(57)【要約】  本発明は、緩衝液、界面活性剤、ショ糖、アルカリまたはアルカリ塩、アルミニウムアジュバント、任意に増量剤、および任意にポリマーを含む肺炎球菌多糖タンパク質コンジュゲートワクチン製剤を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）１または複数の多糖タンパク質コンジュゲートと、（ｉｉ）ｐＨが約５．０〜７．５の範囲の緩衝液と、（ｉｉ）塩化マグネシウム、塩化カルシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウムまたはそれらの組み合わせからなる群から選択されるアルカリまたはアルカリ塩と、（ｉｉｉ）界面活性剤と、（ｉｖ）スクロース、トレハロース、およびラフィノースからなる群から選択されるショ糖と、任意で（ｖ）増量剤と、任意で（ｖｉ）カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、２−ヒドロキシエチルセルロース（２−ＨＥＣ）、クロスカルメロース、メチルセルロース、グリセリン、酸化ポリエチレン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびプロピレングリコール（ＰＧ）、またはそれらの組み合わせからなる群から選択されるポリマーと、（ｖｉｉ）アルミニウムアジュバントとを含む製剤。
【請求項２】
前記製剤が増量剤を含み、ショ糖および増量剤の総濃度が少なくとも約５０ｍｇ／ｍｌである、請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
前記製剤が増量剤を含み、ショ糖および増量剤の総濃度が少なくとも約９０ｍｇ／ｍｌである、請求項１に記載の製剤。
【請求項４】
前記製剤が増量剤を含み、ショ糖および増量剤の総濃度が約５０〜４００ｍｇ／ｍｌであり、ショ糖に対する増量剤の比が１以上である、請求項１に記載の製剤。
【請求項５】
前記製剤が増量剤を含み、ショ糖および増量剤の総濃度が約５０〜１５０ｍｇ／ｍｌであり、前記増量剤とショ糖との比が約２：１である、請求項１に記載の製剤。
【請求項６】
前記製剤が、マンニトール、グリシンまたはラクトースである増量剤を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項７】
前記ショ糖がトレハロースまたはスクロースである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項８】
前記製剤が、約１〜２５ｍｇ／ｍｌのカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、２−ヒドロキシエチルセルロース（２−ＨＥＣ）、グリセリン、酸化ポリエチレン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、もしくはプロピレングリコール（ＰＧ）、またはそれらの組み合わせであるポリマーを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項９】
前記ポリマーが、約１〜１０ｍｇ／ｍｌのカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、２−ヒドロキシエチルセルロース（２−ＨＥＣ）、またはそれらの組み合わせである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１０】
前記界面活性剤が、ポリソルベートまたは分子量が１１００Ｄａ〜１７，４００Ｄａの範囲のポロキサマーである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１１】
前記ポロキサマーの分子量が、７，５００Ｄａ〜１５，０００Ｄａの範囲である、請求項１０に記載の製剤。
【請求項１２】
前記ポロキサマーが、ポロキサマー１８８またはポロキサマー４０７である、請求項１０に記載の製剤。
【請求項１３】
前記ポロキサマーの最終濃度が、約０．０１〜５０ｍｇ／ｍｌである、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１４】
前記ポロキサマーの最終濃度が、約０．２５〜１０ｍｇ／ｍｌである、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１５】
前記界面活性剤が、ポリソルベート２０または８０である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１６】
前記ポリソルベート２０の最終濃度が、約０．０１〜１００ｍｇ／ｍｌの範囲である、請求項１５に記載の製剤。
【請求項１７】
前記ポリソルベート２０の最終濃度が、約０．２５〜２５ｍｇ／ｍｌの範囲である、請求項１５に記載の製剤。
【請求項１８】
前記ポリソルベート２０の最終濃度が、約１〜５ｍｇ／ｍｌの範囲である、請求項１５に記載の製剤。
【請求項１９】
前記ｐＨ緩衝液のｐＨが、約５．０〜７．０の範囲である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２０】
前記緩衝液が、ホスフェート、スクシネート、ヒスチジン、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、アセテートおよびシトレートからなる群から選択される、請求項１９に記載の製剤。
【請求項２１】
前記緩衝液が、最終濃度が約５ｍＭ〜５０ｍＭのヒスチジン、または最終濃度が約１ｍＭ〜１０ｍＭのスクシネートである、請求項２０に記載の製剤。
【請求項２２】
前記ヒスチジンの最終濃度が、約２０ｍＭである、請求項２１に記載の製剤。
【請求項２３】
前記塩が、塩化ナトリウムである、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２４】
前記ＮａＣｌが、約２０ｍＭ〜１７０ｍＭの濃度で存在する、請求項２３に記載の製剤。
【請求項２５】
総多糖タンパク質濃度が、２〜７０４μｇ／ｍｌである、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２６】
総多糖タンパク質濃度が、４〜９２μｇ／ｍｌである、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２７】
０．１〜０．５ｍｇ／ｍＬのリン酸アルミニウムアジュバント（ＡＰＡ）を含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２８】
前記多糖タンパク質コンジュゲートが、キャリアタンパク質にコンジュゲートされた１または複数の肺炎球菌多糖を含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２９】
前記キャリアタンパク質が、ＣＲＭ１９７、ジフテリア毒素フラグメントＢ（ＤＴＦＢ）、ＤＴＦＢ  Ｃ８、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ＴＴのフラグメントＣ、百日咳トキソイド、コレラトキソイド、髄膜炎菌外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）、大腸菌ＬＴ、大腸菌ＳＴ、緑膿菌の外毒素Ａ、分類不能のインフルエンザ菌由来のタンパク質Ｄ、およびそれらの組み合わせから選択される、請求項２８に記載の製剤。
【請求項３０】
１または複数の前記多糖タンパク質コンジュゲートが、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされている、請求項２８に記載の製剤。
【請求項３１】
１または複数の前記多糖タンパク質コンジュゲートが、１または複数のキャリアタンパク質にコンジュゲートされた肺炎連鎖球菌の血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、６Ｅ、６Ｇ、６Ｈ、７Ｆ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、８、９Ａ、９Ｌ、９Ｎ、９Ｖ、１０Ｆ、１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１１Ｆ、１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｄ、１１Ｅ、１２Ｆ、１２Ａ、１２Ｂ、１３、１４、１５Ｆ、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１６Ａ、１７Ｆ、１７Ａ、１８Ｆ、１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃ、１９Ｆ、１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、２０Ａ、２０Ｂ、２１、２２Ｆ、２２Ａ、２３Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、２４Ａ、２４Ｂ、２５Ｆ、２５Ａ、２７、２８Ｆ、２８Ａ、２９、３１、３２Ｆ、３２Ａ、３３Ｆ、３３Ａ、３３Ｂ、３３Ｃ、３３Ｄ、３３Ｅ、３４、３５Ｆ、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｃ、３６、３７、３８、３９、４０、４１Ｆ、４１Ａ、４２、４３、４４、４５、４６、４７Ｆ、４７Ａ、４８、ＣＷＰＳ１、ＣＷＰＳ２、ＣＷＰＳ３の少なくとも１つに由来する莢膜多糖を含む、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項３２】
多糖タンパク質コンジュゲート製剤が、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされた血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆに由来する肺炎連鎖球菌多糖から本質的になる１５価肺炎球菌コンジュゲート（１５ｖＰｎＣ）製剤である、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項３３】
１または複数の前記多糖タンパク質コンジュゲートが、ＤＭＳＯ条件下で還元的アミノ化を用いて調製される、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項３４】
血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、および２３Ｆに由来する前記多糖タンパク質コンジュゲートが、ＤＭＳＯ条件下で調製され、血清型１、３、４、５、９Ｖ、１４、２２Ｆおよび３３Ｆに由来する多糖タンパク質コンジュゲートが、水性条件を用いて調製される、請求項３３に記載の製剤。
【請求項３５】
各用量が、６Ｂが８μｇ／ｍＬまたは１６μｇ／ｍＬであることを除いて、各糖を４μｇ／ｍＬまたは８μｇ／ｍＬ、およびＣＲＭ１９７キャリアタンパク質を約６４μｇ／ｍＬまたは１２８μｇ／ｍＬで含むように製剤化される、請求項３４に記載の製剤。
【請求項３６】
ｐＨが約５．０〜７．５の範囲のｐＨ緩衝生理食塩溶液、約１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、約２ｍｇ／ｍｌポリソルベート２０、約５０ｍｇ／ｍｌマンニトール、および約２０ｍｇ／ｍｌスクロースを含む、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項３７】
ｐＨが約５．０〜７．５の範囲のｐＨ緩衝生理食塩溶液、約１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、約２ｍｇ／ｍｌポリソルベート２０、約６０ｍｇ／ｍｌマンニトール、および約４０ｍｇ／ｍｌスクロースを含む、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項３８】
ｐＨが約５．０〜７．５の範囲のｐＨ緩衝生理食塩溶液、約１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、約２ｍｇ／ｍｌポリソルベート２０、約９０ｍｇ／ｍｌスクロース、および約５ｍｇ／ｍｌ  ＣＭＣを含む、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項３９】
ｐＨが約５．０〜７．５の範囲のｐＨ緩衝生理食塩溶液、約１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、約２ｍｇ／ｍｌポリソルベート２０、約９０ｍｇ／ｍｌスクロース、および約５ｍｇ／ｍｌ  ２−ＨＥＣを含む、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項４０】
ｐＨが約５．０〜７．５の範囲のｐＨ緩衝生理食塩溶液、約１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、約２ｍｇ／ｍｌポリソルベート２０、約９０ｍｇ／ｍｌスクロース、および約５ｍｇ／ｍｌ  ＨＰＣを含む、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項４１】
ｐＨが約５．０〜７．５の範囲のｐＨ緩衝生理食塩溶液、約１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、約２ｍｇ／ｍｌポリソルベート２０、約９０ｍｇ／ｍｌスクロース、約５ｍｇ／ｍｌ  ＣＭＣ、および約５ｍｇ／ｍｌ  ＰＧを含む、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項４２】
ｐＨが約５．０〜７．５の範囲のｐＨ緩衝生理食塩溶液、約１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、約２ｍｇ／ｍｌポリソルベート２０、約４０ｍｇ／ｍｌスクロース、約６０ｍｇ／ｍｌマンニトール、および約５ｍｇ／ｍｌ  ＣＭＣを含む、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項４３】
ｐＨが約５．０〜７．５の範囲のｐＨ緩衝生理食塩溶液、約１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、約２ｍｇ／ｍｌポリソルベート２０、約４０ｍｇ／ｍｌスクロース、約６０ｍｇ／ｍｌマンニトール、約５ｍｇ／ｍｌ  ＣＭＣ、および約５ｍｇ／ｍｌ  ＰＧを含む、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項４４】
ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされた血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆに由来する肺炎連鎖球菌多糖から本質的になる１５価肺炎球菌コンジュゲート（１５ｖＰｎＣ）を約４〜９２μｇ／ｍｌで、ｐＨが約５．０〜７．５の範囲のｐＨ緩衝生理食塩溶液、約３０〜１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、約０．０５〜２ｍｇ／ｍｌ  ポリソルベート２０、約２０〜２５０ｍｇ／ｍｌスクロース、約３０〜１００ｍｇ／ｍｌマンニトール、約０．１〜０．７５ｍｇ／ｍｌ  ＡＰＡ、約１〜１０ｍｇ／ｍｌ  ＣＭＣ、および任意で約１〜１０ｍｇ／ｍｌ  ＰＧを含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項４５】
ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされた肺炎連鎖球菌の血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、６Ｅ、６Ｇ、６Ｈ、７Ｆ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、８、９Ａ、９Ｌ、９Ｎ、９Ｖ、１０Ｆ、１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１１Ｆ、１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｄ、１１Ｅ、１２Ｆ、１２Ａ、１２Ｂ、１３、１４、１５Ｆ、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１６Ａ、１７Ｆ、１７Ａ、１８Ｆ、１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃ、１９Ｆ、１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、２０Ａ、２０Ｂ、２１、２２Ｆ、２２Ａ、２３Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、２４Ａ、２４Ｂ、２５Ｆ、２５Ａ、２７、２８Ｆ、２８Ａ、２９、３１、３２Ｆ、３２Ａ、３３Ｆ、３３Ａ、３３Ｂ、３３Ｃ、３３Ｄ、３３Ｅ、３４、３５Ｆ、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｃ、３６、３７、３８、３９、４０、４１Ｆ、４１Ａ、４２、４３、４４、４５、４６、４７Ｆ、４７Ａ、４８、ＣＷＰＳ１、ＣＷＰＳ２、ＣＷＰＳ３の少なくとも１つに由来する莢膜多糖を約４〜９２μｇ／ｍｌで、ｐＨが約５．０〜７．５の範囲のｐＨ緩衝生理食塩溶液、約３０〜１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、約０．０５〜２ｍｇ／ｍｌポリソルベート２０、約２０〜２５０ｍｇ／ｍｌスクロース、約３０〜１００ｍｇ／ｍｌマンニトール、約０．１〜０．７５ｍｇ／ｍｌ  ＡＰＡ、約１〜１０ｍｇ／ｍｌ  ＣＭＣ、および任意で約１〜１０ｍｇ／ｍｌ  ＰＧを含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項４６】
ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされた肺炎連鎖球菌の血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、６Ｅ、６Ｇ、６Ｈ、７Ｆ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、８、９Ａ、９Ｌ、９Ｎ、９Ｖ、１０Ｆ、１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１１Ｆ、１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｄ、１１Ｅ、１２Ｆ、１２Ａ、１２Ｂ、１３、１４、１５Ｆ、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１６Ａ、１７Ｆ、１７Ａ、１８Ｆ、１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃ、１９Ｆ、１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、２０Ａ、２０Ｂ、２１、２２Ｆ、２２Ａ、２３Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、２４Ａ、２４Ｂ、２５Ｆ、２５Ａ、２７、２８Ｆ、２８Ａ、２９、３１、３２Ｆ、３２Ａ、３３Ｆ、３３Ａ、３３Ｂ、３３Ｃ、３３Ｄ、３３Ｅ、３４、３５Ｆ、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｃ、３６、３７、３８、３９、４０、４１Ｆ、４１Ａ、４２、４３、４４、４５、４６、４７Ｆ、４７Ａ、４８、ＣＷＰＳ１、ＣＷＰＳ２、ＣＷＰＳ３の少なくとも１つに由来する莢膜多糖を約４〜９２μｇ／ｍｌで、ｐＨが約５．０〜７．５の範囲の緩衝液、（ｉｉ）塩化マグネシウム、塩化カルシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウムまたはそれらの組み合わせからなる群から選択されるアルカリまたはアルカリ塩を２０〜１７０ｍＭで、（ｉｉｉ）ポリソルベート２０である界面活性剤を１〜５ｍｇ／ｍｌで、（ｉｖ）スクロース、トレハロース、およびラフィノースからなる群から選択されるショ糖、任意で（ｖ）マンニトールである増量剤、ならびに任意で（ｖｉ）カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、２−ヒドロキシエチルセルロース（２−ＨＥＣ）およびプロピレングリコール（ＰＧ）、またはそれらの組み合わせからなる群から選択されるポリマーを１〜２５ｍｇ／ｍｌで含み、ショ糖、またはショ糖および増量剤の総濃度が約５０〜４００ｍｇ／ｍｌである、請求項１に記載の製剤。
【請求項４７】
凍結乾燥またはマイクロ波エネルギー乾燥前の水溶液である、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項４８】
溶液中の再構成された製剤である、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項４９】
ｄ（０．５０）が１５μｍ未満である、請求項１に記載の製剤。
【請求項５０】
リオスフェア形態である、請求項１に記載の製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、緩衝液、界面活性剤、ショ糖、アルカリまたはアルカリ塩、アルミニウムアジュバント、任意に増量剤、および任意にポリマーを含む肺炎球菌コンジュゲートワクチン製剤を提供する。
【背景技術】
【０００２】
カプセル化された細菌の一例である肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）は、世界中の重篤な疾患の深刻な原因である。１９９７年の疾病対策予防センター（ＣＤＣ）の推定によれば、米国では毎年３，０００例の肺炎球菌性髄膜炎、５０，０００例の肺炎球菌性菌血症、７，０００，０００例の肺炎球菌性中耳炎、５００，０００例の肺炎球菌性肺炎が発生している。Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，ＭＭＷＲ  Ｍｏｒｂ  Ｍｏｒｔａｌ  Ｗｋｌｙ  Ｒｅｐ  １９９７，４６（ＲＲ−８）：１−１３を参照。さらに、これらの疾患の合併症は重症になる可能性があり、いくつかの研究では、肺炎球菌性髄膜炎による死亡率は最大８％、神経系の続発症は２５％と報告されている。Ａｒｄｉｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  １０２：１０８７−９７を参照。
【０００３】
長年にわたって認可されている多価の肺炎球菌多糖ワクチンは、成人、特に高齢者および高リスク者の肺炎球菌性疾患の予防に有益であることが証明されている。しかし、乳児および幼児における非コンジュゲート肺炎球菌多糖に対する応答は不十分である。細菌多糖は、Ｔ細胞に依存しない免疫原であり、乳児では誘発される応答が弱いか、応答がない。細菌多糖免疫原のキャリアタンパク質への化学的コンジュゲーションにより、乳児の免疫応答をＴ細胞依存性の応答に変換する。ジフテリアトキソイド（ＤＴｘ、すなわちＤＴの化学的無毒化物）およびＣＲＭ１９７は、アミノ酸配列にＴ細胞刺激エピトープが存在するため、細菌多糖免疫原のキャリアタンパク質として説明されてきた。
【０００４】
幼児および乳児に侵襲性肺炎球菌性疾患を引き起こした７つの最も頻繁に分離された血清型（４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆ）を含む肺炎球菌コンジュゲートワクチンＰｒｅｖｎａｒ（登録商標）が、２０００年２月に初めて米国で認可された。
【０００５】
Ｐｒｅｖｎａｒ１３（登録商標）は、血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆを含む１３価肺炎球菌多糖タンパク質コンジュゲートワクチンである。例えば、米国特許出願公開第２００６／０２２８３８０Ａ１号、Ｐｒｙｍｕｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｌａｎｃｅｔ  ３６７：７４０−４８およびＫｉｅｎｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  Ｎｏｎ−ｉｎｆｅｒｉｏｒｉｔｙ  ｏｆ  １３−ｖａｌｅｎｔ  Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｃｏｍｐａｒｅｄ  ｔｏ  ７−ｖａｌｅｎｔ  Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｇｉｖｅｎ  ａｓ  ａ  ４−Ｄｏｓｅ  Ｓｅｒｉｅｓ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈｙ  Ｉｎｆａｎｔｓ  ａｎｄ  Ｔｏｄｄｌｅｒｓ，ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ  ａｔ  ｔｈｅ  ４８ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  ＩＣＡＡＣ／ＩＳＤＡ  ４６ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ，Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２５−２８，２００８を参照。Ｄａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．６６：２０９３−２０９８、およびＦａｔｔｏｍ，１９９９，Ｖａｃｃｉｎｅ  １７：１２６も参照。
【０００６】
中国特許出願公開第１０１５９０２２４Ａ号には、血清型１、２、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｎ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆを含む１４価肺炎球菌多糖タンパク質コンジュゲートワクチンが記載されている。
【０００７】
米国特許第８，１９２，７４６号には、すべて個別にＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートされた、血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆを有する、１５価肺炎球菌多糖タンパク質コンジュゲートワクチンが記載されている。
【０００８】
複数のキャリアタンパク質系も記載されている。例えば、米国特許出願公開第２０１００２０９４５０号、第２０１０００７４９２２号、第２００９００１７０５９号、第２００９００１０９５９号および第２００９００１７０７２号を参照。
【０００９】
肺炎連鎖球菌多糖タンパク質コンジュゲートならびにポリソルベート８０（ＰＳ−８０）およびポロキサマー１８８（Ｐ１８８）を含む界面活性剤を含む製剤が開示されている。米国特許第８，５６２，９９９号および米国特許出願公開第２０１３０２７３０９８号をそれぞれ参照。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００６／０２２８３８０Ａ１号
【特許文献２】中国特許出願公開第１０１５９０２２４Ａ号
【特許文献３】米国特許第８，１９２，７４６号
【特許文献４】米国特許出願公開第２０１００２０９４５０号
【特許文献５】米国特許出願公開第２０１０００７４９２２号
【特許文献６】米国特許出願公開第２００９００１７０５９号
【特許文献７】米国特許出願公開第２００９００１０９５９号
【特許文献８】米国特許出願公開第２００９００１７０７２号
【特許文献９】米国特許第８，５６２，９９９号
【特許文献１０】米国特許出願公開第２０１３０２７３０９８号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ａｒｄｉｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  １０２：１０８７−９７
【非特許文献２】Ｐｒｙｍｕｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｌａｎｃｅｔ  ３６７：７４０−４８
【非特許文献３】Ｋｉｅｎｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  Ｎｏｎ−ｉｎｆｅｒｉｏｒｉｔｙ  ｏｆ  １３−ｖａｌｅｎｔ  Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｃｏｍｐａｒｅｄ  ｔｏ  ７−ｖａｌｅｎｔ  Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｇｉｖｅｎ  ａｓ  ａ  ４−Ｄｏｓｅ  Ｓｅｒｉｅｓ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈｙ  Ｉｎｆａｎｔｓ  ａｎｄ  Ｔｏｄｄｌｅｒｓ，ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ  ａｔ  ｔｈｅ  ４８ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  ＩＣＡＡＣ／ＩＳＤＡ  ４６ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ，Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２５−２８，２００８
【非特許文献４】Ｄａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．６６：２０９３−２０９８
【非特許文献５】Ｆａｔｔｏｍ，１９９９，Ｖａｃｃｉｎｅ  １７：１２６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、（ｉ）１または複数の多糖タンパク質コンジュゲートと、（ｉｉ）ｐＨが約５．０〜７．５の範囲の緩衝液と、（ｉｉ）塩化マグネシウム、塩化カルシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウムまたはそれらの組み合わせからなる群から選択されるアルカリまたはアルカリ塩と、（ｉｉｉ）界面活性剤と、（ｉｖ）スクロース、トレハロース、およびラフィノースからなる群から選択されるショ糖と、任意で（ｖ）増量剤と、任意で（ｖｉ）カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、２−ヒドロキシエチルセルロース（２−ＨＥＣ）、クロスカルメロース、メチルセルロース、グリセリン、酸化ポリエチレン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびプロピレングリコール（ＰＧ）、またはそれらの組み合わせからなる群から選択されるポリマーと、（ｖｉｉ）アルミニウムアジュバントとを含む製剤を提供する。
【００１３】
一実施形態では、ショ糖および増量剤の総濃度は、少なくとも約５０ｍｇ／ｍｌである。別の実施形態では、ショ糖および増量剤の総濃度は、少なくとも約９０ｍｇ／ｍｌである。さらなる実施形態では、ショ糖および増量剤の総濃度は、約５０〜４００ｍｇ／ｍｌであり、ショ糖に対する増量剤の比は１以上である。さらなる実施形態では、ショ糖および増量剤の総濃度は、約５０〜１５０ｍｇ／ｍｌであり、増量剤とショ糖との比は約２：１である。一実施形態では、増量剤は、マンニトール、グリシンまたはラクトースである。さらなる実施形態では、ショ糖は、トレハロースまたはスクロースである。
【００１４】
一実施形態では、ポリマーは、約１〜２５ｍｇ／ｍｌのカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、２−ヒドロキシエチルセルロース（２−ＨＥＣ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはプロピレングリコール（ＰＧ）、またはそれらの組み合わせである。好ましい実施形態では、ポリマーは、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）である。一実施形態では、多糖タンパク質濃度は、２〜７０４、５〜５００または４〜９２μｇ／ｍｌである。別の実施形態では、多糖タンパク質濃度は、４０〜８０または４〜９２μｇ／ｍｌである。特定の実施形態では、製剤は、０．１〜０．５ｍｇ／ｍＬのリン酸アルミニウムアジュバント（ＡＰＡ）を含む。
【００１５】
特定の実施形態では、界面活性剤は、分子量が１１００Ｄａ〜１７，４００Ｄａ、７，５００Ｄａ〜１５，０００Ｄａ、または７，５００Ｄａ〜１０，０００Ｄａの範囲のポロキサマーである。ポロキサマーは、ポロキサマー１８８またはポロキサマー４０７であり得る。特定の態様では、ポロキサマーの最終濃度は、０．００１〜５０ｍｇ／ｍｌ、０．２５〜１０ｍｇ／ｍｌである。特定の実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート２０である。特定の態様では、ポリソルベート２０の最終濃度は、０．０１〜１００ｍｇ／ｍｌ、または０．２５〜１ｍｇ／ｍｌ、または０．２５〜５ｍｇ／ｍｌの範囲である。
【００１６】
特定の実施形態では、ｐＨ緩衝生理食塩溶液のｐＨは、５．０〜７．５の範囲であり得る。緩衝液は、ホスフェート、スクシネート、Ｌ−ヒスチジン、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、アセテートまたはシトレートからなる群から選択され得る。一態様では、緩衝液は、最終濃度が５ｍＭ〜５０ｍＭのＬ−ヒスチジン、または最終濃度が１ｍＭ〜１０ｍＭのスクシネートである。特定の態様では、Ｌ−ヒスチジンの最終濃度は、２０ｍＭ±２ｍＭである。ｐＨ緩衝生理食塩溶液中の塩は、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウムまたはそれらの組み合わせであり得る。一態様では、ｐＨ緩衝生理食塩溶液は、塩化ナトリウムである。生理食塩溶液は、２０ｍＭ〜１７０ｍＭの濃度で存在し得る。
【００１７】
特定の実施形態では、多糖タンパク質コンジュゲートは、キャリアタンパク質にコンジュゲートされた１または複数の肺炎球菌多糖を含む。特定の態様では、キャリアタンパク質は、ＣＲＭ１９７、ジフテリア毒素フラグメントＢ（ＤＴＦＢ）、ＤＴＦＢ  Ｃ８、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ＴＴのフラグメントＣ、百日咳トキソイド、コレラトキソイド、髄膜炎菌外膜タンパク質（ＯＭＰＣ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＴ（易熱性エンテロトキシン）、大腸菌ＳＴ（熱安定性エンテロトキシン）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の外毒素Ａ、およびそれらの組み合わせから選択される。特定の一態様では、１または複数の多糖タンパク質コンジュゲートは、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされている。特定の態様では、１または複数の多糖タンパク質コンジュゲートは、水性溶媒またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの非水性溶媒のいずれかにおける還元的アミノ化を用いて調製される。特定の態様では、血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、および２３Ｆに由来する多糖タンパク質コンジュゲートは、ＤＭＳＯ中の還元的アミノ化を用いて調製でき、血清型１、３、４、５、９Ｖ、１４、２２Ｆ、および３３Ｆに由来する多糖タンパク質コンジュゲートは、水溶液中の還元的アミノ化を用いて調製できる。特定の態様では、各用量は、６Ｂが８μｇ／ｍＬまたは１６μｇ／ｍＬであることを除いて、各糖を４μｇ／ｍＬまたは８μｇ／ｍＬ、およびＣＲＭ１９７キャリアタンパク質を約６４μｇ／ｍＬまたは１２８μｇ／ｍＬで含むように製剤化される。
【００１８】
本発明はまた、ＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートされた血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆに由来する肺炎連鎖球菌多糖、またはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされた肺炎連鎖球菌の血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、６Ｅ、６Ｇ、６Ｈ、７Ｆ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、８、９Ａ、９Ｌ、９Ｎ、９Ｖ、１０Ｆ、１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１１Ｆ、１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｄ、１１Ｅ、１２Ｆ、１２Ａ、１２Ｂ、１３、１４、１５Ｆ、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１６Ａ、１７Ｆ、１７Ａ、１８Ｆ、１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃ、１９Ｆ、１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、２０Ａ、２０Ｂ、２１、２２Ｆ、２２Ａ、２３Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、２４Ａ、２４Ｂ、２５Ｆ、２５Ａ、２７、２８Ｆ、２８Ａ、２９、３１、３２Ｆ、３２Ａ、３３Ｆ、３３Ａ、３３Ｂ、３３Ｃ、３３Ｄ、３３Ｅ、３４、３５Ｆ、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｃ、３６、３７、３８、３９、４０、４１Ｆ、４１Ａ、４２、４３、４４、４５、４６、４７Ｆ、４７Ａ、４８、ＣＷＰＳ１、ＣＷＰＳ２、ＣＷＰＳ３の少なくとも１つに由来する莢膜多糖を含む肺炎球菌コンジュゲート製剤であって、６Ｂが８μｇ／ｍＬもしくは１６μｇ／ｍＬであることを除いて、各糖を４μｇ／ｍＬもしくは８μｇ／ｍＬで；およびＣＲＭ１９７キャリアタンパク質を約６４μｇ／ｍＬもしくは１２８μｇ／ｍＬで；ｐＨが約５．０〜７．５の範囲のｐＨ緩衝生理食塩溶液、約１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、約２ｍｇ／ｍｌポリソルベート２０、２５０μｇ／ｍｌ  ＡＰＡ、それとともに約５０ｍｇ／ｍｌマンニトール、および約２０ｍｇ／ｍｌスクロース；約６０ｍｇ／ｍｌマンニトール、約４０ｍｇ／ｍｌスクロース；約９０ｍｇ／ｍｌスクロース、約５ｍｇ／ｍｌ  ＣＭＣ；約９０ｍｇ／ｍｌスクロース、約５ｍｇ／ｍｌ  ２−ＨＥＣ；約９０ｍｇ／ｍｌスクロース、約５ｍｇ／ｍｌ  ＨＰＣ；約９０ｍｇ／ｍｌスクロース、約５ｍｇ／ｍｌ  ＣＭＣ、および約５ｍｇ／ｍｌ  ＰＧ；約４０ｍｇ／ｍｌスクロース、約６０ｍｇ／ｍｌマンニトール、および約５ｍｇ／ｍｌ  ＣＭＣ；または約４０ｍｇ／ｍｌスクロース、約６０ｍｇ／ｍｌマンニトール、約５ｍｇ／ｍｌ  ＣＭＣおよび約５ｍｇ／ｍｌ  ＰＧを含有する、肺炎球菌コンジュゲート製剤に関する。特定の態様では、緩衝液は、ヒスチジンである。
【００１９】
別の態様では、本発明は、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされた血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆに由来する肺炎連鎖球菌多糖から本質的になる１５価肺炎球菌コンジュゲート（１５ｖＰｎＣ）を約２０〜１５０、２〜７０４または４〜９２μｇ／ｍｌで、ｐＨが約５．０〜７．５の範囲のｐＨ緩衝生理食塩溶液、約３０〜１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、約０．０５〜２ｍｇ／ｍｌポリソルベート２０、約２０〜２５０ｍｇ／ｍｌスクロース、約３０〜１００ｍｇ／ｍｌマンニトール、約０．１〜０．７５ｍｇ／ｍｌ  ＡＰＡ、約１〜１０ｍｇ／ｍｌ  ＣＭＣ、および任意で約１〜１０ｍｇ／ｍｌ  ＰＧを含む、ワクチン製剤を提供する。
【００２０】
別の態様では、本発明は、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされた肺炎連鎖球菌の血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、６Ｅ、６Ｇ、６Ｈ、７Ｆ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、８、９Ａ、９Ｌ、９Ｎ、９Ｖ、１０Ｆ、１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１１Ｆ、１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｄ、１１Ｅ、１２Ｆ、１２Ａ、１２Ｂ、１３、１４、１５Ｆ、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１６Ａ、１７Ｆ、１７Ａ、１８Ｆ、１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃ、１９Ｆ、１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、２０Ａ、２０Ｂ、２１、２２Ｆ、２２Ａ、２３Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、２４Ａ、２４Ｂ、２５Ｆ、２５Ａ、２７、２８Ｆ、２８Ａ、２９、３１、３２Ｆ、３２Ａ、３３Ｆ、３３Ａ、３３Ｂ、３３Ｃ、３３Ｄ、３３Ｅ、３４、３５Ｆ、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｃ、３６、３７、３８、３９、４０、４１Ｆ、４１Ａ、４２、４３、４４、４５、４６、４７Ｆ、４７Ａ、４８、ＣＷＰＳ１、ＣＷＰＳ２、ＣＷＰＳ３の少なくとも１つに由来する多糖を約２０〜１５０、４〜９２または２〜７０４μｇ／ｍｌで、ｐＨが約５．０〜７．５の範囲のｐＨ緩衝生理食塩溶液、約３０〜１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、約０．０５〜２ｍｇ／ｍｌ  ポリソルベート２０、約２０〜２５０ｍｇ／ｍｌスクロース、約３０〜１００ｍｇ／ｍｌマンニトール、約０．１〜０．７５ｍｇ／ｍｌ  ＡＰＡ、約１〜１０ｍｇ／ｍｌ  ＣＭＣ、および任意で約１〜１０ｍｇ／ｍｌ  ＰＧを含む、ワクチン製剤を提供する。
【００２１】
別の態様では、本発明は、本発明はまた、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされた血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆに由来する肺炎連鎖球菌多糖４〜７０４もしくは４〜９２μｇを含む肺炎球菌コンジュゲートワクチン、またはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされた肺炎連鎖球菌の血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、６Ｅ、６Ｇ、６Ｈ、７Ｆ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、８、９Ａ、９Ｌ、９Ｎ、９Ｖ、１０Ｆ、１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１１Ｆ、１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｄ、１１Ｅ、１２Ｆ、１２Ａ、１２Ｂ、１３、１４、１５Ｆ、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１６Ａ、１７Ｆ、１７Ａ、１８Ｆ、１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃ、１９Ｆ、１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、２０Ａ、２０Ｂ、２１、２２Ｆ、２２Ａ、２３Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、２４Ａ、２４Ｂ、２５Ｆ、２５Ａ、２７、２８Ｆ、２８Ａ、２９、３１、３２Ｆ、３２Ａ、３３Ｆ、３３Ａ、３３Ｂ、３３Ｃ、３３Ｄ、３３Ｅ、３４、３５Ｆ、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｃ、３６、３７、３８、３９、４０、４１Ｆ、４１Ａ、４２、４３、４４、４５、４６、４７Ｆ、４７Ａ、４８、ＣＷＰＳ１、ＣＷＰＳ２、ＣＷＰＳ３の少なくとも１つに由来する莢膜多糖を含む肺炎球菌コンジュゲートワクチン、ならびにＣＭＣ約３．５ｍｇ、スクロース約６２ｍｇ、ＡＰＡ約０．１８ｍｇ、ＰＳ２０約１．４ｍｇ、ＮａＣｌ約６．３ｍｇ、ヒスチジン約２．２ｍｇ；ＣＭＣ約３．５ｍｇ、ＰＧ約３．５ｍｇ、スクロース約６３ｍｇ、ＡＰＡ約０．１８ｍｇ、ＰＳ２０約１．４ｍｇ、ＮａＣｌ約６．３ｍｇ、ヒスチジン約２．２ｍｇ；ＣＭＣ約３．５ｍｇ、スクロース約２８ｍｇ、マンニトール４２ｍｇ、ＡＰＡ約０．１８ｍｇ、ＰＳ２０約１．４ｍｇ、ＮａＣｌ約６．３ｍｇ、ヒスチジン約２．２ｍｇ；ＣＭＣ約３．５ｍｇ、ＰＧ約３．５ｍｇ、スクロース約２８ｍｇ、マンニトール約４２ｍｇ、ＡＰＡ約０．１８ｍｇ、ＰＳ２０約１．４ｍｇ、ＮａＣｌ約２．１ｍｇ、ヒスチジン約２．２ｍｇからなる群から選択される製剤を含む容器を提供する。一実施形態では、ワクチンのｄ（０．５０）は、１５μｍ未満または１０μｍ未満である。
【００２２】
また、本発明は、真空チャンバ内で進行波形式のマイクロ波を照射して、目視できる沸騰の兆候がない状態で乾燥リオスフェア（ｌｙｏｓｐｈｅｒｅ）および／またはケーキを得ることにより、アルミニウムアジュバントに予め吸収された乾燥コンジュゲートワクチンを得る方法を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、部分的には、アルミニウムアジュバントを含むコンジュゲートワクチン製剤中のショ糖および増量剤が、凍結乾燥、マイクロ波乾燥、およびリオスフェア形成中に凝集する傾向を低減し得ることを発見したことに基づく。
【００２４】
「約」という用語は、物質または組成物の量（例えば、ｍＭ、またはＭ）、製剤成分の割合（ｖ／ｖまたはｗ／ｖ）、溶液／製剤のｐＨ、または方法の工程を特徴付けるパラメータの値などを変更する場合に、例えば、物質または組成物の調製、特性評価、および／または使用に関する典型的な測定、取り扱い、およびサンプリング手順；これらの手順中の意図しない誤差；組成物の製造もしくは使用、または手順の実施に使用される成分の製造、供給源、または純度の違いなどを通じて発生する可能性のある数量の変動を指す。特定の実施形態では、「約」とは、±０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、または１０％の変動を意味し得る。
【００２５】
本明細書で使用する場合、「多糖」（Ｐｓ）という用語は、「糖」、「オリゴ糖」、「多糖」、「リポ糖」、「リポオリゴ糖（ＬＯＳ）」、「リポ多糖（ＬＰＳ）」、「グリコシレート」、「複合糖質」などを含むがこれらに限定されない、免疫学および細菌性ワクチンの分野で一般的に使用される抗原性糖要素（または抗原性ユニット）を含むことを意味する。
【００２６】
本明細書で使用する場合、本発明の免疫原性組成物とともに使用する場合、「含む」という用語は、アジュバントおよび賦形剤などの他の成分（抗原混合物については「からなる」という言葉の制限を受ける）の包含を指す。「からなる」という用語は、多価の多糖タンパク質コンジュゲート混合物とともに使用される場合、それらの特定の肺炎連鎖球菌多糖タンパク質コンジュゲートを有し、異なる血清型からの他の肺炎連鎖球菌多糖タンパク質コンジュゲートを持たない混合物を指す。
【００２７】
「増量剤」という用語には、凍結乾燥製品の構造を提供する薬剤が含まれる。増量剤に使用される一般的な例としては、マンニトール、グリシン、およびラクトースが挙げられる。薬学的に優れたケーキを提供することに加えて、増量剤は、崩壊温度の変更、凍結融解保護の提供、水分低減、長期の保管にわたるタンパク質安定性の向上に関して、有用な特質を付与し得る。これらの薬剤は、張度調整剤としても機能し得る。
【００２８】
本明細書で定義されるように、「沈殿」、「沈殿させる」、「粒子形成」、「凝塊」、「混濁」、および「凝集」という用語は交換可能に使用でき、多糖タンパク質コンジュゲートの凝塊をもたらす物理的相互作用または化学反応を指すことが意図される。凝集のプロセス（例えば、タンパク質凝集）は、熱、圧力、ｐＨ、撹拌、せん断力、凍結融解、脱水、重金属、フェノール化合物、シリコンオイル、変性剤などを含む多数の物理化学的ストレスによって誘発され得る。
【００２９】
「凍結乾燥」、「凍結乾燥した（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）」、および「凍結乾燥した（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ）」という用語は、乾燥される材料が最初に凍結され、その後、真空環境で昇華によって氷または凍結溶媒が除去されるプロセスを指す。凍結乾燥前の製剤に賦形剤を含めて、保管時の凍結乾燥製品の安定性を高めてもよい。
【００３０】
本明細書で使用する場合、「リオスフェア（ｌｙｏｓｐｈｅｒｅ）」とは、実質的に球形または卵形の、治療活性剤を含む乾燥凍結単一体を指す。いくつかの実施形態では、リオスフェアの直径は、約２〜約１２ｍｍ、好ましくは２〜８ｍｍ、例えば２．５〜６ｍｍまたは２．５〜５ｍｍである。いくつかの実施形態では、リオスフェアの体積は、約２０〜５５０μＬ、好ましくは２０〜１００μＬ、例えば２０〜５０μＬである。リオスフェアが実質的に球形ではない実施形態では、リオスフェアのサイズは、そのアスペクト比に関して説明することができ、アスペクト比は、より長い寸法とより短い寸法との比である。リオスフェアのアスペクト比は、０．５〜２．５、好ましくは０．７５〜２、例えば１〜１．５であり得る。リオスフェアは、例えば、液滴の形で液体のアリコート（例えば、約２０、５０、１００または２５０マイクロリットル）を固体の平らな表面上に液滴が無傷のまま残るように載せることにより作製できる。本発明の一実施形態では、表面は、板、例えば金属板であり、その温度は、例えば約−１８０℃〜約−１９６℃または約−１８０℃〜約−２７３℃である。例えば、本発明の一実施形態では、液体を、分注チップによって表面に載せる。本発明の一実施形態では、液体は、約３ｍｌ／分〜約７５ｍｌ／分、約５ｍｌ／分〜約７５ｍｌ／分；約３ｍｌ／分〜約６０ｍｌ／分、約２０ｍｌ／分〜約７５ｍｌ／分；約２０ｍｌ／分〜約６０ｍｌ／分の分注速度で分注される。本発明の一実施形態では、分注されるアリコートは２５０マイクロリットル、分注速度は約５ｍｌ／分〜約７５ｍｌ／分であるか、またはアリコートは１００マイクロリットル、分注速度は約３ｍｌ／分〜約６０ｍｌ／分である。本発明の一実施形態では、分注チップと液体が分注される表面との間のギャップは、約０．１ｃｍ以上（例えば、約０．５ｃｍまたは０．１ｃｍ〜１ｃｍまたは０．１ｃｍ〜０．７５ｃｍ）である。表面に分注されると、液滴は凍結され、その後乾燥される。リオスフェアを作製する方法は、当技術分野で知られている。例えば、米国特許第５６５６５９７号、国際公開第２０１３０６６７６９号、国際公開第２０１４０９３２０６号、国際公開第２０１５０５７５４０号、国際公開第２０１５０５７５４１号または国際公開第２０１５０５７５４８号を参照。
【００３１】
「再構成された」製剤は、ワクチンが再構成された製剤に分散されるように、乾燥ワクチン製剤を希釈剤に溶解させることにより調製した製剤である。再構成された製剤は、投与（例えば、筋肉内投与）に適しており、皮下投与に適していてもよい。
【００３２】
本明細書で定義されるように、本発明の「界面活性剤」は、免疫原性組成物製剤の表面張力を低下させる任意の分子または化合物である。「界面活性剤系」は、界面活性剤を含むが、界面活性剤の効果を高めるポリオールなどの追加の賦形剤の包含を許容し得る。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「ｘ％（ｗ／ｖ）」は、ｘｇ／１００ｍｌに等しい（例えば、０．２％ｗ／ｖ  ＰＳ２０は、２ｍｇ／ｍｌ  ＰＳ２０に等しい）。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「マイクロ波真空乾燥」とは、マイクロ波放射（放射エネルギーまたは非電離放射としても知られる）を利用して、昇華によってワクチン製剤の乾燥ワクチン製品（好ましくは、水分が６％未満）を形成する乾燥方法を指す。特定の実施形態では、マイクロ波乾燥は、米国特許出願公開第２０１６／０２２８５３２号に記載のように実施される。
【００３５】
本発明の免疫原性組成物は、１または複数のキャリアタンパク質にコンジュゲートされた１または複数の抗原を含む多価組成物であり得る。本発明の特定の実施形態では、抗原は、カプセル化された細菌由来の糖である。このようなワクチンでは、糖は、特定の種類の細菌の表面に似たショ糖分子の長い鎖で構成されている。カプセル化された細菌には、肺炎連鎖球菌、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型が含まれるが、これらに限定されない。他の実施形態では、糖は、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）、パラチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｐａｒａｔｙｐｈｉ）Ａ、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｏ１５７、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）Ｏ１およびＯ１３９に由来する。抗原は、同じ生物に由来するものでも、異なる生物に由来するものでもよい。本発明の好ましい実施形態では、抗原は、肺炎連鎖球菌莢膜多糖である。
【００３６】
２つのキャリアタンパク質を使用する実施形態では、第１のキャリアタンパク質にコンジュゲートされていない各莢膜多糖は、同じ第２のキャリアタンパク質にコンジュゲートされている（例えば、各莢膜多糖分子は単一のキャリアタンパク質にコンジュゲートされている）。別の実施形態では、第１のキャリアタンパク質にコンジュゲートされていない莢膜多糖は、２つ以上のキャリアタンパク質にコンジュゲートされている（各莢膜多糖分子は単一のキャリアタンパク質にコンジュゲートされている）。そのような実施形態では、同じ血清型の各莢膜多糖は、通常、同じキャリアタンパク質にコンジュゲートされている。
【００３７】
ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）によって分泌される外毒素であるジフテリア毒素は、ジスルフィド架橋によって結合される、３つのドメインを有する２つのサブユニット（フラグメント）で構成される古典的なＡ−Ｂ毒素である。フラグメントＡ（ＤＴＦＡ）には、ＡＤＰリボース触媒Ｃドメインが含まれ、フラグメントＢ（ＤＴＦＢ）には、中央転座Ｔドメインおよびカルボキシ末端受容体結合Ｒドメインが含まれる。ＤＴＦＢは、ＤＴの全アミノ酸配列の約６０％を構成する非毒性部分である。例えば、Ｇｉｌｌ，Ｄ．Ｍ．ａｎｄ  Ｄｉｎｉｕｓ，Ｌ．Ｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４６，１４８５−１４９１（１９７１）、Ｇｉｌｌ，Ｄ．Ｍ．ａｎｄ  Ｐａｐｐｅｎｈｅｉｍｅｒ，Ｊｒ．，Ａ．Ｍ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４６，１４９２−１４９５（１９７１）、Ｃｏｌｌｉｅｒ，Ｒ．Ｊ．ａｎｄ  Ｋａｎｄｅｌ，Ｊ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４６，１４９６−１５０３（１９７１）、およびＤｒａｚｉｎ，Ｒ．，Ｋａｎｄｅｌ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｃｏｌｌｉｅｒ，Ｒ．Ｊ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４６，１５０４−１５１０（１９７１）を参照。
【００３８】
ジフテリア毒素の完全なアミノ酸配列が公開されている。Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，Ｌ．，Ｂｊｏｒｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｈｏｒｎ，Ｇ．，Ｆｏｎｇ，Ｄ．，Ｂｕｃｋ，Ｇ．Ａ．，Ｃｏｌｌｉｅｒ，Ｒ．Ｊ．ａｎｄ  Ｋａｐｌａｎ，Ｄ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０，６８５３−６８５７（１９８３）を参照。具体的には、ＤＴＦＢは、ＤＴのアミノ酸残基１９４〜５３５を含む。
【００３９】
ＣＲＭ１９７キャリアタンパク質は、ＤＴの変異体であり、フラグメントＡの残基５２の単一アミノ酸置換により無毒化される。ＣＲＭ１９７とＤＴとは、フラグメントＢで完全な配列相同性を共有している。主要なＴ細胞エピトープは、ＤＴアミノ酸配列のＢフラグメントで主に見つかった。Ｂｉｘｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ．（１９８９）２５１：１７５−８０、Ｒａｊｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９５）２５：３２０７−３２１４、Ｄｉｅｔｈｅｌｍ−Ｏｋｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ（２０００）１８１：１００１−９、およびＭｃＣｏｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎ．６７（Ｓｅｐｔ．１９９９），ｐ．４８６２〜４８６９を参照。
【００４０】
本明細書で説明するＤＴＦＢの使用には、ＡＤＰリボシル化活性ドメインのジフテリア毒素の欠失が含まれる。ＤＴＦＢの使用には、欠失、置換および付加を含む、少なくとも９０％、９５％または９９％の配列同一性を有する多様体も含まれる。多様体の例としては、システイン２０１の欠失または変異である。ＤＴＦＢ（Ｃ８）とは、ＡＤＰリボシル化活性化ドメインが削除された、かつシステイン２０１が除去されたかまたは変異したジフテリア毒素を意味する。ＤＴＦＢの使用には、ＤＴの配列２６５〜４５０にわたるフラグメントも含まれ、これには、公開されているＴ細胞エピトープが含まれる（Ｂｉｘｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ．（１９８９）２５１：１７５−８０、Ｒａｊｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９５）２５：３２０７−３２１４を参照）。ＤＴＦＢには、単量体、二量体、または多量体の状態も含まれる。ＤＴＦＢの使用には、タンパク質複合体（全長鎖のＤＴまたはＣＲＭ１９７を除く）、ハイブリッドタンパク質、またはＤＴＦＢもしくはフラグメントを含むコンジュゲートタンパク質も含まれる。ＤＴＦＢの使用には、化学修飾ＤＴＦＢまたはフラグメント（すなわち、ペグ化、非天然アミノ酸修飾）も含まれる。
【００４１】
特定の実施形態では、ＤＴＦＢは、酵素消化、および天然のＤＴまたは変異体ＣＲＭ１９７の還元後に、吸着クロマトグラフィーにより精製することによって生成される。したがって、ＤＴ  Ｃ２０１残基における変異の有無にかかわらず、精製されたＤＴＦＢは、全長鎖の天然もしくはＣ２０１変異のＤＴもしくはＣＲＭ１９７から、またはＡフラグメントが切断されたそれらの多様体から同様に調製できると想定される。Ｃａｐｔｏ（商標）ＡｄｈｅｒｅおよびＣａｐｔｏ（商標）ＭＭＣとして販売されているマルチモーダル樹脂と、クロマトグラフィーサイクル中に５０ｍＭを超えるトリス濃度とによって、切断された天然のＤＴＦＢを精製する例外的なモードが提供されることが特に知られている。
【００４２】
特定の実施形態では、ＤＴＦＢの調製物は、１０ｍＭまでのＤＴＴを含む。ＤＴＴは、残基位置２０１の遊離システインによるＤＴＦＢモノマー間のジスルフィド結合形成によって引き起こされる二量体化を防ぐ。そのような場合、ニッケルは、コンジュゲーション反応混合物に添加されない。ただし、それ以外は同じ方法でコンジュゲーション反応が進行する。ＤＴＴを使用しない場合、二量体化されたＤＴＦＢは、Ｐｓにコンジュゲートされ得、好ましい実施形態では、コンジュゲーションの程度を改善するために残留する阻害性のシアン化物を封鎖するためにニッケルが添加される。
【００４３】
ＤＴＦＢの遊離システイン（ＤＴ  Ｃ２０１の変異）の除去は、マルチモーダル樹脂でも同様の挙動を示すと予想される。遊離システインの除去は、遊離システイン間のジスルフィド結合形成による二量体化が実行できないため、ＤＴＴの必要性を排除すると予想される。トリス緩衝液濃度および塩化ナトリウム溶出緩衝液濃度を上げると、Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣクロマトグラフィー樹脂からのＤＴＦＢタンパク質の回収率が向上することが実証されている。ＤＴＦＢ精製は、他のマルチモーダル樹脂を使用して達成できると予想される。
【００４４】
特定の実施形態では、ＤＴＦＢは、ＤＴ  Ｃ２０１残基の変異の有無にかかわらず組換え的に発現され、その後、当業者に既知の様々な技術により精製される。
【００４５】
本発明の特定の実施形態では、ＣＲＭ１９７は、キャリアタンパク質として使用される。ＣＲＭ１９７は、ジフテリア毒素の非毒性多様体（すなわち、トキソイド）である。一実施形態では、カザミノ酸および酵母エキスベースの培地で成育されたジフテリア菌株Ｃ７（β１９７）の培養物から単離される。別の実施形態では、ＣＲＭ１９７は、米国特許第５，６１４，３８２号に記載されている方法に従って組換えにより調製される。通常、ＣＲＭ１９７は、限外ろ過、硫酸アンモニウム沈殿、およびイオン交換クロマトグラフィーの組み合わせにより精製される。いくつかの実施形態では、ＣＲＭ１９７は、Ｐｆｅｎｅｘ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（商標）（Ｐｆｅｎｅｘ  Ｉｎｃ．社、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）で調製される。
【００４６】
ＤＴＦＢおよびその多様体は、タンパク質（ペプチド）および糖を含む抗原のキャリアタンパク質として使用することができる。他の適切なキャリアタンパク質としては、ＤＴ（ジフテリアトキソイド）、ＴＴ（破傷風トキソイド）またはＴＴのフラグメントＣ、百日咳トキソイド、コレラトキソイド（例えば、国際特許出願公開第２００４／０８３２５１号に記載）、大腸菌ＬＴ、大腸菌ＳＴ、および緑膿菌由来の外毒素Ａなどの追加の不活化細菌毒素が挙げられる。細菌外膜タンパク質群、例えば外膜複合体ｃ（ＯＭＰＣ）、ポリン、トランスフェリン結合タンパク質、肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ、国際特許出願公開第０２／０９１９９８号を参照）、肺炎球菌アドヘシンタンパク質（ＰｓａＡ）、Ａ群もしくはＢ群連鎖球菌（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）由来のＣ５ａペプチダーゼ、またはインフルエンザ菌タンパク質Ｄ、肺炎球菌ニューモリシン（Ｋｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６３；２７０６−１３）、例えばいくつかの様式で解毒されたｐｌｙ、例えばｄＰＬＹ−ＧＭＢＳ（国際特許出願公開第０４／０８１５１５号を参照）またはｄＰＬＹ−ｆｏｒｍｏｌ、ＰｈｔＸ、例えばＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＥ、およびＰｈｔタンパク質の融合物、例えばＰｈｔＤＥ融合物、ＰｈｔＢＥ融合物（国際特許出願公開第０１／９８３３４号および第０３／５４００７号を参照）を使用することもできる。その他のタンパク質、例えばオボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはツベルクリンの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）、ＰｏｒＢ（髄膜炎菌に由来）、ＰＤ（インフルエンザ菌タンパク質Ｄ；欧州特許第０５９４６１０Ｂ号を参照）、またはそれらの免疫学的機能等価物、合成ペプチド（欧州特許第０３７８８８１号および第０４２７３４７号を参照）、熱ショックタンパク質（国際特許出願公開第９３／１７７１２号および第９４／０３２０８号を参照）、百日咳タンパク質（国際特許出願公開第９８／５８６６８号および欧州特許第０４７１１７７号を参照）、サイトカイン、リンホカイン、成長因子またはホルモン（国際特許出願公開第９１／０１１４６号を参照）、様々な病原体由来抗原に由来する複数のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質（Ｆａｌｕｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３１：３８１６−３８２４を参照）、例えばＮ１９タンパク質（Ｂａｒａｌｄｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７２：４８８４−７を参照）、鉄取り込みタンパク質（国際特許出願公開第０１／７２３３７号を参照）、ディフィシル菌（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の毒素ＡまたはＢ（国際特許出願公開第００／６１７６１号を参照）、およびフラジェリン（Ｂｅｎ−Ｙｅｄｉｄｉａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ６４：９を参照）をキャリアタンパク質として使用することもできる。
【００４７】
他のＤＴ変異体、例えばＣＲＭ１７６、ＣＲＭ２２８、ＣＲＭ４５（Ｕｃｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９７３，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２１８：３８３８−３８４４）；Ｎｉｃｈｏｌｌｓ  ａｎｄ  Ｙｏｕｌｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｔｏｘｉｎｓ，Ｅｄ：Ｆｒａｎｋｅｌ，Ｍａｅｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ，１９９２に記載されているＣＲＭ９、ＣＲＭ４５、ＣＲＭ１０２、ＣＲＭ１０３、およびＣＲＭ１０７、ならびに他の変異体；米国特許第４，７０９，０１７号または米国特許第４，９５０，７４０号に開示されているＧｌｕ−１４８からＡｓｐ、ＧｌｎもしくはＳｅｒおよび／またはＡｌａ  １５８からＧｌｙへの欠失または変異体、ならびに他の変異体；米国特許第５，９１７，０１７号または米国特許第６，４５５，６７３号に開示されている少なくとも１つ以上の残基Ｌｙｓ  ５１６、Ｌｙｓ  ５２６、Ｐｈｅ  ５３０および／またはＬｙｓ  ５３４の変異体、ならびに他の変異体；あるいは米国特許第５，８４３，７１１号に開示されているフラグメントを、第２のキャリアタンパク質として使用することができる。そのようなＤＴ変異体は、エピトープ領域を含むＢフラグメントを含むＤＴＦＢ多様体の作製に使用することもできる。
【００４８】
一実施形態では、本発明は、１または複数のキャリアタンパク質にコンジュゲートされた肺炎連鎖球菌の血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、６Ｅ、６Ｇ、６Ｈ、７Ｆ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、８、９Ａ、９Ｌ、９Ｎ、９Ｖ、１０Ｆ、１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１１Ｆ、１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｄ、１１Ｅ、１２Ｆ、１２Ａ、１２Ｂ、１３、１４、１５Ｆ、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１６Ａ、１７Ｆ、１７Ａ、１８Ｆ、１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃ、１９Ｆ、１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、２０Ａ、２０Ｂ、２１、２２Ｆ、２２Ａ、２３Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、２４Ａ、２４Ｂ、２５Ｆ、２５Ａ、２７、２８Ｆ、２８Ａ、２９、３１、３２Ｆ、３２Ａ、３３Ｆ、３３Ａ、３３Ｂ、３３Ｃ、３３Ｄ、３３Ｅ、３４、３５Ｆ、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｃ、３６、３７、３８、３９、４０、４１Ｆ、４１Ａ、４２、４３、４４、４５、４６、４７Ｆ、４７Ａ、４８、ＣＷＰＳ１、ＣＷＰＳ２、ＣＷＰＳ３の少なくとも１つに由来する莢膜多糖と、薬学的に許容されるキャリアとを含む、多糖タンパク質コンジュゲートを含む免疫原性組成物を提供する。一実施形態では、本発明は、１または複数のキャリアタンパク質にコンジュゲートされた肺炎連鎖球菌の血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２１、２２Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、２７、２８Ａ、３１、３３Ｆ、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｆ、および３８の少なくとも１つに由来する莢膜多糖と、薬学的に許容されるキャリアとを含む、多糖タンパク質コンジュゲートを含む免疫原性組成物を提供する。本発明の特定の実施形態では、免疫原性組成物は、ＣＲＭ１９７に個別にコンジュゲートされた血清型２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、または４４に由来する莢膜多糖を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。本発明の特定の態様では、ＣＲＭ１９７は、使用される唯一のキャリアタンパク質である。他の実施形態では、多糖タンパク質コンジュゲート製剤は、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされている血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、および２３Ｆに由来する肺炎連鎖球菌多糖から本質的になる１３価肺炎球菌コンジュゲート（１３ｖＰｎＣ）製剤である。さらなる実施形態では、多糖タンパク質コンジュゲート製剤は、分類不能のインフルエンザ菌タンパク質Ｄにコンジュゲートされている血清型１、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、および２３Ｆに由来する肺炎連鎖球菌多糖から本質的になる１０価肺炎球菌コンジュゲート（１０ｖＰｎＣ）製剤である。
【００４９】
特定の実施形態では、上記の免疫原性組成物は、（第１のキャリアタンパク質と少なくとも１つのアミノ酸が異なる）第２のキャリアタンパク質にコンジュゲートされている血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２１、２２Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、２７、２８Ａ、３１、３３Ｆ、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｆ、および３８のうちの少なくとも１つから選択される１つの追加の肺炎連鎖球菌血清型に由来する莢膜多糖をさらに含んでもよい。特定の血清型に由来する糖は、１より多いキャリアタンパク質にコンジュゲートされていないことが好ましい。
【００５０】
本発明の特定の実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、第２のキャリアタンパク質にコンジュゲートされた少なくとも１つの追加の血清型に由来する莢膜多糖をさらに含む。これらの実施形態では、免疫原性組成物は、ＣＲＭ１９７ではない第２のキャリアタンパク質に個別にコンジュゲートされている血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、または４４に由来する莢膜多糖を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。
【００５１】
本発明の特定の実施形態では、免疫原性組成物は、Ｎが２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、または４４であるＮ血清型に由来する莢膜多糖を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなり、Ｎ血清型の各々に由来する莢膜多糖は、ＣＲＭ１９７である第１のタンパク質キャリアにコンジュゲートされている。本発明の他の実施形態では、１、２、３…またはＮ−１血清型に由来する莢膜多糖は、第１のタンパク質キャリアにコンジュゲートされ、Ｎ−１、Ｎ−２、Ｎ−３…１血清型に由来する莢膜多糖は、ＣＲＭ１９７とは異なる第２のタンパク質キャリアにコンジュゲートされている。
【００５２】
本発明の特定の一実施形態では、本発明は、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされている血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆに由来する莢膜多糖を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる１５価の免疫原性組成物を提供する。
【００５３】
肺炎連鎖球菌に由来する莢膜多糖は、当業者に既知の標準的な技術により調製することができる。例えば、多糖は、細菌から単離することができ、既知の方法により（例えば、欧州特許第４９７５２４号および第４９７５２５号を参照）、好ましくは、ホモジナイザーを使用して、または化学的加水分解によって達成される微小流動化によって、ある程度サイズ調整することができる。一実施形態では、各多糖血清型に対応する肺炎連鎖球菌株は、大豆ベースの培地で成育される。次いで、個々の多糖は、遠心分離、沈殿、および限外ろ過などの標準的な工程で精製される。例えば、米国特許出願公開第２００８／０２８６８３８号および米国特許第５，８４７，１１２号を参照。多糖は、粘度を低下させるため、および／またはその後のコンジュゲート生成物のろ過性を改善するためにサイズ調整することができる。本発明において、莢膜多糖は、血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２１、２２Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、２７、２８Ａ、３１、３３Ｆ、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｆ、および３８の１または複数から調製される。
【００５４】
精製された多糖は、キャリアタンパク質と反応することができる官能性を導入するために化学的に活性化される。活性化されると、各莢膜多糖は、キャリアタンパク質と別個にコンジュゲートされて複合糖質を形成する。多糖コンジュゲートは、既知のカップリング技術により調製され得る。
【００５５】
一実施形態では、多糖の化学的活性化およびその後のキャリアタンパク質へのコンジュゲーションは、米国特許第４，３６５，１７０号、第４，６７３，５７４号および第４，９０２，５０６号に記載されている手段によって達成される。簡単に言えば、肺炎球菌多糖は、過ヨウ素酸ナトリウム、過ヨウ素酸カリウム、または過ヨウ素酸などの過ヨウ素酸塩ベースの酸化剤と反応して、ビシナルヒドロキシル基のランダムな酸化的切断をもたらし、反応性アルデヒド基を生成する。
【００５６】
酸化された多糖のタンパク質キャリア上の第一級アミン基（主にリジン残基）への直接的なアミノ化カップリングは、還元的アミノ化によって達成することができる。例えば、コンジュゲーションは、ニッケルの存在下で、活性化多糖とキャリアタンパク質との混合物をシアノ水素化ホウ素ナトリウムなどの還元剤と反応させることにより行われる。コンジュゲーション反応は、水溶液またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの有機溶媒中で行うことができる。例えば、米国特許出願公開第２０１５／０２３１２７０Ａ１号、欧州特許第０４７１１７７Ｂ１号、米国特許出願公開第２０１１／０１９５０８６Ａ１号を参照。コンジュゲーション反応の終わりに、水素化ホウ素ナトリウムなどの強力な還元剤を添加することにより、未反応のアルデヒドをキャップする。
【００５７】
一実施形態では、製剤化の前に、各肺炎球菌莢膜多糖抗原を肺炎連鎖球菌から個別に精製し、活性化して反応性アルデヒドを形成し、その後、ニッケルの存在下でシアノ水素化ホウ素ナトリウムとの還元的アミノ化を用いて、第１または第２のキャリアタンパク質に共有コンジュゲートさせる。還元的アミノ化に使用されるシアノ水素化ホウ素ナトリウム還元剤からの残留阻害性シアン化物とのニッケル錯体。
【００５８】
特定の実施形態では、コンジュゲーション反応は、還元的アミノ化によって行い、コンジュゲーション反応の効率を高め、遊離シアン化物の除去を促進するためにニッケルを使用する。遷移金属は、シアン化物と安定した錯体を形成することが知られており、シアノ水素化ホウ素ナトリウムによるタンパク質アミノ基およびホルムアルデヒドの還元的メチル化を改善することが知られている（Ｇｉｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２０３：３３１−３３４、Ｊｅｎｔｏｆｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０６：１８６−１９０）。残留阻害性シアン化物の錯体化によって、ニッケルの添加により、コンジュゲーション中のタンパク質の消費が増加し、より大きい、免疫原性がより高い可能性があるコンジュゲートが形成される。
【００５９】
市販のシアノ水素化ホウ素ナトリウム試薬ロットの遊離シアン化物濃度の変動性は、一貫性のないコンジュゲーション性能をもたらし、分子量、多糖とタンパク質との比率など、様々なコンジュゲート属性をもたらす。コンジュゲーション反応にニッケルを添加すると、遊離シアン化物の濃度が低下するため、ロット間のコンジュゲートの一貫性が向上する。
【００６０】
別の実施形態では、コンジュゲーション方法は、１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート（ＣＤＡＰ）による多糖の活性化を使用して、シアン酸エステルを形成してもよい。活性化された糖は、キャリアタンパク質上のアミノ基に直接結合され得る。
【００６１】
別の実施形態では、いくつかの利用可能な様式のいずれかでシアン酸エステルを反応させることにより、反応性のホモ二官能基またはヘテロ二官能基を活性化多糖に導入してもよい。例えば、シスタミンまたはシステアミンを使用して、マレイミド活性化キャリアタンパク質（例えば、ＧＭＢＳを用いる）またはハロアセチル化キャリアタンパク質（例えば、ヨードアセトイミド［例えば、エチルヨードアセトイミドＨＣｌ］またはＮ−スクシンイミジルブロモアセテートまたはＳＩＡＢ、またはＳＩＡ、またはＳＢＡＰを使用する）との反応後に得られるチオエーテル結合を介してキャリアに結合させることができるチオール化多糖を調製してもよい。好ましい実施形態では、シアン酸エステルは、ヘキサンジアミンまたはアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）と反応し、得られたアミノ誘導体化糖は、カルボジイミド（例えば、ＥＤＡＣまたはＥＤＣ）化学を用いて、キャリアタンパク質の遊離カルボキシ基にコンジュゲートする。そのようなコンジュゲート体は、国際特許出願公開第９３／１５７６０号、第９５／０８３４８号および第９６／２９０９４号、およびＣｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４０：２４５−２５６に記載されている。
【００６２】
他の適切なコンジュゲーション方法は、カルボジイミド、ヒドラジド、活性エステル、ノルボラン、ｐ−ニトロ安息香酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｓ−−ＮＨＳ、ＥＤＣ、ＴＳＴＵを用いる。多くは国際特許出願公開第９８／４２７２１号に記載されている。コンジュゲーションは、糖の遊離ヒドロキシル基とＣＤＩとを反応させ（Ｂｅｔｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４：２５７２−４、Ｈｅａｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．２１８：５０９−１８を参照）、その後キャリアタンパク質と反応させてカルバメート結合を形成することによって形成され得るカルボニルリンカーを含み得る。この化学反応は、炭水化物のアノマー末端を還元して第一級ヒドロキシル基を形成し、その後第一級ヒドロキシルとＣＤＩとを反応させてカルバメート中間体を形成し、続いてタンパク質キャリアアミノ基に結合することからなる。この反応には、糖の他の第一級ヒドロキシル基の任意の保護／脱保護を必要とする場合がある。
【００６３】
コンジュゲーション後、多糖タンパク質コンジュゲートを精製して、濃縮／透析ろ過操作、限外ろ過、沈殿／溶出、カラムクロマトグラフィー、および深層ろ過を含む当業者に周知の１または複数の技術によって、過剰なコンジュゲーション試薬、残留遊離タンパク質および遊離多糖を除去する。例えば、米国特許第６，１４６，９０２号を参照。
【００６４】
個々の複合糖質を精製した後、それらを混合して、本発明の免疫原性組成物を製剤化する。これらの肺炎球菌コンジュゲートは、別個のプロセスで調製され、単一投与製剤にバルク製剤化される。
【００６５】
医薬／ワクチン組成物
本発明は、上記の多糖血清型の組み合わせのいずれかを、薬学的に許容されるキャリアおよびアジュバントとともに含む、それらから本質的になる、あるいはそれらからなる、医薬、免疫原、およびワクチン組成物を含む組成物をさらに提供する。一実施形態では、組成物は、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、６Ｅ、６Ｇ、６Ｈ、７Ｆ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、８、９Ａ、９Ｌ、９Ｎ、９Ｖ、１０Ｆ、１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１１Ｆ、１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｄ、１１Ｅ、１２Ｆ、１２Ａ、１２Ｂ、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、または４４の異なる多糖タンパク質コンジュゲートを含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなり、各コンジュゲートは、第１のキャリアタンパク質または第２のキャリアタンパク質のいずれかにコンジュゲートした異なる莢膜多糖を含み、肺炎連鎖球菌の血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２１、２２Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、２７、２８Ａ、３１、３３Ｆ、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｆ、および３８の少なくとも１つに由来する莢膜多糖は、ＣＲＭ１９７から選択された第１のキャリアタンパク質にコンジュゲートしており、薬学的に許容されるキャリアおよびアジュバントとともに、（第１のキャリアタンパク質とは少なくとも１つのアミノ酸が異なる）第２のキャリアタンパク質にコンジュゲートした、血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２１、２２Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、２７、２８Ａ、３１、３３Ｆ、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｆ、および３８から選択された追加の肺炎連鎖球菌血清型を有していてもよい。
【００６６】
本発明の多糖タンパク質コンジュゲートの製剤化は、当該分野で認識されている方法を使用して達成することができる。例えば、１５の個々の肺炎球菌コンジュゲートは、組成物を調製するために生理学的に許容されるビヒクルとともに製剤化され得る。そのようなビヒクルの例としては、これらに限定されないが、水、緩衝生理食塩溶液、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）およびデキストロース溶液が挙げられる。
【００６７】
好ましい実施形態では、ワクチン組成物は、塩化ナトリウムを含むＬ−ヒスチジン緩衝液で製剤化される。
【００６８】
本明細書で定義されるように、「アジュバント」は、本発明の免疫原性組成物の免疫原性を高めるのに役立つ物質である。免疫アジュバントは、単独で投与した場合に免疫原性が弱い、例えば、抗体力価もしくは細胞性免疫応答を誘導しないかまたは弱い抗体力価もしくは細胞性免疫応答を誘導する、抗原に対する免疫応答を増強し、抗原に対する抗体力価を高め、および／または個人の免疫応答を達成するのに効果的な抗原の用量を下げる可能性がある。したがって、免疫応答を促進するためにアジュバントがしばしば投与され、当業者に周知である。組成物の有効性を高めるための適切なアジュバントとしては、
（１）アルミニウム塩（ミョウバン）、例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど、
（２）（ムラミルペプチド（以下に定義）または細菌細胞壁成分などの特定の免疫刺激剤を含むか、または含まない）水中油型エマルション製剤、例えば（ａ）Ｍｏｄｅｌ  １１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ社、ニュートン、マサチューセッツ州）などのマイクロフルイダイザーを使用してサブミクロン粒子に製剤化された、５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ  ８０、および０．５％Ｓｐａｎ  ８５（様々な量のＭＴＰ−ＰＥを含有してもよい）を含有するＭＦ５９（国際特許出願公開第９０／１４８３７号）、（ｂ）サブミクロンエマルションにマイクロ流動化されたか、または大きな粒径のエマルションを生成するためにボルテックスされた、１０％スクアレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ  ８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含有するＳＡＦ、（ｃ）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ  ８０、ならびに米国特許第４，９１２，０９４号に記載されている３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ（商標））、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ（商標））からなる群に由来する１または複数の細菌細胞壁成分を含有するＲｉｂｉ（商標）アジュバントシステム（ＲＡＳ）（Ｃｏｒｉｘａ社、ハミルトン、モンタナ州）、（ｄ）Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ、
（３）サポニンアジュバント、例えばＱｕｉｌ  ＡもしくはＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）ＱＳ−２１（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ社、フレーミングハム、マサチューセッツ州）（米国特許第５，０５７，５４０号を参照）が使用され得るか、またはそれらから生成される粒子、例えばＩＳＣＯＭ（コレステロール、サポニン、リン脂質、および両親媒性タンパク質の組み合わせによって形成される免疫刺激複合体）、Ｉｓｃｏｍａｔｒｉｘ（登録商標）（ＩＳＣＯＭと本質的に同じ構造を有するが、タンパク質を持たない）、
（４）Ｃｏｒｉｘａ社から入手可能であり、米国特許第６，１１３，９１８号に記載されている、細菌のリポ多糖、アミノアルキルグルコサミンフォスフェート化合物（ＡＧＰ）などの合成脂質Ａ類似体、またはそれらの誘導体もしくは類似体；そのようなＡＧＰの１つは、２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］エチル２−デオキシ−４−Ｏ−ホスホノ−３−Ｏ−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイル］−２−［（Ｒ）−３−−テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−ｂ−Ｄ−グルコピラノシドであり、これは５２９としても周知であり（以前はＲＣ５２９として周知）、水性形態または安定したエマルションとして製剤化される、
（５）合成ポリヌクレオチド、例えば（１または複数の）ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド（米国特許第６，２０７，６４６号）、ならびに
（６）サイトカイン、例えばインターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８など）、インターフェロン（例えば、ガンマインターフェロン）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、共刺激分子Ｂ７−１およびＢ７−２など、ならびに
（７）補体、例えば補体成分Ｃ３ｄの三量体
が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
別の実施形態では、アジュバントは、上記のアジュバントの２、３、またはそれ以上の混合物、例えば、ＳＢＡＳ２（３−脱アシル化モノホスホリルリピドＡおよびＱＳ２１も含む水中油型エマルション）である。
【００７０】
ムラミルペプチドとしては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
特定の実施形態では、アジュバントは、アルミニウム塩である。アルミニウム塩アジュバントは、ミョウバン沈殿ワクチンまたはミョウバン吸着ワクチンであり得る。一実施形態では、ワクチンは、アルミニウムアジュバントに予め吸収されている。アルミニウム塩アジュバントは、当技術分野で周知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ  Ｄ．Ｌａｎｅ（１９８８；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）およびＮｉｃｋｌａｓ，Ｗ．（１９９２；Ａｌｕｍｉｎｕｍ  ｓａｌｔｓ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４３：４８９−４９３）に記載されている。アルミニウム塩としては、水和アルミナ、アルミナ水和物、アルミナ三水和物（ＡＴＨ）、アルミニウム水和物、アルミニウム三水和物、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）、Ｓｕｐｅｒｆｏｓ、Ａｍｐｈｏｇｅｌ（登録商標）、水酸化アルミニウム（ＩＩＩ）、ヒドロキシリン酸硫酸アルミニウム（リン酸アルミニウムアジュバント（ＡＰＡ））、アモルファスアルミナ、三水和アルミナ、またはトリヒドロキシアルミニウムが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７２】
ＡＰＡは、ヒドロキシリン酸アルミニウムの水性懸濁液である。ＡＰＡは、塩化アルミニウムとリン酸ナトリウムとを１：１の体積比で混合して、ヒドロキシリン酸アルミニウムを沈殿させることにより製造する。混合プロセス後、材料のサイズを高せん断ミキサーで縮小して、単分散の粒度分布を実現する。次に、生成物を生理食塩溶液に対して透析ろ過し、蒸気滅菌する。
【００７３】
特定の実施形態では、市販のＡｌ（ＯＨ）３（例えば、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）またはＳｕｐｅｒｆｏｓ、Ｄｅｎｍａｒｋ／Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏ．社、ウェストベリー、ニューヨーク州）を使用して、水酸化アルミニウム１ｍｇ当たりタンパク質５０〜１０００μｇの比でタンパク質を吸着する。タンパク質の吸着は、別の実施形態では、タンパク質のｐＩ（等電ｐＨ）および培地のｐＨに依存する。ｐＩが低いタンパク質は、ｐＩが高いタンパク質よりも、正に帯電したアルミニウムイオンに強く吸着する。アルミニウム塩は、２〜３週間かけてゆっくりと放出されるＡｇの貯蔵部を確立し、マクロファージの非特異的活性化および補体活性化に関与し、および／または（おそらく尿酸の刺激により）自然免疫機構を刺激することができる。例えば、Ｌａｍｂｒｅｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２１：２３を参照。
【００７４】
一価のバルク水性コンジュゲートは通常、一緒に混合され、希釈される。希釈したら、バッチを滅菌ろ過する。リン酸アルミニウムアジュバントを無菌的に添加して、６Ｂを除くすべての血清型の最終濃度が４μｇ／ｍＬ、および最終アルミニウム濃度が２５０μｇ／ｍＬとなるようにし、６Ｂは８μｇ／ｍＬとなるように希釈する。アジュバント化された製剤バッチは、バイアルまたはシリンジに充填される。
【００７５】
特定の実施形態では、アジュバントは、ＣｐＧ含有ヌクレオチド配列、例えば、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、特にＣｐＧ含有オリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）である。別の実施形態では、アジュバントはＯＤＮ  １８２６であり、Ｃｏｌｅｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｇｒｏｕｐ社から入手することができる。
【００７６】
「ＣｐＧ含有ヌクレオチド」、「ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド」、「ＣｐＧオリゴヌクレオチド」、および同様の用語は、非メチル化ＣｐＧ部分を含む長さ６〜５０ヌクレオチドのヌクレオチド分子を指す。例えば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２１：４２９７を参照。別の実施形態では、この用語の他の技術的に受け入れられた定義が意図されている。ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドとしては、合成ヌクレオシド間結合、修飾塩基および／または修飾糖を用いる修飾オリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００７７】
ＣｐＧオリゴヌクレオチドの使用方法は、当技術分野で周知であり、例えば、Ｓｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：６２８４−９３、Ｖｅｒｔｈｅｌｙｉ，２００６，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．１２７：１３９−５８、およびＹａｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｔｈｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．２３：８９−１１０に記載されている。
【００７８】
投与／投与量
本発明の組成物および製剤は、全身または粘膜経路を介してワクチンを投与することにより、感染症、例えば肺炎球菌感染症にかかりやすいヒトを保護または治療するために使用することができる。一実施形態では、本発明は、本発明の免疫原性組成物の免疫学的有効量をヒトに投与することを含む、肺炎連鎖球菌莢膜多糖コンジュゲートに対する免疫応答を誘導する方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、本発明の免疫原性組成物の免疫原的有効量をヒトに投与する工程を含む、ヒトに肺炎球菌感染症のワクチン接種をする方法を提供する。
【００７９】
特定のワクチンの成分の最適量は、対象の適切な免疫応答の観察を含む標準的な研究によって確認することができる。例えば、別の実施形態では、ヒトのワクチン接種の用量は、動物研究からヒトデータへの外挿により決定される。別の実施形態では、投与量は、経験的に決定される。実施例で提供される乳児アカゲザルの動物データは、ワクチンが免疫原性であることを示している。
【００８０】
本発明の組成物の「有効量」とは、抗原が持続している間に、微生物、例えば肺炎連鎖球菌の感染性の可能性または重症度を有意に低下させる抗体を誘発するのに必要な用量を指す。
【００８１】
本発明の方法は、侵襲性感染症（髄膜炎、肺炎および菌血症）および非侵襲性感染症（急性中耳炎および副鼻腔炎）の両方を含む、例えば肺炎連鎖球菌などの微生物によって引き起こされる原発性臨床症候群の予防および／または軽減に使用することができる。
【００８２】
本発明の組成物の投与には、筋肉内、腹腔内、皮内もしくは皮下経路を介した注射、または口腔／消化管、呼吸器もしくは泌尿生殖器への粘膜投与の１または複数が含まれ得る。一実施形態では、鼻腔内投与は、（肺炎球菌の鼻咽頭保菌がより効果的に防止され、したがってその初期段階で感染が軽減されるため）肺炎または中耳炎の治療に使用される。
【００８３】
各ワクチン用量中のコンジュゲートの量は、重大な悪影響なしに免疫防御反応を誘発する量として選択される。そのような量は、肺炎球菌の血清型によって異なり得る。一般に、多糖ベースのコンジュゲートの場合、各用量は各多糖を０．１〜１００μｇ、特に０．１〜１０μｇ、とりわけ１〜５μｇ含む。例えば、各用量は、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、もしくは７５０ｎｇ、または１、１．５、２、３、４、５、６、７、７．５、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００μｇを含み得る。
【００８４】
特定のワクチンの成分の最適量は、対象の適切な免疫応答の観察を含む標準的な研究によって確認することができる。例えば、別の実施形態では、ヒトのワクチン接種の用量は、動物研究からヒトデータへの外挿により決定される。別の実施形態では、投与量は、経験的に決定される。
【００８５】
一実施形態では、アルミニウム塩の用量は、１０、１５、２０、２５、３０、５０、７０、１００、１２５、１５０、２００、３００、５００、もしくは７００μｇ、または１、１．２、１．５、２、３、５ｍｇ以上である。さらに別の実施形態では、上記のアルミニウム塩の用量は、組換えタンパク質１μｇ当たりである。
【００８６】
本発明の特定の実施形態では、ＰＣＶ１５ワクチンは、ＣＲＭ１９７に個別にコンジュゲートされた血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆの肺炎球菌莢膜多糖の無菌製剤である。一態様では、各用量は、６Ｂが８μｇ／ｍＬまたは１６μｇ／ｍＬであることを除いて、各糖を４μｇ／ｍＬまたは８μｇ／ｍＬ、およびＣＲＭ１９７キャリアタンパク質を約６４μｇ／ｍＬまたは１２８μｇ／ｍＬ含むように製剤化される。一態様では、各用量０．５ｍＬは、６Ｂが４μｇであることを除いて、各糖を２μｇ；ＣＲＭ１９７キャリアタンパク質を約３２μｇ（例えば、３２μｇ±５μｇ、±３μｇ、±２μｇ、または±１μｇ）、元素アルミニウム（リン酸アルミニウム０．５ｍｇ）アジュバントを０．１２５ｍｇ；ならびに塩化ナトリウムおよびＬ−ヒスチジン緩衝液を含むように製剤化される。塩化ナトリウム濃度は、約１５０ｍＭ（例えば、１５０ｍＭ±２５ｍＭ、±２０ｍＭ、±１５ｍＭ、±１０ｍＭ、または±５ｍＭ）および約２０ｍＭ（例えば、２０ｍＭ±５  ｍＭ、±２．５ｍＭ、±２ｍＭ、±１ｍＭ、または±０．５ｍＭ）のＬ−ヒスチジン緩衝液である。
【００８７】
本発明の方法のいずれかによれば、および一実施形態では、対象はヒトである。特定の実施形態では、ヒト対象は、乳児（１歳未満）、幼児（約１２〜２４ヶ月）、または幼児（約２〜５歳）である。他の実施形態では、ヒト対象は、高齢患者（６５歳を超える）である。本発明の組成物は、年長の子供、青年および成人（例えば、１８〜４５歳または１８〜６５歳）への使用にも適している。
【００８８】
本発明の方法の一実施形態では、本発明の組成物は、単回接種として投与される。別の実施形態では、ワクチンは、適切な間隔をおいて、２回、３回または４回以上投与される。例えば、組成物は、１、２、３、４、５、または６ヶ月間隔で、またはそれらの任意の組み合わせで投与され得る。免疫付与スケジュールは、肺炎球菌ワクチン用に指定されたスケジュールに従うことができる。例えば、肺炎連鎖球菌によって引き起こされる侵襲性疾患に対する乳幼児の定期スケジュールは、生後２、４、６、および１２〜１５ヶ月である。したがって、好ましい実施形態では、組成物は、生後２、４、６、および１２〜１５ヶ月の４回を一連の投与として投与される。
【００８９】
本発明の組成物は、肺炎連鎖球菌由来の１または複数のタンパク質も含み得る。含むのに適した肺炎連鎖球菌タンパク質の例としては、国際特許出願公開第０２／０８３８５５号および第０２／０５３７６１号で特定されたタンパク質が挙げられる。
【００９０】
製剤
本発明の組成物は、非経口、経粘膜、経皮、筋肉内、静脈内、皮内、鼻腔内、皮下、腹腔内などの当業者に既知の１または複数の方法によって対象に投与することができ、それに応じて製剤化できる。
【００９１】
一実施形態では、本発明の組成物は、液体製剤の表皮注射、筋肉内注射、静脈内、動脈内、皮下注射、または呼吸器内粘膜注射を介して投与される。注射用の液体製剤には、溶液などが含まれる。本発明の組成物は、単回投与バイアル、複数回投与バイアル、または事前充填シリンジとして製剤化することができる。
【００９２】
別の実施形態では、本発明の組成物は経口投与され、したがって、経口投与に適した形態で、すなわち、固体または液体製剤として製剤化される。固体経口製剤としては、錠剤、カプセル、丸薬、顆粒、ペレットなどが挙げられる。液体経口製剤としては、溶液、懸濁液、分散液、エマルション、油などが挙げられる。
【００９３】
本発明の一態様では、製剤は、凍結乾燥、凍結、マイクロ波乾燥によって、またはリオスフェアの生成によって調製された固体乾燥製剤である。製剤は、−７０℃、−２０℃、２〜８℃、または室温で保管できる。乾燥製剤は、単位用量バイアル内の成分の重量で表すことができるが、これは用量の違いまたはバイアルのサイズによって異なる。あるいは、本発明の乾燥製剤は、同じサンプル（例えば、バイアル）中の原薬（ＤＳ）の重量と比較した成分の重量の比として、成分の量で表すことができる。この比は、百分率で表される。そのような比は、バイアルのサイズ、投与量、および再構成プロトコルに関係なく、本発明の乾燥製剤の固有の特性を反映している。一実施形態では、製剤のｄ（０．５）μｍは、２０、１５、１０、または５μｍ未満である。他の実施形態では、製剤は、リオスフェア内にある。
【００９４】
本発明の別の態様では、製剤は、再構成された溶液である。乾燥固形製剤は、投与経路や投与量などの臨床的要因に応じて、異なる濃度で再構成することができる。例えば、乾燥製剤は、皮下投与に必要な場合、高濃度で（すなわち、少量で）再構成され得る。特定の対象に高用量が必要な場合、特に注射量を最小限に抑えなければならない皮下投与の場合、高濃度が必要になる場合もある。その後、水または等張緩衝液による希釈を使用して、製剤をより低い濃度に容易に希釈することができる。より低い製剤濃度で等張性が望ましい場合、乾燥粉末を標準的な低容量の水で再構成し、０．９％塩化ナトリウムなどの等張性希釈剤でさらに希釈することができる。
【００９５】
再構成は一般に、完全に水和させるために約２５℃の温度で行われるが、必要に応じて他の温度を使用することもできる。再構成に必要な時間は、例えば、希釈剤の種類、（１または複数の）賦形剤の量、およびタンパク質に依存する。例示的な希釈剤としては、滅菌水、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩溶液）、滅菌生理食塩溶液、リンゲル液またはデキストロース溶液が挙げられる。再構成体積は、約０．５〜１．０ｍｌ、好ましくは０．５ｍｌまたは０．７ｍｌであり得る。
【００９６】
本発明の別の実施形態では、製剤は、凍結乾燥、凍結、マイクロ波乾燥、またはリオスフェアの生成の前に調製された水溶液である。
【００９７】
医薬組成物は、等張性、低張性または高張性であり得る。しかしながら、注入または注射用の医薬組成物は、投与される場合、本質的に等張性であることがしばしば好ましい。したがって、保管のために、医薬組成物は、好ましくは等張性または高張性であり得る。医薬組成物が保管のために高張性である場合、投与前に希釈して等張液にすることができる。
【００９８】
等張剤は、塩などのイオン性等張剤または炭水化物などの非イオン性等張剤であり得る。イオン性等張剤の例としては、ＮａＣｌ、ＣａＣｌ２、ＫＣｌおよびＭｇＣｌ２が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９９】
少なくとも１つの薬学的に許容される添加剤が緩衝液であることも好ましい。いくつかの目的のために、例えば、医薬組成物の注入または注射が意図される場合、組成物は、溶液を４〜１０の範囲、例えば５〜９、例えば６〜８のｐＨに緩衝することができる緩衝液を含むことが望ましい場合が多い。
【０１００】
緩衝液は、例えば、トリス、アセテート、グルタメート、ラクテート、マレエート、タルトレート、ホスフェート、シトレート、カルボネート、グリシネート、Ｌ−ヒスチジン、グリシン、スクシネートおよびトリエタノールアミン緩衝液からなる群から選択され得る。
【０１０１】
緩衝液はさらに、例えば、特に医薬製剤が非経口使用用である場合、非経口使用用のＵＳＰ適合緩衝液から選択され得る。例えば、緩衝液は、一塩基酸、例えば酢酸、安息香酸、グルコン酸、グリセリン酸および乳酸；二塩基酸、例えばアコニット酸、アジピン酸、アスコルビン酸、炭酸、グルタミン酸、リンゴ酸、コハク酸および酒石酸、多塩基酸、例えばクエン酸およびリン酸；塩基、例えばアンモニア、ジエタノールアミン、グリシン、トリエタノールアミン、トリスからなる群から選択され得る。
【０１０２】
非経口ビヒクル（皮下、静脈内、動脈内、または筋肉内注射用）としては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液および固定油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、液体補給剤および栄養補給剤、リンゲルデキストロースに基づくものなどの電解質補給剤などが挙げられる。例としては、界面活性剤および他の薬学的に許容されるアジュバントの添加を伴うかまたは伴わない、水および油などの滅菌液体である。一般に、水、生理食塩溶液、デキストロース水溶液および関連糖溶液、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどのグリコール、ポリソルベート８０（ＰＳ−８０）、ポリソルベート２０（ＰＳ−２０）、ならびにポロキサマー１８８（Ｐ１８８）が、特に注射剤のために好ましい液体キャリアである。油の例としては、動物、植物、または合成起源の油、例えば、落花生油、大豆油、オリーブ油、ヒマワリ油、魚肝油、別の海産油、または牛乳もしくは卵からの脂質である。
【０１０３】
本発明の製剤はまた、界面活性剤を含有してもよい。好ましい界面活性剤としては、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般にＴｗｅｅｎと呼ばれる）、特にＰＳ−２０およびＰＳ−８０；ＤＯＷＦＡＸ（商標）の商品名で販売されているエチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）、および／またはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー、例えば直鎖ＥＯ／ＰＯブロックコポリマー；エトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の反復数が変動し得る、特に着目されるオクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）を有するオクトキシノール；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；リン脂質、例えばホスファチジルコリン（レシチン）；ノニルフェノールエトキシレート、例えばＴｅｒｇｉｔｏｌ（商標）ＮＰシリーズ；ラウリル、セチル、ステアリルおよびオレイルアルコール（Ｂｒｉｊ界面活性剤として知られる）から誘導されたポリオキシエチレン脂肪エーテル、例えばトリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ  ３０）；ならびにソルビタンエステル（一般にＳＰＡＮとして知られている）、例えばソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ  ８５）およびソルビタンモノラウレートが挙げられるが、これらに限定されない。エマルションに含めるのに好ましい界面活性剤は、ＰＳ−８０である。
【０１０４】
界面活性剤の混合物、例えばＰＳ−８０／Ｓｐａｎ  ８５混合物を使用することができる。ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ＰＳ−８０）などのポリオキシエチレンソルビタンエステルとｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）などのオクトキシノールとの組み合わせも適している。別の有用な組み合わせは、ラウレス９にポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキシノールである。
【０１０５】
界面活性剤の好ましい量は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（例えば、ＰＳ−８０）０．０１〜１％ｗ／ｖ、特に約０．１％ｗ／ｖ；オクチルまたはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、またはＴｒｉｔｏｎシリーズの他の界面活性剤）０．００１〜０．１％ｗ／ｖ、特に０．００５〜０．０２％ｗ／ｖ；ポリオキシエチレンエーテル（例えば、ラウレス９）０．１〜２０％ｗ／ｖ、好ましくは０．１〜１０％ｗ／ｖ、特に０．１〜１％ｗ／ｖまたは約０．５％ｗ／ｖである。
【０１０６】
特定の実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート２０（ＩＵＰＡＣ名：ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート；ＰＳ−２０）であり、一般にＴｗｅｅｎ（登録商標）２０と呼ばれる市販の界面活性剤である。特定の実施形態では、本発明の製剤中のポリソルベート２０の最終濃度は、０．００１％〜１０％ｗ／ｖ、０．０２５％〜２．５％ｗ／ｖ、０．１％〜０．２％ｗ／ｖまたは０．０２５％〜０．１％ｗ／ｖの範囲である。
【０１０７】
特定の実施形態において、界面活性剤は、分子量が１１００Ｄａ〜１７，４００Ｄａの範囲のポロキサマーである。
【０１０８】
ポロキサマーは、ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２つの親水性鎖が側面に配置されたポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中心疎水性鎖から構成される非イオン性トリブロックコポリマーである。ポロキサマーは、商品名Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）でも知られている。ポリマーブロックの長さはカスタマイズできるため、特性がわずかに異なる多くの異なるポロキサマーが存在する。総称名「ポロキサマー」では、これらのコポリマーは、一般に文字「Ｐ」（ポロキサマーを指す）とそれに続く３つの数字で命名し、最初の２つの数字×１００はポリオキシプロピレンコアのおおよその分子量を示し、最後の数字×１０は、ポリオキシエチレン含量率を示している（例えば、Ｐ４０７は、ポリオキシプロピレンの分子量が４，０００ｇ／ｍｏｌ、ポリオキシエチレン含量が７０％のポロキサマーである）。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）の商品名では、これらのコポリマーのコーディングは、室温での物理的形状を定義する文字（Ｌ＝液体、Ｐ＝ペースト、Ｆ＝フレーク（固体））で始まり、２または３つの数字が続く。数値表記の最初の数字（３桁の数字では２つの数字）に３００を掛けた値は、疎水性物質のおおよその分子量を示し、最後の数字ｘ１０は、ポリオキシエチレン含有率を示している（例えば、Ｌ６１は、ポリオキシプロピレンの分子量が１，８００ｇ／ｍｏｌ、ポリオキシエチレン含有量が１０％のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）である）。米国特許第３，７４０，４２１号を参照。
【０１０９】
ポロキサマーの例は、一般式：
ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａＨ
を有し、式中、ａおよびｂブロックの値は次のとおりである。
【０１１０】
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）  ポロキサマー  ａ  ｂ            分子量
Ｌ３１                                      ２  １６  １１００（平均）
Ｌ３５                                                １９００（平均）
Ｌ４４ＮＦ                    １２４      １２  ２０  ２０９０〜２３６０
Ｌ６４                                                ２９００（平均）
Ｌ８１                                                ２８００（平均）
Ｌ１２１                                              ４４００（平均）
Ｐ１２３                                  ２０  ７０  ５７５０（平均）
Ｆ６８ＮＦ                  １８８        ８０  ２７  ７６８０〜９５１０
Ｆ８７ＮＦ                  ２３７        ６４  ３７  ６８４０〜８８３０
Ｆ１０８ＮＦ                ３３８      １４１  ４４  １２７００〜１７４００
Ｆ１２７ＮＦ                ４０７      １０１  ５６  ９８４０〜１４６００
本明細書で使用される場合、分子量単位は、ダルトン（Ｄａ）またはｇ／ｍｏｌである。
【０１１１】
製剤の場合、ポロキサマーの分子量は、一般に、１１００Ｄａ〜１７，４００Ｄａ、７，５００Ｄａ〜１５，０００Ｄａ、または７，５００Ｄａ〜１０，０００Ｄａの範囲である。ポロキサマーは、ポロキサマー１８８またはポロキサマー４０７から選択することができる。本発明の製剤中のポロキサマーの最終濃度は、０．００１〜５％ｗ／ｖ、または０．０２５〜１％ｗ／ｖである。
【０１１２】
製剤に適したポリマーは、ポリマーポリオール、特に、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールモノメチルエーテルを含むがこれらに限定されないポリエーテルジオールである。プロピレングリコールは、モノマーの分子量が約４２５〜約２７００の範囲で入手できる。ポリエチレングリコールおよびポリエチレングリコールモノメチルエーテルも、分子量が約２００〜約３５０００の範囲で入手可能であり、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ  ＭＭＥ  ５５０、ＰＥＧ  ＭＭＥ  ６００、ＰＥＧ  ＭＭＥ  ２０００、ＰＥＧ  ＭＭＥ  ３３５０およびＰＥＧ  ＭＭＥ  ４０００を含むがこれらに限定されない。好ましいポリエチレングリコールは、ポリエチレングリコール４００である。本発明の製剤中のポリマーの最終濃度は、１〜２０％ｗ／ｖまたは６〜２０％ｗ／ｖであり得る。
【０１１３】
製剤には、ｐＨ緩衝生理食塩溶液も含まれている。緩衝液は、例えば、トリス、アセテート、グルタメート、ラクテート、マレエート、タルトレート、ホスフェート、シトレート、カルボネート、グリシネート、Ｌ−ヒスチジン、グリシン、スクシネート、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）およびトリエタノールアミン緩衝液からなる群から選択され得る。緩衝液は、溶液を４〜１０、５．２〜７．５、または５．８〜７．０の範囲のｐＨに緩衝することができる。本発明の特定の態様では、緩衝液は、ホスフェート、スクシネート、Ｌ−ヒスチジン、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、アセテートまたはシトレートからなる群から選択され得る。緩衝液はさらに、例えば、特に医薬製剤が非経口使用用である場合、非経口使用用のＵＳＰ適合緩衝液から選択され得る。緩衝液の濃度は、１ｍＭ〜５０ｍＭまたは５ｍＭ〜５０ｍＭの範囲である。特定の態様では、緩衝液は、最終濃度が５ｍＭ〜５０ｍＭのＬ−ヒスチジン、または最終濃度が１ｍＭ〜１０ｍＭのスクシネートである。特定の態様では、Ｌ−ヒスチジンの最終濃度は、２０ｍＭ±２ｍＭである。
【０１１４】
生理食塩溶液（すなわち、ＮａＣｌを含む溶液）が好ましいが、製剤に適した他の塩としては、これらに限定されないが、ＣａＣｌ２、ＫＣｌおよびＭｇＣｌ２、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。適切な塩の範囲には、２５ｍＭ〜５００ｍＭまたは４０ｍＭ〜１７０ｍＭが含まれるが、これらに限定されない。一態様では、生理食塩溶液はＮａＣｌであり、２０ｍＭ〜１７０ｍＭの濃度で存在してもよい。好ましい実施形態では、製剤は、塩化ナトリウムを含むＬ−ヒスチジン緩衝液を含む。
【０１１５】
本明細書に記載の製剤の特定の実施形態では、多糖タンパク質コンジュゲートは、キャリアタンパク質にコンジュゲートされた１または複数の肺炎球菌多糖を含む。キャリアタンパク質は、ＣＲＭ１９７、ジフテリア毒素フラグメントＢ（ＤＴＦＢ）、ＤＴＦＢＣ８、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ＴＴのフラグメントＣ、百日咳トキソイド、コレラトキソイド、大腸菌ＬＴ、大腸菌ＳＴ、緑膿菌の外毒素Ａ、およびそれらの組み合わせから選択され得る。特定の態様では、１または複数の多糖タンパク質コンジュゲートは、ＤＴＦＢにコンジュゲートされている。一態様では、すべての多糖タンパク質コンジュゲートは、水性化学を使用して調製される。一例として、多糖タンパク質コンジュゲート製剤は、ＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートされている血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆに由来する肺炎連鎖球菌多糖から本質的になる１５価肺炎球菌コンジュゲート（１５ｖＰｎＣ）製剤であり得る。別の態様では、ＤＭＳＯ化学を使用して、１または複数の多糖タンパク質コンジュゲートが調製される。例として、多糖タンパク質コンジュゲート製剤は、１５価肺炎球菌コンジュゲート（１５ｖＰｎＣ）製剤であり得、血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、および２３Ｆに由来する多糖タンパク質コンジュゲートは、ＤＭＳＯ化学を使用して調製され、血清型１、３、４、５、９Ｖ、１４、２２Ｆ、および３３Ｆに由来する多糖タンパク質は、水性化学を使用して調製される。
【０１１６】
別の実施形態では、医薬組成物は、制御された放出システムで送達される。例えば、薬剤は、静脈内注入、経皮パッチ、リポソーム、または他の投与方法を使用して投与することができる。別の実施形態では、ポリマー材料が、例えばマイクロスフェアまたはインプラントに使用される。
【０１１７】
本発明の組成物は、肺炎連鎖球菌由来の１または複数のタンパク質も含み得る。含むのに適した肺炎連鎖球菌タンパク質の例としては、国際特許出願公開第０２／０８３８５５号および第０２／０５３７６１号で特定されたタンパク質が挙げられる。
【０１１８】
リオスフェアの調整方法
いくつかの実施形態では、水性媒体混合物を含む単一体積を、空洞を有する固体要素上に形成する。固体要素を混合物の凍結温度未満に冷却し、空洞を混合物で満たし、混合物を空洞内に存在する間に固化させて単一形態を形成する。単一形態を真空中で乾燥させて、リオスフェアを得る。その開示が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，１１９，７９４号は、リオスフェアを形成するための同様の方法を開示している。
【０１１９】
他の実施形態では、リオスフェアは、実質的に球形に形成され、所望の生物学的材料の液体組成物の液滴を、平らな固体表面、特に空洞のない表面で凍結させ、その後単一形態を凍結乾燥することにより調製される。その開示が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１４／０２９４８７２号は、リオスフェアを形成するための同様の方法を開示している。
【０１２０】
簡単に言うと、いくつかの実施形態では、この方法は、実質的に球形の少なくとも１つの液滴を固体平面（すなわち、サンプルウェルまたは空洞がない）に分注し、液滴を低温物質と接触させることなく表面で凍結させる工程と、凍結した液滴を凍結乾燥して実質的に球形の乾燥ペレットを生成する工程とを含む。この方法を高処理モードで使用して、固体平面に所望の数の液滴を同時に分注し、液滴を凍結して、凍結した液滴を凍結乾燥することにより、複数の乾燥ペレットを調製することができる。この方法によって液体製剤から調製されたペレットは、高濃度の生物学的材料（タンパク質治療薬など）を含む場合があり、一式の乾燥ペレットに結合され得る。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、固体平面は、金属板の上面を−９０℃以下の温度に維持するように適合されたヒートシンクと物理的に接触する底面を備える金属板の上面である。金属板の上面は、液体製剤の凝固点を優に下回るため、液滴の底面が金属板の上面に触れると、液滴は本質的に瞬時に凍結する。
【０１２２】
他の実施形態では、固体平面は疎水性であり、分注工程中に０℃超に維持される薄膜の上面を備える。製剤の凍結温度より低い温度まで薄膜を冷却することにより、分注した液滴を凍結させる。
【０１２３】
凍結乾燥方法
本発明の凍結乾燥製剤は、予備凍結乾燥溶液の凍結乾燥（フリーズドライ）により形成される。凍結乾燥は、製剤を凍結し、その後、一次乾燥に適した温度で水を昇華させることにより達成される。この条件下では、生成物の温度は、製剤の共晶点または崩壊温度を下回る。通常、一次乾燥の棚温度は、典型的には約３０〜２５０ｍＴｏｒｒの範囲の適切な圧力で、（一次乾燥中に生成物が凍結したままであれば）約−５０〜２５℃の範囲である。製剤、サンプルを保持する容器（例えば、ガラスバイアル）のサイズおよび種類、ならびに液体の量によって、乾燥に必要な時間が決まるが、必要な時間は、数時間から数日（例えば、４０〜６０時間）の範囲であり得る。主に容器の種類およびサイズ、ならびに使用するタンパク質の種類に応じて、二次乾燥段階は、約０〜４０℃で実施され得る。二次乾燥時間は、所望の生成物内の残留水分レベルによって決まり、典型的には、少なくとも約５時間かかる。典型的には、凍結乾燥製剤の水分含量は、約５％未満、好ましくは約３％未満である。圧力は、一次乾燥工程中に使用される圧力と同じであり得る。凍結乾燥条件は、製剤、バイアルサイズおよび凍結乾燥トレイによって異なり得る。
【０１２４】
場合によっては、移動工程を回避するために、再構成が行われる容器内で、タンパク質多糖製剤を凍結乾燥またはマイクロ波乾燥することが望ましい場合がある。この場合、容器は、例えば、２、３、５、１０または２０ｍｌバイアルである。
【０１２５】
添付の説明および図面を参照して本発明の様々な実施形態を説明したが、本発明はそれらの正確な実施形態に限定されず、添付の特許請求の範囲で定義される本発明の範囲または精神から逸脱することなく、様々な変更および修正が当業者によってもたらされ得ることを理解されたい。
【０１２６】
以下の実施例は、本発明を例示するものであり、限定するものではない。
【０１２７】
［実施例］
［実施例１］
肺炎連鎖球菌莢膜多糖の調製
肺炎球菌を培養する方法は、当技術分野で周知である。例えば、Ｃｈａｓｅ，１９６７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １：５２を参照。肺炎球菌莢膜多糖を調製する方法も当技術分野で周知である。例えば、欧州特許第０４９７５２４号を参照。肺炎球菌の亜型の分離株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（マナサス、バージニア州）から入手することができる。この細菌は、カプセル化された非運動性のグラム陽性ランセット型双球菌であり、血液寒天上でアルファ溶血性であると同定されている。亜型は、特定の抗血清を使用したクウェリング（Ｑｕｅｌｌｉｎｇ）反応に基づいて区別することができる。例えば、米国特許第５，８４７，１１２号を参照。
【０１２８】
対象の肺炎連鎖球菌血清型の各々を表す細胞バンクは、凍結バイアルで、Ｍｅｒｃｋ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ラーウェイ、ニュージャージー州）から入手した。解凍した種培養物を、肺炎連鎖球菌に適した滅菌済みの増殖培地を含む種発酵槽に移した。培養物は、温度およびｐＨを制御して種発酵槽で成育した。種発酵槽の全容積を、滅菌済みの増殖培地を含む生産発酵槽に移した。生産発酵は、本プロセスの最後の細胞増殖段階であった。温度、ｐＨ、および撹拌速度を制御した。
【０１２９】
発酵プロセスは、不活化剤の添加により終了させた。不活化後、バッチを不活化タンクに移し、そこで温度および撹拌を制御して保持した。遠心分離とろ過との組み合わせを用いて、細胞片を除去した。バッチを限外ろ過および透析ろ過した。次いで、バッチを溶媒ベースの分別にかけ、不純物を除去して多糖を回収した。
【０１３０】
［実施例２］
水溶液中の還元的アミノ化を用いたＣＲＭ１９７への血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆのコンジュゲーション
異なる血清型多糖は、共通のプロセスフローを使用して、精製されたＣＲＭ１９７キャリアタンパク質に個別にコンジュゲートした。多糖を溶解し、サイズを縮小し、化学的に活性化し、限外ろ過により緩衝液交換を行った。次いで、精製したＣＲＭ１９７を、反応混合物中のＮｉＣｌ２（２ｍＭ）を利用して活性化多糖にコンジュゲートし、得られたコンジュゲートを、最終の０．２ミクロンろ過の前に限外ろ過により精製した。ｐＨ、温度、濃度、および時間など、各工程内のいくつかのプロセスパラメータは、以下のセクションで血清型固有の値に制御した。
【０１３１】
多糖のサイズの縮小と酸化
精製した肺炎球菌莢膜多糖粉末を水に溶解し、血清型１９Ａを除くすべての血清型を０．４５ミクロンろ過した。血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆを均一化して、多糖の分子量を減少させた。血清型１８Ｃは、９０℃以上で均一化または酸加水分解することによりサイズを縮小した。血清型１９Ａは、開始サイズが比較的小さいため、サイズは縮小されなかった。ホモジナイザーによる均一化圧力およびパス数は、血清型固有の分子量を達成するために、血清型固有の目標値（１５０〜１０００ｂａｒ、４〜７パス）に制御した。サイズが縮小された多糖を０．２ミクロンでろ過し、次いで、１０ｋＤａ  ＮＭＷＣＯの接線流限外ろ過膜を使用して、濃縮および水に対して透析ろ過した。５ｋＤａ  ＮＭＷＣＯの膜を、酸加水分解した血清型１８Ｃに使用した。
【０１３２】
次いで、多糖溶液を酢酸ナトリウム緩衝液を用いて血清型固有の温度（４〜２２℃）およびｐＨ（４〜５）に調整し、活性化による多糖のサイズの減少を最小限に抑えた。すべての血清型（血清型４を除く）において、１００ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加により多糖の活性化を開始させた。添加したメタ過ヨウ素酸ナトリウムの量は、血清型固有であり、多糖反復単位１モル当たりのメタ過ヨウ素酸ナトリウムは約０．１〜０．５モルの範囲であった。血清型固有のメタ過ヨウ素酸ナトリウムの役割は、多糖活性化の目標レベル（多糖反復単位１モル当たりのアルデヒドのモル値）を達成することであった。血清型４では、メタ過ヨウ素酸ナトリウムを添加する前に、バッチを約５０℃およびｐＨ４．１でインキュベートして、多糖を部分的に脱ケタール化した。
【０１３３】
血清型５および７Ｆを除くすべての血清型では、１０ｋＤａ  ＮＭＷＣＯの接線流限外ろ過膜を使用して、活性化した生成物を１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．４に対して透析ろ過した。５ｋＤａ  ＮＭＷＣＯの膜を、酸加水分解した血清型１８Ｃに使用した。血清型５および７Ｆは、１０ｍＭ酢酸ナトリウムに対して透析ろ過した。すべての血清型の限外ろ過は、２〜８℃で実施した。
【０１３４】
ＣＲＭ１９７への多糖のコンジュゲーション
血清型に応じて、酸化多糖溶液を水および１．５Ｍリン酸カリウム、ｐＨ６．０またはｐＨ７．０と混合した。選択した緩衝液のｐＨは、コンジュゲーション反応中の活性化多糖の安定性を改善するためのものであった。前述のような蛍光菌での発現により得られた精製ＣＲＭ１９７（国際特許出願公開第２０１２／１７３８７６Ａ１号を参照）を０．２ミクロンろ過し、血清型に応じて、多糖対ＣＲＭ１９７の質量比が０．４〜１．０ｗ／ｖの範囲の緩衝多糖溶液と結合させた。得られたコンジュゲートの多糖対ＣＲＭ１９７の比を制御するために、質量比を選択した。多糖およびリン酸濃度は、血清型固有であり、血清型に応じてそれぞれ、３．６〜１０．０ｇ／Ｌおよび１００〜１５０ｍＭの範囲であった。血清型固有の多糖濃度は、得られるコンジュゲートのサイズを制御するために選択した。次いで、溶液を０．２ミクロンろ過した。１００ｍＭ塩化ニッケル溶液を使用して、約２ｍＭになるまで塩化ニッケルを加えた。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり２モル）を加えた。多糖およびタンパク質の消費を最大化するために、血清型固有の期間（７２〜１２０時間）コンジュゲーションを進めた。
【０１３５】
酸加水分解血清型１８Ｃを、それぞれ約１２．０ｇ／Ｌおよび６．０ｇ／Ｌの多糖およびタンパク質濃度を使用して、約ｐＨ８の１００ｍＭリン酸カリウム中、３７℃でシアノ水素化ホウ素ナトリウムとコンジュゲートした。
【０１３６】
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
コンジュゲーション反応後、バッチを約３．５ｇ／Ｌの多糖濃度に希釈し、２〜８℃に冷却し、１．２ミクロンろ過した。すべての血清型（血清型５を除く）は、１００ｋＤａ  ＮＭＷＣＯの接線流限外ろ過膜を使用して、２〜８℃で１００ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．０に対して透析ろ過した。残渣物中に回収されたバッチは、その後、約２．０ｇ／Ｌ多糖に希釈し、１．２Ｍ炭酸水素ナトリウム、ｐＨ９．４の添加によりｐＨ調整した。水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり１モル）を添加した。１．５Ｍリン酸カリウム、ｐＨ６．０を後で添加した。血清型５は、１００ｋＤａ  ＮＭＷＣＯの接線流限外ろ過膜を使用して、３００ｍＭリン酸カリウムに対して透析ろ過した。
【０１３７】
最終ろ過および製品保管
次いで、バッチを濃縮し、３００ｋＤａ  ＮＭＷＣＯの接線流限外ろ過膜を使用して、４℃で、１５０ｍＭ塩化ナトリウム中１０ｍＭのＬ−ヒスチジン、ｐＨ７．０に対して透析ろ過した。残渣バッチを０．２ミクロンろ過した。
【０１３８】
血清型１９Ｆを２２℃で約７日間インキュベートし、１００ｋＤａ  ＮＭＷＣＯの接線流限外ろ過膜を使用して、４℃で、１５０ｍＭ塩化ナトリウム中１０ｍＭのＬ−ヒスチジン、ｐＨ７．０に対して透析ろ過し、０．２ミクロンろ過した。
【０１３９】
バッチを、１５０ｍＭ塩化ナトリウム中１０ｍＭのＬ−ヒスチジン、ｐＨ７．０を追加して、１．０ｇ／Ｌの多糖濃度に調整した。バッチをアリコートに分注し、−６０℃以下で凍結した。
【０１４０】
［実施例３］
ジメチルスルホキシド中の還元的アミノ化を使用した血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、および２３ＦのＣＲＭ１９７へのコンジュゲーション方法
異なる血清型多糖は、共通のプロセスフローを使用して、精製されたＣＲＭ１９７キャリアタンパク質に個別にコンジュゲートした。多糖を溶解し、目標の分子量にサイズ調整し、化学的に活性化し、限外ろ過により緩衝液交換を行った。活性化された多糖および精製されたＣＲＭ１９７は個別に凍結乾燥し、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に再溶解させた。次いで、再溶解した多糖およびＣＲＭ１９７溶液を組み合わせて、下記のようにコンジュゲートさせた。得られたコンジュゲートを、最終的な０．２ミクロンろ過の前に限外ろ過により精製した。ｐＨ、温度、濃度、および時間など、各工程内のいくつかのプロセスパラメータは、以下のセクションで血清型固有の値に制御した。
【０１４１】
多糖のサイズの縮小と酸化
精製した肺炎球菌莢膜多糖粉末を水に溶解し、血清型１９Ａを除くすべての血清型を０．４５ミクロンろ過した。血清型１８Ｃおよび１９Ａを除くすべての血清型を均一化して、多糖の分子量を減少させた。ホモジナイザーによる均一化圧力およびパス数は、血清型固有の目標値（１５０〜１０００ｂａｒ、４〜７パス）に制御した。血清型１８Ｃは、９０℃以上での酸加水分解によりサイズを縮小させた。血清型１９Ａのサイズは縮小されなかった。
【０１４２】
サイズが縮小された多糖を０．２ミクロンでろ過し、次いで、１０ｋＤａ  ＮＭＷＣＯの接線流限外ろ過膜を使用して、濃縮および水に対して透析ろ過した。血清型１８Ｃには、５ｋＤａ  ＮＭＷＣＯの膜を使用した。
【０１４３】
次いで、多糖溶液を、酢酸ナトリウム緩衝液で血清型固有の温度（４〜２２℃）およびｐＨ（４〜５）に調整した。多糖の活性化は、メタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加により開始させた。添加したメタ過ヨウ素酸ナトリウムの量は、血清型固有であり、多糖反復単位１モル当たりのメタ過ヨウ素酸ナトリウムは約０．１〜０．５モルの範囲であった。
【０１４４】
すべての血清型について、１０ｋＤａ  ＮＭＷＣＯの接線流限外ろ過膜を使用して、活性化した生成物を１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．４に対して透析ろ過した。血清型１８Ｃには、５ｋＤａ  ＮＭＷＣＯの膜を使用した。すべての血清型の限外ろ過は、２〜８℃で実施した。
【０１４５】
ＣＲＭ１９７への多糖のコンジュゲーション
前述のような蛍光菌での発現により得られた精製ＣＲＭ１９７（国際特許出願公開第２０１２／１７３８７６Ａ１号を参照）を、５ｋＤａ  ＮＭＷＣＯの接線流限外ろ過膜を使用して、２ｍＭリン酸、ｐＨ７緩衝液に対して透析ろ過し、０．２ミクロンろ過した。
【０１４６】
酸化多糖溶液は、凍結乾燥に備えて水およびスクロースとともに製剤化した。タンパク質溶液は、凍結乾燥後のＤＭＳＯでの最適な再溶解を達成するために、凍結乾燥に備えて、水、リン酸緩衝液およびスクロースとともに製剤化した。
【０１４７】
製剤化された多糖およびＣＲＭ１９７溶液は、個別に凍結乾燥した。凍結乾燥した多糖およびＣＲＭ１９７材料をＤＭＳＯに再溶解し、Ｔ字ミキサーを使用して結合した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり１モル）を添加し、血清型固有の期間（１〜４８時間）コンジュゲーションを進めて、目標のコンジュゲートサイズを達成した。
【０１４８】
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
コンジュゲーション反応に続いて、水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり２モル）を添加した。バッチを約４℃で１５０ｍＭ塩化ナトリウムに希釈した。次いで、リン酸カリウム緩衝液を加えてｐＨを中和した。バッチを濃縮し、１０ｋＤａ  ＮＭＷＣＯの接線流限外ろ過膜を使用して、１５０ｍＭ塩化ナトリウムに対して約４℃で透析ろ過した。
【０１４９】
最終ろ過および製品保管
次いで、各バッチを濃縮し、３００ｋＤａ  ＮＭＷＣＯの接線流限外ろ過膜を使用して、４℃で、１５０ｍＭ塩化ナトリウム中１０ｍＭのＬ−ヒスチジン、ｐＨ７．０に対して透析ろ過した。残渣バッチを０．２ミクロンろ過した。
【０１５０】
血清型１９Ｆを約５日間インキュベートし、３００ｋＤａ  ＮＭＷＣＯの接線流限外ろ過膜を使用して、約４℃で、１５０ｍＭ塩化ナトリウム中１０ｍＭのＬ−ヒスチジン、ｐＨ７．０に対して透析ろ過し、０．２ミクロンろ過した。
【０１５１】
バッチに１５０ｍＭ塩化ナトリウム中１０ｍＭのＬ−ヒスチジン、ｐＨ７．０を追加して希釈し、アリコートに分注し、−６０℃以下で凍結した。
【０１５２】
［実施例４］
１５価肺炎球菌コンジュゲートワクチンの製剤
上記のように調製された肺炎球菌多糖タンパク質コンジュゲートを、血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆを有する１５価肺炎球菌コンジュゲートワクチン（ＰＣＶ１５）の製剤に使用した。製剤は、水溶液中の還元的アミノ化により生成した肺炎球菌多糖ＣＲＭ１９７コンジュゲートを使用して調製した（実施例３）。
【０１５３】
製剤賦形剤ストックの調製
賦形剤を組み合わせて１３種類の濃縮賦形剤ストックを調製し、最終的なワクチン製剤の製剤濃度は表１に記載のとおりであり、最終的なベース製剤は、２０ｍＭヒスチジン、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２％ｗ／ｖ  ＰＳ２０（２ｍｇ／ｍｌ）、ｐＨ５．８であった。
【０１５４】
ヒスチジン、ＰＥＧ４００、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、２−ヒドロキシエチルセルロース（２−ＨＥＣ）、およびヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（セントルイス、ミズーリ州）から購入した。カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）およびＰＥＯ１００Ｋは、Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ社から購入した。塩化ナトリウム、ポリソルベート２０、マンニトール、スクロース、プロピレングリコール、およびグリセリンは、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から購入した。
【表１】
2020531421.tif 000002
2020531421.tif 000003
【０１５５】
すべての賦形剤ストック溶液を容量１００ｍＬにし、０．２２μｍ  ＰＥＳろ過ユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ビレリカ、マサチューセッツ州）でろ過し、室温で保存した。
【０１５６】
アジュバント賦形剤混合物およびＰＣＶワクチンの製剤および充填
ワクチン製剤を調製するために、まず、製剤の最終的な目標体積を得るような体積比で、濃縮無菌アルミニウムアジュバントを賦形剤ストックに添加することにより、アルミニウムアジュバントを賦形剤ストックと組み合わせた。均一性を確保するために混合物を２００ｒｐｍで１時間混合し、その後、滅菌ろ過した肺炎球菌多糖コンジュゲートを、最終的なワクチン製剤体積の２５％に相当するアジュバント賦形剤混合物に添加した。ワクチン製剤をさらに２００ｒｐｍで１時間混合した。最終的なワクチン製剤には、肺炎球菌多糖６４μｇ／ｍＬ（８μｇ／ｍＬ血清型６Ｂ多糖、他のすべての血清型では４μｇ／ｍＬ多糖）（バイアル当たり血清型６Ｂ多糖５．６μｇ、その他のすべての血清型ではバイアル当たり２．８μｇ多糖）、ｐＨ５．８が含まれていた。次いで、製剤を無菌ガラス２Ｒバイアルに０．７ｍＬで無菌充填した。表２は、調製された個別の１３種類の製剤それぞれの賦形剤成分と総固形分とを示す。
【表２】
2020531421.tif 000004
【０１５７】
アルミニウムアジュバントへのコンジュゲート吸着のプロセス
アルミニウムアジュバントへのコンジュゲートの吸着プロセスは、まず、濃縮アルミニウムアジュバントが生理食塩溶液（１５０〜１５４ｍＭ塩化ナトリウム）で目的の体積比に希釈されて、アルミニウムアジュバントの最終吸着ワクチン濃度が、０．１〜１．２５ｍｇ  Ａｌ／ｍＬになるときに始まる。希釈されたアルミニウムアジュバントの正確な体積および質量は、アジュバントの望ましい用量に基づいて異なる。この例では、最終ワクチン製剤５０ｍＬを目標とし、したがって、濃縮アルミニウムアジュバント４．６ｍＬを生理食塩溶液３２．９ｍＬに添加して、希釈アルミニウムアジュバント３７．５ｍＬを生成した。このプロセスの次の工程は、無菌ガラス容器内で１〜２インチの撹拌棒を使用する場合、２００ｒｐｍで渦を引くように希釈アジュバントを１時間混合し、その後、２００ｒｐｍで絶えず混合しながら、一価製剤を調製する場合は単独で、または多価ワクチン製剤を調製する場合は多価混合物として添加するかのいずれかで、希釈アルミニウムアジュバントに滅菌ろ過したコンジュゲートをゆっくりと添加することを含む。ここに示す例では、最終ワクチン製剤５０ｍＬについて、滅菌多価コンジュゲート混合物１２．５ｍＬを希釈アルミニウムアジュバント３７．５ｍＬに添加した。コンジュゲートの添加に続いて、前述のように懸濁液を２００ｒｐｍでさらに１時間混合した。次に、製剤化されたワクチンを４℃で一晩（または１２時間を超えて）保存して、コンジュゲートのさらなる吸着を生じさせた。分注して使用する前に、すべてのワクチン製剤を実験室の周囲温度（２１〜２５℃）に戻すように調整し、少なくとも１時間よく混合する。
【０１５８】
製剤の保管および凍結
製剤は、液体対照として機能するように４℃で保管した。凍結対照サンプルは、充填後に製剤を完全に再懸濁し、次いで−１１５℃での液体窒素ブラスト凍結によりすぐに急速凍結することによって調製した。凍結乾燥およびマイクロ波乾燥した製剤は、凍結対照と同じ様式で最初にブラスト凍結した。リオスフェア製剤は４℃から取り出し、再懸濁し、−１８０℃以下に冷却した冷却板上に１００μＬをピペッティングして急速に凍結した。すべてのワクチン製剤（バイアル／凍結乾燥、バイアル／ＲＥＶ乾燥、およびリオスフェア／凍結乾燥用に調製）は、次の乾燥プロセスが開始されるまで−７０℃で保存した。
【０１５９】
ワクチン凍結乾燥および従来の凍結乾燥
凍結乾燥は、Ｌｙｏｓｔａｒ  ＩＩＩ（ＳＰ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ストーンリッジ、ニューヨーク州）を使用して実施した。すべての凍結バイアル製剤は、−５０℃の予備冷却棚を有する凍結乾燥機にロードした。棚温度を０．１℃／分の傾斜率で−５０℃から−３０℃に下降させ、−３０℃／５０ｍＴｏｒｒで一次乾燥を実施した。二次乾燥のために、棚温度を０．１℃／分の傾斜率で２５℃の設定点まで上昇させ、サンプルを６時間保持した。マンニトールを含む製剤は、−５０℃に戻る前に、棚温度を０．５℃／分で−５０℃から−２０℃に上昇させ、１８０分間保持して、一次乾燥の前にアニールした。
【０１６０】
ワクチンのマイクロ波放射エネルギー真空（ＲＥＶ）乾燥
ブラスト凍結バイアルを放射エネルギー真空（ＲＥＶ）乾燥機内に配置した。ＲＥＶ乾燥を介して、真空、圧力、および進行波形式のマイクロ波エネルギー照射を組み合わせて、凍結ワクチンを乾燥させた。すべての製剤を、−７０℃でロードし、すぐに６０〜７０ｍＴｏｒｒ下に置き、その後２００Ｗの放射マイクロ波エネルギーをほぼ７時間照射し、続いて４００Ｗを２０分間照射した。
【０１６１】
ワクチンリオスフェアの生成および従来の凍結乾燥
リオスフェアは、２００ｒｐｍで１時間撹拌して製剤を再懸濁し、製剤１００μＬを液体窒素で予冷した金属ウェルプレートにピペッティングすることにより生成した。凍結ワクチン球体の生成後、個々の球体はバイオセーフティキャビネット内で、個々の製剤ごとに別個の容器に移した。次いで、リオスフェアは、凍結乾燥するまで凍結器内で−７０℃で保存した。リオスフェア製剤を−７０℃の保管庫から取り出し、Ｌｙｏｓｔａｒ  ＩＩＩ凍結乾燥チャンバ（ＳＰ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ストーンリッジ、ニューヨーク州）の−５０℃の予備冷却棚の別個の異なる金属トレイに入れた。
【０１６２】
すべての製剤は、一次乾燥の前に−５０℃でロードおよび維持した。すべての製剤について、１５℃、３０ｍＴｏｒｒ下で、０．４℃／分の傾斜率で一次乾燥を行い、続いて３０℃の設定点、３０ｍＴｏｒｒ下で０．２℃／分の傾斜率で二次乾燥を行い、サンプルを６時間保持した。マンニトールを含む製剤は、一次乾燥の開始前に、棚温度を０．５℃／分で−５０℃から−２０℃に上げ、６０分間保持した後、０．５℃／分で−４５℃に戻し、１５分間保持してから、−５０℃に戻して３０分間保持して、一次乾燥前にアニールした。
【０１６３】
再構成時間の分析
従来の凍結乾燥、ＲＥＶ乾燥により乾燥した、またはリオスフェアとして凍結乾燥したワクチン製剤を−７０℃の保管庫から取り出した。個々の製剤は、滅菌水７００μＬで再構成した。再構成後の濃度は、乾燥前の濃度に類似している。サンプルの視覚的観察および完全な再構成の時間を記録した。
【０１６４】
粒度分析
凝集に関するアジュバントワクチン製剤の物理的安定性は、静的光散乱（ＳＬＳ）の使用により粒径を測定することにより評価した。サンプルは、最終分析濃度がＡｌ  １４．５μｇ／ｍＬの滅菌ろ過および脱気した生理食塩溶液で調製した。粒径および粒度分布の評価は、青色レーザー検出を備えたＭａｌｖｅｒｎ（著作権）Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ  ２０００システムを使用して実施した。ＳＬＳ分析では、サンプルは透明なガラスフローセルに再循環され、赤と青のレーザー光が透過する。大角度、後方散乱、および焦点面検出器のアレイが、溶液中の粒子の多角度光散乱を収集し、回折パターンを収集する。この方法は、回折角が粒径に反比例するという原理に依存する。すべての粒子のレーザー回折から生じる散乱プロファイルは、光散乱挙動、相対粒子透明度、および粒子の消光効率に対する屈折率の影響を説明するＭｉｅ理論の適用を使用して分析する。得られた計算による測定粒径は、体積ベースの粒径測定であり、３回の実行の平均である。
【０１６５】
ＳＬＳ分析によって報告された、計算による報告された直径値間の差に関する説明は、表３に記載されている。Ｄ［４，３］値は、サンプル体積の大部分を構成する粒子のサイズを反映しているため、報告に関連している。この値は、粒度分布におけるより大きな粒子の存在に最も敏感である。さらに、Ｄ［３，２］値は、粒度分布におけるより小さな／細かい粒子の存在に関連し、それらに最も敏感である。さらに、ｄ（０．５）は、サンプル体積の５０％がその直径未満である最大粒子直径を表すため、報告に関連している。ｄ（０．１）およびｄ（０．９）の値は、それぞれ粒径を報告し、サンプルの１０％または９０％がその粒径未満である。
【表３】
2020531421.tif 000005
【０１６６】
結果と考察
１）追加の賦形剤を欠く肺炎球菌コンジュゲートワクチンの粒径および粒度分布
表４は、非凍結液体対照を、−７０℃の凍結製剤、従来の凍結乾燥製剤、ＲＥＶ乾燥製剤、およびリオスフェア製剤と比較することにより、未加工の、ワクチン製剤の平均粒径の変化を報告している。結果は、凍結乾燥法の関数としてのワクチン粒径の変化を示している。体積加重平均粒径（Ｄ［４，３］）および中央粒径（ｄ（０．５））は両方とも凍結乾燥に応じて、リオスフェア、ＲＥＶ乾燥、および従来の凍結乾燥でそれぞれ、８．３μｍ〜１０．０、１２．２、および１５．０μｍ増加する。各凍結乾燥法は、ワクチンを凍結したときに観察される凝塊の程度を緩和し、そうでない場合、粒径は７８．２μｍになる。しかし、賦形剤を含まないベース製剤は、液体対照と比較して、凍結乾燥時に依然として凝塊する。このため、凍結乾燥に適した賦形剤を含む新しい製剤は、この増加を防止または軽減するのに理論的に有益であるはずである。
【表４】
2020531421.tif 000006
【０１６７】
２）キー賦形剤の組み合わせにより、凍結肺炎球菌コンジュゲートワクチンの粒径および分布が改善される。
【０１６８】
凍結ワクチンの平均粒径は、特定の賦形剤の組み合わせを使用すると減少する。５％ｗ／ｖマンニトール／２％ｗ／ｖスクロース（Ｆ１）、または６％ｗ／ｖマンニトール／４％ｗ／ｖスクロース（Ｆ２）の存在下でＰＣＶを凍結すると、凍結凝塊が、７８．２μｍから１２．１μｍ（Ｆ１）および１５．３μｍ（Ｆ２）に有意に減少する。さらに、凍結製剤３、１０、１１、および１２は、表５において、対照製剤よりも小さい平均粒径（５．２〜５．９μｍ）をもたらす。これらの結果は、試験したすべての製剤が、凍結した、賦形剤を含まないＰＣＶ製剤（Ｆ１３）よりも粒径を改善することを示唆している。製剤１、２、４、５、６、７、８、および９はすべて、ワクチンの凍結誘発凝塊の程度を低減する。ただし、製剤３、１０、１１、および１２は、−７０℃で凍結後、凝塊の程度をさらに低減し、ベース製剤の粒径を改善する。
【表５】
2020531421.tif 000007
【０１６９】
３）キー賦形剤の組み合わせにより、凍結乾燥肺炎球菌コンジュゲートワクチンの粒径および分布が改善される
凍結乾燥のプロセスにより、ＰＣＶワクチンの平均粒径が、８．３μｍから１５μｍに増加する。製剤５および４を使用すると、凍結乾燥後のサイズは、液体対照と同様になり、８．０μｍ〜８．８μｍになる（表６）。４つの製剤は、粒径が、４Ｃ液体対照の粒径未満に減少し、つまりＦ１０、Ｆ３、Ｆ１２、およびＦ１１の平均粒径は５．４μｍ〜７．３μｍである（表６）。これらの結果は、製剤４および５が凍結乾燥後に観察される粒径の増加を防ぐことを示している。さらに、製剤３、１０、１１、および１２は、観察される増加を防ぐだけでなく、ワクチンの粒径が液体対照の粒径より十分小さくなるように制御および縮小する。
【表６】
2020531421.tif 000008
【０１７０】
特に２つの製剤、すなわち、２％ｗ／ｖマンニトール／５％ｗ／ｖスクロースまたは４％ｗ／ｖマンニトール／６％ｗ／ｖスクロースをそれぞれ含むＦ１およびＦ２は、凍結乾燥誘発凝塊の程度を増加させた。得られた粒径および不均一性は、各ワクチン製剤について、凍結乾燥後の１５μｍから２６．２μｍおよび２８．２μｍに増加した（表７）。製剤６、７、８、および９は、リオケーキを生成せず、また、ＲＥＶ乾燥またはリオスフェアによるさらなる評価のために進行させなかった。
【表７】
2020531421.tif 000009
【０１７１】
４）キー賦形剤の組み合わせにより、ＲＥＶ乾燥肺炎球菌コンジュゲートワクチンの粒径および分布が改善される
対照ワクチン製剤の粒径は、ＲＥＶ乾燥時に８．３μｍから１２．２μｍに増加する。４％ｗ／ｖマンニトール／６％ｗ／ｖスクロースを含む製剤２は、ＲＥＶ乾燥により観察される凝塊の程度を有意に変更または低減せず、平均粒径１２．０μｍを生じた（表８）。
【０１７２】
対照的に、２つの製剤、Ｆ４およびＦ１は、ＲＥＶ誘発凝塊をそれぞれ９．１μｍおよび８．６μｍに減少させた。５つの特定の製剤、３、５、１０、１１、および１２は、平均粒径を液体対照の平均粒径よりも減少させ、液体対照の平均粒径が８．３μｍであるのに対して、４．７μｍから７．７μｍであった。前述のように、製剤６、７、８、および９は試験しなかった。
【表８】
2020531421.tif 000010
【０１７３】
５）キー賦形剤の組み合わせにより、リオスフェア肺炎球菌コンジュゲートワクチンの粒径および分布が改善される
もともと表４に示したように、リオスフェアの生成では、評価された他の乾燥方法に比べて凝塊の程度が最も低くなる。リオスフェアが形成されると、対照ワクチンの粒径は、８．３μｍから１０．０μｍに増加する。製剤１は、平均粒径を１０．０μｍから９．１μｍへとわずかに低減する（表９）。製剤２、３、４、５、１２、３、１０、および１１はすべて、粒径および凝塊の両方を、８．３μｍの液体対照を下回って、４．４μｍ〜７．９μｍに低減する。最も注目すべきは、粒径を８．３μｍから４．４〜５．５μｍへと低減させた製剤３、１０、１１、および１２である。
【表９】
2020531421.tif 000011
【０１７４】
６）キー賦形剤の組み合わせにより、液体肺炎球菌コンジュゲートワクチンの粒径および分布が改善される
特定の賦形剤は、液体ＰＣＶ製剤の粒径を維持または改善するが、選択されたいくつかは凝集をもたらす。液体ＰＣＶの粒径は、製剤１０、３、２、および４として調製した場合それぞれ、８．３μｍから７５．４μｍ、３６．７μｍ、３４．７μｍ、および２４．２μｍに有意に増加する（表１０）。対照的に、製剤８および９は、８．３〜８．４μｍの粒径を維持する。製剤１、５、６、７、１１、および１２では、液体ワクチンの粒径にさらに改善が見られ、６．１〜７．７μｍの範囲で、対照製剤の粒径より低い。
【０１７５】
最後に、以下の表１１は、製剤の性能、提示、および乾燥方法を相対的にまとめたものである。液体、凍結、凍結乾燥、ＲＥＶ乾燥、およびリオスフェアのサンプルをＳＬＳを使用して試験し、結果を比較し、相対的な性能を表１１に報告した。観察できるように、特定の製剤は、特に製剤１１および１２は、すべての提示にわたってよく機能するが、凍結乾燥プロセスのサイズのみを考慮した場合、製剤３、１０、１１、および１２は、評価した他の製剤すべてよりも優れている。さらに、特定の製剤は、特定の凍結乾燥用途で最も最適に機能する。
【表１０】
2020531421.tif 000012
【表１１】
2020531421.tif 000013
【０１７６】
キー：
［＋＋＋］  ｄ（０．５および４，３）≦１０μｍ、［＋＋］  ｄ（０．５および４，３）≦１５μｍ、［＋］  ｄ（０．５および４，３）
≦２５μｍ、［−］凝集
【国際調査報告】
2020531421.tif 000014
2020531421.tif 000015