(57)【要約】  容易な精製のためのプロテインＡ結合の増加、補体媒介性免疫応答低減のためのＣ１ｑ結合の減少、（例えば抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）誘導低減のため抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）誘導低減のための）ＣＤ１６結合の減少、安定性の向上、および／またはヘテロ二量体タンパク質を形成する能力を有するコンパニオンアニマルの変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに関するさまざまな実施態様が提供される。さらに、このような変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドを含む抗体および融合タンパク質に関するさまざまな実施態様が提供される。また、改善された血清半減期を有する１つまたは複数の変異体ＧＬＰ１ポリペプチドを含む連続ポリペプチドに関する様々な実施態様も提供される。ＧＬＰ１ポリペプチドおよびグルカゴンポリペプチドをＧＬＰ１受容体とグルカゴン受容体のデュアルアゴニストとして含む連続ポリペプチドまたはヘテロ二量体ポリペプチドに関するさまざまな実施態様がさらに提供される。さまざまな実施態様において、このようなポリペプチドは、イヌ、ネコおよびウマ等のコンパニオンアニマルにおける例えば糖尿病、肥満または関連する徴候を治療するために使用され得る。【選択図】図３
2020531002.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コンパニオンアニマル種の野生型ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対する少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドを含むポリペプチドであって、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、野生型ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対して増加したプロテインＡへの結合親和性を有する、ポリペプチド。
【請求項２】
コンパニオンアニマル種の野生型ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対する少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドを含むポリペプチドであって、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、野生型ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対して低下したＣ１ｑおよび／またはＣＤ１６への結合親和性を有する、ポリペプチド。
【請求項３】
変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、バイオレイヤー干渉法で測定して、５ｘ１０−６Ｍ超、１ｘ１０−５Ｍ超、５ｘ１０−５Ｍ超、１ｘ１０−４Ｍ超、５ｘ１０−４Ｍ超、または１ｘ１０−３Ｍ超の解離定数（Ｋｄ）でＣ１ｑおよび／またはＣＤ１６に結合する、請求項１または請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、野生型ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対して増加したプロテインＡへの結合親和性を有する、請求項１から３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、バイオレイヤー干渉法で測定して、５ｘ１０−６Ｍ未満、１ｘ０−６Ｍ未満、５ｘ１０−７Ｍ未満、１ｘ１０−７Ｍ未満、５ｘ１０−８Ｍ未満、１ｘ１０−８Ｍ未満、５ｘ１０−９Ｍ未満、１ｘ１０−９Ｍ未満、５ｘ１０−１０Ｍ未満、１ｘ１０−１０Ｍ未満、５ｘ１０−１１Ｍ未満、１ｘ１０−１１Ｍ未満、５ｘ１０−１２Ｍ未満、または１ｘ１０−１２Ｍ未満の解離定数（Ｋｄ）でプロテインＡに結合する、請求項１から４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
コンパニオンアニマル種がイヌ、ネコまたはウマである、請求項１から５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
野生型ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、
ａ）  イヌＩｇＧ−Ａ  Ｆｃ、ＩｇＧ−Ｂ  Ｆｃ、ＩｇＧ−Ｃ  ＦｃもしくはＩｇＧ−Ｄ  Ｆｃ；
ｂ）  ウマＩｇＧ１  Ｆｃ、ＩｇＧ２  Ｆｃ、ＩｇＧ３  Ｆｃ、ＩｇＧ４  Ｆｃ、ＩｇＧ５  Ｆｃ、ＩｇＧ６  ＦｃもしくはＩｇＧ７  Ｆｃ；または
ｃ）  ネコＩｇＧ１ａ  Ｆｃ、ＩｇＧ１ｂ  ＦｃもしくはＩｇＧ２  Ｆｃ
である、請求項１から６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
野生型ネコまたはウマＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対するヒンジ領域への少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドを含むポリペプチドであって、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、還元および／または非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により決定して、野生型ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対して増加した組換え産生および／または増加したヒンジジスルフィド形成を有するポリペプチド。
【請求項９】
変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、
ａ）  野生型ネコ  ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対する少なくとも１つのアミノ酸置換であって、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが配列番号１６、配列番号８０、配列番号８１、配列番号１１７または配列番号１１８の１６位に対応する位置にアミノ酸置換を含むアミノ酸置換；
ｂ）  野生型ウマＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対する少なくとも１つのアミノ酸置換であって、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが配列番号１２９の３位に対応する位置にアミノ酸置換を含むアミノ酸置換；および／あるいは
ｃ）  野生型ウマＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対する少なくとも１つのアミノ酸置換であって、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが配列番号１２９の２０位に対応する位置にアミノ酸置換を含む、アミノ酸置換
を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、
ａ）  野生型ネコＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対する少なくとも１つのアミノ酸置換であって、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが配列番号１６、配列番号８０、配列番号８１、配列番号１１７または配列番号１１８の１６位にアミノ酸置換を含むアミノ酸置換；
ｂ）  野生型ウマＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対する少なくとも１つのアミノ酸置換であって、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが配列番号１２９の３位にアミノ酸置換を含む、アミノ酸置換；および／あるいは
ｃ）  野生型ウマＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対する少なくとも１つのアミノ酸置換であって、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが配列番号１２９の２０位にアミノ酸置換を含む、アミノ酸置換
を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、
ａ）  野生型ネコＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対する少なくとも１つのアミノ酸置換であって、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが配列番号１６、配列番号８０、配列番号８１、配列番号１１７もしくは配列番号１１８の１６位に対応する位置または１６位にプロリンを含む、アミノ酸置換；
ｂ）  野生型ウマＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対する少なくとも１つのアミノ酸置換であって、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが配列番号１２９の３位に対応する位置または３位にセリンを含むアミノ酸置換；および／あるいは
ｃ）  野生型ウマＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対する少なくとも１つのアミノ酸置換であって、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが配列番号１２９の２０位に対応する位置または２０位にプロリンを含む、アミノ酸置換
を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、異なるアイソタイプのＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドのヒンジ領域またはヒンジ領域の一部を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、野生型ネコＩｇＧ−１ａ  Ｆｃポリペプチドの、野生型ネコＩｇＧ−１ｂ  Ｆｃポリペプチドの、または野生型ウマｇＧ１  Ｆｃポリペプチドのヒンジ領域またはヒンジ領域の一部を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、配列番号１９、配列番号１２５または配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５を含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
配列番号１９、配列番号１２５または配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項１６】
野生型ネコＩｇＧ２  Ｆｃポリペプチドと比較した少なくとも１つのアミノ酸置換を含む変異体ＩｇＧ２  Ｆｃポリペプチドを含むポリペプチドであって、少なくとも１つのアミノ酸置換がシステインであり、変異体ＩｇＧ２  Ｆｃポリペプチドが、野生型ネコＩｇＧ２  Ｆｃポリペプチドと比較して、少なくとも１つの追加の鎖間ジスルフィド結合を形成することができる、ポリペプチド。
【請求項１７】
変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、野生型ネコＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対する少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、少なくとも１つのアミノ酸置換がシステインであり、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、野生型ネコＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対して少なくとも１つの追加の鎖間ジスルフィド結合を形成することができる、請求項１から１６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、配列番号１６の８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位または１６位に対応する位置にシステインを含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが配列番号１６の１４位に対応する位置にシステインを含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、配列番号１６の１４位にシステインを含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号１００、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６または配列番号１５７のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、または少なくとも９９％同一である、請求項１から２０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、配列番号１７を含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
配列番号１７のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項２４】
変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、
ａ）  配列番号１の２１位に対応する位置でのアミノ酸置換、配列番号１の２３位に対応する位置でのアミノ酸置換、配列番号１の２５位に対応する位置でのアミノ酸置換、配列番号１の８０位に対応する位置でのアミノ酸置換、配列番号１の２０５位に対応する位置でのアミノ酸置換、および／もしくは配列番号１の２０７位に対応する位置でのアミノ酸置換；
ｂ）  配列番号３の２１位に対応する位置でのアミノ酸置換、配列番号３の２３位に対応する位置でのアミノ酸置換、および／もしくは配列番号３の２４位に対応する位置でのアミノ酸置換；
ｃ）  配列番号４の２１位に対応する位置でのアミノ酸置換、配列番号４の２３位に対応する位置でのアミノ酸置換、配列番号４の２５位に対応する位置でのアミノ酸置換、配列番号４の８０位に対応する位置でのアミノ酸置換、および／もしくは配列番号４の２０７位に対応する位置でのアミノ酸置換；
ｄ）  配列番号６４の１５位に対応する位置でのアミノ酸置換、および／もしくは配列番号６４の２０３位に対応する位置でのアミノ酸置換；
ｅ）  配列番号６７の１９９位に対応する位置でのアミノ酸置換、および／もしくは配列番号６７の２００位に対応する位置でのアミノ酸置換；ならびに／または
ｆ）  配列番号６８の１９９位に対応する位置でのアミノ酸置換、配列番号６８の２００位に対応する位置でのアミノ酸置換、配列番号６８の２０１位に対応する位置でのアミノ酸置換、および／もしくは配列番号６８の２０２位に対応する位置でのアミノ酸置換
を含む、請求項１から２３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、
ａ）  配列番号１の２１位でのアミノ酸置換、配列番号１の２３位でのアミノ酸置換、配列番号１の２５位でのアミノ酸置換、配列番号１の８０位でのアミノ酸置換、配列番号１の２０５位でのアミノ酸置換、および／もしくは配列番号１の２０７位でのアミノ酸置換；
ｂ）  配列番号３の２１位でのアミノ酸置換、配列番号３の２３位でのアミノ酸置換、および／もしくは配列番号３の２４位でのアミノ酸置換；
ｃ）  配列番号４の２１位でのアミノ酸置換、配列番号４の２３位でのアミノ酸置換、配列番号４の２５位でのアミノ酸置換、配列番号４の８０位でのアミノ酸置換、および／もしくは配列番号４の２０７位でのアミノ酸置換；
ｄ）  配列番号６４の１５位でのアミノ酸置換、および／もしくは配列番号６４の２０３位でのアミノ酸置換；
ｅ）  配列番号６７の１９９位でのアミノ酸置換、および／もしくは配列番号６７の２００位でのアミノ酸置換；ならびに／または
ｆ）  配列番号６８の１９９位でのアミノ酸置換、配列番号６８の２００位でのアミノ酸置換、配列番号６８の２０１位でのアミノ酸置換、および／もしくは配列番号６８の２０２位でのアミノ酸置換
を含む、請求項１から２４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、
ａ）  配列番号１の２１位に対応する位置にスレオニン、配列番号１の２３位に対応する位置にロイシン、配列番号１の２５位に対応する位置にアラニン、配列番号１の８０位に対応する位置にグリシン、配列番号１の２０５位に対応する位置にアラニン、および／もしくは配列番号１の２０７位に対応する位置にヒスチジン；
ｂ）  配列番号３の２１位に対応する位置にスレオニン、配列番号３の２３位に対応する位置にロイシン、および／もしくは配列番号３の２４位に対応する位置にイソロイシン；
ｃ）  配列番号４の２１位に対応する位置にスレオニン、配列番号４の２３位に対応する位置にロイシン、配列番号４の２５位に対応する位置にアラニン、配列番号４の８０位に対応する位置にグリシン、および／もしくは配列番号４の２０７位に対応する位置にヒスチジン；
ｄ）  配列番号６４の１５位に対応する位置にスレオニンもしくはバリン、および／もしくは配列番号６４の２０３位に対応する位置にチロシンもしくはバリン；
ｅ）  配列番号６７の１９９位に対応する位置にロイシン、および／もしくは配列番号６７の２００位に対応する位置にヒスチジン；ならびに／または
ｆ）  配列番号６８の１９９位に対応する位置にロイシン、配列番号６８の２００位に対応する位置にヒスチジン、配列番号６８の２０１位に対応する位置にアスパラギン、および／もしくは配列番号６８の２０２位に対応する位置にヒスチジン
を含む、請求項１から２５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、
ａ）  配列番号１の２１位にスレオニン、配列番号１の２３位にロイシン、配列番号１の２５位にアラニン、配列番号１の８０位にグリシン、配列番号１の２０５位にアラニン、および／もしくは配列番号１の２０７位にヒスチジン；
ｂ）  配列番号３の２１位にスレオニン、配列番号３の２３位にロイシン、および／もしくは配列番号３の２４位にイソロイシン；
ｃ）  配列番号４の２１位にスレオニン、配列番号４の２３位にロイシン、配列番号４の２５位にアラニン、配列番号４の８０位にグリシン、および／もしくは配列番号４の２０７位にヒスチジン；
ｄ）  配列番号６４の１５位にスレオニンもしくはバリン、および／もしくは配列番号６４の２０３位にチロシンもしくはバリン；
ｅ）  配列番号６７の１９９位にロイシン、および／もしくは配列番号６７の２００位にヒスチジン；ならびに／または
ｆ）  配列番号６８の１９９位にロイシン、配列番号６８の２００位にヒスチジン、配列番号６８の２０１位にアスパラギン、および／もしくは配列番号６８の２０２位にヒスチジン
を含む、請求項１から２６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、
ａ）  配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２もしくは配列番号８４；または
ｂ）  配列番号１９、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７５もしくは配列番号７６
のアミノ酸配列を含む、請求項１から２７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号８４、配列番号１９、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７５または配列番号７６のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項３０】
変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、
ａ）  配列番号２の９３位に対応する位置でのアミノ酸置換、もしくは配列番号３の９３位に対応する位置でのアミノ酸置換；
ｂ）  配列番号６３の８７位に対応する位置でのアミノ酸置換、配列番号６５の８７位に対応する位置でのアミノ酸置換、配列番号６６の８７位に対応する位置でのアミノ酸置換、もしくは配列番号６９の８７位に対応する位置でのアミノ酸置換；または
ｃ）  配列番号８０の１９８位に対応する位置でのアミノ酸置換、もしくは配列番号８１の１９８位に対応する位置でのアミノ酸置換
を含む、請求項１から２９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、
ａ）  配列番号２の９３位でのアミノ酸置換、もしくは配列番号３の９３位でのアミノ酸置換；
ｂ）  配列番号６３の８７位でのアミノ酸置換、配列番号６５の８７位でのアミノ酸置換、配列番号６６の８７位でのアミノ酸置換、もしくは配列番号６９の８７位でのアミノ酸置換；または
ｃ）  配列番号８０の１９８位でのアミノ酸置換、もしくは配列番号８１の１９８位でのアミノ酸置換
を含む、請求項１から３０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、
ａ）  配列番号２の９３位に対応する位置にアルギニン、もしくは配列番号３の９３位に対応する位置にアルギニン；
ｂ）  配列番号６３の８７位に対応する位置にセリン、配列番号６５の８７位に対応する位置にセリン置換、配列番号６６の８７位に対応する位置にセリン、もしくは配列番号６９の８７位に対応する位置にセリン；または
ｃ）  配列番号８０の１９８位に対応する位置にアラニン、もしくは配列番号８１の１９８位に対応する位置にアラニン
を含む、請求項１から３１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、
ａ）  配列番号２の９３位にアルギニン、もしくは配列番号３の９３位にアルギニン；
ｂ）  配列番号６３の８７位にセリン、配列番号６５の８７位にセリン、配列番号６６の８７位にセリン、もしくは配列番号６９の８７位にセリン；または
ｃ）  配列番号８０の１９８位にアラニン、もしくは配列番号８１の１９８位にアラニン
を含む、請求項１から３２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、
ａ）  配列番号７８、配列番号７９もしくは配列番号８４；または
ｂ）  配列番号７０、配列番号７３、配列番号７４もしくは配列番号７７；または
ｃ）  配列番号８２もしくは配列番号８３
のアミノ酸配列を含む、請求項１から３３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３５】
配列番号７８、配列番号７９、配列番号８４、配列番号７０、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７７、配列番号８２または配列番号８３のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項３６】
変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、
ａ）  配列番号２の５位に対応する位置でのアミノ酸置換、配列番号２の３８位に対応する位置でのアミノ酸置換、配列番号２の３９位に対応する位置でのアミノ酸置換、配列番号２の９７位に対応する位置でのアミノ酸置換、および／もしくは配列番号２の９８位に対応する位置でのアミノ酸置換；または
ｂ）  配列番号３の５位に対応する位置でのアミノ酸置換、配列番号３の３８位に対応する位置でのアミノ酸置換、配列番号３の３９位に対応する位置でのアミノ酸置換、配列番号３の９７位に対応する位置でのアミノ酸置換、および／もしくは配列番号３の９８位に対応する位置でのアミノ酸置換
を含む、請求項１から３５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３７】
変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、
ａ）  配列番号２の５位でのアミノ酸置換、配列番号２の３８位でのアミノ酸置換、配列番号２の３９位でのアミノ酸置換、配列番号２の９７位でのアミノ酸置換、および／もしくは配列番号２の９８位でのアミノ酸置換；または
ｂ）  配列番号３の５位でのアミノ酸置換、配列番号３の３８位でのアミノ酸置換、配列番号３の３９位でのアミノ酸置換、配列番号３の９７位でのアミノ酸置換、および／もしくは配列番号３の９８位でのアミノ酸置換
を含む、請求項１から３６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３８】
変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、
ａ）  配列番号２の５位に対応する位置にプロリン、配列番号２の３８位に対応する位置にグリシン、配列番号２の３９位に対応する位置にアルギニン、配列番号２の９７位に対応する位置にイソロイシン、および／もしくは配列番号２の９８位に対応する位置にグリシン；または
ｂ）  配列番号３の５位に対応する位置にプロリン、配列番号３の３８位に対応する位置にグリシン、配列番号３の３９位に対応する位置にアルギニン、配列番号３の９７位に対応する位置にイソロイシン、および／もしくは配列番号３の９８位に対応する位置にグリシン
を含む、請求項１から３７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３９】
変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、
ａ）  配列番号２の５位にプロリン、配列番号２の３８位にグリシン、配列番号２の３９位にアルギニン、配列番号２の９７位にイソロイシン、および／もしくは配列番号２の９８位にグリシン；または
ｂ）  配列番号３の５位にプロリン、配列番号３の３８位にグリシン、配列番号３の３９位にアルギニン、配列番号３の９７位にイソロイシン、および／もしくは配列番号３の９８位にグリシン
を含む、請求項１から３８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４０】
変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、
ａ）  配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６もしくは配列番号１４７；または
ｂ）  配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６もしくは配列番号１５７
のアミノ酸配列を含む、請求項１から３９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４１】
配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６または配列番号１５７のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項４２】
ａ）  配列番号１の１３８位に対応する位置にチロシンもしくはトリプトファン、配列番号２の１３７位に対応する位置にチロシンもしくはトリプトファン、配列番号３の１３７位に対応する位置にチロシンもしくはトリプトファン、もしくは配列番号４の１３８位に対応する位置にチロシンもしくはトリプトファン；または
ｂ）  配列番号１６の１５４位に対応する位置にチロシンもしくはトリプトファン、配列番号８０もしくは配列番号１１７の１５４位に対応する位置にチロシンもしくはトリプトファン、もしくは配列番号８１もしくは配列番号１１８の１５４位に対応する位置にチロシンもしくはトリプトファン
を含む変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドを含むポリペプチド。
【請求項４３】
変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、
ａ）  配列番号１の１３８位にチロシンもしくはトリプトファン、配列番号２の１３７位にチロシンもしくはトリプトファン、配列番号３の１３７位にチロシンもしくはトリプトファン、もしくは配列番号４の１３８位にチロシンもしくはトリプトファン；または
ｂ）  配列番号１６の１５４位にチロシンもしくはトリプトファン、配列番号８０もしくは配列番号１１７の１５４位にチロシンもしくはトリプトファン、もしくは配列番号８１もしくは配列番号１１８の１５４位に対応する位置にチロシンもしくはトリプトファン
を含む、請求項１から４２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４４】
変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１９、配列番号１２１または配列番号１２３のアミノ酸配列を含む、請求項１から４３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４５】
配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１９、配列番号１２１または配列番号１２３のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項４６】
請求項１から４５のいずれか一項に記載のポリペプチドとグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ１）ポリペプチドとを含む、連続ポリペプチド。
【請求項４７】
請求項１から４６のいずれか一項に記載のポリペプチドとグルカゴンポリペプチドとを含む、連続ポリペプチド。
【請求項４８】
ａ）  配列番号１の１３８位に対応する位置にセリン、配列番号２の１３７位に対応する位置にセリン、配列番号３の１３７位に対応する位置にセリン、配列番号４の１３８位に対応する位置にセリン、配列番号１６の１５４位に対応する位置にセリン、配列番号８０もしくは配列番号１１７の１５４位に対応する位置にセリン、もしくは配列番号８１もしくは配列番号１１８の１５４位に対応する位置にセリン；
ｂ）  配列番号１の１４０位に対応する位置にアラニン、配列番号２の１３９位に対応する位置にアラニン、配列番号３の１３９位に対応する位置にアラニン、配列番号４の１４０位に対応する位置にアラニン、配列番号１６の１５６位に対応する位置にアラニン、配列番号８０もしくは配列番号１１７の１５６位に対応する位置にアラニン、もしくは配列番号８１もしくは配列番号１１８の１５６位に対応する位置にアラニン；および／または
ｃ）  配列番号１の１８１位に対応する位置にスレオニン、配列番号２の１８０位に対応する位置にスレオニン、配列番号３の１８０位に対応する位置にスレオニン、配列番号４の１８１位に対応する位置にスレオニン、配列番号１６の１９７位に対応する位置にスレオニン、配列番号８０もしくは配列番号１１７の１９７位に対応する位置にスレオニン、もしくは配列番号８１もしくは配列番号１１８の１９７位に対応する位置にスレオニン
を含む変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドを含むポリペプチド。
【請求項４９】
変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、
ａ）  配列番号１の１３８位にセリン、配列番号２の１３７位にセリン、配列番号３の１３７位にセリン、配列番号４の１３８位にセリン、配列番号１６の１５４位にセリン、配列番号８０もしくは配列番号１１７の１５４位にセリン、もしくは配列番号８１もしくは配列番号１１８の１５４位にセリン；
ｂ）  配列番号１の１４０位にアラニン、配列番号２の１３９位にアラニン、配列番号３の１３９位にアラニン、配列番号４の１４０位にアラニン、配列番号１６の１５６位にアラニン、配列番号８０もしくは配列番号１１７の１５６位にアラニン、もしくは配列番号８１もしくは配列番号１１８の１５６位にアラニン；および／または
ｃ）  配列番号１の１８１位にスレオニン、配列番号２の１８１位にスレオニン、配列番号３の１８１位にスレオニン、配列番号４の１８１位にスレオニン、配列番号１６の１９７位にスレオニン、配列番号８０もしくは配列番号１１７の１９７位にスレオニン、もしくは配列番号８１もしくは配列番号１１８の１９７位にスレオニン
を含む、請求項１から４８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５０】
変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１２０、配列番号１２２または配列番号１２４のアミノ酸配列を含む、実施態様１から４９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５１】
配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１２０、配列番号１２２または配列番号１２４のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項５２】
ポリペプチドがグリコシル化されている、請求項１から５１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５３】
ポリペプチドが非グリコシル化されている、請求項１から５１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５４】
請求項４８から５３のいずれか一項に記載のポリペプチドとグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ１）ポリペプチドとを含む、連続ポリペプチド。
【請求項５５】
請求項４８から５３のいずれか一項に記載のポリペプチドとグルカゴンポリペプチドとを含む、連続ポリペプチド。
【請求項５６】
請求項４６に記載の連続ポリペプチドと請求項５４に記載の連続ポリペプチドとを含む、ヘテロ二量体タンパク質。
【請求項５７】
請求項４７に記載の連続ポリペプチドと請求項５５に記載の連続ポリペプチドとを含む、ヘテロ二量体タンパク質。
【請求項５８】
ＧＬＰ１ポリペプチドが野生型ＧＬＰ１ポリペプチドであり、場合により配列番号８５のアミノ酸配列を含む、請求項４６、４７、または５４から５７のいずれか一項に記載の連続ポリペプチドまたはヘテロ二量体タンパク質。
【請求項５９】
ＧＬＰ１ポリペプチドが変異体ＧＬＰ１ポリペプチドである、請求項４６、４７、または５４から５８のいずれか一項に記載の連続ポリペプチドまたはヘテロ二量体タンパク質。
【請求項６０】
ＧＬＰ１ポリペプチドが配列番号８６、配列番号８７、配列番号９８または配列番号９９のアミノ酸配列を含む、請求項４６、４７、または５４から５９のいずれか一項に記載の連続ポリペプチドまたはヘテロ二量体タンパク質。
【請求項６１】
グルカゴンポリペプチドが野生型グルカゴンポリペプチドであり、場合により配列番号２１のアミノ酸配列を含む、請求項４６、４７、または５４から６０のいずれか一項に記載の連続ポリペプチドまたはヘテロ二量体タンパク質。
【請求項６２】
グルカゴンポリペプチドが変異体グルカゴンポリペプチドである、請求項４６、４７、または５４から６１のいずれか一項に記載の連続ポリペプチドまたはヘテロ二量体タンパク質。
【請求項６３】
ｉ）  第１の野生型イヌＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対する少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む第１の変異体イヌＩｇＧ  Ｆｃポリペプチド、および第２の野生型イヌＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対する少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む第２の変異体イヌＩｇＧ  Ｆｃポリペプチド；または
ｉｉ）  第１の野生型ネコＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対する少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む第１の変異体ネコ  ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチド、および第２の野生型ネコＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドと比較した少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む第２の変異体ネコＩｇＧ  Ｆｃポリペプチド
を含むヘテロ二量体タンパク質であって、
ａ）  第１の変異体イヌＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが配列番号１の１３８位、配列番号２の１３７位、配列番号３の１３７位もしくは配列番号４の１３８位に対応する位置にアミノ酸置換を含み；
ｂ）  第２の変異体イヌＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが配列番号１の１３８位、１４０位および／もしくは１８１位、配列番号２の１３７位、１３９および／もしくは１８０位、配列番号３の１３７位、１３９位および／もしくは１８０位、配列番号４の１３８位、１４０位および／もしくは１８１位に対応する位置にアミノ酸置換を含み；
ｃ）  第１の変異体ネコＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが配列番号６、配列番号８０、配列番号８１、配列番号１１７もしくは配列番号１１８の１５４位に対応する位置にアミノ酸置換を含み；かつ／または
ｄ）  第２の変異体ネコＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが配列番号６、配列番号８０、配列番号８１、配列番号１１７もしくは配列番号１１８の１５４位、１５６位および／もしくは１９７位にアミノ酸置換を含む
ヘテロ二量体タンパク質。
【請求項６４】
第１の野生型イヌＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドおよび第２の野生型イヌＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが同じＩｇＧサブタイプのものであり、かつ／または第１の野生型ネコＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドおよび第２の野生型ネコＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが同じＩｇＧサブタイプのものである、請求項６３に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項６５】
第１の野生型イヌ  ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドおよび第２の野生型イヌ  ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが異なるＩｇＧサブタイプのものであり、かつ／または第１の野生型ネコ  ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドおよび第２の野生型ネコ  ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが同じＩｇＧサブタイプのものである、請求項６３に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項６６】
ａ）  第１の変異体イヌＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが配列番号１の１３８位、配列番号２の１３７位、配列番号３の１３７位もしくは配列番号４の１３８位に対応する位置にチロシンもしくはトリプトファンを含み；かつ／または
ｂ）  第１の変異体ネコＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが配列番号６、配列番号８０、配列番号８１、配列番号１１７もしくは配列番号１１８の１５４位に対応する位置にトリプトファンを含む、
請求項６３から６５のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項６７】
ａ）  第２の変異体イヌＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、配列番号１の１３８位に対応する位置にセリンを、１４０位に対応する位置にアラニンを、および／もしくは１８１位に対応する位置にスレオニンを、配列番号２の１３７位に対応する位置にセリンを、１３９位に対応する位置にアラニンを、および／もしくは１８０位に対応する位置にスレオニンを、配列番号３の１３７位に対応する位置にセリンを、１３９位に対応する位置にアラニンを、および／もしくは１８０位に対応する位置にスレオニンを、ならびに／または配列番号４の１３８位に対応する位置にセリンを、１４０位に対応する位置にアラニンを、および／もしくは１８１位に対応する位置にスレオニンを含み；かつ／あるいは
ｂ）  第２の変異体ネコＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、配列番号６、配列番号８０、配列番号８１、配列番号１１７または配列番号１１８の１５４位に対応する位置にセリンを、１５６位に対応する位置にアラニンを、および／または１９７位に対応する位置にスレオニンを含む、
請求項６３から６６のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項６８】
ａ）  第１の変異体イヌＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３もしくは配列番号１１５のアミノ酸配列を含み；かつ／または
ｂ）  第１の変異体ネコＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、配列番号１１９、配列番号１２１もしくは配列番号１２３のアミノ酸配列を含む、
請求項６３から６７のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項６９】
ａ）  第２の変異体イヌＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４もしくは配列番号１１６のアミノ酸配列を含み；かつ／または
ｂ）  第２の変異体ネコＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、配列番号１２０、配列番号１２２もしくは配列番号１２３のアミノ酸配列を含む、
請求項６３から６８のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項７０】
変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチド、第１の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドおよび／または第２の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、野生型ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対する少なくとも１つの追加のアミノ酸修飾を含み、かつ、野生型ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対して増加したプロテインＡへの結合親和性を有する、請求項４２から６９のいずれか一項に記載のポリペプチド、連続ポリペプチド、またはヘテロ二量体タンパク質。
【請求項７１】
変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチド、第１の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドおよび／または第２の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、
ａ）  配列番号１の２１位に対応する位置でのアミノ酸置換、配列番号１の２３位に対応する位置でのアミノ酸置換、配列番号１の２５位に対応する位置でのアミノ酸置換、配列番号１の８０位に対応する位置でのアミノ酸置換、配列番号１の２０５位に対応する位置でのアミノ酸置換、および／もしくは配列番号１の２０７位に対応する位置でのアミノ酸置換；
ｂ）  配列番号３の２１位に対応する位置でのアミノ酸置換、配列番号３の２３位に対応する位置でのアミノ酸置換、および／もしくは配列番号３の２４位に対応する位置でのアミノ酸置換；または
ｃ）  配列番号４の２１位に対応する位置でのアミノ酸置換、配列番号４の２３位に対応する位置でのアミノ酸置換、配列番号４の２５位に対応する位置でのアミノ酸置換、配列番号４の８０位に対応する位置でのアミノ酸置換、および／もしくは配列番号４の２０７位に対応する位置でのアミノ酸置換
を含む、請求項４２から７０のいずれか一項に記載のポリペプチド、連続ポリペプチド、またはヘテロ二量体タンパク質。
【請求項７２】
変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチド、第１の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドおよび／または第２の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、
ａ）  配列番号１の２１位でのアミノ酸置換、配列番号１の２３位でのアミノ酸置換、配列番号１の２５位でのアミノ酸置換、配列番号１の８０位でのアミノ酸置換、配列番号１の２０５位でのアミノ酸置換、および／もしくは配列番号１の２０７位でのアミノ酸置換；
ｂ）  配列番号３の２１位でのアミノ酸置換、配列番号３の２３位でのアミノ酸置換、および／もしくは配列番号３の２４位でのアミノ酸置換；または
ｃ）  配列番号４の２１位でのアミノ酸置換、配列番号４の２３位でのアミノ酸置換、配列番号４の２５位でのアミノ酸置換、配列番号４の８０位でのアミノ酸置換、および／もしくは配列番号４の２０７位でのアミノ酸置換
を含む、請求項４２から７１のいずれか一項に記載のポリペプチド、連続ポリペプチド、またはヘテロ二量体タンパク質。
【請求項７３】
変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチド、第１の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドおよび／または第２の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、
ａ）  配列番号１の２１位に対応する位置にスレオニン、配列番号１の２３位に対応する位置にロイシン、配列番号１の２５位に対応する位置にアラニン、配列番号１の８０位に対応する位置にグリシン、配列番号１の２０５位に対応する位置にアラニン、および／もしくは配列番号１の２０７位に対応する位置にヒスチジン；
ｂ）  配列番号３の２１位に対応する位置にスレオニン、配列番号３の２３位に対応する位置にロイシン、および／もしくは配列番号３の２４位に対応する位置にイソロイシン；または
ｃ）  配列番号４の２１位に対応する位置にスレオニン、配列番号４の２３位に対応する位置にロイシン、配列番号４の２５位に対応する位置にアラニン、配列番号４の８０位に対応する位置にグリシン、および／もしくは配列番号４の２０７位に対応する位置にヒスチジン
を含む、請求項４２から７２のいずれか一項に記載のポリペプチド、連続ポリペプチド、またはヘテロ二量体タンパク質。
【請求項７４】
変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチド、第１の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドおよび／または第２の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、
ａ）  配列番号１の２１位にスレオニン、配列番号１の２３位にロイシン、配列番号１の２５位にアラニン、配列番号１の８０位にグリシン、配列番号１の２０５位にアラニン、および／もしくは配列番号１の２０７位にヒスチジン；
ｂ）  配列番号３の２１位にスレオニン、配列番号３の２３位にロイシン、および／もしくは配列番号３の２４位にイソロイシン；または
ｃ）  配列番号４の２１位にスレオニン、配列番号４の２３位にロイシン、配列番号４の２５位にアラニン、配列番号４の８０位にグリシン、および／もしくは配列番号４の２０７位にヒスチジン
を含む、請求項４２から７３のいずれか一項に記載のポリペプチド、連続ポリペプチド、またはヘテロ二量体タンパク質。
【請求項７５】
変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチド、第１の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドおよび／または第２の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、野生型ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対する少なくとも１つの追加のアミノ酸修飾を含み、かつ、野生型ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対して減少したＣＤ１６への結合親和性を有する、請求項４２から７４のいずれか一項に記載のポリペプチド、連続ポリペプチド、またはヘテロ二量体タンパク質。
【請求項７６】
変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチド、第１の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドおよび／または第２の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、
ａ）  配列番号２の５位に対応する位置でのアミノ酸置換、配列番号２の３８位に対応する位置でのアミノ酸置換、配列番号２の３９位に対応する位置でのアミノ酸置換、配列番号２の９７位に対応する位置でのアミノ酸置換、および／もしくは配列番号２の９８位に対応する位置でのアミノ酸置換；または
ｂ）  配列番号３の５位に対応する位置でのアミノ酸置換、配列番号３の３８位に対応する位置でのアミノ酸置換、配列番号３の３９位に対応する位置でのアミノ酸置換、配列番号３の９７位に対応する位置でのアミノ酸置換、および／もしくは配列番号３の９８位に対応する位置でのアミノ酸置換
を含む、請求項４２から７５のいずれか一項に記載のポリペプチド、連続ポリペプチド、またはヘテロ二量体タンパク質。
【請求項７７】
変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチド、第１の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドおよび／または第２の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、
ａ）  配列番号２の５位でのアミノ酸置換、配列番号２の３８位でのアミノ酸置換、配列番号２の３９位でのアミノ酸置換、配列番号２の９７位でのアミノ酸置換、および／もしくは配列番号２の９８位でのアミノ酸置換；または
ｂ）  配列番号３の５位でのアミノ酸置換、配列番号３の３８位でのアミノ酸置換、配列番号３の３９位でのアミノ酸置換、配列番号３の９７位でのアミノ酸置換、および／もしくは配列番号３の９８位でのアミノ酸置換
を含む、請求項４２から７６のいずれか一項に記載のポリペプチド、連続ポリペプチド、またはヘテロ二量体タンパク質。
【請求項７８】
変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチド、第１の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドおよび／または第２の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、
ａ）  配列番号２の５位に対応する位置にプロリン、配列番号２の３８位に対応する位置にグリシン、配列番号２の３９位に対応する位置にアルギニン、配列番号２の９７位に対応する位置にイソロイシン、および／もしくは配列番号２の９８位に対応する位置にグリシン；または
ｂ）  配列番号３の５位に対応する位置にプロリン、配列番号３の３８位に対応する位置にグリシン、配列番号３の３９位に対応する位置にアルギニン、配列番号３の９７位に対応する位置にイソロイシン、および／もしくは配列番号３の９８位に対応する位置にグリシン
を含む、請求項４２から７７のいずれか一項に記載のポリペプチド、連続ポリペプチド、またはヘテロ二量体タンパク質。
【請求項７９】
変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチド、第１の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドおよび／または第２の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、
ａ）  配列番号２の５位にプロリン、配列番号２の３８位にグリシン、配列番号２の３９位にアルギニン、配列番号２の９７位にイソロイシン、および／もしくは配列番号２の９８位にグリシン；または
ｂ）  配列番号３の５位にプロリン、配列番号３の３８位にグリシン、配列番号３の３９位にアルギニン、配列番号３の９７位にイソロイシン、および／もしくは配列番号３の９８位にグリシン
を含む、請求項４２から７８のいずれか一項に記載のポリペプチド、連続ポリペプチド、またはヘテロ二量体タンパク質。
【請求項８０】
変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチド、第１の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドおよび／または第２の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、野生型イヌＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対する少なくとも１つの追加のアミノ酸修飾を含み、かつ、野生型イヌＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対してＣ１ｑへの減少した結合親和性を有する、請求項４２から７９のいずれか一項に記載のポリペプチド、連続ポリペプチド、またはヘテロ二量体タンパク質。
【請求項８１】
変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチド、第１の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドおよび／または第２の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、配列番号２の９３位に対応する位置でのアミノ酸置換、または配列番号３の９３位に対応する位置でのアミノ酸置換を含む、請求項４２から８０のいずれか一項に記載のポリペプチド、連続ポリペプチド、またはヘテロ二量体タンパク質。
【請求項８２】
変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチド、第１の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドおよび／または第２の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、配列番号２の９３位でのアミノ酸置換、または配列番号３の９３位でのアミノ酸置換を含む、請求項４２から８１のいずれか一項に記載のポリペプチド、連続ポリペプチド、またはヘテロ二量体タンパク質。
【請求項８３】
変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチド、第１の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドおよび／または第２の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、配列番号２の９３位に対応する位置にアルギニンを、または配列番号３の９３位に対応する位置にアルギニンを含む、請求項４２から８２のいずれか一項に記載のポリペプチド、連続ポリペプチド、またはヘテロ二量体タンパク質。
【請求項８４】
変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチド、第１の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドおよび／または第２の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、配列番号２の９３位にアルギニンを、または配列番号３の９３位にアルギニンを含む、請求項４２から８３のいずれか一項に記載のポリペプチド、連続ポリペプチド、またはヘテロ二量体タンパク質。
【請求項８５】
ポリペプチドが抗体、抗体融合体または融合ポリペプチドである、請求項１から８４のいずれか一項に記載のポリペプチド、連続ポリペプチド、またはヘテロ二量体タンパク質。
【請求項８６】
ａ）  第１のグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ１）ポリペプチド  （ＧＬＰ１Ａ）；
ｂ）  第１のリンカー（Ｌ１）；
ｃ）  コンパニオンアニマル種のＦｃポリペプチド（Ｆｃ）；
ｄ）  場合により第２のリンカー（Ｌ２）；および
ｅ）  場合により第２のＧＬＰ１  ポリペプチド（ＧＬＰ１Ｂ）
を含む、連続ポリペプチド。
【請求項８７】
式（Ｉ）：ＧＬＰ１Ａ-Ｌ１-Ｆｃ；または
式（ＩＩ）：Ｆｃ-Ｌ１-ＧＬＰ１Ａ
を含む、請求項６５に記載の連続ポリペプチド。
【請求項８８】
式（ＩＩＩ）：ＧＬＰ１Ａ-Ｌ１-Ｆｃ-Ｌ２-ＧＬＰ１Ｂ
を含む、請求項６５に記載の連続ポリペプチド。
【請求項８９】
ＧＬＰ１Ｂが、存在する場合、ＧＬＰ１Ａと同じアミノ酸配列を含む、請求項８６から８８のいずれか一項に記載の連続ポリペプチド。
【請求項９０】
ａ）  グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ１）ポリペプチド；
ｂ）  第１のリンカー（Ｌ１）；
ｃ）  Ｆｃポリペプチド（Ｆｃ）；
ｄ）  第２のリンカー（Ｌ２）；および
ｅ）  グルカゴンポリペプチド（Ｇｌｕｃ）
を含む、連続ポリペプチド。
【請求項９１】
式（ＩＶ）：ＧＬＰ１-Ｌ１-Ｆｃ-Ｌ２-Ｇｌｕｃ；または
式（Ｖ）：Ｇｌｕｃ-Ｌ１-Ｆｃ-Ｌ２-ＧＬＰ１
を含む、請求項９０に記載の連続ポリペプチド。
【請求項９２】
ＧＬＰ１Ａ、ＧＬＰ１および／またはＧＬＰ１Ｂが、存在する場合、野生型ＧＬＰ１ポリペプチドを含む、請求項８６から９１のいずれか一項に記載の連続ポリペプチド。
【請求項９３】
ＧＬＰ１Ａ、ＧＬＰ１および／またはＧＬＰ１Ｂが、存在する場合、変異体ＧＬＰ１ポリペプチドを含む、請求項８６から９２のいずれか一項に記載の連続ポリペプチド。
【請求項９４】
ＧＬＰ１Ａ、ＧＬＰ１および／またはＧＬＰ１Ｂが、存在する場合、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号９８または配列番号９９のアミノ酸配列を含む、請求項８６から９３のいずれか一項に記載の連続ポリペプチド。
【請求項９５】
グルカゴンポリペプチドが野生型グルカゴンポリペプチドを含み、場合により配列番号２１のアミノ酸配列を含む、請求項８６から９４のいずれか一項に記載の連続ポリペプチド。
【請求項９６】
グルカゴンポリペプチドが変異体グルカゴンポリペプチドである、請求項８６から９５のいずれか一項に記載の連続ポリペプチド。
【請求項９７】
ＦｃポリペプチドがヒトＩｇＧ  Ｆｃである、請求項８６から９６のいずれか一項に記載の連続ポリペプチド。
【請求項９８】
ＦｃポリペプチドがヒトＩｇＧ１  Ｆｃ、ＩｇＧ２  Ｆｃ、ＩｇＧ３  ＦｃまたはＩｇＧ４  Ｆｃである、請求項８６から９７のいずれか一項に記載の連続ポリペプチド。
【請求項９９】
Ｆｃポリペプチドがコンパニオンアニマル種のＦｃである、請求項８６から９８のいずれか一項に記載の連続ポリペプチド。
【請求項１００】
Ｆｃポリペプチドが、
ａ）  イヌＩｇＧ−Ａ  Ｆｃ、ＩｇＧ−Ｂ  Ｆｃ、ＩｇＧ−Ｃ  ＦｃもしくはＩｇＧ−Ｄ  Ｆｃ；
ｂ）  ウマＩｇＧ１  Ｆｃ、ＩｇＧ２  Ｆｃ、ＩｇＧ３  Ｆｃ、ＩｇＧ４  Ｆｃ、ＩｇＧ５  Ｆｃ、ＩｇＧ６  ＦｃもしくはＩｇＧ７  Ｆｃ；または
ｃ）  ネコＩｇＧ１ａ  Ｆｃ、ＩｇＧ１ｂ  ＦｃもしくはＩｇＧ２  Ｆｃ
を含む、請求項８６から９７のいずれか一項または９９に記載の連続ポリペプチド。
【請求項１０１】
Ｆｃポリペプチドが野生型ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドである、請求項８６から１００のいずれか一項に記載の連続ポリペプチド。
【請求項１０２】
Ｆｃポリペプチドが変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドである、請求項８６から１００のいずれか一項に記載の連続ポリペプチド。
【請求項１０３】
Ｆｃポリペプチドが請求項１から８４のいずれか一項に記載のポリペプチド、連続ポリペプチド、またはヘテロ二量体タンパク質を含む、請求項８６から１０２のいずれか一項に記載の連続ポリペプチド。
【請求項１０４】
野生型ＧＬＰ１ポリペプチドよりも長い血清半減期を有する、請求項８５から１０２のいずれか一項に記載の連続ポリペプチド。
【請求項１０５】
Ｌ１およびＬ２が、存在する場合、それぞれ独立に、柔軟なリンカーである、請求項８６から１０４のいずれか一項に記載の連続ポリペプチド。
【請求項１０６】
Ｌ１およびＬ２のアミノ酸配列が、存在する場合、それぞれ独立に、１００％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％のセリンおよび／またはグリシンアミノ酸残基を含む、請求項８６から１０５のいずれか一項に記載の連続ポリペプチド。
【請求項１０７】
Ｃ末端に伸長部を含む、請求項８６から１０６のいずれか一項に記載の連続ポリペプチド。
【請求項１０８】
１つのグリシン残基、２つのグリシン残基、３つのグリシン残基、４つのグリシン残基、５つのグリシン残基、６つのグリシン残基、７つのグリシン残基、８つのグリシン残基、または８つを上回るグリシン残基をＣ末端に含む、請求項８６から１０７のいずれか一項に記載の連続ポリペプチド。
【請求項１０９】
配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４または配列番号９５のアミノ酸配列をＣ末端に含む、請求項８６から１０８のいずれか一項に記載の連続ポリペプチド。
【請求項１１０】
ａ）  配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号９６、配列番号９７、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、もしくは配列番号１０６のアミノ酸配列；または
ｂ）  配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、もしくは配列番号５９のアミノ酸配列
を含む、請求項８６から１０９のいずれか一項に記載の連続ポリペプチド。
【請求項１１１】
配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号９６、配列番号９７、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５または配列番号１０６のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項１１２】
少なくとも１つのアミノ酸修飾または置換が、アミノ酸誘導体によるアミノ酸置換を含む、請求項１から１１１のいずれか一項に記載のポリペプチド、ヘテロ二量体タンパク質、または連続ポリペプチド。
【請求項１１３】
請求項１から１１２のいずれか一項に記載のポリペプチド、ヘテロ二量体タンパク質または連続ポリペプチドをコードする、単離された核酸。
【請求項１１４】
請求項１１３に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項１１５】
請求項１１４に記載の宿主細胞を培養することと、ポリペプチドを単離することとを含む、ポリペプチドを製造する方法。
【請求項１１６】
請求項１から１１２のいずれか一項に記載のポリペプチド、ヘテロ二量体タンパク質または連続ポリペプチドと薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
【請求項１１７】
細胞におけるｃＡＭＰの産生を増加させる方法であって、ポリペプチド、ヘテロ二量体タンパク質または連続ポリペプチドのＧＬＰ１Ｒへの結合を許容する条件下で、請求項１から１１２のいずれか一項または１１６に記載のポリペプチド、ヘテロ二量体タンパク質、連続ポリペプチドまたは薬学的組成物に細胞を曝露することを含む、方法。
【請求項１１８】
細胞がｅｘ  ｖｉｖｏでポリペプチド、ヘテロ二量体タンパク質、連続ポリペプチドまたは薬学的組成物に曝露される、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
細胞がｉｎ  ｖｉｖｏでポリペプチド、ヘテロ二量体タンパク質、連続ポリペプチドまたは薬学的組成物に曝露される、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２０】
細胞がヒト細胞、イヌ細胞、ネコ細胞またはウマ細胞である、請求項１１８または１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
請求項１から１１２のいずれか一項または１１６に記載のポリペプチド、ヘテロ二量体タンパク質、連続ポリペプチドまたは薬学的組成物を非経口投与することを含む、ポリペプチドを対象に送達する方法。
【請求項１２２】
請求項１から１１２のいずれか一項または１１６に記載のポリペプチド、ヘテロ二量体タンパク質、連続ポリペプチドまたは薬学的組成物を筋肉内経路、腹腔内経路、脳脊髄内経路、皮下経路、動脈内経路、滑膜内経路、髄腔内経路または吸入経路で投与することを含む、ポリペプチドを対象に送達する方法。
【請求項１２３】
糖尿病または肥満を有する対象を治療する方法であって、請求項１から１１２のいずれか一項または１１６に記載のポリペプチド、ヘテロ二量体タンパク質、連続ポリペプチドまたは薬学的組成物の治療的有効量を対象に投与することを含む、方法。
【請求項１２４】
インスリン、ＤＰＰ４阻害剤、ＳＧＬＴ２阻害剤、ビグアニド類、スルホニル尿素、メグリチニド誘導体（ａ  ｂｉｇｕａｎｉｄｅｓ  ｓｕｌｆｏｎｙｌｕｒｅａｓ  ｍｅｇｌｉｔｉｎｉｄｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）、アルファグルコシダーゼ阻害剤、チアゾリジンジオン（ＴＺＤ）、アミリノミメティック、胆汁酸封鎖剤、ドーパミンアゴニストを投与することを含む、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２５】
対象がヒトの対象である、請求項１２１から１２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２６】
対象がコンパニオンアニマル種である、請求項１２１から１２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２７】
コンパニオンアニマル種がイヌ、ウマまたはネコである、請求項１２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年８月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／５４５８５８号（その内容全体があらゆる目的で参照により本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
本開示は、プロテインＡ結合の増加（例えば精製を容易にするために）、Ｃ１ｑ結合の減少（例えば補体媒介性免疫応答低減のために）、ＣＤ１６結合の減少（例えば抗体依存性細胞傷害  （ＡＤＣＣ）誘導低減のために）、安定性の向上、および／またはヘテロ二量体タンパク質を形成する能力を含む強化された特徴を有するコンパニオンアニマルの変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに関する。本開示の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、コンパニオンアニマル治療において広範な適用性を有し得る。例えば、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、例えば、イヌ、ネコおよびウマ等のコンパニオンアニマルの糖尿病、肥満または関連する徴候を治療するための長時間作用型ＧＬＰ１ポリペプチドの設計および製造において使用することができる。さらに、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、コンパニオンアニマルのさまざまな障害を治療するための抗体または融合タンパク質の設計および製造において使用することができる。
【背景技術】
【０００３】
ＩｇＧ  Ｆｃは、ＦｃＲｎ、Ｆｃ受容体およびＣ１ｑとの相互作用を通じて、Ｆｃによって媒介される機能において重要な役割を果たす。コンパニオンアニマルでは、さまざまなＩｇＧサブタイプが、これらの機能に違いを有しており、このことは、治療または診断用途に特定のＩｇＧ抗体またはＩｇＧ  Ｆｃ融合タンパク質を選択するときによく考慮される。例えば、ＩｇＧサブタイプの、Ｃ１ｑまたはＣＤ１６に対して測定可能な結合親和性を殆ど有しないか、または全く有しない能力が有利な場合がある。さらに、ＩｇＧ  ＦｃのプロテインＡを結合する能力は、プロテインＡアフィニティー精製プラットフォームを使用する精製に有用であり得る。
【０００４】
ただし、イヌ、ネコおよびウマのほとんどのＩｇＧ  Ｆｃサブタイプは、プロテインＡ結合特性を有しておらず、ＣＤ１６に対しても弱い結合親和性しか有しないか、または測定可能な結合親和性は持たず、Ｃ１ｑに対しても弱い結合親和性しか有しないか、または測定可能な結合親和性は持たない。例えば、４つのイヌＩｇＧ  Ｆｃサブタイプ（ＩｇＧ−Ａ、ＩｇＧ−Ｂ、ＩｇＧ−ＣおよびＩｇＧ−Ｄ）のうち、イヌＩｇＧ−Ｂ  ＦｃのみがプロテインＡに対して明らかな親和性を有する。一方、イヌＩｇＧ−Ａ  ＦｃおよびＩｇＧ−Ｄ  Ｆｃのみが、Ｃ１ｑ結合またはＣＤ１６結合がないか、または弱い。Ｃ１ｑおよび／もしくはＣＤ１６への低下した結合を有し、かつ／またはプロテインＡに結合可能な変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドを含む抗体およびＦｃ融合タンパク質が望ましい。
【０００５】
グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ１）は、強力な血糖降下ホルモンであり、血糖値の調節に重要な役割を果たす。ネイティブＧＬＰ１は、約２分のインビボ半減期を有する。長時間作用型ＧＬＰ１  ポリペプチドは、糖尿病および肥満の治療、糖尿病の予防、高血糖状態の制御、脂質の低下、血糖値の低下が有効である状態の治療、胃または腸の運動の抑制、胃排出の遅延、ならびに／または食物摂取の低減に使用され得る。イヌ、ネコ、ウマ等のコンパニオンアニマルの高血糖または制御不能な血糖誘発状態を治療するための長時間作用型ＧＬＰ１ポリペプチドに対する必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【０００６】
実施態様１．  コンパニオンアニマル種の野生型ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対する少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドを含むポリペプチドであって、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、野生型ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対して増加したプロテインＡへの結合親和性を有するポリペプチド。
実施態様２．  コンパニオンアニマル種の野生型ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対する少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドを含むポリペプチドであって、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、野生型ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対して低下したＣ１ｑおよび／またはＣＤ１６への結合親和性を有する、ポリペプチド。
実施態様３．  変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、バイオレイヤー干渉法で測定して、５ｘ１０−６Ｍ超、１ｘ１０−５Ｍ超、５ｘ１０−５Ｍ超、１ｘ１０−４Ｍ超、５ｘ１０−４Ｍ超、または１ｘ１０−３Ｍ超の解離定数（Ｋｄ）でＣ１ｑおよび／またはＣＤ１６に結合する、実施態様１または実施態様２に記載のポリペプチド。
実施態様４．  変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、野生型ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対して増加したプロテインＡへの結合親和性を有する、実施態様１から３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施態様５．  変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、バイオレイヤー干渉法で測定して、５ｘ１０−６Ｍ未満、１ｘ１０−６Ｍ未満、５ｘ１０−７Ｍ未満、１ｘ１０−７Ｍ未満、５ｘ１０−８Ｍ未満、１ｘ１０−８Ｍ未満、５ｘ１０−９Ｍ未満、１ｘ１０−９Ｍ未満、５ｘ１０−１０Ｍ未満、１ｘ１０−１０Ｍ未満、５ｘ１０−１１Ｍ未満、１ｘ１０−１１Ｍ未満、５ｘ１０−１２Ｍ未満、または１ｘ１０−１２Ｍ未満の解離定数（Ｋｄ）でプロテインＡに結合する、実施態様１から４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施態様６．  コンパニオンアニマル種がイヌ、ネコまたはウマである、実施態様１から５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施態様７．  野生型ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、
ａ）  イヌＩｇＧ−Ａ  Ｆｃ、ＩｇＧ−Ｂ  Ｆｃ、ＩｇＧ−Ｃ  ＦｃもしくはＩｇＧ−Ｄ  Ｆｃ；
ｂ）  ウマＩｇＧ１  Ｆｃ、ＩｇＧ２  Ｆｃ、ＩｇＧ３  Ｆｃ、ＩｇＧ４  Ｆｃ、ＩｇＧ５  Ｆｃ、ＩｇＧ６  ＦｃもしくはＩｇＧ７  Ｆｃ；または
ｃ）  ネコＩｇＧ１ａ  Ｆｃ、ＩｇＧ１ｂ  ＦｃもしくはＩｇＧ２  Ｆｃ
である、実施態様１から６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施態様８．  野生型ネコまたはウマ  ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対するヒンジ領域への少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドを含むポリペプチドであって、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、還元および／または非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により決定して、野生型ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対して増加した組換え産生および／または増加したヒンジジスルフィド形成を有するポリペプチド。
実施態様９．  変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、
ａ）  野生型ネコ  ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対する少なくとも１つのアミノ酸置換であって、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが配列番号１６、配列番号８０、配列番号８１、配列番号１１７または配列番号１１８の１６位に対応する位置にアミノ酸置換を含む、アミノ酸置換；
ｂ）  野生型ウマＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対する少なくとも１つのアミノ酸置換であって、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが配列番号１２９の３位に対応する位置にアミノ酸置換を含むアミノ酸置換；および／あるいは
ｃ）  野生型ウマＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対する少なくとも１つのアミノ酸置換であって、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが配列番号１２９の２０位に対応する位置にアミノ酸置換を含む、アミノ酸置換
を含む、実施態様１から８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施態様１０．  変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、
ａ）  野生型ネコ  ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対する少なくとも１つのアミノ酸置換であって、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが配列番号１６、配列番号８０、配列番号８１、配列番号１１７または配列番号１１８の１６位にアミノ酸置換を含む、アミノ酸置換；
ｂ）  野生型ウマＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対する少なくとも１つのアミノ酸置換であって、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが配列番号１２９の３位にアミノ酸置換を含む、アミノ酸置換；および／あるいは
ｃ）  野生型ウマＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対する少なくとも１つのアミノ酸置換であって、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが配列番号１２９の２０位にアミノ酸置換を含む、アミノ酸置換
を含む、実施態様１から９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施態様１１．  変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、
ａ）  野生型ネコ  ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対する少なくとも１つのアミノ酸置換であって、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが配列番号１６、配列番号８０、配列番号８１、配列番号１１７もしくは配列番号１１８の１６位に対応する位置または１６位にプロリンを含む、アミノ酸置換；
ｂ）  野生型ウマ  ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対する少なくとも１つのアミノ酸置換であって、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが配列番号１２９の３位に対応する位置または３位にセリンを含む、アミノ酸置換；および／あるいは
ｃ）  野生型ウマ  ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対する少なくとも１つのアミノ酸置換であって、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが配列番号１２９の２０位に対応する位置または２０位にプロリンを含むアミノ酸置換
を含む、実施態様１から１０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施態様１２．  変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、異なるアイソタイプのＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドのヒンジ領域またはヒンジ領域の一部を含む、実施態様１から１１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施態様１３．  変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、野生型ネコ  ＩｇＧ−１ａ  Ｆｃポリペプチドの、野生型ネコ  ＩｇＧ−１ｂ  Ｆｃポリペプチドの、または野生型ウマ  ＩｇＧ１  Ｆｃポリペプチドのヒンジ領域またはヒンジ領域の一部を含む、実施態様１から１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施態様１４．  変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、配列番号１９、配列番号１２５または配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５を含む、実施態様１から１３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施態様１５．  配列番号１９、配列番号１２５または配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
実施態様１６．  野生型ネコ  ＩｇＧ２  Ｆｃポリペプチドに対する少なくとも１つのアミノ酸置換を含む変異体ＩｇＧ２  Ｆｃポリペプチドを含むポリペプチドであって、少なくとも１つのアミノ酸置換がシステインであり、変異体ＩｇＧ２  Ｆｃポリペプチドが、野生型ネコ  ＩｇＧ２  Ｆｃポリペプチドに対して少なくとも１つの追加の鎖間ジスルフィド結合を形成することができるポリペプチド。
実施態様１７．  変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、野生型ネコＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対する少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、少なくとも１つのアミノ酸置換がシステインであり、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、野生型ネコＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対して少なくとも１つの追加の鎖間ジスルフィド結合を形成することができる、実施態様１から１６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施態様１８．  変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、配列番号１６の８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位または１６位に対応する位置にシステインを含む、実施態様１から１７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施態様１９．  変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが配列番号１６の１４位に対応する位置にシステインを含む、実施態様１から１８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施態様２０．  変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、配列番号１６の１４位にシステインを含む、実施態様１から１９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施態様２１．  変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号１００、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６または配列番号１５７のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、または少なくとも９９％同一である、実施態様１から２０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施態様２２．  変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、配列番号１７を含む、実施態様１から２１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施態様２３．  配列番号１７のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
実施態様２４．  変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、
ａ）  配列番号１の２１位に対応する位置でのアミノ酸置換、配列番号１の２３位に対応する位置でのアミノ酸置換、配列番号１の２５位に対応する位置でのアミノ酸置換、配列番号１の８０位に対応する位置でのアミノ酸置換、配列番号１の２０５位に対応する位置でのアミノ酸置換、および／もしくは配列番号１の２０７位に対応する位置でのアミノ酸置換；
ｂ）  配列番号３の２１位に対応する位置でのアミノ酸置換、配列番号３の２３位に対応する位置でのアミノ酸置換、および／もしくは配列番号３の２４位に対応する位置でのアミノ酸置換；
ｃ）  配列番号４の２１位に対応する位置でのアミノ酸置換、配列番号４の２３位に対応する位置でのアミノ酸置換、配列番号４の２５位に対応する位置でのアミノ酸置換、配列番号４の８０位に対応する位置でのアミノ酸置換、および／もしくは配列番号４の２０７位に対応する位置でのアミノ酸置換；
ｄ）  配列番号６４の１５位に対応する位置でのアミノ酸置換、および／もしくは配列番号６４の２０３位に対応する位置でのアミノ酸置換；
ｅ）  配列番号６７の１９９位に対応する位置でのアミノ酸置換、および／もしくは配列番号６７の２００位に対応する位置でのアミノ酸置換；ならびに／または
ｆ）  配列番号６８の１９９位に対応する位置でのアミノ酸置換、配列番号６８の２００位に対応する位置でのアミノ酸置換、配列番号６８の２０１位に対応する位置でのアミノ酸置換、および／もしくは配列番号６８の２０２位に対応する位置でのアミノ酸置換
を含む、実施態様１から２３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施態様２５．  変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、
ａ）  配列番号１の２１位でのアミノ酸置換、配列番号１の２３位でのアミノ酸置換、配列番号１の２５位でのアミノ酸置換、配列番号１の８０位でのアミノ酸置換、配列番号１の２０５位でのアミノ酸置換、および／もしくは配列番号１の２０７位でのアミノ酸置換；
ｂ）  配列番号３の２１位でのアミノ酸置換、配列番号３の２３位でのアミノ酸置換、および／もしくは配列番号３の２４位でのアミノ酸置換；
ｃ）  配列番号４の２１位でのアミノ酸置換、配列番号４の２３位でのアミノ酸置換、配列番号４の２５位でのアミノ酸置換、配列番号４の８０位でのアミノ酸置換、および／もしくは配列番号４の２０７位でのアミノ酸置換；
ｄ）  配列番号６４の１５位でのアミノ酸置換、および／もしくは配列番号６４の２０３位でのアミノ酸置換；
ｅ）  配列番号６７の１９９位でのアミノ酸置換、および／もしくは配列番号６７の２００位でのアミノ酸置換；ならびに／または
ｃ）  配列番号６８の１９９位でのアミノ酸置換、配列番号６８の２００位でのアミノ酸置換、配列番号６８の２０１位でのアミノ酸置換、および／もしくは配列番号６８の２０２位でのアミノ酸置換
を含む、実施態様１から２４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施態様２６．  変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、
ａ）  配列番号１の２１位に対応する位置にスレオニン、配列番号１の２３位に対応する位置にロイシン、配列番号１の２５位に対応する位置にアラニン、配列番号１の８０位に対応する位置にグリシン、配列番号１の２０５位に対応する位置にアラニン、および／もしくは配列番号１の２０７位に対応する位置にヒスチジン；
ｂ）  配列番号３の２１位に対応する位置にスレオニン、配列番号３の２３位に対応する位置にロイシン、および／もしくは配列番号３の２４位に対応する位置にイソロイシン；
ｃ）  配列番号４の２１位に対応する位置にスレオニン、配列番号４の２３位に対応する位置にロイシン、配列番号４の２５位に対応する位置にアラニン、配列番号４の８０位に対応する位置にグリシン、および／もしくは配列番号４の２０７位に対応する位置にヒスチジン；
ｄ）  配列番号６４の１５位に対応する位置にスレオニンもしくはバリン、および／もしくは配列番号６４の２０３位に対応する位置にチロシンもしくはバリン；
ｅ）  配列番号６７の１９９位に対応する位置にロイシン、および／もしくは配列番号６７の２００位に対応する位置にヒスチジン；ならびに／または
ｆ）  配列番号６８の１９９位に対応する位置にロイシン、配列番号６８の２００位に対応する位置にヒスチジン、配列番号６８の２０１位に対応する位置にアスパラギン、および／もしくは配列番号６８の２０２位に対応する位置にヒスチジン
を含む、実施態様１から２５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施態様２７．  変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、
ａ）  配列番号１の２１位にスレオニン、配列番号１の２３位にロイシン、配列番号１の２５位にアラニン、配列番号１の８０位にグリシン、配列番号１の２０５位にアラニン、および／もしくは配列番号１の２０７位にヒスチジン；
ｂ）  配列番号３の２１位にスレオニン、配列番号３の２３位にロイシン、および／もしくは配列番号３の２４位にイソロイシン；
ｃ）  配列番号４の２１位にスレオニン、配列番号４の２３位にロイシン、配列番号４の２５位にアラニン、配列番号４の８０位にグリシン、および／もしくは配列番号４の２０７位にヒスチジン；
ｄ）  配列番号６４の１５位にスレオニンもしくはバリン、および／もしくは配列番号６４の２０３位にチロシンもしくはバリン；
ｅ）  配列番号６７の１９９位にロイシン、および／もしくは配列番号６７の２００位にヒスチジン；ならびに／または
ｆ）  配列番号６８の１９９位にロイシン、配列番号６８の２００位にヒスチジン、配列番号６８の２０１位にアスパラギン、および／もしくは配列番号６８の２０２位にヒスチジン
を含む、実施態様１から２６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施態様２８．  変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、
ａ）  配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２もしくは配列番号８４；または
ｂ）  配列番号１９、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７５もしくは配列番号７６
のアミノ酸配列を含む、実施態様１から２７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施態様２９．  配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号８４、配列番号１９、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７５または配列番号７６のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
実施態様３０．  変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、
ａ）  配列番号２の９３位に対応する位置でのアミノ酸置換、もしくは配列番号３の９３位に対応する位置でのアミノ酸置換；
ｂ）  配列番号６３の８７位に対応する位置でのアミノ酸置換、配列番号６５の８７位に対応する位置でのアミノ酸置換、配列番号６６の８７位に対応する位置でのアミノ酸置換、もしくは配列番号６９の８７位に対応する位置でのアミノ酸置換；または
ｃ）  配列番号８０の１９８位に対応する位置でのアミノ酸置換、もしくは配列番号８１の１９８位に対応する位置でのアミノ酸置換
を含む、実施態様１から２９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施態様３１．  変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、
ａ）  配列番号２の９３位でのアミノ酸置換、もしくは配列番号３の９３位でのアミノ酸置換；
ｂ）  配列番号６３の８７位でのアミノ酸置換、配列番号６５の８７位でのアミノ酸置換、配列番号６６の８７位でのアミノ酸置換、もしくは配列番号６９の８７位でのアミノ酸置換；または
ｃ）  配列番号８０の１９８位でのアミノ酸置換、もしくは配列番号８１の１９８位でのアミノ酸置換
を含む、実施態様１から３０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施態様３２．  変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、
ａ）  配列番号２の９３位に対応する位置にアルギニン、もしくは配列番号３の９３位に対応する位置にアルギニン；
ｂ）  配列番号６３の８７位に対応する位置にセリン、配列番号６５の８７位に対応する位置にセリン置換、配列番号６６の８７位に対応する位置にセリン、もしくは配列番号６９の８７位に対応する位置にセリン；または
ｃ）  配列番号８０の１９８位に対応する位置にアラニン、もしくは配列番号８１の１９８位に対応する位置にアラニン
を含む、実施態様１から３１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施態様３３．  変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、
ａ）  配列番号２の９３位にアルギニン、もしくは配列番号３の９３位にアルギニン；
ｂ）  配列番号６３の８７位にセリン、配列番号６５の８７位にセリン、配列番号６６の８７位にセリン、もしくは配列番号６９の８７位にセリン；または
ｃ）  配列番号８０の１９８位にアラニン、もしくは配列番号８１の１９８位にアラニン
を含む、実施態様１から３２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施態様３４．  変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、
ａ）  配列番号７８、配列番号７９もしくは配列番号８４；または
ｂ）  配列番号７０、配列番号７３、配列番号７４もしくは配列番号７７；または
ｃ）  配列番号８２もしくは配列番号８３
のアミノ酸配列を含む、実施態様１から３３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施態様３５．  配列番号７８、配列番号７９、配列番号８４、配列番号７０、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７７、配列番号８２、または配列番号８３のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
実施態様３６．  変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、
ａ）  配列番号２の５位に対応する位置でのアミノ酸置換、配列番号２の３８位に対応する位置でのアミノ酸置換、配列番号２の３９位に対応する位置でのアミノ酸置換、配列番号２の９７位に対応する位置でのアミノ酸置換、および／もしくは配列番号２の９８位に対応する位置でのアミノ酸置換；または
ｂ）  配列番号３の５位に対応する位置でのアミノ酸置換、配列番号３の３８位に対応する位置でのアミノ酸置換、配列番号３の３９位に対応する位置でのアミノ酸置換、配列番号３の９７位に対応する位置でのアミノ酸置換、および／もしくは配列番号３の９８位に対応する位置でのアミノ酸置換
を含む、実施態様１から３５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施態様３７．  変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、
ａ）  配列番号２の５位でのアミノ酸置換、配列番号２の３８位でのアミノ酸置換、配列番号２の３９位でのアミノ酸置換、配列番号２の９７位でのアミノ酸置換、および／もしくは配列番号２の９８位でのアミノ酸置換；または
ｂ）  配列番号３の５位でのアミノ酸置換、配列番号３の３８位でのアミノ酸置換、配列番号３の３９位でのアミノ酸置換、配列番号３の９７位でのアミノ酸置換、および／もしくは配列番号３の９８位でのアミノ酸置換
を含む、実施態様１から３６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施態様３８．  変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、
ａ）  配列番号２の５位に対応する位置にプロリン、配列番号２の３８位に対応する位置にグリシン、配列番号２の３９位に対応する位置にアルギニン、配列番号２の９７位に対応する位置にイソロイシン、および／もしくは配列番号２の９８位に対応する位置にグリシン；または
ｂ）  配列番号３の５位に対応する位置にプロリン、配列番号３の３８位に対応する位置にグリシン、配列番号３の３９位に対応する位置にアルギニン、配列番号３の９７位に対応する位置にイソロイシン、および／もしくは配列番号３の９８位に対応する位置にグリシン
を含む、実施態様１から３７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施態様３９．  変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、
ａ）  配列番号２の５位にプロリン、配列番号２の３８位にグリシン、配列番号２の３９位にアルギニン、配列番号２の９７位にイソロイシン、および／もしくは配列番号２の９８位にグリシン；または
ｂ）  配列番号３の５位にプロリン、配列番号３の３８位にグリシン、配列番号３の３９位にアルギニン、配列番号３の９７位にイソロイシン、および／もしくは配列番号３の９８位にグリシン
を含む、実施態様１から３８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施態様４０．  変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、
ａ）  配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６もしくは配列番号１４７；または
ｂ）  配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６もしくは配列番号１５７
のアミノ酸配列を含む、実施態様１から３９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施態様４１．  配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６または配列番号１５７のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
実施態様４２．
ａ）  配列番号１の１３８位に対応する位置にチロシンもしくはトリプトファン、配列番号２の１３７位に対応する位置にチロシンもしくはトリプトファン、配列番号３の１３７位に対応する位置にチロシンもしくはトリプトファン、もしくは配列番号４の１３８位に対応する位置にチロシンもしくはトリプトファン；または
ｂ）  配列番号１６の１５４位に対応する位置にチロシンもしくはトリプトファン、配列番号８０もしくは配列番号１１７の１５４位に対応する位置にチロシンもしくはトリプトファン、もしくは配列番号８１もしくは配列番号１１８の１５４位に対応する位置にチロシンもしくはトリプトファン
を含む変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドを含むポリペプチド。
実施態様４３．  変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、
ａ）  配列番号１の１３８位にチロシンもしくはトリプトファン、配列番号２の１３７位にチロシンもしくはトリプトファン、配列番号３の１３７位にチロシンもしくはトリプトファン、もしくは配列番号４の１３８位にチロシンもしくはトリプトファン；または
ｂ）  配列番号１６の１５４位にチロシンもしくはトリプトファン、配列番号８０もしくは配列番号１１７の１５４位にチロシンもしくはトリプトファン、もしくは配列番号８１もしくは配列番号１１８の１５４位に対応する位置にチロシンもしくはトリプトファン
を含む、実施態様１から４２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施態様４４．  変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１９、配列番号１２１または配列番号１２３のアミノ酸配列を含む、実施態様１から４３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施態様４５．  配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１９、配列番号１２１または配列番号１２３のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
実施態様４６．  実施態様１から４５のいずれか一項に記載のポリペプチドとグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ１）ポリペプチドとを含む、連続ポリペプチド。
実施態様４７．  実施態様１から４６のいずれか一項に記載のポリペプチドとグルカゴンポリペプチドとを含む、連続ポリペプチド。
実施態様４８．
ａ）  配列番号１の１３８位に対応する位置にセリン、配列番号２の１３７位に対応する位置にセリン、配列番号３の１３７位に対応する位置にセリン、配列番号４の１３８位に対応する位置にセリン、配列番号１６の１５４位に対応する位置にセリン、配列番号８０もしくは配列番号１１７の１５４位に対応する位置にセリン、もしくは配列番号８１もしくは配列番号１１８の１５４位に対応する位置にセリン；
ｂ）  配列番号１の１４０位に対応する位置にアラニン、配列番号２の１３９位に対応する位置にアラニン、配列番号３の１３９位に対応する位置にアラニン、配列番号４の１４０位に対応する位置にアラニン、配列番号１６の１５６位に対応する位置にアラニン、配列番号８０もしくは配列番号１１７の１５６位に対応する位置にアラニン、もしくは配列番号８１もしくは配列番号１１８の１５６位に対応する位置にアラニン；および／または
ｃ）  配列番号１の１８１位に対応する位置にスレオニン、配列番号２の１８０位に対応する位置にスレオニン、配列番号３の１８０位に対応する位置にスレオニン、配列番号４の１８１位に対応する位置にスレオニン、配列番号１６の１９７位に対応する位置にスレオニン、配列番号８０もしくは配列番号１１７の１９７位に対応する位置にスレオニン、もしくは配列番号８１もしくは配列番号１１８の１９７位に対応する位置にスレオニン
を含む変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドを含むポリペプチド。
実施態様４９．  変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、
ａ）  配列番号１の１３８位にセリン、配列番号２の１３７位にセリン、配列番号３の１３７位にセリン、配列番号４の１３８位にセリン、配列番号１６の１５４位にセリン、配列番号８０もしくは配列番号１１７の１５４位にセリン、もしくは配列番号８１もしくは配列番号１１８の１５４位にセリン；
ｂ）  配列番号１の１４０位にアラニン、配列番号２の１３９位にアラニン、配列番号３の１３９位にアラニン、配列番号４の１４０位にアラニン、配列番号１６の１５６位にアラニン、配列番号８０もしくは配列番号１１７の１５６位にアラニン、もしくは配列番号８１もしくは配列番号１１８の１５６位にアラニン；および／または
ｃ）  配列番号１の１８１位にスレオニン、配列番号２の１８１位にスレオニン、配列番号３の１８１位にスレオニン、配列番号４の１８１位にスレオニン、配列番号１６の１９７位にスレオニン、配列番号８０もしくは配列番号１１７の１９７位にスレオニン、もしくは配列番号８１もしくは配列番号１１８の１９７位にスレオニン
を含む、実施態様１から４８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施態様５０．  変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１２０、配列番号１２２または配列番号１２４のアミノ酸配列を含む、実施態様１から４９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施態様５１．  配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１２０、配列番号１２２または配列番号１２４のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
実施態様５２．  ポリペプチドがグリコシル化されている、実施態様１から５１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施態様５３．  ポリペプチドが非グリコシル化されている、実施態様１から５１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施態様５４．  実施態様４８から５３のいずれか一項に記載のポリペプチドとグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ１）ポリペプチドとを含む、連続ポリペプチド。
実施態様５５．  実施態様４８から５３のいずれか一項に記載のポリペプチドとグルカゴンポリペプチドとを含む、連続ポリペプチド。
実施態様５６．  実施態様４６に記載の連続ポリペチドと実施態様５４に記載の連続ポリペプチドとを含む、ヘテロ二量体タンパク質。
実施態様５７．  実施態様４７に記載の連続ポリペプチドと実施態様５５に記載の連続ポリペプチドとを含む、ヘテロ二量体タンパク質。
実施態様５８．  ＧＬＰ１ポリペプチドが野生型ＧＬＰ１  ポリペプチドであり、場合により配列番号８５のアミノ酸配列を含む、実施態様４６、４７または５４から５７のいずれか一項に記載の連続ポリペプチドまたはヘテロ二量体タンパク質。
実施態様５９．  ＧＬＰ１ポリペプチドが変異体ＧＬＰ１ポリペプチドである、実施態様４６、４７または５４から５８のいずれか一項に記載の連続ポリペプチドまたはヘテロ二量体タンパク質。
実施態様６０．  ＧＬＰ１ポリペプチドが配列番号８６、配列番号８７、配列番号９８または９配列番号９９のアミノ酸配列を含む、実施態様４６、４７または５４から５９のいずれか一項に記載の連続ポリペプチドまたはヘテロ二量体タンパク質。
実施態様６１．  グルカゴンポリペプチドが野生型グルカゴンポリペプチドであり、場合により配列番号２１のアミノ酸配列を含む、実施態様４６、４７または５４から６０のいずれか一項に記載の連続ポリペプチドまたはヘテロ二量体タンパク質。
実施態様６２．  グルカゴンポリペプチドが変異体グルカゴンポリペプチドである、実施態様４６、４７または５４から６１のいずれか一項に記載の連続ポリペプチドまたはヘテロ二量体タンパク質。
実施態様６３．
ｉ）  第１の野生型イヌＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対する少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む第１の変異体イヌＩｇＧ  Ｆｃポリペプチド、および第２の野生型イヌＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対する少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む第２の変異体イヌＩｇＧ  Ｆｃポリペプチド；または
ｉｉ）  第１の野生型ネコＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対する少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む第１の変異体ネコＩｇＧ  Ｆｃポリペプチド、および第２の野生型ネコＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対する少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む第２の変異体ネコＩｇＧＦｃポリペプチド
を含むヘテロ二量体タンパク質であって、
ａ）  第１の変異体イヌＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが配列番号１の１３８位、配列番号２の１３７位、配列番号３の１３７位もしくは配列番号４の１３８位に対応する位置にアミノ酸置換を含み；
ｂ）  第２の変異体イヌＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが配列番号１の１３８位、１４０位および／もしくは１８１位、配列番号２の１３７位、１３９および／もしくは１８０位、配列番号３の１３７位、１３９位および／もしくは１８０位、配列番号４の１３８位、１４０位および／もしくは１８１位に対応する位置にアミノ酸置換を含み；
ｃ）  第１の変異体ネコＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが配列番号６、配列番号８０、配列番号８１、配列番号１１７もしくは配列番号１１８の１５４位に対応する位置にアミノ酸置換を含み；かつ／または
ｄ）  第２の変異体ネコＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが配列番号６、配列番号８０、配列番号８１、配列番号１１７もしくは配列番号１１８の１５４位、１５６位および／もしくは１９７位にアミノ酸置換を含む
ヘテロ二量体タンパク質。
実施態様６４．  第１の野生型イヌＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドおよび第２の野生型イヌＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが同じＩｇＧサブタイプのものであり、かつ／または第１の野生型ネコＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドおよび第２の野生型ネコＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが同じＩｇＧサブタイプのものである、実施態様６３に記載のヘテロ二量体タンパク質。
実施態様６５．  第１の野生型イヌＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドおよび第２の野生型イヌＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが異なるＩｇＧサブタイプのものであり、かつ／または第１の野生型ネコＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドおよび第２の野生型ネコＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが同じＩｇＧサブタイプのものである、実施態様６３に記載のヘテロ二量体タンパク質。
実施態様６６．
ａ）  第１の変異体イヌＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが配列番号１の１３８位、配列番号２の１３７位、配列番号３の１３７位もしくは配列番号４の１３８位に対応する位置にチロシンもしくはトリプトファンを含み；かつ／または
ｂ）  第１の変異体ネコＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが配列番号６、配列番号８０、配列番号８１、配列番号１１７もしくは配列番号１１８の１５４位に対応する位置にトリプトファンを含む、
実施態様６３から６５のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質。
実施態様６７．
ａ）  第２の変異体イヌＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、配列番号１の１３８位に対応する位置にセリンを、１４０位に対応する位置にアラニンを、および／もしくは１８１位に対応する位置にスレオニンを、配列番号２の１３７位に対応する位置にセリンを、１３９位に対応する位置にアラニンを、および／もしくは１８０位に対応する位置にスレオニンを、配列番号３の１３７位に対応する位置にセリンを、１３９位に対応する位置にアラニンを、および／もしくは１８０位に対応する位置にスレオニンを、ならびに／または配列番号４の１３８位に対応する位置にセリンを、１４０位に対応する位置にアラニンを、および／もしくは１８１位に対応する位置にスレオニンを含み；かつ／あるいは
ｂ）  第２の変異体ネコＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、配列番号６、配列番号８０、配列番号８１、配列番号１１７または配列番号１１８の１５４位に対応する位置にセリンを、１５６位に対応する位置にアラニンを、および／または１９７位に対応する位置にスレオニンを含む、
実施態様６３から６６のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質。
実施態様６８．
ａ）  第１の変異体イヌＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３もしくは配列番号１１５のアミノ酸配列を含み；かつ／または
ｂ）  第１の変異体ネコＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、配列番号１１９、配列番号１２１もしくは配列番号１２３のアミノ酸配列を含む、
実施態様６３から６７のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質。
実施態様６９．
ａ）  第２の変異体イヌＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４もしくは配列番号１１６のアミノ酸配列を含み；かつ／または
ｂ）  第２の変異体ネコＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、配列番号１２０、配列番号１２２もしくは配列番号１２３のアミノ酸配列を含む、
実施態様６３から６８のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質。
実施態様７０．  変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチド、第１の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドおよび／または第２の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、野生型ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対する少なくとも１つの追加のアミノ酸修飾を含み、かつ、野生型ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対して増加したプロテインＡへの結合親和性を有する、実施態様４２から６９のいずれか一項に記載のポリペプチド、連続ポリペプチド、またはヘテロ二量体タンパク質。
実施態様７１．  変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチド、第１の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドおよび／または第２の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、
ａ）  配列番号１の２１位に対応する位置でのアミノ酸置換、配列番号１の２３位に対応する位置でのアミノ酸置換、配列番号１の２５位に対応する位置でのアミノ酸置換、配列番号１の８０位に対応する位置でのアミノ酸置換、配列番号１の２０５位に対応する位置でのアミノ酸置換、および／もしくは配列番号１の２０７位に対応する位置でのアミノ酸置換；
ｂ）  配列番号３の２１位に対応する位置でのアミノ酸置換、配列番号３の２３位に対応する位置でのアミノ酸置換、および／もしくは配列番号３の２４位に対応する位置でのアミノ酸置換；または
ｃ）  配列番号４の２１位に対応する位置でのアミノ酸置換、配列番号４の２３位に対応する位置でのアミノ酸置換、配列番号４の２５位に対応する位置でのアミノ酸置換、配列番号４の８０位に対応する位置でのアミノ酸置換、および／もしくは配列番号４の２０７位に対応する位置でのアミノ酸置換
を含む、実施態様４２から７０のいずれか一項に記載のポリペプチド、連続ポリペプチド、またはヘテロ二量体タンパク質。
実施態様７２．  変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチド、第１の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドおよび／または第２の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、
ａ）  配列番号１の２１位でのアミノ酸置換、配列番号１の２３位でのアミノ酸置換、配列番号１の２５位でのアミノ酸置換、配列番号１の８０位でのアミノ酸置換、配列番号１の２０５位でのアミノ酸置換、および／もしくは配列番号１の２０７位でのアミノ酸置換；
ｂ）  配列番号３の２１位でのアミノ酸置換、配列番号３の２３位でのアミノ酸置換、および／もしくは配列番号３の２４位でのアミノ酸置換；または
ｃ）  配列番号４の２１位でのアミノ酸置換、配列番号４の２３位でのアミノ酸置換、配列番号４の２５位でのアミノ酸置換、配列番号４の８０位でのアミノ酸置換、および／もしくは配列番号４の２０７位でのアミノ酸置換
を含む、実施態様４２から７１のいずれか一項に記載のポリペプチド、連続ポリペプチド、またはヘテロ二量体タンパク質。
実施態様７３．  変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチド、第１の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドおよび／または第２の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、
ａ）  配列番号１の２１位に対応する位置にスレオニン、配列番号１の２３位に対応する位置にロイシン、配列番号１の２５位に対応する位置にアラニン、配列番号１の８０位に対応する位置にグリシン、配列番号１の２０５位に対応する位置にアラニン、および／もしくは配列番号１の２０７位に対応する位置にヒスチジン；
ｂ）  配列番号３の２１位に対応する位置にスレオニン、配列番号３の２３位に対応する位置にロイシン、および／もしくは配列番号３の２４位に対応する位置にイソロイシン；または
ｃ）  配列番号４の２１位に対応する位置にスレオニン、配列番号４の２３位に対応する位置にロイシン、配列番号４の２５位に対応する位置にアラニン、配列番号４の８０位に対応する位置にグリシン、および／もしくは配列番号４の２０７位に対応する位置にヒスチジン
を含む、実施態様４２から７２のいずれか一項に記載のポリペプチド、連続ポリペプチド、またはヘテロ二量体タンパク質。
実施態様７４．  変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチド、第１の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドおよび／または第２の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、
ａ）  配列番号１の２１位にスレオニン、配列番号１の２３位にロイシン、配列番号１の２５位にアラニン、配列番号１の８０位にグリシン、配列番号１の２０５位にアラニン、および／もしくは配列番号１の２０７位にヒスチジン；
ｂ）  配列番号３の２１位にスレオニン、配列番号３の２３位にロイシン、および／もしくは配列番号３の２４位にイソロイシン；または
ｃ）  配列番号４の２１位にスレオニン、配列番号４の２３位にロイシン、配列番号４の２５位にアラニン、配列番号４の８０位にグリシン、および／もしくは配列番号４の２０７位にヒスチジン
を含む、実施態様４２から７３のいずれか一項に記載のポリペプチド、連続ポリペプチド、またはヘテロ二量体タンパク質。
実施態様７５．  変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチド、第１の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドおよび／または第２の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、野生型ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対して少なくとも１つの追加のアミノ酸修飾を含み、かつ、野生型ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対してＣＤ１６への結合親和性が減少している、実施態様４２から７４のいずれか一項に記載のポリペプチド、連続ポリペプチド、またはヘテロ二量体タンパク質。
実施態様７６．  変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチド、第１の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドおよび／または第２の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、
ａ）  配列番号２の５位に対応する位置でのアミノ酸置換、配列番号２の３８位に対応する位置でのアミノ酸置換、配列番号２の３９位に対応する位置でのアミノ酸置換、配列番号２の９７位に対応する位置でのアミノ酸置換、および／もしくは配列番号２の９８位に対応する位置でのアミノ酸置換；または
ｂ）  配列番号３の５位に対応する位置でのアミノ酸置換、配列番号３の３８位に対応する位置でのアミノ酸置換、配列番号３の３９位に対応する位置でのアミノ酸置換、配列番号３の９７位に対応する位置でのアミノ酸置換、および／もしくは配列番号３の９８位に対応する位置でのアミノ酸置換
を含む、実施態様４２から７５のいずれか一項に記載のポリペプチド、連続ポリペプチド、またはヘテロ二量体タンパク質。
実施態様７７．  変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチド、第１の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドおよび／または第２の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、
ａ）  配列番号２の５位でのアミノ酸置換、配列番号２の３８位でのアミノ酸置換、配列番号２の３９位でのアミノ酸置換、配列番号２の９７位でのアミノ酸置換、および／もしくは配列番号２の９８位でのアミノ酸置換；または
ｂ）  配列番号３の５位でのアミノ酸置換、配列番号３の３８位でのアミノ酸置換、配列番号３の３９位でのアミノ酸置換、配列番号３の９７位でのアミノ酸置換、および／もしくは配列番号３の９８位でのアミノ酸置換
を含む、実施態様４２から７６のいずれか一項に記載のポリペプチド、連続ポリペプチド、またはヘテロ二量体タンパク質。
実施態様７８．  変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチド、第１の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドおよび／または第２の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、
ａ）  配列番号２の５位に対応する位置にプロリン、配列番号２の３８位に対応する位置にグリシン、配列番号２の３９位に対応する位置にアルギニン、配列番号２の９７位に対応する位置にイソロイシン、および／もしくは配列番号２の９８位に対応する位置にグリシン；または
ｂ）  配列番号３の５位に対応する位置にプロリン、配列番号３の３８位に対応する位置にグリシン、配列番号３の３９位に対応する位置にアルギニン、配列番号３の９７位に対応する位置にイソロイシン、および／もしくは配列番号３の９８位に対応する位置にグリシン
を含む、実施態様４２から７７のいずれか一項に記載のポリペプチド、連続ポリペプチド、またはヘテロ二量体タンパク質。
実施態様７９．  変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチド、第１の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドおよび／または第２の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、
ａ）  配列番号２の５位にプロリン、配列番号２の３８位にグリシン、配列番号２の３９位にアルギニン、配列番号２の９７位にイソロイシン、および／もしくは配列番号２の９８位にグリシン；または
ｂ）  配列番号３の５位にプロリン、配列番号３の３８位にグリシン、配列番号３の３９位にアルギニン、配列番号３の９７位にイソロイシン、および／もしくは配列番号３の９８位にグリシン
を含む、実施態様４２から７８のいずれか一項に記載のポリペプチド、連続ポリペプチド、またはヘテロ二量体タンパク質。
実施態様８０．  変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチド、第１の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドおよび／または第２の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、野生型イヌＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対する少なくとも１つの追加のアミノ酸修飾を含み、かつ、野生型イヌＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対してＣ１ｑへの結合親和性が減少している、実施態様４２から７９のいずれか一項に記載のポリペプチド、連続ポリペプチド、またはヘテロ二量体タンパク質。
実施態様８１．  変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチド、第１の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドおよび／または第２の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、配列番号２の９３位に対応する位置でのアミノ酸置換、または配列番号３の９３位に対応する位置でのアミノ酸置換を含む、実施態様４２から８０のいずれか一項に記載のポリペプチド、連続ポリペプチド、またはヘテロ二量体タンパク質。
実施態様８２．  変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチド、第１の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドおよび／または第２の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、配列番号２の９３位でのアミノ酸置換、または配列番号３の９３位でのアミノ酸置換を含む、実施態様４２から８１のいずれか一項に記載のポリペプチド、連続ポリペプチド、またはヘテロ二量体タンパク質。
実施態様８３．  変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチド、第１の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドおよび／または第２の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、配列番号２の９３位に対応する位置にアルギニンを、または配列番号３の９３位に対応する位置にアルギニンを含む、実施態様４２から８２のいずれか一項に記載のポリペプチド、連続ポリペプチド、またはヘテロ二量体タンパク質。
実施態様８４．  変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチド、第１の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドおよび／または第２の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが、配列番号２の９３位にアルギニンを、または配列番号３の９３位にアルギニンを含む、実施態様４２から８３のいずれか一項に記載のポリペプチド、連続ポリペプチド、またはヘテロ二量体タンパク質。
実施態様８５．  ポリペプチドが抗体、抗体融合体または融合ポリペプチドである、実施態様１から８４のいずれか一項に記載のポリペプチド、連続ポリペプチド、またはヘテロ二量体タンパク質。
実施態様８６．
ａ）  第１のグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ１）ポリペプチド（ＧＬＰ１Ａ）；
ｂ）  第１のリンカー（Ｌ１）；
ｃ）  コンパニオンアニマル種のＦｃポリペプチド（Ｆｃ）；
ｄ）  場合により第２のリンカー（Ｌ２）；および
ｅ）  場合により第２のＧＬＰ１ポリペプチド（ＧＬＰ１Ｂ）
を含む、連続ポリペプチド。
実施態様８７．
式（Ｉ）：ＧＬＰ１Ａ-Ｌ１-Ｆｃ；または
式（ＩＩ）：Ｆｃ-Ｌ１-ＧＬＰ１Ａ
を含む、実施態様６５に記載の連続ポリペプチド。
実施態様８８．
式（ＩＩＩ）：ＧＬＰ１Ａ-Ｌ１-Ｆｃ-Ｌ２-ＧＬＰ１Ｂ
を含む、実施態様６５に記載の連続ポリペプチド。
実施態様８９．  ＧＬＰ１Ｂが、存在する場合、ＧＬＰ１Ａと同じアミノ酸配列を含む、実施態様８６から８８のいずれか一項に記載の連続ポリペプチド。
実施態様９０．
ａ）  グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ１）ポリペプチド；
ｂ）  第１のリンカー（Ｌ１）；
ｃ）  Ｆｃポリペプチド（Ｆｃ）；
ｄ）  第２のリンカー（Ｌ２）；および
ｅ）  グルカゴンポリペプチド（Ｇｌｕｃ）
を含む、連続ポリペプチド。
実施態様９１．
式（ＩＶ）：ＧＬＰ１-Ｌ１-Ｆｃ-Ｌ２-Ｇｌｕｃ；または
式（Ｖ）：Ｇｌｕｃ-Ｌ１-Ｆｃ-Ｌ２-ＧＬＰ１
を含む、実施態様９０に記載の連続ポリペプチド。
実施態様９２．  ＧＬＰ１Ａ、ＧＬＰ１および／またはＧＬＰ１Ｂが、存在する場合、野生型ＧＬＰ１ポリペプチドを含む、実施態様８６から９１のいずれか一項に記載の連続ポリペプチド。
実施態様９３．  ＧＬＰ１Ａ、ＧＬＰ１および／またはＧＬＰ１Ｂが、存在する場合、変異体ＧＬＰ１ポリペプチドを含む、実施態様８６から９２のいずれか一項に記載の連続ポリペプチド。
実施態様９４．  ＧＬＰ１Ａ、ＧＬＰ１および／またはＧＬＰ１Ｂが、存在する場合、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号９８または配列番号９９のアミノ酸配列を含む、実施態様８６から９３のいずれか一項に記載の連続ポリペプチド。
実施態様９５．  グルカゴンポリペプチドが野生型グルカゴンポリペプチドを含み、場合により配列番号２１のアミノ酸配列を含む、実施態様８６から９４のいずれか一項に記載の連続ポリペプチド。
実施態様９６．  グルカゴンポリペプチドが変異体グルカゴンポリペプチドである、実施態様８６から９５のいずれか一項に記載の連続ポリペプチド。
実施態様９７．  ＦｃポリペプチドがヒトＩｇＧ  Ｆｃである、実施態様８６から９６のいずれか一項に記載の連続ポリペプチド。
実施態様９８．  ＦｃポリペプチドがヒトＩｇＧ１  Ｆｃ、ＩｇＧ２  Ｆｃ、ＩｇＧ３  ＦｃまたはＩｇＧ４  Ｆｃである、実施態様８６から９７のいずれか一項に記載の連続ポリペプチド。
実施態様９９．  Ｆｃポリペプチドがコンパニオンアニマル種のＦｃである、実施態様８６から９８のいずれか一項に記載の連続ポリペプチド。
実施態様１００．  Ｆｃポリペプチドが、
ａ）  イヌＩｇＧ−Ａ  Ｆｃ、ＩｇＧ−Ｂ  Ｆｃ、ＩｇＧ−Ｃ  ＦｃもしくはＩｇＧ−Ｄ  Ｆｃ；
ｂ）  ウマＩｇＧ１  Ｆｃ、ＩｇＧ２  Ｆｃ、ＩｇＧ３  Ｆｃ、ＩｇＧ４  Ｆｃ、ＩｇＧ５  Ｆｃ、ＩｇＧ６  ＦｃもしくはＩｇＧ７  Ｆｃ；または
ｃ）  ネコＩｇＧ１ａ  Ｆｃ、ＩｇＧ１ｂ  ＦｃまたはＩｇＧ２  Ｆｃ
を含む、実施態様８６から９７のいずれか一項または９９に記載の連続ポリペプチド。
実施態様１０１．  Ｆｃポリペプチドが野生型ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドである、実施態様８６から１００のいずれか一項に記載の連続ポリペプチド。
実施態様１０２．  Ｆｃポリペプチドが変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドである、実施態様８６から１００のいずれか一項に記載の連続ポリペプチド。
実施態様１０３．  Ｆｃポリペプチドが実施態様１から８４のいずれか一項に記載のポリペプチド、連続ポリペプチド、またはヘテロ二量体タンパク質を含む、実施態様８６から１０２のいずれか一項に記載の連続ポリペプチド。
実施態様１０４．  野生型ＧＬＰ１ポリペプチドよりも長い血清半減期を有する、実施態様８５から１０２のいずれか一項に記載の連続ポリペプチド。
実施態様１０５．  Ｌ１およびＬ２が、存在する場合、それぞれ独立に、柔軟なリンカーである、実施態様８６から１０４のいずれか一項に記載の連続ポリペプチド。
実施態様１０６．  Ｌ１およびＬ２のアミノ酸配列が、存在する場合、それぞれ独立に、１００％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％のセリンおよび／またはグリシンアミノ酸残基を含む、実施態様８６から１０５のいずれか一項に記載の連続ポリペプチド。
実施態様１０７．  Ｃ末端に伸長部を含む、実施態様８６から１０６のいずれか一項に記載の連続ポリペプチド。
実施態様１０８．  １つのグリシン残基、２つのグリシン残基、３つのグリシン残基、４つのグリシン残基、５つのグリシン残基、６つのグリシン残基、７つのグリシン残基、８つのグリシン残基、または８つを上回るグリシン残基をＣ末端に含む、実施態様８６から１０７のいずれか一項に記載の連続ポリペプチド。
実施態様１０９．  配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４または配列番号９５のアミノ酸配列をＣ末端に含む、実施態様８６から１０８のいずれか一項に記載の連続ポリペプチド。
実施態様１１０．
ａ）  配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号９６、配列番号９７、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、もしくは配列番号１０６のアミノ酸配列；または
ｂ）  配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、もしくは配列番号５９のアミノ酸配列
を含む、実施態様８６から１０９のいずれか一項に記載の連続ポリペプチド。
実施態様１１１．  配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号９６、配列番号９７、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５または配列番号１０６のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
実施態様１１２．  少なくとも１つのアミノ酸修飾または置換が、アミノ酸誘導体によるアミノ酸置換を含む、実施態様１から１１１のいずれか一項に記載のポリペプチド、ヘテロ二量体タンパク質または連続ポリペプチド。
実施態様１１３．  実施態様１から１１２のいずれか一項に記載のポリペプチド、ヘテロ二量体タンパク質または連続ポリペプチドをコードする、単離された核酸。
実施態様１１４．  実施態様１１３に記載の核酸を含む宿主細胞。
実施態様１１５．  実施態様１１４に記載の宿主細胞を培養することと、ポリペプチドを単離することとを含む、ポリペプチドを製造する方法。
実施態様１１６．  実施態様１から１１２のいずれか一項に記載のポリペプチド、ヘテロ二量体タンパク質または連続ポリペプチドと薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
実施態様１１７．  細胞におけるｃＡＭＰの産生を増加させる方法であって、ポリペプチド、ヘテロ二量体タンパク質または連続ポリペプチドのＧＬＰ１Ｒへの結合を許容する条件下で、実施態様１から１１２のいずれか一項または１１６に記載のポリペプチド、ヘテロ二量体タンパク質、連続ポリペプチドまたは薬学的組成物に細胞を曝露することを含む、方法。
実施態様１１８．  細胞がｅｘ  ｖｉｖｏでポリペプチド、ヘテロ二量体タンパク質、連続ポリペプチドまたは薬学的組成物に曝露される、実施態様１１７に記載の方法。
実施態様１１９．  細胞がｉｎ  ｖｉｖｏでポリペプチド、ヘテロ二量体タンパク質、連続ポリペプチドまたは薬学的組成物に曝露される、実施態様１１７に記載の方法。
実施態様１２０．  細胞がヒト細胞、イヌ細胞、ネコ細胞またはウマ細胞である、実施態様１１８から１１９のいずれか一項に記載の方法。
実施態様１２１．  実施態様１から１１２のいずれか一項または１１６に記載のポリペプチド、ヘテロ二量体タンパク質、連続ポリペプチドまたは薬学的組成物を非経口投与することを含む、ポリペプチドを対象に送達する方法。
実施態様１２２．  実施態様１から１１２のいずれか一項または１１６に記載のポリペプチド、ヘテロ二量体タンパク質、連続ポリペプチドまたは薬学的組成物を筋肉内経路、腹腔内経路、脳脊髄内経路、皮下経路、動脈内経路、滑膜内経路、髄腔内経路または吸入経路で投与することを含む、ポリペプチドを対象に送達する方法。
実施態様１２３．  糖尿病または肥満を有する対象を治療する方法であって、実施態様１から１１２のいずれか一項または１１６に記載のポリペプチド、ヘテロ二量体タンパク質、連続ポリペプチドまたは薬学的組成物の治療的有効量を対象に投与することを含む、方法。
実施態様１２４．  インスリン、ＤＰＰ４阻害剤、ＳＧＬＴ２阻害剤、ビグアニド類、スルホニル尿素、メグリチニド誘導体（ａ  ｂｉｇｕａｎｉｄｅｓ  ｓｕｌｆｏｎｙｌｕｒｅａｓ  ｍｅｇｌｉｔｉｎｉｄｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）、アルファ−グルコシダーゼ阻害剤、チアゾリジンジオン（ＴＺＤ）、アミリノミメティック、胆汁酸封鎖剤、ドーパミンアゴニストを投与することを含む、実施態様１２３に記載の方法。
実施態様１２５．  対象がヒトの対象である、実施態様１２１から１２４のいずれか一項に記載の方法。
実施態様１２６．  対象がコンパニオンアニマル種である、実施態様１２１から１２４のいずれか一項に記載の方法。
実施態様１２７．  コンパニオンアニマル種がイヌ、ウマまたはネコである、実施態様１２６に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】イヌＩｇＧ−Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤ  Ｆｃ配列のアラインメントを示す。ボックスは、プロテインＡと接触する可能性が高い領域を示している。
【図２Ａ−Ｂ】図２Ａは、還元剤（ＤＴＴ）の非存在下および存在下で１つのジスルフィド結合を持つ、野生型ネコＩｇＧ２ヒンジを有するＧＬＰ１−Ｇ８／ＧＬＰ−２Ｇ＿ＩＩＩ＿ＷＴｆｅＩｇＧ２（配列番号２３；この図の「ＧＬＰ１  Ａ変異体」）およびＧＬＰ１−Ｇ８＿Ｉ＿ＷＴｆｅＩｇＧ２（配列番号２４；この図の「ＧＬＰ１  Ｂ変異体」）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示している。    図２Ｂは、還元剤（ＤＴＴ）の非存在下および存在下で２つのジスルフィド結合を持つ、変異型ネコＩｇＧ２ヒンジを有するＧＬＰ１−Ｇ８＿Ｉ＿ＶＡＲｆｅＩｇＧ２（配列番号２６；この図の「ＧＬＰ１  ＭＢ変異体」）のＧＬＰ１−Ｇ８／ＧＬＰ−２Ｇ＿ＩＩＩ＿ＶＡＲｆｅＩｇＧ２（配列番号２５；この図の「ＧＬＰ１  ＭＡ変異体」）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示している。
【図３】図３は、コントロール（ＧＬＰ１（７−３７）およびＥｘｔｅｎｄｉｎ−４）と比較したＧＬＰ１−Ｇ８／ＧＬＰ１−２Ｇ＿ＩＩＩ＿ＶＡＲｆｅＩｇＧ２（配列番号２５）およびＧＬＰ１−Ｇ８＿Ｉ＿ＶＡＲｆｅＩｇＧ２（配列番号２６）の活性を評価するためのｃＡＭＰ  ＣＨＯ−Ｋ１  ＧＬＰ１Ｒバイオアッセイを示している。
【図４】ＣＨＯＫ１−ＧＬＰ１Ｒ細胞とｃＡＭＰ−ｇｌｏ（ｎ＝２）で１年間保管した後のＧＬＰ１−Ｇ８＿Ｉ＿ＶＡＲｆｅＩｇＧ２（配列番号２６）（この図の「ＧＬＰ１−Ｂ」）の活性を評価するための細胞ベースのバイオアッセイを示している。
【図５】血清中３７℃で２４時間（レーン１）、ＰＢＳ中３７℃で２４時間（レーン２）、ＰＢＳ中４℃で２４時間（レーン９）インキュベートした後のＧＬＰ１−Ｇ８＿Ｉ＿ＶＡＲｆｅＩｇＧ２（配列番号２６）（この図の「ＧＬＰ１Ｂ」）のウエスタンブロット分析を示している。マウス抗ＧＬＰ１抗体を使用した。
【図６】定量ＥＬＩＳＡで測定した、５匹の猫への皮下投与後の、血清中の経時的なＧＬＰ１−Ｇ８＿Ｉ＿ＶＡＲｆｅＩｇＧ２（配列番号２６）濃度のプロットである。
【図７】細胞ベースの活性アッセイで測定した、５匹の猫への皮下投与後の、血清中の経時的なＧＬＰ１−Ｇ８＿Ｉ＿ＶＡＲｆｅＩｇＧ２（配列番号２６）濃度のプロットである。０から１６８時間の平均ＡＵＣは約８４０μｇ（ｈ）／ｍＬで、平均ｔ１／２は３６時間であった。
【０００８】
配列の記載
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【発明を実施するための形態】
【０００９】
イヌ、ウマ、ネコなどのコンパニオンアニマルからの変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが記載されている。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、プロテインＡへの結合の増加、Ｃ１ｑへの結合の減少、ＣＤ１６への結合の減少、安定性の増加、組換え産生の増加、ヒンジジスルフィド形成の増加を有し、かつ／またはヘテロ二量体ポリペプチドを形成する。いくつかの実施態様では、抗体、抗体断片または融合タンパク質は、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドを含む。変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドを製造または精製する方法および変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドをコンパニオンアニマルに投与する方法もアッセイで提供される。
【００１０】
また、改善された血清半減期を有する１つまたは複数の変異体ＧＬＰ１ポリペプチドを含む連続ポリペプチドおよびヘテロ二量体ポリペプチドに関する様々な実施態様も提供される。いくつかの実施態様では、連続ポリペプチドまたはヘテロ二量体ポリペプチドは、ＧＬＰ１ポリペプチドおよびグルカゴンポリペプチドをＧＬＰ１受容体とグルカゴン受容体のデュアルアゴニストとして含む。いくつかの実施態様では、このようなポリペプチドは、イヌ、ネコおよびウマ等のコンパニオンアニマルにおける例えば糖尿病、肥満または関連する徴候を治療するために使用され得る。
【００１１】
読者の便宜のために、本明細書で使用される用語の以下の定義が提供される。
【００１２】
本明細書で使用する場合、ＫＤなどの数値用語は科学的測定に基づいて計算されるため、それなりの測定誤差の影響を受ける。場合によっては、数値用語には、最も近い有効数字に丸められた数値が含まれることがある。
【００１３】
本明細書で使用する場合、単数形（「ａ」または「ａｎ」）は、特に明記しない限り、「少なくとも１つ」または「１つ以上」を意味する。本明細書で使用する場合、「または」という用語は、特に明記しない限り「および／または」を意味する。多数項従属クレームの分脈では、他のクレームに戻って引用するときに「または」を使用して、択一的形式でのみ、それらのクレームを引用する。
【００１４】
例示的な変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチド
新規の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチド、例えば、プロテインＡへの結合の増加、Ｃ１ｑへの結合の減少のため、ＣＤ１６への結合の減少のため、安定性の増加のため、組換え生産の増加のため、ヒンジジスルフィド形成の増加のため、および／またはヘテロ二量体タンパク質アッセイを形成するための変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが提供される。
【００１５】
「アミノ酸配列」とは、ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸残基の配列を意味する。用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すために互換的に使用され、最小の長さに限定されない。そのようなアミノ酸残基のポリマーは、天然または非天然のアミノ酸残基を含んでもよく、アミノ酸残基のペプチド、オリゴペプチド、二量体、三量体および多量体が含まれるが、これらに限定されない。全長タンパク質とその断片の両方が定義に含まれる。これらの用語には、ポリペプチドの発現後修飾、例えばグリコシル化、シアリル化、アセチル化、リン酸化等も含まれる。さらに、本開示の場合、「ポリペプチド」は、タンパク質が所望の活性を維持する限り、天然配列に対する欠失、付加および（一般に、天然では保存的な）置換等の修飾を含むタンパク質を指す。これらの修飾は、部位特異的突然変異誘発によるなど意図的なものであっても、タンパク質を産生する宿主の突然変異またはＰＣＲ増幅に起因するエラーなどによる偶発的なものであってもよい。
【００１６】
「断片結晶性ポリペプチド」または「Ｆｃポリペプチド」は、エフェクター分子および細胞と相互作用する抗体分子の一部である。それは、免疫グロブリン重鎖のＣ末端部分で構成されている。本明細書で使用される場合、Ｆｃポリペプチドには、Ｆｃポリペプチド全体の１以上の生物活性を有する、Ｆｃドメインの断片が含まれる。いくつかの実施態様では、Ｆｃポリペプチドの生物活性は、ＦｃＲｎに結合する能力である。いくつかの実施態様では、Ｆｃポリペプチドの生物活性は、Ｃ１ｑに結合する能力である。いくつかの実施態様では、Ｆｃポリペプチドの生物活性は、ＣＤ１６に結合する能力である。いくつかの実施態様では、Ｆｃポリペプチドの生物活性は、プロテインＡに結合する能力である。Ｆｃポリペプチドの「エフェクター機能」は、刺激に応答して任意の抗体によって全体的または部分的に実行される作用または活性であり、補体結合および／またはＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害性）誘導を含む。
【００１７】
「ＩｇＸ  Ｆｃ」は、特定の抗体イソタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ等．）に由来するＦｃポリペプチドを指し、「Ｘ」は抗体アイソタイプを示す。したがって、「ＩｇＧ  Ｆｃ」はＦｃポリペプチドがγ鎖に由来することを示し、「ＩｇＡ  Ｆｃ」はＦｃポリペプチドがα鎖に由来することを示し、「ＩｇＤ  Ｆｃ」はＦｃポリペプチドがδ鎖に由来することを示し、「ＩｇＥ  Ｆｃ」はＦｃポリペプチドがε鎖に由来することを示し、「ＩｇＭ  Ｆｃ」はＦｃポリペプチドがμ鎖に由来すること等を示す。いくつかの実施態様では、ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドはヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３を含むが、ＣＨ１またはＣＬを含まない。いくつかの実施態様では、ＩｇＧ  ＦｃポリペプチドはＣＨ２およびＣＨ３を含むが、ＣＨ１、ヒンジまたはＣＬを含まない。いくつかの実施態様では、ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３を含み、ＣＬ．は、あることもないこともある。「ＩｇＸ−Ｎ  Ｆｃ」または「ＩｇＧＸＮ  Ｆｃ」（「Ｎ」はサブクラスを示す）は、Ｆｃポリペプチドが抗体アイソタイプの特定のサブクラス（例えば、イヌＩｇＧサブクラスＩｇＧ−Ａ、ＩｇＧ−Ｂ、ＩｇＧ−ＣもしくはＩｇＧ−Ｄ；ネコＩｇＧサブクラスＩｇＧ１ａ、ＩｇＧ１ｂもしくはＩｇＧ２；またはウマＩｇＧサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＧ５、ＩｇＧ６またはＩｇＧ７等）に由来することを示す。
【００１８】
「ヒンジ」とは、プロリンリッチであり、全長重鎖定常領域のＣＨ１とＣＨ２の間に位置する少なくとも１つのシステイン残基を含むＦｃポリペプチドまたは変異体Ｆｃポリペプチドの任意の部分を指す。
【００１９】
いくつかの実施態様では、ヒンジは、同じヒンジ領域内、同じＦｃポリペプチド内で、別個のＦｃポリペプチドのヒンジ領域と、または別個のＦｃポリペプチドとジスルフィド結合を形成することができる。いくつかの実施態様では、ヒンジは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０個のプロリン残基を含む。
【００２０】
「コンパニオンアニマル種」という用語は、人間のコンパニオンになるのに適した動物を指す。いくつかの実施態様では、コンパニオンアニマル種は、イヌ（ｃａｎｉｎｅまたはｄｏｇ）、ネコ（ｆｅｌｉｎｅまたはｃａｔ）、またはウマ（ｅｑｕｉｎｅまたはｈｏｒｓｅ）である。いくつかの実施態様では、コンパニオンアニマル種は、イヌ、ネコ、ウサギ、フェレット、モルモット、齧歯動物等の小型哺乳類である。いくつかの実施態様では、コンパニオンアニマル種は、ウマ、ウシ、ブタ等の家畜である。
【００２１】
いくつかの実施態様では、ＩｇＸ  ＦｃポリペプチドまたはＩｇＸ−Ｎ  Ｆｃポリペプチドは、イヌ、ネコ、ウマ等のコンパニオンアニマルに由来する。いくつかの実施態様では、ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、ＩｇＧ−Ａ、ＩｇＧ−Ｂ、ＩｇＧ−ＣまたはＩｇＧ−Ｄ等のイヌγ重鎖から単離される。いくつかの例では、ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、ＩｇＧ１ａ、ＩｇＧ１ｂまたはＩｇＧ２等のネコγ重鎖から単離される。いくつかの例では、ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＧ５、ＩｇＧ６またはＩｇＧ７等のウマγ重鎖から単離される。
【００２２】
「ＩｇＸ  Ｆｃ」および「ＩｇＸ  Ｆｃポリペプチド」という用語には、特に明記しない限り、野生型ＩｇＸ  Ｆｃポリペプチドおよび変異体ＩｇＸ  Ｆｃポリペプチドが含まれる。
【００２３】
「野生型」とは、自然界に存在するポリペプチドの非変異型またはその断片を指す。野生型ポリペプチドは、組換えにより産生されてもよい。
【００２４】
いくつかの実施態様では、野生型ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号１６、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号１００、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１１７、配列番号１１８のアミノ酸配列を含む。
【００２５】
「変異体」は、単一または複数の非天然アミノ酸置換、欠失および／または付加によって、基準ポリペプチドと異なっているポリペプチドである。いくつかの実施態様では、変異体は、基準ポリペプチドの少なくとも１つの生物活性を保持している。いくつかの実施態様では、変異体（例：変異体イヌＩｇＧ−Ａ  Ｆｃ、変異体イヌＩｇＧ−Ｃ  Ｆｃ、変異体イヌＩｇＧ−Ｄ  Ｆｃ、変異体ウマＩｇＧ２  Ｆｃ、変異体ウマＩｇＧ５  Ｆｃまたは変異体ウマＩｇＧ６  Ｆｃ）は、基準ポリペプチドが質的に欠く活性を有する。例えば、いくつかの実施態様では、変異体イヌＩｇＧ−Ａ  Ｆｃ、変異体イヌＩｇＧ−Ｃ  Ｆｃ、変異体イヌＩｇＧ−Ｄ  Ｆｃ、変異体ウマＩｇＧ２  Ｆｃ、変異体ウマＩｇＧ５  Ｆｃまたは変異体ウマＩｇＧ６  Ｆｃは、プロテインＡに結合する。
【００２６】
本明細書で使用される場合、核酸分子またはポリペプチド配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」および「相同性」とは、配列を整列させ、最大の配列同一性パーセントを得るために必要に応じてギャップを導入した後の、特定の核酸分子またはポリペプチド配列中の核酸またはアミノ酸残基と同一である、基準配列中の核酸またはアミノ酸残基のパーセンテージであり、いかなる保存的置換も配列同一性の一部とは考えない。配列同一性パーセントを決定するためのアラインメントは、当業者の範囲内の様々な方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、またはＭＥＧＡＬＩＮＥＴＭ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア等の公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して、達成することができる。当業者であれば、比較する配列の全長にわたって最大のアライメントを得るのに必要な任意のアルゴリズムを含めた、アライメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。
【００２７】
いくつかの実施態様では、変異体は、配列を整列させ、最大の配列同一性パーセントを得るために必要に応じてギャップを導入した後、いかなる保存的置換も配列同一性の一部とは考えず、基準核酸分子またはポリペプチドと少なくとも約５０％の配列同一性を有する。このような変異体は、例えば、ポリペプチドのＮまたはＣ末端において１つまたは複数のアミノ酸残基が付加、削除されているポリペプチドを含む。いくつかの実施態様では、変異体は、基準核酸またはポリペプチドと、少なくとも約５０％の配列同一性、少なくとも約６０％の配列同一性、少なくとも約６５％の配列同一性、少なくとも約７０％の配列同一性、少なくとも約７５％の配列同一性、少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約８５％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、少なくとも約９５％の配列同一性、少なくとも約９７％の配列同一性、少なくとも約９８％の配列同一性、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。
【００２８】
「点突然変異」とは、１つのアミノ酸残基が関与する突然変異である。突然変異は、アミノ酸の喪失、あるアミノ酸残基の別のアミノ酸残基への置換、または追加のアミノ酸残基の挿入であり得る。
【００２９】
「アミノ酸置換」とは、ポリペプチド内の１つのアミノ酸を別のアミノ酸に置き換えることを指す。いくつかの実施態様では、アミノ酸置換は、保存的置換である。非限定的且つ例示的な保存的アミノ酸置換を表２に示す。アミノ酸置換を目的の分子に導入し、その生成物を所望の活性、例えば保持／改善された抗原結合、低下した免疫原性、または改善されたＡＤＣＣもしくはＣＤＣ、または改善された薬物動態についてスクリーニングすることができる。
【００３０】
表２
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【００３１】
アミノ酸は共通の側鎖特性に従ってグループ化することができる。
（１）  疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）  中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）  酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）  塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）  鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）  芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【００３２】
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つの要素を別のクラスの要素と交換することを必然的に伴うものである。
【００３３】
本明細書で使用される「変異体ＩｇＧ  Ｆｃ」は、単一または複数のミノ酸置換、欠失および／または付加によって、基準ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドと異なっており、実質的に基準ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドの少なくとも１つの生物活性を保持するＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドである。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「アミノ酸誘導体」とは、ヒトに見られる２０種の一般的な天然アミノ酸の１つではない、任意のアミノ酸、修飾アミノ酸、および／またはアミノ酸類似体を指す。例示的なアミノ酸誘導体には、ヒトには見られない天然アミノ酸（例えば、一部の微生物に見られるセレノシステインおよびピロリジン）および非天然アミノ酸が含まれる。例示的なアミノ酸誘導体には、化学製品製造業者から市販されているアミノ酸誘導体が含まれるが、それに限定されない（例：参照により本明細書に組み込まれるｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ／ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ．ｈｔｍｌ？ＴａｂｌｅＰａｇｅ＝１６２７４９６５、２０１７年５月６日にアクセス）。宿主細胞、真正細菌シンテターゼに由来する直交アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ、直交ｔＲＮＡｓ、およびアミノ酸誘導体を利用する翻訳系を使用して、特定の位置で１つまたは複数のアミノ酸誘導体をポリペプチドに組み込むことができる。さらなる説明は、例えば米国特許第９６２４４８５号を参照のこと。
【００３５】
いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、アミノ酸誘導体によるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施態様では、アミノ酸誘導体は、アラニン誘導体、システイン誘導体、アスパラギン酸誘導体、グルタミン酸誘導体、フェニルアラニン誘導体、グリシン誘導体、ヒスチジン誘導体、イソロイシン誘導体、リジン誘導体、ロイシン誘導体、メチオニン誘導体、アスパラギン誘導体、プロリン誘導体、グルタミン誘導体、アルギニン誘導体、セリン誘導体、スレオニン誘導体、バリン誘導体、トリプトファン誘導体、またはチロシン誘導体である。
【００３６】
いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、コンパニオンアニマル種の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドを含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、変異体イヌＩｇＧ  Ｆｃポリペプチド、変異体ウマＩｇＧ  Ｆｃポリペプチド、またはネコＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドを含む。
【００３７】
改変型プロテインＡ結合を有する例示的な変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチド
いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、改変型プロテインＡ結合親和性を有する。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、プロテインＡへの増加した結合親和性を有する。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、プロテインＡカラムクロマトグラフィーを用いて精製され得る。
【００３８】
いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号１の２１位、２３位、２５位、８０位、２０５位および／または２０７位に対応する位置にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号３の２１位、２３位および／または２４位に対応する位置にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号４の２１位、２３位、２５位、８０位および／または２０７位に対応する位置にアミノ酸置換を含む。
【００３９】
いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号６４の１５位および／または２０３位に対応する位置にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号６７の１９９位および／または２００位に対応する位置にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号６８の１９９位、２００位、２０１位および／または２０２位に対応する位置にアミノ酸置換を含む。
【００４０】
いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号１の２１位、２３位、２５位、８０位、２０５位および／または２０７位にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号３の２１位、２３位および／または２４位にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号３の２１位、２３位、２５位、８０位および／または２０７位にアミノ酸置換を含む。
【００４１】
いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号６４の１５位および／または２０３位にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号６７の１９９位、２３位および／または２００位にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号６８の１９９位、２００位、２０１位および／または２０２位にアミノ酸置換を含む。
【００４２】
いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号１の２１位に対応する位置にスレオニン、配列番号１の２３位に対応する位置にロイシン、配列番号１の２５位に対応する位置にアラニン、配列番号１の８０位に対応する位置にグリシン、配列番号１の２０５位に対応する位置にアラニン、および／または配列番号１の２０７位に対応する位置にヒスチジンを含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号３の２１位に対応する位置にスレオニン、配列番号３の２３位に対応する位置にロイシン、および／または配列番号３の２４位に対応する位置にイソロイシンを含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号４の２１位に対応する位置にスレオニン、配列番号４の２３位に対応する位置にロイシン、配列番号４の２５位に対応する位置にアラニン、配列番号３の８０位に対応する位置にグリシン、および／または配列番号４の２０７位に対応する位置にヒスチジンを含む。
【００４３】
いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号６４の１５位に対応する位置にスレオニンもしくはバリン、および／または配列番号６４の２０３位に対応する位置にチロシンもしくはバリンを含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号６７の１９９位に対応する位置にロイシン、および／または配列番号６７の２００位に対応する位置にヒスチジンを含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号６８の１９９位に対応する位置にイソロイシン、配列番号６８の２００位に対応する位置にヒスチジン、配列番号６８の２０１位に対応する位置にアスパラギン、および／または配列番号６８の２０２位に対応する位置にヒスチジンを含む。
【００４４】
いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号１の２１位にスレオニン、配列番号１の２３位にロイシン、配列番号１の２５位にアラニン、配列番号１の８０位にグリシン、配列番号１の２０５位にアラニン、および／または配列番号１の２０７位にヒスチジンを含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号３の２１位にスレオニン、配列番号３の２３位にロイシン、および／または配列番号３の２４位にイソロイシンを含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号４の２１位にスレオニン、配列番号４の２３位にロイシン、配列番号４の２５位にアラニン、配列番号４の８０位にグリシン、および／または配列番号４の２０７位にヒスチジンを含む。
【００４５】
いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号６４の１５位にスレオニンもしくはバリン、および／または配列番号６４の２０３位にチロシンもしくはバリンを含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号６７の１９９位にロイシン、および／または配列番号６７の２００位にヒスチジンを含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号６８の１９９位にイソロイシン、配列番号６８の２００位にヒスチジン、配列番号６８の２０１位にアスパラギン、および／または配列番号６８の２０２位にヒスチジンを含む。
【００４６】
いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２または配列番号８４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号１９、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７５または配列番号７６を含む。
【００４７】
改変型ＣＤ１６結合を有する例示的な変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチド
いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、改変型ＣＤ１６結合親和性を有する。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、ＣＤ１６への低下した結合親和性を有する。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃは、低下したＡＤＣＣ免疫応答を有し得る。
【００４８】
いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号２の５位、３８位、３９位、９７位および／または９８位に対応する位置にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号３の５位、３８位、３９位、９７位および／または９８位に対応する位置にアミノ酸置換を含む。
【００４９】
いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号２の５位、３８位、３９位、９７位および／または９８位にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号３の５位、３８位、３９位、９７位および／または９８位にアミノ酸置換を含む。
【００５０】
いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号２の５位に対応する位置にプロリン、３８位に対応する位置にグリシン、３９位に対応する位置にアルギニン、９７位に対応する位置にイソロイシン、および／または９８位に対応する位置にグリシンを含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号３の５位に対応する位置にプロリン、３８位に対応する位置にグリシン、３９位に対応する位置にアルギニン、９７位に対応する位置にイソロイシン、および／または９８位に対応する位置にグリシンを含む。
【００５１】
いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号２の５位にプロリン、３８位にグリシン、３９位にアルギニン、９７位にイソロイシン、および／または９８位にグリシンを含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号３の５位にプロリン、３８位にグリシン、３９位にアルギニン、９７位にイソロイシン、および／または９８位にグリシンを含む。
【００５２】
いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６または配列番号１５７のアミノ酸配列を含む。
【００５３】
改変型Ｃ１ｑ結合を有する例示的な変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチド
いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、改変型Ｃ１ｑ結合親和性を有する。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、Ｃ１ｑへの低下した結合親和性を有する。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、低下した補体結合を有し得る。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃは、低下した補体媒介性免疫応答を有し得る。
【００５４】
いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号２の９３位に対応する位置にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号３の９３位に対応する位置にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号６３の８７位に対応する位置にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号６５の８７位に対応する位置にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号６６の８７位に対応する位置にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号８０の１９８位に対応する位置にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号８１の１９８位に対応する位置にアミノ酸置換を含む。
【００５５】
いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号２の９３位にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号３の９３位にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号６３の８７位にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号６５の８７位にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号６６の８７位にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号８０の１９８位にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号８１の１９８位にアミノ酸置換を含む。
【００５６】
いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号２の９３位に対応する位置にアルギニンを含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号３の９３位に対応する位置にアルギニンを含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号６３の８７位に対応する位置にセリンを含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号６５の８７位に対応する位置にセリン置換を含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号６６の８７位に対応する位置にセリンを含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号８０の１９８位に対応する位置にアラニンンを含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号８１の１９８位に対応する位置にアラニンを含む。
【００５７】
いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号２の９３位にアルギニンを含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号３の９３位にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号６３の８７位に対応するセリンを含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号６５の８７位にセリンを含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号６６の８７位にセリンを含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号８０の１９８位にアラニンを含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号８１の１９８位にアラニンを含む。
【００５８】
いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号７８、配列番号７９または配列番号８４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号７０、配列番号７３、配列番号７４または配列番号７７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号８２または配列番号８３アミノ酸配列を含む。
【００５９】
改変型鎖間ジスルフィド結合を有する例示的な変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチド
いくつかの実施態様では、変異体ネコＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、野生型ネコＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対して少なくとも１つの追加の鎖間ジスルフィド結合を有する。いくつかの実施態様では、変異体ネコＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、ヒンジ領域に少なくとも１つの追加の鎖間ジスルフィド結合を有する。いくつかの実施態様では、少なくとも１つの追加の鎖間ジスルフィド結合を有する変異体ネコＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、野生型ネコＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対して増加した鎖間安定性を有する。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、野生型ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対するヒンジ領域への少なくとも１つのアミノ酸修飾を有する。いくつかの実施態様では、野生型ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、野生型ネコまたはウマＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドである。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、異なるアイソタイプのＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドのヒンジ領域またはヒンジ領域の一部を含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、野生型ネコＩｇＧ−１ａ  Ｆｃポリペプチドの、野生型ネコＩｇＧ−１ｂ  Ｆｃポリペプチドの、または野生型ウマＩｇＧ１  Ｆｃポリペプチドのヒンジ領域を含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ２  Ｆｃポリペプチドは、野生型ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対して、組換え産生の増加および／またはヒンジジスルフィド形成の増加を有する。いくつかの実施態様では、組換え産生の増加および／またはヒンジジスルフィド形成の増加は、還元および／または非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって決定することができる。
【００６０】
いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号１６の８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位または１６位に対応する位置にシステインを含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号１６の８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位または１６位にシステインを含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号１７を含む。
【００６１】
いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号１６、配列番号８０、配列番号８１、配列番号１１７または配列番号１１８の１６位対応する位置にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号１２９の３位に対応する位置および／または２０位に対応する位置にアミノ酸置換を含む。
【００６２】
いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号１６、配列番号８０、配列番号８１、配列番号１１７または配列番号１１８の１６位にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号１２９の３位に、および／または２０位に対応する位置にアミノ酸置換を含む。
【００６３】
いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号１６、配列番号８０、配列番号８１、配列番号１１７または配列番号１１８の１６位対応する位置にプロリンを含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号１２９の３位に対応する位置にセリン、および／または２０位に対応する位置にプロリンを含む。
【００６４】
いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号１６、配列番号８０、配列番号８１、配列番号１１７または配列番号１１８の１６位にプロリンを含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号１２９の３位にセリン、および／または２０位にプロリンを含む。
【００６５】
いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号１９、配列番号１２５または配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５を含む。
【００６６】
ヘテロ二量体ポリペプチドの例示的な変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチド
ある実施態様において、本明細書で提供されるヘテロ二量体ポリペプチドは、二重特異性抗体である。二重特異性抗体は、２つの異なるエピトープまたは標的分子に対して結合特異性を有する。いくつかの実施態様では、二重特異性抗体は、同じ標的分子の２つの異なるエピトープに結合する。二重特異性抗体は、完全長抗体または抗体断片であってもよい。
【００６７】
いくつかの実施態様では、ヘテロ二量体ポリペプチドは、「ノブ」突然変異を含む第１の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドと、「ホール」突然変異を含む第２の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドとを含む。非限定的かつ例示的なノブおよびホールの突然変異は、例えば、Merchant, A. M. et al. An efficient route to human bispecific IgG. Nat Biotechnol, 16(7):677-81 (1998)に記載されている。
【００６８】
いくつかの実施態様では、変異体イヌまたは変異体ネコＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、ノブ突然変異を含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号１の１３８位に対応する位置にチロシンまたはトリプトファンを含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号２の１３７位に対応する位置にチロシンまたはトリプトファンを含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号３の１３７位に対応する位置にチロシンまたはトリプトファンを含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号４の１３８位に対応する位置にチロシンまたはトリプトファンを含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号１６、配列番号８０、配列番号８１、配列番号１１７または配列番号１１８の１５４位対応する位置にトリプトファンを含む。
【００６９】
いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号１の１３８位にチロシンまたはトリプトファンを含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号２の１３７位にチロシンまたはトリプトファンを含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号３の１３７位にチロシンまたはトリプトファンを含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号４の１３８位にチロシンまたはトリプトファンを含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号１６、配列番号８０、配列番号８１、配列番号１１７または配列番号１１８の１５４位にトリプトファンを含む。
【００７０】
いくつかの実施態様では、ノブ突然変異を含む変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１９、配列番号１２１または配列番号１２３のアミノ酸配列を含む。
【００７１】
いくつかの実施態様では、変異体イヌまたは変異体ネコ  ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、ホール突然変異を含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号１の１３８位に対応する位置にセリン、１４０位に対応する位置にアラニン、および／または１８１位に対応する位置にスレオニンを含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号２の１３７位に対応する位置にセリン、１３９位に対応する位置にアラニン、および／または１８０位に対応する位置にスレオニンを含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号３の１３７位に対応する位置にセリン、１３９位に対応する位置にアラニン、および／または１８０位に対応する位置にスレオニンを含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号４の１３８位に対応する位置にセリン、１４０位に対応する位置にアラニン、および／または１８１位に対応する位置にスレオニンを含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号１６、配列番号８０、配列番号８１、配列番号１１７または配列番号１１８の１５４位に対応する位置にセリン、１５６位に対応する位置にアラニン、および／または１９７位に対応する位置にスレオニンを含む。
【００７２】
いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号１の１３８位にセリン、１４０位にアラニン、および／または１８１位にスレオニンを含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号２の１３７位にセリン、１３９位にアラニン、および／または１８１位にスレオニンを含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号３の１３７位にセリン、１３９位にアラニン、および／または１８１位にスレオニンを含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号４の１３８位にセリン、１４０位にアラニン、および／または１８１位にスレオニンを含む。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号１６、配列番号８０、配列番号８１、配列番号１１７または配列番号１１８の１５４位にセリン、１５６位にアラニン、および／または１９７位にスレオニンを含む。
【００７３】
いくつかの実施態様では、ホール突然変異を含む変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１２０、配列番号１２２または配列番号１２４のアミノ酸配列を含む。
【００７４】
いくつかの実施態様では、連続ポリペプチドは、ＧＬＰ１ポリペプチドと、ノブ突然変異を含む変異体イヌまたはネコＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドとを含む。いくつかの実施態様では、連続ポリペプチドは、グルカゴンポリペプチドと、ノブ突然変異を含む変異体イヌまたはネコＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドとを含む。いくつかの実施態様では、連続ポリペプチドは、ＧＬＰ１ポリペプチドと、ホール突然変異を含む変異体イヌまたはネコＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドとを含む。いくつかの実施態様では、連続ポリペプチドは、グルカゴンポリペプチドと、ホール突然変異を含む変異体イヌまたはネコＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドとを含む。
【００７５】
いくつかの実施態様では、ヘテロ二量体ポリペプチドは、ＧＬＰ１ポリペプチドと、ノブ突然変異を含む変異体イヌまたはネコＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドとを含む第１の連続ポリペプチド、および、グルカゴンポリペプチドと、ホール突然変異を含む変異体イヌまたはネコｇＧ  Ｆｃポリペプチドとを含む第２の連続ポリペプチドを含む。いくつかの実施態様では、ヘテロ二量体ポリペプチドは、グルカゴンポリペプチドと、ノブ突然変異を含む変異体イヌまたはネコＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドとを含む第１の連続ポリペプチド、および、グルカゴンポリペプチドと、ホール突然変異を含む変異体イヌまたはネコｇＧ  Ｆｃポリペプチドとを含む第２の連続ポリペプチドを含む。
【００７６】
例示的なＧＬＰ１ポリペプチドおよびグルカゴンポリペプチド
本明細書で使用される「ＧＬＰ１」または「ＧＬＰ１ポリペプチド」は、グルカゴン様ペプチド１受容体（ＧＬＰ１Ｒ）に結合するグルカゴン様ペプチド１の全体または断片を含むポリペプチドである。
【００７７】
例えば、「ＧＬＰ１」は、霊長類（例：ヒトおよびカニクイザル）、げっ歯類（例：マウス、ラット）およびコンパニオンアニマル（例：特に明記しない限りイヌ、ネコ、ウマ）等の哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源からのＧＬＰ１ポリペプチドを指す。いくつかの実施態様では、ＧＬＰ１ポリペプチドは、ＧＬＰ１（７−３７）（配列番号８５）などの野生型ＧＬＰ１ポリペプチドである。いくつかの実施態様では、ＧＬＰ１ポリペプチドは、ＧＬＰ１（７−３６）（配列番号９８）、ＧＬＰ１（７−３５）（配列番号９９）、ＧＬＰ１−Ｓ８（７−３５）（配列番号８６）、またはＧＬＰ１−Ｇ８（７−３５）（配列番号８７）等の変異体ＧＬＰ１ポリペプチドである。いくつかの実施態様では、ＧＬＰ１は、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。
【００７８】
本明細書で使用される「ＧＬＰ１Ｒ」は、野生型ＧＬＰ１に結合することができるグルカゴン様ペプチド１受容体の全体または断片を含むポリペプチドである。
【００７９】
例えば、「ＧＬＰ１Ｒ」は、霊長類（例：ヒトおよびカニクイザル）、げっ歯類（例：マウス、ラット）およびコンパニオンアニマル（例：特に明記しない限りイヌ、ネコ、ウマ）等の哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源からのＧＬＰ１Ｒポリペプチドを指す。いくつかの実施態様では、ＧＬＰ１Ｒは、野生型ＧＬＰ１ポリペプチドに結合する細胞外ドメイン断片である。いくつかの実施態様では、イヌＧＬＰ１Ｒは、配列番号４９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様では、イヌＧＬＰ１Ｒは、配列番号４８のアミノ酸配列を含む。
【００８０】
「細胞外ドメイン」（「ＥＣＤ」）は、膜貫通ドメインを超えて細胞外空間に広がるポリペプチドの部分である。本明細書で使用される「細胞外ドメイン」という用語は、完全な細胞外ドメインを含んでもよく、またはそのリガンドに結合する１つまたは複数のアミノ酸を欠く切断型細胞外ドメインを含んでもよい。細胞外ドメインの組成は、どのアミノ酸が膜内にあるかを決定するために使用されるアルゴリズムに依存する。特定のタンパク質の異なる細胞外ドメインを、異なるアルゴリズムが予測し、また、異なる系が発現することがある。
【００８１】
本明細書で使用される「グルカゴン」または「グルカゴンポリペプチド」は、グルカゴン受容体に結合するグルカゴンの全体または断片を含むポリペプチドである。
【００８２】
例えば、「グルカゴン」は、霊長類（例：ヒトおよびカニクイザル）、げっ歯類（例：マウス、ラット）およびコンパニオンアニマル（例：特に明記しない限りイヌ、ネコ、ウマ）等の哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源からのグルカゴンポリペプチドを指す。いくつかの実施態様では、グルカゴンポリペプチドは、配列番号２１などの野生型グルカゴンポリペプチドである。
【００８３】
例示的な変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドおよび融合分子
ポリペプチドおよび他の分子は、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドを含み得る。いくつかの実施態様では、融合分子は、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチド、例えば本明細書に記載の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドを含む。いくつかの実施態様では、抗体または抗体断片は、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチド、例えば本明細書に記載の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドを含む。
【００８４】
本明細書で使用される「融合分子」は、１つまたは複数の「融合パートナー」を含む分子を指す。いくつかの実施態様では、融合パートナーは、共有結合している（「融合している」）。２つの融合パートナーが両方ともポリペプチドである場合、融合パートナーポリペプチドは、連続したアミノ酸配列の一部（すなわち連続ポリペプチド）であり得る。第１の融合パートナーポリペプチドは、融合パートナーのＮ末端またはＣ末端のいずれかに結合し得る。いくつかの実施態様では、融合パートナーは、両方の融合パートナーをコードするコード配列から単一のポリペプチドとして翻訳される。融合パートナーは、例えばペプチド結合以外の化学結合などの他の手段を介して共有結合していてもよい。ポリペプチドを他の分子（例えば、融合パートナー）に共有結合させる多くの既知の方法が使用され得る。他の実施態様では、融合パートナーは、少なくとも１つのアミノ酸または化学部分から構成される「リンカー」を介して融合している。いくつかの実施態様では、融合パートナーは、非共有結合的に結合している。いくつかの実施態様では、融合パートナーは、例えば結合対を使用して結合することができる。例示的な結合対には、ビオチンとアビジンまたはストレプトアビジン、抗体とその抗原などが含まれるが、これらに限定されない。
【００８５】
いくつかの実施態様では、融合パートナーには、ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドと少なくとも１つのＧＬＰ１ポリペプチドが含まれる。いくつかの実施態様では、融合パートナーには、ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチド、ＧＬＰ１ポリペプチドおよびグルカゴンポリペプチドが含まれる。いくつかの実施態様では、ＧＬＰ１ポリペプチドは、ＩｇＧ  ＦｃポリペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかに結合し得る。いくつかの実施態様では、グルカゴンポリペプチドは、ＩｇＧ  ＦｃポリペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかに結合し得る。
【００８６】
本明細書における用語「連続ポリペプチド」は、アミノ酸の連続した配列を意味するのに使用される。連続ポリペプチドは通常、単一の連続したＤＮＡ配列から翻訳される。それは遺伝子工学によって、例えば、ＤＮＡ配列が単一のタンパク質として発現されるように、第１のタンパク質のＤＮＡ配列から停止コドンを除去し、その後第２のタンパク質のＤＮＡ配列をインフレーム付加することによって作製することができる。通常、これは、既存の遺伝子を使用してインフレームでｃＤＮＡを発現ベクターにクローニングすることにより達成される。
【００８７】
「リンカー」とは、第１のポリペプチドを第２のポリペプチドに接続する１つまたは複数のアミノ酸残基を指す。
【００８８】
いくつかの実施態様では、リンカーは、柔軟な非構造化リンカーである。いくつかの実施態様では、リンカーは、グリシンリッチ、セリンリッチ、またはグリシンおよびセリンリッチなリンカーである。いくつかの実施態様では、リンカーは、１００％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、または少なくとも８５％のセリンおよび／またはグリシンのアミノ酸残基を含む。
【００８９】
「伸長部」は、本明細書で使用する場合、そのＣ末端またはそのＮ末端でポリペプチドに結合している１つまたは複数のアミノ酸残基を指す。
【００９０】
いくつかの実施態様では、伸長部は柔軟である。いくつかの実施態様では、伸長部は、ポリペプチドの生物活性を妨害することなくポリペプチドに柔軟性を加える。いくつかの実施態様では、伸長部は、ポリペプチドの溶解度を増加させる。いくつかの実施態様では、伸長部は、１つまたは複数のグリシン残基を含む。いくつかの実施態様では、伸長部は、１つのグリシン残基（配列番号８８）、２つのグリシン残基（配列番号８９）、３つのグリシン残基（配列番号９０）、４つのグリシン残基（配列番号９１）、５つのグリシン残基（配列番号９２）、６つのグリシン残基（配列番号９３）、７つのグリシン残基（配列番号９４）、８つのグリシン残基（配列番号９５）、またはそれ以上のグリシン残基を含む。
【００９１】
いくつかの実施態様では、連続ポリペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、１００、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１６７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８または１９９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドと、配列番号８５のアミノ酸配列を含むＧＬＰ１ポリペプチドとを含む。いくつかの実施態様では、連続ポリペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、１００、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１６７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８または１９９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドと、配列番号８６のアミノ酸配列を含むＧＬＰ１ポリペプチドとを含む。いくつかの実施態様では、連続ポリペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、１００、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、��１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１６７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８または１９９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドと、配列番号８７のアミノ酸配列を含むＧＬＰ１ポリペプチドとを含む。いくつかの実施態様では、連続ポリペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、１００、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１６７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８または１９９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドと、配列番号９８のアミノ酸配列を含むＧＬＰ１ポリペプチドとを含む。いくつかの実施態様では、連続ポリペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、１００、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１６７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６���、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８または１９９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドと、配列番号９９のアミノ酸配列を含むＧＬＰ１ポリペプチドとを含む。
【００９２】
いくつかの実施態様では、連続ポリペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、１００、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１６７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８または１９９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドと、配列番号２１のアミノ酸配列を含むグルカゴンポリペプチドとを含む。
【００９３】
いくつかの実施態様では、連続ポリペプチドは、コンパニオンアニマル種の第１のＧＬＰ１ポリペプチド（ＧＬＰ１Ａ）、第１のリンカー（Ｌ１）、Ｆｃポリペプチド、場合によって第２のリンカー（Ｌ２）、さらに場合によって第２のＧＬＰ１ポリペプチド（ＧＬＰ１Ｂ）を含む。いくつかの実施態様では、連続ポリペプチドは、
式（Ｉ）：ＧＬＰ１Ａ-Ｌ１-Ｆｃ；
式（ＩＩ）：Ｆｃ-Ｌ１-ＧＬＰ１Ａ；または
式（ＩＩＩ）：ＧＬＰ１Ａ-Ｌ１-Ｆｃ-Ｌ２-ＧＬＰ１Ｂ
を含む。
【００９４】
いくつかの実施態様では、連続ポリペプチドは、ＧＬＰ１ポリペプチド、第１のリンカー（Ｌ１）、Ｆｃポリペプチド、第２のリンカー（Ｌ２）、およびグルカゴンポリペプチド（Ｇｌｕｃ）を含む。いくつかの態様では、連続ポリペプチドは、
式（ＩＶ）：ＧＬＰ１-Ｌ１-Ｆｃ-Ｌ２-Ｇｌｕｃ；または
式（Ｖ）：Ｇｌｕｃ-Ｌ１-Ｆｃ-Ｌ２-ＧＬＰ１
を含む。
【００９５】
いくつかの実施態様では、ＧＬＰ１融合分子は、野生型ＧＬＰ１ポリペプチドと比較して、延長された血清半減期を有する。本明細書に記載のＧＬＰ１融合分子の延長された半減期は、野生型ＧＬＰ１ポリペプチドよりも低い用量とより少ない頻度の投与レジメンを必要とする場合がある。
【００９６】
いくつかの実施態様では、ＧＬＰ１Ｂは、存在する場合、ＧＬＰ１Ａと同じアミノ酸配列を含む。
【００９７】
いくつかの実施態様では、ＧＬＰ１、ＧＬＰ１ＡまたはＧＬＰ１Ｂは、存在する場合、野生型ＧＬＰ１ポリペプチドを含む。いくつかの実施態様では、ＧＬＰ１、ＧＬＰ１ＡまたはＧＬＰ１Ｂは、存在する場合、変異体ＧＬＰ１ポリペプチドを含む。いくつかの実施態様では、ＧＬＰ１、ＧＬＰ１ＡまたはＧＬＰ１Ｂは、存在する場合、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号９８または配列番号９９のアミノ酸配列を含む。
【００９８】
いくつかの実施態様において、グルカゴンポリペプチドは、野生型グルカゴンポリペプチドを含む。いくつかの実施態様では、グルカゴンポリペプチドは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様において、グルカゴンポリペプチドは、変異体グルカゴンポリペプチドを含む。
【００９９】
いくつかの実施様態では、Ｆｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ  Ｆｃである。いくつかの実施態様では、Ｆｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ、ヒトＩｇＧ２  Ｆｃ、ヒトＩｇＧ３  ＦｃまたはヒトＩｇＧ４  Ｆｃである。いくつかの実施様態では、Ｆｃポリペプチドは、変異体ヒトＩｇＧ  Ｆｃである。
【０１００】
いくつかの実施態様では、Ｆｃポリペプチドは、コンパニオンアニマルからのＩｇＧ  Ｆｃである。いくつかの実施態様では、Ｆｃポリペプチドは、イヌＩｇＧ−Ａ  Ｆｃ、イヌＩｇＧ−Ｂ  Ｆｃ、イヌＩｇＧ−Ｃ  Ｆｃ、イヌＩｇＧ−Ｄ  Ｆｃである。いくつかの実施態様では、Ｆｃは、ウマＩｇＧ１  Ｆｃ、ウマＩｇＧ２  Ｆｃ、ウマＩｇＧ３  Ｆｃ、ウマＩｇＧ４  Ｆｃ、ウマＩｇＧ５  Ｆｃ、ウマＩｇＧ６  ＦｃまたはウマＩｇＧ７  Ｆｃである。いくつかの実施態様では、Ｆｃは、ネコＩｇＧ１ａ  Ｆｃ、ネコＩｇＧ１ｂ  ＦｃまたはネコＩｇＧ２  Ｆｃである。
【０１０１】
いくつかの実施様態では、Ｆｃポリペプチドは、変異体ＩｇＧ  Ｆｃである。いくつかの実施態様では、Ｆｃポリペプチドは、変異体イヌＩｇＧ−Ａ  Ｆｃ、変異体イヌＩｇＧ−Ｂ  Ｆｃ、変異体イヌＩｇＧ−Ｃ  Ｆｃ、変異体イヌＩｇＧ−Ｄ  Ｆｃである。いくつかの実施態様では、Ｆｃは、変異体ウマＩｇＧ１  Ｆｃ、変異体ウマＩｇＧ２  Ｆｃ、変異体ウマＩｇＧ３  Ｆｃ、変異体ウマＩｇＧ４  Ｆｃ、変異体ウマＩｇＧ５  Ｆｃ、変異体ウマＩｇＧ６  Ｆｃまたは変異体ウマＩｇＧ７  Ｆｃである。いくつかの実施態様では、Ｆｃは、変異体ネコＩｇＧ１ａ  Ｆｃ、変異体ネコＩｇＧ１ｂ  Ｆｃまたは変異体ネコＩｇＧ２  Ｆｃである。
【０１０２】
いくつかの実施態様では、Ｌ１およびＬ２は、存在する場合、それぞれ独立に、柔軟なリンカーである。いくつかの実施態様では、Ｌ１およびＬ２のアミノ酸配列は、存在する場合、それぞれ独立に、１００％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％のセリンおよび／またはグリシンアミノ酸残基を含む。
【０１０３】
いくつかの実施態様では、連続ポリペプチドは、そのＣ末端に伸長部を含む。いくつかの実施態様では、連続ポリペプチドは、１つのグリシン残基、２つのグリシン残基、３つのグリシン残基、４つのグリシン残基、５つのグリシン残基、６つのグリシン残基、７つのグリシン残基、８つのグリシン残基、または８つを上回るグリシン残基をＣ末端に含む。いくつかの実施態様では、連続ポリペプチドは、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４または配列番号９５のアミノ酸配列をＣ末端に含む。
【０１０４】
いくつかの実施態様では、連続ポリペプチドは、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号９６、配列番号９７、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５または配列番号１０６のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【０１０５】
本明細書に記載の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドまたは他のポリペプチドなどの目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、選択された宿主細胞における発現に適した発現ベクターに挿入され得る。本明細書に記載の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドまたは他のポリペプチドは、ヌクレオチド配列を含む発現ベクターをトランスフェクトされた宿主細胞を培養することにより発現され得る。
【０１０６】
「ベクター」とは、ある生物から別の生物にＤＮＡ配列を移したり、目的の遺伝子を発現させたりするために使用可能なプラスミドである。ベクターは通常、複製開始点と、目的の遺伝子の発現を調節する調節配列とを含み、抗生物質耐性遺伝子などの選択マーカー遺伝子を保有する場合も保有しない場合もある。ベクターは、それが発現する宿主細胞に適している。目的の遺伝子がベクターに存在する場合、ベクターは「組換えベクター」と呼ばれることがある。
【０１０７】
「宿主細胞」とは、ベクターまたは単離されたポリヌクレオチドのレシピエントであり得るか、またはレシピエントである細胞を指す。宿主細胞は、原核細胞でも真核細胞でもよい。例示的な真核細胞には、例えば霊長類または非霊長類動物細胞などの哺乳動物細胞；酵母などの真菌細胞；植物細胞；および昆虫細胞が含まれる。非限定的且つ例示的な哺乳動物細胞には、ＮＳ０細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞（Ｃｒｕｃｅｌｌ）、２９３細胞およびＣＨＯ細胞、ならびにこれらの誘導体、例えば２９３−６Ｅ、ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＳおよびＣＨＯ−Ｋ細胞が含まれるが、これらに限定されない。宿主細胞には、単一の宿主細胞の子孫が含まれ、自然、偶発的または意図的な突然変異により、子孫は元の親と（形態またはゲノムＤＮＡ補体が）必ずしも完全に同じではない。宿主細胞には、本明細書で提供されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドをｉｎ  ｖｉｖｏでトランスフェクトされた細胞が含まれる。
【０１０８】
本明細書で使用される「単離された」という用語は、通常は天然で共に見出されるかまたは産生される成分の少なくともいくつかから分離された分子を指す。例えば、ポリペプチドは、それが産生された細胞の成分の少なくともいくつかから分離されている場合、「単離された」という。ポリペプチドが発現後に細胞によって分泌される場合、ポリペプチドを含む上清を、それを産生した細胞から物理的に分離することは、ポリペプチドを「単離すること」と見なされる。同様に、ポリヌクレオチドが、天然で通常見られるより大きなポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡポリヌクレオチドの場合、ゲノムＤＮＡまたはミトコンドリアＤＮＡなど）の一部ではない場合、または、例えばＲＮＡポリヌクレオチドの場合、それが産生された細胞の成分の少なくともいくつかから分離されている場合、「単離された」という。したがって、宿主細胞内のベクターに含まれるＤＮＡポリヌクレオチドは、「単離された」といわれる場合がある。
【０１０９】
「シグナル配列」とは、目的のポリペプチドの分泌を促進し、細胞表面膜の外側へのポリペプチドの排出時に通常切断されるアミノ酸残基またはそれをコードするポリヌクレオチドの配列をいう。
【０１１０】
いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドまたは変異体Ｆｃポリペプチドを含む連続ポリペプチドは、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡカラムクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、およびＣＨＴクロマトグラフィー等のクロマトグラフィーを使用して単離される。
【０１１１】
標識は、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドまたは変異体Ｆｃポリペプチドを含む連続ポリペプチドに付着させることができる。「標識」とは、分子に付着してそれを検出可能にする部分を意味する。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドまたは変異体Ｆｃポリペプチドを含む連続ポリペプチドは、放射性同位体、蛍光標識、および当該技術分野で既知の様々な酵素基質標識を含むがこれらに限定されない検出可能部分で標識される。いくつかの実施態様では、標識は、例えば放射標識アミノ酸の取り込みまたは標識アビジン（例えば、光学的または比色法で検出できる蛍光マーカーまたは酵素活性を含むストレプトアビジン）によって検出可能なビオチニル部分のポリペプチドへの付着などの視覚的または機器的手段によって検出可能なシグナルを生成できる検出可能マーカーである。ポリペプチド用標識の例には、以下が含まれるがこれらに限定されない：放射性同位体または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏ、または１５３Ｓｍ）；色素原、蛍光標識（例えばＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素標識（例えばｐ−ガラクトシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）；化学発光マーカー；ビオチニル基；二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパーペア配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）；およびガドリニウムキレートなどの磁性剤。イムノアッセイに一般的に使用される標識の代表例には、光を生成する部分、例えばアクリジニウム化合物、および蛍光を生成する部分、例えばフルオレセインが含まれる。これに関して、部分自体は検出可能に標識されていなくても、さらに別の部分との反応で検出可能になる可能性がある。上記の様々なイムノアッセイを実施する際に使用される一般的な技術は、当業者に知られている。
【０１１２】
プロテインＡおよび／またはＣ１ｑおよび／またはＣＤ１６に対する、例示的な変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチド親和性
本明細書に記載の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、プロテインＡおよび／またはＣ１ｑおよび／またはＣＤ１６への改変された結合親和性を有し得る。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、野生型ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対して増加したプロテインＡへの結合親和性を有する。このような変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、プロテインＡカラムクロマトグラフィーにより精製することができる。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、野生型ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対して低下したＣ１ｑへの結合親和性を有する。このような変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、低下した補体媒介性免疫応答を有し得る。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、野生型ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対して低下したＣＤ１６への結合親和性を有する。このような変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、低下したＡＤＣＣ免疫応答を有し得る。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、野生型ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対して増加したプロテインＡへの結合親和性を有し、かつ／または野生型ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対して低下したＣ１ｑへの結合親和性を有し、かつ／または野生型ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対して低下したＣＤ１６への結合親和性を有する。
【０１１３】
「プロテインＡ」とは、本明細書で使用される場合、野生型イヌＩｇＧ−Ｂ  Ｆｃ、野生型ウマＩｇＧ１  Ｆｃ、野生型ウマＩｇＧ３  Ｆｃ、野生型ウマＩｇＧ４  Ｆｃ、野生型ウマＩｇＧ７  Ｆｃ、野生型ネコＩｇＧ１ａ  Ｆｃ、野生型ネコＩｇＧ１ｂ  Ｆｃまたは野生型ネコＩｇＧ２  Ｆｃに結合することができる、プロテインＡの全体または一部を含むポリペプチドである。
【０１１４】
「Ｃ１ｑ」または「Ｃ１ｑ複合体」は、補体系に関与するタンパク質複合体またはその一部を指すために互換的に使用され、野生型イヌＩｇＧ−Ｂ  Ｆｃ、野生型イヌＩｇＧ−Ｃ  Ｆｃ、野生型ウマＩｇＧ１  Ｆｃ、野生型ウマＩｇＧ３  Ｆｃ、野生型ウマＩｇＧ４  Ｆｃ、野生型ウマＩｇＧ７  Ｆｃ、野生型ネコＩｇＧ１ａ  Ｆｃまたは野生型ネコＩｇＧ１ｂ  Ｆｃに結合することができる。
【０１１５】
「ＣＤ１６」とは、本明細書で使用される場合、野生型イヌＩｇＧ−Ａ  Ｆｃまたは野生型イヌＩｇＧ−Ｄ  Ｆｃに結合することができるＣＤ１６の全体または一部を含むポリペプチドである。ある物質に「結合する」という用語は、当該技術分野でよく理解されている用語であり、かつ、当該結合を決定するための方法も、当該技術分野でよく知られている。分子は、特定の細胞または物質と反応するか、会合するか、または親和性を有し、この反応、結合または親和性が、例えば免疫ブロット、ＥＬＩＳＡ、ＫｉｎＥｘＡ、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）、表面プラズモン共鳴装置等の当該技術分野で既知の１つまたは複数の方法によって検出可能な場合、「結合」を示すといわれる。
【０１１６】
「プロテインＡ＋」とは、本明細書で使用される場合、ＦｃポリペプチドがプロテインＡ結合親和性を有することを意味する。いくつかの実施態様では、プロテインＡ＋Ｆｃポリペプチドは、プロテインＡを増加させる少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。
【０１１７】
「プロテインＡ-」とは、本明細書で使用される場合、Ｆｃポリペプチドが、低いプロテインＡ結合親和性を有するか、またはプロテインＡ結合親和性を全く有しないことを意味する。
【０１１８】
「Ｃ１ｑ＋」とは、本明細書で使用される場合、ＦｃポリペプチドがＣ１ｑ結合親和性を有することを意味する。
【０１１９】
「Ｃ１ｑ-」とは、本明細書で使用される場合、Ｆｃポリペプチドが、低いＣ１ｑ結合親和性を有するか、またはＣ１ｑ結合親和性を全く有しないことを意味する。いくつかの実施態様では、Ｃ１ｑ-Ｆｃポリペプチドは、Ｃ１ｑ結合親和性を低下させる少なくとも１つのアミノ酸修飾を有する。
【０１２０】
「ＣＤ１６＋」とは、本明細書で使用される場合、ＦｃポリペプチドがＣＤ１６結合親和性を有することを意味する。
【０１２１】
「ＣＤ１６-」とは、本明細書で使用される場合、Ｆｃポリペプチドが、低いＣＤ１６結合親和性を有するか、またはＣＤ１６結合親和性を全く有しないことを意味する。いくつかの実施態様では、ＣＤ１６-Ｆｃポリペプチドは、ＣＤ１６結合親和性を低下させる少なくとも１つのアミノ酸修飾を有する。
【０１２２】
「親和性」という用語は、ある分子の単一の結合部位（例えば受容体）とその結合パートナー（例えばリガンド）との間の非共有結合的相互作用の総和の強度を意味する。通常、分子ＸのそのパートナーＹへの親和性は、解離定数（ＫＤ）によって表される。親和性は、例えば免疫ブロット、ＥＬＩＳＡ、ＫｉｎＥｘＡ、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）または表面プラズモン共鳴装置等の当該技術分野で知られている一般的な方法によって測定することができる。
【０１２３】
「表面プラズモン共鳴」とは、例えばＢＩＡｃｏｒｅＴＭ（ニュージャージー州ピスカタウェイのＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社傘下のＢＩＡｃｏｒｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＢ（スウェーデン、ウプサラ））を使用して、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化を検出することにより、リアルタイムの生体分子特異的相互作用の分析を可能にする光学現象を指す。さらなる説明は、Jonsson et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51: 19-26を参照のこと。
【０１２４】
「バイオレイヤー干渉法」とは、バイオセンサーの先端と内部基準層上の固定化されたタンパク質の層から反射した光の干渉パターンを分析する光学分析技術を指す。バイオセンサーチップに結合した分子の数の変化は、リアルタイムで測定できる干渉パターンの変化を引き起こす。バイオレイヤー干渉法のための非限定的かつ例示的な装置は、オクテット（登録商標）システム（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ  ＬＬＣ)である。例えば、Abdiche et al., 2008, Anal. Biochem. 377: 209-277を参照されたい。
【０１２５】
用語「ＫＤ」、「Ｋｄ」、「Ｋｄ」または「Ｋｄ値」は、受容体−リガンド相互作用または抗体−抗原相互作用の平衡解離定数を指すのに互換的に使用される。
【０１２６】
いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、バイオレイヤー干渉法で測定して、５ｘ１０−６Ｍ未満、１ｘ１０−６Ｍ未満、５ｘ１０−７Ｍ未満、１ｘ１０−７Ｍ未満、５ｘ１０−８Ｍ未満、１ｘ１０−８Ｍ未満、５ｘ１０−９Ｍ未満、１ｘ１０−９Ｍ未満、５ｘ１０−１０Ｍ未満、１ｘ１０−１０Ｍ未満、５ ｘ １０-１１Ｍ未満、１ ｘ １０−１１Ｍ未満、５ｘ１０−１２Ｍ未満、または１ｘ１０−１２Ｍ未満の解離定数（ＫＤ）を有するプロテインＡに結合する。
【０１２７】
いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、バイオレイヤー干渉法で測定して、５ｘ１０−６Ｍ超、１ｘ１０−５Ｍ超、５ｘ１０−５Ｍ超、１ｘ１０−４Ｍ超、５ｘ１０−４Ｍ超、または１ｘ１０−３Ｍ超の解離定数（ＫＤ）を有するＣ１ｑまたはＣＤ１６に結合する。
【０１２８】
いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  ＦｃポリペプチドなどのＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドの、プロテインＡまたはＣ１ｑまたはＣＤ１６に対するＫＤは、オクテット（登録商標）システム（カリフォルニア州フレモントのＰａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ  ＬＬＣ）などのバイオセンサーを供給業者の指示書に従って使用するバイオレイヤー干渉法を用いることによって測定される。つまり、ビオチン化プロテインＡまたはＣ１ｑまたはＣＤ１６をセンサーチップに結合し、ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドの会合を指定された時間または定常状態に達するまでモニターする。解離は、指定された時間または定常状態に達するまでモニターすることができる。ドリフトを補正するために、バッファーのみのブランク曲線を差し引く。データをデータ解析ソフトウェアを使用して２：１の結合モデルにフィッティングさせ、会合速度定数（ｋｏｎ）、解離速度定数（ｋｏｆｆ）およびＫｄを決定する。平衡解離定数（ＫＤ）は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比として計算される。用語「ｋｏｎ」は、分子ＸのそのパートナーＹとの会合の速度定数を指し、用語「ｋｏｆｆ」は、分子ＸまたはパートナーＹの分子Ｘ／パートナーＹ複合体からの解離の速度定数指す。
【０１２９】
「増加させる」または「刺激する」とは、基準と比較して、活性、機能または量を増加、改善または増強させることである。いくつかの実施態様では、「増加させる」または「刺激する」とは、基準値に対して約５％以上、約１０％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約１００％以上、約１２５％以上、約２００％以上の全体的な増加を引き起こす能力を意味する。いくつかの実施態様では、「増加させる」または「刺激する」とは、基準値に対して約５％から約５０％の、約１０％から約２０％の、約５０％から約１００％の、約２５％から約７０％の全体的な増加を引き起こす能力を意味する。いくつかの実施態様では、「増加させる」または「刺激する」とは、５０％以上の全体的な増加を引き起こす能力を意味する。いくつかの実施態様では、「増加させる」または「刺激する」とは、７５％、８５％、９０％、９５％またはそれを超える全体的な増加を引き起こす能力を意味する。いくつかの実施態様では、上記の量は、ある期間にわたる対照用量（プラセボなど）に対して、同じ期間にわたって刺激または増加される。
【０１３０】
いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、基準ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対して約５％以上、約１０％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約１００％以上、約１２５％以上、約１５０％以上、約２００％以上の増加した親和性でプロテインＡに結合することができる。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、基準ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対して約５％から約５０％の、約１０％から約２０％の、約５０％から約１００％の、約２５％から約７０％の増加した親和性でプロテインＡに結合することができる。いくつかの実施態様では、基準ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、野生型ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドである。いくつかの実施態様では、基準ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、異なる変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドである。
【０１３１】
「低下させる」または「阻害する」ことは、基準と比較して、活性、機能または量を減少、低減または阻むことである。いくつかの実施態様では、「低下させる」または「阻害する」とは、基準ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対して約５％以上、約１０％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、または約９０％以上の全体的な減少を引き起こす能力を意味する。いくつかの実施態様では、「低下させる」または「阻害する」とは、基準値に対して約５％から約５０％の、約１０％から約２０％の、約５０％から約１００％の、約２５％から約７０％の全体的な減少を引き起こす能力を意味する。いくつかの実施態様では、「低下させる」または「阻害する」とは、５０％以上の全体的な減少を引き起こす能力を意味する。いくつかの実施態様では、「低下させる」または「阻害する」とは、７５％、８５％、９０％、９５％またはそれを超える全体的な減少を引き起こす能力を意味する。いくつかの実施態様では、上記の量は、ある期間にわたる対照用量（プラセボなど）に対して、同じ期間にわたって阻害または低減される。
【０１３２】
いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、基準ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対して約５％以上、約１０％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上の減少した親和性でＣ１ｑまたはＣＤ１６に結合できる。いくつかの実施態様では、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、基準ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドに対して約５％から約５０％の、約１０％から約２０％の、約５０％から約１００％の、約２５％から約７０％の減少した親和性でＣ１ｑまたはＣＤ１６に結合できる。いくつかの実施態様では、基準ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、野生型ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドである。いくつかの実施態様では、基準ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドは、異なる変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドである。
【０１３３】
本明細書で用いられる「基準」とは、比較目的のために用いられる、任意の試料、標準またはレベルを指す。基準は、野生型基準であっても、変異体基準であってもよい。基準は、健常または非罹患試料から得ることができる。いくつかの例では、基準は、コンパニオンアニマルの非罹患または無処置試料から得られる。いくつかの例では、基準は、特定の種の１または複数の健康な動物から得られるが、この動物は試験または処置されている動物ではない。
【０１３４】
変異体ＧＬＰ１融合分子の例示的な生物活性
いくつかの実施態様では、ＧＬＰ１融合分子は、ＧＬＰ１Ｒに結合し、ｃＡＭＰ産生を活性化する。いくつかの実施態様では、ＧＬＰ１融合ポリペプチドは、ＧＬＰ１融合ポリペプチドの非存在下でのシグナル伝達機能と比較して、細胞におけるｃＡＭＰの産生を少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％増加させる。
【０１３５】
例示的な薬学的組成物
用語「薬学的製剤」および「薬学的組成物」は、活性成分の生物活性を有効にするような形態であって、製剤が投与される対象にとって許容できない毒性である追加成分を含まない調製物を指す。
【０１３６】
「薬学的に許容される担体」とは、対象への投与用の、「薬学的組成物」をともに含む治療剤とともに使用するための、当該技術分野で一般的な無毒の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、カプセル化材料、処方助剤または担体をいう。薬学的に許容される担体は、用いられる用量および濃度でレシピエントに対して無毒であり、製剤の他の成分と適合性がある。薬学的に許容される担体は、用いられる製剤に適している。薬学的に許容される担体の例には、アルミナ；ステアリン酸アルミニウム；レシチン；ヒト血清アルブミン、イヌまたは他の動物アルブミンなどの血清タンパク質；リン酸、クエン酸、トロメタミンまたはＨＥＰＥＳバッファー等のバッファー；グリシン；ソルビン酸；ソルビン酸カリウム；飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物；水；塩または電解質、例えばプロタミン硫酸塩、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカまたは三ケイ酸マグネシウム；ポリビニルピロリドン、セルロース系物質；ポリエチレングリコール；スクロース；マンニトール；またはアリギニンンを含むがこれに限定されないアミノ酸が含まれる。
【０１３７】
薬学的組成物は、凍結乾燥形態で保存することができる。したがって、いくつかの実施態様では、この調製方法には凍結乾燥工程が含まれる。その後、凍結乾燥組成物は、イヌ、ネコまたはウマへの投与前に、通常は非経口投与に適した水性組成物として再構成され得る。他の実施態様では、特に、本明細書に記載の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドまたは他のポリペプチドが熱変性および酸化変性に対して非常に安定している場合、薬学的組成物は、イヌ、ネコまたはウマへ直接投与できるかまたは適切な希釈で投与できる液体として、すなわち水性組成物として保存することができる。凍結乾燥組成物は、滅菌注射用水（ＷＦＩ）で再構成することができる。ベンジルアルコールなどの静菌剤が含まれる場合がある。したがって、本発明は、固体または液体形態の薬学的組成物を提供する。
【０１３８】
薬学的組成物のｐＨは、投与時で約ｐＨ５から約ｐＨ８までの範囲であり得る。本発明の組成物は、治療目的で使用される場合、無菌である。無菌状態は、滅菌濾過膜（例：０．２ミクロン膜）による濾過を含む、当該技術分野で既知のいくつかの手段のいずれによっても得ることができる。無菌状態は、抗菌剤の有無にかかわらず維持され得る。
【０１３９】
Ｆｃポリペプチドおよび薬学的組成物の特定の用途
本発明の変異体Ｆｃポリペプチド（例えば変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチド）を含むポリペプチドまたは本発明の変異体Ｆｃポリペプチドを含む薬学的組成物は、イヌ、ネコまたはウマを含むがこれらに限定されないコンパニオンアニマルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏでの製品半減期を延長させるのに有用であり得る。
【０１４０】
本明細書で使用される場合、「治療」は、有益なまたは所望の臨床結果を得るための手法である。本明細書で使用される「治療」は、コンパニオンアニマルを含む哺乳動物における疾患の治療薬の投与または適用を包含する。本開示の場合、有益なまたは所望の臨床結果には、１つまたは複数の症状の緩和、疾患の範囲の縮小、疾患の伝播の予防疾患の伝播の予防または遅延、疾患の再発の予防または遅延、疾患の進行の遅延または減速、病状の改善、疾患または疾患の進行の阻害、疾患またはその進行の阻害または減速、その発生の阻止、および（部分または全）寛解のいずれか１つまたは複数を含むがこれらに限定されない。「治療」には、増殖性疾患の病理学的結果の低減も含まれる。本明細書で提供される方法は、治療のこれらの態様のいずれか１つまたは複数を企図している。上記のとおり、治療という用語は、障害のすべての側面の百パーセントの除去を必要としない。
【０１４１】
物質／分子、アゴニストまたはアンタゴニストの「治療的有効量」は、治療する疾患の種類、病状、疾患の重症度および経過、治療目的の種類、以前の治療、病歴、以前の治療に対する応答、担当獣医の裁量、動物の年齢、性別および体重、並びに物質／分子、アゴニストまたはアンタゴニストの動物における望ましい応答を誘発する能力等の要因によって異なる。また、治療的有効量とは、物質／分子、アゴニストまたはアンタゴニストの毒性または有害作用よりも治療的に有益な作用が上回る量である。治療的有効量は、１または複数の投与において送達され得る。治療的有効量は、必要な用量および期間で所望の治療的または予防的結果を得るのに有効な量を指す。
【０１４２】
いくつかの実施態様では、本明細書に記載の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドもしくは他のポリペプチド、またはそれを含む薬学的組成物は、皮下投与、静脈内注入または筋肉内注射で、非経口的に投与される。いくつかの実施態様では、本明細書に記載の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドもしくは他のポリペプチド、またはそれを含む薬学的組成物は、ボーラス注入として、または一定期間にわたる連続注入で投与される。いくつかの実施態様では、本明細書に記載の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドもしくは他のポリペプチド、またはそれを含む薬学的組成物は、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、動脈内、滑膜内、髄腔内または吸入経路で投与される。
【０１４３】
いくつかの実施態様では、ＧＬＰ１融合ポリペプチドまたはそれを含む薬学的組成物を本明細書の方法に従って利用して、高血糖関連状態を治療することができる。いくつかの実施態様では、ＧＬＰ１融合ポリペプチドまたは薬学的組成物をイヌ、ネコまたはウマ等のコンパニオンアニマルに投与して、高血糖関連状態を治療する。
【０１４４】
いくつかの実施態様では、本明細書に記載の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドもしくは他のポリペプチド、またはそれを含む薬学的組成物は、用量あたり０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重から１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の量で投与される。いくつかの実施態様では、ＧＬＰ１アナログは、用量あたり０．００５ｍｇ／ｋｇ体重から２０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の量で投与される。いくつかの実施態様では、ＧＬＰ１アナログは、用量あたり１ｍｇ／ｋｇ体重から１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の量で投与される。いくつかの実施態様では、ＧＬＰ１アナログは、０．５ｍｇ／ｋｇ体重から１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、１ｍｇ／ｋｇ体重から１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、５ｍｇ／ｋｇ体重から１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、１０ｍｇ／ｋｇ体重から１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、２０ｍｇ／ｋｇ体重から１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、５０ｍｇ／ｋｇ体重から１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、１ｍｇ／ｋｇ体重から１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、５ｍｇ／ｋｇ体重から１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、０．５ｍｇ／ｋｇ体重から１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、または５ｍｇ／ｋｇ体重から５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の量で投与され得る。
【０１４５】
いくつかの実施態様では、本明細書に記載の変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドもしくは他のポリペプチド、またはそれを含む薬学的組成物は、単回または一連の治療にわたってコンパニオンアニマルに投与される。その用量は、いくつかの実施態様では、少なくとも２または３週連続で週に１回投与され、いくつかの実施態様では、治療のこのサイクルが２回以上繰り返され、任意選択的に１週間以上の無治療を交える。他の実施態様では、治療的有効量は、２から５日連続で１日１回投与され、いくつかの実施態様では、この治療サイクルが２回以上繰り返され、任意選択的に１日以上または数週間の無治療を交える。
【０１４６】
１種以上のさらなる治療剤「と組み合わせた」投与には、同時（同時発生の）および任意の順序での連続的または逐次的な投与が含まれる。「同時に」という用語は、本明細書では、投与の少なくとも一部が時間的に重複するかまたは一方の治療剤の投与が他方の治療剤の投与と比較して短期間内にある、２種以上の治療剤の投与をいうのに使用される。例えば、２種以上の治療剤は、およそ指定された分数以下の時間間隔で投与される。「逐次」という用語は、本明細書では、１種以上の薬剤の投与が１種以上の他の薬剤の投与の中止後にも継続するか、または１種以上の薬剤の投与が１種以上の他の薬剤の投与の前に開始される、２種以上の治療剤の投与をいうのに使用される。例えば、２種以上の治療剤の投与は、指定された分数位以上の時間間隔で投与される。本明細書において使用される場合、「〜と併せて」とは、一つの治療様式に別の治療様式を加えた投与を指す。すなわち、「〜と併せて」は、動物に対し、他の治療様式の投与の前、最中または後の、一つの治療様式の投与を指す。
【０１４７】
その用量は、いくつかの実施態様では、少なくとも２または３週連続で週に１回投与され、いくつかの実施態様では、治療のこのサイクルが２回以上繰り返され、任意選択的に１週間以上の無治療を交える。他の実施態様では、治療的有効量は、２から５日連続で１日１回投与され、いくつかの実施態様では、この治療サイクルが２回以上繰り返され、任意選択的に１日以上または数週間の無治療を交える。
【０１４８】
１種以上のさらなる治療剤「と組み合わせた」投与には、同時（同時発生の）および任意の順序での連続的または逐次的な投与が含まれる。「同時に」という用語は、本明細書では、投与の少なくとも一部が時間的に重複するかまたは一方の治療剤の投与が他方の治療剤の投与と比較して短期間内にある、２種以上の治療剤の投与を指すのに使用される。例えば、２種以上の治療剤は、およそ指定された分数以下の時間間隔で投与される。「逐次」という用語は、本明細書では、１種以上の薬剤の投与が１種以上の他の薬剤の投与の中止後にも継続するか、または１種以上の薬剤の投与が１種以上の他の薬剤の投与の前に開始される、２種以上の治療剤の投与をいうのに使用される。例えば、２種以上の治療剤の投与は、指定された分数位以上の時間間隔で投与される。本明細書において使用される場合、「〜と併せて」とは、別の治療様式に加えた一つの治療様式の投与を指す。すなわち、「〜と併せて」は、動物に対し、他の治療様式の投与の前、最中または後の、一つの治療様式の投与を指す。
【０１４９】
いくつかの実施態様では、方法は、ＧＬＰ１融合ポリペプチドインスリン、ＤＰＰ４阻害剤、ＳＧＬＴ２阻害剤、ビグアニド類、スルホニル尿素、メグリチニド誘導体、アルファグルコシダーゼ阻害剤、チアゾリジンジオン（ＴＺＤ）、アミリノミメティック、胆汁酸捕捉剤、ドーパミンアゴニストと組み合わせて投与することを含む。
【０１５０】
以下の例は、本開示の特定の態様を説明するものであり、本開示を限定することを意図するものでは決してない。
【実施例】
【０１５１】
実施例１
プロテインＡ結合を増加させるため、および／または補体結合を減少させるため、および／またはＣＤ１６結合を減少させるための変異体イヌ  ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチド
プロテインＡアフィニティーを利用する抗体の精製は、よく発達した方法である。しかしながら、イヌＩｇＧの４つのサブタイプのうち、ＩｇＧ−Ｂ  Ｆｃ（例：配列番号２または配列番号１０７）のみがプロテインＡ結合親和性を有する。イヌＩｇＧ−Ａ  Ｆｃ（例：配列番号１）、ＩｇＧ−Ｃ  Ｆｃ（例：配列番号３または配列番号１０８）およびＩｇＧ−Ｄ  Ｆｃ（例：配列番号４）は、プロテインＡ結合親和性が弱いか、測定できない。変異体イヌＩｇＧ−Ａ  Ｆｃ、ＩｇＧ−Ｃ  ＦｃおよびｇＧ−Ｄ  Ｆｃポリペプチドは、改変されたプロテインＡ結合のために設計された。
【０１５２】
さらに、イヌＩｇＧ−Ｂ  ＦｃおよびＩｇＧ−Ｃ  Ｆｃは補体活性を有し、Ｃ１ｑに結合するが、一方、イヌＩｇＧ−Ａ  ＦｃおよびＩｇＧ−Ｄ  Ｆｃは、Ｃ１ｑとの結合親和性が弱いか、測定できない。Ｃ１ｑ結合を潜在的に低下させるため、および／または補体媒介性免疫応答を潜在的に低下させるために、変異体イヌＩｇＧ−Ｂ  ＦｃおよびＩｇＧ−Ｃ  Ｆｃポリペプチドが設計された。
【０１５３】
さらには、イヌＩｇＧ−Ｂ  ＦｃおよびＩｇＧ−Ｃ  Ｆｃは、ＣＤ１６結合活性を有する。ＣＤ１６のＩｇＧ−Ｂ  ＦｃおよびＩｇＧ−Ｃ  Ｆｃへの結合を潜在的に低下させるため、ならびに／またはＡＤＣＣを潜在的に低下させるために、変異体イヌＩｇＧ−Ｂ  ＦｃおよびＩｇＧ−Ｃ  Ｆｃポリペプチドが設計された。
【０１５４】
以下の表３は、イヌＩｇＧ  ＦｃサブタイプのプロテインＡおよびＣ１ｑ結合特性をまとめたものである。特に、どの野生型イヌＩｇＧ  ＦｃサブタイプもＣ１ｑ結合を欠いておらず、プロテインＡにも結合しない。
【０１５５】
表３
2020531002.tif 000047
【０１５６】
三次元タンパク質モデリングとタンパク質配列解析を使用して、プロテインＡと接触している可能性が高いイヌＩｇＧ−Ｂ  Ｆｃの配列が同定された。図１は、イヌＩｇＧ−Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ  Ｆｃ配列のアラインメントを示している。ボックスは、プロテインＡと接触する可能性が高い領域を示している。
【０１５７】
２つの手法を使用して、プロテインＡ結合を増加させるための変異体イヌＩｇＧ−Ａ、ＩｇＧ−ＣおよびＩｇＧ−Ｄ  Ｆｃポリペプチドを設計した。第１の手法では、変異体イヌＩｇＧ−Ａ、ＩｇＧ−ＣおよびＩｇＧ−Ｄ  Ｆｃポリペプチドは、イヌＩｇＧ−Ｂ  Ｆｃと同じプロテインＡ結合モチーフ配列を持つように設計された（例：それぞれ、配列番号５、配列番号６、配列番号７）。第２の手法，では、イヌＩｇＧ−Ｂ  Ｆｃ配列に対応するプロテインＡ結合領域の１つ以上のアミノ酸置換を有する変異体イヌＩｇＧ−Ａ  ＦｃＩ（２１）Ｔ／Ｑ（２０７）Ｈ（配列番号６０）、変異体イヌ  ＩｇＧ−Ｃ  ＦｃＩ（２１）Ｔ（配列番号６１）および変異体イヌＩｇＧ−Ｄ  ＦｃＩ（２１）Ｔ／Ｑ（２０７）Ｈ（配列番号６２）が設計された。
【０１５８】
さらに、表４に挙げた１つ以上のアミノ酸置換を有する、プロテインＡ結合が増加した変異体イヌＩｇＧ−Ａ  Ｆｃ、ＩｇＧ−Ｃ  ＦｃおよびＩｇＧ−Ｄ  Ｆｃポリペプチドを調製することができる。
【０１５９】
表４
2020531002.tif 000048
【０１６０】
Ｃ１ｑのイヌＩｇＧ−Ｂ  ＦｃおよびＩｇＧ−Ｃ  Ｆｃへの結合を潜在的に低下させるため、ならびに／または補体媒介性免疫応答を潜在的に低下させるため、それぞれ配列番号２または配列番号３の９３位に対応するアミノ酸位置に、Ｌｙｓを除く任意のアミノ酸によるＬｙｓのアミノ酸置換を有する変異体イヌＩｇＧ−Ｂ  ＦｃおよびＩｇＧ−Ｃ  Ｆｃポリペプチドを調製することができる。これらのアミノ酸置換は、補体活性を呈しないと理解されているイヌＩｇＧ−Ａ  ＦｃおよびＩｇＧ−Ｄ  Ｆｃと比較した、イヌＩｇＧ−Ｂ  ＦｃおよびＩｇＧ−Ｃ  Ｆｃのタンパク質配列解析および３Ｄ構造モデリングの後に同定された。例えば、変異体イヌＩｇＧ−Ｂ  Ｆｃ  Ｋ（９３）Ｒ（配列番号７８）および変異体イヌＩｇＧ−Ｃ  ＦｃＫ（９３）Ｒ（配列番号７９）を調製することができる。野生型イヌＩｇＧ−Ｂ  Ｆｃ．を含む融合タンパク質を比較した場合、ヒトＣ１ｑと変異体イヌＩｇＧ−Ｂ  Ｆｃ  Ｋ（９３）Ｒを含む融合タンパク質との間の結合の低下が観察された。
【０１６１】
ＣＤ１６のＩｇＧ−Ｂ  ＦｃおよびＩｇＧ−Ｃ  Ｆｃへの結合を潜在的に低下させるため、ならびに／またはＡＤＣＣを潜在的に低下させるために、表５に挙げた１つ以上のアミノ酸置換を有する変異体イヌＩｇＧ−Ｂ  ＦｃおよびＩｇＧ−Ｃ  Ｆｃポリペプチドを調製することができる。これらのアミノ酸置換は、ＡＤＣＣ活性を呈さないと理解されているＩｇＧ−ＡおよびＩｇＧ−Ｄと比較した、イヌＩｇＧ−ＢおよびＩｇＧ−Ｃのタンパク質配列解析および３Ｄ構造モデリングの後に同定された。
【０１６２】
表５
2020531002.tif 000049
【０１６３】
野生型イヌＩｇＧ−Ｃ  ＦｃはプロテインＡ結合を欠き、Ｃ１ｑ結合を有するため、表４に挙げた１つ以上のアミノ酸置換をＫ（９３）Ｒ置換またはＫ（９３）Ｘ置換（ここでＸは、Ｌｙｓを除く任意のアミノ酸である）と組み合わせることにより、プロテインＡに結合し、かつ、Ｃ１ｑへの低下した結合を有する二重変異体イヌＩｇＧ−Ｃ  Ｆｃを調製することができる。表５に挙げた１つ以上のアミノ酸置換をＫ（９３）Ｒ置換またはＫ（９３）Ｘ置換（ここでＸは、Ｌｙｓを除く任意のアミノ酸である）と組み合わせることにより、Ｃ１ｑへの結合が低下し、かつ、ＣＤ１６への結合も低下している二重変異体イヌＩｇＧ−Ｂ  Ｆｃまたは二重変異体イヌＩｇＧ−Ｃ  Ｆｃを調製することができる。表４に挙げた１つ以上のアミノ酸置換および表５に挙げた１つ以上のアミノ酸置換を、Ｋ（９３）Ｒ置換またはＫ（９３）Ｘ置換（ここでＸは、Ｌｙｓを除く任意のアミノ酸である）と組み合わせることにより、プロテインＡに結合し、かつ、Ｃ１ｑとＣＤ１６への低下した結合を有する三重変異体イヌ−ＩｇＧ−Ｃ  Ｆｃを調製することができる。
【０１６４】
プロテインＡ、ＣＤ１６、および／またはＣ１ｑへの任意の変異体イヌＩｇＧ  Ｆｃの結合を決定し、プロテインＡ、ＣＤ１６、および／またはＣ１ｑへの別のＩｇＧ  Ｆｃ（例：対応する野生型イヌＩｇＧ  Ｆｃ、別の野生型もしくは変異体イヌ  ＩｇＧ  Ｆｃ、または別のコンパニオンアニマルの野生型もしくは変異体ＩｇＧ  Ｆｃ等）の結合と比較することができる。
【０１６５】
結合分析は、オクテットバイオセンサーを使用して実施することができる。つまり、標的分子（例：プロテインＡ、Ｃ１ｑ、ＣＤ１６等．）をビオチン化して、遊離の未反応ビオチンを（例えば透析により）除去することができる。ストレプトアビジンセンサーチップ上にビオチン化標的分子を捕捉する。標的分子のさまざまな濃度（例：１０μｇ／ｍＬ）のＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドとの会合を、指定された時間または定常状態に達するまでモニターする。解離を、特定の時間または定常状態に達するまでモニターする。ドリフトを補正するために、バッファーのみのブランク曲線を差し引くことができる。データをＦｏｒｔｅＢｉｏＴＭデータ解析ソフトウェアを使用して１：１の結合モデルにフィッティングさせ、ｋｏｎ、ｋｏｆｆおよびＫｄを決定する。
【０１６６】
実施例２
プロテインＡ結合を増加させるためおよび／または補体結合を減少させるため
の変異体ウマＩｇＧ  Ｆｃポリペプチド
ウマＩｇＧの７つのサブタイプの中で、ＩｇＧ１  Ｆｃ（例：配列番号６３）、ＩｇＧ３  Ｆｃ（例：配列番号６５）、ＩｇＧ４  Ｆｃ（例：配列番号６６）、ＩｇＧ７  Ｆｃ（例：配列番号６９）がプロテインＡ結合親和性を有する。ウマＩｇＧ２  Ｆｃ（例：配列番号１８、配列番号６４）、ＩｇＧ５  Ｆｃ（例：配列番号６７）およびＩｇＧ６  Ｆｃ（例：配列番号６８）は、プロテインＡ結合親和性が弱いか、測定できない。変異体ウマＩｇＧ２  Ｆｃ、ＩｇＧ５  ＦｃおよびＩｇＧ６  Ｆｃポリペプチドは、改変されたプロテインＡ結合のために設計された。
【０１６７】
さらに、ウマＩｇＧ２  Ｆｃ、ＩｇＧ５  ＦｃおよびＩｇＧ６  Ｆｃは、Ｃ１ｑへの結合親和性が弱いか測定できないが、一方、ウマＩｇＧ１  Ｆｃ、ＩｇＧ３  Ｆｃ、ＩｇＧ４  Ｆｃ、およびＩｇＧ７  Ｆｃは、Ｃ１ｑに結合する。Ｃ１ｑ結合を潜在的に低下させるため、および／または補体媒介性免疫応答を潜在的に低下させるために、変異体ウマＩｇＧ１  Ｆｃ、ＩｇＧ３  Ｆｃ、ＩｇＧ４  ＦｃおよびＩｇＧ７  Ｆｃポリペプチドが設計された。
【０１６８】
以下の表６は、ウマＩｇＧ  ＦｃサブタイプのプロテインＡおよびＣ１ｑ結合特性をまとめたものである。特に、どの野生型ウマＩｇＧ  ＦｃサブタイプもＣ１ｑ結合を欠いておらず、プロテインＡにも結合しない。
【０１６９】
表６
2020531002.tif 000050
【０１７０】
三次元タンパク質モデリングとタンパク質配列解析を使用して、プロテインＡと接触している可能性が高いウマＩｇＧ１  Ｆｃ、ＩｇＧ３  Ｆｃ、ＩｇＧ４  ＦｃおよびＩｇＧ７  Ｆｃの配列が同定された。さらに、表７に挙げた１つ以上のアミノ酸置換を有する、プロテインＡ結合が増加した変異体ウマＩｇＧ２  Ｆｃ、ＩｇＧ５  ＦｃおよびＩｇＧ６  Ｆｃポリペプチドを調製することができる。
【０１７１】
表７
2020531002.tif 000051
【０１７２】
例えば、プロテインＡに結合する野生型ウマＩｇＧ  Ｆｃの配列に対応するように、プロテインＡ結合領域に１つまたは複数のアミノ酸置換を有する変異体ウマＩｇＧ２  Ｆｃ、ＩｇＧ５  ＦｃおよびＩｇＧ６  Ｆｃポリペプチドが設計された。プロテインＡ結合が増加した変異体ウマＩｇＧ２  Ｆｃ  Ｆ（２０３）Ｙ（配列番号７１）；変異体ウマＩｇＧ２  Ｆｃ  Ａ（１５）Ｔ／Ｆ（２０３）Ｙ（配列番号７２）；変異体ウマＩｇＧ５  Ｆｃ  Ｖ（１９９）Ｌ／Ｅ（２００）Ｙ（配列番号７５）；および変異体ウマＩｇＧ６  Ｆｃ  Ｉ（１９９）Ｌ／Ｒ（２００）Ｈ／Ｈ（２０１）Ｎ／Ｔ（２０２）Ｈ（配列番号７６）を調製することができる。
【０１７３】
Ｃ１ｑのウマＩｇＧ１  Ｆｃ、ＩｇＧ３  Ｆｃ、ＩｇＧ４  ＦｃおよびＩｇＧ７  Ｆｃへの結合を潜在的に低下させるため、ならびに／または補体媒介性免疫応答を潜在的に低下させるため、それぞれ配列番号６３、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６９の８７位に対応するアミノ酸位置に、Ｌｙｓを除く任意のアミノ酸によるアミノ酸置換を有する変異体イヌＩｇＧ１  Ｆｃ、ＩｇＧ３  Ｆｃ、ＩｇＧ４  ＦｃおよびＩｇＧ７  Ｆｃポリペプチドを調製することができる。これらのアミノ酸置換は、補体活性を呈しないと理解されているウマＩｇＧ２  Ｆｃ、ＩｇＧ５  ＦｃおよびＩｇＧ６  Ｆｃと比較した、ウマＩｇＧ１  Ｆｃ、ＩｇＧ３  Ｆｃ、ＩｇＧ４  ＦｃおよびＩｇＧ７  Ｆｃのタンパク質配列解析および３Ｄ構造モデリングの後に同定された。例えば、変異体ウマＩｇＧ１  Ｆｃ  Ｋ（８７）Ｓ（配列番号７０）、変異体ウマＩｇＧ  ３  Ｆｃ  Ｋ（８７）Ｓ（配列番号７３）、変異体ウマＩｇＧ４  Ｆｃ  Ｋ（８７）Ｓ（配列番号７４）および変異体ウマＩｇＧ７  Ｆｃ  Ｋ（８７）Ｓ（配列番号７７）を調製することができる。
【０１７４】
プロテインＡおよび／またはＣ１ｑへの任意の変異体ウマＩｇＧ  Ｆｃの結合を決定し、プロテインＡおよび／またはＣ１ｑへの別のＩｇＧ  Ｆｃ（例：対応する野生型ウマＩｇＧ  Ｆｃ、別の野生型もしくは変異体ウマＩｇＧ  Ｆｃ、または別のコンパニオンアニマルの野生型もしくは変異体ＩｇＧ  Ｆｃ等）の結合と比較することができる。実施例１に記載されている結合アッセイを使用することができる。
【０１７５】
実施例３
補体結合を減少させるための変異体ネコＩｇＧ  Ｆｃポリペプチド
ネコＩｇＧの３つのサブタイプ、ＩｇＧ１ａ  Ｆｃ（配列番号８０または配列番号１１７）、ＩｇＧ１ｂ  Ｆｃ（配列番号８１または配列番号１１８）、およびＩｇＧ２  Ｆｃ（配列番号１６）はそれぞれ、プロテインＡ結合親和性を有する。ただし、ネコＩｇＧ２  ＦｃのみがＣ１ｑへの結合親和性が弱いか測定できないが、一方、ネコＩｇＧ１ａ  Ｆｃ、ＩｇＧ１ｂ  ＦｃはＣ１ｑに結合する。Ｃ１ｑ結合を潜在的に低下させるため、および／または補体媒介性免疫応答を潜在的に低下させるために、変異体ネコＩｇＧ１ａ  ＦｃおよびＩｇＧ１ｂ  Ｆｃポリペプチドが設計された。
【０１７６】
以下の表８は、ネコＩｇＧ  ＦｃサブタイプのプロテインＡおよびＣ１ｑ結合特性をまとめたものである。特に、どの野生型ウマＩｇＧ  ＦｃサブタイプもＣ１ｑ結合を欠いておらず、プロテインＡにも結合しない。
【０１７７】
表８
2020531002.tif 000052
【０１７８】
Ｃ１ｑのネコＩｇＧ１ａ  ＦｃおよびＩｇＧ１ｂ  Ｆｃへの結合を潜在的に低下させるため、ならびに／または補体媒介性免疫応答を潜在的に低下させるため、それぞれ配列番号８０または配列番号８１の１９８位に対応するアミノ酸位置に、Ｐｒｏを除く任意のアミノ酸によるＰｒｏのアミノ酸置換を有する変異体ネコＩｇＧ１ａ  ＦｃおよびＩｇＧ１ｂ  Ｆｃポリペプチドを調製することができる。これらのアミノ酸置換は、補体活性を呈しないと理解されているネコＩｇＧ２  Ｆｃと比較した、ネコＩｇＧ１ａ  ＦｃおよびＩｇＧ１ｂ  Ｆｃのタンパク質配列解析および３Ｄ構造モデリングの後に同定された。例えば、変異体ネコＩｇＧ１ａ  Ｆｃ  Ｐ（１９８）Ａ（配列番号８２）および変異体ネコＩｇＧ１ｂ  Ｆｃ  Ｐ（１９８）Ａ（配列番号８３）を調製することができる。
【０１７９】
Ｃ１ｑへの任意の変異体ネコＩｇＧ  Ｆｃの結合を決定し、Ｃ１ｑへの別のＩｇＧ  Ｆｃ（例：対応する野生型ネコＩｇＧ  Ｆｃ、別の野生型もしくは変異体ネコＩｇＧ  Ｆｃ、または別のコンパニオンアニマルの野生型もしくは変異体ＩｇＧ  Ｆｃ等）の結合と比較することができる。実施例１に記載されている結合アッセイを使用することができる。
【０１８０】
実施例４
ヘテロ二量体タンパク質の変異体イヌおよびネコＩｇＧ  Ｆｃポリペプチド
ノブ・イン・ホールヘテロ二量体化手法を使用して、二重特異性のイヌもしくはネコ抗体または二機能性のイヌもしくはネコＦｃ融合タンパク質の調製を可能にするために、変異体イヌＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドと変異体ネコＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドの対形成を調べた。
【０１８１】
イヌＩｇＧ−Ａ（配列番号１）の１３８位に対応する位置、イヌＩｇＧ−Ｂ  Ｆｃ（配列番号２）の１３７位に対応する位置、イヌＩｇＧ−Ｃ  Ｆｃ（配列番号３）の１３７位に対応する位置、またはイヌＩｇＧ−Ｄ  Ｆｃ（配列番号４）の１３８位に対応する位置でのスレオニンからチロシンへのアミノ酸置換（Ｔ１３８ＹまたはＴ１３７Ｙ）を、１つのＦｃ鎖（ヘテロ二量体鎖１）へ導入することができる。変異体イヌＩｇＧ−Ａ  Ｆｃ、ＩｇＧ−Ｂ  Ｆｃ、ＩｇＧ−Ｃ  ＦｃおよびＩｇＧ−Ｄ  Ｆｃヘテロ二量体鎖１のアミノ酸配列の例は、それぞれ配列番号８、配列番号１０、配列番号１２および配列番号１４である。
【０１８２】
イヌＩｇＧ−Ａ（配列番号１）の１８１位に対応する位置、イヌＩｇＧ−Ｂ  Ｆｃ（配列番号２）の１８０位に対応する位置、イヌＩｇＧ−Ｃ  Ｆｃ（配列番号３）の１８０位に対応する位置、またはイヌ  ＩｇＧ−Ｄ  Ｆｃ（配列番号４）の１８１位に対応する位置でのチロシンからスレオニンへのアミノ酸置換（Ｙ１８１ＴまたはＹ１８０Ｔ）を、第２のＦｃ鎖（ヘテロ二量体鎖２）へ導入することができる。変異体イヌＩｇＧ−Ａ  Ｆｃ、ＩｇＧ−Ｂ  Ｆｃ、ＩｇＧ−Ｃ  ＦｃおよびＩｇＧ−Ｄ  Ｆｃヘテロ二量体鎖２のアミノ酸配列の例は、それぞれ配列番号９、配列番号１１、配列番号１３および配列番号１５である。
【０１８３】
変異体イヌＩｇＧ  Ｆｃヘテロ二量体鎖３と４の第２の対形成も調べた。イヌＩｇＧ−Ａ（配列番号１）もしくはイヌＩｇＧ−Ｄ（配列番号４）の１３８位に対応する位置、またはイヌＩｇＧ−Ｂ  Ｆｃ（配列番号２）もしくはイヌＩｇＧ−Ｃ  Ｆｃ（配列番号３）の１３７位に対応する位置でのスレオニンからトリプトファンへのアミノ酸置換（Ｔ１３８Ｗ）（Ｔ１３７Ｗ）を１つのＦｃ鎖（ヘテロ二量体鎖３）に導入することができる。変異体イヌＩｇＧ−Ａ  Ｆｃ、ＩｇＧ−Ｂ  Ｆｃ、ＩｇＧ−Ｃ  ＦｃおよびＩｇＧ−Ｄ  Ｆｃヘテロ二量体鎖３のアミノ酸配列の例は、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３および配列番号１１５である。
【０１８４】
イヌＩｇＧ−Ａ（配列番号１）もしくはＩｇＧ−Ｄ（配列番号４）の１３８位に対応する位置でのスレオニンからセリンへの、１４０位に対応する位置でのロイシンからアラニンへの、１８１位に対応する位置でのチロシンからスレオニンへのアミノ酸置換（Ｔ１３８Ｓ、Ｌ１４０Ａ、Ｙ１８１Ｔ）、またはイヌＩｇＧ−Ｂ  Ｆｃ（配列番号２）もしくはＩｇＧ−Ｃ（配列番号３）の１３７位に対応する位置でのスレオニンからセリンへの、１３９位に対応する位置でロイシンからアラニンへの、１８０位に対応する位置でのチロシンからスレオニンへのアミノ酸置換（Ｔ１３７Ｓ、Ｌ１３９Ａ、Ｙ１８０Ｔ）を第２のＦｃ鎖（ヘテロ二量体鎖４）に導入することができる。変異体イヌＩｇＧ−Ａ  Ｆｃ、ＩｇＧ−Ｂ  Ｆｃ、ＩｇＧ−Ｃ  ＦｃおよびＩｇＧ−Ｄ  Ｆｃヘテロ二量体鎖４のアミノ酸配列の例は、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４および配列番号１１６である。
【０１８５】
ネコＩｇＧ２（配列番号１６）の、ネコＩｇＧ１ａ  Ｆｃ（配列番号８０または配列番号１１７）の、またはネコＩｇＧ１ｂ  Ｆｃ（配列番号８１または配列番号１１８）の１５４位に対応する位置でのスレオニンからトリプトファンへのアミノ酸置換（Ｔ１５４Ｗ）を１つのＦｃ鎖（ヘテロ二量体鎖１）に導入することができる。変異体ネコ  ＩｇＧ２  Ｆｃ、ＩｇＧ１ａ  ＦｃおよびＩｇＧ１ｂ  Ｆｃヘテロ二量体鎖１のアミノ酸配列の例は、それぞれ配列番号１１９、配列番号１２１および配列番号１２３である。
【０１８６】
ネコＩｇＧ２  Ｆｃ（配列番号１６）、ＩｇＧ−１ａ（配列番号８０または配列番号１１７）またはＩｇＧ−１ｂ  Ｆｃ（配列番号８１または配列番号１１８）の１５４位に対応する位置でのスレオニンからセリンへの、１５６位に対応する位置でのロイシンからアラニンへの、１９７位に対応する位置でのチロシンからスレオニンへのアミノ酸置換（Ｔ１５４Ｓ、Ｌ１５６Ａ、Ｙ１９７Ｔ）を第２のＦｃ鎖（ヘテロ二量体鎖４）に導入することができる。変異体ネコＩｇＧ２  Ｆｃ、ＩｇＧ１ａ  ＦｃおよびＩｇＧ１ｂ  Ｆｃヘテロ二量体鎖４のアミノ酸配列の例は、配列番号１２０、配列番号１２２および配列番号１２４である。
【０１８７】
変異体イヌＩｇＧ  Ｆｃヘテロ二量体鎖１と２の対形成、変異体イヌＩｇＧ  Ｆｃヘテロ二量体鎖３と４の対形成または変異体ネコＩｇＧ  Ｆｃヘテロ二量体鎖１と２の対形成は、Ｆｃヘテロ二量体化を可能にし、Ｆｃホモ二量体化を防止または減少させることができる。１つのイヌＩｇＧサブタイプのヘテロ二量体鎖１は、同じかまたは異なるイヌＩｇＧサブタイプのヘテロ二量体鎖２と組み合わされてもよい。１つのイヌＩｇＧサブタイプのヘテロ二量体鎖３は、同じかまたは異なるイヌＩｇＧサブタイプのヘテロ二量体鎖４と組み合わされてもよい。１つのネコＩｇＧサブタイプのヘテロ二量体鎖１は、同じかまたは異なるネコＩｇＧサブタイプのヘテロ二量体鎖２と組み合わされてもよい。この設計により、二重特異性イヌまたはネコ抗体の二量体化が可能になる。さらに、２つの異なるペプチドもしくはタンパク質、または異なるタンパク質の組み合わせをヘテロ二量体Ｆｃ鎖に融合させることができる。例えば、変異体イヌＩｇＧ−Ｄ  Ｆｃヘテロ二量体鎖１（例：配列番号１４）に融合したＧＬＰ１ポリペプチド（例：配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０または配列番号９１）および変異体イヌＩｇＧ−Ｄ  Ｆｃヘテロ二量体鎖２（例：配列番号１５）に融合したグルカゴンポリペプチド（例：配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４または配列番号９５）などの変異体イヌＩｇＧ  Ｆｃヘテロ二量体鎖または変異体ネコＩｇＧ  Ｆｃヘテロ二量体鎖を使用して、ＧＬＰ１とグルカゴンのデュアル分子を作ることができる。
【０１８８】
実施例５
ＧＬＰ１融合タンパク質
ＧＬＰ１のアミノ酸配列は、他の種の中でも、ヒト、ネコ、イヌおよびウマの間で保存されている。ＧＬＰ１タンパク質分解産物（例：ＧＬＰ１（アミノ酸７−３７）（配列番号８５）は、ジペプチジルペプチダーゼ−４（ＤＰＰ−４）によって急速に分解され、数分の短い血清半減期を持つと理解されている。
【０１８９】
長時間作用型ＧＬＰ１融合タンパク質を生成するために、少なくとも１つのＧＬＰ１ポリペプチドとネコ、イヌまたはウマＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドとを含む連続ポリペプチドの設計を調べた。以下のコンストラクトが設計された。
式（Ｉ）：ＧＬＰ１Ａ-Ｌ１-Ｆｃ；
式（ＩＩ）：Ｆｃ-Ｌ１-ＧＬＰ１Ａ；または
式（ＩＩＩ）：ＧＬＰ１Ａ-Ｌ１-Ｆｃ-Ｌ２-ＧＬＰ１Ｂ
式中、ＧＬＰ１Ａは第１のＧＬＰ１ポリペプチドであり、ＧＬＰ１Ｂは  第２のＧＬＰ１ポリペプチドであり、Ｌ１およびＬ２はリンカーであり、Ｆｃはコンパニオンアニマル種のＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドである。    
【０１９０】
ＧＬＰ１は、野生型ＧＬＰ１  （７−３７）（配列番号８５）の８位に対応する位置でアラニンをグリシンまたはセリンのいずれかに置き換えることにより、ＤＰＰ−４耐性になるように修飾された。成熟ネコ  ＧＬＰ１Ｒ（配列番号４９）のＮ末端ドメインに結合するための野生型ＧＬＰ１（７−３７）（配列番号８７）の最小配列を、複合体の三次元タンパク質モデリングによって分析した。このモデリングに基づいて、２つのＣ末端アミノ酸をＤＰＰ−４耐性ＧＬＰ１から除去して、ＧＬＰ１−Ｓ８（７−３５）（配列番号８６）およびＧＬＰ１−Ｇ８（７−３５）（配列番号８７）ポリペプチドを生成した。
【０１９１】
ＧＬＰ１ポリペプチドは、式ＩＩおよびＩＩＩなどのコンストラクトのＣ末端に位置する場合、ＤＰＰ−４分解を受けにくい。ゆえに、アラニンからグリシンまたはセリンへの置換は、Ｃ末端に位置するＧＬＰ１ポリペプチドには必要ない。したがって、野生型ＧＬＰ１（７−３７）（配列番号８５）をＣ末端に使用することができる。
【０１９２】
リンカーは、グリシンおよびセリンに富むリンカーなどの柔軟な非構造リンカーであってもよい。連続ポリペプチドのＣ末端に柔軟な伸長部を追加することができる。伸長部は、１つのグリシン残基（配列番号８８）、２つのグリシン残基（配列番号８９）、３つのグリシン残基（配列番号９０）、４つのグリシン残基（配列番号９１）、５つのグリシン残基（配列番号９２）、６つのグリシン残基（配列番号９３）、７つのグリシン残基（配列番号９４）、８つのグリシン残基（配列番号９５）、またはそれ以上のグリシン残基を含み得る。
【０１９３】
実施例６
ＧＬＰ１およびネコＩｇＧ  Ｆｃ融合タンパク質
（１）  シグナル配列、ＧＬＰ１−Ｇ８（７−３５）（配列番号８７）、柔軟なリンカーおよび野生型ネコＩｇＧ２  Ｆｃを有する式Ｉの連続ポリペプチド（ｓｓＧＬＰ１−Ｇ８＿Ｉ＿ＷＴｆｅＩｇＧ２；配列番号９６）；ならびに（２）シグナル配列、ＧＬＰ１−Ｇ８（７−３５）（配列番号８７）、ＧＬＰ１（７−３５）（配列番号８９）、２つの柔軟なリンカー、２Ｇ  Ｃ末端伸長部おおよび野生型ネコＩｇＧ２  Ｆｃを有する式ＩＩＩの連続ポリペプチド（ｓｓＧＬＰ１−Ｇ８／ＧＬＰ１−２Ｇ＿ＩＩＩ＿ＷＴｆｅＩｇＧ２；配列番号９７）をコードするヌクレオチド配列を合成し、別々の哺乳動物発現ベクターにクローニングした。野生型ネコＩｇＧ２  Ｆｃ（配列番号１６）は、補体活性低減のためにＣ１Ｑ結合が弱いか全くないことに基づいて、および容易な精製のためにプロテインＡ結合に基づいて選択された。
【０１９４】
得られたベクターを別々にＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。シグナルペプチド（配列番号２４および２３）を含まない連続ポリペプチドを含む上清を回収し、濾過した。両方のタンパク質をプロテインＡカラム（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ社製ＣａｐｔｉｖＡ（登録商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ）を使用してアフィニティー精製した。タンパク質は、ＨＰＬＣゲル濾過で評価して、単量体であると決定された。ただし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析では、両方の連続ポリペプチドのパーセンテージが、還元剤（ＤＴＴ）の非存在下および存在下でゲル中の同じ位置に移動することが示された（図２Ａ）。この結果は、システイン残基のペアが１つしかない野生型ネコＩｇＧ２  Ｆｃのヒンジでは、効果的なジスルフィド結合を形成するには不十分である可能性があることを示唆している。
【０１９５】
いくつかのオルソログヒンジ構造の三次元タンパク質モデリング分析を使用して、ネコＩｇＧ２ヒンジを改変してジスルフィド形成を増加させるためのおよその位置を決定した。ネコＩｇＧ２ヒンジでのジスルフィド形成を増加させるために、ミノ酸をシステインで置換することによりヒンジ配列を改変することができる。例えば、改変されたヒンジを有する変異体ネコＩｇＧ２  Ｆｃ（配列番号１７）は、配列番号１６の１４位に対応するアミノ酸位置でＧｌｙをＣｙｓに置換することにより調製された。配列番号１７の変異体ネコＩｇＧ  Ｆｃを含む、対応する連続ポリペプチドｓｓＧＬＰ１−Ｇ８＿Ｉ＿ＶＡＲｆｅＩｇＧ２（配列番号３９）とｓｓＧＬＰ１−Ｇ８／ＧＬＰ１−２Ｇ＿ＩＩＩ＿ＷＴｆｅＩｇＧ２（配列番号３８）を設計し、ＣＨＯ細胞で発現させ、プロテインＡクロマトグラフィーで精製した。シグナル配列の切断後の分泌タンパク質のアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号２６、２５である。変異体ネコＩｇＧ２コンストラクトのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、野生型ネコＩｇＧ２コンストラクトと比較して、還元剤の非存在下で低分子量バンドのタンパク質量の減少を示した（図２Ｂを図２Ａと比較のこと）。これらの結果は、Ｆｃ共有結合対形成が両方の変異体ネコＩｇＧ２コンストラクトで改善されたことを示唆する。
【０１９６】
さらに、示差走査蛍光分析を使用して、平均溶融温度（ｎ＝３）で表される、さまざまなｐＨでの連続ポリペプチドの安定性を評価した（下の表９）。変異体ネコＩｇＧ２ヒンジの安定性の向上は、ｐＨ６で最も顕著である。例えば、変異体ネコＩｇＧ２（配列番号２５および２６）を有するコンストラクトはそれぞれ、ｐＨ６で、野生型ネコＩｇＧ２（配列番号２３および２４）を有する対応するコンストラクトよりも高いＴｍ（５６．９℃、５９．７℃）を示した。
【０１９７】
表９
2020531002.tif 000053
【０１９８】
ＧＬＰ１−Ｇ８（７−３５）（配列番号８７）の代わりにＧＬＰ１−Ｓ８（７−３５）（配列番号８６）を含む式Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩの連続ポリペプチドを、同様に設計および調製することができる。例えば、ｓｓＧＬＰ１−Ｓ８＿Ｉ＿ＷＴｆｅＩｇＧ２（配列番号４０）、ＧＬＰ１−Ｓ８＿Ｉ＿ＷＴｆｅＩｇＧ２（配列番号２８）、ｓｓＧＬＰ１−Ｓ８／ＧＬＰ１−３Ｇ＿ＩＩＩ＿ＷＴｆｅＩｇＧ２（配列番号３７）およびＧＬＰ１−Ｓ８／ＧＬＰ１−３Ｇ＿ＩＩＩ＿ＷＴｆｅＩｇＧ２（配列番号２７）を調製することができる。野生型ネコＩｇＧ  Ｆｃの代わりに、ＧＬＰ１−Ｓ８＿Ｉ＿ＶＡＲｆｅＩｇＧ２、ＧＬＰ１−Ｓ８＿Ｉ＿ＶＡＲｆｅＩｇＧ２、ＧＬＰ１−Ｓ８／ＧＬＰ１−２Ｇ＿ＩＩＩ＿ＶＡＲｆｅＩｇＧ２およびＧＬＰ１−Ｓ８／ＧＬＰ１−３Ｇ＿ＩＩＩ＿ＶＡＲｆｅＩｇＧ２などの変異体を有する類似のコンストラクトも調製することができる。
【０１９９】
この実施例ではネコＩｇＧ２  Ｆｃを使用したが、ＩｇＧ２の代わりにネコＩｇＧ１ａ  ＦｃまたはＩｇＧ１ｂ  Ｆｃを含む式Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩの連続ポリペプチドを設計し、調製するこができる。例えば、野生型ネコＩｇＧ１ａ  Ｆｃ、野生型ネコＩｇＧ１ｂ  Ｆｃ、変異体ネコＩｇＧ１ａ  Ｆｃまたは変異体ネコＩｇＧ１ｂ  Ｆｃ（それぞれ、配列番号８０から８３）を有する類似の連続ポリペプチドを設計し、調製するこができる。
【０２００】
実施例７
ＧＬＰ１およびイヌＩｇＧ  Ｆｃ融合タンパク質
変異体ＧＬＰ１とイヌＩｇＧ  Ｆｃとを含む式Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩのさまざまな連続ポリペプチドを設計し、調製するこができる。例えば、変異体イヌＩｇＧＤ  Ｆｃ（配列番号７または配列番号６２）は、補体活性低減のためにＣ１ｑ結合が弱いか全くないことに基づいて、および容易な精製のためにプロテインＡ結合に基づいて選択され得る。さらに、グリシンおよびセリンに富むリンカーなどの柔軟な非構造リンカーを使用することができる。
【０２０１】
ＧＬＰ１−Ｇ８＿Ｉ＿ＶＡＲｃａＩｇＧＤ（配列番号３０）およびＧＬＰ１−Ｓ８＿Ｉ＿ＶＡＲｃａＩｇＧＤ（配列番号３２）は、（１）ＧＬＰ１−Ｇ８（７−３５）かＧＬＰ１−Ｓ８（７−３５）のいずれか、（２）柔軟なリンカー、および（３）変異体イヌＩｇＧＤ  Ｆｃ（例：配列番号７）を含む式Ｉの連続ポリペプチドの例である。ＧＬＰ１−Ｇ８／ＧＬＰ１−３Ｇ＿ＩＩＩ＿ＶＡＲｃａＩｇＧＤ（配列番号２９）およびＧＬＰ１−Ｓ８／ＧＬＰ１−３Ｇ＿ＩＩＩ＿ＶＡＲｃａＩｇＧＤ（配列番号３１）は、（１）ＧＬＰ１−Ｇ８（配列番号８７）かＧＬＰ１−Ｓ８（配列番号８６）のいずれか、（２）ＧＬＰ１（７−３５）（配列番号６１）、（３）２つの柔軟なリンカー（４）３Ｇ  Ｃ末端伸長部、および（５）変異体イヌＩｇＧＤ  Ｆｃを含む式ＩＩＩの連続ポリペプチドの例である。
【０２０２】
シグナル配列、異なるＧＬＰ１ポリペプチド（例：配列番号８５、８６、８７、９８または９９）またはイヌＩｇＧ  Ｆｃへのさまざまな改変を有する連続ポリペプチドが設計され得る。このような変異の例には、ｓｓＧＬＰ１−Ｓ８／ＧＬＰ１−２Ｇ＿ＩＩＩ＿ＶＡＲｃａＩｇＧＤ（配列番号４１）、ｓｓＧＬＰ１−Ｇ８／ＧＬＰ１−２Ｇ＿ＩＩＩ＿ＶＡＲｃａＩｇＧＤ（配列番号４２）、ｓｓＧＬＰ１−Ｓ８／ＧＬＰ１−３Ｇ＿ＩＩＩ＿ＶＡＲｃａＩｇＧＤ（配列番号４３）、ＧＬＰ１−Ｓ８／ＧＬＰ１−２Ｇ＿ＩＩＩ＿ＶＡＲｃａＩｇＧＤ（配列番号１０５）、およびＧＬＰ１−Ｇ８／ＧＬＰ１−２Ｇ＿ＩＩＩ＿ＶＡＲｃａＩｇＧＤ（配列番号１０６）が含まれる。
【０２０３】
さらに、式Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩの連続ポリペプチドは、変異体イヌＩｇＧＤの代わりに野生型イヌＩｇＧＤまたは野生型もしくは変異体イヌＩｇＧＡ、ＩｇＧＢもしくはＩｇＧＣを含んでもよい。例えば、野生型イヌＩｇＧＡ  Ｆｃ、ＩｇＧＢ  Ｆｃ、ＩｇＧＣ  ＦｃまたはＩｇＧＤ  Ｆｃ（例：それぞれ配列番号１、２、３または４）を有する類似の連続ポリペプチドが設計および調製され得る。さらなる例には、変異体イヌＩｇＧＡ  Ｆｃ（例：配列番号５または６０）、変異体イヌＩｇＧＢ  Ｆｃ（例：配列番号７８）または変異体イヌＩｇＧＣ  Ｆｃ（例：配列番号６、６１、７９または８４）を含む連続ポリペプチドが含まれる。
【０２０４】
ＧＬＰ１−Ｇ８／ＧＬＰ１−３Ｇ＿ＩＩＩ＿ＶＡＲｃａＩｇＧＤ（配列番号２９）およびＧＬＰ１−Ｇ８＿Ｉ＿ＶＡＲｃａＩｇＧＤ（配列番号３０）をＣＨＯ細胞内で別々に発現させ、タンパク質を含む上清を回収して濾過した。プロテインＡクロマトグラフィーによって、両方の連続ポリペプチドをアフィニティー精製した。還元剤（ＤＴＴ）の非存在下および存在下で２つの連続ポリペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイルを比較したが、結果は、両方のポリペプチドに対してＦｃジスルフィド結合が効果的に形成されたことを示唆していた（データは示していない）。
【０２０５】
実施例８
ＧＬＰ１およびウマＩｇＧ  Ｆｃ融合タンパク質
変異体ＧＬＰ１とウマＩｇＧ  Ｆｃとを含む式Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩのさまざまな連続ポリペプチドを設計し、調製するこができる。例えば、変異体イヌＩｇＧ２  Ｆｃ（例：配列番号１９、７１または７２）は、補体活性低減のためにＣ１ｑ結合が弱いか全くないことに基づいて、および容易な精製のためにプロテインＡ結合に基づいて選択され得る。さらに、グリシンおよびセリンに富むリンカーなどの柔軟な非構造リンカーを使用することができる。
【０２０６】
ＧＬＰ１−Ｇ８＿Ｉ＿ＶＡＲｅｑＩｇＧ２（配列番号３４）およびＧＬＰ１−Ｓ８＿Ｉ＿ＶＡＲｅｑＩｇＧ２（配列番号３６）は、（１）ＧＬＰ１−Ｇ８かＧＬＰ１−Ｓ８のいずれか、（２）柔軟なリンカー、および（３）変異体ウマＩｇＧ２  Ｆｃ（例：配列番号１９）を含む式Ｉの連続ポリペプチドの例である。ＧＬＰ１−Ｇ８／ＧＬＰ１−３Ｇ＿ＩＩＩ＿ＶＡＲｅｑＩｇＧ２（配列番号３３）およびＧＬＰ１−Ｓ８／ＧＬＰ１−３Ｇ＿ＩＩＩ＿ＶＡＲｅｑＩｇＧ２（配列番号３５）は、（１）ＧＬＰ１−Ｇ８（７−３５）（配列番号８７）かＧＬＰ１−Ｓ８（７−３５）（配列番号８６）のいずれか、（２）ＧＬＰ１（７−３５）（配列番号６１）、（３）２つの柔軟なリンカー（４）３Ｇ  Ｃ末端伸長部、および（５）変異体ウマＩｇＧＤ  Ｆｃを含む式ＩＩＩの連続ポリペプチドの例である。
【０２０７】
シグナル配列、異なるＧＬＰ１アナログ（例：配列番号８６、８７、９８または９９）、グリシン伸長部（例：配列番号８８から９５）またはウマＩｇＧ  Ｆｃ．への追加の改変を有する連続ポリペプチドが設計され得る。このような変異の例には、ｓｓＧＬＰ１−Ｇ８／ＧＬＰ１−３Ｇ＿ＩＩＩ＿ＶＡＲｅｑＩｇＧ２（配列番号４４）、ｓｓＧＬＰ１−Ｇ８＿Ｉ＿ＶＡＲｅｑＩｇＧ２（配列番号４５）、ｓｓＧＬＰ１−Ｓ８／ＧＬＰ１−３Ｇ＿ＩＩＩ＿ＶＡＲｅｑＩｇＧ２（配列番号４６）、およびｓｓＧＬＰ１−Ｓ８＿Ｉ＿ＶＡＲｅｑＩｇＧ２（配列番号４７）が含まれる。
【０２０８】
さらに、式Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩの連続ポリペプチドは、変異体ウマＩｇＧ２の代わりに野生型ウマＩｇＧ２または野生型もしくは変異体ウマＩｇＧ１、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＧ５、ＩｇＧ６、ＩｇＧ７を含んでもよい。例えば、野生型ウマＩｇＧ１  Ｆｃ（例：配列番号６３）、ＩｇＧ２  Ｆｃ（例：配列番号１８または６４）、ＩｇＧ３  Ｆｃ（例：配列番号６５）、ＩｇＧ４  Ｆｃ（例：配列番号６６）、ＩｇＧ５  Ｆｃ（例：配列番号６７）、ＩｇＧ６  Ｆｃ（例：配列番号６８）またはＩｇＧ７  Ｆｃ（例：配列番号６９）を有する類似の連続ポリペプチドを設計し、調製することができる。さらなる例には、変異体ウマＩｇＧ１Ｆｃ（例：配列番号７０）、変異体ウマＩｇＧ３  Ｆｃ（例：配列番号７３）、変異体ウマＩｇＧ４  Ｆｃ（例：配列番号７４）、変異体ウマＩｇＧ５  Ｆｃ（例：配列番号７５）、変異体ウマＩｇＧ６  Ｆｃ（例：配列番号７６），または変異体ウマＩｇＧ７  Ｇｃ（例：配列番号７７）を含む連続ポリペプチドが含まれる。
【０２０９】
ｓｓＧＬＰ１−Ｇ８／ＧＬＰ１−３Ｇ＿ＩＩＩ＿ＶＡＲｅｑＩｇＧ２（配列番号４４）およびｓｓＧＬＰ１−Ｇ８＿Ｉ＿ＶＡＲｅｑＩｇＧ２（配列番号４５）をコードするヌクレオチド配列を合成し、別々の哺乳動物発現ベクターにクローニングした。得られたベクターを別々にＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。シグナルペプチド（配列番号１０３および１０４）の切断後の連続ポリペプチドを含む上清を回収し、濾過した。両方のタンパク質をプロテインＡカラム（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ社性ＣａｐｔｉｖＡ（登録商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｓｉｎ）を使用してアフィニティー精製し、ＣＨＯ細胞内で別々にｊ発現させ、タンパク質を含む上清を回収し、濾過した。プロテインＡクロマトグラフィーによって、両方の連続ポリペプチドをアフィニティー精製した。還元剤（ＤＴＴ）の非存在下および存在下で２つの連続ポリペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイルを比較したが、結果は、両方のポリペプチドに対してＦｃジスルフィド結合が効果的に形成されたことを示唆していた（データは示していない）。
【０２１０】
実施例９
ネコＧＬＰ１Ｒ  Ｎ末端可溶性ドメインの発現および精製
ＧＬＰ１のＧＬＰ１Ｒへの結合に関与する成熟ネコＧＬＰ１Ｒ（配列番号４９）のＮ末端ドメインは、全長ネコＧＬＰ１Ｒアミノ酸配列（配列番号４８）から同定された。（１）シグナル配列、ネコＮ末端ＧＬＰ１Ｒ、ヒトＦｃおよびポリＨｉｓタグ（ｓｓＦｅＧＬＰ１Ｒ−Ｎ−ｈｕＦｃ＿ＰｏｌｙＨｉｓ；配列番号５０）、並びに（２）シグナル配列、ネコＮ末端ＧＬＰ１ＲおよびポリＨｉｓタグ（ｓｓＦｅＧＬＰ１Ｒ−Ｎ＿ｐｏｌｙＨｉｓ；配列番号５１）をコードするヌクレオチド配列を合成し、別々の哺乳動物発現ベクターにクローニングした。得られたベクターを別々にＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。ポリペプチドを含有する上清を回収し、濾過した。ｈｕＦｃコンストラクト用に、タンパク質をＮｉ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅカラムまたはプロテインＡカラム（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ社製ＣａｐｔｉｖＡ（登録商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ）を使用してアフィニティー精製した。両方のタンパク質をＧＬＰ１機能性結合とＥＬＩＳＡに使用した。
【０２１１】
実施例１０
ＧＬＰ１融合タンパク質結合速度論
ＧＬＰ１−Ｇ８＿Ｉ＿ＶＡＲｆｅＩｇＧ２（配列番号２６）のＦｅＧＬＰ１Ｒ−Ｎ−ｈｕＦｃ＿ＰｏｌｙＨｉｓへの結合親和性をバイオレイヤー干渉法（オクテット）を使用して評価した。つまり、ＦｅＧＬＰ１Ｒ−Ｎ−ｈｕＦｃ＿ＰｏｌｙＨｉｓをビオチン化し、遊離の未反応ビオチンを除去し、ビオチン化タンパク質をストレプトアビジンセンサーチップに捕捉した。さまざまな濃度のＧＬＰ１−Ｇ８＿Ｉ＿ＶＡＲｆｅＩｇＧ２の会合を９０秒間モニターした。解離を６００秒間モニターした。ドリフトを補正するために、バッファーのみのブランク曲線を差し引いた。データをＦｏｒｔｅＢｉｏＴＭデータ解析ソフトウェアを使用して１：１の結合モデルにフィッティングさせ、ｋｏｎ、ｋｏｆｆおよびＫｄを決定した。希釈およびすべての結合工程用のバッファーは、２０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２であった。ネコＧＬＰ１Ｒ  Ｎ末端ドメインとＧＬＰ１−Ｇ８＿Ｉ＿ＶＡＲｆｅＩｇＧ２の間のＫｄは、８．０ｘ１０−９と１６ｘ１０−９Ｍの間であった。
【０２１２】
実施例１１
細胞ベースのアッセイにおけるＧＬＰ１融合タンパク質の生物活性
細胞表面でＧｓ共役型ヒトグルカゴンリガンドペプチ１受容体（ＧＬＰ１Ｒ）を過剰発現するハムスター卵巣細胞株であるＣＨＯＫ−１−ＧＬ１Ｒ細胞株（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｘ、カタログ＃９５−００６２Ｃ２）を使用して、ｃＡＭＰ  Ｈｕｎｔｅｒ  Ｂｉｏａｓｓａｙキット（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｘ、カタログ＃９５−００６２Ｙ２）でＧＬＰ１細胞活性を測定した。細胞を９６ウェルプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。その後、細胞を、３倍段階希釈で、対照アゴニスト-ＧＬＰ１ヒト（３７ａ．ａ．）（Ｐｒｏｓｐｅｃ、カタログ＃  ＨＯＲ−２３６）かＥｘｔｅｎｄｉｎ−４（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｘ、カタログ＃ ９２−１１１５）のいずれか-、または変異体ＧＬＰ１を含む連続ポリペプチドで処理し、その後３７ｏＣで３０分間インキュベートした。試験した連続ポリペプチドは、ＧＬＰ１−Ｇ８／ＧＬＰ１−２Ｇ＿ＩＩＩ＿ＶＡＲｆｅＩｇＧ２（配列番号２５）およびＧＬＰ１−Ｇ８＿Ｉ＿ＶＡＲｆｅＩｇＧ２（配列番号２６）であった。
【０２１３】
Ｇｓ共役型ＧＬＰ１Ｒ受容体にＧＬＰ１が結合すると、Ｇｓはアデニレートシクラーゼを刺激してｃＡＭＰを生成する。インキュベーションの終わりに、ｃＡＭＰ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｒｅａｇｅｎｔと、溶解バッファー、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）の小さな断片がコンジュゲートされているｃＡＭＰ、および基質を含有するｃＡＭＰ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎとを細胞に添加した。細胞を暗所で室温で１時間インキュベートして、内因的に生成されたｃＡＭＰとβ−ｇａｌ小断片がコンジュゲートされているｃＡＭＰの間でｃＡＭＰ抗体結合に対する免疫競合反応を起こさせた。
【０２１４】
１時間のインキュベーションの終わりに、遊離（抗体結合なし）β−ｇａｌ小断片ｃＡＭＰを補充して機能的酵素を形成可能な、β−ｇａｌ大型断片含有ｃＡＭＰ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ａを細胞溶解物に加えた。この溶解物を暗所で室温で３から６時間インキュベートし、β−ｇａｌが基質を加水分解して発光シグナルを生成できるようにした。
【０２１５】
残っている未結合の遊離β−ｇａｌ小断片ｃＡＭＰが多いほど、より機能的なβ−ｇａｌ酵素が形成される。したがって、生成されるシグナルの量は、細胞溶解物中のｃＡＭＰの量に正比例する。インキュベーションの終わりに、発光をＳｙｎｅｒｇｙ  ＨＴマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ社、バーモント州ウィヌースキ）で読み取った。ＥＣ５０は、ソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、米国ラ・ホーヤ）で計算された。
【０２１６】
図３は、試験した各試料の相対光量（ＲＬＵ）と濃度のプロットを示す。ＥＣ５０を以下の表１０に挙げる。ＧＬＰ１−Ｇ８／ＧＬＰ１−２Ｇ＿ＩＩＩ＿ＶＡＲｆｅＩｇＧ２（配列番号２５）およびＧＬＰ１−Ｇ８＿Ｉ＿ＶＡＲｆｅＩｇＧ２（配列番号２６）はいずれも、ＧＬＰ１（７−３７）およびＥｘｔｅｎｄｉｎ−４よりも活性が高い。ＧＬＰ１−Ｇ８／ＧＬＰ１−２Ｇ＿ＩＩＩ＿ＶＡＲｆｅＩｇＧ２（配列番号２５）は、ＧＬＰ１−Ｇ８＿Ｉ＿ＶＡＲｆｅＩｇＧ２（配列番号２６）より強力であり、Ｃ末端ＧＬＰ１が追加の活性に寄与している可能性があることを示唆している。
【０２１７】
表１０
2020531002.tif 000054
【０２１８】
実施例１２
ＧＬＰ１融合タンパク質長期安定性
ＧＬＰ１−Ｇ８＿Ｉ＿ＶＡＲｆｅＩｇＧ２（配列番号２６）を１．３ｍｇ／ｍＬの濃度で、１．５ｍＬエッペンチューブに入れたｐＨ７．２のＰＢＳに保存し、２−８℃で１年間保存した（ロット２−２９−２０１６）。また、ＧＬＰ１−Ｇ８＿Ｉ＿ＶＡＲｆｅＩｇＧ２（配列番号２６）を１０ｍｇ／ｍＬの濃度で、１．５ｍＬエッペンチューブに入れたｐＨ７．２のＰＢＳに保存し、２−８℃で１日保存した（ロット２−２−２０１７）。安定性を評価するために、保存した試料は、実施例１１に記載されているのと同じＣＨＯＫ−１−ＧＬ１Ｒ細胞株（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｘ、カタログ＃９５−００６２Ｃ２）を使用する細胞ベースのアッセイにより分析したが、細胞活性はｃＡＭＰ−ＧｌｏＴＭ  Ｍａｘ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ＃ＰＡＶ１６８２）を使用して評価した。
【０２１９】
熱不活性化した１０％ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ、カタログ＃２８６８）を補充したＦ−１２Ｋ培地（ＡＴＣＣ、カタログ＃ＡＴＣＣ（登録商標）３０−２００４）で、ＣＨＯＫ−１−ＧＬ１Ｒ細胞を９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ＃３６１０）に１ウェルあたり２００００細胞の密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。その後、細胞を無血清培地で３倍段階希釈した対照アゴニストＧＬＰ１ヒト（３７ａ．ａ．）（Ｐｒｏｓｐｅｃ、カタログ＃ＨＯＲ−２３６）、ロット２−２０−２０１６またはロット２−２−２０１７で刺激した後、最終濃度２０ｍＭまでのＭｇＣｌ２、最終濃度５００μＭまでのイソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ＃Ｉ７０１８）、および最終濃度１００μＭまでのＲｏ  ２０−１７２４［４−（３−ブトキシ−４−メトキシ−ベンジル）イミダゾリドン］（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ＃Ｂ８２７９）を含有するＣｏｍｐｌｅｔｅ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを添加した。
【０２２０】
細胞を、約３０分間室温にインキュベートした。このプロセスにおいて、Ｇｓ共役型ＧＬＰ１Ｒ受容体にＧＬＰ１が結合すると、Ｇｓはアデニレートシクラーゼを刺激してｃＡＭＰを生成する。インキュベーションの終わりに、不活性プロテインキナーゼＡホロ酵素、プロテインキナーゼＡ基質、および溶解バッファーを含有するｃＡＭＰ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを細胞に添加した。プレートをオービタルシェーカーに１-２分間置き、その後室温（２３℃）で２０分間インキュベートした。細胞ｃＡＭＰは、プロテインキナーゼＡを、その調節阻害サブユニットに結合し、触媒サブユニットを放出することにより活性化する。遊離触媒サブユニットは、ＡＴＰの末端ホスフェートのプロテインキナーゼＡ基質への転移を触媒し、このプロセスで細胞ＡＴＰを消費する。インキュベーションの終わりに、ルシフェラーゼベースのＫｉｎａｓｅ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔを細胞溶解物に加え、プレートをオービタルシェーカーで２分間振とうした後、プレートをオービタルシェーカーで２分間振とうした後、暗所で室温で１０分間インキュベーションした。
【０２２１】
ルシフェリンのモノ酸素化が、細胞溶解物中にあるＭｇ２＋とＡＴＰの存在下でルシフェラーゼによって触媒され、細胞内のＡＴＰの量に比例した発光シグナルが得られた。１０分のインキュベーションの終わりに、プレートをＳｙｎｅｒｇｙ  ＨＴマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ社、バーモント州ウィヌースキ）で読み取った。発光は、ＡＴＰレベルに比例するが、ｃＡＭＰレベルに反比例する。したがって、ｃＡＭＰ濃度が増加すると、発光が減少する。
【０２２２】
図４は、ロット２−２−２０１７およびＧＬＰ（３１  ａ．ａ．）と比較したロット２−２９−２０１６の発光対濃度のプロットである、細胞ベースのアッセイの結果を示す。ＧＬＰ１−Ｇ８＿Ｉ＿ＶＡＲｆｅＩｇＧ２試料は、２−８℃で１年間ＰＢＳに保管した後も細胞活性を維持していた。
【０２２３】
実施例１３
ＧＬＰ１融合タンパク質血清安定性
ネコ血清を含むｐＨ７．２のＰＢＳにＧ８＿Ｉ＿ＶＡＲｆｅＩｇＧ２（配列番号２６）を３７℃で２４時間保存し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで血清安定性を試験した。この細胞ベースのアッセイは、実施例１２に記載のとおりに行われ、活性が維持されていることを示唆する結果が出た（データは示さない）。さらに、ウェスタンブロット分析では、目に見える分解は観察されなかった（図５）。
【０２２４】
実施例１４
ＧＬＰ１融合タンパク質ｉｎ  ｖｉｖｏ薬物動態
Ｇ８＿Ｉ＿ＶＡＲｆｅＩｇＧ２（配列番号２６）を、５匹のネコに皮下注射により単回投与（２ｍｇ／ｋｇ）した。血清試料が、投与前（０時間）と、４時間、８時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、１６８時間時点で採取された。血清試料中のＧＬＰ１−Ｇ８＿Ｉ＿ＶＡＲｆｅＩｇＧ２の濃度を定量的ＥＬＩＳＡで測定した。４ｎｇ／ｍＬの検出限界を有するＧＬＰ１−Ｇ８＿Ｉ＿ＶＡＲｆｅＩｇＧ２ポリペプチドを基準として使用した。ＧＬＰ１−Ｇ８＿Ｉ＿ＶＡＲｆｅＩｇＧ２の血清濃度を時間に対してプロットした（図６）。ＧＬＰ１−Ｇ８＿Ｉ＿ＶＡＲｆｅＩｇＧ２の平均血清半減期（ｔ1/2）は３９時間であった。平均Ｔｍａｘは２２時間、平均Ｃｍａｘは１２μｇ／ｍＬ、平均曲線下面積（ＡＵＣ）は約９５０μｇ（ｈ）／ｍＬだった。
【０２２５】
定量的ＥＬＩＳＡでは、ｉｎ  ｖｉｖｏ薬物動態試験のネコ血清試料中のＧＬＰ１−Ｇ８＿Ｉ＿ＶＡＲｆｅＩｇＧ２を定量化するために、抗ＧＬＰ１抗体（４Ｆ３、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、カタログＮｏ．ＮＢＰ１−９７４１３）とヤギ抗ネコＩｇＧ−Ｆｃ、ＨＲＰコンジュゲート抗体（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、カタログＮｏ．Ａ２０−１１７Ｐ）が使用された。９６ウェルプレートを抗ＧＬＰ１抗体でコーティングした（コーティングバッファー中５μｇ／ｍＬ、１００μｌ／ウェル）。プレートを密封し、４℃で一晩インキュベートした。プレートを１ＸＴＢＳＴ（１０ＸＴＢＳＴ、Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログＮｏ．Ｔ９５１１）で３回洗浄し、ブロッキングバッファーを加えた。ブロッキングバッファーを除去した後、標準試料の段階希釈液とブロッキングバッファー中の試料を加え（１００μｌ／ウェル）、プレートを室温で２時間インキュベートした。プレートを１ＸＴＢＳＴで３回洗浄し、ヤギ抗ネコＩｇＧ  Ｆｃ抗体を加えた（ブロッキングバッファー中０．１μｇ／ｍＬ；１００μｌ／ウェル）。室温で１時間インキュベーションした後、プレートを１ＸＴＢＳＴで５回洗浄した。ＴＭＢ基質（ＳｃｙＴｅｋ、カタログＮｏ．ＴＭ１９９９）を加え（１００μｌ／ウェル）、室温で１分間インキュベートした。２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４（５０μｌ／ウェル）の添加により反応を止めた。５０ｎｍでの吸光度を測定し、血清試料のＧＬＰ１−Ｇ８＿Ｉ＿ＶＡＲｆｅＩｇＧ２の濃度を計算した。
【０２２６】
さらに、同じ血清試料（ＤＰＰ−４阻害剤の添加なし）のｗＧＬＰ１−Ｇ８＿Ｉ＿ＶＡＲｆｅＩｇＧ２濃度を、細胞ベースの活性アッセイを使用して評価した。実施例１２に記載されているのと同じＣＨＯＫ−１−ＧＬ１Ｒ細胞株（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｘ、カタログ＃９５−００６２Ｃ２）とｃＡＭＰ−ＧｌｏＴＭ  Ｍａｘ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ＃ＰＡＶ１６８２）を使用した。ただし、本実施例では、対照アゴニストＧＬＰ１ヒト（３７  ａ．ａ．）（Ｐｒｏｓｐｅｃ、カタログ＃ＨＯＲ−２３６）または投与前（０時間）および４時間、８時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、１６８時間時点で採取され、無血清培地で希釈された（５％、０．５％および０．０５％希釈）ネコ血清の試料で細胞を刺激した。各試料中のＧＬＰ１−Ｇ８＿Ｉ＿ＶＡＲｆｅＩｇＧ２の濃度は、ＳｏｆｔＭａｘ  ｐｒｏ  ７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、カリフォルニア州サニーベール）を使用して計算された。５匹のネコのＧＬＰ１−Ｇ８＿Ｉ＿ＶＡＲｆｅＩｇＧ２の平均濃度を時間に対してプロットした（図７）。平均ＡＵＣは約８４０μｇ（ｈ）／ｍＬで、平均ｔ１／２は３６時間であった。細胞ベースの活性アッセイから計算された濃度は、ＥＬＩＳＡから得られた濃度と一致しており、これは、ＥＬＩＳＡにより検出された変異体ＧＬＰ１が生物学的に活性であることを示唆している。
【０２２７】
実施例１５
ＧＬＰ１、グルカゴン、およびＩｇＧ  Ｆｃ融合タンパク質
長時間作用型ＧＬＰ１受容体とグルカゴン受容体のデュアルアゴニストを調べるために、ＧＬＰ１ポリペプチド、グルカゴンポリペプチドおよびＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドを含み、以下のコンストラクト：
式（ＩＶ）：ＧＬＰ１-Ｌ１-Ｆｃ-Ｌ２-Ｇｌｕｃ；および
式（Ｖ）：Ｇｌｕｃ-Ｌ１-Ｆｃ-Ｌ２-ＧＬＰ１
を有する連続ポリペプチドが設計され、
上式中、ＧＬＰ１はＧＬＰ１ポリペプチドであり、Ｇｌｕｃはグルカゴンポリペプチドであり、Ｌ１およびＬ２はリンカーであり、ＦｃはＦｃポリペプチドである。
【０２２８】
上述のとおり、ＧＬＰ１は、野生型ＧＬＰ１（７−３７）（配列番号８５）の８位に対応する位置でアラニンをグリシンまたはセリンのいずれかに置き換えることにより、ＤＰＰ−４耐性になるように修飾された。ＤＰＰ−４耐性になるように修飾された。さらに、２つのＣ末端アミノ酸を除去することによりＤＰＰ−４耐性ＧＬＰ１をさらに修飾し、変異体ＧＬＰ１−Ｓ８（７−３５）（配列番号８６）および変異体ＧＬＰ１−Ｇ８（７−３５）（配列番号８７）ポリペプチドを生成する。
【０２２９】
ＧＬＰ１ポリペプチドは、式（Ｖ），などのコンストラクトのＣ末端に位置する場合、ＤＰＰ−４分解を受けにくい。ゆえに、アラニンからグリシンまたはセリンへの置換は、Ｃ末端に位置するＧＬＰ１ポリペプチドには必要ない。したがって、野生型ＧＬＰ１（７−３７）（配列番号８５）をＣ末端に使用することができる。
【０２３０】
リンカーは、グリシンおよびセリンに富むリンカーなどの柔軟な非構造リンカーであってもよい。連続ポリペプチドのＣ末端に柔軟な伸長部を追加することができる。伸長部は、１つのグリシン残基（配列番号８８）、２つのグリシン残基（配列番号８９）、３つのグリシン残基（配列番号９０）、４つのグリシン残基（配列番号９１）、５つのグリシン残基（配列番号９２）、６つのグリシン残基（配列番号９３）、７つのグリシン残基（配列番号９４）、８つのグリシン残基（配列番号９５）、またはそれ以上のグリシン残基を含み得る。
【０２３１】
連続ポリペプチドは、野生型グルカゴンポリペプチド（例：配列番号２１）または変異体グルカゴンポリペプチドを含んでもよい。
【０２３２】
連続ポリペプチドは、ヒトＩｇＧ  Ｆｃまたはイヌ、ネコもしくはウマ等のコンパニオンアニマル種のＩｇＧ  Ｆｃを含んでもよい。使用されるＩｇＧ  Ｆｃのサブタイプは、Ｃ１ｑ結合活性が低いか、全くないこと、および／またはプロテインＡ結合能を有することに基づく。例えば、低いＣ１ｑ結合親和性を有するかまたはＣ１ｑ結合親和性を全く有しない、かつ／あるいはプロテインＡ結合能を有する、野生型または変異体のヒト、イヌ、ウマまたはネコ  ＩｇＧ  Ｆｃが使用され得る（例：配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３または８４）。
【０２３３】
ＧＬＰ１ポリペプチド、グルカゴンポリペプチドおよびネコＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドを含む例示的な連続ポリペプチドには、ＧＬＰ１−Ｇ８／Ｇｌｕｃ−３Ｇ＿ＩＶ＿ＷＴｆｅＩｇＧ２（配列番号５２）とＧｌｕｃ／ＧＬＰ１−２Ｇ＿Ｖ＿ＷＴｆｅＩｇＧ２（配列番号５３）が含まれる。
【０２３４】
ＧＬＰ１ポリペプチド、グルカゴンポリペプチドおよびイヌＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドを含む例示的な連続ポリペプチドには、ＧＬＰ１−Ｇ８／Ｇｌｕｃ−４Ｇ＿ＩＶ＿ＶＡＲｃａＩｇＧＤ（配列番号５４）とＧｌｕｃ／ＧＬＰ１−３Ｇ＿Ｖ＿ＶＡＲｃａＩｇＧＤ（配列番号５５）が含まれる。
【０２３５】
ＧＬＰ１ポリペプチド、グルカゴンポリペプチドおよびウマＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドを含む例示的な連続ポリペプチドには、ＧＬＰ１−Ｇ８／Ｇｌｕｃ−４Ｇ＿ＩＶ＿ＶＡＲｅｑＩｇＧＤ（配列番号５６）とＧｌｕｃ／ＧＬＰ１−３Ｇ＿Ｖ＿ＶＡＲｅｑＩｇＧ２（配列番号５７）が含まれる。
【０２３６】
ＧＬＰ１ポリペプチド、グルカゴンポリペプチドおよびヒトＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドを含む例示的な連続ポリペプチドには、ＧＬＰ１−Ｇ８／Ｇｌｕｃ−４Ｇ＿ＩＶ＿ｈｕＩｇＧ４（配列番号８）とＧｌｕｃ／ＧＬＰ１−３Ｇ＿Ｖ＿ｈｕＩｇＧ４（配列番号５９）が含まれる。
【０２３７】
実施例１６
ヒンジジスルフィド形成を強化するための変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチド
いくつかのオーソログヒンジ構造の追加の三次元タンパク質モデリング分析を使用して、ネコとウマのＩｇＧヒンジを改変した。ネコＩｇＧヒンジでのジスルフィド形成を強化するために、ネコＩｇＧ２（配列番号１６）、ネコＩｇＧ１ａ（配列番号８０または配列番号１１７）またはネコＩｇＧ１ｂ（配列番号８１または配列番号１１８）の１６位に対応する位置でリジンをプロリンに置換する（例：Ｋ１６Ｐ）ことにより、ヒンジ配列を改変することができる。改変されたヒンジを有する変異体ネコＩｇＧポリペプチドのアミノ酸配列の例には、配列番号１２５、配列番号１２６および配列番号１２７が含まれる。
【０２３８】
ウマＩｇＧヒンジでのジスルフィド形成を強化するために、ウマＩｇＧ（例：ＩｇＧ２  Ｆｃ（配列番号１２９））の３位に対応する位置でシステインをセリンに置換することにより、および／またはウマＩｇＧの２０位に対応ｓする位置でグルタミンをプロリンに置換することにより（例：ＩｇＧ２  Ｆｃ（配列番号１２９）（例：Ｃ３Ｓ、Ｑ２０Ｐ）、ヒンジ配列を改変することができる。改変されたヒンジを有する変異体ウマＩｇＧポリペプチドのアミノ酸配列の例には、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３４および配列番号１３５が含まれる。
【０２３９】
実施例１７
組換え産生の増強および／またはジスルフィド形成の強化のための変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチド
三次元タンパク質モデリングを使用して、組換え産生の増強およびヒンジジスルフィド形成の改善のために、異なるｇＧアイソタイプのヒンジ領域からの配列を含むネコおよびウマ変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドが設計された。ネコＩｇＧ１ａまたはＩｇＧ１ｂのヒンジ領域からの配列（例：配列番号１２５）を含む変異体ネコＩｇＧ２  Ｆｃポリペプチドを調製することができる。さらに、ウマＩｇＧ１のヒンジ領域からの配列（例：配列番号１９）を含む変異体ウマＩｇＧ２  Ｆｃポリペプチドを調製することができる。
【０２４０】
還元および非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、変異体ＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドの組換え産生のレベルおよび／またはヒンジジスルフィド形成のレベルを決定し、別のＩｇＧ  Ｆｃのレベルと比較することができる（例：同じかもしくは異なるアイソタイプの対応する野生型ＩｇＧ  Ｆｃ、または別のコンパニオンアニマルの野生型もしくは変異体ＩｇＧ  Ｆｃなど）。
【図１】
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【図２Ａ−Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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