(57)【要約】本発明は、遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドおよびその組成物ならびに遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドを含む組成物を、診断およびその他の目的のために使用する方法を提供する。本発明はまた、本明細書において提供される少なくとも１種のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターも提供する。本発明はまた、本明細書において提供される少なくとも発現ベクターで形質転換された宿主細胞も提供する。
2020518278.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２、６、３２、３４および／または３８の参照配列もしくはその機能的断片に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む遺伝子操作されたリガーゼであって、そのポリペプチド配列中に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２、６、３２、３４または３８に関して番号付けされている、遺伝子操作されたリガーゼ。
【請求項２】
少なくとも１つの置換または置換セットが、５２／５６／４０４、５２／５６／４０４／４１２、１２７／２０７、１２７／２１３、１２７／２１３／２７６／３３９、１４０／１８１／２３４、１６５／１８１／２９９、１６５／１８１／２８１／２９９、２３８／２４１／４０４／４１２／４６２および４６２ならびに／またはそれらの任意の組合せから選択され、前記アミノ酸位置が、配列番号２に関して番号付けされている、請求項１に記載の遺伝子操作されたリガーゼ。
【請求項３】
少なくとも１つの置換または置換セットが、５２／１２７／１４０／１８１／４６２、５２／１２７／１４０／１８１／２３８、５２／１２７／１８１／４６２、５２／１２７／２７６／３７２／４６２、５２／１２７／４０４、５２／１４０／１８１／２３８／２７６／２９３／４０４、５２／１４０／１８１／２７６／２９９／４０４／４６２、５２／１４０／２０７／２９９／３７２／４０４／４６２、５２／１４０／２３８／２７６／２９９／３７２／４０４、５２／１８１、５２／１８１／２３８／２７６、５２／１８１／２３８／２９９／４０４、５２／１８１／２９３、５２／２０７／２３８／２９３／２９９／４０４／４６２、５２／２７６／２９９／４０４、５２／２３８／４０４／４６２、５２／２９３／２９９／４０４／４６２、５２／４０４／４６２、５８／６３／８９、５８／８８／８９／２２６／４４０、５８／８８／１９９／２２５／２２６、５８／８８／２２６／３０６、５８／８８／３０６／４７０、５８／４４０／４７０、５８／４５１、６３／８８／８９、６３／８８／４５１、６３／８９／２２６／４４０／４５１、６３／８９／４５１、６３／１９９／２９７／３７５、８８／２２５／４４０／４５１、８８／３０６／４４０／４５１、８８／４７０、８９、１２７、１２７／１４０／２３８、１２７／１４０／２７６、１２７／１４０／２９９／３７２／４６２、１２７／１８１／２０７、１２７／１８１／２３８／３７２、１２７／１８１／２７６、１２７／１８１／４０４、１２７／２０７／２３８／３７２、１２７／２３８／２９３／４６２、１２７／２３８／２９３／２９９／３７２／４０４、１２７／２３８／２９３／２９９／４０４、１２７／２３８／３７２／４６２、１２７／２９３、１２７／２９３／３７２／４６２、１２７／２９３／４０４／４６２、１２７／４６２、１４０／２３８／３７２／４６２、１４０／２７６／２９３／４０４、１４０／２８５／２９３／４０４、１４０／２９９／３７２／４０４／４６２、１４０／３７２、１４０，１８１／２０７／２３８、１８１／２０７／２３８／２７６／２９３／３７２／４０４、１８１／２０７／２３８／３７２、１８１／２３８／２７６、１８１／２３８／２９９／４０４、１８１，／２３８／４６２、１８１／２７６、１８１／２９３、１８１／４６２、２３８／２９３／２９９／３７２／４６２、２３８／２９３／３７２、２３８／２９９／４０４、２３８／４０４／４６２、２７６／２９３／４６２、２７６／４０４、２９３／３７２、２９９／３７２／４６２、２９９／４０４／４６２、３７２、３７２／４６２、４０４、４５１、および４６２ならびに／またはそれらの任意の組合せから選択されるアミノ酸位置での置換を含み、前記アミノ酸位置が、配列番号６に関して番号付けされている、請求項１に記載の遺伝子操作されたリガーゼ。
【請求項４】
少なくとも１つの置換または置換セットが、１９、１９／１２７／１９９、１９／１２７／３０６、１９／２３８、８９、８９／１２７、８９／１２７／２３８／３０６、１２７、１２７／１３３／２３８／３７５、１２７／１７７／２３８／２９３／３０６、１２７／２３８、１２７／３０６、１２７／３８５、１７６／２４４／２４７／３７３／４３８、１７６／２５０／３７３／４３８／４８０、２３８、  ２３８／３０６／３７２、２４４、２４４／２４７、２４４／２４７／２５０、２４４／２５０／４３８、２４４／４３８、２４７／３７３／４２７／４３８、２９７、３０６、３７２、４０４、および４３８ならびに／またはそれらの任意の組合せから選択されるアミノ酸位置での置換を含み、前記アミノ酸位置が、配列番号３２に関して番号付けされている、請求項１に記載の遺伝子操作されたリガーゼ。
【請求項５】
少なくとも１つの置換または置換セットが、５１、５６、６０、６３、８６、１４９、１７４、１８４、１９９、２０７、２３３、２３７、２３８、２４０、３１４、３２９、３７１、３７３、３８５、４２７、４３８、４３９、４４６、４４８、４５１、４５２、４５３、４５４、４６１、４６６、４７６、および４８５ならびに／またはそれらの任意の組合せから選択されるアミノ酸位置での置換を含み、前記アミノ酸位置が、配列番号３２に関して番号付けされている、請求項１に記載の遺伝子操作されたリガーゼ。
【請求項６】
少なくとも１つの置換または置換セットが、７、１７、５２、５４、５９、７４、８５、１８３、１９９、２４０、２４１、２４２、２８０、３２１、２３５、２３７、３７１、４０４、４０５、４５１、４５２、４５３、４５４、４６２、および４８３ならびに／またはそれらの任意の組合せから選択されるアミノ酸位置での置換を含み、前記アミノ酸位置が、配列番号３２に関して番号付けされている、請求項１に記載の遺伝子操作されたリガーゼ。
【請求項７】
少なくとも１つの置換または置換セットが、７、１１、１３、１４、５４、６２、８９、１４９、１８３、１８４、１８５、１８６、２３１、２３２、２３３、２３８、２３９、２４０、３８５、３８６、４１３、および４５３ならびに／またはそれらの任意の組合せから選択されるアミノ酸位置での置換を含み、前記アミノ酸位置が、配列番号６に関して番号付けされている、請求項１に記載の遺伝子操作されたリガーゼ。
【請求項８】
少なくとも１つの置換または置換セットが、１９／６３／２３３／２３７／３７１／４５２、１９／２３７／４５３、６３／８９／４４８／４５２／４５３、６３／１４９／２４０／３７１／４５２、６３／２３３／２４０／４５２／４５４、８６／８９／１４９／２３３／２３７／２４０、８６／８９／１４９／２３３／２３７／３１４／４５２、８６／８９／２３３／２３７／２４０／４４８、８９／２３３／２３７／２４０／４４８／４５３／４５４、８９／２４０／４５４、１４９／２３３／２３７／４５４、１４９／２３７／２４０、１４９／２３７／２４０／３２９／４０４／４５３、２３３／２３７／３７１／４０４／４５２／４５４および２３３／２３７／４０４ならびに／またはそれらの任意の組合せから選択されるアミノ酸位置での置換を含み、前記アミノ酸位置が、配列番号３４に関して番号付けされている、請求項１に記載の遺伝子操作されたリガーゼ。
【請求項９】
少なくとも１つの置換または置換セットが、１３／８９／１８３／２３１、１３／８９／１８３／２３２／３８６／４５１、１３／１８３／２３２／３２９／４５３／４６６、１３／１８３／２３２／３８６／４５１、１３／２３２／３８５／４５１、８９／１８３／３２９／４５１／４５３、１４９／１８３、１８３、１８３／２０７／３８６、１８３／２０７／３８６／４２７／４５３、１８３／２０７／４３９、１８３／２３１／３７３、１８３／２３１／３８５／４２７、１８３／２３１／４２７／４６６、１８３／３７３／３８６、１８３／３８５、１８３／３８５／４２７、１８３／４１３／４２７、１８３／４２７／４５１、および３８５／４５３／４６６ならびに／またはそれらの任意の組合せから選択されるアミノ酸位置での置換を含み、前記アミノ酸位置が、配列番号３８に関して番号付けされている、請求項１に記載の遺伝子操作されたリガーゼ。
【請求項１０】
少なくとも１つの置換または置換セットが、１３／１９／６３／８８／１２７／１８３／２２５／２３２／２３３／２３７／３２９／３７１／４４０／４５１／４５２／４５３／４６６、１３／１９／６３／８８／１２７／１８３／２２５／２３２／２３３／２３７／３７１／３８６／４４０／４５１／４５２、１９／６３／８８／１２７／１８３／２２５／２３１／２３３／２３７／３７１／４２７／４４０／４５１／４５２／４６６、１９／６３／８８／１２７／１８３／２２５／２３３／２３７／３７１／３７３／３８６／４４０／４５１／４５２、１９／６３／８８／１２７／２２５／２３３／２３７／３７１／３８５／４４０／４５１／４５２／４５３／４６６、１９／６３／８８／１２７／２２５／２３３／２３７／３７１／４４０／４５１／４５２、６３／８８／１２７／１４９／２２５／２４０／３７１／４４０／４５１／４５２、８６／８８／８９／１２７／１４９／２２５／２３３／２３７／２４０／４４０／４５１、８８／８９／１２７／２２５／２３３／２３７／２４０／４４０／４４８／４５１／４５３／４５４、８８／１２７／１４９／２２５／２３３／２３７／４４０／４５１／４５４、８８／１２７／２２５／４４０／４５１、および８８／２２５／４４０／４５１ならびに／またはそれらの任意の組合せから選択されるアミノ酸位置での置換を含み、前記アミノ酸位置が、配列番号６に関して番号付けされている、請求項１に記載の遺伝子操作されたリガーゼ。
【請求項１１】
前記遺伝子操作されたリガーゼが、表４．１、４．２、４．３、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５および／または６．１に示される少なくとも１種の遺伝子操作されたリガーゼバリアントの配列に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超えて同一であるポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の遺伝子操作されたリガーゼ。
【請求項１２】
前記遺伝子操作されたリガーゼが、表４．１、４．２、４．３、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５および／または６．１に提供されるバリアントの遺伝子操作されたリガーゼである、請求項１に記載の遺伝子操作されたリガーゼ。
【請求項１３】
ＤＮＡリガーゼ活性を有する、請求項１から１２のいずれかに記載の遺伝子操作されたリガーゼ。
【請求項１４】
野生型Ｔ４  ＤＮＡリガーゼと比較して少なくとも１つの改善された特性を有する、請求項１から１３のいずれかに記載の遺伝子操作されたリガーゼ。
【請求項１５】
野生型Ｔ４  ＤＮＡリガーゼと比較して少なくとも１つの改善された特性を有し、前記改善された特性が、低ＤＮＡ基質濃度を用いる場合よりも大きな活性を示すことおよびより少ないアダプター二量体の生成から選択される、請求項１４に記載の遺伝子操作されたリガーゼ。
【請求項１６】
野生型Ｔ４  ＤＮＡリガーゼよりも熱安定性である、請求項１から１５のいずれかに記載の遺伝子操作されたリガーゼ。
【請求項１７】
野生型Ｔ４  ＤＮＡリガーゼよりも広いｐＨ安定性の範囲を示す、請求項１から１６のいずれかに記載の遺伝子操作されたリガーゼ。
【請求項１８】
前記ポリペプチドが精製されている、請求項１から１７のいずれかに記載の遺伝子操作されたリガーゼ。
【請求項１９】
請求項１から１８のいずれかに記載の少なくとも１種の遺伝子操作されたリガーゼをコードするポリヌクレオチド配列。
【請求項２０】
配列番号２、６、３２、３４および／または３８の参照配列もしくはその機能的断片に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を含む少なくとも１種の遺伝子操作されたリガーゼをコードするポリヌクレオチド配列であって、前記遺伝子操作されたポリペプチドが、１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換を含む、ポリヌクレオチド配列。
【請求項２１】
配列番号１、５、３１、３３および／または３７の参照配列に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有する配列を含む、請求項１９および／または２０に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項２２】
配列番号１、５、３１、３３および／または３７を含む、請求項２１に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項２３】
制御配列に作動可能に連結されている、請求項１９から２２のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項２４】
コドン最適化されている、請求項１９から２２のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項２５】
請求項１９から２４のいずれかに記載の少なくとも１種のポリヌクレオチド配列を含む、発現ベクター。
【請求項２６】
請求項２５に記載の少なくとも発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項２７】
宿主細胞において遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドを生成する方法であって、少なくとも１種の遺伝子操作されたリガーゼが生成されるように、適した培養条件下で請求項２６に記載の宿主細胞を培養するステップを含む、方法。
【請求項２８】
培養物および／または前記宿主細胞から少なくとも１種の遺伝子操作されたリガーゼを回収するステップをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記少なくとも１種の遺伝子操作されたリガーゼを精製するステップをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
請求項１から１８のいずれかに記載の少なくとも１種の遺伝子操作されたリガーゼを含む組成物。
【請求項３１】
ライゲーション生成物を生成する方法であって、請求項１から１８に記載の少なくとも１種の遺伝子操作されたリガーゼと、少なくとも２種の核酸断片を含む基質と、反応混合物とを提供するステップと、前記核酸断片のライゲーションが生じ、少なくとも１種のライゲーション生成物が生成されるような条件下で、前記少なくとも１種の遺伝子操作されたリガーゼと、前記基質と、前記反応混合物とを組み合わせるステップを含む、方法。
【請求項３２】
ＤＮＡライブラリーを生成する方法であって、請求項１から１８に記載の少なくとも１種の遺伝子操作されたリガーゼと、投入二本鎖ＤＮＡを含む基質と、少なくとも１種のＴテールアダプターオリゴヌクレオチド、アデノシンおよび反応緩衝液を含む反応混合物組成物とを提供するステップと、アデノシンが前記ＤＮＡの両鎖の３’末端に付加されるような条件下で、前記少なくとも１種の遺伝子操作されたリガーゼと、前記基質と、前記反応混合物とを組み合わせるステップと、前記Ｔテールアダプターを前記投入ＤＮＡの前記末端とライゲーションして、ＤＮＡライブラリーを含む生成物を生成するステップとを含む、方法。
【請求項３３】
前記投入二本鎖ＤＮＡが、平滑末端ＤＮＡ断片を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
シーケンシングに適した複数のＤＮＡ断片を生成する方法であって、請求項１から１８に記載の少なくとも１種の遺伝子操作されたリガーゼと、投入二本鎖ＤＮＡを含む基質と、一塩基デオキシアデニン３’オーバーハングおよび５’一リン酸末端を含むオリゴヌクレオチドならびにライゲーション適合末端に５’デオキシチミジンオーバーハングおよび５’リン酸を含むアダプターオリゴヌクレオチドを含む反応混合物とを提供するステップと、前記オリゴヌクレオチド、アダプターオリゴヌクレオチドおよび投入二本鎖ＤＮＡのライゲーションが生じるような条件下で、前記少なくとも１種の遺伝子操作されたリガーゼ、前記基質および前記反応混合物を組み合わせるステップと、シーケンシングに適した複数のＤＮＡ断片を含む生成物を生成するステップとを含む、方法。
【請求項３５】
シーケンシングに適した複数のＤＮＡ断片を生成する方法であって、請求項１から１８に記載の少なくとも１種の遺伝子操作されたリガーゼと、投入二本鎖ＤＮＡを含む基質と、一塩基デオキシアデニン３’オーバーハングおよび５’一リン酸末端を含むオリゴヌクレオチドならびにライゲーション適合末端に５’デオキシチミジンオーバーハングおよび５’リン酸を含むアダプターオリゴヌクレオチドを含む反応混合物とを提供するステップと、前記オリゴヌクレオチド、アダプターオリゴヌクレオチドおよび投入二本鎖ＤＮＡのライゲーションが生じるような条件下で、前記少なくとも１種の遺伝子操作されたリガーゼ、前記基質および前記反応混合物を組み合わせるステップと、シーケンシングに適した複数のＤＮＡ断片を含む生成物を生成するステップとを含み、前記反応混合物中の前記アダプターオリゴヌクレオチドの濃度が、前記基質濃度の２０倍未満モル過剰である、方法。
【請求項３６】
曝露することが、クラウディング剤の存在下で実施される、請求項３１から３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
前記生成物を、前記生成物の熱不活性化後にＥ．ｃｏｌｉに形質転換する、請求項３１から３６のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
前記生成物を使用して、ＤＮＡ分子のライブラリーを作製する、請求項３１から３７のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
ＤＮＡ分子の前記ライブラリーをシーケンシングに付す、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記反応混合物が、ライゲーションを阻害する少なくとも１種の化合物を含む、請求項３１から３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
ライゲーションを阻害する前記少なくとも１種の化合物が、ライゲーションにとって最適以下の緩衝液を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
野生型Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを含む同一方法よりも多くの生成物を生成する、請求項３１から４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
前記反応混合物が、少なくとも１種の酵素を含む、請求項３１から４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
前記酵素が、ポリメラーゼ、ポリヌクレオチドキナーゼ、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼおよびシチジンデアミナーゼから選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記投入二本鎖ＤＮＡ濃度が、１００ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、１ｎＭ未満または１００ｐＭ未満である、請求項３１から４４のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
前記アダプター濃度が、反応物中の挿入物の濃度の１０倍未満、５倍未満、３倍未満または２倍未満過剰である、請求項３１から４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
前記生成物を増幅するステップをさらに含む、請求項３１から４６のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
前記生成物をシーケンシングするステップをさらに含む、請求項３１から４７のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
前記生成物を増幅し、シーケンシングするステップをさらに含む、請求項３１から４８のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
前記生成物からアダプター二量体を除去するためのステップをとらない、請求項３１から４９のいずれかに記載の方法。
【請求項５１】
前記基質が、単離された細胞不含ＤＮＡ、循環腫瘍ＤＮＡ、白血病細胞から単離されたＤＮＡ、リンパ腫細胞から単離されたＤＮＡ、循環腫瘍細胞から単離されたＤＮＡ、ウイルス感染細胞から単離されたＤＮＡ、循環胎児ＤＮＡおよび穿刺吸引液から選択される、請求項３１から４０のいずれかに記載の方法。
【請求項５２】
前記基質が、粗試料で提供された投入二本鎖ＤＮＡを含む、請求項３１から５１のいずれかに記載の方法。
【請求項５３】
前記基質が、前記反応混合物中に含める前に精製される投入二本鎖ＤＮＡを含む、請求項３１から５１のいずれかに記載の方法。
【請求項５４】
マイクロ流体デバイスおよび／または液滴を利用する条件下で実施する、請求項３１から５３のいずれかに記載の方法。
【請求項５５】
前記反応混合物および前記遺伝子操作されたリガーゼの組合せの容量が、５０００ｐＬ未満、１０００ｐＬ未満、１００ｐＬ未満、１０ｐＬ未満または１ｐＬ未満である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記基質が、固定化された二本鎖投入ＤＮＡを含む、請求項３１から５５のいずれかに記載の方法。
【請求項５７】
前記遺伝子操作されたリガーゼを固定化する、請求項３１から５６のいずれかに記載の方法。
【請求項５８】
二本鎖投入ＤＮＡおよび前記遺伝子操作されたリガーゼを含む前記基質を固定化する、請求項３１から５７のいずれかに記載の方法。
【請求項５９】
前記反応混合物中の少なくとも１種の化合物を固定化する、請求項３１から５５のいずれかに記載の方法。
【請求項６０】
前記生成物を使用して、ＤＮＡシーケンシング、ハイスループットスクリーニング、遺伝子選択、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、リボソームディスプレイ、細胞ベースのアッセイ、生化学的アッセイ、イメージングベースのハイコンテントスクリーニングまたはクロマチンコンホメーション捕捉（Ｃ３）のためのライブラリーを作製する、請求項３１から５９のいずれかに記載の方法。
【請求項６１】
前記組み合わせるステップの時間の長さが、３０分未満である、請求項３１から６０のいずれかに記載の方法。
【請求項６２】
前記組み合わせるステップの時間の長さが、１５分未満である、請求項３１から６１のいずれかに記載の方法。
【請求項６３】
前記組み合わせるステップの時間の長さが、１０、９、８、７、６、５、４、３または２分未満である。請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記組み合わせるステップの時間の長さが、５分未満である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記生成物が、前記組み合わせるステップの時間の長さが１５分またはそれより長いライゲーション方法よりも少ないアダプター二量体を含む、請求項３１から６４のいずれかに記載の方法。
【請求項６６】
細胞不含である、請求項３１から６５のいずれかに記載の方法。
【請求項６７】
前記基質が、患者から得た流体から抽出した細胞不含ＤＮＡである、請求項３１から６６のいずれかに記載の方法。
【請求項６８】
前記流体が、血清または血漿を含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記基質が、その３’および５’末端に異なる配列を有する核酸を含む、請求項３１から６８のいずれかに記載の方法。
【請求項７０】
前記ライゲーションにおいて低バイアスを達成する、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記組み合わせるステップを、１０°〜４０℃の間の範囲の温度で実施する、請求項３１から７０のいずれかに記載の方法。
【請求項７２】
前記温度範囲が、１６°〜３７℃である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記組み合わせるステップを、ｐＨ７〜ｐＨ１０の範囲のｐＨで実施する、請求項３１から７２のいずれかに記載の方法。
【請求項７４】
前記組み合わせるステップを、７．５から９の間のｐＨで実施する、請求項７３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１７年５月８日に出願された米国仮特許出願第６２／５０３，０７５号、２０１７年８月３日に出願された米国仮特許出願第６２／５４０，７３４号および２０１７年１１月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／５８７，０３０号に対する優先権の利益を主張し、そのそれぞれは、本明細書に全ての目的のために参照により援用される。
配列表、表またはコンピュータプログラムの参照
【０００２】
ファイル名ＣＸ９−１６０ＷＯ１＿ＳＴ２５．ｔｘｔとしてＥＦＳ−Ｗｅｂを介してコンピュータで読み取り可能な形態（ＣＲＦ）で３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２１の下、本明細書と同時に提出された配列表は、参照により本明細書に組み込まれる。配列表の電子コピーは、１００キロバイトのファイルの大きさで、２０１８年５月７日に作製された。
【０００３】
本発明は、遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドおよびその組成物ならびに遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドを含む組成物を、診断およびその他の目的のために使用する方法を提供する。
【背景技術】
【０００４】
ＤＮＡリガーゼは、隣接する３’−ヒドロキシル末端および５’−リン酸末端の縮合による、核酸分子における新規ホスホジエステル結合の形成を触媒する。酵素は、平滑末端および付着「粘着」末端を結合し、二本鎖ＤＮＡおよび一部のＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド中の一本鎖ニックも修復する。使用される種々のリガーゼがあり、そのうちの１種がバクテリオファージＴ４由来のＤＮＡリガーゼである。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼは、バイオテクノロジーにおいて最も広く使用される酵素のうちの１種である。用途が見出されている種々のＤＮＡリガーゼがあるが、当技術分野では、診断および研究目的のための改善されたリガーゼが依然として必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドおよびその組成物ならびに遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、診断およびその他の目的のために遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドを含む組成物を使用する方法を提供する。
【０００６】
本発明は、配列番号２、６、３２、３４および／または３８の参照配列もしくはその機能的断片に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む遺伝子操作されたリガーゼを提供し、遺伝子操作されたリガーゼは、そのポリペプチド配列中に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２、６、３２、３４または３８に関して番号付けされている。
【０００７】
本発明はまた、少なくとも１つの置換または置換セットを含む遺伝子操作されたリガーゼを提供し、少なくとも１つの置換または置換セットは、５２／５６／４０４、５２／５６／４０４／４１２、１２７／２０７、１２７／２１３、１２７／２１３／２７６／３３９、１４０／１８１／２３４、１６５／１８１／２９９、１６５／１８１／２８１／２９９、２３８／２４１／４０４／４１２／４６２および４６２ならびに／またはそれらの任意の組合せから選択され、アミノ酸位置は、配列番号２に関して番号付けされている。いくつかの実施形態では、置換（複数可）または置換セットは、５２Ｅ／５６Ｒ／４０４Ｋ、５２Ｅ／５６Ｖ／４０４Ｋ／４１２Ｔ、１２７Ｋ／２０７Ｒ、１２７Ｋ／２１３Ｍ、１２７Ｋ／２１３Ｍ／２７６Ｇ／３３９Ｖ、１４０Ａ／１８１Ｔ／２３４Ｍ、１６５Ａ／１８１Ｔ／２９９Ｐ、１６５Ａ／１８１Ｔ／２８１Ａ／２９９Ａ、２３８Ｌ／２４１Ｌ／４０４Ｋ／４１２Ｔ／４６２Ｋおよび４６２Ｋから選択される置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号２に関して番号付けされている。いくつかのさらなる実施形態では、置換または置換セットは、Ｋ５２Ｅ／Ａ５６Ｒ／Ｎ４０４Ｋ、Ｋ５２Ｅ／Ａ５６Ｖ／Ｎ４０４Ｋ／Ｋ４１２Ｔ、Ｐ１２７Ｋ／Ｉ２０７Ｒ、Ｐ１２７Ｋ／Ｌ２１３Ｍ、Ｐ１２７Ｋ／Ｌ２１３Ｍ／Ｃ２７６Ｇ／Ｉ３３９Ｖ、Ｓ１４０Ａ／Ｓ１８１Ｔ／Ｌ２３４Ｍ、Ｃ１６５Ａ／Ｓ１８１Ｔ／Ｋ２９９Ｐ、Ｃ１６５Ａ／Ｓ１８１Ｔ／Ｖ２８１Ａ／Ｋ２９９Ａ、Ｙ２３８Ｌ／Ｎ２４１Ｌ／Ｎ４０４Ｋ／Ｋ４１２Ｔ／Ｉ４６２ＫおよびＩ４６２Ｋから選択される置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号２に関して番号付けされている。
【０００８】
本発明は、５２／１２７／１４０／１８１／４６２、５２／１２７／１４０／１８１／２３８、５２／１２７／１８１／４６２、５２／１２７／２７６／３７２／４６２、５２／１２７／４０４、５２／１４０／１８１／２３８／２７６／２９３／４０４、５２／１４０／１８１／２７６／２９９／４０４／４６２、５２／１４０／２０７／２９９／３７２／４０４／４６２、５２／１４０／２３８／２７６／２９９／３７２／４０４、５２／１８１、５２／１８１／２３８／２７６、５２／１８１／２３８／２９９／４０４、５２／１８１／２９３、５２／２０７／２３８／２９３／２９９／４０４／４６２、５２／２７６／２９９／４０４、５２／２３８／４０４／４６２、５２／２９３／２９９／４０４／４６２、５２／４０４／４６２、５８／６３／８９、５８／８８／８９／２２６／４４０、５８／８８／１９９／２２５／２２６、５８／８８／２２６／３０６、５８／８８／３０６／４７０、５８／４４０／４７０、５８／４５１、６３／８８／８９、６３／８８／４５１、６３／８９／２２６／４４０／４５１、６３／８９／４５１、６３／１９９／２９７／３７５、８８／２２５／４４０／４５１、８８／３０６／４４０／４５１、８８／４７０、８９、１２７、１２７／１４０／２３８、１２７／１４０／２７６、１２７／１４０／２９９／３７２／４６２、１２７／１８１／２０７、１２７／１８１／２３８／３７２、１２７／１８１／２７６、１２７／１８１／４０４、１２７／２０７／２３８／３７２、１２７／２３８／２９３／４６２、１２７／２３８／２９３／２９９／３７２／４０４、１２７／２３８／２９３／２９９／４０４、１２７／２３８／３７２／４６２、１２７／２９３、１２７／２９３／３７２／４６２、１２７／２９３／４０４／４６２、１２７／４６２、１４０／２３８／３７２／４６２、１４０／２７６／２９３／４０４、１４０／２８５／２９３／４０４、１４０／２９９／３７２／４０４／４６２、１４０／３７２、１４０，１８１／２０７／２３８、１８１／２０７／２３８／２７６／２９３／３７２／４０４、１８１／２０７／２３８／３７２、１８１／２３８／２７６、１８１／２３８／２９９／４０４、１８１，／２３８／４６２、１８１／２７６、１８１／２９３、１８１／４６２、２３８／２９３／２９９／３７２／４６２、２３８／２９３／３７２、２３８／２９９／４０４、２３８／４０４／４６２、２７６／２９３／４６２、２７６／４０４、２９３／３７２、２９９／３７２／４６２、２９９／４０４／４６２、３７２、３７２／４６２、４０４、４５１、および４６２ならびに／もしくはそれらの任意の組合せから選択されるアミノ酸位置での置換（複数可）を含む少なくとも１つの置換または置換セットを含む遺伝子操作されたリガーゼをさらに提供し、アミノ酸位置は、配列番号６に関して番号付けされている。いくつかの実施形態では、置換（複数可）または置換セットは、２Ｅ／１２７Ｋ／１４０Ａ／１８１Ｔ／４６２Ｋ、５２Ｅ／１２７Ｋ／１４０Ａ／１８１Ｔ／２３８Ｌ、５２Ｅ／１２７Ｋ／１８１Ｔ／４６２Ｋ、５２Ｅ／１２７Ｋ／２７６Ｇ／３７２Ｉ／４６２Ｋ、５２Ｅ／１２７Ｋ／４０４Ｋ、５２Ｅ／１４０Ａ／１８１Ｔ／２３８Ｌ／２７６Ｇ／２９３Ｅ／４０４Ｋ、５２Ｅ／１４０Ａ／１８１Ｔ／２７６Ｇ／２９９Ｐ／４０４Ｋ／４６２Ｋ、５２Ｅ／１４０Ａ／２０７Ｒ／２９９Ｐ／３７２Ｉ／４０４Ｋ／４６２Ｋ、  ５２Ｅ／１４０Ａ／２３８Ｌ／２７６Ｇ／２９９Ｐ／３７２Ｉ／４０４Ｋ、５２Ｅ／１８１Ｔ、５２Ｅ／１８１Ｔ／２３８Ｌ／２７６Ｇ、５２Ｅ／１８１Ｔ／２３８Ｌ／２９９Ｐ／４０４Ｋ、５２Ｅ／１８１Ｔ／２９３Ｅ、５２Ｅ／２０７Ｒ／２３８Ｌ／２９３Ｅ／２９９Ｐ／４０４Ｋ／４６２Ｋ、５２Ｅ／２７６Ｇ／２９９Ｐ／４０４Ｋ、５２Ｅ／２３８Ｌ／４０４Ｋ／４６２Ｋ、５２Ｅ／２９３Ｅ／２９９Ｐ／４０４Ｋ／４６２Ｋ、５２Ｅ／４０４Ｋ／４６２Ｋ、５８Ｋ／６３Ｒ／８９Ｋ、５８Ｋ／８８Ｒ／８９Ｋ／２２６Ｅ／４４０Ｋ、５８Ｋ／８８Ｒ／１９９Ｅ／２２５Ａ／２２６Ｅ、５８Ｋ／８８Ｒ／２２６Ｅ／３０６Ａ、５８Ｋ／８８Ｒ／３０６Ａ／４７０Ｅ、５８Ｋ／４４０Ｋ／４７０Ｅ、５８Ｋ／４５１Ｋ、６３Ｒ／８８Ｒ／８９Ｋ、６３Ｒ／８８Ｒ／４５１Ｋ、６３Ｒ／８９Ｋ／２２６Ｅ／４４０Ｋ／４５１Ｋ、６３Ｒ／８９Ｋ／４５１Ｋ、６３Ｒ／１９９Ｅ／  ２９７Ｇ／３７５Ｅ、８８Ｒ／２２５Ａ／４４０Ｋ／４５１Ｋ、８８Ｒ／３０６Ａ／４４０Ｋ／４５１Ｋ、８８Ｒ／４７０Ｅ、８９Ｋ、１２７Ｋ、１２７Ｋ／１４０Ａ／２３８Ｌ、１２７Ｋ／１４０Ａ／２７６Ｇ、１２７Ｋ／１４０Ａ／２９９Ｐ／３７２Ｉ／４６２Ｋ、１２７Ｋ／１８１Ｔ／２０７Ｒ、１２７Ｋ／１８１Ｔ／２３８Ｌ／３７２Ｉ、１２７Ｋ／１８１Ｔ／２７６Ｇ、１２７Ｋ／１８１Ｔ／４０４Ｋ、１２７Ｋ／２０７Ｒ／２３８Ｌ／３７２Ｉ、１２７Ｋ／２３８Ｌ／２９３Ｅ／４６２Ｋ、１２７Ｋ／２３８Ｌ／２９３Ｅ／２９９Ｐ／３７２Ｉ／４０４Ｋ、１２７Ｋ／２３８Ｌ／２９３Ｅ／２９９Ｐ／４０４Ｋ、１２７Ｋ／２３８Ｌ／３７２Ｉ／４６２Ｋ、１２７Ｋ／２９３Ｅ、１２７Ｋ／２９３Ｅ／３７２Ｉ／４６２Ｋ、１２７Ｋ／２９３Ｅ／４０４Ｋ／４６２Ｋ、１２７Ｋ／４６２Ｋ、１４０Ａ／２３８Ｌ／３７２Ｉ／４６２Ｋ、１４０Ａ／２７６Ｇ／２９３Ｅ／４０４Ｋ、１４０Ａ／２８５Ａ／２９３Ｅ／４０４Ｋ、１４０Ａ／２９９Ｐ／３７２Ｉ／４０４Ｋ／４６２Ｋ、１４０Ａ／３７２Ｉ、１４０Ｔ、１８１Ｔ／２０７Ｒ／２３８Ｌ、１８１Ｔ／２０７Ｒ／２３８Ｌ／２７６Ｇ／２９３Ｅ／３７２Ｉ／４０４Ｋ、１８１Ｔ／２０７Ｒ／２３８Ｌ／３７２Ｉ、１８１Ｔ／２３８Ｌ／２７６Ｇ、１８１Ｔ／２３８Ｌ／２９９Ｐ／４０４Ｋ、１８１Ｔ／２３８Ｌ／４６２Ｋ、１８１Ｔ／２７６Ｇ、１８１Ｔ／２９３Ｅ、１８１Ｔ／４６２Ｋ、２３８Ｌ／２９３Ｅ／２９９Ｐ／３７２Ｉ／４６２Ｋ、２３８Ｌ／２９３Ｅ／３７２Ｉ、２３８Ｌ／２９９Ｐ／４０４Ｋ、２３８Ｌ／４０４Ｋ／４６２Ｋ、２７６Ｇ／２９３Ｅ／４６２Ｋ、２７６Ｇ／４０４Ｋ、２９３Ｅ／３７２Ｉ、２９９Ｐ／３７２Ｉ／４６２Ｋ、２９９Ｐ／４０４Ｋ／４６２Ｋ、３７２Ｉ、３７２Ｉ／４６２Ｋ、４０４Ｋ、４５１Ｋ、および４６２Ｋから選択される置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号６に関して番号付けされている。いくつかの追加の実施形態では、置換（複数可）または置換セットは、Ｋ５２Ｅ／Ｐ１２７Ｋ／Ｓ１４０Ａ／Ｓ１８１Ｔ／Ｉ４��２Ｋ、Ｋ５２Ｅ／Ｐ１２７Ｋ／Ｓ１４０Ａ／Ｓ１８１Ｔ／Ｙ２３８Ｌ、Ｋ５２Ｅ／Ｐ１２７Ｋ／Ｓ１８１Ｔ／Ｉ４６２Ｋ、Ｋ５２Ｅ／Ｐ１２７Ｋ／Ｃ２７６Ｇ／Ｖ３７２Ｉ／Ｉ４６２Ｋ、Ｋ５２Ｅ／Ｐ１２７Ｋ／Ｎ４０４Ｋ、Ｋ５２Ｅ／Ｓ１４０Ａ／Ｓ１８１Ｔ／Ｙ２３８Ｌ／Ｃ２７６Ｇ／Ｌ２９３Ｅ／Ｎ４０４Ｋ、Ｋ５２Ｅ／Ｓ１４０Ａ／Ｓ１８１Ｔ／Ｃ２７６Ｇ／Ｋ２９９Ｐ／Ｎ４０４Ｋ／Ｉ４６２Ｋ、Ｋ５２Ｅ／Ｓ１４０Ａ／Ｉ２０７Ｒ／Ｋ２９９Ｐ／Ｖ３７２Ｉ／Ｎ４０４Ｋ／Ｉ４６２Ｋ、Ｋ５２Ｅ／Ｓ１４０Ａ／Ｙ２３８Ｌ／Ｃ２７６Ｇ／Ｋ２９９Ｐ／Ｖ３７２Ｉ／Ｎ４０４Ｋ、Ｋ５２Ｅ／Ｓ１８１Ｔ、Ｋ５２Ｅ／Ｓ１８１Ｔ／Ｙ２３８Ｌ／Ｃ２７６Ｇ、Ｋ５２Ｅ／Ｓ１８１Ｔ／Ｙ２３８Ｌ／Ｋ２９９Ｐ／Ｎ４０４Ｋ、Ｋ５２Ｅ／Ｓ１８１Ｔ／Ｌ２９３Ｅ、Ｋ５２Ｅ／Ｉ２０７Ｒ／Ｙ２３８Ｌ／Ｌ２９３Ｅ／Ｋ２９９Ｐ／Ｎ４０４Ｋ／Ｉ４６２Ｋ、Ｋ５２Ｅ／Ｃ２７６Ｇ／Ｋ２９９Ｐ／Ｎ４０４Ｋ、Ｋ５２Ｅ／Ｙ２３８Ｌ／Ｎ４０４Ｋ／Ｉ４６２Ｋ、Ｋ５２Ｅ／Ｌ２９３Ｅ／Ｋ２９９Ｐ／Ｎ４０４Ｋ／Ｉ４６２Ｋ、Ｋ５２Ｅ／Ｎ４０４Ｋ／Ｉ４６２Ｋ、Ｑ５８Ｋ／Ｌ６３Ｒ／Ｅ８９Ｋ、Ｑ５８Ｋ／Ｅ８８Ｒ／Ｅ８９Ｋ／Ｋ２２６Ｅ／Ｅ４４０Ｋ、Ｑ５８Ｋ／Ｅ８８Ｒ／Ｋ１９９Ｅ／Ｋ２２５Ａ／Ｋ２２６Ｅ、Ｑ５８Ｋ／Ｅ８８Ｒ／Ｋ２２６Ｅ／Ｋ３０６Ａ、Ｑ５８Ｋ／Ｅ８８Ｒ／Ｋ３０６Ａ／Ｋ４７０Ｅ、Ｑ５８Ｋ／Ｅ４４０Ｋ／Ｋ４７０Ｅ、Ｑ５８Ｋ／Ｔ４５１Ｋ、Ｌ６３Ｒ／Ｅ８８Ｒ／Ｅ８９Ｋ、Ｌ６３Ｒ／Ｅ８８Ｒ／Ｔ４５１Ｋ、Ｌ６３Ｒ／Ｅ８９Ｋ／Ｋ２２６Ｅ／Ｅ４４０Ｋ／Ｔ４５１Ｋ、Ｌ６３Ｒ／Ｅ８９Ｋ／Ｔ４５１Ｋ、Ｌ６３Ｒ／Ｋ１９９Ｅ／Ｒ２９７Ｇ／Ｋ３７５Ｅ、Ｅ８８Ｒ／Ｋ２２５Ａ／Ｅ４４０Ｋ／Ｔ４５１Ｋ、Ｅ８８Ｒ／Ｋ３０６Ａ／Ｅ４４０Ｋ／Ｔ４５１Ｋ、Ｅ８８Ｒ／Ｋ４７０Ｅ、Ｅ８９Ｋ、Ｐ１２７Ｋ、Ｐ１２７Ｋ／Ｓ１４０Ａ／Ｙ２３８Ｌ、Ｐ１２７Ｋ／Ｓ１４０Ａ／Ｃ２７６Ｇ、Ｐ１２７Ｋ／Ｓ１４０Ａ／Ｋ２９９Ｐ／Ｖ３７２Ｉ／Ｉ４６２Ｋ、Ｐ１２７Ｋ／Ｓ１８１Ｔ／Ｉ２０７Ｒ、Ｐ１２７Ｋ／Ｓ１８１Ｔ／Ｙ２３８Ｌ／Ｖ３７２Ｉ、Ｐ１２７Ｋ／Ｓ１８１Ｔ／Ｃ２７６Ｇ、Ｐ１２７Ｋ／Ｓ１８１Ｔ／Ｎ４０４Ｋ、Ｐ１２７Ｋ／Ｉ２０７Ｒ／Ｙ２３８Ｌ／Ｖ３７２Ｉ、Ｐ１２７Ｋ／Ｙ２３８Ｌ／Ｌ２９３Ｅ／Ｉ４６２Ｋ、Ｐ１２７Ｋ／Ｙ２３８Ｌ／Ｌ２９３Ｅ／Ｋ２９９Ｐ／Ｖ３７２Ｉ／Ｎ４０４Ｋ、Ｐ１２７Ｋ／Ｙ２３８Ｌ／Ｌ２９３Ｅ／Ｋ２９９Ｐ／Ｎ４０４Ｋ、Ｐ１２７Ｋ／Ｙ２３８Ｌ／Ｖ３７２Ｉ／Ｉ４６２Ｋ、Ｐ１２７Ｋ／Ｌ２９３Ｅ、Ｐ１２７Ｋ／Ｌ２９３Ｅ／Ｖ３７２Ｉ／Ｉ４６２Ｋ、Ｐ１２７Ｋ／Ｌ２９３Ｅ／Ｎ４０４Ｋ／Ｉ４６２Ｋ、Ｐ１２７Ｋ／Ｉ４６２Ｋ、Ｓ１４０Ａ／Ｙ２３８Ｌ／Ｖ３７２Ｉ／Ｉ４６２Ｋ、Ｓ１４０Ａ／Ｃ２７６Ｇ／Ｌ２９３Ｅ／Ｎ４０４Ｋ、Ｓ１４０Ａ／Ｖ２８５Ａ／Ｌ２９３Ｅ／Ｎ４０４Ｋ、Ｓ１４０Ａ／Ｋ２９９Ｐ／Ｖ３７２Ｉ／Ｎ４０４Ｋ／Ｉ４６２Ｋ、Ｓ１４０Ａ／Ｖ３７２Ｉ、Ｓ１４０Ｔ、Ｓ１８１Ｔ／Ｉ２０７Ｒ／Ｙ２３８Ｌ、Ｓ１８１Ｔ／Ｉ２０７Ｒ／Ｙ２３８Ｌ／Ｃ２７６Ｇ／Ｌ２９３Ｅ／Ｖ３７２Ｉ／Ｎ４０４Ｋ、Ｓ１８１Ｔ／Ｉ２０７Ｒ／Ｙ２３８Ｌ／Ｖ３７２Ｉ、Ｓ１８１Ｔ／Ｙ２３８Ｌ／Ｃ２７６Ｇ、Ｓ１��１Ｔ／Ｙ２３８Ｌ／Ｋ２９９Ｐ／Ｎ４０４Ｋ、Ｓ１８１Ｔ／Ｙ２３８Ｌ／Ｉ４６２Ｋ、Ｓ１８１Ｔ／Ｃ２７６Ｇ、Ｓ１８１Ｔ／Ｌ２９３Ｅ、Ｓ１８１Ｔ／Ｉ４６２Ｋ、Ｙ２３８Ｌ／Ｌ２９３Ｅ／Ｋ２９９Ｐ／Ｖ３７２Ｉ／Ｉ４６２Ｋ、Ｙ２３８Ｌ／Ｌ２９３Ｅ／Ｖ３７２Ｉ、Ｙ２３８Ｌ／Ｋ２９９Ｐ／Ｎ４０４Ｋ、  Ｙ２３８Ｌ／Ｎ４０４Ｋ／Ｉ４６２Ｋ、Ｃ２７６Ｇ／Ｌ２９３Ｅ／Ｉ４６２Ｋ、Ｃ２７６Ｇ／Ｎ４０４Ｋ、Ｌ２９３Ｅ／Ｖ３７２Ｉ、Ｋ２９９Ｐ／Ｖ３７２Ｉ／Ｉ４６２Ｋ、  Ｋ２９９Ｐ／Ｎ４０４Ｋ／Ｉ４６２Ｋ、Ｖ３７２Ｉ、Ｖ３７２Ｉ／Ｉ４６２Ｋ、Ｎ４０４Ｋ、Ｔ４５１Ｋ、およびＩ４６２Ｋから選択される置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号６に関して番号付けされている。
【０００９】
本発明は、１９、１９／１２７／１９９、１９／１２７／３０６、１９／２３８、８９、８９／１２７、８９／１２７／２３８／３０６、１２７、１２７／１３３／２３８／３７５、１２７／１７７／２３８／２９３／３０６、１２７／２３８、１２７／３０６、１２７／３８５、１７６／２４４／２４７／３７３／４３８、１７６／２５０／３７３／４３８／４８０、２３８、  ２３８／３０６／３７２、２４４、２４４／２４７、２４４／２４７／２５０、２４４／２５０／４３８、２４４／４３８、２４７／３７３／４２７／４３８、２９７、３０６、３７２、４０４、および４３８ならびに／もしくはそれらの任意の組合せから選択されるアミノ酸位置での置換を含む少なくとも１つの置換または置換セットを含む遺伝子操作されたリガーゼをさらに提供し、アミノ酸位置は、配列番号３２に関して番号付けされている。いくつかの実施形態では、置換（複数可）または置換セットは、１９Ｋ、１９Ｋ／１２７Ｋ／１９９Ｓ、１９Ｋ／１２７Ｋ／３０６Ａ、１９Ｋ／２３８Ｌ、８９Ｋ、８９Ｋ／１２７Ｋ、８９Ｋ／１２７Ｋ／２３８Ｌ／３０６Ａ、１２７Ｋ、１２７Ｋ／１３３Ｈ／２３８Ｌ／３７５Ｒ、１２７Ｋ／１７７Ａ／２３８Ｌ／２９３Ｐ／３０６Ａ、１２７Ｋ／２３８Ｌ、１２７Ｋ／３０６Ａ、１２７Ｋ／３８５Ｅ、１７６Ｇ／２４４Ｓ／２４７Ｋ／３７３Ａ／４３８Ｄ、１７６Ｇ／２５０Ｓ／３７３Ａ／４３８Ｄ／４８０Ｓ、２３８Ｌ、２３８Ｌ／３０６Ａ／３７２Ｉ、２４４Ｓ、２４４Ｓ／２４７Ｋ、２４４Ｓ／２４７Ｋ／２５０Ｓ、２４４Ｓ／２５０Ｓ／４３８Ｄ、２４４Ｓ／４３８Ｄ、２４７Ｋ／３７３Ａ／４２７Ｋ／４３８Ｄ、２９７Ｓ、３０６Ａ、３７２Ｉ、４０４Ｋ、および  ４３８Ｄから選択される置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号３２に関して番号付けされている。いくつかの追加の実施形態では、置換（複数可）または置換セットは、Ｑ１９Ｋ、Ｑ１９Ｋ／Ｐ１２７Ｋ／Ｋ１９９Ｓ、Ｑ１９Ｋ／Ｐ１２７Ｋ／Ｋ３０６Ａ、Ｑ１９Ｋ／Ｙ２３８Ｌ、Ｅ８９Ｋ、Ｅ８９Ｋ／Ｐ１２７Ｋ、Ｅ８９Ｋ／Ｐ１２７Ｋ／Ｙ２３８Ｌ／Ｋ３０６Ａ、Ｐ１２７Ｋ、Ｐ１２７Ｋ／Ｑ１３３Ｈ／Ｙ２３８Ｌ／Ｋ３７５Ｒ、Ｐ１２７Ｋ／Ｖ１７７Ａ／Ｙ２３８Ｌ／Ｌ２９３Ｐ／Ｋ３０６Ａ、Ｐ１２７Ｋ／Ｙ２３８Ｌ、Ｐ１２７Ｋ／Ｋ３０６Ａ、Ｐ１２７Ｋ／Ｄ３８５Ｅ、Ｄ１７６Ｇ／Ａ２４４Ｓ／Ｆ２４７Ｋ／Ｄ３７３Ａ／Ｅ４３８Ｄ、Ｄ１７６Ｇ／Ｖ２５０Ｓ／Ｄ３７３Ａ／Ｅ４３８Ｄ／Ｄ４８０Ｓ、Ｙ２３８Ｌ、Ｙ２３８Ｌ／Ｋ３０６Ａ／Ｖ３７２Ｉ、Ａ２４４Ｓ、Ａ２４４Ｓ／Ｆ２４７Ｋ、Ａ２４４Ｓ／Ｆ２４７Ｋ／Ｖ２５０Ｓ、Ａ２４４Ｓ／Ｖ２５０Ｓ／Ｅ４３８Ｄ、Ａ２４４Ｓ／Ｅ４３８Ｄ、Ｆ２４７Ｋ／Ｄ３７３Ａ／Ｅ４２７Ｋ／Ｅ４３８Ｄ、Ｒ２９７Ｓ、Ｋ３０６Ａ、Ｖ３７２Ｉ、Ｎ４０４Ｋ、およびＥ４３８Ｄから選択される置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号３２に関して番号付けされている。
【００１０】
本発明は、５１、５６、６０、６３、８６、１４９、１７４、１８４、１９９、２０７、２３３、２３７、２３８、２４０、３１４、３２９、３７１、３７３、３８５、４２７、４３８、４３９、４４６、４４８、４５１、４５２、４５３、４５４、４６１、４６６、４７６、および４８５ならびに／もしくはそれらの任意の組合せから選択されるアミノ酸位置での置換（複数可）を含む少なくとも１つの置換または置換セットを含む遺伝子操作されたリガーゼをさらに提供し、アミノ酸位置は、配列番号３２に関して番号付けされている。いくつかの実施形態では、置換（複数可）または置換セットは、５１Ｒ、５６Ｓ、６０Ｇ／Ｖ、６３Ｔ、８６Ｒ、１４９Ｒ、１７４Ｐ、１８４Ａ、１９９Ｔ、２０７Ｑ／Ｖ、２３３Ａ／Ｔ、２３７Ｎ／Ｒ、２３８Ｌ、２４０Ｐ、３１４Ｖ、３２９Ｇ／Ｌ、３７１Ｖ／Ｗ、３７３Ａ／Ｇ、３８５Ａ／Ｗ、４２７Ｌ／Ｒ、４３８Ｄ／Ｆ／Ｇ、４３９Ｓ、４４６Ｒ、４４８Ａ／Ｇ／Ｐ、４５１Ｇ、４５２Ｐ／Ｖ、４５３Ｇ／Ｌ／Ｒ／Ｔ、４５４Ｌ、４６１Ｃ、４６６Ｇ／Ｐ、４７６Ａ、および４８５Ｇ／Ｙから選択される置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号３２に関して番号付けされている。いくつかの追加の実施形態では、置換（複数可）または置換セットは、Ｐ５１Ｒ、Ａ５６Ｓ、Ｆ６０Ｇ／Ｖ、Ｌ６３Ｔ、Ａ８６Ｒ、Ｎ１４９Ｒ、Ｌ１７４Ｐ、Ｇ１８４Ａ、Ｋ１９９Ｔ、Ｉ２０７Ｑ／Ｖ、Ｆ２３３Ａ／Ｔ、Ａ２３７Ｎ／Ｒ、Ｙ２３８Ｌ、Ｅ２４０Ｐ、Ｙ３１４Ｖ、Ｄ３２９Ｇ／Ｌ、Ｄ３７１Ｖ／Ｗ、Ｄ３７３Ａ／Ｇ、Ｄ３８５Ａ／Ｗ、Ｅ４２７Ｌ／Ｒ、Ｅ４３８Ｄ／Ｆ／Ｇ、Ｃ４３９Ｓ、Ｋ４４６Ｒ、Ｄ４４８Ａ／Ｇ／Ｐ、Ｋ４５１Ｇ、Ｄ４５２Ｐ／Ｖ、Ｙ４５３Ｇ／Ｌ／Ｒ／Ｔ、Ｖ４５４Ｌ、Ａ４６１Ｃ、Ｅ４６６Ｇ／Ｐ、Ｄ４７６Ａ、およびＴ４８５Ｇ／Ｙから選択される置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号３２に関して番号付けされている。
【００１１】
本発明は、７、１７、５２、５４、５９、７４、８５、１８３、１９９、２４０、２４１、２４２、２８０、３２１、２３５、２３７、３７１、４０４、４０５、４５１、４５２、４５３、４５４、４６２、および４８３ならびに／もしくはそれらの任意の組合せから選択されるアミノ酸位置での置換（複数可）を含む少なくとも１つの置換または置換セットを含む遺伝子操作されたリガーゼをさらに提供し、アミノ酸位置は、配列番号３２に関して番号付けされている。いくつかの実施形態では、置換（複数可）または置換セットは、７Ｌ、１７Ｒ、５２Ｇ、５４Ｅ、  ５９Ｍ、７４Ｇ／Ｔ、８５Ｔ、１８３Ｎ、１９９Ｇ、２４０Ｐ、２４１Ｇ、２４２Ｈ、２８０Ｌ、３２１Ａ／Ｒ、２３５Ｒ、２３７Ｇ、３７１Ｇ、４０４Ｓ／Ｇ、４０５Ｇ、４５１Ｇ、４５２Ｐ、４５３Ｌ、４５４Ａ、４６２Ｑ、および４８３Ｇ／Ｑから選択される置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号３２に関して番号付けされている。いくつかの追加の実施形態では、置換（複数可）または置換セットは、Ｎ７Ｌ、Ｑ１７Ｒ、Ｋ５２Ｇ、Ｇ５４Ｅ、Ｓ５９Ｍ、Ｆ７４Ｇ／Ｔ、Ａ８５Ｔ、Ａ１８３Ｎ、Ｋ１９９Ｇ、Ｅ２４０Ｐ、Ｎ２４１Ｇ、Ｓ２４２Ｈ、Ｑ２８０Ｌ、Ｅ３２１Ａ／Ｒ、Ｆ２３５Ｒ、Ａ２３７Ｇ、Ｄ３７１Ｇ、Ｎ４０４Ｓ、Ａ４０５Ｇ、Ｋ４５１Ｇ、Ｄ４５２Ｐ、Ｙ４５３Ｌ、Ｖ４５４Ａ、Ｉ４６２Ｑ、およびＥ４８３Ｇ／Ｑから選択される置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号３２に関して番号付けされている。
【００１２】
本発明は、７、１１、１３、１４、５４、６２、８９、１４９、１８３、１８４、１８５、１８６、２３１、２３２、２３３、２３８、２３９、２４０、３８５、３８６、４１３、および４５３ならびに／もしくはそれらの任意の組合せから選択されるアミノ酸位置での置換（複数可）を含む少なくとも１つの置換または置換セットを含む遺伝子操作されたリガーゼをさらに提供し、アミノ酸位置は、配列番号６に関して番号付けされている。いくつかの実施形態では、置換（複数可）または置換セットは、７Ｋ、１１Ｋ、１３Ｋ、１４Ｋ、５４Ｋ、６２Ｋ、８９Ｋ、１４９Ｋ、１８３Ｋ、１８４Ｋ、１８５Ｋ、１８６Ｋ、２３１Ｋ、２３２Ｋ、２３３Ｋ、２３８Ｋ、２３９Ｋ、２４０Ｋ、３８５Ｋ、３８６Ｋ、４１３Ｋ、および４５３Ｋから選択される置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号６に関して番号付けされている。いくつかの追加の実施形態では、置換（複数可）または置換セットは、Ｎ７Ｋ、Ｓ１１Ｋ、Ｇ１３Ｋ、Ｓ１４Ｋ、Ｇ５４Ｋ、Ｍ６２Ｋ、Ｅ８９Ｋ、Ｎ１４９Ｋ、Ａ１８３Ｋ、Ｇ１８４Ｋ、Ｎ１８５Ｋ、Ｅ１８６Ｋ、Ｌ２３１Ｋ、Ｄ２３２Ｋ、Ｆ２３３Ｋ、Ｙ２３８Ｋ、Ｐ２３９Ｋ、Ｅ２４０Ｋ、Ｄ３８５Ｋ、Ｐ３８６Ｋ、Ａ４１３Ｋ  およびＹ４５３Ｋから選択される置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号６に関して番号付けされている。
【００１３】
本発明は、１９／６３／２３３／２３７／３７１／４５２、１９／２３７／４５３、６３／８９／４４８／４５２／４５３、６３／１４９／２４０／３７１／４５２、６３／２３３／２４０／４５２／４５４、８６／８９／１４９／２３３／２３７／２４０、８６／８９／１４９／２３３／２３７／３１４／４５２、８６／８９／２３３／２３７／２４０／４４８、８９／２３３／２３７／２４０／４４８／４５３／４５４、８９／２４０／４５４、１４９／２３３／２３７／４５４、１４９／２３７／２４０、１４９／２３７／２４０／３２９／４０４／４５３、２３３／２３７／３７１／４０４／４５２／４５４、および２３３／２３７／４０４ならびに／もしくはそれらの任意の組合せから選択されるアミノ酸位置での置換（複数可）を含む少なくとも１つの置換または置換セットを含む遺伝子操作されたリガーゼをさらに提供し、アミノ酸位置は、配列番号３４に関して番号付けされている。いくつかの実施形態では、置換（複数可）または置換セットは、１９Ｋ／６３Ｔ／２３３Ａ／２３７Ｒ／３７１Ｗ／４５２Ｐ、１９Ｋ／２３７Ｎ／４５３Ｇ、６３Ｔ／８９Ｋ／４４８Ａ／４５２Ｐ／４５３Ｇ、６３Ｔ／１４９Ｒ／２４０Ｐ／３７１Ｗ／４５２Ｐ、６３Ｔ／２３３Ａ／２４０Ｐ／４５２Ｐ／４５４Ｌ、８６Ｒ／８９Ｋ／１４９Ｒ／２３３Ａ／２３７Ｎ／２４０Ｐ、８６Ｒ／８９Ｋ／１４９Ｒ／２３３Ａ／２３７Ｒ／３１４Ｖ／４５２Ｐ、８６Ｒ／８９Ｋ／２３３Ａ／２３７Ｎ／２４０Ｐ／４４８Ａ、８９Ｋ／２３３Ａ／２３７Ｒ／２４０Ｐ／４４８Ａ／４５３Ｇ／４５４Ｌ、８９Ｋ／２４０Ｐ／４５４Ｌ、１４９Ｒ／２３３Ａ／２３７Ｎ／４５４Ｌ、１４９Ｒ／２３７Ｎ／２４０Ｐ、  １４９Ｒ／２３７Ｎ／２４０Ｐ／３２９Ｇ／４０４Ｋ／４５３Ｇ、２３３Ａ／２３７Ｎ／３７１Ｗ／４０４Ｋ／４５２Ｐ／４５４Ｌ、および２３３Ａ／２３７Ｒ／４０４Ｋから選択される置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号３４に関して番号付けされている。いくつかの追加の実施形態では、置換（複数可）または置換セットは、Ｑ１９Ｋ／Ｌ６３Ｔ／Ｆ２３３Ａ／Ａ２３７Ｒ／Ｄ３７１Ｗ／Ｄ４５２Ｐ、Ｑ１９Ｋ／Ａ２３７Ｎ／Ｙ４５３Ｇ、Ｌ６３Ｔ／Ｅ８９Ｋ／Ｄ４４８Ａ／Ｄ４５２Ｐ／Ｙ４５３Ｇ、Ｌ６３Ｔ／Ｎ１４９Ｒ／Ｅ２４０Ｐ／Ｄ３７１Ｗ／Ｄ４５２Ｐ、Ｌ６３Ｔ／Ｆ２３３Ａ／Ｅ２４０Ｐ／Ｄ４５２Ｐ／Ｖ４５４Ｌ、Ａ８６Ｒ／Ｅ８９Ｋ／Ｎ１４９Ｒ／Ｆ２３３Ａ／Ａ２３７Ｎ／Ｅ２４０Ｐ、Ａ８６Ｒ／Ｅ８９Ｋ／Ｎ１４９Ｒ／Ｆ２３３Ａ／Ａ２３７Ｒ／Ｙ３１４Ｖ／Ｄ４５２Ｐ、Ａ８６Ｒ／Ｅ８９Ｋ／Ｆ２３３Ａ／Ａ２３７Ｎ／Ｅ２４０Ｐ／Ｄ４４８Ａ、Ｅ８９Ｋ／Ｆ２３３Ａ／Ａ２３７Ｒ／Ｅ２４０Ｐ／Ｄ４４８Ａ／Ｙ４５３Ｇ／Ｖ４５４Ｌ、Ｅ８９Ｋ／Ｅ２４０Ｐ／Ｖ４５４Ｌ、Ｎ１４９Ｒ／Ｆ２３３Ａ／Ａ２３７Ｎ／Ｖ４５４Ｌ、Ｎ１４９Ｒ／Ａ２３７Ｎ／Ｅ２４０Ｐ、Ｎ１４９Ｒ／Ａ２３７Ｎ／Ｅ２４０Ｐ／Ｄ３２９Ｇ／Ｎ４０４Ｋ／Ｙ４５３Ｇ、Ｆ２３３Ａ／Ａ２３７Ｎ／Ｄ３７１Ｗ／Ｎ４０４Ｋ／Ｄ４５２Ｐ／Ｖ４５４Ｌ、およびＦ２３３Ａ／Ａ２３７Ｒ／Ｎ４０４Ｋから選択される置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号３４に関して番号付けされている。
【００１４】
本発明は、１３／８９／１８３／２３１、１３／８９／１８３／２３２／３８６／４５１、１３／１８３／２３２／３２９／４５３／４６６、１３／１８３／２３２／３８６／４５１、１３／２３２／３８５／４５１、８９／１８３／３２９／４５１／４５３、１４９／１８３、１８３、１８３／２０７／３８６、１８３／２０７／３８６／４２７／４５３、１８３／２０７／４３９、１８３／２３１／３７３、１８３／２３１／３８５／４２７、１８３／２３１／４２７／４６６、１８３／３７３／３８６、１８３／３８５、１８３／３８５／４２７、１８３／４１３／４２７、１８３／４２７／４５１、および３８５／４５３／４６６ならびに／もしくはそれらの任意の組合せから選択されるアミノ酸位置での置換（複数可）を含む少なくとも１つの置換または置換セットを含む遺伝子操作されたリガーゼをさらに提供し、アミノ酸位置は、配列番号３８に関して番号付けされている。いくつかの実施形態では、置換（複数可）または置換セットは、１３Ｋ／８９Ｋ／１８３Ｋ／２３１Ｋ、  １３Ｋ／８９Ｋ／１８３Ｋ／２３２Ｋ／３８６Ｋ／４５１Ｇ、１３Ｋ／１８３Ｋ／２３２Ｋ／３２９Ｌ／４５３Ｇ／４６６Ｇ、１３Ｋ／１８３Ｋ／２３２Ｋ／３８６Ｋ／４５１Ｇ、１３Ｋ／２３２Ｋ／３８５Ｋ／４５１Ｇ、８９Ｋ／１８３Ｋ／３２９Ｇ／４５１Ｇ／４５３Ｒ、１４９Ｒ／１８３Ｋ、１８３Ｋ、１８３Ｋ／２０７Ｖ／３８６Ｋ、１８３Ｋ／２０７Ｖ／３８６Ｋ／４２７Ｒ／４５３Ｇ、１８３Ｋ／２０７Ｖ／４３９Ｓ、１８３Ｋ／２３１Ｋ／３７３Ｇ、１８３Ｋ／２３１Ｋ／３８５Ｋ／４２７Ｒ、１８３Ｋ／２３１Ｋ／４２７Ｒ／４６６Ｇ、１８３Ｋ／３７３Ａ／３８６Ｋ、１８３Ｋ／３８５Ｋ、１８３Ｋ／３８５Ｋ／４２７Ｒ、１８３Ｋ／４１３Ｋ／４２７Ｒ、１８３Ｋ／４２７Ｒ／４５１Ｇ、および３８５Ｋ／４５３Ｒ／４６６Ｇから選択される置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号３８に関して番号付けされている。いくつかの追加の実施形態では、置換（複数可）または置換セットは、Ｇ１３Ｋ／Ｅ８９Ｋ／Ａ１８３Ｋ／Ｌ２３１Ｋ、Ｇ１３Ｋ／Ｅ８９Ｋ／Ａ１８３Ｋ／Ｄ２３２Ｋ／Ｐ３８６Ｋ／Ｋ４５１Ｇ、Ｇ１３Ｋ／Ａ１８３Ｋ／Ｄ２３２Ｋ／Ｄ３２９Ｌ／Ｙ４５３Ｇ／Ｅ４６６Ｇ，Ｇ１３Ｋ／Ａ１８３Ｋ／Ｄ２３２Ｋ／Ｐ３８６Ｋ／Ｋ４５１Ｇ、Ｇ１３Ｋ／Ｄ２３２Ｋ／Ｄ３８５Ｋ／Ｋ４５１Ｇ、Ｅ８９Ｋ／Ａ１８３Ｋ／Ｄ３２９Ｇ／Ｋ４５１Ｇ／Ｙ４５３Ｒ、Ｎ１４９Ｒ／Ａ１８３Ｋ、Ａ１８３Ｋ、Ａ１８３Ｋ／Ｉ２０７Ｖ／Ｐ３８６Ｋ、Ａ１８３Ｋ／Ｉ２０７Ｖ／Ｐ３８６Ｋ／Ｅ４２７Ｒ／Ｙ４５３Ｇ、Ａ１８３Ｋ／Ｉ２０７Ｖ／Ｃ４３９Ｓ、Ａ１８３Ｋ／Ｌ２３１Ｋ／Ｄ３７３Ｇ、Ａ１８３Ｋ／Ｌ２３１Ｋ／Ｄ３８５Ｋ／Ｅ４２７Ｒ、Ａ１８３Ｋ／Ｌ２３１Ｋ／Ｅ４２７Ｒ／Ｅ４６６Ｇ、Ａ１８３Ｋ／Ｄ３７３Ａ／Ｐ３８６Ｋ、Ａ１８３Ｋ／Ｄ３８５Ｋ、Ａ１８３Ｋ／Ｄ３８５Ｋ／Ｅ４２７Ｒ、Ａ１８３Ｋ／Ａ４１３Ｋ／Ｅ４２７Ｒ、Ａ１８３Ｋ／Ｅ４２７Ｒ／Ｋ４５１Ｇ、およびＤ３８５Ｋ／Ｙ４５３Ｒ／Ｅ４６６Ｇから選択される置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号３８に関して番号付けされている。
【００１５】
本発明は、１３／１９／６３／８８／１２７／１８３／２２５／２３２／２３３／２３７／３２９／３７１／４４０／４５１／４５２／４５３／４６６、１３／１９／６３／８８／１２７／１８３／２２５／２３２／２３３／２３７／３７１／３８６／４４０／４５１／４５２、１９／６３／８８／１２７／１８３／２２５／２３１／２３３／２３７／３７１／４２７／４４０／４５１／４５２／４６６、１９／６３／８８／１２７／１８３／２２５／２３３／２３７／３７１／３７３／３８６／４４０／４５１／４５２、１９／６３／８８／１２７／２２５／２３３／２３７／３７１／３８５／４４０／４５１／４５２／４５３／４６６、１９／６３／８８／１２７／２２５／２３３／２３７／３７１／４４０／４５１／４５２、６３／８８／１２７／１４９／２２５／２４０／３７１／４４０／４５１／４５２、８６／８８／８９／１２７／１４９／２２５／２３３／２３７／２４０／４４０／４５１、８８／８９／１２７／２２５／２３３／２３７／２４０／４４０／４４８／４５１／４５３／４５４、８８／１２７／１４９／２２５／２３３／２３７／４４０／４５１／４５４、８８／１２７／２２５／４４０／４５１、および８８／２２５／４４０／４５１ならびに／もしくはそれらの任意の組合せから選択されるアミノ酸位置での置換（複数可）を含む少なくとも１つの置換または置換セットを含む遺伝子操作されたリガーゼをさらに提供し、アミノ酸位置は、配列番号６に関して番号付けされている。いくつかの実施形態では、置換（複数可）または置換セットは、１３Ｋ／１９Ｋ／６３Ｔ／８８Ｒ／１２７Ｋ／１８３Ｋ／２２５Ａ／２３２Ｋ／２３３Ａ／２３７Ｒ／３２９Ｌ／３７１Ｗ／４４０Ｋ／４５１Ｋ／４５２Ｐ／４５３Ｇ／４６６Ｇ、１３Ｋ／１９Ｋ／６３Ｔ／８８Ｒ／１２７Ｋ／１８３Ｋ／２２５Ａ／２３２Ｋ／２３３Ａ／２３７Ｒ／３７１Ｗ／３８６Ｋ／４４０Ｋ／４５１Ｇ／４５２Ｐ、１９Ｋ／６３Ｔ／８８Ｒ／１２７Ｋ／１８３Ｋ／２２５Ａ／２３１Ｋ／２３３Ａ／２３７Ｒ／３７１Ｗ／４２７Ｒ／４４０Ｋ／４５１Ｋ／４５２Ｐ／４６６Ｇ、１９Ｋ／６３Ｔ／８８Ｒ／１２７Ｋ／１８３Ｋ／２２５Ａ／２３３Ａ／２３７Ｒ／３７１Ｗ／３７３Ａ／３８６Ｋ／４４０Ｋ／４５１Ｋ／４５２Ｐ、１９Ｋ／６３Ｔ／８８Ｒ／１２７Ｋ／２２５Ａ／２３３Ａ／２３７Ｒ／３７１Ｗ／３８５Ｋ／４４０Ｋ／４５１Ｋ／４５２Ｐ／４５３Ｒ／４６６Ｇ、１９Ｋ／６３Ｔ／８８Ｒ／１２７Ｋ／２２５Ａ／２３３Ａ／２３７Ｒ／３７１Ｗ／４４０Ｋ／４５１Ｋ／４５２Ｐ、６３Ｔ／８８Ｒ／１２７Ｋ／１４９Ｒ／２２５Ａ／２４０Ｐ／３７１Ｗ／４４０Ｋ／４５１Ｋ／４５２Ｐ、８６Ｒ／８８Ｒ／８９Ｋ／１２７Ｋ／１４９Ｒ／２２５Ａ／２３３Ａ／２３７Ｎ／２４０Ｐ／４４０Ｋ／４５１Ｋ、８８Ｒ／８９Ｋ／１２７Ｋ／２２５Ａ／２３３Ａ／２３７Ｒ／２４０Ｐ／４４０Ｋ／４４８Ａ／４５１Ｋ／４５３Ｇ／４５４Ｌ、８８Ｒ／１２７Ｋ／１４９Ｒ／２２５Ａ／２３３Ａ／２３７Ｎ／４４０Ｋ／４５１Ｋ／４５４Ｌ、８８Ｒ／１２７Ｋ／２２５Ａ／４４０Ｋ／４５１Ｋ、および８８Ｒ／２２５Ａ／４４０Ｋ／４５１Ｋから選択される置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号６に関して番号付けされている。いくつかの追加の実施形態では、置換（複数可）または置換セットは、Ｇ１３Ｋ／Ｑ１９Ｋ／Ｌ６３Ｔ／Ｅ８８Ｒ／Ｐ１２７Ｋ／Ａ１８３Ｋ／Ｋ２２５Ａ／Ｄ２３２Ｋ／Ｆ２３３Ａ／Ａ２３７Ｒ／Ｄ３２９Ｌ／Ｄ３７１Ｗ／Ｅ４４０Ｋ／Ｔ４５１Ｋ／Ｄ４５２Ｐ／Ｙ４５３Ｇ／Ｅ４６６Ｇ、Ｇ１３Ｋ／Ｑ１９Ｋ／Ｌ６３Ｔ／Ｅ８８Ｒ／Ｐ１２７Ｋ／Ａ１８３Ｋ／Ｋ２２５Ａ／Ｄ２３２Ｋ／Ｆ２３３Ａ／Ａ２３７Ｒ／Ｄ３７１Ｗ／Ｐ３８６Ｋ／Ｅ４４０Ｋ／Ｔ４５１Ｇ／Ｄ４５２Ｐ、Ｑ１９Ｋ／Ｌ６３Ｔ／Ｅ８８Ｒ／Ｐ１２７Ｋ／Ａ１８３Ｋ／Ｋ２２５Ａ／Ｌ２３１Ｋ／Ｆ２３３Ａ／Ａ２３７Ｒ／Ｄ３７１Ｗ／Ｅ４２７Ｒ／Ｅ４４０Ｋ／Ｔ４５１Ｋ／Ｄ４５２Ｐ／Ｅ４６６Ｇ、Ｑ１９Ｋ／Ｌ６３Ｔ／Ｅ８８Ｒ／Ｐ１２７Ｋ／Ａ１８３Ｋ／Ｋ２２５Ａ／Ｆ２３３Ａ／Ａ２３７Ｒ／Ｄ３７１Ｗ／Ｄ３７３Ａ／Ｐ３８６Ｋ／Ｅ４４０Ｋ／Ｔ４５１Ｋ／Ｄ４５２Ｐ、Ｑ１９Ｋ／Ｌ６３Ｔ／Ｅ８８Ｒ／Ｐ１２７Ｋ／Ｋ２２５Ａ／Ｆ２３３Ａ／Ａ２３７Ｒ／Ｄ３７１Ｗ／Ｄ３８５Ｋ／Ｅ４４０Ｋ／Ｔ４５１Ｋ／Ｄ４５２Ｐ／Ｙ４５３Ｒ／Ｅ４６６Ｇ、Ｑ１９Ｋ／Ｌ６３Ｔ／Ｅ８８Ｒ／Ｐ１２７Ｋ／Ｋ２２５Ａ／Ｆ２３３Ａ／Ａ２３７Ｒ／Ｄ３７１Ｗ／Ｅ４４０Ｋ／Ｔ４５１Ｋ／Ｄ４５２Ｐ、Ｌ６３Ｔ／Ｅ８８Ｒ／Ｐ１２７Ｋ／Ｎ１４９Ｒ／Ｋ２２５Ａ／Ｅ２４０Ｐ／Ｄ３７１Ｗ／Ｅ４４０Ｋ／Ｔ４５１Ｋ／Ｄ４５２Ｐ、Ａ８６Ｒ／Ｅ８８Ｒ／Ｅ８９Ｋ／Ｐ１２７Ｋ／Ｎ１４９Ｒ／Ｋ２２５Ａ／Ｆ２３３Ａ／Ａ２３７Ｎ／Ｅ２４０Ｐ／Ｅ４４０Ｋ／Ｔ４５１Ｋ、Ｅ８８Ｒ／Ｅ８９Ｋ／Ｐ１２７Ｋ／Ｋ２２５Ａ／Ｆ２３３Ａ／Ａ２３７Ｒ／Ｅ２４０Ｐ／Ｅ４４０Ｋ／Ｄ４４８Ａ／Ｔ４５１Ｋ／Ｙ４５３Ｇ／Ｖ４５４Ｌ、Ｅ８８Ｒ／Ｐ１２７Ｋ／Ｎ１４９Ｒ／Ｋ２２５Ａ／Ｆ２３３Ａ／Ａ２３７Ｎ／Ｅ４４０Ｋ／Ｔ４５１Ｋ／Ｖ４５４Ｌ、Ｅ８８Ｒ／Ｐ１２７Ｋ／Ｋ２２５Ａ／Ｅ４４０Ｋ／Ｔ４５１Ｋ、およびＥ８８Ｒ／Ｋ２２５Ａ／Ｅ４４０Ｋ／Ｔ４５１Ｋから選択される置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号６に関して番号付けされている。
【００１６】
本発明はまた、表４．１、４．２、４．３、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５および／または６．１に示される少なくとも１種の遺伝子操作されたリガーゼバリアントの配列に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超えて同一であるポリペプチド配列を含む遺伝子操作されたリガーゼも提供する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたリガーゼは、表４．１、４．２、４．３、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５および／または６．１に提供されるバリアントの遺伝子操作されたリガーゼである。いくつかのさらなる実施形態では、遺伝子操作されたリガーゼは、ＤＮＡリガーゼ活性を有する。いくつかの追加の実施形態では、遺伝子操作されたリガーゼは、野生型Ｔ４  ＤＮＡリガーゼと比較して少なくとも１つの改善された特性を有する。いくつかのさらなる実施形態では、本発明の遺伝子操作されたリガーゼは、野生型Ｔ４  ＤＮＡリガーゼと比較して少なくとも１つの改善された特性を有し、改善された特性は、低ＤＮＡ基質濃度を用いる場合よりも大きな活性を示すことおよびより少ないアダプター二量体の生成から選択される。いくつかのさらなる実施形態では、本発明の遺伝子操作されたリガーゼは、野生型Ｔ４  ＤＮＡリガーゼよりも熱安定性である。なおいくつかのさらなる実施形態では、本発明の遺伝子操作されたリガーゼは、野生型Ｔ４  ＤＮＡリガーゼよりも広いｐＨ範囲にわたって安定である。いくつかの追加の実施形態では、本発明の遺伝子操作されたリガーゼは精製される。
【００１７】
本発明はまた、本明細書において提供される少なくとも１種の遺伝子操作されたリガーゼをコードするポリヌクレオチド配列も提供する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、配列番号２、６、３２、３４および／または３７の参照配列もしくはその機能的断片に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有する少なくとも１種の遺伝子操作されたリガーゼをコードし、遺伝子操作されたポリペプチドは、１つまたは複数のアミノ酸位置に少なくとも１つの置換を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、配列番号１、５、３１、３３および／または３７の参照配列に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有する配列を含む。いくつかのさらなる実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、配列番号１、５、３１、３３および／または３７を含む。なおいくつかの追加の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、制御配列に作動可能に連結されている。いくつかのさらなる実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。
【００１８】
本発明はまた、本明細書において提供される少なくとも１種のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターも提供する。本発明はまた、本明細書において提供される少なくとも発現ベクターで形質転換された宿主細胞も提供する。
【００１９】
本発明は、宿主細胞において遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドを生成する方法であって、少なくとも１種の遺伝子操作されたリガーゼが生成されるように、適した培養条件下で本明細書において提供される宿主細胞を培養するステップを含む方法をさらに提供する。いくつかの実施形態では、方法は、培養物および／または宿主細胞から少なくとも１種の遺伝子操作されたリガーゼを回収するステップをさらに含む。いくつかの追加の実施形態では、方法は、少なくとも１種の遺伝子操作されたリガーゼを精製するステップをさらに含む。
【００２０】
本発明はまた、本明細書において提供された少なくとも１種の遺伝子操作されたリガーゼを含む組成物も提供する。組成物が、任意の特定の方法を使用して生成されている本明細書において提供される任意の遺伝子操作されたリガーゼを含むことは意図されない。本発明は、任意の具体的な方法を使用して生成された遺伝子操作されたリガーゼに制限されると意図される。
【００２１】
本発明はまた、少なくとも１種のライゲーション生成物を生成する方法であって、本明細書において提供される少なくとも１種の遺伝子操作されたリガーゼと、少なくとも２種の核酸断片を含む反応混合物とを含み、核酸断片のライゲーションが生じ、少なくとも１種のライゲーション生成物が生成されるような条件下で、少なくとも１種の遺伝子操作されたポリペプチドと、反応混合物とを組み合わせるステップを含む方法も提供する。本方法のいくつかの実施形態では、投入二本鎖ＤＮＡ（input double-stranded DNA）は、平滑末端ＤＮＡ断片を含む。
【００２２】
本発明はまた、ライゲーション生成物を生成する方法であって、本明細書において提供される少なくとも１種の遺伝子操作されたリガーゼと、少なくとも２種の核酸断片を含む反応混合物とを含み、核酸断片のライゲーションが生じ、少なくとも１種のライゲーション生成物が生成されるような条件下で、少なくとも１種の遺伝子操作されたポリペプチドと、反応混合物とを組み合わせるステップを含む方法も提供する。本方法のいくつかの実施形態では、投入二本鎖ＤＮＡは、平滑末端ＤＮＡ断片を含む。
【００２３】
本発明はまた、ＤＮＡライブラリーを含む生成物を生成する方法であって、本明細書において提供される少なくとも１種の遺伝子操作されたリガーゼと、投入二本鎖ＤＮＡと、少なくとも１種のＴテールアダプターオリゴヌクレオチド、アデノシンおよび反応緩衝液を含む反応混合物組成物とを提供するステップと、アデノシンがＤＮＡの両鎖の３’末端に付加されるような条件下で、少なくとも１種の遺伝子操作されたリガーゼと、反応混合物とを曝露するステップと、Ｔテールアダプターを投入ＤＮＡの末端とライゲーションして、ＤＮＡライブラリーを生成するステップとを含む方法も提供する。本方法のいくつかの実施形態では、投入二本鎖ＤＮＡは、平滑末端ＤＮＡ断片を含む。
【００２４】
本発明はまた、シーケンシングに適した複数のＤＮＡ断片を含む生成物を生成する方法であって、本明細書において提供される少なくとも１種の遺伝子操作されたリガーゼと、投入二本鎖ＤＮＡ、一塩基デオキシアデニン３’オーバーハングおよび５’一リン酸末端を含むオリゴヌクレオチドならびにライゲーション適合末端に５’デオキシチミジンオーバーハングおよび５’リン酸を含むアダプターオリゴヌクレオチドを含む反応混合物とを提供するステップと、オリゴヌクレオチド、アダプターオリゴヌクレオチドおよび投入二本鎖ＤＮＡのライゲーションが生じるような条件下で、少なくとも１種の遺伝子操作されたリガーゼおよび反応混合物を曝露するステップと、シーケンシングに適した複数のＤＮＡ断片を含む生成物を生成するステップとを含む方法も提供する。
【００２５】
本発明の遺伝子操作されたリガーゼを利用する方法のいくつかの実施形態では、クラウディング剤の存在下で曝露を実施する。本方法のいくつかの実施形態では、生成物の熱不活性化後に、生成物をＥ．ｃｏｌｉに形質転換する。いくつかの追加の実施形態では、生成物を使用して、ＤＮＡ分子のライブラリーを作製する。いくつかのさらなる実施形態では、ＤＮＡ分子のライブラリーをシーケンシングに付す。なおいくつかの追加の実施形態では、反応混合物は、ライゲーションを阻害する少なくとも１種の化合物を含む。なおいくつかのさらなる実施形態では、本方法は、ライゲーションを阻害し、ライゲーションにとって最適以下の緩衝液を含む少なくとも１種の化合物を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、野生型Ｔ４  ＤＮＡリガーゼが使用される同一方法よりも多くの生成物を生成する。いくつかのさらなる実施形態では、反応混合物は、少なくとも１種の酵素を含む。いくつかのさらなる実施形態では、酵素は、ポリメラーゼ、ポリヌクレオチドキナーゼ、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼおよびシチジンデアミナーゼから選択される。なおいくつかの追加の実施形態では、投入二本鎖ＤＮＡ濃度は、１００ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、１ｎＭ未満または１００ｐＭ未満である。いくつかのさらなる実施形態では、アダプター濃度（oncentration）は、反応中の挿入物の濃度の１０倍未満、５倍未満、３倍未満または２倍未満過剰である。なおいくつかの追加の実施形態では、本方法は、生成物を増幅するステップをさらに含む。いくつかのさらなる実施形態では、本方法は、生成物をシーケンシングするステップをさらに含む。なおいくつかの追加の実施形態では、本方法は、生成物を増幅し、シーケンシングするステップをさらに含む。いくつかの追加の実施形態では、生成物からアダプター二量体を除去するためのステップをとらない。いくつかのさらなる実施形態では、投入二本鎖ＤＮＡは、単離された細胞不含ＤＮＡ、循環腫瘍ＤＮＡ、循環腫瘍細胞から単離されたＤＮＡ、循環胎児ＤＮＡおよび穿刺吸引液から選択される。いくつかの実施形態では、投入二本鎖ＤＮＡを、粗試料で提供する。いくつかのさらなる実施形態では、投入二本鎖ＤＮＡを、反応混合物中に含める前に精製する。なおいくつかの追加の実施形態では、投入二本鎖ＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡおよび／または任意のその他の合成もしくは天然に存在する核酸の配列を含む、核酸を含む試料に由来する。実際、本発明は、任意の特定の出発試料ＤＮＡに制限されるとは意図されない。いくつかの実施形態では、本方法を、マイクロ流体デバイスおよび液滴から選択される条件下で実施する。いくつかのさらなる実施形態では、反応混合物および遺伝子操作されたリガーゼの組合せの容量は、５０００ｐＬ未満、１０００ｐＬ未満、１００ｐＬ未満、１０ｐＬ未満または１ｐＬ未満である。いくつかの追加の実施形態では、二本鎖投入ＤＮＡ（double-stranded input DNA）を固定化し、その一方で、いくつかの代替の実施形態では、遺伝子操作されたリガーゼを固定化する。なおいくつかのさらなる実施形態では、二本鎖投入ＤＮＡおよび遺伝子操作されたリガーゼを固定化する。いくつかのさらなる実施形態では、固定化されたＤＮＡおよび／もしくは固定化された遺伝子操作されたリガーゼに加えて、またはその代わりに、反応混合物中の少なくとも１種の化合物を固定化する。いくつかのさらなる実施形態では、生成物を使用して、ＤＮＡシーケンシング、ハイスループットスクリーニング、遺伝子選択、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、リボソームディスプレイ、細胞ベースのアッセイ、生化学的アッセイ、イメージングベースのハイコンテントスクリーニングまたはクロマチンコンホメーション捕捉（Ｃ３）のためのライブラリーを作製する。
【００２６】
本発明の方法のいくつかの実施形態では、曝露するステップの時間の長さは、３０分未満である。いくつかのさらなる実施形態では、曝露するステップの時間の長さは、１５分未満である。いくつかの追加の実施形態では、曝露するステップの時間の長さは、１０、９、８、７、６、５、４、３または２分未満である。なおいくつかの追加の実施形態では、曝露するステップの時間の長さは、５分未満である。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態では、生成物は、曝露するステップの時間の長さが１５分またはそれより長いライゲーション方法よりも少ないアダプター二量体を含む。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、より迅速であり、より少ないアダプター二量体を生成することにより、野生型Ｔ４  ＤＮＡリガーゼと比較して、およびいくつかの実施形態では、その他のリガーゼと比較して、分析される試料あたり、より生産的な読取りをもたらす方法を提供する。いくつかの追加の実施形態では、本発明の方法は、細胞不含である。
【００２８】
本発明はまた、ライゲーション生成物を生成する方法であって、本明細書において提供される少なくとも１種の遺伝子操作されたリガーゼ、少なくとも２種の核酸断片を含む基質および反応混合物を提供するステップと、核酸断片のライゲーションが生じ、少なくとも１種のライゲーション生成物が生成されるような条件下で、少なくとも１種の遺伝子操作されたリガーゼ、基質および反応混合物を組み合わせるステップとを含む方法を提供する。
【００２９】
本発明はまた、ＤＮＡライブラリーを生成する方法であって、本明細書において提供される少なくとも１種の遺伝子操作されたリガーゼ、投入二本鎖ＤＮＡを含む基質ならびに少なくとも１種のＴテールアダプターオリゴヌクレオチド、アデノシンおよび反応緩衝液を含む反応混合物組成物を提供するステップと、アデノシンがＤＮＡの両鎖の３’末端に付加されるような条件下で、少なくとも１種の遺伝子操作されたリガーゼ、基質および反応混合物を組み合わせ、Ｔテールアダプターを投入ＤＮＡの末端とライゲーションして、ＤＮＡライブラリーを含む生成物を生成するステップとを含む方法も提供する。いくつかの実施形態では、投入二本鎖ＤＮＡは、平滑末端ＤＮＡ断片を含む。
【００３０】
本発明はまた、シーケンシングに適した複数のＤＮＡ断片を生成する方法であって、本明細書において提供される少なくとも１種の遺伝子操作されたリガーゼと、投入二本鎖ＤＮＡを含む基質と、一塩基デオキシアデニン３’オーバーハングおよび５’一リン酸末端を含むオリゴヌクレオチドならびにライゲーション適合末端に５’デオキシチミジンオーバーハングおよび５’リン酸を含むアダプターオリゴヌクレオチドを含む反応混合物とを提供するステップと、オリゴヌクレオチド、アダプターオリゴヌクレオチドおよび投入二本鎖ＤＮＡのライゲーションが生じるような条件下で、少なくとも１種の遺伝子操作されたリガーゼ、基質ならびに反応混合物を組み合わせて、シーケンシングに適した複数のＤＮＡ断片を含む生成物を生成するステップとを含む方法も提供する。
【００３１】
本発明はまた、シーケンシングに適した複数のＤＮＡ断片を生成する方法であって、本明細書において提供される少なくとも１種の遺伝子操作されたリガーゼと、投入二本鎖ＤＮＡを含む基質と、一塩基デオキシアデニン３’オーバーハングおよび５’一リン酸末端を含むオリゴヌクレオチドならびにライゲーション適合末端に５’デオキシチミジンオーバーハングおよび５’リン酸を含むアダプターオリゴヌクレオチドを含む反応混合物とを提供するステップと、オリゴヌクレオチド、アダプターオリゴヌクレオチドおよび投入二本鎖ＤＮＡのライゲーションが生じるような条件下で、少なくとも１種の遺伝子操作されたリガーゼ、基質および反応混合物を組み合わせて、シーケンシングに適した複数のＤＮＡ断片を含む生成物を生成するステップとを含み、反応混合物中のアダプターオリゴヌクレオチドの濃度は、基質濃度の２０倍未満モル過剰である、方法も提供する。
【００３２】
本明細書において提供される方法のいくつかの実施形態では、クラウディング剤の存在下で曝露を実施する。いくつかのさらなる実施形態では、生成物の熱不活性化後に、生成物をＥ．ｃｏｌｉに形質転換する。いくつかの追加の実施形態では、生成物を使用して、ＤＮＡ分子のライブラリーを作製する。なおいくつかのさらなる実施形態では、ＤＮＡ分子のライブラリーをシーケンシングに付す。さらにいくつかのさらなる実施形態では、反応混合物は、ライゲーションを阻害する少なくとも１種の化合物を含む。いくつかの実施形態では、ライゲーションを阻害する少なくとも１種の化合物は、ライゲーションにとって最適以下の緩衝液を含む。いくつかの特に好ましい実施形態では、方法は、野生型Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを含む同一方法よりも多くの生成物を生成する。いくつかの追加の実施形態では、反応混合物は、少なくとも１種の酵素を含む。いくつかの実施形態では、酵素は、ポリメラーゼ、ポリヌクレオチドキナーゼ、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼおよびシチジンデアミナーゼから選択される。いくつかの実施形態では、酵素は、リガーゼ緩衝液と不適合である。投入二本鎖ＤＮＡを利用するなおいくつかのさらなる実施形態では、投入二本鎖ＤＮＡ濃度は、１００ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、１ｎＭ未満または１００ｐＭ未満である。アダプターを利用するいくつかの実施形態では、アダプター濃度は、反応中の挿入物の濃度の１０倍未満、５倍未満、３倍未満または２倍未満過剰である。いくつかの追加の実施形態では、方法は、生成物を増幅するステップをさらに含む。さらにいくつかのさらなる実施形態では、方法は、生成物をシーケンシングするステップをさらに含む。なおいくつかの追加の実施形態では、方法は、生成物を増幅し、シーケンシングするステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、生成物からアダプター二量体を除去するためのステップをとらない。なおいくつかのさらなる実施形態では、基質は、単離された細胞不含ＤＮＡ、循環腫瘍ＤＮＡ、白血病細胞から単離されたＤＮＡ、リンパ腫細胞から単離されたＤＮＡ、循環腫瘍細胞から単離されたＤＮＡ、ウイルス感染細胞から単離されたＤＮＡ、循環胎児ＤＮＡおよび穿刺吸引液から選択される。いくつかの実施形態では、基質は、粗試料で提供された投入二本鎖ＤＮＡを含む。いくつかの代替の実施形態では、基質は、反応混合物中に含める前に精製される投入二本鎖ＤＮＡを含む。いくつかの追加の実施形態では、方法を、マイクロ流体デバイスおよび／または液滴を利用する条件下で実施する。いくつかの実施形態では、反応混合物および遺伝子操作されたリガーゼの組合せの容量は、５０００ｐＬ未満、１０００ｐＬ未満、１００ｐＬ未満、１０ｐＬ未満または１ｐＬ未満である。いくつかの実施形態では、基質は、固定化された二本鎖投入ＤＮＡを含む。いくつかの代替の実施形態では、遺伝子操作されたリガーゼを固定化する。なおいくつかの追加の実施形態では、二本鎖投入ＤＮＡおよび遺伝子操作されたリガーゼを含む基質を固定化する。なおいくつかのさらなる実施形態では、反応混合物中の少なくとも１種の化合物を固定化する。いくつかの追加の実施形態では、方法の生成物を���用して、ＤＮＡシーケンシング、ハイスループットスクリーニング、遺伝子選択、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、リボソームディスプレイ、細胞ベースのアッセイ、生化学的アッセイ、イメージングベースのハイコンテントスクリーニングまたはクロマチンコンホメーション捕捉（Ｃ３）のためのライブラリーを作製する。いくつかの実施形態では、組み合わせる時間の長さは、３０分未満である。いくつかのさらなる実施形態では、組み合わせる時間の長さは、１５分未満である。なおいくつかの追加の実施形態では、組み合わせる時間の長さは、１０、９、８、７、６、５、４、３または２分未満である。いくつかの実施形態では、組み合わせる時間の長さは、５分未満である。方法のいくつかの追加の実施形態では、生成物は、組み合わせる時間の長さが１５分またはそれより長いライゲーション方法よりも少ないアダプター二量体を含む。なおいくつかのさらなる実施形態では、本方法は、細胞不含である。いくつかの実施形態では、基質は、患者から得た流体から抽出した細胞不含ＤＮＡである。いくつかのさらなる実施形態では、流体は、血清または血漿を含む。いくつかの追加の実施形態では、基質は、その３’および５’末端に異なる配列を有する核酸を含む。なおいくつかの追加の実施形態では、方法は、ライゲーションにおいて低バイアスを達成する。なおいくつかのさらなる実施形態では、組み合わせるステップは、約１０°〜約４０℃の間の範囲の温度で実施する。いくつかの実施形態では、温度範囲は、約１６°〜約３７℃である。いくつかの実施形態では、１６°〜３７°の範囲の温度を使用することは、その他のリガーゼ（例えば、野生型Ｔ４  ＤＮＡリガーゼまたは当技術分野で公知のその他のリガーゼ）と比較して、生成物への改善された変換を提供する。いくつかの実施形態では、組み合わせるステップは、約ｐＨ７〜約ｐＨ１０の範囲のｐＨで実施する。いくつかの実施形態では、組み合わせるステップは、約７．５から約９の間のｐＨで実施する。いくつかの実施形態では、方法のｐＨは、７．５〜９の範囲であり、回収は、野生型Ｔ４  ＤＮＡリガーゼまたはその他のリガーゼ（例えば、当技術分野で公知のその他のリガーゼ）とともに使用するのに不適合である緩衝液において可能である。その他のｐＨが本発明において使用されるので、本発明は、ｐＨが７．５〜９の範囲にある方法に限定されると意図されない。種々の緩衝液が本発明において使用されるので、本発明は、任意の具体的な緩衝液（複数可）に限定されると意図されない。いくつかの追加の実施形態では、基質濃度の２０倍未満モル過剰のアダプター濃度の使用が、効率的なライブラリー変換および／または生成物が使用される下流ステップへのアダプター分子の持ち越しの回避の両方の達成において使用される。本発明の方法においてその他の基質濃度が使用されるので、本発明の方法は、このような２０倍モル基質過剰に限定されるとは意図されない。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたリガーゼは、インデックスホッピングを防ぐことにおいて使用される。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、実施例９に記載されるような、配列番号３８のポリペプチドおよび野生型Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによる複数の温度条件の二重末端ライゲーション生成物（double-end ligated product）への変換についての温度／活性プロファイルを示すグラフである。
【００３４】
【図２】図２は、実施例１０に記載されるような、配列番号３８のポリペプチドおよび野生型Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによる種々のｐＨでの二重末端ライゲーション生成物への変換を示すグラフを提供する。
【００３５】
【図３】図３は、実施例１１に記載されるような、配列番号３８のポリペプチドおよび野生型Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによる二重末端ライゲーション生成物への変換を示すグラフを提供する。
【００３６】
【図４】図４は、実施例１２に記載されるような、配列番号３８のポリペプチドおよび野生型Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによる２００ｎＭアダプターまたは４０ｎＭアダプターの存在下での二重末端ライゲーションへの基質変換を示すグラフを提供する。
【００３７】
【図５】図５は、実施例１３に記載されるような、配列番号３８のポリペプチドおよび野生型Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによる１０ｎｇおよび１００ｎｇ投入ＤＮＡでの二重末端ライゲーション生成物への変換パーセントを示すグラフを提供する。
【００３８】
【図６】図６は、実施例１４に記載されるような、配列番号３８のポリペプチドおよび野生型Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによる細胞不含ＤＮＡにおける二重末端ライゲーション生成物への変換を示すグラフを提供する。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本発明は、遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドおよびその組成物ならびに遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、診断およびその他の目的のために遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドを含む組成物を使用する方法も提供する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドを、特に、低濃度のＤＮＡ投入が関与する条件ならびにライゲーションされたＤＮＡ生成物、特に、ハイスループット解析および／またはシーケンシング反応に適したＤＮＡの生成にとって好ましくないその他の条件下で、増強されたライゲーション活性を提供するように最適化する。いくつかの実施形態では、本発明は、診断および研究目的のための遺伝子操作されたリガーゼを含む方法および組成物を提供する。本発明はまた、遺伝子操作されたリガーゼポリペプチド、その変異体、生物学的に活性な断片および類似体ならびにそれを含む組成物も提供する。
【００４０】
ＤＮＡリガーゼは、隣接する３’−ヒドロキシルおよび５’リン酸末端の縮合による核酸分子における新規ホスホジエステル結合の形成を触媒する。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼの天然基質は、ＤＮＡ複製の際に生じるニックの入った二本鎖（「ｄｓ」）ＤＮＡ中間体である。分子クローニングおよびＤＮＡシーケンシングライブラリー調製などの実際のｉｎ  ｖｉｔｒｏ用途では、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼは、付着末端または平滑末端ｄｓ  ＤＮＡ断片を結合するために、その他の天然に存在するリガーゼと比較して、その相対的な効率のためによく使用される。
【００４１】
ライゲーション効率は、結合されている二本鎖ＤＮＡ基質の基質濃度および特性によって影響を受ける。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼは、二本鎖末端結合反応において基質に対して極めて低い絶対親和性（Ｋｍ  約５０μＭ）を有する。しかし、１ｎｍほどの低いＤＮＡ濃度を含有する反応において利用されることが多い（Matsumura、Biotechn.、第９５巻：ＩＶ〜ＸＩＩＩ［２０１５年］）。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼは、平滑末端および一塩基付着オーバーハング（例えば、Ｔ／Ａオーバーハング）を結合するが、これらの反応の効率は、１６〜２０℃で一過性にアニーリングされる中間体を形成し得るより長い付着末端を有する基質間のものに対して有意に低減される。次世代シーケンシング（ＮＧＳ）ライブラリー調製ワークフローは、二本鎖アダプター分子の投入ＤＮＡとのライゲーションに依存しており、ライゲーションにとっておそらく最も要求の厳しい条件：一塩基または平滑末端の挿入部分およびアダプター基質ならびに低投入ＤＮＡ濃度（例えば、細胞不含ＤＮＡ、単細胞、穿刺吸引液またはその他の低収率ＤＮＡ試料に由来する）を提示する。
【００４２】
ＤＮＡライゲーション速度および効率を改善するためのいくつかのアプローチが開発されている。現在、最もよく使用されているアプローチは、反応への非特異的ポリマー（例えば、クラウディング剤）の添加を含む。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ；分子量１０００〜８０００）およびフィコール７０の添加は、速度および全体的な基質変換の両方を改善し得る（PheifferおよびZimmerman、Nucl. Acids Res.、１１巻：７８５３〜７８７１頁［１９８３年］を参照のこと）。ＰＥＧ６０００を含有するライゲーション緩衝液は、迅速なライゲーションクローニングおよびＮＧＳライブラリー調製キットにおいて広く使用されている（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ［Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ］およびＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ［Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ］などの商業的な供給業者から入手可能なキット）。しかし、高濃度のクラウディング剤では、高分子量コンカテマーの形成およびＮＧＳ反応において形成されるアダプター二量体などのミスマッチした基質のライゲーションを含むいくつかの望ましくない結果が増加する。さらに、クラウディング剤は、単一チューブまたはマイクロ流体ワークフローにおいて実施されるその他の酵素反応と不適合である場合がある。例えば、ＤＮＡリガーゼの熱不活性化は、Ｅ．ｃｏｌｉ形質転換の前によく実施されるが、ＰＥＧの存在下での熱不活性化は、形質転換効率を有意に低減する。高濃度のクラウディング剤を含有する緩衝液およびライゲーションマスターミックスは、極めて粘性でもある場合があり、これが自動化液体ハンドリングおよびハイスループット試料処理を複雑にする。
【００４３】
クローニングおよびＮＧＳワークフローにおけるライゲーション効率を改善するために、低分子量ライゲーションエンハンサー（例えば、１，２−プロパンジオール）が使用されている（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１４／０１８７４４７号を参照のこと）。１，２−プロパンジオールライゲーション緩衝液の使用は、低濃度ＤＮＡ投入（５ｎｇ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡ）を使用するＰＥＧ緩衝液に対してＮＧＳライブラリー変換を５倍増加した。１，２−プロパンジオールおよびその他の小分子エンハンサーは、熱不活性化と適合するが、それらは、単一チューブＮＧＳワークフローまたはマイクロ流体試料調製におけるその他の酵素またはステップとは不適合である場合がある。
【００４４】
ｄｓＤＮＡ結合ドメインとの種々のペプチド融合物を作製することによって、遺伝子操作された改善されたＴ４  ＤＮＡリガーゼバリアントが開発されている（Wilsonら、Prot. Engin. Des. Select.、７巻：４７１〜４７８頁［２０１３年］を参照のこと）。これらのリガーゼバリアントのいくつかは、十分に発現し、約４０ｎＭの濃度で付着末端基質に対して、または約３０ｎＭの濃度で平滑末端基質に対して改善された活性を示した。しかし、これらのリガーゼのうち、細胞不含ＤＮＡ投入のため（１〜５ｎＭ）またはその他の低投入ＮＧＳ用途のために通常使用される低基質濃度で試験されたと報告されたものはなかった。
【００４５】
ＮＧＳベースのシーケンシング反応の感度は、現在、断片化された投入ＤＮＡの、二重末端アダプターライゲーション断片（double-end adapter-ligated fragment）へのわずかな変換によって制限されており、これは、低濃度基質投入を使用して５％ほどの低いものであり得る。種々のリガーゼ、クラウディング剤およびライゲーションエンハンサーが使用されているが、ＮＧＳベースのシーケンシングアッセイの感度およびその他の分子生物学ワークフローの頑健性は、入手可能な現在の方法によって制限されている。本発明の遺伝子操作されたリガーゼ、組成物および方法は、改善されたＮＧＳベースのシーケンシングならびにその他の診断方法および手順のための当技術分野での必要性に対処する。
【００４６】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作されたリガーゼは、細胞不含ＤＮＡ、循環腫瘍ＤＮＡ、循環腫瘍細胞から単離されたＤＮＡ、循環胎児ＤＮＡ、ウイルス感染細胞から単離されたＤＮＡ、穿刺吸引液またはＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）、レーザー捕捉顕微鏡法もしくはマイクロ流体デバイスによって単離された単細胞を含む、患者試料に由来する少量のＤＮＡを使用する診断的および研究的適用において使用される。しかし、低ＤＮＡ濃度を有するものを含む任意の適した試料が本発明において使用されるので、本発明とともに使用される試料は、任意の特定の試料の種類に制限されるとは意図されない。
【００４７】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作されたリガーゼは、高濃度ＤＮＡ試料への中間体のためのＤＮＡシーケンシングライブラリーの構築において使用される。本明細書において提供される遺伝子操作されたリガーゼは、低濃度のアダプターが、ＷＴ  ＤＮＡリガーゼ（例えば、野生型Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ）に対して同等である二重アダプターライゲーション変換（double-adapter ligation conversion）を達成することを必要とする。低アダプター濃度を使用する結果として、アダプター二量体の生成が最小化される。いくつかの実施形態では、所望の二重アダプターがライゲーション生成物（double adapter-ligated product）が、アダプター二量体に対して高モル過剰で生じ、アダプター二量体を除去するためにそうでなければ必要であるクリーンアップステップが排除されるような制限濃度で、アダプターが使用される。これは、ゲノムリシーケンシングなど、多数の標準シーケンシングワークフローを単純化する。より低いアダプター濃度はまた、ライゲーションに必要なアダプターの量も低減し、これが、全体的なワークフローに対するアダプターの費用寄与を低減し得る。これは、亜硫酸水素塩またはメチロームシーケンシングのために使用されるメチル化アダプターなどの費用のかかるアダプターにとって特に有用である。
【００４８】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作されたリガーゼは、分子クローニング用途、特に、天然に存在する酵素のＫｍと比較してＤＮＡ濃度が低いものにおいて使用される。いくつかの実施形態では、これは、試料が少容量または環境試料、患者試料もしくは古代ＤＮＡなどの任意の低濃度ＤＮＡ試料で調製されるハイスループットクローニング用途に適用される。
【００４９】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作されたリガーゼは、操作間のクリーンアップステップを除去する自動化ワークフローを含む、単純化された分子生物学ワークフローにおいて使用される。遺伝子操作されたリガーゼは低濃度基質で活性であるので、阻害剤を含有する少容量の基質試料（または希釈物）を、ライゲーション反応に添加することができる。関連阻害剤含有ＤＮＡ試料として、ＰＣＲ緩衝液中のＤＮＡ、電気泳動緩衝液中のＤＮＡまたは粗抽出物中のＤＮＡを挙げることができる。本発明の遺伝子操作されたリガーゼは、天然リガーゼと比較して、希釈試料を効率的にライゲーション可能である。あるいは、他の実施形態では、本発明の遺伝子操作されたリガーゼは、阻害剤（複数可）を含有する未希釈試料で使用される。これらの遺伝子操作されたリガーゼのライゲーション性能は、そのより高い特異的活性のために、阻害剤の存在下で野生型リガーゼ（例えば、野生型Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ）のものを超える。
【００５０】
Ｔ４  ＤＮＡリガーゼの熱不活性化は、Ｅ．ｃｏｌｉの形質転換に先立ってライゲーション反応で一般的に実施される。このステップは、カラムまたはビーズベースのクリーンアップと比較して好都合であり、プラスミド形質転換の効率を著しく増大させる。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（およびその他の天然リガーゼ）の速度および効率を増大させるために、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が使用されることが多いが、ＰＥＧの存在下でのリガーゼの熱不活性化は、形質転換にとって強力に阻害性である。したがって、ＰＥＧライゲーションは、より多くの関与するクリーンアップステップを必要とし、ＰＥＧ迅速ライゲーション戦略の便宜性および速度を打ち消す。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作されたリガーゼは、ＰＥＧの不在下で迅速および効率的なライゲーションを実施し、形質転換に先立って熱形質転換によって不活性化され得る。したがって、これらの遺伝子操作されたリガーゼの使用は、迅速ライゲーションおよび形質転換に先立つ好都合なクリーンアップを達成する。
【００５１】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作されたリガーゼは、高度に粘性のライゲーションエンハンサーまたはクラウディング剤（例えば、ＰＥＧ、フィコールもしくは高濃度のグリセロール）と不適合であるものを含む、マイクロ流体用途において使用される。本発明の遺伝子操作されたリガーゼは、天然Ｔ４  ＤＮＡリガーゼまたはその他のリガーゼを使用して同様の効率を達成するのに必要であろうクラウディング剤の不在下で、低濃度基質を効率的に変換する。
【００５２】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作されたリガーゼは、マイクロ流体液滴またはウェルプレートにおいて実施される単一ポットマルチ酵素反応において使用される。リガーゼの高い特異的活性によって、その他の酵素の実施のために選択される緩衝液処方が可能となり、これによって、ワークフロー全体を制限しないライゲーション性能が達成される。
【００５３】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作されたリガーゼは、ＤＮＡライブラリーの構築において使用される。これらのライブラリーは、ＤＮＡシーケンシング、ハイスループットスクリーニング、遺伝子選択、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、リボソームディスプレイ、細胞ベースのアッセイ、生化学的アッセイまたはイメージングベースのハイコンテントスクリーニングのために使用することができる。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作されたリガーゼは、ライブラリーの大きさ、多様性または忠実度が、野生型リガーゼが使用される場合にライゲーション基質濃度によって制限される場合に特に有用性が見出される。
【００５４】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作されたリガーゼは、３Ｃ、４Ｃ、５ＣおよびＨｉ−Ｃを含む、クロマチンコンホメーション捕捉（Ｃ３）ベースのアッセイの実行において使用される。これらのアッセイは、分子内ライゲーションを促進するのに必要である極めて希釈した条件下での消化された基質の効率的なライゲーションに左右される。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作されたリガーゼは、これらの条件下で野生型Ｔ４  ＤＮＡリガーゼよりも効率的に実行する。
略語および定義：
【００５５】
別に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。全般的に、本明細書において使用される命名法および以下に記載される細胞培養、分子遺伝学、微生物学、有機化学、分析化学および核酸化学の実験室手順は、当技術分野で周知であり、一般的に採用されるものである。このような技術は、周知であり、当業者に周知の多数の教本および参考文献に記載されている。化学的合成および化学的分析のために標準技術またはその改変が使用される。
【００５６】
本明細書において言及されるすべての特許、特許出願、論文および刊行物は、前掲および後掲両方とも、ここに参照により本明細書に明確に組み込まれる。
【００５７】
本明細書において記載されるものと同様または等価である任意の適した方法および材料が本発明の実施において使用されるが、いくつかの方法および材料は、本明細書において記載されている。記載されている特定の方法論、プロトコールおよび試薬は、当業者によって使用される状況に応じて変わり得るので、本発明は、これらに限定されないと理解されるべきである。したがって、直後に定義される用語は、本出願を全体として参照することによってより十分に説明される。本明細書において言及されるすべての特許、特許出願、論文および刊行物は、前掲および後掲両方とも、ここに参照により本明細書に明確に組み込まれる。
【００５８】
本明細書において使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明確に別に示さない限り、複数の言及を含む。
【００５９】
数値範囲には、範囲を規定する数字が含まれる。したがって、本明細書において開示されるどの数値範囲も、このようなより広い数値範囲内に入るすべてのより狭い数値範囲を、このようなより狭い数値範囲がすべて本明細書に明確に記載されるかのように包含するよう意図される。また、本明細書において開示されるすべての最大（または最小）の数値限定は、すべてのより低い（またはより高い）数値限定を、このようなより低い（またはより高い）数値限定が本明細書に明確に記載されるかのように含むと意図される。
【００６０】
用語「約」とは、特定の値の許容可能な誤差を意味する。いくつかの場合には、「約」とは、所与の値の範囲の０．０５％、０．５％、１．０％または２．０％内を意味する。いくつかの場合には、「約」とは、所与の値の１、２、３または４標準偏差内を意味する。
【００６１】
さらに、本明細書において提供される見出しは、本出願を全体として参照することによって得ることができる本発明の種々の態様または実施形態の制限ではない。したがって、直下に定義される用語は、本出願を全体として参照することによってより十分に定義される。それにもかかわらず、本発明の理解を促進するために、いくつかの用語を以下に定義する。
【００６２】
特に断りのない限り、それぞれ、核酸は、左から右に５’から３’配向で記載され、アミノ酸配列は、左から右にアミノからカルボキシ配向で記載される。
【００６３】
本明細書において使用する場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」およびその同語源語は、その包括的な意味で使用される（すなわち、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」およびその対応する同語源語と等価）。
【００６４】
本明細書において使用する場合、「ＥＣ」番号は、国際生化学分子生物学連合の命名委員会（ＮＣ−ＩＵＢＭＢ）の酵素命名法を指す。ＩＵＢＭＢ生化学分類は、酵素が触媒する化学反応に基づいた酵素の数値分類システムである。
【００６５】
本明細書において使用する場合、「ＡＴＣＣ」とは、バイオレポジトリーコレクションに遺伝子と株が含まれる、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎを指す。
【００６６】
本明細書において使用する場合、「ＮＣＢＩ」とは、国立生物情報センターとそこに提供されている配列データベースを指す。
【００６７】
本明細書において使用する場合、用語「ＤＮＡ」とは、デオキシリボ核酸を指す。
【００６８】
本明細書において使用する場合、用語「ＲＮＡ」とは、リボ核酸を指す。
【００６９】
本明細書において使用する場合、用語「融合タンパク質」および「キメラタンパク質」および「キメラ」とは、別個のタンパク質を元々コードしていた２種またはそれより多い遺伝子の接合によって作り出されたハイブリッドタンパク質を指す。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、組換え技術（例えば、当技術分野で公知の分子生物学技術）によって作り出される。
【００７０】
本明細書において使用する場合、用語「リガーゼ」とは、ポリヌクレオチドを一緒に結合するために、または単一ポリヌクレオチドの両末端を結合するためによく使用される酵素のクラスを指す。リガーゼとして、ＡＴＰ依存性二本鎖ポリヌクレオチドリガーゼ、ＮＡＤ＋依存性二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡリガーゼおよび一本鎖ポリヌクレオチドリガーゼが挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明は、バクテリオファージリガーゼ（例えば、Ｔ３  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼおよびＴ７  ＤＮＡリガーゼ）ならびにそのバリアントを提供する。いくつかのさらなる実施形態では、本発明は、融合またはキメラリガーゼを提供する。ＤＮＡリガーゼは、ＤＮＡ断片（例えば、遺伝子）のプラスミドへの挿入のために制限酵素とともに使用されることが多い。付着末端断片のライゲーションのために、最適温度を制御することは、効率的な組換えの実施において重要である。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼは、３７℃で最も活性であるが、付着末端断片を用いる最適ライゲーション効率のために、酵素の最適温度は、ライゲーションされる末端の融解温度とバランスをとらなければならず、オーバーハングが短いほど、断片の融解温度は低い。ライゲーション反応は、付着末端がすでに安定してアニーリングされている場合に最も効率的である傾向がある。平滑末端ＤＮＡ断片のライゲーションのためには、融解温度は、反応がライゲーションのために使用される正常温度範囲内で生じる場合には、考慮に入れる因子ではない。これらの反応では、制限因子は、リガーゼ活性というよりも、生じ得るＤＮＡ断片末端間のアラインメントの数である。したがって、平滑末端ＤＮＡ断片のライゲーションのための最も効率的な温度は、アラインメントの最大数が反応において生じ得る温度である。
【００７１】
本明細書において使用する場合、用語「アダプター」とは、ライゲーションのための適合ＤＮＡ末端を有する一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドを指す。アダプターの末端は、一本鎖であっても、二本鎖であってもよく、処理されたライブラリー挿入物ＤＮＡ上の相補的オーバーハングと適合するオーバーハングを含有し得る。アダプターは、一本鎖および二本鎖領域の両方を有し得る。いくつかの実施形態では、用語「アダプター」は、プライマー結合（biding）部位、バーコードおよびその他の特徴を含み得るＮＧＳ（すなわち、次世代シーケンシング）反応において使用される全長アダプターを指すように使用され、さらに全長アダプターと同一のライゲーションに適合する末端を有するが、これらのさらなる特徴を欠く、ＨＴＰスクリーニングおよびライゲーションアッセイにおいて使用される単純化されたモデルアダプターも指す。Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）シーケンシングプラットフォームで使用するために設計されたＮＧＳアダプターは、Ａテール挿入物断片上に存在するデオキシアデノシン３’オーバーハングとのライゲーションに適合するデオキシチミジン３’オーバーハングを有する。Ｔテールアダプターは、非相補的ＤＮＡ末端に対する野生型Ｔ４  ＤＮＡリガーゼの選択性のために、互いに効率的にライゲーションしない。アダプター二量化が、長いインキュベーション期間、高いアダプター濃度または高濃度のクラウディング剤を含む極端なライゲーション条件の結果として起こる。重要なことに、ライゲーション反応中のヌクレアーゼ混入物は、アダプター末端上のオーバーハングを除去することができ、その結果、自己ライゲーションに適合する平滑末端基質が得られる。
【００７２】
本明細書において使用する場合、用語「適合する末端」とは、オーバーハング上のすべての塩基が相補的であるように、５’から３’逆平行配向でハイブリダイズする５’または３’オーバーハングを有する２つのＤＮＡ二本鎖断片の末端を指す。ライゲーションとの関連で、少なくとも１種のＤＮＡ断片は、３’または５’オーバーハングのハイブリダイゼーションの際に別の分子に由来するヌクレオチドの３’ヒドロキシルに隣接して位置するヌクレオチド上に５’リン酸を有さなくてはならない。ライゲーションは、２種の基質分子の適合する末端での共有結合連結をもたらす。ＤＮＡシーケンシングのためのライブラリー調製を含むいくつかの実施形態では、アダプターおよび挿入物断片などの２種のＤＮＡ分子は、適合する末端を有さなくてはならず、アダプター／挿入物ハイブリッドの両鎖は、アダプターとハイブリダイズされるプライマーのポリメラーゼ伸長によるＰＣＲまたはシーケンシングによる生産的なライブラリー増幅を可能にするためにライゲーションされなければならない。
【００７３】
本明細書において使用する場合、用語「オーバーハング」とは、二本鎖ＤＮＡ断片の末端に生じる１つまたは複数の不対ポリヌクレオチドの領域を指す。不対領域中に５’または３’ＤＮＡ末端のいずれかが存在し得る。二本鎖ＤＮＡ断片は、２つの相補的一本鎖ポリヌクレオチドの二本鎖であり得るか、または二本鎖ＤＮＡの領域を形成する自己相補性を有する単一ポリヌクレオチドであり得る。
【００７４】
本明細書において使用する場合、用語「二本鎖」および「ｄｓ」とは、その配列において相補的であり（ＡはＴと対形成し、ＣはＧと対形成する）、逆平行の５’から３’配向に配置され、核酸塩基（すなわち、アデニン［Ａ］、グアニン［Ｇ］、シトシン［Ｃ］およびチミン［Ｔ］）間の水素結合によって一緒に保持された、２つの一本鎖ポリヌクレオチドで構成される二本鎖核酸（例えば、ＤＮＡ）分子を指す。
【００７５】
本明細書において使用する場合、用語「平滑」とは、５’オーバーハングも３’オーバーハングも有さない自己相補性を有するＤＮＡ二本鎖または一本鎖（「ｓｓ」）ＤＮＡの末端を指す。平滑末端は、鎖の一方または両方に５’リン酸を有し得、これがそれらを、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼなどのリガーゼによるライゲーションにとって適合しているものにさせる。
【００７６】
本明細書において使用する場合、用語「アダプター二量体」とは、２つのアダプター間の任意の共有結合ライゲーション生成物を指す。アダプター二量体は、ライゲーション反応の間に形成され得る。
【００７７】
本明細書において使用する場合、用語「ライブラリー挿入物」および「挿入物」とは、アダプターライゲーションにおける使用のための適合末端を提示するように末端修復および／またはＡテール付加によって処理されている二本鎖ＤＮＡ断片を指す。
【００７８】
本明細書において使用する場合、用語「末端修復」とは、ＤＮＡ（例えば、その他のＤＮＡ分子と不適合である、断片化された、または損傷を受けたＤＮＡもしくはＤＮＡ分子）を修復するための方法を指す。いくつかの実施形態では、プロセスは、２つの機能：１）Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼおよび／またはクレノウ断片などの酵素による、オーバーハングを有する二本鎖ＤＮＡの、オーバーハングを有さない二本鎖ＤＮＡへの変換、および２）ポリヌクレオチドキナーゼなどの酵素によるＤＮＡ（一本鎖または二本鎖）の５’末端へのリン酸基の付加を含む。
【００７９】
本明細書において使用する場合、用語「Ａテール付加（A-tailing）」とは、平滑末端二本鎖ＤＮＡ断片の末端に単一デオキシアデノシン残基を付加して、３’デオキシアデノシン一塩基オーバーハングを形成することを指す。Ａテール付加された断片は、自己ライゲーション（すなわち、ＤＮＡの自己環化および鎖状体形成（concantenation））に適合しないが、アダプター上に存在するものなどの３’デオキシチミジンオーバーハングと適合する。
【００８０】
本明細書において使用する場合、用語「アミノブロックされた」とは、３’ヒドロキシルが、アミノ部分において６炭素リンカー終結によって置き換えられている一本鎖または二本鎖ＤＮＡ末端を指す。ＤＮＡリガーゼは、３’ヒドロキシルの不在下でライゲーション反応を触媒できない。
【００８１】
「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）に関わらず、アミド結合によって共有結合的に連結された少なくとも２つのアミノ酸のポリマーを表すために本明細書において同義的に使用される。
【００８２】
「アミノ酸」は、その一般的に知られている３文字記号、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会によって推奨される一文字記号のいずれかによって本明細書において参照される。ヌクレオチドは同様に、その一般的に許容される一文字表記によって参照され得る。
【００８３】
用語「遺伝子操作された（engineered）」、「組換え」、「天然に存在しない」および「バリアント」とは、細胞、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに関して使用される場合、そうでなければ自然界に存在しない方法で修飾されている、あるいはそれと同一であるが、合成材料から、および／もしくは組換え技術を使用する操作によって、生成される、または由来する方法で修飾されている、材料または材料の自然もしくは天然形態に対応する材料を指す。
【００８４】
本明細書において使用する場合、「野生型」および「天然に存在する」とは、自然界に見られる形態を指す。例えば、野生型ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、自然界における供給源から単離することができる、ヒトの操作によって意図的に修飾されていない生物中に存在する配列である。
【００８５】
本明細書において使用する場合、「コード配列」とは、タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸（例えば、遺伝子）の部分を指す。
【００８６】
本明細書において使用する場合、用語「配列同一性パーセント（％）」とは、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド間の比較を指し、２つの最適にアラインされた配列を比較ウィンドウにわたって比較することによって決定され、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、２つの配列の最適アラインメントについて参照配列と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。パーセンテージは、両配列中に同一核酸塩基またはアミノ酸残基が生じる位置の数を決定して、マッチしている位置の数を得ることと、マッチしている位置の数を、比較のウィンドウ中の位置の総数で除することと、結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを得ることとによって算出できる。あるいは、パーセンテージは、同一核酸塩基もしくはアミノ酸残基のいずれかが両配列中に生じる位置の数を決定すること、または核酸塩基もしくはアミノ酸残基をギャップを用いてアラインして、マッチしている位置の数を得ることと、マッチする位置の数を、比較のウィンドウ中の位置の総数で除することと、結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを得ることとによって算出できる。当業者ならば、２つの配列をアラインするために利用可能な多数の確立されたアルゴリズムがあることを理解する。比較のための配列の最適アルゴリズムは、例えば、当技術分野で公知の、SmithおよびWaterman（SmithおよびWaterman、Adv. Appl. Math.、２巻：４８２頁［１９８１年］）の局所相同性アルゴリズムによって、NeedlemanおよびWunsch（NeedlemanおよびWunsch、J. Mol. Biol.、４８巻：４４３頁［１９７０年］）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、PearsonおよびLipman（PearsonおよびLipman、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８５巻：２４４４頁［１９８８年］）の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装（例えば、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎソフトウェアパッケージ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）によって、または目視検査によって実施できる。配列同一性および配列類似性パーセントを決定するために適しているアルゴリズムの例として、それだけに限らないが、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムが挙げられる（例えば、Altschulら、J. Mol. Biol.、２１５巻：４０３〜４１０頁［１９９０年］；およびAltschulら、Nucleic Acids Res.、３３８９〜３４０２頁［１９７７年］）。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎウェブサイトを介して公的に入手可能である。このアルゴリズムは、第１に、データベース配列中の同一の長さのワードとアラインした場合に、幾分かの正の値の閾値スコア「Ｔ」とマッチするか、またはそれを満たす、クエリー配列中の長さ「Ｗ」の短いワードを同定することによって、高スコアリング配列対（ＨＳＰ）を同定することを伴う。Ｔは、近隣ワードスコア閾値と称される（Altschulら、前掲を参照のこと）。これらの初期近隣ワードヒットは、それらを含有するより長いＨＳＰを見出すための検索を開始するためのシードとして作用する。次いで、累積アラインメントスコアが増加し得る限り、ワードヒットを各配���に沿って両方向に広げる。累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメータ「Ｍ」（マッチする残基の対の報酬スコア；常に＞０）および「Ｎ」（ミスマッチする残基のペナルティースコア；常に＜０）を使用して算出する。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスを使用して累積スコアを算出する。累積アラインメントスコアがその最大達成値から量「Ｘ」だけ外れるとき、１つまたは複数の負のスコアを有する残基アラインメントの累積のために累積スコアがゼロまたはそれより小さくなるとき、またはいずれかの配列の末端に到達した時に、各方向でのワードヒットの拡張を停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列のための）は、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列のためには、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用する（例えば、HenikoffおよびHenikoff、Proc.Natl. Acad. Sci. USA  ８９巻：１０９１５頁［１９８９年］を参照のこと）。配列アラインメントおよび配列同一性％の例示的決定は、提供されたデフォルトパラメータを使用して、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎソフトウェアパッケージ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）中のＢＥＳＴＦＩＴまたはＧＡＰプログラムを用いることができる。
【００８７】
本明細書において使用する場合、「参照配列」とは、配列比較の基礎として使用される規定された配列を指す。参照配列は、大きな配列のサブセット、例えば、全長遺伝子またはポリペプチド配列のセグメントであり得る。一般に、参照配列は、少なくとも２０のヌクレオチドもしくはアミノ酸残基の長さ、少なくとも２５残基の長さ、少なくとも５０残基の長さ、少なくとも１００残基の長さまたは核酸もしくはポリペプチドの全長である。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドが各々、（１）２つの配列間で同様である配列（すなわち、完全配列の部分）を含み得る、および（２）２つの配列間で多様である配列をさらに含み得るので、２つ（またはそれより多い）のポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列比較は、通常、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列を「比較ウィンドウ」にわたって比較して、配列類似性の局所領域を同定および比較することによって実施される。いくつかの実施形態では、「参照配列」は、一次アミノ酸配列に基づいたものであり得、ここでは、参照配列は、一次配列において１つまたは複数の変化を有し得る配列である。例えば、語句「Ｘ３９に対応する残基にバリンを有する配列番号４に基づく参照配列」は、配列番号４中のＸ３９位に対応する残基（例えば、アラニン）が、バリンに変更されている参照配列を指す。
【００８８】
本明細書において使用する場合、「比較ウィンドウ」とは、配列を、少なくとも２０の連続ヌクレオチドまたはアミノ酸の参照配列と比較することができ、比較ウィンドウ中の配列の部分が、２つの配列の最適アラインメントについて参照配列（付加も欠失も含まない）と比較して、２０パーセントまたはそれより少ない付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る、少なくとも約２０の連続ヌクレオチド位置またはアミノ酸残基の概念的なセグメントを指す。比較ウィンドウは、２０連続残基より長いものである場合もあり、必要に応じて、３０、４０、５０、１００またはそれより長いウィンドウを含む。
【００８９】
本明細書において使用する場合、「に対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ  ｔｏ）」、「に関して（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｔｏ）」および「に対して（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｔｏ）」は、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列の番号付けに関連して使用される場合に、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列が、参照配列と比較される場合の具体的な参照配列の残基の番号付けを指す。言い換えれば、所与のポリマーの残基数または残基位置は、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列内の残基の実際の数値位置ではなく参照配列に関して指定される。例えば、遺伝子操作されたリガーゼのものなどの所与のアミノ酸配列を、２つの配列間の残基マッチを最適化するようにギャップを導入することによって参照配列に対してアラインできる。これらの場合には、ギャップは存在するが、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列中の残基の番号付けは、アラインされている参照配列に関して行う。いくつかの実施形態では、配列はタグが付けられる（例えば、ヒスチジンタグを用いて）。
【００９０】
本明細書において使用する場合、「アミノ酸の相違」および「残基の相違」とは、参照配列中の対応する位置でのアミノ酸残基に対する、ポリペプチド配列の位置でのアミノ酸残基における相違を指す。アミノ酸の相違の位置は、一般に、本明細書において「Ｘｎ」と称され、ｎは、残基の相違が基づく、参照配列中の対応する位置を指す。例えば、「配列番号４と比較したＸ９１位での残基の相違」とは、配列番号４の９１位に対応するポリペプチド位置でのアミノ酸残基の相違を指す。したがって、配列番号４の参照ポリペプチドが、９１位にアラニンを有する場合には、「配列番号４と比較したＸ９１位での残基の相違」とは、配列番号４の９１位に対応するポリペプチドの位置でのアラニン以外の任意の残基のアミノ酸置換を指す。本明細書におけるほとんどの例では、ある位置での具体的なアミノ酸残基の相違は、「ＸｎＹ」として示され、ここでは、「Ｘｎ」は、参照ポリペプチドの対応する残基および位置を指し示し（上記のように）、「Ｙ」は、遺伝子操作されたポリペプチド中に見られるアミノ酸（すなわち、参照ポリペプチド中とは異なる残基）の一文字識別子である。いくつかの場合には（例えば、実施例の表における）、本開示はまた、従来の表示法「ＡｎＢ」によって表される具体的なアミノ酸の相違も提供し、ここでは、Ａは、参照配列中の残基の一文字識別子であり、「ｎ」は、参照配列中の残基位置の数であり、Ｂは、遺伝子操作されたポリペプチドの配列中の残基置換の一文字識別子である。いくつかの場合には、本開示のポリペプチドは、参照配列に対して残基の相違が存在する具体的な位置のリストによって示される、参照配列に対する１つまたは複数のアミノ酸残基の相違を含み得る。ポリペプチドの具体的な残基位置において１つより多いアミノ酸を使用することができるいくつかの実施形態では、使用できる種々のアミノ酸残基は、「／」によってわけられる（例えば、Ｘ３０７Ｇ／Ｘ３０７ＱまたはＸ３０７Ｇ／Ｑ）。本開示は、保存的および非保存的アミノ酸置換のいずれか／または両方を含む１つまたは複数のアミノ酸の相違を含む遺伝子操作されたポリペプチド配列を含む。
【００９１】
本明細書において使用する場合、用語「アミノ酸置換セット」および「置換セット」とは、ポリペプチド配列内のアミノ酸置換の群を指す。いくつかの実施形態では、置換セットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５またはそれより多いアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、置換セットは、実施例の表のいずれかに列挙されるいずれかのバリアントリガーゼポリペプチド中に存在するアミノ酸置換のセットを指す。これらの置換セットでは、個々の置換は、セミコロン（「；」；例えば、Ｃ１６５Ａ；Ｓ１８１Ｔ；Ｋ２９９Ｐ）またはスラッシュ（「／」；例えば、Ｃ１６５Ａ／Ｓ１８１Ｔ／Ｋ２９９Ｐ）によってわけられる。
【００９２】
本明細書において使用する場合、「保存的アミノ酸置換」とは、残基の、同様の側鎖を有する異なる残基との置換を指し、したがって、通常、ポリペプチド中のアミノ酸の、同一または同様に定義されたクラスのアミノ酸との置換を含む。例として、限定するものではないが、脂肪族側鎖を有するアミノ酸は、別の脂肪族アミノ酸で置換されることができ（例えば、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン）、ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸は、ヒドロキシル側鎖を有する別のアミノ酸で置換され（例えば、セリンおよびトレオニン）、芳香族側鎖を有するアミノ酸は、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸で置換され（例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびヒスチジン）、塩基性側鎖を有するアミノ酸は、塩基性側鎖を有する別のアミノ酸で置換され（例えば、リシンおよびアルギニン）、酸性側鎖を有するアミノ酸は、酸性側鎖を有する別のアミノ酸で置換され（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）；ならびに疎水性または親水性アミノ酸は、それぞれ、別の疎水性または親水性アミノ酸で置換される。
【００９３】
本明細書において使用する場合、「非保存的置換」とは、ポリペプチド中のアミノ酸の、有意に異なる側鎖特性を有するアミノ酸との置換を指す。非保存的置換は、規定の群内ではなく規定の群間のアミノ酸を使用してもよく、（ａ）置換の領域のペプチド骨格の構造（例えば、プロリンのグリシンとの）、（ｂ）電荷または疎水性、および／または（ｃ）側鎖の嵩高さに影響を及ぼす。例として、制限するものではないが、例示的非保存的置換として、塩基性または脂肪族アミノ酸との酸性アミノ酸置換、小さいアミノ酸との芳香族アミノ酸置換および疎水性アミノ酸との親水性アミノ酸置換が挙げられる。
【００９４】
本明細書において使用する場合、「欠失」とは、参照ポリペプチドからの１個または複数のアミノ酸の除去によるポリペプチドへの修飾を指す。欠失は、遺伝子操作されたトランスアミナーゼ酵素の酵素活性を保持しながら、および／または改善された特性を保持しながらの、１個もしくはそれより多いアミノ酸、２個もしくはそれより多いアミノ酸、５個もしくはそれより多いアミノ酸、１０個もしくはそれより多いアミノ酸、１５個もしくはそれより多いアミノ酸または２０個もしくはそれより多いアミノ酸、参照酵素を構成するアミノ酸の総数の最大１０％またはアミノ酸の総数の最大２０％の除去を含み得る。欠失は、ポリペプチドの内部部分および／または末端部分に向けられ得る。種々の実施形態では、欠失は、連続セグメントを含み得る、または不連続であり得る。
【００９５】
本明細書において使用する場合、「挿入」とは、参照ポリペプチドからの１個または複数のアミノ酸の付加によるポリペプチドへの修飾を指す。挿入は、ポリペプチドの内部部分においてであっても、カルボキシ末端またはアミノ末端に対してであってもよい。挿入は、当技術分野で公知であるように、本明細書において使用する場合、融合タンパク質を含む。挿入は、アミノ酸の連続セグメントである場合も、天然に存在するポリペプチド中の１個または複数のアミノ酸によってわけられる場合もある。
【００９６】
本明細書において使用する場合、「機能的断片」および「生物学的に活性な断片」は、本明細書において同義的に使用され、アミノ末端および／もしくはカルボキシ末端欠失ならびに／または内部欠失を有するが、残存するアミノ酸配列は、比較されている配列（例えば、本発明の全長の遺伝子操作されたリガーゼ）中の対応する位置と同一であり、全長ポリペプチドの活性の実質的にすべてを保持するポリペプチドを指す。
【００９７】
本明細書において使用する場合、「単離されたポリペプチド」とは、ポリペプチドに天然に付随するその他の混入物（例えば、タンパク質、脂質およびポリヌクレオチド）から実質的にわけられているポリペプチドを指す。この用語は、その天然に存在する環境または発現系（例えば、宿主細胞もしくはｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成）から回収または精製されているポリペプチドを包含する。組換えリガーゼポリペプチドは、細胞内に存在し得る、細胞培地中に存在し得る、または溶解物もしくは単離された調製物などの種々の形態で調製され得る。そのようなものとして、いくつかの実施形態では、本明細書において提供される組換えリガーゼポリペプチドは、単離されたポリペプチドである。
【００９８】
本明細書において使用する場合、「実質的に純粋なポリペプチド」とは、ポリペプチド種が、存在する主な種であり（すなわち、モルベースで、または重量ベースで、組成物中の任意のその他の個々の高分子種よりも豊富である）、一般に、目的の種が、モルまたは重量％で存在する高分子種の少なくとも約５０パーセントを含む場合に、実質的に精製された組成物である組成物を指す。一般に、実質的に純粋なリガーゼ組成物は、組成物中に存在するモルまたは重量％ですべての高分子種の約６０％またはそれより多く、約７０％またはそれより多く、約８０％またはそれより多く、約９０％またはそれより多く、約９５％またはそれより多くおよび約９８％またはそれより多くを含む。いくつかの実施形態では、目的の種は、本質的に均一性に精製され（すなわち、混入物種は、従来の検出法によって組成物において検出され得ない）、組成物は、単一高分子種から本質的になる。溶媒種、小分子（＜５００ダルトン）および元素イオン種は、考慮される高分子種ではない。いくつかの実施形態では、単離された組換えリガーゼポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチド組成物である。
【００９９】
本明細書において使用する場合、「改善された酵素特性」とは、参照リガーゼポリペプチド、例えば、野生型リガーゼポリペプチド（例えば、配列番号２の野生型Ｔ４リガーゼ）または別の遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドと比較して任意の酵素特性における改善を示す遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドを指す。改善された特性として、それだけには限らないが、タンパク質発現の増加、熱活性の増加、熱安定性の増加、安定性の増加、酵素活性の増加、基質特異性および／または親和性の増加、比活性の増加、基質に対する耐性および／または最終生成物阻害の増加、化学的安定性の増加、化学選択性の改善、溶媒安定性の改善、酸性ｐＨに対する耐性の増加、タンパク質分解活性に対する耐性の増加（すなわち、タンパク質分解に対する低減された感受性）、溶解度の増加ならびに温度プロファイルの変更などの特性が挙げられる。
【０１００】
本明細書において使用する場合、「酵素活性の増加」および「触媒活性の増強」とは、参照リガーゼ酵素（例えば、野生型Ｔ４リガーゼおよび／または別の遺伝子操作されたリガーゼ）と比較した、比活性（例えば、生成された生成物／時間／重量タンパク質）の増加および／または基質の生成物への変換パーセント（例えば、指し示された量のリガーゼを使用する指し示された期間での基質の出発量の生成物への変換パーセント）の増加によって表すことができる、遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドの改善された特性を指す。酵素活性を決定するための例示的方法は、実施例に提供されている。Ｋｍ、Ｖｍａｘまたはｋｃａｔの古典的な酵素特性を含む、酵素活性に関する任意の特性は影響を受ける可能性があり、その変化は、酵素活性の増加につながり得る。酵素活性の改善は、対応する野生型酵素の酵素活性の約１．１倍から、リガーゼポリペプチドが由来した天然に存在するリガーゼまたは別の遺伝子操作されたリガーゼよりも２倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍、１５０倍、２００倍程度またはそれより高い酵素活性であり得る。
【０１０１】
本明細書において同義的に使用される用語「タンパク質分解活性」および「タンパク質分解」とは、より小さいポリペプチドまたはアミノ酸へのタンパク質の分解を指す。タンパク質の分解は、一般に、プロテアーゼ（プロテイナーゼ）酵素によるペプチド結合の加水分解の結果である。プロテアーゼ酵素として、それだけには限らないが、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、カルボキシペプチダーゼＡおよびＢならびにペプチダーゼ（例えば、アミノペプチダーゼ、ジペプチダーゼおよびエンテロペプチダーゼ）が挙げられる。
【０１０２】
語句「タンパク質分解に対する感受性を低減すること」および「タンパク質分解感受性を低減すること」は、本明細書において同義的に使用され、本発明による遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドは、１種または複数種のプロテアーゼを用いる処置後に、標準アッセイ（例えば、実施例において開示されるような）において、参照リガーゼと比較してより高い酵素活性を有するであろうことを意味する。
【０１０３】
本明細書において使用する場合、「変換」とは、基質（複数可）の、対応する生成物（複数可）への酵素変換（または生体内変化）を指す。「変換パーセント」とは、指し示された条件下で期間内に生成物に変換される基質のパーセントを指す。したがって、リガーゼポリペプチドの「酵素活性」または「活性」は、具体的な期間での基質の生成物への「変換パーセント」として表すことができる。
【０１０４】
本明細書において使用する場合、「ハイブリダイゼーションストリンジェンシー」は、核酸のハイブリダイゼーションにおける洗浄条件などのハイブリダイゼーション条件に関する。一般に、ハイブリダイゼーション反応は、低ストリンジェンシーと、それに続く変動するがより高いストリンジェンシーの洗浄の条件下で実施する。用語「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション」とは、標的ＤＮＡが、標的ＤＮＡに対して約６０％の同一性、好ましくは、約７５％の同一性、約８５％の同一性を有し、標的ポリヌクレオチドに対して約９０％を超える同一性を有する相補的核酸と結合することを可能にする条件を指す。例示的な中程度にストリンジェントな条件は、４２℃での５０％ホルムアミド、５×デンハート溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％  ＳＤＳにおけるハイブリダイゼーションと、それに続く、４２℃での０．２×ＳＳＰＥ、０．２％  ＳＤＳにおける洗浄と同等の条件である。「高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション」とは、一般に、規定のポリヌクレオチド配列の溶液条件下で決定されるような熱融解温度Ｔｍから約１０℃またはそれより低い条件を指す。いくつかの実施形態では、高ストリンジェンシー条件とは、６５℃での０．０１８Ｍ  ＮａＣｌ中で安定なハイブリッドを形成する核酸配列のみのハイブリダイゼーションを可能にする条件（すなわち、ハイブリッドが６５℃での０．０１８Ｍ  ＮａＣｌ中で安定でない場合には、本明細書において考慮されるような高ストリンジェンシー条件下では安定でない）を指す。高ストリンジェンシー条件は、例えば、４２℃での５０％ホルムアミド、５×デンハート溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％  ＳＤＳと同等の条件におけるハイブリダイゼーションと、それに続く、６５℃での０．１×ＳＳＰＥおよび０．１％  ＳＤＳにおける洗浄によって提供され得る。別の高ストリンジェンシー条件は、６５℃で０．１％（ｗ：ｖ）ＳＤＳを含有する５×ＳＳＣにおいてハイブリダイズすることと同等の条件においてハイブリダイズすることおよび６５℃で０．１％  ＳＤＳを含有する０．１×ＳＳＣにおいて洗浄することである。その他の高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件ならびに中程度にストリンジェントな条件は、上記で引用された参考文献に記載されている。
【０１０５】
本明細書において使用する場合、「最適化されたコドン」とは、コードされるタンパク質が特定の生物においてより効率的に発現されるように、タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコドンの、その生物において優先的に使用されるものへの変化を指す。ほとんどのアミノ酸は、「同義語」または「同義の」コドンと呼ばれるいくつかのコドンによって表される点で遺伝暗号は縮重しているが、特定の生物によるコドン使用は、非ランダムであり、特定のコドントリプレットに向けて偏りがあるということは周知である。このコドン使用の偏りは、所与の遺伝子、共通の機能または先祖起源の遺伝子、低コピー数タンパク質に対して高度に発現されたタンパク質および生物のゲノムの凝集タンパク質コード領域に関してより高い場合がある。いくつかの実施形態では、リガーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドは、発現のために選択された宿主生物からの最適生成のためにコドン最適化される。
【０１０６】
本明細書において使用する場合、「制御配列」とは、本明細書において、本開示のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現にとって必要である、もしくは有利であるすべての構成要素を含むことを指す。各制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列にとって天然であっても、外来であってもよい。このような制御配列として、それだけには限らないが、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター配列、シグナルペプチド配列、開始配列および転写ターミネーターが挙げられる。最小では、制御配列は、プロモーターならびに転写および翻訳停止シグナルを含む。いくつかの実施形態では、制御配列には、制御配列の、ポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域とのライゲーションを促進する具体的な制限部位を導入する目的でリンカーが提供される。
【０１０７】
「作動可能に連結された」は、制御配列が目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を指示または調節するように、制御配列が、目的のポリヌクレオチドに対する位置に適宜配置される（すなわち、機能的関係で）立体配置として本明細書において定義される。
【０１０８】
本明細書において使用する場合、「プロモーター配列」とは、コード配列などの目的のポリヌクレオチドの発現のために宿主細胞によって認識される核酸配列を指す。プロモーター配列は、目的のポリヌクレオチドの発現を媒介する転写制御配列を含有する。プロモーターは、変異体、トランケート型およびハイブリッドプロモーターを含む、選択した宿主細胞において転写活性を示す任意の核酸配列であってよく、宿主細胞にとって同属もしくは異種いずれかの細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。
【０１０９】
本明細書において使用する場合、「適した反応条件」とは、本開示のリガーゼポリペプチドが、基質を所望の生成物化合物に変換可能である、酵素変換反応溶液における条件（例えば、酵素負荷、基質負荷、温度、ｐＨ、緩衝液、共溶媒などの範囲）を指す。例示的な「適した反応条件」が本明細書において提供されている（実施例を参照のこと）。
【０１１０】
本明細書において使用する場合、「化合物負荷」または「酵素負荷」などにおける「負荷」とは、反応の開始時の反応混合物中の構成成分の濃度または量を指す。酵素変換反応の関連で「基質」とは、リガーゼポリペプチドによって作用される化合物または分子を指す。
【０１１１】
本明細書において使用する場合、酵素変換プロセスの関連で「生成物」とは、基質に対するリガーゼポリペプチドの作用の結果として生じる化合物または分子を指す。
【０１１２】
本明細書において使用する場合、「培養すること」とは、任意の適した培地（例えば、液体、ゲルまたは固体）を使用して適した条件下で微生物細胞の集団を成長させることを指す。
【０１１３】
組換えポリペプチド（例えば、リガーゼ酵素バリアント）は、当技術分野で公知の任意の適した方法を使用して生成できる。例えば、当業者に周知のさまざまな異なる変異誘発技術がある。さらに、変異誘発キットも多数の商業的な分子生物学供給業者から入手可能である。規定のアミノ酸での特異的置換（部位特異的に）、遺伝子の局在領域における特異的もしくはランダム変異（領域特異的）または全遺伝子にわたるランダム変異誘発（例えば、飽和変異誘発）を行うための方法が利用可能である。それだけには限らないが、ＰＣＲを使用する一本鎖ＤＮＡもしくは二本鎖ＤＮＡの部位特異的変異誘発、カセット変異誘発、遺伝子合成、エラー−プローンＰＣＲ、シャッフリングおよび化学的飽和変異誘発または当技術分野で公知の任意のその他の適した方法を含む、酵素バリアントを作製するための多数の適した方法が当業者に公知である。ＤＮＡおよびタンパク質エンジニアリングのために使用される方法の限定されない例が以下の特許において提供されている：米国特許第６，１１７，６７９号、同６，４２０，１７５号、同６，３７６，２４６号、同６，５８６，１８２号、同７，７４７，３９１号、同７，７４７，３９３号、同７，７８３，４２８号および同８，３８３，３４６号。バリアントが生成された後、それらを任意の所望の特性（例えば、高い活性もしくは活性の増加または低い活性もしくは活性の低減、熱活性の増加、熱安定性の増加および／または酸性ｐＨ安定性など）についてスクリーニングできる。いくつかの実施形態では、「組換えリガーゼポリペプチド」（本明細書において「遺伝子操作されたリガーゼポリペプチド」、「バリアントリガーゼ酵素」および「リガーゼバリアント」とも称される）が使用される。
【０１１４】
本明細書において使用する場合、「ベクター」は、ＤＮＡ配列を細胞中に導入するためのＤＮＡ構築物である。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＤＮＡ配列においてコードされるポリペプチドの適した宿主において発現達成可能な、適した制御配列に作動可能に連結されている発現ベクターである。いくつかの実施形態では、「発現ベクター」は、宿主細胞において発現を駆動するためにＤＮＡ配列（例えば、導入遺伝子）に作動可能に連結されているプロモーター配列を有し、いくつかの実施形態では、転写ターミネーター配列も含む。
【０１１５】
本明細書において使用する場合、用語「発現」は、それだけには限らないが、転写、転写後修飾、翻訳および翻訳後修飾を含む、ポリペプチドの生成に関与する任意のステップを含む。いくつかの実施形態では、用語はまた、細胞からのポリペプチドの分泌を包含する。
【０１１６】
本明細書において使用する場合、用語「生成する」とは、細胞によるタンパク質および／またはその他の化合物の生成を指す。この用語は、それだけには限らないが、転写、転写後修飾、翻訳および翻訳後修飾を含む、ポリペプチドの生成に関与する任意のステップを包含することは意図される。いくつかの実施形態では、この用語はまた、細胞からのポリペプチドの分泌を包含する。
【０１１７】
本明細書において使用する場合、アミノ酸またはヌクレオチド配列（例えば、プロモーター配列、シグナルペプチド、ターミネーター配列など）は、２つの配列が自然界で関連していない場合には、ともに作動可能に連結される別の配列に対して「異種」である。
【０１１８】
本明細書において使用する場合、用語「宿主細胞」および「宿主株」とは、本明細書において提供されるＤＮＡ（例えば、少なくとも１種のリガーゼバリアントをコードするポリヌクレオチド配列）を含む発現ベクターにとって適した宿主を指す。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、当技術分野で公知の組換えＤＮＡ技術を使用して構築されたベクターを用いて形質転換またはトランスフェクトされている原核細胞または真核細胞である。
【０１１９】
本明細書において使用する場合、用語「類似体」とは、参照ポリペプチドと、７０％を超える配列同一性を有するが、１００％未満の配列同一性（例えば、７５％、７８％、８０％、８３％、８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％を超える配列同一性）を有するポリペプチドを意味する。いくつかの実施形態では、類似体は、ホモアルギニン、オルニチンおよびノルバリンを含むがそれに限定されない天然に存在しないアミノ酸残基ならびに天然に存在するアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、類似体はまた、１個または複数のＤ−アミノ酸残基および２個またはそれより多いアミノ酸残基間の非ペプチド連結を含む。
【０１２０】
本明細書において使用する場合、用語「有効量」とは、所望の結果をもたらすのに十分な量を意味する。当業者は、日常的な実験を使用することによって有効量を決定することができる。
【０１２１】
用語「単離された」および「精製された」は、天然に会合している少なくとも１種のその他の構成成分から除去されている、分子（例えば、単離された核酸、ポリペプチドなど）またはその他の構成成分を指すために使用される。用語「精製された」は、絶対純度を必要とせず、むしろ、相対的定義として意図される。
【０１２２】
用語「対象」は、ヒト、非ヒト霊長類、家畜、コンパニオンアニマルおよび実験動物（例えば、げっ歯類およびウサギ目の動物（lagamorph））などの哺乳動物を包含する。この用語は、雌ならびに雄を包含すると意図される。
【０１２３】
本明細書において使用する場合、用語「患者」とは、疾患を評価されている、処置される、または経験している任意の対象を意味する。
【０１２４】
本明細書において使用する場合、「組成物」および「製剤」は少なくとも１種（at least one）を含む生成物を包含する。
【０１２５】
本明細書において使用する場合、「細胞不含ＤＮＡ」とは、血流中を自由に循環し、細胞によって含有されない、または細胞と会合しないＤＮＡを指す。いくつかの実施形態では、細胞不含ＤＮＡは、正常な体細胞もしくは生殖系列細胞、がん細胞、胎児細胞、微生物細胞またはウイルスに元々由来する、それから放出されるＤＮＡを含む。
【０１２６】
本明細書において使用する場合、「インデックスホッピング」とは、シーケンシングリードが別のライブラリー由来のインデックスで標識されたライブラリーに不正確に割り当てられるプロセスを指す。インデックスホッピングは、ライブラリークリーンアップの際に、ライゲートされていないアダプター分子が効率的に除去されず、その後、シーケンシングワークフローに入るその後のステップでライブラリー断片に組み込まれる場合に起こり得る。
遺伝子操作されたリガーゼポリペプチド：
【０１２７】
特定のリガーゼバリアント（すなわち、遺伝子操作されたリガーゼポリペプチド）が、野生型リガーゼまたは参照リガーゼの配列中の特定のアミノ酸残基の修飾への参照によって言及される場合には、同等位置（複数可）（それぞれのアミノ酸配列間の最適アミノ酸配列アラインメントから決定されるような）において修飾された別のリガーゼのバリアントが本明細書において包含されるということは理解されるべきである。
【０１２８】
本発明の遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドバリアントは、実施例において示されるような野生型Ｔ４  ＤＮＡリガーゼよりもかなり速い速度でプレート捕捉ハイスループットアッセイにおける単一末端ライゲーション捕捉を実施する。さらに、これらのバリアントリガーゼは、ＰＥＧなどの剤の不在下でライゲーション反応を実施することが可能である。さらに、これらのリガーゼバリアントは、阻害剤耐性の増加を示す。
【０１２９】
本発明の遺伝子操作されたリガーゼバリアントは、ＮＧＳおよびその他の診断法に適したＤＮＡライブラリーを作り出す。これらのリガーゼバリアントは、溶液中で、および固定化された実施形態において使用される。
【０１３０】
いくつかの追加の実施形態では、本発明の遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドは、配列番号２、６、３２、３４および／または３８に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を含むポリペプチドを含む。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドは、少なくとも１種の遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドをコードする少なくとも１種のポリヌクレオチド配列を含む微生物を、遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドを生成するために資する条件下で培養することによって生成される。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドを、続いて、得られた培養培地および／または細胞から回収する。
【０１３２】
本発明は、リガーゼ活性を有する例示的な遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドを提供する。実施例は、具体的なアミノ酸配列の特徴を、遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドの機能活性と関連付ける配列構造情報を示す表を提供する。この構造−機能相関情報は、例示的な遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドについて、配列番号２、６、３２、３４および／または３８の参照の遺伝子操作されたポリペプチドに対する具体的なアミノ酸残基の相違ならびに関連する実験によって決定された活性データの形態で提供される。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、リガーゼ活性を有する本発明の遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドは、参照配列の配列番号２、６、３２、３４および／または３８に対して少なくとも８５％の配列同一性を有し、参照配列（例えば、野生型Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ）と比較して少なくとも１つの改善された特性を示すアミノ酸配列を含む。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改善された特性を示す遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドは、配列番号２、６、３２、３４および／または３８と、少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれを超えるアミノ酸配列同一性ならびに配列番号２、６、３２、３４および／または３８と比較して、１つまたは複数のアミノ酸位置に（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、２０の、またはそれより多いアミノ酸位置などに）アミノ酸残基の相違を有する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドは、実施例において提供される表に列挙されるポリペプチドである。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、本発明は、遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドの機能的断片を提供する。いくつかの実施形態では、機能的断片は、それが由来した遺伝子操作されたリガーゼポリペプチド（すなわち、親の遺伝子操作されたリガーゼ）の活性の少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％を含む。いくつかの実施形態では、機能的断片は、遺伝子操作されたリガーゼの親配列の少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％を含む。いくつかの実施形態では、機能的断片は、５個未満、１０個未満、１５個未満、１０個未満、２５個未満、３０個未満、３５個未満、４０個未満、４５個未満および５０個未満のアミノ酸だけトランケートされる。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、本発明は、遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドの機能的断片を提供する。いくつかの実施形態では、機能的断片は、それが由来した遺伝子操作されたリガーゼポリペプチド（すなわち、親の遺伝子操作されたリガーゼ）の活性の少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を含む。いくつかの実施形態では、機能的断片は、遺伝子操作されたリガーゼの親配列の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を含む。いくつかの実施形態では、機能的断片は、５個未満、１０個未満、１５個未満、１０個未満、２５個未満、３０個未満、３５個未満、４０個未満、４５個未満、５０個未満、５５個未満、６０個未満、６５個未満または７０個未満のアミノ酸だけトランケートされる。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改善された特性を示す遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドは、配列番号２、６、３２、３４および／または３８と、少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれを超えるアミノ酸配列同一性ならびに配列番号２、６、３２、３４および／または３８と比較して、１つまたは複数のアミノ酸位置に（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５の、またはそれより多いアミノ酸位置などに）アミノ酸残基の相違を有する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたリガーゼは、配列番号２、６、３２、３４および／または３８に対して少なくとも９０％の配列同一性を含み、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０の、またはそれより多いアミノ酸位置のアミノ酸の相違を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドは、配列番号６、３２、３４および／または３８の配列からなる。
遺伝子操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、発現ベクターおよび宿主細胞：
【０１３８】
本発明は、本明細書において記載される遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現可能な組換えポリヌクレオチドを作り出すように遺伝子発現を制御する１つまたは複数の異種調節配列と作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたリガーゼポリペプチド（複数可）をコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含有する発現構築物を、対応するリガーゼポリペプチド（複数可）を発現するために適切な宿主細胞に導入する。
【０１３９】
当業者には理解されるとおり、タンパク質配列を入手可能であることおよび種々のアミノ酸に対応するコドンの知識によって、主題のポリペプチドをコード可能なすべてのポリヌクレオチドの記載が提供される。同一アミノ酸が代替コドンまたは同義コドンによってコードされる遺伝暗号の縮重によって、そのすべてが遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドをコードする極めて多数の核酸を作製することが可能である。したがって、本発明は、可能なコドン選択に基づいて組合せを選択することによって、本明細書において記載されるリガーゼポリペプチドをコードする作製できるリガーゼポリヌクレオチドのありとあらゆる可能な変形の生成のための方法および組成物を提供し、実施例において（例えば、種々の表において）提示されるアミノ酸配列を含む本明細書において記載される任意のポリペプチドについて開示されるすべてのこのような変形が具体的に考慮されるべきである。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、コドンは、タンパク質生成のために選択された宿主細胞による利用に対して最適化されることが好ましい。例えば、細菌における発現のためには、細菌において使用される好ましいコドンが通常使用される。結果として、遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドをコードするコドン最適化されたポリヌクレオチドは、全長コード領域中の約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９０％より多いコドン位置で好ましいコドンを含有する。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、リガーゼポリヌクレオチドは、本明細書において開示される特性を有するリガーゼ活性を有する遺伝子操作されたポリペプチドをコードし、ポリペプチドは、配列番号２、６、３２、３４および／もしくは３８から選択される参照配列または任意のバリアントのアミノ酸配列（例えば、実施例において提供されるもの）に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列ならびに配列番号２、６、３２、３４および／もしくは３８の参照ポリヌクレオチドまたは実施例において開示される任意のバリアントのアミノ酸配列と比較して１つまたは複数の残基の相違（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０の、またはそれより多いアミノ酸残基位置）を含む。いくつかの実施形態では、参照配列は、配列番号２、６、３２、３４および／または３８から選択される。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたリガーゼバリアントは、配列番号３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２および／または５４に示されるポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたリガーゼバリアントは、実施例（例えば、表４，１、４．２、４．３、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５および６．１）において提供されるようなバリアントリガーゼ１から２６１の置換（複数可）または置換セット（複数可）を含む。
【０１４２】
本発明は、本明細書において提供される遺伝子操作されたリガーゼバリアントをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１、５、３１、３３および／もしくは３７から選択される参照配列または任意のバリアント（実施例において提供されるもの）のアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える同一性を有するヌクレオチド配列ならびに配列番号１、５、３１、３７および／もしくは３８の参照ポリヌクレオチドまたは実施例において開示される任意のバリアントのアミノ酸配列と比較して１つまたは複数の残基の相違（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０の、またはそれより多いアミノ酸残基位置）を含む。いくつかの実施形態では、参照配列は、配列番号１、５、３１、３３および／または３７から選択される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、高度にストリンジェントな条件下で、配列番号１、５、３１、３３および／または３７から選択される参照ポリヌクレオチド配列もしくはその相補体あるいは本明細書において提供されるバリアントリガーゼポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチド配列とハイブリダイズ可能である。いくつかの実施形態では、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドは、配列番号２、６、３２、３４および／または３８と比較して１つまたは複数の残基の相違を有するアミノ酸配列を含むリガーゼポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたリガーゼバリアントは、配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１および／または５３に示されるポリヌクレオチド配列によってコードされる。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、本明細書における遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドのいずれかをコードする単離されたポリヌクレオチドは、リガーゼポリペプチドの発現を促進する種々の方法で操作される。いくつかの実施形態では、リガーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、リガーゼポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現を調節するために１つまたは複数の制御配列が存在する発現ベクターを含む。利用される発現ベクターに応じて、単離されたポリヌクレオチドの、ベクターへのその挿入に先立つ操作が望まれる、または必要であることがある。組換えＤＮＡ法を利用してポリヌクレオチドおよび核酸配列を修飾する技術は、当技術分野で周知である。いくつかの実施形態では、制御配列として、とりわけ、プロモーター、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、シグナルペプチド配列および転写ターミネーターが挙げられる。いくつかの実施形態では、適したプロモーターは、宿主細胞選択に基づいて選択される。細菌宿主細胞については、本開示の核酸構築物の転写を指示する、適したプロモーターとして、それだけには限らないが、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｌａｃオペロンから得られたプロモーター、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒアガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓレバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓアルファ−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  マルトース生成アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓアルファ−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子ならびに原核生物のベータ−ラクタマーゼ遺伝子（例えば、Villa-Kamaroffら、Proc. Natl Acad. Sci. USA  ７５巻：３７２７〜３７３１頁［１９７８年］を参照のこと）ならびにｔａｃプロモーター（例えば、DeBoerら、Proc. Natl Acad. Sci. USA  ８０巻：２１〜２５頁［１９８３年］を参照のこと）が挙げられる。糸状菌宿主細胞の例示的プロモーターとして、それだけには限らないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ中性アルファ−アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ酸性安定性アルファ−アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉリパーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅアルカリプロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓアセトアミダーゼおよびＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼ（例えば、ＷＯ９６／００７８７を参照のこと）の遺伝子から得られたプロモーターならびにＮＡ２−ｔｐｉプロモーター（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ中性アルファ−アミラーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子に由来するプロモーターのハイブリッド）ならびにそれらの変異体、トランケート型およびハイブリッドプロモーターが挙げられる。例示的酵母細胞プロモーターは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ３−ホスホグリセレートキナーゼの遺伝子に由来し得る（can be from the genes can be from the genes）。酵母宿主細胞のその他の有用なプロモーターは、当技術分野で公知である（例えば、Romanosら、Yeast  ８巻：４２３〜４８８頁［１９９２年］を参照のこと）。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、制御配列はまた、適した転写ターミネーター配列（すなわち、転写を終結するために宿主細胞によって認識される配列）である。いくつかの実施形態では、終結配列は、リガーゼポリペプチドをコードする核酸配列の３’末端に作動可能に連結される。選択された宿主細胞において機能的である任意の適したターミネーターが本発明において使用される。糸状菌宿主細胞の例示的転写ターミネーターは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒアルファ−グルコシダーゼおよびＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得ることができる。酵母宿主細胞の例示的ターミネーターは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅチトクロームＣ（ＣＹＣ１）およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼの遺伝子から得ることができる。酵母宿主細胞のその他の有用なターミネーターは、当技術分野で公知である（例えば、Romanosら、前掲を参照のこと）。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、制御配列はまた、適したリーダー配列（すなわち、宿主細胞による翻訳にとって重要であるｍＲＮＡの非翻訳領域）である。いくつかの実施形態では、リーダー配列は、リガーゼポリペプチドをコードする核酸配列の５’末端に作動可能に連結される。選択された宿主細胞において機能性である任意の適したリーダー配列は、本発明において使用される。糸状菌宿主細胞の例示的リーダーは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞の適したリーダーは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ３−ホスホグリセレートキナーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ因子およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）の遺伝子から得られる。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、制御配列はまた、ポリアデニル化配列（すなわち、核酸配列の３’末端に作動可能に連結され、転写されると、転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加するシグナルとして宿主細胞によって認識される配列）である。選択された宿主細胞において機能性である任意の適したポリアデニル化配列が、本発明において使用される。糸状菌宿主細胞の例示的ポリアデニル化配列として、それだけには限らないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒアルファ−グルコシダーゼの遺伝子が挙げられる。酵母宿主細胞の有用なポリアデニル化配列は公知である（例えば、GuoおよびSherman、Mol.Cell. Bio.、１５巻：５９８３〜５９９０頁［１９９５年］を参照のこと）。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、制御配列はまた、シグナルペプチド（すなわち、ポリペプチドのアミノ末端に連結されたアミノ酸配列をコードし、細胞の分泌経路にコードされたポリペプチドを向けるコード領域）である。いくつかの実施形態では、核酸配列のコード配列の５’末端は、分泌されるポリペプチドをコードするコード領域のセグメントと、翻訳リーディングフレームで天然に連結されたシグナルペプチドコード領域を本質的に含有する。あるいは、いくつかの実施形態では、コード配列の５’末端は、コード配列にとって外来であるシグナルペプチドコード領域を含有する。発現されたポリペプチドを選択された宿主細胞の分泌経路に向ける任意の適したシグナルペプチドコード領域が、遺伝子操作されたポリペプチド（複数可）の発現のために使用される。細菌宿主細胞の有効なシグナルペプチドコード領域は、それだけには限らないが、バチルスＮＣｌＢ１１８３７マルトース生成アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓアルファ−アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓスブチリシン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓベータ−ラクタマーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｐｒｓＡの遺伝子から得られるものが含まれるシグナルペプチドコード領域である。さらなるシグナルペプチドが当技術分野で公知である（例えば、SimonenおよびPalva、Microbiol.Rev.、５７巻：１０９〜１３７頁［１９９３年］を参照のこと）。いくつかの実施形態では、糸状菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード領域として、それだけには限らないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ中性アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓセルラーゼおよびＨｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａリパーゼの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域が挙げられる。酵母宿主細胞のための有用なシグナルペプチドとして、それだけには限らないが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ因子およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼの遺伝子に由来するものが挙げられる。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、制御配列はまた、ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコードするプロペプチドコード領域である。得られたポリペプチドは、「プロ酵素」、「プロポリペプチド」または「チモーゲン」と称される。プロポリペプチドは、プロポリペプチドからプロペプチドの触媒的または自己触媒的切断によって成熟活性ポリペプチドに変換できる。プロペプチドコード領域は、それだけには限らないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓアルカリプロテアーゼ（ａｐｒＥ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ因子、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼおよびＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａラクターゼの遺伝子を含む任意の適した供給源から得ることができる（例えば、ＷＯ９５／３３８３６を参照のこと）。シグナルペプチドおよびプロペプチド領域の両方が、ポリペプチドのアミノ末端に存在する場合には、プロペプチド領域は、ポリペプチドのアミノ末端と隣り合って位置し、シグナルペプチド領域は、プロペプチド領域のアミノ末端と隣り合って位置する。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、調節配列も利用される。これらの配列は、宿主細胞の成長に対してポリペプチドの発現の調節を促進する。調節システムの例として、調節性化合物の存在を含む、化学的または物理的刺激に応じて遺伝子の発現がオンにされるまたはオフにされるものがある。原核生物の宿主細胞では、適した調節配列として、それだけには限らないが、ｌａｃ、ｔａｃおよびｔｒｐオペレーターシステムが挙げられる。酵母宿主細胞では、適した調節システムとして、それだけには限らないが、ＡＤＨ２システムまたはＧＡＬ１システムが挙げられる。糸状菌では、適した調節配列として、それだけには限らないが、ＴＡＫＡアルファ−アミラーゼプロモーター、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼプロモーターおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅグルコアミラーゼプロモーターが挙げられる。
【０１５０】
別の態様では、本発明は、遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドならびにプロモーターおよびターミネーターなどの１つまたは複数の発現調節領域、複製起点などを、それらが導入されるべき宿主の種類に応じて含む組換え発現ベクターに関する。いくつかの実施形態では、本明細書において記載される種々の核酸および制御配列を一緒に結合して、このような部位でのリガーゼポリペプチドをコードする核酸配列の挿入または置換を可能にする１種または複数種の好都合な制限部位を含む組換え発現ベクターを生成する。あるいは、いくつかの実施形態では、本発明の核酸配列は、核酸配列または配列を含む核酸構築物を、発現にとって適切なベクター中に挿入することによって発現される。発現ベクターの創製を伴ういくつかの実施形態では、コード配列を、コード配列が発現にとって適切な制御配列と作動可能に連結されるようにベクター中に配置する。
【０１５１】
組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ手順に好都合に供され得、リガーゼポリヌクレオチド配列発現が起こり得る任意の適したベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であり得る。ベクターの選択は、通常、ベクターが導入される予定の宿主細胞とのベクターの適合性に応じて変わる。ベクターは、直鎖である場合も、閉環プラスミドである場合もある。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、発現ベクターは、自己複製ベクター（すなわち、その複製が染色体複製と独立している染色体外実体として存在するベクター、例えば、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体または人工染色体）である。ベクターは、自身の複製を保証する任意の手段を含有し得る。いくつかの代替実施形態では、ベクターは、宿主細胞中に導入されるときに、ゲノム中に組み込まれ、組み込まれている染色体（複数可）と一緒に複製されるものである。さらに、いくつかの実施形態では、単一ベクターもしくはプラスミドあるいは宿主細胞のゲノム中に導入されるべき総ＤＮＡを一緒に含有する２つもしくはそれより多いベクターまたはプラスミドおよび／あるいはトランスポゾンを利用する。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、発現ベクターは、形質転換された細胞の容易な選択を可能にする１種または複数種の選択マーカーを含有する。「選択マーカー」は、その生成物が殺生物剤またはウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求株に対する原栄養性などを提供する遺伝子である。細菌選択マーカーの例として、それだけには限らないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓもしくはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のｄａｌ遺伝子またはアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコールもしくはテトラサイクリン耐性などの抗生物質耐性を付与するマーカーが挙げられる。酵母宿主細胞の適したマーカーとして、それだけには限らないが、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１およびＵＲＡ３が挙げられる。糸状菌宿主細胞において使用するための選択マーカーとして、それだけには限らないが、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ；例えば、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓまたはＡ．ｏｒｚｙａｅ由来）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ；例えば、Ｓ．ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ由来）、ｈｐｈ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ；例えば、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓまたはＡ．ｏｒｚｙａｅ由来）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）およびｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）ならびにそれらの等価物が挙げられる。別の態様では、本発明は、本発明の少なくとも１種の遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドをコードする少なくとも１種のポリヌクレオチドであって、宿主細胞における遺伝子操作されたリガーゼ酵素（複数可）の発現のために１種または複数種の制御配列に作動可能に連結されているポリヌクレオチド（複数可）を含む宿主細胞を提供する。本発明の発現ベクターによってコードされるポリペプチドの発現において使用するのに適した宿主細胞は、当技術分野で周知であり、それだけには限らないが、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｌｕｖｉａｌｉｓ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞などの細菌細胞、酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＡＴＣＣ受託番号２０１１７８））などの真菌細胞、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、２９３およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞などの動物細胞ならびに植物細胞が挙げられる。例示的宿主細胞としてまた、種々のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株（例えば、Ｗ３１１０（ΔｆｈｕＡ）およびＢＬ２１）が挙げられる。
【０１５４】
したがって、別の態様では、本発明は、遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドを生成する方法を提供し、本方法は、遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現可能な宿主細胞を、ポリペプチドの発現に適した条件下で培養することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、本明細書において記載されるようなリガーゼポリペプチドを単離および／または精製するステップをさらに含む。
【０１５５】
宿主細胞の適切な培養培地および成長条件は、当技術分野で周知である。リガーゼポリペプチドの発現のためにポリヌクレオチドを細胞に導入するための任意の適した方法が本発明において使用されることが考慮される。適した技術として、それだけには限らないが、エレクトロポレーション、微粒子銃粒子衝撃、リポソーム媒介性トランスフェクション、塩化カルシウムトランスフェクションおよびプロトプラスト融合が挙げられる。
【０１５６】
本明細書において開示される特性を有する遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドは、天然に存在するまたは遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、当技術分野で公知のおよび／もしくは本明細書において記載されるような任意の適した変異誘発ならびに／または定向進化法に付すことによって得ることができる。例示的定向進化技術として、変異誘発および／またはＤＮＡシャッフリングがある（例えば、Stemmer、Proc. Natl. Acad. Sci. USA  ９１巻：１０７４７〜１０７５１頁［１９９４年］；ＷＯ９５／２２６２５；ＷＯ９７／００７８；ＷＯ９７／３５９６６；ＷＯ９８／２７２３０；ＷＯ００／４２６５１；ＷＯ０１／７５７６７および米国特許第６，５３７，７４６号を参照のこと）。使用できるその他の定向進化手順として、とりわけ、互い違い伸長プロセス（ＳｔＥＰ）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換え（例えば、Zhaoら、Nat. Biotechnol.、１６巻：２５８〜２６１頁［１９９８年］）、変異原性ＰＣＲ（例えば、Caldwellら、PCR Methods Appl.、３巻：Ｓ１３６〜Ｓ１４０頁［１９９４年］）およびカセット変異誘発（例えば、Blackら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA  ９３巻：３５２５〜３５２９頁［１９９６年］）が挙げられる。
【０１５７】
変異誘発および定向進化法は、リガーゼをコードするポリヌクレオチドに容易に適用して、発現させ、スクリーニングし、アッセイできるバリアントライブラリーを作製できる。任意の適した変異誘発および定向進化法が、本発明において使用され、当技術分野で周知である（例えば、すべて参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，６０５，７９３号、同５，８１１，２３８号、同５，８３０，７２１号、同５，８３４，２５２号、同５，８３７，４５８号、同５，９２８，９０５号、同６，０９６，５４８号、同６，１１７，６７９号、同６，１３２，９７０号、同６，１６５，７９３号、同６，１８０，４０６号、同６，２５１，６７４号、同６，２６５，２０１号、同６，２７７，６３８号、同６，２８７，８６１号、同６，２８７，８６２号、同６，２９１，２４２号、同６，２９７，０５３号、同６，３０３，３４４号、同６，３０９，８８３号、同６，３１９，７１３号、同６，３１９，７１４号、同６，３２３，０３０号、同６，３２６，２０４号、同６，３３５，１６０号、同６，３３５，１９８号、同６，３４４，３５６号、同６，３５２，８５９号、同６，３５５，４８４号、同６，３５８，７４０号、同６，３５８，７４２号、同６，３６５，３７７号、同６，３６５，４０８号、同６，３６８，８６１号、同６，３７２，４９７号、同６，３３７，１８６号、同６，３７６，２４６号、同６，３７９，９６４号、同６，３８７，７０２号、同６，３９１，５５２号、同６，３９１，６４０号、同６，３９５，５４７号、同６，４０６，８５５号、同６，４０６，９１０号、同６，４１３，７４５号、同６，４１３，７７４号、同６，４２０，１７５号、同６，４２３，５４２号、同６，４２６，２２４号、同６，４３６，６７５号、同６，４４４，４６８号、同６，４５５，２５３号、同６，４７９，６５２号、同６，４８２，６４７号、同６，４８３，０１１号、同６，４８４，１０５号、同６，４８９，１４６号、同６，５００，６１７号、同６，５００，６３９号、同６，５０６，６０２号、同６，５０６，６０３号、同６，５１８，０６５号、同６，５１９，０６５号、同６，５２１，４５３号、同６，５２８，３１１号、同６，５３７，７４６号、同６，５７３，０９８号、同６，５７６，４６７号、同６，５７９，６７８号、同６，５８６，１８２号、同６，６０２，９８６号、同６，６０５，４３０号、同６，６１３，５１４号、同６，６５３，０７２号、同６，６８６，５１５号、同６，７０３，２４０号、同６，７１６，６３１号、同６，８２５，００１号、同６，９０２，９２２号、同６，９１７，８８２号、同６，９４６，２９６号、同６，９６１，６６４号、同６，９９５，０１７号、同７，０２４，３１２号、同７，０５８，５１５号、同７，１０５，２９７号、同７，１４８，０５４号、同７，２２０，５６６号、同７，２８８，３７５号、同７，３８４，３８７号、同７，４２１，３４７号、同７，４３０，４７７号、同７，４６２，４６９号、同７，５３４，５６４号、同７，６２０，５００号、同７，６２０，５０２号、同７，６２９，１７０号、同７，７０２，４６４号、同７，７４７，３９１号、同７，７４７，３９３号、同７，７５１，９８６号、同７，７７６，５９８号、同７，７８３，４２８号、同７，７９５，０３０号、同７，８５３，４１０号、同７，８６８，１３８号、同７，７８３，４２８号、同７，８７３，４７７号、同７，８７３，４９９号、同７，９０４，２４９号、同７，９５７，９１２号、同７，９８１，６１４号、同８，０１４，９６１号、同８，０２９，９８８号、同８，０４８，６７４号、同８，０５８，００１号、同８，０７６，１３８号、同８，１０８，１５０号、同８，１７０，８０６号、同８，２２４，５８０号、同８，３７７，６８１号、同８，３８３，３４６号、同８，４５７，９０３号、同８，５０４，４９８号、同８，５８９，０８５号、同８，７６２，０６６号、同８，７６８，８７１号、同９，５９３，３２６号およびすべての関連ＰＣＴおよび非米国対応物；Lingら、Anal. Biochem.、２５４巻（２号）：１５７〜７８頁［１９９７年］；Daleら、Meth. Mol. Biol.、５７巻：３６９〜７４頁［１９９６年］；Smith、Ann. Rev. Genet.、１９巻：４２３〜４６２頁［１９８５年］；Botsteinら、Science、２２９巻：１１９３〜１２０１頁［１９８５年］；Carter、Biochem. J.、２３７巻：１〜７頁［１９８６年］；Kramerら、Cell、３８巻：８７９〜８８７頁［１９８４年］；Wellsら、Gene、３４巻：３１５〜３２３頁［１９８５年］；Minshullら、Curr. Op. Chem. Biol.、３巻：２８４〜２９０頁［１９９９年］；Christiansら、Nat. Biotechnol.、１７巻：２５９〜２６４頁［１９９９年］；Crameriら、Nature、３９１巻：２８８〜２９１頁［１９９８年］；Crameriら、Nat. Biotechnol.、１５巻：４３６〜４３８頁［１９９７年］；Zhangら、Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A.、９４巻：４５０４〜４５０９頁［１９９７年］；Crameriら、Nat. Biotechnol.、１４巻：３１５〜３１９頁［１９９６年］；Stemmer、Nature、３７０巻：３８９〜３９１頁［１９９４年］；Stemmer、Proc. Nat. Acad. Sci. USA、９１巻：１０７４７〜１０７５１頁［１９９４年］；ＷＯ９５／２２６２５；ＷＯ９７／００７８；ＷＯ９７／３５９６６；ＷＯ９８／２７２３０；ＷＯ００／４２６５１；ＷＯ０１／７５７６７およびＷＯ２００９／１５２３３６を参照のこと）。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、変異誘発処置後に得られた酵素クローンを、酵素調製物を規定の温度（またはその他のアッセイ条件）に付すことおよび熱処置またはその他の適したアッセイ条件後に残存する酵素活性の量を測定することによってスクリーニングする。リガーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するクローンを、次いで、遺伝子から単離し、シーケンシングしてヌクレオチド配列変化（あるとすれば）を同定し、これを使用して宿主細胞において酵素を発現させる。発現ライブラリーから酵素活性を測定することは、当技術分野で公知の任意の適した方法を使用して実施できる（例えば、ＨＰＬＣ解析などの標準的な生化学技術）。
【０１５９】
既知配列の遺伝子操作されたポリペプチドのために、既知合成法に従って標準固相法によって、酵素をコードするポリヌクレオチドを調製できる。いくつかの実施形態では、最大約１００塩基の断片を個別に合成し、次いで、結合して（例えば、酵素的もしくは化学的ライゲーション法またはポリメラーゼ媒介法によって）、所望の連続配列を形成できる。例えば、本明細書において開示されるポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、自動合成法で通常実施されるように、古典的なホスホルアミダイト法を使用して化学的合成によって調製できる（例えば、Beaucageら、Tet. Lett.、２２巻：１８５９〜６９頁［１９８１年］；およびMatthesら、EMBO J.、３：８０１〜０５頁［１９８４年］）。ホスホルアミダイト法に従って、オリゴヌクレオチドを合成する（例えば、自動ＤＮＡシンセサイザーで、精製し、アニーリングし、ライゲーションし、適切なベクターにクローニングする）。
【０１６０】
したがって、いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドを調製する方法は、（ａ）本明細書において記載されるような任意のバリアントのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成することと、（ｂ）ポリヌクレオチドによってコードされるリガーゼポリペプチドを発現させることとを含み得る。方法のいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列は、必要に応じて、１つもしくはいくつかの（例えば、最大３、４、５もしくは最大１０の）アミノ酸残基欠失、挿入および／または置換を有し得る。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、必要に応じて、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜２１、１〜２２、１〜２３、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５、１〜４０、１〜４５または１〜５０のアミノ酸残基欠失、挿入および／または置換を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、必要に応じて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３０、３５、４０、４５または５０のアミノ酸残基欠失、挿入および／または置換を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、必要に応じて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４または２５のアミノ酸残基欠失、挿入および／または置換を有する。いくつかの実施形態では、置換は、保存的または非保存的置換である。
【０１６１】
発現された遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドは、それだけには限らないが、本明細書において記載されるアッセイおよび条件を含む、当技術分野で公知の任意の適したアッセイを使用して、任意の所望の改善された特性または特性（例えば、活性、選択性、安定性、酸性耐性、プロテアーゼ感受性など）の組合せについて評価できる。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、宿主細胞において発現される遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドのいずれも、とりわけ、リゾチーム処理、音波処理、濾過、塩析、超遠心分離およびクロマトグラフィーを含むタンパク質精製のための周知の技術のうち１つまたは複数を使用して、細胞および／または培養培地から回収する。
【０１６３】
リガーゼポリペプチドの単離のためのクロマトグラフィー技術として、とりわけ、逆相クロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動およびアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。特定の酵素を精製するための条件は、幾分かは、正味電荷、疎水性、親水性、分子量、分子の形状などといった因子に応じて変わり、当業者に明らかである。いくつかの実施形態では、親和性技術を使用して、改善されたリガーゼ酵素を単離できる。アフィニティークロマトグラフィー精製のために、目的のリガーゼポリペプチドと特異的に結合する任意の抗体が使用され得る。抗体の生成のために、それだけには限らないが、ウサギ、マウス、ラットなどを含む種々の宿主動物を、リガーゼポリペプチドまたはその断片を用いる注射によって免疫する。いくつかの実施形態では、リガーゼポリペプチドまたは断片は、側鎖官能基または側鎖官能基に結合しているリンカーによってＢＳＡなどの適した担体と結合している。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドを、本明細書において記載されるような遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ株）を、遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドの生成に資する条件下で培養することと、細胞および／または培養培地から遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドを回収することとを含む方法によって宿主細胞において生成する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は１種を超える遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドを生成する。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、本発明は、遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドを生成する方法であって、参照配列の配列番号２、６、３２、３４および／または３８に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性ならびに１つまたは複数のアミノ酸残基の相違を有する遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む組換え細菌細胞を、遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドの生成を可能にする、適した培養条件下で培養することと、必要に応じて、培養物および／または培養細菌細胞から遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドを回収することとを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、１種を超える遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドを生成する。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、ひとたび遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドを組換え宿主細胞および／または培養培地から回収すると、それらを当技術分野で公知の任意の適した方法（複数可）によってさらに精製する。いくつかの追加の実施形態では、精製された遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドを、その他の成分および化合物と組み合わせて、適宜異なる用途および使用（例えば、診断方法および組成物）のための遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドを含む組成物および製剤を提供する。
実験
【０１６７】
実験および達成された結果を含む以下の実施例は、単に例示目的で提供するものであって、本発明を制限すると解釈されてはならない。
【０１６８】
以下の実験の開示では、以下の略語が適用される：ｐｐｍ（１００万分率）、Ｍ（モル濃度）；ｍＭ（ミリモル濃度）、ｕＭおよびμＭ（マイクロモル濃度）、ｎＭ（ナノモル濃度）、ｍｏｌ（モル）、ｇｍおよびｇ（グラム）、ｍｇ（ミリグラム）、ｕｇおよびμｇ（マイクログラム）、Ｌおよびｌ（リットル）、ｍｌおよびｍＬ（ミリリットル）、ｃｍ（センチメートル）、ｍｍ（ミリメートル）、ｕｍおよびμｍ（マイクロメートル）、ｓｅｃ．（秒）、ｍｉｎ（分）、ｈおよびｈｒ（時間）、Ｕ（単位）、ＭＷ（分子量）、ｒｐｍ（１分あたりの回転数）、ｒｃｆ（相対遠心力）、ｐｓｉおよびＰＳＩ（平方インチあたりのポンド）、℃（摂氏度）、ＲＴおよびｒｔ（室温）、ＮＧＳ（次世代シーケンシング）、ｄｓ（二本鎖）、ｓｓ（一本鎖）、ＣＤＳ（コード配列）、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）、ＲＮＡ（リボ核酸）、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０（よく使用される実験用Ｅ．ｃｏｌｉ株、Ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ［ＣＧＳＣ］、Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ、ＣＴから入手可能）、ＨＴＰ（ハイスループット）、ＨＰＬＣ（高圧液体クロマトグラフィー）、ＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル）、ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）、ＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）、ＦＩＯＰＣ（陽性対照を上回る改善倍数）、ＥＢ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ）、ＬＢ（ルリア−ベルターニ）、ＳＰＲＩ（固相可逆的固定化）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（ＥＭＤ  ＭｉｌｌｉｐｏｒｅまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｓｉｇｍａ、Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡの一部、Ｄａｒｍｓｔａｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｉｎｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｃｏｒｐ．、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）、ＭａｇＢｉｏ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（ＭａｇＢｉｏ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）、ＢｉｏＣｈａｉｎ（ＢｉｏＣｈａｉｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗａｒｋ、ＣＡ）、Ｄｉｆｃｏ（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＢＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）、Ｋｕｈｎｅｒ（Ａｄｏｌｆ  Ｋｕｈｎｅｒ，ＡＧ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｃｏｒｐ．、Ｗｅｓｔｗｏｏｄ、ＭＡ）、ＮＥＢ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒｐ．の一部、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）、Ｚｙｍｏ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）、Ａｇｉｌｅｎｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅ���  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの一部、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）およびＢｉｏ−Ｒａｄ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）。
【０１６９】
以下のポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列が、本発明において使用される。いくつかの場合には（以下に示される）、ポリヌクレオチド配列に、コードされるポリペプチドが続く。配列番号１および２は、野生型ファージＴ４  ＤＮＡリガーゼ（タグが付いていない）に対応する。配列番号３および４は、ヒスチジンタグが付けられている野生型ファージＴ４  ＤＮＡリガーゼに対応する。配列番号５および６は、最適化された合成Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（タグが付いていない）に対応する。
【化１】
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【化２】
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【化３】
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【化４】
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【化５】
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【化６】
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【０１７０】
以下の配列は、以下の実施例において使用されるオリゴヌクレオチドの核酸配列である。
【化７】
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【化８】
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【化９】
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【０１７１】
以下の配列は、本発明によって提供される遺伝子操作されたリガーゼバリアントに対応する。
【化１０】
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【化１１】
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【化１２】
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【化１３】
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【化１４】
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【化１５】
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【化１６】
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【化１７】
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【化１８】
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【化１９】
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【化２０】
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【化２１】
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【化２２】
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【化２３】
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【化２４】
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【化２５】
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【化２６】
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【化２７】
2020518278.tif 000029
【実施例】
【０１７２】
（実施例１）
リガーゼ遺伝子獲得および発現ベクターの構築
野生型（ＷＴ）Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ酵素（配列番号２）は、バクテリオファージＴ４のゲノムによってコードされている。ＷＴ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（配列番号４）の６−ヒスチジンタグが付けられたバージョンをコードする合成遺伝子（配列番号３）を構築し、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ発現ベクターｐＣＫ１００９００ｉにサブクローニングした（例えば、両方とも参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，６２９，１５７号および米国特許出願公開第２０１６／０２４４７８７号を参照のこと）。６−ヒスチジンタグ付きＴ４  ＤＮＡリガーゼ（配列番号６）をコードする第２の合成遺伝子（配列番号５）を、Ｅ．ｃｏｌｉ発現のためのコドン最適化を用いて設計し、合成し、ｐＣＫ１００９００ｉにクローニングした。これらのプラスミド構築物を、Ｗ３１１０に由来するＥ．ｃｏｌｉ株に形質転換した。当業者によって一般的に知られている定向進化技術を使用して、これらのプラスミドから遺伝子バリアントのライブラリーを作製した（例えば、両方とも参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，３８３，３４６号およびＷＯ２０１０／１４４１０３を参照のこと）。本明細書において記載される酵素バリアントにおける置換は、示される通り、タグが付いていないＷＴ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ酵素（すなわち、配列番号２）またはそのバリアントに関連して示される。
（実施例２）
Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ発現およびハイスループット（ＨＴＰ）精製
Ｔ４  ＤＮＡリガーゼおよびバリアントのハイスループット（ＨＴＰ）成長
【０１７３】
形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ細胞を、１％グルコースおよび３０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含有するＬＢ寒天プレート上にプレーティングすることによって選択した。３７℃で一晩インキュベートした後、コロニーを、１８０μｌ／ウェルの、１％グルコースおよび３０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを補充したＬＢ培地を充填した９６ウェル浅平底ＮＵＮＣ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）プレートのウェルに入れた。培養物をシェーカー（２００ｒｐｍ、３０℃および８５％相対湿度；Ｋｕｈｎｅｒ）中で１８〜２０時間の間、一晩成長させた。一晩成長試料（２０μＬ）を、３８０μＬの、３０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを補充したＴｅｒｒｉｆｉｃブロスを充填したＣｏｓｔａｒ９６ウェル深プレートに移した。ＯＤ６００が０．４〜０．８の間に到達するまで、プレートをシェーカー（２５０ｒｐｍ、３０℃および８５％相対湿度；Ｋｕｈｎｅｒ）中で１２０分間インキュベートした。次いで、細胞を、４０μＬの滅菌水中１０ｍＭのＩＰＴＧを用いて誘導し、シェーカー（２５０ｒｐｍ、３０℃および８５％相対湿度；Ｋｕｈｎｅｒ）中で１８〜２０時間の間、一晩インキュベートした。細胞をペレットにし（４０００ｒｐｍ×２０分）、上清を廃棄し、細胞を分析の前に−８０℃で凍結した。
ＨＴＰペレットの溶解
【０１７４】
細胞ペレットを１５０μｌ／ウェルの２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５に再懸濁し、細胞懸濁液に、３００μｌの溶解緩衝液（１ｍｇ／ｍｌリゾチームおよび０．１ｍＭ硫酸マグネシウムを補充したＢ−Ｐｅｒ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ））を添加した。混合物を室温で１．２５時間撹拌し、ペレットにし（４０００ｒｐｍ×２０分）、上清を精製のために確保した。
粗溶解物から得たＴ４リガーゼのＨＴＰ精製
【０１７５】
粗Ｅ．ｃｏｌｉ抽出物からＴ４  ＤＮＡリガーゼを、ＨＩＳ−Ｓｅｌｅｃｔ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ（ＨＣ）ニッケルコーティングプレート（Ｓｉｇｍａ）を製造業者の指示に従って使用する金属アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。ウェルあたり合計８００μｌの洗浄緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．５、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  イミダゾール、０．１％ｖ／ｖ  ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）試薬（Ｓｉｇｍａ））を用いてＨＩＳ−Ｓｅｌｅｃｔプレートを平衡化した。次いで、２００μｌのＴ４リガーゼを含有するＨＴＰ溶解物および２００ｕｌの洗浄緩衝液を混合し、プレート上にロードし、２０００相対遠心力（ｒｃｆ）および４℃で１分間遠心分離した。プレートを６００μｌの洗浄緩衝液／ウェルを用い、各洗浄のために３０００ｒｃｆおよび４℃で３分の遠心分離を用いて２回洗浄した。２００μｌの溶出緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．５、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール、０．１％ｖ／ｖ  ＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０試薬）を添加し、３０００ｒｃｆ、４℃で１分間の遠心分離によってリガーゼ試料を溶出した。
【０１７６】
Ｚｅｂａ（商標）Ｓｐｉｎ脱塩プレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して溶出物を緩衝液交換した。手短に、プレートを、ウェルあたり３７５μｌの２×Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ貯蔵緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ  ｐＨ７．５、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２％ｗ／ｖ  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）を用いて２回平衡化し、１１００×ｇ、４℃で２分間遠心分離した。脱塩プレートに１００μｌのＨＩＳ−Ｓｅｌｅｃｔ試料溶出液をロードし、１１００×ｇ、４℃で２分間遠心分離した。脱塩プレートから得た溶出液を保持し、５０ｍＭのＴｒｉｓ．ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％ｗ／ｖ  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の最終貯蔵緩衝液濃度のために等容量のグリセロールと混合した。
（実施例３）
Ｔ４  ＤＮＡリガーゼの振盪フラスコ発現および精製
振盪フラスコ発現
【０１７７】
上記の通り成長された選択されたＨＴＰ培養物を、１％グルコースおよび３０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを有するＬＢ寒天プレート上にプレーティングし、３７℃で一晩成長させた。各培養物からの単一コロニーを１％グルコースおよび３０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを有する６ｍｌのＬＢブロスに移した。培養物を３０℃、２５０ｒｐｍで１８時間成長させ、およそ１：１０の希釈で３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを有する２５０ｍｌのＴｅｒｒｉｆｉｃブロスに０．２の最終ＯＤ６００まで継代培養した。培養物を３０℃、２５０ｒｐｍでおよそ３時間、０．６〜０．８のＯＤ６００までインキュベートし、次いで、１ｍＭの最終濃度でＩＰＴＧを添加して誘導した。誘導された培養物を３０℃、２５０ｒｐｍで２０時間インキュベートした。このインキュベーション期間の後、培養物を４０００ｒｐｍ×１０分で遠心分離した。培養上清を廃棄し、ペレットを３５ｍｌの２５ｍＭトリエタノールアミン、ｐＨ７．５に再懸濁した。この細胞懸濁液を氷浴中で冷却し、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ細胞破砕機（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｍ−１１０Ｌ）を使用して溶解した。粗溶解物を遠心分離（１６，０００ｒｐｍ、４℃で６０分間）によってペレットにし、次いで、上清を０．２μｍのＰＥＳメンブレンに通して濾過し、溶解物をさらに清澄化した。
振盪フラスコ溶解物からのＴ４  ＤＮＡリガーゼの精製
【０１７８】
Ｔ４リガーゼ溶解物に、ウェルあたり１／１０容量のＳＦ溶出緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．５、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、３００ｍＭイミダゾール、０．１％ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ−２０（登録商標））を補充した。次いで、ＡＣ  Ｓｔｅｐ  ＨｉＦ設定（実施パラメータを以下に提供する）を使用して、ＡＫＴＡ  Ｓｔａｒｔ精製システムおよび５ｍｌのＨｉｓＴｒａｐ  ＦＦカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して溶解物を精製した。ＳＦ洗浄緩衝液は、５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．５、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭイミダゾールおよび０．１％ｖ／ｖ  ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）（Ｓｉｇｍａ）を含んでいた。
【表３．１−１】
2020518278.tif 000030
【表３．１−２】
2020518278.tif 000031
【０１７９】
単一の最も濃縮された３ｍｌの画分をＵＶ吸収（Ａ２８０）によって同定し、緩衝液交換のために、２×リガーゼ貯蔵緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＤＴＴ、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ）中で一晩、１０Ｋ  Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（商標）透析カセット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）中で一晩透析し、透析された材料に等容量のグリセロールを添加した。Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイおよび２８０ｎｍでの吸収によって調製物中のリガーゼ濃度を測定した。
（実施例４）
プレート−捕捉ライゲーションアッセイ
【０１８０】
低濃度ＤＮＡ投入下でのＴ４  ＤＮＡリガーゼバリアントのライブラリーのスクリーニングにおいて使用するためのハイスループットウェルプレートライゲーションアッセイを開発した。アッセイは、２つの標識二本鎖ＤＮＡ基質のライゲーションを検出する。Ｃｙ（登録商標）３標識二本鎖５０マーＤＮＡ断片「５０マーＣｙ（登録商標）３挿入物」は、２つの一本鎖ＨＰＬＣ精製合成オリゴヌクレオチド（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（配列番号７、配列番号８）で構成され、これらの２つのオリゴヌクレオチドを１×アニーリング緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ｅＥＤＴＡ）中でアニーリングすることによって調製した。得られた二本鎖「５０マーＣｙ（登録商標）３挿入物」は、分子の両端に一塩基デオキシアデニン３’オーバーハングおよび５’一リン酸末端を有し、リン酸骨格に結合させたＣｙ（登録商標）３色素を用いて内部に標識する。１×アニーリング緩衝液中でのアニーリングによって、２つの一本鎖ＨＰＬＣ精製オリゴヌクレオチド（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（配列番号９および配列番号１０）を含む二本鎖「２０マービオチンアダプター」分子も調製した。得られた２０マービオチンアダプター二本鎖は、ライゲーション適合末端にホスホロチオエート保護された５’デオキシチミジンオーバーハングおよび５’リン酸を有し、反対の末端でビオチン化された。これらの短いモデル挿入物のライゲーション適合末端およびアダプター基質は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ＴｒｕＳｅｑワークフローのためのＮＧＳ試料調製ワークフローにおいて作製される適合Ｔ−Ａ付着末端と同一であった。これら２つの基質のライゲーションによって、ビオチンおよびＣｙ（登録商標）３色素両方を用いて標識された共有結合によって連結されたｄｓ  ＤＮＡ分子が作製された。単一または二重にライゲーションされた生成物は、２０マービオチンアダプターの、５０マーＣｙ（登録商標）３挿入物の一方または両方の末端とのライゲーションの際に形成し得る。
【０１８１】
ライゲーション反応を、１×ライゲーション緩衝液（６６ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ）および低濃度のライゲーション基質（１ｎＭ  ５０マーＣｙ（登録商標）３挿入物および５ｎＭまたは１０ｎＭ  ２０マービオチンアダプター）中、８０ｕｌ容量で実施した。反応物にＨＴＰ精製リガーゼ（５μｌ）を添加し、反応物を２０℃で４時間、続いて４℃で１６時間インキュベートした。４０μｌの３×クエンチ溶液（４５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．１５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０試薬）を添加して反応物をクエンチした。
【０１８２】
ストレプトアビジン大容量結合プレート（Ｐｉｅｒｃｅ）を、２００μｌのＴＢＳＴＥ緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％ＴＷＥＥＮ−２０試薬、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を用いて３回予備洗浄した。次いで、予備洗浄したストレプトアビジンプレートに１００μｌのクエンチされたライゲーション反応物を添加し、プレートを室温で１時間振盪して、結合を可能にし、結合していない上清を廃棄した。次いで、ストレプトアビジンプレートを２００ｕｌのＴＢＳＴＥ緩衝液を用いて３回、ＴＢＳ緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）を用いて１回洗浄し、２００ｕｌのＴＢＳ緩衝液を充填した。洗浄によってライゲーションしていない５０マーＣｙ（登録商標）３アダプターが効率的に除去され、ストレプトアビジンコーティングされたウェル表面に蛍光標識された単一および二重ライゲーション生成物を保持した。５３５／３５ｎｍ励起および５９５／３５ｎｍ発光フィルターを使用するＰａｒａｄｉｇｍ（登録商標）マルチモードプレートリーダー（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して蛍光強度を測定した。表４．１は、配列番号２に対して種々のリガーゼバリアントの活性改善データを提供し、表４．２は、配列番号６に対して種々のリガーゼバリアントの活性を提供し、表４．３は、配列番号３２に対して種々のリガーゼバリアントの活性を提供する。
【表４．１】
2020518278.tif 000032
【表４．２−１】
2020518278.tif 000033
【表４．２−２】
2020518278.tif 000034
【表４．２−３】
2020518278.tif 000035
【表４．３−１】
2020518278.tif 000036
【表４．３−２】
2020518278.tif 000037
（実施例５）
キャピラリー電気泳動ライゲーションアッセイ
【０１８３】
単一および二重ライゲーション生成物の直接測定を可能にするためにキャピラリー電気泳動ライゲーションアッセイを開発した。このアッセイは、蛍光標識基質を必要とせず、よく使用されるアダプターおよび関連挿入物長を使用するための柔軟性を提供した。
【０１８４】
プレート捕捉アッセイにおいて使用されるものに対して配列が同一である、短い標識されていないアダプターおよび挿入物断片を設計し、合成した。２つの一本鎖ＨＰＬＣ精製合成オリゴヌクレオチド（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（配列番号１１および配列番号１２）を含むＣｙ（登録商標）３標識二本鎖５０マーＤＮＡ断片「５０マー挿入物」を、１×アニーリング緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中でこれらの２つのオリゴヌクレオチドをアニーリングすることによって調製した。得られた二本鎖５０マー挿入物は、分子の両端に一塩基デオキシアデニン３’オーバーハングおよび５’一リン酸末端を有し、リン酸骨格に結合させた内部標識したＣｙ（登録商標）３である。２つの一本鎖ＨＰＬＣ精製オリゴヌクレオチド（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（配列番号１３および配列番号１４）を含む二本鎖「２０マーアダプター」分子も、１×アニーリング緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中でアニーリングすることによって調製した。得られた２０マーアダプター二本鎖は、ライゲーション適合末端にホスホロチオエート保護された５’デオキシチミジンオーバーハングおよび５’リン酸を有していた。
【０１８５】
ＰＣＲ増幅によって、長い規定された１６０ｂｐの挿入物のセットを構築した。５’アデノシン（プライマー配列番号１５および配列番号１６、生成物配列番号１７）、５’シトシン（配列番号１８および配列番号１９、生成物配列番号２０）、５’グアノシン（配列番号２１および配列番号２２、生成物配列番号２３）および５’チミジン（配列番号２４および配列番号２５、生成物配列番号２６）ヌクレオチドで終結するフォワード／リバースＰＣＲプライマー対の４つのセットを、別個の反応において使用して、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼファージコード配列（配列番号１）を鋳型として使用して１６０ｂｐ断片を増幅した。これらの生成物は、プライマーによって供与される５’末端の塩基を除いて同一の内部ＤＮＡ配列を有する。次いで、等モル量のこれらの挿入物をプールし、製造業者の指示を使用してＮＥＢ  Ｎｅｘｔ  Ｕｌｔｒａ（商標）ＩＩ末端修復／ｄＡテール付加モジュールにより処理して、５’リン酸および３’デオキシアデノシンオーバーハングを付加し、それらをライゲーションのために調製した。
【０１８６】
生成物を、Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ＳＶ  ＰＣＲクリーンアップキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して清澄化し、水に溶出した。
【０１８７】
短い５０／２０マー基質を用いるライゲーション反応を、１×ライゲーション緩衝液（６６ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ）および低濃度のライゲーション基質（２ｎＭ  ５０マー挿入物、１０ｎＭ  ２０マーアダプター）中８０μｌ容量で実施した。より長い１６０マー基質セットを用いる反応については、２ｎＭ基質および２０ｎＭのＮＥＢヘアピンアダプター（配列番号１５）を使用した。反応物にＨＴＰ精製リガーゼ（１０ｕｌ）を添加し、反応物を２０℃で４時間、続いて４℃で１６時間インキュベートした。
【０１８８】
４０μｌの３×クエンチ溶液（４５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．６ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ）を添加して反応物をクエンチした。クエンチされた反応物を５０℃で１時間インキュベートして、電気泳動移動度シフトによって下流の電気泳動を干渉するＤＮＡリガーゼをタンパク質分解した。次いで、１００μｌのタンパク質分解された反応物をＭｏｎｔａｇｅ  ＳＥＱ９６クリーンアッププレート（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上にロードし、真空を適用して試料を濃縮した。次いで、試料を１００μｌのＬｏｗ−ＴＥ緩衝液（２ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ）を用いて洗浄し、フィルター表面をブロットした。ＤＮＡ基質およびライゲーション生成物を溶出するために、ウェルに２５μｌの低ＴＥ緩衝液を添加し、プレートを室温で１０分間振盪し、Ｂｉｏｍｅｋ  ＮＸ液体ハンドラー（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）または１２チャネルピペットを使用して、溶出液を３８４ウェルＢｉｏＲａｄ  Ｈａｒｄｓｈｅｌｌ（登録商標）プレートへ除去した。ＤＮＡ高感度アッセイを使用するＣａｌｉｐｅｒ（現在は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）Ｌａｂｃｈｉｐ  ＧＸキャピラリー電気泳動機器を製造業者の指示に従って使用して反応混合物を分析した。
【０１８９】
ライゲーションされていない挿入物、単一ライゲーションされたおよび二重にライゲーションされた生成物のモル濃度を比較することによって変換を算出した。短い挿入物については、活性改善を算出することにおいて使用するために親の対照およびバリアントについての二重にライゲーションされた生成物の割合を報告した。１６０マーの挿入物セットおよびＮＥＢヘアピンアダプターについては、活性改善を算出することにおいて使用するために合計の変換された種（単一および二重ライゲーション生成物）の割合を報告した。
【表５．１−１】
2020518278.tif 000038
【表５．１−２】
2020518278.tif 000039
【表５．１−３】
2020518278.tif 000040
【表５．２−１】
2020518278.tif 000041
【表５．２−２】
2020518278.tif 000042
【表５．３】
2020518278.tif 000043
【表５．４】
2020518278.tif 000044
【表５．５−１】
2020518278.tif 000045
【表５．５−２】
2020518278.tif 000046
（実施例６）
振盪フラスコ規模の調製でのキャピラリー電気泳動ライゲーションアッセイ
【０１９０】
リガーゼバリアントを、実施例３において記載されるように振盪フラスコ規模で発現させ、精製した。キャピラリー電気泳動ライゲーションアッセイを、８７５ｎＭのＳＦ精製ＤＮＡリガーゼ、１ｎＭの１６０マーＡテール挿入部（実施例５を参照のこと）および２００ｎＭの市販のＹアダプター（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して、実施例５に記載されるように１×ライゲーション緩衝液（６６ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ）中で実施した。このＹアダプターは、実施例４に記載されるようにアニーリングされた２つのＨＰＬＣ精製オリゴヌクレオチド（配列番号１７および配列番号１８）で構成される。ＥＤＴＡを１５ｍＭまで、およびプロテイナーゼＫを０．４ｍｇ／ｍｌ（最終）まで添加して反応物をクエンチし、５０℃で１時間インキュベートして、下流の電気泳動を干渉するＤＮＡリガーゼをタンパク質分解した。次いで、９６ウェルＺｙｍｏ  ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒキットを使用して、タンパク質分解されたライゲーション反応物を清澄化し、緩衝液交換し、２５ｕｌの低ＴＥ緩衝液（２ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ）に溶出した。ＤＮＡ高感度アッセイ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用するＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌａｂｃｈｉｐ  ＧＸキャピラリー電気泳動機器を製造業者の指示に従って使用して反応混合物を分析した。
【０１９１】
挿入物の二重にライゲーションされた生成物への変換を、ライゲーションされていない挿入物、単一ライゲーションされたおよび二重にライゲーションされた生成物のモル濃度を比較することによって算出した。バリアントについての、二重にライゲーションされた生成物に変換された挿入物の割合は、以下の表６．１に示されるように報告された。
【表６．１】
2020518278.tif 000047
（実施例７）
振盪フラスコ規模の調製でのアダプター二量体化アッセイ
【０１９２】
Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）シーケンシングプラットフォームで使用するために設計されたＮＧＳアダプターは、Ａテール挿入物断片上に存在するデオキシアデノシン３’オーバーハングとのライゲーションに適合するデオキシチミジン３’オーバーハングを有する。Ｔテールアダプターは、非相補的ＤＮＡ末端に対する野生型Ｔ４  ＤＮＡリガーゼの選択性のために互いに効率的にライゲーションされない。長いインキュベーション期間、高いアダプター濃度または高濃度のクラウディング剤を含む極端なライゲーション条件の結果としてアダプター二量体化が起こる。重要なことに、ライゲーション反応におけるヌクレアーゼ混入物は、アダプター末端上のオーバーハングを除去することができ、その結果、平滑末端の基質が得られ、これは、自己ライゲーションに適合している。
【０１９３】
例示的バリアントＴ４  ＤＮＡリガーゼの選択性を試験するために、任意の固有のアダプター二量体化活性の直接的な観察結果を混乱させるであろうヌクレアーゼ混入を低減する精製戦略を開発した。
振盪フラスコ溶解物からのＴ４  ＤＮＡリガーゼの勾配精製
【０１９４】
実施例３における方法に従って振盪フラスコ中でリガーゼを発現させ、溶解に先立って５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ７．５に再懸濁した。この細胞懸濁液を氷浴中で冷却し、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ細胞破砕機（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｍ−１１０Ｌ）を使用して溶解した。粗溶解物に５００ｍＭ  ＮａＣｌおよび３０ｍＭイミダゾールを補充し、その後、遠心分離（１６，０００ｒｐｍ、４℃で６０分間）によって清澄化し、次いで、上清を０．２μｍのＰＥＳメンブレンを通して濾過し、溶解物をさらに清澄化した。
【０１９５】
溶解物を、ニッケルＮＴＡプロトコールおよびイミダゾール勾配溶出（実施パラメータは、表７．１に提供されている）を使用するＡＫＴＡ  Ｓｔａｒｔシステムおよび１ｍｌ  ＨｉｓＴｒａｐ  ＦＦカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して精製した。ＳＦ洗浄緩衝液は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ７．５、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、３０ｍＭ  イミダゾールおよび１ｍＭ  ＤＴＴで構成された。ＳＦ溶出緩衝液は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ７．５、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、３００ｍＭイミダゾールおよび１ｍＭ  ＤＴＴで構成された。
【表７．１】
2020518278.tif 000048
【０１９６】
ＵＶ吸収（Ａ２８０）によって４つの最も濃縮された画分を同定し、緩衝液交換のために、１×リガーゼ貯蔵緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中で一晩、１０Ｋ  Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（商標）透析カセット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）中で一晩透析した。Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイおよび２８０ｎｍでの吸収によって調製物中のリガーゼ濃度を測定した。
【０１９７】
実施例１０〜１４における実験のために同一クロマトグラフィーパラメータを使用して発酵ペレットからの大規模精製を実施した。この場合には、ニッケルセファロース溶出液から最も濃縮された画分をプールし、２つの連続ＳＴＩＣ−ＰＡナノ（１ｍｌ）電荷メンブランフィルター（charge membrane filter）（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）をフロースルーモードで通して、混入核酸を除去した。
【０１９８】
アダプター二量体化アッセイを、８７５ｎＭのＳＦ精製ＤＮＡリガーゼおよび１０００ｎＭの、２つのオリゴヌクレオチド（実施例４に記載されるようにアニーリングされた、配列番号１３および配列番号１６）で構成されるブロックされたアダプターを使用して、実施例５に記載されるように１×ライゲーション緩衝液（６６ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ）中で実施した。このブロックされた２０マーアダプター二本鎖は、３’デオキシチミジンオーバーハングおよび５’リン酸を有する１つのライゲーション適格末端と、ライゲーションの基質として働くことができない、５’リン酸およびアミノブロックされた３’末端を有さない第２の平滑なライゲーション不適格末端を有する。ライゲーションを２０℃で１６時間実施して、二量体形成を可能にした。ＥＤＴＡを１５ｍＭまで、およびプロテイナーゼＫを０．２ｍｇ／ｍｌ（最終）まで添加して反応物をクエンチし、５０℃で２時間インキュベートして、ＤＮＡリガーゼをタンパク質分解した。ＤＮＡ  １ｋアッセイ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用するＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌａｂｃｈｉｐ  ＧＸキャピラリー電気泳動機器を、製造業者の指示に従って使用して反応混合物を直接分析した。
【０１９９】
キャピラリー電気泳動によって測定されたライゲーションされていないアダプターおよびアダプター二量体生成物のモル濃度を比較することによってアダプター二量体化変換パーセントを算出した。二重にライゲーションされた生成物に変換されたブロックされた２０マーアダプターの画分が、表７．２に示されている。実施例３からのプロトコールに従って調製された、ヌクレアーゼ混入を含有するとわかっているＷＴ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼの試料を、アダプター二量体形成の陽性対照として含め、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼの「超純粋」市販の調製物（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）をＷＴリガーゼ二量体化活性の参照として使用した。
【表７．２】
2020518278.tif 000049
（実施例８）
ＤＮＡライゲーション時間経過
【０２００】
実施例７に記載の方法に従って精製された８５５ｎＭ最終濃度のバリアントリガーゼ（配列番号３８）または野生型Ｔ４  ＤＮＡリガーゼの市販の調製物（「超純粋」Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（迅速）、Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）のいずれかを使用して、実施例５に記載されたようなクラウディング剤を補充した１×ライゲーション緩衝液（６６ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、６％ＰＥＧ６０００（ｗ／ｖ））中でライゲーション反応時間経過を実施した。ＤＮＡ基質は、実施例６に記載される１ｎＭのＡテール１６０マーＰＣＲ生成物および４０ｎＭの、２つのオリゴヌクレオチド（実施例４に記載されるようにアニーリングされた、配列番号１７および配列番号１８）で構成されるアダプターを含んでいた。リガーゼを添加して反応を開始し、２、５、１５および３０分後にＥＤＴＡを１５ｍＭの最終濃度まで添加してクエンチした。プロテイナーゼＫを０．２ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで添加し、試料を５０℃で２時間タンパク質分解し、続いて、Ｚｙｍｏ  ＺＲ−９６  ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ−５ウェルプレートクリーンアップキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して試料をクリーンアップした。試料を２５ｕｌのＥＢ緩衝液に溶出し、実施例６に記載される方法に従ってキャピラリー電気泳動によって分析した。二重に末端がライゲーションされた生成物への変換は、表８．１において各時点について報告されている。
【表８．１】
2020518278.tif 000050
（実施例９）
温度活性プロファイル
【０２０１】
実施例７に記載の方法に従って精製された８５５ｎＭ最終濃度のバリアントリガーゼ（配列番号３８）または野生型Ｔ４  ＤＮＡリガーゼの市販の調製物（「超純粋」Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（迅速）；Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）のいずれかを使用して、実施例５に記載されるように１×ライゲーション緩衝液（６６ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ）中でライゲーション反応時間経過を実施した。
【０２０２】
ＤＮＡ基質は、実施例６に記載される１ｎＭのＡテール１６０マーＰＣＲ生成物および２００ｎＭの、２つのオリゴヌクレオチド（実施例４に記載されるようにアニーリングされた、配列番号１３および配列番号１６）で構成されるアダプターを含んでいた。リガーゼを添加して反応を開始し、１６℃、２０℃、３０℃または３７℃で３０分間インキュベートし、次いで、ＥＤＴＡを１５ｍＭの最終濃度まで添加してクエンチした。プロテイナーゼＫを０．２ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで添加し、試料を５０℃で１時間タンパク質分解し、続いて、Ｚｙｍｏ  ＺＲ−９６  ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ−５ウェルプレートクリーンアップキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して試料をクリーンアップした。試料を２５ｕｌのＥＢ緩衝液に溶出し、実施例６に記載される方法に従ってキャピラリー電気泳動によって分析した。二重に末端がライゲーションされた生成物への変換は、図１において各温度条件についてグラフにされている。
（実施例１０）
ｐＨ活性プロファイル
【０２０３】
実施例７に記載の方法に従って精製された８５５ｎＭ最終濃度のバリアントリガーゼｃ）または野生型Ｔ４  ＤＮＡリガーゼの市販の調製物（「超純粋」Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（迅速）、Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）のいずれかを使用して、実施例５に記載されたようなクラウディング剤を補充した１×ライゲーション緩衝液（６６ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、６％ＰＥＧ６０００（ｗ／ｖ））中でライゲーション反応を実施した。ＤＮＡ基質は、実施例６に記載される１ｎＭのＡテール１６０マーＰＣＲ生成物および４０ｎＭの、２つのオリゴヌクレオチド（実施例４に記載されるようにアニーリングされた、配列番号１７および配列番号１８）で構成されるアダプターを含んでいた。リガーゼを添加して反応を開始し、１５分後にＨｉＰｒｅｐ（商標）ＰＣＲ  ＳＰＲＩビーズ（ＭａｇＢｉｏ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、１００μｌの反応物中に８０μｌ）の添加によってクエンチした。試料を２５ｕｌのＥＢ緩衝液に溶出し、実施例６に記載される方法に従ってキャピラリー電気泳動によって分析した。二重に末端がライゲーションされた生成物への変換は、図２にプロットされている。
（実施例１１）
ライゲーション配列バイアス
【０２０４】
実施例７に記載の方法に従って精製された８５５ｎＭの最終濃度のバリアントリガーゼ（配列番号３８）または野生型Ｔ４  ＤＮＡリガーゼの市販の調製物（「超純粋」Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（迅速）；Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）のいずれかを使用して、実施例５に記載されたようなクラウディング剤を補充した１×ライゲーション緩衝液（６６ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、６％ＰＥＧ６０００（ｗ／ｖ））中でライゲーション反応時間経過を実施した。ＤＮＡ基質は、個々のＰＣＲ生成物がプールされず、別個にライゲーションされた点を除いて、実施例６に記載される５０ｎｇのＡテール１６０マーＰＣＲ生成物を含んでいた。
【０２０５】
ＰＣＲ増幅によって、その５’末端で（at their 5; ends）配列が変動する規定された１６０ｂｐの挿入物のセットを構築した。５’アデノシン（プライマー配列番号１５および配列番号１６、生成物配列番号１７）、５’シトシン（配列番号１８および配列番号１９、生成物配列番号２０）、５’グアノシン（配列番号２１および配列番号２２、生成物配列番号２３）および５’チミジン（配列番号２４および配列番号２５、生成物配列番号２６）ヌクレオチドで終結するフォワード／リバースＰＣＲプライマー対の４つのセットを、別個の反応において使用して、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼファージコード配列（配列番号１）を鋳型として使用して１６０ｂｐ断片を増幅した。これらの生成物は、プライマーによって供与される５’末端の塩基を除いて同一の内部ＤＮＡ配列を有する。次いで、これらの挿入物を、製造業者の指示を使用してＮＥＢ  Ｎｅｘｔ  Ｕｌｔｒａ（商標）ＩＩ末端修復／ｄＡテール付加モジュールにより個別に処理して、５’リン酸および３’デオキシアデノシンオーバーハングを付加し、それらをライゲーションのために調製した。調製した基質を、ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ−５スピンカラム（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して製造業者の指示に従って個別にクリーンアップした。４０ｎＭの、２つのオリゴヌクレオチド（実施例４に記載されるようにアニーリングされた、配列番号１７および配列番号１８）で構成されるアダプターを使用してライゲーションを実施した。リガーゼを添加して反応を開始し、１５分後にＨｉＰｒｅｐ（商標）ＰＣＲ  ＳＰＲＩビーズ（ＭａｇＢｉｏ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、１００μｌの反応物中に８０μｌ）の添加によってクエンチし、製造業者の指示に従って調製した。試料を２５ｕｌのヌクレアーゼ不含ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に溶出し、実施例６に記載される方法を使用してキャピラリー電気泳動によって分析した。二重に末端がライゲーションされた生成物への変換は、図３にプロットされている。
（実施例１２）
リガーゼ濃度の関数としての変換
【０２０６】
実施例７に記載の方法に従って精製された２〜４０００ｎＭ最終濃度の範囲のバリアントリガーゼ（配列番号３８）または野生型Ｔ４  ＤＮＡリガーゼの市販の調製物（「超純粋」Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（迅速）；Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）を使用して、実施例５に記載されたようなクラウディング剤を補充した１×ライゲーション緩衝液（６６ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、６％ＰＥＧ６０００（ｗ／ｖ））中でライゲーション反応を実施した。ＤＮＡ基質は、実施例６に記載される１０ｎｇのＡテール１６０マーＰＣＲ生成物および４０ｎＭまたは２００ｎＭの、２つのオリゴヌクレオチド（実施例４に記載されるようにアニーリングされた、配列番号１７および配列番号１８）で構成されるアダプターを含んでいた。リガーゼを添加して反応を開始し、１５分後にＨｉＰｒｅｐ（商標）ＰＣＲ  ＳＰＲＩビーズ（ＭａｇＢｉｏ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、１００μｌの反応物中に８０μｌ）の添加によってクエンチした。試料を２５ｕｌのＥＢ緩衝液に溶出し、実施例６に記載される方法を使用してキャピラリー電気泳動によって分析した。二重に末端がライゲーションされた生成物への変換は、図４にプロットされている。
（実施例１３）
アダプター濃度の関数としての変換
【０２０７】
実施例７に記載の方法に従って精製された８５５ｎＭの最終濃度のバリアントリガーゼ（配列番号３８）または野生型Ｔ４  ＤＮＡリガーゼの市販の調製物（「超純粋」Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（迅速）；Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）を使用して、実施例５に記載されたようなクラウディング剤を補充した１×ライゲーション緩衝液（６６ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、６％ＰＥＧ６０００（ｗ／ｖ））中でライゲーション反応を実施した。ＤＮＡ基質は、実施例６に記載される１０ｎｇまたは１００ｎｇのＡテール１６０マーＰＣＲ生成物および３〜４００ｎＭ滴定の、２つのオリゴヌクレオチド（実施例４に記載されるようにアニーリングされた、配列番号１７および配列番号１８）で構成されるアダプターを含んでいた。リガーゼを添加して反応を開始し、１５分後にＨｉＰｒｅｐ（商標）ＰＣＲ  ＳＰＲＩビーズ（ＭａｇＢｉｏ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、１００μｌの反応物中に８０μｌ）の添加によってクエンチし、次いで、製造業者のプロトコールに従ってクリーンアップした。試料を２５ｕｌのＥＢ緩衝液に溶出し、実施例６に記載される方法を使用してキャピラリー電気泳動によって分析した。二重に末端がライゲーションされた生成物への変換パーセントは、図５にプロットされている。
（実施例１４）
細胞不含ＤＮＡ基質の変換
【０２０８】
ヒト血清（ＢｉｏＣｈａｉｎ）から単離された細胞不含ＤＮＡ試料を、反応あたり１０ｎｇのＤＮＡ試料を使用して、製造業者の指示に従って６０μｌ容量でＮＥＢ  Ｎｅｘｔ（登録商標）Ｕｌｔｒａ  ＩＩ（商標）末端修復／Ａテール付加モジュールを使用してライゲーションのために調製した。末端修復／Ａテール付加反応の生成物にライゲーションモジュールを直接添加し、その結果、追加の反応構成成分の最終濃度が、７ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、９ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴおよび１０％ＰＥＧ６０００であった。２つのオリゴヌクレオチド（実施例４に記載されるようにアニーリングされた、配列番号１７および配列番号１８）で構成されるアダプターを、４０ｎＭまたは２００ｎＭの最終濃度まで添加した。９３．５ｕｌの最終総容量について、実施例７に記載の方法に従って精製された８５５ｎＭの最終濃度のバリアントリガーゼ（配列番号３８）または野生型Ｔ４  ＤＮＡリガーゼの市販の調製物（「超純粋」Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（迅速）；Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）を用いて反応を実施した。リガーゼを添加して反応を開始し、１５分後にＨｉＰｒｅｐ（商標）ＰＣＲ  ＳＰＲＩビーズ（ＭａｇＢｉｏ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、９３．５μｌの反応物中に７５μｌ）の添加によってクエンチし、次いで、製造業者のプロトコールに従ってクリーンアップした。試料を２５ｕｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に溶出し、実施例６に記載される方法を使用してキャピラリー電気泳動によって分析した。二重に末端がライゲーションされた生成物への変換パーセントは、図６に示されている。
【０２０９】
具体的な実施形態を参照して本発明を説明してきたが、特定の状況、材料、物質の組成、プロセス、単一のまたは複数のプロセスステップに適応するために、さまざまな変更を行い、同等のものに置換することができ、それにより、特許請求の範囲から逸脱することなく、本発明の利点を達成できる。
【０２１０】
アメリカ合衆国におけるすべての目的のために、本開示で引用されたありとあらゆる刊行物および特許文書は、あたかもそのような刊行物または文書各々が参照により本明細書に組み込まれるように具体的かつ個別に示されたかのように参照により本明細書に組み込まれる。刊行物および特許文書の引用は、任意のそのような文書が適切な先行技術であることを示すものではなく、その内容または日付に関する承認を構成するものでもない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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