(57)【要約】  本発明は、心臓組織試料からの心臓前駆細胞の亜集団を単離する方法、該方法により得られた集団、並びに、細胞治療のための医療分野、又は心臓細胞移植及び／又は心臓組織移植の分野における関連使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップを含む、ヒト心臓前駆細胞亜集団を単離する方法：
ａ）心臓細胞の集団を含む心臓組織試料をミンチすること、
ｂ）細胞懸濁液が得られるまで、酵素混合物を用いて前記心臓組織を４回、漸進的に消化し、そして３０μｍ〜１００μｍの範囲内の大きさのフィルタにより濾過すること、
ｃ）細胞懸濁液が得られるまで、酵素混合物を用いて、ステップｂ）で得られた残りの心臓組織を１６時間さらに消化し、そして３０μｍ〜１００μｍの範囲内の大きさのフィルタにより濾過すること、
ｄ）心臓細胞を増殖させるのに適切な培地中で、ステップｂ）及びステップｃ）で得られた細胞懸濁液を培養すること、
ｅ）心臓細胞を増殖させるのに適切な培地中において、ステップｄ）で得られた細胞懸濁液を酵素溶液又は非酵素溶液の存在下で予備的に増殖させること、
ｆ）心臓細胞をさらに増殖させるのに適切な培地中において、ステップｅ）で得られた心臓細胞を酵素溶液又は非酵素溶液の存在下で二次的に増殖させること、
ｇ）心臓前駆細胞の開始集団内で発現した１又は複数の表面抗原に対するモノクローナル抗体を使用して、陽性選択及び／又は陰性選択によって、心臓細胞の１又は複数の亜集団を単離すること。
【請求項２】
ステップａ）の前記心臓組織試料が、右心耳生検、左心耳生検、中隔生検、心尖生検、及び心室生検からなる群から選択される、請求項１に記載のヒト心臓前駆細胞亜集団を単離する方法。
【請求項３】
ステップａ）を前記ミンチすることが手動又は自動で行われる、請求項１〜請求項２のいずれか一項に記載のヒト心臓前駆細胞亜集団を単離する方法。
【請求項４】
ステップｂ）及びステップｃ）の酵素混合物が基礎培地及び酵素溶液を含む、請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載のヒト心臓前駆細胞亜集団を単離する方法。
【請求項５】
前記酵素溶液がコラゲナーゼ及び／又はプロテアーゼの混合物を含む、請求項４に記載のヒト心臓前駆細胞亜集団を単離する方法。
【請求項６】
前記コラゲナーゼ及び／又はプロテアーゼ混合物が、コラゲナーゼＩ、コラゲナーゼＩＩ、コラゲナーゼＩＶ、トリプシン、ＥＤＴＡ、アクターゼ（accutase）、コラゲナーゼＡ、ディスパーゼ（dispase）及びリベラーゼ（liberase）からなる群から選択される１又は複数の酵素を含む、請求項４〜請求項５のいずれか一項に記載のヒト心臓前駆細胞亜集団の単離のために方法。
【請求項７】
前記基礎培地がＨａｍ’ｓ／Ｆ１２である、請求項４〜請求項６のいずれか一項に記載のヒト心臓前駆細胞亜集団を単離する方法。
【請求項８】
前記コラゲナーゼ混合物が０．１〜３ｍｇ／ｍＬの範囲内の濃度で存在する、請求項４〜請求項７のいずれか一項に記載のヒト心臓前駆細胞亜集団を単離する方法。
【請求項９】
ステップｄ）、ステップｅ）及びステップｆ）の前記心臓細胞を増殖させ、かつ拡大するのに適切な培地が、１０％のウシ胎児血清、２ｍＭのＬ−グルタチオン、５×１０−３Ｕ／ｍＬのヒトエリスロポイエチン、１０ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞成長因子及び抗生物質が補充されたＨａｍ’ｓ／Ｆ１２培地である、請求項１〜請求項８のいずれか一項に記載のヒト心臓前駆細胞亜集団を単離する方法。
【請求項１０】
細胞増殖のためのステップｅ）及びステップｆ）の酵素溶液又は非酵素溶液が、Ｔｒｙｐｌｅ（登録商標）Ｓｅｌｅｃｔ、トリプシン及び／又はＥＤＴＡの混合物、細胞解離緩衝液、セルストリッパ、アクターゼ及びディスパーゼからなる群から選択される、請求項１〜請求項９のいずれか一項に記載のヒト心臓前駆細胞亜集団を単離する方法。
【請求項１１】
ステップｇ）のモノクローナル抗体が、ビオチン又は蛍光分子（好ましくはＦＩＴＣ若しくはＡＰＣから選択される蛍光分子）で標識されている、請求項１〜請求項１０のいずれか一項に記載のヒト心臓前駆細胞亜集団を単離する方法。
【請求項１２】
ステップｇ）の抗体が、
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からなる群から選択される１又は複数の抗原に対するモノクローナル抗体である、請求項１〜請求項１１のいずれか一項に記載のヒト心臓前駆細胞亜集団を単離する方法。
【請求項１３】
ステップｇ）の選択が免疫磁気分離によって行われる、請求項１〜請求項１２のいずれか一項に記載のヒト心臓前駆細胞亜集団を単離する方法。
【請求項１４】
ステップｇ）のモノクローナル抗体が、抗ＣＤ１１７及び／又は抗ＣＤ９０である、請求項１１〜請求項１３のいずれか一項に記載のヒト心臓前駆細胞亜集団を単離する方法。
【請求項１５】
ＣＤ９０−及びＣＤ１１７＋＋／ＣＤ９０−から選択される表面マーカープロファイルを特徴とする、請求項１４に記載の単離方法によって得られるヒト心臓前駆細胞の亜集団。
【請求項１６】
単独で、又は、ヒト心臓前駆細胞の別の亜集団と組み合わせて、医療分野において使用するための請求項１５に記載のヒト心臓前駆細胞の亜集団。
【請求項１７】
心臓血管細胞治療、又は心臓細胞移植及び／又は心臓組織移植の分野における使用のための、請求項１６に記載のヒト心臓前駆細胞の亜集団。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心臓組織試料からの心臓前駆細胞の亜集団を単離する方法、該方法により得られた集団、並びに、細胞治療のための医療分野、又は心臓細胞移植及び／又は心臓組織移植の分野における関連する使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
前駆体は、増殖及び分化する能力を有し、周りの細胞及び組織のための支持機能も行う全ての細胞集団である。
【０００３】
前駆体は、損傷を受けた細胞の交換によって組織の機能を持続させるために生物の組織内に位置する希少細胞である。それらは、最初は、骨髄及び上皮組織などの細胞交換が最も高い組織内で発見されたが、現在では、再生能力が低い種々の組織内で生存する前駆細胞の集団があることがよく知られている。
【０００４】
成人の心臓内に常在する前記前駆体の発見は、心臓が自己複製不可能な器官であるという定説を根底から変えた。
【０００５】
この発見は、虚血又は他の損傷の後で心筋を再生することが可能な治療を開発することを目的とした、常在心臓前駆体の研究につながった。種々の表面マーカーを特徴とする種々の型の細胞が提案及び研究されてきており、そのいくつかは第Ｉ相臨床治験で試験され、いくつかは第ＩＩ相臨床治験で試験されてきた。治験は、最初に米国のＦＤＡによって許可され、最近では世界の残りの国々でも許可されたが、イタリアではまだ許可されていない。
【０００６】
心臓前駆体についてのそのような知識は、再生医療と定義されるものに属する革新的治療を導入するために研究領域を広げてきた。
【０００７】
治験のための幹細胞（常在心臓前駆体を含む）の使用は、厳格な基準に従わなければならない。それらによって、医薬の製造のために用いられる同じ規制基準に従って幹細胞の翻訳（translation）が行われることが確保される。
【０００８】
医薬品および医薬部外品の製造管理および品質管理の基準（ＧＭＰ）は、現行の参照薬局方（米国薬局方、欧州薬局方など）に従った医薬の製造のためのガイドラインである。イタリアでは、細胞治療製品（ＣＴＰ）のための第Ｉ相臨床治験は、イタリア国立衛生研究所（ＩＳＳ）の事前意見に従う。心臓前駆体を臨床的に使用する可能性があるという観点から、細胞治療製品についてのイタリア国立衛生研究所の２００４年のガイドラインに従ってＧＭＰを参照して心臓前駆体を調製するための手法を開発し、検証することは重要である。
【０００９】
本技術分野において利用可能な単離プロトコル（参考文献［４］、［５］、［６］参照）によって、磁気選択システムを用いて研究範囲までであれば心臓前駆体集団（ＣＤ１１７＋）を単離することが可能になる。実際のところ、ＧＭＰ製品及び臨床治験のための磁気選択システムを用いて心臓前駆体の集団を選択するためには、まず第一に、選択を行うことが所望される未選択開始集団を広範に増殖させることが必要である。研究範囲の選択システムによって、約１×１０６、１×１０７の数の細胞から選択を開始することが可能になるが、現在利用可能なＧＭＰグレードの選択システムは、そのような少数の開始細胞から開始しても機能しない。免疫磁気選択システムを機能させるためには、約１×１０９の開始細胞数（末梢血液細胞又は骨髄血液細胞）を選択することが必要である。すなわち、ＧＭＰグレードの条件下で前駆体集団を選択するための第１の必須条件は、１×１０９の細胞の量に近づくよう、選択可能な前記開始集団を最大化する戦略を採用することである。
【００１０】
イタリアでは、イタリア国立衛生研究所が医薬の製造のための法制化などの第Ｉ相試験のためのＧＭＰ製造レベルをすでに要求しているが、イタリアにおける臨床治験で用いることができる心臓前駆体の製造のための方法は、これまでのところ市場に無い。
【００１１】
心臓血管分野における細胞治療の観点から、細胞の型は、治療上の成功のための基本的な役割をカバーしている。細胞採取源としての心臓組織を分析することによって、３つの異なる型の細胞が現在提案されており、すでに第Ｉ相臨床治験で試験され、一部は第ＩＩ相臨床試験で試験されている。
【００１２】
特に、
１）ＣＤ１１７抗原であるc-kitの表面発現を基に選択された心臓幹細胞（ＣＳＣ）の集団、［１］、
２）マーカーによってではなく、球状集合体を形成する能力を有することを基に単離されたカーディオスフェア由来細胞（ＣＤＣ）［２］、
３）ＣＳＣ−ｃｋｉｔ＋細胞と骨髄間葉系幹細胞（ＭＳＣ）との組み合わせを使用する、併用治療手法を用いる第Ｉ相試験及び第Ｉ相治験［３］。
【００１３】
上記の３つの細胞型は、どれも、細胞の型、及び当該型の細胞を得ることができる製造技術によって、メリット及びデメリットを有する。
【００１４】
例えば、いかなるマーカーによっても選択されない前記カーディオスフェア由来細胞（ＣＤＣ）集団には、大量に得ることが容易であるというメリットがあるが、明確に特徴づけられない不均一集団であるというデメリットもある。
【００１５】
一方、前記心臓幹細胞集団は、非常によく特徴づけられた幹細胞／前駆体に富むというメリットを有し、心筋の機能的増加及び処置される患者の生活の質に関する証明された治療上の機能を有するが、上述の集団は、極めてまれな内在的集団であり、また増殖能が低いため、臨床的に重要な数を得ることが困難であるというデメリットを示す。
【００１６】
細胞の組み合わせはより良好な結果を生み出すため、現在利用可能な最新の手法（心臓幹細胞及び間葉系幹細胞の併用）は、より良好な治療上の有利性を潜在的に有しうるが、同時に、改善が可能だとしてもその基礎となるメカニズムは依然不明である。さらに、細胞を組み合わせる結果、損傷を受けた心筋における有効率及び最も活性な集団を決定する上でばらつきが生じてしまう。
【発明の概要】
【００１７】
ここで、本願発明者は、特に臨床的に有意義な数のｈＣＰＣ及び高純度規格を得る際の効率性に関して、背景技術の単離プロセスに影響を及ぼす種々の技術的課題を解決するヒト心臓前駆細胞亜集団（ｈＣＰＣ）を単離する方法を開発した。
【００１８】
実際、本発明に係る心臓前駆体を単離する方法によって、初代培養物から制御されたやり方で心臓細胞の種々の亜集団を増殖させることが可能であり、かつそれらの表現型特性を維持し、相当程度短縮したタイムフレームで臨床的に有意義な数の細胞を得ることができる。
【００１９】
本発明に係る方法の他の目的は、心臓における任意の細胞源から得られる任意の生検（単に例として挙げるだけであるが、左右心耳生検、中隔生検、心尖生検、心室生検）から（少量の出発材料から開始する場合であっても）、細胞を単離することである。
【００２０】
本発明に係る前記単離方法は、極めて多目的に使える、すなわち、表面抗原を陽性及び／又は陰性に発現する元の集団に存在する任意の亜集団の選択に適している点でも有利であり、ＧＭＰ条件においても同様である。ＧＭＰ（医薬品及び医薬部外品の製造管理及び品質管理に関する基準）条件は、good manufacturing practice−つまり（例えば、臨床プロトコルの中における）想定される臨床的バッチの製造について許可された医薬品工場において当該製造を行うことを可能にする試薬、用具及び技術的手段を用いて試験されるプロトコル／試薬／物質−に従った開発のレベルを意味する。
【００２１】
そのようにして臨床的に有意義な数が単離された高選択亜集団は、特異的抗体を用いた検出により、表面マーカーの陽性選択又は陰性選択（又は両方）によって識別され得る。
【００２２】
本発明の単離方法を用いて得ることができる細胞の集団の、興味のある治療分野は、非限定的な例を挙げられば、有効な処置が現在のところ存在しない心臓疾患である。
【００２３】
ゆえに、本発明に係る前駆細胞の集団の単離方法によって、心臓前駆体の治療上の適用を多数の対象に広げることが可能である。特に、本方法は、（由来が虚血性でも非虚血性でも）進行心不全及び難治性虚血性心筋症のための極めて多用途な細胞治療手段を得る可能性を提供する。前記方法は、凍結保存後にも細胞の同一性が維持されていることを考慮して、自家細胞治療の状況及び同種異系細胞治療の状況のどちらにおいても適用可能である。
【００２４】
ゆえに、本発明の主題は、以下のステップを含むヒト心臓前駆細胞（ｈＣＰＣ）の亜集団を単離する方法である。
ａ）心臓細胞の集団を含む心臓組織試料をミンチすること、
ｂ）細胞懸濁液が得られるまで、酵素混合物を用いて前記心臓組織を４回、漸進的に消化し、そして３０μｍ〜１００μｍの範囲内の大きさのフィルタにより濾過すること、
ｃ）細胞懸濁液が得られるまで、酵素混合物を用いて、ステップｂ）で得られた残りの心臓組織を１６時間さらに消化し、そして３０μｍ〜１００μｍの範囲内の大きさのフィルタにより濾過すること、
ｄ）心臓細胞を増殖させるのに適切な培地中で、ステップｂ）及びステップｃ）で得られた細胞懸濁液を培養すること、
ｅ）心臓細胞を増殖させるのに適切な培地中において、ステップｄ）で得られた細胞懸濁液を酵素溶液又は非酵素溶液の存在下で予備的に増殖させること、
ｆ）心臓細胞をさらに増殖させるのに適切な培地中において、ステップｅ）で得られた心臓細胞を酵素溶液又は非酵素溶液の存在下で二次的に増殖させること、
ｇ）心臓前駆細胞の開始集団内で発現した１又は複数の表面抗原に対するモノクローナル抗体を使用して、陽性選択及び／又は陰性選択によって、心臓細胞の１又は複数の亜集団を単離すること。
【００２５】
好ましくは、前記単離ステップはイムノマグネティックソーティングによって行われる。
【００２６】
ステップａ）における心臓組織の試料は、前駆細胞を含む心臓器官及びその付属物におけるいずれの領域に由来するものであってもよく、新鮮組織由来でも凍結組織由来でもよい。特に好ましい実施形態においては、前記心臓組織試料は生検試料である。
【００２７】
好ましくは、前記心臓組織試料は、右心耳生検、左心耳生検、中隔生検、心尖生検又は心室生検に由来する心臓細胞の初代集団を含む（図３参照）。さらに好ましくは、前記心臓組織試料は右心耳に由来する。
【００２８】
上述の方法の別の実施形態によれば、前記開始心臓組織試料は、差別なく、成人対象、小児又は胎児のいずれに由来するものであってもよい。
【００２９】
ステップａ）のミンチステップは、手動又は自動で行うことができる。前記手動においては、殺菌条件においてピンセット又は外科用鋏を使用することも想定される。
【００３０】
ステップｂ）は、生存細胞懸濁液を得るために、４つの酵素消化ステップで実施され得る（３０分消化を４回）。ステップｃ）によって、ステップｂ）で得られた残りの心臓組織の消化を完了し、ＧＭＰ条件下においてインビトロで増殖可能な生存細胞の数を最大にすることができる。好ましくは、ステップｂ）の消化を１６時間、オーバーナイト（Ｏ／Ｎ）で行う。図４には、本発明者によって以前に用いられた方法（参考文献［４］及び［５］参照）に使用された心臓組織の３０分×４回の消化ステップのみを行った後に得られた細胞と、該消化をさらなる１６時間の消化によって得られた心臓組織断片の完全な消化と組み合わせて行った後に得られた細胞との比較を示す。本発明に係る処置により、ステップｂ）終了時に得られる細胞数を２倍にすることができる（継代Ｐ０〜Ｐ１）。
【００３１】
ステップｂ及びステップｃ）の前記酵素消化は、基礎培地（好ましくはＨａｍ’ｓ／Ｆ１２）及び酵素溶液を含む酵素混合物によって起きる。好ましくは、前記酵素溶液は、コラゲナーゼ及び／又はプロテアーゼの混合物を含む。さらに好ましくは、コラゲナーゼ及び／又はプロテアーゼの前記混合物は、コラゲナーゼＩ、コラゲナーゼＩＩ、コラゲナーゼＩＶ、トリプシン、ＥＤＴＡ、アクターゼ（accutase）、コラゲナーゼＡ、ディスパーゼ及びリベラーゼ（liberase）（すなわち、ＮＢ４又はＮＢ６（ＧＭＰ）、Ｓｅｒｖａ）から選択される１又は複数の酵素を含む。
【００３２】
好ましくは、ステップｄ）、ステップｅ）及びステップｆ）において心臓細胞を増加、増殖させるための理想的な前記培地は、基礎培地（好ましくはＨａｍ’ｓ／Ｆ１２）、血清（好ましくは１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ））、細胞成長のために必要な他の因子（具体的には、２ｍＭのＬ−グルタチオン、５×１０−３Ｕ／ｍＬのヒトエリスロポイエチン、１０ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ又はＦＧＦ２））、並びに抗生物質（具体的には、１０００Ｕ／ｍＬ以下のペニシリン及び１０００μｇ／ｍＬ以下のストレプトマイシン）を含む。この培地は、以下ではＦ１２Ｈと表される。イニシャルがＦ１２Ｇのものも同じ培地を表すが、ただしＧＭＰ条件で用いられるものを指す。
【００３３】
あるいは、心臓細胞集団の成長のための他の培地を用いることも可能であり、特に、基礎培地は、MEM、DMEM、Medium199、DMEM/F12、IMDM、neurobasal培地、EBM-2、α-MEM、mesencult又はHCSCEMからなる群から選択してもよい。ウシ血清に代わりにウマ血清を用いることもできる。さらに追加的な又は代替的な成長因子として、endothelial growth factor（ＥＧＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、亜セレン酸ナトリウム、インスリン、アスコルビン酸、ヘパリン、ヒドロコルチゾン、トランスフェリン、２−メルカプトエタノール、Ｌ−グルタメート、Ｂ２７、トランスフォーミング成長因子−β１、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）及び骨形成タンパク質４（ＢＭＰ−４）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２）、アクチビンＡ、カルジオトロフィン−１、ウシ脳抽出物（ＢＢＥ）並びにトロンビンを用いることが可能である。抗生物質として、ゲンタマイシン及びアンフォテリシンＢを代わりに用いてもよい。
【００３４】
さらに、細胞培養のためのプラスチックに代わるものとして、ポリリジン、フィブロネクチン又はブタゼラチンなどの種々のプラスチック上又は種々の支持体上で細胞を成長させることも可能である。
【００３５】
特に好ましい実施形態によれば、前記酵素混合物は、Ｈａｍ’ｓ／Ｆ１２基礎培地と、コラゲナーゼＮＢ４  Ｓｅｒｖａ又はコラゲナーゼＮＢ６  Ｓｅｒｖａの混合物とを含む。
【００３６】
好ましくは、コラゲナーゼの前記混合物は、０．１〜３ｍｇ／ｍＬの範囲内の濃度で存在する。
【００３７】
前記生検試料が完全に酵素消化されるために、上述した方法によれば、既知のプロトコルと比較してより迅速かつ効率よく細胞及び細胞クローンを抽出することができる。
【００３８】
細胞膜を損傷しない酵素溶液又は非酵素溶液を用いることによって、前記主要表面マーカーの発現を維持しつつ１又は複数のステップによる細胞懸濁液二重増殖ステップｅ）及びｆを行うことができる。好ましくは、前記酵素溶液又は前記非酵素溶液は、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔ、トリプシン及び／又はＥＤＴＡの混合物、細胞解離緩衝液（ＧＩＢＣＯ）、アクターゼ、及びディスパーゼからなる群から選択される。
【００３９】
好ましくは、心臓細胞を増殖させるための適切な培地は、上述したＦ１２Ｈである。
【００４０】
前記主要表面マーカーの発現を維持することによって、ステップｃ）の初代培養物から得られた前記細胞集団を凍結保存することができる。
【００４１】
非胚性前駆体／幹細胞は、培地中で非常にゆっくりと成長し、望ましくない希釈及び／又は分化を防ぐために分化細胞から前記非胚性前駆体／幹細胞を分離することが必要であると一般に考えられる。
【００４２】
本発明に係る方法によれば、心臓幹細胞及び心臓前駆細胞は、それらが分化細胞の混合集団内で維持される場合、より迅速に成長する。
【００４３】
予備的増殖ステップ及び二次的増殖ステップを想定するこの新しい手順の処置によって（前記背景技術説明に記載の既知方法（参考文献［１］、［４］、［５］参照）と異なり）、最後の細胞単離プロセスの前に注目する前駆体亜集団を大規模に増殖させることが可能であり（図７参照）、最終純度を高めることが可能である。
【００４４】
出発材料として平均重量が１４１，４±２８．２９ｍｇの心耳の断片（ｆｒａｇｍｅｎ）とし、ＧＭＰグレード条件で注目する集団を選択することを考えたとき、前記の追加的な増殖ステップによって、従来技術（参考文献［４］、図７）と比較して１０倍以上の数の開始細胞を得ることが可能である（実施例４参照）。
【００４５】
選択前の開始細胞の数が増加したことによる別のメリットは、得られた細胞数が細胞治療の治験で使用する上で既に充分であるので（この分野における治験において注射される細胞の数を考慮すると）、本発明の方法は、選択された細胞に対するさらなる選択後増殖ステップを必要としないということである。このことは「品質」に関する別のメリットにつながる。なぜなら、選択後増殖ステップを回避することによって、選択された注目する集団の希釈を防止することが可能であるからである。文献から知られているように、培養は、集団自体を部分的に分化させてしまうという固有の問題を有するので、選択された注目する集団をその状態を保ったまま増殖させることはできない。
【００４６】
したがって、ずっと多くの細胞（現状技術に対して１０倍以上）から開始して注目する集団の単離を行うことが可能であり、このため、著しく多数の、選択された前駆細胞が単離される。
【００４７】
表面抗原を認識する特異的抗体を用いることによる集団の単離に基づいた方法によれば、シグナル増幅システムのおかげで、任意の心臓細胞亜集団（たとえ存在割合の低いものであっても）を単離することが可能になる。
【００４８】
上記の提案された方法は、同様の細胞集団を得るために用いられる他の方法と比較して、明らかにより迅速な方法（平均して２２日間）である（図６ｂ参照）。実際、現状技術は、（数及び純度に関して）品質が明らかにより低い細胞製品を得るために、平均６６．５日間が必要であることを示す。
【００４９】
このように、本発明に係る方法によれば、１又は複数の選択表面マーカーについて高い純度の、１又は複数の心臓細胞亜集団を得ることができ、また、臨床的に有意義な量の細胞を得ることができる。
【００５０】
本発明に係る方法の単離ステップｇ）で用いられる特異的抗体は、好ましくは（例えば、ビオチンで）標識されたモノクローナル抗体であり、より好ましくは蛍光分子で標識されたモノクローナル抗体である。
【００５１】
好ましくは、前記蛍光分子は、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、及び磁気選択システムと併用するのに適切な別の蛍光マーカーから選択される。上述の抗体の直接標識又は間接標識を行うことが可能である。
【００５２】
さらに、前記抗体は一次抗体又は二次抗体（間接標識用のみ）であることができる。
【００５３】
好ましい実施形態によれば、ステップｇ）に係る分離は免疫磁気分離であり、モノクローナル抗体は磁気ビーズに結合させられる。
【００５４】
本発明に係るステップｇ）に従って前記分離を行うために用いることができる代替的な可能な選択システムは、Dynabeads Magnetic Separation Technology Thermo Fisher Scientific,EasySep（商標）Magnet STEMCELL又はフローサイトメトリーセルソーティング（すなわち、FacsAria BD）である。
【００５５】
前記方法の好ましい実施形態によれば、心臓組織試料が右心耳又は中隔に由来する場合（ＦＡＣＳ分析を用いた特性決定についての後述の実施例５を参照のこと）、以下の表１に列挙される抗原の群から選択される１又は複数の抗原に対するモノクローナル抗体を用いることが可能であり、該モノクローナル抗体は所望により蛍光マーカーされており、該蛍光マーカーは好ましくはビオチン、ＦＩＴＣ及びＡＰＣから選択される。
【００５６】
【表１】
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【００５７】
本発明に係る単離方法の好ましい実施形態によれば、本発明に係る方法のステップｇ）に従って注目する心臓前駆細胞亜集団を陽性選択及び／又は陰性選択するための前記モノクローナル抗体は、抗ＣＤ１１７及び／又は抗ＣＤ９０である。
【００５８】
本発明の好ましい実施形態によれば、陰性選択（実施例２参照）を用いるのか、同時二重陽性及び陰性選択（実施例３参照）を用いるのかに応じて、ＣＤ９０−とＣＤ１１７＋／ＣＤ９０−とから選択される表面抗原のプロファイルによって特徴づけられるヒト心臓前駆細胞の亜集団が、上記で概要を説明した単離方法によって得られる。特に、ヒト心臓前駆細胞ｈＣＰＣ  ＣＤ９０−の亜集団は、有意な抗炎症効果（図２２参照）に加えて、高い血管形成能及び高い心臓保護能（図２０〜図２１参照）を示した。また、前記亜集団ＣＤ１１７＋／ＣＤ９０−も有意な抗炎症効果（図２２参照）を示した。前記ｈＣＰＣ  ＣＤ９０−亜集団によって明らかとされたコラーゲン産生の低下のため、前記芦生団は移植の適切な候補になる（図２３参照）。
【００５９】
したがって、本発明のさらなる目的は、医療分野で用いるための、上記に概要を記載した単離方法によって選択されたヒト心臓前駆細胞ＣＤ９０−及びＣＤ１１７＋／ＣＤ９０−の亜集団である。本発明の単離方法によって得ることが可能な前記亜集団は、単独で使用してもよく、又は互いに組み合わせて使用してもよく、又は他のヒト心臓前駆細胞亜集団（例えば、ＣＤ１１７＋、ＣＤ１１７−、ＣＤ９０＋、ＣＤ１１７＋／ＣＤ９０＋、ＣＤ１１７−／ＣＤ９０−及びＣＤ１１７−／ＣＤ９０＋の亜集団）と組み合わせて使用してもよい。
【００６０】
本発明は、さらに、心臓血管細胞治療における、又は、心臓細胞及び／又は心臓組織移植分野における、上記に概要を記載した単離方法によって得られたヒト心臓細胞亜集団の使用に関する。
【００６１】
本発明から利益を得ることができる疾患としては、急性心臓疾患及び慢性心臓疾患、虚血由来又は非虚血由来の疾患、心筋疾患又は心筋病変、遺伝由来の心臓血管疾患、先天性心臓欠陥、弁膜性心臓疾患、悪性形態を含む不整脈、うっ血性心不全及び非うっ血性心不全、心内膜下線維症、左心室肥大又は右心室肥大、左心室の拡張、心筋急性梗塞、再狭窄、心筋炎、特発性拡張型心筋症、慢性虚血性心筋症、ジストロフィー心筋症（ｄｙｓｔｒｏｐｈｙｃ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ）（例えば、Ｄｕｃｈｅｎｎｅ型ジストロフィー又はＢｅｃｋｅｒ型ジストロフィー）、心膜疾患及び／又は心膜障害、難治性形態を含む狭心症、血管の疾患又は障害（アテローム性動脈硬化、動脈瘤、動脈炎、末梢動脈の狭窄及び下肢の高度の虚血を含む動脈、細動脈及び毛細管並びに関連構造の全疾患）、高血圧、自己免疫疾患が挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【００６２】
本発明に係る上述の方法によって選択された細胞の心臓保護、免疫調節能及び心筋再生能のため、上述の方法は、創傷修復プロセス又は再生治療も含む各種疾患の処置のための適切な手段となる。
【００６３】
ここで、本発明を、特に添付図面を参照して、その好ましい実施形態にしたがって、非限定的な例示的目的のために記載する。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】パネルＡ）及びパネルＢ）は、洗浄、秤量及びミンチの前の、大動脈−冠状動脈バイパス手術の間に採取されたばかりの右心耳の断片の図を示す。パネルＣ）及びパネルＤ）は、縦方向の切断後の前記断片の２つの面を示す。パネルＥ）は、手動で切り刻んだ後で得られた前記断片を示す。パネルＦ）は、回収され、処理された心耳の平均重量（組織のｍｇで表される）を関連標準偏差と共に示す図を示す。
【図２】研究又はＧＭＰ規格に従った酵素溶液の使用による心臓組織の消化の２つのヒストグラムを示す。研究酵素溶液及びＧＭＰ酵素溶液の使用によって、ステップ０（Ｐ０〜Ｐ１）の終了時に同等の数の細胞が得られる。
【図３】心臓組織の異なる採取源（心耳及び中隔）に由来する心臓前駆体含有細胞集団の単離の例を表す２つの図を示す。心臓の異なる領域から、同じ条件で、第１ステップ（Ｐ１〜Ｐ２）の終了時に同等の数の細胞を得ることができる。
【図４】第１消化ステップ（３０分×４回）後に、まだ消化されていない心臓組織のオーバーナイト消化を加えることによって得られた前記組織の断片の完全消化によって、ステップ１（Ｐ１〜Ｐ２）の終了時に得られる細胞の数が倍化する状態について示すグラフを示す。
【図５】培養５日後のインビトロ初代培養物の光学顕微鏡下で得られた像を示す。パネルＢ）は、この種の培養においては非常によく見られる、単一の前駆細胞から生じたと推定されるクローンを示す。
【図６】パネルＡ）は、培地における各ステップに必要な平均時間を示す図を示し、新鮮試料及び凍結試料を比較している。パネルＡ）から、どちらの場合も、成長時間に対する統計的に有意な変化無しに手法が再現できることが明らかと考えられる。パネルＢ）は、新鮮試料及び凍結処理試料の両方における、初代培養から注目する集団（Ｐ３）の選択までの日数の合計を示し、ここで日数はステップ毎に細分している。凍結が可能であることは、注目する表現型の維持についても証明された。パネルＣ）は、非選択集団の凍結の前後における抗原c-kit（ＣＤ１１７）の発現を示す図を示す。
【図７】ステップ２（Ｐ２〜Ｐ３）の終了時までに、心臓組織（右心耳）の４つの試料の完全な増殖から得られた細胞の数を示すグラフを示す。
【図８】種々のステップの期間における注目する前駆細胞の割合を報告する細胞蛍光測定分析を示す。パネルＡ）は、ステップＰ２及びステップＰ３の期間における選択されない集団におけるc-kit（ＣＤ１１７）の割合の維持を示すグラフを示す。パネルＢ）は、前記培養ステップＰ２及び前記培養ステップＰ３における前記抗原c-kitの発現を示す図を含む。
【図９】前記抗原c-kitについての陽性選択の例を示す。示された図は、物理的パラメータによって同定された対象集団を示し、注目する抗原の発現が蛍光抗体を用いて強調されている。パネルＡ）は、物理的パラメータによって同定された、分析された集団を示す図を含み、注目する抗原の発現が蛍光抗体を用いて強調されている。パネルＢ）は、非特異的標識の陰性対照として用いられる、選択前における、ＡＰＣと結合したアイソタイプのみで標識された集団を表す画像を示し（ゲートＲ２の内側）、パネルＣ）は、選択前の集団のマーカーの発現を示し（ゲートＲ３の内側）、パネルＤ）は、選択後の陽性集団の選択を示す（ゲートＲ３の内側）。
【図１０】抗原ＣＤ９０についての陰性選択の例を示す。示された図は、物理的パラメータによって同定された、分析された集団を示し（パネルＡ）、注目する抗原の発現は二次蛍光抗体に結合したビオチン化抗体を用いて強調されている。パネルＢ）は、選択前における、二次抗体（ＦＩＴＣで標識された抗ビオチン）のみで標識された集団を表す画像を示す（ゲートＨの内側）。パネルＣ）は、選択前の集団におけるマーカーの発現を示し（ゲートＨの内側）、パネルＤ）は、選択後の陰性集団の選択を示す（ゲートＨの内側）。
【図１１】一方のマーカー（ＣＤ９０）については陰性集団であり、かつ別のマーカー（c-kit）については陽性である集団の二重選択の例を示す。示された図は、パネルＡ）において、分析され、物理的パラメータによって同定された集団を示し、パネルＢ）は、選択前における、非特異的標識の陰性対照として用いられるＦＩＴＣと結合したアイソタイプのみで標識された集団を表す画像を示し、また、ＡＰＣと結合したアイソタイプのみで標識された集団を表す画像を示し（パネルＣ）、パネルＤ）及びパネルＥ）は、注目する抗原、すなわち、蛍光色素ＦＩＴＣと結合したＣＤ９０（パネルＤ）及び蛍光色素ＡＰＣと結合したc-kit（パネルＥ）の発現を示す。特に、パネルＤ）は、陰性選択についての注目する集団を示し（ゲート≪−≫の内側）、パネルＥ）は、陽性選択についての注目する集団を示し（ゲート≪＋≫の内側）、パネルＦ）は、選択後における、２つのマーカーの発現によって同定される集団の選択を示す（ゲート≪Ｌ−＋≫の内側）。
【図１２】注目する抗原（c-kit）を発現する集団であって、中程度又は低い平均蛍光強度を特徴とする集団も選択することを可能とする本発明に係る単離方法の図を示す（パネルＡ）。パネルＢ）は、本発明に係る方法によって得られた細胞集団の細胞数、純度及び細胞生存度を従来技術［４］と比較した表を示す。
【図１３】パネルＡ）は、物理的に分離されるが、選択後に成長が可能ならば成長のための同じ培地を共有する異なる細胞型の同時成長を可能にするＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）培養インサートを備えたプレート内に細胞を播種するプロセスの図を示す。例示された場合においては、選択された細胞をＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）インサート内の上側チャンバ内にプレーティングし、支持された細胞を下側のチャンバ内にプレーティングする。パネルＢ）は、選択された細胞の培養物のいくつかの例を示す。前記細胞は、培養内に戻すと、生存可能であり、かつ再び成長を開始し、クローンも形成する（前駆体／幹細胞の特異な性質である）。
【図１４】選択（この例では、ゲートＩの内側に見られる陰性選択）直後における注目する抗原ＣＤ９０の維持、及び選択された細胞を継代培養した後における注目する抗原ＣＤ９０の維持を示すグラフ（イムノソーティング）を示す。
【図１５】選択の直後、並びに凍結及び解凍後における、選択のために用いられたマーカーの維持の例を示す。この例においては、表面マーカーＣＤ９０について陽性選択を行い、単離の直後では集団の９８．６７％でＣＤ９０が発現しており、細胞の解凍後では集団の９７．３２％でＣＤ９０が発現している。
【図１６】抗c-kit  ＡＰＣヒト抗体（灰色の破線）及びＡＰＣで標識された抗ビオチン抗体（淡い実線）という標識選択肢の両方によって評価された、ＧＭＰ条件におけるc-kit陽性を特徴とする選択を行った後における心臓前駆体の集団を示す図である。陰性対照としてアイソタイプＡＰＣ（ヒストグラム全体）を用いた。
【図１７】心耳及び中隔の心臓組織の試料において評価される表面抗原の表を示す。
【図１８】Ｃｕｌｔｒｅｘアッセイによって評価されたｈＣＰＣ亜集団の内皮分化を示す。結果は、Ｃｕｌｔｒｅｘ膜上におけるｈＣＰＣ−ｎｓ、ｈＣＰＣ−ＣＤ１１７＋、ｈＣＰＣ−ＣＤ９０＋及びｈＣＰＣ−ＣＤ９０−における管構造形成を示す。パネルＡ）の棒グラフは、顕微鏡１視野当たりの管状構造の定量化を示し、パネルＢ）の棒グラフは、管状構造間の分岐点の数を示す。これらの条件で、ｈＣＰＣ−ＣＤ９０−亜集団は、４時間で、検討した他の亜集団（ｈＣＰＣ−ｎｓ）よりも有意に多い管状構造を産生する（（ｎ＝４）＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図１９】ＦＡＣＳ分析によって評価されたｈＣＰＣ亜集団の内皮分化を示す。棒グラフは、血管新生促進ＥＧＭ−２培地での培養後のｈＣＰＣ−ＣＤ１１７＋細胞及びｈＣＰＣ−ＣＤ９０−細胞におけるＶＥ−カドヘリン／ＣＤ１４４＋、ＣＤ１４６＋及びＶＥＧＦＲ−２／ＫＤＲ＋細胞の間の比較を示す。これらの条件で、ｈＣＰＣ−ＣＤ９０−細胞は、内皮マーカーＣＤ１４４及び内皮マーカーＫＤＲについて、有意に高い発現を示した。（ｎ＝４）＊ｐ＜０．０５。
【図２０】ｈＣＰＣ亜集団における成長因子及びサイトカインの発現プロファイルを示す。棒グラフは、非選択集団（ｈＣＰＣ−ｎｓ）と比較した、種々のｈＣＰＣ亜集団（ｈＣＰＣ−ＣＤ１１７＋、ｈＣＰＣ−ＣＤ９０−及びｈＣＰＣ−ＣＤ９０＋）におけるサイトカイン及び成長因子の放出の増加を示す。前記比較から、ｈＣＰＣ−ＣＤ９０−亜集団は、多くの因子について増大した分泌プロファイルを示し、ＩＬ−６及びＩＬ−８については、ｈＣＰＣ−ＣＤ１１７＋亜集団と比較して統計的有意性に達している（ｎ＝３）＊ｐ＜０．０５。
【図２１】ｈＣＰＣ亜集団の心臓保護能を示す。棒グラフは、ジストロフィー心筋症（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ型及びＢｅｃｋｅｒ型）の患者に由来するｉＰＳから誘導された心筋細胞（ＣＭ−ｄ−ｈｉＰＳＣ）における心筋トロポニンアイソフォームＩ（ｃＴｎＩ）の放出を示す。ｈＣＰＣ−ＣＤ９０−亜集団は、両方のＣＭ−ｄ−ｈｉＰＳＣ集団に対し、最も高く、有意な心臓保護効果を示すことが明らかであり、最も低いトロポニン放出を誘導する。（ｎ＝６）＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図２２】ｈＣＰＣ亜集団の抗炎症効果を示す。棒グラフは、ジストロフィー心筋症の患者のｉＰＳから誘導された心筋細胞（ＣＭ−ｄ−ｈｉＰＳＣ）におけるＴＮＦ−αの放出を示す。パネルＡ）：ｈＣＰＣ−ｎｓ、ｈＣＰＣ−ＣＤ１１７＋、ｈＣＰＣ−ＣＤ９０＋及びｈＣＰＣ−ＣＤ９０−の存在下で共培養された（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ型患者由来の）ＣＭ−ｄ−ｈｉＰＳＣ上清における、共培養開始から３日後のＴＮＦ−α放出。これらの条件下で、ｈＣＰＣ−ＣＤ９０−亜集団は、有意な抗炎症効果を示し、ＴＮＦ−α放出を減少させる（ｎ＝４）。パネルＢ：ｈＣＰＣ−ｎｓ、ｈＣＰＣ−ＣＤ１１７＋、ｈＣＰＣ−ＣＤ９０＋及びｈＣＰＣＣＤ９０−で共培養された（Ｂｅｃｋｅｒ型患者由来の）ＣＭ−ｄ−ｈｉＰＳＣ上清における、共培養開始から７日後のＴＮＦ−α放出。これらの条件下で、ｈＣＰＣ−ＣＤ９０−亜集団及びｈＣＰＣ−ＣＤ１１７＋／ＣＤ９０−亜集団は、有意な抗炎症効果を示す（ｎ＝６）。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図２３】５日間のＴＧＦ−β１処置後における、インビトロでのコラーゲン産生によって評価されたｈＣＰＣ亜集団の筋線維芽細胞分化を示す。前記比較は、ｈＣＰＣ−ＣＤ９０−亜集団が、検討した他の集団（ｈＣＰＣ−ｎｓ、ｈＣＰＣ−ＣＤ１１７＋及びｈＣＰＣ−ＣＤ９０＋）と比較してコラーゲンを産生する能力が最も低いことを示す。（ｎ＝３）＊ｐ＜０。
【発明を実施するための形態】
【００６５】
実施例１：陽性選択によるヒト心臓前駆細胞の集団を単離する方法
MATERIALS AND METHODS
（初代培養）
３６．８〜６３１．８ｍｇの範囲内の重量のヒト心耳の試料（図１参照）を手術室で採取し、その脱水を防ぐため、直ちに少なくとも１種の殺菌した溶液（リン酸塩緩衝食塩水、ＰＢＳ又は生理的溶液）、好ましくは前記組織の生存度も維持する溶液（例えば、任意の培地）を含む殺菌した容器内に移す
【００６６】
あるいは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）若しくはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）又はウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む別の溶液を用いることも可能である。その時点から前記試料を制御された温度（＋４℃）で保持し、４８時間以内に処理することができ、又はＦＢＳ及びＤＭＳＯを少なくとも含む溶液中の液体窒素内で凍結させることができる。凍結は、培養が得られるのかどうかに対して影響を及ぼさないからである（図６ａ〜図６ｂ参照）。処理のために、特に心外膜除去プロセスを参照した適切な調製の後、前記断片を秤量し、顕微手術用ピンセット及び微細手術用鋏を用いて約１〜２ｍｍ３の断片にミンチし、消化溶液（一般的には、出発組織１００ｍｇにつき１．７ｍＬの溶液）と共にチューブ内に移す。消化溶液は基礎培地を含み、基礎培地は好ましくは３ｍｇ／ｍＬの濃度でコラゲナーゼＮＢ４（ＳＥＲＶＡ）を含むＨａｍ’ｓ／Ｆ１２である（図２参照）。
【００６７】
（断片の消化）
１．前記組織断片を含む（１又は複数の）前記チューブを、回転振動機内に移す。回転振動機により、前記溶液が前記断片自体の有効な消化により濁る（一般的には、３０〜４０分間又は最高４時間）まで、３７℃の温度で前記チューブの内部で前記断片を動かすことができる。
２．前記（１又は複数の）チューブを回収する。まだ消化されていない断片をチューブの底部に堆積させることができる。（細胞を含む）「消化された」溶液を回収し、チューブ内に移し、ＰＢＳの添加後、チューブを遠心分離して細胞を底部に堆積させる（チューブは、４℃で、４００ｇ１０分間又は８００ｇ５分間遠心分離する）。
３．前記上清を除去し、完全培地中で前記細胞を再懸濁し、氷中に置かれた前記細胞を含むチューブを移し、後に行われる消化を待つ。特定の場合において、前記完全培地は、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭのＬ−グルタチオン及び５×１０−３Ｕ／ｍＬのヒトエリスロポイエチン、１０ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ又はＦＧＦ２）及び抗生物質（１０００Ｕ／ｍＬ以下のペニシリン及び１０００ｕｇ／ｍＬ以下のストレプトマイシン）を含むＨａｍ’ｓ／Ｆ１２からなる（Ｆ１２Ｈ）。
【００６８】
ここで、まだ消化されない組織の断片を含むチューブに新しい消化溶液を加え、上記のステップ１〜３を合計４回繰り返す。
【００６９】
氷中で保存された４つの消化物を回収し、シリンジフィルタ（好ましくは７０μＭのシリンジフィルタ）に接続されたシリンジに移し、新しいチューブへと濾過する。完全培地を有する前記４つのチューブを洗浄し、洗浄液も濾過のために同じシリンジ内に移す。
【００７０】
特定の場合においては、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭのＬ−グルタチオン及び５×１０−３Ｕ／ｍＬのヒトエリスロポイエチン、１０ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ又はＦＧＦ２）及び抗生物質（１０００Ｕ／ｍＬ以下のペニシリン及び１０００ｕｇ／ｍＬ以下のストレプトマイシン）を含むＨａｍ’ｓ／Ｆ１２培地を用いる（Ｆ１２Ｈ）。
【００７１】
濾過された溶液を、ペトリ皿などの殺菌した培養皿（一般的には、元々の培地１００ｍｇにつき直径１００ｍｍのプレート１つ）内にプレーティングする（Ｄａｙ１）。
【００７２】
前記（１又は複数の）チューブ内にまだ存在する断片の全体消化を行うために、新しい消化溶液を加えるが、好ましくは０．３ｍｇ／ｍＬ以下の濃度で該消化溶液を加える。
【００７３】
組織の断片を含む（１又は複数の）前記チューブを、回転振動機内に移す。該回転振動機は、一晩中（約１６時間）３７℃の温度でチューブの内部での前記断片の移動を可能にする。
【００７４】
消化された前記溶液を、ナイロンメッシュフィルタ（好ましくは７０μＭのナイロンメッシュフィルタ）を用いて濾過し、濾液を回収する。同じフィルタをＰＢＳで洗浄し、濾過された溶液を遠心分離して、細胞を底部上に沈降させる。
【００７５】
上清を除去し、細胞を完全培地Ｆ１２Ｈ中に再懸濁し、ペトリ皿などの殺菌した培養皿（一般的には、元々の培地１００ｍｇにつき直径１００ｍｍのプレート１つ）内にプレーティングする。前記チューブは完全培地Ｆ１２Ｈで洗浄してもよく、まだチューブ内に存在する細胞を回収するために、洗浄液を同じペトリ皿内に移してもよい（Ｄａｙ２）。
【００７６】
培養４８時間後（３０分×４回の消化の場合はＤａｙ３、一晩中消化された断片の場合はＤａｙ４）、デトリタス、死滅した細胞又は付着しなかった細胞を含む培地を完全に除去し、プレートをＰＢＳで洗浄し、新しい新鮮な培地Ｆ１２Ｈを加える（図４）。
【００７７】
前記培地を換えるが、好ましくは２日毎に換える。
【００７８】
顕微鏡下で細胞の成長を検査し、約７０％のコンフルエンスに達した場合、又は存在するクローンが過度にコンフルエントになる場合、細胞の増幅を行う（図５）。
【００７９】
（非選択集団の増幅）
４．培地を除去し、細胞がプレーティングされるペトリ皿の表面をＰＢＳで洗浄し、プラスチックから細胞を剥離させる溶液を加える。ペトリ皿は、細胞懸濁液を得るために必要な時間、３７℃に制御された温度でインキュベートされる。このプロセスのために、酵素溶液（トリプシン）又は非酵素溶液（Ｔｒｙｐｌｅ  Ｓｅｌｅｃｔ、ＥＤＴＡ、細胞解離緩衝液又はセルストリッパ）を用いることが可能である。
５．ＦＢＳ（酵素溶液を用いた場合）又はＰＢＳ（非酵素溶液を用いた場合）を含有する溶液の添加によって、前記反応を中断する。チューブ内の細胞を含む溶液を遠心分離する。
６．細胞を計数し、１：１０の希釈率で、又は、好ましくは１２００〜１５００個／ｃｍ２の濃度で、Ｆ１２Ｈ培地内に再度プレーティングする。培地を換えるが、好ましくは２日毎に換える。
【００８０】
顕微鏡下で細胞の成長を検査し、７０％のコンフルエンスに達した場合、（ステップ４〜ステップ６を繰り返すことによって）細胞のさらなる増幅を行う。実際、前記さらなるステップは、後に選択される注目する集団を同定する、注目する抗原の頻度を損なわない（図８）。あるいは、凍結保存は、後に選択される注目する集団を同定する、注目する抗原の頻度を損なわないので、得られた細胞集団を凍結保存して、後日、単離を完了することも可能である（図６ｃ参照）。
【００８１】
（陽性選択による注目する集団の単離）
単離すべき集団を非酵素的方法を用いてペトリ皿から剥離し（「非選択集団の増幅」の項参照）、細胞を計数し、再懸濁する（好ましくは冷たい単離緩衝液（Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ、ＷＢ）中に再懸濁する）。特定の場合においては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ又はＨＳＡ）を含有するＰＢＳを用いる。細胞は、１００μＬあたり１×１０６個の濃度で再懸濁した。
【００８２】
選択前に蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）分析のために一部の細胞（１００，０００個の細胞）を用いる。
【００８３】
細胞を、注目する集団を認識する抗体に結合する蛍光分子と同じ蛍光分子（この例ではＡＰＣ）に結合したＩｇＧアイソタイプイムノグロブリンで標識して周囲温度において暗所で１５分間インキュベートするか、又は、ＡＰＣで標識した抗ビオチン抗体で標識して＋４℃で暗所で１５分間インキュベートした。標識後、前記細胞をＷＢで洗浄し、ＦＡＣＳによって分析した（アイソタイプとして同定されるチューブ）（図９ａ〜図９ｂ参照）。
【００８４】
残りの細胞を選択のための抗体で標識した。細胞を撹拌しながら、＋４℃で２０分間、１×１０６個の細胞につき２μｇの濃度で、ビオチン標識した抗ヒトＣＤ１１７抗体で標識した。
【００８５】
標識後、細胞をＷＢで（好ましくは冷たいＷＢで）洗浄し、遠心分離した。上清を除去し、１６０μＬあたり１×１０６個の濃度で細胞をＷＢ中に再懸濁した。
【００８６】
選択前に、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）分析のために一部の細胞（１００，０００個の細胞）を用いる。細胞を、ＡＰＣ標識抗ビオチン抗体で標識し、＋４℃で暗所で１５分間インキュベートした。標識後、細胞をＷＢで洗浄し、ＦＡＣＳによって分析した（Ｍａｒｋｅｄとして同定されるチューブ）（図９ｃ参照）。
【００８７】
残りの細胞を前記二次抗体で標識した。４０μＬに１×１０７個の濃度で抗ビオチン抗体と共にマイクロスフェアを用い、細胞を撹拌しながら＋４℃で１５〜２０分間標識した。
【００８８】
標識後、細胞を、ＷＢ(好ましくは冷たいＷＢ）で洗浄し、遠心分離した。上清を除去し、細胞を冷たいＷＢ中に再懸濁した。細胞を、次に行う磁気分離のために、１．５×１０６個以下の細胞については体積５００μＬ中に、又は１５×１０７個以下の細胞については体積１ｍＬ中に再懸濁した。
【００８９】
（磁気分離）
磁気分離は、例えばＭｉｌｔｅｎｙｉ社製のカラム及び磁石を用いて行うことができる。ＷＢ（好ましくは冷たいＷＢ）（ＭＳカラムについては５００μＬ、またＬＳカラムについては１ｍＬ）を用いてカラムを活性化する。陰性集団はチューブ内に回収する（ＮＥＧ）。前記細胞を前記磁気カラム内に移す（前記ＭＳカラム内には１．５×１０６個以下の細胞、又は前記ＬＳカラム内には１５〜３０×１０７個以下の細胞）。ＷＢ（好ましくは冷たいＷＢ）を加えて（前記ＭＳカラムに対しては５００μＬ、前記ＬＳカラムに対しては１ｍＬ）、前記カラムを３回洗浄する。陽性集団（ＰＯＳ）は、磁石からはがした後でカラムの内容物をチューブ内に絞り出し、ＷＢ（好ましくは冷たいＷＢ）を加える（前記ＭＳカラムに対しては１ｍＬ、また前記ＬＳカラムに対しては２ｍＬ）ことによって回収する。選択純度を増加させるために、選択された陽性細胞（ＰＯＳ）を、予想される数に基づいて、新しいＭＳ磁気カラム又はＬＳ磁気カラムに通すことができる。選択された陽性細胞の数を増加させるために、開始数に基づいて、前記ＮＥＧチューブの細胞を新しいＭＳ磁気カラム又はＬＳ磁気カラムに通すことが可能である。前記陽性（ＰＯＳ）細胞及び前記陰性（ＮＥＧ）細胞を遠心分離し、Ｆ１２Ｈ培地中に再懸濁し、計数した。
【００９０】
また、この場合、選択後に一部の細胞（１００，０００個の細胞）を、その純度を確認するために蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）分析（図９ｄ）に用いる。細胞を、ＡＰＣで標識した抗ビオチン抗体で標識し、＋４℃で暗所で１５分間インキュベートした（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）。標識後、細胞をＷＢで洗浄し、ＦＡＣＳによって分析した。
【００９１】
選択後、細胞を凍結してもよく、又はプレーティングしてもよい。特に、物理的に分離されるが、同じ培地を共有する異なる細胞型の同時培養を可能にする培養インサートを備えた特定のＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）プレート内にプレーティングしてもよい（図１３）。特に、陽性細胞を、４，０００〜２０，０００個／ｃｍ２の範囲内の濃度で前記培養プレートの底部上のＦ１２Ｈ培地内にプレーティングし、陰性細胞を、３，０００〜１０，０００個／ｃｍ２の範囲内の濃度でＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）インサート上にプレーティングしたが、逆でもよい。
【００９２】
（実施例２：）陰性選択によるヒト心臓前駆細胞の集団を単離する方法
選択前における、断片の消化ステップ、初代培養及び増殖は、実施例１の場合と同様である。
【００９３】
（陰性選択による注目する集団の単離）
非酵素的方法（「非選択集団の増幅」の項参照）を用いて、単離すべき前記集団を前記ペトリ皿から剥離し、前記細胞を計数し、冷たい単離緩衝液（ＷＢ）中に再懸濁する。細胞を、１００μＬあたり１×１０７個の濃度で再懸濁した。
【００９４】
陰性選択前に、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）分析のために一部の細胞（１００，０００個）を用いる。細胞を、注目する集団を認識する抗体（１μＬの抗体）に結合する蛍光分子（この例ではＦＩＴＣ、ＢＤ）と同じ蛍光分子に結合したイムノグロブリン（アイソタイプＩｇＧ）で標識し、周囲温度で暗所内で１５分間インキュベートするか、又は、抗ビオチンＦＩＴＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）抗体（１０μＬの抗体）で標識し、＋４℃で暗所内で１５分間インキュベートした。
【００９５】
標識後、細胞をＷＢで洗浄し、ＦＡＣＳによって分析した（Ｉｓｏｔｙｐｅ同定チューブ、図１０ａ〜図１０ｂ参照）。
【００９６】
残りの細胞を選択のための抗体で標識した。細胞を、＋４℃で、又は氷中において、１０分間、１×１０７個の細胞につき１０μＬの濃度で、ビオチンに結合した抗ヒトＣＤ９０抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）で標識した。
【００９７】
標識後、細胞を冷たいＷＢで洗浄し、遠心分離した。上清を除去し、細胞を、１６０μＬあたり１×１０６個の濃度で、ＷＢ中に再懸濁した。
【００９８】
選択前に、一部の細胞０，０００個）を光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）分析に用いる。細胞を、ＦＩＴＣで標識した抗ビオチン抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）（１０μＬの抗体）で標識し、＋４℃で暗所で１５分間インキュベートした。標識後、細胞をＷＢで洗浄し、ＦＡＣＳによって分析した（Ｍａｒｋｅｄとして同定されるチューブ、図１０ｃ）。
【００９９】
残りの細胞を二次抗体で標識した。１×１０７個の細胞につき４０μＬの濃度で、ビオチン抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）と共にマイクロスフェアを用い、細胞を撹拌しながら、＋４℃で１５〜２０分間標識した。
【０１００】
標識後、細胞を冷たいＷＢで洗浄し、遠心分離した。上清を除去し、細胞を冷たいＷＢ中に再懸濁した。細胞を、次の磁気分離のために、５００μＬあたり３０×１０７個以下の細胞濃度で再懸濁した。
【０１０１】
（磁気分離）
磁気分離は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社製のカラム及び磁石を用いて行うことができる。冷たいＷＢ（ＬＤカラムについては２ｍＬ）を用いてカラムを活性化する。細胞を磁気カラム内に移した（ＬＤカラム一本に３０×１０７個以下の細胞）。毎回冷たいＷＢを加えて（前記ＬＤカラムに対して１ｍＬ）カラムを２回洗浄した。陰性集団はチューブ内に回収する（ＮＥＧ）。選択純度を増加させるために、選択された陰性細胞（ＮＥＧ）を、予想される数に基づいて、新しいＭＳ磁気カラム又はＬＳ磁気カラムに通した。この場合、細胞を、予め活性化されたカラムに（冷たいＷＢを用いて）通過させた後、続いてカラム自体を洗浄すること無しに陰性集団を回収した。陽性集団も回収する場合、それを磁石からはがして、冷たいＷＢを加え、その後に１５ｍＬのチューブ内にカラムの内容物を絞り出すことによって、陽性集団を回収する（ＰＯＳ）。選択純度を増加させるために、選択された陽性細胞（ＰＯＳ）を、予想される数に基づいて、新しいＭＳ磁気カラム又はＬＳ磁気カラムに通した。陽性（ＰＯＳ）細胞及び前記陰性（ＮＥＧ）細胞を遠心分離し、Ｆ１２Ｈ培地中に再懸濁し、計数した。
【０１０２】
選択後に、一部の細胞（１００，０００個の細胞）を、その純度を確認するために、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）分析に用いる。細胞を抗ビオチン抗体ＦＩＴＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）（１０μＬの抗体）で標識し、＋４℃で暗所内で１５分間インキュベートした。標識後、細胞をＷＢで洗浄し、ＦＡＣＳによって分析した（図１０ｄ）。
【０１０３】
選択後、細胞の選択された表現型が変化しないこと（図１４）を考慮すると、細胞を凍結してもよく（陽性選択の例については図１５を参照のこと）、又は３０００〜５０００個／ｃｍ２の範囲内の濃度でプレーティングすることができる。
【０１０４】
実施例３：陽性選択及び陰性選択の組み合わせによるヒト心臓前駆細胞の集団を単離する方法
選択前における、断片の消化ステップ、初代培養及び増殖は、実施例１の場合と同様である。
【０１０５】
（陽性選択及び陰性選択の組み合わせによる注目する集団の単離）
非酵素的方法（「非選択集団の増幅」の項参照）を用いて、単離すべき集団をペトリ皿から剥離し、細胞を計数し、冷たい単離緩衝液（ＷＢ）中に再懸濁する。細胞は、１００μＬあたり１×１０７個の濃度では再懸濁しなかった。
【０１０６】
選択前に、一部の細胞（４００，０００個）を蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）分析のために用いる（図１１Ａ〜図１１Ｅ）。続いて、細胞を４つの別々のチューブに分けた。
【０１０７】
第１のチューブ（Ｉｓｏｔｙｐｅ  ＦＩＴＣとして同定される）を、注目する集団を認識する抗体（１μＬの抗体）に結合した蛍光分子と同じ蛍光分子（この例においてはＦＩＴＣ、ＢＤ）に結合したイムノグロブリン（アイソタイプＩｇＧ）で標識し、周囲温度で暗所において１５分間インキュベートし、第２のチューブ（Ｉｓｏｔｙｐｅ  ＡＰＣとして同定される（図１１Ｃ参照））を、注目する集団を認識する前記抗体に結合した蛍光分子と同じ蛍光分子（この例においてはＡＰＣ、ＢＤ）に結合したイムノグロブリンで標識し、第３のチューブ及び第４のチューブ（それぞれＣＤ９０  ＦＩＴＣ及びc-kitＡＰＣとして同定される（図１１Ｄ及び図１１Ｅ参照））を、それぞれの特異的な抗体（ＣＤ９０  ＦＩＴＣ及びc-kitＡＰＣ、ＢＤ）（５μＬ以下の抗体）で標識し、周囲温度で暗所で１５分間インキュベートした。標識後、細胞をＷＢで洗浄し、ＦＡＣＳによって分析した。
【０１０８】
残りの細胞を選択（陰性選択）のための第１の抗体で標識した。細胞を、＋４℃で又は氷中で、１０分間、１×１０７個の細胞につき１０μＬの濃度で、ビオチンに結合した抗ヒトＣＤ９０抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）で標識した。
【０１０９】
標識後、細胞を冷たいＷＢで洗浄し、遠心分離した。上清を除去し、細胞を、１６０μＬあたり１×１０６個の濃度でＷＢ中に再懸濁した。
【０１１０】
細胞を二次抗体で標識した。抗ビオチン抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）と共にマイクロスフェアを１×１０７個の細胞につき４０μＬの濃度で用い、細胞を撹拌しながら、＋４℃で１５〜２０分間標識した。標識後、細胞を冷たいＷＢで洗浄し、遠心分離した。上清を除去し、細胞を冷たいＷＢ中に再懸濁した。細胞を、次の磁気分離のために、５００μＬあたり３０×１０７個以下の濃度で再懸濁した。
【０１１１】
（陰性磁気分離）
磁気分離は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社製のカラム及び磁石を用いて行うことができる。冷たいＷＢ（ＬＤカラムについては２ｍＬ）を用いて前記カラムを活性化する。細胞を磁気カラム内に移す（ＬＤカラム内に３０×１０７個以下の細胞）。毎回冷たいＷＢを加えて（ＬＤカラムに対して１ｍＬ）、カラムを２回洗浄した。陰性集団はチューブ内に回収する（ＮＥＧ）。選択純度を増加させるために、選択された陰性細胞（ＰＯＳ）を、予想される数に基づいて、新しいＭＳ磁気カラム又はＬＳ磁気カラムに通した。この場合、細胞を、予め活性化されたカラムに（冷たいＷＢを用いて）通過させた後、続いてカラム自体を洗浄すること無しに陰性集団を回収した。陽性集団も回収する場合、それを磁石からはがして、冷たいＷＢを加え、その後にチューブ内にカラムの内容物を絞り出すことによって、陽性集団を回収する（ＰＯＳ）。選択純度を増加させるために、選択された陽性細胞（ＰＯＳ）を、予想される数に基づいて、新しいＭＳ磁気カラム又はＬＳ磁気カラムに通すことができる。
【０１１２】
前記陰性細胞（ＮＥＧ）を遠心分離し、冷たいＷＢ中で再懸濁し、計数した。前記細胞を、１００μＬあたり１×１０６個の濃度で再懸濁しなかった。
【０１１３】
前記細胞を選択（陽性選択）のための抗体で標識した。細胞を撹拌しながら、＋４℃で２０分間、１×１０６個の細胞につき２μｇの濃度で、ビオチンに結合した抗ヒトＣＤ１１７抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で標識した。
【０１１４】
標識後、細胞を冷たいＷＢで洗浄し、遠心分離した。上清を除去し、細胞を、１６０μＬあたり１×１０６個の濃度でＷＢ中に再懸濁し、二次抗体で標識した。１×１０７個の細胞につき４０μＬの濃度で、抗ビオチン抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）と共にマイクロスフェアを用い、細胞を撹拌下で、＋４℃で１５〜２０分間標識した。
【０１１５】
標識後、細胞を冷たいＷＢで洗浄し、遠心分離した。上清を除去し、細胞を冷たいＷＢ中に再懸濁した。細胞を、次の磁気分離のために、１．５×１０６個以下の細胞については５００μＬの濃度で、また１５×１０７個以下の細胞については１ｍＬの濃度で再懸濁した。
【０１１６】
（陽性磁気分離）
磁気分離は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社製のカラム及び磁石を用いて行うことができる。冷たいＷＢ（ＭＳカラムについては５００μＬ、及びＬＳカラムについては１ｍＬ）を用いてカラムを活性化する。陰性集団をチューブ内に回収する（ＮＥＧ−ＮＥＧ）。細胞を磁気カラム内に移す（ＭＳカラム内には１．５×１０６個以下の細胞、またＬＳカラム内には３０×１０７個以下の細胞）。毎回冷たいＷＢを加えて（前記ＭＳカラムに対しては５００μＬ、前記ＬＳカラムに対しては１ｍＬ）、カラムを３回洗浄する。陽性集団を磁石からはがした後で、カラムの内容物をチューブ内に絞り出し、冷たいＷＢを加える（前記ＭＳカラムに対しては１ｍＬ、及び前記ＬＳカラムに対しては２ｍＬ）ことによって陽性集団を回収した（ＰＯＳ）。選択純度を増加させるために、選択された陽性細胞（ＮＥＧ−ＰＯＳ）を、予想される数に基づいて、新しいＭＳ磁気カラム又はＬＳ磁気カラムに通した。選択された陽性細胞の数を増加させるために、開始数に基づいて、ＮＥＧ−ＮＥＧチューブの細胞を新しいＭＳ磁気カラム又はＬＳ磁気カラム内に通した。陽性（ＮＥＧ−ＰＯＳ）細胞及び陰性（ＮＥＧ−ＮＥＧ）細胞を遠心分離し、Ｆ１２Ｈ培地中に再懸濁し、計数した。
【０１１７】
選択後に、一部の細胞（２００，０００個の細胞）を、その純度を確認するために蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）分析に用いた（図１１Ｆ参照）。細胞を、ＡＰＣで標識したマウス抗体である抗ヒトＣＤ１１７（ＢＤ、５μＬ以下）及びＦＩＴＣで標識した抗体である抗ヒトＣＤ９０（ＢＤ、１μＬ）で標識した。
【０１１８】
選択後、細胞は凍結してもよく、又はプレーティングしてもよい。特に、物理的に分離されるが、同じ培地を共有する異なる細胞型の同時培養を可能にする培養インサートを備えた特定のＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）プレート内にプレーティングしてもよい。特に、前記二重選択細胞（一つのマーカーに対しては陽性、かつ別のマーカーに対しては陰性）を、４，０００〜２０，０００個／ｃｍ２の範囲内の濃度で前記培養プレートの底部上のＦ１２Ｈ培地内にプレーティングし、同じ患者の細胞を、３，０００〜１０，０００個／ｃｍ２の範囲内の濃度でＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）インサート上にプレーティングしたが、逆でもよい（図１３）。
【０１１９】
実施例４：ＧＭＰ条件における心臓前駆細胞を単離する方法の実施
MATERIALS AND METHODS
（初代培養）
ヒト心耳の試料（３６．８〜６３１．８ｍｇの範囲内の重量）を手術室で採取し、その脱水を防ぐため、直ちに、殺菌した溶液（リン酸塩緩衝食塩水、ＰＢＳ、生理的溶液）、好ましくは前記組織の生存度も維持する溶液（すなわち、任意の培地）を含む殺菌した容器内に移す。
【０１２０】
あるいは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又はウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む別の溶液を用いることも可能である。
【０１２１】
その時点から前記試料を制御された温度（＋４℃）で保持し、好ましくは４８時間以内に処理する、又は凍結保存に適切な溶液中において液体窒素で凍結させることができる。処理のために、次いで前記断片を機械的にミンチする。ミンチが心耳を覆う心外膜の心耳を先に清浄化することを想定している場合、秤量前に前記断片を清浄化し、それ以外の場合、前記断片の洗浄化を必要としないプロトコルについては、依然として心耳をカバーする心外膜と共に心耳を秤量する。
【０１２２】
機械的なミンチのためには、継代を自動化することができる異なる機器を用いることができる。例えば、Ｍｅｄｉｍａｃｈｉｎｅ（ＢＤ）及びＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）といった機械を用いた。
【０１２３】
（断片の消化）
次いで、コラゲナーゼＮＢ−６（ＧＭＰグレード）を用いて、すでに基礎研究のために開発されている方法を採用して、ミンチされた組織を消化する（図２）。
１．前記組織断片を含む（１又は複数の）前記チューブを、回転振動機内に移す。回転振動機により、前記溶液が前記断片自体の有効な消化により濁る（一般的には、３０〜４０分間又は最高４時間）まで、３７℃の温度で前記チューブの内部で前記断片を動かすことができる。
２．前記（１又は複数の）チューブを回収する。まだ消化されていない断片をチューブの底部に堆積させることができる。（細胞を含む）「消化された」溶液を回収し、チューブ内に移し、ＰＢＳの添加後、チューブを４℃で遠心分離して、細胞を底部に沈降させる。
３．前記上清を除去し、完全培地中で前記細胞を再懸濁する。特定の場合において、１０％のＧＭＰグレードウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭのＬ−グルタチオン及び５×１０−３Ｕ／ｍＬのヒトエリスロポイエチン、１０ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ又はＦＧＦ２）及び抗生物質（１０００Ｕ／ｍＬ以下のペニシリン及び１０００ｕｇ／ｍＬ以下のストレプトマイシン）を含むＨａｍ’ｓ／Ｆ１２培地（Ｆ１２Ｇ）を用い、氷中に置かれた前記細胞を含むチューブを移し、後に行われる消化を待つ。
【０１２４】
ここで、まだ消化されない組織の断片を含むチューブに新しい消化溶液を加え、上記のステップ１〜３を合計４回繰り返す。
【０１２５】
氷中で保存された消化物を回収し、好ましくは７０μＭのシリンジフィルタに接続されたシリンジに移し、新しいチューブ内において濾過する。完全培地Ｆ１２Ｇを有する前記チューブを洗浄し、洗浄液も濾過のために同じシリンジ内に移す。
【０１２６】
濾過された溶液を、ペトリ皿などの殺菌した培養皿（一般的には、元々の培地１００ｍｇにつき直径１００ｍｍのプレート１つ）内にプレーティングする（Ｄａｙ１）。
【０１２７】
前記（１又は複数の）チューブ内にまだ存在する断片の全体消化を行うために、新しい消化溶液を加えるが、好ましくは０．３ｍｇ／ｍＬ以下の濃度で該消化溶液を加える。
【０１２８】
組織の断片を含む（１又は複数の）前記チューブを、回転振動機内に移す。該回転振動機は、一晩中（約１６時間）３７℃の温度でチューブの内部での前記断片の移動を可能にする。
【０１２９】
消化された前記溶液を、ナイロンメッシュフィルタ（好ましくは７０μＭのナイロンメッシュフィルタ）を用いて濾過し、濾液を回収する。同じフィルタをＰＢＳで洗浄し、濾過された溶液を遠心分離して、細胞を底部上に沈降させる。
【０１３０】
上清を除去し、細胞を完全培地Ｆ１２Ｇ中に再懸濁し、ペトリ皿などの殺菌した培養皿（一般的には、元々の培地１００ｍｇにつき直径１００ｍｍのプレート１つ）内にプレーティングする。前記チューブは完全培地Ｆ１２Ｇで洗浄してもよく、まだチューブ内に存在する細胞を回収するために、洗浄液を同じペトリ皿内に移してもよい（Ｄａｙ２）。
【０１３１】
培養４８時間後（３０分×４回の消化の場合はＤａｙ３、一晩中消化された断片の場合はＤａｙ４）、デトリタス、死滅した細胞又は付着しなかった細胞をを含む培地を完全に除去し、プレートをＰＢＳで洗浄し、新しい新鮮な培地Ｆ１２Ｇを加える（図４）。
【０１３２】
前記培地を換えるが、好ましくは２日毎に換える。
【０１３３】
顕微鏡下で細胞の成長を検査し、約７０％のコンフルエンスに達した場合、又は存在するクローンが過度にコンフルエントになる場合、細胞の増幅を行う（図５）。
【０１３４】
（非選択集団の増幅）
４．培地を除去し、細胞がプレーティングされるペトリ皿の表面をＰＢＳで洗浄し、プラスチックから前記細胞を剥離することができる非酵素溶液（ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を加える。前記非酵素溶液を、細胞懸濁液を得るために必要な時間（約３〜１０分間）、約３７℃に制御された温度で細胞と共にインキュベートする。
５．ＰＢＳを加えることによって前記溶液を不活性化する。チューブ内の細胞を含む溶液を遠心分離する。
６．細胞を計数し、１：１０の希釈率で、又は、好ましくは１２００〜１５００個／ｃｍ２の濃度で、Ｆ１２Ｇ培地内に再度プレーティングする。培地を換えるが、好ましくは２日毎に換える。
【０１３５】
顕微鏡下で細胞の成長を計数し、約７０％のコンフルエンスに達した場合、さらなる細胞の増幅を行う（ステップ４〜ステップ６参照）。５つの層（３１８０ｃｍ２）を有するセルスタックなど、大規模な増幅のために、３層（５２５ｃｍ２）を有するマルチフラスコ、５層（８７５ｃｍ２）を有するマルチフラスコを用いた。
【０１３６】
（陽性選択による注目する集団の単離）
前記非酵素的方法を用いて（「非選択集団の増幅」の項参照）、単離すべき集団を前記マルチフラスコ／セルスタックから剥離し、細胞を計数し、好ましくは冷たい単離緩衝液（ＷＢ）（好ましくは冷たい単離緩衝液（ＷＢ））中に再懸濁する。特定の場合においては、ＥＤＴＡ及びＨＳＡを含有するＰＢＳを用いる。細胞は、１００μＬあたり１×１０６個の濃度で再懸濁した。
【０１３７】
選択前に、一部の細胞（１００，０００個）を蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）分析のために用いる。細胞を、注目する集団を認識する抗体に結合する蛍光分子と同じ蛍光分子（この例ではＡＰＣ）に結合したイムノグロブリン（ＩｇＧアイソタイプ）で標識し、周囲温度で暗所内で１５分間インキュベートするか、又は、ＡＰＣで標識した抗ビオチン抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）で標識し、＋４℃で暗所内で１５分間インキュベートした。標識後、細胞をＷＢで洗浄し、ＦＡＣＳによって分析した（アイソタイプとして同定されるチューブ）。
【０１３８】
残りの細胞を選択のための抗体で標識した。細胞を撹拌しながら、＋４℃で約２０分間、１×１０６個の細胞につき２μｇの濃度で、ビオチンで標識した抗ヒトＣＤ１１７抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で標識した。
【０１３９】
標識後、細胞を冷たいＷＢで洗浄し、遠心分離した。上清を除去し、細胞を、１６０μＬあたり１×１０６個の濃度で、ＷＢ中に再懸濁した。
【０１４０】
選択前に、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）分析のために一部の細胞（１００，０００個）を用いる。細胞を、ＡＰＣ標識抗ビオチン抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）（１０μＬの抗体）で標識し、＋４℃で暗所で１５分間インキュベートした。標識後、細胞をＷＢで洗浄し、ＦＡＣＳによって分析した（Ｍａｒｋｅｄとして同定されるチューブ）。
【０１４１】
残りの細胞を二次抗体で標識した。１×１０７個の細胞につき４０μＬの濃度で、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ抗ビオチン抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）と共にマイクロスフェアを用い、細胞を撹拌しながら約＋４℃で１５〜２０分間標識した。
【０１４２】
標識後、細胞を、冷たいＷＢで洗浄し、遠心分離した。上清を除去し、細胞を冷たいＷＢ中に再懸濁した。細胞を、次に行う磁気分離のために、１．６×１０６個の細胞につき１ｍＬの体積に再懸濁した。
【０１４３】
（磁気分離）
臨床用を意図した磁気選択用機器を用いて磁気分離を行う。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社製ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  Ｐｌｕｓを用いた。陰性細胞の場合と同様に、関連プログラムを用いて、陽性細胞を使用し、当初の集団から分離し、関連バッグ内に回収した。
【０１４４】
選択後に一部の細胞（１００，０００個）を、その純度を確認するために蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）分析に用いる。細胞を、ＡＰＣで標識した抗ビオチン抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）（１０μＬの抗体）で標識し、＋４℃で暗所で１５分間インキュベートした。標識後、細胞をＷＢで洗浄し、ＦＡＣＳによって分析した（図１６）。
【０１４５】
選択後、細胞は、それを基に当該細胞を選択したマーカー発現を喪失することなく凍結することが可能であり（図１５におけるＣＤ９０陽性を参照）、次いで、細胞治療又は細胞移植のための臨床的使用にすぐに用いることができる。
【０１４６】
実施例５：心臓細胞の２つの異なる採取源において選択可能な表面マーカーの同定
MATERIALS AND METHODS
選択前における、断片の消化ステップ、初代培養及び増殖は、実施例１の場合と同様である。
【０１４７】
本実施例においては、３つの異なる心耳試料及び３つの異なる中隔試料を用いた。
【０１４８】
第３継代の終わりに、３つの心耳を計数し、単一の試料に合体させ、Ｖ４５０チャネル内の全ての細胞を蛍光にする蛍光マーカーＶｉｏＢｌｕｅ４５０で標識した。同様にして、中隔に由来する３つの試料を計数し、単一の試料に合体させ、ＦＩＴＣチャネル内の全ての細胞を蛍光にする蛍光マーカーＣＦＳＥで標識した。
【０１４９】
用いられた標識に基づいて、フローサイトメーターを用いて、前記２つの細胞集団を同定し、続いて、前記２つの細胞集団を用いて表面抗原のパネルを評価した。
【０１５０】
心耳心臓組織及び中隔心臓組織の試料において評価された表面抗原を図１７に示す表に示す。
【０１５１】
市販のキット（LEGENDScreen（商標）Lyophilized Antibody Panel Human Cell Screening(PE) Kit (BioLegend)）の製造業者の説明書に従って、前記標識を行った。
【０１５２】
適切なゲート戦略を用いて、図１７に示される全ての表面抗原について、前記２つの細胞集団を特性決定した。
【０１５３】
表２は、前記２つの異なる細胞集団によって発現された表面抗原と、前記２つの細胞採取源における各抗原の平均発現とを表す。用いられた前記２つの細胞源の少なくとも１つによって発現された全ての抗原を、陽性選択（実施例１参照）及び陰性選択（実施例２参照）のどちらにおける使用のためにも選択することができ、又は、適当ならば、２つ以上のマーカーの複合選択と組み合わせて（例えば実施例３に示されるように）用いるのに選択してもよい。
【０１５４】
【表２−１】
2020522282.tif 000003
【表２−２】
2020522282.tif 000004
【表２−３】
2020522282.tif 000005
【表２−４】
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【表２−５】
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【表２−６】
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【表２−７】
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【表２−８】
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【表２−９】
2020522282.tif 000011
【０１５５】
実施例６：従来技術の心臓細胞単離方法に対する比較研究
本発明に係る方法によって得られた細胞集団の細胞数、純度及び細胞生存度を、従来技術［４］と比較した。
【０１５６】
背景技術部において、［４］では、Ｆａｃｓ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒ（例えば、機器ＦａｃｓＡｒｉａ  ＢＤを用いて）を用いて選択を行う。しかし、この場合、選択のために用いられる抗原を高レベルで発現する細胞の集団（明るい集団）を選択することが可能であるだけであり、一方、低レベルでしか注目する抗原を発現しない陽性細胞（陽性Ｄｉｍ集団）を得ることはできない。
【０１５７】
本発明に係る方法によれば、発現レベルに関係なく、注目する抗原を発現する細胞の全てを選択することが可能である。
【０１５８】
図１２は、中程度又は低い平均蛍光強度を特徴とする、注目する抗原（c-kit）を発現する集団をも選択することを可能とする本発明に係る単離方法の図を示す（パネルａ）。パネルｂ）は、本発明に係る方法によって得られた細胞集団の細胞数、純度及び細胞生存度を従来技術［４］に対し比較した表を示す。
【０１５９】
（実施例７）：本発明の方法により得られたヒト心臓前駆細胞ＣＤ９０−芦生団及びＣＤ１１７＋／ＣＤ９０−亜集団の表現型及び機能性の特性決定
MATERIALS AND METHODS
（患者及び組織試料）
待機的心臓外科手術を受けている患者からヒト右心耳試料を得た。前もって地域の倫理委員会によって承認されたインフォームドコンセントを、ヘルシンキ宣言に従って各患者について得た。
【０１６０】
（フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ））
ｈＣＰＣ−ＣＤ９０−細胞に対する多色フローサイトメトリーを用いて、間葉マーカー、造血マーカー及び炎症マーカーの免疫表現型分析を行った。非酵素溶液を用いた剥離の後、細胞を、０．１％のＢＳＡ（Ｇｉｂｃｏ、米国）及び２ｍＭのＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ、米国）を含むＰＢＳ中に再懸濁し、以下のモノクローナル抗体又は対応するアイソタイプ（ＣＤ２９−ＰＥ、ＣＤ４４−ＰＥ、ＣＤ７３−ＰＥ、ＣＤ１０５−ＡＰＣ、ＣＤ１４  ＦＩＴＣ、ＣＤ３４−ＦＩＴＣ、ＣＤ４５−ＰＥ、ＨＬＡ−ＤＲ−ＦＩＴＣ、ＣＤ１４６−ＦＩＴＣ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、イタリア）、ＣＤ２００−ＦＩＴＣ、ＫＤＲ−ＰＥ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、米国）及びＣＤ１４４−Ａｌｅｘａ７００（１６Ｂ１クローン；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ））の適切な組み合わせと共に、１５分間、暗所でインキュベートした。次いで、該試料を１ｍＬのウオッシュバッファーで洗浄し、４℃で４００×ｇで１０分間遠心分離して、非結合抗体を除去した。細胞を２５０μＬのウオッシュバッファー中に再懸濁し、前記フローサイトメーターで分析した。
【０１６１】
（内皮機能性アッセイ及び分化）
ｈＣＰＣ−ｎｓ細胞及びそこから誘導された異なる亜集団がインビトロで血管構造を形成する能力を評価するために、Ｃｕｌｔｒｅｘ（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ、米国）の基底膜上に前記細胞を播種した。Ｃｕｌｔｒｅｘを、３７℃、５％ＣＯ２で３０分間、４８ウェルプレート上で重合させた。細胞を非酵素溶液を用いて剥離し、計数し、完全内皮成長培地−２（ＥＧＭ−２、Ｌｏｎｚａ、イタリア）中で８×１０４個／ｍＬに希釈し、ｃｕｌｔｒｅｘマトリックスを含んでいる各ウェルに播種した。前記プレートを、３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベートした後、毛細管構造の数及びそれらの分岐点の数を計数した。これらの実験における陽性対照として、同じ培養条件下でＨＵＶＥＣ細胞（Ｌｏｎｚａ、イタリア）を用いた。ＥＧＭ−２中において、３週間、ｈＣＰＣ−ｎｓ及びそこから誘導された異なる亜集団（ｈＣＰＣ−ＣＤ１１７＋、ｈＣＰＣ−ＣＤ９０−）を培養することにより、内皮へのコミットメントを分析した後、フローサイトメトリーによって免疫表現型を決定した。
【０１６２】
（培地中におけるサイトカイン分泌）
培地中でのサイトカインの発現を決定するために、ｈＣＰＣ−ｎｓ細胞及びそこから誘導される異なる亜集団（ｈＣＰＣ−ＣＤ１１７＋、ｈＣＰＣ−ＣＤ９０＋、ｈＣＰＣ−ＣＤ９０−）の馴化培地を回収して、４８時間以内に前記培地中に放出された可溶性因子の量を測定した。続いて、マイクロスフェアに基づいた多重イムノアッセイ（Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘアッセイ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、培地中に放出されたサイトカイン、ケモカイン及び成長因子を比較した。培地を、１０分間、４０００ｇで遠心分離した。上清を回収し、使用まで８０℃で凍結した。Ｌｕｍｉｎｅｘ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用説明書に従って用いて、以下の血管新生因子（間質細胞由来因子（ＳＤＦ−１）、ＧＲＯ（成長調節癌遺伝子）−α（ＧＲＯ−α）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）、マクロファージ炎症性タンパク質１β（ＭＩＰ−１ｂ）、Regulated on Activation Normal T Cell Expressed and Secreted（ＲＡＮＴＥＳ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）及び肝細胞成長因子（ＨＧＦ））の存在について、前記試料を二連で評価した。
【０１６３】
（トロポニンＩの心臓レベル（ｃＴｎＩ）の分析）
ｉＰＳから誘導される心筋細胞（ＣＭ−ｄ−ｈｉＰＳＣｓ）内のｃＴｎＩの濃度を決定するため、ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）（０．４μｍ孔）内における共培養をＣＭ−ｄ−ｈｉＰＳＣｓ細胞とｈＣＰＣ−ｎｓ細胞（並びにそれらから誘導された異なる亜集団である、ｈＣＰＣ−ＣＤ１１７＋、ｈＣＰＣ−ＣＤ９０＋、ｈＣＰＣ−ＣＤ９０−）との間で行った。共培養の開始から７日後、馴化培地を回収し、心筋トロポニンＥＬＩＳＡアッセイのために用いた。前記馴化培地を、４０００ｇで１０分間遠心分離し、化学発光ＥＬＩＳＡキット（Ｃａｌｂｉｏｔｅｃｈ）を、キットに含まれる説明書に従って使用して、上清をｃＴｎＩ濃度の決定のために用いた。
【０１６４】
（ＴＮＦ−αの分析）
ｉＰＳから誘導される心筋細胞（ＣＭ−ｄ−ｈｉＰＳＣｓ）内のＴＮＦ−α濃度を決定するため、ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）（０．４μｍ孔）内で、
ＣＭ−ｄ−ｈｉＰＳＣｓ細胞とｈＣＰＣ−ｎｓ細胞（並びにそこから誘導された異なる亜集団である、ｈＣＰＣ−ＣＤ１１７＋、ｈＣＰＣ−ＣＤ９０＋、ｈＣＰＣ−ＣＤ９０−）との間で共培養を行った。共培養の開始から３日後及び７日後、馴化培地を回収し、遠心分離（１０分、４０００ｇ）の後、キット内に含まれる説明書に従ってＥＬＩＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）アッセイに用いた。ＥＬＩＳＡアッセイに用いられる同じ馴化培地における各試料のタンパク質濃度に対してＴＮＦ含有量を標準化するために、５４０ｎｍにおける吸光度を測定するＢＣＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてタンパク質定量を行った。
【０１６５】
（Ｓｉｒｃｏｌアッセイ）
ＴＧＦ−β１で５日間処置されたｈＣＰＣ−ｎｓ及びそこから誘導される異なる亜集団であるｈＣＰＣ−ＣＤ１１７＋、ｈＣＰＣ−ＣＤ９０＋、ｈＣＰＣ−ＣＤ９０−、の細胞溶解物及び上清中の総可溶性コラーゲンの含有量を、製造業者のプロトコルの記載に従って、ｓｉｒｃｏｌアッセイ（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ）を用いて測定した。標準曲線によりコラーゲンの量を算出した。
【０１６６】
（統計分析）
定量的結果は、平均±標準偏差（ＳＤ）又は標準誤差（ＳＥ）として表される。スチューデントｔ検定によって変数を分析した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ５によって統計的有意性を評価し、Ｐ値≦０．０５を統計的有意と考えた。
【０１６７】
結果
最近、細胞治療において用いられる幹細胞及び／又は前駆細胞が、心臓保護作用及び抗アポトーシス作用を発揮し、血管形成を増加させ、炎症プロセスを調節する可溶性因子の産生を通じて、損傷を受けた心筋に対して良い効果を及ぼすという概念が明らかになってきた。ゆえに、これらのプロセスを効率的に調節することが可能な細胞集団を見出すことが重要である。
【０１６８】
（ｈＣＰＣ−ＣＤ９０−細胞の免疫表現型の特性決定）
以前の報告［４］と合致するように、ｈＣＰＣ−ＣＤ９０−細胞の亜集団は、典型的な間葉マーカー（例えば、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３及びＣＤ２００）を発現するが造血マーカー（例えば、ＣＤ１４及びＣＤ３４）や免疫系マーカー（ＨＬＡ−ＤＲ）を発現しない間葉系細胞の表現型特性を同様に維持する。表３は、フローサイトメトリーにおけるｈＣＰＣ−ＣＤ９０−の特性決定を示し、間葉マーカー（ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ１０５及びＣＤ２００）、免疫系マーカー（ＨＬＡ−ＤＲ）及び造血マーカー（ＣＤ３４、ＣＤ４５及びＣＤ１４）の発現を示す。データは、平均±ＳＥ（ｎ＝９）として表される。
【０１６９】
【表３】
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【０１７０】
（ｈＣＰＣ−ＣＤ９０−細胞の内皮分化）
機能的アッセイ及びフローサイトメトリーによってｈＣＰＣ−ＣＤ９０−細胞の分化を評価した。増殖後、ｃｕｌｔｒｅｘ合成マトリックス上で管構造を形成する能力について細胞を試験したが、他の分析された集団（（ｈＣＰＣ−ＣＤ１１７＋、ｈＣＰＣ−ＣＤ９０＋、ｈＣＰＣ−ＣＤ９０−）に対して４時間後における新しい管構造分岐の数の有意な増加を示した（図１８）。
【０１７１】
さらに、ｈＣＰＣ−ＣＤ９０−細胞を、３週間、血管新生促進培地ＥＧＭ−２中で成長させ、成熟内皮細胞に分化するそれらの能力を確立させた。結果として、考察された他のｈＣＰＣ集団（ｈＣＰＣ−ｎｓ及びｈＣＰＣ−ＣＤ１１７＋）と比較しての内皮マーカーＣＤ１４４／Ｖｅ−カドヘリン及びＫＤＲ／ＶＥＧＦＲ２の発現の増加によって示されるように、ｈＣＰＣ−ＣＤ９０−はより内皮細胞に分化しやすいことが示され、ｈＣＰＣ−ＣＤ１１７＋細胞との比較においては統計的有意性に達している（図１９）。
【０１７２】
ｈＣＰＣ−ＣＤ９０−細胞によるサイトカイン、ケモカイン及び成長因子分泌の分析
異なるｈＣＰＣ亜集団の血管新生促進能を、ｈＣＰＣ−ｎｓ、ｈＣＰＣ−ＣＤ１１７＋、ｈＣＰＣ−ＣＤ９０＋及びｈＣＰＣ−ＣＤ９０−の上清中におけるサイトカイン含有量を比較することによって、多重分析の使用により試験した。表４に示されるように、ｈＣＰＣ及びそれらから誘導された亜集団の上清中に、多くの血管形成サイトカイン（ＳＤＦ−１、Ｇｒｏ−α、ＳＣＦ、ＬＩＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１ｂ、ＲＡＮＴＥＳ、ＨＧＦ及びＶＥＧＦ）が見出された。
【０１７３】
【表４】
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【０１７４】
前記表は、４８時間で細胞によって放出された各サイトカインの発現（ｐｇ／ｍＬ／１０５）と、３つの細胞型によって産生された因子のスチューデントｔ検定による統計的比較の結果とを示す。＊＝ｈＣＰＣ−ｎｓに対する比較におけるｔ検定によるｐがｐ＜０．０５。データは、平均±ＳＥ（ｎ＝３）として表される。
【０１７５】
特に、血管新生促進サイトカイン（Ｇｒｏ−α及びＩＬ−８）及び炎症誘発性サイトカイン（ＩＬ−６、ＭＣＰ−１及びＭＩＰ−１ｂ）のレベルが、ｈＣＰＣ−ＣＤ９０−の上清中では、同じ患者の非選択集団（ｈＣＰＣ−ｎｓ）と比較して著しく向上したことを我々は見出したが、このことは、選択された前記集団が、同じ試料の非選択の集団と比較して因子を産生する能力がより大きいことを示唆している。さらに、ｈＣＰＣ−ＣＤ１１７＋、ｈＣＰＣ−ＣＤ９０＋及びｈＣＰＣ−ＣＤ９０−亜集団中における分泌因子強化を、同じ患者に由来する非選択の対応物にと比較して分析する（図２０）。その結果、ｈＣＰＣ−ＣＤ１１７＋亜集団と比較してｈＣＰＣ−ＣＤ９０−においては考察されたほとんど全ての因子についてより大きい発現が見られ、ＩＬ−６及びＩＬ−８については統計的有意性に達している。
【０１７６】
（ｈＣＰＣ−ＣＤ９０−は、Ｄｕｃｈｅｎｎｅ型筋ジストロフィー及びＢｅｃｋｅｒ型筋ジストロフィーの主要な病態生理学的特性からの復帰を媒介する。）
ジストロフィー患者（ＤＭＤ）（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ型ジストロフィー及びＢｅｃｋｅｒ型ジストロフィー）のｉＰＳ由来心筋細胞は、他の心筋疾患について記載されている［６］のと同様に心筋細胞死の増加及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−αなどの炎症誘発性サイトカイン放出を含む、筋ジストロフィーにおいて典型的な一連の表現型欠陥を示す。複数のＤＭＤ病態生理学的経路と拮抗する細胞集団を発見することは、細胞治療における開発の可能性の観点において重要である。このために、ジストロフィー患者のｉＰＳ由来心筋細胞の存在下で、ｈＣＰＣのいくつかの集団を培養した。共培養の開始から３日後及び７日後に上清を回収し、該上清を用いてジストロフィー障害において生じる心臓損傷の指標（培地中への心筋トロポニンＩ及びＴＮＦ−αの放出）を評価した。
【０１７７】
（ｈＣＰＣ−ＣＤ９０−亜集団の心臓保護効果）
異なるｈＣＰＣ集団の心臓保護効果を評価するために、Ｄｕｃｈｅｎｎｅ型患者及びＢｅｃｋｅｒ型患者に由来するＣＭ−ｄ−ｈｉＰＳＣの存在下で、それらを共培養した。結果として、分析されたものの中では、ｈＣＰＣ−ＣＤ９０−の亜集団が、培養の７日後における（培養におけるｃＴｎＩの放出で測定された）Ｄｕｃｈｅｎｎｅ型患者及びＢｅｃｋｅｒ型患者のＣＭ−ｄ−ｈｉＰＳＣの死滅を有意に減少させることが可能な唯一のものであることが示された（図２１）。
【０１７８】
（ｈＣＰＣ−ＣＤ９０−及びｈＣＰＣ  ＣＤ１１７＋／ＣＤ９０−亜集団の抗炎症効果）
異なるｈＣＰＣ集団の抗炎症効果を評価するために、Ｄｕｃｈｅｎｎｅ型患者及びＢｅｃｋｅｒ型患者のＣＭ−ｄ−ｈｉＰＳＣの存在下で、細胞を共培養した。結果として、分析されたものの中では、ｈＣＰＣ−ＣＤ９０−亜集団が、培養の３日後にＤｕｃｈｅｎｎｅ型患者のＣＭ−ｄ−ｈｉＰＳＣにおいて生じる損傷を有意に軽減すること（培地中におけるＴＮＦ−αの放出の減少によって示される）が可能な唯一のものであることが示された。表現型が損傷を受ける程度がより低いＢｅｃｋｅｒ型患者のＣＭ−ｄ−ｈｉＰＳＣに関して、それらは、考察された種々の亜集団（ｈＣＰＣ−ＣＤ１１７＋、ｈＣＰＣ−ＣＤ９０−及びｈＣＰＣ−ＣＤ１１７＋／ＣＤ９０−）に対してポジティブに応答し、培地中におけるＴＮＦ−α放出の有意な減少を示した。これらの条件において、より著しい効果を誘発すると見受けられる細胞集団は、ｈＣＰＣ−ＣＤ１１７＋／ＣＤ９０−亜集団であり、続いてｈＣＰＣ  ＣＤ９０−亜集団である（図２２）。
【０１７９】
（ＴＧＦ−β１によるｈＣＰＣ処置のインビトロにおける効果）
間葉由来の前駆細胞を用いた細胞治療の枠組においては、これらの細胞が、コラーゲンを産生する筋線維芽細胞に分化する能力に目を向けることが必要である。なぜなら、この望ましくない現象が、損傷を受けた心筋の回復を損なう可能性があるからである。
【０１８０】
実際、コラーゲン沈着は創傷治癒の本質的かつ通常は可逆的な部分であるが、生理学的組織修復は、線維性結合組織（例えば、コラーゲン及びフィブロネクチン）の蓄積が生じる場合、進行性で不可逆性の線維性応答に展開する可能性があり、永久的な瘢痕、心不全、及び（心不全における場合のように）最終的には死につながる。
【０１８１】
この状況において、線維化促進状況（ＴＧＦ−β１発現の増加を伴う）でもコラーゲンの沈着に関与しない細胞を有することが重要である。このため、ｈＣＰＣの種々の集団において培地中における可溶性コラーゲンの産生を誘発するＴＧＦ−β１処置（５日間）の効果を分析した。
【０１８２】
Ｓｉｒｃｏｌアッセイによるこれらの細胞及び培地におけるコラーゲンの定量の結果から、ｈＣＰＣ−ＣＤ９０−亜集団は、考察された他の集団（ｈＣＰＣ−ｎｓ、ｈＣＰＣ−ＣＤ１１７＋及びｈＣＰＣ−ＣＤ９０＋）と比較して、コラーゲンを産生する能力が最も低いことが示された（図２３）。
【０１８３】
参考文献
［１］Ｂｏｌｌｉ  Ｒ，Ｃｈｕｇｈ  ＡＲ，Ｄ’Ａｍａｒｉｏ  Ｄ，Ｌｏｕｇｈｒａｎ  ＪＨ，Ｓｔｏｄｄａｒｄ  ＭＦ，Ｉｋｒａｍ  Ｓ，Ｂｅａｃｈｅ  ＧＭ，Ｗａｇｎｅｒ  ＳＧ，Ｌｅｒｉ  Ａ，Ｈｏｓｏｄａ  Ｔ，Ｓａｎａｄａ  Ｆ，Ｅｌｍｏｒｅ  ＪＢ，Ｇｏｉｃｈｂｅｒｇ  Ｐ，Ｃａｐｐｅｔｔａ  Ｄ，Ｓｏｌａｎｋｈｉ  ＮＫ，Ｆａｈｓａｈ  Ｉ，Ｒｏｋｏｓｈ  ＤＧ，Ｓｌａｕｇｈｔｅｒ  ＭＳ，Ｋａｊｓｔｕｒａ  Ｊ，Ａｎｖｅｒｓａ  Ｐ，Ｌａｎｃｅｔ．Ｎｏｖｅｍｂｒｅ  ２０１１．２６；３７８（９８０６）：１８４７−５７．
［２］  Ｍａｋｋａｒ  ＲＲ，Ｓｍｉｔｈ  ＲＲ，Ｃｈｅｎｇ  Ｋ，Ｍａｌｌｉａｒａｓ  Ｋ，Ｔｈｏｍｓｏｎ  ＬＥ，Ｂｅｒｍａｎ  Ｄ，Ｃｚｅｒ  ＬＳ，  Ｍａｒｂａｎ  Ｌ，Ｍｅｎｄｉｚａｂａｌ  Ａ，Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ＰＶ，Ｒｕｓｓｅｌｌ  ＳＤ，Ｓｃｈｕｌｅｒｉ  ＫＨ，Ｌａｒｄｏ  ＡＣ，Ｇｅｒｓｔｅｎｂｌｉｔｈ  Ｇ，Ｍａｒｂａｎ  Ｅ．Ｌａｎｃｅｔ．Ｍａｒｚｏ  ２０１２．１０；３７９（９８１９）：８９５−９０４．
［３］Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＡＲ，Ｈａｔｚｉｓｔｅｒｇｏｓ  ＫＥ，Ａｄｄｉｃｏｔｔ  Ｂ，ＭｃＣａｌｌ  Ｆ，Ｃａｒｖａｌｈｏ  Ｄ，Ｓｕｎｃｉｏｎ  Ｖ，Ｍｏｒａｌｅｓ  ＡＲ，Ｄａ  Ｓｉｌｖａ  Ｊ，Ｓｕｓｓｍａｎ  ＭＡ，Ｈｅｌｄｍａｎ  ＡＷ，Ｈａｒｅ  ＪＭ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．Ｇｅｎｎａｉｏ  ２０１３．１５；１２７（２）：２１３−２３．
［４］Ｇａｍｂｉｎｉ  Ｅ，Ｐｏｍｐｉｌｉｏ  Ｇ，Ｂｉｏｎｄｉ  Ａ，Ａｌａｍａｎｎｉ  Ｆ，Ｃａｐｏｇｒｏｓｓｉ  ＭＣ，Ａｇｒｉｆｏｇｌｉｏ  Ｍ，Ｐｅｓｃｅ  Ｍ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ．Ｆｅｂｂｒａｉｏ  ２０１１．Ｖｏｌ．８９（２）：３６２−７３．
［５］  Ｇａｍｂｉｎｉ  Ｅ．Ｐｏｍｐｉｌｉｏ  Ｇ，Ａｌａｍａｎｎｉ  Ｆ，Ｃａｐｏｇｒｏｓｓｉ  ＭＣ，Ａｇｒｉｆｏｇｌｉｏ  Ｍ，Ｐｅｒｓｉｃｏ  Ｌ．，Ｇａｍｂｉｎｉ  Ａ：，Ｐｅｓｃｅ  Ｍ．Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓ．Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２０１２．Ｖｏｌ．１６０（５）：３６３−３７３．
［６］Ｄｉｗａｎ  Ａ．，Ｔｒａｎ  Ｔ，Ｍｉｓｒａ  Ａ  ＭＤ．Ｃｕｒｒ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ２００３；３：１６１−１８２．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2020522282.tif 000029
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年7月3日(2019.7.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップを含む、ヒト心臓前駆細胞亜集団を単離する方法：
ａ）心臓細胞の集団を含む心臓組織試料をミンチすること、
ｂ）細胞懸濁液が得られるまで、酵素混合物を用いて前記心臓組織を４回、漸進的に消化し、そして３０μｍ〜１００μｍの範囲内の大きさのフィルタにより濾過すること、
ｃ）細胞懸濁液が得られるまで、酵素混合物を用いて、ステップｂ）で得られた残りの心臓組織を１６時間さらに消化し、そして３０μｍ〜１００μｍの範囲内の大きさのフィルタにより濾過すること、
ｄ）心臓細胞を増殖させるのに適切な培地中で、ステップｂ）及びステップｃ）で得られた細胞懸濁液を培養すること、
ｅ）心臓細胞を増殖させるのに適切な培地中において、ステップｄ）で得られた細胞懸濁液を酵素溶液又は非酵素溶液の存在下で予備的に増殖させること、
ｆ）心臓細胞をさらに増殖させるのに適切な培地中において、ステップｅ）で得られた心臓細胞を酵素溶液又は非酵素溶液の存在下で二次的に増殖させること、
ｇ）心臓前駆細胞の開始集団内で発現した１又は複数の表面抗原に対するモノクローナル抗体を使用して、陽性選択及び／又は陰性選択によって、心臓細胞の１又は複数の亜集団を単離すること。
【請求項２】
ステップａ）の前記心臓組織試料が、右心耳生検、左心耳生検、中隔生検、心尖生検、及び心室生検からなる群から選択される、請求項１に記載のヒト心臓前駆細胞亜集団を単離する方法。
【請求項３】
ステップａ）を前記ミンチすることが手動又は自動で行われる、請求項１〜請求項２のいずれか一項に記載のヒト心臓前駆細胞亜集団を単離する方法。
【請求項４】
ステップｂ）及びステップｃ）の酵素混合物が基礎培地及び酵素溶液を含む、請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載のヒト心臓前駆細胞亜集団を単離する方法。
【請求項５】
前記酵素溶液がコラゲナーゼ及び／又はプロテアーゼの混合物を含む、請求項４に記載のヒト心臓前駆細胞亜集団を単離する方法。
【請求項６】
前記コラゲナーゼ及び／又はプロテアーゼ混合物が、コラゲナーゼＩ、コラゲナーゼＩＩ、コラゲナーゼＩＶ、トリプシン、ＥＤＴＡ、アクターゼ（accutase）、コラゲナーゼＡ、ディスパーゼ（dispase）及びリベラーゼ（liberase）からなる群から選択される１又は複数の酵素を含む、請求項４〜請求項５のいずれか一項に記載のヒト心臓前駆細胞亜集団の単離のために方法。
【請求項７】
前記基礎培地がＨａｍ’ｓ／Ｆ１２である、請求項４〜請求項６のいずれか一項に記載のヒト心臓前駆細胞亜集団を単離する方法。
【請求項８】
前記コラゲナーゼ混合物が０．１〜３ｍｇ／ｍＬの範囲内の濃度で存在する、請求項４〜請求項７のいずれか一項に記載のヒト心臓前駆細胞亜集団を単離する方法。
【請求項９】
ステップｄ）、ステップｅ）及びステップｆ）の前記心臓細胞を増殖させ、かつ拡大するのに適切な培地が、１０％のウシ胎児血清、２ｍＭのＬ−グルタチオン、５×１０−３Ｕ／ｍＬのヒトエリスロポイエチン、１０ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞成長因子及び抗生物質が補充されたＨａｍ’ｓ／Ｆ１２培地である、請求項１〜請求項８のいずれか一項に記載のヒト心臓前駆細胞亜集団を単離する方法。
【請求項１０】
細胞増殖のためのステップｅ）及びステップｆ）の酵素溶液又は非酵素溶液が、Ｔｒｙｐｌｅ（登録商標）Ｓｅｌｅｃｔ、トリプシン及び／又はＥＤＴＡの混合物、細胞解離緩衝液、セルストリッパ、アクターゼ及びディスパーゼからなる群から選択される、請求項１〜請求項９のいずれか一項に記載のヒト心臓前駆細胞亜集団を単離する方法。
【請求項１１】
ステップｇ）のモノクローナル抗体が、ビオチン又は蛍光分子（好ましくはＦＩＴＣ若しくはＡＰＣから選択される蛍光分子）で標識されている、請求項１〜請求項１０のいずれか一項に記載のヒト心臓前駆細胞亜集団を単離する方法。
【請求項１２】
ステップｇ）の抗体が、
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からなる群から選択される１又は複数の抗原に対するモノクローナル抗体である、請求項１〜請求項１１のいずれか一項に記載のヒト心臓前駆細胞亜集団を単離する方法。
【請求項１３】
ステップｇ）の選択が免疫磁気分離によって行われる、請求項１〜請求項１２のいずれか一項に記載のヒト心臓前駆細胞亜集団を単離する方法。
【請求項１４】
ステップｇ）のモノクローナル抗体が、抗ＣＤ１１７及び／又は抗ＣＤ９０である、請求項１１〜請求項１３のいずれか一項に記載のヒト心臓前駆細胞亜集団を単離する方法。
【請求項１５】
表面マーカープロファイルＣＤ９０−、
間葉マーカーであるＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ１０５及びＣＤ２００を発現すること、
造血マーカーであるＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１４及び免疫系マーカーであるＨＬＡ−ＤＲを発現しないこと、
を特徴とする、請求項１４に記載の単離方法によって抗ＣＤ９０モノクローナル抗体を用いた陰性選択によってのみ得られる、ヒト心耳由来のヒト心臓前駆細胞の亜集団。
【請求項１６】
単独で、又は、ヒト心臓前駆細胞の別の亜集団と組み合わせて、心臓血管疾患の治療において使用するための請求項１５に記載のヒト心臓前駆細胞の亜集団。
【請求項１７】
単独で、又は、ヒト心臓前駆細胞の別の亜集団と組み合わせて、心臓細胞移植及び／又は心臓組織移植において使用するための、請求項１６に記載のヒト心臓前駆細胞の亜集団。
【国際調査報告】
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