(57)【要約】本開示は、Ｂリンパ球活性を調節する、及び急性傷害後の臓器を保護するための組成物及び方法に関する。具体的には、ＰＥＧ−ピルフェニドンは、半減期を延長し、バイオアベイラビリティを向上させ、Ｂ細胞活性の調節に同等の効力を持ち、Ｂ細胞活性の調節不全によって引き起こされる急性臓器障害及び疾患からの保護作用物質として特に有用である。
2020530005.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）の化合物であって、
【化１】
2020530005.tif 000023
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、それぞれ水素、重水素、またはＬ−Ｘ−Ｂからなる群から独立して選択され、
Ｌは、Ｃ１−１２アルキルを含むリンカーであり、Ｘは、Ｏ−ＰＥＧ、ＮＨ（ＣＨ２）ｍＯ−ＰＥＧ、またはＳ（ＣＨ２）ｍＯ−ＰＥＧであり、ｍは、１〜１０の整数であり、ＰＥＧは、ｍＰＥＧ（メトキシポリエチレングリコール）、直鎖ＰＥＧ、分岐状ＰＥＧ、マルチアームＰＥＧ、及びＰＥＧ脂質の群から選択され、Ｂは、水素、重水素、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキニル、置換もしくは非置換アリール、及び置換もしくは非置換ヘテロアリール、またはその重水素化バージョンからなる群から選択され、
Ａは、水素、重水素、ハロゲン、ＣＦ３、ＣＤ３、ＣＮ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＯＲ’’、ＳＲ’’、ＮＲ’’Ｒ’’、ＮＲ’’ＣＯＲ’’、ＮＲ’’ＣＯＮＲ’’Ｒ’’、ＮＲ’’ＣＯ２Ｒ’’、ＣＯＲ’’、ＣＯ２Ｒ’’、ＮＯＲ’’、ＮＯ２、ＣＯＮＲ’’Ｒ’’、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’、ＳＯ２Ｒ’’、ＳＯ２ＮＲ’’Ｒ’’、ＮＲ’’ＳＯ２Ｒ’’、ＮＲ’’ＳＯ２ＮＲ’’Ｒ’’、Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、及びＣ（Ｏ）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、置換または非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換または非置換Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、置換または非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキニル、置換または非置換アリール、及び置換または非置換ヘテロアリールからなる群から選択され、
Ｒ’’は、水素、置換Ｃ１〜Ｃ４脂肪族部分、窒素、酸素、または硫黄を含む脂肪族部分からなる群から独立して選択されてもよく、あるいは、同じ窒素原子に結合した２つのＲ’’部分が、前記窒素原子と任意に一緒になって、窒素、酸素、または硫黄からなる群から独立して選択される１〜２個の追加のヘテロ原子を有する３〜７員の飽和または不飽和環を形成する、前記化合物。
【請求項２】
前記ＰＥＧまたはｍＰＥＧが、約１００〜約５０，０００ダルトン、約２００〜約５０，０００ダルトン、約３００〜約５０，０００ダルトン、約４００〜約５０，０００ダルトン、約５００〜約５０，０００ダルトン、約６００〜約５０，０００ダルトン、約７００〜約５０，０００ダルトン、約８００〜約５０，０００ダルトン、約９００〜約５０，０００ダルトン、約１，０００〜約５０，０００ダルトン、約１，５００〜約５０，０００、約２，０００〜約５０，０００、約２，５００〜約５０，０００、約３，０００〜約５０，０００、約３，５００〜約５０，０００、約４，０００〜約５０，０００、約４，５００〜約５０，０００、約５，０００〜約５０，０００、約５，５００〜約５０，０００、約６，０００〜約５０，０００、約６，５００〜約５０，０００、約７，０００〜約５０，０００、約７，５００〜約５０，０００、約８，０００〜約５０，０００、約８，５００〜約５０，０００、約９，０００〜約５０，０００、約９，５００〜約５０，０００、約１０，０００〜約５０，０００、約１１，０００〜約５０，０００、約１２，０００〜約５０，０００、約１３，０００〜約５０，０００、約１４，０００〜約５０，０００ダルトン、約１５，０００〜約５０，０００ダルトン、約１６，０００〜約５０，０００ダルトン、約１７，０００〜約５０，０００ダルトン、約１８，０００〜約約５０，０００ダルトン、約１９，０００〜約５０，０００ダルトン、約２０，０００〜約５０，０００ダルトン、約３０，０００〜約５０，０００ダルトン、または約４０，０００〜約５０，０００ダルトンの範囲の分子量を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
式中、Ｒ１が、水素、重水素、またはＬ−Ｘ−Ｂからなる群から選択され、Ｌが、Ｃ１−１２アルキルを含むリンカーであり、Ｘが、Ｏ−ＰＥＧ、ＮＨ（ＣＨ２）ｍＯ−ＰＥＧ、またはＳ（ＣＨ２）ｍＯ−ＰＥＧであり、ｍが、１〜１０の整数であり、ＰＥＧが、ｍＰＥＧ（メトキシポリエチレングリコール）、直鎖ＰＥＧ、分岐状ＰＥＧ、マルチアームＰＥＧ、及びＰＥＧ脂質の群から選択され、Ｂが、水素、重水素、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキニル、置換もしくは非置換アリール、及び置換もしくは非置換ヘテロアリール、またはその重水素化バージョンからなる群から選択される、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
式中、Ｒ１がＨである、先行請求項のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５】
式中、Ｒ２が、水素、重水素、またはＬ−Ｘ−Ｂからなる群から選択され、Ｌが、Ｃ１−１２アルキルを含むリンカーであり、Ｘが、Ｏ−ＰＥＧ、ＮＨ（ＣＨ２）ｍＯ−ＰＥＧ、またはＳ（ＣＨ２）ｍＯ−ＰＥＧであり、ｍが、１〜１０の整数であり、ＰＥＧが、ｍＰＥＧ（メトキシポリエチレングリコール）、直鎖ＰＥＧ、分岐状ＰＥＧ、マルチアームＰＥＧ、及びＰＥＧ脂質の群から選択され、Ｂが、水素、重水素、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキニル、置換もしくは非置換アリール、及び置換もしくは非置換ヘテロアリール、またはその重水素化バージョンからなる群から選択される、先行請求項のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項６】
式中、Ｒ２が、水素またはＬ−Ｘ−Ｂから選択され、Ｌが、Ｃ１−２アルキルを含むリンカーであり、Ｘが、Ｏ−ＰＥＧであり、ＰＥＧが、直鎖ＰＥＧ、分岐状ＰＥＧ、マルチアームＰＥＧ、及びＰＥＧ脂質からなる群から選択され、Ｂが、ＣＨ３である、先行請求項のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項７】
式中、Ｒ３が、水素、重水素、またはＬ−Ｘ−Ｂからなる群から選択され得、Ｌが、Ｃ１−１２アルキルを含むリンカーであり、Ｘが、Ｏ−ＰＥＧ、ＮＨ（ＣＨ２）ｍＯ−ＰＥＧ、またはＳ（ＣＨ２）ｍＯ−ＰＥＧであり、ｍが、１〜１０の整数であり、ＰＥＧが、ｍＰＥＧ（メトキシポリエチレングリコール）、直鎖ＰＥＧ、分岐状ＰＥＧ、マルチアームＰＥＧ、及びＰＥＧ脂質の群から選択され、Ｂが、水素、重水素、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキニル、置換もしくは非置換アリール、及び置換もしくは非置換ヘテロアリール、またはその重水素化バージョンからなる群から選択される、先行請求項のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項８】
式中、Ｒ３が、水素またはＬ−Ｘ−Ｂから選択され、Ｌが、Ｃ１−３アルキルを含むリンカーであり、Ｘが、Ｏ−ＰＥＧまたはＮＨ（ＣＨ２）ｍＯ−ＰＥＧであり、ＰＥＧが、ｍＰＥＧ（メトキシポリエチレングリコール）、直鎖ＰＥＧ、分岐状ＰＥＧ、マルチアームＰＥＧ、及びＰＥＧ脂質の群から選択され、ｍが、２〜３の整数であり、Ｂが、ＣＨ３である、先行請求項のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項９】
式中、Ｒ４が、水素、重水素、またはＬ−Ｘ−Ｂからなる群から選択され、Ｌが、Ｃ１−１２アルキルを含むリンカーであり、Ｘが、Ｏ−ＰＥＧ、ＮＨ（ＣＨ２）ｍＯ−ＰＥＧ、またはＳ（ＣＨ２）ｍＯ−ＰＥＧであり、ｍが、１〜１０の整数であり、ＰＥＧが、ｍＰＥＧ（メトキシポリエチレングリコール）、直鎖ＰＥＧ、分岐状ＰＥＧ、マルチアームＰＥＧ、及びＰＥＧ脂質の群から選択され、Ｂが、水素、重水素、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキニル、置換もしくは非置換アリール、及び置換もしくは非置換ヘテロアリール、またはその重水素化バージョンからなる群から選択される、先行請求項のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１０】
式中、Ｒ４が、水素またはＬ−Ｘ−Ｂから選択され、Ｌが、Ｃ１−３アルキルを含むリンカーであり、Ｘが、Ｏ−ＰＥＧまたはＮＨ（ＣＨ２）ｍＯ−ＰＥＧであり、ＰＥＧが、ｍＰＥＧ（メトキシポリエチレングリコール）、直鎖ＰＥＧ、分岐状ＰＥＧ、マルチアームＰＥＧ、及びＰＥＧ脂質の群から選択され、ｍが、２〜３の整数であり、Ｂが、ＣＨ３である、先行請求項のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１１】
式中、Ｒ５が、水素、重水素、またはＬ−Ｘ−Ｂからなる群から選択され得、Ｌが、Ｃ１−１２アルキルを含むリンカーであり、Ｘが、Ｏ−ＰＥＧ、ＮＨ（ＣＨ２）ｍＯ−ＰＥＧ、またはＳ（ＣＨ２）ｍＯ−ＰＥＧであり、ｍが、１〜１０の整数であり、ＰＥＧが、ｍＰＥＧ（メトキシポリエチレングリコール）、直鎖ＰＥＧ、分岐状ＰＥＧ、マルチアームＰＥＧ、及びＰＥＧ脂質の群から選択され、Ｂが、水素、重水素、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキニル、置換もしくは非置換アリール、及び置換もしくは非置換ヘテロアリール、またはその重水素化バージョンからなる群から選択される、先行請求項のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１２】
式中、Ｒ５が、水素またはＬ−Ｘ−Ｂから選択され、Ｌが、ＣＨ３であり、Ｘが、Ｏ−ＰＥＧであり、ＰＥＧが、ｍＰＥＧ（メトキシポリエチレングリコール）、直鎖ＰＥＧ、分岐状ＰＥＧ、マルチアームＰＥＧ、及びＰＥＧ脂質の群から選択され、Ｂが、ＣＨ３である、先行請求項のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１３】
式中、Ａが、水素、ハロゲン、ＣＦ３、ＣＤ３、または置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルからなる群から選択される、先行請求項のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１４】
式中、Ａが、ＣＨ３、ＣＦ３、ＣＤ３、またはＣＨ２−シクロプロピルからなる群から選択される、先行請求項のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１５】
前記化合物が、
【化２】
2020530005.tif 000024
【化３】
2020530005.tif 000025
【化４】
2020530005.tif 000026
【化５】
2020530005.tif 000027
からなる群から選択される、先行請求項のいずれかに記載の化合物。
【請求項１６】
式（ＩＩ）で示される化合物であって、
【化６】
2020530005.tif 000028
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ水素、重水素、またはＬ−Ｘ−Ｂからなる群から独立して選択され、
Ｌは、Ｃ１−１２アルキルを含むリンカーであり、Ｘは、Ｏ−ＰＥＧ、ＮＨ（ＣＨ２）ｍＯ−ＰＥＧ、またはＳ（ＣＨ２）ｍＯ−ＰＥＧであり、ｍは、１〜１０の整数であり、ＰＥＧは、ｍＰＥＧ（メトキシポリエチレングリコール）、直鎖ＰＥＧ、分岐状ＰＥＧ、マルチアームＰＥＧ、及びＰＥＧ脂質の群から選択され、Ｂは、水素、重水素、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキニル、置換もしくは非置換アリール、及び置換もしくは非置換ヘテロアリール、またはその重水素化バージョンからなる群から選択され、
Ｏ−ＰＥＧは、ｍＰＥＧ（メトキシポリエチレングリコール）、直鎖ＰＥＧ、分岐状ＰＥＧ、マルチアームＰＥＧ、及びＰＥＧ脂質の群から選択され、ＰＥＧエンドキャップは、水素、重水素、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキニル、置換もしくは非置換アリール、及び置換もしくは非置換ヘテロアリール、またはその重水素化バージョンからなる群から選択され、
Ａは、水素、重水素、ハロゲン、ＣＦ３、ＣＤ３、ＣＮ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＯＲ’’、ＳＲ’’、ＮＲ’’Ｒ’’、ＮＲ’’ＣＯＲ’’、ＮＲ’’ＣＯＮＲ’’Ｒ’’、ＮＲ’’ＣＯ２Ｒ’’、ＣＯＲ’’、ＣＯ２Ｒ’’、ＮＯＲ’’、ＮＯ２、ＣＯＮＲ’’Ｒ’’、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’、ＳＯ２Ｒ’’、ＳＯ２ＮＲ’’Ｒ’’、ＮＲ’’ＳＯ２Ｒ’’、ＮＲ’’ＳＯ２ＮＲ’’Ｒ’’、Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、及びＣ（Ｏ）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、置換または非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換または非置換Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、置換または非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキニル、置換または非置換アリール、及び置換または非置換ヘテロアリールからなる群から選択され、
Ｒ’’は、水素、置換Ｃ１〜Ｃ４脂肪族部分、窒素、酸素、または硫黄を含む脂肪族部分からなる群から独立して選択されてもよく、あるいは、同じ窒素原子に結合した２つのＲ’’部分が、前記窒素原子と任意に一緒になって、窒素、酸素、または硫黄からなる群から独立して選択される１〜２個の追加のヘテロ原子を有する３〜７員の飽和または不飽和環を形成する、前記化合物。
【請求項１７】
前記ＰＥＧまたはｍＰＥＧが、約１００〜約５０，０００ダルトン、約２００〜約５０，０００ダルトン、約３００〜約５０，０００ダルトン、約４００〜約５０，０００ダルトン、約５００〜約５０，０００ダルトン、約６００〜約５０，０００ダルトン、約７００〜約５０，０００ダルトン、約８００〜約５０，０００ダルトン、約９００〜約５０，０００ダルトン、約１，０００〜約５０，０００ダルトン、約１，５００〜約５０，０００、約２，０００〜約５０，０００、約２，５００〜約５０，０００、約３，０００〜約５０，０００、約３，５００〜約５０，０００、約４，０００〜約５０，０００、約４，５００〜約５０，０００、約５，０００〜約５０，０００、約５，５００〜約５０，０００、約６，０００〜約５０，０００、約６，５００〜約５０，０００、約７，０００〜約５０，０００、約７，５００〜約５０，０００、約８，０００〜約５０，０００、約８，５００〜約５０，０００、約９，０００〜約５０，０００、約９，５００〜約５０，０００、約１０，０００〜約５０，０００、約１１，０００〜約５０，０００、約１２，０００〜約５０，０００、約１３，０００〜約５０，０００、約１４，０００〜約５０，０００ダルトン、約１５，０００〜約５０，０００ダルトン、約１６，０００〜約５０，０００ダルトン、約１７，０００〜約５０，０００ダルトン、約１８，０００〜約約５０，０００ダルトン、約１９，０００〜約５０，０００ダルトン、約２０，０００〜約５０，０００ダルトン、約３０，０００〜約５０，０００ダルトン、または約４０，０００〜約５０，０００ダルトンの範囲の分子量を有する、請求項１６に記載の化合物。
【請求項１８】
非悪性Ｂ細胞の活性を調節し、対象の臓器への非悪性Ｂ細胞の動員を減少させる方法であって、前記方法が、ピルフェニドン、ピルフェニドン誘導体、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の化合物、またはそれらの組み合わせを含む組成物の有効量を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項１９】
前記対象が、重度の臓器障害を有し、前記臓器が、心臓、肝臓、腎臓、腸、及び脳からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記対象が、慢性心不全を有し、臓器障害が存在する場合、前記臓器が、心臓、腎臓、肝臓、腸、及び脳からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記対象に前記組成物を臓器障害が予測される場合に投与し、前記組成物の投与が、臓器障害の進行を防止または遅延させ、前記臓器が、心臓、肝臓、腎臓、腸、及び脳からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記組成物が、急性組織傷害または虚血の影響を防ぐために対象に投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記組成物が、対象の臓器移植の前または後において投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
急性臓器傷害後の臓器の機能障害の発症または進行から対象を保護する方法であって、
前記方法が、ピルフェニドン、ピルフェニドン誘導体、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の化合物、またはそれらの組み合わせを含む治療組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項２５】
前記保護された臓器が、心臓である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記臓器が、有害なリモデリングの防止により保護される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
心機能の心エコー指標が、ピルフェニドン及び／またはその誘導体の投与により改善される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
抗炎症性化合物による治療をさらに含む、請求項１８〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年７月３１日に出願された米国仮出願第６２／５３９，３０９号、及び２０１８年６月６日に出願された米国仮出願第６２／６８１，４１８号の優先権を主張するものであり、これらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府の権利
本発明は、国立衛生研究所により付与され、付与番号ＨＬ００７０８１の下で政府の支援によりなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、Ｂリンパ球活性を調節する方法を包含する。本出願は、一般的に、臓器を急性傷害から保護するための組成物及び方法に関する。特に、本開示は、ピルフェニドンまたはピルフェニドン誘導体を使用してＢリンパ球活性を調節する組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
心不全の流行は、現在、医療における最大の課題の１つである。心不全は、重篤な予後及び非常に高額な治療費を伴う深刻な病気であり、急増する医療費の主要な要因である。今日、米国には５８０万人の心不全を患う成人がおり、新たに心不全と診断される例は毎年５５万を超える。５人に１人のアメリカ人が心不全を発症すると予測されており、これは１年に約３０万人の死亡につながる。毎年３０７億ドルが心不全患者の治療に費やされており、心不全は単独で米国の医療費全体の約２％に相当する。アメリカ心臓協会によると、心不全の医療費は急速に上昇しており、２０３０年までに年間５３０億ドルに到達すると予測されている。この流れを止めるための革新的な治療法が必要とされる。
【０００５】
心臓は損傷した場合、免疫系が活性化され、免疫応答の一部が心臓障害を増幅し、治癒が損なわれる。このことは、患者にとって深刻な問題を引き起こす可能性がある。実際、心臓障害の程度が著しく拡大すると、最終的に心不全につながる一連の代償事象を招き、これは運動耐性の低下、体液貯留、ならびに障害及び死亡率の著しい増加を特徴とする状態である。現在、心機能障害を増幅する代償機構を調節する薬剤は存在する。しかしながら、心臓障害の増幅を減らす、または心臓の即時治癒を促進させるために薬物治療が必要である。
【０００６】
ピルフェニドンは、間質性肺線維症の治療のためにＦＤＡによって承認された薬剤である。当初、解熱剤とされていたピルフェニドンは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで抗線維化活性を有することが判明した。ピルフェニドンは、重篤な予後を伴う希少疾患である間質性肺線維症の治療のためにヒトで試験され、最初に日本（２００８）で、次に欧州（２０１１）で、そして最終的に米国（２０１４）で臨床使用が承認された。ピルフェニドンは安全な薬剤であり、数万人の患者に投与されており、基本的に重篤な副作用は報告されていない。
【発明の概要】
【０００７】
本開示の一態様は、式（Ｉ）の化合物に関し、
【化１】
2020530005.tif 000003
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、それぞれ水素、重水素、またはＬ−Ｘ−Ｂからなる群から独立して選択され、
Ｌは、Ｃ１−１２アルキルを含むリンカーであり、Ｘは、Ｏ−ＰＥＧ、ＮＨ（ＣＨ２）ｍＯ−ＰＥＧ、またはＳ（ＣＨ２）ｍＯ−ＰＥＧであり、ｍは、１〜１０の整数であり、ＰＥＧは、ｍＰＥＧ（メトキシポリエチレングリコール）、直鎖ＰＥＧ、分岐状ＰＥＧ、マルチアームＰＥＧ、及びＰＥＧ脂質の群から選択され、Ｂは、水素、重水素、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキニル、置換もしくは非置換アリール、及び置換もしくは非置換ヘテロアリール、またはその重水素化バージョンからなる群から選択され、
Ａは、水素、重水素、ハロゲン、ＣＦ３、ＣＤ３、ＣＮ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＯＲ’’、ＳＲ’’、ＮＲ’’Ｒ’’、ＮＲ’’ＣＯＲ’’、ＮＲ’’ＣＯＮＲ’’Ｒ’’、ＮＲ’’ＣＯ２Ｒ’’、ＣＯＲ’’、ＣＯ２Ｒ’’、ＮＯＲ’’、ＮＯ２、ＣＯＮＲ’’Ｒ’’、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’、ＳＯ２Ｒ’’、ＳＯ２ＮＲ’’Ｒ’’、ＮＲ’’ＳＯ２Ｒ’’、ＮＲ’’ＳＯ２ＮＲ’’Ｒ’’、Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、及びＣ（Ｏ）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、置換または非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換または非置換Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、置換または非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキニル、置換または非置換アリール、及び置換または非置換ヘテロアリールからなる群から選択され、
Ｒ’’は、水素、置換Ｃ１〜Ｃ４脂肪族部分、窒素、酸素、または硫黄を含む脂肪族部分からなる群から独立して選択されてもよく、あるいは、同じ窒素原子に結合した２つのＲ’’部分が、窒素原子と任意に一緒になって、窒素、酸素、または硫黄からなる群から独立して選択される１〜２個の追加のヘテロ原子を有する３〜７員の飽和または不飽和環を形成する。
【０００８】
本開示の別の態様は、式（ＩＩ）の化合物に関し、
【化２】
2020530005.tif 000004
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ水素、重水素、またはＬ−Ｘ−Ｂからなる群から独立して選択され、
Ｌは、Ｃ１−１２アルキルを含むリンカーであり、Ｘは、Ｏ−ＰＥＧ、ＮＨ（ＣＨ２）ｍＯ−ＰＥＧ、またはＳ（ＣＨ２）ｍＯ−ＰＥＧであり、ｍは、１〜１０の整数であり、ＰＥＧは、ｍＰＥＧ（メトキシポリエチレングリコール）、直鎖ＰＥＧ、分岐状ＰＥＧ、マルチアームＰＥＧ、及びＰＥＧ脂質の群から選択され、Ｂは、水素、重水素、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキニル、置換もしくは非置換アリール、及び置換もしくは非置換ヘテロアリール、またはその重水素化バージョンからなる群から選択され、
Ｏ−ＰＥＧは、ｍＰＥＧ（メトキシポリエチレングリコール）、直鎖ＰＥＧ、分岐状ＰＥＧ、マルチアームＰＥＧ、及びＰＥＧ脂質の群から選択され、ＰＥＧエンドキャップは、水素、重水素、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキニル、置換もしくは非置換アリール、及び置換もしくは非置換ヘテロアリール、またはその重水素化バージョンからなる群から選択され、
Ａは、水素、重水素、ハロゲン、ＣＦ３、ＣＤ３、ＣＮ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＯＲ’’、ＳＲ’’、ＮＲ’’Ｒ’’、ＮＲ’’ＣＯＲ’’、ＮＲ’’ＣＯＮＲ’’Ｒ’’、ＮＲ’’ＣＯ２Ｒ’’、ＣＯＲ’’、ＣＯ２Ｒ’’、ＮＯＲ’’、ＮＯ２、ＣＯＮＲ’’Ｒ’’、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’、ＳＯ２Ｒ’’、ＳＯ２ＮＲ’’Ｒ’’、ＮＲ’’ＳＯ２Ｒ’’、ＮＲ’’ＳＯ２ＮＲ’’Ｒ’’、Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、及びＣ（Ｏ）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、置換または非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換または非置換Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、置換または非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキニル、置換または非置換アリール、及び置換または非置換ヘテロアリールからなる群から選択され、
Ｒ’’は、水素、置換Ｃ１〜Ｃ４脂肪族部分、窒素、酸素、または硫黄を含む脂肪族部分からなる群から独立して選択されてもよく、あるいは、同じ窒素原子に結合した２つのＲ’’部分が、窒素原子と任意に一緒になって、窒素、酸素、または硫黄からなる群から独立して選択される１〜２個の追加のヘテロ原子を有する３〜７員の飽和または不飽和環を形成する。
【０００９】
本開示の別の態様は、Ｂ細胞活性の調節を必要とする対象においてＢ細胞活性を調節する方法に関する。本方法は、本明細書に記載の、治療上有効量のピルフェニドン、ピルフェニドン誘導体、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、またはそれらの組み合わせを含む組成物を対象に投与することを含む。
【００１０】
本開示の追加の態様は、対象の臓器障害を軽減する方法に関し、該方法は、本明細書に記載の、治療上有効量のピルフェニドン、ピルフェニドン誘導体、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、またはそれらの組み合わせを含む組成物を投与することを含む。
【００１１】
本開示のさらなる態様は、加齢性臓器機能障害を治療する方法に関し、該方法は、本明細書に記載の、治療上有効量のピルフェニドン、ピルフェニドン誘導体、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、またはそれらの組み合わせを含む組成物を投与することを含む。
【００１２】
本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏでＢリンパ球の活性を調節するために、ピルフェニドン、ピルフェニドン誘導体、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、またはそれらの組み合わせを使用する方法を提供する。Ｂリンパ球機能の調節により、ピルフェニドン、ピルフェニドン誘導体、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、またはそれらの組み合わせは、急性心臓傷害の状況において強力な心臓保護効果を発揮できる。
【００１３】
毎年、米国だけで、約１００万人が、心臓発作、心筋炎、または薬剤関連毒性のために新たな心臓障害を発症する。それらのおよそ２０％が最終的には心不全を発症する。これらの患者は、死亡率及び障害率が大幅に増加している。彼らは綿密な医学的フォローアップを必要とし、通常は生涯にわたる５〜７個の薬剤のレジメンで治療される。彼らの心機能が十分に低下した場合、急死を防ぐために植込み型除細動器が必要である。それらの一部は末期疾患に進行し、治療を最適化するための侵襲検査が必要であり、心臓をサポートする植込型ポンプ（ＬＶＡＤ）の設置または心臓移植を受ける可能性がある。本発明は、近年心臓障害を経験した全ての患者に使用することができ、心不全に進行するリスクをあらゆる関連費用及び課題とともに大幅に抑える。本発明は、心臓傷害が予測される場合、対象において、心臓傷害の進行を予防または遅延させる予防手段として使用され得る。
【００１４】
ピルフェニドン、ピルフェニドン誘導体、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、またはそれらの組み合わせは、他の臓器を急性傷害（例えば、脳、腎臓、肝臓、腸など）から保護する保護作用物質として使用され得る、またはＢ細胞活性の調節不全を特徴とする他の疾患プロセス（例えば、多発性硬化症、強皮症など）における保護作用物質として使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
本出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面（複数可）を含む本出願公開のコピーは、請求及び必要な料金の支払いに基づいて、特許庁により提供されることとなる。
【図１】図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ、及び図１Ｄは、ＤＴ処置後の死亡率及び心筋細胞死に対するピルフェニドンの効果を示す。心筋にジフテリア毒素受容体（ＤＴＲ）を発現しているマウスをジフテリア毒素に曝露し、ピルフェニドンを豊富に含む飼料（ＤＴＲ−ＰＦＤ）または通常の飼料（ＤＴＲ−対照）を与えた。図１Ａは、ＤＴＲ対照及びＤＴＲ−ＰＦＤマウスのカプラン・マイヤー生存曲線を示す（群あたりｎ＝２０）。図１Ｂは、ＤＴＲ−ＰＦＤ及びＤＴＲ−対照動物（ｎ＝２３／群）においてジフテリア毒素（ＤＴ）処置の４日後に測定した血清トロポニンレベルを示す。図１Ｃは、ジフテリア毒素（ＤＴ）による処置の４日後に測定した心筋細胞アポトーシスを示す；上のパネルは、４０倍の倍率でのＤＴＲ−対照及びＤＴＲ−ＰＦＤマウスの心筋の代表的な組織切片であり、下のパネルは、群データをまとめたものである（ｎ＝６マウス／群、動物あたり４切片を分析）。図１Ｄは、ＤＴＲ対照及びＤＴＲ−ＰＦＤ動物におけるジフテリア毒素処置の４日後におけるエバンスブルー色素の取り込みを示す；上のパネルは、１０倍の倍率での代表的な蛍光顕微鏡画像である；下のパネルは、群データをまとめたものである（ｎ＝５対照；ｎ＝６マウスピルフェニドン；動物あたり４切片を分析）。バーは平均を表す。エラーバーは標準偏差を表す。Ｐ値は、パネルＡではＧｅｈａｎ−Ｂｒｅｓｌｏｗ−Ｗｉｌｃｏｘｏｎ法を使用し、パネルＢ〜Ｄではスチューデントｔ検定を使用して計算した。
【図２】図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ、図２Ｄ、図２Ｅ、図２Ｆ、及び図２Ｇは、ＤＴ処置後の心筋炎症（４日目）に対するピルフェニドンの効果を示す。心筋にジフテリア毒素受容体（ＤＴＲ）を発現しているマウスをジフテリア毒素に曝露し、ピルフェニドンを豊富に含む飼料（ＤＴＲ−ＰＦＤ）または通常の飼料（ＤＴＲ−対照）を与えた。マウスをジフテリア毒素（ＤＴ）注射の４日後に屠殺し、フローサイトメトリーによる分析のために心臓を回収した。図２Ａは、心筋ＣＤ４５＋細胞の異なる亜集団を識別するために使用したフローサイトメトリー分析のゲーティング戦略を示す。図２Ｂ及び図２Ｃは、ピルフェニドンを豊富に含む飼料（ＷＴ  ＰＦＤ）または通常の飼料（ＷＴ対照）のいずれかを野生型マウスに与えたことを示す。７日後、心臓を回収し、フローサイトメトリーで分析した。ｎ＝６／群。図２Ｄは、心臓組織１ｍｇ当たりのＣＤ４５＋細胞の総数を示す（ｎ＝１７対照、ｎ＝１９ピルフェニドン）。図２Ｅは、心筋内の白血球サブセットを示す（全体に占める割合（％）：ＣＤ１９＋、ｎ＝１４対照、ｎ＝１６ピルフェニドン；Ｌｙ６ｇ＋、ｎ＝６／群、Ｌｙ６Ｃ＋ＣＤ６４  ｌｏｗ／−、ｎ＝１０対照、ｎ＝１２ピルフェニドン；ＣＤ６４＋Ｌｙ６Ｃｌｏｗ／−、ｎ＝１０対照、ｎ＝１２ピルフェニドン）。図２Ｆは、ＭＨＣ−ＩＩ及びＣＣＲ−２マクロファージ及び単球の代表的なＦＡＣＳ分析を示す。図２Ｇは、ＣＣＲ２の発現、低「ｌ」または高「ｈ」、及びＭＨＣ−ＩＩ発現、低「ｌ」または高「ｈ」によって定義される心筋内のマクロファージ／単球サブセットを示す。全体に占める割合（％）、ｎ＝１０対照、ｎ＝１２ピルフェニドンである。＊＝ｐ＜０．０５である。バーは平均を表す。エラーバーは標準偏差を表す。Ｐ値は、スチューデントＴ検定で計算した。
【図３】図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ、図３Ｄ、図３Ｅ、図３Ｆ、図３Ｇ及び図３Ｈは、閉胸部Ｉ／Ｒ傷害後のＬＶ構造及び機能に対するピルフェニドンの効果を示す。野生型マウスは、９０分間の閉胸部虚血再灌流（Ｉ／Ｒ）傷害を受けた。マウスには、ピルフェニドンを豊富に含む飼料または通常の飼料のいずれかを与えた。図３Ａは、虚血時の簡略化した区域壁運動スコア指標（ＳＷＭＳＩ）により決定された閉胸部虚血中のリスクのある領域である。図３Ｂは、Ｉ／Ｒ傷害の２週間後の対照マウス（左）及びピルフェニドン処置動物（右）から回収した心臓の代表的な写真である。スケールバー＝１ｍｍ。図３Ｃは、対照マウス（Ｉ／Ｒ対照）及びピルフェニドン処置動物（Ｉ／Ｒ−ＰＦＤ）から回収した心臓の重量分析である。ｎ＝８  対照、ｎ＝７ピルフェニドンである。図３Ｄ〜図３Ｆは、虚血時、及びＩ／Ｒ傷害の２週間後の心筋機能の心エコー評価であり、ｎ＝８  Ｉ／Ｒ対照、ｎ＝７  Ｉ／Ｒ−ＰＦＤである。図３Ｄは、２Ｄ心エコー検査によるＬＶ質量（ＬＶＭ）である。図３Ｅは、ＬＶ拡張末期容積（ＬＶＥＤＶ）である。図３Ｆは、ＬＶ駆出率（ＬＶＥＦ）である。図３Ｇは、対照動物（左パネル）及びピルフェニドン処置動物（右パネル）の心臓の組織切片の代表的なトリクローム染色である。１．２５倍の倍率  図３Ｈは、トリクローム陽性染色の割合（％）の定量的評価であり、各心臓あたり２つの切片を分析した。ｎ＝１６切片  Ｉ／Ｒ−対照、ｎ＝１４切片  Ｉ／Ｒ−ＰＦＤである。＊＝ｐ＜０．０。バーは平均を表し、エラーバーは標準偏差を表す。Ｐ値は、スチューデントＴ検定で計算した。
【図４】図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、図４Ｄ、図４Ｅ、図４Ｆ、図４Ｇ、及び図４Ｈは、Ｉ／Ｒ傷害直後に投与されたピルフェニドンの効果及びＩ／Ｒ傷害後の心筋炎症（４日目）に対するピルフェニドンの効果を示す。野生型マウスは、９０分間の閉胸部虚血再灌流（Ｉ／Ｒ）傷害を受けた。マウスには、ピルフェニドンを豊富に含む飼料または通常の飼料のいずれかを与えた。図３に報告された実験の間、該動物をＩ／Ｒ傷害の３日前にピルフェニドン豊富食または対照食に無作為化した。この実験ではＩ／Ｒ傷害後にマウスにピルフェニドンまたはビヒクルを与え、Ｉ／Ｒ傷害後にのみピルフェニドン豊富食または対照食に無作為化した。図４Ａは、虚血時の簡略化した区域壁運動スコア指標（ＳＷＭＳＩ）により決定された閉胸部虚血中のリスクのある領域である。図４Ｂは、Ｉ／Ｒ傷害の２週間後の対照マウス（左）及びピルフェニドン処置動物（右）から回収した心臓の代表的な写真である。スケールバー＝１ｍｍ。図４Ｃは、対照マウス（Ｉ／Ｒ対照）及びピルフェニドン処置動物（Ｉ／Ｒ−ＰＦＤ）から回収した心臓の重量分析である。ｎ＝８  対照、ｎ＝７ピルフェニドンである。図４Ｄ〜図４Ｆは、虚血時、及びＩ／Ｒ傷害の２週間後の心筋機能の心エコー評価であり、ｎ＝５  Ｉ／Ｒ対照、ｎ＝７  Ｉ／Ｒ−ＰＦＤである。図４Ｄは、２Ｄ心エコー検査によるＬＶ質量（ＬＶＭ）である。図４Ｅは、ＬＶ拡張末期容積（ＬＶＥＤＶ）である。図４Ｆは、ＬＶ駆出率（ＬＶＥＦ）である。＊＝ｐ＜０．０５。バーは平均を表す。エラーバーは標準偏差を表す。図４Ｇは、対照動物（左パネル）及びピルフェニドン処置動物（右パネル）の心臓の組織切片の代表的なトリクローム染色である。１．２５倍の倍率  図４Ｈは、トリクローム陽性染色の割合（％）の定量的評価であり、各心臓あたり２つの切片を分析した。ｎ＝１０切片／群である。＊＝ｐ＜０．０５。バーは平均を表し、エラーバーは標準偏差を表す。Ｐ値は、スチューデントＴ検定で計算した。野生型マウスは、９０分間の閉胸部虚血再灌流（Ｉ／Ｒ）傷害を受けた。マウスには、ピルフェニドンを豊富に含む飼料または通常の飼料のいずれかを与えた。マウスをＩ／Ｒ傷害の４日後に屠殺し、フローサイトメトリーによる分析のために心臓を回収した。ｎ＝８  Ｉ／Ｒ−対照、ｎ＝４  Ｉ／Ｒ−ＰＦＤである。
【図５】図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、及び図５Ｅは、心筋ＣＤ１９＋細胞の異なる亜集団の研究に使用されるゲーティング戦略、脾臓ＣＤ１９＋細胞の染色、及びベースライン時及びＤＴ傷害及びＩ／Ｒ傷害後の心筋Ｂリンパ球のサブセットの特徴付けを示す。図５Ａは、心筋ＣＤ１９＋細胞の異なる亜集団を研究するために使用されるゲーティング戦略の写真であり、図５Ｂは、脾臓ＣＤ１９＋細胞の染色の写真である。図５Ｃは、未感作心臓における心筋ＣＤ１９＋Ｂリンパ球のサブセットの分析（ｎ＝４）である。図５Ｄでは、心筋にジフテリア毒素受容体（ＤＴＲ）を発現しているマウスをジフテリア毒素に曝露し、通常の飼料（対照、灰色のバー）またはピルフェニドンを豊富に含む飼料（ＰＦＤ、白色のバー）のいずれかを与えた。マウスをジフテリア毒素（ＤＴ）注射の４日後に屠殺し、フローサイトメトリーによる心筋ＣＤ１９＋Ｂリンパ球の分析のために心臓を回収した。ｎ＝４  対照、ｎ＝３  ピルフェニドンである。図５Ｅでは、野生型マウスは、９０分間の閉胸部虚血再灌流（Ｉ／Ｒ）傷害を受けた。マウスには通常の飼料（対照、灰色のバー）またはピルフェニドンを豊富に含む飼料（ＰＦＤ、白いバー）のいずれかを与えた。マウスをＩ／Ｒ傷害の４日後に屠殺し、フローサイトメトリーによる心筋ＣＤ１９＋Ｂリンパ球の分析のために心臓を回収した。（ｎ＝８対照、ｎ＝５ピルフェニドン）。＊＝Ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、†ｐ＜０．００１対未感作心臓；バーは平均を表す。エラーバーは標準偏差を表す。Ｐ値は、二元配置分散分析に続いて、多重比較のためにテューキーの検定で計算した。
【図６】図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ、図６Ｄ、図６Ｅ、図６Ｆ、図６Ｇ、図６Ｈ、図６Ｉ、図６Ｊ、及び図６Ｋは、抗ＣＤ２０抗体によるＢ細胞枯渇、及びＩ／Ｒ傷害後のピルフェニドン心臓保護効果に対するＢ細胞枯渇の効果を示す。図６Ｄ〜図６Ｋでは、マウスに抗ＣＤ２０抗体（抗ＣＤ２０）またはアイソタイプ対照（対照）を注射した。注射の７日後、脾臓（図６Ａ、ｎ＝３／群）及び心臓（図６Ｉ、ｎ＝３群）を採取し、フローサイトメトリーにより分析した。図６Ｃでは、マウスに抗ＣＤ２０抗体またはアイソタイプ対照（対照）を注射した。注射の７日後に、マウスは閉胸部虚血再灌流傷害を受けた。虚血再灌流傷害の４日後に、動物を屠殺し、心筋をフローサイトメトリーにより分析した。ｎ＝２  抗ＣＤ２０、ｎ＝３  対照である。バーは平均を表し、エラーバーは標準偏差を表す。野生型マウスは、抗ＣＤ２０抗体の注射によりＢ細胞が枯渇した。抗ＣＤ２０抗体の注射の７日後、Ｂ細胞枯渇マウスは９０分間の閉胸部虚血再灌流（Ｉ／Ｒ）傷害を受けた。マウスには、ピルフェニドンを豊富に含む飼料（抗ＣＤ２０  ＰＦＤ）または通常の飼料（抗ＣＤ２０対照）のいずれかを与えた。図６Ｄは、虚血時の簡略化した区域壁運動スコア指標（ＳＷＭＳＩ）により決定された閉胸部虚血中のリスクのある領域である。図６Ｅは、抗ＣＤ２０処置マウス（左）及び抗ＣＤ２０＋ピルフェニドン処置動物（右）から回収した心臓の代表的な写真である。スケールバー＝１ｍｍ。図６Ｆは、ピルフェニドン処置動物（抗ＣＤ２０  ＰＦＤ）及び未処置対照（抗ＣＤ２０対照）から回収した心臓の重量分析であり、ｎ＝７／群である。図６Ｇ〜図６Ｈは、虚血時、及びＩ／Ｒ傷害の２週間後の心筋機能の心エコー評価であり、ｎ＝７／群である。前の図で既に報告されている非抗ＣＤ２０処置動物のデータが比較のみのために再び示されている（対照）  図６Ｇは、２Ｄ心エコー検査によるＬＶ質量（ＬＶＭ）であり、図６Ｈは、ＬＶ拡張末期容積（ＬＶＥＤＶ）Ｆ）ＬＶ駆出率（ＬＶＥＦ）である。図６Ｊは、対照動物（左パネル）及びピルフェニドン処置動物（右パネル）の心臓の組織切片の代表的なトリクローム染色である。１．２５倍の倍率  図６Ｋは、トリクローム陽性染色の割合（％）の定量的評価であり、各心臓あたり２つの切片を分析した。ｎ＝１０切片／群である。＊＝ｐ＜０．０５。バーは平均を表し、エラーバーは標準偏差を表す。Ｐ値は、スチューデントＴ検定で計算した。
【図７】図７Ａ及び図７Ｂは、平均蛍光強度ピーク（図７Ａ）及びグラフ（図７Ｂ）により、腹膜由来炎症細胞の培養において、ピルフェニドンがＣＤ１９＋細胞におけるＣＤ８６のＬＰＳ誘導性上方制御を妨げることを示す。
【図８】図８Ａ及び図８Ｂは、平均蛍光強度ピーク（図８Ａ）及びグラフ（図８Ｂ）により、脾臓由来ＣＤ１９＋細胞の培養において、ピルフェニドンがＣＤ１９＋細胞におけるＣＤ８６のＬＰＳ誘導性上方制御を妨げることを示す。
【図９】図９Ａ及び図９Ｂは、平均蛍光強度ピーク（図９Ａ）及びグラフ（図９Ｂ）により、ピルフェニドンがＤＴＲ処置マウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏでのＣＤ１９＋細胞でのＣＤ８６の上方制御を低減することを示す。
【図１０】図１０Ａ、図１０Ｂ、図１０Ｃ、図１０Ｄ、図１０Ｅ、図１０Ｆ、図１０Ｇ、図１０Ｈ、図１０Ｉ及び図１０Ｊは、ＣＤ１９＋ＣＤ１１ｂ＋及びＣＤ１９＋ＣＤ１１ｂ−細胞の転写プロファイリング、ならびに野生型及びＴＩＲＡＰ欠損免疫細胞におけるＢ細胞活性化の分析を示す。心筋にジフテリア毒素受容体を発現しているマウスを未処置（未感作）のままにするか、またはジフテリア毒素に曝露し、ピルフェニドンを豊富に含む飼料（ＤＴＲ−ＰＦＤ）もしくは通常の飼料（ＤＴＲ）を与えた。マウスをジフテリア毒素（ＤＴ）注射の４日後に屠殺し、フローサイトメトリーによる分析のために心臓を回収した。ＣＤ１９＋ＣＤ１１ｂ＋及びＣＤ１９＋ＣＤ１１ｂ−細胞を、未感作心臓、及び通常の飼料（ＤＴＲ）、ピルフェニドン豊富食（ＰＦＤ）を与えたＤＴ処置マウスの心臓からＦＡＣＳ選別し、ＲＮＡｓｅｑを使用して転写プロファイリングを実施した。図１０Ａは、未感作マウス（緑）、ＤＴＲ処置マウス（赤）、及びピルフェニドンに曝露されたＤＴＲ処置マウス（紫）から単離された心筋ＣＤ１９＋ＣＤ１１ｂ＋リンパ球の主成分分析である。図１０Ｂは、未感作マウス（緑）、ＤＴＲ処置マウス（赤）、及びピルフェニドンに曝露されたＤＴＲ処置マウス（紫）から単離された心筋ＣＤ１９＋ＣＤ１１ｂ−リンパ球の主成分分析である。図１０Ｃ〜図１０Ｄは、ＣＤ１９＋ＣＤ１１ｂ＋リンパ球（図１０Ｃ）及びＣＤ１９＋ＣＤ１１ｂ−リンパ球（図１０Ｄ）における、ＤＴＲ傷害及び未感作マウス（左列）ならびにＤＴＲ傷害＋ピルフェニドン及び未感作マウス（右列）間の差次的に発現する遺伝子のＫＥＧＧ経路分析である。図１０Ｅ〜図１０Ｆは、未分画腹膜由来免疫細胞を、チオグリコレートの腹腔内注射の４日後に採取し、培養液に入れた。細胞を、培地のみで（対照）、Ｈ９ｃ２細胞の壊死性細胞抽出物の存在下で（ＮＣＥ）、ＮＣＥ及びピルフェニドンの存在下で（ＮＣＥ−ＰＦＤ）、ＬＰＳの存在下で（ＬＰＳ）、またはＬＰＳ及びピルフェニドンの存在下で（ＬＰＳ−ＰＦＤ）培養した。培養の２４時間後、細胞をフローサイトメトリー分析のために採取し、ＣＤ１９＋ＣＤ８６ｈｉｇｈ細胞の有病率を定量化した。各実験ごとに３回の生物学的反復について報告した。図１０Ｅは、野生型マウスから採取した免疫細胞の結果について報告し、図１０Ｆは、ＴＩＲＡＰ−／−動物から採取した免疫細胞の結果について報告する。図１０Ｇ〜図１０Ｈは、脾臓からＢリンパ球を精製し、パネルＡ及びＢについて記載したのと同じ条件下で２４時間培養した。培養の２４時間後、細胞をフローサイトメトリー分析のために採取し、ＣＤ１９＋ＣＤ８６ｈｉｇｈ細胞の有病率を定量化した。各実験ごとに３回の生物学的反復について報告した。図１０Ｇは、野生型マウスから精製した脾臓Ｂ細胞の結果について報告し、図１０Ｈは、ＴＩＲＡＰ−／−動物から採取した免疫細胞の結果について報告する。図１０Ｉ〜図１０Ｊでは、マウスは、ジフテリア毒素への曝露（図１０Ｉ）により、または９０分間の閉胸部虚血と、その後の再灌流（図１０Ｊ）のいずれかにより、急性心筋傷害を受けた。マウスには通常の飼料（対照）またはピルフェニドンを豊富に含む飼料（ＰＦＤ）を与えた。傷害の４日後に、心筋を回収し、フローサイトメトリーにより分析して心筋ＣＤ１９＋ＣＤ８６ｈｉｇｈ細胞の数を評価した。パネルＥはｎ＝４／群であり、パネルＦはｎ＝４  対照、ｎ＝５  ＰＦＤである。＊＝Ｐ＜０．０５、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。バーは平均を表す。エラーバーは標準偏差を表す。Ｐ値は、パネルＡ〜Ｄにおいて、一元配置分散分析に続いて、多重比較のためのテューキーの検定で計算し、パネルＥ及びＦにおいて、スチューデントＴ検定で計算した。
【図１１】図１１Ａ、図１１Ｂ、図１１Ｃ、及び図１１Ｄは、２４時間培養した腹膜由来炎症細胞においてＣＤ１９＋上でのＣＤ８６の発現を示す。腹膜由来炎症細胞をチオグリコレートの腹腔内注射後の日に採取した。細胞を２４時間、ベースライン条件（対照）、ＬＰＳ１００ｎｇ／ｍｌ（ＬＰＳ）の存在下、またはＬＰＳ１００ｎｇ／ｍｌ及び様々な濃度の異なる形態のＰＥＧ化ピルフェニドン（図１１ＡでＣ２及びＣ３、図１１ＢでＣ４〜Ｃ６と命名）の存在下で培養した。培養の２４時間後、細胞を採取し、フローサイトメトリーにより分析して、ＣＤ１９＋細胞（Ｂリンパ球）上でのＣＤ８６の発現を評価した。図１１Ａ及び図１１Ｂのグラフは、ピルフェニドン及び試験した形態のＰＥＧ化ピルフェニドンの両方が、ＣＤ１９＋細胞上でのＣＤ８６の発現を減少させたことを示す。図１１Ｃは、試験した形態のＰＥＧ化ピルフェニドンの分子量及び試験化合物とピルフェニドンとの間の分子量（ＭＷ）比について報告する。図１１Ｄは、試験したＰＥＧ化ピルフェニドンバリアントの分子構造（Ｃ２〜Ｃ６）を、ピルフェニドンに対するそれらの相対的効力の評価（使用する薬剤の量を重量濃度からモル濃度に変換して計算）及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ毒性の評価（培養細胞の目視検査及びフローサイトメトリー分析時のＤＡＰＩ染色により評価される）と合わせて示す。重要なことに、表は、試験したＰＥＧ−ピルフェニドンのバリアントが同等ではなく、Ｃ６（Ｐｅｇｙｄｏｎｅ  ６）が他の試験したバリアントよりも優れていることを示す。
【図１２】図１２Ａ、図１２Ｂ及び図１２Ｃは、ピルフェニドンと比較した、Ｐｅｇｙｄｏｎｅ  ６のＰｋ及びバイオアベイラビリティを示す。６〜８週齢のＣＤ−１／ＩＣＲマウスに４０ｍｇ／ｋｇのピルフェニドンまたはＰｅｇｙｄｏｎｅ−６を静脈内または経口投与した。事前に指定した時点で血液を採取し、投与した薬剤の濃度を質量分析法（ＬＣ−ＭＳ−ＭＳ）で測定した。各時点で３回採取した。図１２Ａは、ピルフェニドンの静脈内投与後に収集したデータについて報告し、図１２Ｂは、Ｐｅｇｙｄｏｎｅ  ６の投与後に収集したデータについて報告する。図１２Ｃは、図１２Ａ及び図１２Ｂに報告されたグラフから計算された２つの薬剤の半減期について報告している。図１２Ｃは、Ｐｅｇｙｄｏｎｅ  ６及びピルフェニドンの計算された半減期及びバイオアベイラビリティについて報告する。
【図１３】図１３Ａ、図１３Ｂ及び図１３Ｃは、心筋Ｂリンパ球の動態を示す。図１３Ａは、３週間の並体結合マウスが循環ＣＤ１９＋Ｂリンパ球の５０％キメラ現象を示すことを示す。図１３Ｂは、心筋Ｂリンパ球のキメラ現象の分析である。結合した動物は、ＣＤ１９＋ＣＤ１１ｂ＋及びＣＤ１９＋ＣＤ１１ｂ−心筋Ｂリンパ球の両方で５０％のキメラ現象を示す。図１３Ｃは、心筋ＣＤ１９＋細胞及び循環ＣＤ１９＋細胞間のキメラ現象の比を示す。血液及び心筋間のＢ細胞キメラ現象の比率は約１である。このことは、心筋Ｂリンパ球が急速に再循環し、循環Ｂリンパ球と平衡状態にあることを裏付け、心筋Ｂ細胞に対するピルフェニドン及び／またはＰＥＧピルフェニドンの効果が末梢血Ｂリンパ球で評価できることを示している。
【図１４】図１４Ａ、図１４Ｂ、図１４Ｃ及び図１４Ｄは、心筋Ｂ細胞が加齢とともに変化するため、ピルフェニドン及び／またはＰＥＧ−ピルフェニドンを使用して、心筋Ｂ細胞の加齢関連変化を調節することができたことを示す。示された異なる年齢のマウスを屠殺し、フローサイトメトリーを介して心臓を分析した。各時点で３回測定した。図１４Ａは、加齢とともにＣＤ１９＋細胞の有病率が増加することを示す。図１４Ｂは、ＣＤ１９＋ＣＤ１１ｂ＋細胞の有病率も同様に増加することを示す。図１４Ｃは、加齢とともにＣＤ１９＋ＣＤ１１ｂ−細胞の有病率が低下することを示す。
【図１５】ヒトの心臓の試料中のＢリンパ球のフローサイトメトリー分析を示す。このデータは、ヒトの心臓がマウスの心臓で観察されるものと同様のＢ細胞の集団を保有していることを示し、したがって、ピルフェニドンまたはＰＥＧ−ピルフェニドンが、マウスで観察されるものと同様のヒトでの心臓保護効果を有する可能性が高いことを立証する。
【図１６】図１６Ａ、図１６Ｂ、図１６Ｃ、図１６Ｄ、図１６Ｅ、図１６Ｆ、図１６Ｇ、図１６Ｈ、図１６Ｉ、図１６Ｊ、図１６Ｋ、図１６Ｌ、図１６Ｍ、図１６Ｎ、図１６Ｏ、図１６Ｐ、図１６Ｑ、図１６Ｒ、図１６Ｓ、図１６Ｔ、図１６Ｕ、図１６Ｖ、及び図１６Ｗは、様々なＰＥＧ化ピルフェニドン誘導体の化学構造を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本明細書では、ピルフェニドン（ＰＦＤ）誘導体を含む組成物及び使用方法が提供される。本出願人らは、ＰＦＤ誘導体が、Ｂリンパ球活性の調節、及び急性傷害からの臓器の保護が可能であることを見出した。さらに、本出願人らは、ＰＥＧ化ピルフェニドンが、Ｂリンパ球に対する生物活性を維持することを見出した。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ−ピルフェニドン化合物は、Ｂリンパ球の活性を調節する能力においてピルフェニドンと同等の効力を持つ。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ−ピルフェニドンは、ピルフェニドンと比較して、半減期の延長及び／またはバイオアベイラビリティの向上を実現する。
【００１７】
開示された組成物を調製するために使用した成分、及び本明細書で開示される方法内で使用した組成物自体が開示される。これらの材料及び他の材料は本明細書に開示されており、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、群などが開示されている場合、これらの化合物の各種個別の、及び集合的な組み合わせの、及び並び替えの具体的な言及が明確に開示されていない可能性があるが、各々は本明細書において特に検討され、記載されていることが理解されよう。例えば、特定の化合物について開示及び論じられ、該化合物の多くの分子に対して行うことができる多くの修飾が論じられている場合、特にそれとは反対の指示がない限り、化合物及び可能な修飾のありとあらゆる組み合わせ及び並び替えが特に検討される。したがって、分子Ａ、Ｂ、及びＣのクラスだけでなく、分子Ｄ、Ｅ、及びＦのクラス、ならびに組み合わせ分子例Ａ−Ｄが開示されている場合、各々が個別に記載されていなくても、各々が個別に、かつ集合的に検討される意味の組み合わせ、Ａ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−Ｅ、及びＣ−Ｆが開示されていると見なされる。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせもまた開示される。したがって、例えば、Ａ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、及びＣ−Ｅのサブ群は開示されていると見なされる。この概念は、開示された組成物を作製及び使用する方法のステップを含むがこれらに限定されない、本出願の全ての態様に適用される。それ故、実行され得る種々の追加的なステップがある場合、これらの追加的なステップのそれぞれが、開示された方法の任意の特定の実施形態または複数実施形態の組み合わせを用いて実行され得ることが理解される。
【００１８】
本開示の追加の態様については、以下で説明する。
【００１９】
（Ｉ）組成物
本開示の一態様は、ＰＦＤまたはＰＦＤ誘導体を包含する。ＰＦＤまたはＰＦＤ誘導体は、改変して、非改変バージョンと比較して、効力、バイオアベイラビリティ、溶解性、安定性、取り扱い特性、またはそれらの組み合わせを改善し得る。したがって、別の態様では、本発明の組成物は、改変ＰＦＤまたはＰＦＤ誘導体を含む。さらに別の態様では、本発明の組成物は、ＰＦＤまたはＰＦＤ誘導体のプロドラッグを含む。
【００２０】
本発明の組成物は、ＰＦＤまたはＰＦＤ誘導体に加えて、１つまたは複数の追加の薬物または治療活性剤を場合により含んでもよい。本発明の組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤、担体、または希釈剤をさらに含んでもよい。さらに、本発明の組成物は、保存剤、可溶化剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、甘味剤、着色剤、着臭剤、塩（本発明の物質自体が薬学的に許容可能な塩の形態で提供され得る）、緩衝液、コーティング剤、または酸化防止剤を含むことができる。
【００２１】
本発明の他の態様は、以下でさらに詳細に説明される。
【００２２】
（ａ）ピルフェニドン（ＰＦＤ）及びＰＦＤ誘導体
一般に、本明細書で詳述する化合物には、以下に図示するような、ＰＦＤまたは５メチル−１−フェニル−２−［Ｈ］ピリドン構造を含む化合物が含まれる。ＰＦＤは、分子量１８５．２３ダルトンの非ペプチド合成分子である。その化学元素は、Ｃ１２Ｈ１１ＮＯとして表され、その合成は知られている。例えば、ＰＦＤは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＵＳ８５１９１４０に記載されているものを含む多くの有機合成方法によっても生成され得る。ＰＦＤは商業的に製造され、広域スペクトル抗線維化薬として臨床的に評価されている。
【化３】
2020530005.tif 000005
【００２３】
本明細書では、ＰＦＤの誘導体を提供する。ＰＦＤ誘導体は、Ｂリンパ球の活性を調節可能なＰＦＤの改変バージョンである。本明細書で使用される場合、「ＰＦＤ誘導体」は、当該分野で公知のＰＦＤ誘導体、式（Ｉ）または式（ＩＩ）のＰＦＤ誘導体であり得る。ＰＦＤ誘導体は当該分野で公知である。例えば、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＣＮ  １０６０８３７０２，ＣＮ  １０５８８４６８０，ＷＯ  ２００９０３５５９８，Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ．２０１４  Ｊａｎ  １；２４（１）：２２０−３，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２０１２（１７）：８８４−８９６、及びＭｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｏｃｔ  ２００５；１４（７）；３８２−４０３を参照のこと。Ｂリンパ球活性を調節する能力を有するＰＤＦ誘導体は、急性組織障害から臓器を保護するか、Ｂ細胞活性の調節不全によって引き起こされる疾患を緩和する薬剤として使用される可能性がある。
【００２４】
本明細書では、式（Ｉ）を含む化合物を提供し、
【化４】
2020530005.tif 000006
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、それぞれ水素、重水素、またはＬ−Ｘ−Ｂからなる群から独立して選択され、
Ｌは、Ｃ１−１２アルキルを含むリンカーであり、Ｘは、Ｏ−ＰＥＧ、ＮＨ（ＣＨ２）ｍＯ−ＰＥＧ、またはＳ（ＣＨ２）ｍＯ−ＰＥＧであり、ｍは、１〜１０の整数であり、ＰＥＧは、ｍＰＥＧ（メトキシポリエチレングリコール）、直鎖ＰＥＧ、分岐状ＰＥＧ、マルチアームＰＥＧ、及びＰＥＧ脂質の群から選択され、Ｂは、水素、重水素、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキニル、置換もしくは非置換アリール、及び置換もしくは非置換ヘテロアリール、またはその重水素化バージョンからなる群から選択され、
Ａは、水素、重水素、ハロゲン、ＣＦ３、ＣＤ３、ＣＮ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＯＲ’’、ＳＲ’’、ＮＲ’’Ｒ’’、ＮＲ’’ＣＯＲ’’、ＮＲ’’ＣＯＮＲ’’Ｒ’’、ＮＲ’’ＣＯ２Ｒ’’、ＣＯＲ’’、ＣＯ２Ｒ’’、ＮＯＲ’’、ＮＯ２、ＣＯＮＲ’’Ｒ’’、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’、ＳＯ２Ｒ’’、ＳＯ２ＮＲ’’Ｒ’’、ＮＲ’’ＳＯ２Ｒ’’、ＮＲ’’ＳＯ２ＮＲ’’Ｒ’’、Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、及びＣ（Ｏ）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、置換または非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換または非置換Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、置換または非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキニル、置換または非置換アリール、及び置換または非置換ヘテロアリールからなる群から選択され、
Ｒ’’は、水素、重水素、置換Ｃ１〜Ｃ４脂肪族部分、窒素、酸素、または硫黄を含む脂肪族部分からなる群から独立して選択されてもよく、あるいは、同じ窒素原子に結合した２つのＲ’’部分が、窒素原子と任意に一緒になって、窒素、酸素、または硫黄からなる群から独立して選択される１〜２個の追加のヘテロ原子を有する３〜７員の飽和または不飽和環を形成する。
【００２５】
ＰＥＧは、約１００〜約５０，０００ダルトン、約２００〜約５０，０００ダルトン、約３００〜約５０，０００ダルトン、約４００〜約５０，０００ダルトン、約５００〜約５０，０００ダルトン、約６００〜約５０，０００ダルトン、約７００〜約５０，０００ダルトン、約８００〜約５０，０００ダルトン、約９００〜約５０，０００ダルトン、約１，０００〜約５０，０００ダルトン、約１，５００〜約５０，０００、約２，０００〜約５０，０００、約２，５００〜約５０，０００、約３，０００〜約５０，０００、約３，５００〜約５０，０００、約４，０００〜約５０，０００、約４，５００〜約５０，０００、約５，０００〜約５０，０００、約５，５００〜約５０，０００、約６，０００〜約５０，０００、約６，５００〜約５０，０００、約７，０００〜約５０，０００、約７，５００〜約５０，０００、約８，０００〜約５０，０００、約８，５００〜約５０，０００、約９，０００〜約５０，０００、約９，５００〜約５０，０００、約１０，０００〜約５０，０００、約１１，０００〜約５０，０００、約１２，０００〜約５０，０００、約１３，０００〜約５０，０００、約１４，０００〜約５０，０００ダルトン、約１５，０００〜約５０，０００ダルトン、約１６，０００〜約５０，０００ダルトン、約１７，０００〜約５０，０００ダルトン、約１８，０００〜約約５０，０００ダルトン、約１９，０００〜約５０，０００ダルトン、約２０，０００〜約５０，０００ダルトン、約３０，０００〜約５０，０００ダルトン、または約４０，０００〜約５０，０００ダルトンの範囲の分子量を有する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約４０〜約１，２００ダルトンの範囲の分子量を有する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約１，０００ダルトン未満の分子量を有する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約１，０００ダルトンの分子量を有する。
【００２６】
一実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、前述の式（Ｉ）の化合物のいずれかを含み、式中、Ｒ１は、水素、重水素、またはＬ−Ｘ−Ｂからなる群から選択され得、Ｌは、Ｃ１−１２アルキルを含むリンカーであり、Ｘは、Ｏ−ＰＥＧ、ＮＨ（ＣＨ２）ｍＯ−ＰＥＧ、またはＳ（ＣＨ２）ｍＯ−ＰＥＧであり、ｍは、１〜１０の整数であり、ＰＥＧは、ｍＰＥＧ（メトキシポリエチレングリコール）、直鎖ＰＥＧ、分岐状ＰＥＧ、マルチアームＰＥＧ、及びＰＥＧ脂質の群から選択され、Ｂは、水素、重水素、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキニル、置換もしくは非置換アリール、及び置換もしくは非置換ヘテロアリール、またはその重水素化バージョンからなる群から選択される。特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、前述の式（Ｉ）の化合物のいずれかを含み、式中、Ｒ１は、Ｈである。
【００２７】
別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、前述の式（Ｉ）の化合物のいずれかを含み、式中、Ｒ２は、水素、重水素、またはＬ−Ｘ−Ｂからなる群から選択され得、Ｌは、Ｃ１−１２アルキルを含むリンカーであり、Ｘは、Ｏ−ＰＥＧ、ＮＨ（ＣＨ２）ｍＯ−ＰＥＧ、またはＳ（ＣＨ２）ｍＯ−ＰＥＧであり、ｍは、１〜１０の整数であり、ＰＥＧは、ｍＰＥＧ（メトキシポリエチレングリコール）、直鎖ＰＥＧ、分岐状ＰＥＧ、マルチアームＰＥＧ、及びＰＥＧ脂質の群から選択され、Ｂは、水素、重水素、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキニル、置換もしくは非置換アリール、及び置換もしくは非置換ヘテロアリール、またはその重水素化バージョンからなる群から選択される。特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、前述の式（Ｉ）の化合物のいずれかを含み、式中、Ｒ２は、水素またはＬ−Ｘ−Ｂから選択され、Ｌは、Ｃ１−２アルキルを含むリンカーであり、Ｘは、Ｏ−ＰＥＧであり、ＰＥＧは、直鎖ＰＥＧ、分岐状ＰＥＧ、マルチアームＰＥＧ、及びＰＥＧ脂質からなる群から選択され、Ｂは、ＣＨ３である。
【００２８】
さらに別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、前述の式（Ｉ）の化合物のいずれかを含み、式中、Ｒ３は、水素、重水素、またはＬ−Ｘ−Ｂからなる群から選択され得、Ｌは、Ｃ１−１２アルキルを含むリンカーであり、Ｘは、Ｏ−ＰＥＧ、ＮＨ（ＣＨ２）ｍＯ−ＰＥＧ、またはＳ（ＣＨ２）ｍＯ−ＰＥＧであり、ｍは、１〜１０の整数であり、ＰＥＧは、ｍＰＥＧ（メトキシポリエチレングリコール）、直鎖ＰＥＧ、分岐状ＰＥＧ、マルチアームＰＥＧ、及びＰＥＧ脂質の群から選択され、Ｂは、水素、重水素、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキニル、置換もしくは非置換アリール、及び置換もしくは非置換ヘテロアリール、またはその重水素化バージョンからなる群から選択される。特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、前述の式（Ｉ）の化合物のいずれかを含み、式中、Ｒ３は、水素またはＬ−Ｘ−Ｂから選択され、Ｌは、Ｃ１−３アルキルを含むリンカーであり、Ｘは、Ｏ−ＰＥＧまたはＮＨ（ＣＨ２）ｍＯ−ＰＥＧであり、ＰＥＧは、ｍＰＥＧ（メトキシポリエチレングリコール）、直鎖ＰＥＧ、分岐状ＰＥＧ、マルチアームＰＥＧ、及びＰＥＧ脂質の群から選択され、ｍは、２〜３の整数であり、Ｂは、ＣＨ３である。
【００２９】
なおさらなる別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、前述の式（Ｉ）の化合物のいずれかを含み、式中、Ｒ４は、水素、重水素、またはＬ−Ｘ−Ｂからなる群から選択され得、Ｌは、Ｃ１−１２アルキルを含むリンカーであり、Ｘは、Ｏ−ＰＥＧ、ＮＨ（ＣＨ２）ｍＯ−ＰＥＧ、またはＳ（ＣＨ２）ｍＯ−ＰＥＧであり、ｍは、１〜１０の整数であり、ＰＥＧは、ｍＰＥＧ（メトキシポリエチレングリコール）、直鎖ＰＥＧ、分岐状ＰＥＧ、マルチアームＰＥＧ、及びＰＥＧ脂質の群から選択され、Ｂは、水素、重水素、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキニル、置換もしくは非置換アリール、及び置換もしくは非置換ヘテロアリール、またはその重水素化バージョンからなる群から選択される。特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、前述の式（Ｉ）の化合物のいずれかを含み、式中、Ｒ４は、水素またはＬ−Ｘ−Ｂから選択され、Ｌは、Ｃ１−３アルキルを含むリンカーであり；Ｘは、Ｏ−ＰＥＧまたはＮＨ（ＣＨ２）ｍＯ−ＰＥＧであり、ＰＥＧは、ｍＰＥＧ（メトキシポリエチレングリコール）、直鎖ＰＥＧ、分岐状ＰＥＧ、マルチアームＰＥＧ、及びＰＥＧ脂質の群から選択され、ｍは、２〜３の整数であり、Ｂは、ＣＨ３である。
【００３０】
異なる実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、前述の式（Ｉ）の化合物のいずれかを含み、式中、Ｒ５は、水素、重水素、またはＬ−Ｘ−Ｂからなる群から選択され得、Ｌは、Ｃ１−１２アルキルを含むリンカーであり、Ｘは、Ｏ−ＰＥＧ、ＮＨ（ＣＨ２）ｍＯ−ＰＥＧ、またはＳ（ＣＨ２）ｍＯ−ＰＥＧであり、ｍは、１〜１０の整数であり、ＰＥＧは、ｍＰＥＧ（メトキシポリエチレングリコール）、直鎖ＰＥＧ、分岐状ＰＥＧ、マルチアームＰＥＧ、及びＰＥＧ脂質の群から選択され、Ｂは、水素、重水素、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキニル、置換もしくは非置換アリール、及び置換もしくは非置換ヘテロアリール、またはその重水素化バージョンからなる群から選択される。特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、前述の式（Ｉ）の化合物のいずれかを含み、式中、Ｒ５は、水素またはＬ−Ｘ−Ｂから選択され、Ｌは、ＣＨ３であり、Ｘは、Ｏ−ＰＥＧであり、ＰＥＧは、ｍＰＥＧ（メトキシポリエチレングリコール）、直鎖ＰＥＧ、分岐状ＰＥＧ、マルチアームＰＥＧ、及びＰＥＧ脂質の群から選択され、Ｂは、ＣＨ３である。
【００３１】
一実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、前述の式（Ｉ）の化合物のいずれかを含み、式中、Ａは、水素、ハロゲン、ＣＦ３、ＣＤ３、または置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルからなる群から選択され得る。特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、前述の式（Ｉ）の化合物のいずれかを含み、式中、Ａは、ＣＨ３、ＣＦ３、ＣＤ３、またはＣＨ２−シクロプロピルからなる群から選択される。
【００３２】
例示的な実施形態では、本開示の化合物は、以下に示す式（Ｉ）
【化５】
2020530005.tif 000007
【化６】
2020530005.tif 000008
【化７】
2020530005.tif 000009
【化８】
2020530005.tif 000010
を含む。
【００３３】
本明細書では、式（ＩＩ）を含む化合物を提供し、
【化９】
2020530005.tif 000011
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ水素、重水素、またはＬ−Ｘ−Ｂからなる群から独立して選択され、
Ｌは、Ｃ１−１２アルキルを含むリンカーであり、Ｘは、Ｏ−ＰＥＧ、ＮＨ（ＣＨ２）ｍＯ−ＰＥＧ、またはＳ（ＣＨ２）ｍＯ−ＰＥＧであり、ｍは、１〜１０の整数であり、ＰＥＧは、ｍＰＥＧ（メトキシポリエチレングリコール）、直鎖ＰＥＧ、分岐状ＰＥＧ、マルチアームＰＥＧ、及びＰＥＧ脂質の群から選択され、Ｂは、水素、重水素、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキニル、置換もしくは非置換アリール、及び置換もしくは非置換ヘテロアリール、またはその重水素化バージョンからなる群から選択され、
Ｏ−ＰＥＧは、ｍＰＥＧ（メトキシポリエチレングリコール）、直鎖ＰＥＧ、分岐状ＰＥＧ、マルチアームＰＥＧ、及びＰＥＧ脂質の群から選択され、ＰＥＧエンドキャップは、水素、重水素、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキニル、置換もしくは非置換アリール、及び置換もしくは非置換ヘテロアリール、またはその重水素化バージョンからなる群から選択され、
Ａは、水素、重水素、ハロゲン、ＣＦ３、ＣＤ３、ＣＮ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＯＲ’’、ＳＲ’’、ＮＲ’’Ｒ’’、ＮＲ’’ＣＯＲ’’、ＮＲ’’ＣＯＮＲ’’Ｒ’’、ＮＲ’’ＣＯ２Ｒ’’、ＣＯＲ’’、ＣＯ２Ｒ’’、ＮＯＲ’’、ＮＯ２、ＣＯＮＲ’’Ｒ’’、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’、ＳＯ２Ｒ’’、ＳＯ２ＮＲ’’Ｒ’’、ＮＲ’’ＳＯ２Ｒ’’、ＮＲ’’ＳＯ２ＮＲ’’Ｒ’’、Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、及びＣ（Ｏ）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、置換または非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換または非置換Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、置換または非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキニル、置換または非置換アリール、及び置換または非置換ヘテロアリールからなる群から選択され、
Ｒ’’は、水素、置換Ｃ１〜Ｃ４脂肪族部分、窒素、酸素、または硫黄を含む脂肪族部分からなる群から独立して選択されてもよく、あるいは、同じ窒素原子に結合した２つのＲ’’部分が、窒素原子と任意に一緒になって、窒素、酸素、または硫黄からなる群から独立して選択される１〜２個の追加のヘテロ原子を有する３〜７員の飽和または不飽和環を形成する。
【００３４】
ＰＥＧまたはｍＰＥＧは、約１００〜約５０，０００ダルトン、約２００〜約５０，０００ダルトン、約３００〜約５０，０００ダルトン、約４００〜約５０，０００ダルトン、約５００〜約５０，０００ダルトン、約６００〜約５０，０００ダルトン、約７００〜約５０，０００ダルトン、約８００〜約５０，０００ダルトン、約９００〜約５０，０００ダルトン、約１，０００〜約５０，０００ダルトン、約１，５００〜約５０，０００、約２，０００〜約５０，０００、約２，５００〜約５０，０００、約３，０００〜約５０，０００、約３，５００〜約５０，０００、約４，０００〜約５０，０００、約４，５００〜約５０，０００、約５，０００〜約５０，０００、約５，５００〜約５０，０００、約６，０００〜約５０，０００、約６，５００〜約５０，０００、約７，０００〜約５０，０００、約７，５００〜約５０，０００、約８，０００〜約５０，０００、約８，５００〜約５０，０００、約９，０００〜約５０，０００、約９，５００〜約５０，０００、約１０，０００〜約５０，０００、約１１，０００〜約５０，０００、約１２，０００〜約５０，０００、約１３，０００〜約５０，０００、約１４，０００〜約５０，０００ダルトン、約１５，０００〜約５０，０００ダルトン、約１６，０００〜約５０，０００ダルトン、約１７，０００〜約５０，０００ダルトン、約１８，０００〜約約５０，０００ダルトン、約１９，０００〜約５０，０００ダルトン、約２０，０００〜約５０，０００ダルトン、約３０，０００〜約５０，０００ダルトン、または約４０，０００〜約５０，０００ダルトンの範囲の分子量を有する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約４０〜約１，２００ダルトンの範囲の分子量を有する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約１，０００ダルトン未満の分子量を有する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約１，０００ダルトンの分子量を有する。
【００３５】
式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物の用量は、治療される疾患または障害、治療される対象の年齢及び状態に応じて、広い範囲で変化し得る。式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物を含む組成物が試料と接触する実施形態では、式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物の濃度は、約０．１μＭ〜約４０μＭであり得る。あるいは、式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物の濃度は、約５μＭ〜約２５μＭであり得る。例えば、式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物の濃度は、約０．１、約０．２５、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１、約２．５、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約３０、約３５、または約４０μＭであり得る。加えて、式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物の濃度は、約４０μＭより高くてもよい。例えば、式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物の濃度は、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、または約１００μＭであり得る。
【００３６】
式（Ｉ）の化合物を含む組成物が対象に投与される実施形態では、式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物の用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇであり得る。例えば、式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物の用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、または約２５ｍｇ／ｋｇであり得る。あるいは、式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物の用量は、約２５ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、約７５ｍｇ／ｋｇ、約１００ｍｇ／ｋｇ、約１２５ｍｇ／ｋｇ、約１５０ｍｇ／ｋｇ、約１７５ｍｇ／ｋｇ、約２００ｍｇ／ｋｇ、約２２５ｍｇ／ｋｇ、または約２５０ｍｇ／ｋｇであり得る。加えて、式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物の用量は、約３００ｍｇ／ｋｇ、約３２５ｍｇ／ｋｇ、約３５０ｍｇ／ｋｇ、約３７５ｍｇ／ｋｇ、約４００ｍｇ／ｋｇ、約４２５ｍｇ／ｋｇ、約４５０ｍｇ／ｋｇ、約４７５ｍｇ／ｋｇ、または約５００ｍｇ／ｋｇであり得る。
【００３７】
（ｃ）組成物の成分
本開示はまた、薬学的組成物を提供する。薬学的組成物は、有効成分としてのＰＦＤ、ＰＦＤ誘導体、式（Ｉ）の化合物、または式（ＩＩ）の化合物、及び少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤を含む。
【００３８】
薬学的に許容可能な賦形剤は、希釈剤、結合剤、充填剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、崩壊剤、分散剤、保存剤、潤滑剤、矯味剤、着香剤、または着色剤であり得る。薬学的組成物を形成するために利用される賦形剤の量及び種類は、薬学の既知の原理にしたがって選択され得る。
【００３９】
本明細書に記載の各実施形態では、本発明の組成物は、ＰＦＤ、ＰＦＤ誘導体、式（Ｉ）の化合物、または式（ＩＩ）の化合物に加えて、１つまたは複数の追加の薬剤または治療活性剤を場合により含んでもよい。いくつかの実施形態では、追加の薬剤または治療活性剤は、抗炎症効果を誘発するか、対象の形質細胞及び／またはＢ細胞のレベルを低下させることができる。いくつかの実施形態では、二次薬剤は、抗体である。いくつかの実施形態では、二次薬剤は、デクスプラミペキソールではない。いくつかの実施形態では、二次薬剤は、コルチコステロイド、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、静脈内免疫グロブリン、チロシンキナーゼ阻害剤、融合タンパク質、１つまたは複数の炎症誘発性サイトカインに対するモノクローナル抗体、化学療法剤、及びこれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、二次薬剤は、グルココルチコイド、コルチコステロイド、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、フェノール性抗酸化剤、抗増殖薬、チロシンキナーゼ阻害剤、抗ＩＬ−５またはＩＬ５受容体モノクローナル抗体、抗ＩＬ−１３または抗ＩＬ−１３受容体モノクローナル抗体、ＩＬ−４またはＩＬ−４受容体モノクローナル抗体、抗ＩｇＥモノクローナル抗体、１つもしくは複数の炎症誘発性サイトカインに対するモノクローナル抗体、ＴＮＦ−α阻害剤、融合タンパク質、化学療法剤、またはこれらの組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、二次薬剤は、抗炎症薬である。いくつかの実施形態では、抗炎症薬は、アルクロフェナック、プロピオン酸アルクロメタゾン、アルゲストンアセトニド、アルファアミラーゼ、アムシナファル、アムシナフィド、アンフェナクナトリウム、塩酸アミプリロース、アナキンラ、アニロラック、アニトラザフェン、アパゾン、バルサラジド二ナトリウム、ベンダザック、ベノキサプロフェン、塩酸ベンジダミン、ブロメライン、ブロペラモール、ブデソニド、カルプロフェン、シクロプロフェン、シンタゾン、クリプロフェン、プロピオン酸クロベタゾール、クロベタゾン酪酸エステル、クロピラク、プロピオン酸クロチカゾン、酢酸コルメタゾン、コルトドキソン、クルクミン、デフラザコート、デソニド、デスオキシメタゾン、ジプロピオン酸デキサメタゾン、ジクロフェナクカリウム、ジクロフェナクナトリウム、酢酸ジフロラゾン、ジフルミドンナトリウム、ジフルニサル、ジフルプレドナート、ジフタロン、ジメチルスルホキシド、ドロシノニド、エンドリゾン、エンリモマブ、エノリカムナトリウム、エピリゾール、エトドラク、エトフェナメート、フェルビナク、フェナモール、フェンブフェン、フェンクロフェナク、フェンクロラク、フェンドサール、フェンピパロン、フェンチアザク、フラザロン、フルアザコート、フルフェナム酸、フルミゾール、酢酸フルニソリド、フルニキシン、フルニキシンメグルミン、フルオコルチンブチル、酢酸フルオロメトロン、フルクアゾン、フルルビプロフェン、フルレトフェン、プロピオン酸フルチカゾン、フラプロフェン、フロブフェン、ハルシノニド、プロピオン酸ハロベタゾール、酢酸ハロプレドン、イブフェナク、イブプロフェン、イブプロフェンアルミニウム、イブプロフェンピコノ���ル、イロニダップ、インドメタシン、インドメタシンナトリウム、インドプロフェン、インドキソール、イントラゾール、酢酸イソフルプレドン、イソキセパック、イソキシカム、ケトプロフェン、ロフェミゾール塩酸塩、ロモキシカム（ｌｏｍｏｘｉｃａｍ）、エタボン酸ロテプレドノール、リソフィリン、メクロフェナメートナトリウム、メクロフェナム酸、メクロリゾンジブチレート、メフェナム酸、メサラミン、メセクラゾン、スレプタン酸メチルプレドニゾロン、モミフルメート、ナブメトン、ナプロキセン、ナプロキセンナトリウム、ナプロキソール、ニマゾン、オルサラジンナトリウム、オルゴテイン、オルパノキシン、オキサプロジン、オキシフェンブタゾン、塩酸パラニリン、ペントサン多硫酸ナトリウム、フェンブタゾンナトリウムグリセレート、ピロキシカム、ケイ皮酸ピロキシカム、ピロキシカムオラミン、ピロプロフェン、プレドナゼート、プリフェロン、プロドール酸、プロクアゾン、プロキサゾール、クエン酸プロキサゾール、リメキソロン、ロマザリット、サルコレックス、サルナセジン、サルサレート、塩化サングイナリウム、セクラゾン、セルメタシン、スドキシカム、スリンダク、スプロフェン、タルメタシン、タルニフルメート、タロサレート、テブフェロン、テニダップ、テニダップナトリウム、テノキシカム、テシカム、テシミド、テトリダミン、チオピナク、チキソコルトールピバレート、トルメチン、トルメチンナトリウム、トリクロニド、トリフルミダート、ジドメタシン、ゾメピラックナトリウム、アスピリン（アセチルサリチル酸）、サリチル酸、コルチコステロイド、グルココルチコイド、タクロリムス、ピメコルリムス、メポリズマブ、それらのプロドラッグ、及びそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されるわけではない。いくつかの実施形態では、チロシンキナーゼ阻害剤は、イマチニブである。いくつかの実施形態では、抗ＩＬ−５モノクローナル抗体は、メポリズマブまたはレズリズマブである。いくつかの実施形態では、ＩＬ−５受容体モノクローナル抗体は、ベンラリズマブである。いくつかの実施形態では、抗ＩＬ−１３モノクローナル抗体は、レブリキズマブまたはデュリプマブ（ｄｕｌｉｐｕｍａｂ）である。いくつかの実施形態では、抗ＩＬ−４モノクローナル抗体は、デュリプマブである。いくつかの実施形態では、抗ＩｇＥモノクローナル抗体は、オマリズマブである。いくつかの実施形態では、ＴＮＦ−α阻害剤は、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、またはゴリムマブである。いくつかの実施形態では、二次薬剤は、β遮断薬、ＡＣＥ阻害薬、アンジオテンシン受容体遮断薬（ＡＲＢ）、ネプリライシン阻害薬、またはアルドステロン拮抗薬など、心不全の治療に使用される薬剤である。
【００４０】
（ｉ）希釈剤
一実施形態では、賦形剤は、希釈剤であり得る。希釈剤は、圧縮性（すなわち、可塑的に変形可能）または研磨脆性（ａｂｒａｓｉｖｅｌｙ  ｂｒｉｔｔｌｅ）であり得る。好適な圧縮性希釈剤の非限定例には、微結晶セルロース（ＭＣＣ）、セルロース誘導体、セルロース粉末、セルロースエステル（すなわち、酢酸及び酪酸混合エステル）、エチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、トウモロコシデンプン、リン酸化トウモロコシデンプン、アルファ化トウモロコシデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、タピオカデンプン、デンプン−乳糖、デンプン−炭酸カルシウム、デンプングリコール酸ナトリウム、グルコース、フルクトース、ラクトース、ラクトース一水和物、スクロース、キシロース、ラクチトール、マンニトール、マリトール、ソルビトール、キシリトール、マルトデキストリン、及びトレハロースが含まれる。好適な研磨脆性希釈剤の非限定例には、第二リン酸カルシウム（無水または二水和物）、リン酸三カルシウム、炭酸カルシウム、及び炭酸マグネシウムが含まれる。
【００４１】
（ｉｉ）結合剤
別の実施形態では、賦形剤は、結合剤であり得る。好適な結合剤は、デンプン、アルファ化デンプン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、ポリアクリルアミド、ポリビニルオキソアゾリドン、ポリビニルアルコール、Ｃ１２−Ｃ１８脂肪酸アルコール、ポリエチレングリコール、ポリオール、糖類、オリゴ糖、ポリペプチド、オリゴペプチド、及びこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００４２】
（ｉｉｉ）充填剤
別の実施形態では、賦形剤は、充填剤であり得る。好適な充填剤には、炭水化物、無機化合物、及びポリビニルピロリドンが含まれるが、これらに限定されるわけではない。非限定例として、充填剤は、二塩基性及び三塩基性の硫酸カルシウム、デンプン、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、微結晶セルロース、二塩基性リン酸カルシウム、炭酸マグネシウム、酸化マグネシウム、ケイ酸カルシウム、タルク、加工デンプン、乳糖、ショ糖、マンニトール、またはソルビトールであり得る。
【００４３】
（ｉｖ）緩衝剤
さらに別の実施形態では、賦形剤は、緩衝剤であり得る。好適な緩衝剤の代表例には、リン酸、炭酸、クエン酸、トリス緩衝液、及び緩衝生理食塩水（例えば、トリス緩衝生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水）が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００４４】
（ｖ）ｐＨ調整剤
様々な実施形態では、賦形剤は、ｐＨ調整剤であり得る。非限定例として、ｐＨ調整剤は、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸、またはリン酸であり得る。
【００４５】
（ｖｉ）崩壊剤
さらなる実施形態では、賦形剤は、崩壊剤であり得る。崩壊剤は、非発泡性または発泡性であり得る。非発泡性崩壊剤の好適な例には、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、それらのアルファ化及び加工デンプンなどのデンプン、甘味剤、ベントナイトなどの粘土、微結晶セルロース、アルギナート、デンプングリコール酸ナトリウム、寒天、グアー、イナゴマメ、カラヤ、ペシチン（ｐｅｃｉｔｉｎ）、及びトラガカントなどのゴムが含まれるが、これらに限定されるわけではない。好適な発泡性崩壊剤の非限定例には、クエン酸と組み合わせた重炭酸ナトリウム及び酒石酸と組み合わせた重炭酸ナトリウムが含まれる。
【００４６】
（ｖｉｉ）分散剤
さらに別の実施形態では、賦形剤は、分散剤または分散促進剤であり得る。好適な分散剤には、デンプン、アルギン酸、ポリビニルピロリドン、グアーガム、カオリン、ベントナイト、精製木材セルロース、デンプングリコール酸ナトリウム、イソアモルファスシリケート（ｉｓｏａｍｏｒｐｈｏｕｓ  ｓｉｌｉｃａｔｅ）、及び微結晶セルロースが含まれ得るが、これらに限定されるわけではない。
【００４７】
（ｖｉｉｉ）賦形剤
別の代替的実施形態では、賦形剤は、保存剤であり得る。好適な保存剤の非限定例には、ＢＨＡ、ＢＨＴ、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、またはパルミチン酸レチノール、クエン酸、クエン酸ナトリウムなどの抗酸化剤、ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡなどのキレート剤、及びパラベン、クロロブタノール、またはフェノールなどの抗菌剤が含まれる。
【００４８】
（ｉｘ）潤沢剤
さらなる実施形態では、賦形剤は、潤沢剤であり得る。好適な潤沢剤の非限定例には、タルクまたはシリカなどの鉱物、及び植物性ステアリン、ステアリン酸マグネシウム、またはステアリン酸などの脂肪が含まれる。
【００４９】
（ｘ）矯味剤
さらに別の実施形態では、賦形剤は、矯味剤であり得る。矯味剤には、セルロースエーテル、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルコール及びポリエチレングリコールのコポリマー、モノグリセリドまたはトリグリセリド、アクリルポリマー、アクリルポリマーとセルロースエーテルの混合物、酢酸フタル酸セルロース、及びこれらの組み合わせが含まれる。
【００５０】
（ｘｉ）着香剤
代替的実施形態では、賦形剤は、着香剤であり得る。着香剤は、合成着香油及び着香芳香剤及び／または天然油、植物、葉、花、果物、及びこれらの組み合わせからの抽出物から選択され得る。
【００５１】
（ｘｉｉ）着色剤
なおさらなる実施形態では、賦形剤は、着色剤であり得る。好適な着色添加剤には、食品、医薬品、及び化粧品の色（ＦＤ＆Ｃ）、医薬品及び化粧品の色（Ｄ＆Ｃ）、または外用医薬品及び化粧品の色（Ｅｘｔ．Ｄ＆Ｃ）が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００５２】
組成物中の賦形剤または賦形剤の組み合わせの重量分率は、組成物の総重量の約９９％以下、約９７％以下、約９５％以下、約９０％以下、約８５％以下、約８０％以下、約７５％以下、約７０％以下、約６５％以下、約６０％以下、約５５％以下、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約２％、または約１％以下であり得る。
【００５３】
（ｄ）投与
（ｉ）投与剤形
組成物は、様々な投与剤形に製剤化され、活性成分の治療的有効量を送達する多くの異なる手段により投与されることができる。そのような組成物は、必要に応じて、従来の非毒性の薬学的に許容可能な担体、アジュバント、及びビヒクルを含む投与単位形態で、経口（例えば、吸入）、非経口、または局所投与することができる。局所投与はまた、経皮パッチまたはイオン導入装置などの経皮投与の使用を伴う場合がある。本明細書で使用される非経口という用語は、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、または胸骨内注射、または注入技術を含む。薬剤の製剤化については、例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．Ｒ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１８ｔｈ  ｅｄ，１９９５）、及びＬｉｂｅｒｍａｎ，Ｈ．Ａ．ａｎｄ  Ｌａｃｈｍａｎ，Ｌ．，Ｅｄｓ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９８０）にて論じられている。特定の実施形態では、組成物は栄養補助食品であってもよく、または組成物は化粧品であってもよい。
【００５４】
経口投与用の固体投与剤形には、カプセル剤、錠剤、カプレット、丸剤、散剤、ペレット、及び顆粒が含まれる。そのような固体投与剤形では、活性成分は、通常、１つまたは複数の薬学的に許容可能な賦形剤と組み合わされ、その例は上で詳述されている。経口製剤は、水性懸濁液、エリキシル剤、またはシロップ剤として投与してもよい。これらの場合、活性成分は、様々な甘味剤または着香剤、着色剤、及び必要に応じて乳化剤、及び／または懸濁剤、ならびに水、エタノール、グリセリン、及びこれらの組み合わせなどの希釈剤と組み合わせてもよい。吸入による投与の場合、化合物は、好適な噴射剤（例えば、二酸化炭素などのガス）、またはネブライザを含む加圧容器またはディスペンサーからエアロゾルスプレーの形態で送達される。
【００５５】
非経口投与（皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、及び腹腔内を含む）の場合、製剤は、水性または油性溶液であり得る。水溶液には、水、生理食塩水、薬学的に許容可能なポリオール、例えばグリセロール、プロピレングリコールなど、または他の合成溶媒などの滅菌希釈剤、ベンジルアルコール、メチルパラベン、クロロブタノール、フェノール、チメロサールなどの抗菌剤及び／または抗真菌剤、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの酸化防止剤、エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤、酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩などの緩衝液、及び／または塩化ナトリウム、デキストロース、または多価アルコール、例えば、マンニトールもしくはソルビトールなどの等張性調整剤が含まれ得る。水溶液のｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基によって調整してもよい。油性溶液または懸濁液は、ゴマ、落花生、オリーブ油、または鉱油をさらに含んでもよい。組成物は、例えば、密封アンプル及びバイアルなどの単回投与容器または多回投与容器中に入れられてもよく、使用する直前に、例えば、注射用水などの運ばれた滅菌液の添加のみを必要とする凍結乾燥（凍結乾燥）状態で保存されてもよい。滅菌粉末、顆粒、及び錠剤から即時注射液及び懸濁液を調製してもよい。
【００５６】
局所（例えば、経皮または経粘膜）投与の場合、浸透する障壁に適した浸透剤が一般に製剤に含まれる。局所投与に適合した薬学的組成物は、軟膏剤、クリーム剤、懸濁剤、ローション剤、散剤、液剤、ペースト剤、ゲル剤、スプレー剤、エアロゾル剤、または油剤として製剤化してもよい。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、局所軟膏剤またはクリーム剤として適用される。軟膏剤に製剤化されると、活性成分は、パラフィン系または水混和性の軟膏基剤のいずれかとともに使用してもよい。あるいは、活性成分は、水中油型クリーム基剤または油中水型基剤を用いてクリーム剤に製剤化してもよい。眼への局所投与に適合した薬学的組成物には、活性成分が好適な担体、特に水性溶媒に溶解または懸濁している点眼剤が含まれる。口内の局所投与に適合した薬学的組成物には、トローチ剤、パステル剤、及び洗口剤が含まれる。経粘膜投与は、点鼻スプレー、エアロゾルスプレー、錠剤、または坐剤の使用により達成され得、経皮投与は、当該分野で一般的に公知の軟膏剤（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏剤（ｓａｌｖｅ）、ゲル剤、パッチ、またはクリーム剤を介し得る。
【００５７】
特定の実施形態では、ＰＦＤ、ＰＦＤ誘導体、式（Ｉ）の化合物、または式（ＩＩ）の化合物を含む組成物は、標的細胞への化合物の送達を助け、組成物の安定性を高め、または組成物の潜在的な毒性を最小限に抑えるために、好適なビヒクル内にカプセル化される。当業者によって理解されるように、様々なビヒクルが、本発明の組成物を送達するのに適している。好適な構造化流体送達システムの非限定例には、ナノ粒子、リポソーム、マイクロエマルション、ミセル、デンドリマー、及び他のリン脂質含有システムが含まれ得る。組成物を送達媒体に組み込む方法は、当該分野で公知である。
【００５８】
１つの代替的実施形態では、リポソーム送達ビヒクルが利用され得る。リポソームは、実施形態に応じて、構造的及び化学的特性の観点から、ＰＦＤ、ＰＦＤ誘導体、式（Ｉ）の化合物、または式（ＩＩ）の化合物の送達に適している。一般的に、リポソームは、リン脂質二重膜を備えた球状の小胞である。リポソームの脂質二重層は、他の二重層（例えば、細胞膜）と融合し、これによりリポソームの内容物を細胞に送達し得る。このようにして、ＰＦＤ、ＰＦＤ誘導体、式（Ｉ）の化合物、または式（ＩＩ）の化合物は、標的細胞の膜と融合するリポソーム内にカプセル化することにより、細胞に選択的に送達され得る。
【００５９】
リポソームは、異なる炭化水素鎖の長さを有する様々な種類のリン脂質で構成されていてもよい。リン脂質は、一般的に、グリセロールリン酸を介して様々な極性基の１つに結合した２つの脂肪酸を含む。好適なリン脂質には、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ジホスファチジルグリセロール（ＤＰＧ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、及びホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）が含まれる。リン脂質を含む脂肪酸鎖は、長さが約６〜約２６個の炭素原子の範囲であり得、脂質鎖は、飽和または不飽和であり得る。好適な脂肪酸鎖には、ｎ−ドデカン酸（ラウリン酸）、ｎ−テトラデカン酸（ミリスチン酸）、ｎ−ヘキサデカン酸（パルミチン酸）、ｎ−オクタデカン酸（ステアリン酸）、ｎ−エイコサン酸（アラキジン酸）、ｎ−ドコサン酸（ベヘン酸）、ｎ−テトラコサン酸（リグノセリン酸）、ｃｉｓ−９−ヘキサデセン酸（パルミトレイン酸）、ｃｉｓ−９−オクタデカン酸（オレイン酸）、ｃｉｓ，ｃｉｓ−９，１２−オクタデカンジエン酸（リノール酸）、全てｃｉｓ−９，１２，１５−オクタデカトリエン酸（リノレン酸）、及び全てのｃｉｓ−５，８，１１，１４−エイコサテトラエン酸（アラキドン酸）が含まれる（括弧内に一般名を示す）。リン脂質の２つの脂肪酸鎖は同一でも異なっていてもよい。許容可能なリン脂質には、ジオレオイルＰＳ、ジオレオイルＰＣ、ジステアロイルＰＳ、ジステアロイルＰＣ、ジミリストイルＰＳ、ジミリストイルＰＣ、ジパルミトイルＰＧ、ステアロイル、オレオイルＰＳ、パルミトイル、リノレニルＰＳなどが含まれる。
【００６０】
リン脂質は、任意の天然源に由来してもよく、したがって、リン脂質の混合物を含んでもよい。例えば、卵黄はＰＣ、ＰＧ、及びＰＥが豊富であり、大豆はＰＣ、ＰＥ、ＰＩ、及びＰＡを含み、動物の脳または脊髄はＰＳが豊富である。リン脂質はまた合成源に由来してもよい。様々な比率の個々のリン脂質を有するリン脂質の混合物を使用してもよい。異なるリン脂質の混合物は、有利な活性または活性特性の安定性を有するリポソーム組成物をもたらし得る。上記のリン脂質は、Ｎ−（１−（２，３−ジオレオリオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル塩化アンモニウム、１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸塩、３，３’−デヘプチルオキサカルボシアニンヨージド、１，１’−デドデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸塩、１，１’−ジオレイル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニンメタンスルホネート、Ｎ−４−（デリノレイルアミノスチリル）−Ｎ−メチルピリジニウムヨージド、または１，１，−ジリノレイル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸塩などのカチオン性脂質と最適な比率で混合することができる。
【００６１】
リポソームは、スフィンゴ脂質を場合により含んでもよく、スフィンゴシンはグリセロールの構造的対応物であり、動物細胞膜の主要成分であるホスホグリセリドまたはコレステロールのうちの１つの脂肪酸の１つである。リポソームは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のポリマーに共有結合した脂質であるＰＥＧ化脂質を任意に含んでもよい。ＰＥＧは、サイズが約５００〜約１０，０００ダルトンの範囲であり得る。
【００６２】
リポソームは、さらに好適な溶媒を含んでもよい。溶媒は、有機溶媒でも無機溶媒でもよい。好適な溶媒には、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メチルピロリドン、Ｎ−メチルピロリドン、アセトニトリル、アルコール、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００６３】
ＰＦＤ、ＰＦＤ誘導体、式（Ｉ）の化合物、または式（ＩＩ）の化合物を担持するリポソームは、参照によりその開示全体が本明細書に組み込まれる、例えば、米国特許第４，２４１，０４６号、同第４，３９４，４４８号、同第４，５２９，５６１号、同第４，７５５，３８８号、同第４，８２８，８３７号、同第４，９２５，６６１号、同第４，９５４，３４５号、同第４，９５７，７３５号、同第５，０４３，１６４号、同第５，０６４，６５５号、同第５，０７７，２１１号、及び同第５，２６４，６１８号に詳述されているような薬物送達用のリポソームを調製する任意の公知の方法によって調製され得る。例えば、リポソームは、水溶液中の脂質の超音波処理、溶媒注入、脂質水和、逆蒸発、または凍結融解の繰り返しによる凍結乾燥によって調製され得る。好ましい実施形態では、リポソームは、超音波処理によって形成される。リポソームは、タマネギのような多くの層を有する多層であってもよく、または単層であってもよい。リポソームは、大きくても小さくてもよい。高せん断超音波処理を継続すると、より小さな単層リポソームが形成される傾向がある。
【００６４】
当業者には明らかであるように、リポソーム形成を左右する全てのパラメーターは変化し得る。これらのパラメーターには、温度、ｐＨ、ＰＦＤ、ＰＦＤ誘導体、式（Ｉ）の化合物、または式（ＩＩ）の化合物の濃度、脂質の濃度及び組成、多価カチオンの濃度、混合速度、溶媒の存在及び濃度が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００６５】
別の実施形態では、本発明の組成物は、マイクロエマルションとして細胞に送達され得る。マイクロエマルションは、一般的に、水溶液、界面活性剤、及び「油」を含む透明で熱力学的に安定した溶液である。この場合の「油」は、超臨界流体相である。界面活性剤は、油と水の界面にある。様々な界面活性剤のいずれも、本明細書に記載されているかまたは当該分野で公知のものを含むマイクロエマルション製剤での使用に適している。本発明での使用に好適な水性マイクロドメインは、一般的に、約５ｎｍ〜約１００ｎｍの特徴的な構造寸法を有する。このサイズの凝集体は可視光の散乱体としては不十分であるため、これらの溶液は光学的に透明である。当業者によって理解されるように、マイクロエマルションは、球形、棒状、または円盤状の凝集体を含む、多数の異なる微細構造を持つことができる。一実施形態では、構造はミセルであってもよく、これは一般的に球形または円筒形の物体である最も単純なマイクロエマルション構造である。ミセルは水中油滴のようなものであり、逆ミセルは油中水滴のようなものである。代替的実施形態では、マイクロエマルション構造はラメラである。これは、界面活性剤の層により隔てられた水及び油の連続した層で構成される。マイクロエマルションの「油」は、最適なことにはリン脂質を含む。リポソームについて上で詳述したリン脂質のいずれも、マイクロエマルションに関する実施形態に好適である。式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物は、当該分野で一般的に公知の任意の方法によってマイクロエマルション内にカプセル化することができる。
【００６６】
さらに別の実施形態では、ＰＦＤ、ＰＦＤ誘導体、式（Ｉ）の化合物、または式（ＩＩ）の化合物は、樹状高分子またはデンドリマーで送達され得る。一般的に、デンドリマーは分岐した樹状分子であり、各分岐は特定の長さの先で２つの新たな分岐（分子）に分かれる分子の連結鎖である。この分岐は、分岐（分子）が密集して樹冠（ｃａｎｏｐｙ）が球体を形成するまで続く。一般的に、デンドリマーの特性は、表面の官能基によって決まる。例えば、カルボキシル基などの親水性末端基は、通常、水溶性デンドリマーを形成する。あるいは、デンドリマーの表面にリン脂質を組み込んで、皮膚全体の吸収を促進させてもよい。リポソームの実施形態での使用について詳述されたリン脂質のいずれかは、デンドリマーの実施形態での使用に好適である。当該分野で一般的に公知の任意の方法を利用して、デンドリマーを作製し、本発明の組成物をその中にカプセル化してもよい。例えば、デンドリマーは、反応ステップの反復連鎖によって生成される場合があり、この場合、追加の反復ごとに高次のデンドリマーが得られる。その結果として、それらは、ほぼ均一なサイズ及び形状の規則的な高度に分岐化された３Ｄ構造を有する。さらに、デンドリマーの最終サイズは通常、合成中に使用された反復ステップの数によって制御される。種々のデンドリマーサイズが本発明での使用に好適である。一般的に、デンドリマーのサイズは、約１ｎｍ〜約１００ｎｍの範囲であり得る。
【００６７】
（ＩＩ）方法
本開示は、有効量のピルフェニドン、ピルフェニドン誘導体、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、またはそれらの組み合わせを含む組成物を接触させることを含む、試料中のＢリンパ球活性を調節する方法を包含する。別の態様では、本開示は、Ｂリンパ球活性の調節、またはそれを必要とする対象において急性障害または加齢に伴う変化からの器官及び組織の保護をもたらす方法を包含し、該方法は、治療的有効量のピルフェニドンの化合物、ピルフェニドン誘導体、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、またはそれらの組み合わせを含む組成物を対象に投与することを含む。さらに別の態様では、本開示は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、またはｅｘ  ｖｉｖｏで使用するための、ピルフェニドン、ピルフェニドン誘導体、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、またはそれらの組み合わせを含む組成物を提供する。好適な組成物は、ＰＦＤ、ＰＦＤ誘導体、または本明細書に開示される化合物、例えばセクションＩに記載されるものを含む。
【００６８】
本発明の態様によれば、ＰＦＤ、ＰＦＤ誘導体、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、またはこれらの組み合わせを含む薬学的組成物は、Ｂリンパ球活性を調節するために使用される。この方法は、一般的に、Ｂリンパ球を、ＰＦＤ、ＰＦＤ誘導体、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、またはこれらの組み合わせを含む薬学的組成物と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、Ｂリンパ球を、ＰＦＤ、ＰＦＤ誘導体、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、またはこれらの組み合わせを含む薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏで接触させることを含む。Ｂリンパ球活性は、サイトカイン−サイトカイン受容体相互作用、Ｂ細胞受容体シグナル伝達経路、細胞接着分子、抗原プロセシング及び抗原提示、ＭＡＰＫシグナル伝達、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）シグナル伝達、ＴＮＦシグナル伝達経路及びケモカイン受容体シグナル伝達経路に関連する遺伝子の活性または発現によって測定される。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞活性は、ＣＤ８６発現を測定し、ＣＤ８６の発現の増加はＢ細胞活性の増加を示す。分化クラスター８６及びＢ７−２としても知られるＣＤ８６は、Ｔ細胞の活性化及び生存に必要な共刺激シグナルを提供するＢ細胞上で発現するタンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞活性は、ＴＩＲＡＰ依存性シグナル伝達経路を通じて測定される。ＴＩＲＡＰは、ＴＬＲ１／２、ＴＬＲ２／６、ＴＬＲ４、及びＴＬＲ１０の下流のシグナル伝達に必要なアダプタータンパク質である。いくつかの実施形態では、組織または臓器へのＢリンパ球の動員が測定される。
【００６９】
いくつかの実施形態では、Ｂリンパ球を、ＰＦＤ、ＰＦＤ誘導体、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、またはこれらの組み合わせを含む薬学的組成物と接触させることにより、Ｂリンパ球活性の低下及び／または臓器または組織へのＢリンパ球の動員の減少が生じる。いくつかの実施形態では、Ｂリンパ球の活性または数は、ＰＦＤ、ＰＦＤ誘導体、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、またはこれらの組み合わせを含む薬学的組成物の存在下で、未処置対照と比較して減少する。いくつかの実施形態では、Ｂリンパ球の活性または数は、ＰＦＤ、ＰＦＤ誘導体、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、またはこれらの組み合わせを含む薬学的組成物の存在下で、活性化Ｂリンパ球と比較して、または損傷した組織もしくは臓器内のＢリンパ球の数と比較して減少する。
【００７０】
本明細書において使用される場合、「Ｂリンパ球」または「Ｂ細胞」という用語は、リンパ球を指す。いくつかの実施形態では、「Ｂリンパ球」または「Ｂ細胞」という用語は、Ｂリンパ球を指す。いくつかの実施形態では、「Ｂリンパ球」または「Ｂ細胞」という用語は、骨髄、全身循環系、及び／または臓器組織に存在するＢ細胞を指す。いくつかの実施形態では、臓器組織は、心臓、脳、腎臓、肝臓、リンパ節、またはこれらの組み合わせである。
【００７１】
本発明の態様によれば、本明細書に記載のＰＦＤ、ＰＦＤ誘導体、式（Ｉ）の化合物、または式（ＩＩ）の化合物のうちの少なくとも１つを含む薬学的組成物は、急性臓器傷害後の臓器の機能不全の発症または進行から対象を保護するために使用される。この方法は、一般的に、治療的有効量のＰＦＤ、ＰＦＤ誘導体、式（Ｉ）の化合物、または式（ＩＩ）の化合物のうちの少なくとも１つを含む薬学的組成物を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、臓器障害が予想される場合に対象に組成物を投与し、組成物の投与により臓器障害の進行を防止または遅延させ、該臓器は、心臓、肝臓、腎臓、腸、及び脳からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、組成物は、急性組織傷害または虚血の影響を防ぐために対象に投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、対象の臓器移植の前に投与される。いくつかの実施形態では、臓器は、心臓、腎臓、肝臓、腸、及び脳からなる群から選択される。
【００７２】
本発明の別の態様によれば、本明細書に記載のＰＦＤ、ＰＦＤ誘導体、式（Ｉ）の化合物、または式（ＩＩ）の化合物のうちの少なくとも１つを含む薬学的組成物は、調節不全のＢ細胞活性に関連する障害を治療するために使用される。したがって、本明細書に記載のＰＦＤ、ＰＦＤ誘導体、式（Ｉ）の化合物、または式（ＩＩ）の化合物は、Ｂ細胞障害を治療または予防する方法において使用してもよい。したがって、本開示のＰＦＤ、ＰＦＤ誘導体、式（Ｉ）の化合物、または式（ＩＩ）の化合物を含む組成物は、Ｂ細胞障害の治療に有用である。本明細書で使用される「Ｂ細胞障害」は、Ｂ細胞媒介性の過剰増殖性、炎症性、または自己免疫性疾患を特徴とする状態である。この方法は、一般的に、治療的有効量のＰＦＤ、ＰＦＤ誘導体、式（Ｉ）の化合物、または式（ＩＩ）の化合物のうちの少なくとも１つを含む薬学的組成物を対象に投与することを含む。
【００７３】
Ｂ細胞障害には、自己抗体産生または自己免疫疾患を特徴とする障害が含まれる。非限定例として、自己免疫疾患及びＢ細胞機能不全に関連する疾患には、関節炎、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、変形性関節症、多発性軟骨炎、乾癬性関節炎、乾癬、皮膚炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、封入体筋炎、炎症性筋炎、中毒性表皮壊死症、全身性強皮症及び硬化症、ＣＲＥＳＴ症候群、炎症性腸疾患に関連する反応、クローン病、潰瘍性大腸炎、呼吸窮迫症候群、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、強皮症、髄膜炎、脳炎、ブドウ膜炎、大腸炎、糸球体腎炎、アレルギー状態、湿疹、喘息、Ｔ細胞の浸潤及び慢性炎症反応を伴う状態、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性心筋炎、白血球接着不全、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、亜急性皮膚エリテマトーデス、円盤状ループス、ループス脊髄炎、ループス脳炎、若年発症糖尿病、多発性硬化症、アレルギー性脳脊髄炎、視神経脊髄炎、リウマチ熱、シデナム舞踏病、サイトカイン及びＴリンパ球によって媒介される急性及び遅延型過敏症に関連する免疫応答、結核、サルコイドーシス、ウェゲナー肉芽腫症及びチャーグ・ストラウス病を含む肉芽腫症、無顆粒球症、血管炎（過敏性血管炎（ｖａｓｃｕｌｉｔｉｓ）／血管炎（ａｎｇｉｉｔｉｓ）、ＡＮＣＡ及びリウマチ性血管炎を含む）、再生不良性貧血、ダイアモンド・ブラックファン貧血、自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）を含む免疫性溶血性貧血、悪性貧血、赤芽球癆（ＰＲＣＡ）、第ＶＩＩＩ因子欠乏症、血友病Ａ、自己免疫性好中球減少症、汎血球減少症、白血球減少症、白血球の血管外遊出を伴う疾患、中枢神経系（ＣＮＳ）炎症性障害、多発性硬化症、多臓器損傷症候群、重症筋無力症、抗原抗体複合体媒介疾患、抗糸球体基底膜疾患、抗リン脂質抗体症候群、アレルギー性神経炎、ベーチェット病、キャッスルマン症候群、グッドパスチャー症候群、ランバート・イートン筋無力症症候群、レイノー症候群、シェーグレン症候群、スティーブンス・ジョンソン症候群、固形臓器移植拒絶反応、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、水疱性類天疱瘡、天疱瘡、自己免疫性多発性内分泌障害、血清反応陰性脊椎関節症、ライター病、スティッフマン症候群、巨細胞性動脈炎、免疫複合体腎炎、ＩｇＡ腎症、ＩｇＭ多発性神経障害またはＩｇＭ媒介性神経障害、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性精巣炎及び卵巣炎を含む精巣及び卵巣の自己免疫疾患、原発性甲状腺機能低下症；自己免疫性甲状腺炎、慢性甲状腺炎（橋本甲状腺炎）、亜急性甲状腺炎、特発性甲状腺機能低下症、アジソン病、グレーブス病、自己免疫性多内分泌腺症候群（または多腺性内分泌症候群）、Ｉ型糖尿病（インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）とも呼ばれる）及びシーハン症候群を含む自己免疫性内分泌疾患；自己免疫性肝炎、リンパ性間質性肺炎（ＨＩＶ）、閉塞性細気管支炎（非移植）ｖｓ  ＮＳＩＰ、ギラン・バレー症候群、大型血管炎（リウマチ性多発筋痛症及び巨細胞性（高安）動脈炎を含む）、中型血管炎（川崎病及び結節性多発動脈炎を含む）、結節性多発動脈炎（ＰＡＮ）強直性脊椎炎、バージャー病（Ｉｇ���腎症）、急速進行性糸球体腎炎、原発性胆汁性肝硬変、セリアックスプルー（グルテン腸症）、クリオグロブリン血症、肝炎に伴うクリオグロブリン血症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、冠動脈疾患、駆出率が低下した心不全、駆出率が保たれた心不全、家族性地中海熱、顕微鏡的多発血管炎、コーガン症候群、ウィスコット・アルドリッチ症候群、及び閉塞性血栓血管炎が含まれる。
【００７４】
Ｂ細胞がんには、Ｂ細胞性リンパ腫（様々な形態のホジキン病、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、または中枢神経系リンパ腫など）、白血病（急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、有毛細胞白血病、及び慢性筋芽細胞性白血病など）、及び骨髄腫（多発性骨髄腫など）が含まれる。さらなるＢ細胞がんには、小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、脾辺縁帯リンパ腫、形質細胞骨髄腫、孤立性骨形質細胞腫、骨外性形質細胞腫、粘膜関連リンパ組織型節外性辺縁帯（ＭＡＬＴ）Ｂ細胞性リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、バーキットリンパ腫／白血病、悪性の可能性をもつＢ細胞増殖、リンパ腫様肉芽腫症、及び移植後リンパ増殖性疾患が含まれる。
【００７５】
ある種の態様では、本発明の組成物の治療的有効量を対象に投与してもよい。投与は、末梢性投与（すなわち、中枢神経系への投与によるものではない）または中枢神経系への局所的投与を含む、標準的な効果のある技術を使用して実施される。末梢性投与には、経口、吸入、静脈内、腹腔内、関節内、皮下、肺、経皮、筋肉内、鼻腔内、頬、舌下、または坐剤投与が含まれるが、これらに限定されるわけではない。中枢神経系（ＣＮＳ）への直接投与を含む局所投与には、腰椎、脳室内または実質内カテーテルを介するもの、または外科的に移植された制御放出製剤を使用するものが含まれるが、これらに限定されるわけではない。投与経路は、治療する疾患または状態によって決まる場合もある。例えば、疾患または状態がＣＯＰＤまたはＩＰＦである場合、組成物は吸入により投与され得る。あるいは、疾患または状態が変形性関節症である場合、組成物は関節内注入を介して投与され得る。治療される疾患または状態に基づいて投与経路を決定することは、当業者の技能の範囲内である。特定の実施形態では、本発明の組成物は経口投与される。
【００７６】
有効な投与のための薬学的組成物は、選択された投与方法に適するように意図的に設計されており、適合性のある分散剤、緩衝剤、界面活性剤、保存剤、可溶化剤、等張化剤、安定化剤などの薬学的に許容可能な賦形剤が状況に応じて使用する。参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ  Ｐａ．，１６Ｅｄ  ＩＳＢＮ：０−９１２７３４−０４−３，ｌａｔｅｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎが、実務者に一般的に知られている製剤技術の大要を提供する。
【００７７】
治療用途の場合、本発明の組成物の治療的有効量が対象に投与される。「治療的有効量」とは、測定可能な反応（例えば、老化細胞の細胞死、抗老化反応、変性疾患に関連する症状の改善、または機能低下障害に関連する症状の改善）をもたらすのに十分な治療組成物の量である。本発明の治療組成物中の活性成分の実際の投与レベルは、特定の対象に対する所望の治療反応を達成するのに有効である活性化合物の量を投与するように変化し得る。選択された投与レベルは、治療組成物の活性、製剤、投与経路、他の薬剤または治療との組み合わせ、年齢、年齢に関連する疾患または状態、変性疾患、機能低下障害、症状、及び治療対象の身体状態及び過去の病歴を含む様々な要因に依存する。いくつかの実施形態では、最小用量を投与し、用量制限毒性がない場合は用量を増やす。治療的有効量の決定及び調整、ならびにそのような調整を行う時期及び方法の評価は、医学の当業者に公知である。
【００７８】
投与の頻度は、症状を効果的に治療するために必要に応じて、毎日、または１日、１週間、もしくは１か月に、１回、２回、３回、もしくはそれ以上であってもよい。疾患自体に対する治療の実施のタイミング及び治療の期間は、症例を取り巻く状況によって決定される。治療は、救急医療従事者によって実施されるように、例えば傷害の部位において、直ちに開始できる。治療は、病院または診療所自体で開始するか、または退院後もしくは外来診療所で診察した後に開始することができる。治療期間は、１回限りの単回投与から生涯にわたる治療的治療の範囲に及ぶ可能性がある。
【００７９】
典型的な用量レベルは、標準的な臨床技術を使用して決定及び最適化することができ、投与方法に依存する。
【００８０】
対象は、げっ歯類、ヒト、家畜動物、愛玩動物、または動物園の動物であり得る。一実施形態では、対象は、げっ歯類、例えば、マウス、ラット、モルモットなどであり得る。別の実施形態では、対象は、家畜動物であり得る。好適な家畜動物の非限定例には、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ラマ、及びアルパカが含まれ得る。さらに別の実施形態では、対象は、愛玩動物であり得る。愛玩動物の非限定例には、イヌ、ネコ、ウサギ、及び鳥類などのペットが含まれ得る。さらに別の実施形態では、対象は、動物園の動物であり得る。本明細書において使用される場合、「動物園の動物」は、動物園で見られ得る動物を指す。このような動物には、非ヒト霊長類、大型ネコ、オオカミ、及びクマが含まれ得る。好ましい実施形態では、対象は、ヒトである。
【００８１】
定義
本開示の要素またはその好ましい態様（複数可）を導入する場合、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、及び「ｓａｉｄ」という冠詞は、１つまたは複数の要素の存在を意味することを意図する。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語は包括的であることを意図しており、列挙された要素以外の追加の要素があってもよいことを意味する。
【００８２】
本明細書において使用される場合、特に明記しない限り、以下の定義が適用される。本発明の目的のために、化学元素は、Ｐｅｒｉｏｄｉｃ  Ｔａｂｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ，ＣＡＳ  ｖｅｒｓｉｏｎ、及びｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ，７５ｔｈＥｄ．１９９４にしたがって識別される。加えて、有機化学の一般原則は、その全ての内容が参照により本明細書に組み込まれる“Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，”Ｔｈｏｍａｓ  Ｓｏｒｒｅｌｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｏｏｋｓ，Ｓａｕｓａｌｉｔｏ：１９９９、及び“Ｍａｒｃｈ’ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，”５ｔｈＥｄ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｂ．ａｎｄ  Ｍａｒｃｈ，Ｊ．，ｅｄｓ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：２００１に説明される。
【００８３】
本明細書で単独または基の一部として使用される「アルキル」という用語は、直鎖状もしくは分岐状炭化水素鎖を有する飽和一価炭化水素ラジカル、または少なくとも３個の炭素原子が存在する場合、環状炭化水素もしくはその組み合わせを指し、１〜２０個の炭素原子（Ｃ１−２０アルキル）、適切には１〜１０個の炭素原子（Ｃ１−１０アルキル）、好ましくは１〜８個の炭素原子（Ｃ１−８アルキル）、より好ましくは１〜６個の炭素原子（Ｃ１−４アルキル）、及びさらにより好ましくは１〜４個の炭素原子（Ｃ１−４アルキル）を含む。アルキルラジカルの例には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソアミル、ヘキシル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどが含まれる。
【００８４】
本明細書で単独または基の一部として使用される「アルケニル」という用語は、１つまたは複数の二重結合を有し、２〜約１８個の炭素原子、好ましくは２〜約８個の炭素原子、より好ましくは２〜約５個の炭素原子を含む直鎖状または分岐状炭化水素鎖を有する一価の炭化水素ラジカルを指す。好適なアルケニルラジカルの例には、エテニル、プロペニル、アルキル、１，４−ブタジエニルなどが含まれる。
【００８５】
本明細書で単独または基の一部として使用される「アルキニル」という用語は、１つまたは複数の三重結合を有し、２〜約１０個、より好ましくは２〜約５個の炭素原子を含む直鎖状または分岐状炭化水素鎖を有する一価の炭化水素ラジカルを指す。アルキニルラジカルの例には、エチニル、プロピニル、（プロパルギル）、ブチニルなどが含まれる。
【００８６】
本明細書で使用される「アリール」という用語は、単独または基の一部として、１つの水素の除去による芳香族炭化水素に由来する有機ラジカルを含み、フェニル、ビフェニル、ナフチルなどの単環式及び多環式ラジカルを含む。
【００８７】
本明細書で使用される「アルコキシ」という用語は、単独または基の一部として、アルキルエーテルラジカルを指し、ここでアルキルという用語は上記で定義されたとおりである。アルキルエーテルラジカルの例には、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシなどが含まれる。
【００８８】
本明細書で使用される「シクロアルキル」という用語は、単独または組み合わせて、各環状部分が約３〜約８個の炭素原子、より好ましくは約３〜約６個の炭素原子を含む、飽和または部分飽和の単環式、二環式、または三環式アルキルラジカルを意味する。そのようなシクロアルキルラジカルの例には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどが含まれる。
【００８９】
本明細書で使用される「シクロアルキルアルキル」という用語は、単独でまたは組み合わせて、上記で定義されたシクロアルキルラジカルによって置換された上記で定義されたアルキルラジカルを意味する。そのようなシクロアルキルアルキルラジカルの例には、シクロプロピルメチル、シクロブチルメチル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシルメチル、１−シクロペンチルエチル、１−シクロヘキシルエチル、２−シクロペンチルエチル、２−シクロヘキシルエチル、シクロブチルプロピル、シクロペンチルプロピル、シクロヘキシルブチルなどが含まれる。
【００９０】
本明細書で使用される「置換」という用語は、鎖または環内の炭素原子に結合した１つまたは複数の水素原子が他の置換基で置き換えられていることを意味する。好適な置換基には、メチル基などのアルキル基を含む一価の炭化水素基、及びメトキシ基などのアルコキシ基を含む一価の不均一基が含まれる。
【００９１】
本明細書で使用される「非置換」という用語は、炭素鎖または環が炭素及び水素以外の他の置換基を含まないことを意味する。
【００９２】
本明細書で使用される「分岐」という用語は、炭素鎖が単なる直鎖ではないことを意味する。「非分岐」とは、炭素鎖が直鎖状炭素鎖であることを意味する。
【００９３】
本明細書で使用される「飽和」という用語は、炭素鎖または環が二重結合または三重結合を含まないことを意味する。「不飽和」とは、炭素鎖または環が少なくとも１つの二重結合を含むことを意味する。不飽和炭素鎖または環は、複数の二重結合を含んでもよい。
【００９４】
用語「炭化水素基」は、１〜２５個の炭素原子、適切には１〜１２個の炭素原子、より適切には１〜１０個の炭素原子、最も適切には１〜８個の炭素原子の鎖を意味する。炭化水素基は、直鎖または分岐鎖構造を有していてもよい。適切には、炭化水素基は、１つの分岐を有する。
【００９５】
「炭素環式基」という用語は、飽和または不飽和の炭化水素環を意味する。炭素環式基は芳香族ではない。炭素環式基は単環式または多環式である。多環式炭素環式基は、縮合、スピロ、または架橋環系であり得る。単環式炭素環式基は、環内に、４〜１０個の炭素原子、適切には４〜７個の炭素原子、及びより適切には５〜６個の炭素原子を含む。二環式炭素環式基は、環内に、８〜１２個の炭素原子、好ましくは９〜１０個の炭素原子を含む。
【００９６】
「ヘテロ原子」という用語は、例えば、複素環基の環または不均一基の鎖内の炭素以外の原子を意味する。好ましくは、ヘテロ原子は、硫黄、リン、窒素、及び酸素原子からなる群から選択される。複数のヘテロ原子を含む群は、異なるヘテロ原子を含む場合がある。
【００９７】
「複素環基」という用語は、環内に炭素原子及び１つまたは複数のヘテロ原子を含む飽和または不飽和の環構造を意味する。複素環基は芳香族ではない。複素環基は単環式または多環式である。多環式複素芳香族基は、縮合、スピロ、または架橋環系であり得る。単環式複素環基は、環内に、４〜１０個の原子（すなわち、炭素原子と少なくとも１つのヘテロ原子の両方を含む）、適切には４〜７、より適切には５〜６個の原子を含む。二環式複素環式基は、環内に、８〜１８個の原子、適切には９または１０個を含む。
【００９８】
本明細書で使用される「異性体（Ｉｓｏｍｅｒ）」、「異性体（ｉｓｏｍｅｒｉｃ  ｆｏｒｍ）」、「立体化学異性体」、または「立体異性体」という用語は、同じ結合配列により結合した同じ原子で構成されるが互換性のない異なる三次元構造を有する、このプロセス中で得られる化合物または中間体が保持し得る、あらゆる可能性のある異性体及び立体配座を規定する。特に言及または指示がない限り、化合物の化学表記は、その化合物が持ち得る、あらゆる可能性のある立体化学的異性体の混合物を含む。該混合物は、化合物の基本分子構造の全てのジアステレオ異性体、エピマー、エナンチオマー、及び／または配座異性体を含み得る。さらに具体的には、立体中心はＲ−またはＳ−立体配置を持ち得、ジアステレオ異性体はシン−またはアンチ−立体配置を持ち得、二価の環状飽和ラジカル上の置換基はシス−またはトランス−立体配置のいずれかを持ち得、アルケニルラジカルはＥまたはＺ−立体配置を持ち得る。純粋形態または互いの混合物の両方における化合物の全ての立体化学的異性体は、本発明の範囲内に包含されることを意図している。
【００９９】
本明細書で開示される特定の実施形態は、「含む」ではなく「〜からなる」または「本質的に〜からなる」という用語を使用して、特許請求の範囲においてさらに限定され得る。特許請求の範囲において使用される場合、出願時であれ補正の際の追加時であれ、「〜からなる」という移行用語は、特許請求の範囲において指定されていない要素、ステップ、または成分を除外している。「本質的に〜からなる」という移行用語は、特許請求の範囲を、特定の材料またはステップ、及び基本的かつ新規な特性（複数可）に実質的に影響を与えないものに限定する。そのように特許請求される本発明の実施形態は、本明細書において本質的または明示的に説明され、可能になる。
【０１００】
本発明の範囲から逸脱することなく、上記の材料及び方法に様々な変更を加えることができるため、上記の説明及び下記の例に含まれる全ての事項は、限定的な意味ではなく、例示として解釈されることとを意図する。
【実施例】
【０１０１】
以下の実施例は、本開示の様々な実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例に開示される技術は、本発明の実施において良好に機能するために発明者らによって発見された技術を表し、したがって、その実施のための好ましい方法を構成すると考えられ得ることを当業者は理解すべきである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、多くの変更が開示される特定の実施形態においてなされるが、それでも同様なまたは類似する結果を得ることができることを理解するべきである。
【０１０２】
実施例１：ピルフェニドンは、ジフテリア毒素媒介性急性心筋傷害後の生存を向上させる。
急性心筋傷害に対するピルフェニドンの効果を測定するために、本発明者らは先に記載したように、ジフテリア毒素（ＤＴ）心筋細胞除去モデルを使用した（１３）。ＤＴを注入した成体Ｒｏｓａ２６−ＤＴ  Ｍｌｃ２ｖ−Ｃｒｅマウスは、ＬＶ機能障害及びリモデリングを発症し、２週間以内に死亡率が増加する（１３）。図１Ａに示すように、ピルフェニドン処置マウスの生存率は、未処置のＤＴ処置同腹仔対照と比較した場合、大幅に改善された（ｐ＝０．０３）。ピルフェニドンの保護効果は、通常の飼料を与えたマウスとピルフェニドンを含む飼料を与えたマウス間において、血清トロポニンレベル（ｐ＝０．３４、図１Ｂ）、心筋細胞アポトーシスの蔓延率（ｐ＝０．３９、図１Ｃ）、及びエバンスブルー色素取り込みの程度（ｐ＝０．２６、図１Ｄ）に有意差がない限り、ＤＴ誘発性心筋細胞細胞死の著しい減少によるものではなかった。
【０１０３】
実施例２：ピルフェニドンは、ジフテリア毒素媒介性急性心筋傷害後の心臓ＣＤ１９＋Ｂリンパ球を減少させる
ピルフェニドンで処置しても心筋細胞の壊死またはアポトーシスが減少しなかったため、ピルフェニドンが急性心臓傷害に対する自然免疫反応を調節することにより生存率を向上させているのかどうかを確認した。したがって、ＤＴ注入の４日後にＦＡＣＳ分析を実施した。このＦＡＣＳ分析のゲーティング戦略を図２Ａに示す。予備的な対照研究では、未感作ＷＴ心臓での１週間のピルフェニドンによる治療が、ＣＤ４５＋細胞／ｍｇ組織（ｐ＝０．５３）、Ｌｙ６Ｇ＋好中球（ｐ＝０．８２）、Ｌｙ６Ｃ＋ＣＤ６４  ｌｏｗ／−単球（ｐ＝０．８１）、ＣＤ６４＋Ｌｙ６Ｃｌｏｗ／−マクロファージ（ｐ＝０．８２）、またはＣＤ１９＋Ｂリンパ球（ｐ＝０．９４、図２Ｂ及び図２Ｃ）の数に有意な影響を及ぼさないと判断した。
【０１０４】
図２に示すように、ピルフェニドン飼料または通常の飼料で処置したマウスのＤＴ傷害心臓において、心筋のＣＤ４５＋細胞（ｐ＝０．８、図２Ｄ）、Ｌｙ６Ｇ＋好中球（ｐ＝０．２７、図２Ｅ）、Ｌｙ６Ｃ＋ＣＤ６４ｌｏｗ／−単球（ｐ＝０．１５  図２Ｅ）及びＬｙ６Ｃｌｏｗ／−ＣＤ６４＋マクロファージ（ｐ＝０．９、図２Ｂ）に関して有意差はなかった。成体の心臓のマクロファージプールは、常在細胞及び動員細胞で構成され、後者は傷害後の有害なＬＶリモデリングに関連している。これらの亜集団は、ＣＣＲ２及びＭＨＣ−ＩＩの発現によって大きく分けられる（１３、１４）。したがって、対照及びピルフェニドン処置動物のマクロファージ集団をさらに特徴付けた。図２Ｆ及び図２Ｇに示すように、ピルフェニドンによる処置の存在下及び不存在下におけるＭＨＣ−ＩＩｈｉｇｈＣＣＲ２ｌｏｗ（ｐ＝０．４３）、ＭＨＣ−ＩＩｈｉｇｈＣＣＲ２ｈｉｇｈ（ｐ＝０．３６）、ＭＨＣ−ＩＩｌｏｗＣＣＲ２ｈｉｇｈ（ｐ＝０．２１）、ＭＨＣ−ＩＩｌｏｗＣＣＲ２ｌｏｗ（ｐ＝０．１１）マクロファージサブセットの割合に有意な差はなかった。障害後の心筋骨髄集団に違いがないにもかかわらず、ピルフェニドンで処置すると、通常の飼料を与えたマウスと比較した場合、ＤＴ傷害後のＣＤ１９＋心筋Ｂリンパ球の割合が３倍以上減少することが観察された（ｐ＝０．０２、図２Ｅ）。
【０１０５】
実施例３：ピルフェニドンは、閉胸部虚血再灌流傷害後の有害なＬＶリモデリング及び心臓のＣＤ１９＋Ｂリンパ球を減少させた。
心臓傷害のより病態生理学的に関連するモデルにおいてピルフェニドンの効果を測定するため、先に記載のように、対照マウス及びピルフェニドン処置マウスは閉胸部虚血（９０分）再灌流（Ｉ／Ｒ）傷害を受けた（１５）。図３Ａに示すように、区域壁運動スコア指標（ＳＷＭＳＩ）によって決定されたように、対照動物及びピルフェニドン処置動物においてリスクのある領域に差はなかった（ｐ＝０．６８）。ピルフェニドンによる処置は、対照マウスと比較した場合、心臓重量対脛骨長比（図３Ｂ及び図３Ｃ）及び２Ｄ心エコー検査により測定されたＬＶ質量の有意な減少（ｐ＝０．０３、図３Ｄ）をもたらした。これらの調査結果と一致して、対照動物と比較した場合、ピルフェニドン処置動物ではＬＶ拡張末期容積の有意な（ｐ＝０．０２）減少が観察された（図３Ｅ）が、処置群ではＬＶＥＦの改善傾向（ｐ＝０．０８）があった（図３Ｆ）。図３Ｇは、対照及びピルフェニドン処置動物における代表的なマッソンのトリクローム染色を示すのに対して、図３Ｈは群データの結果を要約している。図３Ｈに示すように、ピルフェニドン飼料マウスを通常の飼料を与えたマウスと比較した場合、２週間でＭａｓｓｏｎによるコラーゲン染色を示す心筋の割合に有意差がなかった（ｐ＝０．４）。ピルフェニドン処置マウスの心筋におけるトリクローム染色の量は、対照マウスのものと比べて有意な差がなかった。ピルフェニドン処置は、虚血再灌流傷害後の心筋線維症を軽減しなかった。
【０１０６】
前述の実験では、Ｉ／Ｒ傷害の前にピルフェニドンにより前処理の効果を調べたため、ピルフェニドンの急性投与が、Ｉ／Ｒ傷害後のＬＶリモデリングに影響を及ぼすのに十分であったかどうかを判断しようとした。したがって、再灌流傷害の直後にピルフェニドンまたは希釈剤をマウスの静脈内に処置し、その後、１日、腹腔内注射し、１４日間、飼料中のピルフェニドンを経口投与した。図４Ａは、リスクのある領域が、対照及びピルフェニドン処置動物において異なっていなかったことを示す（ｐ＝０．４７）。しかしながら、図４Ａで示された突出した調査結果は、ピルフェニドンの急性投与が、希釈剤処置対照マウスと比較した場合、心臓重量／脛骨長比（ｐ＝０．０１５；図４Ｂ）、２Ｄ心エコー検査によるＬＶ質量（ｐ＝０．０２９；図４Ｄ）、及びＬＶ拡張末期容積（ｐ＝０．０３７；図４Ｅ）を有意に（ｐ＝０．０１５）減少させたことであった。
【０１０７】
実施例４：ピルフェニドンは心臓傷害後の心臓のＢリンパ球のサブセットを調節する。
心臓Ｂリンパ球に対するピルフェニドンの効果をさらに調査するには、まず、Ｂリンパ球の亜型の既知のマーカーを使用して心臓のＢ細胞の表面抗原を分析した。使用したゲーティング戦略を図５Ａに示し、脾臓Ｂリンパ球の染色を図５Ｂに参照として提供する。図５に示すように、非損傷成体の心臓のＣＤ１９＋心臓Ｂ細胞の大部分はＣＤ１９＋ＣＤ１１ｂ−であった。この集団のさらなる特徴付けは、それらがＩｇＤ＋及びＩｇＭｌｏｗ／−ＣＤ２１−ＣＤ２３−ＣＤ１１ｃ−であったことを明らかにした（図５Ａ）。非損傷心臓の常在心臓Ｂ細胞の約１０％はＣＤ１９＋ＣＤ１１ｂ＋であった。この細胞集団は、ほとんどがＢ１ｂリンパ球の特徴を示すＣＤ５−ＩｇＭ＋であるのに対して、より少ない割合がＢ１ａリンパ球の特徴を示すＣＤ５＋ＩｇＭ＋であった（１６）（図５Ｃ）。
【０１０８】
次に、ＤＴ誘発性傷害モデル及び閉胸部Ｉ／Ｒ傷害モデルにおいて、ピルフェニドンの存在下または不存在下にてＢ細胞プロファイルを分析した。図４に示すように、心臓傷害の両モデルにおいて、心臓傷害の４日後、ＣＤ１９＋ＣＤ１１ｂ−細胞対Ｂ１細胞の相対比は、未感作心臓と比較して変化していなかった。ＤＴ傷害心臓（４日目）において、心臓組織のＣＤ１９＋細胞／ｍｇ（ｐ＝０．０９）及び心臓組織のＣＤ１９＋ＣＤ１１ｂ＋細胞／ｍｇ（ｐ＝０．１４）の数にはわずかではあるが有意ではない増加があったが（図５Ｄ）、未感作心臓と比較した場合、心臓組織のＣＤ１９＋ＣＤ１１ｂ−細胞／ｍｇの数において変化はなかった（ｐ＝０．９６）。対照的に、Ｉ／Ｒ傷害後の同じ時点でＣＤ１９＋（ｐ＜０．００１）及びＣＤ１９＋ＣＤ１１ｂ−（ｐ＜０．００１）細胞において有意な２倍の増加があった（図５Ｅ）。ＤＴ傷害心筋細胞除去モデルでは、ピルフェニドン処置動物は、ＣＤ１９＋ＣＤ１１ｂ−細胞のサブセットにおける有意な（ｐ＝０．０４）減少とともに、組織のＣＤ１９＋細胞／ｍｇは有意に低下した（ｐ＜０．０１）（図５Ｄ）。閉胸Ｉ／Ｒ傷害モデルにおいて、ピルフェニドン処置により、Ｉ／Ｒの４日後にＣＤ１９＋リンパ球が有意に（ｐ＜０．００１）減少し、ＣＤ１９＋ＣＤ１１ｂ−Ｂリンパ球のサブセットが有意に（ｐ＜０．００１）減少すると言う非常に類似した変化が観察された（図５Ｅ）。
【０１０９】
実施例５：ピルフェニドンの心臓保護作用はＢリンパ球によって媒介される。
まとめると、上記の結果は、ピルフェニドンの心臓保護作用が、少なくとも部分的に心臓のＢリンパ球によって媒介される可能性があることを示唆している。この仮説を検証するために、市販の抗ＣＤ２０抗体を使用してネイティブＢ細胞を枯渇させ、ピルフェニドンの存在下及び非存在下で閉胸Ｉ／Ｒ試験を繰り返した。閉胸モデルにおけるＩ／Ｒ傷害の７日前にマウスを計測し、計測時にマウスに抗ＣＤ２０抗体を注射した。抗ＣＤ２０抗体Ｂ細胞の枯渇効率は、抗ＣＤ２０注射後の８日目（すなわち、Ｉ／Ｒ傷害が行われた時点）及び注射後１２日目（すなわち、Ｉ／Ｒの４日後）に評価した。図６Ａ及び図６Ｂに示すように、抗ＣＤ２０抗体の単回注射により、８日目までに脾臓Ｂ細胞及び心臓Ｂ細胞の９９％超を除去した。本発明者らは、心臓Ｂ細胞の数がＩ／Ｒ傷害の４日後（すなわち、注射後１２日目）に回復し始めたことに注目した。しかしながら、Ｂ細胞の総数は、未処置対照の数の１０％未満のままであった（図６Ｃ）。注目すべきは、Ｉ／Ｒ傷害後のＢ細胞の枯渇はＣＤ１９＋ＣＤ１１ｂ−細胞の数を有意に減少させた（ｐ＜０．０１）が、ＣＤ１９＋ＣＤ１１ｂ＋細胞の総数は有意に減少させなかった（ｐ＝０．２）（図６Ｃ）。しかしながら、ＣＤ１９＋ＣＤ１１ｂ＋サブセットを調べたところ、抗ＣＤ２０抗体による処置は、Ｂ１ｂリンパ球の数を有意に（ｐ＝０．０５）減少させたが、心臓Ｂ１ａリンパ球の数には影響を及ぼさなかった（ｐ＝０．５８；図６Ｃ）。Ｉ／Ｒ傷害の２週間後のＢ細胞枯渇マウスとＢ細胞枯渇＋ピルフェニドン処置マウス間の、心臓重量対脛骨長比（ｐ＝０．７５；図６Ｅ）、ＬＶ質量（ｐ＝０．２１、図６Ｇ）、ＬＶ拡張末期容積（ｐ＝０．４０、図６Ｈ）、ＬＶＥＦ（ｐ＝０．１５、図６Ｉ）、またはトリクローム陽性心筋の割合（ｐ＝０．４３、図６Ｊ〜６Ｋ）において有意差はなかった。したがって、Ｉ／Ｒ傷害後のピルフェニドンの心臓保護作用はＢ細胞依存性であった。
【０１１０】
実施例６：ＣＤ８６のＬＰＳ誘導性発現は、ピルフェニドンの存在下で減少する。
腹膜（図７Ａ〜７Ｂ）及び脾臓（図８Ａ〜８Ｂ）由来のＢリンパ球をＬＰＳ（ＴＬＲアゴニスト）と共にまたはそれ無しで２４時間培養した。ＬＰＳ刺激と共にまたはそれ無しで培養した群を、０．５％ピルフェニドン有り、またはそれ無しの群にさらに分けた（群：対照、対照＋０．５％ピルフェニドン、ＬＰＳ、及びＬＰＳ＋０．５％ピルフェニドン）。ＬＰＳは、Ｂ細胞上の共刺激分子ＣＤ８６の発現を増加させた。この誘導は、ピルフェニドンの存在下で著しく減少した。
【０１１１】
実施例７：ピルフェニドンは、ＤＴＲ処置マウスのｉｎ  ｖｉｖｏでのＣＤ１９＋細胞でのＣＤ８６の上方制御を減少させた。
この実験では、ＤＴＲマウス（実施例１に記載）に対照または０．５％ピルフェニドン添加飼料を与え、ＤＴＲ処置の４日後に、心臓Ｂリンパ球をＣＤ１９及びＣＤ８６のために染色し、フローサイトメトリーで分析した。この実験には、重傷（トロポニン１０以上）の動物を含んだ。ピルフェニドンでの処置により、Ｂリンパ球上でのＣＤ８６の発現が減少し（図９Ａ〜９Ｂ）、実施例６のｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの結果が確認された。
【０１１２】
実施例８：ピルフェニドンは、ＴＩＲＡＰ依存性シグナル伝達経路を介してＢ細胞の活性を調節する。
Ｂ細胞の枯渇がピルフェニドンの有益な効果を無効にしたという観察は、ピルフェニドンの有益な効果が組織傷害後のＢ細胞の数の減少によって必ずしも媒介されないことを示唆し、ピルフェニドンが組織傷害に対するＢ細胞の応答を調節する可能性があるという興味深い可能性を高めた。ピルフェニドンの免疫調節効果に関与する機序（複数可）についての洞察を得るために、通常の飼料を与えた未感作ＤＴ傷害マウス、及びピルフェニドン飼料で処置したＤＴ傷害マウスからＦＡＣＳ選別されたＣＤ１９＋ＣＤ１１ｂ＋及びＣＤ１９＋ＣＤ１１ｂ−心臓リンパ球の転写プロファイリングを実施した。図１０に示すように、心臓Ｂ細胞のトランスクリプトームの主成分分析は、ＤＴ傷害心臓からのＣＤ１９＋ＣＤ１１ｂ＋（図１０Ａ）及びＣＤ１９＋ＣＤ１１ｂ−（図１０Ｂ）細胞のｍＲＮＡが、未感作心臓からの細胞と異なるプロファイルを有することを示した。重要なことに、ピルフェニドン処置ＤＴ傷害マウスの転写プロファイルは、未感作及び未処置心臓のプロファイル間にクラスター化され、ピルフェニドンが心臓傷害によって引き起こされたＢリンパ球遺伝子発現の変化を調節したことを示唆している。ＤＴと未感作心臓間で２倍超（ＦＤＲ  ０．０５未満）差次的発現したｍＲＮＡのＫＥＧＧ経路解析は、ＤＴ心臓からのＣＤ１９＋ＣＤ１１ｂ＋リンパ球に豊富な６つの経路：造血細胞系統（ｐ＝１ｘ１０−５）、サイトカイン−サイトカイン受容体相互作用（ｐ＝３ｘ１０−３）、Ｂ細胞受容体シグナル伝達経路（ｐ＝１ｘ１０−３）、細胞接着分子（ｐ＝０．０４）、抗原処理及び提示（ｐ＝０．０４）、ならびにＭＡＰＫシグナル伝達（ｐ＝０．０５）を特定した（図１０Ｃ）。これらの経路は、ＤＴＲ＋ＰＦＤ心臓から単離されたＣＤ１９＋ＣＤ１１ｂ＋リンパ球では活性化されず（図１０Ｃ）、ピルフェニドンが心臓傷害によって駆動されたＢ細胞の遺伝子発現変化を変えることを示す。図１０Ｄに示すように、ＫＥＧＧ経路解析により、ＣＤ１９＋ＣＤ１１ｂ−細胞の５つの経路：ＣＤ１９＋ＣＤ１１ｂ＋においても活性化された２つの経路、具体的には造血細胞系統（ｐ＝２ｘ１０−３）及びサイトカイン−サイトカイン受容体相互作用（ｐ＝１ｘ１０−３）、ならびに３つの固有の経路、具体的にはＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）シグナル伝達（ｐ＝１ｘ１０−３）、ＴＮＦシグナル伝達経路（ｐ＝７ｘ１０−３）、及びケモカイン受容体シグナル伝達経路（ｐ＝０．０２）を特定した。造血細胞系統経路を除いて、これらの経路はいずれも、ＤＴＲ＋ＰＦＤ心臓から単離されたＣＤ１９＋ＣＤ１１ｂ−リンパ球では著しく豊富ではなかった（図１０Ｄ）。これらの各ＫＥＧＧ経路の遺伝子リストは、補足表１及び表２に記載されている。まとめると、これらの研究は、心筋ＣＤ１９＋ＣＤ１１ｂ＋及びＣＤ１９＋ＣＤ１１ｂ−リンパ球が共通の生物学的反応を共有するが、組織傷害に対する固有の生物学的反応も有し、心臓傷害に対するこれらの共通及び固有の反応の両方がピルフェニドンによって調節されることを示唆している。
【０１１３】
従来研究が、壊死細胞により放出される障害関連分子パターン（ＤＡＭＰ）によるＴＬＲの関与によりＢ細胞が活性化されることを示していること（１７）に注目し、ＤＴ傷害動物から選別されたＣＤ１９＋ＣＤ１１ｂ−リンパ球にＴＬＲシグナル伝達が存在するが、ピルフェニドンで処置したＤＴ傷害動物から選別された同じ細胞には存在しないことに注目し、本発明者らは、リポ多糖（古典的なＴＬＲ４アゴニスト及びＴ非依存性抗原）及び壊死性心臓細胞抽出物を使用したＣＤ１９＋細胞に関するｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究（本発明者ら及び他の研究者らがＴＬＲ４を介した信号について示している（１８））に焦点を当てた。ＴＬＲシグナル伝達の活性化が培養Ｂ細胞の共刺激分子ＣＤ８６の強力な誘導因子であることを示した従来研究に基づいて（１９）、本発明者らはＢ細胞活性化のマーカーとしてＣＤ８６の上方制御を使用した。図１０Ｅに示すように、ＬＰＳまたは壊死細胞からの細胞質抽出物によるＰＤＩＣの刺激は、ＣＤ１９＋ＣＤ８６ｈｉｇｈリンパ球の強い増加（両方ともｐ＜０．００１）を引き起こした。重要なことに、ＣＤ１９＋ＣＤ８６ｈｉｇｈの数は、ピルフェニドンによって著しく減少した（両方ともｐ＜０．００１）。ＴＬＲを介したシグナル伝達の役割をさらに調べるには、チオグリコレート刺激ＴＩＲＡＰ−／−マウスから得られたＰＤＩＣにおいてこれらの実験を繰り返した。図１０Ｆに示すように、壊死性細胞質抽出物は、ＣＤ１９＋ＣＤ８６ｈｉｇｈリンパ球の割合において有意な増加を引き起こさなかったが、その一方でＬＰＳ刺激は、ＴＩＲＡＰ＋／＋マウスのＰＤＩＣにおいて観察されたものよりも程度は低いが、ＣＤ１９＋ＣＤ８６ｈｉｇｈリンパ球の割合において有意な増加をもたらした（ｐ＜０．００１）。注目すべきは、ピルフェニドンによる処置は、ＬＰＳ刺激された培養液においてＣＤ１９＋ＣＤ８６ｈｉｇｈリンパ球のわずかではあるが有意な（ｐ＜０．００１）減少をもたらした。これらの調査結果は、炎症細胞の混合集団においては、壊死性細胞質抽出物がＴＩＲＡＰ依存メカニズムを通じてＢ細胞上の共刺激分子の発現を調節するのに対し、ＬＰＳはＴＩＲＡＰ非依存性であるメカニズムを通じてＢ細胞上の共刺激分子の発現を調節することを示唆する。重要なことに、両方のメカニズムは、ピルフェニドンによる処置に対して感受性が高かった（図１０Ｅ及び図１０Ｆ）。
【０１１４】
次に、脾臓から回収した精製Ｂリンパ球で上記のｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験を繰り返すことにより、壊死性細胞質抽出物及びＬＰＳに対するＢ細胞の応答が細胞自律性であるかどうかを測定した。興味深いことに、精製したＢ細胞に対するＬＰＳの影響はＰＤＩＣ上で観察されたものと非常に類似していたが、壊死性細胞質抽出物の影響は大幅に減少した。図１０Ｇに示されるように、ＬＰＳは、ピルフェニドンによる阻害に部分的に感受性のあるＣＤ１９＋ＣＤ８６ｈｉｇｈ細胞の有意な（ｐ＜０．００１）増加を引き起こした。対照的に、壊死性細胞質抽出物は、希釈剤処置細胞と比較した場合、ＣＤ１９＋ＣＤ８６ｈｉｇｈ  Ｂ細胞のわずかな統計的に有意ではない（ｐ＝０．６２）上方制御を誘導した（図１０Ｇ）。ＴＩＲＡＰ−／−動物の脾臓Ｂリンパ球でも同様の結果が得られた（図１０Ｈ）。まとめると、これらの調査結果は、ＬＰＳに対するＢ細胞の応答及びピルフェニドンによるその調節が細胞自律的であり、少なくとも部分的にＴＩＲＡＰ依存性シグナル伝達を介して媒介されることを示唆している。対照的に、壊死性細胞抽出物に対するＢ細胞の応答及びピルフェニドンの免疫調節効果は非細胞自律的であり、これらは状況及び組織依存性である可能性が高いことを示唆している。
【０１１５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＣＤ１９＋Ｂ細胞の活性化に関する本発明者らの調査結果がｉｎ  ｖｉｖｏで関連していたかどうかを判断するため、ピルフェニドンの存在下及び非存在下で、ＤＴ傷害モデル及び閉胸部Ｉ／Ｒモデルのマウスの心臓から単離された心筋ＣＤ１９＋ＣＤ８６ｈｉｇｈ  Ｂ細胞の数を測定した。図１０Ｉに示すように、ピルフェニドンによる処置は、ＤＴ傷害モデルにおける心筋ＣＤ１９＋ＣＤ８６ｈｉｇｈ  Ｂリンパ球の数における有意な（ｐ＜０．０４）減少と関連しており、図１０Ｊは、ピルフェニドンによる処置がＩ／Ｒ傷害後の心筋ＣＤ１９＋ＣＤ８６ｈｉｇｈの数における有意な（ｐ＜０．０３）減少と関連していることを示す。
【０１１６】
実施例１〜８の説明。
本明細書では、特発性肺線維症の治療用にＦＤＡ承認された小分子であるピルフェニドンの心臓保護作用、及び組織傷害に対する心臓のＢリンパ球応答の免疫調節に関与する独自のメカニズムによりピルフェニドンが心臓に有益な効果を発揮するという証拠を提供する。次の一連の証拠がこの内容を裏付けている。第１に、ピルフェニドンによる処置は、心筋細胞傷害の遺伝モデルの生存率を改善した。注目すべきは、生存率の改善は、アポトーシスまたは壊死性心筋細胞の細胞死の減少によるものではなかった（図１）。さらに、生存率の改善は、Ｌｙ６Ｇ＋好中球、Ｌｙ６Ｃ＋ＣＤ６４ｌｏｗ／−単球、ＣＤ６４＋Ｌｙ６Ｃｌｏｗ／−マクロファージの流入減少によるものではなかった。むしろ、ピルフェニドン処置後、心臓においてＣＤ１９＋リンパ球の数の有意な減少が観察された（図２）。第２に、ピルフェニドンによる処置は、心臓重量／体重比、ＬＶ質量、及びＬＶ拡張末期容積の減少によって示されるように、閉胸部Ｉ／Ｒ傷害後の心臓リモデリングを有意に減少させた（図３）。重要なことに、ピルフェニドンの有益な効果は、動物が該薬剤で前処理されていたか、またはＩ／Ｒ傷害後に投与されたかにかかわらず存在した。ＬＶリモデリングの減衰は、Ｌｙ６Ｇ＋好中球、Ｌｙ６Ｃ＋ＣＤ６４ｌｏｗ／−単球またはＣＤ６４＋Ｌｙ６Ｃｌｏｗ／−マクロファージの流入の減少によるものではなかった。ＤＴ傷害モデルでなされた観察と同様に、ピルフェニドン処置後、心臓においてＣＤ１９＋リンパ球が有意に減少した。顕著なことには、抗ＣＤ２０抗体によるＢ細胞の枯渇はピルフェニドンの心臓保護作用を弱め、このことはピルフェニドンの効果がＢ細胞依存性であるが、損傷した心臓のＢ細胞数の減少によって必ずしも媒介されないことを示唆した。第３に、ピルフェニドンによる処置は、ｉｎ  ｖｉｖｏで心筋ＣＤ１９＋ＣＤ１１ｂ＋リンパ球及びＣＤ１９＋ＣＤ１１ｂ−ＣＤ２３−ＣＤ２１−ＩｇＭｌｏｗ  ＩｇＤｈｉｇｈリンパ球の新規な集団の組織傷害に対する生物学的応答を変化させ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでのＢ細胞上のＣＤ８６発現を減少させた。本発明者らのデータは他の細胞型に対するピルフェニドンの効果を除外していないが、まとめると上記の観察結果は、ピルフェニドンが心筋Ｂ細胞サブセットの免疫調節に関与する固有のメカニズムを通じた心臓保護作用があることを示唆している。Ｉ／Ｒ傷害後のピルフェニドンの抗線維化作用（全てのグループではないが（８）、一部のグループ（４、５、７、９〜１２）で以前に報告されている）は観察されなかったが、この矛盾は、使用した実験モデル及び使用したピルフェニドンの期間及び／または用量の違いによる可能性がある。
【０１１７】
健康状態及び疾患における心筋Ｂリンパ球
最近の研究では、白血球のいくつかの別個の集団が正常な成体マウスの心筋に存在することが示されている。抗原提示単核細胞（ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋Ｆ４／８０＋、ＭＨＣＩＩ＋）が最も顕著な集団であり、Ｂ細胞、単球、及びＴ細胞がそれに続く（２０）。心臓のマクロファージ、樹状細胞、及びＴ細胞の役割に近年大きな関心が寄せられているが、Ｂ細胞の役割については比較的知られていない。未感作心臓の心筋Ｂ細胞の組成についてはほとんど知られていない。Ｒａｍｏｓ  ｅｔ  ａｌは、未感作成体マウスの心筋がＢ２２０＋（ＣＤ４５Ｒ）リンパ球の２つの集団、より大きな集団ＩｇＭｈｉｇｈ  ＩｇＤｌｏｗ細胞とより小さな集団ＩｇＭｌｏｗ  ＩｇＤｈｉｇｈ細胞を有することを示した（２１）；しかし、これらの２つのリンパ球集団のオントロジーも機能的役割も、本研究では特徴づけられなかった。既存の文献は、特定のＢ細胞媒介メカニズムは完全に特定されていないが、Ｂリンパ球が心臓傷害後の慢性左心室リモデリングに重要な役割を果たすことを示唆している。３つの異なるグループが、急性冠動脈結紮（ＭＩ）後の心筋Ｂリンパ球の役割を研究している。Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ（２２）及びＺｏｕｇｇａｒｉ  ｅｔ  ａｌ（２３）の両者は、心筋ＣＤ１９＋細胞の数がＭＩ後に増加したことを報告した。Ｚｏｕｇｇａｒｉは、ＣＤ１９＋ＩｇＤ＋ＩｇＭｌｏｗ  Ｂリンパ球が梗塞した心筋に流入し、ＣＣＬ７依存性メカニズムによって骨髄からＬｙ６Ｃ＋単球を動員することにより有害なＬＶリモデリングに寄与することを示した（２３）。対照的に、最近の研究では、ＭＩ後の心筋におけるＣＤ１９＋細胞の最小限の検出で、ＣＤ１９＋細胞が心膜脂肪組織の脂肪関連リンパ系クラスターよりも優先的に動員されることが分かった（２４）。心臓傷害の非外科的モデルを使用して、Ｃｏｒｄｅｒｏ−Ｒｅｙｅｓは、野生型マウスにおいて、有害な心臓リモデリングが抗体依存性のＢ細胞の枯渇によって減衰することを示した（２５）。Ｂリンパ球媒介性心筋障害の作用メカニズムは完全には解明されていないが、Ｂ細胞亜集団（Ｂ１対Ｂ２対Ｂ−ｒｅｇ）の調節不全、ＩｇＭまたはＩｇＧ抗体の沈着、及びＢ細胞媒介性Ｌｙ６Ｃ＋単球の動員を含む、いくつかのメカニズムが提案されている（２３）。これに関して、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌが、彼らは心筋Ｂリンパ球を具体的には研究していなかったが、天然ＩｇＭが心筋Ｉ／Ｒ傷害において役割を果たすことを示したことは興味深い（２６）。
【０１１８】
本明細書で提示された結果は、心筋Ｂリンパ球について記載した先行研究を裏付けるかつ発展させ、心臓傷害後の有害な心臓リモデリングの調節においてＢリンパ球が重要な役割を果たすことを示唆した。初めて、未感作マウスの心臓において、Ｂリンパ球の大部分がＣＤ１９＋ＣＤ１１ｂ−ＣＤ２１−ＣＤ２３−ＣＤ１１ｃ−ＩｇＤ＋ＩｇＭｌｏｗ／−である一方、心筋Ｂリンパ球の少数がＣＤ１９＋ＣＤ１１ｂ＋であることを示した。この後者の群では、少数はＢ１ａリンパ球に特徴的なＣＤ５を発現し、大部分はＢ１ｂリンパ球に特徴的なＣＤ５−を発現する（１６）。本発明者らが説明するＣＤ１９＋ＣＤ１１ｂ−細胞の表現型は、Ｚｏｕｇｇａｒｉ  ｅｔ  ａｌによる報告における梗塞後の心筋に蓄積したＢ細胞の表現型の説明と重複するが（つまり、ＣＤ１９＋ＩｇＤ＋ＩｇＭｌｏｗ）、本明細書に記載のＣＤ１９＋ＣＤ１１ｂ−ＣＤ２１−ＣＤ２３−ＣＤ１１ｃ−ＩｇＤ＋ＩｇＭｌｏｗ／−細胞の正確な個体発生（ｏｎｔｏｇｅｎｙ）は公知でないことが強調される。本発明者らの知る限り、これらの細胞の表現型は、既に説明されたいかなるＢ細胞サブセットのプロファイルとも一致しない（２７）。Ｂ細胞は、Ｂ１及びＢ２リンパ球に広く特徴づけられ得、それぞれ一般的に自然及び獲得と考えられている。Ｂ１ａリンパ球の発達は、主に胎子及び周産期中に起こるが、Ｂ１ｂ及びＢ２リンパ球の産生は、成体期にわたって継続する。これらの細胞がＢ２細胞に特徴的な比較的高レベルのＩｇＤ＋と、Ｂ１細胞に特徴的に発現する低レベルのＩｇＭを発現するという観察結果は、これらの細胞がＢ１細胞ではないことを示唆している（３１）。注目すべきことに、数人の著者が、成熟ＣＤ１９＋ＣＤ２１−ＣＤ２３−Ｂ細胞の別個の集団が老化マウスに蓄積することについて報告している（２８）。しかしながら、これらの「加齢関連Ｂ細胞」はＣＤ１１ｃ＋であり、転写因子Ｔ−ｂｅｔを発現するが、その一方でＦＡＣＳによるＣＤ１１ｃ発現もＲＮＡｓｅｑによるＴ−ｂｅｔの遺伝子発現も検出されなかった（データは図示せず）。本発明者らの結果は、ピルフェニドンによって調節されるプロセスにおいて、Ｉ／Ｒ傷害後の心臓においてＢリンパ球の固有のサブセットが増加し、心筋Ｂリンパ球の異なるサブセット（ＣＤ１９＋ＣＤ１１ｂ＋及びＣＤ１９＋ＣＤ１１ｂ−リンパ球）が心臓傷害後に差次的に活性化されることを示すことによってもまた、心筋Ｂ細胞に関する既存の文献をさらに発展させる。ＤＴ媒介性心臓傷害後の心臓においてＣＤ１９＋リンパ球の統計的に有意な増加は観察されなかったが、全体的な傾向はＩ／Ｒ傷害で観察されたものと類似していた。Ｂ細胞応答の定量的な違いは、２つの異なる傷害モデルにおける組織傷害の程度の違い及び／またはＢリンパ球動態の違いによる可能性がある。
【０１１９】
Ｂ細胞は急性組織傷害後のピルフェニドンの心臓保護作用に必要であり、Ｂ細胞の枯渇はｉｎ  ｖｉｖｏの組織傷害後のピルフェニドンの心臓保護作用を模倣しないことが示唆された。これらの結果は一致していないように見えるが、それらは、ピルフェニドンが組織傷害に対するＢ細胞の免疫応答を調節することによりその有益な効果を発揮するｉｎ  ｖｉｖｏでの転写プロファイリング研究によってサポートされる、より僅かな差異のモデルを示唆している。インフォマティクス分析の結果に基づいて、本発明者らは、壊死性細胞からの細胞質内容物の放出（すなわち、障害関連分子パターン、ＤＡＭＰＳ）に応答したＴＬＲシグナル伝達の活性化は、ピルフェニドン感受性プロセスを介してＢ細胞を活性化する可能性があるという仮説を立てた。本発明者らは、壊死性細胞抽出物は混合炎症細胞の培養液から単離されたＢリンパ球の共刺激分子ＣＤ８６を上方制御するのに十分であるが、一方で壊死性細胞抽出物が精製Ｂ細胞調製物のＣＤ８６を上方制御するのに十分ではなかったことを見出した。対照的に、代表的なＴＬＲ４アゴニストであるＬＰＳは、ＰＤＩＣ及び精製Ｂ細胞調製物中のＣＤ１９＋細胞においてＣＤ８６の上方制御を誘導した。これらの発見は従来の報告と一致しており、ＴＬＲアゴニストに対するＢリンパ球の反応が状況依存性であり（２９）、壊死性細胞抽出物に応答したＢリンパ球活性化が少なくとも部分的に非細胞自律的であることを示す。重要なことに、ピルフェニドンが壊死性細胞抽出物またはＬＰＳで刺激されたＰＤＩＣ培養液中のＣＤ１９＋ＣＤ８６＋リンパ球の数を有意に減少させることが観察された。本発明者らのｉｎ  ｖｉｔｒｏの研究と一致して、未処置対照と比較した場合、ピルフェニドンで処置したＤＴ傷害マウス及びＩ／Ｒ傷害マウスの心臓においてＣＤ１９＋ＣＤ８６ｈｉｇｈリンパ球の有意な減少が観察された。ＴＩＲＡＰ−／−細胞でのｉｎ  ｖｉｔｒｏの結果は、壊死性細胞抽出物によるＢ細胞の活性化がＴＩＲＡＰ依存性であることを示唆する。しかしながら、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＬＰＳ誘導性のＢ細胞活性化は減弱したが、ＴＩＲＡＰ−／−マウスでは無効化されなかった。これは、ＬＰＳシグナル伝達がＢ細胞の複数の細胞内経路を活性化できるという以前の観察結果と一致している（３０）。
【０１２０】
本発明者らの研究では、心臓の炎症性浸潤のピルフェニドン依存性免疫調節が急性傷害後の心機能を改善することが見出された。驚いたことに、ピルフェニドンでの処置は、ジフテリア毒素の投与の４日後のトロポニンの減少（図１Ｂ）にも、トリクローム染色により評価されるようにＩ／Ｒ傷害後の梗塞サイズの減少にも関連していなかった（図３Ｇ〜図３Ｈ）。この発見は、心臓Ｂリンパ球が傷害後の心臓リモデリングを調節する可能性があることを示唆する。
【０１２１】
自然免疫系は急性心筋傷害後に起こる有害な心臓リモデリング及び心筋機能障害において重要な役割を果たすことが長い間認識されてきたが、実行可能な治療標的を特定する探求は、組織傷害後の心臓修復の開始に必要な自然免疫応答の固有の二重性のために、実行可能な治療標的を特定することの探求は現在まで見出せていない（３２）。本明細書では、急性心筋障害によって引き起こされる急性炎症反応のＢリンパ球成分の以前は認識されていなかった複雑さを示し、心筋傷害に対するＢ細胞応答が、抗体ベースのアプローチとは対照的に、小分子ベースのアプローチによって調節できることを示す。これは、ＳＴ部心筋梗塞の経皮的心臓血管形成術後の虚血再灌流傷害の状況において、ピルフェニドンが免疫調節剤として転用され得るかどうかという興味深い疑問を提起する。心臓修復に不可欠な単球／マクロファージとは対照的に、Ｂリンパ球は、少なくとも部分的に、Ｔ細胞、心臓マクロファージ、及び樹状細胞間の相互作用を調節することにより機能する。したがって、Ｂ細胞を標的とするように設計された免疫調節戦略は、心筋修復に重要なサイトカイン及び細胞型を目的とした戦略よりも、有害な効果をもたらす可能性が低い可能性がある。最後に、心臓のＢリンパ球の重要性に対する認識が高まっていることを考えると（２１、２５、３３）、これらの研究は、健康、病気、及び老化における心筋Ｂリンパ球の起源、動態、時間的発達、及び機能的意義をよりよく理解するための将来の研究に焦点を当てるという発見的な目的にも役立ち得る。
【０１２２】
実施例１〜８の方法。
マウス傷害モデル
急性心筋傷害に対するピルフェニドンの効果を評価するために、心筋傷害の２つの異なるｉｎ  ｖｉｖｏ実験モデル：選択的心筋細胞死の非外科的モデル（１３）及び閉胸部虚血再灌流（Ｉ／Ｒ）傷害の十分に特徴づけられた外科的モデル、を使用した。（３４）（１５）これらの実験用のマウスは、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅで飼育及び維持され、全ての実験手順を動物使用監視委員会にしたがって行った。
【０１２３】
ＤＴ傷害モデル。Ｍｌｃ２ｖ−Ｃｒｅマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ［Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ］）をＲｏｓａ２６−ＤＴマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と交配させて、Ｒｏｓａ２６−ＤＴ  Ｍｌｃ２ｖ−Ｃｒｅマウスの系統を作成した。９〜４０週齢の雌マウスに、２．５ｎｇ／ｇのジフテリア毒素（Ｓｉｇｍａ）を腹腔内注射した。ジフテリア毒素は製造元の指示にしたがって溶解し、−８０℃で２０００ｎｇ／μＬの濃度でアリコートで保存した。−８０℃で保存したアリコートを、使用の１〜１０日前にＰＢＳ中２０ｎｇ／μＬに希釈し、−２０℃で保存した。ジフテリア毒素は、注射の直前にＰＢＳ中、最終濃度１ｎｇ／μＬに希釈した。各実験に同腹仔対照を使用した。マウスが利用可能になった時点でマウスを処置及び研究し、利用可能な全実験結果を分析のために編集した。
【０１２４】
ＤＴ誘導性傷害後の筋細胞傷害の程度を評価するため、トロポニン放出及びエバンスブルー色素の取り込みを測定した。トロポニンは、ＤＴの注射の４日後、最終的な屠殺時に測定した。血液をＢＤマイクロテイナチューブに採取し、血清をＰＢＳ中１：４に希釈した（血清５０μｌ＋ＰＢＳ  １５０μｌ）。血清トロポニンは、市販の化学発光微粒子アッセイ（Ａｂｂｏｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＩ，ＵＳＡ）を使用して測定した。記載されているように、エバンスブルー色素の取り込みは、ＤＴ注射の４日後に評価した（３５、３６）。Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを使用して、乳頭筋レベルで心臓を検査した。データは、赤色蛍光の心筋面積（％）として表される。
【０１２５】
虚血再灌流（Ｉ／Ｒ）傷害。野生型（ＷＴ）マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ；Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入）の心臓は、Ｅｎｔｍａｎとその同僚によって開発された閉胸部虚血再灌流モデル（３４）を使用して虚血再灌流（Ｉ／Ｒ）傷害を受け、以前に説明したように修正した（１５）。本明細書に記載の研究の場合、計測した９〜１０週齢のマウスを使用し、次いで、計測の１週間後、１．５％のイソフルランで麻酔し、９０分の閉胸部虚血にした後、２週間再灌流を受けた。
【０１２６】
ピルフェニドン処置
ピルフェニドンを投与するため、マウスに、０．５重量％のピルフェニドン（ｅＮｏｖａｔｉｏｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＮＪ，ＵＳＡ，Ｃａｔ＃Ｄ４０４６５５）と混合した粉末状飼料、または粉末状飼料単独を与えた。この用量はげっ歯類モデルで一般的に使用されており、ピルフェニドンで処置したヒトで観察されるものと同様の血漿中濃度になることが示唆される（３７）。特に明記しない限り、マウスは、ＤＴ誘導性傷害またはＩ／Ｒ傷害の３日前に、ピルフェニドンを豊富に含む食餌に切り替え、実験中はこの食餌を維持した。並行研究では、Ｉ／Ｒ傷害前にマウスに通常の食餌を与え、次いで心臓傷害時にピルフェニドンを急性投与した。後者の研究では、マウスに希釈剤（リン酸緩衝液［ＰＢＳ］２００μＬ）を、または再灌流後及びＩ／Ｒ傷害後の朝（合計２回の注射）にピルフェニドン（ＰＢＳ中２００μＬのピルフェニドン［５ｍｇ／ｍＬ］）を、腹腔内注射した。該マウスは、Ｉ／Ｒ傷害の夜にピルフェニドン豊富食または対照食に切り替え、実験が完了するまで同じ食餌を維持した。
【０１２７】
Ｂ細胞の枯渇
Ｂ細胞枯渇研究の場合、マウスに、頸静脈から１００μｇの抗ＣＤ２０抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｃｌｏｎｅ  ＳＡ２７１Ｇ２，Ｃａｔａｌｏｇ＃１５２１０４）を注射した。注射した抗体を、保存剤を含まないｐＨ７．２のＰＢＳ（エンドトキシンレベル  タンパク質の０．０１Ｕ／μｇ未満）中で希釈し、０．２μｍフィルターを使用してろ過した。結果のセクションに記載のように、様々な時点で免疫枯渇を評価した。
【０１２８】
重量分析及び組織学的分析
Ｒｏｓａ２６−ＤＴ  Ｍｌｃ２ｖ−Ｃｒｅ及び同腹仔対照ＷＴマウスをＤＴ注射の１４日後に安楽死させ、心臓を摘出し、重量を測定して心臓重量対脛骨長比を決定した。ＷＴマウスをＩ／Ｒ傷害の１４日後に安楽死させ、心臓を摘出し、重量を測定して心臓重量対脛骨長比を決定した。記載されているように、心臓を処理し、パラフィン包埋し、ヘマトキシリン／エオシン及びマッソンのトリクロームで染色した（３８）。ＴＵＮＥＬ染色は、製造元の指示にしたがってＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）Ｓ７２００  ＡｐｏｐＴａｇ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｏｌｉｇｏ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔで実施した。
【０１２９】
心エコー検査
画像の取得。心血管系の超音波検査は、先に記載のように、３０ＭＨｚリニアアレイトランスデューサーを備えたＶｅｖｏ  ２１００  Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ  Ｉｎｃ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）を使用して実施した（１５）。
【０１３０】
イメージングプロトコル。虚血時及び再灌流の２週間後に心エコー検査でマウスをイメージングし、記載のようにＬＶ構造及び機能を評価した（３９）。心エコー検査士は、研究群の割り当てのために盲検化した。虚血時に音響窓が弱いまたはリスク領域が小さい（０．４５未満）動物は、さらなる分析から除外した。
【０１３１】
細胞培養
腹膜由来炎症細胞（ＰＤＩＣ）を、チオグリコレートで刺激した野生型及びＴＩＲＡＰ−／−欠損マウスの腹腔から回収した。ＰＤＩＣ培養液には、ＣＤ１９＋Ｂ細胞を含む炎症細胞の混合物が含まれる（４０）。ＴＩＲＡＰ欠損マウスは、Ｄｒ．Ｒｕｓｌａｎ  Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ（Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）から供与された。１ｍｌのチオグリコレート培地（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）の腹腔内注射の４日後にＰＤＩＣを回収した。マウスを安楽死させ、１０％ウシ胎仔血清を含有するダルベッコ改変培地３ｍＬで腹腔を３〜４回洗浄した。１８ゲージの針を備えた３ｍＬシリンジを使用して腹腔に注射し、ＰＤＩＣを含有する培地を回収した。回収した細胞を２５０ｇで５分間遠心分離し、５ｍＬの培地に再懸濁し、４０μｍのストレーナーに通してろ過した。細胞を１２または２４ウェルプレートに約１５０万細胞／ｍＬでプレーティングした。製造元の指示にしたがってＭａｇｎｉＳｏｒｔマウスＢ細胞濃縮キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）で脾臓由来の初代リンパ球を単離し、９６ウェルプレートに１００万細胞／ｍｌでプレーティングした。単離されたＢ細胞の純度をフローサイトメトリーにより確認し、報告された全ての実験で８５％以上であった。ＰＤＩＣ及び初代Ｂリンパ球の両方を、１０％ＦＣＳ、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン／ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ，１Ｘ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、及び５５μＭ  ２−メルカプトエタノールを含むＤＭＥＭ中で培養した。
【０１３２】
ＬＰＳ−ＥＢ超高純度リポ多糖（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）または壊死性細胞抽出物（ＮＣＥ）を使用して、細胞培養液を刺激した。ＬＰＳによる刺激のため、プレーティング時にＬＰＳを１００ｎｇ／ｍＬで添加した。ＮＣＥを、マウス心臓及びマウス肝臓抽出物について記載されるプロトコルと同様の方法で、Ｈ９ｃ２細胞から調製した（１８）。刺激のため、ＮＣＥを、細胞がプレーティングされた際に最終濃度１０μｇ／ｍＬで添加した。ＬＰＳ及びＮＣＥ刺激は、ピルフェニドンの存在下及び非存在下で２４時間実施した。ピルフェニドンをダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に溶解（１０ｍｇ／ｍＬ）し、６５℃の水浴で５分間穏やかに２回加熱した後、２０秒間ボルテックスした。ピルフェニドン溶液を４℃で保存し、調製から２４時間以内に使用した。ピルフェニドンを最終濃度１５０ｎｇ／ｍＬで添加した。フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）のため、接着及び非接着培養細胞の両方を採取した。非接着細胞は、培地回収の前に培養培地を上下にピペッティングすることにより回収し、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒｉｐｐｅｒ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，ＵＳＡ）にて単回高速洗浄し、その後２５０ｘｇで３分間穏やかに遠心分離した。接着画分を回収するため、細胞を、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒｉｐｐｅｒ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，ＵＳＡ）を用いて３７℃で３０分間インキュベートし、その後穏やかなピペッティングにより剥離し、その後セルリフターで機械的に剥離した。接着細胞を非接着細胞と混合し、２５０ｘｇで３分間遠心分離し、さらなる処理のために３００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。
【０１３３】
フローサイトメトリー
フローサイトメトリー実験のため、マウスをＣＯ２チャンバーで安楽死させ、心臓を冷ＰＢＳで灌流し、実体顕微鏡下で心臓外組織から注意深く切開し、細かく刻み、３ｍｌのＤＭＥＭに懸濁し、次いで３７℃で６０分間、１２０ＵのＤＮＡｓｅ（Ｓｉｇｍａ）、１８０Ｕのヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ）、及び１３５０Ｕのコラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ）で消化した。消化物質を４０μｍフィルターに通してろ過し、２％ＦＣＳ＋０．２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加したＨＢＳＳ中で遠心分離（４℃で３分間２５０ｘｇ）してペレット化した。赤血球を氷上で１５分間ＡＣＫ溶解緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に溶解し、残りの細胞を３００μＬのＦＡＣＳ緩衝液（２％ＦＣＳ及び２ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳ）中で再懸濁した。上記のように、培養細胞をＦＡＣＳ分析のために採取し、３００μＬのＦＡＣＳ緩衝液中で再懸濁した。以下の表に概説された蛍光コンジュゲート抗体で試料を標識した。細胞を氷上で４５分間染色し、分析前にＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄの全ての抗体を３００μＬ試料あたり０．２μＬで使用し、ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの抗体を３００μＬ試料あたり０．４μＬで使用した。ＦＡＣＳを、Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎａｌｙｚｅｒｓ（ＬＳＲＩＩ，Ｃａｎｔｏ，Ｘ２０またはＦｏｒｔｅｓｓａ）で実施した。ＵｌｔｒａＣｏｍｐ  ｅｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して補正対照を生成し、初代脾細胞を染色して得られた単色対照試料で検証した。ＤＴ傷害モデルを伴うフローサイトメトリー実験のため、トロポニンの定量のために、最終的な屠殺時に血清を採取した。パイロット研究では、血清トロポニン１ｎｇ／ｍｌ未満のマウスでは認識可能な程度の組織傷害が見られないことが観察された；したがって、血清トロポニン１未満のマウスは、さらなる分析から除外した。Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ａｎｄ  Ｓｏｒｔｉｎｇ  ＣｏｒｅにてＦＡＣＳＡｒｉａ選別機器（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して、細胞選別を行った。ブランド、クローン番号、及び使用した蛍光色素分子を含む、使用される全ての抗体のリストは表１に記載される。
【０１３４】
転写プロファイリング
ピルフェニドンの存在下及び非存在下で、未感作及びＤＴＲ傷害心臓から単離した心臓リンパ球の転写プロファイリングを実施した。未感作、ＤＴ傷害心臓、及びＤＴ＋ピルフェニドン心臓のＣＤ１９＋ＣＤ１１ｂ＋及びＣＤ１９＋ＣＤ１１ｂ−心臓リンパ球をＲＮＡ単離のために溶解緩衝液に直接入れてＦＡＣＳ選別した。各心臓から合計６００〜１２，０００個の細胞を選別した。製造元の指示にしたがってＺｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＱｕｉｃｋＲＮＡ  ＭｉｃｒｏＰｒｅｐ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用してＲＮＡを抽出した。ＲＮＡを１１μｌで溶出し、全量を全トランスクリプトーム解析に供した。心筋Ｂリンパ球は、８匹の未感作動物、６匹のＤＴマウス、及び３匹のＤＴ＋ＰＦＤ処置マウスから選別した。選別したＢ細胞集団から得られた全ＲＮＡをポリアデニル化ＲＮＡのために選択し、ＣｌｏｎｔｅｃｈのＳＭＡＲＴｅｒ  ｖ２キットを使用してＲＮＡ配列決定ライブラリーに変換した。シングルエンド５０ｂｐリードをＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ３０００で得、Ｔｏｐｈａｔ２．１を使用してマウストランスクリプトームのＩｌｌｕｍｉｎａ  ｉＧｅｎｏｍｅｓ  ＧＲＣｍ３８＿Ｅｎｓｅｍｂｌリリースにアラインメントし（４１）、試料あたり平均１．８Ｘ１０７のアラインメントされたリードを得た。遺伝子レベルの定量は、ＨＴＳｅｑ  ２を使用して実施した（４２）。ｍＲＮＡは、少なくとも１００万あたり１リードの量にて６つの実験群（ＷＴ、ＤＴ、及びＤＴ＋ＰＦＤのＣＤ１９＋ＣＤ１１ｂ＋及びＣＤ１９＋ＣＤ１１ｂ−）の全ての生物学的複製において存在する場合、ダウンストリーム解析に含まれた。このフィルタリング手順から、合計１２，０９７のｍＲＮＡを得た。未処置のＣＤ１９＋ＣＤ１１ｂ＋細胞及びＣＤ１９＋ＣＤ１１ｂ−細胞の遺伝子発現をそれぞれ比較するために、ＤＴ傷害及びＤＴ傷害＋ピルフェニドン条件、遺伝子発現データを実験バッチ間の変動について修正し、１７個のシーケンスした試料の全ての１２，０９７のｍＲＮＡにわたって主成分分析を実施した。これにより、これらの群の９５％信頼区間（２標準偏差）の外にある大きな外れ値であった５つの試料（１つのＣＤ１９＋ＣＤ１１ｂ＋／ＤＴ心臓、２つのＣＤ１９＋ＣＤ１１ｂ−／未感作心臓、及び１つのＣＤ１９＋ＣＤ１１ｂ−／ＤＴ心臓）がハイライトされ、さらなる分析から除外した。このデータは、ＮＣＢＩＧＥＯリポジトリのアクセッション番号ＧＳＥ１１２９８４で入手可能である。実験条件間で発現が異なるｍＲＮＡを同定するために、ｌｉｍｍａ−ｖｏｏｍ手術を使用した（４３）。ＫＥＧＧ経路解析を、特定の実験群間で発現レベルが２倍超変化したｍＲＮＡについて、ＮＩＨオンラインリソースＤＡＶＩＤの２０１７年リリース内の適切な機能的なアノテーションモジュールを使用し（４４）、ＦＤＲ  ０．０５以下（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法）を採用して実施し、指定の条件間で豊富な経路を同定した。次の３つのカテゴリー内のＫＥＧＧ経路：シグナル伝達（３．２）、シグナル伝達分子及び相互作用（３．３）、ならびに免疫系（５．１）を分析した。
【０１３５】
統計情報
データは平均±標準偏差として表される。両側スチューデントｔ検定を２群間のペアワイズ比較に使用し、複数の事後比較のためのテューキーの補正付き一元配置分散分析を複数の実験群の比較に使用し、複数の事後比較のためのテューキーの補正付き二元配置分散分析を各群の複数条件での複数の実験群の比較に使用した。Ｇｅｈａｎ−Ｂｒｅｓｌｏｗ−Ｗｉｌｃｏｘｏｎ法を使用して、カプラン・マイヤー曲線を比較した。Ｐ値＜０．０５は統計的に有意であると見なした。各実験で使用される特定の統計検定は、図のキャプションに示される。全ての計算は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン７．０４を使用して実施した。
【０１３６】
実施例９：試験したＰＥＧ化合物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫調節効果。
腹膜由来炎症細胞をチオグリコレートの腹腔内注射後の日に採取した。細胞を２４時間、ベースライン条件（対照）、ＬＰＳ１００ｎｇ／ｍｌ（ＬＰＳ）の存在下、またはＬＰＳ１００ｎｇ／ｍｌ及び様々な濃度の異なる形態のＰＥＧ化ピルフェニドン（図１１ＡでＣ２及びＣ３、図１１ＢでＣ４〜Ｃ６と命名）の存在下で培養した。培養の２４時間後、細胞を採取し、フローサイトメトリーにより分析して、ＣＤ１９＋細胞（Ｂリンパ球）上でのＣＤ８６の発現を評価した。図１１Ａ及び図１１Ｂのグラフは、ピルフェニドン及び試験した形態のＰＥＧ化ピルフェニドンの両方が、ＣＤ１９＋細胞上でのＣＤ８６の発現を減少させたことを示す。図１１Ｃは、試験した形態のＰＥＧ化ピルフェニドンの分子量及び試験化合物とピルフェニドンとの間の分子量（ＭＷ）比について報告する。図１１Ｄは、試験したＰＥＧ化ピルフェニドンバリアントの分子構造（Ｃ２〜Ｃ６）を、ピルフェニドンに対するそれらの相対的効力の評価（使用する薬剤の量を重量濃度からモル濃度に変換して計算）及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ毒性の評価（培養細胞の目視検査及びフローサイトメトリー分析時のＤＡＰＩ染色により評価される）と合わせて示す。重要なことに、表は、試験したＰＥＧ−ピルフェニドンのバリアントが同等ではなく、Ｃ６（Ｐｅｇｙｄｏｎｅ  ６）が他の試験したバリアントよりも優れていることを示す。
【０１３７】
実施例１０：ピルフェニドンと比較したＰｅｇｙｄｏｎｅ６のＰｋ及びバイオアベイラビリティ。
【０１３８】
事前に指定した時点で血液を採取し、投与した薬剤の濃度を質量分析法（ＬＣ−ＭＳ−ＭＳ）で測定した。各時点で３回採取した。図１２Ａは、ピルフェニドンの静脈内投与後に収集したデータについて報告し、図１２Ｂは、Ｐｅｇｙｄｏｎｅ  ６の投与後に収集したデータについて報告する。図１２Ｃは、図１２Ａ及び図１２Ｂに報告されたグラフから計算された２つの薬剤の半減期について報告している。図１２Ｃは、Ｐｅｇｙｄｏｎｅ  ６及びピルフェニドンの計算された半減期及びバイオアベイラビリティについて報告する。
【０１３９】
実施例１１：ｉｎ  ｖｉｖｏでの循環Ｂ細胞に対するピルフェニドン効果の測定。
図１３Ａは、３週間の並体結合マウスが循環ＣＤ１９＋Ｂリンパ球の５０％キメラ現象を示すことを示す。図１３Ｂは、心筋Ｂリンパ球のキメラ現象の分析である。結合した動物は、ＣＤ１９＋ＣＤ１１ｂ＋及びＣＤ１９＋ＣＤ１１ｂ−心筋Ｂリンパ球の両方で５０％のキメラ現象を示す。図１３Ｃは、心筋ＣＤ１９＋細胞及び循環ＣＤ１９＋細胞間のキメラ現象の比を示す。血液及び心筋間のＢ細胞キメラ現象の比率は約１である。このことは、心筋Ｂリンパ球が急速に再循環し、循環Ｂリンパ球と平衡状態にあることを裏付け、心筋Ｂ細胞に対するピルフェニドン及び／またはＰＥＧピルフェニドンの効果が末梢血Ｂリンパ球で評価できることを示している。
【０１４０】
実施例１２：ｉｎ  ｖｉｖｏの加齢関連心筋変化の処置におけるピルフェニドン。
心筋Ｂ細胞は加齢とともに変化するため、ピルフェニドン及び／またはＰＥＧ−ピルフェニドンを使用して、心筋Ｂ細胞の加齢関連変化を調節することができた。示された異なる年齢のマウスを屠殺し、フローサイトメトリーを介して心臓を分析した。各時点で３回測定した。図１４Ａは、加齢とともにＣＤ１９＋細胞の有病率が増加することを示す。図１４Ｂは、ＣＤ１９＋ＣＤ１１ｂ＋細胞の有病率も同様に増加することを示す。図１４Ｃは、加齢とともにＣＤ１９＋ＣＤ１１ｂ−細胞の有病率が低下することを示す。
【０１４１】
実施例１３：ヒトの心筋Ｂ細胞を調節するためのピルフェニドンの使用。
データは、ヒト心臓がマウス心臓で観察されるものと同様のＢ細胞の集団を保有していることを示し、したがって、ピルフェニドンまたはＰＥＧ−ピルフェニドンが、マウスで観察されるものと同様のヒトでの心臓保護効果を有する可能性が高いことを立証する。
【０１４２】
実施例１４：ＰＥＧ化ピルフェニドン誘導体。
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーをピルフェニドンに組み込むことにより、様々なＰＥＧ化ピルフェニドン誘導体を設計及び合成した。ＰＥＧ化小分子の潜在的な利点は、１）体内分布の変更、２）細胞外への輸送の減少、３）経口投与量の改善、４）代謝の変更、ならびに５）薬物の半減期及び他の薬物動態的特性の変更、である。
【０１４３】
ＰＥＧ化ピルフェニドン誘導体は、図１６Ａ及び図１６Ｂに示すように、一般構造への様々な置換により合成した。設計及び合成されたピルフェニドンのＰＥＧ化誘導体のいくつかの化学構造を、図１６Ｂ〜１６Ｗに示す。
表１−ＤＴＲ傷害心臓対未感作心臓から選別されたＣＤ１９＋Ｃｄ１１ｂ＋細胞において差次的発現が２倍以上または２倍以下の遺伝子のＫＥＧＧ分析（経路に続いてその経路内で差次的に発現する遺伝子）
【表１−１】
2020530005.tif 000012
【表１−２】
2020530005.tif 000013
【表１−３】
2020530005.tif 000014
表２  ＤＴＲ傷害心臓対未感作心臓から選別されたＣＤ１９＋Ｃｄ１１ｂ−細胞において差次的発現が２倍以上または２倍以下の遺伝子のＫＥＧＧ分析（経路に続いてその経路内で差次的に発現する遺伝子）
【表２−１】
2020530005.tif 000015
【表２−２】
2020530005.tif 000016
【０１４４】
実施例１５：ＰＥＧ−ピルフェニドンは、ピルフェニドンと比較して半減期が延長され、バイオアベイラビリティが改善されている
ピルフェニドン及びＰｅｇｙｏｎｄｅ−６を等モル濃度でラットに静脈内または経口（ＰＯ）投与し、薬物動態パラメーターを測定するために異なる時点で血清濃度を測定した。薬剤は、生理食塩水中、５％アルコール＋２０％ＰＥＧ  ３００に溶解した。以下に報告されたデータは、ＰＥＧ−ピルフェニドンが静脈内及び経口投与後にピルフェニドンよりも長い半減期を有し、ＰＥＧ−ピルフェニドンがピルフェニドンよりも優れたバイオアベイラビリティを有することを示す。
【表３】
2020530005.tif 000017
【表４】
2020530005.tif 000018
【表５】
2020530005.tif 000019
【表６】
2020530005.tif 000020
【表７】
2020530005.tif 000021
【表８】
2020530005.tif 000022
【０１４５】
参考文献
１．  Ｍａｎｎ  ＤＬ．Ｔｈｅ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｅａｒｔ  ａｎｄ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｙｓｔｅｍ：  ｆｏｒ  ｗｈｏｍ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ｔｏｌｌｓ．Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．２０１１；１０８（９）：１１３３−４５．
２．  Ｒｙｍｅｒ  ＪＡ，  Ｎｅｗｂｙ．Ｌ．Ｋ．Ｆａｉｌｕｒｅ  ｔｏ  ｌａｕｎｃｈ：  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ．ＪＡＣＣ：  Ｂａｓｉｃ  ｔｏ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１７；２（４８４−９７．
３．  Ｃａｒｔｅｒ  ＮＪ．Ｐｉｒｆｅｎｉｄｏｎｅ：  ｉｎ  ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｄｒｕｇｓ．２０１１；７１（１３）：１７２１−３２．
４．  Ｗａｎｇ  Ｙ，  Ｗｕ  Ｙ，  Ｃｈｅｎ  Ｊ，  Ｚｈａｏ  Ｓ，  ａｎｄ  Ｌｉ  Ｈ．  Ｐｉｒｆｅｎｉｄｏｎｅ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  ｃａｒｄｉａｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ＴＡＣ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｂｙ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎｇ  ＮＬＲＰ３  ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ．２０１３；１２６（１）：１−１１．
５．  Ｙａｍａｇａｍｉ  Ｋ，  Ｏｋａ  Ｔ，  Ｗａｎｇ  Ｑ，  Ｉｓｈｉｚｕ  Ｔ，  Ｌｅｅ  ＪＫ，  Ｍｉｗａ  Ｋ，  Ａｋａｚａｗａ  Ｈ，  Ｎａｉｔｏ  ＡＴ，  Ｓａｋａｔａ  Ｙ，  ａｎｄ  Ｋｏｍｕｒｏ  Ｉ．  Ｐｉｒｆｅｎｉｄｏｎｅ  ｅｘｈｉｂｉｔｓ  ｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｂｙ  ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ−ｏｖｅｒｌｏａｄｅｄ  ｈｅａｒｔｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１５；３０９（３）：Ｈ５１２−２２．
６．  Ｙａｍａｚａｋｉ  Ｔ，  Ｙａｍａｓｈｉｔａ  Ｎ，  Ｉｚｕｍｉ  Ｙ，  Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｙ，  Ｓｈｉｏｔａ  Ｍ，  Ｈａｎａｔａｎｉ  Ａ，  Ｓｈｉｍａｄａ  Ｋ，  Ｍｕｒｏ  Ｔ，  Ｉｗａｏ  Ｈ，  ａｎｄ  Ｙｏｓｈｉｙａｍａ  Ｍ．  Ｔｈｅ  ａｎｔｉｆｉｂｒｏｔｉｃ  ａｇｅｎｔ  ｐｉｒｆｅｎｉｄｏｎｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃａｒｄｉａｃ  ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ  Ｒｅｓ．２０１２；３５（１）：３４−４０．
７．  Ｍｉｒｋｏｖｉｃ  Ｓ，  Ｓｅｙｍｏｕｒ  ＡＭ，  Ｆｅｎｎｉｎｇ  Ａ，  Ｓｔｒａｃｈａｎ  Ａ，  Ｍａｒｇｏｌｉｎ  ＳＢ，  Ｔａｙｌｏｒ  ＳＭ，  ａｎｄ  Ｂｒｏｗｎ  Ｌ．  Ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｒｄｉａｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｂｙ  ｐｉｒｆｅｎｉｄｏｎｅ  ａｎｄ  ａｍｉｌｏｒｉｄｅ  ｉｎ  ＤＯＣＡ−ｓａｌｔ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ  ｒａｔｓ．Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００２；１３５（４）：９６１−８．
８．  Ｖａｎ  Ｅｒｐ  Ｃ，  Ｉｒｗｉｎ  ＮＧ，  ａｎｄ  Ｈｏｅｙ  ＡＪ．Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｉｒｆｅｎｉｄｏｎｅ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｃａｒｄｉａｃ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｄｘ  ｍｉｃｅ．Ｍｕｓｃｌｅ  Ｎｅｒｖｅ．２００６；３４（３）：３２７−３４．
９．  Ｍｉｒｉｃ  Ｇ，  Ｄａｌｌｅｍａｇｎｅ  Ｃ，  Ｅｎｄｒｅ  Ｚ，  Ｍａｒｇｏｌｉｎ  Ｓ，  Ｔａｙｌｏｒ  ＳＭ，  ａｎｄ  Ｂｒｏｗｎ  Ｌ．  Ｒｅｖｅｒｓａｌ  ｏｆ  ｃａｒｄｉａｃ  ａｎｄ  ｒｅｎａｌ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｂｙ  ｐｉｒｆｅｎｉｄｏｎｅ  ａｎｄ  ｓｐｉｒｏｎｏｌａｃｔｏｎｅ  ｉｎ  ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ−ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｒａｔｓ．Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００１；１３３（５）：６８７−９４．
１０．  Ｌｅｅ  ＫＷ，  Ｅｖｅｒｅｔｔ  ＴＨｔ，  Ｒａｈｍｕｔｕｌａ  Ｄ，  Ｇｕｅｒｒａ  ＪＭ，  Ｗｉｌｓｏｎ  Ｅ，  Ｄｉｎｇ  Ｃ，  ａｎｄ  Ｏｌｇｉｎ  ＪＥ．Ｐｉｒｆｅｎｉｄｏｎｅ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｖｕｌｎｅｒａｂｌｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｆｏｒ  ａｔｒｉａｌ  ｆｉｂｒｉｌｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｃａｎｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２００６；１１４（１６）：１７０３−１２．
１１．  Ｎｇｕｙｅｎ  ＤＴ，  Ｄｉｎｇ  Ｃ，  Ｗｉｌｓｏｎ  Ｅ，  Ｍａｒｃｕｓ  ＧＭ，  ａｎｄ  Ｏｌｇｉｎ  ＪＥ．Ｐｉｒｆｅｎｉｄｏｎｅ  ｍｉｔｉｇａｔｅｓ  ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ａｒｒｈｙｔｈｍｉａｓ．Ｈｅａｒｔ  Ｒｈｙｔｈｍ．２０１０；７（１０）：１４３８−４５．
１２．  Ｌｉ  Ｃ，  Ｈａｎ  Ｒ，  Ｋａｎｇ  Ｌ，  Ｗａｎｇ  Ｊ，  Ｇａｏ  Ｙ，  Ｌｉ  Ｙ，  Ｈｅ  Ｊ，  ａｎｄ  Ｔｉａｎ  Ｊ．  Ｐｉｒｆｅｎｉｄｏｎｅ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｔｈｅ  ｆｅｅｄｂａｃｋ  ｌｏｏｐ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＴ１Ｒ／ｐ３８  ＭＡＰＫ／ｒｅｎｉｎ−ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｘｉｓ  ｂｙ  ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｌｉｖｅｒ  Ｘ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｌｐｈａ  ｉｎ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃａｒｄｉａｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．２０１７；７（４０５２３．
１３．  Ｌａｖｉｎｅ  ＫＪ，  Ｅｐｅｌｍａｎ  Ｓ，  Ｕｃｈｉｄａ  Ｋ，  Ｗｅｂｅｒ  ＫＪ，  Ｎｉｃｈｏｌｓ  ＣＧ，  Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ  ＪＤ，  Ｏｒｎｉｔｚ  ＤＭ，  Ｒａｎｄｏｌｐｈ  ＧＪ，  ａｎｄ  Ｍａｎｎ  ＤＬ．Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｌｉｎｅａｇｅｓ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ  ｔｏ  ｄｉｓｐａｒａｔｅ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｏｆ  ｃａｒｄｉａｃ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ａｎｄ  ａｄｕｌｔ  ｈｅａｒｔ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２０１４；１１１（１６０２９−３４．
１４．  Ｅｐｅｌｍａｎ  Ｓ，  Ｌａｖｉｎｅ  ＫＪ，  Ｂｅａｕｄｉｎ  ＡＥ，  Ｓｏｊｋａ  ＤＫ，  Ｃａｒｒｅｒｏ  ＪＡ，  Ｃａｌｄｅｒｏｎ  Ｂ，  Ｂｒｉｊａ  Ｔ，  Ｇａｕｔｉｅｒ  ＥＬ，  Ｉｖａｎｏｖ  Ｓ，  Ｓａｔｐａｔｈｙ  ＡＴ，  ｅｔ  ａｌ．Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｄ  ａｄｕｌｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｒｅｓｉｄｅｎｔ  ｃａｒｄｉａｃ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ａｒｅ  ｍａｉｎｔａｉｎｅｄ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｔ  ｓｔｅａｄｙ  ｓｔａｔｅ  ａｎｄ  ｄｕｒｉｎｇ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２０１４；４０（１）：９１−１０４．
１５．  Ｌａｖｉｎｅ  ＫＪ，  Ｋｏｖａｃｓ  Ａ，  Ｗｅｉｎｈｅｉｍｅｒ  Ｃ，  ａｎｄ  Ｍａｎｎ  ＤＬ．Ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｓｃｈｅｍｉａ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｄｕｌｔ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｈｅａｒｔ．Ｊ  Ａｍ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃ．２０１３；２（５）：ｅ０００３４３．
１６．  Ｋａｎｔｏｒ  ＡＢ，  Ｓｔａｌｌ  ＡＭ，  Ａｄａｍｓ  Ｓ，  ａｎｄ  Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ  ＬＡ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｒｅｅ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅａｇｅｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  １９９２；８９（８）：３３２０−４．
１７．  Ｒａｈｍａｎ  ＺＳ．Ｉｍｐａｉｒｅｄ  ｃｌｅａｒａｎｃｅ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｇｅｒｍｉｎａｌ  ｃｅｎｔｅｒｓ：  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｌｏｓｓ  ｏｆ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ．２０１１；５１（２−３）：１２５−３３．
１８．  Ｚｈａｎｇ  Ｗ，  Ｌａｖｉｎｅ  ＫＪ，  Ｅｐｅｌｍａｎ  Ｓ，  Ｅｖａｎｓ  ＳＡ，  Ｗｅｉｎｈｅｉｍｅｒ  ＣＪ，  Ｂａｒｇｅｒ  ＰＭ，  ａｎｄ  Ｍａｎｎ  ＤＬ．Ｎｅｃｒｏｔｉｃ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｄａｍａｇｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｔｈａｔ  ｐｒｏｖｏｋｅ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｔｒｉｇｇｅｒ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｊ  Ａｍ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃ．２０１５；４（６）：ｅ００１９９３．
１９．  Ｘｕ  Ｈ，  Ｌｉｅｗ  ＬＮ，  Ｋｕｏ  ＩＣ，  Ｈｕａｎｇ  ＣＨ，  Ｇｏｈ  ＤＬ，  ａｎｄ  Ｃｈｕａ  ＫＹ．Ｔｈｅ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ  ｏｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２００８；１２５（２）：２１８−２８．
２０．  Ｂｏｎｎｅｒ  Ｆ，  Ｂｏｒｇ  Ｎ，  Ｂｕｒｇｈｏｆｆ  Ｓ，  ａｎｄ  Ｓｃｈｒａｄｅｒ  Ｊ．  Ｒｅｓｉｄｅｎｔ  ｃａｒｄｉａｃ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｃｔｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ＣＤ３９  ａｎｄ  ＣＤ７３  ａｆｔｅｒ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｉｎｊｕｒｙ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１２；７（４）：ｅ３４７３０．
２１．  Ｒａｍｏｓ  ＧＣ，  ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ  Ａ，  Ｎｕｎｅｓ−Ｓｉｌｖａ  Ｖ，  Ｗｅｉｒａｔｈｅｒ  Ｊ，  Ｐｅｔｅｒｓ  Ｌ，  Ｂｕｒｋａｒｄ  Ｍ，  Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ  Ｍ，  Ｐｉｎｎｅｃｋｅｒ  Ｊ，  Ａｂｅｓｓｅｒ  Ｍ，  Ｈｅｉｎｚｅ  ＫＧ，  ｅｔ  ａｌ．Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ａｇｉｎｇ  ａｓ  ａ  Ｔ−ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２０１７；１１４（１２）：Ｅ２４２０−Ｅ９．
２２．  Ｙａｎ  Ｘ，  Ａｎｚａｉ  Ａ，  Ｋａｔｓｕｍａｔａ  Ｙ，  Ｍａｔｓｕｈａｓｈｉ  Ｔ，  Ｉｔｏ  Ｋ，  Ｅｎｄｏ  Ｊ，  Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｔ，  Ｔａｋｅｓｈｉｍａ  Ａ，  Ｓｈｉｎｍｕｒａ  Ｋ，  Ｓｈｅｎ  Ｗ，  ｅｔ  ａｌ．Ｔｅｍｐｏｒａｌ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ｃａｒｄｉａｃ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｅｌｌ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．２０１３；６２（２４−３５．
２３．  Ｚｏｕｇｇａｒｉ  Ｙ，  Ａｉｔ−Ｏｕｆｅｌｌａ  Ｈ，  Ｂｏｎｎｉｎ  Ｐ，  Ｓｉｍｏｎ  Ｔ，  Ｓａｇｅ  ＡＰ，  Ｇｕｅｒｉｎ  Ｃ，  Ｖｉｌａｒ  Ｊ，  Ｃａｌｉｇｉｕｒｉ  Ｇ，  Ｔｓｉａｎｔｏｕｌａｓ  Ｄ，  Ｌａｕｒａｎｓ  Ｌ，  ｅｔ  ａｌ．Ｂ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｔｒｉｇｇｅｒ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｐａｉｒ  ｈｅａｒｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２０１３；１９（１０）：１２７３−８０．
２４．  Ｈｏｒｃｋｍａｎｓ  Ｍ，  Ｂｉａｎｃｈｉｎｉ  Ｍ，  Ｓａｎｔｏｖｉｔｏ  Ｄ，  Ｍｅｇｅｎｓ  ＲＴＡ，  Ｓｐｒｉｎｇａｅｌ  ＪＹ，  Ｎｅｇｒｉ  Ｉ，  Ｖａｃｃａ  Ｍ，  Ｄｉ  Ｅｕｓａｎｉｏ  Ｍ，  Ｍｏｓｃｈｅｔｔａ  Ａ，  Ｗｅｂｅｒ  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ．Ｐｅｒｉｃａｒｄｉａｌ  Ａｄｉｐｏｓｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  Ｇｒａｎｕｌｏｐｏｉｅｓｉｓ，  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｃａｒｄｉａｃ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ａｆｔｅｒ  Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  Ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２０１７．
２５．  Ｃｏｒｄｅｒｏ−Ｒｅｙｅｓ  ＡＭ，  Ｙｏｕｋｅｒ  ＫＡ，  Ｔｒｅｖｉｎｏ  ＡＲ，  Ｃｅｌｉｓ  Ｒ，  Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ＤＪ，  Ｆｌｏｒｅｓ−Ａｒｒｅｄｏｎｄｏ  ＪＨ，  Ｏｒｒｅｇｏ  ＣＭ，  Ｂｈｉｍａｒａｊ  Ａ，  Ｅｓｔｅｐ  ＪＤ，  ａｎｄ  Ｔｏｒｒｅ−Ａｍｉｏｎｅ  Ｇ．  Ｆｕｌｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ  Ｉｓ  Ｐａｒｔｌｙ  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｎ  Ｂ−Ｃｅｌｌｓ：  Ａ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ｔｈａｔ  Ｉｎｖｏｌｖｅｓ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ，  ａｎｄ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｊ  Ａｍ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃ．２０１６；５（１）．
２６．  Ｚｈａｎｇ  Ｍ，  Ｍｉｃｈａｅｌ  ＬＨ，  Ｇｒｏｓｊｅａｎ  ＳＡ，  Ｋｅｌｌｙ  ＲＡ，  Ｃａｒｒｏｌｌ  ＭＣ，  ａｎｄ  Ｅｎｔｍａｎ  ＭＬ．Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ＩｇＭ  ｉｎ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｓｃｈｅｍｉａ−ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｊｕｒｙ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．２００６；４１（１）：６２−７．
２７．  Ｓｈｅｎ  Ｐ，  ａｎｄ  Ｆｉｌｌａｔｒｅａｕ  Ｓ．  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ：  ａ  ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１５；１５（７）：４４１−５１．
２８．  Ｒｕｂｔｓｏｖａ  Ｋ，  Ｒｕｂｔｓｏｖ  ＡＶ，  Ｃａｎｃｒｏ  ＭＰ，  ａｎｄ  Ｍａｒｒａｃｋ  Ｐ．  Ａｇｅ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｂ  Ｃｅｌｌｓ：  Ａ  Ｔ−ｂｅｔ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｗｉｔｈ  Ｒｏｌｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９５（５）：１９３３−７．
２９．  Ｈｕａ  Ｚ，  ａｎｄ  Ｈｏｕ  Ｂ．  ＴＬＲ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１３；１０（２）：１０３−６．
３０．  Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｍ，  Ｓａｔｏ  Ｓ，  Ｈｅｍｍｉ  Ｈ，  Ｓａｎｊｏ  Ｈ，  Ｕｅｍａｔｓｕ  Ｓ，  Ｋａｉｓｈｏ  Ｔ，  Ｈｏｓｈｉｎｏ  Ｋ，  Ｔａｋｅｕｃｈｉ  Ｏ，  Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｍ，  Ｆｕｊｉｔａ  Ｔ，  ｅｔ  ａｌ．Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ＴＩＲＡＰ  ｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｃａｓｃａｄｅ  ｓｈａｒｅｄ  ｂｙ  ＴＬＲ２  ａｎｄ  ＴＬＲ４．Ｎａｔｕｒｅ．２００２；４２０（６９１３）：３２４−９．
３１．  Ｂｉｚａｒｇｉｔｙ  Ｐ，  Ｌｉｕ  Ｋ，  Ｗａｎｇ  Ｌ，  Ｈａｎｃｏｃｋ  ＷＷ，  ａｎｄ  Ｖｉｓｎｅｒ  ＧＡ．Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｐｉｒｆｅｎｉｄｏｎｅ  ｏｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｌｕｎｇ  ａｌｌｏｇｒａｆｔ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．２０１２；９４（２）：１１４−２２．
３２．  Ｍａｎｎ  ＤＬ．Ｉｎｎａｔｅ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｆａｉｌｉｎｇ  Ｈｅａｒｔ：  Ｔｈｅ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ  Ｒｅｖｉｓｉｔｅｄ．Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．２０１５；１１６（７）：１２５４−６８．
３３．  Ｚｏｕｇｇａｒｉ  Ｙ，  Ａｉｔ−Ｏｕｆｅｌｌａ  Ｈ，  Ｂｏｎｎｉｎ  Ｐ，  Ｓｉｍｏｎ  Ｔ，  Ｓａｇｅ  ＡＰ，  Ｇｕｅｒｉｎ  Ｃ，  Ｖｉｌａｒ  Ｊ，  Ｃａｌｉｇｉｕｒｉ  Ｇ，  Ｔｓｉａｎｔｏｕｌａｓ  Ｄ，  Ｌａｕｒａｎｓ  Ｌ，  ｅｔ  ａｌ．Ｂ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｔｒｉｇｇｅｒ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｐａｉｒ  ｈｅａｒｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２０１３；１９（１０）：１２７３−８０．
３４．  Ｎｏｓｓｕｌｉ  ＴＯ，  Ｌａｋｓｈｍｉｎａｒａｙａｎａｎ  Ｖ，  Ｂａｕｍｇａｒｔｅｎ  Ｇ，  Ｔａｆｆｅｔ  ＧＥ，  Ｂａｌｌａｎｔｙｎｅ  ＣＭ，  Ｍｉｃｈａｅｌ  ＬＨ，  ａｎｄ  Ｅｎｔｍａｎ  ＭＬ．Ａ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｓｃｈｅｍｉａ−ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ：  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｉｎ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｔｕｄｉｅｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０００；２７８（４）：Ｈ１０４９−Ｈ５５．
３５．  Ｂｕｒｃｈｆｉｅｌｄ  ＪＳ，  Ｄｏｎｇ  ＪＷ，  Ｓａｋａｔａ  Ｙ，  Ｇａｏ  Ｆ，  Ｔｚｅｎｇ  ＨＰ，  Ｔｏｐｋａｒａ  ＶＫ，  Ｅｎｔｍａｎ  ＭＬ，  Ｓｉｖａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ  Ｎ，  ａｎｄ  Ｍａｎｎ  ＤＬ．Ｔｈｅ  Ｃｙｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ  ａｒｅ  Ｃｏｎｖｅｙｅｄ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｆａｃｔｏｒ  ２  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｈｅａｒｔ．Ｃｉｒｃ  Ｈｅａｒｔ  Ｆａｉｌ．２０１０；３（１５７−６４．
３６．  Ｔｚｅｎｇ  ＨＰ，  Ｅｖａｎｓ  Ｓ，  Ｇａｏ  Ｆ，  Ｃｈａｍｂｅｒｓ  Ｋ，  Ｔｏｐｋａｒａ  ＶＫ，  Ｓｉｖａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ  Ｎ，  Ｂａｒｇｅｒ  ＰＭ，  ａｎｄ  Ｍａｎｎ  ＤＬ．Ｄｙｓｆｅｒｌｉｎ  Ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｔｈｅ  Ｃｙｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ＴＲＡＦ２  Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  Ｉｓｃｈｅｍｉａ  Ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  Ｉｎｊｕｒｙ．Ｊ  Ａｍ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃ．２０１４；３（ｅ０００６６２．
３７．  Ｓｃｈａｅｆｅｒ  ＣＪ，  Ｒｕｈｒｍｕｎｄ  ＤＷ，  Ｐａｎ  Ｌ，  Ｓｅｉｗｅｒｔ  ＳＤ，  ａｎｄ  Ｋｏｓｓｅｎ  Ｋ．  Ａｎｔｉｆｉｂｒｏｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｉｒｆｅｎｉｄｏｎｅ  ｉｎ  ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌｓ．Ｅｕｒ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｒｅｖ．  ２０１１；２０（１２０）：８５−９７．
３８．  Ｌａｖｉｎｅ  ＫＪ，  Ｓｉｎｔｅｋ  Ｍ，  Ｎｏｖａｋ  Ｅ，  Ｅｗａｌｄ  Ｇ，  Ｇｅｌｔｍａｎ  Ｅ，  Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓ，  Ｐｆｅｉｆｅｒ  Ｊ，  ａｎｄ  Ｍａｎｎ  ＤＬ．Ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｃｏｌｌａｔｅｒａｌｓ  ｐｒｅｄｉｃｔ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｎｄ  ａｌｌｏｇｒａｆｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｌｌｏｇｒａｆｔ  ｖａｓｃｕｌｏｐａｔｈｙ．Ｃｉｒｃ  Ｈｅａｒｔ  Ｆａｉｌ．２０１３；６（４）：７７３−８４．
３９．  Ｋａｎｎｏ  Ｓ，  Ｌｅｒｎｅｒ  ＤＬ，  Ｓｃｈｕｅｓｓｌｅｒ  ＲＢ，  Ｂｅｔｓｕｙａｋｕ  Ｔ，  Ｙａｍａｄａ  ＫＡ，  Ｓａｆｆｉｔｚ  ＪＥ，  ａｎｄ  Ｋｏｖａｃｓ  Ａ．  Ｅｃｈｏｃａｒｄｉｏｇｒａｐｈｉｃ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｅｃｈｏｃａｒｄｉｏｇｒ．２００２；１５（６）：６０１−９．
４０．  Ｍｉｓｈａｒｉｎ  ＡＶ，  Ｓａｂｅｒ  Ｒ，  ａｎｄ  Ｐｅｒｌｍａｎ  Ｈ．  Ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ  ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｉｏｇｌｙｃｏｌｌａｔｅ−ｅｌｉｃｉｔｅｄ  ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｓｋｅｗｓ  ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｅａｄｏｕｔｓ  ｏｆ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｓｓａｙｓ．Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ．２０１２；９２（２）：３２５−３１．
４１．  Ｔｒａｐｎｅｌｌ  Ｃ，  Ｐａｃｈｔｅｒ  Ｌ，  ａｎｄ  Ｓａｌｚｂｅｒｇ  ＳＬ．ＴｏｐＨａｔ：  ｄｉｓｃｏｖｅｒｉｎｇ  ｓｐｌｉｃｅ  ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２００９；２５（９）：１１０５−１１．
４２．  Ａｎｄｅｒｓ  Ｓ，  Ｐｙｌ  ＰＴ，  ａｎｄ  Ｈｕｂｅｒ  Ｗ．  ＨＴＳｅｑ−−ａ  Ｐｙｔｈｏｎ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｔｏ  ｗｏｒｋ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｄａｔａ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．３１（２）：１６６−９．
４３．  Ｚｈｏｕ  Ｘ，  Ｌｉｎｄｓａｙ  Ｈ，  ａｎｄ  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ＭＤ．Ｒｏｂｕｓｔｌｙ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ＲＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｄａｔａ  ｕｓｉｎｇ  ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｗｅｉｇｈｔｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４２（１１）：ｅ９１．
４４．  Ｈｕａｎｇ  ｄａ  Ｗ，  Ｓｈｅｒｍａｎ  ＢＴ，  ａｎｄ  Ｌｅｍｐｉｃｋｉ  ＲＡ．Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｌａｒｇｅ  ｇｅｎｅ  ｌｉｓｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ＤＡＶＩＤ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ．Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．２００９；４（１）：４４−５７．
【図１Ａ】
2020530005.tif 000029
【図１Ｂ】
2020530005.tif 000030
【図１Ｃ】
2020530005.tif 000031
【図１Ｄ】
2020530005.tif 000032
【図２−１】
2020530005.tif 000033
【図２−２】
2020530005.tif 000034
【図２−３】
2020530005.tif 000035
【図２−４】
2020530005.tif 000036
【図３−１】
2020530005.tif 000037
【図３−２】
2020530005.tif 000038
【図３−３】
2020530005.tif 000039
【図３−４】
2020530005.tif 000040
【図３−５】
2020530005.tif 000041
【図４−１】
2020530005.tif 000042
【図４−２】
2020530005.tif 000043
【図４−３】
2020530005.tif 000044
【図４−４】
2020530005.tif 000045
【図５−１】
2020530005.tif 000046
【図５−２】
2020530005.tif 000047
【図５−３】
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【図５−４】
2020530005.tif 000049
【図６−１】
2020530005.tif 000050
【図６−２】
2020530005.tif 000051
【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図６−６】
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【図７Ａ】
2020530005.tif 000056
【図７Ｂ】
2020530005.tif 000057
【図８Ａ】
2020530005.tif 000058
【図８Ｂ】
2020530005.tif 000059
【図９Ａ】
2020530005.tif 000060
【図９Ｂ】
2020530005.tif 000061
【図１０−１】
2020530005.tif 000062
【図１０−２】
2020530005.tif 000063
【図１０−３】
2020530005.tif 000064
【図１０−４】
2020530005.tif 000065
【図１０−５】
2020530005.tif 000066
【図１０−６】
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【図１１−１】
2020530005.tif 000068
【図１１−２】
2020530005.tif 000069
【図１１−３】
2020530005.tif 000070
【図１２−１】
2020530005.tif 000071
【図１２−２】
2020530005.tif 000072
【図１２−３】
2020530005.tif 000073
【図１３−１】
2020530005.tif 000074
【図１３−２】
2020530005.tif 000075
【図１４Ａ】
2020530005.tif 000076
【図１４Ｂ】
2020530005.tif 000077
【図１４Ｃ】
2020530005.tif 000078
【図１４Ｄ】
2020530005.tif 000079
【図１５】
2020530005.tif 000080
【図１６−１】
2020530005.tif 000081
【図１６−２】
2020530005.tif 000082
【図１６−３】
2020530005.tif 000083
【図１６−４】
2020530005.tif 000084
【図１６−５】
2020530005.tif 000085
【図１６−６】
2020530005.tif 000086
【図１６−７】
2020530005.tif 000087
【図１６−８】
2020530005.tif 000088
【図１６−９】
2020530005.tif 000089
【国際調査報告】
2020530005.tif 000090
2020530005.tif 000091