(57)【要約】  本発明は、可変軽ドメイン及び２つの同族可変重ドメインの両方が２つの別々のタンパク質鎖上にそれぞれタンデムに位置する２つの分割可変ドメイン対のコアを含む複数抗体可変ドメインの新規ヘテロ二量体多重特異的フォーマットに関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１及び第２の一本鎖タンパク質を含むヘテロ二量体タンパク質であって、ここで、前記第１の一本鎖タンパク質は（Ｎ末端からＣ末端へ）
（ｉａ）第１のＶＬドメイン、
（ｉｉａ）第１のポリペプチドリンカー、及び
（ｉｉｉａ）第２のＶＬドメイン
からなる第１のアミノ酸配列を含み、ならびに
ここで、前記第２の一本鎖タンパク質は（Ｎ末端からＣ末端へ）
（ｉｂ）第１のＶＨドメイン、
（ｉｉｂ）第２のポリペプチドリンカー、及び
（ｉｉｉｂ）第２のＶＨドメイン
からなる第２のアミノ酸配列を含み、
ここで、前記第１のＶＬドメインは、前記第１又は前記第２のＶＨドメインのいずれかと第１の標的抗原に特異性を有する可変ドメインの第１の同族対を形成し、前記第２のＶＬドメインは、前記ＶＨドメインの他のものと第２の標的抗原に特異性を有する可変ドメインの第２の同族対を形成し、前記標的抗原の１つがヒト血清アルブミンであり、他の前記標的抗原がヒトＣＤ３であり、
前記第１又は前記第２の一本鎖タンパク質の少なくとも１つは、さらに（ｉｖ）第３のポリペプチドリンカーを介して前記第１又は前記第２のアミノ酸配列に融合される第３の機能的ドメインとしての少なくとも１つの追加ドメインを含むヘテロ二量体タンパク質。
【請求項２】
前記ヘテロ二量体タンパク質が第１及び第２の免疫グロブリン定常ドメインの同族対を含まず、前記第１の免疫グロブリン定常ドメインが前記第１の一本鎖タンパク質に含まれ、前記第２の免疫グロブリン定常ドメインが前記第２の一本鎖タンパク質に含まれる、請求項１に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項３】
（ｖ）第４のポリペプチドリンカーを介して前記第１又は前記第２のアミノ酸配列に融合される第４の機能的ドメイン；（ｖｉ）第４及び第５のポリペプチドリンカーを介して、それぞれ第１及び第２のアミノ酸配列に融合された第４及び第５の機能的ドメイン；又は（ｖｉ）第４、第５及び第６のポリペプチドリンカーを介してそれぞれ第１及び第２のアミノ酸配列に融合される第４、第５及び第６の機能的ドメインをさらに含む、請求項１又は２に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項４】
前記第１のポリペプチドリンカーが、５〜２０個のアミノ酸残基、特に６〜１５個のアミノ酸残基からなる、請求項１〜３のいずれか１項に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項５】
前記第１の一本鎖タンパク質及び前記第２の一本鎖タンパク質が、パラレル配向でヘテロ二量体化する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項６】
前記第１の一本鎖タンパク質及び前記第２の一本鎖タンパク質がアンチパラレル配向でヘテロ二量体化する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項７】
前記第１及び前記第２のポリペプチドリンカーがそれぞれ、４０〜６０％の荷電残基を含む１０〜２０個のアミノ酸残基、特に５０％の荷電残基を含む１２〜１６個のアミノ酸残基からなり、いずれの場合も、２つのリンカーが正及び負に荷電した残基の鎖間対を形成することにより相互作用することができ、特に、第１及び第２のリンカーの一方の荷電残基は専ら正に荷電した残基であり、第１及び第２のリンカーの他方の荷電残基は専ら負に荷電した残基であり、特に第１及び第２のリンカーは配列番号１６及び１７から選択される、請求項６に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項８】
（ａ）前記第１のＶＬドメイン（ｉａ）及び前記第１のＶＨドメイン（ｉｂ）がヒト血清アルブミンに対する特異性を有する可変ドメインの第１の同族対を形成し、前記第２のＶＬドメイン（ｉｉａ）及び前記第２のＶＨドメイン（ｉｉｂ）が、ヒトＣＤ３に対する特異性を有する可変ドメインの第２の同族対を形成し；又は（ｂ）前記第１のＶＬドメイン（ｉａ）及び第２のＶＨドメイン（ｉｉｂ）がヒトＣＤ３に特異的な可変ドメインの第１の同族対を形成し、前記第２のＶＬドメイン（ｉｉａ）及び第１のＶＨドメイン（ｉｂ）がヒト血清アルブミンに特異性を有する可変ドメインの第２の同族対を形成する、請求項１〜７のいずれか１項に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項９】
前記第３、第４、第５、及び／又は第６の機能的ドメインが、以下のリスト：結合ドメイン、毒素、酵素、ホルモン、及びシグナル伝達タンパク質から独立して選択され；特に、前記第３、第４、第５及び／又は第６の機能的ドメインは、結合ドメインから独立して選択され；特に、前記結合ドメインは、抗体ベースの結合ドメイン、特にｓｃＦｖフラグメント、Ｆａｂフラグメント及び単一抗体可変ドメインのリスト、及び代替骨格に基づく結合ドメイン、特にアンキリンベースのドメイン、フィノマー（fynomer）、アビマー、アンチカリン、及び抗体の定常領域に組み込まれている結合部位から独立して選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項１０】
前記抗体可変ドメインの少なくとも１つが、親ウサギ抗体に由来するＣＤＲ領域を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項１１】
前記抗体可変ドメインの少なくとも１つがヒトフレームワーク領域を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項１２】
前記第１の一本鎖タンパク質及び前記第２の一本鎖タンパク質が、少なくとも１つのジスルフィド結合により架橋されている、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項１３】
前記ジスルフィド結合が、前記第１又は前記第２のＶＬドメインに隣接する第１のシステイン残基と、前記第１又は前記第２のＶＨドメインに隣接する第２のシステイン残基との間に形成される、請求項１２に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項１４】
前記ジスルフィド結合が、前記第１又は前記第２のＶＬドメインのフレームワーク領域に含まれる第１のシステイン残基と、前記第１又は前記第２のＶＨドメインのフレームワーク領域に含まれる第２のシステイン残基との間に形成される、請求項１２に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項１５】
前記第１のシステイン残基が前記第１又は前記第２のＶＬドメインの位置１４１に位置し、前記第２のシステイン残基が前記第１又は前記第２のＶＨドメインの位置５１に位置する、請求項１４に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項１６】
前記ヒト血清アルブミンに対する特異性を有する可変ドメインの同族対が、ヒト抗体ＶＬフレームワークにおける配列番号１０、１２、及び１４から選択されるＶＬタンパク質配列の１つに存在する３つのＶＬ  ＣＤＲを含み、ここで、ＶＬフレームワークは、ＶＫフレームワークＦＲ１、ＦＲ２及びＦＲ３を含み、特にＶＫ１フレームワーク、及びフレームワークＦＲ４を含み、これは、ＶＫ  ＦＲ４、特にＶＫ１  ＦＲ４、及びＶＡフレームワーク４から選択され、３つのＶＨ  ＣＤＲは、ヒト抗体ＶＨフレームワーク、特にＶＨ３フレームワークにおいて配列番号１１、１３、及び１５から選択されるＶＨタンパク質の１つに存在する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項１７】
ヒト血清アルブミンに対する特異性を有する可変ドメインの同族対が、配列番号１０、１２、及び１４から選択されるタンパク質配列の少なくとも位置５〜１４０、特に位置３〜１４５を含むＶＬドメイン、及び配列番号１１、１３、及び１５から選択されるタンパク質配列の少なくとも位置５〜１４０、特に位置３〜１４５を含むＶＨドメインを含み、特にヒト血清アルブミンに対する特異性を有する可変ドメインの同族対は、配列番号１０、１２、及び１４から選択されるＶＬドメイン、及び配列番号１０、１２、及び１４から選択されるＶＨドメインを含む、請求項１６に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項１８】
ヒトＣＤ３に対する特異性を有する可変ドメインの同族対が、ヒト抗体ＶＬフレームワークにおいて配列番号２、４、６、及び８から選択されるＶＬタンパク質配列の１つに存在する３つのＶＬ  ＣＤＲを含み、ここで、ＶＬフレームワークは、ＶＫフレームワークＦＲ１、ＦＲ２及びＦＲ３を含み、特にＶＫ１フレームワーク、及びフレームワークＦＲ４を含み、これは、ＶＫ  ＦＲ４、特にＶＫ１  ＦＲ４、及びＶＡフレームワーク４から選択され、３つのＶＨ  ＣＤＲは、ヒト抗体ＶＨフレームワーク、特にＶＨ３フレームワークにおいて配列番号３、５、７及び９から選択されるＶＨタンパク質の１つに存在する、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項１９】
前記ヒトＣＤ３に対する特異性を有する可変ドメインの同族対が、配列２、４、６、及び８から選択されるタンパク質配列の少なくとも位置５〜１４０、特に少なくとも位置３〜１４５を含むＶＬドメイン、及び配列番号３、５、７及び９から選択されるタンパク質配列の少なくとも位置５〜１４０、特に少なくとも位置３〜１４５を含むＶＨドメインを含み、特にヒト血清アルブミンに対する特異性を有する可変ドメインの同族対は、配列番号２、４、６及び８から選択されるＶＬドメイン、及び配列番号３、５、７及び９から選択されるＶＨドメインを含む、請求項１８に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載のヘテロ二量体タンパク質の第１及び第２の一本鎖タンパク質をコードする核酸配列又は２つの核酸配列。
【請求項２１】
請求項２０に記載の核酸配列又は２つの核酸配列を含むベクター又は２つのベクター。
【請求項２２】
請求項２１に記載のベクター又は２つのベクターを含む宿主細胞。
【請求項２３】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載のヘテロ二量体タンパク質、又は前記ヘテロ二量体タンパク質の第１及び第２の一本鎖タンパク質を製造する方法であって、（ｉ）請求項２０に記載の核酸配列又は２つの核酸配列、又は請求項２１に記載のベクター又は２つのベクターを提供し、前記核酸配列若しくは複数の核酸配列、又はベクター若しくは複数のベクターを発現させ、又は発現系から前記ヘテロ二量体タンパク質を回収すること、又は（ｉｉ）請求項２２に記載の前記宿主細胞又は複数の宿主細胞を培養し、細胞培養物から前記第１及び第２の一本鎖タンパク質、又は前記ヘテロ二量体タンパク質を回収することを含み、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載のヘテロ二量体タンパク質及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項２５】
疾患、特にヒト疾患、より具体的には癌、炎症性疾患及び自己免疫疾患から選択されるヒト疾患の治療に使用するための、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のヘテロ二量体タンパク質であって、前記第３、第４、第５、又は第６の機能的ドメインは、対応する疾患における治療関連の標的と特異的に相互作用することができる方法。
【請求項２６】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載のヘテロ二量体タンパク質を投与するステップを含む、疾患、特にヒト疾患、より具体的には癌、炎症性疾患及び自己免疫疾患から選択されるヒト疾患を治療する方法であって、前記第３、第４、第５、又は第６の機能的ドメインの少なくとも１つは、対応する疾患における治療関連の標的と特異的に相互作用することができる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、可変軽ドメイン及び２つの同族可変重ドメインの両方がそれぞれ２つの別個のタンパク質鎖上にタンデムに位置する２つのスプリット可変ドメイン対のコアを含む複数の抗体可変ドメインの新規なヘテロ二量体多重特異的フォーマットに関する。
【背景技術】
【０００２】
最初のモノクローナル抗体の開発［Ｒ１７］以来、過去４０年間で、抗体は研究、診断、治療の目的でますます重要なクラスの生体分子になった。
【０００３】
治療薬としての抗体は、より合理的に設計された機能性へと進化しているため、固有の特性が改善及び拡大している。例には、糖鎖工学によるエフェクター機能の最適化［Ｒ１８］、血液脳関門を越えた移動のような特定の局在化［Ｒ１９］、又は例えばＦｃＲｎへの結合の増加［Ｒ２０］が挙げられる。
【０００４】
抗体の機能化の補完的なアプローチは、１分子内の異なる標的特異性の組み合わせであり、二重又は多重特異性抗体又は抗体フラグメントを生成するため、二重特異性抗体ブリナツモマブ又は三重特異性抗体カツマキソマブによって例示されるように、Ｔ細胞の再標的化のような代替の作用機序が可能になる。
【０００５】
これまでに開発された多数の異なる多重特異性抗体フォーマット［Ｒ２１］にもかかわらず、二重特異性及び多重特異性抗体フォーマットの現在のレパートリーは依然として、かなりの技術的課題とわずかな柔軟性しか業界に残しておらず、三重特異性及び多重特異性結合を可能にするわずかなフォーマットであり、ヘテロ二量体タンパク質の形成をサポートするフォーマットはさらに少ない。
【０００６】
過去に様々な複数のフォーマットが提示されている。概念的に、これらのフォーマットは３つのカテゴリに分類できる：ａ）単一の遺伝子から発現される単一のタンパク質鎖上に異なる標的結合ドメインがすべて存在する単一鎖の多重特異性フォーマット、ｂ）ホモ−二重及びホモ−多量体フォーマット、異なる標的結合ドメインが、多量体化ドメインの使用により組み立てられる同一のタンパク質鎖上に位置し、二価／多価及びさらに任意で多重特異的複合体を生じさせる、ならびにｃ）ヘテロ二量体標的結合ドメインが異なるタンパク質鎖上にあり、２つのタンパク質鎖のアセンブリがヘテロ二量体化ドメインによって駆動されるフォーマット。
【０００７】
ヘテロ二量体の多重特異性フォーマットは、原則として、２つのヘテロ二量体化タンパク質鎖の単純な順列により、異なる特異性と親和性を持つ結合ドメインを様々な組み合わせで簡単にテストできるという利点があり、それにより、面倒なクローニングを必要とせずに、最終フォーマットで特異性と直接の親和性の最適な組み合わせをスクリーニングすることができる。
【０００８】
最終製品フォーマットでのこのようなスクリーニングは、二重特異性タンパク質の最適な効力を達成し、同時に不特定の効果のリスクを最小限に抑えるために、様々なドメインの結合特性及び／又は効力を慎重に一致させる必要がある場合に必要である。臨床状況では、これは副作用のリスクを最小限に抑えた最適な効果につながる。そのような最適な組み合わせが必要な状況は、例えば、疾患の過程で異なる濃度で産生される２つの疾患駆動性サイトカインの同時遮断であり得る。この状況では、治療用二重特異性タンパク質は、１つの同じ治療用量で両方のサイトカインを効果的にブロックできるはずである。
【０００９】
多特異性分子の標的結合ドメインの特性を調整しなければならない別の例は、腫瘍細胞の２つの細胞表面標的を標的とする細胞傷害性抗体による癌の治療である。この状況での抗体の２つの細胞表面標的は、がん細胞でのみ共発現される可能性があるが、様々な健康な組織で個別に発現される可能性がある。腫瘍治療における有害な副作用のリスクを最小限に抑えて最高の効果を達成するために、細胞傷害性抗体は、両方の標的が共発現される場合に優先的に細胞に結合する必要があるが、２つの標的の一方のみを発現する組織には結合するべきではない。これを達成するには、２つの標的結合ドメインの親和性を調整して、一方では個々のドメインの標的に対する親和性が弱すぎて細胞溶解が生じないようにし、他方では協調的な親和性を癌細胞上の両方の標的への二重特異性分子の同時結合は、細胞溶解を誘発するのに十分である。細胞表面に固定化された異なる高分子への同時結合に起因する幾何学的制約のため、最大の協同的結合を達成するためのドメインの組み合わせは、親和性だけでなくエピトープの関数であり、異なるドメインの組み合わせをテストすることによってのみ、実際の製品フォーマットで識別することができる。
【００１０】
ネイティブＩｇＧタイプの抗体は、ホモ二量体フォーマットと見なすことができる。
【００１１】
足場として古典的なＩｇＧアーキテクチャを採用したホモ二量体抗体フォーマットの特異性の数を増やすために、一本鎖Ｆｖｓ［Ｒ１５］、Ｆｖｓ［Ｒ１６］、単一ドメイン［例えば、ナノボディ：Huang et al., Expert Rev Mol Diagn. 10 (2010):777-85］又は代替の足場［例えば、Fynomers: Schlatter et al., MAbs. 4 (2012) 497-508］などの追加の結合部分は、重鎖と軽鎖の両方のアミノ末端又はカルボキシル末端に付加できる。このアプローチの利点の１つは、従来のＩｇＧをコアドメインとして使用して、二重特異性から三重特異性の構築物を生成できることである。これにより、従来のＩｇＧで確立された製造及び修飾技術のほとんどを活用できる。しかしながら、従来のＦｃ領域のホモ二量体の性質により、このアプローチは常に分子あたり少なくとも２つの同一の結合ドメインをもたらし、その結果、特定の標的への二価結合をもたらす。これは必ずしも必要ではない。特に、（ａ）２つの標的への協調的結合のみが望ましい効果をもたらす場合、又は（ｂ）分子量をさらに増加させない場合はそうではない。さらに、このアプローチは、多くの場合、付加された結合部分の不十分なドメイン安定性に苦しみ、それらを医薬品開発に不適切にする。
【００１２】
さらに結合ドメインを融合して特異性を高めるという概念は、Ｆａｂフラグメント［Ｒ１４］又はＩｇＧの他の抗原結合フラグメント［Ｒ２３］にも適用できる。重鎖と軽鎖からなるＦａｂのヘテロ二量体の性質により、Ｆａｂフラグメントはヘテロ二量体化ドメインとして使用できる。Ｆａｂフラグメントは、例えば、いわゆるトリボディを設計するために使用されてきた。このフォーマットでは、ｓｃＦｖフラグメントはＦａｂの軽鎖と重鎖の両方のカルボキシル末端に融合し、真にヘテロ二量体の三特異的分子をもたらす。Ｆａｂの軽鎖と重鎖の結合は、主にＣＬ−ＣＨ１間の相互作用によって駆動され、ＣＬ−ＣＨ１はさらに共有ジスルフィド結合［Ｒ２］を介して接続される。このフォーマットの課題は、（ａ）最も安定性の低いコンポーネント（おそらくｓｃＦｖが追加される）への安定性の制限、及び（ｂ）最大３つの標的特異性への制限である。
【００１３】
ホモ二量体の二重特異性フォーマットの限界を解決するアプローチとして、ヘテロ二量体のＩｇＧが導入された［Ｒ３１］。１つの細胞からの２つの異なるｍＡｂの単純な共発現は、２つの異なる重鎖が互いにペアリングし、２つの異なる軽鎖が対応する重鎖とペアリングするヘテロ二量体二重特異性ＩｇＧのアセンブリに非常に低い確率でつながる［Ｒ２４］しかし、それはまた、Ａ）異なる特異性を持つ重鎖と軽鎖のミスマッチ、及びＢ）単一及び二重特異的変異体をもたらす異なる重鎖の組み合わせの混合物をもたらす。これらの困難に対処するために、分子に人工的な非対称性を作り出すいくつかのアプローチが実施されている。「ノブイントゥーホール」のコンセプト［Ｒ３、Ｒ４］は、重鎖／重鎖又は重鎖／軽鎖のインターフェースのエンジニアリングを使用して、共発現された鎖の結合を望ましい構成に向ける。別のアプローチでは、ＣｒｏｓｓＭａｂ方法論［Ｒ５］により、操作された軽鎖／重鎖対の選択的ペアリングが可能になる。これらの方法論の欠点は、不一致分子の残留画分を生成物から分離するのが非常に難しいことである。したがって、他の手法は、単一及び二重特異性バインダー［Ｒ２２］の異なる結合特性を設計することにより分離問題に焦点を当て、一方で、変異体の確率分布によって生じる収量の損失を許容する。
【００１４】
ＩｇＧベースのヘテロ二量体フォーマットのさらなる制限は、それらがすべてＦｃエフェクタードメインを必ず含むことである。ヘテロ二量体化が、選択された任意の標的に向けられた標的結合ドメインによって駆動されるフォーマットにより、同じ又はより低い分子量で特異性／機能性の数を増やすことができる。低分子量の分子は、標的組織（固形癌など）により効率的に浸透するため、同じ用量又はより低い用量で有効性が向上する可能性がある。しかし、小さなフォーマットでは、血清半減期が短いという欠点がある。
【００１５】
別のアプローチでは、非抗体融合タンパク質を使用して、例えば、ｓｃＦｖ部分に所望の多重特異性を付与する。そのような融合タンパク質の例は、Ｄｏｃｋ−ａｎｄ−Ｌｏｃｋ［Ｒ２５］、ｂａｒｎａｓｅ−ｂａｒｓｔａｒ［Ｒ２６］、ｊｕｎ−ｆｏｓ［Ｒ２７］、ＴＮＦ［Ｒ２８］、又はＨＳＡ［Ｒ２９］である。これらの概念には、ヘテロ二量体の様式で相互作用して、二重特異性又は多重特異性の結合ドメインを結合するドメインの少なくとも１つの対が追加されるという共通点がある。これらのヘテロ二量体化ドメインは標的結合に直接関与していないが、それでもタンパク質の分子量を増加させる−Ｔｒｉｂｏｄｙフォーマットの定常領域１（Ｃ１）と同様である。さらに、非ヒトのエピトープと配列を組み込むことにより、免疫原性が高まるリスクが生じる可能性がある。
【００１６】
上記のＣＬとＣＨ１の相互作用とは対照的に、パラトープ形成ＶＬ−ＶＨドメインの結合は一般に弱いと見なされる。しかしながら、抗体可変ドメインのみで構成されるヘテロ二量体抗体フラグメントの概念がいくつかある。ダイアボディ［Ｒ６］、ＤＡＲＴ［Ｒ１０］、Ｔａｎｄａｂ［Ｒ７、Ｒ８］などのアプローチは、とりわけ、ホモ及びヘテロ二量体の二重特異性及び二価から四価のアセンブリを作成するためのエレガントでミニマルなアプローチを提供する。これらのフォーマット戦略の最も重要な制限は、（ａ）融合によるさらなる特異性の追加ダイアボディ又はＤＡＲＴの鎖のアミノ末端又はカルボキシル末端へのｓｃＦｖにより、可変軽及び可変重ドメインの鎖内ペアリングが生じ、それにより２つのタンパク質鎖のヘテロ二量体化が非常に困難になる、（ｂ）過去にしばしば観察された可変軽鎖と可変重鎖の間の弱いドメイン界面結合により、これらのフォーマットはモノマー安定性が低く、生産性が低いため、ＶＬ／ＶＨインターフェースを安定させるために、ドメイン間ジスルフィド結合の導入などのさらなるエンジニアリング［Ｒ１２］が必要であると見なされた。
【００１７】
Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら［Ｒ３０］は、多重特異性一本鎖タンデムＦｖ抗体の構築を目指して、それぞれＶＬ−（リンカー１）−ＶＨ−（リンカー２）−ＶＬ−（リンカー３）−ＶＨの順序で配置された２つの分割Ｆｖドメインで構成される２つのタンパク質鎖を含む設計を提案した。ヘテロ二量体の四重特異的タンパク質の構築のために、ヘテロ二量体は次の構造を持つ２つのタンパク質鎖で構成される。鎖１：ＶＬＡ−（リンカー１）−ＶＨＡ−（リンカー２）−ＶＬＢ−（リンカー３）−ＶＨＣ、及び鎖Ｂ：ＶＬＤ−（リンカー１）−ＶＨＤ−（リンカー２）−ＶＬＣ−（リンカー３）−ＶＨＢ、ＦｖＢとＦｖＣの組み合わせは、２つの鎖のヘテロ二量体化を促進する（ＷＯ２０１６／２０２４５７の図１０Ａを参照）。タンデム一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ２）のようなフォーマットをもたらす鎖内アセンブリを防止し、２つの単量体タンパク質鎖のヘテロ二量体化を促進するために、最大１０アミノ酸の位置「Ｎｎｋｅｒ３」の短縮リンカーが提案されている（ＥＰ１２９３５１４Ａ１）。少なくとも１５アミノ酸のリンカー２を持つ２つのスプリット可変ドメインの提案された組織は、２番目の可変ドメインがＮ末端ドメインにフォールドバックし、一本鎖につながる可能性があるダイアボディ（ｓｃＤｂ）のような、一致しないＶＨ／ＶＬ対で構成されるフォーマットで、結果として標的をバインドできない可能性がある。さらに、タンパク質鎖１のすべての可変重鎖及び軽鎖がそれぞれタンパク質鎖２の可変軽鎖及び重鎖と対になるヘテロ二量体の形成の可能性もあり、それにより、末端ｓｃＦｖ（ｓｃＦｖＡ及びｓｃＦｖＤ）の結果を阻止し、及び非同種の可変ドメインとペアリングする。タンデムｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ２）又はｓｃＤｂタイプの副産物が、多量体化されていないタンパク質鎖の見かけの分子量で非常に高い割合のタンパク質が観察される理由がある［Ｒ３０］。
【００１８】
理論的には、上記のアプローチにおけるｓｃＤｂのような構造の形成は、２つのスプリット可変ドメイン間の２番目のリンカー（リンカー２）も短縮することでさらに減らすことができる。しかし、これは構築物の柔軟性を制限し、多くの場合、２つの標的の同時結合を可能にするアクセス可能なエピトープの範囲に悪影響を及ぼす。これらの幾何学的制約は、２つの膜タンパク質を同時に結合する場合に特に制限される。
【００１９】
さらには及び最も重要なことは、両方のモノマーがホモ二量体フラグメントを形成する可能性があるため（ＷＯ２０１６／２０２４５７の図１０Ｂを参照）、統計的に二量体生成物の３分の２までが２つのホモ二量体からなり、一方、３分の１だけが所望のヘテロ二量体からなる。
【００２０】
要約すると、最終フォーマットでの異なる結合ドメインの単純な順列とその後の特性化を可能にするヘテロ二量体多重特異性フォーマットに対する業界の明確なニーズがある。このようなフォーマットの主な課題は、（ａ）特定のヘテロ二量体化の効率が比較的低いため、生産収率が最適化されないこと、及び（ｂ）非標的結合タンパク質をヘテロ二量体化ドメイン又は操作されたヘテロ二量体Ｆｃエフェクタードメインとして使用する必要があることであった。これは、血清半減期の調整に柔軟性が乏しく、分子量を増加させずに新しい機能を追加する柔軟性を制限する。
【００２１】
したがって、最適なヘテロ二量体多重特異的フォーマットは、もっぱら標的結合ドメインのみで構成され、例えば、相互作用パートナー（標的）によって定義される幾何学的制約に対応するために異なる結合ドメイン間でリンカーの長さを自由に変更することにより、分子の幾何学を調整できることが示唆された。その課題の解決策として、ＷＯ２０１５／０５８８６１及びEgan et al., MAbs 9 (2017) 68-84は、２つの分割可変ドメインのコアを含む複数の抗体可変ドメインの新規なヘテロ二量体多重特異的フォーマットの開発を報告している。ここで、可変軽ドメインと２つの同族可変重ドメインの両方は、それぞれ２つの別々のタンパク質鎖上にタンデムに配置され、それにより２つのタンパク質鎖のヘテロ二量体化を駆動する。このフォーマットは、「同種ヘテロ二量体化による多重特異性抗体ベースの治療法（ＭＡＴＣＨ）」と呼ばれている。最大２つの追加の結合ドメイン、特にｓｃＦｖフラグメントなどの抗体ベースの結合ドメインは、いずれかのタンパク質鎖のアミノ末端及び／又はカルボキシル末端に融合され、最大６重特異的なヘテロ二量体タンパク質をもたらす。
【００２２】
しかしながら、基礎となる原理により、ヒトＣＤ３に対する結合特異性を有する可変ドメイン対と、治療標的に対する結合特異性を有する可変ドメイン対を含むコアに基づいて、そのようなヘテロ二量体多重特異性タンパク質を生成できることが成功裏に示されたが、ＷＯ２０１５／０５８８６１及びＥｇａｎらでテストされたＭＡＴＣＨ構築物などの構築物は、場合によっては、適切なＶＬ及びＶＨドメインフレームワーク、適切なリンカー、及び必要に応じて、鎖間ジスルフィド結合の形成のためのシステイン残基の位置に適切なリンカーを識別することなどにより、ヘテロ二量体多重特異性タンパク質の特性の微調整が必要になることが予想され得る。そのような微調整は、新規可変ドメイン対を含むそのようなヘテロ二量体多重特異性タンパク質のヘテロ二量化傾向を完全に予測することは不可能であるため、必要であると考えられている。さらに、ＣＤ３結合ドメインと、標的細胞に発現する抗原に結合する少なくとも１つのドメインを含む、このような種類の多重特異性分子の作用機序は、免疫学的シナプス時の標的細胞の溶解に基づくことが知られている。標的細胞膜上の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）との相互作用によるＴ細胞上のＣＤ３受容体の架橋とクラスター化は、Ｔ細胞の活性化と、その後のシナプスへのサイトカイン及び細胞毒性剤の放出をもたらす。理論に拘束されることを望まないが、そのような免疫学的シナプスの形成は、多重特異性タンパク質の幾何学及びそれぞれの結合ドメインのエピトープによって駆動されるか、少なくとも根本的に影響を受けることが予想されるため、そうではない上記のコアを形成する可変ドメイン対の新しい組み合わせが計画どおりに機能することは予測できる。したがって、そのようなヘテロ二量体の多重特異性タンパク質を確実に生成するためのより堅牢な方法を特定する必要性は未だに満たされていない。
【００２３】
さらに、本発明者らは、標的細胞溶解の特異性を高めるために、Ｔ細胞結合分子が、ＣＤ３結合ドメインに加えて、標的細胞の表面に発現する抗原に付随して結合する少なくとも２つのドメインを含み得ることを認識した。ＭＡＴＣＨ複合体の２つのタンパク質鎖のいずれかをコードする発現プラスミドの組み合わせを並べ替えることにより、標的細胞に最適な選択性で結合する２つの結合ドメインを効率的に特定するには、２つのドメインをそれぞれ、ヘテロ二量体ＭＡＴＣＨ複合体のタンパク質鎖の異なる場所に配置する必要がある。したがって、標的細胞の結合に関与しないドメインを含む２つの鎖のヘテロ二量体化を促進するコアドメインを特定する必要があった。
【００２４】
この課題の解決策、つまり、１つ又は複数の追加のターゲティング部分を、一本鎖の一方又は両方のＮ及び／又はＣ末端に融合することによって拡張できる２つの固定可変ドメイン対の定義済みコアの識別タンパク質は、従来技術においてこれまで示されておらず、示唆もされていない。
【発明の概要】
【００２５】
本発明は、２つの分割可変ドメイン対のコアを含む複数の抗体可変ドメインの新規ヘテロ二量体多重特異的フォーマットに関する。ここで、可変軽ドメイン及び２つの同族可変重ドメインの両方がそれぞれ２つの別個のタンパク質鎖上にタンデムに位置する。それにより、２つのタンパク質鎖のヘテロ二量体化を促進する。ここで、コアは、ヒトＣＤ３に特異的な第１可変ドメイン対とヒト血清アルブミンに特異的な第２可変ドメイン対によって形成される。最大２つの追加の結合ドメイン、特にｓｃＦｖフラグメントなどの抗体ベースの結合ドメインは、いずれかのタンパク質鎖のアミノ末端及び／又はカルボキシル末端に融合され、最大で６種までのヘテロ二量体タンパク質をもたらす。安定で十分に発現され、血漿中の長い半減期を示すことが期待される構築物を形成することに加えて、驚くべきことに、そのような構築物は、標的細胞に発現する標的抗原に結合する同一のＣＤ３結合ドメイン及びそれに結合する同じドメインを含む一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）フォーマットと比較した場合、最大標的細胞溶解能力を損なうことなく、より遅いＴ細胞活性化動態及び減少したサイトカイン放出を示すことにより異なる薬力学的プロファイルを提示することが示され得た。匹敵する効果サイズでのそのようなサイトカイン放出の減少は、サイトカイン放出による副作用の減少、したがって有利なリスク対利益プロファイルの見込みを保持している。
【００２６】
したがって、第１の態様では、本発明は、第１及び第２の一本鎖タンパク質を含むヘテロ二量体タンパク質に関し、ここで、前記第１の一本鎖タンパク質は、（Ｎ−からＣ−末端に）：
（ｉａ）第１のＶＬドメイン、
（ｉｉａ）第１のポリペプチドリンカー、及び
（ｉｉｉａ）第２のＶＬドメイン、ここで、前記第２の一本鎖タンパク質は、（Ｎ末端からＣ末端に）以下からなる第２のアミノ酸配列を含む：
（ｉｂ）第１のＶＨドメイン、
（ｉｉｂ）第２のポリペプチドリンカー、及び
（ｉｉｉｂ）第２番のＶＨドメイン、
ここで、前記第１のＶＬドメインは、前記第１又は前記第２のＶＨドメインのいずれかと第１の標的抗原に特異性を有する可変ドメインの第１の同族対を形成し、前記第２のＶＬドメインは、第２の標的抗原に特異性を有する可変ドメインの第２の同族対を形成する。ここで、前記標的抗原の１つがヒト血清アルブミンであり、他の前記標的抗原がヒトＣＤ３であり、前記第１又は前記第２の一本鎖タンパク質の少なくとも１つが、さらに（ｉｖ）第３のポリペプチドリンカーを介して前記第１又は前記第２のアミノ酸配列に融合される第３の機能的ドメインとしての少なくとも１つの追加ドメインを含む。
【００２７】
第２の態様では、本発明は、前記第１及び第２の一本鎖タンパク質をコードする１つ又は２つの核酸配列に関する。
【００２８】
第３の態様では、本発明は、前記１つ又は２つの核酸配列を含む１つ又は２つのベクターに関する。
【００２９】
第４の態様では、本発明は、前記１つ又は２つのベクターを含む１つ又は複数の宿主細胞に関する。
【００３０】
第４の態様では、本発明は、本発明の第１及び第２の一本鎖タンパク質、又はヘテロ二量体タンパク質の製造方法に関する。これは、（ｉ）本発明による核酸又は複数の核酸、本発明のベクター又は複数のベクターを提供し、核酸又はベクターを発現させ、発現系から第１及び第２の一本鎖タンパク質、又はヘテロ二量体タンパク質を回収し、あるいは（ｉｉ）本発明の宿主細胞を提供し、前記宿主細胞を培養し、細胞培養物から前記第１及び第２の一本鎖タンパク質、又は前記ヘテロ二量体タンパク質を回収することを含む。
【００３１】
第５の態様では、本発明は、本発明のヘテロ二量体タンパク質と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物に関する。
【００３２】
第６の態様では、本発明は、疾患、特にヒト疾患、より具体的には癌、炎症性疾患及び自己免疫疾患から選択されるヒト疾患の治療に使用するための本発明のヘテロ二量体タンパク質に関する。前記第３、第４、第５、又は第６の機能的ドメインの少なくとも１つは、対応する疾患における治療関連の標的と特異的に相互作用することができる。
【００３３】
第７の態様では、本発明は、有効量の本発明のヘテロ二量体タンパク質を被験体に投与することを含む、疾患、特にヒト疾患、より具体的には癌、炎症性疾患及び自己免疫疾患から選択されるヒト疾患を患う患者を治療する方法に関する。前記第３、第４、第５、又は第６の機能的ドメインの少なくとも１つが、対応する疾患における治療関連の標的と特異的に相互作用することができる。
【００３４】
本発明の特定の実施形態は、添付の従属請求項に記載されている。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、表２に記載されているＭＡＴＣＨ構築物の還元及び非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図２】図２は、異なる濃度のＭＡＴＣＨ及び参照ｓｃＤｂ分子の標的細胞の存在下でのＴ細胞活性化の用量反応を示す。生理的濃度のヒト血清アルブミンを、５時間及び３０時間のインキュベーション後に細胞培養に加えた。
【図３】図３は、異なる濃度のＭＡＴＣＨ及び参照ｓｃＤｂ分子のコントロール細胞の存在下でのＴ細胞活性化の用量反応を示す。
【図４】図４は、ＭＡＴＣＨと５時間でのｓｃＤｂの信号振幅に対して正規化されたｓｃＤｂ参照分子によって誘導されたＴ細胞の最大活性化のプロットを示す。
【図５】図５は、試験期間中の試験分子の効力のプロットを示す。
【図６】図６は、ＥＬＩＳＡによる様々な時点でのＮＦＡＴ活性化アッセイのＩＬ−２濃度の測定を示す。
【図７】図７は、ＭＡＴＣＨと２つの参照ｓｃＤｂの細胞溶解の用量反応プロットを示す。左側のパネルはＩＬ２３Ｒ発現標的細胞の特異的な溶解を示し、右側のパネルはＩＬ２３Ｒ陰性細胞の特異的な溶解を示していない。
【図８】図８は、活性化Ｔ細胞の割合の用量反応プロットを示す。左パネルはＩＬ２３Ｒ発現標的細胞の存在下での活性化Ｔ細胞の割合を示し、右パネルはＩＬ２３Ｒ陰性細胞の存在下での活性化Ｔ細胞を示す。
【図９】図９は、Ｔ細胞活性化により誘導された細胞毒アッセイの各ウェルにおけるＩＬ−２濃度の用量反応を示す。左のパネルはＩＬ２３Ｒ発現標的細胞の存在下で誘導されたＩＬ−２の濃度を示し、右のパネルはＩＬ２３Ｒ陰性細胞の存在下で誘導されたＩＬ−２のＩＬ−２濃度を示す。
【図１０】図１０に、抗ＣＤ３／抗ＨＳＡヘテロ二量体コアアセンブリとＭＡＴＣＨを使用した二重標的の概要を示す。
【図１１Ａ】図１１は、２つの四重特異的ＭＡＴＣＨアセンブリ（ＰＲ０８２１及びＰＲ０８２４）の細胞溶解の用量反応プロットを示す。左上のパネルはＩＩ２３Ｒ発現標的細胞の特異的な溶解を示し、右上のパネルはＨｅｒ２陽性細胞の特異的な溶解を示している。下のパネルでは、抗原陰性細胞の特異的な溶解が描かれている。
【図１１Ｂ】図１１は、２つの四重特異的ＭＡＴＣＨアセンブリ（ＰＲ０８２１及びＰＲ０８２４）の細胞溶解の用量反応プロットを示す。左上のパネルはＩＩ２３Ｒ発現標的細胞の特異的な溶解を示し、右上のパネルはＨｅｒ２陽性細胞の特異的な溶解を示している。下のパネルでは、抗原陰性細胞の特異的な溶解が描かれている。
【図１２】図１２は、アセンブリ１の概略図を示す。
【図１３】図１３は、アセンブリ３の概略図を示す。
【図１４】図１４は、アセンブリ５の概略図を示す。
【図１５】図１５に、アセンブリ７の概略図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本明細書では、複数の抗体可変ドメインを含む２つのタンパク質鎖の定量的ヘテロ二量体アセンブリを示す新しいフォーマットを提示する。このフォーマットは、２つの分割可変ドメイン対（２つのＦｖフラグメント）のコアで構成され、可変軽ドメインと可変重ドメインの両方がそれぞれ別々のタンパク質鎖に配置され、２つのタンパク質鎖のヘテロ二量体化を駆動する。ＶＬ及びＶＨドメインの一対はヒト血清アルブミンに特異的であり、もう１つはヒトＣＤ３に特異的である。ドメイン内及びドメイン間の安定性の高いｓｃＦｖフォーマットなどの最大２つの追加の結合ドメインが、いずれかのペプチド鎖のアミノ末端及び／又はカルボキシル末端に融合され、最大で６つの特異的ヘテロ二量体タンパク質が生じる。
【００３７】
したがって、第１の態様では、本発明は、第１及び第２の一本鎖タンパク質を含むヘテロ二量体タンパク質に関し、ここで、前記第１の一本鎖タンパク質は、（Ｎ−からＣ−末端に）：
（ｉａ）第１のＶＬドメイン、
（ｉｉａ）第１のポリペプチドリンカー、及び
（ｉｉｉａ）第２のＶＬドメイン
からなる第１のアミノ酸配列を含み、ここで、前記第２の一本鎖タンパク質は、（Ｎ末端からＣ末端に）：
（ｉｂ）第１のＶＨドメイン、
（ｉｉｂ）第２のポリペプチドリンカー、及び
（ｉｉｉｂ）第２のＶＨドメイン
からなる第２のアミノ酸配列を含む。
ここで、前記第１のＶＬドメインは、前記第１又は前記第２のＶＨドメインのいずれかと第１の標的抗原に特異性を有する可変ドメインの第１の同族対を形成し、前記第２のＶＬドメインは、第２の標的抗原に特異性を有する可変ドメインの第２の同族対を形成し、前記標的抗原の１つがヒト血清アルブミンであり、他の前記標的抗原がヒトＣＤ３であり、前記第１又は前記第２の一本鎖タンパク質の少なくとも１つがさらに、
（ｉｖ）第３のポリペプチドリンカーを介して前記第１又は前記第２のアミノ酸配列に融合される第３の機能的ドメインとしての少なくとも１つの追加ドメインを含む。
【００３８】
本明細書及び以下の特許請求の範囲を通して、文脈がそうでないことを必要としない限り、「含む（comprise）」という用語、及び「含む（comprises）」及び「含んでいる（comprising）」などの変形は、述べられた整数、組成又はステップ又はグループを包含することを意味すると理解され、一方、任意の追加の整数、組成若しくはステップ、又は整数、組成若しくはステップのグループは、同様に任意に存在し得、任意の追加の整数、組成若しくはステップ、又は整数、組成又はステップのグループが存在しない実施形態を含む。したがって、このような後者の実施形態に関して、用語「含む」は、より狭い用語「からなる」を含む。
【００３９】
本明細書の本文全体でいくつかの文書が引用されている。ここで引用された各文書（すべての特許、特許出願、科学刊行物、製造業者の仕様、説明書、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号の配列の提出などを含む）は、上記又は下記にかかわらず、可能な範囲でその全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書のいかなるものも、本発明が先行発明のおかげでそのような開示に先行する権利がないことを認めるものと解釈されるべきではない。
【００４０】
本発明の文脈において、「ＶＬドメイン」及び「ＶＨドメイン」という用語は、抗体の可変軽鎖ドメイン及び可変重鎖ドメインをそれぞれ指す。本発明の文脈において、用語「抗体」は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含む分子、すなわち少なくとも抗原−抗体の結合フラグメントが含まれる。
【００４１】
本発明の文脈において、抗体、又は一般的な任意の結合分子は、一般的に、それが１００μΜ以下、好ましくは５０μΜ以下、好ましくは３０μΜ以下、好ましくは２０μΜ以下、好ましくは１０μＭ以下、好ましくは５μΜ以下、より好ましくは１μΜ以下、より好ましくは９００ｎＭ以下、より好ましくは８００ｎＭ以下、より好ましくは７００ｎＭ以下、より好ましくは６００ｎＭ以下、より好ましくは５００ｎＭ以下、より好ましくは４００ｎＭ以下、より好ましくは３００ｎＭ以下、より好ましくは２００ｎＭ以下、さらにより好ましくは１００ｎＭ以下、さらにより好ましくは９０ｎＭ以下、さらにより好ましくは８０ｎＭ以下、さらにより好ましくは７０ｎＭ以下、さらにより好ましくは６０ｎＭ以下、さらにより好ましくは５０ｎＭ以下、さらにより好ましくは４０ｎＭ以下、さらにより好ましくは３０ｎＭ以下、さらにより好ましくは２０ｎＭ以下、さらにより好ましくは１０ｎＭ以下の標的として、抗原／同族結合パートナーに対する解離定数ＫＤを有する場合、抗原（抗体の場合）に、又は同族結合パートナー（一般的に結合分子の場合）に「特異的に結合する」とみなされる。
【００４２】
本発明の文脈において、「機能的ドメイン」という用語は、酵素活性又は同族リガンドへの特異的結合などの所定の機能を有するタンパク質性ドメインを指し、前記タンパク質性ドメインは、少なくとも二次構造エレメントを有する構造化ドメインである。Ｘ線結晶学、円偏光二色性（ＣＤ）、振動円偏光二色性（ＶＣＤ）、ＮＭＲ、又はＦＴ−ＩＲなどのポリペプチド又はタンパク質の二次構造の存在を判定する方法、又はポリペプチド内の二次構造の存在を予測する方法（ＰＥＰ−ＦＯＬＤなど）（Shen et al., J. Chem. Theor. Comput. 10 (2014) 4745-4758）は、当業者に周知である。特定の実施形態では、前記タンパク質性ドメインは、三次構造を有する構造化ドメインである。特定の実施形態では、前記タンパク質性ドメインは、少なくとも約２０個のアミノ酸残基（Heitz et al., Biochemistry 38 (1999) 10615-25を参照）、特に少なくとも約５０個のアミノ酸残基、より特に少なくとも約１００個のアミノ酸残基を含む。特定の実施形態では、機能的ドメインは、同族リガンドに特異的に結合するタンパク質性ドメインである。特定の実施形態では、機能的ドメインは、抗原に特異的に結合する抗体又は抗体の免疫学的に活性な部分である。
【００４３】
本発明の文脈において、「ポリペプチドリンカー」という用語は、それぞれがリンカーの一端に結合している２つのドメインを接続しているペプチド結合により連結されたアミノ酸残基の鎖からなるリンカーを指す。特定の実施形態では、ポリペプチドリンカーは、２〜３０個（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０のアミノ酸残基）のアミノ酸残基の連続鎖を有する。特定の実施形態では、ポリペプチドリンカーは非構造化ポリペプチドである。上記のように、Ｘ線結晶学、円二色性（ＣＤ）、振動円二色性（ＶＣＤ）、ＮＭＲ、又はＦＴ−ＩＲなどのポリペプチドの二次構造の存在を決定する方法、又はポリペプチドの二次構造の存在を予測する方法（ＰＥＰ−ＦＯＬＤなど）（Shen et al., J. Chem. Theor. Comput. 10 (2014) 4745-4758）は、当業者に周知である。特定の実施形態では、リンカーは、グリシン及びセリン残基から選択されるアミノ酸残基からなる。
【００４４】
本発明は、以下によって特徴付けられる：
・抗体可変ドメインを使用してヘテロ二量体フォーマットを作成る。少なくとも２つのＶＬドメインが１つのタンパク質鎖に配置され、対応するＶＨドメインが２番目のタンパク質鎖に配置される。
・ヘテロ二量体コアドメインにより、結合ドメインなどの追加の機能ドメインを追加して、トリ、テトラ、ペンタ、又はヘキサ特異的エンティティを作成することができる。
・ヘテロ二量体コアアセンブリの非常に効率的なペアリングの複数の例。
・共通のヘテロ二量体コアドメインを共有する複数の結合ドメインプールの組み合わせスクリーニングのシンプルなソリューション。
【００４５】
特定の実施形態では、本発明は、前記第１又は前記第２の一本鎖タンパク質がさらに
（ｖ）第４のポリペプチドリンカーを介して前記第１又は前記第２のアミノ酸配列に融合される第４の機能的ドメイン
を含むヘテロ二量体タンパク質に関する。
【００４６】
特定の実施形態では、本発明は、前記第１又は前記第２の一本鎖タンパク質がさらに
（ｖｉ）第５のポリペプチドリンカーを介して前記第１又は前記第２のアミノ酸配列に融合される第５の機能的ドメイン
を含むヘテロ二量体タンパク質に関する。
【００４７】
特定の実施形態では、本発明は、前記第１又は前記第２の一本鎖タンパク質がさらに
（ｖｉｉ）第６のポリペプチドリンカーを介して前記第１又は前記第２のアミノ酸配列に融合される第６の機能的ドメイン
含むヘテロ二量体タンパク質に関する。
【００４８】
特定の実施形態では、前記ヘテロ二量体タンパク質は、前記第３及び第４の機能的ドメインを含む。そのような実施形態では、前記ヘテロ二量体タンパク質は四価であり、特定の実施形態では、前記ヘテロ二量体タンパク質は四特異性である。
【００４９】
特定の実施形態では、前記ヘテロ二量体タンパク質は、前記第３、前記第４、前記第５及び前記第６の機能的ドメインを含む。そのような実施形態において、前記ヘテロ二量体タンパク質は６価であり、特定の実施形態において、前記ヘテロ二量体タンパク質は６特異性である。
【００５０】
特定の実施形態では、前記ヘテロ二量体タンパク質は、第１及び第２免疫グロブリン定常ドメインの同族対を含まない。ここで、前記第１免疫グロブリン定常ドメインは、前記第１一本鎖タンパク質に含まれ、前記第２免疫グロブリン定常ドメインは、第２の一本鎖タンパク質に含まれる。特定の実施形態において、前記第１及び前記第２の一本鎖タンパク質の少なくとも一方は、免疫グロブリン定常ドメインを含まない。特定の実施形態では、前記第１及び第２の一本鎖タンパク質の両方が免疫グロブリン定常ドメインを含まない。
【００５１】
特定の実施形態では、前記ヘテロ二量体タンパク質は、（ｉ）第１のＶＬドメイン及び第１のＶＨドメインと（ｉｉ）第２のＶＬドメイン及び第２のＶＨドメインの同族対以外に、前記第１の一本鎖タンパク質に含まれる第１のタンパク質性相互作用ドメインと、前記の第２の一本鎖タンパク質に含まれる第２のタンパク質性相互作用ドメインの同族対を含まない。
【００５２】
特定の実施形態において、前記第３、前記第４、前記第五及び前記第６の機能的ドメインの少なくとも１つが標的細胞の表面に発現する標的抗原に結合する前記ヘテロ二量体タンパク質は、類似のＴ細胞活性化の時間点で、サイトカインレベルの低下を誘発する生理的濃度のＨＳＡの存在下でＮＦＡＴの制御下でルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞のルシフェラーゼ活性を、同じ標的抗原結合ドメインと同じＣＤ３結合ドメインを含む一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）と比較して測定することにより評価される。特定の実施形態では、前記サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α及び／又はインターフェロン−γ、好ましくはＩＬ−２などのサイトカイン放出症候群に関連するＴ細胞由来サイトカインである。特定の実施形態では、前記サイトカインレベルは、ｓｃＤｂと比較して、少なくとも２倍、好ましくは３倍、より好ましくは４倍、最も好ましくは５倍低い。特定の実施形態において、ルシフェラーゼ活性及びサイトカインレベルの決定は、実施例に記載されるように実施される。
【００５３】
特定の実施形態では、前記第３、前記第４、前記第五及び前記第６の機能的ドメインの少なくとも一つが標的細胞の表面に発現する標的抗原に結合する前記ヘテロ二量体タンパク質は、同様に到達するためのより遅い動力学を示す同じ標的抗原−Ｔ細胞活性化結合ドメインと同じＣＤ３結合ドメインを含む一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）と比較した場合、ＨＳＡの生理的濃度の存在下でｉｎ  ｖｉｔｒｏでＮＦＡＴの制御下でルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞のルシフェラーゼ活性を測定することにより評価される。特定の実施形態では、前記動態は、ｓｃＤｂと比較して少なくとも２倍、好ましくは３倍、最も好ましくは４倍遅い。特定の実施形態において、ルシフェラーゼ活性及びサイトカインレベルの決定は、実施例に記載されるように実施される。
【００５４】
特定の実施形態では、前記第３、前記第４、前記第５及び前記第６の機能的ドメインの少なくとも１つが標的細胞の表面に発現する標的抗原に結合する前記ヘテロ二量体タンパク質は、同じ標的抗原−結合ドメイン及び同じＣＤ３結合ドメインを含む一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）と比較した場合、ＨＳＡの生理的濃度の存在下でのｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＣＤ６９発現により評価される同様のＴ細胞活性化の時点でサイトカインレベルの低下をもたらす。特定の実施形態では、前記サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α及び／又はインターフェロン−γ、好ましくはＩＬ−２などのサイトカイン放出症候群に関連するＴ細胞由来サイトカインである。特定の実施形態では、前記サイトカインレベルは、ｓｃＤｂと比較して、少なくとも２倍、好ましくは３倍、より好ましくは４倍、最も好ましくは５倍低い。特定の実施形態において、ＣＤ６９発現及びサイトカインレベルの決定は、実施例に記載されるように実施される。特定の実施形態では、前記第３、前記第４、前記第五及び前記第六の機能的ドメインの少なくとも一つが標的細胞の表面に発現する標的抗原に結合する前記ヘテロ二量体タンパク質は、同じ標的抗原結合ドメインと同じＣＤ３結合ドメインを含む一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）と比較した場合に、生理的濃度のＨＳＡの存在下でのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの標的細胞溶解の類似の程度の時点でサイトカインレベルの低下をもたらす。特定の実施形態では、前記サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α及び／又はインターフェロン−γ、好ましくはＩＬ−２などのサイトカイン放出症候群に関連するＴ細胞由来サイトカインである。特定の実施形態では、前記サイトカインレベルは、ｓｃＤｂと比較した場合、少なくとも２倍、好ましくは３倍、より好ましくは４倍、最も好ましくは５倍低い。特定の実施形態において、サイトカインレベルの決定は、実施例に記載されるように実施される。
【００５５】
特定の実施形態では、前記第３、前記第４、前記第五及び前記第六の機能的ドメインの少なくとも一つが標的細胞の表面に発現する標的抗原に結合する前記ヘテロ二量体タンパク質は、同じ標的抗原結合ドメインと同じＣＤ３結合ドメインを含む一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）と比較した場合、生理学的濃度のＨＳＡの存在下でのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの標的細胞溶解の程度に同様に到達するためのより遅い動力学を示す。特定の実施形態において、前記動態は、ｓｃＤｂと比較して少なくとも２倍、好ましくは３倍、最も好ましくは４倍遅い。特定の実施形態において、標的細胞溶解の動態の決定は、実施例に記載されるように実施される。
【００５６】
特定の実施形態では、前記第３、前記第４、前記第５及び前記第６の機能的ドメインの少なくとも一つが標的細胞の表面に発現する標的抗原に結合する前記ヘテロ二量体タンパク質は、同じ標的抗原結合ドメインと同じＣＤ３結合ドメインを含む一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）と比較した場合、同様の最大値の標的細胞溶解に達する能力を有する。特定の実施形態において、標的細胞溶解の決定は、実施例に記載されるように実施される。
【００５７】
特定の実施形態では、前記第１のポリペプチドリンカーは、５〜２０個のアミノ酸残基、特に６〜１５個のアミノ酸残基からなる。特定の実施形態では、前記ポリペプチドリンカーは配列（ＧｍＳ）ｎを有する。ｍは２、３、及び４から独立して選択される。及びｎは１、２、３、４、及び５から選択される。
【００５８】
特定の他の実施形態では、前記第１のポリペプチドリンカーは、１１個から２０個のアミノ酸残基、特に１１個から１５個のアミノ酸残基からなる。特定の実施形態では、前記ポリペプチドリンカーは配列（ＧｍＳ）ｎを有する。ｍは２、３、及び４から独立して選択される。ｎは３、４、５から選択される。
【００５９】
特定の実施形態では、前記第２のポリペプチドリンカーは、５〜２０個のアミノ酸残基、特に６〜１５個のアミノ酸残基からなる。特定の実施形態では、前記ポリペプチドリンカーは配列（ＧｍＳ）ｎを有する。ｍは２、３、及び４から独立して選択される。及びｎは１、２、３、４、及び５から選択される。
【００６０】
特定の他の実施形態では、前記第２のポリペプチドリンカーは、１１個から２０個のアミノ酸残基、特に１１個から１５個のアミノ酸残基からなる。特定の実施形態では、前記ポリペプチドリンカーは配列（ＧｍＳ）ｎを有する。ｍは２、３、及び４から独立して選択される。ｎは３、４、５から選択される。
【００６１】
特定の実施形態では、前記第３、第４、第５及び／又は第６のポリペプチドリンカーは、独立して８から２０個のアミノ酸残基、特に１０から１５個のアミノ酸残基からなる。特定の実施形態では、前記ポリペプチドリンカーは独立して配列（ＧｍＳ）ｎを有する。ｍは２、３、及び４、特に４から独立して選択され、及びｎは、１、２、３、４、及び５、特に２及び３から選択される。
【００６２】
特定の実施形態では、前記第１のＶＬドメイン（ｉａ）及び前記第１のＶＨドメイン（ｉｂ）は、第１の標的抗原に対して特異性を有する可変ドメインの第１の同族対を形成し、前記第２のＶＬドメイン（ｉｉａ）及び前記第２のＶＨドメイン（ｉｉｂ）は、第２の標的抗原に対する特異性を有する可変ドメインの第２の同族対を形成する。そのような実施形態では、前記第１及び前記第２の一本鎖タンパク質は、前記一本鎖タンパク質のパラレル配置で前記ヘテロ二量体タンパク質を形成する（図１５を参照）。
【００６３】
特定のそのような実施形態では、前記第１のポリペプチドリンカーは、１０〜２０個のアミノ酸残基、特に１２〜１７個のアミノ酸残基、特に１５個のアミノ酸残基からなる。特定の実施形態では、前記ポリペプチドリンカーは配列（ＧｍＳ）ｎを有する。ｍは２、３、及び４、特に４から独立して選択され、及びｎは、１、２、３、４、及び５、特に３から選択される。
【００６４】
特定のそのような実施形態では、前記第２のポリペプチドリンカーは、１０から２０個のアミノ酸残基、特に１２から１７個のアミノ酸残基、特に１５個のアミノ酸残基からなる。特定の実施形態では、前記ポリペプチドリンカーは配列（ＧｍＳ）ｎを有する。ｍは２、３、及び４、特に４から独立して選択され、及びｎは、１、２、３、４、及び５、特に３から選択される。
【００６５】
特定のこのような実施形態において、前記第３、第４、第５及び／又は第６ポリペプチドリンカーは、独立して１０から２０個のアミノ酸残基、特に１２から１７個のアミノ酸残基、特に１５個のアミノ酸残基からなる。特定の実施形態では、前記ポリペプチドリンカーは配列（ＧｍＳ）ｎを有する。ｍは２、３、及び４、特に４から独立して選択され、及びｎは、１、２、３、４、及び５、特に３から選択される。
【００６６】
特定の他の実施形態では、前記第１のＶＬドメイン（ｉａ）及び前記第２のＶＨドメイン（ｉｉｂ）は、第１の標的抗原に対する特異性を有する可変ドメインの第１の同族対を形成し、前記第２のＶＬドメイン（ｉｉａ）及び前記第１のＶＨドメイン（ｉｂ）は、第２の標的抗原に対する特異性を持つ可変ドメインの第２の同族対を形成する。そのような実施形態において、前記第１及び前記第２の一本鎖タンパク質は、前記一本鎖タンパク質のアンチパラレル配列で前記ヘテロ二量体タンパク質を形成する（図１２から１４を参照）。
【００６７】
特定のそのような実施形態では、前記第１のポリペプチドリンカーは、５から１２個のアミノ酸残基、特に５から１０個のアミノ酸残基、特に６個のアミノ酸残基からなる。特定の実施形態では、前記ポリペプチドリンカーは配列（ＧｍＳ）ｎを有する。ｍは２、３、及び４、特に２から独立して選択され、及びｎは、１、２、３、４、及び５、特に２から選択される。
【００６８】
特定のそのような実施形態では、前記第２のポリペプチドリンカーは、５から１２個のアミノ酸残基、特に６から１０個のアミノ酸残基、特に８個のアミノ酸残基からなる。特定の実施形態では、前記ポリペプチドリンカーは配列（ＧｍＳ）ｎを有する。ｍは２、３、及び４、特に３から独立して選択され、特定のこのような実施形態では、前記第３、第４、第５、及び／又は第６のポリペプチドリンカーは、独立して、１０〜２０個のアミノ酸残基、特に８〜１２アミノ酸残基、特に１０アミノ酸残基からなる。特定の実施形態では、前記ポリペプチドリンカーは配列（ＧｍＳ）ｎを有する。ｍは２、３、及び４、特に４から独立して選択され、及びｎは、１、２、３、４、及び５、特に２から選択される。
【００６９】
アンチパラレル配列の別の特定の実施形態において、前記第１及び前記第２ポリペプチドリンカーはそれぞれ、４０〜６０％荷電残基を含む１０〜２０アミノ酸残基、特に５０％荷電残基を含む１２〜１６アミノ酸残基からなる。各場合において、２つのリンカーが正及び負に帯電した残基の鎖間対を形成することにより相互作用することができる。特定の実施形態では、前記第１及び第２のリンカーの一方の荷電残基は、正に荷電した残基のみであり、前記第１及び第２のリンカーの他方の荷電残基は、負に荷電した残基のみであり、特に前記第１及び第２のリンカーは配列番号１６及び１７から選択される。
【００７０】
特定の実施形態において、前記第３、第４、第５及び／又は第６の機能的ドメインは、結合ドメイン、毒素、酵素、ホルモン、及びシグナル伝達タンパク質のリストから独立して選択される。
【００７１】
特定の実施形態では、前記第３、第４、第５及び／又は第６の機能的ドメインは、結合ドメインから独立して選択される。
【００７２】
特定のそのような実施形態では、結合ドメインは、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ及び単一抗体可変ドメイン、サメからのＶＮＡＲ構造に基づく単一ドメイン抗体、及びに代替の足場に基づく結合ドメインを含むがこれらに限定されない抗体ベースの結合ドメインのリストから独立して選択される。アンキリンベースのドメイン、ファイノマー、アビマー、アンチカリン、フィブロネクチン、及び抗体の定常領域に組み込まれている結合部位を含むが、これらに限定されない（例えば、ｆ−ｓｔａｒ技術について、Wozniak-Knopp et al., Protein Eng. Des. Sel. 23 (2010) 289-297）。
【００７３】
特定のそのような実施形態では、前記結合ドメインは、一本鎖Ｆｖフラグメント及び単一抗体可変ドメインから選択される抗体ベースの結合ドメインである。特定のそのような実施形態では、そのような一本鎖Ｆｖフラグメントにおける可変ドメインの順序は、（Ｎ末端からＣ末端まで）ＶＬ-（リンカー）-ＶＨ及びＶＨ-（リンカー）-ＶＬから選択される。特定の実施形態では、可変ドメインの順序は、ヘテロ二量体タンパク質に含まれるすべての一本鎖Ｆｖフラグメントについて同じである。特定の実施形態では、例えば、ＶＬ−（リンカー）−ＶＨの順序の一本鎖Ｆｖフラグメントの場合、３つのＶＬドメインは、それぞれ第１のポリペプチドリンカー及び第３、第４、及び第５のポリペプチドリンカーの１つによって互いに連結されている前記第１のアミノ酸配列からのＣ末端である。特定の実施形態では、例えば、ＶＬ-（リンカー）-ＶＨの順序の一本鎖Ｆｖフラグメントが第２のアミノ酸配列のＮ末端である場合、それぞれ、前記第２ポリペプチドリンカー及び前記第３、第４及び第５ポリペプチドリンカーの１つによって３つのＶＨドメインが互いに連結される（図１２、１３及び１５を参照）。したがって、特定の実施形態において、前記第１及び前記第２の一本鎖タンパク質の少なくとも１つは、２つのポリペプチドリンカーにより連結された３つのＶＬドメイン又は３つのＶＨドメインからそれぞれなるアミノ酸配列を含む。
【００７４】
特定の他の実施形態では、対応するリンカーを介して前記第１又は第２のアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に直接連結されるそのような抗体ベースの結合ドメインの可変ドメインは、（ａ）ＶＨドメインであるそれが前記第１のアミノ酸配列に融合される場合、及び（ｂ）それが前記第２のアミノ酸配列に融合される場合、ＶＬドメインである。したがって、ＶＨドメインはＶＬリンカー-ＶＬコア領域のＮ末端及び／又はＣ末端に融合され、ＶＬドメインはＶＨリンカー−ＶＨコア領域のＮ末端及び／又はＣ末端に融合される（例えば、図１４を参照）。
【００７５】
特定の実施形態では、前記第３、第４、第５及び／又は第６の結合ドメインは一本鎖Ｆｖフラグメントである。
【００７６】
特定のそのような実施形態では、前記一本鎖Ｆｖフラグメントの可変ドメインを接続するポリペプチドリンカーは、１５〜２５アミノ酸残基、特に２０アミノ酸残基からなる。特定の実施形態では、前記ポリペプチドリンカーは配列（ＧＧＧＧＳ）ｎを有し、ｎは３、４、及び５、特に４から選択される。
【００７７】
特定の実施形態では、ウサギＣＤＲに固有の特定のパターンによって証明されるように、前記抗体可変ドメインの少なくとも１つは、親ウサギ抗体に由来するＣＤＲ領域を含む。特定の実施形態では、前記抗体可変ドメインの少なくとも１つはヒトフレームワーク領域を含む。
【００７８】
特定の実施形態では、前記第１の一本鎖タンパク質及び前記第２の一本鎖タンパク質は、少なくとも１つのジスルフィド結合により架橋されている。
【００７９】
特定の実施形態では、前記ジスルフィド結合は、前記第１又は前記第２のＶＬドメインに隣接する第１のシステイン残基と、前記第１又は前記第２のＶＨドメインに隣接する第２のシステイン残基との間に形成される。
【００８０】
特定の実施形態では、ジスルフィド結合は、第１又は第２のＶＬドメインのフレームワーク領域に含まれる第１のシステイン残基と、第１又は第２のＶＨドメインのフレームワーク領域に含まれる第２のシステイン残基との間に形成される。
【００８１】
特定の実施形態では、前記第１システイン残基は前記第１又は前記第２ＶＬドメインの位置１４１に位置し、前記第２システイン残基は前記第１又は前記第２ＶＨドメインの位置５１に位置する。
【００８２】
本発明の文脈において、抗体可変ドメインに使用される番号付けシステムは、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ（A. Honegger & A. Pluckthun. "Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: An automatic modeling and analysis tool". J. Mol. Biol, 309 (2001 )657-670）によるナンバリングシステム（ＡＨｏナンバリング）に基づく。
【００８３】
特定の実施形態では、ヒト血清アルブミンに特異性を有する可変ドメインの同族対は、ヒト抗体ＶＬフレームワークの配列番号１０、１、２、及び１４から選択されるＶＬタンパク質配列の１つに存在する３つのＶＬ  ＣＤＲを含み、ここで、ＶＬフレームワークは、ＶＫフレームワークＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、特にＶＫ１フレームワーク、及びＶＫ  ＦＲ４、特にＶＫ１  ＦＲ４、ＶＡフレームワーク４から選択されるフレームワークＦＲ４、及びＶＨタンパク質配列の１つに存在する３つのＶＨ  ＣＤＲは、ヒト抗体ＶＨフレームワーク、特にＶＨ３フレームワークの配列番号１１、１３、及び１５から選択される。
【００８４】
本発明の文脈において、ＶＫ、νλ及び／又はＶＨフレームワークへの割り当ては、ＷＯ９７／０８３２０に示されるヒト抗体の配列とのアラインメントにより実施される。フレームワークとＣＤＲの定義は、Honegger & Pluckthun, loc. citに従って使用される。
【００８５】
特定のそのような実施形態では、前記ＶＬドメインの少なくとも１つは、（ｉ）ヒトＶＫフレームワーク領域ＦＲ１〜ＦＲ３、特にヒトＶＫ１フレームワーク領域ＦＲ１〜ＦＲ３；（ｉｉ）ＣＤＲドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３；ならびに（ｉｉｉ）フレームワーク領域ＩＶを含み、
ａ．フレームワーク領域ＩＶのヒトＶＡ生殖系列配列、特に配列番号２４〜３０（ＷＯ２０１４／２０６５６１による配列番号１６〜２２）のリストから選択されたＶＡ生殖系列配列；
ｂ．（ｂｉ）フレームワーク領域ＩＶのヒトＶＡ生殖系列配列、特に配列番号２５（ＷＯ２０１４／２０６５６１による配列番号１７）からのコンセンサスＶＡ配列であるＶＡベースの配列；又は（ｂｉｉ）フレームワーク領域ＩＶの再構成ヒトＶＡ配列からのコンセンサスＶＡ配列、特に配列番号２４及び２５（ＷＯ２０１４／２０６５６１による配列番号１６及び１７）から選択されるＶＡコンセンサス配列；
ｃ．フレームワーク領域ＩＶの最も近いヒトＶＡ生殖系列配列と比較して、１つ又は２つの突然変異、特に１つの突然変異を有するＶＡベースの配列
から選択される。
【００８６】
特定の実施形態では、ヒト血清アルブミンに対する特異性を有する可変ドメインの同族対は、（ｉ）配列番号１０又は配列番号１２又は配列番号１４によるＶＬ配列に対して、少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を示すＶＬドメイン；及び／又は（ｉｉ）配列番号１１又は配列番号１３又は配列番号１５によるＶＨ配列に対して、少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント、好ましくは少なくとも９０パーセントの配列同一性を示すＶＨドメインを含む。
【００８７】
特定の実施形態では、ヒト血清アルブミンに対する特異性を有する可変ドメインの同族対は、（ｉ）配列番号１０によるＶＬ配列に対して、少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を示すＶＬドメイン、及び配列番号１１によるＶＨ配列に対して、少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を示すＶＨドメイン；又は（ｉｉ）配列番号１２によるＶＬ配列に対して、少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を示すＶＬドメイン、及び配列番号１３によるＶＨ配列に対して、少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を示すＶＨドメイン；又は（ｉｉｉ）配列番号１４によるＶＬ配列に対して、少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を示すＶＬドメイン、及び配列番号１５によるＶＨ配列に対して、少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を示すＶＨドメインを含む。
【００８８】
より特定の実施形態では、ヒト血清アルブミンに対する特異性を有する可変ドメインの同族対は、
（ｉ）配列番号１０によるＶＬ配列に対して、少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を示すＶＬドメイン（ここで、ＶＬドメインは、配列番号１０によるＶＬ配列から得られるＣＤＲドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む）、及び配列番号１１によるＶＨ配列に対して、少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を示すＶＨドメイン（ここで、ＶＨドメインは、配列番号１１によるＶＨ配列から得られるＣＤＲドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む）；又は
（ｉｉ）配列番号１２によるＶＬ配列に対して、少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を示すＶＬドメイン（ここで、ＶＬドメインは、配列番号１２によるＶＬ配列から得られるＣＤＲドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む）、及び配列番号１３によるＶＨ配列に対して、少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を示すＶＨドメイン（ここで、ＶＨドメインは、配列番号１３によるＶＨ配列から得られるＣＤＲドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む）
を含み、好ましくは、ＶＬドメインはＫ５０Ｑ及びＡ５１Ｐ（ＡＨｏナンバリング）を含み、ＶＨドメインはＷ５４Ｙ、Ｖ１０３Ｔ及びＹ１０５Ｆ（ＡＨｏナンバリング）を含む。
【００８９】
より特定の実施形態において、ヒト血清アルブミンに対する特異性を有する可変ドメインの同族対は、配列番号１４によるＶＬ配列に対して、少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を示すＶＬドメイン（ここで、ＶＬドメインは、配列番号１４によるＶＬ配列から取られるＣＤＲドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む）、及び配列番号１５によるＶＨ配列に対して、少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％、好ましくは少なくとも９０パーセントの配列同一性を示すＶＨドメイン（ここで、ＶＨドメインは、配列番号１５によるＶＨ配列から得られたＣＤＲドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む）を含み、好ましくは、ＶＬドメインは、Ｉ２Ｖ、Ｑ３Ｖ、Ｋ５０Ｑ及びＡ５１Ｐ（ＡＨｏナンバリング）を含み、ＶＨドメインはＩ５５Ｖ、Ｖ１０３Ｔ、Ｙ１０５Ｆ（ＡＨｏナンバリング）を含む。
【００９０】
特定の実施形態では、ヒト血清アルブミンに対する特異性を有する前記可変ドメインの同族対は、配列番号１０、１２、１２から選択されるタンパク質配列の少なくとも位置５から１４０、特に少なくとも位置３から１４５（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ＆Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，ｌｏｃ．ｃｉｔによる位置）を含むＶＬドメイン；及び配列番号１１、１３、及び１５から選択されるタンパク質配列の少なくとも位置５から１４０、特に少なくとも位置３から１４５を含むＶＨドメインを含む。特に、ヒト血清アルブミンに対する特異性を有する可変ドメインの同族対は、配列番号１０、１２、及び１４から選択されるＶＬドメイン、及び配列番号１０、１２、及び１４から選択されるＶＨドメインを含む。
【００９１】
特定の実施形態では、ヒトＣＤ３に対する特異性を有する可変ドメインの同族対は、ヒト抗体ＶＬフレームワークの配列番号２、４、６及び８から選択されるＶＬタンパク質配列の１つに存在する３つのＶＬ  ＣＤＲを含み、ここで、ＶＬフレームワークは、ＶＫフレームワークＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、特にＶＫ１フレームワーク、及びＶＫ  ＦＲ４、特にＶＫ１  ＦＲ４、ＶＡフレームワーク４、ＶＨタンパク質の１つに存在する３つのＶＨ  ＣＤＲから選択されるフレームワークＦＲ４を含み、ＶＨタンパク質配列の１つに存在する３つのＶＨ  ＣＤＲは、ヒト抗体ＶＨフレームワーク、特にＶＨ３フレームワークの配列番号３、５、７及び９から選択される。
【００９２】
特定のそのような実施形態では、ＶＬドメインの少なくとも１つは、（ｉ）ヒトＶＫフレームワーク領域ＦＲ１〜ＦＲ３、特にヒトＶＫ１フレームワーク領域ＦＲ１〜ＦＲ３；（ｉｉ）ＣＤＲドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３；ならびに（ｉｉｉ）フレームワーク領域ＩＶを含み、
ａ．フレームワーク領域ＩＶのヒトＶＡ生殖系列配列、特に配列番号２４〜３０（ＷＯ  ２０１４／２０６５６１による配列番号１６〜２２）のリストから選択されたＶＡ生殖系列配列；
ｂ．（ｂｉ）フレームワーク領域ＩＶのヒトＶＡ生殖系列配列、特に配列番号２５（ＷＯ２０１４／２０６５６１による配列番号１７）からのコンセンサスＶＡ配列であるか、又は（ｂｉｉ）フレームワーク領域ＩＶの再構成ヒトＶＡ配列、特に配列番号２４及び２５（ＷＯ２０１４／２０６５６１による配列番号１６及び１７）のリストから選択されるＶＡコンセンサス配列であるＶＡベースの配列；ならびに
ｃ．フレームワーク領域ＩＶの最も近いヒトＶＡ生殖系列配列と比較して、１つ又は２つの突然変異、特に１つの突然変異を有するＶＡベースの配列
から選択される。
【００９３】
特定の実施形態では、ヒトＣＤ３に対する特異性を有する可変ドメインの同族対は、（ｉ）配列番号２、４、６、及び８から選択される配列によるＶＬ配列に対して、少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を示すＶＬドメイン、及び／又は（ｉｉ）配列番号３、５、７及びから選択される配列によるＶＨ配列に対して、少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を示すＶＨドメインを含む。
【００９４】
特定の実施形態では、ヒトＣＤ３に対する特異性を有する可変ドメインの同族対は、（ｉ）配列番号２によるＶＬ配列に対して、少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を示すＶＬドメイン、及び配列番号３によるＶＨ配列に対して、少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を示すＶＨドメイン；又は（ｉｉ）配列番号４によるＶＬ配列に対して、少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を示すＶＬドメイン、及び配列番号５によるＶＨ配列に対して、少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を示すＶＨドメイン；又は（ｉｉ）配列番号６によるＶＬ配列に対して、少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を示すＶＬドメイン、及び配列番号７によるＶＨ配列に対して、少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を示すＶＨドメイン；又は（ｉｖ）配列番号８によるＶＬ配列に対して、少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を示すＶＬドメイン、及び配列番号９によるＶＨ配列に対して、少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を示すＶＨドメインを含む。
【００９５】
より特定の実施形態では、ヒトＣＤ３に対する特異性を有する可変ドメインの同族対は、
（ｉ）配列番号２によるＶＬ配列に対して、少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を示すＶＬドメイン（ここで、ＶＬドメインは、配列番号２によるＶＬ配列から得られるＣＤＲドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む）、及び配列番号３によるＶＨ配列に対して、少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を示すＶＨドメイン（ここで、ＶＨドメインは、配列番号３によるＶＨ配列から得られるＣＤＲドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む）、好ましくは、ＶＬドメインはＹ４４Ｆ、Ｋ５０Ｑ、Ａ５１Ｓ及びＬ５４Ｒ（ＡＨｏナンバリング）を含み、ＶＨドメインはＥ５３Ａ、Ｖ１０３Ｔ及びＹ１０５Ｆ（ＡＨｏナンバリング）を含む、又は
（ｉｉ）配列番号４によるＶＬ配列に対して、少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を示すＶＬドメイン（ここで、ＶＬドメインは、配列番号４によるＶＬ配列から得られるＣＤＲドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む）、及び配列番号５によるＶＨ配列に対して、少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を示すＶＨドメイン（ここで、ＶＨドメインは、配列番号５によるＶＨ配列から得られるＣＤＲドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む）、好ましくは、ＶＬドメインはＹ４４Ｆ、Ｋ５０Ｑ、Ａ５１Ｓ及びＬ５４Ｒ（ＡＨｏナンバリング）を含み、ＶＨドメインはＥ５３Ａ、Ｖ１０３Ｔ及びＹ１０５Ｆ（ＡＨｏナンバリング）を含む、又は
（ｉｉｉ）配列番号６によるＶＬ配列に対して、少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を示すＶＬドメイン（ここで、ＶＬドメインは、配列番号６によるＶＬ配列から得られるＣＤＲドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む）、及び配列番号７によるＶＨ配列に対して、少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を示すＶＨドメイン（ここで、ＶＨドメインは、配列番号７によるＶＨ配列から得られるＣＤＲドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む）、好ましくは、ＶＬドメインはＹ４４Ｆ、Ｋ５０Ｑ、Ａ５１Ｓ及びＬ５４Ｒ（ＡＨｏナンバリング）を含み、ＶＨドメインはＥ５３Ａ、Ｖ１０３Ｔ及びＹ１０５Ｆ（ＡＨｏナンバリング）を含む、又は
（ｉｖ）配列番号８によるＶＬ配列に対して、少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を示すＶＬドメイン（ここで、ＶＬドメインは、配列番号８によるＶＬ配列から得られるＣＤＲドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む）、及び配列番号９によるＶＨ配列に対して、少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を示すＶＨドメイン（ここで、ＶＨドメインは、配列番号９によるＶＨ配列から得られるＣＤＲドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む）、好ましくは、ＶＬドメインはＹ４４Ｆ、Ｋ５０Ｑ、Ａ５１Ｓ及びＬ５４Ｒ（ＡＨｏナンバリング）を含み、ＶＨドメインはＥ５３Ａ、Ｖ１０３Ｔ及びＹ１０５Ｆ（ＡＨｏナンバリング）を含む
を含む。
【００９６】
特定の実施形態では、ヒトＣＤ３に特異性を有する可変ドメインの同族対は、配列番号２、４、６及び８から選択されるタンパク質配列の少なくとも位置５から１４０、特に少なくとも位置３から１４５を含むＶＬドメイン、ならびに配列番号３、５、７及び９から選択されるタンパク質配列の少なくとも位置５から１４０、特に少なくとも位置３から１４５を含むＶＨドメイン（Honegger & Pluckthun, loc. citによる位置決め）を含み、特に、ヒトＣＤ３に特異性を有する可変ドメインの同族対は、配列番号２、４、６及び８から選択されるＶＬドメイン、ならびに配列番号３、５、７及び９から選択されるＶＨドメインを含む。
【００９７】
特定のそのような実施形態では、第３、第４、第５及び／又は第６の結合ドメインは、癌標的、及び免疫エフェクター細胞上に存在する標的のリストから選択される標的に対する特異性を有する一本鎖Ｆｖフラグメントである。
【００９８】
本出願の文脈において、「標的」という用語は、そのような結合ドメインによって特異的に結合される抗体の抗原などの結合ドメインの同族結合パートナーを指す。
【００９９】
特定の実施形態では、前記標的は、癌標的であり、特に、非腫瘍細胞の表面と比較して、濃度が増加した及び／又は異なる立体配置の１つ以上の腫瘍細胞型又は腫瘍関連細胞の表面に存在する抗原又はエピトープである。特に、前記癌標的は、１つ以上の腫瘍又は腫瘍間質細胞型の表面上に存在するが、非腫瘍細胞の表面上には存在しない。
【０１００】
他の特定の実施形態では、前記標的は、自己免疫疾患に関与する細胞で優先的に発現される抗原又はエピトープである。他の実施形態では、前記抗原又はエピトープは、炎症性疾患に関与する細胞上で優先的に発現される。
【０１０１】
特定の実施形態では、第１及び第２の一本鎖タンパク質は、以下のリストから選択される。ここで、ＶＬＡ、ＶＬＢ、ＶＨＡ、及びＶＨＢは、それぞれ、第１及び第２のＶＬ及びＶＨドメインに対応し、ＶＬＣ、ＶＬＤ、ＶＬＥ、ＶＬＦ、ＶＨＣ、ＶＨＤ、ＶＨＥ、及びＶＨＦはそれぞれ、第３、第４、第５、及び／又は第６の機能ドメインに対応するリンカーを有する一本鎖フラグメントの一部であり、第３、第４、第５、及び／又は第６のリンカー（ＬＩＮＫＥＲ３、ＬＩＮＫＥＲ４、ＬＩＮＫＥＲ５、及びＬＩＮＫＥＲ６）を介して、コアドメイン（太字）に連結されている；すべての構築物は、Ｎ末端からＣ末端の方向に記述される。
【０１０２】
Ａ（パラレル、６Ｆｖｓ）：
鎖１：ＶＬＣ−（リンカー）−ＶＨＣ−（ＬＩＮＫＥＲ３）−ＶＬＡ−（ＬＩＮＫＥＲ１）−ＶＬＢ−（ＬＩＮＫＥＲ４）−ＶＬＤ−（リンカー）−ＶＨＤ
鎖２：ＶＬＥ−（リンカー）−ＶＨＥ−（ＬＩＮＫＥＲ５）−ＶＨＡ−（ＬＩＮＫＥＲ２）−ＶＨＢ−（ＬＩＮＫＥＲ６）−ＶＬＦ−（リンカー）−ＶＨＦ
【０１０３】
Ｂ（アンチパラレル６Ｆｖ）：
鎖１：ＶＬＣ−（リンカー）−ＶＨＣ−（ＬＩＮＫＥＲ３）−ＶＬＡ−（ＬＩＮＫＥＲ１）−ＶＬＢ−（ＬＩＮＫＥＲ４）−ＶＬＤ−（リンカー）−ＶＨＤ
鎖２：ＶＬＥ−（リンカー）−ＶＨＥ−（ＬＩＮＫＥＲ５）−ＶＨＢ−（ＬＩＮＫＥＲ２）−ＶＨＡ−（ＬＩＮＫＥＲ６）−ＶＬＦ−（リンカー）−ＶＨＦ
【０１０４】
Ｃ１（アンチパラレル４Ｆｖ）（図１２を参照）：
鎖１：ＶＬＣ−（リンカー）−ＶＨＣ−（ＬＩＮＫＥＲ３）−ＶＬＡ−（ＬＩＮＫＥＲ１）−ＶＬＢ
鎖２：ＶＬＤ−（リンカー）−ＶＨＤ−（ＬＩＮＫＥＲ４）−ＶＨＢ−（ＬＩＮＫＥＲ２）−ＶＨＡ
【０１０５】
Ｃ２（アンチパラレル４Ｆｖ）（図１４を参照）：
鎖１：ＶＬＣ−（リンカー）−ＶＨＣ−（ＬＩＮＫＥＲ３）−ＶＬＡ−（ＬＩＮＫＥＲ１）−ＶＬＢ
鎖２：ＶＨＢ−（ＬＩＮＫＥＲ２）−ＶＨＡ−（ＬＩＮＫＥＲ４）−ＶＬＤ−（リンカー）−ＶＨＤ
【０１０６】
Ｃ３（アンチパラレル４Ｆｖ）：
鎖１：ＶＬＡ−（ＬＩＮＫＥＲ１）−ＶＬＢ−（ＬＩＮＫＥＲ３）−ＶＬＣ−（リンカー）−ＶＨＣ
鎖２：ＶＬＤ−（リンカー）−ＶＨＤ−（ＬＩＮＫＥＲ４）−ＶＨＢ−（ＬＩＮＫＥＲ２）−ＶＨＡ
【０１０７】
Ｃ４（アンチパラレル４Ｆｖ）：
鎖１：ＶＬＡ−（ＬＩＮＫＥＲ１）−ＶＬＢ−（ＬＩＮＫＥＲ３）−ＶＬＣ−（リンカー）−ＶＨＣ
鎖２：ＶＨＢ−（ＬＩＮＫＥＲ２）−ＶＨＡ−（ＬＩＮＫＥＲ４）−ＶＬＤ−（リンカー）−ＶＨＤ
【０１０８】
Ｄ１（パラレル４Ｆｖ）（図１５を参照）：
鎖１：ＶＬＣ−（リンカー）−ＶＨＣ−（ＬＩＮＫＥＲ３）−ＶＬＡ−（ＬＩＮＫＥＲ１）−ＶＬＢ
鎖２：ＶＬＤ−（リンカー）−ＶＨＤ−（ＬＩＮＫＥＲ４）−ＶＨＡ−（ＬＩＮＫＥＲ２）−ＶＨＢ
【０１０９】
Ｄ２（パラレル４Ｆｖ）：
鎖１：ＶＬＣ−（リンカー）−ＶＨＣ−（ＬＩＮＫＥＲ３）−ＶＬＡ−（ＬＩＮＫＥＲ１）−ＶＬＢ
鎖２：ＶＨＡ−（ＬＩＮＫＥＲ２）−ＶＨＢ−（ＬＩＮＫＥＲ４）−ＶＬＤ−（リンカー）−ＶＨＤ
【０１１０】
Ｄ３（パラレル４Ｆｖ）：
鎖１：ＶＬＡ−（ＬＩＮＫＥＲ１）−ＶＬＢ−（ＬＩＮＫＥＲ３）−ＶＬＣ−（リンカー）−ＶＨＣ
鎖２：ＶＬＤ−（リンカー）−ＶＨＤ−（ＬＩＮＫＥＲ４）−ＶＨＡ−（ＬＩＮＫＥＲ２）−ＶＨＢ
【０１１１】
Ｄ４（パラレル４Ｆｖ）：
鎖１：ＶＬＡ−（ＬＩＮＫＥＲ１）−ＶＬＢ−（ＬＩＮＫＥＲ３）−ＶＬＣ−（リンカー）−ＶＨＣ
鎖２：ＶＨＡ−（ＬＩＮＫＥＲ２）−ＶＨＢ−（ＬＩＮＫＥＲ４）−ＶＬＤ−（リンカー）−ＶＨＤ
【０１１２】
特定の実施形態では、ヘテロ二量体フォーマットＡ、Ｂ、Ｃ１からＣ４、又はＤ１からＤ４による構築物に含まれる１つ以上のｓｃＦｖフラグメントにおけるＶＨ及びＶＬドメインの順序は逆の順序である（例えば、構築物Ａの鎖１におけるＶＨＣ−（リンカー）−ＶＬＣ−（ＬＩＮＫＥＲ３）−ＶＬＡ−（ＬＩＮＫＥＲ１）−ＶＬＢ−（ＬＩＮＫＥＲ４）−ＶＨＤ−（リンカー）−ＶＬＤ）。
【０１１３】
これらのフォーマットでは、１つのタンパク質鎖上の２つの分割可変重ドメインＶＨＡ及びＶＨＢと、他のタンパク質鎖上の２つの対応する可変軽鎖ドメインＶＬＡ及びＶＬＢ（ＶＨ−ＶＨ／ＶＬ−ＶＬ）の局在化は、鎖内ドメイン対の形成を妨げて、不活性な一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）様構造をもたらす。これは、従来のダイアボディのＶＨ−ＶＬ／ＶＨ−ＶＬ配向（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖらによって提案された設計と同様である）が使用されて、ヘテロ二量体化を駆動している場合であるからである。対照的に、ＶＨ−ＶＨ／ＶＬ−ＶＬ配向は、ヘテロ二量体の２〜６特異的タンパク質のみの形成を強制する。
【０１１４】
ＶＨＡ−ＶＨＢ／ＶＬＡ−ＶＬＢコアドメインに結合する標的Ａ及びＢのＶＨ／ＶＬドメインペアリングは、ＶＨＡ−ＶＬＢ及びＶＨＢ−ＶＬＡ対をもたらすＶＨＡとＶＬＢ、及びＶＨＢとＶＬＡの不適切なペアリングにより、非アクティブなコアドメインになるという理論上の可能性がある。意外にも驚くべきことに、そのような非アクティブなバリアントはこれまでのところ観察されていない。理論に縛られることを望まないが、二量化は、一致しないペアリングで発生する潜在的なパッキング干渉とは対照的に、同族対のＣＤＲのより効率的なパッキングにより、同族ペアリングに向かって駆動することができる。
【０１１５】
ＶＨ−ＶＨ／ＶＬ−ＶＬコアドメインでのヘテロ二量体化を活性なペアリングに向けてさらに駆動するために、ノブイントゥーホール又は同様の技術を、ＶＨ−ＶＨ／ＶＬ−ＶＬコアドメインの１つ又は（相互に適用する場合は）両方のＶＬ／ＶＨ対に適用することができる。したがって、特定の実施形態では、前記ヘテロ二量体タンパク質のＶＨ−ＶＨ／ＶＬ−ＶＬコアドメインにおける活性なペアリングは、以下から選択される技術によってさらに支持される：ノブイントゥーホール（Zhu et al., "Remodeling domain interfaces to enhance heterodimer formation", Protein Sci 1997 Apr; 6(4): 781-788）、及び鎖間システインブリッジ。
【０１１６】
第２の態様では、本発明は、前記第１及び第２の一本鎖タンパク質をコードする１つ又は２つの核酸配列に関する。
【０１１７】
第３の態様では、本発明は、前記１つ又は２つの核酸配列を含む１つ又は２つのベクターに関する。
【０１１８】
第４の態様では、本発明は、前記１つ又は２つのベクターを含む１つ又は複数の宿主細胞に関する。
【０１１９】
第４の態様では、本発明は、本発明の第１及び第２の一本鎖タンパク質、又はヘテロ二量体タンパク質を製造する方法に関し、（ｉ）本発明に係る核酸若しくは複数の核酸、又は本発明に係るベクター若しくは複数のベクターを提供し、前記核酸若しくは複数の核酸、又は前記ベクター若しくは複数のベクターを発現させ、発現系から第１及び第２の一本鎖タンパク質、又はヘテロ二量体タンパク質を収集するステップ、あるいは（ｉｉ）本発明に係る宿主細胞若しくは複数の宿主細胞を提供し、前記宿主細胞若しくは複数の宿主細胞を培養し、細胞培養物から第１及び第２の一本鎖タンパク質、又は前記ヘテロ二量体タンパク質を収集するステップを含む。
【０１２０】
第５の態様では、本発明は、本発明のヘテロ二量体タンパク質と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物に関する。薬学的に許容される担体は、組成物を強化又は安定化するか、又は組成物の調製を促進する。薬学的に許容される担体には、生理学的に適合する溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などが含まれる。
【０１２１】
第６の態様では、本発明は、疾患、特にヒト疾患、より具体的には癌、炎症性疾患及び自己免疫疾患から選択されるヒト疾患の治療に使用するための本発明のヘテロ二量体タンパク質に関する。特定の実施形態では、前記第３、第４、第５、又は第６の機能的ドメインの少なくとも１つは、対応する疾患の治療関連の標的と特異的に相互作用することができる。
【０１２２】
本明細書で使用される「治療」、「治療している」、「治療する」、「治療した」などの用語は、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を得ることを指す。効果は、疾患の部分的又は完全な治癒及び／又は疾患に起因する有害作用、又は疾患の進行を遅らせることの観点から治療的であり得る。本明細書で使用される「治療」は、哺乳動物、例えばヒトにおける疾患のあらゆる治療を包含し、以下：（ａ）疾患の阻害、例えば、その発症の阻止；及び（ｃ）疾患の緩和、例えば、疾患の退行を引き起こすことを含む。
【０１２３】
第７の態様では、本発明は、疾患、特にヒト疾患、より詳細には癌、炎症性疾患及び自己免疫疾患から選択されるヒト疾患の治療方法に関し、本発明のヘテロ二量体タンパク質を投与するステップを含み、ここで、前記第３、第４、第５、又は第６の機能的ドメインの少なくとも１つは、対応する疾患における治療関連の標的と特異的に相互作用することができる。特に、本発明は、癌、炎症性疾患及び自己免疫疾患から選択される疾患に罹患している対象を治療する方法に関し、有効量の本発明のヘテロ二量体タンパク質を対象に投与することを含み、前記第３、第４、第５、又は第６の機能的ドメインのうちの少なくとも１つは、対応する疾患における治療関連の標的と特異的に相互作用することができる。
【０１２４】
「対象」という用語には、ヒト及び非ヒト動物が含まれる。非ヒト動物には、すべての脊椎動物、例えば、哺乳動物、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、トリ、両生類、爬虫類などの非哺乳類が含まれる。特に明記しない限り、「患者」又は「対象」という用語は、本明細書では互換的に使用される。「有効量」又は「治療有効量」又は「有効な量」という用語は、疾患を治療するために哺乳動物又は他の対象に投与された場合、そのような疾患の治療を行うのに十分な薬剤の量を指す。「治療的有効量」は、薬剤、疾患及びその重症度、及び治療される対象の年齢、体重などに応じて異なる。
【０１２５】
第８の態様では、本発明は、疾患、特にヒト疾患、より具体的には癌、炎症性及び自己免疫疾患から選択されるヒト疾患の治療に使用するための医薬の製造における本発明のヘテロ二量体タンパク質の使用に関する。ここで、ＶＬ及びＶＨドメインの同族対の、又は第３、第４、第５、若しくは第６の機能的ドメインの少なくとも１つが、対応する疾患における治療関連の標的と特異的に相互作用することができる。
【０１２６】
第９の態様では、本発明は、疾患、特にヒト疾患、より具体的には癌、炎症性疾患及び自己免疫疾患から選択されるヒト疾患の治療における本発明のヘテロ二量体タンパク質の使用に関する。ここで、ＶＬ及びＶＨドメインの同族対の、又は第３、第４、第５、若しくは第６の機能的ドメインの少なくとも１つは、対応する疾患における治療関連の標的と特異的に相互作用することができる。
【０１２７】
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【実施例】
【０１３５】
実施例１：多重仕様フォーマットの構築
方法及び結果
構築物設計、発現及び精製
ヘテロ二量体ＭＡＴＣＨ分子は、ヘテロ二量体コアアセンブリの分割可変ドメインにＣＤ３Ｅ及びＨＳＡに対する特異性を含むように設計された。ＩＬ２３Ｒ結合ｓｃＦｖは、各ヘテロ二量体化ドメインのＮ末端に結合した。ＭＡＴＣＨの２つのペプチド鎖を共有結合させ、ヘテロ二量体化コアの対応するドメインの正しいアセンブリを確認するために、鎖間ジスルフィド（［１１］に記載）が抗ＣＤ３又は抗ＨＳＡドメインのいずれかのＶＬ／ＶＨインターフェースに導入された。
【０１３６】
多数の様々な実施形態は、ＭＡＴＣＨ配置（パラレル又はアンチパラレル）、使用されるＣＤ３結合ドメイン（クローン２８−２１−Ｄ０９又は０９−２４−Ｈ０９）、使用されるＨＳＡ結合ドメイン（クローン１９−０１−Ｈ０４又は２３−１３−Ａ０１）及び異なるコアリンカー（配列番号１６−２０）のようなパラメータを変動させて生じさせた。ＭＡＴＣＨフォーマットの２つの可能な配置（パラレル又はアンチパラレル）について詳しく説明されている（ＷＯ２０１６２０２４５７）、アンチパラレル配置（ａｐ）：鎖Ａ（ＶＬ１−ＶＨ１−ＶＨ２−ＶＨ３）及び鎖Ｂ（ＶＬ４−ＶＨ４−ＶＬ３−ＶＬ２）；パラレル配置（ｐ）：鎖Ａ（ＶＬ１−ＶＨ１−ＶＨ２−ＶＨ３）及び鎖Ｂ（ＶＬ４−ＶＨ４−ＶＬ２−ＶＬ３）。配列のバリエーション以外にも、コアドメインの様々な選択肢、表１及び表２に示されるｓｃＦｖモジュール及びコアリンカーが試験されている。
【０１３７】
【表１−１】
2020522267.tif 000003
【０１３８】
【表１−２】
2020522267.tif 000004
【０１３９】
【表１−３】
2020522267.tif 000005
【０１４０】
【表２】
2020522267.tif 000006
【０１４１】
上記で概説した構築物を生成するために、Ｆｖドメイン及びリンカーのアミノ酸配列を、対応する核酸配列に逆翻訳し、それをデノボで合成した。コード配列を組み立て、標準的な分子生物学技術（例えば、Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual）により、組換えタンパク質分泌に適した発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３．１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。
【０１４２】
ＭＡＴＣＨタンパク質は、供給元のプロトコルに従ってＣＨＯｇｒｏ発現キット（Ｍｉｒｕｓ  Ｂｉｏ  ＬＬＣ）を使用した一過性トランスフェクションにより、ＣＨＯ−Ｓ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）で生産された。タンパク質画分をＣＨＯ−Ｓ上清から精製し、細胞生存率が８０％未満に低下するとすぐに遠心分離により回収した（３７℃及び８％ＣＯ2での軌道振とうによる６日間のインキュベーション後）。精製はプロテインＬアフィニティ精製によって行われ、ＡＫＴＡ  Ｐｕｒｅ  ＦＰＬＣシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に固定されたカラムでＣａｐｔｏ  Ｌ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で可変ドメインを捕捉し、０．１Ｍクエン酸、ｐＨ  ２．０で溶出した後、迅速に１／３（ｖ／ｖ）２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ７．５の添加によりサンプルｐＨを調整した。その後、透析膜（３．５ｋＤａ  ＭＷＣＯ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用してタンパク質溶液を１×ＰＢＳ  ｐＨ７．４（３００ｍＭアルギニンを補充）とバッファー交換し、最後にＶｉｖａｓｐｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎ（５ｋＤａ  ＭＷＣＯ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して濃縮した。
【０１４３】
一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）フォーマットの参照タンパク質は、以前に説明されているように設計された［１０］。要するに、表１にリストされている可変ドメインは、ＶＬＡ−Ｓ１−ＶＨＢ−Ｌ１−ＶＬＢ−Ｓ２−ＶＨＡ方式で配置された。この場合、Ｓ１とＳ２は短いＧＳ４リンカーであり、Ｌ１は長い（ＧＳ）リンカーである。参照目的で生成された分子には、ＭＡＴＣＨ構築物と同じＦｖフラグメントが含まれていた。
【０１４４】
試験したすべてのタンパク質を、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）及びドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析し、タンパク質含量をＵＶ／Ｖｉｓ分光法で分析した。ＭＡＴＣＨ構築物の場合、２つのヘテロ二量体の定量的ジスルフィド結合は、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認された。
【０１４５】
結果
ＭＡＴＣＨ構築物バリアントのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析では、非還元条件下ではタンパク質バンドの共有結合ヘテロ二量体へのほぼ定量的なシフトが観察されることが図１に示されている。しかしながら、還元条件下では、個々の鎖のサイズで二重帯域が観察される。
【０１４６】
→ＶＬ／ＶＨ対の界面における指定された鎖間ジスルフィドブリッジの位置により、特にＳＰＲ実験におけるコアドメインの保存された親和性と組み合わせて、鎖の誤対合は非常に起こりにくい。
【０１４７】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による親和性測定
一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フォーマットの個々の標的結合ドメイン及び精製されたヘテロ二量体ＭＡＴＣＨ構築物の、組換え標的タンパク質であるヒトＩＬ−２３受容体ＥＣＤ（ＩＬ２３Ｒ）、ヒトＣＤ３ガンマ−イプシロン一本鎖（ＣＤ３）及びヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）への結合親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ）又はＭＡＳＳ−１（Ｓｉｅｒｒａ  Ｓｅｎｓｏｒｓ）デバイスを使用した表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定された。簡単に説明すると、組換えタンパク質は、ＣＭ５（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ）又は大容量センサーチップ（Ｓｉｅｒｒａ  Ｓｅｎｓｏｒｓ）のアミンカップリング化学によって直接固定化された。様々な濃度の標的結合ドメインを分析物として注入し、結合応答（応答単位、ＲＵ）を測定した。各注入後、再生手順が実行された。得られた結合データを二重減算（分析対象物注入なし、参照フローチャネル）し、それぞれのソフトウェアパッケージを使用して分析した。
【０１４８】
結果
【０１４９】
【表３−１】
2020522267.tif 000007
【０１５０】
【表３−２】
2020522267.tif 000008
【０１５１】
標的のそれぞれに対するヘテロ二量体ＭＡＴＣＨ構築物の親和性は、一般にｓｃＦｖ又はｓｃＤｂフォーマットで測定された個々の結合ドメインの親和性と非常に類似した。特に、ＭＡＴＣ構築物のＩＬ２３Ｒへの見かけの親和性はｓｃＤｂ参照分子と比較して増加しているようである。これは、各ＭＡＴＣＨ分子への２つのＩＬ２３Ｒ結合ドメインの取り込みに起因する結合力効果によって説明することができる。
【０１５２】
これらのデータは、ＭＡＴＣＨ構築物の各可変ドメインの維持された結合活性を示し、コアリンカーの選択、鎖間ジスルフィドの位置、抗ＣＤ３、使用されるＨＳＡドメイン、又は結合されるｓｃＦｖモジュールに関係なく、同族可変ドメイン対の正しいアセンブリを確認する。
【０１５３】
コアドメインの標的への親和性の特定の違いは、様々な構築物で観察された。ＣＤ３ドメインのＶＬ／ＶＨ界面にジスルフィド結合を含む構築物の場合、ＰＲ０７４６で使用される荷電コアリンカーの組み合わせ（配列番号１６及び配列番号１７を含む）が最高の親和性を示した。
【０１５４】
ＮＦＡＴレポーター遺伝子アッセイによるＴ細胞活性化
ＮＦＡＴアッセイ
ＣＭＶプロモーターの制御下でヒトＩＬ２３Ｒ  ＩＬ１２Ｒベータ１ヘテロ二量体を安定して発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞株は、親のＣＨＯ−Ｋ１細胞株のレンチウイルス形質導入によって生成された。これらの細胞をＮＦＡｔレポーター遺伝子アッセイの標的細胞として使用し、一方、親ＣＨＯ−Ｋ１細胞株を対照として使用した。２５ｇ／Ｌのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む５０μｌアッセイ培地（ＲＰＭＩ  １６４０、１０％ＦＣＳ）で希釈した２５，０００個の生存可能な標的細胞を、白い平底の９６ウェルプレートに播種した。次に、ＨＳＡ（２５ｇ／Ｌ）を含むアッセイ培地で希釈した４倍濃縮試験タンパク質２５μｌを適切なウェルに加えた。最後に、５００００Ｊｕｒｋａｔ細胞を含むＨＳＡを含む２５μｌのアッセイ培地を各ウェルに添加し、プレートを室温で１０分間穏やかに撹拌しながらインキュベートした。３７℃、５％ＣＯ2でのインキュベーション時間に対応する５時間、２２時間又は３０時間などの各時点で１枚のプレートを作成した。ルシフェラーゼ活性を検出するために、製造業者の指示に従って、一段階ルシフェラーゼアッセイキット（Ａｍｓｂｉｏ）を使用した。簡単に言えば、インキュベーション時間の終わりに、ルシフェラーゼ試薬基質をルシフェラーゼ試薬緩衝液と混合し、５０μｌを各ウェルに加え、プレートを室温にて暗所で１５分間インキュベートした。ＴｏｐＣｏｕｎｔ（ＰｅｋｉｎＥｌｍｅｒ）でプレートを読み取った。５０μｌのアッセイ培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％ＦＣＳ）で希釈した２５０００個の生存可能な標的細胞を、白色の平底９６ウェルプレートに播種した。次に、アッセイ培地で希釈した４倍濃縮試験タンパク質２５μｌを適切なウェルに加えた。最後に、５００００個のＪｕｒｋａｔ細胞を含む２５μｌのアッセイ培地を各ウェルに加え、プレートを室温で１０分間穏やかに撹拌しながらインキュベートした。生理的濃度のヒト血清アルブミンを含む又は含まない３７℃、５％ＣＯ2でのインキュベーション時間に対応する５時間、２２時間又は３０時間などの各時点で１枚のプレートを作成した。ルシフェラーゼ活性を検出するために、製造業者の指示に従って、一段階ルシフェラーゼアッセイキット（Ａｍｓｂｉｏ）を使用した。簡単に言えば、インキュベーション時間の終わりに、ルシフェラーゼ試薬基質をルシフェラーゼ試薬緩衝液と混合し、５０μｌを各ウェルに加え、プレートを室温にて暗所で１５分間インキュベートした。プレートはＴｏｐＣｏｕｎｔ（ＰｅｋｉｎＥｌｍｅｒ）で読み取った。
【０１５５】
ＥＬＩＳＡによるＩＬ−２の定量化
２５０ｎＭの試験分子を含むウェルから、ＮＦＡＴレポーター遺伝子アッセイ中の様々な時点で１００μｌの上清を収集した。ＩＬ−２定量は、製造元の指示に従ってＩＬ−２  ＥＬＩＳＡ  ＭＡＸ標準キット（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して行った。簡単に説明すると、希釈バッファー（ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．２％Ｔｗｅｅｎ  ２０）で希釈した１００μｌの捕捉抗体を９６ウェルプレートＭａｘｉｓｏｒｂ（Ｎｕｎｃ）に４℃で一晩コーティングした。翌日、プレートを洗浄バッファー（ＰＢＳ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ  ２０）で３回洗浄した。ウェルを３００μｌの希釈緩衝液でＲＴにて１時間ブロックした後、洗浄緩衝液で３回洗浄した。次に、試験試料の１００μｌの上清と標準曲線の各濃度１００μｌを適切なウェルに加え、プレートを振とうしながら室温で２時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した後、振盪しながら室温で１時間、検出抗体とインキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で再度３回洗浄し、１００μｌのアビジン−ＨＲＰを各ウェルに加え、振とうしながら室温で３０分間インキュベートした。１００μｌのＴＭＢ基質溶液を加える前に、３回の最終洗浄を実施した。プレートを暗所で１５分間インキュベートし、１００μｌの停止溶液を各ウェルに加えることにより反応を停止させた。４５０ｎｍ及び５７０ｎｍで吸光度を読み取った。４５０ｎｍの吸光度から５７０ｎｍの吸光度を差し引いた。
【０１５６】
結果
【０１５７】
【表４】
2020522267.tif 000009
【０１５８】
５時間のインキュベーション後のＮＦＡＴレポーター遺伝子アッセイでのＭＡＴＣＨ構築物バリアントの機能分析により、Ｔ細胞を活性化する能力が示された。異なるプレート間で比較するために、データはプレート上の参照に対して正規化された。
【０１５９】
さらに詳細な特性評価のために、Ｔ細胞を活性化するための最良の効力も示した最高親和性のＭＡＴＣＨ構築物（ＣＤ３用）ＰＲ０７４６を使用した。さらに、構築物ＰＲ０８２１及びＰＲ０８２４を使用して、ａ）異なるターゲティングドメインとの関連でＨＳＡ／ＣＤ３コアドメインの機能的活性を評価し（この場合は抗Ｈｅｒ２）、及びｂ）抗ＣＤ３ドメインの代わりに、ＨＳＡ結合ドメインのジスルフィド結合の代替の位置決めを評価した。
【０１６０】
抗原保有標的細胞及び生理学的濃度のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下でＴ細胞を活性化する分子の効力は、複数の時点及び分子濃度にわたって決定された（図２参照）。ヘテロ二量体ＭＡＴＣＨ（ＰＲ０７４６）は、ＣＤ３Ｅ及びＩＩ２３Ｒに特異性を持つ二重特異性ｓｃＤｂ（ＰＲ０６２４）と、陰性対照としてＭＡＴＣＨヘテロ二量体化コア（ＣＤ３Ｅ及びＨＳＡ）に存在する特異性を組み合わせた二重特異性ｓｃＤｂ（ＰＲ０８１１）と比較された。データは、陰性対照がＴ細胞の活性化をほとんど示さないのに対し、ｓｃＤｂ  ＰＲ０６２４は、初期及び後期の両方の時点でＩＬ２３Ｒを発現する標的細胞の存在下でＴ細胞の強力な活性化を示すことを示す。シグナル振幅は両方の時点で飽和に達し、ＥＣ５０は５〜３０時間のインキュベーション（１４１．８ｐＭから１９．８ｐＭ）で約７倍改善する。興味深いことに、５〜３０時間のインキュベーションで約５倍になる。興味深いことに、ＭＡＴＣ分子であるＰＲ０７４６は、Ｔ細胞の活性化に顕著な時間依存性を示している。５時間の応答は低い信号振幅のみを示すが、ＭＡＴＣＨ−４の応答は、３０時間後にｓｃＤｂのｓｃＤｂと非常に類似した信号振幅に達する。ＥＣ５０は、すべての時点でｓｃＤｂよりも約５倍高いままである（５時間後の２６６．３ｐＭ及び３０時間後の１０２．２ｐＭ）（ポイントを参照（図４を参照））。したがって、２つのフォーマットは主に、最大活性化の可能性というよりはむしろ、Ｔ細胞活性化の速度が異なる（図３も参照）。
【０１６１】
標的タンパク質のない細胞の存在下での異なる分子のＴ細胞活性化のプロット（図３）は、標的細胞の存在下でのＴ細胞活性化のＥＣ５０をはるかに超える濃度でも、Ｔ細胞の活性化がほとんどないことを示している。これは、ＰＲ０８１１でのＴ細胞活性化の欠如とともに、ＨＳＡ／ＣＤ３コアドメインを含む分子のＴ細胞活性化のための標的細胞結合の必要性を確認する。Ｔ細胞の非特異的活性化の欠如は、Ｔ細胞動員療法による望ましくない副作用を回避するための前提条件である。
【０１６２】
異なる時点での用量反応シグナルのプラトー値のプロット（図４）は、参照ｓｃＤｂ（ＰＲ０６２４）が５時間のインキュベーションでほぼ最大のシグナル振幅を誘導することを示している。一方、ＭＡＴＣＨ分子によって誘導される信号振幅はｓｃＤｂの値の２０％未満で始まるが、時間の経過とともに着実に増加し、３０時間のインキュベーション後に最終的に同じレベルのＴ細胞活性化に達する。
【０１６３】
ｓｃＤｂ及びＭＡＴＣＨ分子の用量反応曲線のＥＣ５０値のプロット（図５）は、時間の経過に伴ってＥＣ５０の改善を示すが、しかしながら、興味深いことに、ＥＣ５０の改善は両方の分子で非常に類似したパターンに従い、曲線は互いに並行して走っている。したがって、効力の動態（ＥＣ５０）は、小さいｓｃＤｂとＨＳＡ結合ドメインを含む大きいＭＡＴＣＨの両方で類似している。しかしながら、最大Ｔ細胞活性化の動態は、ＭＡＴＣＨがより遅い活性化を示すという点で大きく異なる。
【０１６４】
Ｔ細胞活性化マーカーＩＬ−２の放出は、分子ＰＲＯ６２４（ｓｃＤｂ）及びＰＲＯ７４６（ＭＡＴＣＨ）のＮＦＡＴレポーター遺伝子アッセイのサンプルについて定量された（図６参照）。ｓｃＤｂ参照分子の場合、３０時間のインキュベーション中にＩＬ−２濃度の強い増加が観察される。興味深いことに、ＭＡＴＣＨ分子を含むウェルに存在するＩＬ−２の量は、対応するＴ細胞活性化シグナルがほぼ同一である３０時間後でも、すべての時点でかなり低かった。
【０１６５】
要約すると、ＨＳＡ／ＣＤ３コアドメインを含むＭＡＴＣＨフォーマットは、Ｔ細胞を活性化する能力が同じであり、活性化の速度が遅いことを示している。これは、他のＴ細胞が関与する二重特異性物質（例えば、ブリナツモマブ／ブリンサイト）によるサイトカイン放出に関連する副作用が投薬の初期に最も強いという事実に照らして興味深いものである。実際、治療開始時には低用量のブリナツモマブ／ブリンサイトのみが許容されているが、その後はかなり高い用量が許容される。これについてのもっともな説明は、いわゆるサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）につながる可能性のある投薬直後に発生する強いサイトカインバーストである。したがって、ここで提示されるＭＡＴＣＨは、Ｔ細胞の活性化の速度が遅く、結果としてサイトカイン放出が減少するため、毒性が低下する可能性があるが、経時的に同じレベルのＴ細胞活性化に達する能力がある。さらに、Ｔ細胞活性化のレベルが同じでもサイトカイン放出の減少はＰＲ０７４６のさらに驚くべき特徴であり、これはＴ細胞動員療法に関連して頻繁に観察されるサイトカイン放出症候群の発生を減らすことを示唆している。
【０１６６】
サイトトックスアッセイ（Ｔ細胞駆動型標的細胞枯渇）
血球分画
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、製造元の指示に従ってリンパ球分離培地Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して、健康なボランティアの新鮮な血液から分離された。簡単に説明すると、５０ｍｌ遠心分離チューブ（ＰＢＳ、２％ＦＣＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）の分離バッファーで血液を１：１に希釈し、推奨量のＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ培地を含むＬｅｕｃｏｓｅｐチューブに適用した。ＬｅｕｃｏＳｅｐチューブをＲＴでブレーキをかけずに８００ｇで３０分間遠心分離した。次に、ＰＢＭＣを含む細胞層を収集し、分離バッファーで２回洗浄し、赤血球溶解バッファーを使用して室温で５分間赤血球を溶解した。次いで、細胞を単離緩衝液で１回及びアッセイ培地（ＲＰＭＩ−１６４０、１０％ＦＣＳ）で１回洗浄した。血小板除去後、単離されたＰＢＭＣを、２５ｇ／ｍｌのＨＳＡを含むアッセイ培地に、１ｍｌあたり３×１０6個の生存細胞の密度で再懸濁した。
【０１６７】
フローサイトメトリーベースのインビトロ細胞毒性アッセイ及びＣＤ８＋Ｔ細胞活性化
ＣＭＶプロモーターの制御下でヒトＩＬ２３Ｒ  ＩＬ１２Ｒｂｅｔａ  １ヘテロ二量体を安定して発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞株は、親のＣＨＯ−Ｋ１細胞株のレンチウイルス形質導入によって生成された。これらの細胞は細胞毒性アッセイで標的細胞として使用されたが、親ＣＨＯ−Ｋ１細胞株は対照として使用された。さらに、ヒトＨＥＲ２を安定して発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞株は、完全長ＨＥＲ２  ｃＤＮＡを使用した親ＣＨＯ−Ｋ１細胞のレンチウイルス形質導入によっても生成された。ＨＥＲ２とＩＬ２３Ｒの発現レベルは、フローサイトメトリーによって決定された。細胞表面のＨＥＲ２レベルは、ＩＬ２３Ｒレベルと比較してはるかに高くなっている。前もってＰＫＨ６７で標識し、２５ｇ／Ｌのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む７５μｌのアッセイ培地（ＲＰＭＩ−１６４０、１０％ＦＣＳ）で希釈した５，０００個の生存可能な標的細胞を９６ウェルプレートに加えた。次に、ＨＳＡを含むアッセイ培地で希釈した６倍濃縮試験タンパク質２５μｌを適切なウェルに加えた。次に、３０：１のＥ：Ｔ比を得るために、ＨＳＡを含む５０μｌのアッセイ培地で希釈した１５，０００個の生存エフェクター細胞（ＰＢＭＣ）を各ウェルに加え、プレートは、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベーションする前に、室温で転頭ミキサー上で混合した。１６時間後、細胞をトリプシン処理し、染色バッファー（ＰＢＳ、２％ＢＣＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）に再懸濁し、非結合プレートに移した。
【０１６８】
細胞は、ＣＤ６９、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ１１ｃ、及びアネキシン−Ｖなどの様々なマーカーで染色された。分析のために、焦点はアポトーシス及び死んだ標的細胞と活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞にある。それにより、標的細胞は緑色蛍光（ＰＫＨ６７）によって識別され、その生存率はアネキシンＶ  ＡＰＣによって分析される。エフェクター細胞（ＣＤ８＋細胞）は、その表面でＣＤ８を検出することにより同定された（抗ＣＤ８  ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５）。ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化は、最終的にＣＤ６９発現の定量化によって検出される（抗ＣＤ６９  ＰＥ）。ＣＤ４は、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞をよりよく識別するために使用される。ＣＤ１１ｃは単球と樹状細胞をマークし、それらを除外するために使用される。アネキシン−Ｖ抗体を除く各マーカーについて、穏やかに撹拌しながら室温で３０分間インキュベートする。細胞を染色バッファーで１回洗浄し、アネキシン結合バッファーで１回洗浄し、アネキシン−Ｖ染色を撹拌しながら室温で３０分間続ける。細胞をＡｎｎｅｘｉｎ−Ｖ結合バッファーで１回洗浄し、Ｎｏｖｏｃｙｔｅ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒでフローサイトメトリー分析を行った。
【０１６９】
特定の標的細胞溶解の割合は、次の式に従って計算される。
【０１７０】
【数１】
2020522267.tif 000010
【０１７１】
活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合は、ＣＤ６９＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合に対応する。
【０１７２】
フローサイトメトリーによるＩＬ−２の定量上清中のＩＬ−２の定量は、サイトメトリービーズアレイヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインキットＩＩ（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を製造元のプロトコルに従って使用して実施した。簡単に言えば、５０μｌの混合キャプチャビーズを分析した各上清とＩＬ−２標準希釈液に加えた。暗所で室温で３時間インキュベートした後、ビーズを洗浄バッファーで３回洗浄し、ノボサイト機器でフローサイトメトリーにより分析した。
【０１７３】
結果
細胞溶解データは、ＰＲ０７４６（ＭＡＴＣＨ−４抗ＴＡＡ２ｘＣＤ３ｘＨＳＡ）とＰＲ０６２４（ｓｃＤｂ；抗ＴＡＡｘＣＤ３）の両方の分子の特異的な効力と特異性を示し、標的を有する細胞の枯渇を誘発するが、陰性コントロールＰＲ０８１１（ｓｃＤｂ；抗ＣＤ３ｘＨＳＡ）は、標的細胞の溶解を誘導できない（図７を参照）。上記のＮＦＡＴアッセイと一致して、ＭＡＴＣ分子での応答のＥＣ５０はｓｃＤｂと比較してわずかに高い濃度にシフトするが、１６時間のインキュベーション後に同様の割合の標的細胞が溶解する。
【０１７４】
３つの分子の用量反応におけるＴ細胞活性化の定量化は、細胞溶解の観察結果と一致している（図８を参照）。この読み出しにより、ＣＤ３／ＩＬ２３Ｒ  ｓｃＤｂ（ＰＲ０６２４）では、標的発現細胞の非存在下で、非特異的なＴ細胞活性化のシグナルが見られる。一方、ＭＡＴＣＨは、試験した最高濃度まで非特異的なＴ細胞活性化の兆候を示さない。
【０１７５】
ウェル内のＩＬ−２の濃度を測定した（図９）。ＩＬ−２の最大濃度は両方の分子で著しく異なり、ＭＡＴＣＨによりＩＬ−２のプラトーがかなり低くなる。標的陰性細胞株を含むウェルの定量化では、ＣＤ３／ＩＬ２３Ｒ  ｓｃＤｂのみが、最高の試験濃度のｓｃＤｂでＩＬ−２濃度の増加をもたらす。上記のＮＦＡＴレポーター遺伝子アッセイで示されたデータに沿って、図８のデータは、ｓｃＤｂ（ＰＲ０６２４）と比較した場合、ＨＳＡの存在下でＣＤ３／ＨＳＡコアドメインを含むＭＡＴＣＨ（ＰＲ０７４６）でのサイトカイン放出の減少を確認する。重要なことに、両方の分子は標的細胞の溶解を誘発する能力が類似しているが、最大の標的細胞の溶解能力は類似している。テトラスペクティブアセンブリは、異なる発現プロファイルの腫瘍関連抗原の２つの抗原特異性を組み合わせるために使用されるＣＤ３／ＨＳＡヘテロ二量体化コアを備えたＭＡＴＣＨアセンブリの可能性を示すために生成された（図１０を参照）。
【０１７６】
データは、ＣＤ３／ＨＳＡコアドメインに結合した「周辺」ｓｃＦｖの両方の特異性を利用して、１つの分子による２つの異なる標的細胞集団のＴ細胞媒介性枯渇を効率的に駆動できることを示している（図１１を参照）。また、観察された用量反応曲線に対する異なる標的発現の影響も示している。つまり、図６に示すように、低発現標的の多価結合を提供することにより、低濃度の標的発現は反応を高濃度にシフトする。一方、標的の発現は、すでに一価の抗原結合により、非常に強力な標的細胞の枯渇をもたらす。そのようなデュアルターゲティングは、２つの標的の１つを排他的に発現する細胞ではなく、２つの細胞表面標的を共発現する細胞への分子の優先的ターゲティングにより、作用メカニズムの特異性を高めるためにさらに活用できる。これを達成するために、２つの標的のいずれかとの親和性が異なる一連のバインダーを、本明細書に示すＣＤ３／ＨＳＡコアドメインを含むＭＡＴＣＨフォーマットを使用して、可能な限りすべての組み合わせでテストし、細胞溶解における最適な特異性を用いて１つの組み合わせを選択することができる（Ｅｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．ｍＡｂｓ．２０１６参照）。
【図１】
2020522267.tif 000011
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
2020522267.tif 000022
【図１２】
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【図１３】
2020522267.tif 000024
【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
2020522267000001.app
【国際調査報告】
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