(57)【要約】本明細書では、化学的に修飾されたグリカン主鎖に共有結合により結合したコラーゲン結合ペプチドを含む合成バイオコンジュゲート、それを含有する組成物、およびその使用が提供される。本開示の組成物および方法は、これらの疾患、またはこれらの疾患と関連する症状もしくは特色のいずれかを防止および／または処置するのに適していることが企図される。線維症の発症は、コラーゲンおよびグリコサミノグリカンを含めた結合組織を敷く刺激細胞が関与する。
2020526493.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのペプチド（複数可）を含むバイオコンジュゲートであって、前記ペプチド（複数可）が、化学的に硫酸化されたグリカンに共有結合により結合しているコラーゲン結合単位を含む、バイオコンジュゲート。
【請求項２】
前記化学的に硫酸化されたグリカンが、約０．５〜約４の硫酸化度に化学的に硫酸化されている、請求項１に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項３】
前記化学的に硫酸化されたグリカンが、二糖１個当たり約０．５〜約２．５個のサルフェート部分を含む、請求項１に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項４】
前記化学的に硫酸化されたグリカンが、二糖１個当たり約２〜約３個のサルフェート部分を含む、請求項１に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項５】
前記化学的に硫酸化されたグリカンが、単糖１個当たり約０．２５〜約０．７５個のサルフェート部分を含む、請求項１に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項６】
前記化学的に硫酸化されたグリカンが、約５〜約１０００ｋＤａの分子量を有する、請求項１に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項７】
前記化学的に硫酸化されたグリカンが、約２５ｋＤａを超える分子量を有する、請求項１に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項８】
前記化学的に硫酸化されたグリカンが、１５０ｋＤａを超える分子量を有する、請求項１に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項９】
前記化学的に硫酸化されたグリカンが、約１５０〜約７５０ｋＤａの分子量を有する、請求項１に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項１０】
前記化学的に硫酸化されたグリカンが、約１５０〜約３５０ｋＤａの分子量を有する、請求項１に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項１１】
前記化学的に硫酸化されたグリカンが、約２００〜約４００ｋＤａの分子量を有する、請求項１に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項１２】
前記化学的に硫酸化されたグリカンが、化学的に硫酸化されたアルギネート、化学的に硫酸化されたコンドロイチン、化学的に硫酸化されたコンドロイチン硫酸、化学的に硫酸化されたデルマタン、化学的に硫酸化されたヘパラン、化学的に硫酸化されたヘパロサン、化学的に硫酸化されたヘパラン硫酸、化学的に硫酸化されたヘパリン、化学的に硫酸化されたデキストラン、化学的に硫酸化されたデキストラン硫酸、化学的に硫酸化されたヒアルロン酸、またはその誘導体である、請求項１に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項１３】
前記化学的に硫酸化されたグリカンが、カルボキシメチル誘導体である、請求項１に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項１４】
前記化学的に硫酸化されたグリカンが、化学的に硫酸化されたカルボキシメチルアルギネート、化学的に硫酸化されたカルボキシメチルコンドロイチン、化学的に硫酸化されたカルボキシメチルコンドロイチン硫酸、化学的に硫酸化されたカルボキシメチルデルマタン、化学的に硫酸化されたカルボキシメチルヘパラン、化学的に硫酸化されたカルボキシメチルヘパロサン、化学的に硫酸化されたカルボキシメチルヘパラン硫酸、化学的に硫酸化されたカルボキシメチルヘパリン、化学的に硫酸化されたカルボキシメチルデキストラン、化学的に硫酸化されたカルボキシメチルデキストラン硫酸、化学的に硫酸化されたカルボキシメチルヒアルロン酸、またはその誘導体である、請求項１に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項１５】
前記化学的に硫酸化されたグリカンが、化学的に硫酸化されたヘパロサン、化学的に硫酸化されたカルボキシメチルヘパロサン、化学的に硫酸化されたデキストラン、化学的に硫酸化されたカルボキシメチルデキストラン、化学的に硫酸化されたヒアルロン酸、化学的に硫酸化されたカルボキシメチルヒアルロン酸、またはその誘導体である、請求項１に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項１６】
前記化学的に硫酸化されたグリカンが、約１〜約７５パーセント（％）のペプチドによる機能化を含み、ペプチドによる前記機能化パーセント（％）が、ペプチドで機能化されている前記化学的に硫酸化されたグリカン上の二糖単位のパーセントによって決定される、先行する請求項のいずれかに記載のバイオコンジュゲート。
【請求項１７】
前記化学的に硫酸化されたグリカンが、約５〜約３０パーセント（％）のペプチドによる機能化、または約１０〜約４０パーセント（％）のペプチドによる機能化を含む、先行する請求項のいずれかに記載のバイオコンジュゲート。
【請求項１８】
前記化学的に硫酸化されたグリカンが、約１５パーセント（％）のペプチドによる機能化、または約２０パーセント（％）のペプチドによる機能化、または約２５パーセント（％）のペプチドによる機能化、または約３０パーセント（％）のペプチドによる機能化を含む、先行する請求項のいずれかに記載のバイオコンジュゲート。
【請求項１９】
前記ペプチド（複数可）の前記コラーゲン結合単位が、約１ｍＭ未満の解離定数（Ｋｄ）でコラーゲンに結合する、先行する請求項のいずれかに記載のバイオコンジュゲート。
【請求項２０】
前記ペプチド（複数可）が、最大約１２０個のアミノ酸、または最大約１００個のアミノ酸、または最大約５０個のアミノ酸、または最大約４０個のアミノ酸を含む、先行する請求項のいずれかに記載のバイオコンジュゲート。
【請求項２１】
前記ペプチド（複数可）が、最大約２５個のアミノ酸を含む、先行する請求項のいずれかに記載のバイオコンジュゲート。
【請求項２２】
１〜約２５個のペプチド（複数可）、または約５〜約１５０個のペプチド、または約７５〜約１２５個のペプチド、または約１００個のペプチドを含む、先行する請求項のいずれかに記載のバイオコンジュゲート。
【請求項２３】
前記化学的に硫酸化されたグリカンが、酸化的に切断されたサッカリド単位を含有していない、先行する請求項のいずれかに記載のバイオコンジュゲート。
【請求項２４】
前記ヒドラジド基が、必要に応じてスペーサーを介して前記ペプチド（複数可）のＣ末端に結合している、先行する請求項のいずれかに記載のバイオコンジュゲート。
【請求項２５】
前記ヒドラジド基が、必要に応じてスペーサーを介して前記ペプチド（複数可）のＮ末端に結合している、先行する請求項のいずれかに記載のバイオコンジュゲート。
【請求項２６】
前記ヒドラジド基が、グリシン、アラニン、アルギニン、リシンおよびセリンからなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸を含むスペーサーを介して前記Ｃ末端に結合している、先行する請求項のいずれかに記載のバイオコンジュゲート。
【請求項２７】
前記スペーサーが、配列グリシン−グリシン、セリン−グリシン、リシン−アルギニン、アルギニン−アルギニン、およびグリシン−セリン−グリシンを含む、請求項２５に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項２８】
グリカン１個当たりのペプチド（複数可）の平均数が、約５０を超える、先行する請求項のいずれかに記載のバイオコンジュゲートを含む組成物。
【請求項２９】
グリカン１個当たりのペプチド（複数可）の平均数が、約５０〜約１５０である、請求項１〜２７のいずれか一項に記載のバイオコンジュゲートを含む組成物。
【請求項３０】
グリカン１個当たりのペプチド（複数可）の平均数が、約１００である、請求項１〜２７のいずれか一項に記載のバイオコンジュゲートを含む組成物。
【請求項３１】
請求項１〜２７のいずれか一項に記載のバイオコンジュゲートまたは請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の組成物、およびコラーゲン結合単位を含む追加のペプチドを含む組成物であって、前記追加のペプチドが、前記バイオコンジュゲートに非共有結合により結合しており、さらに、前記組成物が、前記グリカンにおける二糖単位の数に基づくと１％〜約２００％のペプチドを含む、組成物。
【請求項３２】
前記追加のペプチドが、前記バイオコンジュゲートにイオン結合している、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
バイオコンジュゲートを作製するための方法であって、化学的に硫酸化されたグリカンを、必要に応じて活性化剤の存在下、カップリング反応条件下で、コラーゲン結合単位を含む少なくとも１つのペプチド（複数可）と接触させて前記バイオコンジュゲートを提供することを含む方法。
【請求項３４】
最初にグリカンを、前記化学的に硫酸化されたグリカンを提供するのに十分な反応条件下で硫酸化剤と接触させることによって、前記化学的に硫酸化されたグリカンを提供することを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ペプチドが、ヒドラジド基を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記ペプチド（複数可）が、前記ペプチド上の末端ヒドラジド基と、前記化学的に硫酸化されたグリカン上のカルボニル基との間のヒドラジド−カルボニル連結を介して、前記化学的に硫酸化されたグリカンに結合している、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記活性化剤が、カルボジイミド試薬である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
前記活性化剤が、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドおよびＯ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレートからなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
前記カップリング反応条件が、有効量の反応性求核試薬、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１−ヒドロキシ−１，２，３−ベンゾトリアゾール、ＨＯＢｔ／ＣｕＣｌ２、７−アザ−１−ヒドロキシ−１，２，３−ベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアゾール（ＨＯＯＢｔ）、および／または３−スルホ−１−ヒドロキシスクシンイミド（Ｓ−ＮＨＳ）、またはその誘導体を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項４０】
線維症を処置することを必要とする患者の線維症を処置するための方法であって、前記患者に、有効量の請求項１〜２７のいずれか一項に記載のバイオコンジュゲートまたは請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項４１】
前記線維症が、線維性疾患の結果である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記線維性疾患が、肺線維症、嚢胞性線維症、特発性肺線維症、腎線維症、肝線維症、肝硬変、心臓線維症、心房線維症、心内膜心筋線維症、心筋梗塞、神経膠瘢痕、関節線維症、クローン病、デュピュイトラン拘縮、ケロイド、縦隔線維症、骨髄線維症、ペロニー病、腎性全身性線維症、進行性塊状線維症、後腹膜線維症、強皮症、全身性硬化症および癒着性関節包炎からなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記線維性疾患が、特発性肺線維症、腎線維症、または心臓線維症である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記線維性疾患が、肝線維症である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記肝線維症が、慢性アルコール曝露、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染、ウィルソン病、アルファ−１−アンチトリプシン欠乏、ヘモクロマトーシス、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、または自己免疫性肝炎の結果である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記線維性疾患が、ファブリ病、ゴーシェ病、ニーマン−ピック病、またはハンター症候群（ムコ多糖症）である、請求項４１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、その開示全体が参照によって本明細書に組み込まれる、２０１７年７月７日出願の米国仮特許出願第６２／５３０，０６６号の利益を３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下で主張する。
【０００２】
本明細書では、化学的に修飾されたグリカン主鎖に共有結合により結合したコラーゲン結合ペプチドを含む合成バイオコンジュゲート、合成バイオコンジュゲートを含有する組成物、およびその使用が提供される。
【背景技術】
【０００３】
組織内で、細胞は、バイオコンジュゲート、コラーゲン、ヒアルロン酸、ラミニン、フィブロネクチンなどのような様々な巨大分子を含有する細胞外マトリックス（ＥＣＭ）によって取り囲まれている。哺乳動物では、バイオコンジュゲートは、細胞外マトリックスの主な構成成分であり、その場でバイオコンジュゲートは、他のバイオコンジュゲート、ヒアルロン酸、および線維マトリックスタンパク質（例えばコラーゲン）と大きい複合体を形成する。哺乳動物が加齢し、創傷を負い、ある疾患状態にあると、身体のある特定のエリア（例えば、滑膜関節、硝子体液、脊椎円板、皮膚などにおける）において細胞外マトリックスが喪失または劣化して、望ましくない症状を引き起こすおそれがある。さらに、一部の組織傷害、例えば血管傷害、角膜傷害および創傷によって、細胞外マトリックスおよび／またはコラーゲンを含めたその構成成分が露出される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
驚くべきことに、本明細書に記載されるバイオコンジュゲートは、ＧＡＧ分解酵素の基質であることが見出されていないことから代謝されにくく、非硫酸化誘導体と比較した場合、低減された腎クリアランスを伴う延長された半減期を有しつつ、肝臓を標的とすることが見出された。本開示は、少なくとも１つのペプチドを含むバイオコンジュゲートを提供し、ペプチド（複数可）は、化学的に硫酸化されたグリカンに共有結合により結合しているコラーゲン結合単位を含む。
【０００５】
また、本明細書に記載されるバイオコンジュゲートを含む組成物、およびその使用方法が提供される。一態様では、本明細書に記載されるバイオコンジュゲートを含む組成物であって、グリカンに結合したペプチドの数が変わる、組成物が提供される。例えば、組成物は、結合したペプチドの数が、グリカン１個当たり約５０〜約１５０個のペプチドなどの平均として算出されるバイオコンジュゲートを含むことができる。
【０００６】
また、本明細書に記載されるバイオコンジュゲートまたはバイオコンジュゲートを含有する組成物、または前記バイオコンジュゲートおよび１つまたは複数の賦形剤または担体（例えば、食塩水）を含む医薬組成物が提供される。
【０００７】
本明細書に記載されるバイオコンジュゲートおよびバイオコンジュゲートを含む組成物は、それらに限定されるものではないが、肺線維症、嚢胞性線維症、特発性肺線維症、腎線維症、肝線維症（例えば、慢性アルコール曝露、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染、ウィルソン病、アルファ−１−アンチトリプシン欠乏、ヘモクロマトーシス、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、または自己免疫性肝炎の結果としての肝線維症）、肝硬変、心臓線維症、心房線維症、心内膜心筋線維症、心筋梗塞、神経膠瘢痕、関節線維症、クローン病、デュピュイトラン拘縮、ケロイド、縦隔線維症、骨髄線維症、ペロニー病、腎性全身性線維症、進行性塊状線維症、後腹膜線維症、強皮症、全身性硬化症および癒着性関節包炎を含めた、線維症を処置することを必要とする患者の線維症を処置するために使用することができる。
【０００８】
また本明細書では、本明細書に記載されるバイオコンジュゲートを作製するための方法であって、化学的に硫酸化されたグリカンを、必要に応じて活性化剤の存在下、カップリング反応条件下で、コラーゲン結合単位を含む少なくとも１つのペプチドと接触させてバイオコンジュゲートを提供することを含む方法が提供される。ある特定の実施形態では、方法は、最初にグリカンを、化学的に硫酸化されたグリカンを提供するのに十分な反応条件下で硫酸化剤と接触させることによって、化学的に硫酸化されたグリカンを提供することを含む。
【０００９】
本開示のある特定の態様は、添付の図によって図示され得る。それらの図には、以下が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、２つの用量の化合物１についての肝臓におけるヒドロキシプロリン含量を示す。
【００１１】
【図２】図２は、ＣＣｌ４モデルにおける肝臓のシリウスレッド染色を示す。
【００１２】
【図３】図３は、シリウスレッド染色によって組織学的に測定される、バルサルタンと比較した２つの用量の化合物１についての肝臓におけるコラーゲン含量を示す。
【００１３】
【図４】図４は、シリウスレッドによって組織学的に測定される、テルミサルタンと比較した２つの用量の化合物１についての肝臓におけるコラーゲン含量を示す。
【００１４】
【図５】図５は、９週齢のＮＡＳＨモデルの動物における肝臓トリグリセリドレベルを示す。
【００１５】
【図６】図６および７は、化合物１および２についての血小板阻害および肝星細胞阻害データを示す。
【図７】図６および７は、化合物１および２についての血小板阻害および肝星細胞阻害データを示す。
【００１６】
【図８】図８は、腎臓、膀胱、または肝臓における蛍光標識分子（化合物１、化合物２および化合物３）の分布を示すＩＶＩＳ画像化を示す。上の画像は、ＩＶ注射の５分後に撮影し、下の画像は、注射の１時間後に撮影した。左の画像は、マウスの腹側であり、右の画像は、背側である。
【００１７】
【図９】図９は、ＶＥＧＦ１８９への非機能化ＨＡ、硫酸化ＨＡおよび化合物１の結合を示す。
【００１８】
【図１０】図１０は、ＰＤＧＦ−ＡＡへの化合物１Ｂ、ペプチド単独、ｓＨＡ−０ＰＭおよびＨＡについての結合曲線を示す。破線は、高い分子濃度におけるコーティングなしのウェルへの結合（非特異的）を示す。
【００１９】
【図１１】図１１は、ＰＤＧＦ−ＢＢへの化合物１Ｂ、ペプチド単独、ｓＨＡ−０ＰＭおよびＨＡについての結合曲線を示す。破線は、高い分子濃度におけるコーティングなしのウェルへの結合（非特異的）を示す。
【００２０】
【図１２】図１２は、ＰＤＧＦ−ＣＣへの化合物１Ｂ、ペプチド単独、ｓＨＡ−０ＰＭおよびＨＡについての結合曲線を示す。破線は、高い分子濃度における非コーティングウェルへの結合（非特異的）を示す。
【００２１】
【図１３】図１３は、ＰＤＧＦ−ＤＤへの化合物１Ｂ、ペプチド単独、ｓＨＡ−０ＰＭおよびＨＡについての結合曲線を示す。破線は、高い分子濃度におけるコーティングなしのウェルへの結合（非特異的）を示す。
【００２２】
【図１４】図１４は、量を増加させた化合物１、ペプチド単独、非機能化ｓＨＡまたは機能化ｓＨＡ（０ＰＭ）の存在下、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＰＤＧＦ−ＢＢのその受容体ＰＤＧＦ−Ｒβへの結合を示す。
【００２３】
【図１５】図１５は、量を増加させた、様々なペプチド負荷の化合物１の存在下、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＰＤＧＦ−ＢＢのその受容体ＰＤＧＦ−Ｒβへの結合を示す。
【００２４】
【図１６】図１６は、ビヒクルで処置した動物と比較した、高スコアの線維症の発生の低下を示す。
【００２５】
【図１７】図１７は、試験物品を２週間投与した後、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の血清レベルが、３０ｍｇ／ｋｇの化合物１による処置で有意に低下したことを示す。
【００２６】
【図１８】図１８は、肝星細胞（ＨＳＣ）増殖に対する、化合物１および様々な度合いの硫酸化およびペプチド負荷のバイオコンジュゲートの効果を実証する用量範囲研究を示す。
【００２７】
【図１９】図１９は、肝星細胞（ＨＳＣ）増殖に対する、化合物１、主鎖（化学的誘導体化なし、すなわち硫酸化なし）、および主鎖（０のペプチド修飾、「ｓＨＡ−０ＰＭ」）の効果を実証する用量範囲研究を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本開示は、記載される特定の実施形態に限定されず、したがって当然のことながら変わり得ることを理解されたい。また、本開示の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ制限されるので、本明細書で使用される専門用語は、単に特定の実施形態を説明することを目的とし、制限することを意図しないことを理解されたい。
１．定義
【００２９】
別段定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、状況によって別段明示されない限り複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば「１つのペプチド」への言及は、複数のペプチドを含む。
【００３０】
本明細書で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、組成物および方法が、列挙されている要素を含むが、他を除外しないことを意味することが意図される。「から本質的になる」は、組成物および方法を定義するために使用される場合、記載される目的のために組合せにとって本質的に少しでも重要な他の要素を除外することを意味するものとする。したがって、本明細書で定義される要素から本質的になる組成物は、特許請求される基本的かつ新規な特徴（複数可）に実質的に影響を及ぼさない他の材料またはステップを除外しないはずである。「からなる」は、他の成分の微量な要素よりも多くをおよび実質的な方法ステップを除外することを意味するものとする。これらの移行句のそれぞれによって定義された実施形態は、本開示の範囲内である。
【００３１】
用語「約」は、範囲を含めた数値表示、例えば、温度、時間、量、および濃度の前に使用される場合、（＋）または（−）１０％、５％または１％変わり得る近似を示す。
【００３２】
本明細書で使用される場合、用語「バイオコンジュゲート」、「ペプチドグリカン」および「プロテオグリカン」および「合成バイオコンジュゲート」は、交換可能に使用され、それに共有結合により結合している１つまたは複数のペプチドを有する化学的に硫酸化されたグリカンを含む合成コンジュゲートを指す。
【００３３】
本明細書で使用される場合、用語「化学的に硫酸化されたグリカン」は、サルフェート部分を含むように化学的に修飾されている、グリコシドにより連結した多数の単糖を有する化合物を指す。ある特定の実施形態では、グリカンは、ウロン酸と交互に連結した２−アミノ糖を含むグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）であり、それには、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン、ケラチン、およびデルマタンなどのポリマーが含まれる。したがって、本明細書に記載される実施形態において使用され得るグリカンの非限定的な例として、アルギネート、アガロース、デキストラン、デキストラン硫酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）、デルマタン、デルマタン硫酸（ＤＳ）、ヘパラン硫酸、ヘパリン（Ｈｅｐ）、ケラチン、ケラタン硫酸、およびヒアルロン酸（ＨＡ）（それらの誘導体を含む）が挙げられる。別の実施形態では、グリカンの分子量は、バイオコンジュゲートの効果を調整するために変えられる（例えば、Radek,  K.  A.,  et  al.,  Wound  Repair  Regen.,  2009,  17:  118-126および  Taylor,  K.  R.,  et  al.,  J.  Biol.  Chem.,  2005,  280:5300-5306を参照されたい）。一実施形態では、グリカンは、酸化およびアルカリ脱離によって分解されて（例えば、Fransson,  L.  A.,  et  al.,  Eur.  J.  Biochem.,  1980,  106  :59-69を参照されたい）、より低い分子量（例えば、約１０ｋＤａ〜約５０ｋＤａ）を有する分解されたグリカンを生じる。別の実施形態では、グリカンは、酵素的に、熱によって、超音波によって、オゾン分解によって、せん断によって、またはグリカンを脱重合し、グリカンの分子量を低減することが公知の他の方法によって、分解される。ある特定の実施形態では、グリカンは、酸化的に切断されるサッカリド（saccharide）環を含有しておらず、したがってアルデヒド官能基を含有しておらず、また含有してもいなかった。
【００３４】
本明細書で使用される場合、用語「結合した」および「共有結合により結合した」は、交換可能に使用することができ、２つの原子による一つまたは複数の電子対の共有を指す。
【００３５】
一実施形態では、本開示のバイオコンジュゲートは、コラーゲンに直接的または間接的かのいずれかで結合する。用語「結合（binding）」または「結合する」は、本明細書で使用される場合、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイ、表面プラズモン共鳴法、ＥＬＩＳＡ、競合的結合アッセイ、等温滴定熱量測定法、ファージディスプレイ、アフィニティークロマトグラフィー、レオロジーまたは免疫組織化学的検査を使用して検出することができる、分子間の相互作用を含むことを意味する。用語はまた、分子間の「結合」相互作用を含むことを意味する。結合は、「直接的」または「間接的」であり得る。「直接的」結合は、分子間の直接的な物理的接触を含む。分子間の「間接的」結合は、１つまたは複数の分子との直接的な物理的接触を同時に有する分子を含む。この結合は、相互作用分子を含む「複合体」の形成をもたらし得る。「複合体」は、共有結合性または非共有結合性の結合、相互作用または力によって一緒に保持された２つまたはそれよりも多い分子の結合を指す。
【００３６】
本明細書で使用される場合、用語「細胞外マトリックス」は、周りを取り囲む細胞を構造的かつ生化学的に支持する、組織の細胞外部分を指す。
【００３７】
本明細書で使用される場合、用語「組成物」は、少なくとも１つの薬学的に活性な成分を含有する、治療目的のために所期の患者への投与に適した調製物であって、その任意の固体形態を含めた、調製物を指す。組成物は、化合物の改善された製剤を提供するための少なくとも１つの薬学的に許容される構成成分、例えば適切な担体を含むことができる。ある特定の実施形態では、組成物は、フィルム剤、ゲル剤、パッチ剤、または液体液剤（liquid  solution）として製剤化される。本明細書で使用される場合、用語「局所的に」は、処置される組織および／または器官（内部、またはある場合には外部）の表面に、局部的効果のために組成物を非全身的に投与することを指す。
【００３８】
本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される」は、合理的に慎重な医師が、使用される量および／または処置される疾患もしくは状態およびそれぞれの投与経路を考慮して患者への投与を回避する理由となる特性を、指示された材料が有していないことを示す。典型的な薬学的に許容される材料は、本質的に無菌である。
【００３９】
本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される担体」は、ある器官もしくは身体のある一部から、別の器官もしくは身体の別の一部に任意の補助成分もしくは組成物、もしくはその構成成分を運ぶもしくは輸送するのに関与するか、または静脈の内表面に薬剤を送達するための、薬学的に許容される材料、組成物またはビヒクル、例えば液体または固体充填剤、賦形剤、添加剤、溶媒または被包材料を指す。
【００４０】
本明細書で使用される場合、用語「製剤化された」または「製剤」は、１つまたは複数の薬学的に活性な成分を含む様々な化学物質を組み合わせて剤形を生成するプロセスを指す。ある特定の実施形態では、２つまたはそれよりも多い薬学的に活性な成分は、単一剤形もしくは組み合わせた投薬単位へと共製剤化する、または別個に製剤化し、その後、組み合わせて組み合わせた投薬単位とすることができる。持続放出製剤は、長期間にわたって体内に治療剤をゆっくり放出するように設計されている製剤であり、一方、即時放出製剤は、より短期間にわたって体内に治療剤を急速に放出するように設計されている製剤である。
【００４１】
本明細書で使用される場合、用語「送達」は、医薬組成物の所望の治療効果を安全に達成するために、必要に応じて体内に医薬組成物を輸送するための経路、アプローチ、製剤、技術、および系を指す。送達経路は、それらに限定されるものではないが、血管内、静脈内、動脈内、筋肉内、皮膚、皮下、経皮、皮内、および表皮内経路を含めた任意の適切な経路であってよい。
【００４２】
本明細書で使用される場合、用語「液剤」は、当技術分野で周知の液剤、懸濁剤、エマルジョン、点滴剤、軟膏剤、液体洗浄剤、スプレー剤、およびリポソーム剤を指す。一部の実施形態では、液体液剤は、少量の酸または塩基が添加されるとｐＨの変化に抵抗する水性ｐＨ緩衝剤を含有する。ある特定の実施形態では、液体液剤は、潤滑増強剤を含有する。
【００４３】
本明細書で使用される場合、用語「処置すること」は、血管傷害または介入の前、間および／または後の、疾患または障害の１つまたは複数の臨床症状の防止、治癒、逆転、減弱、軽減、最小化、阻害、抑制および／または停止することを指す。
２．バイオコンジュゲート
【００４４】
本開示は、少なくとも１つのペプチドを含むバイオコンジュゲートであって、ペプチド（複数可）は、化学的に硫酸化されたグリカンに共有結合により結合しているコラーゲン結合単位を含む、バイオコンジュゲートを提供する。驚くべきことに、本明細書に記載されるバイオコンジュゲートは、ＧＡＧ分解酵素のための基質であることが見出されていないことから代謝されにくく、非硫酸化誘導体と比較した場合、低減された腎クリアランスを伴う延長された半減期を有しつつ、肝臓を標的とすることが見出された。
【００４５】
本明細書に記載される実施形態において使用され得る化学的に硫酸化されたグリカンは、任意の化学的に硫酸化されたグリカン（例えば、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ））であってよい。非限定的な例として、化学的に硫酸化されたアルギネート、化学的に硫酸化されたコンドロイチン、化学的に硫酸化されたコンドロイチン硫酸、化学的に硫酸化されたデルマタン、化学的に硫酸化されたヘパラン、化学的に硫酸化されたヘパロサン、化学的に硫酸化されたヘパラン硫酸、化学的に硫酸化されたヘパリン、化学的に硫酸化されたデキストラン、化学的に硫酸化されたデキストラン硫酸、化学的に硫酸化されたヒアルロン酸、またはその誘導体が挙げられる。一実施形態では、化学的に硫酸化されたグリカンは、化学的に硫酸化されたヘパロサン、またはその誘導体である。一実施形態では、化学的に硫酸化されたグリカンは、化学的に硫酸化されたデキストラン、またはその誘導体である。一実施形態では、化学的に硫酸化されたグリカンは、化学的に硫酸化されたヒアルロン酸、またはその誘導体である。
【００４６】
ある特定の実施形態では、化学的に硫酸化されたグリカンは、さらに誘導体化されており、それは、硫酸化の前または後に行うことができる。ある特定の実施形態では、グリカンは、硫酸化ステップの前にカルボキシメチル置換基を含むように誘導体化されている。したがって、ある特定の実施形態では、化学的に硫酸化されたグリカンは、化学的に硫酸化されたカルボキシメチルアルギネート、化学的に硫酸化されたカルボキシメチルコンドロイチン、化学的に硫酸化されたカルボキシメチルコンドロイチン硫酸、化学的に硫酸化されたカルボキシメチルデルマタン、化学的に硫酸化されたカルボキシメチルヘパラン、化学的に硫酸化されたカルボキシメチルヘパロサン、化学的に硫酸化されたカルボキシメチルヘパラン硫酸、化学的に硫酸化されたカルボキシメチルヘパリン、化学的に硫酸化されたカルボキシメチルデキストラン、化学的に硫酸化されたカルボキシメチルデキストラン硫酸、化学的に硫酸化されたカルボキシメチルヒアルロン酸、またはその誘導体である。
【００４７】
ある特定の実施形態では、化学的に硫酸化されたグリカンは、化学的に硫酸化されたヘパロサン、化学的に硫酸化されたカルボキシメチルヘパロサン、化学的に硫酸化されたデキストラン、化学的に硫酸化されたカルボキシメチルデキストラン、化学的に硫酸化されたヒアルロン酸、化学的に硫酸化されたカルボキシメチルヒアルロン酸（hylauronic  acid）、またはその誘導体である。
【００４８】
グリカン上の硫酸化度は、出発グリカンおよび最終的なバイオコンジュゲートの所望の特性に応じて変わり得る。ある特定の実施形態では、グリカンは、約０．５〜約４、または約０．５〜約３．９、または約０．５を超える、または約０．６、または約０．７、または約０．８、または約０．９、または約１．０、または約１．１、または約１．２、または約１．３、または約１．４、または約１．５、または約１．６、または約１．７、または約１．８、または約１．９、または約２．０、または約２．１、または約２．２、または約２．３、または約２．４、または約２．５、または約２．６、または約２．７、または約２．８、または約２．９、または約３．０、または約３．１、または約３．２、または約３．３、または約３．４、または約３．４、または約３．５、または約３．６、または約３．７、または約３．８、または約３．９、または約４の硫酸化度を有する。硫酸化度は、当技術分野で公知の方法によって算出することができる（例えば、実施例１およびBiomacromolecules,  2009,  10,  3290-3297を参照されたい）。
【００４９】
ある特定の実施形態では、化学的に硫酸化されたグリカンは、二糖１個当たり約０．２５〜約４個、約０．５〜約３個、約２〜約３個、約０．５〜約２．５個、もしくは約０．５〜約２個のサルフェート部分、または二糖１個当たり約０．５個、もしくは約０．６個、もしくは約０．７個、もしくは約０．８個、もしくは約０．９個、もしくは約１．０個、もしくは約１．１個、もしくは約１．２個、もしくは約１．３個、もしくは約１．４個、もしくは約１．５個、もしくは約１．６個、もしくは約１．７個、もしくは約１．８個、もしくは約１．９個、もしくは約２．０個、もしくは約２．１個、もしくは約２．２個、もしくは約２．３個、もしくは約２．４個、もしくは約２．５個、もしくは約２．６個、もしくは約２．７個、もしくは約２．８個、もしくは約２．９個、もしくは約３．０個、もしくは約３．１個、もしくは約３．２個、もしくは約３．３個、もしくは約３．４個、もしくは約３．５個、もしくは約３．６個、もしくは約３．７個、もしくは約３．８個、もしくは約３．９個、もしくは約４個のサルフェート部分を含む。グリカンが従来の「二糖単位」を含有していない実施形態（例えば、アルギン酸）では、化学的に硫酸化されたグリカンは、典型的に、単糖１個当たり約０．２５〜約０．７５個、または約０．３個、または約０．４個、または約０．５個、または約０．６個、または約０．７個、または約０．７５個、または約０．８個、または約０．８５個、または約０．９個、または約０．９５個、または約１個、または約１．２５個、または約１．５個、または約１．７５個、または約２個のサルフェート部分を含む。
【００５０】
本明細書に記載されるバイオコンジュゲートでは、グリカンについて様々な分子量を使用することができるが、より高い分子量は、半減期増加などのある特定の利益をもたらすことができることが企図される。一部の実施形態では、化学的に硫酸化されたグリカンの分子量は、約５〜約１０００ｋＤａである。一部の実施形態では、化学的に硫酸化されたグリカンは、少なくとも約２０、または約２５、または約３０、または約３５、約４０、または約４５、または約５０、または約１００、または約１５０、または約２００、または約２５０、または約３００、または約３５０、または約４００、または約４５０、または約５００、または約５５０、または約６００、または約６５０、または約７００、または約７５０、または約８００、または約８５０、または約９００、または約９５０、または約１０００ｋＤａである。一部の実施形態では、化学的に硫酸化されたグリカンは、約１５０ｋＤａを超える分子量を有する。一部の実施形態では、化学的に硫酸化されたグリカンは、約１５０〜約７５０ｋＤａの分子量を有する。一部の実施形態では、化学的に硫酸化されたグリカンは、約１５０〜約３５０ｋＤａの分子量を有する。一部の実施形態では、化学的に硫酸化されたグリカンは、約２００〜約４００ｋＤａの分子量を有する。ある特定の実施形態では、グリカンは、酸化的に切断されたサッカリド環を含有しておらず、したがってアルデヒド官能基を含有しておらず、また含有してもいなかった。
【００５１】
一実施形態では、バイオコンジュゲートは、コラーゲンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩ、またはＸＩＶ型の１つまたは複数に結合するコラーゲン結合単位を有するペプチドを含む。一実施形態では、コラーゲン結合単位は、コラーゲンに結合すると、原線維形成を促進または阻害する。一実施形態では、コラーゲン結合単位は、コラーゲンに結合すると、原線維形成を促進も阻害もしない。一部の実施形態では、ペプチドは、Ｉ型コラーゲンに結合する。他の実施形態では、ペプチドは、ＩＶ型コラーゲンに結合する。ある特定の実施形態では、コラーゲンに対して特定の結合親和性を有する１つまたは複数のペプチドを、本明細書に記載されるバイオコンジュゲートにおいて使用することができる。例えば、合成バイオコンジュゲートは、Ｉ型コラーゲンに結合親和性を有する少なくとも１つのペプチド、およびＩＶ型コラーゲンに結合親和性を有する少なくとも１つのペプチドを含むことができる。別の実施形態では、ペプチドは、Ｉ型コラーゲンに結合親和性を有する。別の実施形態では、ペプチドは、ＩＶ型コラーゲンに結合親和性を有する。ある特定の実施形態では、ペプチドは、ＩＩ型コラーゲンに結合親和性を有する。ある特定の実施形態では、ペプチドは、ＩＩＩ型コラーゲンに結合親和性を有する。ある特定の実施形態では、ペプチドは、１つよりも多い型のコラーゲンに結合し、各コラーゲン型への相対的親和性は、変わり得る。一実施形態では、バイオコンジュゲートは、約１ｍＭ未満、または約９００μＭ未満、または約８００μＭ未満、または約７００μＭ未満、または約６００μＭ未満、または約５００μＭ未満、または約４００μＭ未満、または約３００μＭ未満、または約２００μＭ未満、または約１００μＭ未満の解離定数（Ｋｄ）でコラーゲンに結合する。
【００５２】
さらに、本明細書に記載されるバイオコンジュゲートは、１つよりも多い結合単位を有するペプチドを含むことができ、結合単位は、同じでも異なっていてもよい。例えば、ある特定の実施形態では、ペプチドは、２つまたはそれよりも多いコラーゲン結合単位を含み、コラーゲン結合単位は同じである。別の実施形態では、ペプチドは、２つまたはそれよりも多いコラーゲン結合単位を含み、コラーゲン結合単位は異なる。
【００５３】
グリカンに結合するペプチドの総数は、バイオコンジュゲートの所望の特性に応じて変わり得る。ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートに存在するペプチドの総数は、グリカン１個当たりペプチド約５０〜約２５０個、または約５０〜約１５０個、または約７５〜約１２５個、または約５０個、または約６０個、または約７０個、または約８０個、または約９０個、または約１００個、または約１１０個、または約１２０個、または約１３０個、または約１４０個、または約１５０個、または約１６０個、または約１７０個、または約１８０個、または約１９０個、または約２００個、または約２１０個、または約２２０個、または約２３０個、または約２４０個、または約２５０個である。
【００５４】
ペプチドは、本明細書で使用される場合、直鎖であっても分岐であってもよく、典型的に１〜約１２０個のアミノ酸を含み、少なくとも１つのコラーゲン結合単位（または配列）を有する。一実施形態では、ペプチドは、約３〜約１２０個のアミノ酸、または約３〜約１１０個のアミノ酸、または約３〜約１００個のアミノ酸、または約３〜約９０個のアミノ酸、または約３〜約８０個のアミノ酸、または約３〜約７０個のアミノ酸、または約３〜約６０個のアミノ酸、または約３〜約５０個のアミノ酸、または約３〜約４０個のアミノ酸、または約５〜約１２０個のアミノ酸、または約５〜約１００個のアミノ酸、または約５〜約９０個のアミノ酸、または約５〜約８０個のアミノ酸、または約５〜約７０個のアミノ酸、または約５〜約６０個のアミノ酸、または約５〜約５０個のアミノ酸、または約５〜約４０個のアミノ酸、または約５〜約３０個のアミノ酸、または約５〜約２０個のアミノ酸、または約５〜約１０個のアミノ酸を含む。これらのペプチドは、「コラーゲン結合ペプチド」と呼ぶこともできる。本明細書で使用される場合、用語「コラーゲン結合単位」は、コラーゲンに結合するペプチドの中のアミノ酸配列を指すことが意図される。「コラーゲン結合」は、化合物がコラーゲンと好都合に結合、または相互作用するように、疎水性、イオン性（荷電）、および／またはファンデルワールス相互作用を含み得る、コラーゲンとの相互作用を示す。この結合（または相互作用）は、共有結合性の結合および一般的官能基との非特異的相互作用とは区別されることが意図され、したがってペプチドは、コラーゲン上でペプチドが結合するその官能基を含有する任意の種と相互作用できる。ペプチドは、当技術分野で公知の任意の方法を使用して、コラーゲンへの結合について試験、および評価することができる。例えば、Li,  Y.,  et  al.,  Current  Opinion  in  Chemical  Biology,  2013,  17:  968-975、Helmes,  B.A.,  et  al.,  J.  Am.  Chem.  Soc.  2009,  131,  11683-11685、およびPetsalaki,  E.,  et  al.,  PLoS  Comput  Biol,  2009,  5(3):  e1000335を参照されたい。一実施形態では、ペプチド、またはペプチドのコラーゲン結合単位は、約１ｍＭ未満、または約９００μＭ未満、または約８００μＭ未満、または約７００μＭ未満、または約６００μＭ未満、または約５００μＭ未満、または約４００μＭ未満、または約３００μＭ未満、または約２００μＭ未満、または約１００μＭ未満の解離定数（Ｋｄ）でコラーゲンに結合する。
【００５５】
コラーゲン結合ペプチドは、コラーゲンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩ、またはＸＩＶ型の１つまたは複数に結合することができる。一部の実施形態では、コラーゲン結合ペプチドは、無傷であっても、切断されていても、分解されていてもよいＩＶ型コラーゲンに結合する。一部の実施形態では、コラーゲン結合ペプチドは、無傷であっても、切断されていても、分解されていてもよいＩまたはＩＩＩ型コラーゲンに結合する。
【００５６】
様々な実施形態では、ＩまたはＩＩＩ型コラーゲンに結合するペプチドは、ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹ（配列番号：）、ＧＥＬＹＫＳＩＬＹ（配列番号：）、ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＣＩＬＹ（配列番号：）、ＧＥＬＹＫＣＩＬＹ（配列番号：）、ＲＬＤＧＮＥＩＫＲ（配列番号：）、ＡＨＥＥＩＳＴＴＮＥＧＶＭ（配列番号：）、ＮＧＶＦＫＹＲＰＲＹＦＬＹＫＨＡＹＦＹＰＰＬＫＲＦＰＶＱ（配列番号：）、ＣＱＤＳＥＴＲＴＦＹ（配列番号：）、ＴＫＫＴＬＲＴ（配列番号：）、ＧＬＲＳＫＳＫＫＦＲＲＰＤＩＱＹＰＤＡＴＤＥＤＩＴＳＨＭ（配列番号：）、ＳＱＮＰＶＱＰ（配列番号：）、ＳＹＩＲＩＡＤＴＮＩＴ（配列番号：）、ＫＥＬＮＬＶＹＴ（配列番号：）、ＧＳＩＴ（配列番号：）、ＧＳＩＴＴＩＤＶＰＷＮＶ（配列番号：）、ＧＱＬＹＫＳＩＬＹ（配列番号：）、ＧＱＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧＳＧＳＲＲ（配列番号：）、ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＱＬＹＫＳＩＬＹ（配列番号：）、または配列がコラーゲンに結合することができるという条件で、それらに対して少なくとも約８０％配列同一性、もしくは少なくとも約８３％配列同一性、もしくは少なくとも約８５％配列同一性、もしくは少なくとも約９０％配列同一性、もしくは少なくとも約９５％配列同一性、もしくは少なくとも約９８％配列同一性を有する配列から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００５７】
一実施形態では、ＩまたはＩＩＩ型コラーゲンに結合するペプチドは、アミノ酸配列ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹ（配列番号：）、または配列がコラーゲンに結合することができるという条件で、それに対して少なくとも約８０％配列同一性、もしくは少なくとも約８３％配列同一性、もしくは少なくとも約８５％配列同一性、もしくは少なくとも約９０％配列同一性、もしくは少なくとも約９５％配列同一性、もしくは少なくとも約９８％配列同一性を有する配列を含む。
【００５８】
一実施形態では、ＩまたはＩＩＩ型コラーゲンに結合するペプチドは、アミノ酸配列ＧＥＬＹＫＳＩＬＹ（配列番号：）、または配列がコラーゲンに結合することができるという条件で、それに対して少なくとも約８０％配列同一性、もしくは少なくとも約８３％配列同一性、もしくは少なくとも約８５％配列同一性、もしくは少なくとも約９０％配列同一性、もしくは少なくとも約９５％配列同一性、もしくは少なくとも約９８％配列同一性を有する配列を含む。
【００５９】
一実施形態では、ＩまたはＩＩＩ型コラーゲンに結合するペプチドは、アミノ酸配列ＧＱＬＹＫＳＩＬＹ（配列番号：）、または配列がコラーゲンに結合することができるという条件で、それに対して少なくとも約８０％配列同一性、もしくは少なくとも約８３％配列同一性、もしくは少なくとも約８５％配列同一性、もしくは少なくとも約９０％配列同一性、もしくは少なくとも約９５％配列同一性、もしくは少なくとも約９８％配列同一性を有する配列を含む。
【００６０】
一実施形態では、ＩまたはＩＩＩ型コラーゲンに結合するペプチドは、アミノ酸配列ＧＱＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧＳＧＳＲＲ（配列番号：）、または配列がコラーゲンに結合することができるという条件で、それに対して少なくとも約８０％配列同一性、もしくは少なくとも約８３％配列同一性、もしくは少なくとも約８５％配列同一性、もしくは少なくとも約９０％配列同一性、もしくは少なくとも約９５％配列同一性、もしくは少なくとも約９８％配列同一性を有する配列を含む。
【００６１】
一実施形態では、ＩまたはＩＩＩ型コラーゲンに結合するペプチドは、アミノ酸配列ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＱＬＹＫＳＩＬＹ（配列番号：）、または配列がコラーゲンに結合することができるという条件で、それに対して少なくとも約８０％配列同一性、もしくは少なくとも約８３％配列同一性、もしくは少なくとも約８５％配列同一性、もしくは少なくとも約９０％配列同一性、もしくは少なくとも約９５％配列同一性、もしくは少なくとも約９８％配列同一性を有する配列を含む。
【００６２】
ＩＶ型コラーゲンに結合するコラーゲン結合単位の非限定的な例は、ＴＬＴＹＴＷＳ（配列番号：）であり、これはＭＭＰ２および９−分解基底膜ＩＶ型コラーゲンに特異的に結合する。同様に、ＧＳＧリンカーをさらに含むＴＬＴＹＴＷＳＧＳＧ（配列番号：）も、切断または分解されたＩＶ型コラーゲンに特異的に結合することができる。別の例は、ＫＬＷＶＬＰＫ（配列番号：）であり、これは無傷ＩＶ型コラーゲンに選択的に結合する。
【００６３】
ある特定の実施形態では、ペプチドは、それぞれ参照によって本明細書に組み込まれるChiang,  T.M.,  et  al.  J.  Biol.  Chem.,  2002,  277:  34896-34901、  Huizinga,  E.G.  et  al.,  Structure,  1997,  5:  1147-1156、  Romijn,  R.A.,  et  al.,  J.  Biol.  Chem.,  2003,  278:  15035-15039、およびChiang,  et  al.,  Cardio.  &  Haemato.  Disorders-Drug  Targets,  2007,  7:  71-75に記載されている通り、フォンビルブランド因子（ｖＷＦ）または血小板コラーゲン受容体のコラーゲン結合ドメイン（複数可）と、少なくとも約８０％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。非限定的な例は、ｖＷＦから得られたＷＲＥＰＳＦＣＡＬＳ（配列番号：）である。
【００６４】
コラーゲン結合親和性（またはコラーゲン結合ドメイン／単位）についてペプチド配列をスクリーニングするための様々な方法が、当技術分野で日常的である。本明細書に開示されるバイオコンジュゲートおよび方法において使用され得る、コラーゲン結合親和性（またはコラーゲン結合単位）を有することが示されている他のペプチド配列には、それらに限定されるものではないが、βＡＷＨＣＴＴＫＦＰＨＨＹＣＬＹＢｉｐ（配列番号：）、βＡＨＫＣＰＷＨＬＹＴＴＨＹＣＦＴＢｉｐ（配列番号：）、βＡＨＫＣＰＷＨＬＹＴＨＹＣＦＴ（配列番号：）など（式中、Ｂｉｐは、ビフェニルアラニンであり、βＡは、ベータ−アラニンである）（Abd-Elgaliel,  W.R.,  et  al.,  Biopolymers,  2013,  100(2),  167-173を参照されたい）、ＧＲＯＧＥＲ（配列番号：）、ＧＭＯＧＥＲ（配列番号：）、ＧＬＯＧＥＮ（配列番号：）、ＧＬＯＧＥＲ（配列番号：）、ＧＬＫＧＥＮ（配列番号：）、ＧＦＯＧＥＲＧＶＥＧＰＯＧＰＡ（配列番号：）など（式中、Ｏは、４−ヒドロキシプロリンである）（Raynal,  N.,  et  al.,  J.  Biol.  Chem.,  2006,  281(7),  3821-3831を参照されたい）、ＨＶＷＭＱＡＰＧＧＧＫ（配列番号：）（Helms,  B.A.,  et  al.,  J.  Am.  Chem.  Soc.  2009,  131,  11683-11685を参照されたい）、ＷＲＥＰＳＦＣＡＬＳ（配列番号：）（Takagi,  J.,  et  al.,  Biochemistry,  1992,  31,  8530-8534を参照されたい）、ＷＹＲＧＲＬ（配列番号：）など（Rothenfluh  D.A.,  et  al.,  Nat  Mater.  2008,  7(3),  248-54を参照されたい）、ＷＴＣＳＧＤＥＹＴＷＨＣ（配列番号：）、ＷＴＣＶＧＤＨＫＴＷＫＣ（配列番号：）、ＱＷＨＣＴＴＲＦＰＨＨＹＣＬＹＧ（配列番号：）など（ＵＳ２００７／０２９３６５６を参照されたい）、ＳＴＷＴＷＮＧＳＡＷＴＷＮＥＧＧＫ（配列番号：）、ＳＴＷＴＷＮＧＴＮＷＴＲＮＤＧＧＫ（配列番号：）など（ＷＯ／２０１４／０５９５３０を参照されたい）、ＣＶＷＬＷＥＱＣ（配列番号：）  環式ＣＶＷＬＷＥＮＣ（配列番号：）、環式ＣＶＷＬＷＥＱＣ（配列番号：）（Depraetere  H.,  et  al.,  Blood.  1998,  92,  4207-4211、およびDuncan  R.,  Nat  Rev  Drug  Discov,  2003,  2(5),  347-360を参照されたい）、ＣＭＴＳＰＷＲＣ（配列番号：）など（Vanhoorelbeke,  K.,  et  al.,  J.  Biol.  Chem.,  2003,  278,  37815-37821を参照されたい）、ＣＰＧＲＶＭＨＧＬＨＬＧＤＤＥＧＰＣ（配列番号：）（Muzzard,  J.,  et  al.,  PLoS  one.  4  (e  5585)  I-  10を参照されたい）、ＫＬＷＬＬＰＫ（配列番号：）（Chan,  J.  M.,  et  al.,  Proc  Natl  Acad  Sci  U.S.A.,  2010,  107,  2213-  2218を参照されたい）、およびＣＱＤＳＥＴＲＴＦＹ（配列番号：）など（ＵＳ２０１３／０２４３７００を参照されたい）、Ｈ−Ｖ−Ｆ／Ｗ−Ｑ／Ｍ−Ｑ−Ｐ／Ａ−Ｐ／Ｋ（Helms,  B.A.,  et  al.,  J.  Am.  Chem.  Soc.,  2009,  131(33),  11683-11685）が含まれ、それぞれ、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【００６５】
本明細書に開示されるバイオコンジュゲートおよび方法において使用され得る、コラーゲン結合親和性（またはコラーゲン結合単位）を有することが示されているさらなるペプチド配列には、それらに限定されるものではないが、ＬＳＥＬＲＬＨＥＮ（配列番号：）、ＬＴＥＬＨＬＤＮＮ（配列番号：）、ＬＳＥＬＲＬＨＮＮ（配列番号：）、ＬＳＥＬＲＬＨＡＮ（配列番号：）、およびＬＲＥＬＨＬＮＮＮ（配列番号：）（Fredrico,  S.,  Angew.  Chem.  Int.  Ed.  2015,  37,  10980-10984を参照されたい）が含まれる。
【００６６】
本明細書に開示されるバイオコンジュゲートおよび方法において使用され得る、コラーゲン結合親和性（またはコラーゲン結合単位）を有することが示されているさらなるペプチド配列には、それらに限定されるものではないが、ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹＧＣ（配列番号：）、ＭＩＶＩＥＬＧＴＮＰＬＫＳＳＧＩＥＮＧＡＦＱＧＭＫＫ（配列番号：）、ＫＥＬＮＬＶＹ（配列番号：）、ＤＡＲＫＳＥＶＱＫ（配列番号：）、ＨＶＷＭＱＡＰ（配列番号：）、ＨＷＧＳＬＲＡ（配列番号：）（Hendra  Wahyudi  et  al.,  J  Control  Release.  2016,  240,  323-331を参照されたい）、およびＧＫＷＨ［ＣＴＴＫＦＰＨＨＹＣ］ＬＹＢｉｐ−ＣＯＮＨ２（式中、Ｂｉｐはビフェニルアラニンである）（Wei  Chen  et  al.,  JACC  Cardiovasc  Imaging.  2013,  6(3):  373-384を参照されたい）が含まれる。
【００６７】
ある特定の実施形態では、ペプチドは、ＲＶＭＨＧＬＨＬＧＤＤＥ（配列番号：）、Ｄ−アミノ酸ＥＤＤＧＬＨＬＧＨＭＶＲ（配列番号：）、ＲＶＭＨＧＬＨＬＧＮＮＱ（配列番号：）、Ｄ−アミノ酸ＱＮＮＧＬＨＬＧＨＭＶＲ（配列番号：）、ＲＶＭＨＧＬＨＬＧＮＮＱ（配列番号：）、（ＧＱＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧ）４Ｋ２Ｋ（配列番号：）（４分岐ペプチド）、ＧＳＧＱＬＹＫＳＩＬＹ（配列番号：）、ＧＳＧＧＱＬＹＫＳＩＬＹ（配列番号：）、ＫＱＬＮＬＶＹＴ（配列番号：）、ＣＶＷＬＷＱＱＣ（配列番号：）、ＷＲＥＰＳＦＳＡＬＳ（配列番号：）、ＧＨＲＰＬＤＫＫＲＥＥＡＰＳＬＲＰＡＰＰＰＩＳＧＧＧＹＲ（配列番号：）、およびＧＨＲＰＬＮＫＫＲＱＱＡＰＳＬＲＰＡＰＰＰＩＳＧＧＧＹＲ（配列番号：）からなる群から選択される１つまたは複数の配列を含む。
【００６８】
コラーゲン結合ペプチドについても同様に、コラーゲンについて選択されたファージディスプレイライブラリーから得られたペプチドを生成することができる。ペプチドは、コラーゲンへの結合についてＳＰＲ、ＥＬＩＳＡ、ＩＴＣ、アフィニティークロマトグラフィー、または当技術分野で公知の他の技術などの技術のいずれかによって合成、および評価することができる。一例は、固定化コラーゲンを含有するマイクロプレートでインキュベートされるビオチン修飾ペプチド配列（例えば、ＳＩＬＹｂｉｏｔｉｎ）であり得る。コラーゲンに結合するペプチドの能力を決定するために、ストレプトアビジン発色団を使用して、用量応答結合曲線を生成することができる。
【００６９】
一実施形態では、ペプチドは、コラーゲンＩ、ＩＩＩまたはＩＶ型のいずれか１つまたは複数に結合する１つまたは複数のコラーゲン結合単位を含む。一実施形態では、ペプチドは、約１ｍＭ未満、または約９００μＭ未満、または約８００μＭ未満、または約７００μＭ未満、または約６００μＭ未満、または約５００μＭ未満、または約４００μＭ未満、または約３００μＭ未満、または約２００μＭ未満、または約１００μＭ未満の解離定数（Ｋｄ）でＩ型コラーゲンに結合する。一実施形態では、ペプチドは、約１ｍＭ未満、または約９００μＭ未満、または約８００μＭ未満、または約７００μＭ未満、または約６００μＭ未満、または約５００μＭ未満、または約４００μＭ未満、または約３００μＭ未満、または約２００μＭ未満、または約１００μＭ未満の解離定数（Ｋｄ）で、ＩＩＩ型コラーゲンに結合する。一実施形態では、ペプチドは、約１ｍＭ未満、または約９００μＭ未満、または約８００μＭ未満、または約７００μＭ未満、または約６００μＭ未満、または約５００μＭ未満、または約４００μＭ未満、または約３００μＭ未満、または約２００μＭ未満、または約１００μＭ未満の解離定数（Ｋｄ）でＩＶ型コラーゲンに結合する。一実施形態では、ペプチドは、約１ｍＭ未満、または約９００μＭ未満、または約８００μＭ未満、または約７００μＭ未満、または約６００μＭ未満、または約５００μＭ未満、または約４００μＭ未満、または約３００μＭ未満、または約２００μＭ未満、または約１００μＭ未満の解離定数（Ｋｄ）でＩＶ型コラーゲンに結合する。
【００７０】
本明細書に記載される実施形態のいずれかでは、ペプチドコラーゲン結合単位は、先行する段落に記載される任意のアミノ酸配列、またはこれらのアミノ酸配列のいずれかに対して少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約８３％、もしくは少なくとも約８５％、もしくは少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約１００％相同性を有するアミノ酸配列を含む。様々な実施形態では、本明細書に記載されるバイオコンジュゲートのペプチド構成成分は、１つまたは複数の保存的アミノ酸置換を含めることによって修飾され得る。当業者に周知の通り、ペプチドの重要ではない任意のアミノ酸を保存的置換によって変えても、置き換えるアミノ酸の側鎖が、置き換えられたアミノ酸の側鎖と類似の結合および接触を形成することができるはずであるので、そのペプチドの活性は有意には変わらないはずである。
【００７１】
本明細書で使用される場合、用語「配列同一性」は、２個のペプチド間または２個の核酸分子間のアミノ酸残基またはヌクレオチド同一性のレベルを指す。比較される配列における位置が、同じ塩基またはアミノ酸によって占められている場合には、分子は、その位置において同一である。ペプチド（またはポリペプチドまたはペプチド領域）は、別の配列に対してある特定のパーセンテージ（例えば、少なくとも約６０％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％）の「配列同一性」を有し、そのことは、そのパーセンテージの塩基（またはアミノ酸）が、整列した場合には２つの配列の比較において同じであることを意味する。本願に開示される任意の配列（「参照配列」）では、参照配列に対して少なくとも約６０％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％配列同一性を有する配列も、本開示に含まれることが注目される。同様に、本開示はまた、参照配列と比較して、アミノ酸残基の１つ、２つ、３つ、４つまたは５つの置換、欠失または付加を有する配列を含む。ある特定の実施形態では、本明細書で特定される配列の任意の１つまたは複数において、配列は、それからそれぞれ１つ、２つ、または３つのアミノ付加、欠失および／または置換を有することによって修飾され得る。
【００７２】
当技術分野で周知の通り、アミノ酸の「保存的置換」またはペプチドの「保存的置換変異体」は、１）ペプチドの二次構造、２）アミノ酸の電荷もしくは疎水性、および３）側鎖の嵩高さ、またはこれらの特徴の任意の１つもしくは複数を維持するアミノ酸置換を指す。例示的に、周知の専門用語である「親水性の残基」は、セリンまたはトレオニンに関する。「疎水性の残基」は、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリンまたはアラニンなどを指す。「正電荷の残基」は、リシン、アルギニン、オルニチン、またはヒスチジンに関する。「負電荷の残基」は、アスパラギン酸またはグルタミン酸を指す。「嵩高い側鎖」を有する残基は、フェニルアラニン、トリプトファンまたはチロシンなどを指す。例示的な保存的アミノ酸置換の一覧を、表１に示す。
【表１】
2020526493.tif 000003
【００７３】
ペプチド（複数可）は、グリカンに直接的にまたはリンカーを介して結合することができる。一部の実施形態では、リンカーは、任意の適切な二官能性リンカー、例えば、Ｎ−［β−マレイミドプロピオン酸］ヒドラジド（ＢＭＰＨ）、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジド（ＰＤＰＨ）などであってよい。本明細書に記載される様々な実施形態のいずれかでは、ペプチドの配列は、グリカンまたはグリカン−リンカーコンジュゲートのための結合点を提供するために、ペプチドのＣ末端に結合したグリシン−システイン（ＧＣ）および／またはＮ末端に結合したグリシン−システイン−グリシン（ＧＣＧ）を含むように修飾され得る。ある特定の実施形態では、リンカーは、Ｎ−［β−マレイミドプロピオン酸］ヒドラジド（ＢＭＰＨ）である。ある特定の実施形態では、リンカーは、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジド（ＰＤＰＨ）である。
【００７４】
グリカンに結合するペプチドの総数は、バイオコンジュゲートの所望の特性に応じて変わり得る。ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートに存在するペプチドの総数は、約５０〜約２００個、または約５０〜約１６０個、または約５０〜約１６０個、または約５０〜約１６０個、または約５０〜約１６０個、または約５０〜約１５０個、または約５０〜約１４０個、または約６０〜約１２０個、または約７０〜約１１０個、または約８０〜約１１０個、または約９０〜約１１０個、または約５０個、または約６０個、または約７０個、または約８０個、または約９０個、または約１００個、または約１１０個、または約１２０個、または約１３０個、または約１４０個、または約１５０個、または約１６０個、または約１７０個、または約１８０個、または約１９０個、または約２００個である。他の実施形態では、バイオコンジュゲートは、約５〜約２００個のペプチドを含む。様々な実施形態では、バイオコンジュゲートは、約４〜約１８０個のペプチドを含む。ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートは、約２００個未満のペプチドを含む。ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートは、約１８０個未満のペプチドを含む。ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートは、約１５０個未満のペプチドを含む。ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートは、約１００個未満のペプチドを含む。
【００７５】
本明細書に記載される実施形態のいずれかでは、グリカン１個当たりのペプチドの数は平均であり、組成物におけるある特定のバイオコンジュゲートは、グリカン１個当たりより多くのペプチドを有することができ、ある特定のバイオコンジュゲートは、グリカン１個当たりより少ないペプチドを有する。したがって、ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるペプチドの数は、バイオコンジュゲートの組成物における平均である。例えば、ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートは、グリカン１個当たりのペプチドの平均数が、約５０または約５０を超える組成物である。他の実施形態では、グリカン１個当たりのペプチドの平均数は、約６０、または約７０、または約８０、または約９０、または約１００、または約１１０、または約１２０、または約１３０、または約１４０、または約１５０、または約１６０、または約１７０、または約１８０、または約１９０、または約２００、または約２５０、または約３００である。
【００７６】
ある特定の実施形態では、グリカン１個当たりのペプチドの数は、ペプチドで機能化されるグリカン主鎖上の二糖単位のパーセントに基づく「機能化パーセント（％）」として記載することができる。例えば、グリカン上に存在する利用可能な二糖単位の総数は、単一の二糖単位の分子量（または平均分子量）（例えば、約５５０〜８００Ｄａ、または約６５０〜７５０Ｄａ）を、グリカンの分子量（例えば、約２５ｋＤａ〜最大約７０ｋＤａ、またはさらには約１００ｋＤａ）で割ることによって算出することができる。グリカンが従来の「二糖単位」を含有していない実施形態（例えば、アルギン酸）では、本明細書で提示される算出において使用されるグリカン上に存在する利用可能な二糖単位の総数は、単一サッカリド単位の分子量（または平均分子量）を、グリカンの分子量で割り、２を掛けることによって算出することができる。
【００７７】
したがって、ある特定の実施形態では、グリカンは、約１〜約５０％、または約５〜約３０％のペプチドによる機能化、または約１０〜約３０％のペプチドによる機能化、または約２０％のペプチドによる機能化を含み、ペプチドによる機能化パーセント（％）は、ペプチドで機能化されているグリカン上の二糖単位のパーセントによって決定される。一部の実施形態では、ペプチドによるグリカンの機能化パーセント（％）は、約１％〜約５０％、または約３％〜約４０％、または約５％〜約３０％、または約１０％〜約３０％、または約５％、または約１０％、または約１５％、または約２０％、または約２５％、または約３０％、または約３５％、または約４０％、または約４５％、または約５０％である。
【００７８】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるバイオコンジュゲートおよびペプチドを含む組成物であって、ペプチドがバイオコンジュゲートに密接に会合している（例えば、イオン結合を介して）組成物が提供される。ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲート凝集体は、それによって形成され得る。バイオコンジュゲート凝集体（バイオコンジュゲートおよび非共有結合により結合したペプチドを含む）は、１％〜２００％のペプチドの機能化（ペプチドで機能化されている、グリカン上の二糖単位のパーセントによって決定される）を含み得ることが企図される。一部の実施形態では、バイオコンジュゲート凝集体におけるペプチドの機能化パーセント（％）は、約１％〜約５０％、または約３％〜約４０％、または約５％〜約３０％、または約１０％〜約２０％、または約１％、または約２％、または約５％、または約１０％、または約１５％、または約２０％、または約２５％、または約３０％、または約３５％、または約４０％、または約４５％、または約５０％、または約５５％、または約６０％、または約６５％、または約７０％、または約７５％、または約８０％、または約８５％、または約９０％、または約９５％、または約１００％である。
【００７９】
一実施形態では、上記の方法において使用されるバイオコンジュゲートは、ヘパリンおよび約５０〜約１５０個、または約１００個のペプチドを含み、ペプチドは、ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹ（配列番号：）、ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧ（配列番号：）、ＧＱＬＹＫＳＩＬＹ（配列番号：）、またはＧＱＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧＳＧＳＲＲ（配列番号：）の少なくとも１つの配列を含み、ヒドラジド−カルボニル連結を介してヘパリンに結合している。ある特定の実施形態では、ヘパリンは、未分画ヘパリン（ＵＦＨ）または低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）である。
【００８０】
一実施形態では、上記の方法において使用されるバイオコンジュゲートは、ヘパリンおよび約１５〜約３０％のペプチドによる機能化を含み、ペプチドは、ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹ（配列番号：）ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧ（配列番号：）、ＧＱＬＹＫＳＩＬＹ（配列番号：）、またはＧＱＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧＳＧＳＲＲ（配列番号：）の少なくとも１つの配列を含み、ヒドラジド−カルボニル連結を介してヘパリンに結合している。
【００８１】
一実施形態では、上記の方法において使用されるバイオコンジュゲートは、ヘパリンおよび約１５〜約３０％のペプチドによる機能化を含み、ペプチドは、ＧＱＬＹＫＳＩＬＹ（配列番号：）、ＧＱＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧＳＧＳＲＲ（配列番号：）、ＣＰＧＲＶＭＨＧＬＨＬＧＤＤＥＧＰＣ（配列番号：）、ＣＶＷＬＷＥＱＣ（配列番号：）もしくはＷＲＥＰＳＦＣＡＬＳ（配列番号：）の少なくとも１つの配列、またはそれからそれぞれ１つ、２つもしくは３つのアミノ付加、欠失および／もしくは置換を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートは、少なくとも２つの異なるコラーゲン結合単位を含む。
【００８２】
ペプチドは、コラーゲンへの結合についてＳＰＲ、ＥＬＩＳＡ、ＩＴＣ、アフィニティークロマトグラフィー、または当技術分野で公知の他の技術などの技術のいずれかによって合成、および評価することができる。一例は、固定化コラーゲンを含有するマイクロプレートでインキュベートされるビオチン修飾ペプチド配列（例えば、ＳＩＬＹｂｉｏｔｉｎ）であり得る。コラーゲンに結合するペプチドの能力を決定するために、ストレプトアビジン発色団を使用して、用量応答結合曲線を生成することができる。本明細書に記載される様々な実施形態では、本明細書に記載されるペプチドは、１つまたは複数の保存的アミノ酸置換を含ませることによって修飾され得る。当業者に周知の通り、ペプチドの重要でない任意のアミノ酸を保存的置換によって変えても、置き換えるアミノ酸の側鎖が、置き換えられたアミノ酸の側鎖と類似の結合および接触を形成することができるはずであるので、そのペプチドの活性は有意には変わらないはずである。非保存的置換も、ペプチドの結合活性（すなわち、コラーゲン結合親和性）に実質的に影響を及ぼさないという条件で可能であり得る。
【００８３】
したがって、一部の実施形態では、グリカン上にアルデヒド結合部位を提供するために、酸化化学反応を利用してグリカン主鎖内のサッカリド環の１つまたは複数を切断することによって、ペプチドをデルマタン硫酸などのグリカンに結合させる。次にアルデヒド結合部位を使用して、ペプチドをコンジュゲートする（例えば、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｎ＝Ｃ結合を介して）。
【００８４】
一部の実施形態では、ペプチドは、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（すなわちヒドラジド−カルボニル）連結を介してグリカンに共有結合により結合することができる。ここでペプチドは、ヒドラジド−カルボニル連結を介してグリカンに結合され、ヒドラジド−カルボニルのカルボニル基は、グリカン上に存在する環外カルボニル基である。環外カルボニル基は、ネイティブなグリカン上に存在することができ、または、あるいはグリカンは、このような官能基を含むように修飾され得る。このような方法は、以下にさらに詳説される。本明細書に開示される通りバイオコンジュゲートによって示された有益な効果（例えば、結合親和性の増加）は、酸化的に切断されたサッカリド環を含有していないグリカンに、少なくとも部分的に起因することが企図される。
【００８５】
したがって、ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるペプチドは、ペプチドへのコンジュゲーションのためのヒドラジド部分をさらに含む。ヒドラジド基は、例えばＣ末端、Ｎ末端などの任意の適切な結合点において、またはアミノ酸上の側鎖を介してペプチド（複数可）に結合することができる。例えば、ペプチドが、ペプチドのアミノ酸の側鎖を介してグリカンに結合する場合、側鎖は、グルタミン酸またはアスパラギン酸である。ヒドラジドは、ペプチド配列のアミノ酸上に存在するカルボニル基（例えば、Ｃ末端カルボニル基）または存在する場合にはスペーサーに結合したヒドラジン（−ＮＨＮＨ２）との間で形成され得る。
【００８６】
ある特定の実施形態では、ペプチド（複数可）は、スペーサーを介してグリカン（またはリンカー、存在する場合）に結合している。本明細書で使用される場合、用語「スペーサー」は、ペプチド（または結合単位）を、存在する場合にはリンカーまたはグリカン（直接的に結合することができる）のいずれかに連結する、バイオコンジュゲートの必要に応じた部分を指すことが意図される。本明細書に記載される実施形態のいずれかでは、ペプチドの任意の１つまたは複数は、１〜約１５個のアミノ酸を含む直鎖または分岐のスペーサー配列を有することができる。一実施形態では、スペーサーは、１つまたは複数の、または１〜２０個、または１０〜２０個、または５〜１５個、または５〜１０個、または１〜１０個、または１〜５個、または１〜３個のアミノ酸を含む。天然または非天然の任意のアミノ酸は、スペーサー配列がペプチドの所期の結合を有意に妨害しないという条件で、スペーサー配列において使用することができることが企図される。アミノ酸は、一部の例では、非極性アミノ酸、例えばアラニン、システイン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシンおよびバリンである。ある特定の実施形態では、アミノ酸は、グリシン、アラニン、アルギニンおよびセリンからなる群から選択される。
【００８７】
例示的なスペーサーとして、それらに限定されるものではないが、１〜５個のグリシン単位（例えば、Ｇ、ＧＧ、ＧＧＧ、ＧＧＧＧ（配列番号：）、またはＧＧＧＧＧ（配列番号：））を含み、必要に応じてシステイン（例えば、ＧＣ、ＧＣＧ、ＧＳＧＣ（配列番号：）、またはＧＧＣ）および／またはセリン（例えば、ＧＳＧ、ＳＧＧ、またはＧＳＧＳＧ（配列番号：）またはＧＳＧＳＧＳ（配列番号：））、１〜５個のアルギニン単位（例えば、Ｒ、ＲＲ、ＲＲＲなど）、またはそれらの組合せ（ＧＳＧＲＲ（配列番号：）、ＧＳＧＳＲＲ（配列番号：）、ＧＳＧＳＧＲＲ（配列番号：）またはＧＳＧＳＧＳＲＲ（配列番号：））を含む短い配列が挙げられる。スペーサーは、追加のアミノ酸スペーサーを伴うまたは伴わない、非アミノ酸部分、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、６−アミノヘキサン酸、コハク酸、またはそれらの組合せを含むこともできる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるペプチド配列は、ＧＳＧ−ＮＨＮＨ２部分をさらに含む。典型的に、ＧＳＧ−ＮＨＮＨ２部分は、ＣまたはＮ末端のいずれかに結合している。
【００８８】
ある特定の実施形態では、スペーサーは、１つよりも多い結合部位（スペーサーは、直鎖であっても分岐であってもよい）を含み、したがって１つよりも多いペプチド配列がそれに結合し、したがって分岐構築物を作り出すことができる。さらに、ペプチドは、末端または非末端アミノ酸部分を介してグリカンに結合することができるので、非末端アミノ酸部分を介してグリカンに結合した場合には分岐となる。スペーサー上の結合部位は、同じでも異なっていてもよく、アミンまたはカルボン酸部分などの任意の適切な結合部位であってよく、したがって、所望のペプチド配列がそれに結合することができる（例えばアミド結合を介して）。したがって、ある特定の実施形態では、スペーサーは、１つまたは複数のリシン、グルタミン酸またはアスパラギン酸残基を含有する。ある特定の実施形態では、スペーサーは、２〜６個のアミノ酸、または３個もしくは４個のアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、スペーサーは、式ＫＸＸ（式中、各Ｘは、独立に、天然または非天然アミノ酸である）の１つまたは複数のアミノ酸配列を含む。分岐構築物を作製するために単独でまたは組合せで使用され得るスペーサーの具体例として、それらに限定されるものではないが、ＫＲＲ、ＫＫＫ、（Ｋ）ｎＧＳＧ、および（ＫＲＲ）ｎ−ＫＧＳＧ（式中、ｎは、０〜５、または１、２、３、４もしくは５である）が挙げられる。一実施形態では、スペーサーは、ＧＳＧＫＲＲＧＳＧ（配列番号：）である。
【００８９】
このような構築物は、式ＰｎＬ（式中、少なくとも１つのＰは、コラーゲン結合単位であり、Ｌは、スペーサーであり、ｎは、２〜約１０、または２〜８、または２〜６、または２〜５、または２〜４、または２、または３、または４、または５、または６、または７、または８、または９、または１０の整数である）の１つよりも多い単位を有するペプチドを提供することができる。例えば、スペーサーＬは、ＫＧＳＧ（配列番号：）、ＫＫＧＳＧ（配列番号：）、Ｋ２ＫＧＳＧ（配列番号：）、またはＫＫＫＧＳＧ（配列番号：）などのアミノ酸配列であってよく、ペプチドは、Ｎ末端および側鎖窒素に結合して、それぞれ２つ、３つおよび４つの結合部位を提供することができる。ペプチドに結合したこれらのスペーサーの模式図を、以下の表に示す。
【表７】
2020526493.tif 000004
【００９０】
一部の実施形態では、ペプチド配列を修飾して、１つもしくは複数のグルタミン酸残基をグルタミンで、かつ／または１つもしくは複数のアスパラギン酸残基をアスパラギンで置き換える。
【００９１】
例示的な分岐コラーゲン結合構築物として、それらに限定されるものではないが、（ＧＥＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧ）２Ｋ（配列番号：）、（ＧＥＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧ）２ＫＧＳＧ（配列番号：）、（ＧＥＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧ）３ＫＫ（配列番号：）、（ＧＥＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧ）３ＫＫＧＳＧ（配列番号：）、（ＧＥＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧ）４ＫＫＫ（配列番号：）、（ＧＥＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧ）４ＫＫＫＧＳＧ（配列番号：）、（ＧＱＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧ）２Ｋ（配列番号：）、（ＧＱＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧ）２ＫＧＳＧ（配列番号：）、（ＧＱＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧ）３ＫＫ（配列番号：）、（ＧＱＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧ）３ＫＫＧＳＧ（配列番号：）、（ＧＱＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧ）４Ｋ２Ｋ（配列番号：）、（ＧＱＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧ）４Ｋ２ＫＧＳＧ（配列番号：）、（ＧＱＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧ）４ＫＫＫ（配列番号：）、（ＧＱＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧ）４ＫＫＫＧＳＧ（配列番号：）、（ＧＱＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧ）４−（ＫＲＲ）２−Ｋ（配列番号：）、および（ＧＱＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧ）４−（ＫＲＲ）２−ＫＧＳＧ（配列番号：）が挙げられる。
【００９２】
一実施形態では、ヒドラジド基は、グリシン、アラニン、アルギニンおよびセリンからなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸を含むスペーサーを介してＣ末端に結合している。一実施形態では、スペーサーは、グリシン、グリシン−グリシン、およびグリシン−セリン−グリシンからなる群から選択される。様々な実施形態では、ペプチドは、グリシン−セリン−グリシン（ＧＳＧ）、ＧＳＧＳＧＳＲＲ（配列番号：）、ＫＲＲＧＳＧ（配列番号：）、またはＧＳＧＫＲＲＧＳＧ（配列番号：）などのアミノ酸スペーサーを含む。
３．バイオコンジュゲートの合成
【００９３】
本明細書で使用されるペプチドは、商業的供給源から購入することができ、または当技術分野で周知の方法（例えば、化学的および／または生物工学的方法）を使用して部分的もしくは完全に合成することができる。ある特定の実施形態では、ペプチドは、当技術分野で周知の固相ペプチド合成プロトコールに従って合成される。別の実施形態では、ペプチドは、周知のＦｍｏｃプロトコールに従って固体支持体上で合成され、トリフルオロ酢酸を用いて支持体から切断され、クロマトグラフィーによって当業者に公知の方法に従って精製される。他の実施形態では、ペプチドは、当業者に周知のバイオテクノロジーの方法を利用して合成される。一実施形態では、所望のペプチドのためのアミノ酸配列情報をコードするＤＮＡ配列を、当業者に公知の組換えＤＮＡ技術によって発現プラスミド（例えば、ペプチドの親和性精製のために親和性タグを組み込むプラスミド）にライゲーションし、プラスミドを、発現のための宿主生物にトランスフェクトし、次にペプチドを、例えば、親和性精製によって宿主生物または成長培地から単離する。組換えＤＮＡ技術方法は、参照によって本明細書に組み込まれるSambrook  et  al.,  “Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual”,  3rd  Edition,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press,  (2001)に記載されており、当業者に周知である。
【００９４】
以下のスキーム１に示される通り、本明細書に記載されるバイオコンジュゲートは、化学的に硫酸化されたグリカン誘導体（例えば、硫酸化ヒアルロン酸）から合成される。本明細書に記載されるバイオコンジュゲートでの使用に適した様々なグリカン誘導体は、グリカン主鎖に沿ったヒドロキシルの求核置換を介するものなどの当技術分野で公知の方法を使用して、調製することができる（例えば、Biomacromolecules,  2009,  10,  3290-3297を参照されたい）。スキーム１に示される通り、グリカン（例えば、ヒアルロン酸）１Ａを、ＳＯ３／ＤＭＦ複合体などの適切な硫酸化剤と反応させて、１つまたは複数の化学的に硫酸化されたグリカン誘導体１Ｂを提供することができる。当業者に明らかである通り、化学的に硫酸化されたグリカン誘導体１Ｂは、部分的な、完全なまたは混合物の硫酸化グリカン誘導体（複数可）１Ｂを得ることができるように、用いる試薬および反応条件に応じて調整され得る。次に、化学的に硫酸化されたグリカン誘導体１Ｂを、必要に応じてカップリング剤の存在下で、典型的なペプチドカップリング反応条件下でペプチドと反応させて、バイオコンジュゲート１Ｃを提供することができる。
【００９５】
ペプチドカップリング反応において典型的である通り、活性化剤を使用して、反応を容易にすることができる。適切なカップリング剤（または活性化剤）は当技術分野で公知であり、それには、例えば、カルボジイミド（例えば、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロペンチルカルボジイミド、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ−ｔ−ブチル−Ｎ−メチルカルボジイミド（ＢＭＣ）、Ｎ−ｔ−ブチル−Ｎ−エチルカルボジイミド（ＢＥＣ）、１，３−ビス（２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−イルメチル）カルボジイミド（ＢＤＤＣ）など）、テトラメチルフルオロホルムアミジニウムヘキサフルオロホスフェート（ＴＦＦＨ）、無水物（例えば、対称型、混合型、または環式無水物）、活性化エステル（例えば、フェニル活性化エステル誘導体、ｐ−ヒドロキサム酸活性化エステル、ヘキサフルオロアセトン（ＨＦＡ）など）、アシルアゾール（ＣＤＩを使用するアシルイミダゾール、アシルベンゾトリアゾールなど）、アシルアジド、酸ハロゲン化物、ホスホニウム塩（ＢＯＰ、ＡＯＰ、ＰｙＡＯＰ、ＢＯＰ−Ｃｌ、Ｂｒｏｐ、ＰｙＢｒｏｐ、ＰｙＯｘｉｍ、ＨＯＢｔ、ＰｙＢＯＰ、ＨＯＡｔなど）、ＥＥＤＱ、ＩＩＤＱ、ＣＩＰ、ＤＰＰＡ、アミニウム／ウロニウム塩（例えば、ＨＡＴＵ、ＨＢＴＵ、ＣＯＭＵ、テトラメチルアミニウム塩、ビスピロリジノアミニウム塩、ビスピペリジノアミニウム塩、イミダゾリウムウロニウム塩、ピリミジニウムウロニウム塩、Ｎ，Ｎ，Ｎ’−トリメチル−Ｎ’−フェニル尿素から得られるウロニウム塩、モルホリノベースのアミニウム／ウロニウムカップリング試薬、アンチモン酸ウロニウム塩など）、有機リン試薬（例えば、ホスフィン酸およびリン酸誘導体）、有機硫黄試薬（例えば、スルホン酸誘導体）、トリアジンカップリング試薬（例えば、２−クロロ−４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４メチルモルホリニウム塩化物、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４メチルモルホリニウムテトラフルオロボレートなど）、ピリジニウムカップリング試薬（例えば、向山試薬、ピリジニウムテトラフルオロボレートカップリング試薬など）、ポリマー支持試薬（例えば、ポリマー結合カルボジイミド、ポリマー結合ＴＢＴＵ、ポリマー結合２，４，６−トリクロロ−１，３，５−トリアジン、ポリマー結合ＨＯＢｔ、ポリマー結合ＨＯＳｕ、ポリマー結合ＩＩＤＱ、ポリマー結合ＥＥＤＱなど）など（例えば、El-Faham,  et  al.  Chem.  Rev.,  2011,  111(11):  6557-6602；Han,  et  al.  Tetrahedron,  2004,  60:2447-2467を参照されたい）が含まれる。
【００９６】
一実施形態では、ペプチドカップリング反応は、活性化グリカン中間体を介して、グリカンのカルボン酸部分をカップリング剤（例えば、カルボジイミド試薬、例えばそれらに限定されるものではないが、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）など）と反応させて、Ｏ−アシルイソ尿素中間体を形成することによって進行する。このようなカルボジイミド化学反応は、当技術分野で周知であり、適切なカップリング剤は、商業的供給源から購入することができる。Ｏ−アシルイソ尿素中間体を、所望のペプチドと接触させると、バイオコンジュゲートが得られる。グリカンは、ペプチドが存在する前にまたはペプチドの存在下で活性化剤と接触させることができる。
【化１】
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【００９７】
ある特定の実施形態では、ペプチド配列は、グリカン、またはそのＯ−アシル尿素中間体とのカップリング反応を助けるために、反応性部分（例えば、ヒドラジド官能基）を含むことができる。一部の実施形態では、ペプチド配列は、結合単位と、末端アミノ酸（例えば、終端グリシン）または反応性部分（すなわち、ヒドラジド官能基）との間のスペーサーとして作用する１つまたは複数のアミノ酸残基を含む。さらに、ペプチドの１つまたは複数のアミノ酸が反応性官能基（例えば、カルボン酸側鎖）を含有する、ある特定の場合には、１つまたは複数の側鎖を保護してカップリング反応を容易にするために、標準保護基化学を使用することができる。さらに、非アミノ酸スペーサーを、単独で、またはアミノ酸スペーサー（例えば、アミノヘキサン酸）と組み合わせて用いることもできる。ある特定の実施形態では、化学的に硫酸化されたグリカン誘導体１Ｂを、Ｏ−カルボキシメチル化グリカン誘導体（複数可）（すなわち、少なくとも１つのＲは、−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＯＨである）から調製し、次に必要に応じてカップリング剤の存在下でペプチドとさらに反応させて、代替バイオコンジュゲートを提供することができる。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの遊離のヒドロキシル基を有する化学的に硫酸化されたグリカン誘導体１Ｂ誘導体を、Ｏ−カルボキシメチル化グリカン誘導体（複数可）に転換し、次に必要に応じてカップリング剤の存在下でペプチドとさらに反応させて、代替バイオコンジュゲートを提供することができる。
【００９８】
一部の実施形態では、反応は、反応性求核試薬、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、および／またはヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１−ヒドロキシ−１，２，３−ベンゾトリアゾール、ＨＯＢｔ／ＣｕＣｌ２、７−アザ−１−ヒドロキシ−１，２，３−ベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアゾール（ＨＯＯＢｔ）、および／または３−スルホ−１−ヒドロキシスクシンイミド（Ｓ−ＮＨＳ）、またはそれらの誘導体の存在下で行われる。
４．使用方法
ａ．線維症の処置
【００９９】
本明細書の一実施形態では、線維症を防止および／または処置するためのバイオコンジュゲートおよび方法が提供される。線維症は、炎症細胞が組織および器官に遊走して、瘢痕化をもたらす細胞の応答を生じる炎症性疾患である。線維症は、典型的に炎症または損傷の結果として、体内の多くの組織において生じ得る。炎症細胞の血管外遊出を防止することによって、線維症を減弱または防止することができる。
【０１００】
一実施形態では、本明細書で提供されるバイオコンジュゲートおよび方法は、肺線維症を防止および／または処置するために使用することができる。肺の線維症の種類には、嚢胞性線維症および特発性肺線維症などの肺線維症が含まれる。肺線維症は、肺組織内に瘢痕が形成されて重篤な呼吸問題が生じる呼吸器疾患である。瘢痕の形成により、壁が肥厚し、血中への酸素供給が減少する。結果として、患者は永続的息切れに苦しむ。
【０１０１】
一実施形態では、本明細書で提供されるバイオコンジュゲートおよび方法は、肝線維症を処置するために使用することができる。肝線維症は、慢性アルコール曝露、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染、ウィルソン病、アルファ−１−アンチトリプシン欠乏、ヘモクロマトーシス、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、および自己免疫性肝炎を含めた多種多様な状態から生じ得る。慢性ＨＣＶは、慢性肝疾患の主な寄与因子であり、肝臓は、肝臓での繊維組織の形成および瘢痕化によって特徴付けられる持続的な炎症性線維症（inflammatory  and  fibrosis）を誘発する。ＮＡＦＬＤおよびＮＡＳＨも、肝臓に炎症および線維症を引き起こす。
【０１０２】
肝硬変は、長期間の損傷に起因して肝臓が適切に機能しなくなっている肝臓の線維症である。典型的に、疾患は、数カ月または数年にわたってゆっくり進展する。初期には、症状がないことが多い。疾患が悪化するにつれて、人は、疲れ、衰弱、そう痒を感じ、下肢にむくみが生じ、皮膚が黄変し、容易にあざができ、腹部に体液が蓄積し、または皮膚にクモ状血管が生じる場合がある。腹部への体液の蓄積は、自然発生的に感染を受けるおそれがある。他の合併症には、肝性脳症、食道の拡張静脈または拡張胃静脈からの出血、および肝臓がんが含まれる。肝性脳症は、錯乱を、場合により意識不明をもたらす。肝硬変は、肝機能不全をもたらすおそれがある。以下の症状または特色は、肝機能不全の直接的な結果であり、したがって、本開示の組成物および方法によって処置または軽快させることもできる。
【０１０３】
肝星細胞（ＨＳＣ）と腫瘍細胞との直接的な相互作用は、複数の機序を介して腫瘍成長を促進することが示されている。したがって、ＨＳＣの腫瘍を支える役割を低減または排除するためにＨＳＣを標的化することは、肝細胞癌（ＨＣＣ）を防止、阻害または処置するための潜在的な治療戦略をもたらす。ある特定の実施形態では、肝細胞癌（ＨＣＣ）の発症を防止または阻害することを必要とする患者の肝細胞癌（ＨＣＣ）の発症を防止または阻害する方法であって、患者に、有効量の本明細書に記載されるバイオコンジュゲートを投与することを含む、方法が提供される。ある特定の実施形態では、肝細胞癌（ＨＣＣ）の発症は、肝硬変の結果である。ある特定の実施形態では、方法は、肝星細胞増殖および／または線維化表現型遷移を阻害することを含む。ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートは、肝動脈化学塞栓（ＴＡＣＥ）術中などに肝臓に局部投与される。
【０１０４】
クモ状血管腫またはクモ状母斑は、多くのより小さい血管によって取り囲まれた中心細動脈からなる血管病変であり、エストラジオールの増加に起因して生じる。手掌紅斑は、やはりエストロゲンの増加の結果として生じる、手掌の母指球および小指球の発赤である。男性の癌性ではない女性化乳房症または乳腺の大きさの増加は、エストラジオールの増加によって引き起こされ、最大患者の３分の２に生じ得る。性ホルモンの低下である性腺機能低下症は、性交不能症、不妊、性衝動の喪失、および精巣萎縮として現れ、原発性性腺傷害または視床下部／下垂体機能の抑制から生じ得る。性腺機能低下症は、アルコール依存症およびヘモクロマトーシスに起因する肝硬変と関連する。肝臓の大きさは、肝硬変を有するヒトでは肥大している、正常、または縮小している場合がある。
【０１０５】
一実施形態では、本明細書で提供されるバイオコンジュゲートおよび方法は、腎線維症を防止および／または処置するために使用することができる。腎線維症は、腎臓への急性または持続性傷害から生じ得る。傷害は、細胞外マトリックスの過度の沈着をもたらすおそれがある。経時的に、これは腎不全をもたらし、患者が透析または腎臓移植を受ける必要が生じ得る。
【０１０６】
腹膜腔に体液が蓄積する腹水症は、脇腹の鈍麻を生じる。これは、腹囲の増加として目に見える場合がある。肝性口臭は、ジメチルスルフィドの増加から生じる、かび臭い口臭である。黄疸は、ビリルビンの増加に起因する皮膚および粘膜の黄変である。さらに、肝硬変は、血流に対する抵抗性を増大させ、門脈静脈系においてより高い圧力をかけて、門脈圧亢進症を生じる。
【０１０７】
一実施形態では、本明細書で提供されるバイオコンジュゲートおよび方法は、心臓の線維症を防止および／または処置するために使用することができる。心臓の線維症は、心房線維症、心内膜心筋線維症、または心筋梗塞の形態で存在する。神経膠瘢痕は、脳内の線維症である。他の種類の線維症には、限定することなく、関節線維症（膝、肩、他の関節）、クローン病（腸）、デュピュイトラン拘縮（手、指）、ケロイド（皮膚）、縦隔線維症（縦隔の軟組織）、骨髄線維症（骨髄）、ペロニー病（陰茎）、腎性全身性線維症（皮膚）、進行性塊状線維症（肺）、後腹膜線維症（後腹膜の軟組織）、強皮症／全身性硬化症（皮膚、肺）、および癒着性関節包炎（肩）の一部の形態が含まれる。
【０１０８】
本開示の組成物および方法は、これらの疾患、またはこれらの疾患と関連する症状もしくは特色のいずれかを防止および／または処置するのに適していることが企図される。線維症の発症は、コラーゲンおよびグリコサミノグリカンを含めた結合組織を敷く刺激細胞が関与する。本開示のバイオコンジュゲートは、コラーゲンまたはグリコサミノグリカンと相互作用し、したがってこのような過度の結合組織の形成を破壊することができる。バイオコンジュゲートは、内皮バリアを保護することもできる。これは、微小血管傷害に起因して露出した細胞外マトリックスと相互作用することによってであり得る。内皮バリアを保護することにより、炎症細胞が、組織に溢出して（extravating）線維化組織をもたらす過度のＥＣＭ沈着を引き起こすのを防止する。したがって、バイオコンジュゲートは、線維症を防止し、阻害し、遅延させ、かつ／または逆行させることができる。
【０１０９】
ある特定の実施形態では、線維症は、虚血後、感染後、または特発性である（例えば、腎臓、肝臓、心臓、肺）。例えば、Guerrot,  D.,  et  al.  Fibrogenesis  &  tissue  repair  5.Suppl  1  (2012):  S15、および  Yamaguchi,  I.,  et  al.  Nephron  Experimental  Nephrology  120.1  (2012):  e20-e31を参照されたい。ある特定の実施形態では、線維症は、後腹膜線維症である。ある特定の実施形態では、線維症は、皮膚線維症である（例えば、強皮症）。例えば、Maurer,  B.,  et  al.  Annals  of  the  rheumatic  diseases  (2013):  annrheumdis-2013を参照されたい。
【０１１０】
一実施形態では、疾患は、急性尿細管壊死、糖尿病性慢性腎不全、狼瘡腎炎、腎線維症、でも急性糸球体腎炎でもない。一実施形態では、疾患は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、慢性閉塞性肺疾患、喘息、でも気腫でもない。
【０１１１】
ある特定の実施形態では、線維症は、それらに限定されるものではないが、ファブリ病、ゴーシェ病、ニーマン−ピック病、およびハンター症候群（ムコ多糖症）を含めたリソソーム蓄積障害によって引き起こされるか、またはそうでなければそれらに関する。したがって、本明細書のある特定の実施形態では、リソソーム蓄積障害によって引き起こされたか、またはそうでなければそれらに関する線維症を防止することを必要とする患者のリソソーム蓄積障害によって引き起こされたか、またはそうでなければそれらに関する線維症を防止するための方法が提供される。
【０１１２】
本明細書の一実施形態では、線維症の防止または処置のための本明細書に開示されるバイオコンジュゲート（複数可）の使用が提供される。本明細書の一実施形態では、線維症の防止または処置のための医薬の調製のための本明細書に開示されるバイオコンジュゲート（複数可）の使用が提供される。本明細書の一実施形態では、肝線維症の防止または処置のための本明細書に開示されるバイオコンジュゲート（複数可）の使用が提供される。本明細書の一実施形態では、肺線維症の防止または処置のための本明細書に開示されるバイオコンジュゲート（複数可）の使用が提供される。実施形態では、バイオコンジュゲートは、硫酸化ヒアルロン酸および約５０〜約１５０個、または約１００個のペプチドを含み、ペプチドは、ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹ（配列番号：）、ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧ（配列番号：）、ＧＱＬＹＫＳＩＬＹ（配列番号：）、またはＧＱＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧＳＧＳＲＲ（配列番号：）、ＣＰＧＲＶＭＨＧＬＨＬＧＤＤＥＧＰＣ（配列番号：）、ＣＶＷＬＷＥＱＣ（配列番号：）、もしくはＷＲＥＰＳＦＣＡＬＳ（配列番号：）の少なくとも１つの配列、またはそれからそれぞれ１つ、２つもしくは３つのアミノ付加、欠失および／もしくは置換を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ペプチド（複数可）は、ヒドラジド−カルボニル連結を介してヘパリンまたは他のグリカンに結合している。一実施形態では、バイオコンジュゲートは、硫酸化ヒアルロン酸および約１５〜約３０％のペプチドによる機能化を含み、ペプチドは、ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹ（配列番号：）、ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧ（配列番号：）、ＧＱＬＹＫＳＩＬＹ（配列番号：）、またはＧＱＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧＳＧＳＲＲ（配列番号：）の少なくとも１つの配列を含む。一実施形態では、ペプチド（複数可）は、ヒドラジド−カルボニル連結を介してヘパリンに結合している。
【０１１３】
本明細書の一実施形態では、肝線維症または肺線維症を防止または処置することを必要とする患者の肝線維症または肺線維症を防止または処置するための方法であって、患者に、ＧＱＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧＳＧＳＲＲ（配列番号：）またはＧＱＬＹＫＳＩＬＹ（配列番号：）を含む約５０〜約１５０個、または約１００個のペプチドに結合した硫酸化ヒアルロン酸を含む有効量のバイオコンジュゲートを投与することを含む、方法が提供される。本明細書の一実施形態では、肝線維症または肺線維症の防止または処置を必要とする患者の肝線維症または肺線維症の防止または処置のための本明細書に開示されるバイオコンジュゲート（複数可）の使用が提供される。一実施形態では、ＧＱＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧＳＧＳＲＲ（配列番号：）を含む約５０〜約１５０個、または約１００個のペプチドに結合した硫酸化ヒアルロン酸を含む有効量のバイオコンジュゲートが投与される。
【０１１４】
また本明細書では、血管炎を防止および／または処置するための方法が提供される。血管炎は、血管壁の炎症によって定義され、個々の疾患実体の多様な群の病理学的基礎を形成する。血管炎は、自己免疫疾患において一般に観測される難治性病態の１つであり、その多くの症例は、ステロイドおよび免疫抑制剤などの従来使用されている治療方法に対して難治性である。血管炎症候群では、炎症は、様々な大きさの動脈に生じ、発熱、筋肉および関節の疼痛、血管閉塞、皮膚潰瘍、ならびに多発性単神経炎が生じるおそれがある。方法は、大型血管の血管炎（ＬＶＶ）、中型血管の血管炎（ＭＶＶ）、小型血管の血管炎（ＳＶＶ）、多様な（variable）血管の血管炎（ＶＶＶ）、単一器官血管炎（ＳＯＶ）、全身性疾患と関連する血管炎、および／または可能性が高い病因と関連する血管炎を処置するために使用することができる。大型血管の血管炎（ＬＶＶ）の非限定的な例として、高安動脈炎（ＴＡＫ）および巨細胞動脈炎（ＧＣＡ）が挙げられる。中型血管の血管炎（ＭＶＶ）の非限定的な例として、結節性多発動脈炎（ＰＡＮ）および川崎病（ＫＤ）が挙げられる。小型血管の血管炎（ＳＶＶ）の非限定的な例として、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連血管炎（ＡＡＶ）、顕微鏡的多発血管炎（ＭＰＡ）、多発血管炎性肉芽腫症（ウェゲナー）（ＧＰＡ）、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症（チャーグ−ストラウス）（ＥＧＰＡ）、免疫複合体ＳＶＶ、抗糸球体基底膜（抗ＧＢＭ）疾患、クリオグロブリン血症性（gryoglobulinemic）血管炎（ＣＶ）、ＩｇＡ血管炎（ヘノッホ−シェーンライン）（ＩｇＡＶ）、および低補体血症性蕁麻疹様血管炎（ＨＵＶ））（抗Ｃ１ｑ血管炎）が挙げられる。多様な血管の血管炎（ＶＶＶ）の非限定的な例として、ベーチェット病（ＢＤ）およびコーガン症候群（ＣＳ）が挙げられる。単一器官血管炎（ＳＯＶ）の非限定的な例として、皮膚白血球破砕性血管炎、皮膚動脈炎、原発性中枢神経系血管炎、および孤立性大動脈炎が挙げられる。全身性疾患と関連する血管炎の非限定的な例として、狼瘡血管炎、リウマチ性血管炎、およびサルコイド血管炎が挙げられる。可能性が高い病因と関連する血管炎の非限定的な例として、Ｃ型肝炎ウイルス関連クリオグロブリン血症性血管炎、Ｂ型肝炎ウイルス関連血管炎、梅毒関連大動脈炎、薬物関連免疫複合体血管炎、薬物関連ＡＮＣＡ関連血管炎、およびがん関連血管炎が挙げられる。血管炎の他の例として、抗リン脂質症候群、バージャー病（閉塞性血栓血管炎）、クリオグロブリン血症、クリオピリン関連自己炎症性症候群（ＣＡＰＳ）（若年性）、グッドパスチャー、限局性強皮症（若年性）、リウマチ性多発筋痛、レイノー現象、強皮症、シェーグレン症候群、および全身性エリテマトーデスが挙げられる。本明細書に開示されるバイオコンジュゲートおよび方法は、血管炎を阻害および／または処置するために使用することができることが企図される。
【０１１５】
本明細書の一実施形態では、血管炎を防止および／または処置するための方法が提供される。本明細書の一実施形態では、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連血管炎（ＡＡＶ）、顕微鏡的多発血管炎（ＭＰＡ）、多発血管炎性肉芽腫症（ウェゲナー）（ＧＰＡ）、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症（チャーグ−ストラウス）（ＥＧＰＡ）、免疫複合体ＳＶＶ、抗糸球体基底膜（抗ＧＢＭ）疾患、クリオグロブリン血症性血管炎（ＣＶ）、ＩｇＡ血管炎（ヘノッホ−シェーンライン）（ＩｇＡＶ）、および／または低補体血症性蕁麻疹様血管炎（ＨＵＶ））（抗Ｃ１ｑ血管炎）を含めた、小型血管の血管炎を防止および／または処置するための方法が提供される。このような疾患は、小血管（例えば、非常に小さい動脈、細動脈、毛細血管、および小静脈）に影響を及ぼす。
組合せ治療
【０１１６】
一部の実施形態では、本開示の組成物は、線維症を防止または処置するのに有用な第２の薬剤と組み合わせて使用することができる。したがって、一実施形態では、本開示の任意の組成物および１つまたは複数のこのような第２の薬剤を含む、組合せ、組成物、パッケージまたはキットが提供される。一実施形態では、本開示の任意の処置方法は、１つまたは複数のこのような第２の薬剤の投与をさらに含む。
【０１１７】
第２の薬剤は、線維症の症状を防止、処置するか、または代わりに軽快させるのに有用な任意の薬学的または生物学的薬剤であってよい。非限定的な例として、ステロイド、例えばプレドニン、還元剤、例えばＮ−アセチルシステイン、抗線維化薬物、例えばピルフェニドンおよびニンテダニブ、免疫抑制薬、例えばコルチコステロイド、シクロホスファミド、アザチオプリン、メトトレキサート、ペニシラミン、ならびにシクロスポリンＡおよびＦＫ５０６、ならびにコルヒチン、ＩＦＮ−γおよびミコフェノール酸モフェチルのような他の薬剤が挙げられる。
【０１１８】
一部の実施形態では、本開示の組成物は、血管炎を防止または処置するのに有用な第２の薬剤と組み合わせて使用することができる。したがって、一実施形態では、本開示の任意の組成物および１つまたは複数のこのような第２の薬剤を含む、組合せ、組成物、パッケージまたはキットが提供される。一実施形態では、本開示の任意の処置方法は、１つまたは複数のこのような第２の薬剤の投与をさらに含む。
【０１１９】
第２の薬剤は、血管炎の症状を防止、処置するか、または代わりに軽快させるのに有用な任意の薬学的または生物学的薬剤であってよい。非限定的な例として、プレドニゾン、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ）、メチルプレドニゾロン、メトトレキサートナトリウム、Ｍｅｄｒｏｌ（Ｐａｋ）、Ｍｅｄｒｏｌ、デキサメタゾン、プレドニゾロン、ＤｅｘＰａｋ、Ｄｅｌｔａｓｏｎｅ、コルチゾン、Ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ  Ｉｎｔｅｎｓｏｌ、デキサメタゾンリン酸エステルナトリウム、Ｏｒａｐｒｅｄ  ＯＤＴ、Ｔｒｅｘａｌｌ、Ｒｈｅｕｍａｔｒｅｘ、メトトレキサートナトリウム（ＰＦ）、Ｖｅｒｉｐｒｅｄ  ２０、Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ  Ｉｎｔｅｎｓｏｌ、プレドニゾロンリン酸エステルナトリウム、Ｐｅｄｉａｐｒｅｄ、Ｍｉｌｌｉｐｒｅｄ、Ｒａｙｏｓ、Ｍｉｌｌｉｐｒｅｄ、およびＤｏｕｂｌｅＤｅｘが挙げられる。
ｂ．冠動脈疾患（ＣＡＤ）および末梢動脈疾患（ＰＡＤ）
【０１２０】
本開示の一実施形態は、外科的バイパス術の成功率を改善し、かつ／またはその失敗を低減するための方法および関連組成物を提供する。バイパスグラフトは、冠動脈疾患（ＣＡＤ）および末梢動脈疾患（ＰＡＤ）の両方における動脈閉塞の処置の一形態として使用される。米国では、年間およそ５００，０００件の冠動脈バイパスグラフト（ＣＡＢＧ）術および７０，０００件を超える末梢バイパスグラフト術が実施されている。最も一般的には、伏在静脈から自家血管グラフトが採取されることが多い。
【０１２１】
血流を回復するために自家静脈グラフトを用いる外科的バイパスの普及にもかかわらず、ＣＡＤおよびＰＡＤの両方で多数の静脈グラフト不全（ＶＧＦ）がある。末梢だけでは、静脈グラフト不全率は、５年以内に５０％不全レベルに達する。静脈グラフトの５％〜１０％が、技術的因子および急性血栓症に起因して移植直後に不全を生じるが、別の２０％〜３０％の症例において、中期の不全（３〜２４カ月）が生じるおそれがあり、調査監視、再介入術および切断に費用がかかる場合がある。ブリガムアンドウィメンズ病院（the  Brigham  and  Women’s  Hospital）での２０年の経験中、ＣＬＩ患者（ｎ＝１２１９）における静脈グラフト不全の１２カ月間の発生率は、２９％であった。静脈グラフト不全の結果は、再発性虚血症状、衰弱させる手術および四肢喪失を含めて、患者にとって多くの場合重症となっている。現在まで、薬物療法および技術革新は、静脈グラフト不全を低減することに対してほとんど影響を及ぼしていない。
【０１２２】
脆弱な内皮層への静脈グラフト管による傷害は、それが、静脈グラフト採取、保存媒体、バイパスのための過度の準備操作、または虚血および再かん流傷害によって引き起こされたものかにかかわらず、移植後の血管壁内に血小板媒介性の炎症応答をもたらすことが企図される。このような内皮傷害およびＥＣＭ−血小板活性化カスケードは、急性炎症および血栓症による初期のＶＧＦ、または新生内膜過形成による遅発性ＶＧＦをもたらすおそれがある。したがって、移植後の循環血小板への静脈グラフト内皮下マトリックスの曝露を制限することは、急性血管壁炎症を低減し、再上皮形成を改善し、血管閉塞およびＶＧＦをもたらし得る過度の新生内膜過形成を制限する一助となり得る。本明細書に記載されるバイオコンジュゲートは、自家静脈グラフトを用いる外科的バイパスを受ける、心血管疾患を有する患者のための静脈グラフト保存溶液として使用することができる。本明細書に記載されるバイオコンジュゲートおよびバイオコンジュゲートを含む組成物は、冠動脈疾患および／または末梢動脈疾患を処置および／または防止することを必要とする患者の冠動脈疾患および／または末梢動脈疾患を処置および／または防止するために使用することができる。
【０１２３】
したがって、本開示の一実施形態によれば、血管の切片の内壁を、本開示の合成バイオコンジュゲートを含有する溶液と接触させることによって、血管グラフト（例えば、静脈グラフト）を調製するための方法が提供される。接触を実施する一つの方法は、その切片を溶液に浸漬させることである。この接触のための条件は変わり得るが、適量の合成バイオコンジュゲートが内壁に結合するように、合成バイオコンジュゲートの濃度および血管の特徴に応じて容易に決定することができる。このような方法で調製された血管グラフトも、本開示の範囲内である。
【０１２４】
グラフトが調製されると、移植することを必要とする患者に移植することができる。外科的バイパス術は、医療専門家によって容易に行われ得る。グラフト（grant）の内壁に結合した合成バイオコンジュゲートは、移植されると、急性血管壁炎症を低減し、グラフトの再上皮形成を改善し、グラフトの過度の新生内膜過形成を制限する一助になり、グラフト不全を低減することができる。
【０１２５】
一実施形態では、グラフトを、バイパス術の間または後に上記の通り合成バイオコンジュゲートで処置した場合、合成バイオコンジュゲートがグラフトの内壁に結合するように、合成バイオコンジュゲートの溶液をグラフトの内腔に注射することができる。一態様では、注射は、血流がグラフトを通して回復または開始される前に行われる。別の態様では、注射は、血流が回復または開始された直後（例えば、１０分以内、５分以内、または１分以内）に行われる。
【０１２６】
一部の実施形態では、方法は、血管の負の再構築を阻害するのに有効である。虚血または冠状動脈性心疾患としても公知の冠動脈疾患は、冠動脈（心筋に血液を供給する動脈）の内側の平坦な弾性内膜の一部がアテローム性動脈硬化症を発症させ、心臓への血流を事実上制限する場合に生じる。アテローム性動脈硬化症または動脈硬化としても公知の末梢動脈疾患は、循環系の動脈内で生じる障害である。負の再構築には、血管径および内腔径の低減をもたらす刺激に対する、血管の生理的または病理学的応答が含まれる。このような刺激は、例えば、血流変化または血管形成術によってもたらされるおそれがある。一部の実施形態では、本明細書に記載されるバイオコンジュゲートおよびバイオコンジュゲートを含む組成物の注射により、注射なしの血管径と比較して、約１０％、２０％、３０％、４０％、６０％、７０％、８０％、９５％のいずれか、またはそれを超えて血管径が増加する。負の再構築は、例えば、病変部位（または疾患部位）における狭窄径パーセントとして血管造影的に（angiographically）定量することができる。再構築の度合いを決定する別の方法には、血管内超音波（ＩＶＵＳ）を使用する病変内の外弾性板面積を測定することが含まれる。ＩＶＵＳは、外弾性板ならびに血管内腔を画像化することができる技術である。一部の実施形態では、負の再構築は、血管介入術、例えば血管形成術、ステント留置、または粥腫切除術と関連する。したがって、本明細書に記載されるバイオコンジュゲートおよびバイオコンジュゲートを含む組成物は、血管介入術の前、間および／または後に注射することができる。ある特定の実施形態では、大腿膝窩動脈内の狭窄または閉塞を処置することを必要とする患者の大腿膝窩動脈内の狭窄または閉塞を処置する方法であって、バルーン血管形成術の前、間および／または後に溶液を内腔の内壁に適用することを含み、溶液が、有効量の本明細書に記載されるバイオコンジュゲートまたはバイオコンジュゲートを含む組成物を含む、方法が提供される。
【０１２７】
したがって本開示は、血管（例えば、動脈）の負の再構築を阻害することを必要とする個体の血管（例えば、動脈）の負の再構築を阻害する方法であって、血管壁または血管壁を取り囲む組織に、有効量の本明細書に記載されるバイオコンジュゲートまたはバイオコンジュゲートを含む組成物を注射することを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、バイオコンジュゲートまたは組成物は、潜在的なまたは実際の負の再構築の部位にまたはそれに隣接して（例えば、部位から約２、１、または０．５ｃｍ以上離さずに）注射される。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物は、潜在的なまたは実際の負の再構築の部位から離して（例えば、部位から少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ｃｍのいずれか離して）注射される。一部の実施形態では、注射は、針を備えたカテーテルを介して行われる。一部の実施形態では、部位は、冠動脈または末梢動脈である。一部の実施形態では、動脈は、腎臓動脈、大脳動脈、肺動脈、および脚の動脈からなる群から選択される。一部の実施形態では、動脈は、バルーン傷害を受けた動脈である。さらなる例として、それらに限定されるものではないが、腹部大動脈、前脛骨動脈、大動脈弓、弓状動脈、腋窩動脈、上腕動脈、頸動脈、腹腔動脈、腓骨回旋動脈、総肝動脈、総腸骨動脈、深大腿動脈、深掌動脈弓、背側指動脈、背側中足動脈、外頸動脈、外腸骨動脈、顔面動脈、大腿動脈、下腸間膜動脈、内部腸骨動脈、腸管動脈、外側下膝動脈、外側上膝動脈、掌側指動脈、腓骨動脈、膝窩動脈、後脛骨動脈、大腿深動脈、肺動脈、橈骨動脈、腎臓動脈、脾臓動脈、鎖骨下動脈、浅掌動脈弓、上腸間膜動脈、上尺側側副動脈、および／または尺骨動脈が挙げられる。ある特定の実施形態では、動脈は、冠血管系の一部である。
【０１２８】
一実施形態では、上記の方法において使用されるバイオコンジュゲートは、硫酸化ヒアルロン酸および約１５〜約３０％のペプチドによる機能化を含み、ペプチドは、ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹ（配列番号：）、ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧ（配列番号：）、ＧＱＬＹＫＳＩＬＹ（配列番号：）、またはＧＱＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧＳＧＳＲＲ（配列番号：）、ＣＰＧＲＶＭＨＧＬＨＬＧＤＤＥＧＰＣ（配列番号：）、ＣＶＷＬＷＥＱＣ（配列番号：）、もしくはＷＲＥＰＳＦＣＡＬＳ（配列番号：）の少なくとも１つの配列、またはそれからそれぞれ１つ、２つもしくは３つのアミノ付加、欠失および／もしくは置換を有するアミノ酸配列を含む。
ｃ．血管処置
【０１２９】
本明細書に記載されるバイオコンジュゲートおよび組成物は、患者の血管を処置するために、血管傷害または介入の前、間および／または後に使用することができる。血管介入には、それらに限定されるものではないが、ステントを用いるおよび用いない血管形成術、グラフト血管、粥腫切除術、ならびに血管アクセス機能不全、または他の外科手技が含まれ得る。
【０１３０】
本明細書に記載される様々な実施形態では、バイオコンジュゲートまたはその組成物は、血栓症、剥離内皮の露出したコラーゲンへの血小板結合、内皮剥離から生じる炎症、内膜過形成、または血管れん縮に関与するものなどの血小板活性化を阻害するために、処置を必要とする患者に投与することができる。
【０１３１】
様々な実施形態では、バイオコンジュゲートは、例えば静脈内または筋肉内に投与することができる。非経口投与に適した他の経路には、血管内、静脈内、動脈内、筋肉内、皮膚、皮下、経皮、皮内、および表皮内送達が含まれる。非経口投与に適した手段には、針（マイクロニードルを含む）注射器、注入技術、およびカテーテルベースの送達が含まれる。カテーテルベースの送達は、バイオコンジュゲートを、バルーン上のコーティングとして、多孔質バルーンを介して、またはステント上のコーティングとして送達することを含み得る。別の実施形態では、バイオコンジュゲートは、全身的に送達され得る（すなわち、標的血管に直接的に送達されるのではなく、非経口投与によって送達される）。
【０１３２】
これらのバイオコンジュゲートは、物理的ペプチド−コラーゲン相互作用を介して、露出したコラーゲンに局部的に結合する。バイオコンジュゲートは、コラーゲンに結合すると、１）血小板付着／活性化に対するバリアとして作用すること、２）ＭＭＰアクセスを阻害することによってコラーゲンを分解から保護すること、ならびに３）成長因子ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−７、およびＦＧＦ−１０を隔離し、したがって内皮細胞および上皮細胞の増殖および遊走を促進することを含めたいくつかの機能を有する。
【０１３３】
バイオコンジュゲートは、コラーゲン上の血小板結合部位を競合し、血小板の結合および活性化を防止することができる。バイオコンジュゲートのグリカン主鎖は、負電荷を帯び、水分子に結合して、コラーゲン表面上に、血小板およびタンパク質接着を防止する親水性バリアを作り出すことができる。バイオコンジュゲートは、正常な血小板機能を阻害するのではなく、露出したコラーゲンをマスキングすることによって、炎症および内膜過形成に至るカスケードの初期ステップに対処する局部的処置を提供することができる。
【０１３４】
一実施形態では、本開示は、血液透析を受けている患者における血管アクセス機能不全に対する満たされていない必要性に対処するための新しいアプローチを提供する。一実施形態では、このアプローチには、本明細書に記載されるバイオコンジュゲートから設計された血管内腔コーティングの生成が必然的に伴う。動静脈瘻（ＡＶＦ）では、例えば新生内膜過形成は、主にＡＶＦの静脈部分において生じる。内膜過形成の初期の機序は、動脈および静脈で類似しているが、生じる病変には差異がある。静脈の新生内膜過形成は、末梢血管疾患の状況において動脈の内膜過形成よりも侵襲性が高い病変になり、血管形成術に対する応答が少なくなる傾向がある。動脈傷害における血小板結合および内膜過形成を防止する開示されたバイオコンジュゲートの能力は、新生内膜過形成を低減または防止するその能力に寄与することが企図される。
【０１３５】
したがって、一部の実施形態では、本開示は、血液透析を必要とする患者の動静脈瘻（ＡＶＦ）の成熟を改善するため、または、あるいは開存性を改善する、静脈の内径を拡大する、狭窄を低減する、新生内膜過形成を低減する、血行力学的ストレスを低減する、内皮もしくは平滑筋細胞傷害を低減する、血管アクセス機能不全を低減する、またはＡＶＦにおける凝固もしくは炎症を低減するための方法を提供する。一部の実施形態では、方法には、ＡＶＦの内腔の内壁に溶液を適用し、ＡＶＦにおける血流を回復または開始することを伴い、溶液は、本開示のバイオコンジュゲートである、または溶液は、有効量の本開示のバイオコンジュゲートを含む。
【０１３６】
露出したコラーゲンに特異的に結合する合成ポリマーの内腔コーティングを使用する局在的処置が開示され、コーティングは、血管壁への血小板接着をブロックし、したがって血栓症および内膜過形成の開始イベントを阻害することができる。さらに、コーティングは、血管壁の急速な再内皮化を促進して、より急速な治癒をもたらすことができる。開示されたバイオコンジュゲートの、作製中の（during  the  creation）ネイティブなＡＶ瘻への適用により、有意により少ない狭窄、およびより大きい直径を有する瘻が生じることが企図される。
【０１３７】
一部の実施形態では、血流が開始される前の新たに作製されたＡＶＦについては、溶液は、血流が開始される約１０分未満前に適用される。一部の実施形態では、溶液は、血流が開始される約２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、もしくは２分、または６０、４５、３０、２０、１０もしくは５秒未満前に適用される。一部の実施形態では、溶液は、血流が開始される少なくとも１分または少なくとも２、３、４、５分前に適用される。一部の実施形態では、溶液は、血流が回復して少なくとも１分または少なくとも２、３、４、５分後に適用される。一部の実施形態では、血流が開始され、次に溶液を送達するために停止される。一部の実施形態では、溶液は、吻合の作製前、吻合の作製中、またはその後に血管に適用される。一部の実施形態では、溶液は、吻合の作製前、吻合の作製中、およびその後に血管に適用される。
【０１３８】
一部の実施形態では、液剤は、例えば、針、カテーテルまたは他の薬物−送達デバイスを用いてＡＶＦの中を流される。一実施形態では、方法にはさらに、ＡＶＦに液剤を流した後、ＡＶＦを閉じることが必然的に伴う。一部の実施形態では、上記の通り液剤の適用に加えて、または、あるいは、確立されたＡＶＦの近位ならびに静脈および動脈をクランプすることによって生じた閉鎖内腔に、液剤を注射する。
【０１３９】
一実施形態では、液剤は、静脈の内径を拡大するために使用される、ＡＶＦの静脈拡張または静脈部分の摩擦後約５分以内（あるいは１０、９、８、７、６、４、３、または２分以内）に適用される。機械的に拡張または摩擦した静脈内表面に液剤を適用することによって、摩擦中の表面上でのバイオコンジュゲートの喪失を低減することができる。
【０１４０】
開示された組成物および方法は、患者における血管アクセスを確立するために使用することができ、その方法には、血管アクセスにおける血管壁に本開示の液剤を適用すること、および血管アクセスでの血流を回復または開始することが必然的に伴い得ることがさらに企図される。一部の実施形態では、壁は、血管内壁であるが、任意の血管の外壁であってもよい。
【０１４１】
一部の実施形態では、血管アクセスは、動静脈瘻（ＡＶＦ）、動静脈グラフト（ＡＶＧ）、または非経口栄養法、化学療法、または血漿交換療法のために使用される堅牢な血管アクセスである。液剤は、血小板への壁の曝露を低減することが企図される。一部の実施形態では、壁は、傷害または外科手技に起因して血流に曝露された細胞または組織を含む。液剤の適用によって、開存性が改善される、生存が改善される、血流が改善される、血管内径が拡大する、またはＡＶＦおよびＡＶＧなどの血管アクセスの狭窄が低減することが示される。
【０１４２】
一実施形態では、本開示は、血液透析を必要とする患者の動静脈瘻（ＡＶＦ）の成熟を改善するため、または、あるいは開存性を改善する、静脈の内径を拡大する、狭窄を低減する、新生内膜過形成を低減する、血行力学的ストレスを低減する、内皮もしくは平滑筋細胞傷害を低減する、血管アクセス機能不全を低減する、またはＡＶＦにおける凝固もしくは炎症を低減するための方法を提供する。一部の実施形態では、方法には、ＡＶＦの内腔の内壁に液剤を適用すること、およびＡＶＦでの血流を回復または開始することが必然的に伴い、液剤は、有効量の本開示のバイオコンジュゲートを含む。
【０１４３】
バイオコンジュゲートは、患者の血管内部に経皮または静脈内投与することができることが企図される。経皮または静脈内送達は、術後の患者の瘻作製の処置を可能にする。バイオコンジュゲートは、血管の処置、血管の維持、または瘻の失敗の防止のために送達することができる。
【０１４４】
一部の実施形態では、方法は、バルーン補助成熟、バルーン血管形成術、粥腫切除術、または血餅除去術などの１つまたは複数の維持適用を行うことをさらに含む。さらに一部の実施形態では、とりわけ、特に高流速によって内皮が損傷する場合の手技、およびグラフトまたは瘻内の注射の後の、血液透析の時点での予防的送達が、狭窄の維持および防止のために有益であることが企図される。
【０１４５】
一実施形態では、上記の方法において使用されるバイオコンジュゲートは、硫酸化ヒアルロン酸および約１５〜約３０％のペプチドによる機能化を含み、ペプチドは、ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹ（配列番号：）、ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧ（配列番号：）、ＧＱＬＹＫＳＩＬＹ（配列番号：）、またはＧＱＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧＳＧＳＲＲ（配列番号：）、ＣＰＧＲＶＭＨＧＬＨＬＧＤＤＥＧＰＣ（配列番号：）、ＣＶＷＬＷＥＱＣ（配列番号：）、もしくはＷＲＥＰＳＦＣＡＬＳ（配列番号：）の少なくとも１つの配列、またはそれからそれぞれ１つ、２つもしくは３つのアミノ付加、欠失および／もしくは置換を有するアミノ酸配列を含む。
ｄ．血管介入
【０１４６】
血管介入、例えば経皮的冠状動脈介入は、任意の従来の手順によって、コラーゲン結合合成バイオコンジュゲートの投与の前、間または後に行うことができる。本発明の方法と併せた使用が企図される血管介入術の例として、ステント留置、粥腫切除術、および血管形成術、例えばバルーン血管形成術が挙げられる。血管介入術は、血管を一時的に閉塞させるもの（例えば、バルーン血管形成術）であってよく、または血管を一時的に閉塞させないもの（例えば、非バルーン血管形成術、バルーン血管形成術を伴わないステント留置術など）であってよい。例示的な送達様式として、カテーテル、非経口投与、バルーン上のコーティング、多孔質バルーンを介するもの、コーティングされたステントおよびそれらの任意の組合せ、または血管介入術中の薬物送達の任意の他の公知の方法を挙げることができる。
【０１４７】
別の例示的な実施形態では、血管介入術中、保存的アミノ酸置換を有するこれらのバイオコンジュゲートのいずれかは、剥離内皮の露出したコラーゲンへの血小板結合、血小板活性化、血栓症、内皮剥離から生じる炎症、内膜過形成、および／もしくは血管れん縮を阻害することができる、または内皮細胞増殖を刺激することができる、または剥離血管のコラーゲンに結合することができる。別の例示的な実施形態では、血管介入術中、この段落に記載される保存的アミノ酸置換を有するバイオコンジュゲートのいずれかは、剥離内皮の露出したコラーゲンへの血小板結合、血小板活性化、内膜過形成、および／もしくは血管れん縮を阻害することができる、または剥離血管のコラーゲンに結合することができる。
【０１４８】
本明細書に記載される様々な実施形態では、コラーゲン結合合成バイオコンジュゲートは、患者（例えば、血栓症、剥離内皮の露出したコラーゲンへの血小板結合、血栓症、内皮剥離から生じる炎症、内膜過形成、または血管れん縮に関与するものなどの血小板活性化を阻害するために、処置を必要とする患者）に投与することができる。様々な実施形態では、コラーゲン結合合成バイオコンジュゲートは、例えば静脈内または筋肉内に投与することができる。非経口投与に適した経路には、血管内、静脈内、動脈内、筋肉内、皮膚、皮下、経皮、皮内、および表皮内送達が含まれる。非経口投与に適した手段には、針（マイクロニードルを含む）注射器、注入技術、およびカテーテルベースの送達が含まれる。例示的な実施形態では、ａ）薬学的に活性な量のコラーゲン結合合成バイオコンジュゲート、ｂ）約ｐＨ４．５〜約ｐＨ９の範囲のｐＨを提供するための薬学的に許容されるｐＨ緩衝剤、ｃ）約０〜約３００ミリモル濃度の濃度範囲のイオン強度改変剤、およびｄ）全処方重量（formula  weight）の約０．２５％〜約１０％の濃度範囲の水溶性粘度改変剤、または任意の個々の構成成分ａ）、ｂ）、ｃ）もしくはｄ）、またはａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）の任意の組合せを含む、非経口投与またはカテーテルベースの送達のためにコラーゲン結合合成バイオコンジュゲートと共に使用するための医薬製剤が提供される。
【０１４９】
本明細書に記載される実施形態のいずれかでは、コラーゲン結合合成バイオコンジュゲートは、任意の適切な方式で患者の血管内に（例えば、動脈または静脈に）投与することができる。本明細書に記載される様々な実施形態では、コラーゲン結合合成バイオコンジュゲートは、血管介入の前、間または後に患者の血管に投与することができる。様々な実施形態では、血管介入、例えば経皮的冠状動脈介入（ＰＣＩ）には、例えば、ステント留置、粥腫切除術、グラフティング、および血管形成術、例えばバルーン血管形成術が含まれ得る。例示的に、血管介入は、動脈、例えば冠動脈もしくは静脈を一時的に閉塞させるもの（例えば、バルーン血管形成術）であってよく、または動脈もしくは静脈を一時的に閉塞させないもの（例えば、非バルーン血管形成術、バルーン血管形成術を伴わないステント留置術など）であってよい。例示的な送達様式として、カテーテル、非経口投与、バルーン上のコーティング、多孔質バルーンを介するもの、コーティングされたステントおよびそれらの任意の組合せ、または血管介入術中の薬物送達の任意の他の公知の方法を挙げることができる。例示的な一実施形態では、標的血管には、ネイティブな冠動脈ならびに例えば早期冠動脈バイパス術で患者にグラフトされたものを含めた、冠動脈、例えば患者の心臓組織に血液を供給する任意の血管が含まれ得る。本明細書に記載される実施形態のいずれかでは、コラーゲン結合合成バイオコンジュゲートが投与されるおよび血管介入術が実施される標的血管は、狭窄などの閉塞、または血管を通る血流の低減を引き起こす完全もしくは部分的閉塞の一部の他の形態を含有していてよい。したがって、コラーゲン結合合成バイオコンジュゲートは、患者に経皮的に挿入され、患者の血管を介して標的血管に通されるカテーテル（例えば、拡張カテーテル、オーバーザワイヤー血管形成術バルーンカテーテル、注入カテーテル、迅速交換もしくはモノレールカテーテル、または当技術分野で公知の任意の他のカテーテルデバイス）によって、血管に送達することができる。参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第７，３００，４５４号に記載されるものを含めた様々なカテーテルベースのデバイスが、当技術分野で公知である。カテーテルが使用される、本明細書に記載される様々な実施形態では、コラーゲン結合合成バイオコンジュゲートを送達するために使用されるカテーテルは、血管介入が実施されるものと同じカテーテルであってよく、または異なるカテーテルであってよい（例えば、同じもしくは異なる皮膚切開によって患者に経皮的に挿入され、かつ／または同じもしくは異なる経路を介して患者の血管を通して標的血管に通される、異なるカテーテル）。別の実施形態では、コラーゲン結合合成バイオコンジュゲートは、標的血管に直接注射することができる。別の実施形態では、コラーゲン結合合成バイオコンジュゲートは、全身送達することができる（すなわち、標的血管に直接送達されるのではなく、カテーテルベースの送達を用いずに非経口投与によって送達される）。
【０１５０】
血管が閉塞（例えば、狭窄）を含有する場合、投与は、コラーゲン結合合成バイオコンジュゲートを、閉塞部位または閉塞の遠位部またはその両方の標的血管に直接送達することによって行うことができる。別の実施形態では、コラーゲン結合合成バイオコンジュゲートは、閉塞に近位の１つまたは複数の部位に送達することができる。例示的に、コラーゲン結合合成バイオコンジュゲートが送達されている間、カテーテルチップを静止させたままにすることができ、またはコラーゲン結合合成バイオコンジュゲートが送達されている間、カテーテルチップを移動することができる（例えば、閉塞に対して最初は遠位にある位置から、閉塞までもしくは閉塞を通して、または閉塞に近位の位置まで、近位方向に）。
【０１５１】
上に示される通り、一実施形態では、コラーゲン結合合成バイオコンジュゲートは、血管介入、例えば経皮的冠状動脈介入の前の時点で、患者の血管に直接投与することができる。例えば、コラーゲン結合合成バイオコンジュゲートの送達は、血管介入の直前に（例えば、血管介入前の約１時間以内、例えば約３０分以内、約１５分以内、および／または約５分以内に）行うことができる。必要に応じて、標的血管へのコラーゲン結合合成バイオコンジュゲートの直接送達は、血管介入術のすべてもしくは一部の間、および／またはこのような術の完了後に継続することができ、あるいは標的血管へのコラーゲン結合合成バイオコンジュゲートの直接送達は、血管介入術の開始前に停止し、その後再開しなくてもよい。本明細書に記載される実施形態のいずれかでは、コラーゲン結合合成バイオコンジュゲートの送達は、継続的であってよく、または単回もしくは複数回の投与によって行うことができる。コラーゲン結合合成バイオコンジュゲートを標的血管に投与する前、間および／または後、同じコラーゲン結合合成バイオコンジュゲート、または１つもしくは複数の異なるコラーゲン結合合成バイオコンジュゲートを投与することができる。
【０１５２】
一実施形態では、上記の方法において使用されるバイオコンジュゲートは、硫酸化ヒアルロン酸および約１５〜約３０％のペプチドによる機能化を含み、ペプチドは、ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹ（配列番号：）、ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧ（配列番号：）、ＧＱＬＹＫＳＩＬＹ（配列番号：）、またはＧＱＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧＳＧＳＲＲ（配列番号：）、ＣＰＧＲＶＭＨＧＬＨＬＧＤＤＥＧＰＣ（配列番号：）、ＣＶＷＬＷＥＱＣ（配列番号：）、もしくはＷＲＥＰＳＦＣＡＬＳ（配列番号：）の少なくとも１つの配列、またはそれからそれぞれ１つ、２つもしくは３つのアミノ付加、欠失および／もしくは置換を有するアミノ酸配列を含む。
ｅ．内皮機能不全
【０１５３】
本開示は、一実施形態では、内皮機能不全と関連する疾患に罹患している患者を処置するための組成物および方法を提供する。組成物は、一部の実施形態では、本開示の合成コラーゲン結合バイオコンジュゲートを含む。
【０１５４】
本明細書では、コラーゲン結合バイオコンジュゲートは、急性および慢性疾患の両方において、内皮機能不全または傷害の炎症性影響を低減することができることが発見される。このようなバイオコンジュゲートは、機能不全内皮へ血小板が結合することを阻害または低減し、したがって、血小板媒介性炎症を低減することが企図される。炎症は、血小板−血小板結合、血小板−白血球結合、白血球漏出の促進、または局部性および局所サイトカインの血小板からの単なる放出などの血小板プロセスを介して活性化され得る。
【０１５５】
さらに、コラーゲン結合バイオコンジュゲートは、曝露された内皮細胞において炎症促進性サイトカインの分泌、ならびにＥ−セレクチンおよびＰ−セレクチンの発現を低減することが発見される。さらに、これらのバイオコンジュゲートは、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）が存在下でも、内皮細胞の増殖および遊走を増加させ、ＩＬ−６分泌および血管傷害マーカーの生成を減弱することができる。コラーゲン結合バイオコンジュゲートを投与することによってもたらされるこれらの効果の一部またはすべては、機能不全内皮における炎症の低減に寄与することが企図される。
【０１５６】
一部の実施形態では、内皮機能不全に罹患している血管部位における炎症を防止または低減するための方法も提供される。方法には、本開示の合成コラーゲン結合バイオコンジュゲートを含む医薬組成物を、その部位に投与することが必然的に伴う。
【０１５７】
用語「内皮機能不全」は、「内皮細胞（ＥＣ）機能不全」、「機能不全内皮」または「機能不全内皮細胞」とも呼ばれる。内皮機能不全は、内皮細胞の細胞表面上のＩＣＡＭおよびＶＣＡＭ受容体またはセレクチン受容体のアンマスキングまたは露出により決定され得る。Ｐ−セレクチンおよびＥ−セレクチンは、損傷および炎症に起因して細胞表面上に一時的に発現され、機能不全内皮において慢性的に発現される、曝露されたセレクチン受容体の例である。
【０１５８】
一部の実施形態では、内皮機能不全は、透過した内皮内膜（endothelial  lining）または損傷を受けた内皮細胞により特徴付けられる。一部の実施形態では、内皮機能不全は、多糖外被の喪失によって特徴付けられる。一部の実施形態では、内皮機能不全は、内皮細胞の表面上に発現され、循環に曝露されたセレクチンタンパク質によって特徴付けられる。一部の実施形態では、その部位は、炎症に罹患している。
【０１５９】
一態様では、血管部位は、物理的手段によって剥離されず、血管介入術からの回復していない。血管介入術の非限定的な例として、経皮的冠状動脈介入（ＰＣＩ）が挙げられる。
【０１６０】
「機能不全内皮細胞」または「内皮細胞（ＥＣ）機能不全」は、内皮細胞の細胞表面上のＩＣＡＭおよびＶＣＡＭ受容体、ならびにセレクチン受容体のアンマスキングまたは露出を意味する。Ｐ−セレクチンおよびＥ−セレクチンは、損傷および炎症に起因して細胞表面上に一時的に発現され、機能不全内皮において慢性的に発現される、露出したセレクチン受容体の例である。慢性機能不全内皮細胞を有する疾患状況の一例は、糖尿病である。
【０１６１】
内皮細胞は、機能的毛細管の維持に関与するので、内皮の機能不全は、広範な疾患の病因において重要な役割を演じている。
【０１６２】
例えば、内皮は、末梢血管疾患、脳卒中、心疾患、糖尿病、インスリン抵抗性、慢性腎不全、腫瘍成長、転移、静脈血栓症、および重症ウイルス感染症に直接関与する（Rajendran  et  al.,  Int.  J.  Biol.  Sci.,  9:1057-1069,  2013）。
【０１６３】
「内皮機能不全と関連する疾患」は、本明細書で使用される場合、内皮機能不全によって少なくとも部分的に引き起こされるか、または内皮機能不全を誘導する、ヒト疾患または状態を指す。したがって、内皮機能不全と関連する疾患を処置することは、疾患の処置、機能不全内皮を回復させること、または機能不全内皮から生じる状態もしくは症状、例えば炎症、内膜過形成、および血栓症を防止もしくは軽快させることを指す。
【０１６４】
本発明者らは、コラーゲン結合バイオコンジュゲートを、ヒト患者の任意の器官に有効に送達することができることを実証した。したがって、コラーゲン結合バイオコンジュゲートは、器官のいずれかにおいて生じ、以下の疾患または状態のいずれかと関連する内皮機能不全を処置するために使用することができる。
【０１６５】
血管疾患。コラーゲン結合バイオコンジュゲートを用いて適切に処置され得る血管疾患には、限定することなく、アテローム硬化性疾患（末梢動脈疾患、冠動脈疾患、脳卒中、頸動脈疾患、腎臓動脈狭窄）、静脈血栓性疾患（深部または表在静脈血栓症）、および医原性大血管傷害（血管形成術、ステント装着を伴う血管形成術、粥腫切除術、血栓摘出術、透析アクセス作製、バイパスのための静脈採取、脳または大動脈瘤の処置）が含まれる。
【０１６６】
腎疾患。コラーゲン結合バイオコンジュゲートを用いて適切に処置され得る腎疾患には、限定することなく、急性尿細管壊死、糖尿病性慢性腎不全、狼瘡腎炎、腎線維症、および急性糸球体腎炎が含まれる。
【０１６７】
肺疾患。コラーゲン結合バイオコンジュゲートを用いて適切に処置され得る肺疾患には、限定することなく、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、慢性閉塞性肺疾患、喘息、および気腫が含まれる。
【０１６８】
血液疾患。コラーゲン結合バイオコンジュゲートを用いて適切に処置され得る血液疾患には、限定することなく、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）、および溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）が含まれる。
【０１６９】
さらに、皮膚疾患、例えば全身性硬化症、血管炎障害（狼瘡）を含むリウマチ疾患、関節リウマチおよび他の炎症性関節炎（痛風）、炎症性腸疾患を含む胃腸疾患、肝炎および肝線維症、腫瘍成長、腫瘍転移、ウイルス性および細菌性敗血症を含む感染症、多発性硬化症、認知症および筋萎縮性側索硬化症を含む神経性疾患、黄斑変性、緑内障およびぶどう膜炎を含む眼科疾患、内分泌疾患、例えば糖尿病、ならびに複合性局所疼痛症候群（ＣＲＰＳ）も、本開示のコラーゲン結合バイオコンジュゲートを用いて処置することができる。
【０１７０】
バイオコンジュゲートは、処置される疾患および影響を受けている機能不全内皮の位置に応じて最適化された処置のために、ペプチドの同一性、グリカンに結合させたペプチドの数、およびＧＡＧ主鎖の同一性に関して調整することができることが企図される。したがって、いくつかの分子設計パラメーターを操作して、標的効果を最適化することができる。
【０１７１】
一実施形態では、上記の方法において使用されるバイオコンジュゲートは、硫酸化ヒアルロン酸および約１５〜約３０％のペプチドによる機能化を含み、ペプチドは、ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹ（配列番号：）、ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧ（配列番号：）、ＧＱＬＹＫＳＩＬＹ（配列番号：）、またはＧＱＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧＳＧＳＲＲ（配列番号：）、ＣＰＧＲＶＭＨＧＬＨＬＧＤＤＥＧＰＣ（配列番号：）、ＣＶＷＬＷＥＱＣ（配列番号：）、もしくはＷＲＥＰＳＦＣＡＬＳ（配列番号：）の少なくとも１つの配列、またはそれからそれぞれ１つ、２つもしくは３つのアミノ付加、欠失および／もしくは置換を有するアミノ酸配列を含む。
ｆ．組織癒着
【０１７２】
本発明の方法は、組織癒着、例えば心臓、腹部または骨盤癒着に関する様々な適用において有用である。本発明の方法は、これらの持続的欠陥または再発性傷害を処置および／または防止するのに有用であり得ることが企図される。
【０１７３】
ある特定の実施形態では、本開示は、腹部または骨盤癒着を処置および／または防止することを必要とする患者の腹部または骨盤癒着を処置および／または防止する方法であって、器官の不自然に露出した組織に医薬組成物を適用することを含む方法を提供する。一実施形態では、組成物は、約１〜約８０個のコラーゲン結合ペプチドが結合したグリカンを含むバイオコンジュゲートを含む。「露出した組織」は、正常で健康な状態下で見られる新しい環境に曝露される組織もしくは表面、あるいは正常で健康な状態下での異なる器官の細胞もしくは組織には曝露されないが、疾患もしくは傷害に起因して、または医学的手順中に露出する組織（すなわち、「不自然に露出した組織」）を指すことができる。
【０１７４】
癒着は、普通は接続していない組織および／または器官を異常に結合する、線維性瘢痕組織帯である。癒着は、様々な種類の傷害または組織障害、例えば、手術、外傷、感染、化学療法、放射線、異物、またはがんなどに応答して生じる。
【０１７５】
腹部および骨盤癒着は、腹部外科手技の一般的な合併症である。腹部癒着は、重症の臨床的問題および／または疼痛を引き起こすおそれがある。例えば、腹部癒着に関係する臨床的問題には、小腸閉塞症、続発性女性不妊症、異所性妊娠、慢性腹痛および骨盤痛、ならびに困難で危険な再手術が含まれ得る（Diamond,  M.  P.,  Freeman,  M.  L.  Eur.  Soc.  Human.  Repro.  Embryo.  2001;  7(6):  567-576）。腹部癒着は、普通は接続していない組織および／または器官を繋ぎ、神経の牽引を引き起こすことによって、疼痛を引き起こすおそれがある。腸が閉塞すると、次に膨満によって疼痛が引き起こされる。したがって、腹部癒着は、腸管障害および腸閉塞症または閉塞を引き起こすおそれがある。極度の場合、腹部癒着は、血流を抑制し、組織死をもたらす線維帯を、腸セグメントの周りに形成するおそれがある。
【０１７６】
上の臨床的問題および／または疼痛を引き起こす腹部および骨盤癒着の標準処置は、外科的介入である。しかし、外科的介入には、追加の腹部癒着およびさらなる合併症の危険性がある。したがって、腹部癒着を処置および／または防止することを必要とする患者の腹部癒着を処置および／または防止するのに、腹部癒着のための代替処置および／または防止選択肢が有益となり得る。
【０１７７】
一態様では、腹部組織または器官への外傷は、腹部組織および／または器官の間に線維組織帯を生じる。本明細書に記載される方法は、前記腹部癒着を処置および／または防止するのに有用であり得ることが企図される。
【０１７８】
本明細書で提供される合成バイオコンジュゲートは、保護水和層を提供して疼痛を最小限にし、腹部組織および／または器官のコラーゲンを分解から保護し、上皮遊走および上皮増殖を促進することが企図される。
【０１７９】
ある特定の実施形態では、本開示は、腹部癒着を処置および／または防止することを必要とする患者の腹部癒着を処置および／または防止する方法であって、腹部器官の露出した組織に医薬組成物を適用することを含む方法を提供する。一実施形態では、組成物は、約１〜約８０個のコラーゲン結合ペプチドが結合したグリカンを含むバイオコンジュゲートを含む。
【０１８０】
ある特定の実施形態では、本開示は、腱−腱鞘癒着を処置および／または防止することを必要とする患者の腱−腱鞘癒着を処置および／または防止する方法であって、不自然に露出した腱および／または腱鞘に本明細書に記載されるバイオコンジュゲートまたは組成物を適用することを含む方法を提供する。
【０１８１】
ある特定の実施形態では、本開示は、心臓癒着を処置および／または防止することを必要とする患者の心臓癒着を処置および／または防止する方法であって、不自然に露出した心臓組織に本明細書に記載されるバイオコンジュゲートまたは組成物を適用することを含む方法を提供する。
【０１８２】
一部の態様では、組織は、手術、外傷、感染、化学療法、放射線、異物、またはがんに起因して露出する。一態様では、組織は、外科的に露出する。
【０１８３】
一部の態様では、組成物は、スプレー剤として適用される。一部の態様では、組織は、腹膜組織である。
【０１８４】
本開示の組成物および方法はまた、例えば手または指の手術の間に、整形外科的癒着を低減または防止するのに有用であることが企図される。
【０１８５】
一部の実施形態では、方法は、癒着を低減または防止することにおいて、組織を囲むメッシュの使用などの当技術分野で公知の他の方法をさらに含むことができる。
【０１８６】
本明細書で提供されるバイオコンジュゲートは、患者に、腹部組織および／または器官の細胞外マトリックス構成成分を標的とする合成バイオコンジュゲートを投与することによって、腹部癒着を処置および／または防止することを必要とする患者の腹部癒着を処置および／または防止するために使用することができる。本明細書で提供される合成バイオコンジュゲートは、腹部組織の血管新生を促進するために、ペプチドの同一性、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）主鎖に結合させたペプチドの数、およびＧＡＧ主鎖の同一性に関して調整することができることが企図される。したがって、いくつかの分子設計パラメーターを操作して、標的効果を最適化することができる。
【０１８７】
本明細書で提供されるバイオコンジュゲートは、組織癒着を防止または低減するために、手術における補助剤として使用することができる。手術中、合成バイオコンジュゲートは、潜在的に癒着形成性（adhesiogenic）である組織または器官に送達することができる。このような投与は、術後癒着を防止および／または低減する一助になることが企図される。一実施形態では、本開示は、術後癒着を低減または防止するための方法であって、本明細書で提供される合成バイオコンジュゲートを、外科手術部位に送達することを含む方法を提供する。別の実施形態では、本明細書で提供されるバイオコンジュゲートは、腹腔鏡下腹部手術などの腹部手技において有用であり得る。さらなる実施形態では、本明細書で提供されるバイオコンジュゲートは、潜在的に癒着形成性である組織または器官に、腹腔鏡によって送達することができる。バイオコンジュゲートを用いる処置は、傷害エリアに結合し、保護水和層を提供して疼痛を最小限にし、腹部組織および／または器官のコラーゲンを分解から保護し、上皮遊走および上皮増殖を促進することによって、腹部癒着を処置および／または防止することが企図される。さらに、バイオコンジュゲートは傷害を受けたエリアに留まり、したがって、１日に複数回の処置は必要ないことが企図される。
【０１８８】
一実施形態では、上記の方法において使用されるバイオコンジュゲートは、硫酸化ヒアルロン酸および約１５〜約３０％のペプチドによる機能化を含み、ペプチドは、ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹ（配列番号：）、ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧ（配列番号：）、ＧＱＬＹＫＳＩＬＹ（配列番号：）、またはＧＱＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧＳＧＳＲＲ（配列番号：）、ＣＰＧＲＶＭＨＧＬＨＬＧＤＤＥＧＰＣ（配列番号：）、ＣＶＷＬＷＥＱＣ（配列番号：）、もしくはＷＲＥＰＳＦＣＡＬＳ（配列番号：）の少なくとも１つの配列、またはそれからそれぞれ１つ、２つもしくは３つのアミノ付加、欠失および／もしくは置換を有するアミノ酸配列を含む。
【０１８９】
本開示の組成物は、直視下手術中、または腹腔鏡によって、または外科手術部位へのアクセスを可能にする任意の機器によって投与することができる。
ｇ．胃食道傷害
【０１９０】
本開示は、一実施形態では、患者の胃食道傷害を処置または防止する、満たされていない必要性に対処するための新しいアプローチを提供する。一般に、新しいアプローチには、本開示の合成コラーゲン結合バイオコンジュゲートを含む医薬組成物を、傷害を受けた胃食道組織または細胞に適用することが必然的に伴う。
【０１９１】
組成物のこのような適用は、合成コラーゲン結合バイオコンジュゲートのコーティングを生成することができる。合成コラーゲン結合バイオコンジュゲートは、物理的ペプチド−コラーゲン相互作用を介して、食道組織において露出したコラーゲンに結合することができる。バイオコンジュゲートは、コラーゲンに結合すると、１）血小板付着／活性化に対するバリアとして作用すること、２）ＭＭＰアクセスを阻害することによってコラーゲンを分解から保護すること、ならびに３）成長因子ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−７、およびＦＧＦ−１０を隔離し、したがって内皮細胞および上皮細胞の増殖および遊走を促進して組織を修復および回復させることを含めたいくつかの機能を有する。
【０１９２】
コラーゲン結合バイオコンジュゲートは、一実施形態では、共有結合により付着したコラーゲン結合ペプチドを有する多糖主鎖を含む。合成バイオコンジュゲートは、コラーゲン上の血小板結合部位を競合し、血小板の結合および活性化を防止することができる。グリカン主鎖は、負電荷を帯び、水分子に結合して、コラーゲン表面上に、血小板およびタンパク質接着を防止する親水性バリアを作製することができる。バイオコンジュゲートは、正常な血小板機能を阻害するのではなく、露出したコラーゲンをマスキングすることによって、炎症および内膜過形成に至るカスケードの初期ステップに対処する局部的処置を提供することができる。
【０１９３】
この新しいアプローチは、それらに限定されるものではないがＧＥＲＤまたは医原性介入によって引き起こされるものを含めた胃食道傷害を処置するのに有用であることが企図される。さらに、以下の分類の患者は、このアプローチから利益を得ることができることが企図される。Ａ）食道胃十二指腸内視鏡検査（esophagogastroduodenoscopic）（ＥＧＤ）アブレーションを必要とするＧＥＲＤ関連食道病変、Ｂ）ＥＧＤ拡張を必要とする食道狭窄、およびＣ）ＥＧＤ処置を必要とする消化性潰瘍疾患（ＰＵＤ）。
【０１９４】
医薬組成物は、傷害を受けた胃食道組織の１つまたは複数の病変に局所適用することができる。組織の到達性が限られていることを考慮すると、送達デバイスの使用が有益であることが企図される。例えば、組成物は、食道胃十二指腸内視鏡検査（ＥＧＤ）手順の間に、または食道胃十二指腸内視鏡を使用して送達することができる。
【０１９５】
パリフェルミンは、口腔粘膜炎処置に有用なケラチノサイト成長因子である。本開示のバイオコンジュゲートは、コラーゲンに結合し、パリフェルミンなどの内因性または外因性成長因子にも結合する。したがって、このような製剤は、パリフェルミンの標的化送達を提供する。一部の実施形態では、本開示は、パリフェルミンを送達するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、方法は、バイオコンジュゲートおよびパリフェルミンを含む組成物を、それを必要とする患者に適用することを含む。他の実施形態では、本開示は、患者の口腔粘膜炎を処置するための方法であって、バイオコンジュゲートおよびパリフェルミンを含む組成物を、それを必要とする患者に適用することを含む方法を提供する。
【０１９６】
液剤で提供されるバイオコンジュゲートは、傷害を受けた胃食道組織の回復を促進するために、ペプチドの同一性、グリカンに結合させたペプチドの数、およびＧＡＧ主鎖の同一性に関して調整することができることが企図される。したがって、いくつかの分子設計パラメーターを操作して、標的効果を最適化することができる。
【０１９７】
一実施形態では、上記の方法において使用されるバイオコンジュゲートは、硫酸化ヒアルロン酸および約１５〜約３０％のペプチドによる機能化を含み、ペプチドは、ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹ（配列番号：）、ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧ（配列番号：）、ＧＱＬＹＫＳＩＬＹ（配列番号：）、またはＧＱＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧＳＧＳＲＲ（配列番号：）、ＣＰＧＲＶＭＨＧＬＨＬＧＤＤＥＧＰＣ（配列番号：）、ＣＶＷＬＷＥＱＣ（配列番号：）、もしくはＷＲＥＰＳＦＣＡＬＳ（配列番号：）の少なくとも１つの配列、またはそれからそれぞれ１つ、２つもしくは３つのアミノ付加、欠失および／もしくは置換を有するアミノ酸配列を含む。
ｈ．創傷治癒
【０１９８】
本明細書に記載される方法および組成物は、慢性創傷および急性創傷、結合組織の創傷、ならびに筋肉、骨および神経組織の創傷を含めた、組織の完全性が損傷を受けた任意の状態を処置するために使用することができる。「創傷」には、本明細書で使用される場合、外科的切開、熱傷、酸およびアルカリによる熱傷、低温熱傷（凍傷）、日焼け、潰瘍、褥瘡、切り傷、擦過創、裂創、物理的外傷によって引き起こされた創傷、先天性障害によって引き起こされた創傷、歯周疾患によってまたは歯科手術後に引き起こされた創傷、ならびにがん組織または腫瘍と関連する創傷が含まれる。本明細書に記載の通り、創傷には、急性または慢性創傷のいずれかが含まれ得る。
【０１９９】
急性創傷は、無傷皮膚への外部の損傷によって引き起こされ、外科的創傷、咬傷、熱傷、切り傷、裂創、擦過創などが含まれる。慢性創傷には、例えば、皮膚または上皮組織の完全性を損なう内因性機序、例えば、脚潰瘍、足潰瘍、および褥瘡によって引き起こされた創傷が含まれる。本明細書に記載される実施形態のいずれかでは、創傷治癒を促進する、または瘢痕形成を低減するための組成物は、慢性または急性創傷を処置するためにいつでも使用することができる。例えば、外科的切開と関連する急性創傷は、患者の創傷治癒を促進する、および／または瘢痕形成を低減するために、手術前、手術中、または手術後に処置することができる。様々な例示的な態様では、本明細書に記載される組成物は、創傷治癒を促進する、および／または瘢痕形成を低減するために、必要な場合１回用量または複数回用量で患者に投与することができる。
【０２００】
本明細書で使用される場合、「瘢痕形成を低減すること」には、瘢痕の極限引張強度の増加および／または目に見える瘢痕の長さの減少が含まれる。本明細書で使用される場合、瘢痕形成の低減には、患者の瘢痕形成の完全阻害または目に見える瘢痕化の完全除去も含まれる。
【０２０１】
本明細書で使用される場合、「創傷治癒を促進すること」は、慢性もしくは急性創傷の部分的もしくは完全な治癒を引き起こすこと、または急性もしくは慢性創傷によって引き起こされた症状のいずれかを低減することを意味する。このような症状には、疼痛、出血、組織壊死、組織潰瘍化、瘢痕形成、および急性または慢性創傷から生じることが公知の任意の他の症状が含まれる。
【０２０２】
本明細書に記載される実施形態のいずれかでは、創傷治癒を促進する方法が提供される。方法は、患者にコラーゲン結合合成バイオコンジュゲートを投与するステップを含み、コラーゲン結合合成バイオコンジュゲートは、患者の創傷治癒を促進する。本明細書に記載される様々な実施形態のいずれかでは、コラーゲン結合合成バイオコンジュゲートは、異常コラーゲン結合合成バイオコンジュゲートであっても、コラーゲン原線維形成を普通は調節するバイオコンジュゲートのアミノ酸配列の一部に対してアミノ酸相同性を有する原線維形成性コラーゲン結合合成バイオコンジュゲートであってもよい。
【０２０３】
本明細書に記載される実施形態のいずれかでは、瘢痕形成を低減する方法が提供される。方法は、患者にコラーゲン結合合成バイオコンジュゲートを投与するステップを含み、コラーゲン結合合成バイオコンジュゲートは、患者の瘢痕形成を低減する。本明細書に記載される様々な実施形態のいずれかでは、コラーゲン結合合成バイオコンジュゲートは、異常コラーゲン結合合成バイオコンジュゲートであっても、コラーゲン原線維形成を普通は調節するバイオコンジュゲートのアミノ酸配列の一部に対してアミノ酸相同性を有する原線維形成性コラーゲン結合合成バイオコンジュゲートであってもよい。
【０２０４】
本明細書に記載される実施形態のいずれかでは、創傷治癒を促進する、および／または瘢痕形成を低減するための組成物は、綿、紙、不織布、織布、および編物、モノフィラメント、フィルム、ゲル、スポンジなどを含めた、創傷への組成物の送達に適した任意の材料に含侵させることができる。例えば、綿、紙、不織布、織布、編物、フィルムおよびスポンジの形態の外科縫合糸（モノフィラメント、撚糸または編糸）、吸収性パッド、経皮パッチ、包帯、熱傷包帯剤およびパッキングを使用することができる。
【０２０５】
一実施形態では、上記の方法において使用されるバイオコンジュゲートは、硫酸化ヒアルロン酸および約１５〜約３０％のペプチドによる機能化を含み、ペプチドは、ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹ（配列番号：）、ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧ（配列番号：）、ＧＱＬＹＫＳＩＬＹ（配列番号：）、またはＧＱＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧＳＧＳＲＲ（配列番号：）、ＣＰＧＲＶＭＨＧＬＨＬＧＤＤＥＧＰＣ（配列番号：）、ＣＶＷＬＷＥＱＣ（配列番号：）、もしくはＷＲＥＰＳＦＣＡＬＳ（配列番号：）の少なくとも１つの配列、またはそれからそれぞれ１つ、２つもしくは３つのアミノ付加、欠失および／もしくは置換を有するアミノ酸配列を含む。
ｉ．角膜創傷
【０２０６】
本発明の方法は、角膜創傷治癒に関する様々な適用において有用である。一実施形態では、処置を必要とする角膜創傷状態は、角膜への外傷的傷害の結果である（Chiapella,  A.  P.,  Rosenthal,  A.  R.  British  Journal  of  Ophthalmology,  1985;  69:  865-870）。別の実施形態では、Ｅｐｉ−Ｌａｓｉｋによって誘導された角膜傷害（Epi-Lasik  induce  corneal  injury）などの、処置を必要とする創傷状態は、眼科的手順によって引き起こされる（Tuft,  S.J.,  et  al.  Br  J  Ophthalmol.  1993;  77:  243-247）。ある場合には、治癒の欠如または不完全な治癒に起因して、持続的欠陥または再発性傷害が生じる場合がある（Kenyon,  K.  R.  Cornea  and  Refractive  Atlas  of  Clinical  Wisdom.  Eds.  S.A.  Melki  and  M.  A.  Fava.  SLACK,  Inc.:  New  Jersey,  US,  2011;  pp.  39）。本発明の方法は、これらの持続的欠陥または再発性傷害を処置するのに有用であり得ることが企図される。
【０２０７】
一態様では、角膜上皮への傷害によって、角膜バリア機能が破損し、本明細書に記載される方法は、前記傷害を処置するのに有用であり得ることが企図される。
【０２０８】
本明細書で提供されるバイオコンジュゲートは、角膜創傷治癒に関与する特異的細胞外マトリックス構成成分を標的とするバイオコンジュゲートを患者に投与することによって、角膜創傷治癒を促進することを必要とする患者の角膜創傷治癒を促進するために使用することができる。本明細書で提供されるバイオコンジュゲートは、角膜創傷治癒を促進するために、ペプチドの同一性、グリカンに結合させたペプチドの数、およびグリカンの同一性に関して調整することができることが企図される。したがって、いくつかの分子設計パラメーターを操作して、標的効果を最適化することができる。
【０２０９】
硫酸化ヒアルロン酸および約１５〜約３０％のペプチドによる機能化を含み、ペプチドが、ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹ（配列番号：）、ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧ（配列番号：）、ＧＱＬＹＫＳＩＬＹ（配列番号：）、またはＧＱＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧＳＧＳＲＲ（配列番号：）、ＣＰＧＲＶＭＨＧＬＨＬＧＤＤＥＧＰＣ（配列番号：）、ＣＶＷＬＷＥＱＣ（配列番号：）、もしくはＷＲＥＰＳＦＣＡＬＳ（配列番号：）の少なくとも１つの配列、またはそれからそれぞれ１つ、２つもしくは３つのアミノ付加、欠失および／もしくは置換を有するアミノ酸配列を含むバイオコンジュゲートを用いる処置は、傷害エリアに結合し、保護水和層を提供して疼痛を最小限にし、角膜コラーゲンを分解から保護し、かつ／または上皮遊走および上皮増殖を促進することによって、角膜創傷（would）治癒を増強することが企図される。さらに、バイオコンジュゲートは傷害を受けたエリアに留まり、したがって、１日に複数回の処置は必要ないことが企図される。
５．組成物
【０２１０】
一実施形態では、バイオコンジュゲートは、組成物で投与される。本開示は、バイオコンジュゲートおよび薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。水または食塩水を含めた当業者に公知の薬学的に許容される担体が使用され得る。当技術分野で公知の通り、構成成分ならびにそれらの相対量は、所期の使用および送達方法によって決定される。組成物において用いられる賦形剤または担体は、バイオコンジュゲートの所望の効果を低減しないように選択され得る。適切な組成物の例として、水溶液、例えば等張食塩水、５％グルコース中溶液が挙げられる。アルコール、グリコール、エステルおよびアミドなどの他の周知の薬学的に許容される液体担体を用いることができる。ある特定の実施形態では、組成物は、１つまたは複数の添加剤、例えばそれらに限定されるものではないが、イオン強度改変剤、溶解増強剤、糖、例えばマンニトールもしくはソルビトール、ｐＨ緩衝剤、界面活性剤、安定化ポリマー、防腐剤、および／または共溶媒をさらに含む。
【０２１１】
ある特定の実施形態では、組成物は、水溶液である。水溶液は、製剤化の容易さ、ならびに溶液の点滴注入によってこのような組成物を容易に投与する能力に基づいて、組成物製剤で使用するのに適している。ある特定の実施形態では、組成物は、懸濁液、粘性もしくは半粘性ゲル、または他の種類の固体もしくは半固体組成物である。一部の実施形態では、組成物は、当技術分野で十分周知のフォーム、軟膏、液体洗浄液、ゲル、スプレーおよびリポソームの形態である。あるいは、局所投与は、ポンプ−カテーテル系、連続的もしくは選択的放出デバイス、または接着バリアから選択されるデバイスを介する、提供されたバイオコンジュゲートの処置部位への注入である。ある特定の実施形態では、組成物は、静脈または動脈の内壁に直接的に適用されるか、または接触する溶液である。一部の実施形態では、組成物は、ポリマーマトリックスを含む。他の実施形態では、組成物は、吸収可能である。ある特定の実施形態では、組成物は、ｐＨ緩衝剤を含む。一部の実施形態では、組成物は、潤滑増強剤を含有する。
【０２１２】
ある特定の実施形態では、組成物のための薬学的に許容される担体または支持体として、ポリマーマトリックスまたはポリマー材料が用いられる。本明細書に記載されるポリマー材料は、天然または非天然ポリマー、例えば、糖、ペプチド、タンパク質、ラミニン、コラーゲン、ヒアルロン酸、イオン性および非イオン性水溶性ポリマーなど；アクリル酸ポリマー；親水性ポリマー、例えばポリエチレンオキシド、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマー、およびポリビニルアルコール；セルロースポリマーおよびセルロースポリマー誘導体、例えばヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、およびエーテル化セルロース；ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、乳酸およびグリコール酸のコポリマー、または天然および合成の両方の他のポリマー性剤を含むことができる。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される組成物は、フィルム剤、ゲル剤、フォーム剤、またはおよび他の剤形として製剤化される。
【０２１３】
適切なイオン強度改変剤には、例えば、グリセリン、プロピレングリコール、マンニトール、グルコース、デキストロース、ソルビトール、塩化ナトリウム、塩化カリウム、および他の電解質が含まれる。
【０２１４】
ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートの溶解度を増強する必要があり得る。このような場合には、溶解度は、適切な製剤化技術の使用、例えば、マンニトール、エタノール、グリセリン、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ポロキサマー、および当技術分野で公知の他のものなどの溶解度増強組成物の組込みによって増加させることができる。
【０２１５】
ある特定の実施形態では、組成物は、潤滑増強剤を含有する。本明細書で使用される場合、潤滑増強剤は、薬学的に許容される担体の粘度を改変することができる１つまたは複数の薬学的に許容されるポリマー材料を指す。適切なポリマー材料には、それらに限定されるものではないが、イオン性および非イオン性水溶性ポリマー；ヒアルロン酸およびその塩、コンドロイチン硫酸およびその塩、デキストラン、ゼラチン、キトサン、ジェラン、他のバイオコンジュゲートもしくは多糖類、またはそれらの任意の組合せ；セルロースポリマーおよびセルロースポリマー誘導体、例えばヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、およびエーテル化セルロース；コラーゲンおよび改変コラーゲン；ガラクトマンナン、例えばグアーガム、ローカストビーンガムおよびタラガム、ならびに上記の天然ガムおよび構造的な主構成成分としてマンノースおよび／またはガラクトース部分を含有する類似の天然または合成ガム（例えば、ヒドロキシプロピルグアー）から得られた多糖類；トラガントガムおよびキサンタンガムなどのガム；ジェランガム；アルギネートおよびアルギン酸ナトリウム；キトサン；ビニルポリマー；親水性ポリマー、例えばポリエチレンオキシド、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマー、およびポリビニルアルコール；カルボキシビニルポリマーまたは架橋アクリル酸ポリマー、例えばポリマーの「カルボマー」ファミリー、例えば、商標Ｃａｒｂｏｐｏｌ（商標）で商業的に得ることができるカルボキシポリアルキレン；ならびに他の様々な粘性または粘弾性（viscoelastomeric）物質が含まれる。一実施形態では、潤滑増強剤は、ヒアルロン酸、デルマタン、コンドロイチン、ヘパリン、ヘパラン、ケラチン、デキストラン、キトサン、アルギネート、アガロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、およびエーテル化セルロース、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポビドン、カルボマー９４１、カルボマー９４０、カルボマー９７１Ｐ、カルボマー９７４Ｐ、または薬学的に許容されるその塩からなる群から選択される。一実施形態では、潤滑増強剤は、バイオコンジュゲートと並行して適用される。あるいは、一実施形態では、潤滑増強剤は、バイオコンジュゲートに対して逐次的に適用される。一実施形態では、潤滑増強剤は、コンドロイチン硫酸である。一実施形態では、潤滑増強剤は、ヒアルロン酸である。潤滑増強剤は、組成物の粘度を変化させることができる。
【０２１６】
一部の実施形態では、バイオコンジュゲートは、ミネラル、アミノ酸、糖、ペプチド、タンパク質、ビタミン（例えばアスコルビン酸）、またはラミニン、コラーゲン、フィブロネクチン、ヒアルロン酸、フィブリン、エラスチン、またはアグリカン、または成長因子、例えば上皮成長因子、血小板由来成長因子、形質転換成長因子ベータ、または線維芽細胞成長因子、およびグルココルチコイド、例えばデキサメタゾンまたは粘弾性修正剤、例えばイオン性および非イオン性水溶性ポリマー；アクリル酸ポリマー；親水性ポリマー、例えばポリエチレンオキシド、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマー、およびポリビニルアルコール；セルロースポリマーおよびセルロースポリマー誘導体、例えばヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、およびエーテル化セルロース；ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、乳酸およびグリコール酸のコポリマー、または天然および合成の両方の他のポリマー性剤と組み合わせることができる。
【０２１７】
本明細書の組成物において使用するのに適したｐＨ緩衝剤には、例えば、酢酸、ホウ酸、炭酸、クエン酸、およびリン酸緩衝液、ならびに塩酸、水酸化ナトリウム、酸化マグネシウム、リン酸一カリウム、炭酸水素塩、アンモニア、炭酸、塩酸、クエン酸ナトリウム、クエン酸、酢酸、リン酸水素二ナトリウム、ホウ砂、ホウ酸、水酸化ナトリウム、ジエチルバルビツール酸、およびタンパク質、ならびに様々な生物学的緩衝液、例えば、ＴＡＰＳ、Ｂｉｃｉｎｅ、Ｔｒｉｓ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、カコジル酸塩、またはＭＥＳが含まれる。ある特定の実施形態では、保存条件下でｐＨドリフトを防止するために、適切な緩衝系（例えば、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウムまたはホウ酸）が組成物に添加される。一部の実施形態では、緩衝液は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液である（すなわち、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウムを、一部の製剤では、塩化カリウムおよびリン酸カリウムを含有する）。用いられる剤に応じて、特定の濃度は変わる。ある特定の実施形態では、ｐＨを約ｐＨ４〜約ｐＨ８、または約ｐＨ５〜約ｐＨ８、または約ｐＨ６〜約ｐＨ８、または約ｐＨ７〜約ｐＨ８の範囲内に維持するために、ｐＨ緩衝系（例えば、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウムまたはホウ酸）が添加される。一部の実施形態では、緩衝液は、ｐＨを約ｐＨ４〜約ｐＨ８の範囲内に維持するように選択される。一部の実施形態では、ｐＨは、約ｐＨ５〜約ｐＨ８である。一部の実施形態では、緩衝液は、食塩水緩衝液である。ある特定の実施形態では、ｐＨは、約ｐＨ４〜約ｐＨ８、または約ｐＨ３〜約ｐＨ８、または約ｐＨ４〜約ｐＨ７である。一部の実施形態では、組成物は、ポリマー性マトリックス、ｐＨ緩衝剤、潤滑増強剤およびバイオコンジュゲートを含む、フィルム剤、ゲル剤、パッチ剤、または液体液剤の形態であり、組成物は、必要に応じて防腐剤を含有し、前記組成物のｐＨは、約ｐＨ４〜約ｐＨ８の範囲内である。
【０２１８】
より高濃度のバイオコンジュゲートを送達するために、組成物に界面活性剤が用いられる。界面活性剤は、阻害剤を可溶化し、コロイド分散液、例えばミセル溶液、マイクロエマルジョン、エマルジョンおよび懸濁液を安定化するように機能する。適切な界面活性剤は、ポリソルベート、ポロキサマー、ポリオシル４０ステアレート、ポリオキシルヒマシ油、チロキサポール、トリトン、およびソルビタンモノラウレートを含む。一実施形態では、ＴｒｉｔｏｎＸ１１４およびチロキサポールなどの界面活性剤は、１２．４〜１３．２の範囲の親水性／親油性／バランス（ＨＬＢ）を有しており、眼科使用に許容される。
【０２１９】
ある特定の実施形態では、安定化ポリマー、すなわち粘滑剤が組成物に添加される。安定化ポリマーは、イオン性／荷電性の一例、より具体的には、物理的安定性のために（−）１０〜５０ｍＶのゼータ電位を示すことができる負電荷を表面上に担持し、水中分散液を作製することができる（すなわち水溶性の）ポリマーであるべきである。一実施形態では、安定化ポリマーは、約０．１％〜約０．５％ｗ／ｗの範囲のカルボマーおよびＰｅｍｕｌｅｎ（登録商標）、具体的にはＣａｒｂｏｍｅｒ  ９７４ｐ（ポリアクリル酸）などの架橋ポリアクリレートのファミリー由来の１つの高分子電解質または１つを超える場合には複数の高分子電解質を含む。
【０２２０】
一実施形態では、組成物は、血管の細胞外マトリックスへのバイオコンジュゲートの透過性を増加させる剤を含む。好ましくは、透過性を増加させる剤は、塩化ベンザルコニウム、サポニン、脂肪酸、ポリオキシエチレン脂肪エーテル、脂肪酸のアルキルエステル、ピロリドン、ポリビニルピロリドン、ピルビン酸、ピログルタミン酸またはそれらの混合物から選択される。
【０２２１】
バイオコンジュゲートは、それらに限定されるものではないが、エンドトキシンおよび感染病原体を含めた望ましくない汚染物質を除去するために、滅菌することができる。バイオコンジュゲートの構造および生物向性（biotropic）特性に有害な影響を及ぼさない滅菌技術を使用することができる。ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートは、プロピレンオキシドまたはエチレンオキシド処置、滅菌濾過、ガスプラズマ滅菌、ガンマ放射線、電子線、および／または過酢酸などの過酸を用いる滅菌を含めた従来の滅菌技術を使用して消毒および／または滅菌することができる。一実施形態では、バイオコンジュゲートは、１つまたは複数の滅菌過程に供することができる。あるいは、バイオコンジュゲートは、プラスチックラップまたはホイルラップを含めた任意の種類の容器で包むことができ、さらに滅菌することができる。
【０２２２】
一部の実施形態では、使用中の微生物汚染を防止するために、防腐剤が組成物に添加される。組成物に添加される適切な防腐剤は、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、アルキルパラベン、安息香酸アルキル、クロロブタノール、クロロクレゾール、セチルアルコール、脂肪アルコール、例えばヘキサデシルアルコール、水銀の有機金属化合物、例えば酢酸塩、硝酸フェニル水銀またはホウ酸フェニル水銀、ジアゾリジニル尿素、アジピン酸ジイソプロピル、ジメチルポリシロキサン、ＥＤＴＡの塩、ビタミンＥおよびそれらの混合物を含む。ある特定の実施形態では、防腐剤は、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、ベンゾドデシニウム臭化物、メチルパラベン、プロピルパラベン、フェニルエチルアルコール、エデト酸（edentate）二ナトリウム、ソルビン酸、またはポリクオタニウム−１から選択される。ある特定の実施形態では、組成物は、防腐剤を含む。一部の実施形態では、防腐剤は、約０．００１ｗ／ｖ％〜約１．０ｗ／ｖ％のレベルで用いられる。ある特定の実施形態では、組成物は、防腐剤を含有せず、「防腐剤不使用」と呼ばれる。一部の実施形態では、単位用量組成物は無菌であるが、防腐剤不使用である。
【０２２３】
一部の実施形態では、バイオコンジュゲートおよび他の薬剤の別個のまたは逐次的な投与が、組成物の送達を容易にするのに必要である。ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートおよび他の薬剤は、異なる投薬頻度または間隔で投与することができる。例えば、バイオコンジュゲートは、毎日投与することができ、一方他の薬剤は、より低い頻度で投与することができる。さらに、当業者に明らかになる通り、バイオコンジュゲートおよび他の薬剤は、同じ投与経路または異なる投与経路を使用して投与することができる。
【０２２４】
バイオコンジュゲートを投与するための任意の有効なレジメンを使用することができる。例えば、バイオコンジュゲートは、単回用量として、または毎日複数回用量のレジメンとして投与することができる。さらに、毎日の処置の代替として、時間をずらしたレジメン、例えば週１〜５日を使用することができる。
【０２２５】
様々な実施形態では、バイオコンジュゲートは、フィルム剤、ゲル剤、パッチ剤、または液体液剤などによって局所投与することができる。実施形態の一部では、提供される組成物は、緩衝された滅菌水溶液で存在する。ある特定の実施形態では、溶液は、約１〜約１００センチポアズ（ｃｐ）、または約１〜約２００ｃｐ、または約１〜約３００ｃｐ、または約１〜約４００ｃｐの粘度を有する。一部の実施形態では、溶液は、約１〜約１００ｃｐの粘度を有する。ある特定の実施形態では、溶液は、約１〜約２００ｃｐの粘度を有する。ある特定の実施形態では、溶液は、約１〜約３００ｃｐの粘度を有する。ある特定の実施形態では、溶液は、約１〜約４００ｃｐの粘度を有する。ある特定の実施形態では、溶液は、注射可能な液体液剤の形態である。他の実施形態では、組成物は、粘性液体、すなわち数百〜数千ｃｐの粘度のゲル剤または軟膏剤として製剤化される。これらの実施形態では、バイオコンジュゲートは、適切な薬学的に許容される担体に分散または溶解される。
【０２２６】
カテーテルベースの送達のためにバイオコンジュゲートと共に使用するための例示的な組成物は、ａ）本明細書に記載される合成バイオコンジュゲート、ｂ）薬学的に許容される担体、ｃ）ポリマーマトリックス、ｄ）約ｐＨ４〜約ｐＨ８の範囲のｐＨを提供するためのｐＨ緩衝剤、およびｅ）全製剤重量の約０．２５％〜約１０％の濃度範囲の水溶性潤滑増強剤、または任意の個々の構成成分ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）もしくはｅ）、またはａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）もしくはｅ）の任意の組合せを含むことができる。
【０２２７】
例示的な製剤は、ａ）本明細書に記載されるバイオコンジュゲート、ｂ）薬学的に許容される担体、ｃ）ポリマーマトリックス、およびｄ）約ｐＨ４〜約ｐＨ８の範囲のｐＨを提供するためのｐＨ緩衝剤を含むことができ、前記溶液は、液体溶液に関して約３〜約３０ｃｐの粘度を有する。
【０２２８】
本開示によって企図される例示的な組成物は、注射による投与のためのものであってもよく、それには、ゴマ油、トウモロコシ油、綿実油もしくはピーナッツ油、ならびにエリキシル、マンニトール、デキストロース、または滅菌水溶液、および類似の薬学的ビヒクルを伴う水性もしくは油性懸濁液、またはエマルジョンが含まれる。食塩水の水溶液も、注射のために従来使用されているが、本開示の文脈ではあまり好ましくない。エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど（および適切なそれらの混合物）、シクロデキストリン誘導体、および植物油を用いることもできる。例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散剤の場合には必要な粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって、適切な流動性を維持することができる。微生物作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらすことができる。
【０２２９】
注入可能な滅菌液剤は、必要量の構成成分を、必要な場合、上に列挙される他の様々な成分と共に適切な溶媒に組み込み、その後滅菌濾過することによって調製される。一般に、分散液剤は、塩基性分散媒および上に列挙されるものから必要とされる他の成分を含有する無菌ビヒクルに、様々な滅菌活性成分を組み込むことによって調製される。注入可能な滅菌液剤の調製のための滅菌粉剤・散剤（powder）の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥技術であり、それらは、活性成分の粉末と任意の追加の所望の成分を、予め滅菌濾過したその溶液から生成する技術である。
【０２３０】
本明細書に記載されるバイオコンジュゲートを含む医薬組成物の作製では、活性成分は、通常、添加剤もしくは担体によって希釈される、および／またはカプセル、サシェ、紙もしくは他の容器の形態であり得るこのような担体に封入される。添加剤は、賦形剤として働く場合、固体、半固体、または液体の材料（上記の通り）であってよく、活性成分のためのビヒクル、担体または媒体として作用する。したがって、組成物は、例えば最大１０重量％の活性化合物を含有する、フィルム剤、ゲル剤、パッチ剤、粉剤・散剤、ロゼンジ剤、サシェ剤、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁剤、エマルジョン、液剤、シロップ剤、エアロゾル剤（固体としてまたは液体媒体中の）、軟膏剤の形態、軟質および硬質ゼラチンフィルム剤、ゲル剤、パッチ剤、注入可能な滅菌液剤、ならびに無菌パッケージ粉剤・散剤であり得る。
【０２３１】
適切な添加剤の一部の例として、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルギネート、トラガント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、滅菌水、シロップ、およびメチルセルロースが挙げられる。製剤は、滑沢剤、例えばタルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱油；湿潤剤；乳化剤および懸濁化剤；保存剤、例えばヒドロキシ安息香酸メチルおよびヒドロキシ安息香酸プロピル；甘味剤；ならびに香味剤をさらに含むことができる。
【０２３２】
薬物送達のために使用されるフィルムは、当技術分野で周知であり、浸出性不純物を含まない非毒性の非刺激性ポリマー、例えば多糖類（例えば、セルロース、マルトデキストリンなど）を含む。一部の実施形態では、ポリマーは、親水性である。他の実施形態では、ポリマーは、疎水性である。フィルムは、それが適用される組織に接着し、約１週間にわたって体内でゆっくり吸収される。本明細書に記載される薄フィルム剤形において使用されるポリマーは、吸収可能であり、当技術分野で周知の通り十分な剥離、せん断および引張強度を示す。一部の実施形態では、フィルムは、注射可能である。ある特定の実施形態では、フィルムは、外科的介入の前、間または後に患者に投与される。
【０２３３】
本明細書で使用されるゲルは、軟質で弱いものから硬質で丈夫なものまでの範囲の特性を有することができる、固体のゼリー様の材料を指す。当技術分野で周知の通り、ゲルは、流体によってその全体積中に拡張される、非流体のコロイド性網目構造またはポリマー網目構造である。ヒドロゲルは、水が分散媒であるコロイド性ゲルとして時として見出される、親水性のポリマー鎖の網目構造を含む種類のゲルである。ヒドロゲルは、高度に吸収性であり、例えば９０％を超える水などの高い度合いの水を含有することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載されるゲルは、天然または合成ポリマー網目構造を含む。一部の実施形態では、ゲルは、親水性ポリマーマトリックスを含む。他の実施形態では、ゲルは、疎水性ポリマーマトリックスを含む。一部の実施形態では、ゲルは、天然の組織に非常に類似している度合いの可撓性を有する。ある特定の実施形態では、ゲルは、生体適合性であり吸収可能である。ある特定の実施形態では、ゲルは、外科的介入の前、間または後に患者に投与される。
【０２３４】
本明細書で使用される液体液剤は、当技術分野で周知の液剤、懸濁剤、エマルジョン剤、点滴剤、軟膏剤、液体洗浄剤、スプレー剤、リポソーム剤を指す。一部の実施形態では、液体液剤は、少量の酸または塩基が添加されるとｐＨの変化に抵抗する水性ｐＨ緩衝剤を含有する。ある特定の実施形態では、液体液剤は、外科的介入の前、間または後に患者に投与される。
【０２３５】
例示的な製剤は、ａ）本明細書に記載される１つまたは複数のバイオコンジュゲート、ｂ）薬学的に許容される担体、およびｃ）マトリックス網目構造としての親水性ポリマーを含むことができ、前記組成物は、粘性液体、すなわち数百〜数千ｃｐの粘度のゲル剤または軟膏剤として製剤化される。これらの実施形態では、バイオコンジュゲートは、適切な薬学的に許容される担体に分散または溶解される。
【０２３６】
ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートまたはバイオコンジュゲートを含む組成物は、製剤化の前、間または後に凍結乾燥される。したがって本明細書では、本明細書に記載されるバイオコンジュゲートまたはバイオコンジュゲートを含む組成物を含む凍結乾燥組成物も提供される。
６．投薬
【０２３７】
バイオコンジュゲートの適切な投薬量は、標準の方法によって、例えば実験動物モデルでまたは臨床試験で用量応答曲線を確立することによって決定することができ、患者の状態、処置されている疾患状況、投与経路および組織分布、ならびに他の治療的処置の併用の可能性に応じて著しく変わり得る。患者に投与される有効量は、体表面積、患者の体重または質量、および医師による患者状態の評価に基づく。様々な例示的な実施形態では、用量は、約０．０１μｇ〜約１０ｇの範囲である。例えば、全身送達のために、用量は、約１０ｇ、または約５ｇ、または約１ｇであってよい。他の例示的な実施形態では、有効用量は、１用量当たり約１００μｇ〜約１０ｇ、または１用量当たり約１００μｇ〜約１ｇ、または１用量当たり約１００μｇ〜約５００ｍｇ、１用量当たり約０．０１μｇ〜約１００ｍｇ、または１用量当たり約１００μｇ〜約５０ｍｇ、または１用量当たり約５００μｇ〜約１０ｍｇ、または１用量当たり約１ｍｇ〜１０ｍｇ、または１用量当たり約１〜約１００ｍｇ、または１用量当たり約１ｍｇ〜５００ｍｇ、または１用量当たり約１ｍｇ〜２００ｍｇ、または１用量当たり約１０ｍｇ〜１００ｍｇ、または１用量当たり約１０ｍｇ〜７５ｍｇ、または１用量当たり約１０ｍｇ〜５０ｍｇ、または１用量当たり約１０ｍｇ、または１用量当たり約２０ｍｇ、または１用量当たり約３０ｍｇ、または１用量当たり約４０ｍｇ、または１用量当たり約５０ｍｇ、または１用量当たり約６０ｍｇ、または１用量当たり約７０ｍｇ、または１用量当たり約８０ｍｇ、または１用量当たり約９０ｍｇ、または１用量当たり約１００ｍｇの範囲である。本明細書に記載される様々な実施形態のいずれにおいても、有効用量は、１用量当たり約０．０１μｇ〜約１０００ｍｇ、１用量当たり１μｇ〜約１００ｍｇ、１用量当たり約１００μｇ〜約１．０ｍｇ、約５０μｇ〜約６００μｇ、約５０μｇ〜約７００μｇ、約１００μｇ〜約２００μｇ、約１００μｇ〜約６００μｇ、約１００μｇ〜約５００μｇ、約２００μｇ〜約６００μｇ、または約１００μｇ〜約５０ｍｇ、または１用量当たり約５００μｇ〜約１０ｍｇまたは１用量当たり約１ｍｇ〜約１０ｍｇの範囲である。
【０２３８】
一部の実施形態では、組成物は、複数回用量の形態でパッケージされる。したがって、使用中の微生物汚染を防止するために、防腐剤が必要とされる。ある特定の実施形態では、上記の通り、適切な防腐剤を組成物に添加することができる。一部の実施形態では、組成物は、防腐剤を含有する。ある特定の実施形態では、防腐剤は、約０．００１ｗ／ｖ％〜約１．０ｗ／ｖ％のレベルで用いられる。一部の実施形態では、単位用量組成物は無菌であるが、防腐剤不使用である。
【実施例】
【０２３９】
（実施例１）
硫酸化ヒアルロン酸（ｓＨＡ）の調製および特徴付け
ヒアルロン酸（ＨＡ）のナトリウム塩は有機溶媒に溶けないので、ＨＡのテトラブチルアンモニウム塩を、硫酸化する前に調製することが必要である。ＨＡ（ナトリウム塩）３．７４ｇ（９．３１ｍｍｏｌ）を、蒸留水４００ｍＬに溶解させた。Ｄｏｗｅｘ−５０ＷＸ８ビーズ（７５．７４ｇ）を、蒸留水１．４Ｌで３回洗浄した。次に、酸性ＤｏｗｅｘビーズをＨＡ溶液に添加し、室温で３０分間撹拌した。溶液を濾過して樹脂を除去し、ｐＨ＝６．５になるまで、テトラブチルアンモニウム水酸化物（Ｈ２Ｏ中１Ｍ）で処理した。テトラブチルアンモニウムＨＡ塩（ＨＡ−ＴＢＡ）を凍結乾燥させ、白色固体として得た（５．７６ｇ、収率９９％）。
【０２４０】
硫酸化ＨＡの調製：１窒素下、乾燥三つ口フラスコ中、ＨＡ−ＴＢＡ（５．７６２２ｇ、９．２８ｍｍｏｌ、３２３ｋＤａのＨＡ）を無水ＤＭＦ（１０５０ｍＬ）に溶解させ、一晩静置して溶解させた。窒素下、別の乾燥三つ口フラスコ中、ＳＯ３−ピリジン複合体（３８．８９０ｇ、２４４．３ｍｍｏｌ、１：２６．３比のＨＡ−ＴＢＡ：ＳＯ３）を、無水ＤＭＦ（４３２ｍＬ）に溶解させ、ＨＡ−ＴＢＡ溶液に添加した。反応物を、室温で２０分間撹拌した。２０分後、冷水（５００ｍＬ）を急速に添加し、反応混合物をビーカーに移した。酢酸ナトリウムで飽和させた冷エタノール（２Ｌ）の添加後、沈殿物が観察された。濾過した後、沈殿物を水（１Ｌ）に溶解させた後、０．５ＭのＮａＣｌ  ５ＣＶを用いたＴＦＦによって、次いで水８ＣＶで精製した。次に、生成物を３日間凍結乾燥させ、ベージュ色の固体を回収した（３．２１ｇ、収率５８％）。
【０２４１】
ｓＨＡの特徴付け：硫酸化度を、窒素および硫黄含量の元素分析によって得た。それが得られたら、以下の算出を行って、硫酸化度（ＤＳ）を決定した。
【数１】
2020526493.tif 000006
【０２４２】
また試料を、Ｄ２Ｏ中１Ｈ  ＮＭＲ分析によって分析して、特有のピークを有するテトラブチルアンモニウムおよび／またはピリジニウム複合体から、任意の微量不純物を決定した。
【０２４３】
硫酸化度は、ＨＡ：ＳＯ３−ピリジンのモル比、ならびに使用した初期ＨＡの分子量に基づいて算出し、二糖単位１個当たりのサルフェートの数として提示する。以下の表は、これらの差異を示す。
【表８】
2020526493.tif 000007
１Biomacromolecules,  2009,  10,  3290-3297
（実施例２）
化合物の合成
【０２４４】
反応緩衝液の調製：８．０Ｍ尿素、０．６％ＮａＣｌを含む０．０６４ＭのＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）、ｐＨ５．５を反応前６時間以内に調製した。８Ｍ尿素には、以下の通り溶質の体積変化の算出が必要であることに留意されたい。反応緩衝液は、以下の等式によって処方する。
・Ｖ０．１Ｍ  ＭＥＳ、０．９％ＮａＣｌ（ｍＬ）＝Ｖ最終（ｍＬ）×０．６４
・尿素（ｇ）＝Ｖ０．１Ｍ  ＭＥＳ、０．９％ＮａＣｌ（ｍＬ）×０．７４４３
・式中、Ｖ最終＝尿素を添加した後の目的の最終体積
【０２４５】
次に、反応緩衝液を、０．２μｍフィルターを通して濾過する。必要とされる場合には１ＭのＨＣｌまたは０．５ＭのＮａＯＨを用いて調整して、ｐＨがｐＨ４．７５以内であることを検証する。
【０２４６】
ＴＦＦ緩衝液の調製：８．０Ｍ尿素、０．６％ＮａＣｌを含むＴＦＦ緩衝液１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０〜７．８を精製前１２時間以内に調製した。８Ｍ尿素には、以下の通り溶質の体積変化の算出が必要であることに留意されたい。反応緩衝液は、以下の等式によって処方する。
・Ｖ１５．６ｍＭリン酸ナトリウム（ｍＬ）＝Ｖ最終（ｍＬ）×０．６４
・Ｖ１００ｍＭ二塩基性リン酸ナトリウム（ｍＬ）＝Ｖ最終（ｍＬ）×０．０６
・Ｖ１００ｍＭ一塩基性リン酸ナトリウム（ｍＬ）＝Ｖ最終（ｍＬ）×０．０４
・Ｖ水（ｍＬ）＝Ｖ１５．６ｍＭリン酸ナトリウム（ｍＬ）−（Ｖ１００ｍＭ二塩基性リン酸ナトリウム（ｍＬ）＋Ｖ１００ｍＭ一塩基性リン酸ナトリウム（ｍＬ））
・尿素（ｇ）＝Ｖ１５．６ｍＭリン酸ナトリウム（ｍＬ）×０．７４４３
【０２４７】
式中、Ｖ最終＝尿素を添加した後の目的の最終体積。次に、反応緩衝液を、０．２μｍフィルターを通して濾過する。必要とされる場合には１ＭのＨＣｌまたは０．５ＭのＮａＯＨを用いて調整して、ｐＨがｐＨ７〜７．８以内であることを検証する。
【０２４８】
反応の算出：反応モル比は、以下の通りである。ＧＡＧ二糖当たり２モルのＥＤＣ、ＧＡＧ二糖当たり０．１２モルのペプチド、ならびに２０ｋＤａのＧＡＧ当たり１モルのビオチンおよび／または蛍光タグＣＦ６３３。反応比は、ＧＡＧ：ペプチド：ＥＤＣとして表す。例えば３００ｋＤＡの硫酸化度２．５のｓＨＡの反応では、反応モル比は１：５５：９１６になり得る。
【０２４９】
反応：コンジュゲートの合成は、ＥＤＣ化学を介して、ＧＡＧ主鎖上のカルボン酸基の活性化（ＧＡＧ活性化）によってＧＡＧ主鎖上にヒドラジド機能化ペプチドをグラフティングして、活性化されたカルボン酸基を、ペプチドのＮ末端におけるヒドラジド端部と反応させることを含む。
【０２５０】
ｓＨＡ２０ｍｇ／ｍｌ、ヒドラジド機能化ペプチド３ｍｇ／ｍｌ、検出タグ（ビオチンおよび／またはＣＦ６３３）それぞれ３ｍｇ／ｍｌ、およびＥＤＣ７５ｍｇ／ｍｌを、反応緩衝液に溶解させる。ＧＡＧは、反応の４時間前に溶解させることができる。ペプチドを、ＧＡＧおよびタグと混合した後、可溶化ＥＤＣを添加する。
【０２５１】
ＥＤＣは、可溶化ＧＡＧ、ペプチドおよびタグを含有する反応混合物に添加する直前に溶解させなければならない。反応を２５℃で２時間進行させると同時に、反応混合物を撹拌または振とうする。次に、反応を、０．５ＭのＮａＯＨを使用してｐＨを８に上昇させることによってクエンチし、３０分間振とう／撹拌する。
【０２５２】
ＴＦＦ精製：ＴＦＦ精製は、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｌａｂｓから購入したＳｐｅｃｔｒｕｍ  ＫＲ２ｉ  ＴＦＦ系を使用して行った。Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｌａｂｓから購入した、３０ｋＤ分子量カットオフの修飾ポリエーテルスルホン（ｍＰＥＳ）フィルターカートリッジを使用した。フィルター表面積は、バッチサイズに応じて変わる。ＴＦＦ緩衝液をＴＦＦ系で１０分間循環させて、系を平衡化し、次にＴＦＦラインを新しい緩衝液で置き換える。次に、合成反応容器をＴＦＦ系に接続し、ＴＦＦを、１００ｍＬ／分および１８ｐｓｉに調整したＴＭＰを使用して実施する。反応物を、６精製体積（ＣＶ）のＴＦＦ緩衝液で、次いで１６ＣＶの水でダイアフィルトレーションする（ＣＶは、反応体積に、ＴＦＦホールドアップ体積を加えたものに等しい）。
【０２５３】
以下のバイオコンジュゲートを、上で概説した手順によって、表（表２）に示される様々な分子量の硫酸化ＨＡ主鎖およびヒドラジド機能化ペプチドを使用して調製した。
【表２−１】
2020526493.tif 000008
【表２−２】
2020526493.tif 000009
【０２５４】
化合物１および化合物１Ｂを、グリカン１個当たり約３０個のペプチドの比でペプチドを反応させることによって合成した。この比を使用すると、グリカンにコンジュゲートするペプチドの平均数は、約８または約８〜１２％の修飾に相当する、グリカン１個当たりペプチド約２０〜２５個であることが企図される。表２に示される様々な分子量のｓＨＡコンジュゲートについて、ペプチドコンジュゲーション度を、ペプチドの主鎖長に対する比が一定になるように線形スケーリングした。具体的には、化合物２および化合物２Ｂについてグリカンにコンジュゲートするペプチドの平均数は、グリカン１個当たりペプチド約７０〜８０個であり、化合物３についてグリカンにコンジュゲートするペプチドの平均数は、グリカン１個当たりペプチド約６個であることが企図され、これらはすべて約８または約８〜１２％の修飾に相当する。
（実施例３）
肝星細胞（ＨＳＣ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ
【０２５５】
細胞増殖アッセイ。単一のドナーヒト肝臓から単離した正常なヒト肝臓初代肝星細胞（ＨＳＣ）を、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入した。初期継代ＨＳＣ（Ｐ２）を、０．５％ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％星状細胞成長サプリメント（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、および１００Ｕ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充した星状細胞培地（ＳｔｅＣＭ；ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中、線維性コラーゲンでコーティングしたプレートにおいて、６０００個の細胞／ウェルの播種密度で成長させた。初代ＨＳＣを、１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−β１（Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）で一晩処理することによって、培養中において活性化させた。次に細胞を、１０００〜０．０００１μｇ／ｍＬの濃度範囲のビオチン標識化合物１Ｂまたは２Ｂを含有する低血清培地に、３０時間曝露した。ＨＳＣの増殖に対する各処理の効果を、ＣｙＱＵＡＮＴ  Ｄｉｒｅｃｔ細胞増殖アッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、製造者の指示に従って評価した。
【０２５６】
アルファ平滑筋アクチンについてのＨＳＣ活性化および免疫染色に対する効果。初期継代ＨＳＣ（Ｐ２）を、以前に記載した通り、線維性コラーゲンでコーティングしたプレートにおいて、６０００個の細胞／ウェルの播種密度で成長させ、１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−β１で一晩処理することによって、培養中において活性化させた。次に細胞を、６０００〜０．０００１μｇ／ｍＬの濃度範囲の化合物１Ｂまたは化合物２Ｂを含有する低血清培地に、３０時間曝露した。３０時間の処理の後、細胞を４％ホルムアルデヒドで１０分間固定し、ＰＢＳで洗浄し、次に０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で７分間透過処理した。次に、細胞を１％ＢＳＡ、１０％正常ヤギ血清、０．１％ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中０．３Ｍグリシンで一晩ブロックした。アルファ平滑筋アクチンを染色するために、すべての試料を、２００倍希釈した抗アルファ平滑筋アクチン抗体（Ａｂｃａｍ）と共に４℃で一晩インキュベートした。次に、試料をＰＢＳで４回、それぞれ５分間洗浄した。この後、試料を、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３二次抗体を使用して２時間対比染色し、次に、ＰＢＳで４回、それぞれ５分間洗浄した。次に細胞を、ＥＶＯＳ蛍光顕微鏡（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して画像化した。
【０２５７】
血小板フローアッセイ。Ｉｂｉｄｉ  μ−Ｓｌｉｄｅ  ＶＩ０．１（Ｉｂｉｄｉ）チャネルを、１００μｇ／ｍＬの線維性Ｉ型コラーゲン（Ｃｈｒｏｎｏ−Ｌｏｇ  Ｃｏｒｐ）で１時間コーティングした。次に、チャネルをＰＢＳですすいだ。アッセイのために使用するヒト血液を、承認されたＩＲＢプロトコールに従って同意したドナーからクエン酸ナトリウムバキュテナーに収集した。新しく収集した血液を、４００倍希釈したＣａｌｃｅｉｎ  ＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で３０分間染色した。化合物１Ｂまたは化合物２Ｂを、予め染色した血液に１００μｇ／ｍＬで添加し、血液を、１０００−１ｓのせん断速度（sheer  rate）で１０分間、各チャネルに流した。流した後、チャネルから目に見えるすべての微量の血液をすすぎ落し、ＥＶＯＳ蛍光顕微鏡（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して画像化した。
結果
【０２５８】
細胞増殖アッセイ。化合物１Ｂおよび化合物２Ｂについて、１ｍｇ／ｍＬの試験最高濃度で、ＨＳＣ増殖はおよそ６０％阻害される。両方のコンジュゲートによって、増殖が用量依存的に阻害される。
【０２５９】
アルファ平滑筋アクチンについてのＨＳＣ活性化および免疫染色に対する効果。慢性肝疾患では、ＴＧＦ−β１は、筋線維芽細胞表現型へのＨＳＣの活性化のための主要な刺激物である。活性化ＨＳＣは、対照群についての画像において示される通り、アルファ平滑筋アクチンの発現によって同定され得る。６ｍｇ／ｍＬの試験最高濃度での、活性化ＨＳＣの化合物１Ｂおよび化合物２Ｂでの処理により、アルファ平滑筋アクチン染色が低減した（図７）。
【０２６０】
血小板フローアッセイ。蛍光画像は、全血流下での１００μｇ／ｍＬの化合物１Ｂおよび化合物２Ｂによる血小板結合および阻害を示す。処理しなかったチャネル１（非阻害対照）は、結合血小板でほぼ完全にカバーされたが、コンジュゲートで処理したチャネルでは、結合した血小板の数が有意に減少した（図６）。
【０２６１】
本明細書に記載されるバイオコンジュゲート（boconjugate）は、驚くべきことに、肝星細胞に対して抗線維効果および抗増殖効果を示したが、このことは、サルフェートおよびペプチドを用いる化学修飾が、生物学的効果を有意に低減しないことを示す。
（実施例４）
四塩化炭素モデル
【０２６２】
本明細書に記載の化合物が肝線維症に影響を及ぼす能力を、毒性傷害としての四塩化炭素（ＣＣｌ４）を使用するマウスモデルにおいて試験した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、鉱油中５％ＣＣｌ４  １００μＬを週２回、合計４週間、腹腔内投与をした。その４週間の間、動物に、食塩水（ビヒクル）または試験物品（化合物１）のいずれかを週３回静脈内投与した。ある群の動物には、バルサルタンの毎日経口投与をした。最後に、いずれの試験物品もＣＣＬ４も受けなかった健康な動物の群は、正常な対照群として働いた。
【０２６３】
４週間の最後に、動物を屠殺し、肝臓を生化学的および組織学的分析のために収集した。ヒドロキシプロリンレベルを、図１に示す。ＣＣｌ４投与は、正常な健康な動物と比較して、ヒドロキシプロリンレベルを増加させた。２０ｍｇ／ｋｇの化合物１を用いる処置では、ヒドロキシプロリンレベルが統計的に有意な度合いに低下した（ｐ＜０．０５）。コラーゲン含量についての肝臓の組織学的分析を、シリウスレッド染色を使用して実施した。図２は、肝臓片の代表的画像を示しており、ビヒクルで処置した群のコラーゲン染色が、正常な健康な動物と比較して増加しており、化合物を用いる処置によってコラーゲン染色が低減していた。染色を定量し、図３に提示した。ＣＣｌ４は、シリウスレッドによって組織学的に測定される通り、肝臓におけるコラーゲンレベルを増加させた。化合物１を用いる処置では、ビヒクル対照と比較してコラーゲン染色が有意に低減した。
（実施例５）
非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）モデル
【０２６４】
肝線維症に影響を及ぼす本明細書に記載の化合物の能力を、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）のマウスモデルで試験した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、出生後にストレプトゾトシン２００μｇの単回皮下注射をした。４週齢に始めて、動物に高脂肪食を与えた。動物に、５週目から初めて９週目までの４週間継続的に、食塩水または化合物１を用いて３回／週で静脈内処置をした。別個の群の動物には、同じ期間中、テルミサルタンの毎日経口投与をした。９週齢目に動物を屠殺し、組織学的および生化学的分析のために肝臓を収集した。
【０２６５】
コラーゲン含量に関する肝臓の組織学的分析を、シリウスレッド染色を使用して実施した。染色を定量し、図４に提示した。テルミサルタンまたは化合物１を用いる処置では、ビヒクルで処置した群と比較して、肝臓におけるコラーゲンレベルが低下した。
【０２６６】
肝臓トリグリセリドを、図５に示す。テルミサルタンおよび化合物１を用いる処置では、研究中の肝臓トリグリセリドが低減した。
ｉｎ  ｖｉｖｏ画像化系による分布
【０２６７】
分子を、蛍光標識して合成した。具体的には、ＣＦ６３３を、１：１の色素対主鎖の合成モル比で、ヒドラジドを介して主鎖に連結した。分子を、１０ｍｇ／ｋｇでヌードマウスに静脈内投与し、ｉｎ  ｖｉｖｏ画像化系（ＩＶＩＳ）を使用して画像化した。異なる時点において、動物を麻酔し、ＩＶＩＳを使用して画像化して、標識化合物の体内分布を決定した。図８は、注射の５および６０分後の化合物の局在を示す。腎臓、膀胱、または肝臓へのいずれかの局在は、化合物の分子量に依存して実証される。
【０２６８】
化合物の分布の差異は、ｓＨＡ主鎖の分子量に関係していた。低分子量のｓＨＡ（２８ｋＤａ）主鎖（化合物３）は、腎臓、膀胱、ならびに肝臓において観測された。それとは対照的に、より高分子量のｓＨＡ（３２３ｋＤａ）主鎖（化合物２）は、肝臓内だけに局在していることが見出され、膀胱でも腎臓でもいかなるシグナルも示さなかった。１６３ｋＤａのｓＨＡ主鎖（化合物１）は、主に肝臓内に局在することが見出されたが、膀胱内でもわずかなシグナルを示した。これらの結果は、ＩＶで投与した場合、ｓＨＡ主鎖の分子量と分子の分布との間に驚くべき相関があり、したがって、およそ１５０ｋＤａの分子量のｓＨＡは主に腎臓から排除され、その代わりに主に肝臓内に局在することを実証している。肝臓内のｓＨＡ−ペプチドコンジュゲートの局在は、親ＨＡ主鎖上の硫酸化およびペプチドコンジュゲーションを用いる化学修飾の未知の性質を考慮すると、予期せぬ知見でもあった。肝臓内に局在し、他の組織または器官では分布が相対的に少ないことは、肝臓疾患を標的にして全身作用を抑えられることが期待される、めったにない機会を提供する。
（実施例６）
ＶＥＧＦ成長因子結合
【０２６９】
ＶＥＧＦ１８９（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、８１４７−ＶＥ）を、１×ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌ溶液７５μｌを各ウェルに添加し、４℃で一晩インキュベートすることによって、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、９０１８）上にコーティングした。プレートを、ＰＢＳＴ（０．０２％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含む１×ＰＢＳ）３００μＬを使用して３回洗浄した。次に、プレートをＰＢＳ中１％ＢＳＡで室温において１時間ブロッキングした。次に、ビオチン化分子を、ＰＢＳＴ中１％ＢＳＡに１００μｇ／ｍＬで溶解させ、最終濃度０．１ｎｇ／ｍＬに達するまで、１：１０の連続希釈を実施した。次に、試料５０μＬを、プレートにおいて３７℃、１時間インキュベートした。次に、プレートを、ＰＢＳＴ中１％ＢＳＡで３回洗浄し、１％ＢＳＡ  ＰＢＳＴ中１：５００のストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｎ５０４）１００μＬと共に室温で２０分間インキュベートした。次に、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（Ａｂｃａｍ  ａｂ１７１５２７）１００μｌを用いて、光から保護して室温で１０分間発色させた。反応を、０．１６Ｍ硫酸１００μＬを添加することによって停止させた。４５０ｎｍにおける吸光度を、１０分以内にプレートリーダーで読み取った。
【０２７０】
二糖１個当たり２．５個のサルフェート基で硫酸化したＨＡ（ｓ２．５ＨＡ、１６３ｋＤａ）を、ＶＥＧＦ１８９への結合について試験し、およそ１ｎＭのＥＣ５０を観測した（図９）。同じ硫酸化ＨＡ主鎖をペプチドとコンジュゲートした場合（化合物１）、類似のＥＣ５０値が観測された。しかし、硫酸化しなかった類似のＭＷのＨＡは、ＶＥＧＦ１８９に結合しなかった。ＦＧＦ２結合を試験するアッセイについても、同じ傾向が観測された。これらのデータは、ＨＡの硫酸化によって成長因子への結合が増強され、驚くべきことに、ペプチドとの硫酸化ＨＡのコンジュゲーション（the  conjugation  if  sulfated  HA  with  peptides）は、この結合を低減しないことを実証している。
（実施例７）
ＰＤＧＦ成長因子結合
【０２７１】
以下のアッセイ（成長因子結合および受容体会合（engagement））によって、様々な硫酸化ＨＡ主鎖が組換えＰＤＧＦ−ＢＢに結合し、その受容体会合を妨害するそれらの能力について評価する。ＰＤＧＦ−ＢＢは、細胞表面上でその受容体であるＰＤＧＦ−Ｒβと相互作用することによって細胞シグナル伝達を誘発する、線維症に見出される非常に重要な炎症性メディエーターである。
【０２７２】
ＰＤＧＦ−ＢＢの主な役割は、ＨＳＣの遊走および増殖を促進することである。また、マウスおよびヒトの両方における活性化ＨＳＣ（筋線維芽細胞）は、高度に上方制御されたＰＤＧＦ−Ｒβの発現を有することが示されている。活性化ＨＳＣはまた、ＰＤＧＦ−ＢＢを生成して、自己分泌線維化促進ループをもたらす。最後に、ＰＤＧＦ−ＢＢ／ＰＤＧＦ−Ｒβシグナル伝達は、ＴＧＦ−βの線維化促進シグナル伝達を相乗的に制御する。ＰＤＧＦおよびＴＧＦ−βは、共に肝線維症を媒介する重要な成長因子を構成する。
【０２７３】
本明細書で提供されるデータは、化合物１が、卓越した成長因子イソ型（ＰＤＧＦ−ＢＢ）および受容体（ＰＤＧＦ−Ｒβ）会合を阻害することを実証している。さらに化合物１は、他のイソ型ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＣＣ、およびＰＤＧＦ−ＤＤへも結合する。このデータに基づくと、化合物１は、あらゆるＰＤＧＦ異性体による受容体会合を、それらに結合し隔離することによって阻害することが企図される。
成長因子結合アッセイ法
【０２７４】
化合物１がＰＤＧＦのすべての異性体にｉｎ  ｖｉｔｒｏで結合する能力を決定するために、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓからの組換えＰＤＧＦ（ＡＡ、ＢＢ、ＣＣ、およびＤＤ）を使用してＥＬＩＳＡを開発した。簡潔には、ＰＤＧＦの４つのすべての異性体を、製造者のプロトコールに従って復元し、Ｃｏｓｔａｒ高結合プレートにおいて１μｇ／ｍＬのコーティング濃度で個々に吸着させた。４℃で一晩のインキュベーション後、任意の非結合ＰＤＧＦを、１×ＰＢＳ  Ｔｗｅｅｎ（０．０２％）洗浄バッファーですすぐことによって除去した。次に、プレートを１×ＰＢＳ中１％ＢＳＡで２５℃において１時間ブロッキングした。化合物１Ｂ（ペプチド負荷およびビオチンを伴う機能化ｓＨＡ）、ゼロのペプチド修飾のグリカン主鎖（ｓＨＡ−０ＰＭ）、またはペプチド単独（検出のためにビオチンですべて標識した）を、１％ＢＳＡ  １×ＰＢＳ  Ｔｗｅｅｎ（０．０２％）で１００μｇ／ｍＬから０．０００１μｇ／ｍＬに連続希釈した。次に、分子希釈物を、ＰＤＧＦでコーティングしたウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。この後、任意の非結合分子を、プレートを１％ＢＳＡ  １×ＰＢＳ  Ｔｗｅｅｎ（０．０２％）で３回すすぐことによって除去した。次に、ビオチン標識を伴う結合分子を、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートしたストレプトアビジンを用いてプローブした。洗浄後、プレートを、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を使用して発色し、酸溶液を用いて反応を停止させた。プレートウェル吸光度を、Ｂｉｏｔｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｈ４マルチモードプレートリーダーを使用して４５０ｎｍで測定した。
【０２７５】
このｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、化合物１Ｂは、ＰＤＧＦのすべてのイソ型に様々な度合いで結合することが観測された（図１０〜１３を参照されたい）。
【０２７６】
驚くべきことに、試験した化合物は、表３に列挙されるＥＣ５０によって示される通り、ある特定のイソ型への選択性を示したことが見出された。要約すると、化合物１Ｂは、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＤＤ、およびＰＤＧＦ−ＣＣのそれぞれよりも良好に、ＰＤＧＦ−ＡＡに結合する。ｓＨＡ−０ＰＭは、ＰＤＧＦ−ＢＢおよびＰＤＧＦ−ＤＤよりも良好にＰＤＧＦ−ＡＡに結合することも観測された。このアッセイでは、ＰＤＧＦ−ＣＣ結合は検出されなかった。この研究に基づくと、非硫酸化ＨＡおよびペプチド単独は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでいかなるＰＤＧＦイソ型にも結合しない。さらに、ｓＨＡへのペプチドのコンジュゲーションは、機能化ｓＨＡ−０ＰＭと比較した場合、ＰＤＧＦ−ＣＣおよびＰＤＧＦ−ＤＤへの結合を改善する。
【０２７７】
【表３】
2020526493.tif 000010
成長因子受容体会合
【０２７８】
異なる度合いの硫酸化および／またはペプチド負荷を有する化合物１または機能化グリカン主鎖（本明細書でコンジュゲートと呼ばれる）を、ＰＤＧＦ−ＲβへのＰＤＧＦ−ＢＢの結合の阻害を測定するように設計された競合的ＥＬＩＳＡアッセイで試験した。組換えヒトＰＤＧＦ−Ｒβ  Ｆｃキメラタンパク質およびビオチン標識ＰＤＧＦ−ＢＢ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、製造者のプロトコールに従って復元した。ＰＤＧＦ−Ｒβ  Ｆｃキメラタンパク質を、Ｃｏｓｔａｒ高結合プレートにおいてコーティング濃度１ｎＭで４℃、一晩吸着させた。プレートを１×ＰＢＳ中１％ＢＳＡを使用して２５℃で１時間ブロッキングした後、非結合ＰＤＧＦ−Ｒβ  Ｆｃを、１×ＰＢＳ  Ｔｗｅｅｎ（０．０２％）洗浄バッファーですすぐことによって除去した。化合物１およびコンジュゲートを、１％ＢＳＡ  １×ＰＢＳ  Ｔｗｅｅｎ（０．０２％）中２倍濃度で調製した（結果１および２については、４０００μｇ／ｍＬ〜０．００２μｇ／ｍＬの範囲の連続希釈、以下の結果３については、２ｍｇ／ｍＬの単一濃度（アッセイした有効ウェル濃度＝１ｍｇ／ｍＬ））。ＰＤＧＦ−ＢＢ原液も、２倍濃度の２０ｎｇ／ｍＬで調製した。コンジュゲートおよびＰＤＧＦ−ＢＢを、同体積のそれぞれを室温で３０分間インキュベートすることによって、１：１で一緒に混合した。次に、プレインキュベートした溶液を、ＰＤＧＦ−Ｒβ  Ｆｃでコーティングされたプレートに添加し、３７℃で１時間結合させた。次に、プレートを１％ＢＳＡ  １×ＰＢＳ  Ｔｗｅｅｎ（０．０２％）で３回すすいだ。結合したビオチン標識ＰＤＧＦ−ＢＢを、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートしたストレプトアビジンを使用して検出した。洗浄後、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質をウェルに添加して、発色させた。反応を、酸溶液を用いて停止させ、吸光度を、Ｂｉｏｔｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｈ４マルチモードプレートリーダーを使用して４５０ｎｍで測定した。阻害度が高いほど、プレート上の受容体に結合するＰＤＧＦ−ＢＢは少ないはずであり、したがってシグナルの読み取り値は、より低いはずである。コンジュゲートの吸光度の参照に対する比を、結果３に記録した。
【０２７９】
化合物１（３０個のペプチド負荷による機能化ｓＨＡは、およそ８％、または８〜１２％ペプチド機能化を結果として生じる）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＰＤＧＦ−ＢＢ（リガンド）がその受容体であるＰＤＧＦ−Ｒβに結合するのを阻害する（図１４）。グリカンにコンジュゲートしたペプチドの平均数は、「ペプチド負荷」で示されるよりも少ないことが企図される。例えば、３０ＰＭコンジュゲートにおけるグリカンにコンジュゲートしたペプチドの平均数は、グリカン１個当たりペプチド約２０〜２５個であり、約８〜１２％の修飾に相当し得ると考えられる。驚くべきことに、ｓＨＡ（機能化または非機能化）は、これを阻害しない。以前に図１１において、機能化ｓＨＡ−０ＰＭが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＰＤＧＦ−ＢＢに結合することが示された。しかし図１４のデータに基づくと、ＰＤＧＦ−ＢＢへのｓＨＡ−０ＰＭの結合は、その受容体の相互作用を妨害しないようである。
【０２８０】
機能化ｓＨＡに対するペプチド負荷を増加させると、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＰＤＧＦ−ＢＢのその受容体への結合を阻害するその能力が増加することも示されている（図１５）。
【０２８１】
これらの結果は、機能化ＨＡの硫酸化度が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいてＰＤＧＦ−ＢＢの受容体会合を妨害するその能力に影響を及ぼすことを示している。一般に、同じペプチド負荷では、硫酸化度を増加させると、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＰＤＧＦ−ＢＢのその受容体への結合の阻害が増加する。以下の表に列挙される通り、２．３〜２．４の硫酸化度を有する化合物による阻害は、１．４または０の硫酸化度を有する化合物による阻害を上回った。
【０２８２】
ペプチド負荷を増加させると、ＰＤＧＦ−ＢＢのその受容体への結合の阻害は改善され、上の知見がさらに裏付けられることも見出された。
【０２８３】
表４は、吸光度４５０コンジュゲート／吸光度４５０参照の比を示す。太字の記入は、反応における類似量の参照化合物１と比較した場合、類似のまたはそれよりも良好な、ＰＤＧＦ−ＢＢの受容体への結合を示す。網掛けのセルは、より高い阻害またはＰＤＧＦ−ＢＢの受容体への結合の低減を示す。
【表４】
2020526493.tif 000011
（実施例８）
チオアセトアミド（ＴＡＡ）モデル
【０２８４】
重症肝線維症を、ラットにおいて１００〜１５０ｍｇ／ｋｇの間の濃度で週３回、合計８週間ＩＰ投与した毒素チオアセトアミドによって誘導した。５週目から、３つの異なる用量の化合物１またはｓＨＡ−０ＰＭ（ペプチドなし）のいずれかの試験物品の投与を開始し、週１回ＩＶ送達した。８週間の最後に、動物を屠殺した。血漿を収集し、肝臓バイオマーカーについて測定した。肝臓を、ヒドロキシプロリンによって測定される全コラーゲンの生化学的分析のために分離、またはシリウスレッド染色によって線維症を評価するための組織学的検査のために処理した。
【０２８５】
線維症を、０が線維症なしを示し、６が重症線維症を示す０〜６の尺度を使用して、組織学的にスコア化した。ビヒクル対照で処置した動物の７０％が、モデルの重症度を示す最高レベルの線維症にランク付けされた。化合物を用いる処置によって、ビヒクルで処置した動物と比較して高スコアの線維症の発生が低減した（図１６）。線維症のこの低減は、逆用量応答へと向かう全体的な傾向を伴って、試験したすべての用量の化合物１で生じた。ｓＨＡ−０ＰＭの投与によって、線維症スコアが一部低減したが、化合物１ほどではなかった。さらに、アスピリンを血小板阻害のための陽性対照として使用し、その使用によって線維症スコアが低減した。
【０２８６】
アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の血清レベルも、研究中に測定した。ＡＬＰは、典型的に、胆汁うっ滞性または代謝的肝損傷の尺度として使用される。試験物品を２週間投与した後、ＡＬＰは、３０ｍｇ／ｋｇの化合物１による処置によって有意に低減したが（図１７）、より低用量の化合物１では、ＡＬＰに対して有意な効果はなかった。ｓＨＡ−０ＰＭは、実際、ＡＬＰを有意に低減した。ＡＬＰに対するこの効果は、処置期間の途中で生じたが、この重症モデルでは研究を通して持続していなかった。ＡＬＰレベルの低下は、モデルにおいて期待された結果ではなかった。さらに、研究の途中のＡＬＰレベルの用量依存的効果は、予想外なことに、研究エンドポイントにおいて線維症スコアに見出される逆用量応答とは対照的である。
【０２８７】
追加の線維症データは、コラーゲン染色の組織学的定量を介して、または肝臓のコラーゲンの生化学的分析においてのいずれかで、線維症の量を定量することを含み得る。化合物１は、コラーゲンのこれらの尺度を低減すると期待される。さらに化合物１は、他のより軽度の線維症モデル（四塩化炭素モデル）における化合物１による処置で見られた通り、コラーゲンのｍＲＮＡレベル、ならびにプロコラーゲンＩＩＩの血清レベルを低減することもできる。さらに化合物１は、ＰＤＧＦＲｂ、アルファ平滑筋アクチン、または線維症と関連することが公知の任意の他のマーカーなどの線維症の他のバイオマーカーを低減することができる。
（実施例９）
硫酸化研究
コラーゲンＩ結合アッセイ
【０２８８】
ラット尾モノマーコラーゲンＩ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を、０．２Ｎ氷酢酸を使用して５０μｇ／ｍＬの作業濃度に希釈した。Ｃｏｓｔａｒ高結合プレートを、希釈したラット尾コラーゲンＩで４℃において一晩コーティングした。プレートを１×ＰＢＳＴ（０．０５％）中１％ＢＳＡを使用して２５℃で１時間ブロッキングした後、非結合コラーゲンを、１×ＰＢＳ  Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）洗浄バッファーですすぐことによって除去した。化合物１および様々な度合いの硫酸化およびペプチド負荷のバイオコンジュゲートの連続希釈物（表５）を、１％ＢＳＡ  １×ＰＢＳＴ（０．０５％）中４０００μｇ／ｍＬ〜０．０６４μｇ／ｍＬの範囲の２倍濃度で調製した。ビオチンでタグ付けした化合物１Ｂ原液も、８μｇ／ｍＬの２倍濃度で調製した。試験バイオコンジュゲートおよび化合物１Ｂを、１：１の体積比で合わせ、室温で５分間インキュベートした。次に、プレインキュベートした溶液を、コラーゲンでコーティングしたプレートに添加し、２５℃で１５分間結合させた。プレートを、１×ＰＢＳＴ（０．０５％）で３回すすぎ、１×ＰＢＳＴ（０．０５％）中５％ＢＳＡで２５℃において１時間ブロッキングした。化合物１Ｂを、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートしたストレプトアビジンを使用して検出した。洗浄後、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質をウェルに添加して、発色させた。反応を、酸溶液を用いて停止させ、吸光度を、Ｂｉｏｔｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｈ４マルチモードプレートリーダーを使用して４５０ｎｍで測定した。
【表５】
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【０２８９】
上の表５は、競合的コラーゲンＩ結合アッセイからのＩＣ５０試料／ＩＣ５０化合物１の比を示す。比≦１は、化合物１と類似しているか、または化合物１よりも強力な結合を実証している。比＞１は、化合物１よりも弱いコラーゲンへの結合を実証している。データは、コラーゲン結合が、ペプチド負荷の増加と共に増加することを、ならびに硫酸化度２．３および２．４では、主鎖当たりのペプチドの増加は、化合物１で見られたものと類似したコラーゲンへの結合を実証していることを示している。このことは、硫酸化度（ＤＯＳ）およびペプチド負荷の両方が、コラーゲンへの結合の決定において相乗的な役割を果たすことを実証している。
肝星細胞増殖アッセイＡ
【０２９０】
この研究は、肝星細胞（ＨＳＣ）増殖に対する、化合物１および様々な度合いの硫酸化およびペプチド負荷のバイオコンジュゲートの効果を実証する。初代ヒト肝星細胞（ＨＳＣ）を、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）から得た。これらの細胞は継代１で提供されたものであり、したがって活性化表現型を示した。細胞を、２％ウシ胎仔血清を含有する、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓによって提供された培地中、９５％空気、５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気中で、ポリ−Ｌ−リシンでコーティングされたＴ−７５フラスコで増やした。細胞は７５〜８０％コンフルエンスに成長させ、すべての実験において使用するためにＰ２で凍結保存した。
【０２９１】
組織培養処理した９６ウェルのμ−プレート（Ｉｂｉｄｉ）を、９５％空気、５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気中、５０μｇ／ｍＬのＣｈｒｏｎｏ−Ｐａｒ線維性コラーゲンＩで２時間コーティングした。２時間のインキュベーション後、プレートを無菌１×ＰＢＳを用いて手作業ですすいで、任意の過剰の線維性コラーゲンを除去した。次に、プレートを、０．５％ウシ胎仔血清を含有する、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓによって提供された培地、１ウェル当たり３０μＬを用いてプレインキュベートした。Ｐ２で凍結保存した細胞を解凍し、実験のために同じ低血清含有培地で復元した。細胞を、線維性コラーゲンでコーティングされたウェル上に、１ウェル当たり３０μＬ中６０００個の細胞の播種密度で播種し、２〜３時間付着させた。細胞付着を、Ｌｅｉｃａ位相差顕微鏡を用いて画像化することによって確認した。ＴＧＦ−β（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、製造者のプロトコールに従って復元した。次に、１ウェル当たり３０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−β  ３０μＬを、各ウェルに添加し、プレートを、９５％空気、５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気中で一晩インキュベートした。化合物１および様々な度合いの硫酸化およびペプチド負荷のコンジュゲートの原液を、１０００、１００、１０、および１μｇ／ｍＬの濃度で調製した。ＴＧＦ−β刺激の２０時間後、培地を、１ウェル当たり８０μＬの調製した希釈物で置き換えた。陰性対照ウェルを、１ウェル当たり８０μＬの低血清培地で処理した。細胞を、９５％空気、５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気中で４８時間成長させた。細胞増殖を、４８時間にＣｙＱｕａｎｔ  Ｄｉｒｅｃｔアッセイキットを使用して評価した。蛍光強度測定値を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｍ５マルチモードプレートリーダーを使用して記録した。
【０２９２】
ゼロ（ｓ０ＨＡ）、１．４（ｓ１．４ＨＡ）、２．３（ｓ２．３ＨＡ）、および２．４（ｓ２．４ＨＡ）の範囲の硫酸化度のＨＡ主鎖を合成し、ペプチド負荷０、１０、２０、３０、または５０とコンジュゲートした。化合物１は、硫酸化度２．５のＨＡ主鎖および３０個のペプチドのペプチド負荷からなる。図１８からわかる通り、硫酸化度およびペプチド負荷の両方が、ＨＳＣの増殖阻害に対して相乗効果を有する。低ペプチド負荷を伴う低硫酸化度は、化合物１と同様に阻害しないが、より低い硫酸化度のコンジュゲートへのペプチド負荷を増加させると、増殖を阻害するその能力が回復する。
【０２９３】
表６は、１０００μｇ／ｍＬの濃度で試験した、化合物１および様々な度合いの硫酸化（ＤＯＳ）およびペプチド負荷のバイオコンジュゲートによるＨＳＣの増殖阻害パーセントを示している。
【表６】
2020526493.tif 000013
【０２９４】
データは、ＨＡ主鎖の硫酸化度を増加させると、主鎖によって媒介されるＨＳＣの増殖阻害が増加することを示している。硫酸化度２．３および２．４では、ペプチド負荷を増加させると、化合物１によって観測されたものと類似したＨＳＣの増殖阻害が得られる。このことは、硫酸化度およびペプチド負荷の両方が、生物活性を決定するのに相乗的な役割を有することを実証している。
肝星細胞増殖アッセイＢ
【０２９５】
この研究は、化学修飾なしの主鎖（非硫酸化ＨＡ）が、化合物１と同様にＨＳＣ増殖を阻害することを示す。初代ヒトＨＳＣを、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）から得た。これらの細胞は継代１で提供されたものであり、したがって活性化表現型を示した。細胞を、２％ウシ胎仔血清を含有する、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓによって提供された培地中、９５％空気、５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気中で、ポリ−Ｌ−リシンでコーティングされたＴ−７５フラスコで増やした。細胞は７５〜８０％コンフルエンスに成長させ、すべての実験において使用するためにＰ２で凍結保存した。
【０２９６】
組織培養処理したＣｏｓｔａｒ９６ウェルを、９５％空気、５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気中、５０μｇ／ｍＬのＣｈｒｏｎｏ−Ｐａｒ線維性コラーゲンＩで２時間コーティングした。２時間のインキュベーション後、プレートを無菌１×ＰＢＳを用いて手作業ですすいで、任意の過剰の線維性コラーゲンを除去した。次に、プレートを、０．５％ウシ胎仔血清を含有する、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓによって提供された培地、１ウェル当たり１００μＬを用いてプレインキュベートした。Ｐ２で凍結保存した細胞を解凍し、実験のために同じ低血清含有培地で復元した。細胞を、線維性コラーゲンでコーティングされたウェル上に、１ウェル当たり１００μＬ中６０００個の細胞の播種密度で播種し、２〜３時間付着させた。細胞付着を、Ｌｅｉｃａ位相差顕微鏡を用いて画像化することによって確認した。ＴＧＦ−β（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、製造者のプロトコールに従って復元した。次に、１ウェル当たり３０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−β  １００μＬを、各ウェルに添加し、プレートを、９５％空気、５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気中で一晩インキュベートした。化合物１、ならびに修飾したおよび修飾なしの主鎖の原液を、１０００〜０．００１μｇ／ｍＬの範囲の濃度で調製した。ＴＧＦ−β刺激の２０時間後、培地を、１ウェル当たり２００μＬの調製した希釈物で置き換えた。陰性対照ウェルを、１ウェル当たり２００μＬの低血清培地で処理した。細胞を、９５％空気、５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気中で４８時間成長させた。細胞増殖を、４８時間にＣｙＱｕａｎｔ  Ｄｉｒｅｃｔアッセイキットを使用して評価した。蛍光強度測定値を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｍ５マルチモードプレートリーダーを使用して記録した。
【０２９７】
図１９は、肝星細胞（ＨＳＣ）増殖に対する、化合物１、主鎖（化学的誘導体化なし、すなわち硫酸化なし）、および主鎖（０のペプチド修飾、「ｓＨＡ−０ＰＭ」）の効果を実証する用量範囲研究を示す。化学修飾なしの主鎖は、化合物１と同様にＨＳＣ増殖を阻害する。ＨＡ主鎖を硫酸化すると、ＨＳＣ増殖を阻害するその能力が低下する。ペプチドを硫酸化主鎖に付加すると（例えば、化合物１）、生物活性の喪失が回復する。したがって、ＨＡ主鎖のペプチド負荷および硫酸化度の両方は、ＨＳＣ増殖の阻害に相乗的な役割を果たす。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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