(57)【要約】  腫瘍溶解性ウイルスおよびＮＫ細胞を含む治療剤、ならびに腫瘍および／またはがんを治療するための薬物におけるその適用が提供される。治療剤の活性成分は、腫瘍溶解性ウイルスおよびＮＫ細胞を含み、腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍細胞において選択的に複製することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）第１の薬学的に許容される担体中に腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを含む第１の医薬組成物と、
（ｂ）第２の薬学的に許容される担体中にＮＫ細胞を含む第２の医薬組成物と
を含む治療剤であって、
前記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、腫瘍細胞において選択的に複製することができる治療剤。
【請求項２】
前記第１の医薬組成物および前記第２の医薬組成物が、一緒に混合されることなく、前記治療剤中に別々に存在する、請求項１に記載の治療剤。
【請求項３】
前記第１の医薬組成物の活性成分が、前記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスであり；前記第２の医薬組成物の活性成分が、前記ＮＫ細胞である、請求項１に記載の治療剤。
【請求項４】
前記第１の医薬組成物が、治療有効用量の前記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを含み、前記第２の医薬組成物が、１×１０７〜１×１０１０細胞／日の範囲の用量の前記ＮＫ細胞を含む、請求項１に記載の治療剤。
【請求項５】
前記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、腫瘍溶解能力を有する遺伝子変異型ウイルスおよび腫瘍溶解能力を有する野生型ウイルスから選択される、請求項１に記載の治療剤。
【請求項６】
前記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、ＴＫ遺伝子および／またはＶＧＦ遺伝子が機能的に欠損している、請求項１に記載の治療剤。
【請求項７】
前記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、Ｐｅｘａ−ｖａｃ、ＪＸ−９６３、ＪＸ−９２９、ＶＳＣ２０、ＧＬ−ＯＮＣ１、および／またはＴＧ６００２から選択される、請求項１に記載の治療剤。
【請求項８】
前記ＮＫ細胞が、自家ＮＫ細胞および同種ＮＫ細胞から選択される、請求項１に記載の治療剤。
【請求項９】
前記ＮＫ細胞が、インビトロで増殖させた自家ＮＫ細胞またはインビトロで増殖させた同種ＮＫ細胞である、請求項８に記載の治療剤。
【請求項１０】
前記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、腫瘍内注入を介して投与されるかまたは静脈内投与されるように製剤化され；前記ＮＫ細胞が、静脈内投与されるように製剤化される、請求項１に記載の治療剤。
【請求項１１】
前記第１の医薬組成物の活性成分が、１×１０５〜５×１０９ｐｆｕ／日の範囲の用量の腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを含み；前記第２の医薬組成物の活性成分が、１×１０７〜１×１０１０細胞／日の範囲の用量のＮＫ細胞を含む、請求項１に記載の治療剤。
【請求項１２】
前記第１の医薬組成物および前記第２の医薬組成物からなる、請求項１に記載の治療剤。
【請求項１３】
腫瘍および／またはがんの治療のための薬物の調製のための請求項１〜１２の何れか１項に記載の治療剤の使用。
【請求項１４】
前記腫瘍および／またはがんが、肺がん、黒色腫、頭頸部がん、肝臓がん、脳がん、結腸直腸がん、膀胱がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、リンパがん、胃がん、食道がん、腎臓がん、前立腺がん、膵臓がん、および白血病を含む、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
腫瘍および／またはがんの治療のための相乗作用を有する組合せ薬物のキットであって、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを含む第１の容器と、ＮＫ細胞を含む第２の容器と、投与のタイミングおよび経路を示す説明書とを含み、前記第１の容器が、前記第２の容器とは別個であり、前記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、腫瘍細胞において選択的に複製することができる、キット。
【請求項１６】
前記第１の容器が、治療有効用量の前記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを含み、前記第２の容器が、１×１０７〜１×１０１０細胞／日の範囲の用量の前記ＮＫ細胞を含む、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
前記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、腫瘍溶解能力を有する遺伝子変異型ウイルスおよび腫瘍溶解能力を有する野生型ウイルスから選択される、請求項１５に記載のキット。
【請求項１８】
前記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、ＴＫ遺伝子および／またはＶＧＦ遺伝子が機能的に欠損している、請求項１５に記載のキット。
【請求項１９】
前記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、Ｐｅｘａ−ｖａｃ、ＪＸ−９６３、ＪＸ−９２９、ＶＳＣ２０、ＧＬ−ＯＮＣ１、および／またはＴＧ６００２から選択される、請求項１５に記載のキット。
【請求項２０】
前記ＮＫ細胞が、自家ＮＫ細胞および同種ＮＫ細胞から選択される、請求項１５に記載のキット。
【請求項２１】
前記ＮＫ細胞が、インビトロで増殖させた自家ＮＫ細胞またはインビトロで増殖させた同種ＮＫ細胞である、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
前記腫瘍および／またはがんが、肺がん、黒色腫、頭頸部がん、肝臓がん、脳がん、結腸直腸がん、膀胱がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、リンパがん、胃がん、食道がん、腎臓がん、前立腺がん、膵臓がん、および白血病を含む、請求項１５に記載のキット。
【請求項２３】
前記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、腫瘍内注入を介して投与されるかまたは静脈内投与されるように製剤化され；前記ＮＫ細胞が、静脈内投与されるように製剤化される、請求項１５に記載のキット。
【請求項２４】
前記第１の容器が、１×１０５〜５×１０９ｐｆｕ／日の範囲の用量の腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを含み；前記第２の容器が、１×１０７〜１×１０１０細胞／日の範囲の用量のＮＫ細胞を含む、請求項１５に記載のキット。
【請求項２５】
腫瘍および／またはがんを治療するための方法であって、逐次的な様式で、以下の工程：
１）腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを、腫瘍および／またはがん患者に投与する工程であって、前記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、腫瘍細胞において選択的に複製することができる工程と、
２）前記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの前記投与の１８〜７２時間後に、ＮＫ細胞を、前記腫瘍および／またはがん患者に投与する工程と
を含む方法。
【請求項２６】
前記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、腫瘍溶解能力を有する遺伝子変異型ウイルスおよび腫瘍溶解能力を有する野生型ウイルスから選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、ＴＫ遺伝子および／またはＶＧＦ遺伝子が機能的に欠損している、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、Ｐｅｘａ−ｖａｃ、ＪＸ−９６３、ＪＸ−９２９、ＶＳＣ２０、ＧＬ−ＯＮＣ１、および／またはＴＧ６００２から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＮＫ細胞が、自家ＮＫ細胞および同種ＮＫ細胞から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＮＫ細胞が、インビトロで増殖させた自家ＮＫ細胞またはインビトロで増殖させた同種ＮＫ細胞である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記腫瘍および／またはがんが、肺がん、黒色腫、頭頸部がん、肝臓がん、脳がん、結腸直腸がん、膀胱がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、リンパがん、胃がん、食道がん、腎臓がん、前立腺がん、膵臓がん、および白血病を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
前記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、治療有効用量で、１日１回、１〜６日間連続で投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＮＫ細胞が、１×１０７〜１×１０１０細胞／日の範囲の用量レベルで、１日１回、１〜６日間連続で投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３４】
前記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、治療有効用量で、１日おきに、２〜６日間連続で投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＮＫ細胞が、１×１０７〜１×１０１０細胞／日の範囲の用量レベルで、１日おきに、２〜６日間連続で投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３６】
前記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、腫瘍内注入を介して投与されるかまたは静脈内投与され；前記ＮＫ細胞が、静脈内投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３７】
前記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの投薬量が、１×１０５〜５×１０９ｐｆｕ／日の範囲に及ぶ、請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジーの分野に関し、特に、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスおよびＮＫ細胞を含む治療剤、ならびに腫瘍および／またはがんの治療のための薬物のためのその使用に関する。
【発明の背景】
【０００２】
悪性腫瘍は、ヒト疾患における主要な死因の１つであり、その主な治療方法は、外科手術、放射線療法、および化学療法である。腫瘍の生物学的療法が、近年開発されており、悪性腫瘍治療の第４のモダリティと呼ばれ、これには、腫瘍ワクチン療法、非特異的腫瘍免疫療法、モノクローナル抗体を用いた標的化免疫療法、サイトカイン療法、養子細胞免疫療法、腫瘍遺伝子療法などが含まれる。がんウイルス療法もまた、生物学的療法に属し、過去２０年間で急速に進化している。現時点では、ウイルス療法における最も有意な進歩の１つは、幾つかのウイルスが、腫瘍細胞において選択的に複製し、最終的に腫瘍細胞を殺滅することができるように、幾つかのウイルスを正常細胞とがん細胞との間の差異に基づいて構造的に修飾することができることである。これらの修飾されたウイルスは、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルスなどを起源とし、それらの機能に基づいて、集合的に「腫瘍溶解性ウイルス」と呼ばれている。幾つかの野生型ウイルスもまた、腫瘍細胞において選択的に複製し、それらを溶解することができることが、発見されている。
【０００３】
中国において販売が承認されている腫瘍溶解性ウイルス注射薬であるＨ１０１の成分は、腫瘍細胞において優先的に複製することができる遺伝子修飾されたアデノウイルス５型である。Ｈ１０１については、Ｅ１Ｂ  ５５ＫＤ遺伝子およびＥ３領域を、主として、ヒトアデノウイルス５型から欠失させており、これによって、Ｈ１０１は、腫瘍細胞において選択的に複製し、最終的にそれを溶解する能力を達成している。その作用機序の１つは、ｐ５３遺伝子によるアデノウイルスのクリアランスが阻害されるように、野生型アデノウイルスのＥ１Ｂ領域においてコードされる５５ＫＤタンパク質を、ｐ５３タンパク質と組み合わせることができることである。腫瘍溶解性ウイルスは、Ｅ１Ｂ−５５ＫＤタンパク質を発現することができないため、機能性ｐ５３遺伝子を有する細胞においては複製することができない。しかしながら、ｐ５３遺伝子の阻害性機能を有さないｐ５３遺伝子変異を有する腫瘍細胞では、このウイルスは、大規模に複製することができる。加えて、Ｅ３領域の欠失により、ウイルスが、免疫系（たとえば、ＮＫ細胞）によって認識され、排除されることが可能となり、これにより、臨床適用に関するウイルスの安全性が増加する。ｐ５３遺伝子の変異だけでなく、ｐ５３経路における任意の欠損もまた、Ｈ１０１の選択的な複製を促進することができるというのが、現在の見解である。腫瘍内投与によって、Ｈ１０１は、腫瘍細胞において大規模に複製し、最終的に腫瘍細胞の溶解および死滅を引き起こすことができる。
【０００４】
米国においてＦＤＡによって販売が承認されている腫瘍溶解性ウイルスであるＴ−Ｖｅｃの成分は、遺伝子修飾された単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）である。ＩＣＰ３４．５遺伝子およびＩＣＰ４７遺伝子を、Ｔ−Ｖｅｃから欠失させており、一方で、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、すなわち、ヒト免疫刺激タンパク質の遺伝子が、Ｔ−Ｖｅｃに挿入されているため、このウイルスは、腫瘍細胞において複製し、ＧＭ−ＣＳＦを発現することができる。黒色腫の病変部に注入された後、このウイルスは、腫瘍細胞を溶解し、それらの破裂を引き起こすことができ、同時に、腫瘍関連抗原およびＧＭ−ＣＳＦを放出し、これにより、抗腫瘍免疫応答を促進することができるが、その機序は、Ａｍｇｅｎ  Ｉｎｃによってまだ解明されていない。２０１５年１０月２７日、ＦＤＡは、初期外科手術後に黒色腫を再発した患者において、切除不能な黒色腫病変部の局所治療に関して、Ｔ−Ｖｅｃを承認した。
【０００５】
ワクシニアウイルスは、比較的サイズが大きく、野生型の遺伝子修飾によって得られる腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、有意に増加した選択性で腫瘍細胞において複製することができる。これらの腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの幾つかにおいて、腫瘍溶解性ウイルスが正常細胞において複製することも増殖することもできなくなるように、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子を、ウイルスＤＮＡから欠失させた。正常細胞とは異なり、腫瘍細胞は、チミジンキナーゼを合成することができ、それが、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスに、その複製のために提供されるため、腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍細胞において大規模に複製することができる。加えて、ある特定の腫瘍溶解性ワクシニアウイルスにおいて、それらの腫瘍特異的増殖を増加させ、最終的に、腫瘍細胞の溶解および死滅を引き起こすように、血管増殖因子（ＶＧＦ）遺伝子を欠失させた。さらに、ＴＫ遺伝子とＶＧＦ遺伝子の両方を、ある特定の腫瘍溶解性ワクシニアウイルスにおいて欠失させた。これまでのところ、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスで、販売が承認されているものはない。アデノウイルスまたはヘルペスウイルスに基づく腫瘍溶解性ウイルスと比較して、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、静脈内注入によって全身投与して、腫瘍部位に到達させることができるという利点を有する。さらに、ワクシニアウイルスは、大きなゲノムを有し、そのため、その腫瘍殺滅作用の増加を目的とする遺伝子修飾が可能である。
【０００６】
しかしながら、腫瘍の単剤療法として使用した場合、腫瘍溶解性ウイルスは、満足できる有効性を示さないことが時々あり；腫瘍溶解性ウイルスを、腫瘍の治療のための化学療法剤と組み合わせた場合、化学療法剤が正常細胞も損傷するため、重大な副作用が生じ得る。
【０００７】
ＮＫ細胞（ナチュラルキラー細胞）は、骨髄において産生される非特異的先天免疫細胞の一種であり、ヒトの身体のほぼすべての器官に存在する。それらは、ＣＤ３−／ＣＤ５６＋として一様に特定され、２つのサブタイプ、すなわち、ＣＤ１６−／ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔおよびＣＤ１６＋／ＣＤ５６ｄｉｍに分類することができ、これらは、それぞれ、免疫調節および腫瘍殺滅のインビボ機能を有する。ＮＫ細胞は、ＭＨＣクラスＩ抗原決定基を有さないため、宿主の正常細胞に対する免疫応答（ＧｖＨＤ）の危険性がほとんどないかまたはまったくない。インビトロで増殖させたＮＫ細胞は、品質検査の実施が容易であり、細胞を同種間で使用することができるという利点を有する。ヒトの身体におけるＮＫ細胞の数は、Ｔ細胞の数よりも少ないが、ＮＫ細胞は、応答がより迅速であり、監視役として機能し、がん細胞、特に、転移の源および再発の原因となり得る比較的小さながん病巣を直接的に殺滅することができる。ＮＫ細胞はまた、循環器系における腫瘍細胞を殺滅することもできる。ＮＫ細胞はまた、ウイルス、たとえば、Ｂ型肝炎ウイルスおよび子宮頸がんを引き起こすヘルペスウイルスを阻害することができ、加齢細胞も同様に除去することができる。しかしながら、ＮＫ細胞は、がん細胞およびウイルスを非特異的な様式で殺滅するため、がんを治療するのにＮＫ細胞を用いた単剤療法の有効性は、まだ改善の余地がある。現在のところ、ＮＫ細胞およびモノクローナル抗体の様々な組合せ療法が開発されており、治療効果を示しているが、そのような組合せ療法の適用は、モノクローナル抗体のオフターゲット作用のために限定されている。
【０００８】
したがって、腫瘍および／またはがんの免疫療法において、より有効な治療レジメンおよび薬物の開発が、依然として必要とされている。
【発明の概要】
【０００９】
当該技術分野における上述の問題を解決するために、本開示は、治療剤、医薬組成物、キット、腫瘍および／またはがんの治療のための薬物のためのその使用、ならびに腫瘍および／またはがんの治療のための方法を提供する。治療剤、組成物、方法、およびキットは、様々な方法で具現化され得る。
【００１０】
ある態様において、（ａ）第１の薬学的に許容される担体中に腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを含む第１の医薬組成物と、（ｂ）第２の薬学的に許容される担体中にＮＫ細胞を含む第２の医薬組成物とを含む、治療剤または医薬組成物であって、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、腫瘍細胞において選択的に複製することができる、治療剤または医薬組成物が提供される。
【００１１】
別の態様において、腫瘍および／またはがんの治療のための薬物の調製のための治療剤または医薬組成物の使用が提供される。
【００１２】
さらに別の態様において、腫瘍および／またはがんの治療のための相乗作用を有する組合せ薬物のキットであって、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを含む第１の容器と、ＮＫ細胞を含む第２の容器と、投与のタイミングおよび経路を示す説明書とを含み、第１の容器が、第２の容器とは別個であり、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、腫瘍細胞において選択的に複製することができる、キットが提供される。
【００１３】
なおも別の態様において、腫瘍および／またはがんを治療するための方法であって、逐次的な様式で、１）腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを、腫瘍および／またはがん患者に投与する工程であって、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、腫瘍細胞において選択的に複製することができる工程と、２）腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの投与の１８〜７２時間後に、ＮＫ細胞を、腫瘍および／またはがん患者に投与する工程とを含む方法が提供される。
【００１４】
具体的には、本開示は、以下のものを提供する。
【００１５】
ある側面において、医薬組成物であって、医薬組成物の活性成分が、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスおよびＮＫ細胞を含み、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、腫瘍細胞において選択的に複製することができる医薬組成物が提供される。好ましくは、医薬組成物の活性成分は、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスおよびＮＫ細胞からなる。
【００１６】
幾つかの例において、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスおよびＮＫ細胞は、一緒に混合されることなく、医薬組成物中に別々に存在している。
【００１７】
ある特定の態様において、医薬組成物は、治療有効用量の腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを含んでいてもよく、１×１０７〜１×１０１０細胞／日の範囲の用量のＮＫ細胞を含んでいてもよい。
【００１８】
幾つかの態様において、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、腫瘍溶解能力を有する遺伝子変異型ウイルスおよび腫瘍溶解能力を有する野生型ウイルスから選択される。幾つかの態様において、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、ＴＫ遺伝子および／またはＶＧＦ遺伝子が機能的に欠損している。幾つかの態様において、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、Ｐｅｘａ−ｖａｃ、ＪＸ−９６３、ＪＸ−９２９、ＶＳＣ２０、ＧＬ−ＯＮＣ１、および／またはＴＧ６００２から選択される。
【００１９】
幾つかの態様において、ＮＫ細胞は、自家ＮＫ細胞および同種ＮＫ細胞から選択される。好ましくは、ＮＫ細胞は、インビトロで増殖させた自家ＮＫ細胞またはインビトロで増殖させた同種ＮＫ細胞である。
【００２０】
医薬組成物の腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、腫瘍内注入を介して投与され得るか、または静脈内投与され得、ＮＫ細胞は、静脈内投与され得る。
【００２１】
ある特定の態様において、医薬組成物の活性成分は、１×１０５〜５×１０９ｐｆｕ／日の範囲の用量の腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、および１×１０７〜１×１０１０細胞／日の範囲の用量のＮＫ細胞を含む。好ましくは、医薬組成物の活性成分は、１×１０５〜５×１０９ｐｆｕ／日の範囲の用量の腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、および１×１０７〜１×１０１０細胞／日の範囲の用量のＮＫ細胞からなる。
【００２２】
別の側面において、腫瘍および／またはがんの治療のための薬物の調製のための医薬組成物の使用が提供される。
【００２３】
腫瘍および／またはがんには、肺がん、黒色腫、頭頸部がん、肝臓がん、脳がん、結腸直腸がん、膀胱がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、リンパがん、胃がん、食道がん、腎臓がん、前立腺がん、膵臓がん、および白血病が含まれ得る。
【００２４】
治療剤もまた、提供される。ある態様において、治療剤は、（ａ）第１の薬学的に許容される担体中に腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを含む第１の医薬組成物と、（ｂ）第２の薬学的に許容される担体中にＮＫ細胞を含む第２の医薬組成物とを含んでいてもよく、ここで、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、腫瘍細胞において選択的に複製することができる。
【００２５】
第１の薬学的に許容される担体は、第２の薬学的に許容される担体と同じであるか、またはそれとは異なるかのいずれかであり得る。
【００２６】
幾つかの態様において、第１の医薬組成物および第２の医薬組成物は、一緒に混合されることなく、治療剤中に別々に存在する。ある態様において、第１の医薬組成物の活性成分は、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスであり、第２の医薬組成物の活性成分は、ＮＫ細胞である。
【００２７】
様々な用量レベルが、適宜適用され得る。ある特定の態様において、第１の医薬組成物は、治療有効用量の腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを含み、第２の医薬組成物は、１×１０７〜１×１０１０細胞／日の範囲の用量のＮＫ細胞を含む。
【００２８】
様々な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、適宜適用され得る。ある特定の態様において、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、腫瘍溶解能力を有する遺伝子変異型ウイルスおよび腫瘍溶解能力を有する野生型ウイルスから選択される。たとえば、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、ＴＫ遺伝子および／またはＶＧＦ遺伝子が機能的に欠損している。幾つかの態様において、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、Ｐｅｘａ−ｖａｃ、ＪＸ−９６３、ＪＸ−９２９、ＶＳＣ２０、ＧＬ−ＯＮＣ１、および／またはＴＧ６００２から選択される。
【００２９】
様々なＮＫ細胞が、適宜適用され得る。ある特定の態様において、ＮＫ細胞は、自家ＮＫ細胞および同種ＮＫ細胞から選択される。好ましくは、ＮＫ細胞は、インビトロで増殖させた自家ＮＫ細胞またはインビトロで増殖させた同種ＮＫ細胞である。
【００３０】
様々な投与経路が、適宜適用され得る。たとえば、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、腫瘍内注入を介して投与されるかまたは静脈内投与されるように製剤化され、ＮＫ細胞は、静脈内投与されるように製剤化される。
【００３１】
治療剤の特定の態様において、第１の医薬組成物の活性成分は、１×１０５〜５×１０９ｐｆｕ／日の範囲の用量の腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを含み、第２の医薬組成物の活性成分は、１×１０７〜１×１０１０細胞／日の範囲の用量のＮＫ細胞を含む。他の特定の態様において、第１の医薬組成物の活性成分は、１×１０５〜５×１０９ｐｆｕ／日の範囲の用量の腫瘍溶解性ワクシニアウイルスからなり、第２の医薬組成物の活性成分は、１×１０７〜１×１０１０細胞／日の範囲の用量のＮＫ細胞からなる。他の特定の態様において、治療剤は、第１の医薬組成物および第２の医薬組成物からなる。
【００３２】
幾つかの態様において、治療剤は、腫瘍および／またはがんの治療のための薬物を調製するために使用され得る。腫瘍および／またはがんには、肺がん、黒色腫、頭頸部がん、肝臓がん、脳がん、結腸直腸がん、膀胱がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、リンパがん、胃がん、食道がん、腎臓がん、前立腺がん、膵臓がん、および白血病が含まれるが、これらに限定されない。
【００３３】
本開示はまた、腫瘍および／またはがんの治療のための相乗作用を有する組合せ薬物のキットも提供する。ある特定の態様において、キットには、それぞれが腫瘍溶解性ワクシニアウイルスおよびＮＫ細胞を含む独立した容器、ならびに投与のタイミングおよび経路を示す説明書が含まれ、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、腫瘍細胞において選択的に複製することができる。
【００３４】
キットの幾つかの態様において、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを含む独立した容器（第１の容器）は、治療有効用量の腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを含み、ＮＫ細胞を含む独立した容器（第２の容器）は、１×１０７〜１×１０１０細胞／日の範囲の用量のＮＫ細胞を含む。
【００３５】
幾つかの態様において、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、腫瘍溶解能力を有する遺伝子変異型ウイルスおよび腫瘍溶解能力を有する野生型ウイルスから選択される。幾つかの態様において、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、ＴＫ遺伝子および／またはＶＧＦ遺伝子が機能的に欠損している。幾つかの態様において、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、Ｐｅｘａ−ｖａｃ、ＪＸ−９６３、ＪＸ−９２９、ＶＳＣ２０、ＧＬ−ＯＮＣ１、および／またはＴＧ６００２から選択される。
【００３６】
キットに含まれるＮＫ細胞は、自家ＮＫ細胞および同種ＮＫ細胞から選択され得る。好ましくは、ＮＫ細胞は、インビトロで増殖させた自家ＮＫ細胞またはインビトロで増殖させた同種ＮＫ細胞である。
【００３７】
腫瘍および／またはがんには、肺がん、黒色腫、頭頸部がん、肝臓がん、脳がん、結腸直腸がん、膀胱がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、リンパがん、胃がん、食道がん、腎臓がん、前立腺がん、膵臓がん、および白血病が含まれ得る。
【００３８】
幾つかの態様において、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、腫瘍内注入を介して投与されるかまたは静脈内投与されるように製剤化され、ＮＫ細胞は、静脈内投与されるように製剤化される。
【００３９】
特定の態様において、第１の容器は、１×１０５〜５×１０９ｐｆｕ／日の範囲の用量の腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを含み、第２の容器は、１×１０７〜１×１０１０細胞／日の範囲の用量のＮＫ細胞を含む。
【００４０】
本開示は、腫瘍および／またはがんを治療するための方法であって、逐次的な様式で、以下の工程：
１）腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを、腫瘍および／またはがん患者に投与する工程であって、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、腫瘍細胞において選択的に複製することができる工程と、
２）腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの投与の１８〜７２時間後に、ＮＫ細胞を、腫瘍および／またはがん患者に投与する工程と
を含む方法をさらに提供する。
【００４１】
幾つかの態様において、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、腫瘍溶解能力を有する遺伝子変異型ウイルスおよび腫瘍溶解能力を有する野生型ウイルスから選択される。幾つかの態様において、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、ＴＫ遺伝子および／またはＶＧＦ遺伝子が機能的に欠損している。幾つかの態様において、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、Ｐｅｘａ−ｖａｃ、ＪＸ−９６３、ＪＸ−９２９、ＶＳＣ２０、ＧＬ−ＯＮＣ１、および／またはＴＧ６００２から選択される。
【００４２】
幾つかの態様において、ＮＫ細胞は、自家ＮＫ細胞および同種ＮＫ細胞から選択される。好ましくは、ＮＫ細胞は、インビトロで増殖させた自家ＮＫ細胞またはインビトロで増殖させた同種ＮＫ細胞である。
【００４３】
幾つかの態様において、腫瘍および／またはがんには、肺がん、黒色腫、頭頸部がん、肝臓がん、脳がん、結腸直腸がん、膀胱がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、リンパがん、胃がん、食道がん、腎臓がん、前立腺がん、膵臓がん、および白血病が含まれる。
【００４４】
ある特定の態様において、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、治療有効用量で、１日１回、１〜６日間連続で投与され、ＮＫ細胞は、１×１０７〜１×１０１０細胞／日の範囲の用量レベルで、１日１回、１〜６日間連続で投与される。あるいは、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、治療有効用量で、１日おきに、２〜６日間連続で投与され、ＮＫ細胞は、１×１０７〜１×１０１０細胞／日の範囲の用量レベルで、１日おきに、２〜６日間連続で投与される。
【００４５】
様々な投与経路が、適宜適用され得る。幾つかの態様において、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、腫瘍内注入を介して投与されるかまたは静脈内投与され、ＮＫ細胞は、静脈内投与される。
【００４６】
本方法の特定の態様において、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの投薬量は、１×１０５〜５×１０９ｐｆｕ／日の範囲に及ぶ。
【００４７】
他の態様を、以下に記載する。
【００４８】
本開示は、先行技術と比較して、以下の利点および優れた作用を有する。
【００４９】
本開示により、腫瘍および／またはがんの治療のために腫瘍溶解性ウイルスおよびＮＫ細胞を組み合わせるという考えが初めて提供され、この考えに基づく医薬組成物およびその方法により、腫瘍溶解性ウイルスが、腫瘍細胞における選択的な複製およびこれらの腫瘍細胞の溶解、ならびに免疫応答のさらなる誘導という役割を完全に果たすことが可能となり；一方で、ＮＫ細胞が、腫瘍細胞の殺滅という役割を完全に果たすことが可能となり；また、腫瘍溶解性ウイルスが腫瘍細胞において選択的に複製することができるという利点を巧妙に利用し、それによって、腫瘍溶解性ウイルスに感染した腫瘍細胞が、ＮＫ細胞の特異的な標的となり、これによって、ＮＫ細胞の腫瘍殺滅機能がさらに改善される。本開示により、腫瘍溶解性ウイルスおよびＮＫ細胞の単純な組合せが、相乗作用をもたらし得ることが、発見された。加えて、腫瘍溶解性ウイルスとＮＫ細胞の両方とも、腫瘍細胞を認識することができ、基本的には正常細胞に対して有害とならないため、これらの２つの組合せは、安全性および有効性の点で、有意な利点を示すことができる。
【００５０】
さらに、理論の探求および実験的研究が、本開示に従って実行され、腫瘍および／またはがんの有効な治療を提供するため、腫瘍溶解性ウイルスおよびＮＫ細胞のそれぞれの用量レベル、それらの投与順序、ならびに投与間隔が、アンタゴニスト作用を回避しながら組合せ療法で最良の相乗作用を達成するように提供された。
【定義】
【００５１】
ここで使用されるとき、「腫瘍」、「がん」、「腫瘍細胞」、および「がん細胞」という用語は、当該技術分野において一般に認識されている意味を包含する。
【００５２】
ここで使用されるとき、「腫瘍溶解性ウイルス」という用語は、腫瘍細胞において選択的に複製し、腫瘍細胞を溶解することができる、ウイルスを指す。腫瘍溶解性ウイルスは、遺伝子修飾型ウイルスであってもよく、または野生型ウイルスであってもよい。
【００５３】
ここで使用されるとき、「治療有効用量」という用語は、検出可能な治療的もしくは阻害的作用を示すか、または抗腫瘍応答を誘起するのに有用な、機能性薬剤または医薬組成物の量を指す。作用は、当該技術分野において公知の任意のアッセイ方法によって検出することができる。たとえば、治療有効用量のうちのいくつかを、表１において、「臨床実践における用量範囲または最良の用量レベル」という見出しの列に列挙する。
【００５４】
ここで使用されるとき、「投与する」または「投与」という用語は、化合物、複合物、または組成物（ウイルスおよび細胞を含む）を対象に提供することを指す。
【００５５】
ここで使用されるとき、「患者」という用語は、ヒトまたは非ヒト生物を指す。したがって、ここに記載される方法および組成物は、ヒトと獣医学の両方の疾患に適用可能である。ある特定の態様において、患者は、腫瘍を有する。幾つかの事例において、患者は、１種以上のがんを同時に患っている場合がある。
【００５６】
ここで使用されるとき、「相乗作用」という用語は、２つ以上の薬剤間で生じる、それぞれの作用の合計を上回る作用をもたらす作用を指す。
【００５７】
ここで使用されるとき、「ｐｆｕ」または「プラーク形成単位」という用語は、プラークを形成するウイルスの数を指す。
【００５８】
ここで使用されるとき、「ＶＰ」という用語は、ウイルス粒子の数を指す。
【００５９】
ここで使用されるとき、「ＶＰ／ｋｇ」という用語は、患者の体重１キログラム当たりのウイルス粒子の数を指す。
【００６０】
ここで使用されるとき、「ＴＣＩＤ５０」という用語は、組織培養物感染用量の中央値を表し、組織培養物の５０％に感染をもたらし、細胞変性作用を引き起こす、ウイルス用量を指す。
【００６１】
ここで使用されるとき、「ＭＯＩ」または「感染多重度」という用語は、ウイルスの数と細胞の数との比、すなわち、ウイルス感染を開始するのに使用される、細胞当たりのウイルス粒子の数を指す。ＭＯＩ＝ｐｆｕ／細胞であり、すなわち、細胞の数×ＭＯＩ＝総ＰＦＵである。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】図１は、本開示による実験例Ａ１におけるＡ５４９細胞に対するＮＫ細胞の用量応答実験の結果を示す。
【図２】図２は、本開示による実験例Ａ２におけるＡ５４９細胞に対する腫瘍溶解性ウイルスＨ１０１の用量応答実験の結果を示す。
【図３】図３は、本開示による例Ａ４におけるＨ１０１およびＮＫ細胞の組合せ殺滅実験の結果を示す。
【図４】図４は、本開示による比較例Ａ５におけるＨ１０１およびＮＫ細胞の組合せ同時投与の結果を示す。
【図５】図５は、本開示による例Ａ４におけるＨ１０１およびＮＫ細胞の組合せ殺滅実験の結果と、比較例Ａ５におけるＨ１０１およびＮＫ細胞の組合せ同時投与の結果との比較を示す。
【図６】図６は、本開示による比較例Ａ６におけるＨ１０１およびＮＫ細胞の順序逆転様式での組合せ投与の結果を示す。
【図７】図７は、本開示による比較例Ａ７におけるＨ１０１およびＮＫ細胞の組合せ投与の正常細胞に対する殺滅作用を示す。
【図８】図８は、本開示による例Ａ８における組合せ投与の用量漸増研究の結果を示す。四角形が連なった曲線は、Ｈ１０１を最初に投与し、ＮＫ細胞を後から投与した場合のＡ５４９細胞に対する殺滅作用を表し、三角形が連なった曲線は、Ｈ１０１およびＮＫ細胞を同時に投与した場合のＡ５４９細胞に対する殺滅作用を表し、円形が連なった曲線は、ＮＫ細胞を最初に投与し、Ｈ１０１を後から投与した場合のＡ５４９細胞に対する殺滅作用を表す。
【図９】図９は、本開示による実験例Ｂ１におけるＨｅｐＧ２細胞に対するＮＫ細胞の用量応答実験の結果を示す。
【図１０】図１０は、本開示による実験例Ｂ２におけるＨｅｐＧ２細胞に対するＨ１０１の用量応答実験の結果を示す。
【図１１】図１１は、本開示による例Ｂ３におけるＨ１０１およびＮＫ細胞の組合せ殺滅実験の結果を示す。
【図１２】図１２は、本開示による比較例Ｂ４におけるＨ１０１およびＮＫ細胞の組合せ同時投与の結果を示す。
【図１３】図１３は、本開示による例Ｂ３におけるＨ１０１およびＮＫ細胞の組合せ殺滅実験の結果と、比較例Ｂ４におけるＨ１０１およびＮＫ細胞の組合せ同時投与の結果との比較を示す。
【図１４】図１４は、本開示による比較例Ｂ５におけるＨ１０１およびＮＫ細胞の順序逆転様式での組合せ投与の結果を示す。
【図１５】図１５は、本開示による例Ｂ６における組合せ投与の用量漸増研究の結果を示す。四角形が連なった曲線は、Ｈ１０１を最初に投与し、ＮＫ細胞を後から投与した場合のＨｅｐＧ２細胞に対する殺滅作用を表し、三角形が連なった曲線は、Ｈ１０１およびＮＫ細胞を同時に投与した場合のＨｅｐＧ２細胞に対する殺滅作用を表し、円形が連なった曲線は、ＮＫ細胞を最初に投与し、Ｈ１０１を後から投与した場合のＨｅｐＧ２細胞に対する殺滅作用を表す。
【図１６】図１６は、本開示による実験例Ｃ１におけるＨＴ２９細胞に対するＮＫ細胞の用量応答実験の結果を示す。
【図１７】図１７は、本開示による実験例Ｃ２におけるＨＴ２９細胞に対するＨ１０１の用量応答実験の結果を示す。
【図１８】図１８は、本開示による例Ｃ３における２４時間間隔で投与したＨ１０１およびＮＫ細胞の組合せ殺滅実験の結果を示す。
【図１９】図１９は、本開示による比較例Ｃ５におけるＨ１０１およびＮＫ細胞の組合せ同時投与の結果を示す。
【図２０】図２０は、本開示による例Ｃ３におけるＨ１０１およびＮＫ細胞の組合せ殺滅実験の結果と、比較例Ｃ５におけるＨ１０１およびＮＫ細胞の組合せ同時投与の結果との比較を示す。
【図２１】図２１は、本開示による比較例Ｃ７における２４時間間隔でのＨ１０１およびＮＫ細胞の順序逆転様式での組合せ投与の結果を示す。
【図２２】図２２は、本開示による例Ｃ９における組合せ投与の用量漸増研究の結果を示す。四角形が連なった曲線は、Ｈ１０１を最初に投与し、ＮＫ細胞を後から投与した場合のＨＴ２９細胞に対する殺滅作用を表し、三角形が連なった曲線は、Ｈ１０１およびＮＫ細胞を同時に投与した場合のＨＴ２９細胞に対する殺滅作用を表し、円形が連なった曲線は、ＮＫ細胞を最初に投与し、Ｈ１０１を後から投与した場合のＨＴ２９細胞に対する殺滅作用を表す。
【図２３】図２３は、本開示による例Ｃ４における４８時間間隔で投与したＨ１０１およびＮＫ細胞の組合せ殺滅実験の結果を示す。
【図２４】図２４は、本開示による比較例Ｃ６におけるＨ１０１およびＮＫ細胞の組合せ同時投与の結果を示す。
【図２５】図２５は、本開示による例Ｃ４におけるＨ１０１およびＮＫ細胞の組合せ殺滅実験の結果と、比較例Ｃ６におけるＨ１０１およびＮＫ細胞の組合せ同時投与の結果との比較を示す。
【図２６】図２６は、本開示による比較例Ｃ８における４８時間間隔でのＨ１０１およびＮＫ細胞の順序逆転様式での組合せ投与の結果を示す。
【図２７】図２７は、本開示による例Ｃ１０における組合せ投与の用量漸増研究の結果を示す。四角形が連なった曲線は、Ｈ１０１を最初に投与し、ＮＫ細胞を後から投与した場合のＨＴ２９細胞に対する殺滅作用を表し、三角形が連なった曲線は、Ｈ１０１およびＮＫ細胞を同時に投与した場合のＨＴ２９細胞に対する殺滅作用を表し、円形が連なった曲線は、ＮＫ細胞を最初に投与し、Ｈ１０１を後から投与した場合のＨＴ２９細胞に対する殺滅作用を表す。
【図２８】図２８は、本開示による実験例Ｃ１１における、ＨＴ２９細胞をＨ１０１に感染させ２４時間培養した後の細胞表面上のＮＫＧ２Ｄリガンドの変化の結果を示す。
【図２９】図２９は、本開示による実験例Ｃ１２における、ＨＴ２９細胞をＨ１０１に感染させ４８時間培養した後の細胞表面上のＮＫＧ２Ｄリガンドの変化の結果を示す。
【図３０】図３０は、本開示による実験例Ｄ１におけるＡ５４９細胞に対するＮＫ細胞の用量応答実験の結果を示す。
【図３１】図３１は、本開示による実験例Ｄ２におけるＡ５４９細胞に対するｄｄｖｖ−ＲＦＰの用量応答実験の結果を示す。
【図３２】図３２は、本開示による例Ｄ３におけるｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫ細胞の組合せ殺滅実験の結果を示す。
【図３３】図３３は、本開示による比較例Ｄ４におけるｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫ細胞の組合せ同時投与の結果を示す。
【図３４】図３４は、本開示による比較例Ｄ５におけるｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫ細胞の順序逆転様式での組合せ投与の結果を示す。
【図３５】図３５は、本開示による実験例Ｅ１におけるＨｅｐＧ２細胞に対するｄｄｖｖ−ＲＦＰの用量応答実験の結果を示す。
【図３６】図３６は、本開示による例Ｅ２における２４時間間隔で投与したｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫ細胞の組合せ殺滅実験の結果を示す。
【図３７】図３７は、本開示による比較例Ｅ４におけるｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫ細胞の組合せ同時投与の結果を示す。
【図３８】図３８は、本開示による比較例Ｅ６における２４時間間隔でのｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫ細胞の順序逆転様式での組合せ投与の結果を示す。
【図３９】図３９は、本開示による例Ｅ３における４８時間間隔で投与したｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫ細胞の組合せ殺滅実験の結果を示す。
【図４０】図４０は、本開示による比較例Ｅ５におけるｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫ細胞の組合せ同時投与の結果を示す。
【図４１】図４１は、本開示による比較例Ｅ７における４８時間間隔でのｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫ細胞の順序逆転様式での組合せ投与の結果を示す。
【図４２】図４２は、本開示による実験例Ｆ１におけるＨＴ２９細胞に対するｄｄｖｖ−ＲＦＰの用量応答実験の結果を示す。
【図４３】図４３は、本開示による例Ｆ２における２４時間間隔で投与したｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫ細胞の組合せ殺滅実験の結果を示す。
【図４４】図４４は、本開示による比較例Ｆ４におけるｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫ細胞の組合せ同時投与の結果を示す。
【図４５】図４５は、本開示による比較例Ｆ６における２４時間間隔でのｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫ細胞の順序逆転様式での組合せ投与の結果を示す。
【図４６】図４６は、本開示による例Ｆ３における４８時間間隔で投与したｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫ細胞の組合せ殺滅実験の結果を示す。
【図４７】図４７は、本開示による比較例Ｆ５におけるｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫ細胞の組合せ同時投与の結果を示す。
【図４８】図４８は、本開示による比較例Ｆ７における４８時間間隔でのｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫ細胞の順序逆転様式での組合せ投与の結果を示す。
【図４９】図４９は、本開示による実験例Ｇ１におけるＨＣＴ１１６細胞に対するＮＫ細胞の組合せ投与の用量応答実験の結果を示す。
【図５０】図５０は、本開示による実験例Ｇ２におけるＨＣＴ１１６細胞に対するｄｄｖｖ−ＲＦＰの用量応答実験の結果を示す。
【図５１】図５１は、本開示による例Ｇ３におけるｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫ細胞の組合せ殺滅実験の結果を示す。
【図５２】図５２は、本開示による比較例Ｇ４におけるｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫ細胞の組合せ同時投与の結果を示す。
【図５３】図５３は、本開示による比較例Ｇ５におけるｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫ細胞の順序逆転様式での組合せ投与の結果を示す。
【図５４】図５４は、本開示による実験例Ｈ１におけるＦａＤｕ細胞に対するＮＫ細胞の用量応答実験の結果を示す。
【図５５】図５５は、本開示による実験例Ｈ２におけるＦａＤｕ細胞に対するｄｄｖｖ−ＲＦＰの用量応答実験の結果を示す。
【図５６】図５６は、本開示による例Ｈ３におけるｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫ細胞の組合せ殺滅実験の結果を示す。
【図５７】図５７は、本開示による比較例Ｈ４におけるｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫ細胞の組合せ同時投与の結果を示す。
【図５８】図５８は、本開示による比較例Ｈ５におけるｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫ細胞の順序逆転様式での組合せ投与の結果を示す。
【図５９】図５９は、本開示による実験例Ｉ１におけるＳＫ−ＨＥＰ−１に対するＮＫ細胞の用量応答実験の結果を示す。
【図６０】図６０は、本開示による実験例Ｉ２におけるＳＫ−ＨＥＰ−１細胞に対するｄｄｖｖ−ＲＦＰの用量応答実験の結果を示す。
【図６１】図６１は、本開示による例Ｉ３におけるｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫ細胞の組合せ殺滅実験の結果を示す。
【図６２】図６２は、本開示による比較例Ｉ４におけるｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫ細胞の組合せ同時投与の結果を示す。
【図６３】図６３は、本開示による比較例Ｉ５におけるｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫ細胞の順序逆転様式での組合せ投与の結果を示す。
【図６４】図６４は、本開示による実験例Ｊ１におけるＰＡＮＣ−１細胞に対するＮＫ細胞の用量応答実験の結果を示す。
【図６５】図６５は、本開示による実験例Ｊ２におけるＰＡＮＣ−１細胞に対するｄｄｖｖ−ＲＦＰの用量応答実験の結果を示す。
【図６６】図６６は、本開示による例Ｊ３における４８時間間隔で投与したｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫ細胞の組合せ殺滅実験の結果を示す。
【図６７】図６７は、本開示による比較例Ｊ４におけるｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫ細胞の組合せ同時投与の結果を示す。
【図６８】図６８は、本開示による比較例Ｊ５における４８時間間隔でのｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫ細胞の順序逆転様式での組合せ投与の結果を示す。
【詳細な説明】
【００６３】
本開示は、添付の図面を参照して、以下の好ましい態様の詳細な説明によりさらに説明されるが、これは、限定的な意味と解釈されるものではなく、様々な修正または改善が本開示の趣旨から逸脱することなく適宜行われ得ること、したがってそれらが本開示の範囲内であることが当業者に明らかであろう。
【００６４】
ヒトの身体は、呼吸器系、循環器系、消化器系などを含めた１０個の系を含む複雑な生命体である。これらの系は、互いに調和し、それによってあらゆる種類の複雑な生命活動の正常な機能が可能となる。体系的思考は、統合した概念に基づき、薬物作用、疾患、系、およびヒト身体の間の相関性および相互作用を包括的に考慮するようなアプローチである。
【００６５】
現在のところ、多くの非細胞傷害性抗腫瘍薬物は、化学療法と組み合わせた場合、腫瘍患者における長期生存を改善するものではない。これは、これらの組合せ療法における体系的思考の欠如に起因し得る。たとえば、腫瘍が発生すると、ヒトの身体は、細胞媒介性免疫および体液性免疫を含み、かつ様々な免疫エフェクター分子およびエフェクター細胞が関与する、複数の緊密に相関した免疫作用または機序を介して抗腫瘍応答を生じる。細胞媒介性免疫が、抗腫瘍プロセスにおいて主要な役割を果たし、体液性免疫が、幾つかの条件下において、より二次的な役割を果たすと一般に考えられている。しかしながら、従来的な化学療法は、主として、細胞周期のある特定の段階、たとえば、ＲＮＡまたはＤＮＡの合成、および有糸分裂を妨害し、そのため、主に成長の速い細胞を標的としている。結果として、これらの化学療法は、腫瘍細胞を殺滅することができるが、免疫系の損傷も引き起こすこともでき；免疫系が弱くなると、腫瘍細胞の成長は、止めることができなくなる。したがって、標的化された非細胞傷害性抗腫瘍薬物を、化学療法または放射線療法と組み合わせる場合、化学療法または放射線療法の順序および投薬量は、免疫系を保護するために、適切にスケジューリングおよび決定を行わなければならず、これが、有効性を向上させる鍵である。
【００６６】
上述の体系的思考に基づくと、免疫機能を向上させるために他のアプローチを利用し、本開示に従って様々な療法を体系的に組み合わせることによって、免疫系への損傷を最小限に抑えながら、有効性を最大限に引き出すことが可能である。したがって、本開示は、腫瘍および／またはがんの治療のための、腫瘍溶解性ウイルスおよびＮＫ細胞を含む新規な組合せ療法を提供する。特に、本開示に従って腫瘍溶解性ウイルスおよびＮＫ細胞を組み合わせるだけで、相乗作用が達成され得る。
【００６７】
したがって、本開示は、（ａ）第１の薬学的に許容される担体中に腫瘍溶解性ウイルスを含む第１の医薬組成物と、（ｂ）第２の薬学的に許容される担体中にＮＫ細胞を含む第２の医薬組成物とを含む治療剤であって、腫瘍溶解性ウイルスが、腫瘍細胞において選択的に複製することができる治療剤を提供する。
【００６８】
幾つかの事例において、治療剤は、薬物の組合せとして解釈することができる。
【００６９】
幾つかの態様において、第１の医薬組成物の活性成分は、腫瘍溶解性ウイルスであり、第２の医薬組成物の活性成分は、ＮＫ細胞である。幾つかの態様において、第１の医薬組成物は、治療有効用量の腫瘍溶解性ウイルスを含み、第２の医薬組成物は、１×１０７〜１×１０１０細胞／日（好ましくは１×１０８〜５×１０９細胞／日、より好ましくは１×１０９〜４×１０９細胞／日、およびさらにより好ましくは１×１０９〜３×１０９細胞／日）の範囲の用量のＮＫ細胞を含む。
【００７０】
本開示はまた、医薬組成物であって、医薬組成物の活性成分が、腫瘍溶解性ウイルスおよびＮＫ細胞を含み、腫瘍溶解性ウイルスが、腫瘍細胞において選択的に複製することができる、医薬組成物を提供する。好ましくは、医薬組成物の活性成分は、腫瘍溶解性ウイルスおよびＮＫ細胞からなる。
【００７１】
好ましくは、腫瘍溶解性ウイルスおよびＮＫ細胞は、一緒に混合されることなく、医薬組成物中に別々に提供される。
【００７２】
腫瘍溶解性ウイルスが腫瘍細胞を殺滅させる機序は、一般に類似している。様々な態様において、腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍内注入を介して投与されるかまたは静脈内投与され、腫瘍溶解性ウイルスが腫瘍細胞と接触すると、ウイルスが腫瘍細胞に感染し、腫瘍細胞に進入する。腫瘍溶解性ウイルスは、主に、腫瘍細胞において複製および繁殖し、正常細胞における複製はほとんどないかまったくないため、大量の腫瘍溶解性子孫ウイルスを、感染した腫瘍細胞において産生することができ、腫瘍細胞の溶解および死滅をもたらし得る。腫瘍細胞が溶解すると、多数の主要関連抗原および腫瘍溶解性子孫ウイルスを放出することができ、次いで、抗原が、インビボで免疫系をさらに活性化することができ、インビボでＮＫ細胞およびＴ細胞を刺激して、残りの腫瘍細胞の攻撃を継続することができる。その一方で、腫瘍溶解性子孫ウイルスが、まだ感染していない腫瘍細胞に感染することができる。
【００７３】
ＮＫ細胞は、広範な腫瘍細胞を殺滅させることができる免疫細胞であり、ＮＫ細胞は、腫瘍細胞と正常細胞とを区別することができる。ＮＫ細胞が、腫瘍細胞と接触すると、ＮＫ細胞は、腫瘍細胞を異常な細胞として認識し、複数の補助プロセス、たとえば、受容体認識、抗体による標的認識（ＡＤＣＣ）、ならびに腫瘍細胞を間接的に殺滅することができるグランザイム、パーフォリン、およびインターフェロンの放出を通じて、腫瘍細胞を殺滅させる。インビトロでの研究により、健常なＮＫ細胞は、その寿命の間に、最大で２７の腫瘍細胞を殺滅させることができる。
【００７４】
ＮＫ細胞はまた、抗ウイルス機能も有する。正常細胞が、ウイルスに感染すると、ウイルスは、大規模に複製され、感染した細胞が老齢となり、その細胞膜におけるタンパク質クラスターの組成の変化を示す。このプロセスの間に、ＮＫ細胞は、感染した細胞を高感度かつ効果的に認識することができ、正常細胞におけるウイルスの複製および増殖を阻害するために、上述のように腫瘍細胞を殺滅させるのに使用するものと同様のアプローチを用いてこれらの細胞を殺滅させることができる。その後は、抗原の活性化およびインターフェロンなどの免疫因子の関与により、他の種類の免疫細胞が、ウイルスとの争いを継続することになる。
【００７５】
本開示においては、腫瘍溶解性ウイルスおよびＮＫ細胞の個々の特徴を考慮に入れ、それにより、これらをうまく組み合わせることができる。一緒に組み合わせる場合、ＮＫ細胞の抗ウイルス機序は、腫瘍溶解性ウイルスに感染した腫瘍細胞にも適用可能であり、これは、ＮＫ細胞の抗腫瘍機序を補足する。加えて、組合せ療法により、腫瘍溶解性ウイルスが感染した腫瘍細胞が、ＮＫ細胞の特異的な標的となることが可能となり、これにより、それらの腫瘍殺滅作用が向上し得る。腫瘍溶解性ウイルスは、がん細胞において選択的に複製し、がん細胞を内側から殺滅させるだけでなく、ＮＫ細胞ががん細胞を外側から攻撃することができるように、細胞膜のタンパク質受容体クラスターの変化を引き起こし、それによって、ＮＫ細胞によるがん細胞の認識を促進することもできる。したがって、腫瘍溶解性ウイルスおよびＮＫ細胞は、がん細胞を相乗的に殺滅させ、有効性の向上を達成する。
【００７６】
野生型ウイルスおよびＮＫ細胞は、互いに阻害し得る。一方では、ウイルスが、ＮＫ細胞の表面上のＫＩＲ受容体の活性化を通じてＮＫ細胞を不活性化し、ＮＫ細胞の抗ウイルス活性を回避し；他方では、ＮＫ細胞は、ウイルスの増殖を阻害できるように、ウイルスに感染した細胞を認識し、その細胞を殺滅させることができるだけでなく、インターフェロンの放出を介してウイルスを直接的に阻害することもできる。しかしながら、ほとんどの腫瘍溶解性ウイルスは、遺伝子修飾されているため、腫瘍特異性が改善されており、また、腫瘍溶解性ウイルスによるＮＫ細胞などの免疫細胞の阻害は、弱まっている。
【００７７】
本開示における腫瘍溶解性ウイルスには、腫瘍溶解能力を有する遺伝子変異型ウイルスおよび腫瘍溶解能力を有する野生型ウイルスが含まれる。腫瘍溶解能力を獲得するように遺伝子を変異させることができるウイルスとしては、アデノウイルス、ポックスウイルス（ワクシニアウイルスとしても知られている）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、麻疹ウイルス、セムリキ森林ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ポリオウイルス、およびレトロウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。腫瘍溶解能力を有する野生型ウイルスとしては、レオウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ポリオウイルス、セネカバレーウイルス、エコーエンテロウイルス、コクサッキーウイルス、ニューカッスル病ウイルス、およびマラバウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７８】
外因性遺伝子が、腫瘍溶解性ウイルスのゲノムに組み込まれていてもよい。外因性遺伝子の例としては、外因性免疫調節遺伝子、外因性スクリーニング遺伝子、外因性レポーター遺伝子などが挙げられる。外因性遺伝子は、腫瘍溶解性ウイルスのゲノムに組み込まれていなくてもよい。
【００７９】
アデノウイルスとしては、ヒトアデノウイルス５型またはヒトキメラアデノウイルスが挙げられるがこれらに限定されず、具体的には、たとえば、例として、Ｏｎｙｘ−０１５（Ｏｎｙｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓから入手可能）、Ｈ１０１（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｓｕｎｗａｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏｍｐａｎｙから入手可能）、Ａｄ５−ｙＣＤ／ｍｕｔＴＫＳＲ３９ｒｅｐ−ｈＩＬ１２（Ｈｅｎｒｙ  Ｆｏｒｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｙｓｔｅｍから入手可能）、ＣＧ００７０（Ｃｏｌｄ  Ｇｅｎｅｓｙｓから入手可能）、ＤＮＸ−２４０１（ＤＮＡｔｒｉｘから入手可能）、ＯＢＰ−３０１（Ｏｎｃｏｌｙｓ  ＢｉｏＰｈａｒｍａから入手可能）、ＯＮＣＯＳ−１０２（Ｔａｒｇｏｖａｘ  Ｏｙ／Ｏｎｃｏｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓから入手可能）、ＣｏｌｏＡｄ１（ＰｓｉＯｘｕｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓから入手可能）、ＶＣＮ−０１（ＶＣＮ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能）、ＰｒｏｓｔＡｔａｋ（商標）（Ａｄｖａｎｔａｇｅｎｅから入手可能）などが挙げられる。
【００８０】
好ましくは、アデノウイルスは、Ｈ１０１である。
【００８１】
ワクシニアウイルスは、Ｗｙｅｔｈ株、ＷＲ株、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ株などであり得る。
【００８２】
ワクシニアウイルスは、ＴＫ遺伝子が機能的に欠損していてもよく、ＶＧＦ遺伝子が機能的に欠損していてもよく、またはＴＫ遺伝子およびＶＧＦ遺伝子が機能的に欠損していてもよい。ワクシニアウイルスはまた、ＨＡ、Ｆ１４．５Ｌ、およびＦ４Ｌを含むがこれらに限定されない他の遺伝子が機能的に欠損していてもよい。
【００８３】
好ましくは、ワクシニアウイルスは、ＴＫ遺伝子およびＶＧＦ遺伝子が機能的に欠損している。
【００８４】
ワクシニアウイルスとしては、Ｐｅｘａ−ｖａｃ（Ｊｅｎｎｅｒｅｘ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓから入手可能）、ＪＸ−９６３（Ｊｅｎｎｅｒｅｘ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓから入手可能）、ＪＸ−９２９（Ｊｅｎｎｅｒｅｘ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓから入手可能）、ＶＳＣ２０（その調製方法については、「ＭｃＣａｒｔ，  ＪＡ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ａ  ｔｕｍｏｒ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｍｕｔａｎｔ  ｌａｃｋｉｎｇ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ａｎｄ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｇｅｎｅｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  （２００１）  ６１：  ８７５１−８７５７」を参照されたい）、ＧＬ−ＯＮＣ１（Ｇｅｎｅｌｕｘから入手可能）、ＴＧ６００２（Ｔｒａｎｓｇｅｎｅから入手可能）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８５】
単純ヘルペスウイルスとしては、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２が挙げられるがこれらに限定されず、具体的には、たとえば、例として、Ｉｍｌｙｇｉｃ（登録商標）（Ａｍｇｅｎから入手可能）、Ｇ２０７（Ｍｅｄｉｇｅｎｅから入手可能）、ＨＦ１０（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏから入手可能）、Ｓｅｐｒｅｈｖｉｒ（Ｖｉｒｔｔｕ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓから入手可能）、ＯｒｉｅｎＸ０１０（Ｂｅｉｊｉｎｇ  ＯｒｉｅｎＧｅｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ．から入手可能）、ＮＶ１０２０（Ｃａｔｈｅｒａｘから入手可能）などが挙げられる。
【００８６】
上述の腫瘍溶解性ウイルスの具体的な例を、以下の表１に列挙する。
【００８７】
【表１−１】
2020503344.tif 000002
【００８８】
【表１−２】
2020503344.tif 000003
【００８９】
【表１−３】
2020503344.tif 000004
【００９０】
【表１−４】
2020503344.tif 000005
【００９１】
本開示におけるＮＫ細胞には、自家ＮＫ細胞および同種ＮＫ細胞が含まれる。ＮＫ細胞は、インビトロで増殖させたＮＫ細胞であってもよい。ＮＫ細胞の大規模なインビトロ増殖の技術は、当該技術分野において公知であり、高度に発達している（たとえば、「Ｓｏｍａｎｃｈｉ  ＳＳ，  Ｌｅｅ  ＤＡ．  Ｅｘ  Ｖｉｖｏ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  ＮＫ  Ｃｅｌｌｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｋ５６２  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｔｏ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｏｕｎｄ  ＩＬ２１．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２０１６；  １４４１：１７５−９３」または「Ｐｈａｎ  ＭＴ，  Ｌｅｅ  ＳＨ，  Ｋｉｍ  ＳＫ，  Ｃｈｏ  Ｄ．  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ＮＫ  Ｃｅｌｌｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｋ５６２  Ｆｅｅｄｅｒ  Ｃｅｌｌｓ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２０１６；  １４４１：１６７−７４」を参照されたい）。自家ＮＫ細胞、半同種ＮＫ細胞（同種ＮＫ細胞に属する）、または臍帯血由来ＮＫ細胞を、ヒトの身体に注入した場合、毒性も長期依存性も観察されておらず、治療が安全かつ効果的であることが、臨床データにより示されている。
【００９２】
治療に有用なＮＫ細胞の純度は、自家ＮＫ細胞については８５％以上であり得、同種ＮＫ細胞については９０％以上であり得、そこに混入している細胞は、ＮＫ−Ｔ細胞および／またはγδ  Ｔ細胞であり得る。好ましくは、ＮＫ細胞の活性（生存率）は、９０％以上であり、ＮＫ細胞の殺滅活性は、８０％以上である。
【００９３】
本開示における組合せ戦略に基づいて、腫瘍溶解性ウイルスおよびＮＫ細胞のそれぞれの用量レベル、その投与の順序、ならびに投与間の間隔に関して、さらなる探求および改善がなされるが、これは、腫瘍溶解性ウイルスの抗腫瘍有効性、ＮＫ細胞の抗腫瘍有効性、およびこれらの２つの組合せの腫瘍細胞に対する最良の相乗殺滅作用を判定するために必須である。
【００９４】
したがって、好ましくは、医薬組成物または治療剤は、治療有効用量の腫瘍溶解性ウイルスを含み、１×１０７〜１×１０１０細胞／日（好ましくは１×１０８〜５×１０９細胞／日、より好ましくは１×１０９〜４×１０９細胞／日、およびさらにより好ましくは１×１０９〜３×１０９細胞／日）の範囲の用量のＮＫ細胞を含む。様々な腫瘍溶解性ウイルスについて、臨床適用に好適な様々な好ましい用量範囲、たとえば、表１に列挙されるものが、選択され得る。
【００９５】
腫瘍溶解性ウイルスは、それぞれ、当該技術分野において広く使用されている様々な経路を通じて投与することができ、たとえば、それらは、腫瘍内注入を介して投与され得るか、または静脈内投与され得る。
【００９６】
ＮＫ細胞は、当該技術分野において広く使用されている様々な経路を通じて投与することができ、たとえば、それらは、静脈内投与され得る。
【００９７】
特定の態様において、本開示による医薬組成物または治療剤における腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍溶解能力を有するアデノウイルスである（これ以降、「腫瘍溶解性アデノウイルス」とも称される）。幾つかの例において、腫瘍溶解性アデノウイルスのＥ１領域および／またはＥ３領域は、遺伝子修飾されている。幾つかの例において、腫瘍溶解性アデノウイルスは、Ｏｎｙｘ−０１５、Ｈ１０１、Ａｄ５−ｙＣＤ／ｍｕｔＴＫＳＲ３９ｒｅｐ−ｈＩＬ１２、ＣＧ００７０、ＤＮＸ−２４０１、ＯＢＰ−３０１、ＯＮＣＯＳ−１０２、ＣｏｌｏＡｄ１、ＶＣＮ−０１、および／またはＰｒｏｓｔＡｔａｋ（商標）から選択される。
【００９８】
ある特定の態様において、本開示による医薬組成物または治療剤の活性成分は、５×１０７〜５×１０１２ＶＰ／日（たとえば、５×１０７〜１．５×１０１２ＶＰ／日、５×１０８〜１×１０１２ＶＰ／日、１×１０９〜５×１０１１ＶＰ／日、３×１０１０〜３×１０１１ＶＰ／日など）の範囲の用量の腫瘍溶解性アデノウイルス、および１×１０７〜１×１０１０細胞／日（たとえば、１×１０８〜５×１０９細胞／日、１×１０９〜４×１０９細胞／日、１×１０９〜３×１０９細胞／日など）の範囲の用量のＮＫ細胞を含む。好ましくは、医薬組成物または治療剤の活性成分は、５×１０７〜５×１０１２ＶＰ／日（たとえば、５×１０７〜１．５×１０１２ＶＰ／日、５×１０８〜１×１０１２ＶＰ／日、１×１０９〜５×１０１１ＶＰ／日、３×１０１０〜３×１０１１ＶＰ／日など）の範囲の用量の腫瘍溶解性アデノウイルス、および１×１０７〜１×１０１０細胞／日（たとえば、１×１０８〜５×１０９細胞／日、１×１０９〜４×１０９細胞／日、１×１０９〜３×１０９細胞／日など）の範囲の用量のＮＫ細胞からなる。
【００９９】
ある態様において、本開示による医薬組成物または治療剤の活性成分は、５×１０７〜１．５×１０１２ＶＰ／日（たとえば、５×１０１１〜１．５×１０１２ＶＰ／日など）の範囲の用量の腫瘍溶解性ウイルスＨ１０１、および１×１０７〜１×１０１０細胞／日の範囲の用量のＮＫ細胞を含む。好ましくは、医薬組成物または治療剤の活性成分は、５×１０７〜１．５×１０１２ＶＰ／日（たとえば、５×１０１１〜１．５×１０１２ＶＰ／日など）の範囲の用量の腫瘍溶解性ウイルスＨ１０１、および１×１０７〜１×１０１０細胞／日（たとえば、１×１０８〜５×１０９細胞／日、１×１０９〜４×１０９細胞／日、１×１０９〜３×１０９細胞／日など）の範囲の用量のＮＫ細胞からなる。
【０１００】
特定の態様において、本開示による医薬組成物または治療剤における腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍溶解能力を有するワクシニアウイルスである（これ以降、「腫瘍溶解性ワクシニアウイルス」とも称される）。幾つかの例において、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、腫瘍溶解能力を有する遺伝子変異型ウイルスおよび腫瘍溶解能力を有する野生型ウイルスから選択される。幾つかの例において、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、ＴＫ遺伝子および／またはＶＧＦ遺伝子が機能的に欠損している。幾つかの例において、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、Ｐｅｘａ−ｖａｃ、ＪＸ−９６３、ＪＸ−９２９、ＶＳＣ２０、ＧＬ−ＯＮＣ１、および／またはＴＧ６００２から選択される。
【０１０１】
ある特定の態様において、本開示による医薬組成物または治療剤の活性成分は、１×１０５〜５×１０９ｐｆｕ／日（たとえば、１×１０５〜３×１０９ｐｆｕ／日、１×１０５〜１×１０８ｐｆｕ／日など）の範囲の用量の腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、および１×１０７〜１×１０１０細胞／日（たとえば、１×１０８〜５×１０９細胞／日、１×１０９〜４×１０９細胞／日、１×１０９〜３×１０９細胞／日など）の範囲の用量のＮＫ細胞を含む。好ましくは、医薬組成物または治療剤の活性成分は、１×１０５〜５×１０９ｐｆｕ／日（たとえば、１×１０５〜３×１０９ｐｆｕ／日、１×１０５〜１×１０８ｐｆｕ／日など）の範囲の用量の腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、および１×１０７〜１×１０１０細胞／日（たとえば、１×１０８〜５×１０９細胞／日、１×１０９〜４×１０９細胞／日、１×１０９〜３×１０９細胞／日など）の範囲の用量のＮＫ細胞からなる。
【０１０２】
当業者であれば、本開示による医薬組成物または治療剤が、好適な薬学的賦形剤も含み得ることを理解することができる。
【０１０３】
本開示による医薬組成物または治療剤はまた、当該技術分野において公知の他の活性成分、たとえば、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）なども含み得る。
【０１０４】
好ましくは、本開示による医薬組成物または治療剤は、ボルテゾミブを含まない。
【０１０５】
幾つかの態様において、本開示の医薬組成物または治療剤は、１つ以上の薬学的に許容される担体を含む。医薬製剤は、当該技術分野において公知の手順によって調製することができる。たとえば、化合物などを含む活性成分を、一般的な賦形剤、希釈剤（たとえば、リン酸緩衝液または生理食塩水）、組織培養培地、および担体（たとえば、自家血漿またはヒト血清アルブミン）とともに製剤化し、懸濁液として投与することができる。他の担体としては、リポソーム、ミセル、ナノカプセル、ポリマーナノ粒子、固体脂質粒子を挙げることができる（たとえば、Ｅ．  Ｋｏｒｅｎ  ａｎｄ  Ｖ．  Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ，  Ｌｉｆｅ，  ６３：５８６−５９５，  ２０１１を参照されたい）。ここで開示される医薬組成物または治療剤の製剤化のための技法の詳細は、科学文献および特許文献に十分に記載されており、たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｍａａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ（「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ」）の最新版を参照されたい。
【０１０６】
幾つかの態様において、本開示は、（ａ）第１の薬学的に許容される担体中に腫瘍溶解性ウイルスを含む第１の医薬組成物と、（ｂ）第２の薬学的に許容される担体中にＮＫ細胞を含む第２の医薬組成物とを含む治療剤であって、腫瘍溶解性ウイルスが、腫瘍細胞において選択的に複製することができる治療剤を提供する。幾つかの態様において、第１および第２の薬学的に許容される担体は、同じである。他の態様において、第１および第２の薬学的に許容される担体は、異なる。
【０１０７】
本開示による医薬組成物または治療剤は、肺がん（たとえば、非小細胞肺がん）、黒色腫、頭頸部がん、肝臓がん、脳がん、結腸直腸がん、膀胱がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、リンパがん、胃がん、食道がん、腎臓がん、前立腺がん、膵臓がん、および白血病などを含むがこれらに限定されない、様々な腫瘍および／またはがんを治療するために使用することができる。
【０１０８】
本開示の医薬組成物または治療剤の適用方法は、次の通りである：まず、腫瘍溶解性ウイルス（たとえば、腫瘍溶解性アデノウイルス、腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、または腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス）を、腫瘍および／またはがんを有する患者に投与し、次いで、腫瘍溶解性ウイルスの投与の１８〜７２時間後（たとえば、２０〜７０時間後、２２〜４８時間後、２４〜４８時間後、３０〜４８時間後など）に、ＮＫ細胞を、腫瘍および／またはがん患者に投与する。「腫瘍溶解性ウイルスの投与の１８〜７２時間後（たとえば、２０〜７０時間後、２２〜４８時間後、２４〜４８時間後、３０〜４８時間後など）に、ＮＫ細胞を、腫瘍および／またはがん患者に投与する」という語句は、ＮＫ細胞の最初の投与と、腫瘍溶解性ウイルスの最初の投与との間の時間間隔が、１８〜７２時間（たとえば、２０〜７０時間、２２〜４８時間、２４〜４８時間、３０〜４８時間など）の範囲であるか、またはＮＫ細胞の最初の投与と、腫瘍溶解性ウイルスの直近の投与との間の時間間隔が、１８〜７２時間（たとえば、２０〜７０時間、２２〜４８時間、２４〜４８時間、３０〜４８時間など）の範囲であることを意味する。好ましくは、ＮＫ細胞の最初の投与と、腫瘍溶解性ウイルスの直近の投与との間の時間間隔は、１８〜７２時間（たとえば、２０〜７０時間、２２〜４８時間、２４〜４８時間、３０〜４８時間など）の範囲である。より好ましくは、ＮＫ細胞の最初の投与と、腫瘍溶解性ウイルスの直近の投与との間の時間間隔は、２４〜４８時間の範囲である。
【０１０９】
本開示の好ましい態様において、腫瘍溶解性ウイルス（たとえば、腫瘍溶解性アデノウイルス、腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、または腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス）は、治療有効用量で、１日１回、１〜６日間連続で投与され、ＮＫ細胞は、１×１０７〜１×１０１０細胞／日（たとえば、１×１０８〜５×１０９細胞／日、１×１０９〜４×１０９細胞／日、または１×１０９〜３×１０９細胞／日）の範囲の用量レベルで、１日１回、１〜６日間連続で投与される。本開示の別の好ましい態様において、腫瘍溶解性ウイルス（たとえば、腫瘍溶解性アデノウイルス、腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、または腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス）は、治療有効用量で、１日おきに、２〜６日間連続で投与され、ＮＫ細胞は、１×１０７〜１×１０１０細胞／日（たとえば、１×１０８〜５×１０９細胞／日、１×１０９〜４×１０９細胞／日、または１×１０９〜３×１０９細胞／日）の範囲の用量レベルで、１日おきに、２〜６日間連続で投与される。ＮＫ細胞が、腫瘍溶解性ウイルス（たとえば、腫瘍溶解性アデノウイルス、腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、または腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス）の投与の１８〜７２時間後に腫瘍および／またはがん患者に投与される限り、上述の態様のうちの任意のもの、または任意の他の代替的な態様を、本開示に従って用いることができる。腫瘍溶解性ウイルスおよびＮＫ細胞は、交互に投与してもよく（たとえば、腫瘍溶解性ウイルスを１日目に投与し、ＮＫ細胞を２日目に投与し、腫瘍溶解性ウイルスを３日目に投与し、ＮＫ細胞を４日目に投与するなど）、または逐次的に投与してもよく（たとえば、腫瘍溶解性ウイルスを１日目に投与し、腫瘍溶解性ウイルスおよびＮＫ細胞を逐次的な順序で２日目に投与し、腫瘍溶解性ウイルスおよびＮＫ細胞を逐次的な順序で３日目に投与し、腫瘍溶解性ウイルスおよびＮＫ細胞を逐次的な順序で４日目に投与するなど）、または他の投薬レジメンを使用して投与してもよい（たとえば、最初に、腫瘍溶解性ウイルスを、１日１回、１〜６日間連続で投与し、１８〜７２時間の間隔を空けた後に、ＮＫ細胞を、１日１回、１〜６日間連続で投与する）。好ましくは、腫瘍溶解性ウイルスを、最初に投与し、ＮＫ細胞を、腫瘍溶解性ウイルスのすべての用量の投与が完了した１８〜７２時間後に投与する。本開示の好ましい態様において、まず、腫瘍および／またはがん患者に、腫瘍溶解性ウイルスを投与し、腫瘍溶解性ウイルスは、治療有効用量で１回のみ投与され、腫瘍溶解性ウイルスの投与の１８〜７２時間後に、腫瘍および／またはがん患者に、ＮＫ細胞を投与し、ＮＫ細胞は、１×１０７〜１×１０１０細胞／日（たとえば、１×１０８〜５×１０９細胞／日、１×１０９〜４×１０９細胞／日、または１×１０９〜３×１０９細胞／日）の範囲の用量レベルで１回のみ投与される。様々な腫瘍溶解性ウイルスについて、臨床適用に好適な様々な好ましい用量範囲、たとえば、表１に列挙されるものが、選択され得る。
【０１１０】
腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍またはがん細胞において選択的に複製することができ、その量は、ある特定の期間後に、ピークに達する。本開示の発明者らは、ウイルス複製期間の後に、腫瘍細胞中の腫瘍溶解性ウイルスが、ＮＫ細胞の腫瘍細胞に対する殺滅作用を促進し得ることを発見した。したがって、本開示において提案される腫瘍溶解性ウイルスおよびＮＫ細胞の投与間の間隔は、それらの機能のピーク値が重なることを可能にし得るものである。
【０１１１】
本開示はまた、腫瘍および／またはがんの治療のための薬物の調製のための本開示の医薬組成物または治療剤の使用を提供する。
【０１１２】
腫瘍および／またはがんには、肺がん（たとえば、非小細胞肺がん）、黒色腫、頭頸部がん、肝臓がん、脳がん、結腸直腸がん、膀胱がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、リンパがん、胃がん、食道がん、腎臓がん、前立腺がん、膵臓がん、および白血病などが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１３】
本開示はまた、腫瘍および／またはがんの治療のための相乗作用を有する組合せ薬物のキットであって、本開示による腫瘍溶解性ウイルスを含む第１の容器およびＮＫ細胞を含む第２の容器を含み、第１の容器が、第２の容器とは別個である、キットを提供する。キットは、投与のタイミングおよび経路を示す説明書をさらに含み、ここで、腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍細胞において選択的に複製することができる。好ましくは、キットは、本開示による腫瘍溶解性ウイルスおよびＮＫ細胞をそれぞれ含む独立した容器、ならびに投与のタイミングおよび経路を示す説明書からなる。
【０１１４】
腫瘍および／またはがんには、肺がん（たとえば、非小細胞肺がん）、黒色腫、頭頸部がん、肝臓がん、脳がん、結腸直腸がん、膀胱がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、リンパがん、胃がん、食道がん、腎臓がん、前立腺がん、膵臓がん、および白血病などが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１５】
好ましくは、キットに含まれる腫瘍溶解性ウイルスを含む第１の容器は、治療有効用量の腫瘍溶解性ウイルスを含み、ＮＫ細胞を含む第２の容器は、１×１０７〜１×１０１０細胞／日（たとえば、１×１０８〜５×１０９細胞／日、１×１０９〜４×１０９細胞／日、１×１０９〜３×１０９細胞／日など）の範囲の用量を提供するのに十分な量のＮＫ細胞を含む。様々な腫瘍溶解性ウイルスについて、臨床適用に好適な様々な好ましい用量範囲、たとえば、表１に列挙されるものが、選択され得る。
【０１１６】
腫瘍溶解性ウイルスは、当該技術分野において広く使用されているそれぞれの経路を通じて投与することができ、たとえば、それらは、腫瘍内注入を介して投与され得るか、または静脈内投与され得る。
【０１１７】
ＮＫ細胞は、当該技術分野において広く使用されている経路を通じて投与することができ、たとえば、それらは、静脈内投与され得る。
【０１１８】
本開示によるキットの特定の態様において、腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍溶解能力を有するアデノウイルスである。幾つかの例において、腫瘍溶解性アデノウイルスのＥ１領域および／またはＥ３領域は、遺伝子修飾されている。幾つかの例において、腫瘍溶解性アデノウイルスは、Ｏｎｙｘ−０１５、Ｈ１０１、Ａｄ５−ｙＣＤ／ｍｕｔＴＫＳＲ３９ｒｅｐ−ｈＩＬ１２、ＣＧ００７０、ＤＮＸ−２４０１、ＯＢＰ−３０１、ＯＮＣＯＳ−１０２、ＣｏｌｏＡｄ１、ＶＣＮ−０１、および／またはＰｒｏｓｔＡｔａｋ（商標）から選択される。
【０１１９】
本開示によるキットの特定の態様において、第１の容器は、５×１０７〜５×１０１２ＶＰ／日（たとえば、５×１０７〜１．５×１０１２ＶＰ／日、５×１０８〜１×１０１２ＶＰ／日、１×１０９〜５×１０１１ＶＰ／日、３×１０１０〜３×１０１１ＶＰ／日など）の範囲の用量の腫瘍溶解性アデノウイルスを含む。
【０１２０】
ある態様において、第１の容器は、５×１０７〜１．５×１０１２ＶＰ／日（たとえば、５×１０１１〜１．５×１０１２ＶＰ／日など）の範囲の用量の腫瘍溶解性ウイルスＨ１０１を含む。
【０１２１】
本開示によるキットの特定の態様において、腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスである。幾つかの例において、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、腫瘍溶解能力を有する遺伝子変異型ウイルスおよび腫瘍溶解能力を有する野生型ウイルスから選択される。幾つかの例において、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、ＴＫ遺伝子および／またはＶＧＦ遺伝子が機能的に欠損している。幾つかの例において、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、Ｐｅｘａ−ｖａｃ、ＪＸ−９６３、ＪＸ−９２９、ＶＳＣ２０、ＧＬ−ＯＮＣ１、および／またはＴＧ６００２から選択される。
【０１２２】
本開示によるキットの特定の態様において、第１の容器は、１×１０５〜５×１０９ｐｆｕ／日（たとえば、１×１０５〜３×１０９ｐｆｕ／日、１×１０５〜１×１０８ｐｆｕ／日など）の範囲の用量の腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを含む。
【０１２３】
本開示はまた、腫瘍および／またはがんの治療のための方法であって、逐次的な様式で、以下の工程：
１）本開示による腫瘍溶解性ウイルスを、腫瘍および／またはがん患者に投与する工程であって、腫瘍溶解性ウイルスが、腫瘍細胞において選択的に複製することができる工程と、
２）腫瘍溶解性ウイルスの投与の１８〜７２時間後（たとえば、２０〜７０時間後、２２〜４８時間後、２４〜４８時間後、３０〜４８時間後など）に、本開示によるＮＫ細胞を、腫瘍および／またはがん患者に投与する工程と
を含む方法を提供する。
【０１２４】
「腫瘍溶解性ウイルスの投与の１８〜７２時間後（たとえば、２０〜７０時間後、２２〜４８時間後、２４〜４８時間後、３０〜４８時間後など）に、本開示によるＮＫ細胞を、腫瘍および／またはがん患者に投与する」という語句は、ＮＫ細胞の最初の投与と、腫瘍溶解性ウイルスの最初の投与との間の時間間隔が、１８〜７２時間（たとえば、２０〜７０時間、２２〜４８時間、２４〜４８時間、３０〜４８時間など）の範囲であるか、またはＮＫ細胞の最初の投与と、腫瘍溶解性ウイルスの直近の投与との間の時間間隔が、１８〜７２時間（たとえば、２０〜７０時間、２２〜４８時間、２４〜４８時間、３０〜４８時間など）の範囲であることを意味する。好ましくは、ＮＫ細胞の最初の投与と、腫瘍溶解性ウイルスの直近の投与との間の時間間隔は、１８〜７２時間（たとえば、２０〜７０時間、２２〜４８時間、２４〜４８時間、３０〜４８時間など）の範囲である。より好ましくは、ＮＫ細胞の最初の投与と、腫瘍溶解性ウイルスの直近の投与との間の時間間隔は、２４〜４８時間の範囲である。
【０１２５】
腫瘍および／またはがんには、肺がん（たとえば、非小細胞肺がん）、黒色腫、頭頸部がん、肝臓がん、脳がん、結腸直腸がん、膀胱がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、リンパがん、胃がん、食道がん、腎臓がん、前立腺がん、膵臓がん、および白血病などが含まれるが、これらに限定されない。
【０１２６】
本開示の好ましい態様において、腫瘍溶解性ウイルスは、治療有効用量で、１日１回、１〜６日間連続で投与され、ＮＫ細胞は、１×１０７〜１×１０１０細胞／日（たとえば、１×１０８〜５×１０９細胞／日、１×１０９〜４×１０９細胞／日、または１×１０９〜３×１０９細胞／日）の範囲の用量レベルで、１日１回、１〜６日間連続で投与される。本開示の別の好ましい態様において、腫瘍溶解性ウイルスは、治療有効用量で、１日おきに、２〜６日間連続で投与され、ＮＫ細胞は、１×１０７〜１×１０１０細胞／日（たとえば、１×１０８〜５×１０９細胞／日、１×１０９〜４×１０９細胞／日、または１×１０９〜３×１０９細胞／日）の範囲の用量レベルで、１日おきに、２〜６日間連続で投与される。ＮＫ細胞が、腫瘍溶解性ウイルスの投与の１８〜７２時間後に腫瘍および／またはがん患者に投与される限り、上述の態様のうちの任意のもの、または任意の他の代替的な態様を、本開示に従って用いることができる。腫瘍溶解性ウイルスおよびＮＫ細胞は、交互に投与してもよく（たとえば、腫瘍溶解性ウイルスを１日目に投与し、ＮＫ細胞を２日目に投与し、腫瘍溶解性ウイルスを３日目に投与し、ＮＫ細胞を４日目に投与するなど）、または逐次的に投与してもよく（たとえば、腫瘍溶解性ウイルスを１日目に投与し、腫瘍溶解性ウイルスおよびＮＫ細胞を逐次的な順序で２日目に投与し、腫瘍溶解性ウイルスおよびＮＫ細胞を逐次的な順序で３日目に投与し、腫瘍溶解性ウイルスおよびＮＫ細胞を逐次的な順序で４日目に投与するなど）、または他の投薬レジメンを使用して投与してもよい（たとえば、最初に、腫瘍溶解性ウイルスを、１日１回、１〜６日間連続で投与し、１８〜７２時間の間隔を空けた後に、ＮＫ細胞を、１日１回、１〜６日間連続で投与する）。好ましくは、腫瘍溶解性ウイルスを、最初に投与し、ＮＫ細胞を、腫瘍溶解性ウイルスのすべての用量の投与が完了した１８〜７２時間後に投与する。本開示の好ましい態様において、まず、腫瘍および／またはがん患者に、腫瘍溶解性ウイルスを投与し、腫瘍溶解性ウイルスは、治療有効用量で１回のみ投与され、腫瘍溶解性ウイルスの投与の１８〜７２時間後に、腫瘍および／またはがん患者に、ＮＫ細胞を投与し、ＮＫ細胞は、１×１０７〜１×１０１０細胞／日（たとえば、１×１０８〜５×１０９細胞／日、１×１０９〜４×１０９細胞／日、または１×１０９〜３×１０９細胞／日）の範囲の用量レベルで１回のみ投与される。様々な腫瘍溶解性ウイルスについて、臨床適用に好適な様々な好ましい用量範囲、たとえば、表１に列挙されるものが、選択され得る。
【０１２７】
特定の状況および必要性に基づいて、本開示による腫瘍および／またはがんの治療のための方法は、１回または複数回、患者に適用することができる。
【０１２８】
腫瘍溶解性ウイルスは、当該技術分野において広く使用されているそれぞれの経路を通じて投与することができ、たとえば、それらは、腫瘍内注入を介して投与され得るか、または静脈内投与され得る。
【０１２９】
ＮＫ細胞は、当該技術分野において広く使用されている経路を通じて投与することができ、たとえば、それらは、静脈内投与され得る。
【０１３０】
本開示による方法の特定の態様において、腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍溶解能力を有するアデノウイルスである。幾つかの例において、腫瘍溶解性アデノウイルスのＥ１領域および／またはＥ３領域は、遺伝子修飾されている。幾つかの例において、腫瘍溶解性アデノウイルスは、Ｏｎｙｘ−０１５、Ｈ１０１、Ａｄ５−ｙＣＤ／ｍｕｔＴＫＳＲ３９ｒｅｐ−ｈＩＬ１２、ＣＧ００７０、ＤＮＸ−２４０１、ＯＢＰ−３０１、ＯＮＣＯＳ−１０２、ＣｏｌｏＡｄ１、ＶＣＮ−０１、および／またはＰｒｏｓｔＡｔａｋ（商標）から選択される。
【０１３１】
本開示による方法のある特定の態様において、腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍溶解性アデノウイルスであり、その投薬量は、５×１０７〜５×１０１２ＶＰ／日（たとえば、５×１０７〜１．５×１０１２ＶＰ／日、５×１０８〜１×１０１２ＶＰ／日、１×１０９〜５×１０１１ＶＰ／日、３×１０１０〜３×１０１１ＶＰ／日など）の範囲に及ぶ。
【０１３２】
ある態様において、腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍溶解性ウイルスＨ１０１であり、その投薬量は、５×１０７〜１．５×１０１２ＶＰ／日（たとえば、５×１０１１〜１．５×１０１２ＶＰ／日など）の範囲に及ぶ。
【０１３３】
本開示による方法の特定の態様において、腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスである。幾つかの例において、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、腫瘍溶解能力を有する遺伝子変異型ウイルスおよび腫瘍溶解能力を有する野生型ウイルスから選択される。幾つかの例において、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、ＴＫ遺伝子および／またはＶＧＦ遺伝子が機能的に欠損している。幾つかの例において、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、Ｐｅｘａ−ｖａｃ、ＪＸ−９６３、ＪＸ−９２９、ＶＳＣ２０、ＧＬ−ＯＮＣ１、および／またはＴＧ６００２から選択される。
【０１３４】
本開示による方法のある特定の態様において、腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスであり、その投薬量は、１×１０５〜５×１０９ｐｆｕ／日（たとえば、１×１０５〜３×１０９ｐｆｕ／日、１×１０５〜１×１０８ｐｆｕ／日など）の範囲に及ぶ。
【発明の例示的な態様】
【０１３５】
本発明の非限定的な態様の一覧を、以下に提供する。
【０１３６】
１．（ａ）第１の薬学的に許容される担体中に腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを含む第１の医薬組成物と、
（ｂ）第２の薬学的に許容される担体中にＮＫ細胞を含む第２の医薬組成物と
を含む治療剤であって、
腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、腫瘍細胞において選択的に複製することができる治療剤。
【０１３７】
２．第１の医薬組成物および第２の医薬組成物が、一緒に混合されることなく、治療剤中に別々に存在する、態様１に記載の治療剤。
【０１３８】
３．第１の医薬組成物の活性成分が、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスであり；第２の医薬組成物の活性成分が、ＮＫ細胞である、態様１に記載の治療剤。
【０１３９】
４．第１の医薬組成物が、治療有効用量の腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを含み、第２の医薬組成物が、１×１０７〜１×１０１０細胞／日の範囲の用量のＮＫ細胞を含む、態様１に記載の治療剤。
【０１４０】
５．腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、腫瘍溶解能力を有する遺伝子変異型ウイルスおよび腫瘍溶解能力を有する野生型ウイルスから選択される、態様１に記載の治療剤。
【０１４１】
６．腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、ＴＫ遺伝子および／またはＶＧＦ遺伝子が機能的に欠損している、態様１に記載の治療剤。
【０１４２】
７．腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、Ｐｅｘａ−ｖａｃ、ＪＸ−９６３、ＪＸ−９２９、ＶＳＣ２０、ＧＬ−ＯＮＣ１、および／またはＴＧ６００２から選択される、態様１に記載の治療剤。
【０１４３】
８．ＮＫ細胞が、自家ＮＫ細胞および同種ＮＫ細胞から選択される、態様１に記載の治療剤。
【０１４４】
９．ＮＫ細胞が、インビトロで増殖させた自家ＮＫ細胞またはインビトロで増殖させた同種ＮＫ細胞である、態様８に記載の治療剤。
【０１４５】
１０．腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、腫瘍内注入を介して投与されるかまたは静脈内投与されるように製剤化され；ＮＫ細胞が、静脈内投与されるように製剤化される、態様１に記載の治療剤。
【０１４６】
１１．第１の医薬組成物の活性成分が、１×１０５〜５×１０９ｐｆｕ／日の範囲の用量の腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを含み；第２の医薬組成物の活性成分が、１×１０７〜１×１０１０細胞／日の範囲の用量のＮＫ細胞を含む、態様１に記載の治療剤。
【０１４７】
１２．第１の医薬組成物および第２の医薬組成物からなる、態様１に記載の治療剤。
【０１４８】
１３．腫瘍および／またはがんの治療のための薬物の調製のための態様１〜１２の何れか１つに記載の治療剤の使用。
【０１４９】
１４．腫瘍および／またはがんが、肺がん、黒色腫、頭頸部がん、肝臓がん、脳がん、結腸直腸がん、膀胱がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、リンパがん、胃がん、食道がん、腎臓がん、前立腺がん、膵臓がん、および白血病を含む、態様１３に記載の使用。
【０１５０】
１５．腫瘍および／またはがんの治療のための相乗作用を有する組合せ薬物のキットであって、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを含む第１の容器と、ＮＫ細胞を含む第２の容器と、投与のタイミングおよび経路を示す説明書とを含み、第１の容器が、第２の容器とは別個であり、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、腫瘍細胞において選択的に複製することができる、キット。
【０１５１】
１６．第１の容器が、治療有効用量の腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを含み、第２の容器が、１×１０７〜１×１０１０細胞／日の範囲の用量のＮＫ細胞を含む、態様１５に記載のキット。
【０１５２】
１７．腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、腫瘍溶解能力を有する遺伝子変異型ウイルスおよび腫瘍溶解能力を有する野生型ウイルスから選択される、態様１５に記載のキット。
【０１５３】
１８．腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、ＴＫ遺伝子および／またはＶＧＦ遺伝子が機能的に欠損している、態様１５に記載のキット。
【０１５４】
１９．腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、Ｐｅｘａ−ｖａｃ、ＪＸ−９６３、ＪＸ−９２９、ＶＳＣ２０、ＧＬ−ＯＮＣ１、および／またはＴＧ６００２から選択される、態様１５に記載のキット。
【０１５５】
２０．ＮＫ細胞が、自家ＮＫ細胞および同種ＮＫ細胞から選択される、態様１５に記載のキット。
【０１５６】
２１．ＮＫ細胞が、インビトロで増殖させた自家ＮＫ細胞またはインビトロで増殖させた同種ＮＫ細胞である、態様２０に記載のキット。
【０１５７】
２２．腫瘍および／またはがんが、肺がん、黒色腫、頭頸部がん、肝臓がん、脳がん、結腸直腸がん、膀胱がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、リンパがん、胃がん、食道がん、腎臓がん、前立腺がん、膵臓がん、および白血病を含む、態様１５に記載のキット。
【０１５８】
２３．腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、腫瘍内注入を介して投与されるかまたは静脈内投与されるように製剤化され；ＮＫ細胞が、静脈内投与されるように製剤化される、態様１５に記載のキット。
【０１５９】
２４．第１の容器が、１×１０５〜５×１０９ｐｆｕ／日の範囲の用量の腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを含み、第２の容器が、１×１０７〜１×１０１０細胞／日の範囲の用量のＮＫ細胞を含む、態様１５に記載のキット。
【０１６０】
２５．腫瘍および／またはがんを治療するための方法であって、逐次的な様式で、以下の工程：
１）腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを、腫瘍および／またはがん患者に投与する工程であって、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、腫瘍細胞において選択的に複製することができる工程と、
２）腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの投与の１８〜７２時間後に、ＮＫ細胞を、腫瘍および／またはがん患者に投与する工程と
を含む方法。
【０１６１】
２６．腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、腫瘍溶解能力を有する遺伝子変異型ウイルスおよび腫瘍溶解能力を有する野生型ウイルスから選択される、態様２５に記載の方法。
【０１６２】
２７．腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、ＴＫ遺伝子および／またはＶＧＦ遺伝子が機能的に欠損している、態様２５に記載の方法。
【０１６３】
２８．腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、Ｐｅｘａ−ｖａｃ、ＪＸ−９６３、ＪＸ−９２９、ＶＳＣ２０、ＧＬ−ＯＮＣ１、および／またはＴＧ６００２から選択される、態様２５に記載の方法。
【０１６４】
２９．ＮＫ細胞が、自家ＮＫ細胞および同種ＮＫ細胞から選択される、態様２５に記載の方法。
【０１６５】
３０．ＮＫ細胞が、インビトロで増殖させた自家ＮＫ細胞またはインビトロで増殖させた同種ＮＫ細胞である、態様２９に記載の方法。
【０１６６】
３１．腫瘍および／またはがんが、肺がん、黒色腫、頭頸部がん、肝臓がん、脳がん、結腸直腸がん、膀胱がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、リンパがん、胃がん、食道がん、腎臓がん、前立腺がん、膵臓がん、および白血病を含む、態様２５に記載の方法。
【０１６７】
３２．腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、治療有効用量で、１日１回、１〜６日間連続で投与される、態様２５に記載の方法。
【０１６８】
３３．ＮＫ細胞が、１×１０７〜１×１０１０細胞／日の範囲の用量レベルで、１日１回、１〜６日間連続で投与される、態様２５に記載の方法。
【０１６９】
３４．腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、治療有効用量で、１日おきに、２〜６日間連続で投与される、態様２５に記載の方法。
【０１７０】
３５．ＮＫ細胞が、１×１０７〜１×１０１０細胞／日の範囲の用量レベルで、１日おきに、２〜６日間連続で投与される、態様２５に記載の方法。
【０１７１】
３６．腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、腫瘍内注入を介して投与されるかまたは静脈内投与され；ＮＫ細胞が、静脈内投与される、態様２５に記載の方法。
【０１７２】
３７．腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの投薬量が、１×１０５〜５×１０９ｐｆｕ／日の範囲に及ぶ、態様２５に記載の方法。
【０１７３】
以下に、本開示を、例を用いてさらに説明または記載するが、これらの例は、本開示の保護の範囲を制限することを意図するものではない。
【実施例】
【０１７４】
別途指定されない限り、それぞれの薬剤の濃度割合（％）はすべて、体積を基準とした割合である（％（体積／体積））。
【０１７５】
以下の例において使用した材料を、以下に説明する。
【０１７６】
１．腫瘍細胞
Ａ５４９（ヒト非小細胞肺がん細胞）、ＨｅｐＧ２（ヒト肝細胞癌細胞）、ＨＴ２９（ヒト結腸がん細胞）、ＨＣＴ１１６（ヒト結腸直腸がん細胞）、ＦａＤｕ（ヒト頭頸部がん細胞）、ＳＫ−ＨＥＰ−１（ヒト肝細胞癌細胞）、ＰＡＮＣ−１（ヒト膵臓がん細胞）などは、Ｃｈｉｎａ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｆｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅから入手した。細胞を、通常の環境において培養した：ＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ、ＤＭＥＭ：Ｆ１２（１：１）＋１０％  ＦＢＳ、マッコイ５Ａ＋１０％  ＦＢＳ、またはＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ。ＤＭＥＭ：Ｆ１２（１：１）は、Ｈｙｃｌｏｎｅから購入し、一方で、ＤＭＥＭ、マッコイ５Ａ、およびＭＥＭは、ＧＩＢＣＯから購入した。ウシ胎児血清（ＦＢＳ）は、ＧＩＢＣＯ  Ｉｎｃから購入した。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）およびその培養系は、両方とも、ＡＬＬＣＥＬＬＳ  ＬＬＣ，Ｇｅｒｍａｎｙから購入した。
【０１７７】
２．ＮＫ細胞
実験において使用したＮＫ細胞の供給源は、次の通りである：
１）群Ａのそれぞれの例において使用したＮＫ細胞は、Ｈａｎｇｚｈｏｕ  Ｄｉｎｇ  Ｙｕｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏ．，Ｌｔｄから購入した、サンプル番号０２１５１１１７０３のヒトＮＫ細胞であった。
【０１７８】
２）群Ｂ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、およびＪのそれぞれの例において使用したＮＫ細胞は、Ｈａｎｇｚｈｏｕ  ＣｏｎＶｅｒｄ  Ｃｏ．，Ｌｔｄによって培養および凍結保存されているヒトＮＫ細胞であった。ヒトＮＫ細胞は、以下のプロセスによって調製した。当該技術分野において広く使用されている技法として、免疫細胞ＰＢＭＣの抽出のために、採血針を、尺骨静脈に挿入して、健常な人物の末梢静脈血を採取した。照射したＫ５６２フィーダー細胞（Ｈａｎｇｚｈｏｕ  Ｄｉｎｇ  Ｙｕｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入）を使用して、自家血漿培養によってＮＫ細胞を増殖させ、ＮＫ細胞は、最大で９０％の最終的な純度、最大で９０％の生存率、および最大で８５％のインビトロでの腫瘍細胞殺滅率を有した。
【０１７９】
３）群ＤおよびＥのそれぞれの例において使用したＮＫ細胞は、Ｈａｎｇｚｈｏｕ  Ｄｉｎｇ  Ｙｕｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏ．，Ｌｔｄから購入した、サンプル番号０１１６０１０８０５のヒトＮＫ細胞である。
【０１８０】
３．腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）
腫瘍溶解性アデノウイルスＨ１０１は、Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｓｕｎｗａｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏ．，Ｌｔｄから入手した。
【０１８１】
腫瘍溶解性ワクシニアウイルスｄｄｖｖ−ＲＦＰは、公知であり、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスＷＲ株に属する（たとえば、「Ｘ  Ｓｏｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔ−ｃｅｌｌ  Ｅｎｇａｇｅｒ−ａｒｍｅｄ  Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  Ｖａｃｃｉｎｉａ  Ｖｉｒｕｓ  Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ  Ｅｎｈａｎｃｅｓ  Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ＴｈｅｒａｐｙＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ．  （２０１４）；  ２２  １，  １０２−１１１」を参照されたい）。腫瘍溶解性ワクシニアウイルスｄｄｖｖ−ＲＦＰは、ＴＫ遺伝子とＶＧＦ遺伝子の両方が機能的に欠損しており、外因性の赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）遺伝子を有している。ＲＦＰ遺伝子は、スクリーニング／報告の役割のみを果たすため、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスｄｄｖｖ−ＲＦＰの抗腫瘍機能は、ＴＫ遺伝子およびＶＧＦ遺伝子が機能的に欠損している腫瘍溶解性ワクシニアウイルスと実質的に同等である。また、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスｄｄｖｖ−ＲＦＰは、当該技術分野における従来的な技法を使用したＶＳＣ２０ワクシニアウイルスの遺伝子修飾によって得ることができる。ＶＳＣ２０ワクシニアウイルスは、ＶＧＦ遺伝子が欠如したワクシニアウイルスである。ＶＳＣ２０ワクシニアウイルスの調製方法については、「ＭｃＣａｒｔ，  ＪＡ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ａ  ｔｕｍｏｒ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｍｕｔａｎｔ  ｌａｃｋｉｎｇ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ａｎｄ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｇｅｎｅｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  （２００１）  ６１：  ８７５１−８７５７」を参照されたい。遺伝子修飾は、外因性ＤｓＲｅｄ遺伝子（すなわち、ＲＦＰ遺伝子）を調節するための人工合成ワクシニアウイルス初期／後期プロモーターｐＳＥＬの使用、ならびにインビトロ細胞内組換え技法を使用したワクシニアウイルスＶＳＣ２０株のＴＫ遺伝子領域へのＤｓＲｅｄ遺伝子の挿入を含み、それによって、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスｄｄｖｖ−ＲＦＰが構築される。
【０１８２】
４．培養プレート
２４ウェルの細胞培養プレート（１ウェル当たり５００μｌ、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．）を、群Ａ〜Ｊのそれぞれの例において使用した（実験例Ｃ１１およびＣ１２を除く）。１２ウェルの細胞培養プレート（１ウェル当たり１ｍｌ、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．）を、実験例Ｃ１１およびＣ１２のそれぞれにおいて使用した。
【０１８３】
以下の例において使用した細胞計数方法を、以下に説明する。
【０１８４】
トリパンブルー染色法を使用した細胞計数：細胞を、ＰＢＳで洗浄し、トリプシンを使用して消化させた後、細胞を、ＰＢＳ中に懸濁させた。懸濁液に、トリパンブルー溶液を、０．０４％（重量／体積）の最終濃度まで添加した。次いで、顕微鏡下において細胞計数を行ったが、このとき、死細胞は、青色に染色され、生細胞は、何れの色もない透明に見えた。生細胞計数を、最終的なデータとして使用した。
【０１８５】
以下の例における腫瘍細胞に対する腫瘍溶解性ウイルスの用量応答実験および殺滅実験において、腫瘍細胞を、まず腫瘍溶解性ウイルスに感染させ、次いで、培養またはインキュベートする場合、腫瘍溶解性ウイルスを添加した時点を、０時間とした。
【０１８６】
Ａ：腫瘍溶解性アデノウイルスおよびＮＫ細胞の組合せ適用のＡ５４９細胞に対する殺滅作用に関する研究
実験例Ａ１：Ａ５４９細胞に対するＮＫ細胞の用量応答実験
Ａ５４９細胞を、３０％のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、３７℃で５％  ＣＯ２において、ＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ中で４８時間インキュベートした。次いで、培地を、新しいＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳで置きかえ、ＮＫ細胞を、以下のエフェクター対標的細胞の比（すなわち、Ｅ：Ｔ、細胞数の比）で添加した：ＮＫ：Ａ５４９＝それぞれ２０：１、１０：１、５：１、２．５：１、および１．２５：１。それぞれのＥ：Ｔ比での殺滅プロセスは、細胞を３７℃で５％  ＣＯ２においてインキュベートした状態で、それぞれ、２４時間および４８時間行った。その後に、トリパンブルー染色法を、生存Ａ５４９細胞の計数に使用し、ＮＫ細胞によるＡ５４９細胞の殺滅率を、ＮＫ細胞を添加しなかった対照群に対して計算した。用量応答曲線のＸ軸は、Ｅ：Ｔ比を表し、Ｙ軸は、阻害率（ＩＲ）の百分率値を表す。殺滅時間（すなわち、ＮＫ細胞を腫瘍細胞培養物に導入した時間から、殺滅が検出された時間までの期間）が４８時間であった実験の結果を、図１に示すが、これは、Ｅ：Ｔ比が５：１のときに、約１４％の阻害率を呈し、好適な用量レベルを示している。この投薬量を、組合せ殺滅実験において使用するＮＫ細胞の用量レベルとして採用した。殺滅作用は、殺滅時間が２４時間であった場合には、殺滅時間が４８時間であった場合のものと比較して、より弱かった。したがって、ＮＫ細胞の好適な殺滅時間の長さは、約４８時間であった。
【０１８７】
実験例Ａ２：Ａ５４９細胞に対するＨ１０１の用量応答実験
Ａ５４９細胞を、３０％のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、３７℃で５％  ＣＯ２において、ＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ中で２４時間インキュベートした。次いで、培地を、新しい無血清ＤＭＥＭで置きかえ、Ｈ１０１を、それぞれ、３４０、１７０、８５、４２．５、および２１．２５のＭＯＩで添加した。Ｈ１０１を添加した時点を、０時間とした（以下同様）。感染プロセスは、細胞を３７℃で５％  ＣＯ２においてインキュベートした状態で、６時間継続させ、次いで、培地を除去し、細胞を、ＰＢＳで洗浄した。次いで、新しいＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳを添加し、細胞を、さらに７２時間インキュベートした。その後に、トリパンブルー染色法を、生存Ａ５４９細胞の計数に使用し、Ｈ１０１によるＡ５４９細胞の殺滅率を、Ｈ１０１を添加しなかった対照群に対して計算した。図２は、用量応答曲線（Ｘ軸は、ＭＯＩを表し、Ｙ軸は、阻害率（ＩＲ）の百分率値を表す）を示すが、これは、Ａ５４９細胞に対するＨ１０１の用量レベルが約８５のＭＯＩであるときに、約３７％の阻害率を呈し、好適な用量レベルを示している。この投薬量を、組合せ殺滅実験において使用するＨ１０１の用量レベルとして採用した。
【０１８８】
実験例Ａ３：Ｈ１０１によるＡ５４９細胞の感染時間の長さの実験
好適な感染作用を達成するために、Ｈ１０１によるＡ５４９細胞の様々な長さの感染時間について試験した。Ａ５４９細胞を、３０％のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、３７℃で５％  ＣＯ２において、ＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ中で２４時間インキュベートした。次いで、培地を、無血清ＤＭＥＭまたはＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳのいずれかで置きかえ、Ｈ１０１を添加した（ＭＯＩ＝８５）。無血清ＤＭＥＭ環境の細胞については、感染プロセスを、それぞれ、２または６時間継続させた。ＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ環境の細胞については、感染プロセスを、２４時間継続させた。すべての感染プロセスは、３７℃で５％  ＣＯ２において行った。ウイルスを洗い流した後、新しいＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳを添加し、細胞を、３７℃で５％  ＣＯ２において、それぞれ、２４時間、４８時間、または７２時間インキュベートした。その後に、生存Ａ５４９細胞を、トリパンブルー染色法を使用して計数し、Ａ５４９細胞の阻害率を比較した。
【０１８９】
結果は、Ｈ１０１によるＡ５４９細胞の感染に好適な時間の長さは、無血清環境では約６時間であり、Ｈ１０１の細胞内複製に好適な時間の長さは、約２４時間であったことを示した。
【０１９０】
例Ａ４：Ｈ１０１およびＮＫの組合せ殺滅実験
上述の実験例から、Ａ５４９に対する殺滅に好適なＨ１０１の用量レベルは、約８５のＭＯＩであり、Ｈ１０１によるＡ５４９細胞の感染に好適な時間の長さは、約６時間であり、Ｈ１０１の細胞内複製に好適な時間の長さは、約２４時間であり、Ａ５４９細胞に対する殺滅に好適なＮＫ細胞の用量レベルは、約５：１のＥ：Ｔ比（すなわち、ＮＫ：Ａ５４９）であり、ＮＫ細胞による殺滅に好適な時間の長さは、約４８時間であったと結論付けることができる。
【０１９１】
Ａ５４９細胞を、３０％のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、３７℃で５％  ＣＯ２において、ＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ中で２４時間インキュベートした。次いで、培地を、無血清ＤＭＥＭで置きかえ、Ｈ１０１を添加した（ＭＯＩ＝８５）。６時間感染させた後、培地を、ＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳで置きかえ、細胞を、３７℃で５％  ＣＯ２において、２４時間インキュベートした。培地を、新しいＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳで置きかえ、ＮＫ細胞を添加し（Ｅ：Ｔ比（ＮＫ：Ａ５４９）＝５：１）、細胞を、さらに４８時間インキュベートした。死細胞および残屑を洗い流し、トリパンブルー染色法を、残っている生存Ａ５４９細胞の計数に使用した。この実験には、ウイルスもＮＫ細胞もＡ５４９細胞に添加していないブランク対照群、Ｈ１０１をその対応する時点で添加したが、ＮＫ細胞を添加していないＨ１０１群、およびＮＫ細胞をその対応する時点で添加したが、Ｈ１０１を添加していないＮＫ群も、存在した。すべての対照群に、対応する時間において対応する培地置きかえ操作を行った。すべての実験を、３回にわたって繰り返し、平均を、統計学的分析に使用した。
【０１９２】
図３に示されるように（Ｘ軸は、様々な群を表し、Ｙ軸は、対応する阻害率の百分率値を表す）、Ｈ１０１およびＮＫ細胞の組合せ適用（腫瘍溶解性ウイルスを最初に投与し、ＮＫ細胞を後から投与する）は、Ａ５４９細胞に対して有意な相乗殺滅作用を有し、相乗阻害率は、約７８％であった。しかしながら、この実験において、Ｈ１０１の単独適用の阻害率は、約４１％であり、ＮＫ細胞の単独適用の阻害率は、約２０％であった。
【０１９３】
Ｈ１０１の添加による感染の後、細胞を、２４時間ではなく４８時間インキュベートしたことを除き、上述のものと類似である別の実験において、Ｈ１０１およびＮＫ細胞の組合せ適用（腫瘍溶解性ウイルスを最初に投与し、ＮＫ細胞を後から投与する）が、Ａ５４９細胞に対して有意な相乗殺滅作用を有し、相乗阻害率は、約８０％であったことも、結果により示された。
【０１９４】
比較例Ａ５：薬物の組合せ同時投与
Ａ５４９細胞を、３０％のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、３７℃で５％  ＣＯ２において、ＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ中で２４時間インキュベートした。次いで、培地を、新しいＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳで置きかえ、Ｈ１０１（ＭＯＩ＝８５）およびＮＫ細胞（Ｅ：Ｔ比（ＮＫ：Ａ５４９）＝５：１）を、同時に添加した。細胞を、さらに７２時間インキュベートし、次いで、死細胞および残屑を洗い流し、残っている生存Ａ５４９細胞を、トリパンブルー染色法を使用して計数した。この実験には、ウイルスもＮＫ細胞もＡ５４９細胞に添加していないブランク対照群、Ｈ１０１をその対応する時点で添加したが、ＮＫ細胞を添加していないＨ１０１群、およびＮＫ細胞をその対応する時点で添加したが、Ｈ１０１を添加していないＮＫ群も、存在した。すべての対照群に、対応する時間において対応する培地置きかえ操作を行った。すべての実験を、３回にわたって繰り返し、平均を、統計学的分析に使用した。
【０１９５】
図４に示されるように（Ｘ軸は、様々な群を表し、Ｙ軸は、対応する阻害率の百分率値を表す）、Ｈ１０１の単独適用の阻害率は、約４７％であり、ＮＫ細胞の単独適用の阻害率は、約１６％であった。これらの単独適用と比較して、ＮＫ細胞およびＨ１０１の組合せ使用の阻害率は、約５５％であったため増加していたが、しかしながら、例Ａ４と比較して有意な相乗作用は示されなかった（図５に示される比較を参照されたく、ここで、Ｘ軸は、様々な群を表し、Ｙ軸は、対応する阻害率の百分率値を表す）。
【０１９６】
上述の結果は、１）Ｈ１０１およびＮＫ細胞の組合せ適用が、Ｈ１０１またはＮＫ細胞のいずれかの単独適用よりも優れた有効性を有すること、ならびに２）投与のタイミングが、Ｈ１０１およびＮＫ細胞の組合せ適用の有効性に有意に影響を及ぼすことができ、Ｈ１０１およびＮＫ細胞を、実質的に同時に投与した場合、組合せ適用は相乗作用を示さなかったが、Ｈ１０１の投与の約２４〜４８時間後にＮＫ細胞を投与した場合には、組合せ適用は有意な相乗作用を示したことを示している。
【０１９７】
比較例Ａ６：組合せ適用における異なる投与順序間での比較
Ａ５４９細胞を、３０％のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、３７℃で５％  ＣＯ２において、ＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ中で２４時間インキュベートした。次いで、培地を、新しいＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳで置きかえ、ＮＫ細胞を添加した（Ｅ：Ｔ比（ＮＫ：Ａ５４９）＝５：１）。細胞を、３７℃で５％  ＣＯ２において、２４時間インキュベートした。次いで、Ｈ１０１（ＭＯＩ＝８５）を、培地を置きかえることなく添加し、細胞を、さらに４８時間インキュベートした。死細胞および残屑を洗い流し、トリパンブルー染色法を、残っている生存Ａ５４９細胞の計数に使用した。この実験には、ウイルスもＮＫ細胞もＡ５４９細胞に添加していないブランク対照群、Ｈ１０１をその対応する時点で添加したが、ＮＫ細胞を添加していないＨ１０１群、およびＮＫ細胞をその対応する時点で添加したが、Ｈ１０１を添加していないＮＫ群も、存在した。すべての対照群に、対応する時間において対応する培地置きかえ操作を行った。すべての実験を、３回にわたって繰り返し、平均を、統計学的分析に使用した。
【０１９８】
図６に示されるように（Ｘ軸は、様々な群を表し、Ｙ軸は、対応する阻害率の百分率値を表す）、順序逆転様式での組合せ適用（ＮＫ細胞を最初に投与し、Ｈ１０１を後から投与する）の阻害率は、約３８％であり、Ｈ１０１の単独適用の阻害率は、約３５％であり、ＮＫ細胞の単独適用の阻害率は、約６％であった。Ａ５４９細胞に対する７２時間のＮＫ細胞の単独適用の阻害率は、４８時間のものよりも低かった。これは、Ａ５４９細胞が、急速な成長率を有するが、ＮＫ細胞に対する感受性が比較的低く、ＮＫ細胞の殺滅作用が、短期間の特徴を有するためであり得る。したがって、ＮＫ細胞によって殺滅されなかったＡ５４９細胞が、急速に増殖し、７２時間の殺滅の阻害率が、４８時間のものよりも低くなる結果となった。順序逆転様式での組合せ適用は、相乗作用を示さなかった。
【０１９９】
比較例Ａ７：正常細胞における薬物の組合せ適用
ＨＵＶＥＣ細胞（ヒト臍帯静脈内皮細胞）を、３０％のコンフルエンシーで、ゼラチンを有する培養プレートに播種し、３７℃で５％  ＣＯ２において、適切な完全培地（ＨＵＶＥＣ細胞および完全培地は、ＡＬＬＣＥＬＬＳ  ＬＬＣから購入した品目番号Ｈ−００３である）中で２４時間培養した。次いで、培地を、新しい完全培地で置きかえ、Ｈ１０１（ＭＯＩ＝８５）を添加し、感染プロセスを、６時間継続させた。次いで、培地を、新しい完全培地で置きかえ、細胞を、３７℃で５％  ＣＯ２において、２４時間インキュベートした。その後に、培地を、新しい完全培地で置きかえ、次いで、ＮＫ細胞を添加し（Ｅ：Ｔ比（ＮＫ：ＨＵＶＥＣ）＝５：１）、細胞を、さらに４８時間インキュベートした。死細胞および残屑を洗い流し、トリパンブルー染色法を、残っている生存ＨＵＶＥＣ細胞の計数に使用した。この実験には、ウイルスもＮＫ細胞もＨＵＶＥＣ細胞に添加していないブランク対照群、Ｈ１０１をその対応する時点で添加したが、ＮＫ細胞を添加していないＨ１０１群、およびＮＫ細胞をその対応する時点で添加したが、Ｈ１０１を添加していないＮＫ群も、存在した。すべての対照群に、対応する時間において対応する培地置きかえ操作を行った。すべての実験を、３回にわたって繰り返し、平均を、統計学的分析に使用した。
【０２００】
図７に示されるように（Ｘ軸は、様々な群を表し、Ｙ軸は、対応する阻害率の百分率値を表す）、ＮＫ細胞およびＨ１０１の組合せ適用は、正常ヒト初代細胞ＨＵＶＥＣに対して殺滅作用を有さなかった。Ｈ１０１の単独適用またはＮＫ細胞の単独適用も、正常ヒト初代ＨＵＶＥＣ細胞に対して殺滅作用を有さなかった。
【０２０１】
例Ａ８：組合せ投与の用量漸増研究
Ａ５４９細胞を、３０％のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、３７℃で５％  ＣＯ２において、ＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ中で２４時間インキュベートした。第１の群において、培地を、無血清ＤＭＥＭで置きかえ、次いで、Ｈ１０１（ＭＯＩ＝８５）を添加し、感染プロセスを、６時間継続させた。培地を、次いで、新しいＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳで置きかえ、細胞を、２４時間インキュベートした。次いで、培地を、新しいＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳで置きかえ、様々な用量レベル（Ｅ：Ｔ＝１：１、５：１、１０：１、１５：１、または２０：１）のＮＫ細胞を、それぞれ添加し、培養物を、さらに４８時間インキュベートした。死細胞および残屑を洗い流し、トリパンブルー染色法を、残っている生存Ａ５４９細胞の計数に使用した。第２の群において、培地を新しいＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳで置きかえた後、Ｈ１０１（ＭＯＩ＝８５）およびＮＫ細胞を、それぞれＥ：Ｔ＝１：１、５：１、１０：１、１５：１、または２０：１のＮＫ細胞の用量レベルで、同時に添加し、細胞を、さらに７２時間インキュベートした。死細胞および残屑を洗い流し、トリパンブルー染色法を、残っている生存Ａ５４９細胞の計数に使用した。第３の群において、培地を新しいＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳで置きかえた後、様々な用量レベル（Ｅ：Ｔ＝１：１、５：１、１０：１、１５：１、または２０：１）のＮＫ細胞を、それぞれ、最初に添加し、培養物を、２４時間インキュベートした。次いで、同じ用量レベル（ＭＯＩ＝８５）のＨ１０１を、培地を置きかえることなく添加し、培養物を、さらに４８時間インキュベートした。死細胞および残屑を洗い流し、トリパンブルー染色法を、残っている生存Ａ５４９細胞の計数に使用した。この実験には、ウイルスもＮＫ細胞もＡ５４９細胞に添加していないブランク対照群も、存在した。対照群には、対応する時間において対応する培地置きかえ操作を行った。すべての実験を、３回にわたって繰り返し、平均を、統計学的分析に使用した。
【０２０２】
図８に示されるように（Ｘ軸は、Ｅ：Ｔ比を表し、Ｙ軸は、対応する阻害率の百分率値を表す）、組合せ適用において、ＮＫ細胞の用量レベルと、その殺滅作用との間には正相関があり、Ｈ１０１およびＮＫ細胞の用量レベルを、それぞれ変更しなかった場合には、Ｈ１０１を最初に投与し、ＮＫ細胞を後から投与した組合せの殺滅作用は、Ｈ１０１およびＮＫ細胞を同時に投与した組合せの殺滅作用またはＮＫ細胞を最初に投与し、Ｈ１０１を後から投与した組合せの殺滅作用よりも有意に高かった。
【０２０３】
Ｂ：腫瘍溶解性アデノウイルスおよびＮＫ細胞の組合せ適用のＨｅｐＧ２細胞に対する殺滅作用に関する研究
実験例Ｂ１：ＨｅｐＧ２細胞に対するＮＫ細胞の用量応答実験
ＨｅｐＧ２細胞を、３０％のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、３７℃で５％  ＣＯ２において、ＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ中で４８時間インキュベートした。次いで、培地を、新しいＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳで置きかえ、ＮＫ細胞を、以下のエフェクター対標的細胞の比（すなわち、Ｅ：Ｔ、細胞数の比）で添加した：ＮＫ：ＨｅｐＧ２＝それぞれ２０：１、１５：１、１０：１、７：１、５：１、３：１、および１：１。それぞれのＥ：Ｔ比での殺滅プロセスは、細胞を３７℃で５％  ＣＯ２においてインキュベートした状態で、４８時間継続させた。その後に、トリパンブルー染色法を、生存ＨｅｐＧ２細胞の計数に使用し、ＮＫ細胞によるＨｅｐＧ２細胞の殺滅率を、ＮＫ細胞を添加しなかった対照群に対して計算した。図９は、用量応答曲線（Ｘ軸は、Ｅ：Ｔ比を表し、Ｙ軸は、阻害率（ＩＲ）の百分率値を表す）を示すが、これは、Ｅ：Ｔ比が３：１であるときに、約１８％の阻害率を呈し、好適な用量レベルを示している。この投薬量を、組合せ殺滅実験において使用するＮＫ細胞の用量レベルとして採用した。
【０２０４】
実験例Ｂ２：ＨｅｐＧ２細胞に対するＨ１０１の用量応答実験
ＨｅｐＧ２細胞を、３０％のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、３７℃で５％  ＣＯ２において、ＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ中で２４時間インキュベートした。次いで、培地を、新しい無血清ＤＭＥＭで置きかえ、Ｈ１０１を、それぞれ、１３６、６８、３４、１７、８．５、４．２５、および１．７のＭＯＩで添加した。感染プロセスは、細胞を３７℃で５％  ＣＯ２においてインキュベートした状態で、６時間継続させ、次いで、培地を除去し、細胞を、ＰＢＳで洗浄した。次いで、新しいＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳを添加し、細胞を、さらに７２時間インキュベートした。その後に、トリパンブルー染色法を、生存ＨｅｐＧ２細胞の計数に使用し、Ｈ１０１によるＨｅｐＧ２細胞の殺滅率を、Ｈ１０１を添加しなかった対照群に対して計算した。図１０は、用量応答曲線（Ｘ軸は、ＭＯＩを表し、Ｙ軸は、阻害率（ＩＲ）の百分率値を表す）を示すが、これは、ＨｅｐＧ２細胞に対するＨ１０１の用量レベルが約１３．６のＭＯＩであるときに、約２７％の阻害率を呈し、好適な用量レベルを示している。この投薬量を、組合せ殺滅実験において使用するＨ１０１の用量レベルとして採用した。
【０２０５】
例Ｂ３：Ｈ１０１およびＮＫの組合せ殺滅実験
上述の実験例から、ＨｅｐＧ２細胞に対する殺滅に好適なＨ１０１の用量レベルは、約１３．６のＭＯＩであり、ＨｅｐＧ２細胞に対する殺滅に好適なＮＫ細胞の用量レベルは、約３：１のＥ：Ｔ比（すなわち、ＮＫ：ＨｅｐＧ２）であったと結論付けることができる。
【０２０６】
ＨｅｐＧ２細胞を、３０％のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、３７℃で５％  ＣＯ２において、ＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ中で２４時間インキュベートした。次いで、培地を、無血清ＤＭＥＭで置きかえ、Ｈ１０１を添加した（ＭＯＩ＝１３．６）。６時間感染させた後、培地を、ＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳで置きかえ、細胞を、３７℃で５％  ＣＯ２において、４８時間インキュベートした。培地を、新しいＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳで置きかえ、ＮＫ細胞を添加し（Ｅ：Ｔ比（ＮＫ：ＨｅｐＧ２）＝３：１）、細胞を、さらに４８時間インキュベートした。死細胞および残屑を洗い流し、トリパンブルー染色法を、残っている生存ＨｅｐＧ２細胞の計数に使用した。この実験には、ウイルスもＮＫ細胞もＨｅｐＧ２細胞に添加していないブランク対照群、Ｈ１０１をその対応する時点で添加したが、ＮＫ細胞を添加していないＨ１０１群、およびＮＫ細胞をその対応する時点で添加したが、Ｈ１０１を添加していないＮＫ群も、存在した。すべての対照群に、対応する時間において対応する培地置きかえ操作を行った。すべての実験を、３回にわたって繰り返し、平均を、統計学的分析に使用した。
【０２０７】
図１１に示されるように（Ｘ軸は、様々な群を表し、Ｙ軸は、対応する阻害率の百分率値を表す）、Ｈ１０１およびＮＫ細胞の組合せ適用（腫瘍溶解性ウイルスを最初に投与し、ＮＫ細胞を後から投与する）は、ＨｅｐＧ２細胞に対して有意な相乗殺滅作用を有し、相乗阻害率は、約７５％であった。しかしながら、この実験において、Ｈ１０１の単独適用の阻害率は、約４４％であり、ＮＫ細胞の単独適用の阻害率は、約２４％であった。
【０２０８】
比較例Ｂ４：薬物の組合せ同時投与
ＨｅｐＧ２細胞を、３０％のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、３７℃で５％  ＣＯ２において、ＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ中で２４時間インキュベートした。次いで、培地を、無血清ＤＭＥＭで置きかえ、Ｈ１０１を添加した（ＭＯＩ＝１３．６）。６時間感染させた後、培地を、ＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳで置きかえ、ＮＫ細胞を添加した（Ｅ：Ｔ比（ＮＫ：ＨｅｐＧ２）＝３：１）。細胞を、さらに９６時間インキュベートし、次いで、死細胞および残屑を洗い流し、残っている生存ＨｅｐＧ２細胞を、トリパンブルー染色法を使用して計数した。この実験には、ウイルスもＮＫ細胞もＨｅｐＧ２細胞に添加していないブランク対照群、Ｈ１０１をその対応する時点で添加したが、ＮＫ細胞を添加していないＨ１０１群、およびＮＫ細胞をその対応する時点で添加したが、Ｈ１０１を添加していないＮＫ群も、存在した。すべての対照群に、対応する時間において対応する培地置きかえ操作を行った。すべての実験を、３回にわたって繰り返し、平均を、統計学的分析に使用した。
【０２０９】
図１２に示されるように（Ｘ軸は、様々な群を表し、Ｙ軸は、対応する阻害率の百分率値を表す）、Ｈ１０１の単独適用の阻害率は、約４４％であり、ＮＫ細胞の単独適用の阻害率は、約１７％であった。これらの単独適用と比較して、ＮＫ細胞およびＨ１０１の組合せ使用の阻害率は、約５４％であったため増加していたが、しかしながら、例Ｂ３と比較して有意な相乗作用は示されなかった（図１３に示される比較を参照されたく、ここで、Ｘ軸は、様々な群を表し、Ｙ軸は、対応する阻害率の百分率値を表す）。
【０２１０】
上述の結果は、１）Ｈ１０１およびＮＫ細胞の組合せ適用が、Ｈ１０１またはＮＫ細胞のいずれかの単独適用よりも優れた有効性を有すること、ならびに２）投与のタイミングが、Ｈ１０１およびＮＫ細胞の組合せ適用の有効性に有意に影響を及ぼすことができ、Ｈ１０１およびＮＫ細胞を、実質的に同時に投与した場合、組合せ適用は相乗作用を示さなかったが、Ｈ１０１を最初に投与し、ＮＫ細胞を後から投与した場合には、組合せ適用は有意な相乗作用を示したことを示している。
【０２１１】
比較例Ｂ５：組合せ適用における異なる投与順序間での比較
ＨｅｐＧ２細胞を、３０％のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、３７℃で５％  ＣＯ２において、ＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ中で２４時間インキュベートした。次いで、培地を、新しいＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳで置きかえ、ＮＫ細胞を添加した（Ｅ：Ｔ比（ＮＫ：ＨｅｐＧ２）＝３：１）。細胞を、３７℃で５％  ＣＯ２において、４８時間インキュベートした。次いで、Ｈ１０１（ＭＯＩ＝１３．６）を、培地を置きかえることなく添加し、細胞を、さらに４８時間インキュベートした。死細胞および残屑を洗い流し、トリパンブルー染色法を、残っている生存ＨｅｐＧ２細胞の計数に使用した。この実験には、ウイルスもＮＫ細胞もＨｅｐＧ２細胞に添加していないブランク対照群、Ｈ１０１をその対応する時点で添加したが、ＮＫ細胞を添加していないＨ１０１群、およびＮＫ細胞をその対応する時点で添加したが、Ｈ１０１を添加していないＮＫ群も、存在した。すべての対照群に、対応する時間において対応する培地置きかえ操作を行った。すべての実験を、３回にわたって繰り返し、平均を、統計学的分析に使用した。
【０２１２】
図１４に示されるように（Ｘ軸は、様々な群を表し、Ｙ軸は、対応する阻害率の百分率値を表す）、順序逆転様式での組合せ適用（ＮＫ細胞を最初に投与し、Ｈ１０１を後から投与する）の阻害率は、約３２％であり、Ｈ１０１の単独適用の阻害率は、約１８％であり、ＮＫ細胞の単独適用の阻害率は、約２６％であった。順序逆転様式での組合せ適用は、相乗作用を示さなかった。
【０２１３】
例Ｂ６：組合せ投与の用量漸増研究
ＨｅｐＧ２細胞を、３０％のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、３７℃で５％  ＣＯ２において、ＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ中で２４時間インキュベートした。第１の群において、培地を、無血清ＤＭＥＭで置きかえ、次いで、Ｈ１０１（ＭＯＩ＝１３．６）を添加し、感染プロセスを、６時間継続させた。培地を、次いで、新しいＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳで置きかえ、細胞を、４８時間インキュベートした。次いで、培地を、新しいＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳで置きかえ、様々な用量レベル（Ｅ：Ｔ＝１：１、２：１、３：１、４：１、または５：１）のＮＫ細胞を、それぞれ添加し、細胞を、さらに４８時間インキュベートした。死細胞および残屑を洗い流し、トリパンブルー染色法を、残っている生存ＨｅｐＧ２細胞の計数に使用した。第２の群において、培地を、無血清ＤＭＥＭで置きかえ、Ｈ１０１（ＭＯＩ＝１３．６）を添加し、感染プロセスを、６時間継続させた。次いで、培地を、新しいＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳで置きかえ、様々な用量レベル（Ｅ：Ｔ＝１：１、２：１、３：１、４：１、または５：１）のＮＫ細胞を、それぞれ添加した。細胞を、さらに９６時間インキュベートし、次いで、死細胞および残屑を洗い流し、残っている生存ＨｅｐＧ２細胞を、トリパンブルー染色法を使用して計数した。第３の群において、培地を新しいＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳで置きかえた後、様々な用量レベル（Ｅ：Ｔ＝１：１、２：１、３：１、４：１、または５：１）のＮＫ細胞を、それぞれ添加し、細胞を、４８時間インキュベートした。次いで、同じ用量のＨ１０１（ＭＯＩ＝１３．６）を、培地を置きかえることなく添加し、細胞を、さらに４８時間インキュベートした。死細胞および残屑を洗い流し、トリパンブルー染色法を、残っている生存ＨｅｐＧ２細胞の計数に使用した。この実験には、ウイルスもＮＫ細胞もＨｅｐＧ２細胞に添加していないブランク対照群も、存在した。対照群には、対応する時間において対応する培地置きかえ操作を行った。すべての実験を、３回にわたって繰り返し、平均を、統計学的分析に使用した。
【０２１４】
図１５に示されるように（Ｘ軸は、Ｅ：Ｔ比を表し、Ｙ軸は、対応する阻害率の百分率値を表す）、組合せ適用において、ＮＫ細胞の用量レベルと、その殺滅作用との間には正相関があり、Ｈ１０１およびＮＫ細胞の用量レベルを、それぞれ変更しなかった場合には、Ｈ１０１を最初に投与し、ＮＫ細胞を後から投与した組合せの殺滅作用は、Ｈ１０１およびＮＫ細胞を同時に投与した組合せの殺滅作用またはＮＫ細胞を最初に投与し、Ｈ１０１を後から投与した組合せの殺滅作用よりも有意に高かった。
【０２１５】
Ｃ：腫瘍溶解性アデノウイルスおよびＮＫ細胞の組合せ適用のＨＴ２９細胞に対する殺滅作用に関する研究
実験例Ｃ１：ＨＴ２９細胞に対するＮＫ細胞の用量応答実験
ＨＴ２９細胞を、３０％のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、３７℃で５％  ＣＯ２において、ＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ中で４８時間インキュベートした。次いで、培地を、新しいＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳで置きかえ、ＮＫ細胞を、以下のエフェクター対標的細胞の比（すなわち、Ｅ：Ｔ、細胞数の比）で添加した：ＮＫ：ＨＴ２９＝それぞれ４０：１、２０：１、１０：１、５：１、および１：１。それぞれのＥ：Ｔ比での殺滅プロセスは、細胞を３７℃で５％  ＣＯ２においてインキュベートした状態で、４８時間継続させた。その後に、トリパンブルー染色法を、生存ＨＴ２９細胞の計数に使用し、ＮＫ細胞によるＨＴ２９細胞の殺滅率を、ＮＫ細胞を添加しなかった対照群に対して計算した。図１６は、用量応答曲線（Ｘ軸は、Ｅ：Ｔ比を表し、Ｙ軸は、阻害率（ＩＲ）の百分率値を表す）を示すが、これは、Ｅ：Ｔ比が３：１であるときに、約１７％の阻害率を呈し、好適な用量レベルを示している。この投薬量を、組合せ殺滅実験において使用するＮＫ細胞の用量レベルとして採用した。
【０２１６】
実験例Ｃ２：ＨＴ２９細胞に対するＨ１０１の用量応答実験
ＨＴ２９細胞を、３０％のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、３７℃で５％  ＣＯ２において、ＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ中で２４時間インキュベートした。次いで、培地を、新しい無血清ＤＭＥＭで置きかえ、Ｈ１０１を、それぞれ、１３６、６８、３４、１７、８．５、および１．７のＭＯＩで添加した。感染プロセスは、細胞を３７℃で５％  ＣＯ２においてインキュベートした状態で、６時間継続させ、次いで、培地を除去し、細胞を、ＰＢＳで洗浄した。次いで、新しいＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳを添加し、細胞を、さらに７２時間インキュベートした。その後に、トリパンブルー染色法を、生存ＨＴ２９細胞の計数に使用し、Ｈ１０１によるＨＴ２９細胞の殺滅率を、Ｈ１０１を添加しなかった対照群に対して計算し、比較した。図１７は、用量応答曲線（Ｘ軸は、ＭＯＩを表し、Ｙ軸は、阻害率（ＩＲ）の百分率値を表す）を示すが、これは、ＭＯＩが１３．６であるときに、約４０％の阻害率を呈し、好適な用量レベルを示している。この投薬量を、組合せ殺滅実験において使用するＨ１０１の用量レベルとして採用した。
【０２１７】
例Ｃ３：Ｈ１０１およびＮＫの組合せ殺滅実験
上述の実験例から、ＨＴ２９細胞に対する殺滅に好適なＨ１０１の用量レベルは、約１３．６のＭＯＩであり、ＨＴ２９細胞に対する殺滅に好適なＮＫ細胞の用量レベルは、約３：１のＥ：Ｔ比（すなわち、ＮＫ：ＨＴ２９）であったと結論付けることができる。
【０２１８】
ＨＴ２９細胞を、３０％のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、３７℃で５％  ＣＯ２において、ＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ中で２４時間インキュベートした。次いで、培地を、無血清ＤＭＥＭで置きかえ、Ｈ１０１を添加した（ＭＯＩ＝１３．６）。６時間感染させた後、培地を、ＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳで置きかえ、細胞を、３７℃で５％  ＣＯ２において、２４時間インキュベートした。培地を、新しいＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳで置きかえ、ＮＫ細胞を添加し（Ｅ：Ｔ比（ＮＫ：ＨＴ２９）＝３：１）、細胞を、さらに４８時間インキュベートした。死細胞および残屑を洗い流し、トリパンブルー染色法を、残っている生存ＨＴ２９細胞の計数に使用した。この実験には、ウイルスもＮＫ細胞もＨＴ２９細胞に添加していないブランク対照群、Ｈ１０１をその対応する時点で添加したが、ＮＫ細胞を添加していないＨ１０１群、およびＮＫ細胞をその対応する時点で添加したが、Ｈ１０１を添加していないＮＫ群も、存在した。すべての対照群に、対応する時間において対応する培地置きかえ操作を行った。すべての実験を、３回にわたって繰り返し、平均を、統計学的分析に使用した。
【０２１９】
図１８に示されるように（Ｘ軸は、様々な群を表し、Ｙ軸は、対応する阻害率の百分率値を表す）、Ｈ１０１およびＮＫ細胞の組合せ適用（腫瘍溶解性ウイルスを最初に投与し、ＮＫ細胞を後から投与する）は、ＨＴ２９細胞に対して有意な相乗殺滅作用を有し、相乗阻害率は、約６０％であった。しかしながら、この実験において、Ｈ１０１の単独適用の阻害率は、約３７％であり、ＮＫ細胞の単独適用の阻害率は、約１６％であった。
【０２２０】
例Ｃ４：Ｈ１０１およびＮＫの組合せ殺滅実験
例Ｃ４は、Ｈ１０１の添加による感染の後、細胞を、２４時間ではなく４８時間インキュベートした後に、ＮＫ細胞を添加したことを除き、上述の例Ｃ３と類似であった。図２３に示されるように（Ｘ軸は、様々な群を表し、Ｙ軸は、対応する阻害率の百分率値を表す）、最終的な結果はまた、Ｈ１０１およびＮＫ細胞の組合せ適用（腫瘍溶解性ウイルスを最初に投与し、ＮＫ細胞を後から投与する）は、ＨＴ２９細胞に対して有意な相乗殺滅作用を有し、相乗阻害率は、約７６％であったことを示した。しかしながら、この実験において、Ｈ１０１の単独適用の阻害率は、約５４％であり、ＮＫ細胞の単独適用の阻害率は、約１４％であった。
【０２２１】
比較例Ｃ５：薬物の組合せ同時投与
ＨＴ２９細胞を、３０％のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、３７℃で５％  ＣＯ２において、ＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ中で２４時間インキュベートした。次いで、培地を、無血清ＤＭＥＭで置きかえ、Ｈ１０１を添加した（ＭＯＩ＝１３．６）。６時間感染させた後、培地を、新しいＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳで置きかえ、ＮＫ細胞を添加した（Ｅ：Ｔ比（ＮＫ：ＨＴ２９）＝３：１）。細胞を、さらに７２時間インキュベートし、次いで、死細胞および残屑を洗い流し、残っている生存ＨＴ２９細胞を、トリパンブルー染色法を使用して計数した。この実験には、ウイルスもＮＫ細胞もＨＴ２９細胞に添加していないブランク対照群、Ｈ１０１をその対応する時点で添加したが、ＮＫ細胞を添加していないＨ１０１群、およびＮＫ細胞をその対応する時点で添加したが、Ｈ１０１を添加していないＮＫ群も、存在した。すべての対照群に、対応する時間において対応する培地置きかえ操作を行った。すべての実験を、３回にわたって繰り返し、平均を、統計学的分析に使用した。
【０２２２】
図１９に示されるように（Ｘ軸は、様々な群を表し、Ｙ軸は、対応する阻害率の百分率値を表す）、Ｈ１０１の単独適用の阻害率は、約３６％であり、ＮＫ細胞の単独適用の阻害率は、約３３％であった。これらの単独適用と比較して、ＮＫ細胞およびＨ１０１の組合せ使用の阻害率は、約５２％であったため増加していたが、しかしながら、例Ｃ３と比較して有意な相乗作用は示されなかった（図２０に示される比較を参照されたく、ここで、Ｘ軸は、様々な群を表し、Ｙ軸は、対応する阻害率の百分率値を表す）。
【０２２３】
比較例Ｃ６：薬物の組合せ同時投与
比較例Ｃ６は、Ｈ１０１およびＮＫを添加した後、細胞を、７２時間ではなく９６時間インキュベートしたことを除き、上述の比較例Ｃ５と類似であった。図２４に示されるように（Ｘ軸は、様々な群を表し、Ｙ軸は、対応する阻害率の百分率値を表す）、Ｈ１０１の単独適用の阻害率は、約４６％であり、ＮＫ細胞の単独適用の阻害率は、約２３％であった。これらの単独適用と比較して、ＮＫ細胞およびＨ１０１の組合せ使用の阻害率は、約６６％であったため増加していたが、しかしながら、図２３と比較して有意な相乗作用は示されなかった（図２５に示される比較を参照されたく、ここで、Ｘ軸は、様々な群を表し、Ｙ軸は、対応する阻害率の百分率値を表す）。
【０２２４】
上述の結果は、１）Ｈ１０１およびＮＫ細胞の組合せ適用が、Ｈ１０１またはＮＫ細胞のいずれかの単独適用よりも優れた有効性を有すること、ならびに２）投与のタイミングが、Ｈ１０１およびＮＫ細胞の組合せ適用の有効性に有意に影響を及ぼすことができ、Ｈ１０１およびＮＫ細胞を、実質的に同時に投与した場合、組合せ適用は相乗作用を示さなかったが、Ｈ１０１の投与の約２４〜４８時間後にＮＫ細胞を投与した場合には、組合せ適用は有意な相乗作用を示したことを示している。
【０２２５】
比較例Ｃ７：組合せ適用における異なる投与順序間での比較
ＨＴ２９細胞を、３０％のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、３７℃で５％  ＣＯ２において、ＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ中で２４時間インキュベートした。次いで、培地を、新しいＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳで置きかえ、ＮＫ細胞を添加した（Ｅ：Ｔ比（ＮＫ：ＨＴ２９）＝３：１）。細胞を、３７℃で５％  ＣＯ２において、２４時間インキュベートした。次いで、Ｈ１０１（ＭＯＩ＝１３．６）を、培地を置きかえることなく添加し、細胞を、さらに４８時間インキュベートした。死細胞および残屑を洗い流し、トリパンブルー染色法を、残っている生存ＨＴ２９細胞の計数に使用した。この実験には、ウイルスもＮＫ細胞もＨＴ２９細胞に添加していないブランク対照群、Ｈ１０１をその対応する時点で添加したが、ＮＫ細胞を添加していないＨ１０１群、およびＮＫ細胞をその対応する時点で添加したが、Ｈ１０１を添加していないＮＫ群も、存在した。すべての対照群に、対応する時間において対応する培地置きかえ操作を行った。すべての実験を、３回にわたって繰り返し、平均を、統計学的分析に使用した。
【０２２６】
図２１に示されるように（Ｘ軸は、様々な群を表し、Ｙ軸は、対応する阻害率の百分率値を表す）、順序逆転様式での組合せ適用（ＮＫ細胞を最初に投与し、Ｈ１０１を後から投与する）の阻害率は、約４２％であり、Ｈ１０１の単独適用の阻害率は、約２０％であり、ＮＫ細胞の単独適用の阻害率は、約２６％であった。順序逆転様式での組合せ適用は、相乗作用を示さなかった。
【０２２７】
比較例Ｃ８：組合せ適用における異なる投与順序間での比較
比較例Ｃ８は、ＮＫを添加した後、細胞を、２４時間ではなく４８時間インキュベートした後に、Ｈ１０１を添加したことを除き、上述の比較例Ｃ７と類似であった。図２６に示されるように（Ｘ軸は、様々な群を表し、Ｙ軸は、対応する阻害率の百分率値を表す）、順序逆転様式での組合せ適用（ＮＫ細胞を最初に投与し、Ｈ１０１を後から投与する）の阻害率は、約３８％であり、Ｈ１０１の単独適用の阻害率は、約８％であり、ＮＫ細胞の単独適用の阻害率は、約３７％であった。順序逆転様式での組合せ適用は、相乗作用を示さなかった。
【０２２８】
例Ｃ９：組合せ投与の用量漸増研究
ＨＴ２９細胞を、３０％のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、３７℃で５％  ＣＯ２において、ＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ中で２４時間インキュベートした。第１の群において、培地を、無血清ＤＭＥＭで置きかえ、次いで、Ｈ１０１（ＭＯＩ＝１３．６）を添加し、感染プロセスを、６時間継続させた。次いで、培地を、新しいＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳで置きかえた。細胞を、２４時間インキュベートした後、様々な用量レベル（Ｅ：Ｔ＝１：１、２：１、３：１、４：１、または５：１）のＮＫ細胞を、それぞれ添加し、細胞を、さらに４８時間インキュベートした。死細胞および残屑を洗い流し、トリパンブルー染色法を、残っている生存ＨＴ２９細胞の計数に使用した。第２の群において、培地を、無血清ＤＭＥＭで置きかえ、Ｈ１０１（ＭＯＩ＝１３．６）を添加した。６時間感染させた後、培地を、新しいＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳで置きかえ、様々な用量レベル（Ｅ：Ｔ＝１：１、２：１、３：１、４：１、または５：１）のＮＫ細胞を、それぞれ添加した。細胞を、さらに７２時間インキュベートし、次いで、死細胞および残屑を洗い流し、残っている生存ＨＴ２９細胞を、トリパンブルー染色法を使用して計数した。第３の群において、培地を新しいＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳで置きかえた後、様々な用量レベル（Ｅ：Ｔ＝１：１、２：１、３：１、４：１、または５：１）のＮＫ細胞を、それぞれ、最初に添加し、細胞を、２４時間インキュベートした。次いで、同じ用量のＨ１０１（ＭＯＩ＝１３．６）を、培地を置きかえることなく添加し、細胞を、さらに４８時間インキュベートした。死細胞および残屑を洗い流し、トリパンブルー染色法を、残っている生存ＨＴ２９細胞の計数に使用した。この実験には、ウイルスもＮＫ細胞もＨＴ２９細胞に添加していないブランク対照群も、存在した。対照群には、対応する時間において対応する培地置きかえ操作を行った。すべての実験を、３回にわたって繰り返し、平均を、統計学的分析に使用した。
【０２２９】
図２２に示されるように（Ｘ軸は、Ｅ：Ｔ比を表し、Ｙ軸は、対応する阻害率の百分率値を表す）、組合せ適用において、ＮＫ細胞の用量レベルと、その殺滅作用との間には正相関があり、Ｈ１０１およびＮＫ細胞の用量レベルを、それぞれ変更しなかった場合には、Ｈ１０１を最初に投与し、ＮＫ細胞を後から投与した組合せの殺滅作用は、Ｈ１０１およびＮＫ細胞を同時に投与した組合せの殺滅作用またはＮＫ細胞を最初に投与し、Ｈ１０１を後から投与した組合せの殺滅作用よりも有意に高かった。
【０２３０】
例Ｃ１０：組合せ投与の用量漸増研究
例Ｃ１０は、実験群（腫瘍溶解性ウイルスを最初に投与し、ＮＫ細胞を後から投与する）では、Ｈ１０１を添加した後に、細胞を、２４時間ではなく４８時間インキュベートした後、ＮＫ細胞を添加し、組合せ同時投与群では、Ｈ１０１およびＮＫを同時に添加した後に、細胞を、７２時間ではなく９６時間インキュベートし、順序逆転様式での組合せ投与群では、ＮＫを添加した後、細胞を、２４時間ではなく４８時間インキュベートした後に、Ｈ１０１を添加したことを除き、上述の例Ｃ９と類似であった。図２７に示されるように（Ｘ軸は、Ｅ：Ｔ比を表し、Ｙ軸は、対応する阻害率の百分率値を表す）、組合せ適用において、ＮＫ細胞の用量レベルと、その殺滅作用との間には正相関があり、Ｈ１０１およびＮＫ細胞の用量レベルを、それぞれ変更しなかった場合には、Ｈ１０１を最初に投与し、ＮＫ細胞を後から投与した組合せの殺滅作用は、Ｈ１０１およびＮＫ細胞を同時に投与した組合せの殺滅作用またはＮＫ細胞を最初に投与し、Ｈ１０１を後から投与した組合せの殺滅作用よりも有意に高かった。
【０２３１】
実験例Ｃ１１：Ｈ１０１によるＨＴ２９細胞の感染後の細胞表面上のＮＫＧ２Ｄリガンドの検出
ＨＴ２９細胞を、５０％のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、３７℃で５％  ＣＯ２において、ＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ中で２４時間インキュベートした。次いで、Ｈ１０１（ＭＯＩ＝１７）を、培地を置きかえることなく添加した。感染プロセスは、細胞を３７℃で５％  ＣＯ２においてインキュベートした状態で、２４時間継続させた。この実験には、ウイルスをＨＴ２９細胞に添加していないブランク対照群も、存在した。細胞を、トリプシン処理によって収集し、ＰＢＳで１回洗浄し、次いで、ＨＴ２９細胞上のＮＫＧ２Ｄ関連リガンド（ＵＬＢＰ−１、ＵＬＢＰ−４、ＵＬＢＰ−２／５／６、およびＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ）を、検出した。Ｈ１０１に感染したＨＴ２９細胞の表面上のＮＫＧ２Ｄ関連リガンドの変化を、Ｈ１０１を添加していない対照群に対して計算した。以下の抗体を使用した：抗ヒトＵＬＢＰ−１  ＰＥ（Ｒ＆Ｄ、品目番号ＦＡＢ１３８０Ｐ）、抗ヒトＵＬＢＰ−４／ＲＡＥＴ１Ｅ  ＡＰＣ（Ｒ＆Ｄ、品目番号ＦＡＢ６２８５Ａ）、抗ヒトＵＬＢＰ−２／５／６  ＡＰＣ（Ｒ＆Ｄ、品目番号ＦＡＢ１２９８Ａ）、および抗ヒトＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ  ＦＩＴＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、品目番号１３０−１０６−１００）。結果として得られたＨＴ２９細胞ペレットを、それぞれ、５０μｌの１％  ＦＢＳ＋ＰＢＳ中に再懸濁させた。対応する抗体（１〜２μｌ）を、それぞれのサンプルに添加し、均一に混合した。４℃で３０分間インキュベートした後、結果として得られたサンプルを、１％  ＦＢＳ＋ＰＢＳで１回洗浄した。結果として得られたＨＴ２９細胞ペレットを、３００μｌの１％  ＦＢＳ＋ＰＢＳ中に再懸濁させ、均一に混合し、次いで、フローサイトメーターによって検出した。
【０２３２】
図２８に示されるように（Ｘ軸は、様々なＮＫＧ２Ｄリガンド検出群を表し、Ｙ軸は、対応する細胞数の百分率値を表す）、ＨＴ２９細胞をＨ１０１に感染させ、２４時間培養した後、ＵＬＢＰ−１およびＵＬＢＰ−４には有意な変化はなかったが、ＵＬＢＰ−２／５／６およびＭＩＣＡ／ＭＩＣＢの発現は、有意に増加した。
【０２３３】
実験例Ｃ１２：Ｈ１０１によるＨＴ２９細胞の感染後の細胞表面上のＮＫＧ２Ｄリガンドの検出
実験例Ｃ１２は、検出を、Ｈ１０１によるＨＴ２９細胞の感染を２４時間ではなく４８時間継続させた後に行ったことを除き、上述の実験例Ｃ１１と類似であった。図２９に示されるように（Ｘ軸は、様々なＮＫＧ２Ｄリガンド検出群を表し、Ｙ軸は、対応する細胞数の百分率値を表す）、ＨＴ２９細胞をＨ１０１に４８時間感染させた後、ＵＬＢＰ−１およびＵＬＢＰ−２／５／６には有意な変化はなかったが、ＵＬＢＰ−４およびＭＩＣＡ／ＭＩＣＢの発現は、有意に増加した。
【０２３４】
上述の結果は、１）ＨＴ２９細胞をＨ１０１に感染させた後、細胞表面上の幾つかのＮＫＧ２Ｄリガンドが、有意に増加し、２）ＨＴ２９細胞の表面上のＮＫＧ２Ｄリガンドの増加が、ＨＴ２９細胞に対するＮＫ細胞の認識および殺滅作用を促進し、３）Ｈ１０１およびＮＫの組合せ治療レジメンは、腫瘍溶解性ウイルスを最初に投与し、ＮＫ細胞を後から投与する場合に、最良の有効性を有することを示す。
【０２３５】
Ｄ：腫瘍溶解性ワクシニアウイルスおよびＮＫ細胞の組合せ適用のＡ５４９細胞に対する殺滅作用に関する研究
実験例Ｄ１：Ａ５４９細胞に対するＮＫ細胞の用量応答実験
Ａ５４９細胞を、３０％のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、３７℃で５％  ＣＯ２において、ＤＭＥＭ：Ｆ１２（１：１）＋１０％  ＦＢＳ中で４８時間インキュベートした。次いで、培地を、新しいＤＭＥＭ：Ｆ１２（１：１）＋１０％  ＦＢＳで置きかえ、ＮＫ細胞を、以下のエフェクター対標的細胞の比（すなわち、Ｅ：Ｔ、細胞数の比）で添加した：ＮＫ：Ａ５４９＝それぞれ４０：１、３０：１、２０：１、１５：１、１０：１、５：１、および１：１。それぞれのＥ：Ｔ比での殺滅プロセスは、細胞を３７℃で５％  ＣＯ２においてインキュベートした状態で、４８時間継続させた。その後に、トリパンブルー染色法を、生存Ａ５４９細胞の計数に使用し、ＮＫ細胞によるＡ５４９細胞の殺滅率を、ＮＫ細胞を添加しなかった対照群に対して計算した。用量応答曲線のＸ軸は、Ｅ：Ｔ比を表し、Ｙ軸は、阻害率（ＩＲ）の百分率値を表す。殺滅時間が４８時間であった実験の結果を、図３０に示すが、これは、Ｅ：Ｔ比が５：１のときに、約２４％の阻害率を呈し、好適な用量レベルを示している。この投薬量を、組合せ殺滅実験において使用するＮＫ細胞の用量レベルとして採用した。
【０２３６】
実験例Ｄ２：Ａ５４９細胞に対するｄｄｖｖ−ＲＦＰの用量応答実験
Ａ５４９細胞を、３０％のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、３７℃で５％  ＣＯ２において、ＤＭＥＭ：Ｆ１２（１：１）＋１０％  ＦＢＳ中で２４時間インキュベートした。次いで、培地を、新しい無血清ＤＭＥＭ：Ｆ１２（１：１）で置きかえ、ｄｄｖｖ−ＲＦＰを、それぞれ、０．１３５、０．０２７、０．０１３５、０．００５４、０．００２７、０．００１３５、および０．０００５４のＭＯＩで添加した。ｄｄｖｖ−ＲＦＰを添加した時点を、０時間とした（以下同様）。感染プロセスは、細胞を３７℃で５％  ＣＯ２においてインキュベートした状態で、６時間継続させ、次いで、培地を除去し、細胞を、ＰＢＳで洗浄した。次いで、新しいＤＭＥＭ：Ｆ１２（１：１）＋１０％  ＦＢＳを添加し、細胞を、さらに７２時間インキュベートした。その後に、トリパンブルー染色法を、生存Ａ５４９細胞の計数に使用し、ｄｄｖｖ−ＲＦＰによるＡ５４９細胞の殺滅率を、ｄｄｖｖ−ＲＦＰを添加しなかった対照群に対して計算した。図３１は、用量応答曲線（Ｘ軸は、ＭＯＩを表し、Ｙ軸は、阻害率（ＩＲ）の百分率値を表す）を示すが、これは、ＭＯＩが０．００２７であるときに、約３２％の阻害率を呈する。この投薬量を、組合せ殺滅実験において使用するｄｄｖｖ−ＲＦＰの用量レベルとして採用した。
【０２３７】
例Ｄ３：ｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫの組合せ殺滅実験
上述の実験例から、Ａ５４９細胞に対する殺滅に好適なｄｄｖｖ−ＲＦＰの用量レベルは、約０．００２７のＭＯＩであり、Ａ５４９細胞に対する殺滅に好適なＮＫ細胞の用量レベルは、約５：１のＥ：Ｔ比（すなわち、ＮＫ：Ａ５４９）であったと結論付けることができる。
【０２３８】
Ａ５４９細胞を、３０％のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、３７℃で５％  ＣＯ２において、ＤＭＥＭ：Ｆ１２（１：１）＋１０％  ＦＢＳ中で２４時間インキュベートした。次いで、培地を、無血清ＤＭＥＭ：Ｆ１２（１：１）で置きかえ、ｄｄｖｖ−ＲＦＰ（ＭＯＩ＝０．００２７）を添加した。６時間感染させた後、培地を、ＤＭＥＭ：Ｆ１２（１：１）＋１０％  ＦＢＳで置きかえ、細胞を、３７℃で５％  ＣＯ２において、４８時間インキュベートした。次いで、ＮＫ細胞を、培地を置きかえることなく添加し（Ｅ：Ｔ比（ＮＫ：Ａ５４９）＝５：１）、細胞を、さらに４８時間インキュベートした。死細胞および残屑を洗い流し、トリパンブルー染色法を、残っている生存Ａ５４９細胞の計数に使用した。この実験には、ウイルスもＮＫ細胞もＡ５４９細胞に添加していないブランク対照群、ｄｄｖｖ−ＲＦＰをその対応する時点で添加したが、ＮＫ細胞を添加していないｄｄｖｖ−ＲＦＰ群、およびＮＫ細胞をその対応する時点で添加したが、ｄｄｖｖ−ＲＦＰを添加していないＮＫ群も、存在した。すべての対照群に、対応する時間において対応する培地置きかえ操作を行った。すべての実験を、３回にわたって繰り返し、平均を、統計学的分析に使用した。
【０２３９】
図３２に示されるように（Ｘ軸は、様々な群を表し、Ｙ軸は、対応する阻害率の百分率値を表す）、ｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫ細胞の組合せ適用（腫瘍溶解性ウイルスを最初に投与し、ＮＫ細胞を後から投与する）は、Ａ５４９細胞に対して有意な相乗殺滅作用を有し、相乗阻害率は、約８３％であった。しかしながら、この実験において、ｄｄｖｖ−ＲＦＰの単独適用の阻害率は、約４９％であり、ＮＫ細胞の単独適用の阻害率は、約２８％であった。
【０２４０】
比較例Ｄ４：薬物の組合せ同時投与
Ａ５４９細胞を、３０％のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、３７℃で５％  ＣＯ２において、ＤＭＥＭ：Ｆ１２（１：１）＋１０％  ＦＢＳ中で２４時間インキュベートした。次いで、培地を、無血清ＤＭＥＭ：Ｆ１２（１：１）で置きかえ、ｄｄｖｖ−ＲＦＰを添加した（ＭＯＩ＝０．００２７）。６時間感染させた後、培地を、新しいＤＭＥＭ：Ｆ１２（１：１）＋１０％  ＦＢＳで置きかえ、ＮＫ細胞を添加した（Ｅ：Ｔ比（ＮＫ：Ａ５４９）＝５：１）。細胞を、さらに９６時間インキュベートし、次いで、死細胞および残屑を洗い流し、残っている生存Ａ５４９細胞を、トリパンブルー染色法を使用して計数した。この実験には、ウイルスもＮＫ細胞もＡ５４９細胞に添加していないブランク対照群、ｄｄｖｖ−ＲＦＰをその対応する時点で添加したが、ＮＫ細胞を添加していないｄｄｖｖ−ＲＦＰ群、およびＮＫ細胞をその対応する時点で添加したが、ｄｄｖｖ−ＲＦＰを添加していないＮＫ群も、存在した。すべての対照群に、対応する時間において対応する培地置きかえ操作を行った。すべての実験を、３回にわたって繰り返し、平均を、統計学的分析に使用した。
【０２４１】
図３３に示されるように（Ｘ軸は、様々な群を表し、Ｙ軸は、対応する阻害率の百分率値を表す）、ｄｄｖｖ−ＲＦＰの単独適用の阻害率は、約４９％であり、ＮＫ細胞の単独適用の阻害率は、約３３％であった。これらの単独適用と比較して、ＮＫ細胞およびｄｄｖｖ−ＲＦＰの組合せ使用の阻害率は、約８０％であったため増加していたが、しかしながら、有意な相乗作用は示されなかった。
【０２４２】
上述の結果は、１）ｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫ細胞の組合せ適用が、ｄｄｖｖ−ＲＦＰまたはＮＫ細胞のいずれかの単独適用よりも優れた有効性を有すること、ならびに２）投与のタイミングが、ｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫ細胞の組合せ適用の有効性に有意に影響を及ぼすことができ、ｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫ細胞を、実質的に同時に投与した場合、組合せ適用は相乗作用を示さなかったが、ｄｄｖｖ−ＲＦＰを最初に投与し、ＮＫ細胞を後から投与した場合には、組合せ適用は有意な相乗作用を示したことを示している。
【０２４３】
比較例Ｄ５：組合せ適用における異なる投与順序間での比較
Ａ５４９細胞を、３０％のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、３７℃で５％  ＣＯ２において、ＤＭＥＭ：Ｆ１２（１：１）＋１０％  ＦＢＳ中で２４時間インキュベートした。次いで、ＮＫ細胞を、培地を置きかえることなく添加し（Ｅ：Ｔ比（ＮＫ：Ａ５４９＝５：１）、細胞を、３７℃で５％  ＣＯ２において、４８時間インキュベートした。次いで、ｄｄｖｖ−ＲＦＰ（ＭＯＩ＝０．００２７）を、培地を置きかえることなく添加し、細胞を、さらに４８時間インキュベートした。死細胞および残屑を洗い流し、トリパンブルー染色法を、残っている生存Ａ５４９細胞の計数に使用した。この実験には、ウイルスもＮＫ細胞もＡ５４９細胞に添加していないブランク対照群、ｄｄｖｖ−ＲＦＰをその対応する時点で添加したが、ＮＫ細胞を添加していないｄｄｖｖ−ＲＦＰ群、およびＮＫ細胞をその対応する時点で添加したが、ｄｄｖｖ−ＲＦＰを添加していないＮＫ群も、存在した。すべての実験を、３回にわたって繰り返し、平均を、統計学的分析に使用した。
【０２４４】
図３４に示されるように（Ｘ軸は、様々な群を表し、Ｙ軸は、対応する阻害率の百分率値を表す）、順序逆転様式での組合せ適用（ＮＫ細胞を最初に投与し、ｄｄｖｖ−ＲＦＰを後から投与する）の阻害率は、約８０％であり、ｄｄｖｖ−ＲＦＰの単独適用の阻害率は、約３３％であり、ＮＫ細胞の単独適用の阻害率は、約４８％であった。順序逆転様式での組合せ適用は、相乗作用を示さなかった。
【０２４５】
Ｅ：腫瘍溶解性ワクシニアウイルスおよびＮＫ細胞の組合せ適用のＨｅｐＧ２細胞に対する殺滅作用に関する研究
実験例Ｅ１：ＨｅｐＧ２細胞に対するｄｄｖｖ−ＲＦＰの用量応答実験
ＨｅｐＧ２細胞を、３０％のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、３７℃で５％  ＣＯ２において、ＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ中で２４時間インキュベートした。次いで、培地を、新しい無血清ＤＭＥＭで置きかえ、ｄｄｖｖ−ＲＦＰを、それぞれ、ＭＯＩ＝０．２７、０．１３５、０．０５４、０．０２７、０．０１３５、および０．００２７のＭＯＩで添加した。感染プロセスは、細胞を３７℃で５％  ＣＯ２においてインキュベートした状態で、６時間継続させ、次いで、培地を除去し、細胞を、ＰＢＳで洗浄した。次いで、新しいＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳを添加し、細胞を、さらに７２時間インキュベートした。その後に、トリパンブルー染色法を、生存ＨｅｐＧ２細胞の計数に使用し、ｄｄｖｖ−ＲＦＰによるＨｅｐＧ２の殺滅率を、ｄｄｖｖ−ＲＦＰを添加しなかった対照群に対して計算した。図３５は、用量応答曲線（Ｘ軸は、ＭＯＩを表し、Ｙ軸は、阻害率（ＩＲ）の百分率値を表す）を示すが、これは、ＨｅｐＧ２細胞に対するｄｄｖｖ−ＲＦＰの用量レベルが約０．０２７のＭＯＩであるときに、約４２％の阻害率を呈し、用量レベルが約０．０１３５のＭＯＩであるときに、約１９％の阻害率を呈する。後続の組合せ殺滅実験において、ｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫ細胞の投与間の間隔が２４時間であった場合には、使用するｄｄｖｖ−ＲＦＰの用量レベルとして、ＭＯＩ＝０．０２７を採用することが好適であったが、一方で、その間隔が４８時間であった場合には、使用するｄｄｖｖ−ＲＦＰの用量レベルとして、ＭＯＩ＝０．０１３５を採用することが好適であった。
【０２４６】
例Ｅ２：ｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫの組合せ殺滅実験
上述の実験例から、ＨｅｐＧ２細胞に対する殺滅に好適なｄｄｖｖ−ＲＦＰの用量レベルは、約０．０２７のＭＯＩであり、ＨｅｐＧ２細胞に対する殺滅に好適なＮＫ細胞の用量レベルは、約３：１のＥ：Ｔ比（すなわち、ＮＫ：ＨｅｐＧ２）であったと結論付けることができる。
【０２４７】
ＨｅｐＧ２細胞を、３０％のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、３７℃で５％  ＣＯ２において、ＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ中で２４時間インキュベートした。次いで、培地を、無血清ＤＭＥＭで置きかえ、ｄｄｖｖ−ＲＦＰを添加した（ＭＯＩ＝０．０２７）。６時間感染させた後、培地を、ＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳで置きかえ、細胞を、３７℃で５％  ＣＯ２において、２４時間インキュベートした。次いで、ＮＫ細胞を、培地を置きかえることなく添加し（Ｅ：Ｔ比（ＮＫ：ＨｅｐＧ２＝３：１）、細胞を、さらに４８時間インキュベートした。死細胞および残屑を洗い流し、トリパンブルー染色法を、残っている生存ＨｅｐＧ２細胞の計数に使用した。この実験には、ウイルスもＮＫ細胞もＨｅｐＧ２細胞に添加していないブランク対照群、ｄｄｖｖ−ＲＦＰをその対応する時点で添加したが、ＮＫ細胞を添加していないｄｄｖｖ−ＲＦＰ群、およびＮＫ細胞をその対応する時点で添加したが、ｄｄｖｖ−ＲＦＰを添加していないＮＫ群も、存在した。すべての対照群に、対応する時間において対応する培地置きかえ操作を行った。すべての実験を、３回にわたって繰り返し、平均を、統計学的分析に使用した。
【０２４８】
図３６に示されるように（Ｘ軸は、様々な群を表し、Ｙ軸は、対応する阻害率の百分率値を表す）、ｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫ細胞の組合せ適用（腫瘍溶解性ウイルスを最初に投与し、ＮＫ細胞を後から投与する）は、ＨｅｐＧ２細胞に対して有意な相乗殺滅作用を有し、相乗阻害率は、約８５％であった。しかしながら、この実験において、ｄｄｖｖ−ＲＦＰの単独適用の阻害率は、約５１％であり、ＮＫ細胞の単独適用の阻害率は、約２３％であった。
【０２４９】
例Ｅ３：ｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫの組合せ殺滅実験
例Ｅ３は、ｄｄｖｖ−ＲＦＰをＭＯＩ＝０．０１３５の用量レベルで添加し、感染した細胞を、２４時間ではなく４８時間インキュベートした後に、ＮＫ細胞を添加したことを除き、上述の例Ｅ２と類似であった。図３９に示されるように（Ｘ軸は、様々な群を表し、Ｙ軸は、対応する阻害率の百分率値を表す）、最終的な結果はまた、ｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫ細胞の組合せ適用（腫瘍溶解性ウイルスを最初に投与し、ＮＫ細胞を後から投与する）は、ＨｅｐＧ２細胞に対して有意な相乗殺滅作用を有し、相乗阻害率は、約７９％であったことを示した。しかしながら、この実験において、ｄｄｖｖ−ＲＦＰの単独適用の阻害率は、約５３％であり、ＮＫ細胞の単独適用の阻害率は、約２０％であった。
【０２５０】
比較例Ｅ４：薬物の組合せ同時投与
ＨｅｐＧ２細胞を、３０％のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、３７℃で５％  ＣＯ２において、ＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ中で２４時間インキュベートした。次いで、培地を、無血清ＤＭＥＭで置きかえ、ｄｄｖｖ−ＲＦＰを添加した（ＭＯＩ＝０．０２７）。６時間感染させた後、培地を、新しいＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳで置きかえ、ＮＫ細胞を添加した（Ｅ：Ｔ比（ＮＫ：ＨｅｐＧ２）＝３：１）。細胞を、さらに７２時間インキュベートし、次いで、死細胞および残屑を洗い流し、残っている生存ＨｅｐＧ２細胞を、トリパンブルー染色法を使用して計数した。この実験には、ウイルスもＮＫ細胞もＨｅｐＧ２細胞に添加していないブランク対照群、ｄｄｖｖ−ＲＦＰをその対応する時点で添加したが、ＮＫ細胞を添加していないｄｄｖｖ−ＲＦＰ群、およびＮＫ細胞をその対応する時点で添加したが、ｄｄｖｖ−ＲＦＰを添加していないＮＫ群も、存在した。すべての対照群に、対応する時間において対応する培地置きかえ操作を行った。すべての実験を、３回にわたって繰り返し、平均を、統計学的分析に使用した。
【０２５１】
図３７に示されるように（Ｘ軸は、様々な群を表し、Ｙ軸は、対応する阻害率の百分率値を表す）、ｄｄｖｖ−ＲＦＰの単独適用の阻害率は、約５２％であり、ＮＫ細胞の単独適用の阻害率は、約３６％であった。これらの単独適用と比較して、ＮＫ細胞およびｄｄｖｖ−ＲＦＰの組合せ使用の阻害率は、約８０％であったため増加していたが、しかしながら、有意な相乗作用は示されなかった。
【０２５２】
比較例Ｅ５：薬物の組合せ同時投与
比較例Ｅ５は、ｄｄｖｖ−ＲＦＰをＭＯＩ＝０．０１３５の用量レベルで添加し、細胞を、ｄｄｖｖ−ＲＦＰとＮＫ細胞の両方とともに７２時間ではなく９６時間インキュベートしたことを除き、上述の比較例Ｅ４と類似であった。図４０に示されるように（Ｘ軸は、様々な群を表し、Ｙ軸は、対応する阻害率の百分率値を表す）、ｄｄｖｖ−ＲＦＰの単独適用の阻害率は、約５０％であり、ＮＫ細胞の単独適用の阻害率は、約４９％であった。これらの単独適用と比較して、ＮＫ細胞およびｄｄｖｖ−ＲＦＰの組合せ使用の阻害率は、約８４％であったため増加していたが、しかしながら、有意な相乗作用は示されなかった。
【０２５３】
上述の結果は、１）ｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫ細胞の組合せ適用が、ｄｄｖｖ−ＲＦＰまたはＮＫ細胞のいずれかの単独適用よりも優れた有効性を有すること、ならびに２）投与のタイミングが、ｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫ細胞の組合せ適用の有効性に有意に影響を及ぼすことができ、ｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫ細胞を、実質的に同時に投与した場合、組合せ適用は相乗作用を示さなかったが、ｄｄｖｖ−ＲＦＰの投与の約２４〜４８時間後にＮＫ細胞を投与した場合には、組合せ適用は有意な相乗作用を示したことを示している。
【０２５４】
比較例Ｅ６：組合せ適用における異なる投与順序間での比較
ＨｅｐＧ２細胞を、３０％のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、３７℃で５％  ＣＯ２において、ＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ中で２４時間インキュベートした。次いで、培地を、新しいＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳで置きかえ、ＮＫ細胞を添加した（Ｅ：Ｔ比（ＮＫ：ＨｅｐＧ２）＝３：１）。細胞を、３７℃で５％  ＣＯ２において、２４時間インキュベートした。次いで、ｄｄｖｖ−ＲＦＰ（ＭＯＩ＝０．００２７）を、培地を置きかえることなく添加し、細胞を、さらに４８時間インキュベートした。死細胞および残屑を洗い流し、トリパンブルー染色法を、残っている生存ＨｅｐＧ２細胞の計数に使用した。この実験には、ウイルスもＮＫ細胞もＨｅｐＧ２細胞に添加していないブランク対照群、ｄｄｖｖ−ＲＦＰをその対応する時点で添加したが、ＮＫ細胞を添加していないｄｄｖｖ−ＲＦＰ群、およびＮＫ細胞をその対応する時点で添加したが、ｄｄｖｖ−ＲＦＰを添加していないＮＫ群も、存在した。すべての対照群に、対応する時間において対応する培地置きかえ操作を行った。すべての実験を、３回にわたって繰り返し、平均を、統計学的分析に使用した。
【０２５５】
図３８に示されるように（Ｘ軸は、様々な群を表し、Ｙ軸は、対応する阻害率の百分率値を表す）、順序逆転様式での組合せ適用（ＮＫ細胞を最初に投与し、ｄｄｖｖ−ＲＦＰを後から投与する）の阻害率は、約５５％であり、ｄｄｖｖ−ＲＦＰの単独適用の阻害率は、約２８％であり、ＮＫ細胞の単独適用の阻害率は、約３５％であった。順序逆転様式での組合せ適用は、相乗作用を示さなかった。
【０２５６】
比較例Ｅ７：組合せ適用における異なる投与順序間での比較
比較例Ｅ７は、ＮＫを添加した後、細胞を、２４時間ではなく４８時間インキュベートした後に、ｄｄｖｖ−ＲＦＰを添加したこと（ＭＯＩ＝０．０１３５）を除き、上述の比較例Ｅ６と類似であった。図４１に示されるように（Ｘ軸は、様々な群を表し、Ｙ軸は、対応する阻害率の百分率値を表す）、順序逆転様式での組合せ適用（ＮＫ細胞を最初に投与し、ｄｄｖｖ−ＲＦＰを後から投与する）の阻害率は、約５６％であり、ｄｄｖｖ−ＲＦＰの単独適用の阻害率は、約２５％であり、ＮＫ細胞の単独適用の阻害率は、約４１％であった。順序逆転様式での組合せ適用は、相乗作用を示さなかった。
【０２５７】
Ｆ：腫瘍溶解性ワクシニアウイルスおよびＮＫ細胞の組合せ適用のＨＴ２９細胞に対する殺滅作用に関する研究
実験例Ｆ１：ＨＴ２９に対するｄｄｖｖ−ＲＦＰの用量応答実験
ＨＴ２９細胞を、３０％のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、３７℃で５％  ＣＯ２において、ＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ中で２４時間インキュベートした。次いで、培地を、新しい無血清ＤＭＥＭで置きかえ、ｄｄｖｖ−ＲＦＰを、それぞれ、ＭＯＩ＝２、１、０．５、０．２５、０．１、および０．０５のＭＯＩで添加した。感染プロセスは、細胞を３７℃で５％  ＣＯ２においてインキュベートした状態で、６時間継続させ、次いで、培地を除去し、細胞を、ＰＢＳで洗浄した。次いで、新しいＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳを添加し、細胞を、さらに７２時間インキュベートした。その後に、トリパンブルー染色法を、生存ＨＴ２９細胞の計数に使用し、ｄｄｖｖ−ＲＦＰによるＨＴ２９細胞の殺滅率を、ｄｄｖｖ−ＲＦＰを添加しなかった対照群に対して計算した。図４２は、用量応答曲線（Ｘ軸は、ＭＯＩを表し、Ｙ軸は、阻害率（ＩＲ）の百分率値を表す）を示すが、これは、ＨＴ２９細胞に対するｄｄｖｖ−ＲＦＰの用量レベルが約０．２のＭＯＩであるときに、約４９％の阻害率を呈し、好適な用量レベルを示している。この投薬量ＭＯＩ＝０．２を、組合せ殺滅実験において使用するｄｄｖｖ−ＲＦＰの用量レベルとして採用した。
【０２５８】
例Ｆ２：ｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫの組合せ殺滅実験
上述の実験例から、ＨＴ２９細胞に対する殺滅に好適なｄｄｖｖ−ＲＦＰの用量レベルは、約０．２のＭＯＩであり、ＨＴ２９細胞に対する殺滅に好適なＮＫ細胞の用量レベルは、約３：１のＥ：Ｔ比（すなわち、ＮＫ：ＨＴ２９）であったと結論付けることができる。
【０２５９】
ＨＴ２９細胞を、３０％のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、３７℃で５％  ＣＯ２において、ＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ中で２４時間インキュベートした。次いで、培地を、無血清ＤＭＥＭで置きかえ、ｄｄｖｖ−ＲＦＰを添加した（ＭＯＩ＝０．２）。６時間感染させた後、培地を、ＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳで置きかえ、細胞を、３７℃で５％  ＣＯ２において、２４時間インキュベートした。培地を、新しいＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳで置きかえ、ＮＫ細胞を添加し（Ｅ：Ｔ比（ＮＫ：ＨＴ２９）＝３：１）、細胞を、さらに４８時間インキュベートした。死細胞および残屑を洗い流し、トリパンブルー染色法を、残っている生存ＨＴ２９細胞の計数に使用した。この実験には、ウイルスもＮＫ細胞もＨＴ２９細胞に添加していないブランク対照群、ｄｄｖｖ−ＲＦＰをその対応する時点で添加したが、ＮＫ細胞を添加していないｄｄｖｖ−ＲＦＰ群、およびＮＫ細胞をその対応する時点で添加したが、ｄｄｖｖ−ＲＦＰを添加していないＮＫ群も、存在した。すべての対照群に、対応する時間において対応する培地置きかえ操作を行った。すべての実験を、３回にわたって繰り返し、平均を、統計学的分析に使用した。
【０２６０】
図４３に示されるように（Ｘ軸は、様々な群を表し、Ｙ軸は、対応する阻害率の百分率値を表す）、ｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫ細胞の組合せ適用（腫瘍溶解性ウイルスを最初に投与し、ＮＫ細胞を後から投与する）は、ＨＴ２９細胞に対して有意な相乗殺滅作用を有し、相乗阻害率は、約７０％であった。しかしながら、この実験において、ｄｄｖｖ−ＲＦＰの単独適用の阻害率は、約３８％であり、ＮＫ細胞の単独適用の阻害率は、約２３％であった。
【０２６１】
例Ｆ３：ｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫの組合せ殺滅実験
例Ｆ３は、ｄｄｖｖ−ＲＦＰの添加による感染の後、細胞を、２４時間ではなく４８時間インキュベートした後に、ＮＫ細胞を添加したことを除き、上述の例Ｆ２と類似であった。図４６に示されるように（Ｘ軸は、様々な群を表し、Ｙ軸は、対応する阻害率の百分率値を表す）、最終的な結果はまた、ｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫ細胞の組合せ適用（腫瘍溶解性ウイルスを最初に投与し、ＮＫ細胞を後から投与する）は、ＨＴ２９細胞に対して有意な相乗殺滅作用を有し、相乗阻害率は、約７８％であったことを示した。しかしながら、この実験において、ｄｄｖｖ−ＲＦＰの単独適用の阻害率は、約５９％であり、ＮＫ細胞の単独適用の阻害率は、約１２％であった。
【０２６２】
比較例Ｆ４：薬物の組合せ同時投与
ＨＴ２９細胞を、３０％のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、３７℃で５％  ＣＯ２において、ＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ中で２４時間インキュベートした。次いで、培地を、無血清ＤＭＥＭで置きかえ、ｄｄｖｖ−ＲＦＰを添加した（ＭＯＩ＝０．２）。６時間感染させた後、培地を、新しいＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳで置きかえ、ＮＫ細胞を添加した（Ｅ：Ｔ比（ＮＫ：ＨＴ２９）＝３：１）。細胞を、さらに７２時間インキュベートし、次いで、死細胞および残屑を洗い流し、残っている生存ＨＴ２９細胞を、トリパンブルー染色法を使用して計数した。この実験には、ウイルスもＮＫ細胞もＨＴ２９細胞に添加していないブランク対照群、ｄｄｖｖ−ＲＦＰをその対応する時点で添加したが、ＮＫ細胞を添加していないｄｄｖｖ−ＲＦＰ群、およびＮＫ細胞をその対応する時点で添加したが、ｄｄｖｖ−ＲＦＰを添加していないＮＫ群も、存在した。すべての対照群に、対応する時間において対応する培地置きかえ操作を行った。すべての実験を、３回にわたって繰り返し、平均を、統計学的分析に使用した。
【０２６３】
図４４に示されるように（Ｘ軸は、様々な群を表し、Ｙ軸は、対応する阻害率の百分率値を表す）、ｄｄｖｖ−ＲＦＰの単独適用の阻害率は、約３８％であり、ＮＫ細胞の単独適用の阻害率は、約３０％であった。これらの単独適用と比較して、ＮＫ細胞およびｄｄｖｖ−ＲＦＰの組合せ使用の阻害率は、約６１％であったため増加していたが、しかしながら、有意な相乗作用は示されなかった。
【０２６４】
比較例Ｆ５：薬物の組合せ同時投与
比較例Ｆ５は、ｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫを添加した後、細胞を、７２時間ではなく９６時間インキュベートしたことを除き、上述の比較例Ｆ４と類似であった。図４７に示されるように（Ｘ軸は、様々な群を表し、Ｙ軸は、対応する阻害率の百分率値を表す）、ｄｄｖｖ−ＲＦＰの単独適用の阻害率は、約６４％であり、ＮＫ細胞の単独適用の阻害率は、約１９％であった。これらの単独適用と比較して、ＮＫ細胞およびｄｄｖｖ−ＲＦＰの組合せ使用の阻害率は、約７７％であったため増加していたが、しかしながら、有意な相乗作用は示されなかった。
【０２６５】
上述の結果は、１）ｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫ細胞の組合せ適用が、ｄｄｖｖ−ＲＦＰまたはＮＫ細胞のいずれかの単独適用よりも優れた有効性を有すること、ならびに２）投与のタイミングが、ｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫ細胞の組合せ適用の有効性に有意に影響を及ぼすことができ、ｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫ細胞を、同時に投与した場合、組合せ適用は相乗作用を示さなかったが、ｄｄｖｖ−ＲＦＰの投与の約２４〜４８時間後にＮＫ細胞を投与した場合には、組合せ適用は相乗作用を示したことを示している。
【０２６６】
比較例Ｆ６：組合せ適用における異なる投与順序間での比較
ＨＴ２９細胞を、３０％のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、３７℃で５％  ＣＯ２において、ＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ中で２４時間インキュベートした。次いで、培地を、新しいＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳで置きかえ、ＮＫ細胞を添加した（Ｅ：Ｔ比（ＮＫ：ＨＴ２９）＝３：１）。細胞を、３７℃で５％  ＣＯ２において、２４時間インキュベートした。次いで、ｄｄｖｖ−ＲＦＰ（ＭＯＩ＝０．２）を、培地を置きかえることなく添加し、細胞を、さらに４８時間インキュベートした。死細胞および残屑を洗い流し、トリパンブルー染色法を、残っている生存ＨＴ２９細胞の計数に使用した。この実験には、ウイルスもＮＫ細胞もＨＴ２９細胞に添加していないブランク対照群、ｄｄｖｖ−ＲＦＰをその対応する時点で添加したが、ＮＫ細胞を添加していないｄｄｖｖ−ＲＦＰ群、およびＮＫ細胞をその対応する時点で添加したが、ｄｄｖｖ−ＲＦＰを添加していないＮＫ群も、存在した。すべての対照群に、対応する時間において対応する培地置きかえ操作を行った。すべての実験を、３回にわたって繰り返し、平均を、統計学的分析に使用した。
【０２６７】
図４５に示されるように（Ｘ軸は、様々な群を表し、Ｙ軸は、対応する阻害率の百分率値を表す）、順序逆転様式での組合せ適用（ＮＫ細胞を最初に投与し、ｄｄｖｖ−ＲＦＰを後から投与する）の阻害率は、約４３％であり、ｄｄｖｖ−ＲＦＰの単独適用の阻害率は、約３０％であり、ＮＫ細胞の単独適用の阻害率は、約３０％であった。順序逆転様式での組合せ適用は、相乗作用を示さなかった。
【０２６８】
比較例Ｆ７：組合せ適用における異なる投与順序間での比較
比較例Ｆ７は、ＮＫを添加した後、細胞を、２４時間ではなく４８時間インキュベートした後に、ｄｄｖｖ−ＲＦＰを添加したことを除き、上述の比較例Ｆ６と類似であった。図４８に示されるように（Ｘ軸は、様々な群を表し、Ｙ軸は、対応する阻害率の百分率値を表す）、順序逆転様式での組合せ適用（ＮＫ細胞を最初に投与し、ｄｄｖｖ−ＲＦＰを後から投与する）の阻害率は、約３４％であり、ｄｄｖｖ−ＲＦＰの単独適用の阻害率は、約２１％であり、ＮＫ細胞の単独適用の阻害率は、約２２％であった。順序逆転様式での組合せ適用は、相乗作用を示さなかった。
【０２６９】
Ｇ：腫瘍溶解性ワクシニアウイルスおよびＮＫ細胞の組合せ適用のＨＣＴ１１６細胞に対する殺滅作用に関する研究
実験例Ｇ１：ＨＣＴ１１６細胞に対するＮＫ細胞の用量応答実験
ＨＣＴ１１６細胞を、３０％のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、３７℃で５％  ＣＯ２において、マッコイ５Ａ＋１０％  ＦＢＳ中で４８時間インキュベートした。次いで、培地を、新しいマッコイ５Ａ＋１０％  ＦＢＳで置きかえ、ＮＫ細胞を、以下のエフェクター対標的細胞の比（すなわち、Ｅ：Ｔ、細胞数の比）で添加した：ＮＫ：ＨＣＴ１１６＝それぞれ４０：１、２０：１、１０：１、および５：１。それぞれのＥ：Ｔ比での殺滅プロセスは、細胞を３７℃で５％  ＣＯ２においてインキュベートした状態で、４８時間継続させた。その後に、トリパンブルー染色法を、生存ＨＣＴ１１６細胞の計数に使用し、ＮＫ細胞によるＨＣＴ１１６細胞の殺滅率を、ＮＫ細胞を添加しなかった対照群に対して計算した。用量応答曲線を、図４９に示すが（Ｘ軸は、Ｅ：Ｔ比を表し、Ｙ軸は、阻害率（ＩＲ）の百分率値を表す）、これは、Ｅ：Ｔ比が１０：１であるときに、約１３％の阻害率を呈し、好適な用量レベルを示している。この投薬量を、組合せ殺滅実験において使用するＮＫ細胞の用量レベルとして採用した。
【０２７０】
実験例Ｇ２：ＨＣＴ１１６細胞に対するｄｄｖｖ−ＲＦＰの用量応答実験
ＨＣＴ１１６細胞を、３０％のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、３７℃で５％  ＣＯ２において、マッコイ５Ａ＋１０％  ＦＢＳ中で２４時間インキュベートした。次いで、培地を、新しい無血清マッコイ５Ａで置きかえ、ｄｄｖｖ−ＲＦＰを、それぞれ、ＭＯＩ＝８、４、２、１、０．５、０．２５、および０．１２５のＭＯＩで添加した。感染プロセスは、細胞を３７℃で５％  ＣＯ２においてインキュベートした状態で、６時間継続させ、次いで、培地を除去し、細胞を、ＰＢＳで洗浄した。次いで、マッコイ５Ａ＋１０％  ＦＢＳを添加し、細胞を、さらに７２時間インキュベートした。その後に、トリパンブルー染色法を、生存ＨＣＴ１１６細胞の計数に使用し、ｄｄｖｖ−ＲＦＰによるＨＣＴ１１６細胞の殺滅率を、ｄｄｖｖ−ＲＦＰを添加しなかった対照群に対して計算した。図５０は、用量応答曲線（Ｘ軸は、ＭＯＩを表し、Ｙ軸は、阻害率（ＩＲ）の百分率値を表す）を示すが、これは、ＨＣＴ１１６細胞に対するｄｄｖｖ−ＲＦＰの用量レベルが約０．７のＭＯＩであるときに、約２２％の阻害率を呈し、好適な用量レベルを示している。この投薬量を、組合せ殺滅実験において使用するｄｄｖｖ−ＲＦＰの用量レベルとして採用した。
【０２７１】
例Ｇ３：ｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫの組合せ殺滅実験
上述の実験例から、ＨＣＴ１１６細胞に対する殺滅に好適なｄｄｖｖ−ＲＦＰの用量レベルは、約０．７のＭＯＩであり、ＨＣＴ１１６細胞に対する殺滅に好適なＮＫ細胞の用量レベルは、約１０：１のＥ：Ｔ比（すなわち、ＮＫ：ＨＣＴ１１６）であったと結論付けることができる。
【０２７２】
ＨＣＴ１１６細胞を、３０％のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、３７℃で５％  ＣＯ２において、マッコイ５Ａ＋１０％  ＦＢＳ中で２４時間インキュベートした。次いで、培地を、無血清マッコイ５Ａで置きかえ、ｄｄｖｖ−ＲＦＰを添加した（ＭＯＩ＝０．７）。６時間感染させた後、培地を、マッコイ５Ａ＋１０％  ＦＢＳで置きかえ、細胞を、３７℃で５％  ＣＯ２において、２４時間インキュベートした。次いで、ＮＫ細胞を、培地を置きかえることなく添加し（Ｅ：Ｔ比（ＮＫ：ＨＣＴ１１６＝１０：１）、細胞を、さらに４８時間インキュベートした。死細胞および残屑を洗い流し、トリパンブルー染色法を、残っている生存ＨＣＴ１１６細胞の計数に使用した。この実験には、ウイルスもＮＫ細胞もＨＣＴ１１６細胞に添加していないブランク対照群、ｄｄｖｖ−ＲＦＰをその対応する時点で添加したが、ＮＫ細胞を添加していないｄｄｖｖ−ＲＦＰ群、およびＮＫ細胞をその対応する時点で添加したが、ｄｄｖｖ−ＲＦＰを添加していないＮＫ群も、存在した。すべての対照群に、対応する時間において対応する培地置きかえ操作を行った。すべての実験を、３回にわたって繰り返し、平均を、統計学的分析に使用した。
【０２７３】
図５１に示されるように（Ｘ軸は、様々な群を表し、Ｙ軸は、対応する阻害率の百分率値を表す）、ｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫ細胞の組合せ適用（腫瘍溶解性ウイルスを最初に投与し、ＮＫ細胞を後から投与する）は、ＨＣＴ１１６細胞に対して有意な相乗殺滅作用を有し、相乗阻害率は、約７１％であった。しかしながら、この実験において、ｄｄｖｖ−ＲＦＰの単独適用の阻害率は、約３７％であり、ＮＫ細胞の単独適用の阻害率は、約２５％であった。
【０２７４】
比較例Ｇ４：薬物の組合せ同時投与
ＨＣＴ１１６細胞を、３０％のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、３７℃で５％  ＣＯ２において、マッコイ５Ａ＋１０％  ＦＢＳ中で２４時間インキュベートした。次いで、培地を、無血清マッコイ５Ａで置きかえ、ｄｄｖｖ−ＲＦＰを添加した（ＭＯＩ＝０．７）。６時間感染させた後、培地を、新しいマッコイ５Ａ＋１０％  ＦＢＳで置きかえ、ＮＫ細胞を添加した（Ｅ：Ｔ比（ＮＫ：ＨＣＴ１１６）＝１０：１）。細胞を、さらに７２時間インキュベートし、次いで、死細胞および残屑を洗い流し、残っている生存ＨＣＴ１１６細胞を、トリパンブルー染色法を使用して計数した。この実験には、ウイルスもＮＫ細胞もＨＣＴ１１６細胞に添加していないブランク対照群、ｄｄｖｖ−ＲＦＰをその対応する時点で添加したが、ＮＫ細胞を添加していないｄｄｖｖ−ＲＦＰ群、およびＮＫ細胞をその対応する時点で添加したが、ｄｄｖｖ−ＲＦＰを添加していないＮＫ群も、存在した。すべての対照群に、対応する時間において対応する培地置きかえ操作を行った。すべての実験を、３回にわたって繰り返し、平均を、統計学的分析に使用した。
【０２７５】
図５２に示されるように（Ｘ軸は、様々な群を表し、Ｙ軸は、対応する阻害率の百分率値を表す）、ｄｄｖｖ−ＲＦＰの単独適用の阻害率は、約３７％であり、ＮＫ細胞の単独適用の阻害率は、約４１％であった。これらの単独適用と比較して、ＮＫ細胞およびｄｄｖｖ−ＲＦＰの組合せ使用の阻害率は、約７８％であったため増加していたが、しかしながら、有意な相乗作用は示されなかった。
【０２７６】
上述の結果は、１）ｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫ細胞の組合せ適用が、ｄｄｖｖ−ＲＦＰまたはＮＫ細胞のいずれかの単独適用よりも優れた有効性を有すること、ならびに２）投与のタイミングが、ｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫ細胞の組合せ適用の有効性に有意に影響を及ぼすことができ、ｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫ細胞を、実質的に同時に投与した場合、組合せ適用は相乗作用を示さなかったが、ｄｄｖｖ−ＲＦＰを最初に投与し、ＮＫ細胞を後から投与した場合には、組合せ適用は相乗作用を示したことを示している。
【０２７７】
比較例Ｇ５：組合せ適用における異なる投与順序間での比較
ＨＣＴ１１６細胞を、３０％のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、３７℃で５％  ＣＯ２において、マッコイ５Ａ＋１０％  ＦＢＳ中で２４時間インキュベートした。次いで、ＮＫ細胞を、培地を置きかえることなく添加し（Ｅ：Ｔ比（ＮＫ：ＨＣＴ１１６）＝１０：１）、細胞を、３７℃で５％  ＣＯ２において、２４時間インキュベートした。次いで、ｄｄｖｖ−ＲＦＰ（ＭＯＩ＝０．７）を、培地を置きかえることなく添加し、細胞を、さらに４８時間インキュベートした。死細胞および残屑を洗い流し、トリパンブルー染色法を、残っている生存ＨＣＴ１１６細胞の計数に使用した。この実験には、ウイルスもＮＫ細胞もＨＣＴ１１６細胞に添加していないブランク対照群、ｄｄｖｖ−ＲＦＰをその対応する時点で添加したが、ＮＫ細胞を添加していないｄｄｖｖ−ＲＦＰ群、およびＮＫ細胞をその対応する時点で添加したが、ｄｄｖｖ−ＲＦＰを添加していないＮＫ群も、存在した。すべての実験を、３回にわたって繰り返し、平均を、統計学的分析に使用した。
【０２７８】
図５３に示されるように（Ｘ軸は、様々な群を表し、Ｙ軸は、対応する阻害率の百分率値を表す）、順序逆転様式での組合せ適用（ＮＫ細胞を最初に投与し、ｄｄｖｖ−ＲＦＰを後から投与する）の阻害率は、約５８％であり、ｄｄｖｖ−ＲＦＰの単独適用の阻害率は、約２１％であり、ＮＫ細胞の単独適用の阻害率は、約４１％であった。順序逆転様式での組合せ適用は、相乗作用を示さなかった。
【０２７９】
Ｈ：腫瘍溶解性ワクシニアウイルスおよびＮＫ細胞の組合せ適用のＦａＤｕ細胞に対する殺滅作用に関する研究
実験例Ｈ１：ＦａＤｕ細胞に対するＮＫ細胞の用量応答実験
ＦａＤｕ細胞を、３０％のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、３７℃で５％  ＣＯ２において、ＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ中で４８時間インキュベートした。次いで、培地を、新しいＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳで置きかえ、ＮＫ細胞を、以下のエフェクター対標的細胞の比（すなわち、Ｅ：Ｔ、細胞数の比）で添加した：ＮＫ：ＦａＤｕ＝それぞれ４０：１、３０：１、２０：１、１５：１、１０：１、および５：１。それぞれのＥ：Ｔ比での殺滅プロセスは、細胞を３７℃で５％  ＣＯ２においてインキュベートした状態で、４８時間継続させた。その後に、トリパンブルー染色法を、生存ＦａＤｕ細胞の計数に使用し、ＮＫ細胞によるＦａＤｕ細胞の殺滅率を、ＮＫ細胞を添加しなかった対照群に対して計算した。用量応答曲線を、図５４に示すが（Ｘ軸は、Ｅ：Ｔ比を表し、Ｙ軸は、阻害率（ＩＲ）の百分率値を表す）、これは、Ｅ：Ｔ比が１０：１であるときに、約２７％の阻害率を呈し、好適な用量レベルを示している。この投薬量を、組合せ殺滅実験において使用するＮＫ細胞の用量レベルとして採用した。
【０２８０】
実験例Ｈ２：ＦａＤｕ細胞に対するｄｄｖｖ−ＲＦＰの用量応答実験
ＦａＤｕ細胞を、３０％のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、３７℃で５％  ＣＯ２において、ＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ中で２４時間インキュベートした。次いで、培地を、新しい無血清ＭＥＭで置きかえ、ｄｄｖｖ−ＲＦＰを、それぞれ、ＭＯＩ＝２、１、０．５、０．２５、０．１２５、０．０６２５、および０．０３１２５のＭＯＩで添加した。感染プロセスは、細胞を３７℃で５％  ＣＯ２においてインキュベートした状態で、６時間継続させ、次いで、培地を除去し、細胞を、ＰＢＳで洗浄した。次いで、ＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳを添加し、細胞を、さらに７２時間インキュベートした。その後に、トリパンブルー染色法を、生存ＦａＤｕ細胞の計数に使用し、ｄｄｖｖ−ＲＦＰによるＦａＤｕの殺滅率を、ｄｄｖｖ−ＲＦＰを添加しなかった対照群に対して計算した。図５５は、用量応答曲線（Ｘ軸は、ＭＯＩを表し、Ｙ軸は、阻害率（ＩＲ）の百分率値を表す）を示すが、これは、ＦａＤｕ細胞に対するｄｄｖｖ−ＲＦＰの用量レベルが約０．２のＭＯＩであるときに、約３２％の阻害率を呈し、好適な用量レベルを示している。この投薬量を、組合せ殺滅実験において使用するｄｄｖｖ−ＲＦＰの用量レベルとして採用した。
【０２８１】
例Ｈ３：ｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫ細胞の組合せ殺滅実験
上述の実験例から、ＦａＤｕ細胞に対する殺滅に好適なｄｄｖｖ−ＲＦＰの用量レベルは、約０．２のＭＯＩであり、ＦａＤｕ細胞に対する殺滅に好適なＮＫ細胞の用量レベルは、約１０：１のＥ：Ｔ比（すなわち、ＮＫ：ＦａＤｕ）であったと結論付けることができる。
【０２８２】
ＦａＤｕ細胞を、３０％のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、３７℃で５％  ＣＯ２において、ＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ中で２４時間インキュベートした。次いで、培地を、無血清ＭＥＭで置きかえ、ｄｄｖｖ−ＲＦＰを添加した（ＭＯＩ＝０．２）。６時間感染させた後、培地を、ＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳで置きかえ、細胞を、３７℃で５％  ＣＯ２において、２４時間インキュベートした。次いで、ＮＫ細胞を、培地を置きかえることなく添加し（Ｅ：Ｔ比（ＮＫ：ＦａＤｕ＝１０：１）、細胞を、さらに４８時間インキュベートした。死細胞および残屑を洗い流し、トリパンブルー染色法を、残っている生存ＦａＤｕ細胞の計数に使用した。この実験には、ウイルスもＮＫ細胞もＦａＤｕ細胞に添加していないブランク対照群、ｄｄｖｖ−ＲＦＰをその対応する時点で添加したが、ＮＫ細胞を添加していないｄｄｖｖ−ＲＦＰ群、およびＮＫ細胞をその対応する時点で添加したが、ｄｄｖｖ−ＲＦＰを添加していないＮＫ群も、存在した。すべての対照群に、対応する時間において対応する培地置きかえ操作を行った。すべての実験を、３回にわたって繰り返し、平均を、統計学的分析に使用した。
【０２８３】
図５６に示されるように（Ｘ軸は、様々な群を表し、Ｙ軸は、対応する阻害率の百分率値を表す）、ｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫ細胞の組合せ適用（腫瘍溶解性ウイルスを最初に投与し、ＮＫ細胞を後から投与する）は、ＦａＤｕ細胞に対して有意な相乗殺滅作用を有し、相乗阻害率は、約８２％であった。しかしながら、この実験において、ｄｄｖｖ−ＲＦＰの単独適用の阻害率は、約３８％であり、ＮＫ細胞の単独適用の阻害率は、約２６％であった。
【０２８４】
比較例Ｈ４：薬物の組合せ同時投与
ＦａＤｕ細胞を、３０％のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、３７℃で５％  ＣＯ２において、ＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ中で２４時間インキュベートした。次いで、培地を、無血清ＭＥＭで置きかえ、ｄｄｖｖ−ＲＦＰを添加した（ＭＯＩ＝０．２）。６時間感染させた後、培地を、新しいＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳで置きかえ、ＮＫ細胞を添加した（Ｅ：Ｔ比（ＮＫ：ＦａＤｕ）＝１０：１）。細胞を、さらに７２時間インキュベートし、次いで、死細胞および残屑を洗い流し、残っている生存ＦａＤｕ細胞を、トリパンブルー染色法を使用して計数した。この実験には、ウイルスもＮＫ細胞もＦａＤｕ細胞に添加していないブランク対照群、ｄｄｖｖ−ＲＦＰをその対応する時点で添加したが、ＮＫ細胞を添加していないｄｄｖｖ−ＲＦＰ群、およびＮＫ細胞をその対応する時点で添加したが、ｄｄｖｖ−ＲＦＰを添加していないＮＫ群も、存在した。すべての対照群に、対応する時間において対応する培地置きかえ操作を行った。すべての実験を、３回にわたって繰り返し、平均を、統計学的分析に使用した。
【０２８５】
図５７に示されるように（Ｘ軸は、様々な群を表し、Ｙ軸は、対応する阻害率の百分率値を表す）、ｄｄｖｖ−ＲＦＰの単独適用の阻害率は、約３８％であり、ＮＫ細胞の単独適用の阻害率は、約４１％であった。これらの単独適用と比較して、ＮＫ細胞およびｄｄｖｖ−ＲＦＰの組合せ使用の阻害率は、約７２％であったため増加していたが、しかしながら、有意な相乗作用は示されなかった。
【０２８６】
上述の結果は、１）ｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫ細胞の組合せ適用が、ｄｄｖｖ−ＲＦＰまたはＮＫ細胞のいずれかの単独適用よりも優れた有効性を有すること、ならびに２）投与のタイミングが、ｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫ細胞の組合せ適用の有効性に有意に影響を及ぼすことができ、ｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫ細胞を、実質的に同時に投与した場合、組合せ適用は相乗作用を示さなかったが、ｄｄｖｖ−ＲＦＰを最初に投与し、ＮＫ細胞を後から投与した場合には、組合せ適用は有意な相乗作用を示したことを示している。
【０２８７】
比較例Ｈ５：組合せ適用における異なる投与順序間での比較
ＦａＤｕ細胞を、３０％のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、３７℃で５％  ＣＯ２において、ＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ中で２４時間インキュベートした。次いで、ＮＫ細胞を、培地を置きかえることなく添加し（Ｅ：Ｔ比（ＮＫ：ＦａＤｕ＝１０：１）、細胞を、３７℃で５％  ＣＯ２において、２４時間インキュベートした。次いで、ｄｄｖｖ−ＲＦＰ（ＭＯＩ＝０．２）を、培地を置きかえることなく添加し、細胞を、さらに４８時間インキュベートした。死細胞および残屑を洗い流し、トリパンブルー染色法を、残っている生存ＦａＤｕ細胞の計数に使用した。この実験には、ウイルスもＮＫ細胞もＦａＤｕ細胞に添加していないブランク対照群、ｄｄｖｖ−ＲＦＰをその対応する時点で添加したが、ＮＫ細胞を添加していないｄｄｖｖ−ＲＦＰ群、およびＮＫ細胞をその対応する時点で添加したが、ｄｄｖｖ−ＲＦＰを添加していないＮＫ群も、存在した。すべての実験を、３回にわたって繰り返し、平均を、統計学的分析に使用した。
【０２８８】
図５８に示されるように（Ｘ軸は、様々な群を表し、Ｙ軸は、対応する阻害率の百分率値を表す）、順序逆転様式での組合せ適用（ＮＫ細胞を最初に投与し、ｄｄｖｖ−ＲＦＰを後から投与する）の阻害率は、約６４％であり、ｄｄｖｖ−ＲＦＰの単独適用の阻害率は、約２２％であり、ＮＫ細胞の単独適用の阻害率は、約４１％であった。順序逆転様式での組合せ適用は、有意な相乗作用を示さなかった（Ｐ＞０．８）。
【０２８９】
Ｉ：腫瘍溶解性ワクシニアウイルスおよびＮＫ細胞の組合せ適用のＳＫ−ＨＥＰ−１細胞に対する殺滅作用に関する研究
実験例Ｉ１：ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞に対するＮＫ細胞の用量応答実験
ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞を、３０％のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、３７℃で５％  ＣＯ２において、ＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ中で４８時間インキュベートした。次いで、培地を、新しいＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳで置きかえ、ＮＫ細胞を、以下のエフェクター対標的細胞の比（すなわち、Ｅ：Ｔ、細胞数の比）で添加した：ＮＫ：ＳＫ−ＨＥＰ−１＝それぞれ４０：１、３０：１、２０：１、１０：１、および５：１。それぞれのＥ：Ｔ比での殺滅プロセスは、細胞を３７℃で５％  ＣＯ２においてインキュベートした状態で、４８時間継続させた。その後に、トリパンブルー染色法を、生存ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞の計数に使用し、ＮＫ細胞によるＳＫ−ＨＥＰ−１細胞の殺滅率を、ＮＫ細胞を添加しなかった対照群に対して計算した。図５９は、用量応答曲線（Ｘ軸は、Ｅ：Ｔ比を表し、Ｙ軸は、阻害率（ＩＲ）の百分率値を表す）を示すが、これは、Ｅ：Ｔ比が５：１であるときに、約１７％の阻害率を呈し、好適な用量レベルを示している。この投薬量を、組合せ殺滅実験において使用するＮＫ細胞の用量レベルとして採用した。
【０２９０】
実験例Ｉ２：ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞に対するｄｄｖｖ−ＲＦＰの用量応答実験
ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞を、３０％のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、３７℃で５％  ＣＯ２において、ＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ中で２４時間インキュベートした。次いで、培地を、新しい無血清ＭＥＭで置きかえ、ｄｄｖｖ−ＲＦＰを、それぞれ、ＭＯＩ＝１、０．５、０．２５、０．１２５、０．０６２５、０．０３、および０．０１５のＭＯＩで添加した。感染プロセスは、細胞を３７℃で５％  ＣＯ２においてインキュベートした状態で、６時間継続させ、次いで、培地を除去し、細胞を、ＰＢＳで洗浄した。次いで、ＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳを添加し、細胞を、さらに７２時間インキュベートした。その後に、トリパンブルー染色法を、生存ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞の計数に使用し、ｄｄｖｖ−ＲＦＰによるＳＫ−ＨＥＰ−１の殺滅率を、ｄｄｖｖ−ＲＦＰを添加しなかった対照群に対して計算した。図６０は、用量応答曲線（Ｘ軸は、ＭＯＩを表し、Ｙ軸は、阻害率（ＩＲ）の百分率値を表す）を示すが、これは、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞に対するｄｄｖｖ−ＲＦＰの用量レベルが約０．１５のＭＯＩであるときに、約４０％の阻害率を呈し、好適な用量レベルを示している。この投薬量を、組合せ殺滅実験において使用するｄｄｖｖ−ＲＦＰの用量レベルとして採用した。
【０２９１】
例Ｉ３：ｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫの組合せ殺滅実験
上述の実験例から、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞に対する殺滅に好適なｄｄｖｖ−ＲＦＰの用量レベルは、約０．１５のＭＯＩであり、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞に対する殺滅に好適なＮＫ細胞の用量レベルは、約５：１のＥ：Ｔ比（すなわち、ＮＫ：ＳＫ−ＨＥＰ−１）であったと結論付けることができる。
【０２９２】
ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞を、３０％のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、３７℃で５％  ＣＯ２において、ＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ中で２４時間インキュベートした。次いで、培地を、無血清ＭＥＭで置きかえ、ｄｄｖｖ−ＲＦＰを添加した（ＭＯＩ＝０．１５）。６時間感染させた後、培地を、ＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳで置きかえ、細胞を、３７℃で５％  ＣＯ２において、２４時間インキュベートした。培地を、新しいＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳで置きかえ、ＮＫ細胞を添加し（Ｅ：Ｔ比（ＮＫ：ＳＫ−ＨＥＰ−１）＝５：１）、細胞を、さらに４８時間インキュベートした。死細胞および残屑を洗い流し、トリパンブルー染色法を、残っている生存ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞の計数に使用した。この実験には、ウイルスもＮＫ細胞もＳＫ−ＨＥＰ−１細胞に添加していないブランク対照群、ｄｄｖｖ−ＲＦＰをその対応する時点で添加したが、ＮＫ細胞を添加していないｄｄｖｖ−ＲＦＰ群、およびＮＫ細胞をその対応する時点で添加したが、ｄｄｖｖ−ＲＦＰを添加していないＮＫ群も、存在した。すべての対照群に、対応する時間において対応する培地置きかえ操作を行った。すべての実験を、３回にわたって繰り返し、平均を、統計学的分析に使用した。
【０２９３】
図６１に示されるように（Ｘ軸は、様々な群を表し、Ｙ軸は、対応する阻害率の百分率値を表す）、ｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫ細胞の組合せ適用（腫瘍溶解性ウイルスを最初に投与し、ＮＫ細胞を後から投与する）は、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞に対して有意な相乗殺滅作用を有し、相乗阻害率は、約７２％であった。しかしながら、この実験において、ｄｄｖｖ−ＲＦＰの単独適用の阻害率は、約５１％であり、ＮＫ細胞の単独適用の阻害率は、約１３％であった。
【０２９４】
比較例Ｉ４：薬物の組合せ同時投与
ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞を、３０％のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、３７℃で５％  ＣＯ２において、ＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ中で２４時間インキュベートした。次いで、培地を、無血清ＭＥＭで置きかえ、ｄｄｖｖ−ＲＦＰを添加した（ＭＯＩ＝０．１５）。６時間感染させた後、培地を、新しいＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳで置きかえ、ＮＫ細胞を添加した（Ｅ：Ｔ比（ＮＫ：ＳＫ−ＨＥＰ−１）＝５：１）。細胞を、さらに７２時間インキュベートし、次いで、死細胞および残屑を洗い流し、残っている生存ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞を、トリパンブルー染色法を使用して計数した。この実験には、ウイルスもＮＫ細胞もＳＫ−ＨＥＰ−１細胞に添加していないブランク対照群、ｄｄｖｖ−ＲＦＰをその対応する時点で添加したが、ＮＫ細胞を添加していないｄｄｖｖ−ＲＦＰ群、およびＮＫ細胞をその対応する時点で添加したが、ｄｄｖｖ−ＲＦＰを添加していないＮＫ群も、存在した。すべての対照群に、対応する時間において対応する培地置きかえ操作を行った。すべての実験を、３回にわたって繰り返し、平均を、統計学的分析に使用した。
【０２９５】
図６２に示されるように（Ｘ軸は、様々な群を表し、Ｙ軸は、対応する阻害率の百分率値を表す）、ｄｄｖｖ−ＲＦＰの単独適用の阻害率は、約５１％であり、ＮＫ細胞の単独適用の阻害率は、約１７％であった。これらの単独適用と比較して、ＮＫ細胞およびｄｄｖｖ−ＲＦＰの組合せ使用の阻害率は、約６０％であったため増加していたが、しかしながら、有意な相乗作用は示されなかった。
【０２９６】
上述の結果は、１）ｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫ細胞の組合せ適用が、ｄｄｖｖ−ＲＦＰまたはＮＫ細胞のいずれかの単独適用よりも優れた有効性を有すること、ならびに２）投与のタイミングが、ｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫ細胞の組合せ適用の有効性に有意に影響を及ぼすことができ、ｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫ細胞を、実質的に同時に投与した場合、組合せ適用は相乗作用を示さなかったが、ｄｄｖｖ−ＲＦＰを最初に投与し、ＮＫ細胞を後から投与した場合には、組合せ適用は有意な相乗作用を示したことを示している。
【０２９７】
比較例Ｉ５：組合せ適用における異なる投与順序間での比較
ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞を、３０％のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、３７℃で５％  ＣＯ２において、ＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ中で２４時間インキュベートした。次いで、培地を、新しいＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳで置きかえ、ＮＫ細胞を添加した（Ｅ：Ｔ比（ＮＫ：ＳＫ−ＨＥＰ−１）＝５：１）。細胞を、３７℃で５％  ＣＯ２において、２４時間インキュベートした。次いで、ｄｄｖｖ−ＲＦＰ（ＭＯＩ＝０．１５）を、培地を置きかえることなく添加し、細胞を、さらに４８時間インキュベートした。死細胞および残屑を洗い流し、トリパンブルー染色法を、残っている生存ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞の計数に使用した。この実験には、ウイルスもＮＫ細胞もＳＫ−ＨＥＰ−１細胞に添加していないブランク対照群、ｄｄｖｖ−ＲＦＰをその対応する時点で添加したが、ＮＫ細胞を添加していないｄｄｖｖ−ＲＦＰ群、およびＮＫ細胞をその対応する時点で添加したが、ｄｄｖｖ−ＲＦＰを添加していないＮＫ群も、存在した。すべての対照群に、対応する時間において対応する培地置きかえ操作を行った。すべての実験を、３回にわたって繰り返し、平均を、統計学的分析に使用した。
【０２９８】
図６３に示されるように（Ｘ軸は、様々な群を表し、Ｙ軸は、対応する阻害率の百分率値を表す）、順序逆転様式での組合せ適用（ＮＫ細胞を最初に投与し、ｄｄｖｖ−ＲＦＰを後から投与する）の阻害率は、約２１％であり、ｄｄｖｖ−ＲＦＰの単独適用の阻害率は、約１１％であり、ＮＫ細胞の単独適用の阻害率は、約１７％であった。順序逆転様式での組合せ適用は、相乗作用を示さなかった。
【０２９９】
Ｊ：腫瘍溶解性ワクシニアウイルスおよびＮＫ細胞の組合せ適用のＰＡＮＣ−１細胞に対する殺滅作用に関する研究
実験例Ｊ１：ＰＡＮＣ−１細胞に対するＮＫ細胞の用量応答実験
ＰＡＮＣ−１細胞を、３０％のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、３７℃で５％  ＣＯ２において、ＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ中で４８時間インキュベートした。次いで、培地を、新しいＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳで置きかえ、ＮＫ細胞を、以下のエフェクター対標的細胞の比（すなわち、Ｅ：Ｔ、細胞数の比）で添加した：ＮＫ：ＰＡＮＣ−１＝それぞれ４０：１、２０：１、１５：１、１０：１、および５：１。それぞれのＥ：Ｔ比での殺滅プロセスは、細胞を３７℃で５％  ＣＯ２においてインキュベートした状態で、４８時間継続させた。その後に、トリパンブルー染色法を、生存ＰＡＮＣ−１細胞の計数に使用し、ＮＫ細胞によるＰＡＮＣ−１細胞の殺滅率を、ＮＫ細胞を添加しなかった対照群に対して計算した。図６４は、用量応答曲線（Ｘ軸は、Ｅ：Ｔ比を表し、Ｙ軸は、阻害率（ＩＲ）の百分率値を表す）を示すが、これは、Ｅ：Ｔ比が３：１であるときに、約１０％の阻害率を呈する。この投薬量を、組合せ殺滅実験において使用するＮＫ細胞の用量レベルとして採用した。
【０３００】
実験例Ｊ２：ＰＡＮＣ−１細胞に対するｄｄｖｖ−ＲＦＰの用量応答実験
ＰＡＮＣ−１細胞を、３０％のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、３７℃で５％  ＣＯ２において、ＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ中で２４時間インキュベートした。次いで、培地を、新しい無血清ＤＭＥＭで置きかえ、ｄｄｖｖ−ＲＦＰを、それぞれ、ＭＯＩ＝０．５、０．２５、０．１２５、０．０６２５、０．０３、および０．０１５のＭＯＩで添加した。感染プロセスは、細胞を３７℃で５％  ＣＯ２においてインキュベートした状態で、６時間継続させ、次いで、培地を除去し、細胞を、ＰＢＳで洗浄した。次いで、ＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳを添加し、細胞を、さらに７２時間インキュベートした。その後に、トリパンブルー染色法を、生存ＰＡＮＣ−１細胞の計数に使用し、ｄｄｖｖ−ＲＦＰによるＰＡＮＣ−１の殺滅率を、ｄｄｖｖ−ＲＦＰを添加しなかった対照群に対して計算した。図６５は、用量応答曲線（Ｘ軸は、ＭＯＩを表し、Ｙ軸は、阻害率（ＩＲ）の百分率値を表す）を示すが、これは、ＭＯＩが０．１であるときに、約５８％の阻害率を呈する。この投薬量を、組合せ殺滅実験において使用するｄｄｖｖ−ＲＦＰの用量レベルとして採用した。
【０３０１】
例Ｊ３：ｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫの組合せ殺滅実験
上述の実験例から、ＰＡＮＣ−１細胞に対する殺滅に好適なｄｄｖｖ−ＲＦＰの用量レベルは、約０．１のＭＯＩであり、ＰＡＮＣ−１細胞に対する殺滅に好適なＮＫ細胞の用量レベルは、約３：１のＥ：Ｔ比（すなわち、ＮＫ：ＰＡＮＣ−１）であったと結論付けることができる。
【０３０２】
ＰＡＮＣ−１細胞を、３０％のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、３７℃で５％  ＣＯ２において、ＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ中で２４時間インキュベートした。次いで、培地を、無血清ＤＭＥＭで置きかえ、ｄｄｖｖ−ＲＦＰを添加した（ＭＯＩ＝０．１）。６時間感染させた後、培地を、ＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳで置きかえ、細胞を、３７℃で５％  ＣＯ２において、４８時間インキュベートした。培地を、新しいＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳで置きかえ、ＮＫ細胞を添加し（Ｅ：Ｔ比（ＮＫ：ＰＡＮＣ−１）＝３：１）、細胞を、さらに４８時間インキュベートした。死細胞および残屑を洗い流し、トリパンブルー染色法を、残っている生存ＰＡＮＣ−１細胞の計数に使用した。この実験には、ウイルスもＮＫ細胞もＰＡＮＣ−１細胞に添加していないブランク対照群、ｄｄｖｖ−ＲＦＰをその対応する時点で添加したが、ＮＫ細胞を添加していないｄｄｖｖ−ＲＦＰ群、およびＮＫ細胞をその対応する時点で添加したが、ｄｄｖｖ−ＲＦＰを添加していないＮＫ群も、存在した。すべての対照群に、対応する時間において対応する培地置きかえ操作を行った。すべての実験を、３回にわたって繰り返し、平均を、統計学的分析に使用した。
【０３０３】
図６６に示されるように（Ｘ軸は、様々な群を表し、Ｙ軸は、対応する阻害率の百分率値を表す）、ｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫ細胞の組合せ適用（腫瘍溶解性ウイルスを最初に投与し、ＮＫ細胞を後から投与する）は、ＰＡＮＣ−１細胞に対して有意な相乗殺滅作用を有し、相乗阻害率は、約８５％であった。しかしながら、この実験において、ｄｄｖｖ−ＲＦＰの単独適用の阻害率は、約５９％であり、ＮＫ細胞の単独適用の阻害率は、約１３％であった。
【０３０４】
比較例Ｊ４：薬物の組合せ同時投与
ＰＡＮＣ−１細胞を、３０％のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、３７℃で５％  ＣＯ２において、ＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ中で２４時間インキュベートした。次いで、培地を、無血清ＤＭＥＭで置きかえ、ｄｄｖｖ−ＲＦＰを添加した（ＭＯＩ＝０．１）。６時間感染させた後、培地を、新しいＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳで置きかえ、ＮＫ細胞を添加した（Ｅ：Ｔ比（ＮＫ：ＰＡＮＣ−１）＝３：１）。細胞を、さらに９６時間インキュベートし、次いで、死細胞および残屑を洗い流し、残っている生存ＰＡＮＣ−１細胞を、トリパンブルー染色法を使用して計数した。この実験には、ウイルスもＮＫ細胞もＰＡＮＣ−１細胞に添加していないブランク対照群、ｄｄｖｖ−ＲＦＰをその対応する時点で添加したが、ＮＫ細胞を添加していないｄｄｖｖ−ＲＦＰ群、およびＮＫ細胞をその対応する時点で添加したが、ｄｄｖｖ−ＲＦＰを添加していないＮＫ群も、存在した。すべての対照群に、対応する時間において対応する培地置きかえ操作を行った。すべての実験を、３回にわたって繰り返し、平均を、統計学的分析に使用した。
【０３０５】
図６７に示されるように（Ｘ軸は、様々な群を表し、Ｙ軸は、対応する阻害率の百分率値を表す）、ｄｄｖｖ−ＲＦＰの単独適用の阻害率は、約５９％であり、ＮＫ細胞の単独適用の阻害率は、約１９％であった。これらの単独適用と比較して、ＮＫ細胞およびｄｄｖｖ−ＲＦＰの組合せ使用の阻害率は、約８０％であったため増加していたが、しかしながら、有意な相乗作用は示されなかった（Ｐ＞０．３）。
【０３０６】
上述の結果は、１）ｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫ細胞の組合せ適用が、ｄｄｖｖ−ＲＦＰまたはＮＫ細胞のいずれかの単独適用よりも優れた有効性を有すること、ならびに２）投与のタイミングが、ｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫ細胞の組合せ適用の有効性に有意に影響を及ぼすことができ、ｄｄｖｖ−ＲＦＰおよびＮＫ細胞を、実質的に同時に投与した場合、組合せ適用は有意な相乗作用を示さなかったが、ｄｄｖｖ−ＲＦＰを最初に投与し、ＮＫ細胞を後から投与した場合には、組合せ適用は有意な相乗作用を示したことを示している。
【０３０７】
比較例Ｊ５：組合せ適用における異なる投与順序間での比較
ＰＡＮＣ−１細胞を、３０％のコンフルエンシーで培養プレートに播種し、３７℃で５％  ＣＯ２において、ＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ中で２４時間インキュベートした。次いで、培地を、新しいＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳで置きかえ、ＮＫ細胞を添加した（Ｅ：Ｔ比（ＮＫ：ＰＡＮＣ−１）＝３：１）。細胞を、３７℃で５％  ＣＯ２において、４８時間インキュベートした。次いで、ｄｄｖｖ−ＲＦＰ（ＭＯＩ＝０．１）を、培地を置きかえることなく添加し、細胞を、さらに４８時間インキュベートした。死細胞および残屑を洗い流し、トリパンブルー染色法を、残っている生存ＰＡＮＣ−１細胞の計数に使用した。この実験には、ウイルスもＮＫ細胞もＰＡＮＣ−１細胞に添加していないブランク対照群、ｄｄｖｖ−ＲＦＰをその対応する時点で添加したが、ＮＫ細胞を添加していないｄｄｖｖ−ＲＦＰ群、およびＮＫ細胞をその対応する時点で添加したが、ｄｄｖｖ−ＲＦＰを添加していないＮＫ群も、存在した。すべての対照群に、対応する時間において対応する培地置きかえ操作を行った。すべての実験を、３回にわたって繰り返し、平均を、統計学的分析に使用した。
【０３０８】
図６８に示されるように（Ｘ軸は、様々な群を表し、Ｙ軸は、対応する阻害率の百分率値を表す）、順序逆転様式での組合せ適用（ＮＫ細胞を最初に投与し、ｄｄｖｖ−ＲＦＰを後から投与する）の阻害率は、約２８％であり、ｄｄｖｖ−ＲＦＰの単独適用の阻害率は、約２１％であり、ＮＫ細胞の単独適用の阻害率は、約１９％であった。順序逆転様式での組合せ適用は、相乗作用を示さなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【国際調査報告】
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