１は、１つまたは複数のさらなるＨＩＶ抗原、および／または１つまたは複数の単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドをコードする、１つまたは複数のさらなる発現ベクターをさらに含む、実施形態１３の組成物または実施形態１４のワクチンである。
【０１９１】
実施形態２２は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む、またはからなる合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードするアデノウイルスベクター、好ましくはアデノウイルス２６ベクターをさらに含む、実施形態１３の組成物または実施形態１４のワクチンである。
【０１９２】
実施形態２３は、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＩＶ抗原をコードする第２のアデノウイルスベクター、好ましくはアデノウイルス２６ベクター、ならびに任意選択で配列番号１〜４、２８および２９、好ましくは配列番号２８および２９のアミノ酸配列を含む１つまたは複数のさらなるＨＩＶ抗原をコードする、１つまたは複数のさらなるアデノウイルスベクター、好ましくはアデノウイルス２６ベクターをさらに含み、より好ましくは、配列番号２８および２９が第３および第４のアデノウイルスベクター、好ましくはアデノウイルス２６ベクターに別々にコードされる、実施形態２２に記載の組成物またはワクチンである。
【０１９３】
実施形態２４は、それを必要とする対象においてヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する免疫応答を生じさせる方法であって、実施形態１３〜２３のいずれか１つに記載の組成物またはワクチンまたはワクチン組合せ物を対象に投与するステップを含む方法である。
【０１９４】
実施形態２５は、組成物またはワクチン組合せ物を産生する方法であって、実施形態１〜１１のいずれか１つのポックスウイルスベクターを担体と、および任意選択で１つまたは複数の組成物において、１つまたは複数のさらなるＨＩＶ抗原および／または１つまたは複数の単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドをコードする１つまたは複数のさらなるベクターを担体と一緒に組み合わせるステップを含む方法である。
【０１９５】
実施形態２６は、それを必要とする対象において、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する免疫応答を誘導する方法であって、方法が、
（ｉ）配列番号１〜５、１８、２８、および２９のいずれか１つまたは複数のアミノ酸配列を含む１つまたは複数のＨＩＶ抗原をコードする免疫原的有効量の１つまたは複数の組換えアデノウイルスベクター、好ましくはＡｄ２６ベクター、ならびに担体を含む第１のワクチン、
（ｉｉ）実施形態１〜１１のいずれか１つに記載のポックスウイルスベクター、および担体を含む第２のワクチン、ならびに
（ｉｉｉ）任意選択で、免疫原的有効量の単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチド、および担体を含む１つまたは複数のポリペプチドを含み、任意選択でアジュバント、好ましくはリン酸アルミニウムをさらに含む第３のワクチン
を対象に投与するステップを含み、ステップ（ｉ）および（ｉｉ）がいずれかの順序で実施され、１つのステップがプライム免疫であり、他のステップがブースト免疫であり、プライムおよび／またはブースト免疫のために任意選択の第３のワクチンが第１の組成物または第２の組成物と一緒に投与される、方法である。
【０１９６】
実施形態２７は、第３の組成物がブーストワクチンに使用される組成物とほぼ同時に投与される、実施形態２６に記載の方法である。
【０１９７】
実施形態２８は、１つまたは複数の単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドが、（ｉ）配列番号７のアミノ酸配列の残基３０〜７０８を含むポリペプチド、または（ｉｉ）配列番号３６の残基３０〜７２４を含むポリペプチド、または（ｉｉｉ）ポリペプチド（ｉ）と（ｉｉ）の両方を含み、１つまたは複数の単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドが、ブーストワクチンおよび／またはプライムワクチンと同じ組成物中、またはブーストワクチンおよび／またはプライムワクチンとは別の組成物中にある、実施形態２６または２７に記載の方法である。
【０１９８】
実施形態２９は、（ｉ）第１のワクチンが、配列番号１８のアミノ酸配列を含む合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードするアデノウイルスベクター、好ましくはアデノウイルス２６ベクター、ならびに配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＩＶ抗原をコードする第２のアデノウイルスベクター、好ましくはアデノウイルス２６ベクター、ならびに任意選択で１つまたは複数のさらなるＨＩＶ抗原をコードする１つまたは複数のさらなる発現ベクター、好ましくはアデノウイルスベクター、より好ましくはアデノウイルス２６ベクターを含み、（ｉｉ）第２のワクチンが、配列番号１８のアミノ酸配列を含む合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする、ならびに好ましくは配列番号１〜５、２８、および２９の１つまたは複数のアミノ酸配列を含むさらなるＨＩＶ抗原をコードするポックスウイルスベクター、好ましくはＭＶＡベクターを含み、ならびに（ｉｉｉ）第３のワクチンが、配列番号７のアミノ酸配列の残基３０〜７０８、または配列番号３６の残基３０〜７２４を有する単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドを含み、ここで第１のワクチンがプライム免疫のために１または複数回対象に投与され、第２のワクチンがブースト免疫のために１または複数回対象に投与され、第３のワクチンがブースト免疫のために１または複数回第２のワクチンと一緒に対象に投与される、実施形態２６〜２８のいずれか１つに記載の方法である。
【０１９９】
実施形態３０は、第１のワクチンが、配列番号１〜４、２８、および２９、好ましくは配列番号２８および２９のアミノ酸配列を含む１つまたは複数のＨＩＶ抗原をコードする１つまたは複数のさらなるアデノウイルス２６ベクターを含む、実施形態２９に記載の方法である。
【０２００】
実施形態３１は、第１のワクチン組成物が、配列番号２８をコードする第３のアデノウイルスベクターおよび配列番号２９をコードする第４のアデノウイルスベクターを含む、実施形態３０に記載の方法である。
【０２０１】
実施形態３２は、以下の成分、
（ｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードするＡｄ２６ベクター、
（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＩＶエンベロープタンパク質をコードするＡｄ２６ベクター、
（ｉｉｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＩＶ  Ｇａｇ−Ｐｏｌ融合タンパク質をコードするＡｄ２６ベクター、
（ｉｖ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＩＶ  Ｇａｇ−Ｐｏｌ融合タンパク質をコードするＡｄ２６ベクター、ならびに
（ｖ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む第１のＨＩＶエンベロープタンパク質、配列番号５のアミノ酸配列を含む第２のＨＩＶエンベロープタンパク質、配列番号２８のアミノ酸配列を含む第１のＧａｇ−Ｐｏｌ融合タンパク質および配列番号２９のアミノ酸配列を含む第２のＧａｇ−Ｐｏｌ融合タンパク質をコードするＭＶＡベクター
を含むワクチン組合せ物である。
【０２０２】
実施形態３３は、以下の成分、
（ｖｉ）（ｖｉ、ａ）：配列番号７のアミノ酸配列の残基３０〜７０８を有する単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチド、または（ｖｉ、ｂ）：配列番号３６のアミノ酸配列の残基３０〜７２４、または（ｖｉ、ｃ）：（ｖｉ、ａ）と（ｖｉ、ｂ）の両方をさらに含み、ここで（ｖｉ、ａ）、（ｖｉ、ｂ）、または（ｖｉ、ｃ）が任意選択でアジュバントをさらに含む、
実施形態３２に記載のワクチン組合せ物である。
【０２０３】
実施形態３４は、それを必要とするヒト対象においてヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する免疫応答を誘導する方法であって、
（ａ）（ｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードするｒＡｄ２６ベクター、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む抗原をコードするｒＡｄ２６ベクター、（ｉｉｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含む抗原をコードするｒＡｄ２６ベクター、および（ｉｖ）配列番号２９のアミノ酸配列を含む抗原をコードするｒＡｄ２６ベクターを対象に投与するステップであって、好ましくは、ｒＡｄ２６ベクターは、約１〜１０×１０１０ウイルス粒子（ｖｐ）、例えば５×１０１０ｖｐの総用量で約１：１：１：１の比で投与される、ステップ；
（ｂ）任意選択でステップ（ａ）を繰り返すステップ；
（ｃ）（ｉ）（ｉ，ａ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む合成ＨＩＶエンベロープタンパク質、（ｉ，ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＩＶ  Ｅｎｖ抗原、（ｉ，ｃ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＩＶ  Ｇａｇ−Ｐｏｌ融合抗原、（ｉ，ｄ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＩＶ  Ｇａｇ−Ｐｏｌ融合抗原をコードする各鎖を含むＭＶＡまたはＭＶＡ−ＢＮベクターを対象に投与するステップであって、好ましくは、ＭＶＡは１０５〜１０１１ｐｆｕの用量で、例えば、１０７ｐｆｕ、１０８ｐｆｕ、１０９ｐｆｕ、１０１０ｐｆｕの用量で、または１０６〜１０１０ＴＣＩＤ５０、例えば１０７と１０９ＴＣＩＤ５０の間の用量で投与される、ステップ、ならびに
（ｄ）任意選択でステップ（ｃ）を繰り返すステップ
を含む方法である。
【０２０４】
実施形態３５は、それを必要とするヒト対象においてヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する免疫応答を誘導する方法であって、
（ａ）（ｉ）（ｉ，ａ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む合成ＨＩＶエンベロープタンパク質、（ｉ，ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＩＶ  Ｅｎｖ抗原、（ｉ，ｃ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＩＶ  Ｇａｇ−Ｐｏｌ融合抗原、（ｉ，ｄ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＩＶ  Ｇａｇ−Ｐｏｌ融合抗原をコードする核酸を含むＭＶＡまたはＭＶＡ−ＢＮベクターを対象に投与するステップであって、好ましくは、ＭＶＡは、１０５〜１０１１ｐｆｕの用量で、例えば、１０７ｐｆｕ、１０８ｐｆｕ、１０９ｐｆｕ、または１０１０ｐｆｕの用量で、または１０６〜１０１０ＴＣＩＤ５０、例えば１０７と１０９ＴＣＩＤ５０の間の用量で投与される、ステップ、
（ｂ）任意選択でステップ（ａ）を繰り返すステップ、
（ｃ）（ｉ）（ｉ，ａ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む合成ＨＩＶエンベロープタンパク質、（ｉ，ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＩＶ  Ｅｎｖ抗原、（ｉ，ｃ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＩＶ  Ｇａｇ−Ｐｏｌ融合抗原、（ｉ，ｄ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＩＶ  Ｇａｇ−Ｐｏｌ融合抗原をコードする核酸を含むＭＶＡまたはＭＶＡ−ＢＮベクター、ならびに任意選択で１つまたは複数の（ｉｉ，ａ）配列番号７のアミノ酸３０〜７０８の配列を有する単離されたＨＩＶ  ｇｐ１４０タンパク質、（ｉｉ，ｂ）配列番号３６のアミノ酸３０〜７２４の配列を有する単離されたＨＩＶ  ｇｐ１４０タンパク質、および（ｉｉｉ）リン酸アルミニウムアジュバントを対象に投与するステップであって、好ましくは、ＭＶＡが１０５〜１０１１ｐｆｕの用量で、例えば、１０７ｐｆｕ、１０８ｐｆｕ、１０９ｐｆｕ、または１０１０ｐｆｕの用量で、または１０６〜１０１０ＴＣＩＤ５０、例えば１０７と１０９ＴＣＩＤ５０の間の用量で投与され、任意選択で、単離されたＨＩＶ  ｇｐ１４０タンパク質が総用量約５０〜３００マイクログラム、例えば２５０マイクログラムで約１：１の比で投与される、ステップ、ならびに
（ｄ）任意選択でステップ（ｃ）を繰り返すステップ
を含み方法である。
【０２０５】
実施形態３６は、それを必要とするヒト対象においてＨＩＶに対する免疫応答を誘導する方法であって、
（ａ）配列番号１８、配列番号５、配列番号２８、および配列番号２９のアミノ酸配列を含む合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードするＭＶＡまたはＭＶＡ−ＢＮベクターを対象に投与するステップであって、ＭＶＡまたはＭＶＡ−ＢＮベクターは、１０５〜１０１１ｐｆｕの用量で、例えば、１０７ｐｆｕ、１０８ｐｆｕ、１０９ｐｆｕ、または１０１０ｐｆｕの用量で、例えば、２×１０７〜５×１０８ｐｆｕ、例えば約１×１０８ｐｆｕの用量で、または１０６〜１０１０ＴＣＩＤ５０、例えば１０７と１０９ＴＣＩＤ５０の間の用量で投与される、ステップ
（ｂ）任意選択でステップ（ａ）を繰り返すステップ、
（ｃ）（ｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードするｒＡｄ２６ベクター、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む抗原をコードするｒＡｄ２６ベクター、（ｉｉｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含む抗原をコードするｒＡｄ２６ベクター、（ｉｖ）配列番号２９のアミノ酸配列を含む抗原をコードするｒＡｄ２６ベクター、および任意選択で、１つまたは複数の：（ｖ，ａ）配列番号７のアミノ酸３０〜７０８の配列を有する単離されたＨＩＶ  ｇｐ１４０タンパク質、（ｖ，ｂ）配列番号３６のアミノ酸３０〜７２４の配列を有する単離されたＨＩＶ  ｇｐ１４０タンパク質、（ｖ，ｃ）（ｖ，ａ）と（ｖ，ｂ）の両方、および（ｖ，ｄ）リン酸アルミニウムアジュバントを対象に投与するステップであって、好ましくは、ｒＡｄ２６ベクターは、約１〜１０×１０１０ウイルス粒子（ｖｐ）、例えば５×１０１０ｖｐの総用量で約１：１：１：１の比で投与され、任意選択で単離されたＨＩＶ  ｇｐ１４０タンパク質が総用量約５０〜３００マイクログラム、例えば２５０マイクログラムで約１：１の比で投与される、ステップ、
（ｄ）任意選択で、ステップ（ｃ）を繰り返すステップ
を含み方法である。
【０２０６】
実施形態３７は、それを必要とするヒト対象においてＨＩＶに対する免疫応答を誘導する方法であって、
（ａ）（ｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードするｒＡｄ２６ベクター、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む抗原をコードするｒＡｄ２６ベクター、（ｉｉｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含む抗原をコードするｒＡｄ２６ベクター、および（ｉｖ）配列番号２９のアミノ酸配列を含む抗原をコードするｒＡｄ２６ベクターを対象に投与するステップであって、好ましくは、ｒＡｄ２６ベクターは、約１〜１０×１０１０ウイルス粒子（ｖｐ）、例えば５×１０１０ｖｐの総用量で約１：１：１：１の比で投与される、ステップ、
（ｂ）任意選択でステップ（ａ）を繰り返すステップ、
（ｃ）（ｉ）配列番号１８、配列番号５、配列番号２８、および配列番号２９のアミノ酸配列を含む合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードするＭＶＡまたはＭＶＡ−ＢＮベクターであって、好ましくはＭＶＡまたはＭＶＡ−ＢＮベクターは、１０５〜１０１１ｐｆｕの用量で、例えば、１０７ｐｆｕ、１０８ｐｆｕ、１０９ｐｆｕ、または１０１０ｐｆｕの用量で、例えば２×１０７〜５×１０８ｐｆｕの用量で、例えば約１×１０８ｐｆｕの用量で、または１０６〜１０１０ＴＣＩＤ５０、例えば１０７と１０９ＴＣＩＤ５０の間の用量で投与される、ＭＶＡまたはＭＶＡ−ＢＮベクター、ならびに（ｉｉ，ａ）配列番号７のアミノ酸３０〜７０８の配列を有する単離されたＨＩＶ  ｇｐ１４０タンパク質、または（ｉｉ，ｂ）配列番号３６のアミノ酸３０〜７２４の配列を有する単離されたＨＩＶ  ｇｐ１４０タンパク質、または（ｉｉ，ｃ）第１の単離されたＨＩＶ  ｇｐ１４０タンパク質が配列番号７のアミノ酸３０〜７０８の配列を有し、第２の単離されたＨＩＶ  ｇｐ１４０タンパク質が配列番号３６のアミノ酸３０〜７２４の配列を有する２つの単離されたＨＩＶ  ｇｐ１４０タンパク質であって、好ましくは、これらのタンパク質は約１：１の比で投与される、２つの単離されたＨＩＶ  ｇｐ１４０タンパク質、および（ｉｉｉ）リン酸アルミニウムアジュバントを対象に投与するステップであって、好ましくは、単離されたＨＩＶ  ｇｐ１４０タンパク質（単数または複数）が、約５０〜３００マイクログラム、例えば２５０マイクログラムの総用量で投与される、ステップ、ならびに
（ｄ）任意選択でステップ（ｃ）を繰り返すステップ
を含み方法である。
【０２０７】
実施形態３８は、対象に、ベクターまたはワクチン成分を投与する第１のステップより前にＨＩＶが感染している、実施形態２６〜３１または３４〜３７のいずれかの方法である。
【０２０８】
実施形態３９は、対象に潜伏ウイルスリザーバー除去剤を投与するステップをさらに含む、実施形態２６〜３１または３４〜３８のいずれかの方法である。
【０２０９】
実施形態４０は、潜伏ウイルスリザーバー除去剤がＴＬＲ７モジュレーターである、実施形態３９の方法である。
【０２１０】
実施形態４１は、対象が抗レトロウイルス療法（ＡＲＴ）をさらに受ける、実施形態２６〜３１または３４〜４０のいずれかの方法である。
【０２１１】
実施形態４２は、対象がプライム／ブースト免疫の完了後にＡＲＴの中断を受ける、実施形態４１の方法である。
【０２１２】
実施形態４３は、ＡＲＴの中断がＡｄ２６プライム免疫およびＭＶＡブースト免疫の完了後に開始され、任意選択でＭＶＡブースト免疫が１つまたは複数の単離されたＨＩＶ  Ｅｎｖ  ｇｐ１４０タンパク質と一緒に投与される、実施形態４２の方法である。
【０２１３】
実施形態４４は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染および／または疾患の処置および／または予防における使用のための、実施形態１３または２１〜２３のいずれか１つの組成物、実施形態１４または２１〜２３のいずれか１つのワクチン、または実施形態１５〜１８または３２〜３３のいずれか１つのワクチン組合せ物である。
【０２１４】
実施形態４５は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染および／または疾患の処置および／または予防のための医薬を製造するステップでの使用のための、実施形態１３または２１〜２３のいずれか１つの組成物、実施形態１４または２１〜２３のいずれか１つのワクチン、または実施形態１５〜１８または３２〜３３のいずれか１つのワクチン組合せ物である。
【０２１５】
実施形態４６は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染および／または疾患の処置および／または予防のための医薬を製造するステップのための、実施形態１３または２１〜２３のいずれか１つの組成物、実施形態１４または２１〜２３のいずれか１つのワクチン、または実施形態１５〜１８または３２〜３３のいずれか１つのワクチン組合せ物の使用である。
【実施例】
【０２１６】
[実施例１]
ＨＩＶエンベロープ抗原配列の設計
いくつかのＨＩＶエンベロープ抗原配列は、モザイクＨＩＶ抗原ｍｏｓ２Ｅｎｖ（配列番号６；以前に国際公開第２０１０／０５９７３２号パンフレットにも記載された）と配列類似性を有するように設計された。新しく設計された膜結合配列は、ＨＩＶエンベロープタンパク質由来の完全に天然の野生型配列、またはｍｏｓ２Ｅｎｖ配列と野生型ＨＩＶエンベロープタンパク質配列のキメラ（の組合せ）に基づいた。全長エンベロープタンパク質配列（図１Ａ参照）に加えて、細胞質ドメインのＣ末端トランケーションを有する配列も設計された（例えば、図１Ｃ参照）。例えば、Schiernle et al., PNAS 1997; Abrahamyan et al., J Virol 2005; Edwards et al., J. Virology, 2002, 76:2683-2691も参照。可溶性変異体は、三量体ドメイン、例えばＧＣＮ４三量体ドメイン（例えば、図１Ｂ参照）によって置き換えられた膜貫通（ＴＭ）領域の前のＣ末端トランケーションによっても調整された。これらの可溶性変異体は、フューリン切断部位の変異によって一本鎖変異体へとさらに変換され、したがってエンベロープタンパク質の細胞外ドメインのｇｐ１２０およびｇｐ４１サブユニットへのプロセシングを阻害する。
【０２１７】
生成および試験された構築物の中で、Ｃ４に基づく構築物は最も適した性質、例えば良好な製造可能性、フォールディング、免疫原性等を有し、これらはさらなる研究のために選択された。膜貫通ドメインの代わりにＧＣＮ４三量体ドメインを有するＣ４構築物の可溶性変異体（ｓＣ４、図１Ｂ）、および細胞質ドメインの７アミノ酸断片を含む変異体（Ｃ４Ｄ７、図１Ｃ）も生成され、さらなる研究で試験された。Ｃ４、ｓＣ４、およびＣ４Ｄ７のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１７、１９、および１８に示す。これらをコードする配列は、それぞれ、配列番号２５、２７、および２６に示す。構築物Ｃ１は、ｍｏｓ２Ｅｎｖ配列（配列番号６）に基づく細胞外ドメイン配列を有する。それぞれ図１Ｂおよび図１Ｃに示すｓＣ４およびＣ４Ｄ７に類似している膜貫通ドメインの代わりにＧＣＮ４三量体ドメインを有する構築物Ｃ１の可溶性変異体（ｓＣ１）、および細胞質ドメインの７アミノ酸断片を含む変異体（Ｃ１Ｄ７）も生成された。構築物Ｃ１およびその変異体は、これらが本質的に先行技術のｍｏｓ２Ｅｎｖ配列に基づくため、比較目的のためにさらなる研究に使用された。Ｃ１、ｓＣ１およびＣ１Ｄ７のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３１、３０、および３２に示す。これらをコードする核酸配列は、それぞれ配列番号３４、３３、および３５に示す。試験された他の構築物は、構築物Ｃ４に基づくものより適しておらず、さらなる開発に用いられなかった。
【０２１８】
[実施例２]
合成ＨＩＶエンベロープタンパク質の発現およびフォールディング
合成ＨＩＶエンベロープタンパク質の発現レベル、フォールディング、および細胞表面発現が測定された。
【０２１９】
発現レベル
ＨＥＫ２９３Ｆ細胞は、実施例１に記載のように可溶性合成ＨＩＶエンベロープタンパク質ｓＣ１およびｓＣ４をコードするプラスミドを一過的にトランスフェクトされた。可溶性タンパク質の発現レベルは、定量的ウェスタンブロット（ＱＷＢ）を使用して上澄み液で測定された。結果は図２に示す。ｓＣ１の低い発現レベル（本質的に膜貫通ドメインが添加されたｍｏｓ２Ｅｎｖに相当する）は、ｍｏｓ２Ｅｎｖに関する本発明者らの最近の見識に則している。結果によって実証されたように、本発明のｓＣ４変異体は、ｓＣ１変異体（対照）よりも有意に高い発現レベルを示した。
【０２２０】
タンパク質フォールディング
タンパク質フォールディングは、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって、ＣＤ４の結合後にのみ暴露されるＨＩＶエンベロープタンパク質の共受容体結合部位に結合することが公知の抗体（ＭＡｂ  １７ｂ）への可溶性合成ＨＩＶエンベロープタンパク質の結合を測定することによって試験された。特に、精製されたｓＣ４の結合は、先立つＣＤ４へのｓＣ４の結合あり、および先立つＣＤ４へのｓＣ４の結合無しで、Ｍａｂ  １７ｂへの結合に関して試験された。精製されたｓＣ１が対照として使用された。エンベロープタンパク質への先立つＣＤ４結合無しでのｓＣ４へのＭＡｂ  １７ｂの結合は、部分的にフォールドされていない、またはトリガーされる前の（ｐｒｅ−ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ）エンベロープタンパク質（すなわち、ＣＤ４結合の非存在下で「開いた」構造に採用される不安定なＥｎｖ）であることを示す。ＥＬＩＳＡアッセイの結果は図３Ａおよび図３Ｂに示す。
【０２２１】
図３Ｂに示すように、ｓＣ４は、先立つＣＤ４への結合によってＭＡｂ  １７ｂへの強い結合を示すが、先立つＣＤ４への結合無しではＭＡｂ  １７ｂへの検出可能な結合は無かった。これに対し、図３Ａに示すように、ｓＣ１は、先立つＣＤ４へ結合有りおよび無し両方でＭＡｂ  １７への非常に低い結合を示した。結果は、ｓＣ４が、ＣＤ４結合前に共受容体結合部位の暴露なく、正しいフォールディングパターンを有することを示す。
【０２２２】
タンパク質フォールディングはまた、ｓＣ１およびｓＣ４の未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によっても分析され、可溶性タンパク質変異体の四次構造、およびプロトマー間の不正確なジスルフィド結合形成の可能性を評価した。未変性ゲルでの電気泳動後、ゲル内のタンパク質はウェスタンブロット分析によって検出された。図４の結果によって示されるように、大部分のｓＣ４は、正しい四次構造である三量体状態で存在する。
【０２２３】
まとめると、タンパク質フォールディング実験の結果は、ｓＣ４可溶性合成ＨＩＶエンベロープタンパク質が所望のフォールディングプロファイルを有し、既存のｍｏｓ２Ｅｎｖ抗原（ｓＣ１によって表される）のフォールディングプロファイルと比較して改善されることを実証する。
【０２２４】
細胞表面発現
ＨＩＶエンベロープタンパク質Ｃ１（全長）、Ｃ４（全長、図１Ａ参照）、Ｃ１Ｄ７、およびＣ４Ｄ７の膜結合変異体の細胞表面発現も研究された。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ｅＧＦＰコードプラスミドのみを（陰性対照、ＮＣ）、またはＨＩＶエンベロープタンパク質変異体をコードする発現構築物と一緒にｅＧＦＰコードプラスミドを、一過的にトランスフェクトされた。トランスフェクションの２日後、細胞は、ｇｐ１２０に対するいくつかのポリ−およびモノクローナル抗体、ならびに二次抗体に暴露され、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）分析に供され、次いで、エンベロープタンパク質細胞表面発現レベルを調べた。エンベロープ変異体の質は、抗ｇｐ１２０ポリクローナル抗体を使用して全体的な発現レベルを決定すること、および四次構造依存的であり、正しくフォールドされたエンベロープ三量体に優先的に結合する広域中和抗体ＰＧ９およびＰＧ１６の相対的な結合を評価することによって評価された。
【０２２５】
細胞表面発現実験の結果は、図５に示す。抗ｇｐ１２０抗体を使用して測定した場合、トランケートした変異体Ｃ１Ｄ７およびＣ４Ｄ７の表面発現レベルは、それらの全長対応物、それぞれＣ１およびＣ４の表面発現レベルよりも非常に高い。これは、Ｅｎｖのカルボキシル末端から１４４残基の欠失が、エンベロープ表面発現レベルを増加することを確認する。本発明の全長Ｃ４構築物はまた、全長Ｃ１と比較してＰＧ９およびＰＧ１６結合の改善も示し、Ｃ４エンベロープ配列が細胞表面で適当にフォールドされる（すなわち三量体）ことを示している。
【０２２６】
結果は、本質的に膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインの７アミノ酸が添加されたＭｏｓ２ＥｎｖであるＣ１Ｄ７変異体が、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で表面発現され得ることも実証する。これは、Ａ５４９細胞にトランスフェクトされた場合、表面上に検出可能なレベルで発現され得ないＡｄ２６．ｍｏｓ２Ｅｎｖの可溶性構築物と対照的である。しかしながら、ＰＧ９およびＰＧ１６への相対結合は、バックグラウンドよりもわずかに検出可能であり、Ｃ１Ｄ７エンベロープ配列は不十分にフォールドされ、おそらく細胞表面上で完全な三量体として存在しない。
【０２２７】
総合すると、Ｃ４Ｄ７エンベロープ変異体は、その全長対応物Ｃ４よりも高いｇｐ１２０発現、ならびにＣ１およびＣ１Ｄ７と比較して１５倍より高く増加したＰＧ９およびＰＧ１６結合により、最も適した抗体結合プロファイルを有する（図５）。
【０２２８】
[実施例３]
ＨＩＶエンベロープ配列をコードするベクターの安定性
本発明者らの研究室での以前の研究（未発表）は、ｍｏｓ２Ｅｎｖ抗原配列をコードするアデノウイルス２６（Ａｄ２６）ベクターが、比較的高いＶＰ／ＩＵ比（アデノウイルス産物バッチの低い質を示す）を示し、さらにそのようなベクターが安定性の問題を提示することを示した。したがって、アデノウイルスバックグラウンドで本発明の合成ＨＩＶエンベロープタンパク質構築物の安定性を試験することが重要であった。
【０２２９】
実施例１に上記したように、本発明のＨＩＶ抗原配列をコードする組換えＡｄ２６（ｒＡｄ２６）ベクター、Ｃ４、Ｃ４Ｄ７、およびｓＣ４は、ＰＥＲ．Ｃ６細胞で生成された（それぞれ「ｒＡｄ２６．Ｃ４」、「ｒＡｄ２６．Ｃ４Ｄ７」、および「ｒＡｄ２６．ｓＣ４」と呼ばれる）。ベクタークローン（プラーク）を採集し、研究バッチの生成のためにスケールアップした。最大５個のウイルスクローン（プラーク）がＴ２５フォーマットにスケールアップされ、Ｔ２５フォーマットで１０継代の間、段階的に継代された（継代１〜３は、トランスフェクションおよびプラーク精製ステップ、続いてＴ２５フォーマットで１０継代、合計１３継代になる）。遺伝的安定性は、Ｅ１導入遺伝子カセットＰＣＲアッセイ、続いてｖｐｎ１３のシーケンシングによって、ウイルス継代数（ｖｐｎ）３、５、１０および１３で評価された。結果は図６に示す。
【０２３０】
全長Ｃ４をコードするｒＡｄ２６ベクター（ｒＡｄ２６．Ｃ４）は、２〜３日は完全な細胞変性効果（ＣＰＥ）が無いことによって決定されたように、弱い増殖特徴；Ｅ１導入遺伝子カセット領域の欠失によって決定されたように、遺伝的不安定性；またはそれらの組合せ（図６）を示した。弱い増殖特徴および観察された遺伝的不安定性により、全長Ｃ４をコードするこのベクターは、さらには探究されなかった。
【０２３１】
対照的に、Ｃ４Ｄ７（ｒＡｄ２６．Ｃ４Ｄ７）およびｓＣ４（ｒＡｄ２６．ｓＣ４）をコードするｒＡｄ２６ベクターでは、実験の過程の間、増殖させた全てのプラークは遺伝的に安定なままであった（図６）。したがって、新規のｓＣ４およびＣ４Ｄ７構築物は、アデノウイルスベクターバックグラウンドでの安定性に関して、元のｍｏｓ２Ｅｎｖ構築物よりも優れている。ｖｐｎ１３までの遺伝的安定性試験は、ベクターの産業スケールでの調製で使用されるよりも数継代多い増殖を表す。
【０２３２】
[実施例４]
アデノウイルスベクターでのＨＩＶエンベロープ配列の発現およびｉｎ  ｖｉｖｏ抗原性
ｒＡｄ２６．Ｃ４Ｄ７およびｒＡｄ２６．ｓＣ４の発現および抗原性は、別々にまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでベクター形質導入Ａ５４９細胞（ヒト細胞系）において、ｍｏｓ１Ｅｎｖ（配列番号５）をコードする組換えＡｄ２６ベクター（以降、「ｒＡｄ２６．ｍｏｓ１Ｅｎｖ」）を組み合わせて評価された（データは示さず）。フローサイトメトリー分析は、全ての抗原が、対照として２×１０４ウイルス粒子（ｖｐ）の単一のエンベロープ抗原またはアデノウイルス形質導入による１×１０４ｖｐの２つの組み合わせたＥｎｖ抗原のいずれかによって形質導入された細胞培養物中で発現されたことを実証した。全ての形質導入はさらに、ｍｏｓ１ＧａｇＰｏｌ（「ｒＡｄ２６．ｍｏｓ１ＧａｇＰｏｌ」）およびｍｏｓ２ＧａｇＰｏｌ（ｒＡｄ２６．ｍｏｓ２ＧａｇＰｏｌ）をコードする単回用量（１×１０４ｖｐ）のアデノウイルスベクターを含有し（Barouch et al, Nat Med 2010, 16:319-323）、そのため、評価したベクターの組合せが、前臨床および臨床使用を意図されたように、異なるアデノウイルスベクターの同じ相対比を示した。好ましくは、本発明の合成エンベロープタンパク質をコードするベクターは、臨床使用のため、ｍｏｓ１ＧａｇＰｏｌおよびｍｏｓ２ＧａｇＰｏｌ抗原をコードするベクターと組み合わされる。
【０２３３】
ｒＡｄ２６．ｍｏｓ１ＥｎｖとｒＡｄ２６．Ｃ４Ｄ７の組合せは、モノクローナル抗体結合によって決定されるように、評価したエピトープの最大適用範囲をもたらした。特に、Ａｄ２６．Ｃ４Ｄ７によるトランスフォーメーションによって寄与されたＰＧ１６エピトープの暴露は、ＰＧ１６が、ＨＩＶ−１  ＥｎｖのＶ１／Ｖ２ループ領域を認識する広範なモノクローナル中和抗体を表すため、ワクチン使用が期待される（Walker et al, Science 326:258-9, 2009）。したがって、Ｃ４配列由来の本発明の合成ＨＩＶエンベロープタンパク質は、ｍｏｓ１Ｅｎｖのみによって生成された免疫応答と比較してＨＩＶエンベロープタンパク質に対する免疫応答の幅を増加した。エンベロープタンパク質領域に対するワクチン誘導性抗体応答は、ＲＶ１４４研究においてＨＩＶ−１感染からの保護と関係することが示され（Haynes et al, N Engl J Med. 336:1275-86, 2012）、したがって、本発明の合成ＨＩＶエンベロープタンパク質は、ＨＩＶワクチンレジメンに含まれる有望な候補である。
【０２３４】
[実施例５]
合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードするベクターの免疫原性
Ａｄ２６ベクターバックグラウンドの本発明の合成ＨＩＶエンベロープタンパク質配列はウサギで試験され、これらの構築物が、ｒＡｄ２６．ｍｏｓ２Ｅｎｖ構築物の免疫原性の代わりであるか決定された。
【０２３５】
ｍｏｓ１Ｅｎｖをコードするアデノウイルスベクター（ｒＡｄ２６．ｍｏｓ１Ｅｎｖ；配列番号５）の免疫原性は単独、および本発明の合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードするアデノウイルスベクター（ｒＡｄ２６．Ｃ４Ｄ７およびｒＡｄ２６．ｓＣ４；配列番号８、特にそれぞれ配列番号１８および１９を含む）と組み合わせて試験された。全ての場合で、ｍｏｓ１ＧａｇＰｏｌおよびｍｏｓ２ＧａｇＰｏｌ抗原をコードするアデノウイルス２６ベクター（それぞれｒＡｄ２６．ｍｏｓ１ＧａｇＰｏｌ［配列番号２８］およびｒＡｄ２６．ｍｏｓ２ＧａｇＰｏｌ［配列番号２９］）も投与された。より具体的には、ｒＡｄ２６．ｍｏｓ１Ｅｎｖ単独の免疫原性は（３価のワクチン：ｒＡｄ２６．ｍｏｓ１ＧａｇＰｏｌ、ｒＡｄ２６．ｍｏｓ２ＧａｇＰｏｌおよびｒＡｄ２６．ｍｏｓ１Ｅｎｖ）、ｒＡｄ２６．Ｃ４Ｄ７またはｒＡｄ２６．ｓＣ４の１つと組み合わせたｒＡｄ２６．ｍｏｓ１Ｅｎｖの免疫原性と比較された（４価のワクチン：ｒＡｄ２６．ｍｏｓ１ＧａｇＰｏｌ、ｒＡｄ２６．ｍｏｓ２ＧａｇＰｏｌ、ｒＡｄ２６．ｍｏｓ１ＥｎｖおよびｒＡｄ２６．Ｃ４Ｄ７のいずれかの投与；またはｒＡｄ２６．ｍｏｓ１ＧａｇＰｏｌ、ｒＡｄ２６．ｍｏｓ２ＧａｇＰｏｌ、ｒＡｄ２６．ｍｏｓ１ＥｎｖおよびｒＡｄ２６．ｓＣ４の投与）。本発明の合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする任意のベクターを欠如する３価のワクチンの、本発明の合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードするベクターを含有する４価のワクチンとのこの比較により、本発明のＨＩＶエンベロープタンパク質が保護の幅に寄与するかどうかの決定が可能にする。
【０２３６】
投与は、ワクチンレジメンで行われ、これらのＡｄ２６ベクターは、二重のプライミングとして０週および６週目に投与され、クレードＣ  ｇｐ１４０タンパク質（残基１〜２９のシグナルペプチド配列無しで配列番号７を有する３価のＥｎｖ  ｇｐ１４０タンパク質、国際公開第２０１０／０４２９４２号パンフレット参照）は、二重のブーストとして１２週および１８週目に投与された（例えば、Barouch et al, 2015, Science 349: 320-324参照）。表１は、本研究に使用されるワクチンレジメンを記載する。ｒＡｄ２６．Ｅｍｐｔｙは、ＨＩＶ抗原タンパク質の配列をコードする任意の遺伝子を欠如する対照ベクターを指す。各群は６匹のウサギを含有した。
【０２３７】
【表１】
2020527029.tif 000003
【０２３８】
３価のＡｄ２６ワクチン（本発明の新規のＥｎｖ抗原を欠如する）の４価のＡｄ２６ワクチン（新規のｓＣ４またはＣ４Ｄ７  Ｅｎｖ抗原を含む）との比較は、本発明の新規の抗原が保護の幅に寄与するかどうか試験することを可能にする。確立されたＴＺＭ−ｂ１細胞ベースの中和アッセイ［Montefiori DC. Methods Mol Biol 2009,485:395-405; Sarzotti-Kelsoe M et al.,  J Immunol Methods 2014,409:131-146］は、ワクチン候補の中和活性を測定するために使用された。
【０２３９】
結果は図７に示され、対照群として３価のワクチン（表１の群１）を使用すること、および新規の４価のワクチン（表１の群２および３）のそれぞれを比較することによって統計的に分析された。
【０２４０】
全体的に、新規のＣ４−由来（すなわち、配列番号８を含むＥｎｖタンパク質をコードし、ｍｏｓ２Ｅｎｖの代わりである）アデノウイルス構築物は、ラビットにおける２つの同種筋肉内免疫後、免疫原性であった。
【０２４１】
Ｔｉｅｒ  １Ｂ偽型ウイルスに対するウサギ抗血清の中和能力は無く（データは示さない）、そのようなウイルスは中和がより困難であることは公知であったため意外ではない。
【０２４２】
クレードＢ  Ｔｉｅｒ  １Ａウイルスに対するウサギ抗血清の偽型ウイルス中和能力は、新しい成分の添加に影響されなかった（データは示さない）。これは、新規の抗原が、ワクチンに存在する既存のクレードＢ抗原の免疫原性とネガティブに緩衝しなかったことを実証する（新しい成分はクレードＣに向き、そのような望まない緩衝は、試験される前に先験的に除外できなかった）。
【０２４３】
クレードＣ  Ｔｉｅｒ  １Ａウイルスに対するウサギ抗血清の偽型ウイルス中和能力は、３価の（ｍｏｓ１Ｅｎｖのみを有する）免疫単独と比較して（群１）（図７パネルＢ）、アデノを含有する４価の新規Ｃ４Ｄ７（４価、群２）で有意に増強された。さらに、８週目のクレードＣ  Ｔｉｅｒ  １Ａウイルスに対するウサギ抗血清の偽型ウイルス中和能力は、３価の（ｍｏｓ１Ｅｎｖのみを有する）免疫単独と比較して（群１）（図７パネルＢ）、アデノウイルスを含有する４価の新規ｓＣ４（４価、群３）で著しく増強された。
【０２４４】
結論として、Ａｄ２６にコードされるＣ４Ｄ７およびｓＣ４構築物は免疫原性であり、その添加は単独のＡｄ２６コードＥｎｖ成分としてｍｏｓ１Ｅｎｖ（主にクレードＢ）を有するワクチンの結合および中和能力をクレードＣ株に向けて拡大した（図７Ｂ）。
【０２４５】
[実施例６]
本発明の合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードするベクターを含むワクチンレジメンの免疫原性
さらなるウサギ研究は、１３および１９週目に、クレードＣ  ｇｐ１４０［配列番号７のアミノ酸残基３０〜７０８の配列を有する］、モザイクｇｐ１４０［配列番号３６のアミノ酸残基３０〜７２４の配列を有する］、またはクレードＣ  ｇｐ１４０とモザイクｇｐ１４０の組合せを使用する組換えＨＩＶ−１  Ｅｎｖタンパク質ブーストと組み合わせて、０および６週目に、二重プライム免疫として筋肉内に適用された、４価のベクター組合せＡｄ２６．Ｍｏｓ４．ＨＩＶ（４つのアデノウイルスベクター：Ａｄ２６．Ｍｏｓ１ＧａｇＰｏｌ［配列番号２８をコードする］、Ａｄ２６．Ｍｏｓ２ＧａｇＰｏｌ［配列番号２９をコードする］、Ａｄ２６．Ｍｏｓ１Ｅｎｖ［配列番号５をコードする］およびＡｄ２６．Ｍｏｓ２ＳＥｎｖ［上記で使用される名前「Ｃ４Ｄ７」も「Ｍｏｓ２Ｓ」と呼ばれ、このベクターは、本発明に記載の新規の配列番号１８をコードする］からなり、総用量５×１０９ｖｐで１：１：１：１の混合物中）を評価した。これらのタンパク質ブーストは、免疫の日に製剤化された２５０マイクログラムのリン酸アルミニウムアジュバントと組み合わせた、総用量１０または５０マイクログラムのタンパク質で筋肉内に適用された。
【０２４６】
結果は、全ての試験したレジメンは全ての動物において免疫原性であり、高い抗体力価およびＴｉｅｒ  １  Ｅｎｖ偽型ウイルスに対する高い抗体力価および中程度の中和活性を誘導することを示す。モザイクｇｐ１４０が、ワクチン抗原として、単独もしくはクレードＣ  ｇｐ１４０との組合せのいずれかで使用された場合、モザイクｇｐ１４０特異的ＥＬＩＳＡ力価およびクレードＢ偽型ウイルス認識は、クレードＣ  ｇｐ１４０単独でブーストされた参照群と比較して１５週目に著しく増加された。改善の全体的な効果量は中程度であり、モザイクｇｐ１４０単独と比較して２価のクレードＣ  ｇｐ１４０−モザイクｇｐ１４０組合せによりブーストされた群ではより大きかった。研究の２１週目に、これらの違いはなくなり、２価のクレードＣ  ｇｐ１４０−モザイクｇｐ１４０ブースト、または１価のクレードＣ  ｇｐ１４０ブーストを受けるコホートに関して測定された免疫応答は統計的に区別できなかった。
【０２４７】
２価のタンパク質レジメンは、クレードＣ  ｇｐ１４０単独ブーストレジメンと匹敵するクレードＣ  ＥＬＩＳＡ力価の誘導および偽型ウイルス認識を示し、クレードＢ関連免疫原モザイクｇｐ１４０の包含がクレードＣ抗原適用範囲にネガティブな効果を持たないが、研究の１５週目にクレードＢ適用範囲を有意に増強することを示している。
【０２４８】
データは、本発明に記載の合成ＨＩＶ抗原をコードするＡｄ２６．Ｍｏｓ２ＳＥｎｖベクターがワクチンレジメンに成功裏に使用され得ることを裏付ける。
【０２４９】
[実施例７]
他のＨＩＶ抗原と組み合わせた本発明の合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードするＭＶＡベクターの構築
本実施例では、配列番号１８として本明細書に記載される新規のＨＩＶ  ｍｏｓ２ＳＥｎｖ抗原をコードする核酸（Ｃ４Ｄ７とも呼ばれる）を含む、ＭＶＡ−ＢＮベクターが生成される（「ＭＶＡ−ｍＢＮ４１４」と呼ばれる）。ＭＶＡ−ｍＢＮ４１４ベクターはさらに、以下のＨＩＶ抗原：ｍｏｓ１Ｅｎｖ（配列番号５）；ｍｏｓ１Ｇａｇ（配列番号１）；ｍｏｓ２Ｇａｇ（配列番号２）；ｍｏｓ１Ｐｏｌ（配列番号３）；およびｍｏｓ２Ｐｏｌ（配列番号４）をコードする核酸を含む。ＭＶＡ−ｍＢＮ４１４では、ｍｏｓ１Ｇａｇ（配列番号１）およびｍｏｓ１Ｐｏｌ（配列番号３）は融合タンパク質（配列番号２８、「ｍｏｓ１ＧａｇＰｏｌ」）としてコードされ、ｍｏｓ２Ｇａｇおよびｍｏｓ２Ｐｏｌは融合タンパク質（配列番号２９、「ｍｏｓ２ＧａｇＰｏｌ」）としてコードされた。ＭＶＡゲノムの領域へのインサートの概略図は図８を参照。
【０２５０】
本発明者らは、ＨＩＶ抗原ｍｏｓ２ＳＥｎｖ（配列番号１８）をコードする新規の核酸（配列番号４１）；ＨＩＶ抗原ｍｏｓ１Ｅｎｖ（配列番号５）をコードする新規の核酸（配列番号３９）；ＨＩＶ抗原ｍｏｓ１ＧａｇＰｏｌ（配列番号２８）をコードする新規の核酸（配列番号３８）；およびＨＩＶ抗原ｍｏｓ２ＧａｇＰｏｌ（配列番号２９）をコードする新規の核酸（配列番号４０）を設計した。新規の核酸は、ヒト発現、互いに最小の相同性、およびポリ−ｎｔストレッチならびに繰り返しエレメントの減少のために設計された。
【０２５１】
ＰｒＭＶＡ１３．５ロングプロモーター（配列番号４２）は、ｍｏｓ１ＧａｇＰｏｌとｍｏｓ２ＧａｇＰｏｌ抗原配列の両方のＡＴＧ開始コドンの前に含まれた。ＰｒＨｙｂプロモーター（配列番号４３）は、ｍｏｓ２ＳＥｎｖとｍｏｓ１Ｅｎｖ抗原配列の両方のＡＴＧ開始コドンの前に含まれた。
【０２５２】
ｍｏｓ１ＧａｇＰｏｌおよびｍｏｓ１Ｅｎｖコード配列はＳａｃＩＩおよびＰａｃＩによりｐＢＮＸ２０８、ＩＧＲ４４／４５  ＭＶＡ−ＢＮ相同領域をコードする導入ベクターに挿入され、相同組換えによりＭＶＡ−ＢＮの標的領域（ＩＧＲ  ４４／４５）への挿入を可能にする。さらに、ｐＢＮＸ２０８は、正の選択のためのｈｅＧＦＰおよびｎｐｔＩＩ、ならびに選択圧の非存在下での相同組換えによる選択カセットの後の削除のためのＩＧＲ４４／４５  ＭＶＡ−ＢＮ相同領域Ｆｌａｎｋ２の繰り返し配列をコードする。ｍｏｓ２ＧａｇＰｏｌおよびｍｏｓ２Ｅｎｖコード配列はＮｏｔＩによりｐＢＮＸ２２７、ＩＧＲ８８／８９  ＭＶＡ−ＢＮ相同領域をコードする導入ベクターに挿入され、相同組換えによりＭＶＡ−ＢＮの標的領域（ＩＧＲ  ８８／８９）への挿入を可能にする。さらに、ｐＢＮＸ２２７は、それらの標的配列ｌｏｘＰに隣接する核酸配列の正確な削除を触媒するＣＲＥリコンビナーゼをコードするプラスミドによるトランスフェクション後、選択圧の非存在下で選択カセットの後の削除のための２つのｌｏｘＰ部位に隣接する、正の選択のためのｍＲＦＰ１およびｅｃｏｇｐｔをコードする。
【０２５３】
ＭＶＡベースのベクターは、ニワトリ一次線維芽細胞（ＣＥＦ）において生成され、本明細書に記載のように産生された。ＣＥＦ細胞は、ニワトリ胚から毎週単離され、ＦＢＳを含まないＶＰ−ＳＦＭ培地で維持された。簡単に述べると、ＣＥＦ細胞は、ＭＶＡベクタープラスミドを、製造業者（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって提供された説明書に従ってＦｕｇｅｎｅを使用してトランスフェクトされ、ＭＶＡ−ＢＮによる共感染が行われた。細胞は、２または３日後に採取され、超音波処理され、さらに継代された。ウイルスは、マルチウェル１２−組織培養プレートの単一のウェル内での増殖後、マルチウェル９６−組織培養プレートで培養されたＣＥＦ細胞でプラーク精製された。さらなる増幅が、マルチウェル６組織プレートの単一ウェル、および続いてＴ１７５組織培養フラスコで培養されたＣＥＦ細胞で行われた。
【０２５４】
ＭＶＡ−ｍＢＮ４１４は、したがって、そのＩＧＲ４４／４５領域にＰｒＭＶＡ１３．５ロングプロモーター（配列番号４２）の制御下のｍｏｓ１ＧａｇＰｏｌ（配列番号２８）をコードする核酸およびＰｒＨｙｂプロモーター（配列番号４３）の制御下のｍｏｓ１Ｅｎｖ（配列番号５）をコードする核酸を含むＭＶＡ−ＢＮである。ＩＧＲ８８／８９領域では、ＰｒＭＶＡ１３．５ロングプロモーター（配列番号４２）の制御下のｍｏｓ２ＧａｇＰｏｌ（配列番号２９）をコードする核酸およびＰｒＨｙｂプロモーター（配列番号４３）の制御下のｍｏｓ２ＳＥｎｖ（配列番号１８）をコードする核酸がある。ＭＶＡ−ｍＢＮ４１４ベクターは、本明細書に記載の抗原をコードするアデノウイルスベクターによる、プライム−ブーストレジメンでの続く実験で使用された。
【０２５５】
[実施例８]
ウサギにおけるＭＶＡ−ｍＢＮ４１４の免疫原性
ニュージーランドホワイト系（ＮＺＷ）ウサギにおけるＭＶＡ−ｍＢＮ４１４の免疫原性（図７参照）は、Ａｄ２６．Ｍｏｓ．ＨＩＶ（合わせて、配列番号１、２、３、４および５を有するＨＩＶ抗原をコードする３つのＡｄ２６ベクターを有する３価のワクチン；抗原ｍｏｓ１ＧａｇＰｏｌ（配列番号２８）、ｍｏｓ２ＧａｇＰｏｌ（配列番号２９）、およびｍｏｓ１Ｅｎｖ（配列番号５）の形態）プライミングの文脈で、ならびにＡｄ２６．Ｍｏｓ．ＨＩＶによる同種プライム−ブーストと比較して評価された。さらに、４２日および６２日目の、クレードＣ  ｇｐ１４０タンパク質（リン酸アルミニウムによりアジュバントされる）の同時投与（対側の筋肉（すなわち別の足）への注射）の付加利益が評価された。
【０２５６】
使用された免疫スケジュールは以下の表２に提供される：
【０２５７】
【表２】
2020527029.tif 000004
【０２５８】
読み出しアッセイは、クレードＣ（配列番号７のアミノ酸残基３０〜７０８）およびモザイクｇｐ１４０（配列番号３６のアミノ酸残基３０〜７２４）ＥＬＩＳＡ、ならびにＨＩＶ−１偽型ウイルス中和アッセイであった。免疫したウサギからの血清の中和能力は、ＴＺＭ−ｂ１細胞への侵入の阻害によってＨＩＶ−１  ＥＮＶ偽型ウイルス粒子（ＥＰＶ）に対して試験された。ＴＺＭ−ｂ１細胞は、高レベルのＣＤ４ならびに共受容体ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４を発現し、ＨＩＶ末端反復配列の制御下のインテグレートされたｔａｔ応答性ルシフェラーゼレポーター遺伝子を含有する。ＥＰＶに対する血清含有ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ抗体の中和効果は、ルシフェラーゼ発現の減少、およびそれによる基質を含有するルシフェリンと組み合わせた発光シグナルの減少をもたらす。血清または抗体は、１／２０から開始して、６段階にわたり３倍の段階希釈で試験された。最大ルシフェラーゼ発現は、血清または抗体を含まない１つのウェル内で細胞＋ＥＰＶのみを添加することによって測定された。バックグラウンドルシフェラーゼ発現は、血清／抗体およびＥＰＶを含まないウェルに細胞のみを添加することによって測定された。非線形４パラメーター曲線は最大とバックグラウンドのルシフェラーゼシグナルの間でフィットし、ｌｏｇ１０変換したＩＣ５０値は報告可能な値として決定された。
【０２５９】
結果は、図９に示す。
【０２６０】
結果は、ＭＶＡ−ｍＢＮ４１４が全てのウサギにおいて免疫原性であったことを示す。雄と雌の動物間に免疫原性の明らかな違いはなかった。Ａｄ２６プライムでのＭＶＡブーストは、同種Ａｄ２６プライム−ブーストと比較してＨＩＶ特異的液性免疫応答の増加を誘導した（クレードＣ  ＥＬＩＳＡ、クレードＢ様モザイクＥＬＩＳＡおよびクレードＢ  ＶＮＡで測定可能）。
【０２６１】
ブーストとして、クレードＣ  ｇｐ１４０タンパク質のＭＶＡとの同時投与は、ＭＶＡのみによるブーストと比較して、（同種）クレードＣ  ｇｐ１４０  ＥＬＩＳＡおよび（異種）モザイクｇｐ１４０  ＥＬＩＳＡ力価の増加を誘導した。
【０２６２】
[実施例９]
マウスにおけるＭＶＡ−ｍＢＮ４１４の免疫原性
ＭＶＡ−ｍＢＮ４１４の免疫原性はまた、同種ＭＶＡプライム−ブーストと比較して（すなわち、プライミングおよびブースト両方がＭＶＡ−ｍＢＮ４１４による）、異種Ａｄ２６．Ｍｏｓ４．ＨＩＶ（実施例６参照）プライミングおよびＭＶＡ−ｍＢＮ４１４（実施例７参照）ブーストの免疫原性を評価するために、ＣＢＦ１マウスにおいても評価された。
【０２６３】
使用された免疫スケジュールは、以下の表３に提供される：
【０２６４】
【表３】
2020527029.tif 000005
【０２６５】
液性免疫応答のための読み出しアッセイ（５および７週目の抗原特異的ＩｇＧ測定）は、モザイクｇｐ１４０（配列番号３６のアミノ酸残基３０〜７２４）ＥＬＩＳＡであった（実施例８参照）。細胞性免疫応答のための読み出しアッセイ（７週目）は、刺激としてＥｎｖ、Ｇａｇ、およびＰｏｌ免疫優性ペプチドを使用する、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴであった（Khan et al, Int J Cancer, 2017, Mar 6, doi: 10.1002/ijc.30679. [Epub ahead of print]; 2017, Jul 14, 141(2), 393-404に記載のアッセイ）。
【０２６６】
ＥＬＩＳＰＯＴの結果は図１０に示す。細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）アッセイも実施され、同様の結果をもたらした（図示せず）。
【０２６７】
結果は、Ａｄ２６またはＭＶＡによるプライミングが５週目に検出可能な免疫応答を誘導し（図１０Ａ）、異種Ａｄ−ＭＶＡレジメンおよび同種ＭＶＡ−ＭＶＡレジメンの両方に関し、７週目のＭＶＡによるブースト免疫によってさらに増加される（図１０Ｂ）。異種Ａｄ−ＭＶＡプライム−ブーストは、同種ＭＶＡ−ＭＶＡプライム−ブーストレジメンよりも著しく高いＥＬＩＳＡ力価を誘導した。これは、７週目の抗原Ｅｎｖ、Ｇａｇ、およびＰｏｌに対するＥＬＩＳＰＯＴによって測定された細胞性免疫応答についても観察された（図１０Ｃ〜Ｅ）。同種ＭＶＡプライム−ブースト免疫は、対照データとははっきりと区別できる低いが検出可能な抗原ＧａｇおよびＰｏｌに対する細胞性免疫応答を誘導した。
【０２６８】
概して、結果は、本発明に記載のＨＩＶ抗原を有するＭＶＡが免疫原性であることを示す。さらに、そのようなベクターが、ＨＩＶ抗原をコードするアデノウルスベクター、および／または単離されたＨＩＶ  ｇｐ１４０タンパク質によるプライム−ブーストレジメンで有利に使用され得ることを示す。
【０２６９】
参照
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【図１】
2020527029.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
2020527029000001.app
【国際調査報告】
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2020527029.tif 000017
2020527029.tif 000018
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