(57)【要約】【課題】Ｔ細胞受容体欠損キメラ抗原受容体Ｔ細胞およびその使用方法に関する。【解決手段】本発明は、標的結合分子および局在化ドメインを含むタンパク質発現ブロッカーまたはＰＥＢＬを含む組成物、ならびに癌治療においてそのような組成物を使用する方法を提供する。ＰＥＢＬは、免疫細胞における標的表面受容体（ペプチドまたは抗原）の発現の遮断に有用である。本明細書では、そのようなＰＥＢＬを発現するＣＤ３／ＴＣＲαβ欠損Ｔ細胞およびＣＤ３／ＴＣＲαβ欠損キメラ抗原受容体Ｔ細胞も提供される。【選択図】図１５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
局在化ドメインに連結された標的結合分子を含むポリペプチドを含む操作されたＣＤ３／ＴＣＲαβ陰性Ｔ細胞であって、
前記標的結合分子は、ＣＤ３／ＴＣＲαβ複合体タンパク質に結合する抗体を含み、
前記局在化ドメインは、小胞体（ＥＲ）保持配列、ゴルジ体保持配列、およびプロテオソーム局在化配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む保持シグナル伝達ドメインを含み、
前記局在化ドメインに連結された前記標的結合分子は、前記操作された細胞によって分泌されず、前記操作された細胞の細胞表面に発現されない、操作されたＣＤ３／ＴＣＲαβ陰性Ｔ細胞。
【請求項２】
前記ＣＤ３／ＴＣＲαβ複合体タンパク質が、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、およびＣＤ３ζからなる群から選択される、請求項１に記載の操作されたＴ細胞。
【請求項３】
前記抗体が、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である、請求項１または２に記載の操作された免疫細胞。
【請求項４】
前記ｓｃＦｖが、配列番号１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する可変重鎖（ＶＨ）配列と、配列番号２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する可変軽鎖（ＶＬ）配列とを含む、請求項３に記載の操作されたＴ細胞。
【請求項５】
前記操作されたＴ細胞が、同種異系Ｔ細胞である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の操作されたＴ細胞。
【請求項６】
前記操作されたＴ細胞が、自己Ｔ細胞である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の操作されたＴ細胞。
【請求項７】
前記局在化ドメインが、ＣＤ８α、ＣＤ８β、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、またはＦＧＦＲ２Ｂに由来する膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメインをさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の操作されたＴ細胞。
【請求項８】
前記ＥＲ保持配列が、ＫＤＥＬ（配列番号３２）、ＫＫＭＰ（配列番号３３）、ＫＫＴＮ（配列番号４３）、またはＫＫＸＸ（前記Ｘは任意のアミノ酸である）（配列番号３５）から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の操作されたＴ細胞。
【請求項９】
ＣＤ３／ＴＣＲαβの発現が、前記操作されたＴ細胞において遮断される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の操作されたＴ細胞。
【請求項１０】
自己免疫疾患またはウイルス疾患の治療を必要とする患者において自己免疫疾患またはウイルス疾患を治療する方法であって、請求項１〜９のいずれか一項に記載の操作されたＴ細胞を含む薬学的組成物の治療有効量を前記自己免疫疾患またはウイルス性疾患患者に投与することを含む、方法。
【請求項１１】
患者における移植片対宿主病の可能性を低減または排除する方法であって、請求項１〜９のいずれか一項に記載の操作されたＴ細胞を含む薬学的組成物の治療有効量を前記患者に投与することを含む、方法。
【請求項１２】
前記操作されたＴ細胞が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の操作されたＴ細胞。
【請求項１３】
前記ＣＡＲが、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖドメイン、４−１ＢＢ刺激シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む、請求項１２に記載の操作されたＴ細胞。
【請求項１４】
前記操作されたＴ細胞が、ＣＤ１９＋癌細胞の細胞傷害性を誘導する、請求項１３に記載の操作されたＴ細胞。
【請求項１５】
前記ＣＡＲが、抗ＣＤ３ｓｃＦｖドメイン、４−１ＢＢ刺激シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む、請求項１２に記載の操作されたＴ細胞。
【請求項１６】
前記操作されたＴ細胞がＣＤ３＋癌細胞の細胞傷害性を誘導する、請求項１５に記載の操作されたＴ細胞。
【請求項１７】
癌の治療を必要とする患者において癌を治療する方法であって、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の操作されたＴ細胞を含む薬学的組成物の治療有効量を前記癌患者に投与し、それにより前記患者の癌を治療することを含む、方法。
【請求項１８】
前記癌が、ＣＤ３＋癌、ＣＤ１９＋癌、またはＢ細胞悪性腫瘍である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｂ細胞悪性腫瘍が、再発性または難治性の急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（Ｂ−ＮＨＬ）、および大細胞Ｂ細胞リンパ腫からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
投与が、静脈内注入、動脈内注入、腹腔内注入、腫瘍への直接注射および／または手術後の腫瘍床の灌流、人工足場の腫瘍部位への移植、または髄腔内投与を含む、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年８月１０日に出願された米国仮出願第６２／５４３，７３５号の利益を主張し、その開示全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表の参照
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０１８年８月９日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーの名前は「１１９４１９−５００３−ＷＯ−ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」で、サイズは２４．０キロバイトである。
【背景技術】
【０００３】
遺伝子組み換え免疫細胞は、癌の強力な新しい治療法である。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴリンパ球を用いた最近の臨床試験の結果は、このアプローチの力の説得力のある実証を提供している。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、免疫細胞をリダイレクトして、腫瘍細胞を特異的に認識して死滅させることができる。ＣＡＲは、膜貫通ドメインを介してシグナル伝達分子に連結された抗体の単鎖可変領域（ｓｃＦｖ）で構成される人工的な多分子タンパク質である。ｓｃＦｖがその同族抗原をライゲーションすると、シグナル伝達がトリガーされ、ＣＡＲ発現細胞傷害性Ｔリンパ球による腫瘍細胞の死滅を引き起こす（Ｅｓｈｈａｒ  Ｚ，Ｗａｋｓ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ  ＵＳＡ。９０（２）：７２０−７２４，１９９３、Ｇｅｉｇｅｒ  ＴＬ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２（１０）：５９３１−５９３９，１９９９、Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ  ＲＪ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ．９（３）：２７９−２８６，２００３、Ｃｏｏｐｅｒ  ＬＪ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  １０１（４）：１６３７−１６４４，２００３，Ｉｍａｉ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ．１８：６７６−６８４，２００４）。ＣＡＲ発現自己Ｔリンパ球を用いた臨床試験では、Ｂ細胞難治性白血病およびリンパ腫の患者で陽性反応が示されている（例：Ｔｉｌｌ  ＢＧ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  １１９（１７）：３９４０−３９５０，２０１２、Ｍａｕｄｅ  ＳＬ，ｅｔ  ａｌ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．３７１（１６）：１５０７−１５１７，２０１４）。
【０００４】
表面分子ＣＤ１９に特異的なＣＡＲ−Ｔ細胞は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病、非ホジキンリンパ腫などの治療抵抗性のＣＤ１９陽性悪性腫瘍の患者で形態学的および分子的寛解を誘発することが示されている。他の悪性腫瘍は、異なる抗原に対してリダイレクトされたＴ細胞によって攻撃され得る。したがって、腫瘍学における遺伝子工学的細胞療法の可能な応用は広範囲である。
【０００５】
ＣＡＲ−Ｔ細胞注入の初期の臨床経験も潜在的な限界を特定しており、これは治療効果を著しく低下させ、開発を妨げる可能性がある。主要な問題は、がん患者から収集された免疫細胞の適応度が変化し、インビボで拡大し、抗腫瘍効果を発揮する予測不可能な能力をもたらすことである。この変動により、最も効果的な細胞用量の特定が複雑になり、短命で効果のない細胞産物の注入につながり、最終的には一貫した「生体薬（ｌｉｖｉｎｇ  ｄｒｕｇ）」の開発が妨げられる可能性がある。健康なドナーからのＴリンパ球の使用は、有効性と一貫性を改善するはずであるが、ドナーリンパ球注入の重大な、そして潜在的に致命的な結果である移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）のリスクを伴う。そのような同種異系環境では、不可欠な細胞によって発現される組織抗原を認識する能力を抑制するために、注入されたＴ細胞に対する追加の修飾が必要である。１３
【０００６】
遺伝子編集のための実用的な方法論の出現は、癌の細胞療法に適用可能な治療細胞工学の新しい機会を開いた。ジンクフィンガーメガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、およびＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を使用して、ＴＣＲαβ鎖をコードする遺伝子を削除し、アロ反応性を欠くＴ細胞を誘導でき、同時に他の遺伝子を標的して、拒絶反応を遅らせることができる。ＴＣＲαおよびＣＤ５２遺伝子座のＴＡＬＥＮ欠失と抗ＣＤ１９ＣＡＲ発現を使用した報告は、ＣＡＲ発現と遺伝子編集を組み合わせることは、技術的には難しいものの、臨床現場で実現可能であることを示している。
【０００７】
要するに、Ｂ細胞悪性腫瘍の患者に対する新しい治療法の選択肢に対する未だ対処されていない重要なニーズがある。
【発明の概要】
【０００８】
本明細書で提供されるのは、免疫細胞における表面受容体発現の遮断のための単純で効果的な方法である。タンパク質発現ブロッカー（ＰＥＢＬ）という名称の特定の構築物は、標的タンパク質の細胞膜への輸送を防ぐ。ＰＥＢＬ構築物は、他の遺伝子修飾と容易に組み合わせることができ、既存の大規模ｃＧＭＰグレードのプロトコルに組み込まれてエクスビボで細胞を処理して免疫細胞の機能を最適化できる。
【０００９】
一態様では、本発明は、ＣＡＲ−Ｔ細胞を含むＴ細胞の表面分子の迅速かつ効率的なダウンレギュレーションを可能にする方法を提供する。本発明の一実施形態では、抗ＣＤ３εＰＥＢＬの形質導入がＣＤ３の細胞内保持を引き起こし、その結果、Ｔリンパ球の表面上のＴＣＲαβの発現が妨げられた抗ＣＤ３εＰＥＢＬが提供される。本明細書で概説されるＰＥＢＬ構築物は、細胞外漏出が最小限であるか、または全くない可能性があり、ＣＤ３／ＴＣＲαβの発現およびシグナル伝達のブロッキングに非常に効果的である。このようなＰＥＢＬ構築物は、抗ウイルスＴＣＲで形質導入されたＴ細胞を同種のウイルスペプチドに応答できなくし、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を引き起こすヒトＴ細胞の能力を著しく低下させることができる。ＰＥＢＬの発現とＣＤ３／ＴＣＲαβの妨害は永続的であり、他の表面分子の発現には影響しない。ＰＥＢＬを発現するＴ細胞は、匹敵するＴ細胞と同様に生存および増殖できる。重要なことに、ＰＥＢＬ発現Ｔ細胞はＣＡＲシグナル伝達に正常に反応し、インビトロでＣＡＲ標的白血病細胞を効果的に死滅させることができる。ＣＤ３／ＴＣＲαβの発現とシグナル伝達のＰＥＢＬ遮断は、ＣＡＲ−Ｔ細胞などの同種異系Ｔ細胞の注入をサポートするためのシンプルで効果的なツールである。
【００１０】
一態様では、本発明は、局在化ドメインに連結された標的結合分子を含むポリペプチドを含む操作されたＣＤ３／ＴＣＲαβ欠損Ｔ細胞を提供し、標的結合分子はＣＤ３／ＴＣＲαβ複合体タンパク質に結合する抗体を含み、局在化ドメインは、小胞体（ＥＲ）保持配列、ゴルジ体保持配列、およびプロテオソーム局在化配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む保持シグナル伝達ドメインを含み、および局在化ドメインに連結された標的結合分子は、操作されたＣＤ３／ＴＣＲαβ欠損Ｔ細胞によって分泌されない。
【００１１】
いくつかの態様において、抗体は、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、およびＣＤ３ζからなる群から選択されるＣＤ３／ＴＣＲαβ複合体タンパク質に結合する単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１と少なくとも９５％の配列同一性を有する可変重鎖（ＶＨ）配列と、配列番号２と少なくとも９５％の配列同一性を有する可変軽鎖（ＶＬ）配列とを含む。
【００１２】
いくつかの態様において、局在化ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ８β、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、またはＦＧＦＲ２Ｂに由来する膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＥＲ保持配列は、ＫＤＥＬ（配列番号３２）、ＫＫＭＰ（配列番号３３）、ＫＫＴＮ（配列番号４３）、またはＫＫＸＸ（前記Ｘは任意のアミノ酸である）（配列番号３５）から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１３】
他の態様において、本明細書に記載の操作されたＴ細胞の任意の１つおよび薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、患者における移植片対宿主病の可能性を低減または排除する方法も本明細書で提供され、そのような薬学的組成物の治療有効量を患者に投与することを含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作されたＴ細胞は、ＣＤ３またはＣＤ１９に結合するＣＡＲなどであるがこれらに限定されないキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をさらに含む。本明細書に開示されるのは、そのような操作されたＴ細胞および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物である。いくつかの態様では、本発明は、そのような薬学的組成物の治療的有効量を投与することを含む、癌の治療を必要とする患者において癌を治療する方法に関する。場合によっては、癌は造血器癌（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）である。他の例では、癌はＣＤ３発現癌である（例えば、癌細胞はＣＤ３を発現する）。特定の例において、癌はＣＤ１９発現癌である（例えば、癌細胞はＣＤ１９を発現する）。
【００１５】
様々な態様において、本発明は、操作されたＣＤ３／ＴＣＲαβ欠損キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）であって：（ｉ）局在化ドメインに連結された標的結合分子を含むポリペプチドであって、標的結合分子は、ＣＤ３／ＴＣＲαβ複合体タンパク質に結合する抗体を含み、局在化ドメインは、小胞体（ＥＲ）保持配列、ゴルジ体保持配列、およびプロテオソーム局在化配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む保持シグナル伝達ドメインを含み、および局在化ドメインに連結された標的結合分子は、操作された細胞によって分泌されない、ペプチドと、（ｉｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と、を含むものを提供する。
【００１６】
いくつかの態様において、抗体は、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、およびＣＤ３ζからなる群から選択されるＣＤ３／ＴＣＲαβ複合体タンパク質に結合する単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１と少なくとも９５％の配列同一性を有する可変重鎖（ＶＨ）配列と、配列番号２と少なくとも９５％の配列同一性を有する可変軽鎖（ＶＬ）配列とを含む。局在化ドメインには、ＣＤ８α、ＣＤ８β、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、またはＦＧＦＲ２Ｂに由来する膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＥＲ保持配列は、ＫＤＥＬ（配列番号３２）、ＫＫＭＰ（配列番号３３）、ＫＫＴＮ（配列番号４３）、またはＫＫＸＸ（前記Ｘは任意のアミノ酸である）（配列番号３５）から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、操作されたＣＤ３／ＴＣＲαβ欠損ＣＡＲ−Ｔ細胞のＣＡＲはＣＤ３またはＣＤ１９に結合する。場合によっては、ＣＡＲは、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖドメイン、４−１ＢＢ刺激シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。他の例では、ＣＡＲは抗ＣＤ３ｓｃＦｖドメイン、４−１ＢＢ刺激シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。
【００１８】
特定の態様において、本明細書では、操作されたＣＤ３／ＴＣＲαβ欠損キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）であって、（ｉ）局在化ドメインに連結された標的結合分子を含むポリペプチドであって、標的結合分子はＣＤ３／ＴＣＲαβ複合体タンパク質に結合する抗体を含み、局在化ドメインは小胞体（ＥＲ）保持配列、ゴルジ体保持配列、およびプロテオソーム局在化配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む保持シグナル伝達ドメインを含み、局在化ドメインに連結された標的結合分子は、操作された細胞によって分泌されない、ポリペプチドと、（ｉｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と、を含む、操作されたＣＤ３／ＴＣＲαβ欠損キメラ抗原受容体Ｔ細胞を含む、薬学的組成物の治療的有効量を患者に投与することを含む、癌の治療を必要とする患者において癌を治療する方法が提供される。抗体は、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、およびＣＤ３ζからなる群から選択されるＣＤ３／ＴＣＲαβ複合体タンパク質に結合する単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）であり得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ３εに結合するｓｃＦｖは、配列番号１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する可変重鎖（ＶＨ）配列と、配列番号２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する可変軽鎖（ＶＬ）配列を含む。いくつかの実施形態では、局在化ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ８β、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、またはＦＧＦＲ２Ｂに由来する膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＥＲ保持配列は、ＫＤＥＬ（配列番号３２）、ＫＫＭＰ（配列番号３３）、ＫＫＴＮ（配列番号４３）、またはＫＫＸＸ（前記Ｘは、任意のアミノ酸である）（配列番号３５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、局在化ドメインは、配列番号１１〜３１の任意の１つから選択されるアミノ酸配列を含む。場合によっては、操作されたＣＡＲ−Ｔ細胞のＣＡＲはＣＤ３に結合する。他の例では、操作されたＣＡＲ−Ｔ細胞のＣＡＲがＣＤ３に結合する。ＣＡＲには、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖドメイン、４−１ＢＢ刺激シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含めることができる。または、ＣＡＲには、抗ＣＤ３ｓｃＦｖドメイン、４−１ＢＢ刺激シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含めることができる。
【００１９】
いくつかの実施形態では、操作されたＣＡＲ−Ｔ細胞は同種異系Ｔ細胞（例えば、同種異系の操作されたＣＡＲ−Ｔ細胞）である。他の実施形態では、操作されたＣＡＲ−Ｔ細胞は自己Ｔ細胞（例えば、自己の操作されたＣＡＲ−Ｔ細胞）である。そのような操作されたＣＡＲ−Ｔ細胞は、細胞の投与時に患者の移植片対宿主反応の低下を誘発すことができる。
【００２０】
いくつかの態様において、患者はＣＤ３陽性癌などの癌を患っている。他の実施形態では、患者はＣＤ１９陽性癌などの癌を患っている。
【００２１】
他の態様において、本明細書で提供されるのは、同種の操作されたＣＤ３／ＴＣＲαβ欠損キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）であって、ｉ）局在化ドメインに結合した標的結合分子を含むポリペプチドであって、標的結合分子はＣＤεに結合する抗体を含み、局在化ドメインは、小胞体（ＥＲ）保持配列、ゴルジ体保持配列、およびプロテオソーム局在化配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む保持シグナル伝達ドメインを含み、局在化ドメインに連結された標的結合分子は、操作された細胞によって分泌されないポリペプチドと、（ｉｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と、を含む、同種の操作されたＣＤ３／ＴＣＲαβ欠損キメラ抗原受容体Ｔ細胞を含む、薬学的組成物の治療的有効量を患者に投与することを含む、癌の治療を必要とする患者において癌を治療する方法である。
【００２２】
いくつかの実施形態では、抗体は、ＣＤ３εに結合する単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。ＣＤ３εに結合するｓｃＦｖは、配列番号１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する可変重鎖（ＶＨ）配列と、配列番号２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する可変軽鎖（ＶＬ）配列とを含む。いくつかの実施形態では、局在化ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ８β、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、またはＦＧＦＲ２Ｂに由来する膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＥＲ保持配列は、ＫＤＥＬ（配列番号３２）、ＫＫＭＰ（配列番号３３）、ＫＫＴＮ（配列番号４３）、またはＫＫＸＸ（前記Ｘは任意のアミノ酸である）（配列番号３５）から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、局在化ドメインは、配列番号１１〜３１の任意の１つから選択されるアミノ酸配列を含む。場合によっては、ＣＡＲはＣＤ３またはＣＤ１９を結合する。ＣＡＲは、抗ＣＤ３ｓｃＦｖドメイン、４−１ＢＢ刺激シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、または抗ＣＤ１９ｓｃＦｖドメイン、４−１ＢＢ刺激シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むことができる。
【００２３】
本明細書で提供されるのは、局在化ドメインに連結された標的結合分子を含むポリペプチドを含む操作されたＣＤ３／ＴＣＲαβ陰性Ｔ細胞であって、標的結合分子はＣＤ３／ＴＣＲαβ複合体タンパク質に結合する抗体を含み、局在化ドメインは小胞体（ＥＲ）保持配列、ゴルジ体保持配列、およびプロテオソーム局在化配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む保持シグナル伝達ドメインを含み、および局在化ドメインに連結された標的結合分子は操作された細胞によっては分泌されないものである。
【００２４】
また、本明細書で提供されるのは、局在化ドメインに連結された標的結合分子をコードするポリヌクレオチドであって、標的結合分子はＣＤ３／ＴＣＲαβ複合体タンパク質に結合する抗体を含み、局在化ドメインは小胞体（ＥＲ）保持配列、ゴルジ体保持配列、およびプロテオソーム局在化配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む保持シグナル伝達ドメインを含むものである。
【００２５】
本明細書で提供されるのは、操作されたＣＤ３／ＴＣＲαβ陰性キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）であって、（ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と、（ｉｉ）局在化ドメインに連結された標的結合分子とを含み、標的結合分子は、ＣＤ３／ＴＣＲαβ複合体タンパク質に結合する抗体を含み、局在化ドメインは、小胞体（ＥＲ）保持配列、ゴルジ体保持配列およびプロテオソーム局在化配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む保持シグナル伝達ドメインを含み、および局在化ドメインに連結された標的結合分子は、操作されたＣＡＲ−Ｔ細胞によって分泌されない、ものである。
【００２６】
本明細書で提供されるのは、本明細書に記載の操作された免疫細胞の任意の１つを含む薬学的組成物の治療有効量を癌患者に投与し、それにより癌の治療を必要とする対象における癌を治療することを含む、癌の治療を必要とする患者において癌を治療する方法である。
【００２７】
他の態様では、患者におけるＣＤ３またはＣＤ１９を発現する前悪性状態または癌を治療する方法であって、本明細書で提供される操作された免疫細胞の任意の１つを含む薬学的組成物の治療有効量を患者に投与することと、それにより癌の治療を必要とする対象における癌を治療することと、を含む、方法が本明細書で提供される。
【００２８】
別の態様において、血液癌細胞を、本明細書に記載の操作された免疫細胞の任意の１つと接触させることを含む、ＣＤ３またはＣＤ１９を発現する血液癌を弱める方法が本明細書に提供される。
【００２９】
いくつかの実施形態では、本発明は、哺乳動物、例えばヒト患者の標的細胞集団または組織に対してＴ細胞を刺激する方法であって、哺乳動物に、本明細書に記載された操作された免疫細胞の任意の１つを含む薬学的組成物の治療有効量を投与することを含む方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１Ａ〜図１Ｄ：抗ＣＤ３εＰＥＢＬは表面ＣＤ３発現をブロックする。（図１Ａ）フローサイトメトリーのドットプロットは、ＧＦＰのみで（「対照」）またはＳＥＫＤＥＬ（配列番号５０）で形質導入された細胞と比較した、抗ＣＤ３εＰＥＢＬによるジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）の表面ＣＤ３ダウンレギュレーションを示している。（図１Ｂ）示された構築物で形質導入されたジャーカットにおける表面ＣＤ３発現。バーは、ＫＥＤＬ、ＳＥＫＤＥＬ、およびＰＥＢＬ２，４，５，８，９，１１に対する２〜３回の実験の平均、または残りの個々の結果を示している。（図１Ｃ）ジャーカットにおけるＰＥＢＬで誘導された抗ＣＤ３εｓｃＦｖの細胞内または表面発現。バーは、ＰＥＢＬ２，４，８，９，１１に対する２〜３回の実験の平均、または残りの個々の結果を示す。（図１Ｄ）フローサイトメトリーのヒストグラムは、ＧＦＰのみで形質導入されたリンパ球のものと比較する、形質導入後８〜１３日間の抗ＣＤ３εＳＥＫＤＥＬまたはＰＥＢＬで形質導入された末梢血Ｔ細胞におけるＣＤ３発現を示している。
【図２】図２Ａ〜図２Ｄ：抗ＣＤ３εＰＥＢＬはＴＣＲαβをダウンレギュレートする。（図２Ａ）ＰＥＢＬ形質導入の５〜９日後のＧＦＰ陽性Ｔリンパ球におけるＴＣＲαβ発現。平均（±標準偏差￥［ＳＤ］）は、ＧＦＰのみで（「対照」、ｎ＝２５）、ＰＥＢＬ２（ｎ＝４）で、およびＰＥＢＬ５（ｎ＝１８）で形質導入された細胞について示されており、他のデータは、１回の実験の結果または２回の実験の平均を表す。（図２Ｂ）フローサイトメトリーのドットプロットは、ＧＦＰのみで形質導入された細胞と比較したＴリンパ球におけるＴＣＲαβのダウンレギュレーションを示している。（図２Ｃ）長期培養後にＰＥＢＬを形質導入したジャーカット細胞でのＣＤ３／ＴＣＲαβ発現；対照、ＧＦＰのみで形質導入された細胞。（図２Ｄ）Ｔリンパ球（２００ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２である）またはジャーカット細胞の長期培養におけるＣＤ３／ＴＣＲαβ発現の集合的結果。記号は、ＧＦＰ＋形質導入細胞における表面ＣＤ３／ＴＣＲαβの９０％以上の減少の持続性を示している。
【図３】図３Ａ〜図３Ｆ：ＰＥＢＬによるＣＤ３／ＴＣＲαβのダウンレギュレーションは細胞増殖に影響を与えないが、ＣＤ３／ＴＣＲαβシグナル伝達を抑制する。（図３Ａ）抗ＣＤ３ＰＥＢＬまたはＧＦＰのみ（「対照」）で形質導入されたジャーカットの増殖率。記号は、３回測定の平均（±ＳＤ）を示す。（図３Ｂ）ＩＬ−２（２００ＩＵ／ｍＬ）で培養した５人のドナー（７回の実験）からのＰＥＢＬ形質導入または対照Ｔリンパ球の生存。記号は、３回測定の平均を示す。（図３Ｃ）ＯＫＴ３または非反応性マウスＩｇＧ２ａを使用した２４時間後のジャーカットのＣＤ２５およびＣＤ６９平均蛍光強度（ＭＦＩ）。バーは、３回の測定の平均（±ＳＤ）を示す。（図３Ｄ）ＩＬ−２（２００ＩＵ／ｍＬ）をすべて含むが、ＯＫＴ３を含まない培養と比較する、ＯＫＴ３を含む培養から回収された生存可能なＰＥＢＬまたは対照Ｔリンパ球。記号は、３人のドナーからの細胞による９回の測定の平均（±ＳＤ）を表す。スチューデントのｔ検定によるＰ値が、有意差について示される（＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。（図３Ｅ）ＨＢＶｓ１８３に特異的なＴＣＲまたはネオマイシン耐性遺伝子のみを含むベクター（「ＮｅｏＲ」）で形質導入されたジャーカット細胞は、ネオマイシン選択後、抗ＣＤ３ＰＥＢＬでまたはｍＣｈｅｒｒｙのみ（「対照」）で形質導入された。ＣＤ３、ＴＣＲαβ、およびＴＣＲＶβ３鎖（ＨＢＶｓ１８３ＴＣＲの一部）の発現が示されており、ＴＣＲＶβ３の発現は、細胞表面で、および細胞透過処理後に細胞内で、試験された。（図３Ｆ）パネルＥに示す形質導入されたジャーカット細胞を、ＨＢＶｓ１８３ペプチドをロードしたＴ２細胞と２４時間共培養した。示されているのは、ＣＤ２５およびＣＤ６９ＭＦＩから、ペプチドを含まないがＴ２細胞での培養後に測定されたものを差し引いたものである。記号は、３回測定の平均を表す。
【図４】図４Ａ〜図４Ｄ：ＣＤ３／ＴＣＲαβ発現遮断を伴うＴ細胞におけるＣＡＲ発現およびシグナル伝達。（図４Ａ）フローサイトメトリーのドットプロットは、ＣＤ３のダウンレギュレーションと抗ＣＤ１９−４１ＢＢ−ＣＤ３ζＣＡＲの発現を示している。細胞にＣＡＲ構築物、続いて抗ＣＤ３εＰＥＢＬを導入し、またはＧＦＰのみ、続いてｍＣｈｅｒｒｙのみを形質導入した（「対照」）。（図４Ｂ）ＣＡＲｍＲＮＡエレクトロポレーションの２４時間後（ｎ＝５）、またはＣＡＲウイルス形質導入の５〜６日後（ｎ＝４）、抗ＣＤ１９−４１ＢＢ−ＣＤ３ζＣＡＲを発現するＰＥＢＬまたはＧＦＰのみ（「対照」）で形質導入されたＴリンパ球の割合、Ｐ＝０．２０７。（図４Ｃ）ＣＡＲ  ｍＲＮＡでまたはｍＲＮＡなしでのエレクトロポレーションをし、ＣＤ１９＋ＲＳ４；１１でＥ：Ｔ  １：２にて８時間培養したＰＥＢＬまたは対照Ｔ細胞によるＩＦＮγ産生バーは、３人のドナーの細胞での９回の測定の平均（±ＳＤ）を表す、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。（図４Ｄ）Ｔリンパ球に最初にＣＡＲを形質導入し、次にｍＣｈｅｒｒｙのみまたは抗ＣＤ３ＰＥＢＬのいずれかで形質導入した。次いで、細胞を照射ＣＤ１９＋ＯＰ−１とともに３週間培養した。結果をＧＦＰのみで形質導入した細胞と比較し、次にｍＣｈｅｒｒｙのみ（「対照」）で形質導入した細胞と比較した。記号は、３連の培養における投入細胞の数に対する平均（±ＳＤ）細胞回収率を示している。
【図５】図５Ａ〜図５Ｄ：ＣＡＲ＋ＰＥＢＬＴリンパ球の細胞傷害性。（図５Ａ）抗ＣＤ１９−４１ＢＢ−ＣＤ３ζＣＡＲｍＲＮＡまたはｍＲＮＡなしのいずれかでエレクトロポレーションした、３人のドナーからのＴ細胞のＰＥＢＬまたは対照（ｍＣｈｅｒｒｙ形質導入）の、２：１  Ｅ：ＴでのＣＤ１９＋ＡＬＬ細胞株に対して４時間細胞傷害性アッセイ（補足図４も参照）。記号は、各ドナーについて３回の測定の平均を示す。（図５Ｂ）ｍＣｈｅｒｒｙのみまたは抗ＣＤ３ＰＥＢＬのいずれかを含有するレトロウイルスベクターで逐次的に形質導入された２人のドナーからのＣＡＲ形質導入Ｔリンパ球の細胞傷害性をＣＤ１９＋細胞株に対して試験した。対照、ＧＦＰのみで形質導入された細胞、続いてｍＣｈｅｒｒｙのみで形質導入された細胞。示されているのは、１：１  Ｅ：ＴでのＣＤ１９＋ＡＬＬ細胞株に対する４時間アッセイのデータである（図１２Ａおよび図１２Ｂのデータ一式）。各記号は、各ドナーに対して３回の実験の平均を示している。（図５Ｃ〜図５Ｄ）パネルＢのように形質導入されたＴリンパ球を、ｍＣｈｅｒｒｙで形質導入されたＮａｌｍ６に対する長期細胞傷害性について試験した。白血病細胞の増殖は、ＩｎｃｕＣｙｔｅ  Ｚｏｏｍ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｅｓｓｅｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）で測定された。８０時間、Ｅ：Ｔ１：８での３連の培養のホールウェルイメージングを図５Ｃに示す。図５Ｄに示されたＥ：Ｔ比での白血病細胞増殖測定。＊＊＊Ｐ＜．００１、＊＊＊＊Ｐ＜．０００１。
【図６】図６Ａ〜図６Ｅ：ＰＥＢＬによるＣＤ３／ＴＣＲαβノックダウンはＧＶＨＤを防ぐ。（図６Ａ）ＮＳＧマウスに２．５Ｇｙを照射し、１日後に抗ＣＤ３ＰＥＢＬまたはＧＦＰのみ（「対照」、群あたりｎ＝８）で形質導入した１×１０７Ｔリンパ球を静脈内注射した。体重は、照射後３日目の体重に対する変化として表される。（図６Ｂ）ヘモグロビンレベルおよび（Ｃ）末梢血の血小板数。（図６Ｄ）カプラン・マイヤーの全生存曲線とログランク検定。２回の連続測定で体重減少が２０％を超えたときにマウスを安楽死させた（図１４の追加データ）。（図６Ｅ）Ｔ細胞注射の１８日後の血液中のヒトＣＤ４５＋細胞数。＊Ｐ＝０．０１４８、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図７】図７Ａ〜図７Ｆ：ＰＥＢＬおよびＣＡＲ発現によるＣＤ３／ＴＣＲαβノックダウンを持つＴ細胞は、マウスの白血病細胞を死滅させる。（図７Ａ）ＮＳＧマウスに５×１０５個のＮａｌｍ６−ルシフェラーゼ細胞を静脈内注射した。３日後、マウスに抗ＣＤ１９−４１ＢＢ−ＣＤ３ζＣＡＲに加えてＰＥＢＬまたはｍＣｈｅｒｒｙのみのいずれかを形質導入した２×１０７個のＴリンパ球を投与した。他のマウスには代わりに組織培養培地を投与した（「Ｔ細胞なし」）。Ｎａｌｍ６の生着を説明するために、３日目の生物発光画像が感度を高めて表示されている。（図７Ｂ）記号は、腹部および背部のイメージングにおける平均生物発光シグナルに対応する。（図７Ｃ）全生存率のカプラン・マイヤー曲線とログランク検定。腹部および背部の生物発光の平均シグナルが１秒あたり１ｘ０１０光子に達したときにマウスを安楽死させた。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。（図７Ｄ）ＮＳＧマウスに、パネルＡに記載されているように、３日目に５ｘ０５Ｎａｌｍ６−ルシフェラーゼ細胞と２×１０７Ｔリンパ球を静脈内注射した。Ｔリンパ球注射の前に、マウスは２．５Ｇｙの全身照射を受けた。Ｎａｌｍ６の生着を説明するために、３日目の生物発光画像が感度を高めて表示されている。（図７Ｅ）シンボルは、腹側および背側のイメージングによる生物発光の平均に対応している。（図７Ｆ）カプラン・マイヤー曲線と全生存率のログランク検定。マウスは、腹部および背部の生物発光の平均シグナルが１秒あたり１×１０１０光子に達したとき、またはＧＶＨＤの兆候（２回の連続測定で２０％を超える体重減少、可動性の低下および／または毛皮の損失）が明らかとなったときに安楽死させた。ＧＶＨＤは、ＣＡＲ＋ｍＣｈｅｒｒｙマウス５匹中３匹、ＣＡＲ＋ＰＥＢＬマウス６匹中０匹で発生した。再発（「相対」）率は、それぞれ５匹中０匹対６匹中２匹であった。＊＊Ｐ＝０．００１４、＊＊＊Ｐ＝０．０００６。
【図８Ａ】本明細書に記載のタンパク質発現ブロッカー（ＰＥＢＬ）構築物。
【図８Ｂ】ＰＥＢＬまたはＧＦＰのみ（「対照」）で形質導入されたＴリンパ球の免疫表現型。４人のドナーからの形質導入リンパ球における３〜５回の測定の平均値（±ＳＤ）が示されている。細胞マーカーは、形質導入の６〜８日後に分析された。モックのＧＦＰ＋細胞およびＰＥＢＬのＣＤ３陰性細胞をゲーティングした後、パーセンテージを計算した。すべての比較に対しＰ＞０．０５。抗体はＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＣＤ４  ＰＥ−Ｃｙ７、ＣＤ８  ＰＥ、ＣＤ７  ＰＥ、ＣＤ２５  ＰＥ−Ｃｙ７、ＣＤ６２Ｌ  ＡＰＣ、ＣＤ６９  ＰＥ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（ＣＤ２  ＡＰＣ、ＣＤ１３７  ＡＰＣ、ＣＤ２７９  ＰＥ、ＣＤ３６６  ＰＥ）、およびＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＣＤ２２３  ＡＰＣ）から得た。
【図８Ｃ】抗ＣＤ３ＰＥＢＬまたはＧＦＰのみ（「対照」）を形質導入したＴ細胞を注射した免疫不全マウスの病理学的特徴。
【図９】ＰＥＢＬのｓｃＦｖの導き出しに使用した抗ＣＤ３抗体の特異性。Ｋ５６２細胞に、各ＣＤ３サブユニットのｃＤＮＡ（δ、ε、γ、ζ）、２つのサブユニットの組み合わせ、またはＧＦＰのみを含むベクター（「対照」）を形質導入した。形質導入された細胞を透過処理し、ＰＬＵ４ハイブリドーマ細胞から分泌された上清とともにインキュベートした後、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７コンジュゲート（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ、アラバマ州、バーミンガム）で染色した。分析は、Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して行った。
【図１０】図１０Ａ〜図１０Ｃ：抗ＣＤ３εＰＥＢＬの細胞内局在。（図１０Ａ）フローサイトメトリーのヒストグラムは、抗ＣＤ３ＰＥＢＬ５またはＧＦＰのみ（「モック」）で形質導入されたジャーカット細胞におけるＣＤ３の表面および細胞内発現を示している。（図１０Ｂ）抗ＣＤ３ＰＥＢＬ５形質導入ジャーカット細胞の共焦点顕微鏡イメージング。細胞透過処理後、ＰＥＢＬｓｃＦｖはビオチンコンジュゲートヤギ抗マウスＦ（ａｂ´）２抗体、続いてストレプトアビジンＰＥで検出され、ＣＤ３は抗ＣＤ３ＡＰＣで検出された。（図１０Ｃ）ＰＥＢＬは形質導入細胞から分泌されない。ＰＥＢＬは、細胞内の細胞内区画に局在化できる。たとえば、ＰＥＢＬはＥＲまたはゴルジ体に保持できる。抗ＣＤ３ＰＥＢＬ、抗ＣＤ３ｓｃＦｖのみ、またはＧＦＰのみ（「モック」）を４８時間かけて形質導入したジャーカット細胞の上清を、ＣＤ３＋Ｌｏｕｃｙ細胞とともに４℃で４５分間インキュベートした。Ｌｏｕｃｙの表面に結合した分泌ｓｃＦｖは、ビオチンコンジュゲートヤギ抗マウスＦ（ａｂ´）２抗体とそれに続くストレプトアビジンＡＰＣで可視化された。
【図１１】長期培養後のＴリンパ球におけるＣＤ３／ＴＣＲαβのダウンレギュレーション。フローサイトメトリーのドットプロットは、２００ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２で５５日間培養した後、ＰＥＢＬ５とＧＦＰ、またはＧＦＰのみ（「対照」）で形質導入されたＴリンパ球におけるＣＤ３およびＴＣＲαβの発現を示している。残留ＣＤ３＋細胞の枯渇の前後の結果が示される。
【図１２】図１２Ａ〜図１２Ｂ：ＰＥＢＬ−ＣＡＲ  Ｔリンパ球の細胞傷害性。図１１Ａ：抗ＣＤ１９−４１ＢＢ−ＣＤ３ζＣＡＲｍＲＮＡまたはｍＲＮＡなしでエレクトロポレーションしたＰＥＢＬまたはモック形質導入Ｔ細胞の細胞傷害性。示されているのは、ＣＤ１９＋ＡＬＬ細胞株に対する４時間アッセイのデータである。各記号は、示されたＥ：Ｔ比での３回の実験の平均（±ＳＤ）を示している。図１１Ｂ：ｍＣｈｅｒｒｙのみまたは抗ＣＤ３ＰＥＢＬのいずれかで連続的に形質導入されたＣＡＲでまたはＧＦＰのみで形質導入されたＴリンパ球の細胞傷害性をＣＤ１９＋細胞株に対して試験した。示されているのは、ＣＤ１９＋ＡＬＬ細胞株に対する４時間アッセイのデータである。各記号は、示されたＥ：Ｔ比での３回の実験の平均（±ＳＤ）を示している。各パネルは、１人のドナーからの細胞を使用した実験に対応している。
【図１３】図１３Ａ〜図１３Ｃ：ＣＡＲおよびＰＥＢＬ構築物を送達するバイシストロン性ベクターの開発。（図１３Ａ）バイシストロン性構築物の概略図。ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰの例示的な２Ａ配列（配列番号４２）は、図１３Ａに提供されている。（図１３Ｂ）フローサイトメトリーのドットプロットは、末梢血Ｔリンパ球におけるＣＤ３ダウンレギュレーションおよび抗ＣＤ１９−４１ＢＢ−ＣＤ３ζＣＡＲ発現を示している。細胞に、ＧＦＰのみ（「対照」）またはバイシストロン性構築物（ＣＡＲ−２Ａ−ＰＥＢＬ）を形質導入した。後者については、残留ＣＤ３＋細胞の枯渇前後の結果が示されている。（図１３Ｃ）対照Ｔリンパ球の細胞傷害性と比較した、ＣＡＲまたはＣＡＲ−２Ａ−ＰＥＢＬのいずれかで形質導入されたＴリンパ球の細胞傷害性。ＣＤ１９＋ＡＬＬ細胞株ＯＰ−１、Ｎａｌｍ６およびＲＳ４；１１に対する４時間アッセイのデータが示されている。各記号は、示されているＥ：Ｔ比での３回の実験の平均（±ＳＤ）を示している。
【図１４】図１４Ａ〜図１４Ｃ：ＣＤ３／ＴＣＲαβ発現のＰＥＢＬダウンレギュレーションなしでヒトＴリンパ球を投与されたマウスにおけるＧｖＨＤの兆候。ＮＯＤ−ＳＣＩＤ−ＩＬ２ＲＧｎｕｌｌマウスに２．５Ｇｙを照射し、１日後に抗ＣＤ３ＰＥＢＬまたはＧＦＰのみ（「Ｍｏｃｋ」；各グループでｎ＝８）のいずれかで形質導入した１×１０７Ｔリンパ球を静脈内注射した。すべてのマウスにＩＬ−２（２００００ＩＵ）を週に３回腹腔内投与した。（図１４Ａ）ヘモグロビンレベルおよび（図１４Ｂ）頬穿刺により採取された血液中の血小板数。（図１４Ｃ）ヘマトキシリン−エオシン染色、およびモック群のマウスの１匹からの組織の抗ヒトＣＤ４およびＣＤ８抗体による免疫組織化学。脾臓および骨髄の造血細胞の減少とともに、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋リンパ球の浸潤ならびに線維症がすべての組織で見られた。
【図１５】抗ＣＤ３εＰＥＢＬを発現する非アロ反応性Ｔ細胞と、抗ＣＤ３εＰＥＢＬを発現する非アロ反応性ＣＡＲ−Ｔ細胞およびバイシストロン性構築物由来のＣＡＲの模式図。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明の例示的な実施形態の説明は以下の通りである。
【００３２】
１．タンパク質発現ブロッカー（ＰＥＢＬ）を発現する操作された細胞
本明細書に記載の方法は、免疫細胞におけるＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ３（例えばＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、およびＣＤ３ζ）などの特定の標的ＴＣＲ複合体タンパク質の迅速な除去または不活性化を可能にする。この方法は、一部は、除去または中和される標的（例えば、タンパク質）に結合する標的結合分子を含むポリペプチド構築物に依存している。標的結合分子は、用途に応じて、ゴルジ体、小胞体（ＥＲ）、プロテアソーム、または細胞膜などの特定の細胞区画にポリペプチドを導くドメイン（たとえば、局在化ドメイン）に連結されている。簡単にするために、局在化ドメインに連結された標的結合分子は、本明細書では「タンパク質発現ブロッカー」または「ＰＥＢＬ」と呼ぶことができる。
【００３３】
活性化された免疫細胞によるサイトカインの分泌は、サイトカイン放出症候群およびマクロファージ活性化症候群を引き起こし、免疫細胞療法の深刻な悪影響をもたらすことが示されている（Ｌｅｅ  ＤＷ，ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ．２０１４；１２４（２）：１８８−１９５）。したがって、本明細書で概説したＰＥＢＬを使用して、ＩＬ−６、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２７、ＩＬ−３５、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−α、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、およびそのような炎症カスケードに寄与する可能性のある形質転換成長因子（ＴＧＦ）−βなどのサイトカインをブロックすることができる。したがって、標的結合分子は、ＩＬ−６、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２７、ＩＬ−３５、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−α、ＴＮＦ−α、またはＴＧＦ−βに特異的に結合する分子であり得る。いくつかの実施形態では、標的結合分子は、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、およびＣＤ３ζなどのＴＣＲ複合体タンパク質に特異的に結合する分子である。
【００３４】
Ｔ細胞上で発現されるリガンド（例えば、ペプチドまたは抗原）への結合時に免疫応答を活性化または不活性化することができるそのような適切な結合分子はすべて、「標的結合分子」と総称される。当業者であれば、標的結合分子は、抗体または抗原結合フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ）のみを含む必要はなく、むしろ、標的分子に結合する標的結合分子の部分は、例えば、受容体−リガンド対の受容体、または受容体−リガンド対のリガンドに由来し得る。
【００３５】
いくつかの実施形態では、局在化ドメインは保持シグナル伝達ドメインを含む。特定の実施形態では、局在化ドメインは、保持シグナル伝達ドメインおよび膜貫通ドメインを含む。場合によっては、保持シグナル伝達ドメインは、小胞体（ＥＲ）保持配列、ゴルジ体保持配列、またはプロテアソーム局在化配列を含む。保持シグナル伝達ドメインには、タンパク質が細胞によって分泌されるのを防ぐまたは妨げるアミノ酸配列を含めることができる。保持シグナル伝達ドメインは、細胞内区画にタンパク質を保持するアミノ酸配列を含むことができる。いくつかの場合、保持シグナル伝達ドメインは、ＥＲまたはゴルジ体の膜などの細胞膜内にタンパク質のアンカーを保持するアミノ酸配列を含むことができる。例えば、保持シグナル伝達ドメインは、ＫＤＥＬ配列（配列番号３２）、ＫＫＤまたはＫＫＥ配列ＫＫＭＰ配列（配列番号３３）、ＹＱＲＬ配列（配列番号３４）、またはＫＫＸＸ配列（前記Ｘは任意のアミノ酸配列である）（配列番号３５）を含むことができる。
【００３６】
いくつかの実施形態では、タンパク質発現ブロッキング（ＰＥＢＬ）ポリペプチドは細胞によって分泌されない。いくつかの実施形態では、ＰＥＢＬポリペプチドは細胞の細胞表面に発現されない。いくつかの実施形態では、ＰＥＢＬポリペプチドは、Ｔ細胞の細胞表面に発現されるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）として機能しない。
【００３７】
膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ８β、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、またはＦＧＦＲ２Ｂに由来する膜貫通ドメインを含むことができる。特定の実施形態では、局在化ドメインの膜貫通ドメインはＣＤ８αに由来する。膜貫通ドメインは保持シグナル伝達ドメインに連結することができる。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、リンカーを介して保持シグナル伝達ドメインに連結されている。
【００３８】
リンカーの非限定的な例には、（ＧＳ）ｎ、（ＧＧＳ）ｎ、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）ｎ、（Ｇｌｙ２ＳｅｒＧｌｙ）ｎ、（Ｇｌｙ２ＳｅｒＧｌｙ２）ｎ、または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎが含まれ、前記ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。いくつかの実施形態では、リンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４である。リンカーの長さの変動は、活性を保持するかまたは強化でき、活性研究において優れた有効性を生じる。
【００３９】
いくつかの実施形態では、本発明の局在化ドメインは、表１および図８Ａに提供されるアミノ酸配列を含む。場合によっては、局在化ドメインは配列番号１１のアミノ酸配列を含む。場合によっては、局在化ドメインは配列番号１２のアミノ酸配列を含む。場合によっては、局在化ドメインは配列番号１３のアミノ酸配列を含む。場合によっては、局在化ドメインは配列番号１４のアミノ酸配列を含む。場合によっては、局在化ドメインは配列番号１５のアミノ酸配列を含む。場合によっては、局在化ドメインは配列番号１６のアミノ酸配列を含む。場合によっては、局在化ドメインは配列番号１７のアミノ酸配列を含む。場合によっては、局在化ドメインは配列番号１８のアミノ酸配列を含む。場合によっては、局在化ドメインは配列番号１９のアミノ酸配列を含む。場合によっては、局在化ドメインは配列番号２０のアミノ酸配列を含む。場合によっては、局在化ドメインは配列番号２１のアミノ酸配列を含む。場合によっては、局在化ドメインは配列番号２２のアミノ酸配列を含む。場合によっては、局在化ドメインは配列番号２３のアミノ酸配列を含む。場合によっては、局在化ドメインは配列番号２４のアミノ酸配列を含む。場合によっては、局在化ドメインは配列番号２５のアミノ酸配列を含む。場合によっては、局在化ドメインは配列番号２６のアミノ酸配列を含む。場合によっては、局在化ドメインは配列番号２７のアミノ酸配列を含む。場合によっては、局在化ドメインは配列番号２８のアミノ酸配列を含む。場合によっては、局在化ドメインは配列番号２９のアミノ酸配列を含む。場合によっては、局在化ドメインは配列番号３０のアミノ酸配列を含む。場合によっては、局在化ドメインは配列番号３１のアミノ酸配列を含む。
【００４０】
したがって、ＰＥＢＬのＣ末端領域に位置する局在化ドメインは、Ｎ末端領域にある。いくつかの実施形態では、Ｎ末端からＣ末端までのＰＥＢＬは、標的結合ドメイン、リンカー、および局在化ドメインを含む。他の実施形態では、Ｎ末端からＣ末端までのＰＥＢＬは、シグナルペプチド、標的結合ドメイン、リンカー、および局在化ドメインを含む。特定の実施形態では、Ｎ末端からＣ末端までのＰＥＢＬは、シグナルペプチド、標的結合ドメイン、および局在化ドメインを含む。他の実施形態において、Ｎ末端からＣ末端までのＰＥＢＬは、標的結合ドメインおよび局在化ドメインを含む。
【００４１】
本発明の操作された細胞は、機能的Ｔ細胞受容体を産生しない。いくつかの実施形態では、ＣＤ３／ＴＣＲαβ複合体構成要素またはサブユニットの１つ以上は細胞表面に発現されない。言い換えれば、そのような細胞はＣＤ３／ＴＣＲαβ陰性またはＣＤ３／ＴＣＲαβ欠損である。
【００４２】
２．タンパク質発現ブロッカー（ＰＥＢＬ）およびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する操作された細胞
したがって、一実施形態では、本発明は、キメラ抗原受容体（例えば、ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、および局在化ドメイン（例えば、ＰＥＢＬ）に連結された標的結合分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、を含む、操作された免疫細胞（例えば、操作されたＴ細胞）に関する。
【００４３】
本明細書で使用される「操作された」免疫細胞は、天然に存在する免疫細胞と比較して遺伝的に改変された免疫細胞を含む。例えば、本方法に従って産生された操作されたＴ細胞は、それが由来するＴ細胞に天然には存在しないヌクレオチド配列を含む核酸を保有する。いくつかの実施形態では、本発明の操作された免疫細胞は、ＰＥＢＬおよびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。例示的なＣＡＲの非限定的な例には、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１２３、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＧＤ２、メソセリン、ＥＧＶＲｖＩＩＩ、ＨＥＲ２、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＤ−Ｌ１、その他の腫瘍関連抗原に結合するＣＡＲが含まれる。
【００４４】
例示的な腫瘍関連抗原には、メソセリン、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＴＳＨＲ、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ−１、ＣＬＬ−１、ＣＤ３３、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、Ｔｎ  Ａｇ、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ−１３Ｒａ２、インターロイキン−１１受容体ａ（ＩＬ−１１Ｒａ）、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ＬｅｗｉｓＹ、ＣＤ２４、血小板由来増殖因子受容体−ベータ（ＰＤＧＦＲ−ベータ）、ＳＳＥＡ−４、ＣＤ２０、葉酸受容体アルファ（ＦＲａ）、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＭＵＣｌ、表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＮＣＡＭ、Ｐｒｏｓｔａｓｅ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、ＩＧＦ−Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐｌＯＯ、ｂｃｒ−ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ−アセチル−ＧＤ２、葉酸受容体ベータ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−ｌａ、ＭＡＧＥ−Ａ１、レグマイン、ＨＰＶ  Ｅ６、Ｅ７、ＭＡＧＥ  Ａｌ、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ  ２、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＭＡＤ−ＣＴ−２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロスタイン（ｐｒｏｓｔｅｉｎ）、サバイビンおよびテロメラーゼ、ＰＣＴＡ−１／ガレクチン８、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点、ＭＬ−ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ  ｌ、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ−２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ−１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸管カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５、およびＩＧＬＬ１が含まれるが、これらに限定されない
【００４５】
いくつかの実施形態では、本発明の操作された免疫細胞は、局在化ドメインに連結された抗ＣＤ３  ｓｃＦｖおよびＣＤ１９に結合するＣＡＲを含む。特定の実施形態では、本発明の操作された免疫細胞は、局在化ドメインおよび抗ＣＤ１９−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζＣＡＲに連結された抗ＣＤ３  ｓｃＦｖを含む。
【００４６】
他の実施形態では、本発明の操作された免疫細胞は、局在化ドメインに連結された抗ＣＤ３ｓｃＦｖおよびＣＤ３に結合するＣＡＲを含む。特定の実施形態では、本発明の操作された免疫細胞は、局在化ドメインおよび抗ＣＤ３−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζＣＡＲに連結された抗ＣＤ３ｓｃＦｖを含む。
【００４７】
特定の実施形態では、操作された免疫細胞は、操作されたＴ細胞である。場合によっては、Ｔ細胞は細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、エフェクターＴ細胞、記憶Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、ガンマデルタＴ細胞などである。
【００４８】
本明細書で概説するＰＥＢＬは、標的タンパク質の細胞膜への輸送を妨げる。例えば、本明細書に記載のＣＤ３／ＴＣＲ複合体のタンパク質を対象とするＰＥＢＬは、ＥＲに保持されている。ＣＤ３εを対象とするＰＥＢＬは、内因性ＣＤ３と細胞内で共局在（ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚｅ）できる。したがって、細胞表面での内因性ＣＤ３発現は抑制される。いくつかの実施形態では、そのようなＰＥＢＬはＣＤ３を抑制する。他の実施形態では、ＰＥＢＬはＴＣＲαβ発現を抑制する。ＣＤ３を対象とするＰＥＢＬは、ＣＤ３／ＴＣＲαβ発現を抑制することができる。場合によっては、ＰＥＢＬは、操作された免疫細胞に免疫表現型の変化を引き起こさない。また、ＰＥＢＬは操作された免疫細胞の増殖に影響を与えない。いくつかの実施形態では、ＰＥＢＬは、抗ＣＤ１９−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζＣＡＲなどのＣＡＲと同時発現される。
【００４９】
特定の態様では、ＣＡＲは、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ４５、ＣＤ５２、ＣＤ３８、ＣＳ−１、ＴＩＭ３、ＣＤ１２３、メソセリン、葉酸受容体、ＨＥＲ２−ｎｅｕ、上皮増殖因子受容体、および上皮増殖因子受容体を含むがこれらに限定されない、腫瘍細胞の表面に発現する分子に結合する。いくつかの実施形態では、免疫活性化受容体はＣＡＲ（例えば、抗ＣＤ１９−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ  ＣＡＲ）である。特定の実施形態では、免疫活性化受容体は、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ４５、ＣＤ５２、ＣＤ３８、ＣＳ−１、ＴＩＭ３、ＣＤ１２３、メソセリン、葉酸受容体、ＨＥＲ２−ｎｅｕ、表皮増殖因子受容体、および表皮増殖因子受容体を含むがこれらに限定されない、腫瘍細胞の表面上に発現する分子に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント（例えばｓｃＦｖ）を含む。
【００５０】
本発明によるキメラ抗原受容体（例えば、ＣＡＲ）の膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ８ｐ、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃｓＲＩγ、ＣＤ１６（例えば、ＣＤ１６ＡまたはＣＤ１６Ｂ）ＯＸ４０、ＣＤ３ζ、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、ＣＤ３５、ＴＣＲα、ＣＤ３２（例えば、ＣＤ３２ＡまたはＣＤ３２Ｂ）、ＣＤ６４（例えば、ＣＤ６４Ａ、ＣＤ６４Ｂ、またはＣＤ６４Ｃ）、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、およびＦＧＦＲ２Ｂを含むがこれらに限定されないシングルパス膜タンパク質に由来し得る。いくつかの例では、膜タンパク質はＣＤ８αではない。膜貫通ドメインは、天然に存在しない疎水性タンパク質セグメントであってもよい。
【００５１】
キメラ抗原受容体（例えば、ＣＡＲ）のヒンジドメインは、ＣＤ８αまたはＩｇＧなどのタンパク質に由来し得る。ヒンジドメインは、ＣＤ８αの膜貫通またはヒンジドメインのフラグメント、または様々な長さの親水性残基からなるポリペプチドなどの非天然ペプチド、または（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３６）ポリペプチド（前記ｎは、例えば２〜１２の整数である）であってよい。
【００５２】
キメラ抗原受容体（例えば、ＣＡＲ）のシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ、ＦｃεＲＩγ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、または免疫細胞に活性化シグナルを送達することが知られている他の分子に由来し得る。受容体の少なくとも１つの同時刺激シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７としても知られる）、ＣＤ２８変異体、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−３、ＬＦＡ−１、またはＣＤ２などの同時刺激分子であり得る。そのような分子は容易に入手可能であり、当技術分野で知られている。
【００５３】
当業者によって理解されるように、免疫活性化受容体の構成要素は、本明細書に記載されるような多くの機能的組み合わせを含むように操作して、所望の結果を生み出すことができる。特定の抗ＣＤ１９−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζＣＡＲを例として使用すると、分子を結合する抗体（またはｓｃＦｖなどのその抗原結合フラグメント）は、本明細書に記載されているように、異なる分子を結合する抗体と置き換えることができる（例えば、抗ＣＤ１９の代わりに、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ３３、抗ＣＤ１２３など）。他の実施形態では、同時刺激分子（この特定の例では４−１ＢＢ）は、異なる同時刺激分子、例えばＣＤ２８で変化させることもできる。いくつかの実施形態では、刺激分子（この特定の例ではＣＤ３）は、別の既知の刺激分子で置き換えることができる。様々な実施形態では、受容体の膜貫通ドメインはまた、必要に応じて変化させることができる。そのような免疫活性化受容体の機能性に関する設計、産生、および試験は、当業者によって容易に決定され得る。同様に、このような免疫活性化受容体をコードする核酸の設計、細胞への送達、および発現は、容易に知られており、当技術分野で利用可能である。
【００５４】
本明細書で使用される場合、用語「核酸」は、複数のヌクレオチドモノマー（例えば、リボヌクレオチドモノマーまたはデオキシリボヌクレオチドモノマー）を含むポリマーを指す。「核酸」には、例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド分子が含まれる。核酸分子は、天然に存在する、組換え、または合成のものであり得る。さらに、核酸分子は、一本鎖、二本鎖または三本鎖であり得る。いくつかの実施形態では、核酸分子を修飾することができる。二本鎖ポリマーの場合、「核酸」は分子の片方または両方の鎖を指す。
【００５５】
核酸に関する「ヌクレオチド配列」という用語は、リン結合（例えば、ホスホジエステル、アルキルおよびアリールホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル結合）および／または非リン結合（例えば、ペプチドおよび／またはスルファメート結合）などの共有結合により接合された連続した一連のヌクレオチドを指す。特定の実施形態では、例えば、局在化ドメインに連結された標的結合分子をコードするヌクレオチド配列は、異種配列（例えば、異なる種または細胞型起源の遺伝子）である。
【００５６】
用語「ヌクレオチド」および「ヌクレオチドモノマー」は、天然に存在するリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドモノマー、ならびにその天然に存在しない誘導体および類似体を指す。したがって、ヌクレオチドには、例えば、天然に存在する塩基（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、イノシン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、またはデオキシシチジン）を含むヌクレオチド、および当技術分野で既知の修飾塩基を含むヌクレオチドが含まれ得る。
【００５７】
当業者によって理解されるように、いくつかの態様では、核酸はプラスミド配列をさらに含む。プラスミド配列は、例えば、プロモーター配列、選択マーカー配列、および遺伝子座標的配列からなる群から選択される１つ以上の配列を含むことができる。
【００５８】
本明細書で使用される場合、局在化ドメインに連結された標的結合分子をコードする遺伝子は、「ＰＥＢＬをコードする遺伝子」と呼ばれることがある。
【００５９】
特定の実施形態では、標的結合分子は抗体またはその抗原結合フラグメントである。本明細書で使用する「抗体」とは、無傷の抗体または抗体の抗原結合フラグメントを意味し、無傷の抗体または修飾されたまたは操作された、またはヒト抗体である抗原結合フラグメントを含む。修飾されたまたは操作された抗体の例は、キメラ抗体、ヒト化抗体、マルチパラトピック抗体（たとえば、バイパラトピック抗体（ｂｉｐａｒａｔｏｐｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ））、および多特異性抗体（たとえば、二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ））である。抗原結合フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ´）２、Ｆｖ、単鎖抗体（例えばｓｃＦｖ）、ミニ抗体（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）および二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）が含まれる。
【００６０】
「Ｆａｂフラグメント」は、１つの軽鎖と１つの重鎖のＣＨ１および可変領域を含む。Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成できない。
【００６１】
「Ｆｃ」領域は、抗体のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む２つの重鎖フラグメントを含む。２つの重鎖フラグメントは、２つ以上のジスルフィド結合と、ＣＨ３ドメインの疎水性相互作用によって結合している。
【００６２】
「Ｆａｂ´フラグメント」には、１つの軽鎖と、ＶＨドメインとＣＨＩドメイン、およびＣＨＩドメインとＣＨ２ドメイン間の領域を含む１つの重鎖の一部が含まれ、２つのＦａｂ´フラグメントの２つの重鎖間で鎖間ジスルフィド結合が形成されＦ（ａｂ´）２分子を形成する。
【００６３】
「Ｆ（ａｂ´）２フラグメント」は、２つの軽鎖とＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメイン間の定常領域の一部を含む２つの重鎖を含み、２つの重鎖間に鎖間ジスルフィド結合が形成される。したがって、Ｆ（ａｂ´）２フラグメントは、２つの重鎖間のジスルフィド結合によって結合された２つのＦａｂ´フラグメントで構成されている。
【００６４】
「Ｆｖ領域」は、重鎖と軽鎖の両方からの可変領域を含むが、定常領域を欠いている。
【００６５】
特定の実施形態では、標的結合分子は単鎖Ｆｖ抗体（「ｓｃＦｖ抗体」）である。ｓｃＦｖは、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含む抗体フラグメントを指し、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。一般に、Ｆｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合に望ましい構造を形成できるようにするＶＨドメインとＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓｃＦｖの総説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９９４）Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  ｖｏｌ．  １１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５を参照されたい。ＰＣＴ公開第ＷＯ８８／０１６４９および米国特許第４，９４６，７７８号および第５，２６０，２０３号も参照されたい。例として、本明細書に開示されるｓｃＦｖのＶＨドメインとＶＬドメインとの間のリンカーは、例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３７）またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３８）を含む。当業者によって理解されるように、様々な適切なリンカーは、当該技術分野において提供され、本明細書に開示されるように、最適な機能のために設計および試験され得る。
【００６６】
ＰＥＢＬ分子の一部であるｓｃＦｖは、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または同様の抗体結合シグナル伝達受容体との関連で生じるｓｃＦｖと必ずしも同じではない。いくつかの実施形態では、ＰＥＢＬ分子の一部であるｓｃＦｖは、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または同様の抗体結合シグナル伝達受容体との関連で生じるｓｃＦｖと同じである。
【００６７】
いくつかの実施形態では、標的結合分子（例えば、ＰＥＢＬ分子と関連するｓｃＦｖ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、配列番号１および２のいずれか１つ以上と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する１つ以上のアミノ酸配列を含む。
【００６８】
「配列同一性」という用語は、デフォルトのギャップ重みを使用するプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適に整列させた場合、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列が、少なくとも、例えば７０％の配列同一性、または少なくとも８０％の配列同一性、または少なくとも８５％の配列同一性、または少なくとも９０％の配列同一性、または少なくとも９５％以上の配列同一性を共有する意味する。配列比較では、通常、１つの配列が参照配列（親配列など）として機能し、試験配列と比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験および参照配列がコンピューターに入力され、必要に応じてサブ配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。次に、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。
【００６９】
比較のための配列の最適なアライメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同アライメントアルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ´ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４（１９８８）の類似法の検索により、これらのアルゴリズムのコンピューター化された実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＰａｃｋａｇｅのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、ウィスコンシン州マディソン）により、または目視検査により（一般的にＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｈ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙを参照）。パーセント配列同一性および配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの一例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、これはＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０）に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎから公開されている（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ＮＣＢＩインターネットサーバーから公開されている）。通常、デフォルトのプログラムパラメータを使用して配列比較を実行できるが、カスタマイズされたパラメータも使用できる。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとしてワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５（１９８９）を参照）。
【００７０】
特定の実施形態において、抗体（例えば、ｓｃＦｖ）は、それぞれ配列番号１および配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＶＨおよびＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗体（例えばｓｃＦｖ）は、それぞれ配列番号１および配列番号２に示されるＶＨおよびＶＬ配列に対して、それぞれ少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を有する配列を有するＶＨおよびＶＬを含む。
【００７１】
「二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）」は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体フラグメントである。フラグメントは、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨ）中に軽鎖可変領域（ＶＬ）に接続された重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。同じ鎖上の２つのドメインをペアリングするには短すぎるリンカーを使用すると、ドメインは別のチェーンの相補ドメインとペアリングさせられ、２つの抗原結合部位が作成される。二重特異性抗体は、例えば、特許文献ＥＰ４０４，０９７、ＷＯ９３／１１１６１、およびＨｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６４４４−６４４８に記載されている。
【００７２】
特定の実施形態では、抗体は三重特異性抗体（ｔｒｉａｂｏｄｙ）または四重特異性抗体（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）である。三重特異性抗体および四重特異性抗体を設計および生産する方法は、当技術分野で知られている。例えば、Ｔｏｄｏｒｏｖｓｋａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２４８（ｌ−２）：４７−６６，２００１を参照されたい。
【００７３】
「ドメイン抗体フラグメント」は、重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域のみを含む免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントである。場合によっては、２つ以上のＶＨ領域がペプチドリンカーと共有結合して、二価ドメイン抗体フラグメントを作成する。二価ドメイン抗体フラグメントの２つのＶＨ領域は、同じ抗原または異なる抗原を標的とし得る。
【００７４】
いくつかの実施形態では、抗体は修飾または操作されている。修飾または操作された抗体の例には、キメラ抗体、マルチパラトピック抗体（例えば、バイパラトピック抗体）、および多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ））が含まれる。
【００７５】
本明細書で使用する場合、「マルチパラトピック抗体」とは、少なくとも２つの単一ドメイン抗体を含む抗体を意味し、少なくとも１つの単一ドメイン抗体は抗原上の第１の抗原決定基に対するものであり、少なくとも１つの他の単一ドメイン抗体は同じ抗原上の第２の抗原決定基に対するものである。したがって、例えば、「バイパラトピック」抗体は、抗原上の第１の抗原決定基に対する少なくとも１つの単一ドメイン抗体と、同じ抗原上の第２の抗原決定基に対する少なくとも１つのさらなる単一ドメイン抗体を含む。
【００７６】
本明細書で使用する場合、「多特異性抗体」とは、少なくとも２つの単一ドメイン抗体を含む抗体を意味し、少なくとも１つの単一ドメイン抗体は第１の抗原に対するものであり、少なくとも１つの他の単一ドメイン抗体は第２の抗原に対するものである（第１の抗原とは異なる）。したがって、例えば、「二重特異性」抗体は、第１の抗原に対する少なくとも１つの単一ドメイン抗体と、例えば第１の抗原とは異なる、第２の抗原に対する少なくとも１つのさらなる単一ドメイン抗体を含む抗体である。
【００７７】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される抗体は、モノクローナル抗体、例えばマウスモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体を産生する方法は、当該分野で公知である。例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９９４）Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５を参照されたい。
【００７８】
様々な実施形態において、ＰＥＢＬ分子に関連する標的結合分子は、標的分子に結合する受容体またはリガンドである。例えば、その標的結合分子は、ＰＤ−１（例えば、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２）に結合するリガンドであり得る。したがって、当業者によって理解されるように、標的結合分子は、抗体、または標的分子に結合するリガンド／受容体であり得る。
【００７９】
本明細書で使用する場合、ＰＥＢＬ遺伝子に関連する「作動可能に連結された」とは、１つ以上の局在化ドメインをコードする１つ以上の遺伝子に隣接するフレームに（例えば、リンカーなしで）標的結合分子を直接コードする遺伝子を指す。あるいは、標的結合分子をコードする遺伝子は、本明細書に記載されるように、リンカー配列を介して１つ以上の局在化ドメインをコードする１つ以上の遺伝子に接続されてもよい。
【００８０】
本明細書で使用する場合、ＰＥＢＬタンパク質に関連する「連結された」とは、第１のドメイン、例えば標的結合分子の、第２のドメイン、例えば局在化ドメインへの接合を指す。リンカーはアミノ酸配列であり得る。当技術分野で公知の様々な適切なリンカーを使用して、標的結合分子を局在化ドメインにつなぐことができる。例えば、様々な長さの親水性残基からなるポリペプチド、または（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号４０）ポリペプチド（前記ｎは例えば２〜１２の整数である）などの天然に存在しないペプチドを、包括的に、本発明に従って使用することができる。特定の実施形態では、リンカーは、例えばＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３９）を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３７）を含む。様々な実施形態では、約５〜約１００アミノ酸の長さを有するペプチドリンカーを、包括的に、本発明で使用することができる。特定の実施形態では、約２０〜約４０アミノ酸の長さを有するペプチドリンカーを本発明で使用することができる。いくつかの実施形態では、少なくとも５アミノ酸、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも１５アミノ酸、少なくとも２０アミノ酸、少なくとも２５アミノ酸、少なくとも３０アミノ酸、少なくとも３５アミノ酸、または少なくとも４０アミノ酸の長さを有するペプチドリンカーを本発明で使用することができる。当業者によって理解されるように、そのようなリンカー配列およびそのようなリンカー配列の変異体は、当技術分野で知られている。リンカー配列を組み込む構築物を設計する方法、および機能性を評価する方法は、当業者に容易に利用可能である。
【００８１】
特定の実施形態では、ＰＥＢＬ分子は、免疫細胞の表面上に発現される標的に結合する。いくつかの態様では、ＰＥＢＬ分子は標的分子の活性または機能を阻害する。例として、本明細書に開示されるように、ＰＥＢＬ分子は、例えば、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ３（例えば、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、またはＣＤ３ζ）、ＣＤ７、ＣＤ４５、ｈＢ２ＭＧ、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／ＤＬ３、ＮＫＧ２ＡまたはＮＫＧ２Ｄと結合するように設計され、これにより、そのような分子の細胞表面発現をダウンレギュレートする。このような分子のダウンレギュレーションは、例えば、分解および／または内部移行のために分子を局在化／標的化することにより達成できる。他の実施形態では、ＰＥＢＬ分子は標的を不活性にする（例えば、標的はその同族リガンドまたは受容体と相互作用および／または結合することができなくなる）。
【００８２】
いくつかの実施形態では、本発明の操作された免疫細胞は治療効果が増強される。本明細書で使用する「治療効果の増強」とは、ホストまたはレシピエントにおける移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の減少、ホストによる拒絶の減少または排除、ホストにおける生存期間の延長、ホストにおける腫瘍、ホストにおける自己殺傷（ｓｅｌｆ−ｋｉｌｌｉｎｇ）の減少、ホストにおける炎症カスケードの減少、またはホストにおけるＣＡＲ媒介シグナル伝達の持続のうちの１つ以上を指す。
【００８３】
本発明の特定の実施形態では、ＰＥＢＬ分子に関連する標的結合分子は、ＣＤ３／Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体の分子、サイトカイン、ヒトＭＨＣクラスＩ分子、ヒトＭＨＣクレームＩＩ分子、または免疫応答をダウンレギュレートする受容体に結合する。
【００８４】
特定の実施形態では、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体の分子は、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、またはＣＤ３ζであり得る。特定の実施形態では、分子はＣＤ３δである。特定の実施形態では、分子はＣＤ３γである。いくつかの実施形態では、分子はＣＤ３εである。特定の実施形態では、分子はＣＤ３ζである。
【００８５】
別の実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子は、β−２ミクログロブリン、α１−ミクログロブリン、α２−ミクログロブリン、またはα３−ミクログロブリンであり得る。
【００８６】
他の実施形態では、免疫応答をダウンレギュレートする受容体は、例えば、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−３、キラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ、例えばＫＩＲ２ＤＬ１（ＣＤ１５８ａとしても知られる）、ＫＩＲ２ＤＬ２／ＤＬ３（ＣＤ１５８ｂとしても知られる））、ＣＤ９４またはＮＫＧ２Ａ（ＣＤ１５９ａとしても知られる）、Ｓｒｃ相同性領域２ドメイン含有ホスファターゼ（ＳＨＰ）−１およびＳＨＰ−２などのタンパク質チロシンホスファターゼから選択される。したがって、このような受容体は、本明細書に記載されるように、ＰＥＢＬ分子の標的結合分子により標的化され得る。
【００８７】
様々な実施形態では、ＰＥＢＬ分子の標的結合分子で標的化され得るサイトカインの例には、例えば、インターロイキン（ＩＬ）−６、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２７、ＩＬ−３５、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−α、ＴＮＦ−α、またはＴＧＦ−βが含まれる。さらなる態様において、ＰＥＢＬ分子は、例えばＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ５２、またはＣＤ１２７から選択される分子に結合する。本発明の特定の態様では、ＰＥＢＬは、糖タンパク質のＣＤ１ファミリーのメンバー、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ９９、ＣＤ１２７、およびＣＤ１３７を含むがこれらに限定されない細胞の表面で発現される分子に結合することができる。いくつかの態様において、ＰＥＢＬ分子はＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、またはＣＤ３ζに特異的に結合する。
【００８８】
任意の標的タンパク質に対する抗体およびその抗体フラグメントを産生する方法は、当技術分野で周知であり、通例のものである。さらに、本明細書に例示されるように、様々な標的、例えばＣＤ３およびＣＤ７に対する市販の抗体を使用して、本明細書に例示されるＰＥＢＬ分子を生成することができる。本明細書に例示されるように、当技術分野で公知の抗体、ならびにそれから誘導される抗体のフラグメント（例えばｓｃＦｖ）を本発明で使用することができる。
【００８９】
他の態様では、ＰＥＢＬ分子の局在化ドメインは、小胞体（ＥＲ）保持配列ＫＤＥＬ（配列番号３２）、またはＫＫＸＸ（配列番号３５）、ＫＸＤまたはＫＸＥ（Ｘは任意のアミノ酸であってよく、例えば、Ｇａｏ  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９：５０８−５１５，２０１４を参照）およびＹＱＲＬ（配列番号３４）（例えば、Ｚｈａｎ  Ｊ，  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ４６：５５−６０，１９９８）などの他のＥＲまたはゴルジ体保持配列、例えば「ＰＥＳＴ」モチーフ−ＳＨＧＦＰＰＥＶＥＥＱＤＤＧＴＬＰＭＳＣＡＱＥＳＧＭＤＲＨＰＡＡＣＡＳＡＲＩＮＶ（配列番号４１）を含むプロテオソーム標的配列、および／またはＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、または本明細書に記載の別のシングルパス膜タンパク質の膜貫通（例えば、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｐ、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃｓＲＩｙ、ＣＤ１６（ＣＤ１６ＡまたはＣＤ１６Ｂなど）、ＯＸ４０、ＣＤ３ζ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３５、ＴＣＲａ、ＣＤ３２（ＣＤ３２ＡまたはＣＤ３２Ｂなど）、ＣＤ６４（ＣＤ６４Ａ、ＣＤ６４Ｂ、またはＣＤ６４Ｃなど）、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、またはＦＧＦＲ２Ｂ）などの、標的結合分子を細胞膜に標的化する配列を含む。本明細書に例示される特定の局在化ドメイン（配列）の例を図８ａに示す。他の様々な局在化配列が知られており、当技術分野、例えばＷＯ２０１６／１２６２１３で利用可能である。
【００９０】
いくつかの実施形態では、本発明のＰＥＢＬ分子は、１つ以上の局在化ドメインを含むことができる。例えば、ＰＥＢＬ分子は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０個の一緒に連結された局在化ドメインを有することができる。特定のＰＥＢＬ分子で２つ以上の局在化ドメインを使用する場合、各局在化ドメインは、リンカーを介して、または介在せずに連結できる。場合によっては、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＫＤＥＬモチーフ、リンカーなどの局在化ドメインを単一のＰＥＢＬ分子で使用できる。この特定の構築物は介在性リンカーのない局在化ドメインを示しているが、局在化ドメインの一部またはすべての間に様々な介在性リンカーを組み込むことができる。他の例を図８Ａに示す。
【００９１】
当業者によって理解されるように、キメラ抗原受容体および／またはＰＥＢＬ分子は、本明細書に開示される標的ならびに本明細書に開示される標的の変異体に結合するように設計され得る。例として、キメラ抗原受容体および／またはＰＥＢＬ分子は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体の分子、またはその天然に存在する変異体分子に結合するように設計することができる。そのような天然に存在する変異体は、分子の野生型と同じ機能を持つことができる。他の実施形態では、変異体は、分子の野生型と比較して変化する機能を有することができる（例えば、病的状態を与える）。
【００９２】
当業者によって理解されるように、組み合わせが機能的なＰＥＢＬを産生する限り、ＰＥＢＬ分子構築物の様々な構成要素は、異なる組み合わせで（例えば、異なるリンカー、異なる局在化配列、異なるｓｃＦｖなどを含むように）置換することができる。特定の構築物の機能性を評価する方法は、本明細書に開示されているように、当業者の範囲内である。
【００９３】
さらなる態様では、本発明は、癌を治療するための、ＰＥＢＬ分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、およびキメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む操作された免疫細胞の使用であって、操作された免疫細胞の治療的有効量を、癌の治療を必要とする対象に投与することを含む、使用に関する。
【００９４】
別の態様では、本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸と、癌を治療するための局在化ドメインに連結された単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）をコードするヌクレオチド配列を含む第２の核酸と、を含む操作された免疫細胞の使用であって、操作された免疫細胞の治療的有効量を、癌の治療を必要とする対象に投与することを含む、使用に関する。いくつかの態様において、第１の核酸配列および第２の核酸配列はバイシストロン性である。
【００９５】
他の態様では、本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、自己免疫障害を治療するための局在化ドメインに連結された標的結合分子（例えば、ｓｃＦｖ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、を含む操作された免疫細胞の使用であって、操作された免疫細胞の治療的有効量を、自己免疫障害の治療を必要とする対象に投与することを含む、使用に関する。
【００９６】
他の態様では、本発明はまた、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、および感染性疾患を治療するための局在化ドメインに連結された標的結合分子（例えば、ｓｃＦｖ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、を含む操作された免疫細胞の使用であって、操作された免疫細胞の治療的有効量を、感染性疾患の治療を必要とする対象に投与することを含む、使用に関する。
【００９７】
様々な実施形態において、キメラ抗原受容体はＣＡＲ（例えば、抗ＣＤ１９−４−ｌ−ＢＢ−ＣＤ３ζＣＡＲ）である。いくつかの実施形態では、局在化ドメインに連結されたＰＥＢＬ分子または単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）は、図８Ａに示される任意の１つ以上の構築物から選択される。
【００９８】
３．操作された免疫細胞の投与
本明細書では、ＰＥＢＬおよび／またはＣＡＲを発現する操作された免疫細胞の治療的有効量を投与することにより、疾患または障害を軽減または改善することを目的とする方法が提供される。一実施形態では、操作されたＣＤ３／ＴＣＲαβ陰性Ｔ細胞は、癌の症状を軽減、治療、または予防するために投与される。いくつかの実施形態では、操作されたＣＤ３／ＴＣＲαβ陰性Ｔ細胞は、自己免疫疾患の症状を軽減、治療、または予防するために投与される。他の実施形態において、操作されたＣＤ３／ＴＣＲαβ陰性Ｔ細胞は、移植手術を受けた際の移植片対宿主病または移植片拒絶を治療または予防するために投与される。
【００９９】
「治療有効量」という用語は、患者に投与されたときに疾患（例えば、癌、感染症またはＧＶＨＤ）の徴候およびまたは症状を緩和する、本発明の操作された免疫細胞（例えば、操作されたＣＤ３／ＴＣＲαβ陰性Ｔ細胞）の量を指す。投与される実際の量は、機能的ＣＤ３／ＴＣＲαβ陰性Ｔ細胞が疾患に対して薬理活性を示すインビトロまたはインビボで行われた研究に基づいて決定することができる。例えば、標的細胞増殖の阻害についてＣＤ３／ＴＣＲαβ陰性Ｔ細胞の量をアッセイすることができ、阻害を示すＣＤ３／ＴＣＲαβ陰性Ｔ細胞の量は治療有効量を表すことができる。
【０１００】
「薬学的組成物」とは、対象、例えばヒト対象への投与に適した組成物を指す。そのような組成物は、口腔（ｂｕｃｃａｌ）、動脈内、心臓内、脳室内、皮内、筋肉内、眼内、腹腔内、脊髄内、くも膜下、静脈内、経口、非経口、浣腸または坐剤を介して直腸、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、皮下（ｓｕｂｄｅｒｍａｌ）、舌下、経皮、および経粘膜を含むがこれらに限定されない多数の経路の１つ以上を介した投与のために特に製剤化することができる。加えて、投与は、注射、液体、ゲル、液滴、または他の投与手段によって起こり得る。
【０１０１】
本発明による操作されたＴ細胞は、適切な担体または希釈剤とともに、インビボでの投与に適切な薬学的組成物またはインプラントにされ得、これらはさらに薬学的に許容され得る。そのような組成物またはインプラントを作製する手段は、当技術分野において記載されている（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ´ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  Ｅｄ．，Ｍａｃｋ，ｅｄ（１９８０）を参照されたい）。適切な場合、操作されたＴ細胞は、それぞれの投与経路の通常の方法で、カプセル、溶液、注射、吸入剤、またはエアロゾルなどの半固体または液体形態の製剤に製剤化することができる。ほとんどの場合、薬学的に許容される形態は、ＰＥＢＬおよび／またはＣＡＲを発現する細胞を無効にしない（ｎｏｔ  ｉｎｅｆｆｅｃｔｕａｔｅ）ものである。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、平衡塩類溶液、好ましくはハンクス平衡塩類溶液、または生理食塩水を含む薬学的組成物にすることができる。
【０１０２】
いくつかの態様では、操作された免疫細胞は、対象への注入によって投与される。免疫細胞（例えば、同種異系または自己免疫細胞）を注入する方法は、当技術分野で知られている。病気の症状を改善するために、十分な数の細胞がレシピエントに投与される。典型的には、１０７〜１０１０個の細胞の投与量が、例えば、１０９個の細胞の投与量の１回の設定で注入される。注入は、１回の１０９個の細胞用量として、または数回に分けた１０９個の細胞用量として投与される。注入の頻度は、３〜３０日ごと、または必要に応じて、または必要ならばより長い間隔にすることができる。注入の量は、一般に、対象ごとに少なくとも１回の注入であり、好ましくは、許容されるように、または疾患の症状が改善されるまで、少なくとも３回の注入である。細胞は、５０〜２５０ｍｌ／時間の速度で静脈内に注入することができる。他の適切な投与様式には、動脈内注入、腫瘍への直接注射および／または手術後の腫瘍床の灌流、人工足場の腫瘍部位への移植、髄腔内投与、および眼内投与が含まれる。本発明をそのような送達様式に適合させる方法は、当業者に容易に利用可能である。
【０１０３】
特定の態様において、治療される癌は固形腫瘍または血液悪性腫瘍である。血液悪性腫瘍の例には、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫が含まれる。固形腫瘍の例には、肺癌、黒色腫、乳癌、前立腺癌、結腸癌、腎細胞癌、卵巣癌、膵臓癌、肝細胞癌、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、および脳腫瘍が含まれる。
【０１０４】
４．操作された免疫細胞の生産
別の実施形態では、本発明は、本発明の操作された免疫細胞を産生する方法であって、キメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、局在化ドメイン（例えば、ＰＥＢＬ分子）に連結された標的結合分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを免疫細胞に導入することと、それにより操作された免疫細胞を産生することと、を含む、方法に関する。
【０１０５】
特定の実施形態では、ヌクレオチド配列を含む核酸は、エクスビボまたはインビトロで免疫細胞に導入される。他の実施形態では、ヌクレオチド配列を含む核酸は、インビボで免疫細胞に導入される。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に置かれたときに「作動可能に連結され」ている。例えば、シグナル配列のＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結されており、プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を与える場合、コード配列に作動可能に連結されている。標的結合分子をコードする核酸は、局在化ドメインをコードする核酸に作動可能に連結され得る。一般に、「作動可能に連結された」とは、連結されたＤＮＡ配列が連続的であること、および分泌リーダーの場合、連続的かつリーディングフレームであることを意味する。ただし、エンハンサーは連続している必要はない。連結は、都合の良い制限部位でのライゲーションにより、あるいは当業者によく知られているＰＣＲ／組換え法により達成される。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、従来の慣例に従って使用される。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、「免疫細胞」には、例えば、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、エフェクターＴ細胞、記憶Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、ガンマデルタＴ細胞などのＴ細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０８】
導入されるヌクレオチド配列を含む核酸は、本明細書に記載のキメラ抗原受容体および局在化ドメインに連結された標的結合分子（例えばｓｃＦｖ）を含む単一のバイシストロン性構築物であり得る。本明細書に記載されるように、本明細書に記載のキメラ抗原受容体（例えばＣＡＲ）と標的結合分子（例えばｓｃＦｖ）をコードする２つのｃＤＮＡの間に内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）または２Ａペプチドコード領域部位を挿入することにより、単一のバイシストロン性構築物を調製することができる。いくつかの実施形態では、バイシストロン性構築物は、それらの間にＩＲＥＳまたは２Ａペプチドコード領域を有するＰＥＢＬの上流にＣＡＲを含む。いくつかの場合では、例示的なバイシストロン性構築物が図１３Ａに表されている。他の実施形態では、バイシストロン性構築物は、それらの間にＩＲＥＳまたは２Ａペプチドコード領域を伴うＣＡＲ上流のＰＥＢＬを含む。２つ以上の標的を削除するためのトリシストロン性送達システムの設計も実行可能でなければならない。あるいは、個々の構築物（例えば、ＣＡＲおよびＰＥＢＬ）の別々の形質導入（同時または連続）を実施することができる。外因性核酸を導入する方法は本明細書に例示されており、当技術分野で周知である。
【０１０９】
本明細書に記載の核酸は、レトロウイルスおよびレンチウイルスベクター構築物を使用して細胞に導入（直接形質導入）することができる。「レンチウイルスベクター」という用語は、特に、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７（８）：１４５３−１４６４（２００９）で提供される、自己不活性化レンチウイルスベクターを含む、レンチウイルスゲノムの少なくとも一部に由来するベクターを指す。診療所で使用され得るレンチウイルスベクターの他の例には、例えば、Ｏｘｆｏｒｄ  ＢｉｏＭｅｄｉｃａからのＬＥＮＴＩＶＥＣＴＯＲ（登録商標）遺伝子送達技術、ＬｅｎｔｉｇｅｎからのＬＥＮＴＩＭＡＸ（商標）ベクターシステムなどが含まれるが、これらに限定されない。非臨床型のレンチウイルスベクターも利用可能であり、当業者に知られている。他の実施形態では、核酸を細胞に直接トランスフェクトすることができる。さらに他の実施形態では、核酸を細胞にエレクトロポレーションすることができる。エレクトロポレーションの詳細な方法は、Ｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１８，５５９：４０５−４０９およびＶａｎ  Ｔｅｎｄｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２０００，７，１４３１−１４３７に記載されている。
【０１１０】
本明細書で使用されるように、不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、明らかに反対の指示がない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。
【０１１１】
本明細書に記載の操作された免疫細胞は、ＷＯ２０１６／１２６２１３に記載されているように、ＣＤ３に結合する局在化ドメインに連結された標的結合分子を含むことができる。ＷＯ２０１６／１２６２１３の図２および表１および２ならびに以下の表１に記載される抗ＣＤ３ＰＥＢＬの構成要素の配列。
【０１１２】
【表１−１】
2020530291.tif 000003
【表１−２】
2020530291.tif 000004
【０１１３】
５．ＣＤ３／ＴＣＲαβ陰性免疫細胞を産生するゲノム編集
上記のように、エフェクターＴ細胞上の免疫分子の発現のダウンレギュレーションは、たとえばメガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、およびジンクフィンガーヌクレアーゼを使用した遺伝子編集法など、様々な他の既知の方法に従って達成できる。したがって、特定の実施形態では、操作された免疫細胞は、修飾により標的遺伝子またはタンパク質を非機能的にする修飾遺伝子をさらに含む。例として、本発明の操作された免疫細胞は、ＣＤタンパク質の発現を防止または低減する、および／またはその他の方法でＣＤタンパク質がＣＡＲによって認識または干渉されるのを（たとえば、構造的に）阻害する、修飾された（例えば、非機能性）ＴＣＲα遺伝子、ＴＣＲβ遺伝子、またはＣＤ３遺伝子（例えば、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、またはジンクフィンガーヌクレアーゼを使用して修飾された）をさらに含む。そのような方法を使用して遺伝子発現を改変する方法は、容易に入手可能であり、当技術分野で周知である。
【０１１４】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ６技術を使用して免疫細胞内の標的遺伝子を不活性化する方法は、例えば、米国特許公開番号ＵＳ２０１６／０２７２９９９、ＵＳ２０１７／０２０４３７２、およびＵＳ２０１７／０１１９８２０に記載されている。
【０１１５】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、標的遺伝子の変化（ゲノム修飾）を誘発するシステムである。Ｃａｓ９タンパク質による標的認識には、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）内の「シード」配列と、ｇＲＮＡ結合領域の上流にあるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を含む保存されたマルチヌクレオチドが必要である。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、細胞株、初代細胞、および操作された細胞のｇＲＮＡを再設計することにより、実質的に任意のＤＮＡ配列を切断するように操作できる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、単一のＣａｓ９タンパク質を２つ以上のｇＲＮＡと同時発現させることにより、複数のゲノム遺伝子座を同時に標的とすることができ、このシステムを、複数の遺伝子編集または標的遺伝子の相乗的活性化に独自に適合させている。遺伝子発現の阻害に使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの例は、米国公開番号２０１４／００６８７９７および米国特許番号８，６９７，３５９および８，７７１，９４５に記載されている。このシステムは、ＲＮＡ誘導Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを利用してエラーを起こしやすい修復経路をトリガーしてフレームシフト変異を引き起こすＤＮＡ二本鎖切断を導入する永続的な遺伝子破壊を誘導する。いくつかの場合、限定するものではないが、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２しても知られる）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、Ｔ７、Ｆｏｋ１、当技術分野で知られている他のヌクレアーゼ、その相同体、またはその修飾型を含む他のエンドヌクレアーゼも使用することができる。
【０１１６】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子破壊は、標的遺伝子に特異的なｇＲＮＡ配列とＣａｓエンドヌクレアーゼが細胞に導入され、Ｃａｓエンドヌクレアーゼが標的遺伝子に二本鎖切断を導入できる複合体を形成するときに発生する。場合によっては、ＣＲＩＳＰＲシステムは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードする核酸配列および標的遺伝子に特異的なガイド核酸配列を含む１つ以上の発現ベクターを含む。ガイド核酸配列は遺伝子に特異的であり、Ｃａｓエンドヌクレアーゼによって誘導される二本鎖切断の遺伝子を標的とする。ガイド核酸配列の配列は、遺伝子の遺伝子座内にあってもよい。一部の実施形態では、ガイド核酸配列は、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、またはそれ以上のヌクレオチド長である。ガイド核酸配列には、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列、それらの組み合わせ（ＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列）、またはペプチド核酸（ＰＮＡ）やロックド核酸（ＬＮＡ）などの合成ヌクレオチドを含む配列が含まれる。ガイド核酸配列は、単一分子または二重分子であり得る。一実施形態では、ガイド核酸配列は単一のガイドＲＮＡを含む。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、本発明の操作された免疫細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを介して修飾されて、ヒトＣＤ３遺伝子を不活性化することができる。ヒトＣＤ３遺伝子のゲノム構造と配列の詳細は、例えば、ＮＣＢＩ  ＧｅｎｅデータベースのＧｅｎｅＩＤ番号６９５５（ＴＣＲα）、６９５７（ＴＣＲβ）、９１５（ＣＤ３δ）、９１６（ＣＤ３ε）、９１７（ＣＤ３γ）、および９１９（ＣＤ３ζ）に見出すことができる。
【０１１８】
特定の標的遺伝子をノックアウトするための市販のキット、ｇＲＮＡベクターおよびドナーベクターは、例えばＯｒｉｇｅｎｅ（メリーランド州ロックビル）、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（ジョージア州アトランタ）、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ（ＡＢＭ；ブリティッシュコロンビア州リッチモンド）、ＢｉｏＣａｔ（ドイツ、ハイデルベルク）またはその他から入手できる。例えば、ＣＲＩＳＰＲを介したＣＤ３δのノックアウト用の市販のキットまたはキット構成要素には、例えば、カタログ番号ＫＮ２１００１０、ＫＮ２１００１０Ｇ１、ＫＮ２１００１０Ｇ２、およびＫＮ２１００１０Ｄとして入手可能なものが含まれ、ＣＲＩＳＰＲを介したＣＤ３εδのノックアウト用のものには例えばカタログ番号ＫＮ２０８２７６、ＫＮ２０８２７６Ｇ１、ＫＮ２０８２７６Ｇ２、およびＫＮ２０８２７６Ｄとして入手可能なものが含まれ、ＣＲＩＳＰＲを介したＣＤ３γのノックアウト用のものには例えばカタログ番号ＫＮ２２０５１２、ＫＮ２２０５１２Ｇ１、ＫＮ２２０５１２Ｇ２、およびＫＮ２２０５１２Ｄとして入手可能なものが含まれ、それぞれＯｒｉＧｅｎｅから入手できる。また、ＣＲＩＳＰＲを介したＣＤ３ζのノックアウト用のＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手可能な市販のキットまたはキット構成要素には、たとえば、カタログ番号ｓｃ−４１９５５４、ｓｃ−４１９５５４−ＨＤＲ、ｓｃ−４１９５５４−ＮＩＣ、およびｓｃ−４１９５５４−ＮＩＣ２として入手可能なものが含まれる。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して、本明細書で概説される核酸のいずれかを免疫細胞、例えばＴ細胞のゲノムに導入することができる。
【０１２０】
６．例示的な実施形態の詳細な説明
特定の実施形態では、操作された免疫細胞であって、（ｉ）局在化ドメイン（例えば、ＰＥＢＬ）に連結された標的結合分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、標的結合分子は、ＣＤ３結合する抗体であり、および局在化ドメインは、小胞体（ＥＲ）配列、ゴルジ体保持配列、プロテオソーム局在化配列、およびＣＤ８α、ＣＤ８β、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、またはＦＧＦＲ２Ｂに由来する膜貫通ドメイン配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む保持シグナルドメインを含む、免疫細胞が提供される。場合によっては、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列を含む別の核酸。特定の場合において、ＣＡＲは４−１ＢＢおよびＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ分類１９（ＣＤ１９）に結合する抗体を含む。特定の実施形態では、標的結合分子に関連するＣＤ３に結合する抗体は、配列番号１に記載のＶＨ配列および配列番号２に記載のＶＬ配列を含む。本明細書に記載されるように、特定の実施形態において、抗体は、配列番号１および配列番号２にそれぞれ示されるＶＨおよびＶＬ配列に対して、それぞれ少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性を有する配列、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を有するＶＨおよびＶＬを含む。いくつかの場合、抗体は単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。いくつかの実施形態では、ＰＥＢＬの局在化ドメインは、図８Ａまたは表１に示されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ＣＡＲは、ヒンジおよび膜貫通配列をさらに含む。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、操作されたＴ細胞（例えば、操作された細胞傷害性Ｔ細胞、操作されたヘルパーＴ細胞、操作された制御性Ｔ細胞、操作されたエフェクターＴ細胞、操作された記憶Ｔ細胞、操作されたナチュラルキラーＴ細胞、および操作されたガンマデルタＴ細胞）、操作されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、操作されたＮＫ／Ｔ細胞、操作された単球、操作されたマクロファージ、または操作された樹状細胞である。いくつかの場合、操作された免疫細胞は同種異系細胞である。他の場合、操作された免疫細胞は自己細胞である。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、少なくとも６ヶ月、例えば６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１３ヶ月、１４ヶ月、１５ヶ月、１６か月、１７か月、またはそれ以上の間ＣＤ３／ＴＣＲαβ発現を欠く。他の実施形態では、操作された免疫細胞は、少なくとも１２ヶ月、例えば１２ヶ月、１３ヶ月、１４ヶ月、１５ヶ月、１６ヶ月、１７ヶ月、１８ヶ月、１９ヶ月、２０ヶ月、２２ヶ月、２３か月、２４か月、またはそれ以上の間ＣＤ３／ＴＣＲαβ発現を欠く。特定の実施形態では、操作された免疫細胞は、少なくとも２０ヶ月、例えば２０ヶ月、２２ヶ月、２３ヶ月、２４ヶ月、２５ヶ月、２６ヶ月、２７ヶ月、２８ヶ月、２９ヶ月、３０ヶ月、３１か月、３２か月、またはそれ以上の間ＣＤ３／ＴＣＲαβ発現を欠く。
【０１２３】
特定の実施形態では、操作された免疫細胞は、相当する免疫細胞と比較して実質的に等しい速度で増殖する。
【０１２４】
本発明の操作された細胞は、特定の条件下、培地で増殖させることができる。いくつかの実施形態では、操作された細胞はＩＬ−２の存在下で培養される。操作された細胞は、当業者に認識されている任意の方法に従って凍結保存することができる。患者に投与する前に、操作されたコールを解凍して培養することができる。他の場合では、操作されたコールを投与前に増殖させることもできる。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、対象は、操作された免疫細胞であって、その対象に対して同種異系である操作された免疫細胞が対象に投与されたとき、移植片対宿主病を発症する可能性が低減される。操作された免疫細胞は、ＣＤ１９＋白血病細胞の細胞傷害性を誘導できる。
【０１２６】
いくつかの態様では、本明細書に記載の操作された免疫細胞のいずれか１つを含む操作された免疫細胞の実質的に純粋な集団も提供され、操作された免疫細胞の少なくとも９０％、例えば少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上、ＣＤ３／ＴＣＲαβ発現を欠いている。いくつかの場合、実質的に純粋な母集団は、少なくとも８０％、例えば少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上、ＣＤ３／ＴＣＲαβ発現を欠く操作された免疫細胞を含む。
【０１２７】
いくつかの態様では、局在化ドメイン（例えば、ＰＥＢＬ）に連結された標的結合分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸も提供され、標的結合分子はＣＤ３に結合する抗体であり、局在化ドメインは、小胞体（ＥＲ）配列、ゴルジ体保持配列、プロテオソーム局在化配列、およびＣＤ８α、ＣＤ８β、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、またはＦＧＦＲ２Ｂに由来する膜貫通ドメイン配列からなる群から選択されるアミノ酸配列である、保持シグナルドメインを含む。いくつかの場合、本明細書に記載の核酸を含む発現ベクターが提供される。場合によっては、発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。
【０１２８】
他の態様において、癌の治療を必要とする対象の癌を治療する方法であって、本明細書に記載の実施形態のいずれかを有する操作された免疫細胞の治療的有効量を対象に投与することと、それにより癌の治療を必要とする対象の癌を治療することと、を含む、方法も提供する。いくつかの態様では、癌の治療を必要とする対象の癌を治療する方法であって、本明細書に記載の実施形態のいずれかを有する操作された免疫細胞の実質的に純粋な集団の治療有効量を対象に投与することと、それにより癌の治療を必要とする対象の癌を治療することと、を含む、方法を提供する。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、自己免疫疾患の治療を必要とする対象の自己免疫疾患を治療する方法であって、本明細書に記載の実施形態のいずれかを有する操作された免疫細胞の治療有効量を対象に投与することと、それにより自己免疫疾患の治療を必要とする対象の自己免疫疾患を治療することと、を含む、方法も提供する。いくつかの実施形態では、自己免疫疾患の治療を必要とする対象の自己免疫疾患を治療する方法であって、本明細書に記載の実施形態のいずれかを有する操作された免疫細胞の実質的に純粋な集団の治療有効量を対象に投与することと、それにより自己免疫疾患の治療を必要とする対象の自己免疫疾患を治療することと、を含む、方法を提供する。
【０１３０】
特定の実施形態では、本方法は、本明細書に記載されるように、局在化ドメインに連結された標的結合分子をコードするヌクレオチド配列を有する核酸を含む操作された免疫細胞の治療有効量を投与することを含む。場合によっては、第２の核酸はＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、４−１ＢＢおよびＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメイン、ならびにＣＤ１９またはＣＤ３などのサイトカインに結合する抗体を含む。
【０１３１】
特定の実施形態では、癌には、ＣＤ３陽性癌、ＣＤ１９陽性癌、固形腫瘍癌、血液癌、Ｂ細胞悪性腫瘍、例えばＢ細胞急性リンパ性白血病、リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３２】
本明細書で使用される「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、臨床的に許容される基準に従って、病状が改善される程度まで、医学的状態（例えば、悪性腫瘍、自己免疫疾患、移植片対宿主病、移植拒絶、ウイルス感染、感染症など）に対抗することを指す。
【０１３３】
交換可能に使用される用語「対象」または「患者」は、哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ラット、マウス）を指す。特定の実施形態では、対象はヒトである。「治療を必要とする対象」とは、Ｔ細胞を誘導して標的細胞に対して特異的な細胞傷害性を発揮することにより治療（例えば、改善（ｉｍｐｒｏｖｅｄ）、改善（ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｄ）、予防）することができる疾患または状態を有する、または発症するリスクがある対象（例えば、患者）を指す。
【０１３４】
本明細書で定義されるように、「治療有効量」とは、対象に投与されたときに、投与条件下で対象において所望の治療効果を達成する（Ｔ細胞悪性腫瘍に関連する状態を治療する）のに十分な量を指す。投与される薬剤の有効量は、本明細書で提供されるガイダンスおよび当技術分野で知られている他の方法を使用して、および例えば、選択された特定の薬剤、対象の年齢、感受性、薬物に対する耐性および全体的な健康状態を含むいくつかの要因に依存して、通常の技能の臨床医が決定できる。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、治療、例えば、癌治療、自己免疫疾患治療、感染症治療、ＧＶＨＤ治療、および移植拒絶治療を必要とする対象に対して自己由来である。他の実施形態では、操作された免疫細胞は、治療を必要とする対象に対して同種異系である。本発明の単離された操作された免疫細胞は、複数の対象に投与することができ、ＧＶＨＤのリスクを低減する「既製」免疫細胞になり得る。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、複数の対象（例えば、少なくとも２人以上の対象）への投与時にＧＶＨＤ応答を誘発しない。
【０１３６】
特定の実施形態では、操作された免疫細胞は、静脈内注射、静脈内注入、動脈内注入、皮下注射、筋肉内注射、胸骨内注射、腫瘍内注射、腫瘍への直接注射、および／または手術後の腫瘍床の灌流、人工足場の腫瘍部位への移植、髄腔内投与、および眼内投与によって対象に投与される
【０１３７】
特定の実施形態では、操作された免疫細胞は、対象への注入によって投与される。免疫細胞（例えば、同種異系または自己免疫細胞）を注入する方法は、当技術分野で知られている。病気の症状を改善するために、十分な数の細胞がレシピエントに投与される。典型的には、１０７〜１０１０個の細胞の投与量、例えば、１０９個の細胞の投与量が、で１回の設定で注入される。注入は、１回の１０９個細胞用量として、または数回に分けた１０９個の細胞用量として投与される。注入の頻度は、毎日、２〜３０日ごと、または必要に応じて、または必要ならばより長い間隔にすることができる。注入の量は、一般に、対象ごとに少なくとも１回の注入であり、好ましくは、許容されるように、または疾患の症状が改善されるまで、少なくとも３回の注入である。細胞は、５０〜２５０ｍｌ／時間の速度で静脈内に注入することができる。他の適切な投与様式には、動脈内注入、腹腔内注入、腫瘍への直接注射および／または手術後の腫瘍床の灌流、人工足場の腫瘍部位への移植、髄腔内投与が含まれる。本発明をそのような送達様式に適合させる方法は、当業者に容易に利用可能である。
【０１３８】
特定の実施形態では、本発明による癌の治療方法は、少なくとも１つの他の既知の癌療法、例えば化学療法と組み合わされる。
【０１３９】
他の態様において、癌を治療するための本明細書に記載の実施形態のいずれかを有する操作された免疫細胞の使用であって、操作された免疫細胞の治療有効量を、癌の治療を必要とする対象に投与することを含む、使用も提供される。特定の実施形態では、癌はＢ細胞悪性腫瘍である。特定の実施形態では、Ｂ細胞悪性腫瘍は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病、または非ホジキンリンパ腫である。
【０１４０】
特定の実施形態では、操作された免疫細胞は、静脈内注入、動脈内注入、腹腔内注入、腫瘍への直接注射、および／または手術後の腫瘍床の灌流、人工足場の腫瘍部位への移植、または髄腔内投与により投与される。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列およびＰＥＢＬをコードするヌクレオチド配列は連続的に導入される。他の実施形態では、ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列およびＰＥＢＬをコードするヌクレオチド配列は同時に導入される。特定の場合、ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列とＰＥＢＬをコードするヌクレオチド配列は機能的に連結されており、したがって単一の発現ベクターまたはプラスミドに導入することができる。
【０１４２】
特定の態様では、本明細書において提供されるのは、局在化ドメイン（例えば、ＰＥＢＬ）に連結された標的結合分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸である。いくつかの実施形態では、標的結合分子はＣＤ３／ＴＣＲαβ複合体タンパク質に結合する抗体であり、局在化ドメインは、ＥＲ配列、ゴルジ体保持配列、およびプロテオソーム局在化配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む保持シグナル伝達ドメインを含む。ＣＤ３／ＴＣＲαβ複合体タンパク質は、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、およびＣＤ３ζから選択できる。ＣＤ３／ＴＣＲαβ複合体タンパク質に結合する抗体は、ｓｃＦｖであり得る。いくつかの例では、ｓｃＦｖは、配列番号１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する可変重鎖（ＶＨ）配列と、配列番号２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する可変軽鎖（ＶＬ）配列とを含む。特定の例において、ｓｃＦｖは、配列番号１に示される可変重鎖（ＶＨ）配列および配列番号２に示される可変軽鎖（ＶＬ）配列を含む。上記のように、操作された免疫細胞は同種異系免疫細胞であり得る。たとえば、操作された免疫細胞は、「既製の」免疫細胞として使用できる。他の実施形態では、操作された免疫細胞は自己免疫細胞である。膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ８β、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、またはＦＧＦＲ２Ｂに由来する膜貫通ドメインを含むことができる。例えば、膜貫通ドメインはＣＤ８αからの膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、保持シグナル伝達ドメインは、ＫＤＥＬ、ＫＫＭＰ、ＫＫＴＮ、またはＫＫＸＸ（Ｘは任意のアミノ酸であり得る）から選択されるアミノ酸配列を含む。局在化ドメインは、図８Ａまたは表１に示されるアミノ酸配列を含むことができる。他の態様では、本明細書で概説される核酸を含む発現ベクターが提供される。特定の態様では、本明細書に記載の発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。
【０１４３】
別の態様では、操作された免疫細胞を産生する方法が提供される。この方法は、本明細書に概説した核酸を免疫細胞に導入することを含む。免疫細胞はＴ細胞であり得る。いくつかの場合、免疫細胞は同種異系細胞である。いくつかの実施形態では、この方法は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を免疫細胞に導入することをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＢＬの核酸は、ＣＡＲをコードする核酸に作動可能に連結されている。他の実施形態では、ＰＥＢＬの核酸およびＣＡＲをコードする核酸は、バイシストロン発現のために配置される（例えば、両方の核酸配列は同じＲＮＡ転写物から発現される）。
【０１４４】
さらに別の態様では、局在化ドメインに連結した標的結合分子を含むポリペプチドが提供され、局在化ドメインは、小胞体（ＥＲ）配列、ゴルジ体保持配列、およびプロテオソーム局在化配列、およびＣＤ８αに由来する膜貫通ドメインからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む保持シグナル伝達ドメインを含み、およびこのポリペプチドは細胞によって分泌されず、細胞の細胞表面に発現されない。そのようなものとして、このポリペプチドは細胞内にとどまり、隣接細胞（例えば、癌細胞）と相互作用または結合しない。いくつかの場合、標的結合分子のＣ末端は、局在化ドメインのＮ末端に接続される。標的結合分子は、チェックポイント阻害剤、ＣＤタンパク質、またはＴ細胞抗原に特異的に結合できる。標的結合分子は、単鎖可変フラグメントまたはｓｃＦｖなどの抗体であり得る。場合によっては、ｓｃＦｖは、配列番号１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する可変重鎖（ＶＨ）配列と、配列番号２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する可変軽鎖（ＶＬ）配列とを含む。特定の例において、ｓｃＦｖは、配列番号１に示される可変重鎖（ＶＨ）配列と、配列番号２に示される可変軽鎖（ＶＬ）配列を含む。一部の実施形態では、保持シグナル伝達ドメインは、ＫＤＥＬ、ＫＫＭＰ、ＫＫＴＮ、またはＫＫＸＸ（Ｘは任意のアミノ酸であり得る）から選択されるアミノ酸配列を含む。局在化ドメインは、図８Ａまたは表１に示されるアミノ酸配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。他の実施形態では、本明細書で提供されるのは、本明細書で概説されるそのようなポリヌクレオチドを含む発現ベクターである。特定の実施形態では、本明細書に記載の発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。
【０１４５】
様々な態様において、本明細書に記載の操作された免疫細胞を産生するためのキットも提供される。本キットは、例えば、同種異系または自己エフェクターＴ細胞、同種異系または自己細胞傷害性Ｔ細胞、同種異系または自己ヘルパーＴ細胞、同種異系または自己制御性Ｔ細胞などを産生するために使用することができる。
【０１４６】
したがって、本明細書では、抗ＣＤ３εＰＥＢＬなどのＰＥＢＬをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含むキットが提供される。いくつかの態様において、キットは、抗ＣＤ３εＰＥＢＬなどのＰＥＢＬをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む。キットは、本明細書に記載の実施形態のいずれかに従って設計することができる。
【０１４７】
特定の実施形態では、ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列および／またはＰＥＢＬをコードするヌクレオチド配列は、例えば、クローニングおよび／または発現を可能にする配列（例えば、プラスミドまたはベクター配列）をさらに含む。例えば、ヌクレオチド配列は、例えば細胞（例えば免疫細胞）へのトランスフェクションのために他のプラスミドおよび／またはベクターへのクローニングを容易にするためにプラスミドの一部として提供され得る。特定の実施形態では、ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列およびＰＥＢＬをコードするヌクレオチド配列は、単一のプラスミドまたはベクターで提供される。特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、別個のプラスミドまたはベクターで提供される。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、キットは、ＣＤ３／ＴＣＲαβ陰性免疫細胞を単離するための構成要素または試薬をさらに含む。特定の実施形態では、キットは抗ＣＤ３抗体または抗ＴＣＲαβ抗体を含む。ＣＤ３／ＴＣＲαβ陽性細胞を除去することにより、ＣＤ３／ＴＣＲαβ陰性免疫細胞を細胞集団から分離できる。キットには、ＣＤ３／ＴＣＲαβ陽性細胞に結合する抗ＣＤ３抗体に付着した固体支持体も含まれる。様々な実施形態では、キットは、ＣＤ３／ＴＣＲαβ陽性細胞に結合する抗ＴＣＲαβ抗体に付着した固体支持体を含むことができる。
【０１４９】
通常、キットは使いやすさのために区画化されており、試薬が入った１つ以上の容器を含むことができる。特定の実施形態では、キットの構成要素はすべて一緒に包装される。あるいは、キットの１つ以上の個別の構成要素を、他のキットの構成要素とは別のパッケージで提供できる。キットには、キットの構成要素を使用するための指示も含まれ得る。
【０１５０】
ＷＯ２０１６／１２６２１３およびＫａｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  Ａｄｖａｎｃｅｓ，２０１８，２（８）：５１７−５２８の開示は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５１】
本明細書では、以下に示す例示的な実施形態が提供される。
【０１５２】
実施形態１局在化ドメインに連結した標的結合分子を含むポリペプチドを含む操作されたＣＤ３／ＴＣＲαβ陰性Ｔ細胞であって、標的結合分子はＣＤ３／ＴＣＲαβ複合体タンパク質に結合する抗体を含み、局在化ドメインは、小胞体（ＥＲ）保持配列、ゴルジ体保持配列、およびプロテオソーム局在化配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む保持シグナル伝達ドメインを含み、局在化ドメインに連結された標的結合分子は、操作された細胞によって分泌されない、操作されたＣＤ３／ＴＣＲαβ陰性Ｔ細胞。
【０１５３】
実施形態２。ＣＤ３／ＴＣＲαβ複合体タンパク質が、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、およびＣＤ３ζからなる群から選択される、実施形態１に記載の操作されたＴ細胞。
【０１５４】
実施形態３抗体が、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である、実施形態１または２に記載の操作された免疫細胞。
【０１５５】
実施形態４ｓｃＦｖが、配列番号１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する可変重鎖（ＶＨ）配列と、配列番号２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する可変軽鎖（ＶＬ）配列とを含む、実施形態３に記載の操作されたＴ細胞。
【０１５６】
実施形態５ｓｃＦｖが、配列番号１に記載の可変重鎖（ＶＨ）配列と配列番号２に記載の可変軽鎖（ＶＬ）配列とを含む、実施形態３に記載の操作されたＴ細胞。
【０１５７】
実施形態６操作されたＴ細胞が、操作されたＣＤ４＋Ｔ細胞または操作されたＣＤ８＋Ｔ細胞である、実施形態１〜５のいずれか１つに記載の操作されたＴ細胞。
【０１５８】
実施形態７操作されたＴ細胞が、操作されたヘルパーＴ細胞または操作された制御性Ｔ細胞である、実施形態１〜５のいずれか１つの操作されたＴ細胞。
【０１５９】
実施形態８操作されたＴ細胞が、操作されたエフェクターＴ細胞または操作された記憶Ｔ細胞である、実施形態１〜５のいずれか１つに記載の操作されたＴ細胞。
【０１６０】
実施形態９操作されたＴ細胞が、同種異系Ｔ細胞である、実施形態１〜８のいずれか１つに記載の操作されたＴ細胞。
【０１６１】
実施形態１０操作されたＴ細胞が、自己Ｔ細胞である、実施形態１〜８のいずれか１つに記載の操作されたＴ細胞。
【０１６２】
実施形態１１局在化ドメインが、ＣＤ８α、ＣＤ８β、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、またはＦＧＦＲ２Ｂに由来する膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメインをさらに含む、実施形態１〜１０のいずれか１つに記載の操作されたＴ細胞。
【０１６３】
実施形態１２膜貫通ドメインが、ＣＤ８αに由来する膜貫通ドメインである、実施形態１１に記載の操作されたＴ細胞。
【０１６４】
実施形態１３ＥＲ保持配列が、ＫＤＥＬ（配列番号３２）、ＫＫＭＰ（配列番号３３）、ＫＫＴＮ（配列番号４３）、またはＫＫＸＸ（前記Ｘは任意のアミノ酸である）（配列番号３５）から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１〜１２のいずれか１つに記載の操作されたＴ細胞。
【０１６５】
実施形態１４局在化ドメインが、図８Ａのいずれか１つまたは配列番号１１〜３１のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１〜１３のいずれか１つに記載の操作されたＴ細胞。
【０１６６】
実施形態１５ＣＤ３／ＴＣＲαβ発現が、操作されたＴ細胞においてブロックされる、実施形態１〜１４のいずれか１つに記載の操作されたＴ細胞。
【０１６７】
実施形態１６ＣＤ３／ＴＣＲαβ発現の妨害が、少なくとも６ヶ月間または少なくとも１２ヶ月間持続する、実施形態１５に記載の操作されたＴ細胞。
【０１６８】
実施形態１７操作されたＴ細胞が、相当するＴ細胞と実質的に同等の速度で増殖する、実施形態１〜１６のいずれか１つに記載の操作されたＴ細胞。
【０１６９】
実施形態１８操作されたＴ細胞が、細胞の投与時に対象において移植片対宿主応答の低下を誘発する、実施形態１〜１７のいずれか１つに記載の操作されたＴ細胞。
【０１７０】
実施形態１９操作されたＴ細胞が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をさらに含む、実施形態１〜１８のいずれか１つに記載の操作されたＴ細胞。
【０１７１】
実施形態２０ＣＡＲが、抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖドメイン、４−１ＢＢ刺激シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む、実施形態１９に記載の操作されたＴ細胞。
【０１７２】
実施形態２１操作されたＴ細胞が、ＣＤ１９＋癌細胞の細胞傷害性を誘導する、実施形態２０に記載の操作されたＴ細胞。
【０１７３】
実施形態２２ＣＡＲが、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖドメイン、４−１ＢＢ刺激シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む、実施形態１９に記載の操作されたＴ細胞。
【０１７４】
実施形態２３操作されたＴ細胞が、ＣＤ３＋癌細胞の細胞傷害性を誘導する、実施形態２２に記載の操作されたＴ細胞。
【０１７５】
実施形態２４操作されたＴ細胞の少なくとも９０％がＣＤ３／ＴＣＲαβ発現の妨害を示す、実施形態１〜２３に記載の操作されたＴ細胞のいずれか１つを含む操作されたＴ細胞の実質的に純粋な集団。
【０１７６】
実施形態２５操作されたＴ細胞の少なくとも９５％がＣＤ３／ＴＣＲαβ発現の妨害を示す、請求項２４に記載の操作されたＴ細胞の実質的に純粋な集団。
【０１７７】
実施形態２６自己免疫疾患またはウイルス疾患の治療を必要とする患者において自己免疫疾患またはウイルス疾患を治療する方法であって、実施形態１〜１８のいずれか１つに記載の操作されたＴ細胞を含む薬学的組成物の治療的有効量を自己免疫疾患またはウイルス疾患を有する患者に投与することを含む、方法。
【０１７８】
実施形態２７患者における移植片対宿主病の可能性を低減または排除する方法であって、実施形態１〜１８のいずれか１つに記載の操作されたＴ細胞を含む薬学的組成物の治療的有効量を患者に投与することを含む、方法。
【０１７９】
実施形態２８投与が静脈内、筋肉内、皮下、動脈内、腹腔内、またはくも膜下腔内投与を含む、実施形態２６または２７に記載の方法。
【０１８０】
実施形態２９癌の治療を必要とする患者において癌を治療する方法であって、実施形態１９〜２３に記載のいずれか１つの操作されたＴ細胞を含む治療的有効量の薬学的組成物を癌患者に投与し、それにより患者の癌を治療することを含む、方法。
【０１８１】
実施形態３０癌がＢ細胞悪性腫瘍である、実施形態２９に記載の方法。
【０１８２】
実施形態３１Ｂ細胞悪性腫瘍が、再発性または難治性の急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（Ｂ−ＮＨＬ）、および大細胞Ｂ細胞リンパ腫からなる群から選択される、実施形態３０に記載の方法。
【０１８３】
実施形態３２投与が、静脈内注入、動脈内注入、腹腔内注入、腫瘍への直接注射および／または手術後の腫瘍床の灌流、人工足場の腫瘍部位への移植、または髄腔内投与を含む、実施形態２９〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【０１８４】
実施形態３３局在化ドメインに連結された標的結合分子をコードするポリヌクレオチドであって、標的結合分子はＣＤ３／ＴＣＲαβ複合体タンパク質に結合する抗体を含み、局在化ドメインは、小胞体（ＥＲ）保持配列、ゴルジ体保持配列、およびプロテオソーム局在化配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む保持シグナル伝達ドメインを含む、ポリヌクレオチド。
【０１８５】
実施形態３４ＣＤ３／ＴＣＲαβ複合体タンパク質が、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、およびＣＤ３ζからなる群から選択される、実施形態３３に記載のポリヌクレオチド。
【０１８６】
実施形態３５抗体が、ｓｃＦｖである、実施形態３３または３４に記載のポリヌクレオチド。
【０１８７】
実施形態３６前記ｓｃＦｖが、配列番号１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する可変重鎖（ＶＨ）配列と、配列番号２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する可変軽鎖（ＶＬ）配列とを含む、実施形態３５に記載のポリヌクレオチド。
【０１８８】
実施形態３７前記ｓｃＦｖが、配列番号１に示される可変重鎖（ＶＨ）配列と、配列番号２に示される可変軽鎖（ＶＬ）配列とを含む、実施形態３５に記載のポリヌクレオチド。
【０１８９】
実施形態３８局在化ドメインが、ＣＤ８α、ＣＤ８β、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、またはＦＧＦＲ２Ｂに由来する膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメインをさらに含む、実施形態３３〜３７のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
【０１９０】
実施形態３９膜貫通ドメインがＣＤ８αに由来する膜貫通である、実施形態３８に記載のポリヌクレオチド。
【０１９１】
実施形態４０保持シグナル伝達ドメインが、ＫＤＥＬ（配列番号３２）、ＫＫＭＰ（配列番号３３）、ＫＫＴＮ（配列番号４３）、またはＫＫＸＸ（前記Ｘは任意のアミノ酸である）（配列番号３５）から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態３３〜３９のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
【０１９２】
実施形態４１局在化ドメインが、図８Ａのいずれか１つまたは配列番号１１〜３１のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態３３〜４０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
【０１９３】
実施形態４２実施形態３３〜４１のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【０１９４】
実施形態４３キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、実施形態４２に記載の発現ベクター。
【０１９５】
実施形態４４局在化ドメインに連結された標的結合分子をコードするポリヌクレオチドと、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドが、バイシストロン性である、実施形態４３に記載の発現ベクター。
【０１９６】
実施形態４５実施形態４２〜４４のいずれか１つに記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【０１９７】
実施形態４６癌を治療するための、実施形態２５または２６における操作されたＴ細胞の実質的に純粋な集団の使用であって、実質的に純粋な集団の操作されたＴ細胞の治療有効量を、癌の治療を必要とする対象に投与することを含む、使用。
【０１９８】
実施形態４７癌がＢ細胞悪性腫瘍である、実施形態４６に記載の使用。
【０１９９】
実施形態４８Ｂ細胞悪性腫瘍が、再発性または難治性の急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（Ｂ−ＮＨＬ）、および大細胞Ｂ細胞リンパ腫からなる群から選択される、実施形態４７に記載の使用。
【０２００】
実施形態４９操作された免疫細胞の実質的に純粋な集団が、静脈内注入、動脈内注入、腹腔内注入、腫瘍への直接注射および／または手術後の腫瘍床の灌流、人工足場の腫瘍部位への移植、または髄腔内投与によって対象に投与される、実施形態４６〜４８のいずれか１つに記載の使用。
【０２０１】
実施形態５０（ｉ）請求項３３〜４１のいずれか一項に記載の局在化ドメインに連結された標的結合ドメインをコードするポリヌクレオチドをＴ細胞に導入することと、（ｉｉ）得られたＣＤ３／ＴＣＲαβ陰性Ｔ細胞を単離することと、を含む、操作されたＣＤ３／ＴＣＲαβ陰性Ｔ細胞を産生する方法。
【０２０２】
実施形態５１Ｔ細胞が、同種異系Ｔ細胞である、実施形態５０に記載の方法。
【０２０３】
実施形態５２Ｔ細胞が、操作されたＣＤ４＋Ｔ細胞または操作されたＣＤ８＋Ｔ細胞である、実施形態５０または５１に記載の方法。
【０２０４】
実施形態５３操作されたＴ細胞が、操作されたヘルパーＴ細胞または操作された制御性Ｔ細胞である、実施形態５０または５１に記載の方法。
【０２０５】
実施形態５４操作されたＴ細胞が、操作されたエフェクターＴ細胞または操作された記憶Ｔ細胞である、実施形態５０または５１に記載の方法。
【０２０６】
実施形態５５キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドをＴ細胞に導入することをさらに含む、実施形態５０〜５４のいずれか１つに記載の方法。
【０２０７】
実施形態５６局在化ドメインに連結された標的結合ドメインをコードするポリヌクレオチドと、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドが、ＣＡＲをコードする核酸に機能的に連結されている、バイシストロン性である、実施形態５５に記載の方法。
【０２０８】
実施形態５７（ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と、（ｉｉ）局在化ドメインに結合した標的結合分子を含む、操作されたＣＤ３／ＴＣＲαβ陰性キメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ−Ｔ）細胞であって、標的結合分子は、ＣＤ３／ＴＣＲαβ複合体タンパク質に結合する抗体を含み、局在化ドメインは、小胞体（ＥＲ）保持配列、ゴルジ体保持配列、およびプロテオソームからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む保持シグナル伝達ドメインを含み、局在化ドメインに連結された標的結合分子は、操作されたＣＡＲ−Ｔ細胞によって分泌されない、操作されたＣＤ３／ＴＣＲαβ陰性キメラ抗原受容体Ｔ細胞。
【０２０９】
実施形態５８ＣＤ３／ＴＣＲαβ複合体タンパク質が、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、およびＣＤ３ζからなる群から選択される、実施形態５７に記載の操作されたＣＡＲ−Ｔ細胞。
【０２１０】
実施形態５９抗体が、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である、実施形態５７または５８に記載の操作されたＣＡＲ−Ｔ細胞。
【０２１１】
実施形態６０ｓｃＦｖが、配列番号１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する可変重鎖（ＶＨ）配列と、配列番号２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する可変軽鎖（ＶＬ）配列を含む、実施形態５９に記載の操作されたＣＡＲ−Ｔ細胞。
【０２１２】
実施形態６１ｓｃＦｖが、配列番号１に示される可変重鎖（ＶＨ）配列と、配列番号２に示される可変軽鎖（ＶＬ）配列とを含む、実施形態５９に記載の操作されたＣＡＲ−Ｔ細胞。
【０２１３】
実施形態６２操作されたＣＡＲ−Ｔ細胞が、操作されたＣＤ４＋Ｔ細胞または操作されたＣＤ８＋Ｔ細胞である、実施形態５７〜６１のいずれか１つに記載の操作されたＣＡＲ−Ｔ細胞。
【０２１４】
実施形態６３操作されたＣＡＲ−ＴＴ細胞が、操作されたヘルパーＴ細胞または操作された制御性Ｔ細胞である、実施形態５７〜６１のいずれか１つに記載の操作されたＣＡＲ−Ｔ細胞。
【０２１５】
実施形態６４操作されたＣＡＲ−Ｔ細胞が、操作されたエフェクターＴ細胞または操作された記憶Ｔ細胞である、実施形態５７〜６１のいずれか１つに記載の操作されたＣＡＲ−Ｔ細胞。
【０２１６】
実施形態６５操作されたＣＡＲ−Ｔ細胞が、自己Ｔ細胞である、実施形態５７〜６４のいずれか１つに記載の操作されたＣＡＲ−Ｔ細胞。
【０２１７】
実施形態６６操作されたＣＡＲ−Ｔ細胞が、同種異系Ｔ細胞である、実施形態５７〜６４のいずれか１つに記載の操作されたＣＡＲ−Ｔ細胞。
【０２１８】
実施形態６７局在化ドメインが、ＣＤ８α、ＣＤ８β、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、またはＦＧＦＲ２Ｂに由来する膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメインをさらに含む、実施形態５７〜６６のいずれか１つに記載の操作されたＣＡＲ−Ｔ細胞。
【０２１９】
実施形態６８膜貫通ドメインがＣＤ８αに由来する膜貫通ドメインである、実施形態６７に記載の操作されたＣＡＲ−Ｔ細胞。
【０２２０】
実施形態６９ＥＲ保持配列が、ＫＤＥＬ（配列番号３２）、ＫＫＭＰ（配列番号３３）、ＫＫＴＮ（配列番号４３）、またはＫＫＸＸ（前記Ｘは任意のアミノ酸である）（配列番号３５）から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態５７〜６８のいずれか１つに記載の操作されたＣＡＲ−Ｔ細胞。
【０２２１】
実施形態７０局在化ドメインが、図８Ａのいずれか１つまたは配列番号１１〜３１のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態５７〜６９のいずれか１つに記載の操作されたＣＡＲ−Ｔ細胞。
【０２２２】
実施形態７１ＣＡＲが、ＣＤ３またはＣＤ１９に結合する、実施形態５７〜７０のいずれか１つに記載の操作されたＣＡＲ−Ｔ細胞。
【０２２３】
実施形態７２ＣＡＲが、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖドメイン、４−１ＢＢ刺激シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む、実施形態７１に記載の操作されたＣＡＲ−Ｔ細胞。
【０２２４】
実施形態７３ＣＡＲが、抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖドメイン、４−１ＢＢ刺激シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む、実施形態７１に記載の操作されたＣＡＲ−Ｔ細胞。
【実施例】
【０２２５】
実施例１：Ｔ細胞受容体欠損キメラ抗原受容体Ｔ細胞を生成する新規方法
摘要
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）−Ｔ細胞療法を改善する実用的な方法は、それらの適用性を広げるために必要である。自己ＣＡＲ−Ｔ細胞の代わりに同種異系ＣＡＲ−Ｔ細胞を使用することは魅力的であるが、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）のリスクを減らすために内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をノックダウンする必要がある。表面のＴＣＲαβを除去するために、ＣＤ３εに特異的な抗体由来の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）と、細胞内でそれを保持するために媒介すると予測される２１種類のアミノ酸配列を組み合わせた。ジャーカット細胞および末梢血Ｔ細胞への形質導入後、これらのタンパク質発現ブロッカー（ＰＥＢＬ）のいくつかはＣＤ３と細胞内で共局在し、表面ＣＤ３およびＴＣＲαβ発現をブロックした。２５回の実験で、Ｔリンパ球のＴＣＲαβ発現の中央値は９５．７％から２５．０％に減少し、ＣＤ３／ＴＣＲαβ細胞の枯渇により、実質的に純粋なＴＣＲαβ陰性Ｔ細胞が得られた。抗ＣＤ３εＰＥＢＬは、免疫表現型や増殖に影響を与えることなく、ＴＣＲαβを介したシグナル伝達を抑制した。抗ＣＤ３εＰＥＢＬ−Ｔ細胞では、抗ＣＤ１９−４１ＢＢ−ＣＤ３ζＣＡＲの発現により、通常のＣＤ３／ＴＣＲαβ発現を有するＣＡＲ−Ｔ細胞と同等以上の割合で、サイトカイン分泌、長期増殖、ＣＤ１９＋白血病細胞の死滅が誘導された。免疫不全マウスでは、抗ＣＤ３εＰＥＢＬ  Ｔ細胞はＧＶＨＤポテンシャルを著しく低下させ、抗ＣＤ１９  ＣＡＲを形質導入すると、これらのＴ細胞は白血病細胞を移植した。ＣＤ３／ＴＣＲαβ発現のＰＥＢＬ遮断は、同種異系ＣＡＲ−Ｔ細胞を調製するための効果的なツールである。ＰＥＢＬとＣＡＲを組み合わせた発現は、シングルステップ手順で実現でき、現在の細胞製造プロトコルに容易に適応でき、他のＴ細胞分子を標的としてＣＡＲ−Ｔ細胞療法を強化するために使用できる。
【０２２６】
導入
遺伝子操作された免疫細胞は、癌の強力な新しい治療法である。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴリンパ球を用いた最近の臨床試験の結果は、このアプローチの力の説得力のある実証を提供した。したがって、表面分子ＣＤ１９に特異的なＣＡＲ−Ｔ細胞は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病、非ホジキンリンパ腫などの治療抵抗性のＣＤ１９陽性悪性腫瘍患者の形態学的および分子的寛解を誘発した。１−１０他の悪性腫瘍は、異なる抗原に対してリダイレクトされたＴ細胞によって攻撃される可能性がある。したがって、腫瘍学における遺伝子操作された細胞療法の可能な応用は広範囲である。１０，１１
【０２２７】
ＣＡＲ−Ｔ細胞の最初の臨床経験は、治療効果を低下させ、開発を妨げる可能性のある制限も特定した。主要な問題は、がん患者から収集された免疫細胞の適応度が変化することであり、その結果、生体内で増殖し、抗腫瘍効果を発揮する予測不可能な能力がもたらされる。１０，１２この可変性は、最も効果的な細胞投与量の特定を複雑にし、短命で効果のない細胞の注入につながる可能性がある。健康なドナーからのＴリンパ球は、より良い一貫性と有効性を提供するはずであるが、ドナーリンパ球注入の潜在的に致命的な結果である移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）のリスクをもたらす。１３，１４このような同種異系環境では、宿主組織を認識する能力を抑制するために、注入されたＴ細胞に対する追加の修正、すなわち、ＣＤ３／ＴＣＲαβのダウンレギュレーション、が必要である。１５，１６
【０２２８】
遺伝子編集に関する現代の方法論は、癌の細胞療法に関連する新しい機会を開いている。１７ジンクフィンガーメガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、およびＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９はＴＣＲαβ鎖をコードする遺伝子を削除し、アロ反応性を欠くＴ細胞を誘導する１５，１８，１９一方、拒絶反応を遅らせるために他の遺伝子を標的にすることができる。１５ＴＡＬＥＮを用いる、抗ＣＤ１９  ＣＡＲの発現と一緒にＴＣＲαおよびＣＤ５２の遺伝子座の削除のレポートは、それが依然として技術的に困難かもしれないが、遺伝子編集とＣＡＲの発現を組み合わせることは、臨床設定、で実行可能であることを示している。２０
【０２２９】
がんの細胞ベースの治療を強化するためのツールの貯蔵庫を拡大するために、免疫細胞における表面受容体発現の単純かつ効果的な遮断を可能にする方法を開発した。タンパク質発現ブロッカー（ＰＥＢＬ）という名前の特定の構築物は、標的タンパク質の細胞膜への輸送を防ぐ。ＰＥＢＬ構築物は、他の遺伝子修飾と容易に組み合わせることができ、免疫細胞の機能を最適化するためのエクスビボ細胞処理用の既存の臨床グレードのプロトコルに組み込むことができる。ＣＡＲ−Ｔ細胞におけるＣＤ３／ＴＣＲαβ発現をダウンレギュレートするこのアプローチの可能性を試験した。
【０２３０】
材料および方法
腫瘍細胞株とＴ細胞
Ｋｕｒｋａｔ、Ｌｏｕｃｙ、Ｎａｌｍ６、ＲＳ４；１１、およびＫ５６２は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（メリーランド州、ロックビル）から得て、ＯＰ−１は私たちの研究室で設立した。２１マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）レトロウイルスベクターを使用してＮａｌｍ６で、ホタルルシフェラーゼ遺伝子と緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を、Ｋ５６２でＣＤ１９とＤｓＲｅｄを発現させた。２２
【０２３１】
健康なドナーからの末梢血は、ヘルシンキ宣言に従って、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ（シンガポール国立大学）の承認を得て、シンガポールのＮａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋでの血小板提供の匿名化された副産物から入手した。単核細胞は、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ、ノルウェー、オスロ）での遠心分離によって分離された。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｔ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州ウォルサム）で強化されたＴ細胞を、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）、１０％ウシ胎児血清（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、イリノイ州シカゴ）および抗生物質で培養し、インターロイキン２（ＩＬ−２；Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ，Ｎｏｖａｒｔｉｓ，スイス、バーゼル、１００ＩＵ／ｍＬ）を２日ごとに添加した。
【０２３２】
ＰＥＢＬ構築物
ＰＬＵ４マウスハイブリドーマのＲＮＡから、抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体（免疫グロブリンＧ２ａ［ＩｇＧ２ａ］アイソタイプ、Ｃｒｅａｔｉｖｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ニューヨーク州、シャーリー）を分泌させ、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素とＯｌｉｇｏ（ｄＴ）１５プライマー（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州、マディソン）によってｃＤＮＡを合成した。ＩｇＧ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｓｅｔ  Ｍｏｕｓｅ  ＢｉｏＧｅｎｏｍｉｃｓ（ＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、マサチューセッツ州、セーラム）で重鎖および軽鎖の可変領域を増幅し、可動性リンカー配列エンコード（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４によって単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）に組み立てた。ＣＤ８αシグナルペプチドおよび膜貫通ドメインは、ヒト活性化Ｔ細胞ｃＤＮＡから得た。
【０２３３】
ＰＥＢＬ構築物を生成するために、各保持シグナル伝達ドメイン（図８Ａ）をＰＣＲにより可変重鎖フラグメントの３´末端に付加した。構築物を、配列内リボソーム進入部位およびＧＦＰまたはｍＣｈｅｒｒｙを含むＭＳＣＶレトロウイルスベクターにサブクローニングした。レトロウイルス上清の調製と遺伝子導入は前述のように行った。２３手短に言えば、レトロウイルスベクター馴化培地をＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（Ｔａｋａｒａ、日本、大津）でコーティングされたポリプロピレンチューブに加えた、上清を除去した後、活性化Ｔ細胞を添加し、３７℃で１２時間放置した、新鮮なウイルス上清を他の２日間連続して追加した。Ｔリンパ球を、実験時まで、ウシ胎児血清、抗生物質、および２００ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２を含むＲＰＭＩ−１６４０で維持した。
【０２３４】
ＰＥＢＬ形質導入後に残留ＣＤ３／ＴＣＲαβ陽性Ｔ細胞を除去するために、抗ＡＰＣ  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓおよびＬＤカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）とともにアロフィコシアニン（ＡＰＣ）結合抗ＣＤ３（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州、サンノゼ、またはＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、ドイツ、ベルギッシュグラートバッハ）および抗ＴＣＲαβ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カリフォルニア州、サンディエゴ）を使用した。
【０２３５】
【０２３６】
ＰＥＢＬについて説明したように、抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ、ＣＤ８αヒンジおよび膜貫通ドメイン、ならびに４１ＢＢおよびＣＤ３ζの細胞質ドメイン（抗ＣＤ１９−４１ＢＢ−ＣＤ３ζ）２２で構成されるＣＡＲをＭＳＣＶベクターに挿入した。いくつかの実験では、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ１９で形質導入された１００Ｇｙ照射Ｋ５６２細胞との共培養により、１：１のＥ：Ｔ比で増殖した。また、自己切断２Ａペプチドをコードする配列で区切られたＣＡＲとＰＥＢＬの両方の構築物を含むＭＳＣＶベクターでＴ細胞を形質導入した。２４抗ＣＤ１９−４１ＢＢ−ＣＤ３ζｍＲＮＡのエレクトロポレーションは、前述のように実施した。２５，２６ｍＲＮＡなしでエレクトロポレーションした細胞を対照として使用した。
【０２３７】
ｓｃＦｖ特異性、ＰＥＢＬおよびＣＡＲ発現、および細胞マーカープロファイルの決定
ＰＬＵ４ハイブリドーマ由来の抗体に結合したＣＤ３サブユニットを同定するために、各ＣＤ３サブユニットのｃＤＮＡ（Ｏｒｉｇｅｎｅ、メリーランド州ロックビル）をＭＳＣＶ−配列内リボソーム進入部位−ＧＦＰにサブクローニングし、Ｋ５６２細胞に形質導入した。次に、Ｋ５６２細胞を８Ｅ試薬（発明者らが開発した透過処理試薬）で透過処理し、ＰＬＵ４ハイブリドーマ細胞の上清とインキュベートした後、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、アラバマ州、バーミンガム）でインキュベートした。
【０２３８】
ＣＡＲおよびＰＥＢＬの発現を、ビオチンコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ´）２抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ウェストグローブ、ペンシルバニア州）、およびフィコエリトリン（ＰＥ）またはＡＰＣコンジュゲートストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）によって検出した。細胞内染色のために、細胞を８Ｅで透過処理した。ＰＥＢＬが分泌されているかどうかを判断するために、抗ＣＤ３εｓｃＦｖまたはＰＥＢＬを導入したジャーカットの上清をＬｏｕｃｙに加え、４℃で４５分間インキュベートした。ビオチン結合ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ´）２抗体とストレプトアビジンＡＰＣで表面結合ｓｃＦｖとＰＥＢＬを検出した。
【０２３９】
ＣＤ３発現は、抗ＣＤ３  ＡＰＣ（ＳＫ７、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で検出した。ＰＥまたはＡＰＣコンジュゲート抗ＴＣＲαβ（ＩＰ２６）、ＣＤ２  ＡＰＣ（ＲＰＡ−２．１０）、ＣＤ１３７  ＡＰＣ（４Ｂ４−１）、ＣＤ２７９  ＰＥ（ＥＨ１２．２Ｈ７）、およびＣＤ３６６  ＰＥ（Ｆ３８−２Ｅ２）はＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（Ｓａｎカリフォルニア州ディエゴ）から得た。Ａｎｔｉ−ＣＤ４  ＰＥ−Ｃｙ７（ＳＫ３）、ＣＤ８  ＰＥ（ＲＰＡ−Ｔ８）、ＣＤ７  ＰＥ（Ｍ−Ｔ７０１）、ＣＤ２５  ＰＥ−Ｃｙ７またはＡＰＣ（２Ａ３）、ＣＤ６２Ｌ  ＡＰＣ（ＤＲＥＧ−５６）、およびＣＤ６９  ＰＥまたはＡＰＣ（Ｌ７８）ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから得た、ＣＤ２２３  ＡＰＣ（３ＤＳ２２３Ｈ）はＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒから得た。ＦｏｒｔｅｓｓａまたはＡｃｃｕｒｉＣ６フローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、細胞染色を分析した。
【０２４０】
Ｔ細胞の活性化、サイトカイン産生、増殖、細胞毒性
ＯＫＴ３（１０μｇ／ｍＬ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）またはアイソタイプ適合（ｉｓｏｔｙｐｅ−ｍａｔｃｈｅｄ）対照（Ｒ＆Ｄ、ミネソタ州、ミネアポリス）を９６ウェル平底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ニューヨーク州、コーニング）に分注し、４℃で１２時間放置した。可溶性抗体を除去した後、１ウェルあたり１〜２×１０５個のジャーカット細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間培養した。ＰＥまたはＡＰＣコンジュゲート抗ＣＤ２５および抗ＣＤ６９抗体を使用して、対照としてアイソタイプ適合の非反応性抗体（すべてＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）を使用して、Ｔ細胞活性化を決定した。
【０２４１】
ジャーカット細胞は、ＨＬＡ−Ａ２に関連するＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ｓ１８３ペプチドに特異的なＴＣＲで形質導入された（Ａ．Ｂｅｒｔｏｌｅｔｔｉ、Ｄｕｋｅ−ＮＵＳ、シンガポール提供）。２７ＴＣＲはネオマイシン耐性遺伝子を含むＭＳＣＶベクターに挿入され、形質導入された細胞はネオマイシンへの暴露により選択された。フルオレセインイソチオシアネートにコンジュゲートした抗ＴＣＲＶβ３抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、カリフォルニア州、ブレア）を用いて、細胞表面および細胞内（８Ｅでの細胞透過処理後）のＴＣＲβの発現を検出した。抗ＣＤ３  ＰＥＢＬを含むまたは含まないｍＣｈｅｒｒｙベクターで形質導入されたＨＢＶ  ｓ１８３−ジャーカット細胞を、１μｇ／ｍＬ  ＨＢＶ  ｓ１８３ペプチド（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）でパルスしたＴ２細胞（Ａ．Ｂｅｒｔｏｌｅｔｔｉからも）と１：１  Ｅ：Ｔ比で共培養した。２４時間後、細胞は抗ＣＤ２５  ＰＥおよび抗ＣＤ６９  ＡＰＣで染色された。
【０２４２】
インターフェロンγ（ＩＦＮγ）産生を測定するために、１×１０５個のＴ細胞と２×１０５個のＲＳ４；１１細胞を９６ウェル丸底プレートに播種した。０．１％Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａ（ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の存在下で８時間後、細胞膜透過処理後、細胞をＡＰＣまたはＰＥコンジュゲート抗ＩＦＮγ（クローン２５７２３．１１、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で標識した。
【０２４３】
細胞増殖を測定するために、ＣＡＲまたはＧＦＰのみで形質導入した５×１０４Ｔ細胞を、１０％ウシ胎児血清、抗生物質、および２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含むＲＰＭＩ−１６４０の９６ウェル丸底プレートに入れた。ＯＰ−１細胞を照射（１００Ｇｙ）し、１：１  Ｅ：ＴでＴ細胞と混合した。２日ごとに、２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ２を追加した。ＧＦＰ＋細胞を、フローサイトメトリーによりカウントした。照射されたＯＰ−１細胞の新しいセットが、７日ごとに１：１  Ｅ：Ｔで追加された。２３
【０２４４】
細胞傷害性を試験するために、標的細胞をカルセインレッドオレンジＡＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）で標識し、１００μＬあたり５×１０４細胞の濃度で９６ウェル丸底プレートに播種した。Ｔ細胞を様々なＥ：Ｔ比で添加し、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。４時間後、フローサイトメトリーにより生存標的細胞の数を数えた。一部の試験では、ルシフェラーゼ標識細胞を標的として使用した。アッセイは９６ウェル平底プレートで実施し、４時間後にＢｒｉｇｈｔＧｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）をウェルに加え、Ｆｌｘ８００プレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ、バーモント州、ウィヌースキー）を使用して発光を測定した。２３
【０２４５】
マウスモデル
ＧＶＨＤをモデル化するために、ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩＬ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、メイン州、バーハーバー）は２．５Ｇｙの全身照射を受けた。１日後、抗ＣＤ３  ＰＥＢＬとＧＦＰまたはＧＦＰのみのいずれかを形質導入した１×１０７個のＴ細胞を静脈内注入した。すべてのマウスに、週３回ＩＬ−２（２００００ＩＵ）を腹腔内（ＩＰ）投与した。体重とＧＶＨＤ症状を週３回監視した。頬穿刺により血液を週１回採取した。２回の連続測定で体重の減少がベースラインの２０％を超えたときにマウスを安楽死させた。ＧＶＨＤの組織病理学的評価は、分子細胞生物学研究所（シンガポール）のＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙで実施された。免疫組織化学には、抗ヒトＣＤ３ポリクローナル抗体（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州サンタクララ）、抗ヒトＣＤ４（ＥＰＲ６８５５）、および抗ヒトＣＤ８（ＥＰ１１５０Ｙ、両者ともＡｂｃａｍ、英国ケンブリッジから入手）を使用した。
【０２４６】
急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）モデルでは、ルシフェラーゼを発現するＮａｌｍ６細胞（マウスあたり０．５×１０６細胞）を静脈内注射し、３日後に抗ＣＤ１９−４１ＢＢ−ＣＤ３ζと抗ＣＤ３  ＰＥＢＬまたはｍＣｈｅｒｒｙいずれかで形質導入されたＴ細胞で注射した（マウスあたり２×１０７静脈内）；対照マウスにはＲＰＭＩ−１６４０培地を投与した。２番目の実験では、３日目にＴ細胞またはＲＰＭＩ−１６４０を注入する前に、マウスに２．５Ｇｙの全身照射を行った。すべてのマウスにＩＬ−２（２００００  ＩＵ）を週３回ＩＰで投与した。白血病細胞負荷は、１５０μｇ／ｇ体重のｄ−ルシフェリンカリウム塩水溶液（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）ＩＰで注射した後、Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ−２００システム（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒマサチューセッツ州、ウォルサム）で測定した。発光は、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ３．０ソフトウェアで分析された。発光が１×１０１０光子／秒に達したとき、または２回の連続測定で体重減少がベースラインの２０％を超えた場合、もしくは安楽死を正当化する他の身体的兆候があった場合にはより早く、マウスを安楽死させた。
【０２４７】
結果
ＰＥＢＬ構築物の設計と機能性スクリーニング
ＣＤ３／ＴＣＲαβ複合体は小胞体（ＥＲ）に集合しており、細胞表面発現にはすべての構成要素が必要である。ＰＬＵ４抗体のＣＤ３特異性を決定するために、Ｋ５６２細胞にＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、およびＣＤ３ζを単独または組み合わせて形質導入し、フローサイトメトリーによりＰＬＵ４反応性を試験した（図９）。染色パターンは、ＣＤ３γまたはＣＤ３δのいずれかに関連する場合に最もアクセス可能なＣＤ３εのエピトープとの反応性を示した。
【０２４８】
ＰＬＵ４ハイブリドーマｃＤＮＡからｓｃＦｖを生成し、それをＥＲおよび／またはゴルジ装置に固定すると予測されるペプチドをコードする配列に連結した（図８Ａ）。ＣＤ３表面発現を抑制する能力について２１の構築物を試験し、それらを、ｓｃＦｖに連結したときに表面タンパク質の発現を抑制すると報告されている配列であるＳＥＫＤＥＬ（配列番号５０）を含む構築物と比較した。３１ジャーカット細胞では、多くのＰＥＢＬのレトロウイルス形質導入により、表面ＣＤ３発現がほぼ完全に消失した（図１Ａ〜１Ｂ）が、ＳＥＫＤＥＬ構築物を形質導入したほとんどの細胞はＣＤ３陽性のままであった。
【０２４９】
ＰＥＢＬ  １〜８、１１、および１９の発現は細胞内に限定されていた。他のＰＥＢＬは、様々な程度の表面発現を有していた（図１Ｃ、図１０Ａ〜１０Ｃ）。ＰＥＢＬは細胞内でＣ３と共局在した。ＰＥＢＬ１〜５との試験では分泌は検出されなかった（図１０Ａ〜１０Ｃ）。重要なことに、ＰＥＢＬは活性化末梢血Ｔリンパ球におけるＣＤ３発現も効果的にダウンレギュレートした（図１Ｄ）。
【０２５０】
ＰＥＢＬによるＣＤ３ダウンレギュレーションはＴＣＲαβ発現を抑制する
ＣＤ３に加えて、ＰＥＢＬ形質導入は、末梢血Ｔリンパ球のＴＣＲαβ発現もダウンレギュレートした。２５回の実験で、ＴＣＲαβを発現するＴ細胞の割合の中央値は、９５．７％（範囲、８９．４％〜９９．０％）から２５．０％（範囲、３．５％〜５５．２％、図２Ａ）に減少した。ＣＤ３／ＴＣＲαβダウンレギュレーションの程度を決定する主な要因は、レトロウイルス形質導入の効率であり、５８．５％〜９９．８％の範囲であった（ＧＦＰ＋細胞の中央値、９４．２％）。残留ＣＤ３／ＴＣＲαβ陽性細胞の磁気除去により、ＣＤ３／ＴＣＲαβ陰性Ｔ細胞の実質的に純粋な集団が得られた（図２Ｂ）。６人のドナーからの１１のＴ細胞調製物では、ＣＤ３／ＴＣＲαβが１回だけ枯渇した後、ＣＤ３／ＴＣＲαβの正常レベルを発現するＴ細胞は０．０１％（＜０．０１％〜０．１５％）であった。
【０２５１】
連続培養で維持された末梢血Ｔリンパ球およびジャーカット細胞では、ＣＤ３／ＴＣＲαβダウンレギュレーションが持続し、Ｔリンパ球では最大２か月、ジャーカット細胞では２１か月の追跡調査が行われた（図２Ｃ〜２Ｄ；図１１）。
【０２５２】
ＰＥＢＬによってダウンレギュレートされたＣＤ３／ＴＣＲαβを持つＴ細胞の機能
表面ＣＤ３／ＴＣＲαβの欠如に加えて、ＰＥＢＬで形質導入されたリンパ球に顕著な表現型の変化はなかった。ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２５、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、およびＣＤ３６６（ＴＩＭ−３）の発現は有意に変化しなかった（ＦＧＩ．８Ｂ）。Ｔ細胞の増殖も影響を受けなかった。ジャーカット細胞を用いた実験では、ＰＥＢＬ形質導入細胞の増殖速度はＧＦＰのみで形質導入された細胞の増殖速度と同一であった（図３Ａ）。同様に、ＩＬ−２（２００ＩＵ／ｍＬ）を含む末梢血Ｔ細胞の増殖および生存は、ＰＥＢＬ形質導入およびＣＤ３／ＴＣＲαβダウンレギュレーションの影響を受けなかった（図３Ｂ）。
【０２５３】
予想どおり、表面ＣＤ３のノックダウンはＣＤ３シグナル伝達を抑制した。したがって、抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３で培養したジャーカット細胞では、細胞に抗ＣＤ３  ＰＥＢＬを導入した場合、活性化マーカーＣＤ２５およびＣＤ６９はアップレギュレートされなかった（図３Ｃ）。さらに、末梢血Ｔ細胞をＯＫＴ３とともに４８時間培養すると、ＧＦＰのみで形質導入された細胞の生存率は急速に低下したが、ＰＥＢＬ形質導入細胞の数は高いままであった（図３Ｄ）。最後に、ＨＬＡ−Ａ２に関連する発現されたＨＢＶ  ｓ１８３ペプチドに対するＴＣＲでＪｕｒｋａｔ細胞を形質導入した。２７抗ＣＤ３εＰＥＢＬ形質導入は、ＣＤ３、抗ＨＢＶＴＣＲαβ、およびそのＴＣＲＶβ３鎖の表面発現をブロックした（図３Ｅ）、ＨＢＶ  ｓ１８３ペプチドをパルスしたＨＬＡ−Ａ２発現細胞（Ｔ２）に応答する細胞の能力を抑制した（図３Ｆ）。
【０２５４】
抗ＣＤ３εＰＥＢＬで形質導入されたＴ細胞における抗ＣＤ１９  ＣＡＲの機能
ＰＥＢＬ形質導入はＴ細胞の免疫表現型と増殖に影響を与えず、ＰＥＢＬ−Ｔ細胞でのＣＡＲの発現はＣＤ３／ＴＣＲαβ陽性Ｔ細胞と同様に標的特異的細胞傷害性を誘発する可能性があることを示唆した。この考えを試験するために、Ｔ細胞で抗ＣＤ１９−４１ＢＢ−ＣＤ３ζＣＡＲおよび抗ＣＤ３  ＰＥＢＬを発現させ、それらの機能をＰＥＢＬなしのＣＡＲ−Ｔ細胞の機能と比較した。９対の実験では、ＣＤ３／ＴＣＲαβの発現に関係なく、ウイルス形質導入（ｎ＝４）またはｍＲＮＡエレクトロポレーション（ｎ＝５）によるＣＡＲ発現が高かった（図４Ａ〜４Ｂ）。ＰＥＢＬ発現もＣＤ３／ＴＣＲαβのダウンレギュレーションもＣＡＲ媒介ＩＦＮγ分泌およびＴ細胞増殖を含むＣＡＲ機能に影響しなかった（図４Ｃ〜４Ｄ）。
【０２５５】
ＣＡＲがｍＲＮＡエレクトロポレーションまたはウイルス形質導入によって発現されたかどうかに関係なく、ＰＥＢＬ形質導入Ｔ細胞におけるＣＡＲ発現は、ＣＤ１９＋白血病細胞標的に対する強力な細胞傷害性を誘導した（図５Ａ〜５Ｂ、図１２ａ〜１２Ｂ）。また、生細胞イメージングシステムを使用して、長期間にわたって低いＥ：Ｔ比でＣＡＲの細胞傷害性を測定した。ＣＡＲ＋ＰＥＢＬ−Ｔ細胞は、抗白血病細胞死滅を発揮するのにＰＥＢＬなしのＣＡＲ−Ｔ細胞と少なくとも同程度に有効であり、１：８および１：１６  Ｅ：Ｔでより高い細胞毒性が見られた（図５Ｃ〜５Ｄ）。
【０２５６】
ＣＡＲとＰＥＢＬの両方を含むバイシストロン性ベクターを使用することにより、ＣＡＲの発現と機能によるＣＤ３のダウンレギュレーションも効果的に達成できる（図１３Ａ〜１３Ｃ）。２４
【０２５７】
免疫不全マウスにおけるＰＥＢＬ−Ｔ細胞の異物反応性と抗白血病効力
ＰＥＢＬによるＣＤ３／ＴＣＲαβノックアウトの有効性をさらに試験するために、２．５Ｇｙの放射線を受けたＮＳＧマウスに抗ＣＤ３  ＰＥＢＬＴ細胞を注入し、ＧＶＨＤを引き起こすＴ細胞の能力を評価した。ＧＦＰのみを形質導入したヒトＴ細胞を注射した８匹のマウスはすべて、体重減少、貧血、および血小板減少症を示したが、これらのＧＶＨＤ徴候はＰＥＢＬ形質導入Ｔ細胞を注射した８匹のマウスのうち１匹のみで見られた（図６Ａ〜６Ｄ、生存率のログランク検定でＰ＝０．０００３）。末梢血で測定されたヒトＴ細胞数は、ＧＦＰ形質導入Ｔ細胞を注射したマウスで全体的に著しく高く（図６Ｅ）、ＰＥＢＬが異種抗原によるＴ細胞刺激を抑制したことを示唆している。ＧＶＨＤの発生は病理学的所見によって確認された（図１４Ｃおよび図８Ｃ）。
【０２５８】
インビトロ実験の結果は、抗ＣＤ１９  ＣＡＲを発現するＰＥＢＬ形質導入Ｔ細胞がＣＡＲ媒介細胞傷害能を保持していることを示した。したがって、異種移植ＡＬＬモデルで抗白血病能力を試験した。図７Ａ〜７Ｃに示すように、ＣＡＲ＋ＰＥＢＬ−Ｔ細胞は、抗ＣＤ３εＰＥＢＬの代わりにｍＣｈｅｒｒｙを形質導入したＣＡＲ−Ｔ細胞の速度と重複する速度でＮａｌｍ６白血病細胞を効果的に死滅させたのに対し、白血病細胞の増殖はすべての未処理対照マウスで発生した。３番目のモデルでは、前の２つの条件を組み合わせた。マウスにＮａｌｍ６細胞を注射し、生着を評価した後、マウスに２．５Ｇｙで照射し、ＰＥＢＬまたはｍＣｈｅｒｒｙのみで形質導入したＣＡＲ−Ｔ細胞で処理した。図７Ｄ〜７Ｅに示すように、すべての未処理の対照マウスは照射に関係なく白血病を発症したが、ＣＡＲ−Ｔ細胞は白血病の負担を著しく減少させた。特に、ＰＥＢＬなしでＣＡＲ−Ｔ細胞を投与された５匹のマウスのうち３匹がＧＶＨＤを発症した（＞２０％の体重減少、毛皮の減少、運動性の低下）が、ＣＡＲ＋ＰＥＢＬ  Ｔ細胞を投与された６匹のマウスはいずれも発症しなかった（図７Ｆ）。ＣＡＲ＋ｍＣｈｅｒｒｙ群の残りの２匹のマウス、およびＣＡＲ＋ＰＥＢＬ  Ｔ細胞を投与された６匹のマウスのうち４匹は、白血病細胞の生着後１５０日を超えて寛解状態を維持する（図７Ｆ）。
【０２５９】
考察
Ｔ細胞におけるＣＤ３／ＴＣＲαβの迅速かつ効率的なダウンレギュレーションを可能にする方法を開発した。抗ＣＤ３εＰＥＢＬ形質導入により、ＣＤ３εが細胞内に保持され、これによりＴリンパ球の表面でのＴＣＲαβの発現が防止された。細胞外漏出が最小限または全くなく、ＴＣＲαβシグナル伝達のブロッキングに非常に効果的なＰＥＢＬ構築物を特定した。抗ウイルスＴＣＲで形質導入されたＰＥＢＬ−Ｔ細胞は、同族のウイルスペプチドに応答できず、ＰＥＢＬ形質導入は、マウスのＧＶＨＤを引き起こすヒトＴ細胞の能力を著しく低下させた。ＰＥＢＬ発現とＣＤ３／ＴＣＲαβダウンレギュレーションは永続的であって、他の表面分子の発現、Ｔ細胞の生存、または増殖には影響しなかった。重要なことに、ＰＥＢＬ−Ｔ細胞はＣＡＲシグナル伝達に正常に反応し、インビトロおよびインビボでＣＡＲを標的とするＡＬＬ細胞を死滅させた。ＫＤＥＬ配列（配列番号３２）、ＫＫＤ／Ｅ配列ＫＫＭＰ配列（配列番号３３）、ＹＱＲＬ配列（配列番号３４）、またはＫＫＸＸ配列（Ｘは任意のアミノ酸配列である）（配列番号３５）。
【０２６０】
我々の研究で最高のＰＥＢＬは、ＫＤＥＬ（配列番号３２）またはＫＫＸＸ［配列番号３５、ＫＫＭＰ（配列番号３３）またはＫＫＴＮ（配列番号４３）などであるがこれらに限定されない］保持ドメインであり、それらは関連する管腔ＥＲタンパク質を固定し、それらの分泌または膜発現を防止する。３２，３３このように、我々の抗ＣＤ３εＰＥＢＬは、ＣＤ３／ＴＣＲαβ複合体の他の構成要素とのＣＤ３εアセンブリおよびその表面発現をブロックした。ＫＤＥＬペプチド（ＳＥＫＤＥＬ、配列番号５０など）は、ｓｃＦｖに以前に連結されており、主に細胞株で実施された実験で様々な効率でタンパク質発現をブロックしていた。３１，３４タンパク質輸送研究により、ＫＤＥＬを超えた位置−５および−６のアミノ酸が可溶性タンパク質のＥＲ局在化に重要であることがわかった。３５ＰＥＢＬの状況では、ｓｃＦｖとＫＤＥＬの間に介在する配列がその機能にとって重要であることを発見し、ＳＥＫＤＥＬと比較してタンパク質保持を改善する配列を同定した。タンパク質輸送研究では、カルボキシル末端ＫＫＸＸモチーフがＥＲ局在化を指示し、膜に関連するＫＫＸＸポジショニングがその効果的な機能にとって重要であることも示されていた。３６我々は、ＣＤ８α膜貫通ドメインに連結されたＫＫＸＸモチーフがＰＥＢＬの強固なアンカープラットフォームを構成し、これら２つの構成要素間のスペーサーがＰＥＢＬ機能に影響することを発見した。
【０２６１】
ＴＣＲαまたはＴＣＲβ鎖を直接標的にしていないため、潜在的な懸念は、フローサイトメトリーでは検出できないがシグナルを誘導するのに十分な低レベルのＴＣＲαβが依然として持続する可能性があることである。しかし、抗ＣＤ３εＰＥＢＬで形質導入されたＴ細胞は一般にＴＣＲ媒介シグナル伝達に反応しないことがわかった。ＣＤ３／ＴＣＲおよび／またはＰＥＢＬの保持がそれらの蓄積とストレス応答につながる可能性はあるが、有害な影響を検出することはできなかった。ＰＥＢＬ形質導入ＣＤ３／ＴＣＲ陰性ジャーカット細胞の正常な増殖をほぼ２年間観察することに加えて、ＰＥＢＬ形質導入Ｔ細胞の増殖および細胞毒性の可能性に欠陥はなかった。おそらく、ＰＥＢＬのマウス由来ｓｃＦｖは注入されたＣＡＲ−Ｔ細胞の拒絶を加速する可能性がある。ただし、ＣＡＲに含まれるｓｃＦｖについて報告されているように、この懸念は、ヒト由来のｓｃＦｖを使用することで対処できる。３７
【０２６２】
現代の遺伝子編集方法は、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法に興味深い用途がある。１５，１８，２０例えば、最近、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用して、抗ＣＤ１９  ＣＡＲ遺伝子をＴＣＲα定常（ＴＲＡＣ）遺伝子座に挿入し、ＴＣＲαβの発現を排除した。１９，３８ＰＥＢＬメソッドの利点の１つは、臨床グレードの大規模細胞処理のために現在のプロトコルを大幅に変更する必要がないことである。抗ＣＤ３  ＰＥＢＬ遺伝子は単一のバイシストロン構造でＣＡＲ遺伝子と組み合わせることができるため、単一の形質導入手順の後に同種異系ＣＡＲ−Ｔ細胞産物を得ることができる。ＰＥＢＬとＣＡＲの発現を伴うＴ細胞の製造は、現在の臨床試験でＣＡＲの発現に使用されているものと本質的に同一のウイルスベクターと遺伝子構成要素に依存している。したがって、このアプローチでは、標準的なＣＡＲ発現に関連するものを超えて安全性の懸念が生じる可能性は低く、遺伝子編集方法論の適用に関する不確実性は関係なかった。それにも関わらず、ＰＥＢＬアプローチは、遺伝子編集法と組み合わせて、拒絶に耐性があってより高い効力を持つＣＡＲ−Ｔ細胞を操作することもできる。１５，３９，４０別の用途は、正常および悪性Ｔ細胞が共有するＴ細胞抗原の発現をブロックすることであり、Ｔ細胞白血病およびリンパ腫を標的としながらＣＡＲ媒介性のフラトリサイド（ｆｒａｔｒｉｃｉｄｅ）を回避する。４１
【０２６３】
自己ＣＡＲ−Ｔ細胞の臨床結果は、その並外れた可能性を実証している。１−１０このテクノロジーの重要な次のステップは、一貫性と製造を改善し、患者が均一に堅牢でタイムリーな製品にアクセスできるようにすることである。この目的のために、同種異系ＣＡＲ−Ｔ細胞を確実に生成する方法は重要な進歩である。同種異系細胞は、患者の免疫細胞の状態とアフェレーシスを受ける適応性に関係なく利用できる。ＣＡＲ−Ｔ細胞は、最適な細胞組成、高いＣＡＲ発現、および最大の機能的効力で調製できる。臨床観察と実験データは、ＣＡＲがＣＤ２８共刺激に依存し、ＨＬＡ適合レシピエントに注入された場合、同種異系ＣＡＲ−Ｔ細胞によるＧＶＨＤのリスクが予想よりも低い可能性があることを示唆している。４２−４５ただし、これは他のＣＡＲおよび／または異なる移植設定には適用されない場合がある。したがって、グレードＩＩ  ＧＶＨＤは、ＣＤ１３７同時刺激ドナーＣＡＲ−Ｔ細胞の注入を受けた３人の患者中２人の患者で報告されており４６、グレードＩＩ／ＩＩＩ  ＧＶＨＤは、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、およびＣＤ２７を同時刺激したハプロタイプ一致ＣＡＲ−Ｔ細胞の注入を受けた６人の患者のうち３人で報告された。４７これらの研究では、ＧＶＨＤはＣＡＲ−Ｔ細胞を除去する可能性が高いコルチコステロイドの投与を必要とした。臨床的有効性および毒性の点で異なる同時刺激分子の相対的な利点に関係なく、４８ＴＣＲαβ発現の欠如は、報告によれば、ＣＡＲ−Ｔ細胞の抗腫瘍活性を高めることができる。１９興味深いことに、インビトロでの長期細胞傷害性試験では、ＰＥＢＬとＣＡＲで形質導入されたＴ細胞は、この観察と一致して、ＣＡＲのみで形質導入されたＴ細胞よりも優れた性能を示した。全体として、ＣＤ３／ＴＣＲαβを同種異系ＣＡＲ−Ｔ細胞産物から除去することは、特に確立された製造プロトコルの中断を最小限に抑えて達成できる場合は特に有利である。
【０２６４】
参考文献
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５．Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ  ＪＮ，  Ｄｕｄｌｅｙ  ＭＥ，  Ｋａｓｓｉｍ  ＳＨ，  Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ  ＲＰ，  Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  ＲＯ，  Ｓｔｅｔｌｅｒ−Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ−ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  ｄｉｆｆｕｓｅ  ｌａｒｇｅ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ａｎｄ  ｉｎｄｏｌｅｎｔ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ  ｃａｎ  ｂｅ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ａｎ  ａｎｔｉ−ＣＤ１９  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１４  Ａｕｇ  ２５．
【０２６９】
６．Ｌｅｅ  ＤＷ，  Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ  ＪＮ，  Ｓｔｅｔｌｅｒ−Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  Ｍ，  Ｃｕｉ  ＹＫ，  Ｄｅｌｂｒｏｏｋ  Ｃ，  Ｆｅｌｄｍａｎ  ＳＡ，  ｅｔ  ａｌ．Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ＣＤ１９  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋａｅｍｉａ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ａｎｄ  ｙｏｕｎｇ  ａｄｕｌｔｓ：  ａ  ｐｈａｓｅ  １  ｄｏｓｅ−ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ  ｔｒｉａｌ．Ｌａｎｃｅｔ  ２０１４  Ｏｃｔ  １０．
【０２７０】
７．Ｔｕｒｔｌｅ  ＣＪ，  Ｈａｎａｆｉ  ＬＡ，  Ｂｅｒｇｅｒ  Ｃ，  Ｇｏｏｌｅｙ  ＴＡ，  Ｃｈｅｒｉａｎ  Ｓ，  Ｈｕｄｅｃｅｋ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．ＣＤ１９  ＣＡＲ−Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ＣＤ４＋：ＣＤ８＋  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｄｕｌｔ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ＡＬＬ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２０１６  Ｊｕｎ  １；  １２６（６）：  ２１２３−２１３８．
【０２７１】
８．Ｎｅｅｌａｐｕ  ＳＳ，  Ｌｏｃｋｅ  ＦＬ，  Ｂａｒｔｌｅｔｔ  ＮＬ，  ｅｔ  ａｌ．Ａｘｉｃａｂｔａｇｅｎｅ  Ｃｉｌｏｌｅｕｃｅｌ  ＣＡＲ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  ｌａｒｇｅ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｎ．  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２０１７；  ３７７（２６）：２５３１−２５４４．
【０２７２】
９．Ｓｃｈｕｌｅｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａｓ．Ｎ．  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２０１７；  ３７７（２６）：２５４５−２５５４．
【０２７３】
１０．Ｓａｄｅｌａｉｎ  Ｍ，  Ｒｉｖｉｅｒｅ  Ｉ，  Ｒｉｄｄｅｌｌ  Ｓ．  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ  ２０１７  Ｍａｙ  ２４；  ５４５（７６５５）：  ４２３−４３１．
【０２７４】
１１．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ＳＡ，  Ｒｅｓｔｉｆｏ  ＮＰ．Ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｓ  ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１５  Ａｐｒ  ３；  ３４８（６２３０）：  ６２−６８．
【０２７５】
１２．Ｐａｒｋ  ＪＨ，  Ｇｅｙｅｒ  ＭＢ，  Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ  ＲＪ．ＣＤ１９−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ＣＡＲ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｆｏｒ  ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ：  ｉｎｔｅｒｐｒｅｔｉｎｇ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｕｔｃｏｍｅｓ  ｔｏ  ｄａｔｅ．Ｂｌｏｏｄ  ２０１６  Ｊｕｎ  ３０；  １２７（２６）：  ３３１２−３３２０．
【０２７６】
１３．Ａｐｐｅｌｂａｕｍ  ＦＲ．Ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ａｓ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔｕｒｅ  ２００１；  ４１１（６８３５）：  ３８５−３８９．
【０２７７】
１４．Ｂｌｅａｋｌｅｙ  Ｍ，  Ｒｉｄｄｅｌｌ  ＳＲ．Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｌｅｕｋａｅｍｉａ  ｅｆｆｅｃｔ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００４  Ｍａｙ；  ４（５）：  ３７１−３８０．
【０２７８】
１５．Ｐｏｉｒｏｔ  Ｌ，  Ｐｈｉｌｉｐ  Ｂ，  Ｓｃｈｉｆｆｅｒ−Ｍａｎｎｉｏｕｉ  Ｃ，  Ｌｅ  Ｃｌｅｒｒｅ  Ｄ，  Ｃｈｉｏｎ−Ｓｏｔｉｎｅｌ  Ｉ，  Ｄｅｒｎｉａｍｅ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｇｅｎｏｍｅ−Ｅｄｉｔｅｄ  Ｔ−ｃｅｌｌ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ”Ｏｆｆ−ｔｈｅ−Ｓｈｅｌｆ”  Ａｄｏｐｔｉｖｅ  Ｔ−ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｉｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１５  Ｓｅｐ  １５；  ７５（１８）：  ３８５３−３８６４．
【０２７９】
１６．Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ  ａｎｄ  ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｄｏｎｏｒ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ＣＡＲ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ．２０１５；２２（６）：  ５０９５−５１５．
【０２８０】
１７．Ｂｏｅｔｔｃｈｅｒ  Ｍ，  ＭｃＭａｎｕｓ  ＭＴ．Ｃｈｏｏｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｒｉｇｈｔ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｊｏｂ：  ＲＮＡｉ，  ＴＡＬＥＮ，  ｏｒ  ＣＲＩＳＰＲ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２０１５  Ｍａｙ  ２１；  ５８（４）：  ５７５−５８５．
【０２８１】
１８．Ｔｏｒｉｋａｉ  Ｈ，  Ｒｅｉｋ  Ａ，  Ｌｉｕ  ＰＱ，  Ｚｈｏｕ  Ｙ，  Ｚｈａｎｇ  Ｌ，  Ｍａｉｔｉ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｂａｓｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｔｏ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ａ  ＣＤ１９−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ−ａｎｔｉｇｅｎ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｄ  ｅｌｉｍｉｎａｔｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ＴＣＲ．Ｂｌｏｏｄ  ２０１２  Ｊｕｎ  １４；  １１９（２４）：  ５６９７−５７０５．
【０２８２】
１９．Ｅｙｑｕｅｍ  Ｊ，  Ｍａｎｓｉｌｌａ−Ｓｏｔｏ  Ｊ，  Ｇｉａｖｒｉｄｉｓ  Ｔ，  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｓｔｅｇｅｎ  ＳＪ，  Ｈａｍｉｅｈ  Ｍ，  Ｃｕｎａｎａｎ  ＫＭ，  ｅｔ  ａｌ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａ  ＣＡＲ  ｔｏ  ｔｈｅ  ＴＲＡＣ  ｌｏｃｕｓ  ｗｉｔｈ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｕｍｏｕｒ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ２０１７  Ｍａｒ  ０２；  ５４３（７６４３）：  １１３−１１７．
【０２８３】
２０．Ｑａｓｉｍ  Ｗ，  Ｚｈａｎ  Ｈ，  Ｓａｍａｒａｓｉｎｇｈｅ  Ｓ，  Ａｄａｍｓ  Ｓ，  Ａｍｒｏｌｉａ  Ｐ，  Ｓｔａｆｆｏｒｄ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆａｎｔ  Ｂ−ＡＬＬ  ａｆｔｅｒ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＴＡＬＥＮ  ｇｅｎｅ−ｅｄｉｔｅｄ  ＣＡＲ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０１７  Ｊａｎ  ２５；  ９（３７４）．
【０２８４】
２１．Ｍａｎａｂｅ  Ａ，  Ｃｏｕｓｔａｎ−Ｓｍｉｔｈ  Ｅ，  Ｋｕｍａｇａｉ  Ｍ，  Ｂｅｈｍ  ＦＧ，  Ｒａｉｍｏｎｄｉ  ＳＣ，  Ｐｕｉ  ＣＨ，  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−４  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  （ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）  ｉｎ  ｃａｓｅｓ  ｏｆ  ｈｉｇｈ−ｒｉｓｋ  ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｂｌｏｏｄ  １９９４；  ８３（７）：  １７３１−１７３７．
【０２８５】
２２．Ｉｍａｉ  Ｃ，  Ｍｉｈａｒａ  Ｋ，  Ａｎｄｒｅａｎｓｋｙ  Ｍ，  Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ  ＩＣ，  Ｐｕｉ  ＣＨ，  Ｃａｍｐａｎａ  Ｄ．  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ４−１ＢＢ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ｐｒｏｖｏｋｅ  ｐｏｔｅｎｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ２００４；  １８：  ６７６−６８４．
【０２８６】
２３．Ｋｕｄｏ  Ｋ，  Ｉｍａｉ  Ｃ，  Ｌｏｒｅｎｚｉｎｉ  Ｐ，  Ｋａｍｉｙａ  Ｔ，  Ｋｏｎｏ  Ｋ，  Ｄａｖｉｄｏｆｆ  ＡＭ，  ｅｔ  ａｌ．Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ａ  ＣＤ１６  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｅｘｅｒｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｋｉｌｌｉｎｇ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１４  Ｊａｎ  １；  ７４（１）：  ９３−１０３．
【０２８７】
２４．Ｓｈｉｍａｓａｋｉ  Ｎ，  Ｆｕｊｉｓａｋｉ  Ｈ，  Ｃｈｏ  Ｄ，  Ｍａｓｓｅｌｌｉ  Ｍ，  Ｌｏｃｋｅｙ  Ｔ，  Ｅｌｄｒｉｄｇｅ  Ｐ，  ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ  ａｄａｐｔａｂｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｔｏ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ  ２０１２  Ａｕｇ；１４（７）：  ８３０−４０．
【０２８８】
２６．Ｓｈｉｍａｓａｋｉ  Ｎ，  Ｃａｍｐａｎａ  Ｄ．  Ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２０１３；  ９６９：  ２０３−２２０．
【０２８９】
２７．Ｋｏｈ  Ｓ，  Ｓｈｉｍａｓａｋｉ  Ｎ，  Ｓｕｗａｎａｒｕｓｋ  Ｒ，  Ｈｏ  ＺＺ，  Ｃｈｉａ  Ａ，  Ｂａｎｕ  Ｎ，  ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｕｓｉｎｇ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ２０１３；  ２：  ｅ１１４．
【０２９０】
２８．Ａｌａｒｃｏｎ  Ｂ，  Ｂｅｒｋｈｏｕｔ  Ｂ，  Ｂｒｅｉｔｍｅｙｅｒ  Ｊ，  Ｔｅｒｈｏｒｓｔ  Ｃ．  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ＣＤ３  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｔａｋｅｓ  ｐｌａｃｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ａｎｄ  ｉｎｖｏｌｖｅｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｒｙ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｅ  ＣＤ３−ｇａｍｍａ  ｄｅｌｔａ  ｅｐｓｉｌｏｎ  ｃｏｒｅ  ａｎｄ  ｓｉｎｇｌｅ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａ  ｏｒ  ｂｅｔａ  ｃｈａｉｎｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９８８  Ｆｅｂ  ２５；  ２６３（６）：  ２９５３−２９６１．
【０２９１】
２９．Ｃｌｅｖｅｒｓ  Ｈ，  Ａｌａｒｃｏｎ  Ｂ，  Ｗｉｌｅｍａｎ  Ｔ，  Ｔｅｒｈｏｒｓｔ  Ｃ．  Ｔｈｅ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ／ＣＤ３  ｃｏｍｐｌｅｘ：  ａ  ｄｙｎａｍｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｓｅｍｂｌｅ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９８８；  ６：  ６２９−６６２．
【０２９２】
３０．Ｗｅｉｓｓ  Ａ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  １９９１；  ２５：  ４８７−５１０．
【０２９３】
３１．Ｍａｒａｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｓｉｇｎ，  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  ａｎｄ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉ−ｈｕｍｎａ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｇｐ１２０  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９３；  ９０（１６）：  ７８８９−７８９３．
【０２９４】
３２．Ｍｕｎｒｏ  Ｓ，  Ｐｅｌｈａｍ  ＨＲ．Ａ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｕｍｉｎａｌ  ＥＲ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｃｅｌｌ  １９８７  Ｍａｒ  １３；  ４８（５）：  ８９９−９０７．
【０２９５】
３３．Ｊａｃｋｓｏｎ  ＭＲ，  Ｎｉｌｓｓｏｎ  Ｔ，  Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ＰＡ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｍｏｔｉｆ  ｆｏｒ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ．ＥＭＢＯ  Ｊ  １９９０  Ｏｃｔ；  ９（１０）：  ３１５３−３１６２．
【０２９６】
３４．Ｍａｒｓｃｈａｌｌ  ＡＬ，  Ｄｕｂｅｌ  Ｓ，  Ｂｏｌｄｉｃｋｅ  Ｔ．  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｉｎｔｒａｂｏｄｉｅｓ．  ｍＡｂｓ  ２０１５；  ７（６）：  １０１０−１０３５．
【０２９７】
３５．Ａｌａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｅｙｏｎｄ  ＫＤＥＬ：  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ５  ａｎｄ  ６  ｉｎ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ＥＲ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０１１；  ４０９（３）：  ２９１−２９７．
【０２９８】
３６．Ｓｈｉｋａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ：  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｐｒｏｘｉｍａｌ  ａｎｄ  ｄｉｓｔａｌ  ｚｏｎｅｓ  ｃｏｎｆｅｒｒｅｄ  ｂｙ  ｔｗｏ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００３；  １００（１０）：  ５７８３−５７８８．
【０２９９】
３７．Ｓｏｍｍｅｒｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｕｌｌｙ  ｈｕｍａｎ  ＣＤ１９−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ，  ２０１７；  ３１（１０）：  ２１９１−２１９９．
【０３００】
３８．ＭａｃＬｅｏｄ  ＤＴ，  Ａｎｔｏｎｙ  Ｊ，  Ｍａｒｔｉｎ  ＡＪ，  Ｍｏｓｅｒ  ＲＪ，  Ｈｅｋｅｌｅ  Ａ，  Ｗｅｔｚｅｌ  ＫＪ，  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ＣＤ１９  ＣＡＲ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ＴＣＲ  ａｌｐｈａ  ｃｈａｉｎ  ｌｏｃｕｓ  ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅｓ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｇｅｎｅ−ｅｄｉｔｅｄ  ＣＡＲ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２０１７  Ａｐｒ  ０５；  ２５（４）：  ９４９−９６１．
【０３０１】
３９．Ｓｃｈｕｍａｎｎ  Ｋ，  Ｌｉｎ  Ｓ，  Ｂｏｙｅｒ  Ｅ，  Ｓｉｍｅｏｎｏｖ  ＤＲ，  Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍ  Ｍ，  Ｇａｔｅ  ＲＥ，  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｋｎｏｃｋ−ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｃａｓ９  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ２０１５  Ａｕｇ  １８；  １１２（３３）：  １０４３７−１０４４２．
【０３０２】
４０．Ｓｕ  Ｓ，  Ｈｕ  Ｂ，  Ｓｈａｏ  Ｊ，  Ｓｈｅｎ  Ｂ，  Ｄｕ  Ｊ，  Ｄｕ  Ｙ，  ｅｔ  ａｌ．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ＰＤ−１  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｓｃｉ  Ｒｅｐｏｒｔｓ．２０１６；  ６（１）：  ２００７０．
【０３０３】
４１．Ｐｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｏｆ  ＣＤ７  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｂｌｏｏｄ  Ａｄｖ，  ２０１７；  １（２５）：  ２３４８−２３６０．
【０３０４】
４２．Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ  ＪＮ，  Ｄｕｄｌｅｙ  ＭＥ，  Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  ＲＯ，  Ｋａｓｓｉｍ  ＳＨ，  Ｒｏｓｅ  ＪＪ，  Ｔｅｌｆｏｒｄ  ＷＧ，  ｅｔ  ａｌ．Ｄｏｎｏｒ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ＣＤ１９−ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｃａｕｓｅ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ  ｐｅｒｓｉｓｔｉｎｇ  ａｆｔｅｒ  ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄ  ２０１３  Ｄｅｃ  １２；  １２２（２５）：  ４１２９−４１３９．
【０３０５】
４３．Ｂｒｕｄｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｔｈａｔ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ａｎ  ａｎｔｉ−ＣＤ１９  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎｄｕｃｅ  ｒｅｍｉｓｓｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ  ｔｈａｔ  ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ａｆｔｅｒ  ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ−ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｃａｕｓｉｎｇ  ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２０１６；  ３４（１０）：  １１１２−１１２１．
【０３０６】
４４．Ｇｈｏｓｈ  Ａ，  Ｓｍｉｔｈ  Ｍ，  Ｊａｍｅｓ  ＳＥ，  Ｄａｖｉｌａ  ＭＬ，  Ｖｅｌａｒｄｉ  Ｅ，  Ａｒｇｙｒｏｐｏｕｌｏｓ  ＫＶ，  ｅｔ  ａｌ．Ｄｏｎｏｒ  ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｅｒｔ  ｐｏｔｅｎｔ  ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｌｙｍｐｈｏｍａ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｗｉｔｈ  ｄｉｍｉｎｉｓｈｅｄ  ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２０１７  Ｆｅｂ；  ２３（２）：  ２４２−２４９．
【０３０７】
４５．Ａｎｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｏｎｏｒ  ｏｒｉｇｉｎ  ＣＡＲ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ：  ｇｒａｆｔ  ｖｅｒｓｕｓ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ  ｅｆｆｅｃｔ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ＧＶＨＤ，  ａ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｒｅｖｉｅｗ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．２０１７；  ９（２）：  １２３−１３０．
【０３０８】
４６．Ｄａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｏｒ  ｄｏｎｏｒ−ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ＣＤ１９  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ａｄｕｌｔ  Ｂ−ＡＬＬ  ｗｉｔｈ  ｅｘｔｒａｍｅｄｕｌｌａｒｙ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１５；  ４（１１）：  ｅ１０２７４６９．
【０３０９】
４７．Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｏｎｏｒ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ＣＤ１９−ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｍｉｎｉｍａｌ  ｒｅｓｉｄｕａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｒｅｌａｐｓｅｄ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋａｅｍｉａ  ｗｉｔｈ  ｎｏ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｄｏｎｏｒ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｉｎｆｕｓｉｏｎｓ  ａｆｔｅｒ  ｈａｐｌｏｉｄｅｎｔｉｃａｌ  ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．２０１７；  １７９（４）：  ５９８−６０５．
【０３１０】
４８．Ｃａｍｐａｎａ  Ｄ，  Ｓｃｈｗａｒｚ  Ｈ，  Ｉｍａｉ  Ｃ．４−１ＢＢ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  ２０１４  Ｍａｒ−Ａｐｒ；  ２０（２）：  １３４−１４０．
【０３１１】
本明細書で引用されたすべての特許、公開された出願および参考文献の教示は、その全体が参照により組み込まれる。
【０３１２】
本発明をその例示的な実施形態を参照して特に示し、説明したが、添付の特許請求の範囲に含まれる本発明の範囲から逸脱することなく、形態および詳細の様々な変更を行うことができることを当業者は理解するであろう。
【図１Ａ】
2020530291.tif 000005
【図１Ｂ】
2020530291.tif 000006
【図１Ｃ】
2020530291.tif 000007
【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
2020530291.tif 000009
【図２Ｂ】
2020530291.tif 000010
【図２Ｃ】
2020530291.tif 000011
【図２Ｄ】
2020530291.tif 000012
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
2020530291.tif 000039
【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
2020530291.tif 000042
【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
2020530291.tif 000045
【図１２Ａ】
2020530291.tif 000046
【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５】
2020530291.tif 000054
【配列表】
2020530291000001.app
【国際調査報告】
2020530291.tif 000055
2020530291.tif 000056
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