(57)【要約】  本発明は、とりわけ、i)1つ以上のコンパニオンアニマルのIGH V領域遺伝子、1つ以上のコンパニオンアニマルのD領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのJ領域遺伝子と、ii)必要に応じて、1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLカッパV領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLカッパJ領域遺伝子;並びに/又は1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLラムダV領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLラムダJ領域遺伝子とを含むゲノムを有するげっ歯動物又はげっ歯動物細胞であって、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞が、コンパニオンアニマルの可変領域遺伝子を発現して抗体鎖を形成することができ、コンパニオンアニマル種がげっ歯動物ではない、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
i)1つ以上のコンパニオンアニマルのIGH V領域遺伝子、1つ以上のコンパニオンアニマルのD領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのJ領域遺伝子を含み、
ii)1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLカッパV領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLカッパJ領域遺伝子;並びに/又は1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLラムダV領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLラムダJ領域遺伝子を含んでもよい
ゲノムを有するげっ歯動物又はげっ歯動物細胞であって、
げっ歯動物又はげっ歯動物細胞が、コンパニオンアニマルの可変領域遺伝子を発現して抗体鎖を形成することができ、
コンパニオンアニマル種がげっ歯動物ではない、
げっ歯動物又はげっ歯動物細胞。
【請求項２】
i)1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLカッパV領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLカッパJ領域遺伝子;並びに/又は1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLラムダV領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLラムダJ領域遺伝子を含み、
ii)1つ以上のコンパニオンアニマルのIGH V領域遺伝子、1つ以上のコンパニオンアニマル又は宿主のD領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマル又は宿主のJ領域遺伝子を含んでもよい
ゲノムを有するげっ歯動物又はげっ歯動物細胞であって、
げっ歯動物又はげっ歯動物細胞が、コンパニオンアニマルの可変領域遺伝子を発現して抗体鎖を形成することができ、
コンパニオンアニマル種がげっ歯動物ではない、
げっ歯動物又はげっ歯動物細胞。
【請求項３】
挿入されたコンパニオンアニマルのV、D、又はJ領域遺伝子の1つ以上が、同一のコンパニオンアニマル由来の制御配列を伴う、請求項1又は2に記載のげっ歯動物又はげっ歯動物細胞。
【請求項４】
げっ歯動物のゲノムが、重鎖と少なくとも1つの軽鎖の両方に由来するコンパニオンアニマルの遺伝子を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載のげっ歯動物又はげっ歯動物細胞。
【請求項５】
少なくとも4、5、10、15、20、30、40、50、60、70、又は少なくとも80個のコンパニオンアニマルのIGH V領域遺伝子を含み、V領域遺伝子がイヌ科の動物のものであってもよい、請求項1〜4のいずれか一項に記載のげっ歯動物又はげっ歯動物細胞。
【請求項６】
少なくとも4、5、10、15、16、17、18、又は19個のコンパニオンアニマルのIGLカッパV領域遺伝子を含み、V領域遺伝子がイヌ科の動物のものであってもよい、請求項1〜5のいずれか一項に記載のげっ歯動物又はげっ歯動物細胞。
【請求項７】
少なくとも5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、又は少なくとも160個のコンパニオンアニマルのIGLラムダV領域遺伝子を含み、V領域遺伝子がイヌ科の動物のものであってもよい、請求項1〜6のいずれか一項に記載のげっ歯動物又はげっ歯動物細胞。
【請求項８】
コンパニオンアニマルの遺伝子が、げっ歯動物の定常領域のゲノム上流に、好適には挿入されるコンパニオンアニマル重鎖可変領域遺伝子については重鎖定常領域の上流、及び好適には挿入されるコンパニオンアニマル軽鎖可変領域遺伝子については軽鎖定常領域の上流に位置し、これにより、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞は、挿入された可変領域遺伝子と宿主の定常領域との発現により生じるキメラ抗体鎖を生成できる、請求項1〜7のいずれか一項に記載のげっ歯動物又はげっ歯動物細胞。
【請求項９】
コンパニオンアニマルの遺伝子が、同一のコンパニオンアニマル由来の定常領域とともに機能的配置でゲノム中に位置し、これによりげっ歯動物が、挿入されたコンパニオンアニマルのVDJ又はVJ領域遺伝子と、コンパニオンアニマルの定常領域との発現により生じる抗体鎖を産生することができ、コンパニオンアニマル遺伝子が、同一のコンパニオンアニマルに由来するラムダ定常領域とともに機能的配置にあるラムダ軽鎖V及びJ遺伝子であってもよい、ゲノムを有する、請求項1〜7のいずれか一項に記載のげっ歯動物又はげっ歯動物細胞。
【請求項１０】
げっ歯動物細胞のカッパ座位、例えばげっ歯動物のカッパ定常領域の下流に位置する、1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLラムダV領域遺伝子、1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLラムダJ領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルラムダ定常領域遺伝子を含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載のげっ歯動物又はげっ歯動物細胞。
【請求項１１】
イヌ科の動物のカッパ可変領域遺伝子を含み、げっ歯動物のゲノム中のイヌ科の動物のカッパ可変領域遺伝子は全て、可変領域遺伝子がともに発現される定常領域の上流に位置し、宿主のカッパ定常領域の上流に位置してもよい、請求項1〜10のいずれか一項に記載のげっ歯動物又はげっ歯動物細胞。
【請求項１２】
コンパニオンの遺伝子セグメントの全てがCanFam 3.1のイヌ科の動物の参照対立遺伝子に対応するか、又はコンパニオンの遺伝子セグメントが以下の遺伝子セグメントIGKV2-S13、IGLV 1-57、IGLV 1-68、IGLV 1-72、IGLV 1-88、IGLV 1-96、IGLV 8-60、IGLV 8-90、及びIGLV 8-120の1つ以上に由来する非参照対立遺伝子を含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載のげっ歯動物又はげっ歯動物細胞。
【請求項１３】
げっ歯動物がマウスであり、コンパニオンアニマルがイヌ、又はネコ、又はウマであり、好ましくはイヌである、請求項1〜12のいずれか一項に記載のげっ歯動物又はげっ歯動物細胞。
【請求項１４】
請求項1〜13のいずれか一項に記載のげっ歯動物又はげっ歯動物細胞を産生する方法であって、げっ歯動物細胞ゲノムに1つ以上のコンパニオンアニマルのIGH V領域遺伝子、1つ以上のコンパニオンアニマルのIGH D領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのIGH J領域遺伝子を挿入する工程を含み、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞が、定常領域との組合せでコンパニオンアニマルの可変領域遺伝子を発現し、抗体鎖を形成できる、方法。
【請求項１５】
げっ歯動物細胞ゲノムに1つ以上のコンパニオンアニマルのIGL V領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのIGL領域J遺伝子を挿入する工程を含み、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞が、定常領域との組合せでコンパニオンアニマルの可変領域遺伝子を発現し、抗体鎖を形成できる、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
所望の抗原に特異的な抗体鎖を産生する方法であって、請求項1〜13のいずれか一項に記載のげっ歯動物を所望の抗原で免疫する工程と、抗体鎖を単独で若しくは完全抗体の一部として回収するか、又は抗体鎖を単独で若しくは完全抗体の一部として産生する細胞を回収する工程とを含む、方法。
【請求項１７】
所望の抗原に特異的であり、単一種のコンパニオンアニマルに由来する抗体鎖又は抗体を産生する方法であって、コンパニオンの遺伝子を含む請求項1〜13のいずれか一項に記載のげっ歯動物を免疫する工程と、次いで好適には抗体をコードする核酸を遺伝子操作することにより、げっ歯動物の抗体鎖の定常領域を同一のコンパニオン動物由来のコンパニオン動物の定常領域で置き換える工程とを含む、方法。
【請求項１８】
コンパニオンアニマルの可変領域を有する抗体鎖又はその一部を産生する方法であって、抗体鎖又はその一部をコードするDNAを細胞内で発現させる工程を含み、
抗体鎖の可変領域をコードするDNAの配列は、請求項1から13のいずれか一項に記載のげっ歯動物を抗原で免疫して抗体鎖を産生することから得られるか、又はそれにより得ることができ、
方法が、続いて次の:
(i)抗原受容体鎖を精製及び/又は単離する工程と、
(ii)必要に応じて、次いで、抗原受容体鎖をコンパニオンアニマルへの投与に適した薬学的に許容される製剤に製剤化する工程と
を含んでもよい、方法。
【請求項１９】
請求項1〜13のいずれか一項に記載のげっ歯動物若しくはげっ歯動物細胞から、又は請求項16〜18のいずれか一項に記載の方法から得られたか、又は得ることができる抗体若しくは抗体鎖、又はその一部、又は抗体鎖若しくはその一部をコードするDNA。
【請求項２０】
それを必要とするコンパニオンアニマルの疾患の治療又は予防における使用のための、請求項1〜13のいずれか一項に記載のげっ歯動物又は細胞から得られるか、又は得ることができる抗体若しくは抗体鎖、又はその一部。
【請求項２１】
コンパニオンアニマルの治療の方法であって、請求項1〜13のいずれか一項に記載のげっ歯動物若しくは細胞から、又は請求項16〜18のいずれか一項に記載の方法から得られるか、又は得ることができる抗体若しくは抗体鎖、又はその一部を、それを必要とするコンパニオンアニマルに送達する工程を含む、方法。
【請求項２２】
げっ歯動物又はげっ歯動物細胞において、全体的に又は部分的に、内因性免疫グロブリン可変領域遺伝子の座位を相同又はオルソロガスなコンパニオンアニマルの遺伝子の座位及び制御配列に置き換える方法であって、
i)相同又はオルソロガスなコンパニオンアニマルの遺伝子の座位及び制御配列を全体的に又は部分的に含むクローニングされたゲノム断片又は合成配列を取得する工程と、
ii)相同組換えを使用して、(i)のクローニングされたゲノム断片を遺伝子改変し、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞で使用するための大型のターゲティングベクターを作製する工程と、
iii)(ii)のベクターをげっ歯動物又はげっ歯動物細胞に導入して、内因性免疫グロブリン可変遺伝子の座位を全体的に又は部分的に置き換える工程と
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、とりわけ、コンパニオンアニマルの外因性DNAを含むように遺伝子操作されたげっ歯動物及び細胞、医学及び疾患の研究におけるそれらの使用、げっ歯動物及び細胞の産生方法、並びにそのような動物から産生される抗体及び抗体鎖並びにその誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトDNAのげっ歯動物への挿入は、例えば、Murphy等、111巻、14号、5153〜5158頁、doi:10.1073/pnas.1324022111;MacDonald等、111巻、14号、5147〜5152頁、doi:10.1073/pnas.1323896111;及びLee等、Nature Biotechnology、32巻、356〜363頁、発行年:2014DOI:, doi:10.1038/nbt.2825に開示されている。このアプローチは、ヒトの治療用途のための抗体製品を作製するために設計されている。しかしながら、コンパニオンアニマル等の他の種での使用に適した抗体を生成するためのげっ歯動物モデルは開発されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】US2017306352
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Murphy等、111巻、14号、5153〜5158頁、doi:10.1073/pnas.1324022111
【非特許文献２】MacDonald等、111巻、14号、5147〜5152頁、doi:10.1073/pnas.1323896111
【非特許文献３】Lee等、Nature Biotechnology、32巻、356〜363頁、発行年:2014DOI:, doi:10.1038/nbt.2825
【非特許文献４】Harlow, E.及びLane, D.、1998、第5版、「Antibodies: A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Lab. Press、Plainview、NY
【非特許文献５】Pasqualini及びArap、Proceedings of the National Academy of Sciences(2004)101:257〜259頁
【非特許文献６】Sambrook, J及びRussell, D.(2001、第3版)「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」(Cold Spring Harbor Lab. Press、Plainview、NY)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、そのようなげっ歯動物、細胞、抗体、及びそれらから産生されるその部分、例えばコンパニオンアニマルで使用するためのその後に改変された抗体、並びにそのようなげっ歯動物、細胞、抗体、及び抗体鎖の作製方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、以下に関する。
i)1つ以上のコンパニオンアニマルのIGH V領域遺伝子、1つ以上のコンパニオンアニマルのIGH D領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのIGH J領域遺伝子と、
ii)必要に応じて、1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLカッパV領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLカッパJ領域遺伝子;並びに/又は1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLラムダV領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLラムダJ領域遺伝子と
を含むゲノムを有するげっ歯動物又はげっ歯動物細胞であって、
げっ歯動物又はげっ歯動物細胞が、コンパニオンアニマルの可変領域遺伝子を発現して抗体鎖を形成することができ、
コンパニオンアニマル種がげっ歯動物ではない、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞。
【０００７】
i)1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLカッパV領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLカッパJ領域遺伝子;並びに/又は1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLラムダV領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLラムダJ領域遺伝子と、
ii)必要に応じて、1つ以上のコンパニオンアニマルのIGH V領域遺伝子、1つ以上のコンパニオンアニマル又は宿主のIGH D領域遺伝子、及び1以上のコンパニオンアニマル又は宿主のIGH J領域遺伝子と
を含むゲノムを有するげっ歯動物又はげっ歯動物細胞であって、
げっ歯動物又はげっ歯動物細胞が、コンパニオンアニマルの可変領域遺伝子を発現して抗体鎖を形成することができ、
コンパニオンアニマル種がげっ歯動物ではない、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞。
【０００８】
げっ歯動物又はげっ歯動物細胞を産生する方法であって、げっ歯動物細胞ゲノムに対し、
i)1つ以上のコンパニオンアニマルのIGH V領域遺伝子、1つ以上のコンパニオンアニマルのIGH D領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのIGH J領域遺伝子、並びに/又は
ii)1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLカッパV領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLカッパJ領域遺伝子、並びに/又は
1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLラムダV領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLラムダJ領域遺伝子
のいずれかを挿入する工程を含み、
げっ歯動物又はげっ歯動物細胞が、コンパニオンアニマルの遺伝子を発現して、げっ歯動物又はコンパニオンアニマルの定常領域との組合せで抗体鎖を形成することができる、方法。
【０００９】
所望の抗原に特異的な抗体鎖又は抗体を産生する方法であって、本明細書に開示されるげっ歯動物を所望の抗原で免疫する工程と、抗体鎖を単独で若しくは完全抗体の一部として回収するか、又は抗体鎖を単独で若しくは完全抗体の一部として産生する細胞を回収する工程とを含む方法。
【００１０】
所望の抗原に特異的であり、単一種のコンパニオンアニマルに由来する抗体鎖又は抗体を産生する方法であって、本明細書に開示されるコンパニオンアニマルの遺伝子を含むげっ歯動物を免疫する工程と、次いで抗体鎖又は抗体をコードする核酸を適切に遺伝子操作することにより、げっ歯動物の抗体鎖の定常領域を同一のコンパニオン動物由来のコンパニオン動物の定常領域で置き換える工程とを含む方法。
【００１１】
抗体、又はその一部を作製する方法であって、
(i)本発明に従って得られた抗体若しくはその一部をコードする核酸、又は
(ii)本発明に従って得られた抗体若しくはその一部をコードする核酸を発現させて抗体を産生させることができる配列情報
を提供する工程を含む方法。
【００１２】
コンパニオンアニマルの可変領域を有する抗体鎖又はその一部を産生する方法であって、抗体鎖又はその一部をコードする核酸を細胞内で発現させる工程を含み、
抗体鎖の可変領域をコードするDNAの配列は、抗体鎖が産生されるように本発明のげっ歯動物を抗原で免疫することにより得られるか、又は得ることができ、
必要に応じて、方法が、次の:
抗原受容体鎖を精製及び/又は単離する工程と、
必要に応じて、次いで、可変領域として、コンパニオンアニマル、好ましくは同一のコンパニオンアニマルへの、又はそれを必要とするヒト若しくは他の哺乳動物への投与に適した薬学的に許容される製剤に抗原受容体鎖を製剤化する工程と
を含む、方法。
【００１３】
本発明によるげっ歯動物又は細胞から得られるか又は得ることができる抗体若しくは抗体鎖、又はその一部。
【００１４】
コンパニオンアニマルの治療における使用のための、本発明により得られるか又は得ることができる抗体若しくは抗体鎖、又はその一部。
【００１５】
コンパニオンアニマルの治療の方法であって、抗体若しくは抗体鎖又はその一部を、それを必要とするコンパニオンアニマルに送達する工程を含み、抗体若しくは抗体鎖又はその一部が、完全にコンパニオンアニマル抗体となるように改変されている、方法。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】座位にまたがる細菌人工染色体で覆われている、イヌ科の動物の免疫グロブリン重鎖座位を示す図である。イヌ科の動物及びネコ科の動物の遺伝子の群が公的に入手可能なBACに位置することと、次いで、そのような遺伝子が本発明に従ってげっ歯動物座位に組み込まれ得ることの両方を更に説明するためにBACが示される。
【図１Ｂ】図１Ａの続きを示す。
【図２Ａ】座位にまたがる細菌人工染色体で覆われている、イヌ科の動物の免疫グロブリンカッパ座位を示す図である。イヌ科の動物及びネコ科の動物の遺伝子の群が公的に入手可能なBACに位置することと、次いで、そのような遺伝子が本発明に従ってげっ歯動物座位に組み込まれ得ることの両方を更に説明するためにBACが示される。
【図２Ｂ】図２Ａの続きを示す。
【図２Ｃ】図２Ｂの続きを示す。
【図３】座位にまたがる細菌人工染色体で覆われている、イヌ科の動物の免疫グロブリンラムダ座位を示す図である。イヌ科の動物及びネコ科の動物の遺伝子の群が公的に入手可能なBACに位置することと、次いで、そのような遺伝子が本発明に従ってげっ歯動物座位に組み込まれ得ることの両方を更に説明するためにBACが示される。
【図４】座位にまたがる細菌人工染色体で覆われている、ネコ科の動物の免疫グロブリン重鎖座位を示す図である。イヌ科の動物及びネコ科の動物の遺伝子の群が公的に入手可能なBACに位置することと、次いで、そのような遺伝子が本発明に従ってげっ歯動物座位に組み込まれ得ることの両方を更に説明するためにBACが示される。
【図５】座位にまたがる細菌人工染色体で覆われている、ネコ科の動物の免疫グロブリンカッパ座位を示す図である。イヌ科の動物及びネコ科の動物の遺伝子の群が公的に入手可能なBACに位置することと、次いで、そのような遺伝子が本発明に従ってげっ歯動物座位に組み込まれ得ることの両方を更に説明するためにBACが示される。
【図６】座位にまたがる細菌人工染色体で覆われている、ネコ科の動物の免疫グロブリンラムダ座位を示す図である。イヌ科の動物及びネコ科の動物の遺伝子の群が公的に入手可能なBACに位置することと、次いで、そのような遺伝子が本発明に従ってげっ歯動物座位に組み込まれ得ることの両方を更に説明するためにBACが示される。
【図７】対立遺伝子の変化を示す図である。非参照V遺伝子対立遺伝子の存在量は、3つのクラスに基づいて品種ごとにプロットされる。参照対立遺伝子が存在しない場合に機能していた対立遺伝子、並びに参照が偽遺伝子であるORFであった対立遺伝子は、「獲得(gain)」として分類される。参照対立遺伝子が存在しない偽遺伝子であった対立遺伝子、並びに機能的でORFになった対立遺伝子は、「喪失(loss)」として分類される。機能に変化のない対立遺伝子は「なし(None)」に分類される。黒い十字線は、各変化タイプの期待値を表す。
【図８】イヌ科の動物の免疫グロブリンカッパ座位の自己アライメントを示す図である。緑色のボックス(A)は、自身に対してアライメントされた上流V遺伝子を表す。赤色のボックス(C)は、自身に対してアライメントされた下流V遺伝子を表す。青色のボックス(B)は、上流V遺伝子と下流V遺伝子のアライメントを表す。
【図９】イヌ科の動物とヒトの免疫グロブリン座位のアライメントを示す図である。(A)完全な座位。(B)(A)の赤色のボックスに対応するアライメントの増幅されたセクション。
【図１０】マウスIGH座位へのイヌ科の動物のBAC 1挿入を示す図である。
【図１１】マウスIGHについての欠失部位を示す図である。
【図１２】マウスIGHの欠失の結果を示す図である。
【図１３】マウスIGLラムダ座位へのイヌ科の動物のBAC 1挿入を示す図である。
【図１４】マウスIGKについての欠失部位を示す図である。
【図１５】キメラ重鎖座位のPCR解析により確認されたキメラ転写産物の発現を示す図である。
【図１６】強い生殖系列イヌ科の動物-ヒトIGの相同性を示す図であり、TCR相同性はあまり保存されていない。
【図１７】生殖系列IG Vの相同性比較は、イヌとネコの間の強い相関を示すことを示す図である。
【図１８】BAC組換えプロセスを示す図である。A:改変されていない5'(上)と3'(下)の改変ベクターで、線状化部位が赤で示されている。B:BAC相同性アームを備えた線状化されたベクター、ギブソンアセンブリーの準備ができている。C:ベクター断片を放出する消化の準備ができた組み立てられたベクター。消化部位が赤で示されている。D:組換えの準備ができた精製ベクター断片。E:組換えは、断片と改変されていないBACの間の破線に沿って行われる。F:S-RMCEの準備ができた組換えされたBAC。
【図１９】S-RMCEプロセスとスクリーニングを示す図である。A:組換えされたBACは、Creリコンビナーゼの作用によりランディングパッドに挿入される。B:プライマー対P1+P2及びP3+P4を使用して、成功したBAC挿入をスクリーニングできる。C: PB-aseの作用による3'改変DNAの切除(切除点は破線で示される)。プライマー対P5+P6で切除の成功をスクリーニングできる。
【図２０】Ky9マウスV0.5のキメラIGH及びIGLの座位を示す図である
【図２１】Ky9マウスV0.5は非常に多様な抗体レパートリーを生成することを示す図である。
【図２２】健康な犬と比較したKy9 V0.5でのクロノタイプの豊富さを示す図である。
【図２３】ベースライン(健康なイヌ)に対するKy9 V0.5でのIGHD及びIGHJの使用を示す図である。
【図２４】Ky9 V0.5でのIGLJの使用を示す図である。
【図２５】Ky9 V0.5マウスで見られるN及びPヌクレオチドの付加を示す図である。
【図２６】領域ごとの変異率は、Ky9 V0.5マウスでの体細胞超変異の証拠を示すことを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、
i)1つ以上のコンパニオンアニマルのIGH V領域遺伝子、1つ以上のコンパニオンアニマルのIGH D領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのIGH J領域遺伝子と、
ii)必要に応じて、1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLカッパV領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLカッパJ領域遺伝子;並びに/又は1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLラムダV領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLラムダJ領域遺伝子と
を含むゲノムを有するげっ歯動物又はげっ歯動物細胞であって、
げっ歯動物又はげっ歯動物細胞が、コンパニオンアニマルの可変領域遺伝子を発現して、抗体の定常領域との組合せで抗体鎖を形成することができ、
コンパニオンアニマル種がげっ歯動物ではない、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞に関する。
【００１８】
本発明は、以下にも関する。
i)1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLカッパV領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLカッパJ領域遺伝子;並びに/又は1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLラムダV領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLラムダJ領域遺伝子と、
ii)必要に応じて、1つ以上のコンパニオンアニマルのIGH V領域遺伝子、1つ以上のコンパニオンアニマルのIGH D領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのIGH J領域遺伝子と
を含むゲノムを有するげっ歯動物又はげっ歯動物細胞であって、
げっ歯動物又はげっ歯動物細胞が、コンパニオンアニマルの可変領域遺伝子を発現して、抗体の定常領域との組合せで抗体鎖を形成することができ、
コンパニオンアニマル種がげっ歯動物ではない、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞。
【００１９】
例示的な例として、本発明に拘束されず、イヌ由来の免疫グロブリン重(IGH)鎖可変(V)領域遺伝子、IGH D領域遺伝子、及びIGH J領域遺伝子のマウスへの挿入は、定常領域との組合せで、マウスにおけるイヌ科の動物のDNAの発現に由来する可変抗体領域を含む抗体重鎖の産生を可能にする。定常領域は、げっ歯動物免疫グロブリン(IG)定常領域であってもよく、結果として、イヌ科の動物の可変領域とげっ歯動物の定常領域を有するキメラ重鎖が生成される。そのようなキメラ抗体鎖の可変領域に関する情報、又はそれを含む核酸は、例えばイヌでの治療的使用のために、完全なイヌ科の動物の抗体を生成するために使用され得る。イヌ科の動物のDNAを含むげっ歯動物は、疾患を理解し、医薬を試験するための動物モデルとしても役立ち得る。
【００２０】
マウスの全てのヌクレオチド座標は、別段の定めがない限り、マウスの2011年12月GRCm38/mm10アセンブリ(アセンブリ受託GCA_000001635.2)に対応するものである。
【００２１】
疑念を避けるため、マウスゲノムで参照される挿入点は、Lee等、Nature Biotechnology、Nature Biotechnology 32、356〜363頁(2014)で詳述されている挿入点と同一である。
【００２２】
イヌのゲノムビルドはCanFam3.1(アセンブリ受託-GCA_000002285.2)であり、2011年9月に作成され、最後に2016年5月に更新された。
【００２３】
ネコのゲノムビルドは、2014年11月に作成されたFelisCatus8.0(アセンブリ受託-GCA_000181335.3)である。
【００２４】
本発明のげっ歯動物は、好ましくはマウス又はラットであり、好ましくはマウスである。
【００２５】
本発明のコンパニオンアニマルは、イヌ、ネコ、ウマ、トリ、ウサギ、ヤギ、爬虫類、魚類、及び両生類から適切に選択される。イヌは、本発明の好ましいコンパニオンアニマルである。ネコは、本発明の好ましいコンパニオンアニマルである。ウマは、本発明の好ましいコンパニオンアニマルである。疑念を避けるため、ヒトはコンパニオンアニマルではない。
【００２６】
一態様では、げっ歯動物はマウスであり、コンパニオンアニマルはイヌである。
【００２７】
一態様では、げっ歯動物はマウスであり、コンパニオンアニマルはネコである。
【００２８】
一態様では、げっ歯動物はマウスであり、コンパニオンアニマルはウマである。
【００２９】
コンパニオンアニマルのIG重鎖(IGH)座位（ローカス）は、複数のV、D、及びJ領域の遺伝子を含む。V、D、及びJ領域の遺伝子を一緒に発現させると、抗体の重鎖の可変領域が生成される。IGH V、D、及びJ遺伝子は、重鎖定常領域との組合せで自然に発現する。ラムダ又はカッパであり得るIG軽鎖座位(IGL)は、一緒に発現すると抗体の軽鎖の可変領域を形成する複数のV及びJ遺伝子セグメントを含む。IGL V及びJ領域遺伝子は、カッパ又はラムダの軽鎖の軽鎖定常領域との組合せで自然に発現する。本発明のげっ歯動物又はげっ歯動物細胞は、コンパニオンアニマルのVDJ又はVJ領域遺伝子を発現して抗体鎖を形成することができる。コンパニオンアニマルの遺伝子は、抗体鎖の発現を可能にするために、げっ歯動物のゲノムで定常領域と作動可能に連結される。コンパニオンアニマルIG遺伝子は、外因性定常領域遺伝子(げっ歯動物以外の種由来)とともにげっ歯動物のゲノムに位置し得るか、又はげっ歯動物のゲノムに天然に存在するげっ歯動物の定常領域とともに、例えば上流等の機能的な配置でげっ歯動物のゲノムに位置し得、定常領域を伴うV領域遺伝子の発現が起き得る。
【００３０】
げっ歯動物又はげっ歯動物細胞のゲノムは、1つ以上のコンパニオンアニマルのIGH V及びIGH D及びIGH J領域遺伝子を含み得るが軽鎖のコンパニオンアニマルのDNAは含まないか、1つ以上のコンパニオンアニマルIGL V及びIGL J領域遺伝子を含み得るが重鎖のコンパニオンアニマルのDNAを含まない。げっ歯動物又は細胞のゲノムは、重鎖及びカッパ鎖(ラムダではない)、若しくは重鎖及びラムダ鎖(カッパではない)由来のコンパニオンアニマルの遺伝子を含んでもよいか、又は3つの全ての座位、重鎖、カッパ、及びラムダ由来のコンパニオンアニマルの遺伝子を含んでもよい。
【００３１】
一態様では、挿入されたコンパニオンアニマルのDNAは、コンパニオンアニマルの重鎖可変(V)遺伝子の少なくとも50%、例えば少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%等を含み、一態様では、コンパニオンアニマルのV遺伝子の全てを含む。
【００３２】
一態様では、挿入されたコンパニオンアニマルのDNAは、コンパニオンアニマルの重鎖多様性(D)遺伝子の少なくとも50%、例えば少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%等を含み、一態様では、コンパニオンアニマルのD遺伝子の全てを含む。
【００３３】
一態様では、挿入されたコンパニオンアニマルのDNAは、コンパニオンアニマルの重鎖連結(J)遺伝子の少なくとも50%、例えば少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%等を含み、一態様では、コンパニオンアニマルのJ遺伝子の全てを含む。
【００３４】
一態様では、挿入されたコンパニオンアニマルのDNAは、コンパニオンアニマルの軽鎖可変(V)遺伝子の少なくとも50%、例えば少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%等を含み、一態様では、コンパニオンアニマルの軽鎖V遺伝子の全てを含む。
【００３５】
一態様では、挿入されたコンパニオンアニマルのDNAは、コンパニオンアニマルの軽鎖連結(J)遺伝子の少なくとも50%、例えば少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%等を含み、一態様では、コンパニオンアニマルの軽鎖J遺伝子の全てを含む。
【００３６】
一態様では、げっ歯動物のゲノムは、コンパニオンアニマル由来のIGH V、D、及びJ領域遺伝子、並びに介在配列の全てを含む。
【００３７】
一態様では、げっ歯動物のゲノムは、コンパニオンアニマル由来のIGLカッパV、及びJ領域遺伝子、並びに介在配列の全てを含む。
【００３８】
一態様では、げっ歯動物のゲノムは、コンパニオンアニマル由来のIGLラムダV、及びJ領域遺伝子、並びに介在配列の全てを含む。
【００３９】
げっ歯動物又はげっ歯動物細胞のゲノムは、少なくとも4、5、10、15、又は20個のコンパニオンアニマルのIGH V領域遺伝子、例えば少なくとも30、40、50、60、70、80個のV領域遺伝子を含んでもよい。好ましい一態様では、これらはイヌ科の動物のV領域遺伝子である。好ましい一態様では、げっ歯動物のゲノムは、少なくとも83個のイヌ科の動物のIG重鎖V領域遺伝子を含む。
【００４０】
げっ歯動物又はげっ歯動物細胞のゲノムは、コンパニオンアニマル由来の少なくとも1、2、3、4、5、又は6個のIGHD領域遺伝子、好ましくはイヌ科の動物の遺伝子を含んでもよい。
【００４１】
げっ歯動物又はげっ歯動物細胞のゲノムは、コンパニオンアニマル由来の少なくとも1、2、3、4、5、又は6個のIGHJ領域遺伝子、好ましくはイヌ科の動物の遺伝子を含んでもよい。
【００４２】
げっ歯動物又はげっ歯動物細胞のゲノムは、少なくとも10、15、16、17、18、又は19個のコンパニオンアニマルのIGLカッパV領域遺伝子を含んでもよい。好ましい態様では、これらはイヌ科の動物のカッパV領域遺伝子である。好ましい一態様では、げっ歯動物のゲノムは、少なくとも19個のイヌ科の動物の軽鎖カッパV領域遺伝子を含む。
【００４３】
げっ歯動物又はげっ歯動物細胞のゲノムは、コンパニオンアニマル由来の少なくとも1、2、3、4、又は5個のIGLカッパJ領域遺伝子、好ましくはイヌ科の動物の遺伝子を含んでもよい。
【００４４】
げっ歯動物又はげっ歯動物細胞のゲノムは、少なくとも5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、又は少なくとも160個のコンパニオンアニマルのIGLラムダV領域遺伝子を含んでもよい。好ましい態様では、これらはイヌ科の動物のラムダV領域遺伝子である。好ましい一態様では、げっ歯動物のゲノムは、少なくとも160個のイヌ科の動物の軽鎖ラムダV領域遺伝子を含む。
【００４５】
げっ歯動物又はげっ歯動物細胞のゲノムは、コンパニオンアニマル由来の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、又は9個のIGLラムダJ領域遺伝子、好ましくはイヌ科の動物の遺伝子を含んでもよい。
【００４６】
別の態様では、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞のゲノムは、ネコ由来の少なくとも4、5、10、15、又は20個のIGH V領域遺伝子、例えば少なくとも23個のV領域遺伝子を含んでもよい。
【００４７】
別の態様では、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞のゲノムは、ネコ由来の少なくとも4、5、10、又は11個のコンパニオンアニマルのIGH D領域遺伝子を含んでもよい。
【００４８】
別の態様では、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞のゲノムは、ネコ由来の少なくとも1、2、3、4、又は5個のコンパニオンアニマルのIGH J領域遺伝子を含んでもよい。
【００４９】
別の態様では、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞のゲノムは、ネコ由来の少なくとも4、5、10、15個のIGLカッパV領域遺伝子を含んでもよい。
【００５０】
別の態様では、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞のゲノムは、ネコ由来の少なくとも1、2、3、4、5、又は6個のコンパニオンアニマルのIGHカッパJ領域遺伝子を含んでもよい。
【００５１】
別の態様では、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞のゲノムは、ネコ由来の、少なくとも5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、100、又はそれ以上、例えば113個のIGLラムダV領域遺伝子を含んでもよい。
【００５２】
別の態様では、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞のゲノムは、ネコ由来の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、又は9個のコンパニオンアニマルのIGHラムダJ領域遺伝子を含んでもよい。
【００５３】
上のいずれかの態様で言及したコンパニオンアニマルの遺伝子の数は、更に増加する可能性もあり、一態様では、両方の対立遺伝子に挿入を有するホモ接合体の場合、2倍になる。
【００５４】
好ましくは、ゲノムに挿入されるV、D、及びJ領域の遺伝子は、同一のコンパニオンアニマル由来のものである。好ましくは、挿入されるIGH VDJ領域遺伝子、又はIGL VJ領域遺伝子は、全てイヌ科の動物であるか、全てネコ科の動物であるか、又はすべてウマ科の動物である。好ましくは、遺伝子は全てイヌ科の動物である。
【００５５】
一態様では、挿入されるコンパニオンアニマルの遺伝子は全て、コンパニオンアニマルの同一の品種、例えば同一の犬品種由来のものである。
【００５６】
一態様では、コンパニオンアニマルの遺伝子は、げっ歯動物の定常領域のゲノム上流に位置し、挿入されるコンパニオンアニマル重鎖可変領域遺伝子については重鎖定常領域(複数可)の上流に適切に位置し、及び/又は挿入されるコンパニオンアニマル軽鎖可変領域遺伝子については軽鎖定常領域の上流に適切に位置し、これにより、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞は、挿入される可変領域遺伝子とげっ歯動物の定常領域の発現に起因するキメラ抗体鎖を生成できる。
【００５７】
好ましくは、コンパニオンアニマル由来の重鎖V、D、及びJ領域遺伝子は、げっ歯動物の重鎖定常領域の上流でげっ歯動物のゲノムに位置する。
【００５８】
好ましくは、コンパニオンアニマル由来の軽鎖カッパV、J領域遺伝子は、げっ歯動物のカッパ軽鎖定常領域の上流でげっ歯動物のゲノムに位置する。
【００５９】
げっ歯動物の定常領域等の定常領域の上流の可変領域の位置へのいかなる言及も、げっ歯動物のin vivoでキメラ抗体鎖が発現することを可能にするために、抗体の可変領域と定常領域をコードする2つのゲノム部分の適切な相対位置が存在することを意味する。このようにして、挿入されたコンパニオンアニマルのDNAとげっ歯動物の定常領域は、抗体又は抗体鎖の産生のために互いに機能的に配置される。
【００６０】
一態様では、可変VDJ又はVJ領域遺伝子等の挿入されるコンパニオンアニマルのDNAは、げっ歯動物のゲノムの天然に存在する重鎖又は軽鎖定常領域の部位とは異なる部位、例えば、異なる染色体上に位置する。この場合、VDJ又はVJ領域遺伝子の挿入は、定常領域を伴い、好ましくはげっ歯動物又はコンパニオンアニマル由来の3'エンハンサーも伴う。1つの好ましい実施形態は、イヌ科の動物の定常領域及びイヌ科の動物の3'エンハンサー等のコンパニオンアニマルのVDJ又はVJ領域とのげっ歯動物の定常領域及びげっ歯動物の3'エンハンサーの使用である。一態様では、コンパニオンアニマルの遺伝子は、同一のコンパニオンアニマル由来の定常領域との機能的配置でゲノムに位置し、げっ歯動物は挿入されたコンパニオンアニマルのVDJ又はVJ領域遺伝子とコンパニオンアニマルの定常領域の発現から生じる抗体鎖を産生できる。代替的に、コンパニオンアニマルの遺伝子は、異なるコンパニオンアニマル等の他のコンパニオンアニマル由来の定常領域、又はげっ歯動物由来の定常領域等との機能的配置でゲノムに位置する。
【００６１】
コンパニオンアニマルの遺伝子が定常領域を伴ってげっ歯動物のゲノムに挿入される場合、内因性の定常領域遺伝子は抗体鎖の生産には必要ないため、挿入はげっ歯動物細胞のゲノム内の任意の適切な位置である可能性があり、げっ歯動物のIG座位を標的としない場合があることが理解されよう。挿入は、げっ歯動物のゲノムへのランダムな場所でなされ得る。
【００６２】
本発明はまた、コンパニオンアニマルのラムダV及びJ及びC遺伝子をコードするDNA等の内因性のげっ歯動物のIG座位において、コンパニオンアニマルの定常領域を伴う(「完全(fully)」なコンパニオンアニマルの抗体鎖をコードする)コンパニオンアニマルの遺伝子の挿入を有する細胞及びげっ歯動物を特に企図する。
【００６３】
好ましくは、コンパニオンアニマル由来の軽鎖ラムダV及びJ領域遺伝子は、同一のコンパニオンアニマル由来のラムダ鎖定常領域とともに、例えば上流等の機能的な配置でゲノムに位置する。このようにして、コンパニオンアニマル由来のラムダ定常領域を有するラムダ抗体鎖が生成される。したがって、本発明は、ゲノムが1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLラムダV領域遺伝子、1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLラムダJ領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのラムダ定常領域を含み、細胞又はげっ歯動物がコンパニオンアニマルの可変領域と定常領域との両方を有するラムダ抗体鎖を発現できる、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞に関する。
【００６４】
一態様では、上述のコンパニオンアニマルのVJCラムダ抗体鎖は、マウスのラムダ座位、好ましくは最後のげっ歯動物のC遺伝子と3'エンハンサーとの間に挿入される。
【００６５】
一態様では、げっ歯動物又はげっ歯動物の細胞は、げっ歯動物細胞のカッパ座位内、例えば、げっ歯動物のカッパ定常領域の座位又は上流又は下流に位置する、1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLラムダV領域遺伝子、1つ以上のコンパニオンアニマルのIGLラムダJ領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルラムダ定常領域を含む。IGLラムダV及びJ領域遺伝子がIGLカッパ定常領域で発現するように、挿入はIGLカッパ座位定常領域の上流にあることが好ましい。適切には、挿入はコンパニオンアニマルの遺伝子を天然のげっ歯動物のカッパ遺伝子とほぼ同一の位置に配置し、潜在的にそれらを欠失又は置換し、例えば、最後に挿入された3'ラムダJ遺伝子からげっ歯動物カッパ定常領域遺伝子までは、最後のげっ歯動物のカッパ3'J遺伝子からカッパ定常領域までと同一又は実質的に同一の距離がある。一態様では、挿入は、げっ歯動物の免疫グロブリンカッパ座位の境界(上流又は下流)の1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10kb以内である。マウスのカッパ軽鎖は、天然で、マウスのラムダ軽鎖よりも高いレベルで発現し、このカッパ座位にコンパニオンアニマルのDNAを挿入すると、コンパニオンのラムダ鎖V領域遺伝子の高レベルの発現をもたらし得る。
【００６６】
一態様では、げっ歯動物のゲノムは、免疫グロブリン座位の1つ、又は両方、又は3つ全てでのコンパニオンアニマルの遺伝子の挿入についてホモ接合体であり得る。
【００６７】
別の態様では、げっ歯動物のゲノムは、免疫グロブリン座位の1つ、又は2つ、又は3つ全てでのコンパニオンアニマルの遺伝子の挿入についてヘテロ接合体であり得る。
【００６８】
特に、げっ歯動物のゲノムは、カッパ座位でのコンパニオンアニマルの遺伝子の挿入についてヘテロ接合体である。
【００６９】
一態様では、挿入されたDNAは、アイソタイプスイッチングにより異なるげっ歯動物の定常領域とともに発現することができる。
【００７０】
一態様では、挿入されたコンパニオンアニマルのDNAは、トランススイッチングにより異なるげっ歯動物の定常領域とともに発現することができる。
【００７１】
一態様では、コンパニオンアニマルはイヌであり、げっ歯動物のゲノムはイヌ科の動物のカッパ可変領域遺伝子を含み、げっ歯動物のゲノムのイヌ科の動物のカッパ可変領域遺伝子は全て、可変領域遺伝子がそれとともに発現する定常領域の上流、例えばげっ歯動物のカッパ定常領域の上流、又は例えばイヌ科の動物のカッパ定常領域の上流に位置する。
【００７２】
別の好ましい態様では、コンパニオンアニマルはウマであり、げっ歯動物のゲノムはウマ科の動物のカッパ可変領域遺伝子を含み、げっ歯動物のゲノムのウマ科の動物のカッパ可変領域遺伝子は全て、可変領域遺伝子がそれとともに発現する定常領域の上流、例えばげっ歯動物のカッパ定常領域の上流、又は例えばウマ科の動物のカッパ定常領域の上流に位置する。
【００７３】
一態様では、コンパニオンアニマルのDNAは、野生型座位に位置するげっ歯動物の野生型定常領域、適切にはげっ歯動物の定常領域と宿主VDJ又はVJ領域との間に挿入される。一態様では、IGH可変領域遺伝子は重鎖J領域の下流、及びEmuエンハンサーの上流に挿入される。
【００７４】
一態様では、げっ歯動物はマウスであり、IGH可変領域遺伝子はマウスの重鎖J領域の下流、及びEmuエンハンサーの上流に挿入される。一態様では、IGH V領域遺伝子の挿入は、マウス第12染色体上のマウスゲノムの位置114666435で行われる。一態様では、IGLラムダV領域遺伝子の挿入は、マウス第16染色体上のマウスゲノムの位置19047551で行われる。一態様では、IGLカッパV領域遺伝子(複数可)の挿入は、マウス第6染色体上のマウスゲノムの位置70674755で行われる。
【００７５】
一態様では、げっ歯動物はマウスであり、ゲノムは、少なくともイヌ科の動物のV4-1、V3-2、V3-3、及びV3-4のIGH可変領域遺伝子を含む。
【００７６】
一態様では、げっ歯動物はマウスであり、ゲノムは、少なくともイヌ科の動物のV4-1、V7-2、V3-3、V2-4、V2-5、V2-6、V2-7、V2-8、V2-9、V2-10、及びV2-11のIGLカッパ可変領域遺伝子を含む。
【００７７】
一態様では、げっ歯動物又はげっ歯動物の細胞は、マウス又はマウスの細胞であり、イヌ科の動物のカッパV遺伝子、4-S17、2-S16、3-S15、2-S14、2-S13、及び2-S12の1つ以上、又は全ては、げっ歯動物のカッパ定常領域の上流に位置する。
【００７８】
一態様では、げっ歯動物はマウスであり、ゲノムは、少なくともイヌ科の動物のV3-1、V3-2、V3-3、V3-4、V4-5、及びV4-6のIGLラムダ可変領域遺伝子を含む。
【００７９】
一態様では、げっ歯動物はマウスであり、ゲノムは、マウスIGH V領域遺伝子の1つ又はいくつか又は全て、好ましくはV1-85〜V5-2の欠失を含む。
【００８０】
一態様では、げっ歯動物はマウスであり、ゲノムは、マウスIGLカッパV領域遺伝子の1つ又はいくつか又は全て、好ましくはV3-1〜V2-137の欠失を含む。
【００８１】
一態様では、げっ歯動物はマウスであり、マウス重鎖D及びJ領域遺伝子は、挿入されるコンパニオンアニマルの重鎖可変領域遺伝子のゲノム上流に保持される。
【００８２】
一態様では、げっ歯動物のゲノムは、げっ歯動物由来の可変領域と定常領域の両方を有する完全げっ歯動物抗体の発現を低減又は防止するために改変される。これは、げっ歯動物のVDJ領域の全部若しくは一部の反転、又はゲノムの内因性げっ歯動物のVDJ若しくはVJ領域の欠失若しくはそこへの挿入によるものであり得る。一態様では、げっ歯動物のVDJ若しくはVJ領域又はその一部が欠失する。一態様では、げっ歯動物のV領域遺伝子の全て又はいくつかが、例えば、げっ歯動物のIGH遺伝子及び/又はげっ歯動物のIGLカッパVJ領域遺伝子及び/又はげっ歯動物のラムダVJ遺伝子の少なくとも50%、好ましくは少なくとも75%、若しくは少なくとも90%、又はその全てが欠失する。一態様では、げっ歯動物のIGLラムダ遺伝子は、げっ歯動物のゲノムから欠失しない。
【００８３】
一態様では、げっ歯動物のカッパ座位でのコンパニオンアニマルのDNAの挿入により、げっ歯動物のカッパ座位の一方又は両方の対立遺伝子が全体的又は部分的に欠失又は不活性化する。
【００８４】
一態様では、げっ歯動物のカッパ座位は、例えば挿入、又は欠失、又は反転により、全体的又は部分的に不活性化する。
【００８５】
一態様では、げっ歯動物のラムダ座位は、例えば挿入、又は欠失、又は反転により、全体的又は部分的に不活性化する。
【００８６】
一態様では、げっ歯動物の重鎖座位は、例えば挿入、又は欠失、又は反転により、全体的又は部分的に不活性化する。
【００８７】
コンパニオンアニマルの可変領域遺伝子は、げっ歯動物の定常領域の上流に適切に挿入され、げっ歯動物の定常領域は、完全な定常領域又は抗原を特異的に認識することのできる有効なキメラ抗体の形成を可能にするのに十分な定常領域の一部をコードするのに必要なDNAの全てを含む。したがって、本明細書におけるげっ歯動物の定常領域を有するキメラ抗体又は抗体鎖への言及は、完全な定常領域又は完全な定常領域座位を有する抗体鎖に限定されず、げっ歯動物で天然に存在する抗体で見られる1つ以上のエフェクター機能を提供するのに十分な定常領域又は定常領域座位の一部を有するキメラ抗体又はキメラ抗体鎖をも含む。エフェクター機能には、Fc受容体と相互作用する能力、及び/又は補体に結合する能力が含まれる。この教示は、げっ歯動物定常領域の全て又は一部とキメラ抗体鎖を形成して抗体鎖又はその一部を形成するように、可変領域DNAが宿主ゲノムに位置する本発明のげっ歯動物及び細胞並びに方法にも適用される。
【００８８】
好ましくは、げっ歯動物ゲノムは、コンパニオンアニマルのラムダ定常領域DNA及び介在領域の全てを含む。
【００８９】
コンパニオンアニマルの可変領域とともに発現するげっ歯動物の定常領域は、コンパニオンアニマルの重鎖又は軽鎖VDJ又はVJに適切な、野生型座位に位置するげっ歯動物の野生型定常領域であることが好ましい。
【００９０】
一態様では、少なくとも1つのげっ歯動物のエンハンサー又はスイッチ領域等の他の制御配列は、げっ歯動物の定常領域との機能的配置で維持される。このようにして、エンハンサー又は他の制御配列の効果は、細胞又はトランスジェニックげっ歯動物において全体的又は部分的に発揮され得る。
【００９１】
一態様では、Emuエンハンサー配列等の1つ以上のげっ歯動物の制御配列が、げっ歯動物のMu定常領域の上流、適切には定常領域からの距離に関してその天然の位置に維持される。
【００９２】
一態様では、エンハンサー配列等の1つ以上のげっ歯動物の制御配列が、げっ歯動物の定常領域の下流、適切には定常領域からの距離に関してその天然の位置に維持される。
【００９３】
一態様では、げっ歯動物のSmuスイッチ配列は、げっ歯動物のMu定常領域の上流、適切には定常領域からの距離に関してその天然の位置に維持される。
【００９４】
そのような位置では、げっ歯動物のエンハンサー又はスイッチ配列は、宿主定常領域配列でin vivoで適切に作動可能である。
【００９５】
更なる態様では、コンパニオンアニマルのV、D、又はJ領域遺伝子の1つ以上のプロモーターエレメント、又は他の制御エレメントは、げっ歯動物の転写機構と相互作用するようにゲノムで最適化される。
【００９６】
一態様では、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞のゲノムは、1つ以上のコンパニオンアニマルのプロモーター、又はエンハンサー、及び/又はコンパニオンアニマルV、D、又はJ領域に伴う他の制御エレメントを含む。一態様では、プロモーター又はエンハンサー又はスイッチ領域等の1つ以上のコンパニオンアニマルの制御領域は、それぞれ1つ以上のげっ歯動物のプロモーター又はエンハンサー又はスイッチ領域を置き換える。コンパニオンアニマルの制御配列は、細胞又はトランスジェニックげっ歯動物において制御配列の効果が全体的又は部分的に発揮されるように、定常領域との機能的配置で適切に維持される。
【００９７】
一態様では、挿入されるコンパニオンアニマルのV、D、又はJ遺伝子セグメントの少なくとも1つ又はそれ以上は、同一のコンパニオンアニマル由来の組換えシグナル配列(RSS)等の制御配列を伴い、必要に応じて制御配列は、V、D、又はJ遺伝子セグメント(複数可)の組換えの成功を誘導する。
【００９８】
この文脈では、「同一の(same)」コンパニオンアニマルは、コンパニオンアニマルのV、D、又はJ遺伝子セグメントが取得される正確なコンパニオンアニマルに限定されない。一態様では、「同一の(same)」コンパニオンアニマルは、コンパニオンアニマルのV、D、又はJ遺伝子セグメントが取得されるコンパニオンアニマルと同一の品種又は種を指す。一態様では、それはまったく同一のコンパニオンアニマルである。
【００９９】
一態様では、挿入されるコンパニオンアニマルV、D、又はJ遺伝子セグメントの少なくとも1つ又はそれ以上は、制御配列をシス若しくはトランスで直接伴うか、又は制御配列が片側若しくは両側に隣接し、必要に応じて1つ以上の遺伝子セグメントには、制御配列が直接隣接する。
【０１００】
一態様では、制御配列は、個々のV遺伝子セグメントに先行するプロモーター、及び/又は個々のV遺伝子セグメント内のスプライス部位、及び/又はV遺伝子セグメントの下流、D遺伝子セグメントに隣接して、若しくはJ遺伝子セグメントの上流のV(D)J組換えのための組換えシグナル配列を含む。
【０１０１】
一態様では、挿入されるコンパニオンアニマルのV、D、又はJ配列には、同一のコンパニオンアニマル由来のRSS配列が隣接する。例えば、イヌ科の動物のRSS配列は、イヌ科の動物のV、D、及び/又はJ配列とともに使用できる。これは、コンパニオンアニマル由来のゲノム断片のげっ歯動物のゲノムへの挿入によって提供できることが理解されよう。更なる態様では、本発明は、げっ歯動物細胞において内因性免疫グロブリン可変領域遺伝子の座位をコンパニオンアニマルの遺伝子の座位で全体的に又は部分的に置き換える方法であって、少なくとも1つのV又はD(重鎖用)又はJ遺伝子セグメント、及びそれに伴う少なくとも1つの制御配列を含むコンパニオンの遺伝子の座位を全体的又は部分的に含むクローニングされたゲノム断片又は合成配列を取得する工程と、コンパニオンアニマルのDNAを、内因性マウス免疫グロブリン座位で、好ましくは挿入されるコンパニオンアニマルのDNAの天然に対応する重鎖又は軽鎖の、げっ歯動物の座位で、げっ歯動物のゲノムに適切に挿入する工程とを含む方法を提供する。
【０１０２】
一態様では、挿入されるコンパニオンアニマルのDNAは、コンパニオンアニマル由来の少なくとも5kb、少なくとも10kb、少なくとも15kb、20kb以上のゲノムDNAを含む。
【０１０３】
一態様では、本発明のげっ歯動物細胞は、コンパニオンアニマルのDNAによってコードされる可変領域を含む抗体鎖、例えば、キメラ抗体重鎖、若しくはキメラ抗体軽鎖、又は可変領域及び定常領域を有するコンパニオンアニマルの可変領域によってコードされる完全なコンパニオンアニマルの抗体鎖若しくは抗体のレパートリーを産生できるげっ歯動物に発生することができるげっ歯動物ES細胞、げっ歯動物造血幹細胞、又は他の細胞である。
【０１０４】
一態様では、本発明の細胞は、げっ歯動物のES細胞又は誘導多能性幹細胞(iPS細胞)である。
【０１０５】
一態様では、細胞は単離されたげっ歯動物細胞である。
【０１０６】
一態様では、細胞は単離されたげっ歯動物のB細胞である。
【０１０７】
好ましくは、げっ歯動物細胞はげっ歯動物のES細胞又はiPS細胞である。そのような細胞は、コンパニオンアニマルのDNAの挿入に適しており、本明細書に記載の抗体鎖を発現するげっ歯動物を生成する。
【０１０８】
ES細胞は、マウス細胞株129若しくはC57BL、例えばC57BL/6N、C57BL/6J、129S5若しくは129Sv株、又は129又はC57BLのゲノムDNAを含むハイブリッドゲノムを有する細胞であってもよい。
【０１０９】
本発明はまた、不死化細胞株を含む、本明細書に記載の細胞から増殖するか、又はそうでなければ細胞に由来する細胞株に関する。
【０１１０】
本発明の細胞又は細胞株は、生殖系列構成又はin vivo成熟後の再構成後のコンパニオンアニマルのV、(D)、又はJ遺伝子を含んでもよい。
【０１１１】
本発明はまた、抗原で本発明のげっ歯動物を免疫することによって得られる、キメラ抗体重鎖等の抗体鎖を発現する細胞又は細胞株に関する。
【０１１２】
本発明はまた、好ましくはコンパニオンアニマルの定常領域を伴うコンパニオンアニマル可変領域を有する抗体鎖を発現する細胞又は細胞株に関し、その抗体の可変領域の核酸配列は、本発明のげっ歯動物を抗原で免疫し、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞から抗体鎖又は抗体鎖の配列を得ることにより、同定されてもよく、又は同定されている。発現する抗体鎖は、好ましくは、コンパニオンアニマル由来の可変領域が、同一のコンパニオンアニマル由来の定常領域(げっ歯動物の定常領域ではなく)を伴って本発明のげっ歯動物で発現する、完全なイヌ科の動物の抗体鎖、又は完全なウマ科の動物の抗体鎖、又は完全なネコ科の動物の抗体鎖である。抗体鎖又は抗体を発現する細胞又は細胞株は、CHO細胞、又はヒト若しくは動物の使用のための治療薬の生産に適した他の哺乳動物細胞株であり得る。
【０１１３】
細胞は、腫瘍細胞との融合により不死化されて、抗体産生細胞及び細胞株を提供するか、又は直接的な細胞不死化により作製され得る。
【０１１４】
本発明はまた、本発明で使用するためのベクターに関する。一態様では、そのようなベクターは、コンパニオンアニマルのIG座位の全部又は一部を含む細菌人工染色体(BAC)である。本発明では他のクローニングベクターを使用することができ、したがって、本明細書のBACへの言及は、一般に任意の適切なベクターを指すと解釈され得ることが理解されよう。ベクターは、1つ以上の選択マーカー及び/又は1つ以上の部位特異的組換え部位を含んでもよい。一態様では、ベクターは、2つ以上、例えば3つのヘテロ特異的及び不適合部位特異的組換え部位を含む。一態様では、部位特異的組換え部位は、loxP部位若しくはそのバリアント、又はFRT部位若しくはそのバリアントであり得る。一態様では、ベクターは、1つ以上のトランスポゾンITR(末端逆位配列)配列を含む。
【０１１５】
イヌ科の動物のDNAを含む適切なBACは、子供病院オークランド研究所のBACPACリソースセンターからCHORI-82 BACライブラリーとして入手できる。
【０１１６】
ネコ科の動物のDNAを含む適切なBACは、Amplicon Express社からFCABライブラリーとして入手できる。
【０１１７】
ウマ科の動物のDNAを含む適切なBACは、子供病院オークランド研究所のBACPACリソースセンターからCHORI-241 BACライブラリーとして入手できる。
【０１１８】
本発明は、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞を産生する方法であって、げっ歯動物細胞ゲノムに1つ以上のコンパニオンアニマルのIGH V領域遺伝子、1つ以上のコンパニオンアニマルのIGH D領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのIGH J領域遺伝子を挿入する工程を含み、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞が、定常領域との組合せでコンパニオンアニマルの可変領域遺伝子を発現し、抗体鎖を形成できる、方法に関する。
【０１１９】
本発明はまた、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞を産生する方法であって、げっ歯動物細胞ゲノムに1つ以上のコンパニオンアニマルのIGL V領域遺伝子、及び1つ以上のコンパニオンアニマルのIGL領域J遺伝子を挿入する工程を含み、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞が、定常領域との組合せでコンパニオンアニマルの可変領域遺伝子を発現し、抗体鎖を形成できる、方法に関する。
【０１２０】
好ましくは、本方法は、軽鎖と重鎖との両方がコンパニオンアニマルのDNAの発現に由来する可変領域を有する抗体が産生されるように、軽鎖と重鎖との両方のコンパニオンアニマルのVDJ及びVJ領域遺伝子をそれぞれ挿入することに関する。
【０１２１】
本発明はまた、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞を産生する方法であって、複数のコンパニオンアニマルのDNA断片を逐次的にげっ歯動物細胞ゲノムに挿入する工程を含み、挿入される断片が、げっ歯動物細胞に連続挿入を形成する、すなわち、それらが介在配列を含まずに直接結合される、方法を含む。
【０１２２】
一態様では、挿入プロセスは、ES細胞等の細胞のゲノムに開始カセットが挿入される部位で開始する。一態様では、開始カセットは、ヒト重鎖DNAの挿入に使用するために、げっ歯動物の重鎖座位に挿入される。同様に、開始カセットは、ヒト軽鎖VJ DNAの挿入に使用するために、げっ歯動物の軽鎖座位に挿入してもよい。開始カセットは、げっ歯動物の重鎖とカッパ鎖の最後のJ領域とC領域との間に配置してもよい。開始カセットは、IGLラムダコンパニオンアニマルの遺伝子の挿入に使用するために、同一の染色体上の、げっ歯動物カッパIGL座位の下流に配置してもよい。
【０１２３】
開始カセットは、コンパニオンアニマルDNAの挿入を行うことができる、げっ歯動物のゲノムに固有の連続した座位を適切に含む。
【０１２４】
一態様では、第1のDNA断片の開始カセットへの挿入の後に、第2のDNA断片の第1のDNA断片の一部への挿入が続いてもよい。事前に挿入されるDNAフラグメントの少なくとも一部に後続の挿入を行ってもよい。
【０１２５】
一態様では、方法は、相同組換えによる開始カセットのげっ歯動物ゲノムへの標的化挿入、部位特異的組換えによる開始カセットの少なくとも一部への第1のDNA配列の挿入、第1のDNA配列の少なくとも一部への第2のDNA配列の部位への挿入、必要に応じて、先行するdNA配列の少なくとも一部への更なる1つ以上のDNA配列の挿入を含み、コンパニオンアニマルのDNAを含む標的内の連続したDNA断片を構築する。初期の断片の少なくとも一部へのDNA断片の挿入は、例えばリコンビナーゼ媒介カセット交換(RMCE)による部位特異的組換えによるものであり得る。この方法は、相同組換え(例えば、開始カセットの挿入の最初の工程)と部位特異的組換え、例えばRMCE(例えば、1つ以上のその後の挿入事象)との両方を含んでもよい。部位特異的リコンビナーゼシステムは当該技術分野で周知であり、Cre-lox、及びFLP/FRT、又はそれらの組み合わせを含んでもよい。
【０１２６】
一態様では、挿入されるコンパニオンアニマルのDNAは、ES細胞等の細胞のゲノムに、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、又はそれ以上の重鎖又は軽鎖領域ごとの別個の挿入を使用して段階的に構築される。コンパニオンアニマルのDNA断片は、同一又は実質的に同一の細胞の座位、例えば、ES細胞の座位に、次々と適切に挿入され、完全なVDJ若しくはVJ領域、又はその一部を形成する。
【０１２７】
本発明はまた、プロセス中に中間体を含む細胞及びげっ歯動物に関し、そのゲノムは、コンパニオンアニマルの可変領域遺伝子DNAのみ等の部分的なコンパニオンアニマルのVDJ又はVJ領域のみを含み得る。
【０１２８】
挿入されるV、D、及びJ遺伝子が宿主の定常領域で発現できるようにされる内因性マウス座位での外因性DNAの標的化挿入のための方法は、当該技術分野で周知である。Murphy等、111巻、14号、5153〜5158頁、doi:10.1073/pnas.1324022111;MacDonald等、111巻、14号、5147〜5152頁、doi:10.1073/pnas.1323896111;及びLee等、Nature Biotechnology、32巻、356〜363頁、発行年:2014DOI:, doi:10.1038/nbt.2825を参照されたい。
【０１２９】
特に、トランスジェニックげっ歯動物を生産する方法は、順次リコンビナーゼ媒介カセット交換(SRMCE)による複数のDNA断片の段階的な挿入による、対応するげっ歯動物哺乳類の定常領域の上流又は下流への、本明細書に開示されるコンパニオンアニマルのVDJ又はVJ領域遺伝子の挿入を含む。
【０１３０】
一態様では、マルチステップクローニングプロセスの次の工程に進む前に、正しい挿入事象が確認される。
【０１３１】
一態様では、コンパニオンアニマルはイヌであり、げっ歯動物はマウスであり、イヌ科の動物のカッパ定常領域の下流に天然で位置するイヌ科の動物のIGLカッパV領域遺伝子は、げっ歯動物カッパ定常領域の上流、好ましくはイヌ科の動物のIGLカッパ定常領域の上流に天然で見られるイヌ科の動物のIGLカッパV遺伝子と同一の向きで上流に挿入される。
【０１３２】
一態様では、げっ歯動物は、少なくとも1×106個の異なる機能的キメラ免疫グロブリン配列の組み合わせの多様性を生成することができる。
【０１３３】
一態様のげっ歯動物では、1つ以上のキメラ座位を有するES細胞を使用してキメラを作製し、ここで、RAG-1欠損バックグラウンド又は成熟した宿主B及びTリンパ球の産生を妨げる他の適切な遺伝的バックグラウンドから宿主胚が生成される。これにより、全てのB及びT細胞を、注入されたES細胞由来のものとすることができる。
【０１３４】
一態様では、好ましいげっ歯動物はマウスであり、本発明の細胞はマウス細胞又はES細胞である。別の態様では、好ましいげっ歯動物はラットであり、本発明の細胞はラット細胞又はES細胞である。
【０１３５】
本発明のES細胞は、ES細胞を胚盤胞に注入し、続いてキメラ胚盤胞を雌に移植して子孫を生成し、これをヘテロ接合子孫を生成するために交配させ、その後、必要な挿入を有するホモ接合組換え体を生成するために交配させることを含む、当該技術分野で周知の技術を使用して動物を生成するために使用することができる。一態様では、宿主胚盤胞はRag欠損である。
【０１３６】
本発明は、本発明のES細胞を胚盤胞に注入した後、キメラ胚盤胞(blastocystys)をげっ歯動物の雌に移植して子孫を生産することにより生成されるキメラのげっ歯動物に関する。
【０１３７】
一態様では、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞はマウス又はマウス細胞であり、マウスADAM6a及びADAM6b遺伝子はマウスゲノムに存在し、以前にIGH座位から削除及び再挿入されていない。
【０１３８】
一態様では、げっ歯動物のADAM6a及びADAM6b遺伝子は、挿入された1つ以上のコンパニオンアニマルのV、D、及びJ遺伝子の5'の位置に位置する。
【０１３９】
一態様では、げっ歯動物のIGH D及びJ遺伝子は、げっ歯動物のゲノムに存在する。一態様では、げっ歯動物のIGH D及びJ遺伝子は、げっ歯動物のゲノムから欠失していない。一態様では、げっ歯動物のIGH D及びJ遺伝子は、挿入された1つ以上のコンパニオンアニマルのV、D、及びJ遺伝子の5'の位置に位置する。
【０１４０】
一態様では、本発明で使用されるイヌ科の動物の対立遺伝子は、各イヌ科の動物の遺伝子の参照対立遺伝子である。これらは、CanFam3.1のものである。2011年9月に作成され、最後に2016年5月に更新されたアセンブリ受託-GCA_000002285.2を参照されたい。
【０１４１】
驚くべきことに、19品種にわたる107匹のイヌのゲノムデータから、品種のばらつきが最小限であり、参照対立遺伝子(ボクサー犬由来)が試料全体にわたって76%の割合で見出され、非参照対立遺伝子は、典型的には参照対立遺伝子とのヘテロ接合体として見出されることが本発明者等により判明した。これは、イヌ科の動物の参照対立遺伝子を含むげっ歯動物から生成された抗体集団が、異なる犬品種にわたる使用に広く適用可能であることを意味する。
【０１４２】
したがって、本発明は、挿入された少なくとも90%、少なくとも95%、及び好ましくは全てのコンパニオンの遺伝子セグメントがCanFam 3.1からのイヌ科の動物の参照対立遺伝子である、本明細書に開示されるげっ歯動物細胞又はげっ歯動物に関する。
【０１４３】
好ましくは、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞は、以下の遺伝子セグメントの1つ以上の参照対立遺伝子ではない(「*01対立遺伝子」ではない)対立遺伝子を含む:IGKV2-S13、IGLV1-57、IGLV1-68、IGLV1-72、IGLV1-88、IGLV1-96、IGLV8-60、IGLV8-90、IGLV8-120。好ましくは、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞のゲノムは、これらの非参照対立遺伝子の2、3、4、5、6、7、8、又は9つ全てを含む。
【０１４４】
一態様では、げっ歯動物又はげっ歯動物細胞は、コンパニオンアニマルの遺伝子セグメントの1つ以上の参照対立遺伝子、例えば2、3、4、5、6、7、8、又は9つの参照対立遺伝子等を含む。
【０１４５】
本発明はまた、本明細書に開示されるように得られるか、又は得ることができ、特に、参照ゲノムの品種以外の犬品種における、疾患の治療における、イヌ科の動物の参照対立遺伝子の発現に由来する可変領域を有する抗体鎖又はその一部に関する。一態様では、挿入されるV遺伝子セグメントの少なくとも50、60、70、80、90、又は100%はイヌ科の動物のV遺伝子参照対立遺伝子であり、及び/又は挿入されるD遺伝子セグメントの少なくとも50、60、70、80、90、又は100%はイヌ科の動物のD遺伝子参照対立遺伝子であり、及び/又は挿入されるJ遺伝子セグメントの少なくとも50、60、70、80、90、又は100%はイヌ科の動物のJ遺伝子参照対立遺伝子であり、並びにこれらの組み合わせである。好ましくは、挿入されるイヌ科の動物の遺伝子セグメント対立遺伝子の少なくとも90%、例えば100%が、その遺伝子セグメントの参照対立遺伝子である。
【０１４６】
本発明はまた、異なる犬品種における疾患の予防又は治療に使用するための、抗体若しくは抗体鎖、又はその一部の生成における、本明細書に開示されるイヌ科の動物のV、D、及びJセグメントを挿入したげっ歯動物、並びに異なる犬品種の疾患の予防又は治療に使用するための、抗体鎖又はその一部の生成における、本明細書に記載のイヌV、D、及びJセグメントを挿入したげっ歯動物の使用に関する。
【０１４７】
本発明はまた、本明細書に記載されるように、ボクサー犬品種由来の1つ以上又は全てのイヌ科の動物のV、D、及びJセグメントを有するげっ歯動物に関する。本発明は更に、本明細書に記載のゲノムのイヌ科の動物の遺伝子セグメントを有するあらゆるげっ歯動物から得られる又は得ることのできる抗体又はその断片の使用を提供し、抗体は、イヌ科の動物の遺伝子セグメントで使用されている品種とは異なる犬品種での疾患の予防又は治療におけるイヌ科の動物のDNAから少なくとも部分的に発現する。
【０１４８】
例えば、挿入されるイヌ科の動物のDNAがボクサー由来である場合、ボクサー以外の犬種で使用される。
【０１４９】
本発明は、以下にも関する。
(i)ボクサー犬品種由来のイヌ科の動物のV、D、Jセグメント、好ましくは、参照対立遺伝子である1つ以上のボクサー遺伝子セグメントを有するげっ歯動物;
(ii)ボクサー以外の犬品種に由来する、本明細書に記載のイヌ科の動物のV、D、及びJセグメント、好ましくはボクサー犬と同一である1つ以上のV、D及び/又はJ遺伝子セグメント(すなわち、イヌは参照対立遺伝子を有する)を有するげっ歯動物;
(iii)(i)又は(ii)のげっ歯動物由来の抗体又は抗体鎖を発現するB細胞、ハイブリドーマ、CHO、又は他の適切な細胞等の細胞、ここで抗体は、イヌ科の動物のV、D、J DNA(又はイヌ科の動物の軽鎖のV、及びJ DNA)から発現する、好ましくは参照対立遺伝子から発現する少なくともいくつかのアミノ酸を含む;
(iv)例えば、イヌ科の動物の定常領域をコードするDNAとともにイヌ科の動物の可変領域をコードするDNAを発現することにより生成され得る、上記(iii)の抗体の抗体可変領域を含む完全なイヌ科の動物の抗体又は抗体鎖;
(v)そのような完全なイヌ科の動物の抗体の全部又は一部をコードするDNAを含むCHO細胞等の発現細胞。
【０１５０】
好ましくは、ボクサーのV、D、及びJ遺伝子セグメントは、CHORI-82 BACライブラリー由来である。
【０１５１】
別の態様では、本発明は、異なる犬品種における疾患の予防又は治療における、イヌ科の動物の可変領域を有する抗体又は抗体鎖、及び抗体又は抗体鎖の使用を提供し、抗体又は鎖は、本明細書に開示されているげっ歯動物から得られるか、又は得ることができ、イヌ科の動物の可変領域を生成するために使用されるV遺伝子セグメントは、イヌ科の動物の参照対立遺伝子であり、好ましくは、抗体又は抗体鎖は、異なる犬品種の少なくとも50%、例えば、60%又は少なくとも70%で有効である。好ましくは、重鎖及び/又は軽鎖由来のイヌ科の動物のV遺伝子セグメントは、ボクサー由来である。好ましくは、D及びJ遺伝子セグメントもボクサーの遺伝子セグメントである。
【０１５２】
本発明は、以下に関する。
所望の抗原に特異的な抗体鎖を産生する方法であって、本明細書に開示されるげっ歯動物を所望の抗原で免疫する工程と、抗体鎖を単独で若しくは完全抗体の一部として回収するか、又は抗体鎖を単独で若しくは完全抗体の一部として産生する細胞を回収する工程とを含む方法(例えば、Harlow, E.及びLane, D.、1998、第5版、「Antibodies: A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Lab. Press、Plainview、NY;並びにPasqualini及びArap、Proceedings of the National Academy of Sciences(2004)101:257〜259頁を参照されたい)。適切には、免疫原性量の抗原が送達される。本発明はまた、標的抗原を検出する方法であって、上述のように産生された抗体を、その抗体の一部を認識する二次検出剤で検出する工程を含む方法に関する。
【０１５３】
所望の抗原に特異的であり、単一種のコンパニオンアニマルに由来する抗体鎖又は抗体を産生する方法であって、本明細書に開示されるコンパニオンアニマルの遺伝子を含むげっ歯動物を免疫する工程と、次いで抗体をコードする核酸を適切に遺伝子操作することにより、げっ歯動物の抗体鎖の定常領域を同一のコンパニオン動物由来のコンパニオン動物の定常領域で置き換える工程とを含む方法。これは、DNAレベルでの標準的なクローニング技術により、非ヒト哺乳動物の定常領域を適切なヒト定常領域DNA配列に置き換えることができる。例えば、Sambrook, J及びRussell, D.(2001、第3版)「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」(Cold Spring Harbor Lab. Press、Plainview、NY)を参照されたい。又は、直接的な核酸合成によって達成できる。
【０１５４】
コンパニオンアニマルの可変領域を有する抗体鎖又はその一部を産生する方法であって、抗体鎖又はその一部をコードするDNAを細胞内で発現させる工程を含み、
抗体鎖の可変領域をコードするDNAの配列は、抗体鎖が産生されるように本発明のげっ歯動物を抗原で免疫することによりそこから得られるか、又は得ることができ、
必要に応じて、方法が、次の:
抗原受容体鎖を精製及び/又は単離する工程と、
必要に応じて、次いで、抗原受容体鎖をコンパニオンアニマルへの投与に適した薬学的に許容される製剤に製剤化する工程と
を含む、方法。
【０１５５】
本発明によるげっ歯動物又は細胞から得られるか、又は得ることができる抗体若しくは抗体鎖、又はその一部、又は抗体鎖若しくはその一部をコードする核酸。
【０１５６】
本発明はまた、本明細書に開示されるイヌ科の動物の可変ドメイン及びげっ歯動物由来のB細胞に由来するげっ歯動物の定常ドメインを含む免疫グロブリン分子の一部、又は全体に関し、同様に、そのB細胞から得られる又は得ることのできるハイブリドーマ細胞、及びそのハイブリドーマ細胞から得られる又は得ることのできるイヌ科の動物の可変ドメインとげっ歯動物の定常ドメインを含む免疫グロブリン分子の一部又は全体に関する。本発明はまた、単一細胞のシークエンシングによるイヌ科の動物の可変領域の同定、及び対応するイヌ科の動物の定常領域を有する完全な抗体鎖を発現する合成ベクターの作製に関する。本発明はまた、PCRによりこれらの配列を得て、ブリッジPCR及びギブソンクローニング等であるがこれらに限定されない適切な分子生物学技術により適切な定常領域に結合することに関する。
【０１５７】
コンパニオンアニマルの治療における使用のための、本発明によるげっ歯動物又は細胞から得られるか又は得ることができる抗体若しくは抗体鎖、又はその一部。
【０１５８】
コンパニオンアニマルの治療の方法であって、本発明に従って得られるか又は得ることのできる適切な抗体若しくは抗体鎖又はその一部を、それを必要とするコンパニオンアニマルに送達する工程を含む方法。特に、本発明は、それを必要とするコンパニオンアニマルに抗体鎖若しくは抗体、又はその一部を送達する工程を含み、少なくとも抗体の可変領域は、コンパニオンのDNA V(D)J領域遺伝子を含む本発明のげっ歯動物を抗原で免疫することによって得られるか、又はそうでなければ同定される、医学的治療の方法に関する。
【０１５９】
一態様では、本発明は、げっ歯動物の定常領域とコンパニオンアニマルの可変領域を有するキメラコンパニオンアニマル抗体及び抗体鎖、並びに前記抗体及び鎖の断片及び機能的誘導体、並びに前記抗体、鎖及び断片の、診断を含む医学並びにin vitro又はex vivo研究における使用に関する。機能的抗体断片には、抗原への特異的結合が可能な断片が含まれ得る。機能的抗体断片は、例えば、FAB又は単鎖可変断片(scFv)であってもよい。更なる態様では、本発明は、「完全な(fully)」コンパニオンアニマル抗体及び抗体鎖(「完全な(fully)」は、抗体の可変領域と定常領域との両方が同一の種のコンパニオンアニマルの遺伝子から発現するという事実を反映する)、並びに前記抗体及び鎖の断片及び機能的誘導体、並びに前記抗体、鎖及び断片の、診断を含む医学並びにin vitro又はex vivo研究における使用に関する。
【０１６０】
モノクローナル抗体とポリクローナル抗体との両方を生成する方法は当該技術分野で周知であり、本発明は、本発明のげっ歯動物における抗原負荷に応答して産生されるキメラ又は完全なコンパニオンアニマル抗体のポリクローナル抗体とモノクローナル抗体との両方に関する。
【０１６１】
更なる態様では、本発明は、薬物及びワクチンの試験のためのモデルとしての、本明細書に記載されるようなげっ歯動物の使用に関する。したがって、本発明は、薬物又はワクチンの同定又は検証のための方法であって、本発明の哺乳動物にワクチン又は薬物を送達する工程と、及び免疫応答、安全性プロファイル、疾患に対する影響の1つ以上をモニタリングする工程とを含む方法に関する。
【０１６２】
更に別の態様では、本発明で生成されたキメラ抗体又は抗体鎖を適切にDNAレベルで操作して、抗体様の特性又は構造を有する分子、例えばドメイン抗体等の定常領域が存在しない重鎖若しくは軽鎖からコンパニオンアニマルの可変領域、又は、同種若しくは異種由来の重鎖若しくは軽鎖のいずれかからの任意の定常領域を有するコンパニオンアニマルの可変領域、又は天然に存在しない定常領域を有するコンパニオンアニマルの可変領域、又は他の任意の融合パートナーを有するコンパニオンアニマルの可変領域を生成することができる。本発明は、本発明に従って同定されたキメラ抗体に由来する全てのそのようなキメラ抗体誘導体に関する。
【０１６３】
本発明はまた、本明細書に開示される抗体又は抗体誘導体、及びそのような抗体又は緩衝液、抗体検出試薬等の適切な実験用試薬の使用説明書のいずれかを含むキットに関する。
【０１６４】
本発明はまた、抗体、又はその一部を作製する方法であって、
(i)本発明に従って得られた抗体若しくはその一部をコードする核酸、又は
(ii)本発明に従って得られた抗体若しくはその一部をコードする核酸を発現させて抗体を産生させることができる配列情報
を提供する工程を含む方法に関する。
【０１６５】
本発明はまた、コンパニオンアニマルの可変領域とげっ歯動物の定常領域(必要に応じて、Cガンマ又はCミュー)を含むキメラ抗体に関し、抗体は、細胞(必要に応じて、B細胞、ES細胞又はハイブリドーマ)のキメラ重鎖の座位のヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列によりコードされ、座位は、げっ歯動物の定常領域のヌクレオチド配列、並びに、コンパニオンアニマルのV領域、コンパニオンアニマルのD領域、及びコンパニオンアニマルのJ領域のin vivo再構成によって生成された再構成VDJヌクレオチド配列を含み、コンパニオンアニマルのV領域は、イヌ科の動物のIGH V4-1、V3-2、V3-3、V3-4、V3-5のIGH可変領域遺伝子から選択される。
【０１６６】
必要に応じて、J領域は、イヌ科の動物のJH1、JH2、JH3、JH4、JH5、又はJH6のいずれかである。
【０１６７】
必要に応じて、D領域は、イヌ科の動物のDH1、DH2、DH3、DH4、DH5、及びDH6のいずれかである。
【０１６８】
一態様では、抗体は、本明細書の実施例及び図面に例示される任意の組み合わせを含む。必要に応じて、in vivo再構成は、定常領域配列と同一のげっ歯動物種(例えば、マウスB細胞又はES細胞)の細胞(例えば、B細胞又はES細胞)内で起きる。本発明はまた、そのゲノムがこの段落で上述したキメラ重鎖座位を含む非ヒト脊椎動物又は哺乳動物細胞(例えば、B細胞又はES細胞又はハイブリドーマ)に関する。
【０１６９】
本発明はまた、そのゲノムがこの段落で上述したキメラ重鎖座位を含む非ヒト脊椎動物又は哺乳動物(例えば、マウス又はラット)に関する。
【０１７０】
本発明の抗体は単離されてもよく、一態様では、それらが発現する細胞又は生物から単離される。
【０１７１】
本発明はまた、抗体鎖の一部に関する。特に、この一部は少なくとも抗体の可変領域を含む。これは、特に抗体産生のために、細胞から発現し得る。この一部は、抗体のFab領域を含んでもよく、又は少なくともCDR領域を含んでもよい。
【０１７２】
本発明は、抗体又は抗体鎖の生成方法であって、本明細書に記載のげっ歯動物を、げっ歯動物のゲノムに存在するコンパニオンアニマルのDNAの供給源と同一のコンパニオンアニマルから得ることのできる抗原で免疫する工程を含む方法に関する。例えば、イヌ科の動物の抗原は、本明細書に開示されるイヌ科の動物のV、D、及びJ遺伝子を含むげっ歯動物を免疫するために使用することができる。
【０１７３】
したがって、本発明はまた、げっ歯動物のゲノムに存在するコンパニオンアニマルのDNAの供給源に対応するコンパニオンアニマル由来の抗原で免疫されたげっ歯動物に関する。
【０１７４】
正確に同一のコンパニオンアニマルを使用する必要はない。例えば、ある品種から採取したイヌ科の動物の抗原を使用して、異なる品種由来のイヌ科の動物のDNAを含むげっ歯動物を免疫することができる。同一の犬品種由来の抗原も使用できる。
【０１７５】
代替的に、抗原は、コンパニオンアニマルに感染することが知られている細菌又はウイルス等の病原体由来のものであり得る。例えば、イヌに感染して疾患を引き起こす病原体由来の抗原は、本明細書に開示されるイヌ科の動物のV、D、及びJ遺伝子を含むげっ歯動物を免疫するために使用することができる。
【０１７６】
したがって、本発明は、げっ歯動物のゲノムに存在するコンパニオンアニマルのDNAの供給源に対応するコンパニオンアニマルに疾患を引き起こす抗原で免疫されたげっ歯動物に関する。
【０１７７】
更なる態様では、抗原は、ヒトの疾患に関連する、好ましくはヒトの疾患の予防又は治療の標的として検証されているヒト抗原のコンパニオンアニマルでの均等物であってもよい。
【０１７８】
一態様では、本発明は、本明細書に記載の抗原によるげっ歯動物の免疫により得られるか、又は得ることのできる抗体鎖又はその断片を提供する。
【０１７９】
本発明はまた、前記抗体、抗体鎖、又はそれらの一部をコードするDNA又はRNA等の核酸に関する。特に、その一部は抗体鎖の可変部分である可能性があり、これはげっ歯動物内のコンパニオンアニマルのDNAによってコードされる部分である。
【０１８０】
本発明はまた、部分的に若しくは完全にイヌ科の動物の抗体鎖、又は部分的に若しくは完全にイヌ科の動物の抗体鎖の一部を発現するB細胞若しくはハイブリドーマ等の細胞、又は発現細胞株(例えばCHO細胞)に関し、そのDNA又はタンパク質の配列は、本明細書に記載のげっ歯動物から得ることができるか、又は得られている。
【０１８１】
目的の抗体が免疫されたげっ歯動物から同定されると、B細胞からその抗体をコードするDNA配列を同定し、その配列から、又は、遺伝暗号の冗長性の結果として同一のタンパク質を発現できる実際には別のDNA配列から、抗体又はその部分を発現することができることは、当該技術分野で標準的であることが理解されよう。特に、イヌ科の動物の可変領域をイヌ科の動物の定常領域とともに発現して、完全なイヌ科の動物の抗体鎖又は抗体を生成することができる。
【０１８２】
したがって、本発明はまた、完全なイヌ科の動物の抗体を得る方法であって、
少なくとも1つの重鎖イヌ科の動物の免疫グロブリンV遺伝子セグメント、少なくとも1つのイヌ科の動物の重鎖D遺伝子セグメント、及び少なくとも1つのイヌ科の動物の重鎖J遺伝子セグメントを有する、並びに/又は少なくとも1つの軽鎖イヌ科の動物の免疫グロブリンV遺伝子セグメント及び少なくとも1つのイヌ科の動物の重鎖J遺伝子セグメントを有するげっ歯動物を本明細書に記載される抗原で免疫する工程と、
イヌ科の動物のDNAによってコードされる可変抗体領域を有する、げっ歯動物によって産生された抗体鎖(複数可)を選択する工程と、
好ましくは完全なイヌ科の動物のものであり、例えば、イヌ科の動物の可変領域とイヌ科の動物の定常領域を含む抗体若しくは抗体鎖又はその一部を発現するために、発現細胞株のDNAからその可変抗体領域を発現させる工程と、
必要に応じて、抗体、抗体鎖又はその一部を精製する工程と、
必要に応じて、それを必要とするコンパニオンアニマルへの投与を可能にするのに適した薬学的に許容される賦形剤とともに抗体若しくは鎖又はその一部を更に製剤化する工程と
を含む方法を提供する。
【０１８３】
本発明はまた、コンパニオンアニマルの治療におけるそのような抗体若しくは抗体鎖又はその断片の使用に関する。
【０１８４】
上述のアプローチは、ネコやウマ等の他の好ましいコンパニオンアニマルにも同様に適用される。ネコ科の動物の抗原は同等のネコ科の動物/げっ歯動物モデルで使用でき、ウマ科の動物の抗原は同等のウマ科の動物/げっ歯動物モデルで使用でき、本発明の他の全ての態様はネコ及びウマに同様に適用できる。
【０１８５】
本発明は、交差反応性抗体又は抗体鎖の生成方法であって、本明細書に開示されるコンパニオンアニマルのDNAを含むげっ歯動物を、前記げっ歯動物由来の目的の抗原及びコンパニオンアニマル由来の対応する抗原で免疫する工程を含み、げっ歯動物が前記抗原をコードする遺伝子の遺伝子ノックアウトを含む、方法に関する。前記免疫されたげっ歯動物から生じる抗体集団は、げっ歯動物とコンパニオンアニマルの抗原の両方に結合することができる、すなわち、交差反応する抗体を含むことができる。
【０１８６】
したがって、更なる態様では、本発明は、目的のげっ歯動物の抗原及びコンパニオンアニマル由来の対応する抗原で免疫された、本明細書に記載のコンパニオンアニマルのDNAを含むげっ歯動物に由来する交差反応性抗体又は抗体断片に関し、げっ歯動物が前記抗原をコードする遺伝子の遺伝子ノックアウトを有する。
【０１８７】
一態様では、げっ歯動物は、タンパク質又はそのペプチド断片で直接的に、又は関連する抗原若しくはその断片をコードするベクター、又は所望の抗原を発現する同系細胞株のいずれかによって、げっ歯動物の抗原によって、及びコンパニオンアニマル由来の対応する抗原によって、逐次的に又は同時に免疫される。
【０１８８】
一態様では、げっ歯動物はマウスであり、コンパニオンアニマルは、イヌ、ネコ、又はウマである。
【０１８９】
創薬の分野では交差反応性抗体が非常に重要である。交差反応性抗体は、抗体修飾の必要なしに、抗体が反応性である他の種をモデルとして使用することにより、抗体が反応性である種のための薬物候補として迅速に検証できる。
【０１９０】
本発明はまた、本明細書で請求されるげっ歯動物の免疫のためのイヌ科の動物の抗原の使用に関し、本明細書で請求されるげっ歯動物の免疫のためのイヌ科の動物の抗原に関し、イヌ科の動物の抗原は、ヒトにおいてファミリー遺伝子又はタンパク質均等物を有し、好ましくは治療的に検証されており、ヒト均等抗原に対する抗体が疾患の治療に有効であることが示されていることを意味する。
【０１９１】
本発明は、イヌ科の動物とヒトとのIg可変領域の間の強い相同性を初めて開示する。図16を参照されたい。[生殖系列イヌ科の動物-ヒトIG Vの強い相同性、TCR V相同性はあまり保存されていない]。この情報は、イヌ科の動物の可変領域のDNAを含むげっ歯動物モデルは、例えば、マウスの制御配列を必要とするのではなく、イヌ科の動物の制御配列を利用できる可能性があることを示唆し、これは、ヒト化マウスがマウス内のヒト制御配列を使用できるためである。実際、本発明者等は、挿入されたイヌ科の動物のゲノムDNAの制御配列とRSS配列は、げっ歯動物によって認識され、げっ歯動物でキメラ抗体を発現するために使用できることを実験的に検証した。
【０１９２】
本発明者等によるこれらの発見は驚くべきものであり、イヌ科の動物とヒトの進化的相違に基づいて予想されるものではない。
【０１９３】
割り当てられた系統発生内で、マウスとヒトは、(例えば)ネコ及びイヌを含む肉食動物、並びにウマのいずれよりも密接に関連していることはよく知られている。これが、ヒトDNAのV、D、及びJ遺伝子セグメント挿入を有するキメラマウスモデルでのヒト制御配列の使用が前記モデルで成功する理由である可能性が高い。これに基づいて、ヒト及びイヌ等の進化的により多様な動物についても同じことは予測できなかった。実際、マウスでイヌ科の動物の遺伝子セグメントを使用しようとする以前の試みでは、ネズミの制御性制御配列を利用していた(例えば、Trianni、US2017306352)。
【０１９４】
一態様では、本発明は、挿入された(コンパニオンアニマル)IGHJ4及びIGHJ6が成熟B細胞抗体集団に見られる主要なJH遺伝子セグメントであるげっ歯動物に関する。好ましくは、げっ歯動物はイヌ科の動物のV、D、及びJ遺伝子セグメントを含み、J4及びJ6はイヌ科の動物のJ4及びJ6遺伝子セグメントである。本発明の一態様では、げっ歯動物は、げっ歯動物抗体レパートリー内の抗体鎖の生成において、異なる挿入IGH Dセグメントの1、2、3、4、5、6、若しくはそれ以上、又はその全て、並びに/又は挿入されたIGH J遺伝子セグメントの1、2、3、4、5、6、若しくはそれ以上、又はその全てを使用することができる。
【０１９５】
イヌ科の動物の挿入された重鎖D1-6及びJ1-6遺伝子セグメントを有する現在試験されているげっ歯動物マウスは、抗体形成においてイヌ科の動物のIGH J1-6及びD1-6の全てを利用することができる。
【０１９６】
本発明の一態様では、げっ歯動物は、他の軽鎖J遺伝子セグメントよりも多くのIGLJ1を利用する。
【０１９７】
本発明の一態様では、げっ歯動物はイヌ由来のコンパニオンアニマルのDNAを含み、げっ歯動物は以下の特徴のうちの1つ以上を有する:
げっ歯動物は、IGHJ4から発現するキメラ抗体重鎖を、個々に、IGHJ1、2、3、5、又は6のいずれよりも多く発現し、げっ歯動物は、IGHJ6から発現するキメラ抗体重鎖を、個々に、IGHJ1、2、3、又は5のいずれよりも多く発現する;
げっ歯動物は、IGHD5から発現するキメラ抗体重鎖を、個々に、IGHD1、2、3、4、又は6のいずれよりも多く発現する;
げっ歯動物は、IGHD2から発現するキメラ抗体重鎖を、個々に、IGHD1、3、4、又は6のいずれよりも多く発現する;
げっ歯動物は、IGHJ4とともにIGHD2から抗体鎖を発現する;
げっ歯動物は、IGHJ4とともにIGHD5から抗体鎖を発現する;
げっ歯動物は、IGHJ4とともにIGHD5から、イヌ科の動物のIGHDとIGHJセグメントの他の組み合わせのいずれかから発現するよりも多くの抗体鎖を発現する;
げっ歯動物は、IGLJ1から発現するキメラ抗体軽鎖を、任意の他のIGL J遺伝子セグメントよりも多く発現する。
【０１９８】
一態様では、げっ歯動物は、以下のような挿入されたイヌ科の動物の重鎖遺伝子セグメントを含む。J1-6、D1-6、V4-1、V3-2、V3-3、及びV3-5、必要に応じてV3-4(偽遺伝子である)とともに。
【０１９９】
一態様では、げっ歯動物は、以下のような挿入されたイヌ科の動物のラムダ軽鎖遺伝子セグメントを含む。C1-9を伴うJ1-9(つまり、完全なイヌ科の動物のラムダJCクラスター)、並びにV3-2、V3-3、V3-4、V4-5、V4-6、並びに必要に応じてV3-1及びV3-7(どちらも偽遺伝子)。
【０２００】
本発明のげっ歯動物は、挿入されたコンパニオンアニマルのV、D、及びJ遺伝子セグメントをN及び/若しくはP付加により適切に修飾することができ、並びに/又は挿入されたコンパニオンアニマルのV、D、及びJ遺伝子セグメントの体細胞超変異を受けることができる。
【０２０１】
本発明はまた、HCDR3、VHドメイン、抗体重鎖、又は抗体を提供し、ここで、重鎖又は抗体のVHドメインは、げっ歯動物のAIDパターン体細胞超変異及び/又はマウスdTdパターン変異を含む。このパターンは、例えば、VHドメインが、げっ歯動物AID及び/又はげっ歯動物TdT(例えば、内因性AID又はTdT)を含むげっ歯動物で産生される場合に提供され得る。マウスは好ましいげっ歯動物である。
【０２０２】
本発明の一態様では、キメラ抗体鎖の可変領域は、抗体を生成するために使用されるV、D、及びJ遺伝子セグメントの生殖系列配列から予測されるアミノ酸配列とは異なる。そのため、ある程度の体細胞超変異、及び/又はN/Pの付加が存在していた。
【０２０３】
驚くべきことに、実施例4のRNAシークエンシングアプローチを使用して両方の試料を同一の深度で調査すると、イヌ科の動物のV、D、及びJ遺伝子セグメントを含むげっ歯動物を使用して生成されたキメラ抗体集団の多様性、又は本明細書に記載のV及びJセグメントは、遺伝子セグメントが由来する野生型イヌの観察された抗体多様性よりも大きいことが本発明者等により見出された。図21は、イヌ科の動物の重鎖V、D、及びJ遺伝子セグメント、又は軽鎖V及びJセグメントを含むげっ歯動物のシークエンシングされたライブラリー内で一度だけ見つかった抗体ヌクレオチド配列が、イヌ自体で見出されるものよりも、はるかに多いことを示している。
【０２０４】
そのため、本発明は、各抗体が少なくとも1つのコンパニオンアニマルの遺伝子セグメントの発現に起因するキメラ抗体鎖の集団を発現する本明細書に記載の任意のげっ歯動物に関し、その集団は、対応するコンパニオンアニマルに見られる抗体の集団と比べて、より多様であるか又は少なくとも同じくらい多様である。換言すると、げっ歯動物で生成される抗体集団の多様性は、コンパニオンアニマルの抗体レパートリーで見られるものよりも大きいか、又は少なくとも同じくらい大きい。
【０２０５】
好ましくは、イヌ科の動物のDNAのV、D、及びJ遺伝子セグメント、又は軽鎖V及びJセグメントを有するマウスで生成される抗体集団の多様性は、イヌの抗体レパートリーで見られるものよりも大きいか、又は少なくとも同じくらい大きい。
【０２０６】
適切には、集団の多様性は、重鎖集団又は軽鎖集団、或いはその両方に存在する一意的な抗体配列の数によって評価される。
【０２０７】
本発明はまた、例えば実施例4における、5'RACEによって決定されるような配列に関して、少なくとも65%、又は少なくとも70%が一意的であるキメラ抗体鎖の集団を含むげっ歯動物、例えば、65〜80%のキメラ抗体配列が一意的であるげっ歯動物、例えば、65〜75%が一意的であるげっ歯動物に関する。
【０２０８】
げっ歯動物は本明細書に開示されるいずれのげっ歯動物であってよく、例えば、一態様では、げっ歯動物は、以下のような挿入されたイヌ科の動物の重鎖遺伝子セグメントを含む。J1-6、D1-6、V4-1、V3-2、V3-3、及びV3-5、必要に応じてV3-4(偽遺伝子である)とともに。一態様では、げっ歯動物は、以下のような挿入されたイヌ科の動物のラムダ軽鎖遺伝子セグメントを含む。C1-9とともにJ1-9(完全なイヌ科の動物のラムダJCクラスター)、並びにV3-2、V3-3、V3-4、V4-5、V4-6、並びに必要に応じてV3-1及びV3-7(どちらも偽遺伝子)。一態様では、げっ歯動物は、イヌ科の動物の重鎖挿入と軽鎖挿入の両方を含む。
【０２０９】
本発明はまた、コンパニオンアニマル自体で見られるよりも多いか、又は少なくとも同程度多様なキメラ抗体鎖又は抗体のレパートリーの生成における、本明細書に開示されるコンパニオンアニマルのDNAを含む任意のげっ歯動物(例えばマウス)の使用に関し、コンパニオンアニマル自体に見られるよりも多いか、又は少なくとも同程度多様なキメラ抗体鎖又は抗体のレパートリーを生成するための本明細書に開示されるコンパニオンアニマルのDNAを含むマウス等のげっ歯動物に関する。
【０２１０】
したがって、本発明の好ましい態様は次のとおりである。
【０２１１】
抗体又は抗体鎖の生成方法であって、請求項1から13に記載のげっ歯動物を、げっ歯動物のゲノムに存在するコンパニオンアニマルのDNAの供給源と同一であるコンパニオンアニマルから得られるか、又は得ることのできる抗原で免疫する工程を含み、抗原が、タンパク質抗原、抗原を発現する細胞、又は抗原をコードする核酸であり得る方法。
【０２１２】
抗体又は抗体鎖の生成方法であって、請求項1から13に記載のげっ歯動物を、げっ歯動物のゲノムに存在するコンパニオンアニマルのDNAの供給源であるコンパニオンアニマルの種に感染する細菌又はウイルス等の病原体由来の抗原で免疫する工程を含む方法。
【０２１３】
げっ歯動物のゲノムに存在するコンパニオンアニマルのDNAの供給源に対応するコンパニオンアニマル由来の抗原で免疫された請求項1から13に記載のげっ歯動物。
【０２１４】
げっ歯動物のゲノムに存在するコンパニオンアニマルのDNAの供給源に対応するコンパニオンアニマルに疾患を引き起こす抗原で免疫された請求項1から13に記載のげっ歯動物。
【０２１５】
ヒトの疾患に関連するヒト抗原のコンパニオンアニマル抗原均等物で免疫された、請求項1から13に記載のげっ歯動物。
【０２１６】
げっ歯動物がイヌ由来のコンパニオンアニマルのDNAを含み、げっ歯動物は以下の特徴のうちの1つ以上又は全てを有する、請求項1から13に記載のげっ歯動物:
げっ歯動物は、IGHJ4から発現するキメラ抗体重鎖を、個々に、IGHJ1、2、3、5、又は6のいずれよりも多く発現する;
げっ歯動物は、IGHJ6から発現するキメラ抗体重鎖を、個々に、IGHJ1、2、3、又は5のいずれよりも多く発現する;
げっ歯動物は、IGHD5から発現するキメラ抗体重鎖を、個々に、IGHD1、2、3、4、又は6のいずれよりも多く発現する;
げっ歯動物は、IGHD2から発現するキメラ抗体重鎖を、個々に、IGHD1、3、4、又は6のいずれよりも多く発現する;
げっ歯動物は、IGHJ4とともにIGHD2から抗体鎖を発現する;
げっ歯動物は、IGHJ4とともにIGHD5から抗体鎖を発現する;
げっ歯動物は、IGHJ4とともにIGHD5から、イヌ科の動物のIGHDとIghJセグメントの他の組み合わせのいずれかから発現するよりも多くの抗体鎖を発現する;
げっ歯動物は、IGLJ1から発現するキメラ抗体軽鎖を、任意の他のIGL J遺伝子セグメントよりも多く発現する。
【０２１７】
以下のような挿入されたイヌ科の動物の重鎖遺伝子セグメントを含む、請求項1から13に記載のげっ歯動物。J1-6、D1-6、V4-1、V3-2、V3-3、及びV3-5、必要に応じてV3-4とともに。
【０２１８】
以下のような挿入されたイヌ科の動物のラムダ軽鎖遺伝子セグメントを含む、請求項1から13に記載のげっ歯動物。J1-9、C1-9、V3-2、V3-3、V3-4、V4-5、V4-6、並びに必要に応じて、V3-1及びV3-7。
【０２１９】
挿入されたコンパニオンアニマルのV、D、及びJ遺伝子セグメントをN及び/若しくはP付加によって改変できる、並びに/又は体細胞超変異を示す請求項1から13に記載のげっ歯動物。
【０２２０】
各抗体鎖が少なくとも1つのコンパニオンアニマルの遺伝子セグメントの発現に起因するキメラ抗体鎖の集団を発現し、そのキメラ抗体集団が、対応する野生型コンパニオンアニマルに見られる抗体集団よりも多様である、請求項1から13に記載のげっ歯動物。
【０２２１】
少なくとも65%、又は少なくとも70%が一意的であるキメラ抗体鎖の集団を含み、必要に応じて、げっ歯動物がイヌである、請求項1から13に記載のげっ歯動物。
【０２２２】
65〜75%が一意的であるげっ歯動物等、キメラ抗体配列の65〜80%が一意的である、請求項1から13に記載のげっ歯動物。
【０２２３】
コンパニオンアニマル自体に見られるよりも多様なキメラ抗体鎖又は抗体のレパートリーの生成における、請求項1から13に規定のコンパニオンアニマルのDNAを含む任意のげっ歯動物(例えば、マウス)の使用。
【０２２４】
コンパニオンアニマル自体に見られるよりも多様なキメラ抗体鎖又は抗体のレパートリーを生成するための、マウス等の、請求項1から13に記載のげっ歯動物。
【０２２５】
挿入されたコンパニオンアニマルV、D、又はJ遺伝子セグメントの1つ以上が、同一のコンパニオンアニマル由来の制御配列を伴い、必要に応じて制御配列が個々のV遺伝子セグメントに先行するプロモーター、及び/又はスプライス部位、及び/又はV(D)J組換えのための組換えシグナル配列を含む、請求項1から13に記載のげっ歯動物。
【０２２６】
挿入されたコンパニオンアニマルのV、D、又はJ配列に同一のコンパニオンアニマル由来のRSS配列が隣接し、宿主のげっ歯動物のRSS配列が使用されない、請求項1から13に記載のげっ歯動物。
【０２２７】
ある品種のイヌ科の動物のDNAを含み、異なる犬品種の疾患の治療又は予防に使用するための、抗体若しくは抗体鎖、又はその一部の生成に使用する、請求項1から13に記載のげっ歯動物。
【０２２８】
ある品種のイヌ科の動物のDNAを含み、異なる犬品種の処理に使用するための、抗体鎖又はその一部の生成における、請求項1から13に記載のげっ歯動物の使用。
【０２２９】
1つ以上又は全てのイヌ科の動物のV、D、及びJセグメントがボクサー犬由来である、請求項1から13に記載のげっ歯動物。
【０２３０】
本明細書に記載される特定の実施形態は、本発明の限定としてではなく、例示として示されることが理解されるであろう。本発明の主な特徴は、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な実施形態で使用することができる。当業者は、日常的な研究にすぎないものを用いて、本明細書において記載される具体的な手順の多くの均等物を認識するか、又はそれを確かめることができるであろう。そのような均等物は、本発明の範囲内にあるとみなされ、特許請求の範囲に含まれる。本明細書中で言及されている全ての刊行物及び特許出願は、本発明が関係する当業者の技術水準を示している。全ての刊行物及び特許出願は、個々の刊行物又は特許出願が、参照により組み込まれているように具体的かつ個別に示されているかのように、それと同程度まで、参照により本明細書に組み込まれている。特許請求の範囲及び/又は本明細書において用語「含む(comprising)」と合わせて使用される場合の「1つの(a)」又は「1つの(an)」という用語の使用は、「1つ(one)」を意味する場合もあるが、それはまた「1つ以上(one or more)」、「少なくとも1つ(at least one)」、及び「1つ又は1つ以上(one or more than one)」の意味とも一致する。特許請求の範囲における用語「又は(or)」の使用は、本開示が選択肢のみ、及び「及び/又は(and/or)」を指す定義を裏付けるとしても、選択肢のみを指すと明示的に示されない限り、又は選択肢が互いに排他的である場合を除いて、「及び/又は(and/or)」を意味するのに使用される。この出願全体を通して、「約(about)」という用語は、値が装置、すなわち値を決定するために採用されている方法の誤差の固有の変動、又は研究対象間に存在する変動を含むことを示すために使用される。
【０２３１】
本明細書及び特許請求の範囲において使用されるとき、用語「含むこと(comprising)」(並びに、「含む(comprise)」及び「含む(comprises)」等の含むことの任意の形態)、「有する(having)」こと(並びに、「有する(have)」及び「有する(has)」等の有することの任意の形態)、「含む(including)」こと(並びに、「含む(includes)」及び「含む(include)」等の含むことの任意の形態)、又は「含む(containing)」こと(並びに、「含む(contains)」及び「含む(contain)」等の含むことの任意の形態)は、両立的又はオープンエンドであり、追加の、言及されていない要素又は方法の工程を排除しない。
【０２３２】
本明細書において使用されるとき、「又はそれらの組み合わせ(or combinations thereof)」という用語は、用語に先行して列挙された項目の全ての順列及び組み合わせを指す。例えば、「A、B、C、又はそれらの組み合わせ(A, B, C, or combinations thereof)」は、A、B、C、AB、AC、BC、又はABCの少なくとも1つを含むことを意図しており、特定の文脈において順序が重要である場合、BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC、又はCABをもまた含む。この例を続けると、例えばBB、AAA、ABAB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等の1つ以上の項目又は用語の繰り返しを含む組み合わせが明示的に含まれる。当業者であれば、文脈から他が明らかでない限り、典型的には、任意の組み合わせにおける項目又は用語の数に制限はないことを理解するであろう。
【０２３３】
本開示の任意の部分は、文脈からそうでないことが明らかでない限り、本開示の任意の他の部分と組み合わせて読むことができる。
【０２３４】
本明細書に開示され請求される全ての組成物及び/又は方法は、本開示に照らして過度の実験をすることなく作製及び実行することができる。本発明の組成物及び方法を好ましい実施形態に関して説明してきたが、本発明の概念、趣旨及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載される、組成物及び/又は方法、並びに方法の工程又は工程の順序に変更を加えてもよいことが当業者には明らかであろう。当業者に明らかなそのような類似の置換及び改変は全て、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨、範囲及び概念内にあるとみなされる。
【０２３５】
本発明は、以下の非限定的な実施例においてより詳細に説明される。
【実施例】
【０２３６】
(実施例1)
イヌ科の動物のIG座位のアノテーション
イヌは、ヒトの疾患の優れたモデルであり、例えば、イヌ科の動物のリンパ腫の治療は、多くの場合、その治療に対するヒトの反応を予測する。しかしながら、それらの抗原受容体(AR)遺伝子の座位が不完全にしか分っていないため、その使用は制限される。この研究は、イヌ科の動物のAR座位のアノテーションを進め、その進化ストレスを調査する方法を開発し、座位の品種固有の特徴を調べる。偏りのないRNAシークエンシングとともにバイオインフォマティクスのアプローチを使用して、イヌ科の動物のAR遺伝子のアノテーションを完成させ、これらの配列を使用して19の品種から107個の全ゲノム配列を照会した。既存の方法と新規の方法の組み合わせを使用して、これらの遺伝子にわたる多様性と変異率を分析した。AR座位の約550個の遺伝子セグメント(そのうち326に新たにアノテーションが付けられている)にわたって5,500を超える新規対立遺伝子が同定され、AR進化の洞察が得られ、並びにイヌとヒトとの間において、そのいずれかとマウスとの間よりも保存性が高いことが確認された。この研究により、イヌのARの遺伝学と発現に関する理解がマウス及びヒトと同一の高水準になり、アノテーションを付けた全てのAR座位を有する、たった3番目の種になった。多数のゲノム配列は、将来の研究の参考になり、これらの座位を形作ったストレスについて統計的に強力な結論を引き出すことができた。
【０２３７】
1.導入
この研究では、イヌ科の動物のIGK及びIGLにアノテーションが付けられ、IGH座位が更新された(図1〜図3)。100匹を超えるイヌの全ゲノム配列データを使用して、5,000の非参照対立遺伝子を同定し、これらは、これらの座位を形作った進化ストレスに光を当てた。種間比較により、更なる洞察が得られ、イヌがより忠実な免疫モデルであることを確認した。
【０２３８】
2.物質及び方法
2.1.1  バイオインフォマティクスによるアノテーション
座位には、最初はDas等に類似する方法に従って、Olivieri等のアルゴリズムと同等の原理を使用してアノテーションが付けられた1、2。簡潔に述べると、ヒト及びマウスの配列を使用して、イヌ科の動物の参照ゲノム(CanFam3.1)を調査した。領域が同定されると、AR遺伝子を局所的に検索した。当初はマウスとヒトのAR遺伝子とRSSコンセンサスが使用されていたが、より多くのイヌ科の動物の遺伝子が同定されると、代わりにこれらが使用された。次に、RNAシークエンシングデータのアライメントに基づいてアノテーションを検証し、追加した。
【０２３９】
2.1.2  イヌ
26匹のイヌから末梢血試料を確保した。試料は、ケンブリッジ大学の獣医病院で見られる患畜からの獣医が義務付けられた採血の未使用の臨床的過剰のものであった。この研究は、ケンブリッジ大学の獣医学部の倫理委員会から事前に承認を受けていた。
【０２４０】
2.1.3  シークエンシング
製造者の取扱説明書に従って、Ficoll-Paque(GE Healthcare社)を使用して、末梢血から単核細胞を単離した。細胞は、Wellcome Trust Sanger Instituteのコアシークエンシングチームにより、polyAプルダウンを使用してmRNAに処理され、切断され、250bpのペアエンドリードを使用して、HiSeq 2500マシン(Illumina社)でシークエンシングされた。
【０２４１】
2.1.4  遺伝子命名
AR遺伝子はファミリーに分割され、Bao等3と同一の基準を使用して、機能的、偽遺伝子、又はORFとして割り当てられた。ファミリー番号は、ヒトのファミリーとの相同性に基づいて割り当てられ、明らかな一致が見つからない場合に新規の番号が与えられた。全ての遺伝子名は、IMGT4の命名体系に合わせて割り当てられた。
【０２４２】
2.1.5  非参照対立遺伝子
107個のイヌ科の動物の全ゲノム配列からのAR座位へのバリアントコールファイルのマッピングは、ミネソタ大学のSteven Friedenbergから親切に提供された。
【０２４３】
2.1.6  種間及び種内の座位アライメント
RepeatMaskerを使用して配列をマスクし、PipMakerを使用してアライメントプロットを生成した5、6。
【０２４４】
2.1.7  系統樹解析
Clustal Omegaを使用して配列をアライメントし、Interactive Tree of Lifeを使用して出力ツリーを視覚化した7、8。
【０２４５】
3.結果
3.1.1  遺伝子数
以前にアノテーションされた座位内で、3つの新規のIGHJ遺伝子が同定された。7つの遺伝子ファミリーにわたる162のIGLV遺伝子が同定され、IGLV1は86のメンバーを有する最大のものであった。他のIGL座位と一致して、J及びC遺伝子は合計9個の対として発見された。19個のIGKV遺伝子が同定され、そのうち14個はIGKV2で、同時に5個のIGKJ遺伝子と1個のIGKC遺伝子が同定された。
【０２４６】
3.1.2  非参照対立遺伝子
全て現在のリファレンスビルド(CanFam3.1)とアライメントしされた19品種のイヌ107匹からの全ゲノム配列が新規AR対立遺伝子について調査され、3つの座位にわたって4,074個が同定された。対立遺伝子の分布に関して、参照対立遺伝子は、コールされた68,908個の対立遺伝子のうち53,311回発見された(77%)。対立遺伝子の分布における有意な品種特異性は同定されなかった。
【０２４７】
機能的、偽遺伝子、又はORFの割り当ては、全ての新規対立遺伝子で行われ、参照対立遺伝子に戻して比較された。新規の対立遺伝子の大部分(72.8%)は、参照対立遺伝子と同一の機能を有する。新規の対立遺伝子の機能を選択中の対立遺伝子の機能とみなすと、「喪失(loss)」(23.8%)である対立遺伝子が多くなり、すなわち、新規の対立遺伝子が機能的である、「獲得(gain)」(3.4%)よりも、新規の対立遺伝子は偽遺伝子であった。機能を得るよりも機能を失うためのはるかに多くの方法があるため、これは驚くことではなく、したがって、変異がその変化の方向をもたらす可能性が高い。機能からのORFへの変更は喪失として分類され、偽からのORFへの変更は獲得として分類された。
【０２４８】
非参照V対立遺伝子は、全ての試料及び座位で13,129回コールされた。興味深いことに、IGKV2-S13、及び8つのIGLV遺伝子は、ボクサーの試料を含む非参照対立遺伝子としてのみ検出された。これはおそらく参照ゲノムのエラーであるが、参照イヌがたまたまこのデータセットに表れない9つのまれな対立遺伝子を有している可能性もある。非参照対立遺伝子を考慮すると、選択圧がなかったとき、データセット内の変更タイプの分布は、対立遺伝子自体内の分布と同一になる。例えば、対立遺伝子の3.4%は「獲得」であるため、データセット内で446回の獲得対立遺伝子の検出が期待される。
【０２４９】
しかしながら、喪失の変化は予想よりも少ない頻度で検出され、変化や獲得は予想よりも頻繁には検出されない(図7)。更に、品種間の差異は非常に低く、品種依存性が限られているAR座位の選択圧に更に重きが置かれた。z検定が実行され、母集団と予想平均の差は非常に有意で、p=2.34×10-25からp=0の範囲であった(値の計算に使用されるソフトウェアは1×10-250未満のp値を表示できない)。
【０２５０】
3.1.3  座位の構造
イヌ科の動物のIGH座位は、アンチセンス鎖上の第8染色体のサブテロメアに位置する。このテロメアの位置は、単孔類及び有袋類を除く全ての哺乳類で観察される1。しかしながら、軽鎖座位は、ヒト、マウス、及びイヌ間の染色体位置の強力な保存を示さない。
【０２５１】
ヒト及びマウスのIGH座位と同様に、イヌ科の動物のIGH座位は、定常領域と同一の意味で転写される全ての機能的遺伝子セグメントがあり、1つの偽遺伝子で転写が逆方向である(図1)。IGH座位の構造は、バオ等によって発表されたものと類似する3。しかしながら、3つの新規のIGHJ遺伝子が同定されており、V遺伝子の位置と予想される機能にはわずかな違いがあるが、絶対的な比率と数は一致している。この不一致は、参照ゲノムの異なるビルドの使用が原因である可能性があり、このアノテーションは、最新の公開されているビルド(CanFam3.1)を使用している。
【０２５２】
イヌ科の動物のIGK座位は小さく(約400kbp)、また通常ではない構造を有する(図2)。J及びC遺伝子の上流に11個のV遺伝子があり、IGKV2ファミリーの8つのC遠位遺伝子が全て機能し、3つのC近位遺伝子とは異なり、J及びC遺伝子と同一の転写方向にある。しかしながら、また、他の遺伝子の下流に8つのV遺伝子があり、他の遺伝子に対して大部分が反転している。これはウマ科の動物のIGL座位を連想させるもので、向きはV遺伝子の使用に影響を与えないことがわかった。
【０２５３】
逆位及びブロック重複は、軽鎖座位、特にIGK座位の特徴であるようである。ヒト、ブタ、マウス、ウマ、及びイヌのIGK座位には、全てC遺伝子とは逆の転写方向を有するV遺伝子が含まれているだけでなく、イヌ、ヒト、及びブタの座位がブロック全体の反転重複を受けている10、11。ブタとヒトの座位では、2つのブロックの遺伝子が十分に発散していないため、一部又は全てが他のブロックの対と同一の名前で知られている10、12。
【０２５４】
ヒト、ブタ、及びマウスのIGLV遺伝子は座位に沿って転写方向を維持するが、イヌ科の動物のIGLVはそうではない13。大きな(2.6Mbp)イヌ科の動物のIGL座位には、J-C-クラスターに対して反転した多くのV遺伝子が含まれる(図3)。逆位は、ある程度の場所固有の選択圧下にあるようで、J-C遺伝子とは逆の転写方向にある116個の最もC近位のIGLV遺伝子のうち3つだけであり、最後の46個のうち26個の逆位V遺伝子がある。この増加は、非常に高いレベルの配列同一性を示すIGLV1及びIGLV8の区間が、メンバーが繰り返しブロック内で位置的に保存されているパターンとなるかたちで発生したブロックの重複に一部起因する。
【０２５５】
より広範な傾向の観点から、イヌ科の動物のIG座位は、他の公開された座位と一貫性を保持する。以前にアノテーションが付けられたIGHVでは、遺伝子対偽遺伝子の比率はおよそ1:1であり、イヌ科の動物のIgH座位1と一致していることが判明した1。しかしながら、2つの軽鎖座位は5:1に近いように見え、重鎖と軽鎖の間の偽遺伝子に対する異なる許容差を反映する可能性がある。更に、遺伝子数は、これまでに研究されたほとんどの種の軽鎖における偏った鎖の使用と相関することが判明している14、15。例えば、9つの機能遺伝子のみを含むマウスIGL座位は、発現した抗体のわずか5%でのその使用を反映している14。イヌ科の動物のレパートリーも同様の偏りを示しているが、反対に、各種の2つの軽鎖レパートリーの相対的なサイズに応じて、91%でのIGK鎖の使用を報告している15。
【０２５６】
3.1.4  種間及び種内の座位アライメント
ゲノムの領域をそれ自体に対して及び他の種の同等の領域に対してアライメントすることは、進化の洞察を引き出す確立された方法であり、PipMakerはこの目的に使用される一般的なツールである16、17、6、18。イヌ科の動物のIGK、IGL、及びTRA/D座位を使用して、それら自体に対して、並びにそれぞれマウス及びヒト座位に対してアライメントを実行した。
【０２５７】
IGK自己アライメントでは、3つの比較、上流と下流のブロックのセルフアライメント(それぞれ図8の緑色と赤色のボックス)、並びにそれらの相互のアライメント(図8の青色のボックス)が注目すべきである。同一性パーセンテージプロット(PIP)内では、線は同一性の領域を示し、したがって、それ自体に対してアライメントされた配列は、常に対角線に沿って走る実線を有する。メインの対角線から外れた実線は、重複事象の可能性が高いことを示しており、ギャップは重複以降に蓄積されたインデル及び他の変異を表す。
【０２５８】
上流の自己アライメントにおける複数の破線の対角線は、イヌ科の動物のTCRB座位内の3つの遺伝子カセットのブロック重複と同様に、ブロックの特徴であり、この場合、単一のVとその隣接配列が局所的に複数回複製される16。下流ブロックの自己アライメントでは、線はより短く、時には垂直であり、局所的な反転した相同性を意味する。最後に、上流ブロックと下流ブロックの相同性比較により、C遺伝子の上流のIgKV2遺伝子との良好な相同性の程度、特にIGKV2-S18とIGKV-S19が明らかになった。このパターンは、単一の遺伝子がC遺伝子の上流で複数回複製され、その後、ヒトIGK及びウマ科の動物のIGLを連想させる様式でブロック反転複製が発生した場合に見られはずである。したがってこの下流のブロックは、選択圧が低下した可能性が高く、発散がより少ないIGKV2-S18及びIGKV-S19遺伝子を除いて、変異と局所的逆位をより高い割合で蓄積している。これが唯一の可能な説明ではないが、他の種及びAR座位にわたる類似の特徴についての提案された説明と一致している。
【０２５９】
イヌとヒトのIGL座位の比較では、以下の2つのことが印象的ある。ヒトの配列の中点付近でほぼ切れ目のない対角線と、コード配列又はその近くの多数の線によって特徴付けられる非常に高い相同性の程度である(図9a)。ヒト/イヌPIPにおける対角線の更なる分析は、それが非AR遺伝子ZNF280A、ZNF280B、及びPRAMEを含むヒト座位の領域に及ぶことが明らかになった(図9b)。これらの遺伝子の配列、及びそれらを取り巻く領域のほとんどは、イヌとヒトとの間で高度に保存されており、イヌにとってヒトと同様の機能的重要性がある可能性が高いことをほのめかす。特定の比較は、ZNF280B及びPRAME遺伝子がイヌで機能する可能性が高いことを示すが、ZNF280Aはこの座位で確実に同定することができない(データ示さず)。更なる調査により、ZNF280Bの近くにある別の非IGL遺伝子PCBP2が同定される。
【０２６０】
問題の場所と遺伝子が常に保存されているわけではないが、AR座位に散在する非AR遺伝子は種間で共通の特徴である。例えば、ADAM6遺伝子は、ヒトとマウスのIGHV遺伝子とIGHD遺伝子との間のIGH座位に見出されるが、ヒトオルソログは非機能的である。イヌではオルソログが特徴付けられていないが、2つの候補がある。そのうちの1つはIGHV3-4とIGHV3-5との間にあり、そのうちの他方はIGH座位全体の上流にある。イヌのADAM遺伝子ファミリーの研究が限られているため、この潜在的なオルソログはIGHアノテーションに追加されていないが、今後の研究の候補として維持される。イヌ科の動物のIGK又はIGL座位では、現時点では他の非AR遺伝子は同定されていない。
【０２６１】
3.1.5  対立遺伝子の分布
イヌのモデル生物としての使用の、際立った特徴の1つは、品種間の不均一性が高い一方で、品種の均一性が非常に高く、品種形成がヌクレオチドの多様性における35%の損失の原因であると推定されている点である19。選択は非常に厳しいため、最近の研究では、特定の品種で1メガベースより長い22個のホモ接合性のブロックが同定されており、著者は、これ育種家が課した選択圧に起因するとしている20。これは、ヒトに見られる多様性とは対照的である。地理的に孤立した集団であっても、この分離に起因する変動は5〜10%であるのに対し、4分の1を超えるイヌのゲノム変動は、個体の変動ではなく、品種の変動に起因する21。
【０２６２】
イヌ科の動物のゲノミクスの品種特異性のレベルを考慮すると、非参照AR対立遺伝子が強力な品種特異的ハプロタイプに従うように見えなかったことはおそらく驚くべきことである。この試料で最も割合が高い2つの品種は、ボクサーとスタンダードプードル(それぞれ22匹と20匹の犬)であり、これらは類似のパターン、つまり、少数の非参照対立遺伝子が両方の品種で比較的頻繁に見つかり、よりまれな対立遺伝子が1つの品種の1匹のイヌの単一の染色体上に見出されるパターンに従った。あまり割合が高くない品種は同様の分布に従っており、一回しか出現しない対立遺伝子の数を考慮すると、非参照対立遺伝子は典型的にはヘテロ接合体に見られるようであった。
【０２６３】
より大きな品種固有のコホートサイズは、このデータセットでは明らかではない傾向を明らかにする可能性があるが、現状では、AR遺伝子の座位を形成する選択圧は品種に依存せず、品種自体よりも勝っているようである。例外の可能性は、あまり一般的でない対立遺伝子の存在量を増やす進化のボトルネックの場合である。例えば、IGLC1*01(参照対立遺伝子)は、シークエンシングされた44個のボクサー染色体のうち19個、及び6個のトイプードル染色体のうちの1個で見つかるが、他のいずれの品種でも見つからない。全ての品種にわたってコールされた217個の対立遺伝子のうちの194個は、その他の対立遺伝子IGLC1*02によって表される。トイプードルがボクサーと以前に交配されているか、又はシークエンシングのエラーがあり、これが実際にボクサー固有の対立遺伝子である可能性があるが、これらの問題に何らかの方法で最終的に答えるには、より大きなデータセットが必要な場合が残されている。
【０２６４】
非参照対立遺伝子の分布を考慮すると、これらは全て予想されるものと一致する。予想より頻繁に変化が見られないのは、問題の遺伝子が現在の状態を保つように選択圧を受けており、したがってこれからの逸脱は好ましくないためである可能性が高い。これは、有効な機能遺伝子の喪失、又は自己反応性遺伝子の再活性化のいずれかである可能性があり、どちらの場合も、生物の適応度が低下するため、これが除かれるように選択される。同様に、AR遺伝子は生物の適応度にとって非常に重要であり、その損失には選択コストが伴う。
【０２６５】
機能の獲得が、予想よりも一般的であるという事実は、AR座位の偽遺伝子の量が多いことに関して提唱された理論に重みを与える。偽遺伝子の量は、一般にAR座位、特にイヌで多く、しばしば発現する16、1、12、9。例えば、SHM又は組換え自体により停止コドンが失われた場合、それらは組換えにおいて機能性を獲得し、遺伝子変換の基質として作用し得る22。参照対立遺伝子がその大多数の使用に沿ったオリジナルであると仮定すると、機能非参照対立遺伝子の獲得は、新規の有益な対立遺伝子の変異可能な開始プールである偽遺伝子の例であり、そのような選択圧の下にある。
【０２６６】
(参考文献)
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22. Sun, Y. et al. Immunoglobulin genes and diversity: what we have learned from domestic animals. J. Anim. Sci. Biotechnol. 3, 18 (2012).
【０２６７】
(実施例2)
マウス細胞におけるキメラIG座位の構築
マウスES細胞のIG座位は、以下のように、マウスのIGH座位にイヌ科の動物の重鎖DNAを導入し、マウスのIGLカッパ及びラムダ座位にイヌ科の動物の軽鎖免疫グロブリンDNAを導入するために、BAC挿入によって改変された:
【０２６８】
イヌ科の動物のIGH挿入
第8染色体からのイヌ科の動物のDNAの挿入は、BAC挿入によりマウスのIGH座位に対して行われた。挿入されたDNAはヌクレオチド72,988,807-73,128,041を含み、IGHV4-1からIGHV3-4、並びにIGHD1-6及びIGHJ1-6を含む。図1及び10を参照されたい。
【０２６９】
イヌ科の動物のIGLラムダDNA挿入
第26染色体からのイヌ科の動物のDNAの挿入は、マウスの第16染色体上のIGLラムダ座位に対して行われた。挿入されたDNAはヌクレオチド27,509,860-27,646,373を含み、IGLV3-1からIGLV4-6、並びにIGLJ1-9及びIGLC1-9を含む。図2及び13を参照されたい。
【０２７０】
座標は、マウスでは2011年12月のGRCm38/mm10アセンブリから、イヌではCanfam3.1からのものである。
【０２７１】
イヌ科の動物のDNAの挿入は、マウスゲノムの以下の位置にあるランディングパッドに挿入された。
イヌ科の動物の重鎖DNA:マウス第12染色体、位置114,666435のすぐ上流に挿入
イヌ科の動物のカッパDNA:マウス第6染色体、位置70,674,7.55のすぐ上流に挿入
イヌ科の動物のラムダDNA:マウス第16染色体、位置19,047,551のすぐ上流に挿入
【０２７２】
キメラ転写物の発現は、キメラ重座位からのPCR分析により確認されている-図15を参照されたい。
【０２７３】
方法は以下の通りであった。
【０２７４】
BAC改変
CHORI-82ライブラリーに由来するイヌ科の動物のBACは、子供病院オークランド研究所のBACライブラリーから直接入手した。
【０２７５】
BACを含む全ての細菌は、12.5μg/mlクロラムフェニコールを補充したルリアベルタニ(LB)培地又はLB寒天上で32℃で培養した。BAC含有細胞は、標準的なCaCl2熱ショックプロトコールによる細胞へのpSIM18プラスミドの添加により組換え能を発揮し、培地に75μg/mlハイグロマイシンを補充することにより、pSIM18の維持を選択した。
【０２７６】
pRMCE38等の組換えプラスミドを線状化し、ギブソンアセンブリーを使用して1kbpのBAC特異的相同性アームを導入した。プラスミドには、cre-lox及びPiggbyBac配列等の下流の組換えに必要な配列、並びにBAC又はESCエンジニアリング工程の選択マーカーが含まれている。完成したプラスミドを制限消化し、ゲル精製して、BAC特異的相同性アーム、導入される組換え配列、及びBACのベクターバックボーンに対する相同性アームにまたがる断片を得た。これらの断片は、エレクトロポレーションによりBACに挿入され、BACへの断片の組込みが成功したものが選択された。
【０２７７】
挿入されたDNAと内因性DNAとの接合部を横切るPCRにより、耐性クローンの成功した改変が検証された。BACの両端が改変されると、BAC DNAが精製され、Electromax(商標)DH10B細胞(Life Technologies社)にエレクトロポレーションされた。ハイグロマイシン耐性を失い、したがってpSIM18陰性であったクローンを、更なる分析のために選択した。これらのクローンのDNAに対してPCR反応を行い、適切なBACを使用して挿入されるエクソンの存在と同様に、両方の末端での正しい改変を確実にした。この品質管理チェックに合格したクローンは、胚性幹細胞(ESC)の遺伝子操作に使用された。
【０２７８】
ESC遺伝子操作
ESC培養、エレクトロポレーション、及び薬物選択のプロセスは、Lee等、2014年に記載されるようになされた。各免疫グロブリン座位にSRMCEのランディングパッドをすでに含むマウスオスAB2.1細胞を使用し、M15培地(15%FBS、2mMグルタミン、及び100μMのβ-メルカプトエタノールを補充したノックアウトDMEM)で培養し、照射されたSNL76/7フィーダー上で維持した。使用した全ての細胞を試験して、マイコプラズマ等の汚染物質がないことを確認した。
【０２７９】
各トランスフェクションには1×107個の細胞を使用し、全てのトランスフェクションはBio-Rad社のエレクトロポレーター(GenePulser Xcell)を使用して500μF及び230Vで実施した。BACの導入のために、10μgのBAC DNA及び25μgのpCAGGS-iCREを、トランスフェクションごとに使用した。24時間後に細胞を3μg/mlピューロマイシンで1週間選択し、増殖と試験のためにコロニーを選択した。マウスとBAC DNAとの接合部にまたがるプライマーを使用したPCRで、BACのランディングパッドへの組み込みが成功したことを確認した。
【０２８０】
次いで、陽性クローンをPBaseを使用する3'のランディングパッドの切除に供した。クローンを増殖し、10μgのPiggyBacトランスポザーゼプラスミドのエレクトロポレーションあたり1×105個の細胞を使用した。M15での3日間の回復後、細胞を分割し、低密度で播種した後、翌日にFIAUで選択し、10日間維持した。ランディングパッドの3'末端の正常な切除は、ジャンクションPCRによって確認された。次いで、陽性クローンを元のBACと同一のエクソン試験にかけ、欠失が発生していないことを確認した。
【０２８１】
マウスの生成と分析
陽性ES細胞クローンを、標準手順によりC57BL/6 Tyrc-Brdマウス系統の胚盤胞に注入した。注入された胚盤胞は、偽妊娠した雌のB6/CBA F1レシピエントの子宮に移された。各クローンについて、約40個の胚盤胞を注入した。コート色素に基づいて注入されたESCに由来する仔犬を識別できるようにするために、高いパーセンテージのキメラ雄をアルビノC57BL/6 Tyrc-Brd雌と交配させた。ESCクローンに由来するマウスは、マウスと挿入されたDNAとの接合部にまたがるプライマーをによるPCR試験にかけられた。
【０２８２】
挿入された遺伝子の発現を検証するために、逆転写に基づくアプローチが実施された。BACを有することが確認されたマウス並びに関連する野生型対照の血液、脾臓、及び大腿骨を採取した。大腿骨をPBSで吸引して、骨髄試料を得た。NucleoSpin RNA-kit(Macherey-Nagel社)を使用して、これら3つの組織タイプをRNAに変換した。逆転写は、挿入されたBACに関連するマウスの定常領域の5'末端(例えば、IGL BACを含むマウスのIGLC)又はmRNAのpolyAテールに対するプライマーを使用して、superscript II(Thermo Fisher社)を使用して実施された。次いで、これらの転写産物は、ネズミC領域にネストされたバーコードプライマーと、イヌ科の動物のV遺伝子由来の挿入されたリーダー領域からのプライミングを使用して増幅された。これにより、全てのマウス免疫グロブリン転写物ではなく、キメラ転写物のみが増幅されることを確証した。これらのPCR産物をゲル上で視覚化し、野生型マウスではなく、BACを有するマウスにキメラ転写物が存在することを確認した。図15-IGHキメラ転写産物の確認を参照されたい。最初の8レーンは血液試料からのRNA、2番目の8レーンは骨髄試料、及び最後の8レーンは脾臓試料に対応する。所与の8個のうち最初の4個はC領域でプライミングされ、2番目の4個はpolyAテールでプライミングされる。4つのうち、最初の2つは対照であり、後の2つはキメラ転写産物の産生が予想されるマウスである。
【０２８３】
全ての動物実験及び飼育は、ウェルカムトラストサンガーインスティテュートAWERB(動物福祉及び倫理審査機関)の承認の下で実施された。英国内務省の承認は、プロジェクトライセンス80/2432の下で提供される。
【０２８４】
(実施例3)
図4、5、及び6は、ネコのIg座位のアノテーションを示す。アノテーションの方法は、実施例1の2.1.1で概説した方法と同一であるが、ネコのゲノムがイヌ科の動物のゲノムの代わりに調査され、RNAシークエンシングのデータが使用されなかった点が異なる。
【０２８５】
アノテーションは、上述の方法を使用して、げっ歯動物のゲノムでネコのDNAを使用できるツールと情報を提供する。
【０２８６】
(実施例4)
cDNA末端の5'迅速増幅(5'RACE)
物質及び方法
血液試料
ベースライン試料:末梢血は、ミネソタ大学の獣医学部で13匹の犬から採取された。RNAは現場で抽出され、ドライアイス上で運搬された。この研究は、ミネソタ大学獣医学部の倫理委員会から事前に承認を受けていた。
【０２８７】
ライブラリー調製
C特異的プライマーとテンプレートスイッチオリゴ(TSO)との混合プールを使用して、第1鎖cDNAを合成した。反応に含まれるもの:30μlの容量中、666.7μMのdNTP(Sigma Aldrich社)、666.7nMのTSO、333.3nMのそれぞれの重鎖及び軽鎖RTプライマー混合物、1〜5μgのRNA、2mMのDTT(Invitrogen社)、3mMのMgCl2、40単位のRNaseOUT(Invitrogen社)、並びに100単位のSuperScript II逆転写酵素(Invitrogen社)。伸長は42℃で60分間であり、その後1μlのRNase A/T1混合物(Thermo Scientific社)を添加し、反応液を37℃で15分間インキュベートした。次いで、製造元の推奨に従ってAMPure XPシステム(Agencourt社)を使用して、反応をクリーンアップした(初期反応:AMPure XP溶液比5:4を使用)。cDNAを21μlのPCRグレードの水に再懸濁し、1つの重鎖反応と1つの軽鎖反応に均等に分割した。PCRは、Q5 high fidelity polymerase (New England Biolabs社)、10.5μlの再懸濁されたcDNA、及び5'RFWAと重鎖又は軽鎖のPCR1混合物のそれぞれ400nMを使用して、25μlの容量で実施された。サイクリング条件は以下のとおりである。98℃30秒間、次いで20サイクルの(98℃10秒間、63℃30秒間、72℃20秒間)、続いて、72℃2分間の最後の伸長。PCR反応は、以前と同一のAMPure XPクリーンアップに供し、10.5μlのPCRグレードの水に再懸濁した。これは、Q5ポリメラーゼ、並びに5'RRVA及び試料特異的インデックスヘキサマーを含むフォワードプライマーのそれぞれ400nMを使用した25μLのPCR反応で行われた。PCR条件は以前と同一で、産物は同一のAMPure XPシステムを使用してクリーンアップされ、20μlのPCRグレードの水に再懸濁した。次いで、これらのライブラリーを定量化し、等モル混合液にプールし、シークエンシングのために最終濃度10nMに希釈した。
【０２８８】
シークエンシング及びデータ分析
ライブラリーは、ウェルカムトラストサンガーインスティテュートのコアシークエンシングチームにより、300bpのペアエンドリード(10%PhiXスパイクインを含む)を使用して、MiSeqマシン(Illumina社)でシークエンシングされた。次いで、IMGT V-Questソフトウェアに送信する前に、逆多重化されたデータの品質をフィルタリングした(「HighV-Quest」ソフトウェアを使用し、「種」=「Canis lupus familiaris(イヌ)」及び「受容体タイプ又は座位=「IG」」を選択する)14。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【国際調査報告】
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