(57)【要約】【課題】細菌性感染症の患者を保護および治療するのに有用な、殺菌特性または静菌特性を有する細胞外基質組成物に関する。【解決手段】非上皮組織および上皮組織由来の消化されたまたは非消化の細胞外基質材料による、ヒトおよび動物における細菌感染を軽減および治療するための配合物および方法について説明する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者において呼吸器感染症を治療するための方法であって、
失活した天然細胞外基質材料から得られ、有効用量の、未消化であり、非架橋の微粉化粉末を、気道を介して前記患者に投与することを含み、前記失活した天然細胞外基質（ＥＣＭ）が、非上皮組織、膀胱基質（ＵＢＭ）、小腸粘膜下組織（ＳＩＳ）、および膀胱粘膜下組織（ＵＢＳ）からなる群から選択される、方法。
【請求項２】
前記微粉化粉末が、非酵素的に処理される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記微粉化粉末が、室温で少なくとも２ヶ月間貯蔵される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記微粉化粉末が、室温で少なくとも６ヶ月間貯蔵される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記感染症が、黄色ブドウ球菌、緑膿菌、および肺炎桿菌からなる細菌の群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記感染症が、少なくとも肺に局在している、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記気道が気管である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記投与経路が気管内または鼻腔内である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記投与経路が吸入によるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記投与がスプレーを介するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞外基質材料が、膀胱基質（ＵＢＭ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞外基質材料が、ＵＢＳを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記治療が、前記患者の前記気道を緩衝溶液中の前記微粉化粒子で洗浄することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
上皮基底膜を含む失活した細胞外基質材料から得られる、未消化であり、非架橋の微粉化粉末を含む緩衝液中の再構成材料を含む組成物であって、前記再構成材料が、前記細胞外基質の１つ以上の天然成分を含む、組成物。
【請求項１５】
前記１つ以上の天然成分が、非上皮由来ＥＣＭ、膀胱基質（ＵＢＭ）、小腸粘膜下組織（ＳＩＳ）、および膀胱粘膜下組織（ＵＢＳ）からなる群から選択される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
細菌に感染した患者において、細菌性バイオフィルムの形成を減少させるための方法であって、
未消化であり、非架橋の、微粉化され、失活した上皮基底膜の細胞外基質を前記患者に投与することを含み、前記上皮基底膜がＭＳＳＡ−黄色ブドウ球菌、ＭＲＳＡ−黄色ブドウ球菌、肺炎桿菌および緑膿菌からなる群から選択される１つ以上の細菌に対する殺菌活性を含む、方法。
【請求項１７】
前記失活した天然の細胞外基質（ＥＣＭ）が、非上皮組織、ＵＢＭ、ＳＩＳおよびＵＢＳからなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
哺乳動物を細菌誘発性感染症から保護するための方法であって、
緩衝液中の、上皮基底膜の失活した細胞外基質材料から得た、未消化であり、非架橋の微粉化粉末を含む再構成材料を提供すること（ここで、前記再構成材料は、前記細胞外基質の１つ以上の天然成分を含む）、および
気管内注入、鼻腔内注入、吸入、スプレー、局所適用、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される経路により、治療有効用量の前記物質を投与すること、
を含む、方法。
【請求項１９】
前記失活した細胞外基質（ＥＣＭ）が、非上皮組織、ＵＢＭ、ＳＩＳおよびＵＢＳからなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［0001］  本明細書に記載の発明は、ヒトおよび動物における細菌性感染症を治療するための組成物、作製方法、および使用方法に関する。
【０００２】
（関連出願）
［0002］  本出願は、２０１７年３月３１日に出願された米国仮特許出願第６２／４７９，８８８号の優先権および利益を主張し、その全体が、すべての意図および目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
［0003］  多くの場合、細菌性感染症により、患者の火傷、慢性創傷、ならびに組織および臓器の他の細菌性感染症、肺炎などの治癒過程が損なわれる。しかし、局所銀スルファジアジンなど、一般的に使用される予防的抗生物質は、火傷創感染率の上昇、治療の失敗、入院期間の延長に関連する。理想的には、細菌成長阻害活性を有するｉｎ  ｖｉｖｏ組成物を用いて、局所および全身の細菌感染を有する火傷創を治療することが有利となる。この場合、この組成物による治療は、好ましくは、追加の抗生物質を適用する必要性が低下し得るか、またはその必要がなくなり得る。上記の利点を達成するための組成物および方法を以下に説明する。
【０００４】
［0004］  黄色ブドウ球菌は、グラム陽性球菌であり、ヒトの鼻、気道、および皮膚に高い頻度で見られ、傷害または手術後の感染症の一般的な原因のうちの１つである。現在利用可能な抗生物質の広い範囲に及ぶ使用および細菌の進化により、抗生物質耐性グラム陽性黄色ブドウ球菌、グラム陰性緑膿菌および肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)株が近年出現している。
【０００５】
［0005］  メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）は、ペニシリン（メチシリン、ジクロキサシリン、オキサシリンなど）およびセファロスポリンなどのベータラクタム系抗生物質に対する耐性が発現した黄色ブドウ球菌の任意の株である。これらの抗生物質に抵抗できない株は、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌またはＭＳＳＡとして分類される。ＭＲＳＡがヒトの健康に及ぼす全体的な影響に関する最も重要な展開は、ＭＲＳＡが市中感染症となる脅威が増すことである。過去２０年にわたり、ＭＲＳＡは、院内感染型から始まって、主に市中（院外）感染型となっており、院内感染型では、ＭＲＳＡ症例の６５％が病院環境内で生じ、疾患患者に影響を及ぼすものであるが、市中感染型では、さもなければ、健康な人に感染し、多くの場合、致命的な結果となる。ヒトおよび動物において、こうした感染症を予防および治療するための改善された方法が必要である。
【０００６】
［0006］  緑膿菌（ＰＡ）は、グラム陰性棒状細菌の一種であり、動物およびヒトにおいてさまざまな感染症を引き起こす。多くの場合、院内感染を引き起こす、臨床的に重要な新興の日和見病原体として、ますます認知されている。緑膿菌感染症は、免疫不全の個体においては生命を脅かす疾患であり、そのコロニー形成は、嚢胞性線維症患者において非常に大きな問題となっている。いくつかの疫学的研究では、抗生物質耐性が、緑膿菌の臨床分離株において増大していることを示している。これは、抗菌剤への曝露後に新たな耐性が発現し得るためである。
【０００７】
［0007］  クレブシエラ属（ＫＰ）は、細菌性市中肺炎、および全院内感染のうちの８％を引き起こす一般的なグラム陰性病原体でもある。肺炎桿菌による肺感染症は、多くの場合、壊死性である。感染性市中肺炎桿菌での観察された死亡率は、アルコール患者において５０％からほぼ１００％の範囲である。クレブシエラ属などのカルバペネム耐性腸内細菌（ＣＲＥ）は、ＣＤＣレポートに基づき、緊急の脅威の細菌の１つであり、一方、ＭＲＳＡおよびＰＡは、両方とも深刻な脅威に分類されている。
【０００８】
［0008］  本明細書に記載されている発明は、これらの問題に対処する組成物および方法を含み、細菌汚染または感染に対して代替治療を認めている場合に適用可能である。
【０００９】
［0009］  足場材料、特に上皮組織の天然に存在する細胞外基質に由来するものは、患者に適用されたときに、統合応答を誘発する。細胞外基質（ＥＣＭ）は、成長、発達、および創傷修復に重要な構造的および機能的巨大分子の複合混合物により構成されている。ＥＣＭ由来の足場材料としては、これらに限定されないが、非上皮由来ＥＣＭ、小腸粘膜下組織（ＳＩＳ）、膀胱粘膜下組織（ＵＢＳ）、肝臓（Ｌ−ＥＣＭ）および膀胱基質（ＵＢＭ）が挙げられる。
【００１０】
［0010］  膀胱基質は、米国特許第６，５７６，２６５号に記載されている生物由来の足場細胞外基質材料であり（その全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる）、上皮基底膜、および、（これに限定されないが）膀胱などの上皮組織の他の層に見られる構造的特性および生物学的特性をいずれも提供する天然分子の複合混合物で構成されている。ＵＢＭは、さまざまな身体システムにおいて、建設的リモデリングと称される、部位に適した組織形成を促進するための効果的な足場として使用されている。ＵＢＭの足場は、身体によって完全に再吸収されるため、組織の足場となる。この足場の組成物および分解動態により、ＵＢＭに対する宿主の応答は、適応免疫応答を特徴とし、リモデリング部位においてＴヘルパー細胞およびＭ２マクロファージが優勢となる。ＵＢＭの分解により、建設的なリモデリングを促進できるペプチド断片が放出されることが示されている。
【発明の概要】
【００１１】
［0011］  驚くべきことに、本明細書に記載の研究では、ブタ膀胱、具体的には膀胱基質（ＵＢＭ）に由来する例示的なＥＣＭが、ＭＳＳＡの実験室株に対して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいて細菌活性を呈し、かつ複数の臨床ＭＲＳＡ、ＰＡ、およびＫＰ分離株に対して明らかな抗バイオフィルム活性を呈することが判明した。マウスモデルを使用して、ヒトおよび動物の細菌性感染症の予防、軽減、および／または消失における、ＵＢＭなどのＥＣＭの潜在的な有用性を研究した。マウスでのグラム陽性菌（ＧＰＢ）ＭＳＳＡおよびＭＲＳＡ、ならびにグラム陰性菌（ＰＡ）誘発性呼吸器感染症は、肺細菌負荷の大幅な増加をもたらし、好中球の動員の増加、ならびに炎症性サイトカインおよびケモカインの増加を伴う。しかし、気管内注入を介して、ＵＢＭ消化物の外因的な投与を行うことにより、細菌負荷の大幅な減少を介して、および細菌のサイトカイン／ケモカインの分泌を減衰させることを介して、接種マウスを重度の肺感染から保護した。さらに、長時間室温で維持された、水で再構成され、予め製剤化した消化ＵＢＭも、未消化の微粒子形態のＵＢＭも、同様に、ＧＰＢ誘発性およびＧＮＢ誘発性感染症に対するＵＢＭの保護機能を実現し、細菌性感染症を最小限に抑えて治療することができる、既製の容易に入手可能なリソースを提供することができる。
【００１２】
［0012］  まとめると、以下に記載する研究の結果は、これらに限定されないが、ヒトおよび動物における、肺炎、創傷、火傷、皮膚の持続性感染、粉砕骨折、膀胱炎、蜂巣炎、局所および全身の細菌性感染症、ならびに院内感染など、哺乳類におけるＧＰＢ誘発性およびＧＮＢ誘発性感染症を、消失させるためあるいは減衰させるための、既知の療法の代替または補助としてのＵＢＭの使用を裏付けるものである。
【００１３】
［0013］  一態様では、本明細書に記載の発明は、これらに限定されないが、患者における呼吸器感染症などの細菌性感染症を治療するための方法に関し、本方法は、これらに限定されないが、例えば気道など、好適な経路を介して、失活した天然の細胞外基質材料（好ましくは室温で処理されている）から得た、有効用量の非架橋の微粉化粉末を患者に投与することを含む。失活した天然の細胞外基質は、非上皮組織、ＵＢＭ、ＳＩＳ、およびＵＢＳからなる群から選択される。
【００１４】
［0014］  本発明の一実施形態では、微粉化粉末は、非酵素的に処理され、これらに限定されないが、４週間、２ヶ月、６ヶ月、１年、２年、５年などの長期間にわたり、室温で貯蔵され得、なおも動物およびヒトの細菌性感染症の治療に対するそれらの有効性を保持する。
【００１５】
［0015］  上記の微粉化粉末によって治療される細菌性感染症は、これらに限定されないが、黄色ブドウ球菌関連細菌からなる細菌などのグラム陽性細菌、またはこれらに限定されないが、緑膿菌、および肺炎桿菌、および関連細菌からなる群から選択される細菌などのグラム陰性細菌によって引き起こされ得る。
【００１６】
［0016］  呼吸器感染症は、肺などの気道に局在している可能性があり、投与経路としては、吸入、スプレーまたは人工呼吸器、鼻腔内注入、または気管内経路による経路が挙げられる。あるいは、投与経路は、緩衝液中の微粉化ＥＣＭ粒子により、患者の気道を洗浄することを含む。
【００１７】
［0017］  別の態様では、本発明は、上皮基底膜などの失活した細胞外基質材料から得［0018］た酵素的消化または非酵素的消化された微粉化粉末を含む、緩衝液中の再構成材料を含む組成物に関し、再構成材料は、細胞外基質の１つ以上の天然成分を含む。緩衝液は、これに限定されないが、緩衝生理食塩水などの生理的緩衝液から選択されてもよい。
【００１８】
［0019］  別の態様では、本発明は、治療有効用量の、１つ以上の細菌に対する殺菌活性を含む、上皮組織の微粉化され、失活した細胞外基質を患者に投与することにより、細菌に感染した患者において細菌性バイオフィルムの形成を減少させる方法に関する。１つ以上の細菌は、これらに限定されないが、ＭＳＳＡ−黄色ブドウ球菌、ＭＲＳＡ−黄色ブドウ球菌、肺炎桿菌および緑膿菌からなる群から選択され得る。この治療では、細菌性感染症を予防するか、軽減させるか、または消失させ得る。
【００１９】
［0020］  さらに別の態様では、本発明は、上皮組織または非上皮組織の失活した細胞外基質材料から得た緩衝液中に微粉化粉末を含む再構成材料を提供することにより、細菌誘発性感染症から哺乳動物を保護する方法に関する。再構成材料は、細胞外基質の１つ以上の天然成分を含み、本方法は、これらに限定されないが、気管内注入、鼻腔内吸入、スプレー、経口吸入、局所適用、洗浄、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される経路により、治療有効用量の材料を投与することを含む。
【００２０】
［0021］  図面は一般に、本発明の原理を例示することに重点を置いている。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】［0022］図１Ａ〜図１Ｈは、ＰＢＳ抽出ＵＢＭ上清と比較した、ペプシン消化ＵＢＭのＭＳＳＡに対する抗菌活性の増大をグラフで示す図である。［0023］図１Ａは、ＰＢＳ抽出ＵＢＭ上清によるＭＳＳＡの成長の阻害をグラフで示す図である。［0024］図１Ｂは、ＰＢＳ抽出ＵＢＭ上清の存在下でのＭＲＳＡの成長をグラフで示す図である。［0025］図１Ｃは、ＰＢＳ抽出ＵＢＭ上清の存在下での緑膿菌（ＰＡＯ１）の成長をグラフで示す図である。［0026］図１Ｄは、ＰＢＳ抽出ＵＢＭ上清の存在下での肺炎桿菌の成長をグラフで示す図である。［0027］図１Ｅは、酵素消化させたＵＢＭによるＭＳＳＡの成長の阻害をグラフで示す図である。［0028］図１Ｆは、酵素消化させたＵＢＭの存在下でのＭＲＳＡの成長をグラフで示す図である。［0029］図１Ｇは、酵素消化させたＵＢＭの存在下での緑膿菌（ＰＡＯ１）の成長をグラフで示す図である。［0030］図１Ｈは、酵素消化させたＵＢＭの存在下での肺炎桿菌の成長をグラフで示す図である。光学密度の測定値は、培地での細菌の成長を表す。結果は、３回の独立した実験から得た。
【図２】［0031］図２Ａ〜図２Ｄは、消化させたＵＢＭ（１０ｍｇ／ｋｇ）を野生型ＦＶＢ／ＮＪマウス肺の気管内（ｉ．ｔ．）に注入することにより、肺毒性が引き起こされることはないことをグラフで示す図である。［0032］図２Ａは、ＰＢＳおよびＵＢＭで処理されたマウス肺における総炎症細胞および細胞百分率数（differential cell count）を示す図である。［0033］図２Ｂは、ＰＢＳおよびＵＢＭで処理されたマウス肺のＢＡＬ中の総タンパク質を示す図である。［0034］図２Ｃは、ＰＢＳおよびＵＢＭで処理されたマウス肺における炎症関連遺伝子の発現を示す図である。［0035］図２Ｄは、ＰＢＳおよびＵＢＭで処理されたマウス肺における上皮細胞関連遺伝子の発現を示す図である。図２Ａ〜図２Ｄに示す結果は、肺毒性が、ＵＢＭにより引き起こされることがないことを示唆している。結果は、２回の独立した実験の平均値±ＳＥＭである。ｎ＝５匹のマウス／群。
【図３】［0036］図３Ａ〜図３Ｄは、ＵＢＭ処理マウスがＭＳＳＡ誘発性呼吸器感染症に対して保護されていることをグラフで示す図である。［0037］図３Ａは、ＵＢＭ処理マウスと比較した、ＭＳＳＡ感染ＰＢＳ処理マウスにおける肺、ＣＦＵ、ＢＡＬ、および肺の総負荷（ＢＡＬおよび肺ホモジネート）をグラフで示す図である。［0038］図３Ｂは、ＵＢＭ処理マウスと比較した、ＭＳＳＡ感染ＰＢＳ処理マウスにおける細胞百分率数をグラフで示す図である。［0039］図３Ｃは、ＵＢＭ処理マウスと比較した、ＭＳＳＡ感染ＰＢＳ処理マウスにおける炎症関連遺伝子の発現をグラフで示す図である。［0040］図３Ｄは、ＵＢＭ処理マウスと比較した、ＭＳＳＡ感染ＰＢＳ処理マウスにおける上皮細胞関連遺伝子の発現をグラフで示す図である。結果は、３回の独立した実験の平均値±ＳＥＭである。ｎ＝４〜６匹マウス／処理群。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、ＵＢＭ処理とＰＢＳ処理との比較。
【図４】［0041］図４〜図４Ｄは、ＵＢＭ処理により、マウスがＭＲＳＡ誘発性呼吸器感染症から保護されることをグラフで示す図である。［0042］図４Ａは、ＵＢＭ処理により、マウス１匹あたり２ｘ１０６ＣＦＵ  ＭＲＳＡ（ＵＳＡ３００）を鼻腔内（ｉ．ｎ．）接種させた、年齢を適合させた野生型ＦＶＢ／ＮＪマウスのＢＡＬ、肺、および総肺負荷（ＢＡＬおよび肺ホモジネート）において、ＣＦＵが有意に減少したことをグラフで示す図である。ＭＲＳＡ感染ＰＢＳ処理マウスは、ＵＢＭ処理マウスと比較した。［0043］図４Ｂは、ＵＢＭ処理マウスと比較した、ＭＲＳＡ感染ＰＢＳ処理マウスにおける細胞百分率数をグラフで示す図である。［0044］図４Ｃは、ＵＢＭ処理マウスと比較した、ＭＲＳＡ感染ＰＢＳ処理マウスにおける炎症関連遺伝子の発現をグラフで示す図である。［0045］図４Ｄは、ＵＢＭ処理マウスと比較した、ＭＲＳＡ感染ＰＢＳ処理マウスにおける上皮細胞関連遺伝子の発現をグラフで示す図である。結果は、３回の独立した実験の平均値±ＳＥＭである。ｎ＝４〜６匹マウス／処理群。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、ＵＢＭ処理とＰＢＳ処理との比較。
【図５】［0046］図５Ａ〜図５Ｄは、ＵＢＭが、ＧＰＢ（ＭＳＳＡおよびＭＲＳＡ）およびＧＮＢ（ＰＡおよびＫＰ）細菌のバイオフィルム形成を著しく阻害することをグラフで示す図である。［0047］図５Ａは、異なる濃度のＵＢＭで処理した後のＭＳＳＡのバイオフィルム形成を示す図である。［0048］図５Ｂは、異なる濃度のＵＢＭで処理した後のＭＲＳＡのバイオフィルム形成を示す図である。［0049］図５Ｃは、異なる濃度のＵＢＭで処理した後のＰＡのバイオフィルム形成を示す図である。［0050］図５Ｄは、異なる濃度のＵＢＭで処理した後のＫＰのバイオフィルム形成を示す図である。結果は、３回の独立した実験の平均値±ＳＥＭである。＊＊＊ｐ＜０．００５、および＊＊＊＊ｐ＜０．００１。処理群と対照群の比較。
【図６】［0051］図６Ａ〜図６Ｄは、ＵＢＭ処理が緑膿菌誘発性呼吸器感染症からマウスを保護することをグラフで示す図である。［0052］図６Ａは、ＵＢＭ処理マウス対ＰＢＳ処理マウスにおける緑膿菌感染から１５時間後のＢＡＬ、肺、および肺の総負荷（ＢＡＬおよび肺ホモジネート）のＣＦＵをグラフで示す図である。［0053］図６Ｂは、ＵＢＭ処理マウス対ＰＢＳ処理マウスの緑膿菌感染後１５時間での細胞百分率数をグラフで示す図である。［0054］図６Ｃは、ＵＢＭ処理マウス対ＰＢＳ処理マウスにおける緑膿菌感染後１５時間での炎症関連遺伝子の発現をグラフで示す図である。［0055］図６Ｄは、ＵＢＭ処理マウス対ＰＢＳ処理マウスにおける緑膿菌感染後１５時間での上皮細胞関連遺伝子の発現をグラフで示す図である。図６Ａ〜図６Ｄは、感染後１５時間でＵＢＭ処理マウスとＰＢＳ処理マウスとの間に統計的差異のないことを示す図である。結果は、３回の独立した実験の平均値±ＳＥＭである。ｎ＝５匹マウス／処理群。＊ｐ＜０．００５、および＊＊ｐ＜０．０１、ＵＢＭ処理とＰＢＳ処理との比較。
【図７】［0056］図７Ａ〜図７Ｂは、予め製剤化したＵＢＭ（ＰＦ−ＵＢＭ）が消化させたばかりの(freshly digested)ＵＢＭ（ＦＤ−ＵＢＭ）と類似の生物活性を示すことをグラフで示す図である。［0057］図７Ａは、ＭＳＳＡ（ＡＴＣＣ＃４９７７５）およびＭＲＳＡ（ＵＳＡ３００）に対するＵＢＭのｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗バイオフィルム活性を示す図である。［0058］図７Ｂは、ＭＲＳＡ感染後１５時間でのマウスＢＡＬ、肺、肺の総負荷（ＢＡＬおよび肺ホモジネート）、および脾臓における細菌ＣＦＵによるｉｎ  ｖｉｖｏ抗菌活性を示す図である。図７Ａ〜図７Ｂに示す結果は、ＭＲＳＡ感染に対する保護において、予め製剤化したＵＢＭ（ＰＦ−ＵＢＭ）と、消化させたばかりのＵＢＭ（ＦＤ−ＵＢＭ）との間に統計的な差のないことを示している。ＰＦ−ＵＢＭおよびＦＤ−ＵＢＭの両方が、マウスでのＭＲＳＡ誘発性細菌性感染症に対する有意な保護を示した。結果は、３回の独立した実験の平均値±ＳＥＭである。ｎ＝５匹のマウス／群。一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）後、Ｐ値が有意である（Ｐ＜０．０５）場合に、ダネットの多重比較検定を使用して事後比較を行った。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５、および＊＊＊＊ｐ＜０．００１（群間比較用）。
【図８−１】［0059］図８Ａから図８Ｃは、外因的に投与された、予め製剤化したＵＢＭが、呼吸器ＭＲＳＡ感染症によって誘発された炎症応答を有意に減衰させることをグラフで示す図である。［0060］図８Ａは、ＦＤ−ＵＢＭ、ＰＤ−ＵＢＭ、およびＰＢＳ処理マウスの肺を比較し、ＭＲＳＡ感染マウスにおけるサイトカインおよびケモカインの遺伝子発現を示す図である。［0061］図８Ｂは、ＦＤ−ＵＢＭ、ＰＤ−ＵＢＭ、およびＰＢＳ処理マウスの肺を比較し、ＭＲＳＡ感染マウスのマウスＢＡＬ中におけるサイトカインおよびケモカインのタンパク質分泌を示す図である。
【図８−２】［0062］図８Ｃは、ＭＲＳＡ感染ＦＤ−ＵＢＭ、ＰＤ−ＵＢＭおよびＰＢＳ処理マウス肺からの肺切片の顕微鏡写真での好中球浸潤および肺損傷を示す図である。結果は、３回の独立した実験の平均値±ＳＥＭである。ｎ＝５匹のマウス／群。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５、および＊＊＊＊ｐ＜０．００１（群間比較用）。
【図９】［0063］図９Ａ〜図９Ｂは、予め製剤化した未消化ＵＢＭ（Ｕ−ＵＢＭ）により、宿主が重篤な急性呼吸器ＭＲＳＡ感染症から保護されることをグラフで示す図である。［0064］図９Ａは、ＰＢＳ、Ｕ−ＵＢＭおよびＰＦ−ＵＢＭによる処理を比較したＭＲＳＡ感染マウスのマウスＢＡＬ、肺、および肺の総負荷（ＢＡＬプラス肺ホモジネート）の細菌ＣＦＵを示す図である。［0065］図９Ｂは、ＰＢＳ、Ｕ−ＵＢＭおよびＰＦ−ＵＢＭによる処理を比較した、ＭＲＳＡ感染マウスにおけるＣｘｃｌ１、Ｃｘｃｌ２、Ｃｘｃｌ３、ＩＬ−１７、Ｔｎｆ−αおよびＮｆ−κｂなどの炎症性サイトカインおよびケモカインの発現を示す図である。結果は、３回の独立した実験の平均値±ＳＥＭである。ｎ＝５匹のマウス／群。一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して、薬物処理感染マウスとＰＢＳ処理感染動物を比較し、Ｐ値が有意（Ｐ＜０．０５）である場合に、ダネットの多重比較検定を使用して、事後比較を行った。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５、および＊＊＊＊ｐ＜０．００１（群間比較用）。例示的発明
【００２２】
［0066］  本明細書に記載の発明は、感染のマウス肺炎モデルによって例示される、ヒトおよび動物における細菌感染を治療するためのＵＢＭなどのＥＣＭの使用に関する。下記のプロトコルを使用して、ＭＳＳＡ、ＭＲＳＡ、肺炎桿菌および緑膿菌誘発性感染症から宿主を保護するための、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでのＵＢＭの抗菌活性を調査した。以下に詳細に説明する結果は、ＵＢＭが、ＭＳＳＡおよびＭＲＳＡの実験用細菌株に対して殺菌活性を呈し、かつ複数の臨床ＭＲＳＡ分離株および緑膿菌に対してかなりの抗バイオフィルム活性を呈することを示したものである。
【００２３】
［0067］  ヒトにおける細菌性感染症のマウスモデル、マウスにおけるＭＳＳＡ、ＭＲＳＡ、緑膿菌、および肺炎桿菌誘発性呼吸器感染症のマウスモデルを使用すると、肺細菌負荷の大幅な増加をもたらし、好中球の動員の増加、ならびに炎症誘発性サイトカインおよびケモカインの増加を伴う。気管内（ｉ．ｔ．）注入を介して、ＵＢＭ消化物の外因的な投与を行うことにより、細菌負荷の大幅な減少を介して、および細菌のサイトカイン／ケモカインの分泌を減衰させることを介して、接種マウスを重度の肺炎から保護した。さらに、室温に維持された、予め消化され、凍結乾燥されたＵＢＭの水再構成物も、未消化のＵＢＭ微粒子形態も、同様に、ＧＰＢ誘発性およびＧＮＢ誘発性肺炎に対するＵＢＭの保護機能を達成し、ヒトおよび動物における細菌性感染症を治療するための、既製の容易に入手可能なリソースを提供することができる。呼吸器感染症のマウスモデルを使用したこれらの研究結果は、ＵＢＭが、例えば、呼吸器ＭＳＳＡ、ＭＲＳＡ、および緑膿菌、および肺炎桿菌の細菌性感染症など、ヒトおよび動物における細菌性感染症に対して保護するための従来の治療法の実行可能な代替法または補充法となることを示している。
【実施例】
【００２４】
例示的材料および方法
ＵＢＭ消化物の調製
【００２５】
［0068］  試験用の物品は、以下に記載のｉｎ  ｖｉｖｏ試験のために、未消化ＵＢＭ（Ｕ−ＵＢＭ）とラベル付けされた非滅菌形態の微粉化ＵＢＭ粉末（ＡＣｅｌｌ、Ｉｎｃ．、Ｃｏｌｕｍｂｉａ、ＭＤ）から調製した。
【００２６】
［0069］  簡潔には、独自のＡＣｅｌｌ（登録商標）ＵＢＭ粉末（ＭｉｃｒｏＭａｔｒｉｘ（登録商標））は、市場体重のブタ（ｍａｒｋｅｔ  ｗｅｉｇｈｔ  ｐｉｇ）から膀胱を分離し、機械により、漿膜、外筋層、粘膜下組織および粘膜筋板を除去することによって製造される。粘膜層の管腔尿路上皮細胞は、脱イオン水で洗浄することにより基底膜から解離した。残りの組織は、上皮基底膜、およびＵＢＭと称される粘膜の下層にある粘膜固有層で構成されていた。次に、残りの組織を、１５０ｒｐｍで２時間、４％エタノールを含む０．１％過酢酸中で撹拌することにより脱細胞化する。次いで、組織を１ＸＰＢＳおよび滅菌水で徹底的にすすいだ。ＵＢＭの調製には、架橋剤、界面活性剤、ペプチダーゼ、プロテアーゼはいずれも使用していない。続いて、組織を凍結乾燥し、次いで、＃６０メッシュスクリーンを備えたＷｉｌｅｙ  Ｍｉｌｌ（Ｔｈｏｍａｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＮＪ）を使用して、粉末粒子形態に粉砕した。次いで、ＵＢＭ粉末を、Ｔａｐｐｉｎｇ  Ｓｉｅｖｅ  Ｓｈａｋｅｒ（Ｇｉｌｓｏｎ、ＯＨ）を使用して、１５０ミクロンのスクリーンを通して４時間ふるい分けた。あるいは、凍結乾燥したＵＢＭをＣｒｙｏｍｉｌｌサンプルチャンバーに適合するように小片に切断し、Ｃｒｙｏｍｉｌｌ機器（Ｒｅｔｓｃｈ、Ｈａａｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、冷却、振とう、および休止のステップを交互に２時間半処理した。
【００２７】
代替的実施形態では、以下のように既報のとおり、微粉化ＵＢＭ粉末も酵素消化させて、ストックＵＢＭ消化溶液を作製した：Ｄ．Ｏ．Ｆｒｅｙｔｅｓ、Ｊ．Ｍａｒｔｉｎ、Ｓ．Ｓ．Ｖｅｌａｎｋａｒ、Ａ．Ｓ．Ｌｅｅ、Ｓ．Ｆ．Ｂａｄｙｌａｋ、Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｈｅｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｇｅｌ  ｆｏｒｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｕｒｉｎａｒｙ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｍａｔｒｉｘ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２９（１１）（２００８年）１６３０−７（この全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。簡単に説明すると、０．０１ＨＣｌと１２０ｍｇのブタペプシン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の溶液を溶解するまで混合した。Ｔ．Ｗ．Ｇｉｌｂｅｒｔ、Ｄ．Ｂ．Ｓｔｏｌｚ、Ｆ．Ｂｉａｎｃａｎｉｅｌｌｏ、Ａ．Ｓｉｍｍｏｎｓ−Ｂｙｒｄ、Ｓ．Ｆ．Ｂａｄｙｌａｋ、Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＥＣＭ  ｐｏｗｄｅｒ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ２６（１２）（２００５年）１４３１−５（この全体が参照によって本明細書に組み込まれる）に従って作製した１．２ｇの非滅菌ＵＢＭ（ＭｉｃｒｏＭａｔｒｉｘ（登録商標））微粒子をペプシン溶液に加えて、所望のストック溶液濃度を達成し、室温で約４８時間完全に溶解するまで撹拌した。次に、氷浴を使用して、消化させたＵＢＭ溶液を５℃まで冷却した。撹拌しながら、１２ｍｌの１０Ｘリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、５ｍＬの０．０２Ｍ  ＮａＯＨ、および３ｍｌの脱イオン水を加えて、ＵＢＭ消化物を中和させた。次に、中和を確実に達成させるためにｐＨの試験を行った。予め製剤化したＵＢＭ（ＰＦ−ＵＢＭ）の場合、得られた中和消化物を遠心分離管に分注し、一晩凍結させた。次に、中和させたＰＦ−ＵＢＭ消化物の管を取り出して凍結乾燥し、サンプルを包装して、電子ビーム照射を用いて滅菌した。サンプルは、実験に必要になるまで室温で貯蔵した。消化させたばかりのＵＢＭ（ＦＤ−ＵＢＭ）およびＰＦ−ＵＢＭ群（予め製剤化、凍結乾燥、および滅菌させた消化物）の両方について、以下に記載する個々の実験に対して所望の最終濃度で試験品を最終的に調製した。
マウスおよび畜産
【００２８】
［0070］  野生型ＦＶＢ／ＮＪマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から購入し、１２時間の明暗サイクルで特定の病原体非含有状態で維持した。すべての手順は、米国実験動物管理認定協会（ＡＡＡＬＡＣ）認定動物施設に収容された換気マイクロアイソレーターケージで維持されている、８〜９週齢のマウスを用いて実施した。動物に関するプロトコルおよび研究は、国立衛生研究所のガイドラインに従って実施し、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈの施設内動物管理使用委員会によって承認された。
細菌
【００２９】
［0071］  グラム陽性（ＧＰＢ）黄色ブドウ球菌株（ＭＳＳＡ  ＡＴＣＣ＃４９７７５およびＭＲＳＡ  ＵＳＡ３００）、およびグラム陰性ＧＮＢ緑膿菌（ＰＡ０１、ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−４７）および肺炎桿菌（ＫＰ、Ｂ３）をすべての実験に使用した。これらのグラム陽性菌株およびグラム陰性菌株は、ヒトの健康に影響を及ぼすことが知られている。単一のコロニーから得た細菌は、１５％グリセロール／トリプシンソイブイヨン（ＴＳＢ）のアリコートで−８０℃で貯蔵した。各実験について、細菌のアリコートを３７℃で１６時間、オートクレーブしたＴＳＢ中で振とうしながら成長させた。次に、一晩成長させた細菌のアリコートを５ｍｌの新鮮なＴＳＢに１ｍｌで希釈し、振とうしながら３７℃でさらに２時間インキュベートした。細菌を２回洗浄し、１０ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁した。
肺毒性
【００３０】
［0072］  ＵＢＭのｉｎ  ｖｉｖｏ肺毒性は、マウス肺への気管内（ｉ．ｔ．）投与により調べた。ＦＶＢ／ＮＪマウスを、１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲の、異なる濃度のＵＢＭ１ｍｌあたり、５０μｌのＰＢＳでｉ．ｔ．洗浄した。肺組織は、Ｙ．Ｐ．Ｄｉ、Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｌｕｎｇ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｂｒｏｎｃｈｏａｌｖｅｏｌａｒ  ｌａｖａｇｅ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１０５（２０１４年）３３−４２（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているとおりに洗浄し、ＵＢＭ投与後２４時間で収穫し、リアルタイムＰＣＲ分析を用いて、総タンパク質、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、総白血球、および気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）中の細胞百分率数、および遺伝子発現により毒性を分析した。
マウスの細菌へのｉｎ  ｖｉｖｏ曝露
【００３１】
［0073］  イソフルランの吸入によりマウスを麻酔し、５０μｌＰＢＳでマウス１匹あたり約２ｘ１０６ＣＦＵ（通常の感染）または約２ｘ１０７ＣＦＵ（重度の感染）の鼻腔内（ｉ．ｎ．）注入を介して、ＡＴＣＣ＃４９７７４、ＵＳＡ３００、またはＰＡ０１で処理した。対照マウスには、ＰＢＳ５０μｌを鼻腔内接種した。菌接種の１時間後に、ＵＢＭ５０μｌを１０ｍｇ／ｋｇでマウスに気管内注入し、対照マウスにＰＢＳ５０μｌを注入した。次に、ＵＢＭ投与の１４時間後にマウスを屠殺して、細菌感染およびその後の処理に対する急性宿主応答を調査した。
ＣＦＵアッセイ
【００３２】
［0074］  ＣＦＵの数は、ＴＳＢ寒天プレートでの連続希釈および定量培養によって求めた。左肺葉を１ｍｌの生理食塩水で均質化し、氷上に置いた。肺組織ホモジネートまたは気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）の１００μＬの希釈液を９００μＬの生理食塩水と混合した。生理食塩水中の４つの連続１０倍希釈液を調製し、ＴＳＢ寒天プレートに播種し、３７℃で１８時間インキュベートし、各希釈液を三連で播種した。次に、コロニーを数え、生存細菌をｌｏｇ１０単位で表した。
ＢＡＬＦおよび細胞の百分率数
【００３３】
［0075］  細菌感染処理１５時間後（ＵＢＭ投与１４時間後）に、マウス（５匹マウス／群）を２．５％トリブロモエタノール（アベルチン）で麻酔した。気管にカニューレを挿入し、１ｍｌの生理食塩水を使用して、肺を２回洗浄し、ＢＡＬＦサンプルを貯留した。１６μｌのアリコートを４μｌのアクリジンオレンジ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｓａｎｔａ  Ａｎａ、ＣＡ）で染色し、Ｖｉｓｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒセルカウンター（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ、Ｌａｗｒｅｎｃｅ、ＭＡ）で細胞数を数えた。追加のアリコートをガラス顕微鏡スライド（Ｓｈａｎｏｎ  Ｃｙｔｏｓｐｉｎ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）に置き、Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋで染色した。細胞差は、顕微鏡により確定した。すべてのスライドの合計４００個の細胞を、炎症細胞の百分率数として少なくとも２回カウントした。
リアルタイムＰＣＲ分析
【００３４】
［0076］  Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して、ＷＴおよびＳｐｌｕｎｃ１  ＫＯマウスの右肺組織の上部２つの葉からｔｏｔａｌ  ｍＲＮＡを単離した。ＡＢＩ７９００ＨＴ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）およびＭｕｃ５ａｃ、Ｍｕｃ５ｂ、ＣＣＳＰ、Ｆｏｘｊ１、Ｃｘｃｌ１、Ｃｘｃｌ２、Ｃｘｃｌ５、ＮＦ−κＢ、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１α、Ｃｃｌ２０のプライマーを使用して、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を実施した。検証試験を実施して、標的遺伝子の同等のＰＣＲ効率を確認した。高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、試験およびキャリブレーターの肺ＲＮＡを逆転写させ、ＰＣＲを次のように増幅した。５０℃で２分間、９５℃で１０分間、４０サイクル。９５℃で、１５秒間；６０℃で１分間。３つの複製を使用して、目的の転写物および正規化用の転写物（β−グルクロニダーゼ［ＧＵＳ−Ｂ］；Ａｓｓａｙｓ  ｏｎ  Ｄｅｍａｎｄ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の平均サイクルしきい値を計算した。相対的なｍＲＮＡ発生量は、ΔΔサイクルしきい値（Ｃｔ）メソッドを使用して計算した。
サイトカインアッセイ
【００３５】
［0077］  ＢＡＬのサイトカインレベルは、マウスサイトカインマルチプレックスパネルＭｉｌｌｉｐｌｅｘ  ａｓｓａｙ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いて、定量化した。ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２（ｐ７０）、ＩＬ−１７、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦ、ＫＣ、ＩＰ−１０、ＶＥＧＦおよびＭＩＰ−１αの発現は、製造業者の指示に基づき、およびＹ．Ｚｈａｎｇ、Ｒ．Ｂｉｒｒｕ、Ｙ．Ｐ．Ｄｉ、Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓａｍｐｌｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ−ｂａｓｅｄ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ  Ｌｕｍｉｎｅｘ  ｓｙｓｔｅｍ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １１０５（２０１４年）４３−５７に既報のとおり、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイシステムを用いて分析した。標準の組換えタンパク質溶液を使用して、分析した各タンパク質の標準曲線を作成した。絶対サイトカイン濃度は、各サイトカインの標準曲線から計算した。
肺組織病理学
【００３６】
［0078］  肺組織を感染１５時間後に採取し、胸腔を開いた状態で４％パラホルムアルデヒド（１０ｃｍ  Ｈ２Ｏ）により、１０分間ｉｎ  ｓｉｔｕで膨張を固定した。右葉をパラフィンに包埋し、５μｍの切片を調製した。切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、細菌感染により誘発された病理学的重症度を調べるために組織学的評価を実施した。染色された肺切片は、組織病理学的炎症スコアリングシステムを使用して、光学顕微鏡下において二重盲検法で評価した。
バイオフィルムアッセイ
【００３７】
［0079］  Ｏ’ＴｏｏｌｅおよびＫｏｌｔｅｒによって開発されたマイクロタイタープレートアッセイのわずかに変更された型を使用した。これは、Ｙ．Ｌｉｕ、Ｍ．Ｅ．Ｄｉ、Ｈ．Ｗ．Ｃｈｕ、Ｘ．Ｌｉｕ、Ｌ．Ｗａｎｇ、Ｓ．Ｗｅｎｚｅｌ、Ｙ．Ｐ．Ｄｉ、Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｐｌｕｎｃ１  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｍｉｃｅ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９１（８）（２０１３年）４２５９−６８およびＧ．Ａ．Ｏ’Ｔｏｏｌｅ、Ｒ．Ｋｏｌｔｅｒ、Ｆｌａｇｅｌｌａｒ  ａｎｄ  ｔｗｉｔｃｈｉｎｇ  ｍｏｔｉｌｉｔｙ  ａｒｅ  ｎｅｃｅｓｓａｒｙ  ｆｏｒ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ｂｉｏｆｉｌｍ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３０（２）（１９９８年）２９５−３０４（両方ともその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているものである。
【００３８】
［0080］  簡潔に言えば、細菌の一晩の浮遊培養は、ＵＢＭまたは抗生物質対照の有無にかかわらず、ＤＭＥＭ１００μＬの入った９６ウェル培養処理ポリスチレンマイクロタイタープレート（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）に接種した。成長培地のみで満たされたウェルを陰性対照として含めた。３７℃で３時間インキュベートした後、結合細胞を０．５％（ｗ／ｖ）のクリスタルバイオレット水溶液で１５分間染色することにより、表面付着バイオフィルムの形成を測定した。蒸留水ですすいだ後、９５％エタノールを使用して、結合した色素を染色細胞から放出させ、５９０ｎｍで光学密度を求めた。
データ分析
【００３９】
［0081］  データは、平均±ＳＥＭとして表す。マウスの群間統計比較は、ＡＮＯＶＡ、その後、ダネットの多重比較検定（一元配置ＡＮＯＶＡ）を使用して行った。ｐ値＜０．０５は、統計的に有意であるとみなした。
結果
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究
ＵＢＭはｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗菌活性を示す。
【００４０】
［0082］  ＵＢＭに、細菌に対して成長阻害を示し得る任意の成分が含まれているかを判断するために、微粉化ＵＢＭ粉末を４ｍｇ／ｍｌの濃度の生理食塩水（ＡＣｅｌｌ，Ｉｎｃ．）に懸濁し、その抗菌活性の試験を行った。これらは呼吸器感染症に高い頻度で関連する最も一般的な細菌株であるため、ＧＰＢ（ＭＭＳＡおよびＭＲＳＡ）ならびにＧＮＢ（緑膿菌および肺炎桿菌）などの複数の一般的な細菌性呼吸器感染症のパネルの試験を行った。
【００４１】
［0083］  ＵＢＭの２つの異なる調製を実施した。最初は、単純にＵＢＭ（ミクロ基質（登録商標）、ＡＣｅｌｌ、Ｉｎｃ．）の粉末形態をＰＢＳ中で懸濁し、未溶解の材料を遠心分離し、ＵＢＭの溶解部分（ＵＢＭ上清）を回収した。これは、抗菌ペプチド（ＡＭＰ）などの抗菌剤が上清内においても依然として細菌の増殖阻害に活性であるという認識による。
【００４２】
［0084］  ２番目の方法は、上記のようにＵＢＭをペプシンで酵素消化させ、基質材料（消化ＵＢＭ）からペプチドなどの潜在的な抗菌分子をすべて抽出する方法であった。対数期に成長したすべての試験細菌を使用して、細菌の直接死滅における、非消化および消化ＵＢＭ材料の抗菌活性を判定した。
【００４３】
［0085］  図１Ａ〜図１Ｃを参照すると、ＵＢＭ上清には、ＧＰＢ（ＭＳＳＡおよびＭＲＳＡ）（図１Ａ、１Ｂ）またはＧＮＢ（ＰＡおよびＫＰ）（図１Ｃ、１Ｄ）に対する顕著な抗菌活性はいずれも現れなかった。消化させたＵＢＭは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、ＭＳＳＡに対して殺菌活性を有するが（図１Ｅ）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、他のＧＰＢ（ＭＲＳＡ；図１Ｆ）またはＧＮＢ（ＰＡおよびＫＰ；図１Ｇ、図１Ｈ）に対する殺菌活性は有さない。消化させたＵＢＭは、ＵＢＭの可溶性成分と比較して、向上した抗菌活性を示したため、ＵＢＭベースの殺菌活性を助長するＰＢＳ可溶性成分のみでなく、プロテアーゼ消化後にいくつかの抗菌分子が基質から放出されると考えられる（図１）。したがって、以下に記載するこの研究での２つのｉｎ  ｖｉｖｏ実験群では、消化形態のＵＢＭを使用した。別の実験群では、肺への注入時に材料が分解されるという予想に基づいて、ｉｎ  ｖｉｖｏの未消化ＵＢＭ微粉化粉末をマウス肺炎モデルの洗浄液として使用した。
Ｉｎ  ｖｉｖｏ研究−ＵＢＭに対する組織の耐性
ＵＢＭは、肺において、十分な耐性があり、肺毒性を示さない。
【００４４】
［0086］  以下の研究は、ＵＢＭが肺に対して毒性がなく、肺損傷を引き起こさないことを示す。
【００４５】
［0087］  ８〜９週齢のＦＶＢ／ＮＪマウスを気管内（ｉ．ｔ．）に異なる濃度（０．１、０．５、１、および２ｍｇ／ｍｌ）、結果として投与用量０．２５、１．２５、２．５、または５ｍｇ／ｋｇ）の消化したＦＤ−ＵＢＭ５０μｌをマウスの肺に注入した。ＵＢＭ注入マウス群と、ビヒクル対照のみ注入されたマウス対照群との間で、（ＢＡＬ中の総細胞数およびＬＤＨ、肺上皮細胞の遺伝子発現およびＮＦ−κｂなど）毒性の複数の指標を比較した場合、有意な変化は確認されなかった。マウス肺において、結果的に１０ｍｇ／ｋｇの投与量（２００μｇ／マウス肺）で高濃度の消化ＵＢＭ（４ｍｇ／ｍｌ）も評価した。
【００４６】
［0088］  図２を参照すると、高い濃度のＵＢＭ１０ｍｇ／ｋｇであっても、ほぼすべての測定において、ビヒクル群とＦＤ−ＵＢＭ処理群との間でマウスにおいてほぼ同じ状態であった。図２Ａに示すように、好中球では、ＦＤ−ＵＢＭ処理群において最小の増加が観察された。これはマウス肺において総白血球の約３〜４％を占めるが、統計上有意ではなかった。同様に、図２Ｂに示す肺内の総タンパク質（肺損傷の指標として）は、ＰＢＳ対照群とＦＤ−ＵＢＭ処理マウス群との間に差を示さなかった。図２Ｃを参照すると、マウス肺へのＵＢＭの投与後（合計２００μｇ／マウスに、１０ｍｇ／ｋｇ）、Ｃｃｓｐ（クラブ細胞）、Ｆｏｘｊ１（繊毛細胞）、Ｍｕｃ５ａｃ（ゴブレット細胞）、およびＭｕｃ５ｂ（粘液細胞）などの上皮細胞関連遺伝子の発現は、いかなる顕著な変化も示さず、また図２Ｄに示すとおり、ＴＬＲ−２、ＴＬＲ−４、Ｔｎｆ−α、およびＮｆ−κｂにおいて炎症関連遺伝子の発現も示さなかった。これらのデータは、最高濃度（１０ｍｇ／ｋｇ）でマウス肺にＵＢＭを投与しても、肺上皮細胞の統合性（ｃｅｌｌ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）を妨げること、または炎症反応を誘発することがないことを示唆している。
Ｉｎ  ｖｉｖｏＵＢＭ抗菌研究
ＵＢＭは、呼吸器感染症のマウスモデルにおいて、ＭＳＳＡに対するｉｎ  ｖｉｖｏ抗菌活性を表す。
【００４７】
［0089］  ＵＢＭの外因的な投与により、黄色ブドウ球菌誘発性感染症から宿主を保護し得るかを調べるために、マウス肺炎モデルを使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏで、ＵＢＭベースの抗菌活性を測定した。年齢を適合させたＦＶＢ／Ｎマウスに、約２ｘ１０６ＣＦＵ／肺の用量で、ＭＳＳＡ（ＡＴＣＣ＃４９７７５）を気管内（ｉ．ｔ．）に注入した。細菌感染の１時間後に、ＦＤ−ＵＢＭ  ５０μｌを１０ｍｇ／ｋｇで送達（ｉ．ｔ．）して、細菌性呼吸器感染症に対するＵＢＭの治療効果に関する試験を行った。図３Ａに示すように、細菌感染後１５時間で、ＦＤ−ＵＢＭで処理したマウスは、ＢＡＬおよび肺の両方において細菌数の大幅な減少を示した。したがって、細菌感染後１時間に、ＵＢＭで処理したマウス群における肺の総細菌量は、初期の肺細菌量と比較して６倍以上有意に減少した。予期せぬことに、図３Ｂに示すように、ＰＢＳ処理群およびＦＤ−ＵＢＭ処理群のマウスは、両方とも、ＢＡＬ中の総炎症細胞数およびマクロファージおよび好中球の細胞百分率数において統計的差異を示さなかったため、細菌負荷の差が、白血球の総数に影響を及ぼすことはなかった。図３Ｃに例示する抗炎症性サイトカインＩＬ−１０、および炎症性誘発性サイトカインＩＬ−６、Ｎｆ−κｂ、およびＴｎｆ−αの発現にも有意差はなく、また、図３Ｄに示す気道上皮細胞関連遺伝子に顕著な変化は観察されなかった。
ＵＢＭは、ＭＲＳＡ誘発性呼吸器感染症からマウスを効果的に保護する
【００４８】
［0090］  マウス肺炎モデルにおいてＭＲＳＡ（ＵＳＡ３００）を使用して、ＭＳＳＡを使用した、上記と同様の、一連のマウス黄色ブドウ球菌感染症実験セットを実施した。図４Ａを参照すると、ＦＤ−ＵＢＭ  ＭＲＳＡ感染マウスは、上記のＭＳＳＡを使用した研究と比較して、ＢＡＬおよび肺の両方で細菌数が有意に増加した。ただし、大部分の細菌（ＭＲＳＡ）は、ＭＳＳＡよりも肺に強固に結合しており、ＢＡＬ（約１．８ｘ１０４ＣＦＵ／肺）ですすぎ流されることはなく、肺に残存した（約１０５ＣＦＵ／肺、肺の総細菌ＣＦＵの約８４％）。
【００４９】
［0091］  有利なことに、外因的に投与されたＵＢＭは、ｉｎ  ｖｉｖｏではＭＲＳＡに対して効果的であると考えられた。これは、マウスにおいて、この処理により、ＭＲＳＡ誘発性呼吸器感染症に対する抗菌活性が示されたためである。ＰＢＳ対照のみで処理されたマウスとは対照的に、ＦＤ−ＵＢＭ処理マウスでは、ＭＲＳＡ細菌の肺の総負荷の８０％超の減少が観察された。ＭＲＳＡに曝露されたマウス由来のＦＤ−ＵＢＭで処理されたＢＡＬ中の総白血球は、ＰＢＳ対照群よりわずかに少なかったが、統計的有意性は得られなかった（図４Ｂ）。図４Ｃおよび図４Ｄに示すように、ＵＢＭ処理し、ＭＲＳＡに曝露させたマウスの炎症関連および上皮細胞関連遺伝子の発現は、ＵＢＭ処理していないＭＲＳＡ曝露マウスよりも少ない発現を示す傾向を示したが、統計的有意性は得られなかった。
ＵＢＭの生物活性により、ｉｎ  ｖｉｖｏでの細菌の付着が防止される。
【００５０】
［0092］  ＭＳＳＡおよびＭＲＳＡの両方に共通するＵＢＭを介する抗菌メカニズムは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＭＲＳＡに対して直接的な死滅活性を有するのではないようであるが（図１）、それでも、ＭＲＳＡに対して、優れたｉｎ  ｖｉｖｏ抗菌活性を示す（図４）。接種された細菌は、マウス肺炎モデルの粘膜毛様体クリアランスによって肺から押し出されることを避けるために上皮に付着する必要があるため、マウス肺へＵＢＭを投与することで、マウス肺上皮への細菌の付着が明らかに防止される。
【００５１】
［0093］  ＦＤ−ＵＢＭ（下記）の存在下でのＭＳＳＡおよびＭＲＳＡの細菌付着を、バイオフィルム形成アッセイを使用して、さまざまな濃度で調査した。ＭＳＳＡ、ＭＲＳＡ、ＰＡ、およびＫＰに対するＦＤ−ＵＢＭの抗バイオフィルム効果の測定は、上記のとおりクリスタルバイオレット染色（ＯＤ６２０）により、非生物表面のバイオフィルムバイオマスを測定することにより行った。０．０６２５ｍｇ／ｍｌよりも高い濃度でのＦＤ−ＵＢＭにより、図５Ａに示すＭＳＳＡおよび図５Ｂに示すＭＲＳＡの培養プレートへの細菌付着が効果的に減少し、これによりバイオフィルム形成の開始を防止した。
【００５２】
［0094］  ＦＤ−ＵＢＭ媒介抗バイオフィルム活性が広い抗菌スペクトルであるか、またはＧＰＢのみに限定されているかを判断するために、ＦＤ−ＵＢＭの抗バイオフィルム活性を、緑膿菌（ＰＡ）および肺炎桿菌（ＫＰ）などの関連呼吸ＧＮＢ病原体に対する前述のバイオフィルム形成アッセイにおいて試験を行った。発明者らの結果は、ＦＤ−ＵＢＭがＧＮＢに対しても優れた抗バイオフィルム活性を有することを示した（図５Ｃおよび５Ｄ）。
ＵＢＭは、緑膿菌誘発性呼吸器感染症からマウスを保護する
【００５３】
［0095］  ＵＢＭ媒介抗バイオフィルム活性により、宿主をＧＮＢ細菌感染から保護できるかをさらに評価するために、緑膿菌（ＰＡＯ１）を使用して、マウス呼吸器感染実験を同様に実施した。年齢を適合させた野生型ＦＶＢ／ＮＪマウスに、マウス１匹あたり１ｘ１０７ＣＦＵの緑膿菌（ＰＡＯ１）を気管内接種した。予め製剤化したＵＢＭ（ＰＦ−ＵＢＭ）が外因的に投与されることにより、ＧＮＢ緑膿菌誘発性呼吸器感染に対してマウスが効果的に保護された（図６Ａ〜図６Ｄ）。これらのデータは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて細菌感染と戦うためには、図５に示すＰＦ−ＵＢＭを介した抗バイオフィルム活性が、宿主の一般的な保護メカニズムに寄与する可能性が高いことを示唆している。
予め製剤化したＵＢＭは、再構成後に抗菌活性を維持する。
【００５４】
［0096］  無処置のＵＢＭは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは分解しないことが知られているため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究では、消化させたばかりのＵＢＭ（ＦＤ−ＵＢＭ）を使用し（図１および図５）、ｉｎ  ｖｉｖｏでは、消化させたばかりのＵＢＭを、比較を容易にするために使用した。しかし、消化させたばかりのＵＢＭを使用することは、臨床環境では実用的でない。肺感染症における損傷に対しては、迅速な対応を必要とすることから、予め製剤化し、凍結乾燥および滅菌されたＵＢＭ（ＰＦ−ＵＢＭ）消化物の既製の形態は、肺を保護するために消化させたばかりのＵＢＭの特性を維持するために、消化させたばかりのＵＢＭよりも有利である。
【００５５】
［0097］  これらの研究では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの抗菌活性について、凍結乾燥されたＰＦ−ＵＢＭの３つのバッチに対して個別に試験を行い、上記の抗バイオフィルム測定法を使用して、ＦＤ−ＵＢＭ（使用直前に実験室で作製したもの）と比較した。ＰＦ−ＵＢＭ溶液は、長年貯蔵し得るが、緑膿菌およびＭＲＳＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの阻害は、ＦＤ−ＵＢＭとほぼ同じである（図７Ａ）。凍結乾燥ＰＦ−ＵＢＭは、マウス肺炎感染モデルにおいて、緑膿菌およびＭＲＳＡから宿主を保護する際に、ＰＦ−ＵＢＭと同様のｉｎ  ｖｉｖｏ抗菌活性も示した（図７Ｂ）。
【００５６】
［0098］  炎症反応関連サイトカインおよびケモカインの遺伝子およびタンパク質発現に対するＰＦ−ＵＢＭおよびＦＤ−ＵＢＭ処理の効果をさらに評価するために、リアルタイムｑＰＣＲおよびＬｕｍｉｎｅｘを使用して、図８Ａに示すとおり、マウス肺サンプルおよびＢＡＬサンプルをそれぞれ分析した。マウスに約２ｘ１０６ＣＦＵのＭＲＳＡをｉ．ｔ．により感染させ、ＭＲＳＡ接種の１時間後に１０ｍｇ／ｋｇのＰＦ−ＵＢＭまたはＦＤ−ＵＢＭのｉ．ｔ．により処理した。図３および図４で調べたとおり、いくつかの遺伝子は、ＰＢＳ処理マウス群とＵＢＭ処理マウス群との間で差が示されなかったため、評価するために追加の遺伝子およびタンパク質を選択した。予期しないことに、図８Ａを参照すると、Ｔｎｆ−α、ＩＬ−１α、およびＩＬ−６ではなく、Ｃｘｃｌ１、Ｃｘｃｌ２、Ｃｘｃｌ３、Ｃｘｃｌ１０、およびＣｃｌ２０に関して、ＦＤ−ＵＢＭ処理マウスでは、ＰＢＳ処理対照マウスよりも著しく少ない遺伝子発現が検出された。さらに、ＰＦ−ＵＢＭは、ＩＬ−６を除くＣｘｃｌ１、Ｃｘｃｌ２、Ｃｘｃｌ３、Ｃｘｃｌ１０、Ｃｃｌ２０、Ｔｎｆ−α、およびＩＬ−１αのすべての調査した遺伝子発現に対して有意な阻害を示した（図８Ａ）。Ｃｘｃｌ１およびＩＬ−６のＢＡＬ中の分泌タンパク質の量は、ＰＢＳ処理対照マウスよりもＰＦ−ＵＢＭおよびＦＤ−ＵＢＭ処理マウスの両方で有意に低かった（図８Ｂ）。ＢＡＬ中でのＣｘｃｌ１０、ＩＬ−１２、Ｔｎｆ−α、およびＲＡＮＴＥＳの分泌に関して有意差はなかったが、ＩＬ−１７およびＭＩＰ−１αは、ＵＢＭ処理後に発現が少なくなる傾向を示した（図８Ｂ）。
【００５７】
［0099］  炎症性サイトカインおよびケモカインの発現低下は、図８Ｃに示すＵＢＭ処理後のＭＲＳＡ（ＵＳＡ３００）感染マウスの肺病理分析にも反映された。ＰＦ−ＵＢＭおよびＦＤ−ＵＢＭで処理されたマウスはいずれも、ＭＲＳＡに対する細菌クリアランスの向上も示した（図８Ｃ）。これらの結果は、ＰＦ−ＵＢＭおよびＦＤ−ＵＢＭの両方が同程度であり、いずれもＭＲＳＡ誘発性呼吸器感染症から宿主を保護する際に有効であることを示す。
予め製剤化した未消化のＵＢＭにより、高用量の細菌誘発性呼吸器感染に対する保護効果が現れる。
【００５８】
［0100］  患者の急性重症ＧＰＢ誘発性およびＧＮＢ誘発性呼吸器感染症の治療におけるＵＢＭの有用性を試験するために、マウス肺炎モデルにおいて以前に使用したＣＦＵよりも高い細菌負荷（１０倍）で、ＭＲＳＡおよび緑膿菌を接種した。緑膿菌のＭＲＳＡ（ＵＳＡ３００）をＦＶＢ／Ｎマウスに約２ｘ１０７ＣＦＵ／肺の用量でｉ．ｎ．注入した。ＰＦ−ＵＢＭ、および１０ｍｇ／ｋｇで生理食塩水に懸濁した未消化であり、無処置の形態の微粒子ＵＢＭ（Ｕ−ＵＢＭ）を、細菌感染１時間後に送達した（ｉ．ｔ．）。図９を参照すると、ＰＦ−ＵＢＭおよびＵ−ＵＢＭの両方の処理で、ＰＢＳ処理マウス群と比較して、肺の総細菌負荷が有意に減少した。
結論
【００５９】
［0101］  本明細書に記載の、患者におけるＧＰＢ誘発性およびＧＮＢ誘発性細菌性感染症と戦うための治療用途での、例示的なＥＣＭとしてＵＢＭを使用する潜在的な抗菌効果を評価するために実施した一連のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ実験の結果により、消化形態のＵＢＭが、生理緩衝液ＰＢＳ抽出ＵＢＭの上清よりも、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＭＳＳＡに対して良好な抗菌活性を表すことが結論付けられた。消化させたＵＢＭは、ＰＦ−ＵＢＭおよびＵ−ＵＢＭのｉｎ  ｖｉｔｒｏ気管内注入において、ＭＲＳＡまたは緑膿菌に対して直接的な殺菌活性を示さなかったが、マウス呼吸器肺炎モデルにおいて、ＭＳＳＡ、ＭＲＳＡの両方、および緑膿菌感染マウスに対して効果的に保護した。黄色ブドウ球菌および緑膿菌は、感染に関連する一般的な病原体であるため、これらの感染症に対するＵＢＭの抗菌活性は、これらに限定されないが、皮膚および肺など、多くの組織の外傷性急性損傷および火傷など、さまざまな創傷の治療にＵＢＭを高い頻度で使用することに適切であるのみならず、潜在的に、非局所治療用途（例えば、吸入）、または全身治療用途などとして適切である。
【００６０】
［0102］  未消化のＵＢＭ、消化させたばかりのＵＢＭ、および細菌誘発性肺炎から宿主を保護する際に予め製剤化され、消化させたＵＢＭのｉｎ  ｖｉｖｏ抗菌活性は、肺の総細菌負荷の平均約５〜６分の１の減少（約８０％〜８５％の保護）であった。実証されたｉｎ  ｖｉｖｏの結果は、他の研究で使用した他の炎症関連遺伝子ノックアウトマウス（ＩＬ−１７ノックアウトなど）が、肺のＭＲＳＡ細菌負荷を約２〜３分の１しか減少させることができなかったことから、バイオ負荷を減少させる際のＵＢＭの利点を示すものである。さらに、予め製剤化したＰＦ−ＵＢＭは、図９に示すように、厳しい接種（通常よりも１０倍多いＭＲＳＡのＣＦＵ）をマウスの肺に投与して、重度の呼吸ＭＲＳＡ感染症を誘発させた場合であっても、ＭＲＳＡ感染の低減に有効であった。ＰＢＳ処理マウスでの肺細菌負荷の増加は、ＰＦ−ＵＢＭ処理マウスの２５０倍以上であり、Ｕ−ＵＢＭ処理マウスの８７倍多かった。これらの結果は、哺乳類での細菌感染環境において、ＵＢＭがｉｎ  ｖｉｖｏにおいて治療効果があることを示している。理論によって拘束されるものではないが、ＵＢＭは、ＭＲＳＡがマウスの肺にホーミングするのを防ぐ一方で、ＵＢＭにより、限られた数の細菌のみが上皮に付着し得ると考えられる。
【００６１】
［0103］  ＵＢＭがｉｎ  ｖｉｖｏにおいて強力な抗菌活性を呈する可能性の高いメカニズムのうちの１つは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの酵素分解後の強力な抗バイオフィルム形成活性である。細菌は共にグループ化し、表面で互いに固着してバイオフィルムを形成し、その後表現型および遺伝子発現の変化を受ける傾向がある。ヒトの感染症の８０％超が細菌のバイオフィルム形成に直接関連していると推定されているが、現在までの細菌研究の大部分は、バイオフィルム関連細菌ではなく、自由遊泳性の浮遊性細菌で行われていた。バイオフィルム関連細菌は、細菌のコロニー形成の病因において浮遊性形態よりもはるかに重要である。バイオフィルム形成におけるＵＢＭの潜在的なモードのうちの１つは、肺への細菌のホーミングを遅らせ得る、かつ／または上皮に保護層を形成し得るという、および上皮表面でのバイオフィルム形成を減少させ得るという、ＵＢＭの生物物理特性によるものである。ＵＢＭの成分は、肺上皮細胞に付着する細菌の能力と相互作用し得るか、または中和し得る。
【００６２】
［0104］  本明細書に記載の結果は、ｉｎ  ｖｉｖｏで外因的に投与されたＵＢＭが、細菌感染に対して効率の良い保護を提供することを示している。ＵＢＭ処理マウスで観察された細菌クリアランスの向上は、その抗菌活性を増強するための、ＵＢＭとデフェンシンなどの他の抗菌ペプチドおよび／またはリゾチームなどの抗菌タンパク質との相互作用により発生し得る。
【００６３】
［0105］  また、サイトカインは、免疫学的プロセスおよび炎症プロセスの調整および調節において重要な役割を果たす。通常、微生物産物の認識後、上皮細胞内のＴＬＲ媒介シグナル伝達は、好中球のその後の動員を調整する２つの初期応答性サイトカインである、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βの産生をもたらす。炎症性メディエータが十分に調整されバランスを取って産生されることは、細菌感染に対する効果的な局所および全身の宿主防御にとって重要である。
【００６４】
［0106］  本明細書に開示されている研究では、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−αなどの炎症性サイトカインのほとんどは、一般的な用量誘発性の細菌感染後、ＰＢＳ処理マウスとＵＢＭ処理マウスとの間で顕著な変化はなかった（図３、図４および図５）。しかし、いくつかのサイトカインおよびケモカインは、ＰＢＳ処理マウス群と比較してＵＢＭ処理マウス群において有意に減少した（図８および図９）。
【００６５】
［0107］  細菌性感染症の既知の治療法を上回る、本研究で特定されたＵＢＭの重要かつ予想外の利点のうちの１つは、予め製剤化した（予め消化、凍結乾燥、および滅菌させた）ＰＦ−ＵＢＭが、室温で長期間貯蔵した後であっても、ＭＳＳＡおよびＭＲＳＡ誘発性感染症に対する抗菌活性を保持することである。この研究で使用したＰＦ−ＵＢＭは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方の実験で使用する前に、最大６か月間室温条件で滅菌し、貯蔵した。長期安定性を備えたＰＦ−ＵＢＭは、既製品として室温で何年も貯蔵することができ、微生物感染症の治療に使用できる容易に入手可能な抗菌剤としての有用性がさらに高まる。
【００６６】
［0108］  これらの研究で特定された別の利点は、未消化のＵ−ＵＢＭも、ＭＲＳＡ誘発性呼吸器感染症に対して優れた抗菌活性を呈したことである。ここでも、理論に拘束されるものではないが、潜在的なメカニズムは、Ｕ−ＵＢＭが宿主気道内の分泌プロテアーゼによって消化されるため、未消化ＵＢＭをｉｎ  ｓｉｔｕで消化・分解させ、消化されたＰＦ−ＵＢＭおよびＦＤ−ＵＢＭの観察された抗菌効果と同様に、細菌性感染症から宿主を保護する。タンパク質架橋剤の非存在下で製剤化された、これに限定されないが、ＵＢＭなどの上記のＥＣＭ由来組成物の調製は、これに限定されないが、呼吸器感染症などの細菌性感染症の治療における組成物の使用に有利であり得る。架橋タンパク質のｉｎ  ｓｉｔｕでの分解は、宿主プロテアーゼおよびペプチダーゼの能力を超え得る。
【００６７】
［0109］  要約すると、本明細書に開示される発明としては、これに限定されないが、気道内でｉｎ  ｖｉｖｏアプローチを使用する、細菌病原体に対するＵＢＭの広域抗菌活性の使用が挙げられる。さらに、ＵＢＭは、例えば、例示的な細菌感染、および創傷、火傷、皮膚の持続感染、粉砕骨折、膀胱炎、蜂巣炎、院内感染における他の細菌感染、ならびに気道および他の組織感染として本明細書において研究された、治療として、または黄色ブドウ球菌および緑膿菌に対する耐性を改善するために使用され得る。非限定的な例として、ＵＢＭは、嚢胞性線維症患者において、初期の細菌のコロニー形成を治療するのに有用であり得る。ＵＢＭを介する抗菌活性は、免疫能のある患者および免疫不全の患者の気道の細菌性感染症などの細菌性感染症と効率良く闘うための代替的アプローチである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【国際調査報告】
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