(57)【要約】  本発明は、５ｍＣ、５ｈｍＣ、および６ｍＡに対して認識選好および異なる結合特性を有するＲＶＤ、前記ＲＶＤを含有するＴＡＬＥ反復ドメインを含む単離されたＤＮＡ結合ポリペプチド、融合タンパク質、それをコードするポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含有するベクターおよび宿主細胞を提供する。本発明はまた、メチル化依存遺伝子活性化、効率的なゲノム編集、標的遺伝子の標的配列におけるメチル化された塩基および標的結合細胞内の標的遺伝子の検出における、上記ＤＮＡ結合ポリペプチド、融合タンパク質の使用を提供する。
2020531572.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
５ｍＣを特異的に認識できるＨＡまたはＮＡ；
５ｈｍＣを特異的に認識できるＦＳ；
Ｃと５ｍＣの両方を認識できるＮ＊、ＮＧまたはＫＰ；
Ｃと５ｈｍＣの両方を認識できるＨＶまたはＫＶ；
５ｍＣと５ｈｍＣの両方を認識できるＫ＊またはＲＧ；
Ｃ、５ｍＣおよび５ｈｍＣの三つを認識できるＧ＊、Ｈ＊、Ｒ＊、またはＹ＊；
６ｍＡを特異的に認識できるＮＰ、ＦＴ、ＣＶまたはＣＰ；または
Ａと６ｍＡの両方を認識であるＲＩ、ＮＩ、ＫＩまたはＨＩ
[ここで、＊はその位置でのアミノ酸が欠失していることを表す]から選択される一つ以上のＲＶＤを含むＴＡＬＥを含む、単離されたＤＮＡ結合ポリペプチド。
【請求項２】
５ｍＣを特異的に認識できるＨＡまたはＮＡ；
５ｈｍＣを特異的に認識できるＦＳ；
Ｃと５ｍＣの両方を認識できるＮ＊、ＮＧまたはＫＰ；
Ｃと５ｈｍＣの両方を認識できるＨＶまたはＫＶ；
５ｍＣと５ｈｍＣの両方を認識できるＫ＊またはＲＧ；
Ｃ、５ｍＣおよび５ｈｍＣの三つを認識できるＧ＊、Ｈ＊、Ｒ＊、またはＹ＊；
６ｍＡを特異的に認識できるＮＰ、ＦＴ、ＣＶまたはＣＰ；または
Ａと６ｍＡの両方を認識であるＲＩ、ＮＩ、ＫＩまたはＨＩ
[ここで、＊はその位置でのアミノ酸が欠失していることを表す]から選択される一つ以上のＲＶＤを含むＴＡＬＥと、機能ドメインとを含む、融合タンパク質。
【請求項３】
前記機能ドメインが、遺伝子発現を調節する機能ドメイン、後成的修飾機能ドメイン、遺伝子編集機能ドメイン、または蛍光タンパク質であり、
好ましくは、前記遺伝子発現を調節する機能ドメインは、転写活性化因子、転写抑制因子またはその機能的フラグメントであり、前記後成的修飾機能ドメインは、メチルトランスフェラーゼ、デメチラーゼまたはその機能的フラグメントであり、前記遺伝子編集機能ドメインは、ヌクレアーゼまたはその機能的フラグメントであり、
より好ましくは、前記遺伝子編集機能ドメインはエンドヌクレアーゼ、好ましくはＦｏｋＩエンドヌクレアーゼ、より好ましくはＦｏｋＩエンドヌクレアーゼのＤＮＡ切断ドメインである、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
請求項１に記載のＤＮＡ結合ポリペプチドまたは請求項２〜３のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項４に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項６】
請求項４に記載のポリヌクレオチドまたは請求項５に記載ベクターを含む宿主細胞。
【請求項７】
（１）ＴＡＬＥ反復ドメインの一つ以上のＲＶＤがＨＡまたはＮＡである、標的遺伝子の標的配列中のメチル化された塩基５ｍＣを検出するための試薬の調製における、ＴＡＬＥ反復ドメインを含むタンパク質の使用；
（２）ＴＡＬＥ反復ドメインの一つ以上のＲＶＤがＦＳである、標的遺伝子の標的配列中のメチル化された塩基５ｈｍＣを検出するための試薬の調製における、ＴＡＬＥ反復ドメインを含むタンパク質の使用；または
（３）ＴＡＬＥ反復ドメインの一つ以上のＲＶＤがＮＰ、ＦＴ、ＣＶまたはＣＰである、標的遺伝子の標的配列中のメチル化された塩基６ｍＣを検出するための試薬の調製における、ＴＡＬＥ反復ドメインを含むタンパク質の使用；
を含む、標的遺伝子の標的配列中のメチル化された塩基を検出するための試薬の調製における、ＴＡＬＥ反復ドメインを含むタンパク質の使用。
【請求項８】
細胞における標的遺伝子の標的配列を標的結合するための試薬の調製における、請求項１に記載のＤＮＡ結合ポリペプチド、請求項２〜３のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項４に記載のポリヌクレオチド、請求項５に記載のベクターまたは請求項６に記載の宿主細胞の使用。
【請求項９】
細胞における標的遺伝子発現を調節するための試薬の調製における、請求項２〜３のいずれか一項に記載の融合タンパク質またはその融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの使用であって、前記融合タンパク質に含まれる機能ドメインは、遺伝子発現を調節する機能ドメインであり、
好ましくは、前記遺伝子発現を調節する機能ドメインは、転写活性化因子またはその機能的フラグメント、若しくは転写抑制因子またはその機能的フラグメントである、使用。
【請求項１０】
細胞における標的遺伝子に対して遺伝子編集をするための試薬の調製における、請求項２〜３のいずれか一項に記載の融合タンパク質またはその融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの使用であって、前記融合タンパク質に含まれる機能ドメインは、遺伝子編集機能ドメインであり、
好ましくは、前記遺伝子編集は核酸切断であり、前記遺伝子編集機能ドメインはヌクレアーゼまたはその機能的フラグメント、好ましくはエンドヌクレアーゼまたはその機能的フラグメント、より好ましくはＦｏｋＩエンドヌクレアーゼまたはそのＤＮＡ切断ドメインである、使用。
【請求項１１】
細胞における標的遺伝子に対して後成的修飾をするための試薬の調製における、請求項２〜３のいずれか一項に記載の融合タンパク質またはその融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの使用であって、前記融合タンパク質に含まれる機能ドメインは、後成的修飾機能ドメインであり、
好ましくは、前記後成的修飾機能ドメインはメチルトランスフェラーゼ、デメチラーゼまたはその機能的フラグメントである、使用。
【請求項１２】
請求項１に記載のＤＮＡ結合ポリペプチド、請求項２〜３のいずれか一項に記載の融合タンパク質、または請求項４に記載のポリヌクレオチドを細胞に導入して前記ＤＮＡ結合ポリペプチドまたは融合タンパク質中のＴＡＬＥを標的遺伝子の標的配列に結合させることを含む、細胞における標的遺伝子の標的配列を標的結合する方法。
【請求項１３】
前記ＤＮＡ結合ポリペプチドまたは融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＨＡまたはＮＡから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列が５ｍＣである場合しか、前記ＤＮＡ結合ポリペプチドまたは融合タンパク質におけるＴＡＬＥは標的遺伝子の標的配列に結合しない；
前記ＤＮＡ結合ポリペプチドまたは融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＦＳから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列が５ｈｍＣである場合しか、前記ＤＮＡ結合ポリペプチドまたは融合タンパク質におけるＴＡＬＥは標的遺伝子の標的配列に結合しない；
前記ＤＮＡ結合ポリペプチドまたは融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＮＰ、ＦＴ、ＣＶまたはＣＰから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列が６ｍＡである場合しか、前記ＤＮＡ結合ポリペプチドまたは融合タンパク質におけるＴＡＬＥは標的遺伝子の標的配列に結合しない；
前記ＤＮＡ結合ポリペプチドまたは融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、Ｎ＊，ＮＧまたはＫＰから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、Ｃまたは５ｍＣであり得る；
前記ＤＮＡ結合ポリペプチドまたは融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＨＶまたはＫＶから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、Ｃまたは５ｈｍＣであり得る；
前記ＤＮＡ結合ポリペプチドまたは融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、Ｋ＊またはＲＧから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、５ｍＣまたは５ｈｍＣであり得る；
前記ＤＮＡ結合ポリペプチドまたは融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、Ｇ＊、Ｈ＊、Ｒ＊またはＹ＊から選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、Ｃ、５ｍＣまたは５ｈｍＣであり得る；または
前記ＤＮＡ結合ポリペプチドまたは融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＲＩ、ＮＩ、ＫＩまたはＨＩから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、Ａまたは６ｍＡであり得る；
ここで、＊はその位置でのアミノ酸が欠失していることを表す、
請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項２〜３のいずれか一項に記載の融合タンパク質、または前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入して前記融合タンパク質中のＴＡＬＥを標的遺伝子の標的配列に結合させ、これによって、融合タンパク質中の、遺伝子発現を調節する機能ドメインである機能ドメインによって標的遺伝子の発現が調節されることを含む、細胞における標的遺伝子の発現を調節する方法。
【請求項１５】
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＨＡまたはＮＡから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列が５ｍＣである場合しか、前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは標的遺伝子の標的配列に結合しない；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＦＳから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列が５ｈｍＣである場合しか、前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは標的遺伝子の標的配列に結合しない；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＮＰ、ＦＴ、ＣＶまたはＣＰから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列が６ｍＡである場合しか、前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは標的遺伝子の標的配列に結合しない；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、Ｎ＊，ＮＧまたはＫＰから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、Ｃまたは５ｍＣであり得る；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＨＶまたはＫＶから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、Ｃまたは５ｈｍＣであり得る；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、Ｋ＊またはＲＧから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、５ｍＣまたは５ｈｍＣであり得る；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、Ｇ＊、Ｈ＊、Ｒ＊またはＹ＊から選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、Ｃ、５ｍＣまたは５ｈｍＣであり得る；または
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＲＩ、ＮＩ、ＫＩまたはＨＩから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、Ａまたは６ｍＡであり得る；
ここで、＊はその位置でのアミノ酸が欠失していることを表し、
より好ましくは、前記遺伝子発現を調節する機能ドメインは、転写活性化因子またはその機能的フラグメント、若しくは転写抑制因子またはその機能的フラグメントである、
請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項２〜３のいずれか一項に記載の融合タンパク質、または前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入して前記融合タンパク質中のＴＡＬＥを標的遺伝子の標的配列に結合させ、これによって、融合タンパク質中の、遺伝子編集機能ドメインである機能ドメインによって標的遺伝子が編集されることを含む、細胞における標的遺伝子に対して遺伝子編集をする方法。
【請求項１７】
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＨＡまたはＮＡから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列が５ｍＣである場合しか、前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは標的遺伝子の標的配列に結合しない；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＦＳから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列が５ｈｍＣである場合しか、前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは標的遺伝子の標的配列に結合しない；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＮＰ、ＦＴ、ＣＶまたはＣＰから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列が６ｍＡである場合しか、前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは標的遺伝子の標的配列に結合しない；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、Ｎ＊，ＮＧまたはＫＰから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、Ｃまたは５ｍＣであり得る；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＨＶまたはＫＶから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、Ｃまたは５ｈｍＣであり得る；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、Ｋ＊またはＲＧから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、５ｍＣまたは５ｈｍＣであり得る；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、Ｇ＊、Ｈ＊、Ｒ＊またはＹ＊から選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、Ｃ、５ｍＣまたは５ｈｍＣであり得る；または
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＲＩ、ＮＩ、ＫＩまたはＨＩから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、Ａまたは６ｍＡであり得る；
ここで、＊はその位置でのアミノ酸が欠失していることを表し、
より好ましくは、前記遺伝子編集は核酸切断であり、前記遺伝子編集機能ドメインはヌクレアーゼまたはその機能的フラグメント、好ましくはエンドヌクレアーゼまたはその機能的フラグメント、より好ましくはＦｏｋＩエンドヌクレアーゼまたはそのＤＮＡ切断ドメインである、
請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項２〜３のいずれか一項に記載の融合タンパク質、または前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入して前記融合タンパク質中のＴＡＬＥを標的遺伝子の標的配列に結合させ、これによって、融合タンパク質中の、後成的修飾機能ドメインである機能ドメインによって標的遺伝子が後成的修飾されることを含む、細胞における標的遺伝子に対して後成的修飾をする方法。
【請求項１９】
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＨＡまたはＮＡから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列が５ｍＣである場合しか、前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは標的遺伝子の標的配列に結合しない；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＦＳから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列が５ｈｍＣである場合しか、前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは標的遺伝子の標的配列に結合しない；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＮＰ、ＦＴ、ＣＶまたはＣＰから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列が６ｍＡである場合しか、前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは標的遺伝子の標的配列に結合しない；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、Ｎ＊，ＮＧまたはＫＰから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、Ｃまたは５ｍＣであり得る；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＨＶまたはＫＶから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、Ｃまたは５ｈｍＣであり得る；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、Ｋ＊またはＲＧから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、５ｍＣまたは５ｈｍＣであり得る；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、Ｇ＊、Ｈ＊、Ｒ＊またはＹ＊から選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、Ｃ、５ｍＣまたは５ｈｍＣであり得る；または
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＲＩ、ＮＩ、ＫＩまたはＨＩから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、Ａまたは６ｍＡであり得る；
ここで、＊はその位置でのアミノ酸が欠失していることを表し、
より好ましくは、前記後成的修飾機能ドメインはメチルトランスフェラーゼ、デメチラーゼまたはその機能的フラグメントである、
請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項２〜３のいずれか一項に記載の融合タンパク質、または前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入して前記融合タンパク質中のＴＡＬＥを標的遺伝子の標的配列に結合させることを含む生細胞染色体の標識方法であって、前記機能ドメインが蛍光タンパク質であり、前記融合タンパク質中のＴＡＬＥを標的遺伝子の標的配列に結合させることによって標的配列に対する蛍光標識を実現する、生細胞染色体の標識方法。
【請求項２１】
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＨＡまたはＮＡから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列が５ｍＣである場合しか、前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは標的遺伝子の標的配列に結合しない；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＦＳから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列が５ｈｍＣである場合しか、前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは標的遺伝子の標的配列に結合しない；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＮＰ、ＦＴ、ＣＶまたはＣＰから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列が６ｍＡである場合しか、前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは標的遺伝子の標的配列に結合しない；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、Ｎ＊，ＮＧまたはＫＰから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、Ｃまたは５ｍＣであり得る；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＨＶまたはＫＶから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、Ｃまたは５ｈｍＣであり得る；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、Ｋ＊またはＲＧから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、５ｍＣまたは５ｈｍＣであり得る；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、Ｇ＊、Ｈ＊、Ｒ＊またはＹ＊から選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、Ｃ、５ｍＣまたは５ｈｍＣであり得る；または
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＲＩ、ＮＩ、ＫＩまたはＨＩから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、Ａまたは６ｍＡであり得る；
ここで、＊はその位置でのアミノ酸が欠失していることを表す、
請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
細胞ゲノム中の標的配列の特定の部位に５ｍＣが存在するか否かを検出する方法であって、
（１）ＴＡＬＥを含むタンパク質を細胞に導入し、前記ＴＡＬＥは標的配列を標的とし、前記ＴＡＬＥ内の、前記特定の部位を認識するＲＶＤがＨＡまたはＮＡである；
（２）次に、ヌクレアーゼを細胞に導入し、前記ヌクレアーゼの標的切断部位をＴＡＬＥ標的配列に位置する；
（３）標的配列が切断されているかどうかを検出し、それによって標的配列の特定の部位に５ｍＣが存在するかどうかを判断する；標的配列が切断されていない場合、前記ＴＡＬＥが前記標的配列に結合し、前記ヌクレアーゼが当該標的配列に結合して切断することができず、前記特定の部位に５ｍＣが存在しているとされ；標的配列が切断されている場合、前記ＴＡＬＥが前記標的配列に結合しておらず、前記ヌクレアーゼが当該標的配列に結合して切断されており、前記特定の部位に５ｍＣが存在しないとされている、ことを含む方法。
【請求項２３】
細胞ゲノム中の標的配列の特定の部位に５ｈｍＣが存在するか否かを検出する方法であって、
（１）ＴＡＬＥを含むタンパク質を細胞に導入し、前記ＴＡＬＥは標的配列を標的とし、前記ＴＡＬＥ内の、前記特定の部位を認識するＲＶＤがＦＳである；
（２）次に、ヌクレアーゼを細胞に導入し、前記ヌクレアーゼの標的切断部位をＴＡＬＥ標的配列に位置する；
（３）標的配列が切断されているかどうかを検出し、それによって標的配列の特定の部位に５ｈｍＣが存在するかどうかを判断する；標的配列が切断されていない場合、前記ＴＡＬＥが前記標的配列に結合し、前記ヌクレアーゼが当該標的配列に結合して切断することができず、前記特定の部位に５ｈｍＣが存在しているとされ；標的配列が切断されている場合、前記ＴＡＬＥが前記標的配列に結合しておらず、前記ヌクレアーゼが当該標的配列に結合して切断されており、前記特定の部位に５ｈｍＣが存在しないとされている、ことを含む方法。
【請求項２４】
細胞ゲノム中の標的配列の特定の部位に６ｍＡが存在するか否かを検出する方法であって、
（１）ＴＡＬＥを含むタンパク質を細胞に導入し、前記ＴＡＬＥは標的配列を標的とし、前記ＴＡＬＥ内の、前記特定の部位を認識するＲＶＤがＮＰ、ＦＴ、ＣＶまたはＣＰである；
（２）次に、ヌクレアーゼを細胞に導入し、前記ヌクレアーゼの標的切断部位をＴＡＬＥ標的配列に位置する；
（３）標的配列が切断されているかどうかを検出し、それによって標的配列の特定の部位に６ｍＡが存在するかどうかを判断する；標的配列が切断されていない場合、前記ＴＡＬＥが前記標的配列に結合し、前記ヌクレアーゼが当該標的配列に結合して切断することができず、前記特定の部位に６ｍＡが存在しているとされ；標的配列が切断されている場合、前記ＴＡＬＥが前記標的配列に結合しておらず、前記ヌクレアーゼが当該標的配列に結合して切断されており、前記特定の部位に６ｍＡが存在しないとされている、ことを含む方法。
【請求項２５】
前記ヌクレアーゼがエンドヌクレアーゼであり、
好ましくは、前記ヌクレアーゼがＣａｓ９ヌクレアーゼであり、しかもステップ（１）において前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼとｓｇＲＮＡを共に細胞に導入する、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ結合タンパク質を用いて遺伝子を調節、編集および検出する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
転写アクチベーター様エフェクター（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ，ＴＡＬＥ）は、植物病原菌キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）に由来する毒性因子であり、真核生物ゲノムを再プログラム（ｒｅｐｒｏｇｒａｍ）することができる（１，２）。ＴＡＬＥは、可変数のタンデム繰り返し単位で構成されるＤＮＡ結合ドメインを含む（３）。各反復は、１２位と１３位に二つの可変性の高いアミノ酸（反復可変二重残基、ｒｅｐｅａｔ−ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｉｒｅｓｉｄｕｅｓまたはＲＶＤ）を有する他、３３〜３５のアミノ酸残基のコンセンサス配列（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含む（４，５）。ＴＡＬＥタンパク質のＤＮＡ認識は、タンデム繰り返し単位によって媒介される。タンデム繰り返し単位は、ＲＶＤを介してヌクレオチドを標的とし、配列特異的な方法でＤＮＡに結合し、ＲＶＤはヌクレオチドの特異性を決定する（４，６）。ＲＶＤｓはＤＮＡ塩基と直接的、配列特異的に接触し、モジュール化されたＤＮＡ認識特性により、ＴＡＬＥは転写活性化因子（７，８）、転写抑制因子（９，１０）またはエンドヌクレアーゼ（１１，１２）のような機能ドメインと融合することができ、これはプログラマブル遺伝子編集ツールと呼ばれる。既存の研究では、実験方法と計算方法を使用してＲＶＤ−ＤＮＡ認識コードを部分的にデコードした結果（４，６）、もっともよく使用される四つのＲＶＤ（ＮＩ、ＮＧ、ＨＤおよびＮＮ）がそれぞれＡ、Ｔ、ＣおよびＧ／Ａに優先的に結合することは分かった（４，６）。
【０００３】
四つの通常のデオキシリボヌクレオチドの他に、哺乳動物ゲノムはさらに、修飾されたＤＮＡ塩基を含む。例えば、５番目のＤＮＡ塩基と呼ばれる５−メチルシトシン（５ｍＣ）は、遺伝子発現を調節する重要なエピジェネティックマーカーである（図１Ａ）（１５，１６）。５ｍＣは、１０〜１１転座酵素（ＴＥＴ）ファミリーのタンパク質によって相次いで酸化されて５−ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）、５−ホルミルシトシン（５ｆＣ）および５−カルボキシシトシン（５ｃａＣ）を生成することができ、５−ホルミルシトシン（５ｆＣ）と５−カルボキシシトシン（５ｃａＣ）はチミンＤＮＡグリコシラーゼの基質であり、最終的に修飾されていないシトシンに戻る（１７，２２）。５ｈｍＣは、〜１％〜１０％の修飾されたシトシンを構成し、安定したエピジェネティックマーカーと見なされ、５ｈｍＣの調節異常は癌で頻繁に観察される。
【０００４】
シトシンのメチル化修飾の他に、もう一つのよく見られるＤＮＡメチル化修飾Ｎ６−メチルアデニン（Ｎ６−ｍｅｔｈｙｌａｄｅｎｉｎｅ，６ｍＡ）は、ＤＮＡのアデニン上の共有結合修飾として原核細胞において重要な役割を果たし、複数の生物学的経路の調節に参与し、制限修飾系（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ−ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＲＭ）の一部として外来ＤＮＡの侵入を抵抗し、ＤＮＡ複製、ミスマッチ修復、遺伝子転写および転座などの過程において調節制御の役割などを果たす（４１，４７）。真核生物における６ｍＡに関する研究は比較的に少なく、エピジェネティックスにおける６ｍＡの役割は明確ではない（４６）。
【０００５】
２０１５年にＣｅｌｌで発表された三つの文章には、クラミドモナス、線虫、キイロショウジョウバエなどの真核生物のゲノムでの６ｍＡが報告された（４２，４３，４８）。クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）中の６−メチルシトシンの位置を測定した結果、クラミドモナスのほとんどの遺伝子には６ｍＡの分布があり、しかもそれらのほとんどがＡｐＴ二重塩基モードで現れており、それと同時に、６ｍＡは転写開始部位で濃縮され、アクティブな遺伝子発現に関連している（４２）。キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）と線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）に対する研究では、６ｍＡが分化と発達の過程において重要な調節制御の役割を果たす可能性が高いことが分かった（４８）。６ｍＡのメチル化および脱メチル化に関連する酵素は進化において保存的であることが発見されたため、６ｍＡは他の真核生物にも分布している可能性が高い（４３）。２０１６年まで、Ｋｏｚｉｏｌらは、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）の異なる組織およびマウスとヒトの組織または細胞株を含む、脊椎動物のゲノムに６ｍＡが存在することを実証した。脊椎動物における６ｍＡ修飾の豊富さは非常に低く、クラミドモナスやキイロショウジョウバエとは違って、アフリカツメガエルとマウスゲノムにおいて６ｍＡはエクソン以外の領域に広く分布しているとともに、一定の配列モチーフを示していることは研究により明らかになり、これは、異なる真核生物において６ｍＡ修飾が異なる機能を持つ可能性があることを示している（４４）。６ｍＡの後成的修飾が高等生物における分布と、細胞及び個体の発達などの過程における役割とメカニズムをさらに研究する必要がある。
【０００６】
ＴＡＬＥタンパク質は、修飾されたＤＮＡ塩基を認識することができることは報告されている（２４〜２６）。例えば、ＮＧまたはＮ＊（アスタリスクは、１３位のアミノ酸の欠失を表す）が相同ＤＮＡ中の５ｍＣを認識でき（２５，２７〜３１）、ＮＧ／Ｎ＊とＨＤとの組み合わせがインビトロ検出で５ｍＣ／５ｈｍＣとＣとの区別づけに使用されていることは報告された（３２）。最近の研究では、切られた反復ループ（Ｇ＊、Ｓ＊、およびＴ＊）を持つＴＡＬＥタンパク質が、類似した親和性でＣ、５ｍＣ、５ｈｍＣ、５ｆＣおよび５ｃａＣに結合することができることは報告されている（３３，３４）。ＴＡＬＥ−ＤＮＡ複合体の結晶構造では、ＲＶＤループはＤＮＡの二重らせんの主溝（ｄｕｐｌｅｘ  ｍａｊｏｒ  ｇｒｏｏｖｅ）と接触し、１番目の残基は適切なループ構成を安定化にし、２番目の残基は直接な塩基特異的な接触をする（３５，３６）。現在、ＲＶＤが５ｍＣ、５ｈｍＣおよび６ｍＡを認識する潜在能力についてさらに研究する必要がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｋａｙ  Ｓ  ＆  Ｂｏｎａｓ  Ｕ  （２００９）  Ｈｏｗ  Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｅ  ｔｈｅ  ｈｏｓｔ  ｐｌａｎｔ．  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １２（１）：３７−４３．
【非特許文献２】Ｋａｙ  Ｓ，  Ｈａｈｎ  Ｓ，  Ｍａｒｏｉｓ  Ｅ，  Ｈａｕｓｅ  Ｇ，  ＆  Ｂｏｎａｓ  Ｕ  （２００７）  Ａ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ａｃｔｓ  ａｓ  ａ  ｐｌａｎｔ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａ  ｃｅｌｌ  ｓｉｚｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８（５８５０）：６４８−６５１．
【非特許文献３】Ｂｏｃｈ  Ｊ  ＆  Ｂｏｎａｓ  Ｕ  （２０１０）  Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ＡｖｒＢｓ３  ｆａｍｉｌｙ−ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ：  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ  ４８：４１９−４３６．
【非特許文献４】Ｂｏｃｈ  Ｊ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ｂｒｅａｋｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｏｄｅ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ＴＡＬ−ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６（５９５９）：１５０９−１５１２．
【非特許文献５】Ｇｕｒｌｅｂｅｃｋ  Ｄ，  Ｔｈｉｅｍｅ  Ｆ，  ＆  Ｂｏｎａｓ  Ｕ  （２００６）  Ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｐｌａｎｔ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｈｏｓｔ  ｐｌａｎｔ．  Ｊ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １６３（３）：２３３−２５５．
【非特許文献６】Ｍｏｓｃｏｕ  ＭＪ  ＆  Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ  ＡＪ  （２００９）  Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｃｉｐｈｅｒ  ｇｏｖｅｒｎｓ  ＤＮＡ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ＴＡＬ  ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６（５９５９）：１５０１．
【非特許文献７】Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ  ＡＪ  ＆  Ｖｏｙｔａｓ  ＤＦ  （２０１１）  ＴＡＬ  ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ：  ｃｕｓｔｏｍｉｚａｂｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３３（６０５１）：１８４３−１８４６．
【非特許文献８】Ｍｏｒｂｉｔｚｅｒ  Ｒ，  Ｒｏｍｅｒ  Ｐ，  Ｂｏｃｈ  Ｊ，  ＆  Ｌａｈａｙｅ  Ｔ  （２０１０）  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｌｏｃｉ  ｕｓｉｎｇ  ｄｅ  ｎｏｖｏ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  （ＴＡＬＥ）−ｔｙｐｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０７（５０）：２１６１７−２１６２２．
【非特許文献９】Ｃｏｎｇ  Ｌ，  Ｚｈｏｕ  Ｒ，  Ｋｕｏ  ＹＣ，  Ｃｕｎｎｉｆｆ  Ｍ，  ＆  Ｚｈａｎｇ  Ｆ  （２０１２）  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ＴＡＬＥ  ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｄｕｌｅｓ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ  ｄｏｍａｉｎｓ．  Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３：９６８．
【非特許文献１０】Ｇａｒｇ  Ａ，  Ｌｏｈｍｕｅｌｌｅｒ  ＪＪ，  Ｓｉｌｖｅｒ  ＰＡ，  ＆  Ａｒｍｅｌ  ＴＺ  （２０１２）  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ＴＡＬ  ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ｔａｒｇｅｔ  ｓｉｔｅｓ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ４０（１５）：７５８４−７５９５．
【非特許文献１１】Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ＤＮＡ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋｓ  ｗｉｔｈ  ＴＡＬ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １８６（２）：７５７−７６１．
【非特許文献１２】Ｍｉｌｌｅｒ  ＪＣ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ａ  ＴＡＬＥ  ｎｕｃｌｅａｓｅ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２９（２）：１４３−１４８．
【非特許文献１３】Ｙａｎｇ  Ｊ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１４）  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｄｅｃｏｄｉｎｇ  ｏｆ  ＴＡＬ  ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ．  Ｃｅｌｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２４（５）：６２８−６３１．
【非特許文献１４】Ｍｉｌｌｅｒ  ＪＣ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ＴＡＬＥ−ｂａｓｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ａｎ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ＲＶＤ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ．  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２（５）：４６５−４７１．
【非特許文献１５】Ｋｏｈｌｉ  ＲＭ  ＆  Ｚｈａｎｇ  Ｙ  （２０１３）  ＴＥＴ  ｅｎｚｙｍｅｓ，  ＴＤＧ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ．  Ｎａｔｕｒｅ  ５０２（７４７２）：４７２−４７９．
【非特許文献１６】Ｐａｓｔｏｒ  ＷＡ，  Ａｒａｖｉｎｄ  Ｌ，  ＆  Ｒａｏ  Ａ  （２０１３）  ＴＥＴｏｎｉｃ  ｓｈｉｆｔ：  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ＴＥＴ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ＤＮＡ  ｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４（６）：３４１−３５６．
【非特許文献１７】Ｋｒｉａｕｃｉｏｎｉｓ  Ｓ  ＆  Ｈｅｉｎｔｚ  Ｎ  （２００９）  Ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ＤＮＡ  ｂａｓｅ  ５−ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ  ｉｓ  ｐｒｅｓｅｎｔ  ｉｎ  Ｐｕｒｋｉｎｊｅ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｂｒａｉｎ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２４（５９２９）：９２９−９３０．
【非特許文献１８】Ｔａｈｉｌｉａｎｉ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ５−ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ  ｔｏ  ５−ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ＤＮＡ  ｂｙ  ＭＬＬ  ｐａｒｔｎｅｒ  ＴＥＴ１．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２４（５９２９）：９３０−９３５．
【非特許文献１９】Ｉｔｏ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｔｅｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ５ｍＣ  ｔｏ  ５ｈｍＣ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ，  ＥＳ−ｃｅｌｌ  ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ  ａｎｄ  ｉｎｎｅｒ  ｃｅｌｌ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４６６（７３１０）：１１２９−１１３３．
【非特許文献２０】Ｈｅ  ＹＦ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｔｅｔ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ５−ｃａｒｂｏｘｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｅｘｃｉｓｉｏｎ  ｂｙ  ＴＤＧ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ＤＮＡ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３３（６０４７）：１３０３−１３０７．
【非特許文献２１】Ｍａｉｔｉ  Ａ  ＆  Ｄｒｏｈａｔ  ＡＣ  （２０１１）  Ｔｈｙｍｉｎｅ  ＤＮＡ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ  ｃａｎ  ｒａｐｉｄｌｙ  ｅｘｃｉｓｅ  ５−ｆｏｒｍｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ  ａｎｄ  ５−ｃａｒｂｏｘｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ：  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ａｃｔｉｖｅ  ｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣｐＧ  ｓｉｔｅｓ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８６（４１）：３５３３４−３５３３８．
【非特許文献２２】Ｐｆａｆｆｅｎｅｄｅｒ  Ｔ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｔｈｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ５−ｆｏｒｍｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ  ｉｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ＤＮＡ．  Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ  ５０（３１）：７００８−７０１２．
【非特許文献２３】Ｈｕａｎｇ  Ｙ  ＆  Ｒａｏ  Ａ  （２０１４）  Ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ＴＥＴ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ａｂｅｒｒａｎｔ  ＤＮＡ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ  ３０（１０）：４６４−４７４．
【非特許文献２４】Ｂｕｌｔｍａｎｎ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｌｅｎｔ  ｏｃｔ４  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ  ｇｅｎｅ  ｂｙ  ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｄｅｓｉｇｎｅｒ  ＴＡＬＥｓ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ４０（１２）：５３６８−５３７７．
【非特許文献２５】Ｖａｌｔｏｎ  Ｊ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｏｖｅｒｃｏｍｉｎｇ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  （ＴＡＬＥ）  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８７（４６）：３８４２７−３８４３２．
【非特許文献２６】Ｋｉｍ  Ｙ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ａ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  ＴＡＬ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｓｐａｎｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３１（３）：２５１−２５８．
【非特許文献２７】Ｄｅｎｇ  Ｄ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ＤＮＡ  ｂｙ  ＴＡＬ  ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ．  Ｃｅｌｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２２（１０）：１５０２−１５０４．
【非特許文献２８】Ｄｕｐｕｙ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｘｅｒｏｄｅｒｍａ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓｕｍ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｍｅｇａｎｕｃｌｅａｓｅ  ａｎｄ  ＴＡＬＥＮ．  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ８（１１）：ｅ７８６７８．
【非特許文献２９】Ｈｕ  Ｊ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１４）  Ｄｉｒｅｃｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｍｏｕｓｅ  Ｏｃｔ４  ｇｅｎｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ＴＡＬＥ  ａｎｄ  Ｃａｓ９  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ４２（７）：４３７５−４３９０．
【非特許文献３０】Ｋｕｂｉｋ  Ｇ，  Ｓｃｈｍｉｄｔ  ＭＪ，  Ｐｅｎｎｅｒ  ＪＥ，  ＆  Ｓｕｍｍｅｒｅｒ  Ｄ  （２０１４）  Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  ａｎｄ  ｈｉｇｈｌｙ  ｒｅｓｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ５−ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ  ｂｙ  ＴＡＬＥｓ．  Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ  ５３（２３）：６００２−６００６．
【非特許文献３１】Ｋｕｂｉｋ  Ｇ  ＆  Ｓｕｍｍｅｒｅｒ  Ｄ  （２０１５）  Ａｃｈｉｅｖｉｎｇ  ｓｉｎｇｌｅ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ５−ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＴＡＬＥｓ．  Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ  １６（２）：２２８−２３１．
【非特許文献３２】Ｋｕｂｉｋ  Ｇ，  Ｂａｔｋｅ  Ｓ，  ＆  Ｓｕｍｍｅｒｅｒ  Ｄ  （２０１５）  Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  ｓｅｎｓｏｒｓ  ｏｆ  ５−ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ．  Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １３７（１）：２−５．
【非特許文献３３】Ｍａｕｒｅｒ  Ｓ，  Ｇｉｅｓｓ  Ｍ，  Ｋｏｃｈ  Ｏ，  ＆  Ｓｕｍｍｅｒｅｒ  Ｄ  （２０１６）  Ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ  Ｋｅｙ  Ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｓｉｚｅ−Ｒｅｄｕｃｅｄ  ＴＡＬＥ  Ｒｅｐｅａｔｓ  Ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  Ｓｅｎｓｏｒ  ｏｆ  ５−Ｃａｒｂｏｘｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ．  ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  １１（１２）：３２９４−３２９９．
【非特許文献３４】Ｒａｔｈｉ  Ｐ，  Ｍａｕｒｅｒ  Ｓ，  Ｋｕｂｉｋ  Ｇ，  ＆  Ｓｕｍｍｅｒｅｒ  Ｄ  （２０１６）  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｅｘｐａｎｄｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ．  Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １３８（３１）：９９１０−９９１８．
【非特許文献３５】Ｄｅｎｇ  Ｄ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｂｙ  ＴＡＬ  ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３５（６０６９）：７２０−７２３．
【非特許文献３６】Ｍａｋ  ＡＮ，  Ｂｒａｄｌｅｙ  Ｐ，  Ｃｅｒｎａｄａｓ  ＲＡ，  Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ  ＡＪ，  ＆  Ｓｔｏｄｄａｒｄ  ＢＬ  （２０１２）  Ｔｈｅ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ＴＡＬ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ＰｔｈＸｏ１  ｂｏｕｎｄ  ｔｏ  ｉｔｓ  ＤＮＡ  ｔａｒｇｅｔ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３５（６０６９）：７１６−７１９．
【非特許文献３７】Ｙａｎｇ  Ｊ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  ＵＬｔｉＭＡＴＥ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｃｕｓｔｏｍｉｚｅｄ  ＴＡＬ  ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ．  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ８（９）：ｅ７５６４９．
【非特許文献３８】Ｗｕ  Ｈ  ＆  Ｚｈａｎｇ  Ｙ  （２０１５）  Ｃｈａｒｔｉｎｇ  ｏｘｉｄｉｚｅｄ  ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅｓ  ａｔ  ｂａｓｅ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ．  Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２（９）：６５６−６６１．
【非特許文献３９】Ｙｕ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｂａｓｅ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ５−ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｇｅｎｏｍｅ．  Ｃｅｌｌ  １４９（６）：１３６８−１３８０．
【非特許文献４０】Ｈｓｕ  ＰＤ，  Ｌａｎｄｅｒ  ＥＳ，  ＆  Ｚｈａｎｇ  Ｆ  （２０１４）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｆｏｒ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．  Ｃｅｌｌ  １５７（６）：１２６２−１２７８．
【非特許文献４１】Ｍｕｓｓｏｌｉｎｏ  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ＴＡＬＥ  ｎｕｃｌｅａｓｅ  ｓｃａｆｆｏｌｄ  ｅｎａｂｌｅｓ  ｈｉｇｈ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｌｏｗ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３９（２１）：９２８３−９２９３．
【非特許文献４２】Ｆａｎｇ，  Ｇ．，  Ｍｕｎｅｒａ，  Ｄ．，  Ｆｒｉｅｄｍａｎ，  Ｄ．Ｉ．，  Ｍａｎｄｌｉｋ，  Ａ．，  Ｃｈａｏ，  Ｍ．Ｃ．，  Ｂａｎｅｒｊｅｅ，  Ｏ．，  Ｆｅｎｇ，  Ｚ．，  Ｌｏｓｉｃ，  Ｂ．，  Ｍａｈａｊａｎ，  Ｍ．Ｃ．，  Ｊａｂａｄｏ，  Ｏ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）．  Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｉｎ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｕｓｉｎｇ  ｓｉｎｇｌｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．  Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３０，  １２３２−１２３９．
【非特許文献４３】Ｆｕ，  Ｙ．，  Ｌｕｏ，  Ｇ．Ｚ．，  Ｃｈｅｎ，  Ｋ．，  Ｄｅｎｇ，  Ｘ．，  Ｙｕ，  Ｍ．，  Ｈａｎ，  Ｄ．，  Ｈａｏ，  Ｚ．，  Ｌｉｕ，  Ｊ．，  Ｌｕ，  Ｘ．，  Ｄｏｒｅ，  Ｌ．Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）．  Ｎ６−ｍｅｔｈｙｌｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｍａｒｋｓ  ａｃｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｓｔａｒｔ  ｓｉｔｅｓ  ｉｎ  Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ．  Ｃｅｌｌ  １６１，  ８７９−８９２．
【非特許文献４４】Ｇｒｅｅｒ，  Ｅ．Ｌ．，  Ｂｌａｎｃｏ，  Ｍ．Ａ．，  Ｇｕ，  Ｌ．，  Ｓｅｎｄｉｎｃ，  Ｅ．，  Ｌｉｕ，  Ｊ．，  Ａｒｉｓｔｉｚａｂａｌ−Ｃｏｒｒａｌｅｓ，  Ｄ．，  Ｈｓｕ，  Ｃ．Ｈ．，  Ａｒａｖｉｎｄ，  Ｌ．，  Ｈｅ，  Ｃ．，  ａｎｄ  Ｓｈｉ，  Ｙ．  （２０１５）．  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｏｎ  Ｎ６−Ａｄｅｎｉｎｅ  ｉｎ  Ｃ．  ｅｌｅｇａｎｓ．  Ｃｅｌｌ  １６１，  ８６８−８７８．
【非特許文献４５】Ｋｏｚｉｏｌ，  Ｍ．Ｊ．，  Ｂｒａｄｓｈａｗ，  Ｃ．Ｒ．，  Ａｌｌｅｎ，  Ｇ．Ｅ．，  Ｃｏｓｔａ，  Ａ．Ｓ．，  Ｆｒｅｚｚａ，  Ｃ．，  ａｎｄ  Ｇｕｒｄｏｎ，  Ｊ．Ｂ．  （２０１６）．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅｓ  ｉｎ  ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｉｎ  ＤＮＡ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ＆  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ２３，  ２４−３０．
【非特許文献４６】Ｍａｋ，  Ａ．Ｎ．，  Ｂｒａｄｌｅｙ，  Ｐ．，  Ｃｅｒｎａｄａｓ，  Ｒ．Ａ．，  Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ，  Ａ．Ｊ．，  ａｎｄ  Ｓｔｏｄｄａｒｄ，  Ｂ．Ｌ．  （２０１２）．  Ｔｈｅ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ＴＡＬ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ＰｔｈＸｏ１  ｂｏｕｎｄ  ｔｏ  ｉｔｓ  ＤＮＡ  ｔａｒｇｅｔ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３５，  ７１６−７１９．Ｒａｔｅｌ，  Ｄ．，  Ｒａｖａｎａｔ，  Ｊ．Ｌ．，  Ｂｅｒｇｅｒ，  Ｆ．，  ａｎｄ  Ｗｉｏｎ，  Ｄ．  （２００６）．  Ｎ６−ｍｅｔｈｙｌａｄｅｎｉｎｅ：  ｔｈｅ  ｏｔｈｅｒ  ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ｂａｓｅ  ｏｆ  ＤＮＡ．  ＢｉｏＥｓｓａｙｓ  ：  ｎｅｗｓ  ａｎｄ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ２８，  ３０９−３１５．
【非特許文献４７】Ｗｉｏｎ，  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｃａｓａｄｅｓｕｓ，  Ｊ．  （２００６）．  Ｎ６−ｍｅｔｈｙｌ−ａｄｅｎｉｎｅ：  ａｎ  ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｉｇｎａｌ  ｆｏｒ  ＤＮＡ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ４，  １８３−１９２．
【非特許文献４８】Ｚｈａｎｇ，  Ｇ．，  Ｈｕａｎｇ，  Ｈ．，  Ｌｉｕ，  Ｄ．，  Ｃｈｅｎｇ，  Ｙ．，  Ｌｉｕ，  Ｘ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｗ．，  Ｙｉｎ，  Ｒ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｄ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｐ．，  Ｌｉｕ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）．  Ｎ６−ｍｅｔｈｙｌａｄｅｎｉｎｅ  ＤＮＡ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ．  Ｃｅｌｌ  １６１，  ８９３−９０６．
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、５ｍＣ、５ｈｍＣおよび６ｍＡに対して認識選好、およびこれらの後成的修飾に対して異なる結合特性を有するＲＶＤを同定した。これらのＲＶＤは、メチル化依存遺伝子活性化、効率的なゲノム編集、および５ｈｍＣに対する標的検出などにおいて使用することができる。
【０００９】
本発明は一態様において、以下から選択される一つ以上のＲＶＤを含むＴＡＬＥを含む、単離されたＤＮＡ結合ポリペプチドを提供する：
５ｍＣを特異的に認識できるＨＡまたはＮＡ；
５ｈｍＣを特異的に認識できるＦＳ；
Ｃと５ｍＣの両方を認識できるＮ＊、ＮＧまたはＫＰ；
Ｃと５ｈｍＣの両方を認識できるＨＶまたはＫＶ；
５ｍＣと５ｈｍＣの両方を認識できるＫ＊またはＲＧ；
Ｃ、５ｍＣおよび５ｈｍＣの三つを認識できるＧ＊、Ｈ＊、Ｒ＊、またはＹ＊；
６ｍＡを特異的に認識できるＮＰ、ＦＴ、ＣＶまたはＣＰ；または
Ａと６ｍＡの両方を認識であるＲＩ、ＮＩ、ＫＩまたはＨＩ；
ここで、＊はその位置でのアミノ酸が欠失していることを表す。
【００１０】
本発明はもう一態様において、以下から選択される一つ以上のＲＶＤを含むＴＡＬＥと、機能ドメインとを含む、融合タンパク質を提供する：
５ｍＣを特異的に認識できるＨＡまたはＮＡ；
５ｈｍＣを特異的に認識できるＦＳ；
Ｃと５ｍＣの両方を認識できるＮ＊、ＮＧまたはＫＰ；
Ｃと５ｈｍＣの両方を認識できるＨＶまたはＫＶ；
５ｍＣと５ｈｍＣの両方を認識できるＫ＊またはＲＧ；
Ｃ、５ｍＣおよび５ｈｍＣの三つを認識できるＧ＊、Ｈ＊、Ｒ＊、またはＹ＊；
６ｍＡを特異的に認識できるＮＰ、ＦＴ、ＣＶまたはＣＰ；または
Ａと６ｍＡの両方を認識であるＲＩ、ＮＩ、ＫＩまたはＨＩ；
ここで、＊はその位置でのアミノ酸が欠失していることを表す。
【００１１】
一部の実施形態では、前記機能ドメインが、遺伝子発現を調節する機能ドメイン、後成的修飾機能ドメイン、遺伝子編集機能ドメイン、または蛍光タンパク質である。
【００１２】
一部の実施形態では、前記遺伝子発現を調節する機能ドメインは、転写活性化因子、転写抑制因子またはその機能的フラグメントであり、前記後成的修飾機能ドメインは、メチルトランスフェラーゼ、デメチラーゼまたはその機能的フラグメントであり、前記遺伝子編集機能ドメインは、ヌクレアーゼまたはその機能的フラグメントである。
【００１３】
一部の実施形態では、前記遺伝子編集機能ドメインはエンドヌクレアーゼ、好ましくはＦｏｋＩエンドヌクレアーゼ、より好ましくはＦｏｋＩエンドヌクレアーゼのＤＮＡ切断ドメインである。
【００１４】
本発明はもう一態様において、上記ＤＮＡ結合ポリペプチドまたは上記いずれか一つの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００１５】
本発明はもう一態様において、上記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【００１６】
本発明はもう一態様において、上記ポリヌクレオチドまたは上記ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００１７】
本発明はもう一態様において、
（１）ＴＡＬＥ反復ドメインの一つ以上のＲＶＤがＨＡまたはＮＡである、標的遺伝子の標的配列中のメチル化された塩基５ｍＣを検出するための試薬の調製における、ＴＡＬＥ反復ドメインを含むタンパク質の使用；
（２）ＴＡＬＥ反復ドメインの一つ以上のＲＶＤがＦＳである、標的遺伝子の標的配列中のメチル化された塩基５ｈｍＣを検出するための試薬の調製における、ＴＡＬＥ反復ドメインを含むタンパク質の使用；または
（３）ＴＡＬＥ反復ドメインの一つ以上のＲＶＤがＮＰ、ＦＴ、ＣＶまたはＣＰである、標的遺伝子の標的配列中のメチル化された塩基６ｍＣを検出するための試薬の調製における、ＴＡＬＥ反復ドメインを含むタンパク質の使用；
を含む、標的遺伝子の標的配列中のメチル化された塩基を検出するための試薬の調製における、ＴＡＬＥ反復ドメインを含むタンパク質の使用を提供する。
【００１８】
本発明はもう一態様において、細胞における標的遺伝子の標的配列を標的結合するための試薬の調製における、上記ＤＮＡ結合ポリペプチド、上記いずれか一つの融合タンパク質、上記ポリヌクレオチド、上記ベクターまたは上記宿主細胞の使用を提供する。
【００１９】
本発明はもう一態様において、細胞における標的遺伝子発現を調節するための試薬の調製における、上記いずれか一つの融合タンパク質またはその融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの使用を提供し、前記融合タンパク質に含まれる機能ドメインは、遺伝子発現を調節する機能ドメインである。
【００２０】
一部の実施形態では、前記遺伝子発現を調節する機能ドメインは、転写活性化因子またはその機能的フラグメント、若しくは転写抑制因子またはその機能的フラグメントである。
【００２１】
本発明はもう一態様において、細胞における標的遺伝子に対して遺伝子編集をするための試薬の調製における、上記いずれか一つの融合タンパク質またはその融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの使用を提供し、前記融合タンパク質に含まれる機能ドメインは遺伝子編集機能ドメインである。
【００２２】
一部の実施形態では、前記遺伝子編集は核酸切断であり、前記遺伝子編集機能ドメインはヌクレアーゼまたはその機能的フラグメント、好ましくはエンドヌクレアーゼまたはその機能的フラグメント、より好ましくはＦｏｋＩエンドヌクレアーゼまたはそのＤＮＡ切断ドメインである。
【００２３】
本発明はもう一態様において、細胞における標的遺伝子に対して後成的修飾をするための試薬の調製における、上記いずれか一つの融合タンパク質またはその融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの使用を提供し、前記融合タンパク質に含まれる機能ドメインは、後成的修飾機能ドメインである。
【００２４】
一部の実施形態では、前記後成的修飾機能ドメインはメチルトランスフェラーゼ、デメチラーゼまたはその機能的フラグメントである。
【００２５】
本発明はもう一態様において、上記ＤＮＡ結合ポリペプチド、上記いずれか一つの融合タンパク質、または上記ポリヌクレオチドを細胞に導入して前記ＤＮＡ結合ポリペプチドまたは融合タンパク質中のＴＡＬＥを標的遺伝子の標的配列に結合させることを含む、細胞における標的遺伝子の標的配列を標的結合する方法を提供する。
【００２６】
一部の実施形態では、上記方法において、
前記ＤＮＡ結合ポリペプチドまたは融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＨＡまたはＮＡから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列が５ｍＣである場合しか、前記ＤＮＡ結合ポリペプチドまたは融合タンパク質におけるＴＡＬＥは標的遺伝子の標的配列に結合しない；
前記ＤＮＡ結合ポリペプチドまたは融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＦＳから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列が５ｈｍＣである場合しか、前記ＤＮＡ結合ポリペプチドまたは融合タンパク質におけるＴＡＬＥは標的遺伝子の標的配列に結合しない；
前記ＤＮＡ結合ポリペプチドまたは融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＮＰ、ＦＴ、ＣＶまたはＣＰから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列が６ｍＡである場合しか、前記ＤＮＡ結合ポリペプチドまたは融合タンパク質におけるＴＡＬＥは標的遺伝子の標的配列に結合しない；
前記ＤＮＡ結合ポリペプチドまたは融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、Ｎ＊，ＮＧまたはＫＰから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、Ｃまたは５ｍＣであり得る；
前記ＤＮＡ結合ポリペプチドまたは融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＨＶまたはＫＶから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、Ｃまたは５ｈｍＣであり得る；
前記ＤＮＡ結合ポリペプチドまたは融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、Ｋ＊またはＲＧから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、５ｍＣまたは５ｈｍＣであり得る；
前記ＤＮＡ結合ポリペプチドまたは融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、Ｇ＊、Ｈ＊、Ｒ＊またはＹ＊から選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、Ｃ、５ｍＣまたは５ｈｍＣであり得る；または
前記ＤＮＡ結合ポリペプチドまたは融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＲＩ、ＮＩ、ＫＩまたはＨＩから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、Ａまたは６ｍＡであり得る；
ここで、＊はその位置でのアミノ酸が欠失していることを表す。
【００２７】
本発明はもう一態様において、上記いずれか一つの融合タンパク質、または前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入して前記融合タンパク質中のＴＡＬＥを標的遺伝子の標的配列に結合させ、これによって、融合タンパク質中の、遺伝子発現を調節する機能ドメインである機能ドメインによって標的遺伝子の発現が調節されることを含む、細胞における標的遺伝子の発現を調節する方法を提供する。
【００２８】
一部の実施形態では、上記方法において、
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＨＡまたはＮＡから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列が５ｍＣである場合しか、前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは標的遺伝子の標的配列に結合しない；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＦＳから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列が５ｈｍＣである場合しか、前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは標的遺伝子の標的配列に結合しない；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＮＰ、ＦＴ、ＣＶまたはＣＰから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列が６ｍＡである場合しか、前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは標的遺伝子の標的配列に結合しない；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、Ｎ＊，ＮＧまたはＫＰから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、Ｃまたは５ｍＣであり得る；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＨＶまたはＫＶから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、Ｃまたは５ｈｍＣであり得る；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、Ｋ＊またはＲＧから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、５ｍＣまたは５ｈｍＣであり得る；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、Ｇ＊、Ｈ＊、Ｒ＊またはＹ＊から選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、Ｃ、５ｍＣまたは５ｈｍＣであり得る；または
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＲＩ、ＮＩ、ＫＩまたはＨＩから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、Ａまたは６ｍＡであり得る；
ここで、＊はその位置でのアミノ酸が欠失していることを表す。
【００２９】
一部の実施形態では、上記方法において、前記遺伝子発現を調節する機能ドメインは、転写活性化因子またはその機能的フラグメント、若しくは転写抑制因子またはその機能的フラグメントである。
【００３０】
本発明はもう一態様において、上記いずれか一つの融合タンパク質、または前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入して前記融合タンパク質中のＴＡＬＥを標的遺伝子の標的配列に結合させ、これによって、融合タンパク質中の、遺伝子編集機能ドメインである機能ドメインによって標的遺伝子が編集されることを含む、細胞における標的遺伝子に対して遺伝子編集をする方法を提供する。
【００３１】
一部の実施形態では、上記方法において、
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＨＡまたはＮＡから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列が５ｍＣである場合しか、前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは標的遺伝子の標的配列に結合しない；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＦＳから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列が５ｈｍＣである場合しか、前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは標的遺伝子の標的配列に結合しない；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＮＰ、ＦＴ、ＣＶまたはＣＰから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列が６ｍＡである場合しか、前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは標的遺伝子の標的配列に結合しない；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、Ｎ＊，ＮＧまたはＫＰから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、Ｃまたは５ｍＣであり得る；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＨＶまたはＫＶから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、Ｃまたは５ｈｍＣであり得る；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、Ｋ＊またはＲＧから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、５ｍＣまたは５ｈｍＣであり得る；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、Ｇ＊、Ｈ＊、Ｒ＊またはＹ＊から選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、Ｃ、５ｍＣまたは５ｈｍＣであり得る；または
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＲＩ、ＮＩ、ＫＩまたはＨＩから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、Ａまたは６ｍＡであり得る；
ここで、＊はその位置でのアミノ酸が欠失していることを表す。
【００３２】
一部の実施形態では、上記方法において、前記遺伝子編集は核酸切断であり、前記遺伝子編集機能ドメインはヌクレアーゼまたはその機能的フラグメント、好ましくはエンドヌクレアーゼまたはその機能的フラグメント、より好ましくはＦｏｋＩエンドヌクレアーゼまたはそのＤＮＡ切断ドメインである。
【００３３】
本発明はもう一態様において、上記いずれか一つの融合タンパク質、または前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入して前記融合タンパク質中のＴＡＬＥを標的遺伝子の標的配列に結合させ、これによって、融合タンパク質中の、後成的修飾機能ドメインである機能ドメインによって標的遺伝子が後成的修飾されることを含む、細胞における標的遺伝子に対して後成的修飾をする方法を提供する。
【００３４】
一部の実施形態では、上記方法において、
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＨＡまたはＮＡから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列が５ｍＣである場合しか、前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは標的遺伝子の標的配列に結合しない；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＦＳから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列が５ｈｍＣである場合しか、前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは標的遺伝子の標的配列に結合しない；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＮＰ、ＦＴ、ＣＶまたはＣＰから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列が６ｍＡである場合しか、前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは標的遺伝子の標的配列に結合しない；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、Ｎ＊，ＮＧまたはＫＰから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、Ｃまたは５ｍＣであり得る；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＨＶまたはＫＶから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、Ｃまたは５ｈｍＣであり得る；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、Ｋ＊またはＲＧから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、５ｍＣまたは５ｈｍＣであり得る；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、Ｇ＊、Ｈ＊、Ｒ＊またはＹ＊から選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、Ｃ、５ｍＣまたは５ｈｍＣであり得る；または
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＲＩ、ＮＩ、ＫＩまたはＨＩから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、Ａまたは６ｍＡであり得る；
ここで、＊はその位置でのアミノ酸が欠失していることを表す。
【００３５】
一部の実施形態では、上記方法において、前記後成的修飾機能ドメインはメチルトランスフェラーゼ、デメチラーゼまたはその機能的フラグメントである。
【００３６】
本発明はもう一態様において、上記いずれか一つの融合タンパク質、または前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入して前記融合タンパク質中のＴＡＬＥを標的遺伝子の標的配列に結合させることを含む生細胞染色体の標識方法を提供し、前記機能ドメインが蛍光タンパク質であり、前記融合タンパク質中のＴＡＬＥを標的遺伝子の標的配列に結合させることによって標的配列に対する蛍光標識を実現する。
【００３７】
一部の実施形態では、上記方法において、
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＨＡまたはＮＡから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列が５ｍＣである場合しか、前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは標的遺伝子の標的配列に結合しない；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＦＳから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列が５ｈｍＣである場合しか、前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは標的遺伝子の標的配列に結合しない；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＮＰ、ＦＴ、ＣＶまたはＣＰから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列が６ｍＡである場合しか、前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは標的遺伝子の標的配列に結合しない；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、Ｎ＊，ＮＧまたはＫＰから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、Ｃまたは５ｍＣであり得る；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＨＶまたはＫＶから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、Ｃまたは５ｈｍＣであり得る；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、Ｋ＊またはＲＧから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、５ｍＣまたは５ｈｍＣであり得る；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、Ｇ＊、Ｈ＊、Ｒ＊またはＹ＊から選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、Ｃ、５ｍＣまたは５ｈｍＣであり得る；または
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＲＩ、ＮＩ、ＫＩまたはＨＩから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、Ａまたは６ｍＡであり得る；
ここで、＊はその位置でのアミノ酸が欠失していることを表す。
【００３８】
本発明はもう一態様において、以下を含む、細胞ゲノム中の標的配列の特定の部位に５ｍＣが存在するか否かを検出する方法を提供する：
（１）ＴＡＬＥを含むタンパク質を細胞に導入し、前記ＴＡＬＥは標的配列を標的とし、前記ＴＡＬＥ内の、前記特定の部位を認識するＲＶＤがＨＡまたはＮＡである；
（２）次に、ヌクレアーゼを細胞に導入し、前記ヌクレアーゼの標的切断部位をＴＡＬＥ標的配列に位置する；
（３）標的配列が切断されているかどうかを検出し、それによって標的配列の特定の部位に５ｍＣが存在するかどうかを判断する；標的配列が切断されていない場合、前記ＴＡＬＥが前記標的配列に結合し、前記ヌクレアーゼが当該標的配列に結合して切断することができず、前記特定の部位に５ｍＣが存在するとされ；標的配列が切断されている場合、前記ＴＡＬＥが前記標的配列に結合しておらず、前記ヌクレアーゼが当該標的配列に結合してそれを切断しており、前記特定の部位に５ｍＣが存在しないとされている。
【００３９】
本発明はもう一態様において、以下のステップを含む、細胞ゲノム中の標的配列の特定の部位に５ｈｍＣが存在するか否かを検出する方法を提供する：
（１）ＴＡＬＥを含むタンパク質を細胞に導入し、前記ＴＡＬＥは標的配列を標的とし、前記ＴＡＬＥ内の、前記特定の部位を認識するＲＶＤがＦＳである；
（２）次に、ヌクレアーゼを細胞に導入し、前記ヌクレアーゼの標的切断部位をＴＡＬＥ標的配列に位置する；
（３）標的配列が切断されているかどうかを検出し、それによって標的配列の特定の部位に５ｈｍＣが存在するかどうかを判断する；標的配列が切断されていない場合、前記ＴＡＬＥが前記標的配列に結合し、前記ヌクレアーゼが当該標的配列に結合して切断することができず、前記特定の部位に５ｈｍＣが存在するとされ；標的配列が切断されている場合、前記ＴＡＬＥが前記標的配列に結合しておらず、前記ヌクレアーゼが当該標的配列に結合してそれを切断しており、前記特定の部位に５ｈｍＣが存在しないとされている。
【００４０】
本発明はもう一態様において、以下を含む、細胞ゲノム中の標的配列の特定の部位に６ｍＡが存在するか否かを検出する方法を提供する：
（１）ＴＡＬＥを含むタンパク質を細胞に導入し、前記ＴＡＬＥは標的配列を標的とし、前記ＴＡＬＥ内の、前記特定の部位を認識するＲＶＤがＮＰ、ＦＴ、ＣＶまたはＣＰである；
（２）次に、ヌクレアーゼを細胞に導入し、前記ヌクレアーゼの標的切断部位をＴＡＬＥ標的配列に位置する；
（３）標的配列が切断されているかどうかを検出し、それによって標的配列の特定の部位に６ｍＡが存在するかどうかを判断する；標的配列が切断されていない場合、前記ＴＡＬＥが前記標的配列に結合し、前記ヌクレアーゼが当該標的配列に結合して切断することができず、前記特定の部位に６ｍＡが存在するとされ；標的配列が切断されている場合、前記ＴＡＬＥが前記標的配列に結合しておらず、前記ヌクレアーゼが当該標的配列に結合してそれを切断しており、前記特定の部位に６ｍＡが存在しないとされている。
【００４１】
一部の実施形態では、前記ヌクレアーゼがエンドヌクレアーゼである。
【００４２】
一部の実施形態では、前記ヌクレアーゼがＣａｓ９ヌクレアーゼであり、しかもステップ（１）において前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼとｓｇＲＮＡを共に細胞に導入する。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】修飾されたシトシンを認識するすべての潜在的なＴＡＬＥ  ＲＶＤｓを評価するためのスクリーニング概略図である。（ａ）はＣ、５ｍＣおよび５ｈｍＣの化学構造である。（ｂ）は、ＴＡＬＥアクチベーターとＧＦＰ発現レポーターＤＮＡフラグメントで構成される、修飾されたシトシンに対して新しいＲＶＤをスクリーニングするためのシステムの概略図である。（ｃ）では、ＴＡＬＥ−（Ｅ＊）３が５ｍＣレポーターＤＮＡフラグメントに対する場合のように、構築されたＴＡＬＥがレポーターＤＮＡフラグメントに結合しない場合（左図）、ＧＦＰ発現はベースラインレベルにある（右図）；逆に、ＴＡＬＥ−（Ｇ＊）３が５ｍＣレポーターＤＮＡフラグメントに対する場合のように、ＴＡＬＥがレポーターＤＮＡフラグメントに密接に結合する場合（左図）、ＧＦＰ発現は上昇する（右図）。ｍＣｈｅｒｒｙ強度は、ＴＡＬＥ−（ＸＸ’）３プラスミドのトランスフェクション効率を示す。
【図２】５ｍＣと５ｈｍＣを含むレポーターＤＮＡフラグメントの調製を示す図である。５ｍＣと５ｈｍＣは、５ｍＣと５ｈｍＣを含むレポーターＤＮＡフラグメントを生成するためのプライマーに組み込まれた。ＨＰＬＣクロマトグラフィーは、（ａ）５ｍＣおよび（ｂ）５ｈｍＣの組み込みを示しており、拡大画像から、５ｈｍＣのピークは明確に観察された。（ｃ）は、５ｍＣと５ｈｍＣを含むレポーターＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅の概略図である。
【図３】５ｍＣと５ｈｍＣに対するＴＡＬＥ  ＲＶＤの効率および特異性に対する完全な評価を示した図である。（ａ）５ｍＣと５ｈｍＣのスクリーニングデータは、ヒートマップを使用してまとめられた。比較のために、従来のＣおよびＴレポーターＤＮＡフラグメントの結果も示している。レポーターＤＮＡフラグメントのアイデンティティを異なる色で示し、異なるレポーターＤＮＡフラグメントのＥＧＦＰ活性を番号付けし、色の明るさは、ベースラインレベルに対して標準化された、レポーターＤＮＡフラグメントに対するＴＡＬＥ構造体の誘導倍数を示す。ここで、アミノ酸の１文字の略語が使用されている。（ｂ）図ａの予備スクリーニング結果から、５ｍＣと５ｈｍＣに対して認識能力を持っているいくつかのＲＶＤを選択して実験し、具体的には、５ｍＣと５ｈｍＣのレポーターシステムに対してＥＧＦＰ活性化倍数が大きいいくつかのＲＶＤを選択して３回重複した確認実験をし、この図は、修飾されたシトシンに対するＲＶＤの選好を示している。塩基選好によってＲＶＤを群分けし、各群において１３位の塩基によってグループ化した。データは、平均値±ＳＤ、ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５である。
【図４】修飾されたシトシンへの４２０個のＴＡＬＥ  ＲＶＤの結合選好を示す図である。このデータはヒートマップ（図３ａ）に対応している。Ｙ軸はＥＧＦＰレポーターの誘導倍数であり、Ｘ軸はＲＶＤである。ＲＶＤの１番目の残基によってヒストグラムをソートし、２番目の残基のアルファベット順にデータをリストした。
【図５】インビトロ保護アッセイによるＴＡＬＥ  ＲＶＤｓのＤＮＡ認識の定量的測定を示す図である。（ａ）インビトロ保護アッセイの原理を示す図である。簡単に言えば、ＴＡＬＥタンパク質（すなわち、図中のＴＡＬエフェクタータンパク質）は特定の配列のＤＮＡフラグメントに結合すると、ＭｓｐＩ制限エンドヌクレアーゼ部位をブロックし、それによってエンドヌクレアーゼの切断を阻害し、変性ＰＡＧＥ分析において保護された完全長バンドと切断されたＤＮＡバンドが生成する。ＤＮＡの保護効率は、ＴＡＬＥタンパク質のＤＮＡへの結合効率を反映している。（ｂ）切断されていないまたは保護されたＤＮＡフラグメントを測定することにより標準化された保護効率を取得し、それを異なるＴＡＬＥ  ＲＶＤの保護曲線に適合させた。Ｈｉｌｌ  ｓｌｏｐｅ（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いてその曲線を特異的結合曲線に適合させた。すべての実験を３回繰り返した。（ｃ）（ｂ）から計算された阻害定数であり、同じＲＶＤの最低阻害定数に対する各定数の比率を括弧内に示している。ＲＶＤの阻害定数は、異なるＲＶＤを含むＴＡＬＥタンパク質がＣ、５ｍＣおよび５ｈｍＣに対する切断保護実験を通して保護効率を得て、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６ソフトウェアを使用して保護効率曲線を適合させて阻害定数を計算して得られたものであり、この阻害定数は、Ｃ、５ｍＣおよび５ｈｍＣに対する異なるＲＶＤの結合効率を示し、阻害定数の値が小さければ小さいほど、ＲＶＤの保護効率が強く、対応するＤＮＡフラグメントへの結合が強いことを表す。ここでいう同じＲＶＤの最低阻害定数とは、当該ＲＶＤとＣ、５ｍＣおよび５ｈｍＣとの結合効率が最も高いグループの阻害定数値を指す。
【図６】インビトロ保護アッセイでの、異なるＴＡＬＥ  ＲＶＤのエピジェネティックマーカーとしてのシトシンへの特異的結合を示す図である。（ａ）精製されたＴＡＬＥタンパク質の代表的なサイズ排除クロマトグラフィーである。（ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、精製されたＴＡＬＥタンパク質の分子量が計算された分子量とよく相関することを示している。（ｃ）インビトロ保護アッセイの代表的なゲル画像である。図６から分かるように、ＭＡＰＫ６−ＨＤはＣを最高の効率で保護することができ、ＨＡは、修飾されていないＣより高い効率で５ｍＣと５ｈｍＣを保護し、ＦＳは最高の効率で５ｈｍＣを保護する。
【図７】メチル化依存性遺伝子の発現活性化と遺伝子編集を示す図である。（ａ）ＴＡＬＥＴＥＴ１は、ＴＥＴ１遺伝子の転写開始部位（ＴＳＳ）の上流約８０ｂｐでの１６ｂｐＤＮＡ配列を標的としている。この領域での三つのＣｐＧ（Ｃは黒色で表示）はすべて、ＨｅＬａ細胞では高度にメチル化されているが、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞ではメチル化されていない。（ｂ）異なるＲＶＤを含むＴＡＬＥＴＥＴ１でトランスフェクションしたＨｅＬａとＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＴＥＴ１の相対的ｍＲＮＡレベルを示す図である。（ｃ）ＴＡＬＥＬＲＰ２は、ＬＲＰ２遺伝子のＴＳＳの上流１００ｂｐでの１６ｂｐ配列を標的としている。これら二つの領域での二つのＣｐＧはＨｅＬａ細胞では中程度のレベルのメチル化を含むが、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞ではメチル化されていない。（ｄ）異なるＲＶＤを含むＴＡＬＥＬＲＰ２でトランスフェクションしたＨｅＬａとＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＬＲＰ２の相対的ｍＲＮＡレベルを示す図である。（ｅ）ＴＡＬＥＮ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅ、すなわち、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼと融合したＴＡＬＥエフェクター）の標的配列の位置を示す図である。メチル化されたＣｐＧは赤色で表示される。（ｆ）異なるＲＶＤを使用したＴＡＬＥＮの遺伝子編集効率を示す図である。データは、平均値±ＳＤ、ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５である。
【図８】メチル化依存性遺伝子の発現活性化と遺伝子編集を示す図である。（Ａ）ＲＶＤ  ＮＡ、Ｇ＊、およびＹ＊を有するＴＡＬＥＴＥＴ１でトランスフェクションしたＨｅＬａとＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＴＥＴ１の相対的ｍＲＮＡレベルを示す図である。（Ｂ）ＲＶＤ  ＮＡ、Ｇ＊、およびＹ＊を有するＴＡＬＥＬＲＰ２でトランスフェクションしたＨｅＬａとＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＬＲＰ２の相対的ｍＲＮＡレベルを示す図である。（Ｃ）ＲＶＤ  ＮＡ、Ｇ＊、およびＹ＊を有するＴＡＬＥＮのゲノム編集効率を示す図である。データは、平均値±ＳＤ、ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５である。
【図９】ゲノムＤＮＡにおける単一塩基解像度での５ｈｍＣの検出を示す図である。（ａ）新しく同定されたＲＶＤを用いて塩基レベルの解像度で５ｈｍＣを検出するワークフローである。簡単に言えば、標的ゲノム領域は、Ｃａｓ９を介したＤＮＡに切断されないように、ＴＡＬＥによって保護されている。（ｂ）ｍＥＳＣゲノム内の単一の５ｈｍＣ部位を標的とするＴＡＬＥ−ＦＳ（黒色）とＴＡＬＥ−ＨＤ（灰色）の保護効率を示す図である。（ｃ）ＴＡＬＥ−ＦＳがｍＥＳＣ、ＲＡＷ２６４．７、Ｌ−Ｍ（ＴＫ−）およびＬ９２９細胞のゲノムＤＮＡにおける単一５ｈｍＣ部位に対する保護効率を示す図である。当該特定の部位では、すべての細胞株の中で、ｍＥＳＣゲノムは最高の５ｈｍＣ修飾レベルを含む。
【図１０】５ｈｍＣを含むＤＮＡに対するＴＡＬＥ−ＦＳの選択的保護を示す図である。５ｍＣ、５ｈｍＣ、および修飾されていないＣを含むＤＮＡ（ＭＡＰＫ６遺伝子と同じ配列を持つ）を異なる比率でペアして混合した。５ｍＣ（灰色の円）の割合が増加すると、保護効率は僅かに上昇し。５ｈｍＣの割合が増加すると（Ｃおよび５ｍＣと混合し、黒丸、黒色三角形で表示）、保護効率は大幅に向上し、これは、５ｈｍＣに対するＲＶＤ  ＦＳの選択的保護を示している。
【図１１】６ｍＡおよびＡに対するＴＡＬＥ−（ＸＸ’）３の結合特定を示す図である。
【図１２】６ｍＡおよびＡに対する一部のＴＡＬＥ−（ＸＸ’）３の結合特性を示す図である。ＲＶＤの２位のアミノ酸によって群分けし、各群のＲＶＤについて６ｍＡレポーターシステムの活性化効率に従って低から高へソートした。縦軸はレポーターシステムＥＧＦＰの活性化倍数であり、灰色はＡレポーターシステムに対応し、黒色は６ｍＡレポーターシステムに対応し、横軸はＲＶＤであり、反復した後の６ｍＡの平均値が５より大きいデータ群のみが示されている。データは、ｍｅａｎｓ±ｓ．ｄ．、ｎ＝３である。
【図１３】Ａ、Ｔ、ＣおよびＧレポーターシステムに対する異なるＲＶＤの認識効率を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
本発明は、ＤＮＡへのＴＡＬＥタンパク質の結合がＤＮＡ塩基修飾により影響されることを示している。本発明は、４２０のＲＶＤについて研究した結果、５ｍＣ、５ｈｍＣおよび／または６ｍＡに対して独特の特異性を有するＲＶＤを同定した。５ｍＣ、５ｈｍＣ、及び６ｍＡは、高等真核生物の重要なエピジェネティックマーカーである。メチル化およびヒドロキシメチル化群は、塩基対形成を妨げないが、ＤＮＡ二本鎖の主溝に存在しているので、ＴＡＬＥタンパク質との相互作用に影響を与える。
【００４５】
ＴＡＬＥ−ＤＮＡ複合体の構造は、１３位のアミノ酸がセンス鎖のＤＮＡ塩基と直接に相互作用する唯一の残基であり、１２位の残基の役割が、塩基対認識プロセスで適切なループ構造を安定化にすることであることを示している（３５，３６）。１３位に小さいアミノ酸（ＧｌｙとＡｌａ）である場合、あるいはアミノ酸が欠失している場合、５ｍＣに対する親和性が増加できることは本発明により証明された。この観察結果は、Ｎ＊およびＮＧ（自然にＴを認識する）が５ｍＣに結合できるという前の発見と一致している。１３位に大きな側鎖が欠失することは、５ｍＣのメチル基を収容するのに十分なスペースを提供できる可能性がある。ただし、この一般的な傾向には例外がある。例えば、５ｍＣに対するＨＧの親和性が非常に弱く、ＨＤと比べてＨＧが１３位において小さい残基を含み、ＨＤがＣの天然の結合体であることは本発明において観察された。興味深いことに、１２位のＨｉｓがＡｒｇに置き換えられた場合（したがってＲＧになる）、５ｍＣへの強い結合が観察された。実は、ＲＧは５ｈｍＣをも認識する。これらの観察結果は、二重残基が修飾に対する認識にはより複雑なモードが存在するかもしれないことを示している。
【００４６】
本発明は、ＴＡＬＥに媒介された、いくつかの高度にメチル化されたゲノム領域のメチル化依存性遺伝子活性化とゲノム編集を証明した。重要な対照として、同じ領域にシトシンのメチル化が存在しない場合（異なる細胞内）、遺伝子の活性化はほとんど観察されていない。したがって、本発明によって発見されたＲＶＤは、インビボでの標的遺伝子の修飾状態によって標的遺伝子を操作するという可能性を提供することができる。ゲノム刷り込みと疾患などを含む、多くの重要な生物学的イベントに係るメチル化可変領域（differentially methylated region、ＤＭＲ）が多く存在することは知られている。したがって、エピジェネティックマーカーを読み取るＴＡＬＥタンパク質の独特な能力により、将来的にはインビボでのエピゲノム依存性の応用が可能になる。
【００４７】
本文で使用される「ポリヌクレオチド」という用語は、線状または環状の立体構造及び一本鎖または二本鎖形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。
【００４８】
本発明において、用語の「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は互いに置き換えて使用でき、アミノ酸の重合体を指し、その中で、一つ以上のアミノ酸は天然アミノ酸、または化学的類似体若しくは修飾誘導体であってもよい。
【００４９】
本文の「結合」とは、高分子間（例えば、タンパク質と核酸との間）の配列特異的な非共有相互作用を指す。本文で使用される用語の「結合ポリペプチド」は、別の分子と非共有結合することができるポリペプチドまたはタンパク質である。この別の分子は、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子及び／またはタンパク質分子であってもよい。
【００５０】
本発明で使用される用語の「ＴＡＬＥ」とは、ＤＮＡ結合ドメイン（ＴＡＬＥ反復ドメインまたはＴＡＬＥ繰り返し単位とも呼ばれる）およびその両側のＮ−末端とＣ−末端非反復配列を含み、ＤＮＡ配列を特異的に認識できる転写活性化因子様エフェクター（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ）を指す。前記ＤＮＡドメインは、タンデムの「繰り返し単位」で構成される。各「繰り返し単位」に３３〜３５のアミノ酸が含まれ、そのうち１２位と１３位の残基は標的認識の肝心な部位であり、反復可変二重残基（ｒｅｐｅａｔ−ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｉｒｅｓｉｄｕｅｓまたはＲＶＤ）と呼ばれ、各ＲＶＤは一つの塩基しか認識できない。ＴＡＬＥまたはそのＤＮＡドメインは、ＲＶＤを介してそのＲＶＤに順に対応するＤＮＡ標的配列を認識する。
【００５１】
天然ＴＡＬＥは一般的に１．５〜３３．５の繰り返し単位を含むが、ＤＮＡに対する効果的な認識と結合には一般的には６．５の繰り返し単位が必要であり、より強い活性を示すには１０．５以上の繰り返し単位が必要であることは研究によって明らかになった（Ｂｏｃｈ，Ｊｅｎｓ，ａｎｄ  Ｕｌｌａ  Ｂｏｎａｓ．“Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ＡｖｒＢｓ３  ｆａｍｉｌｙ−ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ：ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．”Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ４８（２０１０）：４１９−４３６．；Ｂｏｃｈ，Ｊｅｎｓ，ｅｔ  ａｌ．“Ｂｒｅａｋｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｏｄｅ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ＴＡＬ−ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ．”Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６．５９５９（２００９）：１５０９−１５１２．）。
【００５２】
ＴＡＬＥ繰り返し単位は、切られた繰り返し単位であることができ、半繰り返し単位とも呼ばれ、つまり、完全は繰り返し単位のＮ−末端の一部であり、切られた繰り返し単位はＲＶＤを含む。一般的には、天然ＴＡＬＥ反復ドメインのカルボキシ末端の最後の繰り返し単位は、切られた繰り返し単位である。繰り返し単位は一般的には１７〜２０のアミノ酸を含む。
【００５３】
本発明では、一部の実施形態では、ＴＡＬＥの繰り返し単位は、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５であってもよい。ＴＡＬＥの繰り返し単位は、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、または３４個の完全な繰り返し単位と一つの半繰り返し単位を含んでもよい。
【００５４】
好ましい実施形態では、ＴＡＬＥは、１４個の完全な繰り返し単位と一つの半繰り返し単位とを含み、半繰り返し単位は、ＴＡＬＥ繰り返し単位全体のカルボキシ末端に位置する。
【００５５】
好ましい実施形態では、ＴＡＬＥ中の単一の「繰り返し単位」は、ＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＸＸ’ＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧであってもよい。一部の実施形態では、ＴＡＬＥ中の半繰り返し単位配列は、ＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＸＸ’ＧＧＫＱである。その中で、ＸＸ’はＲＶＤである。
【００５６】
本発明の実施例で使用されるＴＡＬＥ繰り返し単位配列は、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ（キサントモナス属）のＡｖｒＢｓ３タンパク質アミノ酸配列である。この配列の他に、本発明のＲＶＤはその他の繰り返し単位配列を含むＴＡＬＥにも適用可能である。ＡｖｒＢｓ３は、異なるキサントモナス属の亜種において異なるホモログを持っており、その具体的配列について、「Ｂｏｃｈ，Ｊｅｎｓ，ａｎｄ  Ｕｌｌａ  Ｂｏｎａｓ．“Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ＡｖｒＢｓ３  ｆａｍｉｌｙ−ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ：ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．”Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ４８（２０１０）：４１９−４３６．」を参照できる。
【００５７】
本発明において、ポリペプチド配列中のアミノ酸は一文字略語で示され、本発明に係るアミノ酸およびその一文字略語は下記通りである。
【００５８】
【表１】
2020531572.tif 000003
【００５９】
本発明において、ＲＶＤを説明する時、＊はその位置でのアミノ酸が欠失していることを表す。
【００６０】
本発明において、「塩基」と「ヌクレオチド」は互いに置き換えて使用でき、プリン塩基またはピリミジン塩基、リボースまたはデオキシリボース、及びリン酸の三つの物質からなる化合物を指し、ＤＮＡ配列とＲＮＡ配列の主な組成成分である。一般的なでオキシヌクレオチドには、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、アデニン（Ａ）、及びグアニン（Ｇ）が含まれる。
【００６１】
上記四つの従来のデオキシリボヌクレオチドの他に、ほ乳類のゲノムには、修飾されたＤＮＡ塩基も含まれている。例えば、５番目のＤＮＡ塩基と呼ばれる５−メチルシトシン（５ｍＣ）は、遺伝子発現を調節する重要なエピジェネティックマーカーである。５ｍＣは、１０〜１１転座酵素（ＴＥＴ）ファミリーのタンパク質によって相次いで酸化されて５−ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）、５−ホルミルシトシン（５ｆＣ）および５−カルボキシシトシン（５ｃａＣ）を生成することができる。シトシンのメチル化修飾の他に、もう一つのよく見られるＤＮＡメチル化修飾Ｎ６−メチルアデニン（Ｎ６−ｍｅｔｈｙｌａｄｅｎｉｎｅ，６ｍＡ）は、ＤＮＡのアデニン上の共有結合修飾として原核細胞において重要な役割を果たす。
【００６２】
本発明でいう「メチル化修飾塩基」とは、メチル化修飾を有する塩基をいい、５−メチル化シトシン（５ｍＣ）、５−ヒドロキシメチル化シトシン（５ｈｍＣ）、及び６−メチル化アデニン（６ｍＡ）を含む。
【００６３】
本発明は、５ｍＣ、５ｈｍＣ、６ｍＡを特異的に認識するＲＶＤ、及びこれらのメチル化修飾塩基および対応する非修飾塩基を認識できる縮退ＲＶＤを発見した。詳細は下記表を参照できる。
【００６４】
【表２】
2020531572.tif 000004
【００６５】
上記表によれば、ＲＶＤ  ＨＡまたはＮＡは５ｍＣを特異的に認識でき、すなわち、５ｍＣを５ｈｍＣとＣとから区別付けることができる；ＲＶＤ  ＦＳは５ｈｍＣを特異的に認識でき、すなわち、５ｈｍＣを５ｍＣとＣとから区別付けることができる；ＲＶＤ  ＮＰ、ＦＴ、ＣＶまたはＣＰは６ｍＡを特異的に認識でき、すなわち、６ｍＡとＡを区別付けることができる；縮退ＲＶＤ  Ｎ＊、ＮＧまたはＫＰはＣと５ｍＣを認識できる。
【００６６】
本発明において、特に断らない限り、ＲＶＤにより認識される塩基を説明する時、「Ｃ」を用いる場合、メチル化修飾のないシトシンを意味し、「Ａ」を用いる場合、メチル化修飾のないアデニンを意味し、「５ｍＣ」を用いる場合、５−メチルシトシンを指し、「５ｈｍＣ」を用いる場合、５−ヒドロキシメチル化シトシンを指し、「６ｍＡ」を用いる場合、６−メチル化アデニンを指す。
【００６７】
本発明によれば、ある特定のメチル化修飾塩基に対する「特異的認識」とは、この特定のメチル化修飾塩基に対するＲＶＤの結合親和性が、その他の形態の修飾を有する同じ塩基よりも有意に大きい、または修飾のない同じ塩基より大きい、またはその他の異なる塩基より大きいことをいう。
【００６８】
結合親和性は、当業者によく知られている様々な方法で測定することができる。例えば、下記の参考文献に記載されているようにＴＡＬＥ−ＶＰ６４−ｍＣｈｅｒｒｙ構造体を構築し、異なる修飾塩基と蛍光タンパク質遺伝子を含むレポーターＤＮＡフラグメントを構築し、ＴＡＬＥ−ＶＰ６４−ｍＣｈｅｒｒｙ構造体が細胞内で発現したＴＡＬＥ−ＶＰ６４タンパク質がレポーターＤＮＡフラグメントを結合かつ活性化して引き起こした蛍光タンパク質シグナルの上昇倍数を利用して、ＴＡＬＥに含まれるＲＶＤとレポーターＤＮＡフラグメントに含まれる異なる修飾塩基との結合親和性を確定する。ある特定の修飾塩基に対するＲＶＤのＥＧＦＰ活性化倍数は、その他の形態の塩基に対するＥＧＦＰ活性化倍数より有意に高い場合、ＲＶＤが当該特定の修飾塩基を特異的に認識できると考えられる。結合親和性は、本発明の実施例４に記載されているインビトロ保護アッセイによっても確定できる。
【００６９】
上記表によれば、ＲＶＤ  ＨＡまたはＮＡが５ｍＣを特異的に認識できることを本発明は発見した。ＲＶＤ  ＨＡまたはＮＡの５ｍＣへの結合親和性は、５ｈｍＣとＣへの結合親和性より有意に高く、このＲＶＤを利用すれば、５ｍＣを５ｈｍＣとＣとを区別付けることができ、ＴＡＬＥと５ｍＣとの特異的な結合を実現することができ、５ｍＣに依存する様々な具体的な使用を実現することができる。
【００７０】
５ｍＣに依存する様々な具体的な使用は、遺伝子中の５ｍＣの検出、５ｍＣに依存する、遺伝子発現調節、遺伝子編集、後成的修飾など（すなわち、標的配列に５ｍＣが存在する場合にのみ遺伝子発現調節、遺伝子編集または後成的修飾をせずに、対応する位置にＣまたは５ｈｍＣである場合には遺伝子発現調節、遺伝子編集または後成的修飾をする）、５ｍＣに依存する生細胞染色体標識（すなわち、染色体中の対応する位置に５ｍＣを有する遺伝子のみを標識し、対応する位置にはＣまたは５ｈｍＣである場合は標識せずに、これによって生細胞における遺伝子のシトシンのメチル化状況を観察することができる）、５ｍＣを含む配列に特異的に結合できるタンパク質の調製を含むが、これらに限られていない。
【００７１】
ＲＶＤ  ＦＳが５ｈｍＣを特異的に認識できることを本発明はさらに発見した。ＲＶＤ  ＦＳの５ｈｍＣへの結合親和性は、５ｍＣとＣへの結合親和性より有意に高く、このＲＶＤを利用すれば、５ｈｍＣを５ｍＣとＣとを区別付けることができ、ＴＡＬＥと５ｈｍＣとの特異的な結合を実現することができ、５ｈｍＣに依存する様々な具体的な使用を実現することができる。
【００７２】
５ｈｍＣに依存する様々な具体的な使用は、遺伝子中の５ｈｍＣの検出、５ｈｍＣに依存する、遺伝子発現調節、遺伝子編集、後成的修飾など（すなわち、標的配列に５ｈｍＣが存在する場合にのみ遺伝子発現調節、遺伝子編集または後成的修飾をせずに、対応する位置にＣまたは５ｍＣである場合には遺伝子発現調節、遺伝子編集または後成的修飾をする）、５ｈｍＣに依存する生細胞染色体標識（すなわち、染色体中の対応する位置に５ｈｍＣを有する遺伝子のみを標識し、対応する位置にはＣまたは５ｍＣである場合は標識せずに、これによって生細胞における遺伝子のシトシンのメチル化状況を観察することができる）、５ｈｍＣを含む配列に特異的に結合できるタンパク質の調製を含むが、これらに限られていない。
【００７３】
また、ＲＶＤ  ＮＰ、ＦＴ、ＣＶまたはＣＰが６ｍＡを特異的に認識できることを本発明は発見した。これらのＲＶＤの６ｍＡへの結合親和性はＡへの結合親和性より有意に高く、これらのＲＶＤを利用すれば、６ｍＡをＡとを区別付けることができ、ＴＡＬＥと６ｍＡとの特異的な結合を実現することができ、６ｍＡに依存する様々な具体的な使用を実現することができる。
【００７４】
６ｍＡに依存する様々な具体的な使用は、遺伝子中の６ｍＡの検出、６ｍＡに依存する、遺伝子発現調節、遺伝子編集、後成的修飾など（すなわち、標的配列に６ｍＡが存在する場合にのみ遺伝子発現調節、遺伝子編集または後成的修飾をせずに、対応する位置にＡである場合には遺伝子発現調節、遺伝子編集または後成的修飾をする）、６ｍＡに依存する生細胞染色体標識（すなわち、染色体中の対応する位置に６ｍＡを有する遺伝子のみを標識し、対応する位置にはＡである場合は標識せずに、これによって生細胞における遺伝子のシトシンのメチル化状況を観察することができる）、６ｍＡを含む配列に特異的に結合できるタンパク質の調製を含むが、これらに限られていない。
【００７５】
また、縮退ＲＶＤ  Ｎ＊、ＮＧまたはＫＰがＣと５ｍＣを認識できることを本発明は発見した。これらの縮退ＲＶＤは類似した結合親和性でＣと５ｍＣに結合し、しかもこれらの縮退ＲＶＤのＣと５ｍＣへの結合親和性は５ｈｍＣへの結合親和性より有意に高い。
【００７６】
また、縮退ＲＶＤ  ＨＶまたはＫＶがＣと５ｈｍＣを認識できることを本発明は発見した。これらの縮退ＲＶＤは類似した結合親和性でＣと５ｈｍＣに結合し、しかもこれらの縮退ＲＶＤのＣと５ｈｍＣへの結合親和性は５ｍＣへの結合親和性より有意に高い。
【００７７】
また、縮退ＲＶＤ  Ｋ＊またはＲＧが５ｍＣと５ｈｍＣを認識できることを本発明は発見した。これらの縮退ＲＶＤは類似した結合親和性で５ｍＣと５ｈｍＣに結合し、しかもこれらの縮退ＲＶＤの５ｍＣと５ｈｍＣへの結合親和性は５ｍＣへの結合親和性より有意に高い。
【００７８】
また、縮退ＲＶＤ  Ｇ＊、Ｈ＊、Ｒ＊またはＹ＊がＣ、５ｍＣ、及び５ｈｍＣを認識できることを本発明は発見した。これらの縮退ＲＶＤは類似した結合親和性でＣ、５ｍＣ、及び５ｈｍＣに結合する。
【００７９】
また、縮退ＲＶＤ  ＲＩ、ＮＩ、ＫＩまたはＨＩが６ｍＡとＡを認識できることを本発明は発見した。これらの縮退ＲＶＤは類似した結合親和性でＡと６ｍＡに結合する。
【００８０】
これらの縮退ＲＶＤは、二つまたは三つの異なるメチル化修飾されたまたはメチル化修飾されていない塩基を同時に認識することができ、塩基のメチル化修飾状況を知らなくても使用することができ、ＴＡＬＥの標的結合効率を向上させ、ＴＡＬＥと標的配列との結合に対するメチル化修飾の影響を低減することができる。例えば、細胞ゲノム中の５ｍＣは、ＴＥＴファミリータンパク質の触媒作用下で５ｈｍＣに酸化されることができ、５ｍＣと５ｈｍＣを同時に認識できる縮退ＲＶＤを使用すると、シトシンメチル化の違いによる結合効率の低下などの問題を避けることができる。そのため、具体的な実験では、実験の目的によって、具体的な実験のニーズを満たすように、ある一つのメチル化修飾塩基を特異的に認識するＲＶＤ、二つのメチル化形態の塩基を認識する縮退ＲＶＤ、及び三つのメチル化形態の塩基を認識する縮退ＲＶＤを組み合わせて使用することができる。
【００８１】
本発明のＲＶＤは、特定のメチル化形態の塩基に結合する必要がある任意の応用に使用することができ、これらの応用は、インビトロまたはインビボであってもよく、これらの応用は非治療的であってもよい。
【００８２】
本発明のＲＶＤを含むＴＡＬＥは、特定のメチル化形態を有する塩基に結合するためのＤＮＡ結合ポリペプチドとして発現されることができる。場合によって、このＤＮＡ結合ポリペプチドは「抗体」として機能して、その「抗原」（すなわち、特定のメチル化形態を有する塩基の標的配列）に結合することができる。場合によって、このＤＮＡ結合ポリペプチドは、特定のメチル化形態を有する塩基の標的配列に結合して、ヌクレアーゼによって切断されないように、またはその他のＤＮＡ結合ポリペプチド（例えば、転写調節因子など）と相互作用をしないようにそれを保護することができる。
【００８３】
本発明のＲＶＤを含むＴＡＬＥはまた、蛍光タンパク質とカップリングして融合タンパク質を形成することができる。この融合タンパク質を用いて、生細胞の染色体上の、特定のメチル化形態を有する塩基の標的配列に結合させ、これによって生細胞中の染色体の動的変化を観察することができる。
【００８４】
蛍光タンパク質は当業者に周知であり、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）または青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）などを含むが、これらに限られていない。
【００８５】
本発明のＲＶＤを含むＴＡＬＥはまた、機能ドメインにカップリングして融合タンパク質を形成することができ、この融合タンパク質を使用して、特定のメチル化形態の塩基を有する標的配列を操作することができる。この操作は、遺伝子編集、遺伝子発現の調節、または後成的修飾などであってもよく、前記機能ドメインは、遺伝子編集機能ドメイン、遺伝子発現を調節するドメイン、または後成的修飾ドメインであってもよい。
【００８６】
用語の「遺伝子編集」とは、遺伝子の挿入、削除または置換を含む、標的部位での遺伝子配列を変更することを指す。例えば、前記遺伝子編集は、ヌクレアーゼを使用して標的部位にＤＮＡ二本鎖切断してＤＮＡ一本鎖ギャップなどを形成し、続いてＤＮＡ配列の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復中にＤＮＡの挿入または削除（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ，ｉｎｄｅｌ）が生じてフレームシフト突然変異を引き起こし、これによって遺伝子ノックアウトの目的を達成する。遺伝子編集機能ドメインとは、遺伝子編集機能を実現可能なアミノ酸配列を指す。
【００８７】
本発明のＲＶＤを含むＴＡＬＥと遺伝子編集機能ドメインとを含む融合タンパク質を使用して遺伝子編集をする時、遺伝子編集機能ドメインはヌクレアーゼであってもよい。ヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを含むが、これらに限られていない。Ｃａｓ９ヌクレアーゼの使用は本分野で周知であり、その使用は通常、標的配列の切断を実現するようにＣａｓ９ヌクレアーゼとｓｇＲＮＡを共に細胞に導入することである。
【００８８】
本発明において、遺伝子編集を行う場合、前記融合タンパク質をＴＡＬＥＮの形で提供可能であることが好ましく、この場合、遺伝子編集機能ドメインはＦｏｋＩエンドヌクレアーゼのＤＮＡ切断ドメインである。
【００８９】
用語の「遺伝子発現の調節」とは、非コードＲＮＡ、及び一つ以上のタンパク質またはタンパク質サブユニットをコードするＲＮＡを含む、遺伝子の発現またはＲＮＡ分子のレベルを変更することを指す。「遺伝子発現の調節」はさらに、一つ以上の遺伝子産物、タンパク質またはタンパク質サブユニットの活性を変更することを含む。遺伝子発現を調節する機能ドメインとは、標的遺伝子の発現を調節できるアミノ酸配列をいう。
【００９０】
前記遺伝子発現を調節する機能ドメインは、転写活性化因子またはその機能的フラグメント、若しくは転写抑制因子またはその機能的フラグメントであってもよい。
【００９１】
用語の「後成的修飾」とは、標的遺伝子のＤＮＡ配列を変更せずに、ＤＮＡメチル化修飾、ＤＮＡ脱メチル化などを含むＤＮＡの修飾を指す。後成的修飾機能ドメインとは、標的遺伝子に対して後成的修飾が可能なアミノ酸配列を指す。
【００９２】
後成的修飾機能ドメインは、メチルトランスフェラーゼ、デメチラーゼであってもよい。
【００９３】
用語の「機能的フラグメント」とは、その配列が完全長のタンパク質またはポリペプチドの一部であるが、完全長のタンパク質またはポリペプチドと同じ機能を有するタンパク質またはポリペプチド、例えば、ヌクレアーゼの切断機能ドメインのような、特定の実験条件下で対応する機能を発揮可能なタンパク質ドメインである。
【００９４】
本文に記載の細胞は、任意の細胞または細胞株であってもよく、植物、動物（例えば、マウス、ラット、霊長類、家畜、ウサギなどの哺乳動物）、魚などの細胞であってもよく、真核生物（例えば、酵母、植物、真菌、魚、及びネコ、イヌ、ねずみ、ウシ、ヒツジ、ブタなどのような哺乳動物細胞）細胞であってもよい。
【００９５】
本文に記載の細胞は、卵母細胞、Ｋ５６２細胞、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞、ＨＥＰ−Ｇ２細胞、ＢａＦ−３細胞、シュナイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）細胞、ＣＯＳ細胞（ＳＶ４０Ｔ−抗原を発現するサル腎細胞）、ＣＶ−１細胞、ＨｕＴｕ８０細胞、ＮＴＥＲＡ２細胞、ＮＢ４細胞、ＨＬ−６０細胞、及びＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞などであってもよい。
【００９６】
本発明のいずれか一項の技術方案の方法は、インビトロまたはインビボで実施することができる。
【００９７】
本発明のいずれか一項の技術方案の方法は、非治療的であってもよい。
【実施例】
【００９８】
実施例１  材料と方法
【００９９】
１、ＤＮＡの合成と精製
オリゴ（Ｏｌｉｇｏ）ＤＮＡプライマーを、５ｍＣと５ｈｍＣホスホルアミダイトを含む標準試薬（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用してＥｘｐｅｄｉｔｅ  ８９０９  ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーで合成した。Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ．が推奨した標準法でＯｌｉｇｏ  ＤＮＡを脱保護し、Ｇｌｅｎ−Ｐａｋ  ＤＮＡ精製カートリッジ（ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｃａｒｔｒｉｄｇｅ）を使用してＯｌｉｇｏ  ＤＮＡを精製した。
【０１００】
合成されたＤＮＡを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で検証した。要するに、ＤＮＡをリボザイムＰ１（Ｓｉｇｍａ、Ｎ８６３０）およびアルカリホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ、Ｐ４２５２）でヌクレオシドに消化させた。ＳＢ−Ａｑ  Ｃ１８カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ）で５％〜５０％アセトニトリルを使用して３０分間内にヌクレオシドを分離した。
【０１０１】
２、細胞培養、トランスフェクション、フローサイトメトリー
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（スタンフォード大学のＳｔａｎｌｅｙ  Ｃｏｈｅｎ  Ｌａｂから）、及びＨｅＬａ細胞（本Ｌａｂで保存）をＤＭＥＭで培養し、１０％ＦＢＳおよび１％ペイシリン‐ストレプトマイシンを添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。トランスフェクションの２４時間前に、１ウェル当たり７×１０４細胞の播種密度で細胞を２４ウェルプレートに播種した。０．１５μｇのＴＡＬＥ−（ＸＸ’）３プラスミドと０．１５μｇのレポーターＤＮＡを用いてポリエチレンイミン（ＰＥＩ）で各ウェルの細胞を同時トランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を収集し、ＢＤ  ＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。４８８ｎｍと５６１ｎｍの波長のレーザーを使用してそれぞれＥＧＦＰとｍＣｈｅｒｒｙタンパク質発現を定量化した。各サンプルから少なくとも１００００イベントを収集し、分析に十分なデータを取得した。ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光密度が５×１０３〜５×１０４である細胞は、分析に用いられた。
【０１０２】
３、ＴＡＬＥＮの構築
ＴＡＬＥＮプラスミドの骨格には、ＣＭＶプロモーター、核局在化シグナル、ＴＡＬＥアミノ末端とカルボキシル末端の非反復配列、及びエンドヌクレアーゼのＦｏｋＩモノマーが含まれており、その具体的な配列について、参考文献３７を参照できる。
使用中、異なるＲＶＤを含むＴＡＬＥ繰り返し単位がＴＡＬＥＮ骨格ベクターに挿入され、異なるＲＶＤの効果が検証された。その構築方法について、Ｙａｎｇ，Ｊｕｎｊｉａｏ，ｅｔ  ａｌ．“Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  Ｃｕｓｔｏｍｉｚｅｄ  ＴＡＬ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＵＬｔｉＭＡＴＥ  Ｓｙｓｔｅｍ．”ＴＡＬＥＮｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  （２０１６）：４９−６０を参照できる。
【０１０３】
４、ＴＡＬＥタンパク質の発現と精製
発現及び精製されたＴＡＬＥタンパク質は、インビトロ保護アッセイに使用された。
前述のように、ＵＬｔｉＭＡＴＥシステムを使用して標準ＲＶＤ（すなわち、ＮＩ、ＮＧ、ＨＤおよびＮＮ）を有するＴＡＬＥ繰り返し単位を構築した（３７）。新しいＲＶＤを使用したＴＡＬＥ繰り返し単位の場合、新しいＲＶＤを含むＴＡＬＥ繰り返し単位モノマーは個別に合成された。前述のように、同じＵＬｔｉＭＡＴＥプロトコルを使用してこれらのＴＡＬＥ構造体の最終組み立てを実行した（３７）。
【０１０４】
ＴＡＬＥ発現プラスミドの構築は、ＴＡＬＥ繰り返し単位をＴＡＬＥＮ骨格に組み換えることにより実現された。ＴＡＬＥｎのＮ−およびＣ−末端配列を含み、しかも中間繰り返し単位を持つフラグメントを、対応するＴＡＬＥＮプラスミドから増幅し、ｐＥＴ−２８ａ（＋）のＮｈｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングした。
異なるＲＶＤを有するＴＡＬＥの配列（精製用Ｈｉｓタグ、ＴＡＬＥのＮ−およびＣ−末端配列、及び、ＤＮＡを特異的に認識できるＴＡＬＥ繰り返し単位を含む）は、ｐＥＴ２８ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングされた。細胞密度がＯＤ６００  ８．０に達すると、１．０ｍＭイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）においてＴＡＬＥタンパク質の過剰発現を誘導した。２０℃で１６時間増殖させた後、細胞を回収し、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０および１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含むバッファーに再懸濁し、超音波処理により細胞を破壊した。Ｎｉ２＋‐ニトリロトリアセテート親和性樹脂（Ｎｉ−ＮＴＡ、ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）（Ｂｕｆｆｅｒ  Ａ：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌおよび５００ｍＭイミダゾール）、およびＨｉＬｏａｄ  ｓｕｐｅｒｄａｘ  ＰＧ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）（Ｂｕｆｆｅｒ  ＧＦ：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）を順次に用いて組み換えタンパク質を精製した。
【０１０５】
５、ＴＡＬＥＮ繰り返し単位
以下の実施例で使用されたＴＡＬＥ繰り返し単位は、連続した１４の繰り返し単位と一つの半繰り返し単位とを含み、各単一の繰り返し単位は３４のアミノ酸残基を含み、その配列は、ＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＸＸ’ＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧであり、半繰り返し単位は単一の繰り返し単位の最初の１７のアミノ酸残基を含み、その配列は、ＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＸＸ’ＧＧＫＱである。ここで、ＸＸ’はＲＶＤである。
本実施例で説明された材料と方法は、下記の実施例２〜７に用いられている。
【０１０６】
実施例２  人工スクリーニングシステムの構築
【０１０７】
人工スクリーニングシステムは、レポーターＤＮＡエレメントとＴＡＬＥ−ＶＰ６４発現ライブラリーで構成されている。
ＴＡＬＥ−ＶＰ６４発現ライブラリーは、４００のＴＡＬＥ−ＶＰ６４−ｍＣｈｅｒｒｙ構造体を含み、各ＴＡＬＥ−ＶＰ６４−ｍＣｈｅｒｒｙ構築体は、細胞にトランスフェクションされるとＴＡＬＥ−ＶＰ６４融合タンパク質を発現する環状プラスミドである（具体的な構築方法について、後文の参考文献３７を参照できる）。図１Ｂに示すように、各構築体は人工ＴＡＬＥアレイを含み、この人工ＴＡＬＥアレイは、ＶＰ６４に融合された１４．５の反復を含み、１〜６、１０〜１４番目の反復、および最後の半反復（図１Ｂで１４．５番目の反復として示されている）にとって、異なる構築体の間は同じであるが、７〜９番目の反復は、異なる構築体の間で異なる。各構築体について、人工ＴＡＬＥアレイの７〜９番目の反復の三つの連続したモノマーのＲＶＤは、同じ６つのランダムに合成されたヌクレオチドによりコードされ、すなわち、７〜９番目の繰り返し単位は、三つの同一のＲＶＤをタンデムで発現し、これらの人工ＴＡＬＥアレイはＴＡＬＥ−（ＸＸ’）３と呼ばれ、これによって、異なるＲＶＤの５ｍＣおよび５ｈｍＣに対する認識を検出するために、異なるテストＲＶＤ  ＸＸ’を有する４００のＴＡＬＥを形成した。ここで、ＸおよびＸ’はそれぞれ、反復の１２と１３番目の残基（すなわちＲＶＤ）を表す。また、Ｎ＊が５ｍＣを認識することができることは発見されていたため、２０のＴＡＬＥ−（Ｘ＊）３が別途に組み立てられており、１３番目の残基は欠失している。後文で、上記のＴＡＬＥ−（ＸＸ’）３とＴＡＬＥ−（Ｘ＊）３をまとめてＴＡＬＥ−（ＸＸ’）３と呼ぶ。したがって、使用されるＴＡＬＥ−ＶＰ６４発現ライブラリーは合計、４２０種類の異なるＴＡＬＥ−（ＸＸ’）３を含む４２０種類のＴＡＬＥ−ＶＰ６４−ｍＣｈｅｒｒｙ構築体を含み、後文でまとめてＴＡＬＥ構築体と呼ばれ、ＴＡＬＥ−（ＸＸ’）３プラスミドまたはＴＡＬＥ−（ＸＸ’）３発現プラスミドとも呼ばれる。
【０１０８】
ＴＡＬＥ−ＶＰ６４発現ライブラリーを生成した。具体的には、４２０種類のＴＡＬＥ−（ＸＸ’）３を２種類に分けて、そのうち４００種類のＴＡＬＥ−（ＸＸ’）３プラスミドの７〜９番目の繰り返し単位のＲＶＤの１２と１３番目のアミノ酸残基は、２０種類の天然アミノ酸残基の組み合わせであり、このようなＴＡＬＥ−（ＸＸ’）３プラスミドの構築方法は、後文の参考文献１３に記載されている。
【０１０９】
他の２０種類のＴＡＬＥ−（ＸＸ’）３の７〜９番目の繰り返し単位に発現されたＲＶＤは、１３位のアミノ酸残基が欠失しているＲＶＤであり、すなわち、Ａ＊、Ｃ＊、Ｄ＊、Ｅ＊、Ｆ＊、Ｇ＊、Ｈ＊、Ｉ＊、Ｋ＊、Ｌ＊、Ｍ＊、Ｎ＊、Ｐ＊、Ｑ＊、Ｒ＊、Ｓ＊、Ｔ＊、Ｖ＊、Ｗ＊、Ｙ＊である。これらの２０種類のＴＡＬＥ−（ＸＸ’）３発現プラスミドの構築について、後文の参考文献１３に報告されているＴＡＬＥ−（ＸＸ’）３の分別構築法が使用される。すなわち、特定のＲＶＤをコードするフォワードプライマー５’‐ｔＣＧＴＣＴＣａＧＡＡＣＡＧＧＴＴＧＴＡＧＣＣＡＴＡＧＣＴＴＣＴＮＮＮＮＮＮＧＧＡＧＧＴＡＡＧＣＡＧＧＣＡＣＴＧＧＡＡ‐３’（ＮＮＮＮＮＮは、特定のＲＶＤをコードする塩基配列を表す）と、同じのリバースプライマー５’‐ａａＣＧＴＣＴＣａＧＴＴＣＧＧＧＧＧＴＣＡＡＣＣＣＡＴＧＡＧＣＣＴＧＡＣＡＣＡＧＴＡＣＴＧＧＧＡＧＣＡＧＧＣＧＣＴＧＣＡＣＧＧＴＴＴＣＣＡＧＴＧＣＣＴＧＣＴＴ‐３’とを用いて、ＢｓｍＢＩ制限性エンドヌクレアーゼ部位を両端に有する、１０２ｂｐ長のＴＡＬＥモノマーフラグメントをアニーリングとＰＣＲ伸長により生成した。その後、６つのＧｏｌｄｅｎ−Ｇａｔｅ消化ライゲーションサイクルを通してＴＡＬＥモノマーフラグメントを連結し、プライマーＧ−ｌｉｂ−ＦとＧ−ｌｉｂ−Ｒを使用してＴＡＬＥマルチマーを増幅した。最後に、ゲル回収法を使用して、３つのＴＡＬＥモノマーしか含有しないフラグメントを選択的に回収し、予め構築したライブラリー発現ベクターに連結し、Ｔｒａｎｓ１−Ｔ１コンピテント細胞に形質転換した。対応するＲＶＤを正確に発現するＴＡＬＥ−（ＸＸ’）３プラスミドをＳａｎｇｅｒシーケンスにより得た。その中で、
Ｇ−ｌｉｂ−Ｆ： ５’−ＴＡＧＣＴＡＴＡＣＧＴＣＴＣＡＴＴＧＡＣＣＣＣＣＧＡＡＣＡＧＧＴＴＧＴＡＧＣＣ−３’
Ｇ−ｌｉｂ−Ｒ： ５’−ＴＡＧＣＴＡＴＡＣＧＴＣＴＣＡＣＣＣＡＴＧＡＧＣＣＴＧＡＣＡＣＡＧＴＡＣＴＧＧＧＡＧＣＡ−３’である。
【０１１０】
レポーターＤＮＡエレメントは、ＴＡＬＥ−（ＸＸ’）３認識配列、ｍｉｎｉＣＭＶプロモーター、ＥＧＦＰタンパク質コーディング配列、およびｐｏｌｙＡシグナルを含む直線状ＤＮＡフラグメントである（図１ｂ）。レポーターＤＮＡエレメントのＴＡＬＥ−（ＸＸ’）３認識配列は１５塩基長であり、そのうち１〜６、１０〜１５番目の塩基は、それぞれライブラリーＴＡＬＥ構築体の１〜６、１０〜１４．５番目の反復に含まれるＲＶＤにより認識されることができる。レポーターＤＮＡエレメントのＴＡＬＥ−（ＸＸ’）３認識配列の７〜９番目の塩基は、対応するメチル化修飾塩基に対する異なるＲＶＤの結合能力をテストするための、連続した３つの５ｍＣ、５ｈｍＣまたは６ｍＡであってもよく、それぞれ５ｍＣレポーターＤＮＡエレメント、５ｈｍＣレポーターＤＮＡエレメント、または５ｍＡレポーターＤＮＡエレメントと呼ばれる。スクリーニングされるメチル化修飾塩基に基づいて、一つまたはそれ以上のレポーターＤＮＡエレメントの使用を決定する。レポーターＤＮＡエレメントは、化学合成された特定のメチル化修飾塩基を含むフォワードプライマーＲｅｐｏｒｔ−Ｆと、同じのリバースプライマーＲｅｐｏｒｔ−Ｒとを使用してＰＣＲ増幅によって得られたものであり、サイズは約１４５０ｂｐである。
【０１１１】
プライマーの配列の下記通りである。
Ｒｅｐｏｒｔ−Ｆ：
５’−Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊ＡＧＡＴＡＴＡＣＧＣＧＴＴＡＣＴＧＧＡＧＣＣＡＴＣＴＧＧＣＣＮＮＮＴＡＣＧＴＡＧＧＣＧＴＧＴＡＣ−３’、ここで、Ｎは５ｍＣ、５ｈｍＣ、または６ｍＡを表す；
Ｒｅｐｏｒｔ−Ｒ：５’−Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊ＧＴＣＴＣＣＣＧＴＡＡＡＧＣＡＣＴＡＡＡＴＣＧＧＡＡＣＣＣＴＡＡＡＧＧＧＡＧＣ−３’
（＊は、主にレポーターＤＮＡエレメントを細胞内でヌクレアーゼによる分解から保護する役割を果たすチオ修飾塩基を表し、下線は、ＴＡＬＥ−（ＸＸ’）３認識配列、すなわち、ＴＡＬＥ結合配列を表す。）
【０１１２】
レポーターＤＮＡエレメントの構築過程は次の通りである。まず、大腸菌からレポータープラスミドｐｃＤＮＡ６＿３Ａを増幅し（図２ｃ）、このレポータープラスミドは、ＴＡＬＥ−（ＸＸ’）３の結合部位のテンプレート配列ＣＴＧＧＣＣＡＡＡＴＡＣＧＴＡを含む。次に、５ｍＣ、５ｈｍＣまたは６ｍＡを含む上記のプライマーを化学合成し、ＴＡＬＥ結合配列に５ｍＣ、５ｈｍＣまたは６ｍＡを含む直線状レポーターＤＮＡエレメントをＰＣＲによって生成し（図２ｃ）、フォワードプライマーはＴＡＬＥ−（ＸＸ’）３結合配列ＣＴＧＧＣＣＮＮＮＴＡＣＧＴＡを含み、その中で、Ｎは５ｍＣ、５ｈｍＣまたは６ｍＡを表し、最小ＣＭＶプロモーター（ｐｍｉｎｉＣＭＶ）とその下流のＥＧＦＰ遺伝子のすぐ上流に位置する。その中で、ＴＡＬＥ結合配列の７〜９番目の反復塩基に対応するのは、三つの連続した５ｍＣ、５ｈｍＣ、または６ｍＡである。
また、人工スクリーニングシステムは、下記の参考文献１３に記載の方法に従って構築された環状ＤＮＡである、ＣおよびＴのレポーターＤＮＡエレメントを含んでもよい。その中に含まれるＴＡＬＥ−（ＸＸ’）３認識配列は、ＮＮＮがＣＣＣまたはＴＴＴであることを除き、その他は上記と同じである。
上記の人工スクリーニングシステムを使用して、レポーターＤＮＡエレメントのＴＡＬＥ結合配列へのＴＡＬＥ−（ＸＸ’）３の結合の特異性を、ＥＧＦＰの蛍光レベルを測定することにより検出した。これによって、ＴＡＬＥ  ＲＶＤ認識スクリーニングを体系的に評価するためのプラットフォームが構築されて取得された。
【０１１３】
実施例３  修飾されたシトシンを認識するＴＡＬＥ  ＲＶＤのスクリーニング
【０１１４】
４２０個のＲＶＤの５ｍＣおよび５ｈｍＣへの結合親和性を測定するために、４２０個のＴＡＬＥ構築体のそれぞれを、３種類のＥＧＦＰレポーターＤＮＡエレメント（それぞれ、三つの連続したＣ、５ｍＣまたは５ｈｍＣを含む）のうちの一つと一緒にＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入した。ＥＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙ蛍光レベルを、ＦＡＣＳ分析を使用して測定した（図１ｃ）。対応する塩基のベースラインレベルに対する各ＲＶＤのＥＧＦＰ発現の倍数変化を比較することにより、ＴＡＬＥ構築体の４２０個のＲＶＤのそれぞれがＣ、５ｍＣおよび５ｈｍＣへの結合特異性を確定した。Ｃ、５ｍＣおよび５ｈｍＣの１２６０のデータポイント、および前の研究（以下の参考文献１３を参照）の、Ｔに対する４２０のデータポイントをヒートマップ（ｈｅａｔ  ｍａｐ）にまとめた（図３ａおよび図４）。
図３ａの予備スクリーニング結果から、５ｍＣと５ｈｍＣへの結合力のより高いＲＶＤをいくつか選択して３回の反復の確認実験をした。そのうち、５ｍＣ、５ｈｍＣレポーターＤＮＡフラグメントについてＥＧＦＰ活性化倍数が４以上であるＲＶＤは、これらの２つのヌクレオチドに対してそれぞれより高い結合力を有する者であると認定され、その結果は図３ｂに示される。
【０１１５】
その結果から分かるように、スクリーニングにより、５ｍＣおよび５ｈｍＣを効果的に認識する特異性の縮退ＲＶＤが得られた。５ｍＣへの高い結合力を持つ複数の結合剤が認識され、それらは、１３位のアミノ酸残基によって、Ｇｌｙを含むＲＶＤｓ（ＮＧ、ＫＧおよびＲＧ）、Ａｌａを含むＲＶＤｓ（ＨＡおよびＮＡ）、および欠失を含むＲＶＤｓ（Ｎ＊、Ｋ＊、Ｈ＊、Ｒ＊、Ｙ＊、およびＧ＊）の３種類に分けられた。Ｇｌｙを含むＲＶＤｓと欠失を含むＲＶＤｓの中には、一般のＲＶＤｓ（５ｍＣ、５ｈｍＣ、および通常のＣを認識する）と縮退ＲＶＤｓ（５ｍＣおよび５ｈｍＣを認識する）の両方がある。興味深いことに、Ａｌａを含む２つのＲＶＤｓ（ＨＡおよびＮＡ）は、５ｍＣに対して選択性を有する。これまでの研究では、ＮＧ（Ｔの天然結合剤）とＮ＊が使用されて５ｍＣが認識された。スクリーニングの過程において、これら２つのＲＶＤｓをも認識したが、本研究で報告された多くの新しいＲＶＤｓの５ｍＣへの結合親和性は、前記２つのＲＶＤｓを上回った。例えば、ＨＡ、ＮＡ、およびＸ＊（Ｘは、Ｋ、Ｈ、Ｙ、およびＧを指す）は、５ｍＣに対してより高い結合親和性を示している。これら３種類のＲＶＤｓが通常のＴにも結合することは未だに発見していないが、これは驚くことではない。それらは、小さい側鎖が付いているアミノ酸残基を有するものであるか、１３位に当該残基が欠失しているものである。
【０１１６】
５ｈｍＣに選択的に結合するＲＶＤは今まで報告されていない。上述のように、５ｈｍＣによく結合する縮退ＲＶＤｓと一般のＲＶＤｓを特定した。それらの中で、これらの５ｈｍＣ結合剤について〜１５倍の誘導が観察され、これは、５ｈｍＣに強い親和性を有することは証明された。また、１３位の残基にセリン（ＦＳ、ＹＳおよびＷＳ）を有する一組の新しい５ｈｍＣ‐結合ＲＶＤｓも観察された。それらの５ｈｍＣへの親和性は、一般の結合剤より低いが、５ｍＣよりも５ｈｍＣに優先的に結合するため、フォワードおよび選択的な５ｈｍＣ認識の可能性を提供する。総じていえば、５ｍＣおよび５ｈｍＣの一般の結合剤と縮退結合剤は１３位にグリシンまたは欠失を含む傾向が有り、５ｍＣおよび５ｈｍＣの特異性結合剤はそれぞれ１３位にアラニンまたはセリンを有することを発見した。
【０１１７】
実施例４  ５ｍＣ、５ｈｍＣ、および通常のＣに対するＲＶＤの結合親和性と特異性の定量測定
【０１１８】
実施例３で得られた新しいＲＶＤによるＤＮＡの認識は、インビトロ保護アッセイによって検証された（反応原理は図５ａに示されている）。この実験では、ＭＡＰＫ６遺伝子における遺伝子配列、５’−ＴＴＣＡＧＣＴＧＧＡＴ［ＣＣＣＧＧＡＧＧＡ］ＧＣＧＧＡＴＡＴＡＡＣＣＡＧＧ−３’が化学合成によって合成された。この配列に基づいて設計されたＴＡＬＥ認識配列は、角括弧で示される配列であり、この配列には、一つのＭｓｐＩ制限性エンドヌクレアーゼ認識部位（下線に示される）が含まれている。化学合成時に、所定の位置（ＭｓｐＩ認識部位の２番目のＣ）には、Ｃ、５ｍＣまたは５ｈｍＣのＤＮＡオリゴヌクレオチドを含有させる。様々な濃度のＴＡＬＥタンパク質の存在下で、エンドヌクレアーゼＭｓｐＩをＤＮＡプローブに加えた。ＴＡＬＥタンパク質の、それによって認識されたシトシン塩基への結合は、エンドヌクレアーゼによるＤＮＡの切断を阻害し、その結果、保護された完全長バンドと切断されたＤＮＡバンドが変性ＰＡＧＥ分析で生じた。次に、各ＲＶＤについて保護効率を計算して阻害定数（Ｋｉ、結合親和性の逆数で測定した）の形で表示した。ＲＶＤの阻害定数は、異なるＲＶＤを含むＴＡＬＥタンパク質がＣ、５ｍＣおよび５ｈｍＣに対する切断保護実験を通して保護効率を得て、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６ソフトウェアを使用して保護効率曲線を適合させて阻害定数を計算して得られたものであり、この阻害定数は、Ｃ、５ｍＣおよび５ｈｍＣに対する異なるＲＶＤの結合効率を示し、阻害定数の値が小さければ小さいほど、ＲＶＤの保護効率が強く、対応するＤＮＡフラグメントへの結合が強いことを表す。
【０１１９】
エンドヌクレアーゼＭｓｐＩを使用してインビトロ保護アッセイを行った（その原理は図５ａに示される）。各１０μｌの反応系には、１ｎＭの標記されたＤＮＡ、１μｌの１０Ｘ  ＣｕｔＳｍａｒｔ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ）、および１００ｎＭのＮａＣｌが含まれている。ＴＡＬＥタンパク質を加え、最終濃度は１０ｎＭ〜８μＭであった。結合システムを２５℃で３０分間インキュベートした。そして、０．４Ｕ  ＭｓｐＩを加えてインキュベーションを１５分間続けた。１０μｌのホルムアミドを添加して反応を停止させ、その後９５℃で５分間加熱した。保護されたおよび切断されたＤＮＡをＵｒｅａ−ＰＡＧＥで分離し、化学発光核酸検出モジュールキット（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｍｏｄｕｌｅ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ））でイメージングした。
【０１２０】
アッセイを、ＲＶＤ  ＨＤを用いて最適化した。ＨＤは、通常のシトシンに対して高い親和性を有する天然結合剤である。ＨＤは、Ｃに対して低いＫｉが観察され、５ｍＣおよび５ｈｍＣに対するＫｉが少なくとも３０倍高いことが観察された（図５ｂおよびｃ、図６ｃ）。これは、結合親和性に対する定量的評価における保護アッセイの能力を証明した。このインビトロアッセイでは、ＮＧとＮ＊は５ｈｍＣに結合せず、５ｍＣのみに結合することが示されている（図５ｂおよびｃ）。スクリーニング結果（図３ｂ）から代表的なＲＶＤを選択して更なる評価をした。５ｍＣ特異性ＲＶＤ  ＨＡは５ｍＣに対して最も低いＫｉを示し、このインビトロアッセイでは、５ｍＣに対する選択性は、Ｃおよび５ｈｍＣに対する選択性の約５〜７倍である。５ｈｍＣ特異性ＲＶＤ  ＦＳは、５ｈｍＣへの結合親和性が、５ｍＣへのＨＡの親和性ほど強くないように見えるが、５ｈｍＣに対する選択性がＣおよび５ｍＣに対する選択性の約５〜６倍であることを示している。また、縮退ＲＶＤ  ＲＧは５ｍＣおよび５ｈｍＣに対してかなりの保護を示しているが、Ｃ、５ｍＣおよび５ｈｍＣに結合する一般のＲＶＤ  Ｒ＊は、前記三つのすべてに対して類似した親和性を示している（図５ｂおよび図５ｃを参照）。
【０１２１】
実施例５  新しいＲＶＤがメチル化依存的に遺伝子発現を活性化した
【０１２２】
生体内でシトシンのメチル化を認識する新しく同定されたＲＶＤの潜在能力を研究するために、ヒト細胞での標的遺伝子の活性化におけるそれらの性能について研究した。特定の遺伝子の活性化を実現するために以前に開発されたＴＡＬＥ−ＶＰ６４を使用してＴＡＬＥ−ａｃｔｉｖａｔоｒを設計構築した（３７）。ＴＡＬＥ−ａｃｔｉｖａｔоｒプラスミドの骨格には、ＣＭＶプロモーター、核局在化シグナル、ＴＡＬＥアミノ末端とカルボキシル末端の非反復配列、及び活性化因子ＶＰ６４が含まれており、その具体的な配列について、後文の参考文献３７を参照できる。
使用中、異なるＲＶＤを含むＴＡＬＥ繰り返し単位がＴＡＬＥ−ａｃｔｉｖａｔоｒ骨格に挿入され、異なるＲＶＤの効果が検証された。その構築方法について、Ｙａｎｇ，Ｊｕｎｊｉａｏ，ｅｔ  ａｌ．“Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  Ｃｕｓｔｏｍｉｚｅｄ  ＴＡＬ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＵＬｔｉＭＡＴＥ  Ｓｙｓｔｅｍ．”ＴＡＬＥＮｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  （２０１６）：４９−６０を参照できる。
【０１２３】
まず、ＵＳＣＳデータベースからの既存のメチル化データを使用して、ＴＥＴ１遺伝子を選択し、そのプロモーターはＨｅＬａ細胞では高いメチル化レベルを有しているが、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞では脱メチル化されている（図７ａ）。標的ＴＥＴ１遺伝子を含むＴＡＬＥ繰り返し単位のＴＡＬＥ−ａｃｔｉｖａｔоｒを構築した。ＨｅＬａ細胞では、５ｍＣ特異的ＨＡ、縮退ＲＧ、および一般のＲ＊はいずれもＴＥＴ１の発現を有意に活性化し（有意な活性化の基準は、対照群と比べてＴＥＴ１の発現量を高めることができ、しかも発現量が対照群と比べて有意に向上したことであり、＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．００５）、その中で、ＲＧは約１０倍の活性化に達し（図７ｂ）、同定された３つの新しいＲＶＤ（ＨＡ、ＲＧ、Ｒ＊）はいずれも、ＮＧとＮ＊よりも優れた性能を発揮したことは証明された。また、ＨＤはＴＥＴ１の発現を有意に向上させることはない。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞では、ＨＤは、脱メチル化されたＴＥＴ１プロモーターによく結合し、その発現をさらに強め（すでに高い発現レベルを有しているが）、ＨＡとＲＧは遺伝子発現に影響せず、一般のＲ＊は通常のＣに対する親和性は、ＨＤより低く、遺伝子発現をわずかにアップレギュレートした。ＮＧとＮ＊は、未修飾Ｃを区別付けることが難しいため、ＴＥＴ１遺伝子発現をわずかに活性化する。
【０１２４】
次に、ＬＲＰ２遺伝子を標的とするＴＡＬＥ繰り返し単位を含むＴＡＬＥ−ａｃｔｉｖａｔоｒを構築した。それらはＬＲＰ２遺伝子のプロモーター領域を標的しおり、このプロモーター領域は、ＨｅＬａ細胞では中程度にメチル化されているが、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞では脱メチル化されている（図７ｃ）。また、この領域には２つのＣｐＧしか含まれていないため、ＲＶＤを介した区別にとってさらに困難である。
ＨＥＫ２９３ＴとＨｅＬａ細胞を６ウェルプレートに播種し、６０％の密度まで増殖させた。各ウェルについて、２μｇのＴＡＬＥ−アクチベータープラスミドをＬｉｐｏｆａｃｔａｍｉｎｅ(R)２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でトランスフェクションした。ｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞をフローサイトメトリーにより選別する前に、トランスフェクションされた細胞を３日間培養した。総ＲＮＡをｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞から単離して逆転写をし、ＶｉｉＡＴＭ７  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ２Ｘ  ｐｒｅｍｉｘ  ＩＩ（Ｔａｋａｒａ）を使用して標準反応条件下でリアルタイムＰＣＲ分析を行った。
５ｍＣに結合したＲＶＤ（ＨＡ、ＲＧ）がＨｅＬａ細胞において遺伝子を有意に活性化したことは観察された。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞では、ＨＤと一般のＲＶＤ  Ｒ＊のみがＬＲＰ２遺伝子の発現を活性化し、５ｍＣに結合したＲＶＤはＬＲＰ２遺伝子の発現を活性化しなかった（図７ｄ）。したがって、同定された新しいＲＶＤ（ＨＡ、ＲＧ）は、インビボで中程度メチル化された部位と、メチル化されていない部位とを区別付けることができる。
【０１２５】
実施例６  新しいＲＶＤによるメチル化依存性ゲノム編集
【０１２６】
メチル化依存性ゲノム編集の可能性を確認するために、異なるＲＶＤを含むＴＡＬＥＮ構築体（ＴＡＬＥ繰り返し単位をＴＡＬＥＮ発現ベクターに挿入して得られ、ＴＡＬＥＮ発現ベクター（すなわち、ＴＡＬＥＮプラスミドの骨格）には、ＣＭＶプロモーター、核局在化シグナル、ＴＡＬＥアミノ末端とカルボキシル末端の非反復配列、及びエンドヌクレアーゼのＦｏｋＩモノマーが含まれており、その具体的な配列について、以下の参考文献３７を参照でき、その構築方法について、Ｙａｎｇ，Ｊｕｎｊｉａｏ，ｅｔ  ａｌ．“Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  Ｃｕｓｔｏｍｉｚｅｄ  ＴＡＬ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＵＬｔｉＭＡＴＥ  Ｓｙｓｔｅｍ．”ＴＡＬＥＮｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  （２０１６）：４９−６０を参照できる）を使用してヒトＰＬＸＮＢ２遺伝子を標的としてＤＮＡ切断を行った（図７ｅ）。ＨｅＬａ細胞で高度にメチル化されている（ＵＣＳＣによるデータ）、ＰＬＸＮＢ２の２番目のエクソンを選択し、ＴＡＬＥＮを介したＤＮＡ切断をｉｎｄｅｌ比（すなわち、挿入欠失比）を使用して評価した。
【０１２７】
ＨｅＬａ細胞を６ウェルプレートに播種し、６０％の密度まで増殖させた。各ウェルについて、Ｘｔｒｅｍｅ  Ｇｅｎｅ  ＨＰ（Ｒоｃｈｅ）を使用して、一対のＴＡＬＥＮプラスミドとｐｍａｘＧＦＰ（ＬｏｎＺａ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ．）を９：９：２の比率（０．９μｇ：０．９μｇ：０．２μｇ）でコトランスフェクションした。ＧＦＰ陽性細胞をフローサイトメトリーにより選別する前に、トランスフェクションされた細胞を３日間培養した。ＴＡＬＥＮ−標的領域は、単離されたＧＦＰ陽性細胞のゲノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅されたものである。前述のように、ミスマッチ感受性Ｔ７エンドヌクレアーゼ（Ｔ７Ｅ１；Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、ＴＡＬＥＮを介したｉｎｄｅｌを分析した（４１）。
【０１２８】
その結果、ＴＡＬＥＮ−ＨＤは、無視されてもよい編集効率を示し（図７ｆ）、これは、この領域には３つの５ｍＣ修飾があり、その結合を効果的に阻止したことを示した。ＨＤを含む３つのＲＶＤが、５ｍＣに結合したＲＶＤ（ＨＡ、Ｒ＊、ＮＧ、およびＮ＊が検出された）で置き換えられると、高いｉｎｄｅｌ比が観察された（図７ｆおよび図８Ｃ）。これらの結果は、これらのＲＶＤがヒト細胞でメチル化依存性ゲノム編集を可能にしたことを示している。
【０１２９】
実施例７  単一塩基解像度での哺乳動物ゲノム中の５ｈｍＣのＲＶＤ媒介検出
【０１３０】
シトシンのメチル化比率は、バイサルファイトシーケンスで確定できるが、従来のバイサルファイトシーケンスでは５ｈｍＣと５ｍＣを区別付けることができない（３８）。Ｃと５ｍＣに結合するＴＡＬＥタンパク質を使用した間接的な５ｈｍＣ検出は以前にも報告されている（３２）。５ｈｍＣ認識ＲＶＤを含むＴＡＬＥタンパク質を使用して直接５ｈｍＣ検出を行う可能性を研究するために、まず、５ｈｍＣ、５ｍＣ、およびＣを特定の部位に取り込んだモデルＤＮＡ配列を合成し、５ｈｍＣ検出に対するＲＶＤ  ＦＳの選択性を検出した。インビトロ保護アッセイでは、５ｈｍＣの割合が増加するにつれて、保護された完全長ＤＮＡが直線的に増加した（図１０）。逆に、５ｍＣとＣの割合が変化すると、保護率はわずかに変化した。この実験では、それぞれＣ、５ｍＣ、および５ｈｍＣを含みかつ同じ配列を持つＤＮＡフラグメントを図に示す割合で混合した。黒丸は、５ｍＣと５ｈｍＣの混合物における５ｈｍＣの割合が０％から１００％に増加した時の保護程度の変化を示す。黒色三角は、Ｃと５ｈｍＣの混合物における５ｈｍＣの割合が０％から１００％に増加した時の保護程度の変化を示す。灰色の円は、Ｃと５ｍＣの混合物における５ｍＣの割合が０％から１００％に増加した時の保護程度の変化を示す。図１０から分かるように、Ｃと５ｍＣの混合物における５ｍＣの割合が増加するにつれて、ＴＡＬＥ−ＦＳがＤＮＡに対する保護程度は僅かにしか増加していない。これと比べて、Ｃと５ｈｍＣの混合物、および５ｍＣと５ｈｍＣの混合物における５ｈｍＣの割合が増加するにつれて、ＴＡＬＥ−ＦＳがＤＮＡに対する保護程度も大幅に増加し、これは、ＴＡＬＥ−ＦＳが、５ｈｍＣを含むＤＮＡフラグメントに対して選択的な保護作用を有することを示している。これらの観察結果は、５ｈｍＣ特異的なＲＶＤ  ＦＳがゲノムＤＮＡサンプルに使用されて、複雑な修飾状況（興味のあるヌクレオチドには、少なくともＣ、５ｍＣ、および５ｈｍＣ修飾が同時に存在する）下で５ｈｍＣ修飾を検出することができることを示している。
【０１３１】
そして、ＦＳを含むＴＡＬＥタンパク質（すなわち、図９ａのＴＡＬエフェクタータンパク質）を使用してゲノムＤＮＡで部位特異性５ｈｍＣ検出を行った。ゲノムＤＮＡの複雑性を考慮にして、制限性酵素の代わりにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用し、この保護アッセイでＤＮＡ切断を生成した（図９ａ）。マウスｓｌｃ９ａ９遺伝子のイントロンの１０ｂｐ配列を選択した。その中の最初のシトシンがｍＥＳ細胞で高度にヒドロキシメチル化されていることは報告された（３９）。
【０１３２】
反応条件は次の通りである。各１０μｌの反応系には、５０ｎｇのゲノムＤＮＡ、１μｌの１０Ｘ  Ｃａｓ９ヌクレアーゼ反応緩衝液（ＮＥＢ）、および１ｎＭのＤＴＴが含まれている。ＴＡＬＥタンパク質を２０ｎＭ〜５００ｎＭの最終濃度まで添加した。結合反応を２５℃で３０分間インキュベーションした。５μｌのプレインキュベーションしたＣａｓ９とｓｇＲＮＡを加え、３７℃で１時間インキュベーションを続けた。９５℃で５分間加熱することにより反応を停止させた。Ａｍｐｕｒｅ  ＢｅａｄｓでＤＮＡを精製し、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ２Ｘ  ｐｒｅｍｉｘ  ＩＩ（Ｔａｋａｒａ）  оｎ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ(R)９６（Ｒｏｃｈｅ）でｑＰＣＲを分析した。
【０１３３】
その結果、ＴＡＬＥ−ＦＳの保護効率はＴＡＬＥ−ＨＤよりはるかに高く（図９ｂ）、これは、ＴＡＬＥ−ＦＳがゲノムＤＮＡの複雑な環境での一つの単一の５ｈｍＣ部位を検出できることを示している。５ｈｍＣ検出におけるこの方法の能力をさらに研究するために、この方法を、同じ部位でのヒドロキシメチル化レベルが不明な他の細胞株のゲノムＤＮＡに適用した。ｍＥＳＣサンプルと比べて、比較的に低い濃度のＴＡＬＥタンパク質（ＲＡＷ２６４．７、Ｌ−Ｍ（ＴＫ−）、およびＬ９２９細胞）が存在する場合、これらの細胞のゲノムＤＮＡに対する保護ははるかに弱く（図９ｃ）、これは、これらの細胞でのこの特定の部位での５ｈｍＣのレベルが低いことを示している。上記結果は、新しく同定されたＲＶＤを含むＴＡＬＥタンパク質を、塩基レベルの解像度でゲノムＤＮＡにおけるヒドロキシメチル基の状態の検出に使用することができることを示している。
【０１３４】
実施例８  ６ｍＡを認識するＴＡＬＥタンパク質ＲＶＤの同定
【０１３５】
実施例２に記載したのと同じスクリーニングシステム、すなわち、ＴＡＬＥ−（ＸＸ’）３独立ＲＶＤライブラリーと６ｍＡ修飾を含む直線状ＤＮＡレポーターシステムを使用して、それぞれＨＥＫ２９３Ｔ細胞にコトランスフェクションした後、６ｍＡレポーターシステムに対するＴＡＬＥ−（ＸＸ’）３のＥＧＦＰ発現活性化倍数をフローサイトメトリーにより検出した。図１１は、６ｍＡに対する４２０のＲＶＤのスクリーニング結果のヒートマップである。
【０１３６】
６ｍＡのスクリーニング結果のヒートマップから分かるように、６ｍＡレポーターシステムに対して活性化効率を有するＴＡＬＥ−（ＸＸ’）３は比較的に多く、その１位のアミノ酸は主にＨｉｓ（Ｈ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｓｎ（Ｎ）、およびＡｒｇ（Ｒ）であり、これらの高効率的なＲＶＤの２位のアミノ酸のほとんどは、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）またはＶａｌ（Ｖ）である。重ね合わせたヒートマップ（図１１ｃ）から分かるように、上記の６ｍＡに対して高い認識能力を持つＲＶＤの中で、ＸＩ、ＸＳ、ＸＴ、ＸＶなどのシリーズの多くのＲＶＤは、非修飾アデニンに対してもよい認識能力を持っている。また、たとえばＸＰシリーズのＲＶＤのような一部は６ｍＡに対する特異性が良い。図１２は、予備スクリーニング結果から、６ｍＡに対して認識能力を持っているいくつかのＲＶＤを選択して実験し、具体的には、６ｍＡのレポーターシステムに対してＥＧＦＰ活性化倍数が５より大きいいくつかのＲＶＤを選択して３回重複した確認実験をした結果である。
【０１３７】
６ｍＡに対する認識能力および選好は全体から見ると、依然としてＲＶＤの２位のアミノ酸と密接に関連している。本研究では、ＸＰシリーズＲＶＤとＮＡ、ＣＶ、ＦＴなどのＲＶＤは、６ｍＡに対する明確な選好を示すが、ＸＩ、ＸＣおよび一部のＸＴシリーズは、非修飾アデニンおよびＮ６−メチルアデニンに対する認識に明確な選好がない。Ｉｌｅ（Ｉ）とＡ塩基の接触は、その側鎖とアデニンＣ８およびＮ７との間に形成されたファンデルワールス相互作用である（４５）ため、６位アミノ基上のメチル基の増加による影響を受けない可能性がある。６ｍＡに対して高い特異性（６ｍＡ／Ａ＞５）を持つＲＶＤの中で、ＦＴ、ＣＶ、ＣＰおよびＮＰは、メチル化修飾のないその他の塩基に対する認識のバックグラウンド値が低く（図１３）、その中で、ＮＰが６ｍＡに対する認識能力は最も高く、ＦＴが低く、ＣＶおよびＣＰがより低くなり、これらは、６ｍＡに対して最適な選好を有するＲＶＤの選択肢と見なすことができる。
【０１３８】
以上によって、一般に、１３位に小さいアミノ酸（ＧｌｙとＡｌａ）である場合、あるいはアミノ酸が欠失している場合、５ｍＣに対する親和性が増加できることは本研究により発見された。この観察結果は、Ｎ＊およびＮＧ（自然にＴを認識する）が５ｍＣに結合できるという前の発見と一致している。１３位に大きな側鎖が欠失することは、５ｍＣのメチル基を収容するのに十分なスペースを提供できる可能性がある。ただし、この一般的な傾向には例外がある。例えば、５ｍＣに対するＨＧの親和性が非常に弱く、ＨＤと比べてＨＧが１３位において小さい残基を含み、ＨＤがＣの天然の結合体であることは観察された。興味深いことに、１２位のＨｉｓがＡｒｇに置き換えられた場合（したがってＲＧになる）、５ｍＣへの強い結合が観察された。実は、ＲＧは５ｈｍＣをも認識する。これらの観察結果は、二重残基が修飾に対する認識にはより複雑なモードが存在するかもしれないことを示している。ＴＡＬＥｓの修飾認識メカニズムを十分に解明するには、これらの新しいＲＶＤｓと修飾シトシンとから形成された複合体におけるこれらの新しいＲＶＤの結晶構造が必要である。
【０１３９】
本発明はさらに、ＴＡＬＥに媒介された、いくつかの高度にメチル化されたゲノム領域のメチル化依存性遺伝子活性化とゲノム編集を証明した。重要な対照として、同じ領域にシトシンのメチル化が存在しない場合（異なる細胞内）、遺伝子の活性化はほとんど観察されていない。したがって、本研究で報告された新しいＲＶＤは、インビボでの標的遺伝子の修飾状態によって標的遺伝子を操作するという可能性を提供することができる。ゲノム刷り込みと疾患などを含む、多くの重要な生物学的イベントに係るメチル化可変領域（differentially methylated region、ＤＭＲ））が多く存在することは知られている。したがって、エピジェネティックマーカーを読み取るＴＡＬＥタンパク質の独特な能力により、将来的にはインビボでのエピゲノム依存性の応用が可能になる。
【０１４０】
また、本研究は、ＣＶ、ＦＴ、ＮＰなど、Ｎ６−メチルアデニンに対して選好度の高いＲＶＤを、ハイスループットスクリーニング法により見つけた。これらのＲＶＤは、配列特異的Ｎ６−メチルアデニン結合ＴＡＬＥタンパク質の構築に使用でき、抗体に類似した役割を果たすことができ、さらに、未修飾のＡ塩基のみを認識するＲＶＤと組み合わせて使用して、６ｍＡの定量的または定性的検出を行うこともできる。ＮＩなどの、６ｍＡおよびＡ塩基に対して選好のないＲＶＤは、潜在的なアデニンメチル化修飾を含む配列を偏差なくターゲティングすることに使用でき、これによって、メチル化修飾による遺伝子編集の効率低下という問題を克服することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年4月7日(2020.4.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
５ｍＣを特異的に認識できるＨＡまたはＮＡ；
５ｈｍＣを特異的に認識できるＦＳ；
Ｃと５ｍＣの両方を認識できるＮ＊、ＮＧまたはＫＰ；
Ｃと５ｈｍＣの両方を認識できるＨＶまたはＫＶ；
５ｍＣと５ｈｍＣの両方を認識できるＫ＊またはＲＧ；
Ｃ、５ｍＣおよび５ｈｍＣの三つを認識できるＧ＊、Ｈ＊、Ｒ＊、またはＹ＊；
６ｍＡを特異的に認識できるＮＰ、ＦＴ、ＣＶまたはＣＰ；または
Ａと６ｍＡの両方を認識できるＲＩ、ＮＩ、ＫＩまたはＨＩ
[ここで、＊はその位置でのアミノ酸が欠失していることを表す]から選択される一つ以上のＲＶＤを含むＴＡＬＥを含む、単離されたＤＮＡ結合ポリペプチド。
【請求項２】
５ｍＣを特異的に認識できるＨＡまたはＮＡ；
５ｈｍＣを特異的に認識できるＦＳ；
Ｃと５ｍＣの両方を認識できるＮ＊、ＮＧまたはＫＰ；
Ｃと５ｈｍＣの両方を認識できるＨＶまたはＫＶ；
５ｍＣと５ｈｍＣの両方を認識できるＫ＊またはＲＧ；
Ｃ、５ｍＣおよび５ｈｍＣの三つを認識できるＧ＊、Ｈ＊、Ｒ＊、またはＹ＊；
６ｍＡを特異的に認識できるＮＰ、ＦＴ、ＣＶまたはＣＰ；または
Ａと６ｍＡの両方を認識できるＲＩ、ＮＩ、ＫＩまたはＨＩ
[ここで、＊はその位置でのアミノ酸が欠失していることを表す]から選択される一つ以上のＲＶＤを含むＴＡＬＥと、機能ドメインとを含み、
前記機能ドメインが、遺伝子発現を調節する機能ドメイン、後成的修飾機能ドメイン、遺伝子編集機能ドメイン、または蛍光タンパク質であり、
好ましくは、前記遺伝子発現を調節する機能ドメインは、転写活性化因子、転写抑制因子またはその機能的フラグメントであり、前記後成的修飾機能ドメインは、メチルトランスフェラーゼ、デメチラーゼまたはその機能的フラグメントであり、前記遺伝子編集機能ドメインは、ヌクレアーゼまたはその機能的フラグメントであり、
より好ましくは、前記遺伝子編集機能ドメインはエンドヌクレアーゼ、好ましくはＦｏｋＩエンドヌクレアーゼ、より好ましくはＦｏｋＩエンドヌクレアーゼのＤＮＡ切断ドメインである、融合タンパク質。
【請求項３】
請求項１に記載のＤＮＡ結合ポリペプチド、請求項２に記載の融合タンパク質、または請求項１に記載のＤＮＡ結合ポリペプチドまたは請求項２に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入して前記ＤＮＡ結合ポリペプチドまたは融合タンパク質中のＴＡＬＥを標的遺伝子の標的配列に結合させることを含む、細胞における標的遺伝子の標的配列を標的結合する方法。
【請求項４】
前記ＤＮＡ結合ポリペプチドまたは融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＨＡまたはＮＡから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列が５ｍＣである場合しか、前記ＤＮＡ結合ポリペプチドまたは融合タンパク質におけるＴＡＬＥは標的遺伝子の標的配列に結合しない；
前記ＤＮＡ結合ポリペプチドまたは融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＦＳから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列が５ｈｍＣである場合しか、前記ＤＮＡ結合ポリペプチドまたは融合タンパク質におけるＴＡＬＥは標的遺伝子の標的配列に結合しない；
前記ＤＮＡ結合ポリペプチドまたは融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＮＰ、ＦＴ、ＣＶまたはＣＰから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列が６ｍＡである場合しか、前記ＤＮＡ結合ポリペプチドまたは融合タンパク質におけるＴＡＬＥは標的遺伝子の標的配列に結合しない；
前記ＤＮＡ結合ポリペプチドまたは融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、Ｎ＊，ＮＧまたはＫＰから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、Ｃまたは５ｍＣであり得る；
前記ＤＮＡ結合ポリペプチドまたは融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＨＶまたはＫＶから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、Ｃまたは５ｈｍＣであり得る；
前記ＤＮＡ結合ポリペプチドまたは融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、Ｋ＊またはＲＧから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、５ｍＣまたは５ｈｍＣであり得る；
前記ＤＮＡ結合ポリペプチドまたは融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、Ｇ＊、Ｈ＊、Ｒ＊またはＹ＊から選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、Ｃ、５ｍＣまたは５ｈｍＣであり得る；または
前記ＤＮＡ結合ポリペプチドまたは融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＲＩ、ＮＩ、ＫＩまたはＨＩから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、Ａまたは６ｍＡであり得る；
ここで、＊はその位置でのアミノ酸が欠失していることを表す、
請求項３に記載の方法。
【請求項５】
請求項２に記載の融合タンパク質、または前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入して前記融合タンパク質中のＴＡＬＥを標的遺伝子の標的配列に結合させ、これによって、融合タンパク質中の、遺伝子発現を調節する機能ドメインである機能ドメインによって標的遺伝子の発現が調節されることを含む、細胞における標的遺伝子の発現を調節する方法。
【請求項６】
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＨＡまたはＮＡから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列が５ｍＣである場合しか、前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは標的遺伝子の標的配列に結合しない；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＦＳから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列が５ｈｍＣである場合しか、前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは標的遺伝子の標的配列に結合しない；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＮＰ、ＦＴ、ＣＶまたはＣＰから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列が６ｍＡである場合しか、前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは標的遺伝子の標的配列に結合しない；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、Ｎ＊，ＮＧまたはＫＰから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、Ｃまたは５ｍＣであり得る；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＨＶまたはＫＶから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、Ｃまたは５ｈｍＣであり得る；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、Ｋ＊またはＲＧから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、５ｍＣまたは５ｈｍＣであり得る；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、Ｇ＊、Ｈ＊、Ｒ＊またはＹ＊から選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、Ｃ、５ｍＣまたは５ｈｍＣであり得る；または
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＲＩ、ＮＩ、ＫＩまたはＨＩから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、Ａまたは６ｍＡであり得る；
ここで、＊はその位置でのアミノ酸が欠失していることを表し、
より好ましくは、前記遺伝子発現を調節する機能ドメインは、転写活性化因子またはその機能的フラグメント、若しくは転写抑制因子またはその機能的フラグメントである、
請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項２に記載の融合タンパク質、または前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入して前記融合タンパク質中のＴＡＬＥを標的遺伝子の標的配列に結合させ、これによって、融合タンパク質中の、遺伝子編集機能ドメインである機能ドメインによって標的遺伝子が編集されることを含む、細胞における標的遺伝子に対して遺伝子編集をする方法。
【請求項８】
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＨＡまたはＮＡから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列が５ｍＣである場合しか、前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは標的遺伝子の標的配列に結合しない；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＦＳから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列が５ｈｍＣである場合しか、前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは標的遺伝子の標的配列に結合しない；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＮＰ、ＦＴ、ＣＶまたはＣＰから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列が６ｍＡである場合しか、前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは標的遺伝子の標的配列に結合しない；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、Ｎ＊，ＮＧまたはＫＰから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、Ｃまたは５ｍＣであり得る；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＨＶまたはＫＶから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、Ｃまたは５ｈｍＣであり得る；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、Ｋ＊またはＲＧから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、５ｍＣまたは５ｈｍＣであり得る；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、Ｇ＊、Ｈ＊、Ｒ＊またはＹ＊から選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、Ｃ、５ｍＣまたは５ｈｍＣであり得る；または
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＲＩ、ＮＩ、ＫＩまたはＨＩから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、Ａまたは６ｍＡであり得る；
ここで、＊はその位置でのアミノ酸が欠失していることを表し、
より好ましくは、前記遺伝子編集は核酸切断であり、前記遺伝子編集機能ドメインはヌクレアーゼまたはその機能的フラグメント、好ましくはエンドヌクレアーゼまたはその機能的フラグメント、より好ましくはＦｏｋＩエンドヌクレアーゼまたはそのＤＮＡ切断ドメインである、
請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項２に記載の融合タンパク質、または前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入して前記融合タンパク質中のＴＡＬＥを標的遺伝子の標的配列に結合させ、これによって、融合タンパク質中の、後成的修飾機能ドメインである機能ドメインによって標的遺伝子が後成的修飾されることを含む、細胞における標的遺伝子に対して後成的修飾をする方法。
【請求項１０】
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＨＡまたはＮＡから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列が５ｍＣである場合しか、前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは標的遺伝子の標的配列に結合しない；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＦＳから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列が５ｈｍＣである場合しか、前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは標的遺伝子の標的配列に結合しない；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＮＰ、ＦＴ、ＣＶまたはＣＰから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列が６ｍＡである場合しか、前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは標的遺伝子の標的配列に結合しない；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、Ｎ＊，ＮＧまたはＫＰから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、Ｃまたは５ｍＣであり得る；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＨＶまたはＫＶから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、Ｃまたは５ｈｍＣであり得る；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、Ｋ＊またはＲＧから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、５ｍＣまたは５ｈｍＣであり得る；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、Ｇ＊、Ｈ＊、Ｒ＊またはＹ＊から選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、Ｃ、５ｍＣまたは５ｈｍＣであり得る；または
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＲＩ、ＮＩ、ＫＩまたはＨＩから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、Ａまたは６ｍＡであり得る；
ここで、＊はその位置でのアミノ酸が欠失していることを表し、
より好ましくは、前記後成的修飾機能ドメインはメチルトランスフェラーゼ、デメチラーゼまたはその機能的フラグメントである、
請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項２に記載の融合タンパク質、または前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入して前記融合タンパク質中のＴＡＬＥを標的遺伝子の標的配列に結合させることを含む生細胞染色体の標識方法であって、前記機能ドメインが蛍光タンパク質であり、前記融合タンパク質中のＴＡＬＥを標的遺伝子の標的配列に結合させることによって標的配列に対する蛍光標識を実現する、生細胞染色体の標識方法。
【請求項１２】
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＨＡまたはＮＡから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列が５ｍＣである場合しか、前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは標的遺伝子の標的配列に結合しない；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＦＳから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列が５ｈｍＣである場合しか、前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは標的遺伝子の標的配列に結合しない；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＮＰ、ＦＴ、ＣＶまたはＣＰから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列が６ｍＡである場合しか、前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは標的遺伝子の標的配列に結合しない；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、Ｎ＊，ＮＧまたはＫＰから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、Ｃまたは５ｍＣであり得る；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＨＶまたはＫＶから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、Ｃまたは５ｈｍＣであり得る；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、Ｋ＊またはＲＧから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、５ｍＣまたは５ｈｍＣであり得る；
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、Ｇ＊、Ｈ＊、Ｒ＊またはＹ＊から選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、Ｃ、５ｍＣまたは５ｈｍＣであり得る；または
前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥは、ＲＩ、ＮＩ、ＫＩまたはＨＩから選択されるＲＶＤを含み、前記ＲＶＤの認識部位での前記標的遺伝子の標的配列の特定の塩基はそのメチル化状態が不確定であり、Ａまたは６ｍＡであり得る；
ここで、＊はその位置でのアミノ酸が欠失していることを表す、
請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
細胞ゲノム中の標的配列の特定の部位に５ｍＣ、５ｈｍＣ又は６ｍＡが存在するか否かを検出する方法であって、
（１）ＴＡＬＥを含むタンパク質を細胞に導入し、前記ＴＡＬＥは標的配列を標的とし、前記ＴＡＬＥ内の、前記特定の部位を認識するＲＶＤがＨＡまたはＮＡである；
（２）次に、ヌクレアーゼを細胞に導入し、前記ヌクレアーゼの標的切断部位をＴＡＬＥ標的配列に位置する；
（３）標的配列が切断されているかどうかを検出し、それによって標的配列の特定の部位に５ｍＣが存在するかどうかを判断する；標的配列が切断されていない場合、前記ＴＡＬＥが前記標的配列に結合し、前記ヌクレアーゼが当該標的配列に結合して切断することができず、前記特定の部位に５ｍＣが存在しているとされ；標的配列が切断されている場合、前記ＴＡＬＥが前記標的配列に結合しておらず、前記ヌクレアーゼが当該標的配列に結合して切断されており、前記特定の部位に５ｍＣが存在しないとされている、又は、
（１）ＴＡＬＥを含むタンパク質を細胞に導入し、前記ＴＡＬＥは標的配列を標的とし、前記ＴＡＬＥ内の、前記特定の部位を認識するＲＶＤがＦＳである；
（２）次に、ヌクレアーゼを細胞に導入し、前記ヌクレアーゼの標的切断部位をＴＡＬＥ標的配列に位置する；
（３）標的配列が切断されているかどうかを検出し、それによって標的配列の特定の部位に５ｈｍＣが存在するかどうかを判断する；標的配列が切断されていない場合、前記ＴＡＬＥが前記標的配列に結合し、前記ヌクレアーゼが当該標的配列に結合して切断することができず、前記特定の部位に５ｈｍＣが存在しているとされ；標的配列が切断されている場合、前記ＴＡＬＥが前記標的配列に結合しておらず、前記ヌクレアーゼが当該標的配列に結合して切断されており、前記特定の部位に５ｈｍＣが存在しないとされている、又は、
（１）ＴＡＬＥを含むタンパク質を細胞に導入し、前記ＴＡＬＥは標的配列を標的とし、前記ＴＡＬＥ内の、前記特定の部位を認識するＲＶＤがＮＰ、ＦＴ、ＣＶまたはＣＰである；
（２）次に、ヌクレアーゼを細胞に導入し、前記ヌクレアーゼの標的切断部位をＴＡＬＥ標的配列に位置する；
（３）標的配列が切断されているかどうかを検出し、それによって標的配列の特定の部位に６ｍＡが存在するかどうかを判断する；標的配列が切断されていない場合、前記ＴＡＬＥが前記標的配列に結合し、前記ヌクレアーゼが当該標的配列に結合して切断することができず、前記特定の部位に６ｍＡが存在しているとされ；標的配列が切断されている場合、前記ＴＡＬＥが前記標的配列に結合しておらず、前記ヌクレアーゼが当該標的配列に結合して切断されており、前記特定の部位に６ｍＡが存在しないとされている、
ことを含む方法。
【請求項１４】
前記ヌクレアーゼがエンドヌクレアーゼであり、
好ましくは、前記ヌクレアーゼがＣａｓ９ヌクレアーゼである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ステップ（１）においてＣａｓ９ヌクレアーゼとｓｇＲＮＡを共に細胞に導入する、請求項１４に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０５】
５、ＴＡＬＥＮ繰り返し単位
以下の実施例で使用されたＴＡＬＥ繰り返し単位は、連続した１４の繰り返し単位と一つの半繰り返し単位とを含み、各単一の繰り返し単位は３４のアミノ酸残基を含み、その配列は、ＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＸＸ’ＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１）であり、半繰り返し単位は単一の繰り返し単位の最初の１７のアミノ酸残基を含み、その配列は、ＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＸＸ’ＧＧＫＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２）である。ここで、ＸＸ’はＲＶＤである。
本実施例で説明された材料と方法は、下記の実施例２〜７に用いられている。 
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０９】
他の２０種類のＴＡＬＥ−（ＸＸ’）３の７〜９番目の繰り返し単位に発現されたＲＶＤは、１３位のアミノ酸残基が欠失しているＲＶＤであり、すなわち、Ａ＊、Ｃ＊、Ｄ＊、Ｅ＊、Ｆ＊、Ｇ＊、Ｈ＊、Ｉ＊、Ｋ＊、Ｌ＊、Ｍ＊、Ｎ＊、Ｐ＊、Ｑ＊、Ｒ＊、Ｓ＊、Ｔ＊、Ｖ＊、Ｗ＊、Ｙ＊である。これらの２０種類のＴＡＬＥ−（ＸＸ’）３発現プラスミドの構築について、後文の参考文献１３に報告されているＴＡＬＥ−（ＸＸ’）３の分別構築法が使用される。すなわち、特定のＲＶＤをコードするフォワードプライマー５’‐ｔＣＧＴＣＴＣａＧＡＡＣＡＧＧＴＴＧＴＡＧＣＣＡＴＡＧＣＴＴＣＴＮＮＮＮＮＮＧＧＡＧＧＴＡＡＧＣＡＧＧＣＡＣＴＧＧＡＡ‐３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３）（ＮＮＮＮＮＮは、特定のＲＶＤをコードする塩基配列を表す）と、同じのリバースプライマー５’‐ａａＣＧＴＣＴＣａＧＴＴＣＧＧＧＧＧＴＣＡＡＣＣＣＡＴＧＡＧＣＣＴＧＡＣＡＣＡＧＴＡＣＴＧＧＧＡＧＣＡＧＧＣＧＣＴＧＣＡＣＧＧＴＴＴＣＣＡＧＴＧＣＣＴＧＣＴＴ‐３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４）とを用いて、ＢｓｍＢＩ制限性エンドヌクレアーゼ部位を両端に有する、１０２ｂｐ長のＴＡＬＥモノマーフラグメントをアニーリングとＰＣＲ伸長により生成した。その後、６つのＧｏｌｄｅｎ−Ｇａｔｅ消化ライゲーションサイクルを通してＴＡＬＥモノマーフラグメントを連結し、プライマーＧ−ｌｉｂ−ＦとＧ−ｌｉｂ−Ｒを使用してＴＡＬＥマルチマーを増幅した。最後に、ゲル回収法を使用して、３つのＴＡＬＥモノマーしか含有しないフラグメントを選択的に回収し、予め構築したライブラリー発現ベクターに連結し、Ｔｒａｎｓ１−Ｔ１コンピテント細胞に形質転換した。対応するＲＶＤを正確に発現するＴＡＬＥ−（ＸＸ’）３プラスミドをＳａｎｇｅｒシーケンスにより得た。その中で、
Ｇ−ｌｉｂ−Ｆ： ５’−ＴＡＧＣＴＡＴＡＣＧＴＣＴＣＡＴＴＧＡＣＣＣＣＣＧＡＡ
ＣＡＧＧＴＴＧＴＡＧＣＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５）
Ｇ−ｌｉｂ−Ｒ： ５’−ＴＡＧＣＴＡＴＡＣＧＴＣＴＣＡＣＣＣＡＴＧＡＧＣＣＴＧ
ＡＣＡＣＡＧＴＡＣＴＧＧＧＡＧＣＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６）である。 
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１１】
プライマーの配列の下記通りである。
Ｒｅｐｏｒｔ−Ｆ：
５’−Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊ＡＧＡＴＡＴＡＣＧＣＧＴＴＡＣＴＧＧＡＧＣＣＡＴＣＴＧＧＣＣＮＮＮＴＡＣＧＴＡＧＧＣＧＴＧＴＡＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７）、ここで、Ｎは５ｍＣ、５ｈｍＣ、または６ｍＡを表す；
Ｒｅｐｏｒｔ−Ｒ：５’−Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊ＧＴＣＴＣＣＣＧＴＡＡＡＧＣＡＣＴＡＡＡＴＣＧＧＡＡＣＣＣＴＡＡＡＧＧＧＡＧＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８）
（＊は、主にレポーターＤＮＡエレメントを細胞内でヌクレアーゼによる分解から保護する役割を果たすチオ修飾塩基を表し、下線は、ＴＡＬＥ−（ＸＸ’）３認識配列、すなわち、ＴＡＬＥ結合配列を表す。） 
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１２】
レポーターＤＮＡエレメントの構築過程は次の通りである。まず、大腸菌からレポータープラスミドｐｃＤＮＡ６＿３Ａを増幅し（図２ｃ）、このレポータープラスミドは、ＴＡＬＥ−（ＸＸ’）３の結合部位のテンプレート配列ＣＴＧＧＣＣＡＡＡＴＡＣＧＴＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．９）を含む。次に、５ｍＣ、５ｈｍＣまたは６ｍＡを含む上記のプライマーを化学合成し、ＴＡＬＥ結合配列に５ｍＣ、５ｈｍＣまたは６ｍＡを含む直線状レポーターＤＮＡエレメントをＰＣＲによって生成し（図２ｃ）、フォワードプライマーはＴＡＬＥ−（ＸＸ’）３結合配列ＣＴＧＧＣＣＮＮＮＴＡＣＧＴＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１０）を含み、その中で、Ｎは５ｍＣ、５ｈｍＣまたは６ｍＡを表し、最小ＣＭＶプロモーター（ｐｍｉｎｉＣＭＶ）とその下流のＥＧＦＰ遺伝子のすぐ上流に位置する。その中で、ＴＡＬＥ結合配列の７〜９番目の反復塩基に対応するのは、三つの連続した５ｍＣ、５ｈｍＣ、または６ｍＡである。
また、人工スクリーニングシステムは、下記の参考文献１３に記載の方法に従って構築された環状ＤＮＡである、ＣおよびＴのレポーターＤＮＡエレメントを含んでもよい。その中に含まれるＴＡＬＥ−（ＸＸ’）３認識配列は、ＮＮＮがＣＣＣまたはＴＴＴであることを除き、その他は上記と同じである。
上記の人工スクリーニングシステムを使用して、レポーターＤＮＡエレメントのＴＡＬＥ結合配列へのＴＡＬＥ−（ＸＸ’）３の結合の特異性を、ＥＧＦＰの蛍光レベルを測定することにより検出した。これによって、ＴＡＬＥ  ＲＶＤ認識スクリーニングを体系的に評価するためのプラットフォームが構築されて取得された。 
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１８】
実施例３で得られた新しいＲＶＤによるＤＮＡの認識は、インビトロ保護アッセイによって検証された（反応原理は図５ａに示されている）。この実験では、ＭＡＰＫ６遺伝子における遺伝子配列、５’−ＴＴＣＡＧＣＴＧＧＡＴ［ＣＣＣＧＧＡＧＧＡ］ＧＣＧＧＡＴＡＴＡＡＣＣＡＧＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１１）が化学合成によって合成された。この配列に基づいて設計されたＴＡＬＥ認識配列は、角括弧で示される配列であり、この配列には、一つのＭｓｐＩ制限性エンドヌクレアーゼ認識部位（下線に示される）が含まれている。化学合成時に、所定の位置（ＭｓｐＩ認識部位の２番目のＣ）には、Ｃ、５ｍＣまたは５ｈｍＣのＤＮＡオリゴヌクレオチドを含有させる。様々な濃度のＴＡＬＥタンパク質の存在下で、エンドヌクレアーゼＭｓｐＩをＤＮＡプローブに加えた。ＴＡＬＥタンパク質の、それによって認識されたシトシン塩基への結合は、エンドヌクレアーゼによるＤＮＡの切断を阻害し、その結果、保護された完全長バンドと切断されたＤＮＡバンドが変性ＰＡＧＥ分析で生じた。次に、各ＲＶＤについて保護効率を計算して阻害定数（Ｋｉ、結合親和性の逆数で測定した）の形で表示した。ＲＶＤの阻害定数は、異なるＲＶＤを含むＴＡＬＥタンパク質がＣ、５ｍＣおよび５ｈｍＣに対する切断保護実験を通して保護効率を得て、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６ソフトウェアを使用して保護効率曲線を適合させて阻害定数を計算して得られたものであり、この阻害定数は、Ｃ、５ｍＣおよび５ｈｍＣに対する異なるＲＶＤの結合効率を示し、阻害定数の値が小さければ小さいほど、ＲＶＤの保護効率が強く、対応するＤＮＡフラグメントへの結合が強いことを表す。
【国際調査報告】
2020531572.tif 000018
2020531572.tif 000019
2020531572.tif 000020
2020531572.tif 000021
2020531572.tif 000022
2020531572.tif 000023