(57)【要約】  本発明は、構造R1-L-R2-B又はB-R2-L-R1を有する生物発光共鳴エネルギー転移センサー分子であって、式中、R1は生物発光タンパク質であり、Lは連結エレメントであり、R2は非タンパク質アクセプタードメインであり、及びBはブロッキング基であり、加水分解された場合にBRETにおける変化を生じる加水分解性結合をBに結合したR2が含む、生物発光共鳴エネルギー転移センサー分子に関する。本発明は、試料を分子B-R2に接触させる工程、次いでR2のLへの結合を生じさせる条件下で、化合物R1-L又はL-R1に接触させる工程、及びBRET比における変化を検出する工程による、ヒドロラーゼを検出する方法も開示する。具体的に例示されるセンサーは、エステラーゼによって加水分解されるルシフェラーゼ及びフルオレセインジアセテートを含む。本発明は、システイン残基を除去することによってRLuc8に由来するルシフェラーゼ酵素も開示する。
2020531022.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
R1-L-R2-B(I)、又は
B-R2-L-R1(II)
から選択される一般式を有する、ヒドロラーゼを検出するためのセンサー分子であって、
式中
R1は生物発光タンパク質であり;
Lは連結エレメントであり;
R2は非タンパク質アクセプタードメインであり;及び
Bはブロッキング基であり
Bに結合したR2が加水分解性結合を含み、ヒドロラーゼによる加水分解性結合の加水分解が生物発光共鳴エネルギー転移(BRET)における変化を生じる、センサー分子。
【請求項２】
ブロッキング基が、低蛍光又は非蛍光状態にあるアクセプタードメインを安定化する、請求項1に記載のセンサー分子。
【請求項３】
ブロッキング基が、リン酸含有成分、糖含有成分、アミノ酸含有成分、ヌクレオチド、ヌクレオシド、エステル又はエーテルを含む、請求項1又は請求項2に記載のセンサー分子。
【請求項４】
連結エレメントが、アルキル鎖、グリコール、エーテル、ポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、ペプチド、ポリペプチド、アミノ酸又はポリヌクレオチドを含む、請求項1から3のいずれか一項に記載のセンサー分子。
【請求項５】
連結エレメントがポリペプチドを含む、請求項4に記載のセンサー分子。
【請求項６】
R1-L又はL-R1が単一ポリペプチドである、請求項5に記載のセンサー分子。
【請求項７】
連結エレメントがシステイン残基及び/又はリジン残基を含む、請求項5又は請求項6に記載のセンサー分子。
【請求項８】
R2がシステイン残基を介して連結エレメントに結合している、請求項7に記載のセンサー分子。
【請求項９】
R2が、Alexa Fluor色素、Bodipy色素、Cy色素、フルオレセイン、ダンシル、ウンベリフェロン、蛍光ミクロスフェア、発光ミクロスフェア、蛍光ナノクリスタル、マリーナブルー(Marina Blue)、カスケードブルー(Cascade Blue)、カスケードイエロー(Cascade Yellow)、パシフィックブルー、オレゴングリーン、テトラメチルローダミン、ローダミン、クマリン、BODIPY、レゾルフィン、テキサスレッド、希土類元素キレート又はこれらの任意の組合せ若しくは誘導体から選択される、請求項1から8のいずれか一項に記載のセンサー分子。
【請求項１０】
R1が、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ラクタマーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-グルクロニダーゼ又はβ-グルコシダーゼから選択される、請求項1から9のいずれか一項に記載のセンサー分子。
【請求項１１】
ルシフェラーゼが、ウミシイタケルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、腔腸動物ルシフェラーゼ、北アメリカグローワームルシフェラーゼ、コメツキムシルシフェラーゼ、レイルロードワームルシフェラーゼ、細菌性ルシフェラーゼ、ガウシアルシフェラーゼ、エクオリン、アラキノカンパルシフェラーゼ、或いはそのいずれか1つの生物学的に活性な変種若しくは断片又は2つ以上のキメラである、請求項10に記載のセンサー分子。
【請求項１２】
ヒドロラーゼが、エステラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、ホスファターゼ、ヌクレアーゼ、グリコシダーゼ、DNAグリコシラーゼ又は酸無水物ヒドロラーゼである、請求項1から11のいずれか一項に記載のセンサー分子。
【請求項１３】
ヒドロラーゼの存在及び/又は非存在下でのR1とR2との分離及び相対配向が、フォルスター距離の±50%以内である、請求項1から12のいずれか一項に記載のセンサー分子。
【請求項１４】
R1とR2とのフォルスター距離が少なくとも4.0nmである、請求項13に記載のセンサー分子。
【請求項１５】
R1とR2とのフォルスター距離が約4.0nmから約10nmの間である、請求項14に記載のセンサー分子。
【請求項１６】
i)試料を請求項1から15及び請求項31のいずれか一項に記載のセンサー分子に接触させる工程;及び
ii)BRET比における変化を検出する工程であって、BRET比における変化が試料中のヒドロラーゼの存在に対応する工程
を含む、試料中のヒドロラーゼを検出する方法。
【請求項１７】
i)処理試料を形成するために、試料を構造B-R2を有するブロックされた非タンパク質アクセプタードメインに接触させる工程;
ii)R2のLへの結合を生じさせる条件下で、処理試料を式R1-L又はL-R1の化合物に接触させる工程;及び
iii)BRET比における変化を検出する工程であって、BRET比における変化が試料中のヒドロラーゼの存在及び式R1-L-R2又はR2-L-R1の化合物の形成に対応する工程
を含み、式中
R1は生物発光タンパク質であり;
Lは連結エレメントであり;
R2は非タンパク質アクセプタードメインであり;及び
Bはブロッキング基であり、Bに結合したR2は加水分解性結合を含む、
試料中のヒドロラーゼを検出する方法。
【請求項１８】
R2がシステイン特異的求電子剤又はアミン特異的求電子剤を含む、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
Lがシステイン及び/又はリジン残基を含む、請求項17又は請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
試料中のヒドロラーゼの濃度及び/又は試料中のヒドロラーゼの活性を決定する工程を更に含む、請求項18から21のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
マイクロ流体デバイス上で実施される、請求項18から22のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
試料が、気体、液体、生物学的材料又は土壌のいずれか1つである、請求項16から21のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
試料が、乳、血液、血清、痰、粘液、膿及び腹水からなる群から選択される生物学的材料を含む、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
対応する天然に存在するタンパク質と比較して少なくとも1つ少ないシステイン残基を含む変種生物発光タンパク質。
【請求項２５】
RLuc8(配列番号50)の24位又は73位に対応する位置のシステイン残基を欠いている、請求項24に記載の変種生物発光タンパク質。
【請求項２６】
RLuc8(配列番号50)のアミノ酸24位及び73位に対応する位置のシステイン残基を欠いている、請求項24に記載の変種生物発光タンパク質。
【請求項２７】
請求項24から26のいずれか一項に記載の変種生物発光タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２８】
請求項27に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２９】
請求項27に記載のポリヌクレオチド及び/又は請求項28に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３０】
請求項29に記載の宿主細胞又は請求項28に記載のベクターを、タンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下で培養する工程、及び発現されたタンパク質を回収する工程を含む、変種生物発光タンパク質を産生するための方法。
【請求項３１】
R1が、請求項24から26のいずれか一項に記載の変種生物発光タンパク質である、請求項1から15のいずれか一項に記載のセンサー分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中のホスファターゼ、グリコシダーゼ、エステラーゼ、エキソペプチダーゼ及びリパーゼ等のヒドロラーゼを検出するためのセンサー及び方法に関する。具体的には、本発明は、食品、飲料及び臨床試料中のヒドロラーゼを検出するためのセンサー及び方法に関する。センサー及び方法は、試料中に存在するヒドロラーゼの量を決定するためにも使用され得る。
【背景技術】
【０００２】
ヒドロラーゼは、生命体のすべての領域において見出される酵素の種類である。それらの役割は多様である、例えばヒドロラーゼはバイオマスの分解、防御、病態形成及び正常な細胞機能に関与している。ヒドロラーゼの活性を決定するためのアッセイは、食品、臨床及び診断設定において日常的に使用されている。これらのアッセイは、分光光度的、電流測定的、比色分析又は蛍光検出にしばしば依存している。しかし、より伝統的なアッセイ形式に対する、簡易、高感度及び/又は費用対効果が高い代替法となるアッセイに対する要求は高まっている。ハイスループットなスクリーニングのために好適である再現性のあるアッセイに対する要求もある。特に興味深いのは、ホスファターゼ、グリコシダーゼ、エステラーゼ、エキソペプチダーゼ及びリパーゼ等の広くさまざまな加水分解酵素を検出し、レベルを測定するために使用され得るセンサー及びアッセイである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】WO 2007/140282
【特許文献２】WO 00/024878
【特許文献３】WO 99/049019
【特許文献４】US 5,229,285
【特許文献５】US 5,219,737
【特許文献６】US 5,843,746
【特許文献７】US 5,196,524
【特許文献８】US 5,670,356
【特許文献９】WO 2007/019634
【特許文献１０】WO 01/46691
【特許文献１１】WO/2014/036482
【特許文献１２】US20140302539
【特許文献１３】WO 2013/155553
【特許文献１４】PCT/AU2018/050824
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984)
【非特許文献２】J. Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989)
【非特許文献３】T.A. Brown (編集), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991)
【非特許文献４】D.M. Glover and B.D. Hames (編集), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995及び1996)
【非特許文献５】F.M. Ausubelら(編集), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988、現在までのすべてのアップデートを含む)
【非特許文献６】Ed Harlow and David Lane (編集) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988)
【非特許文献７】J.E. Coliganら、(編集) Current Protocols in Immunology John Wiley & Sons(現在までのすべてのアップデートを含む)
【非特許文献８】Greg T. Hermanson, Bioconjugate Techniques (Third Edition), Academic Press (2013)
【非特許文献９】Enzyme Nomenclature 1992 [Academic Press, San Diego, California, ISBN 0-12-227164-5 (hardback), 0-12-227165-3 (paperback)] with Supplement 1 (1993), Supplement 2 (1994), Supplement 3 (1995), Supplement 4 (1997) and Supplement 5 (Tipton 1994; Barrett 1995; Barrett 1995; Barrett 1997, and Nomenclature Committee 1999)
【非特許文献１０】the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme /EC3/)
【非特許文献１１】ExPASy http://enzyme.expasy.org/EC/3.-.-.-
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、試料料中のヒドロラーゼを検出するために使用され得るセンサー分子を同定した。本発明者らは、試料中のヒドロラーゼを検出する方法も同定した。
【０００６】
一態様では:
R1-L-R2-B(I)、又は
B-R2-L-R1(II)
から選択される一般式を有する、ヒドロラーゼを検出するためのセンサー分子であって、
式中
R1は生物発光タンパク質であり;
Lは連結エレメントであり;
R2は非タンパク質アクセプタードメインであり;及び
Bはブロッキング基であり
Bに結合したR2が加水分解性結合を含み、ヒドロラーゼによる加水分解性結合の加水分解が生物発光共鳴エネルギー転移(BRET)における変化を生じる、センサー分子が提供される。
【０００７】
一実施形態では、非タンパク質アクセプタードメインは、非タンパク質蛍光アクセプタードメインである。
【０００８】
一部の実施形態では、ブロッキング基は、非蛍光状態にあるアクセプタードメインを安定化する。一部の実施形態では、ブロッキング基は、低蛍光状態にあるアクセプタードメインを安定化する。
【０００９】
一部の実施形態では、Bは、リン酸含有成分、糖含有成分、アミノ酸含有成分、ヌクレオチド、ヌクレオシド、エステル又はエーテルを含む。
【００１０】
一部の実施形態では、連結エレメントは、アルキル鎖、グリコール、エーテル、ポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、ペプチド、ポリペプチド、アミノ酸又はポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、連結エレメントは、ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、R1-L又はL-R1は単一ポリペプチドである。一部の実施形態では、連結エレメントは、システイン残基及び/又はリジン残基を含む。一部の実施形態では、R2は、システイン残基を介して連結エレメントに結合している。
【００１１】
一部の実施形態では、R2は、Alexa Fluor色素、Bodipy色素、Cy色素、フルオレセイン、ダンシル、ウンベリフェロン、蛍光ミクロスフェア、発光ミクロスフェア、蛍光ナノクリスタル、マリーナブルー(Marina Blue)、カスケードブルー(Cascade Blue)、カスケードイエロー(Cascade Yellow)、パシフィックブルー、オレゴングリーン、テトラメチルローダミン、ローダミン、クマリン、BODIPY、レゾルフィン、テキサスレッド、希土類元素キレート又はこれらの任意の組合せ若しくは誘導体から選択される。
【００１２】
一部の実施形態では、生物発光タンパク質R1は、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ラクタマーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-グルクロニダーゼ又はβ-グルコシダーゼから選択される。一部の実施形態では、R1は、ウミシイタケルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、腔腸動物ルシフェラーゼ、北アメリカグローワームルシフェラーゼ、コメツキムシルシフェラーゼ、レイルロードワームルシフェラーゼ、細菌性ルシフェラーゼ、ガウシアルシフェラーゼ、エクオリン、アラキノカンパルシフェラーゼを含むルシフェラーゼ或いはそのいずれか1つの生物学的に活性な変種若しくは断片又は2つ以上のキメラである。
【００１３】
一部の実施形態では、生物発光タンパク質R1は、基質を修飾できる。一部の実施形態では、基質は、ルシフェリン、カルシウム、セレンテラジン又はセレンテラジンの誘導体若しくは類似物である。
【００１４】
一部の実施形態では、ヒドロラーゼは、エステラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、ホスファターゼ、ヌクレアーゼ、グリコシダーゼ、DNAグリコシラーゼ及び酸無水物ヒドロラーゼである。一部の実施形態では、ヒドロラーゼは、エステラーゼである。一部の実施形態では、ヒドロラーゼは、ホスファターゼである。一部の実施形態では、ヒドロラーゼは、リパーゼである。
【００１５】
一部の実施形態では、R1はRLuc8を含む、Lはシステイン残基を含むポリペプチドであり、Bに結合したR2はフルオレセインジアセテートである。本実施形態では、Bに結合したR2は、マレイミド連結基を介してシステインに結合しており、Lは28アミノ酸を含み、L-R1は単一ポリペプチドである。このセンサーは、エステラーゼセンサーとして使用され得る。
【００１６】
一部の実施形態では、ヒドロラーゼの存在及び/又は非存在下でのR1とR2との分離及び相対配向は、フォルスター距離の±50%以内である。一部の実施形態では、R1とR2とのフォルスター距離は少なくとも4.0nmである。一部の実施形態では、R1とR2とのフォルスター距離は少なくとも5.6nmである。一部の実施形態では、R1とR2とのフォルスター距離は約4.0nmから約10nmの間である。一部の実施形態では、R1とR2とのフォルスター距離は約5.6nmから約10nmの間である。
【００１７】
別の態様では、
i)試料を本明細書に定義されるセンサー分子に接触させる工程;及び
ii)BRET比における変化を検出する工程であって、BRET比における変化が試料中のヒドロラーゼの存在に対応する工程
を含む、試料中のヒドロラーゼを検出する方法が提供される。
【００１８】
更に別の態様では、
i)処理試料を形成するために、試料を構造B-R2を有するブロックされた非タンパク質アクセプタードメインに接触させる工程;
ii)R2のLへの結合を生じさせる条件下で、処理試料を式R1-L又はL-R1の化合物に接触させる工程;及び
iii)BRET比における変化を検出する工程であって、BRET比における変化が試料中のヒドロラーゼの存在及び式R1-L-R2又はR2-L-R1の化合物の形成に対応する工程
を含み、式中
R1は生物発光タンパク質であり;
Lは連結エレメントであり;
R2は非タンパク質アクセプタードメインであり;及び
Bはブロッキング基であり、Bに結合したR2は加水分解性結合を含む、
試料中のヒドロラーゼを検出する方法が提供される。
【００１９】
一実施形態では、非タンパク質アクセプタードメインR2は、非タンパク質蛍光アクセプタードメインである。
【００２０】
一部の実施形態では、R2は、システイン特異的求電子剤又はアミン特異的求電子剤を含む。一部の実施形態では、Lは、システイン及び/又はリジン残基を含む。
【００２１】
一部の実施形態では、本明細書に定義される方法は、試料中のヒドロラーゼの濃度及び/又は活性を決定する工程を更に含む。一部の実施形態では、本明細書に定義される方法は、マイクロ流体デバイス上で実施される。
【００２２】
一部の実施形態では、試料は、気体、液体、生物学的材料又は土壌からなる群から選択される。一部の実施形態では、試料は、(これだけに限らないが)乳、血液、血清、痰、粘液、膿、尿、汗、大便、涙又は腹水等の任意の好適な生物学的材料であってよい。一部の実施形態では、試料は、乳、血液、血清、痰、粘液、膿及び腹水からなる群から選択される生物学的材料を含む。一部の実施形態では、試料は、固体農産物、食品又は他の物質を水性溶液中で洗浄、浸漬、粉砕又は軟化(macerating)することによって得られる懸濁物若しくは抽出物であってよく、液相を試料として使用する。液体相は、沈降(settling)、ろ過又は遠心分離によって清澄化され得る。
【００２３】
更に別の態様では、対応する天然に存在するタンパク質と比較して少なくとも1つ少ないシステイン残基を含む変種生物発光タンパク質が提供される。一部の実施形態では、変種生物発光タンパク質は、RLuc(配列番号49)のアミノ酸番号24、73及び/又は124に対応する位置のシステイン残基を欠いている。一部の実施形態では、変種生物発光タンパク質は、アミノ酸番号24 RLucに対応する位置のシステイン残基を欠いている。一部の実施形態では、変種生物発光タンパク質は、アミノ酸番号73 RLucに対応する位置のシステイン残基を欠いている。一部の実施形態では、変種生物発光タンパク質は、アミノ酸番号124 RLucに対応する位置のシステイン残基を欠いている。一部の実施形態では、変種生物発光タンパク質は、RLuc8のアミノ酸番号24及び/又は73に対応する位置のシステイン残基を欠いている。一部の実施形態では、変種生物発光タンパク質は、RLuc8(配列番号50)の24位又は73位に対応する位置のシステイン残基を欠いている。一部の実施形態では、変種生物発光タンパク質は、RLuc8(配列番号50)の24位及び73位に対応する位置のシステイン残基を欠いている。一部の実施形態では、変種生物発光タンパク質は、RLuc2(配列番号51)のアミノ酸番号24、73及び/又は124に対応する位置のシステイン残基を欠いている。
【００２４】
更に別の態様では、本明細書に定義される変種生物発光タンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。
【００２５】
一部の実施形態では、本明細書に定義される変種生物発光タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。
【００２６】
一部の実施形態では、本明細書に定義されるポリヌクレオチド及び/又はベクターを含む宿主細胞が提供される。
【００２７】
一部の実施形態では、本明細書に定義される宿主細胞又は本明細書に定義されるベクターを、タンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下で培養する工程、及び発現されたタンパク質を回収する工程を含む、変種生物発光タンパク質を産生するための方法が提供される。
【００２８】
一部の実施形態では、R1が本明細書に定義される変種生物発光タンパク質である、本明細書で定義されるセンサー分子が提供される。
【００２９】
本明細書の任意の実施形態は、特に具体的に明記しない限り、変更すべき所は変更して、任意の他の実施形態に適用されると解釈されるべきである。
【００３０】
本発明は、例示の目的だけを意図する本明細書に記載の具体的な実施形態によって範囲を限定されない。機能的に等価な産生物、組成物及び方法は、明確に、本明細書に記載の本発明の範囲内である。
【００３１】
本明細書全体を通じて、特に具体的に明記しない限り、又は文脈上他の意味に解釈すべき場合を除いて、単一のステップ、物質の組成、ステップの群又は物質の組成の群を参照することは、これらのステップ、物質の組成、ステップの群又は物質の組成の群の1つ及び複数(すなわち1つ又は複数)を包含すると解釈されるべきである。
【００３２】
本発明は、本明細書以下に、次の非限定的例の方法によって、及び添付の図を参照して記載される。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】本明細書で定義されるヒドロラーゼを検出するための例示的センサー分子を示す図である。例示される実施形態では、生物発光タンパク質R1は、連結エレメントLによって、非タンパク質アクセプタードメインR2に連結されており、その蛍光は、アセテートブロッキング基Bによって調節される。例示される実施形態では、ブロッキング基Bは、非タンパク質アクセプタードメインの蛍光を回復させ、BRETが生じるようにするエステラーゼによって除去される。
【図２】マレイミド、アクリルアミド及びフェニルカルボニルアクリルアミド等のマイケルアクセプターを使用するシステイン特異的標識化戦略の例を示す図である。
【図３】内部RLuc8標識化を最小化するための標識化条件の最適化を示す図である。5μM R1-L(連結エレメントを有するRLuc8)は、50mM MES緩衝液、pH5.0、4℃中で4eq.のフルオレセイン-5-マレイミド(20μM)とインキュベートされ、反応はフルオレセイン-5-マレイミドの添加前並びにフルオレセイン-5-マレイミド添加の6、15、30及び60分後に、BRETを使用してモニターされた。(A) wt-RLuc8(配列番号1);(B)RLuc8Cys1(配列番号2)。
【図４】(A)例示的センサー分子(RLuc8Cys2-フルオレセイン-ジアセテート) (実線)とエステラーゼ(0.8U)を用いた30分間、37℃でのインキュベーション後のセンサー分子についての生物発光共鳴エネルギー転移(BRET)との比較を示す図である。(B)例示的センサー分子(実線)とブロックされていないセンサー分子(RLuc8Cys2-フルオレセイン)とのBRETの比較。
【図５】pH7.0、7.5及び8.0でのRLuc8Cys1-FMコンジュゲートについてのBRET比の比較(50mM HEPES、50mM NaCl中1μMコンジュゲート) (平均±S.D.、n=3)を示す図である。
【図６】(A)位置1(R1とR2との間1アミノ酸、配列番号2)、2(R1とR2との間11アミノ酸、配列番号3)又は3(R1とR2との間21アミノ酸、配列番号4)のいずれか1つでのRLuc8のN末端ペプチド連結エレメントへの単一システイン残基の導入;(B)1μMのセンサー分子のBRET比(平均±S.D.、n=6)を示す図である。
【図７Ａ】(A)フルオレセイン-マレイミドで標識されたRLuc8Cys1、RLuc8Cys2、RLuc8Cys3、RLuc8Cys4、RLuc8Cys5及びMBP(K239C)RLuc8についてのBRETの比較(平均±S.D.、n=3)を示す図である。
【図７Ｂ】(B)フルオレセイン-マレイミド(FM)又はローダミン赤C2マレイミド(RM)で標識されたRLuc8Cys1、RLuc8Cys2、RLuc8Cys3、RLuc8Cys4、RLuc8Cys5及びMBP(K239C)RLuc8についてのBRETの比較(平均±S.D.、n=3)を示す図である。
【図７Ｃ】(C)フルオレセイン-マレイミドで標識されたRLuc8Cys1、RLuc8Cys2、RLuc8Cys3、RLuc8Cys4、RLuc8Cys5及びMBP(K239C)RLuc8についてのBRET2比の比較(平均±S.D.、n=3)を示す図である。
【図８】pH7.0、25℃でのエステラーゼ活性を検出及び測定するための例示的センサー分子、RLuc8Cys4-フルオレセイン-ジアセテート、RLuc8Cys3-フルオレセイン-ジアセテート及びRLuc8Cys2-フルオレセイン-ジアセテートの使用を示す図である。
【図９】30℃(A)、25℃(B)又は20℃(C)でのエステラーゼ活性を検出及び測定するための例示的センサー分子(RLuc8Cys4-フルオレセイン-ジアセテート)の使用を示す図である。
【図１０】本開示の実施形態によるヒドロラーゼを検出するための方法を示す図である。(A)本実施形態では、小分子アクセプターは、ヒドロラーゼと接触することに先立ってBRETドナーに共有結合的に結合されている。(B)本実施形態では、小分子アクセプターR2は、検出のためのBRETドナーに共有結合的に結合される前にヒドロラーゼを用いて予め活性化される。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
配列表集
配列番号1-wt-RLuc8 (RLuc8及びN末端連結エレメントを含む)
配列番号2-RLuc8Cys1 (RLuc8及びN末端連結エレメントを含む)
配列番号3-RLuc8Cys2 (RLuc8及びN末端連結エレメントを含む)
配列番号4-RLuc8Cys3 (RLuc8及びN末端連結エレメントを含む)
配列番号5から7-連結エレメント配列
配列番号8-wt-RLuc8(C24X)
配列番号9-wt-RLuc8(C73Z)
配列番号10-wt-RLuc8(C24X.C73Z)
配列番号11-wt-RLuc8をコードするヌクレオチド配列
配列番号12-RLuc8Cys1をコードするヌクレオチド配列
配列番号13-RLuc8Cys2をコードするヌクレオチド配列
配列番号14-RLuc8Cys3をコードするヌクレオチド配列
配列番号15から20-プライマー配列
配列番号21から22-mTGに対する高親和性基質
配列番号23-ソルターゼ認識配列
配列番号24から30-スペーサー配列
配列番号31-mTGに対する高親和性基質
配列番号32-RLuc8Cys4 (RLuc8及びN末端連結エレメントを含む)
配列番号33-RLuc8Cys5 (RLuc8及びN末端連結エレメントを含む)
配列番号34-MBP(K239C)RLuc8 (MBP(K239C)を含むN末端連結エレメント及びRLuc8を含む)
配列番号35-RLuc8Cys4をコードするヌクレオチド配列
配列番号36-RLuc8Cys5をコードするヌクレオチド配列
配列番号37-MBP(K239C)RLuc8をコードするヌクレオチド配列
配列番号38から43-プライマー配列
配列番号44から48-システイン残基を含有する連結エレメント
配列番号49-RLucのアミノ酸配列
配列番号50-RLuc8のアミノ酸配列
配列番号51-RLuc2のアミノ酸配列
【００３５】
本発明の詳細な記載
一般的技術及び定義
他所に具体的に定義しない限り、本明細書で使用するすべての技術的及び科学的用語は、当業者(例えば、細胞培養、BRETに基づくセンサー技術、バイオコンジュゲーション技術、タンパク質化学、生化学等)によって一般に理解されるのと同じ意味を有すると解釈されるべきである。
【００３６】
特に具体的に明記しない限り、本発明において利用される組換えタンパク質、細胞培養及び免疫学的技術は、当業者に十分周知の標準的手順である。そのような技術は、J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984)、J. Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989)、T.A. Brown (編集), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991)、D.M. Glover and B.D. Hames (編集), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995及び1996)並びにF.M. Ausubelら(編集), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988、現在までのすべてのアップデートを含む)、Ed Harlow and David Lane (編集) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988)並びにJ.E. Coliganら、(編集) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons(現在までのすべてのアップデートを含む)等の出典の文献を通じて記載され、説明されている。
【００３７】
用語「及び/又は」、例えば「X及び/又はY」は、「X及びY」又は「X又はY」のいずれかを意味すると理解されるべきであり、両方の意味に、又はいずれかの意味に明確な支持を提供すると解釈されるべきである。
【００３８】
本明細書において使用される用語、約は、そうでないと記載しない限り、指定の値の+/-10%、より好ましくは+/-5%、更により好ましくは+/-1%を指す。
【００３９】
本明細書全体を通じて、語「含む(comprise)」又は「含む(comprises)」若しくは「含んでいる(comprising)」等の変化形は、述べられる要素、整数若しくはステップ又は要素、整数若しくはステップの群を含むことを意味するが、任意の他の要素、整数若しくはステップ又は要素、整数若しくはステップの群の排除を意味しないと理解される。
【００４０】
センサー
明細書全体を通じて「センサー」及び「センサー分子」は、互換的に用いられる。
【００４１】
一態様では、本開示は、
R1-L-R2-B(I)、又は
B-R2-L-R1(II)
から選択される一般式を有する、ヒドロラーゼを検出するためのセンサー分子であって、
式中
R1は生物発光タンパク質であり;
Lは連結エレメントであり;
R2は非タンパク質アクセプタードメインであり;及び
Bはブロッキング基であり
Bに結合したR2が加水分解性結合を含み、ヒドロラーゼによる加水分解性結合の加水分解が生物発光共鳴エネルギー転移(BRET)における変化を生じる、センサー分子を提供する。
【００４２】
一部の実施形態では、R1-L又はL-R1は、単一ポリペプチドである。一部の実施形態では、R1-Lは、アミノ酸の連続的ストレッチである。他の実施形態では、L-R1は、アミノ酸の連続的ストレッチである。例えば、生物発光タンパク質(R1)及び連結エレメントは、これだけに限らないが、連結エレメントのN末端に共有結合的に結合した生物発光タンパク質又は連結エレメントのC末端に共有結合的に結合した生物発光タンパク質等のアミノ酸の単一のストレッチである。共有結合は、ペプチド結合である。例えば、R1-L又はL-R1は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号32及び配列番号33から選択されるポリペプチド配列を含む単一ポリペプチドである。一部の実施形態では、単一ポリペプチドは、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号32及び配列番号33の任意の1つ又は複数に少なくとも30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%配列同一性を有するポリペプチド配列も含み得る。
【００４３】
さらなる実施形態では、本明細書に定義されるR1-L又はL-R1をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸も提供される。一部の実施形態では、核酸は、単離された核酸である。例えば、一実施形態では核酸分子は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号32及び配列番号33からなる群から選択されるポリペプチド配列をコードする配列を含む。一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号32及び配列番号33の任意の1つ又は複数に少なくとも30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%配列同一性を有するポリペプチド配列をコードする配列を含む。一実施形態では、核酸分子は、配列番号1、配列番号2、配列番号3及び配列番号4からなる群から選択されるポリペプチド配列、又は配列番号1、配列番号2、配列番号3及び配列番号4の任意の1つ又は複数に少なくとも30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%配列同一性を有するポリペプチド配列をコードする配列を含む。本発明のセンサー(又はその一部)をコードする配列に加えて、核酸分子は、プライマー部位、転写因子結合部位、ベクター挿入部位及び核酸分解に抵抗する配列(例えば、ポリアデノシンテール)等の他の配列を含有し得る。核酸分子は、ポリヌクレオチドが本発明のタンパク質を合成するために翻訳され得る限り、DNA又はRNAであってよく、合成ヌクレオチドを含み得る。
【００４４】
一部の実施形態では、核酸は、プラスミド等のベクターの一部を形成する。上に記載される核酸配列に加えて、プラスミドは、原核複製開始点(例えば、大腸菌(E. coli)OR1複製開始点)自己複製配列、セントロメア配列;核酸に作動可能に連結された、宿主細胞において核酸を発現できるプロモーター配列、核酸配列の下流に位置するターミネーター配列、抗菌薬耐性遺伝子及び/又は分泌シグナル配列等の他のエレメントを含む。自己複製配列を含むベクターは、酵母人工染色体でもある。一部の代替的実施形態では、ベクターは、バクテリオファージ等のウイルスであり、本発明の核酸配列に加えて、構造タンパク質、プロモーター、転写活性化等のバクテリオファージの複製のための核酸配列を含む。
【００４５】
本発明の核酸又はベクターは、本発明のセンサー又は標的配列を合成するために宿主細胞にトランスフェクト又は形質転換するために使用され得る。好適な宿主細胞として、大腸菌(E. coli)等の原核細胞及び酵母細胞等の真核細胞、又は哺乳動物若しくは植物細胞株が挙げられる。宿主細胞は、電気穿孔法;リン酸カルシウムに基づく方法;微粒子銃技術又はウイルスベクターの使用によって等の当技術分野において周知の技術を使用してトランスフェクト又は形質転換される。
【００４６】
トランスフェクション/形質転換後、本発明の核酸又はベクターは、必要に応じて転写され、翻訳される。一部の実施形態では、合成されたタンパク質は、例えば、ベクター中の分泌シグナルの存在のために細胞から分泌されることによって、又は宿主細胞の溶解及びそれからのタンパク質の精製によってのいずれかで宿主細胞から抽出される。
【００４７】
一部の実施形態では、センサー(又はその一部、例えばR1-L若しくはL-R1)は、細胞不含有組成物として提供される。本明細書において使用される、用語「細胞不含有組成物」は、センサーを含み、あるとしてもごくわずかな未処置細胞を含有する単離された組成物を指す。細胞不含有組成物の例として、細胞(酵母細胞等)抽出物及び、単離された、精製された及び/又は組換えセンサー分子(タンパク質等)を含有する組成物が挙げられる。細胞から細胞不含有組成物を調製するための方法は、当技術分野において十分周知である。
【００４８】
ブロッキング基
本発明のセンサーでは、「B」は、ブロッキング基を指し、R2に結合したBは、加水分解性結合を含む。Bは、加水分解性結合が未変化の場合にBに結合したR2の蛍光特性が、加水分解性結合が切断された場合のBに結合したR2の蛍光特性と異なるように、R2の蛍光特性を調節できる。一部の実施形態では、ブロッキング基Bは、蛍光状態AにあるアクセプタードメインR2を安定化する。ヒドロラーゼによるR2-B又はB-R2の加水分解性結合の切断は、アクセプタードメインR2の蛍光状態を蛍光状態A*に変化させる。蛍光状態A及び蛍光状態A*は、加水分解性結合の切断がBRETにおける変化を生じるように異なる。一部の実施形態では、Bは、Bに結合したR2がBを含まないR2のシグナルと比較してシグナルが低減するように選択される。
【００４９】
一部の実施形態では、ブロッキング基Bは、基質の添加でR2によって放射される光の強度が蛍光状態Aと蛍光状態A*との間で異なり、加水分解性結合の切断がBRETにおける変化を生じるようにR2の吸収スペクトルを変化させる。例えば、ヒドロラーゼによる加水分解性結合の切断は、R2によって放射される光の強度を増加させ得る。これは、アクセプタードメインがクエンチャーである場合、及びブロッキング基がアクセプタードメインの蛍光特性を変化させ、もはやクエンチャーとして作用しない場合に生じ得る。加水分解性結合の切断は、アクセプタードメインをクエンチャーに戻し、BRETにおける減少を生じる。代替的に、ヒドロラーゼによる加水分解性結合の切断は、R2によって放射される光の強度を減少させ得る。一部の実施形態では、ブロッキング基Bは、低蛍光状態にあるアクセプタードメインR2を安定化する。一部の実施形態では、ブロッキング基Bは、非蛍光状態にあるアクセプタードメインR2を安定化する。ヒドロラーゼによる加水分解性結合の切断後、R2は、もはや低又は非蛍光状態にない。結果として、ヒドロラーゼによる加水分解性結合の切断は、検出及び/又は定量され得るBRETにおける変化を生じる。
【００５０】
本明細書において使用される、「低蛍光状態」は、高蛍光状態のものから識別可能である蛍光状態を指す。例えば、低蛍光状態は、Bに結合していない場合のR2よりも少なくとも20%少ない蛍光、少なくとも30%少ない蛍光、少なくとも40%少ない蛍光、少なくとも50%少ない蛍光、少なくとも60%少ない蛍光、少なくとも70%少ない蛍光、少なくとも80%少ない蛍光、少なくとも90%少ない蛍光、少なくとも95%少ない蛍光、少なくとも98%少ない蛍光又は少なくとも99%少ない蛍光であり得る。一部の実施形態では、低蛍光状態は、Bに結合していない場合のR2よりも少なくとも90%少ない蛍光、少なくとも95%少ない蛍光、少なくとも98%少ない蛍光又は少なくとも99%少ない蛍光である。一部の実施形態では、低蛍光状態は、Bに結合していない場合のR2より20〜99%、30〜99%、40〜99%、50〜99%、60〜99%、70〜99%、80〜99%又は90〜99%の間少ない蛍光である。一部の実施形態では、低蛍光状態は、Bに結合していない場合のR2より80〜99%の間少ない蛍光、85〜97%少ない蛍光又は90〜95%の間少ない蛍光である。
【００５１】
本明細書において使用される、「非蛍光状態」は、バックグラウンドノイズの100倍レベル、バックグラウンドノイズの50倍レベル、バックグラウンドノイズの20倍レベル、バックグラウンドノイズの10倍レベル又はバックグラウンドノイズの5倍レベルである蛍光状態を指す。例えば、「非蛍光」状態にあるフルオロフォアは、ベースラインに近い励起及び発光を呈し得る。当業者が理解するとおり、「非蛍光状態」及び「低蛍光状態」は、相互に排他的でない。
【００５２】
低蛍光又は非蛍光状態にあるブロックされたフルオロフォアは、マスク(masked)又は潜在性(latent)フルオロフォアとも称される。
【００５３】
一部の実施形態では、ブロッキング基Bは、吸収スペクトルのピーク波長が蛍光状態Aと蛍光状態A*との間で異なり、加水分解性結合の切断がBRETにおける変化を生じるようにR2の吸収スペクトルを変化させる。例えば、一部の実施形態では、ブロッキング基Bは、R2が励起で光をわずかに放射する又は放射しないようにR2の吸収スペクトルを変化させる。これらの実施形態では、R1とR2との間にエネルギー転移がある場合があるが、加水分解性結合が切断されるまでR2はクエンチャーとして機能する。言い換えるとR1の基質の存在下で、未切断センサーは、R2-Bの作用のために暗い。ヒドロラーゼによって加水分解性結合が切断されると、R2はもはやクエンチャーとして機能せず、励起で光を放射する。結果として、R1の基質の添加での、R2からの蛍光発光における増加(及びBRETにおける対応する変化)が、検出及び/又は定量され得る。他の実施形態では、ブロッキング基Bは、R2の吸収スペクトルを変化させ、R1発光スペクトルに重複はない、又は実質的になく、R1とR2との間にエネルギー転移はない、又は実質的にない。ヒドロラーゼによる加水分解性結合の切断後、R2の蛍光状態は、R2の吸収スペクトルがR1の発光スペクトルと重複(少なくとも部分的に)し、R1とR2との間にエネルギー転移があるように変化する。結果として、R1の基質の添加での、R2からの蛍光発光における増加(及びBRETにおける対応する変化)が、検出及び/又は定量され得る。
【００５４】
一部の実施形態では、ブロッキング基Bは、発光スペクトルが蛍光状態Aと蛍光状態A*との間で異なり、加水分解性結合の切断がBRETにおける変化を生じるようにR2の発光スペクトルを変化させる。例えば、ヒドロラーゼによる加水分解性結合の切断は、R2によって放射される光の強度を増加させ得る。代替的に、ヒドロラーゼによる加水分解性結合の切断は、R2によって放射される光の強度を減少させ得る。一部の実施形態では、ブロッキング基Bは、低蛍光状態又は非蛍光状態にあるアクセプタードメインR2を安定化する。ヒドロラーゼによる加水分解性結合の切断後、R2は、もはや低蛍光状態又は非蛍光状態にない。結果として、ヒドロラーゼによる加水分解性結合の切断は、BRETにおける変化を生じ、検出及び/又は定量され得る。
【００５５】
代替的実施形態では、本開示によるブロッキング基Bは、クエンチャーとして作用でき、光エネルギーとして再度放射することなくBRET対の活性の結果として放射されるエネルギーを受容することによって、BRET対、R1及びR2によって放射される光の強度を減少させ得る。これらの実施形態では、R1とR2との間、及びR2とBとの間にエネルギー転移がある場合があるが、加水分解性結合が切断されるまでBはクエンチャーとして機能する。言い換えるとR1の基質の存在下で、センサーは、Bの作用によって暗い。ヒドロラーゼによって加水分解性結合が切断されると、Bは除去され、BRET対は、励起により光を放射する。結果として、R1の基質の添加での、BRETにおける変化は、検出及び/又は定量され得る。
【００５６】
Bは、当業者に周知の任意の好適なブロッキング基であってよく、目的のヒドロラーゼに基づいて当業者によって選択され得る。好適なブロッキング基は、R2の蛍光特性を調節できる基である。B又はR2に結合したBは、ヒドロラーゼの基質を含む。例えば一部の実施形態では、Bは、加水分解性結合を含む。一部の実施形態では、Bは、加水分解性結合を介してR2に結合される。
【００５７】
本開示の文脈では、Bは、リン酸含有成分、糖含有成分、アミノ酸含有成分、アミド含有成分、ヌクレオチド、ヌクレオシド、エステル又はエーテルを含む。一部の実施形態では、Bは、リン酸含有成分、糖含有成分又はエステルを含む。一部の実施形態では、Bは、リン酸含有成分又はエステルを含む。一部の実施形態では、Bは、エステルを含む。当業者が理解するとおり、ブロッキング基Bは、上の1つ又は複数として分類され得る。例えば、ヌクレオチドは、リン酸含有成分及びヌクレオチドの両方である。
【００５８】
一部の実施形態では、Bは、リン酸含有成分を含み得る。一部の実施形態では、Bは、1つ又は複数の共有結合的に結合したリン酸基を含むリン酸エステル成分を含む。例えば、Bは、次の構造:
【００５９】
【化１】
2020531022.tif 000003
【００６０】
を有するリン酸エステル成分を含み、
式中、nは1〜4の間の整数である。一連の実施形態では、BはH2PO4-である。一例として、BはR2を含む、又はR2にリン酸エステル結合によって結合されている。これらの実施形態では、センサーはホスファターゼの基質を形成できる。
【００６１】
代替的実施形態では、Bは、アミノ酸含有成分を含む。例えば、一部の実施形態ではBは、(Xaa)nを含み、ここでXaaはアミノ酸であり、nは1から10、2から9、3から7、4から6又は5の整数である。一部の実施形態では、Bは、プロテアーゼのための切断部位を含む、例えばBは、プロテアーゼのために好ましいP1-P1'アミノ酸を少なくとも含有する(Schechter and Berger, 1967、Schechter and Berger, 1968)。これらの実施形態では、センサーはプロテアーゼの基質を形成できる。
【００６２】
他の実施形態では、Bは、アミド結合を含む又はアミド結合を介してR2に結合されている。例えば、Bは、次の構造:
【００６３】
【化２】
2020531022.tif 000004
【００６４】
からなる群から選択されてよく
式中、Raは(Xaa)nを含み、ここで、Xaaはアミノ酸であり、nは1から10、2から9、3から7、4から6又は5の整数である。これらの実施形態では、センサーは、非ペプチド性C-N結合に作用するプロテアーゼ又はヒドロラーゼの基質を形成できる。
【００６５】
他の実施形態では、Bは、糖含有成分を含む。一例ではBは、R2を含む、又はグリコシド結合によってR2に結合されている。本明細書において使用されるグリコシド結合は、炭水化物(糖)分子を別の炭水化物であってもなくてもよい別の基に連結する共有結合である。一部の実施形態では、グリコシド結合は、O-グリコシド結合、S-グリコシド結合又はN-グリコシド結合である。例えば、Bは、グルコース成分、ガラクトース成分又はフルクトース成分を含む。これらの実施形態では、センサーは、α-グリコシダーゼ又はβ-グリコシダーゼ等のグリコシダーゼの基質を形成できる。
【００６６】
一部の実施形態では、Bは、ヌクレオシドを含む。ヌクレオシドは、窒素性塩基及び五炭糖を含む。一部の実施形態では、五炭糖はリボースである。一部の実施形態では、五炭糖はデオキシリボースである。一部の実施形態では、窒素性塩基は、アデニン(A)、ウラシル(U)、グアニン(G)、チミン(T)及びシトシン(C)からなる群から選択される。一部の実施形態では、ヌクレオシドは、シチジン、ウリジン、アデノシン、グアノシン、チミジン及びイノシンからなる群から選択される。一部の実施形態では、ヌクレオシドは、デオキシシチジン、デオキシウリジン、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン及びデオキシイノシンからなる群から選択される。これらの実施形態では、センサーは、ヌクレオシドヒドロラーゼの基質を形成できる。
【００６７】
一部の実施形態では、Bは、ヌクレオチドを含む。本明細書において使用されるヌクレオチドは、広範に定義され、少なくとも1つのリン酸基、窒素性塩基及び五炭糖を含む。一部の実施形態では、五炭糖はリボースである。一部の実施形態では、五炭糖はデオキシリボースである。一部の実施形態では、窒素性塩基は、アデニン(A)、ウラシル(U)、グアニン(G)、チミン(T)及びシトシン(C)からなる群から選択される。例えば、一部の実施形態では、ヌクレオチドはヌクレオシド及び少なくとも1つのリン酸基、例えば、これだけに限らないが、ヌクレオシド一リン酸、ヌクレオシド二リン酸及びヌクレオシド三リン酸である。一部の実施形態では、Bは、ATP、GTP、CTP及びUTP等の直鎖ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、Bは、サイクリックグアノシン一リン酸(cGMP)及びサイクリックアデノシン一リン酸(cAMP)等のサイクリックヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、Bは、コエンザイムA、フラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)、フラビンモノヌクレオチド(FMN)、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADP+)からなる群から選択される。これらの実施形態では、センサーは、N-グリコシルヒドロラーゼ又はヌクレオチドヒドロラーゼの基質を形成できる。
【００６８】
一部の実施形態では、Bは、オリゴヌクレオチドを含む。例えば、Bは、(XNT)nを含んでよく、式中XNTはヌクレオチドであり、nは1から10、2から9、3から7、4から6又は5の整数である。一部のXNTは、アデニン(A)、ウラシル(U)、グアニン(G)、チミン(T)及びシトシン(C)からなる群から選択される窒素性塩基を含む。これらの実施形態では、センサーは、ヌクレアーゼ又はDNAグリコシラーゼの基質を形成できる。
【００６９】
一部の実施形態では、Bはエステルを含む。一部の実施形態では、Bは、次の構造:
【００７０】
【化３】
2020531022.tif 000005
【００７１】
からなる群から選択され、
式中Raは、任意選択でハロゲン原子の1つで置換された、C1〜30直鎖又は分枝鎖アルキル、C3〜8シクロアルキル又はシクロアルケニル、C3〜8ヘテロシクリル(heterocyclyl)又はアリールである。一部の実施形態では、Raは、任意選択でハロゲン原子の1つで置換されたC1〜4直鎖又は分枝鎖アルキルである。一部の実施形態では、Raはメチル、エチル、ブチル、プロピル、ブチル又はt-ブチルである。一部の実施形態では、Raはメチルである。これらの実施形態では、センサーは、エステラーゼの基質を形成できる。一部の好ましい実施形態では、Bは次の構造:
【００７２】
【化４】
2020531022.tif 000006
【００７３】
を有する1つ又は複数の基を含み、式中、Raは本明細書に定義されるとおりである。好ましくはRaはメチルである。
【００７４】
一部の実施形態では、Bはチオエステルを含む。一部の実施形態では、Bは、次の構造:
【００７５】
【化５】
2020531022.tif 000007
【００７６】
からなる群から選択され、
式中Raは、任意選択でハロゲン原子の1つで置換されたC1〜30直鎖又は分枝鎖アルキル、C3〜8シクロアルキル又はシクロアルケニル、C3〜8ヘテロシクリル(heterocyclyl)又はアリールである。一部の実施形態では、Raは、任意選択でハロゲン原子の1つでの置換されたC1〜4直鎖又は分枝鎖アルキルである。一部の実施形態では、Raは、メチル、エチル、ブチル、プロピル、ブチル又はt-ブチルである。これらの実施形態では、センサーは、チオエステラーゼの基質を形成できる。
【００７７】
一部の実施形態では、Bは、エーテル又はチオエーテルを含む。一部の実施形態では、Bは、次の構造:
【００７８】
【化６】
2020531022.tif 000008
【００７９】
からなる群から選択され、
式中Raは、任意選択でハロゲン原子の1つで置換されたC1〜30直鎖又は分枝鎖アルキル、C3〜8シクロアルキル又はシクロアルケニル、C3〜8ヘテロシクリル又はアリールである。一部の実施形態では、Raは、任意選択でハロゲン原子の1つで置換されたC1〜4直鎖又は分枝鎖アルキルである。一部の実施形態では、Raは、メチル、エチル、ブチル、プロピル、ブチル又はt-ブチルである。これらの実施形態では、センサーは、デアルキラーゼ(dealkylase)の基質を形成できる。
【００８０】
一部の実施形態では、Bは、ハロゲン又はハロアルキルを含む。一部の実施形態では、Bは、
【００８１】
【化７】
2020531022.tif 000009
【００８２】
であり、
式中、nは1〜8の整数であり、Xはハロゲンである。一部の実施形態では、Xは、Cl、Br、F及びIからなる群から選択される。これらの実施形態では、センサーは、デハロゲナーゼの基質を形成できる。
【００８３】
一部の実施形態では、Bは、β-ラクタムを含む。一部の実施形態では、ペニシリン、セファロスポリン、セファマイシン又はカルバペネム等のβ-ラクタム抗菌薬を含む。一部の実施形態では、Bは、ペニシリン及びセファロスポリンからなる群から選択されるβ-ラクタム抗菌薬を含む。例えば、一部の実施形態ではBは、次の構造:
【００８４】
【化８】
2020531022.tif 000010
【００８５】
を含む。
【００８６】
これらの実施形態では、センサーはβ-ラクタマーゼの基質を形成できる。
【００８７】
一部の実施形態では、Bは、「トリメチルロック」を含む。本明細書において使用される「トリメチルロック」は、o-ヒドロキシ-ケイ皮酸誘導体である。これらの実施形態では、R2に結合したBは、「潜在性フルオロフォア」、「マスクフルオロフォア」又は「プロフルオロフォア」としばしば称され、低蛍光状態又は非蛍光状態にある。トリメチルロックを有するセンサーの例は、次の構造:
【００８８】
【化９】
2020531022.tif 000011
【００８９】
を有し、
式中、フルオロフォアは、トリメチルロックに連結され得る任意の好適なフルオロフォアであり、式中ORbは、目的のヒドロラーゼによってアンマスクフェノール酸素に加水分解され得る加水分解性結合を含む。例えば、Rbは、アシル基、ホスホリル基、スルフリル基又はグリコシル基であってよい。一例では、Rbは、アセチル基である。フルオロフォアに応じて、センサーは、1つより多い「トリメチルロック」を含む場合がある。フェノール性酸素がアンマスクされると、3個のメチル基間の好ましくない立体的相互作用は、急速なラクトン化、L-R1に結合したフルオロフォアの放出及びBRET比の増加を生じる。好適なフルオロフォアとして、これだけに限らないが、ローダミン110、7-アミノ-4-メチルクマリン及びクレシルバイオレットが挙げられる。この例では、センサーは、エステラーゼの基質を形成できる。別の例では、ORbは、OPO3H2基であり、センサーは、ホスファターゼの基質を形成できる。トリメチルロックに基づく潜在性フルオロフォア例は、Chandranら、2005、Levine and Raines, 2012、Lavisら、2006a及びLavisら、2006bに提供されている。理論に束縛されることなく、トリメチルブロックを加水分解性結合とフルオロフォアとの間に含むことは、ヒドロラーゼにとっての加水分解性結合への到達性を改善できると考えられる。
【００９０】
一部の実施形態では、Bは、自己犠牲型(self-immolative)リンカーを含む。自己犠牲型リンカーは、フルオロフォアと加水分解性結合との間に位置していてよく、ヒドロラーゼにとっての加水分解性結合への到達性を改善する可能性がある。本明細書において使用される「自己犠牲型リンカー」は、2つの分子種(この場合、フルオロフォア及び加水分解性結合)の間の可逆的共有結合である。加水分解性結合の切断に先立って、フルオロフォアは、低蛍光又は非蛍光状態にある。共有結合部の自己分解は、ヒドロラーゼによる加水分解性結合の切断によって引き起こされ、高蛍光状態のフルオロフォアを放出する。したがって、ヒドロラーゼによる加水分解性結合の切断は、BRET比を増加させる。好適な自己犠牲型蛍光発生プローブは、Zadlo-Dobrowolskaら、2016に記載されている。
【００９１】
加水分解性結合
本発明のセンサーは、加水分解性結合を含む。本明細書において使用される「加水分解性結合」は、ヒドロラーゼによって壊され得る共有結合である。言い換えると、加水分解性結合は、ヒドロラーゼの基質である。加水分解性結合の切断は、R2の蛍光特性を変化させ、BRETにおける変化を生じる。B又はR2に結合したBは、加水分解性結合を含む。一部の実施形態では、Bは、加水分解性結合を含む。他の実施形態では、Bは、加水分解性結合によってR2に結合されている。
【００９２】
本発明は、本開示のセンサーにおける任意の好適な加水分解性結合の使用を提供する。一部の例では、加水分解性結合は、エステル結合、アミド(又はペプチド)結合、エーテル結合、チオエーテル結合、グリコシド結合、チオエステル結合、リン酸エステル結合、炭素-窒素結合、酸無水物結合、炭素-炭素結合、ハロゲン結合、亜リン酸-窒素結合、イオウ-窒素結合、炭素-亜リン酸結合、イオウ-イオウ結合及び炭素-イオウ結合からなる群から選択される。一部の実施形態では、加水分解性結合は、エステル結合、アミド(又はペプチド)結合、エーテル結合、チオエーテル結合、グリコシド結合、チオエステル結合、リン酸エステル結合及び炭素-窒素結合からなる群から選択される。好ましい実施形態では、加水分解性結合は、エステル結合である。
【００９３】
本開示の実施形態では、R2-B/B-R2は、加水分解性結合を含み、目的のヒドロラーゼの基質を形成する。R2-B/B-R2の好適な非限定的例は、Table 1(表1)に列挙されている。
【００９４】
【表１Ａ】
2020531022.tif 000012
【００９５】
【表１Ｂ】
2020531022.tif 000013
【００９６】
【表１Ｃ】
2020531022.tif 000014
【００９７】
【表１Ｄ】
2020531022.tif 000015
【００９８】
好ましい実施形態では、R2-B/B-R2は、フルオレセインアセテート又はフルオレセインジアセテートを含む。
【００９９】
上記化合物は、商業的供給者から入手可能であり、当技術分野において周知の方法により合成され得る、又は公開された方法により合成され得る。
【０１００】
連結エレメント
本発明のセンサーは、連結エレメント、Lを含む。連結エレメントは、R1をR2に結合する分子成分である。一部の実施形態では、連結エレメント(又はその一部)は、R1の欠くことのできない部分である(例えば、R2が天然に存在するシステイン又はリジンの側鎖を介してR1に直接結合するようにR1のN若しくはC末端又はR1中の天然に存在するシステイン若しくはリジン残基)。一部の実施形態では、連結エレメント(又はその一部)は、R2の欠くことのできない部分である(例えば、R1が、アミン若しくはチオール基又はソルターゼ認識配列を介してR2に直接結合するR2中のアミン又はチオール基)。一部の実施形態では連結エレメントは、R1をR2に結合する別の化学実体である。
【０１０１】
好適な連結エレメントとして、これだけに限らないが、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレングリコール鎖の少なくとも1つの酸素が窒素で置換されているポリアルキレングリコール、ポリアミン(Herveら、2008)、ペプチド核酸(PNA) (Egholmら、2005)、ロックド核酸(LNA) (Singhら、1998)、トリアゾール、ピペラジン、オキシム、チアゾリジン、芳香族環系、アルカン、アルケン、アルキン、サイクリックアルカン、サイクリックアルケン、アミド、チオアミド、エーテル及びヒドラゾンが挙げられる。一部の実施形態では、連結エレメントは、アルキル鎖、グリコール、ポリグリコール、エーテル、ポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド又はポリヌクレオチドを含む、又はこれらからなる群から選択される。一部の実施形態では、連結エレメントは、ペプチド又はポリペプチドである。一部の実施形態では、連結エレメントは、ポリエチレングリコール又はポリプロピレングリコールである。
【０１０２】
連結エレメントの長さは、選択された連結エレメント及び選択されたR1-R2対に依存する。例えば、連結エレメントの長さは、選択されたR1-R2対の作動距離範囲に依存する。一部の実施形態では、連結エレメントの長さは、BRET比における変化を変更する又は調節するために変えられてよい。
【０１０３】
一部の実施形態では、連結エレメントは、ポリアルキレングリコールを含み得る。好適なポリアルキレングリコールとして、ポリエチレングリコール(PEG)及びメトキシポリエチレングリコール(mPEG)が挙げられる。PEGは、エチレングリコールのポリマーであり、置換に応じて、化学式C2n+2H4n+6On+2を有し得る。例えば、連結エレメントは、約40に至るエチレングリコール成分を有するPEGを含む。一部の実施形態では、連結エレメントは、約30に至るエチレングリコール成分を有するPEGリンカーを含む。一部の実施形態では、連結エレメントは、約20に至るエチレングリコール成分を有するPEGリンカーを含む。一部の実施形態では、連結エレメントは、約10に至るエチレングリコール成分を有するPEGリンカーを含む。一部の実施形態では、連結エレメントは、約8に至るエチレングリコール成分を有するPEGリンカーを含む。一部の実施形態では、連結エレメントは、約6に至るエチレングリコール成分を有するPEGリンカーを含む。他の有用なポリアルキレングリコールは、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール、PEG-グリシジルエーテル及びPEG-オキシカルボニルイミダゾールである。
【０１０４】
代替的実施形態では、連結エレメントは、オリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、ヌクレオシド塩基若しくは修飾ヌクレオシド塩基又は両方を含み得る。連結エレメントは、約50に至るヌクレオシド塩基及び/又は修飾ヌクレオシド塩基を有し得る。一実施形態では、連結エレメントは、約40に至るヌクレオシド塩基及び/又は修飾されるヌクレオシド塩基を含み得る。別の実施形態では連結エレメントは、約30に至るヌクレオシド塩基及び/又は修飾ヌクレオシド塩基を含む。別の実施形態では連結エレメントは、約20に至るヌクレオシド塩基及び/又は修飾ヌクレオシド塩基を含む。別の実施形態では連結エレメントは、約10に至るヌクレオシド塩基及び/又は修飾ヌクレオシド塩基を含む。更に別の実施形態では、連結エレメントは、約5に至るヌクレオシド塩基及び/又は修飾ヌクレオシド塩基を含む。
【０１０５】
好ましい実施形態では、連結エレメントは、ポリペプチドを含む。ペプチド、オリゴペプチド及びポリペプチドは、本明細書において互換的に用いられ2つ以上のアミノ酸のポリマーを指す。典型的には、オリゴペプチドは、2から10の間のアミノ酸を含有する鎖について使用され、用語ポリペプチドは、10を超えるアミノ酸を含有する鎖について使用される。ペプチドは、天然に存在する又は存在しないアミノ酸又はこれらの組合せを含み得る。ペプチド又はポリペプチドは、修飾アミノ酸を含み得る。一実施形態では、連結エレメントは、約50に至るアミノ酸残基を有し得る。一実施形態では、連結エレメントは、約40に至るアミノ酸残基を有し得る。別の実施形態では、連結エレメントは、約37に至るアミノ酸残基を含む。別の実施形態では、連結エレメントは、約31に至るアミノ酸残基を含む。別の実施形態では、連結エレメントは、約30に至るアミノ酸残基を含む。別の実施形態では、連結エレメントは、約28に至るアミノ酸残基を含む。別の実施形態では、連結エレメントは、約23に至るアミノ酸残基を含む。別の実施形態では、連結エレメントは、約21に至るアミノ酸残基を含む。別の実施形態では、連結エレメントは、約20に至るアミノ酸残基を含む。別の実施形態では、連結エレメントは、約13に至るアミノ酸残基を含む。別の実施形態では、連結エレメントは、約11に至るアミノ酸残基を有し得る。別の実施形態では、連結エレメントは、約10に至るアミノ酸残基を含む。更に別の実施形態では、連結エレメントは、約5に至るアミノ酸残基を含む。更に別の実施形態では、連結エレメントは、約3に至るアミノ酸残基を含む。更に別の実施形態では、連結エレメントは、1アミノ酸残基を含む。更に別の実施形態では、連結エレメントは、約1〜30の間のアミノ酸、約5〜25の間のアミノ酸、約7〜23の間のアミノ酸、約10〜20の間のアミノ酸又は約13〜18の間のアミノ酸を含む。更に別の実施形態では、連結エレメントは、約1〜30の間のアミノ酸、約10〜30の間のアミノ酸、約20〜30の間のアミノ酸、約25〜30の間のアミノ酸又は約28アミノ酸を含む。好ましい実施形態では、連結エレメントは、約25〜30アミノ酸又は約28アミノ酸を含む。好ましい実施形態では、連結エレメントは、遊離システイン又は遊離リジンを含
む。本明細書において使用される、「遊離」は、アミノ酸を定義する場合、未修飾側鎖、例えばそれぞれ-SH基又は-NH2/-NH3+基を有するものを指す。一部の実施形態では、連結エレメントは、R1のN末端のペプチド配列である。一部の実施形態では、連結エレメントは、R1のC末端のペプチド配列である。
【０１０６】
一部の実施形態では、連結エレメントは、配列Cを含むペプチドである。一部の実施形態では、連結エレメントは、配列CDDKDRWGSEF (配列番号5)を含むペプチドである。一部の実施形態では、連結エレメントは、配列CQQMGRDLYDDDDKDRWGSEF (配列番号6)を含むペプチドである。一部の実施形態では、連結エレメントは、配列MRGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDKDRWGSEF (配列番号7)を含むペプチドである。一部の実施形態では、配列中の少なくとも1つのアミノ酸は、システインによって置き換えられている。例えば、配列番号5、配列番号6又は配列番号7中の少なくとも1つのアミノ酸は、システインによって置き換えられている。一部の実施形態では、連結エレメントは、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47及び配列番号48のいずれか1つに提供される配列を含む又はそれからなる。
【０１０７】
一部の実施形態では、連結エレメントは、微生物トランスグルタミナーゼに対する高親和性Gln基質を含む(Oteng-Pabiら、2014)。例えば、連結エレメントは、WALQRPH (配列番号21)及びWELQRPY (配列番号22)からなる群から選択される配列を有するペプチドを含む。一部の実施形態では、連結エレメントは、ソルターゼ認識配列を含む(Theileら、2013)。例えば、連結エレメントは、配列LPXTを有するペプチドを含み、式中Xは任意のアミノ酸である(配列番号23)。当業者が理解するとおり、ソルターゼ媒介反応は、R1のN末端を標識化するために使用され得る。一部の実施形態では、連結エレメントは、スペーサー配列を更に含む。一部の実施形態では、スペーサー配列は、1つ又は複数のグリシン、セリン及び/又はスレオニン残基を含む。例えば、一部の実施形態では、スペーサー配列は、GSSGGS (配列番号24)、GGSGGS (配列番号25)、GGTGGG (配列番号26)、GGGGGT (配列番号27)、LQGGTGGG (配列番号28)、FEGGTGGG (配列番号29)及びGGSGGSL (配列番号30)から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１０８】
連結エレメントは、約5kD未満、約4.5kD未満、約4.0kD未満、約3.5kD未満、約3kD未満又は約2.5kD未満の質量を有する場合があり、約2kD未満であってよい。連結エレメントは、約1kDaから5kDの間、約2kDaから約5kDの間及び約3kDaから約5kDの間の質量を有する場合がある。
【０１０９】
一部の実施形態では、連結エレメントは、反応性成分を含む。反応性成分は、本明細書に記載のセンサー分子を形成するように化学的反応の任意の手段によってR1及び/又はR2中の化学的基と反応できる。任意の好適な反応性成分は、使用され得る。一部の実施形態では、反応性成分は、スルフヒドリル反応性成分、アミン反応性成分及びカルボニル反応性成分からなる群から選択される。一部の実施形態では、反応性成分は、スルフヒドリル反応性成分、アミン反応性成分及び/又はカルボニル反応性成分と反応する基である。例えば、反応性成分は、遊離システイン残基、遊離リジン残基又はカルボニル基を含み得る。
【０１１０】
例えば、一部の実施形態では、連結エレメントに、R1及び/又はR2中の遊離システイン(例えば、天然に存在するシステイン又は変異によって導入されたシステイン)と、それらの間に共有結合性連結を形成するように反応性であるスルフヒドリル反応性成分を加える。他の実施形態では、連結エレメントに、R1及び/又はR2中のリジン残基(例えば、天然に存在するリジン又は変異によって導入されたリジン)と、それらの間に共有結合性連結を形成するように反応性であるアミン反応性成分を加える。他の実施形態では、連結エレメントに、R1及び/又はR2中のカルボニル基と、それらの間に共有結合性連結を形成するように反応性であるカルボニル反応性成分を加える。更に別の実施形態では、連結エレメントに、R2及び/又はR1中のスルフヒドリル反応性成分と、それらの間に共有結合性連結を形成するように反応性である遊離システイン又は遊離リジンを加える。更に別の実施形態では、連結エレメントに、R2及び/又はR1中のアミン反応性成分と、それらの間に共有結合性連結を形成するように反応性である遊離リジンを加える。別の実施形態では、連結エレメントに、R2及び/又はR1中のカルボニル反応性成分と、それらの間に共有結合性連結を形成するように反応性であるカルボニル基を加える。
【０１１１】
スルフヒドリル反応性成分として、チオール、トリフレート、トレシレート(tresylate)、アジリジン、オキシラン、S-ピリジル、マレイミドベンゾイルスルホサクシミドエステル又はマレイミド成分が挙げられる。好ましいスルフヒドリル反応性成分として、マレイミド、アクリルアミド、フェニルカルボニルアクリルアミド及びヨードアセトアミドが挙げられる。アミン反応性成分として、活性エステル(これだけに限らないが、サクシニジミルエステル、スルホサクシニジミルエステル、テトラフルオロフェニルエステル及びスルホジクロロフェノールエステルが挙げられる)、イソチオシアネート、ジクロロトリアジン、アリールハライド、アシルアジド及びスルホニルクロリドが挙げられる。これらのアミン反応性成分の内、活性エステルは、それらが安定なカルボキサミド結合を産生することから好ましい試薬である(例えば、Banks and Paquette, 1995を参照されたい)。カルボニル反応性成分として、ヒドラジド及びアルコキシアミン等の一級アミンが挙げられる。カルボニル含有成分として、アルデヒド(RCHO)及びケトン(RCOR')が挙げられる。一部の例では、アルデヒドは、連結エレメント中の糖基の過ヨウ素酸化によって作出される。
【０１１２】
一例では、連結エレメントがPEG(又はNPEG)を含む場合、PEGリンカーをR1及び/又はR2に結合するために使用され得る求電子性又は求核性基等の1つ又は複数の反応性成分も含む場合がある(例えば、WO 2007/140282を参照されたい)。一部の実施形態では、連結エレメントは、PEG-二酸又はNPEG-二酸由来である。これらの実施形態では、PEG-二酸又はNPEG-二酸連結エレメントのカルボキシ基は、アミド結合を介してR1の末端残基の末端アミノ基に連結される。PEG-二酸又はNPEG-二酸連結エレメントの他のカルボキシ基は、アミド結合を介してR2に連結される。
【０１１３】
一例では、連結エレメントがペプチドを含む場合、システイン残基及び/又はリジン残基も含み得る。好ましい実施形態では、連結エレメントは、システインを含む。
【０１１４】
当業者は、リンカーの長さが生物発光タンパク質とアクセプタードメインとの間のBRETに影響を与え得ることを理解する。したがって、リンカーの好ましい長さは、センサーにおいて使用される生物発光タンパク質及びアクセプタードメインに応じて変わる場合がある。
【０１１５】
非タンパク質アクセプタードメイン(R2)
R2は、任意の好適な非タンパク質アクセプタードメインであってよい。本明細書において使用される、「アクセプタードメイン」は、生物発光タンパク質、R1(本明細書に記載のとおり)の活性の結果として放射されるエネルギーを受容できる任意の分子である。一部の実施形態では、非タンパク質アクセプタードメインは、蛍光アクセプタードメイン又はクエンチャーであってよい。本明細書において使用される、用語「蛍光アクセプタードメイン」(本明細書において「蛍光アクセプター分子」とも称される)は、生物発光タンパク質、R1の活性の結果として放射されたエネルギーを受容でき、光エネルギーとしてそれを再度放射する任意の化合物を指す。本明細書において使用される、用語「クエンチャー」は、生物発光タンパク質、R1の活性の結果として放射されたエネルギーを、光エネルギーとしてそれを再度放射することなく受容できる任意の化合物を指す。非蛍光アクセプターは、クエンチャーであってよい。
【０１１６】
本発明において使用され得る多数のアクセプタードメインがある。好適なアクセプタードメインは、非タンパク質であり、好ましい実施形態においてR2が有機アクセプタードメインであるような有機分子を含む。好ましい実施形態では、アクセプタードメインは、量子ドットではない。
【０１１７】
一部の実施形態では、R2は、非タンパク質蛍光アクセプタードメインである。任意の好適な非タンパク質蛍光アクセプタードメインが使用され得る。一部の実施形態では、R2は、Alexa Fluor色素、Bodipy色素、Cy色素、フルオレセイン、ダンシル、ウンベリフェロン、マリーナブルー(Marina Blue)、カスケードブルー(Cascade Blue)、カスケードイエロー(Cascade Yellow)、パシフィックブルー、オレゴングリーン、テトラメチルローダミン、ローダミン、クマリン、ホウ素ジピロメテン(BODIPY)、レゾルフィン、テキサスレッド、希土類元素キレート又はこれらの任意の組合せ若しくは誘導体から選択される。誘導体の例として、これだけに限らないが、アミン反応性誘導体、アルデヒド/ケトン反応性誘導体、シトシン反応性又はスルフヒドリル反応性誘導体が挙げられる。
【０１１８】
一部の実施形態では、R2は、フルオレセイン又はその誘導体である。好適な誘導体として、これだけに限らないが、アミン-反応性フルオレセイン誘導体、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、NHS-フルオレセイン、NHS-LC-フルオレセイン、スルフヒドリル-反応性フルオレセイン誘導体、5-(及び6)-ヨードアセトアミド-フルオレセイン、フルオレセイン-5-マレイミド、フルオレセイン-6-マレイミド、SAMSA-フルオレセイン、アルデヒド/ケトン及びシトシン反応性フルオレセイン誘導体、フルオレセイン-5-チオセミカルバジド及び5-(((2-(カルボヒドラジン)メチル)チオ)アセチル)-アミノフルオレセインが挙げられる。一部の実施形態では、R2は、フルオレセイン-5-マレイミド誘導体である。一部の実施形態では、R2は、フルオレセイン-6-マレイミド誘導体である。好ましい実施形態では、B-R2又はR2-Bは、フルオレセイン-ジアセテート-6-マレイミドである。好ましい実施形態では、B-R2又はR2-Bは、フルオレセイン-ジアセテート-5-マレイミドである。
【０１１９】
一部の実施形態では、R2は、ローダミン又はその誘導体である。好適な誘導体として、これだけに限らないが、アミン反応性ローダミン誘導体、テトラメチルローダミン-5-(及び6)-イソチオシアネート、NHS-ローダミン、Lissamine(登録商標)ローダミンBスルホニルクロリド、Lissamine(登録商標)ローダミンBスルホニルヒドラジン、スルフィドリル(sulphydryl)反応性ローダミン誘導体、テトラメチルローダミン-5-(及び6)-ヨードアセトアミド、アルデヒド/ケトン及びシトシン反応性ローダミン誘導体、テキサスレッドヒドラジン及びテキサスレッドスルホニルクロリドが挙げられる。一部の実施形態では、R2は、スルホローダミンB、C2マレイミド誘導体である((RhodamineRed(登録商標) C2-マレイミド又は2-(6-(ジエチルアミノ)-3-(ジエチルイミニオ)-3H-キサンテン-9-イル)-5-(N-(2-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)エチル)スルファモイル)ベンゼンスルホネートとも称される)。
【０１２０】
一部の実施形態では、R2は、クマリン又はその誘導体である。好適な誘導体として、これだけに限らないが、アミン反応性クマリン誘導体、AMCA、AMCA-NHS、AMCA-スルホ-NHS、スルフィドリル反応性クマリン誘導体、AMCA-HPDP、DCIA、アルデヒド及びケトン反応性クマリン誘導体並びにAMCA-ヒドラジドが挙げられる。
【０１２１】
一部の実施形態では、R2は、ボロン-ジピロメテン(dipyrromethene) (BODIPY)又はその誘導体である。好適な誘導体として、これだけに限らないが、アミン反応性ボロン-ジピロメテン色素、BODIPY FL C3-SE、BODIPY 530/550 C3、BODIPY 530/550 C3-SE、BODIPY 530/550 C3-ヒドラジド、BODIPY 493/503 C3-ヒドラジド、BODIPY FL C3-ヒドラジド、スルフィドリル反応性ボロン-ジピロメテン色素、BODIPY FL 1A、BOPDIY 530/550 1A、Br-BOPDIPY 493/503並びにアルデヒド及びケトン反応性ボロン-ジピロメテン色素が挙げられる。
【０１２２】
一部の実施形態では、R2は、Cy (シアニン)色素又はその誘導体である。好適な誘導体として、これだけに限らないが、アミン反応性シアニン色素、チオール反応性シアニン色素及びカルボニル反応性シアニン色素が挙げられる。
【０１２３】
一部の実施形態では、R2は、クエンチャーである。任意の好適なクエンチャーが使用され得る。一部の実施形態では、R2は、DABCYL [4-((4-(ジメチルアミノ)フェニル)アゾ)安息香酸]、DABSYL (ジメチルアミノアゾスルホン酸)、金及び銀等の金属ナノ粒子、ブラックホールクエンチャー(BHQ)、QSY色素並びにQXLクエンチャーからなる群から選択される。一部の実施形態では、R2は、DABCYL [4-((4-(ジメチルアミノ)フェニル)アゾ)安息香酸]、DABSYL (ジメチルアミノアゾスルホン酸)、ブラックホールクエンチャー(BHQ)、QSY色素及びQXLクエンチャーからなる群から選択される。
【０１２４】
一部の実施形態では、連結エレメントLにカップリング基を添加することによって、及び/又はR2中に存在するカップリング基によって、R1中に天然に存在する反応性成分、連結エレメントL中に天然に存在する反応性成分を介してセンサーを形成するようにR2は、連結エレメントLに結合され得る。例えば、一部の実施形態では、連結エレメントは、R2がシステインのチオール含有側鎖を介して連結エレメントLに結合され得るようにシステインを含む。一部の実施形態では、連結エレメントは、R2がリジンのアミン含有側鎖を介して連結エレメントLに結合され得るようにリジンを含む。一部の実施形態では、連結エレメントLは、R2が非天然アミノ酸の側鎖を介して連結エレメントLに結合され得るように非天然アミノ酸を含む。一部の実施形態では、連結エレメントLは、R2がヒドラジド反応化学又はアルコキシアミン反応化学を介して連結エレメントLに結合され得るように糖基を含む。
【０１２５】
例示的カップリング基は、本明細書以下に記載され、そのようなカップリング基を、R2若しくはR1に結合するために連結エレメントLに、又は連結エレメントLに結合するためにR2若しくはR1中に組み込むための方法は、当業者に周知である。例えば、好適なカップリング基及び関連技術は、Greg T. Hermanson, Bioconjugate Techniques (Third Edition), Academic Press (2013)に記載及び説明されている。保護された機能性成分又は保護されたカップリング基を含む本発明の化合物の場合は、保護基の除去は、当技術分野において周知の方法によって実施される。この文脈において使用される場合、用語「結合する」は、連結基LとR1及び/又はLとR2との間の共有結合の形成を指す。
【０１２６】
好適なカップリング基として、これだけに限らないが、システイン特異的求電子剤及び/又はアミン特異的求電子剤が挙げられる。一部の実施形態では、R1、R2及び連結エレメントの1つ又は複数は、システイン特異的求電子剤を含む。当業者に周知の任意のシステイン特異的求電子剤は、使用され得る。例えば、システイン特異的求電子剤として、これだけに限らないが、マレイミド、アルキルハライド、アリールハライド、α-ハロカルボニル(例えば、ヨードアセトアミド)、ピリジルジスルフィド、アクリルアミド及びフェニルカルボニルアクリルアミドが挙げられる。他のチオール特異的カップリング基として、これだけに限らないが、ハロアセチル及びアルキルハライド誘導体、アジリジン、アクリロイル誘導体、アリール化剤、チオール-ジスルフィド交換試薬、ビニルスルホン誘導体、金属チオール供与結合(dative bond)、天然化学的ライゲーション、メチオニンのシスプラチン修飾及びシステインが挙げられる。
【０１２７】
一部の実施形態では、システイン特異的求電子剤は、図2に示されるマレイミド、アクリルアミド及びフェニルカルボニルアクリルアミド等のマイケルアクセプターである。一部の実施形態では、R1は、マイケルアクセプターに直接結合され得る、又は連結化学を介してマイケルアクセプターに間接的に結合され得る。好適な連結化学の例として、これだけに限らないが、C1〜6アルキル直鎖又は分枝鎖、-NO2、-NH2、=O、ハロゲン、トリハロメチル、C1〜6アルコキシ,-OH、-CH2OH及び-C(O)NH2からなる群から独立に選択される1から4個の置換基を用いて任意選択で置換された0〜4個の骨格(すなわち、非置換基)ヘテロ原子を含む、C1〜10アルキレン直鎖又は分枝鎖が挙げられる。好ましい実施形態では、システイン特異的求電子剤は、反応スキーム:
【０１２８】
【化１０】
2020531022.tif 000016
【０１２９】
により連結されるマレイミドであり、
式中、R2-L-SHは、遊離チオールを、遊離チオール又は保護チオールの脱保護後のいずれかとして含む。
【０１３０】
当業者に周知の任意のアミン特異的求電子剤は、使用され得る。例えば、アミン特異的求電子剤として、これだけに限らないが、活性化エステル、スルホニルクロリド及びイソチオシアネートが挙げられる。他のアミン特異的カップリング基として、これだけに限らないが、イソシアネート、アシルアジド、N-ヒドロキシサクシニミド(NHS)エステル、トシレートエステル、アルデヒド及びグリコキサール(glycoxal)、エポキシド及びオキシラン、炭酸、アリール化剤、イミドエステル、カルボジイミド、酸無水物(ahydride)、フルオロフェニルエステル、ヒドロキシメチルホスフィン誘導体及びアミンのグアニジン化(guanidination)が挙げられる。
【０１３１】
好ましいアミン特異的求電子剤として、イミドエステル及びNHSエステルが挙げられる。NHSエステルは、一次又は二次アミンとの反応で安定産生物を生じる。カップリングは、生理的pHで効率的であり、NHS-エステル架橋-リンカーは、溶液中で、イミデート対応物よりも更に安定である。一級アミンは、NHS-エステルの主な標的である。タンパク質のN末端に存在する到達可能なα-アミン基は、NHS-エステルと反応でき、アミドを形成する。リジンのε-アミノ基は、NHS-エステルと著しく反応する。共有アミド結合は、NHS-エステル架橋結合剤が一級アミン反応する場合に形成され、N-ヒドロキシサクシニミドを放出する。
【０１３２】
他の好適な技術は、R2をLに結合するために使用され得る。例えば、カルボジイミドは、カルボキシを一級アミン又はヒドラジドにカップルするために使用でき、アミド又はヒドラゾン結合の形成を生じる。カルボジイミドは、カルボジイミドとカップルされる分子との間に架橋が形成されないことにおいて他の薬剤と異なり;むしろ、ペプチド結合が、利用可能なカルボキシ基と利用可能なアミン基との間に形成される。利用可能性に応じて、タンパク質のカルボキシ末端は、標的化されてよく、グルタミン酸及びアスパラギン酸側鎖も同様である。別の例では、シアノ水素化ホウ素ナトリウムの存在下でアルデヒドを使用する、還元アルキル化は、R2をLに結合するために使用され得る。
【０１３３】
一部の実施形態では、R2は、酵素媒介標識化を介してLに結合され得る。好適な酵素として、これだけに限らないが、ソルターゼ及びランスグルタミナーゼが挙げられる。ソルターゼは、タンパク質の部位特異的N末端標識化に影響を与えることができる(Theileら、2013)。トランスグルタミナーゼは、グルタミン特異的残基の部位特異的標識化に影響を与える(Oteng-Pabiら、2014)。例えば、ソルターゼ媒介N末端標識化のためにR2は、配列LPXTZを有するペプチドを含むカップリング基を含み、式中Xは任意のアミノ酸であり、Zはグリシン又はアラニンである(配列番号31)。
【０１３４】
他の技術として、これだけに限らないが、ネイティブ・ケミカル・ライゲーション、ディールス・アルダー試薬対、ヒドラジン-アルデヒド試薬対、アミノオキシ-アルデヒド試薬対、クリック化学及びシュタウディンガーライゲーションが挙げられる。これらの技術は、Greg T. Hermanson, Bioconjugate Techniques (Third Edition), Academic Press (2013)により詳細に記載されている。
【０１３５】
カップリング基は、官能基特異性に基づいて本明細書において定義されるが、当業者は、これらのカップリング基が目的のもの以外の官能基と反応する可能性を有することを認識している。例えば、N-ヒドロキシサクシニミドエステルは、本明細書においてアミン特異的カップリング基と定義されるが、それらはシステイン、ヒスチジン、セリン、スレオニン及びチロシン側鎖基とも反応できる。同様に、マレイミドは本明細書においてシステイン特異的求電子剤であると定義されるが、それらは、適した条件下でアミンとも反応できる。
【０１３６】
生物発光タンパク質(R1)
生物発光は、化学発光の1形態である。化学発光は、化学反応の結果としての、熱の限定的な放射を伴うエネルギーの放射(発光)である。化学発光放射は、有機色素の励起状態からのエネルギーとして生じ、化学的に誘導され、基底状態に減衰する。化学発光放射の持続時間及び強度は、反応溶液中に存在する化学試薬の量に主に依存する。非酵素的化学発光は、触媒の存在下での有機色素と酸化剤との間の化学反応の結果である。生物発光は、しばしば生物発光タンパク質と称される酵素の活性に依存する。本明細書において使用される、用語「生物発光タンパク質」は、発光を生じる好適な基質に作用できる任意のタンパク質を指す。
【０１３７】
生物発光タンパク質が、基質を、緩和された場合にエネルギーを放つ活性化産生物に転換する酵素であることは理解される。活性化産生物(基質への生物発光タンパク質の活性によって生成される)は、アクセプター分子に転移される生物発光タンパク質生成発光の供給源である。
【０１３８】
例示的生物発光タンパク質は、本明細書以下に記載されている(例えば、Table 2(表2)を参照されたい)。光放射系は、周知であり、細菌、プロトゾア、腔腸動物、軟体動物、魚、ヤスデ、ハエ目(fly)、真菌、ワーム(worm)、甲殻類及び甲虫、具体的にはピロフォルス(Pyrophorus)属のコメツキムシ及びフォティヌス(Photinus)、フォツリス(Photuris)及びルシオラ(Luciola)属のホタルを含む多数の発光生物から単離されている。生物発光を呈する追加的生物は、WO 00/024878、WO 99/049019及びViviani (2002)に列挙されている。
【０１３９】
本発明のセンサーでは、R1は、任意の好適な生物発光タンパク質であり得る。1つの非常によく知られた例は、特定の生化学物質、ルシフェリン(天然に存在するフルオロフォア)がルシフェラーゼ活性を有する酵素によって酸化されるエネルギー産生化学反応を触媒するルシフェラーゼとして周知のクラスのタンパク質である(Hastings, 1996)。多種多様な生物、細菌、藻類、真菌、昆虫、魚及び他のマリンフォームの種を含む原核生物及び真核生物の両方は、この様式で光エネルギーを放射することができ、それぞれ、他の生物のものと化学的に異なる特異的なルシフェラーゼ活性及びルシフェリンを有する。ルシフェリン/ルシフェラーゼ系は、形態、化学及び機能において非常に多様である。そのため、ルシフェラーゼ活性を有する生物発光タンパク質は、種々の供給源から又は種々の手段によって入手可能である。ルシフェラーゼ活性を有する生物発光タンパク質の例は、US 5,229,285、US 5,219,737、US 5,843,746、US 5,196,524及びUS 5,670,356において見出すことができる。2つの最も広く使用されているルシフェラーゼは:(i)ウミシイタケルシフェラーゼ(R.ニレフォルミス由来)、35kDaタンパク質、基質としてセレンテラジンを使用し、480nmの光を放射する(Lorenzら、1991);及び(ii)ホタルルシフェラーゼ(フォティヌス・ピラリス由来)、61kDaタンパク質、基質としてルシフェリンを使用し、560nmの光を放射する(de Wetら、1987)である。
【０１４０】
ガウシアルシフェラーゼ(ガウシア・プリンセプス(Gaussia princeps)由来)は、生化学アッセイにおいて使用されている(Verhaegenら、2002)。ガウシアルシフェラーゼは、急速な反応でセレンテラジンを酸化し、470nmに明るい光放射を生じる20kDaタンパク質である。
【０１４１】
本発明のために有用なルシフェラーゼは、ヒカリキノコバエ(Anachnocampa)種からも特徴付けられている(WO 2007/019634)。これらの酵素は、大きさ約59kDaであり、スペクトラムの青色部分内に放射スペクトルを有する発光反応を触媒するATP依存性ルシフェラーゼである。
【０１４２】
天然に存在する生物発光タンパク質の生物学的に活性な変種又は断片は当業者によって容易に産生され得る。本発明のために有用なそのような変種の3種の例は、ウミシイタケルシフェラーゼのそれぞれ変種であるRLuc2(Loeningら、2006)、RLuc8(Loeningら、2006)及びRLuc8.6-535(Loeningら、2007)である。RLuc8は、RLucと比較して変異A55T、C124A、S130A、K136R、A143M、M185V、M253L及びS287Lを含有する。RLuc2は、RLucと比較して変異M185V及びQ235Aを含有する。さらなる例は、NanoLuc(登録商標)である(Hallら、2012)。更に好ましい実施形態では、BRET化学発光ドナーの配列は、天然ウミシイタケルシフェラーゼセンサーを組み込んでいるセンサー分子よりも大きな熱安定性を有するように選択される。RLuc2又はRLuc8は、天然ウミシイタケルシフェラーゼ配列を組み込んでいるセンサーよりも≧5x又は≧10x高い発光を結果として呈する、好適な選択の好都合な例である。そのような増強された発光は、任意の所与の時間分解能のための試薬の更に有効な利用を可能にすることから顕著な利益を有する。生物発光タンパク質の非限定的例は、Table 2(表2)に提供されている。
【０１４３】
【表２Ａ】
2020531022.tif 000017
【０１４４】
【表２Ｂ】
2020531022.tif 000018
【０１４５】
【表２Ｃ】
2020531022.tif 000019
【０１４６】
代替的に、本発明において使用され得る非ルシフェラーゼ、生物発光タンパク質は、発光シグナルを発生させる好適な基質に作用できる任意の酵素である。そのような酵素の具体的な例は、β-ガラクトシダーゼ、ラクタマーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-グルクロニダーゼ及びβ-グルコシダーゼである。これらの酵素のための合成発光基質は、当技術分野において十分周知であり、Tropix Inc.社(Bedford、MA、USA)等の企業から商業的に入手できる。
【０１４７】
本発明のために有用なペルオキシダーゼの例は、Hushpulianら、(2007)によって記載されている。
【０１４８】
一部の実施形態では、R1として、これだけに限らないが、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ラクタマーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-グルクロニダーゼ及びβ-グルコシダーゼ又はその生物学的に活性な断片若しくは変種が挙げられる。
【０１４９】
好ましい実施形態では、生物発光タンパク質はルシフェラーゼである。一部の実施形態では、R1は、ウミシイタケルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、腔腸動物ルシフェラーゼ、北アメリカグローワームルシフェラーゼ、コメツキムシルシフェラーゼ、レイルロードワームルシフェラーゼ、細菌性ルシフェラーゼ、ガウシアルシフェラーゼ、エクオリン、アラキノカンパルシフェラーゼ、或いはそのいずれか1つの生物学的に活性な変種若しくは断片又は2つ以上のキメラからなる群から選択されるルシフェラーゼである。一部の実施形態では、R1は、RLuc (配列番号49)又はその生物学的に活性断片若しくは変種を含む。一部の実施形態では、R1は、RLuc8(配列番号50)又はその生物学的に活性断片若しくは変種を含む。一部の実施形態では、R1は、RLuc2 (配列番号51)又はその生物学的に活性断片若しくは変種を含む。一部の実施形態では、R1は、配列番号49、配列番号50及び配列番号51の任意の1つ又は複数に提供される配列と少なくとも30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、R1は、配列番号1、配列番号2、配列番号3;配列番号4、配列番号32及び配列番号33の任意の1つ又は複数に提供される配列と少なくとも30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を有する。
【０１５０】
本明細書において使用される「生物学的に活性な断片」は、全長ポリペプチドの定義される活性を維持している本明細書に記載のポリペプチドの一部である。例えば、全長ポリペプチドが生物発光タンパク質である実施形態では、「生物学的に活性な断片」は、全長生物発光タンパク質の活性の少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも99%又は100%を維持しており、ここで活性は、活性化産生物に基質を転換するポリペプチドの能力の測定値であり、活性化産生物は次いで緩和するにつれてエネルギーを放出する。
【０１５１】
生物学的に活性な断片は、天然に存在する及び/又は定義されるポリペプチドと典型的には少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%又は少なくとも99%同一である。本明細書において使用される「生物学的に活性な変種」は、天然ポリペプチドの定義される活性を維持している本明細書に記載のポリペプチドの配列変種である。生物学的に活性な変種は、天然に存在する及び/又は定義されたポリペプチドと典型的には少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%又は少なくとも99%同一である。本明細書において使用される「生物学的に活性な変種」は、融合タンパク質を含む。融合タンパク質は、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドに融合された生物発光タンパク質(又はその断片若しくは変種)を含む。タンパク質、ポリペプチド又はペプチドは、タグ、例えば溶解性タグ又は精製タグであってよい。融合タンパク質は、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドからの生物発光タンパク質(又はその断片若しくは変種)の切断を可能にするアミノ酸配列を任意選択で含んでよい。
【０１５２】
一部の実施形態では、R1は、対応する天然に存在するタンパク質と比較して少なくとも1つ少ないシステイン残基を含む生物発光タンパク質の生物学的に活性な変種である。例えば、生物学的に活性な変種は、対応する天然に存在するタンパク質と比較して少なくとも1つ少ないシステイン残基、少なくとも2つ少ないシステイン残基又は少なくとも3つ少ないシステイン残基を含む場合がある。システイン残基は、天然に存在する又は天然に存在しないアミノ酸を用いて置き換えられてよい。一部の実施形態では、システインは、セリン、バリン、アラニン、スレオニン又はセレノシステインによって置き換えられる。一部の実施形態では、変種生物発光タンパク質は、RLuc(配列番号49)のアミノ酸24位に対応する位置、アミノ酸73位に対応する位置又はアミノ酸124位に対応する位置のシステイン残基を欠いている。一部の実施形態では、変種生物発光タンパク質は、RLuc(配列番号49)のアミノ酸24及び73位に対応する位置、アミノ酸24及び124位に対応する位置又はアミノ酸73及び124位に対応する位置のシステイン残基を欠いている。一部の実施形態では、変種生物発光タンパク質は、RLuc(配列番号49)のアミノ酸24、73及び124位に対応する位置のシステイン残基を欠いている。一部の実施形態では、変種生物発光タンパク質は、RLuc8(配列番号50)のアミノ酸24位に対応する位置のシステイン残基を欠いている。一部の実施形態では、変種生物発光タンパク質は、RLuc8(配列番号50)のアミノ酸73位に対応する位置のシステイン残基を欠いている。一部の実施形態では、変種生物発光タンパク質は、RLuc8のアミノ酸24及び73位に対応する位置のシステイン残基を欠いている。一部の実施形態では、変種生物発光タンパク質は、配列番号8、配列番号9及び配列番号10からなる群から選択されるポリペプチド配列を含む。本明細書において使用される、句「アミノ酸位置に対応する位置」又はその変化形は、周囲のアミノ酸と比較したアミノ酸の関連する位置を指す。この関連で、一部の実施形態では本発明のポリペプチドは、例えば配列番号49に対してアラインした場合にアミノ酸の相対的な位置決定を変更する欠失又は置換変異を有し得る。
【０１５３】
一部の実施形態では、R1は、対応する天然に存在するタンパク質が同じ配列位置にシステイン残基を含まない場合、少なくとも1つのシステイン残基を含む生物発光タンパク質の生物学的に活性な変種である。一部の実施形態では、R1は、対応する天然に存在するタンパク質が露出したシステイン残基を含まない場合、少なくとも1つの露出したシステイン残基を含む生物発光タンパク質の生物学的に活性な変種である。本明細書において使用される「露出したシステイン」は、システインの側鎖が本明細書に記載のセンサー分子を形成するようにL又はR2と反応するために利用可能であるように、タンパク質の表面近くに又は表面に位置しているものである。システインへのアミノ酸変化を通じて、又は露出されたシステイン残基の供給を通じて達成された変異したシステイン残基は、本明細書に定義されるセンサーにおける連結エレメントとして作用できる又はその一部を形成できる。例えば、変異したシステインの側鎖は、本明細書に定義のセンサーを形成するようにR2中のチオール反応性基と反応できる。一部の実施形態では、R1は、対応する天然に存在するタンパク質が同じ配列位置にシステイン残基を含まない場合に少なくとも1つのシステイン残基を含み、対応する天然に存在するタンパク質が同じ列位置にシステイン残基を含む場合に少なくとも1つ少ないシステイン残基を含む、生物発光タンパク質の生物学的に活性な変種である。
【０１５４】
好ましい実施形態では、低分子量を有する生物発光タンパク質は、立体障害によるヒドロラーゼとセンサーとの間の相互作用の阻害を予防又は低減するために使用される。生物発光タンパク質は、好ましくは単一のポリペプチド鎖を含む。同様に生物発光タンパク質は、オリゴマー又は凝集物を好ましくは形成しない。生物発光タンパク質ウミシイタケルシフェラーゼ、ガウシアルシフェラーゼ及びホタルルシフェラーゼは、これらの基準のすべて又は大部分に合致する。
【０１５５】
一部の実施形態では、生物発光タンパク質は、基質を修飾できる。本明細書において使用される、用語「基質」は、発光を発生させる又は吸収する化学発光ドナーと併せて使用され得る任意の分子を指す。基質の選択は、化学発光ドナーによって発生させる光の波長及び強度に影響を与え得る。一部の実施形態では、生物発光タンパク質はルシフェリン、カルシウム、セレンテラジン、セレンテラジンの誘導体若しくは類似物又はルシフェリンの誘導体若しくは類似物から選択される基質を有する。好ましい実施形態では、基質は、ルシフェリン、カルシウム、セレンテラジン又はセレンテラジンの誘導体若しくは類似物である。
【０１５６】
セレンテラジンは、刺胞動物、カイアシ類、毛顎動物、有櫛動物、十脚類エビ、アミ(mysid shrimp)、放散虫(radiolarians)及び一部の魚分類群に存在する広く知られた基質である(Greer and Szalay, 2002)。ウミシイタケルシフェラーゼについて、例えば、418から547nmの間に光放射を生じるセレンテラジン類似物/誘導体は利用手可能である(Inouyeら、1997, Loeningら、2007)。セレンテラジン類似物/誘導体(400A、DeepBlueC)は、ウミシイタケルシフェラーゼを用いて400nmに光を放射すると記載されている(WO 01/46691)。セレンテラジン類似物/誘導体の他の例は、EnduRen、Prolume purple、Prolume purple II、Prolume purple III、ViviRen及びフリマジンである。セレンテラジン類似物/誘導体の他の例として、これだけに限らないが、WO/2014/036482及びUS20140302539において開示されている化合物が挙げられる。
【０１５７】
本明細書において使用される、用語「ルシフェリン」は、広範に定義され、生物発光できる生物において見出される光を放射する生物学的ピグメント並びに、酵素ルシフェラーゼの存在下でオキシルシフェリン及び光の形態でのエネルギーを産生するように酸化される合成類似物又は機能的に等価な化学物質を指す。D-ルシフェリン、又は2-(6-ヒドロキシベンゾチアゾルl-2-イル)-2-チオアゾリン-4-カルボン酸は、ホタル、フォティヌス・ピラリスから最初に単離された。それ以降、ルシフェリンの種々の化学に異なる形態は、種々の異なる生物から、主に海、例えば魚及びイカから発見され、研究されたが、多くは陸上生物、例えば、ワーム、甲虫及び種々の他の昆虫において同定されている(Dayら、2004; Viviani, 2002)。本明細書において使用される、ルシフェリンは、ルシフェリンの誘導体又は類似物も含む。
【０１５８】
サイクリックアルキルアミノルシフェリン(CycLuc1)等の完全に合成のルシフェリンに加えて、それぞれ化学的に異なり、広範な異なる補助因子を使用する化学的に及び構造的に異なるルシフェラーゼによって触媒される、少なくとも5個の一般的な種類の生物学的に進化したルシフェリンがある。第1は、ホタルルシフェリン、ホタルルシフェラーゼの基質であり、触媒のためにATPを必要とする(EC 1.13.12.7)。第2は、細菌性ルシフェリンであり、一部のイカ及び魚においても見出され、長鎖アルデヒド及び還元リン酸リボフラビンからなる。細菌性ルシフェラーゼは、FMNH依存性である。第3は、夜間の海のリン光の原因である生物、渦鞭毛藻類(海洋プランクトン)において見出される渦鞭毛藻類ルシフェリン、テトラピロールクロロフィル誘導体である。渦鞭毛藻類ルシフェラーゼは、渦鞭毛藻類ルシフェリンの酸化を触媒し、3つの同一の触媒的に活性なドメインからなる。第4は、ある種のカイムシ及び深海魚、例えば、ポリクチス(Porichthys)において見出されるイミダゾロピラジンヴァルグリンである。最後は、放散虫、有櫛動物、刺胞動物、イカ、カイアシ類、毛顎動物、魚及びエビにおいて見出されるタンパク質エクオリンの光放射体、セレンテラジン(イミダゾールピラジン)である。
【０１５９】
一部の実施形態では、生物発光タンパク質は、補助因子を必要とする。補助因子の例として、必ずしも限定されずにATP、マグネシウム、酸素、FMNH2、カルシウム又はこれらの任意の2つ以上の組合せが挙げられる。
【０１６０】
ヒドロラーゼ
ヒドロラーゼは、加水分解反応を触媒する酵素である。加水分解は、水の付加による化学結合の切断である。水素は、壊される化学結合の一方に加えられ、ヒドロキシルは、壊される化学結合の他方に加えられる。例えば:
【０１６１】
【化１１】
2020531022.tif 000020
【０１６２】
本明細書において使用される、用語「ヒドロラーゼ」は、加水分解反応を触媒できる任意のタンパク質を指す。ヒドロラーゼは、酵素のEC番号(酵素番号)分類においてEC3と分類される。それらは、それらが加水分解する化学結合に基づいてサブクラスに更に分類され得る。一部の実施形態では、ヒドロラーゼは、次のEC 3.1; EC 3.2; EC 3.3; EC 3.4; EC 3.5; EC 3.6; EC 3.7; EC 3.8; EC 3.9; EC 3.10; EC 3.11及びEC 3.13からなる群から選択されるEC番号を有するポリペプチド、又は前述のいずれかの断片若しくは変種であってよい。
【０１６３】
上のEC番号によって定義されるポリペプチドの詳細は、Enzyme Nomenclature 1992 [Academic Press, San Diego, California, ISBN 0-12-227164-5 (hardback), 0-12-227165-3 (paperback)] with Supplement 1 (1993), Supplement 2 (1994), Supplement 3 (1995), Supplement 4 (1997) and Supplement 5 (それぞれTipton 1994; Barrett 1995; Barrett 1995; Barrett 1997, and Nomenclature Committee 1999)に記載されている。詳細は、とりわけ、the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme /EC3/)及びExPASy http://enzyme.expasy.org/EC/3.-.-.-)からも得られる。
【０１６４】
関連ポリペプチドのアミノ酸配列は、当業者によって容易に得ることができる。例えば配列は、ExPASy http://enzyme.expasy.org/EC/3.-.-.-を介して得られる。
【０１６５】
例示的ヒドロラーゼとして、これだけに限らないが、エステル結合に作用するヒドロラーゼ、エーテル結合に作用するヒドロラーゼ、ペプチド結合に作用するヒドロラーゼ、ペプチド結合以外の炭素-窒素結合に作用するヒドロラーゼ、酸無水物に作用するヒドロラーゼ、炭素-炭素結合に作用するヒドロラーゼ、ハライド結合に作用するヒドロラーゼ、亜リン酸-窒素結合に作用するヒドロラーゼ、イオウ-窒素結合に作用するヒドロラーゼ、炭素-亜リン酸結合に作用するヒドロラーゼ、炭素-イオウ結合に作用するヒドロラーゼ、イオウ-イオウ結合に作用するヒドロラーゼ及びグリコシラーゼが挙げられる。一部の例では、エステル結合に作用するヒドロラーゼとして、カルボキシエステラーゼ、アリールエステラーゼ、アセチルエステラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、コリンエステラーゼ、チオエステラーゼ(アセチル-CoAヒドロラーゼ、グルタチオンチオエステラーゼ等)、ホスファターゼ(アルカリホスファターゼ)、硫酸エステルヒドロラーゼ及びリパーゼが挙げられる。一部の例では、ペプチド結合に作用するヒドロラーゼとして、セリン及びシステインプロテアーゼ、カルボキシ-及びアミノペプチダーゼ、メタロペプチダーゼ、ジペプチダーゼ、ジペプチジル-ペプチダーゼ及びトリペプチジル-ペプチダーゼが挙げられる。一部の例では、ペプチド結合以外の炭素-窒素結合に作用するヒドロラーゼとして、直鎖アミド又はサイクリックアミドを標的化するアミダーゼが挙げられる。一部の実施形態では、ヒドロラーゼは、β-ラクタマーゼである。一部の例では、ヒドロラーゼは、α-グリコシダーゼ又はβ-グリコシダーゼ等のグリコシダーゼである。グリコシダーゼは、N-、O-及びS-グリコシル化合物を加水分解し、これだけに限らないが、アミラーゼ、マルターゼ、スクラーゼ、ラクターゼ及びガラクトシダーゼが挙げられる。一部の例では、ヒドロラーゼは、プリンヌクレオシダーゼ又はピリミジンヌクレオシダーゼ等のヌクレオシドヒドロラーゼである。一部の例では、ヒドロラーゼは、GTPase等のヌクレオチドヒドロラーゼである。一部の例では、ヒドロラーゼは、エクソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ又はDNAグリコシラーゼである。一部の例では、ヒドロラーゼは、デアルキラーゼである。一部の例では、ヒドロラーゼは、デハロゲナーゼである。
【０１６６】
一部の実施形態では、ヒドロラーゼは、コリンエステラーゼ、エステラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、ホスファターゼ、ヌクレアーゼ、グリコシダーゼ、DNAグリコシラーゼ及び酸無水物ヒドロラーゼからなる群から選択される。一部の例では、ヒドロラーゼは、コリンエステラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ及びホスファターゼからなる群から選択される。一部の実施形態では、ヒドロラーゼは、エステラーゼである。好適なヒドロラーゼの一例は、ブタ肝臓エステラーゼである。一部の実施形態では、ヒドロラーゼは、ホスファターゼである。
【０１６７】
R1及びR2
任意の数のR1及びR2組合せが本発明のセンサーにおいて使用され得る。当業者は、効率的なエネルギー転移を可能にするR1及びR2対を選択できる。好ましい実施形態では、R1及びR2の分離及び相対配向は、フォルスター距離の±50%である。本明細書において使用される、用語「R1とR2との分離及び相対配向は、フォルスター距離の±50%以内である」は、R0の±50%の範囲で実行され得る定常状態RET測定を指す(Forster 1948; Forster 1960)。この句は、10〜90%の範囲の化学発光ドナードメインからアクセプタードメインへの発光エネルギー転移の効率を包含する。一部の実施形態では、化学発光ドナードメインとアクセプタードメインとのフォルスター距離は、少なくとも4nmである、少なくとも4.5nmである、少なくとも5.0nmである、少なくとも5.6nmである又は少なくとも6nmである。一部の実施形態では、化学発光ドナードメインとアクセプタードメインとのフォルスター距離は、約4nmから約10nmの間である、約4.5nmから約10nmの間である、約5.0nmから約10nmの間である、約5.6nmから約10nmの間である、又は約6nmから約10nmの間である。
【０１６８】
好適な対形成を決定するために考慮されるべき評価基準は、生物発光タンパク質(R1)のものと比較したアクセプター分子(R2)の相対的放射/蛍光スペクトルである。一部の実施形態では、生物発光タンパク質の発光スペクトルは、ドナー発光放射からの光エネルギーがアクセプター分子を励起できる波長であり、それにより2つの分子が互いに適切な近接及び配向性である場合にアクセプター分子蛍光を促進できるように、アクセプター分子の吸光度スペクトルと重複しているべきである。対形成可能性を研究するために、融合(例えば)は、選択された生物発光タンパク質及びアクセプタードメインを、ブロッキング基Bを含まずに含有して調製され、検査される(実施例を参照されたい)。
【０１６９】
ドナーとアクセプター分子とが互いに擬似的に会合しないことも確認されるべきである。
【０１７０】
ドナー放射は、基質への修飾によって操作され得る。ウミシイタケルシフェラーゼの場合では、基質はセレンテラジンである。ドナー放射を変えることの背後にある理論的根拠は、ドナー放射とアクセプター放射との間の分解能を改善するためである。元のBRET系は、ウミシイタケルシフェラーゼをドナーとして、EYFP(又はTopaz)をアクセプターとして、及びセレンテラジンh誘導体を基質として使用する。BRETアッセイにおいて組み合わされた場合に、これらの成分は、生物発光タンパク質について475〜480nMの範囲で、アクセプター分子について525〜530nMの範囲で光を発生し、スペクトル解像度45〜55nmをもたらす。
【０１７１】
ウミシイタケルシフェラーゼは、系のシグナル対ノイズを減少させることに寄与する、GFP放射に実質的に重複する幅広い放射ピークを発生させる。本発明における使用のための1つのBRET系は、ウミシイタケルシフェラーゼ基質としてcoel400aを有し、ドナーとアクセプター放射波長との間に(約105nm)幅広いスペクトル分解能を提供する。
【０１７２】
種々のセレンテラジン誘導体が、ウミシイタケルシフェラーゼ活性の結果として種々の波長(野生型セレンテラジンによって発生されたものとは異なる)で光を発生させるcoel400aを含め、当技術分野において周知である。当業者は、ドナーの光放射ピークが変化したことから、この波長で光を吸収し、それにより効率的なエネルギー転移を可能にするアクセプター分子を選択することが必要であることを理解している。ドナーの光放射とアクセプターの光吸収ピークとの間でスペクトルが重複していることは、特に効率的なエネルギー転移のための1つの条件である。
【０１７３】
生物発光タンパク質及びアクセプター分子の対のさらなる例は、Table 3(表3)に提供されている。
【０１７４】
【表３Ａ】
2020531022.tif 000021
【０１７５】
【表３Ｂ】
2020531022.tif 000022
【０１７６】
【表３Ｃ】
2020531022.tif 000023
【０１７７】
【表３Ｄ】
2020531022.tif 000024
【０１７８】
生物発光共鳴エネルギー転移(BRET)
本明細書において使用される「BRET」又は「生物発光共鳴エネルギー転移」は、生物発光タンパク質ドナーとアクセプター分子との間のエネルギーの非放射性転移に基づく近接アッセイである。「生物発光共鳴エネルギー転移」及び「BRET」は、互換的に用いられる。
【０１７９】
ヒドロラーゼによる本明細書に記載のセンサーの加水分解性結合の切断は、BRET比における変化を生じる。生物発光タンパク質とアクセプター分子の間に生じるエネルギー転移は、特異的な波長を選択する光学フィルター(1つはアクセプター分子放射に対して及び他は生物発光タンパク質放射に対して)を使用して測定された放射からの計算された比として提示される(式1を参照されたい)。
Ea/Ed=BRET比(1)
式中Eaはアクセプター分子放射強度と定義され(放射光は、アクセプターの放射に適合させた特異的なフィルターを使用して選択される)及びEdは生物発光タンパク質放射強度と定義される(放射光は、生物発光タンパク質の放射に適合させた特異的なフィルターを使用して選択される)。
【０１８０】
光学フィルターがBRETに適切な波長の識別を許容する任意のタイプのフィルターであってもよいことは当業者によって容易に理解されるはずである。例えば、本発明に従い使用される光学フィルターは、干渉フィルター、ロングパスフィルター、ショートパスフィルター等であってもよい。フィルターを通る波長の強度(通常、1秒あたりのカウント数(CPS)又は相対発光量(RLU))は、固体マイクロ光電子増倍管(solid state micro-photomultiplier) (マイクロ-PMT)、光電子増倍管(PMT)、カスケード光ダイオード、光ダイオードアレイを含む光ダイオード、又は、電荷結合デバイス(CCD)カメラ等の高感度カメラのいずれかを使用して定量され得る。定量したシグナルを引き続いて使用して、BRET比を計算し、エネルギー転移効率を表す。BRET比は、アクセプター放射の強度の増加とともに増加する。
【０１８１】
一般に、アクセプター放射強度のドナー放射強度に対する比が、決定され(式1を参照されたい)、これはエネルギー転移効率を反映する任意単位で表される数である。比は、エネルギー転移効率の増加とともに増加する(Xuら、1999を参照されたい)。
【０１８２】
エネルギー転移効率はまた、ドナー放射強度のアクセプター放射強度に対する逆の比を使用して表されてもよい(式2を参照されたい)。このケースでは、比は、エネルギー転移効率の増加とともに減少する。この計算を実施する前、放射強度は、背景光及び基質の自家発光の存在に関して補正される。この補正は、基質を含有するが、本発明の生物発光タンパク質、アクセプター分子、センサー又はポリペプチドを含有しない対照試料から、適切な波長で測定された、放射強度を減算することによって一般になされる。
Ed/Ea=BRET比(2)
式中Ea及びEdは、上記で定義される通りである。
【０１８３】
生物発光タンパク質及びアクセプター分子放射の光強度はまた、モノクロメーターに基づく機器、例えば、分光蛍光光度計、電荷結合素子(CCD)カメラ又はダイオードアレイ検出器を使用して定量することができる。分光蛍光光度計を使用して、放射スキャンが実施され、生物発光タンパク質及びアクセプター分子放射ピークの両方が、基質の添加時に検出される。ピーク下面積又はλmax若しくは最大強度と比較した任意の強度百分率によって定義される波長での強度は、上に概要を述べるとおり相対光強度を表すために使用でき、比を算出するために使用できる。同じ試料からの生物発光タンパク質及びアクセプター分子に関する光を測定可能な任意の機器を使用して本発明のBRETシステムをモニターすることができる。
【０１８４】
代替的実施形態では、アクセプター分子放射単独は、BRETの有効な検出及び/又は定量にとって適切である。このケースでは、エネルギー転移効率は、アクセプター放射強度のみを使用して表される。エネルギー転移を測定するために、いかなる比も計算することなく、アクセプター放射強度を使用することができることが、当業者に容易に明らかとなるであろう。これは、理想的にはアクセプター分子が、生物発光タンパク質から転移される光を吸収する場合に限り、光を放射(emit)するとの事実に起因する。このケースでは、1つだけ光フィルターが必要とされる。
【０１８５】
関連する実施形態では、生物発光タンパク質放射単独は、BRETの有効な検出及び/又は定量にとって適切である。このケースでは、エネルギー転移効率は、生物発光タンパク質放射強度のみを使用して計算される。エネルギー転移を測定するために、いかなる比も計算することなく、ドナー放射強度を使用することができることが、当業者に容易に明らかとなるであろう。これは、アクセプター分子が、生物発光タンパク質から転移される光を吸収するので、生物発光タンパク質からの検出可能な放射における対応する減少が存在するとの事実に起因する。このケースでは、1つだけ光フィルターが必要とされる。
【０１８６】
代替的実施形態では、エネルギー転移効率は、測定に1つの光学フィルターを要求するだけであるレシオメトリック(ratiometric)測定を使用して表される。このケースでは、ドナー又はアクセプターに関する光強度は、適切な光学フィルターを使用して決定され、試料の別の測定は、いかなるフィルターも使用することなくなされる(オープンスペクトルの強度)。この後者の測定では、(全ての波長に対する)全ての光出力が、定量される。比の計算は、次に、式3又は4を使用してなされる。式3に関して、アクセプターに対する光学フィルターだけが、要求される。式4に関して、ドナーに対する光学フィルターだけが、要求される。
Ea/Eo-Ea=BRET比又は=Eo-Ea/Ea(3)
Eo-Ed/Ed=BRET比又は=Ed/Eo-Ed(4)
式中Ea及びEdは上記で定義される通りであり、Eoは、組合された全ての波長(オープンスペクトル)に対する放射強度として定義される。
【０１８７】
さらなる式が、式1から4から導くことができることは、当業者に容易に明らかとなるはずである。例えば、そういうものの1つの派生することには、生物発光タンパク質及び/又はアクセプター分子に関する放射波長で存在する背景光に対して補正することが関与する。
【０１８８】
BRETアッセイの実施では、発光は、BRETCountを使用して各ウエルから決定することができる。BRETCount機器は改変型TopCountであり、TopCountはPackard Instrument (Meriden、CT)によって販売されたマイクロタイタープレートシンチレーション及びルミネセンスカウンターである。背景ノイズの排除を同時発生させる2つの光電子増倍管(PMT)を利用する古典的なカウンターとは異なり、TopCountは、単一のPMT技術及びノイズリダクションのための時間分解型パルス計数を利用することにより、標準的な不透明なマイクロタイタープレート中での計数が可能になる。不透明なマイクロタイタープレートの使用は、光学的なクロストークを無視できるレベルに低下させることができる。TopCountは1、2、6及び12の検出器(PMT)を含むさまざまなフォーマットで参入しており、これにより、それぞれ、1、2、6又は12試料の同時読み取りが可能になる。BRETCountに加えて、他の市販されている機器はBRETを実施可能である:Victor 2(Wallac、Finland(Perkin Elmer Life Sciences))及びFusion(Packard Instrument、Meriden)。BRETは、少なくともアクセプター分子放射及び好ましくは(アクセプター分子及び生物発光タンパク質に対する)2つの波長又はそれ以上を検出することができるリーダーを使用して、実施することができる。
【０１８９】
当業者が理解するとおり、BRETは、センサーが化学発光ドナードメイン(この場合、生物発光タンパク質)及びアクセプタードメインを含むことを必要とする。一部の実施形態では、アクセプタードメインに対する化学発光ドナードメインの空間的位置及び/又は双極子配向は、加水分解性結合がヒドロラーゼによって切断され、BRET比における変化を生じる場合に変わる。本明細書において使用される、用語「空間的位置」は、アクセプター分子に対するドナーの三次元位置決定を指し、これは、プロテアーゼのセンサー分子切断の結果として、もはやドナードメインが標的配列を介してアクセプタードメインに連結されないように変化する。本明細書において使用される、用語「双極子配向」は、ドナー及び/又はアクセプター分子のいずれかと関連した双極子モーメントの三次元空間における方向を、三次元空間におけるそれらの方向に対する相対的なものとして指す。双極子モーメントは、分子における電荷の変化の結果である。
【０１９０】
一部の実施形態では、ヒドロラーゼによる加水分解性結合の切断は、蛍光アクセプタードメイン、R2についての吸収及び/又は発光スペクトルにおける変化を生じる。例えば、一部の実施形態では、加水分解性結合の切断は、ヒドロラーゼによって切断され、蛍光アクセプタードメインについて最大励起(Ex)及び/又は発光(Em)波長における変化を生じる。これらの変化は、BRET比における変化を生じ得る。
【０１９１】
ヒドロラーゼによる加水分解性結合の切断は、BRET比における変化を生じ、例えば、ヒドロラーゼによる加水分解性結合の切断は、観察された最大BRET比の約2%から約100%の間のBRET比における変化を生じ得る。本明細書において使用される「観察された最大BRET比」は、R1-L-R2又はR2-L-R1 (Bの非存在下で最適な連結エレメントを介してR1に連結されているR2についてである)について観察されたBRET比である。一部の実施形態では、BRET比における変化は、観察された最大BRET比の約5%から約95%、約15%から約50%又は約15%から40%の間である。一部の実施形態では、ヒドロラーゼによる加水分解性結合の切断は、観察された最大BRET比の≧2%であるBRET比における変化を生じる。一部の実施形態では、ヒドロラーゼによる加水分解性結合の切断は、観察された最大BRET比の≧5%、≧10%、≧20%、≧30%、≧40%、≧50%、≧60%、≧70%、≧80%、≧90%又は≧95%であるBRET比における変化を生じる。15%以上のBRET比における変化は、ヒドロラーゼ検出のシグナル対ノイズ比を増加させる。これは、任意の所与の試料採取時期についての検出の優れた極限及びヒドロラーゼの濃度の更に正確な測定をもたらす。代替的に、検出の固定限界、BRET比におけるより大きな変化は、短いシグナル積分時間及びそれにより更に急速な検出を促進する。
【０１９２】
一部の実施形態では、ヒドロラーゼによる加水分解性結合の切断は、約2倍を超える、約3倍を超える、約4倍を超える、約5倍を超える、約10倍を超える、約20倍を超える、約30倍を超える、約40倍を超える、約50倍を超える、約60倍を超える、約70倍を超える、約80倍を超える、約90倍を超える又は約100倍を超えるBRET比における変化を生じ得る。一部の実施形態では、BRET比における変化は、約1倍から約60倍の間、約2倍から約50倍の間、約3倍から約40倍の間又は約4倍から約30倍の間である。
【０１９３】
本明細書において使用される「ストークスシフト」は、同じ電子遷移の吸収スペクトルと発光スペクトルとのバンド極大(band maxima)の位置間の波長における差異である。好ましくは、アクセプタードメインは、大きなストークスシフトを有する。大きなストークスシフトは、吸収スペクトルと発光スペクトルとのバンド極大の位置間の大きな差異が、放射されるシグナルからの反映される励起照射の除外を容易にすることから望ましい。一部の実施形態では、アクセプタードメインは、約50nmより大きいストークスシフトを有する。一部の実施形態では、アクセプタードメインは、約50nmから約350nmの間、約50nmから約150nmの間のストークスシフトを有する。一部の実施形態では、アクセプタードメインは、約90nmより大きい、例えば100nm、110nm、120nm、130nm、140nm又は150nmのストークスシフトを有する。
【０１９４】
組成物及びキット
本発明のセンサーは、ヒドロラーゼを検出することにおける使用のための組成物に含まれ得る。一部の実施形態では、本明細書に記載のセンサーは、エステラーゼを検出するための組成物に含まれ得る。例えば、一部の実施形態では、本明細書に記載のセンサーは、コリンエステラーゼ又はリパーゼを検出するための組成物に含まれ得る。他の実施形態では、本明細書に記載のセンサーは、ホスファターゼを検出するための組成物に含まれ得る。例えば、一部の実施形態では、本明細書に記載のセンサーは、アルカリホスファターゼを検出するための組成物に含まれ得る。更に他の実施形態では、本明細書に記載のセンサーは、グリコシダーゼを検出するための組成物に含まれ得る。例えば、一部の実施形態では、本明細書に記載のセンサーは、ラクターゼ、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ又はマルターゼを検出するための組成物に含まれ得る。更に別の実施形態では、本明細書に記載のセンサーは、プロテアーゼを検出するための組成物に含まれ得る。例えば、一部の実施形態では、本明細書に記載のセンサーは、カスパーゼを検出するための組成物に含まれ得る。更に別の実施形態では、本明細書に記載のセンサーは、ヌクレアーゼ又はDNA/RNAヒドロラーゼを検出するための組成物に含まれ得る。例えば、一部の実施形態では、本明細書に記載のセンサーは、リボヌクレアーゼ又はエンドヌクレアーゼを検出するための組成物に含まれ得る。更に別の実施形態では、本明細書に記載のセンサーは、β-ラクタマーゼを検出するための組成物に含まれ得る。
【０１９５】
一部の実施形態では、本発明に従うセンサー及び許容される担体を含む組成物を提供する。本明細書で使用される、用語「許容される担体」には、本発明の方法及び使用に適合する、任意の及び全ての固体又は溶媒(例えば、リン酸緩衝生理食塩水緩衝液、水、生理食塩水)分散媒、コーティング等が含まれる。許容される担体は、組成物の他の成分に適合性であり、検査されるヒドロラーゼを阻害及び障害しないという意味で「許容」されなければならない。一般に、好適な許容される担体は、当技術分野において周知であり、最終使用適用に基づいて選択される。
【０１９６】
本発明のセンサーは、ヒドロラーゼを検出する使用のためのキットに含まれ得る。一部の実施形態では、本発明によるセンサー及び使用のための説明書を含むキットが提供される。一例では、キットは、本発明によるセンサー、使用のための説明書及びセンサーの生物発光タンパク質の好適な基質を含む。
【０１９７】
方法及び使用
当業者が理解するとおり、本発明のセンサーは、試料中のヒドロラーゼの存在又は非存在を検出するために使用でき、存在する場合、ヒドロラーゼの活性を決定するためにも使用され得る(図10)。したがって、一態様では、i)試料を本発明のセンサー分子と接触させる工程;及び(ii)BRET比における変化を検出する工程であって、BRET比における変化が試料中のヒドロラーゼの存在に対応する工程(例えば、図10Aを参照されたい)を含む、試料中のヒドロラーゼを検出する方法が提供される。例えば、一部の実施形態では、(i)試料を本発明のセンサー分子と接触させる工程;及び(ii)BRET比における変化を検出する工程であって、BRET比における変化が試料中のエステラーゼの存在に対応する工程を含む、試料中のエステラーゼを検出する方法が提供される。当業者によって理解されるとおり、工程(i)における「接触させる工程」は、ヒドロラーゼによるセンサーの加水分解のために好適である条件下で行われる。一部の実施形態では、方法は、工程(ii)後に形成された組成物を生物発光タンパク質基質及び任意選択で先に補助因子と接触させる工程を含む。
【０１９８】
代替的実施形態では、i)処理試料を形成するために、試料を構造B-R2を有するブロックされた非タンパク質アクセプタードメインに接触させる工程;ii)R2のLへの結合を生じさせる条件下で、処理試料を式R1-L又はL-R1の化合物に接触させる工程;及びiii)BRET比における変化を検出する工程であって、BRET比における変化が試料中のヒドロラーゼの存在及び式R1-L-R2又はR2-L-R1の化合物の形成に対応する工程を含み、式中、R1は生物発光タンパク質であり;Lは連結エレメントであり;R2は非タンパク質アクセプタードメインであり;及びBは加水分解性結合を含むブロッキング基である、試料中のヒドロラーゼを検出する方法が提供される(例えば、図10Bを参照されたい)。R1、L、R2及びBは、すべて本明細書先に定義されている。一部の実施形態では、方法は、工程(ii)後に形成された組成物を工程(iii)の前に生物発光タンパク質基質及び任意選択で補助因子と接触させる工程を更に含む。例えば、一部の実施形態では、i)処理試料を形成するために、試料を構造B-R2を有するブロックされた非タンパク質アクセプタードメインに接触させる工程;ii)R2のLへの結合を生じさせる条件下で、処理試料を式R1-L又はL-R1の化合物に接触させる工程;及びiii)BRET比における変化を検出する工程であって、BRET比における変化が試料中のヒドロラーゼの存在及び式R1-L-R2又はR2-L-R1の化合物の形成に対応する工程を含み、式中、R1は生物発光タンパク質であり;Lは連結エレメントであり;R2は非タンパク質アクセプタードメインであり;及びBはブロッキング基であり、及びBに結合したR2は加水分解性結合を含む、試料中のエステラーゼを検出する方法が提供される。R1、L、R2及びBは、すべて本明細書先に定義されている。これらの実施形態の有利点は、ブロッキング基(及び、したがって加水分解性結合)が、広範な加水分解酵素に応答性で、任意選択でさまざまな適用のために最適化された異なる色出力を有するBRETセンサーをもたらすために容易に変えられることである。これらの実施形態は、実際的応用がそれを必要とする場合にも有用であり得る(例えば、特定の酵素のためのセンサーの障害、酵素反応性蛍光タグの不安定性等)。当業者によって理解されるとおり、処理試料を形成するために試料を構造B-R2を有するブロックされた非タンパク質アクセプタードメインと接触させる工程は、ヒドロラーゼによる加水分解性結合の加水分解のために好適である条件下で行われる。
【０１９９】
当業者が理解するとおり、本発明のセンサーは、試料中に存在するヒドロラーゼの量を定量するためにも使用され得る。例えば一部の実施形態では、方法は、試料中のヒドロラーゼの濃度及び/又は活性を決定することを更に含む。
【０２００】
当業者が認識するとおり、本発明のセンサーは、多重化されてもよい。この系では、異なるヒドロラーゼによって切断される2つ以上の異なるセンサー分子が提供される。例えば、本発明のセンサーは、ウシプラスミンによって切断されるセンサー(例えば、WO 2013/155553を参照されたい)及び/又はシュードモナス菌種(Pseudomonas spp.)プロテアーゼによって切断されるセンサーを用いて多重化されてよい。一部の実施形態では、各々の異なるセンサー分子が、異なるドナー及び/又はアクセプター分子を含んでもよく、それらが異なる波長で放射して異なる標的化合物の検出及び定量を可能にする。一部の実施形態では、各々の異なるセンサー分子は、同じドナー及び/又はアクセプター分子を有していてもよい。一部の実施形態では、単一の流動性検出チャンバー(fluidic detection chamber)が使用される。代替的実施形態では、マルチチャネル検出デバイスは、使用され得る。
【０２０１】
本発明の方法は、BRET比における変化を検出するために好適な任意の系において実施されてよい。当業者が認識するように、本発明の方法は、バッチ(例えば、プレートリーダーを使用するバッチ形式)又はフロー形式で実施することができる。例えば、本発明の方法は、適切なフィルターを備えたマイクロプレートリーダーを使用するマイクロプレート形式で実施することができる。本発明の方法はまた、例えば、WO 2013/155553に記載されるマイクロ流体デバイスで実施することができる。マイクロ流体デバイス(CYBERTONGUEデバイス)において実施されるBRETに基づくアッセイの例は、PCT/AU2018/050824に提供されている。
【０２０２】
当業者によって理解されるとおり、本開示のセンサー、組成物及びキットは、ヒドロラーゼの活性を測定する及び/又はヒドロラーゼの濃度を決定するためにも使用され得る。本開示のセンサー、組成物及びキットは、ヒドロラーゼの活性化剤又は阻害剤を検出する、測定する及び/又は濃度を決定するためにも使用され得る。
【０２０３】
本明細書に記載のセンサー及び組成物は、食品、飲料、動物の健康及びヒトの健康の診断分野において、食品、化学物質、生化学及び生物製剤の製造及び処理における工程管理のため、並びにバイオレメディエーションのモニタリングのために、ヒドロラーゼ活性をモニタリングするために使用され得る。一例では、本明細書に記載のセンサー及び組成物は、神経剤の検出のために使用され得る。この例では、センサーは、コリンエステラーゼの基質であってよい。別の例では、本明細書に記載のセンサー及び組成物は、乳中のアルカリホスファターゼ活性の検出を通じて乳牛における乳腺炎の早期診断のために使用され得る。この例では、センサーは、アルカリホスファターゼの基質であってよい。別の例では、本明細書に記載のセンサー及び組成物は、乳試料中のホスファターゼ活性の検出を通じて乳の低温殺菌の有効性を評価するために使用され得る。この例では、センサーは、アルカリホスファターゼの基質であってよい。別の例では、本明細書に記載のセンサー及び組成物は、膵臓の病態の早期診断のために血液中のリパーゼ活性レベル等のリパーゼ活性レベルを測定するために使用され得る。この例では、センサーは、エステラーゼ、例えばリパーゼの基質であってよい。
【０２０４】
試料
上に記載のとおり、本発明のセンサーは、試料中のヒドロラーゼの存在又は非存在を検出するために使用され得る。センサーは、試料中のヒドロラーゼの量及び/又は活性を定量するためにも使用され得る。「試料」はヒドロラーゼを含有する可能性を有する任意の物質又は組成物であってよい。典型的には、試料は、ヒドロラーゼを含むことが周知の又は疑われる任意の物質である。一部の実施形態では、試料は、気体、液体、生物学的材料、動物性試料、臨床試料、土壌、植物試料又はそれらの抽出物であってよい。一部の実施形態では、試料は、気体、液体、生物学的材料、及び土壌又はそれらの抽出物からなる群から選択される。試料は、機器であってもよい。
【０２０５】
一部の例では試料は、生物学的材料を含む。本明細書において使用される「生物学的材料」は、広範に定義され、生物全体又は一部に由来する任意の材料を含む。生物学的材料として、これだけに限らないが、体液、細胞、軟部組織(結合及び非結合組織等)並びに硬組織(骨及び軟骨等)が挙げられる。一部の実施形態では、体液は、血液、血清、痰、粘液、膿、腹水、尿、涙、大便、汗又は他の体液である。一部の実施形態では、そのような材料は、生存している生物から収集及び回収されてよく、次にさらなる処理及び/又は化学的処理に供されている。一実施形態では、センサーは、生細胞内のヒドロラーゼを検出するためには使用されない。生物学的材料として、植物材料、動物材料、細菌材料等又はそれらの抽出物が挙げられる。
【０２０６】
一部の実施形態では、試料は、臨床試料を含む。臨床試料として、これだけに限らないが血液、血清、痰、粘液、膿、涙、大便、汗、腹水及び他の体液が挙げられる。
【０２０７】
一部の例では試料は、乳製品を含む。本明細書において使用される用語「乳製品」として、乳及び、乳に部分的に又は完全に由来する産生物が挙げられる。乳は、任意の哺乳動物、例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラクダ、水牛、ヒト等から得られてよい。乳製品として、これだけに限らないが、生乳、低脂肪乳、スキムミルク、低温殺菌乳、UHT乳、乳糖加工(lactose-modified)UHT乳、栄養強化UHT乳、フレーバーUHT乳及びこれらの製品の組合せ並びにUHT乳児用調製乳、チーズ、ヨーグルト、乳清、バターミルク、クリーム、粉乳、乳児用調製粉乳及びバター等が挙げられる。一部の例では、試料は、乳又は希釈乳である。乳製品は、目的の炭水化物を含む、又は含むと考えられる乳製品の部分的に精製された一部等の抽出物であってもよい。
【０２０８】
一部の実施形態では、試料は、土壌又はその抽出物、医療機器由来の試料(例えばスワブ、リンス等)、機械由来の試料(例えばスワブ、リンス等)、食品加工機器由来の試料(例えばスワブ、リンス等)等からなる群から選択される。一部の実施形態では、食品加工機器として、これだけに限らないが、輸送タンカー、貯蔵タンク、加工機械、ライン、管類、コネクター、バルブ等が挙げられる。試料は、機械由来(例えばスワブ、リンス等)であってよい。機械として、目的のヒドロラーゼ及び/又は目的のヒドロラーゼを発現している細菌を保持することが疑われる又は周知の任意の機械、例えば乳製品の生産、保存及び加工に関する任意の機械が挙げられる。一部の実施形態では、機械として、これだけに限らないが、緩衝剤及び保存サイロ、溶接接合部、緩衝剤タンク出口、コンベヤーベルト、限外ろ過膜、バルブ、空気分離器、タンクローリー、タンクローリー保存タンク、保存タンク、ガスケット、接続管等が挙げられる。試料は、医療機器由来であってもよく、例えば試料は、これだけに限らないが、カテーテル、静脈内ライン、人工呼吸器、創傷被覆材、コンタクトレンズ、透析機器、医学的デバイス等が挙げられる医療機器からのスワブ又はリンスであってよい。
【０２０９】
試料は、環境又は供給源から直接得られてよい、又は本発明の方法が実施される前に好適な手順によって抽出及び/若しくは少なくとも部分的に精製されてよい。
【０２１０】
一部の実施形態では、試料は、水性液体である。例えば試料として、これだけに限らないが、乳、果実汁、他の飲料並びに血液及び血清を含む体液が挙げられる。
【０２１１】
一部の実施形態では、試料は、固体農産物、食品又は他の物質を水性溶液中で洗浄、浸漬、粉砕又は軟化することによって得られる懸濁物若しくは抽出物であってよく、液相を試料として使用する。液体相試料は、任意の好適な技術、例えば沈降、ろ過又は遠心分離によって清澄化され得る。
【０２１２】
一部の実施形態では、試料は、水性相を通じて気体若しくは他の気相試料を通気すること、又は気体若しくは他の気相を通じて水性相を噴霧すること、又は代わりに気体若しくは他の気相試料から水性相への分子の移行を可能にすることによって得ることができる。得られた水性相は、次に分析のための試料として使用される。
【実施例】
【０２１３】
(実施例1)
センサー分子の構築
エステラーゼ活性を測定するためのセンサー分子を設計した。センサーは、ブロッキング基としてアセテートを有する合成蛍光プローブフルオレセインに、N末端ペプチド連結エレメントを介して共有結合的に結合されたRLuc8を含む。アセテートブロッキング基は、エステル結合がエステラーゼによって切断されるまでフルオレセインを非蛍光状態に安定化する。結果として、ドナーから小分子フルオロフォアへのBRETは、エステラーゼによるアセテート基の除去及びフルオレセインアクセプターの活性化後にだけ観察される。
【０２１４】
材料及び方法
wt-RLuc8並びにRLuc8Cys変種1、2及び3の産生
例示されるセンサーでは、RLuc8は、N末端ペプチド連結エレメントを通じて合成フルオロフォアに繋がれている(図1)。連結エレメントの特異的タギングを可能にするために、単一のCys残基をペプチドリンカー内に導入した。2つのCys残基がRLuc8に内在しているが、1つのCys残基を蛍光アクセプタードメイン及び/又はヒドロラーゼとの反応のための利用可能性を増加させるために連結エレメントに導入した。
【０２１５】
pRSET RLuc8 PCRは、配列番号7に示す配列を有するN末端連結エレメントが先行してRLuc8 (配列番号1)をコードしている。単一のシステイン残基をpRSET RLuc8を鋳型として使用し、適切なプライマーを用いてPCRによってN末端ペプチド連結エレメント中の種々の位置に導入した(Table 4(表4))。pRSET-RLuc8の変異導入を公開された手順(Zhengら、2004)により実行した。RLuc8Cys1、2及び3(配列番号12〜14)をコードするプラスミドをDNA配列決定によって同定し、確認した。
【０２１６】
【表４】
2020531022.tif 000025
【０２１７】
野生型(wt) RLuc8並びにシステイン変種、RLuc8Cys1、2及び3を大腸菌(E. coli) BL21(DE3) (New England BioLabs社)で発現させた。一晩培養物を単一コロニーから100μg/mLアンピシリン及び2%グルコースを含有するLB (1Lあたり10gトリプトン、5g酵母エキス、5g NaCl (pH7.4))中で、37℃、200rpmで増殖させた。一晩培養物を250mL LB (100μg/mLアンピシリン)、OD6000.05に接種するために使用し、培養物を37℃、200rpm、4.5時間インキュベートした。タンパク質発現を温度を22℃に低下させ、200rpmで一晩インキュベートすることによって誘導した。細胞を接種24時間後に遠心分離(5000xg、10分間、4℃)によって収集した。上清を除去し、細胞沈殿物を50mM NaPi、0.3M NaCl、pH7.0に懸濁する前にPBSを用いて洗浄した。細胞をホモジナイザー(Microfluidics M-110P)をP=20000psiで使用して破壊し、可溶性画分を遠心分離(15000xg、15分間、4℃)によって単離した。His6-タグ化タンパク質をコバルト親和性クロマトグラフィー(TALON(登録商標)Superflow Metal Affinity Resin (Takara Clontech社、オーストラリア))を製造者の説明書に従って使用して単離した。150mMイミダゾール溶液を用いた溶出後に、タンパク質をMES緩衝液(50mM MES、300mM NaCl、0.1mM EDTA、pH6.0)に対して、透析装置(GE Healthcare社、Vivaspin 6、10kDa MWCO)を使用して透析した。精製タンパク質の500μLアリコートを液体窒素中で急速凍結し、-80℃で保存した。タンパク質濃度を280nmでの吸光度によって決定した。
【０２１８】
フルオレセイン類似物を用いたRLuc8システイン変種の標識
50mM MES、pH5.0中のwt-RLuc8又はRLuc8Cys 1、2及び3変種(5μM)を4xモル過剰(20μM)のフルオレセイン類似物(DMSO中の1mM保存物から)を用いてインキュベートし、混合物を4℃で表示時間(6から60分間)穏やかに振とうした。インキュベーション時間の終わりに、過剰な標識化剤を除去するために反応混合物を遠心分離(10kDa MWCO、13000xg、13分間、4℃)又は脱塩カラム(HiTrap(商標)desalting、GE Healthcare社)によって緩衝液交換した。下に記載される生物発光スペクトルを標識化直後に記録した。
【０２１９】
BRETアッセイ
BRETアッセイを最終体積100μLで96ウエルプレート(Perkin-Elmer社、オーストラリア)中で実行した。1μMの精製タンパク質をすべてのBRETアッセイのために最終体積100μLで使用し、タンパク質を必要に応じてPBS又はMES中に希釈した。
【０２２０】
BRET測定のために、EtOH中の5μLのセレンテラジン400aをタンパク質センサー溶液(最終[coel 400a]=16.7μM)に加え、スペクトルスキャンを直ちに記録した。スペクトルスキャンをSpectramaxM3プレート読み取り蛍光光度計(Molecular Devices社)を用いて記録した。生物発光スキャンを発光スキャンモード、380〜600nm、20nm間隔で使用して記録した。
【０２２１】
データ分析
BRET2比を最大アクセプター発光強度(520nm)の最大ドナー発光強度(420nm)に対する比として算出した。
【０２２２】
結果
エステラーゼセンサーをRLuc8Cys2のN末端ペプチドリンカーを加水分解性フルオレセインジアセテート-5-マレイミドを用いて標識化することによって調製した。標識化条件をRLuc8のN末端ペプチドリンカーの標識化効率を最大化し、一方でフルオレセイン誘導体のアセテート基の化学的加水分解を最小化するように最適化した。酵素アッセイに先立ってタグの化学的加水分解を最小化することは、センサーのバックグラウンド蛍光を低減し、酵素検出の感度を増大させる。
【０２２３】
最適な標識化条件を決定するために、wt-RLuc8及びRLuc8Cys変種の両方の標識をフルオレセイン-5-マレイミドを使用して、インキュベーション時間を変えて実行した。過剰な標識剤をろ過によって除去し、生物発光スペクトルを記録した。測定したBRET比をwt-RLuc8 (図3A)及びRLuc8Cys1 (図3B)の経時的な標識化効率の指標として使用した。図3に示すとおり、フルオレセインを用いたRLuc8Cys1の標識化は、検査したすべてのインキュベーション時間についておよそ6.5のBRET比をもたらし(図3B)、標識化が6分間以内に完了に達したことを示している。本センサーに関する好ましい標識化時間は、6分間であった。
【０２２４】
wt-RLuc8標識化について非常に低いBRET比が測定されたが(図3A)、BRET比におけるわずかな増加を6から60分間の間の標識化時間について観察した。これは、側鎖Cysの定量的標識化は数分間以内に達成される一方で、インキュベーション時間の延長は内在性Cys残基の標識化を増加させる可能性を有することを示している。
【０２２５】
図4Aに示すとおり、フルオレセインジアセテート5-マレイミドを用いるRLuc8Cys2の標識化は、0.11の非常に低いBRET比をもたらした(実線)。「ブロックされた」小分子アクセプターを用いて観察された低いBRETレベルは、最適化された標識化及び精製条件は、最小のバックグラウンド蛍光を有するエステラーゼBRETセンサーをもたらすために好適であることを示している。
【０２２６】
BRET比のpH依存性を図5に示す。BRET比は、pH7.0で最高である。
【０２２７】
(実施例2)
リンカー長
例示的センサー分子のためのBRETへの連結エレメントの長さの効果を評価するために、システイン残基をN末端連結エレメントのRLuc8のN末端から1アミノ酸、11アミノ酸及び21アミノ酸に導入した(Table 4(表4);図6A)。RLuc8Cys変種(すなわちRLuc8Cys1、2及び3)を実施例1に記載の最適化されたプロトコールに従ってフルオレセイン-5-マレイミドを用いて標識し、BRET比を実施例2に記載のとおり測定した(図6B)。図6Bに示すとおり、BRET比は、RLuc8とフルオレセインとの間のアミノ酸の数が増加するに従って減少した。検査した3個のセンサーの内、RLuc8Cys2センサーは、最大に近いBRET比をもたらし、加水分解性結合の到達性を改善すると考えられているより長い連結エレメントを有することからさらなる調査のために選択した。
【０２２８】
(実施例3)
RLuc8Cys2センサーを使用するエステラーゼ活性の測定
エステラーゼの活性を検出及び測定するためにRLuc8Cys2を使用できるかどうかを判定するために、アセテート基を加水分解し、蛍光アクセプターを遊離するようにセンサーをブタ肝臓エステラーゼ(PLE;8U/mL)と反応させた。簡潔には、最終体積100μLのMES pH5.0に希釈した1μM RLuc8Cys2をPLE(0.8U)と10分間、37℃でインキュベートした。インキュベーション時間の終わりに、EtOH中5μLのセレンテラジン400aをタンパク質センサー溶液に加え(最終[coel 400a]=16.7μM)、スペクトルスキャンを実施例2に記載のとおり直ちに記録した。
【０２２９】
図4Aに示すとおり、PLEを用いたエステラーゼセンサーの処理は、部分的にブロックされていないアクセプターをもたらし、0.11から0.47の4.4倍増加したBRET比の増加をもたらした(図4、点線)。使用した加水分解条件下で4.4倍のBRETの増加が観察されたが、6.6の最大BRET比(図4B、点線)を得られる可能性があり、60倍に至る潜在的なダイナミックレンジを表していることは注目すべきである。
【０２３０】
(実施例4)
センサー分子のクローニング、発現及び精製
材料及び方法
RLuc8Cys変種4及び5並びにMBP(K239C)RLuc8のクローニング
単一のCys残基を、pRSET RLuc8を鋳型として及び適切なプライマーを使用するPCRによってペプチドリンカー内、2及び11位(すなわちHis6タグにすぐ続いて)に導入した(Table 5(表5))。pRSET-RLuc8の変異導入を公開された手順(Zhengら、2004)により実行した。RLuc8Cys4及び5(配列番号35及び36)をコードするプラスミドをDNA配列決定によって同定し、確認した。
【０２３１】
ドナーとアクセプタードメインとの間のより大きな距離の効果を調査するために、マルトース結合タンパク質をpRSET RLuc8(N末端ヒスチジンタグとRLuc8とをコードする配列の間)にクローニングし、pRSET MBP RLuc8を形成した。蛍光アクセプタードメインを用いた標識化を可能にするために、MBPの表面にあると予測されるリジン残基(K289)をシステインに変異させた。変異導入をpRSET MBP RLuc8を鋳型として及び適切なプライマーを使用するPCRによって実行した(Table 5(表5)) (Zhengら、2004)。MBP(K289C)RLuc8 (配列番号34)をコードするプラスミドをDNA配列決定によって同定し、確認した。
【０２３２】
すべての構築物を、N末端ヘキサ-ヒスチジンタグを伴って発現させた。
【０２３３】
RLuc8センサーの発現及び精製
野生型(wt) RLuc8、システイン変種、RLuc8Cys1、2、3、4及び5並びにMBP(K239C)RLuc8を大腸菌BL21(DE3) (New England BioLabs社)で発現させた。一晩培養物を単一コロニーから100μg/mLアンピシリン及び2%グルコースを含有するLB (1Lあたり10gトリプトン、5g酵母エキス、5g NaCl (pH7.4))中で、37℃、200rpmで増殖させた。一晩培養物を250mL LB (100μg/mLアンピシリン)、OD6000.05に接種するために使用し、培養物を37℃、200rpm、4.5時間インキュベートした。タンパク質発現を温度を22℃に低下させ、200rpmで一晩インキュベートすることによって誘導した。細胞を遠心分離(4000xg、10分間、4℃)によって収集した。上清を除去し、細胞沈殿を50mM NaPi、0.3M NaCl、pH7.0に懸濁する前にPBSを用いて洗浄した。細胞をホモジナイザー(Microfluidics M-110P)をP=20000psiで使用して破壊し、可溶性画分を遠心分離(15000xg、15分間、4℃)によって単離した。His6-タグ化タンパク質をコバルト親和性クロマトグラフィー(TALON(登録商標)Superflow Metal Affinity Resin (Takara Clontech社、オーストラリア))を製造者の説明書に従って使用して単離した。150mMイミダゾール、50mM NaPi、0.1M NaCl (pH7.4)を用いた溶出後に、タンパク質をMES緩衝液(50mM MES、300mM NaCl、0.1mM EDTA、pH6.0)に対して、透析装置(Novagen社、D-Tube(登録商標) Dialyzer Mega、MWCO 6-8kDa)を使用して透析した。精製タンパク質を液体窒素中で急速凍結し、-80℃で保存した。タンパク質濃度をBradford法(Sigma Aldrich社プロトコール)を使用して決定した。
【０２３４】
【表５】
2020531022.tif 000026
【０２３５】
RLuc8変種のバイオコンジュゲーション
8:2 MES:HEPES、pH5.5 (50mM MES、50mM NaCl、pH3.6; 50mM HEPES、50mM NaCl、pH7.5)中のRLuc8又はRLuc8変種(10μM)を10当量(100μM)のフルオレセイン-5-マレイミド(FM; Sapphire Bioscience社)、スルホローダミンB,C2-マレイミド(RM; Serateh Biotech社、USA)又はフルオレセイン-ジアセテート-6-マレイミド(FD; Sapphire Bioscience社) (DMSO中10〜20mM保存液から)を用いて25℃、5から60分間インキュベートした。インキュベーション時間の終わりに、RLuc8バイオコンジュゲートを過剰な標識化剤を除去するためにHiTrap(商標)脱塩カラム(GE Healthcare社)で精製した。MES pH5.0 (50mM MES、50mM NaCl、pH5.0)を溶出緩衝液として使用した。RLuc8バイオコンジュゲートを液体窒素中で急速凍結し、-80℃で保存した。
【０２３６】
RLuc8バイオコンジュゲート定量
緩衝液(50mM MES、50mM NaCl、pH5.0)中の5μLのBSA標準物(0、0.1、0.3、0.6、1.0、1.4mg/mL)又はRLuc8バイオコンジュゲートを透明96-ウエルプレートの別々のウエルに3回反復で分注した。250μLの室温試薬Bradford試薬(Sigma Aldrich社)を各ウエルに加え、プレートを30秒間穏やかに混合した。反応混合物を室温、10分間インキュベートし、595nm(A595)での吸光度を測定した。試料のA595をBSA標準濃度に対してプロットすることによって標準曲線を構築した。RLuc8バイオコンジュゲート濃度を、正味のA595値を標準曲線に対して比較することによって決定した。
【０２３７】
RLuc8バイオコンジュゲートのSDS-PAGE
RLuc8バイオコンジュゲート(5μg)及びNuPage LDS試料緩衝液4x(ThermoFisher社)を混合し、試料を98℃、5分間インキュベートした。タンパク質試料をNuPage bis-trisゲル(ThermoFisher社)にロードし、200V、40分間実行した。蛍光ゲルをgelDoc (5msec曝露)に記録し、Coomassie BullDog染色で染色した。
【０２３８】
BRETアッセイ
BRETアッセイを最終体積100μLで96ウエルプレート(Perkin-Elmer社、オーストラリア)中で実行した。1μMの精製タンパク質をすべてのBRETアッセイのために、タンパク質を8:2 HEPES:MES、pH 7.5(50mM HEPES、50mM NaCl、pH7.8;50mM MES、50mM NaCl、pH5.0)に希釈して、最終体積100μLで使用した。
【０２３９】
BRET測定のために、EtOH中1μLのセレンテラジン400aを反応混合物に加え(最終[coel400a]=17μM)、1msec振とうし、スペクトルスキャンを直ちに記録した。スペクトルスキャンをSpectramaxM3プレート読み取り蛍光光度計(Molecular Devices社)を用いて記録した。フルオレセインに基づくセンサーについて、生物発光スキャンを発光スキャンモード、360〜600nm、20nm間隔で使用して記録した。ローダミンに基づくセンサーについて、生物発光スキャンを発光スキャンモード、360〜700nm、20nm間隔で使用して記録した。
【０２４０】
データ分析
BRET2比を、アクセプター発光強度(520nm (フルオレセイン)又は600nm (ローダミン))の最大ドナー発光強度(420nm)に対する比として算出した。
【０２４１】
結果
例示的センサー分子についてBRETへの連結エレメントの長さの効果を更に評価するために、システイン残基をN末端連結エレメント、2位(RLuc8Cys5;配列番号33)及び11位(RLuc8Cys4;配列番号32)に導入した。MBP(K239C)RLuc8融合もドナーとアクセプタードメインとの間のより大きなギャップの影響を評価するために生成した(Table 5(表5))。RLuc8Cys変種をフルオレセイン-5-マレイミド(FM)又はスルホローダミンB,C2-マレイミド(RM)で標識し、BRETスペクトルをFM(図7A)及びRM変種(図7B)について測定した。FM及びRM変種についてのBRET比も算出した(図7C)。図7に示すとおり、BRET比は、ドナーとアクセプターとの間のアミノ酸の数が増加するに従って減少した。図7に示すとおり、BRET比は、FM変種についてより大きく、これらの変種をさらなる調査のために選択した。しかし、RM変種のBRET比は、ローダミンが本出願のセンサーにおける使用のために好適であることを示している。
【０２４２】
(実施例5)
エステラーゼ活性の測定
材料及び方法
白色96-ウエルプレート中で、1μMのRLuc8Cys(変種)-フルオレセインジアセテートセンサー(RLuc8Cys-FD))を2.9Uのブタ肝臓エステラーゼ(PLE) (Sigma-Aldrich社#E3019)と共に10、20、40又は60分間、種々の温度でインキュベートした(Table 6(表6))。最終反応混合物は、20% 40mM MES、50mM NaCl、pH5.0及び80%のTable 6(表6)に記載の緩衝液を含有した。
【０２４３】
インキュベーション時間の終わりに、EtOH中1μLのセレンテラジン400aを加え(最終[coel 400a]=17μM)、スペクトルスキャンを実施例4に記載のとおり直ちに記録した。センサーの化学的加水分解を評価するために、同じアッセイをPLEの非存在下で実施した。データをセンサーの化学的加水分解について補正した。pH7.0、pH7.5及びpH8.0での実験を20分間についてだけ実行した。pH6.0及びpH6.5での実験を20、40及び60分間にわたってモニターした。
【０２４４】
【表６】
2020531022.tif 000027
【０２４５】
結果
最初の実験は、20℃、pH7.0でエステラーゼ、PLEの活性を検出及び測定するRLuc8Cys2-フルオレセイン-ジアセテートセンサー、RLuc8Cys3-フルオレセイン-ジアセテートセンサー及びRLuc8Cys4-フルオレセイン-ジアセテートセンサーの能力を特徴付けた。図8に示すとおり、BRET比における百分率の増加は、RLuc8Cys4-フルオレセイン-ジアセテートセンサーについて最も大きかった。理論に束縛されることなく、エステル結合は、RLuc8Cys4-フルオレセイン-ジアセテートセンサーにおいて更に到達可能であると考えられた。したがって、RLuc8Cys4-フルオレセイン-ジアセテートセンサーをさらなる調査のために選択した。
【０２４６】
エステラーゼの活性を検出及び測定するRLuc8Cys4-フルオレセイン-ジアセテートセンサーの能力を更に特徴付けるために、センサーをPLEと種々のpH及び温度で反応させた。図9に示すとおり、PLEを用いたRLuc8Cys4-フルオレセイン-ジアセテートセンサーの処理は、部分的にブロックされていないアクセプターをもたらし、pH6.5、7.0及び7.5でのBRET比を増加させた。pH6.0では、PLEの活性は検出不能であり、PLEの周知のpH依存性と一致した。pH8.0では、PLEの活性は、センサーの化学的加水分解の速度がエステラーゼ活性の速度より高いことから、検出不能であった。理論に束縛されることなく、経時的なBRET比の%増加の直線性の欠如もセンサーの化学的加水分解の結果であると考えられる。エステラーゼ酵素が化学的加水分解(バックグラウンド加水分解)の速度と比較して、経時的に活性を失っている可能性もある。
【０２４７】
(実施例6)
乳の低温殺菌の有効性を評価するためのホスファターゼ活性の測定
ホスファターゼ(EC 3.1.3.x)は、ホスホモノエステルの加水分解を触媒するヒドロラーゼのサブクラスである。ホスファターゼ酵素は、天然でほぼ至る所にあり、核酸形質転換、タンパク質の翻訳後修飾並びに生体エネルギー及び二次代謝の多数の反応に関与している。ホスファターゼ活性、又はホスファターゼ活性の阻害剤の効果は、本開示に定義されるセンサーを使用して好都合に測定され得る。例えば、アルカリホスファターゼ(EC 3.1.3.1)は、広く分布したホスファターゼであり、その活性の測定は、広範な医学及び他の診断目的の代用としてしばしば使用される。例えば、残存アルカリホスファターゼ活性の測定は、生乳に天然で存在するアルカリホスファターゼ活性を不活性化するために必要とされる温度-時間プロファイルが、乳中に存在する可能性がある主な病原体を不活性化するために必要であるよりもわずかによりストリンジェントであることから、生乳の低温殺菌の有効性を評価するために使用され得る(Kay, 1935; Hoy and Neave, 1937; Rankinら、2010)。したがって、本明細書に記載の種類のリン酸-ブロックセンサー(例えば、Table 1(表1)を参照されたい)は、処理後、又は処理前後のアルカリホスファターゼの残存レベルを測定することによって、乳の低温殺菌の有効性を決定するために適用できる。
【０２４８】
材料及び方法
BRETアッセイを最終体積100μLで96ウエルプレート中で実行する。スペクトルスキャンを発光モード(20nmインクリメント)、白色96ウエルプレート(Opti-plate(登録商標)-96、PerkinElmer社)においてSpectramaxM3プレート読み取り蛍光光度計(Molecular Devices社)を用いて記録する。
【０２４９】
R1がRLuc8を含み、Lはシステイン残基を含む28アミノ酸ポリペプチドを含み、Bに結合したR2はフルオレセインリン酸又はフルオレセイン二リン酸(Table 1(表1)に示すとおり)であり、Bに結合したR2はマレイミド連結基を介して28アミノ酸ポリペプチド上のシステイン残基に結合している、センサー分子等の1μMの本明細書に定義されるセンサー分子。センサーを100mM Tris HCl、68mM NaCl、pH8.0等の好適な緩衝液を使用して所望の濃度に希釈し、45μLのこの調製物を50μLの乳と混合する。任意の好適な乳、例えば対照としての生の牛乳又は低温殺菌乳をアッセイにおいて使用することができ、他に未加工であってよい又は脂肪及び/若しくはタンパク質、及び若しくは乳糖のレベルが加工されていてよい、又は実際に追加的な熱処理若しくは添加物(香料又は着色剤等)に供されてよい。乳とセンサーとの混合物を1から120分間の間、典型的には5〜10分間の間、20〜30℃でインキュベートする。インキュベーション時間の終わりに、EtOH中5μLのセレンテラジン400aを加え(最終セレンテラジン400a  濃度17μMに)、反応物を最終体積100μLにし、スペクトルスキャンを直ちに記録する。BRET比をピーク蛍光アクセプター発光強度の、RLucについて典型的には420nmであるピークドナー発光強度に対する比として算出する。代替的に、ドナー及びアクセプター発光の強度は、バンドパス又は、Clariostar plate reader (BMG Labtech社)等の他のスペクトルフィルターを有する装置で測定でき、BRET比をRLuc発光強度の蛍光アクセプター発光強度に対する比として算出する。このアッセイは、WO 2013/155553及びPCT/AU2018/050824に記載のとおりマイクロ流体デバイス上でも実施できる。
【０２５０】
データ分析及び結果の解釈
低温殺菌の有効性を、典型的には、既知の量のアルカリホスファターゼ及び/又は低温殺菌していない生乳の試料(高レベルのアルカリホスファターゼを有する)並びに確実に低温殺菌した又は更にUHT乳(非常に低い若しくは検出不可能なレベルのアルカリホスファターゼを含む)試料を使用して観察された、BRET比における変化を比較することによって評価する。良好な低温殺菌では、アルカリホスファターゼのレベルは低い又は検出不可能となる。したがって、乳が良好に低温殺菌された場合、低いBRET比に対応する、高レベルのRLucドナー発光強度及び低レベルの蛍光アクセプター成分発光強度が観察される。良好でない低温殺菌又は低温殺菌されていない乳が低温殺菌された乳に混入した場合、上昇した又は高いBRET比に対応する、低レベルのドナーピーク発光強度及び高レベルのアクセプターピーク発光強度が観察される。陰性対照試料を超えるBRET比の中程度の上昇でさえ、不完全な低温殺菌又は低温殺菌されていない乳の混入を示す懸念の原因であるとみなされる。
【０２５１】
(実施例7)
発症前又は臨床的乳腺炎を診断するためのホスファターゼ活性の測定
ウシにおける発症前又は臨床的乳腺炎は、炎症を有する1つ又は複数の分房(quarter)からの乳に局在化され得る乳中のアルカリホスファターゼ(EC3.1.3.1)の上昇と関連する(Bogin and Ziv, 1973)。研究は、ホルスタインウシの乳中のアルカリホスファターゼを測定することは、個々のウシにおいて無症候性乳腺炎を診断するために使用するために十分な感度及び特異性を有することを示している(Babaeiら、2007)。したがって、本明細書に記載の種類のリン酸-ブロックセンサー(例えば、Table 1(表1)を参照されたい)は、個々のウシ又は発症前乳腺炎又は乳腺炎を経験したウシの特定の分房の可能性を決定するために使用できる。
【０２５２】
材料及び方法
BRETアッセイを最終体積100μLで96ウエルプレート中で実行する。スペクトルスキャンを発光モード(20nmインクリメント)、白色96ウエルプレート(Opti-plate(登録商標)-96、PerkinElmer社)においてSpectramaxM3プレート読み取り蛍光光度計(Molecular Devices社)を用いて記録する。
【０２５３】
R1がRLuc8を含み、Lはシステイン残基を含む28アミノ酸ポリペプチドを含み、Bに結合したR2はフルオレセインリン酸又はフルオレセイン二リン酸(Table 1(表1)に示すとおり)であり、Bに結合したR2はマレイミド連結基を介して28アミノ酸ポリペプチド上のシステイン残基に結合している、センサー分子等の1μMの本明細書に定義されるセンサー分子。センサーを100mM TrisHCl、68mM NaCl、pH8.0等の好適な緩衝液を使用して所望の濃度に希釈する。45μLのセンサーを50μLの未加工の生の牛乳と混合する。試料は、乳房の各分房から別々に回収してよい、又は代替的に試料は、2つ以上の分房から合わせてよい。センサーを含む乳を1から120分間の間、典型的には5〜10分間の間、20〜30℃でインキュベートする。インキュベーション時間の終わりに、エタノール中5μLのセレンテラジン400aを加え(最終セレンテラジン400a濃度17μM)、スペクトルスキャンを直ちに記録する。BRET比をピーク蛍光アクセプター発光強度の、RLucについて典型的には420nmであるピークドナー発光強度に対する比として算出する。代替的に、ドナー及びアクセプター発光の強度は、バンドパス又は、Clariostar plate reader (BMG Labtech社)  等の他のスペクトルフィルターを有する装置で測定でき、BRET比をRLuc発光強度の蛍光アクセプター発光強度に対する比として算出する。このアッセイは、WO 2013/155553及びPCT/AU2018/050824に記載のとおりマイクロ流体デバイス上でも実施できる。
【０２５４】
データ分析及び結果の解釈
乳腺炎又は無症候性乳腺炎の可能性は、アッセイが検査試料(例えば、乳腺炎を有すると疑われるウシ由来)を使用して実施される場合に得られるBRET比を、アッセイが同じ群れの健康な動物からの生乳試料若しくは同じ動物から回収された以前の乳を使用して実施される場合に得られるBRET比と比較することによって、又は理想的には、各ウシの各分房において測定されたアルカリホスファターゼ活性の以前の記録と比較することによって、評価される。この手法は、個々の分房から乳を規定どおり回収し、分析する現在の自動搾乳システムを使用すると実現可能である。
【０２５５】
アルカリホスファターゼのレベルの上昇は、低レベルのドナーピーク発光強度及び高レベルのアクセプターピーク発光強度を生じる(本明細書に定義される上昇した又は高BRET比に対応する)。ウシ又はその分房から以前観察された平均レベルを1〜3標準偏差以上超えるアルカリホスファターゼ活性の上昇等の統計的閾値は、BRET比の上昇が懸念の原因とみなす、及び/又は追跡を始める時期を決定するために使用できる。
【０２５６】
(実施例8)
リパーゼ活性の測定
リパーゼ(EC 3.1.1.x)は、アルコールと中鎖から長鎖脂肪酸との間に形成されたエステルを加水分解するエステラーゼのサブクラスである。リパーゼは、天然で広範囲に分布し、多数の重要な産業的及び他の使用が見出されている。したがって、臨床診断及び、産業加工における及びリパーゼを含有する商業的製品の製剤化の際の品質管理の一部を含む、さまざまな環境においてリパーゼ活性を測定することは重要である(Stoytchevaら、2012)。リパーゼ活性の測定は、本明細書に定義されるセンサーを使用して達成でき、ここでBは、例えばアシルエステル結合を介してフルオロフォアに連結された中鎖から長鎖脂肪酸又はアシル若しくはジアシルグリセロールである。
【０２５７】
材料及び方法
BRETアッセイを最終体積100μLで96ウエルプレート中で実行する。スペクトルスキャンを発光モード(20nmインクリメント)、白色96ウエルプレート(Opti-plate(登録商標)-96、PerkinElmer社)においてSpectramaxM3プレート読み取り蛍光光度計(Molecular Devices社)を用いて記録する。
【０２５８】
R1がRLuc8を含み、Lはシステイン残基を含む28アミノ酸ポリペプチドを含み、Bに結合したR2はフルオレセインラウリンレート又はフルオレセインジラウレートであり、Bに結合したR2はマレイミド連結基を介して28アミノ酸ポリペプチド上のシステイン残基に結合しているセンサー分子等の本明細書に定義されるセンサー分子を好適な緩衝液(例えば、50〜100mM NaCl、40〜100mM Tris-HCl、pH8.0、0.0125〜0.05%(v/v) Zwittergent若しくはTriton X-100若しくは当量のミセル形成界面活性剤及び2〜4%(w/v)脂肪酸不含有ウシ血清アルブミン(albumen) (Basuら、2011に基づく)を使用して2〜5μMの最終濃度に希釈する。45μLのこの調製物を、試料を含む50μLのリパーゼと混合し、1から120分間の時間、典型的には5〜10分間、20〜30℃でインキュベートする。インキュベーション時間の終わりに、EtOH中5μLのセレンテラジン400aを加え(最終[coel 400a]=17μM)、スペクトルスキャンを直ちに記録する。BRET比をピーク蛍光アクセプター発光強度の、RLucについて典型的には420nmであるピークドナー発光強度に対する比として算出する。代替的に、ドナー及びアクセプター発光の強度は、バンドパス又は、Clariostar plate reader (BMG Labtech社)等の他のスペクトルフィルターを有する装置で測定でき、BRET比をRLuc発光強度の蛍光アクセプター発光強度に対する比として算出する。代替的に、ドナー及びアクセプター発光の強度は、バンドパス又は、Clariostar plate reader (BMG Labtech社)等の他のスペクトルフィルターを有する装置で測定でき、BRET比をRLuc発光強度の蛍光アクセプター発光強度に対する比として算出する。このアッセイは、WO 2013/155553及びPCT/AU2018/050824に記載のとおりマイクロ流体デバイス上でも実施できる。
【０２５９】
アッセイを実施する前に、リパーゼ含有試料は、リパーゼアッセイの特異性を目的の1つ又は複数のリパーゼだけに調整できる、例えばIglesiasら、2016において述べられているものから選択される特異的リパーゼ阻害剤とプレインキュベートされてよい。
【０２６０】
アッセイは、これだけに限らないが、臨床試料又は他の種類の生物学的試料又は目的のリパーゼを含有する産業試料が挙げられる、リパーゼを含有する可能性がある試料を用いて実施される。
【０２６１】
データ分析及び結果の解釈
特異的リパーゼ阻害剤の存在又は非存在での特定のリパーゼの相対的活性は、センサー改変の程度及びしたがってBRET比における変化を、同じ条件下で既知の量の標準リパーゼによってもたらされるBRET比における変化と比較することによって評価できる。同等の条件下で、高レベルのリパーゼ活性は、低レベルのドナーピーク発光強度及び高レベルのアクセプターピーク発光強度を生じる(本明細書に定義される上昇した又は高いBRET比に対応する)。
【０２６２】
(実施例9)
エステラーゼ、ホスファターゼ又はリパーゼ活性の算出
エステラーゼ、ホスファターゼ又はリパーゼ活性は、本明細書に定義されるセンサーを用いて測定されたBRET比における変化から算出できる。酵素活性は、相対的な語、この場合、特定の期間にわたるBRET比における変化で好都合に表現できる。標準アッセイ条件下での試料間、並びに/又は試料と標準物、並びに/又は試料と陽性及び陰性対照の間でのBRET比における変化(例えば、1分間にわたるBRET比における数値的変化)を比較することは、エステラーゼ、ホスファターゼ及びリパーゼ又は本明細書に定義される他のヒドロラーゼセンサーのほとんどの実施適用のために好適である。
【０２６３】
絶対的に(すなわち、1分間に転換される基質のマイクロモル)結果を推定することが望ましい場合、本明細書に定義されるセンサーに基づくBRETは、未知試料によって生じるBRET比における変化の速度を、同じ又は同様の条件下で、その特異的活性が別の手段によって決定されている同じエステラーゼ、ホスファターゼ、リパーゼ又は他のヒドロラーゼ酵素の精製調製物によって生じる比における変化の速度と、比較することによって校正できる。酵素の多数のそのように精製された調製物は、Merck社等の種々の供給者から商業的に入手できる。代替的に、基質の転換速度は、後の反応からセレンテラジンを省き、代わりに吸光度分光法を使用してブロックされていないフルオロフォアの濃度における増加の速度を測定することによって、並行アッセイにおいて推定できる。フルオレセインアセテート、フルオレセインリン酸又はフルオレセインラウレート等のブロックされたフルオレセイン基の場合、1分間に転換されるセンサーのモル数として、同じアッセイ条件下でのBRET比における変化の速度を較正するために、所与の波長及びアッセイpHでのフルオレセインの公開されたモル吸光計数(例えば、Sjobackら、1995において開示のとおり)をすべてのバックグラウンド吸収を減算して使用する。1度実施されると較正は、同様の又は同一の条件下で異なる時期に得られた測定値に適用できる。
【０２６４】
特異的活性の観点から酵素活性を表すことが望ましい場合(すなわち、1分間に1mgのタンパク質あたりで転換される基質のマイクロモル)、280nmでの吸光度、Bradfordタンパク質アッセイ、Lowryタンパク質アッセイ、ビシンコニン酸タンパク質アッセイ又は任意の公開された若しくは商業的に入手できる代替法又は、当業者に周知であるこれらの方法の変法等の任意の一般に許容される方法を使用して試料中のタンパク質の濃度を推定することも必要である。
【０２６５】
活性の観点よりむしろ質量として試料中に存在する酵素の量を表すことが望ましい場合、目的の酵素の純粋な調製物に対する典型的又は測定された特異的活性を使用してこれを算出することは可能である。例えば、上の手法を使用して、具体的なエステラーゼ含有試料が1分間あたり基質0.005マイクロモルの転換と等価であると決定された、アッセイにおけるBRET比の変化の速度を支持し、純粋なエステラーゼの特異的活性が1分間あたり、タンパク質1ミリグラムあたり基質100マイクロモルが転換されることが周知である場合、存在するエステラーゼの量は、どのような体積の試料が使用されても0.005/100=0.00005mg又は50ngと算出される。
【０２６６】
これを、モル数で表すことが望ましい場合、次に目的の酵素の公開された分量を適用する。例えば、ブタ肝臓カルボキシエステラーゼの場合(M=163,000±15,000;Horganら、1969)、上記の無作為な例の値を使用して、存在するエステラーゼのモル量は、およそ50ng/163,000gM-1およそ0.3フェムトモルと推定される。
【０２６７】
本出願は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる、2017年8月24日に出願された豪州出願第2017903420号の優先権を主張する。
【０２６８】
広範に記載される本発明の精神又は範囲から逸脱することなく、特定の実施形態に示されているような発明に対して、数々の変形及び/又は改変を施し得ることを当業者は理解するであろう。したがって、本発明の実施形態は、あらゆる点で、限定的ではなく例示的なものとして考慮される。
【０２６９】
本明細書で議論及び/又は参照した全ての公開資料は、本明細書にその全体が組み込まれる。
【０２７０】
本明細書に挙げた文書、法律(acts)、材料、デバイス、物品等の議論はいずれも、本発明に文脈を提供することのみを目的とする。これらの事項のいずれか又は全てが、本出願の各請求項の優先日より前に存在したからといって、先行技術基準の一部を構成していること、又は、本発明に関連する分野における共通一般知識であったことの承認と解釈されない。
【０２７１】
［参考文献］
2020531022.tif 000028
2020531022.tif 000029
【図１】
2020531022.tif 000030
【図２】
2020531022.tif 000031
【図３】
2020531022.tif 000032
【図４】
2020531022.tif 000033
【図５】
2020531022.tif 000034
【図６】
2020531022.tif 000035
【図７Ａ】
2020531022.tif 000036
【図７Ｂ】
2020531022.tif 000037
【図７Ｃ】
2020531022.tif 000038
【図８】
2020531022.tif 000039
【図９】
2020531022.tif 000040
【図１０】
2020531022.tif 000041
【配列表】
2020531022000001.app
【国際調査報告】
2020531022.tif 000042
2020531022.tif 000043
2020531022.tif 000044
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