(57)【要約】  【課題】  本発明は、アシル化インスリン類似体などの新規のインスリン類似体およびそれらの誘導体、ならびに特に糖尿病、肥満、および循環器疾患に関連する医学的病態の治療または予防におけるそれらの薬学的使用に関する。  【選択図】図１
2020531451.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インスリン誘導体であって、Ｂ５ＹもしくはＢ５Ｆと、アシル基を含む置換基と、を含む、インスリン誘導体、またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル。
【請求項２】
前記インスリン誘導体が、Ｂ２６ＧまたはＢ２６Ａをさらに含む、請求項１に記載のインスリン誘導体。
【請求項３】
前記アシル基を含む置換基が、Ｂ２８Ｋ、Ｂ２６Ｋ、またはＢ２９Ｋに結合している、請求項１または２のいずれか一項に記載のインスリン誘導体。
【請求項４】
０前記置換基が、以下の式（Ｉ）を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のインスリン誘導体。
Ａｃｙ−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３
式中、
・Ａｃｙが、アシル基であり、リトコール酸によって表されるか、または以下の式のうちの少なくとも１つの官能基を含むか、
化学式  １：−ＣＯ−（ＣＨ２）ｘ−ＣＯＯＨ、もしくは
化学式  ２：−ＣＯ−（ＣＨ２）ｘ−テトラゾリル、
（式中、ｘが、１２〜２０の範囲内の整数を表し、テトラゾリル基が、１Ｈ−テトラゾル−５−イルである）
あるいは以下の式の脂肪酸であり、
化学式  ３：−ＣＯ−（ＣＨ２）ｘ−ＣＨ３
（式中、ｘが、８〜１６の範囲内の整数を表す）
・Ｌ１が、不在であり、共有結合を表すか、またはＯＥＧ、ｇＧｌｕ、ＤｇＧｌｕ、もしくはスルホンイミドＣ−４を表し、
・Ｌ２が、不在であり、共有結合を表すか、またはＯＥＧ、ｇＧｌｕ、ＤｇＧｌｕ、もしくはスルホンイミドＣ−４を表し、
・Ｌ３が、不在であり、共有結合を表すか、またはＯＥＧ、ｇＧｌｕ、ＤｇＧｌｕ、もしくはスルホンイミドＣ−４を表し、
ｇＧｌｕが、ガンマグルタミン酸残基を表し、ＯＥＧが、［２−（２−アミノエトキシ）エトキシ］アセチルを表す］。
【請求項５】
前記インスリン誘導体が、Ａ１４Ｅおよび／またはｄｅｓＢ３０および／またはｄｅｓＢ２９−３０および／またはｄｅｓＢ２７−３０をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のインスリン誘導体。
【請求項６】
前記置換が、
ｉ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ａ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および４）
ｉｉ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｇ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および５）
ｉｉｉ．Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ａ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および７）
ｉｖ．Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｇ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および８）
ｖ．Ｂ５Ｙ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および９）
ｖｉ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｆ、Ｂ２６Ｇ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および１０）
ｖｉｉ．Ｂ５Ｆ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および１１）
ｖｉｉｉ．Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｋ、ｄｅｓＢ２７−ｄｅｓＢ３０（配列番号１および１２）
ｉｘ．Ｂ５Ｙ、ｄｅｓＢ３０（配列番号１および１３）
ｘ．Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｇ、ｄｅｓＢ３０（配列番号１および１４）
ｘｉ．Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ａ、ｄｅｓＢ３０（配列番号１および１５）
ｘｉｉ．Ｂ５Ｆ、Ｂ２６Ａ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および６）
ｘｉｉｉ．Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ａ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および４）
ｘｉｖ．Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｇ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および５）
ｘｖ．Ｂ５Ｆ、Ｂ２６Ｇ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および１０）
ｘｖｉ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｆ、Ｂ２６Ａ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および６）
ｘｖｉｉ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ａ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および７）
ｘｖｉｉｉ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｇ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および８）
ｘｉｘ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および９）
ｘｘ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｆ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および１１）
ｘｘｉ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｋ、ｄｅｓＢ２７−ｄｅｓＢ３０（配列番号３および１２）
ｘｘｉｉ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、ｄｅｓＢ３０（配列番号３および１３）
ｘｘｉｉｉ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｇ、ｄｅｓＢ３０（配列番号３および１４）
ｘｘｉｖ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ａ、ｄｅｓＢ３０（配列番号３および１５）からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載のインスリン誘導体。
【請求項７】
０Ａｃｙが、リトコール酸、１，１６−ヘキサデカン二酸、１，１８−オクタデカン二酸、１，２０−エイコサン二酸、テトラゾール−Ｃ１６、テトラゾール−Ｃ１７、テトラゾールＣ１８、およびテトラデカン酸からなる群から選択される、請求項６に記載のインスリン誘導体。
【請求項８】
０−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３が、ＤｇＧｌｕ、ｇＧｌｕ、ｇＧｌｕ−ｇＧｌｕ、ｇＧｌｕ−ＯＥＧ、ｇＧｌｕ−ＯＥＧ−ＯＥＧ、ＯＥＧ、スルホンイミド−Ｃ４、およびスルホンイミド−Ｃ４−スルホンイミド−Ｃ４から選択される二価結合基を表す、請求項６に記載のインスリン誘導体。
【請求項９】
前記インスリン誘導体が、実施例１５の化合物、Ｎ｛エプシロン−Ｂ２８｝−［２−［２−［２−［［（４Ｓ）−４−カルボキシ−４−（１７−カルボキシヘプタデカノイルアミノ）ブタノイル］アミノ］エトキシ］エトキシ］アセチル］−［ＧｌｕＡ１４，ＴｙｒＢ５，ＧｌｙＢ２６，ＬｙｓＢ２８］，ｄｅｓ−（Ｂ２９−Ｂ３０）−インスリンである、請求項１〜８のいずれかに記載のインスリン誘導体。
【化１】
2020531451.tif 000094
【請求項１０】
中間生成物であって、
ｉ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ａ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および４）
ｉｉ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｇ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および５）
ｉｉｉ．Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ａ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および７）
ｉｖ．Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｇ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および８）
ｖ．Ｂ５Ｙ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および９）
ｖｉ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｆ、Ｂ２６Ｇ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および１０）
ｖｉｉ．Ｂ５Ｆ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および１１）
ｖｉｉｉ．Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｋ、ｄｅｓＢ２７−ｄｅｓＢ３０（配列番号１および１２）
ｉｘ．Ｂ５Ｙ、ｄｅｓＢ３０（配列番号１および１３）
ｘ．Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｇ、ｄｅｓＢ３０（配列番号１および１４）
ｘｉ．Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ａ、ｄｅｓＢ３０（配列番号１および１５）
ｘｉｉ．Ｂ５Ｆ、Ｂ２６Ａ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および６）
ｘｉｉｉ．Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ａ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および４）
ｘｉｖ．Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｇ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および５）
ｘｖ．Ｂ５Ｆ、Ｂ２６Ｇ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および１０）
ｘｖｉ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｆ、Ｂ２６Ａ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および６）
ｘｖｉｉ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ａ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および７）
ｘｖｉｉｉ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｇ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および８）
ｘｉｘ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および９）
ｘｘ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｆ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および１１）
ｘｘｉ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｋ、ｄｅｓＢ２７−ｄｅｓＢ３０（配列番号３および１２）
ｘｘｉｉ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、ｄｅｓＢ３０（配列番号３および１３）
ｘｘｉｉｉ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｇ、ｄｅｓＢ３０（配列番号３および１４）
ｘｘｉｖ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ａ、ｄｅｓＢ３０（配列番号３および１５）からなる群から選択される骨格を含む、中間生成物、
またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル。
【請求項１１】
０薬物として使用するための、請求項１〜９のいずれか一項に記載のインスリン誘導体。
【請求項１２】
０糖尿病、循環器疾患、アテローム動脈硬化症、および／もしくは内皮機能障害の予防もしくは治療において使用するため、ならびに／または肝トリグリセリド含有量を予防もしくは低減するため、ならびに／または体重増加を予防もしくは低減するための、請求項１〜９のいずれか一項に記載のインスリン誘導体。
【請求項１３】
０糖尿病、１型糖尿病、２型糖尿病、耐糖能障害、高血糖症、脂質異常症、肥満、メタボリックシンドローム（メタボリックシンドロームＸ、インスリン抵抗性症候群）、高血圧症、認知障害、アテローム動脈硬化症、心筋梗塞、脳卒中、循環器障害、冠動脈心疾患、脳卒中、炎症性腸症候群、消化不良、低血圧症、または胃潰瘍の治療または予防のための薬物を製造するための、請求項１〜９のいずれか一項に記載のインスリン誘導体の使用。
【請求項１４】
糖尿病、１型糖尿病、２型糖尿病、耐糖能障害、高血糖症、脂質異常症、肥満、メタボリックシンドローム（メタボリックシンドロームＸ、インスリン抵抗性症候群）、高血圧症、認知障害、アテローム動脈硬化症、心筋梗塞、脳卒中、循環器障害、冠動脈心疾患、脳卒中、炎症性腸症候群、消化不良、低血圧症、または胃潰瘍の治療または予防のための方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の請求項１〜０のいずれか一項に記載のインスリン誘導体、または請求項０に記載のインスリン類似体を、投与することを含む、方法。
【請求項１５】
インスリン化合物の選択性を決定するための方法であって、以下、
・ヒトインスリンと比較した、前記インスリン化合物によって誘発される最大ＡＫＴリン酸化を測定するステップと、
・ヒトインスリンと比較した、前記インスリン化合物によって誘発される最大ＥＲＫ活性化を測定するステップと、を含み、
ＥＲＫ／ＡＫＴ比が、１未満である、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アシル化インスリン類似体などの新規のインスリン類似体およびそれらの誘導体、ならびに具体的には、糖尿病、肥満、および循環器疾患に関連する医学的病態の治療または予防におけるそれらの薬学的使用に関する。
【０００２】
参照による配列表の組み込み
「ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＬＩＳＴＩＮＧ」と題する配列表は、８，００ＫＢであり、２０１８年７月１３日に作成され、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
糖尿病は、グルコースを利用する能力が部分的または完全に失われる代謝障害である。世界人口の５％超が糖尿病を抱えており、さらに数百万人がこの疾患を発症するリスクがある。
【０００４】
現在の治療法では、糖尿病を有する人々の約５０％が、依然として循環器疾患で死亡しており、糖尿病を有する人々はまた、微小血管合併症（腎障害、網膜症、および神経障害など）を発症するリスクもあるため、改善された治療のための新たな薬物の開発に対する継続した必要性が存在している。特に２型糖尿病の場合、これらの患者は、高血糖症に加えて、多くの場合、現在のインスリン療法が有する有益な効果が限定的でしかない、代謝機能障害（例えば、脂質異常症、肥満、および循環器合併症など）を患っているため。
【０００５】
肝臓では、インスリンは、糖新生およびグリコーゲン分解を抑制し、グリコーゲン合成を増加させ、これは、肝臓からのグルコース出力の減少をもたらす。これらのプロセスは、肝細胞インスリン抵抗性によって著しく障害され、これは、メタボリックシンドロームにおける空腹時高血糖症の主要な原因である。グルコース代謝に対する効果に加えて、インスリンはまた、転写因子ＳＲＥＢＰ−１ｃの活性化を通して肝臓内の脂肪酸およびトリグリセリドの合成も増加させ、これが転じて、アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼおよび脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）を含む脂質生成酵素の遺伝子の転写を増加させる。しかしながら、グリコーゲン合成およびグルコース産生に対する効果とは対照的に、２型糖尿病のインスリン抵抗性げっ歯類モデル、および脂肪萎縮症または細胞内インスリンシグナリング経路内の特定の節に影響を与える変異によって引き起こされる糖尿病を患うヒトでは、脂質合成のインスリン誘発性増加には全く影響がないか、または少なくとも障害の程度がより少ない。したがって、メタボリックシンドロームに関連する高インスリン血症は、肝脂質合成の増加を直接引き起こし、それによりトリグリセリドの循環レベルの増加を悪化させる可能性がある。これは、肝インスリン抵抗性が、２型糖尿病を有する人々において観察される、ヒト脂質異常症、脂肪肝、循環器血管機能障害、および腎機能低減にさえ寄与することをいくつかの研究が示している理由である可能性が非常に高い。これと一致して、血糖値を低下させるための高濃度のインスリンを有するインスリン抵抗性の対象の治療は、例えば、新規脂質生成に関与する非抵抗性経路の過剰刺激をもたらす可能性がある。非抵抗性経路（例えば、脂質生成経路）を過剰刺激することなく血糖値を低下させるために、グルコース低下経路を選択的に活性化するインスリン類似体へのアクセスを有することが望ましい。そのような機能的に選択的なインスリン類似体は、血糖値を低下させるだけでなく、脂質異常症、脂肪肝、アテローム動脈硬化症、および循環器疾患（ＣＶＤ）に対する改善された効果も呈する。
【０００６】
ＷＯ２００５／０５４２９１は、申し立てによると、Ｂ２８Ｋアシル化を有する単鎖インスリンについて記載している。ＷＯ２００９／１１２５８３は、申し立てによると、Ｂ２８Ｋを含むプロテアーゼ安定化インスリン類似体について記載している。ＷＯ９０／０７５１１、ＷＯ９６／１５８０４、ＷＯ２０００／４３０３４、ＵＳ２０１２／２４１３５６、ＷＯ２０１２／０１５６９２、およびＷＯ９７／３１０２２は、申し立てによると、Ｂ２８Ｋを含むインスリン類似体を開示しており、これらの一部はまた、申し立てによると、同じ位置でのアシル化も開示している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
多種多様なインスリン類似体および誘導体が報告されている。しかしながら、それらは全て、全く同じ方法でインスリン受容体を活性化し、すなわち、活性化が高親和性類似体への結合から生じるか、低親和性類似体への結合から生じるかに関わらず、インスリン受容体活性化の下流効果は比較的類似しており、効力のみが異なる。
【０００８】
したがって、抵抗性および非抵抗性経路、例えば、糖新生および脂質代謝経路に対して機能的に選択的な特性を有するインスリン類似体および誘導体に対する必要性が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
第１の態様では、本発明は、インスリン誘導体に関し、該インスリン誘導体は、Ｂ５Ｙと、アシル基を含む置換基とを含む。
【００１０】
第２の態様では、本発明は、インスリン誘導体に関し、該インスリン誘導体は、Ｂ５Ｆと、アシル基を含む置換基とを含む。
【００１１】
別の態様では、本発明は、インスリン誘導体に関し、該インスリン誘導体は、Ｂ５ＹおよびＢ２６ＧまたはＢ２６Ａと、Ｂ２８Ｋ、Ｂ２６Ｋ、またはＢ２９Ｋに結合いているアシル基を含む置換基とを含む。
【００１２】
別の態様では、本発明は、インスリン誘導体に関し、該インスリン誘導体は、Ｂ５ＦおよびＢ２６ＧまたはＢ２６Ａと、Ｂ２８Ｋ、Ｂ２６Ｋ、またはＢ２９Ｋに結合いているアシル基を含む置換基とを含む。
【００１３】
別の態様では、本発明は、本発明のインスリン誘導体と、１つ以上の薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む、薬学的組成物を提供する。
【００１４】
さらなる態様では、本発明は、糖尿病、１型糖尿病、２型糖尿病、耐糖能障害、高血糖症、脂質異常症、肥満、メタボリックシンドローム（メタボリックシンドロームＸ、インスリン抵抗性症候群）、高血圧症、認知障害、アテローム動脈硬化症、心筋梗塞、脳卒中、循環器障害、冠動脈心疾患、脳卒中、炎症性腸症候群、消化不良、低血圧症、または胃潰瘍の治療または予防のための薬物を製造するための、本発明によるインスリン誘導体の使用に関する。
【００１５】
同様に、または代替的に第２の態様では、本発明は、肥満、脂質異常症、循環器合併症に関連するプロセスに対する改善された効果（より低い体重増加、より低い体脂肪量増加、より低い肝トリグリセリド増加、または内皮機能の改善など）を有するインスリン誘導体を提供する。
【００１６】
一態様では、本発明のインスリン誘導体は、脂質代謝に悪影響を与えることなく血糖を低下させることができる。
【００１７】
別の態様では、本発明のインスリン誘導体は、準最大のインスリン受容体リン酸化を誘発し、選択的なシグナリング、および故に選択的な細胞応答を誘発し、すなわち、ヒトインスリンと比較した場合、グルコース低下経路に対してよりも脂質代謝経路に対して低い最大応答をもたらす。
【００１８】
さらに別の態様では、本発明のインスリン誘導体はまた、グルコース低下の他に、特により低い体脂肪量増加による、より低い体重増加を有する。
【００１９】
一態様では、本発明は、ヒトインスリンと比較して、特に肝トリグリセリド低下の増加による、肝脂質異常症、脂肪肝、または非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）に関連するプロセスに対する改善された効果を有するインスリン誘導体を提供する。
【００２０】
別の態様では、本発明は、ヒトインスリンと比較して、循環器障害に関連するプロセスに対する改善された効果（内皮機能の改善など）を有するインスリン誘導体を提供する。
【００２１】
さらに別の態様では、本発明のインスリン誘導体は、糖尿病を有する患者における循環器の有害事象のより低い発生率を提供する。
【００２２】
一態様では、本発明は、製剤中で改善された安定性を有するインスリン誘導体を提供する。
【００２３】
本発明はまた、例示的な実施形態の開示から明らかとなる、さらなる問題を解決することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、可溶化ＩＲ−Ａによる競合結合アッセイからの、ヒトインスリン（●）および実施例１５の化合物（▲）の代表的な受容体結合曲線を示す（ＣＰＭ＝カウント毎分）。
【図２】図２は、ＩＲ−Ａを過剰発現するＣＨＯ−ｈＩＲ細胞内でのＩＲｐＹ１１５８リン酸化アッセイからの、ヒトインスリン（●）および実施例１５の化合物（▲）の代表的な用量応答曲線を示す。
【図３】図３は、ＩＲ−Ａを過剰発現するＣＨＯ−ｈＩＲ細胞内でのＡＫＴリン酸化アッセイ（セリン残基番号４７３のリン酸化）からの、ヒトインスリン（●）および実施例１５の化合物（▲）の代表的な用量応答曲線を示す。
【図４】図４は、ＩＲ−Ａを過剰発現するＣＨＯ−ｈＩＲ細胞内でのＥＲＫリン酸化アッセイからの、ヒトインスリン（●）および実施例１５の化合物（▲）の代表的な用量応答曲線を示す。
【図５】図５は、初代ラット脂肪細胞内での脂質生成アッセイからの、ヒトインスリン（●）および実施例１５の化合物（▲）の代表的な用量応答曲線を示す（ＤＰＭ＝壊変毎分）。
【図６】図６は、初代ラット肝細胞内でのグリコーゲン合成アッセイからの、ヒトインスリン（●）および実施例１５の化合物（▲）の代表的な用量応答曲線を示す。
【図７】図７は、初代ラット肝細胞から単離したｃＤＮＡに対して実行した、ｆａｓｎの定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイからの、ヒトインスリン（●）および実施例１５の化合物（▲）の代表的な用量応答曲線を示す。
【図８】図８は、初代ラット肝細胞から単離したｃＤＮＡに対して実行した、ｇ６ｐｃの定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイからの、ヒトインスリン（●）および実施例１５の化合物（▲）の代表的な用量応答曲線を示す。
【図９】図９は、初代ラット肝細胞内での新規脂質生成アッセイからの、ヒトインスリン（●）および実施例１５の化合物（▲）の代表的な用量応答曲線を示す（ＣＰＭ＝カウント毎分）。
【図１０】図１０は、ビヒクル、ＰＫ対照薬（対照薬番号５）、および実施例１５の化合物を６週間にわたって１日２回皮下に投薬した糖尿病のＳＴＺ−ＤＩＯマウスにおける、亜慢性インビボ研究からのＨｂＡ１ｃレベルの代表的な曲線を示す。
【図１１】図１１は、ビヒクル、ＰＫ対照薬（対照薬番号５）、および実施例１５の化合物を６週間にわたって１日２回皮下に投薬した糖尿病のＳＴＺ−ＤＩＯマウスにおける、亜慢性インビボ研究からの体重の代表的な曲線を示す。
【図１２】図１２は、ビヒクル、ＰＫ対照薬（対照薬番号５）、および実施例１５の化合物を６週間にわたって１日２回皮下に投薬した糖尿病のＳＴＺ−ＤＩＯマウスにおける、亜慢性インビボ研究からの体脂肪量の代表的な曲線を示す。
【図１３】図１３は、ビヒクル、ＰＫ対照薬（対照薬番号５）、および実施例１５の化合物を６週間にわたって１日２回皮下に投薬した糖尿病のＳＴＺ−ＤＩＯマウスにおける、亜慢性インビボ研究からの肝ＴＧの代表的な曲線を示す。
【図１４】図１４は、ビヒクル、ＰＫ対照薬（対照薬番号５）、および実施例１５の化合物を６週間にわたって１日２回皮下に投薬した糖尿病のＳＴＺ−ＤＩＯマウスにおける、亜慢性インビボ研究からの腸間膜動脈のＡＣｈ刺激血管弛緩の代表的な曲線を示す。
【図１５】図１５は、０．６ｍＭの対照薬化合物、すなわち、３Ｚｎ／６ｉｎｓ、３０ｍＭのフェノール、１．６％のグリセロール、および７ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを含む、対照薬９（ｐＨ７．６）の製剤の代表的なＳＥＣデータを示す（黒色線）。ヒトアルブミンと、Ｃｏ（ＩＩＩ）インスリンヘキサマーと、モノマーインスリン類似体（Ｂ９Ａｓｐ、Ｂ２７Ｇｌｕ）とのＳＥＣ基準混合物が含まれる（灰色線）。
【図１６】図１６は、実施例３の化合物に類似した製剤の代表的なＳＥＣデータを示す（黒色線）。
【図１７】図１７は、実施例１１の化合物に類似した製剤の代表的なＳＥＣデータを示す（黒色線）。
【図１８】図１８は、実施例１２の化合物に類似した製剤の代表的なＳＥＣデータを示す（黒色線）。
【図１９】図１９は、実施例１５の化合物に類似した製剤の代表的なＳＥＣデータを示す（黒色線）。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明は、アシル化されており、糖新生および脂質代謝に関与する経路に対して機能的に選択的な特性を示す、ヒトインスリンの新規の類似体を提供する。
【００２６】
本発明は、Ｂ５ＹまたはＢ５Ｆと、アシル基を含む置換基とを含む、インスリン誘導体に広く関する。
【００２７】
一実施形態では、本発明のインスリン誘導体は、ヒトインスリンと比較した場合、およそ６５％またはそれ未満のインスリン受容体の準最大のリン酸化を誘発する。
【００２８】
一実施形態では、インスリン誘導体は、アシル基を含む置換基を含む。
【００２９】
一実施形態では、置換基は、Ｂ２８Ｋ、Ｂ２６Ｋ、またはＢ２９Ｋに結合している。
【００３０】
一実施形態では、置換基は、Ｂ２８Ｋに結合している。
【００３１】
一実施形態では、置換基は、Ｂ２６Ｋに結合している。
【００３２】
一実施形態では、置換基は、Ｂ２９Ｋに結合している。
【００３３】
別の実施形態では、インスリン誘導体は、Ｂ２６ＧまたはＢ２６Ａを含む。
【００３４】
別の実施形態では、インスリン誘導体は、Ａ１４Ｅを含む。
【００３５】
別の実施形態では、インスリン誘導体は、ｄｅｓＢ３０、ｄｅｓＢ２９−３０、またはｄｅｓＢ２７−３０を含む。
【００３６】
別の実施形態では、インスリン誘導体は、ｄｅｓＢ３０を含む。
【００３７】
別の実施形態では、インスリン誘導体は、ｄｅｓＢ２９−３０を含む。
【００３８】
別の実施形態では、インスリン誘導体は、ｄｅｓＢ２７−３０を含む。
【００３９】
別の実施形態では、本発明のインスリン誘導体は、実施例１〜４６の化合物からなる群から選択される。
【表１−１】
2020531451.tif 000003
【表１−２】
2020531451.tif 000004
【表１−３】
2020531451.tif 000005
【表１−４】
2020531451.tif 000006
【表１−５】
2020531451.tif 000007
【表１−６】
2020531451.tif 000008
【表１−７】
2020531451.tif 000009
【００４０】
本発明は、糖尿病の治療または予防のための薬物を製造するための、本発明によるインスリン誘導体の使用に関する。
【００４１】
動物モデルでは、驚くべきことに、本発明のインスリン誘導体が、脂質代謝または内皮機能障害に対するより少ない悪影響をもって、血糖を低下させることができることが見出されている。これは、より低い発生率の循環器の有害事象をもたらすと考えられ、これらの動物実験はまた、従来のインスリン治療と比較した場合、グルコース低下が、特により低い体脂肪量増加による、より低い体重増加を伴うことも示している。
【００４２】
これらの動物実験はまた、従来のインスリン治療と比較した場合、グルコース低下が、肝トリグリセリド低下の増加を伴うことも示しているため、これは、肝疾患発症または進行に対して有益な効果をもたらす可能性が高い。
【００４３】
さらに、インビトロでの下流シグナリングを検査すると、本発明のインスリン誘導体は、準最大のインスリン受容体リン酸化を誘発すること、ならびに選択的なシグナリング、および故に選択的な細胞応答を誘発を誘発すること、すなわち、ヒトインスリンと比較した場合、グルコース低下経路に対してよりも脂質代謝経路に対して低い最大応答をもたらすことを示している。
【００４４】
最後に、本発明のインスリン誘導体はまた、所望の選択的なシグナリングおよび製剤中での改善された安定性も有する。
【００４５】
インスリン
本明細書で使用される場合、「ヒトインスリン」という用語は、その構造および特性が周知のヒトインスリンホルモンを意味する。ヒトインスリンは、Ａ鎖およびＢ鎖と称される２つのポリペプチド鎖を有する。Ａ鎖は、２１個のアミノ酸のペプチドであり、Ｂ鎖は、３０個のアミノ酸のペプチドであり、２つの鎖は、ジスルフィド架橋によって接続され、第１の架橋は、Ａ鎖の７位のシステインとＢ鎖の７位のシステインとの間であり、第２の架橋は、Ａ鎖の２０位のシステインとＢ鎖の１９位のシステインとの間である。第３の架橋は、Ａ鎖の６位のシステインとＡ鎖の１１位のシステインとの間に存在する。
【００４６】
ヒトインスリンＡ鎖は、以下の配列、ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ（配列番号１）を有する一方、Ｂ鎖は、以下の配列、ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴ（配列番号２）を有する。
【００４７】
ヒトの体内では、このホルモンは、２４個のアミノ酸のプレペプチドからなる単鎖前駆体プロインスリン（プレプロインスリン）の後に、プレペプチド−Ｂ−Ａｒｇ  Ａｒｇ−Ｃ−Ｌｙｓ  Ａｒｇ−Ａ（式中、Ｃは、３１個のアミノ酸の接続ペプチドである）の構成にある８６個のアミノ酸を含有するプロインスリンが続いたものとして合成される。Ａｒｇ−ＡｒｇおよびＬｙｓ−Ａｒｇは、Ａ鎖およびＢ鎖からの接続ペプチドの切断のための切断部位である。
【００４８】
本発明による「インスリン」は、本明細書では、ヒトインスリンまたは別の種に由来するインスリン（ブタまたはウシインスリンなど）として理解される。
【００４９】
本明細書で使用する場合、「インスリンペプチド」という用語は、ヒトインスリン、またはインスリン活性を有するその類似体もしくは誘導体のいずれかであるペプチドを意味する。
【００５０】
インスリン類似体
本明細書で使用される場合、「インスリン類似体」という用語は、インスリンの１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基によって置換されている、かつ／または１つ以上のアミノ酸残基がインスリンから欠失している、かつ／または１つ以上のアミノ酸残基がインスリンに付加および／もしくは挿入されている、単一修飾ヒトインスリン分子を意味する。
【００５１】
一実施形態では、インスリン類似体は、ヒトインスリンと比較して、１０個未満のアミノ酸修飾（置換、欠失、付加（挿入を含む）、およびこれらの任意の組み合わせ）、代替的にはヒトインスリンと比較して、９、８、７、６、５、４、３、２、または１個未満の修飾を含む。
【００５２】
インスリン分子内の修飾は、鎖（ＡまたはＢ）、位置、および天然アミノ酸残基を置換するアミノ酸残基の１文字または３文字のコードを述べることで表わされる。
【００５３】
「接続ペプチド」または「Ｃ−ペプチド」は、単鎖プロインスリン分子のＢ−Ｃ−Ａポリペプチド配列の接続部分「Ｃ」を意味する。ヒトインスリン鎖では、Ｃ−ペプチドは、Ｂ鎖の３０位およびＡ鎖の１位を接続し、３５個のアミノ酸の残基長である。接続ペプチドは、２つの末端二塩基性アミノ酸配列、例えば、Ａｒｇ−ＡｒｇおよびＬｙｓ−Ａｒｇを含み、これらは、Ａ鎖およびＢ鎖から接続ペプチドを切断して、二本鎖インスリン分子を形成するための切断部位として機能する。
【００５４】
「ｄｅｓＢ３０」または「Ｂ（１−２９）」は、天然インスリンＢ鎖、またはＢ３０アミノ酸を欠くその類似体を意味し、「Ａ（１−２１）」は、天然インスリンＡ鎖を意味する。したがって、例えば、Ｂ５Ｙ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンは、Ｂ鎖の５位のアミノ酸がチロシン（ＴｙｒまたはＹ）で置換され、Ｂ鎖の２８位のアミノ酸がリジン（ＬｙｓまたはＫ）で置換され、かつＢ鎖の２９位および３０位のアミノ酸が欠失している、ヒトインスリンの類似体である。
【００５５】
本明細書では、Ａ１、Ａ２、およびＡ３などの用語は、（Ｎ末端から数えて）インスリンのＡ鎖のそれぞれ１位、２位、および３位などのアミノ酸を示す。同様に、Ｂ１、Ｂ２、およびＢ３などの用語は、（Ｎ末端から数えて）インスリンのＢ鎖のそれぞれ１位、２位、および３位などのアミノ酸を示す。
【００５６】
本明細書では、「アミノ酸残基」という用語は、形式上、ヒドロキシ基がカルボキシ基から除去されている、かつ／または形式上、水素原子がアミノ基から除去されている、アミノ酸である。
【００５７】
一実施形態では、本発明のインスリン類似体は、２〜１０個の変異を含むヒトインスリンの類似体である。
【００５８】
一実施形態では、本発明のインスリン類似体は、２〜６個の変異を含むヒトインスリンの類似体である。
【００５９】
一実施形態では、本発明のインスリン類似体は、２〜３個の変異を含むヒトインスリンの類似体である。
【００６０】
一実施形態では、本発明のインスリン類似体は、２個の変異を含むヒトインスリンの類似体である。
【００６１】
一実施形態では、本発明のインスリン類似体は、３個の変異を含むヒトインスリンの類似体である。
【００６２】
一実施形態では、本発明のインスリン類似体は、４個の変異を含むヒトインスリンの類似体である。
【００６３】
一実施形態では、本発明のインスリン類似体は、５個の変異を含むヒトインスリンの類似体である。
【００６４】
一実施形態では、本発明のインスリン類似体は、６個の変異を含むヒトインスリンの類似体である。
【００６５】
一実施形態では、本発明のインスリン類似体は、７個の変異を含むヒトインスリンの類似体である。
【００６６】
一実施形態では、本発明のインスリン類似体は、８個の変異を含むヒトインスリンの類似体である。
【００６７】
一実施形態では、本発明のインスリン類似体は、９個の変異を含むヒトインスリンの類似体である。
【００６８】
一実施形態では、本発明のインスリン類似体は、１０個の変異を含むヒトインスリンの類似体である。
【００６９】
一実施形態では、本発明のインスリン類似体は、１０個未満の変異を含むヒトインスリンの類似体である。
【００７０】
一実施形態では、本発明のインスリン類似体は、７個未満の変異を含むヒトインスリンの類似体である。
【００７１】
一実施形態では、本発明のインスリン類似体は、５個未満の変異を含むヒトインスリンの類似体である。
【００７２】
一実施形態では、本発明のインスリン類似体は、４個未満の変異を含むヒトインスリンの類似体である。
【００７３】
一実施形態では、本発明のインスリン類似体は、３個未満の変異を含むヒトインスリンの類似体である。
【００７４】
一実施形態では、インスリン類似体は、Ｂ５Ｙを含む。
【００７５】
一実施形態では、インスリン類似体は、Ｂ５Ｆを含む。
【００７６】
一実施形態では、インスリン誘導体は、Ｂ２６ＡまたはＢ２６Ｇを含む。
【００７７】
一実施形態では、インスリン類似体は、Ｂ２６Ａを含む。
【００７８】
一実施形態では、インスリン類似体は、Ｂ２６Ｇを含む。
【００７９】
別の実施形態では、インスリン類似体は、Ａ１４Ｅを含む。
【００８０】
一実施形態では、インスリン類似体は、Ｂ５ＹおよびＢ２６Ａを含む。
【００８１】
一実施形態では、インスリン類似体は、Ｂ５ＹおよびＢ２６Ｇを含む。
【００８２】
一実施形態では、インスリン類似体は、Ｂ５ＦおよびＢ２６Ａを含む。
【００８３】
一実施形態では、インスリン類似体は、Ｂ５ＦおよびＢ２６Ｇを含む。
【００８４】
一実施形態では、インスリン類似体は、Ｂ２８Ｋ、Ｂ２６Ｋ、またはＢ２９Ｋを含む。
【００８５】
一実施形態では、インスリン類似体は、Ｂ２８Ｋを含む。
【００８６】
一実施形態では、インスリン類似体は、Ｂ２６Ｋを含む。
【００８７】
一実施形態では、インスリン類似体は、Ｂ２９Ｋを含む。
【００８８】
別の実施形態では、インスリン類似体は、Ｂ２６ＧまたはＢ２６Ａを含む。
【００８９】
別の実施形態では、インスリン類似体は、ｄｅｓＢ３０、ｄｅｓＢ２９−３０、またはｄｅｓＢ２７−３０を含む。
【００９０】
別の実施形態では、インスリン類似体は、ｄｅｓＢ３０を含む。
【００９１】
別の実施形態では、インスリン類似体は、ｄｅｓＢ２９−３０を含む。
【００９２】
別の実施形態では、インスリン類似体は、ｄｅｓＢ２７−３０を含む。
【００９３】
一実施形態では、インスリン類似体は、Ｂ５Ｙに加えて、最大１０個の置換をさらに含み得る。
【００９４】
一実施形態では、インスリン類似体は、Ｂ５Ｙに加えて、最大５個の置換をさらに含む。
【００９５】
一実施形態では、インスリン類似体は、Ｂ５Ｙに加えて、２個の置換をさらに含む。
【００９６】
一実施形態では、インスリン類似体は、Ｂ５Ｙに加えて、３個の置換をさらに含む。
【００９７】
一実施形態では、インスリン類似体は、Ｂ５Ｙに加えて、４個の置換をさらに含む。
【００９８】
一実施形態では、インスリン類似体は、Ｂ５Ｙに加えて、５個の置換をさらに含む。
【００９９】
一実施形態では、インスリン類似体は、Ｂ５Ｙに加えて、６個の置換をさらに含む。
【０１００】
一実施形態では、インスリン類似体は、Ｂ５Ｙに加えて、７個の置換をさらに含む。
【０１０１】
一実施形態では、インスリン類似体は、Ｂ５Ｙに加えて、８個の置換をさらに含む。
【０１０２】
一実施形態では、インスリン類似体は、Ｂ５Ｙに加えて、９個の置換をさらに含む。
【０１０３】
一実施形態では、インスリン類似体は、Ｂ５Ｆに加えて、最大１０個の置換をさらに含み得る。
【０１０４】
一実施形態では、インスリン類似体は、Ｂ５Ｆに加えて、最大５個の置換をさらに含む。
【０１０５】
一実施形態では、インスリン類似体は、Ｂ５Ｆに加えて、２個の置換をさらに含む。
【０１０６】
一実施形態では、インスリン類似体は、Ｂ５Ｆに加えて、３個の置換をさらに含む。
【０１０７】
一実施形態では、インスリン類似体は、Ｂ５Ｆに加えて、４個の置換をさらに含む。
【０１０８】
一実施形態では、インスリン類似体は、Ｂ５Ｆに加えて、５個の置換をさらに含む。
【０１０９】
一実施形態では、インスリン類似体は、Ｂ５Ｆに加えて、６個の置換をさらに含む。
【０１１０】
一実施形態では、インスリン類似体は、Ｂ５Ｆに加えて、７個の置換をさらに含む。
【０１１１】
一実施形態では、インスリン類似体は、Ｂ５Ｆに加えて、８個の置換をさらに含む。
【０１１２】
一実施形態では、インスリン類似体は、Ｂ５Ｆに加えて、９個の置換をさらに含む。
【０１１３】
本発明のインスリン類似体の非限定的な例には、以下が含まれる。
Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ａ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および４）
Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｇ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および５）
Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ａ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および７）
Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｇ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および８）
Ｂ５Ｙ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および９）
Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｆ、Ｂ２６Ｇ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および１０）
Ｂ５Ｆ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および１１）
Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｋ、ｄｅｓＢ２７−ｄｅｓＢ３０（配列番号１および１２）
Ｂ５Ｙ、ｄｅｓＢ３０（配列番号１および１３）
Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｇ、ｄｅｓＢ３０（配列番号１および１４）
Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ａ、ｄｅｓＢ３０（配列番号１および１５）
【０１１４】
一実施形態では、本発明のインスリン類似体は、以下を含む。
Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ａ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および４）
Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｇ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および５）
Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ａ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および７）
Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｇ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および８）
Ｂ５Ｙ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および９）
Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｆ、Ｂ２６Ｇ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および１０）
Ｂ５Ｆ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および１１）
Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｋ、ｄｅｓＢ２７−ｄｅｓＢ３０（配列番号１および１２）
Ｂ５Ｙ、ｄｅｓＢ３０（配列番号１および１３）
Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｇ、ｄｅｓＢ３０（配列番号１および１４）
Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ａ、ｄｅｓＢ３０（配列番号１および１５）
Ｂ５Ｆ、Ｂ２６Ａ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および６）
Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ａ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および４）
Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｇ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および５）
Ｂ５Ｆ、Ｂ２６Ｇ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および１０）
Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｆ、Ｂ２６Ａ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および６）
Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ａ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および７）
Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｇ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および８）
Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および９）
Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｆ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および１１）
Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｋ、ｄｅｓＢ２７−ｄｅｓＢ３０（配列番号３および１２）
Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、ｄｅｓＢ３０（配列番号３および１３）
Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｇ、ｄｅｓＢ３０（配列番号３および１４）、ならびに
Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ａ、ｄｅｓＢ３０（配列番号３および１５）。
【０１１５】
インスリン誘導体
本明細書で使用される場合、「インスリン誘導体」という用語は、１つ以上の側鎖がペプチドに共有結合している、化学修飾された親インスリンまたはその類似体を意味する。本明細書で使用される場合、「側鎖」という用語はまた、「置換基」または「アルブミン結合部分」とも称され得る。側鎖の非限定的な例には、アミド、炭水化物、アルキル基、アシル基、エステル、およびペグ化などが含まれ、これらは、リンカーをさらに含み得る。
【０１１６】
本明細書で使用される場合、「アルブミン結合部分」という用語は、アルブミンに非共有結合することができ、すなわち、アルブミン結合親和性を有する、任意の化学基を指す。いくつかの実施形態では、アルブミン結合部分は、アシル基を含む。
【０１１７】
別の特定の実施形態では、側鎖は、アルブミン結合、およびそれにより突出に特に関連する部分を含み、したがって、この部分は、「突出部分」または「突出体」または「アシル基」と称され得る。突出部分は、ペプチドへのその結合点に対して、アルブミン結合部分の末端（または遠位端、または遊離端）の近く、および好ましくはその末端にあってもよい。
【０１１８】
本発明による「置換基」、「側鎖」、または「アルブミン結合部分」は、以下の式（Ｉ）を有する。
Ａｃｙ−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３
式中、
・Ａｃｙが、アシル基であり、リトコール酸によって表されるか、以下の式の官能基によって表されるか、
化学式  １：−ＣＯ−（ＣＨ２）ｘ−ＣＯＯＨ、もしくは
化学式  ２：−ＣＯ−（ＣＨ２）ｘ−テトラゾリル、
（式中、ｘが、１２〜２０の範囲内の整数を表し、テトラゾリル基が、１Ｈ−テトラゾル−５−イルである）
または以下の式の脂肪酸によって表され、
化学式  ３：−ＣＯ−（ＣＨ２）ｘ−ＣＨ３
（式中、ｘが、８〜１６の範囲内の整数を表す）
・Ｌ１が、不在であるか、またはＯＥＧ、ｇＧｌｕ、ＤｇＧｌｕ、もしくはスルホンイミドＣ−４を表し、
・Ｌ２が、不在であるか、またはＯＥＧ、ｇＧｌｕ、ＤｇＧｌｕ、もしくはスルホンイミドＣ−４を表し、
・Ｌ３が、不在であるか、またはＯＥＧ、ｇＧｌｕ、ＤｇＧｌｕ、もしくはスルホンイミドＣ−４を表し、
・ＯＥＧが、［２−（２−アミノエトキシ）エトキシ］アセチルまたはアミノ酸残基８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸−ＮＨ（ＣＨ２）２Ｏ（ＣＨ２）２ＯＣＨ２ＣＯ−を表し、以下の構造によって表され、
【化１】
2020531451.tif 000010
・ｇＧｌｕが、以下の構造によって表されるガンマグルタミン酸残基を表し、
【化２】
2020531451.tif 000011
（式中、構造図の右側のカルボキシル基が、隣接するアミノ基への結合を形成する、ガンマ−カルボキシ基である）
・ＤｇＧｌｕが、以下の構造によって表されるガンマグルタミン酸残基を表し、
【化３】
2020531451.tif 000012
（式中、構造図の右側のカルボキシル基が、隣接するアミノ基への結合を形成する、ガンマ−カルボキシ基である）
・スルホンイミドＣ−４が、以下の構造によって表される。
【化４】
2020531451.tif 000013
【０１１９】
一実施形態では、式（Ｉ）のＬ１−Ｌ２−Ｌ３は、以下によって独立して表される。
・なし
・ｇＧｌｕ
・ＯＥＧ
・２ｘｇＧｌｕ
・ｇＧｌｕ−ＯＥＧ
・ｇＧｌｕ−２ｘＯＥＧ
・スルホンイミド−Ｃ４
・２ｘスルホンイミド−Ｃ４
・ＤｇＧｌｕ
【０１２０】
一実施形態では、置換基は、式（Ｉ）Ａｃｙ−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３を有し、以下によって独立して表される。
・リトコール酸
・リトコール酸−ｇＧｌｕ
・Ｃ１４
・Ｃ１６二酸
・Ｃ１６二酸−ｇＧｌｕ
・Ｃ１８二酸
・Ｃ１８二酸−ｇＧｌｕ
・Ｃ１８二酸−２ｘｇＧｌｕ
・Ｃ１８二酸−ＤｇＧｌｕ
・Ｃ１８二酸−ｇＧｌｕ−ＯＥＧ
・Ｃ１８二酸−ｇＧｌｕ−２ｘＯＥＧ
・Ｃ１８二酸−ＯＥＧ
・Ｃ１８二酸−スルホンイミド−Ｃ４
・Ｃ２０二酸
・Ｃ２０二酸−ｇＧｌｕ
・Ｃ２０二酸−ｇＧｌｕ−ＯＥＧ
・Ｃ２０二酸−ｇＧｌｕ−２ｘＯＥＧ
・テトラゾール−Ｃ１６
・テトラゾール−Ｃ１６−ｇＧｌｕ−ＯＥＧ
・テトラゾール−Ｃ１６−ｇＧｌｕ−２ｘＯＥＧ
・テトラゾール−Ｃ１６−２ｘスルホンイミド−Ｃ４
・テトラゾール−Ｃ１７
・テトラゾール−Ｃ１７−スルホンイミド−Ｃ４
・テトラゾール−Ｃ１８、
・テトラゾール−Ｃ１８−スルホンイミド−Ｃ４
・テトラゾール−Ｃ１８−２ｘスルホンイミド−Ｃ４
【０１２１】
一実施形態では、置換基は、実施例１５の化合物の置換基であり、Ａｃｙ−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３は、Ｃ１８二酸−ｇＧｌｕ−ＯＥＧによって、および以下の構造によって表される。
【化５】
2020531451.tif 000014
【０１２２】
一実施形態では、本発明のインスリン誘導体は、実施例１〜４６の化合物からなる群から選択される。
【０１２３】
さらに別の実施形態では、本発明のインスリン誘導体は、実施例１〜３６の化合物からなる群から選択される。
【０１２４】
さらに別の実施形態では、本発明のインスリン誘導体は、実施例１０〜３４の化合物からなる群から選択される。
【０１２５】
さらに別の実施形態では、本発明のインスリン誘導体は、実施例３、４、１２〜１６、１８〜２０、２２、２３、２５、２６、２８〜３０の化合物からなる群から選択される。
【０１２６】
さらに別の実施形態では、本発明のインスリン誘導体は、実施例１４〜１６、１８、２０、および２６の化合物からなる群から選択される。
【０１２７】
さらに別の実施形態では、本発明のインスリン誘導体は、実施例３７〜３９または４６の化合物からなる群から選択される。
【０１２８】
さらに別の実施形態では、本発明のインスリン誘導体は、実施例４０〜４５の化合物からなる群から選択される。
【０１２９】
一実施形態では、本発明のインスリン誘導体は、実施例１５の化合物、Ｎ｛エプシロン−Ｂ２８｝−［２−［２−［２−［［（４Ｓ）−４−カルボキシ−４−（１７−カルボキシヘプタデカノイルアミノ）ブタノイル］アミノ］エトキシ］エトキシ］アセチル］−［ＧｌｕＡ１４，ＴｙｒＢ５，ＧｌｙＢ２６，ＬｙｓＢ２８］，ｄｅｓ−（Ｂ２９−Ｂ３０）−インスリンである。
【化６】
2020531451.tif 000015
【０１３０】
アシル基
一実施形態では、本発明のインスリン誘導体は、アシル基を含む。したがって、アシル基を含むインスリン誘導体は、「アシル化インスリン類似体」と称され得る。
【０１３１】
好ましい実施形態では、本発明のインスリン誘導体は、アシル基（Ａｃｙ）を含み、このアシル基は、リトコール酸を表すか、または以下の式の官能基を表し、
・化学式１：−ＣＯ−（ＣＨ２）ｘ−ＣＯＯＨ、もしくは
・化学式２：−−ＣＯ−（ＣＨ２）ｘ−テトラゾリル−
（式中、ｘが、１２〜２０の範囲内の整数を表し、テトラゾリル基が、１Ｈ−テトラゾル−５−イルである）
または以下の式の脂肪酸を表す。
・化学式３：−ＣＯ−（ＣＨ２）ｘ−ＣＨ３
（式中、ｘが、８〜１６の範囲内の整数を表す）。
【０１３２】
一実施形態では、Ａｃｙは、リトコール酸、１，１６−ヘキサデカン二酸、１，１８−オクタデカン二酸、１，２０−エイコサン二酸、テトラゾール−Ｃ１６、テトラゾール−Ｃ１７、テトラゾールＣ１８、およびテトラデカン酸からなる群から選択される。
【０１３３】
一実施形態では、インスリン誘導体は、ジカルボン酸を含むアシル基を含む。
一実施形態では、インスリン誘導体は、化学式１の式のアシル基を含み、式中、ｘが、１２〜２０の範囲内の整数を表す。
【０１３４】
一実施形態では、インスリン誘導体は、化学式１の式の式のアシル基を含み、式中、ｘが、１２〜１８の範囲内の整数を表す。
【０１３５】
一実施形態では、インスリン誘導体は、化学式１の式の式のアシル基を含み、式中、ｘが、１２〜１６の範囲内の整数を表す。
【０１３６】
一実施形態では、インスリン誘導体は、化学式１の式の式のアシル基を含み、式中、ｘが、１２〜１４の範囲内の整数を表す。
【０１３７】
一実施形態では、インスリン誘導体は、化学式１の式の式のアシル基を含み、式中、ｘが、整数１４、１６、または１８（すなわち、それぞれ脂肪二酸基１，１６−ヘキサデカン二酸、１，１８−オクタデカン二酸、および１，２０−エイコサン二酸）を表す。
【０１３８】
一実施形態では、インスリン誘導体は、式、−ＣＯ−（ＣＨ２）１２−ＣＯＯＨのアシル基を含み、以下の構造によって表される。
【化７】
2020531451.tif 000016
【０１３９】
一実施形態では、インスリン誘導体は、１，１６−ヘキサデカン二酸とも称される、式、−ＣＯ−（ＣＨ２）１４−ＣＯＯＨのアシル基を含み、以下の構造によって表される。
【化８】
2020531451.tif 000017
【０１４０】
一実施形態では、インスリン誘導体は、１，１８−オクタデカン二酸とも称される、式、−ＣＯ−（ＣＨ２）１６−ＣＯＯＨのアシル基を含み、以下の構造によって表される。
【化９】
2020531451.tif 000018
【０１４１】
一実施形態では、インスリン誘導体は、１，２０−エイコサン二酸とも称される、式−ＣＯ−（ＣＨ２）１８−ＣＯＯＨのアシル基を含み、以下の構造によって表される。
【化１０】
2020531451.tif 000019
【０１４２】
一実施形態では、インスリン誘導体は、式、−ＣＯ−（ＣＨ２）２０−ＣＯＯＨのアシル基を含み、以下の構造によって表される。
【化１１】
2020531451.tif 000020
【０１４３】
一実施形態では、インスリン誘導体は、リトコール酸を含むアシル基を含み、以下の構造によって表される。
【化１２】
2020531451.tif 000021
【０１４４】
一実施形態では、インスリン誘導体は、式、−ＣＯ−（ＣＨ２）１２−ＣＨ３の脂肪酸を含むアシル基を含み、以下の構造によって表される。
【化１３】
2020531451.tif 000022
【０１４５】
別の実施形態では、インスリン誘導体は、少なくとも１つの官能基を含むアシル基を含む。
【０１４６】
一実施形態では、インスリン誘導体は、カルボン酸およびテトラゾール部分からなる群から選択される官能基を含むアシル基を含む。
【０１４７】
一実施形態では、インスリン誘導体は、以下の式から選択される官能基を含むアシル基を含む。
化学式１：−ＣＯ−（ＣＨ２）ｘ−ＣＯＯＨ、もしくは
化学式２：−−ＣＯ−（ＣＨ２）ｘ−テトラゾリル−
（式中、ｘが、１２〜２０の範囲内の整数を表し、テトラゾリル基が、１Ｈ−テトラゾル−５−イルである）。
【０１４８】
一実施形態では、インスリン誘導体は、テトラゾール−Ｃ１６、テトラゾール−Ｃ１７、およびテトラゾールＣ１８からなる群から選択されるテトラゾール部分を含む官能基を含む。
【０１４９】
一実施形態では、インスリン誘導体は、以下の構造によって表されるテトラゾール−Ｃ１６である官能基を含む。
【化１４】
2020531451.tif 000023
【０１５０】
一実施形態では、インスリン誘導体は、以下の構造によって表されるテトラゾール−Ｃ１７である官能基を含む。
【化１５】
2020531451.tif 000024
【０１５１】
一実施形態では、インスリン誘導体は、以下の構造によって表されるテトラゾール−Ｃ１８である官能基を含む。
【化１６】
2020531451.tif 000025
【０１５２】
一実施形態では、インスリン誘導体は、脂肪酸を含む。
【０１５３】
一実施形態では、インスリン誘導体は、以下の式の脂肪酸を含む。
化学式３：−ＣＯ−（ＣＨ２）ｘ−ＣＨ３
（式中、ｘが、８〜１６の範囲内の整数を表す）。
【０１５４】
リンカー
本明細書で使用される場合、「リンカー」という用語は、アシル基などの部分をインスリンまたはインスリン類似体に接合することができる好適な側鎖を含む。したがって、リンカーおよびアシル基は、ともに側鎖となる。リンカーに接合される部分は、任意の好適な部分であり得る。例には、アルブミン結合部分が含まれる。
【０１５５】
リンカーは、その部分（例えば、アルブミン結合部分）の結合効果に寄与すること、および／またはそれを増強することができ、例えば、ｇＧｌｕを含むリンカーは、インスリンまたはインスリン類似体のアルブミン結合効果を増強することができる。
【０１５６】
一実施形態では、側鎖は、アシル基と、インスリンまたはインスリン類似体への結合点との間の部分を含み、この部分は、「リンカー」、「リンカー部分」、「リンカー基」、「結合基」、または「スペーサー」などと称され得る。リンカーは、任意であってもよく、故に側鎖は、アシル基と同一であってもよい。
【０１５７】
アシル基またはリンカーは、アシル化によって、すなわち、その（アシル基、アルブミン結合部分、突出部分、またはリンカーの）カルボン酸基と、Ｎ末端のリジン残基またはアミノ酸残基のアミノ基との間に形成されたアミド結合を介して、インスリンペプチドのリジン残基に共有結合することができる。追加的または代替的な共役化学には、アルキル化、エステル形成、アミド形成、またはシステイン残基へのカップリング（マレイミドまたはハロアセトアミド（ブロモ−／フルオロ−／ヨード−など）カップリングによるものなど）が含まれる。
【０１５８】
好ましい実施形態では、好ましくは突出部分およびリンカーを含む、アシル基の活性エステルは、上記に説明されるアミド結合の形成下で、リジン残基のアミノ基、好ましくはそのイプシロンアミノ基に共有結合している。
【０１５９】
別の実施形態では、リンカー基は、不在であり、共有結合を表す。
【０１６０】
一実施形態では、本発明のインスリン誘導体は、式、−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３のリンカー基を含む。［式中、
・Ｌ１が、不在であるか、またはＯＥＧ、ｇＧｌｕ、ＤｇＧｌｕ、もしくはスルホンイミドＣ−４を表し、
・Ｌ２が、不在であるか、またはＯＥＧ、ｇＧｌｕ、ＤｇＧｌｕ、もしくはスルホンイミドＣ−４を表し、
・Ｌ３が、不在であるか、またはＯＥＧ、ｇＧｌｕ、ＤｇＧｌｕ、もしくはスルホンイミドＣ−４を表し、
・ｇＧｌｕが、以下の構造によって表されるガンマグルタミン酸残基を表し、
【化１７】
2020531451.tif 000026
（式中、構造図の右側のカルボキシル基が、隣接するアミノ基への結合を形成する、ガンマ−カルボキシ基である）
・ＤｇＧｌｕが、以下の構造によって表されるガンマグルタミン酸残基を表し、
【化１８】
2020531451.tif 000027
（式中、構造図の右側のカルボキシル基が、隣接するアミノ基への結合を形成する、ガンマ−カルボキシ基である）
・ＯＥＧが、［２−（２−アミノエトキシ）エトキシ］アセチルを表し、以下の構造によって表され、
【化１９】
2020531451.tif 000028
・スルホンイミドＣ−４が、以下の構造によって表され、
【化２０】
2020531451.tif 000029
・２ｘスルホンイミド−Ｃ４またはスルホンイミド−Ｃ４−スルホンイミド−Ｃ４が、以下の構造によって表される。
【化２１】
2020531451.tif 000030
【０１６１】
一実施形態では、本発明のインスリンペプチドは、ＤｇＧｌｕ、ｇＧｌｕ、ｇＧｌｕ−ｇＧｌｕ、ｇＧｌｕ−ＯＥＧ、ｇＧｌｕ−ＯＥＧ−ＯＥＧ、ＯＥＧ、スルホンイミド−Ｃ４、および２ｘスルホンイミド−Ｃ４から選択される二価結合基を表すリンカー基を含み、
・ｇＧｌｕが、ガンマグルタミン酸残基を表し、
・ＯＥＧが、基または残基、−ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ−（［２−（２−アミノ−エトキシ）エトキシ］アセチルとも指定される）に対応する式、ＮＨ２−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯＯＨを有するアミノ酸を表し、
・スルホンイミド−Ｃ４が、以下の構造によって表され、
【化２２】
2020531451.tif 000031
・以下の構造によって表される、２ｘスルホンイミド−Ｃ４またはスルホンイミド−Ｃ４−スルホンイミド−Ｃ４。
【化２３】
2020531451.tif 000032
【０１６２】
リンカーの非限定的な例は、以下からなる一覧から選択される。ＤｇＧｌｕ、ｇＧｌｕ、ｇＧｌｕ−ｇＧｌｕ、ｇＧｌｕ−ＯＥＧ、ｇＧｌｕ−ＯＥＧ−ＯＥＧ、ＯＥＧ、スルホンイミド−Ｃ４、２ｘスルホンイミド−Ｃ４。
【０１６３】
一実施形態では、結合基は、不在である。
【０１６４】
一実施形態では、結合基は、ＤｇＧｌｕである。
【０１６５】
一実施形態では、結合基は、ｇＧｌｕである。
【０１６６】
一実施形態では、結合基は、ｇＧｌｕ−ｇＧｌｕである。
【０１６７】
一実施形態では、結合基は、ｇＧｌｕ−ＯＥＧである。
【０１６８】
一実施形態では、結合基は、ｇＧｌｕ−ＯＥＧ−ＯＥＧである。
【０１６９】
一実施形態では、結合基は、ＯＥＧである。
【０１７０】
一実施形態では、結合基は、スルホンイミド−Ｃ４である。
【０１７１】
一実施形態では、結合基は、スルホンイミド−Ｃ４−スルホンイミド−Ｃ４または２ｘスルホンイミドＣ−４である。
【０１７２】
中間生成物
本発明はさらに、本発明の置換基への結合時に本発明のインスリン誘導体ペプチドをもたらす、新規の骨格の形態の中間生成物に関する。
本発明はまた、
ｉ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ａ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および４）
ｉｉ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｇ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および５）
ｉｉｉ．Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ａ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および７）
ｉｖ．Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｇ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および８）
ｖ．Ｂ５Ｙ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および９）
ｖｉ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｆ、Ｂ２６Ｇ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および１０）
ｖｉｉ．Ｂ５Ｆ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および１１）
ｖｉｉｉ．Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｋ、ｄｅｓＢ２７−ｄｅｓＢ３０（配列番号１および１２）
ｉｘ．Ｂ５Ｙ、ｄｅｓＢ３０（配列番号１および１３）
ｘ．Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｇ、ｄｅｓＢ３０（配列番号１および１４）
ｘｉ．Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ａ、ｄｅｓＢ３０（配列番号１および１５）
ｘｉｉ．Ｂ５Ｆ、Ｂ２６Ａ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および６）
ｘｉｉｉ．Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ａ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および４）
ｘｉｖ．Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｇ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および５）
ｘｖ．Ｂ５Ｆ、Ｂ２６Ｇ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および１０）
ｘｖｉ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｆ、Ｂ２６Ａ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および６）
ｘｖｉｉ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ａ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および７）
ｘｖｉｉｉ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｇ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および８）
ｘｉｘ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および９）
ｘｘ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｆ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および１１）
ｘｘｉ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｋ、ｄｅｓＢ２７−ｄｅｓＢ３０（配列番号３および１２）
ｘｘｉｉ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、ｄｅｓＢ３０（配列番号３および１３）
ｘｘｉｉｉ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｇ、ｄｅｓＢ３０（配列番号３および１４）
ｘｘｉｖ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ａ、ｄｅｓＢ３０（配列番号３および１５）からなる群から選択される、本発明のインスリンペプチドの新規の骨格の形態の中間生成物、
またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステルにも関する。
【０１７３】
薬学的に許容される塩、アミド、またはエステル
本発明の中間生成物、類似体、および誘導体は、薬学的に許容される塩、アミド、またはエステルの形態であってもよい。
【０１７４】
塩は、例えば、塩基と酸との間の化学反応、例えば、２  ＮＨ３＋Ｈ２ＳＯ４→（ＮＨ４）２ＳＯ４によって形成される。
【０１７５】
塩は塩基性塩、酸性塩であってもよく、またはそれはどちらでもなくてもよい（すなわち、中性塩）。塩基性塩は水中で水酸化イオンを生成し、酸性塩はヒドロニウムイオンを生成する。
【０１７６】
本発明の誘導体の塩は、それぞれアニオン性基またはカチオン性基と反応する追加のカチオンまたはアニオンとともに形成されてもよい。これらの基は、ペプチド部分内、および／または本発明の誘導体の側鎖内に位置することができる。
【０１７７】
本発明の誘導体のアニオン性基の非限定的な例には、存在する場合、側鎖内、およびペプチド部分内の遊離カルボキシル基が含まれる。ペプチド部分は、多くの場合、Ｃ末端に遊離カルボン酸基を含み、それはまた、ＡｓｐおよびＧｌｕなどの内部酸アミノ酸残基における遊離カルボキシル基も含み得る。
【０１７８】
ペプチド部分内のカチオン性基の非限定的な例には、存在する場合、Ｎ末端の遊離アミノ基、ならびにＨｉｓ、Ａｒｇ、およびＬｙｓなどの内部塩基性アミノ酸残基の任意の遊離アミノ基が含まれる。
【０１７９】
本発明の誘導体のエステルは、例えば、遊離カルボン酸基とアルコールまたはフェノールとの反応によって形成されてもよく、これは、アルコキシまたはアリールオキシ基による少なくとも１つのヒドロキシル基の置換をもたらす。
【０１８０】
エステル形成は、ペプチドのＣ末端における遊離カルボキシル基、および／または側鎖内の任意の遊離カルボキシル基に関与し得る。
【０１８１】
本発明の誘導体のアミドは、例えば、活性化形態の遊離カルボン酸基とアミンまたは置換アミンとの反応によって、または遊離もしくは置換アミノ基と活性化形態のカルボン酸との反応によって形成され得る。
【０１８２】
アミド形成は、ペプチドのＣ末端の遊離カルボキシル基、側鎖内の任意の遊離カルボキシル基、ペプチドのＮ末端の遊離アミノ基、ならびに／またはペプチド内および／もしくは側鎖内のペプチドの任意の遊離もしくは置換アミノ基に関与し得る。
【０１８３】
特定の実施形態では、ペプチドまたは誘導体は、薬学的に許容される塩の形態である。別の特定の実施形態では、誘導体は、好ましくはアミド基がペプチドのＣ末端にある、薬学的に許容されるアミドの形態である。依然さらなる特定の実施形態では、ペプチドまたは誘導体は、薬学的に許容されるエステルの形態である。
【０１８４】
安定性
インスリン誘導体の安定性は、三次元構造を維持する能力（物理的安定性）、および構造内で共有結合的変化に耐える能力（化学的安定性）として定義される。有利な安定性は、インスリン誘導体単独の固有の特性によるもの、またはインスリン誘導体とビヒクルに含有される１つ以上の成分との間の有利な相互作用の結果によるものであり得る。
【０１８５】
インスリン誘導体の良好な安定性は、インスリンアスパルトに相当するか、またはそれよりも良好な安定性として定義される。
【０１８６】
一態様では、本発明は、製剤中で良好な安定性を有するインスリン誘導体を提供する。
【０１８７】
一態様では、本発明は、製剤中で改善された安定性を有するインスリン誘導体を提供する。
【０１８８】
本発明者らは、本発明によるインスリン誘導体が、製剤中で良好な安定性を有することを見出した。本発明者らは、驚くべきことに、本発明によるヒトインスリン誘導体が、良好な安定性を有し、インスリン受容体の部分的活性化も保持することを見出した。
【０１８９】
安定性は、従来の方法および当業者に既知の様々な標準的方法によって決定することができる。
【０１９０】
インスリン誘導体は、例えば、亜鉛およびフェノールを含む製剤中での安定性についてスクリーニングすることができる。一実施形態では、この目的は、保管中または温度上昇時に変化しない単一のインスリン自己会合状態（例えば、六量体状態）を含む製剤を得ることである。
【０１９１】
安定性を測定する方法の一例は、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）であり、これは、典型的にはアンフォールディングの開始温度（Ｔ開始）の評価によって、またはより頻繁にはインスリン誘導体自己会合時の熱アンフォールディングの中間点（Ｔｍ）によって、タンパク質安定性を評価するための一般的方法である。インスリンの（ＤＳＣによる）熱アンフォールディングが、いかに亜鉛−六量体の安定性に相関するか、およびそれをもって、いかにインスリンの製剤安定性に相関するかは、文献（Ｈｕｕｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００５）４４，１１１７１−１１１７７）に記載されている（Ｈｕｕｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ（２００６）２３（１１），２６１１−２０）。低い開始温度は、インスリン解離と見なされる可能性がある一方で、より高い開始温度は、アンフォールディング温度まで安定したインスリン誘導体複合体を示す。良好な安定性は、薬学的製剤に類似した条件で、インスリンアスパルト（Ｂ２８Ｄヒトインスリン）のおよそのＴ開始およびＴｍまたはそれを超える、Ｔ開始およびＴｍで得られる。
【０１９２】
そのような方法の別の例は、フェノールを添加し、イオン強度を低く保って、製剤条件に類似した溶離液を使用する、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によるインスリン自己会合の評価である。広範囲のピークおよび尾を引くピークは、クロマトグラフィー中に変化するいくつかの自己会合状態の兆候である一方で、単一の鋭いピークは、安定した自己会合状態を示す。
【０１９３】
一実施形態では、本発明によるインスリン誘導体は、インスリンアスパルトと比較して、良好な化学的および／または物理的安定性を有する。
【０１９４】
別の実施形態では、本発明によるインスリン誘導体は、Ｂ５ＹまたはＢ５Ｆ変異を有しない対応するインスリン誘導体と比較して、良好な化学的および／または物理的安定性を有する。
【０１９５】
別段本明細書に示されない限り、単数形で提示される用語はまた、複数の状況も含む。
【０１９６】
インビトロ生物学
インスリン結合および受容体活性化／リン酸化
インスリン受容体の活性化は、受容体の活性化、すなわち、受容体上のいくつかの残基のリン酸化をもたらし、この活性化が、血漿グルコース濃度を低下に寄与する細胞プロセス、脂質代謝を調節する細胞プロセス、ならびに細胞成長および増殖を促進する細胞プロセスを含む、細胞応答のカスケードをもたらす。
【０１９７】
本発明のインスリン誘導体は、インスリン受容体からヒトインスリンを完全に置換することができるが、それらは実際には、インスリン受容体の準最大のリン酸化を誘発する。したがって、本発明のインスリン誘導体は、インスリン受容体リン酸化に関して部分アゴニストと見なすことができ、それらは、「部分インスリン誘導体」と称され得る。
【０１９８】
本発明の文脈では、「部分インスリン誘導体」は、インスリン受容体リン酸化を誘発するが、得られる最大応答、すなわち、最大インスリン受容体リン酸化レベルがヒトインスリンによって誘発される最大応答未満である、すなわち、ヒトインスリンによって誘発される最大応答の６５％未満である、インスリン類似体として定義される。
【０１９９】
準最大の応答または準最大の効果は、ヒトインスリンによって誘発される最大応答よりも低い、本発明の部分インスリン誘導体によって誘発される最大応答として定義することができる。インスリン誘導体が準最大の効果を有するかどうかを決定するためには、該誘導体の最大応答をアッセイで決定し、ヒトインスリンの最大応答と比較しなくてはならない。インスリン誘導体の最大応答は、増加する量のインスリン誘導体の存在下での応答を測定して、用量応答曲線を得ることによって決定することができる。最大応答（最上部）は、用量応答曲線から計算し、ヒトインスリンによって誘発される最大応答と比較することができる。
【０２００】
インスリン結合および受容体リン酸化は、従来の方法および当業者に既知の様々な標準的アッセイによって決定することができる。インビトロ決定のためのそのような標準的アッセイには、インスリン誘導体の相対的親和性が、例えば、細胞全体上、細胞膜画分上、または精製された受容体上のインスリン受容体に特異的に結合した標識化１２５Ｉ−インスリンの５０％を置換するのに必要とされるインスリン対インスリン誘導体の比率として定義される、動脈内インスリン放射受容体アッセイ、およびインスリン誘導体がインスリン受容体を活性化する能力が、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）またはウェスタンブロット技術を使用して、例えば、インスリン受容体上のチロシン残基のリン酸化を測定することによって決定される、インスリン受容体リン酸化アッセイが含まれる。
【０２０１】
一実施形態では、本発明のインスリン誘導体は、ヒトインスリンと比較した場合、およそ６５％またはそれ未満のインスリン受容体の準最大のリン酸化を誘発する。
【０２０２】
一実施形態では、本発明のインスリン誘導体は、ヒトインスリンと比較した場合、およそ６０％またはそれ未満のインスリン受容体の準最大のリン酸化を誘発する。
【０２０３】
一実施形態では、本発明のインスリン誘導体は、ヒトインスリンと比較した場合、およそ５０％またはそれ未満のインスリン受容体の準最大のリン酸化を誘発する。
【０２０４】
一実施形態では、本発明のインスリン誘導体は、ヒトインスリンと比較した場合、およそ４０％またはそれ未満のインスリン受容体の準最大のリン酸化を誘発する。
【０２０５】
一実施形態では、本発明のインスリン誘導体は、ヒトインスリンと比較した場合、およそ３０％またはそれ未満のインスリン受容体の準最大のリン酸化を誘発する。
【０２０６】
一実施形態では、本発明のインスリン誘導体は、ヒトインスリンと比較した場合、およそ２０％またはそれ未満のインスリン受容体の準最大のリン酸化を誘発する。
【０２０７】
一実施形態では、本発明のインスリン誘導体は、ヒトインスリンと比較した場合、およそ１５％またはそれ未満のインスリン受容体の準最大のリン酸化を誘発する。
【０２０８】
一実施形態では、本発明のインスリン誘導体は、ヒトインスリンと比較した場合、およそ１２％またはそれ未満のインスリン受容体の準最大のリン酸化を誘発する。
【０２０９】
一実施形態では、本発明のインスリン誘導体は、ヒトインスリンと比較した場合、およそ１％またはそれを超えるインスリン受容体のリン酸化を誘発する。
【０２１０】
一実施形態では、本発明のインスリン誘導体は、インスリン受容体のリン酸化を誘発することができる。
【０２１１】
インスリン受容体シグナリング
インスリン受容体の活性化は、ＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ）としても知られる細胞外調節キナーゼ（ＥＲＫ）、およびタンパク質キナーゼＢ（ＰＫＢ）としても知られるＡＫＴを含む、様々な細胞内タンパク質上の残基のリン酸化、および様々な細胞内タンパク質の活性化などの細胞内応答のカスケードを開始する。ＡＫＴの活性化は、血糖濃度の低下に寄与する細胞プロセスの誘発にとって重要である一方で、ＥＲＫの活性化は、細胞成長および成長する細胞の増殖の促進に寄与する細胞プロセスの誘発にとって重要である。
【０２１２】
ＡＫＴシグナリング経路は、グルコース低下経路にとって重要なシグナル伝導経路の一例である一方で、ＡＫＴは、重要なタンパク質である。２型糖尿病を有する人々では、ＡＫＴシグナリング経路の活性化が大幅に障害されており、これが、例えば、骨格筋および脂肪組織へのグルコース取り込みの減少をもたらす。しかしながら、ＥＲＫシグナリング経路は、依然としてインスリンに対して反応性であり、治療中に過剰刺激され得る非抵抗性経路の一例である。インスリンによるＥＲＫ経路の活性化はまた、ＶＳＭＣの遊走および増殖ならびにコラーゲン合成も促進し、これらは、アテローム硬化性の病変の進行にとって重要なステップである。好ましい実施形態では、本発明のインスリン誘導体は、ＥＲＫシグナリング経路に対する準最大の効果を誘発する。
【０２１３】
インスリン活性化シグナリング、例えば、インビトロでＥＲＫおよびＡＫＴなどのシグナリング分子をリン酸化する能力を測定するためのアッセイは、当業者に既知であり、それらには、動脈内ウェスタンブロット技術、Ｓｕｒｅｆｉｒｅ、および／またはＥＬＩＳＡ技術が含まれる。
【０２１４】
本発明のインスリン誘導体は、ヒトインスリンの効果と比較した場合、ＡＫＴ活性化（リン酸化）に対してよりもＥＲＫ活性化（リン酸化）に対して低い準最大の効果を有する。
【０２１５】
驚くべきことに、我々は、試験化合物が誘発することができる最大インスリン受容体リン酸化（すなわち、インスリン受容体の局部性の程度）と、それが非抵抗性経路を過剰刺激することなくグルコース低下経路を活性化する能力との間には、相関性が存在することを見出した。例えば、本発明の化合物は、ヒトインスリンと比較した場合、ＡＫＴ活性化（リン酸化）に対してよりもＥＲＫ活性化（リン酸化）に対して低い準最大の効果を有し、それらは、血糖値を低減することができるが、例えば、脂質代謝に関連するプロセスに対する改善された効果（より少ない体重増加、より少ない体脂肪量増加、および肝ＴＧ低下の増加、ならびに／または内皮機能の改善など）を有する。
【０２１６】
局部性は、試験化合物の最大インスリン受容体リン酸化／ヒトインスリンの最大インスリン受容体リン酸化の比率が１未満であるものとして定義される。
【０２１７】
一実施形態では、本発明は、インスリン受容体局部性を測定するための方法であって、以下、
ａ）試験化合物によって誘発される最大インスリン受容体リン酸化を測定するステップと、
ｂ）ヒトインスリンによって誘発される最大インスリン受容体リン酸化を測定するステップとを含み、
ａ）／ｂ）の比率が、１未満である、を含む、方法に関する。
【０２１８】
一実施形態では、該インスリン受容体の局部性は、０．６５未満である。
【０２１９】
一実施形態では、該インスリン受容体の局部性は、０．６未満である。
【０２２０】
一実施形態では、該インスリン受容体の局部性は、０．５未満である。
【０２２１】
一実施形態では、該インスリン受容体の局部性は、０．４未満である。
【０２２２】
一実施形態では、該インスリン受容体の局部性は、０．３未満である。
【０２２３】
一実施形態では、該インスリン受容体の局部性は、０．２未満である。
【０２２４】
一実施形態では、該インスリン受容体の局部性は、０．１５未満である。
【０２２５】
一実施形態では、該インスリン受容体の局部性は、０．１２未満である。
【０２２６】
選択性は、試験化合物が非抵抗性経路を過剰刺激することなくグルコース低下経路を活性化する能力として定義され、この比率は、１未満である。
【０２２７】
一実施形態では、本発明は、選択性を測定するための方法に関し、この方法は、ヒトインスリンと比較した、グルコース低下経路および非抵抗性経路の最大リン酸化を独立して測定することと、グルコース低下経路／非抵抗性経路の間の比率が１未満であるかどうかを決定することとを含む。
【０２２８】
一実施形態では、本発明は、選択性を測定するための方法に関し、この方法は、ヒトインスリンと比較した、ＥＲＫおよびＡＫＴの最大リン酸化を独立して測定することと、ＥＲＫ／ＡＫＴの間の比率が１未満であるかどうかを決定することとを含む。
【０２２９】
一実施形態では、該比率は、０．８未満である。
【０２３０】
一実施形態では、該比率は、０．７未満である。
【０２３１】
一実施形態では、該比率は、０．６未満である。
【０２３２】
一実施形態では、該比率は、０．５未満である。
【０２３３】
一実施形態では、該比率は、０．４未満である。
【０２３４】
脂質代謝／非抵抗性経路
本発明のインスリン誘導体は、ヒトインスリンと比較した場合、非抵抗性経路を過剰刺激することなく血糖値を低下させることができ、例えば、脂質代謝経路に対する準最大の効果を示す。
【０２３５】
上述のように、インスリン受容体を介してインスリンによって開始されるシグナリングカスケードは、脂質代謝経路に対する効果を含む広範囲の細胞効果をもたらす。本明細書で定義されるように、「脂質代謝経路」という用語は、インスリンによって誘発または阻害される生物学的作用を網羅し、この作用は、例えば、肝臓内のトリグリセリドの合成に影響を与える。非抵抗性経路の一例は、ＥＲＫシグナリング経路である。
【０２３６】
好ましい実施形態では、本発明のインスリン誘導体は、ヒトインスリンの効果と比較して、初代肝細胞内での新規脂質合成（ＤＮＬ）に関連する代謝経路に対する準最大の効果を誘発する。肝臓内での脂肪酸合成に対する効果を測定するための標準的アッセイは、当業者に既知であり、それらには、初代肝細胞内での有機抽出可能材料（すなわち、脂質）への１４Ｃ標識化酢酸塩の変換を測定することによる、新規脂質生成に対する効果を動脈内決定することが含まれる。
【０２３７】
インスリン受容体を介してインスリンによって開始されるシグナリングカスケードは、脂質代謝の調節に必要な酵素の誘発をもたらす。そのような酵素の例は、脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）である。ＦＡＳは、脂質合成を調節するように機能する細胞プロセスにおける重要な酵素である。
【０２３８】
本発明のインスリン誘導体はまた、ヒトインスリンと比較した場合、脂質合成に関与する因子をコードするｍＲＮＡ、例えば、初代肝細胞内では本発明のインスリン誘導体によって準最大にしか誘発されないＦＡＳに対する、準最大の効果も有する。
【０２３９】
インスリンならびにその類似体および誘導体が、脂質代謝経路に関与する遺伝子のｍＲＮＡ発現を誘発または阻害する能力を測定するための標準的アッセイは、当業者に既知であり、それらには、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用してｍＲＮＡ発現を動脈内測定することが含まれる。
【０２４０】
グルコース低下経路
本発明のインスリン誘導体は、脂質代謝などの非抵抗性経路に関連する経路に対してより低い準最大の効果を呈する一方で、それらは、グルコース低下経路に対してヒトインスリンと同じ最大応答を誘発することができる。
【０２４１】
本発明の文脈では、「グルコース低下経路」という用語は、インスリンが解糖およびグリコーゲン生成を促進する酵素を活性化し、糖新生に関与する酵素を抑制する（脂肪細胞内での脂質へのグルコース組み込みの促進、および例えば、筋肉内でのグルコース取り込みの増加など）場合の、血漿グルコース濃度の低下を引き起こす、インスリンによって誘発される生物学的作用（肝臓内でのグルコース貯蔵の促進など）を網羅する。
【０２４２】
上述のように、インスリン受容体を介してインスリンによって開始されるシグナリングカスケードは、グルコース低下経路に対する効果を含む広範囲の細胞効果をもたらす。血漿グルコース濃度を低下させるように機能するインスリン刺激細胞プロセスの例は、筋肉、脂肪、およびいくつかの他の組織へのグルコースの進入を促進すること、ならびにグリコーゲンの形態でグルコースを貯蔵するように肝臓を刺激することである。ＡＫＴシグナリング経路は、グルコース低下経路にとって重要なシグナル伝導経路の一例である一方で、ＡＫＴは、重要なタンパク質である。
【０２４３】
グルコース低下経路に対するヒトインスリンまたはその類似体および誘導体の効果を測定するためのインビトロアッセイは、既知であり、それらには、グリコーゲン蓄積を測定することによってグリコーゲン合成を決定することができる、単離されたラット肝細胞による動脈内アッセイ、および有機抽出可能材料（すなわち、脂質）に変換された［３−３Ｈ］グルコースの量を測定する、例えば、ラット脂肪細胞によって実行される、脂質生成アッセイが含まれる。
【０２４４】
インスリン受容体を介してインスリンによって開始されるシグナリングカスケードはまた、グルコース低下経路の調節に必要な酵素および転写因子の活性化および／または誘発ももたらす。そのような酵素の一例は、グルコース−６−ホスファターゼ（Ｇ６Ｐｃ）である。Ｇ６Ｐｃは、ピルビン酸塩、乳酸塩、グリセロール、グルコース生成アミノ酸、および奇数鎖脂肪酸などの非炭水化物炭素基質からのグルコースの生成をもたらす、糖新生における律速酵素である。
【０２４５】
本発明のインスリン誘導体は、肝細胞内および／または筋肉内でのグリコーゲンの形態のグルコースの刺激貯蔵に対して同じ最大効果を呈する。
【０２４６】
本発明のインスリン誘導体は、初代ラット肝細胞内での糖新生に関与する因子をコードするｍＲＮＡに対してヒトインスリンと同じ最大効果を有する。
【０２４７】
ヒトインスリンおよびその類似体または誘導体が、グルコース低下経路アッセイに関与する遺伝子のｍＲＮＡ発現を誘発または阻害する能力を測定するための標準的アッセイもまた、当業者に既知であり、それらには、すなわち、定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用してｍＲＮＡ発現を測定することが含まれる。
【０２４８】
本発明のインスリン誘導体は、ヒトインスリンの効果と比較した場合、グルコース低下経路に対する完全な（最大）効果（初代細胞、例えば、筋肉、肝細胞、および／または脂肪細胞内での、糖新生に関与する酵素をコードするｍＲＮＡの発現、グリコーゲン合成の刺激、脂質へのグルコース組み込みなど）を呈する。
【０２４９】
インスリン誘導体は、初代ラット脂肪細胞内での脂質へのグルコースの刺激組み込みに対してヒトインスリンと同じ最大応答を呈する。
【０２５０】
インビボ生物学
別の特定の実施形態では、本発明のインスリン誘導体は、インビボで血糖値を低減することができ、脂質代謝に関連するプロセスに対する改善された効果（ヒトインスリンと比較して、より少ない体重増加、より少ない体脂肪量増加、肝トリグリセリド低下の増加、または内皮機能の改善など）を有し、これらは、任意の好適な動物モデルにおいて、および臨床試験において、当該技術分野で既知のように決定することができる。
【０２５１】
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ食事誘発性肥満（ＤＩＯ）マウスは、好適な動物モデルの一例であり、そのようなマウスでは、血糖および／または脂質代謝に関連するプロセスに対する効果（より少ない体重増加、より少ない体脂肪量増加、もしくは肝トリグリセリド低下の増加など）は、例えば、アッセイ（ＩＩ）に記載のように決定することができる。
【０２５２】
血管恒常性を維持し、アテローム動脈硬化症を予防するためには、内皮の構造的および機能的統合性が重要である。内皮機能障害は、血管内皮のいくつかの機能的改変を含み、動脈内皮機能の障害動脈内皮機能の障害は、アテローム動脈硬化症の早期事象であり、循環器疾患の主要なリスク因子に相関する。したがって、これらは、アテローム動脈硬化症および／またはＣＶＤに有益な効果を有するため、内皮機能障害を予防または低減するインスリン誘導体を有することが、主要な利点である。
【０２５３】
一実施形態では、本発明は、血糖値を低減することができ、従来のインスリン療法と比較して、内皮機能に対する改善された効果を有する、例えば、内皮機能障害を予防または低減する、インスリン誘導体を提供する。
【０２５４】
別の実施形態では、本発明は、糖尿病の対象における循環器疾患を予防もしくは低減し、かつ／またはアテローム動脈硬化症の発症を予防もしくは低減する、インスリン誘導体を提供する。
【０２５５】
動脈内皮機能は、例えば、アッセイ（ＩＩ）に記載のように、腸間膜動脈におけるアセチルコリン誘発性血管弛緩に対する効果の測定などの、当業者に既知の方法によって測定することができる。
【０２５６】
肝臓の肝代謝は、糖尿病では著しく調節不全となる。通常、肝臓体積の５％未満が脂肪であるが、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）または非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を有する患者では、肝臓重量の最大５０％〜８０％がほぼトリグリセリドの形態の脂肪からなる可能性があり、例えば、Ｓａｎｙａｌ，Ａ．Ｊ．ｉｎ“ＡＧＡ  ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｎ  ｎｏｎ−ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｆａｔｔｙ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ”，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ２００２；１２３，１７０５−１７２５を参照されたい。
【０２５７】
好ましい実施形態では、本発明は、血糖値を低減することができるが、従来のインスリン療法と比較して、より低い肝トリグリセリド含有量をもたらす、インスリン誘導体を提供する。
【０２５８】
肝トリグリセリド含有量は、例えば、アッセイ（ＩＩ）に記載のように、当業者に既知の方法（アッセイＩＩ）によって測定することができる。
【０２５９】
インスリンペプチドの生成
ポリペプチド、例えば、インスリンの生成は、当技術分野で周知である。インスリンは、例えば、古典的なペプチド合成、例えば、ｔ−ＢｏｃもしくはＦｍｏｃ化学または他の確立した技術を使用する固相ペプチド合成によって生成することができ、例えば、Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｗｕｔｓ，“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９９を参照されたい。インスリンはまた、類似体をコードするＤＮＡ配列を含有し、好適な栄養培地中、インスリンペプチドの発現を許容する条件下で、インスリン類似体を発現することができる宿主細胞を培養することを含む方法によっても生成することができる。ヒトインスリンおよびヒトインスリン類似体の生成では、いくつかの組み換え方法を使用することができる。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの微生物におけるインスリンの生成に使用することができる方法の例は、例えば、ＷＯ２００８／０３４８８１に開示されている。
【０２６０】
典型的には、インスリン類似体は、例えば、ＥＰ１２４６８４５またはＷＯ２００８／０３４８８１に開示される周知の技術によって、当該のインスリン類似体またはその前駆体をコードするＤＮＡ配列を、好適な宿主細胞内で発現させることによって生成される。
【０２６１】
インスリン類似体は、ＥＰ１，２４６，８４５に開示されるように、Ｎ末端伸長部を用いて発現させてもよい。培養培地への分泌および回収後、インスリン前駆体は、可能性のあるＮ末端伸長配列および接続ペプチドを除去して、インスリン類似体をもたらすために、様々なインビトロ手順に供される。そのような方法には、ＵＳ４３４３８９８またはＵＳ４９１６２１２に記載のように、Ｌ−スレオニンエステルの存在下で、トリプシンまたはＡｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｌｙｔｉｃｕｓプロテアーゼによって酵素変換すること、その後、塩基性または酸性加水分解によって、インスリン類似体のスレオニンエステルをインスリン類似体に変換することが含まれる。
【０２６２】
本発明に好適な種類のＮ末端伸長部の例は、ＵＳ５３９５９２２およびＥＰ７６５３９５に開示されている。
【０２６３】
非天然アミノ酸残基を含むインスリン類似体では、非天然アミノ酸が、例えば、ｔＲＮＡ変異体の使用によって類似体に組み込まれるように、組み換え細胞は、修飾されるべきである。故に、簡潔に述べると、本発明によるインスリンペプチドは、既知のインスリン類似体の調製に類似して調製される。
【０２６４】
タンパク質精製
本発明のインスリン誘導体の作製に使用されるインスリン類似体は、細胞培養培地から回収される。本発明のインスリン誘導体の作製に使用されるインスリン類似体は、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、疎水性、等電点電気泳動、およびサイズ排除）、電気泳動手順（例えば、分取等電点電気泳動（ＩＥＦ）、示差溶解度（例えば、硫酸アンモニウム沈殿））、または抽出（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｊ．−Ｃ．Ｊａｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｒｓ  Ｒｙｄｅｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９を参照されたい）を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で既知の様々な手順によって精製することができる。好ましくは、それらは、抗「［インスリン／インスリン類似体／インスリン誘導体］」抗体カラム上で親和性クロマトグラフィーによって精製することができる。高性能液体クロマトグラフィーなどの従来の化学精製手段によって、追加的な精製を達成することができる。クエン酸バリウム沈殿を含む他の精製方法が、当該技術分野で既知であり、本明細書に記載の新規の「［インスリン／インスリン類似体／インスリン誘導体］」の精製に適用することができる（例えば、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｒ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．，１９８２を参照されたい）。
【０２６５】
薬学的製剤
本発明のインスリン誘導体を含有する注射可能な組成物は、医薬品産業の従来の技術を使用して調製することができ、これらの技術は、必要に応じて成分を溶解させ、混合して、所望の最終生成物をもたらすことを伴う。したがって、１つの手順によると、本発明のインスリン誘導体を、調製される組成物の最終体積よりも幾分少ない量の水中に溶解させる。等張剤、保存剤、および緩衝液を、必要に応じて添加し、必要に応じて酸（塩酸など）または塩基（例えば、水酸化ナトリウム水溶液など）を使用して、必要に応じて溶液のｐＨ値を調節する。最後に、溶液の体積を、水で調節して、所望の濃度の成分をもたらす。
【０２６６】
任意で、本発明のインスリン調製物、例えば、溶液または懸濁液は、本発明のインスリン誘導体を、例えば、約２４０〜約６０００ｎｍｏｌ／ｍｌの範囲内の濃度で水性培地中に溶解させることによって調製することができる。例えば、塩化ナトリウム、プロピレングリコール、またはグリセロールを用いて、水性培地を等張性にする。さらに、水性培地は、酢酸塩またはクエン酸塩などの緩衝液、ｍ−クレゾールまたはフェノールおよび亜鉛イオンなどの保存剤を、例えば、最大約１２Ｚｎ／６ｉｎｓの濃度で含有してもよい。潜在的な沈殿を回避するために、本発明の化合物の等電点に近づきすぎることなく、溶液のｐＨ値を、中和に向かって調節する。最終インスリン調製物のｐＨ値は、本発明のどの化合物が使用されるか、亜鉛イオンの濃度、および本発明の化合物の濃度に依存する。例えば、無菌濾過によって、インスリン調製物を無菌にする。
【０２６７】
実施形態
本発明は、以下の非限定的な実施形態によってさらに記載される。
【０２６８】
１．インスリン誘導体であって、Ｂ５ＹもしくはＢ５Ｆと、アシル基を含む置換基とを含む、インスリン誘導体、またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル。
２．該インスリン誘導体が、１つ以上のアミノ酸置換および／または欠失をさらに含む、実施形態１に記載のインスリン類似体。
３．該インスリン誘導体が、最大５個の追加のアミノ酸置換および／または欠失をさらに含む、実施形態１または２のいずれかに記載のインスリン誘導体。
４．該インスリン誘導体が、２、３、または４個のアミノ酸置換をさらに含む、実施形態１〜３のいずれかに記載のインスリン誘導体。
５．０該インスリン誘導体が、Ｂ２６ＧまたはＢ２６Ａをさらに含む、実施形態１〜４のいずれかに記載のインスリン誘導体。
６．０該インスリン誘導体が、Ｂ２６Ｇをさらに含む、実施形態５に記載のインスリン誘導体。
７．０該インスリン誘導体が、Ｂ２６Ａをさらに含む、実施形態５に記載のインスリン誘導体。
８．０該置換基が、以下の式（Ｉ）を有する、実施形態１〜７のいずれか一項に記載のインスリン誘導体。
Ａｃｙ−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３
式中、
Ａｃｙが、アシル基であり、リトコール酸によって表されるか、または以下の式の官能基によって表されるか、
化学式１：−ＣＯ−（ＣＨ２）ｘ−ＣＯＯＨ、もしくは
化学式２：−ＣＯ−（ＣＨ２）ｘ−テトラゾリル、
（式中、ｘが、１２〜２０の範囲内の整数を表し、テトラゾリル基が、１Ｈ−テトラゾル−５−イルである）
または以下の式の脂肪酸によって表され、
化学式３：−ＣＯ−（ＣＨ２）ｘ−ＣＨ３
（式中、ｘが、８〜１６の範囲内の整数を表す）
・Ｌ１が、不在であり、共有結合を表すか、またはＯＥＧ、ｇＧｌｕ、ＤｇＧｌｕ、もしくはスルホンイミドＣ−４を表し、
・Ｌ２が、不在であり、共有結合を表すか、またはＯＥＧ、ｇＧｌｕ、ＤｇＧｌｕ、もしくはスルホンイミドＣ−４を表し、
・Ｌ３が、不在であり、共有結合を表すか、またはＯＥＧ、ｇＧｌｕ、ＤｇＧｌｕ、もしくはスルホンイミドＣ−４を表し、
ｇＧｌｕが、ガンマグルタミン酸残基を表し、ＯＥＧが、［２−（２−アミノエトキシ）エトキシ］アセチルを表す］。
９．該インスリン誘導体が、Ａ１４Ｅをさらに含む、実施形態１〜８のいずれかに記載のインスリン誘導体。
１０．該インスリン誘導体が、Ｂ２８Ｋ、Ｂ２６Ｋ、またはＢ２９Ｋをさらに含む、実施形態１〜９のいずれかに記載のインスリン誘導体。
１１．０該インスリン誘導体が、Ｂ２８Ｋをさらに含む、実施形態１０に記載のインスリン誘導体。
１２．０該インスリン誘導体が、Ｂ２６Ｋをさらに含む、実施形態１０に記載のインスリン誘導体。
１３．０該インスリン誘導体が、Ｂ２９Ｋをさらに含む、実施形態１０に記載のインスリン誘導体。
１４．０該置換基が、Ｂ２６Ｋ、Ｂ２８Ｋ、またはＢ２９Ｋのリジンのエプシロンアミノ基に結合している、実施形態１〜１３のいずれか一項に記載のインスリン誘導体。
１５．該インスリン誘導体が、ｄｅｓＢ３０、ｄｅｓＢ２９−３０、またはｄｅｓＢ２７−３０をさらに含む、実施形態１〜１４のいずれか一項に記載のインスリン誘導体。
１６．０該インスリン誘導体が、ｄｅｓＢ３０をさらに含む、実施形態１５に記載のインスリン誘導体。
１７．０該インスリン誘導体が、ｄｅｓＢ２９−３０をさらに含む、実施形態１５に記載のインスリン誘導体。
１８．０該インスリン誘導体が、ｄｅｓＢ２７−３０をさらに含む、実施形態１５に記載のインスリン誘導体。
１９．該置換が、
ｉ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ａ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および４）
ｉｉ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｇ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および５）
ｉｉｉ．Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ａ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および７）
ｉｖ．Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｇ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および８）
ｖ．Ｂ５Ｙ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および９）
ｖｉ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｆ、Ｂ２６Ｇ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および１０）
ｖｉｉ．Ｂ５Ｆ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および１１）
ｖｉｉｉ．Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｋ、ｄｅｓＢ２７−ｄｅｓＢ３０（配列番号１および１２）
ｉｘ．Ｂ５Ｙ、ｄｅｓＢ３０（配列番号１および１３）
ｘ．Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｇ、ｄｅｓＢ３０（配列番号１および１４）
ｘｉ．Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ａ、ｄｅｓＢ３０（配列番号１および１５）
ｘｉｉ．Ｂ５Ｆ、Ｂ２６Ａ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および６）
ｘｉｉｉ．Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ａ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および４）
ｘｉｖ．Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｇ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および５）
ｘｖ．Ｂ５Ｆ、Ｂ２６Ｇ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および１０）
ｘｖｉ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｆ、Ｂ２６Ａ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および６）
ｘｖｉｉ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ａ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および７）
ｘｖｉｉｉ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｇ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および８）
ｘｉｘ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および９）
ｘｘ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｆ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および１１）
ｘｘｉ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｋ、ｄｅｓＢ２７−ｄｅｓＢ３０（配列番号３および１２）
ｘｘｉｉ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、ｄｅｓＢ３０（配列番号３および１３）
ｘｘｉｉｉ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｇ、ｄｅｓＢ３０（配列番号３および１４）
・Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ａ、ｄｅｓＢ３０（配列番号３および１５）からなる群から選択される、実施形態１〜１８のいずれかに記載のインスリン誘導体。
２０．該アシル基が、リトコール酸であるか、または以下の式の官能基を含むか、
化学式  １：−ＣＯ−（ＣＨ２）ｘ−ＣＯＯＨ、
化学式  ２：−−ＣＯ−（ＣＨ２）ｘ−テトラゾリル、
（式中、ｘが、１２〜２０の範囲内の整数を表し、テトラゾリル基が、１Ｈ−テトラゾル−５−イルである）
または以下の式の脂肪酸である、
化学式３：−ＣＯ−（ＣＨ２）ｘ−ＣＨ３
（式中、ｘが、８〜１６の範囲内の整数を表す）、実施形態１〜１９のいずれかに記載のインスリン誘導体。
２１．０Ａｃｙが、リトコール酸、１，１６−ヘキサデカン二酸、１，１８−オクタデカン二酸、１，２０−エイコサン二酸、テトラゾール−Ｃ１６、テトラゾール−Ｃ１７、テトラゾールＣ１８、およびテトラデカン酸からなる群から選択される、実施形態２０に記載のインスリン誘導体。
２２．０該置換基が、リトコール酸を含む、実施形態２１に記載のインスリン誘導体。
２３．０該アシル基が、１，１６−ヘキサデカン二酸、１，１８−オクタデカン二酸、および１，２０−エイコサン二酸から選択される脂肪二酸基を含む、実施形態２１に記載のインスリン誘導体。
２４．０該少なくとも１つの置換基が、脂肪二酸基１，１６−ヘキサデカン二酸を含む、実施形態２３に記載のインスリン誘導体。
２５．０該少なくとも１つの置換基が、脂肪二酸基１，１８−オクタデカン二酸を含む、実施形態２３に記載のインスリン誘導体。
２６．０該少なくとも１つの置換基が、脂肪二酸基１，２０−エイコサン二酸を含む、実施形態２３に記載のインスリン誘導体。
２７．０該テトラゾール部分が、テトラゾール−Ｃ１６、テトラゾール−Ｃ１７、およびテトラゾールＣ１８からなる群から選択される、実施形態２１に記載のインスリン誘導体。
２８．０該テトラゾール部分が、テトラゾール−Ｃ１６である、実施形態２７に記載のインスリン誘導体。
２９．０該テトラゾール部分が、テトラゾール−Ｃ１７である、実施形態２７に記載のインスリン誘導体。
３０．０該テトラゾール部分が、テトラゾールＣ１８である、実施形態２７に記載のインスリン誘導体。
３１．０該脂肪酸が、テトラデカン酸またはＣ１４である、実施形態２０に記載のインスリン誘導体。
３２．該置換基が、リンカー基を含む、実施形態１〜３１のいずれかに記載のインスリン誘導体。
３３．０該リンカー基が、不在であり、共有結合によって表される、実施形態１〜３１に記載のインスリン誘導体。
３４．０−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３が、ＤｇＧｌｕ、ｇＧｌｕ、ｇＧｌｕ−ｇＧｌｕ、ｇＧｌｕ−ＯＥＧ、ｇＧｌｕ−ＯＥＧ−ＯＥＧ、ＯＥＧ、スルホンイミド−Ｃ４、およびスルホンイミド−Ｃ４−スルホンイミド−Ｃ４から選択される二価リンカー基を表し、ｇＧｌｕが、ガンマグルタミン酸残基を表し、ＯＥＧが、［２−（２−アミノエトキシ）エトキシ］アセチルを表す、実施形態１〜３２のいずれか一項に記載のインスリン誘導体。
３５．０該二価結合基が、ＤｇＧｌｕである、実施形態３４に記載のインスリン誘導体。
３６．０該二価結合基が、ｇＧｌｕである、実施形態３４に記載のインスリン誘導体。
３７．０該二価結合基が、ｇＧｌｕ−ｇＧｌｕである、実施形態３４に記載のインスリン誘導体。
３８．０該二価結合基が、ｇＧｌｕ−ＯＥＧである、実施形態３４に記載のインスリン誘導体。
３９．０該二価結合基が、ｇＧｌｕ−ＯＥＧ−ＯＥＧである、実施形態３４に記載のインスリン誘導体。
４０．０該二価結合基が、ＯＥＧである、実施形態３４に記載のインスリン誘導体。
４１．０該二価結合基が、スルホンイミド−Ｃ４である、実施形態３４に記載のインスリン誘導体。
４２．０該二価結合基が、スルホンイミド−Ｃ４−スルホンイミド−Ｃ４である、実施形態３４に記載のインスリン誘導体。
４３．該置換基が、実施例１〜４６の化合物の置換基であり、以下によって独立して表される、実施形態１〜４２のいずれか一項に記載のインスリン誘導体。
・リトコール酸
・リトコール酸−ｇＧｌｕ
・Ｃ１４
・Ｃ１６二酸
・Ｃ１６二酸−ｇＧｌｕ
・Ｃ１８二酸
・Ｃ１８二酸−ｇＧｌｕ
・Ｃ１８二酸−２ｘｇＧｌｕ
・Ｃ１８二酸−ＤｇＧｌｕ
・Ｃ１８二酸−ｇＧｌｕ−ＯＥＧ
・Ｃ１８二酸−ｇＧｌｕ−２ｘＯＥＧ
・Ｃ１８二酸−ＯＥＧ
・Ｃ１８二酸−スルホンイミド−Ｃ４
・Ｃ２０二酸
・Ｃ２０二酸−ｇＧｌｕ
・Ｃ２０二酸−ｇＧｌｕ−ＯＥＧ
・Ｃ２０二酸−ｇＧｌｕ−２ｘＯＥＧ
・テトラゾール−Ｃ１６
・テトラゾール−Ｃ１６−ｇＧｌｕ−ＯＥＧ
・テトラゾール−Ｃ１６−ｇＧｌｕ−２ｘＯＥＧ
・テトラゾール−Ｃ１６−２ｘスルホンイミド−Ｃ４
・テトラゾール−Ｃ１７
・テトラゾール−Ｃ１７−スルホンイミド−Ｃ４
・テトラゾール−Ｃ１８
・テトラゾール−Ｃ１８−スルホンイミド−Ｃ４
・テトラゾール−Ｃ１８−２ｘスルホンイミド−Ｃ４
４４．該置換基が、実施例１〜４６の化合物からなる群から選択される、実施形態１〜４３のいずれか一項に記載のインスリン誘導体。
４５．実施例１〜３６の化合物からなる群から選択される、実施形態１〜４４のいずれか一項に記載のインスリン誘導体。
４６．実施例１０〜３４の化合物からなる群から選択される、実施形態１〜４５のいずれか一項に記載のインスリン誘導体。
４７．実施例３、４、１２〜１６、１８〜２０、２２、２３、２５、２６、２８〜３０の化合物からなる群から選択される、実施形態１〜４６のいずれか一項に記載のインスリン誘導体。
４８．実施例１４〜１６、１８、２０、および２６の化合物からなる群から選択される、実施形態１〜４７のいずれか一項に記載のインスリン誘導体。
４９．実施例３７〜３９および４６の化合物からなる群から選択される、実施形態１〜４８のいずれか一項に記載のインスリン誘導体。
５０．実施例４０〜４５の化合物からなる群から選択される、実施形態１〜４９のいずれか一項に記載のインスリン誘導体。
５１．実施例１５の化合物、Ｎ｛エプシロン−Ｂ２８｝−［２−［２−［２−［［（４Ｓ）−４−カルボキシ−４−（１７−カルボキシヘプタデカノイルアミノ）ブタノイル］アミノ］エトキシ］エトキシ］アセチル］−［ＧｌｕＡ１４，ＴｙｒＢ５，ＧｌｙＢ２６，ＬｙｓＢ２８］，ｄｅｓ−（Ｂ２９−Ｂ３０）−インスリンによって表される、実施形態１〜５０のいずれか一項に記載のインスリン誘導体。
【化２４】
2020531451.tif 000033
５２．該インスリン誘導体が、ヒトインスリンと比較した場合、およそ６５％またはそれ未満のインスリン受容体の準最大のリン酸化を誘発する、実施形態１〜５１のいずれか一項に記載のインスリン誘導体。
５３．該インスリン誘導体が、ヒトインスリンと比較した場合、およそ６０％またはそれ未満のインスリン受容体の準最大のリン酸化を誘発する、実施形態１〜５２のいずれか一項に記載のインスリン誘導体。
５４．該インスリン誘導体が、ヒトインスリンと比較した場合、およそ５０％またはそれ未満のインスリン受容体の準最大のリン酸化を誘発する、実施形態１〜５３のいずれか一項に記載のインスリン誘導体。
５５．該インスリン誘導体が、ヒトインスリンと比較した場合、およそ４０％またはそれ未満のインスリン受容体の準最大のリン酸化を誘発する、実施形態１〜５３のいずれか一項に記載のインスリン誘導体。
５６．該インスリン誘導体が、ヒトインスリンと比較した場合、およそ３０％またはそれ未満のインスリン受容体の準最大のリン酸化を誘発する、実施形態１〜５３のいずれか一項に記載のインスリン誘導体。
５７．該インスリン誘導体が、ヒトインスリンと比較した場合、およそ２０％またはそれ未満のインスリン受容体の準最大のリン酸化を誘発する、実施形態１〜５３のいずれか一項に記載のインスリン誘導体。
５８．該インスリン誘導体が、ヒトインスリンと比較した場合、およそ１２％またはそれ未満のインスリン受容体の準最大のリン酸化を誘発する、実施形態１〜５７のいずれか一項に記載のインスリン誘導体。
５９．薬物として使用するための、実施形態１〜５８のいずれかに記載のインスリン誘導体。
６０．０治療方法において使用するための、実施形態１〜５８のいずれかに記載のインスリン誘導体。
６１．０循環器疾患の予防または治療において使用するための、実施形態１〜５８のいずれかに記載のインスリン誘導体。
６２．０アテローム動脈硬化症の予防または治療において使用するための、実施形態１〜５８のいずれかに記載のインスリン誘導体。
６３．０内皮機能障害の予防または低減において使用するための、実施形態１〜５８のいずれかに記載のインスリン誘導体。
６４．０脂質パラメータの改善において使用するための、実施形態１〜５８のいずれかに記載のインスリン誘導体。
６５．０肝トリグリセリド含有量の予防または低減において使用するための、実施形態１〜５８のいずれかに記載のインスリン誘導体。
６６．０体重増加の予防または低減において使用するための、実施形態１〜５８のいずれかに記載のインスリン誘導体。
６７．０
・脂質パラメータの改善（脂質異常症の予防および／もしくは治療、総血清脂質の低下、ＨＤＬ−Ｃの増加、ＬＤＬ−Ｃの低下、小型高密度ＬＤＬ−Ｃの低下、ＶＬＤＬ−Ｃの低下、トリグリセリドの低下、コレステロールの低下、リポタンパク質ａ（Ｌｐ（ａ））の血漿レベルの低下、またはアポリポタンパク質Ａ（ａｐｏ（Ａ））の生成の阻害など）、
・循環器疾患（心症候群Ｘ、アテローム動脈硬化症、心筋梗塞、冠動脈心疾患、再灌流傷害、脳卒中、脳虚血、早期心疾患もしくは循環器疾患、左室肥大、冠動脈疾患、高血圧症、本態性高血圧症、急性高血圧性緊急症、心筋症、心不全、運動不耐性、急性および／もしくは慢性心不全、不整脈（ａｒｒｈｙｔｈｍｉａ）、不整脈（ｃａｒｄｉａｃ  ｄｙｓｒｈｙｔｈｍｉａ）、失神（ｓｙｎｃｏｐｙ）、狭心症、心バイパスおよび／もしくはステント再閉塞、間欠性跛行（閉塞性動脈硬化症（ａｔｈｅｒｏｓｃｈｌｅｒｏｓｉｓ  ｏｂｌｉｔｔｅｒｅｎｓ））、拡張障害、ならびに／または収縮不全など）の予防および／もしくは治療、ならびに／または血圧の低減（収縮期血圧の低減など）、循環器疾患の治療の治療において使用するための、実施形態１〜５８のいずれかに記載のインスリン誘導体。
６８．実施形態１〜５８のいずれかに記載の０インスリン誘導体と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、薬学的組成物。
６９．皮下投与のための、実施形態０に記載の薬学的組成物。
７０．糖尿病の治療を必要とする患者における糖尿病の治療のための薬学的組成物であって、実施形態１〜５８のいずれか一項に記載の治療有効量のインスリン誘導体を、薬学的に許容される担体とともに含む、薬学的組成物。０
７１．００薬物として使用するための、実施形態６８〜７０に記載の薬学的組成物。
７２．００および糖尿病および高いリスクの循環器疾患を有する患者の治療において使用するための、実施形態６８〜７０に記載の薬学的組成物。
７３．００および／またはアテローム動脈硬化症の発症を予防または低減する、実施形態６８〜７０に記載の薬学的組成物。
７４．０糖尿病、１型糖尿病、２型糖尿病、耐糖能障害、高血糖症、脂質異常症、肥満、メタボリックシンドローム（メタボリックシンドロームＸ、インスリン抵抗性症候群）、高血圧症、認知障害、アテローム動脈硬化症、心筋梗塞、脳卒中、循環器障害、冠動脈心疾患、脳卒中、炎症性腸症候群、消化不良、低血圧症、または胃潰瘍の治療または予防のための薬物を製造するための、実施形態１〜５８のいずれか一項に記載のインスリン誘導体の使用。
７５．脂質パラメータを改善するための方法であって、薬学的に活性な量の実施形態１〜５８のいずれかに記載のインスリン誘導体を投与するステップを含む、方法。０
７６．脂質パラメータを改善するための方法であって、薬学的に活性な量の実施形態１〜５８のいずれかに記載のインスリン誘導体を投与するステップを含み、脂質パラメータの改善が、脂質異常症の予防および／もしくは治療、総血清脂質の低下、ＨＤＬの増加、ＬＤＬ−Ｃの低下、小型高密度ＬＤＬ−Ｃの低下、ＶＬＤＬ−Ｃの低下、非＿ＨＤＬ−Ｃ、トリグリセリドの低下、コレステロールの低下、リポタンパク質ａ（Ｌｐ（ａ））の血漿レベルの低下、またはアポリポタンパク質Ａ（ａｐｏ（Ａ））の生成の阻害などである、方法。０
７７．０循環器疾患の予防および／または治療のための方法であって、薬学的に活性な量の実施形態１〜５８のいずれかに記載のインスリン誘導体を投与するステップを含む、方法。
７８．糖尿病、１型糖尿病、２型糖尿病、耐糖能障害、高血糖症、脂質異常症、肥満、メタボリックシンドローム（メタボリックシンドロームＸ、インスリン抵抗性症候群）、高血圧症、認知障害、アテローム動脈硬化症、心筋梗塞、脳卒中、循環器障害、冠動脈心疾患、脳卒中、炎症性腸症候群、消化不良、または胃潰瘍の治療または予防のための方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の実施形態１〜５８のいずれか一項に記載のヒトインスリンの誘導体０を、投与することを含む、方法。
７９．中間生成物であって、
ｉ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ａ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および４）
ｉｉ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｇ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および５）
ｉｉｉ．Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ａ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および７）
ｉｖ．Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｇ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および８）
ｖ．Ｂ５Ｙ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および９）
ｖｉ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｆ、Ｂ２６Ｇ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および１０）
ｖｉｉ．Ｂ５Ｆ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および１１）
ｖｉｉｉ．Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｋ、ｄｅｓＢ２７−ｄｅｓＢ３０（配列番号１および１２）
ｉｘ．Ｂ５Ｙ、ｄｅｓＢ３０（配列番号１および１３）
ｘ．Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｇ、ｄｅｓＢ３０（配列番号１および１４）
ｘｉ．Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ａ、ｄｅｓＢ３０（配列番号１および１５）
ｘｉｉ．Ｂ５Ｆ、Ｂ２６Ａ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および６）
ｘｉｉｉ．Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ａ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および４）
ｘｉｖ．Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｇ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および５）
ｘｖ．Ｂ５Ｆ、Ｂ２６Ｇ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および１０）
ｘｖｉ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｆ、Ｂ２６Ａ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および６）
ｘｖｉｉ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ａ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および７）
ｘｖｉｉｉ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｇ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および８）
ｘｉｘ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および９）
ｘｘ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｆ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および１１）
ｘｘｉ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｋ、ｄｅｓＢ２７−ｄｅｓＢ３０（配列番号３および１２）
ｘｘｉｉ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、ｄｅｓＢ３０（配列番号３および１３）
ｘｘｉｉｉ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｇ、ｄｅｓＢ３０（配列番号３および１４）
ｘｘｉｖ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ａ、ｄｅｓＢ３０（配列番号３および１５）からなる群から選択される骨格を含む、中間生成物、またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル。
８０．化合物の選択性を決定するための方法であって、以下、
・ヒトインスリンと比較した、該化合物によって誘発される最大ＡＫＴリン酸化を測定するステップと、
・ヒトインスリンと比較した、該化合物Ａによって誘発される最大ＥＲＫ活性化を測定するステップとを含み、
ＥＲＫ／ＡＫＴ比が、１未満である、方法。
８１．０該化合物が、インスリン化合物である、実施形態８０に記載の方法。
８２．０該インスリン化合物が、実施形態１〜５８に記載の化合物である、実施形態８１に記載の方法０。
【実施例】
【０２６９】
薬理学的方法
アッセイ（Ｉ）インビトロ生物学
インスリン受容体結合
シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）における競合結合（Ｇｌｅｎｄｏｒｆ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２００８  ４７  ４７４３−４７５１によるもの）によって、ヒトインスリン受容体（ＩＲ）に対する本発明のインスリン誘導体の相対結合親和性を決定した。
【０２７０】
簡潔に述べると、ヒトインスリン標準物質およびインスリン誘導体の希釈系列を、９６ウェルプレート内で実行し、その後、ＳＰＡビーズ（抗マウスポリビニルトルエンＳＰＡビーズ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、抗ＩＲマウス抗体８３−７（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入可能）、可溶化ヒトＩＲ−Ａ（ＩＲ−Ａを過剰発現するベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞から精製）、および結合緩衝液中の［１２５Ｉ−ＴｙｒＡ１４］−ヒトインスリンを添加した。インキュベーション後、プレートを遠心分離し、ＴｏｐＣｏｕｎｔ  ＮＸＴ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で計数した。
【０２７１】
ＳＰＡからのデータを、４パラメータのロジスティックモデル（Ｖｏｌｕｎｄ  Ａ；Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ１９７８  ３４  ３５７−３６５）に従って分析し、類似体の結合親和性を、同じプレート内で測定したヒトインスリン標準物質のものに対して計算した。
【０２７２】
本発明の代表的なインスリン誘導体の相対結合親和性を、以下の表１に列挙する。図１は、可溶化ＩＲ−Ａによる競合結合アッセイからの、ヒトインスリンおよび実施例１５の化合物の代表的な受容体結合曲線を示す。
【０２７３】
インスリン受容体リン酸化（ＩＲｐＹ１１５８）
本発明のインスリン誘導体がインスリン受容体（ＩＲ）の活性化に与える効果を、Ｈａｎｓｅｎ  ＢＦ  ｅｔ  ａｌ；ＰＬＯＳ  Ｏｎｅ  Ｍａｙ２０１２  ７ｅ３４２７４によって記載のように、インスリン受容体のインスリンが１１５８位のチロシン残基をリン酸化する能力によって評価した。
【０２７４】
簡潔に述べると、ＣＨＯ−ｈＩＲ細胞（インスリン受容体Ａを過剰発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞）を、増加する濃度のインスリン類似体で３０分間刺激し、氷冷リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、瞬間凍結し、溶解緩衝液中に溶解させた。等量のタンパク質を、ホスホ−ＩＲ−ＥＬＩＳＡウェル（ＩＲｐＹ１１５８）に充填し、製造業者のプロトコル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って、測定したリン酸化を測定した。
【０２７５】
インスリン受容体リン酸化レベルに対する本発明のインスリン誘導体の最大応答を、増加する濃度の該インスリン誘導体の存在下でのインスリン受容体リン酸化レベルを測定して、用量応答曲線を得ることによって決定した。標準的用量応答曲線を、ベースライン応答（最下部）、最大応答（最上部）、傾斜、およびベースラインと最大との中間の応答を引き起こす薬物濃度（ＥＣ５０）の４つのパラメータによって定義した。
【０２７６】
インスリン受容体リン酸化データ用量応答曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．のＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ７を使用して、非線形回帰（４パラメータモデル（Ｙ＝最下部＋（最上部−最下部）／（１＋１０＾（（ＬｏｇＥＣ５０−Ｘ）＊ヒル傾斜）））によって適合させた。推定したパラメータ推定値を使用して、各リガンドの最大％を、（最上部（類似体）−最下部（類似体））＊１００／（最上部（インスリン）−最下部（インスリン））として計算した。
【０２７７】
本発明の代表的なインスリン誘導体の最大％値の計算値を、以下の表１に列挙する。図２は、ＩＲ−Ａを過剰発現するＣＨＯ−ｈＩＲ細胞内でのＩＲｐＹ１１５８リン酸化アッセイからの、ヒトインスリンおよび実施例１５の化合物のそのような用量応答曲線の例を示す。
【０２７８】
したがって、図１および図２から、本発明の代表的な化合物、すなわち、実施例１５の化合物が、いかにインスリン受容体からヒトインスリンを完全に置換することができる（図１）が、インスリン受容体の準最大のリン酸化を誘発するにすぎない（図２）ことを理解することができる。
【０２７９】
インスリン受容体シグナリング
ＡＫＴ経路およびＥＲＫ経路を介した本発明の類似体のインスリン受容体（ＩＲ）シグナリングを、従来のウエスタンブロット技術によって、またはアルファスクリーン技術であるＳｕｒｅｆｉｒｅの使用によってのいずれかで評価した。
【０２８０】
ウエスタンブロット
簡潔に述べると、ＣＨＯ−ｈＩＲ細胞を、増加する濃度のインスリン類似体で１０分間刺激し、氷冷ＰＢＳ中で洗浄し、瞬間凍結し、溶解緩衝液（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）中に溶解させた。等量のタンパク質をゲルに充填し、ニトロセルロース膜にブロットした。リン酸化ＡＫＴおよびＥＲＫをそれぞれ、ホスホ−ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）（細胞シグナリング番号９２７１）抗体およびｐＭＡＰＫ  ４４／４２  ＥＲＫ１／２ウサギ（細胞シグナリング番号４３７６）抗体を使用して視覚化した。バンド強度を、ＬＡＳ３０００（Ｆｕｊｉ）を使用して評価した。
【０２８１】
Ｓｕｒｅｆｉｒｅ
細胞を９６ウェル組織培養プレートに蒔き、３７℃で１０分間、インスリンまたはインスリン誘導体で刺激した次の日に、製造プロトコル（ＡＫＴ１／２／３（ｐ−Ｓｅｒ４７３）カタログ番号ＴＧＲＡ４Ｓ１０ＫおよびＥＲＫ１／２ｐ−Ｔ２０２／Ｙ２０４カタログ番号ＴＧＲＥＳＢ１０Ｋ）に従って分析した。
【０２８２】
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＩｎｃのＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ７における非線形回帰を使用して、各類似体の応答性値（Ｓｐａｎ）を計算し、インスリンの応答性のパーセント（最大ＡＫＴ％または最大ＥＲＫ％）として表した。
【０２８３】
図３および４は、ＩＲ−Ａを過剰発現するＣＨＯ−ｈＩＲ細胞内でのＡＫＴリン酸化アッセイおよびＥＲＫリン酸化アッセイからのヒトインスリンおよび実施例１５の化合物の代表的な用量応答曲線を示し、本発明の代表的な化合物、すなわち、実施例１５の化合物が、ヒトインスリンと比較して、いかにＡＫＴよりも低いＥＲＫの準最大の活性化を誘発するかを示す。本発明の代表的なインスリン類似体および基準インスリン誘導体の計算値（最大ＥＲＫ％／最大ＡＫＴ％）を、表１に列挙する。
【０２８４】
表１に与えられる結果は、ヒトインスリンによって誘発される最大応答の６５％未満のインスリン受容体リン酸化を誘発するインスリン誘導体のみが、ヒトインスリンの効果と比較した場合、ＡＫＴ活性化（リン酸化）に対するよりも低いＥＲＫ活性化（リン酸化）に対する準最大の効果を有することを示す。
【０２８５】
ラット遊離脂肪細胞アッセイにおける効力（脂質生成）
本発明のインスリン誘導体の代謝効力を、単離したラット脂肪細胞を使用して脂質生成によって決定した。このアッセイを、ほぼＭｏｏｄｙ  ＡＪ  ｅｔ  ａｌ；Ｈｏｒｍ  Ｍｅｔａｂ  Ｒｅｓ１９７４  ６  １２−１６（このアッセイの修正バージョンは、Ｒｏｄｂｅｌｌ  Ｍ；Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ１９６４  ２３９  ３７５−３８０に記載）によって記載のように実行した。
【０２８６】
簡潔に述べると、精巣上体脂肪パッドを、殺傷したスプラーグドーリーラットから除去し、コラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）を有する分解緩衝液中に置いて、脂肪パッドを単一細胞懸濁液に分解させた。細胞懸濁液を、ＰＢＳで洗浄し、細胞を、０．１％または１％のＨＳＡ（Ａ−１８８７、Ｓｉｇｍａ）およびＨＥＰＥＳを補充したクレブス緩衝液中に再懸濁した。細胞懸濁液アリコートを、Ｄ−［３−３Ｈ］グルコース（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）および増加する濃度のヒトインスリン標準物質またはインスリン誘導体を含有するグルコース溶液とともにインキュベートした。ＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ−Ｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）の添加によってインキュベーションを停止し、プレートをＴｏｐＣｏｕｎｔ  ＮＸＴ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で計数した。
【０２８７】
このデータを、４パラメータのロジスティックモデル（Ｖｏｌｕｎｄ  Ａ；Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ１９７８  ３４  ３５７−３６５）に従って分析し、類似体の代謝効力を、同じプレート内で測定したヒトインスリン標準物質のものに対して計算した。
【０２８８】
本発明の代表的なインスリン誘導体の代謝効力を、以下の表１に列挙する。図５は、本発明の代表的な化合物、すなわち、実施例１５の化合物が、初代ラット脂肪細胞内での脂質生成の刺激に対してヒトインスリンと同じ最大効果を有することを示す。
【０２８９】
ラット肝細胞の単離
ラット肝細胞を、Ｂｅｒｒｙ  Ｍ  Ｎ  ａｎｄ  Ｆｒｉｅｎｄ  Ｄ  Ｓ；Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ１９６９  ４３  ５０６−５２０の修正バージョンを使用してコラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ）による肝臓の逆行性灌流によって、雄のスプラーグドーリーラットから単離した。
【０２９０】
肝細胞を、ヒトインスリン、デキサメタゾン、および胎児仔ウシ血清（Ｇｉｂｃｏ）を補充した培地１９９（Ｇｉｂｃｏ）中で洗浄し、コラーゲンでコーティングしたプレート（ＢＤ  ＢｉｏＣｏａｔ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上に播種し、１〜４時間結合させた。
【０２９１】
初代ラット肝細胞内でのグリコーゲン合成の刺激
本発明のインスリン類似体がグリコーゲン蓄積の刺激に与える効果を、Ｍ．Ｋｉｌｃｏｙｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４１６（２０１１）１８−２６から適応させたＰＡＳ（過ヨウ素酸−シッフ）アッセイと称される特異的かつ単純な酵素法を使用して、初代肝細胞（上記の単離手順を参照されたい）内で決定した。この方法は、マイクロタイタープレート比色アッセイ用のＰＡＳ試薬染色の適応である。初代ラット肝細胞を、様々なヒトインスリンまたはインスリン誘導体濃度を有する９６ウェルプレート内で１８〜２４時間培養した。細胞グリコーゲン含有量を決定するために、肝細胞を、室温、振盪機内で１％のＴｒｉｔｏｎ中に３０分間溶解させた。過ヨウ素酸溶液（ＭＱ水中０．１％の過ヨウ素酸＋７％の酢酸）（過ヨウ素３９５１、Ｓｉｇｍａ社）を、各ウェルに添加し、振盪機内で１分間混合した。その後、プレートを、３７℃で９０分間インキュベートして、グルコースのヒドロキシル基をアルデヒドに酸化させた。シッフ溶液を添加し、プレートを光から保護し、５分間振盪してから、それらを室温で２５分間放置した。その後、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ分光光度計を使用して、５５０ｎｍでの吸光度を測定した。データを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ７で分析し、インスリン類似体の相対代謝効力を、ヒトインスリンのＥＣ５０推定値とインスリン類似体のＥＣ５０推定値との比率として計算した。
【０２９２】
肝細胞内でのグリコーゲン蓄積に対する本発明の代表的なインスリン誘導体の効力を、以下の表１に列挙する。図６、本発明の代表的な化合物、すなわち、実施例１５の化合物は、初代ラット肝細胞内でのグリコーゲン蓄積の刺激に対してヒトインスリンと同じ最大効果を有する。
【０２９３】
遺伝子発現
本発明のインスリン誘導体が遺伝子発現に与える効果を、初代ラット肝細胞から単離（上記の単離手順を参照されたい）したｃＤＮＡに対する定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって決定した。
【０２９４】
単離の１日後、肝細胞を、１μＭのデキサメタゾンおよび０．１％のＨＳＡ（Ａ−１８８７、Ｓｉｇｍａ）を補充したアッセイ培地１９９（Ｇｉｂｃｏ）中、グルカゴンで２時間処理した。プレインキュベーション後、細胞を、アッセイ培地中のヒトインスリンまたはインスリン誘導体で１６時間処理し、２、４、および６時間後に新鮮な培地に交換した。
【０２９５】
ＲＮＡを抽出し、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、肝細胞から精製した。ｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して、ＲＮＡからｃＤＮＡを生成した。ＴａｇＭａｎ  Ｆａｓｔ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘおよび要求に応じてプライマー／プローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ、Ｐｐｉｂ番号Ｒｎ０３３０２２７４＿ｍ１  ｒＦＡＳ番号Ｒｎ００５６５３４７＿ｍ１、ｒＧ６Ｐｃ番号Ｒｎ００５６５３４７＿ｍ１）を使用して、遺伝子発現を決定した。遺伝子発現を、Ｐｐｉｐ（ｃｙｃＢ、シクロフィリンｂ）の発現に対して正規化し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＩｎｃのＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ７を使用して、Ｓ字形の用量応答曲線に適合させた。
【０２９６】
図７および８は、初代ラット肝細胞から単離したｃＤＮＡに対して実行したｆａｓｎおよびｇ６ｐｃの定量的ＲＴ−ＰＣＲアッセイからの、ヒトインスリンおよび実施例１５の化合物の代表的な用量応答曲線を示す。図７に与えられる結果は、本発明の代表的な化合物、すなわち、実施例１５の化合物が、ヒトインスリンと比較した場合、いかにＦＡＳ  ｍＲＮＡの準最大の誘発を誘発するかを示す。
【０２９７】
図８は、本発明の代表的な化合物、すなわち、実施例１５の化合物が、初代ラット肝細胞内で、ヒトインスリンと同じレベルまでＧ６Ｐｃ  ＲＮＡの発現を阻害することを示す。
【０２９８】
新規脂質生成
本発明のインスリン誘導体が脂質の新規合成（ＤＮＬ）に与える効果を、標識化酢酸塩を使用して、初代肝細胞（上記の単離手順を参照されたい）内で決定した（上記の遮断手順を参照）。
【０２９９】
単離の１日後、肝細胞を、グルコース（Ｓｉｇｍａ）およびヒトインスリンまたはインスリン誘導体を補充したアッセイ培地（培地１９９（Ｇｉｂｃｏ）、ＨＳＡ（Ｓｉｇｍａ））中で２４時間プレインキュベートした。プレインキュベーション後、肝細胞を、ヒトインスリンまたはインスリン誘導体および１４Ｃ標識化酢酸塩（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を有するアッセイ培地中で２４時間処置した。インキュベーション後、細胞を、ＰＢＳ中で洗浄し、ＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ−Ｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で溶解させた。
【０３００】
脂質への放射性酢酸塩の組み込み（ＤＮＬ）を、ＴｏｐＣｏｕｎｔ  ＮＸＴ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して決定し、結果を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＩｎｃのＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ７を使用して、Ｓ字形の用量応答曲線に適合させた。
【０３０１】
図９は、初代ラット肝細胞内での新規脂質生成アッセイからの、ヒトインスリンおよび実施例１５の化合物の代表的な用量応答曲線を示し、本発明の代表的な化合物、すなわち、実施例１５の化合物が、いかに初代ラット肝細胞内での新規脂質生成に対する準最大の応答を呈するかを示す。
【表２−１】
2020531451.tif 000034
【表２−２】
2020531451.tif 000035
【表３】
2020531451.tif 000036
【０３０２】
アッセイ（ＩＩ）糖尿病のマウスを用いた亜慢性インビボ研究
動物および化合物
Ｄ１２４９２高脂肪固形飼料の研究食事をする、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙからの１２週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊ食事誘発性肥満（ＤＩＯ）マウスを、施設内で２週間慣らし、その後、短時間イソフルランガス麻酔下、１５０ｍｇ／ｋｇのストレプトゾトシン（ＳＴＺ）（Ｓｉｇｍａ）の皮下（ｓ．ｃ．）注射によって糖尿病にした。動物に、２週間かけて安定した糖尿病を発症させてから、体重、血糖値、および血中グリコシル化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）レベルの測定に基づいて、治療群に割り当てた。動物は、標準的照明および温度条件下で収容し、常時Ｄ１２４９２の食事および水への自由なアクセスを有した。
【０３０３】
動物を、ビヒクル治療（ｎ＝１６）、または異なる用量のＰＫ対照薬（対照薬番号５）もしくは実施例１５の化合物（１用量群当たりｎ＝２６）のいずれかに割り当てた。
【０３０４】
試験化合物、すなわち、ＰＫ対照薬（対照薬番号５）および実施例１５の化合物を、５ｍＭのリン酸塩、１４０ｍＭの塩化ナトリウム、および７０ｐｐｍのポリソルベート−２０中に製剤化した。
ＰＫ対照薬（対照薬番号５）は、アシル化されているが、非部分的なインスリン誘導体である。
【０３０５】
治療プロトコル
動物を、それらに割り当てた治療を用いて、１日２回の皮下注射で６週間治療した。注射は、毎日７時３０分〜８時３０分および１９時３０分〜２０時３０分の時間枠で、１２時間間隔で与えた。投薬体積は、２ｍＬ／ｋｇであり、注射は、ＮｏｖｏＰｅｎ（登録商標）注射デバイスで投与した。
【０３０６】
研究全体を通して、動物を、体重および血糖値について定期的に測定し、血中ＨｂＡ１ｃレベルおよび体組成を、研究開始時および完了時に測定した。さらに、ＰＫ対照薬（対照薬番号５）および実施例１５の化合物の血漿曝露レベルを、評価した。
【０３０７】
分析方法
全血をＥＢＩＯ緩衝液溶液中に希釈し、その後、ＥＫＦ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｂｉｏｓｅｎ自動分析器で測定することによって、血糖濃度を決定した。
【０３０８】
全血を溶血緩衝液中に希釈し、その後、Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｃｏｂａｓ６０００自動分析器で測定することによって、およびＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＨｂＡ１ｃキットを使用することによって、血中ＨｂＡ１ｃレベルを決定した。
【０３０９】
定量的磁気共鳴（ＥｃｈｏＭＲＩ−１００ＴＭ、Ｅｃｈｏ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって、非麻酔マウスを体脂肪量および除脂肪量について走査することによって、体組成を決定した。
【０３１０】
肝ＴＧ含有量を、安楽死の直後に収集した肝組織の試料中で決定した。肝臓試料の均質化、けん化、および遠心分離後、上清中のＴＧ濃度を、Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｃｏｂａｓ６０００分析器（Ｒｏｃｈｅ）で測定した。その後、ＴＧ含有量を、元の均質化した肝臓試料の質量で除し、１ｍｇの肝組織当たりのμｍｏｌのＴＧとして表した。
【０３１１】
ワイヤ筋運動記録器にマウントした腸間膜動脈におけるＡＣｈ誘発性血管弛緩を使用して、ＨｂＡ１ｃ適合群（ビヒクルｎ＝１２、ＰＫ対照薬（対照薬番号５）ｎ＝１５、および実施例１５の化合物ｎ＝１５）においてエクスビボで内皮機能を評価した。動脈を、フェニレフリンで最大緊張度の７０％まで事前収縮させ、その後、累積的に増加する用量のＡＣｈで刺激した。
【０３１２】
ＰＫ対照薬（対照薬番号５）および実施例１５の化合物の血漿曝露レベルを、院内蛍光酸素チャネリング免疫アッセイ（ＬＯＣＩ）を使用する血漿試料の分析によって決定した。
図１０〜１４は、ビヒクル、ＰＫ対照薬（対照薬番号５）、および本発明の代表的なインスリン類似体（すなわち、実施例１５の化合物）を１日２回皮下に６週間投薬した、糖尿病のＳＴＺ−ＤＩＯマウスにおける亜慢性インビボ研究からの、メセンタイル動脈のＨｂＡ１ｃレベル、体重、体脂肪量、肝ＴＧ、および腸間膜動脈のＡＣｈ刺激血管弛緩の代表的な曲線を示す。
【０３１３】
動物実験は、糖尿病の高脂肪給餌マウスを本発明のインスリン誘導体で治療すると、薬物動態（ＰＫ）対照薬（対照薬番号５）と同様に、血糖値を低下させることができることを示した。ＰＫ対照薬（対照薬番号５）は、インスリン受容体リン酸化に対する部分アゴニストではないが、マウスにおいて本発明の実施例１５の化合物のＰＫプロファイルに類似したＰＫプロファイルを有する、アシル化インスリン類似体である。
【０３１４】
同じレベルの糖血症制御（ＨｂＡ１ｃレベルによって測定）に達するように投薬したＰＫ対照薬（対照薬番号５）に対して、本発明の代表的なインスリン誘導体、すなわち、実施例１５の化合物で、糖尿病の高脂肪給餌マウスを亜慢性治療（６週間）すると、有意により少ない体重増加、より少ない体脂肪量増加、肝トリグリセリド（ＴＧ）低下の増加、およびエクスビボでのアセチルコリン（ＡＣｈ）刺激血管弛緩の改善がもたらされた。
【０３１５】
したがって、本発明は、血糖値を低減することができるが、脂質代謝に関連するプロセスに対する改善された効果（より少ない体重増加、より少ない体脂肪量増加、および肝ＴＧ低下の増加など）、ならびにＰＫ適合対照薬比較して、改善された内皮機能を有する、インスリン誘導体を提供する。
略語一覧
ＡＣｈ−アセチルコリン
ＡＫＴ−タンパク質キナーゼＢ（ＰＫＢ）
ＢＨＫ−ベビーハムスター腎臓
ＣＨＯ−チャイニーズハムスター卵巣
ＣＰＭ−カウント毎分
ＣＶＤ−循環器疾患
ＤＩＯ−食事誘発性肥満
ＤＮＬ−新規脂質生成
ＤＰＭ−壊変毎分
ＥＬＩＳＡ−酵素結合免疫吸着アッセイ
ＥＲＫ−細胞外調節キナーゼ（ＭＡＰＫとしても知られる）
ＦＡＳ−脂肪酸シンターゼ
Ｇ６Ｐｃ−グルコース−６−ホスファターゼ
ＨｂＡ１ｃ−グリコシル化ヘモグロビン
ＨＥＰＥＳ−４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸
ＨＩ−ヒトインスリン
ＨＳＡ−ヒト血清アルブミン
ＩＲ−インスリン受容体
ＩＲ−Ａ−インスリン受容体アイソフォームＡ
ＬＯＣＩ−蛍光酸素チャネリング免疫アッセイ
ＭＡＰＫ−ミトゲン活性化タンパク質キナーゼ（ＥＲＫとしても知られる）
ＮＡＦＬＤ−非アルコール性脂肪性肝疾患
ＰＡＳ−過ヨウ素酸溶液
ＰＢＳ−リン酸緩衝食塩水
ＰＫ−薬物動態
ＰＫＢ−タンパク質キナーゼＢ（ＡＫＴとしても知られる）
Ｐｐｉｐ−シクロフィリンｂ（ｃｙｃＢ）
ＲＴ−ＰＣＲ−リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応
ＳＰＡ−シンチレーション近接アッセイ
ＳＲＥＰＢ１ｃ−ステロール調節エレメント結合転写因子１ｃ
ＳＴＺ−ストレプトゾトシン
ＳＴＺ−ＤＩＯ−ストレプトゾトシンで治療した食事誘発性肥満
ＴＧ−トリグリセリド
安定性
本発明のインスリン誘導体の安定性を、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）およびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して評価した
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によるインスリン誘導体自己会合および安定性の評価
【０３１６】
製剤
インスリン誘導体を、約０．２ｍＭまで溶解させ、水酸化ナトリウムおよび塩酸でｐＨを約７．６に調節した。２．５Ｍの酢酸、４ｍＭのＬ−アルギニン、および２０体積％のアセトニトリルを含有する溶離液を有する、ＳＥＣ  Ｗａｔｅｒｓ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＰＡＫ１２５（２５０＊８ｍｍ）によって、１ｍｌ／分の流量および環境温度で、濃度を決定した。Ｐａｃｅによる吸収係数補正を使用する、ヒトインスリン基準物に対する２８０ｎｍでの検出。
【０３１７】
０．１ｍＭの最終インスリン誘導体濃度に、１６ｍＭのフェノール、７ｍＭのリン酸塩、１０ｍＭのＮａＣｌ、および０．１ｍＭの酢酸亜鉛を添加した。塩酸および水酸化ナトリウムでｐＨを７．４に調節した。
【０３１８】
ＭｉｃｒｏＣａｌ  ＶＰ−Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ＤＳＣ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ）を使用して、データ収集を実行した。全ての走査を、２０℃〜１１０℃、４℃の／分の走査速度で、基準細胞内でビヒクル（インスリン試料と同じであるが、インスリンおよび酢酸亜鉛を有しない組成物）を用いて実行した。機器フィードバックモードを「低」に設定し、データフィルタリング期間を２秒間に設定した。緩衝液間基準走査（前述のビヒクルで実行）を、濃縮正規化およびベースライン作成前に、各試料走査から減算した。インスリン亜鉛複合体は、インスリンに関して六量体以外の会合状態にある可能性があるが、単純化のために、亜鉛安定化インスリン複合体は、六量体と称されることに留意されたい。
【０３１９】
（Ｔ開始）および六量体アンフォールディングピークの中間点（Ｔｍ、六量体）を、異なるインスリン誘導体について比較し、Ｔ開始およびＴｍ、六量体の値を、表２に示す。結果は、Ｂ５Ｔｙｒ変異およびＢ５Ｐｈｅ変異がインスリン亜鉛六量体に対して高度に安定した効果を有することを示す。
【表４−１】
2020531451.tif 000037
【表４−２】
2020531451.tif 000038
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によるインスリン誘導体自己会合の評価
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、インスリン誘導体自己会合を評価する一般的方法である。
【０３２０】
製剤
インスリン類似体を、約２ｍＭまで溶解させ、水酸化ナトリウムおよび塩酸でｐＨを７．６に調節した。２．５Ｍの酢酸、０．０６５％のＬ−アルギニン、および２０体積％のアセトニトリルを含有する溶離液を有する、ＳＥＣ  Ｗａｔｅｒｓ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＰＡＫ１２５（２５０＊８ｍｍ）によって、１ｍｌ／分の流量および環境温度で、濃度を決定した。Ｐａｃｅ  ＣＮ［Ｐａｃｅ  ＣＮ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９５）４，２４１１−２４３３］による吸収係数補正を使用する、ヒトインスリン基準物に対する２８０ｎｍでの検出。
【０３２１】
０．６ｍＭの最終インスリン誘導体濃度に、１．６％のグリセロール、３０ｍＭのフェノール、７ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、および０．３ｍＭの酢酸亜鉛を添加した。ｐＨを、塩酸および水酸化ナトリウムでｐＨ７．６に調節した。
【０３２２】
インスリン誘導体製剤条件をシミュレートするために、溶離液は、１６ｍＭのフェノール、２０ｍＭの塩化ナトリウム、および塩酸によってｐＨ７．３に調節された１０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを含んだ。使用したカラムは、Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡのＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ（登録商標）ＢＥＨ２００（１５０＊４．６ｍｍ、ｄ＝１．７μｍ）であった。流量は０．３ｍＬ／分、注射体積は２０μＬ、紫外線検出は２８６ｎｍであった。カラム温度は、２３℃に維持した。
【０３２３】
図１５〜１９は、ＳＥＣ実験からの代表的なクロマトグラムを示す。様々なピークが広範囲であり、尾を引いており、これは、いくつかの重複する自己会合状態を示すため、図１５は、対照薬化合物、すなわち、対照薬９が、製剤中でいかに不安定であったかを示す。対照的に、クロマトグラムが優勢な単一の鋭いピークを示したため、図１６〜１９に与えられる結果は、本発明の代表的な化合物、すなわち、実施例３、１１、１２、および１５の化合物が、製剤中でいかに安定しているかを示す。
【０３２４】
本発明の特定の特徴を本明細書に例示し、記載している一方で、ここで多くの修正、置換、変更、および均等物が当業者に想起されるであろう。したがって、添付の実施形態が、本発明の真の趣旨の範囲内にある全てのそのような修正および変更を網羅することが意図されることを理解されたい。
【０３２５】
一般的調製方法
以下の実施例および一般的手順は、本明細書および合成スキームにおいて特定される中間化合物および最終生成物に言及する。本発明の化合物の調製について、以下の実施例を使用して詳細に記載しているが、記載の化学反応は、本発明の化合物の調製に対するそれらの一般的適用可能性に関して開示されている。
【０３２６】
時には、本発明の開示された範囲内に含まれる各化合物に対して、反応が記載どおりには適用可能でないこともあり得る。これが生じる化合物は、当業者によって容易に認識されるであろう。これらの場合、当業者に既知の従来の修正によって、すなわち、干渉する基の適切な保護、他の従来の試薬への変更、または反応条件の通例の修正によって、反応を首尾よく実行することができる。
【０３２７】
代替的には、本明細書に開示される他の反応または別の従来の反応が、本発明の対応する化合物の調製に適用されることとなる。全ての調製方法では、全ての出発材料は既知であるか、または既知の出発材料から容易に調製することができる。全ての温度は摂氏温度で明記されており、別段示されない限り、固体に言及する場合の全ての部およびパーセンテージは重量によるものであり、溶媒および溶離液に言及する場合の全ての部は体積によるものである。
【０３２８】
本発明の化合物は、当該技術分野で典型的な以下の手順のうちの１つ以上を用いることによって精製することができる。これらの手順は、個人の嗜好により、必要に応じて、勾配、ｐＨ、塩、濃度、流動、カラムなどに関して修正することができる。不純物プロファイル、当該のインスリンの溶解度などの因子に応じて、これらの修正は、当業者によって容易に認識され、行われ得る。
【０３２９】
（方法１）調製例−骨格発現および精製
骨格発現
インスリンペプチド骨格、すなわち、本発明による使用のための二本鎖非アシル化インスリン類似体は、例えば、ＵＳ６５００６４５に開示されるものなどの周知の技術によって、好適な宿主細胞内で当該のインスリン骨格をコードするＤＮＡ配列を発現させることによって組み換え生成される。インスリンペプチド骨格は、直接発現されるか、またはＢ鎖上および／もしくはＢ鎖とＡ鎖との間の接続ペプチド（Ｃ−ペプチド）上にＮ末端伸長部を有し得る前駆体分子として発現されるかのいずれかである。このＮ末端伸長部およびＣ−ペプチドは、好適なプロテアーゼ、例えば、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｏｒ  ｌｙｔｉｃｕｓプロテアーゼ（ＡＬＰ）またはトリプシンによって、インビトロで切断されており、したがって、それぞれＢ１位およびＡ１位の隣に切断部位を有する。本発明による使用に好適な種類のＮ末端伸長部およびＣ−ペプチドは、例えば、ＵＳ５３９５９２２、ＥＰ７６５３９５、およびＷＯ９８２８４２９Ａ１に開示されている。
【０３３０】
本発明による使用のためのインスリン類似体ペプチド骨格前駆体をコードするポリヌクレオチド配列は、確立された方法、例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ１９８１  ２２  １８５９−１８６９によって記載されるホスホアミダイト法、またはＭａｔｔｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ；ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ１９８４  ３  ８０１−８０５によって記載される方法によって合成的に調製することができる。ホスホアミダイト法によると、オリゴヌクレオチドを、例えば、自動ＤＮＡ合成機内で合成し、精製し、二本鎖化し、連結して、合成ＤＮＡ構築物を形成する。ＤＮＡ構築物を調製する現在好ましい方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるものである。
【０３３１】
組み換え方法は、典型的には選択された微生物内または宿主細胞内で複製することができ、かつ本発明による使用のためのインスリンペプチド骨格前駆体をコードするポリヌクレオチド配列を担持するベクターを使用する。組み換えベクターは、自己複製ベクター、すなわち、染色体外の実体として存在するベクターであってもよく、その複製は、染色体（例えば、プラスミド、染色体外要素、ミニ染色体、または人工染色体）の複製とは独立している。ベクターは、自己複製を確保するための任意の手段を含有してもよい。代替的には、ベクターは、宿主細胞内への導入時にそのゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体（複数可）と一緒に複製されるものであり得る。さらに、単一ベクターもしくはプラスミド、または宿主細胞のゲノム内に導入される総ＤＮＡを合わせて含有する２つ以上のベクターもしくはプラスミド、あるいはトランスポゾンを使用してもよい。ベクターは、直鎖状または閉環状プラスミドであってもよく、好ましくは宿主細胞のゲノム内へのベクターの安定した組み込み、またはゲノムとは独立した細胞内でのベクターの自己複製を許容する要素（複数可）を含有する。
【０３３２】
組み換え発現ベクターは、酵母内で複製することができるものであり得る。酵母内でのベクターの複製を可能にする配列の例は、酵母プラスミド２μｍ複製遺伝子のＲＥＰ１〜３および複製開始点である。
【０３３３】
ベクターは、トランスフォーム細胞の容易な選択を許容する、１つ以上の選択可能マーカーを含有してもよい。選択可能マーカーは、殺生物またはウイルス抵抗性、重金属に対する抵抗性、および栄養要求体への原栄養性などを提供する遺伝子産物である。細菌選択可能マーカーの例は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓもしくはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのｄａｌ遺伝子、またはアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、もしくはテトラサイクリン抵抗性などの抗生物質抵抗性を与えるマーカーである。糸状菌宿主細胞内で使用するための選択可能マーカーには、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、およびｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）が含まれる。酵母宿主細胞に好適なマーカーは、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１、およびＵＲＡ３である。酵母によく適した選択可能マーカーは、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｐｅＴＰＩ遺伝子（Ｒｕｓｓｅｌｌ；Ｇｅｎｅ１９８５  ４０  １２５−１３０）である。
【０３３４】
ベクターでは、ポリヌクレオチド配列は、好適なプロモーター配列に動作可能に接続される。プロモーターは、変異型、切断型、混成型プロモーターを含む、選択される宿主細胞内で転写活性を示す任意の核酸配列であってもよく、宿主細胞に対して相同または異種のいずれかである細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。
【０３３５】
細細菌宿主細胞内の転写を指向するのに好適なプロモーターの例は、Ｅ．ｃｏｌｉｌａｃオペロン、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒアガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓレバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓアルファ−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓマルトジェニック（ｍａｌｔｏｇｅｎｉｃ）アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓアルファ−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）から得られるプロモーターである。糸状菌宿主細胞内の転写を指向するのに好適なプロモーターの例は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ中性アルファ−アミラーゼ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ酸安定性アルファ−アミラーゼの遺伝子から得られるプロモーターである。酵母宿主では、有用なプロモーターは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＭａ１、ＴＰＩ、ＡＤＨ、ＴＤＨ３、またはＰＧＫプロモーターである。
【０３３６】
本発明による使用のためのインスリンペプチド骨格をコードするポリヌクレオチド配列はまた、典型的には好適な転写終結コドンにも動作可能に接続される。酵母では、好適な転写終結コドンは、ＴＰＩ転写終結コドン（Ａｌｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ；Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１９８２  １  ４１９−４３４）である。
【０３３７】
本発明による使用のためのインスリンペプチド骨格をコードするポリヌクレオチド配列と、プロモーターと、転写終結コドンとをそれぞれ組み合わせて、それらを、選択された宿主内での複製に必要な情報を含有する好適なベクター内に挿入するために使用される手順は、当業者に周知である。ベクターは、本発明による使用のためのインスリン骨格をコードするＤＮＡ配列全体を含有するＤＮＡ構築物を最初に調製し、その後、この断片を好適な発現ベクター内に挿入することによって、または個々の要素（シグナルおよびプロペプチド（Ｂ鎖のＮ末端伸長部）、Ｃ−ペプチド、Ａ鎖およびＢ鎖など）のゲノム情報を含有するＤＮＡ断片を連続的に挿入し、その後、連結することのいずれかによって、構築され得ることが理解されるであろう。
【０３３８】
本発明による使用のためのインスリン骨格をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターは、宿主細胞内に導入され、その結果、そのベクターは、染色体組み込み体として、または自己複製する染色体外ベクターとして維持される。「宿主細胞」という用語は、複製中に生じる変異のために親細胞と同一ではない、親細胞の任意の子孫を包含する。宿主細胞は、単細胞微生物（例えば、原核生物）であっても、非単細胞微生物（例えば、真核生物）であってもよい。有用な単細胞は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ細胞、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ細胞を含むがこれらに限定されない、グラム陽性細菌、またはＥ．ｃｏｌｉおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐなどのグラム陰性細菌などの細菌細胞である。真核細胞は、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、または真菌細胞であり得る。
【０３３９】
宿主細胞は、特に酵母細胞であってもよい。酵母生物は、培養時にインスリンペプチド骨格またはその前駆体を培養培地中に分泌する、任意の好適な酵母生物であり得る。好適な酵母生物の例には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｓａｃｃｈｏｒｏｍｙｃｅｓ  ｕｖａｒｕｍ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐ．、Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｃａｃａｏｉ、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｓｐ．、およびＧｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓから選択される株が含まれる。
【０３４０】
酵母細胞の形質転換は、例えば、原形質体形成、その後、既知の方法による形質転換によってもたらされ得る。細胞の培養に使用される培地は、酵母生物の成長に好適な任意の従来の培地であり得る。
【０３４１】
骨格精製
分泌されたインスリンペプチド骨格またはその前駆体は、遠心分離による、濾過による、またはイオン交換マトリックスもしくは逆相吸収マトリックス上へのインスリンペプチド骨格もしくはその前駆体の捕獲による、上清のタンパク質性構成成分の沈殿、または塩（例えば、硫酸アンモニウム）による濾過、その後の様々なクロマトグラフィー手順（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィーなど）による精製による、培地からの酵母細胞の分離を含む、従来の手順によって、培地から回収することができる。
【０３４２】
本発明のインスリンペプチド骨格の精製および消化は、以下のとおり実行される。
【０３４３】
Ｂ鎖のＮ末端伸長部およびＢ鎖とＡ鎖との間の修飾Ｃ−ペプチドを含有し得る、単鎖インスリンペプチド骨格前駆体を精製し、カチオン交換によって酵母培養上清から濃縮した（Ｋｊｅｌｄｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ；Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒ．１９９８  １４  ３０９−３１６）。単鎖インスリンペプチド骨格前駆体は、リジン特異的固定化ＡＬＰ（Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９７  ２０  １２９７８−１２９８３）を用いた消化によって、またはトリプシンを使用して、存在する場合、Ｂ鎖のＮ末端伸長部、およびＣ−ペプチドを切断することによって、二本鎖インスリンペプチド骨格へと成熟される。
【０３４４】
ＡＬＰ消化
インスリンペプチド骨格前駆体を含有するカチオン交換クロマトグラフィーステップからの溶出液を、１５〜２０％のエタノール濃度まで水で希釈する。１５ｍＭの濃度までグルタミン酸ナトリウムを添加し、ＮａＯＨによってｐＨを９．７に調節する。固定化ＡＬＰ（４グラム／Ｌ）を、１：１００（体積：体積）の割合で添加し、室温で一晩穏やかに撹拌しながら消化を進行させることを可能にする。
【０３４５】
消化反応を、Ｃ１８カラムを使用するＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  Ｕｌｔｒａ−Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙシステムで分析ＬＣによって分析し、分子量を、マトリックス補助レーザー脱着イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析（ＭＳ）（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ  Ａｕｔｏｆｌｅｘ  ＩＩ  ＴＯＦ／ＴＯＦ）によって確認する。
【０３４６】
固定化ＡＬＰを、０．２μｍのフィルターを使用する濾過によって除去する。二本鎖インスリンペプチド骨格を、アセトニトリル勾配を使用するＣ１８カラム上で逆相ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ６００システム）によって精製する。所望のインスリンペプチド骨格、すなわち、Ｂ２８Ｋ  ｄｅｓＢ２９−Ｂ３０ヒトインスリンを、凍結乾燥によって回収する。
【０３４７】
トリプシン消化
インスリンペプチド骨格前駆体を含有するカチオン交換クロマトグラフィーステップからの溶出液を、１５〜２０％のエタノール濃度まで水で希釈する。５０ｍＭの濃度までグリシンを添加し、ＮａＯＨによってｐＨを９．０〜９．５に調節する。トリプシンを、１：３００（重量：重量）の割合で添加し、消化を４度で進行させることを可能にする。消化を、消化が完了するまで２０分毎に分析的に監視する。消化を、３：１００（体積：体積）の割合の１Ｍのクエン酸を添加して終結させる。
【０３４８】
消化反応を、Ｃ１８カラムを使用するＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  Ｕｌｔｒａ−Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙシステムで分析ＬＣによって分析し、分子量を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ  Ａｕｔｏｆｌｅｘ  ＩＩ  ＴＯＦ／ＴＯＦ）によって確認する。
【０３４９】
二本鎖インスリンペプチド骨格を、アセトニトリル勾配を使用するＣ１８カラム上で逆相ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ６００システム）によって精製する。所望のインスリンペプチド骨格を、凍結乾燥によって回収する。
【０３５０】
純度を、Ｃ１８カラムを使用するＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  Ｕｌｔｒａ−Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙシステムで分析ＬＣによって決定し、分子量を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって確認する。
【０３５１】
（方法２）調製例−アシル化および精製手順
精製手順
精製方法１
カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ｘＢｒｉｄｇｅ  ＰｒｅｐＣ１８、３０×２５０ｍｍ
流量：２０ｍｌ／分
緩衝液Ａ：水中０．１％のＴＦＡ
緩衝液Ｂ：アセトニトリル中０．１％のＴＦＡ
勾配：４０分間かけて２０〜４５％のＢ、または３０〜４０％のＢ、または２０〜６０％のＢ、または２０〜４０％のＢ、または２５〜５０％のＢ、または２０〜５５％のＢ、または３０〜４５％のＢ
精製方法２
カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、５ｕ、Ｃ１８、１１０Å、３０×２５０ｍｍ
流量：２０ｍｌ／分
緩衝液Ａ：水中０．１％のＴＦＡ
緩衝液Ｂ：アセトニトリル中０．１％のＴＦＡ
勾配：８０分間かけて１０〜６０％のＢ、または９５分間かけて０〜６０％のＢ、または６０分間かけて２５〜５５％のＢ
【０３５２】
アシル化試薬の調製のための一般的手順
単純な二酸：ＮＨＳ活性化一酸を、二酸−モノ−ｔ−ブチルエステルをＮＭＰ中のＴＳＴＵおよびＤＩＰＥＡで活性化することによって調製し、直接使用するか、または二酸−モノ−ＮＨＳエステルを調製し、単離するかのいずれかにした。ｔｅｒｔ−ブチル保護されたアシル化試薬を使用した場合、結果として得られるインスリン誘導体を、ＴＦＡで処理することによって脱保護した。
【０３５３】
ＯＥＧリンカーを有する二酸：試薬を、Ｆｍｏｃ化学を使用するクロロトリチル樹脂上での段階的な固相合成によって作製し、ＨＦＩＰ、ＴＦＡ、ＨＦＩＰ／ＤＣＭ混合物、またはＴＦＡ／ＤＣＭ混合物を用いて樹脂から切断した。
【０３５４】
いくつかのアシル化剤を調製し、単離し、いかなる保護基も有しないＮＨＳ−エステルとして使用した。
【０３５５】
一般的アシル化手順１
１００ｍｇの適切なインスリン類似体を、１．２ｍｌの０．１Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３および０．６ｍｌのＮＭＰ中に溶解させ、ｐＨを１０．７±０．３に調節した。必要に応じて４Ｍ  ＮａＯＨを添加することによってｐＨを１０．７±０．３に維持した状態で、０．３ｍｌのＮＭＰ中０．０３ｍｍｏｌのアシル化試薬を添加した。３０〜６０分後、反応が完了し、生成物を、４０ｍｌのイソプロパノールを添加することによって沈殿させ、遠心分離し、エーテルで洗浄し、乾燥させた。代替的には、生成物を、３０ｍｌの水で希釈すること、およびｐＨを４．５〜５．０に調節することによって単離してもよく、これは、等電沈殿をもたらした。代替的には、反応混合物を、酢酸またはＴＦＡで酸性化し、直ちに精製した。
【０３５６】
その後、生成物を、上述のＴＦＡ−アセトニトリル中の逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって精製し、純粋な画分を、凍結乾燥した。生成物の同一性を、マトリックス補助レーザー脱着イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳまたは超高性能液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）／エレクトロスプレー−ＭＳによって確認した。
【０３５７】
場合によっては、合成の規模を調節して、より多くの量またはより少ない量を生成するようにした。その場合、全ての量の出発材料、試薬、および溶媒の規模を、同一の因子によって調節した。
【０３５８】
修正１
アシル化試薬がｔｅｒｔ−ブチル保護基を含有した場合、ソプロパノールまたは等電沈殿後の生成物を、５ｍｌのＴＦＡまたはＴＦＡ：水（９５：５）中に５分間溶解させ、３５ｍｌのエーテルで沈殿させ、エーテルで２回洗浄し、乾燥させた。
【０３５９】
修正２
アシル化試薬がｔｅｒｔ−ブチル保護基を含有する場合、粗イソ沈殿生成物を、５ｍｌのＴＦＡまたはＴＦＡ：水（９５：５）またはＴＦＡ：トリイソプロピルシラン（９９：１）中に溶解させた。溶液を、２０〜３０分間撹拌し、その後、水で、場合によっては追加的にＤＭＳＯまたはＮＭＦのいずれかで希釈し、分取ＨＰＬＣによって直ちに精製した。
【０３６０】
修正３
反応混合物中でのアシル化試薬の溶解性が不良である場合には、より多くのＮＭＰを添加し（最大１ｍｌ）、反応混合物を、短時間に３７℃まで加温した。
【０３６１】
一般的アシル化手順２
１００ｍｇの適切なインスリンを、２ｍｌのＤＭＳＯ中に溶解させ、４０ｕｌのバートン塩基（２−ｔ−ブチル−１，１，３，３−テトラメチルグアニジン）を添加した。２０ｕｍｏｌのアシル化剤を添加し、１分後に反応が完了した。反応混合物を、酸性化し、水中に希釈し、直ちに精製した。
【０３６２】
（方法３）インスリン誘導体の化学合成
インスリンＡ鎖を、標準的Ｆｍｏｃペプチド合成によって、例えば、ＰｒｅｌｕｄｅまたはＬｉｂｅｒｔｙ合成機で合成した。脱保護を、ＤＭＦ中１０％または２０％のピペリジンで実行した。Ｃｙｓ６、１１、および２０がＴｒｔ保護基を有し、Ｃｙｓ７がＡｃｍを有したことを除いて、全ての保護基は標準的なものであった。Ｃ末端残基がＡｓｎであった場合、ペプチドを、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ−ＯＢｕｔを有するＰＡＬまたはＲｉｎｋ樹脂上で第１のアミノ酸として合成した。
【０３６３】
合成後、樹脂をＤＣＭで洗浄し、ＤＣＭ／ＨＦＩＰ（４：１）中１％のヨウ素で１分間処理し、ＤＣＭ／ＨＦＩＰ（４：１）中で１５分間インキュベートし、これは、Ａ６〜Ａ１１ジスルフィドの形成をもたらした。ＤＣＭで洗浄し、乾燥させた後、ペプチドを、ＴＦＡ／水／ＤＰＤＳ（９３：５：２）で切断し、これは、Ｃｙｓ２０上にピリジルスルフィドを有するインスリンＡ鎖を提供した。エーテル沈殿、洗浄、および乾燥は、粗Ａ鎖をもたらし、これをその後の鎖の組み合わせで使用した。
【０３６４】
インスリンＢ鎖を、標準的Ｆｍｏｃペプチド合成によって、例えば、ＬｉｂｅｒｔｙまたはＰｒｅｌｕｄｅ合成機で合成した。樹脂は、例えば、事前充填したＷａｎｇ樹脂であった。Ｃｙｓ７がＡｃｍを有し、Ｃｙｓ１９がＴｒｔを有したことを除いて、全ての保護基は標準的なものであった。
【０３６５】
切断を、ＴＦＡ／水／ＴＩＰＳ（９３：４：３）で実行した。エーテル沈殿、洗浄、および乾燥は、粗Ｂ鎖をもたらし、これをその後の鎖の組み合わせで使用した。
【０３６６】
側鎖修飾リジンを有するインスリン誘導体が所望される場合、修飾を、ペプチド合成中に導入した。修飾されるリジンを、Ｆｍｏｃ−リジン（Ｍｔｔ）−ＯＨとして導入し、ペプチドのＮ末端を、（最終カップリングステップでＢｏｃ保護されたアミノ酸をカップリングすることによって、または樹脂結合ペプチドとＤＭＦ中５当量のＢｏｃ−無水物とを反応させることによってのいずれかで）Ｂｏｃで保護した。Ｍｔｔ基を、樹脂をＤＭＦ／ＨＦＩＰ（１：４）で３０分間処理することによって除去し、側鎖を、ペプチド骨格について記載の標準的Ｆｍｏｃ化学によって合成した。
【０３６７】
粗Ａ鎖およびＢ鎖（各０．１４ｍｍｏｌ）を、４０ｍｌのＤＭＳＯ中に溶解させた。２ｍｌの２Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．５）を添加し、鎖の組み合わせが、約１０分間で完了した。溶液を、４０ｍｌのＤＭＳＯおよび２００ｍｌの４０％のアセトニトリル、１％のＴＦＡで希釈した。Ｎ−クロロサクシニミドを、５ｍＭの最終濃度まで添加した。これは、１０分未満で第３のジスルフィド架橋を形成した。溶液を、６００ｍｌの０．２Ｍトリス（ｐＨ７．８）で希釈および中和し、２０ｍＭのリン酸塩（ｐＨ７．２）中のアセトニトリル勾配を実施するＣ１８カラム上でのＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。
【０３６８】
所望の化合物を含有する画分を組み合わせて、０．１％のＴＦＡ中アセトニトリル勾配を有する同じカラム上で再精製した。純粋な画分を組み合わせ、凍結乾燥した。収率は通常、２０〜５０ｍｇの所望のインスリン誘導体であり、これをその後、ＵＰＬＣおよびＬＣ−ＭＳによって特性評価した。
【０３６９】
本発明のインスリン誘導体の実施例
実施例１：Ｎ｛エプシロン−Ｂ２８｝−１５−カルボキシペンタデカノイル−［ＴｙｒＢ５，ＬｙｓＢ２８］，ｄｅｓ−（Ｂ２９−Ｂ３０）−インスリン］
【化２５】
2020531451.tif 000039
【０３７０】
合成方法３によって合成した。
質量計算値＝５９０３．８、実測値ＬＣ−ＭＳ  ｍ／４＝１４７６．６６
実施例２：Ｎ｛エプシロン−Ｂ２８｝−［（４Ｓ）−４−カルボキシ−４−（１５−カルボキシペンタデカノイルアミノ）ブタノイル］−［ＴｙｒＢ５，ＬｙｓＢ２８］，ｄｅｓ−（Ｂ２９−Ｂ３０）−インスリン
【化２６】
2020531451.tif 000040
合成方法３によって合成した。
質量計算値＝６０３２．９、実測値ＬＣ−ＭＳ  ｍ／４＝１５０９．０７
実施例３：Ｎ｛エプシロン−Ｂ２８｝−１７−カルボキシヘプタデカノイル−［ＴｙｒＢ５，ＬｙｓＢ２８］，ｄｅｓ−（Ｂ２９−Ｂ３０）−インスリン
【化２７】
2020531451.tif 000041
合成方法３によって合成した。
質量計算値＝５９３１．８、実測値ＬＣ−ＭＳ  ｍ／４＝１４８４
実施例４：Ｎ｛エプシロン−Ｂ２８｝−［（４Ｓ）−４−カルボキシ−４−（１７−カルボキシヘプタデカノイルアミノ）ブタノイル］−［ＴｙｒＢ５，ＬｙｓＢ２８］，ｄｅｓ−（Ｂ２９−Ｂ３０）−インスリン
【化２８】
2020531451.tif 000042
合成方法３によって合成した
質量計算値＝６０６０．９、実測値ＬＣ−ＭＳ  ｍ／４＝１５１６．７３
実施例５：Ｎ｛エプシロン−Ｂ２８｝−［２−［２−［２−（１７−カルボキシヘプタデカノイルアミノ）エトキシ］エトキシ］アセチル］−［ＴｙｒＢ５，ＬｙｓＢ２８］，ｄｅｓ−（Ｂ２９−Ｂ３０）−インスリン
【化２９】
2020531451.tif 000043
合成方法３によって合成した
質量計算値＝６０７７．０、実測値ＬＣ−ＭＳ  ｍ／５＝１２１６．３４
実施例６：Ｎ｛エプシロン−Ｂ２８｝−［（４Ｓ）−４−カルボキシ−４−［［（４Ｓ）−４−カルボキシ−４−（１７−カルボキシヘプタデカノイルアミノ）ブタノイル］アミノ］ブタノイル］−［ＴｙｒＢ５，ＬｙｓＢ２８］，ｄｅｓ−（Ｂ２９−Ｂ３０）−インスリン
【化３０】
2020531451.tif 000044
合成方法３によって合成した
質量計算値＝６１９０．０、実測値ＬＣ−ＭＳ  ｍ／４＝１５４８．３７
実施例７：Ｎ｛エプシロン−Ｂ２８｝−［２−［２−［２−［［（４Ｓ）−４−カルボキシ−４−（１７−カルボキシヘプタデカノイルアミノ）ブタノイル］アミノ］エトキシ］エトキシ］アセチル］−［ＴｙｒＢ５，ＬｙｓＢ２８］，ｄｅｓ−（Ｂ２９−Ｂ３０）−インスリン
【化３１】
2020531451.tif 000045
合成方法３によって合成した
質量計算値＝６２０６．１、実測値ＬＣ−ＭＳ  ｍ／４＝１５５２．３７
実施例８：Ｎ｛エプシロン−Ｂ２８｝−［（４Ｓ）−４−カルボキシ−４−［［（４Ｒ）−４−［（３Ｒ，１０Ｓ，１３Ｒ，１７Ｒ）−３−ヒドロキシ−１０，１３−ジメチル−２，３，４，５，６，７，８，９，１１，１２，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−１７−イル］ペンタノイル］アミノ］ブタノイル］−［ＴｙｒＢ５，ＬｙｓＢ２８］，ｄｅｓ−（Ｂ２９−Ｂ３０）−インスリン
【化３２】
2020531451.tif 000046
合成方法３によって合成した
質量計算値＝６１２３．１、実測値ＬＣ−ＭＳ  ｍ／４＝１５３１．７
実施例９：Ｎ｛エプシロン−Ｂ２８｝−［（４Ｒ）−４−［（３Ｒ，１０Ｓ，１３Ｒ，１７Ｒ）−３−ヒドロキシ−１０，１３−ジメチル−２，３，４，５，６，７，８，９，１１，１２，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−１７−イル］ペンタノイル］−［ＴｙｒＢ５，ＬｙｓＢ２８］，ｄｅｓ−（Ｂ２９−Ｂ３０）−インスリン
【化３３】
2020531451.tif 000047
合成方法３によって合成した
質量計算値＝５９９３．９、実測値ＬＣ−ＭＳ  ｍ／４＝１４９９．１６
実施例１０：Ｎ｛エプシロン−Ｂ２８｝−１５−カルボキシペンタデカノイル−［ＴｙｒＢ５，ＧｌｙＢ２６，ＬｙｓＢ２８］，ｄｅｓ−（Ｂ２９−Ｂ３０）−インスリン
【化３４】
2020531451.tif 000048
合成方法３によって合成した
質量計算値＝５７９７．７、実測値ＬＣ−ＭＳ  ｍ／４＝１４４９．９３
実施例１１：Ｎ｛エプシロン−Ｂ２８｝−１７−カルボキシヘプタデカノイル［ＴｙｒＢ５，ＧｌｙＢ２６，ＬｙｓＢ２８］，ｄｅｓ−（Ｂ２９−Ｂ３０）−インスリン
【化３５】
2020531451.tif 000049
合成方法３によって合成した
質量計算値＝５８２５．７、実測値ＭＡＬＤＩ−ＭＳ＝５８２５．７
実施例１２：Ｎ｛エプシロン−Ｂ２８｝−１７−カルボキシヘプタデカノイル−［ＧｌｕＡ１４，ＴｙｒＢ５，ＧｌｙＢ２６，ＬｙｓＢ２８］，ｄｅｓ−（Ｂ２９−Ｂ３０）−インスリン
【化３６】
2020531451.tif 000050
合成方法３によって合成した
質量計算値＝５７９１．６、実測値ＬＣ−ＭＳ  ｍ／３＝１９３１．４４
実施例１３：Ｎ｛エプシロン−Ｂ２８｝−［（４Ｓ）−４−カルボキシ−４−（１７−カルボキシヘプタデカノイルアミノ）ブタノイル］−［ＧｌｕＡ１４，ＴｙｒＢ５，ＧｌｙＢ２６，ＬｙｓＢ２８］，ｄｅｓ−（Ｂ２９−Ｂ３０）−インスリン
【化３７】
2020531451.tif 000051
合成方法３によって合成した
質量計算値＝５９２０．８、実測値ＬＣ−ＭＳ  ｍ／５＝１１８５．０４
実施例１４：Ｎ｛エプシロン−Ｂ２８｝−［（４Ｓ）−４−カルボキシ−４−［［（４Ｓ）−４−カルボキシ−４−（１７−カルボキシヘプタデカノイルアミノ）ブタノイル］アミノ］ブタノイル］−［ＧｌｕＡ１４，ＴｙｒＢ５，ＧｌｙＢ２６，ＬｙｓＢ２８］，ｄｅｓ−（Ｂ２９−Ｂ３０）−インスリン
【化３８】
2020531451.tif 000052
合成方法３によって合成した
質量計算値＝６０４９．９、実測値ＬＣ−ＭＳ  ｍ／４＝１５１３．３２
実施例１５：Ｎ｛エプシロン−Ｂ２８｝−［２−［２−［２−［［（４Ｓ）−４−カルボキシ−４−（１７−カルボキシヘプタデカノイルアミノ）ブタノイル］アミノ］エトキシ］エトキシ］アセチル］−［ＧｌｕＡ１４，ＴｙｒＢ５，ＧｌｙＢ２６，ＬｙｓＢ２８］，ｄｅｓ−（Ｂ２９−Ｂ３０）−インスリン
【化３９】
2020531451.tif 000053
合成方法３によって合成した
質量計算値＝６０６５．９、実測値ＬＣ−ＭＳ  ｍ／４＝１５１７．３４
実施例１６：Ｎ｛エプシロン−Ｂ２８｝−［２−［２−［２−［［（４Ｓ）−４−カルボキシ−４−（１９−カルボキシノナデカノイルアミノ）ブタノイル］アミノ］エトキシ］エトキシ］アセチル］−［ＧｌｕＡ１４，ＴｙｒＢ５，ＧｌｙＢ２６，ＬｙｓＢ２８］，ｄｅｓ−（Ｂ２９−Ｂ３０）−インスリン
【化４０】
2020531451.tif 000054
合成方法３によって合成した
質量計算値＝６０９４．０、実測値ＬＣ−ＭＳ  ｍ／４＝１５２４．３６
実施例１７：Ｎ｛エプシロン−Ｂ２８｝−［２−［２−［２−［［２−［２−［２−［［（４Ｓ）−４−カルボキシ−４−（１９−カルボキシノナデカノイルアミノ）ブタノイル］アミノ］エトキシ］エトキシ］アセチル］アミノ］エトキシ］エトキシ］アセチル］−［ＧｌｕＡ１４，ＴｙｒＢ５，ＧｌｙＢ２６，ＬｙｓＢ２８］，ｄｅｓ−（Ｂ２９−Ｂ３０）−インスリン
【化４１】
2020531451.tif 000055
合成方法３によって合成した
質量計算値＝６２３９．１、実測値ＬＣ−ＭＳ  ｍ／４＝１５６０．４
実施例１８：Ｎ｛エプシロン−Ｂ２８｝−［（４Ｓ）−４−カルボキシ−４−（１９−カルボキシノナデカノイルアミノ）ブタノイル］−［ＧｌｕＡ１４，ＴｙｒＢ５，ＧｌｙＢ２６，ＬｙｓＢ２８］，ｄｅｓ−（Ｂ２９−Ｂ３０）−インスリン
【化４２】
2020531451.tif 000056
合成方法３によって合成した
質量計算値＝５９４８．８、実測値ＬＣ−ＭＳ  ｍ／５＝１１９０．６９
実施例１９：Ｎ｛エプシロン−Ｂ２８｝−１９−カルボキシノナデカノイル−［ＧｌｕＡ１４，ＴｙｒＢ５，ＧｌｙＢ２６，ＬｙｓＢ２８］，ｄｅｓ−（Ｂ２９−Ｂ３０）−インスリン
【化４３】
2020531451.tif 000057
合成方法３によって合成した
質量計算値＝５８１９．７、実測値ＬＣ−ＭＳ  ｍ／４＝１４５５．６７
実施例２０：Ｎ｛エプシロン−Ｂ２８｝−１５−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ペンタデカノイル−［ＧｌｕＡ１４，ＴｙｒＢ５，ＧｌｙＢ２６，ＬｙｓＢ２８］，ｄｅｓ−（Ｂ２９−Ｂ３０）−インスリン
【化４４】
2020531451.tif 000058
合成方法２によって合成した。
質量計算値＝５７８７．６、実測値ＬＣ−ＭＳ  ｍ／４＝１４４８．１４
実施例２１：Ｎ｛エプシロン−Ｂ２８｝−１７−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ヘプタデカノイル−［ＧｌｕＡ１４，ＴｙｒＢ５，ＧｌｙＢ２６，ＬｙｓＢ２８］，ｄｅｓ−（Ｂ２９−Ｂ３０）−インスリン
【化４５】
2020531451.tif 000059
合成方法２によって合成した。
質量計算値＝５８１５．７、実測値ＬＣ−ＭＳ  ｍ／４＝１４５５．１９
実施例２２：Ｎ｛エプシロン−Ｂ２８｝−１６−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ヘキサデカノイル−［ＧｌｕＡ１４，ＴｙｒＢ５，ＧｌｙＢ２６，ＬｙｓＢ２８］，ｄｅｓ−（Ｂ２９−Ｂ３０）−インスリン
【化４６】
2020531451.tif 000060
合成方法２によって合成した。
質量計算値＝５８０１．７、実測値ＬＣ−ＭＳ  ｍ／４＝１４５１．６
実施例２３：Ｎ｛エプシロン−Ｂ２８｝−４−［１６−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ヘキサデカノイルスルファモイル］ブタノイル−［ＧｌｕＡ１４，ＴｙｒＢ５，ＧｌｙＢ２６，ＬｙｓＢ２８］，ｄｅｓ−（Ｂ２９−Ｂ３０）−インスリン
【化４７】
2020531451.tif 000061
合成方法２によって合成した。
質量計算値＝５９５０．８、実測値ＬＣ−ＭＳ  ｍ／４＝１４８８．８１
実施例２４：Ｎ｛エプシロン−Ｂ２８｝−４−［４−［１５−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ペンタデカノイルスルファモイル］ブタノイルスルファモイル］ブタノイル−［ＧｌｕＡ１４，ＴｙｒＢ５，ＧｌｙＢ２６，ＬｙｓＢ２８］，ｄｅｓ−（Ｂ２９−Ｂ３０）−インスリン
【化４８】
2020531451.tif 000062
合成方法２によって合成した。
質量計算値＝６０８６．０、実測値ＬＣ−ＭＳ  ｍ／４＝１５２２．６５
実施例２５：Ｎ｛エプシロン−Ｂ２８｝−４−［１７−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ヘプタデカノイルスルファモイル］ブタノイル−［ＧｌｕＡ１４，ＴｙｒＢ５，ＧｌｙＢ２６，ＬｙｓＢ２８］，ｄｅｓ−（Ｂ２９−Ｂ３０）−インスリン
【化４９】
2020531451.tif 000063
合成方法２によって合成した。
質量計算値＝５９６４．８、実測値ＬＣ−ＭＳ  ｍ／４＝１４９２．４１
実施例２６：Ｎ｛エプシロン−Ｂ２８｝−［２−［２−［２−［［２−［２−［２−［［（４Ｓ）−４−カルボキシ−４−［１５−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ペンタデカノイルアミノ］ブタノイル］アミノ］エトキシ］エトキシ］アセチル］アミノ］エトキシ］エトキシ］アセチル］−［ＧｌｕＡ１４，ＴｙｒＢ５，ＧｌｙＢ２６，ＬｙｓＢ２８］，ｄｅｓ−（Ｂ２９−Ｂ３０）−インスリン
【化５０】
2020531451.tif 000064
合成方法２によって合成した。
質量計算値＝６２０７．０、実測値ＬＣ−ＭＳ  ｍ／４＝１５５２．９５
実施例２７：Ｎ｛エプシロン−Ｂ２８｝−４−［４−［１７−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ヘプタデカノイルスルファモイル］ブタノイルスルファモイル］ブタノイル−［ＧｌｕＡ１４，ＴｙｒＢ５，ＧｌｙＢ２６，ＬｙｓＢ２８］，ｄｅｓ−（Ｂ２９−Ｂ３０）−インスリン
【化５１】
2020531451.tif 000065
合成方法２によって合成した。
質量計算値＝６１１４．０、実測値ＬＣ−ＭＳ  ｍ／４＝１５２９．６２
実施例２８：Ｎ｛エプシロン−Ｂ２８｝−４−（１７−カルボキシヘプタデカノイルスルファモイル）ブタノイル−［ＧｌｕＡ１４，ＴｙｒＢ５，ＧｌｙＢ２６，ＬｙｓＢ２８］，ｄｅｓ−（Ｂ２９−Ｂ３０）−インスリン
【化５２】
2020531451.tif 000066
合成方法２によって合成した。
質量計算値＝５９４０．８、実測値ＬＣ−ＭＳ  ｍ／４＝１４８６．３４
実施例２９：Ｎ｛エプシロン−Ｂ２８｝−［２−［２−［２−［［（４Ｓ）−４−カルボキシ−４−［１５−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ペンタデカノイルアミノ］ブタノイル］アミノ］エトキシ］エトキシ］アセチル］−［ＧｌｕＡ１４，ＴｙｒＢ５，ＧｌｙＢ２６，ＬｙｓＢ２８］，ｄｅｓ−（Ｂ２９−Ｂ３０）−インスリン
【化５３】
2020531451.tif 000067
合成方法２によって合成した。
質量計算値＝６０６１．９、実測値ＬＣ−ＭＳ  ｍ／４＝１５１６．６３
実施例３０：Ｎ｛エプシロン−Ｂ２８｝−［（４Ｒ）−４−カルボキシ−４−（１７−カルボキシヘプタデカノイルアミノ）ブタノイル］−［ＧｌｕＡ１４，ＴｙｒＢ５，ＧｌｙＢ２６，ＬｙｓＢ２８］，ｄｅｓ−（Ｂ２９−Ｂ３０）−インスリン
【化５４】
2020531451.tif 000068
合成方法２によって合成した。
質量計算値＝５９２０．８、実測値ＬＣ−ＭＳ  ｍ／４＝１４８１．１３
実施例３１：Ｎ｛エプシロン−Ｂ２８｝−［２−［２−［２−［［（４Ｓ）−４−カルボキシ−４−（１７−カルボキシヘプタデカノイルアミノ）ブタノイル］アミノ］エトキシ］エトキシ］アセチル］−［ＴｙｒＢ５，ＧｌｙＢ２６，ＬｙｓＢ２８］，ｄｅｓ−（Ｂ２９−Ｂ３０）−インスリン
【化５５】
2020531451.tif 000069
合成方法２によって合成した。
質量計算値＝６１００．０、実測値ＬＣ−ＭＳ  ｍ／４＝１５２５．８
実施例３２：Ｎ｛エプシロン−Ｂ２８｝−［２−［２−［２−［［（４Ｓ）−４−カルボキシ−４−（１７−カルボキシヘプタデカノイルアミノ）ブタノイル］アミノ］エトキシ］エトキシ］アセチル］−［ＧｌｕＡ１４，ＴｙｒＢ５，ＡｌａＢ２６，ＬｙｓＢ２８］，ｄｅｓ−（Ｂ２９−Ｂ３０）−インスリン
【化５６】
2020531451.tif 000070
合成方法２によって合成した。
質量計算値＝６０７９．９、実測値ＬＣ−ＭＳ  ｍ／４＝１５２０．７７
実施例３３：Ｎ｛エプシロン−Ｂ２８｝−［２−［２−［２−［［（４Ｓ）−４−カルボキシ−４−（１７−カルボキシヘプタデカノイルアミノ）ブタノイル］アミノ］エトキシ］エトキシ］アセチル］−［ＴｙｒＢ５，ＡｌａＢ２６，ＬｙｓＢ２８］，ｄｅｓ−（Ｂ２９−Ｂ３０）−インスリン
【化５７】
2020531451.tif 000071
合成方法２によって合成した。
質量計算値＝６１１４．０、実測値ＬＣ−ＭＳ  ｍ／４＝１５２９．２
実施例３４：Ｎ｛エプシロン−Ｂ２８｝−［（４Ｓ）−４−カルボキシ−４−（１７−カルボキシヘプタデカノイルアミノ）ブタノイル］−［ＧｌｕＡ１４，ＴｙｒＢ５，ＡｌａＢ２６，ＬｙｓＢ２８］，ｄｅｓ−（Ｂ２９−Ｂ３０）−インスリン
【化５８】
2020531451.tif 000072
合成方法２によって合成した。
質量計算値＝５９３４．８、実測値ＬＣ−ＭＳ  ｍ／４＝１４８４．５
実施例３５：Ｎ｛エプシロン−Ｂ２８｝−１７−カルボキシヘプタデカノイル−［ＰｈｅＢ５，ＬｙｓＢ２８］，ｄｅｓ−（Ｂ２９−Ｂ３０）−インスリン
【化５９】
2020531451.tif 000073
合成方法３によって合成した
質量計算値＝５９１５．８、実測値ＭＡＬＤＩ−ＭＳ＝５９１６
実施例３６：Ｎ｛エプシロン−Ｂ２８｝−１７−カルボキシヘプタデカノイル−［ＧｌｕＡ１４，ＰｈｅＢ５，ＧｌｙＢ２６，ＬｙｓＢ２８］，ｄｅｓ−（Ｂ２９−Ｂ３０）−インスリン
【化６０】
2020531451.tif 000074
合成方法３によって合成した
質量計算値＝５７７５．６、実測値ＬＣ−ＭＳ  ｍ／４＝１４４４．８
実施例３７：Ｎ｛エプシロン−Ｂ２６｝−１７−カルボキシヘプタデカノイル−［ＴｙｒＢ５，ＬｙｓＢ２６］，ｄｅｓ−（Ｂ２７−Ｂ３０）−インスリン
【化６１】
2020531451.tif 000075
合成方法３によって合成した
質量計算値＝５６６７．６、実測値ＬＣ−ＭＳ  ｍ／３＝１８８９．９
実施例３８：Ｎ｛エプシロン−Ｂ２６｝−［（４Ｓ）−４−カルボキシ−４−（１７−カルボキシヘプタデカノイルアミノ）ブタノイル］−［ＴｙｒＢ５，ＬｙｓＢ２６］，ｄｅｓ−（Ｂ２７−Ｂ３０）−インスリン
【化６２】
2020531451.tif 000076
合成方法３によって合成した
質量計算値＝５７９６．７、実測値ＬＣ−ＭＳ  ｍ／３＝１９３３．１
実施例３９：Ｎ｛エプシロン−Ｂ２６｝−［２−［２−［２−［［２−［２−［２−［［（４Ｓ）−４−カルボキシ−４−（１７−カルボキシヘプタデカノイルアミノ）ブタノイル］アミノ］エトキシ］エトキシ］アセチル］アミノ］エトキシ］エトキシ］アセチル］−［ＴｙｒＢ５，ＬｙｓＢ２６］，ｄｅｓ−（Ｂ２７−Ｂ３０）−インスリン
【化６３】
2020531451.tif 000077
合成方法３によって合成した
質量計算値＝６０８７．０、実測値ＬＣ−ＭＳ  ｍ／４＝１５２２．５
実施例４０：Ｎ｛エプシロン−Ｂ２９｝−［（４Ｓ）−４−カルボキシ−４−（１５−カルボキシペンタデカノイルアミノ）ブタノイル］−［ＴｙｒＢ５］，ｄｅｓ−ＴｈｒＢ３０−インスリン
【化６４】
2020531451.tif 000078
合成方法３によって合成した
質量計算値＝６１３０．０、実測値ＬＣ−ＭＳ  ｍ／３＝２０４４．３
実施例４１：Ｎ｛エプシロン−Ｂ２９｝−テトラデカノイル−［ＴｙｒＢ５］，ｄｅｓ−ＴｈｒＢ３０−インスリン
【化６５】
2020531451.tif 000079
合成方法３によって合成した
質量計算値＝５９４２．９、実測値ＬＣ−ＭＳ  ｍ／３＝１９８２
実施例４２：Ｎ｛エプシロン−Ｂ２９｝−［（４Ｓ）−４−カルボキシ−４−（１５−カルボキシペンタデカノイルアミノ）ブタノイル］−［ＴｙｒＢ５，ＧｌｙＢ２６］，ｄｅｓ−ＴｈｒＢ３０−インスリン
【化６６】
2020531451.tif 000080
合成方法３によって合成した
質量計算値＝６０２３．９、実測値ＭＡＬＤＩ−ＭＳ＝６０２６
実施例４３：Ｎ｛エプシロン−Ｂ２９｝−［（４Ｓ）−４−カルボキシ−４−（１５−カルボキシペンタデカノイルアミノ）ブタノイル］−［ＴｙｒＢ５，ＡｌａＢ２６］，ｄｅｓ−ＴｈｒＢ３０−インスリン
【化６７】
2020531451.tif 000081
合成方法３によって合成した
質量計算値＝６０３７．９、実測値ＬＣ−ＭＳ  ｍ／４＝１５１０．５
実施例４４：Ｎ｛エプシロン−Ｂ２９｝−［（４Ｓ）−４−カルボキシ−４−（１７−カルボキシヘプタデカノイルアミノ）ブタノイル］−［ＴｙｒＢ５，ＧｌｙＢ２６］，ｄｅｓ−ＴｈｒＢ３０−インスリン
【化６８】
2020531451.tif 000082
合成方法３によって合成した
質量計算値＝６０５１．９、実測値ＭＡＬＤＩ−ＭＳ＝６０５２
実施例４５：Ｎ｛エプシロン−Ｂ２９｝−［（４Ｓ）−４−カルボキシ−４−（１７−カルボキシヘプタデカノイルアミノ）ブタノイル］−［ＴｙｒＢ５，ＡｌａＢ２６］，ｄｅｓ−ＴｈｒＢ３０−インスリン
【化６９】
2020531451.tif 000083
合成方法３によって合成した
質量計算値＝６０６６．０、実測値ＭＡＬＤＩ−ＭＳ＝６０６５
実施例４６：Ｎ｛エプシロン−Ｂ２６｝−［２−［２−［２−［［（４Ｓ）−４−カルボキシ−４−（１７−カルボキシヘプタデカノイルアミノ）ブタノイル］アミノ］エトキシ］エトキシ］アセチル］−［ＴｙｒＢ５，ＬｙｓＢ２６］，ｄｅｓ−（Ｂ２７−Ｂ３０）−インスリン
【化７０】
2020531451.tif 000084
合成方法３によって合成した
質量計算値＝５９４１．８、実測値ＬＣ−ＭＳ  ｍ／４＝１４８６
対照薬
対照薬１：［ＴｙｒＢ５，ＬｙｓＢ２８］，ｄｅｓ−（Ｂ２９−Ｂ３０）−インスリン
【化７１】
2020531451.tif 000085
合成方法１によって合成した
質量計算値＝５６３５．４、実測値ＭＡＬＤＩ−ＭＳ  ５６３５
対照薬２：［ＴｙｒＢ５，ＧｌｙＢ２６］，ｄｅｓ−ＴｈｒＢ３０−インスリン
【化７２】
2020531451.tif 000086
合成方法１によって合成した
質量計算値＝５６２６．４、実測値ＭＡＬＤＩ−ＭＳ＝５６２６
対照薬３：［ＴｙｒＢ５，ＡｌａＢ２６］，ｄｅｓ−ＴｈｒＢ３０−インスリン
【化７３】
2020531451.tif 000087
合成方法１によって合成した
質量計算値＝５６４０．４、実測値ＭＡＬＤＩ−ＭＳ＝５６４１
対照薬４：［ＧｌｕＡ１４，ＴｙｒＢ５，ＧｌｙＢ２６，ＬｙｓＢ２８］，ｄｅｓ−（Ｂ２９−Ｂ３０）−インスリン
【化７４】
2020531451.tif 000088
合成方法１によって合成した
質量計算値＝５４９５．２、実測値ＬＣ−ＭＳ  ｍ／４＝１３７４．８３
対照薬５：Ｎ｛エプシロン−Ｂ２９｝−［（４Ｓ）−４−カルボキシ−４−（１５−カルボキシペンタデカノイルアミノ）ブタノイル］−インスリン
【化７５】
2020531451.tif 000089
対照薬６：Ｎ｛エプシロン−Ｂ２８｝−１７−カルボキシヘプタデカノイル−［ＬｅｕＢ５，ＬｙｓＢ２８］，ｄｅｓ−（Ｂ２９−Ｂ３０）−インスリン
【化７６】
2020531451.tif 000090
合成方法３によって合成した
質量計算値＝５８８１．８、実測値ＭＡＬＤＩ−ＭＳ＝５８８２
対照薬７：Ｎ｛エプシロン−Ｂ２８｝−１７−カルボキシヘプタデカノイル−［ＳｅｒＢ５，ＬｙｓＢ２８］，ｄｅｓ−（Ｂ２９−Ｂ３０）−インスリン
【化７７】
2020531451.tif 000091
合成方法３によって合成した
質量計算値＝５８７５．７、実測値ＭＡＬＤＩ−ＭＳ＝５８７６
対照薬８：Ｎ｛エプシロン−Ｂ２８｝−１７−カルボキシヘプタデカノイル−［ＡｌａＢ５，ＬｙｓＢ２８］，ｄｅｓ−（Ｂ２９−Ｂ３０）−インスリン
【化７８】
2020531451.tif 000092
合成方法３によって合成した
質量計算値＝５８３９．７、実測値ＭＡＬＤＩ−ＭＳ＝５８４０
対照薬９：Ｎ｛エプシロン−Ｂ２８｝−１７−カルボキシヘプタデカノイル−［ＧｌｙＢ２６，ＬｙｓＢ２８］，ｄｅｓ−（Ｂ２９−Ｂ３０）−インスリン
【化７９】
2020531451.tif 000093
合成方法３によって合成した
質量計算値＝５７９９．７、実測値ＭＡＬＤＩ−ＭＳ＝５８００
【図１】
2020531451.tif 000095
【図２】
2020531451.tif 000096
【図３】
2020531451.tif 000097
【図４】
2020531451.tif 000098
【図５】
2020531451.tif 000099
【図６】
2020531451.tif 000100
【図７】
2020531451.tif 000101
【図８】
2020531451.tif 000102
【図９】
2020531451.tif 000103
【図１０】
2020531451.tif 000104
【図１１】
2020531451.tif 000105
【図１２】
2020531451.tif 000106
【図１３】
2020531451.tif 000107
【図１４】
2020531451.tif 000108
【図１５】
2020531451.tif 000109
【図１６】
2020531451.tif 000110
【図１７】
2020531451.tif 000111
【図１８】
2020531451.tif 000112
【図１９】
2020531451.tif 000113
【配列表】
2020531451000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年3月25日(2020.3.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インスリン誘導体であって、Ｂ５ＹもしくはＢ５Ｆと、アシル基を含む置換基と、を含む、インスリン誘導体、またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル。
【請求項２】
前記インスリン誘導体が、Ｂ２６ＧまたはＢ２６Ａをさらに含む、請求項１に記載のインスリン誘導体。
【請求項３】
前記アシル基を含む置換基が、Ｂ２８Ｋ、Ｂ２６Ｋ、またはＢ２９Ｋに結合している、請求項１または２のいずれか一項に記載のインスリン誘導体。
【請求項４】
前記置換基が、以下の式（Ｉ）
Ａｃｙ−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３
［式中、
・Ａｃｙが、アシル基であり、リトコール酸によって表されるか、または以下の式のうちの少なくとも１つの官能基を含むか、
化学式  １：−ＣＯ−（ＣＨ２）ｘ−ＣＯＯＨ、もしくは
化学式  ２：−ＣＯ−（ＣＨ２）ｘ−テトラゾリル、
（式中、ｘが、１２〜２０の範囲内の整数を表し、テトラゾリル基が、１Ｈ−テトラゾル−５−イルである）
あるいは以下の式の脂肪酸であり、
化学式  ３：−ＣＯ−（ＣＨ２）ｘ−ＣＨ３
（式中、ｘが、８〜１６の範囲内の整数を表す）
・Ｌ１が、不在であり、共有結合を表すか、またはＯＥＧ、ｇＧｌｕ、ＤｇＧｌｕ、もしくはスルホンイミドＣ−４を表し、
・Ｌ２が、不在であり、共有結合を表すか、またはＯＥＧ、ｇＧｌｕ、ＤｇＧｌｕ、もしくはスルホンイミドＣ−４を表し、
・Ｌ３が、不在であり、共有結合を表すか、またはＯＥＧ、ｇＧｌｕ、ＤｇＧｌｕ、もしくはスルホンイミドＣ−４を表し、
ｇＧｌｕが、ガンマグルタミン酸残基を表し、ＯＥＧが、［２−（２−アミノエトキシ）エトキシ］アセチルを表す］
を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のインスリン誘導体。
【請求項５】
前記インスリン誘導体が、Ａ１４Ｅおよび／またはｄｅｓＢ３０および／またはｄｅｓＢ２９−３０および／またはｄｅｓＢ２７−３０をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のインスリン誘導体。
【請求項６】
前記置換が、
ｉ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ａ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および４）
ｉｉ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｇ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および５）
ｉｉｉ．Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ａ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および７）
ｉｖ．Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｇ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および８）
ｖ．Ｂ５Ｙ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および９）
ｖｉ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｆ、Ｂ２６Ｇ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および１０）
ｖｉｉ．Ｂ５Ｆ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および１１）
ｖｉｉｉ．Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｋ、ｄｅｓＢ２７−ｄｅｓＢ３０（配列番号１および１２）
ｉｘ．Ｂ５Ｙ、ｄｅｓＢ３０（配列番号１および１３）
ｘ．Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｇ、ｄｅｓＢ３０（配列番号１および１４）
ｘｉ．Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ａ、ｄｅｓＢ３０（配列番号１および１５）
ｘｉｉ．Ｂ５Ｆ、Ｂ２６Ａ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および６）
ｘｉｉｉ．Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ａ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および４）
ｘｉｖ．Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｇ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および５）
ｘｖ．Ｂ５Ｆ、Ｂ２６Ｇ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および１０）
ｘｖｉ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｆ、Ｂ２６Ａ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および６）
ｘｖｉｉ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ａ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および７）
ｘｖｉｉｉ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｇ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および８）
ｘｉｘ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および９）
ｘｘ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｆ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および１１）
ｘｘｉ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｋ、ｄｅｓＢ２７−ｄｅｓＢ３０（配列番号３および１２）
ｘｘｉｉ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、ｄｅｓＢ３０（配列番号３および１３）
ｘｘｉｉｉ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｇ、ｄｅｓＢ３０（配列番号３および１４）
ｘｘｉｖ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ａ、ｄｅｓＢ３０（配列番号３および１５）からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載のインスリン誘導体。
【請求項７】
Ａｃｙが、リトコール酸、１，１６−ヘキサデカン二酸、１，１８−オクタデカン二酸、１，２０−エイコサン二酸、テトラゾール−Ｃ１６、テトラゾール−Ｃ１７、テトラゾールＣ１８、およびテトラデカン酸からなる群から選択される、請求項６に記載のインスリン誘導体。
【請求項８】
−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３が、ＤｇＧｌｕ、ｇＧｌｕ、ｇＧｌｕ−ｇＧｌｕ、ｇＧｌｕ−ＯＥＧ、ｇＧｌｕ−ＯＥＧ−ＯＥＧ、ＯＥＧ、スルホンイミド−Ｃ４、およびスルホンイミド−Ｃ４−スルホンイミド−Ｃ４から選択される二価結合基を表す、請求項６に記載のインスリン誘導体。
【請求項９】
前記インスリン誘導体が、実施例１５の化合物：Ｎ｛エプシロン−Ｂ２８｝−［２−［２−［２−［［（４Ｓ）−４−カルボキシ−４−（１７−カルボキシヘプタデカノイルアミノ）ブタノイル］アミノ］エトキシ］エトキシ］アセチル］−［ＧｌｕＡ１４，ＴｙｒＢ５，ＧｌｙＢ２６，ＬｙｓＢ２８］，ｄｅｓ−（Ｂ２９−Ｂ３０）−インスリン
【化１】
2020531451.tif 000114
である、請求項１〜８のいずれかに記載のインスリン誘導体。
【請求項１０】
中間生成物であって、
ｉ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ａ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および４）
ｉｉ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｇ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および５）
ｉｉｉ．Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ａ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および７）
ｉｖ．Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｇ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および８）
ｖ．Ｂ５Ｙ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および９）
ｖｉ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｆ、Ｂ２６Ｇ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および１０）
ｖｉｉ．Ｂ５Ｆ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および１１）
ｖｉｉｉ．Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｋ、ｄｅｓＢ２７−ｄｅｓＢ３０（配列番号１および１２）
ｉｘ．Ｂ５Ｙ、ｄｅｓＢ３０（配列番号１および１３）
ｘ．Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｇ、ｄｅｓＢ３０（配列番号１および１４）
ｘｉ．Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ａ、ｄｅｓＢ３０（配列番号１および１５）
ｘｉｉ．Ｂ５Ｆ、Ｂ２６Ａ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および６）
ｘｉｉｉ．Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ａ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および４）
ｘｉｖ．Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｇ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および５）
ｘｖ．Ｂ５Ｆ、Ｂ２６Ｇ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号１および１０）
ｘｖｉ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｆ、Ｂ２６Ａ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および６）
ｘｖｉｉ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ａ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および７）
ｘｖｉｉｉ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｇ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および８）
ｘｉｘ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および９）
ｘｘ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｆ、Ｂ２８Ｋ、ｄｅｓＢ２９−３０（配列番号３および１１）
ｘｘｉ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｋ、ｄｅｓＢ２７−ｄｅｓＢ３０（配列番号３および１２）
ｘｘｉｉ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、ｄｅｓＢ３０（配列番号３および１３）
ｘｘｉｉｉ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ｇ、ｄｅｓＢ３０（配列番号３および１４）
ｘｘｉｖ．Ａ１４Ｅ、Ｂ５Ｙ、Ｂ２６Ａ、ｄｅｓＢ３０（配列番号３および１５）からなる群から選択される骨格を含む、中間生成物、
またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル。
【請求項１１】
薬物として使用するための、請求項１〜９のいずれか一項に記載のインスリン誘導体。
【請求項１２】
糖尿病、循環器疾患、アテローム動脈硬化症、および／もしくは内皮機能障害の予防もしくは治療において使用するため、ならびに／または肝トリグリセリド含有量を予防もしくは低減するため、ならびに／または体重増加を予防もしくは低減するための、請求項１〜９のいずれか一項に記載のインスリン誘導体。
【請求項１３】
糖尿病、１型糖尿病、２型糖尿病、耐糖能障害、高血糖症、脂質異常症、肥満、メタボリックシンドローム（メタボリックシンドロームＸ、インスリン抵抗性症候群）、高血圧症、認知障害、アテローム動脈硬化症、心筋梗塞、脳卒中、循環器障害、冠動脈心疾患、脳卒中、炎症性腸症候群、消化不良、低血圧症、または胃潰瘍の治療または予防のための薬物を製造するための、請求項１〜９のいずれか一項に記載のインスリン誘導体の使用。
【請求項１４】
糖尿病、１型糖尿病、２型糖尿病、耐糖能障害、高血糖症、脂質異常症、肥満、メタボリックシンドローム（メタボリックシンドロームＸ、インスリン抵抗性症候群）、高血圧症、認知障害、アテローム動脈硬化症、心筋梗塞、脳卒中、循環器障害、冠動脈心疾患、脳卒中、炎症性腸症候群、消化不良、低血圧症、または胃潰瘍の治療または予防のための方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の請求項１〜９のいずれか一項に記載のインスリン誘導体、または請求項１０に記載のインスリン類似体を、投与することを含む、方法。
【請求項１５】
インスリン化合物の選択性を決定するための方法であって、以下、
・ヒトインスリンと比較した、前記インスリン化合物によって誘発される最大ＡＫＴリン酸化を測定するステップと、
・ヒトインスリンと比較した、前記インスリン化合物によって誘発される最大ＥＲＫ活性化を測定するステップと、を含み、
ＥＲＫ／ＡＫＴ比が、１未満である、方法。
【国際調査報告】
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