(57)【要約】本発明は、害虫、特に線虫を防除するための材料および方法を提供する。本発明はまた、殺害虫剤として生物界面活性剤を含む組成物を提供する。2020512305.tif 000012
2020512305.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
線虫を防除するための方法であって、該方法は、微小生物が生物界面活性剤を産生する条件下で微小生物を培養することによって微生物に基づく殺線虫組成物を調製する工程を含み、該殺線虫組成物は、微小生物および/または微小生物が培養される培養液を含み、かつ該方法は、線虫および/またはそれらの環境に該殺線虫組成物を適用する工程をさらに含む、該方法。
【請求項２】
生物界面活性剤が糖脂質である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
糖脂質がソホロ脂質（SLP）である、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
糖脂質がマンノシルエリスリトール脂質（MEL）である、請求項2に記載の方法。
【請求項５】
微小生物が、スターメレラ（Starmerella）、ピキア（Pichia）、およびシュードザイマ（Pseudozyma）より選択される真菌である、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
真菌がスターメレラ・ボンビコーラ（Starmerella bombicola）である、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
真菌がシュードザイマ・アフィディス（Pseudozyma aphidis）である、請求項5に記載の方法。
【請求項８】
真菌がピキア・アノマラ（Pichia anomala）（ウィッカーハモマイセス・アノマルス（Wickerhamomyces anomalus））である、請求項5に記載の方法。
【請求項９】
培養液が生物界面活性剤を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
培養液を処理して生物界面活性剤を細胞塊から分離し、それに続いて生物界面活性剤を線虫および/またはそれらの環境に適用する工程をさらに含む、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
最初に生物界面活性剤を細胞塊から分離することなく、培養液を線虫および/またはそれらの環境に適用する、請求項9に記載の方法。
【請求項１２】
根瘤線虫（サツマイモネコブセンチュウ（Meloidogyne incognital））、刺毛線虫（sting nematode）（ベロノライムス・ロンギカウダツス（Belonolaimus longicaudatus））、大豆シスト線虫（ダイズシストセンチュウ（Heterodera glycines））、病変線虫（プラチレンクス（Pratylenchus）種）、ダガー線虫（dagger nematode）（キシフィネマ（Xiphinema）種）、および柑橘類線虫（ミカンネセンチュウ（Tylenchulus semipenetrans））より選択される線虫を防除するために用いられる、請求項1に記載の方法。
【請求項１３】
植物の線虫害虫を防除するために用いられる、請求項1に記載の方法。
【請求項１４】
植物が、トマト、大豆、コーン、柑橘類、および芝草より選択される、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
前記組成物が種子処理として適用される、請求項13に記載の方法。
【請求項１６】
前記組成物が土壌に適用される、請求項1に記載の方法。
【請求項１７】
線虫誘引物を適用する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１８】
生物界面活性剤および生物界面活性剤を産生する微小生物を含む、線虫を防除するための組成物。
【請求項１９】
生物界面活性剤が糖脂質である、請求項18に記載の組成物。
【請求項２０】
糖脂質がSLPである、請求項19に記載の組成物。
【請求項２１】
糖脂質がMELである、請求項19に記載の組成物。
【請求項２２】
線虫誘引物質をさらに含む、請求項19に記載の組成物。
【請求項２３】
線虫誘引物質がカノコソウ（Valerian）の根抽出物を含む、請求項22に記載の組成物。
【請求項２４】
マンノシルエリスリトール脂質（MEL）を線虫および/または線虫の環境に適用する工程を含む、線虫を防除するための方法。
【請求項２５】
線虫にSLPを適用する工程をさらに含む、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
線虫誘引物質をさらに含む、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
根瘤線虫（サツマイモネコブセンチュウ）、刺毛線虫（ベロノライムス・ロンギカウダツス）、大豆シスト線虫（ダイズシストセンチュウ）、病変線虫（プラチレンクス種）、ダガー線虫（キシフィネマ種）、および柑橘類線虫（ミカンネセンチュウ）より選択される線虫を防除するために用いられる、請求項25に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2016年11月16日に提出された米国仮出願第62/422,918号の恩典を主張し、それは参照によりその全体として本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
収量を高めるため、ならびに作物を病原菌、害虫、および病害から守るために、農場経営者は、合成化学物質および化学肥料の使用に大きく依存している；しかしながら、過度に用いられたまたは不適正に適用された場合、これらの物質は地表水に流出し得、地下水に浸出し得、および空気中に蒸発し得る。空気および水の汚染源として、これらの物質はますます精査され、それらの責任ある使用が生態学的および商業的な責務になっている。適正に用いられた場合でさえ、ある特定の化学肥料および殺害虫剤の過度の依存および長期にわたる使用は、土壌生態系を有害に変更し得、ストレス耐性を低下させ得、害虫抵抗性を増加させ得、植物および動物の成長および生命力を妨げ得る。
【０００３】
線虫は、線形動物門の回虫または蟯虫（threadworm）の1つのクラスである。このクラスにおける例は、ヘテロデラ（Heterodera）属（例えば、ダイズシストセンチュウ（H. glycines）、ムギシストセンチュウ（H. avenae）、およびテンサイシストセンチュウ（H. shachtii））およびグロボデラ（Globodera）属（例えば、ジャガイモシストセンチュウ（G. rostochiens）およびジャガイモシロシストセンチュウ（G. pallida））の嚢胞形成線虫、トリコドラス（Trichodorus）属のずんぐりした根線虫、クキセンチュウ（Ditylenchus）属の球根および茎線虫、ジャガイモシスト線虫（golden nematode）であるヘテロデラ・ロストキエンシス（Heterodera rostochiensis）、ネコブセンチュウ（Meloidogyne）属（例えば、ジャワネコブセンチュウ（M. javanica）、キタネコブセンチュウ（M. hapla）、アレナリアネコブセンチュウ（M. arenaria）、およびサツマイモネコブセンチュウ（M. incognita））の根瘤線虫、プラチレンクス（Pratylenchus）属（例えば、P.グーデイ（goodeyi）、キタネグサレセンチュウ（P. penetrans）、P.ブラクトルバルス（P. bractrvurus）、モロコシネグサレセンチュウ（P. zeae）、ミナミネグサレセンチュウ（P. coffeae）、P.ブラクトルバルス、およびP.トルネイ（P. thornei））の根病変線虫、チレンチュラス（Tylenchulus）属の柑橘類線虫、ならびにベロノライムス（Belonalaimus）属の刺毛線虫（sting nematode）である。
【０００４】
線虫は、植物および動物の両方に感染することで知られる。これらの微小蠕虫は、ほぼあらゆるタイプの環境に見い出され得る。土壌に住む場合、線虫は植物の根を餌にし、根構造への重大な損傷および植物の不適正な発達を引き起こす。損傷は、一般的に、こぶの発達、根瘤、および他の異常によって現れる。こぶ形成は、根のサイズの低下および根系の無効性につながり、それが次に植物の他の部分に深刻な影響を及ぼす。結果として、弱った植物は、他の病原菌による攻撃を受けやすくなる。適正な処理なしでは、植物は死滅する。線虫は、毎年、芝草、観賞植物、および食用作物への数百万ドルの損害を引き起こしている。
【０００５】
根瘤線虫（ネコブセンチュウ種）は、園芸作物および農作物の植物寄生線虫の最も経済的に損害を与える3種の属の1つである。根瘤線虫は世界中に分布しており、単子葉植物および双子葉植物、草木植物、ならびに木本植物を含めた数千の植物種の根の偏性寄生生物である。温暖な気候で成長する野菜作物は、根瘤線虫による重度の損失を経験し得、化学的殺線虫剤でしばしば日常的に処理される。根瘤線虫による損害は、成長不良、作物の品質および収量の下落、ならびに他のストレス（例えば、干ばつ、他の病害）に対する抵抗性の低下をもたらす。高レベルの損害は、全体的な作物の損失につながり得る。例えば、1年あたりおよそ15億ドルが大豆シスト線虫のみのために失われている。
【０００６】
線虫を防除するために用いられる従来的な殺線虫剤は、植え付け時にまき溝に適用される。鳥類などの付近の動物への毒性が理由で、ネマクール、テミック、フラダン、ダジナット（Dazinat）、およびモカップ（Mocap）などの毒性化合物の液体適用による頭上センターピボットはすっかり支持を失っている。
【０００７】
1960年代以来、臭化メチルは、植え付け前に田畑を有効に消毒して、主として線虫を防除するためならびに病害および雑草を処理するために、栽培者によって用いられてきた；しかしながら、この毒性化合物は気体形態で用いられるため、土壌に注入された量の半分を上回る割合が、最終的に大気中に行き着き得、オゾン層の薄層化の一因となり得る。2005年に、先進諸国は、成層圏オゾン層を保護するために1987年に署名された国際条約であるモントリオール議定書の下で臭化メチルを禁止した。
【０００８】
禁止の下で、条約は、イチゴ、アーモンド、ならびに線虫、病害、および雑草の有効でかつ手頃な防除に対して代替手段を欠く他の作物における臭化メチルの限定的使用を許可している。認可された使用の程度は毎年減少しており、おそらくまもなく終わるであろう。ゆえに、臭化メチルの代替手段を見い出すことは、栽培者および規制機関にとっての優先事項である；しかしながら、1つの製品も、臭化メチルによって付与される広域スペクトルの防除を提供していない。
【０００９】
化学物質の利用率および使用を取り締まる規制指令の高まり、ならびに残留物不含の、持続可能に育てられた食料に対する消費者の需要は、産業に影響を与えており、どのようにして無数の課題に対処するかに関する考えの進化を引き起こしている。化学物質の大規模な排除は現時点では実現可能でないものの、農場経営者は、統合栄養素管理（Integrated Nutrient Management）および統合害虫管理（Integrated Pest Management）プログラムの実行可能な構成要素として生物学的処置の使用をますます取り入れつつある。
【００１０】
上記した主な手法の欠点が原因で、より安全な殺害虫剤および代替的な害虫防除戦略に対する需要が増加しつつある。特に、近年、線虫の生物学的防除が大きな関心を集めている。この方法は、殺害虫剤として、生きた微生物、これらの微生物に由来するバイオ産物（bio-product）、およびそれらの組み合わせなどの生物学的作用物質を利用する。これらの生物学的殺害虫剤は、他の従来的殺害虫剤と比べて重要な利点を有する。例えば、それらは、従来の化学的殺害虫剤と比較して害が少ない。それらはより効率的でかつ特異的であり、それらはしばしば迅速に生物分解し、より少ない環境汚染につながる。
【００１１】
生物農薬および他の生物学的作用物質の使用は、生産、輸送、投与、価格設定、および効力における難しさによって大きく限定されている。例えば、多くの微生物は増殖しにくく、その後、有用であるほど十分な分量で農業および林業生産システムに展開しにくい。この問題点は、安定化、輸送、および適用の手段としての加工、製剤化、貯蔵、流通前の安定化、栄養期細胞（vegetative cell）の胞子形成が原因の生存率および/または活性の喪失によって悪化する。さらには、いったん適用されても、例えば不十分な初期細胞密度、特定の場所で既存のミクロフローラと有効に競合することができないこと、ならびに微生物が繁殖し得ないまたは生存さえし得ない土壌および/または他の環境条件に導入されることを含めたいくつもの理由で、生物学的製品は目的を達成できない可能性がある。
【００１２】
したがって、線虫を防除する有効な生物農薬を生産するための方法および材料の開発に対する緊急の必要性がある。
【発明の概要】
【００１３】
簡単な概要
本発明は、線虫を防除するための組成物および方法を提供する。加えて、本発明は、線虫による作物への損傷を防止し、ゆえに収量増加をもたらすための方法および組成物を提供する。有利なことに、本発明に従った殺害虫剤は、微生物および微生物培養の副産物などの非毒性物質を利用する。
【００１４】
1つの態様において、本発明は、微生物増殖副産物を産生する微小生物を培養する工程、ならびに有効量の微生物および/または微生物増殖副産物を線虫またはそれらの環境に接触させる工程を含む、線虫損傷を防止しおよび線虫を防除するための方法を提供する。
【００１５】
1つの態様において、微生物増殖副産物は生物界面活性剤である。1つの態様において、生物界面活性剤は、ラムノ脂質、ソホロ脂質（SLP）、トレハロース脂質、またはマンノシルエリスリトール脂質（MEL）などの糖脂質である。特に好ましい態様において、生物界面活性剤はSLPおよび/またはMELである。
【００１６】
本発明の微生物に基づく殺線虫組成物は、小規模から大規模に及ぶ培養過程を通じて得ることができる。これらの培養過程には、液内培養/発酵、表面培養、固体状発酵（SSF）、およびそれらの組み合わせが含まれるが、それらに限定されるわけではない。殺線虫組成物は、例えば発酵培養液および/または精製された生物界面活性剤であり得る。
【００１７】
一部の態様において、組成物における生物界面活性剤産生微小生物は、現場で増殖しおよび直接使用のための生物界面活性剤を産生して、線虫を防除し得る。その結果として、処理部位（例えば、土壌）における高濃度の生物界面活性剤および/または生物界面活性剤産生微小生物が容易にかつ継続的に達成され得る。
【００１８】
1つの態様において、本発明に従ったシステムは、微生物に基づく製品のフィールド適用を提供する付加的な局面を含む。本発明の微生物に基づく製品は、例えば灌漑システムを通じて、噴霧剤として、種子処理として、土壌表面に、植物表面に、および/または害虫表面に適用され得る。従来的実行による機械的適用、または空中もしくは地上に基づく「ドローン」によるロボット適用も促される。
【００１９】
殺線虫組成物は、線虫を防除することによって、植物、ヒト、または動物を保護するために用いられ得る。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】様々な条件下における処理の3日後の線虫運動性低下を示す：それぞれ、0.05％（v/v）、0.125％（v/v）、0.25％（v/v）、および0.5％（v/v）のSD10；それぞれ、0.025％（v/v）、0.05％（v/v）、0.1％（v/v）、および0.2％（v/v）のSD12；10ppm aiのNimitz（登録商標）；ならびに未処理チェック。SD10はSLP処理を指す。SD12はMEL処理を指す。
【図２】様々な条件下における処理の3日後の線虫死亡割合を示す：それぞれ、0.05％（v/v）、0.125％（v/v）、0.25％（v/v）、および0.5％（v/v）のSD10；それぞれ、0.025％（v/v）、0.05％（v/v）、0.1％（v/v）、および0.2％（v/v）のSD12；10ppm aiのNimitz（登録商標）；ならびに未処理チェック。
【図３】病理検査室ジャーテストにおける様々な土壌処理の3、14、および23日後の生きた線虫カウント数を示す：0.25％（v/v）および0.5％（v/v）のSD10；0.1％（v/v）および0.2％（v/v）のSD12；SD10（0.25％ v/v/）＋SD12（0.1％ v/v）；10ppm prのNimitz（登録商標）；ならびに未処理チェック。
【図４】病理検査室ジャーテストにおける様々な土壌処理の3、14、および23日後の生きた線虫防除（すなわち線虫死滅）を示す：0.25％（v/v）および0.5％（v/v）のSD10；0.1％（v/v）および0.2％（v/v）のSD12；SD10（0.25％ v/v/）＋SD12（0.1％ v/v）；10ppm prのNimitz（登録商標）；ならびに未処理チェック。
【図５】病理検査室ジャーテストにおける様々な土壌処理の3、14、および23日後の非運動性線虫カウント数を示す：0.25％（v/v）および0.5％（v/v）のSD10；0.1％（v/v）および0.2％（v/v）のSD12；SD10（0.25％ v/v/）＋SD12（0.1％ v/v）；10ppm prのNimitz（登録商標）；ならびに未処理チェック。
【図６】病理検査室ジャーテストにおける様々な土壌処理の3、14、および23日後の非運動性の生きた線虫カウント数を示す：0.25％（v/v）および0.5％（v/v）のSD10；0.1％（v/v）および0.2％（v/v）のSD12；SD10（0.25％ v/v/）＋SD12（0.1％ v/v）；10ppm prのNimitz（登録商標）；ならびに未処理チェック。
【図７】5つの異なる処理で処理されたキュウリ小区画に関する、収穫時のこぶ形成率を示す：未処理チェック；5pt/aのNimitz（登録商標）；SD12 0.2％（ai/v）単回処理；SD12 0.2％（ai/v）二重処理；SD12 0.2％（ai/v）三重処理。
【図８】5つの異なる処理で処理されたキュウリ小区画に関する、収穫時の線虫カウント数を示す：未処理チェック；5pt/aのNimitz（登録商標）；SD12 0.2％（ai/v）単回処理；SD12 0.2％（ai/v）二重処理；SD12 0.2％（ai/v）三重処理。
【図９】線虫接種ゾーンおよび誘引物適用ゾーンの場所を含めた、線虫誘引効力の評価のための区画設定を示す。
【図１０】線虫誘引評価のための区画における3つの異なる場所での（区画全体の線虫集団についての）蔓延パーセントを示す。「中心部」は接種ゾーンの中心部を指し、「誘引物」は誘引物ゾーンを指し、「未処理」は他のすべての区画エリアを指す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
詳細な開示
本発明は、線虫を防除するための材料および方法を提供する。本発明はまた、線虫を防除するための殺害虫剤として用いられ得る組成物を提供する。本発明は、そのような組成物を調製するための方法をさらに提供する。加えて、本発明は、線虫による作物の損傷を防止し、ゆえに収量増加をもたらすための方法および組成物を提供する。
【００２２】
本発明の微生物に基づく製品は、作物、家畜、森林地、芝生管理、牧草地、ならびにヒトおよび動物の健康状態を含むがそれらに限定されない設定において用いられ得る。
【００２３】
1つの態様において、本発明に従った線虫を防除するための組成物は、有効量の微生物生物界面活性剤および/またはそのような生物界面活性剤を産生する微小生物を含む。
【００２４】
1つの態様において、線虫を防除する方法は、微生物生物界面活性剤を得る工程、および有効量の微生物生物界面活性剤を線虫またはそれらの地点に適用する工程を含む。
【００２５】
本発明に従った組成物は、例えば、小規模から大規模に及ぶ培養過程によって得ることができる。これらの培養過程には、液内培養/発酵、表面培養、固体状発酵（SSF）、およびそれらの組み合わせが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００２６】
微生物生物界面活性剤を含有する発酵の産物は、抽出または精製なしで線虫処理に直接用いられ得る。所望の場合には、生物界面活性剤の抽出および精製は、本明細書において記載されるように達成され得る。有利には、本発明に従った培養法は、高濃度の微小生物および高濃度の生物界面活性剤を産生し得る。
【００２７】
ある特定の態様において、本発明に従った方法および組成物は、未処理植物と比較して、線虫によって引き起こされる損傷を約5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、もしくは90％、またはそれを上回る割合低下させる。
【００２８】
1つの態様において、本発明は、作物または植物収量を増加させる方法を提供する。ある特定の態様において、本発明に従った方法および組成物は、未処理植物と比較して、作物収量を約5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、もしくは90％、またはそれを上回る割合増加させる。
【００２９】
1つの態様において、本発明の方法は、未処理植物と比較して、植物の根における線虫卵の数を約5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、もしくは90％、またはそれを上回る割合低下させる。
【００３０】
別の態様において、本発明は、未処理植物と比べて、植物の重量またはサイズを増加させる方法を提供する。
【００３１】
選択された定義
本明細書において使用するとき、生物界面活性剤または生物界面活性剤産生微小生物によってもたらされる活性に関連して用いられる「防除」という用語は、害虫を殺傷する、不能にする、もしくは動きを止める、または別様に害虫が実質的に害を引き起こし得なくすることにまで及ぶ。
【００３２】
本明細書において使用するとき、「殺線虫性」とは、線虫を防除し得る能力を有することを意味する。ゆえに、例えば、線虫を殺傷すること、それらの運動性を低下させること、および卵数を低下させることはすべて、殺線虫活性の例である。
【００３３】
本明細書において使用するとき、「微生物に基づく組成物」への言及は、微小生物または他の細胞培養物の増殖の結果として産生された構成要素を含む組成物を意味する。ゆえに、微生物に基づく組成物は、微生物自体および/または微生物増殖の副産物を含み得る。微生物は、栄養期状態、胞子形態、菌糸形態、散布体の他の任意の形態にあり得、またはこれらの混合物であり得る。微生物は、プランクトン様であり得るもしくはバイオフィルム形態にあり得る、またはその両方の混合物であり得る。増殖の副産物は、例えば代謝産物、細胞膜構成要素、発現タンパク質、および/または他の細胞構成要素であり得る。微生物は、無傷であり得るか、または溶解され得る。好ましい態様において、微生物は、それらが増殖した培養液とともに、微生物に基づく組成物中に存在する。細胞は、例えば、1ミリリットルの組成物あたり1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、もしくは1×1011個、またはそれを上回る数の散布体の濃度で存在し得る。本明細書において使用するとき、散布体とは、細胞、胞子、菌糸、芽、および種子を含むがそれらに限定されない、新たなおよび/または成熟した生物が発生し得る、微小生物の任意の部分である。
【００３４】
本発明は、所望の結果を達成するために実践において適用される対象となる製品である「微生物に基づく製品」をさらに提供する。微生物に基づく製品は、微生物培養過程から収集された単なる微生物に基づく組成物であり得る。あるいは、微生物に基づく製品は、付加されたさらなる成分を含み得る。これらの付加的な成分には、例えば安定剤、緩衝剤、適当な担体、例えば水、塩類溶液、もしくは他の任意の適当な担体、さらなる微生物増殖を支持する付加栄養素、植物ホルモンなどの非栄養素成長増強剤、ならびに/または微生物および/もしくはそれが適用される環境における組成物の追跡を容易にする作用物質が含まれ得る。微生物に基づく製品は、微生物に基づく組成物の混合物も含み得る。微生物に基づく製品は、濾過、遠心分離、溶解、乾燥、精製などであるがそれらに限定されない何らかのやり方で加工された、微生物に基づく組成物の1つまたは複数の構成要素も含み得る。
【００３５】
微小生物
微生物生物界面活性剤は、細菌、真菌、および酵母などの多様な微小生物によって産生される化合物である。
【００３６】
1つの態様において、微小生物は、グラム陽性およびグラム陰性細菌を含めた細菌である。これらの細菌には、例えば大腸菌（Escherichia coli）、リゾビウム（Rhizobium）（例えば、リゾビウム・ジャポニクム（Rhizobium japonicum）、シノリゾビウム・メリロティ（Sinorhizobium meliloti）、シノリゾビウム・フレディ（Sinorhizobium fredii）、リゾビウム・レグミノサルム・ビオバル・トリフォリイ（Rhizobium leguminosarum biovar trifolii）、およびリゾビウム・エトリ（Rhizobium etli））、ブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）（例えば、B.ジャポニクムおよびB.パラスポニア（parasponia））、バチルス（Bacillus）（例えば、B.サブティリス（subtilis）、B.フィルムス（firmus）、B.ラテロスポルス（laterosporus）、B.プミルス（pumillus）、B.セレウス（cereus）、B.リケニフォルミス（licheniformis）、B.メガテリウム（megaterium）、およびB.アミロリケファシエンス（amyloliquifaciens））、アゾトバクター（Azobacter）（例えば、A.ビネランジイ（vinelandii）およびA.クロオコッカム（chroococcum））、アルスロバクター（Arthrobacter）（例えば、A.パッセンス（pascens））、アグロバクテリウム（Agrobacterium）（例えば、A.ラジオバクター（radiobacter））、シュードモナス（Pseudomonas）（例えば、P.クロロラフィス（chlororaphis）亜種オーレオファシエンス（aureofaciens）（クルイヴァー（Kluyver））、P.エルギノーサ（aeruginosa）、P.プチダ（putida）、P.フルオレッセンス（florescens）、P.フラギ（fragi）、およびP.シリンガエ（syringae））、フラボバクテリウム（Flavobacterium）種；アゾスピリルム（Azospirillium）（例えば、A.ブラシリエンシス（brasiliensis）、アゾモナス（Azomonas）、デルキシア（Derxia）、ベイジェリンキア（Beijerinckia）、ノカルディア（Nocardia）、クレブシエラ（Klebsiella）、クラビバクター（Clavibacter）（例えば、C.キシリー（xyli）亜種キシリーおよびC.キシリー亜種サイノドンティス（cynodontis））、シアノバクテリア（Cyanobacteria）、パントエア（Pantoea）（例えば、P.アグロメランス（agglomerans））、スフィンゴモナス（Sphingomonas）（例えば、S.パウシモビリス（paucimobilis））、ストレプトマイセス（Streptomyces）（例えば、S.グリセオクロモゲネス（griseochromogenes）、S.グリセウス（qriseus）、S.カカオイ（cacaoi）、S.アウレウス（aureus）、およびS.カスガエンシス（kasugaenis））、ストレプトベルティシリウム（Streptoverticillium）（例えば、S.リモファシエンス（rimofaciens））、ラルストニア（Ralslonia）（例えば、R.ユートロファ（eulropha））、ロドスピリルム（Rhodospirillum）（例えば、R.ルブルム（rubrum））、キサントモナス（Xanthomonas）（例えば、X.カンペストリス（campestris））、エルウィニア（Erwinia）（例えば、E.カロトボーラ（carotovora））、クロストリジウム（Clostridium）（例えば、C.ブチリカム（butyricum）、C.チロブチリカム（tyrobutyricum）、C.アセトブチリカム（acetobutyricum）、C.ベイジェリンキ（beijerinckii）、C.ブラビダシエンス（bravidaciens）、およびC.マラクソマエ（malacusomae））、ロドコッカス（Rhodococcus）、カンピロバクター（Campylobacter）、コリネバクテリウム（Cornybacterium）、およびそれらの組み合わせが含まれ得るが、それらに限定されるわけではない。
【００３７】
別の態様において、微小生物は酵母である。サッカロマイセス（Saccharomyces）（例えば、S.セレビシエ（cerevisiae）、S.ブラウディ・セクエラ（boulardii sequela）、およびS.トルラ（torula））、デバロマイセス（Debaromyces）、イッサチェンキア（Issalchenkia）、カンジダ（Candida）（C.アルビカンス（albicans）、C.ルゴサ（rugosa）、C.トロピカリス（tropicalis）、C.リポリティカ（lipolytica）、およびC.トルロプシス（torulopsis））、クルイウェロマイセス（Kluyveromyces）（例えば、K.ラクティス（lactis）、K.フラギリス（fragilis））、ピキア（Pichia）（例えば、ピキア・パストリス（Pichia pastoris））、ウィッカーハモマイセス（Wickerhamomyces）、スターメレラ（Starmerella）（例えば、スターメレラ・ボンビコーラ（Starmerella bombicola））、および/またはそれらの組み合わせを含むがそれらに限定されない多数の酵母種が、本発明に従った産生に適切である。
【００３８】
1つの態様において、酵母はキラー酵母である。本明細書において使用するとき、「キラー酵母」とは、それが毒性のタンパク質または糖タンパク質を分泌するということによって特徴付けられる酵母の株を意味し、それに対してその株自体は免疫がある。キラー酵母によって分泌された外毒素は、酵母の他の株、真菌、または細菌を殺傷し得る。例えば、キラー酵母によって防除され得る微小生物には、フザリウム（Fusarium）および他の糸状真菌が含まれる。本発明に従ったキラー酵母の例は、食料および発酵産業、例えばビール、ワイン、およびパン作りにおいて安全に用いられ得るもの；そのような生産過程に混入し得る他の微小生物を防除するために用いられ得るもの；食品防腐のための生物防除において用いられ得るもの；ヒトおよび植物の両方における真菌感染症の処置に用いられ得るもの；ならびに組換えDNA技術において用いられ得るものである。そのような酵母には、ウィッカーハモマイセス、ピキア（例えば、ピキア・アノマラ（Pichia anomala）、ピキア・ギリエルモンディ（Pichia guielliermondii）、ピキア・クドリアブゼビ（Pichia kudrizvzevii））、ハンゼヌラ（Hansenula）、サッカロマイセス、ハンセニアスポラ・ウバルム（Hanseniaspora uvarum）などのハンセニアスポラ、ウスチラゴ・マイディス（Ustilago maydis）、デバリオマイセス・ハンセニイ（Debaryomyces hansenii）、カンジダ、クリプトコッカス（Cryptococcus）、クルイウェロマイセス、トルロプシス、ウスチラゴ、ウィリオプシス（Williopsis）、ジゴサッカロマイセス・バイリ（Zygosaccharomyces bailii）などのジゴサッカロマイセス、およびその他が含まれ得るが、それらに限定されるわけではない。
【００３９】
1つの態様において、微小生物は、ミコリザ（Mycorrhiza）（例えば、嚢状体-アーバスキュラー菌根（vesicular-arbuscular mycorrhizae）（VAM）、アーバスキュラー菌根（AM））、モルティエレラ（Mortierella）、フィコマイセス（Phycomyces）、ブラケスレア（Blakeslea）、トラウストキトリウム（Thraustochytrium）、ペニシリウム（Penicillium）、フィチウム（Phythium）、エントモフトラ（Entomophthora）、アウレオバシジウム・プルランス（Aureobasidium pullulans）、フザリウム・ベネナタム（Fusarium venenalum）、アスペルギルス（Aspergillus）、トリコデルマ（Trichoderma）（例えば、T.リーセイ（reesei）、T.ハルチアナム（harzianum）、T.ビリデ（viride）、およびT.ハマタム（hamatum））、リゾプス（Rhizopus）種、内生菌（例えば、ピリフォルミス・インディカ（Piriformis indica））、およびそれらの組み合わせを含むがそれらに限定されない真菌である。
【００４０】
さらなる態様において、微小生物は、グロムス（Glomus）種およびアカウロスポラ（Acaulospora）種などの菌根菌（Mycorrhizal fungi）である。1つの態様において、微小生物はアーバスキュラー菌根菌（AMF）である。
【００４１】
具体的な態様において、SLPの産生のための微生物は、カンジダ種、スターメレラ種、クリプトコッカス種、シバーリンドネラ・サムトプラカルネンシス（Cyberlindnera samutprakarnensis）JP52（T）、ピキア種、ロドトルラ（Rhodotorula）種、またはウィッカーハミエラ（Wickerhamiella）種であり得る。
【００４２】
さらなる具体的な態様において、MELの産生のための微生物は、シュードザイマ（Pseudozyma）種、カンジダ種、ウスチラゴ種、スキゾネラ（Schizonella）種、またはクルツマノマイセス（Kurtzmanomyces）種であり得る。
【００４３】
好ましい態様において、微生物は酵母である。具体的な態様において、酵母は、スターメレラ、ピキア、および/またはシュードザイマである。本明細書において具体的に例示されるのは、スターメレラ・ボンビコーラ、ピキア・アノマラ（ウィッカーハモマイセス・アノマルス（Wickerhamomyces anomalus））、およびシュードザイマ・アフィディス（Pseudozyma aphidis）である。
【００４４】
生物界面活性剤
生物界面活性剤は、多くの微小生物において生じる二次代謝産物の重要なクラスを形成する。生物界面活性剤は生分解性であり、再生可能な基板上で選択生物を用いて容易かつ安価に産生され得る。生物界面活性剤を産生するほとんどの生物は、成長培地における炭化水素供給源（例えば、油、糖類、グリセロール等）の存在に応答して生物界面活性剤を産生する。他の培地構成要素も、生物界面活性剤産生に大いに影響を及ぼし得る。例えば、シュードモナス・エルギノーサ細菌によるラムノ脂質の産生は、窒素の供給源としてアンモニウムよりもむしろニトレートが用いられる場合に増加し得る。鉄、マグネシウム、ナトリウム、およびカリウムの濃度；炭素:リン比；ならびに撹拌も、ラムノ脂質産生に大きな影響を及ぼし得る。
【００４５】
生物界面活性剤には、低分子量の糖脂質（GL）、リポペプチド（LP）、フラボ脂質（flavolipid）（FL）、リン脂質、ならびにリポタンパク質、リポ多糖-タンパク質複合体、および多糖-タンパク質-脂肪酸複合体などの高分子量ポリマーが含まれる。生物界面活性剤分子の共通の親油性部分は脂肪酸の炭化水素鎖であり、一方で親水性部は、中性脂質のエステルもしくはアルコール基によって、フラボ脂質の場合には脂肪酸もしくはアミノ酸（もしくはペプチド）、有機酸のカルボキシレート基によって、または糖脂質の場合には炭水化物によって形成される。
【００４６】
本発明の態様によると、生物界面活性剤は、害虫の組織に浸透し得、アジュバントの使用なしでより少ない量で有効である。臨界ミセル濃度を上回る濃度で、生物界面活性剤は、処理された対象に、より有効に浸透し得ることが見い出されている。
【００４７】
多量に産生され得る本発明の天然生物農薬の開発は、当技術分野における著しい進歩である。害虫は、生物防除剤として生物界面活性剤産生生物を用いて、または生物界面活性剤自体によって防除され得る。加えて、害虫防除は、生物界面活性剤産生生物の成長を支持するならびに生物界面活性剤殺害虫剤を産生する特異的基質の使用によって達成され得る。有利には、天然生物界面活性剤は、競合する生物の成長を阻害し得、かつ特異的生物界面活性剤産生生物の成長を増強し得る。
【００４８】
加えて、これらの生物界面活性剤は、動物およびヒトの疾患を処置することにおいて重要な役割を果たし得る。動物は、例えば、生物界面活性剤溶液のみの中に、微生物細胞塊有りもしくは無しで、および/または銅もしくは亜鉛などの他の化合物の存在下で、浸すまたは入れることによって処置され得る。
【００４９】
微生物を培養するための方法
本発明は、微小生物の培養、ならびに生物界面活性剤および/または微生物増殖の他の副産物の産生のための方法を提供する。これらの培養過程には、液内培養/発酵、表面培養、固体状発酵（SSF）、およびそれらの組み合わせが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００５０】
微生物培養システムは典型的には液内培養発酵を用いる；しかしながら、表面培養およびハイブリッドシステムも用いられ得る。本明細書において使用するとき、「発酵」とは、制御された条件下での細胞、胞子、菌糸、および/または他の微生物散布体の成長を指す。成長は、好気性または嫌気性であり得る。
【００５１】
本発明に従って用いられる微生物増殖容器は、産業的用途のための任意の発酵槽または培養リアクターであり得る。培養過程は、例えば円錐状またはチューブ状であり得る容器内で行われる。1つの態様において、容器は、機能的な制御器/センサーを任意で有し得る、あるいはpH、酸素、圧力、温度、撹拌器軸動力、湿度、粘度および/もしくは微生物密度、ならびに/または代謝産物濃度など、培養過程における重要な因子を測定する機能的な制御器/センサーに接続され得る。
【００５２】
さらなる態様において、容器は、容器内部での微小生物の増殖（例えば、細胞数および増殖フェーズの測定）をモニターすることも可能であり得る。あるいは、毎日のサンプルを、容器から採取し得、希釈プレーティング技法などの当技術分野において公知の技法による計数に供し得る。希釈プレーティングは、サンプルにおける細菌の数を概算するために用いられる単純な技法である。この技法は、異なる環境または処理を比較し得る指標も提供し得る。
【００５３】
1つの態様において、方法は、培養物に窒素供給源を補給する工程を含む。窒素供給源は、例えば硝酸カリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、アンモニア、尿素、および/または塩化アンモニウムであり得る。これらの窒素供給源は、独立してまたは2種もしくはそれを上回る種類の組み合わせで用いられ得る。
【００５４】
方法は、増殖中の培養物に酸素供給を提供し得る。1つの態様は、空気のゆっくりとした動きを利用して、低酸素を含有する空気を除去し、酸素を豊富に含んだ空気を導入する。酸素を豊富に含んだ空気は、液体の機械的撹拌のためのインペラー、および液体中への酸素の溶解のために液体に気体の泡を供給するための空気スパージャーを含むメカニズムにより毎日補給される周囲空気であり得る。
【００５５】
方法は、培養物に炭素供給源を補給する工程をさらに含み得る。炭素供給源は、典型的に、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、トレハロース、マンノース、マンニトール、および/またはマルトースなどの炭水化物；酢酸、フマル酸、クエン酸、プロピオン酸、リンゴ酸、マロン酸、および/またはピルビン酸などの有機酸；エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、イソブタノール、および/またはグリセロールなどのアルコール；大豆油、キャノーラ油、ココナツ油、こめ油、オリーブ油、コーン油、ゴマ油、および/またはアマニ油などの油脂等である。これらの炭素供給源は、独立してまたは2種もしくはそれを上回る種類の組み合わせで用いられ得る。
【００５６】
1つの態様において、微小生物のための成長因子および微量栄養素が培地中に含まれる。これは、増殖中の微生物がそれらの要するビタミンのすべてを産生することができない場合に、特に好ましい。鉄、亜鉛、銅、マンガン、モリブデン、および/またはコバルトなどの微量元素を含めた無機栄養素も、培地中に含まれ得る。
【００５７】
1つの態様において、無機塩類も含まれ得る。使用可能な無機塩類は、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸水素二ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、硫酸鉄、塩化鉄、硫酸マンガン、塩化マンガン、硫酸亜鉛、塩化鉛、硫酸銅、塩化カルシウム、炭酸カルシウム、および/または炭酸ナトリウムであり得る。これらの無機塩類は、独立してまたは2種もしくはそれを上回る種類の組み合わせで用いられ得る。
【００５８】
一部の態様において、培養のための方法は、培養過程の前および/または間に、液体培地中に付加的な酸および/または抗微生物薬を添加する工程をさらに含み得る。抗微生物剤または抗生物質は、培養物をコンタミネーションから守るために用いられる。加えて、培養中に気体が産生される場合、気泡の形成および/または蓄積を防止するために、消泡剤も添加され得る。
【００５９】
混合物のpHは、関心対象の微小生物に適切であるべきである。カーボネートおよびホスフェートなど、緩衝剤およびpH調節因子を用いて、好ましい値の近くにpHを安定化させ得る。金属イオンが高濃度で存在する場合、液体培地におけるキレート剤の使用が必要であり得る。
【００６０】
微小生物の培養および微生物副産物の産生のための方法および設備は、バッチ式、準連続式、または連続式の過程で実施され得る。
【００６１】
微生物は、プランクトン様形態でまたはバイオフィルムとして増殖させ得る。バイオフィルムの場合、容器は、その上に微生物がバイオフィルムの状態で増殖し得る基板をその中に有し得る。システムは、例えば、バイオフィルムの増殖特徴を助長するおよび/または向上させる刺激（剪断応力など）を適用する能力も有し得る。
【００６２】
1つの態様において、微小生物の培養のための方法は、約5°〜約100℃、好ましくは15〜60℃、より好ましくは25〜50℃で行われる。さらなる態様において、培養は、一定温度で連続的に行われ得る。別の態様において、培養は、変化する温度に供され得る。
【００６３】
1つの態様において、方法および培養過程において用いられる設備は無菌である。リアクター/容器などの培養設備は、滅菌ユニット、例えば加圧滅菌器から分離され得るが、それに接続されていてもよい。培養設備はまた、接種を開始する前にインサイチューで滅菌する滅菌ユニットを有し得る。空気は、当技術分野において公知の方法によって滅菌され得る。例えば、周囲空気は、容器内に導入される前に、少なくとも1つのフィルターを通過し得る。他の態様において、培地は低温殺菌され得る、または任意で、低い水分活性および低いpHの使用を活用して細菌増殖を制御し得る場合、熱は全く加えられない。
【００６４】
発酵培養液のバイオマス含有量は、例えば5g/l〜180g/lまたはそれを上回る量であり得る。1つの態様において、培養液の固形含有量は、10g/l〜150g/lである。
【００６５】
1つの態様において、本発明に従った、微生物代謝産物を産生するための方法は、1）疎水性および親水性粒子を混合して、マトリックス形成固形物質を形成する工程；2）このマトリックス形成固形物質を関心対象の微小生物の接種された培地に接触させ、それによってマイクロリアクターのマトリックスを作る工程；および3）このマイクロリアクター内で微小生物を増殖させる工程を含む。
【００６６】
関心対象の微小生物によって産生された微生物増殖副産物は、微小生物内に保持され得るか、または液体培地中に分泌され得る。別の態様において、微生物増殖副産物を産生するための方法は、関心対象の微生物増殖副産物を濃縮するおよび精製する工程をさらに含み得る。さらなる態様において、液体培地は、微生物増殖副産物の活性を安定化させる化合物を含有し得る。
【００６７】
1つの態様において、培養が完了すると（例えば、培養液中での所望の細胞密度または指定された代謝産物の密度を、例えば達成すると）、微生物培養組成物のすべてが取り出される。このバッチ手順では、第一のバッチを収集すると、全く新たなバッチが始動される。
【００６８】
別の態様において、発酵産物の一部のみが、任意の一時点で取り出される。この態様において、生存細胞を有するバイオマスは、新たな培養バッチのための接種源として容器内に残る。取り出される組成物は、細胞不含培養液であってもよく、細胞を含有していてもよい。このようにして、準連続式システムが作られる。
【００６９】
1つの態様において、微生物は、微生物に基づく製品の使用される場所の100マイル、50マイル、25マイル、10マイル、5マイル、1マイル、またはそれ未満の範囲内で培養される。
【００７０】
微生物に基づく製品の調製
本発明の微生物に基づく製品の1つは、微小生物および/または微小生物によって産生された微生物代謝産物（生物界面活性剤など）および/または任意の残留栄養素を含有する単なる発酵培養液である。発酵の産物は、抽出、単離、または精製なしで直接用いられ得る。所望の場合には、抽出、単離、および/または精製は、本明細書および/または文献に記載される標準的な方法または技法を用いて容易に達成され得る。
【００７１】
微生物に基づく製品内の微小生物は、活性または不活性の形態、細胞の形態、胞子の形態、および/または菌糸体の形態にあり得る。微生物に基づく製品は、さらなる安定化、防腐、および貯蔵なしで用いられ得る。有利には、これらの微生物に基づく製品の直接的使用は、微小生物の高い生存率を保ち、外来作用物質および望ましくない微小生物によるコンタミネーションの可能性を低下させ、ならびに微生物増殖の副産物の活性を維持する。
【００７２】
微生物および/または微生物増殖によって生じる培養液（分離した層または部分を含む）は、増殖容器から取り出され得、即時使用のために、例えばパイプを通じて移され得る。
【００７３】
他の態様において、組成物（微生物、培養液、または微生物および培養液）は、例えば意図される用途、企図される適用の方法、発酵タンクのサイズ、および微生物増殖施設から使用の場所への輸送の任意の様式を考慮に入れて、適当なサイズのコンテナに入れられ得る。ゆえに、微生物に基づく組成物が入れられるコンテナは、例えば1ガロン〜1,000ガロンまたはそれを上回る容量であり得る。他の態様において、コンテナは、2ガロン、5ガロン、25ガロン、またはそれよりも大きい。
【００７４】
本明細書で使用される場合、「培養液」は、全培養液または全培養液の一部を含む。
【００７５】
増殖容器から微生物に基づく組成物を収集すると、収集された産物はコンテナ内に入れられおよび/またはパイプで送られる（またはそうでなければ使用のために輸送される）ため、さらなる構成要素が加えられ得る。添加物は、例えば緩衝剤、担体、同じまたは異なる施設で生産された他の微生物に基づく組成物、粘度調整剤、防腐剤、pH調整剤、微生物増殖のための栄養素、植物成長のための栄養素、追跡剤、殺害虫剤、除草剤、動物飼料、食品、および意図される用途に特異的な他の成分であり得る。
【００７６】
有利には、本発明によると、微生物に基づく製品は、微生物を増殖させた培養液を含み得る。製品は、重量で、例えば少なくとも1％、5％、10％、25％、50％、75％、または100％の培養液であり得る。製品内のバイオマスの量は、重量で、例えばそれらの間のすべてのパーセンテージを含む0％〜100％のどこかであり得る。
【００７７】
任意で、製品は使用前に貯蔵され得る。貯蔵期間は好ましくは短い。ゆえに、貯蔵期間は、60日、45日、30日、20日、15日、10日、7日、5日、3日、2日、1日、または12時間未満であり得る。好ましい態様において、製品中に生細胞が存在する場合、製品は、例えば20℃、15℃、10℃、または5℃未満などの冷温で貯蔵される。他方で、生物界面活性剤組成物は典型的には、より長い期間、周囲温度で貯蔵され得る。
【００７８】
1つの態様において、培養産物は、噴霧乾燥バイオマス産物として調製され得る。バイオマスは、遠心分離、濾過、分離、デカンテーション、分離とデカンテーションとの組み合わせ、限外濾過、または精密濾過などの公知の方法によって分離され得る。バイオマス産物は、培養培地から分離され得、噴霧乾燥され得る。
【００７９】
微生物に基づく製品は、本開示の恩恵を有する当業者によって理解されるであろう手段によって、液体、固体、顆粒、細粉、または徐放製品を含めた多様な形で製剤化され得る。
【００８０】
ヒトまたは動物適用に関して、製剤は、液体、ペースト、軟膏、坐薬、カプセル、または錠剤の形態で調製され得、医薬品産業において用いられる薬物と同様のやり方で用いられ得る。製剤は、薬学的産業において公知の構成要素を用いてカプセル化され得る。カプセル化は、望ましくない反応から構成要素を保護し、成分が、環境または処置された対象もしくは身体、例えば胃における悪条件に対抗するのを助ける。
【００８１】
本発明の固体製剤は、円筒形、棒状、ブロック、カプセル、錠剤、丸薬、ペレット、細片、先のとがったものなど、種々の形態および形状を有し得る。固体製剤はまた、粉砕され得る、顆粒化され得る、または粉末化され得る。顆粒化または粉末化された材料は、加圧して錠剤にされ得るか、またはあらかじめ製造されたゼラチンカプセルもしくはシェルを充填するために用いられ得る。半固体製剤は、ペースト、ワックス、ゲル、またはクリーム調製物に調製され得る。
【００８２】
本発明の固体または半固体組成物は、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ソルビトール、ゴム、糖類、またはポリビニルアルコールなど、薬学的産業において用いられるフィルムコーティング化合物を用いてコーティングされ得る。これは、殺害虫製剤において用いられる錠剤またはカプセルに特に必須である。フィルムコーティングは、取扱者が製剤中の活性成分に直接触れるのを保護し得る。加えて、安息香酸デナトニウムまたはクァシンなどの苦味剤も、殺害虫製剤、コーティング、またはその両方に組み入れられ得る。
【００８３】
本発明の組成物は、粉末製剤にも調製され得、あらかじめ製造されたゼラチンカプセル内に充填され得る。
【００８４】
製剤における成分の濃度および組成物の適用率は、処理される害虫、植物、もしくはエリア、または適用の方法に応じて大幅に変動し得る。
【００８５】
好ましい態様において、本発明に従った線虫を防除するための組成物は、有効量の微生物生物界面活性剤を含む。
【００８６】
1つの態様において、微生物生物界面活性剤は、ラムノ脂質、ソホロ脂質（SLP）、トレハロース脂質、および/またはマンノシルエリスリトール脂質（MEL）などの糖脂質である。
【００８７】
1つの態様において、本発明に従った線虫を防除するための組成物は、有効量の単一の微生物生物界面活性剤および/または生物界面活性剤を産生する単一の微小生物を含む。別の態様において、線虫を防除するための組成物は、微生物生物界面活性剤の混合物および/またはこれらの生物界面活性剤を産生する微小生物の混合物を含み得る。
【００８８】
1つの態様において、線虫を防除するための組成物はSLPを含む。SLPは、精製された形態にあっても、発酵産物の混合物の状態にあってもよい。組成物は、0.01〜90重量％（wt％）、好ましくは0.1〜50wt％、およびより好ましくは0.1〜20wt％の濃度で、SLPなどの活性構成要素を好ましくは含有する。別の態様において、精製されたSLPは、許容される担体との組み合わせの状態にあり得、その中でSLPは、0.001〜50％（v/v）、好ましくは0.01〜20％（v/v）、より好ましくは0.02〜5％（v/v）の濃度で提示され得る。
【００８９】
1つの態様において、線虫を防除するための組成物はMELを含む。MELは、精製された形態にあり得るまたは発酵産物の混合物の状態にあり得る。組成物は、0.01〜90重量％（wt％）、好ましくは0.1〜50wt％、およびより好ましくは0.1〜20wt％の濃度で、SLPなどの活性構成要素を好ましくは含有する。別の態様において、精製されたMELは、許容される担体との組み合わせの状態にあり得、その中でSLPは、0.0001〜50％（v/v）、好ましくは0.005〜20％（v/v）、より好ましくは0.001〜5％（v/v）の濃度で提示され得る。
【００９０】
別の態様において、線虫を防除するための組成物は、SLPとMELとの混合物を含む。組成物が、活性構成要素であるSLPとMELとの組み合わせを0.01〜90重量％（wt％）、好ましくは0.1〜50wt％、およびより好ましくは0.1〜20wt％の濃度で含有する限りにおいて、SLPおよびMELは任意の比率で混合され得る。別の態様において、精製されたSLPおよびMELは、許容される担体との組み合わせの状態にあり得、その中でSLPは、0.0001〜50％（v/v）、好ましくは0.005〜20％（v/v）、より好ましくは0.001〜5％（v/v）の濃度で提示され得る。
【００９１】
さらなる態様において、組成物は、例えばスターメレラ、ウィッカーハモマイセス・アノマルス、またはシュードザイマ種など、SLPおよび/またはMELを産生する微小生物の株と組み合わせて、SLPおよび/またはMELを含む。
【００９２】
生物界面活性剤は、単独で用いられてもよく、他の許容される活性または不活性な構成要素と組み合わせられてもよい。これらの構成要素は、例えば、桂皮油、丁子油、綿実油、ニンニク油、もしくはローズマリー油などの油構成要素；ユッカ（Yucca）もしくはキラヤ（Quillaja）サポニンなどの別の天然界面活性剤であり得る；または構成要素は、桂皮アルデヒドなどのアルデヒドであり得る。殺害虫性構成要素またはアジュバントとして用いられ得る他の油には、アーモンド油、樟脳油、キャノーラ油、ヒマシ油、シダー油、シトロネラ油、柑橘油、ココナツ油、コーン油、ユーカリ油、魚油、ゼラニウム油、レシチン、レモングラス油、アマニ油、鉱油、ミントまたはペパーミント油、オリーブ油、パイン油、菜種油、サフラワー油、セージ油、ゴマ種子油、スイートオレンジ油、タイム油、植物油、およびウインターグリーン油が含まれる。
【００９３】
他の許容される構成要素は、例えば、宿主植物の根によってまたは付随する根圏微小生物によって産生される可溶性および気体の物質など、線虫を誘引する物質であり得る。本発明に従った線虫誘引物の1つの例は、カノコソウ（Valerian）の根（セイヨウカノコソウ（Valeriana officianalis））である。特に、カノコソウの根抽出物、ならびにカノコソウ植物の根に関連した他の任意の化合物または副産物を含む溶液は、本組成物および方法に従った誘引物として用いられ得る。
【００９４】
本発明に従った製剤中に含有され得る他の適切な添加物には、そのような調製物に習慣的に用いられる物質が含まれる。そのような添加物の例には、アジュバント、界面活性剤、乳化剤、植物栄養素、充填剤、可塑剤、潤滑油、滑剤、着色剤、色素、苦味剤、緩衝化剤、溶解度制御剤、pH調整剤、防腐剤、安定剤、および紫外線抵抗剤が含まれる。製剤を強固にし、土壌、根フレア（flare）、または樹木の注入錠剤など、ある特定の適用における圧力または力に抵抗するのにそれらを十分強くするために、補強剤または硬化剤も組み入れられ得る。
【００９５】
1つの態様において、組成物は、有機酸およびアミノ酸またはそれらの塩を含む緩衝化剤をさらに含み得る。適切な緩衝剤には、シトレート、グルコネート、タータレート、マレート、アセテート、ラクテート、オキサレート、アスパルテート、マロネート、グルコヘプトネート、ピルベート、ガラクタレート、グルカレート、タルトロネート、グルタメート、グリシン、リジン、グルタミン、メチオニン、システイン、アルギニン、およびそれらの混合物が含まれる。リン酸および亜リン酸またはそれらの塩も用いられ得る。合成緩衝剤は用いられるのに適切であるが、上記で列挙される有機酸およびアミノ酸またはそれらの塩などの天然緩衝剤を用いることが好ましい。
【００９６】
さらなる態様において、pH調整剤には、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、炭酸カリウムもしくは重炭酸カリウム、塩酸、硝酸、硫酸、または混合物が含まれる。
【００９７】
1つの態様において、重炭酸ナトリウムまたは炭酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、重リン酸ナトリウムなど、付加的な構成要素が製剤中に含まれ得る。
【００９８】
1つの態様において、組成物は、殺線虫活性を有する1種または複数種の化学的化合物を含み得る。これらには、アバメクチンなどの抗生物質殺線虫剤；ベノミル、カルボフラン、カルボスルファン、およびクレオソカード（cleothocard）などのカルバメート殺線虫剤；アラニカルブ、アルジカルブ、アルドキシカルブ、オキサミルなどのオキシムカルバメート殺線虫剤；ジアミダホス、フェナミホス、ホスチエタン、ホスファミドン、カズサホス、クロルピリホス、ジクロフェンチオン、ジメトエート、エトプロホス、フェンスルホチオン、ホスチアゼート、ヘテロホス、イサミドホス（isamidofos）、イサゾホス、メソミル、ホレート、ホスホカルブ（phosphocarb）、テルブホス、チオジカルブ、チオナジン、トリアゾホス、イミシアホス、およびメカルホンなどの有機リン系殺線虫剤が含まれる。殺線虫活性を有する他の化合物には、アセトプロール、ベンクロチアズ（benclothiaz）、クロロピクリン、ダゾメット、DB CP、DCIP、1,2-ジクロロプロパン、1,3-ジクロロプロペン、フルフラール、ヨードメタン、メタム、臭化メチル、イソチオシアン酸メチル、およびキシレノールが含まれる。
【００９９】
1つの態様において、組成物は、有効量の少なくとも1種の殺虫剤をさらに含み得る。適切な殺虫剤には、1-(6-クロロ-3-ピリジルメチル)-N-ニトロイミダゾリジン-2-イリデンアミン（イミダクロプリド）；3-(6-クロロ-3-ピリジルメチル)-1,3-チアゾリジン-2-イリデンシアナミド（チアクロプリド）；1-(2-クロロ-1,3-チアゾール-5-イルメチル)-3-メチル-2-ニトログアニジン（クロチアニジン）；ニテンピラム（nitempyran）；N1-[(6-クロロ-3-ピリジル)メチル]-N2-シアノ-N1-メチルアセトアミジン（アセタミプリド）；3-(2-クロロ-1,3-チアゾール-5-イルメチル)-5-メチル-1,3,5-オキサジアジナン-4-イリデン(ニトロ)アミン（チアメトキサム）；および1-メチル-2-ニトロ-3-(テトラヒドロ-3-フリルメチル)グアニジン（ジノテフラン）などの非殺線虫性ネオニコチノイド系殺虫剤が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【０１００】
微生物に基づく製品の適用
さらに別の局面において、本発明は、微生物に基づく製品を適用するための方法、システム、および装置を含む。
【０１０１】
1つの態様において、本発明は、土壌、種子、または植物の部分に本明細書において開示される組成物を適用することによって、植物の健康状態を向上させるおよび/または作物収量を増加させる方法を提供する。別の態様において、本発明は、本明細書において記載される組成物の複数の適用を含む、作物または植物収量を増加させる方法を提供する。
【０１０２】
有利には、方法は、線虫を、および害虫によって引き起こされる対応する病害を有効に防除し得、同時に収量増加が達成されかつ副作用および付加的なコストが回避される。
【０１０３】
1つの態様において、組成物は、根、茎、および葉を含めた、すでに発芽したおよび/または成長中の植物に適用され得る。組成物は、種子処理としても適用され得る。種子処理としての使用は、適用が容易に達成され得、処理に用いられる量は低下し得、たとえあったとしても潜在的毒性をさらに低下させるため、有益である。
【０１０４】
1つの態様において、生物界面活性剤産生微小生物および/または生物界面活性剤を、土壌、植物の成長培地、植物、水媒体、または処理される対象となる任意のエリアに添加して、害虫損傷を防止し得る。微小生物はインサイチューで成長し現場で生物界面活性剤を産生して、線虫を防除し得る。加えて、適用部位に適用された天然生物界面活性剤産生生物は、成長して生物界面活性剤を産生し得る。その結果として、処理部位（例えば、土壌）における高濃度の生物界面活性剤および生物界面活性剤産生微小生物が容易にかつ継続的に達成され得る。
【０１０５】
生物界面活性剤産生生物の増殖を支持しならびに所望の生物界面活性剤を現場で産生して、本発明の目的を達成するために、微小生物の増殖および生物界面活性剤の産生を増強する物質も組成物および/または処理部位に適用され得る。これらの物質には、炭素、または油、グリセロール、糖類、もしくは他の栄養素などの有機物質が含まれるが、それらに限定されるわけではない。例えば、生物界面活性剤産生生物は基板上で増殖して、適所で生物界面活性剤を産生し線虫を防除し得る。適用の部位（土壌、水相系、植物の部分等）における天然生物界面活性剤産生生物は、炭素基質を利用しながら、生物界面活性剤を産生する。この過程の間、産生された生物界面活性剤は、標的エリアにおける害虫を破壊または麻痺させる。本発明によると、標的部位または炭素基質混合物に生物界面活性剤産生生物をあらかじめ接種する必要はない。
【０１０６】
炭素基質には、使用済みフライ油を含めた天然または合成の油などの有機炭素供給源；脂肪；脂質；ワックス（天然またはパラフィン）；ラウリン酸、ミリスチン酸などの脂肪酸；ラウリルアルコールなどの脂肪酸アルコール；グリセリルモノラウレートなど、脂肪酸とグリセロールとの両親媒性エステル；ポリエチレンモノステアレートなど、脂肪酸のグリコールエステル；ラウリルアミンなどの脂肪酸アミン；脂肪酸アミド；ヘキサン；グリセロール；グルコース等が含まれ得るが、それらに限定されるわけではない。生物界面活性剤の産生を助長するために、非水溶性炭素基質を用いることが好ましい。
【０１０７】
1つの態様は、炭素基質を十分量の特異的生物界面活性剤でスパイクまたは修飾して、乳化過程を始動する、および生物界面活性剤産生生物に対する他の競合生物の成長を阻害するまたは低下させる、および線虫を防除する工程を伴う。例えば、シュードモナス・シリンガエおよびバチルス・サブティリスは、ポレン（poren）と称される一連のリポペプチド生物界面活性剤を産生する。これらのリポペプチドポレンには、シュードマイシン（pseudomycin）、シリンゴマイシン、タブトキシン、ファゼオロトキシン（phaseolotoxin）、およびサーファクチン（surfactin）が含まれる。一部のリポペプチドは、細胞膜、細胞、および組織に穴を作り得る。
【０１０８】
シュードマイシンは、作物産生における線虫防除のための植物前処理として適用され得る。バチルス・サブティリスの増殖を助長することが望まれる場合、少量のサーファクチン生物界面活性剤を炭素基質培地に添加して、B.サブティリス集団の確立、および現場でのより多くのサーファクチンの産生を支援する。
【０１０９】
1つの態様において、組成物は、目下の特定の目的に最も適切であるような濃度の活性剤を含有する、濃縮されたまたは希釈された液体、溶液、懸濁液、粉末等の形態で噴霧する、注ぐ、浸すことによって適用され得る。それらは、そのままで適用されても、使用前に再構成されてもよい。例えば、それらは、樹木または根フレアへの直接注入によって適用され得る。
【０１１０】
1つの態様において、本発明に従った組成物は、約0.0001ポンド/エーカー〜約10ポンド/エーカー、約0.001ポンド/エーカー〜約5ポンド/エーカー、約0.01ポンド/エーカー〜約1ポンド/エーカー、約0.01ポンド/エーカー〜約0.1ポンド/エーカー、または約0.01ポンド/エーカー〜約0.05ポンド/エーカーで適用され得る。
【０１１１】
1つの態様において、本発明に従った組成物は、土壌または種子への初回適用の約1〜約100日後、約2〜約50日後、約10〜約40日後、約20〜約30日後に植物または作物に適用される。
【０１１２】
特定の態様において、組成物は、例えば灌漑システムに導入され得る、バックパックもしくは同様の装置から噴霧され得る、ドローンなど、陸地に基づくもしくは空中を浮遊するロボット装置によって適用され得る、および/または種子とともに適用され得る。
【０１１３】
種子適用は、例えば種子コーティングによる、または種子をまくのと同時に土壌に組成物を適用することによるものであり得る。これは、例えば、種子をまくときにまたはその間近に、種子とともにおよび/またはそれに隣接して、微生物に基づく組成物を適用する装置または灌漑システムを提供することによって自動化され得る。ゆえに、微生物に基づく組成物は、種まきのときの例えば5、4、3、2、もしくは1日前もしくは後以内に、または種子をまくのと同時に適用され得る。
【０１１４】
ある特定の態様において、本明細書において提供される組成物は、機械的組み入れなしで土壌表面に適用される。土壌適用の有益な効果は、降雨、散水、浸水、または点滴灌漑によって活性化され得、その後、例えば標的害虫に送達されてそれらの集団レベルを許容される閾値まで押し下げ得る、あるいは植物の根に送達されて、根微生物叢に影響し得るまたは微生物製品が適用される作物もしくは植物の維管束系への微生物製品の取り込みを促し得る。例示的な態様において、本明細書において提供される組成物は、センターピボット灌漑システムを通じてまたはまき溝にわたる噴霧により、効率的に適用され得る。
【０１１５】
本明細書における、害虫もしくは植物の「上もしくはその近く」へのまたは害虫もしくは植物の「環境」への組成物の投与への言及は、投与が、所望の結果（例えば、害虫を殺傷する、収量を増加させる、植物への損傷を防止する、遺伝子および/またはホルモンを調節する等）が達成されるように、組成物が害虫または植物と十分に接触するものであることを意味する。これは、典型的に、害虫、植物、雑草、または他の所望の標的の例えば10、5、3、2、もしくは1フィートまたはそれ未満以内であり得る。
【０１１６】
微生物に基づく製品は、根および/または根圏ならびに植物の維管束系での定着を促進して、植物の健康状態および生命力を促進するためにも適用され得る。ゆえに、害虫もしくは病害と闘うか、またはそうでなければ作物の成長、健康状態、および/もしくは収量を促進する、リゾビウム（rhizohium）および/または菌根（mycorrhzae）などの栄養素固定微生物、ならびに他の内在性の（土壌にすでに存在する）、ならびに外因性の微生物またはそれらの副産物が、促進され得る。微生物に基づく製品はまた、例えば維管束系に入ってそこに定着し、植物の健康状態および生産性に重要な代謝産物および栄養素、または害虫防除特性を有する代謝産物に寄与することによって、植物の維管束系を支持し得る。
【０１１７】
有利には、方法は、複雑な設備または高いエネルギー消費を要しない。関心対象の微小生物は、現場で小さなまたは大きな規模で培養され得、それらの培地と混合されたままでさえ利用され得る。同様に、微生物代謝産物も、必要な場で量産され得る。
【０１１８】
有利には、微生物に基づく製品は、遠隔地で生産され得る。1つの態様において、微生物に基づく製品は、ヒトの栄養ならびに/または疾患の予防および/もしくは処置に用いられ得る。
【０１１９】
標的害虫
本発明の好ましいが非限定的な態様において、防除される線虫は以下から選定される。
（1）稲（例えば、サツマイモネコブセンチュウ、ジャワネコブセンチュウ、またはイネネコブセンチュウ（M. graminicola））、大豆（例えば、サツマイモネコブセンチュウまたはアレナリアネコブセンチュウ）、綿（例えば、サツマイモネコブセンチュウ）、じゃがいも（例えば、コロンビアネコブセンチュウ（M. chitwoodi）またはキタネコブセンチュウ）、トマト（例えば、コロンビアネコブセンチュウ）、タバコ（例えば、サツマイモネコブセンチュウ、ジャワネコブセンチュウ、またはアレナリアネコブセンチュウ）、およびコーン（例えば、サツマイモネコブセンチュウ）における根瘤線虫（ネコブセンチュウ種）；稲（例えば、イネシストセンチュウ（H. oryzae））、大豆（例えば、ダイズシストセンチュウ（H. glycines））、およびコーン（例えば、トウモロコシシストセンチュウ（H. zeae））におけるシスト線虫（ヘテロデラ種）；じゃがいも（例えば、ジャガイモシロシストセンチュウまたはジャガイモシストセンチュウ（G. rostochiensis））におけるシスト線虫（グロボデラ種）；綿（例えば、R.レニフォルミス（reniformis））におけるニセフクロ（Reniform）線虫（ロチレンチュラス（Rotylenchulus）種）；バナナ（例えば、ミナミネグサレセンチュウまたはP.グーデイ）における根病変線虫（プラチレンクス種）；バナナ（例えば、バナナネモグリセンチュウ（R. similis））における穴掘り線虫（ラドフォラス（Radopholus）種）；ならびに稲根線虫（ヒルシュマニエラ（Hirschmaniella）種、例えばイネネモグリセンチュウ（H. oryzae））などの稲に損傷を与える他の線虫などであるがそれらに限定されない、植物病原性線虫である線虫；
（2）蟯虫症を引き起こす蟯虫（pinworm）であるヒトギョウチュウ（Enterobius vermicularis）；回虫症を引き起こす大腸回虫であるヒトカイチュウ（Ascaris lumbridoides）；十二指腸虫症を引き起こす2つのタイプの鉤虫であるネカトール（Necator）およびアンシロストマ（Ancylostoma）；鞭虫症を引き起こす鞭虫であるベンチュウ（Trichuris trichiura）；糞線虫症を引き起こすストロンギロイデス・ステルコラリス（Strongyloides stercoralis）；ならびに旋毛虫症（trichinosis）を引き起こすトリキネラ・スピラリス（Trichonella spirae）；リンパ系フィラリア症として知られる蠕虫感染症およびその肉眼的兆候である象皮症と関連した糸状線虫であるマレー糸状虫（Brugia malayi）およびバンクロフト糸状虫（Wuchereria bancrofti）、ならびに河川盲目症を引き起こす回旋糸状虫（Onchocerca volvulus）などであるがそれらに限定されない、ヒトに蔓延し得る線虫；
（3）イヌ（鉤虫、例えばイヌコウチュウ（Ancylostoma caninum）またはウンシナリア・ステノセファラ（Uncinaria stenocephala）、回虫類（Ascarids）、例えばイヌカイチュウ（Toxocara canis）もしくはトキサスカリス・レオニナ（Toxascaris leonina）、または鞭虫、例えばイヌベンチュウ（Trichuris vulpis））、ネコ（鉤虫、例えばアンシロストマ・ツバエホルメ（Ancylostoma tubaeforme）、回虫類、例えばネコカイチュウ（Toxocara cati））、魚類（ニシン蠕虫もしくはタラ蠕虫、例えばアニサキス（Anisakid）、または条虫、例えば裂頭条虫（Diphyllobothrium））、ヒツジ（ハリガネムシ、例えば捻転胃虫（Haemonchus contortus））、およびウシ（消化管蠕虫、例えばオステルターグ胃虫（Ostertagia ostertagi）、クーペリア・オンコホラ（Cooperia oncophora））などであるがそれらに限定されない、動物に蔓延し得る線虫；
（4）食材、種子、木材、塗料、プラスチック、衣類等を攻撃する線虫など、基材または材料への不要な損傷を引き起こす線虫。そのような線虫の例には、ネコブセンチュウ種（例えば、サツマイモネコブセンチュウ、ジャワネコブセンチュウ、アレナリアネコブセンチュウ、イネネコブセンチュウ、コロンビアネコブセンチュウ、またはキタネコブセンチュウ）；ヘテロデラ種（例えば、イネシストセンチュウ、ダイズシストセンチュウ、トウモロコシシストセンチュウ、またはテンサイシストセンチュウ）；グロボデラ種（例えば、ジャガイモシロシストセンチュウまたはジャガイモシストセンチュウ）；クキセンチュウ種（例えば、ナミクキセンチュウ（D. dipsaci）、イモグサレセンチュウ（D. destructor）、またはイネクキセンチュウ（D. angustus））；ベロノライムス（Belonolaimus）種；ロチレンチュラス種（例えば、R.レニフォルミス）；プラチレンクス種（例えば、ミナミネグサレセンチュウ、P.グーデイ、またはモロコシネグサレセンチュウ）；ラドフォラス種（例えば、バナナネモグリセンチュウ）；ヒルシュマニエラ種（例えば、イネネモグリセンチュウ）；アフェレンコイデス（Aphelenchoides）種（例えば、イネシンガレセンチュウ（A. besseyi））；クリコネモイデス（Criconemoides）種；ロンギドラス（Longidorus）種；ヘリコチレンチュス（Helicotylenchus）種；ホプロライムス（Hoplolaimus）種；キシフィネマ（Xiphinema）種；パラトリコドラス（Paratrichodorus）種（例えば、ヒメユリハリセンチュウ（P. minor））；チレンコリンクス（Tylenchorhynchus）種が含まれるが、それらに限定されるわけではない；
（5）ウイルス伝播線虫（例えば、プルヌスえそ輪点ウイルスを伝播するロンギドラス・マクロソマ（Longidorus macrosoma）、タバコ輪点ウイルスを伝播するキシフィネマ・アメリカナム（Xiphinema americanum）、エンドウ早期褐変ウイルス（pea early browning virus）を伝播するパラトリコドラス・テレス（Paratrichadorus teres）、またはタバコラットルウイルスを伝播するトリコドラス・シミリス（Trichodorus similis））。
【０１２０】
具体的な線虫害虫には、メジナ虫症（ギニア虫症）を引き起こす回虫であるメジナ虫（Dracunculus medinensis）；皮膚フィラリア症を引き起こす線虫ロア・ロア（Loa loa）（ロア糸状虫（African eye worm））、マンソネラ・ストレプトセルカ（Mansonella streptocerca）、および回旋糸状虫；体腔フィラリア症を引き起こすマンソネラ・ペルスタンス（Mansonella perstans）およびマンソネラ・オザルディ（Mansonella ozzardi）；旋毛虫病（Trichinellosis）を引き起こす、T.シュードスピラリス（pseudospiralis）（世界中の哺乳類および鳥類に感染する）、T.ナティバ（nativa）（ホッキョクグマに感染する）、T.ネルソニ（nelsoni）（アフリカの捕食動物および清掃動物に感染する）、およびT.ブリトビ（britovi）（ヨーロッパおよび西アジアの肉食動物に感染する）を含めたトリキネラ（Trichinella）；ヒト好酸球性髄膜炎の最も一般的な原因である広東住血線虫（Angiostrongylus cantonensis）（ラット肺虫）；腹部（または腸）住血線虫症を引き起こすコスタリカ住血線虫（Angiostrongylus costaricensis）；ヒトトキソカラ症を引き起こすトキソカラ（Toxocara）；顎口虫症を引き起こすナソトーマ・スピニゲルム（Gnathostoma spinigerum）、および稀にG.ヒスピディウム（hispidum）；ならびにアニサキス症を引き起こすアニサキス・シンプレックス（Anisakis simplex）またはシュードテラノーバ・ディシピエンス（Pseudoterranova decipiens）が含まれる。
【０１２１】
具体的な態様において、本発明の方法および組成物を用いて、根瘤線虫（サツマイモネコブセンチュウ（Meloidogyne incognital））、刺毛線虫（ベロノライムス・ロンギカウダツス（Belonolaimus longicaudatus））、大豆シスト線虫（ダイズシストセンチュウ）、病変線虫（プラチレンクス種）、ダガー線虫（dagger nematode）（キシフィネマ種）、および/または柑橘類線虫（ミカンネセンチュウ（Tylenchulus semipenetrans））を防除する。
【０１２２】
標的植物
本発明の製品および方法の適用により利益を受け得る植物には、列にして植える作物（例えば、コーン、大豆、ソルガム、落花生、じゃがいも等）、農作物（例えば、アルファルファ、小麦、穀物等）、樹木作物（例えば、クルミ、アーモンド、ピーカン、ヘーゼルナッツ、ピスタチオ等）、柑橘作物（例えば、オレンジ、レモン、グレープフルーツ等）、果実作物（例えば、リンゴ、ナシ等）、芝生作物、観賞作物（例えば、花、つる植物等）、野菜（例えば、トマト、ニンジン等）、つる作物（例えば、ブドウ、イチゴ、ブルーベリー、ブラックベリー等）、森林地（例えば、マツ、トウヒ、ユーカリ、ポプラ等）、管理された牧草地（放牧動物を支持するために用いられる植物の任意の混合）が含まれる。
【０１２３】
利益は、例えば増加した収量、品質、耐病性および耐虫性、ストレス低下（例えば、塩分、干ばつ、熱等からの）、ならびに向上した水使用の形態であり得る。
【０１２４】
本発明の製品および方法から利益を受け得るさらなる植物には、緑色植物亜界（Viridiplantae）スーパーファミリー、他の中でも、カエデ（Acer）種、マタタビ属（Actinidia）種、トロロアオイ属（Abelmoschus）種、サイザルアサ（Agave sisalana）、コムギダマシ属（Agropyron）種、ハイコヌカグサ（Agrostis stolonifera）、ネギ属（Allium）種、アマランサス（Amaranthus）種、アンモフィラ・アレナリア（Ammophila arenaria）、パイナップル（Ananas comosus）、バンレイシ属（Annona）種、セロリ（Apium graveolens）、ラッカセイ属（Arachis）種、パンノキ属（Artocarpus）種、アスパラガス（Asparagus officinalis）、カラスムギ属（Avena）種（例えば、エンバク（Avena sativa）、カラスムギ（Avena fatua）、赤エンバク（Avena byzantina）、カラスムギ変種サティバ（Avena fatua var. sativa）、カラスムギ雑種（Avena hybrida））、スターフルーツ（Averrhoa carambola）、ホウライチク属（Bambusa）種、トウガン（Benincasa hispida）、ブラジルナッツ（Bertholletia excelsea）、ビート（Beta vulgaris）、アブラナ属（Brassica）種（例えば、セイヨウアブラナ（Brassica napus）、ブラッシカ・ラパ（Brassica rapa）種［キャノーラ、ナタネ、アブラナ］）、カダバ・ファリノーサ（Cadaba farinosa）、チャノキ（Camellia sinensis）、ダンドク（Canna indica）、アサ（Cannabis sativa）、トウガラシ属（Capsicum）種、カレックス・エラータ（Carex elata）、パパイア（Carica papaya）、オオバナカリッサ（Carissa macrocarpa）、ペカン属（Carya）種、ベニバナ（Carthamus tinctorius）、クリ属（Castanea）種、カポック（Ceiba pentandra）、エンダイブ（Cichorium endivia）、ニッケイ属（Cinnamomum）種、スイカ（Citrullus lanatus）、ミカン属（Citrus）種、ココス（Cocos）種、コーヒーノキ（Coffea）種、サトイモ（Colocasia esculenta）、コーラ（Cola）種、ツナソ属（Corchorus）種、コリアンダー（Coriandrum sativum）、ハシバミ属（Corylus）種、サンザシ属（Crataegus）種、サフラン（Crocus sativus）、カボチャ属（Cucurbita）種、キュウリ属（Cucumis）種、チョウセンアザミ属（Cynara）種、ノラニンジン（Daucus carota）、ヌスビトハギ属（Desmodium）種、リュウガン（Dimocarpus longan）、ヤマノイモ属（Dioscorea）種、カキノキ属（Diospyros）種、ヒエ属（Echinochloa）種、アブラヤシ（Elaeis）（例えば、ギニアアブラヤシ（Elaeis guineensis）、アメリカアブラヤシ（Elaeis oleifera））、シコクビエ（Eleusine coracana）、テフ（Eragrostis tef）、エリアンサス属（Erianthus）種、ビワ（Eriobotrya japonica）、ユーカリ（Eucalyptus）種、ピタンガ（Eugenia uniflora）、ソバ属（Fagopyrum）種、ブナ属（Fagus）種、オニウシノケグサ（Festuca arundinacea）、イチジク（Ficus carica）、キンカン（Fortunella）種、オランダイチゴ属（Fragaria）種、イチョウ（Ginkgo biloba）、ダイズ属（Glycine）種（例えば、ダイズ（Glycine max）、ソーヤ・ヒスピダ（Soja hispida）、またはソーヤ・マックス（Soja max））、ワタ（Gossypium hirsutum）、ヒマワリ属（Helianthus）種（例えば、ヒマワリ（Helianthus annuus））、ワスレグサ（Hemerocallis fulva）、フヨウ属（Hibiscus）種、オオムギ属（Hordeum）種（例えば、オオムギ（Hordeum vulgare））、サツマイモ（Ipomoea batatas）、クルミ（Juglans）種、レタス（Lactuca sativa）、レンリソウ属（Lathyrus）種、レンズマメ（Lens culinaris）、アマ（Linum usitatissimum）、レイシ（Litchi chinensis）、ハス（Lotus）種、トカドヘチマ（Luffa acutangula）、ルピナス属��Lupinus）種、オオスズメノヤリ（Luzula sylvatica）、リコペルシコン（Lycopersicon）種（例えば、リコペルシコン・エスクレンタム（esculentum）、リコペルシコン・リコペルシカム（lycopersicum）、リコペルシコン・ピリフォルメ（pyriforme））、マクロティロマ（Macrotyloma）種、リンゴ属（Malus）種、アセロラ（Malpighia emarginata）、マメイアップル（Mammea americana）、マンゴー（Mangifera indica）、イモノキ属（Manihot）種、サポジラ（Manilkara zapota）、ムラサキウマゴヤシ（Medicago sativa）、シナガワハギ属（Melilotus）種、ミント（Mentha）種、ススキ（Miscanthus sinensis）、ツルレイシ属（Momordica）種、クロミグワ（Morus nigra）、バショウ属（Musa）種、タバコ属（Nicotiana）種、オリーブ属（Olea）種、オプンティア（Opuntia）種、オルニソパス属（Ornithopus）種、イネ属（Oryza）種（例えば、イネ（Oryza sativa）、オリザ・ラティフォリア（Oryza latifolia））、キビ（Panicum miliaceum）、スイッチグラス（Panicum virgatum）、クダモノトケイソウ（Passiflora edulis）、パースニップ（Pastinaca sativa）、チカラシバ属（Pennisetum）種、ワニナシ属（Persea）種、パセリ（Petroselinum crispum）、クサヨシ（Phalaris arundinacea）、インゲンマメ属（Phaseolus）種、オオアワガエリ（Phleum pratense）、ナツメヤシ属（Phoenix）種、ヨシ（Phragmites australis）、ホオズキ属（Physalis）種、マツ属（Pinus）種、ピスタチオ（Pistacia vera）、エンドウ（Pisum）種、イチゴツナギ属（Poa）種、ポプラ（Populus）種、プロソピス属（Prosopis）種、サクラ属（Prunus）種、バンジロウ属（Psidium）種、ザクロ（Punica granatum）、セイヨウナシ（Pyrus communis）、ナラ（Quercus）種、ダイコン（Raphanus sativus）、ルバーブ（Rheum rhabarbarum）、スグリ属（Ribes）種、トウゴマ（Ricinus communis）、キイチゴ属（Rubus）種、サトウキビ属（Saccharum）種、ヤナギ（Salix）種、スワトコ属（Sambucus）種、ライムギ（Secale cereale）、ゴマ属（Sesamum）種、シロガラシ属（Sinapis）種、ナス属（Solanum）種（例えば、ジャガイモ（Solanum tuberosum）、ヒラナス（Solanum integrifolium）、またはトマト（Solanum lycopersicum））、モロコシ（Sorghum bicolor）、ホウレンソウ属（Spinacia）種、フトモモ属（Syzygium）種、マリーゴールド（Tagetes）種、タマリンド（Tamarindus indica）、カカオ（Theobroma cacao）、シャジクソウ属（Trifolium）種、トリプサクム・ダクチロイデス（Tripsacum dactyloides）、トリチコセカレ・リンパウイ（Triticosecale rimpaui）、コムギ属（Triticum）種（例えば、パンコムギ（Triticum aestivum）、デュラムコムギ（Triticum durum）、リベットコムギ（Triticum turgidum）、トリチカム・ハイベルナム（Triticum hybernum）、トリチカム・マチャ（macha）、コムギ（Triticum sativum）、ヒトツブコムギ（Triticum monococcum）、またはトリチカム・バルガレ（Triticum vulgare））、トロパエオルム・ミヌス（Tropaeolum minus）、キンレンカ（Tropaeolum majus）、スノキ属（Vaccinium）種、ソラマメ属（Vicia）種、ササゲ属（Vigna）種、ニオイスミレ（Viola odorata）、ブドウ属（Vitis）種、トウモロコシ（Zea mays）、ワイルドライス（Zizania palustris）、ナツメ属（Ziziphus）種より選択される、飼い葉もしくは餌用のマメ、観賞植物、食用作物、樹木、または低木を含めた、特に単子葉および双子葉植物に属するすべての植物が含まれる。
【０１２５】
関心対象の植物のさらなる例には、コーン（トウモロコシ）、アブラナ属種（例えば、セイヨウアブラナ、ブラッシカ・ラパ、カラシナ（B. juncea））、特に種子油の供給源として有用なそれらのアブラナ属種、アルファルファ（ムラサキウマゴヤシ）、米（イネ）、ライ麦（ライムギ）、ソルガム（モロコシ、ソルガム・ブルガレ（Sorghum vulgare））、雑穀（例えば、トウジンビエ（pearl millet）（トウジンビエ（Pennisetum glaucum））、黍（キビ（Panicum miliaceum））、粟（アワ（Setaria italica））、シコクビエ（finger millet）（シコクビエ（Eleusine coracana））、向日葵（ヒマワリ）、紅花（ベニバナ）、小麦（パンコムギ）、大豆（ダイズ）、タバコ（tobacco）（タバコ（Nicotiana tabacum））、じゃがいも（ジャガイモ）、落花生（ラッカセイ（Arachis hypogaea））、綿（カイトウメン（Gossypium barbadense）、リクチメン（Gossypium hirsutum））、さつまいも（サツマイモ）、キャッサバ（cassava）（キャッサバ（Manihot esculenta））、コーヒー（コーヒーノキ種）、ココナツ（ココヤシ（Cocos nucifera））、パイナップル（pineapple）（パイナップル（Ananas comosus））、柑橘樹木（ミカン属種）、ココア（カカオ）、茶（チャノキ）、バナナ（バショウ属種）、アボカド（avocado）（アボカド（Persea americana））、イチジク（fig）（イチジク（Ficus casica））、グアバ（guava）（グアバ（Psidium guajava））、マンゴー（mango）（マンゴー（Mangifera indica））、オリーブ（olive）（オリーブ（Olea europaea））、パパイア（papaya）（パパイア（Carica papaya））、カシュー（カシューナッツ（Anacardium occidentale））、マカダミア（macadamia）（マカダミア（Macadamia integrifolia））、アーモンド（almond）（アーモンド（Prunus amygdalus））、テンサイ（ビート）、甘蔗（サトウキビ属種）、オート麦、大麦、野菜、観賞植物、および針葉樹が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【０１２６】
野菜には、トマト（リコペルシコン・エスクレンタム）、レタス（lettuce）（例えば、レタス（Lactuca sativa））、サヤマメ（インゲンマメ（Phaseolus vulgaris））、ライ豆（ライマメ（Phaseolus limensis））、エンドウ豆（レンリソウ属種）、ならびにキュウリ（cucumber）（キュウリ（C. sativus））、カンタループ（C.カンタルペンシス（cantalupensis））、およびマスクメロン（メロン（C. melo））などのキュウリ属のメンバーが含まれる。観賞植物には、ツツジ（azalea）（ツツジ（Rhododendron）種）、アジサイ（hydrangea）（アジサイ（Macrophylla hydrangea））、ハイビスカス（ブッソウゲ（Hibiscus rosasanensis））、薔薇（バラ（Rosa）種）、チューリップ（tulip）（チューリップ（Tulipa）種）、ラッパスイセン（スイセン属（Narcissus）種）、ペチュニア（petunia）（ペチュニア（Petunia hybrida））、カーネーション（carnation）（カーネーション（Dianthus caryophyllus））、ポインセチア（poinsettia）（ポインセチア（Euphorbia pulcherrima））、およびキク属（chrysanthemum）が含まれる。態様の実践において採用され得る針葉樹には、例えば、タエダ松（テーダマツ（Pinus taeda））、スラッシュパイン(スラッシュマツ（Pinus elliotii））、ポンデローサ松（ポンデローサマツ（Pinus ponderosa））、ロッジポールパイン（コントルタマツ（Pinus contorta））、およびラジアータ松（ラジアータパイン（Pinus radiata））などの松；ダグラスファー（ベイマツ（Pseudotsuga menziesii））；ベイツガ（カナダツガ（Tsuga canadensis））；シトカトウヒ（カナダトウヒ（Picea glauca））；アカスギ（セコイア（Sequoia sempervirens））；ヨーロッパモミ（アマビリスモミ（Abies amabilis））およびバルサムモミ（balsam fir）（バルサムモミ（Abies balsamea））などの純種のモミ；ならびにウェスタンレッドシーダー（ベイスギ（Thuja plicata））およびアラスカイエローシーダー（アラスカヒノキ（Chamaecyparis nootkatensis））などのシーダーが含まれる。態様の植物には、コーンおよび大豆植物など、農作物（例えば、コーン、アルファルファ、向日葵、アブラナ属、大豆、綿、紅花、落花生、ソルガム、小麦、雑穀、タバコ等）が含まれる。
【０１２７】
芝草には、アニュアルブルーグラス（スズメノカタビラ（Poa annua））；アニュアルライグラス（ネズミムギ（Lolium multiflorum））；カナダブルーグラス（コイチゴツナギ（Poa compressa））；チューイングフェスク（オオウシノケグサ（Festuca rubra））；コロニアルベントグラス（イトコヌカグサ（Agrostis tenuis））；クリーピングベントグラス（コヌカグサ（Agrostis palustris））；クレステッドウィートグラス（ニセコムギダマシ（Agropyron desertorum））；フェアウェイウィートグラス（アグロピロン・クリスタツム（Agropyron cristatum））；ハードフェスク（フェスツカ・ロンギフォリア（Festuca longifolia））；ケンタッキーブルーグラス（ナガハグサ（Poa pratensis））；オーチャードグラス（カモガヤ（Dactylis glomerate））；ペレニアルライグラス（ホソムギ（Lolium perenne））；レッドフェスク（オオウシノケグサ（Festuca rubra））；レッドトップ（コヌカグサ（Agrostis alba））；ラフブルーグラス（オオスズメノカタビラ（Poa trivialis））；シープフェスク（ウシノケグサ（Festuca ovine））；スムーズブロムグラス（ブロムス・イネルミス（Bromus inermis））；トールフェスク（オニウシノケグサ）；チモシー（オオアワガエリ（Phleum pretense））；ベルベットベントグラス（アグロスティス・カニナ（Agrostis canine））；ウィーピングアルカリグラス（プッシネリア・ディスタンス（Puccinellia distans））；ウェスタンウィートグラス（アグロピロン・スミチイ（Agropyron smithii））；バーミューダグラス（ギョウギシバ属（Cynodon）種）；セントオーガスチングラス（ステノタフルム・セクンダツム（Stenotaphrum secundatum））；ノシバ（シバ属（Zoysia）種）；バヒアグラス（アメリカスズメノヒエ（Paspalum notatum））；カーペットグラス（アクソノプス・アフィニス（Axonopus affinis））；センチピードグラス（ムカデシバ（Eremochloa ophiuroides））；キクユグラス（ペニセツム・クランデスティヌム（Pennisetum clandesinum））；シーショアパスパルム（サワスズメノヒエ（Paspalum vaginatum））；ブルーグラマ（ボウテロウア・グラシリス（Bouteloua gracilis））；バッファローグラス（ヤギュウシバ（Buchloe dactyloids））；サイドオーツグラマ（ボウテロウア・カルチペンデュラ（Bouteloua curtipendula））が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【０１２８】
さらなる関心対象の植物には、カンナビス属（Cannabis）（例えば、サティバ（sativa）、インディカ（indica）、およびルデラリス（ruderalis）等）ならびに産業用ヘンプが含まれる。
【０１２９】
関心対象の植物には、関心対象の種子を提供する穀物植物、油糧種子植物、およびマメ科（leguminous）植物が含まれる。関心対象の種子には、コーン、小麦、大麦、米、ソルガム、ライ麦、雑穀などの穀物種子が含まれる。油糧種子植物には、綿、大豆、紅花、向日葵、アブラナ属、トウモロコシ（maize）、アルファルファ、ヤシ、ココナツ、亜麻、ヒマシ、オリーブ等が含まれる。マメ科植物には、豆およびエンドウ豆が含まれる。豆には、グアー、イナゴマメ、フェヌグリーク、大豆、インゲン、カウピー、リョクトウ、ライ豆、ソラマメ、レンズ豆、ひよこ豆等が含まれる。
【０１３０】
すべての植物および植物の部分は、本発明に従って処理され得る。この文脈において、植物とは、所望および非所望の野生植物または作物植物（天然に存在する作物植物を含む）など、すべての植物および植物集団を意味すると理解される。作物植物とは、トランスジェニック植物および植物品種を含めた、伝統的な繁殖法および最適化法によって、またはバイオテクノロジー法および組換え法もしくはこれらの方法の組み合わせによって得ることができる植物であり得る。
【０１３１】
植物の部分とは、シュート、葉、花、および根など、植物のすべての空中および地下の部分および器官を意味すると理解され、挙げられ得る例は、葉、針状葉、柄、茎、花、子実体、果実、および種子であるが、根、塊茎、および根茎もそうである。植物の部分には、作物材料、ならびに栄養期および生殖期（generative）増殖材料、例えば切穂（cutting）、塊茎、根茎、接ぎ穂（slip）、および種子も含まれる。
【実施例】
【０１３２】
本明細書において記載される実施例および態様は、単に例証目的のためのものであること、およびそれに照らした様々な改変または変化は、当業者に示唆され、本出願の精神および権限の内に含まれる対象となることが理解されるべきである。
【０１３３】
実施例1−110Lの分配可能なリアクターにおけるソホロ脂質（SLP）産生のためのS.ボンビコーラの発酵
水濾過、温度制御ユニット、および搭載された送風機を備えたPLCによって運転される、可搬式のエアリフト型の完全に密閉されたリアクターを用いる。リアクターは、SLP産生のためにスターメレラ・ボンビコーラを増殖させる場合、90Lの作業体積を有する。
【０１３４】
好ましい態様において、SLP産生のための栄養素は、グルコース、尿素、酵母エキス、キャノーラ油、硫酸マグネシウム、およびリン酸カリウムである。
【０１３５】
リアクターに、フラスコ内で増殖させた8リットルの液体培養物を接種する。SLP産生のための培養サイクルの継続期間は、25℃およびpH3.5で7〜8日間であり、サンプリングは1日2回実施される。
【０１３６】
SLPの最終濃度は作業体積のほぼ10％であり、この場合約9Lの産物であり、1リットルあたり300〜400グラムのSLPを含有する。
【０１３７】
実施例2−可搬式の14Lの分配可能なリアクターにおけるSLP産生のためのS.ボンビコーラの発酵
このリアクターは、空気スパージャー（spurge）およびインペラーを備えた加圧滅菌可能な被覆ガラス容器である。それは、溶存酸素、pH、温度、および気泡プローブ（prob）が配備されており；それは、カラータッチスクリーンインターフェース、内蔵式ポンプ、ガスフロー制御装置、およびpH/DO気泡/レベル制御装置を備えた統合制御ステーションを有する。リアクターの作業体積は10リットルである。
【０１３８】
栄養培地は、グルコース、酵母エキス、尿素、および植物油を含有する。接種材料は、総培養物体積の約5〜10％での、スターメレラ・ボンビコーラの1〜2日間経過後の培養物であり得る。培養継続期間および既成産物回収は、5〜14日間続く。最終のソホロ脂質産生量は、1サイクルあたり1〜2キログラムに達し得る。
【０１３９】
実施例3：450Lの分配可能なリアクターにおけるSLP産生のためのウィッカーハモマイセスおよび/またはピキア酵母の発酵
水濾過、温度制御ユニット、および十分な通気のための送風機を備えたPLCによって運転される、可動エアリフトリアクターを用いる。過程は、バッチ培養過程として行われ得る。リアクターは、SLP産生のためにウィッカーハモマイセスまたはピキアを増殖させる場合、400Lの作業体積を有する。
【０１４０】
好ましい態様において、SLP産生のための栄養素は、グルコース、尿素、酵母エキス、キャノーラ油、硫酸マグネシウム、およびリン酸カリウムである。
【０１４１】
このリアクターの接種は、作業体積の最高5％の液体種培養物を要する。培養サイクルの継続期間は、25℃の温度およびpH3.5で7日間であり、サンプリングは1日2回実施される。
【０１４２】
SLPの最終濃度は作業体積のほぼ20〜25％であり、この場合90Lを上回る産物が形成される。
【０１４３】
実施例4：900Lの分配可能なリアクターにおける細胞および単一細胞タンパク質産生のためのウィッカーハモマイセスおよび/またはピキア酵母の発酵
2つのタンクを同時に混合するのを助ける中心エアリフトによって作動される、2つのタンクに分割された可搬式リアクターを用いる。リアクターは、細胞産生のためにウィッカーハモマイセスおよび/またはピキアを増殖させる場合、600Lの作業体積を有する。
【０１４４】
好ましい態様において、細胞産生のための栄養素は、グルコースまたはベーキング糖類（baking sugar）、尿素、酵母エキス、硫酸マグネシウム、およびリン酸カリウムである。
【０１４５】
リアクターに、2％の種培養物を接種する。pHの安定化なしおよび26〜32℃の温度で、発酵を48〜72時間続ける。
【０１４６】
細胞の最終濃度は、1リットルあたり100gの湿重量となる。湿潤バイオマス濃度は、最高45キロのタンパク質濃度を有し、1サイクルあたり90キロに達し得る。
【０１４７】
実施例5：2000Lの分配可能なリアクターにおける細胞および単一細胞タンパク質産生のためのウィッカーハモマイセスおよび/またはピキア酵母の発酵
タンク間での質量交換のための2本のループを伴う2つの四角いタンクに分割された可搬式リアクターを用いる。リアクターは、細胞産生のためにウィッカーハモマイセスおよび/またはピキアを増殖させる場合、2000Lの作業体積を有する。
【０１４８】
好ましい態様において、細胞産生のための栄養素は、グルコースまたはベーキング糖類、尿素、酵母エキス、硫酸マグネシウム、およびリン酸カリウムである。
【０１４９】
リアクターに、2％の種培養物を接種する。pHの安定化なしおよび26〜32℃の温度で、発酵を48〜72時間続ける。
【０１５０】
細胞の最終濃度は、1リットルあたり100gの湿重量となる。湿潤バイオマス濃度は、最高100キロのタンパク質濃度を有し、1サイクルあたり最高200キロに達し得る。
【０１５１】
実施例6：可搬式の14Lの分配可能なリアクターにおけるマンノシルエリスリトール脂質（MEL）産生のためのシュードザイマ・アフィディスの発酵
これは、空気スパージャーおよびRushtonインペラーを備えた加圧蒸気滅菌可能な被覆ガラス容器である。それは、DO、pH、温度、および気泡プローブが配備されている。それは、カラータッチスクリーンインターフェース、内蔵式ポンプ、ガスフロー制御装置、およびpH/DO気泡/レベル制御装置を備えた統合制御ステーションを有する。リアクターの作業体積は10リットルである。
【０１５２】
栄養培地組成：硝酸ナトリウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、酵母エキス、および植物油。接種材料は、総培養物体積の約5〜10％での、シュードザイマ・アフィディスの1〜2日間経過後の培養物であり得る。培養継続期間およびサンプル回収：9〜15日間。最終MEL産生量:800〜1000グラム。
【０１５３】
実施例7−トマト植物上の根瘤線虫卵を低下させるためのSLPの使用
スターメレラ・ボンビコーラを、上記のように増殖させた。発酵培養の終わりに、培養液は落ち着き、SLPのほとんどは暗褐色層として分離する（約500gm/Lの濃度）。この褐色層は、主としてSLP、および一部の細胞も含有する。層を回収し、pHをpH7.0に調整する。次いで、その溶液を水で希釈して、所望の濃度を達成する。
【０１５４】
1日目：トマト（マネーメーカー（Moneymaker））種子を発芽させる。
14日目：1％肥料（オスモコート（osmocote））を有する砂/ターフェス（turface）（1:1）を調製し、トマトの2週間苗を移植する。
28日目：4週齢の植物に土壌灌注によって微生物を接種する。各10cm×10cm正方形の鉢に対して、土壌を湿らせるのに80〜100mlの培養物で十分であった。
32日目：微生物接種の4日後、各植物にRKN卵（1個の鉢あたり4000個の卵）を適用する。
76日目：卵接種の6週間後、植物を収穫する。
【０１５５】
収穫後、植物を水道水の下で洗浄して、根に付着した砂/ターフェスを除去した。根の生重量を記録した。その後、根を細かく切り、小さなプラスチック製ランチバッグの中に入れた。200mlの5％漂白剤を添加した後、バッグを15分間インキュベートしかつ穏やかに振とうした。次いで、10ulのサンプル中の卵を実体顕微鏡下で三つ組でカウントした。各根の上の卵の総数を算出した。最後に、グラム当たりの根バイオマスにおける卵の数を算出した。
【０１５６】
SLP 0.25％も、根瘤線虫（Root Knot Nematode）（RNK）に対する活性を示し、約52％分の卵の低下を伴う。
【０１５７】
実施例8−根瘤、刺毛、および病変線虫を防除し得る能力における、SLP、MEL、およびNIMITZ（登録商標）の比較
Nimitz（登録商標）は、20年を超える期間のあいだに開発された第一の新たな化学的殺線虫剤である。Nimitz（登録商標）は、適用直後に不可逆的でかつ迅速な殺線虫活性を引き起こす。接触の1時間以内に、線虫は摂食を止め、急速に麻痺する。24〜48時間以内に、有機リン酸およびカルバメート殺線虫剤を用いて見られる一時的な静線虫（動きを止める）活性ではなく、害虫死亡が起こる。
【０１５８】
シュードザイマ・アフィディスを、上記のように増殖させた。MELは溶媒を全く用いずに分離することが非常に難しいため、発酵の終わりに、培養物培養液全体を用いた。次いで、適用の直前に、MELを水で所望の濃度に希釈する。
【０１５９】
スターメレラ・ボンビコーラを、上記のように増殖させた。発酵培養の終わりに、培養液は落ち着き、SLPのほとんどは暗褐色層として分離する（約500gm/Lの濃度）。この褐色層は、主としてSLP、および一部の細胞も含有する。層を回収し、pHをpH7.0に調整する。次いで、その溶液を水で希釈して、所望の濃度を達成する。
【０１６０】
以下のバイオアッセイを実行した：ガラス製くぼみスライド（cavity slide）に適当量の検査産物を充填する。殺線虫剤を含有する溶液に、標的線虫幼若体の既知の集団を添加する。くぼみスライドを室温で維持する。線虫死亡率は、24、48、および72時間の時点で線虫の数をカウントすることによって判断され得る。死亡率パーセンテージを、[処理中の幼若体の死滅した数の平均/処理中の幼若体の総数]×100として算出した。
【０１６１】
A．根瘤線虫
根瘤線虫（サツマイモネコブセンチュウ）の死亡率（すなわち、どれぐらいの線虫が殺傷されたか）および運動性の欠如（すなわち、どれぐらいの線虫が死んだように状態が悪いか）を、様々な濃度のSLP（SD10）またはMEL（SD12）の処理の3日後に判定し、Nimitz（登録商標）の処理および未処理対照と比較した（図1および2）。死亡率パーセントを、死滅した線虫の数/検査前の線虫の総カウントの数によって算出した。非運動性線虫パーセントを、非運動性線虫の数/生きた線虫の数によって算出した。ゆえに、運動性は、殺傷されなかったが非運動性であると判定されるそれらの線虫のパーセンテージとして算出される。
【０１６２】
検査において、高レベルのMEL（0.1％ v/v）が最も有効な処理であった。それは、死亡率に関してNimitz（登録商標）よりも有意に有効であった。明らかな用量応答が観察された。結果は、根瘤線虫の死亡率および運動性の欠如に対して、SLPがNimitz（登録商標）と同じくらい有効であったことも示している。
【０１６３】
B．刺毛線虫
刺毛線虫（ベロノライムス・ロンギカウダツス）の死亡率および運動性低下率を、様々な濃度のSLPまたはMELの処理の3日後に判定し、Nimitz（登録商標）の処理および未処理対照と比較した（図1および2）。
【０１６４】
結果は、SLPおよびMELの両方が、刺毛線虫の死亡率および運動性低下率を用量依存的様式で増加させることを示している。検査において、高レベルのMEL（0.1％または0.2％ v/v）が最も有効な処理であった。それらは、死亡率に関してNimitz（登録商標）と同じくらい有効であり、運動性低下率に関してNimitz（登録商標）よりも有効であった。
【０１６５】
C．病変線虫
病変線虫（プラチレンクス種）の死亡率および運動性低下率を、様々な濃度のSLPまたはMELの処理の3日後に判定し、Nimitz（登録商標）の処理および未処理対照と比較した（図1および2）。
【０１６６】
結果は、SLPおよびMELの両方が、病変線虫の死亡率および運動性低下率を用量依存的様式で増加させることを示している。検査において、MELはSLPよりも有効であり、Nimitz（登録商標）に匹敵した。
【０１６７】
実施例9−病理検査室ジャーテストにおけるサツマイモ根瘤線虫（SOUTHERN ROOT KNOT NEMATODE）に対する様々な処理についての評価
線虫が感染した土壌に直接適用されるSLP処理（SD10）およびMEL処理（SD12）を、単独でまたは一緒に2種類の割合で検査し、生きたサツマイモ根瘤線虫集団を減少させることに関してNimitz（登録商標）および未処理対照と比較した。処理後の3つの異なる時点でカウント数を取った。
【０１６８】
350cm3の99％砂質土壌を含有するガラス製ジャー中で、7種類の処理の6回の反復を実行した。ジャーに70匹のサツマイモ根瘤線虫成体（サツマイモネコブセンチュウ）を接種した。線虫接種の直後に処理の1回の適用を行い、85mLの処理液を各ジャーに手で注いだ。処理混合物は表1（下記）に従って調製した。処理後3日目、14日目、および23日目に、生きた線虫および死滅した線虫のカウントを行った。全生体のパーセンテージとして、非運動性線虫のカウント数も表にした。
【０１６９】
（表１）処理混合物の調製
2020512305.tif 000003
反復：6；噴霧体積：85mL/個；区画；4×20フィート（ft.）；混合サイズ：1L（0Lの算出された混合サイズ）。
【０１７０】
結果
SD10およびSD12産物に関するジャーテスト結果は、サツマイモ根瘤線虫に対する活性に関して正の用量応答を示唆する。低い割合で一緒に適用されたSD10およびSD12は、より高い割合における単独でのいずれかの産物ほど有効でなかった。Nimitz（登録商標）は、より優れた防除を提供した。
【０１７１】
図3および表2（下記）は、各処理に関する生きた線虫カウント数を示している。図4および表3（下記）は、各処理に関する生きた線虫防除（すなわち、線虫死滅率）を示している。
【０１７２】
（表２）生きた線虫カウント数
2020512305.tif 000004
【０１７３】
Nimitz（登録商標）（10ppm）で処理されたジャーにおいて、早くも3日目（3 DA-A）に記録される有意により高い防除があった。SD10およびSD12の両方に関して、23 DA-Aの時点でそれぞれに対して観察される有意な用量応答があり、より高い割合で処理されたサンプルほど、より低い割合のサンプルよりも少ない線虫カウント数を有した。SD10およびSD12の両方を低い割合で組み合わせて適用した場合、線虫死亡率は、より高い割合の処理において見られるレベルまで有意に高まらなかった。
【０１７４】
（表３）生きた線虫防除（％）
2020512305.tif 000005
【０１７５】
図5および表4（下記）は、非運動性線虫カウント数を示している。図6および表5（下記）は、非運動性の生きた線虫カウント数（％）を示している。
【０１７６】
（表４）非運動性線虫カウント数
2020512305.tif 000006
【０１７７】
非運動性線虫カウント数は、Nimitz（登録商標）で処理されたサンプルにおいて最も低かった。3 DA-Aの時点で、SD10またはSD12のいずれかの割合が増加するにつれて、より高いパーセンテージの非運動性線虫が存在し、殺害虫剤の早期活性が即時の致死をもたらさないことを示唆した。14 DA-Aまでに、非運動性と評定された生きた線虫のパーセンテージは、SD処理されたジャーの間で統計的に異ならなかった。
【０１７８】
（表５）非運動性の生きた線虫カウント数（％）
2020512305.tif 000007
【０１７９】
実施例10−キュウリ植物小区画システムにおける殺線虫剤としてのMELの使用
米国フロリダ州ソノトサッサに位置する屋外小区画を用いて、Nimitz（登録商標）および未処理対照と比較した、キュウリ植物に対するMEL線虫処理を調査した。それぞれが8つの植物からなる6つの異なる処理群を調査した。SD12（0.2％ ai/v）処理を受ける群に関して、処理を、土壌に1回、2回、または3回適用した。収穫時に、線虫カウント数およびこぶ形成（galling）率の両方を収集した。植物活力、収量、および植物の重量も測定した。
【０１８０】
Nimitz（登録商標）（5pt/a）処理を受ける植物を、植え付けの7日前に処理された土壌に植え付けた（化学的処理は、生育期に適用するには植物毒性が高すぎる）。SD12処理を受けるすべての植物に関して、土壌へのSD12の最初の適用（各植物に対して60mL）は、植え付け時であった。SD12二重処理および三重処理を受ける植物に関して、第二の60mLの適用は、最初の処理の2週間後であった。SD12三重処理を受ける植物に関して、第三の60mLの適用は、最初の処理の4週間後であった。
【０１８１】
三重処理群における最後のSD12処理の31日後に、線虫カウント数およびこぶ形成率をすべての群に対して収集した。植物活力（0〜10指数/スケール）、収量（ポンド（lb））、および重量（ポンド）を翌日に測定した。
【０１８２】
結果
こぶ形成（図7および表6（下記））および処理後の線虫カウント数（図8および表7（下記））において割合応答が観察された。SD12は商業規格に合致する能力を示した。SD12処理とNimitz（登録商標）処理との間に有意な格差はなかったが、SD12処理と未処理チェックとの間に有意な差が観察された。収穫時の植物活力、収量、および重量が、下記の表8に報告されている。
【０１８３】
（表６）こぶ形成率（1〜10指数/スケール）
2020512305.tif 000008
LSD（P＝.05）＝0.88；SD＝0.86；CV＝69.39；バートレットのX2＝11.754；P（バートレットのX2）＝0.019*；反復F＝3.712；反復プローブ（Prob）（F）＝0.0061；処理F＝11.133；処理プローブ（F）＝0.0001。
【０１８４】
（表７）線虫カウント数
2020512305.tif 000009
LSD（P＝.05）＝17.33；SD＝16.3；CV＝63.88；バートレットのX2＝17.263；P（バートレットのX2）＝0.002*；反復F＝2.774；反復プローブ（F）＝0.0261；処理F＝10.44；処理プローブ（F）＝0.0001。
【０１８５】
（表８）植物収穫時の植物活力（0〜10）、収量（ポンド）、および重量（ポンド）測定結果
2020512305.tif 000010
【０１８６】
実施例11−線虫誘引効力の評価
誘引材料でスパイクされた、湖の微細な砂質土壌を含有する4個の11.6インチ（in.）×7.6インチの密閉チャンバーにおいて、サツマイモ根瘤線虫のカウント数および蔓延パーセンテージを取った。あらかじめ作られている購入したカノコソウの根抽出物と、水、植物性グリセリン、および20％穀物アルコールとを混ぜ合わせて、誘引物を産生した。
【０１８７】
各区画に直径2cmゾーンで線虫を接種した。10mLの線虫誘引物を、接種ゾーンから2cmの、3cm（h）×1cm（w）ゾーンに添加した（図9）。
【０１８８】
処理の3日後および処理の8日後に、3つの場所で線虫カウント数および蔓延パーセンテージを取った。検査された3つの場所には、接種ゾーンの中心部、誘引物ゾーン、および未処理エリアが含まれた。
【０１８９】
結果
結果は、図10および表9（下記）に要約されている。総集団のパーセンテージとして、誘引物エリアまたは未処理エリアへの移動は、接種エリアと比べて有意に異なった。24時間および48時間のサンプリング事象の時点で、チャンバーの未処理エリアよりも誘引物ゾーンにおいて、14％を上回って、より多くのカウントされた線虫が存在した；しかしながら、線虫が接種された中心部ゾーンが、全体のほとんどの線虫を保持した。
【０１９０】
（表９）誘引評価における線虫カウント数および蔓延パーセンテージ
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【０１９１】
すべての図および表を含めた、本明細書において言及されるまたは引用されるすべての特許、特許出願、仮出願、および刊行物は、それらが本明細書の明示的な教示と矛盾しない程度まで、参照によりそれらの全体として組み入れられる。
【０１９２】
1つまたは複数の要素に関する、「含む（comprising）」、「有する（having）」、「含む（including）」、または「含有する（containing）」などの用語を用いた、本発明の任意の局面または態様についての本明細書における記載は、文脈によって別様に述べられていないまたは明らかに相反しない限り、その特定の1つまたは複数の要素「からなる」、「から本質的になる」、または「を実質的に含む」、本発明の同様の局面または態様への支持を提供することが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年7月30日(2019.7.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
殺線虫組成物は、線虫を防除することによって、植物、ヒト、または動物を保護するために用いられ得る。
[本発明1001]
線虫を防除するための方法であって、該方法は、微小生物が生物界面活性剤を産生する条件下で微小生物を培養することによって微生物に基づく殺線虫組成物を調製する工程を含み、該殺線虫組成物は、微小生物および/または微小生物が培養される培養液を含み、かつ該方法は、線虫および/またはそれらの環境に該殺線虫組成物を適用する工程をさらに含む、該方法。
[本発明1002]
生物界面活性剤が糖脂質である、本発明1001の方法。
[本発明1003]
糖脂質がソホロ脂質（SLP）である、本発明1002の方法。
[本発明1004]
糖脂質がマンノシルエリスリトール脂質（MEL）である、本発明1002の方法。
[本発明1005]
微小生物が、スターメレラ（Starmerella）、ピキア（Pichia）、およびシュードザイマ（Pseudozyma）より選択される真菌である、本発明1001の方法。
[本発明1006]
真菌がスターメレラ・ボンビコーラ（Starmerella bombicola）である、本発明1005の方法。
[本発明1007]
真菌がシュードザイマ・アフィディス（Pseudozyma aphidis）である、本発明1005の方法。
[本発明1008]
真菌がピキア・アノマラ（Pichia anomala）（ウィッカーハモマイセス・アノマルス（Wickerhamomyces anomalus））である、本発明1005の方法。
[本発明1009]
培養液が生物界面活性剤を含む、本発明1001の方法。
[本発明1010]
培養液を処理して生物界面活性剤を細胞塊から分離し、それに続いて生物界面活性剤を線虫および/またはそれらの環境に適用する工程をさらに含む、本発明1009の方法。
[本発明1011]
最初に生物界面活性剤を細胞塊から分離することなく、培養液を線虫および/またはそれらの環境に適用する、本発明1009の方法。
[本発明1012]
根瘤線虫（サツマイモネコブセンチュウ（Meloidogyne incognital））、刺毛線虫（sting nematode）（ベロノライムス・ロンギカウダツス（Belonolaimus longicaudatus））、大豆シスト線虫（ダイズシストセンチュウ（Heterodera glycines））、病変線虫（プラチレンクス（Pratylenchus）種）、ダガー線虫（dagger nematode）（キシフィネマ（Xiphinema）種）、および柑橘類線虫（ミカンネセンチュウ（Tylenchulus semipenetrans））より選択される線虫を防除するために用いられる、本発明1001の方法。
[本発明1013]
植物の線虫害虫を防除するために用いられる、本発明1001の方法。
[本発明1014]
植物が、トマト、大豆、コーン、柑橘類、および芝草より選択される、本発明1013の方法。
[本発明1015]
前記組成物が種子処理として適用される、本発明1013の方法。
[本発明1016]
前記組成物が土壌に適用される、本発明1001の方法。
[本発明1017]
線虫誘引物を適用する工程をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1018]
生物界面活性剤および生物界面活性剤を産生する微小生物を含む、線虫を防除するための組成物。
[本発明1019]
生物界面活性剤が糖脂質である、本発明1018の組成物。
[本発明1020]
糖脂質がSLPである、本発明1019の組成物。
[本発明1021]
糖脂質がMELである、本発明1019の組成物。
[本発明1022]
線虫誘引物質をさらに含む、本発明1019の組成物。
[本発明1023]
線虫誘引物質がカノコソウ（Valerian）の根抽出物を含む、本発明1022の組成物。
[本発明1024]
マンノシルエリスリトール脂質（MEL）を線虫および/または線虫の環境に適用する工程を含む、線虫を防除するための方法。
[本発明1025]
線虫にSLPを適用する工程をさらに含む、本発明1024の方法。
[本発明1026]
線虫誘引物質をさらに含む、本発明1025の方法。
[本発明1027]
根瘤線虫（サツマイモネコブセンチュウ）、刺毛線虫（ベロノライムス・ロンギカウダツス）、大豆シスト線虫（ダイズシストセンチュウ）、病変線虫（プラチレンクス種）、ダガー線虫（キシフィネマ種）、および柑橘類線虫（ミカンネセンチュウ）より選択される線虫を防除するために用いられる、本発明1025の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８９】
1つの態様において、線虫を防除するための組成物はMELを含む。MELは、精製された形態にあり得るまたは発酵産物の混合物の状態にあり得る。組成物は、0.01〜90重量％（wt％）、好ましくは0.1〜50wt％、およびより好ましくは0.1〜20wt％の濃度で、MELなどの活性構成要素を好ましくは含有する。別の態様において、精製されたMELは、許容される担体との組み合わせの状態にあり得、その中でMELは、0.0001〜50％（v/v）、好ましくは0.005〜20％（v/v）、より好ましくは0.001〜5％（v/v）の濃度で提示され得る。
【国際調査報告】
2020512305.tif 000023
2020512305.tif 000024