(57)【要約】  確率論的グラフィカルパスウェイモデルは、制御要因としてＲＩＳＣを加えることによりｍｉＲＮＡの制御を含むように修正されている。最も好ましくは、パスウェイモデルは、複数のファクターグラフを使用して構成されており、ＲＩＳＣは、ＤＩＣＥＲ、ＴＡＲＢＰ２、およびＡＧＯ２またはＡＧＯ１／３／４を含む。このように構築されたパスウェイモデルを使用して、様々な予測因子または診断試験を構築するために、様々な臨床的に関連するパラメータと関連付けることができるＲＩＳＣの活性を推測することができる。【選択図】図４
2020512004.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の腫瘍組織におけるＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）の活性を定量化する方法であって、
前記患者の腫瘍組織からオミクスデータを取得するステップであって、前記腫瘍組織は、サブタイプがルミナルＡの乳癌組織である、ステップと、
複数のパスウェイ要素を有する確率論的グラフィカルパスウェイモデルを使用して前記オミクスデータからＲＩＳＣの活性を定量化するステップと、
を含み、
前記確率論的グラフィカルパスウェイモデルにおけるパスウェイ要素の各々が、それぞれのファクターグラフにより表され、
前記ファクターグラフのうちの少なくとも１つが、ＲＩＳＣをモデル化し、ＡＧＯ１、ＡＧＯ２、ＡＧＯ３、およびＡＧＯ４のうちの少なくとも１つを含む、
方法。
【請求項２】
前記オミクスデータが、コピー数のデータ、転写レベルのデータ、およびｍｉＲＮＡのデータを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記確率論的グラフィカルパスウェイモデルが、先験的な既知のｍｉＲＮＡおよびそれぞれのｍｉＲＮＡ標的を使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＲＩＳＣをモデル化するファクターグラフが、ＡＧＯ２を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
定量化されたＲＩＳＣの活性を閾値のレベルと比較するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
定量化されたＲＩＳＣの活性が前記閾値のレベルを超える場合に患者の記録を更新するステップ、または臨床的なパラメータを、定量化されたＲＩＳＣの活性と関連付けるステップ、をさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
患者の腫瘍組織においてＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）の活性を検出する方法であって、
前記患者の腫瘍組織からオミクスデータを取得するステップと、
前記オミクスを確率論的グラフィカルパスウェイモデルに入力することにより、前記患者のＲＩＳＣの活性を検出するステップであって、前記確率論的グラフィカルパスウェイモデルが、先験的な既知のｍｉＲＮＡおよびそれぞれのｍｉＲＮＡ標的を使用し、前記確率論的グラフィカルパスウェイモデルが、複数のファクターグラフを使用する、ステップと、
前記パスウェイモデルにおいて前記オミクスデータからＲＩＳＣの活性を計算するステップと、
を含む方法。
【請求項８】
前記オミクスデータが、コピー数のデータ、転写レベルのデータ、およびｍｉＲＮＡのデータを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
（削除）
【請求項１０】
前記複数のファクターグラフのうちの少なくとも１つが、ＡＧＯ１、ＡＧＯ２、ＡＧＯ３、およびＡＧＯ４のうちの少なくとも１つを含むＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）をモデル化する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
確率論的グラフィカルパスウェイがＰＡＲＡＤＩＧＭである、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
定量化されたＲＩＳＣの活性を閾値のレベルと比較するステップをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
定量化されたＲＩＳＣの活性が前記閾値のレベルを超える場合に患者の記録を更新するステップ、または臨床的なパラメータを、定量化されたＲＩＳＣの活性と関連付けるステップ、をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
サブタイプがルミナルＡの乳癌を有する患者の全生存率を予測する方法であって、
前記患者の腫瘍組織からオミクスデータを取得するステップと、
複数のパスウェイ要素を有する確率論的グラフィカルパスウェイモデルを使用して前記オミクスデータからＲＩＳＣの活性を定量化するステップであって、前記確率論的グラフィカルパスウェイモデルにおけるパスウェイ要素の各々が、それぞれのファクターグラフにより表され、前記ファクターグラフのうちの少なくとも１つが、ＡＧＯ２を伴うＲＩＳＣをモデル化する、ステップと、
ＲＩＳＣ−ＡＧＯ２の活性の減少が検出された場合に前記患者を、全生存率が低下していると診断するステップと、
を含む方法。
【請求項１５】
前記オミクスデータが、コピー数のデータ、転写レベルのデータ、およびｍｉＲＮＡのデータを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記確率論的グラフィカルパスウェイモデルが、先験的な既知のｍｉＲＮＡおよびそれぞれのｍｉＲＮＡ標的を使用する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
確率論的グラフィカルパスウェイがＰＡＲＡＤＩＧＭである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
オミクス解析のためのコンピュータシステムであって、
解析エンジンに情報的に連結されているオミクスデータベースを含み、
前記オミクスデータベースは、患者のオミクスデータベースを保存し、
前記解析エンジンは、
（ａ）前記オミクスデータベースからオミクスデータを受信する；
（ｂ）前記オミクスデータおよび確率論的グラフィカルパスウェイモデルを使用してＲＩＳＣ活性を計算する；
（ｃ）前記確率論的グラフィカルパスウェイモデルが、複数のパスウェイ要素を有し、前記確率論的グラフィカルパスウェイモデルにおけるパスウェイ要素の各々が、それぞれのファクターグラフにより表される；および
（ｄ）前記ファクターグラフのうちの少なくとも１つが、前記ＲＩＳＣをモデル化し、ＡＧＯ１、ＡＧＯ２、ＡＧＯ３、およびＡＧＯ４のうちの少なくとも１つを含む；
ようにプログラムされている、
コンピュータシステム。
【請求項１９】
前記オミクスデータが、コピー数のデータ、転写レベルのデータ、およびｍｉＲＮＡのデータを含む、請求項１８に記載のコンピュータシステム。
【請求項２０】
前記確率論的グラフィカルパスウェイモデルが、先験的な既知のｍｉＲＮＡおよびそれぞれのｍｉＲＮＡ標的を使用する、請求項１８に記載のコンピュータシステム。
【請求項２１】
確率論的グラフィカルパスウェイがＰＡＲＡＤＩＧＭである、請求項１８に記載のコンピュータシステム。
【請求項２２】
前記ＲＩＳＣをモデル化するファクターグラフが、ＡＧＯ２を含む、請求項１８に記載のコンピュータシステム。
【請求項２３】
前記ＲＩＳＣをモデル化するファクターグラフが、ＡＧＯ１、ＡＧＯ３、およびＡＧＯ４のうちの少なくとも１つを含む、請求項１８に記載のコンピュータシステム。
【請求項２４】
前記解析エンジンが、定量化されたＲＩＳＣの活性を閾値のレベルと比較するようにさらにプログラムされている、請求項１８に記載のコンピュータシステム。
【請求項２５】
前記解析エンジンが、定量化されたＲＩＳＣの活性が前記閾値のレベルを超える場合に患者の記録を更新するように、または臨床的なパラメータを、定量化されたＲＩＳＣの活性と関連付けるように、さらにプログラムされている、請求項２４に記載のコンピュータシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、本出願人らの同時係属中である２０１７年３月２８日に出願の米国特許仮出願番号第６２／４７７，９２９号に対する優先権を主張する。
【０００２】
本発明の分野
本発明の分野は、パスウェイ活性を推測して癌における全生存率を予測するためにオミクスのデータを使用するコンピュータ上のパスウェイ解析（ｐａｔｈｗａｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ）であり、特にこのパスウェイ解析は、ｍｉＲＮＡのデータを使用する。
【背景技術】
【０００３】
背景の説明は、本発明の理解に有用であり得る情報を含む。本明細書中提供されるいずれかの情報が従来技術であるかもしくはここで請求される発明に関連する、または具体的もしくは暗示的に言及されているいずれかの刊行物が従来技術であると見なすべきではない。
【０００４】
本明細書中の全ての刊行物および特許出願は、それぞれ個々の刊行物または特許出願が、具体的かつ個別に参照により組み込まれているように表されている場合と同じ程度で、参照により組み込まれている。組み込まれた参照文献における用語の定義または使用が、本明細書中示される当該用語の定義と食い違っているかまたは矛盾している場合、本明細書中示される用語の定義を適用し、参照文献における当該用語の定義は適用されない。
【０００５】
現在の乳癌の分子分類学は、従来のｍＲＮＡ発現のプロファイリングの研究から生じており、少なくとも４つの明確に異なるグループ：ルミナルＡ、ルミナルＢ、ｂａｓａｌ−ｌｉｋｅ、ＨＥＲ２陽性への乳癌の亜分類をもたらしている。健常な乳房組織および乳癌組織においてｍｉＲＮＡ発現を使用したさらなる分子解析により、存在または進行、さらには乳癌のサブタイプを表す特定のｍｉＲＮＡの同定がもたらされた。たとえば、８６の乳房の腫瘍および正常な組織におけるｍｉＲＮＡ発現の早期の研究は、乳癌で調節不全であった多くのｍｉＲＮＡを同定し、正常な乳房組織と悪性の乳房組織とを区別するシグネチャーの生成を可能にした（たとえばＣａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００５；  ６５，  ７０６５−７０７０を参照）。また実際に、９つの循環ｍｉＲＮＡシグネチャーが、早期乳癌と健常な対照とを区別できることが報告された（Ｍｏｌ  Ｏｎｃｏｌ．  ２０１４；  ８：８７４−８３）
【０００６】
さらに乳癌サンプルの詳細な研究により、乳癌における特異的なｍｉＲＮＡの疑わしい機能と併せて、ルミナルＡおよびｂａｓａｌ−ｔｙｐｅの腫瘍に特異的なｍｉＲＮＡのシグネチャーが明らかとなった（たとえばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  （２０１０）  ２３０−２４１）。同様に、他の研究で、ｍｉＲＮＡ発現、ｍＲＮＡ発現、およびＤＮＡのコピー数を、ヒトの乳癌で測定し、ｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡの発現データの併用解析に基づき、分子学的な腫瘍のサブタイプ間で差次的に発現した多くのｍｉＲＮＡが同定された。さらに、多くのｍｉＲＮＡが、分子学的な腫瘍のサブタイプ間で差次的に発現し、個々のｍｉＲＮＡは、臨床病理学的な要因に関連付けられた。実際に、選択されたｍｉＲＮＡは、独立したデータセットにおいて、ｂａｓａｌ対ルミナルの腫瘍のサブタイプを分類することができた（たとえばＧｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２００７，  ８：Ｒ２１４参照）。
【０００７】
さらに最近、予後および予測のバイオマーカーとしてのｍｉＲＮＡの使用の可能性が研究され、いくつかのｍｉＲＮＡが、乳癌における推定治療標的として記載された。たとえば、選択されたｍｉＲＮＡは、ホルモン療法、標的治療（たとえばＥＲ、ＰＲ、ＨＥＲ２）に関連付けられ、特定の化学療法薬に応答性があった。さらに、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−３７５、ｍｉＲ−３０ａ、ｍｉＲ−４３２−５ｐ、およびｍｉＲ−４９７は、正の予後に関連すると報告がなされた（Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  （２０１５）  １７：２１参照）。しかしながら、少なくとも、特定のｍｉＲＮＡが乳癌または乳癌のサブタイプと統計的に関連しているにも関わらず、ｓｉＲＮＡがＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ）に結合するかどうかさえも不明なままである。また、ＲＩＳＣの分子組成（たとえばＡＧＯ２またはＡＧＯ１／３／４）も不明なままであり、見込まれる作用機構も不明なままである。
【０００８】
さらに別の研究において、ＲＩＳＣの活性が、肝細胞癌で研究され、研究者らは、高いＲＩＳＣの活性が、肝発がんに関連していることを観測した。より具体的には、著者らは、ＡＥＧ−１（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ  ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｇｅｎｅ−１）およびＳＮＤ１（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  ｎｕｃｌｅａｓｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  １、ＲＩＳＣヌクレアーゼ）の両方が過剰発現することにより、ＲＩＳＣの活性の増大がもたらされることを見出した。しかしながら、どのｍｉＲＮＡがＲＩＳＣに結合したか、およびＲＩＳＣの活性の増大が何らかの予測力を有しているかどうかは依然として不明である。
【０００９】
よって、多くのｍｉＲＮＡ解析の方法が当該分野で知られているにもかかわらず、これらの全てまたはほぼ全ては、様々な欠点を有している。結果、オミクスの解析においてｍｉＲＮＡを使用するためのシステムおよび方法の改善が、依然として必要とされている。
【発明の概要】
【００１０】
本発明の主題は、ｍｉＲＮＡを使用してオミクスのデータを解析するシステムおよび方法、特に、他のオミクスのデータに加えてｍｉＲＮＡを使用する確率論的グラフィカルパスウェイモデル（a probabilistic graphical pathway model）を使用するオミクスの解析、を対象とする。本発明の主題の好ましい態様では、オミクスの解析を使用して、ルミナルＡの乳癌におけるＲＩＳＣのパスウェイ活性を推測して全生存率を予測する。
【００１１】
本発明の主題の一態様では、本発明者らは、患者の腫瘍組織におけるＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ；ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ）の活性を定量化する方法であって、患者の腫瘍組織からオミクスのデータを取得するステップであって、前記腫瘍組織が、サブタイプがルミナルＡの乳癌組織である、ステップと、複数のパスウェイ要素を有する確率論的グラフィカルパスウェイモデルを使用してオミクスのデータからＲＩＳＣの活性を定量化するさらなるステップと、を含む方法を企図している。最も典型的には、確率論的グラフィカルパスウェイモデルにおけるパスウェイ要素の各々は、それぞれのファクターグラフ（factor graphs）により表され、ファクターグラフのうちの少なくとも１つはＲＩＳＣをモデル化し、ＡＧＯ１、ＡＧＯ２、ＡＧＯ３、およびＡＧＯ４のうちの少なくとも１つを含む。
【００１２】
全般的に、オミクスのデータは、典型的には、コピー数のデータ、転写レベルのデータ、およびｍｉＲＮＡのデータを含むことが企図されており、さらに全般的に、確率論的グラフィカルパスウェイモデルは、先験的な既知のｍｉＲＮＡおよびそれぞれのｍｉＲＮＡの標的を使用することが企図されている。一部の実施形態では、ＲＩＳＣをモデル化するファクターグラフは、ＡＧＯ２を含む。必要に応じて、企図した方法は、定量化したＲＩＳＣの活性を閾値のレベルと比較するステップと、任意選択で、定量化したＲＩＳＣの活性が閾値のレベルを超える場合に患者の記録を更新するステップまたは臨床的なパラメータを定量化したＲＩＳＣの活性と関連付けるステップと、を含み得る。
【００１３】
よって、異なる視点からみると、本発明者らはまた、患者の腫瘍組織におけるＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ）の活性を検出する方法をも企図している。このような方法では、オミクスのデータは、患者の腫瘍組織から取得され、ＲＩＳＣの活性は、オミクスを確率論的グラフィカルパスウェイモデルに入力することにより、患者において検出され、ここで確率論的グラフィカルパスウェイモデルは、先験的な既知のｍｉＲＮＡおよびそれぞれのｍｉＲＮＡの標的を使用する。次に、ＲＩＳＣの活性が、パスウェイモデルにおいてオミクスのデータから計算される。
【００１４】
最も典型的には、オミクスのデータは、コピー数のデータ、転写レベルのデータ、およびｍｉＲＮＡのデータを含み、確率論的グラフィカルパスウェイモデルは、複数のファクターグラフを使用する。さらに全般的に、複数のファクターグラフのうちの少なくとも１つは、ＡＧＯ１、ＡＧＯ２、ＡＧＯ３、およびＡＧＯ４のうちの少なくとも１つを含むＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ）をモデル化することが好ましい。また、本発明の主題を限定するものではないが、確率論的グラフィカルパスウェイはＰＡＲＡＤＩＧＭであることが好ましい。また企図した方法は、定量化したＲＩＳＣの活性を閾値のレベルと比較するステップと、任意選択で、定量化したＲＩＳＣの活性が閾値のレベルを超える場合に患者の記録を更新するステップまたは臨床的なパラメータを定量化したＲＩＳＣの活性と関連付けるステップと、を含んでもよい。
【００１５】
さらに企図される実施形態では、サブタイプがルミナルＡである乳癌を有する患者の全生存率を予測する方法であって、患者の腫瘍組織からオミクスのデータを取得するステップを含む方法が、企図されている。さらなるステップでは、ＲＩＳＣの活性は、複数のパスウェイ要素を有する確率論的グラフィカルパスウェイモデルを使用してオミクスのデータから定量化され、ここで確率論的グラフィカルパスウェイモデルにおけるパスウェイ要素の各々は、それぞれのファクターグラフにより表され、ファクターグラフのうちの少なくとも１つは、ＡＧＯ２を伴うＲＩＳＣをモデル化する。その後、最終的に患者は、ＲＩＳＣ−ＡＧＯ２の活性の減少が検出された場合に、全生存率が低下していると診断される。
【００１６】
上述のように、このような方法におけるオミクスのデータはコピー数のデータ、転写レベルのデータ、およびｍｉＲＮＡのデータを含むことならびに／または確率論的グラフィカルパスウェイモデル（好ましくはＰＡＲＡＤＩＧＭ）は先験的な既知のｍｉＲＮＡおよびそれぞれのｍｉＲＮＡの標的を使用することが企図されている。
【００１７】
結果として、本発明者らはまた、解析エンジンに情報的に連結されているオミクスのデータベースを含むオミクスの解析のためのコンピュータシステムであって、上記オミクスのデータベースが患者のオミクスのデータを保存する、システムをも企図している。最も好ましくは、解析エンジンは、オミクスのデータベースからオミクスのデータを受信し、オミクスのデータおよび確率論的グラフィカルパスウェイモデルを使用して、ＲＩＳＣの活性を計算するようにプログラムされている。最も典型的には、確率論的グラフィカルパスウェイモデルは、複数のパスウェイ要素を有し、確率論的グラフィカルパスウェイモデルにおけるパスウェイ要素の各々は、それぞれのファクターグラフにより表され、ファクターグラフのうちの少なくとも１つは、ＲＩＳＣをモデル化し、ＡＧＯ１、ＡＧＯ２、ＡＧＯ３、およびＡＧＯ４のうちの少なくとも１つを含んでいる。
【００１８】
大部分の実施形態では、オミクスのデータは、コピー数のデータ、転写レベルのデータ、およびｍｉＲＮＡのデータを含み、ならびに／または確率論的グラフィカルパスウェイモデル（たとえばＰＡＲＡＤＩＧＭ）は、先験的な既知のｍｉＲＮＡおよびそれぞれのｍｉＲＮＡの標的を使用する。また全般的に、ＲＩＳＣをモデル化するファクターグラフは、ＡＧＯ２、またはＡＧＯ１、ＡＧＯ３、およびＡＧＯ４のうちの少なくとも１つを含むことが好ましい。必ずしも必要ではないが、好ましくは、解析エンジンは、定量化したＲＩＳＣの活性を閾値のレベルと比較するようにもプログラムされている。さらに、解析エンジンはまた、定量化したＲＩＳＣの活性が閾値のレベルを超える場合に患者の記録を更新するように、または臨床的なパラメータを定量化したＲＩＳＣの活性と関連付けるように、プログラムされてもよい。
【００１９】
本発明の主題の様々な対象、特性、態様、および利点が、添付の図面と併せて、以下の好ましい実施形態の詳細な説明からより明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１Ａ】図１Ａは、単一のパスウェイ要素に関するファクターグラフの例示的な描写である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、図１Ａの例示的ファクターグラフに従う論理結合（logical connections）を使用したＲＩＳＣ複合体の例示的な描写である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、図１Ｂに図示されるようにＲＩＳＣ複合体によりパスウェイ要素が制御されている、改変された図１Ａのパスウェイ要素に関するファクターグラフの詳細な図面を表す。
【図１Ｄ】図１Ｄは、パスウェイ要素が転写制御因子としてのヌクレオチド鎖切断型（endoculeolytic）ＲＩＳＣ複合体により制御されている、改変された図１Ａのパスウェイ要素に関するファクターグラフの詳細な図面を表す。
【図１Ｅ】図１Ｅは、パスウェイ要素が転写制御因子としての非ヌクレオチド鎖切断型ＲＩＳＣ複合体により制御されている、改変された図１Ａのパスウェイ要素に関するファクターグラフの詳細な図面を表す。
【図２】図２は、様々な乳癌のサブタイプにおける経路に及ぼすｍｉＲＮＡ、ＡＧＯ１／３／４  ＲＩＳＣ、およびＡＧＯ２  ＲＩＳＣの影響を比較した、推測されたパスウェイ活性の例示的なヒートマップである。
【図３Ａ】図３Ａは、乳癌のサブタイプによりグループ分けされた、ＡＧＯ２  ＲＩＳＣに関して推測されたパスウェイ活性の分布を表す例示的なバイオリン図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、乳癌のサブタイプによりグループ分けされた、ＡＧＯ１／３／４  ＲＩＳＣに関して推測されたパスウェイ活性の分布を表す例示的なバイオリン図である。
【図４】図４は、患者における高いＡＧＯ２  ＲＩＳＣおよび低いＡＧＯ２  ＲＩＳＣを比較した、ルミナルＡ型の乳癌に関する生存率の予測のプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明者らは、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡの標的の予測、およびＲＩＳＣのモデルをパスウェイ解析モデル（たとえばＰＡＲＡＤＩＧＭ）に加えることにより、パスウェイのコンテキストにおいてｍｉＲＮＡ誘導性遺伝子サイレンシングを調査できる更新されたモデルを作成できることを発見した。転写制御のみのモデルと転写レベルおよび／または翻訳レベルで遺伝子を制御する更新されたＲＩＳＣのモデルとの間での比較に基づき、本発明者らは、このような更新されたモデルが、転写制御レベルでのｍｉＲＮＡ−標的の関連を極めて良好に学習できることに気付いた。
【００２２】
たとえば、および参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１１／１３９３４５号、同第２０１３／０６２５０５号、および同第２０１４／０５９０３６号において詳細に説明されているような近年開発されたパスウェイ解析のシステムおよび方法に基づき、本発明者らは、ＰＡＲＡＤＩＧＭのパスウェイ解析およびパスウェイモデルの改変をｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで利用して、乳癌の組織サンプル由来のＤＮＡのコピー数のデータ、ＲＮＡ発現のデータ、およびｍｉＲＮＡのデータを用いて乳癌（特にサブタイプがルミナルＡの乳癌）における全生存率を予測できることを企図する。
【００２３】
ＰＡＲＡＤＩＧＭは、パスウェイ活性の予測を作成するために複数のゲノムデータタイプをキュレートされたパスウェイのデータベースと統合することを可能にする、パスウェイベースのアルゴリズムである。本発明の主題では、本発明者らは、ｍｉＲＮＡが媒介する遺伝子のサイレンシングのモデルをＰＡＲＡＤＩＧＭに加え、パスウェイのコンテキストにおいてｍｉＲＮＡ発現を研究した。より具体的には、以下でより詳細に示されるように、本発明者らは、３つの標的予測アルゴリズム（ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ、ＰｉｃＴａｒ、ｍｉＲａｎｄａ）のユニオンから、７７５１個のｍｉＲＮＡ−ｍＲＮＡ相互作用のセットをキュレートした。これらの相互作用には、６６種のｍｉＲＮＡおよび２８１４種のｍＲＮＡ転写物が関与していた。このように更新されたＰＡＲＡＤＩＧＭアルゴリズムを、ＴＣＧＡ乳癌コホートの６９７名の患者からのコピー数、ＲＮＡｓｅｑおよびｍｉＲＮＡｓｅｑのデータに対して実行し、異なるサブタイプ間でのアクティブなｍｉＲＮＡとその標的との間の学習された相互作用の変化を調査した。以下でより詳細に示されるように、更新されたＰＡＲＡＤＩＧＭアルゴリズムは、ヌクレオチド鎖切断の活性を有するＲＩＳＣ（ＤＩＣＥＲ１、ＴＡＲＢＰ２、ＡＧＯ２＋ｍｉＲＮＡ）およびヌクレオチド鎖切断の活性を有しないＲＩＳＣ（ＤＩＣＥＲ１、ＴＡＲＢＰ２、ＡＧＯ１／３／４＋ｍｉＲＮＡ）を含むものであった。
【００２４】
一部の実施形態では、ＢａｓａｌとルミナルＡの乳癌サブタイプ間で最も大きな相関の変化を示したｍｉＲＮＡ−標的のペアは、既知の癌遺伝子、ならびに癌においてｍｉＲＮＡの活性に関連するｍｉＲＮＡと遺伝子に関して豊富であった。さらに、これらの標的は、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ、ＲＡＰ１およびＲＡＳを含む、いくつかの関連するシグナリング経路に関与していた。これらの著しく差次的な関連の大部分には、既知の腫瘍のサプレッサーであるｍｉＲＮＡのｍｉＲ−１６ファミリーが関与していた。２つのｍｉＲＮＡ−ｍＲＮＡ標的ペアが、ＢａｓａｌとルミナルＡのグループ間で、いずれのパスウェイの関連（ｐａｔｈｗａｙ  ｌｉｎｋ）の関連の強度（ｌｉｎｋ  ｓｔｒｅｎｇｔｈ）においても、最も大きな変化を示した。これらのペア中のｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−１９５とｍｉＲ−２２１は、両方とも以前に報告された乳癌のマーカーである。よって、腫瘍のサブタイプ間でｍｉＲＮＡ−標的の関連の変化をみることにより、更新されたＰＡＲＡＤＩＧＭアルゴリズムは、乳癌に関連する経路に関与するｍｉＲＮＡと標的遺伝子の両方を特定することを可能にした。
【００２５】
よく知られているように、ｍｉＲＮＡは、様々な機構を介してｍＲＮＡ転写物を標的とし遺伝子をサイレンシングする、短い（１８〜２５ヌクレオチド）ノンコーディングＲＮＡ分子である。ｍｉＲＮＡ標的化による遺伝子のサイレンシングは、多くの生体プロセスに関与しており、ｍｉＲＮＡ標的配列は、遺伝子の３０％程度であると予測されている。ｍｉＲＮＡの制御不全は、様々なヒトの疾患と関連しており、ｍｉＲＮＡは、上述のように癌において大規模に研究されている。遺伝子を転写後にサイレンシングするために、ｍｉＲＮＡは、いくつかのタンパク質と結合して、サイレンシングをもたらす生体プロセスを行うＲＩＳＣ（ＲＮＡ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｍｐｌｅｘ）を形成する。ＲＩＳＣの形成に関与する分子は、相当程度変動し得るが、ヒトにおいて最小限の構成要素であるタンパク質は、ｍｉＲＮＡ転写物を成熟した形態に処理するＲＮＡａｓｅ  Ｄｉｃｅｒ、Ａｒｇｏｎａｕｔｅファミリーのタンパク質、ＲＩＳＣの触媒的な構成要素、およびＡｒｇｏｎａｕｔｅのタンパク質をＤｉｃｅｒおよび結合したｍｉＲＮＡ分子に動員するＴＲＢＰである。
【００２６】
ＲＩＳＣの全般的な構造は知られているが、各ｍｉＲＮＡが標的とするｍＲＮＡの適切な同定は、依然として大きな課題である。実際、ｍｉＲＮＡ−ｍＲＮＡターゲティングの実験による検証が困難であるため、相対的に見て、検証された標的はほんのわずかである。よって、様々なｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでの方法が、配列、結合エネルギー、および保存などの要因に基づきターゲティングを予測するために開発された。残念なことに、これらの方法で共通する結果は通常、予測される標的の数に比べて少ない。よって本発明者らは、信頼性の高い標的予測のセットを特定するために、これらのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでの方法のうちのいくつかのユニオンを使用した。本願の実施例において、本発明者らは、ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ、ｍｉＲａｎｄａ、およびＰｉｃＴａｒのセットのユニオンを使用した。
【００２７】
いくつかの以前の研究は、ｍｉＲＮＡの標的の予測を、経路のデータ（ＰｌｏＳ  ｏｎｅ７：ｅ４２３９０）、ｍＲＮＡの発現（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：ｂｔｕ４８９）、またはその両方（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３９（Ｗｅｂ  Ｓｅｒｖｅｒ  ｉｓｓｕｅ）：Ｗ４１６−４２３）のいずれかと組み合わせようとしてきた。ＭｉｒＳｙｓｔｅｍ（ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ７：ｅ４２３９０）は、それらのｍＲＮＡ標的を介して、ｍｉＲＮＡを経路の知見と関連させ、次に、どの経路が所与のグループのｍｉＲＮＡにより制御されそうであるかを決定するためのｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ試験（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｔｅｓｔ）を行った。Ｚｈａｎｇのシステム（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：ｂｔｕ４８９）は、条件特異的な様式でｍｉＲＮＡの活性を予測するために、マッチしたｍｉＲＮＡとｍＲＮＡのデータと組み合わせた因果関係を表す学習方法（causal learning methods）を使用する。他方で、ＭｉｒＣｏｎｎＸ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３９（Ｗｅｂ  Ｓｅｒｖｅｒ  ｉｓｓｕｅ）：  Ｗ４１６−４２３）は、条件特異的な制御ネットワークを見出すために、マッチしたｍｉＲＮＡとｍＲＮＡのデータを、標的の予測および転写因子制御のデータと組み合わせる。
【００２８】
対照的に、更新されたＰＡＲＡＤＩＧＭアルゴリズムは、これらの既知の方法を超える利点をいくつか提供した。まず、いくつかのこれらの方法は、条件特異的なモデルを提供するが、更新されたＰＡＲＡＤＩＧＭアルゴリズムは、患者特異的なパスウェイ活性をモデル化することができ、これにより、より柔軟な下流の解析を可能にする。さらに、現在知られている方法は、ｍｉＲＮＡ−標的ペア間のペアでの相関を見ることにより、ペアとなったｍｉＲＮＡとｍＲＮＡのデータを試験するが、更新されたＰＡＲＡＤＩＧＭアルゴリズムは、アクティブなｍｉＲＮＡサイレンシング複合体の予測を使用して、ｍｉＲＮＡ−標的ＲＮＡ相互作用の調査を可能にする。よって、ＡｒｇｏｎａｕｔｅまたはＤＩＣＥＲなどのサイレンシング経路に必須なタンパク質がサンプル中でアクティブではない場合、更新されたＰＡＲＡＤＩＧＭアルゴリズムは、当該サンプルにおいてｍｉＲＮＡの制御が少ないことを予測するであろう。
【００２９】
前述のように（国際公開第２０１１／１３９３４５号、同第２０１３／０６２５０５号、および同第２０１４／０５９０３６号を参照のこと）、ＰＡＲＡＤＩＧＭは、観察されたＤＮＡおよびｍＲＮＡのデータから、個々のタンパク質、タンパク質複合体、およびファミリーの活性の観察されていないレベルを推測するために、キュレートしたパスウェイのデータベースからファクターグラフを構築する。観察されたデータは、ｈｉｇｈ、ｌｏｗ、およびｎｏｒｍａｌに対応する３つのレベルに離散化される。ＰＡＲＡＤＩＧＭ経路における全てのタンパク質で、分子生物学のセントラルドグマのモデルが、図１Ａに示されるようにファクターグラフに含まれている。このセントラルドグマは、細胞における各タンパク質コード遺伝子が同一のセントラルドグマの構造を有することを意味しており、よって、全遺伝子間でパラメータを共有することが可能である。たとえば、単一のパスウェイエンティティ（たとえば受容体、キナーゼ、転写因子など）が、図１Ａに示されるファクターグラフで表されてもよく、ここでエンティティは、測定または推測され得る、ゲノムデータ、ｍＲＮＡのデータ、タンパク質のデータ、および活性のデータなどのその特定の変数により表される。異なる観点からみると、ドグマの各ステップは、グラフで、観察されていない変数（ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、およびアクティブ（活性化されたタンパク質またはタンパク質活性に関する））を有してよいことを認識すべきである。これらの潜在的な変数の各々は、観察されたデータ（利用可能な場合）と、およびパスウェイのデータベースで制御因子としてアノテートされ得る他の遺伝子のアクティブな変数と、結び付けられる。次に、潜在的な変数の状態を、ｌｏｏｐｙ−ｂｅｌｉｅｆ  ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎを使用してこのデータから推測し、期待値最大化（Expectation-maximization）を行うことにより、国際公開第２０１１／１３９３４５号、同第２０１３／０６２５０５号、および同第２０１４／０５９０３６号にすでに記載されている確率論的グラフィカルパスウェイモデルに至る。
【００３０】
典型的なパスウェイモデルは、好ましくはファクターグラフの形態の、モデル化される標的オミクス系のアクティビティのデジタルモデルを表す。よって、各パスウェイモデルは、典型的には、シグナル伝達ネットワークのメンバー（たとえば受容体、キナーゼ、ホスホリラーゼ（ｐｈｏｐｈｏｒｙｌａｓｅ）、転写因子など）などの、複数のパスウェイ要素を含む。少なくとも２つのパスウェイ要素の間は、少なくとも１つの制御性ノード（regulatory node）である。よって、少なくとも２つのパスウェイ要素は、制御性ノードを有するパスを介して互いに連結され、制御性ノードは、１つ以上の制御性パラメータの関数として要素間のパスに沿ってアクティビティを制御する。パスウェイモデルは、任意の実用的な数のパスウェイ要素、制御性ノード、および制御性パラメータを含んでよいことが認識されるべきである。しかしながら、最も典型的には、パスウェイ要素は、ＤＮＡ配列、ＤＮＡ配列から転写されるＲＮＡ配列、ＲＮＡにコードされるタンパク質、および当該タンパク質のタンパク質機能、または他のいずれかのアクティビティ要素を含むであろう。
【００３１】
たとえば、パスウェイ要素がＤＮＡ配列を含む場合、制御性パラメータは、転写因子、転写活性化因子、ＲＮＡポリメラーゼサブユニット、シス調節エレメント、トランス調節エレメント、アセチル化ヒストン、メチル化ヒストン、リプレッサー、または他のアクティビティパラメータを含んでよい。さらに、パスウェイ要素がＲＮＡ配列を含むシナリオでは、制御性パラメータは、開始因子、翻訳因子、ＲＮＡ結合タンパク質、リボソームタンパク質、ｓｉＲＮＡ、ポリＡ結合タンパク質、または他のＲＮＡアクティビティパラメータを含んでよい。さらに、パスウェイ要素がタンパク質を含む場合、制御性パラメータは、リン酸化、アシル化、タンパク質切断、または少なくとも第２のタンパク質との結合を含んでよい。ＰＡＲＡＤＩＧＭの変数間の関係は設定されるが、それらがつなぐノード間の関係をモデル化する要因のパラメータはアルゴリズムによって学習されるということが認識されるべきである。よって、ＰＡＲＡＤＩＧＭを用いて新規のエッジ（ｅｄｇｅ）を学習することが可能ではないが、観察されたデータから学習された制御パラメータを見ることにより、所与のセットのサンプルにおいてエッジがどの程度強いかを測定することができる。
【００３２】
本明細書中企図される修正されたＰＡＲＡＤＩＧＭアルゴリズムでは、タンパク質をコードするＲＮＡが使用する同じドグマを使用するｍｉＲＮＡが含まれる。ｍｉＲＮＡに適用されない唯一のドグマ変数は、「タンパク質」の変数（ノード）であり、パスウェイにおいてｍｉＲＮＡに対する翻訳または活性化の制御因子が存在しないため、「アクティブ」変数は、高確率で、ｍｉＲＮＡに関する「ＲＮＡ」変数と同じ状態を有するであろう。本発明のＲＩＳＣモデルは、ＰＡＲＡＤＩＧＭにおいてビルトイン型複合モデルを使用し、これは「ｎｏｉｓｙ  ＡＮＤ」関数である。言い換えると、複合体の予測されるアクティブな状態は、高確率で複合体の全構成要素の状態の最低限度であり、または低い誤差確率で別の状態である。図１Ｂは、図１Ａに示されるようなファクターグラフでＲＩＳＣがモデル化されており、Ａｒｇｏｎａｕｔｅファミリーにおける異なるタンパク質の推定上の制御機構（ＴＸ，転写制御（transcription control）；ＴＬ，翻訳制御（translation control））を提示する、例示的な図である。Ａｒｇｏｎａｕｔｅ  ２（ＡＧＯ２）は、ｍＲＮＡ分子を切断させることによりそれらをサイレンシングすることを可能にするエンドリボヌクレアーゼ活性によって転写を制御する複合体の一部である。このプロセスは転写後に起こるが、ＡＧＯ２による切断の動態の研究は、観察される転写物のレベルに影響するように、十分に迅速に起こることを示唆している。
【００３３】
Ａｒｇｏｎａｕｔｅファミリーの残り（ＡＧＯ１／３／４）は、代替的サイレンシング機構が、観察されるｍＲＮＡ転写物のレベルに影響する可能性が低いため、翻訳の制御因子として扱われた。これらの機構は、追加的な因子のリクルートを介した直接的な翻訳抑制、および翻訳を阻害することになるｍＲＮＡ分子のポリ（Ａ）尾部の脱アデニル化など、翻訳制御活性を含む。結果として、これらの異なる制御モデルは、図１Ｃに示されるように、予測された標的タンパク質の制御性ノードと相互作用する。図１Ｃに提示されるようにＲＩＳＣによる転写と翻訳の抑制の両方を伴う完全なモデルを使用できるが、ＡＧＯ２によるｍＲＮＡ切断に対応する転写調節コンポーネントのみを加える、より単純なモデルを使用してもよい。
【００３４】
よって、様々なＲＩＳＣの構成要素（たとえばコピー数ＤＮＡ、ｍｉＲＮＡの転写レベルもしくは測定量、および／またはタンパク質の量／活性）の推測または実際の測定により、確率論的グラフィカルパスウェイモデルのためのファクターグラフは、ｍｉＲＮＡの（測定または推測された）作用をも新たに含むように改変されてよいということが理解されるべきである。よって、ｍｉＲＮＡの情報は、ｍｉＲＮＡの生理的または遺伝的な作用を適切に予測および／または定量化するために、ｍｉＲＮＡと疾患または病態との単純な関連付けを超えて使用できるということが認識されるべきである。さらに、そのような作用は、作用機構により区別されてよく、その場合、Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質の種類が考慮される（たとえばｍＲＮＡに対するヌクレオチド鎖切断作用ではＡＧＯ２、翻訳の阻害ではＡＧＯ１／３／４）。
【００３５】
当然、上述のパスウェイモデルの改変はｐａｒａｄｉｇｍの改変に限定される必要はなく、全ての既知のパスウェイモデルを、ｍｉＲＮＡの制御に供される遺伝子の転写および／または翻訳の活性の改変を可能にする様式で、ＲＩＳＣ複合体（特にＴＡＲＢＰ２、ＤＩＣＥＲ、Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質、およびｍｉＲＮＡ）の測定または推測された量をパスウェイモデルに適用することにより改変できるということに留意すべきである。従って、およびより全般的に、企図されるシステムおよび方法は、ｍｉＲＮＡと特定の標的との特定の関連が知られていない場合であっても、ＲＮＡサイレンシングの作用の調査に適切であることが認識されるべきである。実際、ＲＩＳＣの活性を（確率論的）パスウェイモデルに組み入れる企図したシステムおよび方法を使用することにより、ＲＩＳＣ（ＡＧＯ２またはＡＧＯ１／３／４を伴うＲＩＳＣ）の活性の増加または減少に関連する臨床的な関連する特性を、特定することができ、その後、典型的には従来の機械学習アルゴリズムを使用して、予測モデルまたは解析モデルにおいて使用することができる。さらにまた、臨床的な関連する特性の特定は、他の方法では容易に特定されない標的またはｍｉＲＮＡに対するさらなる知見を提供する。
【００３６】
コンピュータを指すいずれの言語も、個別または集合的に作動する、サーバ、インターフェース、システム、データベース、エージェント、ピア、エンジン、コントローラ、または他の種類のコンピュータデバイスを含む、任意の適切なコンピュータデバイスの組み合わせを含むと読解されるべきであることに留意されたい。コンピュータデバイスは、有体の非一時的コンピュータ可読記憶媒体（たとえばハードドライブ、ソリッドステートドライブ、ＲＡＭ、フラッシュ、ＲＯＭなど）に保存されたソフトウェア命令を実行するように構成されたプロセッサを含むことを認識すべきである。ソフトウェア命令は、好ましくは、開示される装置に関して以下で説明されるような役割、責任、または他の機能性を提供するようにコンピュータ装置を構成する。特に好ましい実施形態では、様々なサーバ、システム、データベース、またはインターフェースが、標準的なプロトコルまたはアルゴリズムを使用して、恐らくはＨＴＴＰ、ＨＴＴＰＳ、ＡＥＳ、公開鍵暗号の交換、ウェブサービスのＡＰＩ、既知の金融取引のプロトコル、または他の電子情報交換方法に基づいて、データを交換する。データ交換は、好ましくは、パケット通信ネットワーク、インターネット、ＬＡＮ、ＷＡＮ、ＶＰＮ、または他の種類のパケット通信ネットワークを通して、行われる。
【実施例】
【００３７】
ｍｉＲＮＡの標的の予測。３つのｍｉＲＮＡ標的予測アルゴリズム：ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ（ＵＲＬ：ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ．ｏｒｇ）、ｍｉＲＡＮＤＡ（ＵＲＬ：ｍｉｃｒｏＲＮＡ．ｏｒｇ）、およびＰｉｃＴａｒ（ＵＲＬ：ｐｉｃｔａｒ．ｍｄｃ−ｂｅｒｌｉｎ．ｄｅ）からのｍｉＲＮＡ−ｍＲＮＡ標的予測の交差を使用した。標的のデータベースは、ｍｉｒＣｏｎｎＸ（ＵＲＬ：ｂｅｎｏｓｌａｂ．ｐｉｔｔ．ｅｄｕ／ｍｉｒｃｏｎｎｘ／）から得ている。この手法は、６６種のｍｉＲＮＡおよび２８１４種のｍＲＮＡを含む７７５１のｍｉＲＮＡ−ｍＲＮＡ相互作用をもたらした。
【００３８】
オミクスのデータ：本発明者らは、ＴＣＧＡ乳癌コホート由来の６９７名の患者についての、マッチしたＲＮＡｓｅｑ、ｍｉＲＮＡｓｅｑおよびＤＮＡコピー数のデータを使用した。ＤＮＡコピー数のデータでは、ＧＩＳＴＩＣ  ２．０の予測を使用した。ＲＮＡｓｅｑのデータを正規化するために、リード数がゼロの転写物を、サンプルの５０％超で除外し、ＴＰＭ値を対数処理（ｌｏｇ−ｓｃａｌｅ）し、全サンプルにわたって各転写物の中央値を正規化した。ｍｉＲＮＡの正規化では、フィルタリングされた、リード数がゼロのｍｉＲＮＡは、サンプルの７５％超でフィルタリングされ、次に、生のカウントが対数処理され、各ｍｉＲＮＡは、全サンプルにわたって中央値正規化された。ＰＡＲＡＤＩＧＭモデルの検証のため、本発明者らは、これらの患者に、Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｒｒａｙ（ＲＰＰＡ）、免疫組織化学検査からのホルモン受容体の状態、生存率、およびＰＡＭ５０サブタイプ予測を使用する。
【００３９】
ＰＡＲＡＤＩＧＭの改変：ＰＡＲＤＡＩＧＭ（ＮａｎｔＯｍｉｃｓ，  ９９２０  Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ  Ｂｌｖｄ．  Ｃｕｌｖｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ    ９０２３２）を図１Ｂに示すようにファクターグラフにＲＩＳＣモデルを組み込むことにより改変して、図１Ｃに示されるような更新されたファクターグラフの提示に至った。ＡＧＯ１、ＡＧＯ３、およびＡＧＯ４を、ファクターグラフにおいて「ファミリー（ｆａｍｉｌｙ）」ノードとして処理した（論理的ＯＲ関数と組み合わせた入力）。ＡＧＯ２およびＡＧＯ１／３／４ファミリーは、ＤＩＣＥＲ１およびＴＡＲＢＰ２と組み合わさって、ファクターグラフにおいて「複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）」ノードを形成し（論理的ＡＮＤ演算）、これは、ヌクレオチド鎖切断の活性を有する、および有さない、ＲＩＳＣローディング複合体（RISC loading complexes）を表す。パスウェイにおける全てのｍｉＲＮＡノードは、これらのローディング複合体と組み合わさって、アクティブなサイレンシング複合体を形成し、当該サイレンシング複合体は、インヒビターとしてｍＲＮＡパスウェイの転写調節ノードに結合することにより、ローディングされたｍｉＲＮＡのｍＲＮＡ標的の予測された活性を調節する。
【００４０】
さらなる改変（以下で説明されるデータで使用）では、ＡＧＯ２複合体およびＡＧＯ１／３／４複合体が、転写のみの調節因子（transcriptional only regulator）として結合され、これらの複合体の結合の例示的なモードが、図１Ｄおよび図１Ｅに示される。
【００４１】
生存の予測：どの程度良好に、異なるＰＡＲＡＤＩＧＭモデルにより予測されるＩＰＡ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ）が根底にある腫瘍の生物学を表すかを調べるために、本発明者らは、それらがどの程度良好に患者の生存率を予測できるかを試験した。このタスクは、２つのクラスが生存率の上位４分の１または下位４分の１の患者である、分類の問題として処理された。多くの患者に関して生存データが不完全なため、データセットは、３０名の患者、１５の高生存率および１５の低生存率に限定された。ｍｉＲＮＡ転写制御モデルが最も良好に機能し、このモデル由来のＩＰＡでトレーニングしたＳＶＭ（サポートベクターマシン）は、６０％の正確性のｌｅａｖｅ−ｏｎｅ−ｏｕｔ交差検証を達成した一方で、完全モデルは、不十分な４３％の正確性しか達成せず、ｍｉＲＮＡのデータを用いずにモデルが学習を行った場合では３７％の正確性であった。より単純なモデルの性能は、ＲＮＡｓｅｑのデータ（５９％の正確性）またはまとめたＲＮＡｓｅｑおよびｍｉＲＮＡｓｅのデータ（６２％の正確性）を用いた分類を行うことに匹敵する。
【００４２】
ＩＨＣのデータとＩＰＡの相関：本発明者らのモデルを検証するための別の方法は、他のデータ種と比較することである。本発明者らは、ＩＨＣにより測定されたエストロゲン受容体の状態と比較するためのＥＳＲ１およびＥＲ！ホモ二量体、ならびにＩＨＣで測定されたＨＥＲ２の状態を比較するためのＥＲＢＢ２に関して、各モデル由来のＩＰＡを比較した。ＩＨＣの実験によって、各ホルモン受容体に正または負の判定（ｃａｌｌ）が得られ、よって、２つのサンプルのＩＰＡの順位和検定は、対応するホルモン受容体の正のグループ対負のグループに関して行われた。３つ全てのモデルを、これら検定で良好に行った。完全なｍｉＲＮＡモデル（制御された転写および翻訳）は、これら検定から著しく有意なｐ値を有していた：ＥＳＲ１では２．９ｅ−４８、ＥＲ！ホモ二量体では２．９ｅ−４７、およびＥＲＢＢ２では１．２ｅ−９。転写のみのｍｉＲＮＡモデルは、やや低いｐ値を有する：ＥＳＲ１では１．４ｅ−４９、ＥＲ！ホモ二量体では７．９ｅ−４８、およびＥＲＢＢ２では２．８ｅ−１１。いずれのｍｉＲＮＡのデータも有さない元のＰＡＲＡＤＩＧＭモデルは、ＥＳＲ１（８．５ｅ−５０）およびＥＲＢＢ２（９．１ｅ−１２）では最小のｐ値を有したが、ＥＲ！ホモ二量体では最も高いｐ値を有した（９ｅ−４６）。
【００４３】
上位のｍｉＲＮＡ−標的の関連：上述の検定は、ｍｉＲＮＡ制御モデルのそれぞれを明確に分けるものではなかったが、本発明者らは、転写のみのモデルにより学習された関連に焦点を当てることを選択するが、これは、それが全ての試験で良好に機能するためであり、転写制御の関連がより多くの情報上のパラメータを有する可能性が高いためである。さらなる研究では、乳癌のサブタイプ間で（具体的には、高悪性度のｂａｓａｌの腫瘍を有する９７名の患者をより治療可能なルミナルＡの腫瘍を有する２８８名の患者と比較した場合に）どのようにｍｉＲＮＡ−標的の関連が変化するかについて調査された。
【００４４】
本発明者らは、ｂａｓａｌとルミナルＡのサブグループ間の相関における最大の変化により、ｍｉＲＮＡ−標的の関連を分類した。グループ間で大きな相関変化を有する上位１０個の関連のうち９個が、ｍｉＲ−１６を伴う。これは、ルミナルＡの腫瘍（中央値０）と比較して非常に低い、ｂａｓａｌ腫瘍におけるｍｉＲ−１６のＩＰＡ（中央値−４．０）に起因する可能性が高い（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ  ｐ＜２ｅ−１６）。ｍｉＲ−１６は、リンパ腫、白血病、および乳癌を含む様々な癌で特性が示されている既知の腫瘍のサプレッサーである。相関の変化による上位２００の関連の標的は、以下でより詳細に示されているように、癌に関連するいくつかの経路で著しく豊富である（偽発見率（ＦＤＲ）＜  ．０５）。以下の表１は、ｂａｓａｌとルミナルＡの乳癌のサブグループ間での相関の変化による上位２００のｍｉＲＮＡ−標的の関連の遺伝子標的に関するＫＥＧＧの豊富さを示している。
【表１】
2020512004.tif 000003
【００４５】
相関に加え、本発明者らはまた、Ｇ検定を使用して、関連の「強度（ｓｔｒｅｎｇｔｈ）」と我々が呼称する、変数の統計的依存を測定した。Ｇ検定は、高度に依存性である、但し必ずしもピアソンの相関により得られ得る線形の関係を有するわけではない、関連を明らかにする。ｂａｓａｌおよびルミナルのグループ間のＧ検定のｐ値の順位差を見ると、２つのｍｉＲＮＡ制御の関連が、経路の全ての関連のうち最大の変化を有することが観察された：ｍｉＲ−２２１−ＡＲＦ４は、ルミナルＡのサブグループにおいて強力な関連を示す（ＦＤＲ＝９．９ｅ−７）が、ｂａｓａｌ腫瘍においては比較的弱い関係を示す（ＦＤＲ＝１．５ｅ−３）。この関連における両ノードは、以前に、乳癌に関連付けられている；ｍｉＲ−２２１の過剰発現は、上皮間葉移行の促進を介して、高悪性度のｂａｓａｌ腫瘍に関連付けられており、ＡＲＦ４の発現は、乳癌における細胞遊走および転移に関連付けられている。同様に、ｍｉＲ−１９５−ＢＤＮＦは、ルミナルＡの腫瘍において強力なサイレンシングの関係を有するが（ＦＤＲ＝５．６ｅ−２１）、これは、ｂａｓａｌの患者では弱い（ＦＤＲ＝３．２ｅ−３）。ｍｉＲ−１９５は、乳癌を診断するための見込みのある循環バイオマーカーとして同定されており、ＢＤＮＦは、結腸癌において腫瘍の成長および増殖を促進することが示されている増殖因子である。
【００４６】
ＴＣＧＡのデータに関して上述のように改変された確率論的グラフィカルパスウェイ解析モデルＰＡＲＡＤＩＧＭを使用して、さらに本発明者らは、特定の種類のＲＩＳＣ複合体（ＡＧＯ２タンパク質を伴うヌクレオチド鎖切断性のもの、またはＡＧＯ１、３、もしくは４タンパク質を伴う非ヌクレオチド鎖切断性のもの）が、推測されたパスウェイ活性（さらには、統合されたパスウェイの尤度）の影響を有するかどうかを調査した。図２から容易にわかるように、ｍｉＲＮＡに関する推測されたパスウェイ活性のみが、全患者にわたって有意差を示していない。また、（図３Ａおよび３Ｂと同じ色のコーディングを有する）４つの異なるサブタイプでは、特定のグループ分けは明らかではない。推測されたパスウェイ活性における中程度の一貫した差のみが、ＲＩＳＣがＡＧＯ１、ＡＧＯ３、およびＡＧＯ４のうちのいずれか１つを含む場合に見ることができる。しかしながら、いくらかの活性の減少が、ｂａｓａｌ型と相関するように思われる（図３Ｂも参照のこと）。最も有意な差は、ＲＩＳＣがＡＧＯ２を含む場合およびサブタイプがルミナルＡである場合に観察された。
【００４７】
図３Ａおよび３Ｂは、癌のサブタイプが活性の変化に対して個別にプロットされているバイオリン図において、これらの知見を示している。より具体的には、図３Ａは、乳癌のサブタイプのそれぞれについて、ＡＧＯ２を伴うＲＩＳＣに関する、推測されたパスウェイ活性（ＩＰＬ）を示している。ここで、高いパスウェイ活性は高い正の値を有し、プロットの厚さは、所与のレベルのパスウェイ活性を有する患者の数を表している。容易に明らかであるように、ｂａｓａｌ型およびＨｅｒ２型の癌では、大部分で、ＡＧＯ２を伴うＲＩＳＣに関する推測されたパスウェイ活性が概ねアップレギュレートされているが、ルミナルＡおよびルミナルＢでは、ＡＧＯ２を伴うＲＩＳＣに関する推測されたパスウェイ活性がアップレギュレートされている。他方で、図３Ｂに表されるように、ｂａｓａｌの乳癌では、ＡＧＯ１／３／４を伴うＲＩＳＣに関するパスウェイ活性が概ねダウンレギュレートされているが、ルミナルＡおよびルミナルＢでは、ＡＧＯ１／３／４を伴うＲＩＳＣに関する推測されたパスウェイ活性がアップレギュレートされている。Ｈｅｒ２のサブタイプでは、ＡＧＯ１／３／４を伴うＲＩＳＣに関する推測されたパスウェイ活性がアップレギュレートおよびダウンレギュレートされていた。
【００４８】
これら観察に基づき、次に本発明者らは、ＲＩＳＣ活性におけるこれら差が、生存時間（または、薬物耐性、恐らくは免疫療法を使用した治療の予後等など、任意の他の患者特異的パラメータ）と相関するかどうかを決定することを目指した。その目標に向けて、推測されたＲＩＳＣの活性が、ＴＣＧＡデータベースからの全生存率のデータと関連付けられ、ＳＶＭパッケージを使用した教師付き機械学習を、このデータに対して行い、ここで活性は、５超の推測されたパスウェイ活性を「ｈｉｇｈ」、５未満の推測されたパスウェイ活性を「ｌｏｗ」と設定された（図３Ａも参照のこと）。図４は、この解析に関する例示的な結果を示している。グラフからわかるように、ＡＧＯ２を伴うＲＩＳＣの高い活性は、生存時間の増加と統計的に相関していた。よって、ＲＩＳＣ／ｍｉＲＮＡの影響を使用したパスウェイ解析を用いて、ＲＮＡサイレンシングに関連した様々な臨床上のパラメータを予測できること（ここで上記パラメータは、癌特異的、ステージ特異的、および／またはサブタイプ特異的であってよい）が理解されるべきである。
【００４９】
さらに、企図した方法はまた、制御性の関連の変化および結合した標的の特定も可能にし、従って、特定のｍｉＲＮＡを使用してＲＮＡサイレンシングの新規の標的を特定し得るか既知の標的を裏付け得るさらなる情報を提供する。表２は、ｈｉｇｈ  ｖｓ．ｌｏｗのルミナルＡの患者における最大の推測されたパスウェイ活性（ＩＰＬ）の差を例示的に列挙しており、表３は、ルミナルＡとｂａｓａｌの患者間の制御性の関連の変化を例示的に列挙している。
【表２】
2020512004.tif 000004
【表３】
2020512004.tif 000005
【００５０】
よって、上記を考慮すると、ＲＮＡサイレンシングの機構は、ルミナルＡのサブタイプとＢａｓａｌ型との間で異なっており、よってこれは、選択され得る異なる治療形式を表し得ることが理解される。さらに本発明者らは、低いヌクレオチド鎖切断のＲＩＳＣの活性（特にＡＧＯ２を伴うＲＩＳＣの低い活性）が、高悪性度の腫瘍と強力に関連することを示すことができた。よって、企図したシステムおよび方法は、特に、ルミナルＡ型乳癌の全生存率の予測に有用であり、これを考慮して、高悪性度の治療戦略を推奨するためにツールを提供する。
【００５１】
一部の実施形態では、本発明の特定の実施形態を説明および請求するために使用される、成分、特性、たとえば濃度、反応、条件などの量を表す数は、場合により用語「約」により修飾されることを理解されたい。よって一部の実施形態では、記載された説明および添付の特許請求の範囲に記載される数学的なパラメータは、特定の実施形態により得られると考えられる所望の特性に応じて変動し得る近似値である。一部の実施形態では、数学的なパラメータは、報告された有意な桁の数の観点から、通常の丸め技術を使用することにより、解釈されるべきである。本発明の一部の実施形態の幅広い範囲を記載する数学的な範囲およびパラメータは近似値であるにも関わらず、特定の実施例に記載される数値は、可能な限り正確に記録されている。本発明の一部の実施形態に提示される数値は、各試験の測定値で見いだされる標準偏差から必然的にもたらされる一定の誤差を含み得る。
【００５２】
本明細書中の説明およびそれに続く特許請求の範囲にわたり使用される場合、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」の意味は、文脈が別の意味を明確に表さない限り、複数形を含む。同様に、本明細書中の記載で使用される場合、「ｉｎ」の意味は、文脈が別の意味を明確に表さない限り、「ｉｎ」および「ｏｎ」を含む。文脈が矛盾した記載を表さない限り、本明細書中記載される全ての範囲は、それらのエンドポイントを含むと解釈すべきであり、オープンエンドな範囲は、商業上実用的な値を含むとみなすべきである。同様に、全ての値の列挙は、文脈が矛盾した記載を表さない限り、中間の値を含むと解釈すべきである。
【００５３】
すでに記載されたもの以外のより多くの修正が、本明細書中の発明の概念から逸脱することなく可能であることは、当業者に明らかである。よって、本発明の主題は、添付の特許請求の範囲を除き、限定されるべきではない。さらに、本明細書および特許請求の範囲の両方を解釈する際に、全ての用語は、文脈と一致する可能な限り最も広い方法で解釈されるべきである。特に、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「を含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、非排他的に要素、構成要素、またはステップに言及しており、記載された要素、構成要素、またはステップが、明らかに言及されていない他の要素、構成要素、もしくはステップと共に存在してもよく、またはそれらと利用されてもよく、またはそれらと組み合わせてもよいことを表すと解釈されるべきである。本明細書の特許請求の範囲が、Ａ、Ｂ、Ｃ…、およびＮからなる群から選択される何等かのうちの少なくとも１つを表す場合、テキストは、Ａ＋ＮまたはＢ＋Ｎなどではなく、この群由来の１つの要素のみを必要とすると解釈すべきである。
【図１Ａ】
2020512004.tif 000006
【図１Ｂ】
2020512004.tif 000007
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【国際調査報告】
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