(57)【要約】本発明は、生物試料からの核酸、好ましくはDNAの精製のための方法に関し、本方法は、(a)該試料の任意の溶解、(b)該試料の任意の熱インキュベーション、(c)工程(a)または(b)の生成物中の非核酸成分の酵素消化、(d)工程(c)で使用した1種または複数種の酵素の熱失活、(e)非核酸成分を保持することができる樹脂上への工程(d)の生成物の移動（核酸は樹脂を通過する）を含み、それによって核酸を精製する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程：
(a)試料の任意の溶解、
(b)該試料の任意の熱インキュベーション、
(c)工程(a)または(b)の生成物中の非核酸成分の酵素消化、
(d)工程(c)で使用した1種または複数種の酵素の熱失活、
(e)非核酸成分を保持することができる樹脂上への工程(d)の該生成物の移動であって、該核酸が樹脂を通過する、移動
を含み、それによって核酸を精製する、試料から核酸を単離するための方法。
【請求項２】
工程(b)の熱インキュベーションが、75℃〜95℃の温度で、1〜20分間、好ましくは2〜10分間行われる、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
界面活性剤が、工程(a)の生成物において、少なくとも20 mM SDS、少なくとも60 mM SDS、好ましくは、少なくとも100 mM SDS、少なくとも150 mM SDS、または200 mM SDSの終濃度まで、工程(a)の間に加えられる、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
工程(b)の熱インキュベーションが、少なくとも1分、少なくとも5分、少なくとも10分、少なくとも15分、または少なくとも20分行われる、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
1種または好ましくは複数種の酵素が、前記酵素消化のために工程(c)で使用され、該1種または複数種の酵素が溶解酵素であり、好ましくはプロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、ヒドロラーゼ、キチナーゼ、アミラーゼ、およびグルカナーゼからなる群より選択され、ヒドロラーゼがヌクレアーゼではない、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
工程(c)の酵素消化が15℃〜70℃で5分〜120分行われる、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
1種または複数種のプロテアーゼが工程(c)で使用され、該1種または複数種のプロテアーゼが、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）由来のプロテアーゼ、バチルス種（Bacillus spec.）由来のプロテアーゼ、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）由来のプロテアーゼ、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）由来のプロテアーゼ、ヒトヨタケ種（Coprinus spec.）由来のプロテアーゼ、およびコウジカビ（Aspergillus oryzae）由来のプロテアーゼからなる群より選択される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
アンモニウム塩および／または硫酸塩、好ましくは硫酸アンモニウムが、好ましくは少なくとも70 mM硫酸アンモニウムの終濃度まで、工程(a)において加えられる、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
工程(d)の生成物が、工程(e)で、60℃〜95℃の温度で前記樹脂上に加えられる、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
SrCl2および／またはBaCl2が、工程(e)における前記樹脂上への移動の前に、少なくとも400 mMの終濃度まで、工程(d)の生成物に加えられる、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
キレート剤が工程(a)で加えられ、好ましくはEDTAである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記試料が、糞便試料、血液試料、尿試料、組織試料、および／または体液試料である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記核酸が、DNAおよび／またはRNA、好ましくはDNAである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
遠心分離工程が工程(e)において実行され、前記樹脂上への工程(d)の生成物の移動の後に400 g〜3000 gで0.5分〜5分間、好ましくは約1分間実行される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記樹脂が、20〜2000 bpの範囲の1本鎖および／または2本鎖のヌクレオチド鎖の排除限界を有するサイズ排除樹脂である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記樹脂がスピンカラム中に組み込まれる、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
工程(d)の可溶化液が工程(e)において前記樹脂また前記スピンカラム上に加えられる前に、前記樹脂が、少なくとも300 gで少なくとも1分間遠心分離される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
工程(c)または工程(d)の可溶化液が、工程(e)において前記樹脂上に加えられる前に可溶化液を遠心分離することによって、好ましくは、約10.000 gで1〜5分間遠心分離することによって、沈殿物から除かれる、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
界面活性剤、DNA安定化剤、およびキレート剤を含む溶解緩衝液であって、該キレート剤が、少なくとも0.1または少なくとも1 mMの濃度で存在する、溶解緩衝液。
【請求項２０】
界面活性剤、DNA安定化剤、およびキレート剤を含む溶解緩衝液であって、該キレート剤が、少なくとも20 mg/Lの濃度で存在する、溶解緩衝液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、以下の工程：
(a)試料の任意の溶解、(b)該試料の任意の熱インキュベーション、(c)工程(a)または(b)の生成物中の非核酸成分の酵素消化、(d)工程(c)で使用した1種または複数種の酵素の熱失活、(e)非核酸成分を保持することができる樹脂上への工程（d)の生成物の移動であって、核酸が樹脂を通過する、移動
を含み、それによって核酸を精製する、試料から核酸を単離するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
分子解析のための、組織、細胞培養細胞、および血液試料からのゲノムDNAの単離は、一般に適用される技法である。この適用のための様々なプロトコールは、科学界内で過去数十年間にわたって開発されてきた。一般に最も使用される手法は、高濃縮のカオトロピック塩および有機溶媒の存在下におけるシリカ表面への核酸の結合である。
【０００３】
結合した核酸は、低塩緩衝液条件下でシリカ表面から最終的に溶出される添加された有機溶媒とともにまたは伴わず、カオトロープも含むいくつかの洗浄緩衝液で洗浄される。シリカベース精製の原理は、90％を超える市販キットで使用されている。この方法によって精製されるDNAは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、クローニング、シークエンシングなどのような下流の分子適用において使用される。シリカベース精製の欠点は以下の通りである：シリカ表面へのDNAの結合およびそこからのDNAの溶出で使用される、高塩で、しばしば有機溶媒を含有する緩衝液は、DNA含有溶出液中に持ち越され、それによって、下流の適用、特に高感度のPCRベースアッセイだけでなく、ライゲーションおよびシークエンシング反応のような他の酵素反応をも損なう、またはさらには阻害する危険性を示す。さらに、いわゆるポジティブクロマトグラフィーの根底にある結合−洗浄−溶出原理は、試料中に存在するDNAの低回収率につながる。手順は、多工程操作であり、多量のプラスチック廃棄物および危険な廃液を発生させる。
【０００４】
過去数十年間にわたって核酸抽出の分野で革新的な勢いがないので、この方法は、新規な組み合わせおよびセットアップ中で組み合わせる場合に核酸の単離のための革新的かつ改良された方法を作製することができる、新しい酵素配合物および界面活性剤と全く同様に、最新の分離マトリックスおよびフィルターが利用できるにも関わらず、依然として市場をリードする常法である。
【０００５】
ポジティブクロマトグラフィーの原理の不利な点を克服する1つの有望なアプローチは、リード物質（この場合、DNAおよび／またはRNAのような核酸）はマトリックスに結合しないが、代わりに夾雑物、抑制物質および望ましくない細胞残渣が結合し、一方で、DNAが精製された状態でカラムから離れる、ネガティブクロマトグラフィーの原理を適用することである。原理を逆転すると、結合−洗浄−溶出−プロトコールと比較して必要とされる工程がより少なくなり、より速い処理がもたらされる。これは、従来の核酸キット製品において招かれるプラスチック廃棄物の70％を超える低減につながる。同時に、水性緩衝液および無毒の試薬のみを使用することによって、危険な廃棄化学物質の発生も回避される。ポジティブクロマトグラフィー（これは、標的DNAが結合する）と比較したネガティブクロマトグラフィーの最大の利点の1つは、周知の、標的分子のより高い相対的回収である。結合−洗浄−溶出精製は、結合、洗浄、および溶出工程の間に標的分子を失うという危険性をもたらすが、ネガティブクロマトグラフィーは、精製が結合イベントに依存しないので、典型的には90％を超える標的を回収する。
【０００６】
ネガティブクロマトグラフィーそれ自体の原理は新しくなく、核酸のいくつかの「クリーンアップ」手順において既に用いられており、商品化されている。1工程手順を使用するDNA精製キットを販売する少数の供給業者も存在するが、これらの生成物のすべては、粗雑で不十分に開発されたプレカラムプロセス工程の理由から、低品質のDNA調製物をもたらし、これは、着色溶出液、低比率のOD260/OD230および／もしくはOD260/OD280、UV吸収性安定化剤（例えば、アジド）を含有する溶出液、または抑制物質含有溶出などを意味する。
【０００７】
核酸に対する高品質の精製手法としてネガティブクロマトグラフィーを用いるための鍵は、核酸が単離されることが意図されるそれぞれの試料（例えば、組織、血液、細胞培養細胞、細菌、植物細胞など）を効率的かつ完全に崩壊させるためのプレカラム工程にある。
【０００８】
環境的に有害な高塩溶液および有機溶媒の使用を回避する試料精製手法を開発するためのアプローチは、カオトロピック塩溶液の助けを借りずに試料または検体を十分に崩壊するという課題に直面している。それらは、タンパク質を変性させ、それによって、細胞膜を不安定化し、細胞壁および細胞膜の崩壊を促進する。その毒性の原因にもなる、カオトロピック塩のタンパク質変性の別の重要な効果は、RNaseおよびDNaseのようなヌクレアーゼ活性の阻害である。カオトロピック塩のこれら両方の主な活性によって、核酸精製方法におけるその使用が決定された。
【０００９】
これら化学物質の使用を排除しようとする試みは、異なるアプローチにおいて細胞膜の崩壊およびヌクレアーゼの阻害を達成するという課題をもたらす。同様の試みが行われ、発表されたが、低品質または低収率の方法しかもたらされなかった。例えば、核酸の分離の前の調製工程を含めた、核酸の精製のための方法は、WO 2011/124703 A1（特許文献1）で開示されている。
【００１０】
しかし、核酸の分離の前に生物試料を調製する、信頼できる向上した代替の方法の要求が依然として存在する。したがって、本出願の根底にある技術的問題は、この要求に応じることである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】WO 2011/124703 A1
【発明の概要】
【００１２】
本出願の発明者らは、説明、実施例および特許請求の範囲に例示するように、生物試料から単離される核酸の品質を向上させ、量を増大させる条件を予想外に発見した。これらの条件は、新規なプロテアーゼの使用、（NH4)2SO4の使用、SDSおよび／もしくはSrCl2濃度の増大、ヌクレアーゼの初期の熱失活、ならびに／または高温の溶解した生物試料を樹脂上へ移動することを特徴とする。
【００１３】
本発明は、下流のすべての分子適用に適した高品質のDNAを精製するために、ネガティブクロマトグラフィーの使用を可能にするアプローチを開示する。この向上した手順は、核酸精製を劇的に速め、ハンドリング工程の数を著しく減らし、試料に含まれる核酸の収率を著しく上げる。同時に、DNA溶出液中への高濃縮の塩または有機溶媒の共溶出による偽陰性の結果をもたらして、PCRおよび次世代シークエンシング（NGS）のような下流の解析を損なうまたは阻害する傾向がない。
【００１４】
本発明は、以下の工程：
（a)試料の任意の溶解、
（b)該試料の任意の熱インキュベーション、
（c)工程（a)または（b)の生成物中の非核酸成分の酵素消化、
（d)工程（c)で使用した1種または複数種の酵素の熱失活、
（e)非核酸成分を保持することができる樹脂上への、工程（d)の生成物の移動であって、核酸が樹脂を通過する、移動
を含み、それによって核酸を精製する、試料から核酸を単離するための方法に関する。
【００１５】
本発明の好ましい態様では、工程（b)の熱インキュベーションは、75℃〜95℃の温度で、1〜20分間、より好ましくは2〜10分間行われる。
【００１６】
本発明による方法では、界面活性剤は、工程（a)の生成物において、少なくともまたは約10 mMのSDS、少なくともまたは約20 mMのSDS、少なくともまたは約30 mMのSDS、少なくともまたは約40 mMのSDS、少なくともまたは約50 mMのSDS、少なくともまたは約60 mMのSDS、少なくともまたは約100 mMのSDS、少なくともまたは約 150 mMのSDS、少なくともまたは約200 mMのSDS、少なくともまたは約250 mMの終濃度まで、工程（a)の間で好ましくは加えられる。
【００１７】
本発明による方法の工程（b)の熱インキュベーションは、好ましくは、少なくとも1分、少なくとも5分、少なくとも10分、少なくとも15分、または少なくとも20分行われる。
【００１８】
本発明の好ましい態様では、1種または好ましくは複数種の酵素が酵素消化のために工程（c)で使用され、1種または複数種の酵素は溶解酵素であり、好ましくはプロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、ヒドロラーゼ、キチナーゼ、アミラーゼ、およびグルカナーゼからなる群より選択され、ヒドロラーゼはヌクレアーゼではない。
【００１９】
本発明のより好ましい態様では、工程（c)の溶解酵素は、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）由来のプロテアーゼ、バチルス種（Bacillus spec.）由来のプロテアーゼ、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）由来のプロテアーゼ、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）由来のプロテアーゼ、ヒトヨタケ種（Coprinus spec.）由来のプロテアーゼ、およびコウジカビ（Aspergillus oryzae）由来のプロテアーゼからなる群より選択される、1種または複数種、好ましくは複数種のプロテアーゼである。
【００２０】
本発明の方法による工程（c)の酵素消化は、好ましくは、15℃〜70℃で5分〜120分間行われる。
【００２１】
アンモニウム塩および／または硫酸塩、好ましくは硫酸アンモニウムは、本発明による方法において、好ましくは、工程（a)において、より好ましくは少なくとも70 mM硫酸アンモニウムの終濃度まで加えられる。あるいはまたはさらに、アンモニウム塩、例えば塩化アンモニウムを工程（a)において加えることができる。特に、少なくとも5 mM、10 mM、25 mM、50 mM、100 mM、120 mM、150 mM、180 mM、200 mM、225 mM、250 mM、275 mM、300 mM、350 mMまたはそれ以上を工程（a)において加えることができる。例えば、155 mM塩化アンモニウムを工程（a)において加えることができる。150 mM塩化アンモニウムを工程（a)において加えることができることも想定される。
【００２２】
本発明の方法による工程（d)の生成物は、本発明の方法による工程（e)の樹脂上に、60℃〜95℃の温度で好ましくは加えられる。
【００２３】
好ましくは、SrCl2および／またはBaCl2は、工程（e)における樹脂上への移動の前に、少なくとも400 mMの終濃度まで工程（d)の生成物に加えられる。
【００２４】
好ましくは、キレート剤、より好ましくはEDTAは、本発明の方法による工程（a)で加えられる。
【００２５】
本発明の方法による試料は、好ましくは、糞便試料、血液試料、尿試料、組織試料、および／または体液試料である。
【００２６】
本発明の核酸は、好ましくはDNAおよび／またはRNA、より好ましくはDNAである。
【００２７】
本発明の方法による工程（e)における遠心分離工程は、好ましくは、400 g〜3000 gで、0.5分〜5分間、より好ましくは約1分間実行される。本発明の方法による工程（e)における遠心分離工程は、好ましくは、樹脂上への工程（d)の生成物の移動の後に、400 g〜3000 gで、0.5分〜5分間、より好ましくは約1分間実行される。
【００２８】
本発明の方法による樹脂は、好ましくは、20〜2000 bpの範囲の1本鎖および／または2本鎖のヌクレオチド鎖の排除限界を有するサイズ排除樹脂である。
【００２９】
本発明の方法による樹脂は、好ましくは、遠心分離カラム中に組み込まれる。したがって、本発明の方法による樹脂は、スピンカラム中に組み込まれ得る。
【００３０】
本発明の方法による樹脂は、好ましくは、本発明の工程（d)の可溶化液が本発明の工程（e)における樹脂またはスピンカラム上へ加えられる前に、少なくとも300 gで少なくとも1分間遠心分離される。
【００３１】
工程（c)または工程（d)の本発明の方法による可溶化液は、好ましくは、工程（e)において樹脂上に加えられる前に可溶化液を遠心分離することによって、より好ましくは、10.000 gで1〜5分間遠心分離することによって、沈殿物から除かれる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】熱失活工程、溶解緩衝液中のEDTAおよび高SDS濃度の影響。実施例1に記載されているように試料を処理した。得られたDNAをアガロースゲル電気泳動にかけた。
【図２】溶解緩衝液中の硫酸アンモニウムの影響。実施例2に記載されているように試料を処理した。得られたDNAをアガロースゲル電気泳動にかけた。
【図３】新しいプロテアーゼの影響。実施例3に記載されているように試料を処理した。得られたDNAをアガロースゲル電気泳動にかけた。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
詳細な説明
定義
本明細書において使用する場合、用語「核酸」は、任意のタイプのDNAまたはRNA、ならびに任意のタイプのDNAおよびRNAの混合物を含む。
【００３４】
本明細書において使用する場合、「ポジティブクロマトグラフィー」は、本明細書において、濃縮される化合物をクロマトグラフィー装置中に保持し、望ましくない夾雑物、抑制物質および他の成分を洗い流し、濃縮される化合物を最終工程で溶出することによって、化合物を濃縮する方法を指す。「ネガティブクロマトグラフィー」は、本明細書において、望ましくない夾雑物をクロマトグラフィー装置および／または樹脂中に保持するが、濃縮される化合物はクロマトグラフィー装置を通過することによって、化合物を濃縮する方法を指す。
【００３５】
本明細書において使用する場合、用語「非核酸成分」は、溶液中のすべての非核酸化合物、特に、核酸のPCR、クローニング、ライゲーションおよび／またはシークエンシングのような、その後のまたは下流の適用を損なう、またはさらに阻害するものを含む。タンパク質、塩、カオトロピック剤、界面活性剤、有機または無機溶媒、色素、代謝物、試料残屑、低分子性分子（例えば、ヌクレオチドなど）および／またはPCR抑制物質が、用語「非核酸成分」に特に含まれる。
【００３６】
本明細書において使用する場合、用語「樹脂」は、結合パートナーと相互作用することができる不溶性のマトリックスまたは媒体を含む。典型的には、樹脂は、クロマトグラフィー手順において使用され、樹脂は、様々な成分をその特徴に応じて異なる程度まで保持し、それによって、溶液または混合物の様々な成分を分離する。
【００３７】
本明細書において使用する場合、「生物試料」は、核酸、好ましくはDNAを含む任意の生物材料を指す。一態様では、生物試料は、細菌、ウイルス、原生動物、クロミスタ、真菌、植物、および／または動物由来の細胞および／または無細胞核酸を含む。別の態様では、生物試料は真菌、植物、および／または動物から単離されるが、細菌、原生動物、クロミスタ、真菌、植物、および／または動物由来の細胞からなる生物試料を含むことができる。一態様では、動物は、脊椎動物、好ましくは、四足類、魚、および／または鳥、より好ましくは哺乳動物、さらにいっそう好ましくは、ウシ、ネコ、イヌ、ウマ、ブタ、ヒトを指す。本発明の別の好ましい態様では、動物は、生産／家畜のための動物を指す。本発明の追加的な態様では、生物試料は、法医学的な場合の試料を指す。
【００３８】
好ましい態様では、生物試料は、体液試料、環境試料、細胞培養試料、骨髄試料、汚水試料、食品試料、乳試料、法医学的試料、生体分子産生試料、タンパク質調製試料、脂質調製試料、炭水化物調製試料、およびそれらの任意の組み合わせであり、任意で、体液試料は、血液試料、血清試料、羊水試料、精液試料、リンパ液試料、脳脊髄液試料、鼻咽頭洗浄試料、痰試料、口スワブ試料、咽頭スワブ試料、鼻スワブ試料、気管支肺胞洗浄試料、気管支分泌試料、および尿試料のうちの1つである。
【００３９】
態様の詳細な説明
本発明の試料から核酸を単離するための方法は、以下の工程を含み、それによって核酸を精製する：
(a)試料の任意の溶解、
(b)該試料の任意の熱インキュベーション、
(c)工程(a)または(b)の生成物中の非核酸成分の酵素消化、
(d)工程(c)で使用した1種または複数種の酵素の熱失活、
(e)非核酸成分を保持することができる樹脂上への、工程(d)の生成物の移動であって、核酸が樹脂を通過する、移動。
【００４０】
本発明の好ましい態様を含むある特定の異なる態様は、以下の発明の詳細な説明に記載される。すべての核酸が本発明で想定されるが、DNAの精製が好ましい。
【００４１】
本発明の好ましい態様では、樹脂は、サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）に使用されるものである。好ましくは、移動相として、水系移動相、例えば、水、水性有機溶媒または水性緩衝液／溶液が使用される。SECは、分子がそのサイズに基づいて、またはより正確には、その流体力学的体積に基づいて分離される、クロマトグラフィー方法である。一般に、固形マトリックスは、水性媒質中に懸濁される場合にゲル床を形成することができる。そのような固形マトリックスの成分は、Sephadex、Sephacryl、架橋アガロース、シリカベースの材料、珪藻土、ポリスチレン／ジビニルベンゼン、および／またはセラミックヒドロキシアパタイトを含む。1種または複数種の成分を混合することもできる。1種または複数種の成分は、緩衝液中に懸濁され、カラムの中空体に充填される。カラムは、ガラス、プラスチック、Teflon、または移動相とも分析物とも反応しない任意の他の材料で作られてもよい。ビーズまたは非結晶粒子のサイズは、それぞれの樹脂またはカラム床上にロードされる体積および残屑の濃度に応じて、1μm〜500μm、好ましくは25μm〜400μmの平均直径の範囲におよび得る。
【００４２】
次いで、精製される試料はゲル床の上面に加えられ、重力によって、または遠心分離、真空、もしくは圧力によって力が加えられるかのいずれかで、ゲルを通過させられる。本発明内で、遠心力は、好ましくは、移動相をカラムの下に移動させるように加えられ、カラムは遠心分離機中で回転させられる（いわゆる、スピンカラム技法、「遠心分離カラム」）。樹脂の性質の理由から、ある特定のサイズの孔がゲルの内部に存在する。小分子は孔に侵入することができ、したがって、樹脂を通ってよりゆっくりと移動することができ、カラムの下へ通過して保持され得るが、大分子は孔に侵入することができず、カラムの下により速く移動できない。カラムを通過した後、精製された核酸を含む移動相（これから、「溶出液」と称される）が、次いで、カラムの出口部で収集される。カラムの中空体に樹脂を保持するために、多孔性のフリット、フィルター、フリース、または膜が、カラムの出口部と固形マトリックスの間に好ましくは設置され、すべてのサイズの核酸が、該フリット、フィルター、フリース、または膜を通過することができる。
【００４３】
SECでは、サイズ排除限界は、分子が固定相／樹脂中にトラップされるには大きすぎる核酸の分子量または長さを規定する。樹脂のサイズ排除限界は、樹脂の組成によって規定され、粒径、樹脂のタイプ、および架橋の程度の影響を受ける可能性がある。本発明の一態様では、樹脂のサイズ排除限界は、1〜106塩基対（bp）である。好ましい態様では、サイズ排除限界は5〜10000 bpであり、より好ましい態様では、サイズ排除限界は20〜2000 bpの範囲である。本明細書において使用する場合、単位「塩基対」（bp）および「ヌクレオチド」（nt）は、互換的に使用され得る。
【００４４】
樹脂は、好ましくはカラム中に組み込まれる。このカラムは入口部および出口部を有する中空体を含み、中空体はサイズ排除性を与える固形マトリックスを含む。好ましくはこれは、好ましくは任意のサイズの核酸を通過させ、カラム内で樹脂を保持するように出口部と樹脂の間に設置された、多孔性のフリット、フィルター、フリース、または膜をさらに含む。カラムは、任意で、多孔性のフリット、フィルター、フリース、または膜と樹脂の間に設置され、移動相が樹脂を通過することなくフリットに進入するのを防止するために、フリット、フィルター、フリース、または膜の外部領域を密閉する、非多孔性リングを含む。さらに、任意で、カラムは、クロマトグラフィーユニットの入口部および／または出口部を密閉するために、少なくとも1つの除去可能な閉鎖装置を含む。さらに任意で、カラムは、樹脂を通過した後に移動相（溶出液）を収集するために、少なくとも1つの収集チューブを含む。カラムの材料は、ガラス、ポリプロピレン、ポリカーボネート、またはポリエチレンからなる群より選択され得る。
【００４５】
例えば、糞便試料、血液試料、組織試料、および／または体液試料のような生物試料の溶解は、この精製プロトコールのその後の工程に極めて重要である。しかし、例えば尿試料のようないくつかの試料に関しては、溶解は任意である。溶解工程は任意であり得るが、熱インキュベーション工程(b)は、依然として必要であり得る。試料の完全な溶解に不可欠なことは、溶解酵素の選択および活性、界面活性剤およびそれぞれの濃度、インキュベーション時間およびインキュベーション温度である。
【００４６】
溶解工程は、例えば工程(a)で、本明細書において記載される界面活性剤、キレート剤、または他の物質／成分が加えられ、溶解され得る緩衝物質の使用を含むことができる。緩衝物質は、当業者に公知の任意の緩衝物質でもよい。非限定例としては、TRIS、例えばTRIS-HCl、酒石酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、HEPES、HPPS、または任意のアンモニア緩衝液が挙げられる。緩衝物質を、5 mM、10 mM、15 mM、20 mM、25 mM、50 mM、75 mM、100 mM、125 mM、150 mM、175 mM、200 mM、250 mMまたはそれ以上の濃度で工程(a)の間に加えることができることが想定される。例えば、25 mMの緩衝物質、例えばTRIS/HClを工程(a)の間に加えることができる。50 mMの緩衝物質、例えばTRIS/HClを工程(a)の間に加えることができるも想定される。さらにまたは代わりに、50 mMの緩衝物質、例えば、酒石酸、ホウ酸、炭酸、またはクエン酸を工程(a)の間に加えることができる。試料の溶解に適した様々な界面活性剤が利用可能である。核酸精製のための生物試料の溶解に有用なものの重要な特色は、細胞を溶解する能力であり、任意の特色として、ヌクレアーゼの活性を阻害する能力である。一態様では、界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、Triton X-100、Triton X-114、NP-40、Brij-35、Brij-58、Tween 20、Tween 80、オクチルグルコシド、オクチルチオグルコシド、3−［（3-コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−1−プロパンスルホネート（CHAPS）、および／または3−［（3−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−2−ヒドロキシ−1−プロパンスルホネート（CHAPSO）である。界面活性剤はまた、ドデシル硫酸リチウム（LiDS）でもよい。好ましい態様では、生物試料の溶解に使用される界面活性剤は、SDSおよび／またはその誘導体である。したがって、生物試料の溶解に使用される界面活性剤はドデシル硫酸リチウムでもよい。
【００４７】
一態様では、界面活性剤の濃度は少なくとも1 mMである。別の態様では、濃度は最大で100 mM SDSである。さらに別の態様では、濃度は少なくとも10 mM、20 mM、30 mM、40 mM、50 mM、少なくとも60 mM、少なくとも100 mM、少なくとも150 mM、少なくとも200 mM、または少なくとも300 mMである。好ましい態様では、界面活性剤の濃度は少なくとも100 mMである。別の好ましい態様では、界面活性剤の濃度は100 mMを超える（100 mMを除く）。より好ましい態様では、界面活性剤は、工程(a)の生成物において、少なくとも60 mM SDS、好ましくは少なくとも100 mM SDSの終濃度まで、工程(a)の間に加えられる。したがって、例えばSDSなどの界面活性剤は、工程(a)の生成物において、少なくとも110 mM、120 mM、130 mM、140 mM、150 mM、160 mM、170 mM、180 mM、190 mM、200 mM、210 mM、220 mM、230 mM、240 mM、250 mM、260 mM、270 mM、280 mM、290 mM、300 mM、400 mM、500 mMまたはそれ以上の終濃度まで、工程(a)の間に加えられ得る。
【００４８】
一態様では、ドデシル硫酸リチウムの濃度は少なくとも1 mMである。別の態様では、濃度は最大で300 mMドデシル硫酸リチウムである。さらに別の態様では、ドデシル硫酸リチウムの濃度は少なくともまたは約10 mM、少なくともまたは約20 mM、少なくともまたは約30 mM、少なくともまたは約40 mM、少なくともまたは約50 mM、少なくともまたは約60 mM、少なくともまたは約100 mM、少なくともまたは約150 mM、少なくともまたは約200 mM、少なくともまたは約250 mM、または少なくともまたは約300 mMである。好ましい態様では、ドデシル硫酸リチウムなどの界面活性剤の濃度は約100 mMである。
【００４９】
一態様では、SDSの濃度は少なくとも1 mMである。別の態様では、濃度は最大で300 mM SDSである。さらに別の態様では、SDSの濃度は、少なくともまたは約10 mM、少なくともまたは約20 mM、少なくともまたは約30 mM、少なくともまたは約0 mM、少なくともまたは約50 mM、少なくともまたは約60 mM、少なくともまたは約100 mM、少なくともまたは約150 mM、少なくともまたは約200 mM、少なくともまたは約250 mM、または少なくともまたは約300 mMである。好ましい態様では、SDSなどの界面活性剤の濃度は約100 mMである。
【００５０】
溶解工程が強酸などの酸の使用を含まないことが、さらに想定される。例えば、溶解工程は硫酸（H2SO4）の使用を含まなくてもよい。本明細書において記載される方法がH2SO4の非存在下で実施されることが、さらに想定される。したがって、本発明の方法の工程(a)〜(e)はすべて、H2SO4の添加なしで実施することができる。
【００５１】
効率的な溶解の別の重要な因子はインキュベーション時間である。溶解は、任意の適切な時間量にわたって行うことができる。溶解は、少なくとも1分、少なくとも2分、少なくとも5分、少なくとも10分、少なくとも15分、少なくとも20分、少なくとも30分、少なくとも45分、または少なくとも60分にわたって行うことができる。インキュベーション時間は、生物試料のタイプに依存し得る。他の態様では、インキュベーション時間は、1〜20分の範囲であり、好ましい態様では、2〜15分であり、より好ましい態様では、2〜10分の範囲である。
【００５２】
効率的な溶解の別の重要な因子は、溶解が起こるpHである。溶解は、任意の適切なpHで行うことができる。例えば、溶解は、5〜15のpHで実施することができる。pHはまた、7〜13でもよい。pHはまた、7〜10、7〜9、または7〜8.5でもよい。pHはまた、8.0〜8.5でもよい。好ましくは、pHはHClなどの酸で調整される。ヌクレアーゼの失活は、任意の熱インキュベーション工程(b)によって促進され得る。この任意の熱インキュベーション工程は、75℃〜95℃の温度で行われる。本発明のさらに好ましい態様では、工程(b)の熱インキュベーションは1〜20分間、より好ましくは2〜10分間行われる。本発明のより好ましい態様では、工程(b)の熱インキュベーションは、75〜95℃の温度で、さらにいっそう好ましくは80〜95℃の温度で、1〜20分間、さらにいっそう好ましくは2〜10分間行われる。
【００５３】
樹脂上における非核酸成分からの核酸のその後の分離のための、生物試料の速くかつ効率的な調製に寄与する別の不可欠な因子は、そうした非核酸成分の酵素消化である。非核酸成分の酵素処理は非核酸成分の（流体力学的）サイズを低下させ、それによって、樹脂との相互作用を増大させる。したがって、非核酸成分は樹脂によってより多くの量が保持され、非核酸成分からの核酸の分離が向上する。本発明の一態様では、酵素、好ましくは、溶解酵素は、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、ヒドロラーゼ、キチナーゼ、アミラーゼ、およびグルカナーゼからなる群より選択され、ヒドロラーゼはヌクレアーゼではない。ヒドロラーゼの群はヌクレアーゼを含むが、本発明の方法の目的が核酸を単離することであるので、本明細書において使用する場合、用語「ヒドロラーゼ」はヌクレアーゼを含まない。そのような酵素群の1種または複数種の酵素のどの組み合わせもみな、本発明に包含される。本発明の好ましい態様では、1種または好ましくは複数種の酵素が酵素消化のために工程(c)で使用され、1種または複数種の酵素は溶解酵素であり、好ましくはプロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、ヒドロラーゼ、キチナーゼ、アミラーゼ、およびグルカナーゼからなる群より選択される。
【００５４】
好ましい態様では、プロテアーゼが、タンパク質性非核酸成分の消化のために使用される。一般に、1種または複数種の異なるプロテアーゼが、酵素消化に使用され得る。本発明のより好ましい態様では、1種または複数種のプロテアーゼは工程(c)で使用され、1種または複数種のプロテアーゼは、バチルス・リケニフォルミス由来のプロテアーゼ、バチルス種由来のプロテアーゼ、黄色ブドウ球菌由来のプロテアーゼ、バチルス・アミロリケファシエンス由来のプロテアーゼ、ヒトヨタケ種由来のプロテアーゼ、およびコウジカビ由来のプロテアーゼからなる群より選択される。別の態様では、1種または複数種のプロテアーゼは工程(c)で使用され、1種または複数種のプロテアーゼは、バチルス・リケニフォルミス由来のプロテアーゼ、バチルス種由来のプロテアーゼ、黄色ブドウ球菌由来のプロテアーゼ、バチルス・アミロリケファシエンス由来のプロテアーゼ、およびコウジカビ由来のプロテアーゼからなる群より選択される。プロテアーゼの異なる組み合わせの選択は、生物試料に依存する。
【００５５】
酵素消化が起こるインキュベーションの時間および温度も、酵素消化の効率を決定する。一態様では、酵素消化のためのインキュベーション時間は、1〜240分の範囲、好ましくは5〜120分の範囲である。酵素消化が行われる温度は、一態様では、4〜95℃の範囲である。別の態様では、温度は、4〜55℃の範囲、55〜65℃の範囲、または65〜95℃の範囲である。好ましい態様では、インキュベーション温度は15〜70℃の範囲である。より好ましい態様では、インキュベーション温度は15〜65℃の範囲である。当業者は、当技術分野において公知の標準的な手順を使用して、効率的な酵素消化に必要とされる時間および温度を容易に決定することができる。
【００５６】
好ましくは、工程(c)で使用される酵素は、工程(c)の生成物を加熱することによって失活させることができる。この熱失活は、核酸を精製した後に、それに続く適用を妨害することを防止する。一態様では、工程(c)の生成物は、75〜95℃の、好ましくは90〜95℃の範囲の温度まで加熱される。別の態様では、工程(c)の生成物は、2〜10分間、好ましくは5〜10分間加熱される。別の態様では、工程(c)の生成物は、75〜95℃、好ましくは90〜95℃の範囲の温度まで、2〜10分間、好ましくは5〜10分間加熱される。
【００５７】
好ましい態様では、工程(c)の酵素消化は15℃〜70℃で5分〜120分行われ、任意で、その後に、工程(c)で使用される1種または複数種の酵素の75〜95℃で2〜10分間の熱失活が続く。
【００５８】
本発明によって単離される核酸、好ましくはDNAの品質を向上させるために、および分解を防止するために、「DNA安定化剤」を本発明のある特定の態様の工程(a)で加えることができる。一態様では、アンモニウム塩、例えば、塩化アンモニウム、および／または硫酸塩がDNA安定化剤として使用され、工程(a)で加えられる。別のDNA安定化剤は塩化カルシウム（CaCl2）でもよく、これを、さらにまたは代わりに、工程(a)で加えることができる。好ましい態様では、硫酸アンモニウムがDNA安定化剤として使用され、工程(a)の生物試料に加えられる。一態様では、DNA安定化剤の濃度は、少なくとも1 mM、少なくとも5 mM、少なくとも10 mM、少なくとも50 mM、少なくとも70 mM、少なくとも100 mM、少なくとも150 mM、少なくとも180 mM、少なくとも200 mM、少なくとも250 mM、少なくとも500 mMまたは少なくとも1 Mである。好ましい態様では、DNA安定化剤の濃度は少なくとも70 mMである。別の好ましい態様では、アンモニウム塩、例えば、塩化アンモニウム、および／または硫酸塩、より好ましくは硫酸アンモニウムが、より好ましくは少なくとも70 mM硫酸アンモニウムの終濃度まで、工程(a)において加えられる。さらにまたは代わりに、150 mM塩化アンモニウムを工程(a)の間に加えることができる。さらにまたは代わりに、155 mM塩化アンモニウムを工程(a)の間に加えることができる。
【００５９】
さらなる添加剤を本発明のある特定の態様の工程(a)において加えることができる。例えば、塩化カルシウムを本発明のある特定の態様の工程(a)において加えることができる。少なくとも0.5 mM、1 mM、2 mM、3 mM、4 mM、5 mM、6 mM、7 mM、8 mM、9 mM、10 mMまたはそれ以上のCaCl2が工程(a)において加えられることが想定される。例えば、5 mM CaCl2が工程(a)において加えられる。
【００６０】
工程(e)の樹脂上への工程(c)または(d)の生成物のローディングは、4〜95℃の範囲の温度で行うことができる。しかし、工程(e)の樹脂上への工程(c)または(d)の高温の生成物のローディングが利点を示すので、工程(e)の樹脂へ工程(c)または(d)の高温の生成物を加えることが好ましい。好ましい態様では、工程(c)または(d)の生成物の温度は、工程(e)の樹脂へ加えられる前に、60〜95℃、70〜95℃、80〜95℃、90〜95℃、60〜70℃、60〜80℃、または70〜80℃の範囲である。好ましい態様では、工程(d)の生成物は、60〜95℃の温度で工程(e)の樹脂上へ加えられる。
【００６１】
望ましくない非核酸成分の沈殿は、工程(e)の樹脂上への移動の前にアルカリ金属の塩および／またはアルカリ土類金属の塩を工程(d)の生成物に加えることによって、促進され得る。原理上は、任意の適切なアルカリ金属の塩および／またはアルカリ土類金属の塩を使用することができる。好ましい態様では、SrCl2および／またはBaCl2が、工程(e)の樹脂上への移動の前に工程(d)の生成物に加えられる。SrCl2、BaCl2、RbCl、CsCl、CaCl2が、工程(e)の樹脂上への移動の前に工程(d)の生成物に加えられることも想定される。
【００６２】
一態様では、アルカリ土類金属塩および／またはアルカリ金属の塩の終濃度は、少なくとも1 mM、少なくとも5 mM、少なくとも10 mM、少なくとも50 mM、少なくとも100 mM、少なくとも150 mM、少なくとも180 mM、少なくとも200 mM、少なくとも250 mM、少なくとも400 mM、少なくとも500 mM 少なくとも1 M、少なくとも1.25 mM、少なくとも1.5 mM、少なくとも1.75 mM、少なくとも2 mM、少なくとも2.25 mM、少なくとも2.5 mM、少なくとも2.75 mM、少なくとも3 mMまたはそれ以上である。好ましい態様では、アルカリ土類金属塩および／またはアルカリ金属の塩の濃度は少なくとも400 mMである。例えば、アルカリ土類金属塩および／またはアルカリ金属の塩の濃度は、少なくとも1.5 mM、2 mM、または2.5 mMである。より好ましい態様では、SrCl2および／またはBaCl2および／またはRbClおよび／またはCsClおよび／またはCaCl2が、工程(e)における樹脂上への移動の前に、少なくとも400 mMの終濃度まで工程(d)の生成物に加えられる。
【００６３】
任意で、遠心力を加え、それによって、工程(d)の生成物の遠心分離に使用される容器の底部に不溶性沈殿物を押し込むことによって、沈殿した物質は工程(d)の生成物から除くことができる。次いで、清澄化された上清を、工程(e)の樹脂上へ加えることができる。本発明の好ましい態様では、工程(c)または工程(d)の可溶化液は、工程(e)において樹脂上に加えられる前に可溶化液を遠心分離することによって、好ましくは、約10000 gで1〜5分間遠心分離することによって、沈殿物から除かれる。
【００６４】
任意で、キレート剤を工程(a)で生物試料に加えることができる。金属イオンに結合するキレート剤は、核酸の安定性において特に興味深いものである。多くのDNaseが、その活性に対する補助因子としてZn2+を使用し、キレート剤の使用は、補助因子を取り除くことによって、そうしたDNaseを阻害する。一態様では、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）および／またはエチレングリコール−ビス（β-アミノエチルエーテル）−N,N,N',N'−テトラ酢酸（EGTA）がキレート剤として使用される。好ましい態様では、EDTAがキレート剤として使用される。キレート剤の濃度は、好ましくは、少なくとも0.1 mM、0.2 mM、0.3 mM、0.4 mM、0.5 mM、0.6 mM、0.7 mM、0.8 mM、0.9 mM、1 mM、少なくとも5 mM、少なくとも10 mM、少なくとも50 mM、少なくとも100 mM、少なくとも150 mM、少なくとも180 mM、少なくとも200 mM、少なくとも250 mM、少なくとも400 mM、少なくとも500 mMまたは少なくとも1 Mである。キレート剤、例えばEDTAは、約10 mMの、約1 mMの、または約0.1 mMの濃度で使用することができる。好ましい態様では、キレート剤は、工程(a)で生物試料に加えられる。したがって、工程(a)において実施される溶解は、少なくとも0.1 mM、0.6 mM、1 mM、または2 mMのキレート剤、例えばEDTAの存在を含む。工程(a)において実施される溶解が、少なくとも20 mg/L、25 mg/L、30 mg/L、35 mg/L、40 mg/L、45 mg/L、50 mg/L、55 mg/L、60 mg/L、65 mg/L、70 mg/L、75 mg/L、80 mg/L、90 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、300 mg/L、400 mg/L、500 mg/Lまたはそれ以上のキレート剤、例えばEDTAの存在を含むことも意図される。1種を超えるキレート剤が工程(a)で生物試料に加えられることも想定される。
【００６５】
本明細書において記載される界面活性剤およびDNA安定化剤を、工程(a)で生物試料に加えることができることが意図される。したがって、塩化アンモニウムおよびSDSを工程(a)で生物試料に加えることができる。さらに、キレート剤（0.1 mMを超える、もしくは1 mMを超えるかもしくは約1 mMの、もしくは20 mg/Lを超えるキレート剤が使用される）および／または緩衝物質を、工程(a)で生物試料に加えることができる。例えば、酒石酸緩衝液、ドデシル硫酸リチウム、および塩化アンモニウム、ならびにEDTAを、工程(a)で生物試料に加えることができる。したがって、約50 mM酒石酸、約100 mMドデシル硫酸リチウム、約155 mM塩化アンモニウム、および少なくとも0.1 mMの、もしくは少なくとも1 mMの、または20 mg/Lを超えるキレート剤、例えばEDTAを、工程(a)で生物試料に加えることができる。工程(a)における溶解が約8.3のpHで実施されることが想定される。溶解がH2SO4の非存在下で実施されることがさらに意図される。
【００６６】
本明細書において記載される界面活性剤、DNA安定化剤、およびキレート剤を、工程(a)で生物試料に加えることができることも想定される。例えば、ドデシル硫酸リチウム、塩化アンモニウム、およびEDTAを工、程(a)で生物試料に加えることができる。SDS、EDTA、および塩化アンモニウムも、工程(a)で生物試料に加えることができる。さらに、緩衝物質を工程(a)で生物試料に加えることができる。
【００６７】
例えば、約100 mMドデシル硫酸リチウム、約155 mM塩化アンモニウム、および少なくとも0.1 mMもしくは少なくとも1 mMまたは少なくとも20 mg/Lのキレート剤を、工程(a)で生物試料に加えることができる。好ましくは、溶解は約8.3のpHで実施される。好ましくは、溶解はH2SO4の非存在下で実施される。例えば、酒石酸緩衝液などの緩衝物質を、工程(a)で生物試料に加えることができる。例えば、50 mMの酒石酸を工程(a)で生物試料に加えることができる。
【００６８】
例えば、約100 mM SDS、約150 mM塩化アンモニウム、および少なくとも0.1 mMの、もしくは少なくとも1 mMの、または20 mg/Lを超えるキレート剤を、工程(a)で生物試料に加えることができる。溶解が約8.0のpHで実施されることが意図される。好ましくは、溶解はH2SO4の非存在下で実施される。例えば、TRISまたはTRIS/HClなどの緩衝物質、例えば、50 mMのTRISまたはTRIS/HClを、工程(a)で生物試料に加えることができる。
【００６９】
界面活性剤、DNA安定化剤、およびキレート剤、例えば少なくとも1 mMの本明細書において記載されるキレート剤を、工程(a)で生物試料に加えることができることも意図される。例えば、EDTA、SDS、および塩化アンモニウムを、工程(a)で生物試料に加えることができる。さらに、DNA安定化剤であるCaCl2を、工程(a)で生物試料に加えることができる。例えば、約100 mM SDS、約150 mM塩化アンモニウム、および約0.1〜15 mMもしくは1 mM〜15 mM（または少なくとも20 mg/L）のキレート剤、例えばEDTA（Na/EDTA）を、工程(a)で生物試料に加えることができる。任意で、約5 mM CaCl2および／または緩衝物質を工程(a)で生物試料にさらに加えることができる。溶解がH2SO4の非存在下で実施されることが想定される。
【００７０】
通過画分が樹脂から外に出るのを促進するために遠心力が使用される本発明の一態様では、遠心分離工程は、樹脂上への工程(d)の生成物の移動の後に、工程(e)において、400 g〜3000 gで0.5〜5分間実行される。この遅い遠心分離によって、単離核酸、好ましくはDNAの品質および量が高まる。好ましくは、工程(e)における遠心分離工程は、樹脂上への工程(d)の生成物の移動の後に、400 g〜3000 gで0.5分〜5分間、より好ましくは約1分間実行される。
【００７１】
溶出液の体積を低下させ、それによって、溶出液中の核酸の濃度を増大させるために、高い遠心力を樹脂に加えることが可能であり、これは、本明細書において「前処理」と称される。好ましい態様では、樹脂は、工程(d)の可溶化液が工程(e)において樹脂またはスピンカラム上に加えられる前に、少なくとも300 gで少なくとも1分間遠心分離される。
【００７２】
以下において、核酸の精製のための上記の必須および任意の工程の異なる組み合わせを含む態様を提示する。
【００７３】
本発明の一態様では、以下の工程からなり、それによって核酸を精製する、核酸を単離するための方法が行われる：
(a)試料の任意の溶解、
(b)該試料の任意の熱インキュベーション、
(c)工程(a)または(b)の生成物中の非核酸成分の酵素消化、
(d)工程(c)で使用した1種または複数種の酵素の熱失活、
(e)非核酸成分を保持することができる樹脂上への、工程(d)の生成物の移動であって、核酸が樹脂を通過する、移動。
【００７４】
本発明の好ましい態様では、以下の工程からなり、それによって核酸を精製する、核酸を単離するための方法が行われる：
(a)試料の溶解、
(b)該試料の熱インキュベーション、
(c)工程(a)または(b)の生成物中の非核酸成分の酵素消化、
(d)工程(c)で使用した1種または複数種の酵素の熱失活、
(e)非核酸成分を保持することができる樹脂上への、工程(d)の生成物の移動であって、核酸が樹脂を通過する、移動。
【００７５】
本発明の好ましい態様では、以下の工程を含み、それによって核酸を精製する、核酸を単離するための方法が行われる：
(a)試料の任意の溶解、
(b)該試料の任意の熱インキュベーション、
(c)工程(a)または(b)の生成物中の非核酸成分の酵素消化であって、1種または複数種のプロテアーゼが使用され、1種または複数種のプロテアーゼが、バチルス・リケニフォルミス由来のプロテアーゼ、バチルス種由来のプロテアーゼ、黄色ブドウ球菌由来のプロテアーゼ、バチルス・アミロリケファシエンス由来のプロテアーゼ、ヒトヨタケ種由来のプロテアーゼ、およびコウジカビ由来のプロテアーゼからなる群より選択される、酵素消化、
(d)工程(c)で使用した1種または複数種の酵素の熱失活、
(e)非核酸成分を保持することができる樹脂上への、工程(d)の生成物の移動であって、核酸が樹脂を通過する、移動。
【００７６】
本発明の好ましい態様では、以下の工程を含み、それによって核酸を精製する、核酸を単離するための方法が行われる：
(a)界面活性剤が、少なくとも20 mM SDS、少なくとも60 mM SDS、好ましくは少なくとも100 mM SDS、少なくとも150 mM SDS、または少なくとも200 mM SDSの終濃度まで加えられ、アンモニウム塩、例えば、塩化アンモニウム、および／または硫酸塩、好ましくは硫酸アンモニウムが加えられ、好ましくは、硫酸アンモニウムまたは塩化アンモニウムが少なくとも70 mMの終濃度まで加えられる、試料の任意の溶解、
(b)該試料の任意の熱インキュベーション、
(c)工程(a)または(b)の生成物中の非核酸成分の酵素消化であって、1種または複数種のプロテアーゼが使用され、1種または複数種のプロテアーゼが、バチルス・リケニフォルミス由来のプロテアーゼ、バチルス種由来のプロテアーゼ、黄色ブドウ球菌由来のプロテアーゼ、バチルス・アミロリケファシエンス由来のプロテアーゼ、ヒトヨタケ種由来のプロテアーゼ、およびコウジカビ由来のプロテアーゼからなる群より選択される、酵素消化、
(d)工程(c)で使用した1種または複数種の酵素の熱失活、
(e)非核酸成分を保持することができる樹脂上への、工程(d)の生成物の移動であって、核酸が樹脂を通過する、移動。
【００７７】
本発明の好ましい態様では、以下の工程を含み、それによって核酸を精製する、核酸を単離するための方法が行われる：
(a)アンモニウム塩、例えば、塩化アンモニウム、および／または硫酸塩、好ましくは硫酸アンモニウムが、好ましくは、少なくとも50または少なくとも70 mMの硫酸アンモニウムまたは塩化アンモニウムの終濃度まで加えられ、界面活性剤が、少なくとも20 mM、少なくとも60 mM SDS、好ましくは、少なくとも100 mM SDS、少なくとも150 mM SDS、または少なくとも200 mM SDSの終濃度まで加えられる、試料の任意の溶解、
(b)該試料の任意の熱インキュベーション、
(c)工程(a)または(b)の生成物中の非核酸成分の酵素消化であって、1種または複数種のプロテアーゼが使用され、1種または複数種のプロテアーゼが、バチルス・リケニフォルミス由来のプロテアーゼ、バチルス種由来のプロテアーゼ、黄色ブドウ球菌由来のプロテアーゼ、バチルス・アミロリケファシエンス由来のプロテアーゼ、ヒトヨタケ種由来のプロテアーゼ、およびコウジカビ由来のプロテアーゼからなる群より選択される、酵素消化、
(d)工程(c)で使用した1種または複数種の酵素の熱失活、
(e)非核酸成分を保持することができる樹脂上への、工程(d)の生成物の移動であって、核酸が樹脂を通過し、SrCl2および／またはBaCl2が、工程(e)の樹脂上への移動の前に、少なくとも400 mMの終濃度まで工程(c)または(d)の生成物に加えられている、移動。
【００７８】
本発明の好ましい態様では、以下の工程を含み、それによって核酸を精製する、核酸を単離するための方法が行われる：
(a)アンモニウム塩、例えば、塩化アンモニウム、および／または硫酸塩、好ましくは硫酸アンモニウムが、好ましくは、少なくとも50 mMまたは少なくとも70 mMの硫酸アンモニウムまたは塩化アンモニウムの終濃度まで加えられ、界面活性剤が、少なくとも20 mM SDS、少なくとも60 mM SDS、好ましくは、少なくとも100 mM SDS、少なくとも150 mM SDS、または少なくとも200 mM SDSの終濃度まで加えられる、試料の任意の溶解、
(b)該試料の熱インキュベーション、
(c)工程(a)または(b)の生成物中の非核酸成分の酵素消化であって、1種または複数種のプロテアーゼが使用され、1種または複数種のプロテアーゼが、バチルス・リケニフォルミス由来のプロテアーゼ、バチルス種由来のプロテアーゼ、黄色ブドウ球菌由来のプロテアーゼ、バチルス・アミロリケファシエンス由来のプロテアーゼ、ヒトヨタケ種由来のプロテアーゼ、およびコウジカビ由来のプロテアーゼからなる群より選択される、酵素消化、
(d)工程(c)で使用した1種または複数種の酵素の熱失活、
(e)非核酸成分を保持することができる樹脂上への、工程(d)の生成物の移動であって、核酸が樹脂を通過し、SrCl2および／またはBaCl2が、工程(e)の樹脂上への移動の前に、少なくとも400 mMの終濃度まで工程(c)または(d)の生成物に加えられている、移動。
【００７９】
本発明の好ましい態様では、以下の工程を含み、それによって核酸を精製する、核酸を単離するための方法が行われる：
(a)アンモニウム塩、例えば、塩化アンモニウム、および／または硫酸塩、好ましくは硫酸アンモニウムが、好ましくは、少なくとも50 mMまたは少なくとも70 mMの硫酸アンモニウムまたは塩化アンモニウムの終濃度まで加えられ、界面活性剤が、少なくとも20 mM SDS、少なくとも60 mM SDS、好ましくは、少なくとも100 mM SDS、少なくとも150 mM SDS、または少なくとも200 mM SDSの終濃度まで加えられる、試料の任意の溶解、
(b)該試料の熱インキュベーション、
(c)工程(a)または(b)の生成物中の非核酸成分の酵素消化であって、1種または複数種のプロテアーゼが使用され、1種または複数種のプロテアーゼが、バチルス・リケニフォルミス由来のプロテアーゼ、バチルス種由来のプロテアーゼ、黄色ブドウ球菌由来のプロテアーゼ、バチルス・アミロリケファシエンス由来のプロテアーゼ、ヒトヨタケ種由来のプロテアーゼ、およびコウジカビ由来のプロテアーゼからなる群より選択される、酵素消化、
(d)工程(c)で使用した1種または複数種の酵素の熱失活、
(e)非核酸成分を保持することができる樹脂上への、工程(d)の生成物の移動であって、核酸が樹脂を通過し、SrCl2および／またはBaCl2が、工程(e)の樹脂上への移動の前に、少なくとも400 mMの終濃度まで工程(c)または(d)の生成物に加えられており、工程(c)または(d)の生成物が60℃〜95℃の温度で樹脂上に加えられる、移動。
【００８０】
本発明の好ましい態様では、以下の工程を含み、それによって核酸を精製する、核酸を単離するための方法が行われる：
(a)アンモニウム塩、例えば、塩化アンモニウム、および／または硫酸塩、好ましくは硫酸アンモニウムが、好ましくは、少なくとも50 mMまたは少なくとも70 mMの硫酸アンモニウムまたは塩化アンモニウムの終濃度まで加えられ、界面活性剤が、少なくとも20 mM SDS、少なくとも60 mM SDS、好ましくは、少なくとも100 mM SDS、少なくとも150 mM SDS、または少なくとも200 mM SDSの終濃度まで加えられる、試料の任意の溶解、
(b)該試料の任意の熱インキュベーション、
(c)工程(a)または(b)の生成物中の非核酸成分の酵素消化であって、1種または複数種のプロテアーゼが使用され、1種または複数種のプロテアーゼが、バチルス・リケニフォルミス由来のプロテアーゼ、バチルス種由来のプロテアーゼ、黄色ブドウ球菌由来のプロテアーゼ、バチルス・アミロリケファシエンス由来のプロテアーゼ、ヒトヨタケ種由来のプロテアーゼ、およびコウジカビ由来のプロテアーゼからなる群より選択される、酵素消化、
(d)工程(c)で使用した1種または複数種の酵素の熱失活、
(e)非核酸成分を保持することができる樹脂上への、工程(d)の生成物の移動であって、核酸が樹脂を通過し、SrCl2および／またはBaCl2が、工程(e)の樹脂上への移動の前に、少なくとも400 mMの終濃度まで工程(c)または(d)の生成物に加えられており、工程(c)または(d)の生成物が60℃〜95℃の温度で樹脂上に加えられる、移動。
【００８１】
本発明の核酸を単離するための方法のための手段が、キットに含まれ得る。そのようなキットは、試料の溶解のための溶液、酵素消化のための溶液、非核酸成分の沈殿のための溶液、および／または非核酸成分の除去のための樹脂を含む。試料の溶解のための溶液は、好ましくは、SDSの原液および／または硫酸アンモニウムの原液を含む。このキットで提供される酵素は、好ましくは、本明細書において定義された1種または複数種の酵素、より好ましくはプロテアーゼを含む。1種または複数種の酵素の選択は、生物試料に最適化され得る。非核酸化合物の沈殿のための溶液は、BaCl2またはSrCl2の原液を含む。好ましくは、樹脂は、スピンカラム中に組み込まれる、および／またはそれはサイズ排除樹脂である。キットは、本明細書において記載される溶解緩衝液を含むこともできる。キットは、本明細書において記載される溶解緩衝液の成分を含むこともできる。したがって、キットは、以下の1つまたは複数を含むことができる：
(a)試料の溶解のための溶液、例えば、本明細書において記載される溶解緩衝液、
(b)酵素消化のための溶液、
(c)非核酸成分の沈殿のための溶液、および／または
(d)非核酸成分の除去のための樹脂。
【００８２】
本発明は、本明細書において記載される界面活性剤およびDNA安定化剤を含む／それらからなる溶解緩衝液にも関する。したがって、そのような溶解緩衝液は、塩化アンモニウムおよびSDSを含むことができる。溶解緩衝液は、さらにキレート剤を含んでもよく／キレート剤からなってもよく、0.1 mMを超えるもしくは1 mMを超えるまたは20 mg/mlを超えるキレート剤が使用される、および／またはそれが緩衝物質である。例えば、溶解緩衝液は、酒石酸緩衝液、ドデシル硫酸リチウム、および塩化アンモニウム、ならびにEDTAを含むことができる。したがって、そのような溶解緩衝液は、約50 mM酒石酸、約100 mMドデシル硫酸リチウム、約155 mM塩化アンモニウム、および少なくとも約0.1 mM、0.5 mM、もしくは1 mM、または少なくとも20 mg/Lのキレート剤、例えばEDTAを含むことができる。好ましくは、この溶解緩衝液は約8.3のpHを有する。この緩衝液は、好ましくはH2SO4を含まない。
【００８３】
本発明は、本明細書において記載される界面活性剤、DNA安定化剤、およびキレート剤を含む／それらからなる溶解緩衝液にも関する。例えば、溶解緩衝液は、ドデシル硫酸リチウム、塩化アンモニウム、およびEDTAを含むことができる。溶解緩衝液は、SDS、EDTA、および塩化アンモニウムを含むことができる。これらの溶解緩衝液は、さらに緩衝物質を含んでもよく／緩衝物質からなってもよい。
【００８４】
したがって、そのような溶解緩衝液は、約100 mMドデシル硫酸リチウム、約155 mM塩化アンモニウム、および少なくとも0.1 mMもしくは少なくとも1 mMまたは少なくとも20 mg/Lのキレート剤を含むことができる。好ましくは、この溶解緩衝液は約8.3のpHを有する。この緩衝液は、好ましくはH2SO4を含まない。この溶解緩衝液は、さらに、酒石酸緩衝液などの緩衝物質を含むことができる。例えば、50 mMの酒石酸がこの溶解緩衝液中に含まれてもよい。
【００８５】
あるいは、そのような溶解緩衝液は、約100 mM SDS、約150 mM塩化アンモニウム、および少なくとも0.1 mMもしくは少なくとも1 mMまたは少なくとも20 mg/Lのキレート剤を含むことができる。好ましくは、この溶解緩衝液は約8.0のpHを有する。この緩衝液は、好ましくはH2SO4を含まない。この溶解緩衝液は、さらに、TRISまたはTRIS/HClなどの緩衝物質を含むことができる。例えば、50 mMのTRISまたはTRIS/HClがこの溶解緩衝液中に含まれてもよい。
【００８６】
本発明は、本明細書において記載される界面活性剤、DNA安定化剤、およびキレート剤を含む／それらからなる溶解緩衝液にも関する。例えば、溶解緩衝液は、EDTA、SDS、および塩化アンモニウムを含むことができる。溶解緩衝液は、さらにCaCl2を含んでもよく／CaCl2からなってもよい。したがって、そのような溶解緩衝液は、約100 mM SDS、約150 mM塩化アンモニウム、および約0.1〜15 mMもしくは1〜15 mMの（または、20 mg/Lを超える）キレート剤を含むことができる。任意で、この溶解緩衝液は、さらに約5 mM CaCl2を含んでもよく／約5 mM CaCl2からなってもよい。任意で、この溶解緩衝液は、さらに緩衝物質を含んでもよく／緩衝物質からなってもよい。この緩衝液は、好ましくはH2SO4を含まない。
【００８７】
本発明の溶解緩衝液は、少なくとも20 mg/L、25 mg/L、30 mg/L、35 mg/L、40 mg/L、45 mg/L、50 mg/L、55 mg/L、60 mg/L、65 mg/L、70 mg/L、75 mg/L、80 mg/L、90 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、300 mg/L、400 mg/L、500 mg/Lまたはそれ以上のキレート剤、例えばEDTAを含むことができる。
【００８８】
本発明の溶解緩衝液は、本発明の方法の工程(a)で使用することができる。
【００８９】
本発明は、さらに以下の項目を特徴とする：
1． (a)試料の任意の溶解、
(b)該試料の任意の熱インキュベーション、
(c)工程(a)または(b)の生成物中の非核酸成分の酵素消化、
(d)工程(c)で使用した1種または複数種の酵素の熱失活、
(e)非核酸成分を保持することができる樹脂上への工程(d)の該生成物の移動であって、該核酸が樹脂を通過する、移動
を含み、それによって核酸を精製する、試料から核酸を単離するための方法。
2． 界面活性剤が工程(a)の間に加えられる、項目1の方法。
3． 界面活性剤がSDSまたはLiDSである、項目1または2の方法。
4． 界面活性剤が、約15 mM〜250 mM、50 mM〜200 mM、好ましくは75〜125 mMの終濃度まで加えられ、約100 mMが最も好ましい、前記項目のいずれかの方法。
5． SDSが、工程(a)の生成物において、少なくともまたは約60 mMのSDS、好ましくは、少なくともまたは約100 mMのSDSの終濃度まで加えられ、少なくともまたは約150 mMのSDSがさらにいっそう好ましく、少なくともまたは約200 mMのSDSが最も好ましい、前記項目のいずれかの方法。
6． LiDSが、工程(a)の生成物において、少なくともまたは約60 mMのLiDS、好ましくは、少なくともまたは約100 mMのLiDSの終濃度まで加えられ、少なくともまたは約150 mMのLiDSがより好ましい、前記項目のいずれかの方法。
7． キレート剤が工程(a)で加えられ、好ましくはキレート剤がEDTAである、前記項目のいずれかの方法。
8． キレート剤が、少なくとも0.1 mM、0.2 mM、0.3 mM、0.4 mM、0.5 mM、0.6 mM、0.7 mM、0.8 mM、0.9 mM、1 mM、1.1 mM、1.2 mM、1.3 mM、1.4 mM、1.5 mM、2 mM、2.5 mM、3 mM、3.5 mM、4 mM、4.5 mM、5 mM、5.5 mM、6 mM、6.5 mM、7 mM、7.5 mM、7.5 mM、8 mM、8.5 mM、9 mM、9.5 mM、10 mM、11 mM、12 mM、13 mM、14 mM、15 mM、またはそれ以上の終濃度まで、工程(a)で加えられる、前記項目のいずれかの方法。
9． キレート剤が、約10 mMまたは約0.1 mMまたは約1 mMの終濃度まで加えられる、前記項目のいずれかの方法。
10． キレート剤が、少なくとも20 mg/L、25 mg/L、30 mg/L、35 mg/L、40 mg/L、45 mg/L、50 mg/L、55 mg/L、60 mg/L、65 mg/L、70 mg/L、75 mg/L、80 mg/L、90 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、300 mg/L、400 mg/L、500 mg/L、またはそれ以上の終濃度まで加えられる、前記項目のいずれかの方法。
11． DNA安定化剤が工程(a)で加えられる、前記項目のいずれかの方法。
12． DNA安定化剤が塩化アンモニウムおよび／または塩化カルシウムである、前記項目のいずれかの方法。
13． DNA安定化剤が、少なくとも25 mM、50 mM、75 mM、100 mM、125 mM、150 mM、175 mM、200 mM、225 mM 250 mM、またはそれ以上の終濃度まで加えられる、前記項目のいずれかの方法。
14． DNA安定化剤が、約150 mMまたは約155 mMの終濃度まで加えられる塩化アンモニウムである、前記項目のいずれかの方法。
15． 緩衝物質が工程(a)で加えられる、前記項目のいずれかの方法。
16． 緩衝物質が、TRIS、例えばTRIS-HCl、酒石酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、HEPES、HPPS、または任意のアンモニア緩衝液からなる群より選択され、好ましくは、緩衝物質がTRISまたは酒石酸緩衝液である、前記項目のいずれかの方法。
17． 緩衝物質が、少なくとも5 mM、10 mM、20 mM、30 mM、40 mM、50 mM、60 mM、70 mM、80 mM、90 mM、100 mM、またはそれ以上の終濃度まで加えられる、前記項目のいずれかの方法。
18． 緩衝物質がTRISであり、約50 mMの終濃度まで工程(a)で加えられる、前記項目のいずれかの方法。
19． 緩衝物質が酒石酸緩衝液であり、約50 mMの終濃度まで工程(a)で加えられる、前記項目のいずれかの方法。
20． CaCl2が工程(a)で加えられる、前記項目のいずれかの方法。
21． CaCl2が、少なくとも0.5 mM、1 mM、1.5 mM、2 mM、2.5 mM、3 mM、3.5 mM、4 mM、4.5 mM、5 mM、5.5 mM、6 mM、6.5 mM、7 mM、7.5 mM、8 mM、8.5 mM、9 mM、9.5 mM、10 mM、またはそれ以上の終濃度まで加えられ、好ましくは、CaCl2が約5 mMの終濃度まで加えられる、前記項目のいずれかの方法。
22． 工程(a)における溶解が、約5〜約15、好ましくは約7〜約13、より好ましくは約7〜約10、最も好ましくは約7〜約9のpHで、または約8のpHで実施される、前記項目のいずれかの方法。
23． 工程(b)の熱インキュベーションが、75℃〜95℃の温度で、1〜20分間、好ましくは2〜10分間行われる、前記項目のいずれかの方法。
24． 工程(b)の熱インキュベーションが、少なくとも1分、少なくとも5分、少なくとも10分、少なくとも15分、または少なくとも20分行われる、前記項目のいずれかの方法。
25． 1種または好ましくは複数種の酵素が、前記酵素消化のために工程(c)で使用され、該1種または複数種の酵素が溶解酵素であり、好ましくはプロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、ヒドロラーゼ、キチナーゼ、アミラーゼ、およびグルカナーゼからなる群より選択され、ヒドロラーゼがヌクレアーゼではない、前記項目のいずれかの方法。
26． 工程(c)の酵素消化が15℃〜70℃で5分〜120分行われる、前記項目のいずれかの方法。
27． 1種または複数種のプロテアーゼが工程(c)で使用され、該1種または複数種のプロテアーゼが、バチルス・リケニフォルミス由来のプロテアーゼ、バチルス種由来のプロテアーゼ、黄色ブドウ球菌由来のプロテアーゼ、バチルス・アミロリケファシエンス由来のプロテアーゼ、ヒトヨタケ種由来のプロテアーゼ、およびコウジカビ由来のプロテアーゼからなる群より選択される、前記項目のいずれかの方法。
28． アンモニウム塩および／または硫酸塩、好ましくは硫酸アンモニウムが、好ましくは少なくとも70 mM硫酸アンモニウムの終濃度まで、工程(a)において加えられる、前記項目のいずれかの方法。
29． 工程(d)の生成物が、工程(e)で、60℃〜95℃の温度で前記樹脂上に加えられる、前記項目のいずれかの方法。
30． SrCl2および／またはBaCl2が、工程(e)における前記樹脂上への移動の前に、少なくとも400 mMの終濃度まで、工程(d)の生成物に加えられる、前記項目のいずれかの方法。
31． 前記試料が、糞便試料、血液試料、尿試料、組織試料、および／または体液試料である、前記項目のいずれかの方法。
32． 前記核酸が、DNAおよび／またはRNA、好ましくはDNAである、前記項目のいずれかの方法。
33． 遠心分離工程が工程(e)において実行され、前記樹脂上への工程(d)の生成物の移動の後に400 g〜3000 gで0.5分〜5分間、好ましくは約1分間実行される、前記項目のいずれかの方法。
34． 前記樹脂が、20〜2000 bpの範囲の1本鎖および／または2本鎖のヌクレオチド鎖の排除限界を有するサイズ排除樹脂である、前記項目のいずれかの方法。
35． 前記樹脂がスピンカラム中に組み込まれる、前記項目のいずれかの方法。
36． 工程(d)の可溶化液が工程(e)において前記樹脂また前記スピンカラム上に加えられる前に、前記樹脂が、少なくとも300 gで少なくとも1分間遠心分離される、前記項目のいずれかの方法。
37． 工程(c)または工程(d)の可溶化液が、工程(e)において前記樹脂上に加えられる前に可溶化液を遠心分離することによって、好ましくは、約10.000 gで1〜5分間遠心分離することによって、沈殿物から除かれる、前記項目のいずれかの方法。
38． 界面活性剤、DNA安定化剤、およびキレート剤を含む溶解緩衝液であって、該キレート剤が、少なくとも0.1または少なくとも1 mMの濃度で存在する、溶解緩衝液。
39． 界面活性剤、DNA安定化剤、およびキレート剤を含む溶解緩衝液であって、該キレート剤が、少なくとも20 mg/Lの濃度で存在する、溶解緩衝液。
40． 界面活性剤および1種または複数種のDNA安定化剤を含む、溶解緩衝液。
41． 界面活性剤、DNA安定化剤、および緩衝物質を含む、溶解緩衝液。
42． 界面活性剤がSDSまたはLiDSである、請求項37または38の溶解緩衝液。
43． 界面活性剤が、約15 mM〜250 mM、50 mM〜200 mM、好ましくは、75〜125 mMの濃度で存在し、約100 mMがさらにいっそう好ましく、約150 mMの濃度が最も好ましい、前記請求項のいずれかの溶解緩衝液。
44． SDSが、少なくとも20 mM、少なくとも60 mMのSDSの濃度で、好ましくは、少なくとも100 mM SDSまたは少なくとも150 mMの濃度で緩衝液中に存在する、前記項目のいずれかの溶解緩衝液。
45． LiDSが、少なくとも20 mM、少なくとも60 mMのLiDSの濃度で、好ましくは、少なくとも100 mM LiDSまたは少なくとも150 mMの濃度で緩衝液中に存在する、前記項目のいずれかの溶解緩衝液。
46． DNA安定化剤が塩化アンモニウムである、前記項目のいずれかの溶解緩衝液。
47． DNA安定化剤、例えば塩化アンモニウムが、少なくとも25 mM、50 mM、75 mM、100 mM、125 mM、150 mM、175 mM、200 mM、225 mM、250 mM、300 mM、またはそれ以上の終濃度まで加えられる、前記項目のいずれかの溶解緩衝液。
48． DNA安定化剤が塩化アンモニウムであり、約150 mMまたは約155 mMの濃度で溶解緩衝液中に存在する、前記項目のいずれかの溶解緩衝液。
49． キレート剤が、工程(a)で、少なくとも0.1 mM、0.2 mM、0.3 mM、0.4 mM、0.5 mM、0.6 mM、0.7 mM、0.8 mM、0.9 mM、1 mM、1.1 mM、1.2 mM、1.3 mM、1.4 mM、1.5 mM、2 mM、2.5 mM、3 mM、3.5 mM、4 mM、4.5 mM、5 mM、5.5 mM、6 mM、6.5 mM、7 mM、7.5 mM、7.5 mM、8 mM、8.5 mM、9 mM、9.5 mM、10 mM、11 mM、12 mM、13 mM、14 mM、15 mM、またはそれ以上の濃度で存在する、前記項目のいずれかの溶解緩衝液。
50． キレート剤が、少なくとももしくは約0.1 mM、少なくとももしくは約1 mM、または少なくとももしくは約10 mMの濃度で存在する、前記項目のいずれかの溶解緩衝液。
51． キレート剤が、少なくとも20 mg/L、25 mg/L、30 mg/L、35 mg/L、40 mg/L、45 mg/L、50 mg/L、55 mg/L、60 mg/L、65 mg/L、70 mg/L、75 mg/L、80 mg/L、90 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、300 mg/L、400 mg/L、500 mg/L、またはそれ以上の濃度で存在する、前記項目のいずれかの溶解緩衝液。
52． キレート剤がEDTAであり、より好ましくはキレート剤がNa-EDTAである、先行請求項のいずれか一項の溶解緩衝液。
53． 溶解緩衝液が塩化アンモニウムおよびSDSを含む、前記項目のいずれかの溶解緩衝液。
54． 溶解緩衝液がドデシル硫酸リチウムおよび塩化アンモニウムを含む、前記項目のいずれかの溶解緩衝液。
55． 溶解緩衝液が緩衝物質をさらに含む、前記項目のいずれかの溶解緩衝液。
56． 緩衝物質が、TRIS、例えばTRIS-HCl、酒石酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、HEPES、HPPS、または任意のアンモニア緩衝液からなる群より選択され、好ましくは、緩衝物質がTRISまたは酒石酸緩衝液である、前記項目のいずれかの溶解緩衝液。
57． 緩衝物質が、少なくとも5 mM、10 mM、20 mM、30 mM、40 mM、50 mM、60 mM、70 mM、80 mM、90 mM、100 mM、またはそれ以上の濃度で存在する、前記項目のいずれかの溶解緩衝液。
58． 緩衝物質がTRISであり、工程(a)で約50 mMの濃度で存在する、前記項目のいずれかの溶解緩衝液。
59． 緩衝物質が酒石酸緩衝液であり、工程(a)で約50 mMの濃度で存在する、前記項目のいずれかの溶解緩衝液。
60． 溶解緩衝液が、塩化アンモニウム、SDS、およびTRIS/HClを含む、前記項目のいずれかの溶解緩衝液。
61． 溶解緩衝液が、ドデシル硫酸リチウム、塩化アンモニウム、および酒石酸緩衝液を含む、前記項目のいずれかの溶解緩衝液。
62． CaCl2をさらに含む、前記項目のいずれかの溶解緩衝液。
63． CaCl2が、少なくとも0.5 mM、1 mM、1.5 mM、2 mM、2.5 mM、3 mM、3.5 mM、4 mM、4.5 mM、5 mM、5.5 mM、6 mM、6.5 mM、7 mM、7.5 mM、8 mM、8.5 mM、9 mM、9.5 mM、10 mM、またはそれ以上の濃度で存在し、好ましくは、CaCl2が約5 mMの濃度で存在する、前記項目のいずれかの溶解緩衝液。
64． 溶解緩衝液が、約5〜約15、好ましくは約7〜約13、より好ましくは約7〜約10、最も好ましくは約7〜約9のpH、または約8のpHを有する、前記項目のいずれかの溶解緩衝液。
65． 溶解緩衝液が、酒石酸緩衝液、ドデシル硫酸リチウム、塩化アンモニウム、ならびにEDTAを含む、前記項目のいずれかの溶解緩衝液。
66． 溶解緩衝液が、ドデシル硫酸リチウム、塩化アンモニウム、およびEDTAを含む、前記項目のいずれかの溶解緩衝液。
67． 溶解緩衝液が、SDS、EDTA、および塩化アンモニウムを含む、前記項目のいずれかの溶解緩衝液。
68． 溶解緩衝液が、EDTA、SDS、塩化アンモニウム、およびTRIS/HClを含む、前記項目のいずれかの溶解緩衝液。
69． 溶解緩衝液がH2SO4を含まない、前記項目のいずれかの溶解緩衝液。
70． 溶解緩衝液がMg2+を含む、前記項目のいずれかの溶解緩衝液。
71． 溶解緩衝液が、酒石酸、LiDS、および塩化アンモニウムからなる、前記項目のいずれかの溶解緩衝液。
72． 溶解緩衝液が、酒石酸、LiDS、塩化アンモニウム、およびEDTAからなる、前記項目のいずれかの溶解緩衝液。
73． 溶解緩衝液が、SDS、塩化アンモニウム、およびEDTAからなる、前記項目のいずれかの溶解緩衝液。
74． 溶解緩衝液が、TRIS/HCl、塩化アンモニウム、SDS、およびCaCl2からなる、前記項目のいずれかの溶解緩衝液。
75． 溶解緩衝液が、TRIS/HCl、塩化アンモニウム、SDS、CaCl2、およびEDTAからなる、前記項目のいずれかの溶解緩衝液。
76． 溶解緩衝液が、TRIS/HCl、塩化アンモニウム、SDS、およびNa-EDTAからなる、前記項目のいずれかの溶解緩衝液。
77． 溶解緩衝液が、50 mM TRIS/HCl、150 mM塩化アンモニウム、100 mM SDS、および約0.1または約1 mMのNa-EDTAからなる、前記項目のいずれかの溶解緩衝液。
78． 溶解緩衝液が、50 mM TRIS/HCl、150 mM塩化アンモニウム、100 mM SDS、および約0.1または約1 mMのNa-EDTAからなり、約8のpHを有する、前記項目のいずれかの溶解緩衝液。
【００９０】
本明細書において使用する場合、単数形「1つ（a）」、「1つ（an）」、および「該（the）」は、文脈において別段示さない限り、複数の意味を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「1つの試薬」への言及は、1つまたは複数のそのような異なる試薬を含み、「該方法」への言及は、本明細書において記載される方法に対して修正または置換され得る、当業者に公知の均等な工程および方法への言及を含む。
【００９１】
本開示で引用されるすべての刊行物および特許は、参照によりその全体が組み入れられる。参照により組み入れられる材料が本明細書と矛盾するかまたは一致しない場合は、本明細書がいかなるそのような材料にも優先すると考えられる。
【００９２】
別段指示がない限り、一連の要素に先行する用語「少なくとも」は、その一連のすべての要素を指すことを理解されたい。当業者は、慣例にすぎない実験を使用して、本明細書において記載される本発明の特定の態様に対する多くの均等物を認識する、または確認することができるであろう。そのような均等物は、本発明に包含されることが意図される。
【００９３】
本明細書および次に続く特許請求の範囲の全体にわたって、文脈上別段必要でない限り、単語「含む（comprise）」ならびに「含む（comprises）」および「含む（comprising）」などの変形は、記載された整数もしくは工程、または整数もしくは工程の群を含むことを意味するが、任意の他の整数もしくは工程、または整数もしくは工程の群を排除することを意味しないと理解されるであろう。本明細書において使用する場合、用語「含む（comprising）」は、用語「含有する（containing）」で置換され得、または時には、本明細書において使用する場合、用語「有する（having）」で置換され得る。
【００９４】
本明細書において使用する場合、「からなる（consisting of）」は、請求項の要素で明記されない、任意の要素、工程、または成分を排除する。本明細書において使用する場合、「から本質的になる（consisting essentially of）」は、請求項の基本的および新規な特徴に実質的に影響を及ぼさない材料または工程を排除しない。
【００９５】
本明細書における各例では、用語「含む（comprising）」、「から本質的になる（consisting essentially of）」、および「からなる（consisting of）」のいずれも、他の2つの用語で置き換えられ得る。
【００９６】
いくつかの文献が本明細書の本文全体にわたって引用される。本明細書において引用される文献（すべての特許、特許出願、科学刊行物、製造者の仕様書、指示書などを含む）のそれぞれは、前記または下記に関わらず、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。本明細書におけるいかなるものも、本発明が先行発明によって、そのような開示に先行する権利が与えられないことを容認すると解釈されるべきでない。
【００９７】
本明細書において使用する場合、用語「約」は、所与の値の5％まで、10％まで、15％まで、または20％まで（20％を含む）であり得る、それぞれの値または範囲（例えば、pH、濃度、パーセンテージ、モル濃度、アミノ酸の数、時間など）の変動があり得ることを意味すると理解される。例えば、配合物が約5 mg/mlの化合物を含む場合、これは、配合物が、4〜6 mg/ml、好ましくは4.25〜5.75 mg/ml、より好ましくは4.5〜5.5 mg/ml、さらにいっそう好ましくは4.75〜5.25 mg/mlを有し得、最も好ましくは5 mg/mlであることを意味すると理解される。本明細書において使用する場合、「XからYまで」と定義される間隔は、「X〜Y」と定義される間隔と同等と考える。両方の間隔は、特に、上限を含み、下限も含む。これは、例えば、「5 mg/mlから10 mg/mlまで」または「5 mg/ml〜10 mg/ml」の間隔が、5、6、7、8、9、および10 mg/mlの濃度、ならびに任意の所与の中間値を含むことを意味する。
【実施例】
【００９８】
材料および方法
核酸抽出に必要とされる材料および核酸の単離のための一般的方法が本明細書において記載される。実施例で示される変更は、一般的方法に取って代わる。この一般的方法は、調製あたり10 mgまでの新鮮な、凍結した、または安定化された組織試料に適するが、5 mgを超える脾臓組織には適さない。
【００９９】
材料
本リストは、核酸を単離するために必要とされる材料を示す：
・1.5 mlおよび2 ml反応チューブ用のローターを有する650 gに設定された微量遠心機。
・最速性能のために：撹拌（800〜1500 rpm）しながら60℃〜80℃に加熱することができ、60℃に事前に加熱されたサーモミキサー、または代わりに、60℃に事前に加熱された加熱ブロック。
・ボルテックスミキサー。
・好ましくは安全ロックの、溶解工程のための試料あたり1本の反応チューブ（1.5 ml）。
・カラム調製のための、試料あたり1本の反応チューブ（2 ml）。
・精製されたゲノムDNAの溶出および収集のための、試料あたり1本の反応チューブ（1.5 ml）。
・10μlおよび最大200μl用のピペット。対応するピペットチップ。
・サイズ排除クロマトグラフィーカラム：TRIS緩衝液、pH 7中のSephacryl S-400（GE）700μlで満たされたスピンカラム。
・溶解緩衝液：25 mM TRIS緩衝液、pH 7；70 mM SDS；90 mM (NH4)2SO4。
・清澄化溶液：2 M SrCl2。
・保護溶液：100 mM EDTA。
【０１００】
プロテアーゼはQIAGEN（表2、列2〜4）、Sigma-Aldrich（表2、列5〜10、13〜17、19〜20）、またはCLEA technologies（19〜20）から得た。他のプロテアーゼは自製であった。
【０１０１】
核酸の単離
以下において、DNAを単離するための方法を記載する。これは、溶解および試料清澄化工程、カラム調製工程、ならびに清澄化および精製工程からなる。
溶解および試料清澄化
・試料（最大10 mg組織、5 mg脾臓）を小片に切断し、1.5 mlチューブに入れる。
・80μl溶解緩衝液、3μlプロテアーゼ、2μl RNase A溶液を加える。
・撹拌（30〜60分、ボルテックス）しながら、60℃で15〜30分インキュベートする。
・撹拌（10分、ボルテックス）しながら、80℃で10分間インキュベートする。
カラム調製（80℃のインキュベーションの間）
・空気がカラム中に存在する場合は、ボルテックスすることによって除去する。
・650×gで1分間遠心分離する。
・1.5 mlチューブ中にカラムを設置する。
清澄化および精製
・20μl清澄化溶液を加え、ボルテックスする。
・最高速度で3分間遠心分離する。
・100μl可溶化液を移す：キャップを介して垂直に、カラム中にピペットでゆっくり移すか、または樹脂床上にピペットでゆっくり移す。
・650×gで1分間遠心分離する。
【０１０２】
溶出液は単離DNAを含み、さらに処理することができる。得られたDNAはアガロースゲル電気泳動によって解析した。
【０１０３】
以下において、DNA単離のより詳細な説明を記載する：
溶解および清澄化
1． 試料あたり80μl溶解緩衝液および3μlプロテアーゼを調製し、軽く叩くかボルテックスすることによって混合する。2種以上の試料を用いて作業する場合は、試料数に対して必要とされるものよりも10％大きい最終体積を用いてプレミックスを調製する（以下の表1の実施例を参照されたい）。
（表１）
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2． 10 mg組織（脾臓についてのみ5 mg）まで小片に切断し、1.5 ml反応チューブに入れる。すべての試料を調製するまで、新鮮なまたは凍結した試料を冷却状態に保つ。安定化された組織試料についてのみ：それらを水で短時間すすいで、安定化溶液の痕跡を除去してから、試料を試料チューブに加える。
3． 工程1由来の85μlのプレミックスを各試料に加える。
4． 30分間全速で撹拌しながら、60℃のサーモミキサー中で試料をインキュベートする。あるいは、加熱ブロック上で60分間インキュベートし、溶解の間に3回パルスボルテックスする。上記の期間後に試料が完全に溶解しない場合は、次の工程を続ける。残留細胞残屑は、精製の性能を妨げないと考えられる。注釈：いくつかの組織型については、15分後に溶解は既に完了している。残りの組織は目に見えず、それに応じて、全体の時間を短縮することができる。
5． 温度を80℃へ高め、インキュベーションを上記のようにさらに10分間続ける。その間に、「カラム調製」（以下）を進める。
【０１０４】
カラム調製
6.2 mlの反応チューブにスピンカラムを設置する。注釈：空気がカラム中に存在する場合は、短時間ボルテックスすることによって除去する。
・スピンカラムの底部の閉鎖具を取り外す。重要：真空の発生による収率低減を回避するために、スピンカラムのスクリューキャップを半回転ゆるめる。カラムを2 mlの収集チューブに戻す。
7． 650 gで1分間遠心分離する。詳細については、上記のセクション「必要とされる材料および機器」を参照されたい。通過画分を含む2 ml反応チューブを捨てる。
8． 調製したスピンカラムを試料の溶出のための新しい1.5 ml反応チューブに設置し、両方を一緒にラックに設置する。「精製」（以下）を続ける。
【０１０５】
精製
9． 工程5を実施した後に、20μl清澄化溶液および2μl RNase Aを各試料に加える。3回ボルテックスして、混合する。
10． 最高速度で3分間遠心分離する。
11． 上清（DNAを含む90〜110μlの可溶化液）を吸引し、以下に記載のように、工程8由来の調製したカラムに移動させる。
・キャップを開け、調製したスピンカラムの樹脂床の中央に、溶解した試料をゆっくりとピペットで移す。キャップを閉める。重要：収率低減を回避するために、スピンカラムのスクリューキャップを半回転ゆるめる。
12． 650 gで1分間遠心分離する。精製されたゲノムDNA（90〜100μl；10 mM Tris-Cl、pH 7.6）がカラムを通って1.5 ml溶出チューブ中に流れる。スピンカラムを捨てる。
13． 溶出したゲノムDNAは、直ちに使用することができ、または4℃もしくは−20℃で保存することができる。
【０１０６】
実施例1：熱失活工程、溶解緩衝液中のEDTAおよび高SDS濃度の影響。
ヌクレアーゼの熱失活、溶解緩衝液中のEDTAおよび高SDS濃度の役割を解明するために、溶解および熱失活工程に対する様々な条件を比較した。以下の表は、使用した様々な条件を示す。
【０１０７】
（表２）実施例1で使用した条件
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【０１０８】
試料は糞便試料であった。溶解および熱インキュベーションの後、タンパク質消化および樹脂での精製を続けた。得られたDNAをアガロースゲルで解析した。図1に示す結果により、熱インキュベーション工程（レーン4〜6および10〜12）は利点があり、より高い量の単離DNAをもたらすことが示された。さらに、高SDS濃度（レーン4および10）は、低濃度と比較して有利である。さらなる結果は、EDTAの添加は得られるDNA量を増大させることであった（レーン7〜12）。
【０１０９】
実施例2：硫酸アンモニウムの影響
高(NH4)2SO4濃度の影響を試験するために、溶解の間の(NH4)2SO4濃度に対する様々な条件を試験した。ここでは、以下の表に示す条件を用いて血液試料を解析した。
【０１１０】
（表３）実施例2で使用したSDSおよび硫酸アンモニウムの濃度
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【０１１１】
溶解工程は60℃で30分間行い、その後に、80℃で10分間の熱インキュベーション工程が続いた。さらに、様々な体積のプロテアーゼを使用した。次いで、樹脂によってDNAを単離し、得られた溶出液をゲル電気泳動にかけた。図2に示す結果は、(NH4)2SO4の好ましい影響に対する明解なパターンを示す。硫酸アンモニウムの濃度が低い奇数（1、3、5、7、9、11、13、15）のすべてのレーンでは、高濃度の硫酸アンモニウムが使用された偶数（2、4、6、8、10、12、14、16）のレーンと比較して、回収されたDNAが少ない。さらに、SDS濃度も本実施例で変化させたので、再度、高SDS濃度の好ましい影響が明確に示される。レーン5〜8および13〜16は、回収率が低い他のレーンと比較して、はるかに高いDNA回収を示す。
【０１１２】
実施例3：新しいプロテアーゼの影響
説明で概要を述べるように、非核酸成分の酵素消化は、好結果の核酸精製に不可欠である。本実施例では、異なるプロテアーゼを比較した。血液試料を溶解し、続いて、タンパク質消化にかけた。タンパク質消化は60℃で30分間行った。以下の表は、本実施例で使用した異なるプロテアーゼを示す。
【０１１３】
（表４）実施例3で使用したプロテアーゼ
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【０１１４】
タンパク質消化の後に、DNAを単離し、アガロースゲル電気泳動によって解析した。図3に結果を示す。レーン1から明らかなように、プロテアーゼなしは、ほとんどDNAの回収をもたらさず、これは、プロテアーゼの重要な役割を支持する。レーン2〜4は、先行技術で公知のプロテアーゼを示す。これらは、いくらかの、しかし、多くないDNAの回収をもたらす。レーン5〜10は、バチルス・リケニフォルミス、バージョン1由来のプロテアーゼの異なる濃度およびバッチを示す。これらは、先行技術のプロテアーゼと類似した回収率をもたらす。レーン11〜20に示される他のプロテアーゼを使用することによって、回収率を大いに増大させることができた。これは、プロテアーゼの有利な選択の重要性を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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