(57)【要約】本発明は、皮膚の再生および／または治癒を促進する化粧料組成物であって、化粧料上許容される媒質にウェッサン黒蜂 (OUESSANT black bee; Apis mellifera mellifera)由来のロイヤルゼリーを含む、化粧料組成物を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
化粧料上許容される媒質にウェッサン黒蜂由来のロイヤルゼリーを含む、化粧料組成物。
【請求項２】
前記ロイヤルゼリーを、全組成物の0.001重量％と1重量％との間、好ましくは0.005重量％と0.5重量％との間、または、より好ましくは0.05重量％と0.2重量％との間の濃度にて含む、請求項１に記載の化粧料組成物。
【請求項３】
皮膚再生および／または治癒を局所刺激する、請求項１または２に記載の化粧料組成物。
【請求項４】
１以上の化粧料上許容される賦形剤を含む、請求項１〜３いずれかに記載の化粧料組成物。
【請求項５】
前記化粧料上許容される賦形剤が、ポリマー、表面活性剤、レオロジー剤、香料、電解質、pH調節剤、抗酸化剤、保存料、染料、真珠貝、顔料およびそれらの組合せから選択される、請求項４に記載の化粧料組成物。
【請求項６】
水中油または油中水エマルジョン、クリーム、油、ミルク、ローション、化粧水の形態、好ましくはクリームまたは化粧水の形態である、請求項１〜５いずれかに記載の化粧料組成物。
【請求項７】
単花または多花ハチミツまたはハチミツエキス、好ましくは シロツメクサまたはトウダイグサハチミツをさらに含む、請求項１〜６いずれかに記載の化粧料組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の目的は、皮膚の再生および／または治癒を促進する化粧料組成物であって、化粧料上許容される媒質にウェッサン黒蜂 (OUESSANT black bee; Apis mellifera mellifera)由来のロイヤルゼリーを含む、化粧料組成物である。
【０００２】
組織の治癒および再生は、多数の転写因子の分泌を伴う複雑で、密に連携するプロセスである (Martin, 1997)。
【０００３】
ＴＧＦ-ベータ（ＴＧＦ-β）は、治癒過程の３つの主段階：炎症、細胞増殖および組織再構築の主たる誘因およびレギュレーターである。その活性スペクトルおよびこの過程の上流の作用により、ＴＧＦ-β経路は、治癒機序を加速、または、反対に減速する生体経路である。
【０００４】
ＴＧＦ-βは、Ｉ型（ＴβＲ-Ｉ）およびＩＩ型（ＴβＲ-ＩＩ）受容体の複合体を形成する細胞受容体に結合し、Ｓｍａｄ経路を活性化することによって作用し、かくして、一組の遺伝子の正の調節に至る。これらのＴＧＦ-β-調節遺伝子は、細胞外マトリクスタンパク質の合成、細胞の増殖と運動性、タンパク質分解酵素発現のダウンレギュレーション、および皮膚線維芽細胞の増殖に関与する。
【０００５】
ＴＧＦ-β経路は内因性老化および光老化によって変化し、例えば、高齢者に見られる皮膚の薄化や治癒の遅延に至る。古い皮膚のもう一つの特徴は、コラーゲン合成の減少であり、皮膚の薄化や脆弱化をもたらす。しかしながら、老化の影響を緩和するためにＴＧＦ-βの生成または濃度を増大する生物学的作用は不十分である。なぜならば、それは、細胞および組織レベルでのＴＧＦ-β活性の喪失を生じるＴＧＦ-β受容体の変化だからである。
【０００６】
さらに、TIEG-1（ＴＧＦベータ初期誘導遺伝子１）は、骨再生 (Subramaniam M. et al. Mol. Cell. Biol., 2005, 119-1199)、創傷治癒 (Taguchi M. et al., J. Musculoskelet. Res., 2008, 11, 63-69)だけではなく、コラーゲン繊維およびコラーゲンマトリクスの組成物の分子組織化 (Gumez L. et al., J. Appl. Physiol., 2010, 108, 1706-1710)における重要な因子として、ＴＧＦ-β経路の下流に同定されている。
【０００７】
Subramaniam M.らによって報告された最近の研究 (Biofactors, 2010, 36, 8-18)は、骨再生におけるTIEG-1をコードする遺伝子の関与を実証した。実際、その発現は骨芽細胞（骨の非ミネラル部分を合成する細胞）のＴＧＦ-βに対する初期反応の要素である。
【０００８】
ＴＧＦ-β経路の下流でのTIEG-1タンパク質の同定は、それ故、特に、ＴＧＦ-β受容体が変化するとき、ＴＧＦ-βシグナリング経路を活性化する対象の分子標的である。
【０００９】
この文脈において、発明者らは、驚くべきことに、TIEG-1遺伝子の発現は、ウェッサン（またはウシャン）黒蜂 (Apis mellifera mellifera)のロイヤルゼリーを含む新規化粧料組成物の効果の下、特異的に増大することを示した。発明者らは、この組成物は、内因性または外因性老化過程によって、または損傷、例えば、けがによって変化した皮膚の再生を向上することができることも実証した。後者のケースは治癒過程に関係する。
【００１０】
特に、発明者らは、ウェッサン黒蜂ロイヤルゼリーが、特に、非治癒領域と比較して治癒領域内でのTIEG-1の発現を刺激し得ることを示した。
【００１１】
ロイヤルゼリーは、ハチミツ (honey)、プロポリス、花粉、蜂の毒および蝋などの養老産物のひとつである。しかしながら、これらの産物は、それらが巣内で生成されるかどうかとの観点、および、それらの組成および特性の観点のいずれでも、互いに区別ができる。
【００１２】
かくして、ハチミツは、花から蜜 (nectar)を探しまわり、収集し、消化と逆流を繰り返して生産する蜂によって生産される。蜂の胃の産生ｐＨならびにインベルターゼ、ジアスターゼおよびアミラーッゼの酵素活性は、80%の糖類、主にフルクトースおよびグルコースと、少量のスクロース、マルトースおよび他の複合糖類からなる過飽和水溶液をもたらす。
【００１３】
ハチミツおよび花粉は、年間通して蜂の餌となる物質であり、前者は糖類を供給し、後者はタンパク質を供給するハチミツおよび花粉は、巣内に長期間保存できる。
【００１４】
働き蜂は、コロニーの維持と生存に必須の複数のタスクを実行する蜂のカテゴリーであり、一方、女王蜂および雄蜂は、コロニーの再生を保証する。蜂が花から収集してきた花粉および蜜 (nectar)からロイヤルゼリーを生産するのは働き蜂であり、ロイヤルゼリーは、それらの下顎および下咽頭の唾液腺の分泌で得られる。
【００１５】
ロイヤルゼリーは、例外なく、生まれて最初の三日間、巣内の全幼虫の食糧であり、女王蜂の命つきるまでの専用の食糧である。そのまさに完全な組成のため、ロイヤルゼリーは、幼虫の成長のため、そして、女王蜂の均衡のために必要な全ての栄養：大量の水（６０〜７０％）、糖類（９〜２３％）、大部分のアミノ酸を含むタンパク質（１０〜１８％）、脂質（４〜８％）を供給する。それは、ゼラチン質の白黄色酸コロイドの形態であり、コロニーの発展ストラテジーに関連する重要な活動の責を担うと認識される特定の脂肪酸：10-HDA（１０−ヒドロキシ−２−デカン酸）を含有する。
【００１６】
ロイヤルゼリーは、蜂の種類および蜂が進化する環境に依存して非常に変化する。
【００１７】
ウェッサン黒蜂は、セイヨウクロミツバチ (Apis mellifera mellifera)の地元生態型の純血種である。フィニステール (Finistere)の海岸から２０ｋｍ以上離れたウェッサン島の地理的な位置が、ウェッサン黒蜂を他の蜂種とのいかなる交雑からも防ぐ越境できない障壁を構成している。さらに、ウェッサン島は常にエコシステムで保護され、これにより、蜂の健康および、蜂とその生産物に独特の特徴を付与する多様な環境が保証される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Biofactors, 2010, 36, 8−8)
【非特許文献２】Gumez L. et al., J. Appl. Physiol., 2010, 108, 1706-1710
【非特許文献３】Paul Martin,Wound Healing−Aiming for Perfect Skin Regeneration, Science,１９９７, ２７６, ５３０９, pp.7７５-８１.
【非特許文献４】Snyder L.R. Journal of Chromatography, vol. 92, 1974, pages 223-230
【非特許文献５】Subramaniam M. et al. Mol. Cell. Biol., 2005, 1191-1199
【非特許文献６】Subramaniam M. et al., Biofactors, 2010, 36, 8-18
【非特許文献７】Taguchi M. et al., J. Musculoskelet. Res., 2008, 11, 63-69
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明の目的は、かくして、化粧料上許容される媒体中にウェッサン黒蜂ロイヤルゼリーを含む化粧料組成物である。
【００２０】
ウェッサン黒蜂のハチミツを化粧料組成物に使用することは何年も前から知られているが、ウェッサン黒蜂ロイヤルゼリーの使用を検討されることはなかった。それは、事実上、異なる組成および異なる特性を有する２つの異なる生成物である。
【００２１】
さらに、ウェッサン黒蜂 (Apis mellifera mellifera)に由来しない「古典的な」ロイヤルゼリーとは異なり、ウェッサン黒蜂ロイヤルゼリーは、特に、治癒領域において、細胞単層および再コロニー化を除去することによるイン・ビトロ治癒モデルにおいて、TIEG-1の発現を刺激する利点を持っている。
【００２２】
「化粧料上許容される」とは、組成物が哺乳類の皮膚、より特別にはヒトの皮膚に触れる局所的使用に適していることを意味する。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
好ましい具体例によれば、本発明による化粧料組成物は、全組成物の0.001重量％から1重量％、好ましくは0.005重量％から0.5重量％、より好ましくは0.05重量％から0.2重量％の間の濃度にて、ウェッサン黒蜂ロイヤルゼリーを含む。本発明のもうひとつの目的によれば、本発明の化粧料組成物は、より特別には、皮膚再生および／または治癒を意図している。
【００２４】
本発明の組成物は、自然老化 (chronological aging)、または光老化 (photoaging)の徴候を示す皮膚を意図している。
【００２５】
実際、皮膚の内因性または外因性老化は、細胞再生の減速と、細胞外マトリックスの新合成よりも大幅な劣化を引き起こし、皮膚の恒常性の喪失を示す。これは皮膚の薄化、皮膚のたるみ、ならびに、しわ小じわの出現を招く。
【００２６】
好ましい具体例によれば、本発明の組成物は局所適用を意図している。
【００２７】
本発明の化粧料組成物は、ウェッサン黒蜂ロイヤルゼリーに加えて、乳液、クリーム、軟膏、油中水もしくは水中油エマルジョン、香油、ジェル、ローション、美容液、スプレー、好ましくはクリームまたは美容液の形態の局所適用組成物を得るために当業者に知られたもののなかから許容される１以上の化粧料賦形剤を含む。
【００２８】
組成物の性質に依存して、１以上の化粧料上許容される賦形剤は、」ポリマー、表面活性剤、レオロジー剤、香料、電解質、pH調節剤、抗酸化剤、保存料、染料、真珠貝、顔料およびそれらの組合せから選択される。
【００２９】
特別な具体例において、本発明による化粧料組成物は、当業者に周知の少なくともひとつの化粧用活性剤も含むことができ、内因性または外因性皮膚老化の徴候の出現を遅延化または緩徐化するための剤；皮膚脱色または明色活性を有する剤；スリム化活性を有する剤；湿潤活性を有する剤； 鎮める (calming)、癒やす (soothing)または緩和する ( relaxing)活性を有する剤；皮膚の微小循環を刺激して、特に顔の輝くような血色を改善する剤；油性皮膚ケアのための皮脂調節活性を有する剤；皮膚を清浄化および浄化活性を有する剤；抗ラジカル活性を有する剤から選択される。
【００３０】
本発明の化粧料組成物は、かくして、１以上の他の物質を含み、それらは有利に以下から選択することができる：
−  細胞再生を促進する分子、例えば、レチノールおよび／またはそのエステル；フルーツ酸、特にリンゴ酸、グリコール酸またはクエン酸、サリチル酸またはそのエステル、ゲンチアン酸またはそのエステル、特にトコフェロールゲンチサートなどのアルファ−またはベータ−ヒドロキシ酸；
−  皮膚の硬さを刺激する分子またはエキス、例えば、コラーゲン合成を刺激するペプチド、特にコラーゲンＩ型、ＩＩ型、ＩＶ型またはＶＩＩ型、ツボクサ (Centella asiatica)のエキス、マデカシン酸 (madecassic acid)、アジア酸 (asiatic acid)、マデカソシド (madecassoside)、オーツ麦エキス、ブラジルナッツノキ (Bertholletia excelsa)のエキス、ダイズタンパク質またはペプチド加水分解物、タチキジムシロ (Potentilla erecta)のエキス、ツクシメナモミ (Siegesbeckia orientali)のエキス、ジンセノシドまたはノトギンセノシド、ネムノキ (Albizia julibrissin)樹皮エキス、ローズマリー葉のウルソール酸豊富エキス；
−  表皮および真皮におけるヒアルロン酸またはグリコサミノグリカンの合成を促進する分子またはエキス、例えば、ママクバイタルエッセンス (Mamaku Vital Essence)のエキス、ブラックツリーシダ (Cyathea medullaris)葉エキス、ビワ (Eriobotrya japonica)のエキスすなわちヒアルロン酸の低分子量断片またはアデニウム・オベスム (Adenium obesum)のエキス；
−  表皮分化を調節する分子またはエキス、例えば、エクジストロン (ecdysterone)、トゥルケストロン (turkesterone)、カルシウム誘導体、ビタミンＤ前駆体；
−  アデノシン、カルニチンまたはその誘導体、特に、アセチルカルニチン、化粧料上許容されるレチノールのエステル、特に、プロピオン酸レチノールまたはパルミチン酸；
−  メタロプロテイナーゼ（MMP）阻害剤、特に、MMP 1,2,9阻害剤、例えば、ナギイカダ (Ruscus aculeatus)のエキス、ダイズペプチドまたはそれらを含有する植物のフラボノイドエキス；
−  エラスターゼ阻害剤、例えば、アスペルギウス・フミガタス (Aspergillus fumigatus)、ツルレイシ (Momordica charantia)、クリカボチャ (Cucurbita maxima)の植物エキス；
−  エラスチン様ペプチド、有利にはエステル化物、例えば、SEDERMAによってBIOPEPTIDE ELの商標名で市販されている配列パルミトイル−Val−Gly−Val−Ala−Pro−Glyによって形成されたもの；
−  デルマトポンチン (dermatopontin)合成ができる物質、例えば、コハクエキス；
−  毛穴を引き締める収れん性植物分子またはエキス、例えば、マンサク (hamamelis)エキス；グルコン酸亜鉛；
−  UVAおよびUVB放射から保護するフィルター、例えば、ベンゾフェノン4-ブチルメトキシベンゾイルメタン、メトキシケイ皮酸エチルヘキシル、オクトクリレン、サリチル酸エチルヘキシル、ベンズイミダゾールスルホン酸、ホモサレートを単独または酸化チタンとの組合せ；
−  色素沈着に作用する植物分子またはエキス、例えば、コウジ酸、カンゾウまたは桑の根エキス、アルブチン、パントテノスルホン酸カルシウム、ボルジン、ジアセチルボルジン、ビタミンＣ、またはグリコシド、ユリエキス、特に球根エキスなどの誘導体；
−  抗−フリーラジカルもしくは抗−炎症性分子またはエキス、例えば、カワラヨモギ (Artemisia capillari)のエキス、ワレモコウ (Sanguisorba officinali)のエキス、レスベラトロールおよびその誘導体；ククルマ、ククルミンまたはテトラヒドロククルミン、グレープシードから抽出されたポリフェノール、ビタミンＥおよびその誘導体、特にリン酸誘導体、エルゴチオネインまたはその誘導体、イデベノン；
−  ランエキス、例えば、ブラッソカトレア (Brassocattleya)属に属する蘭、例えば、ブラッソカトレア・マーセラ (Brassocattleya marcella)、または、ヒスイラン (Vanda)属に属する蘭、例えば、バンダ・セルレア (Vanda coerulea)、バンダ・テレス (Vanda teres)およびバンダ・デニソニアナ (Vanda denisoniana)のエキス；
−  湿潤剤、例えば、グリセロール、トリメチルグリシンまたは天然ポリオール、天然または合成セラミド、湧水またはミネラル水。
【００３１】
有利には、本発明の組成物は、ハチミツまたはハチミツエキスを含むこともできる。ハチミツは、好ましくは、単花または多花ハチミツである。
【００３２】
好ましくは、本発明の組成物に用いられるハチミツは、シロツメクサ (Trifolium repens)ハチミツ、ウェッサンハチミツ、トウダイグサハチミツ (Euphorbia echinus) または コルシカ (Corsican)ハチミツであってよい。
【００３３】
形態にかかわらず、本発明の化粧料組成物は、体の一部、特に、顔、首、襟足および／または手に適用される。
【００３４】
別の局面によれば、本発明は、皮膚再生および／または治癒を刺激する化粧処理方法に関し、化粧量活性剤としてウェッサン黒蜂ロイヤルゼリーを含む、十分な量の化粧料組成物を皮膚に適用することを特徴とする。
【００３５】
以下の図面および実施例は、例示であり、限定的なものではない。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】NHFのイン・ビトロ治癒モデルにおけるTIEG-1タンパク質発現Ａ．治癒モデルにおいて、免疫蛍光信号が定量される対象の領域の模式図。領域A：創傷領域から離れた領域；領域Ｂ：創傷に接する領域および細胞単層上の対照領域を含む混合領域；領域Ｃ：ピペット先端で削り取られた領域に対応する創傷領域。Ｂ．創傷４８時間後の線維芽細胞におけるTIEG-1タンパク質発現
【図２】創傷（または治癒）および非創傷領域での培養NHFにおけるTIEG-1タンパク質レベルに対するウェッサン黒蜂ロイヤルゼリーの効果
【図３】培養NHFにおけるV型コラーゲンの合成に対するウェッサン黒蜂ロイヤルゼリーおよびバックファストミツバチロイヤルゼリーの効果
【図４】培養NHFにおけるエラスチン合成に対するウェッサン黒蜂ロイヤルゼリーおよびバックファストミツバチロイヤルゼリーの効果
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００３７】
実施例１：イン・ビトロ治癒モデルにおけるTIEG-1の発現
細胞培養を用いて、細胞で均質に被覆された表面を得ることができる。この細胞単層はその表面にわたってピペット先端で削ったり、破ったりすることができる。
【００３８】
このモデルでは、３つの異なる領域が区別される：ピペット先端によって削り取られた領域に対応する創傷領域（領域Ｃ）、混合領域、すなわち、創傷に接する領域（領域Ｂ）および創傷領域からある距離での細胞単層上の対照領域（領域Ａ）を含む領域である（図１Ａ）TIEG-1発現は、免疫標識によって明らかにされ、治癒過程が開始されたときにこれら３つの領域に存在する線維芽細胞の画像分析によって定量化される。
【００３９】
この研究は、創傷領域Ｃにおいて、混合領域Ｂと比較して４７％、対照領域と比較して５３％も顕著に過剰発現していることを示す（図１Ｂ）。
【００４０】
これは、TIEG-1が、特に、線維芽細胞の細胞移動のメカニズム、治癒過程の主要なメカニズムにおいて、主要な役割を果たしていることを示している。
【００４１】
実施例２：治癒試験に付された培養正常ヒト線維芽細胞 (NHF)におけるTIEGタンパク質発現に対するウェッサン黒蜂ロイヤルゼリーの効果
TIEG-1発現は、培養NHFのイン・ビトロ治癒モデルにおけるウェッサン黒蜂ロイヤルゼリー (0.01%)での処理の効果で評価される。
【００４２】
２．１  細胞処理
３７歳白人女性の腹部形成術からのNHFを、10% FBSおよび抗生物質の混合物（ペニシリン／ストレプトマイシン）を補給した低グルコースDMEM培地内で、35 ibidi処理で播種し（ペトリ皿あたり80,000細胞）、４８時間培養で維持し、次いで、培地を変えて、FBS−枯渇培地と交換した。FBSなしの培養２４時間後、NHFを１００μｇ/ｍｌの容量にてウェッサン黒蜂ロイヤルゼリーで処理した。
【００４３】
処理１５時間後、各ペトリ皿のNHF単層を十字型のピペット先端を用いて傷つけた。
【００４４】
傷つけて２４時間後、培養培地を取り出し、TIEG-1免疫標識を行った。
【００４５】
細胞をホルマリンで固定した後、Triton（0.1％）で10分間透過処理した。次に、それらを1％リン酸緩衝生理食塩水（PBS）/ウシ血清アルブミン（BSA）で30分間飽和させる。一次抗体（ウサギ抗KLF10; Abcam）を1％PBS-BSAバッファーで1：200に希釈し、室温にて1時間細胞上でインキュベートする。PBSでリンスした後、二次抗体（Alexa Fluor(R)568ヤギ抗ウサギIgG）を1％PBS-BSAバッファーで1：200に希釈し、室温にて1時間、暗所で沈殿させる。二次抗体のインキュベーションと並行して、DAPI（1：100希釈）で核を、ファロイジン488（1：200希釈）でアクチンフィラメントを標識する。
【００４６】
PBSでリンスした後、数滴の水性封入剤を添加する。皿は最終的に４℃で保管され、蛍光顕微鏡下での画像取得まで待機する。
【００４７】
２．２  共焦点顕微鏡での画像取得および解析
画像は、20倍エア対物レンズ (x20 air objective)を取り付けたLeica SP5 II共焦点顕微鏡で1024 x 1024ピクセル解像度にて取得する。同じ取得パラメータで、３つの画像を非創傷領域で、３つ以上の画像を創傷領域で撮影する。画像は、特定のレーザ：１．アルゴンレーザ (488 nm)、２．レーザダイオード (405 nm)および３．ヘリウムネオンレーザ (633 nm)による蛍光発色団の励起後に撮影する。
【００４８】
一旦、取得したら、画像は、ひとつずつ、Leica QWinソフトウェアを用いて解析して、定量的記述を得る。
【００４９】
画像解析プログラムは、核およびTIEG-1標識の特定検出を可能にする。TIEG-1標識の検出は、細胞質画分内および細胞核内で行う。各条件につき、TIEG-1の定量を、治癒領域および非創傷領域で測定する。この定量の値は核数および細胞表面積で体系的に重み付けする。
【００５０】
２．３  結果
結果（図２）を、以下の表１に、非創傷および創傷領域（治療領域）に分類する。
【００５１】
【表１】
2020503319.tif 000002
【００５２】
ウェッサン黒蜂ロイヤルゼリーは、未処理対照と比較して、TIEG-1の核発現を、非創傷領域で+700%および治癒領域で+751%、増大した（図２）。
【００５３】
加えて、細胞の核質でのTIEG1発現は、非創傷領域と比較して治癒領域で、ウェッサン黒蜂ロイヤルゼリーでの処理したとき23%、未処理対照で16%増大した。
【００５４】
かくして、ウェッサン黒蜂ロイヤルゼリーでの処理は、治癒領域でより効率的に作用し、内因性または外因性皮膚老化の徴候の出現を防止または遅延するように設計された化粧料スキンケア組成物における抗老化剤としての使用に特に魅力的にする。
【００５５】
実施例３：培養した正常ヒト線維芽細胞 (NHF)におけるコラーゲンVおよびエラスチンの発現に対するウェッサン黒蜂ロイヤルゼリーおよびバックファストミツバチロイヤルゼリーの効果の研究
３．１  細胞処理
NHFを10%ウシ胎児血清で補給したダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM)中T75バイアル (75 cm2フラスコ, BD Biosciences)に播種する。
【００５６】
NHFを0.05%トリプシン−EDTA溶液との合流でトリプシン化し、血清を含有する培地で中和する。次に、それらを２枚の24−ウェルプレートにウェルあたり38,000細胞で播種する。
【００５７】
NHFを、次に、試験したウェッサン黒蜂またはバックファスト (Buckfast)ミツバチのロイヤルゼリーで１００  μｇ／ｍｌ濃度にて６日間、任意に処理する。バックファストミツバチは、ミツバチ亜種アピス・メリファラ・メリフェラ (Apis mellifera mellifera)とアピス・メリファラ・リグスチカ (Apis mellifera ligustica)との間の交配種である。処理は、条件ごとに２回行い、この６日間で３回繰り返す。未処理 (UT)対照条件では、培地は新しいものに置き換える。
【００５８】
処理して６日後、細胞をリン酸バッファーで２回リンスし、次いで、ホルマリン（10%溶液）で１０分間固定する。PBSでの２回リンスした後、細胞膜を0.1% PBS/Triton X-100 溶液 (Sigma)で透過処理し、次いで、リン酸バッファーで２回リンスする。
【００５９】
細胞は、リン酸バッファー中1%ウシ血清アルブミン溶液で３０分間室温にて被覆する。
【００６０】
PBS/BSA溶液は、次いで、1% PBS/BSAに1:100希釈した各標識化タンパク質（以下の表２を参照）)に対応する一次抗体溶液で置き換える。
【００６１】
【表２】
2020503319.tif 000003
【００６２】
プレートを、室温にて２時間インキュベートする。
【００６３】
細胞を、次いで、リン酸バッファーでリンスし、1%リン酸バッファー中1%ウシ血清アルブミン溶液で、それぞれ、1:200および1:100希釈された標的される一次抗体（表２）およびDAPI (4',6'-ジアミジノ-2-フェニルインドール、ジヒドロクロリド)に対応する二次抗体の溶液で被覆する。プレートは、一時間暗所で室温にて保管する。
【００６４】
二次抗体溶液を、次いで、吸引し、細胞をPBSでリンスし、次いで、水で希釈する。
数滴の水性封入剤 (Aqua-Mount, Lab Vision Thermo Scientific) を各ウェルに堆積する。
【００６５】
3.2. 画像取得および高含量スクリーニング (HCS)による解析
プレートは、「ArrayScan XTi」 (Thermo Cellomics)でスキャンする。
【００６６】
取得条件：
検出：
−  DAPI：フィルター XF53_386_23
−  Alexa Fluor 568：フィルター XF53_572_15
−  解像度：1104 x 1104
−  対物レンズ：10x ドライ
−  画像：ウェルあたり49（すなわち、条件あたり2 x 49 = 98）
【００６７】
画像は、Spot Detector画像解析ソフトウェアを用いて解析し、それは、標的タンパク質の発現に対応する赤色標識を検出する。測定領域の表面は、画像の全表面に対応する。細胞数は、青色標識を検出して核を計数することによって決定する。
【００６８】
３．３  結果
ａ．V型コラーゲン発現
ウェッサン黒蜂ロイヤルゼリーは、未処理対照と比較して、NHF上のV型コラーゲンの合成を著しく増大する（図３）。
【００６９】
ウェッサン黒蜂ロイヤルゼリーは、バックファストミツバチロイヤルゼリーで観察される効果よりも顕著に高い効果も有する（図３）。
【００７０】
ｂ．エラスチン発現
ウェッサン黒蜂ロイヤルゼリーは、NHF上のエラスチン合成をより顕著に増大する(+66.8%)（図４）。
【００７１】
NHFにおける細胞外マトリクスの合成に関与する異なる標的上で得られた結果は、ウェッサン黒蜂ロイヤルゼリーがV型コラーゲンおよびエラスチンの発現に活性効果を有し、それは、バックファストミツバチロイヤルゼリーよりも著しく高いことを示す。バックファストミツバチロイヤルゼリーで処理したNHFでは、V型コラーゲンおよびエラスチンの発現にたいして格別の効果はない。
【００７２】
それどころか、バックファストミツバチロイヤルゼリーは、未処理対照と比較して、NHF上のV型コラーゲンの合成を著しく減少させる（−１３．２％）。
【００７３】
実施例４：SPF15デイクリーム
以下の組成物は水中油エマルジョンである。
【００７４】
ウェッサン黒蜂ロイヤルゼリーは、バックファストミツバチゼリーの化合物の含量と比較して、高１０−ヒドロキシ−２−デセン酸含量で識別される。
【００７５】
パーセンテージは、最終組成物を基準とする重量比で表現される：
【００７６】
【表３】
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【００７７】
ウェッサン黒蜂ロイヤルゼリーは、クリームの連続水相に溶解するペーストである。
【００７８】
各相は、別々に調製し、ついで、水相を撹拌しつつ脂質相を添加して、連続相内の脂質相液滴の均質分散体を得る。
【００７９】
クリームは、塗ったときに特別好ましい質感を示す。起床したとき、しわ小じわなどの老化の徴候を示す部分や肌がたるんだ部分を集中的に顔に軽くマッサージしながら塗り込む。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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