(57)【要約】本開示の態様は、細胞の集団に関し、各細胞は、（ｉ）異種レセプター遺伝子と、（ｉｉ）レセプター応答性エレメントを含む誘導性レポーターとを含み、ここで、レポーターの発現が、レセプター遺伝子によってコードされるレセプターの活性の活性化に依存し、レポーターが、異種レセプター遺伝子に固有のインデックス領域を含むバーコードを含み、かつ、細胞が異なる異種レセプターを発現し、各単一の細胞が１つの特定の異種レセプターの１つ以上のコピーおよび１つの特定のレポーターの１つ以上のコピーを発現する。2020530281.tif 000119
2020530281.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）異種レセプター遺伝子と；
（ｉｉ）レセプター応答性エレメントを含む誘導性レポーターであって、
該レポーターの発現は、該レセプター遺伝子によってコードされるレセプターの活性の活性化に依存し、
該レポーターは、該異種レセプター遺伝子に固有であるインデックス領域を含むバーコードを含む、
誘導性レポーターと
を含む、核酸。
【請求項２】
請求項１に記載の核酸を含むベクター。
【請求項３】
異種レセプター遺伝子を含むベクター。
【請求項４】
誘導性レポーターをさらに含み、該レポーターの発現が、前記レセプター遺伝子によってコードされるレセプターの活性の活性化に依存し、該レポーターが、前記異種レセプター遺伝子に固有のインデックス領域を含むバーコードを含む、請求項３に記載のベクター。
【請求項５】
誘導性レポーターを含むベクターであって、該レポーターがバーコードを含む、ベクター。
【請求項６】
前記レセプター遺伝子がＧタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）をコードする、請求項２〜４のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項７】
前記レセプター遺伝子が、補助ポリペプチドをコードする１つ以上のさらなるポリヌクレオチドをさらに含む、請求項２〜６のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項８】
前記補助ポリペプチドが、選択可能またはスクリーニング可能なタンパク質を含む、請求項７に記載のベクター。
【請求項９】
前記補助ポリペプチドがタンパク質タグを含む、請求項７または８に記載のベクター。
【請求項１０】
前記補助ポリペプチドが転写因子を含む、請求項７〜８のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１１】
前記レセプター遺伝子が、レセプター遺伝子および補助ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする、請求項１０に記載のベクター。
【請求項１２】
前記融合タンパク質が、レセプター遺伝子と補助ポリペプチドとの間にプロテアーゼ部位を含む、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】
前記補助ポリペプチドが、１つ以上の輸送タグを含む、請求項２〜１２のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１４】
前記補助ポリペプチドが２つの輸送タグを含む、請求項１３に記載のベクター。
【請求項１５】
前記輸送タグが、Ｌｕｃｙおよび／またはＲｈｏタグを含む、請求項１３または１４に記載のベクター。
【請求項１６】
前記レポーターが、ＧＰＣＲの活性化時のシグナル伝達によって誘導される、請求項２〜１５のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１７】
前記レセプター応答性エレメントが、ｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）、活性化Ｔ細胞応答要素の核因子（ＮＦＡＴ−ＲＥ）、血清応答エレメント（ＳＲＥ）、がおよび血清応答因子応答エレメント（ＳＲＦ−ＲＥ）のうちの１つ以上を含む、請求項２〜１６のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１８】
前記レセプター応答性エレメントがＣＲＥを含む、請求項１７に記載のベクター。
【請求項１９】
前記ＣＲＥが、配列番号１の少なくとも５つの繰り返しを含む、請求項１８に記載のベクター。
【請求項２０】
前記レセプター応答性エレメントが、前記補助ポリペプチド転写因子によって結合されるＤＮＡエレメントを含む、請求項１０〜１９のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項２１】
前記補助ポリペプチド転写因子が逆テトラサイクリン制御トランスアクチベーター（ｒｔＴＡ）を含み、前記レセプター応答性エレメントがテトラサイクリン応答性エレメント（ＴＲＥ）を含む、請求項２０に記載のベクター。
【請求項２２】
ＧＰＣＲが嗅覚レセプター（ＯＲ）である、請求項６〜２１のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項２３】
前記レセプターがアドレナリンレセプターを含む、請求項２〜２２のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項２４】
前記アドレナリンレセプターがβ−２アドレナリンレセプターを含む、請求項２３に記載のベクター。
【請求項２５】
前記レセプター遺伝子が核ホルモンレセプター遺伝子を含む、請求項２〜２２のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項２６】
レセプター遺伝子がレセプターチロシンキナーゼ遺伝子を含む、請求項２〜２２のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項２７】
前記レセプターが膜貫通レセプターである、請求項２〜２６のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項２８】
前記レセプターが細胞内レセプターである、請求項２〜２６のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項２９】
ウイルスベクターを含む、請求項２〜２８のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項３０】
レンチウイルスベクターを含む、請求項２９に記載のベクター。
【請求項３１】
前記レセプター遺伝子が構成的プロモーターを含む、請求項２〜２９のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項３２】
前記レセプター遺伝子が条件的プロモーターを含む、請求項２〜２９のいずれか１項に記載のベクター。
請求項３２．１
前記異種レセプター遺伝子が、条件的プロモーターに作動可能に連結される、請求項２〜３２のいずれか１項に記載のベクター。
請求項３２．２
前記条件的プロモーターがテトラサイクリン応答エレメントである、請求項３２．１に記載のベクター。
【請求項３３】
バーコードが少なくとも１０個の核酸である、請求項２〜３２のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項３４】
前記レポーターが、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むか、またはさらに含み、
前記遺伝子が、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む、
請求項２〜３２のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項３５】
前記バーコードが、蛍光タンパク質の遺伝子の３’ＵＴＲに位置する、請求項３４に記載のベクター。
【請求項３６】
前記ＯＲＦが、選択可能またはスクリーニング可能なタンパク質をコードする、請求項３４または３５に記載のベクター。
【請求項３７】
前記ＯＲＦがルシフェラーゼタンパク質をコードする、請求項３６に記載のベクター。
【請求項３８】
レセプター遺伝子が、５’末端および／または３’末端でインスレーター配列に隣接している、請求項２〜３７のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項３９】
レポーターが、５’および／または３’末端でインスレーター配列に隣接している、請求項２〜３７のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項４０】
インスレーターがｃＨＳ４インスレーターを含む、請求項３８または３９に記載のベクター。
【請求項４１】
第２、第３、または第４のバーコードを含む、請求項２〜４０のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項４２】
前記第２、第３、または第４のバーコードのうちの少なくとも１つが、アッセイ条件またはマイクロプレート上の位置の１つまたは複数に固有のインデックス領域を含む、請求項４１に記載のベクター。
【請求項４３】
請求項２〜４０のいずれか１項に記載のベクターを含むウイルス粒子。
【請求項４４】
請求項３〜３９のいずれか１項に記載のベクターまたは請求項４３に記載のウイルス粒子を含む、細胞。
請求項４４．１
請求項２〜４２のいずれか１項に記載のベクターの複数のコピーを含む細胞。
請求項４４．２
前記ベクターの少なくとも３つのコピーを含む、請求項４４．１に記載の細胞。
【請求項４５】
細胞の集団であって、
各細胞は、
（ｉ）異種レセプター遺伝子と；
（ｉｉ）レセプター応答性エレメントを含む誘導性レポーターであって、
該レポーターの発現は、該レセプター遺伝子によってコードされるレセプターの活性の活性化に依存し、
該レポーターは、該異種レセプター遺伝子に固有であるインデックス領域を含むバーコードを含む、
誘導性レポーターと
を含み、
前記細胞は、異なる異種レセプターを発現し、各単一の細胞は、１つの特定の異種レセプターの１つ以上のコピーおよび１つの特定のレポーターの１つ以上のコピーを有する、
細胞の集団。
【請求項４６】
（ｉ）異種レセプター遺伝子と；
（ｉｉ）レセプター応答性エレメントを含む誘導性レポーターであって、
該レポーターの発現は、該レセプター遺伝子によってコードされるレセプターの活性の活性化に依存し、
該レポーターは、該異種レセプター遺伝子に固有であるインデックス領域を含むバーコードを含む、
誘導性レポーターと
を含む、細胞。
【請求項４７】
前記レセプター遺伝子がＧＰＣＲをコードする、請求項４４．２〜４６のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項４８】
前記レポーターが、ＧＰＣＲの活性化時のシグナル伝達によって誘導される、請求項４７に記載の細胞。
【請求項４９】
前記レセプター遺伝子が、補助ポリペプチドをコードする１つ以上のさらなるポリヌクレオチドをさらに含む、請求項４４．２〜４８のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項５０】
前記補助ポリペプチドが、選択可能またはスクリーニング可能なタンパク質を含む、請求項４９に記載の細胞。
【請求項５１】
前記補助ポリペプチドがタンパク質タグを含む、請求項４９または５０に記載の細胞。
【請求項５２】
前記補助ポリペプチドが転写因子を含む、請求項４９〜５１のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項５３】
前記レセプター遺伝子が、該レセプター遺伝子および前記補助ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする、請求項４９〜５２のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項５４】
前記融合タンパク質が、レセプター遺伝子と補助ポリペプチドとの間にプロテアーゼ部位を含む、請求項５３に記載の細胞。
【請求項５５】
前記誘導性レポーターが、ｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）、活性化Ｔ細胞応答エレメントの核因子（ＮＦＡＴ−ＲＥ）、血清応答エレメント（ＳＲＥ）、および血清応答因子応答エレメント（ＳＲＦ−ＲＥ）のうちの１つ以上を含む、請求項４７〜５４のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項５６】
前記ＧＰＣＲが嗅覚レセプター（ＯＲ）である、請求項４７〜５５のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項５７】
１つ以上のアクセサリータンパク質をコードする１つ以上の遺伝子をさらに含む、請求項４４〜５６のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項５８】
前記１つ以上のアクセサリータンパク質が、Ｇαサブユニット、Ｒｉｃ−８Ｂ、ＲＴＰ１Ｌ、ＲＴＰ２、ＲＴＰ３、ＲＴＰ４、ＣＨＭＲ３、およびＲＴＰ１Ｓのうちの１つ以上を含む、請求項５７に記載の細胞。
請求項５８．１
前記細胞が、１つ以上のアクセサリー因子遺伝子をコードする１つ以上の外因性ヌクレオチドの安定な組み込みを含み、アクセサリー因子遺伝子が、ＲＴＰ１Ｓ、ＲＴＰ２、Ｇαサブユニット、およびＲｉｃ−８ｂを含む、請求項４４．２〜５８のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項５９】
前記１つ以上のアクセサリータンパク質がアレスチンタンパク質を含む、請求項５７に記載の細胞。
【請求項６０】
前記アレスチンタンパク質がプロテアーゼに融合されている、請求項５９に記載の細胞。
【請求項６１】
前記レセプター遺伝子が核ホルモンレセプター遺伝子を含む、請求項４４．２〜６０のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項６２】
前記レセプター遺伝子がレセプターチロシンキナーゼ遺伝子を含む、請求項４４．２〜６１のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項６３】
レセプターが膜貫通レセプターである、請求項４４．２〜６２のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項６４】
前記１つ以上のアクセサリータンパク質が、シャペロンタンパク質、Ｇタンパク質、およびグアニンヌクレオチド交換因子の１つ以上を含む、請求項５７〜６３のいずれか１つに記載の細胞。
【請求項６５】
前記異種レセプター遺伝子から発現されるレセプタータンパク質をさらに含む、請求項４４．２〜６４のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項６６】
前記レセプタータンパク質が細胞内に局在する、請求項６５に記載の細胞。
【請求項６７】
前記異種レセプター遺伝子と少なくとも８０％同一であるタンパク質をコードする内因性遺伝子を欠いている、請求項４４．２〜６６のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項６８】
前記レセプター遺伝子が細胞のゲノムに組み込まれている、請求項４４．２〜６７のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項６９】
前記誘導性レポーターが細胞のゲノムに組み込まれている、請求項４４．２〜６８のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項７０】
前記レセプター遺伝子および誘導性レポーターが遺伝的に連結されている、請求項６８または６９に記載の細胞。
【請求項７１】
前記レセプター遺伝子および誘導性レポーターが遺伝的に連結されていない、請求項６８または６９に記載の細胞。
【請求項７２】
組み込まれた前記レセプター遺伝子および／または誘導性レポーターが、標的指向させた組み込みによって組み込まれている、請求項６８〜７１のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項７３】
前記組み込みが、Ｈ１１セーフハーバー遺伝子座内である、請求項７２に記載の細胞。
【請求項７４】
組み込まれた前記レセプター遺伝子および／または誘導性レポーターが、ゲノムにランダムに組み込まれている、請求項６８〜７１のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項７５】
前記ランダムな組み込みが、前記レセプター遺伝子および／または誘導性レポーターの転位を含む、請求項７４に記載の細胞。
【請求項７６】
少なくとも２コピーのレセプター遺伝子および／または誘導性レポーターを含む、請求項４４．２〜７５のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項７７】
前記レセプター遺伝子が構成的プロモーターを含む、請求項４４．２〜７６のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項７８】
前記レセプターの発現が構成的である、請求項６５〜７７のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項７９】
前記レセプター遺伝子が条件的プロモーターを含む、請求項４４．２〜７６のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項８０】
前記レセプターの発現が条件的である、請求項６５〜７６または７９のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項８１】
前記バーコードおよび／またはインデックス領域が少なくとも１０個の核酸である、請求項４４．２〜８０のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項８２】
前記レポーターが蛍光タンパク質の遺伝子を含むか、またはさらに含み、該遺伝子が３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む、請求項４４．２〜８１のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項８３】
前記バーコードが、前記蛍光タンパク質の遺伝子の３’ＵＴＲに位置する、請求項８２に記載の細胞。
【請求項８４】
前記遺伝子がルシフェラーゼタンパク質をコードする、請求項８２または８３に細胞の細胞。
【請求項８５】
前記レセプター遺伝子が、５’末端および３’末端でインスレーター配列に隣接している、請求項６８〜８４のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項８６】
前記レポーターが、５’および３’末端でインスレーター配列に隣接している、請求項６８〜８５のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項８７】
前記異種レセプターの発現レベルが、生理学的に関連する発現レベルである、請求項４４．２〜８６のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項８８】
凍結されている、請求項４４．２〜８７のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項８９】
哺乳動物細胞である、請求項４４．２〜８８のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項９０】
ヒト胎児由来腎臓２９３Ｔ（ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞である、請求項９０に記載の細胞。
【請求項９１】
請求項４４〜９０のいずれか１項に記載の細胞を含むアッセイシステム。
【請求項９２】
リガンドおよびレセプターの結合をスクリーニングするための方法であって、
請求項４４〜９０のいずれか１項に記載の細胞をリガンドと接触させる工程と、
１つ以上のレポーターを検出する工程と、
１つ以上のレポーターの同一性を決定する工程と
を含み、
前記レポーターの同一性は、結合したレセプターの同一性を示す、
方法。
【請求項９３】
前記レポーターの同一性を決定する工程が、細胞から核酸を単離することを含む、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記核酸がＲＮＡを含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記単離されたＲＮＡに対して逆転写酵素反応を行ってｃＤＮＡを作製する工程をさらに含む、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記ＲＴが前記溶解物中で行われる、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
前記単離された核酸を増幅する工程をさらに含む、請求項９３〜９６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９８】
単離された前記核酸を配列決定する工程をさらに含む、請求項９３〜９７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９９】
前記１つ以上のレポーターを検出する工程が、前記細胞からの蛍光レベルを検出することを含む、請求項９２〜９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１００】
少なくとも２つの異なる異種レセプターが前記細胞において発現される、請求項９２〜９９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０１】
細胞の集団が１つの組成物中で共混合される、請求項９２〜１００のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０２】
細胞の集団が基材に接着している、請求項９２〜１０１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０３】
細胞の集団が、基材の１つのウェル内または１つの細胞培養皿内に含まれる、請求項９２〜１０２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０４】
前記細胞をプレーティングする工程をさらに含む、請求項９２〜１０３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０５】
前記細胞が９６ウェル細胞培養プレート上にプレーティングされる、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記細胞が凍結されており、前記方法が、凍結された細胞を解凍する工程をさらに含む、請求項９２〜１０５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０７】
以下の工程を含む、リガンドおよびレセプターの結合をスクリーニングするための方法:
細胞の集団をリガンドと接触させる工程であって、
細胞の集団の各細胞は、
（ｉ）異種レセプター遺伝子と；
（ｉｉ）レセプター応答性エレメントを含む誘導性レポーターであって、
該レポーターの発現は、該レセプター遺伝子によってコードされるレセプターの活性の活性化に依存し、
該レポーターは、該異種レセプター遺伝子に固有であるインデックス領域を含むバーコードを含む、
誘導性レポーターと
を含み、
前記細胞の集団は、前記異種レセプター遺伝子に由来する少なくとも３００個の異なるレセプターを発現し、各単一の細胞は、１つの特定の異種レセプターの１つ以上のコピーおよび１つの特定のレポーターの１つ以上のコピーを有する、
工程と、
１つ以上のレポーターを検出する工程と、
１つ以上のレポーターの同一性を決定する工程であって、レポーターの同一性は、結合したレセプターの同一性を示す、工程。
【請求項１０８】
少なくとも２つの異なるベクターを含むベクターライブラリーであって、該ベクターが、異なる異種レセプター遺伝子および異なる誘導性レポーターを含む、ベクターライブラリー。
【請求項１０９】
請求項４５〜９０のいずれか１項に記載の細胞の集団を含む細胞ライブラリー。
【請求項１１０】
前記ウイルス粒子が、異なる異種レセプター遺伝子および異なる誘導性レポーターを含む、請求項４３に記載の少なくとも２つのウイルス粒子を含むウイルスライブラリー。
【請求項１１１】
レセプタータンパク質を含む細胞のライブラリーを作製するための方法であって、
（ｉ）請求項１に記載の核酸もしくは請求項２〜３９のいずれか１項に記載のベクターを細胞中で発現させる工程；または
（ｉｉ）細胞を請求項４３に記載のウイルスに感染させる工程
を含み、
前記細胞は、異なる異種レセプターを発現し、各単一の細胞は、１つの特定の異種レセプターの１つ以上のコピーおよび１つの特定のレポーターの１つ以上のコピーを発現する、方法。
【請求項１１２】
請求項１０８〜１１０のいずれか１項に記載のライブラリーを含むキット。
【請求項１１３】
（ｉ）誘導性プロモーターに作動可能に連結された異種レセプター遺伝子と；
（ｉｉ）レセプター応答性エレメントを含むレポーターであって、
該レポーターの発現は、異種レセプター遺伝子によってコードされるレセプターの活性の活性化に依存し、
該レポーターは、該異種レセプター遺伝子に固有であるインデックス領域を含むバーコードを含む、
レポーターと
を含む、核酸。
【請求項１１４】
請求項１１３に記載の核酸の少なくとも２コピー〜少なくとも６コピーを含む、細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年７月５日に出願された米国仮特許出願第６２／５２８，８３３号の優先権の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、National Science Foundationにより授与された1555952に基づく政府の支援によりなされた。政府は本発明に一定の権利を保有する。
【０００３】
１．発明の属する技術分野
本開示は、医薬および創薬の分野に関する。
【背景技術】
【０００４】
２．関連技術の説明
Ｇタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）は、薬物標的の最も重要なクラスの１つであり、現在市販されている薬物の約３分の１がＧＰＣＲを介してその効果を有する。Ｇタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）は、現在の薬物標的の５０〜６０％を占める。膜タンパク質のこのファミリーは、現在の創薬において重要な役割を果たしている。古典的には、ＧＰＣＲに基づく多数の薬物が、心血管疾患、代謝疾患、神経変性疾患、精神疾患、および腫瘍疾患などの様々な適応症のために開発されてきた。
【０００５】
さらに、単一のアッセイプラットホームにおいて、数千、さらには数万ものレセプターの効果的かつ効率的な大規模スクリーニングを可能にする方法は、現在、たとえあったとしても、ほとんど存在しない。当技術分野において、レセプターおよびリガンドの相互作用スクリーニングの向上が大いに必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
本開示は、特定のレセプター活性化を決定するために使用され得る核酸、ベクター、細胞、ウイルス粒子、および方法に関する。したがって、特定の実施形態は、（ｉ）異種レセプター遺伝子；および（ｉｉ）レセプター応答性エレメントを含む誘導性レポーターを含み；レポーターの発現が、レセプター遺伝子によってコードされるレセプターの活性の活性化に依存し、そしてレポーターが、異種レセプター遺伝子に対して一意に同定可能なインデックス領域を含むバーコードを含む、核酸に関する。さらなる態様は、本開示の核酸を含むベクターに関する。さらなる態様は、異種レセプター遺伝子を含むベクターに関する。用語「異種」は、ポリヌクレオチドの文脈において、当該分野で公知のまたは本明細書中に記載される遺伝子導入方法によって細胞に導入された遺伝子またはポリヌクレオチドをいい；このような細胞の子孫はまた、外因的に誘導された配列が子孫細胞に残存する場合、異種核酸配列を含むといわれ得る。細胞は、異種レセプター遺伝子と同一である内因性遺伝子を既に含み得るか、または細胞は、異種遺伝子に関連するかまたは同一である任意の内因性遺伝子を欠失し得る。用語「異種細胞」または「宿主細胞」は、異種核酸配列を意図的に含有する細胞を指す。
【０００７】
用語「コードする」は、それがポリヌクレオチドに適用される場合、その天然状態において、または当業者に周知の方法によって操作される場合、ポリペプチドおよび／またはその断片のためのｍＲＮＡを産生するために転写および／または翻訳され得る場合、ポリペプチドを「コードする」と言われるポリヌクレオチドをいう。アンチセンスストランドは、このような核酸の相補体であり、そしてコード配列は、そこから推定され得る。
【０００８】
いくつかの実施形態では、ベクターは、誘導性レポーターをさらに含み、レポーターの発現は、レセプター遺伝子によってコードされるレセプターの活性の活性化に依存し、レポーターは、異種レセプター遺伝子に固有のインデックス領域を含むバーコードを含む。さらなる態様は、バーコードを含む誘導性レポーターを含むベクターに関する。
【０００９】
さらなる態様は、細胞の集団に関し、ここで、各細胞は、（ｉ）異種レセプター遺伝子を含み；（ｉｉ）レセプター応答性エレメントを含む誘導性レポーター；ここで、レポーターの発現は、レセプター遺伝子によってコードされるレセプターの活性の活性化に依存し、そしてここで、レポーターは、異種レセプター遺伝子に独特であるインデックス領域を含むバーコードを含み；そしてここで、細胞は、異なる異種レセプターを発現し、そしてここで、各単一細胞は、１つの特定の異種レセプターの１つ以上のコピーおよび１つの特定のレポーターの１つ以上のコピーを発現する。例えば、細胞の集団は、第１のレセプター遺伝子および第１の誘導性レポーターを有する少なくとも第１の細胞、第２のレセプター遺伝子および第２の誘導性レポーターを有する第２の細胞、第３のレセプター遺伝子および誘導性レポーターを有する第３の細胞、第４のレセプター遺伝子および第４の誘導性レポーターを有する第４の細胞、・・・ならびに、１０００番目のレセプター遺伝子および１０００番目の誘導性レポーターを有する１０００番目の細胞などを含み得る。細胞の集団は、細胞を含み得、その各々は、１つのみのレセプター、および同じ細胞において活性化される異種レセプターを同定するために使用され得るインデックス領域を含むバーコードを含む関連する誘導性レポーターを含む。細胞の集団は、少なくともまたは多くとも５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、４５００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、または１０１０個の細胞（またはその中の誘導可能な任意の範囲）を含むことができ、これは異なるレセプター遺伝子およびそれらの関連する誘導性レポーターの数を表す。さらに、いくつかの実施形態において、誘導性レポーターは、その細胞において発現された異種レセプター遺伝子を一意に同定する発現核酸を産生する。異なるレセプター遺伝子は、嗅覚レセプター、ホルモンレセプター、アドレノセプター、薬物応答性レセプターなどのようなレセプターのクラスに属するレセプターであり得る。したがって、細胞の集団は、1つの唯一のレセプター遺伝子（同じ遺伝子の複数のコピーから発現され得るが）および１つの唯一の関連する誘導性レポーター（誘導性レポーターの複数のコピーが存在し得るが）を発現する細胞を含み得る。いくつかの実施形態では、細胞はそれぞれ、同じレセプター遺伝子の１つのバリアントを発現する。単一のスクリーニングは、本明細書中で議論される細胞／レセプターの数を含み得ることが意図される。これは、本開示によって提供されるいくつかの実施形態の大きさを有するために、スクリーニングを連続的��使用することを含み得る他のスクリーニングとは、スケールが異なる。
【００１０】
さらなる実施形態は、（ｉ）異種レセプター遺伝子；および（ｉｉ）レセプター応答性エレメントを含む誘導性レポーターを含み；ここで、レポーターの発現は、レセプター遺伝子によってコードされるレセプターの活性の活性化に依存し、そしてレポーターは、異種レセプター遺伝子に固有であるインデックス領域を含むバーコードを含む、細胞に関する。いくつかの実施形態では、異種遺伝子の発現は「持続可能」であり、異種遺伝子の発現は、後の細胞の前、または後の細胞の前の時点で、１、２、３、４、５、６、７日および／または１、２、３、４、５週間および／または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２か月（またはその中の誘導可能な任意の範囲）から、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０継代以上（またはその中の誘導可能な任意の範囲）の細胞の発現レベルの約または少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％以内のレベルに留まることを意味する。特定の実施形態では、細胞は、試験されるレセプターの持続可能な発現を示す。いくつかの実施形態では、細胞は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０継代またはそれ以上（またはその中の誘導可能な任意の範囲）後に最初に測定されたレベルの２倍以内のレベルでレセプターを発現する。
【００１１】
いくつかの実施形態では、レセプター遺伝子は、Ｇタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）をコードする。いくつかの実施形態では、レポーターは、活性化レセプタータンパク質によるシグナル伝達時に誘導される。いくつかの実施形態では、レセプタータンパク質の活性化は、レセプターのリガンドへの結合を含む。いくつかの実施形態において、レセプター遺伝子は、補助ポリペプチドをコードする１つ以上のさらなるポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、補助ポリペプチドは、選択可能またはスクリーニング可能なタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、補助ポリペプチドは、タンパク質またはペプチドタグを含む。いくつかの実施形態では、補助ポリペプチドは転写因子を含む。いくつかの実施形態において、補助ポリペプチドは、１つ以上の輸送タグを含む。いくつかの実施形態では、補助ポリペプチドは、２つの輸送段階を含む。いくつかの実施形態では、補助ポリペプチドは、少なくとも、多くとも、または厳密に１、２、３、４、もしくは５（またはその中の誘導可能な任意の範囲）の輸送タグを含む。いくつかの実施形態では、輸送タグは、Ｌｕｃｙおよび／またはＲｈｏ輸送タグを含む。いくつかの実施形態では、輸送タグはシグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、内因性タンパク質によってｉｎ ｖｉｖｏで切断される切断可能なペプチドである。例示的な補助ポリペプチドは、本明細書中に記載される。いくつかの実施形態において、レセプター遺伝子は、レセプター遺伝子および補助ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、レセプター遺伝子と補助ポリペプチドとの間にプロテアーゼ部位を含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、レポーターは、ＧＰＣＲの活性化時のシグナル伝達によって誘導される。いくつかの実施態様において、レセプター応答性エレメントは、ｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）、活性化Ｔ細胞応答性エレメントの核因子（ＮＦＡＴ−ＲＥ）、血清応答エレメント（ＳＲＥ）、及び血清応答因子応答エレメント（ＳＲＦ−ＲＥ）のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、レセプター応答性エレメントは、補助ポリペプチド転写因子によって結合されるＤＮＡエレメントを含む。いくつかの実施形態では、補助ポリペプチド転写因子は、逆テトラサイクリン制御トランスアクチベーター（ｒｔＴＡ）を含み、レセプター応答性エレメントは、テトラサイクリン応答性エレメント（ＴＲＥ）を含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、レセプター応答性エレメントはＣＲＥを含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＥは、ｔｇａｃｇｔｃａ（配列番号１）の少なくとも５つの繰り返しを含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＥは、配列番号１（またはその中の誘導可能な任意の範囲）の少なくとも、多くとも、または厳密に３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個の繰り返しを含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＥは、
2020530281.tif 000003
または配列番号２またはその断片、例えば配列番号２の５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３０１、３０２、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１２、３１３、３１４、または３１５の連続した核酸の断片と少なくとも、多くとも、または厳密に７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、または９９％同一である配列を含む（またはその中の誘導可能な任意の範囲）。
【００１４】
いくつかの実施形態では、ＧＰＣＲは嗅覚レセプター（ＯＲ）である。ＯＲは、当該分野で公知であり、そして本明細書中にさらに記載される。いくつかの実施形態において、レセプター遺伝子は、核ホルモンレセプター遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、レセプター遺伝子は、レセプターチロシンキナーゼ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、レセプターは、アドレナリンレセプターを含む。いくつかの実施形態では、アドレナリンレセプターは、β−２アドレナリンレセプターを含む。いくつかの実施形態では、レセプターは、本明細書に記載のレセプターを含む。いくつかの実施形態では、レセプターは膜貫通レセプターである。いくつかの実施形態では、レセプターは細胞内レセプターである。
【００１５】
いくつかの実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。さらなる実施形態では、ベクターは、当技術分野で公知のものおよび／または本明細書に記載のものである。いくつかの実施形態では、ベクターはレンチウイルスベクターを含む。
【００１６】
いくつかの実施形態において、レセプター遺伝子は、構成的プロモーターを含む。例示的な構成的プロモーターには、ＣＭＶ、ＲＳＶ、ＳＶ４０などが含まれる。いくつかの実施形態では、レセプター遺伝子は、条件的プロモーターを含む。本明細書で使用される「条件的プロモーター」という語は、インデューサーの添加によって誘導することができる、かつ／あるいは、温度の変化またはアクチベーター、共アクチベーター、もしくはリガンドなどの分子の添加などの条件の変化によって「オフ」状態から「オン」状態または「オン」状態から「オフ」状態に切り替えることができる、プロモーターを指す。条件的プロモーターの例には、細胞内でタンパク質を誘導発現させるために使用することができる「Ｔｅｔ−ｏｎ」または「Ｔｅｔ−ｏｆｆ」システムが含まれる。
【００１７】
いくつかの実施形態において、レポーターは、発現されたＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子は、少なくとも１０個の核酸のバーコードを含む。バーコードは、長さが、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００以上の、あるいは少なくともまたは多くとも、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００以上の核酸（またはその中の誘導可能な任意の範囲）であり得る。いくつかの実施形態では、レポーターは、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含むオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むか、またはさらに含む。いくつかの実施形態では、バーコードは、遺伝子、レポーター、または蛍光タンパク質をコードする遺伝子などの他の核酸セグメントの３’ＵＴＲに位置する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、選択可能またはスクリーニング可能なタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ＯＲＦは蛍光タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ＯＲＦはルシフェラーゼタンパク質をコードする。
【００１８】
いくつかの実施形態において、レセプター遺伝子は、５’末端および／または３’末端でインスレーター配列に隣接している。いくつかの実施形態では、レポーターは、５’および／または３’末端でインスレーター配列に隣接している。いくつかの実施形態において、レポーター遺伝子は、５’末端のみまたは３’末端のみで隣接している。いくつかの実施形態では、レポーター遺伝子は、３’末端でインスレーターに隣接していない。いくつかの実施形態では、レポーター遺伝子は、５’末端でインスレーターに隣接していない。いくつかの実施形態において、レセプター遺伝子は、５’末端のみまたは３’末端のみで隣接している。いくつかの実施形態において、レセプター遺伝子は、３’末端でインスレーターに隣接していない。いくつかの実施形態において、レセプター遺伝子は、５’末端でインスレーターに隣接していない。
【００１９】
いくつかの実施形態では、インスレーターはｃＨＳ４インスレーターを含む。いくつかの実施形態では、インスレーターは、
2020530281.tif 000004
または配列番号３またはその断片、例えば配列番号３の５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２０５、２１０、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、または２３１個の連続した核酸の断片と少なくとも、多くとも、または厳密に７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、または９９％同一である配列（またはその中の誘導可能な任意の範囲）を含む。
【００２０】
いくつかの実施形態において、インスレーターは、ショウジョウバエのジャイプシレトロトランスポゾンにおいて見出されるＣＴＣＦリプレッサーまたはジャイプシインスレーターによって調節されるＣＴＣＦインスレーターである。
【００２１】
いくつかの実施形態では、ベクターは、第２、第３、第４、または第５のバーコードを含む。いくつかの実施形態では、第２、第３、または第４のバーコードのうちの少なくとも１つは、アッセイ条件またはマイクロプレート上の位置の１つまたは複数に固有のインデックス領域を含む。アッセイ条件は、特定のリガンドの添加、特定の濃度のリガンドの添加、またはリガンドのバリアント、または代謝産物、小分子、ポリペプチド、インヒビター、リプレッサー、もしくは核酸の濃度もしくはバリアントを含み得る。いくつかの実施形態では、追加のバーコードを使用して、細胞がマイクロプレート上のどこに配置されたかを識別することができ、その結果、その特定の位置でのアッセイ条件を識別し、バーコードに接続することができる。
【００２２】
本開示のさらなる態様は、本開示の１つ以上のベクターまたは核酸を含むウイルス粒子に関する。
本開示のなおさらなる態様は、本開示の核酸、ベクター、またはウイルス粒子を含む細胞に関する。さらなる実施形態は、本開示のベクターの複数のコピーを含む細胞に関する。いくつかの実施形態では、細胞は、ベクターの少なくとも３つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ベクターの少なくとも４つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ベクターの少なくとも、多くとも、または厳密に３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、もしくは２０コピー（またはその中の誘導可能な任意の範囲）を含む。
【００２３】
いくつかの実施形態では、本開示の１つまたは複数の細胞は、１つまたは複数のアクセサリータンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のアクセサリータンパク質は、Ｇαサブユニット、Ｒｉｃ−８Ｂ、ＲＴＰ１Ｌ、ＲＴＰ２、ＲＴＰ３、ＲＴＰ４、ＣＨＭＲ３、およびＲＴＰ１Ｓの１つ以上を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のアクセサリータンパク質は、アレスチンタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のアクセサリータンパク質は、ＧｉまたはＧｑタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、アレスチンタンパク質は、プロテアーゼに融合される。いくつかの実施形態において、１つ以上のアクセサリータンパク質は、シャペロンタンパク質、Ｇタンパク質、およびグアニンヌクレオチド交換因子の１つ以上を含む。いくつかの実施形態において、アクセサリータンパク質は、細胞のゲノムに組み込まれる。本出願の実施例に示されるように、アクセサリー因子の安定な組み込みは、一過性発現と比較して、驚くほど良好な結果を提供する。いくつかの実施形態において、アクセサリータンパク質は、一過性に発現される。いくつかの実施形態では、細胞は、１つ以上のアクセサリー因子遺伝子をコードする１つ以上の外因性ヌクレオチドの安定な組み込みを含み、アクセサリー因子遺伝子は、ＲＴＰ１Ｓ、ＲＴＰ２、Ｇαサブユニット（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：２７７４）、またはＲｉｃ−８ｂ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ  ２３７４２２）を含む。
【００２４】
いくつかの実施形態では、細胞は、異種レセプター遺伝子から発現されるレセプタータンパク質をさらに含む。いくつかの実施形態では、レセプタータンパク質は、細胞内に局在する。いくつかの実施形態では、細胞は、異種レセプター遺伝子と少なくとも８０％同一であるタンパク質をコードする内因性遺伝子を欠いている。いくつかの実施形態では、細胞は、異種レセプター遺伝子と少なくとも、多くとも、または厳密に６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００％同一（またはその中の誘導可能な任意の範囲）であるタンパク質をコードする内因性遺伝子を欠いている。いくつかの実施形態では、レセプター遺伝子は、細胞のゲノムに組み込まれる。いくつかの実施形態において、誘導性レポーターは、細胞のゲノムに組み込まれる。いくつかの実施形態において、レセプター遺伝子および／または誘導性レポーターは、一過性に発現される。
【００２５】
いくつかの実施形態では、レセプター遺伝子および誘導性レポーターは、遺伝的に連結される。いくつかの実施形態において、レセプター遺伝子および誘導性レポーターは、遺伝的に連結されない。いくつかの実施形態では、レセプター遺伝子および誘導性レポーターは、細胞のゲノムに挿入され、互いに少なくとも１０、５０、１００、２００、５００、１０００、２０００、３０００、５０００、または１００００塩基対（ｂｐ）（またはその中の誘導可能な任意の範囲）内にあるか、またはそれらによって分離される。さらなる実施形態において、レセプター遺伝子および誘導性レポーターは、別個の遺伝子エレメント（例えば、別個の染色体および／または染色体外分子）上にある。
【００２６】
いくつかの実施形態では、組み込まれたレセプター遺伝子および／または誘導性レポーターは、標的指向させた組み込みによって細胞ゲノムに組み込まれる。いくつかの実施形態では、組み込まれたレセプター遺伝子および／または誘導性レポーターは、ゲノムにランダムに組み込まれる。いくつかの実施形態では、ランダム組み込みは、レセプター遺伝子および／または誘導性レポーターの転位を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、少なくとも２コピーのレセプター遺伝子および／または誘導性レポーターを含む。ランダム組み込みの他の方法では、ＤＮＡを細胞に導入し、組換えによってランダムに組み込むことができる。いくつかの実施形態では、組み込みは、Ｈ１１セーフハーバー遺伝子座への組み込みである。いくつかの実施形態では、組み込みは、Ｈ１１セーフハーバー遺伝子座への標的指向させた組み込みである。
【００２７】
いくつかの実施形態において、レセプター遺伝子は、構成的プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、レセプターの発現は構成的である。いくつかの実施形態では、レセプター遺伝子は、条件的プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、レセプターの発現は、条件的または誘導性である。いくつかの実施形態において、異種レセプター遺伝子は、誘導性プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、誘導プロモーターまたは条件的プロモーターは、テトラサイクリン応答エレメントである。
【００２８】
いくつかの実施形態では、異種レセプターの発現レベルは、生理学的に関連する発現レベルである。「生理学的に関連する発現レベル」という語は、細胞内のレセプターの内因性発現レベルに類似するまたは同等の発現レベルを指す。他の実施形態では、発現レベルは、生理学的に関連するレベル未満であってもよい。いくつかの実施形態において、バーコードを配列決定する感度は、より感度の低いアッセイに必要とされるものよりも低い発現レベルを可能にすることが企図される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写産物の濃度は、約１０、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、もしくは１０１０、あるいは、少なくともまたは多くとも約１０、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、もしくは１０１０、あるいはその中の誘導可能な任意の範囲である。
【００２９】
いくつかの実施形態では、細胞は凍結されている。いくつかの実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト胎児由来腎臓２９３Ｔ（ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞である。
【００３０】
さらなる態様は、本明細書中に記載される細胞または細胞の集団を含むアッセイシステムに関する。
【００３１】
さらなる態様は、リガンドおよびレセプターの結合についてスクリーニングするための方法に関し、この方法は、本発明の細胞をリガンドと接触させる工程；１つ以上のレポーターを検出する工程；および１つ以上のレポーターの同一性を決定する工程を包含し；ここで、レポーターの同一性は、結合したレセプターの同一性を示す。方法は、特定の期間内に、いくつかのレセプターおよび／またはいくつかのリガンドをスクリーニングする工程を含み得る。いくつかの実施形態では、単一のスクリーニングは、約、少なくとも約、または多くとも約１０、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、または１０１０種（またはその中の誘導可能な任意の範囲）の様々な細胞および／またはレセプターを、約、少なくとも約、または多くとも約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、４５００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、または１０１０種のリガンドまたは潜在的なリガンド（またはその中の誘導可能な任意の範囲）で、２、３、４、５、６、７日および／または１、２、３、４、５週および／または１、２、３、４、５、または６ヶ月（およびその中の誘導可能な任意の範囲）の態様にて、アッセイすることを含み、候補リガンドと細胞とが接触した場合にスクリーニングが開始され、配列決定されたバーコードによってレセプターが同定されると、スクリーニングは終了する。
【００３２】
いくつかの実施形態において、少なくとも３００種の異なる異種レセプターが、細胞の集団において発現される。いくつかの実施形態では、少なくとも２、５、１０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００種、またはそれ以上のレセプターが、細胞の集団において発現される。いくつかの実施形態では、細胞の集団は、少なくともまたは多くとも１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、または１０１２細胞（またはその中の誘導可能な任意の範囲）を含む。いくつかの実施形態では、細胞の集団は、１つの組成物中で共混合される。組成物は、細胞の懸濁組成物または細胞のプレート組成物であってもよい。いくつかの実施形態では、細胞の集団は、細胞培養皿などの基材に接着される。いくつかの実施形態において、細胞の集団は、基材の１つのウェル内または１つの細胞培養皿内に含まれる。
【００３３】
いくつかの実施形態では、レポーターの同一性を決定する工程は、細胞から核酸を単離することを含む。いくつかの実施形態では、核酸はＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、この方法は、単離されたＲＮＡに対して逆転写酵素反応を行ってｃＤＮＡを作製する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態では、方法は、単離された核酸を増幅する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、この方法は、単離された核酸を配列決定する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、逆転写酵素反応は、溶解物中で行われる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のレポーターを検出する工程は、１つまたは複数の細胞からの蛍光レベルを検出することを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、細胞をプレーティングする工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、細胞は、９６ウェル細胞培養プレート上にプレーティングされる。いくつかの実施形態において、細胞は凍結されており、この方法は、凍結された細胞を解凍する工程をさらに含む。
【００３４】
本発明の特定の態様は、以下の工程を含む、リガンドおよびレセプターの結合についてスクリーニングするための方法に関する:細胞の集団をリガンドと接触させる工程であって、細胞の集団の各細胞は、（ｉ）異種レセプター遺伝子と、（ｉｉ）レセプター応答性エレメントを含む誘導性レポーターとを含み、レポーターの発現は、レセプター遺伝子によってコードされるレセプターの活性の活性化に依存し、レポーターは、異種レセプター遺伝子に固有のインデックス領域を含むバーコードを含み、細胞の集団は、異種レセプター遺伝子に由来する少なくとも２つの異なるレセプターを発現し、各単一細胞は、１つの特定の異種レセプターの１つ以上のコピーおよび１つの特定のレポーターの１つ以上のコピーを有する、工程; １つ以上のレポーターを検出する工程; １つ以上のレポーターの同一性を決定する工程であって、レポーターの同一性が、結合したレセプターの同一性を示す、工程。
【００３５】
方法はさらに、スクリーニングにおいて同定された任意のレセプターを細胞中で発現させる工程を含む。レセプターは、精製または単離され得る。１つ以上の同定されたレセプターもまた、クローニングされ得る。次いで、それを発現のために異なる宿主細胞にトランスフェクトすることができる。
【００３６】
さらなる態様は、少なくとも２つの異なるベクターを含むベクターライブラリーに関し、ここで、ベクターは、異なる異種レセプター遺伝子および異なる誘導性レポーターを含む。ベクターは、本明細書中に記載されるベクターであり得る。さらなる態様は、本開示の細胞の集団を含む細胞ライブラリーに関する。さらなる態様は、本開示の少なくとも２つのウイルス粒子を含むウイルスライブラリーに関し、ここで、ウイルス粒子は、異なる異種レセプター遺伝子および異なる誘導性レポーターを含む。
【００３７】
さらなる態様は、レセプタータンパク質を含む細胞のライブラリーを作製するための方法に関し、この方法は、（ｉ）細胞中で本開示の核酸またはベクターを発現させる工程、または（ｉｉ）細胞を本開示のウイルス粒子に感染させる工程を包含し；ここで、細胞は、異なる異種レセプターを発現し、各単一の細胞は、１つの特定の異種レセプターの１つ以上のコピーおよび１つの特定のレポーターの１つ以上のコピーを有する。各細胞は、異種レセプター遺伝子および／または誘導性レポーターの少なくとも、多くとも、または厳密に１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０コピー（またはその中の誘導可能な任意の範囲）を有し得る。特定の実施形態では、細胞は、レセプター遺伝子および／または誘導性レポーターをコードする核酸の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０コピー（またはその中の誘導可能な任意の範囲）を含む。
【００３８】
さらなる態様は、本明細書に記載のベクター、細胞、核酸、ライブラリー、プライマー、プローブ、配列決定試薬および／または緩衝液を含むキットに関する。
【００３９】
さらなる態様は、（ｉ）誘導性プロモーターに作動可能に連結された異種レセプター遺伝子；および（ｉｉ）レセプター応答性エレメントを含むレポーターであって、レポーターの発現は、異種レセプター遺伝子によってコードされるレセプターの活性の活性化に依存し、レポーターは、異種レセプター遺伝子に固有であるインデックス領域を含むバーコードを含む、レポーターと、を含む核酸に関する。いくつかの実施形態では、核酸は、少なくとも２コピー〜少なくとも６コピーの核酸を含む。
【００４０】
「同等の核酸」という語は、核酸またはその相補体のヌクレオチド配列とある程度の相同性を有するヌクレオチド配列を有する核酸を指す。二本鎖核酸の相同体は、その相補体とある程度の相同性を有するヌクレオチド配列を有する核酸を含むことが意図される。一態様では、核酸の相同体は、核酸またはその相補体にハイブリダイズすることができる。本発明の核酸には、同等の核酸も含まれる。
【００４１】
ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドまたはポリペプチド領域）は、少なくとも、多くとも、または厳密に、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％（またはその中の誘導可能な任意の範囲）の、別の配列に対する「配列同一性」または「相同性」を有してもよく、これは、整列された場合、塩基（またはアミノ酸）の割合が、２つの配列を比較して同じであることを意味する。このアラインメントおよび相同性または配列同一性パーセントは、当該分野で公知のソフトウェアプログラム、例えば、Ausubel et al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biologyに記載のものを使用して決定され得る。
【００４２】
生物学的に同等のポリヌクレオチドは、特定の相同率を有し、同じまたは類似の生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【００４３】
「約」および「おおよそ」は、一般に、測定の性質または精度が与えられた場合に、測定される量について許容可能な程度の誤差を意味するものとする。典型的には、例示的な誤差の程度は、所与の値または値の範囲の２０パーセント（％）以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内である。あるいは、特に生物学的系において、用語「約」および「およそ」は、所定の値のオーダー内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内である値を意味し得る。いくつかの実施形態では、本明細書で論じる数値は、「約」または「およそ」という用語と共に使用することができることが企図される。
【００４４】
本明細書中で使用される場合、用語「含む」は、組成物および方法が列挙されたエレメントを含むが、他を排除しないことを意味することが意図される。組成物および方法を定義するために使用される場合、「本質的に構成する」は、記載された目的のための組み合わせに本質的な意義を有する他のエレメントを除外することを意味するものとする。本開示の医薬組成物の文脈における「本質的に構成する」は、列挙された全ての活性剤を含むことが意図され、任意の追加の列挙されていない活性剤を除外するが、活性成分ではない組成物の他の成分を除外しない。したがって、本質的に本明細書で定義されるエレメントからなる配合物は、単離および純化法からの微量汚染物質、ならびにリン酸緩衝生理食塩水、防腐剤などの薬学的に許容される担体を排除しない。「からなる」とは、他の成分の微量エレメントおよび本発明の組成物を投与するための実質的な方法工程、または組成物を生成するか、または意図された結果を達成するためのプロセス工程を超えるものを除外することを意味するものとする。これらの転移用語の各々によって定義される実施形態は、本発明の範囲内である。
【００４５】
用語「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、遺伝子産物または機能性タンパク質を指す場合、本明細書中で互換的に使用される。
【００４６】
用語「接触された」および「曝露された」は、細胞に適用される場合、本明細書中では、薬剤が標的細胞に送達されるか、または標的細胞もしくは標的分子と直接並置されるプロセスを記載するために使用される。
【００４７】
特許請求の範囲および／または本明細書において、用語「含む」と共に使用される場合の、語句「ａ」または「ａｎ」の使用は、「１つ」を意味し得るが、それはまた、「１つ以上」、「少なくとも１つ」および「１つまたはそれ以上」の意味と一致する。
【００４８】
本出願全体を通して、用語「約」は、値が、値を決定するために使用されている装置またはメソッドの誤差の標準偏差を含むことを示すために使用される。
【００４９】
特許請求の範囲における用語「または」の使用は、代替物のみを指すことが明示的に示されない限り、または代替物が相互に排他的である場合を除き、「および／または」を意味するために使用されるが、本開示は、「および／または」と同様に代替物のみを指す定義をサポートする。本明細書中で使用される場合、「別の」は、少なくとも第２またはそれ以上を意味し得る。
【００５０】
本明細書および特許請求の範囲で使用されるように、用語「含む（comprising）」（および「含む（comprises）」および「含む（comprise）」などの任意の形成を備える）、「有する」（ならびに「有する」および「有する」などの任意の形成を有する）、「含む（including）」（ならびに「含む（include）」および「含む（includes）」などの任意の形成を含む）または「含む（containing）」（ならびに「含む（contain）」および「含む（contains）」などの任意の形成を含む）は、包括的またはオープンエンドであり、追加の、認識されていないエレメントまたは方法ステップを排除しない。用語「含む（comprising）」で示される任意の実施形態はまた、「含む（comprising）」の代わりに「からなる（consisting）」という単語で置き換えられてもよいことが企図される。
【００５１】
本明細書で説明される任意の方法または組成物は、本明細書で説明される任意の他の方法または組成物に関して実施することができ、異なる実施形態を組み合わせることができることが企図される。
【００５２】
１つ以上の組成物の使用は、本明細書中に記載される方法に基づいて使用され得る。１つ以上の組成物の使用は、本明細書中に記載される方法に従う処置のための薬物の調製において使用され得る。他の実施形態は、本出願全体にわたって論じられる。本開示の１つの態様に関して論じられた任意の実施形態は、本開示の他の態様にも適用され、逆もまた同様である。実施例のセクションにおける実施形態は、本明細書に記載される技術のすべての態様に適用可能な実施形態であると理解される。
【００５３】
本発明の他の目的、特徴および利点は以下の詳細な記載から明らかとなるであろう。しかしながら、詳細な説明および具体例は、本発明の好ましい態様を示してはいるが、それらは例示としてのみ提示されていることを理解すべきである。なぜなら、本発明の趣旨および範囲内の種々の変更および改変は、この詳細な説明から、当業者には明らかだからである。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
添付の図面は本明細書の一部を掲載し、本発明のある態様をさらに示すために含まれる。本発明は、ここに提示される特別な具体例の詳細な記載と組み合わせてこれらの図面の１以上を参照することによって良好に理解されるであろう。
【００５５】
【図１】多重化レポータースキームの概要。多重化スキームを詳細に示す図である。ＯＲライブラリーのバーコード化戦略を詳細に示す図。各ＯＲは、レポーター遺伝子の３’ＵＴＲにおける固有のバーコードに連結される。Ｍｕｋｋｕ３ａ細胞に各ＯＲをクローン的に組み込み、これをプールし、そして臭気物質誘導のために播種する。誘導後、バーコード化された転写物を配列決定し、定量して、それぞれの臭気物質−レセプター対についての相対親和性を決定する。
【図２】個々の細胞株Ｌｕｃ／ＲＮＡおよびパイロットスクリーニング。ａ）安定な細胞株についての個々のＬｕｃを示す。ｂ）安定な細胞株についての個々のＲＮＡを示す。ａ）Ｍｕｋｋｕ３ａ細胞におけるｃＡＭＰ応答性ルシフェラーゼ遺伝子レポーターを介して測定した既知のリガンドを用いた、個々の安定なＯＲ活性化。ｂ）Ｍｕｋｋｕ３ａ細胞におけるバーコード化された遺伝的レポーターのＱ−ＲＴＰＣＲを介して測定された既知のリガンドによる個々の安定なＯＲ活性化。
【図３】組み合わされた遺伝子レポーター 対 別々の遺伝子レポーター。ａ）組み合わせ 対 別々の概略。ｂ）別々 対 組み合わせの一時的データ。ａ）ＯＲおよびレポーターを別々におよび一緒にコードするためのプラスミド構成。ｂ）一過性のＯＲ活性化（ＭＯＲ４２−３およびＭＯＲ９−１）と既知のリガンドとの比較は、別々の構成および組み合わされた構成において、ｃＡＭＰ応答性ルシフェラーゼ遺伝子レポーターを介して測定した。
【図４Ａ】ランディングパッド。ａ）Ｂｘｂ１、ｂ）組み込み効率、ｃ）Ｂ２およびＯＲ組み込みルシフェラーゼの模式図。ａ）ランディングパッドへのＢｘｂ１の再結合の模式図。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、セーフハーバー遺伝子座Ｈ１１（Ｍｕｋｋｕ１ａ細胞）のランディングパッドの単一コピーを含むように予め操作した。ランディングパッドは、Ｂｘｂ１リコンビナーゼ認識部位ａｔｔｐを含む。リコンビナーゼと、対応するａｔｔｂ認識部位を含むプラスミドとの同時発現は、単一の不可逆的な部位特異的組み込み事象をもたらす。この組み込みストラテジーは、単一のポットにおける不均一ライブラリーのクローン組み込みを可能にする。ｂ）フローサイトメトリーを用いたＢｘｂ１ランディングパッドの統合効率の評価。細胞を、リコンビナーゼを発現するプラスミド、および組み込み時にｍＣｈｅｒｒｙを条件的に発現するプラスミド、ならびにｍＣｈｅｒｒｙプラスミドのみで同時トランスフェクトした。複数継代後、リコンビナーゼでトランスフェクトされた細胞の７〜８％も蛍光性であり、リコンビナーゼを含まない細胞は蛍光性ではなかった。ｃ）ＯＲ（ＭＯＲ４２−３）およびβ−２アドレナリンレセプター（ＡＤＲＢ２）をコードする組み合わされた遺伝子レポーターを、ランディングパッドに組み込んだ。両方を既知のアゴニストで誘導し、遺伝的レポーター活性化をルシフェラーゼアッセイで測定した。用量依存性の活性化がＡＤＲＢ２で観察されたが、ＭＯＲ４２−３では観察されなかった。
【図４Ｂ】図４Ａの説明を参照されたい。
【図４Ｃ】図４Ａの説明を参照されたい。
【図５】誘導性方式。ａ）概要、ｂ）一過性のおよび組み込まれた誘導性。ａ）逆テトラサイクリントランスアクチベーター（ｍ２ｒｔＴＡ）を構成的に発現するようにＭｕｋｋｕ１ａ細胞を形質導入し、ＯＲ発現を駆動する構成的プロモーターをテトラサイクリン調節プロモーターで置き換えた。（テトラサイクリン応答性ＧＦＰは、ドキシサイクリンの添加によりランディングパッドにおける発現を確認するために組み込まれた）ｂ）誘導性の組み合わされた遺伝子レポーターは、ＯＲ活性化について一時的にスクリーニングされ、Ｍｕｋｋｕ２ａ細胞のランディングパッドに組み込まれた。ＭＯＲ４２−３の一過性の活性化は、臭気物質で刺激された場合にｄｏｘの存在下で観察されたが、ランディングパッドに組み込まれた場合には観察されなかった。部分ｂの各濃度の上のバーは、−Ｄｏｘ（左バー）および＋Ｄｏｘ（右バー）を表す。
【図６】コピー数。ａ）トランスポゾン方式、ｂ）構成的トランスポゾン、ｃ）誘導性トランスポゾン、ｄ）ＱＰＣＲ。ａ）トランスポゾンの模式図。ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼは、中間末端反復に隣接する組み合わされた遺伝的レポーターを切り出す。次いで、この配列の複数のコピーを、ゲノムを横切るＴＴＡＡ遺伝子座に挿入する。ｂ）Ｍｕｋｋｕ１ａ細胞において構成的発現下で転位された場合、ＭＯＲ４２−３は、リガンドに対する用量応答性ルシフェラーゼ産生を示さない。ｃ）誘導性発現下でＭｕｋｋｕ２ａに転位させた場合、ＭＯＲ４２−３は、ドキシサイクリンの存在下でリガンドに対する強い用量応答性ルシフェラーゼ産生を示す。部分ｃの各濃度の上のバーは、−Ｄｏｘ（左バー）および＋Ｄｏｘ（右バー）を表す。ｄ）ゲノムＤＮＡのＱＰＣＲによりトランスポゾンのコピー数を、３つの異なるＯＲのトランスポゾンについて決定した。絶対コピー数は、ランディングパッド中のクローン的に組み込まれた遺伝子レポーターと比較して、トランスポゾンのＣｑを比較することによって決定した。部分ｄのバーは、（左から右へ）対照、ＭＯＲ２０３−１、ＭＯＲ９−１、およびＯｌｆｒ６２を表す。
【図７】ａ）トランスＡＦ、ｂ）クローン選択。ａ）アクセサリー因子ＲＴＰ１ＳおよびＲＴＰ２の存在下または非存在下で、組み合わされたルシフェラーゼ遺伝子レポーターを介して測定した既知のリガンドとの一過性ＯＲ活性化（Ｏｌｆｒ６２およびＭＯＲ３０−１）の比較。ｂ）Ｍｕｋｋｕ２ａ細胞を、誘導性発現により調節される４つのアクセサリー因子（ＲＴＰ１Ｓ、ＲＴＰ２、Ｇαｏｌｆ、およびＲｉｃ８ｂ）で転位させた。個々のクローンを単離し、アクセサリー因子発現について機能的に評価した。クローンを、別個のルシフェラーゼ遺伝子レポーターを介して既知のリガンドで一過性ＯＲ活性化（Ｏｌｆｒ６２およびＯＲ７Ｄ４）についてアッセイした。典型的な形態および増殖速度の両方について強い活性化を示したクローン（Ｍｕｋｋｕ３ａ）を、下流の適用について選択した。
【図８】ランディングパッド組み込み。
【図９】ゲノムに組み込まれた合成回路は、哺乳動物嗅覚レセプター活性化のスクリーニングを可能にする。ａ）操作されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞株における安定なＯＲ発現および機能のための合成回路の模式図。ｂ）ＭＯＲ４２−３レポーター活性化は、様々なコピー数で、構成的または誘導的発現下で、一過性またはゲノム的に組み込まれたレセプターを発現する。ｃ）Ｏｌｆｒ６２レポーター活性化は、アクセサリー因子を伴って／伴わず、そして操作された細胞株に一時的に発現／組み込まれる。ｄ）操作された細胞株に組み込まれたＯＲレポーター活性化の用量−応答曲線。
【図１０】嗅覚レセプター−臭気物質相互作用の大規模多重スクリーニング。ａ）ＯＲレポーター細胞株のライブラリーの作製および多重スクリーニングのための図式。ｂ）一過性またはゲノム統合ルシフェラーゼアッセイまたはプールＲＮＡ−ｓｅｑアッセイで試験した場合のＭＯＲ３０−１およびＯｌｆｒ６２レポーター活性化の比較。ｃ）スクリーニングからの全ての相互作用のヒートマップは、臭気物質およびレセプター応答の類似性によってクラスター化され、そしてレポーター活性を誘発した最低濃度によって着色された。ｄ）４つのＯＲ（ブラック）について同定されたヒットは、本発明者らの臭気物質パネル（灰色）の化学空間のＰＣＡ突起部上にマッピングされた。
【図１１】安定な機能的ＯＲ発現のためのＨＥＫ２９３細胞の操作。ａ）Ｈ１１ゲノム遺伝子座において一過性にトランスフェクトされたか、または単一コピーで組み込まれた、誘導的に駆動されるレセプター発現からのＭＯＲ４２−３活性化の比較。Ｂ．ＭＯＲ４２−３を有する細胞からの活性化は、構成的または誘導的発現のいずれかの下で、ゲノム中に複数のコピーで組み込まれた。ｃ）単一コピー組込み体と比較した３つの転置ＯＲについてｑＰＣＲを用いて決定された相対レセプター／レポーターＤＮＡコピー数。ｄ）アクセサリー因子（ＡＦ）Ｇαｏｌｆ、Ｒｉｃ８ｂ、ＲＴＰ１Ｓ、およびＲＴＰ２を伴って、または伴わずに、ＭＯＲ３０−１およびＯｌｆｒ６２活性化（それぞれデカン酸および２−クマラノンで刺激）を同時トランスフェクトした。ｅ）安定なアクセサリー因子発現のための細胞株生成。トランスフェクション後、クローンを単離し、機能的に発現するためにアクセサリー因子を必要とするＯＲ、Ｏｌｆｒ６２およびＯＲ７Ｄ４の活性化についてスクリーニングした。濃い灰色のバーは、さらなる実験のために選択されたクローンを表す。
【図１２】ＯＲ活性化のための多重遺伝子レポーターの設計。ａ）組込みのためのＯＲ発現カセットおよび遺伝子レポーターを含むベクターの模式図。ｂ）レセプターカセットを別々のプラスミド上または一緒に一時的に共発現する細胞におけるＭＯＲ４２−３レポーター活性化。ｃ）ＰｒｏｍｅｇａのｐＧＬ４．１９ＣＲＥエンハンサーと比較した、操作されたＣＲＥエンハンサーの活性化倍率。ｄ）ＣＲＥエンハンサーの上流にＤＮＡインスレーターを有するかまたは有さない誘導性ＯＲプロモーターの誘発時の遺伝子レポーターの基礎活性化。
【図１３】操作された細胞株における合成的な有機活性化回路の模式図。図９に示され、実施例２に記載されるように、ＯＲおよびバーコード化されたレポーターシステムの発現／シグナル伝達のための発現された成分の完全なグラフ表示。レセプターの表現は、Ｔｅｔ−Ｏｎシステムによって制御される。ドキシサイクリン誘導後、ＯＲは、２つの外因的に発現されたシャペロン、ＲＴＰ１ＳおよびＲＴＰ２の助けを借りて、細胞表面上で発現される。臭気物質が活性化されると、ｇタンパク質シグナル伝達がｃＡＭＰ産生を誘発する。シグナル伝達は、天然ＯＲ Ｇアルファサブユニット、Ｇｏｌｆ、およびその対応するＧＥＦ、Ｒｉｃ８ｂのトランスジェニック発現によって増大する。ｃＡＭＰは、転写因子ＣＲＥＢをリン酸化するキナーゼＰＫＡの活性化をもたらし、バーコード化されたレポーターの発現をもたらす。
【図１４Ａ】マルチプレックスにおける臭気物質応答のパイロットスケール再現。ａ）４０個のプールされたレセプターを示すヒートマップは、９種の臭気物質および２種の混合物に応答する。相互作用は、遺伝子レポーターのｌｏｇ２倍活性化によって着色される。以前に同定された臭気物質相互作用（Ｓａｉｔｏら、２００９）は、黄色で囲まれている。ｂ）５つの濃度でＯＲライブラリーに対してスクリーニングした臭気物質またはフォルスコリン（アデニル酸シクラーゼ刺激物質）の用量応答曲線。臭気物質と相互作用することが知られているＯＲの曲線は着色されている。ホルスコリンによる刺激は、本発明者らのアッセイにおいて、ＯＲ間で実質的な示差活性を示さない。
【図１４Ｂ】図１４Ａの説明を参照されたい。
【図１５】ライブラリー表示。ＯＲライブラリーにおける個々のＯＲの表示。ａ）ＤＭＳＯと共にインキュベートした各レポーターの相対活性化によって決定されるライブラリーの分率としての各ＯＲの頻度。ｂ）ライブラリー中のそれぞれのＯＲの頻度と、すべての条件についてのレポーター活性化の生物学的複製測定値間の平均変動係数との間の関係。
【図１６】大規模多重画面の再現性。ａ）ヒストグラムは、ＤＭＳＯで刺激された場合のＯＲライブラリーの変動係数の分布を示す。ｂ）アッセイしたすべての条件について、ＯＲライブラリーの変動係数の分布を示すヒストグラム。ｃ）アッセイした各９６ウェルプレートに含まれる制御臭気物質の用量−応答曲線。それぞれの色彩は、異なった板を表す。
【図１７】ハイスループットアッセイデータの有意性と倍変化、ａ）ＦＤＲ（False Discovery Rate）‐負の二項仮定を使用した一般化線形モデルから計算され、その後、複数の仮説が修正され、各ＯＲ‐臭気物質相互作用の倍率変化に対してプロットされた。破線は、１％ＦＤＲを表し、相互作用を同定するために使用される保存的カットオフである。ｂ）個々の直交ルシフェラーゼアッセイ色彩のために選択される相互作用のサブセットは、相互作用が検出されたかどうかを示す。１％ＦＤＲを超える２８種の相互作用のうちの２１種もまた、直交フォローアップアッセイにおいて相互作用を示した。
【図１８−１】一時的直交系におけるスクリーニングの再現。ルシフェラーゼ読み出しを用いた、単一嗅覚レセプターを発現する細胞株に対する化学物質の二次スクリーニング。各プロットは、ＯＲを発現しないが着臭剤で処理された陰性対照細胞株（黒線）、ならびに特異的ＯＲを発現する細胞株の挙動を示す。さらに、高スループット配列決定スクリーニング（Ｓｅｑとラベル付けされた）からのデータを、参照のためにプロットする。
【図１８−２】図１８−１の続きを示す図である。
【図１８−３】図１８−２の続きを示す図である。
【図１８−４】図１８−３の続きを示す図である。
【図１９】以前にスクリーニングされた臭気物質−レセプター対とのアッセイの一致。ａ）Saito et al.が以前にテストした５４０種の臭気‐ＯＲ相互作用について、ＦＤＲを倍数インダクションとプロットした。点は、Saito et al.（2009）によって同定された相互作用のＥＣ５０によって着色される。灰色の点は、前のスクリーニングで識別されなかった相互作用を表す。一過性のルシフェラーゼアッセイと統合されたルシフェラーゼアッセイとを比較すると、場合によっては、統合されたシステムは、有意な活性化を達成するために、おそらくＣＲＥ駆動ルシフェラーゼおよびレセプターのより低いＤＮＡコピー数のために、より高い濃度の臭気物質を必要とすることが明らかになった。アッセイした臭気物質の最高濃度は１ｍＭであったので、このスクリーニングでは低親和性相互作用は検出できなかったかもしれない。ｂ）アッセイにおけるＦＤＲは、多重化スクリーニングからの倍活性化によって着色された前のスクリーニングからのヒットのＥＣ５０に関連した。
【図２０】レセプターに対する臭気物質応答のクラスター化。ここでは、図２０と同じ座標上に、試験した他の化学物質（灰色）に対する任意のヒット（ブラック）の位置をプロットする。これは、より大きな化学物質空間に関する所与のＯＲの活性の幅の可視化を提供する。
【図２１】深い変異走査の概要を示す。
【図２２】ライブラリー活性の分布。
【図２３】０．６２５ｕＭイソプロテレノールにおけるβ２のバリアント活性ランドスケープ。
【図２４】個々にアッセイした変異体との比較
【図２５】リガンド相互作用サイト。
【図２６】ｋは、クラスタリングを意味する。
【図２７】Ａ）Ｂｘｂ１組換えが、細胞当たり１つの構築物のみが挿入されることを確実にするための試験（細胞は、赤色または緑色のみである）の文脈において、どのように機能するかの図である）。Ｂ）２つの色彩試験の流れの結果。Ｃ）ＫＯまたは野生型細胞における、Ｂ２アゴニスト、イソプロテレノールで刺激された場合のレポーターの活性。Ｄ）単一コピー遺伝子座に遺伝子導入Ｂ２を付加すると、Ｂ２活性Ｅ）を読み取る能力を回復させることができ、ＲＮＡレベルでも低下させることができ、インスレーターエレメントで倍数活性化が改善される。
【図２８】Ｈ１１遺伝子座に挿入されているＢ２構築物の図。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
例示的態様の説明
ブルートフォース化学的スクリーニングは、かなりの財政的コスト、スケーリング問題を有し、嗅覚レセプターなどのいくつかのレセプターの場合、スクリーニングはまた、信頼できない機能的発現に悩まされる。最近、ヒトレセプターの包括的嗅覚スクリーニングを実施するための大規模な努力が、７３種の臭気物質にわたって３９４種のＯＲをアッセイした。研究者らは、一過性トランスフェクションと組み合わせて、機能的ＯＲ発現に必要な全ての因子の発現を可能にする細胞株を構築した。一過性にトランスフェクトされたＯＲの活性化は、ルシフェラーゼレポーター発現をもたらし、これは、マルチウェルプレートにおいてアッセイすることができる。このスクリーニングは、５０，０００を超える個々の測定を必要とし、長年を要した。この研究は、単独で、既知数のリガンド−レセプター結合対を２倍にし、２７個のヒトＯＲレセプターをそれらの化学リガンドにマッピングした。このアプローチの成功にもかかわらず、この比較的小さな化学的スクリーニングを実施するために必要とされる規模は、全ての化合物が、数百のＯＲにわたる濃度範囲で試験されなければならず、各試験が別々の一過性トランスフェクションを必要とするので、非常に大きかった。したがって、このような方法は、本開示の方法のタイプにスケーリングする機会がほとんどない。
【００５７】
本開示の方法は、本明細書中に記載される検出方法を使用して、マルチプレックスにおけるそれらの活性について報告し得る、細胞株内に含まれるレセプターの大きなライブラリーの構築を記載する。この自動化可能な特徴付けプラットホームを用いて、現行の方法を使用して、以前に実施されたよりはるかに大きいスケールで、リガンドおよびレセプター結合を調査することができる。アッセイおよび方法は、薬物発見および試験において多数の用途を有することができる。
【００５８】
Ｉ．レセプターおよび誘導性レポーターエレメント
本開示の現方法、核酸、ベクター、ウイルス粒子、および細胞は、リガンドが係合すると、レセプター応答性エレメントを介してレポーターの転写を誘導するレセプタータンパク質に関する。従って、レポーターは、レセプタータンパク質の直接的な制御下にあるか、またはレセプタータンパク質によって間接的に制御されるかのいずれかである。「レセプター応答性エレメント」という語は、レセプターによって結合される誘導性レポーターのプロモーター領域におけるエレメント、またはレセプターおよびリガンドの係合後のレセプターの下流エレメントをいう。いくつかの実施形態では、レセプタータンパク質は、Ｇタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）であるか、またはレセプター遺伝子は、ＧＰＣＲをコードする。Ｇタンパク質結合レセプター（ＧＰＣＲ）は、広範な種々の正常な生物学的プロセスを調節し、そしてそれらの下流シグナル伝達活性の調節不全に際して、多くの疾患の病態生理学において役割を果たす。ＧＰＣＲのリガンドには、神経伝達物質、ホルモン、サイトカイン、および脂質シグナル伝達分子が含まれる。ＧＰＣＲは、視覚、嗅覚、自律神経系、および行動などの多種多様な生物学的プロセスを調節する。その細胞外リガンドの他に、それぞれのＧＰＣＲは、下流のシグナル伝達経路を活性化するＧ−アルファ、Ｇ−ベータ、およびＧ−ガンマサブユニットからなる特異的な細胞内ヘテロ三量体Ｇタンパク質に結合する。これらの細胞内シグナル伝達経路には、ｃＡＭＰ／ＰＫＡ、カルシウム／ＮＦＡＴ、ホスホリパーゼＣ、プロテインチロシンキナーゼ、ＭＡＰキナーゼ、ＰＩ−３−キナーゼ、一酸化窒素／ｃＧＭＰ、Ｒｈｏ、およびＪＡＫ／ＳＴＡＴが含まれる。ＧＰＣＲ機能またはシグナル伝達の破壊は、神経障害から免疫障害、ホルモン障害に至るまで、それらのリガンドおよびそれらが調節する工程に応じて変化する病理学的状態に寄与する。ＧＰＣＲは、全ての現在の薬物開発標的の３０％を占める。薬物スクリーニングアッセイを開発するには、選択された細胞ベースのモデルシステムにおける標的および関連するＧＰＣＲ発現および機能の両方、ならびに直接的および潜在的なオフターゲット副作用の両方を評価するための関連するＧＰＣＲの発現の調査が必要である。
【００５９】
レセプターシグナル伝達およびレセプターによってもたらされる転写調節の広範な知識に基づいて、レセプター遺伝子／レセプター応答性エレメントを構築することは、当業者の技術範囲内である。
【００６０】
ＧＰＣＲでは、誘導性レポーターは、リガンド係合によるＧＰＣＲシグナル伝達活性化時にレポーターの転写活性を指令する反応エレメントを含む。ＧＰＣＲ応答エレメントには、ｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）、活性化Ｔ細胞応答エレメントの核因子（ＮＦＡＴ−ＲＥ）、血清応答エレメント（ＳＲＥ）および血清応答因子応答エレメント（ＳＲＦ−ＲＥ）が含まれる。ＧＰＣＲはさらにＧｓ、Ｇｉ、Ｇｑ、Ｇ１２に分類できる。レセプター遺伝子／タンパク質および応答エレメントの例を以下の表に示す。
2020530281.tif 000005
【００６１】
ＧｏｌｆまたはＧ嗅覚レセプターはＧＳ  ＧＰＣＲであり、そのシグナル伝達によりＡＴＰがｃＡＭＰに変換される。次いで、ｃＡＭＰは、ＣＲＥ応答エレメントを介して転写を指向する。典型的な嗅覚レセプターには、以下の表に示すものが含まれる。
【００６２】
嗅覚レセプター、ファミリー１：
2020530281.tif 000006
2020530281.tif 000007
2020530281.tif 000008
2020530281.tif 000009
【００６３】
嗅覚レセプター、ファミリー２：
2020530281.tif 000010
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2020530281.tif 000012
2020530281.tif 000013
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2020530281.tif 000017
2020530281.tif 000018
【００６４】
嗅覚レセプター、ファミリー３：
2020530281.tif 000019
【００６５】
嗅覚レセプター、ファミリー４：
2020530281.tif 000020
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【００６６】
嗅覚レセプター、ファミリー５：
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【００６７】
嗅覚レセプター、ファミリー６：
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【００６８】
嗅覚レセプター、ファミリー７：
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【００６９】
嗅覚レセプター、ファミリー８：
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【００７０】
嗅覚レセプター、ファミリー９：
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【００７１】
嗅覚レセプター、ファミリー１０：
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【００７２】
嗅覚レセプター、ファミリー１１：
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【００７３】
嗅覚レセプター、ファミリー１２：
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【００７４】
嗅覚レセプター、ファミリー１３：
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【００７５】
嗅覚レセプター、ファミリー１４：
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【００７６】
嗅覚レセプター、ファミリー５１：
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【００７７】
嗅覚レセプター、ファミリー５２：
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【００７８】
嗅覚レセプター、ファミリー５５：
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【００７９】
嗅覚レセプター、ファミリー５６：
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【００８０】
本開示の方法および組成物による異種レセプターとして有用なさらなる例示的なレセプター遺伝子／タンパク質は、以下の表に列挙されるものなどのレセプターを含む。
【００８１】
ＧＰＣＲレセプター
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【００８２】
核ホルモンレセプター
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【００８３】
触媒レセプター
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【００８４】
リガンドは、レセプターまたは試験化合物のための既知のリガンドであってもよい。例えば、嗅覚レセプターのケースでは、リガンドは臭気物質であってもよい。例示的な臭気物質には、酢酸ゲラニル、ギ酸メチル、酢酸メチル、プロピオン酸メチル、プロパン酸メチル、酪酸メチル、ブタノ酸メチル、酢酸エチル、酪酸エチル、ブタノ酸エチル、酢酸イソアミル、酪酸ペンチル基、ブタノ酸ペンチル基、ペンチル基ペンタノエート、酢酸オクチル、酢酸ベンジル、およびアントラニル酸メチルが含まれる。
【００８５】
いくつかの実施形態では、リガンドは、小分子、ポリぺプチド、または核酸リガンドを含む。本発明の方法は、レセプターとのリガンド結合を検出するスクリーニング手順に関する。したがって、リガンドは、試験化合物または薬物であってもよい。本発明の方法は、リガンド／医薬効力および／またはオフターゲット効果を決定する目的で、リガンドおよびレセプターの係合を決定するために利用され得る。ポリペプチドリガンドは、長さが１００アミノ酸未満であるペプチドであってもよい。
【００８６】
化学薬品は、典型的には、１０，０００Ｄａ未満の分子量を有する有機非ペプチド分子である「小分子」化合物である。いくつかの実施形態では、それらは、５，０００Ｄａ未満、１，０００Ｄａ未満、または５００Ｄａ未満（およびその中の誘導可能な任意の範囲）である。このクラスのモジュレーターは、化学的に合成された分子、例えば、コンビナトリアル化学ライブラリーからの化合物を含む。合成化合物は、本明細書中に記載されるスクリーニング方法から合理的に設計または同定され得る。小分子を生成し、獲得する方法は、当業者によく知られている（Schreiber、Science 2000； 151：1964〜1969; Radmann et al.、Science 2000； 151：1947〜1948、本明細書にて参照により組み込まれる）。
【００８７】
ＩＩ．レポーターシステム
Ａ．核酸レポーター
レポーターは、活性化レセプターを同定することができるインデックス領域を含むバーコード領域を含む。インデックス領域は、少なくとも、多くとも、または厳密に５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００またはそれ以上（またはその中の誘導可能な任意の範囲）のヌクレオチド長のポリヌクレオチドであり得る。バーコードは、１つ以上のユニバーサルＰＣＲ領域、アダプター、リンカー、またはそれらの組み合わせを含み得る。
【００８８】
バーコードのインデックス領域は、利用されるスクリーニングの文脈において特定の異種レセプターに独特であるため、バーコードと同じ細胞において活性化および／または発現される異種レセプターを同定するために使用され得るポリヌクレオチド配列である。細胞の集団に関する実施形態において、バーコードの同一性の決定は、どのレセプターが細胞の集団において活性化されたかを同定するために、インデックス領域のヌクレオチド配列を決定することによって行われる。本明細書中で議論されるように、方法は、１つ以上のインデックス領域を配列決定すること、または配列決定されたこのようなインデックス領域を有することを含み得る。
【００８９】
核酸構築物は、ポリメラーゼおよび固体状態核酸合成（例えば、カラム、マルチウォールプレート、またはマイクロアレイ上）の使用を含む、当該分野で公知の任意の手段によって生成される。本発明は、活性化されたレセプターのインデックスであり得る特異的核酸調節エレメント（すなわち、レセプター応答エレメント）の活性の決定を容易にするためのバーコードの介在物を提供する。これらのバーコードは、核酸構築物および核酸調節エレメントを含む発現ベクターに含まれる。バーコードの各インデックス領域は、対応する異種レセプター遺伝子に固有である（すなわち、特定の核酸調節エレメントは、２つ以上のバーコードまたはインデックス領域（例えば、２、３、４、５、１０、またはそれ以上）を有し得るが、各バーコードは、単一のレセプターの活性化を示す）。これらのバーコードは、関連するオープンリーディングフレームと同じｍＲＮＡ転写物中で転写されるように、発現ベクター中で配向される。バーコードは、ｍＲＮＡ転写物において、５’からオープンリーディングフレームへ、３’からオープンリーディングフレームへ、直ちに５’から末端ポリＡテールへ、またはその間のどこかに配向され得る。いくつかの実施形態において、バーコードは、３’非翻訳領域にある。
【００９０】
バーコードの固有の部分は、バーコード配列の長さに沿って連続的であってもよく、またはバーコードは、任意の１つのバーコードに固有ではない核酸配列の延伸を含んでもよい。１つの適用において、バーコードの固有の部分（すなわち、インデックス領域）は、ｍＲＮＡ（例えば、イントロン）への転写の間に細胞機構によって除去される核酸の延伸によって分離され得る。
【００９１】
誘導性レポーターは、プロモーターなどの調節エレメント、およびバーコードを含む。いくつかの実施形態では、調節エレメントは、オープンリーディングフレームをさらに含む。オープンリーディングフレームは、本明細書中に記載されるように、選択可能なマーカーまたはスクリーニング可能なマーカーをコードし得る。核酸調節エレメントは、５’、３’、またはオープンリーディングフレーム内であり得る。バーコードは、ｍＲＮＡに転写される領域内の任意の場所（例えば、オープンリーディングフレームの上流、オープンリーディングフレームの下流、またはオープンリーディングフレーム内）に位置し得る。重要なことに、バーコードは転写終結部位の５’に位置する。
【００９２】
バーコードおよび／またはインデックス領域は、定量的配列決定（例えば、Illumina（登録商標）シーケンサーを使用する）または定量的ハイブリダイゼーション技術（例えば、マイクロアレイハイブリダイゼーション技術またはLuminex（登録商標）ビーズシステムを使用する）を含む、当該分野で公知の方法によって定量または決定される。配列決定方法は、本明細書中にさらに記載される。
【００９３】
Ｂ．バーコードを検出するための配列決定方法
１．大規模並列シグネチャ配列決定（ＭＰＳＳ）。
次世代配列決定技術の最初のもの、大規模並列シグネチャ配列決定（すなわちMPSS）は、1990年代にLynx Therapeuticsで開発された。MPSSは、アダプター連結の複雑なアプローチを使用し、続いてアダプターを解読し、4ヌクレオチドずつ配列を読み取る、ビーズベースの方法であった。この方法は、配列特異的バイアスまたは特異的配列の損失を受けやすくした。この技術は非常に複雑であったので、MPSSは、Lynx Therapeuticsによって「社内」でのみ実施され、DNA配列決定機械は、独立した研究所に販売されなかった。Lynx Therapeuticsは、2004年にSolexa (後にIlluminaによって買収された）と合併し、Manteia Predictive Medicineから得られされたより単純なアプローチである合成による配列決定の開発につながり、ＭＰＳＳが旧式になった。しかし、ＭＰＳＳ出力の本質的な特性は、何十万もの短いＤＮＡ配列を含む、後の「次世代」データ型に典型的であった。ＭＰＳＳの場合、これらは、典型的には、遺伝子発現レベルの測定のためにｃＤＮＡを配列決定するために使用された。実際、強力なIllumina HiSeq2000、HiSeq2500、およびＭｉＳｅｑシステムは、ＭＰＳＳに基づいている。
【００９４】
２．Ｐｏｌｏｎｙ配列決定
ハーバードのGeorge M．Churchの研究室で開発されたＰｏｌｏｎｙ配列決定法は、最初の次世代配列決定システムの1つであり、２００５年に完全なゲノムを配列決定するために使用された。これは、インビトロ対タグライブラリーを乳剤ＰＣＲ、自動化マイクロスコープ、およびライゲーションベースの配列決定ケミストリーと組み合わせて、大腸菌ゲノムを＞９９．９９９９％の精度で配列決定し、サンガー配列決定の約１／９の費用を要した。この技術は、Agencourt Biosciencesにライセンス供与され、その後Agencourt Personal Genomicsにスピンアウトされ、最終的には、現在Life Technologiesが所有するApplied Biosystems SOLiDプラットホームに組み込まれた。
【００９５】
３．４５４パイロシークエンシング
パイロシークエンシングの並列バージョンは、454 Life Sciencesによって開発されたが、これは以来Roche Diagnosticsによって取得されている。該方法は、水滴中のＤＮＡをオイル溶液（乳剤ＰＣＲ）中で増幅し、各々の液滴は、単一のプライマー被覆ビーズに結合した単一のＤＮＡ鋳型を含み、次いで、クローンコロニーを形成する。配列決定機は、各々が単一のビーズおよび配列決定酵素を含む多くのピコリットル容積のウェルを含む。ピロシークエンシングは、ルシフェラーゼを使用して、新生ＤＮＡに付加された個々のヌクレオチドの検出のための光を生成し、そして組み合わされたデータは、配列読み出しを生成するために使用される。このテクノロジーは、一方の末端ではサンガー配列決定、他方の末端ではSolexaおよびSOLiD配列決定と比較して、中間の読み取り長さおよび塩基当たりの価格を提供する。
【００９６】
４．Illumina（Solexa）配列決定
現在、Illuminaの一部であるSolexaは、内部で開発した、可逆的色素−ターミネーター技術に基づく配列決定法、および操作されたポリメラーゼを開発した。終了した化学は、Solexaで内部的に開発され、Solexaシステムの概念は、ケンブリッジ大学の化学部門からBalasubramanianおよびKlennermanによって発明された。2004年、Solexaは、表面上のDNAのクローン増幅を含む「ＤＮＡクラスター」に基づく大規模並列配列決定技術を得るために、Manteia Predictive Medicine社を買収した。クラスター技術は、カリフォルニア州のLynx Therapeuticsと共同取得した。Solexa Ltd.は後にLynxと合併し、Solexa Inc.を設立した。
【００９７】
この方法において、ＤＮＡ分子およびプライマーは、最初にスライド上に付着され、そしてポリメラーゼで増幅され、その結果、局部クローンＤＮＡコロニー（後に、鋳造された「ＤＮＡクラスター」）が形成される。配列を決定するために、４種類のリバーシブルターミネーター塩基（ＲＴ−塩基）を付加し、取り込まれていないヌクレオチドを洗い流す。カメラで蛍光標識ヌクレオチドの画像を撮影し、次いで染料を末端３’ブロッカーと共にＤＮＡから化学的に除去し、次のサイクルを開始させる。パイロシークエンシングとは異なり、ＤＮＡ鎖は一度に１ヌクレオチド伸長され、画像取得は遅れた瞬間に実行され得、ＤＮＡコロニーの非常に大きなアレイが、単一のカメラから撮影された連続画像によって捕捉されることを可能にする。
【００９８】
酵素反応と画像捕捉の分離は、最適なスループットおよび理論的に無限の配列決定能力を可能にする。したがって、最適な構成では、最終的に到達可能な機器のスループットは、カメラのアナログ／デジタル変換レートにカメラの数を乗じ、それらを最適に視覚化するために必要なＤＮＡコロニー当たりのピクセル数で割ることによってのみ決定される（約１０ピクセル／コロニー）。２０１２年には、１０ＭＨｚを超えるＡ／Ｄ転化率で動作するカメラおよび利用可能な光学系、流体工学および酵素を用いて、処理量は、１００万ヌクレオチド／秒の倍数であり得、これは、おおよそ、１時間あたり１倍の被覆率での１つのヒトゲノム当量／機器、および１日あたり１つのヒトゲノム再配列決定（約３０倍）／機器（単一のカメラを装備）に対応する。
【００９９】
５．SOLiD配列決定
Applied Biosystemsの(現在はLife Technologies銘柄)SOLiD技術は、ライゲーションによる配列決定を用いる。ここで、固定長の全ての可能なオリゴヌクレオチドのプールは、配列決定された位置に従って標識される。オリゴヌクレオチドはアニーリングされ、ライゲーションされる；マッチング配列のためのＤＮＡリガーゼによる優先的ライゲーションは、その位置でのヌクレオチドの情報を与えるシグナルを生じる。配列決定の前に、該ＤＮＡを乳剤ＰＣＲにより増幅する。得られたビーズ（各々が同じＤＮＡ分子の単一コピーを含む）をスライドガラス上に置く。その結果、Illumina配列決定に匹敵する量および長さの配列が得られる。ライゲーション法によるこの配列決定は、配列決定パリンドローム配列のいくつかの問題を有することが報告されている。
【０１００】
６．Ion Torrent半導体配列決定
Ion Torrent Systems Inc.(現在、Life Technologiesによって所有されている）は、標準的な配列決定化学を使用するが、新規な半導体ベースの検出システムを有するシステムを開発した。この配列決定方法は、他の配列決定システムで使用される光学的方法とは対照的に、ＤＮＡの重合中に放出される水素イオンの検出に基づく。配列決定される鋳型ＤＮＡ鎖を含むマイクロウェルを、単一型のヌクレオチドで溢れさせる。導入されたヌクレオチドがリーディング鋳型ヌクレオチドに相補的である場合、それは成長する相補的ストランドに組み込まれる。これは、反応が起こったことを示す、過敏性イオンセンサーを誘発する水素イオンの放出を引き起こす。単独重合体の繰り返しが鋳型配列中に存在する場合、多数のヌクレオチドが単一周期で組み込まれる。これにより、対応する数の水素が放出され、それに比例して高い電子信号が得られる。
【０１０１】
７．ＤＮＡナノボール配列決定
ＤＮＡナノボール配列決定は、生物の全ゲノム配列を決定するために使用されるハイスループット配列決定技術の一種である。コンプリートゲノミクス社は、このテクノロジーを用いて、独立した研究者から提出された試料を配列決定する。この方法は、ローリングサークル複製を使用して、ゲノムＤＮＡの小さな断片をＤＮＡナノボールに増幅する。次いで、ライゲーションによる非鎖配列決定を使用して、ヌクレオチド配列を決定する。このＤＮＡ配列決定方法は、他の次世代配列決定プラットホームと比較して、１回のラン当たりおよび低い試薬コストで多数のＤＮＡナノボールが配列決定されることを可能にする。しかし、ＤＮＡの短い配列のみが、各ＤＮＡナノボールから決定され、これは、短い読み取りを参照ゲノムにマッピングすることを困難にする。この技術は、複数のゲノム配列決定プロジェクトのために使用されており、より多くのために使用される予定である。
【０１０２】
８．ヘリスコープ単一分子配列決定
ヘリスコープ配列決定は、Helicos Biosciencesによって開発された単一分子配列決定の方法である。それは、フローセル表面に付着したポリＡテールアダプターが付加されたＤＮＡ断片を使用する。次の工程は、蛍光標識ヌクレオチド（Ｓａｎｇｅｒ法と同様に、一度に１つのヌクレオチド型）を用いたフローセルの周期的洗浄による延ベースの配列決定を含む。読み取りは、ヘリスコープシーケンサによって実行される。読み取りは短く、１回のラン当たり５５塩基までであるが、最近の改良は、１種類のヌクレオチドの延伸のより正確な読み取りを可能にする。この配列決定方法および装置を用いて、Ｍ１３バクテリオファージのゲノムを配列決定した。
【０１０３】
９．単一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）配列決定
ＳＭＲＴ配列決定は、合成アプローチによる配列決定に基づく。ＤＮＡは、ゼロモード導波管（ＺＭＷ）−ウェルの底部に位置する捕捉ツールを有する小さなウェル様容器中で合成される。配列決定は、未修飾ポリメラーゼ（ＺＭＷ底部に付着）および溶液中を自由に流れる蛍光標識ヌクレオチドを用いて行う。ウェルは、ウェルの底部によって生じる蛍光のみが検出されるように構築される。蛍光標識は、ＤＮＡストランドへの取り込み時にヌクレオチドから分離され、未修飾ＤＮＡストランドを残す。Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＳＭＲＴ技術開発者）によれば、この方法論は、ヌクレオチド修飾（シトシンメチル化など）の検出を可能にする。これは、ポリメラーゼ動力学の観察を通して起こる。このアプローチは、５キロベースの平均読み取り長で、２０，０００ヌクレオチド以上の読み取りを可能にする。
【０１０４】
Ｃ．遺伝子またはバーコード発現の測定
本開示の実施形態は、レポーターバーコードおよび／またはレポーター遺伝子またはオープンリーディングフレームの発現を決定することに関する。レポーターの発現は、バーコードまたはインデックス領域のＲＮＡ転写物およびレポーター構築物から発現される任意の他のポリヌクレオチドのレベルを測定することによって決定され得る。この目的に適した方法には、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット、インサイチュハイブリダイゼーション、サザンブロット、スロットブロット、核酸保護アッセイおよびオリゴヌクレオチドアレイが含まれるが、これらに限定されない。
【０１０５】
特定の態様において、細胞から単離されたＲＮＡは、検出および／または定量の前に、ｃＤＮＡまたはｃＲＮＡに増幅され得る。単離されたＲＮＡは、全ＲＮＡまたはｍＲＮＡのいずれかであり得る。ＲＮＡ増幅は、特異的であっても非特異的であってもよい。いくつかの実施形態において、増幅は、レポーターバーコードまたはその領域（例えば、インデックス領域）を特異的に増幅するという点で特異的である。いくつかの実施形態では、増幅および／または逆転写酵素工程は、ランダムプライミングを除外する。適切な増幅方法としては、逆転写酵素ＰＣＲ、等温増幅、リガーゼ連鎖反応、およびＱｂｅｔａレプリカーゼが挙げられるが、これらに限定されない。増幅された核酸産物は、標識プローブへのハイブリダイゼーションによって検出および／または定量することができる。いくつかの実施形態では、検出は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）または他の種類の量子ドットを含み得る。
【０１０６】
レポーターバーコードの増幅プライマーまたはハイブリダイゼーションプローブは、レポーターの発現部分の配列から調製することができる。用語「プライマー」または「プローブ」は、本明細書中で使用される場合、テンプレート依存性プロセスにおいて新生核酸の合成をプライミングし得る任意の核酸を包含することを意味する。典型的には、プライマーは、１０〜２０および／または３０塩基対の長さのオリゴヌクレオチドであるが、より長い配列を用いることができる。プライマーは、二本鎖および／または一本鎖形成で提供されるが、一本鎖形成が好ましい。
【０１０７】
１３〜１００ヌクレオチドの間、特に１７〜１００ヌクレオチドの長さ、またはいくつかの態様において１〜２キロベースまたはそれ以上の長さのプローブまたはプライマーの使用は、安定かつ選択的である二重鎖分子の形成を可能にする。長さが２０塩基を超える連続した延伸にわたって相補的配列を有する分子は、得られるハイブリッド分子の安定性および／または選択性を増大させるために使用され得る。２０〜３０ヌクレオチド、または所望の場合はそれより長い１つ以上の相補的配列を有するハイブリダイゼーションのための核酸分子を設計し得る。このような断片は、例えば、化学的手段によって、または組換え産生のために選択された配列を組換えベクターに導入することによって、断片を直接合成することによって、容易に調製され得る。
【０１０８】
一実施形態では、各プローブ／プライマーは、少なくとも１５ヌクレオチドを含む。例えば、各プローブは、少なくともまたは多くとも２０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、４００またはそれ以上のヌクレオチド（またはその中の誘導可能な任意の範囲）を含み得る。それらは、これらの長さを有し得、そして本明細書中に記載される遺伝子と同一であるかまたは相補的である配列を有し得る。特に、各々のプローブ／プライマーは、比較的高度な配列複雑性を有し、いかなる多義的な残基（未決定の「ｎ」残基）も有さない。プローブ／プライマーは、ストリンジェントまたは高度にストリンジェントな条件下で、標的遺伝子（そのＲＮＡ転写物を含む）にハイブリダイズし得る。いくつかの実施形態では、バイオマーカーの各々は、１つより多いヒト配列を有するので、プローブおよびプライマーは、これらの配列の各々と共に使用するために設計され得ることが企図される。例えば、イノシンは、２つ以上の配列にハイブリダイズするためにプローブまたはプライマーにおいて頻繁に使用されるヌクレオチドである。プローブまたはプライマーは、特定のバイオマーカーについての２つ以上のヒト配列の認識に適応するイノシンまたは他の設計実装を有し得ることが企図される。
【０１０９】
高い選択性を必要とする用途では、典型的には、ハイブリッドを形成するために比較的高いストリンジェンシー条件を用いることが望ましい。例えば、約５０℃〜約７０℃の温度で約０．０２Ｍ〜約０．１０Ｍの塩化ナトリウムによって提供されるような、比較的低塩類および／または高温状態である。このような高ストリンジェンシー条件は、プローブまたはプライマーと鋳型または標的ストランドとの間の不整合を、もしあったとしても、ほとんど許容せず、そして特定の遺伝子を単離するために、または特定のｍＲＮＡ転写物を検出するために特に適している。一般に、ホルムアミドの添加量を増加させることにより、条件をより厳しくすることができることが理解される。
【０１１０】
１つの実施形態において、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（例えば、ＴａｑＭａｎ、ＡＢＩ）は、試料中のＲＮＡ転写物のレベルを検出および比較するために使用される。定量的ＲＴ−ＰＣＲは、ＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転写（ＲＴ）、続いて相対的定量的ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を含む。ＰＣＲ法の直鎖状部における標的ＤＮＡの濃度は、ＰＣＲを開始する前の標的の開始濃度に比例する。同数のサイクルを完了し、それらの直鎖状範囲にあるＰＣＲ反応における標的ＤＮＡのＰＣＲ産物の濃度を決定することによって、元のＤＮＡ混合物中の特異的標的配列の相対濃度を決定することができる。ＤＮＡ混合物が、異なる組織または細胞から単離されたＲＮＡから合成されたｃＤＮＡである場合、標的配列が由来する特異的ｍＲＮＡの相対的存在量は、それぞれの組織または細胞について決定され得る。ＰＣＲ産物の濃度とｍＲＮＡ量との間のこの直接的な比例関係は、ＰＣＲ反応の直鎖状領域において真実である。曲線のプラトー部における標的ＤＮＡの最終濃度は、反応混合物中の試薬の利用可能性によって決定され、標的ＤＮＡの元の濃度とは無関係である。したがって、増幅されたＰＣＲ産物の試料採取および定量は、ＰＣＲ反応がそれらの曲線の直鎖状部にある場合に行うことができる。さらに、増幅可能なｃＤＮＡの相対濃度は、内部に存在するＲＮＡ種または外部に導入されたＲＮＡ種のいずれかに基づいてもよい、いくつかの独立した標準に正規化されてもよい。特定のｍＲＮＡ種の存在量はまた、試料中の全てのｍＲＮＡ種の平均存在量に対して決定され得る。
【０１１１】
１つの実施形態において、ＰＣＲ増幅は、１つ以上の内部ＰＣＲ標準を利用する。内部標準は、細胞内の豊富なハウスキーピング遺伝子であってもよく、または特にＧＡＰＤＨ、ＧＵＳＢおよびβ−２ミクログロブリンであってもよい。これらの標準は、異なる遺伝子産物の発現量が直接比較され得るように、発現量を正規化するために使用され得る。当業者は、発現レベルを正規化するために内部標準を使用する方法を知っている。
【０１１２】
いくつかの試料に固有の課題は、それらが様々な量および／または質のものであることである。この問題は、ＲＴ−ＰＣＲを、内部標準が標的ｃＤＮＡ断片と類似またはそれ以上の増幅可能なｃＤＮＡ断片であり、かつ、内部標準をコードするｍＲＮＡの豊富さが標的をエンコーディングするｍＲＮＡよりもおよそ５〜１００倍高い内部標準を有する相対定量ＲＴ−ＰＣＲとして実施すれば、克服できる。このアッセイは、それぞれのｍＲＮＡ種の絶対的な存在量ではなく、相対的な存在量を測定する。
【０１１３】
別の実施形態では、相対定量ＲＴ−ＰＣＲは、外部基準プロトコルを使用する。このプロトコルでは、ＰＣＲ産物を、それらの増幅曲線の直鎖状部でサンプリングする。サンプリングに最適なＰＣＲサイクルの数は、各標的ｃＤＮＡ断片について経験的に決定することができる。さらに、種々の試料から単離された各々のＲＮＡ集団のリバーストランスクリプターゼ製品は、等しい濃度の増幅可能なｃＤＮＡについて標準化され得る。
【０１１４】
核酸アレイは、異なるおよび／または同じバイオマーカーにハイブリダイズし得る、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上の異なるポリヌクレオチドプローブを含み得る。同じ遺伝子に対する複数のプローブを、単一の核酸アレイ上で使用することができる。他の疾患遺伝子のためのプローブもまた、核酸アレイに含まれ得る。アレイ上のプローブ密度は、任意の範囲であり得る。いくつかの実施形態において、濃度は、５０、１００、２００、３００、４００、５００またはそれ以上のプローブ／ｃｍ２であり得る。
【０１１５】
特に意図されるのは、Haciaら（1996）およびShoemakerら（1996）によって記載されるようなチップベースの核酸技術である。簡潔には、これらの技術は、多数の遺伝子を迅速かつ正確に分析するための定量的方法を含む。遺伝子をオリゴヌクレオチドでタグ付けすることにより、または固定プローブアレイを使用することにより、標的分子を高密度アレイとして分離し、そしてハイブリダイゼーションに基づいてこれらの分子をスクリーニングするためにチップ技術を使用し得る（また、Peaseら、1994；およびFodorら、1991を参照のこと）。この技術は、診断方法、予後方法、および処理方法に関して、1つ以上の癌バイオマーカーの発現レベルを評価することと併せて使用され得ることが企図される。
【０１１６】
特定の実施形態は、アレイまたはアレイから生成されたデータの使用を含み得る。データは容易に入手可能である。さらに、アレイは、相関性実験において使用され得るデータを生成するために調製され得る。
【０１１７】
アレイとは、一般に、複数のｍＲＮＡ分子またはｃＤＮＡ分子に完全にまたはほぼ相補的または同一であり、空間的に分離された構成で支持体材料上に位置する、核酸分子（プローブ）の規則正しいマクロアレイ（単数）またはマイクロアレイ（複数）を指す。マクロアレイは、典型的には、プローブがスポットされたニトロセルロースまたはナイロンのシートである。マイクロアレイは、１０，０００個までの核酸分子が典型的には１〜４平方センチメートルの領域に適合することができるように、核酸プローブをより密に配置する。マイクロアレイは、核酸分子（例えば、遺伝子、オリゴヌクレオチドなど）を基材上にスポットするか、またはオリゴヌクレオチド配列を基材上にインサイチュで作製することによって作製され得る。スポットされたまたは製作された核酸分子は、１平方センチメートル当たり約３０個まで、またはそれ以上、例えば１平方センチメートル当たり約１００個まで、さらには１０００個までの非同一核酸分子の高密度マトリックスパターンで適用することができる。マイクロアレイは、典型的には、フィルタアレイのニトロセルロースベースの材料とは対照的に、コーティングされたガラスを固相支持体として使用する。相補的核酸試料の規則正しい配列を有することによって、各々の試料の位置を追跡し、元の試料に連結することができる。複数の別個の核酸プローブが固相支持体の表面と安定に会合する様々な異なるアレイデバイスが、当業者に公知である。アレイのための有用な基材には、ナイロン、ガラスおよびケイ素が含まれる。このようなアレイは、平均プローブ長、プローブの配列またはタイプ、プローブとアレイ表面との間の結合の性質（例えば、共有結合または非共有結合）などを含む、多くの異なる方法で変化し得る。標識およびスクリーニング方法ならびにアレイは、プローブが発現レベルを検出することを除いて、任意のパラメーターに関するその有用性において限定されず；結果として、方法および組成物は、種々の異なる型の遺伝子とともに使用され得る。
【０１１８】
マイクロアレイを調製するための代表的な方法および装置は、例えば、米国特許第5,143,854号、第5,202,231号、第5,242,974号、第5,288,644号、第5,324,633号、第5,384,261号、第5,405,783号、第5,412,087号、第5,424,186号、第5,429,807号、第5,432,049号、第5,436,327号、第5,445,934号、第5,468,613号、第5,470,710号、第5,472,672号、第5,492,806号、第5,525,464号、第5,503,980号、第5,510,270号、第5,525,464号、第5,527,681号、第5,529,756号、第5,532,128号、第5,545,531号、第5,547,839号、第5,554,501号、第5,556,752号、第5,561,071号、第5,571,639号、第5,580,726号、第5,580,732号、第5,593,839号、第5,599,695号、第5,599,672号、第5,610;287号、第5,624,711号、第5,631,134号、第5,639,603号、第5,654,413号、第5,658,734号、第5,661,028号、第5,665,547号、第5,667,972号、第5,695,940号、第5,700,637号、第5,744,305号、第5,800,992号、第5,807,522号、第5,830,645号、第5,837,196号、第5,871,928号、第5,847,219号、第5,876,932号、第5,919,626号、第6,004,755号、第6,087,102号、第6,368,799号、第6,383,749号、第6,617,112号、第6,638,717号、第6,720,138号、並びに、WO 93/17126、WO 95/11995、WO 95/21265、WO 95/21944、WO 95/35505、WO 96/31622、WO 97/10365、WO 97/27317、WO 99/35505、WO 09923256、WO 09936760、WO0138580、WO 0168255、WO 03020898、WO 03040410、WO 03053586、WO 03087297、WO 03091426、WO03100012、WO 04020085、WO 04027093、EP 373 203、EP 785 280、EP 799 897および UK 8 803 000に記載され、これらの開示は全て本明細書中に参考として援用される。
【０１１９】
アレイは、１００個以上の異なるプローブを含むように、高密度アレイであり得ることが企図される。それらは、１０００、１６，０００、６５，０００、２５０，０００または１，０００，０００またはそれ以上の異なるプローブを含み得ることが企図される。オリゴヌクレオチドプローブは、いくつかの実施形態において、長さが５〜５０、５〜４５、１０〜４０、または１５〜４０ヌクレオチドの範囲である。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、長さが２０〜２５ヌクレオチドである。
【０１２０】
アレイ中の各異なるプローブ配列の位置および配列は、一般に知られている。さらに、多数の異なるプローブは、ｃｍ２当たり、概して、約６０、１００、６００、１０００、５，０００、１０，０００、４０，０００、１００，０００、または４００，０００を超える異なるオリゴヌクレオチドプローブのプローブ密度を有する高密度アレイを提供する比較的小さい面積を占めることができる。アレイの表面積は、約１、１．６、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ｃｍ２、あるいは約１、１．６、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ｃｍ２未満であり得る。
【０１２１】
さらに、当業者は、アレイを使用して生成されたデータを容易に分析し得る。このようなプロトコルは、WO9743450；WO030023058；WO03022421；WO03029485；WO03029485；WO03067217；WO03066906; WO03076928; WO03093810; WO03100448A1に見出される情報を含み、これらの全ては、本明細書中で参考として援用される。
【０１２２】
１つの実施形態において、ヌクレアーゼプロテクションアッセイは、ガン試料に由来するＲＮＡを定量するために使用される。当業者に公知のヌクレアーゼ保護アッセイの多くの異なるバージョンが存在する。これらのヌクレアーゼ保護アッセイが有する共通の特徴は、アンチセンス核酸と定量されるＲＮＡとのハイブリダイゼーションを含むことである。次いで、得られたハイブリッド二本鎖分子を、二本鎖分子よりも効率的に一本鎖核酸を消化するヌクレアーゼで消化する。消化を生き残るアンチセンス核酸の量は、定量される標的ＲＮＡ種の量の尺度である。市販されているヌクレアーゼ保護アッセイの例は、Ambion、Inc．（Austin，TX）によって製造されるＲＮａｓｅ保護アッセイである。
【０１２３】
ＩＩＩ．レセプター遺伝子および誘導性レポーター付加
特定の実施形態では、レセプター遺伝子および／または誘導性レポーターシステムは、１つ以上の補助ポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチド配列を含む。例示的な補助ポリペプチドには、転写因子、タンパク質またはペプチドタグ、およびスクリーニング可能または選択可能な遺伝子が含まれる。
【０１２４】
Ａ．遺伝子の選択とスクリーニング
本開示の特定の実施形態において、誘導性レポーターおよび／またはレセプター遺伝子は、選択またはスクリーニング遺伝子を含み得るか、またはさらに含み得る。さらに、本開示の細胞、ベクター、およびウイルス粒子は、選択またはスクリーニング遺伝子をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、選択またはスクリーニング遺伝子は、選択またはスクリーニングタンパク質に融合されたレセプタータンパク質を含む１つの融合タンパク質が細胞中に存在するように、レセプター遺伝子に融合される。このような遺伝子は、同定可能な変化を細胞に付与し、異種レセプター遺伝子の活性化を有する細胞の容易な同定を可能にする。一般に、選択可能な（すなわち、選択遺伝子）遺伝子は、選択を可能にする特性を付与する遺伝子である。陽性選択遺伝子は、遺伝子または遺伝子産物の存在がその選択を可能にする遺伝子であり、一方、陰性選択遺伝子は、その遺伝子または遺伝子産物の存在がその選択を妨げる遺伝子である。陽性選択遺伝子の例は、抗生物質耐性遺伝子である。
【０１２５】
通常、薬物選択遺伝子の介在物は、例えば、成功したリガンド係合を介して、活性化されたレセプター遺伝子を有する細胞のクローニングおよび同定を助ける。選択遺伝子は、例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシン、Ｇ４１８、フレオマイシン、ブラストサイジン、およびヒスチジノールに対する耐性を付与する遺伝子であり得る。条件の実施に基づいてレセプター活性化の識別を可能にする表現型を与える遺伝子に加えて、その遺伝子産物が比色分析を提供する、ＧＦＰのようなスクリーニング可能な遺伝子を含む、他の型の遺伝子もまた意図される。あるいは、スクリーニング可能な酵素（例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ））が利用され得る。当業者はまた、おそらくＦＡＣＳ分析と組み合わせて、スクリーニング可能な遺伝子およびそれらのタンパク質産物を使用する方法を知っている。選択可能およびスクリーニング可能な遺伝子のさらなる例は、当業者に周知である。特定の実施形態では、遺伝子は、蛍光タンパク質、酵素活性タンパク質、発光タンパク質、光活性化可能タンパク質、光変換可能タンパク質、または比色タンパク質を産生する。蛍光マーカーには、例えば、ＧＦＰおよびＹＦＰ、ＲＦＰ等のバリアント、ならびにＤｓＲｅｄ、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＹＰｅｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅおよびＶｅｎｕｓ等の他の蛍光タンパク質が含まれる。光活性マーカーには、例えば、ＫＦＰ、ＰＡ−ｍＲＦＰおよびＤｒｏｎｐａが含まれる。光変換可能マーカーには、たとえば、ｍＥｏｓＦＰ、ＫｉｋＧＲ、ＰＳ−ＣＦＰ２などがある。発光タンパク質には、例えば、Ｎｅｐｔｕｎｅ、ＦＰ５９５、およびフィアリジンが含まれる。
【０１２６】
Ｂ．タンパク質またはペプチドのタグ
例示的なタンパク質／ペプチドタグには、ＡｖｉＴａｇ、酵素ＢｉｒＡによるビオチン化を可能にするペプチドであり、ストレプトアビジン（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ、配列番号４）によってタンパク質を分離できる；カルモジュリンタグ、タンパク質カルモジュリンが結合したペプチド（ＫＲＲＷＫＫＮＦＩＡＶＳＡＡＮＲＦＫＫＩＳＳＳＧＡＬ、配列番号５）；ポリグルタミン酸タグ、Ｍｏｎｏ−Ｑ（ＥＥＥＥＥＥ、配列番号６）などの陰イオン交換樹脂に効率的に結合するペプチド；Ｅタグ、抗体によって認識されるペプチド（ＧＡＰＶＰＹＰＤＰＬＥＰＲ、配列番号７）；ＦＬＡＧタグ、抗体によって認識されるペプチド（ＤＹＫＤＤＤＤＫ、配列番号８）；ＨＡタグ、抗体によって認識される血球凝集素由来のペプチド（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ、配列番号９）；Ｈｉｓタグ、ニッケルまたはコバルトキレートが結合した５−１０個のヒスチジン（ＨＨＨＨＨＨ、配列番号１０）；Ｍｙｃ−ｔａｇ、抗体によって認識されるｃ−ｍｙｃに由来するペプチド（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ、配列番号１１）；ＮＥタグ、モノクローナルＩｇＧ１抗体によって認識される新規１８アミノ酸合成ペプチド（ＴＫＥＮＰＲＳＮＱＥＥＳＹＤＤＮＥＳ、配列番号１２）、これは、ウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、免疫細胞化学、免疫沈降を含む幅広いアプリケーションおよび組換えタンパク質のアフィニティ精製、に有用であり；Ｓタグ、リボヌクレアーゼＡ由来のペプチド（ＫＥＴＡＡＡＫＦＥＲＱＨＭＤＳ、配列番号１３）；ＳＢＰタグ、ストレプトアビジンに結合するペプチド（ＭＤＥＫＴＴＧＷＲＧＧＨＶＶＥＧＬＡＧＥＬＥＱＬＲＡＲＬＥＨＨＰＱＧＱＲＥＰ、配列番号１４）；Ｓｏｆｔａｇ１、哺乳類発現用（ＳＬＡＥＬＬＮＡＧＬＧＧＳ、配列番号１５）；Ｓｏｆｔａｇ３、原核生物発現用（ＴＱＤＰＳＲＶＧ、配列番号１６）；Ｓｔｒｅｐタグ、ストレプトアビジンまたはストレプトアクチンと呼ばれる修飾ストレプトアビジンに結合するペプチド（Ｓｔｒｅｐタグ ＩＩ：ＷＳＨＰＱＦＥＫ、配列番号１７）；ＴＣタグ、ＦｌＡｓＨおよびＲｅＡｓＨ二ヒ素化合物（ＣＣＰＧＣＣ、配列番号１８）によって認識されるテトラシステインタグ；Ｖ５タグ、抗体によって認識されるペプチド（ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ、配列番号１９）；ＶＳＶタグ、抗体によって認識されるペプチド（ＹＴＤＩＥＭＮＲＬＧＫ、配列番号２０）；Ｘｐｒｅｓｓタグ（ＤＬＹＤＤＤＤＫ、配列番号２１）；共有結合ペプチドタグ、イソペプタグ、ピリン−Ｃタンパク質に共有結合するペプチド（ＴＤＫＤＭＴＩＴＦＴＮＫＫＤＡＥ、配列番号２２）；ＳｐｙＴａｇ、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質に共有結合するペプチド（ＡＨＩＶＭＶＤＡＹＫＰＴＫ、配列番号２３）；ＳｎｏｏｐＴａｇ、ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒタンパク質に共有結合するペプチド（ＫＬＧＤＩＥＦＩＫＶＮＫ、配列番号２４）；ＢＣＣＰ（ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質）、ストレプトアビジンによる認識を可能にするＢｉｒＡによりビオチン化されたタンパク質ドメイン；固定化グルタチオンに結合するタンパク質であるグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ−タグ；緑色蛍光タンパク質タグ、自然発生的に蛍��を発し、ナノボディに結合できるタンパク質；ＨａｌｏＴａｇは、反応性ハロアルカン基質に共有結合する変異細菌ハロアルカンデハロゲナーゼであり、これにより、多種多様な基質への結合が可能になる；マルトース結合タンパク質タグ、アミロースアガロースに結合するタンパク質；ヌスタグ、チオレドキシンタグ；二量体化と可溶化を可能にする、免疫グロブリンＦｃドメインに由来するＦｃタグ、を含む。プロテインＡセファロース、アミノ酸（Ｐ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ａ、Ｑ、Ｇなど）を促進する障害を含む設計された固有障害タグ、およびＴｙタグでの精製に使用できる。
【０１２７】
Ｃ．転写因子
いくつかの実施形態において、レセプター遺伝子は、レセプタータンパク質および補助ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、補助ポリペプチドは転写因子である。関連する実施形態において、誘導性レポーターは、レセプター応答性エレメントを含み、ここで、レセプター応答性エレメントは、転写因子によって結合される。このような転写因子および応答エレメントは、当該分野で公知であり、そして例えば、テトラサイクリン応答性エレメント（ＴＲＥ）を介して転写を誘導し得る逆テトラサイクリン制御トランスアクチベーター（ｒｔＴＡ）、ＧＡＬ１プロモーターを介して転写を誘導するＧａｌ４ｐ、およびリガンドに結合した場合に、エストロゲン応答エレメントを介して発現を誘導するエストロゲンレセプターを含む。したがって、関連する実施形態は、補助ポリペプチド転写因子の転写を活性化するためにリガンドを投与することを含む。
【０１２８】
ＩＶ．ベクターおよび核酸
本開示は、異種レセプター遺伝子および誘導性レポーターの１つ以上を含む核酸の実施形態を含む。用語「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」、および「核酸」は、交換可能に使用され、天然または修飾されたモノマーまたは結合の直鎖状オリゴマー（デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、それらのα−アノマー形態、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などを含む）であって、ワトソン−クリック型の塩基対、塩基積み重ね、フーグスティーン型またはリバースフーグスティーン型の塩基対などのモノマー−モノマー相互作用の規則的なパターンによって標的ポリヌクレオチドに特異的に結合することができるものを含む。通常、モノマーは、ホスホジエステル結合またはその類似体によって連結されて、数単量体単位、例えば３〜４から数十単量体単位の大きさの範囲のオリゴヌクレオチドを形成する。オリゴヌクレオチドが「ＡＴＧＣＣＴＧ」などの一連の文字によって表される場合はいつでも、特に断らない限り、ヌクレオチドは左から右へ５’→３’の順序であり、「Ａ」はデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」はデオキシシチジンを示し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを示し、「Ｔ」はチミジンを示すことが理解されるであろう。ホスホジエステル結合のアナログには、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホラニリデート、ホスホラミデートなどが含まれる。天然または非天然ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドが使用され得る場合（例えば、酵素によるプロセシングが必要とされる場合）、通常、天然ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドが必要とされる場合は、当業者に明らかである。
【０１２９】
核酸は、一般にリボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のオリゴマーまたはポリマーを指す「未修飾オリゴヌクレオチド」または「未修飾核酸」であってもよい。いくつかの実施形態では、核酸分子は、未修飾オリゴヌクレオチドである。この用語は、天然に存在する核酸塩基、糖および共有結合ヌクレオシド間結合から構成されるオリゴヌクレオチドを含む。用語「オリゴヌクレオチドアナログ」は、オリゴヌクレオチドと同様の様式で機能する１つ以上の天然に存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドをいう。このような天然に存在しないオリゴヌクレオチドは、所望の特性（例えば、増強された細胞取り込み、他のオリゴヌクレオチドまたは核酸標的に対する増強された親和性性、およびヌクレアーゼの存在下での増大した安定性）のために、天然に存在する形態よりもしばしば選択される。用語「オリゴヌクレオチド」は、未修飾オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を指すために使用することができる。
【０１３０】
核酸分子の具体例には、修飾された、すなわち天然に存在しないヌクレオシド間結合を含む核酸分子が含まれる。このような非天然ヌクレオシド間結合は、例えば、増強された細胞取り込み、他のオリゴヌクレオチドまたは核酸標的に対する増強された親和性性、およびヌクレアーゼの存在下での増大した安定性のような所望の特性のために、天然に存在する形態よりもしばしば選択される。具体的な実施形態では、修飾はメチル基を含む。
【０１３１】
核酸分子は、１つ以上の改変されたヌクレオシド間結合を有し得る。本明細書において定義されるように、改変されたヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドは、リン原子を保持するヌクレオシド間結合およびリン原子を有さないヌクレオシド間結合を含む。本明細書の目的のために、および当技術分野で時々言及されるように、ヌクレオシド間骨格にリン原子を有さない修飾オリゴヌクレオチドもまた、オリゴヌクレオシドであると考えることができる。
【０１３２】
核酸分子に対する修飾は、一方または両方の末端ヌクレオチドが修飾されている修飾を含むことができる。
【０１３３】
１つの適切なリン含有修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。多数の他の修飾オリゴヌクレオチド骨格（ヌクレオシド間結合）が当技術分野で公知であり、この実施形態の文脈において有用であり得る。
【０１３４】
リン含有ヌクレオシド間結合の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第3,687,808号、第4,469,863号、第4,476,301号、第5,023,243号、第5,177,196号、第5,188,897号、第5,264,423号、第5,276,019号、第5,278,302号、第5,286,717号、第5,321,131号、第5,399,676号、第5,405,939号、第5,453,496号、第5,455,233号、第5,466,677号、第5,476,925号、第5,519,126号、第5,536,821号、第5,541,306号、第5,550,111号、第5,563,253号、第5,571,799号、第5,587,361号、第5,194,599号、第5,565,555号、第5,527,899号、第5,721,218号、第5,672,697号、第5,625,050号、第5,489,677号、および第5,602,240号が含まれるが、これに限定されない。
【０１３５】
リン原子を含まない修飾オリゴヌクレオシド骨格（ヌクレオシド間結合）は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１つ以上の短鎖ヘテロ原子または複素環ヌクレオシド間結合によって形成されるヌクレオシド間結合を有する。これらには、アミド骨格を有するもの；および混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２成分部分を有するものを含む他のものが含まれる。
【０１３６】
上記の非リン含有オリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第5,034,506号、第5,166,315号、第5,185,444号、第5,214,134号、第5,216,141号、第5,235,033号、第5,264,562号、第5,264,564号、第5,405,938号、第5,434,257号、第5,466,677号、第5,470,967号、第5,489,677号、第5,541,307号、第5,561,225号、第5,596,086号、第5,602,240号、第5,610,289号、第5,602,240号、第5,608,046号、第5,610,289号、第5,618,704号、第5,623,070号、第5,663,312号、第5,633,360号、第5,677,437号、第5,792,608号、第5,646,269号、および第5,677,439号が含まれるが、これに限定されない。
【０１３７】
オリゴマー化合物はまた、オリゴヌクレオチド模倣物を含み得る。オリゴヌクレオチドに適用されるような模倣体という用語は、フラノース環のみまたはフラノース環とヌクレオチド間結合の両方が新規基で置換され、フラノース環のみが例えばモルホリノ環で置換されているオリゴマー化合物を含むことが意図され、当技術分野では糖代用物とも呼ばれる。複素環塩基部分または修飾複素環塩基部分は、適切な標的核酸とのハイブリダイゼーションのために維持される。
【０１３８】
オリゴヌクレオチド模倣物は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）およびシクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡとして知られる、Ｗａｎｇら、J. Am. Chem. Soc., 2000, 122, 8595-8602を参照のこと）のようなオリゴマー化合物を含み得る。オリゴヌクレオチド模倣物の調製を教示する代表的な米国特許は、米国特許を含むが、これに限定されない。米国特許第5,539,082号、第5,714,331号、および第5,719,262号（これらの各々は、本明細書中に参考として援用される）。オリゴヌクレオチド模倣物の別のクラスは、ホスホノモノエステル核酸と呼ばれ、骨格にリン基を組み込む。このクラスのオリゴヌクレオチド模倣体は、遺伝子発現を阻害する面積（アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、センスオリゴヌクレオチドおよびトリプレックス形成オリゴヌクレオチド）において、核酸の検出のためのプローブとして、および分子生物学における使用のための補助として、有用な物理的および生物学的および薬理学的特性を有することが報告されている。フラノシル環がシクロブチル部分によって置換されている別のオリゴヌクレオチド模倣体が報告されている。
【０１３９】
核酸分子はまた、１つ以上の改変または置換された糖部分を含み得る。塩基部分は、適宜核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。糖修飾は、ヌクレアーゼ安定性、結合親和性、または何らかの他の有利な生物学的特性をオリゴマー化合物に付与することができる。
【０１４０】
代表的な修飾糖には、炭素環式または非環状糖、それらの２’、３’または４’位の１つ以上に置換基を有する糖、糖の１つ以上の水素原子の代わりに置換基を有する糖、および糖中の任意の２つの他の原子間に結合を有する糖が含まれる。多数の糖修飾が当技術分野で知られており、２’位で修飾された糖、および糖の任意の２原子間の橋梁を有する糖（糖が二環式であるように）が、この実施形態で特に有益である。この実施形態において有用な糖修飾の例には、ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルから選択される糖置換基を含む化合物が含まれるが、これらに限定されず、ここで、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換または無置換のＣ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであってもよい。特に好適なものは、２−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−メトキシエチル、２’−ＭＯＥ、または２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３としても知られる）、２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−−ＣＨ３）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、または４’炭素原子を２’炭素原子に連結する架橋基を有する二環式糖修飾ヌクレオシドであり、例示的な橋梁基には、−−ＣＨ２−−Ｏ−−、−−（ＣＨ２）２−−Ｏ−−または−−ＣＨ２−−Ｎ（Ｒ３）−−Ｏが含まれ、ここでＲ３はＨまたはＣ１−Ｃ１２アルキルである。
【０１４１】
ヌクレアーゼ耐性の増大およびヌクレオチドへの非常に高度な結合親和性を付与する１つの修飾は、２’−ＭＯＥ側鎖である（Bakerら、J. Biol. Chem., 1997, 272, 11944-12000）。2’−ＭＯＥ置換の直接的な利点の１つは、Ｏ−メチル、Ｏ−プロピル、およびＯ−アミノプロピルのような多くの類似の２’修飾よりも大きい結合親和性の向上である。２’−ＭＯＥ置換基を有するオリゴヌクレオチドはまた、インビボ使用のための有望な特徴を有する遺伝子発現のアンチセンスインヒビターであることが示されている（Martin, P., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504; Altmann et al., Chimia, 1996, 50, 168-176; Altmann et al., Biochem. Soc. Trans., 1996, 24, 630-637; およびAltmann et al., Nucleosides Nucleotides, 1997, 16, 917-926）。
【０１４２】
２’−糖置換基は、アラビノ（上）位置またはリボ（下）位置にあり得る。１つの２’−アラビノ修飾は２’−Ｆである。同様の修飾は、オリゴマー化合物上の他の位置、特に３’末端ヌクレオシド上の糖の３’位置、または２’−５’連結オリゴヌクレオチドおよび５’末端ヌクレオチドの５’位置でも行うことができる。オリゴマー化合物はまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣物を有してもよい。このような修飾糖構造の調製を教示する代表的な米国特許には、その全体において参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第4,981,957号、第5,118,800号、第5,319,0800号、第5,359,044号、第5,393,878号、第5,446,137号、第5,446,786号、第5,514,785号、第5,519,134号、第5,567,811号、第5,576,427号、第5,591,722号、第5,597,909号、第5,610,300号、第5,627,053号、第5,639,873号、第5,646,265号、第5,658,873号、第5,670,633号、第5,792,747号、および第5,700,920号が含まれるが、これに限定されない。
【０１４３】
核酸分子はまた、天然に存在する核酸塩基または合成の非修飾核酸塩基と構造的に区別可能であるが、機能的に交換可能である１つ以上の核酸塩基（当技術分野では単に「塩基」と呼ばれることが多い）修飾または置換を含むことができる。このような核酸塩基修飾は、オリゴマー化合物に、ヌクレアーゼ安定性、結合親和性、または何らかの他の有利な生物学的特性を付与することができる。本明細書中で使用される場合、「未修飾」または「天然」核酸塩基は、プリン塩基アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を含む。本明細書中で複素環塩基部分とも呼ばれる修飾核酸塩基には、他の合成および天然核酸塩基が含まれ、その多くの例として、特に５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、７−デアザグアニンおよび７−デアザデニンが挙げられる。
【０１４４】
複素環塩基部分はまた、プリンまたはピリミジン塩基が他の複素環、例えば、７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジンおよび２−ピリドンで置換されているものを含み得る。いくつかの核酸塩基には、米国特許第3，687，808号に開示されているもの、The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990、Englischらにより公開されているAngewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613、および Sanghvi, Y. S. により公開されているChapter 15, Antisense Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., ed., CRC Press, 1993に開示されているもの含まれる。これらの核酸塩基の一定のものは、オリゴマー化合物の結合親和性を増加させるのに特に有効である。これらには、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、および２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンを含むＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリンが含まれる。
【０１４５】
核酸分子の追加的な改変は、米国特許公開２００９／０２２１６８５に開示されているが、参照により本明細書に組み込まれる。核酸分子に対するさらなる適切な共役もまた、本明細書中に開示される。
【０１４６】
異種レセプター遺伝子および誘導レポーターは、ベクターなどの核酸分子によってコードされ得る。いくつかの実施形態において、それらは、同じ核酸分子上にコードされる。いくつかの実施形態において、それらは、別々の核酸分子上にコードされる。特定の実施形態において、核酸分子は、核酸ベクターの形態であり得る。用語「ベクター」は、異種核酸配列が、複製され、発現され、および／または宿主細胞のゲノムに組み込まれ得る、細胞への導入のために挿入され得るキャリア核酸分子をいうために使用される。核酸配列は、「異種」であり得、これは、ベクターが導入されている細胞に対して、または組み込まれている核酸に対して外来性であることを意味し、これは、細胞または核酸中の配列と相同であるが、通常見出されない宿主細胞または核酸内の位置にある配列を含む。ベクターには、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、コスミド、ウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルス、および植物ウイルス）、および人工染色体（例えば、ＹＡＣ）が含まれる。当業者は、標準的な組換え技術（例えば、Sambrook et al.、2001; Ausbel et al.、1996、両者を参照して取り入れた）を通してベクターを構築するのに十分な能力を有するであろう。ベクターは、抗体を産生するために宿主細胞において使用され得る。
【０１４７】
用語「発現ベクター」は、宿主細胞のゲノムに転写されるか、または安定に組み込まれ、続いて転写され得る遺伝子産物の少なくとも一部をコードする核酸配列を含むベクターをいう。いくつかの場合において、次いで、ＲＮＡ分子をタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに翻訳する。発現ベクターは、特定の宿主生物における操作可能に連結したコーディング配列の転写および、恐らくは、翻訳に必要な核酸配列をいう種々の「対照配列」を含有することができる。転写および翻訳を支配する制御配列に加えて、ベクターおよび発現ベクターは、同様に他の機能を果たし、本明細書中に記載される核酸配列を含み得る。
【０１４８】
本明細書中に開示されるベクターは、当該分野で公知の任意の核酸ベクターであり得る。例示的なベクターには、プラスミド、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）およびウイルスベクターが含まれる。
【０１４９】
動物細胞のための任意の発現ベクターを使用することができる。適切なベクターの例としては、ｐＡＧＥ１０７（Miyajiら、1990）、ｐＡＧＥ１０３（MizukamiおよびItoh、1987）、ｐＨＳＧ２７４（Bradyら、1984）、ｐＫＣＲ（Ｏ’Hareら、1981）、ｐＳＧ１βｄ２−４（Miyajiら、1990）などが挙げられる。
【０１５０】
プラスミドの他の例としては、複製起点を含む複製プラスミド、または組み込みプラスミド（例えば、ｐＵＣ、ｐｃＤＮＡ、ｐＢＲなど）が挙げられる。
【０１５１】
ウイルスベクターの他の例には、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルスおよびＡＡＶベクターが含まれる。このような組換えウイルスは、当該分野で公知の技術（例えば、パッケージング細胞をトランスフェクトすることによって、またはヘルパープラスミドまたはウイルスを用いた一過性トランスフェクションによって）によって産生され得る。ウイルスパッケージング細胞の典型的な例には、ＰＡ３１７細胞、ＰｓｉＣＲＩＰ細胞、ＧＰｅｎｖ＋細胞、２９３細胞などが含まれる。このような複製欠陥のある組換えウイルスを作り出すための詳細な手順は、WO95/14785、WO96/22378、米国特許第5,882,877号、米国特許第6,013,516号、米国特許第4,861,719号、米国特許第5,278,056およびWO94/19478にみられる。
【０１５２】
「プロモーター」は制御配列である。プロモーターは、典型的には、転写の開始および速度が制御される核酸配列の領域である。それは、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子のような調節タンパク質および分子が結合し得る遺伝要素を含み得る。「作動可能に配置された」、「作動可能に連結された」、「制御下にある」、および「転写制御下にある」という語句は、プロモーターが、その配列の転写開始および発現を制御するために、核酸配列に対して正しい機能的位置および／または配向性にあることを意味する。プロモーターは、核酸配列の転写活性化に関与するシス作用性調節配列を指す「エンハンサー」と組み合わせて使用されてもよく、または使用されなくてもよい。
【０１５３】
動物細胞の発現ベクターに使用されるプロモーターおよびエンハンサーの例としては、ＳＶ４０の初期プロモーターおよびエンハンサー（MizukamiおよびItoh、1987）、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲプロモーターおよびエンハンサー（Kuwanaら、1987）、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター（Masonら、1985）およびエンハンサー（Gilliesら、1983）などが挙げられる。
【０１５４】
特定の開始シグナルもまた、コード配列の効率的な翻訳のために必要とされ得る。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドンまたは隣接配列が含まれる。ＡＴＧ開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルが提供される必要があり得る。当業者は、これを容易に決定し、必要なシグナルを提供することができるであろう。
【０１５５】
ベクターは、複数の制限酵素部位を含む核酸領域である複数クローニング部位（MCS）を含むことができ、そのいずれも、ベクターを消化するために標準的な組換え技術と組み合わせて使用することができる。（Carbonelliら、1999、Levensonら、1998、およびCocea、1997（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。）
【０１５６】
ほとんどの転写された真核生物ＲＮＡ分子は、一次転写物からイントロンを除去するためにＲＮＡスプライシングを受ける。ゲノム真核生物配列を含むベクターは、タンパク質発現のための転写物の適切な工程を確実にするために、ドナーおよび／またはアクセプタースプライシング部位を必要とし得る。（Chandler et al.、1997（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。）
【０１５７】
ベクターまたは構築物は、一般に、少なくとも１つの終結シグナルを含む。「終結シグナル」または「ターミネーター」は、ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ転写物の特異的終結に関与するＤＮＡ配列からなる。従って、特定の実施形態において、ＲＮＡ転写産物の産生を終結させる終結シグナルが意図される。ターミネーターは、所望のメッセージレベルを達成するためにインビボで必須であり得る。真核生物システムでは、ターミネーター領域はまた、ポリアデニル化領域を露出させるように新規転写物の領域特異的切断を可能にする特異的ＤＮＡ配列を含んでもよい。これは、転写物の３’末端に約２００Ａの残基（ポリＡ）の伸長を付加するための特殊な内因性ポリメラーゼをシグナル伝達する。このポリＡテールで修飾されたＲＮＡ分子は、より安定であり、より効率的に翻訳されるようである。したがって、真核生物を含む他の実施形態では、ターミネーターがＲＮＡの切断のためのシグナルを含むことが好ましく、ターミネーターシグナルがメッセージのポリアデニル化を促進することがより好ましい。
【０１５８】
発現、特に真核生物の発現において、転写物の適切なポリアデニル化をもたらすポリアデニル化シグナルが典型的に含まれる。
【０１５９】
宿主細胞中でベクターを増殖させるために、ベクターは、複製が開始される特定の核酸配列である１つ以上の複製起点部位（しばしば「ｏｒｉ」と呼ばれる）を含み得る。あるいは、宿主細胞が酵母である場合、自律複製配列（ＡＲＳ）を用いることができる。
【０１６０】
いくつかのベクターは、原核細胞および真核細胞の両方において複製および／または発現されることを可能にする制御配列を使用し得る。当業者は、上記の宿主細胞の全てをインキュベートしてそれらを維持し、そしてベクターの複製を可能にする条件をさらに理解する。また、ベクターの大規模な産生、ならびにベクターおよびそれらの同族ポリペプチド、タンパク質、またはペプチドによってコードされる核酸の産生を可能にする技術および条件も理解され、公知である。
【０１６１】
本開示のさらなる態様は、本明細書中に記載されるように、レセプター遺伝子および誘導性レポーターを含む細胞（単数または複数）に関する。いくつかの実施形態では、原核細胞または真核細胞は、本開示による少なくとも１つの核酸分子またはベクターで遺伝的に形質転換またはトランスフェクトされる。いくつかの実施形態において、細胞を、本開示のウイルス粒子に感染させる。
【０１６２】
用語「形質転換」または「トランスフェクション」は、宿主細胞が導入された遺伝子または配列を発現して所望の物質、典型的には導入された遺伝子または配列によってコードされるタンパク質または酵素を産生するように、「外来」（すなわち、外因性または細胞外）遺伝子、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を宿主細胞に導入することを意味する。導入されたＤＮＡまたはＲＮＡを受容し、発現する宿主細胞は、「形質転換」または「トランスフェクト」されている。本開示による発現ベクターの構築、および宿主細胞の形質転換またはトランスフェクションは、従来の分子生物学技術を用いて実施することができる。
【０１６３】
細胞の形質転換／トランスフェクションのための核酸送達に適した方法、本発明で使用するための組織または生物は、本明細書に記載されるように、または、当業者に知られているように、核酸（例えば、ＤＮＡ）を細胞、組織または生物に導入することができる実質的にあらゆる方法を含むと考えられる。（例えば、StadtfeldおよびHochedlinger、Nature Methods 6(5):329-330 (2009); Yusa et al., Nat. Methods 6:363-369 (2009); Woltjen et al., Nature 458, 766-770 (9 Apr. 2009)）。このような方法には、エキソビボトランスフェクション（Wilsonら、Science, 244:1344-1346, 1989, Nabel and Baltimore, Nature 326:711-713, 1987）、任意にFugene6（Roche）またはLipofectamine(Invitrogen)による、注射（米国特許第5,994,624号、第5,981,274号、第5,945,100号、第5,780,448号、第5,736,524号、第5,702,932号、第5,656,610号、第5,589,469号、および第5,580,859号）による、マイクロインジェクション(Harland and Weintraub, J. Cell Biol., 101:1094-1099, 1985；本明細書中で参考として援用される米国特許第5,789,215号）による；エレクトロポレーション（本明細書中で参考として援用される米国特許第5,384,253号；Tur-Kaspaら, Mol. Cell Biol., 6:716-718, 1986; Potter et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 81:7161-7165, 1984）による、リン酸カルシウム沈殿（Graham and Van Der Eb, Virology, 52:456-467, 1973; Chen and Okayama, Mol. Cell Biol., 7(8):2745-2752, 1987; Rippe et al., Mol. Cell Biol., 10:689-695, 1990）による、DEAE−デキストラン、続いてポリエチレングリコール（Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190, 1985）；直接音波負荷Fechheimer et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 84:8463-8467, 1987）による、リポソーム媒介トランスフェクション(Nicolau and Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190, 1982; Fraley et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 76:3348-3352, 1979; Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176, 1987; Wong et al., Gene, 10:87-94, 1980; Kaneda et al., Science, 243:375-378, 1989; Kato et al., J Biol. Chem., 266:3361-3364, 1991）による、およびレセプター媒介トランスフェクション（WuおよびWu, Biochemistry, 27:887-892, 1988; Wu and Wu, J. Biol. Chem., 262:4429-4432, 1987）；ならびに、各々が参照により本明細書に組み込まれる任意の組み合わせによるなどのＤＮＡの直接送達が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６４】
Ｖ．細胞
本明細書中で使用される場合、用語「細胞」、「細胞株」および「細胞培養物」は、交換可能に使用され得る。これらの用語の全てはまた、新たに単離された細胞およびインビトロで培養または増殖された細胞の両方を含む。これらの用語の全てはまた、それらの子孫（これは、任意のおよび全ての後続の世代である）を含む。全ての子孫は、意図的または不注意な変異のために同一ではないかもしれないことが理解される。異種核酸配列を発現する文脈において、「宿主細胞」または単に「細胞」は、原核細胞または真核細胞を指し、ベクターを複製することができるか、またはベクターもしくは組み込まれた核酸によってコードされる異種遺伝子を発現することができる任意の形質転換可能な生物を含む。宿主細胞は、ベクター、ウイルス、および核酸のレシピエントとして使用することができ、かつ使用されている。宿主細胞は、「トランスフェクト」または「形質転換」され得、これは、組換えタンパク質をコードする配列のような外因性核酸が宿主細胞に移入または導入されるプロセスをいう。形質転換細胞は、一次対象細胞およびその子孫を含む。
【０１６５】
特定の実施形態では、核酸移入は、任意の原核細胞または真核細胞上で行うことができる。いくつかの態様において、本開示の細胞は、ヒト細胞である。他の態様では、本開示の細胞は動物細胞である。いくつかの態様では、１つまたは複数の細胞は、癌細胞、腫瘍細胞、または不死化細胞である。さらなる態様では、細胞は疾患モデル細胞を表す。特定の態様において、細胞は、Ａ５４９、Ｂ細胞、Ｂ１６、ＢＨＫ−２１、Ｃ２Ｃ１２、Ｃ６、ＣａＣｏ−２、ＣＡＰ／、ＣＡＰ−Ｔ、ＣＨＯ、ＣＨ０２、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＯＳ−１、Ｃｏｓ−７、ＣＶ−１、樹状細胞、ＤＬＤ−１、胚幹（ＥＳ）細胞または誘導体、Ｈ１２９９、ＨＥＫ、２９３、２９３Ｔ、２９３ＦＴ、Ｈｅｐ  Ｇ２、造血幹細胞、ＨＯＳ、Ｈｕｈ−７、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞または誘導体、Ｊｕｒｋａｔ、Ｋ５６２、Ｌ５２７８Ｙ、ＬＮＣａＰ、ＭＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＣＫ、間葉細胞、Ｍｉｎ−６、単核球細胞、Ｎｅｕｒｏ２ａ、ＮＩＨ  ３Ｔ３、ＮＩＨ３Ｔ３Ｌ１、Ｋ５６２、ＮＫ細胞、ＮＳ０、Ｐａｎｃ−１、ＰＣ１２、ＰＣ−３、末梢血細胞、形質細胞、原発性線維芽細胞、ＲＢＬ、Ｒｅｎｃａ、ＲＬＥ、ＳＦ２１、ＳＦ９、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、ＳＫ−ＭＥＳ−１、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、ＳＬ３、ＳＷ４０３、刺激惹起性多能性獲得（ＳＴＡＰ）細胞または誘導体ＳＷ４０３、Ｔ細胞、ＴＨＰ−１、腫瘍細胞、Ｕ２ＯＳ、Ｕ９３７、末梢血リンパ球、増殖Ｔ細胞、造血幹細胞、またはＶｅｒｏ細胞であり得る。いくつかの実施形態では、細胞はＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。
【０１６６】
本明細書で使用する「継代」という用語は、既存の細胞から多数の細胞を生成するために細胞を分割するプロセスを指すことを意図する。細胞は、本明細書中に記載される任意の工程の前または後に、複数回継代され得る。継代は、細胞を分割し、少数を各新しい容器に移すことを含む。固体培養液については、まず細胞を切り離す必要があり、一般的にはトリプシン−ＥＤＴＡを混合して行う。次いで、少数の分離された細胞を使用して、新たな培養物を播種し得、一方、残りは廃棄される。また、全ての細胞を新鮮なフラスコに分配することにより、培養細胞の量を容易に増やすことができる。細胞は、培養物中に保持され、細胞複製を可能にする条件下でインキュベートされ得る。いくつかの実施形態では、細胞は、細胞が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回またはそれ以上の回数の細胞分裂を可能にする培養条件で維持される。
【０１６７】
いくつかの実施形態において、細胞は、細胞のクローン集団の拡大を可能にするために、限界希釈法に供され得る。限界希釈クローニングの方法は、当業者に周知である。このような方法は、例えば、ハイブリドーマについて記載されているが、任意の細胞に適用され得る。そのような方法は、参照により本明細書に組み込まれる（Cloning hybridoma cells by limiting dilution, Journal of tissue culture methods, 1985, Volume 9, Issue 3, pp 175-177, Joan C. Rener, Bruce L. Brown, および Roland M. Nardoneによる）。
【０１６８】
本開示の方法は、細胞の培養を含む。懸濁細胞および接着細胞を培養する方法は、当業者に周知である。いくつかの実施形態において、細胞は、市販の細胞培養容器および細胞培養培地を使用して、懸濁液中で培養される。ＡＤＭＥ／ＴＯＸプレート、細胞チャンバースライドおよびカバースリップ、細胞計数装置、細胞培養表面、Corning HYPERFlask細胞培養容器、コーティングされた培養容器、Nalgene Cryoware、培養チャンバー、培養皿、ガラス培養フラスコ、プラスチック培養フラスコ、３Ｄ培養フォーマット、培養マルチウェルプレート、培養プレート挿入、ガラス培養チューブ、プラスチック培養チューブ、積み重ね可能な細胞培養容器、低酸素培養チャンバー、ペトリ皿およびフラスコキャリア、クイックフィット培養容器、ロールボトルを使用するスケールアップ細胞培養、スピナーフラスコ、３Ｄ細胞培養、または細胞培養バッグを含むいくつかの実施形態において使用され得る市販の培養容器の例。
【０１６９】
他の実施形態において、培地は、当業者に周知の成分を使用して処方され得る。細胞を培養する製剤および方法は、以下の参考文献に詳細に記載されている：Short Protocols in Cell Biology J. Bonifacino, et al., ed., John Wiley & Sons, 2003, 826 pp; Live Cell Imaging: A Laboratory Manual D. Spector & R. Goldman, ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2004, 450 pp.; Stem Cells Handbook S. Sell, ed., Humana Press, 2003, 528 pp.; Animal Cell Culture: Essential Methods, John M. Davis, John Wiley & Sons, Mar 16, 2011; Basic Cell Culture Protocols, Cheryl D. Helgason, Cindy Miller, Humana Press, 2005; Human Cell Culture Protocols, Series: Methods in Molecular Biology, Vol. 806, Mitry, Ragai R.; Hughes, Robin D. (Eds.), 3rd ed. 2012, XIV, 435 p. 89, Humana Press; Cancer Cell Culture: Method and Protocols, Cheryl D. Helgason, Cindy Miller, Humana Press, 2005; Human Cell Culture Protocols, Series: Methods in Molecular Biology, Vol. 806, Mitry, Ragai R.; Hughes, Robin D. (Eds.), 3rd ed. 2012, XIV, 435 p. 89, Humana Press; Cancer Cell Culture: Method and Protocols, Simon P. Langdon, Springer, 2004; Molecular Cell Biology. 4th edition., Lodish H, Berk A, Zipursky SL, et al., New York: W. H. Freeman; 2000., Section 6.2Growth of Animal Cells in Culture、これらの全てが参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７０】
ＶＩ．核酸のゲノム統合
Ａ．標的指向させた組み込み
本開示は、核酸の組み込みを標的指向するための方法を提供する。これはまた、本明細書および当技術分野において「遺伝子編集」とも呼ばれる。いくつかの実施形態では、標的指向させた組み込みは、部位特異的リコンビナーゼおよび／または標的指向エンドヌクレアーゼなどのＤＮＡ消化剤／ポリヌクレオチド修飾酵素の使用によって達成される。用語「ＤＮＡ消化剤」は、核酸のヌクレオチドサブユニット間の結合（すなわち、ホスホジエステル結合）を切断することができる薬剤を指す。
【０１７１】
一態様では、本開示は、標的指向させた組み込みを含む。これを達成する１つの方法は、部位特異的リコンビナーゼおよび／または標的指向エンドヌクレアーゼなどの少なくとも１つのポリヌクレオチド修飾酵素のための少なくとも１つの認識配列を含む外因性核酸配列（すなわち、ランディングパッド）の使用による。部位特異的リコンビナーゼは、当該分野で周知であり、そして一般に、インベルターゼ、レゾルバーゼ、またはインテグラーゼと呼ばれ得る。部位特異的リコンビナーゼの非限定的な例としては、ラムダインテグラーゼ、Ｃｒｅリコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼ、ガンマデルタレゾルベーゼ、Ｔｎ３リゾルベーゼ、ΦＣ３１インテグラーゼ、Ｂｘｂ１インテグラーゼ、およびＲ４インテグラーゼが挙げられ得る。部位特異的リコンビナーゼは、特異的認識配列（または認識部位）またはそのバリアントを認識し、その全ては当技術分野で周知である。例えば、ＣｒｅリコンビナーゼはＬｏｘＰ部位を認識し、ＦＬＰリコンビナーゼはＦＲＴ部位を認識する。
【０１７２】
意図される標的指向エンドヌクレアーゼには、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓ様エンドヌクレアーゼ、Ｉ−Ｔｅｖｌヌクレアーゼもしくは関連するモノマーハイブリッド、または人工の標的指向ＤＮＡ二重ストランド切断誘導剤が含まれる。例示的な標的指向エンドヌクレアーゼは、以下にさらに記載される。例えば、代表的には、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、ＤＮＡ結合ドメイン（すなわち、ジンクフィンガー）および切断ドメイン（すなわち、ヌクレアーゼ）を含み、これらの両方は、以下に記載される。ポリヌクレオチド修飾酵素の定義には、ＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼを含み得るような、当業者に公知の任意の他の有用な融合タンパク質も含まれる。
【０１７３】
ランディングパッド配列は、部位特異的リコンビナーゼおよび／または標的指向エンドヌクレアーゼなどの特異的ポリヌクレオチド修飾酵素によって選択的に結合および修飾される少なくとも１つの認識配列を含むヌクレオチド配列である。一般に、ランディングパッド配列中の認識配列は、改変される細胞のゲノム中に内因的に存在しない。例えば、改変されるべき細胞がＣＨＯ細胞である場合、ランディングパッド配列中の認識配列は、内因性ＣＨＯゲノム中に存在しない。標的指向組み込みの速度は、標的細胞のゲノム内に内因的に存在しない高効率ヌクレオチド修飾酵素の認識配列を選択することによって改善することができる。内因的に存在しない認識配列の選択はまた、電位オフターゲット組み込みを減少させる。他の態様において、改変されるべき細胞において天然である認識配列の使用が所望され得る。例えば、複数の認識配列がランディングパッド配列において使用される場合、１つ以上は外因性のであり得、そして１つ以上は天然であり得る。
【０１７４】
当業者は、部位特異的リコンビナーゼおよび／または標的指向エンドヌクレアーゼによって結合および切断された配列を容易に決定することができる。
【０１７５】
複数の認識配列が単一のランディングパッドに存在してもよく、これにより、２つ以上の独特の核酸（とりわけ、レセプター遺伝子および／または誘導性レポーターを含む）が挿入され得るようにランディングパッドを２つ以上のポリヌクレオチド修飾酵素によって連続的に標的指向することが可能になる。あるいは、ランディングパッドにおける複数の認識配列の存在は、同じ核酸の複数のコピーがランディングパッドに挿入されることを可能にする。２つの核酸が単一のランディングパッドに標的指向される場合、ランディングパッドは、第１のポリヌクレオチド修飾酵素（例えば、第１のＺＦＮ対）のための第１の認識配列、および第２のポリヌクレオチド修飾酵素（例えば、第２のＺＦＮ対）のための第２の認識配列を含む。あるいは、またはさらに、１つ以上の認識配列を含む個々のランディングパッドは、複数の位置に統合され得る。タンパク質発現の増加は、ペイロードの複数のコピーで形質転換された細胞で観察される場合がある。別の方法として、複数のコピーを用いて変形された細胞において、異なる発現カセットを構成する複数の固有核酸配列を同一または別の着地パッドに投入した場合に、複数の遺伝子製品を同時に発現することも可能である。核酸の数および種類にかかわらず、標的指向エンドヌクレアーゼがＺＦＮである場合、例示的なＺＦＮ対は、ｈＳＩＲＴ、ｈＲＳＫ４、およびｈＡＡＶＳ１を含み、認識配列を伴う。
【０１７６】
一般的に言えば、標的指向組み込みを容易にするために使用されるランディングパッドは、少なくとも１つの認識配列を含み得る。例えば、ランディングパッドは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０以上の認識配列を含み得る。２つ以上の認識配列を含む実施形態において、認識配列は、互いに固有であり得る（すなわち、異なるポリヌクレオチド修飾酵素によって認識される）、同じ反復配列、または反復配列と固有の配列との組み合わせであり得る。
【０１７７】
当業者は、ランディングパッドとして使用される外因性核酸が、認識配列に加えて他の配列も含み得ることを容易に理解する。例えば、抗生物質耐性遺伝子、代謝選択マーカー、または蛍光タンパク質のような、本明細書に記載されるような選択可能またはスクリーニング可能な遺伝子をコードする１つ以上の配列を含むことが好都合であり得る。転写調節エレメントおよび制御エレメント（すなわち、プロモーター、部分プロモーター、プロモータートラップ、スタートコドン、エンハンサー、イントロン、インスレーターおよび他の発現エレメント）のような他の補足配列の使用もまた存在し得る。
【０１７８】
適切な認識配列の選択に加えて、高い切断効率を有する標的指向エンドヌクレアーゼの選択はまた、ランディングパッドの標的指向組み込みの速度を改善する。標的指向エンドヌクレアーゼの切断効率は、例えば、ＣＥＬ−１アッセイのようなアッセイまたはＰＣＲアンプリコンにおける挿入／欠失の直接配列決定を使用することを含む、当該分野で周知の方法を使用して決定され得る。
【０１７９】
本明細書中に開示される方法および細胞において使用される標的指向エンドヌクレアーゼの型は、変動し得るか、または変動する。標的指向エンドヌクレアーゼは、天然に存在するタンパク質または操作されたタンパク質であり得る。標的指向エンドヌクレアーゼの一例は、亜鉛フィンガーヌクレアーゼであり、これについては以下でさらに詳細に論じる。
【０１８０】
使用することができる標的指向エンドヌクレアーゼの別の例は、真核細胞の核へのエンドヌクレアーゼの侵入を可能にする、少なくとも１つの核局在化シグナルを含むＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼである。ＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼはまた、少なくとも１つのヌクレアーゼドメインと、誘導ＲＮＡと相互作用する少なくとも１つのドメインとを含む。ＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼは、ＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼが特定の染色体配列を切断するように、誘導ＲＮＡによって特定の染色体配列に向けられる。誘導ＲＮＡは標的切断のための特異性を提供するので、ＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼのエンドヌクレアーゼは普遍的であり、異なる標的染色体配列を切断するために異なる誘導ＲＮＡと共に使用することができる。例示的なＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼタンパク質が、以下でさらに詳細に議論される。例えば、ＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様融合タンパク質、クラスター化された規則的に点在する短パリンドローム繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）システムに由来するＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼであり得る。
【０１８１】
標的指向エンドヌクレアーゼはまた、メガヌクレアーゼであり得る。メガヌクレアーゼは、大きな認識部位を特徴とするエンドデオキシリボヌクレアーゼであり、すなわち、認識部位は、一般に、約１２塩基対〜約４０塩基対の範囲である。この要件の結果として、認識部位は、一般に、任意の所定のゲノムにおいて１回のみ生じる。メガヌクレースの中で、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧと名づけられた内核解体ファミリーは、ゲノムとゲノム工学の研究のための貴重なツールとなった。メガヌクレアーゼは、当業者に周知の技術を用いてそれらの認識配列を修飾することによって、特定の染色体配列を標的とすることができる。例えば、Epinat et al.、2003、Nuc Acid Res.,31（11）：2952−62およびStoddard，2005、Quarterly Review of Biophysics、pp．1−47を参照されたい。
【０１８２】
使用することができる標的指向エンドヌクレアーゼの別例は、転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）ヌクレアーゼである。ＴＡＬＥは、植物病原体キサントモナス（Xanthomonas）由来の転写因子であり、これは、新しいＤＮＡ標的に結合するように容易に操作され得る。ＴＡＬＥまたはその切断型は、ＴＡＬＥヌクレアーゼまたはＴＡＬＥＮと呼ばれる標的指向エンドヌクレアーゼを作製するために、ＦｏｋＩなどのエンドヌクレアーゼの触媒ドメインに連結されてもよい。例えば、Sanjanaら、2012、Nature Protocols 7（1）：171−192; Bogdanove A J、Voytas D F.,2011、Science，333（6051）：1843−6; Bradley P、Bogdanove A J、Stoddard B L.,2013、Curr Opin Struct Biol.,23（1）：93−9を参照のこと。
【０１８３】
別の例示的な標的指向エンドヌクレアーゼは、部位特異的ヌクレアーゼである。特に、部位特異的ヌクレアーゼは、その認識配列がゲノム中でまれにしか生じない「希切断装置」エンドヌクレアーゼであってもよい。好ましくは、部位特異的ヌクレアーゼの認識配列は、ゲノム中で１回のみ生じる。あるいは、標的指向ヌクレアーゼは、人工の標的指向ＤＮＡ二重ストランド破断誘導剤であってもよい。
【０１８４】
いくつかの実施形態において、標的指向組み込みは、インテグラーゼの使用によって達成され得る。例えば、ｐｈｉＣ３１インテグラーゼは、バクテリオファージｐｈｉＣ３１のゲノム内にコードされる配列特異的リコンビナーゼである。ｐｈｉＣ３１インテグラーゼは、結合部位（ａｔｔ）と呼ばれる２つの３４塩基対配列間の組換えを媒介し、一方はファージ中に見出され、他方は細菌宿主中に見出される。このセリンインテグラーゼは、哺乳動物細胞を含む多くの異なるセル型において効率的に機能することが示されている。ｐｈｉＣ３１インテグラーゼの存在下で、ａｔｔＢ含有ドナープラスミドは、天然ａｔｔＰ部位（偽ａｔｔＰ部位と呼ばれる）と配列類似性を有する部位での組換えを介して、標的ゲノムに一方向に組み込まれ得る。ｐｈｉＣ３１インテグラーゼは、任意のサイズのプラスミドを単一コピーとして組み込むことができ、補因子を必要としない。組み込まれた導入遺伝子は、安定に発現され、遺伝可能である。
【０１８５】
１つの実施形態において、本開示のポリヌクレオチドのゲノム組み込みは、トランスポザーゼの使用によって達成される。例えば、脊椎動物の染色体に正確に規定されたＤＮＡ配列を導入するように設計された合成ＤＮＡトランスポゾン（例えば、「睡眠美容」トランスポゾンシステム）を使用することができる。睡眠美容トランスポゾンシステムは、睡眠美容（ＳＢ）トランスポザーゼと、脊椎動物のゲノムにＤＮＡの特定の配列を挿入するように設計されたトランスポゾンとから構成される。ＤＮＡトランスポゾンは、単純なカット・アンド・ペーストの方法で、あるＤＮＡ部位から別の部位に移動する。転位は、定義されたＤＮＡセグメントが１つのＤＮＡ分子から切り出され、同じまたは異なるＤＮＡ分子またはゲノム中の別の部位に移動される正確なプロセスである。
【０１８６】
他の全てのＴｃ１／マリナー型トランスポザーゼと同様に、ＳＢトランスポザーゼは、レシピエントＤＮＡ配列のＴＡジヌクレオチド塩基対にトランスポゾンを挿入する。挿入部位は、同じＤＮＡ分子のどこか、または別のＤＮＡ分子（または染色体）のどこかにあり得る。ヒトを含む哺乳動物ゲノムでは、約２億のＴＡ部位が存在する。ＴＡ挿入部位は、トランスポゾン組み込みの過程で複製される。ＴＡ配列のこの複製は、転位の特徴であり、一部の実験において機構を確かめるために使用される。トランスポザーゼは、トランスポゾン内にコードされ得るか、またはトランスポザーゼは、別の供給源によって供給され得るかのいずれかであり、この場合、トランスポゾンは、非自律要素となる。非自律トランスポゾンは、挿入後、独立して切除および再挿入を続けることができないので、遺伝的ツールとして最も有用である。ヒトゲノムおよび他の哺乳動物ゲノムにおいて同定されたＤＮＡトランスポゾンの全ては、それらがトランスポザーゼ遺伝子を含有するにもかかわらず、遺伝子が非機能的であり、トランスポゾンを動員することができるトランスポザーゼを生成することができないので、非自律的である。
【０１８７】
ＶＩＩ．使用方法
本明細書中に記載されるアッセイは、大規模スクリーニングを、時間および費用の両方で効果的にする。さらに、本明細書中に記載されるアッセイは、オンおよびオフターゲット効果についてのリガンドのスクリーニング、特定のリガンドまたはリガンドの組に対する１つ以上のレセプターのバリアントの活性の決定、リガンド結合に必要とされるレセプターにおいて必要とされる重要な残基のマッピング、およびレセプターにおけるどの残基がリガンド結合に重要ではないかの決定に役立つ。
【０１８８】
いくつかの態様では、アッセイ方法は、レセプターが１つのレセプターのバリアントであるアッセイに関する。いくつかの実施形態において、各バリアントは、野生型タンパク質配列に対して１つの置換を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、各バリアントは、野生型アミノ酸配列と比較して、少なくとも、多くとも、または厳密に１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個の置換（またはその中の誘導可能な任意の範囲）を含むか、またはそれらからなる。いくつかの態様において、この方法は、リガンドに対するレセプターの集団の活性を決定する工程を包含し、ここで、レセプターの集団は、同じレセプターの少なくとも２つのバリアントを包含し、そしてここで、この活性は、リガンドに応じて決定される。いくつかの態様では、レセプターの集団は、少なくとも、多くとも、または約２、１０、１００、２００、３００、４００、５００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、または５０００個のレセプター（またはその中の誘導可能な任意の範囲）を含み、スクリーニングされる。いくつかの態様において、少なくとも、多くとも、または厳密に１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０リガンド（またはその中の誘導可能な任意の範囲）がスクリーニングされる。いくつかの態様では、少なくとも、多くとも、または約２、１０、１００、２００、３００、４００、５００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、または５０００個のレセプター（またはその中の誘導可能な任意の範囲）が、少なくとも、多くとも、または厳密に１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０リガンド（またはその中の誘導可能な任意の範囲）に応じてスクリーニングされる。いくつかの実施形態において、アッセイは、リガンドに対するバリアントレセプターの決定された活性に基づいて、リガンドに対する患者の反応を予測するために使用され得る。例えば、本明細書中に記載されるアッセイは、リガンドに対するバリアントレセプターの治療反応を予測するために使用され得る。次いで、この情報は、バリアントレセプターを有する患者を処置するための処理方法において使用され得る。いくつかの実施形態では、この方法は、患者をリガンドで処置する工程を包含し、ここで、この患者は、バリアントレセプターを有すると決定されている。いくつかの実施形態では、リガンドに対するバリアントレセプターの活性は、本明細書に記載の手法によって決定されている。
【０１８９】
いくつかの態様において、このアッセイは、１つ以上のリガンドに対するレセプターのクラスの活性を決定するためのものである。
【０１９０】
いくつかの実施形態において、レセプターのクラスは嗅覚、ＧＰＣＲ、核ホルモン、ホルモン、または触媒レセプターである。いくつかの実施形態では、レセプターは、アルファもしくはベータアドレナリンレセプター、またはアルファ−１、アルファ−２、ベータ−１、ベータ−２、もしくはベータ−３アドレナリンレセプター、またはアルファ−１Ａ、アルファ−１Ｂ、アルファ−１Ｄ、アルファ−２Ａ、アルファ−２Ｂ、もしくはアルファ−２Ｃアドレナリンレセプターなどのアドレナリンレセプターである。いくつかの実施形態において、レセプターまたはレセプターのクラスは、本明細書中に記載されるものである。
【０１９１】
ＶＩＩＩ．キット
本開示の特定の態様はまた、本開示の核酸、ベクター、または細胞を含むキットに関する。キットは、本開示の方法を実施するために使用することができる。いくつかの実施形態では、キットを使用して、レセプター遺伝子またはレセプター遺伝子群の活性化を評価することができる。いくつかの実施形態では、キットを使用して、単一遺伝子のバリアントを評価することができる。特定の実施形態では、キットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、１００、５００、１，０００またはそれ以上の、あるいは少なくともまたは多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、１００、５００、１，０００またはそれ以上の、核酸プローブ、プライマー、または合成ＲＮＡ分子、またはその中で導き出せる任意の値または範囲および組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、リガンドによるレセプターの活性化または関与を評価するためのキットが存在する。いくつかの実施形態では、バーコードまたはレセプターを増幅、同定、または配列決定するためのユニバーサルプローブまたはプライマーが含まれる。このような試薬はまた、スクリーニングにおいて使用され得る宿主細胞を生成または試験するために使用され得る。
【０１９２】
特定の実施形態では、キットは、組織学的スライドおよび試薬、組織学的染色、アルコール、緩衝液、組織包埋媒体、パラフィン、ホルムアルデヒド、および組織脱水剤などの、細胞形態および／または表現型を分析するための材料を含み得る。
【０１９３】
キットは、チューブ、ボトル、バイアル、シリンジ、または他の適切な包装手段のような、個々に包装され得るか、または瓶中に配置され得る成分を含み得る。
【０１９４】
個々の成分はまた、濃縮された量でキット中に提供されてもよく、いくつかの実施形態では、成分は、他の成分との溶液中にあるのと同じ濃度で個々に提供される。成分の濃度は、１ｘ、２ｘ、５ｘ、１０ｘ、または２０ｘ以上とすることができる。
【０１９５】
薬物発見のために本開示のプローブ、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド検出剤を使用するためのキットが企図される。
【０１９６】
特定の態様において、陰性および／または陽性対照剤は、いくつかのキットの実施形態に含まれる。制御分子を用いて、トランスフェクション効率および／または細胞におけるトランスフェクション誘導変化の制御を検証することができる。
【０１９７】
本発明の実施形態は、発現されたポリヌクレオチドを検出するための２つ以上のＲＮＡプローブまたはプライマーを、好適な容器中に含む、試料のための核酸またはポリペプチド輪郭を評価することによって、病理学的試料を分析するためのキットを含む。さらに、プローブまたはプライマーを標識してもよい。標識は当技術分野で公知であり、本明細書にも記載されている。いくつかの実施形態では、キットは、プローブ、核酸、および／または検出剤を標識するための試薬をさらに含むことができる。キットはまた、アミン修飾ヌクレオチド、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ、およびポリ（Ａ）ポリメラーゼ緩衝液の少なくとも１つを含む標識試薬を含み得る。標識試薬は、アミン反応性色素を含むことができる。キットは、以下の物質：酵素、反応管、緩衝液、界面活性剤、プライマー、プローブ、抗体のいずれか１つ以上を含み得る。いくつかの実施形態では、これらのキットは、ＲＮＡ抽出、ＲＴ−ＰＣＲ、およびゲル電気泳動を行うために必要な装置を含む。アッセイを実施するための説明書もまた、キットに含まれ得る。
【０１９８】
キットは、発現を評価するためにキットを使用するための説明書、発現データを発現値に変換するための手段、および／またはリガンド／レセプター相互作用データを生成するために発現値を分析するための手段をさらに含み得る。
【０１９９】
キットは、ラベルを有する容器を含んでもよい。適当な容器には、例えば、ボトル、バイアルおよび試験管を包含する。これら容器は、たとえばガラスまたはプラスチックのような各種の材料から成形しうる。容器は、本開示の方法に有用なプローブを含む組成物を保持することができる。キットは、上述の容器と、緩衝液、希釈剤、フィルター、針、注射器、および使用説明書を有する添付文書を含む、商用および使用者の観点から望ましい材料を含む１つ以上の他の容器とを含んでもよい。
【実施例】
【０２００】
ＩＸ．実施例
以下の実施例は、本開示の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例において開示される技術は、本開示の実施において十分に機能することが発明者によって発見された技術を表し、したがって、その実施のための好ましいモードを構成すると考えることができることが、当業者によって理解されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、開示された特定の実施形態において多くの変更を行うことができ、それでも、本開示の精神および範囲から逸脱することなく、同様のまたは同様の結果を得ることができることを理解すべきである。
【０２０１】
実施例１−多重化臭気物質−レセプタースクリーニングシステム。
哺乳動物嗅覚は非常に複雑な過程であり、おそらく最も理解されていない感覚である。嗅覚レセプター（ＯＲ）は、臭気知覚の第１の層である。ヒトＯＲは、鼻上皮に位置するニューロンにおいて単一対立遺伝子的に発現される４００種のＧタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）のセットである。臭気物質は、レセプターに多対多様式で結合し、そのパターンは嗅球に伝達され、皮質における知覚に変換される。高親和性リガンドが同定されたヒトＯＲはわずか約５％であり、多数のオーファンレセプターによって、嗅覚を支配する下流の神経生物学を調査する可能性が阻害されている。以前の脱アルファ化の試みは、それぞれの臭気物質−レセプター対を個別にスクリーニングする異種細胞ベースのアッセイを利用した。多数の潜在的なレセプター−臭気物質の組み合わせ、および異種ＯＲ発現を達成することの困難さは、「一度に１つ」のアプローチのスループットを制限した。代わりに、本発明者らは、多重化された臭気物質−レセプタースクリーニングを可能にする安定なＯＲ発現細胞株を操作した。
【０２０２】
レセプター−臭気物質相互作用を測定するために、本発明者らは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｃＡＭＰシグナル伝達のための遺伝的リポーターを適合させた。臭気物質結合時には、Ｇタンパク質シグナル伝達によりｃＡＭＰの生産が刺激され、それが転写因子ＣＲＥＢのリン酸化につながる。ＣＲＥＢは、短いタンデムリピート配列ＣＲＥと結合し、通常ルシフェラーゼである下流レポーター遺伝子の転写をオンにする。このアッセイは、同じプラスミド上で発現されるライブラリー中の１つのＯＲと独自に会合するレポーター遺伝子の３’ＵＴＲ中にＤＮＡバーコードを含むように改変された（図１）。ｃＡＭＰシグナル伝達が、臭気物質によって結合されないが同一細胞内に存在するレセプターに対応するバーコードの発現を引き起こさないことを確実にするために、各細胞に単一のライブラリーメンバーを組み込む。本発明者らは、細胞株を９６ウェルプレートに播種し、異なる臭気で各ウェルを誘導し、バーコード化された転写物を配列決定した。本発明者らは、各バーコードの相対的な存在量を、各レセプターについての臭気の親和性を表示するヒートマップに変換した。
【０２０３】
ＧＰＣＲ活性化のための典型的な遺伝子レポーターアッセイは、レセプターおよびレポーターを個別に同時トランスフェクトする。各バーコードをその対応するＯＲにマッピングするために、配列決定を介してバーコードおよびＯＲの会合を可能にする単一のプラスミド上でアッセイのための全ての成分を発現させる必要がある。本発明者らは、全ての必要な成分を発現するようにプラスミドを構成した（図３）。本発明者らは一時的に、２つのＯＲ、ＭＯＲ４２−３およびＭＯＲ９−１について、両方の構造に対する既知の高親和性リガンドを用いて一連の濃度をスクリーニングし、比較可能なレポーター活性化を観察した。
【０２０４】
多重化ストラテジーは、ＯＲライブラリーの安定なクローン的組み込みを必要とする。最初に、本発明者らは、Ｂｘｂ１組換えを使用することを決定したが、これは、それが、単一のポット反応において細胞あたり単一のコピーで各ライブラリーメンバーが組み込まれることを可能にしたからである。本発明者らは、Ｂｘｂ１ ａｔｔｐリコンビナーゼ部位を含む「ランディングパッド」を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＨ１１セーフハーバー遺伝子座に操作した（図４）。操作された細胞株は、Ｍｕｋｋｕ１ａと呼ばれる（表１）。Ｂｘｂ１組換えは、相補的ａｔｔｂ認識部位を含むプラスミドＤＮＡを不可逆的に組み込み、細胞当たり1つの単一組換えを制限するゲノムａｔｔｐ配列を破壊する。本発明者らは、ランディングパッドにおいてＭＯＲ４２−３を誘導する場合、レポーター活性化を観察することができなかった。しかしながら、ベータ−２アドレナリンレセプター（アデニル酸シクラーゼも活性化する標準的なＧＰＣＲ）は、ランディングパッドから発現した場合、誘導時にレポーターを強く活性化した。
2020530281.tif 000100
【０２０５】
ＯＲは、異種発現が困難であることが知られており、安定な異種発現は報告されていない。本発明者らは、ＯＲの安定な構成的発現がダウンレギュレーションの多くの可能な道を導くと仮定し、誘導性発現を試みることを決意した。本発明者らは、逆Ｔｅｔトランスアクチベーターを発現するようにＭｕｋｋｕ１ａ細胞を操作し、ＯＲ発現を駆動するプロモーターをＴｅｔ−Ｏｎ誘導性プロモーターで置き換えた（図５）。誘導システムは、以前のシステムに匹敵するレポーター活性化を一時的に達成したが、本発明者らは、ランディングパッドにある場合、依然としてレポーター発現を観察することができなかった。次の仮説は、単一のＯＲ遺伝子が、遺伝的レポーターを活性化するのに必要な発現を達成するのに不十分であるということであった。本発明者らは、中間末端反復を遺伝子構築物に隣接させ、トランスポザーゼを用いてプラスミドを組み込んだ（図６）。構成的ＯＲ発現下では、レポーターは依然として臭気物質に応答しなかった。予想外に、レポーターの転位とＯＲ発現の制御との組み合わせは、レポーターの臭気物質応答を誘導的に回復させた。ＱＰＣＲにより、トランスポゾンが平均して細胞当たり４〜６コピーで組み込まれていることが確認された。
【０２０６】
多くのＯＲは、異種システムにおいて一過性に発現される場合、細胞膜輸送および適切なシグナル伝達のためにアクセサリー因子の同時発現を必要とする（図７）。これは、安定な発現ならびにゲノム的に組み込まれた４つのアクセサリー因子導入遺伝子：ＲＴＰ１ＳおよびＲＴＰ２（表面発現を増大させるシャペロン）、Ｇαｏｌｆ（ＯＲと天然に相互作用するＧタンパク質アルファサブユニット）、およびＲｉｃ８ｂ（Ｇαｏｌｆと関連するグアニンヌクレオチド交換因子）についての問題であると予測された。本発明者らは、Ｔｅｔ誘導性調節下でこれらの４つの因子をプールし、Ｍｕｋｋｕ２ａ細胞に転移させた。強力なＯＲ発現能力を有する細胞株を作製するために、本発明者らは単一クローンを単離し、異種機能発現のためのアクセサリー因子を必要とすることが以前に知られている２つのＯＲ、Ｏｌｆｒ６２およびＯＲ７Ｄ４に対する遺伝子レポーター活性化についてそれらを一時的にスクリーニングした。
【０２０７】
４２種のマウスＯＲを、レポーター遺伝子の３’ＵＴＲにランダムバーコードを含むトランスポゾンベクターにクローニングし、配列決定したクローンを用いて、バーコードを各レセプターにマッピングした。次に、各構築物をＭｕｋｋｕ３ａ細胞に個々に転位させ、次いで、転位後に細胞を一緒にプールした。最終的に、統合されたＭｕｋｋｕ３ａ細胞は、Ｔｅｔ−Ｏｎシステムの制御下でアクセサリー因子およびＯＲの両方を誘導的に発現する（データは示していない）。本発明者らは、安定な細胞株が大きなレセプターコホートについて以前のレセプター−臭気物質会合を再現しかつ確実に働くことを確認するために、タンパク質および転写物両方のレベルで既知のリガンドを用いて少数のレセプターを試験した（図２Ａ〜Ｂ）。
【０２０８】
このアッセイをハイスループットスクリーニングに従うようにするために、ライブラリー調製のための９６ウェルプレート適合性インライセートプロトコール（図８）を開発した。プレートの各ウェルおよびプレート自体を、カスタムインデックスでバーコード化した。本発明者らは、本発明者らの４２−レセプターライブラリーに対して４つの別々の濃度の９６種の臭気物質をスクリーニングし、１６，１２８種の独特のレセプター−リガンド相互作用を得た。各条件下での各レセプターの相対的活性化を示すために、ヒートマップを構築した（図２Ｃ）。
【０２０９】
臭気物質−レセプター相互作用空間は複雑であり、横断するのが困難である。本発明者らは、異種ＯＲ発現の課題を克服し、多重化によって相互作用空間を圧縮するプラットホームを開発した。このプラットホームは、哺乳動物ＯＲの大規模脱アルファ化を経済的かつ技術的に可能にする。
【０２１０】
実施例２−嗅覚−配列：嗅覚レセプター−リガンド相互作用をデコードするための多重ＧＰＣＲ活性アッセイ
本発明者らは、ハイスループットフォーマットで次世代配列決定によりマルチプレックスで読み取ることができる安定なヒト細胞株レポーターのライブラリーを構築することにより、マルチプレックスレセプター−リガンドプロファイリングのためのプラットホームを開発した。この技術は、多くの他のクラスのレセプターに一般化され、そして薬学的に関連するＧＰＣＲについての薬物発見のためのハイスループットスクリーニングを可能にする。
【０２１１】
小分子とレセプターとの相互作用は、生体の内部状態や内部環境を感知し、それに反応する機能を支えている。多くの薬物および天然産物について、多くの生物学的標的の機能を一度に調節する能力は、それらの効力にとって重要である。このような多剤耐性は、どの化学物質がどの標的と相互作用するかがわからないことが多いため、検討が困難である。この多対多の課題により、一度に１つずつの相互作用を検討するのが骨の折れるものとなり、これは哺乳動物の嗅覚において特に明らかである。
【０２１２】
嗅覚は、嗅覚レセプター（ＯＲ）として知られる、あるクラスのＧタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）によって媒介される。ＧＰＣＲは、哺乳動物における小分子シグナル伝達の中心的なプレーヤーであり、米国食品医薬品局承認医薬の３０％超が標的とする。ＯＲは、ヒト、マウス、および象においてそれぞれ約３９６、１１３０、および１９４８のインタクトなレセプターを有する多くの異なる進化的状況に特化した、クラスＡ ＧＰＣＲの大きなファミリーである。各ＯＲは、潜在的に、無限に近い数の臭気物質と相互作用することができ、各臭気物質は、多くのＯＲと相互作用することができる。ＯＲの大多数は、この複雑さのため、およびｉｎ ｖｉｔｒｏでの哺乳動物ＧＰＣＲ機能の再現が困難であるため、オーファンのままである。さらに、いずれのＯＲについての結晶構造も存在せず、このことはどの臭気物質がそれぞれのＯＲを活性化するかを予測するための計算努力を妨げる。
【０２１３】
ここで、本発明者らは、多重様式で哺乳動物ＯＲライブラリーに対する小分子ライブラリーを特徴付けるための新しいＨＴＳ適合性システムを報告する（図９Ａ）。これを行うために、本発明者らは、機能的ＯＲ発現が可能な安定な細胞株（図１１）およびＯＲ活性のための多重化レポーター（図１２）の両方を開発した。最終的なプラットホームは、ＯＲ輸送およびシグナル伝達に必要な誘導的に発現されたタンパク質を有する、操作された細胞株の内部に位置する、誘導的に発現されたマルチコピーＯＲを含む（図１３）。各ＯＲの活性化は、固有の１５ヌクレオチドバーコード配列を有するレポーター転写物の発現をもたらす。各バーコードはＯＲを同定し、バーコードのアンプリコンＲＮＡ配列による多重読出しを可能にする（図９Ａ、図１３）。このプラットホームを用いて本発明者らは少なくとも４２種の異なるレセプターをスクリーニングし、本発明者らは、このプラットホームを、新規な臭気物質対の発見を可能にしたハイスループットスクリーニングに適合させた。本発明者らは、マルチコピー組み込みおよび誘導性発現がレポーター活性化を可能にすることを見出した。個々に、これらの特徴は、反応を生じなかった；しかしながら、それらの組み合わせは、機能的ＯＲレポーター細胞株を生じ、これは、マルチコピー組み込みまたは誘導性発現のいずれかが単独で使用された場合には見出されない相乗的応答を実証する。次いで、Ｇ＿ａｌｐｈａ＿ｏｌｆ、Ｒｉｃ８ｂ、ＲＴＰ１Ｓ、ＲＴＰ２を誘導的に発現させた（図９Ｂ、図１１）。レポーター構築物を操作するために、本発明者らは、タンパク質輸送タグを使用して表面発現を増大させ、ＤＮＡインスレーター配列を付加してバックグラウンドレポーター活性化を減少させ、ｃＡＭＰ反応エレメント（ＣＲＥ）エンハンサーを改変してレポーターシグナルを改善し、そしてこれらのエレメントを組み合わせて単一の転移性ベクターにし、細胞株の発生を促進した（図１２）。本発明者らは、既知のリガンドを有する３つのマウスＯＲに対する本発明者らのシステムを検証し、以前は発現することが困難であったＯｌｆｒ６２を含む、誘導および用量依存性活性化を観察した（図９Ｃ）。
【０２１４】
修飾後、本発明者らは、４２種のマウスＯＲ発現細胞株のライブラリーを作製し、活性化の多重リードアウトを試験した。最初に、Ｓａｎｇｅｒ配列決定によりＯＲをクローニングし、それらの対応するバーコードにマッピングし、プラスミドを個々にＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に転位させ、選択後に細胞株を一緒にプールした（図１０Ａ）。多重化アッセイを導くために、本発明者らは、細胞ライブラリーを６ウェル培養皿に播種し、特異的ＯＲを活性化することが知られている臭気物質を添加した（図１４）；３つを除く全てのＯＲは、活性化の確実な推定値を得るのに十分な細胞中に存在した。配列決定読み出しの分析は、以前に同定された臭気物質−レセプター対を再現し、化学混合物は、複数のＯＲを適切に活性化した。興味深いことに、本発明者らは、このアッセイが、それらが発現するＯＲとは無関係に細胞を非特異的に刺激する、直接アデニル酸シクラーゼ刺激因子ホルスコリンなどの化学物質に対して強力であることを見出した。このような化学物質は、全てのバーコードを同等に活性化するので、このような迷惑な化学物質は、容易に除去することができる。次に、本発明者らは、９６ウェル形式でのハイスループットスクリーニングのためのプラットホームを適合させた。試薬費用および分析期間を短縮するために、本発明者らは、インライセート逆転写プロトコルを開発し、それぞれのウェルを一意に同定するために二重インデックス付けを使用した（「方法」を参照のこと）。これらの改善を用いて、既知の臭気物質−レセプター対の用量−応答曲線を再現することができた（図１０Ｂ、図１４）。本発明者らは、同一に処理したが生物学的に独立したウェル間で、再現性のある結果を観察した（図１５〜１６）。
【０２１５】
続いて、本発明者らは、ＯＲ細胞ライブラリーに対して３つの濃度で１８２種の臭気物質を３連でスクリーニングした。これは、対照を含む約８５，０００種の別個のルシフェラーゼアッセイに相当する（図１０Ａ、表２）。アッセイにおける各９６ウェルプレートは、正規化のために陽性対照臭気物質および溶媒ＤＭＳＯウェルを含有した（図１６）。ＥｄｇｅＲソフトウェアパッケージを用いて、バーコードカウントの負の二項モデルに基づいて差動応答ＯＲを決定した。本発明者らは、１１４種のＯＲ−臭気物質相互作用（可能性のある７，２００種のうち）を見出し、そのうち８１種が新規であり、２４種の相互作用が、１５種のオーファンレセプターとのものであることを見出した（図１０Ｃ、図１７および補足表４）（ＦＤＲ＝１％；ベンジャミニ−ホッチバーグ補正）。全３９個のレセプターのうちの２８個が少なくとも１つの臭気物質によって活性化され、１８２個の臭気物質のうちの６８個が少なくとも１つのＯＲを活性化した（表４）。本発明者らは、少なくとも１．２倍誘導の３７種の相互作用を選択し、以前に開発された、いくつかの重要な差異を有する一過性ＯＲアッセイを用いて、個々に試験した（図１８）。ヒットと呼ばれる１％ＦＤＲでの２８種の相互作用のうち、２１種がこの直交系で再現された（図１７）。再現されなかった７種のうちの一部も、真である可能性が高い。例えば、本発明者らのアッセイは、ＭＯＲ１９−１について高い化学的類似性を有する２つのヒット（サリチル酸メチルおよびサリチル酸ベンジル）を記録し、このことは、これらが偽陽性でない可能性があることを示唆した（図１８）。さらに、１％ＦＤＲ閾値を超えない９種の相互作用のうちの３つは、直交アッセイにおいて活性化を示し、控えめな閾値を示した。以前の大規模なＯＲ脱臭研究では同じレセプターと化学薬品のいくつかを使用しており、本発明者らは以前の低親和性相互作用の大部分を特定しなかったにもかかわらず、ＥＣ５０が１００μＭ以下の報告された相互作用のうち９／１２種が本発明者らのプラットホームにおいても検出されたことを発見した（図１９）。逆に、本発明者らはまた、この以前の研究で試験され陰性とされた１４種の相互作用を検出した。最後に、本発明者らのアッセイは、相互作用しなかった臭気物質およびＯＲの組み合わせをほとんど再現した（４９３／５０７）。
【０２１６】
本発明者らは、類似の特徴を有する化学物質が、類似のＯＲセット、例えば本研究で本発明者らが脱オーファン化したレセプターを活性化することを見出した。例えば、以前にオーファンであったＭＯＲ１３−１は、４つの化学物質によって活性化され、極性基は、３つの場合において、剛性の回転不能な足場に付着される。別の例は、サリチル酸官能基に対して明確な親和性を有するＭＯＲ１９−１である。不完全な、時には任意である化学的記述子に頼ることなく、化学的類似性がレセプター活性化にどのように関連するかをより良く理解するために、本発明者らは、以前に検証された計算オートエンコーダを使用して、それぞれの化学物質をおよそ２９２次元の潜在空間で表し、これは化学構造のほとんど無損失の圧縮を可能にした（データは示さず）。本発明者らは、同じＯＲを活性化する化学物質が明確にクラスター化する傾向があることを見出した（図１０Ｄ、図２０）。例えば、ＭＯＲ５−１リガンドは潜在空間に集まり、長鎖（＞５炭素）アルデヒドおよびカルボン酸である１０／１３種の臭気物質がレセプターを活性化することを示す。さらに、ＭＯＲ１７０−１は、広い活性化パターン、すなわち、ベンゼン環およびカルボニル基またはエーテル基のいずれかを含む全ての臭気物質の約５０％の結合を示し、このパターンは潜在空間にも反映される。全てではないが多くのレセプター。相互作用のセット全体の活性化ランドスケープは、いくつかのＯＲが切断された化学部分空間によって活性化されることを示唆する（図２０）。それぞれのＯＲを活性化する化学物質の空間を理解することは、新規な臭気物質−ＯＲの相互作用を予測するための基礎を確立する。
【０２１７】
特定の化学物質は多数の標的と相互作用することができるので、内因性リガンド、医薬、天然産物、または臭気のどれであるかにかかわらず、化学物質がどのように潜在的標的と相互作用するかについての本発明者らの理解が不完全であることは、本発明者らが多数の可能性のある標的および機能経路を有する新しいものを合理的に開発する能力を制限する。これは、天然および治療の両方の状況において、ますます明らかになってきている。本発明者らは、Ｓｍｅｌｌ−ｓｅｑが３９６人のメンバーのヒトＯＲレパートリーにスケールアップでき、臭気に対するＯＲの反応を包括的に定義できると予測した。Ｓｍｅｌｌ−ｓｅｑのウェル当たりのおおよそのコストは、現存するアッセイと同等であるが、多重化は、調査される相互作用当たりのコストおよび労力を劇的に低減する。特定の標的へとより選択的にヒットさせるかまたはレセプターのセットをより広範に活性化させるための取り組みは、巨大なデータセットに頼った機械学習方法を利用する。Ｓｍｅｌｌ−ｓｅｑのようなマルチプレックス方式は、この規模の品質データを生成するためのスケーラブルなソリューションを提供する。
【０２１８】
表
（表２）本研究でスクリーニングされた嗅覚レセプター
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【０２１９】
（表３）本研究でスクリーニングした臭気物質
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【０２２０】
（表４）ヒットと呼ばれる臭気物質−レセプター対
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【０２２１】
（表５）本研究で使用したプライマーおよび配列
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【０２２２】
方法
１．臭気レセプター活性化ルシフェラーゼアッセイ（一過性）
Dual−Glo Luciferase Assay System (Promega)を使用して、以前に記載されたように（ZhuangおよびMatsunami 2008）、ＯＲ−臭気物質応答を測定した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ＃１１２６８）を、１００ｕｌのＤＭＥＭ(Thermo Fisher Scientific)中、１ウェルあたり７，３３３細胞の密度で、ポリ−Ｄ−リジンでコーティングされた白色９６ウェルプレート（Corning）中にプレーティングした。２４時間後、リポフェクタミン２０００（Thermo Fisher Scientific）を使用して、ＯＲをコードするプラスミド５ｎｇ／ウェルで、サイクリックＡＭＰ応答エレメントによって駆動されるのルシフェラーゼ１０ｎｇ／ウェルまたは、ＯＲおよびルシフェラーゼ遺伝子の両方をコードするプラスミド１０ｎｇ／ウェルで、どちらの場合も、ウミシイタケルシフェラーゼをコードするプラスミド５ｎｇ／ウェルで、細胞をトランスフェクトした。アクセサリー因子を用いて行った実験には、ＲＴＰ１Ｓ（遺伝子ＩＤ：１３２１１２）およびＲＴＰ２（遺伝子ＩＤ：３４４８９２）をコードするプラスミド５ｎｇ／ウェルが含まれた。誘発的に発現したＯＲは、トランスフェクション培地に１ｕｇ／ｍｌドキシサイクリン(Sigma-Aldrich)を追加してトランスフェクションした。１０〜１００ｍＭ臭素ストックは、ＤＭＳＯまたはエチルアルコール中で確立された。トランスフェクションの２４時間後、トランスフェクション培地を除去し、そしてＣＤ２９３(Thermo Fisher Scientific)中にストックから希釈した２５ｕｌ／ウェルの適切な濃度の臭気物質で置き換えた。臭気物質刺激の４時間後、Ｄｕａｌ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイキットを、製造業者の説明書に従って投与した。発光を、Ｍ１０００プレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）を用いて測定した。全ての発光値を、所与のウェルにおけるトランスフェクション効率をコントロールするために、ウミシイタケルシフェラーゼ活性に対して標準化した。データをMicrosoft ExcelおよびRで分析した。
【０２２３】
２．嗅覚レセプター活性化ルシフェラーゼアッセイ（組み込み）
組み合わされたレセプター／レポータープラスミドと組み込まれたＨＥＫ２９３ＴおよびＨＥＫ２９３Ｔ由来細胞を、ポリ−Ｄ−リジン被覆９６ウェルプレート中の１００ｕＬＤＭＥＭ中に７３３３細胞／ウェルの密度で播種した。２４時間後、１ｕｇ／ｍｌのドキシサイクリンをウェル培地に添加した。臭気刺激、ルシフェラーゼ試薬付加、および発光測定を、一過性アッセイと同様の方法で行った。構成的に発現されたＯＲを、ドキシサイクリンを添加せずに、同じ様式でアッセイした。データをMicrosoft ExcelおよびＲで分析した。
【０２２４】
３．パイロットスケール多重臭気物質スクリーニングのための臭気刺激およびＲＮＡ抽出
組み合わされたレセプター／レポータープラスミドと転位したＨＥＫ２９３ＴおよびＨＥＫ２９３Ｔ由来細胞を、２ｍＬのＤＭＥＭ中に２００ｋ細胞／ウェルの密度で、６ウェルプレートに播種した。２４時間後、１ｕｇ／ｍｌのドキシサイクリンをウェル媒体に添加した。１０〜１００ｍＭ臭素ストックは、ＤＭＳＯまたはエチルアルコール中で確立された。ドキシサイクリン添加の２４時間後、臭気物質をＯｐｔｉＭＥＭで希釈し、培地を吸引し、１ｍＬの臭気物質−ＯｐｔｉＭＥＭ溶液で置き換えた。臭気刺激の３時間後、臭気培地を吸引し、６００ｕＬの緩衝液ＲＬＴ（Qiagen）を各ウェルに添加した。細胞をQiashredder Tissue and Cell ホモジナイザー（Qiagen）で溶解し、ＲＮＡを、RNEasy MiniPrep Kit (Qiagen)を用いて、製造業者のプロトコルに従って任意のオンカラムＤＮＡｓｅ工程で精製した。
【０２２５】
４．パイロットスケールライブラリーの調製とＲＮＡ−ｓｅｑ
バーコード化されたレポーター遺伝子（ＯＬ００３）の遺伝子特異的プライマーを用いて、スーパースクリプトＩＶ（Thermo-Fisher）を用いて、１試料当たり５ｕｇの全ＲＮＡを逆転写した。反応条件は以下の通りである：アニーリング：［６５℃で５分間、０℃で１分間］伸長：［５２℃で６０分間、８０℃で１０分間］ｃＤＮＡライブラリー容量の１０％を、ＨｉＦｉマスターミックス（Kapa Biosystems）を用いて５サイクル（ＯＬ００４ＦおよびＲ）増幅した。反応およびサイクル条件は、以下のように最適化される：９５℃で３分間、９８℃で２０秒間、５９℃で１５秒間、および７２℃で１０秒間の５サイクル、続いて７２℃で１分間の延長。ＰＣＲ産物を、ＤＮＡクリーンアンドコンセントレーターキット（ザイモリサーチ）を用いて１０ｕｌに精製し、それぞれの試料１ｕｌを、ＣＦＸコネクトサーモサイクラー（Biorad）を有するSYBR FAST qPCRマスターミックス（Kapa Biosystems）を用いて増幅し（ＯＬ００５ＦおよびＲ）、ライブラリー増幅に要するＰＣＲサイクル数を決定した。反応およびサイクル条件は、以下のように最適化される：９５℃で３分間、９５℃で３秒間、および６０℃で２０秒間の４０サイクル。ｑＰＣＲ後、５ｕｌの予め増幅されたｃＤＮＡライブラリーを、以前に決定されたＣｑよりも大きい４サイクルにわたってｑＰＣＲに使用されたのと同じプライマーを用いて、第１の増幅と同じサイクル条件で第２回目に増幅した。次いで、ＰＣＲ産物を、Zymoclean Gel DNA Recovery Kit(Zymo Research)を用いて１％アガロースゲルからゲル単離した。ライブラリー濃度を、Tape Station 2200（Agilent）を用いて定量し、２０％ＰｈｉＸスパイクインを有するＨｉ−Ｓｅｑ ３０００上に等モルでロードし、カスタムプライマーで配列決定した：リード１（ＯＬ００３）およびｉ７インデックス（ＯＬ００６）。
【０２２６】
５．ORライブラリーのクローニング
Gibson Assembly Hifi Mastermix (SGI−DNA）との等温アッセンブリーを用いて、骨格プラスミド（ＯＲおよびバーコードを除く全ての遺伝エレメント）を作製した。短い断片を、１５個のランダムヌクレオチドを含むプライマーで増幅して、ＨｉＦｉマスターミックスを用いてバーコード配列（ＯＬ００７ＦおよびＲ）を作製した。反応およびサイクル条件は、以下のように最適化される：９５℃で３分間、９８℃で２０秒間、６０℃で１５秒間、および７２℃で２０秒間の３５サイクル、続いて７２℃で１分間の延長。アンプリコンおよび骨格プラスミドを制限酵素ＭｌｕＩおよびＡｇｅＩ(New England Biolabs)で消化し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ(New England Biolabs)と一緒に連結した。ＤＨ５α大腸菌コンピテント細胞(New England Biolabs)を、バーコードライブラリーの多様性を維持するために、抗生物質を含む液体培養物に直接形質転換した。
【０２２７】
ＯＲ遺伝子を、ＨｉＦｉマスターミックスを使用して、バーコード化された骨格プラスミドに相同性を付加するプライマー（ＯＬ００８）を用いて個々に増幅した。反応およびサイクル条件は、以下のように最適化される：９５℃で３分間、９８℃で２０秒間、６１℃で１５秒間、および７２℃で３０秒間の３５サイクル、続いて７２℃で１分間の延長。増幅したＯＲをDNA Clean and Concentratorで精製し、一緒にプールした。バーコード化された骨格プラスミドをＮｄｅＩおよびＳｂｆＩで消化し、Gibson Assembly HifiMastermixとの等温アッセンブリーを用いてＯＲアンプリコンプールをその中にクローニングした。ＤＨ５α大腸菌コンピテント細胞をアッセンブリーで形質転換し、抗生物質耐性クローンを採取し、９６ウェルプレート中で一晩増殖させた。プラスミドＤＮＡを、Ｚｙｐｐｙ−９６プラスミドミニプレップキット（Zymo Research）で調製した。プラスミドをＳａｎｇｅｒ配列決定（ＯＬ１０９−１１１）して、バーコードをレポーター遺伝子と会合させ、エラーのないＯＲを同定した。
【０２２８】
６．ORライブラリーゲノム統合
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞およびＨＥＫ２９３Ｔ由来細胞を、２ｍｌのＤＭＥＭ中の６ウェルプレートに３５０ｋ細胞／ウェルの密度で播種した。播種の２４時間後、細胞を、レセプター／レポータートランスポゾンおよびSuper PiggyBac Transposase (Systems Bioscience)をコードするプラスミドで、製造業者の説明書に従ってトランスフェクトした。リポフェクタミン３０００で１ウェルあたり１ｕｇのトランスポゾンＤＮＡと２００ｎｇのトランスポザーゼＤＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後、細胞を６ウェルプレートに１：１０で継代し、継代の１日後、８ｕｇ／ｍｌのブラスチシジンを細胞に添加した。細胞を選択しながら７〜１０日間増殖させた。ＯＲライブラリーを個々に転置し、等しい細胞数で一緒にプールした。
【０２２９】
７．アクセサリー因子細胞株の生成
ＨＥＫ２９３Ｔ由来細胞を、ＯＲライブラリー統合セクションにおける転位プロトコルに従って、Ｔｅｔ−Ｏｎプロモータープール等モルによって誘導的に駆動されるアクセサリー因子遺伝子ＲＴＰ１Ｓ、ＲＴＰ２、Ｇα ｏｌｆ（遺伝子ＩＤ：２７７４）、およびＲｉｃ８ｂ（遺伝子ＩＤ：２３７４２２）をコードするプラスミドで転位した。細胞を２ｕｇ／ｍｌのピューロマイシン（Thermo Fisher）で選択した。選択後、細胞を０．５細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種した。ウェルを、３日後に単一コロニーについて試験し、そして７日後に２４ウェルプレートに拡大した。クローンを、一過性ルシフェラーゼアッセイでＯｌｆｒ６２およびＯＲ７Ｄ４の強力な活性化についてスクリーニングすることによって、アクセサリー因子発現についてスクリーニングした（図１１）。両方のレセプターについて最高の倍数活性化を有し、顕著な成長欠陥を有さないクローンを、多重化スクリーニングについて確立した。
【０２３０】
８．トランスポゾンコピー数検証
ｇＤＮＡを、ＯＲレポーターベクターで転位した細胞から、およびＱｕｉｃｋ−ｇＤＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを用いて単一コピーランディングパッドを含む細胞から精製した。５０ｎｇのｇＤＮＡを、製造業者のプロトコルを使用して、ＣＦＸコネクトサーモサイクラー上でＳＹＢＲ ＦＡＳＴ ｑＰＣＲマスターミックス（Kapa Biosystems）を使用して、それぞれの試料由来の外因性ＤＮＡの領域にアニールするプライマーを用いて増幅した。反応およびサイクル条件は、以下のように最適化される：９５℃で３分間、９５℃で３秒間、および６０℃で２０秒間の４０サイクル。転位されたＯＲのＣｑ値は、コピー数を決定するために、単一コピーランディングパッドに対して正規化された。
【０２３１】
９．レンチウイルス形質導入
レンチウイルスベクターは、Mirus TransIT-293を用いて、レンチウイルストランスファープラスミド、ｐＣＭＶΔＲ８．９１およびｐＣＡＧＧＳ−ＶＳＶ−Ｇで２９３Ｔ細胞を一過性トランスフェクションすることにより作製した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、５０％コンフルエントでｍ２ｒｔＴＡ転写因子（Ｔｅｔ−Ｏｎ）を発現するように形質導入し、形質導入の１日前に播種した。クローンは、０．５細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに細胞を播種することによって単離した。ウェルを、７日後に単一コロニーについて試験し、２４ウェルプレートに拡大した。一過性ルシフェラーゼアッセイを用いてＭＯＲ４２−３（遺伝子ＩＤ：２５７９２６）の強力な活性化についてスクリーニングすることにより、ｍ２ｒｔＴＡ発現についてクローンを評価した。
【０２３２】
１０．ハイスループット臭気物質スクリーニング
ＯＲライブラリー細胞株を、液体窒素凍結ストックからＴ−２２５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に３日間解凍した後、スクリーニングのために９６ウェルプレートに播種した。このライブラリーを、１００ｕｌのＤＭＥＭ中に、１ウェルあたり６，６６６細胞で播種した。２４時間後、ＤＭＥＭ中の１ｕｇ／ｍｌのドキシサイクリンのワーキング濃度をウェルに添加した。誘導の２４時間後、培地を各プレートから除去し、ＯｐｔｉＭＥＭで希釈した臭気物質２５ｕｌで置き換えた。各臭気を、３つの異なる濃度（１０ｕＭ、１００ｕＭ、１ｍＭ）で、同じ量の最終ＤＭＳＯ（１％）と共に３連で添加した。各プレートは、３連の３つの濃度（１０ｕＭ、１００ｕＭ、１ｍＭ）の２つの対照臭気物質、および培地に溶解した１％ＤＭＳＯを含有する３つのウェルを含有した。ライブラリーを、蓋を取り除いた細胞培養インキュベーター中で臭気物質と共に３時間インキュベートした。
【０２３３】
臭気インキュベーション後、培地をプレートからピペットで取り出し、２５ｕＬの氷冷Cells−to−cDNA II Lysis Buffer (Thermo Fisher)を添加し、上下にピペッティングして細胞をホモジナイズおよび溶解することによって細胞を溶解した。次いで、溶解物を７５℃に１５分間加熱し、液体窒素で急速冷凍し、さらなる工程まで−８０℃に保った。次いで、０．５ｕＬのＤＮａｓｅ Ｉ（New England Biolabs）を溶解物に添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。ＲＴプライマーをアニールするために、各ウェルからの５ｕｌの溶解物を、２．５ｕｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ(New England Biosciences)、１ｕｌの２ｕＭ遺伝子特異的ＲＴプライマー（ＯＬ００３）、および１．５ｕｌのＨ２Ｏと合わせた。反応物を６５℃に５分間加熱し、０℃に冷却した。アニーリング後、１ｕｌのＭ−ＭｕＬＶ逆転写酵素（Enzymatics）、１ｕｌの緩衝液、および０．２５ｕｌのＲＮアーゼインヒビター（Enzymatics）を各反応に添加した。反応物を４２℃で６０分間インキュベートし、ＲＴ酵素を８５℃で１０分間熱不活性化した。
【０２３４】
各バッチについて、SYBR FAST qPCR Mastermixを用いて数個のウェル（ＯＬ００５ＦおよびＯＬ０１３）でｑＰＣＲを行い、ＰＣＲベースのライブラリー調製に必要なサイクル数を決定した。反応およびサイクル条件は、以下のように最適化される：９５℃で３分間、９５℃で３秒間、および６０℃で２０秒間の４０サイクル。ｑＰＣＲ後、５ｕｌの各ＲＴ反応物を、配列決定アダプター（ＯＬ００５ＦおよびＯＬ０１３）、１０ｕｌのNEB−Next Q5 Mastermix (New England Biosciences)および４．２ｕｌのＨ２Ｏを含有する０．４ｕｌの１０ｕＭプライマーと合わせ、ＰＣＲを製造業者のプロトコルに従って実施した。順方向プライマーは、Ｐ７アダプター配列およびアッセイにおけるウェルを同定するインデックスを含み、逆方向プライマーは、Ｐ５アダプター配列およびアッセイにおけるプレートを同定するインデックスを含む。ＰＣＲ産物をプレートにより一緒にプールし、DNA Clean and Concentrator Kitで精製した。ライブラリー濃度を、Tape Station 2200およびQubit (Thermo Fisher)を用いて定量した。ライブラリーを、高出力モード（イルミナ）で、ＮｅｘｔＳｅｑ５００上で、２つのインデックスリードおよび単一末端７５ｂｐリードを用いて配列決定した。
【０２３５】
１１．次世代配列決定データの分析
試料は、各ウェル（５’末端）に固有であり、各プレート（３’末端）に固有であるアダプターをＰＣＲインデックスによってインデックス付けすることによって同定した。ウェルバーコードは、（Illumina Sequencing Library Preparation for Highly Multiplexed Target Capture and Sequencing Matthias Meyer、Martin Kircher、Cold Spring Harb Protoc; 2010; doi:10．1101／pdb．prot5448）の７ｂｐインデックス方式に従った。プレートインデックス方式は、イルミナインデックス方式に従った。配列決定データを逆多重化し、１５ｂｐバーコード配列を、カスタムのｐｙｔｈｏｎスクリプトおよびｂａｓｈスクリプトによる正確な一致のみで計数した。
【０２３６】
１２．ヒットを呼び出すための統計的方法
次いで、差次的発現包装体ＥｄｇｅＲを使用して、カウントデータを分析した。低表示のＯＲをフィルターで除去するために、ＯＲが１９５４の試験試料のうち３９９を超えるものからのリードの少なくとも０．５％を含まなければならないカットオフを設定した。これは、細胞ライブラリー（ＭＯＲ１７２−１、ＭＯＲ１７６−１およびＭＯＲ１８１−１）において過小表示された４２のＯＲのうちの３つをフィルターで除去した。正規化係数は、ＥｄｇｅＲパッケージ機能ｃａｌｃＮｏｒｍＦａｃｔｏｒｓを使用して決定され、ｇｌｍＦｉｔは、４０個のＯＲのみがライブラリーに存在し、傾向分散値がデータによく適合したので、タグごとの分散に設定された分散と共に使用された。臭気物質が特異的ＯＲを刺激したかどうかを決定するために、一般化直鎖状模型を計数データに当てはめることにより、それぞれのＯＲ臭気物質相互作用の平均活性化とｐ値の両方を決定することができた。次に、このｐ値を、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ＆Ｈｏｃｈｂｅｒｇ補正を用いた内蔵のｐ．ａｄｊｕｓｔ機能を使用して複数の仮説検定について補正し、誤発見率（ＦＤＲ）を得た。本発明者らは、相互作用する臭気物質−ＯＲ対を決定するために、１％の保守的カットオフを設定した。臭気物質とＯＲとの間のそれぞれの相互作用について、本発明者らはさらに、ＯＲ−臭気物質相互作用が、２つの異なった濃度の臭気物質において、またはちょうど１０００ｕＭ濃度において、カットオフを超えることを必要とした。
【０２３７】
１３．分子オートエンコーダ
本発明者らは、Ｇｏｍｅｚ−Ｂｏｍｂａｒｅｌｌｉらに記載されているようなオートエンコーダを使用して、化学的空間におけるＯＲ−化学相互作用を可視化した。著者らのアドバイスに従い、本発明者らは、オリジナルのインプリメンテーションが機能しないＰｙｔｈｏｎ包装体を必要とするので、オートエンコーダの再インプリメンテーションを使用した。このモデルは、ＳＭＩＬＥＳが１２０文字より長い分子を除いて、ＣｈＥＭＢＬ２３データベース全体で０．９９の検証精度に予め訓練されている。本発明者らは、この予め訓練されたモデルを使用して、本発明者らの１６８の化学物質（ＳＭＩＬＥＳ表示を見出すことができた）およびＣｈＥＭＢＬ２３からの２５０，０００のランダムにサンプリングされた化学物質の両方の潜在的表示を生成した。次に、ｓｃｉｋｉｔ−ｌｅａｒｎを用いて主成分解析を行い、得られたマトリックスを２次元に投影した。
【０２３８】
実施例３−ＡＤＲＢ２バリアントスクリーニング
変異体ライブラリーの作成および機能評価の概要。本発明者らは、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ上で変異配列を合成するが、各オリゴの長さ限界は約２３０ｎｔであり、ＡＤＲＢ２は約１２００ｎｔ長である。タンパク質の長さをカバーするために、８つの部分にセグメント化し、各変異体８番目を合成し、別々の背景ベクターにクローニングしなければならなかった。バリアントセグメントを増幅およびクローニングする場合、本発明者らは、１５ｎｔのランダムバーコードを各配列に付着させた。クローニングに際して、本発明者らは、次の遺伝子配列決定を用いて、各バーコードを各バリアントにマッピングした。その後、本発明者らは、バーコードをタンパク質の残りの部分にクローニングし、Ｇｓシグナル伝達の際に発現する環状ＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）レポーター遺伝子の３’ＵＴＲに転位した。そこから、本発明者らは、セリンリコンビナーゼ技術を用いて、ΔＡＤＲＢ２ ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中の規定されたゲノム遺伝子座におけるライブラリーを、細胞当たり単一コピーで組み込んだ（多重化アッセイにおける変異体間のクロストークを防ぐために必須）。組み込み、種々のイソプロテレノール濃度を有するライブラリセルラインを刺激し、バーコードシークエンスでＲＮＡ−ｓｅｑを実施した。各バーコードの相対的存在量は、表現のための正規化後の各Ｂ２バリアントの相対的活性として推論することができる。これを図２１に示す。
【０２３９】
図２２において、本発明者らは、２つの生物学的複製にわたるフレームシフト（オリゴヌクレオチドマイクロアレイ合成のコモンエラーモード）および本発明者らの単一変異体ライブラリーの両方についての野生型シグナルのメジアンに対する分布活性を示す。本発明者らのバリアント分布を構築するために、所与のバリアントに関連する全てのバーコードの測定値を平均化する。フレームシフト分布を構築するために、本発明者らは、特定のコドン（Ｃ末端を除く）における挿入欠失に関連する全てのバーコードの測定値を平均する。予想されるように、フレームシフトは、平均ミスセンス変異よりも有害な効果を有する。本発明者らはまた、高いイソプロテレノール濃度において、本発明者らのミスセンス変異のより高い割合が、野生型レベルの活性に近づくことを見出す。
【０２４０】
図２３において、本発明者らは、０．６２５ｕＭのイソプロテレノールにおけるβ２のバリアント活性ランドスケープを示す。変異ランドスケープは、β２構造および機能の一般的な傾向を明らかにする。例えば、本発明者らは、膜貫通ドメインが、末端または細胞内ループ３よりもプロリンおよび荷電残基の置換に対してより感受性があることを見出す（変異耐性は、全ての変異の平均的な効果である）。また、フレームシフトの効果はＣ末端で大きく減少することが分かる。本発明者らは、変異データがＥＶ変異スコアと相関していることを見ており、また、ＧＮＯＭＡＤデータから、どの程度稀なバリアントが機能に影響を及ぼすかを見ることができる。
【０２４１】
図２４において、本発明者らは、多重配列決定アプローチと比較した、ルシフェラーゼレポーターを用いて個々にアッセイされたミスセンスバリアント間の比較を示す。ＷＴと比較した変異体活性は、大部分が再現される。多重化アッセイは、イソプロテレノール刺激の範囲にわたって、完全に死んだ変異体と部分的に有害な変異体とを区別することができる。
【０２４２】
本発明者らは、ヒドロキシベンジルイソプロテレノールとレセプターとのRingらのコンタクトマップから注釈されるように、β２のリガンド結合ポケットの変異耐性（全ての置換の平均）を調べた。本発明者らのアッセイでは、イソプロテレノールのみで刺激し、イソプロテレノールと相互作用する残基の変異は、ヒドロキシベンジルテールと相互作用する残基と比較して、変異に対して有意に寛容性が低いことが分かった。これを図２５に示す。
【０２４３】
また、ｋ平均クラスタリングのような単純なアルゴリズムが、機能的に関連する方法でβ２の構造にマッピングする別個のクラスに本発明者らのデータをグループ化できることを見出した。この特定の例では、アミノ酸変異を一緒に機能的クラスにグループ分けし、それらのシグナルを平均した。重要なことに、本発明者らは、アルゴリズムに空間情報を全く提供しなかった。今後の深部変異走査は、タンパク質構造を調べるための強力な方法であると考えられる。これを図２６に示す。
【０２４４】
本明細書に開示され、特許請求された方法のすべては、本開示に照らして過度の実験を行うことなく、作成し、実行することができる。本発明の組成物および方法を好ましい実施形態に関して説明したが、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載された方法および方法のステップまたはステップのシーケンスに変形を適用することができることは、当業者には明らかであろう。より具体的には、化学的にも生理学的にも関連する特定の薬剤で本明細書中に記載の薬剤を代用し、同じまたは類似の試験結果が達成され得ることが理解されるであろう。当業者に明らかなすべてのそのような同様な置換および修飾は、添付の請求の範囲によって定義される本発明の精神、範囲および概念内にあるとみなされる。
【０２４５】
参考文献
本明細書全体を通して参照される以下の参考文献および刊行物は、本明細書中に記載されるものを補足する例示的な手順または他の詳細を提供する範囲で、本明細書中に特に援用される。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１８−４】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年4月20日(2020.4.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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