(57)【要約】  コード化化学ライブラリをスクリーニングするための方法を記載する。該ライブラリが、各々コード化タグに放出可能に連結された複数の異なる化学構造を含み、該方法は、（ａ）該タグ付き化学構造のライブラリを提供する工程；（ｂ）そのタグから各化学構造を放出させ、複数の遊離するタグなし化学構造（ＴＣＳ）を生じさせる工程；（ｃ）それらをアッセイシステムと、各ＴＣＳとそのタグとの間の空間的結び付けが維持される条件下で接触させることによって該ＴＣＳをスクリーニングし、各々そのタグと空間的に結び付けられている複数の異なるスクリーニングされたＴＣＳを生じさせる工程；および（ｄ）スクリーニングされたＴＣＳを、それと空間的に結び付けられたタグを解読することにより同定する工程を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
コード化化学ライブラリをスクリーニングするための方法であって、該ライブラリが、各々コード化タグに放出可能に連結された複数の異なる化学構造を含み、該方法が、（ａ）該タグ付き化学構造のライブラリを提供する工程；（ｂ）そのタグから各化学構造を放出させ、複数の遊離するタグなし化学構造（ＴＣＳ）を生じさせる工程；（ｃ）それらをアッセイシステムと、各ＴＣＳとそのタグとの間の空間的結び付けが維持される条件下で接触させることによって該ＴＣＳをスクリーニングし、各々そのタグと空間的に結び付けられている複数の異なるスクリーニングされたＴＣＳを生じさせる工程；および（ｄ）スクリーニングされたＴＣＳを、それと空間的に結び付けられたタグを解読することにより同定する工程を含む、方法。
【請求項２】
前記コード化タグが核酸を含み、前記方法が核酸コード化化学ライブラリをスクリーニングするためである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸がＤＮＡであり、前記方法がＤＮＡコード化化学ライブラリをスクリーニングするためである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｄ）が、前記核酸を配列決定することにより前記コード化タグを解読する工程を含む、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記化学構造が小分子である、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記化学構造が切断可能なリンカーによって前記コード化タグに放出可能に連結され、必要に応じて該切断可能なリンカーは、酵素的に切断可能なリンカー；求核性／塩基感受性リンカー；還元感受性リンカー；光切断可能なリンカー；求電子性／酸感受性リンカー；金属補助切断感受性リンカー；酸化感受性リンカー；および前出の２つまたはそれ以上の組合せから選択されるリンカーを含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記化学構造が、切断部分および自己犠牲部分（ＳＩＭ）を含む自己犠牲リンカーによって前記コード化タグに放出可能に連結され、必要に応じて前記切断部位がペプチドまたは非ペプチドの酵素的に切断可能な部分（例えば、Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ）である、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記化学構造が、核酸ハイブリダイゼーションによって前記コード化タグに放出可能に連結されている、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記切断可能なリンカーがＲＮＡを含み、工程（ｂ）が前記タグ付き化学構造をＲＮＡｓｅと接触させることを含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記化学構造が、前記コード化タグに対し、（ａ）該コード化タグの核酸にハイブリダイズし；かつ（ｂ）該化学構造にカップリングされている核酸によって放出可能に連結されている、請求項２から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記ハイブリダイズする核酸が、請求項６または７に記載の切断可能なリンカーによって前記化学構造にカップリングされている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ハイブリダイズする核酸がＲＮＡである、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｂ）が前記タグ付き化学構造をＲＮＡｓｅと接触させることを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ｂ）が、前記化学構造にカップリングしかつ前記コード化タグの核酸にハイブリダイズした核酸の脱ハイブリダイゼーション、例えば、融解、を含む、請求項１０から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
工程（ａ）の前記コード化化学ライブラリがｎ個のクローン集団のタグ付き化学構造を含み、各クローン集団がｎ個の個別のライブラリ微小区画に閉じ込められている、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記ライブラリ微小区画が、微小液滴、微小粒子または微小小胞から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
（ａ）ｎ＞１０３；または（ｂ）ｎ＞１０４；または（ｃ）ｎ＞１０５；または（ｄ）ｎ＞１０６；または（ｅ）ｎ＞１０７；または（ｆ）ｎ＞１０８；または（ｇ）ｎ＞１０９；または（ｈ）ｎ＞１０１０；または（ｉ）ｎ＞１０１１；または（ｊ）ｎ＞１０１２；または（ｋ）ｎ＞１０１３；（ｌ）ｎ＞１０１４；または（ｍ）ｎ＞１０１５である、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記タグ付き化学構造が、１つまたは複数の前記ライブラリ微小区画中に、少なくとも０．１ｎＭ、０．５ｎＭ、１．０ｎＭ、５．０ｎＭ、１０．０ｎＭ、１５．０ｎＭ、２０．０ｎＭ、３０．０ｎＭ、５０．０ｎＭ、７５．０ｎＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、１．０μＭ、５．０μＭ、１０．０μＭ、１５．０μＭ、２０．０μＭ、３０．０μＭ、５０．０μＭ、７５．０μＭ、１００．０μＭ、２００．０μＭ、３００．０μＭ、５００．０μＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭまたは１０ｍＭの濃度で存在する、請求項１５から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記タグ付き化学構造が、１つまたは複数の前記ライブラリ微小区画中に、１ｎＭ未満；１〜１００ｎＭ；１００ｎＭより多い；１μＭ未満；１〜１００μＭ；１００μＭより多い；５〜５０μＭまたは１０〜２０μＭの濃度で存在する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記工程（ｃ）の空間的結び付けが、前記ＴＣＳおよびそのタグが空間的に近接して閉じ込められているような微小区画化によって維持されている、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記工程（ｃ）のタグが、前記アッセイシステムから機能的または物理的に分離されている、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記タグが、請求項１５または１６に記載のライブラリ微小区画内または上に配置されている、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ライブラリ微小区画の各々が、工程（ｂ）の前に、例えばマイクロカプセル化、ピコインジェクションまたは微小液滴溶合によって、個別のスクリーニング微小区画内に配置される、請求項１５から２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記スクリーニング微小区画が、微小液滴、マイクロウェルまたはマイクロフルイディックチャネルから選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記スクリーニング微小区画が、前記ライブラリ微小区画と、（ｉ）水性溶媒；および／または（ｉｉｉ）ゲル化システム、例えば、ヒドロゲル；および／または（ｉｉｉ）前記工程（ｃ）のアッセイシステムとを含有する、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記スクリーニング微小区画が、前記同定工程（ｄ）前にゲル化されて、前記ライブラリ微小区画が該ゲル化したスクリーニング微小区画内に固定化されるようなゲル化システムを含み、必要に応じて該ゲル化工程の後、該同定工程（ｄ）の前に洗浄工程が行われる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記工程（ｂ）において、前記ＴＣＳが前記スクリーニング微小区画中に放出されるのに対し、前記タグが（ａ）前記ライブラリ微小区画内または上に、例えば共有結合および／または水素結合によって、保持される；（ｂ）ライブラリまたはスクリーニング微小液滴の表面で、官能基化された界面活性剤によって隔離される；または（ｃ）前記アッセイシステムの構成要素によって隔離される、請求項２３から２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
工程（ｂ）において、前記ＴＣＳが、拡散によって前記スクリーニング微小区画中に放出される、請求項２３から２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
工程（ｃ）が、前記アッセイシステムと、前記ＴＣＳのクローン集団と、前記タグを含む前記ライブラリ微小区画とを含むスクリーニング微小液滴内で行われる、請求項１５から２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記コード化核酸タグが、前記化学構造のテンプレートである、請求項２から２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
工程（ａ）が、前記化学構造の核酸テンプレート化合成、例えば、ＤＮＡテンプレート化合成の工程を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記テンプレート化合成が、前記コード化核酸テンプレートを、必要に応じてＰＣＲによって、増幅することを含む工程の前に行われる、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記テンプレート化合成が、（ａ’）（ｉ）コード化テンプレートのクローン集団；および（ｉｉ）複数の化学部分構造を含有するリアクタ微小区画を提供する工程；ならびに、次いで（ｂ’）該部分構造が、核酸テンプレート化合成によって化学構造のクローン集団を形成するように反応する条件下で、該リアクタ微小区画内で該テンプレートを該部分構造と接触させる工程を含み、それにより、コード化テンプレートにハイブリダイズした化学構造のクローン集団を含むリアクタ微小区画を生じさせる、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３４】
（ｉ）前記コード化テンプレートから前記化学構造を脱ハイブリダイズし、そして次いで（ｉｉ）前記リアクタ微小区画内で該脱ハイブリダイズしたテンプレートを未反応の部分構造と、該部分構造が核酸テンプレート化合成によって化学構造のさらなるクローン集団を形成するように反応する条件下で接触させ、そして次いで（ｉｉｉ）工程（ｉ）および（ｉｉ）を繰り返すことによって、化学構造の数を増幅させる工程をさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記化学構造が、前記リアクタ微小区画中に、少なくとも０．１ｎＭ、０．５ｎＭ、１．０ｎＭ、５．０ｎＭ、１０．０ｎＭ、１５．０ｎＭ、２０．０ｎＭ、３０．０ｎＭ、５０．０ｎＭ、７５．０ｎＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、１．０μＭ、５．０μＭ、１０．０μＭ、１５．０μＭ、２０．０μＭ、３０．０μＭ、５０．０μＭ、７５．０μＭ、１００．０μＭ、２００．０μＭ、３００．０μＭ、５００．０μＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭまたは１０ｍＭの濃度で存在するまで、工程（ｉ）および（ｉｉ）が繰り返される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記化学構造が、前記リアクタ微小区画中に、１〜１００μＭ、５〜５０μＭまたは１０〜２０μＭの濃度で存在するまで、工程（ｉ）および（ｉｉ）が繰り返される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記リアクタ微小区画が、マイクロウェル、マイクロアレイ、マイクロフルイディックチャネル、微小粒子、微小小胞または微小液滴から選択される、請求項３０から３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
前記テンプレート化合成が、前記化学構造にカップリングされた核酸と前記コード化タグテンプレートの核酸との間のハイブリダイゼーションを含む、請求項３１から３７のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
前記コード化核酸タグが前記化学構造のためのテンプレートではない、請求項２から２９のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
工程（ａ）が、前記化学構造の核酸レコード化合成、例えば、ＤＮＡレコード化合成の工程を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
工程（ａ）が、前記化学構造の核酸レコード化合成をスプリット・アンド・プールで行う工程を含む、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記ライブラリが、化学構造のクローン集団を含み、そして工程（ａ）が、該クローン集団内で該化学構造の各々にコード化タグを放出可能に連結する工程を含む、請求項１から２９のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
前記コード化タグが核酸配列を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
前記コード化タグがＤＮＡ配列を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記コード化タグが、複数の異なる架橋部位にて前記化学構造に放出可能に連結されている、請求項４２から４４のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
前記コード化タグが、複数の異なる架橋基で官能基化されている、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記アッセイシステムが均一水相アッセイシステムである、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
前記スクリーニング工程（ｃ）が表現型スクリーンを含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
前記アッセイシステムが生存標的細胞を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記標的細胞が原核細胞または真核細胞である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記標的細胞が原核細胞である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記標的細胞が古細菌、例えば（ａ）クレン古細菌（Crenarchaeota）；（ｂ）ユーリ古細菌（Euryarchaeota）；（ｃ）コル古細菌（Korarchaeota）；（ｄ）ナノ古細菌（Nanoarchaeota）および（ｅ）タウム古細菌（Thaumarchaeota）の門から選択され、例えばハロフェラックス・ウォルカニイ（Haloferax volcanii）またはスルフォロブス属種（Sulfolobus spp.）である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記標的細胞が細菌、例えば病原性細菌である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記細菌がグラム陽性細菌であり、必要に応じてエンテロコッカス・フェカーリス（Enterococcus faecalis）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）およびスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）から選択される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記細菌がグラム陰性細菌であり、必要に応じてクレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）、アシネトバクター・バウマニ（Acinetobacter baumanii）およびエシェリキア・コリ（Escherichia coli）、エシェリキア・コリST131株（E. coli  ST131 strains）、シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、エンテロバクター・クロアカ（Enterobacter cloacae）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）およびナイセリア・ゴノレア（Neisseria gonorrhoeae）から選択される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記細菌のグラム反応が不確定である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
前記細胞が（ａ）真菌細胞；（ｂ）哺乳類細胞；（ｃ）高等植物細胞；（ｄ）原虫細胞；（ｅ）蠕虫細胞；（ｆ）藻類細胞；または（ｈ）無脊椎動物細胞である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５８】
前記細胞が癌細胞、例えば、ヒト癌細胞である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記アッセイシステムが、単離された標的タンパク質または単離された標的タンパク質複合体を含み、必要に応じて該標的タンパク質／タンパク質複合体が、細胞内標的タンパク質／タンパク質複合体である、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項６０】
前記標的タンパク質／タンパク質複合体が溶液中に存在する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記標的タンパク質／タンパク質複合体が膜または膜貫通タンパク質／タンパク質複合体である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
工程（ｃ）において、前記化学構造が、前記標的タンパク質／タンパク質複合体に結合するリガンドについてスクリーニングされる、請求項５９から６１のいずれかに記載の方法。
【請求項６３】
前記リガンドが、前記標的タンパク質／タンパク質複合体のインヒビターである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記アッセイシステムが、検出可能な標識を含むかまたは生成する、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項６５】
前記検出可能な標識が、請求項４６から５７のいずれかに記載の細胞、または請求項５９から６１のいずれかに記載の単離された標的タンパク質もしくは単離された標的タンパク質複合体に連結されている、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記スクリーニング工程がＦＡＤＳを含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項６７】
前記スクリーニング工程が、蛍光分析、例えばＦＲＥＴ、ＦｌｉＭ、フルオロフォアタグ付き抗体、フルオロフォアタグ付きＤＮＡ配列および／または蛍光染料分析を含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項６８】
工程（ｄ）が、前記核酸を配列決定することによってコード化タグを解読する工程を含み、そして前記方法が、複数の異なるスクリーニングされたＴＣＳの配列を比較する工程をさらに含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項６９】
前記スクリーニングされたＴＣＳに対して配列−活性の関係の分析を行う工程をさらに含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
先行する請求項のいずれかに記載の方法において使用するためのコード化化学ライブラリであって、該ライブラリが、各々コード化タグに放出可能に連結された化学構造のｎ個のクローン集団を含み、各クローン集団が、ｎ個の個別のライブラリ微小区画に閉じ込められている、ライブラリ。
【請求項７１】
前記化学構造が、請求項７に記載の切断可能なリンカーによって前記コード化タグに連結されている、請求項７０に記載のライブラリ。
【請求項７２】
前記化学構造が、例えば請求項７から１２のいずれかに記載される、核酸ハイブリダイゼーションによって前記コード化タグに連結されている、請求項７０または７１に記載のライブラリ。
【請求項７３】
請求項１から６９のいずれかに記載の方法において使用するためのコード化化学ライブラリであって、該ライブラリが、遊離する化学構造のｎ個のクローン集団を含み、各クローン集団が、ｎ個の個別のライブラリ微小区画に閉じ込められ、該化学構造が、コード化タグと共に該微小区画内に含まれるが該コード化タグと共有結合されていない、ライブラリ。
【請求項７４】
前記コード化タグが核酸タグ、例えばＤＮＡタグである、請求項７０から７３のいずれかに記載のライブラリ。
【請求項７５】
（ａ）ｎ＞１０３；または（ｂ）ｎ＞１０４；または（ｃ）ｎ＞１０５；または（ｄ）ｎ＞１０６；または（ｅ）ｎ＞１０７；または（ｆ）ｎ＞１０８；または（ｇ）ｎ＞１０９；または（ｈ）ｎ＞１０１０；または（ｉ）ｎ＞１０１１；または（ｊ）ｎ＞１０１２；または（ｋ）ｎ＞１０１３；（ｌ）ｎ＞１０１４；または（ｍ）ｎ＞１０１５である、請求項７０から７４のいずれかに記載のライブラリ。
【請求項７６】
前記化学構造が、前記ライブラリ微小区画中に、少なくとも０．１ｎＭ、０．５ｎＭ、１．０ｎＭ、５．０ｎＭ、１０．０ｎＭ、１５．０ｎＭ、２０．０ｎＭ、３０．０ｎＭ、５０．０ｎＭ、７５．０ｎＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、１．０μＭ、５．０μＭ、１０．０μＭ、１５．０μＭ、２０．０μＭ、３０．０μＭ、５０．０μＭ、７５．０μＭ、１００．０μＭ、２００．０μＭ、３００．０μＭ、５００．０μＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭまたは１０ｍＭの濃度で存在する、請求項７０から７５のいずれかに記載のライブラリ。
【請求項７７】
前記化学構造が、前記ライブラリ微小区画中に、１〜１００μＭ、５〜５０μＭまたは１０〜２０μＭの濃度で存在する、請求項７６に記載のライブラリ。
【請求項７８】
前記化学構造が小分子である、請求項７０から７７のいずれかに記載のライブラリ。
【請求項７９】
前記微小区画が、微小液滴、微小粒子および微小小胞から選択される、請求項７０から７８のいずれかに記載のライブラリ。
【請求項８０】
前記化学構造がライブラリ微小液滴内に含まれ、そして前記コード化タグが、該ライブラリ微小液滴内にカプセル化された微小液滴、ビーズまたは微小小胞内または上に配置されている、請求項７１から７９のいずれかに記載のライブラリ。
【請求項８１】
請求項１から６９のいずれかに記載の方法において使用するためのアッセイ組成物であり、請求項７３から８０のいずれかに記載のライブラリを含み、前記微小区画内に含まれる化学構造がアッセイシステムと接触させられる、組成物。
【請求項８２】
前記コード化ラグが、前記アッセイシステムから機能的または物理的に分離されている、請求項８１に記載の組成物。
【請求項８３】
前記化学構造が前記アッセイシステムを含むライブラリ微小液滴内に含まれ、そして前記コード化タグが、該ライブラリ微小液滴内にカプセル化された微小液滴、ビーズまたは微小小胞内または上に配置されている、請求項８１または８２に記載の組成物。
【請求項８４】
前記アッセイシステムが請求項４４から６９のいずれかに記載されている、請求項８１から８３のいずれかに記載の組成物。
【請求項８５】
請求項３１から６９のいずれかに記載の方法において使用するための核酸コード化化学ライブラリリアクタであって、（ａ）コード化核酸テンプレート分子のクローン集団、および（ｂ）複数の化学部分構造を含み、該部分構造が、核酸テンプレートアセンブリがコード化核酸タグ付き化学構造を形成するように適合され、該コード化タグが該化学構造に放出可能に連結されている、リアクタ。
【請求項８６】
前記微小区画が、微小液滴、微小粒子および微小小胞から選択される、請求項８５に記載のリアクタ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コード化化学ライブラリに関し、特に、コード化タグと空間的に結び付けられた（spatially associated）タグなし（tagless）化学構造を含む核酸コード化ライブラリに関する。本発明はまた、核酸テンプレート化化学ライブラリ生成のための方法、コード化ライブラリをスクリーニングするための方法、ならびにコード化ライブラリを調製およびスクリーニングするための組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
創薬は、典型的には、化合物の大きなライブラリの組み立て、それに続く、標的に対する所望の活性（例えば、酵素活性または標識の置換）を示す「ヒット（hits）」を同定するための標的を含むマイクロウェルに化合物を個々に添加するアッセイまたはスクリーニングを含む。このプロセスは、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）として知られる。それは、ロボット装置を使用して何百万もの化学物質をテストするために自動化することができるが、それは労力を要しかつ高価である。
【０００３】
したがって、ライブラリのサイズの増加がスクリーニングの負担を増大させるという事実から生じる根本的な問題がある。スクリーニングアッセイの個別の性質のために、スクリーニング時間およびコストはライブラリサイズとほぼ直線的に比例する。これは、このようなアプローチを用いてスクリーニング可能な化学ライブラリのサイズに厳しい実用の制約を課した：ＨＴＳは、典型的には、１０３〜１０６のメンバーを含むライブラリに適用される。
【０００４】
この問題は、選択に基づくスクリーニング技術（例えば、パンニング技術）の開発によって対処されてきた。ここでは、ライブラリ内のすべての化合物が、ワンポット形式で目的の標的と相互作用する能力について同時にテストされる。そのようなアッセイでは、スクリーニング工程の時間と費用はライブラリの大きさとは無関係であり、そのため、アッセイは比較的大きなライブラリに適用することができる。１０１２のメンバーまで含むライブラリが、このようなアプローチを用いてスクリーニングされてきた。
【０００５】
この問題はまた、微小液滴ベースのライブラリの開発によっても対処されてきた。これは、マイクロ流体技術によって処理してスループットを数桁向上させることができ、かつ細胞ベースの表現型スクリーンと適合可能である（例えば、Clausell-Tormos et al.,(2008) Chemistry & Biology 15：427-437）。
【０００６】
しかし、選択ベースのアッセイおよび微小液滴ベースのスクリーニングの両方とも、選択された化合物の同一性（すなわち、「ヒット」）が容易に決定されることを要求する。スクリーニング可能であるが解読可能でないライブラリは、有用ではない。
【０００７】
この問題に対する解決策は、1992年にBrennerとLernerによって最初に提案され（Brenner and Lerner (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89：5381-5383）、そしてＤＮＡコード化化学ライブラリ（ＤＥＣＬ）の生成に基づく。ＤＥＣＬにおいて、各化合物は、その構造または反応履歴に対応するＤＮＡ配列と結び付け（タグ付け）され、それによって、その特定の化合物のユニークな識別子として機能する（すなわち、ＤＮＡタグはその化合物を「コード化」し、そうして、分子「バーコード」として機能する）。
【０００８】
化合物は、種々の異なる方法でタグを付けることができ、そして、ＤＮＡタグは、単に特定の化学構造をコードする（「ＤＮＡレコード化」）だけでなく、その合成を指向させるテンプレートとして（「ＤＮＡテンプレート化」）、使用することもできる。この技術は、近年、Mannocci et al. (2011) Chem. Commun., 47：12747-12753；Kleiner et al. (2011) Chem Soc Rev. 40(12)：5707-5717；およびMullard (2016) Nature 530：367-369によって概説されている。
【０００９】
ＤＥＣＬ技術は現在、製薬業界内で十分に確立されている。２００７年には、ＧＳＫは、５５００万ＵＳドルで、ＤＥＣＬのパイオニアである会社の１つのPraecis Pharmaceuticalsを獲得した。一方、他のトップ１０の製薬会社は、それら自身のインハウスのＤＮＡコード化ライブラリプログラムを開始した。その他のバイオテクノロジー企業（X-Chem、Vipergen、Ensemble TherapeuticsおよびPhilochemを含む）もまた、積極的にＤＥＣＬ技術を開発し、活用を進めている。
【００１０】
しかしながら、現在のＤＥＣＬの有用性は、現在、タグの存在と結び付けられた問題によって制限されている。例えば、タグをコード化することは、（ａ）目的の標的上の分子結合部位へのタグ付き化合物のアクセスを化学的または立体的に妨害し、その結果、回収されるヒットの数および／または種類が制限される；（ｂ）細胞の透過性および／または拡散を制限し、細胞の取り込みを効果的に防止し、細胞質へのアクセスに依存する細胞ベースの表現型スクリーンの使用を排除する；（ｃ）タグ付けした後に化学化合物が化学的に修飾され得る程度を制限する（特定の反応は、タグと化学的に不適合である）；そして（ｄ）構造−活性分析の有用性を制限する（そのような分析は、活性に対するタグ自体の潜在的な影響によって混乱されるため）。現在の方法は低濃度で多数の化合物を含む化合物の混合プールを生じるという事実から、なおさらなる制限が生じる。これは、プールからの活性成分のデコンボリューションの必要性につながり、低濃度は、適用可能なスクリーンの形式と性質を厳しく制限する。均一な細胞ベースの表現型スクリーニングは不可能である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
解読可能な化学ライブラリのスクリーニングを可能にし、上記の問題を解決するＨＴＳ技術が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の第１の態様によれば、コード化された化学ライブラリをスクリーニングするための方法が提供され、該ライブラリが、各々コード化タグに放出可能に連結された複数の異なる化学構造を含み、該方法は、（ａ）該タグ付き化学構造のライブラリを提供する工程；（ｂ）そのタグから各化学構造を放出させ、複数の遊離するタグなし化学構造（ＴＣＳ）を生じさせる工程；（ｃ）それらをアッセイシステムと、各ＴＣＳとそのタグとの間の空間的結び付けが維持される条件下で接触させることによって該ＴＣＳをスクリーニングし、各々そのタグと空間的に結び付けられている複数の異なるスクリーニングされたＴＣＳを生じさせる工程；および（ｄ）スクリーニングされたＴＣＳを、それと空間的に結び付けられたタグを解読することにより同定する工程を含む。
【００１３】
スクリーニングは任意の濃度のＴＣＳで実施することができる。好ましくは、ＴＣＳの濃度は断片ベースのスクリーニングを容易にし、そして例えば、ｎＭ〜ｍＭの範囲にあり得る。
【００１４】
したがって、本発明の方法は、タグなしコード化化学構造のライブラリのスクリーニングを可能にし、それによりコード化タグの存在に伴う問題を回避する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】スプリット・アンド・プールＤＥＣＬ生成の模式図。一次ファーマコアがタグ付けされ、当該一次ファーマコアに特異的である相補的オリゴヌクレオチドを介してビーズに担持される。ビーズ中のガイドＤＮＡのμＭ〜ｍＭ濃度は、ビーズ中のファーマコアの対応するμＭ〜ｍＭ濃度を生じる。伝統的な化学的方法を用いた一次ファーマコア周辺のアセンブリ−各付加は、コード化タグ（これはバーコードとして機能する）の末端にライゲートされた特定のＤＮＡにカップリングされる。したがって、ビーズは固相合成に使用することができ、そして反応のために大量の反応性の二次ファーマコアを付加することができる。追加のオリゴヌクレオチドのライゲーションは、同時に（例えば、クリックまたは同様の化学反応を介して）または合成後工程によって起こり得る。
【図２】スプリット・アンド・プールＤＥＣＬの模式図。図１に示すように、合成工程は、ＤＮＡ配列（タグ）の付加によってコード化されたファーマコア（部分構造）アセンブリを含む。ビーズ中のガイドＤＮＡのμＭ〜ｍＭ濃度は、合成された化学構造の対応するμＭ〜ｍＭ濃度を生じる。指標細胞は、表現型スクリーニング用である。液滴内部のタグ放出は、表現型スクリーンにおいて指標細胞と相互作用するのに十分な濃度の遊離のタグなし化学構造をもたらす。ＤＮＡタグはなお、液滴内の遊離化学構造と空間的に結び付けられている。ポジティブＦＡＣヒットは、化学構造の構造を同定するためにＮＧＳ配列決定によって配列決定される。
【図３】ビーズマウント捕捉オリゴヌクレオチドへのコード化オリゴヌクレオチドのライゲーション。
【図４】ゲル上の切断可能なリンカーからのペイロードの酵素的放出。
【図５】１００μｍの水性液滴中の切断可能なリンカーからのペイロードの酵素的放出。
【図６】ビーズ結合オリゴヌクレオチドからのヒュースゲン１，３−双極子環化付加を用いて蛍光染料で官能基化された化学構造ペイロードの放出。
【図７】ビーズ結合オリゴヌクレオチドからのイソチオシアネート付加を用いて蛍光染料で官能基化された化学構造ペイロードの放出。
【図８】自己犠牲リンカーを用いた遊離化学構造の放出の模式図。
【図９】自己犠牲ジペプチドリンカーを用いたスプリット・アンド・プールＤＥＣＬの模式図。
【図１０】コード化タグを有するビーズに結合したＶａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ自己犠牲ペプチドリンカーを用いた遊離化学構造の放出の模式図。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（タグ）
任意のコード化タグは、それがその同族の化学構造（またはその反応履歴）をユニークに同定する情報（例えば、化学的および／または光学的性質／特性の形態で）を含む限り、本発明に従って使用することができる。それによって、その特定の化学構造のユニークな識別子として機能する。したがって、タグは、特定の化学構造を「コード化」し、分子の「バーコード」として機能する。好ましい実施形態において、タグは、その情報が核酸の配列にコードされる核酸（例えば、ＤＮＡ）タグである。しかし、他のタグを使用してもよく、非ＤＮＡタグ、非ＲＮＡタグ、修飾核酸タグ、ペプチドタグ、光ベースのバーコード（例えば量子ドット）およびＲＦＩＤタグを含む。
【００１７】
以上説明したように、化学構造は、種々の異なる方法でタグを付けることができ、そしてＤＮＡタグを、単に特定の化学構造をコード化する（「ＤＮＡレコード化」）だけでなく、その合成を指向させるテンプレートとして（「ＤＮＡテンプレート化」、以下参照）、使用することもできる。この技術は、近年、Mannocci et al. (2011) Chem. Commun., 47：12747-12753；Kleiner et al. (2011) Chem Soc Rev. 40(12)：5707-5717;およびMullard (2016) Nature 530：367-369によって概説されている。
【００１８】
特定の実施形態では、スプリット・アンド・プールタグ付け技法が使用される（例えば、Mannocci et al. (2011) Chem. Commun., 47：1274-12753、および特に図３を参照のこと。これは、参照により本明細書に援用される）。
【００１９】
同定工程（ｄ）は、コード化タグを解読する工程を含み、したがって、コード化タグの性質に従って選択される。核酸タグの場合、同定工程は、核酸（例えばＤＮＡ）を配列決定することを含む。
【００２０】
化学構造は、（本明細書で定義される）小分子であってもよい。特定の実施形態では、構造は、いくつかの連結した部分構造から構成される。他の実施形態では、例えば非薬物適用のためのスクリーニングにおいて、化学構造は、（本明細書で定義される）大分子であり得る。
【００２１】
（リンカー）
化学構造は、切断可能なリンカーによってコード化タグに（直接的または間接的に）放出可能に連結され得る。そのような実施形態において、切断可能なリンカーは、酵素的に切断可能なリンカー；求核性／塩基感受性リンカー；還元感受性リンカー；光切断可能なリンカー；求電子性／酸感受性リンカー；金属補助切断感受性リンカー；酸化感受性リンカー；および前出の２つまたはそれ以上の組合せから選択されるリンカーを含み得る。
【００２２】
化学構造は、核酸ハイブリダイゼーションによって、コード化タグに（直接的または間接的に）放出可能に連結され得る。そのような実施形態において、化学構造はまた、上記のように、切断可能なリンカーによって、コード化タグに（直接的または間接的に）放出可能に連結され得る。
【００２３】
好ましい実施形態では、切断可能なリンカーはＲＮＡを含み得、そのような実施形態では、工程（ｂ）は、タグ付き化学構造をＲＮＡｓｅと接触させることを含み得る。
【００２４】
他の実施形態では、切断可能なリンカーはペプチドを含み得、そのような実施形態では、工程（ｂ）は、タグ付き化学構造をペプチダーゼと接触させることを含み得る。
【００２５】
他の実施形態では、切断可能なリンカーはＤＮＡを含み得、そのような実施形態では、工程（ｂ）は、タグ付き化学構造を部位特異的エンドヌクレアーゼと接触させることを含み得る。
【００２６】
化学構造は、コード化タグに対し、（ａ）該コード化タグの核酸にハイブリダイズし；かつ（ｂ）該化学構造にカップリングされている核酸によって放出可能に連結され得る。そのような実施形態では、ハイブリダイズする核酸は、上で定義されたような切断可能なリンカーによって化学構造にカップリングされ得る。ここで、ハイブリダイズする核酸は、好ましくはＲＮＡであり、その場合、工程（ｂ）は、タグ付き化学構造をＲＮＡｓｅと接触させることを含み得る。
【００２７】
本発明の方法において、工程（ｂ）は、化学構造にカップリングしかつコード化タグの核酸にハイブリダイズした核酸の脱ハイブリダイゼーション、例えば融解を含み得る。
【００２８】
（ライブラリの微小区画）
工程(ａ)のコード化化学ライブラリは、ｎ個のクローン集団のタグ付き化学構造を含み、各クローン集団がｎ個の個別のライブラリ微小区画に閉じ込められている。 (a)n> 103;そのような実施形態では、（ａ）ｎ＞１０３；または（ｂ）ｎ＞１０４；または（ｃ）ｎ＞１０５；または（ｄ）ｎ＞１０６；または（ｅ）ｎ＞１０７；または（ｆ）ｎ＞１０８；または（ｇ）ｎ＞１０９；または（ｈ）ｎ＞１０１０；または（ｉ）ｎ＞１０１１；または（ｊ）ｎ＞１０１２；または（ｋ）ｎ＞１０１３；（ｌ）ｎ＞１０１４；または（ｍ）ｎ＞１０１５。ライブラリ微小区画は、微小液滴、微小粒子および微小小胞から選択され得る。例えば、ビーズの形態の微小粒子ライブラリ微小区画が好ましい。
【００２９】
タグ付き化学構造は、細胞ベースまたは表現型スクリーン（特に均一な細胞ベースの表現型アッセイ）を可能にするように、十分に高い濃度にてライブラリ微小区画で存在し得る。特定の実施形態では、タグ付き化学構造は、ライブラリ微小区画（１つまたは複数）中に、少なくとも０．１ｎＭ、０．５ｎＭ、１．０ｎＭ、５．０ｎＭ、１０．０ｎＭ、１５．０ｎＭ、２０．０ｎＭ、３０．０ｎＭ、５０．０ｎＭ、７５．０ｎＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、１．０μＭ、５．０μＭ、１０．０μＭ、１５．０μＭ、２０．０μＭ、３０．０μＭ、５０．０μＭ、７５．０μＭ、１００．０μＭ、２００．０μＭ、３００．０μＭ、５００．０μＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭまたは１０ｍＭの濃度で存在し得る。
【００３０】
他の実施形態では、タグ付き化学構造は、ライブラリ微小区画（１つまたは複数）中に、少なくとも０．１ｐＭ、０．５ｐＭ、１．０ｐＭ、５．０ｐＭ、１０．０ｐＭ、１５．０ｐＭ、２０．０ｐＭ、３０．０ｐＭ、５０．０ｐＭ、７５．０ｐＭ、０．１ｎＭ、０．５ｎＭ、１．０ｎＭ、５．０ｎＭ、１０．０ｎＭ、１５．０ｎＭ、２０．０ｎＭ、３０．０ｎＭ、５０．０ｎＭ、７５．０ｎＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、１．０μＭ、５．０μＭ、１０．０μＭ、１５．０μＭ、２０．０μＭ、３０．０μＭ、５０．０μＭ、７５．０μＭ、１００．０μＭ、２００．０μＭ、３００．０μＭ、５００．０μＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭまたは１０ｍＭの濃度で存在し得る。
【００３１】
他の実施形態では、タグ付き化学構造は、ライブラリ微小区画（１つまたは複数）中に、１μＭ未満；１〜１００μＭ；１００μＭより多い；５〜５０μＭまたは１０〜２０μＭの濃度で存在し得る。
【００３２】
工程（ｃ）の空間的な結び付けは、任意の適切な手段によって維持され得るが、好ましいのは、ＴＣＳとそのタグが空間的に近接して閉じ込められているような微小区画化である。（以下により詳細に記載されるように）微小液滴、微小粒子、マイクロウェル、マイクロアレイおよび微小胞を含む種々の微小区画を使用することによって、物理的閉じ込めを達成することができる。
【００３３】
好ましい局面において、工程（ｃ）のタグはアッセイシステムから機能的または物理的に分離されている。これにより、アッセイ試薬によるタグの干渉が防止される。そのような実施形態では、タグは、上で定義されたように、ライブラリの微小区画内またはその上に分離され、隔離され、閉じ込められ、または配置され得る。
【００３４】
（スクリーニング微小区画）
好ましい実施形態では、ライブラリ微小区画のそれぞれは、工程（ｂ）の前に、例えば、マイクロカプセル化、ピコインジェクションまたは微小液滴融合によって、個別のスクリーニング微小区画に配置さ得る。スクリーニング微小区画は、任意の形態をとることができるが、ハイスループットスクリーニングに適した形態が好ましい。特に好ましいのは、微小液滴、マイクロウェルおよび／またはマイクロフルイディックチャネルから選択されるスクリーニング微小区画である。
【００３５】
スクリーニング微小区画は、好ましくは、（ｉ）水性溶媒；および／または（ｉｉｉ）ゲル化システム、例えばヒドロゲル、および／または（ｉｉｉ）アッセイシステムと一緒に、ライブラリ微小区画を含む。
【００３６】
スクリーニング微小区画は、好都合に、ライブラリ微小区画が該ゲル化したスクリーニング微小区画内に固定化されるように、同定工程（ｄ）前にゲル化され得るゲル化システムを含む。そのような実施形態では、ゲル化工程の後、同定工程（ｄ）前に洗浄工程が行われ得、それによって、そうでなければ解読工程の信頼性を損なう可能性がある干渉の反応物／生成物を除去する。
【００３７】
本発明の方法の工程（ｂ）では、ＴＣＳは、スクリーニング微小区画中に放出され得、一方でタグは、（ａ）ライブラリ微小区画内または上に、例えば共有結合および／または水素結合によって、保持される；（ｂ）ライブラリまたはスクリーニング微小液滴の表面で、官能基化された界面活性剤によって隔離される；または（ｃ）アッセイシステムの構成要素によって隔離されている。
【００３８】
本発明の方法は、そのタグから各化学構造を放出して、複数の遊離するタグなし化学構造（ＴＣＳ）を生成する工程を含む。ＴＣＳは、好都合には、拡散によって（例えば、ライブラリ微小区画から直接拡散によって）、スクリーニング微小区画中に放出される。
【００３９】
スクリーニング工程（ｃ）は、アッセイシステム、ＴＣＳのクローン集団、およびタグを含むライブラリ微小区画を含むスクリーニング用微小液滴内で行われ得る。
【００４０】
（テンプレート化合成）
特定の実施形態では、コード核酸タグは、化学構造のテンプレートとして機能する。そのような実施形態では、タグ付き化学構造のライブラリは、化学構造の核酸テンプレート化、例えばＤＮＡテンプレート化合成によって提供される。任意の適切なテンプレート化技術が使用され得、そして適切な技術は、例えば、Mannocci et al. (2011) Chem. Commun., 47：12747-12753；Kleiner et al. (2011) Chem Soc Rev. 40(12)：5707-5717およびMullard (2016) Nature 530：367-369に記載されている。Pehr Harbury教授および共同研究者（Stanford University、米国）によって開発されたＤＮＡ経路指定アプローチもまた適切である。ＤＮＡテンプレートは、任意の方法でパターン化／構成され得る。例えば、YoctoReactorシステムは、適切なドナー化学部分をコアアクセプター部位上に転移させることによってライブラリ合成を補助するために、３方向ＤＮＡ−ヘアピンループ接合部を使用する（ＷＯ２００６／０４８０２５を参照のこと。この開示は参照により本明細書に援用される）。
【００４１】
代替の構造幾何学もまた利用可能である：例えば、４方向ＤＮＡホリデイジャンクションおよび六角形構造（Lundberg et al. (2008) Nucleic acids symposium (52)：683-684によって記載されるような）、ならびにRothemund (2006) Nature 440：297-302により概説される「スキャフォールド化ＤＮＡ折り紙」技術によって作成された複雑な形状およびパターン。
【００４２】
（リアクタ微小区画）
コード核酸タグが化学構造のためのテンプレートとして機能する実施形態では、テンプレート化合成は、コード化核酸テンプレートを、必要に応じてＰＣＲによって、増幅することを含む工程の前に行われ得る。この増幅工程は、リアクタ微小区画中で行われ得る。
【００４３】
したがって、本発明は、以下のライブラリ合成を企図した：（ａ’）（ｉ）コード化テンプレートのクローン集団；および（ｉｉ）複数の化学部分構造を含有するリアクタ微小区画を提供する工程；ならびに、次いで（ｂ’）部分構造が、核酸テンプレート化合成によって化学構造のクローン集団を形成するように反応する条件下で、リアクタ微小区画内でテンプレートを部分構造と接触させる工程を含み、それにより、コード化テンプレートにハイブリダイズした化学構造のクローン集団を含むリアクタ微小区画を生じさせる。
【００４４】
そのような実施形態におけるリアクタ微小区画は、マイクロウェル、マイクロアレイ、マイクロフルイディックチャネル、微小粒子、微小小胞または微小液滴から選択され得る。微小液滴が好ましい。微小区画はヒドロゲルを含んでもよく、そのようなヒドロゲル含有微小区画の例は本明細書に記載されている。
【００４５】
ここで、この方法は、（ｉ）コード化テンプレートから化学構造を脱ハイブリダイズし、そして次いで（ｉｉ）リアクタ微小区画内で脱ハイブリダイズしたテンプレートを未反応の部分構造と、部分構造が核酸テンプレート化合成によって化学構造のさらなるクローン集団を形成するように反応する条件下で接触させ、そして次いで（ｉｉｉ）工程（ｉ）および（ｉｉ）を繰り返すことによって、化学構造の数を増幅させる工程をさらに含み得る。
【００４６】
そのような実施形態では、化学構造が、リアクタ微小区画中に、少なくとも０．１ｎＭ、０．５ｎＭ、１．０ｎＭ、５．０ｎＭ、１０．０ｎＭ、１５．０ｎＭ、２０．０ｎＭ、３０．０ｎＭ、５０．０ｎＭ、７５．０ｎＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、１．０μＭ、５．０μＭ、１０．０μＭ、１５．０μＭ、２０．０μＭ、３０．０μＭ、５０．０μＭ、７５．０μＭ、１００．０μＭ、２００．０μＭ、３００．０μＭ、５００．０μＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭまたは１０ｍＭの濃度で存在するまで、工程（ｉ）および（ｉｉ）が繰り返され得る。従って、工程（ｉ）および（ｉｉ）は、化学構造がリアクタ微小区画中に、１〜１００μＭ、５〜５０μＭまたは１０〜２０μＭの濃度で存在するまで繰り返され得る。
【００４７】
本発明の方法の文脈においてテンプレート化合成は、化学構造にカップリングされた核酸とコード化タグテンプレートの核酸との間のハイブリダイゼーションを含んでいてもよい。
【００４８】
（既存の化学ライブラリのクローンタグ付け）
テンプレート化合成は、本発明の方法にとって必須の要件ではないが、タグ付き化学構造のライブラリは、任意の適切な手段によって提供され得る。たとえば、本発明による使用のためのライブラリは、化学構造のクローン集団を含んでもよく、工程（ａ）は、該クローン集団内で化学構造の各々にコード化タグを放出可能に連結する工程を含む。そのような実施形態における化学構造のクローン集団は、市販の化学ライブラリの要素であり得る。
【００４９】
このような実施形態では、コード化タグは、核酸配列、例えばＤＮＡ配列を含み得る。タグは、複数の異なる架橋部位にて化学構造に放出可能に連結され得、それによって化学構造上の特定の部位（１つまたは複数）での架橋から生じるあらゆる有害な影響を軽減する。そのような実施形態では、コード化タグは、タグ付けが複数の異なる架橋部位で起こり得るように、複数の異なる架橋部位にて官能基化され得る。
【００５０】
適切な核酸ベースのタグは市販されている（例えばTwist Bioscience Corporationから）が、それらは例えばＷＯ２０１５／０２１０８０（その内容は参照により本明細書に援用される）に記載されているように合成してもよい。
【００５１】
（標的細胞）
本発明は、表現型の細胞ベースのアッセイにおける特定の適用を見出す。
【００５２】
従って、アッセイシステムは、均一水相アッセイシステムであり得、そしてスクリーニング工程（ｃ）は、表現型スクリーンを含み得る。そのような実施形態では、アッセイシステムは、生存標的細胞を含み得る。そのような実施形態において、任意の細胞が使用され得、これは、原核細胞および真核細胞を含む。好適な原核細胞は、古細菌細胞を含み、例えば（ａ）クレン古細菌（Crenarchaeota）；（ｂ）ユーリ古細菌（Euryarchaeota）；（ｃ）コル古細菌（Korarchaeota）；（ｄ）ナノ古細菌（Nanoarchaeota）および（ｅ）タウム古細菌（Thaumarchaeota）の門から選択され、例えばハロフェラックス・ウォルカニイ（Haloferax volcanii）およびスルフォロブス属種（Sulfolobus spp.）から選択される。
【００５３】
本発明に従って標的細胞として使用するのに適した他の原核細胞は、細菌細胞を含む。そのような実施形態では、標的細胞は病原性細菌であり得る。他の細菌標的細胞は、グラム陽性細菌（例えば、エンテロコッカス・フェカーリス（Enterococcus faecalis）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）およびスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus））；グラム陰性細菌（例えば、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）、アシネトバクター・バウマニ（Acinetobacter baumanii）およびエシェリキア・コリ（Escherichia coli）、エシェリキア・コリST131株（E. coli  ST131 strains）、シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、エンテロバクター・クロアカ（Enterobacter cloacae）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）およびナイセリア・ゴノレア（Neisseria gonorrhoeae））；および不確定のグラム反応を示す細菌から選択される細胞を含む。
【００５４】
本発明の標的細胞として使用するのに適した真核細胞は、（ａ）真菌細胞；（ｂ）哺乳類細胞；（ｃ）高等植物細胞；（ｄ）原虫細胞；（ｅ）蠕虫細胞；（ｆ）藻類細胞；（ｇ）臨床組織サンプル、例えばヒト患者サンプルに由来する細胞および（ｈ）無脊椎動物細胞を含む。
【００５５】
適切な哺乳類細胞は、癌細胞（例えばヒト癌細胞）、筋肉細胞、ヒト神経細胞、および他の細胞（疾患関連表現型を示す生きているヒト患者に由来する）を含む。
【００５６】
（標的タンパク質）
アッセイシステムは、単離された標的タンパク質または単離された標的タンパク質複合体を含み得る。例えば、標的タンパク質／タンパク質複合体は、細胞内標的タンパク質／タンパク質複合体であり得る。標的タンパク質／タンパク質複合体は、溶液中にあってもよいし、膜または膜貫通タンパク質／タンパク質複合体を構成してもよい。このような実施形態では、化学構造は、標的タンパク質／タンパク質複合体に結合するリガンドについてスクリーニングされ得る。リガンドは、標的タンパク質／タンパク質複合体のインヒビターであってもよい。
【００５７】
アッセイシステムは、検出可能な標識を含むか、または生成し得る。そのような実施形態では、検出可能な標識は、上記のように、標的細胞または単離された標的タンパク質もしくは単離された標的タンパク質複合体に連結され得る。
【００５８】
スクリーニング工程は、ＦＡＤＳおよび／またはＦＡＣＳを含み得る。スクリーニング工程はまた、蛍光分析を含んでいてもよく、これは、ＦＲＥＴ、ＦｌｉＭ、フルオロフォアタグ付き抗体、フルオロフォアタグ付きＤＮＡ配列または蛍光染料分析を含むがこれらに限定されない。
【００５９】
（配列ベースの構造活性分析）
本発明は、空間的に結び付けられているタグを解読することによってスクリーニングされたＴＣＳを同定する工程を含む。タグが核酸配列を含む場合、解読工程は、核酸を配列決定することを含み得る。そのような実施形態では、方法は、複数の異なるスクリーニングされたＴＣＳの配列を比較することをさらに含み得る。そのような工程の後に、スクリーニングされたＴＣＳに関して配列−活性の関係の分析を実施する工程が続いてもよく、それはスクリーニングされたライブラリメンバーの異なるケモタイプへの分類を可能にし得る。
【００６０】
（ライブラリ）
別の局面において、本発明は、本発明の方法において使用するためのコード化化学ライブラリを提供し、このライブラリは、各々コード化タグに放出可能に連結された化学構造のｎ個のクローン集団を含み、各クローン集団は、ｎ個の個別のライブラリ微小区画に閉じ込められている。
【００６１】
ここで、化学構造は、例えば、切断可能なリンカーによっておよび／または核酸ハイブリダイゼーションによって、上記のようにコード化タグに連結され得る。
【００６２】
別の局面において、本発明は、本発明の方法において使用するためのコード化化学ライブラリを提供し、このライブラリは、遊離する化学構造のｎ個のクローン集団を含み、各クローン集団は、ｎ個の個別のライブラリ微小区画に閉じ込められ、該化学構造は、コード化タグと共に該微小区画内に含まれるが、該コード化タグに共有結合されていない。
【００６３】
別の局面において、本発明は、本発明の方法で使用するためのアッセイ組成物を提供し、この組成物は、微小区画内に含まれる化学構造がアッセイシステムと接触される本発明のライブラリを含む。ここで、コード化タグは、アッセイシステムから機能的または物理的に分離され得る。例えば、化学構造は、アッセイシステムを含むライブラリ微小液滴内に含まれ得、そしてコード化タグは、ライブラリ微小液滴内にカプセル化された微小液滴、ビーズまたは微小小胞内または上に配置することができる。
【００６４】
別の局面において、本発明は、本発明の方法において使用するための核酸コード化化学ライブラリリアクタを提供し、これは、（ａ）コード化核酸テンプレート分子のクローン集団、および（ｂ）複数の化学部分構造を含む微小区画を含み、該部分構造が、核酸テンプレートアセンブリがコード化核酸タグ化化学構造を形成するように適合され、該コード化タグが該化学構造に放出可能に連結されている。
【００６５】
本発明の他の態様および好ましい実施形態は、以下に示した他の特許請求の範囲において定義および説明されている。
【００６６】
（発明の詳細な説明）
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、特許出願および他の参考文献は、全ての目的でそれらの全体が参照によって援用される。あたかもそれぞれ個々の刊行物、特許または特許出願が具体的かつ個別に示されているかのごとく、参照によりその引用した内容全体が援用される。
【００６７】
（定義と全般の設定）
本明細書で使用される場合、そして他に具体的に示されない限り、以下の用語は、当該用語が当該技術分野において享受し得る任意のより広い（またはより狭い）意味に加えて、以下の意味を有することを意図する。
【００６８】
文脈によって他に必要とされない限り、本明細書における単数形の使用は複数形を含むと解釈されるべきであり、逆もまた同様である。ある実体に関して使用される「１つの」という用語は、その実体の１つまたは複数を指すと読まれるべきである。そのように、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１つまたはそれ以上」、および「少なくとも１つ」は、本明細書では互換的に使用される。
【００６９】
本明細書で使用されるとき、用語「含む（comprise）」、または「含む（comprises）」または「含む（comprising）」などのその変形は、任意の列挙された整数（integer）（例えば、特徴、要素、特質、特性、方法／プロセス工程または制限）または整数のグループ（例えば、特徴、要素、特質、特性、方法／プロセス工程または制限）の包含を示すと読まれるべきであるが、他の整数または整数のグループを排除するものではない。したがって、本明細書で使用されるとき、用語「含む（comprising）」は包括的または無制限であり、列挙されていない追加の整数または方法／プロセス工程を排除するものではない。
【００７０】
用語グラム陽性細菌とは、特定の細胞壁染色特性に基づいてグループ化された細菌の特定のクラスを定義する用語である。
【００７１】
用語低Ｇ＋Ｃグラム陽性細菌とは、ＤＮＡの塩基組成に基づいて、グラム陽性内に進化的に関連した細菌の特定のサブクラスのクラスを定義する用語である。サブクラスは、ストレプトコッカス属種（Streptococcus spp.）、スタフィロコッカス属種（Staphylococcus spp.）、リステリア属種（Listeria spp.）、バチルス属種（Bacillus spp.）、クロストリジウム属種（Clostridium spp.）、エンテロコッカス属種（Enterococcus spp.）およびラクトバチルス属種（Lactobacillus spp.）を含む。
【００７２】
用語高Ｇ＋Ｃグラム陽性細菌とは、ＤＮＡの塩基組成に基づいて、グラム陽性内に進化的に関連した細菌の特定のサブクラスのクラスを定義する技術用語である。サブクラスは、アクチノマイセス属種（Actinomyces spp.）、アルスロバクター属種（Arthrobacter spp.）、コリネバクテリウム属種（Corynebacterium spp.）、フランキア属種（Frankia spp.）、ミクロコッカス属種（Micrococcus spp.）、ミクロモノスポラ属種（Micromonospora spp.）、マイコバクテリウム属種（Mycobacterium spp.）、ノカルディア属種（Nocardia spp.）、プロピオニバクテリウム属種（Propionibacterium spp.）およびストレプトミセス属種（Streptomyces spp.）を含む放線菌科（actinomycetes（放線菌(actinobacteria)））を含む。
【００７３】
用語グラム陰性細菌とは、特定の細胞壁染色特性に基づいてグループ化された細菌の 特定のクラスを定義する用語である。グラム陰性菌属の例は、クレブシエラ属（Klebsiella）、アシネトバクター属（Acinetobacter）、エシェリキア属（Escherichia）、シュードモナス属（Pseudomonas）、エンテロバクター属（Enterobacter）および ナイセリア属（Neisseria）を含む。
【００７４】
本明細書で使用されるように、用語アッセイシステムとは、所望の活性を検出するための手段を規定する。アッセイシステムは、それが、ライブラリに存在し、所望の活性を有する化学構造と接触するかまたは反応すると、検出可能および／または測定可能なシグナルを直接的または間接的に生成する。所望の活性は、標的タンパク質結合、薬理学的活性、細胞受容体結合、抗生物質、抗癌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、駆虫剤、殺虫剤、薬理学的活性、免疫学的活性、所望の化合物の産生、化合物の産生増加または特定産物の分解であり得る。所望の活性は、薬理学的標的細胞、細胞のタンパク質または代謝経路に対する活性であり得る。所望の活性はまた、例えば１つまたはそれ以上の遺伝子の発現および／またはそれらの時間的もしくは空間的（例えば組織特異的）発現パターンを減少または増加させることによって、遺伝子発現を調節する能力であり得る。所望の活性は、例えば標的タンパク質に対するリガンドとして作用するための、結合活性であり得る。所望の活性はまた、種々の工業プロセスにおいて有用であるものであり得、これには、バイオレメディエーション、微生物増強石油回収、下水処理、食品製造、バイオ燃料生産、エネルギー生成、バイオ生産、バイオ消化／生分解、ワクチン生産およびプロバイオティクス生産が含まれる。それはまた、化学剤（例えば、フルオロフォアまたは色素）、特定の化学反応、または色、マトリックス構造または屈折率変化に結びつくことができる任意の化学反応であってもよい。
【００７５】
アッセイシステムは、化学的指標を含み得、これは、レポーター分子および検出可能な標識（本明細書中で定義されるような）を含む。それは、例えば、比色（すなわち、可視範囲の光を吸収する着色反応生成物をもたらす）、蛍光（例えば、酵素が基質を反応生成物に変換し、この反応生成物は特定の波長の光によって励起されると蛍光を発することに基づく）、および／または発光（例えば、生物発光、化学発光および／またはフォトルミネッセンスに基づく）であり得る。
【００７６】
アッセイシステムは、細胞、例えば本明細書に記載のような標的細胞を含み得る。アッセイシステムはまた、タンパク質、例えば本明細書に記載のような標的タンパク質を含み得る。あるいは、またはさらに、アッセイシステムは、細胞画分、細胞成分、組織、組織抽出物、多タンパク質複合体、膜結合タンパク質膜画分および／またはオルガノイドを含み得る。
【００７７】
本明細書で使用される用語リガンドとは、インビボでの生物学的標的分子に対する結合相手（例えば、酵素または受容体）を定義するために使用される。したがって、そのようなリガンドは、その結合の生理学的影響に関係なく、インビボで標的と結合する（または直接的に物理的に相互作用する）ものを含む。したがって、本発明のリガンドは、標的が一部を形成する細胞内シグナル伝達カスケードの一部として標的に結合し得る。あるいは、それらは細胞生理学の他のいくつかの局面の状況において標的と結合し得る。後者の場合、リガンドは、例えば、シグナル伝達カスケードを誘発することなく細胞表面で標的に結合し得、その場合、結合は細胞機能の他の局面に影響を及ぼし得る。したがって、本発明のリガンドは細胞表面および／または細胞内で標的に結合することができる。
【００７８】
本明細書で使用する場合、用語小分子とは、１０００Ｄａ以下、例えば、９００Ｄａ未満、８００Ｄａ未満、６００Ｄａ未満、または５００Ｄａ未満の分子量を有する任意の分子を意味する。好ましくは、本発明のライブラリ中に存在する化学構造は、本明細書中で定義されるような小分子、特に６００Ｄａ未満の分子量を有する小分子であり得る。
【００７９】
本明細書中で使用される場合、用語「大分子」は、１０００Ｄａより大きい分子量を有する任意の分子を意味する。
【００８０】
本明細書中で使用される場合、用語抗体とは、全抗体（ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を含む）を定義する。この用語はまた、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ'）、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ、Ｆｃ３および一本鎖抗体（およびそれらの組み合わせ）を含む抗体フラグメント（これらは、組換えＤＮＡ技術またはインタクトな抗体の酵素的もしくは化学的開裂によって製造され得る）をいうために本明細書で用いられる。用語「抗体」はまた、二重特異性または二機能性の抗体（これらは２つの異なる重鎖／軽鎖対および２つの異なる結合部位を有する合成ハイブリッド抗体である）を包含するために本明細書中で使用される。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’フラグメントの連結を含む、種々の方法によって製造することができる。キメラ抗体（１つまたはそれ以上の非ヒト可変抗体免疫グロブリンドメインにカップリングしたヒト定常抗体免疫グロブリンドメインを有する抗体、またはそのフラグメント）もまた「抗体」という用語に包含される。したがって、そのようなキメラ抗体は「ヒト化」抗体を含む。「抗体」という用語には、ミニボディ（ＷＯ９４／０９８１７参照）、一本鎖Ｆｖ−Ｆｃ融合体、およびトランスジェニック動物によって産生されるヒト抗体も含まれる。「抗体」という用語には、多量体抗体およびタンパク質の高次複合体（例えばヘテロ二量体抗体）も含まれる。
【００８１】
本明細書で使用する場合、用語ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質とは、ペプチド結合によって共有結合された２個またはそれ以上のアミノ酸を含む有機化合物を定義するために互換的に使用される。対応する形容詞的な用語「ペプチド性」は、それに応じて解釈されるべきである。ペプチドは構成アミノ酸の数に関して称され得、すなわち、ジペプチドは２個のアミノ酸残基を含有し、トリペプチドは３個を含有するなどである。１０個以下のアミノ酸を含有するペプチドはオリゴペプチドと称され得る。１０個より多いアミノ酸残基を有するものがポリペプチドである。そのようなペプチドはまた、修飾ならびにさらなるアミノ基およびカルボキシ基のいずれかを含んでもよい。
【００８２】
本明細書で使用されるように、用語クリックケミストリーとは、高収量で、広い範囲で、クロマトグラフィーなしで除去することができる副生成物のみを生じ、立体特異的で、実行が簡単で、そして容易に除去可能または良性の溶媒中で行われる反応を表すために、2001年にSharplessによって導入された技術用語である。それ以来、化学と生物学の両方で幅広い用途で、多くの異なる形で実行されている。クリック反応のサブクラスは、周囲の生物学的環境に不活性な反応物を含む。このようなクリック反応は生体直交（bioorthogonal）と呼ばれる。生体直交クリックケミストリーに適した生体直交反応体ペアは、以下の特性を有する分子群である：（１）それらは相互に反応性であるが、細胞内環境において細胞生化学システムと有意に交差反応または相互作用しない；（２）それらまたはそれらの産物および副産物は、生理学的環境において安定であり、非毒性である；そして（３）それらの反応は非常に特異的で速い。反応性部分（またはクリック反応体）は、用いる特定のクリックケミストリーへの参照によって選択され得、そして当業者に知られている生体直交クリック反応体の広範な適合可能な対のいずれかが、本発明に従って使用され得、これは、逆電子要請型ディールス・アルダー環化付加反応（ＩＥＤＤＡ）、ひずみ促進アルキンアジド環化付加（ＳＰＡＡＣ）およびシュタウディンガーライゲーションを含む。
【００８３】
用語単離されたとは、その材料が天然に存在するものとは異なる物理的環境に存在することを示すために、任意の材料（例えば、化合物、アッセイ試薬、標的タンパク質または標的細胞）に関して、本明細書で使用される。例えば、単離された細胞は、それらが天然に存在する複雑な組織環境に関して実質的に単離されたものであり得る（例えば精製されていてもよい）。単離された細胞は、例えば精製または分離されたものであってもよい。そのような場合、単離された細胞は、存在する全細胞型の少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％を占め得る。単離された細胞は、当業者に公知の通常の技術により得られ得、このような技術は、ＦＡＣＳ、密度勾配遠心分離、富化培養、選択培養、細胞選別およびパニング（表面タンパク質に対する固定化抗体を用いる）を含む。
【００８４】
単離された材料が精製されるとき、純度の絶対レベルは重要ではなく、そして当業者は材料が置かれるべき用途に従って適切なレベルの純度を容易に決定することができる。しかしながら、少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％ｗ／ｗの純度レベルが好ましい。状況によっては、単離された材料は、他の成分を含み得る組成物（例えば、他の多くの細胞成分を含む多かれ少なかれ粗製の細胞抽出物）または緩衝系の一部を形成する。
【００８５】
用語接触するとは、少なくとも２つの異なる部分またはシステム（例えば、化学構造およびアッセイシステム）が反応、相互作用または物理的接触するのに十分に近位になることを可能にするプロセスをいうために、本明細書において使用される。
【００８６】
用語検出可能な標識とは、分光学的、蛍光的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的、電気化学的、無線周波数により、または任意の他の物理的手段により検出可能な部分を定義するために、本明細書において使用される。適切な標識としては、蛍光タンパク質、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて一般的に使用されるような）、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテン、および、（例えば、標的ペプチドと特異的に反応するペプチドまたは抗体に放射性または蛍光標識を取り込ませることによって）検出可能となるタンパク質または他の実体が挙げられる。
【００８７】
本明細書で使用される場合、用語微小液滴とは、０．１μｍ〜１０００μｍの直径を有し、かつ／または５×１０−７ｐＬと５００ｎＬとの間の体積を有する、個別体積が小さな流体、液体又はゲルを定義する。典型的には、微小液滴は、１０００μｍ未満、例えば５００μｍ未満、５００μｍ未満、４００μｍ未満、３００μｍ未満、２００μｍ未満、１００μｍ未満、５０μｍ未満、４０μｍ未満、３０μｍ未満、２０μｍ未満、１０μｍ未満、５μｍ未満、または１μｍ未満。したがって、微小液滴は、以下の直径を有する実質的に球形であり得る：（ａ）１μｍ未満；（ｂ）１０μｍ未満；（ｃ）０．１〜１０μｍ；（ｄ）１０μｍ〜５００μｍ；（ｂ）１０μｍ〜２００μｍ；（ｃ）１０μｍ〜１５０μｍ；（ｄ）１０μｍ〜１００μｍ；（ｅ）１０μｍ〜５０μｍ；または（ｆ）約１００μｍ。
【００８８】
本発明の微小液滴は、典型的には、第二の流体、液体またはゲル（例えば、非混和性の液体又は気体）によって完全に囲まれている第一の流体、液体またはゲルの単離された部分から構成されている。いくつかの場合、液滴は、球形または実質的に球形であり得る。しかし、いくつかの場合、（例えば、外部環境によって、または本明細書に記載のアッセイおよびスクリーニングプロセス中の物理的操作の間に課される力のために）微小液滴は非球形で、不規則な形状を有してもよい。したがって、微小液滴は、（例えば、それらが周囲のマイクロチャネルの幾何学的形状に適合する状況において）実質的に円筒形、栓状、および／または楕円形であり得る。
【００８９】
本明細書で使用される場合、用語微粒子とは、１０００μｍ未満、例えば、５００μｍ未満、５００μｍ未満、４００μｍ未満、３００μｍ未満、２００μｍ未満、１００μｍ未満、５０μｍ未満、４０μｍ未満、３０μｍ未満、２０μｍ未満、１０μｍ未満、５μｍ未満、または１μｍ未満の直径を有する粒子を定義する。マイクロ粒子は、好ましくは、非平面であり、そして以下の（または直径を有する実質的に球形である）最大寸法を有し得る：（ａ）１０μｍ〜５００μｍ；（ｂ）１０μｍ〜２００μｍ；（ｃ）１０μｍ〜１５０μｍ；（ｄ）１０μｍ〜１００μｍ；（ｅ）１０μｍ〜５０μｍ；または（ｆ）約１００μｍ。したがって、微粒子は、本明細書で定義されるように微小液滴内にカプセル化され得る。微粒子は、硬質固体、軟質ゲル、多孔質固体、多孔質ゲルまたは硬質もしくは半硬質のフィブリルもしくは細管の網状組織もしくはマトリックスから形成され得る。
【００９０】
本明細書中で使用される場合、 用語ビーズとは、固体微粒子を定義するために使用される。好ましいビーズは、ゲル（アガロースなどのヒドロゲルを含む）から、例えばゲル化バルク組成物の断片化またはプレゲル化状態からの成形によって形成される。ビーズは、ストレプトアビジン、アミンまたは臭化シアンのような反応性基または部分で官能基化されていてもよい。あるいは、これらのビーズは、シリコン、ポリスチレン（ＰＳ）、 架橋ポリ（スチレン／ジビニルベンゼン）（Ｐ［Ｓ／ＤＶＢ］）、およびポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）から作られるもののような固体支持体であり得る。
【００９１】
用語微小小胞とは、リポソームのような内部容積を取り囲む外壁または膜を含む中空微小粒子を定義するために、本明細書において使用される。
【００９２】
本発明の微小液滴、微小粒子および微小小胞は単分散性であり得る。用語単分散性とは、本発明による使用のため微小液滴および微小粒子に適用されると、１．０以下、０．５以下、および好ましくは０．３以下の液滴／粒子サイズ分散の係数εを有する微小液滴／微小粒子の集団を定義する。係数εは以下の式によって定義される：
ε=（９０Ｄｐ−１０Ｄｐ）／５０Ｄｐ（１）
ここで、１０Ｄｐ、５０Ｄｐ、および９０Ｄｐは、エマルジョンの相対累積粒子サイズ分布曲線から推定される累積度数がそれぞれ１０％、５０％および９０％であるときの粒子サイズである。ε＝０の場合は、エマルジョン粒子の粒子サイズのばらつきが全くない理想的な状態を意味する。
【００９３】
本明細書で使用される場合、用語コード化タグとは、化学構造に関しては、化学構造またはその反応履歴をユニークに同定する情報を含み、それによりその特定の化学構造のユニークな識別子として機能する部分又は因子を定義するために使用される（すなわち、タグは、その構造を「コード化」し、分子「バーコード」として機能する）。情報は任意の形態でコード化され得るが、好ましい実施形態では、タグは、情報が核酸の配列にコード化されている核酸（例えばＤＮＡ）タグである。しかし、他のタグを使用してもよく、非ＤＮＡタグ、非ＲＮＡタグ、修飾核酸タグ、ペプチドタグ、光ベースのバーコード（例えば量子ドット）およびＲＦＩＤタグを含む。
【００９４】
本明細書で使用される場合、化学構造に関して用語クローンとは、それぞれが共通のタグによってコード化される化学構造の集団を定義する。化学構造は、化学的に同一であってもよく、または化学構造をその同族のコード化タグにカップリングする切断可能なリンカーの性質および／または位置に関して（またはそのようなリンカーの切断後に残る痕に関して）のみ異なってもよい。
【００９５】
本明細書で使用される場合、化学構造に適用される場合の用語遊離とは、固相に結合していない化学構造を定義するために使用される。いくつかの実施形態では、この用語は固相に共有結合していない化学構造を定義する。したがって、遊離化学構造は液相に入ってもよく、および／または溶液に入ってもよく、そしていくつかの実施形態では、アッセイシステムに存在する細胞によって結合および／または取り込まれてもよい。
【００９６】
本明細書で使用される場合、用語マイクロウェル（本明細書で用語ウェルと互換的に使用される）とは、１ｍｌ未満の容積を有するチャンバをいう。ｎｍ範囲の寸法を有するマイクロウェルは、電子ビームリソグラフィーによって作製することができる（例えば、Odom et al. (2002) J. AM. CHEM. SOC. 124：12112-12113を参照のこと）。マイクロウェルは、典型的には、固体基板またはマイクロタイタープレート（マイクロプレート、マイクロウェルまたはマルチウォールプレートとも呼ばれる）上に配置され、これは、典型的には、小さな試験管として使用される複数の「ウェル」を有する平板の形をとる。マイクロプレートは、典型的には、２：３の矩形マトリックスにて配置された６、２４、９６、３８４または１５３６のサンプルのマイクロウェルを有する。
【００９７】
本明細書で使用される場合、用語自己犠牲リンカー（self-immolative linker）とは、自己犠牲化学基（本明細書では自己犠牲部分（self-immolative moiety）または「ＳＩＭ」と呼ばれ得る）を含むリンカーを定義し、この自己犠牲化学基は、安定なタグ付き化学構造を形成するように化学構造およびそのコード化タグを直接的または間接的に（例えばペプチド部分を介して）共有結合することが可能であり、かつ化学構造の自発的放出を包含する機構により（例えば、脱離基の排除および遊離化学構造の放出につながる酵素切断により引き起こされる電子カスケードを介して）、化学構造からコード化タグを放出することが可能である。
【００９８】
（微小区画）
本発明は、遊離化学構造とそのコード化タグとの間の空間的結び付けの維持を包含する。これは、好都合には、微小区画化によって達成される。それは、化学構造およびその対応するコード化タグを、それらが物理的に近接して維持される（すなわち、各化学構造は、そのコード化タグの1０００μｍ以内（例えば、５００μｍ、２５０μｍ、１００μｍ、５０μｍ、２５μｍ、１０μｍまたは１μｍ以内）に配置される）ように、物理的に閉じ込めるプロセスである。以下に説明するように、物理的閉じ込めは、微小液滴、微小粒子、マイクロウェルおよび微小小胞を含む、種々の微小区画の使用を通じて達成することができる。物理的閉じ込めは、空間的に結び付けられたタグを解読することによって、スクリーニングヒットの化学構造の同定を可能にする。
【００９９】
（微小液滴）
本発明による微小区画化での使用に適した微小液滴を調製および処理するための適切な材料および方法は、当業者の常識の一部を形成し、例えば、ＷＯ２０１０／００９３６５、ＷＯ２００６／０４０５５１、ＷＯ２００６／０４０５５４、ＷＯ２００４／００２６２７、ＷＯ２００４／０９１７６３、ＷＯ２００５／０２１１５１、ＷＯ２００６／０９６５７１、ＷＯ２００７／０８９５４１、ＷＯ２００７／０８１３８５およびＷＯ２００８／０６３２２７（それらの内容は参照により本明細書に援用される）に記載されている。
【０１００】
微小液滴のサイズは、カプセル化される化学構造およびアッセイシステムの性質を参照することによって選択される。微小液滴は、以下の直径を有する実質的に球状であり得る：（ａ）１μｍ未満；（ｂ）１０μｍ未満；（ｃ）０．１〜１０μｍ；（ｄ）１０μｍ〜５００μｍ；（ｂ）１０μｍ〜２００μｍ；（ｃ）１０μｍ〜１５０μｍ；（ｄ）１０μｍ〜１００μｍ；（ｅ）１０μｍ〜５０μｍ；または（ｆ）約１００μｍ。
【０１０１】
微小液滴は、好ましくは、サイズが均一であり、例えば、ライブラリ内の任意の液滴の直径が、同じライブラリ内の他の液滴の直径と比較した場合に５％、４％、３％、２％、１％または０．５％未満で変動する。いくつかの実施形態では、微小液滴は単分散性である。しかしながら、多分散性微小液滴も本発明に従って使用され得る。
【０１０２】
単一Ｗ／Ｏ型エマルジョンでは、キャリア液は、任意の水不混和性液体、例えば油であり得、必要に応じて以下から選択される：（ａ）炭化水素油；（ｂ）フルオロカーボン油；（ｃ）エステル油；（ｄ）シリコーンオイル；（ｅ）水相の生物学的成分に対する溶解度が低い油；（ｆ）微小液滴間の分子拡散を抑制する油；（ｇ）疎水性かつ疎油性の油；（ｈ）気体に対して良好な溶解性を有する油；および／または（ｉ）上記のうちの任意の２つ以上の組み合わせ。
【０１０３】
したがって、微小液滴は、Ｗ／Ｏエマルジョン中に含まれていてもよく、ここで微小液滴は、水性分散相を構成し、そしてキャリア液は連続油相を構成する。
【０１０４】
他の実施形態では、微小液滴はＷ／Ｏ／Ｗ二重エマルジョン中に含まれ、そしてキャリア液体は水性液体であり得る。そのような実施形態では、水性液体は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）であり得る。
【０１０５】
したがって、微小液滴は、微小液滴が（ａ）分散相として外側油殻に包まれた水性増殖培地の内側コアと（ｂ）連続水相としてキャリア液とを含む、Ｗ／Ｏ／Ｗ二重エマルジョン中に含まれ得る。当然のことながら、Ｏ／Ｗ／Ｏ液滴は、非生物学的実体をスクリーニングするのに特に有用であり得ることも理解される。
【０１０６】
（界面活性剤）
微小液滴がエマルジョンに含まれる実施形態では、キャリア液が連続相を構成し、そして微小液滴が分散相を構成してもよく、そのような実施形態では、エマルジョンは界面活性剤および必要に応じて補助界面活性剤をさらに含んでもよい。
【０１０７】
界面活性剤および／または補助界面活性剤は、分散相と連続相との界面に位置してもよく、微小液滴がＷ／Ｏ／Ｗ二重エマルジョンに含まれる場合、界面活性剤および／または補助界面活性剤は、水性コアと油殻との界面、ならびに油殻と外側の連続相との界面に配置され得る。
【０１０８】
広範囲の適切な界面活性剤が利用可能であり、そして当業者は選択されたスクリーニングパラメーターに従って適切な界面活性剤（および必要ならば補助界面活性剤）を選択することができる。例えば、適切な界面活性剤は、Bernath et al. (2004) Analytical Biochemistry 325：151-157；Holtze and Weitz (2008) Lab Chip 8(10)：1632-1639;およびHoltze et al. (2008) Lab Chip. 8(10):1632-1639に記載される。他の適切な界面活性剤（特にフッ素界面活性剤を含む）は、ＷＯ２０１０／００９３６５およびＷＯ２００８／０２１１２３（それらの内容は参照により本明細書に援用される）に記載されている。
【０１０９】
界面活性剤（１つまたは複数）および／または補助界面活性剤（１つまたは複数）は、単一のＷ／Ｏ型エマルジョンが使用される実施形態において界面活性剤（１つまたは複数）および／または補助界面活性剤（１つまたは複数）が水性成長媒体微小液滴と連続（例えば油）相との界面に存在し得るように、Ｗ／Ｏ界面に組み込まれることが好ましい。同様に、二重Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルジョンが本発明による共カプセル化に使用される場合、界面活性剤（１つまたは複数）および／または補助界面活性剤（１つまたは複数）は、水性コアと不混和性（例えば油）の殻との間の界面、および油殻と連続水相との間の界面の一方または両方に存在し得る。
【０１１０】
界面活性剤（１つまたは複数）は、好ましくは生体適合性である。例えば、界面活性剤（１つまたは複数）は、スクリーンに使用される任意の細胞に対して非毒性であるように選択され得る。選択された界面活性剤（１つまたは複数）はまた、気体に対して良好な溶解度を有し得、これは任意のカプセル化細胞の増殖および／または生存能力に必要であり得る。
【０１１１】
生体適合性は、任意の適切なアッセイによって決定することができ、このようなアッセイは、細胞レベルでの生体適合性の代用としての役割を果たす、参照の感受性生化学的アッセイ（例えばインビトロ翻訳）との適合性についての試験に基づくアッセイを含む。例えば、蛍光性基質（フルオレセインジ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＦＤＧ））を有する酵素β−ガラクトシダーゼをコードするプラスミドＤＮＡのインビトロ翻訳（ＩＶＴ）が、生体適合性の指標として使用され得る。これは、例えば、カプセル化されたＤＮＡ、転写および翻訳に関与する分子、ならびに翻訳されたタンパク質が液滴界面に吸着せずにタンパク質の高次構造がなおインタクトである場合に、蛍光産物が形成されるためである。
【０１１２】
生体適合性はまた、界面活性剤の存在下でアッセイに使用される細胞を増殖させ、抗体または生存細胞染料で細胞を染色し、そして界面活性剤の非存在下での対照と比較した細胞集団の全体的な生存率を決定することによって決定され得る。
【０１１３】
界面活性剤（１つまたは複数）はまた、微小液滴界面での生体分子の吸着を防止し得る。界面活性剤はまた、個々の微小液滴（および対応する微小培養物）を単離するように機能し得る。界面活性剤は、好ましくは、微小液滴を安定化する（すなわちその合体を防止する）。安定化性能は、例えば位相差顕微鏡、光散乱、集束ビーム反射率測定、遠心分離および／またはレオロジーによってモニタリングすることができる。
【０１１４】
界面活性剤はまた、アッセイシステムの機能的部分を形成し得、そして、例えば、反応物および／または分析物および／またはアッセイ中に存在する他の部分（放出タグなど）を他の構成要素から分離または隔離するように作用し得る。例えば、官能基化界面活性剤の親水性頭部基中のニッケル錯体は、表面にヒスチジンタグ付きタンパク質を濃縮し得る（例えば、Kreutz et al. (2009) J Am Chem Soc. 131(17)：6042-6043を参照のこと）。そのような官能基化界面活性剤は、小分子合成用の触媒としても作用し得る（例えば、Theberge et al. (2009) Chem. Commun.：6225-6227を参照のこと）。それらは細胞溶解を引き起こすためにも使用され得る（例えば、Clausell-Tormos et al. (2008) Chem Biol. 15(5)：427-37を参照のこと）。したがって、本発明はそのような官能基化界面活性剤の使用を企図する。
【０１１５】
（エマルジョン共カプセル化に使用するための油）
不連続相と不混和性である任意の液体が本発明に従って使用するための微小液滴エマルジョンの形成に使用され得ることが理解されるが、この不混和性の流体は、典型的には油である。
【０１１６】
好ましくは、水相の生物学的成分に対して低い溶解度を有する油が選択される。他の好ましい機能的特性は、気体に対する調整可能な（例えば、高いまたは低い）溶解度、微小液滴間の分子拡散を阻害する能力、および／または疎水性と疎油性の組み合わせを含む。油は炭化水素油、例えば、軽鉱油、フルオロカーボン油、シリコーン油、またはエステル油であり得る。上記油の２種またはそれ以上の混合物もまた好ましい。
【０１１７】
適切な油の例は、ＷＯ２０１０／００９３６５、ＷＯ２００６／０４０５５１、ＷＯ２００６／０４０５５４、ＷＯ２００４／００２６２７、ＷＯ２００４／０９１７６３、ＷＯ２００５／０２１１５１、ＷＯ２００６／０９６５７１、ＷＯ２００７／０８９５４１、ＷＯ２００７／０８１３８５およびＷＯ２００８／０６３２２７（これは参照により本明細書に援用される）に記載されている。
【０１１８】
（微小液滴乳化プロセス）
広範囲の異なる乳化方法が当業者に知られており、それらのいずれも本発明の微小液滴を作製するために使用することができる。
【０１１９】
多くの乳化技術は、液滴崩壊を促進するためにしばしば乱流を使用して、バルクプロセスにおいて２つの液体を混合することを含む。そのような方法は、ボルテックス、超音波処理、均質化またはそれらの組み合わせを含む。
【０１２０】
乳化に対するこれらの「トップダウン」アプローチでは、個々の液滴の形成に対する制御はほとんど利用できず、典型的には広い範囲の微小液滴サイズの分布が生じる。代替の「ボトムアップ」アプローチは個々の液滴のレベルで機能し、そしてマイクロ流体デバイスの使用を含み得る。例えば、エマルジョンは、Ｔ字形接合部で油流と水流とを衝突させることによってマイクロ流体装置内で形成することができ、得られる微小液滴は各流れの流速に応じて大きさが変化する。
【０１２１】
本発明に従って使用するための微小液滴を製造するための好ましい方法は、フローフォーカシングを含む（例えば、Anna et al. (2003) Appl. Phys. Lett. 82(3)：364-366に記載されているように）。ここでは、分散相（集束した流体またはコア流体）に隣接するまたはそれを取り囲む連続相流体（集束する流体またはシース流体）は、両方の流体が押し出されるオリフィスの近傍で液滴の破壊を引き起こす。フローフォーカシング装置は、連続的な集束流体供給源で加圧された圧力チャンバからなる。内側に、１つまたはそれ以上の集束した流体が、圧力チャンバを外部の周囲環境と連結する小さなオリフィスの前に、先端が開いている毛細管供給チューブを通して注入される。集束する流体流は流体メニスカスを尖端に成形し、オリフィスを通ってチャンバを出る定常的なマイクロまたはナノジェットを生じさせる。噴流の大きさは出口オリフィスよりずっと小さい。毛細管不安定性は定常ジェットを均質な液滴または気泡に分解する。
【０１２２】
供給管は、２つまたはそれ以上の同心針から構成されてもよく、そして異なる不混和性の液体または気体が注入されて化合物滴をもたらし得る。フローフォーカシングは、ジェットが分裂したときに毎秒最大数百万の液滴の極めて高速で制御された生成を確実とする。
【０１２３】
他のマイクロ流体処理技術がピコインジェクションを含み、この技術では、試薬が電場を用いて水性液滴に注入される（例えば、Eastburn et al. (2013) Picoinjection Enables Digital Detection of RNA with Droplet RT-PCR. PLoS ONE 8(4)：e62961. doi:10.1371/journal.pone.0062961を参照のこと）。微小液滴が、例えば電気融合によって能動的に（例えば Tan and Takeuchi (2006) Lab Chip. 6(6)：757-63を参照のこと）、または受動的に（例えばSimon and Lee (2012) 「Microdroplet Technology」, in Integrated Analytical Systems pp 23-50, 10.1007/978-1-4614-3265-4_2に概説されるように）、融合されて２つの試薬を一緒にすることができる。
【０１２４】
全ての場合において、選択された微小液滴形成プロセスの性能は、位相差顕微鏡、光散乱、集束ビーム反射率測定、遠心分離および／またはレオロジーによってモニタリングすることができる。
【０１２５】
（蛍光活性化液滴ソーティング）
本明細書で説明するように、本発明の方法は、スクリーニングアッセイを微量の媒体中に個別の微小液滴の形態で区画化することを含むので、ハイスループットスクリーニングに適している。これにより、各微小液滴を別個の培養容器として扱うことが可能になり、確立された微小流体および／または細胞選別方法論を用いて多数の個々の液体共培養物を迅速にスクリーニングすることが可能になる。
【０１２６】
したがって、同時カプセル化工程に続いて、得られた微小液滴は、十分に確立された蛍光活性化セルソーティング（細胞選別）（ＦＡＣＳ）装置およびプロトコルを適合させることによって選別することができる。この技術は、蛍光活性化液滴ソーティング（ＦＡＤＳ）と呼ばれており、例えば、Baret et al. (2009) Lab Chip 9：1850-1858に記載されている。蛍光部分を使用することによって検出することができるあらゆる変化をスクリーニングすることができる。
【０１２７】
標的細胞はＦＡＤＳを可能にするために蛍光標識することができる。種々の蛍光タンパク質をこの目的のための標識として使用することができ、蛍光タンパク質としては、例えば、オワンクラゲ（Aequorea victoria）の野生型緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（Chalfie et al. 1994, Science 263:802-805）、および修飾ＧＦＰ（Heim et al. 1995, Nature 373:663-4；ＰＣＴ公開ＷＯ９６／２３８１０）が挙げられる。あるいは、DNA2.0のIP-Free(c)合成非Aequorea蛍光タンパク質が、異なる蛍光タンパク質コード配列の供給源として使用でき、これは、ＰＣＲによって増幅することができるかまたは隣接するＢｓａＩ制限部位を使用して容易に切り出して選択した任意の他の発現ベクターにクローニングすることができる。
【０１２８】
このタイプのレポーター遺伝子の転写および翻訳は、細胞内の蛍光タンパク質の蓄積をもたらし、それによりそれらはＦＡＤＳに適するようになる。
【０１２９】
あるいは、細胞内で特定のレベルおよび条件で蛍光を発する広範囲の色素が利用可能である。例としては、Molecularプローブ（Thermo Scientific）から入手可能なものが挙げられる。あるいは、細胞成分は、抗体を用いて検出することができ、これらは、市販のキットを使用して、種々のフルオロフォアで染色することができる。同様に、ＤＮＡ配列は、フルオロフォアで標識して細胞に導入することができ、そして細胞中の相補的ＤＮＡおよびＲＮＡ配列へのハイブリダイゼーションによって付着し、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）と呼ばれるプロセスにおける遺伝子発現の直接検出を可能とする。
【０１３０】
現在のハイコンテントスクリーニングにおいて適用することができる任意の標識化処理が、ＦＡＤＳに適用することができ、対照に対する蛍光シグナルの変化として検出され得る。
【０１３１】
（タグテンプレート化合成）
コード化タグは、ＤＮＡテンプレート化技術を利用することによってコード化化学構造の合成を指向させるテンプレートとして機能し得る。適切な技術は当業者に知られており、そして例えば Mannocci et al. (2011) Chem. Commun., 47：12747-12753；Kleiner et al. (2011) Chem Soc Rev. 40(12)：5707-5717;およびMullard (2016) Nature 530：367-369（それらの開示は参照により本明細書に援用される）に記載されている。したがって、任意の適切なテンプレート化技術を使用し得、この技術としては、David Liu教授およびその共同研究者（Harvard University、米国）によって記載され、後にEnsemble Discovery（Cambridge、MA、米国）によって商品化されているＤＮＡテンプレート化合成（ＤＴＳ）に基づくものが挙げられる。ここでは、化学反応は、ワトソン・クリック塩基対合を介してＤＮＡ結合試薬を近接させることによって促進される。
【０１３２】
Pehr Harbury教授とその共同研究者（Stanford University、米国）によって開発されたＤＮＡルーティングアプローチ、およびVipergen（コペンハーゲン、デンマーク）によって開発されたYoctoReactorシステムも適している。後者のアプローチでは、三方ＤＮＡヘアピンループ接合が、コアアクセプター部位上に適当なドナー化学的部分を転移させることによって、ライブラリ合成を補助する（ＷＯ２００６／０４８０２５を参照のこと。この開示は参照により本明細書に援用される）。代替の構造配置もまた利用可能であり、例えば、四方ＤＮＡホリデイジャンクションおよび六方晶構造（Lundberg et al. (2008) Nucleic acids symposium (52)：683-684に記載のような）、およびRothemund (2006) Nature 440：297-302によって概説される「スキャフォールドＤＮＡ折り紙」技術によって作出された複雑な形状およびパターンがある。
【０１３３】
近接トリガー反応は、例えば、クリックケミストリー（本明細書で定義されるような）の使用により促進され得る。
【０１３４】
（タグ配列決定）
任意の適切な配列決定技術を使用することができ、これは、サンガー配列決定を含むが、次世代配列決定（ＮＧＳ）と呼ばれる配列決定の方法およびプラットフォーム（ハイスループット配列決定としても知られる）が好ましい。本発明の方法に使用するのに適した多くの市販のＮＧＳ配列決定プラットフォームがある。合成による配列決定（ＳＢＳ）ベースの配列決定プラットフォームが特に適している。IlluminaTMシステム（数百万の比較的短い配列読み取り（５４、７５または１００ｂｐ）を生じる）が特に好ましい。
【０１３５】
他の適切な技術は、IlluminaTMにより販売されているものを含む、可逆的ダイターミネーターに基づく方法を含む。ここでは、ＤＮＡ分子が最初にスライド上のプライマーに付着され、そして局所クローンコロニーが形成されるように増幅される（ブリッジ増幅）。４種類のｄｄＮＴＰが添加され、そして取り込まれなかったヌクレオチドが洗い流される。パイロシーケンシングとは異なり、ＤＮＡは一度に１ヌクレオチドのみ伸長され得る。カメラが蛍光標識されたヌクレオチドの画像を撮り、次いで末端の３’ブロッカーと共に染料をＤＮＡから化学的に除去し、次のサイクルを可能にする。
【０１３６】
短い配列読み取りが可能な他のシステムには、SOLiDTMおよびIon Torrent技術（どちらも Thermo Fisher Scientific Corporationによって販売されている）が含まれる。SOLiDTM技術はライゲーションによる配列決定を採用している。ここでは、固定長の全ての可能なオリゴヌクレオチドのプールが、配列決定された位置に従って標識される。オリゴヌクレオチドはアニールされそしてライゲートされる。配列を一致させるためのＤＮＡリガーゼによる優先的ライゲーションは、その位置でヌクレオチドの情報となるシグナルをもたらす。配列決定の前に、ＤＮＡはエマルジョンＰＣＲによって増幅される。得られたビーズは、それぞれ同じＤＮＡ分子のコピーのみを含み、ガラススライド上に置かれる。その結果、Illuminaのシーケンシングに匹敵する量と長さの配列が得られる。
【０１３７】
Ion Torrent Systems Inc.は、標準的な配列決定化学を使用することを基本としたシステムを開発したが、新しい半導体ベースの検出システムを伴う。この配列決定方法は、他の配列決定システムで使用されている光学的方法とは対照的に、ＤＮＡの重合中に放出される水素イオンの検出に基づいている。配列決定されるべきテンプレートＤＮＡ鎖を含むマイクロウェルは、単一の種類のヌクレオチドであふれている。導入されたヌクレオチドが主要なテンプレートヌクレオチドと相補的である場合、それは成長している相補鎖に組み込まれる。これは水素イオンの放出を引き起こし、それが過敏性イオンセンサーを誘発し、それは反応が起こったことを示す。ホモポリマー反復がテンプレート配列に存在する場合、複数のヌクレオチドが単一のサイクルに組み込まれる。これは、対応する数の放出される水素および比例して高くなる電子信号をもたらす。
【０１３８】
核酸または他の高分子がナノスケールの細孔を通過し、特定のイオン電流の変化または電気信号が生じる場合、Oxford Nanopore Technologiesによって使用されるもののような方法または類似の方法がそれを同定するために用いられる。例えば、オリゴヌクレオチドの個々の塩基は、連続した塩基がオリゴヌクレオチドの一部としてまたは連続した切断工程後に単一のヌクレオチドとしてイオン孔を通過するかが同定され得る。
【０１３９】
（切断可能なリンカー）
以下の条件で、任意の切断可能なリンカーが、化学構造およびそのコード化タグを連結するために使用され得る：（ａ）その連結は、タグのコード情報を無傷のままとするように破壊されることができ、かつ（ｂ）コード化された化学構造は、スクリーンにおけるその活性がリンカー切断後に残る「痕」によって損なわれないように、それが完全にまたは実質的にリンカー残基を含まない形態で放出される。−ＯＨおよび／または−ＳＨ基のようないくつかのリンカー「痕」は許容され得ることが理解される。切断の方法は、アッセイシステムと適合性があることが好ましい。
【０１４０】
広範囲の適切な切断可能なリンカーが当業者に知られており、そして適切な例は、Leriche et al. (2012) Bioorganic & Medicinal Chemistry 20 (2)：571-582によって記載されている。したがって適切なリンカーは以下を含む：酵素的に切断可能なリンカー；求核性／塩基感受性リンカー；還元感受性リンカー；光切断可能なリンカー；求電子性／酸感受性リンカー；金属補助切断感受性リンカー；酸化感受性リンカー；および前出の２つまたはそれ以上の組合せから選択されるリンカー。
【０１４１】
酵素切断可能なリンカーは、例えば、以下に記載されている：ＷＯ２０１７／０８９８９４；ＷＯ２０１６／１４６６３８；ＵＳ２０１０２７３８４３；ＷＯ２００５／１１２９１９；ＷＯ２０１７／０８９８９４；de Groot et al. (1999) J. Med. Chem. 42：5277；de Groot et al. (2000) J Org. Chem. 43：3093 (2000)；de Groot et al., (2001) J Med. Chem. 66：8815；ＷＯ０２／０８３１８０；Carl et al. (1981) J Med. Chem. Lett. 24：479；Studer et al. (1992) Bioconjugate Chem. 3 (5)：424-429；Carl et al. (1981) J. Med. Chem. 24 (5)：479-480およびDubowchik et al. (1998) Bioorg & Med. Chern. Lett. 8：3347。これらは、以下から選択される酵素によって切断可能なリンカーを含む：β−グルクロニダーゼ、リソソーム酵素、ＴＥＶ、トリプシン、トロンビン、カテプシンＢ、ＢおよびＫ、カスパーゼ、マトリックスメタロプロテイナーゼ配列、リン酸ジエステル、リン脂質、エステルおよびβ−ガラクトース。求核性／塩基感受性リンカーは、以下を含む：ジアルキルジアルコキシシラン、シアノエチル基、スルホン、エチレングリコールジスクシネート、２−Ｎ−アクリルニトロベンゼンスルホンアミド、α−チオフェニルエステル、不飽和ビニルスルフィド、スルホンアミド、マロンジアルデヒドインドール誘導体、レブリノイルエステル、ヒドラジン、アシルヒドラゾン、アルキルチオエステル。還元切断可能リンカーは、以下を含む：ジスルフィド架橋およびアゾ化合物。放射線切断可能リンカーは、以下を含む：２−ニトロベンジル誘導体、フェナシルエステル、８−キノリニルベンゼンスルホネート、クマリン、ホスホトリエステル、ビス−アリールヒドラゾン、ビマンビチオプロピオン酸誘導体。求電子性／酸切断可能リンカーは、以下を含む：パラメトキシベンジル誘導体、tert-ブチルカルバメートアナログ、ジアルキルまたはジアリールジアルコキシシラン、オルトエステル、アセタール、アコニチル、ヒドラジン、β−チオプロピオネート、ホスホロアミダイト、イミン、トリチル、ビニルエーテル、ポリケタール、アルキル２−（ジフェニルホスフィノ）安息香酸誘導体。有機金属／金属触媒切断可能リンカーは、以下を含む：アリルエステル、８−ヒドロキシキノリンエステルおよびピコリン酸エステル。酸化により切断可能なリンカーは、以下を含む：ビシナルジオールおよびセレン化合物。
【０１４２】
特定の実施形態において、切断可能なリンカーは、共有結合および非共有結合（例えば、核酸ハイブリダイゼーションから生じる水素結合）の組み合わせを含む。
【０１４３】
切断可能な（例えば、酵素で切断可能な）ペプチドリンカーは、１アミノ酸、またはアミノ酸のジペプチドもしくはトリペプチド配列からなるペプチド部分を含み得る。アミノ酸は、天然および非天然アミノ酸から選択され得、そして各場合において、側鎖の炭素原子がＤまたはＬ（ＲまたはＳ）のいずれかの配置であり得る。例示的なアミノ酸は、以下を含む：アラニン、２−アミノ−２−シクロヘキシル酢酸、２−アミノ−２−フェニル酢酸、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、γ−アミノ酪酸、β，β−ジメチルγ−アミノ酪酸、α，α−ジメチルγ−アミノ酪酸、オルニチン、およびシトルリン（Ｃｉｔ）。適当なアミノ酸はまた、側鎖の反応性官能基が保護されている上記アミノ酸の保護形態を含む。そのような保護アミノ酸は、アセチル、ホルミル、トリフェニルメチル（トリチル）、およびモノメトキシトリチル（ＭＭＴ）で保護されたリジンを含む。他の保護されたアミノ酸ユニットは、トシルまたはニトロ基で保護されたアルギニンおよびアセチルまたはホルミル基で保護されたオルニチンを含む。
【０１４４】
（自己犠牲リンカー）
本発明における切断可能なリンカーとしての使用に特に適しているのは、以下を含む自己犠牲リンカーである：（ａ）切断部分;および（ｂ）自己犠牲部分（「ＳＩＭ」）。
【０１４５】
そのようなリンカーは、図８（遊離化学構造を放出させる切断後のＳＩＭの自発的除去を示す）に模式的に示されるように使用され得る。
【０１４６】
以下を含む自己犠牲リンカーが、特に適している：（ａ）酵素的切断部分；および（ｂ）ＳＩＭ。そのような実施形態では、酵素的切断部分は、（プロテアーゼによる切断可能な）ペプチド配列または非ペプチドの酵素的に切断可能な基であり得、例えば、β−グルクロニダーゼにより切断可能な親水性糖基を取り込むグルクロニド部分（McCombs and Owen (2015) Antibody Drug Conjugates：Design and Selection of Linker, Payload and Conjugation Chemistry The AAPS Journal 17(2)：339-351に説明するような）であり、以下に示す：
【０１４７】
【化１】
2020503846.tif 000002
【０１４８】
適切なβ−グルクロニド系リンカーは、ＷＯ２００７／０１１９６８、ＵＳ２０１７０１８９５４２およびＷＯ２０１７／０８９８９４（その内容は参照により本明細書に援用される）に記載されている。したがって、そのようなリンカーは、以下の式を有し得る：
【０１４９】
【化２】
2020503846.tif 000003
【０１５０】
（式中、Ｒ３は水素またはカルボキシル保護基であり、各Ｒ４は独立して水素またはヒドロキシル保護基である）。
【０１５１】
本発明における使用のための自己犠牲リンカーのＳＩＭは、以下から選択され得る：置換アルキル、非置換アルキル、置換ヘテロアルキル、非置換ヘテロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、置換および非置換のアリールまたは置換および非置換のヘテロアリール。したがって適切なＳＩＭは、ｐ−アミノベンジルアルコール（ＰＡＢ）ユニットおよびＰＡＢ基と電子的に類似している芳香族化合物（例えば、Hay et al. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9：2237によって記載されている２−アミノイミダゾール−５−メタノール誘導体）およびオルト−またはパラ−アミノベンジルアセタールを含む。
【０１５２】
他の適切なＳＩＭは、アミド結合加水分解の際に環化を受けるもの、例えばRodrigues et al. (1995) Chemistry Biology 2：223によって記載されている置換および非置換の４−アミノ酪酸アミドである。さらに他の適切なＳＩＭは、適切に置換されたビシクロ［２．２．１］およびビシクロ［２．２．２］環系（Storm et al. (1972) J. Amer. Chem. Soc. 94：5815によって記載されているような）および種々の２−アミノフェニルプロピオン酸アミド（例えば、Amsberry et al. (1990) J. Org. Chem. 55：5867を参照のこと）を含む。
【０１５３】
切断部分としてペプチドを含む自己犠牲ペプチドリンカーが、特に適している。図９および図１０は、そのようなリンカーを用いたコード化化学ライブラリの構築および使用を示す。ここで、切断可能なペプチドは、ジペプチドのバリン−シトルリンであり、そしてＳＩＭは、ｐ−アミノベンジルアルコール（ＰＡＢ）である。そのような実施形態では、アミド結合ＰＡＢの酵素切断は、二酸化炭素の１，６−脱離および遊離化学構造の同時放出を引き起こす。図９にまた示されるように、コード化タグおよび化学構造（１つまたは複数）はビーズを介して連結され得、そして単一のビーズに複数（ｎ＞１）の化学構造を装填することができる（例えば、コード化タグ（１つまたは複数）と連結される化学構造との比が、１：１０〜１：１０００である）。そのような実施形態では、ペプチドリンカーが比較的小さいサイズであることによって拡散速度の向上およびより高いビーズへの装填が可能となり、化学構造は官能基化のために単一のアミンを必要とするのみである。
【０１５４】
本発明の自己犠牲リンカーとして使用するのに適した切断部分およびＳＩＭの非限定的な例は、例えば、以下に記載されている：ＷＯ２０１７／０８９８９４；ＷＯ２０１６／１４６６３８；ＵＳ２０１０２７３８４３；ＷＯ２００５／１１２９１９；ＷＯ２０１７／０８９８９４；de Groot et al. (1999) J. Med. Chem. 42：5277；de Groot et al. (2000) J Org. Chem. 43：3093 (2000)；de Groot et al., (2001) J Med. Chem. 66：8815；ＷＯ０２／０８３１８０；Carl et al. (1981) J Med. Chem. Lett. 24：479；Studer et al. (1992) Bioconjugate Chem. 3 (5)：424-429；Carl et al. (1981) J. Med. Chem. 24 (5)：479-480およびDubowchik et al. (1998) Bioorg & Med. Chern. Lett. 8：3347（その内容は参照により本明細書に援用される）。
【０１５５】
（微粒子）
微粒子は、固体またはゲルから形成され得る。適切なゲルとしては、ポリマーゲル、例えば、ポリサッカライドまたはポリペプチドゲル（これらは、例えば、加熱、冷却またはｐＨ調整によって液体からゲルに固化することができる）が挙げられる。適切なゲルとしては、ヒドロゲルが挙げられ、これはアルギン酸塩、ゼラチンおよびアガロースゲルを含む。他の適切な微粒子材料としては、シリコン、ガラス、金属およびセラミックのような無機材料が挙げられる。他の適切な材料としては、以下が挙げられる：プラスチック（例えば、ポリ（塩化ビニル、シクロオレフィンコポリマー、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ナイロンおよびポリビニルブチレート）。
【０１５６】
（標的細胞）
本発明のアッセイシステムは標的細胞を含み得る。任意の適切な標的細胞が使用され得、原核細胞および真核細胞を含む。
【０１５７】
例えば、標的細胞は古細菌であり得、例えば（ａ）クレン古細菌（Crenarchaeota）；（ｂ）ユーリ古細菌（Euryarchaeota）；（ｃ）コル古細菌（Korarchaeota）；（ｄ）ナノ古細菌（Nanoarchaeota）および（ｅ）タウム古細菌（Thaumarchaeota）の門から選択され、例えばハロフェラックス・ウォルカニイ（Haloferax volcanii）またはスルフォロブス属種（Sulfolobus spp.）である。
【０１５８】
他の実施形態では、標的細胞は細菌、例えば病原性細菌であり得る。このような場合において、細菌は、グラム陽性細菌（例えば、エンテロコッカス・フェカーリス（Enterococcus faecalis）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）およびスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）から選択される）、グラム陰性細菌（例えば、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）、アシネトバクター・バウマニ（Acinetobacter baumanii）およびエシェリキア・コリ（Escherichia coli）、エシェリキア・コリST131株（E. coli ST131 strains）、シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、エンテロバクター・クロアカ（Enterobacter cloacae）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）およびナイセリア・ゴノレア（Neisseria gonorrhoeae）から選択される）、または不確定なグラム反応を示す細菌であり得る。
【０１５９】
他の実施形態では、標的細胞は、真核細胞であり得、例えば、以下から選択される：（ａ）真菌細胞；（ｂ）哺乳類細胞；（ｃ）高等植物細胞；（ｄ）原虫細胞；（ｅ）蠕虫細胞；（ｆ）藻類細胞；または（ｈ）無脊椎動物細胞。そのような実施形態では、標的細胞は、癌細胞、例えば、ヒト癌細胞、筋細胞、ヒト神経細胞および疾患関連表現型を示す生きているヒト患者に由来する他の細胞であり得る。
【０１６０】
細胞が真核細胞（例えば、ヒト細胞）である場合、細胞は、以下から選択され得る：全能性細胞、多能性細胞、人工多能性細胞、多分化能細胞、オリゴ能細胞、幹細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、体細胞、生殖細胞系細胞、最終分化型細胞、非分裂（有糸分裂後）細胞、有糸分裂細胞、初代細胞、細胞株由来細胞および腫瘍細胞。
【０１６１】
細胞は、好ましくは、単離されており（すなわち、その天然の細胞／組織環境に存在していない）、かつ／または代謝的に活性である（例えば、細胞生存率および／または活性を維持するかつ／または細胞成長または増殖を支持するための培養培地または輸送培地とともにアッセイシステムに存在している）。
【０１６２】
適切な真核細胞は、生物から単離され得、例えば、以下から選択される生物における：後生動物、真菌（例えば、酵母）、哺乳動物、非哺乳動物、植物、原生動物、蠕虫、藻類、昆虫（例えば、ハエ）、魚（例えば、ゼブラフィッシュ）、両生類（例えばカエル）、鳥類、無脊椎動物および脊椎動物。
【０１６３】
適切な真核細胞はまた、以下から選択される非ヒト動物から単離され得る：哺乳動物、げっ歯類、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ラット、マウス、非ヒト霊長類およびハムスター。他の実施形態では、細胞は、非ヒト疾患モデル、または異種遺伝子（例えば治療産物をコードする異種遺伝子）を発現するトランスジェニック非ヒト動物から単離され得る。
【０１６４】
（標的細胞としての細菌）
本発明に従って使用するための標的細胞は、細菌細胞であり得る。そのような実施形態では、細菌は、以下から選択され得る：（ａ）グラム陽性細菌、グラム陰性細菌および／またはグラム可変細菌；（ｂ）芽胞形成細菌；（ｃ）非芽胞形成細菌；（ｄ）糸状菌；（ｅ）細胞内細菌；（ｆ）偏性好気性菌；（ｇ）偏性嫌気性菌；（ｈ）通性嫌気性菌；（ｉ）微好気性細菌および／または（ｆ）日和見性細菌性病原体。
【０１６５】
特定の実施形態では、本発明による使用のための標的細胞は、以下の属の細菌から選択され得る：アシネトバクター属（Acinetobacter）（例えば、アシネトバクター・バウマニ（A. baumannii）)；エロモナス属（Aeromonas）（例えば、エロモナス・ハイドロフィラ（A. hydrophila）)；バチルス属（Bacillus）（例えば、バチルス・アントラシス（B. anthracis）)；バクテロイデス属（Bacteroides）（例えば、バクテロイデス・フラギリス（B. fragilis）)；ボルデテラ属（Bordetella）（例えば、ボルデテラ・パーツシス（B. pertussis）)；ボレリア属（Borrelia）（例えば、ボレリア・ブルグドルフェリ（B. burgdorferi））；ブルセラ属（Brucella）（例えば、ブルセラ・アボルツス（B. abortus）、ブルセラ・カニス（B. canis）、ブルセラ・メリテンシス（B. melitensis）およびブルセラ・スイス（B. suis））；バークホルデリア属（Burkholderia）（例えば、バークホルデリア・セパシア・コンプレックス（B. cepacia complex））；カンピロバクター属（Campylobacter）（例えば、カンピロバクター・ジェジュニ（C. jejuni））；クラミジア属（Chlamydia）（例えば、クラミジア・トラコマチス（C. trachomatis）、クラミジア・スイス（C. suis）およびクラミジア・ムリダルム（C. muridarum））；クラミドフィラ属（Chlamydophila）（例えば、（例えば、クラミドフィラ・ニューモニエ（C. pneumoniae）、クラミドフィラ・ペコルム（C. pecorum）、クラミドフィラ・シッタシ（C. psittaci）、クラミドフィラ・アボルタス（C. abortus）、クラミドフィラ・フェリス（C. felis）およびクラミドフィラ・カビエ（C. caviae））；シトロバクター属（Citrobacter）（例えば、シトロバクター・フレンディ（C. freundii））；クロストリジウム属（Clostridium）（例えば、クロストリジウム・ボツリヌム（C. botulinum）、クロストリジウム・デフィシル（C. difficile）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（C. perfringens）およびクロストリジウム・テタニ（C. tetani））；コリネバクテリウム属（Corynebacterium）（例えば、コリネバクテリウム・ジフテリア（C. diphteriae）およびコリネバクテリウム・グルタミカム（C. glutamicum））；エンテロバクター属（Enterobacter）（例えば、エンテロバクター・クロアカ（E. cloacae）およびエンテロバクター・アエロゲネス（E. aerogenes））；エンテロコッカス属（Enterococcus）（例えば、エンテロコッカス・フェカーリス（E. faecalis）およびエンテロコッカス・フェシウム（E. faecium））；エシェリキア属（Escherichia）（例えば、エシェリキア・コリ（E. coli））；フラボバクテリウム属（Flavobacterium）；フランシセラ属（Francisella）（例えば、フランシセラ・ツラレンシス（F. tularensis））；フソバクテリウム属（Fusobacterium）（例えば、フソバクテリウム・ネクロフォルム（F. necrophorum））；ヘモフィルス属（Haemophilus）（例えば、ヘモフィルス・ソムナス（H. somnus）、ヘモフィルス・インフルエンザ（H. influenzae）およびヘモフィルス・パラインフルエンザ（H. parainfluenzae））；ヘリコバクター属（Helicobacter）（例えば、ヘリコバクター・ピロリ（H. pylori））；クレブシエラ属（Klebsiella）（例えば、クレブシエラ・オキシトカ（K. oxytoca）およびクレブシエラ・ニューモニエ（K. pneumoniae）)、レジオネラ属（Legionella）（例えば、レジオネラ・ニューモフィラ（L. pneumophila））；レプトスピラ属（Leptospira）（例えば、レプトスピラ・インテロガンス（L. interrogans））；リステリア属（Listeria）（例えば、リステリア・モノサイトゲネス（L. monocytogenes））；モラクセラ属（Moraxella）（例えば、モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis））；モルガネラ属（Morganella）（例えば、モルガネラ・モルガニイ（M. morganii））；マイコバクテリウム属（Mycobacterium）（例えば、マイコバクテリウム・レプラエ（M. leprae）およびマイコバクテリウム・ツベルクロシス（M. tuberculosis））；マイコプラズマ属（Mycoplasma）（例えば、マイコプラズマ・ニューモニエ（M. pneumoniae））；ナイセリア属（Neisseria）（例えば、ナイセリア・ゴノレア（N. gonorrhoeae）およびナイセリア・メニンジティディス（N. meningitidis））；パスツレラ属（Pasteurella）（例えば、パスツレラ・ムトルシダ（P. multocida））；ペプトストレプトコッカス属（Peptostreptococcus）；プレボテーラ属（Prevotella）；プロテウス属（Proteus）(例えば、プロテウス・ミラビリス（P. mirabilis）およびプロテウス・ブルガリス（P. vulgaris）)、シュードモナス属（Pseudomonas）（例えば、シュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa））；リケッチア属（Rickettsia）（例えば、リケッチア・リケッチ（R. rickettsii））；サルモネラ属（Salmonella）（例えば、血清型チフス菌および非チフス型（serotypes . TyphiおよびTyphimurium））；セラチア属（Serratia）（例えば、セラチア・マルセッセンス（S. marcesens））；シゲラ属（Shigella）（例えば、シゲラ・フレクスナリア（S. flexnaria）、シゲラ・ディセンテリエ（S. dysenteriae）およびシゲラ・ソンネ（S. sonnei））；スタフィロコッカス属（Staphylococcus）（例えば、スタフィロコッカス・アウレウス（S. aureus）、スタフィロコッカス・ヘモリティカス（S. haemolyticus）、スタフィロコッカス・インターメディウス（S. intermedius）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（S. epidermidis）およびスタフィロコッカス・サプロフィティカス（S. saprophyticus））；ステノトロホモナス属（Stenotrophomonas）（例えば、ステノトロホモナス・マルトフィリア（S.maltophila））；ストレプトコッカス属（Streptococcus）（例えば、ストレプトコッカス・アガラクティエ（S. agalactiae）、ストレプトコッカス・ミュータンス（S. mutans）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（S. pneumoniae）およびストレプトコッカス・ピオゲネス（S. pyogenes）；トレポネーマ属（Treponema）（例えば、トレポネーマ・パリドム（T. pallidum）；ビブリオ属（Vibrio）（例えば、ビブリオ・コレラ（V. cholerae））ならびにエルシニア属（Yersinia）（例えば、エルシニア・ペスティス（Y. pestis）)。
【０１６６】
本発明に従って使用するための標的細胞は、高Ｇ＋Ｃグラム陽性細菌から、および低Ｇ＋Ｃグラム陽性細菌から選択することができる。
【０１６７】
（標的細胞としての病原菌）
ヒトまたは動物の細菌性病原体としては、以下のような細菌が挙げられる：レジオネラ属種（Legionella spp.）、リステリア属種（Listeria spp.）、シュードモナス属種（Pseudomonas spp.）、サルモネラ属種（Salmonella spp.）、クレブシエラ属種（Klebsiella spp.）、ハフニア属種（Hafnia spp）、ヘモフィルス属種（Haemophilus spp.）、プロテウス属種（Proteus spp.）、セラチア属種（Serratia spp.）、シゲラ属種（Shigella spp.）、ビブリオ属種（Vibrio spp.）、バチルス属種（Bacillus spp.）、カンピロバクター属種（Campylobacter spp.）、エルシニア属種（Yersinia spp.）、クロストリジウム属種（Clostridium spp.）、エンテロコッカス属種（Enterococcus spp.）、ナイセリア属種（Neisseria spp.）、ストレプトコッカス属種（Streptococcus spp.）、スタフィロコッカス属種（Staphylococcus spp.）、マイコバクテリウム属種（Mycobacterium spp.）、エンテロバクター属種（Enterobacter spp.）。
【０１６８】
（標的細胞としての真菌）
本発明に従って使用するための標的細胞は真菌細胞であり得る。これらとしては、酵母（例えば、カンジダ（Candida）種（カンジダ・アルビカンス（C. albicans）、カンジダ・クルセイ（C krusei）およびカンジダ・トロピカリス（C tropicalis）を含む）、ならびに糸状菌（アスペルギルス属種（Aspergillus spp.）およびペニシリウム属種（Penicillium spp.）など）、および皮膚糸状菌（白癬菌属種（Trichophyton spp.）など）が挙げられる。
【０１６９】
（標的細胞としての植物病原体）
本発明に従って使用するための標的細胞は、植物病原体であり得、例えば、シュードモナス属種（Pseudomonas spp.）、キシレラ属種（Xylella spp.）、ラルストニア属種（Ralstonia spp.）、キサントモナス属種（Xanthomonas spp.）、エルウィニア属種（Erwinia spp.）、フザリウム属種（Fusarium spp.）、フィトフトラ属種（Phytophthora spp.）、ボトリチス属種（Botrytis spp.）、レプトスフェリア属種（Leptosphaeria spp.）、うどんこ病（子嚢菌門（Ascomycota））および錆（担子菌門（Basidiomycota））。
【０１７０】
（標的としての癌細胞）
癌細胞を標的細胞として使用することができる。そのような細胞は、細胞株または原発腫瘍に由来し得る。癌細胞は哺乳動物であり得、そして好ましくはヒトである。特定の実施形態では、癌細胞は、黒色腫、肺、腎臓、結腸、前立腺、卵巣、乳房、中枢神経系および白血病細胞株からなる群より選択される。
【０１７１】
適切な癌細胞株としては、限定されないが、以下が挙げられる：卵巣癌細胞株（例えば、ＣａＯＶ−３、ＯＶＣＡＲ−３、ＥＳ−２、ＳＫ−ＯＶ−３、ＳＷ６２６、ＴＯＶ−２１Ｇ、ＴＯＶ−１１２Ｄ、ＯＶ−９０、ＭＤＡ−Ｈ２７７４およびＰＡ−１）；乳癌細胞株（例えば、ＭＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１、ＭＤＡ−ＭＤ−４５３、ＢＴ−４７４、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＣＣ１００８、ＨＣＣ１９５４、ＨＣＣ３８、ＨＣＣ１１４３、ＨＣＣ１１８７、ＨＣＣ１３９５、ＨＣＣ１５９９、ＨＣＣ１９３７、ＨＣＣ２２１８、Ｈｓ５７４．Ｔ、Ｈｓ７４２．Ｔ、Ｈｓ６０５．ＴおよびＨｓ６０６）；肺癌細胞株（例えば、ＮＣＩ−Ｈ２１２６、ＮＣＩ−Ｈ１３９５、ＮＣＩ−Ｈ１４３７、ＮＣＩ−Ｈ２００９、ＮＣＩ−Ｈ１６７２、ＮＣＩ−Ｈ２１７１、ＮＣＩ−Ｈ２１９５、ＮＣＩ−ＨＩ  １８４、ＮＣＩ−Ｈ２０９、ＮＣＩ−Ｈ２１０７およびＮＣＩ−Ｈ１２８）；皮膚癌細胞株（例えば、ＣＯＬＯ８２９、ＴＥ３５４．Ｔ、Ｈｓ９２５．Ｔ、ＷＭ−１１５およびＨｓ６８８（Ａ）．Ｔ）；骨癌細胞株（例えば、Ｈｓ９１９．Ｔ、Ｈｓ８２１．Ｔ、Ｈｓ８２０．Ｔ、Ｈｓ７０４．Ｔ、Ｈｓ７０７（Ａ）．Ｔ、Ｈｓ７３５．Ｔ、Ｈｓ８６０．Ｔ、Ｈｓ８８８．Ｔ、Ｈｓ８８９．Ｔ、Ｈｓ８９０．ＴおよびＨｓ７０９．Ｔ）；結腸癌細胞株（例えば、Ｃａｃｏ−２、ＤＬＤ−１、ＨＣＴ−１１６、ＨＴ−２９およびＳＷ４８０）；および胃癌細胞株（例えばＲＦ−Ｉ）。本発明の方法において有用な癌細胞株は、任意の便利な供給源（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）および国立がん研究所を含む）から得られ得る。
【０１７２】
他の癌細胞株としては、新生細胞／新生物に罹患している被験体に由来するものが挙げられ、増殖性障害、良性、前癌および悪性新生物、過形成、化生、および異形成を含む。増殖性障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：癌、癌転移、平滑筋細胞増殖、全身性硬化症、肝硬変、成人呼吸窮迫症候群、特発性心筋症、紅斑性狼瘡、網膜症（例えば糖尿病性網膜症）、心臓過形成、良性前立腺肥大症、卵巣嚢胞、肺線維症、子宮内膜症、線維腫症、腺腫、リンパ管腫症、サルコイドーシスおよびデスモイド腫瘍。平滑筋細胞増殖を伴う新生物は、血管系における細胞の過剰増殖（例えば、内膜平滑筋細胞過形成、再狭窄および血管閉塞（特に生物学的または機械的に媒介された血管損傷（例えば、血管形成術）後の狭窄を含む））を含む。さらに、内膜平滑筋細胞過形成は、血管系以外の平滑筋における過形成（例えば、胆管、気管支気道の閉塞、および腎間質性線維症患者の腎臓における過形成）を含み得る。非癌性増殖性障害としては、皮膚中の細胞の過剰増殖（乾癬およびその多様な臨床形態など）、ライター症候群、毛孔性紅色粃糠疹、ならびに角化障害の過増殖性変形（日光角化症、老人性角化症および強皮症を含む）も挙げられる。
【０１７３】
（標的としての細胞株）
細胞株に由来する他の細胞が、標的細胞として使用され得る。そのような細胞（好ましくは、ヒトまたは哺乳動物であり得る）は、検出可能な細胞表現型を有する希少疾患に罹患している患者からのものを含む。細胞は任意の種類のものであり得、血球、免疫細胞、骨髄細胞、皮膚細胞、神経組織および筋肉細胞を含むがこれらに限定されない。
【０１７４】
本発明の方法において有用な細胞株は、任意の便利な供給源（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）と国立がん研究所を含む）から得られ得る。
【０１７５】
細胞／細胞株は、例えば、リソソーム蓄積症、筋ジストロフィー、嚢胞性線維症、マルファン症候群、鎌状赤血球貧血、小人症、フェニルケトン尿症、神経線維腫症、ハンチントン病、骨形成不全症、サラセミアおよびヘモクロマトーシスに罹患している被験体に由来し得る。
【０１７６】
細胞／細胞株は、例えば、他の疾患に罹患している被験体に由来し得、このような疾患として、以下の疾患および障害が挙げられる：血液、凝固、細胞増殖および調節不全、新生物（癌を含む）、炎症過程、免疫系（自己免疫疾患を含む）、代謝、肝臓、腎臓、筋骨格系、神経系、神経および眼の組織。例示的な血液および凝固疾患および障害としては、以下が挙げられる：貧血、裸リンパ球症候群、出血性障害、Ｈ因子欠乏症、Ｈ因子様１因子、Ｖ因子、ＶＩＩＩ因子、ＶＩＩ因子、Ｘ因子、ＸＩ因子、ＸＩＩ因子、ＸＩＩＩＡ因子、ＸＩＩＩＢ因子、ファンコニ貧血、血球貪食性リンパ組織球増加症、血友病Ａ、血友病Ｂ、出血性障害、白血球欠乏症、鎌状赤血球貧血およびサラセミア。
【０１７７】
免疫関連疾患および障害の例としては、以下が挙げられる：ＡＩＤＳ；自己免疫性リンパ増殖性症候群；複合免疫不全；ＨＩＶ−１；ＨＩＶの感受性または感染；免疫不全および重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）。本発明に従って治療することができる自己免疫疾患としては、以下が挙げられる：グレーブ病、慢性関節リウマチ、橋本甲状腺炎、尋常性白斑、Ｉ型（早期発症）糖尿病、悪性貧血、多発性硬化症、糸球体腎炎、全身性狼瘡Ｅ（ＳＬＥ、狼瘡）およびシェーグレン症候群。他の自己免疫疾患としては、以下が挙げられる：強皮症、乾癬、強直性脊椎炎、重症筋無力症、天疱瘡、多発性筋炎、皮膚炎、ブドウ膜炎、ギランバレー症候群、クローン病および潰瘍性大腸炎（しばしばまとめて炎症性腸疾患（ＩＢＤ）と呼ばれる）。
【０１７８】
他の例示的な疾患としては、以下が挙げられる：アミロイドニュロパチー；アミロイドーシス；嚢胞性線維症；リソソーム蓄積症；肝腺腫；肝不全；神経障害；肝リパーゼ欠乏症；肝芽腫、癌または癌腫；骨髄嚢胞性腎臓病；フェニルケトン尿症；多嚢胞腎；または肝疾患。
【０１７９】
例示的な筋骨格系疾患および障害としては、以下が挙げられる：筋ジストロフィー（例えば、デュシェンヌおよびベッカー筋ジストロフィー）、骨粗鬆症および筋萎縮症。
【０１８０】
例示的な神経系および神経の疾患および障害としては、以下が挙げられる：ＡＬＳ、アルツハイマー病；自閉症；脆弱Ｘ症候群、ハンチントン病、パーキンソン病、統合失調症、セクレターゼ関連障害、トリヌクレオチドリピート障害、ケネディ病、フリードリヒ失調症、マカド・ジョセフ病、脊髄小脳失調症、筋緊張性ジストロフィーおよび歯状尿管淡蒼球萎縮症（ＤＲＰＬＡ）。
【０１８１】
例示的な眼疾患としては、以下が挙げられる：加齢黄斑変性症、角膜混濁およびジストロフィー、先天性扁平角膜、緑内障、レーバー先天性黒内障および黄斑ジストロフィー。
【０１８２】
細胞／細胞株は、例えば、少なくとも部分的には、タンパク質恒常性の欠乏により仲介される疾患に罹患している被験体に由来し得、タンパク質恒常性の欠乏は、集合性のおよびミスフォールディングのタンパク質恒常性疾患を含み、特に神経変性疾患（例えばパーキンソン病、アルツハイマー病およびハンチントン病）、リソソーム蓄積症、糖尿病、肺気腫、癌および嚢胞性線維症を含む。
【０１８３】
（標的細胞としての古細菌）
標的細胞は、古細菌であり得、例えば、（ａ）クレン古細菌（Crenarchaeota）；（ｂ）ユーリ古細菌（Euryarchaeota）；（ｃ）コル古細菌（Korarchaeota）；（ｄ）ナノ古細菌（Nanoarchaeota）および（ｅ）タウム古細菌（Thaumarchaeota）の門から選択され、例えばハロフェラックス・ウォルカニイ（Haloferax volcanii）またはスルフォロブス属種（Sulfolobus spp.）である。
【０１８４】
典型的な古細菌属としては、以下が挙げられる：アキディアヌス属（Acidianus）、アキディロブス属（Acidilobus）、アキドコックス属（Acidococcus）、アキデュリプロファンダム属（Aciduliprofundum）、アエロピュルム属（Aeropyrum）、アルカエオグロブス属（Archaeoglobus）、バキロビリダエ属（Bacilloviridae）、カルディスパエラ属（Caldisphaera）、カルディビルガ属（Caldivirga）、カルドコックス属（Caldococus）、ケナルカエウム属（Cenarchaeum）、デスルフロコックス属（Desulfurococcus）、フェログロブス属（Ferroglobus）、フェロプラズマ属（Ferroplasma）、ゲオーゲンマ属（Geogemma）、ゲオグロブス属（Geoglobus）、ハルアダプタトゥス属（Haladaptaus）、ハルアルカリコックス属（Halalkalicoccus）、ハロアルカロピリウム属（Haloalcalophilium）、ハロアルクラ属（Haloarcula）、ハロバクテリウム属（Halobacterium）、ハロバクルム属（Halobaculum）、ハロビフォルマ属（Halobiforma）、ハロコックス属（Halococcus）、ハロフェラックス属（Haloferax）、ハロゲオメトリクム属（Halogeometricum）、ハロミクロビウム属（Halomicrobium）、ハロピゲル属（Halopiger）、ハロプラヌス属（Haloplanus）、ハロクアドラトゥム属（Haloquadratum）、ハロラブダス属（Halorhabdus）、ハロルブルム属（Halorubrum）、ハロサルキナ属（Halosarcina）、ハロシンプレクス属（Halosimplex）、ハロスタグニコラ属（Halostagnicola）、ハロテッリゲナ属（Haloterrigena）、ハロウィウァックス属（Halovivax）、ヒュペルテルムス属（Hyperthermus）、イグニコックス属（Ignicoccus）、イグニスパエラ属（Ignisphaera）、メタッロスパエラ属（Metallosphaera）、メタニミクロコックス属（Methanimicrococcus）、メタノバクテリウム属（Methanobacterium）、メタノブレヴィバクテル属（Methanobrevibacter）、メタノカルクルス属（Methanocalculus）、メタノカルドコックス属（Methantxaldococcus）、メタノケッラ属（Methanocella）、メタノコッコイデス属（Methanococcoides）、メタノコックス属（Methanococcus）、メタノコルプスクルム属（Methanocorpusculum）、メタノクッレウス属（Methanoculleus）、メタノフォッリス属（Methanofollis）、メタノゲニウム属（Methanogenium）、メタノハロビウム属（Methanohalobium）、メタノハロピルス属（Methanohalophilus）、メタノラキニア属（Methanolacinia）、メタノロブス属（Methanolobus）、メタノメチュロウォランス属（Methanomethylovorans）、メタノミクロビウム属（Methanomicrobium）、メタノプラナス属（Methanoplanus）、メタノピュルス属（Methanopyrus）、メタノレグラ属（Methanoregula）、メタノサエタ属（Methanosaeta）、メタノサルスム属（Methanosalsum）、メタノサルキナ属（Methanosarcina）、メタノスパエラ属（Methanosphaera）、メタノスピリルム属（Melthanospirillum）、メタノテルモバクター属（Methanothermobacter）、メタノテルモコックス属（Methanothermococcus）、メタノテルムス属（Methanothermus）、メタノトリクス属（Methanothrix）、メタノトッリス属（Methanotorris）、ナノアーケウム属（Nanoarchaeum）、ナトリアルバ属（Natrialba）、ナトリネマ属（Natrinema）、ナトロノバクテリウム属（Natronobacterium）、ナトロノコックス属（Natronococcus）、ナトロノリムノビウス属（Natronolimnobius）、ナトロノモナス属（Natronomonas）、ナトロノルブルム属（Natronorubrum）、ニトロソプミルス属（Nitracopumilus）、パレオコックス属（Palaeococcus）、ピクロフィルス属（Picrophilus）、ピュロバクルム属（Pyrobaculum）、ピュロコックス属（Pyrococcus）、ピュロディクティウム属（Pyrodictium）、ピュロロブス属（Pyrolobus）、スタピュロテルムス属（Staphylothermus）、ステッテリア属（Stetteria）、ステュギオロブス属（Stygiolobus）、スルフォロブス属（Sulfolobus）、スルフォポボコックス属（Sulfophobococcus）、スルフリスパエラ属（Sulfurisphaera）、テルモクラディウム属（Thermocladium）、テルモコックス属（Thermococcus）、テルモディスクス属（Thermodiscus）、テルモフィルム属（Thermofilum）、テルモプラズマ属（Thermoplasma）、テルモプロテウス属（Thermoproteus）、テルモスパエラ属（Thermosphaera）およびウァルカニサエタ属（Vulcanisaeta）。
【０１８５】
典型的な古細菌種としては、以下が挙げられる：アエロピュルム・ペルニクス（Aeropyrum pernix）、アルカエオグロブス・フルギドゥス（Archaeglobus fulgidus）、アルカエオグロブス・フルギドゥス（Archaeoglobus fulgidus）、デスルフロコックス属種ＴＯＫ（Desulforcoccus species TOK）、メタノバクテリウム・テルモオートロピクム（Methanobacterium thermoantorophicum）、メタノコックス・ヤンナスキイ（Methanococcus jannaschii）、ピュロバクルム・アエロフィルム（Pyrobaculum aerophilum）、ピュロバクルム・カリディフォンティス（Pyrobaculum calidifontis）、ピュロバクルム・イスランディクム（Pyrobaculum islandicum）、ピュロコックス・アビッシ（Pyrococcus abyssi）、ピュロコックスＧＢ−Ｄ（Pyrococcus GB-D）、ピュロコックス・グリコウォランス（Pyrococcus glycovorans）、ピュロコックス・ホリコシイ（Pyrococcus horikoshii）、ピュロコックス属種ＧＥ２３（Pyrococcus spp. GE23）、ピュロコックス属種ＳＴ７００（Pyrococcus spp. ST700）、ピュロコックス・ウォエセイ（Pyrococcus woesii）、ピュロディクティウム・オクルトゥム（Pyrodictium occultum）、スルフォロブス・アキドカルダリウム（Sulfolobus acidocaldarium）、スルフォロブス・ソラタリクス（Sulfolobus solataricus）、スルフォロブス・トコダリイ（Sulfolobus tokodalii）、テルモコックス・アグレガンス（Thermococcus aggregans）、テルモコックス・バロッシイ（Thermococcus barossii）、テルモコックス・ケレル（Thermococcus celer）、テルモコックス・フミコランス（Thermococcus fumicolans）、テルモコックス・ゴルゴナリウス（Thermococcus gorgonarius）、テルモコックス・ヒュドロテルマリス（Thermococcus hydrothermalis）、テルモコックス・オニュリネウスＮＡ１（Thermococcus onnurineus NA1）、テルモコックス・パシフィクス（Thermococcus pacificus）、テルモコックス・プロフンドゥス（Thermococcus profundus）、テルモコックス・シキュリ（Thermococcus siculi）、テルモコックス属種ＧＥ８（Thermococcus spp. GE8）、テルモコックス属種ＪＤＦ−３（Thermococcus spp. JDF-3）、テルモコックス属種ＴＹ（Thermococcus spp. TY）、テルモコックス・チオレデュケンス（Thermococcus thioreducens）、テルモコックス・ジリグチ（Thermococcus zilligti）、テルモプラズマ・アキドフィルム（Thermoplasma acidophilum）、テルモプラズマ・ヴォルカニウム（Thermoplasma volcanium）、アキディアヌス・ホスピタリス（Acidianus hospitalis）、アキディロブス・サカロボランス（Acidilobus sacharovorans）、アキドゥリプロフンドゥム・ブーネイ（Aciduliprofundum boonei）、アエロピュルム・ペルニクス（Aeropyrum pernix）、アルカエオグロブス・フルギドゥス（Archaeoglobus fulgidus）、アルカエオグロブス・プロフンドゥス（Archaeoglobus profundus）、アルカエオグロブス・ベネフィクス（Archaeoglobus veneficus）、カルディビルガ・マキリンゲンシス（Caldivirga maquilingensis）、コラルカエウム・クリプトフィルム（暫定）（Candidatus Korarchaeum cryptofilum）、メタノレグラ・ブーネイ（暫定）（Candidatus Methanoregula boonei）、ニトロソアルカエウム・リムニア（暫定）（Candidatus Nitrosoarchaeum limnia）、ケナルカエウム・シュンビオスム（Cenarchaeum symbiosum）、デスルフロコックス・カンチャトケンシス（Desulfurococcus kamchatkensis）、フェログロブス・プラキドゥス（Ferroglobus placidus）、フェロプラズマ・アシダルマヌス（Ferroplasma acidarmanus）、ハルアルカリコックス・イェトガリ（Halalkalicoccus jeotgali）、ハロアルクラ・ヒスパニカ（Haloarcula hispanica）、ハロアルクラ・マリスモルツイ（Holaoarcula marismortui）、ハロバクテリウム・サリナルム（Halobacterium salinarum）、ハロバクテリウム属種（Halobacterium species）、ハロビフォルマ・ラシサルシ（Halobiforma lucisalsi）、ハロフェラックス・ウォルカニイ（Haloferax volvanii）、ハロゲオメトリクム・ボリンクエンス（Halogeometricum borinquense）、ハロミクロビウム・ムコハタエイ（Halomicrobium mukohataei）、ハロピリック・アルカセオン種ＤＬ３１（halophilic archaceon sp. DL31）、ハロピゲル・ザナデュエンシス（Halopiger xanaduensis）、ハロクアドラトゥム・ワルスビイ（Haloquadratum walsbyi）、ハロラブドゥス・ティアマテア（Halorhabdus tiamatea）、ハロラブドゥス・ウタヘンシス（Halorhabdus utahensis）、ハロルブルム・ラクスプロフンディ（Halorubrum lacusprofundi）、ハロテッリゲナ・ツルクメニカ（Haloterrigena turkmenica）、ヒュペルテルムス・ブチリクス（Hyperthermus butylicus）、イグニコックス・ホスピタリス（Igniococcus hospitalis）、イグニスパエラ・アグレガンス（Ignisphaera aggregans）、メタロスパエラ・クプリナ（Metallosphaera cuprina）、メタッロスパエラ・セドゥラ（Metallosphaera sedula）、メタノバクテリウム属種ＡＬ−２１（Methanobacterium sp. AL-21）、メタノバクテリウム属種ＳＷＡＮ−１（Methanobacterium sp. SWAN-1）、メタノバクテリウム・テルモオートロピクム（Methanobacterium thermoautrophicum）、メタノブレヴィバクテル・ルミナンティクム（Methanobrevibacter ruminantium）、メタノブレヴィバクテル・スミティ（Methanobrevibacter smithii）、メタノカルドコックス・フェルヴェンス（Methanocaldococcus fervens）、メタノカルドコックス・インフェルヌス（Methanocaldococcus infernus）、メタノカルドコックス・ヤンナスキイ（Methanocaldococcus jannaschii）、メタノカルドコックス属種ＦＳ４０６−２２（Methanocaldococcus sp. FS406-22）、メタノカルドコックス・ヴルカニウス（Methanocaldococcus vulcanius）、メタノケッラ・コンラディ（Methanocella conradii）、メタノケッラ・パルディコラ（Methanocella paludicola）、メタノケッラ属種Rice Cluster I(RC-I)（Methanocella sp. Rice Cluster I (RC-I)）、メタノコッコイデス・ブルトニイ（Methanococcoides burtonii）、メタノコックス・アエオリクス（Methanococcus aeolicus）、メタノコックス・マリパルディス（Methanococcus maripaludis）、メタノコックス・ヴァニエリ（Methanococcus vannielii）、メタノコックス・ヴォルタエ（Methanococcus voltae）、メタノコルプスクルム・ラブレアントゥム（Methanocorpusculum labreantum）、メタノクッレウス・マリスニグリ（Methanoculleus marisnigri）、メタノハロビウム・エヴェスティガトゥム（Methanohalobium evestigatum）、メタノハロピルス・マヒイ（Methanohalophilus mahii）、メタノプラナス・ペトロレアリウス（Methanoplanus petrolearius）、メタノピュルス・カンドレリ（Methanopyrus kandleri）、メタノサエタ・コンキリイ（Methanosaeta concilii）、メタノサエタ・ハルンディナケア（Methanosaeta harundinacea）、メタノサエタ・テルモピラ（Methanosaeta thermophila）、メタノサルスム・チリナエ（Methanosalsum zhilinae）、メタノサルキナ・アケチヴォランス（Methanosarcina acetivorans）、メタノサルキナ・バルケリ（Methanosarcina barkeri）、メタノサルキナ・マゼイ（Methanosarcina mazei）、メタノスパエラ・スタドトマナエ（Methanosphaera stadtmanae）、メタノスパエラ・パルス���リス（Methanosphaerula palustris）、メタノスピリルム・フンガテイ（Methanospiriullum hungatei）、メタノテルモバクター・マルブルゲンシス（Mathanothermobacter marburgensis）、メタノテルモコックス・オキナウェンシス（Methanothermococcus okinawensis）、メタノテルムス・フェルヴィドゥス（Methanothermus fervidus）、メタノトッリス・イグネウス（Methanotorris igneus）、ナノアーケウム・エキタンス（Nanoarchaeum equitans）、ナトリアルバ・アシアチカ（Natrialba asiatica）、ナトリアルバ・マガディ（Natrialba magadii）、ナトロノモナス・パラオニス（Natronomonas pharaonis）、ニトロソプミルス・マリティムス（Nitrosopumilus maritimus）、ピクロフィルス・トリドゥス（Picrophilus torridus）、ピュロバクルム・アエロピルム（Pyrobaculum aerophilum）、ピュロバクルム・アルセナティクム（Pyrobaculum arsenaticum）、ピュロバクルム・カリディフォンティス（Pyrobaculum calidifontis）、ピュロバクルム・イスランディクム（Pyrobaculum islandicum）、ピュロバクルム属種１８６０（Pyrobaculum sp. 1860）、ピュロコックス・アビッシ（Pyrococcus abyssi）、ピュロコックス・フリオスス（Pyrococcus furiosus）、ピュロコックス・ホリコシイ（Pyrococcus horikoshii）、ピュロコックス属種ＮＡ４２（Pyrococcus sp. NA42）、ピュロコックス・ヤヤノシイ（Pyrococcus yayanosii）、ピュロロブス・フマリイ（Pyrolobus fumarii）、スタピュロテルムス・ヘレニクス（Staphylothermus hellenicus）、スタピュロテルムス・マリヌス（Staphylothermus marinus）、スルフォロブス・アキドカルディリウス（Sulfolobus acidocaldirius）、スルフォロブス・イスランディクス（Sulfolobus islandicus）、スルフォロブス・ソルファタリクス（Sulfolobus solfataricus）、スルフォロブス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii）、テルモコックス・バロピルス（Thermococcus barophilus）、テルモコックス・ガンマトレランス（Thermococcus gammatolerans）、テルモコックス・コダカラエンシス（Thermococcus kodakaraensis）、テルモコックス・リトラリス（Thermococcus litoralis）、テルモコックス・オヌリネウス（Thermococcus onnurineus）、テルモコックス・シビリクス（Thermococcus sibiricus）、テルモコックス属種４５５７（Thermococcus sp. 4557）、テルモコックス属種ＡＭ４（Thermococcus sp. AM4）、テルモフィルム・ペンデンス（Thermofilum pendens）、テルモプラズマ・アキドピルム（Thermoplasma acidophilum）、テルモプラズマ・ヴォルカニウム（Thermoplasma volcanium）、テルモプロテウス・ネウトロピルス（Thermoproteus neutrophilus）、テルモプロテウス・テナクス（Thermoproteus tenax）、テルモプロテウス・ウゾニエンシス（Thermoproteus uzoniensis）、テルモスパエラ・アグレガンス（Thermosphaera aggregans）、ウァルカニサエタ・ジストリブタ（Vulcanisaeta distributa）、およびウァルカニサエタ・モウトノヴスキア（Vulcanisaeta moutnovskia）。
【０１８６】
本発明によるプロデューサー細胞として有用な古細菌細胞の特定の例としては、ハロフェラックス・ウォルカニイ（Haloferax volcanii）およびスルフォロブス属種（Sulfolobus spp.）が挙げられる。
【０１８７】
（標的タンパク質）
本発明のアッセイシステムは標的タンパク質を含み得る。
【０１８８】
任意の適切な標的タンパク質が使用され得、前のセクションで論じた標的細胞のいずれか由来のタンパク質を含む。したがって、本発明によるアッセイシステムでの使用に適した標的タンパク質は、真核生物、原核生物、真菌およびウイルスのタンパク質から選択され得る。
【０１８９】
したがって、適切な標的タンパク質としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：癌タンパク質、輸送（核、キャリア、イオン、チャネル、電子、タンパク質）、行動、受容体、細胞死、細胞分化、細胞表面、構造タンパク質、細胞接着、細胞コミュニケーション、細胞運動性、酵素、細胞機能（ヘリカーゼ、生合成、モーター、抗酸化、触媒作用、代謝作用、タンパク質分解作用）、膜融合、発生、生物学的プロセスを調節するタンパク質、以下の活性を有する各タンパク質：シグナルトランスデューサー活性、受容体活性、イソメラーゼ活性、酵素調節活性、シャペロン調節因子、結合活性、転写調節活性、翻訳調節活性、構造分子活性、リガーゼ活性、細胞外組織化活性、キナーゼ活性、生合成活性、リガーゼ活性、および核酸結合活性。
【０１９０】
標的タンパク質は、以下から選択され得るが、これらに限定されない：ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＡＫＴ経路タンパク質、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路タンパク質、チロシンキナーゼ、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）、血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、エリスロポエチン産生ヒト肝細胞受容体（Ｅｐｈ）、トロポミオシン受容体キナーゼ、腫瘍壊死因子、アポトーシス制御因子Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質、オーロラキナーゼ、クロマチン、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）、ＮＦ−κＢ経路、ＨＣＶタンパク質、ＨＩＶタンパク質、アスパルチルプロテアーゼ、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、グリコシダーゼ、リパーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）、サイトカインおよびホルモン。
【０１９１】
特定の標的タンパク質は、以下から選択され得る：ＥＲＫ１／２、ＥＲＫ５、Ａ−Ｒａｆ、Ｂ−Ｒａｆ、Ｃ−Ｒａｆ、ｃ−Ｍｏｓ、Ｔｐｌ２／Ｃｏｔ、ＭＥＫ、ＭＫＫ１、ＭＫＫ２、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ５、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、ＴＹＫ２、ＪＮＫ１、ＪＮＫ２、ＪＮＫ３、ＭＥＫＫ１、ＭＥＫＫ２、ＭＥＫＫ３、ＭＥＫＫ４、ＡＳＫ１、ＡＳＫ２、ＭＬＫ１、ＭＬＫ２、ＭＬＫ３、Ｐ３８α、ｐ３８β、Ｐ３８γ、ｐ３８δ、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４、ホスファチジルイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）、ＡＫＴ、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）、プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）、ＰＧＣ１α、ＳＩＲＴ１、ＰＤ−Ｌ１、ｍＴＯＲ、ＰＤＫ−１、ｐ７０  Ｓ６キナーゼ、フォークヘッド転位因子、ＭＥＬＫ、ｅＩＦ４Ｅ、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ６０、トポイソメラーゼＩ型、トポイソメラーゼＩＩ型、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ、Ｃｄｋ１１、Ｃｄｋ２、Ｃｄｋ３、Ｃｄｋ４、Ｃｄｋ５、Ｃｄｋ６、Ｃｄｋ７、α−チューブリン、β−チューブリン、γ−チューブリン、δ−チューブリン、ε−チューブリン、ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３）、ＡＢＬ１、ＡＢＬ２、ＥＧＦＲ、ＥＰＨ  Ａ１、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ４、ＥＰＨＡ５、ＥＰＨＡ６、ＥＰＨＡ７、ＥＰＨＡ８、ＥＰＨＡ１０、ＥＰＨＢ１、ＥＰＨＢ２、ＥＰＨＢ３、ＥＰＨＢ４、ＥＰＨＢ６、ＮＥＨ２／ｎｅｕ、Ｈｅｒ３、Ｈｅｒ４、ＡＬＫ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＮＳＲ、ＩＮＳＲＲ、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、ＦＬＴ−３、ＦＬＴ４、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＣＳＦ１Ｒ、Ａｘｌ、ＩＲＡＫ４、ＳＣＦＲ、Ｆｙｎ、ＭｕＳＫ、Ｂｔｋ、ＣＳＫ、ＰＬＫ４、Ｆｅｓ、ＭＥＲ、ｃ−ＭＥＴ、ＬＭＴＫ２、ＦＲＫ、ＩＬＫ、Ｌｃｋ、ＴＩＥ１、ＦＡＫ、ＰＴＫ６、ＴＮＮＩ３、ＲＯＳＣＣＫ４、ＺＡＰ−７０、ｃ−Ｓｒｃ、Ｔｅｃ、Ｌｙｎ、ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、ＴｒｋＣ、ＲＥＴ、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＡＣＫ１、Ｓｙｋ、ＭＤＭ２、ＨＲａｓ、ＫＲａｓ、ＮＲａｓ、ＲＯＣＫ、ＰＩ３Ｋ、ＢＡＣＥ１、ＢＡＣＥ２、ＣＴＳＤ、ＣＴＳＥ、ＮＡＰＳＡ、ＰＧＣ、レニン、ＭＭＳＥＴ、Ａｕｒｏｒａ  Ａキナーゼ、Ａｕｒｏｒａ  Ｂキナーゼ、Ａｕｒｏｒａ  Ｃキナーゼ、ファルネシルトランスフェラーゼ、テロメラーゼ、アデニリルシクラーゼ、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ、ＰＡＲＰ１、ＰＡＲＰ２、ＰＡＲＰ４、ＰＡＲＰ−５ａ、ＰＡＲＰ−５ｂ、ＰＫＭ２、Ｋｅａｐ１、Ｎｒｆ２、ＴＮＦ、ＴＲＡＩＬ、ＯＸ４０Ｌリンホトキシン−α、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮＬＲ１、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＩＬ１α、ＩＬ１β、ＩＬ−２、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂａｘ、ＨＣＶヘリカーゼ、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ｂ、ＮＦ−κＢ１、ＮＦ−κＢ２、ＲｅｌＡ、ＲｅｌＢ、ｃ−Ｒｅｌ、ＲＩＰ１、ＡＣＥ、ＨＩ��プロテアーゼ、ＨＩＶインテグラーゼ、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、ｇｐ１６０、Ｔａｔ、Ｒｅｖ  Ｎｅｆ、Ｖｐｒ、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ、ＲＮＡポリメラーゼ、ＧＡＢＡトランスアミナーゼ、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、プロラクチン、ＡＣＴＨ、ＡＮＰ、インスリン、ＰＤＥ、ＡＭＰＫ、ｉＮＯＳ、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、ＨＤＡＣ１１、ラクターゼ、アミラーゼリゾチーム、ノイラミニダーゼ、インベルターゼ、キチナーゼ、ヒアルロニダーゼ、マルターゼ、スクラーゼ、ホスファターゼ、ホスホリラーゼ、Ｐ、ヒスチジンデカルボキシラーゼ、ＰＴＥＮ、ヒストンリジンデメチラーゼ（ＫＤＭ）、ＧＣＮ５、ＰＣＡＦ、Ｈａｔ１、ＡＴＦ−２、Ｔｉｐ６０、ＭＯＺ、ＭＯＲＦ、ＨＢＯ１、ｐ３００、ＣＢＰ、ＳＲＣ−１、ＳＲＣ−３、ＡＣＴＲ、ＴＩＦ−２、ＴＡＦ１、ＴＦＩＩＩＣ、プロテインＯ−マンノシルトランスフェラーゼ１（ＰＯＭＴ１）、アミロイドβおよびタウ。
【実施例】
【０１９２】
本発明を特定の実施例を参照して説明する。これらは単なる例示であり、説明の目的のためだけである：それらは決して特許請求の範囲または記載された発明の範囲を限定することを意図しない。
【０１９３】
（実施例１：液滴中でのスクリーニングを伴うヒドロゲルマトリックスビーズを用いたタグなし化合物ライブラリの生成）
（１：ガイド配列のアセンブリ）
１）アセンブリは、架橋のためにアミン基に対する１２Ｃリンカーを含む５’タグオリゴヌクレオチドと、３’タグオリゴヌクレオチドとを包含する。ガイド配列は、ライブラリ中で使用するモノマーに対応するオリゴヌクレオチドのプールであり、この場合、２００オリゴヌクレオチドが１．６×１０９を超える個数のユニークな配列のアセンブリを可能とすることに留意されたい。
【０１９４】
２）５’および３’タグを１μＭ最終濃度で添加する。
【０１９５】
３）２５０個のバーコードオリゴヌクレオドを１．２５μＭの最終濃度でプールする。
【０１９６】
反応混合物：
１０μｌ  ＮＥ緩衝液１（New England Biolabs）
（１×反応ミックスは、１０ｍＭ  ビス−トリス−プロパン−ＨＣｌ、1０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ７（２５℃にて）である）
５μｌ  ５’タグオリゴヌクレオチド（１００μＭ）
５μｌ  ３’タグオリゴヌクレオチド（１００μＭ）
６．２５μｌのプールしたオリゴヌクレオチド（１００μＭ）
２．５μｌ  熱安定性５’AppDNA/RNAリガーゼ（New England Biolabs）
７０．２５μｌのヌクレアーゼフリー水
【０１９７】
６５℃にて４時間インキュベートする。
【０１９８】
【表１】
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【０１９９】
４）１×１０ｍＭ  トリス、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）緩衝液で３００μｌとし、そしてillustra S-200マイクロスピンHRカラム（GE Healthcare）を用いて反応物をクリーンアップし、ライゲートしなかったオリゴヌクレオチドと試薬とを除去する。
【０２００】
５）４０μｌの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）および２．５容量（１ｍｌ）の１００％エタノールを添加する。混合し、−２０℃にて少なくとも１時間置き、次いで、４℃にて１５，０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離によってＤＮＡをペレット化する。
【０２０１】
６）上清を除去し、１ｍｌの７０％エタノールで洗浄し、５分間遠心分離し、洗浄を繰り返し、次いでこのペレットを風乾する。
【０２０２】
７）このペレットを２５μｌのヌクレアーゼフリー水中に再懸濁する。
【０２０３】
（２：ＰＣＲ中に架橋させるための５’タグオリゴヌクレオチドのアガロースへの架橋）
１）２５ｇの低融点アガロースを５０ｍｌの１８．２ΩＭ水中に計量することによって架橋用のアガロースを調製し、そして４℃にて３０分間混合して水和させる。濾過により乾燥させ、そして１００ｍｌの水で洗浄し、スラリーを回収してその容量を測定する（通常１５〜２０ｍｌ）。
【０２０４】
２）等容量の０．０５Ｍ  ＮａＯＨをスラリー化したアガロースに添加し、ｐＨを確認し、必要であれば１０Ｍ  ＮａＯＨを必要なだけ添加することによって、１０．５と１１との間に調整する。
【０２０５】
３）スラリーをマグネチックスターラー上に置き、ＣＮＢｒを添加しながら混合する。
【０２０６】
４）１００ｍｇ／ｍｌスラリー  臭化シアン活性化セファロース（ＣＮＢｒ）（Sigma）を添加し（すなわち、４０ｍｌのスラリー中に４ｇのＣＮＢｒを添加する）、直ちにｐＨをチェックし、ＣＮＢｒが完全に溶解するまでモニタリングする（１〜２ｍｌの１０Ｍ  ＮａＯＨの添加が、ｐＨを１０．５〜１１に保つために必要であり得る）。反応が１５分間進行するにつれてｐＨをモニタリングする。
【０２０７】
５）１５分後またはｐＨが安定したら、反応は完了する。等容量の２００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．５）を添加することによって、残存する活性ＣＮＢｒをブロックする。
【０２０８】
６）ブフナー漏斗を使用してスラリーを濾過し、１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、５００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．５）で３×５０ｍｌ洗浄する。
【０２０９】
７）１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、５００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．５）緩衝液全容量２５ｍｌ中に再懸濁する。
【０２１０】
８）５’末端にＮＨ２−リンカーを有する１００μＭの５’タグオリゴヌクレオチド２５０μｌを取り、スラリー化アガロースと混合し、室温にて２時間混合する。
【０２１１】
９）等容量（２５ｍｌ）の０．２Ｍグリシンを添加し、残存する活性ＣＮＢｒ結合部位をブロックする。
【０２１２】
１０）スラリーを濾過し、１００ｍｌの１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、５００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．５）緩衝液で洗浄し、次いで１００ｍｌの水で洗浄し、風乾させ、ゲルを集めて計量する（注：この物質は０．１％アジ化ナトリウムを添加することによって保存用に保存できる。あるいは、これを凍結乾燥させて、長期使用のために室温で保存することができる。アジ化ナトリウムを添加する場合、スラリーを使用前に濾過して洗浄してアジドを除去しなければならない）。
【０２１３】
１１）これは約４０％アガロースであり、この段階でアミンリンカーを介して架橋された５’タグオリゴヌクレオチドで飽和されており、後でヒドロゲルマトリックスを製造するために使用することができる。少量のアリコート（１００μｌ）を採取して、約７５℃ではなお融解し、２０℃を下回ると固体となることをチェックするようにアッセイし、架橋がゲル化特性に悪影響を与えていないことをチェックする。
【０２１４】
（３：ビーズにおけるＰＣＲ）
この工程は、単一の液滴中で、単一の特異的ＤＮＡガイドを増幅し、これにより各ビーズ中にクローンＤＮＡ集団を生じる。架橋５’タグオリゴヌクレオチドがＰＣＲに使用されるが、共有結合としてアガロースに結合したままであることに留意されたい。これはアガロースから失われることはない。これにより、ビーズの全表面およびビーズ内にμＭ濃度のＤＮＡガイドが付着したクローンビーズが得られる。
【０２１５】
１）必要に応じて、乾燥アガロース−ＣＢＢｒ−オリゴヌクレオチドを溶解するか、または最終濃度0.5％までスラリーを添加する。
【０２１６】
２）次のように水性反応混合物を作製し、それを保温する。還元した３’Ｒｅｖタグは、非対称ＰＣＲによる５’タグ産物の産生を促進し、したがってテンプレートと比較してより多くの架橋ガイドが生成される。組み立てられたガイドＤＮＡは１コピー／液滴である（一部の液滴は空である）。
【０２１７】
反応は１ｍｌ容量／カプセル化を構成する
２００μｌ  ５× Phusion HF緩衝液
２０μｌ  １０ｍＭ  ｄＮＴＰミックス（等ミックス）
２μｌの３’Rev-compオリゴヌクレオチド（GGGTTAATGGCTAATATCGCG）
５０μｌ  Phusion HSIIポリメラーゼ（New England Biolabs）
０．０１５ｇのＣＮＢｒ−５’タグアガロースを含むヌクレアーゼフリー水で１０００μｌにする（１．５％アガロースビーズ）。
【０２１８】
３）連続相（２０μＬ／分の水相、４０μＬ／分の油相）としてPico-Surf1（２％界面活性剤、Dolomite、英国）を使用して、１４μｍのエッチングされた液滴生成チップ（Dolomite、英国）中にカプセル化する。
【０２１９】
４）液滴混合物全体をまとめてＰＣＲし、４８ウェル間で等分（スプリット）する（５０μｌ／ウェル）。
【０２２０】
５）９８℃にて２分、［９８℃にて１５秒、５４℃にて１５秒、７２℃にて１０秒］×３０、７２℃にて２分、次いで４℃にして２０分で凝固させる（行う直前まで４℃に保つ）。
【０２２１】
６）ビーズをプールし、５容量（５ｍｌ）のＰＢＳ＋１％Ｔｗｅｅｎ８０を添加し、転倒混和し、４℃にて２５００ｇで１５分間遠心してペレット化する。
【０２２２】
７）上清を除去し、ビーズを５倍量（５ｍｌ）のＰＢＳ＋１％Ｔｗｅｅｎ８０で再度洗浄して油をすべて除去し、４℃にて２５００ｇで１５分間遠心してペレット化する。
【０２２３】
８）ビーズにはオイルがなくなり、ハイブリダイズした、架橋していないＤＮＡ（またはガイドの逆相補鎖）を除去するために５ｍｌの０．１Ｍ  ＮａＯＨで洗浄し、室温にて５分間混合し、次いで４℃にて２５００ｇで１５分間遠心してペレット化する。
【０２２４】
９）０．１Ｍ  ＮａＯＨ洗浄を繰り返す。
【０２２５】
１０）ビーズに５ｍｌの水を加え、４℃にて２５００ｇで１５分間遠心してペレット化する。
【０２２６】
１１）水洗を繰り返して、ビーズは化学反応をガイドする準備が整う。
【０２２７】
（４：ケミカルライブラリのガイド付きアセンブリ）
モノマーのＤＮＡガイドアセンブリを従来の化学を用いて合成し、ＲＮＡタグをＩＤＴによって予め合成した。最後の３つのヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼによる切断を防ぐためにホスホロチオエート結合を含む。次いで、個々の試薬に、ガイドオリゴヌクレオチドに組み込まれたユニークな配列に対して特異的である特定のＲＮＡに対するガイドでタグ付けする（最大４つのガイド配列を100,000,000を超えるユニークな化合物にすると仮定して、１００のユニークモノマーが組み立てられ得る）。ガイドおよびタグは１８〜２５マーで、ＤＮＡに対するＴｍは＞６０℃であるが、ＲＮＡ−ＤＮＡ相互作用がより安定しているため、これらのオリゴヌクレオチドの実際の融解温度は７５〜８５℃であることが分かった。
【０２２８】
１）ビーズをカラムに充填し（各ビーズはガイドアセンブリに対してユニークなＤＮＡ配列を持つクローンであるが、各ビーズ上のこのクローンガイドはμＭの濃度である）、２０μＭでは、ビーズ容量１ｍｌあたり２０億が存在し得る。
【０２２９】
２）次に、モノマーと適切な試薬とのプールをカラム上で洗浄し、反応を進行させる。カラムを洗浄し、必要に応じて新しい反応化学を添加することができる（注：新鮮なモノマーも追加できる）。
【０２３０】
３）化学合成は使用するモノマーによって異なる（実施例２、セクション４を参照）。
【０２３１】
４）最後に、ビーズを１００ｍＭ  ＮａＣｌを含む１０カラム容量のＴＥで洗浄し、次いで表現型スクリーンにおける細胞の増殖のために２カラム容量の適切な培地（例えば、ＲＰＭＩ）で洗浄する。
【０２３２】
５）次にビーズを増殖培地中に集め、標的細胞をカプセル化する準備をする。新たに合成された化合物は、ＤＮＡガイド−ＲＮＡタグ相互作用を介して結合したままである（ｐＨが５〜９、温度が７５℃以下に保たれている限り（新規化合物は２〜４のガイドを介して結合されるので、それは非常に安定である））。
【０２３３】
（５：指標細胞による化学ビーズのカプセル化）
ビーズ上の化学物質はカプセル化されるまで結合したままである。ジャーカット細胞を２〜８個／液滴を捕捉するように希釈する。
【０２３４】
１）アガロースビーズ、ＲＰＭＩ培地中の２〜８個のジャーカット細胞、および０．４％ｗ／ｖのタイプＩＸ−Ａアガロースおよび０．１μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡを、１００μｍの接合部を有する液滴発生チップにおいて１００μＬ／分の水性流速および２００μＬ／分でPicosurf 1（Dolomite、英国）でカプセル化する。クローン性を維持するために、液滴ごとに＜１アガロースビーズをカプセル化する。
【０２３５】
２）ハイブリダイズした化合物からの化学物質の放出は、細胞混合物中に０．１μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡを含めたことによる。これは細胞の増殖には影響せず、試験した増殖培地で少なくとも４８時間有効である。ＲＮＡガイドの切断は、ＲＰＭＩ、溶原性ブロス、トリプシンソイブロスおよびＤＭＥＭ中で１５〜２０分以内に起こる。ＲＮａｓｅＡはＲＮＡタグを切断して遊離させ（ＤＮＡでは起こらない）、タグがつかなかった化合物はもはやガイドに結合せず、アガロースビーズから指標小滴中に自由に拡散する。これは０．５〜１００μＭの濃度で起こる。
【０２３６】
（６：表現型スクリーン）
１）指標細胞と共に化学ビーズを２４時間インキュベートした後、液滴は破壊される。細胞をより長期間インキュベートすることが可能である：例えば、ヒト細胞はアッセイにおいて１０日間インキュベートすることができ、そして細菌細胞は２８日後に回収される。しかし、通常のインキュベーション時間は２４〜１４４時間である。
【０２３７】
２）氷上に置くことによってビーズを固化させ、次いで４容量のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）＋１％Ｔｗｅｅｎ８０を添加することによって破壊し、転倒混和し、次いで４℃にて３５００ｇで１５分間遠心分離する。
【０２３８】
３）上清を除去し、ビーズペレットを４容量のＰＢＳ＋１％Ｔｗｅｅｎ８０で再度洗浄する。
【０２３９】
４）次にビーズペレットを１２５μｍから４５μｍの粒子フィルターを通してろ過し、これによって、より大きな液滴を除去し、より小さな破片および細胞を通して洗浄する。
【０２４０】
５）フィルター上のビーズを５容量のＰＢＳですすぎ、次いで遠心分離管に集める。
【０２４１】
６）ＰＢＳで混合液を１００ｍｌにする。
【０２４２】
７）ＴＭＲＭおよびHoescht 33342（Thermo Fisher Scientific）染料をそれぞれ２００μＭの最終濃度および１μｇ／ｍｌで添加する。室温で３０分間インキュベートする。
【０２４３】
８）４℃にて３５００ｇで１５分間遠心分離してビーズをペレット化する。
【０２４４】
９）５０ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、洗浄工程を繰り返し、染料を除去する。
【０２４５】
１０）蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）を使用して、４０５ｎｍレーザーを使用してHoeschおよび４８８ｎｍレーザーを使用してＴＭＲＭを励起し、既知の対照と比較してこれらのチャンネルの出力を検出する。
【０２４６】
１１）ＴＭＲＭ／Hoescht染色比の増加を示す液滴をチューブに選別する。
【０２４７】
（７：ヒット化合物を同定するための標的の配列決定）
１）「ヒット」ビーズをペレット化し、２５μｌの水に再懸濁する。
【０２４８】
２）各ヒットのコピー数を増やすために第一ラウンドのＰＣＲを設定する−長いリンカーによってアガロースに液滴あたり数百万が付着した：
１０μｌのＨＦ緩衝液（Thermo Fisher Scientific）
１μｌ  ５’タグ（１０μＭ）（リンカーなしバージョンATTATGACCGTAGGCCTTGGC）
１μｌ  ３’Rev-compオリゴヌクレオチド（１０μＭ）（GGGTTAATGGCTAATATCGCG）
０．２５μｌ  Phusion DNAポリメラーゼ（Thermo Fisher Sceintific）
２５μｌの水中ビーズ
２．７５μｌのヌクレアーゼフリー水で５０μｌにする
【０２４９】
ＰＣＲ  ９８℃にて２分、［９８℃にて１５秒、５４℃にて１５秒、７２℃にて１０秒］×１５、７２℃にて２分。
【０２５０】
３）Ampure XPビーズ（Beckman Coulter）でクリーンアップする
・１．８倍量（９０μｌのAmpure XPビーズ）を添加し、ピペッティングでよく混ぜる
・２分待ってからマグネットの上に置き、ビーズが２〜５分で集まったら上清を取り除く
・２００μｌの８０％エタノールで洗浄し、室温で２分間インキュベートする
・２〜５分間マグネットに戻してエタノールを除去する
・エタノール洗浄を繰り返し、ビーズが乾くまで５分間風乾する
・２０μｌの１０ｍＭ  トリスＨＣＬ  ｐＨ７．０に再懸濁し（これによりＤＮＡが溶出する）、マグネット上に戻す
・上清を集めて保管する
【０２５１】
４）プライマーを添加して第二ラウンドＰＣＲ。
【０２５２】
５）５’タグおよび３’タグおよび修飾RC_INDEXおよびPS_I2インデックスプライマー（illuminaより）を使用して、プライマーの３’末端にタグ配列を用いてコード化する（12×ECおよび8×PS_I2）。これらのタグは変わらないが、インデックスは、以下の条件で９６ウェルプレートＰＣＲをコードするように変わる：
・１０μｌ  ２×NEBNext PCRマスターミックス（New England Biolabs）
・２．５μｌのRC_INDEX（３．３μＭ）（１／３０希釈のストック）
・２．５μｌのPS_I2プライマー（３．３μＭ）（１／３０希釈のストック）
・５μｌのＤＮＡ（ＰＣＲ（工程３）から溶出したもの）
・ＰＣＲ  ９８℃にて２分、［９８℃にて１０秒、５４℃にて６０秒、７２℃にて３０秒］×３０、７２℃にて２分。
【０２５３】
６）Ampure XPビーズ（Beckman Coulter）を用いてＰＣＲ産物セレクチン２５０〜３５０ｂｐのサイズ選択。
【０２５４】
より大きなフラグメントを除去するには：
・１５μｌの水を加えて容量を６５μｌに増やす。  
・４９μｌ（０．７５×容量）のAmpureビーズを加えてよく混ぜ、５分間インキュベートする。  
・マグネット上に２分間置き、上清をきれいなウェルに移す。  
・目的のフラグメントをビンに入れる。  
・１０μｌ（０．１５×容量のAmpureビーズ）を加えてよく混ぜ、５分間インキュベートする。  
・マグネットの上に置き、今度は上清を捨てる。  
・８０％エタノール２００μｌで洗浄し、室温で２分間インキュベートする。  
・２〜５分間マグネットに戻してエタノールを除去する。  
・エタノール洗浄を繰り返し、ビーズが乾くまで５分間風乾する。  
・３５μｌの１０ｍＭ  トリス−ＨＣＬ  ｐＨ７．０に再懸濁し（これによりＤＮＡが溶出する）、マグネット上に戻す。  
・２５μｌの上清を集めて保管する。
【０２５５】
７）希釈液を１：１００、１：１００００および１：２０００００に設定する。Illumina定量キット用のKapa Fast qPCR（Kapabiosytems）を１２μｌ反応液中で使用して、ｑＰＣＲによりＤＮＡ濃度を決定する。
【０２５６】
８）ｑＰＣＲ結果を使用して、NextSeq500システムガイド（15046563）およびNextSeq Denature and Dilute Libraries Guide（15048776）のIlluminaプロトコルに従って、すべてのサンプルの２ｎＭライブラリミックスを作製し、シーケンサーにロードする。
【０２５７】
９）２つのタグでフラグ付けしたガイド核酸の戻り配列は、容易に同定され、化合物組立の順序およびその構造を決定するために使用される−ガイド（２００ヌクレオチド未満である）は、必要であればＩＤＴからのウルトラマーを用いて合成することができ、このようにして迅速にモノマーからより多くの化合物を作製し、活性を確認する。あるいは、化合物は、ＤＮＡ配列決定データから解読された構造に基づいて直接合成される。
【０２５８】
（実施例２−固体ビーズ上の固定化ＤＮＡガイドを用いたタグなし化合物ライブラリの生成）
（１：ガイド配列のアセンブリ）
５’タグをアミンではなくビオチン化することを除き、実施例１のセクション１に記載の通り。
【０２５９】
（２：ストレプトアビジンコートビーズへの単一ガイドの付着）
付着を可能にするためにストレプトアビジンでコーティングされた活性化ビーズに単一のＤＮＡ分子を付着させる。ビーズは、平均直径4.95μmのBangs laboratories Cat No:CP01Nから購入した。ビーズはストレプトアビジンでポリマーコーティングされている。
【０２６０】
１）１０００μｌ（５ｍｇのビーズ）を採取し、室温にて５０００ｇで５分間の遠心分離によりペレット化した。
【０２６１】
２）上清を除去し、ビーズを１０００μｌの１００ｍＭ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ８、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０で洗浄した。
【０２６２】
３）残存する緩衝液を除去するために洗浄をさらに２回繰り返した。
【０２６３】
４）最終容量１００μｌの１００ｍＭ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ８、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０にビーズを再懸濁する。
【０２６４】
５）ビーズは６×１０７ビーズ／ｍｇなので、１０００μｌの中に６×１０８ビーズがあり、これはビーズあたり平均１つのガイドを得るのに同じ数のガイドが必要であることを意味する。このためには約３フェムトモルのＤＮＡが必要である。平均的なガイドの長さは１２３ｂｐであるので、これは経験的に０．２５ｎｇのオリゴヌクレオチドＤＮＡが必要であることを意味する。最良の結果を得るために、このほぼ２倍が必要であることを見出し、０．４ｎｇのガイド構築物を使用した−これを１００μｌの１００ｍＭ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ８、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０に希釈し、そしてビーズと混合する。
【０２６５】
６）ビーズを室温で１時間混合する。
【０２６６】
７）工程１および２に記載のように、ビーズを遠心分離によりペレット化し、そして５００μｌの１００ｍＭ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ８、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０で５回洗浄して未結合ＤＮＡを除去する。
【０２６７】
８）最終再懸濁は５００μｌの１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ８、１ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液中にあり、４℃にて数週間保存することができ、１０μｌを０．５％アガロースゲル上で泳動し、そしてビーズ上のタンパク質を染色するために１×sypro-rubyで、そしてＤＮＡを染色するために１×Sybr Goldで染色し、両方ともの局在が見られるはずであるが、SybR goldはゲル上では非常に弱く、最大４つの異なるバンド（ガイド内の１〜４の可変領域）となり得、大部分はより大きな断片で流れる。ビーズに付着すると、フラグメントはすべての場合において＞１０ｋｂであるように見える。より多くのバンドが見える場合、バッチは均質ではないので繰り返さなければならない。
【０２６８】
９）液滴あたり１つのビーズを与えるよう液滴が作製されるようにサンプルを希釈する。
【０２６９】
（３：機能性ビーズ上のガイドオリゴヌクレオチドの増幅）
１）以下の混合物中にオリゴヌクレオチド官能基化ビーズを７０，０００ビーズ／μＬに希釈する：
反応は１ｍｌ容量／カプセル化を構成する：
２００μｌ  5×Phusion HF緩衝液（Thermo Fisher Scientific）
２０μｌ  １０ｍＭ  ｄＮＴＰミックス（等量ミックス）
２μｌの３’Rev-compオリゴヌクレオチド（GGGTTAATGGCTAATATCGCG）（IDT）
５０μｌ  Phusion HSIIポリメラーゼ（Thermo Fisher Scientific）。
【０２７０】
２）連続相（２０μＬ／分の水相、４０μＬ／分の油相）としてPico-Surf 1（２％界面活性剤、Dolomite、英国）を使用して、１４μｍのエッチングされた液滴生成チップ（Dolomite、UK）中にカプセル化する。ビーズ希釈は１０滴ごとに１つのビーズとしてクローン性を保証し、そして全混合物をカプセル化するのに約１時間かかる。
【０２７１】
３）得られた１４μｍの液滴（１８ｐＬ）をエッペンドルフチューブに集める。
【０２７２】
４）液滴混合物全体をまとめてＰＣＲし、６０ウェル間で等分（スプリット）する（５０μｌ／ウェル）。
【０２７３】
５）９８℃にて２分、［９８℃にて１５秒、５４℃にて１５秒、７２℃にて１０秒］×３０、７２℃にて２分、次いで４℃にして２０分で凝固させる（行う直前まで４℃に保つ）。
【０２７４】
６）製造業者のプロトコルに従ってビーズをプールし、Pico-break 1（Dolomite、英国）を使用して液滴を粉砕する。
【０２７５】
７）ビーズを回収し、ビーズを５容量（５ｍｌ）のＰＢＳ＋１％Ｔｗｅｅｎ８０で再度洗浄してすべての油を除去し、４℃にて２５００ｇで１５分間遠心してペレット化する。
【０２７６】
８）ビーズにはオイルがなくなり、ハイブリダイズした、架橋していないＤＮＡ（またはガイドの逆相補鎖）を除去するために５ｍｌの０．１Ｍ  ＮａＯＨで洗浄し、室温で５分間混合し、次いで４℃にて２５００ｇで１５分間遠心してペレット化する。
【０２７７】
９）０．１Ｍ  ＮａＯＨ洗浄を繰り返す。
【０２７８】
１０）ビーズに５ｍｌの水を加え、４℃にて２５００ｇで１５分間遠心してペレット化する。
【０２７９】
１１）水洗を繰り返し、ビーズの使用準備を整える。
【０２８０】
（４：ビーズ上でのＤＮＡテンプレート化アシスト合成）
ＤＮＡ指向性アセンブリのためのタグ付きモノマーのアセンブリを、従来の化学を用いて合成した。ＲＮＡタグをＩＤＴによって予め合成し、そして最後の３ヌクレオチドには、エキソヌクレアーゼによる切断を防ぐためにホスホロチオエート結合を含ませた。次いで、個々の試薬を、ガイドオリゴヌクレオチドに組み込まれたユニークなガイド配列に対して特異的である特定のＲＮＡに対するガイドでタグ付けする（最大４つのガイド配列を100,000,000を超えるユニークな化合物にすると仮定して、１００のユニークなモノマーが組み立てられ得る）。設計したガイドおよびタグは１８〜２５マーで、ＤＮＡに対するＴｍが＞６０℃であるが、ＲＮＡ−ＤＮＡ相互作用がより安定しているため、これらのオリゴヌクレオチドでは７５〜８５℃にて安定性が見られた。交差反応性を最小限に抑えるために、モノマー濃度を０．５μＭ以下に保つ。ガイドオリゴヌクレオチドのプールに対応して、試薬を配列の５’末端に連結した。この例示的な実施例では、（ａ）アルデヒドまたは（ｂ）アミンのいずれかを含有するビルディングブロックを使用してモノマーを互いに連結し、還元的アミノ化後に第二級アミン結合をもたらす。
【０２８１】
１）２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ水素化ホウ素ナトリウムおよび０．５μＭ反応性オリゴヌクレオチド結合モノマーを有する５０ｍＭ  ＴＡＰＳ緩衝液、ｐＨ８．０中で官能基化ガイダンスビーズ（実施例２のセクションＸから）を２０，０００ビーズ／μＬに希釈する。
【０２８２】
２）２０μｍのエッチング深さのマイクロフルイディックチップ（Dolomite、英国）を使用して、５０μＬ／分および１００μＬ／分のPico-surf1（２％界面活性剤、Dolomite、英国）の水性流速でこの混合物をカプセル化し、直径２０μｍの液滴（４２ｐＬ）を生じる。
【０２８３】
３）液滴を５０ｍＬ  Falconチューブに集め、２５℃にて２４時間反応させる。
【０２８４】
（５：組み立てられた化合物、ガイダンスビーズ、および指標細胞の液滴融合）
この工程は、小さな液滴生成部位、直径１００μｍの液滴を生成するための別のより大きい液滴生成部位、液滴同期のためのＹ字型チャネル、および液滴合体のための一対のアドレス可能電極を含む特注のマイクロ流体チップを含む。これらのデバイスは、Dolomite（英国）またはMicronit（オランダ）のような企業から容易に入手可能である。
【０２８５】
１）指標液滴のために以下を含む混合物を調製する：
ジャーカット細胞（５細胞／液滴で21,000細胞／μＬ）
ＲＮａｓｅ  Ａ、０．１μｇ／ｍＬ
０．５重量％ＩＸ−Ａ型アガロース（Sigma）
ＲＰＭＩ培地
【０２８６】
２）カスタムメイドのチップに実施例２の工程４からの２０μｍ液滴の再注入を開始する。
【０２８７】
３）Pico-surf1の流速２００μＬ／分で、１００μＬ／ｍＬの流速で１００μｍ液滴の作製を開始する。
【０２８８】
４）高速度カメラ（Pixellink、カナダ）を使用して、２０μｍ液滴の再注入の速度を１００μｍ液滴の生成速度に合わせて、Ｙチャネルで１：１の同期を確実にする。小さい方の液滴の方がチャネル内での流体力学的抗力が小さく、より速く移動し、１００μｍ液滴に追い付き、自己同期させて対にする。
【０２８９】
５）パルス発生器（Aim-TTi、RS components、英国）および高電圧増幅器（Trek 2220、Trek、米国）からの１ＫＨｚの方形波パルスで４ｋＶ／ｃｍの電場を印加することによって、電極でのエレクトロフュージョンにより隣接する液滴対を融合させる。
【０２９０】
６）チップから融合された液滴を収集し、５％ＣＯ２、３７℃にて組織培養フラスコ（Fisher、英国）中にインキュベートする。
【０２９１】
（６：表現型スクリーン）
実施例１のセクション６に記載の通り。
【０２９２】
（７：ヒット化合物を同定するための標的の配列決定）
実施例１のセクション７に記載の通り。
【０２９３】
（実施例３−既存の化合物ライブラリを可逆的にタグ付け）
（１：化合物ライブラリに追加するためのランダムオリゴヌクレオチドタグの生成）
１）ランダムタグをTwist Bioscienceから購入する。これらは、Ｔｍ＞５５℃を有する１８〜２５マーの100,000〜1,000,000個のユニークな配列を含み、それぞれに５’RNA_アダプター１オリゴヌクレオチドおよび３’DNA_アダプター１オリゴヌクレオチドを付加し、それぞれ修飾して、特異的末端への付加を確実にする。
【０２９４】
２）２００μｌ反応用の反応混合物：
２０μｌ  １０×緩衝液（１×反応緩衝液（５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ））
１００μｌ  ５０％  PEG 8000（ｗ／ｖ）（１×２５％（ｗ／ｖ）PEG 8000）
２０μｌ  １０ｍＭヘキサミンコバルトクロリド（１×１ｍＭヘキサミンコバルトクロリド）
２０μｌ（１００単位）Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ
２０μｌ  １０ｍＭ  ＡＴＰ（１×１ｍＭ  ＡＴＰ）
【０２９５】
２０μｌのオリゴヌクレオチドミックス（ランダムバーコードオリゴヌクレオチドならびにＲＮＡおよびＤＮＡアダプターの各々水中３０μＭの等量ミックス）。２５℃にて１６時間インキュベートする。４０μｌの１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、２．５ｍＭ  ＥＤＴＡを添加して反応を停止させる。
【０２９６】
【表２】
2020503846.tif 000005
【０２９７】
３）１０ｍＭ  トリス、１ｍＭ  ＥＤＴＡ緩衝液、ｐＨ７で３００μｌを調製し、そしてillustra Ｓ−２００マイクロスピンＨＲカラム（GE Healthcare）を使用して反応物をクリーンアップし、ライゲートしなかったオリゴヌクレオチドおよび試薬を除去する。
【０２９８】
４）４０μｌの酢酸ナトリウムｐＨ５．２および２．５容量（１ｍｌ）の１００％エタノールを加える。混合し、−２０℃にて少なくとも１時間置き、次に４℃にて１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心してＤＮＡをペレット化する。
【０２９９】
５）上清を除去し、１ｍｌの７０％エタノールで洗浄し、５分間回転させ、洗浄を繰り返し、次いでペレットを風乾させる。
【０３００】
６）２５μｌのヌクレアーゼフリー水にペレットを再懸濁する。
【０３０１】
（２：ＰＣＲ中に架橋させるための５’タグオリゴヌクレオチドのアガロースへの架橋）
１）２５ｇの低融点アガロース（Sigma）を５０ｍｌの１８．２ΩＭ水中に計量して架橋するためのアガロースを調製し、そして４℃にて３０分間混合して水和させる。濾過して乾燥させ、１００ｍｌの水で洗浄し、スラリーを回収しそして容量を測定する（通常１５〜２０ｍｌ）。
【０３０２】
２）スラリーアガロースに等容量の０．０５Ｍ ＮａＯＨを添加し、ｐＨを確認し、必要ならば１０Ｍ  ＮａＯＨを必要なだけ添加することによって１０．５〜１１に調整する。
【０３０３】
３）スラリーをマグネチックスターラー上に置き、ＣＮＢｒ（Sigma）を添加しながら混合する。
【０３０４】
４）１００ｍｇ／ｍｌのスラリーＣＮＢｒを加える。すなわち、４０ｍｌのスラリーに４ｇのＣＮＢｒを加える。直ちにｐＨを確認し、ＣＮＢｒが完全に溶解するまでモニタリングする。必要に応じて１０．５〜１１の間にｐＨを保つために１〜２ｍｌの１０Ｍ  ＮａＯＨを加える。反応が１５分間進行するごとにｐＨをモニタリングする。
【０３０５】
５）１５分後またはｐＨが安定になった後、反応は完了する。等容量の２００ｍＭ ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．５）を加えることにより、残存する活性ＣＮＢｒをブロックする。
【０３０６】
６）ブフナー漏斗を使用してスラリーを濾過し、１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、５００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．５）で３×５０ｍｌ洗浄する。
【０３０７】
７）全容量２５ｍｌの１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、５００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．５）緩衝液に再懸濁する。
【０３０８】
８）５’末端にＮＨ２−リンカーを有する１００μＭの５’タグオリゴヌクレオチド２５０μｌを取り、スラリー化アガロースと混合し、室温で２時間混合する。
【０３０９】
９）等容量（２５ｍｌ）の０．２Ｍグリシンを加えて、残存する活性ＣＮＢｒ結合部位をブロックする。
【０３１０】
１０）スラリーを濾過し、１００ｍｌの１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、５００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．５）緩衝液で洗浄し、次いで１００ｍｌの水で洗浄して風乾させ、ゲルを集めて計量する（この物質は０．１％アジ化ナトリウムを添加することによって保存用に保存できる。あるいは、それは凍結乾燥して長期使用のために室温で貯蔵することができる。アジドを添加する場合は、使用する前にスラリーを濾過して洗浄し、アジドを除去しなければならない。）
【０３１１】
１１）これは約４０％のアガロースであり、この段階でアミンリンカーを介して架橋した５’タグオリゴヌクレオチドで飽和しており、後でヒドロゲルマトリックスを製造するために使用することができる。少量のアリコート（１００μｌ）を採取し、それがまだ約７５℃にて融解し、２０℃未満で固化することを確認するためにアッセイし、架橋がゲル化特性に悪影響を及ぼしていないことを確認する。
【０３１２】
（３）化合物ライブラリのタグ付け（化学法））
この反応の正確な性質は、問題のライブラリおよびその中に含まれる官能基に依存するが、本実施例においては、ライブラリはアミノ基で高度に官能基化する。次いで、バーコード化オリゴヌクレオチドの末端をスクシンイミジルエステルで官能基化する。液滴内で化合物を放出させるために、バーコード化オリゴヌクレオチドを切断可能な基で官能基化する。
【０３１３】
（１）個々のライブラリメンバーを０．１Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．３に最終濃度１ｍＭまで溶解する。
【０３１４】
（２）１：１のモル比を達成するために、スクシンイミジルエステル官能基化ガイドオリゴヌクレオチドを個々のウェルに添加する。各ウェルに特定の配列が１つだけ付加されることを確実にする。
【０３１５】
（３）室温で１時間インキュベートする。
【０３１６】
（４）溶液を４０℃に温める。
【０３１７】
（５）工程３からビーズのストックを希釈し、ウェルにロードする。スクリーニングプロセス中にオーバーサンプリングを確実にするために少なくとも１００ビーズ／ウェルをロードするよう目標とする。
【０３１８】
（６）４０℃にてインキュベートしてタグ付き化合物をビーズにハイブリダイズさせる。
【０３１９】
（７）スピンダウンして各ウェルから上清を除去する。１×ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄する。
【０３２０】
（８）１×ＰＢＳ緩衝液を用いてビーズをウェルから洗い流す。一緒にプールしてから、新しい１×ＰＢＳに再懸濁する。
【０３２１】
（４）化合物のタグ付け（酵素法））
この反応および官能基の正確な性質から、いくつか挙げるとグリコシラーゼ、非リボソームペプチドシンターゼ、ユビキチナーゼ、およびホスホリラーゼを含む、本質的に任意の適切な酵素を使用することができる。この説明では、ホスホリラーゼ酵素を使用する。
【０３２２】
化合物を水またはＤＭＳＯに溶解して０．５ｍＭにする（ＤＭＳＯ中の場合は２．５μＬ以下）：
（１）５μｌの１０×反応緩衝液（最終は７０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．６（２５℃にて）である）
（２）１０μｌ  ５０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ−４０００（最終濃度１０％）
（３）２．５μｌの１０ｍＭ  ＡＴＰ（最終濃度５００μＭ）
（４）５μ  Ｔ４  ＰＮＫ（New England Biolabs）
（５）水で５０μｌにする
【０３２３】
３７℃にて４時間インキュベートする。
【０３２４】
ランダムタグをTwist Bioscienceから購入する。これらは、Ｔｍ＞５５℃を有する１８〜２５マーの100,000〜1000,000のユニークな配列を含み、それぞれに５’DNA_アダプター１オリゴヌクレオチドおよび３’RNA_アダプター１オリゴヌクレオチドを付加し、それぞれ修飾して、特異的末端への付加を確実にする。この反応はバーコードを一緒にライゲートする。
【０３２５】
以下のミックスを２００μＬにする：
（１）２０μｌ  １０×緩衝液（１×反応緩衝液（５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ））
（２）１００μｌ  ５０％  PEG 8000（ｗ／ｖ）（１×２５％（ｗ／ｖ）PEG 8000）
（３）２０μｌ  １０ｍＭヘキサミンコバルトクロリド（１×１ｍＭヘキサミンコバルトクロリド）
（４）２０μｌ（１００単位）Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ（New England Biolabs）
（５）２０μｌ  １０ｍＭ  ＡＴＰ（１×１ｍＭ  ＡＴＰ）（Sigma）
（６）２０μｌ  オリゴヌクレオチドミックス（ランダムバーコードオリゴヌクレオチドならびにＲＮＡおよびＤＮＡアダプターの各々水中３０μＭの等量ミックス）
【０３２６】
２５℃にて１６時間インキュベートする。
【０３２７】
４０μｌの１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、２．５ｍＭ  ＥＤＴＡを添加して反応を停止させる。
【０３２８】
【表３】
2020503846.tif 000006
【０３２９】
１）１０ｍＭ  トリス、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７）緩衝液で３００μｌを調製し、そしてillustra Ｓ−２００マイクロスピンＨＲカラム（GE Healthcare）を使用して反応物をクリーンアップし、ライゲートしなかったオリゴヌクレオチドおよび試薬を除去する。
【０３３０】
２）４０μｌの酢酸ナトリウムｐＨ５．２および２．５容量（１ｍｌ）の１００％エタノールを加える。混合し、−２０℃にて少なくとも１時間置き、次に４℃にて１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心してＤＮＡをペレットにする。
【０３３１】
３）上清を除去し、１ｍｌの７０％エタノールで洗浄し、５分間回転させ、洗浄を繰り返し、次いでペレットを風乾させる。
【０３３２】
４）２５μｌのヌクレアーゼフリー水にペレットを再懸濁する。
【０３３３】
（５）ビーズへの化合物の付着）
１）上記化合物に、ＮＨ−Ｃ１２−GGGTTAATGGCTAATATCGCGオリゴヌクレオチドを有する５０μｌのジェネリック付着ビーズを添加する（実施例３、セクション２に記載の通り）。
【０３３４】
（６）表現型スクリーン）
実施例１、セクション６に記載の通り。
【０３３５】
（７）ヒット化合物を同定するための標的の配列決定）
実施例１、セクション７に記載の通り。
【０３３６】
（実施例４−タグなしＤＥＣＬ合成のためのスプリット−プール法）
広く使用されているスプリット・アンド・プール戦略（例えば、Mannocci et al.（2011）Chem. Commun., 47：12747-12753；Mannocci et al.（2008）Proc. Natl. Acad. Sci. 105：17670-17675を参照）が、下記の通り、反復化学合成およびＤＮＡコード化工程が関与する複数セットの化学部分構造および対応するＤＮＡコードフラグメントの段階的スプリット・アンド・プールコンビナトリアルアセンブリに基づいて、本発明に従って使用する単一ファーマコフォアＤＥＣＬを生成するために、使用することができる。
【０３３７】
（１）概要）
ここで図１を参照して、まずガイドオリゴヌクレオチドを官能基化アガロースビーズに付着させる。各ビーズは、オリゴヌクレオチド付着のために、少なくとも１０１１個の官能基を含む。タグ付き部分構造（本明細書では「ファーマコア（pharmacore）」と呼ぶことがある）を、切断可能なリンカーを介してガイドオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドに連結し、次いでライゲーションによってガイドオリゴヌクレオチドに付着させる。これは、一次ファーマコアとして機能し、それからさらなるファーマコア（二次、三次などのファーマコア）で「装飾」される（以下に説明する）。
【０３３８】
次いで、連続したラウンドの合成を行い、さらなる部分構造／ファーマコアとの反応により一次ファーマコア部分構造を装飾する。各反応およびビルディングブロック用のコードオリゴヌクレオチドもまた、ライゲーションによってガイドオリゴヌクレオチドに付加する。ライブラリを、代替ラウンドの化学合成およびコードライゲーションを伴うスプリット・アンド・プール技術を用いて構築する。ライブラリ生成後、各ビーズを単一化合物の複数コピーで装飾する。
【０３３９】
ここで図２を参照して、次いで、ライブラリビーズを、指標細胞を有する微小液滴の内側にカプセル化する（タンパク質標的もまた使用され得る）。化合物は、液滴内で切断可能なリンカーを切断する酵素の添加によって放出され、水性内部に化合物を放出させる。次いで、液滴を所定の期間インキュベートし、化合物の表現型効果をＦＡＣＳを用いて測定する。細胞が所望の表現型を示す液滴を選別して、収集する。したがって、ライブラリメンバー合成をコード化するオリゴヌクレオチドは、それが引き起こす表現型効果に物理的には連結していないが、空間的に連結している。
【０３４０】
化合物の同定は、ガイドオリゴヌクレオチドをビーズからの制限消化によって切断し、続いて配列決定することによって行われる。オリゴヌクレオチドのコード配列は、ファーマコアが曝された合成工程とＦＡＣＳによって観察された表現型効果の原因となる化合物の構造とを記述する。ガイドオリゴヌクレオチドのＰＣＲ増幅は、１０１０を超えるオリゴヌクレオチド分子が存在するので必要とされないが、必要ならばＰＣＲを使用して増幅することができる。
【０３４１】
このタグ付きライブラリ合成は、ＤＮＡコード化（バーコード化）および合成規模の重要な利点を保持しながら、少数の比較的高価なタグ付き化学部分構造を使用する分子ライブラリの合成を可能にする。それはまた、いかなる痕も単一の切断事象から生じる痕まで減少させる。したがって、スプリット・アンド・プール方法は、すべてのファーマコア部分構造単位をタグ付けする必要がないので、既知の化学を利用する多様なファーマコア付加を可能にする。
【０３４２】
（２）アガロースアミンビーズの官能基化）
アミン官能基化アガロースビーズ（Cube Bioscience）の５０％懸濁液の２ｍＬアリコートを５００×ｇで１０分間遠心し、そしてＲＯ水で３回洗浄し、次いで５ｍＬの１００ｍＭ ＭＥＳ＋１５０ｍＭ ＮａＣｌカップリング緩衝液、ｐＨ５．５に懸濁した。別個の管中で、アジド官能基化ミックスを調製した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、Sigma Aldrich）の２０ｍＭ溶液２．５ｍＬおよびＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ'−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ、Sigma Aldrich）の２０ｍＭ溶液２．５ｍＬ（両方ともカップリング緩衝液中）を混合した。２−アジド酢酸（５μＬ、Carbosynth）を加え、そしてこの混合物を室温で２０分間反応させた。２０分後、アミンビーズをスピンダウンし、５ｍＬのアジド官能基化混合物に再懸濁した。この管を室温で１時間ローテーター上に置き、次に回転させ、そして５ｍＬの新鮮なアジド官能基化混合物中に再懸濁した。これをローテーター上に置き、一晩反応させた。次にビーズを３×５ｍＬの１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄し、次いで５ｍＬの１００ｍＭ炭酸水素ナトリウム（ｐＨ７．５）に再懸濁し、必要になるまで４℃にて保存した。
【０３４３】
（３）官能基化アジド−アガロースビーズへの捕捉オリゴヌクレオチドの付着）
１ｍＬのアジドビーズストックをスピンダウンし、１ｍＬの１００ｍＭ  ＭＯＰＳ、ｐＨ７．０で３回洗浄した。次にビーズを７８５μＬのＭＯＰＳ緩衝液に懸濁した。100μLの捕捉オリゴヌクレオチド（５’−GAAGGGTCGACTAAG ATTATACTGCATAGCTAGGGGAATGGATCCCGCC TTTTTTT（Int 5-オクタジイニル(Octadiynyl) Du）TTTTTTTTT GGCGGGATCC−３’、ADTbio、４８．９２μＭ）を添加し、続いて１０μＬの５０ｍＭトリス（３−ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル）アミン（ＴＨＰＴＡ、Sigma Aldrich）、５μＬの２０ｍＭ硫酸銅（ＩＩ）溶液（Sigma Aldrich）および１００μＬの１０ｍＭアスコルビン酸ナトリウム（Sigma Aldrich）溶液を加えた。ビーズをローテーター上に置き、一晩反応させ、次いで混合物を遠心沈降させ、１×ｍＬの１００ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液で洗浄し、次いで７５８μＬのＭＯＰＳ緩衝液、１００μＬの１０ｍＭプロパルギルアルコール（Sigma Aldrich）に再懸濁した。続いて１０μＬの５０ｍＭ ＴＨＰＴＡ、５μＬの２０ｍＭ硫酸銅（ＩＩ）溶液および１００μＬの１０ｍＭアスコルビン酸ナトリウム溶液。１時間後、ビーズを３×１ｍＬのＭＯＰＳ緩衝液で洗浄し、次いで１００ｍＭ炭酸水素ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５に再懸濁した。
【０３４４】
（４）切断可能なオリゴヌクレオチドの一次ファーマコアとのライゲーション）
１ｍｌのアジドアガロースビーズ＋捕捉オリゴヌクレオチドを遠心し、５００μＬのヌクレアーゼフリー水（ＮＦＷ）で３回洗浄した後、４７５μＬのＮＦＷおよび５００μＬの２×クイックリガーゼ緩衝液（Quick Ligase Buffer）（ＮＥＢ）に再懸濁した。１５μＬのペイロードオリゴヌクレオチド（５’ATTCCCCTAGCTATGCAAGTrGrArGRrArArGrUX３’、ここでX＝ヘキシニルヒドロキシプロリノール、ADTbio、８１．５３μＭ）を１０μＬのクイックリガーゼと共に加えた。ビーズを３７℃にて回転させながらインキュベートし、次いで１００ｍＭ炭酸水素ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５で３回洗浄しそして必要になるまで４℃にて貯蔵した。
【０３４５】
（５）タグ付け）
ビーズ上の捕捉オリゴヌクレオチドへのコード化オリゴヌクレオチドのライゲーションによるタグ付けは、ビーズを水中で洗浄することにより行った（５０００ｇで５分間ビーズを遠心分離し、５×ビーズ容量のヌクレアーゼフリー水（ＮＦＷ）に再懸濁し、合計２回洗浄を繰り返す）。次いで、ビーズを５×ビーズ容量のライゲーション混合物（これは、最終濃度１×クイックリガーゼ緩衝液（New England Biolabs）、２５０ｎＭ スプリント（Splint）オリゴヌクレオチド、２５０ｎＭコード化オリゴヌクレオチド、２０Ｕ／μｌ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（New England Biolabs）を有し、次いでヌクレアーゼフリー水で５×ビーズ容量にしたものである）中に再懸濁した。
【０３４６】
ライゲーション効率を試験しそしてライゲーション効率を最大にするために、サンプルを２つに等分（スプリット）した。一方のサンプルを９５℃に２分間加熱し、次いでサーマルサイクラー中で０．２℃／秒で４℃に冷却した。他方のサンプルは熱処理せずに室温で放置した。加熱工程の後にＴ４ ＤＮＡリガーゼ（２０Ｕ／μｌ）を加えた。
【０３４７】
両方の反応物を３７℃にて１時間インキュベートしてライゲーションを進行させた。一旦インキュベートしたら、９５℃に２０分間加熱することによりリガーゼを熱失活し、次いで２０Ｕ／μｌのＢａｍＨＩ（ＮＥＢ）を用いてオリゴヌクレオチドをビーズから切り出し、さらに３７℃にて１時間インキュベートした。ビーズを遠心分離（５０００ｇ、５分）によってペレット化し、次いで上清を取り除いた。ビーズから切り出した（cute）このＤＮＡを、０．１×容量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）および２．５×容量の１００％エタノールを添加することによって試験のために沈殿させた。次にこれを氷上で１時間インキュベートし、沈殿した物質を１７，０００ｇで２０分間の遠心分離によりペレット化し、上清をデカントし、５００μｌの７０％エタノールで２回洗浄した。次いでペレットを風乾し、１００μｌのヌクレアーゼフリー水に再懸濁した。次に、この２５μｌを変性ローディング染料（９５％ホルムアミド、０．１％キシレンシアノール、０．１％ブロムフェノールブルー、２０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７．５）と１：１で混合し、サンプルを９５℃にて２分間ボイルし、次いで４℃／秒の冷却速度で４℃まで冷却した。沈殿したサンプルを次に変性ＴＢＥゲル（１２．５％ポリアクリルアミド、７ＭのＵＲＥＡ）にロードした。１５０Ｖで、室温にて４５分間泳動させる。泳動したら、ゲルをミリＱグレードの水で２回洗浄して尿素を除去し、次いで１×ＴＢＥ中で１×SyBr gold（thermoscientific）ＤＮＡ染色液で２０分間染色した後、染色液を除去するために再度２回水で洗浄した。
【０３４８】
次いで、ゲルをSyngene InGenius 3ゲルドックシステムを使用して画像化した（図３）。全ての試薬が存在する場合にライゲーションが起こるが、これは加熱工程を用いた場合により効率的であることが分かる−これは、合成小胞上に各ＤＮＡの多数のコピーがあるので、妥当なレベルでライゲーションが生じるために必要とされるわけではない。
【０３４９】
（６）コード化タグからの化学構造の放出）
コード化オリゴヌクレオチドタグは、オリゴヌクレオチドからペイロードを切断することによって除去される。
【０３５０】
ここで図４を参照して、リンカーの切断およびファーマコアの放出を示すために、切断可能なオリゴヌクレオチドの配列内の切断可能なリンカーの５’側にフルオロフォア（ＦＩＴＣ、図４ではＦとして示す）を組み込むオリゴヌクレオチドを作製した。次に、クエンチング分子、ＢＨＱ−１を切断可能なリンカーに付着させた。これは、ライブラリ作製において使用される任意の化学構造と同じ様式での切断によって放出され得る。クエンチング剤が切断可能なリンカーから除去されると、オリゴヌクレオチドのライトアップが見られる。
【０３５１】
それらの関連するリンカーを痕なしに切断する３つの異なる酵素が同定されている（ＲＮａｓｅ  Ａ、ＲＮａｓｅ  Ｔ１  ＡおよびＲＮａｓｅ  １Ａ；図４においてそれぞれ酵素Ａ、ＢおよびＣと表示）。３つ全部を同胞のリンカーを用いて試験した。それぞれの場合において、１０μｌの反応をセットした：１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５０ｎＭ  切断可能オリゴヌクレオチド、０．１μｌのストック酵素（ＲＮａｓｅ  Ａ＝１０ｍｇ／ｍｌ、ＲＮａｓｅ  Ｔ１＝１０ｍｇ／ｍｌ、ＲＮａｓｅ  １＝１．５ｍｇ／ｍｌ）、次いでヌクレアーゼフリー水で１０μｌにする。サンプルを３７℃にて１５分間インキュベートし、次いで１０μＬの変性ローディング染料（９５％ホルムアミド、０．１％キシレンシアノール、０．１％ブロムフェノールブルー、２０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ ｐＨ７．５）を添加した。サンプルを９５℃にて２分間ボイルし、次いで４℃／秒で４℃に急冷した。次にこれらのサンプルを変性ＴＢＥゲル（１２．５％ポリアクリルアミド、７Ｍ尿素）にロードした。ゲルを１５０Ｖで７５分間泳動し、ＦＩＴＣを励起するSyngene Ingenius 3システムを用いて画像化した。クエンチング剤の放出は、フルオロフォアが「ライトアップ」として見られそして画像化され得ることを意味する。これは酵素の存在下にて黄色のＤＮＡバンドの出現として見られる。SyBr gold（Thermo）で染色することによりＤＮＡを見ることができ、クエンチング剤が存在する場合にこれもまたクエンチされるが、質量の変化に対応するサイズシフトならびにシグナルの増加が見られる（フルオロフォアの下のグレースケール画像、図４）。両方の場合において、放出が酵素の存在下でのみ起こり、そして急速である（＜１５分）ことを見ることができる。さらに、酵素は非常に活性であり、酵素の１０倍段階希釈を１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中で行い、そして反応を同様にして行った。酵素を１０−２から１０−５に希釈した後、ＲＮａｓｅ  Ａが１０−４、ＲＮａｓｅ  Ｔ１とＲＮａｓｅ  １が１０−３で活性を見ることができる。これは、酵素活性の大きな窓があること、およびこのプロセスが複数の酵素に対して１０−４希釈で３０分以内に起こり得ることを意味する。
【０３５２】
また、酵素が液滴環境で機能することを確認した（図５を参照）。ＲＮａｓｅ  Ａについての結果を示す。１ｍｌの水相を１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５０ｎＭ  切断可能なオリゴヌクレオチド、１０μｌのストックＲＮａｓｅ  Ａ（１０ｍｇ／ｍｌ）を用いて、次いでヌクレアーゼフリー水で１ｍｌにすることで調製した。１００μｍの平均直径の液滴を、２％ｗ／ｖのGransurf G67（Grant Industries Inc.）と共に上記のような水相とＰＳＦ−２  ｃＳＴ油（Clearco Products Inc.）で構成される油相と、１００μｍエッチング深さチップを用いて作製した。液滴を酵素と共にまたは酵素なしで３７℃にて１５分間インキュベートし、それらを４８２／１８ｎｍで照射するFloid蛍光顕微鏡および５３２／５９ｎｍの発光フィルターの下で画像化した。酵素の存在下にて液滴内でライトアップが起こり、反応が液滴環境によって影響されないことが分かる。
【０３５３】
（７）ヒュースゲン１，３−双極子環化付加およびチオウレタン形成を用いた切断可能な化学構造ペイロードの官能基化）
切断可能なリンカーおよびコアペイロード（ヘキシニルヒドロキシプロリノール（hexynyl hydrodroxyprolinol））で官能基化されたビーズの２つの１００μＬ部分を１００ｍＭのＭＯＰＳ ｐＨ７．０で３回洗浄し、そして１００μＬの同じものの中に再懸濁した。両方の部分に、ＤＭＳＯ中の５−ＦＡＭ−アジド（Jena Bioscience）の１０ｍＭストック２μＬを加えた。一方の部分を未反応の陰性コントロールとして保持し、他方の部分に５μＬの５０ｍＭトリス（３−ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル）アミン（ＴＨＰＴＡ、Sigma Aldrich）、２．５μＬの２０ｍＭ硫酸銅（ＩＩ）（Sigma Aldrich）溶液および１００μＬの１０ｍＭアスコルビン酸ナトリウム（Sigma Aldrich）溶液を添加した。捕捉オリゴヌクレオチドのみで官能基化されたビーズ（切断可能なリンカーまたは機能的コアを含まない）を含むさらなるサンプルも同様に処理した。ビーズをローテーター上に置き、一晩反応させた後、混合物をスピンダウンさせ、１×ｍＬの１００ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液ｐＨ７．０で洗浄した。
【０３５４】
官能基化を確認するために、３０μＬのＮＥＢ緩衝液３．１、１０μＬのＢａｍＨＩを有する２６０μＬのヌクレアーゼフリー水中に懸濁することにより、官能基化ペイロードをビーズサンプルから切り離した。３７℃にて１時間インキュベートした後、サンプルを２×１５０μＬずつに等分（スプリット）した。５μＬのＲＮａｓｅ Ａを添加し、そしてサンプルを３７℃にてさらに１時間インキュベートし、次いでビーズをペレット化した。上清を清潔なチューブに移し、１５μＬの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）および３７５μＬの１００％エタノールを加えた。サンプルを−２０℃にて一晩沈殿させ、次いでペレット化し、５００μＬの７０％エタノールで洗浄し、そして２０分間風乾させた。ペレットを２０μＬのヌクレアーゼフリー水に再懸濁し、２０μＬの変性ローディング染料を加えた（９５％ホルムアミド、０．１％キシレンシアノール、０．１％ブロムフェノールブルー、２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ７．５）。サンプルを９５℃にて５分間加熱し、次いで４℃に冷却した。サンプルをＴＢＥ尿素ゲルにロードし、１００Ｖで７５分間泳動した。
【０３５５】
図６に示されるように、遊離する染色された成分は処理されたサンプル中に見られ、ともにライゲートされた切断可能なリンカー、機能的なコアおよび染料を有し、未ライゲートサンプルに存在する遊離５−ＦＡＭアジドの存在よりも、官能基化され放出されたコアを示す。
【０３５６】
別に、官能基化ビーズのさらに２つの１００μＬ部分を乾燥アセトニトリル（ＭｅＣＮ、Sigma Aldrich）で３回洗浄した。一方の部分を、ＭｅＣＮ中の１ｍＭフルオレセインイソチオシアネート異性体１（Sigma Aldrich）中に、ＭｅＣＮ中のトリエチレンジアミン（Sigma Aldrich）の１０ｍｇ／ｍＬ溶液０．６μＬと共に懸濁した。３７℃にて一晩回転させた後、ビーズをＭｅＣＮで３回洗浄し、次いで１００ｍＭ炭酸水素ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５で３回洗浄した。官能基化を確認するために、サンプルを上記のように酵素的に切断し、ＴＢＥゲル上で泳動した。フルオロフォアを観察するために、Syngene InGenius3ゲルドックシステムを使用してゲルを画像化し、次いで、ＴＢＥ中の５０μＬの１×Sybr goldで染色した。次に第二の画像を記録した。
【０３５７】
図７に示すように、ＲＮａｓｅ  Ａで処理した消化サンプルにおいて、染料なしのコントロールと比較して強いシグナルが見られ、これは切断された化合物の官能基化を示す。
【０３５８】
（８）スプリット・アンド・プール法を用いたタグ付けを伴うビーズ上の１００個のメンバーの機能的ライブラリの構築）
アジド官能基化ビーズのストックを、実施例４のセクション３に記載したように捕捉オリゴで官能基化した。次いで、このビーズストックを、切断可能なペイロードを有する切断可能なオリゴ（５’ATTCCCCTAGCTATGCAAGTrGrArGRrArArGrUX３’、ここでX＝３’−（Ｏ−プロパルギル）−アデノシン（ADTBio））と、実施例４（セクション４）に記載されているのと同じ技術を使用してライゲートした。血球計により、ビーズの数は５．６×１０６ビーズ／ｍＬであると測定された。このストック２００μＬを、ディープ９６ウェルプレート（Fisher）の１０個の別個のウェルに添加した。以下の説明では、特記しない限り、全てのストック溶液は１００ｍＭ  ＭＯＰＳ  ｐＨ７．０中で調製した。プレートを遠心分離し、１４０μＬの１００ｍＭ  ＭＯＰＳ  ｐＨ７．０、１００ｍＭを各占有ウェルに添加し、続いて２０μＬの５０ｍＭストックのトリス（３−ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル）アミン（Sigma-Aldrich）および１０μＬの２０ｍＭストックの２０ｍＭ硫酸銅（ＩＩ）（Sigma-Aldrich）を添加した。
【０３５９】
１０個の個々に選択されたアジド（１０μＬの５０ｍＭ  ＤＭＳＯ、Enamine）の１つをそれぞれの別個の占有されたウェルに加えた。２０μＬの１００ｍＭストックのアスコルビン酸ナトリウム（Sigma-Aldrich）を添加し、そして平らな密封キャップ（Fisher）を使用してプレートを密封した。プレートを振盪しながら室温にて１８時間インキュベートした。次いでプレートを遠心分離し、各占有ウェルを３×１ｍＬのヌクレアーゼフリー水（ＮＦＷ、Fisher）で洗浄し、次いで２５０μＬのクイックリガーゼ緩衝液２×（ＮＥＢ）に再懸濁した。
【０３６０】
２００μＬの５０ｍＭストックのコードオリゴ（配列GAAGGGTCGACTCCGXXXXXXXXXXGATGGGCATCATCCTを含み、ここでXXXXXXXXXは、２０個のユニークなコードオリゴのセレクションから選ばれたヌクレオチド（Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ）のランダム配列を表し、それぞれIntegrated DNA Technologies（ＩＤＴ）から入手）を各ウェルに加えた。５０μＬの１００μＭスプリンティングオリゴ（CTT AGT CGA CCC GGC AGG ATG ATG CCC AT/3ddC/，/3ddC＝ジデオキシシチジン、ＩＤＴ）を２．５μＬのクイックリガーゼ（ＮＥＢ）と共に加えた。プレートを密封し、そして振盪しながら３７℃にてインキュベートした。
【０３６１】
１０個のウェルに渡るビーズの各個々の集団は、特定のアジドと結び付けられたユニークなＤＮＡ配列でコード化されており、用いたビルディングブロックをスクリーニング後に追跡して化合物の構造を決定することを可能とした。２時間インキュベートした後、各ウェルを３×１ｍＬのＮＦＷで洗浄し、２００μＬの２００ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５に再懸濁した。次いで、各ウェルの内容物を１５ｍＬの遠心分離管内に２ｍＬの混合プールとして一緒に合わせ、ボルテックスによって完全に混合した後、新たなディープ９６ウェルプレート上の１０個の別個のウェルに２００μＬずつに等分（スプリット）した。プレートを遠心分離し、ビーズを１９０μＬの２００ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．５に再懸濁した。個々に選択された１０個のアルデヒドのうちの１つのストック（８３μＬの５０ｍＭ  ＤＭＳＯストック、Enamine）を個々のウェルに添加した。次いで、２６μＬの１０ｍｇ／ｍＬストックのシアノ水素化ホウ素ナトリウム（２００ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．５（Sigma-Aldrich）中）を各占有ウェルに添加した。プレートを密封し、振盪しながら室温で１８時間インキュベートした。全てのウェルをヌクレアーゼフリー水で３×１ｍＬ洗浄し、次いで２５０μＬのクイックリガーゼ緩衝液に再懸濁し、そしてアジドブロックについて前述したのと同じプロセスを用いて、各ウェルをユニークなコードオリゴとライゲートした。次いで、各ウェルを３×１ｍＬのＮＦＷで洗浄し、２００μＬのヌクレアーゼフリー水に再懸濁した後、１５ｍＬ遠心チューブ中の２ｍＬストックにプールした。ビーズをペレット化し、２００μＬの２×クイックリガーゼ緩衝液に再懸濁した。２００μＬの１００μＭストックのオリゴ（配列CGGGTCGACTTCGGTTAGACTTTCGGACCTGATGGGCATCATCCTを有する）を、１０μＬのクイックリガーゼ（New England Biolabs）と共に添加した。次いでビーズを回転させながら３７℃にて２時間インキュベートし、次いで１ｍＬの１０ｍＭトリスＨＣｌ＋１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ７．５で３回洗浄した。ビーズを１ｍＬのトリス緩衝液に再懸濁し、次いで必要になるまで４℃にて保存した。
【０３６２】
（同等）
前述の説明は、本発明の現在好ましい実施形態を詳述している。これらの説明を考慮すれば、それらの実施における多数の改変および変形が当業者には想起される。それらの改変および変形は、添付の特許請求の範囲内に包含されることが意図されている。
【図１】
2020503846.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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