(57)【要約】  超並列シークエンシングライブラリーを生成する方法であって、ａ）ＷＧＡライブラリーユニバーサルシークエンスアダプターを含むフラグメントを含む一次ＷＧＡ  ＤＮＡライブラリー（ｐＷＧＡｌｉｂ）を準備する工程と、ｂ）１回のＰＣＲサイクルを、ｐＷＧＡｌｉｂにおいて、５’から３’の順に、第１のシークエンシングアダプター（１ＰＲ５ＳＡ）、及びＷＧＡライブラリーユニバーサルシークエンスアダプターの逆相補とハイブリダイズする第１のプライマー３’セクション（１ＰＲ３Ｓ）を含む、第１のプライマー（１ＰＲ）を用いて実施する工程と、ｃ）１回のＰＣＲサイクルを工程ｂ）の産物において、５’から３’の順に、１ＰＲ５ＳＡとは異なる第２のシークエンシングアダプター（２ＰＲ５ＳＡ）、及びＷＧＡライブラリーユニバーサルシークエンスアダプターの逆相補とハイブリダイズする第２のプライマー３’セクション（２ＰＲ３Ｓ）を含む、第２のプライマー（２ＰＲ）を用いて実施する工程と、ｄ）工程ｃ）の産物を、１ＰＲ５ＳＡを含む第３のプライマー、及び２ＰＲ５ＳＡを含む第４のプライマーを用いてＰＣＲにより増幅する工程とを含む、方法が開示される。【選択図】図２Ａ
2020530767.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
超並列シークエンシングライブラリーを生成する方法であって、
ａ．既知の５’配列セクション（５ＳＳ）、中央配列セクション（ＭＳＳ）、及び前記既知の５’配列セクションと逆相補性である既知の３’配列セクション（３ＳＳ）を含むフラグメントを含む一次ＷＧＡ  ＤＮＡライブラリー（ｐＷＧＡｌｉｂ）を準備する工程であって、
前記既知の５’配列セクション（５ＳＳ）がＷＧＡライブラリーユニバーサルシークエンスアダプターを含み、前記中央配列セクション（ＭＳＳ）が少なくともＷＧＡの前の増幅されていないオリジナルＤＮＡのＤＮＡ配列に対応するインサートセクション（ＩＳ）を含み、前記中央配列セクション（ＭＳＳ）が加えて任意に隣接５’中間セクション（Ｆ５）及び／又は隣接３’中間セクション（Ｆ３）を含む、工程と、
ｂ．１回のＰＣＲサイクルを、一次ＷＧＡ  ＤＮＡライブラリーにおいて、少なくとも第１のプライマー５’セクション（１ＰＲ５Ｓ）及び第１のプライマー３’セクション（１ＰＲ３Ｓ）を含む、少なくとも１種類の第１のプライマー（１ＰＲ）を用いて実施し、第１のプライマーで伸長されたＷＧＡ  ＤＮＡライブラリーを得る工程であって、
前記第１のプライマー５’セクション（１ＰＲ５Ｓ）が少なくとも１つの第１のシークエンシングアダプター（１ＰＲ５ＳＡ）を含み、前記第１のプライマー３’セクション（１ＰＲ３Ｓ）が、既知の３’配列セクション（３ＳＳ）にハイブリダイズする工程と、
ｃ．１回のＰＣＲサイクルを、前記第１のプライマーで伸長されたＷＧＡ  ＤＮＡライブラリーにおいて、第２のプライマー５’セクション（２ＰＲ５Ｓ）及び第２のプライマー３’セクション（２ＰＲ３Ｓ）を含む少なくとも１種類の第２のプライマー（２ＰＲ）を用いて実施し、第１のプライマー及び第２のプライマーで伸長されたＷＧＡ  ＤＮＡライブラリーを得る工程であって、
前記第２のプライマー５’セクション（２ＰＲ５Ｓ）が、前記少なくとも１つの第１のシークエンシングアダプター（１ＰＲ５ＳＡ）とは異なる、少なくとも１つの第２のシークエンシングアダプター（２ＰＲ５ＳＡ）を含み、前記第２のプライマー３’セクション（２ＰＲ３Ｓ）が、前記既知の３’配列セクション（３ＳＳ）にハイブリダイズする、工程と、
ｄ．前記第１のプライマー及び第２のプライマーで伸長されたＷＧＡ  ＤＮＡライブラリーを、前記第１のシークエンシングアダプター（１ＰＲ５ＳＡ）を含む少なくとも１種類の第３のプライマー（３ＰＲ）、及び前記第２のシークエンシングアダプター（２ＰＲ５ＳＡ）を含む少なくとも１種類の第４のプライマー（４ＰＲ）を用いてＰＣＲにより増幅し、増幅された第１のプライマー及び第２のプライマーで伸長されたＷＧＡ  ＤＮＡライブラリーを得る工程と、
を含む、方法。
【請求項２】
前記少なくとも１つの第１のプライマー（１ＰＲ）が、前記第１のプライマー５’セクション（１ＰＲ５Ｓ）の３’位置、及び前記第１のプライマー３’セクション（１ＰＲ３Ｓ）の５’位置に、少なくとも１つのリードシークエンシングプライマー配列（１ＰＲＳＥＱ）を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１のプライマー５’セクション（１ＰＲ５Ｓ）が、前記少なくとも１つの第１のシークエンシングアダプター（１ＰＲ５ＳＡ）の３’位置、及び前記第１のプライマー３’セクション（１ＰＲ３Ｓ）の５’位置に、少なくとも１つの第１のシークエンシングバーコード（１ＰＲ５ＢＣ）を更に含み、及び／又は前記第２のプライマー５’セクション（２ＰＲ５Ｓ）が、前記少なくとも１つの第２のシークエンシングアダプター（２ＰＲ５ＳＡ）の３’位置、及び前記第２のプライマー３’セクション（２ＰＲ３Ｓ）の５’位置に、少なくとも１つの第２のシークエンシングバーコード（２ＰＲ５ＢＣ）を更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１のプライマーで伸長されたＷＧＡ  ＤＮＡライブラリーを工程ｂの後に精製する工程、及び／又は前記第１のプライマー及び第２のプライマーで伸長されたＷＧＡ  ＤＮＡライブラリーを工程ｃの後に精製する工程、及び／又は前記増幅された第１のプライマー及び第２のプライマーで伸長されたＷＧＡ  ＤＮＡライブラリーを工程ｄの後に精製する工程を更に含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＷＧＡライブラリーユニバーサルシークエンスアダプターが、ＤＲＳ−ＷＧＡライブラリーユニバーサルシークエンスアダプター又はＭＡＬＢＡＣライブラリーユニバーサルシークエンスアダプターである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＷＧＡライブラリーユニバーサルシークエンスアダプターが、ＤＲＳ−ＷＧＡライブラリーユニバーサルシークエンスアダプターである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＤＲＳ−ＷＧＡライブラリーユニバーサルシークエンスアダプターが配列番号５０であり、前記ＭＡＬＢＡＣライブラリーユニバーサルシークエンスアダプターが配列番号５１である、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
ローパス全ゲノムシークエンシングの方法であって、
請求項３〜７のいずれか１項に記載の方法により得られる、バーコードを付した超並列シークエンシングライブラリーを複数準備し、異なるシークエンシングバーコード（ＢＣ）を使用して得られたサンプルをプールする工程と、
前記プールされたライブラリーをシークエンシングする工程と、
を含む、方法。
【請求項９】
異なるシークエンシングバーコード（ＢＣ）を使用してサンプルをプールする工程が、
バーコードを付した超並列シークエンシングライブラリーそれぞれにおけるＤＮＡを定量化する工程と、
バーコードを付した超並列シークエンシングライブラリーの量を正規化する工程と、
を更に含む、請求項８に記載のローパス全ゲノムシークエンシングの方法。
【請求項１０】
少なくとも第１のプライマー５’セクション（１ＰＲ５Ｓ）及び第１のプライマー３’セクション（１ＰＲ３Ｓ）を含む少なくとも１種類の第１のプライマー（１ＰＲ）であって、前記第１のプライマー５’セクション（１ＰＲ５Ｓ）が少なくとも１つの第１のシークエンシングアダプター（１ＰＲ５ＳＡ）を含み、前記第１のプライマー３’セクション（１ＰＲ３Ｓ）が、一次ＷＧＡ  ＤＮＡライブラリー（ｐＷＧＡｌｉｂ）のフラグメントのＷＧＡライブラリーユニバーサルシークエンスアダブターを含む既知の５’配列セクション（５ＳＳ）と逆相補性である既知の３’配列セクション（３ＳＳ）にハイブリダイズし、前記フラグメントが前記既知の５’配列セクション（５ＳＳ）の中央配列セクション（ＭＳＳ）３’及び前記既知の３’配列セクション（３ＳＳ）の５’を更に含む、少なくとも１種類の第１のプライマーと、
少なくとも第２のプライマー５’セクション（２ＰＲ５Ｓ）及び第２の３’セクション（２ＰＲ３Ｓ）を含む少なくとも１種類の第２のプライマー（２ＰＲ）であって、前記第２のプライマー５’セクション（２ＰＲ５Ｓ）が、前記少なくとも１つの第１のシークエンシングアダプター（１ＰＲ５ＳＡ）とは異なる、少なくとも１つの第２のシークエンシングアダプター（２ＰＲ５ＳＡ）を含み、前記第２の３’セクションが、前記フラグメントの前記既知の３’配列セクション（３ＳＳ）にハイブリダイズする、少なくとも１種類の第２のプライマーと、
前記第１のシークエンシングアダプター（１ＰＲ５ＳＡ）を含む少なくとも１種類の第３のプライマー（３ＰＲ）と、
前記第２のシークエンシングアダプター（２ＰＲ５ＳＡ）を含む少なくとも１種類の第４のプライマー（４ＰＲ）と、
を含む、超並列シークエンシングライブラリー調製キット。
【請求項１１】
ａ）配列番号１〜配列番号１２からなる群より選択される１種類以上のプライマー、配列番号１３〜配列番号２０からなる群より選択される１種類以上のプライマー、並びに配列番号２１及び配列番号２２のプライマー、又は、
ｂ）配列番号２７〜配列番号３８からなる群より選択される１種類以上のプライマー、配列番号３９〜配列番号４６からなる群より選択される１種類以上のプライマー、並びに配列番号２１及び配列番号２２のプライマー、又は、
ｃ）配列番号５２〜配列番号６３からなる群より選択される１種類以上のプライマー、配列番号１３〜配列番号２０からなる群より選択される１種類以上のプライマー、並びに配列番号２１及び配列番号２２のプライマー、又は、
ｄ）配列番号６４〜配列番号７５からなる群より選択される１種類以上のプライマー、配列番号３９〜配列番号４６からなる群より選択される１種類以上のプライマー、並びに配列番号２１及び配列番号２２のプライマー、
を含む、超並列シークエンシングライブラリー調製キット。
【請求項１２】
ａ）配列番号１〜配列番号１２からなる群より選択される少なくとも１種類のプライマー、配列番号１３〜配列番号２０からなる群より選択される少なくとも１種類のプライマー、配列番号２１及び配列番号２２のプライマー、並びに配列番号２３のカスタムシークエンシングプライマー、又は、
ｂ）配列番号２７〜配列番号３８からなる群より選択される少なくとも１種類のプライマー、配列番号３９〜配列番号４６からなる群より選択される少なくとも１種類のプライマー、配列番号２１及び配列番号２２のプライマー、並びに配列番号４７のプライマー、又は、
ｃ）配列番号５２〜配列番号６３からなる群より選択される少なくとも１種類のプライマー、配列番号１３〜配列番号２０からなる群より選択される少なくとも１種類のプライマー、配列番号２１及び配列番号２２のプライマー、配列番号２３のカスタムシークエンシングプライマー、並びに配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６からなる群より選択されるカスタムインデックス２プライマー、又は、
ｄ）配列番号６４〜配列番号７５からなる群より選択される少なくとも１種類のプライマー、配列番号３９〜配列番号４６からなる群より選択される少なくとも１種類のプライマー、配列番号２１及び配列番号２２のプライマー、並びに配列番号４７のプライマー、
を含む、ローパス全ゲノムシークエンシングキット。
【請求項１３】
選択肢ａ）が配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６からなる群より選択されるプライマーを更に含み、選択肢ｂ）又は選択肢ｄ）が配列番号４８を更に含む、請求項１２に記載のローパス全ゲノムシークエンシングキット。
【請求項１４】
選択肢ｂ）又は選択肢ｄ）が配列番号４９のプライマーを更に含む、請求項１３に記載のローパス全ゲノムシークエンシングキット。
【請求項１５】
ゲノムワイドコピー数プロファイリングの方法であって、
請求項１０又は１１に記載のシークエンシングライブラリー調製キットを使用して開発されたＤＮＡライブラリーをシークエンシングする工程と、
ゲノムの異なる領域にわたるシークエンシングリード深度を解析する工程と、
ゲノム領域におけるリード数を、参照ゲノムの同じ領域において期待されるリード数と比較することにより、ゲノムの領域のコピー数の値を決定する工程と、
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１７年７月２１日に出願された欧州特許出願第１７１８２６９３．６号の優先権を主張し、その開示は引用することにより本出願の一部をなす。
【０００２】
本発明は、全ゲノムシークエンシングのための超並列シークエンシングライブラリーを、全ゲノム増幅産物（ＷＧＡ）から生成する方法及びキットに関する。特に、上記方法は有利には、確定的制限酵素部位全ゲノム増幅（ＤＲＳ−ＷＧＡ）ＤＮＡ産物に適用することができる。
【０００３】
上記ライブラリーは有利には、ローパス全ゲノムシークエンシング及びゲノムワイドコピー数プロファイリングに使用することができる。
【背景技術】
【０００４】
単一細胞に関して、シークエンシング、ＳＮＰ検出等を含む様々なタイプの遺伝的解析を行うことを簡単にする及び／又は可能にするため、全ゲノム増幅（ＷＧＡ）を行い、より多くのＤＮＡを得ることが有用である。
【０００５】
確定的制限酵素部位に基づくＬＭ−ＰＣＲによるＷＧＡ（例えば特許文献１に記載されている）は当該技術分野から既知である（以下で単にＤＲＳ−ＷＧＡと称する）。ＬＭ−ＰＣＲに基づくＤＲＳ−ＷＧＡの市販のキット（Ａｍｐｌｉ１（商標）ＷＧＡキット、Menarini Silicon Biosystems）が非特許文献１において使用されている。この研究において、単一細胞ＷＧＡ材料におけるローパス全ゲノムシークエンシングによるコピー数解析が実施された。しかしながら、この論文で使用された標準ワークフローでは、イルミナライブラリー作製は、ｉ）ＷＧＡアダプターの消化と、ｉｉ）ＤＮＡのフラグメント化と、ｉｉｉ）ＥｎｄＲｅｐａｉｒ、ｉｖ）Ａ−テーリング、ｖ）バーコードを付したアダプターのライゲーション、及びｖｉ）バーコードを付したＮＧＳライブラリーのサンプルプーリングの一般的工程等の標準的イルミナワークフロー工程と、ｖｉｉ）シークエンシングとを含む複数の工程を要する。前述の論文（図５ｂ）に示されるように、一般的なＣＴＣの方がより多くの逸脱を示すものの、ＷＢＣは少数の偽陽性と推測されるコピー数コールを示した。
【０００６】
Ａｍｐｌｉ１（商標）ＷＧＡは、アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（ａＣＧＨ）に適合可能であり、実際に幾つかのグループ（非特許文献２、非特許文献３）により、高分解能コピー数解析に適していることが示されている。しかしながら、ａＣＧＨ技術は高価で労力を要するため、体細胞コピー数変化（ＣＮＡ）検出にはローパス全ゲノムシークエンシング（ＬＰＷＧＳ）等の異なる方法が好ましい場合がある。
【０００７】
均質でバランスの良い増幅という観点においてはＤＲＳ−ＷＧＡは最良の結果をもたらすものの、ａＣＧＨ又は中期ＣＧＨに基づく現行のプロトコルは手間がかかる、及び／又は高価である。ローパス全ゲノムシークエンシングが、複数のサンプルを、ａＣＧＨより高い処理能力及びより低い費用で解析するハイスループットの方法として提示されている。しかしながら、ＷＧＡ産物（ＤＲＳ−ＷＧＡ等）のための超並列シークエンシングライブラリーの生成のための既知の方法は、依然として酵素による工程及び反応を幾つか含むプロトコルを要する。
【０００８】
ＤＲＳ−ＷＧＡの再現性及び品質と、ゲノムワイドコピー数多形（ＣＮＶ）を解析する能力とを併せ持つより効率化された方法が望ましい。加えて、僅かな量の細胞、ＦＦＰＥ又は組織生検試料から全ゲノムコピー数プロファイルを決定することが望ましい。
【０００９】
本出願人名義の特許文献２は、ＷＧＡ産物から出発する、ＮＧＳ（次世代シークエンシング）ライブラリーとも称される超並列シークエンシングライブラリーを効率的に生成する方法を開示する。
【００１０】
上記方法は、一次ＷＧＡ  ＤＮＡライブラリーを、それぞれが、特定のシークエンシングプラットフォームでのシークエンシングを可能にする異なるシークエンシングアダプターを５’末端に有する２種類のプライマーで増幅することを含む。使用することができるシークエンシングプラットフォームは、例えばイオントレントプラットフォーム又はイルミナプラットフォームである。
【００１１】
或る特定のシークエンシングプラットフォーム、例えばイルミナプラットフォームを使用する場合、異なる２つのシークエンシングアダプター（イルミナの場合Ｐ５及びＰ７）をフラグメントの反対側の末端に含むライブラリーフラグメントを選択することが特に有利である。これらのフラグメントは、「ヘテロアダプターフラグメント」と称される。このために、上述の出願に開示される実施の形態のうちの１つは、一次ＷＧＡ  ＤＮＡライブラリーを増幅するための２種類のプライマーのうちの１つを、５’末端でビオチン化することを提供する。図１にこの実施の形態を要約する。一次ＷＧＡ  ＤＮＡライブラリーが２種類のプライマーで増幅されると、フラグメントはストレプトアビジンビーズで選択される。両端に同一のシークエンシングアダプターを有するフラグメント（以下「ホモアダプターフラグメント」と称する）は、溶出される（ビオチン化していない場合）か、又はストレプトアビジンビーズに結合したままとなる（両端がビオチン化している場合）かのいずれかである一方、ｓｓＤＮＡヘテロアダプターフラグメント（両端に異なるシークエンシングアダプターを有する）は変性され、溶出されることで選択される。
【００１２】
ビオチン化プライマーによる選択には幾つかの欠点がある。具体的には、一本鎖ＤＮＡライブラリーをより定量しにくく、より保存に好ましくないものにする。加えて、イルミナシークエンシングワークフローには、二本鎖ＤＮＡライブラリーの使用が好ましい。この問題は二本鎖の合成又はＰ５及びＰ７プライマーを用いた更なる増幅サイクルの実施により対処することができるが、当然ながらこれにより、方法は幾分複雑なものになり、シングルチューブ反応は不可能となる。その結果、例えば上記の目的のために設計される特別なバッファーの使用を要するため、キットの設計はより複雑になる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】国際公開第２０００／０１７３９０号
【特許文献２】国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５９０７５号
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Hodgkinson C.L. et al., Tumorigenicity and genetic profiling of circulating tumor cells in small-cell lung cancer, Nature Medicine 20, 897-903 (2014）
【非特許文献２】Moehlendick B, et al. (2013) A Robust Method to Analyze Copy Number Alterations of Less than 100 kb in Single Cells Using Oligonucleotide Array CGH. PLoS ONE 8(6): e67031
【非特許文献３】Czyz ZT, et al (2014) Reliable Single Cell Array CGH for Clinical Samples. PLoS ONE 9(1): e85907
【発明の概要】
【００１５】
したがって、本発明の目的は、ＷＧＡ産物から出発する、上述の問題を克服する、超並列シークエンシングライブラリーの生成の方法を提供することである。
【００１６】
本発明の他の目的は、ＷＧＡ産物から出発し、本発明によるライブラリー調製方法を使用する、ローパス全ゲノムシークエンシングの方法及びゲノムワイドコピー数プロファイリングの方法を提供することである。
【００１７】
本発明の更なる目的は、上述の方法を実行するための、超並列シークエンシングライブラリー調製キット及びローパス全ゲノムシークエンシングキットを提供することである。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本出願人による特許文献２に開示される、ヘテロアダプターフラグメントを選択する方法の工程を要約する図である。
【図２Ａ】具体的には一次ＷＧＡ  ＤＮＡライブラリーがＤＲＳ−ＷＧＡにより得られる状況に関する、本発明による方法の工程を要約する図である。しかしながら、本発明の範囲をこの特定の種類のＷＧＡに限定する意図はない。
【図２Ｂ】図２Ａに示す本発明による方法に使用される、一次ＷＧＡ  ＤＮＡライブラリー及び４種類のプライマーの構造を示す図である。特許請求の範囲及び明細書において、一次ＷＧＡ  ＤＮＡライブラリー及び４種類のプライマーの種々のセグメントに使用される頭字語は、括弧内にも示される。
【図３Ａ】本発明による１種類のカスタムシークエンシングプライマーによる、ＭｉＳｅｑ、ＨｉＳｅｑ２０００／２５００及び１０００／１５００におけるデュアルインデックスシークエンシングを示す図である。
【図３Ｂ】本発明による２種類のカスタムシークエンシングプライマーによる、ＭｉｎｉＳｅｑ、ＮｅｘｔＳｅｑ、ＨｉＳｅｑ３０００／４０００イルミナシークエンシングプラットフォームにおけるデュアルインデックスシークエンシングを示す図である。
【図４Ａ】本発明による方法により実施される、ローパス全ゲノムシークエンシングのシークエンシング結果を示す図である。ＤＥＰＡｒｒａｙ（商標）（Menarini Silicon Biosystems）により分離された、ＮＣＩ−Ｈ４４１及びＳＷ−４８０細胞株に属する２種類の単一細胞のコピー数変化（ＣＮＡ）プロファイルが示される。
【図４Ｂ】本発明による方法により実施される、ローパス全ゲノムシークエンシングのシークエンシング結果を示す図である。ＤＥＰＡｒｒａｙ（商標）（Menarini Silicon Biosystems）により分離された、単一の血液細胞（循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）及び白血球（ＷＢＣ））のコピー数変化（ＣＮＡ）プロファイルが示される。
【図５】本発明による方法により実施される、ローパス全ゲノムシークエンシングのシークエンシング結果を示す図である。脱凝集されたＦＦＰＥ切片に属し、ＤＥＰＡｒｒａｙ（商標）（Menarini Silicon Biosystems）により計数的に分離され、全ゲノムをＡｍｐｌｉ１（商標）ＷＧＡキットを用いて増幅した単一の腫瘍細胞及び５０個の間質細胞集団のコピー数変化（ＣＮＡ）プロファイルが示される。
【図６Ａ】方法間及びプラットフォーム間（イオントレント及びイルミナ）の比較結果を示す図である。具体的には、イオントレントのためのローパス全ゲノムシークエンシング法（特許文献２に示される）、及びイルミナプラットフォームのための本発明による方法で得られたＮＣＩ−Ｈ２３単一細胞のコピー数変化（ＣＮＡ）プロファイルを示す。
【図６Ｂ】方法間及びプラットフォーム間（イオントレント及びイルミナ）の比較結果を示す図である。具体的には、ＣＮＡプロファイルに基づく、ＮＣＩ−Ｈ４４１及びＷＢＣ単一細胞の階層的クラスタリングを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
定義
他の指定が無い限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様の又は同等の多数の方法及び材料を、本発明を実行し、又は試験する際に使用してもよいが、好ましい方法及び材料が以下に記載される。特に言及しない限り、本発明とともに使用される本明細書に記載の技術は、当業者に既知の標準技法である。
【００２０】
「オリジナルＤＮＡ」という用語は、ＤＲＳ−ＷＧＡによる増幅の前のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を意図する。
【００２１】
「アダプター」又は「ＷＧＡアダプター」又は「ＷＧＡ  ＰＣＲプライマー」又は「ＷＧＡライブラリーユニバーサルシークエンスアダプター」という用語は、ＤＲＳ−ＷＧＡの場合には、制限酵素の作用により生成される各フラグメントへとライゲーションされる追加のオリゴヌクレオチドを意図し、又はＭＡＬＢＡＣの場合には、伸長及びＰＣＲプロセスにより生ずる、ＷＧＡ  ＤＮＡライブラリーの各分子の５’セクションに存在する既知のポリヌクレオチド配列を意図する。
【００２２】
「コピー数変化（ＣＮＡ）」という用語は、一般的には同一個体のゲノムに対して規定される、ゲノム領域のコピー数の体細胞における変化を意図する。
【００２３】
「コピー数多形（ＣＮＶ）」という用語は、一般的には参照ゲノムに対して規定される、ゲノム領域のコピー数の生殖細胞系列多形を意図する。ほとんどの論拠が両方の状況に当てはまり得るため、明細書中でＣＮＡ及びＣＮＶは区別無く使用され得る。反対の指定のない限り、これらの用語それぞれが両方の状況を指すことを意図するものとする。
【００２４】
「超並列シークエンシング（ＭＰＳ）」又は「次世代シークエンシング（ＮＧＳ）」という用語は、空間的及び／又は時間的に分離して、クローン的にシークエンシングされた（前もってクローン増幅する、又は増幅しない）ＤＮＡ分子のライブラリーを作製することを含むＤＮＡシークエンシングの方法を意図する。例として、イルミナプラットフォーム（Illumina社）、イオントレントプラットフォーム（ThermoFisher Scientific社）、パシフィックバイオサイエンスプラットフォーム、ＭｉｎＩＯＮ（Oxford Nanopore Technologies社）が挙げられる。
【００２５】
「標的配列」という用語は、オリジナルＤＮＡの関心の領域を意図する。
【００２６】
「一次ＷＧＡ  ＤＮＡライブラリー（ｐＷＧＡｌｉｂ）」という用語は、ＷＧＡ反応から得られるＤＮＡライブラリーを意図する。
【００２７】
「多重アニーリング及びループ化による増幅サイクル法（ＭＡＬＢＡＣ）」という用語は、準線形全ゲノム増幅法を意図する（Zong et al., Genome-wide detection of single-nucleotide and copy-number variations of a single human cell, Science. 2012 Dec 21;338(6114):1622-6. doi: 10.1126/science.1229164.）。ＭＡＬＢＡＣプライマーは、テンプレートにハイブリダイズする８ヌクレオチドの３’ランダム配列、及び２７ヌクレオチドの５’共通配列（ＧＴＧ  ＡＧＴ  ＧＡＴ  ＧＧＴ  ＴＧＡ  ＧＧＴ  ＡＧＴ  ＧＴＧ  ＧＡＧ）を有する。最初の伸長の後、セミアンプリコンが再度の伸長のテンプレートとして使用され、相補的な５’及び３’末端を有するフルアンプリコンが得られる。数サイクルの準線形増幅の後、続くＰＣＲサイクルによりフルアンプリコンを指数関数的に増幅することができる。
【００２８】
「ＤＮＡライブラリー精製」という用語は、ＤＮＡライブラリー材料を、酵素、ｄＮＴＰ、塩及び／又は所望のＤＮＡライブラリーの一部ではない他の分子等の不所望な反応成分から分離するプロセスを意図する。ＤＮＡライブラリー精製プロセスの例として、常磁性ビーズに基づく技術による精製（科学文献及び以下で簡便のためしばしば「磁性ビーズ」と称される）、例えばＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ、若しくはBeckman Coulterによる固相可逆的固定法（ＳＰＲＩ）ビーズ、又はスピンカラム精製、例えばMerck MilliporeによるＡｍｉｃｏｎスピンカラムが挙げられる。ＤＮＡライブラリー精製プロセスの他の例として、オリゴヌクレオチドベイトと直接に又はタンパク質−タンパク質相互作用を介してコンジュゲートした磁性ビーズ、例えばビオチン化されたオリゴヌクレオチドと相互作用する、ストレプトアビジンコーティングされた磁性ビーズによる精製が挙げられる。
【００２９】
「ＤＮＡライブラリー選択」という用語は、ＤＮＡライブラリー精製又はＤＮＡライブラリーサイズ選択のいずれか又は両方が行われるプロセスを意図する。
【００３０】
「シークエンシングアダプター（ＳＡ）」という用語は、ＤＮＡインサートのシークエンシングの手段となる１種類以上の分子を意図する。各分子は、ポリヌクレオチド配列、官能基のいずれも含まないか、又はそれらの１つ以上を含んでもよい。具体的には、シークエンサーが正確にアウトプット配列を生成するために超並列シークエンシングライブラリーに存在することが必要とされるが、情報を保持しないポリヌクレオチド配列を意図する（非限定的な例として、イルミナシークエンシングの場合ｓｓＤＮＡをフローセルにハイブリダイズするポリヌクレオチド配列、又はイオントレントシークエンシングの場合にはイオンスフェアにハイブリダイズするポリヌクレオチド配列、又は合成によるシークエンシング反応を開始するのに必要なポリヌクレオチド配列が挙げられる）。
【００３１】
「シークエンシングバーコード」という用語は、或るシークエンサーリード内でシークエンシングされれば、そのリードをそのバーコードに関連付けられる特定のサンプルに割り当てることができるポリヌクレオチド配列を意図する。
【００３２】
「ローパス全ゲノムシークエンシング」という用語は、平均シークエンシング深度が１未満である全ゲノムシークエンシングを意図する。
【００３３】
「平均シークエンシング深度」という用語は、本明細書において、サンプルごとの、シークエンシングされ、参照ゲノムにマッピングされた塩基の合計数を参照ゲノム全体のサイズで除算したものを意図する。シークエンシングされ、マッピングされた塩基の合計数は、マッピングされたリード数を平均リード長で乗算することで近似することができる。
【００３４】
「均等化」は、１つ以上のサンプルの濃度を調整し、均等にする操作を意図する。
【００３５】
「正規化」は、１つ以上のサンプルの濃度を調整し、それらの間の望ましい比率にする操作を意図する（均等化は比率が１である特別な場合である）。明細書において、簡便のため、正規化及び均等化という用語は区別無く使用される。これらは明らかに概念的に同一であるためである。
【００３６】
発明の詳細な説明
一次ＷＧＡ  ＤＮＡライブラリーがＤＲＳ−ＷＧＡにより得られ、シークエンシングプラットフォームがイルミナプラットフォームである場合の例示である、図２Ａを参照すると、本発明による超並列シークエンシングライブラリー生成方法は以下の工程を含む。
【００３７】
工程ａにおいて、既知の５’配列セクション（５ＳＳ）、中央配列セクション（ＭＳＳ）、及び上記既知の５’配列セクションと逆相補的である既知の３’配列セクション（３ＳＳ）を含むフラグメントを含む一次ＷＧＡ  ＤＮＡライブラリー（ｐＷＧＡｌｉｂ）が準備される。既知の５’配列セクション（５ＳＳ）はＷＧＡライブラリーユニバーサルシークエンスアダプターを含む。中央配列セクション（ＭＳＳ）は少なくとも、ＷＧＡの前の増幅されていないオリジナルＤＮＡのＤＮＡ配列に対応するインサートセクション（ＩＳ）を含む。中央配列セクション（ＭＳＳ）は任意に、インサートセクション（ＩＳ）に加えて、隣接５’中間セクション（Ｆ５）及び／又は隣接３’中間セクション（Ｆ３）を含む（例えば一次ＷＧＡ  ＤＮＡライブラリーがＭＡＬＢＡＣ又は国際公開第２０１５／１１８０７７号の教示によるＤＲＳ−ＷＧＡにより生成される場合）。図２Ａ及び図２Ｂにおいて、既知の５’配列セクション（５ＳＳ）は、ＤＲＳ−ＷＧＡに特異的なＬＩＢ配列（配列番号５０）に相当し、既知の３’配列セクション（３ＳＳ）はＬＩＢ配列の逆相補である（ＬＩＢｒｃ）。
【００３８】
工程ｂにおいて、１回のＰＣＲサイクルが、一次ＷＧＡ  ＤＮＡライブラリーにおいて少なくとも１種類の第１のプライマー（１ＰＲ）を用いて行われ、第１のプライマーは少なくとも第１のプライマー５’セクション（１ＰＲ５Ｓ）及び第１のプライマー３’セクション（１ＰＲ３Ｓ）を含む。第１のプライマー５’セクション（１ＰＲ５Ｓ）は少なくとも１つの第１のシークエンシングアダプター（１ＰＲ５ＳＡ）を含む。第１のプライマー３’セクション（１ＰＲ３Ｓ）は、既知の３’配列セクション（３ＳＳ）にハイブリダイズする。工程ｂの１回のＰＣＲサイクルにより、第１のプライマーで伸長されたＷＧＡ  ＤＮＡライブラリーがもたらされる。
【００３９】
１回のＰＣＲサイクルは、二本鎖ＤＮＡ変性工程と、プライマーアニーリング工程と、アニーリングされたプライマーの伸長工程とを含む。好ましい実施形態は、９５℃で３０秒間の変性工程と、６２℃で３０秒間のアニーリング工程と、７２℃で３分間の伸長工程とを含む。
【００４０】
第１のプライマー（１ＰＲ）は、第１のプライマー５’セクション（１ＰＲ５Ｓ）の３’位置及び第１のプライマー３’セクション（１ＰＲ３Ｓ）の５’位置に少なくとも１つのリードシークエンシングプライマー配列（１ＰＲＳＥＱ）を更に含むことが好ましい。
【００４１】
第１のプライマー（１ＰＲ）は、配列番号１〜配列番号１２からなる群より選択される配列を有することが好ましい。
【００４２】
工程ｂの後、第１のプライマー（１ＰＲ）が他の一次ＷＧＡ産物すなわち第１のプライマーで伸長されたＷＧＡ  ＤＮＡライブラリーフラグメントを重合させるのを防止する必要がある。好ましい実施形態では、第１のプライマーで伸長されたＷＧＡ  ＤＮＡライブラリーは工程ｂの後に精製される。この精製はＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔビーズ（Beckman Coulter）で行われるのが好ましい。
【００４３】
工程ｃにおいて、１回のＰＣＲサイクルが、第１のプライマーで伸長されたＷＧＡ  ＤＮＡライブラリーにおいて少なくとも１種類の第２のプライマー（２ＰＲ）を用いて実施され、第２のプライマーは第２のプライマー５’セクション（２ＰＲ５Ｓ）及び第２のプライマー３’セクション（２ＰＲ３Ｓ）を含む。第２のプライマー５’セクション（２ＰＲ５Ｓ）は、少なくとも１つの第１のシークエンシングアダプター（１ＰＲ５ＳＡ）とは異なる、少なくとも１つの第２のシークエンシングアダプター（２ＰＲ５ＳＡ）を含む。第２のプライマー３’セクション（２ＰＲ３Ｓ）は、既知の３’配列セクション（３ＳＳ）にハイブリダイズする。
【００４４】
工程ｃの１回のＰＣＲサイクルにより、第１のプライマー及び第２のプライマーで伸長されたＷＧＡ  ＤＮＡライブラリーがもたらされる。
【００４５】
１回のＰＣＲサイクルは、二本鎖ＤＮＡ変性工程と、プライマーアニーリング工程と、アニーリングされたプライマーの伸長工程とを含む。好ましい実施形態は、９５℃で３０秒間の変性工程と、６０℃で３０秒間のアニーリング工程と、７２℃で３分間の伸長工程とを含む。
【００４６】
第２のプライマー（２ＰＲ）は、配列番号１３〜配列番号２０からなる群より選択される配列を有することが好ましい。
【００４７】
工程ｃの後、第１のプライマー及び第２のプライマーで伸長されたＷＧＡ  ＤＮＡライブラリーを、好ましくは２．５Ｍ  ＮａＣｌ  ＰＥＧ２０％溶液により、精製する。
【００４８】
工程ｄにおいて、第１のプライマー及び第２のプライマーで伸長されたＷＧＡ  ＤＮＡライブラリーは、第１のシークエンシングアダプター（１ＰＲ５ＳＡ）を含む少なくとも１種類の第３のプライマー（３ＰＲ）、及び第２のシークエンシングアダプター（２ＰＲ５ＳＡ）を含む少なくとも１種類の第４のプライマー（４ＰＲ）を用いて増幅される。工程ｄのＰＣＲ増幅により、増幅された第１のプライマー及び第２のプライマーで伸長されたＷＧＡ  ＤＮＡライブラリーがもたらされる。ＤＮＡライブラリーに関するこの増幅工程の収量は、そのシークエンシングを行うのに十分なものである。
【００４９】
工程ｄの後、増幅された第１のプライマー及び第２のプライマーで伸長されたＷＧＡ  ＤＮＡライブラリーを、好ましくは２．５Ｍ  ＮａＣｌ  ＰＥＧ２０％溶液により、精製する。
【００５０】
第３のプライマー（３ＰＲ）は配列番号２２の配列を有することが好ましく、第４のプライマー（４ＰＲ）は配列番号２１の配列を有することが好ましい。
【００５１】
第１のプライマー（１ＰＲ）の第１のプライマー５’セクション（１ＰＲ５Ｓ）は、少なくとも１つの第１のシークエンシングアダプター（１ＰＲ５ＳＡ）の３’位置、及び第１のプライマー３’セクション（１ＰＲ３Ｓ）の５’位置に、少なくとも１つの第１のシークエンシングバーコード（１ＰＲ５ＢＣ）を更に含むことが好ましい。第２のプライマー（２ＰＲ）の第２のプライマー５’セクション（２ＰＲ５Ｓ）は、少なくとも１つの第２のシークエンシングアダプター（２ＰＲ５ＳＡ）の３’位置、及び第２のプライマー３’セクション（２ＰＲ３Ｓ）の５’位置に、少なくとも１つの第２のシークエンシングバーコード（２ＰＲ５ＢＣ）を更に含むことが好ましい。これにより、より高い多重化が可能となる。具体的には、配列番号１〜配列番号１２が第１のプライマー（１ＰＲ）として使用され、各プライマーが異なるバーコードを含み、また配列番号１３〜配列番号２０が第２のプライマー（２ＰＲ）として使用され、各プライマーが異なるバーコードを含む場合、９６個のバーコードの組み合わせが得られ、９６個のライブラリーを解析することができる。
【００５２】
ＷＧＡライブラリーユニバーサルシークエンスアダプターは、ＤＲＳ−ＷＧＡライブラリーユニバーサルシークエンスアダプター又はＭＡＬＢＡＣライブラリーユニバーサルシークエンスアダプターであることが好ましく、ＤＲＳ−ＷＧＡライブラリーユニバーサルシークエンスアダプターであることがより好ましい。
【００５３】
ＤＲＳ−ＷＧＡライブラリーユニバーサルシークエンスアダプターは配列番号５０を有することが好ましく、ＭＡＬＢＡＣライブラリーユニバーサルシークエンスアダプターは配列番号５１を有することが好ましい。
【００５４】
本発明によるローパス全ゲノムシークエンシングの方法は以下の工程を含む。
【００５５】
最初に、上に開示の超並列シークエンシングライブラリーの生成方法によって得られる、バーコードを付した超並列シークエンシングライブラリーを複数準備し、異なるシークエンシングバーコード（ＢＣ）を使用して得られたサンプルをプールする。次にプールされたライブラリーをシークエンシングする。
【００５６】
異なるシークエンシングバーコード（ＢＣ）を使用してサンプルをプールする工程は、バーコードを付された、超並列シークエンシングライブラリーのそれぞれにおけるＤＮＡを定量化する工程と、バーコードを付された、超並列シークエンシングライブラリーの量を正規化する工程とを更に含む。
【００５７】
本発明による超並列シークエンシングライブラリー調製キットは、少なくとも１種類の第１のプライマー（１ＰＲ）、１種類の第２のプライマー（２ＰＲ）、１種類の第３のプライマー（３ＰＲ）、及び１種類の第４のプライマー（４ＰＲ）を含む。これらのプライマーの構造は既に上記に開示されている。
【００５８】
一次ＷＧＡ  ＤＮＡライブラリーがＤＲＳ−ＷＧＡである好ましい一実施形態において、超並列シークエンシングライブラリー調製キットは、配列番号１〜配列番号１２からなる群より選択される１種類以上のプライマー、配列番号１３〜配列番号２０からなる群より選択される１種類以上のプライマー、並びに配列番号２１及び配列番号２２のプライマーを含む。
【００５９】
一次ＷＧＡ  ＤＮＡライブラリーがＤＲＳ−ＷＧＡである代替的な好ましい実施形態において、超並列シークエンシングライブラリー調製キットは、配列番号５２〜配列番号６３からなる群より選択される１種類以上のプライマー、配列番号１３〜配列番号２０からなる群より選択される１種類以上のプライマー、並びに配列番号２１及び配列番号２２のプライマーを含む。
【００６０】
一次ＷＧＡ  ＤＮＡライブラリーがＭＡＬＢＡＣ  ＷＧＡである代替的な好ましい実施形態において、超並列シークエンシングライブラリー調製キットは、配列番号２７〜配列番号３８からなる群より選択される１種類以上のプライマー、配列番号３９〜配列番号４６からなる群より選択される１種類以上のプライマー、並びに配列番号２１及び配列番号２２のプライマーを含む。
【００６１】
一次ＷＧＡ  ＤＮＡライブラリーがＭＡＬＢＡＣ  ＷＧＡである代替的な好ましい実施形態において、超並列シークエンシングライブラリー調製キットは、配列番号６４〜配列番号７５からなる群より選択される１種類以上のプライマー、配列番号３９〜配列番号４６からなる群より選択される１種類以上のプライマー、並びに配列番号２１及び配列番号２２のプライマーを含む。
【００６２】
本発明の一実施形態によるローパス全ゲノムシークエンシングキットは、配列番号１〜配列番号１２からなる群より選択される少なくとも１種類のプライマー、配列番号１３〜配列番号２０からなる群より選択される少なくとも１種類のプライマー、配列番号２１及び配列番号２２のプライマー、並びに配列番号２３のカスタムシークエンシングプライマーを含む。キットは配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６からなる群より選択されるプライマーを更に含むことが好ましい。具体的には配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６のプライマーのうちの１種類が、ＭｉｎｉＳｅｑ、ＮｅｘｔＳｅｑ、ＨｉＳｅｑ３０００／４０００イルミナシークエンシングプラットフォームとともに使用され、インデックス２を読み取る。更なる説明を以下に示す。３種類のプライマーの中でも、配列番号２４が特に好ましい。
【００６３】
代替的な実施形態において、ローパス全ゲノムシークエンシングキットは、配列番号５２〜配列番号６３からなる群より選択される少なくとも１種類のプライマー、配列番号１３〜配列番号２０からなる群より選択される少なくとも１種類のプライマー、配列番号２１及び配列番号２２のプライマー、配列番号２３のカスタムシークエンシングプライマー、並びに配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６からなる群より選択されるカスタムインデックス２プライマーを含む。
【００６４】
本発明の別の実施形態によるローパス全ゲノムシークエンシングキットは、配列番号２７〜配列番号３８からなる群より選択される少なくとも１種類のプライマー、配列番号３９〜配列番号４６からなる群より選択される少なくとも１種類のプライマー、配列番号２１及び配列番号２２のプライマー、並びに配列番号４７のプライマーを含む。キットは配列番号４８も含むことが好ましい。更により好ましくは、キットは配列番号４９のプライマーを含む。
【００６５】
代替的な実施形態において、ローパス全ゲノムシークエンシングキットは、配列番号６４〜配列番号７５からなる群より選択される少なくとも１種類のプライマー、配列番号３９〜配列番号４６からなる群より選択される少なくとも１種類のプライマー、配列番号２１及び配列番号２２のプライマー、並びに配列番号４７のプライマーを含む。キットは配列番号４８も含むことが好ましい。更により好ましくは、キットは配列番号４９のプライマーを含む。
【００６６】
本発明によるゲノムワイドコピー数プロファイリングの方法は、
上記のシークエンシングライブラリー調製キットの１つを使用して開発されたＤＮＡライブラリーをシークエンシングする工程と、
ゲノムの異なる領域にわたるシークエンシングリード深度を解析する工程と、
ゲノム領域におけるリード数を、参照ゲノムの同じ領域において期待されるリード数と比較することにより、ゲノムの領域のコピー数の値を決定する工程と、
を含む。
【００６７】
イルミナプラットフォームにおけるローパス全ゲノムシークエンシングのためのプロトコル１
確定的制限酵素部位全ゲノム増幅（ＤＲＳ−ＷＧＡ）
単一細胞ＤＮＡを、製造者の説明書に従ってＡｍｐｌｉ１（商標）ＷＧＡキット（Menarini Silicon Biosystems）を使用して増幅した。５μＬのＷＧＡ増幅したＤＮＡを、５μＬのヌクレアーゼフリー水を加え希釈し、ＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔビーズ（Beckman Coulter）システム（１．８×比）を使用して精製した。ＤＮＡを１２．５μＬで溶出し、Ｑｕｂｉｔ（商標）２．０蛍光光度計におけるｄｓＤＮＡ  ＨＳ  Ａｓｓａｙにより定量した。
【００６８】
Ｐ７単独伸長
１５μＬの容量で、Ａｍｐｌｉ１（商標）ＰＣＲキット（Menarini Silicon Biosystems）及びＬＩＢ＿ＩＬ＿ｉｎｄｅｘ  Ｄ７ｘｘ（配列番号１〜配列番号１２のプライマーの１つ）を使用して１工程のＰＣＲ伸長を行った。各ＰＣＲ反応ミックスは、１．５μＬのＡｍｐｌｉ１（商標）ＰＣＲ反応バッファー（１０×）、３μＬの配列番号１〜配列番号１２の範囲の１種類のプライマーＬＩＢ＿ＩＬ＿ｉｎｄｅｘ  Ｄ７ｘｘ［２．５μＭ］、０．５１μＬのＡｍｐｌｉ１（商標）ＰＣＲ  ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）、０．３７μＬのＢＳＡ、０．１２μＬのＡｍｐｌｉ１（商標）ＰＣＲ  Ｔａｑポリメラーゼ、ＷＧＡ精製ＤＮＡ（１０ｎｇ〜７５ｎｇ）及び最終容量１５μＬに達するＡｍｐｌｉ１（商標）水を含んでいた。
【００６９】
Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標）２７２０サーマルサイクラーを以下のようにセットした：９５℃で４分間、１サイクル（９５℃で３０秒間、６２℃で３０秒間、７２℃で３分間）。
【００７０】
ＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔビーズ精製及びＰ５単独伸長
前の工程の１５μＬのＡｍｐｌｉ１（商標）ＷＧＡ増幅物を、ＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔビーズ（Beckman Coulter）システム（１．５×比）を使用して精製した。ＤＮＡを以下のように調製した１５μＬのＰＣＲ反応ミックスに溶出した：１．５μＬのＡｍｐｌｉ１（商標）ＰＣＲ反応バッファー（１０×）、３μＬの１種類のプライマーＬＩＢ＿ＩＬ＿ｉｎｄｅｘ  Ｄ５ｘｘ（配列番号１３〜配列番号２０のプライマーの１種類）［２．５μＭ］、０．５１μＬのＡｍｐｌｉ１（商標）ＰＣＲ  ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）、０．３７μＬのＢＳＡ、０．１２μＬのＡｍｐｌｉ１（商標）ＰＣＲ  Ｔａｑポリメラーゼ及び９．５μＬのＡｍｐｌｉ１（商標）水。Ｐ５単独伸長ＰＣＲ反応はビーズの存在下で行われた。
【００７１】
Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標）２７２０サーマルサイクラーを以下のようにセットした：９５℃で４分間、１サイクル（９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で３分間）。
【００７２】
２．５Ｍ  ＮａＣｌ  ＰＥＧ２０％溶液精製及びライブラリー増幅
前の工程の１５μＬのＡｍｐｌｉ１（商標）ＷＧＡ増幅物を、２．５Ｍ  ＮａＣｌ  ＰＥＧ２０％溶液（１．５×比）を使用して精製した。ＤＮＡを以下のように調製した１５μＬのＰＣＲ反応ミックスに溶出した：１．５μＬのＡｍｐｌｉ１（商標）ＰＣＲ反応バッファー（１０×）、１μＬの１種類のプライマーアダプターＰ５（配列番号２１）及び１μＬの１種類のプライマーアダプターＰ７（配列番号２２）（それぞれ７．５μＬ）、０．５１μＬのＡｍｐｌｉ１（商標）ＰＣＲ  ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）、０．３７μＬのＢＳＡ、０．１２μＬのＡｍｐｌｉ１（商標）ＰＣＲ  Ｔａｑポリメラーゼ及び１０．５μＬのＡｍｐｌｉ１（商標）水。
【００７３】
ライブラリー増幅ＰＣＲ反応はビーズの存在下で行われた。
【００７４】
Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標）２７２０サーマルサイクラーを以下のようにセットした：９５℃で４分間、１サイクル（９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で２分間）、１０サイクル（９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で２分間（サイクルごとに２０秒間延長））及び７２℃で７分間の最終伸長。
【００７５】
好ましい実施形態では、ライブラリー増幅中に追加の２サイクルを加えることでライブラリー濃度を少なくとも２（〜４）倍増やすため、９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で２分間のサイクルを１２回に延長し、サイクルの合計数を１１から１３に増やすことができる。
【００７６】
最終的ライブラリー精製
増幅したライブラリー（イルミナシークエンシングアダプター配列を含む）を、最終的に２．５Ｍ  ＮａＣｌ  ＰＥＧ２０％溶液（１．５×比）を使用して精製し、１５μＬのＡｍｐｌｉ１（商標）水に溶出した。等モルプールを得るため、２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（商標）においてＡｇｉｌｅｎｔ  ＤＮＡ  ７５００、ＤＮＡ  １０００又はＤＮＡ  ＨＳキットにより精製したライブラリーの質を評価し（qualified）、及びＱｕｂｉｔ（商標）２．０蛍光光度計においてｄｓＤＮＡ  ＨＳ  Ａｓｓａｙにより定量した。ライブラリーの平均サイズ（一般的に、Ａｍｐｌｉ１（商標）ＷＧＡキット（Menarini Silicon Biosystems）を使用して得られるＤＲＳ−ＷＧＡ産物において、実験的に平均長７００ｂｐが観察される）に基づき、定量工程で得られるライブラリー濃度を、当業者に既知のようにｎＭに変換することができる（例えば６００ｂｐのライブラリー平均サイズに対し１ｎｇ／μＬ＝２．５ｎＭ、７００ｂｐのライブラリー平均サイズに対し１ｎｇ／μＬ＝２ｎＭ、８００ｂｐのライブラリー平均サイズに対し１ｎｇ／μＬ＝１．９ｎＭ）。Illumina Technical Note: DNA Sequencing "Nextera（商標）Library Validation and Cluster Density Optimization"Pub No. 770-2013-003を参照されたい。
【００７７】
好ましい代替として、精製したライブラリーを、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）法で定量した。ｑＰＣＲ法は機能的なライブラリー、具体的には各端に正しいアダプターを有するフラグメント（ヘテロアダプターフラグメント）を、コントロールテンプレート希釈物から生成される検量線に基づき正確に定量する。
【００７８】
ＭｉＳｅｑシークエンシングシステムにおけるシークエンシング
４ｎＭのプールを０．１Ｎ  ＮａＯＨで５分間変性した。変性したサンプルをＨＴ１バッファー（Illumina）で希釈し、２０ｐＭの変性したライブラリーを得た。６００μＬの変性したライブラリーをＭｉＳｅｑ試薬カートリッジ（Illumina）に充填した。
【００７９】
シングルエンドの１５０塩基のリード又はペアエンドのリード（７５ＰＥ）を、IlluminaのＭｉＳｅｑのｖ３  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙを使用して生成した。
【００８０】
次にカスタムリード１シークエンシングプライマー（配列番号２３）をＨＴ１で希釈し、最終濃度０．５μＭを得た。６００μＬの希釈したカスタムリード１シークエンシングプライマーをＭｉＳｅｑ試薬カートリッジ（Illumina）に充填した。
【００８１】
ＨｉＳｅｑ  １０００／１５００及び２０００／２５００システムにおけるシークエンシング
４ｎＭのプールを０．１Ｎ  ＮａＯＨで５分間変性した。
【００８２】
シングルエンドの１００塩基のリード又はペアエンドのリード（１００ＰＥ）を、IlluminaのＨｉＳｅｑのｖ２  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙをラピッドランモードで使用して、又はIlluminaのＨｉＳｅｑのｖ４  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙをハイアウトプットランモードで使用して生成した。
【００８３】
次に、カスタムリード１シークエンシングプライマー（配列番号２３）をＨＴ１で希釈し、最終濃度０．５μＭを得た。
【００８４】
ＮｅｘｔＳｅｑ、ＨｉＳｅｑ  ３０００及び４０００、ＮｏｖａＳｅｑシリーズ並びにＨｉＳｅｑ  Ｘ  Ｔｅｎシステムにおけるシークエンシング
４ｎＭのプールを０．１Ｎ  ＮａＯＨで５分間変性した。
【００８５】
シングルエンドの１５０塩基のリード又はペアエンドのリード（１００ＰＥ）を、イルミナプラットフォームの特定のｃｈｅｍｉｓｔｒｙを使用して生成した。
【００８６】
次に、カスタムリード１シークエンシングプライマー（配列番号２３）及びカスタムプライマーインデックス２Ａ（ｉ５）［ＬＮＡ−５’］（配列番号２４）をＨＴ１で希釈し、最終濃度０．５μＭを得た。
【００８７】
以下の表に、全てのイルミナプラットフォームの、ＤＲＳ−ＷＧＡに適合するプライマーの配列をまとめる（５’から３’方向の配列、５’及び３’を省略）。
【００８８】
【表１】
2020530767.tif 000003
【００８９】
以下の表に、全てのイルミナプラットフォームの、ＭＡＬＢＡＣ−ＷＧＡに適合するプライマーの配列をまとめる（５’から３’方向の配列、５’及び３’を省略）。
【００９０】
【表２】
2020530767.tif 000004
【００９１】
図２Ａ及び図２Ｂに示すように、ＤＲＳ−ＷＧＡを使用する場合、ＬＩＢ逆相補が、表１に列挙される配列番号１〜配列番号２０のプライマーの標的である。さらに、最終的なライブラリーはイルミナリード１シークエンシングプライマーの標的配列を欠くため、カスタムリード１シークエンシングプライマー（配列番号２３）を設計した。カスタムリード１シークエンシングプライマー（配列番号２３）はＬＩＢ配列を含み、ＬＩＢ逆相補配列と相補的である。
【００９２】
注目すべきことに、このシークエンシング設定において、この方法により本発明者らのＡｍｐｌｉ１（商標）ＷＧＡ産物の投入をもとに高い複雑性のライブラリーの構成が可能となるため、ＰｈｉＸ  ｓｐｉｋｅ−ｉｎ  ｃｏｎｔｒｏｌ（Illumina）の使用を回避することができる。
【００９３】
さらに、シークエンシングランはカスタムリード１シークエンシングプライマー（配列番号２３）を使用して実行されることが好ましく、ＰｈｉＸ  ＤＮＡライブラリーはカスタムリード１シークエンシングプライマーの標的配列を欠くため、ＰｈｉＸ  ＤＮＡはシークエンシングされない。
【００９４】
さらに、本発明の方法により得られる最終ライブラリーは、インデックス２（ｉ５）を読み取るためにＭｉｎｉＳｅｑ、ＮｅｘｔＳｅｑ、ＨｉＳｅｑ  ３０００及び４０００イルミナシステムに使用される正規のイルミナシークエンスアダプターを有しない。
【００９５】
このため、これらのプラットフォームでは、インデックスｉ５の正確な読み取りを可能とするため、カスタムプライマーインデックス２（配列番号２４又は配列番号２５又は配列番号２６）を使用する。カスタムシークエンシングプライマーインデックス２がＬＩＢ配列を含むことは注目すべきことである。詳細には、カスタムプライマーインデックス２Ａ（ｉ５）［ＬＮＡ−５’］（配列番号２４）及びカスタムプライマーインデックス２Ａ（ｉ５）［ＬＮＡ−３’］（配列番号２５）は、表１において横の「＋」で示される（例えば「＋Ａ」）、３つのＬＮＡ（ロックド核酸［ＬＮＡ（商標）］、Exiqon）修飾されたヌクレオチドを有する。さらに、カスタムプライマーインデックス２（ｉ５）［ＲＮＡ］（配列番号２６）は、横の「ｒ」で示される（例えば「ｒＡ」）、１５個のＲＮＡヌクレオチドで形成される。
【００９６】
上述の同様の考慮が、表２に列挙されるＭＡＬＢＡＣに適合するプライマー（配列番号２７〜配列番号４９）を使用する場合にも、必要な変更を加え当てはまる。
【００９７】
全てのイルミナプラットフォームに適するライブラリーを産生することができる（また、一次ＷＧＡライブラリーがＤＲＳ−ＷＧＡライブラリーである）更なる代替的な実施形態として、以下のプライマーの組み合わせを使用することができる：
配列番号５２〜配列番号６３からなる群より選択される少なくとも１種類のプライマー、
配列番号１３〜配列番号２０からなる群より選択される少なくとも１種類のプライマー、
配列番号２１及び配列番号２２のプライマー、
配列番号２３のカスタムシークエンシングプライマー並びに配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６からなる群より選択されるカスタムインデックス２プライマー。
【００９８】
配列番号５２〜配列番号６３のプライマーは、カスタムシークエンシングプライマーのアニーリング温度を上げるため、ＲＤＳＰ配列の代わりに、第１のプライマー３’セクションの５’に必要な８ヌクレオチドの配列を含む。第２のプライマー（配列番号１３〜配列番号２０）が、第２のプライマー３’セクションの８ヌクレオチドの５’の同じ配列を含むことに注目すべきである。配列番号２３のカスタムシークエンシングプライマーを、リード１及び／又はリード２を読み取るためにイルミナシークエンシングプラットフォームに使用し、配列番号２４（又は配列番号２５若しくは配列番号２６）のカスタムシークエンシングプライマーを、インデックス１及びインデックス２を読み取るためにイルミナシークエンシングプラットフォームに使用する。
【００９９】
以下の表に、本実施形態によるイルミナプラットフォームのＤＲＳ−ＷＧＡに適合するプライマーの配列をまとめる（５’から３’方向の配列、５’及び３’を省略）。
【０１００】
【表３】
2020530767.tif 000005
【０１０１】
全てのイルミナプラットフォームに適するライブラリーを生産することができる（また、一次ＷＧＡライブラリーがＭＡＬＢＡＣライブラリーである）更なる代替的な実施形態として、以下のプライマーの組み合わせを使用することができる：
配列番号６４〜配列番号７５からなる群より選択される少なくとも１種類のプライマー、
配列番号３９〜配列番号４６からなる群より選択される少なくとも１種類のプライマー、
配列番号２１及び配列番号２２のプライマー、
配列番号４７のカスタムリードプライマー。
【０１０２】
配列番号４８のプライマーも使用することが好ましい。配列番号４９のプライマーも使用することが更に好ましい。
【０１０３】
以下の表に、本実施形態によるイルミナプラットフォームのＤＲＳ−ＷＧＡに適合するプライマーの配列をまとめる（５’から３’方向の配列、５’及び３’を省略）。
【０１０４】
【表４】
2020530767.tif 000006
【実施例】
【０１０５】
実施例１
シークエンシングされたリードを、ＢＷＡ  ＭＥＭアルゴリズム（Li H. and Durbin R., 2010）を使用して、ｈｇ１９ヒト参照ゲノムにアラインメントした。
【０１０６】
Ｃｏｎｔｒｏｌ−ＦＲＥＥＣ（Boeva V. et al., 2011）アルゴリズムを使用して、コントロールサンプルを用いずに、コピー数コールを得た。リードカウントをＧＣ含量及びマッピング可能性（mappability）により補正し（ｕｎｉｑＭａｔｃｈオプション）、ウィンドウサイズを変動係数＝０．０６を使用するソフトウェアにより決定した。主要倍数性パラメーターは試験される遺伝子材料の倍数性に基づき設定し、コンタミネーション修正は使用しなかった。
【０１０７】
ＤＥＰＡｒｒａｙ（商標）（Menarini Silicon Biosystems）により分離されたＮＣＩ−４４１及びＳＷ−４８０細胞株に属する２つの単一細胞、並びにＤＥＰＡｒｒａｙ（商標）により分離された単一血液細胞である、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）及び白血球（ＷＢＣ）のＣＮＡプロファイルのプロットを、カスタムｐｙｔｈｏｎスクリプトを使用して、図４Ａ及び図４Ｂに示すように得た。
【０１０８】
図から、２２番常染色体において、分離された単一の腫瘍細胞における絶対コピー数として現れる大幅な増減が示されることが特筆される。
【０１０９】
倍数性値をｙ軸に表し、分割したデータとのプロファイルのより良好な対応を提供し（黒線）、ＣＮＡコーリングを改善する。評定される主要な倍数性より上のドットは増加とみなすことができ、評定される主要な倍数性より下のドットは減少とみなすことができる。
【０１１０】
一方、ＷＢＣ正常細胞には、予想されるような増減は存在しない。
【０１１１】
実施例２
脱凝集されたＦＦＰＥ切片に属する、単一の腫瘍細胞及び５０個の間質細胞集団をＤＥＰＡｒｒａｙ（商標）（Menarini Silicon Biosystems）により計数的に分離し、Ａｍｐｌｉ１（商標）ＷＧＡキットを使用して全ゲノムを増幅した。図５に上記に開示の方法で実施したローパス全ゲノムシークエンシングの結果を示す。図から、単一の腫瘍細胞にのみコピー数変化（ＣＮＡ）プロファイルの増減が示される。これらの高品質ＣＮＡプロファイルにより、本方法がＤＮＡ分解に高い耐性があることが確認され、ＦＦＰＥ組織における単一細胞レベルまでの腫瘍不均一性の分子特性評価のための信頼性のある有用な方法であると示される。
【０１１２】
実施例３
図６Ａ及び図６Ｂに、方法間及びプラットフォーム間（イオントレント及びイルミナ）の比較の結果を示す。
【０１１３】
具体的には、図６Ａは、イオントレントのローパス全ゲノムシークエンシング法（特許文献２に示される）、及びイルミナプラットフォームの本発明による方法により得られたＮＣＩ−Ｈ２３単一細胞のコピー数変化（ＣＮＡ）プロファイルを示す。２つのプラットフォームで得られた結果は互いによく一致する。
【０１１４】
さらに、ＮＣＩ−Ｈ４４１及びＷＢＣ単一細胞のＣＮＡプロファイルに基づく階層的クラスタリングにより、サンプルが方法又はプラットフォームによってではなく、サンプルタイプ（腫瘍及び正常）により階層化されることが示される（図６Ｂ）。
【０１１５】
結論として、イオントレント及びイルミナシークエンシングプラットフォームのＡｍｐｌｉ１（商標）ローパス法は、いずれもＣＮＡプロファイルの高い一致を示す。
【０１１６】
Ａｍｐｌｉ１（商標）ＷＧＡの方法についてのみ本発明を説明したが、説明される技術は、当業者には明白であるように、自己相補性５’及び３’領域を有するライブラリーを含む他の任意の種類のＷＧＡ（例えばＭＡＬＢＡＣ）にも、必要な変更を加え明らかに適用される。
【０１１７】
本発明の代替的な実施形態において、第１のプライマー又は第２のプライマー（１ＰＲ及び／又は２ＰＲ）を、処理の少なくとも１工程においてその５’末端で固体の基材と結合するように変更してもよい。
【０１１８】
一例として、第１のプライマー（１ＰＲ）はビオチン化５’末端を含んでもよい。最初のＰＣＲサイクル（工程ｂ）の後、ストレプトアビジンコーティングされたビーズを反応チューブに加え、第１のプライマーで伸長されたＤＮＡライブラリーフラグメントを捕捉する一方、第１のプライマーを含まない伸長していないフラグメントは、プライマーｄＮＴＰ及びポリメラーゼとともに溶出される。工程ｃにおいて、第２のプライマー（２ＰＲ）が（他のＰＣＲ試薬とともに）供給され、第１のプライマーで伸長されたＤＮＡライブラリーフラグメントとハイブリダイズし、チューブに残されたビーズと結合したＤＮＡライブラリーフラグメントをテンプレートとして使用して重合が起き、ヘテロアダプターＤＮＡフラグメントを生成する。工程ｃの反応ミックスを洗浄した後、同じチューブ内で第３のプライマー（３ＰＲ）及び第４のプライマー（４ＰＲ）を（他のＰＣＲ試薬とともに）使用して、ヘテロアダプターを更にＰＣＲにより増幅することができる（工程ｄ）。代替的には、ヘテロアダプターを変性し、チューブから溶出して、別のチューブ内で第３のプライマー（３ＰＲ）及び第４のプライマー（４ＰＲ）を使用して更にＰＣＲ増幅することができる（工程ｄ）。
【０１１９】
別の例として、第１のプライマー（１ＰＲ）は磁性ビーズに共有結合していてもよい。最初のＰＣＲサイクル（工程ｂ）の後、第１のプライマーで伸長されたＤＮＡライブラリーフラグメントをビーズに結合させて保持し、一方既知の３’配列セクション（３ＳＳ）を含むが第１のプライマーを含まない、伸長していないフラグメントは溶出される。工程ｃにおいて、第２のプライマー（２ＰＲ）は、第１のプライマーで伸長されたＤＮＡライブラリーフラグメントの既知の３’配列セクション（３ＳＳ）にハイブリダイズし、チューブに残されたビーズと結合したＤＮＡライブラリーフラグメントをテンプレートとして使用する重合が起き、ヘテロアダプターＤＮＡフラグメントを産生する。工程ｃの反応ミックスを洗浄した後、同じチューブ内で第３のプライマー（３ＰＲ）及び第４のプライマー（４ＰＲ）を使用して、ヘテロアダプターを更にＰＣＲにより増幅することができる（工程ｄ）。代替的には、ヘテロアダプターを変性し、チューブから溶出して、別のチューブ内で第３のプライマー（３ＰＲ）及び第４のプライマー（４ＰＲ）を使用して更にＰＣＲ増幅することができる（工程ｄ）。
【０１２０】
これらの実施形態の利点の１つは、ＳＰＲＩビーズの使用に関連するサイズ選択的効果がプロセスに含まれないことである。これにより、ＳＰＲＩビーズにより通常保持されるよりも小さい及び／又は大きい長さのフラグメントを、最終的なシークエンシング可能なライブラリーに存在させることができる。不利点の１つは、プライマーのビーズ又はビオチンとの結合に固有である、キット試薬の複雑性の増加である。より幅広い範囲のフラグメントの存在は、ローパスＷＧＳによってより高い深度で全ゲノムシークエンシングを求め、ゲノムワイドコピー数プロファイリングにわたり完全なリシークエンシングを達成するときに特に有益である。
【０１２１】
実施形態の更に別の例として、最初のＰＣＲサイクル（工程ｂ）で第１のプライマー（１ＰＲ）を使用した後、ＳＰＲＩ精製を行って残留する第１のプライマーを除去し、それから磁性ビーズと（共有結合により直接、又は第２のプライマーのビオチン修飾及びストレプトアビジンコーティングされた磁性ビーズとのビオチン−ストレプトアビジン相互作用により間接的に）結合した上記第２のプライマー（２ＰＲ）を、工程ｃの上記１回のＰＣＲサイクルに使用し、それから反応ミックス及びモノアダプターフラグメントの残余を溶出し、得られるヘテロアダプターフラグメントのみを磁力によりチューブに保持し、その後、上記第３のプライマー（３ＰＲ）及び第４のプライマー（４ＰＲ）によるＰＣＲ増幅の工程ｄに進む。
【０１２２】
利点
本発明による超並列シークエンシングライブラリー生成方法により、ヘテロアダプターフラグメントのみを含むライブラリーを必要とするシークエンシングプラットフォームのために、そのようなライブラリーを、迅速に、効率的に、信頼性をもって、かつ高い費用対効果で得ることができる。特に、本発明による方法により、二本鎖ＤＮＡの直ちにシークエンシング可能なライブラリーを、能率的な、１日の、かつシングルチューブのワークフローで生成することができる。
【０１２３】
最後に、ＣＮＶの調査に対する現行の主要な技術である、アレイＣＧＨ（ａＣＧＨ）に関するローパス全ゲノムシークエンシングの利点を強調すべきである。アレイＣＧＨ（ａＣＧＨ）は、スライドガラス又は他の固体プラットフォーム上に整列されたＤＮＡ標的に同時にハイブリダイズされる、示差的に標識された試験ＤＮＡサンプル及び参照ゲノムＤＮＡサンプルの使用に基づく。しかしながら、低品質／低量のＤＮＡの使用は難しいことが示されており、或る特定の用途には制限が残る。さらに、ローパス全ゲノムシークエンシング法に基づく染色体コピー数の評価は、ａＣＧＨと比較して、ＤＮＡシークエンシングの費用の削減、染色体分析の分解能の増大の可能性の結果としての部分又はセグメント異数性検出の向上、コントロールを用いないコピー数変化コーリングを含む幾つかの利点をもたらし得る。加えて、シークエンシングライブラリー調製の自動化の可能性により、ヒューマンエラーの最小化、実操作時間の削減、並びにより高いスループット及び一貫性の実現が可能となる。
【図１】
2020530767.tif 000007
【図２Ａ】
2020530767.tif 000008
【図２Ｂ】
2020530767.tif 000009
【図３Ａ】
2020530767.tif 000010
【図３Ｂ】
2020530767.tif 000011
【図４Ａ】
2020530767.tif 000012
【図４Ｂ】
2020530767.tif 000013
【図５】
2020530767.tif 000014
【図６Ａ】
2020530767.tif 000015
【図６Ｂ】
2020530767.tif 000016
【配列表】
2020530767000001.app
【国際調査報告】
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