(57)【要約】  ＨＬＡ拘束性にＨＬＡ−Ａ２／チロシナーゼ（ＴｙｒＤ）に結合することができる抗体を提供する。具体的には、抗体は、ＨＬＡ拘束性にＨＬＡ−Ａ２／ＴｙｒＤ３６９−３７７に結合することができる。さらに、抗体の重鎖及び軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）配列、ならびにがんの治療のために抗体を使用する方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−Ｃの順にＣＤＲ配列：
ＣＤＲ１重鎖（ＨＣ）  配列番号８    ＴＳＧＭＧＶＳ
ＣＤＲ２  ＨＣ        配列番号９    ＨＩＹＷＤＤＤＫＲＹＮＰＳＬＫＳ
ＣＤＲ３  ＨＣ        配列番号１０  ＫＤＹＧＳＳＦＹＡＭＨＹ
ＣＤＲ１軽鎖（ＬＣ）  配列番号５    ＫＡＳＱＤＩＨＮＹＩＡ
ＣＤＲ２  ＬＣ        配列番号６    ＹＴＳＴＬＱＰ
ＣＤＲ３  ＬＣ        配列番号７    ＬＱＹＤＮＬＷＴ
を含む抗原結合ドメインを含む抗体であって、前記抗体の前記重鎖の可変領域が配列番号４で示され、前記抗体がＨＬＡ拘束性にＨＬＡ−Ａ２／ＴｙｒＤ３６９−３７７に結合することができる、前記抗体。
【請求項２】
Ｎ−Ｃの順にＣＤＲ配列：
ＣＤＲ１重鎖（ＨＣ）  配列番号８    ＴＳＧＭＧＶＳ
ＣＤＲ２  ＨＣ        配列番号９    ＨＩＹＷＤＤＤＫＲＹＮＰＳＬＫＳ
ＣＤＲ３  ＨＣ        配列番号１０  ＫＤＹＧＳＳＦＹＡＭＨＹ
ＣＤＲ１軽鎖（ＬＣ）  配列番号５    ＫＡＳＱＤＩＨＮＹＩＡ
ＣＤＲ２  ＬＣ        配列番号６    ＹＴＳＴＬＱＰ
ＣＤＲ３  ＬＣ        配列番号７    ＬＱＹＤＮＬＷＴ
を含む抗原結合ドメインを含む抗体であって、前記抗体の前記重鎖の可変領域が配列番号４で示され、前記抗体の前記軽鎖の可変領域が配列番号２で示され、前記抗体がＨＬＡ拘束性にＨＬＡ−Ａ２／ＴｙｒＤ３６９−３７７に結合することができる、前記抗体。
【請求項３】
ＩｇＧである、請求項１または請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
キメラ抗体である、請求項１及び請求項３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項５】
抗体断片である、請求項１、請求項２及び請求項４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項６】
Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ及び単一ドメイン分子からなる群から選択される、請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
前記抗体の前記重鎖が配列番号２１または配列番号２７で示される、請求項１または請求項３に記載の抗体。
【請求項８】
前記抗体の前記軽鎖が配列番号２、配列番号１９または配列番号２５で示される、請求項１、請求項３〜７のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項９】
治療薬部分を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１０】
前記治療薬部分が、細胞傷害性部分、毒性部分、サイトカイン部分及び薬物からなる群から選択される、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
前記治療薬部分が細胞を含む、請求項９に記載の抗体。
【請求項１２】
前記細胞が、αβＴ細胞、γδＴ細胞、ＮＫ、ＣＩＫ、ＮＫＴ、マクロファージ及びＢ細胞からなる群から選択される、請求項１１に記載の抗体。
【請求項１３】
二重特異性抗体である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１４】
前記二重特異性抗体が抗ＣＤ３または抗ＣＤ１６を含む、請求項１３に記載の抗体。
【請求項１５】
前記抗ＣＤ３がｓｃＦｖを含む、請求項１４に記載の抗体。
【請求項１６】
ＨＬＡ拘束性にＨＬＡ−Ａ２／ＴｙｒＤ３６９−３７７に結合することができる前記抗体の軽鎖が配列番号２を含む、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の抗体をコードする核酸配列を含む、単離ポリヌクレオチド。
【請求項１８】
シス作用性調節エレメントに機能可能に繋げられた請求項１７に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項１９】
ウイルスベクターである、請求項１８に記載の発現ベクター。
【請求項２０】
請求項１７に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１８に記載の発現ベクターを含む、細胞。
【請求項２１】
請求項１〜１６のいずれかに記載の抗体、請求項１８に記載のベクター、または請求項２０に記載の細胞を含む、医薬組成物。
【請求項２２】
メラノーマまたは神経膠芽腫を治療する方法であって、
それを必要とする対象に治療的有効量の請求項１〜１６に記載の抗体、請求項１８に記載のベクターまたは請求項２０に記載の細胞を投与してそれによって前記メラノーマまたは神経膠芽腫を治療すること
を含む、前記方法。
【請求項２３】
メラノーマまたは神経膠芽腫を治療する上での請求項１〜１６のいずれか１項に記載の抗体、請求項１８に記載のベクターまたは請求項２０に記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、ＨＬＡ拘束性にＨＬＡ−Ａ２／ＴｙｒＤに結合することができる抗体及びその用途に関する。
【０００２】
ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞は、腫瘍及びウイルス感染細胞を認識し、それに応えて活性化され、これらの細胞を排除する。活性化されるためにはクロノタイプのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が、膜表面の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子によって提示された特定のペプチド抗原と遭遇する必要がある。悪性形質転換またはウイルス感染を経た細胞はそれらのＭＨＣクラスＩ分子上に、腫瘍関連抗原またはウイルスタンパク質に由来するペプチドを提示する。それゆえ、疾患特異的なＭＨＣ−ペプチド複合体は、免疫療法的手法の望ましい標的である。１つのそのような手法は、ＭＨＣ−ペプチド複合体に対して本質的な親和性は低いながらもＴＣＲが有している固有の鋭敏な特異性を、腫瘍またはウイルスエピトープに対するＴＣＲ様の特異性が付与された高親和性の可溶性抗体分子に変換する。これらの抗体は、ＴＣＲ様抗体と呼称されるが、腫瘍及びウイルス感染細胞を標的としそれらの特異的傷害を媒介する新しい部類の免疫療法薬として開発されつつある。その治療能力に加えて、ＴＣＲ様抗体はがん及び感染症の診断試薬としても開発されつつあり、また、ＭＨＣクラスＩ抗原提示を試験するための価値ある研究用ツールとして役立つ。
【０００３】
メラノーマは、メラノサイトかメラノサイト関連母斑細胞かのどちらかに由来する頻繁に転移する侵攻性腫瘍である。メラノーマが一見して皮膚に限局されている場合でさえ、全身転移を発症する患者は３０％にのぼる。メラノーマの古典的な治療様式には外科手術、放射線及び化学療法が含まれる。過去１０年間で免疫療法及び遺伝子療法は、メラノーマを治療するための新しく有望な方法として出現した。
【０００４】
ＷＯ０３／０６８２０１には、チロシナーゼを含めた腫瘍抗原に対するＴＣＲ様抗体を生産する方法が開示されている。
【０００５】
ＷＯ２００８／１２０２０２には、ＨＬＡ−チロシナーゼ３６９−３７７複合体に対するＴＣＲ様抗体が開示されている。
【０００６】
さらなる背景技術としては、
ＷＯ２０１６／１９９１４１
ＷＯ２０１６／１９９１４０
が挙げられる。
【発明の概要】
【０００７】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、Ｎ−Ｃの順にＣＤＲ配列：
ＣＤＲ１重鎖（ＨＣ）  配列番号８    ＴＳＧＭＧＶＳ
ＣＤＲ２  ＨＣ        配列番号９    ＨＩＹＷＤＤＤＫＲＹＮＰＳＬＫＳ
ＣＤＲ３  ＨＣ        配列番号１０  ＫＤＹＧＳＳＦＹＡＭＨＹ
ＣＤＲ１軽鎖（ＬＣ）  配列番号５    ＫＡＳＱＤＩＨＮＹＩＡ
ＣＤＲ２  ＬＣ        配列番号６    ＹＴＳＴＬＱＰ
ＣＤＲ３  ＬＣ        配列番号７    ＬＱＹＤＮＬＷＴ
を含む抗原結合ドメインを含む抗体であって、抗体の重鎖の可変領域が配列番号４で示され、抗体がＨＬＡ拘束性にＨＬＡ−Ａ２／ＴｙｒＤ３６９−３７７に結合することができる、当該抗体が提供される。
【０００８】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、Ｎ−Ｃの順にＣＤＲ配列：
ＣＤＲ１重鎖（ＨＣ）  配列番号８    ＴＳＧＭＧＶＳ
ＣＤＲ２  ＨＣ        配列番号９    ＨＩＹＷＤＤＤＫＲＹＮＰＳＬＫＳ
ＣＤＲ３  ＨＣ        配列番号１０  ＫＤＹＧＳＳＦＹＡＭＨＹ
ＣＤＲ１軽鎖（ＬＣ）  配列番号５    ＫＡＳＱＤＩＨＮＹＩＡ
ＣＤＲ２  ＬＣ        配列番号６    ＹＴＳＴＬＱＰ
ＣＤＲ３  ＬＣ        配列番号７    ＬＱＹＤＮＬＷＴ
を含む抗原結合ドメインを含む抗体であって、抗体の重鎖の可変領域が配列番号４で示され、抗体の軽鎖の可変領域が配列番号２で示され、抗体がＨＬＡ拘束性にＨＬＡ−Ａ２／ＴｙｒＤ３６９−３７７に結合することができる、当該抗体が提供される。
【０００９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、抗体はＩｇＧである。
【００１０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、抗体はキメラ抗体である。
【００１１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、抗体は抗体断片である。
【００１２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、抗体は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ及び単一ドメイン分子からなる群から選択される。
【００１３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、抗体の重鎖は、配列番号２１または配列番号２７で示される。
【００１４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、抗体の軽鎖は、配列番号２、配列番号１９または配列番号２５で示される。
【００１５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、抗体は治療薬部分を含む。
【００１６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、治療薬部分は、細胞傷害性部分、毒性部分、サイトカイン部分及び薬物からなる群から選択される。
【００１７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、治療薬部分は細胞を含む。
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞は、αβＴ細胞、γδＴ細胞、ＮＫ、ＣＩＫ、ＮＫＴ、マクロファージ及びＢ細胞からなる群から選択される。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、抗体は二重特異性抗体である。
【００２０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、二重特異性抗体は抗ＣＤ３または抗ＣＤ１６を含む。
【００２１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、抗ＣＤ３はｓｃＦｖを含む。
【００２２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＨＬＡ拘束性にＨＬＡ−Ａ２／ＴｙｒＤ３６９−３７７に結合することができる抗体の軽鎖は配列番号２を含む。
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、抗体をコードする核酸配列を含む単離ポリヌクレオチドが提供される。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、シス作用性調節エレメントに機能可能に繋げられたポリヌクレオチドを含む発現ベクターが提供される。
【００２５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、発現ベクターはウイルスベクターである。
【００２６】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、ポリヌクレオチドまたは発現ベクターを含む、細胞が提供される。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、抗体、請求項に記載のベクター、または細胞を含む、医薬組成物が提供される。
【００２８】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、メラノーマまたは神経膠芽腫を治療する方法であって、それを必要とする対象に治療的有効量の抗体、ベクターまたは細胞を投与してそれによってメラノーマまたは神経膠芽腫を治療することを含む、当該方法が提供される。
【００２９】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、メラノーマまたは神経膠芽腫を治療する上での抗体、ベクターまたは細胞が提供される。
【００３０】
特に定義されていない限り、本明細書中で使用する全ての技術的及び／または科学的用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。本発明の実施形態の実施または試験において、本明細書に記載されているのと類似しているかまたは等価である方法及び材料を用いることはできるが、例示的な方法及び／または材料を以下に記載する。係争の場合には、定義を含めた本特許明細書が優先されよう。さらに、材料、方法及び例は例説のためのものであるにすぎず、必ずしも限定を意図していない。
【００３１】
添付の図面を参照して本発明のいくつかの実施形態を、単なる例として本明細書に記載する。これから詳しく具体的に言及する図面に関して、示されている詳細は例としてのものであり、本発明の実施形態を例説する目的のためのものである、といことを強調しておく。この点で、図面と併せて理解される説明は当業者に対して本発明の実施形態がいかにして実施され得るかを明確にする。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１−１】ヒト化Ｄ１１（ｈＤ１１−５）ＴＣＲＬ抗体重鎖及び軽鎖のヌクレオチド及びアミノ酸配列（配列番号１〜４及び配列番号２４〜２７を含む）を示す。
【図１−２】ヒト化Ｄ１１（ｈＤ１１−５）ＴＣＲＬ抗体重鎖及び軽鎖のヌクレオチド及びアミノ酸配列（配列番号１〜４及び配列番号２４〜２７を含む）を示す。
【図２】ＳＰＲによって決定した、ＨＬＡ−Ａ２／ＴｙｒＤ３６９−３７７複合体に対するＤ１１及びｈＤ１１−５ＴＣＲＬ抗体の見掛けの結合親和性の決定結果を示す。
【図３】ビオチン化されたＤ１１及びｈＤ１１−５  ＴＣＲＬ抗体の、ＨＬＡ−Ａ２＋／Ｔｙｒ抗原陽性または陰性細胞に対する結合特異性を示す。
【図４】ビオチン化されたＤ１１及びｈＤ１１−５  ＴＣＲＬ抗体の、ＨＬＡ−Ａ２＋初代正常細胞に対する結合を示す。
【図５】Ａ〜Ｂは、ＣＤ３−ＣｈＤ１１−５二重特異性（ＢＳ）ＴＣＲＬ（配列番号１６〜２１）によるＨＬＡ−Ａ２＋／Ｔｙｒ＋及びＨＬＡ−Ａ２＋／Ｔｙｒ−細胞株の傷害を示す。
【図６】ＣＤ３−ＣｈＤ１１−５  ＢＳ  ＴＣＲＬによるＨＬＡ−Ａ２＋正常初代細胞及び正常網膜色素上皮細胞株（ＡＲＰＥ−１９）の傷害を示す。
【図７】確立されたヒトメラノーマ異種移植モデルＭｅｌ５２６におけるＣＤ３−Ｄ１１及びＣＤ３−ＣｈＤ１１−５  ＢＳ  ＴＣＲＬの抗腫瘍活性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、ＨＬＡ拘束性にＨＬＡ−Ａ２／ＴｙｒＤに結合することができる抗体及びその用途に関する。
【００３４】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明の用途が必ずしも、以下の説明で示されるかまたは実施例で例示される詳細によって限定されるわけではないことは理解されるべきである。本発明は、他の実施形態が可能である、または様々な方法で実施もしくは実行されることができる。
【００３５】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）様（ＴＣＲＬ）抗体は、腫瘍エピトープに対するＴＣＲ様の特異性が付与されている。ＨＬＡ−ペプチド抗原複合体に対する低い親和性を呈するＴＣＲとは異なり、ＴＣＲＬは、その可溶性形態においてさえ親和性を有することを特徴としている。ＴＣＲＬは、腫瘍細胞を標的とするため及びその特異的な傷害を媒介するための新しい治療薬の部類として開発されつつある。
【００３６】
本発明者らは以前に、困難なスクリーニング及び実験を通して、ＴｙｒＤ−ＨＬＡ−Ａ２に対するかつてない鋭敏な特異性を呈するＴＣＲＬを同定した（ＷＯ２０１６／１９９１４１）。当該抗体はＤ１１と名付けられた。
【００３７】
本発明者らはいま、Ｄ１１をヒト化すること、及び抗ＣＤ３アームを有するその二重特異性配置を生み出すことに成功した。軽鎖可変領域における必須のフレームワーク改変（Ｙ４９Ｈ）を含めた煩雑なヒト化プロセスの後に、ｈＤ１１−５と呼ぶ完全なヒト化抗体が得られた。ヒト化形態は、見掛けの結合親和性及び結合特異性を含めたＤ１１の全ての機能的特徴を維持している（図２〜４）。抗ＣＤ３アームを含む抗体の二重特異性配置（ＣＤ３−ＣｈＤ１１−５と呼ぶ）は、試験管内及び生体内で決定した場合に有力なメラノーマ細胞傷害活性を示した（図５〜７参照）。
【００３８】
総じて本発明の発見は、がんを治療する上での強力なツールとしてｈＤ１１−５を位置付ける。
【００３９】
かくして、本発明の態様によれば、Ｎ−Ｃの順にＣＤＲ配列：
ＣＤＲ１重鎖（ＨＣ）  配列番号８    ＴＳＧＭＧＶＳ
ＣＤＲ２  ＨＣ        配列番号９    ＨＩＹＷＤＤＤＫＲＹＮＰＳＬＫＳ
ＣＤＲ３  ＨＣ        配列番号１０  ＫＤＹＧＳＳＦＹＡＭＨＹ
ＣＤＲ１軽鎖（ＬＣ）  配列番号５    ＫＡＳＱＤＩＨＮＹＩＡ
ＣＤＲ２  ＬＣ        配列番号６    ＹＴＳＴＬＱＰ
ＣＤＲ３  ＬＣ        配列番号７    ＬＱＹＤＮＬＷＴ
を含む抗原結合ドメインを含む抗体であって、抗体の重鎖の可変領域が配列番号４で示され、抗体がＨＬＡ拘束性にＨＬＡ−Ａ２／ＴｙｒＤ３６９−３７７に結合することができる、当該抗体が提供される。
【００４０】
あるいは、Ｎ−Ｃの順にＣＤＲ配列：
ＣＤＲ１重鎖（ＨＣ）  配列番号８    ＴＳＧＭＧＶＳ
ＣＤＲ２  ＨＣ        配列番号９    ＨＩＹＷＤＤＤＫＲＹＮＰＳＬＫＳ
ＣＤＲ３  ＨＣ        配列番号１０  ＫＤＹＧＳＳＦＹＡＭＨＹ
ＣＤＲ１軽鎖（ＬＣ）  配列番号５    ＫＡＳＱＤＩＨＮＹＩＡ
ＣＤＲ２  ＬＣ        配列番号６    ＹＴＳＴＬＱＰ
ＣＤＲ３  ＬＣ        配列番号７    ＬＱＹＤＮＬＷＴ
を含む抗原結合ドメインを含む抗体であって、抗体の重鎖の可変領域が配列番号４で示され、抗体の軽鎖の可変領域が配列番号２で示され、抗体がＨＬＡ拘束性にＨＬＡ−Ａ２／ＴｙｒＤ３６９−３７７に結合することができる、当該抗体が提供される。
【００４１】
本明細書中で使用する場合、「結合」または「結合する」は、抗体−抗原様式の結合を指すが、これは概して、臨床上関連のあるＴＣＲＬの場合であり、この場合、表面プラズモン共鳴アッセイ（ＳＰＲ）で決定されるＫＤが５ｎＭ未満（例えば３．５〜４．９ｎＭ）の範囲にある。
【００４２】
抗体のその抗原に対する親和性は、アビディティーがその一因となることを最小限に抑えるために、捕捉または固定化モノクローナル抗体（ＭＡｂ）フォーマットを用いて表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定される。親和性を評価するためには、可溶性形態の、つまり以下に記載する一本鎖（ｓｃ）ＨＬＡ−Ａ２／ＴｙｒＤ３６９−３７７複合体としての抗原を使用する。
【００４３】
本明細書中で使用する場合、「ＫＤ」という用語は、抗原結合ドメインとその個別の抗原との平衡解離定数を指す。
【００４４】
本発明において使用する「抗体」という用語は、完全な分子、例えばＩｇＧを含むだけでなく、ヒト化重鎖の可変領域すなわち配列番号４を含むその断片も含む。
【００４５】
具体的な実施形態によれば、抗体断片には、ＨＬＡ拘束性に抗原のエピトープに結合することができる、一本鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、ミニボディ、ナノボディ、Ｆａｂ発現ライブラリーまたは単一ドメイン分子、例えばＶＨ及びＶＬが含まれるが、これらに限定されない。
【００４６】
本明細書で使用する場合、「可変領域」及び「ＣＤＲ」は、当技術分野で知られている、手法の組合せも含めた任意の手法によって定義される、可変領域及びＣＤＲを指すものであり得る。具体的な実施形態によれば、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（上記参照）に従って決定される。
【００４７】
具体的な実施形態によれば、抗体はヒト化抗体である。
【００４８】
具体的な実施形態によれば、抗体はキメラ抗体である。
【００４９】
本明細書中で使用する場合、「キメラ抗体」は、少なくとも１つの鎖が非ヒト（例えばマウス）動物のものでありかつ定常領域［例えば定常領域、例えばＣＬ（カッパまたはラムダ）］がヒトである抗体を指す。このように、抗体は例えば、両方の鎖が非ヒト可変領域及びヒト定常領域を含む完全抗体またはその断片であり得る。別の例によれば、１本の鎖はヒト化されており、もう１本の鎖は非ヒト可変領域及びヒト定常領域を含む。キメラ抗体の二重特異性配置を以下に記載する。
【００５０】
非ヒト（例えばマウス）抗体のヒト化形態は免疫グロブリンのキメラ分子であり、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含有する免疫グロブリン鎖である。ヒト化抗体は、この場合のマウスなどの非ヒト種（ドナー抗体）の所望の特異性、親和性及び効力（細胞傷害性）を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基によってレシピエントのＣＤＲからの残基が置き換えられた、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）を含む。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基が、対応する非ヒト残基で置き換えられる。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体にも移入ＣＤＲまたはフレームワーク配列にもみられない残基を含んでいてもよい。ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応する全てのＣＤＲ領域と、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のＦＲ領域の全てまたは実質的に全てとを含む。ヒト化抗体は、場合によってはさらに、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれの、少なくとも一部を含むであろう［Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９（１９８８）、及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２）］。
【００５１】
具体的な実施形態によれば、抗体は、配列番号２または配列番号２５で示される軽鎖の可変領域を含み、したがって、ヒト化抗体である。
【００５２】
具体的な実施形態によれば、抗体は、配列番号１９で示される軽鎖の可変領域を含む。
【００５３】
いくつかの実施形態において、免疫グロブリンアイソタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４から選択され、とりわけＩｇＧ１またはＩｇＧ４である。具体的な実施形態では、アイソタイプはＩｇＧ１である。
【００５４】
具体的な実施形態によれば、抗体は治療薬部分を含む。
【００５５】
具体的な実施形態によれば、抗体は二重特異性抗体である。
【００５６】
したがって、本明細書ではｈＤ１１−５抗体の二重特異性配置も、（配列番号２及び配列番号４で示されるそれぞれ軽鎖及び重鎖の可変領域を有する）ヒト化形態か、（例えば配列番号１９で示される軽鎖及び配列番号２１で示される重鎖の可変ドメインを有する）キメラ形態かのどちらかとして企図される。二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）は、２つの異なるモノクローナル抗体の断片から構成される人工タンパク質であり、それゆえ、タイプの異なる２つの抗原に結合し、この場合ではＨＬＡ−Ａ２／ＴｙｒＤ３６９−３７７と、上記ＴｙｒＤ３６９−３７７とは異なる別のエピトープとに結合する。具体的な実施形態によれば、ＢｓＡｂは、ＣＤ３を介してＴ細胞などの細胞傷害性細胞に結合すると同時にＴｙｒＤ  ＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドを介して標的メラノーマ細胞に結合するように操作される。他の例示的な配置を以下に記載する。
【００５７】
本明細書中で使用する場合、「ＭＨＣ（またはＨＬＡ）拘束性ペプチド」という語句は、ＨＬＡ分子上に提示されるペプチドを指し、この場合では、ＨＬＡ−Ａ２分子上に提示されるＴｙｒＤ３６９−３７７（本明細書では略すと「ＴｙｒＤ」配列番号１５）を指す。
【００５８】
具体的な実施形態によれば、抗ＣＤ３のｓｃＦｖは、配列番号１６、１７のポリヌクレオチドまたはポリペプチドで示される。
【００５９】
本発明の態様によれば、本明細書に記載の抗体をコードする核酸配列を含む単離ポリヌクレオチドも提供される。
【００６０】
具体的な実施形態によれば、ＨＬＡ−Ａ２拘束性にＴｙｒＤ３６９−３７７に結合することができるヒト化抗体をコードする核酸配列は、配列番号１、配列番号３、配列番号２４、配列番号２６で示される。
【００６１】
具体的な実施形態によれば、ＨＬＡ拘束性にＴｙｒＤ３６９−３７７に結合することができるキメラ抗体をコードする核酸配列は、配列番号３、配列番号２０または配列番号２６及び配列番号１８で示される。
【００６２】
具体的な実施形態によれば、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖをコードする核酸配列は、配列番号１７で示される。
【００６３】
また、シス作用性調節エレメントに機能可能に繋げられたポリヌクレオチドを含む発現ベクターも提供される。
【００６４】
本発明のいくつかの実施形態の核酸構築物（本明細書中では「発現ベクター」とも呼称される）は、このベクターを原核生物、真核生物または好ましくはその両方（例えばシャトルベクター）における複製及び組込みに適したものにする追加の配列を含む。加えて、典型的なクローニングベクターはさらに、転写及び翻訳開始配列、転写及び翻訳終結及びポリアデニル化シグナルも含有し得る。例を挙げると、そのような構築物は、５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、第２鎖ＤＮＡ合成起点、及び３’ＬＴＲまたはその一部を含むのが典型的であろう。
【００６５】
本発明のいくつかの実施形態の核酸構築物は、典型的には、中にそれが入っている宿主細胞からの抗体の分泌または提示のためのシグナル配列を含む。好ましくはこの目的のためのシグナル配列は哺乳動物シグナル配列である。
【００６６】
真核生物プロモーターは典型的には、２つのタイプの認識配列、ＴＡＴＡボックス、及び上流プロモーターエレメントを含有する。ＴＡＴＡボックスは、転写開始部位よりも２５〜３０塩基対だけ上流側に位置し、ＲＮＡポリメラーゼにＲＮＡ合成を開始させるように仕向けることに関与すると考えられている。その他の上流プロモーターエレメントは、転写を開始する速度を決定付ける。
【００６７】
本発明のいくつかの実施形態の核酸構築物が利用するプロモーターは、形質転換された特定細胞集団において活性であることが好ましい。細胞種特異的及び／または組織特異的プロモーターの例としては、肝臓特異的なアルブミンなどのプロモーター［Ｐｉｎｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１：２６８−２７７］、リンパ系特異的プロモーター［Ｃａｌａｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５−２７５］、特に、Ｔ細胞受容体［Ｗｉｎｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）ＥＭＢＯ  Ｊ．８：７２９−７３３］及び免疫グロブリン［Ｂａｎｅｒｊｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３７２９−７４０］のプロモーター、ニューロン特異的プロモーター、例えばニューロフィラメントプロモーター［Ｂｙｒｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：５４７３−５４７７］、膵臓特異的プロモーター［Ｅｄｌｕｎｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：９１２−９１６］、または乳腺特異的プロモーター、例えば乳清プロモーター（米国特許第４，８７３，３１６号及び欧州特許出願公開第２６４，１６６号）が挙げられる。
【００６８】
エンハンサーエレメントは、繋げられた同種または異種プロモーターに比べて転写を１，０００倍にまで刺激することができる。エンハンサーは転写開始部位の下流または上流に配置された場合に活性である。ウイルスに由来する多くのエンハンサーエレメントは、広範な宿主範囲を有し、様々な組織において活性である。例えば、ＳＶ４０早期遺伝子エンハンサーは多くの細胞種に適する。本発明のいくつかの実施形態に適する他のエンハンサー／プロモーターの組合せとしては、ポリオーマウイルス、ヒトまたはマウスサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来するもの、マウス白血病ウイルス、マウスまたはラウス肉腫ウイルス、及びＨＩＶなどの様々なレトロウイルスからの長鎖末端反復配列（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍ  ｒｅｐｅａｔ）が挙げられる。Ｅｎｈａｎｃｅｒｓ  ａｎｄ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８３を参照されたく、参照によりこれを本明細書に援用する。
【００６９】
発現ベクターを構築する際、プロモーターは、異種転写開始部位からの距離がその天然環境での転写開始部位からの距離とほぼ同じになるように配置されることが好ましい。但し、当技術分野で知られているように、プロモーター機能を失うことなくこの距離のいくらかの変更を許容することができる。
【００７０】
ＴＣＲＬ  ｍＲＮＡ翻訳の効率を向上させるためにポリアデニル化配列も発現ベクターに加えることができる。正確かつ効率的なポリアデニル化のためには２つの別個の配列エレメントが必要とされる：ポリアデニル化部位の下流に位置する、ＧＵまたはＵに富む配列、及び１１〜３０ヌクレオチドだけ上流側に位置する高度に保存された６ヌクレオチドＡＡＵＡＡＡの配列。本発明のいくつかの実施形態に適する終結及びポリアデニル化シグナルとしては、ＳＶ４０に由来するものが挙げられる。
【００７１】
既に記載したエレメントの他にも、本発明のいくつかの実施形態の発現ベクターは、クローニングされた核酸の発現レベルを向上させること、または組換えＤＮＡを保有する細胞の同定を容易にすることを意図した他の特殊なエレメントを含有し得るのが典型的である。例えば、いくつかの動物ウイルスは、許容細胞種におけるウイルスゲノムの染色体外複製を促進するＤＮＡ配列を含有する。これらのウイルスレプリコンを担ったプラスミドは、プラスミド上に保有しているか宿主細胞のゲノムと共にあるかのどちらかである遺伝子によって適切な因子が提供される限り、エピソームとして複製される。
【００７２】
ベクターは、真核生物レプリコンを含んでいてもいなくてもよい。真核生物レプリコンが存在する場合には、適切な選択マーカーを使用してベクターを真核細胞内で増幅することができる。ベクターが真核生物レプリコンを含んでいない場合、エピソームによる増幅はできない。その代わりに、操作された細胞のゲノムの中に組換えＤＮＡが組み込まれ、そこでプロモーターが所望の核酸の発現を促す。
【００７３】
哺乳動物細胞における組換えポリペプチド発現の改善は、トランスフェクトされる宿主細胞への遺伝子投入量を効果的に増加させることによって実現され得る。遺伝子コピー数の増加は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）またはグルタミン合成酵素（ＧＳ）などの酵素を欠く細胞株と併せて、これらの酵素をコードする遺伝子を含有する発現ベクターと、ＤＨＦＲを阻害するメトトレキサート（ＭＴＸ）及びＧＳを阻害するメチオニンスルホキシアミン（ＭＳＸ）などの薬剤とを使用する、遺伝子増幅によって実現されるのが最も一般的である。このように、例示的な実施形態では、強力なプロモーターの制御下にある組換え遺伝子とＤＨＦＲまたはＧＳをコードする遺伝子とを含有する発現ベクター、ＤＨＦＲ＋またはＧＳ．ｓｕｐ＋形質移入体をそれぞれ得ることができ、その後、漸増濃度のＭＴＸまたはＭＳＸ０のもとで形質移入体を成長させることによって遺伝子増幅が成し遂げられる。
【００７４】
発現のための例示的なシステムはＥＰ２８６１７４１、ＵＳ２０１２０１７８１２６及びＵＳ２００８０１４５８９５に記載されており、参照によりその全体を本明細書に援用する。
【００７５】
さらに、本明細書に記載のポリヌクレオチド／発現ベクターを含む細胞が提供される。
【００７６】
抗体コードベクターのクローニングまたは発現に適する宿主細胞としては、本明細書に記載の原核細胞または真核細胞が挙げられる。例えば、抗体は、とりわけグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要でない場合に、細菌内で産生され得る。Ｅ．ｃｏｌｉにおける抗体断片の発現について記載しているＣｈａｒｌｔｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，２００３），ｐｐ．２４５−２５４も参照されたい。発現後、細菌細胞ペーストから抗体を可溶性画分として単離することができ、さらに精製がなされ得る。
【００７７】
原核生物に加えて糸状菌または酵母などの真核微生物は抗体コードベクターに適したクローニングまたは発現宿主であり、これには、グリコシル化経路が「ヒト化」されておりその結果として部分的または完全にヒトのグリコシル化型を有する抗体を産生する真菌及び酵母株が含まれる。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２：１４０９−１４１４（２００４）、及びＬｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４：２１０−２１５（２００６）を参照されたい。
【００７８】
グリコシル化抗体の発現に適する宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）からも得られる。無脊椎動物細胞の例としては、植物及び昆虫細胞が挙げられる。昆虫細胞と一緒に使用され得る、特にSpodoptera frugiperda細胞のトランスフェクションのために使用され得る、多くのバキュロウイルス株が同定されている。
【００７９】
植物細胞培養物を宿主として利用することもできる。例えば、（遺伝子導入植物において抗体を産生させるためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術について記載している）米国特許第５，９５９，１７７号、第６，０４０，４９８号、第６，４２０，５４８号、第７，１２５，９７８号、及び第６，４１７，４２９号を参照されたい。
【００８０】
脊椎動物細胞も宿主として使用され得る。例えば、懸濁液中で成長するのに適合した哺乳動物細胞株が有用であり得る。他の有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０で形質転換したサル腎ＣＶ１株（ＣＯＳ−７）；ヒト胚性腎臓株（例えばＧｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７）に記載されているような２９３または２９３細胞）；ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例えばＭａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０）に記載されているようなＴＭ４細胞）；サル腎細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）；ヒト子宮頸部癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）；例えばＭａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２）に記載されているようなＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、ＤＨＦＲ．ｓｕｐ．−ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））を含めたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；ならびに骨髄腫細胞株、例えばＹ０，ＮＳ０及びＳｐ２／０が挙げられる。抗体産生に適する特定の哺乳動物宿主細胞株の総説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．），ｐｐ．２５５−２６８（２００３）を参照されたい。
【００８１】
抗体の高い特異性はそれを診断（とりわけ、抗体のヒト化された特性が必須となる生体内診断）及び治療の用途に特に適したものにする。
【００８２】
かくして、本発明の態様によれば、ＨＬＡ拘束性にＴｙｒＤ３６９−３７７を提示する細胞を検出する方法が提供される。方法は、ＨＬＡ−Ａ２拘束性ＴｙｒＤペプチド抗原に対する特異性を有する本発明の抗体に細胞を接触させることを含む。接触は、免疫複合体形成を可能にする条件の下でもたらされ、免疫複合体の存在またはそのレベルは、関心対象のＨＬＡ拘束性ペプチド抗原を提示する細胞を示すものである。
【００８３】
本明細書中で使用される「検出する」という用語は、細胞を検出する、検知する、明らかにする、曝露する、可視化する、または同定する行為を指す。厳密な検出方法は、本明細書中で以下にさらに説明する、抗体が取り付けられる検出可能部分（本明細書中では同定可能部分とも呼ぶ）によって決まる。
【００８４】
上記検出方法は、ＨＬＡ拘束性なＴｙｒＤ３６９−３７７の提示を特徴とするがん、例えばメラノーマ及び神経膠芽腫の診断に役立てられ得る。
【００８５】
本明細書中で使用する場合、「診断する」という用語は、疾患を分類すること、疾患の重症度（グレードまたはステージ）を判定すること、進行を追跡評価すること、疾患の転帰及び／または回復の見込みを予測することを指す。
【００８６】
対象は、定期的な健康診断を受けている健常な対象（例えばヒト）であり得る。あるいは、対象は疾患リスクを有していてもよい。あるいはまた、治療有効性を追跡評価するために方法を用いてもよい。
【００８７】
ＴＣＲＬは、同定可能部分を含み得、例えばそれに取り付けられ得る。あるいは、またはさらに、ＴＣＲＬ（またはそれを含む複合体）を間接的に、例えば二次抗体を使用することによって同定してもよい。
【００８８】
既に述べたとおり、本発明の方法は、免疫複合体（例えば、典型的には細胞を溶解させていないときの、本発明の抗体とＨＬＡに複合化したペプチドとの複合体）を形成するのに十分な条件の下で成し遂げられ、そのような条件（例えば、適切な濃度、緩衝液、温度、反応時間）及びそのような条件を最適化するための方法は当業者に知られており、本明細書中に例が開示されている。
【００８９】
本発明の抗体は、がんの治療に特に有用である。
【００９０】
本明細書中で使用する「がん」という用語は、異常細胞の急速な制御されない成長を特徴とする疾患として定義される。がん細胞は、局所的に、または血流及びリンパ系によって他の身体部分に蔓延し得る。
【００９１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、病状は固形腫瘍である。
【００９２】
具体的な実施形態によれば、病状はメラノーマである。
【００９３】
具体的な実施形態によれば、病状は神経膠芽腫である。
【００９４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明の抗体は抗腫瘍作用を有する。
【００９５】
本明細書中で使用する「抗腫瘍作用」という用語は、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞の数の減少、転移の数の減少、平均余命の延び、またはがん性病態に関連する様々な生理学的症候の改善によって証明され得る生物学的作用を指す。「抗腫瘍作用」はまた、最初の腫瘍の発生の防止における本発明の医薬の能力によっても証明され得る。
【００９６】
具体的な実施形態によれば、抗体は、チロシナーゼ（ＴｙｒＤ）陽性がんのためのものである。
【００９７】
「ＴｙｒＤ３６９−３７７陽性がん」という用語は、ＨＬＡ拘束性にＴｙｒＤを提示する細胞を含むがんを指す。具体的な実施形態によれば、ＴｙｒＤ３６９−３７７陽性がんはメラノーマまたは神経膠芽腫である。
【００９８】
本明細書中で使用する場合、「メラノーマ」は、メラノサイトとして知られる色素含有細胞から発症するがんを指す。メラノーマは典型的には皮膚に起こるが、口腔、腸または眼に起こることが稀にあり得る。
【００９９】
本発明の実施形態は、以下のタイプのメラノーマに言及している：
悪性黒子
悪性黒子型メラノーマ
表在拡大型メラノーマ
末端黒子型メラノーマ
粘膜メラノーマ
結節型メラノーマ
ポリープ状メラノーマ
線維形成性メラノーマ
小型母斑様細胞を伴うメラノーマ
スピッツ母斑の特徴を有するメラノーマ
ぶどう膜メラノーマ。
【０１００】
メラノーマのがんステージ判定はＴＮＭを利用することができる。また、腫瘍浸潤の微視的深度に言及するものである「Ｃｌａｒｋレベル」及び「Ｂｒｅｓｌｏｗの厚さ」も重要である。メラノーマのステージはその各々が本明細書において企図される。
ステージ０：表皮内メラノーマ（ＣｌａｒｋレベルＩ）、生存率９９．９％
ステージＩ／ＩＩ：浸潤性メラノーマ、生存率８９〜９５％
Ｔ１ａ：原発腫瘍厚さが１．０ｍｍ未満であり、潰瘍形成がなく、有糸分裂が１／ｍｍ２未満である
Ｔ１ｂ：原発腫瘍厚さが１．０ｍｍ未満であり、潰瘍形成があるかまたは有糸分裂が１／ｍｍ２以上である
Ｔ２ａ：原発腫瘍厚さが１．０１〜２．０ｍｍであり、潰瘍形成がない
ステージＩＩ：高リスクのメラノーマ、生存率４５〜７９％
Ｔ２ｂ：原発腫瘍厚さが１．０１〜２．０ｍｍであり、潰瘍形成がある
Ｔ３ａ：原発腫瘍厚さが２．０１〜４．０ｍｍであり、潰瘍形成がない
Ｔ３ｂ：原発腫瘍厚さが２．０１〜４．０ｍｍであり、潰瘍形成がある
Ｔ４ａ：原発腫瘍厚さが４．０ｍｍより厚く、潰瘍形成がない
Ｔ４ｂ：原発腫瘍厚さが４．０ｍｍより厚く、潰瘍形成がある
ステージＩＩＩ：局所転移、生存率２４〜７０％
Ｎ１：単一の陽性リンパ節
Ｎ２：２〜３個の陽性リンパ節または局所皮膚／イントランジット転移
Ｎ３：４個の陽性リンパ節または１個のリンパ節及び局所皮膚／イントランジット転移
ステージＩＶ：遠隔転移、生存率７〜１９％
Ｍ１ａ：遠隔皮膚転移、正常ＬＤＨ
Ｍ１ｂ：肺転移、正常ＬＤＨ
Ｍ１ｃ：その他の遠隔転移、またはＬＤＨ上昇を伴う任意の遠隔転移
【０１０１】
適切な処置がなされた場合の初回メラノーマ診断時からのＡＪＣＣ５年生存率に基づく。
【０１０２】
本明細書中で使用する場合、「神経膠芽腫」または「多形性神経膠芽腫（ＧＢＭ）」は、脳内で始まる最も侵攻性が高いがんを指す。
【０１０３】
具体的な実施形態によれば、神経膠芽腫は以下のとおりに分類される：
【０１０４】
古典的：「古典的」亜型である腫瘍のうちの９７パーセントは、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）遺伝子の余剰のコピーを保有しており、ほとんどのものは上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の発現が正常時よりも高いが、これに対して、神経膠芽腫において突然変異を起こすことが多い遺伝子ＴＰ５３（ｐ５３）は、この亜型において滅多に突然変異を起こさない。
【０１０５】
前神経亜型は、ＴＰ５３（ｐ５３）、ａ型血小板由来成長因子受容体をコードする遺伝子であるＰＤＧＦＲＡ、及びイソクエン酸脱水素酵素１をコードする遺伝子であるＩＤＨ１が高い割合で変化していることが多い。
【０１０６】
間葉系亜型は、ニューロフィブロミン１をコードする遺伝子であるＮＦ１における突然変異またはその他の変化の高い割合、及びＥＧＦＲ遺伝子におけるより少ない変化、及び他の型に比べて少ないＥＧＦＲの発現によって特徴付けられる。
【０１０７】
神経系亜型の象徴は、ＮＥＦＬ、ＧＡＢＲＡ１、ＳＹＴ１及びＳＬＣ１２Ａ５などのニューロンマーカーの発現である。
【０１０８】
神経膠芽腫における他の遺伝子変化について記載が多くなされており、その大部分はＲＢとＰＩ３Ｋ／ＡＫＴとの２つの経路にまとめられる。神経膠芽腫ではこれらの経路のそれぞれ６８〜７８％及び８８％が変化している。
【０１０９】
もう１つの重要な変化は、ＤＮＡ修復酵素の「自殺」であるＭＧＭＴのメチル化である。メチル化は、ＤＮＡ転写、したがってＭＧＭＴ酵素の発現を修復するという記載がある。ＭＧＭＴ酵素はその自殺修復機序によってたった１つのＤＮＡアルキル化しか修復できないので、逆行能は低く、ＭＧＭＴ遺伝子プロモーターのメチル化はＤＮＡ修復能に非常に大きな影響を与える。［３５］［３６］実際、ＭＧＭＴメチル化は、ＤＮＡを損傷する化学療法薬、例えばテモゾロミドによる処置の奏効の改善と関係がある。
【０１１０】
どの場合においても、いくつかの実施形態によれば、がんは、（例えばＲＴ−ＰＣＲまたは免疫組織化学などの当技術分野でよく知られている方法を用いて決定される）チロシナーゼｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を特徴とする。
【０１１１】
上記分類は、診断及び治療の両方に適したものである。
【０１１２】
本発明の免疫複合体の存在またはレベルの判定は、抗体を取り付ける検出可能部分に依拠する。
【０１１３】
本発明で使用することができる検出可能部分の例としては、限定されないが、放射性同位体、リン光化学物質、化学発光化学物質、蛍光化学物質、酵素、蛍光ポリペプチド、及びエピトープタグが挙げられる。検出可能部分は結合対のメンバーであり得るが、これは、結合対の別のメンバーとの相互作用、及び直接可視化される標識による同定が可能なものである。一例として、結合対のメンバーは、対応する標識抗体によって同定される抗原である。一例として、標識は、蛍光タンパク質、または比色分析反応を生じる酵素である。
【０１１４】
検出可能部分のさらなる例には、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）及び磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）によって検出することができるものが含まれ、これらは全て当業者によく知られている。
【０１１５】
検出可能部分がポリペプチドである場合、免疫標識（すなわち、検出可能部分と複合した抗体）を組換え手段によって作ってもよいし、またはそれを、例えば固相ペプチド合成技術を用いて所定の順序で１つ以上のアミノ酸残基を段階的に添加することによって化学合成してもよい。（ＴＣＲＬをコードするポリヌクレオチドが翻訳によって検出可能部分と融合する）組換えＤＮＡ技術を用いて本発明の抗体に繋げられることができるポリペプチド検出可能部分の例としては、蛍光ポリペプチド、リン光ポリペプチド、酵素、及びエピトープタグが挙げられる。
【０１１６】
あるいは、検出可能部分を本発明の抗体に化学的に取り付けることは、直接的または間接的な任意の好適な化学結合を用いて、例えば（検出可能部分がポリペプチドである場合に）ペプチド結合を介して、または介在するリンカー要素、例えばリンカーペプチドもしくはその他の化学部分、例えば有機ポリマーとの共有結合を介して成し遂げられ得る。そのようなキメラペプチドは、ペプチドのカルボキシ（Ｃ）またはアミノ（Ｎ）末端における結合を介して、または内部の化学基、例えば、直鎖、分岐鎖または環状側鎖、内部の炭素または窒素原子などとの結合を介して繋げられ得る。そのような修飾ペプチドは、ペプチドを合成する及び／またはペプチドを共有結合で繋げる周知の方法を用いて当業者によって簡単に同定及び調製され得る。抗体を蛍光標識することについての記載は米国特許第３，９４０，４７５号、第４，２８９，７４７号、及び第４，３７６，１１０号に詳しく提供されている。
【０１１７】
このように、本明細書に記載の複合体は、抗体を脂質、炭水化物、タンパク質、毒素、薬物、またはその他の原子及び分子に繋げる既知の方法によって調製され得る。いくつかの実施形態では、複合体は、好適な連結または結合を用いる部位特異的複合化によって形成される。部位特異的複合化は抗体の結合活性を保護する可能性が高い。物質はチオエーテル結合形成によって、還元された抗原結合構築物のヒンジ領域に複合し得る、または取り付けられ得る。いくつかの実施形態では、チロシン複合化を採用することができる。複合体を形成するために用いられる他の連結または結合には、共有結合、非共有結合、ジスルフィド結合、ヒドラゾン結合、エステル結合、アミド結合、及びアミノ結合、イミノ結合、チオセミカルバゾン結合、セミカルバゾン結合、オキシム結合、及び炭素−炭素結合が含まれ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、抗体にシステインまたはその他の連結態様を含ませる必要がない（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）Ａｕｔｈｏｒ（ｓ）：Ｇｒｅｇ  Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ  ＩＳＢＮ：９７８−０−１２−３８２２３９−０）。
【０１１８】
部分を複合させる例示的な方法はＷＯ２０１７／０２７３２５またはＵ．Ｓ．９，０７８，９３１に記載されており、これをもって参照によりこれらの各々の全体を援用する。
【０１１９】
既に述べたとおり、本発明の抗体を治療薬に使用することもできる。
【０１２０】
全抗体においては、Ｆｃドメインが抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を活性化させるので、治療効果は分子に固有のものである。ＡＤＣＣは、膜表面抗原に特異性抗体が結合した標的細胞を免疫系のエフェクター細胞が活発に溶解する手立てとなる細胞媒介性免疫防御の機序である。それは、体液性免疫応答の一部として抗体が感染を制限し封じ込めるように振る舞うことができるすべとなる機序の１つである。古典的なＡＤＣＣはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞によって媒介されるが、マクロファージ、好中球及び好酸球もＡＤＣＣを媒介することができる。例えば、好酸球は、ＩｇＥが媒介するＡＤＣＣによって、寄生蠕虫として知られる特定の寄生虫を殺滅することができる。ＡＤＣＣは、以前の抗体応答に依存するので、適応免疫応答の一部である。
【０１２１】
あるいは、またはさらに、抗体は、既に述べたとおり、治療薬部分がＴ細胞係合子、例えば抗ＣＤ３抗体または抗ＣＤ１６ａである二重特異性抗体であってもよく、あるいは、治療薬部分は抗免疫チェックポイント分子（例えば、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＣＴＬＡ４）であってもよい。具体的な実施形態によれば、治療薬部分は抗ＣＤ３である。
【０１２２】
あるいは、またはさらに、抗体を異種治療薬部分に取り付けてもよい（複合化の方法は以上に記載されている）。治療薬部分は、例えば、細胞傷害性部分、毒性部分、サイトカイン部分、薬物であり得る。例としては、限定されないが、ＢＲＡＦ阻害薬、例えばベムラフェニブ及びダブラフェニブ、ならびに放射性同位体または毒素、例えば、プロチオニン、シュードモナス属の外毒素Ａ、メトトレキサートが挙げられる。
【０１２３】
抗体は可溶性または不溶性形態であり得る。
【０１２４】
不溶性形態は、その中で細胞（すなわち、本明細書では治療薬部分とも呼ぶ）がヒト化抗体の可変領域を含む分子を発現させるものであり得る。
【０１２５】
そのような細胞の例としては、免疫細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、ＣＩＫ、ＮＫＴ、ＮＫ細胞（自家、同種異系、異種）が挙げられる。
【０１２６】
具体的な実施形態によれば、抗体（またはその可変領域）はＣＡＲまたは人工Ｔ細胞受容体を形成する。
【０１２７】
本明細書中で使用される「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」という用語は、例えば、人工Ｔ細胞受容体、Ｔボディ、一本鎖免疫受容体、キメラＴ細胞受容体、またはキメラ免疫受容体を指し得、また、人工的な特異性を特定の免疫エフェクター細胞に結び付ける操作された受容体を包含し得る。ＣＡＲは、モノクローナル抗体の特異性をＴ細胞に付与するために採用されてもよく、それによって、例えば養子細胞療法に使用するための、多くの特異性Ｔ細胞を生み出すことが可能になり得る。具体的な実施形態では、ＣＡＲは細胞の特異性を例えば腫瘍関連抗原へと指向する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、（標的腫瘍細胞などの標的細胞との標的指向性部分の係合によってＴ細胞が活性化するのを可能にする）細胞内活性化ドメイン、膜貫通ドメイン及び、疾患または障害に関連する例えば腫瘍抗原結合領域を含み様々な長さであり得る細胞外ドメインを含む。特定の態様では、ＣＡＲは、モノクローナル抗体由来の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）と、ＣＤ３−ゼータに融合した膜貫通ドメインと、エンドドメインとの融合体を含む。他のＣＡＲデザインの特異性は、受容体のリガンド（例えばペプチド）に由来するものであってもよいし、またはデクチンなどのパターン認識受容体に由来するものであってもよい。ある場合には、抗原認識ドメインの間隔を調整して活性化誘導細胞死を軽減することができる。ある場合には、ＣＡＲは、追加の共刺激シグナル伝達のためのドメイン、例えば、ＣＤ３−ゼータ、ＦｃＲ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＤＡＰ１０／１２、及び／またはＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＴＬＲなどを含む。ある場合には、共刺激分子、撮像のための（例えば陽電子放射断層撮影のための）レポーター遺伝子、プロドラッグ添加時に条件的にＴ細胞を除去する遺伝子産物、ホーミング受容体、ケモカイン、ケモカイン受容体、サイトカイン、及びサイトカイン受容体を含めた分子をＣＡＲと共発現させることができる。
【０１２８】
特定の実施形態では、本発明のいくつかの実施形態のαβＴ細胞、γδＴ細胞、ＮＫ、マクロファージまたはＢ細胞または細胞集団（複数可）は、発現カセットにコードされる１つ以上の構造的に別個な抗体を安定的に発現させるように操作される。抗体は、ＭＨＣとの複合体（ペプチド−ＭＨＣ複合体）として細胞表面に発現した（ｉ）細胞表面腫瘍抗原または（ｉｉ）腫瘍抗原由来のペプチドに結合する、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、全抗体もしくはそれらの抗原結合断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、重鎖もしくは軽鎖単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２またはそれらの任意の組合せからなる群から選択され得る。
【０１２９】
したがって、そのような分子をコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号１、配列番号３または、配列番号２、配列番号４をコードする任意のポリヌクレオチド）を関心対象の細胞に形質導入する。
【０１３０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、標的細胞に対してエフェクター傷害機能を働かせる細胞、エフェクターＴ細胞に対して抑制作用を及ぼす細胞、エフェクター傷害機能によって操作された細胞、または抑制機能によって操作された細胞である。
【０１３１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞は、Ｔ細胞、またはαβＴ細胞、またはγδＴ細胞である。
【０１３２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。
【０１３３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、がんを標的とするためにナチュラルキラー細胞を使用する。
【０１３４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、Ｔ細胞はサイトカインＴ細胞（エフェクターＴ細胞）である。
【０１３５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、がん抗原、この場合ではＴｙｒＤを標的とするために、サイトカインＴ細胞（エフェクターＴ細胞）を使用する。
【０１３６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、Ｔ細胞はＴｒｅｇ（Ｔ調節性細胞）を含む。
【０１３７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、Ｔ細胞はＣＤ３  Ｔ細胞を含む。
【０１３８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、Ｔ細胞はＣＤ４  Ｔ細胞を含む。
【０１３９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、Ｔ細胞はＣＤ８  Ｔ細胞を含む。
【０１４０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、抗体は一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子である。
【０１４１】
本発明のＣＡＲ分子の細胞質側ドメイン（「細胞内シグナル伝達ドメイン」とも呼ぶ）は、ＣＡＲが配置された免疫細胞の正常なエフェクター機能のうちの少なくとも１つの活性化を担う。
【０１４２】
「エフェクター機能」という用語は、細胞の特殊な機能を指す。例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、サイトカインの分泌を含めた細胞溶解活性またはヘルパー活性であり得る。したがって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを変換して、特殊な機能を実施するように細胞を仕向ける、タンパク質の部分を指す。大抵は細胞内シグナル伝達ドメインの全体が採用され得るが、多くの場合、鎖全体を使用する必要はない。切断された細胞内シグナル伝達ドメインの部分を使用する範囲内で、そのような切断された部分は、それがエフェクター機能シグナルを変換する限り、完全鎖の代わりに使用され得る。このように、細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを変換するに足る任意の切断された細胞内シグナル伝達ドメインの部分を含むことが意図されている。
【０１４３】
本発明のＣＡＲ分子に使用するための細胞内シグナル伝達ドメインの例としては、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及び、抗原受容体係合後に協奏的に作用してシグナル伝達を開始する共受容体の細胞質側配列、ならびにこれらの配列の任意の派生物または変異体、及び同じ機能的能力を有する任意の合成配列が挙げられる。
【０１４４】
ＴＣＲ単独で生成したシグナルがＴ細胞の十分な活性化には不十分であること、及び二次または共刺激シグナルも必要であることは知られている。このように、Ｔ細胞活性化は２つの別個の部類の細胞質側シグナル伝達配列によって媒介され得る：ＴＣＲによって抗原依存的な一次活性化を開始するもの（一次細胞質側シグナル伝達配列）、及び抗原依存的に作用して二次または共刺激シグナルを供給するもの（二次細胞質側シグナル伝達配列）。
【０１４５】
一次細胞質側シグナル伝達配列は、ＴＣＲ複合体の一次活性化を刺激するように、または抑制するように調節する。刺激するように働く一次細胞質側シグナル伝達配列は、免疫受容体チロシン依存性活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）として知られるシグナル伝達モチーフを含有し得る。
【０１４６】
本発明において特に有用な、ＩＴＡＭを含有する一次細胞質側シグナル伝達配列の例としては、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ及びＣＤ６６ｄに由来するものが挙げられる。本発明のＣＡＲの中の細胞質側シグナル伝達分子は、ＣＤ３ゼータに由来する細胞質側シグナル伝達配列を含むことが特に好ましい。
【０１４７】
好ましい実施形態では、ＣＡＲの細胞質側ドメインはＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインを、単独で、または本発明のＣＡＲに関して有用な他の所望の細胞質側ドメイン（複数可）と組み合わせて、含むように設計され得る。例えば、ＣＡＲの細胞質側ドメインはＣＤ３ゼータ鎖部分と共刺激シグナル伝達領域とを含むことができる。共刺激シグナル伝達領域は、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの部分を指す。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効率的応答に必要とされる、抗原受容体またはそのリガンドとは異なる細胞表面分子である。そのような分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、及びＣＤ８３に特異的に結合するリガンドなどが挙げられる。このように、本発明において共刺激シグナル伝達エレメントは主に４−１ＢＢによって例示されるが他の共刺激エレメントも本発明の範囲に含まれる。
【０１４８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞内ドメインは共刺激シグナル伝達領域とゼータ鎖部分とを含む。共刺激シグナル伝達領域は、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲ分子の部分を指す。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効率的応答に必要とされる、抗原受容体またはそのリガンドとは異なる細胞表面分子である。
【０１４９】
「共刺激リガンド」は、当該用語が本明細書中で使用される場合、Ｔ細胞上の同族共刺激分子に特異的に結合する、抗原提示細胞上［例えば、ａＡＰＣ（人工抗原提示細胞）上、樹状細胞上、Ｂ細胞上など］の分子を含む。当該結合は、例えばＴＣＲ／ＣＤ３複合体とペプチドを負荷したＭＨＣ分子との結合によって提供される一次シグナルに加えて、増殖、活性化、分化などを含むがこれらに限定されないＴ細胞応答を媒介するシグナルを提供する。共刺激リガンドには、ＣＤ７、Ｂ７−１、（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、誘導性共刺激リガンド（ＩＣＯＳ−Ｌ）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ−Ｇ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＨＶＥＭ、リンホトキシンベータ受容体、３／ＴＲ６、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、ＨＶＥＭ、Ｔｏｌｌリガンド受容体に結合する作動薬または抗体、及びＢ７−Ｈ３に特異的に結合するリガンドが含まれ得るが、これらに限定されない。共刺激リガンドはさらに、数ある中でも、限定されないがＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３などのＴ細胞上に存在する共刺激分子に特異的に結合する抗体、及びＣＤ８３に特異的に結合するリガンドを包含する。
【０１５０】
「共刺激分子」は、共刺激リガンドに特異的に結合してそれによってＴ細胞による共刺激応答、例えば、限定されないが、増殖を媒介する、Ｔ細胞上の同族結合相手を指す。共刺激分子としては、限定されないが、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡ及びＴｏｌｌリガンド受容体が挙げられる。
【０１５１】
「共刺激シグナル」は、本明細書中で使用される場合、ＴＣＲ／ＣＤ３ライゲーションなどの一次シグナルと組み合わさってＴ細胞増殖及び／または重要分子の上方制御もしくは下方制御をもたらすシグナルを指す。
【０１５２】
「刺激」という用語は、刺激分子（例えばＴＣＲ／ＣＤ３複合体）とその同族リガンドとの結合によって誘導されてそれによってシグナル変換事象、例えば、限定されないが、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介したシグナル変換を媒介する、一次応答を意味する。刺激は、特定の分子の発現の変化、例えばＴＧＦ−βの下方制御、及び／または細胞骨格構造の再構築などを媒介し得る。
【０１５３】
「刺激分子」は、当該用語が本明細書中で使用される場合、抗原提示細胞上に存在する同族刺激リガンドに特異的に結合するＴ細胞上の分子を意味する。
【０１５４】
「刺激リガンド」は、本明細書中で使用される場合、抗原提示細胞上（例えば、ａＡＰＣ上、樹状細胞上、Ｂ細胞上など）に存在しているときにＴ細胞上の同族結合相手（本明細書中では「刺激分子」と呼ぶ）に特異的に結合することができ、それによって活性化、免疫応答の開始、増殖などを含むがこれらに限定されないＴ細胞による一次応答を媒介することができる、リガンドを意味する。刺激リガンドは当技術分野でよく知られており、数ある中でも、ペプチドを負荷したＭＨＣクラスＩ分子、抗ＣＤ３抗体、スーパーアゴニスト抗ＣＤ２８抗体、及びスーパーアゴニスト抗ＣＤ２抗体を包含する。
【０１５５】
細胞質側ドメインに関して、本発明のいくつかの実施形態のＣＡＲ分子は、ＣＤ２８及び／または４−１ＢＢシグナル伝達ドメインを単独で、または本発明のいくつかの実施形態のＣＡＲ分子に関して有用である他の任意の所望の細胞質側ドメイン（複数可）と組み合わせて含むように、設計され得る。一実施形態では、ＣＡＲの細胞質側ドメインは、ＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインをさらに含むように設計され得る。例えば、ＣＡＲの細胞質側ドメインは、限定されないが、ＣＤ３−ゼータ、４−１ＢＢ、及びＣＤ２８シグナル伝達モジュール、及びそれらの組合せを含み得る。
【０１５６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞内ドメインは、ＣＤ３ζ（ＣＤ２４７、ＣＤ３ｚ）、ＣＤ２８、４１ＢＢ、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０及びＣＤ１３７からなる群から選択される少なくとも１つ、例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、例えば少なくとも６つのポリペプチドを含む。
【０１５７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞内ドメインはＣＤ３ζ鎖［「ＣＤ３−ゼータ」及び「ＣＤ３ｚ」としても知られるＣＤ２４７分子；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００７２５．１及びＮＰ＿９３２１７０．１］を含むが、これは内在性ＴＣＲからのシグナルの一次伝達物質である。
【０１５８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞内ドメインは、Ｔ細胞にさらなるシグナルを供給するためにＣＡＲの細胞質側テイル部までの様々な共刺激タンパク質受容体を含む（第２世代ＣＡＲ）。例としては、限定されないが、ＣＤ２８［例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１２３０００６．１、ＮＰ＿００１２３０００７．１、ＮＰ＿００６１３０．１］、４−１ＢＢ［「ＣＤ１３７」としても知られる腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバー９（ＴＮＦＲＳＦ９）、例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１５５２．２］、及びＩＣＯＳ［誘導性Ｔ細胞共刺激因子、例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０３６２２４．１］が挙げられる。前臨床試験は、ＣＡＲデザインの第２世代がＴ細胞の抗腫瘍活性を向上させることを示した。
【０１５９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞内ドメインは、有効性をさらに増大させるために、複数のシグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ｚ−ＣＤ２８−４１ＢＢ、またはＣＤ３ｚ−ＣＤ２８−ＯＸ４０を含む。「ＯＸ４０」という用語は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバー４（ＴＮＦＲＳＦ４）、例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００３３１８．１（「第３世代」ＣＡＲ）を指す。
【０１６０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞内ドメインは、ＣＤ２８−ＣＤ３ｚ、ＣＤ３ｚ、ＣＤ２８−ＣＤ１３７−ＣＤ３ｚを含む。「ＣＤ１３７」という用語は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバー９（ＴＮＦＲＳＦ９）、例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１５５２．２を指す。
【０１６１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＣＡＲ分子をナチュラルキラー細胞のために設計する場合には、シグナル伝達ドメインはＣＤ２８及び／またはＣＤ３ζであり得る。膜貫通ドメインは、天然供給源か合成供給源かのどちらかに由来するものであり得る。供給源が天然のものである場合、ドメインは任意の膜結合または膜貫通タンパク質に由来するものであり得る。本発明において特に有用な膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４に由来するもの（すなわち、少なくともその膜貫通領域（複数可）を含むもの）であり得る。あるいは、膜貫通ドメインは合成のものであってもよく、この場合それは、ロイシン及びバリンなどの主に疎水性である残基を含むであろう。好ましくは、フェニルアラニンとトリプトファンとバリンとの三つ組が合成膜貫通ドメインの両末端にみられよう。場合によっては、２〜１０アミノ酸の長さを有することが好ましい短鎖のオリゴまたはポリペプチドリンカーが、ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞質側シグナル伝達ドメインとの間の連結を形成していてもよい。グリシン−セリンの２つ組は特に好適なリンカーを提供する。
【０１６２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明のいくつかの実施形態のＣＡＲ分子の中に含まれている膜貫通ドメインは、天然ではＣＡＲ中のドメインのうちの１つに関連している膜貫通ドメインである。本発明のいくつかの実施形態によれば、膜貫通ドメインは、そのようなドメインが同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインに結合することを回避して受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えるために、アミノ酸置換によって選択または改変され得る。
【０１６３】
いくつかの実施形態によれば、ＣＡＲ分子の細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間、またはＣＡＲ分子の細胞質側ドメインと膜貫通ドメインとの間に、スペーサードメインが組み込まれ得る。本明細書中で使用する場合、「スペーサードメイン」という用語は、総じて、膜貫通ドメインをポリペプチド鎖の細胞外ドメインか細胞質側ドメインかのどちらかに繋げる機能をする任意のオリゴまたはポリペプチドを意味する。スペーサードメインは、３００個以下のアミノ酸、好ましくは１０〜１００個のアミノ酸、最も好ましくは２５〜５０個のアミノ酸を含み得る。
【０１６４】
上記配置のいずれかを療法に用いることができる。
【０１６５】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、それを必要とする対象のがんを治療する方法であって、本明細書に記載の抗体を対象に投与してそれによって対象のがんを治療することを含む、当該方法が提供される。
【０１６６】
さらに、病状、例えばがんを治療するための医薬の製造における本明細書に記載の抗体の用途が提供される。
【０１６７】
「治療する」という用語は、病状（疾患、障害または病態）の進展を抑制、防止もしくは阻止すること、及び／または病状の軽減、寛解または消退をもたらすことを指す。当業者であれば、病状の進展を評価するために様々な方法論及びアッセイを用いることができること、及び同様に病状の軽減、寛解または消退を評価するために様々な方法論及びアッセイが用いられ得ることを理解するであろう。
【０１６８】
本明細書中で使用する場合、「対象」という用語は、病状を患っている任意の年齢の哺乳動物、好ましくはヒトを含む。
【０１６９】
本発明のいくつかの実施形態の抗体は、それ自体が、または好適な担体もしくは賦形剤と混合した医薬組成物として、生物に投与され得る。
【０１７０】
本明細書中で使用する場合、「医薬組成物」は、本明細書に記載の１つ以上の有効成分と、他の化学成分、例えば生理学的に適する担体及び賦形剤との調合物を指す。医薬組成物の目的は、生物への化合物の投与を容易にすることである。
【０１７１】
本明細書において、「有効成分」という用語は、生物学的作用の根拠となっている抗体を指す。
【０１７２】
以下、交換可能に使用され得る「生理学的に許容される担体」及び「薬学的に許容される担体」という語句は、生物に顕著な刺激を引き起こさず、投与される化合物の生物学的活性及び特性をなくさせない、担体または希釈剤を指す。アジュバントはこれらの語句の下に含まれる。
【０１７３】
本明細書において「賦形剤」という用語は、有効成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性物質を指す。賦形剤の限定されない例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、デンプンの様々な糖及び種類の、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、及びポリエチレングリコールが挙げられる。
【０１７４】
薬物の製剤化及び投与のための技術は、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，”Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，ｌａｔｅｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎの中に見出され得るが、参照によりこれを本明細書に援用する。
【０１７５】
好適な投与経路としては、例えば、経口、直腸、経粘膜、特に、経鼻腔、腸内または非経口送達が挙げられ、これらには、粘膜内、皮下及び髄内注射ならびに、クモ膜下腔内、直接脳室内、心臓内、例えば、右心室内または左心室内、共通冠動脈内、静脈内、腹腔内、鼻腔内または眼内注射が含まれる。
【０１７６】
具体的な実施形態によれば、投与は静脈内投与を含む。
【０１７７】
中枢神経系（ＣＮＳ）への薬物送達のための従来の手法としては、神経外科的方策（例えば脳内注射または脳室内輸注）；ＢＢＢの内因性輸送経路の１つを利用する試みのための、薬剤の分子操作（例えば、内皮細胞表面分子との親和性を有する輸送ペプチドを、単独でＢＢＢを越えることができない薬剤と組み合わせて含む、キメラ融合タンパク質の生産）；薬剤の脂質溶解性を向上させることを企図した薬理学的方策（例えば、水溶性薬剤と脂質またはコレステロール担体との複合化）；及び（頸動脈内へのマンニトール溶液の輸注またはアンジオテンシンペプチドなどの生物学的活性剤の使用によって起こる）高浸透崩壊によるＢＢＢの完全性の一時的崩壊が挙げられる。しかしながら、これらの方策の各々には限界があり、例えば、侵襲的外科手技に関連する固有のリスク、内因性輸送系に固有の限界によって課されるサイズ制限、ＣＮＳ外で活性となり得る担体モチーフを含むキメラ分子の全身投与に関連する潜在的に望ましくない生物学的副作用、及び、それを最適未満の送達方法にするものである、ＢＢＢが崩壊した脳の領域内にあり得る脳損傷リスクがある。
【０１７８】
あるいは、全身的にではなく局所的に、例えば患者の組織領域への直接的な医薬組成物の注射によって、医薬組成物を投与してもよい。
【０１７９】
「組織」という用語は、１つまたは複数の機能をなすよう設計される細胞からなる、生物の部分を指す。例としては、限定されないが、脳、組織、網膜、皮膚組織、肝臓組織、膵臓組織、骨、軟骨、結合組織、血液組織、筋肉組織、心臓組織  脳組織、脈管組織、腎組織、肺組織、性腺組織、造血組織が挙げられる。
【０１８０】
本発明のいくつかの実施形態の医薬組成物は、当技術分野でよく知られているプロセスによって、例えば従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、粉砕、乳化、カプセル封入、捕捉または凍結乾燥プロセスによって製造され得る。
【０１８１】
このように、本発明のいくつかの実施形態に係る用途のための医薬組成物は、有効成分を加工して薬学的に使用可能な調合物にするのを容易にするものである賦形剤及び助剤を含む１つ以上の生理学的に許容される担体を使用して従来の方法で製剤化され得る。適切な製剤は、選択される投与経路によって決まる。
【０１８２】
注射のためには、医薬組成物の有効成分は、水溶液、好ましくは生理学的に適合する緩衝液、例えば、ハンクス溶液、リンガー溶液または生理食塩水緩衝液として製剤化され得る。経粘膜投与のためには、障壁の通過に適した浸透剤を製剤に使用する。そのような浸透剤は当技術分野で一般的に知られている。
【０１８３】
経口投与のためには、活性化合物と、当技術分野でよく知られている薬学的に許容される担体とを混合することによって容易に医薬組成物を製剤化することができる。そのような担体は、患者による経口服用のための錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー、懸濁液などとして医薬組成物を製剤化することを可能にする。経口使用のための薬物調合物は、固体賦形剤を使用して、得られた混合物を場合によって粉砕し、顆粒の混合物を加工し、所望により好適な助剤を添加して、錠剤または糖衣錠コアを得ることによって作られ得る。好適な賦形剤は、詳しくは、ラクトース、スクロース、マンニトールもしくはソルビトールを含めた糖などのフィラー；セルロース調製品、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボメチルセルロースナトリウムなど；及び／または生理学的に許容されるポリマー、例えばポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）である。所望により、崩壊剤、例えば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムを添加してもよい。
【０１８４】
糖衣錠コアには好適なコーティングを施す。この目的のために、濃い糖溶液を使用してもよく、それは場合によって、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液及び好適な有機溶媒または溶媒混合物を含有していてもよい。活性化合物の投薬の様々な組合せを同定するまたは特徴付けるために、染料または顔料を錠剤または糖衣錠コーティングに添加してもよい。
【０１８５】
経口使用され得る医薬組成物は、ゼラチン製の押込式カプセルならびに、ゼラチンとグリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤とで作られた密封軟カプセルを含む。押込式カプセルは有効成分を、ラクトースなどのフィラー、デンプンなどの結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、及び場合によって安定化剤との混合剤として含有し得る。軟カプセルでは、好適な液体、例えば、脂肪油、流動パラフィンまたは液体ポリエチレングリコールの中に有効成分が溶解または懸濁していてもよい。さらに、安定化剤を添加してもよい。経口投与のための製剤は全て、選択された投与経路に適した投薬量のものでなければならない。
【０１８６】
頬側投与のためには、組成物は、従来の様式で製剤化された錠剤または口内錠の形態をとり得る。
【０１８７】
鼻腔内吸入による投与のためには、本発明のいくつかの実施形態に係る用途のための有効成分は、加圧パックからの、または好適な推進薬、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンまたは二酸化炭素の使用を伴うネブライザーからのエアゾールスプレー提供の形態で簡便に送達される。加圧エアゾールの場合、投薬単位は、計量された量を送達するためのバルブを設けることによって決定され得る。分配器で使用するための、化合物とラクトースまたはデンプンなどの好適な粉末基剤との粉末混合物を含有する例えばゼラチンのカプセル及びカートリッジを製剤化してもよい。
【０１８８】
本明細書に記載の医薬組成物を例えばボーラス注射または連続輸注による非経口投与のために製剤化してもよい。注射用製剤は、場合によって保存剤の添加を伴って単位剤形、例えばアンプルまたは多回投薬容器で提供され得る。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンであり得、また、製剤化剤、例えば、懸濁化剤、安定化剤及び／または分散剤を含有し得る。
【０１８９】
非経口投与のための医薬組成物は、水溶性形態の活性調合物の水溶液を含む。加えて、有効成分の懸濁液は、適切な油性または水性の注射用懸濁液として調製され得る。好適な親油性溶媒またはビヒクルとしては、ゴマ油などの脂肪油、または合成脂肪酸エステル、例えば、オレイン酸エチル、トリグリセライドもしくはリポソームが挙げられる。水性の注射用懸濁液は、懸濁液の粘度を向上させる物質、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランを含有し得る。高濃度溶液の調製を可能にするために懸濁液はまた、場合によって、好適な安定化剤、または有効成分の溶解性を向上させる薬剤を含有してもよい。
【０１９０】
あるいは、有効成分は、使用前に適切なビヒクル、例えば発熱物質不含滅菌水溶液で構成するための粉末形態であってもよい。
【０１９１】
本発明のいくつかの実施形態の医薬組成物は、例えばココアバターまたはその他のグリセライドなどの従来の坐薬基剤を使用して、坐薬または停留浣腸などの直腸用組成物としても製剤化され得る。
【０１９２】
本発明のいくつかの実施形態に関して使用するのに適する医薬組成物には、意図した目的を達成するのに有効な量で有効成分を含有する組成物が含まれる。より具体的には、治療的有効量は、障害（例えばがん）の症候を防止、緩和もしくは改善するかまたは処置される対象の生存率を延ばすのに効果的な有効成分（ＴＣＲＬ抗体）の量を意味する。
【０１９３】
治療的有効量の決定は、特に本明細書において提供される詳細な開示に鑑みれば、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１９４】
本発明の方法に使用されるいかなる調合物についても、治療的有効量または用量は最初に試験管内及び細胞培養アッセイから推定することができる。例えば、所望の濃度または力価を実現するために動物モデルで用量を定めることができる。そのような情報は、ヒトに有用な用量をより正確に決定するために使用され得る。
【０１９５】
本明細書に記載の有効成分の毒性及び治療有効性は、試験管内で、細胞培養で、または実験動物で標準的な薬学的手順によって決定され得る。これらの試験管内及び細胞培養アッセイならびに動物試験から得られたデータは、ヒトに用いるための投薬量範囲を定めるために使用することができる。投薬量は、採用する剤形及び利用する投与経路によって様々であり得る。厳密な製剤化、投与経路及び投薬量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選択され得る（例えば、Ｆｉｎｇｌ，ｅｔ  ａｌ．，１９７５，ｉｎ  “Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”，Ｃｈ．１  ｐ．１を参照のこと）。
【０１９６】
投薬の量及び間隔は、有効成分のレベルが生物学的作用を誘発または抑制するのに十分（最小有効濃度、ＭＥＣ）となるように、ＴＣＲＬまたはＴＣＲＬ含有実体、例えば細胞（ＴＣＲＬ組織）を提供すべく、個々に調節され得る。ＭＥＣは、調合物ごとに様々であろうものの、試験管内でのデータから推定され得る。ＭＥＣを実現するのに必要とされる投薬量は個体の特質及び投与経路によって決まるであろう。検出アッセイを用いて血漿中濃度を決定することができる。
【０１９７】
処置される病態の重症度及び応答性に応じて、投薬量は単回または複数回の投与によるものであり得、治療過程は数日〜数週間、または治癒がもたらされるまで、もしくは疾患状態の縮小が得られるまで継続される。
【０１９８】
投与される組成物の量は当然、処置される対象、病の重症度、投与の様式、処方医師の判断などに依存するであろう。
【０１９９】
本発明のいくつかの実施形態の組成物は、所望により、有効成分を含有する１つ以上の単位剤形を収容し得る包みまたは分配装置、例えばＦＤＡ承認済みのキット（診断用または治療用）の中に入った状態で提供されてもよい。包みは例えば金属またはプラスチックの薄膜、例えばブリスターパックを含み得る。包みまたは分配装置には投与のための説明書を添えてもよい。包みまたは分配器にはさらに、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって定められた書式の通知書を容器に関連付けて添えてもよいが、この通知書は、組成物の形態またはヒトへの投与もしくは獣医学的投与についての当局による承認を反映するものである。そのような通知書は例えば、処方薬のための米国食品医薬品局によって承認されたラベル表示であってもよいし、または承認済みの製品添付文書であってもよい。上にさらに詳しく述べたように、適合性を有する医薬担体の中に入れて製剤化した本発明の調合物を含む組成物を調製し、適切な容器に入れ、表示された病態の処置のためのラベルを付けてもよい。
【０２００】
本明細書中で使用する場合、「約」という用語は、±１０％を指す。
【０２０１】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する」という用語及びそれらの活用形は、「限定はしないが含んでいる」ということを意味する。
【０２０２】
「からなる」という用語は、「含んでおりかつ限定される」ということを意味する。
【０２０３】
「から本質的になる」という用語は、組成物、方法または構造が追加の成分、ステップ及び／または部分を含む可能性はあるがそれは、追加の成分、ステップ及び／または部分が特許請求の範囲に記載の組成物、方法または構造の基本的及び新規な特質を実質的に変化させない場合だけである、ということを意味する。
【０２０４】
本明細書中で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は複数形での意味を含むが、但し、そうでないことが文脈から明らかである場合は除く。例えば、「化合物」または「少なくとも１つの化合物」という用語には、その混合物も含めた複数の化合物が含まれ得る。
【０２０５】
本願の全体を通して本発明の様々な実施形態が範囲形式で提供され得る。範囲形式での記載が単に便宜及び簡潔さのためのものであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定と解釈されるべきでないことは、理解されるべきである。したがって、範囲の記載は、可能なあらゆる小範囲及びその範囲内の個々の数値を具体的に開示したものとみなされねばならない。例えば、１〜６などの範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などの小範囲ならびにその範囲内の個々の数字、例えば、１、２、３、４、５及び６を具体的に開示したものとみなされねばならない。このことは範囲の広さに関係なく当てはまる。
【０２０６】
数値範囲を本明細書中に示すときは常に、その示された範囲に入る任意の引用される数字（小数または整数）を含むことを意図する。第１指示数と第２指示数との「間の範囲にある／間の範囲」、及び第１指示数「から」第２指示数「までの範囲にある／までの範囲」という語句は、本明細書中では交換可能に使用され、第１及び第２の指示数ならびにそれらの間にあるあらゆる小数及び整数の数を含むことを意図する。
【０２０７】
本明細書中で使用する場合、「方法」という用語は、所与の課題を成し遂げるための様式、手段、技術及び手順を指し、これらには、化学、薬理学、生物学、生物化学及び医学の分野の専門家に知られているかまたは彼らによって既知の様式、手段、技術及び手順から容易に開発される様式、手段、技術及び手順が含まれるが、これらに限定されない。
【０２０８】
本明細書中で使用する場合、「治療する」という用語は、病態の進行をなくさせること、実質的に阻止すること、遅らせること、もしくは反転させること、病態の臨床的もしくは審美的症候を実質的に改善すること、または病態の臨床的もしくは審美的症候の顕在化を実質的に防止することを含む。
【０２０９】
特定の配列表に言及する場合、このような言及は、例えば配列過誤、クローニング過誤または、塩基置換、塩基欠失もしくは塩基付加をもたらすその他の変化によって起こる軽微な配列変異を含む実質的にその相補的配列に対応する配列も包含すると理解されるべきであるが、但し、そのような変異の頻度は５０ヌクレオチドに１回未満、あるいは１００ヌクレオチドに１回未満、あるいは２００ヌクレオチドに１回未満、あるいは５００ヌクレオチドに１回未満、あるいは１０００ヌクレオチドに１回未満、５，０００ヌクレオチドに１回未満、あるいは１０，０００ヌクレオチドに１回未満である。
【０２１０】
本願において開示される任意の配列識別番号（配列番号）がたとえＤＮＡ配列形式またはＲＮＡ配列形式だけで表現されていても、その配列番号は、その配列番号について言及している文脈に応じてＤＮＡ配列かＲＮＡ配列かのどちらかを指し得ることは、理解される。
【０２１１】
明瞭さのために別々の実施形態の文脈で記載されている本発明の特定の特徴が、単一の実施形態で組み合わさって提供される場合もあることは認識される。反対に、簡潔さのために単一の実施形態の文脈で記載されている本発明の様々な特徴が、本発明の他の任意の記載された実施形態では個別に、または任意の好適な部分的組合せとして、または好適な加減で提供される場合もある。様々な実施形態の文脈で記載されるある特徴は、それらの要素なしでは実施形態が機能しないというわけでない限り、それらの実施形態の必須の特徴とみなされるべきでない。
【０２１２】
以上に列挙される、及び以下の特許請求の範囲の部で特許請求される本発明の様々な実施形態及び態様は、以下の実施例において実験によって裏付けられる。
【実施例】
【０２１３】
これより、以下の実施例に言及するが、これは上記説明と一緒に本発明のいくつかの実施形態を非限定的に例示するものである。
【０２１４】
概して、本明細書中で用いる術語体系、及び本発明に利用される実験室手順は、分子、生化学、微生物及び組換えＤＮＡの技術を含む。そのような技術は文献の中で克明に説明されている。例えば、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）、“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，ｅｄ．（１９９４）、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）、Ｐｅｒｂａｌ，“Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）、Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ”，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｂｉｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ）“Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ”，Ｖｏｌｓ．１−４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８）；米国特許第４，６６６，８２８号、第４，６８３，２０２号、第４，８０１，５３１号、第５，１９２，６５９号及び第５，２７２，０５７号に示されている方法論、“Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ”，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）、“Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ−Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ”ｂｙ  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９４），Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ｃｏｌｉｇａｎ  Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）、Ｓｔｉｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ），“Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）、Ｍｉｓｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｈｉｉｇｉ（ｅｄｓ），“Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）を参照されたく、利用可能なイムノアッセイについては、特許及び科学文献に広範囲に記載されており、例えば、米国特許第３，７９１，９３２号、第３，８３９，１５３号、第３，８５０，７５２号、第３，８５０，５７８号、第３，８５３，９８７号、第３，８６７，５１７号、第３，８７９，２６２号、第３，９０１，６５４号、第３，９３５，０７４号、第３，９８４，５３３号、第３，９９６，３４５号、第４，０３４，０７４号、第４，０９８，８７６号、第４，８７９，２１９号、第５，０１１，７７１号及び第５，２８１，５２１号、“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”Ｇａ���ｔ，Ｍ．Ｊ．，ｅｄ．（１９８４）、“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ．（１９８５）、“Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ”Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ．（１９８４）、“Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．，ｅｄ．（１９８６）、“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ”ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）、“Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．，（１９８４）、及び“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌ．１−３１７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、“ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）、Ｍａｒｓｈａｋ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ”ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）を参照されたく、参照によりこれらの全てを、あたかも全体的に本明細書中に示したかのように援用する。その他の一般的な参考文献はこの文書の全体にわたって提供されている。その中の手順は、当技術分野でよく知られていると考えられ、読み手の便宜のために提供される。参照によりその中に含まれている全ての情報を本明細書に援用する。
【０２１５】
実施例１
ＣＤＲ接合を用いるＤ１１  ＴＣＲＬ抗体のヒト化
ヒトＩｇフレームワーク領域に対する相補性決定領域（ＣＤＲ）接合を用いることによって、ＨＬＡ−Ａ２／ＴｙｒＤ３６９−３７７（配列番号１５）ペプチド−ＨＬＡ複合体に対するマウスモノクローナル抗体であるＤ１１（Ｋａｂａｔに従って決定される配列番号５〜１０で示されるＣＤＲを有する配列番号１１〜１４）をヒト化した。重鎖及び軽鎖のためのヒトフレームワークは、機能性ヒト生殖細胞系遺伝子との配列及び構造の類似性に基づいて選択された。これに関して、構造類似性は、マウスカノニカルＣＤＲ構造と、同じカノニカル構造を有するヒト候補体との比較によって評価された。
【０２１６】
コンピュータ支援によるＣＤＲ接合法（Ａｂｙｓｉｓ  Ｄａｔａｂａｓｅ，ＵＣＬ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｐｌｃ．）と、分子操作技術とを用いてＤ１１をヒト化してｈＤ１１−５を得た。分子操作手順は、当技術分野で認知されている技術を用いて行った。その目的に向けて、ＲＴ−ＰＣＲで増幅するマウス抗体可変領域ＤＮＡ配列の正確な決定、及びその重鎖及び軽鎖タンパク質翻訳の相同性モデリングが出発点となった。
【０２１７】
Ｄ１１の結合の好ましい特性を維持するためには単一のフレームワーク変更が必要であった。この点に関して、重鎖可変領域になされるフレームワーク変更または復帰突然変異はなく、軽鎖可変領域において単一のフレームワーク改変（ｈＤ１１−５におけるＹ４９Ｈ）を行うのみとした。Ｙ４９Ｈ復帰突然変異は、ＨＬＡ−Ａ２／ＴｙｒＤ３６９−３７７複合体に対するヒト化抗体の完全な結合性を回復させるために必須であった。ヒト化Ｄ１１抗体（ｈＤ１１−５）のアミノ酸及びヌクレオチド配列を図１に示す（配列番号２４〜２７）。
【０２１８】
ＣＤＲ接合による全ての選択された抗体のヒト化の後、得られた重鎖及び軽鎖可変領域アミノ酸配列を分析して、マウスドナー及びヒトアクセプター軽鎖及び重鎖可変領域とのそれらの相同性を決定した。
【０２１９】
実施例２
ヒトＩｇＧ１発現ベクターへのｈＤ１１−５  ＴＣＲＬ抗体のクローニングならびにそれに続くＥｘｐｉ２９３系における発現及び精製。
図１に示すように、ｈＩｇＧ１重鎖及び軽鎖の定常領域を含有するｐＣＩ発現ベクターにｈＤ１１−５のヒト化可変重鎖及び軽鎖の合成ＤＮＡ断片をクローニングした。その後、得られた重鎖及び軽鎖の構築物のＥｘｐｉ２９３細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ａ１４６３５）への共トランスフェクションによってｈＤ１１−５抗体を発現させた。分泌を媒介するためにシグナル配列を含ませた（軽鎖には配列番号３６、配列番号３７、また、重鎖には配列番号３８、配列番号３９）。
【０２２０】
手短に述べると、選択されたヒト免疫グロブリン発現ベクターの中へのヒト化可変領域遺伝子の指向的クローニングを行った。Ｉｇ遺伝子特異的ＰＣＲにおいて使用した全てのプライマーは、ヒトＩｇＧ１重鎖及び軽鎖の定常領域を含有する発現ベクターの中への直接クローニングを可能にする制限部位を含んでいた。（重鎖では）ＡｇｅＩ及びＸｈｏＩならびに（軽鎖では）ＸｍａＩ及びＤｒａＩＩＩによって消化された合成遺伝子を精製し、その後、発現ベクターにライゲートした。ライゲーション反応は２００ＵのＴ４−ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）と、消化及び精製された遺伝子特異的ＰＣＲ産物７．５μＬと、２５ｎｇの線状化ベクターＤＮＡとを使用して１０μＬの総体積で実施された。１μＬのライゲーション産物をアンピシリンプレート上に播種した状態（１００μｇ／ｍＬ）で電気穿孔（ＢｉｏＲａｄ）によってエレクトロコンピテントＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂ細菌（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を形質転換した。ＶＨ領域のＡｇｅＩ−ＸｈｏＩ断片はｐＣＩ−ＨｕＩｇＧ１発現ベクターの同じ部位にクローニングされた一方、合成ＸｍａＩ−ＤｒａＩＩＩ  ＶＫインサートはそれぞれのｐＣＩ−Ｈｕ−カッパ発現ベクターのＸｍａＩ−ＤｒａＩＩＩ部位にクローニングされた。
【０２２１】
プラスミドＤＮＡをＱＩＡｐｒｅｐスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。Ｅｘｐｉ２９３細胞を、２％のＦＢＳが補充されたＤＭＥＭ培地の中で培養した。
【０２２２】
一過的トランスフェクションのために、Ｅｘｐｉ２９３細胞を１ｍｌあたり細胞が２５０万個になるまで成長させた。等量のＩｇＨ及び対応ＩｇＬ鎖ベクターＤＮＡ（各々１５μｇずつ）を、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ３１９８５０６２）１．５ｍＬ中８０μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ２９３試薬が混ざった１．５ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地に添加した。混合物を３０分間室温でインキュベートし、１０ｃｍ組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に均一に広げた。トランスフェクションから３日後に上清を採集し、１０％のＦＢＳが補充された２０ｍＬの新鮮なＤＭＥＭに替え、トランスフェクション後６日目に再び採集した。８００×ｇで１０分間の遠心分離によって培養上清から細胞残屑を除去した。組換えヒト化抗体ｈＤ１１−５を、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製したかまたは、上清として使用した。
【０２２３】
実施例３
Ｅｘｐｉ２９３系におけるＤ１１  ＴＣＲＬ抗体のクローニング及び発現
マウス親Ｄ１１（ＩｇＧ１アイソタイプ）重鎖及び軽鎖（配列番号１１〜１４）をＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＧｅｎｅＡｒｔによって個々にｐＣＤＮＡ３．４発現ベクターにクローニングした。分泌を媒介するためにリーダー配列（配列番号３４、配列番号３５）をインフレームに含ませた。
【０２２４】
一過的トランスフェクションのために、Ｅｘｐｉ２９３細胞をＥｘｐｉ２９３発現用培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ．Ａ１４３５１−０１）の中で１ｍｌあたり細胞が２５０万個になるまでエルレンマイヤーフラスコ（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｔ．４１１５−１０００）内でオービタルシェーカー（１２５ｒｐｍ）、３７℃のインキュベーター、８％のＣＯ２で成長させた。等量のＩｇＨ及び対応ＩｇＬ鎖ベクターＤＮＡ（各々３７５μｇずつ）を３７．５ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ．３１９８５−０４７）に添加した。２．０ｍｌのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ２９３Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ．１０００１４９９４）をＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地に添加して３７．５ｍＬの終体積にした。２つの溶液を混合し、室温で３０分間インキュベートした。混合物２５ｍｌを１リットルエルレンマイヤーフラスコ１つあたり２１２．５ｍｌの細胞培養物に添加することを合計３つのフラスコに行った。トランスフェクションから１６〜１８時間後にＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ２９３ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ１（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ．１０００１３８６３）及びＥｎｈａｎｃｅｒ２（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ．Ａ１４３５０−０１）を添加した（フラスコ１つあたりそれぞれ１．２５ｍｌ及び１２．５ｍｌ）。トランスフェクションから６日後に細胞を７００×ｇで５分間の遠心分離によって採集し、上清を回収し、濾過し、４℃で保存した。組換えマウス抗体をＰｒｏｔｅｉｎＡ  Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ  Ｈｉｔｒａｐ  ｅｘｔｒａカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製し、適切な条件の下で保存した。
【０２２５】
実施例４
ＳＰＲによって決定したｈＤ１１−５  ＴＣＲＬ抗体結合の親和性
一本鎖ＨＬＡ−ペプチド複合体の生産
一本鎖ＨＬＡ−Ａ２（ｓｃＨＬＡ−Ａ２）／ＴｙｒＤ３６９−３７７ペプチド複合体を、Ｄｅｎｋｂｅｒｇ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０，３５２２−３５３２に詳しく記載されているようなイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）誘導によってＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉで産生された封入体の試験管内での再折りたたみによって生産した。手短に述べると、柔軟なリンカーによって互いに連結され合ったＨＬＡ−Ａ２遺伝子のβ２−マイクログロブリンと細胞外ドメインとを含有するものであるｓｃＨＬＡを、遺伝子操作によって作った。試験管内での再折りたたみはＴｙｒＤ３６９−３７７（配列番号１５）ペプチドの存在下で実施した。正しく折りたたまれたＨＬＡ−ペプチド複合体を単離し、アニオン交換Ｑ−セファロースクロマトグラフィー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって精製した。
【０２２６】
親Ｄ１１  ＴＣＲＬ抗体と比較したときのｈＤ１１−５の見掛けの親和性を決定するために、チップ表面に固定された抗マウスまたは抗ヒト抗体によってＩｇＧ  ＴＣＲＬ抗体を捕捉する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）結合分析を実施した。精製した一本鎖組換えＨＬＡ−Ａ２／ＴｙｒＤ３６９−３７７ペプチド複合体を被分析物として使用した。手短に述べると、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＧＬＭセンサーチップ（ＢｉｏＲａｄ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の６本のチャネルを０．０４ＭのＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）と０．０１Ｍのスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ）との混合物５０μｌによって３０μｌ／分の流速で活性化させた。抗マウスまたは抗ヒトポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を１０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．５で希釈して２５μｇ／ｍｌの終濃度にし、１５０μｌを注入し、その後、１Ｍのエタノールアミン−ＨＣｌ  ｐＨ８．５を１５０μｌ注入した。ＩｇＧ  ＴＣＲＬ抗体を垂直配向で３０μｌ／分の流速で注入した。精製した一本鎖組換えＨＬＡ−Ａ２／ＴｙｒＤ３６９−３７７ペプチド複合体を、５つの異なる濃度（２５０、１２５、６２．５、３１．２及び１６ｎＭ）を用いてＰｒｏｔｅＯｎの水平配向で注入した。実験中のチップセンサー表面からの捕捉抗体の逸失について補正する二重参照のために流動用緩衝液（ＰＢＳＴ）を６番目のチャネルに同時に注入した。全ての結合センサーグラムを収集し、組み込まれているＰｒｏｔｅＯｎ  Ｍａｎａｇｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＵＳＡ）ソフトウェアを使用して処理及び解析した。１：１結合化学量論を表現するラングミュアモデルを使用して、またはラングミュア及び物質移動限界モデルによって結合曲線を近似した。図２に示すように、ＨＬＡ−Ａ２／ＴｙｒＤ３６９−３７７ペプチド複合体に対してｈＤ１１−５及びＤ１１  ＴＣＲＬ抗体はどちらも、それぞれ３．９及び４．６ｎＭの類似した親和性を示した。
【０２２７】
実施例５
ｈＤ１１−５  ＴＣＲＬ抗体の選択性及び特異性
ＨＬＡ−Ａ２／ＴｙｒＤ３６９−３７７複合体に対するｈＤ１１−５結合の選択性及び特異性を、ＨＬＡ−Ａ２＋細胞株及び初代細胞のパネルに対するフローサイトメトリーによって示した。ＷＭ２６６．４細胞株（ＣＲＬ−１６７６、ＡＴＣＣ）を、１０％ＦＢＳが補充された完全ＤＭＥＭ（全てＧＩＢＣＯ提供）の中で培養した。Ｃ３３Ａ細胞株（ＨＴＢ−３１、ＡＴＣＣ）を、１０％のＦＢＳが補充された完全ＥＭＥＭ（全てＧＩＢＣＯ提供）の中で培養した。５０１Ａ、Ｍｅｌ５２６、ＳＫＭｅｌ５（ＨＴＢ−７０、ＡＴＣＣ）、Ｍｅｗｏ（ＨＴＢ−６５、ＡＴＣＣ）及び１９３８（メラノーマ）、Ｓａｏｓ２（ＨＴＢ−８５、ＡＴＣＣからの骨肉腫）、Ｐａｎｃ１（ＣＲＬ−１４６９、ＡＴＣＣからの膵臓癌）、Ｊ８２（ＨＴＢ−１、ＡＴＣＣ）、ＪＶＭ２（ＣＲＬ−３００２、ＡＴＣＣからのマントル細胞リンパ腫）及びＳＷ６２０（ＣＣＬ−２２７、ＡＴＣＣからの大腸腺癌）細胞株を、１０％のＦＢＳが補充された完全ＲＰＭＩ（全てＧＩＢＣＯ提供）の中で培養した。Ｍａｌｍｅ３Ｍ（ＨＴＢ−６４、ＡＴＣＣからのメラノーマ）及びＹ７９（ＨＴＢ−１８、ＡＴＣＣからの網膜芽細胞腫）細胞株を、２０％のＦＢＳが補充された完全ＲＰＭＩ（全てＧＩＢＣＯ提供）の中で培養した。細胞株は７．５％ＣＯ２の加湿雰囲気中で３７℃に維持した。
【０２２８】
正常初代角化細胞、肝細胞、心筋細胞、骨芽細胞、星状膠細胞、気管支上皮細胞、結腸平滑筋細胞、尿路上皮細胞及び腎上皮細胞はＳｃｉｅｎｃｅｌｌから入手した。網膜上皮（ＡＲＰＥ−１９）細胞はＡＴＣＣ（ＣＲＬ−２３０２）から入手した。細胞を製造者の指示に従って培養し、７．５％ＣＯ２の加湿雰囲気中で３７℃に維持した。
【０２２９】
手短に述べると、Ｔｙｒ＋（５０１Ａ、ＳＫＭＥＬ５、ＷＭ２６６．４、５２６）及びＴｙｒ−（１９３８、ＰＡＮＣ１、Ｃ３３Ａ、ＳＡＯＳ２、ＳＷ６２０、ＪＶＭ２）細胞株を１０μｇ／ｍｌのビオチン化ｈＤ１１−５及びＤ１１  ＴＣＲＬ抗体と共に４℃で１時間インキュベートし、その後、ＰＥ標識ストレプトアビジン複合体と共に４℃で４５分間インキュベートした。ＢＢ７．２抗体（１０μｇ／ｍｌ）を使用し、二次ＰＥ標識抗マウスＩｇＧを使用して、ＨＬＡ−Ａ２の発現を追跡評価した。
【０２３０】
図３に示すように、ビオチン化ｈＤ１１−５及びＤ１１  ＴＣＲＬ抗体はＨＬＡ−Ａ２＋／Ｔｙｒ陽性細胞を特異的に染色した。複数のＨＬＡ−Ａ２＋／Ｔｙｒ陰性細胞株に対する反応性は何ら検出されなかった。ＢＢ７．２抗体染色はこのパネル中の細胞株のＨＬＡ−Ａ２＋状態を裏付けた。
【０２３１】
星状膠細胞、肝細胞、腎細胞、心筋細胞、結腸筋、気管支上皮、骨芽細胞、気管支、角化細胞及び正常網膜色素上皮細胞株ＡＲＰＥ１９を含む正常初代細胞のパネルで、ビオチン化ｈＤ１１−５及びＤ１１  ＴＣＲＬ抗体の反応性も試験した（図４）。これらのＨＬＡ−Ａ２＋細胞に対する結合は何ら認められなかった。ＢＢ７．２抗体染色はこのパネル中の細胞のＨＬＡ−Ａ２＋状態を裏付けた。
【０２３２】
実施例６
細胞傷害性アッセイにおけるキメラ二重特異性ＴＣＲＬ  ＣＤ３−ＣｈＤ１１−５の生成及び機能性特徴
ヒト化重鎖の可変領域及びヒト定常領域１（ＶＨ−ＣＨ１）ならびにマウス軽鎖の可変領域（ＶＬ）及びＤ１１のヒト定常カッパ鎖（ＣＬ）（配列番号２０及び配列番号１８）を抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ断片（配列番号１６）と共にアセンブルして二重特異性構築物にしたが、これは、エフェクターＴ細胞をＨＬＡ−Ａ２＋／Ｔｙｒ３６９−３７７＋標的細胞へ再指向することができるものである。手短に述べると、コネクタ（配列番号３２、配列番号３３）を介して抗ＣＤ３  ｓｃＦｖをキメラ軽鎖（マウス−ＶＬ  ヒト−ＣＬカッパ）のＮ末端と融合させ、６ｘＨｉｓタグをｈＤ１１−５のＶＨ−ＣＨ１（配列番号２０、配列番号２１）ドメインのＣ末端に付加させた。リーダー配列（配列番号３４、配列番号３５）をインフレームに含ませた。どちらの構築物も哺乳動物細胞での発現のためのｐｃＤＮＡ３．４ベクターにクローニングして、ＣＤ３−ＣｈＤ１１−５  ＢＳと呼ぶ二重特異性抗体を得た。
【０２３３】
実施例３に記載のとおりに２つの構築物をＥｘｐｉ２９３Ｆヒト細胞に共トランスフェクションすることによってＣＤ３−ＣｈＤ１１−５  ＢＳ  ＴＣＲＬを発現させた。６日間培養した後に細胞を７００×ｇで５分間遠心分離し、ＣＤ３−ＣｈＤ１１−５  ＢＳ  ＴＣＲＬ抗体を含有する上清を採集、濾過及び透析した。ＣＤ３−ＣｈＤ１１−５  ＢＳ  ＴＣＲＬ組換えタンパク質を金属親和性（Ｔａｌｏｎ）及びサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００  １０／３００ＧＬ  ＧＥ）によって精製した。
【０２３４】
細胞傷害性は、ＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用する非放射アッセイにおいて測定された。このアッセイは、細胞溶解時に放出される酵素である乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を定量的に測定する。培養上清中に放出されたＬＤＨは１０分の結合酵素アッセイで測定するが、これはテトラゾリウム塩（ＩＮＴ）から赤色のホルマザン生成物への転化をもたらすものである。生成する色素の量は、溶解した細胞の数に比例する。
【０２３５】
具体的には、標的細胞及びエフェクター細胞を洗浄し、計数し、そしてフェノールレッドなしでｃＲＰＭＩ培地（１％ＦＢＳ）中に再懸濁させた。標的細胞を１ｍｌあたり２．５×１０５細胞の細胞密度に調整し、エフェクター細胞を１ｍｌあたり２．５×１０６細胞の細胞密度に調整した。４０μｌ（１×１０４細胞）の標的細胞を９６ウェルＶ字形プレート内で培養した。ＣＤ３−ＣｈＤ１１−５  ＢＳ  ＴＣＲＬ試験試薬の５×の原液を最高試験濃度に調製し、その後、別のプレートにおいてフェノールレッドを含まない培地で１：１０に段階希釈して他の試験濃度を得た。その後、アッセイプレート内の標的細胞に１ウェルあたり２０μｌのＣＤ３−ＣｈＤ１１−５及びＣＤ３−Ｄ１１  ＢＳ  ＴＣＲＬを添加して、最終指示滴定量を得た。その後、ＢＳ  ＴＣＲＬと混ざった標的細胞を含有するアッセイプレートを３７℃／５％ＣＯ２で２０分間インキュベートした。インキュベート後に４０μｌのエフェクター細胞（１×１０５細胞）を各ウェルに加えて１０：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比にした。エフェクターの自然放出を計算するためのエフェクター細胞単独、標的の自然放出を計算するための標的細胞単独、及び最大放出を計算するための最終的に８０μｇ／ｍｌのジギトニンを含む標的細胞を含んだ対照ウェルを設けた。１００μｌの終体積で各条件を３反復でアッセイした。プレートを３７℃／５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。インキュベーション期間の後、プレートを７００×ｇで５分間遠心分離し、５０μｌを各ウェルから９６ウェル平底Ｍａｘｉｓｏｒｂプレート（Ｎｕｎｃ）内の対応ウェルへと移した。ＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）アッセイ用緩衝液を製造者の指示に従って使用してＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）基質ミックスを再構成し、５０μｌをプレートの各ウェルに加えた。プレートをアルミニウム箔で覆い、室温で１０分間インキュベートした。４９０ｎｍでの吸光度をプレートリーダーで記録した。その後、下記式を使用して百分率での細胞傷害性を算出した：特異的溶解＝［（実験値−エフェクター自然値−標的自然値）／（標的最大値−標的自然値）］×１００。傷害アッセイのためのＰＢＭＣは、あらゆる規制上のＩＲＢ承認及び書面での同意を伴って健常ボランティアから単離される。エフェクターＰＢＭＣは、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ手順を用いて単離される。
【０２３６】
図５Ａ〜Ｂ及び図６に示すように、ＣＤ３−ｃｈＤ１１−５  ＢＳ  ＴＣＲＬは試験管内でヒトＰＢＭＣの存在下でメラノーマＷＭ２６６．４細胞に対する細胞傷害性を示した。Ｐａｎｃ−１、ＨＬＡ−Ａ２＋／Ｔｙｒ−細胞株は陰性対照としての役割を果たし、細胞傷害性を何ら示さなかった。細胞傷害性はＨＬＡ−Ａ２＋／Ｔｙｒ＋  メラノーマ細胞株のパネルに対しても検出された（図５Ａ）。ＨＬＡ−Ａ２＋／Ｔｙｒ−細胞株（図５Ｂ）及び正常ヒト初代細胞（図６）のパネルに対してはＣＤ−ＣｈＤ１１−５  ＢＳ  ＴＣＲＬによる細胞傷害性は何ら検出されず、その選択性が裏付けられた。
【０２３７】
実施例７
確立されたメラノーマ異種移植マウスモデルにおけるＣＤ３−ＣｈＤ１１−５  ＢＳ  ＴＣＲＬ及びＣＤ３−Ｄ１１  ＢＳ  ＴＣＲＬの抗腫瘍活性
Ｍｅｌ５２６メラノーマ細胞株を、１０％のウシ胎仔血清（ＧＩＢＣＯ，Ｗａｌｔｈａｍ  ＭＡ，ＵＳＡ）が補充されたＲＰＭＩ１６４０成長培地（ＧＩＢＣＯ，Ｗａｌｔｈａｍ  ＭＡ，ＵＳＡ）の中で培養した。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を健常ドナーから調製し、ＣＤ３陽性細胞を生体外で増殖させ、参照によりここに全体を援用するＷＯ２０１６／１９９１４  １に記載されているようにエフェクター細胞として使用した。
【０２３８】
０日目に６〜８週齢の雌のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（Ｅｎｖｉｇｏ，Ｉｓｒａｅｌ）の片方の側腹の皮下（ｓ．ｃ．）に、１５×１０６個の生体外増殖したエフェクターＰＢＭＣ（エフェクター：腫瘍細胞の比３：１）を含むかまたは含まない５×１０６個のＭｅｌ５２６メラノーマ細胞が入った終体積０．１ｍｌの５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を接種した。５日目に触診可能な腫瘍が確立された時点でマウスを終体積０．１ｍｌで投薬量１５μｇ／マウスのＣＤ３−Ｄ１１、ＣＤ３−ＣｈＤ１１−５もしくはＣＤ３−対照  ＢＳ  ＴＣＲＬ、またはビヒクル対照（ＰＢＳ）をｉ．ｖ．にて処置し、追加で５回の投薬を２４時間ごとに投与して合計６回の投薬とした。
【０２３９】
図７は、このモデルでＣＤ３−ＣｈＤ１１−５及びＣＤ３−Ｄ１１  ＢＳ  ＴＣＲＬが両方とも２９日の期間にわたって腫瘍退縮を誘導したことを示す。
【０２４０】
本発明をその具体的な実施形態と関連させて説明してきたが、多くの代替形態、改変及び変化形態が当業者にとって明らかであろうことは明白である。したがって、別記の特許請求の範囲の趣旨及び広い範囲に含まれるそのような代替形態、改変及び変化形態を全て包含することが意図される。
【０２４１】
本明細書中で言及した全ての刊行物、特許及び特許出願は、各個の刊行物、特許または特許出願を参照により本明細書に援用することを具体的かつ個別に示したのと同じ程度に、参照によりそれらの全体が本明細書の中に援用される。加えて、本願におけるいかなる参考文献の引用または特定も、本発明に対する先行技術としてそのような参考文献を利用できることの容認であると解釈されるべきでない。節の見出しが使用されている範囲内において、それらは必ずしも限定をしていると解釈されるべきでない。
【配列表フリーテキスト】
【０２４２】
配列番号１：  可変軽鎖
配列番号２：  可変軽鎖
配列番号３：  可変重鎖
配列番号４：  可変重鎖
配列番号５：  ＣＤＲ１  Ｖａｒｉａｂｌｅ重鎖
配列番号６：  ＣＤＲ２軽鎖
配列番号７：  ＣＤＲ３軽鎖
配列番号８：  ＣＤＲ１重鎖
配列番号９：  ＣＤＲ２重鎖
配列番号１０：  ＣＤＲ３重鎖
配列番号１５：  ＴｙｒＤ  ３６９−３７７アミノ酸配列
配列番号１６：  ＳｃＦｖ  ＣＤ３核酸配列
配列番号１７：  ＳｃＦｖ  ＣＤ３アミノ酸配列
配列番号１８：軽鎖  Ｄ１１  ｉｎ  ＢＳ核酸配列
配列番号１９：軽鎖  Ｄ１１  ｉｎ  ＢＳアミノ酸配列
配列番号２０：  ＶＨＣＨ１  ｉｎ  ＢＳ核酸配列
配列番号２１：  ＶＨＣＨ１  ｉｎ  ＢＳアミノ酸配列
配列番号２２：  ＣＤＲ１軽鎖核酸配列
配列番号２３：  ＣＤＲ２軽鎖核酸配列
配列番号２４：  ｈＤ１１−５全長軽鎖核酸配列
配列番号２５：  ｈＤ１１−５全長軽鎖アミノ酸配列
配列番号２６：  ｈＤ１１−５全長重鎖核酸配列
配列番号２７：  ｈＤ１１−５全長重鎖アミノ酸配列
配列番号２８：  ＣＤＲ３軽鎖核酸配列
配列番号２９：  ＣＤＲ１重鎖核酸配列
配列番号３０：  ＣＤＲ２重鎖核酸配列
配列番号３１：  ＣＤＲ３重鎖核酸配列
配列番号３２：  抗ＣＤ３とＤ１１  ＶＬ核酸配列との間のコネクター
配列番号３３：  抗ＣＤ３とＤ１１  ＶＬアミノ酸配列との間のコネクター
配列番号３４：  ｐＣＤＮＡ３．４における発現のためのマウスＩｇＨシグナル配列−リーダー配列
配列番号３５：  ｐＣＤＮＡ３．４における発現のためのマウスＩｇＨシグナル配列−リーダー配列
配列番号３６：  ｐＣＩ軽鎖における発現用のリーダー配列
配列番号３７：  ｐＣＩ軽鎖における発現用のリーダー配列
配列番号３８：  ｐＣＩ重鎖における発現用のリーダー配列
配列番号３９：  ｐＣＩ重鎖における発現用のリーダー配列
【図１−１】
2020530259.tif 000002
【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
2020530259000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年6月15日(2020.6.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−Ｃの順にＣＤＲ配列：
ＣＤＲ１重鎖（ＨＣ）  配列番号８    ＴＳＧＭＧＶＳ
ＣＤＲ２  ＨＣ        配列番号９    ＨＩＹＷＤＤＤＫＲＹＮＰＳＬＫＳ
ＣＤＲ３  ＨＣ        配列番号１０  ＫＤＹＧＳＳＦＹＡＭＨＹ
ＣＤＲ１軽鎖（ＬＣ）  配列番号５    ＫＡＳＱＤＩＨＮＹＩＡ
ＣＤＲ２  ＬＣ        配列番号６    ＹＴＳＴＬＱＰ
ＣＤＲ３  ＬＣ        配列番号７    ＬＱＹＤＮＬＷＴ
を含む抗原結合ドメインを含む抗体であって、前記抗体がＨＬＡ拘束性にＨＬＡ−Ａ２／ＴｙｒＤ３６９−３７７に結合することができる、前記抗体。
【請求項２】
前記重鎖の可変領域が配列番号４、２１または２７で示される、請求項１に記載の抗体。 
【請求項３】
前記軽鎖の可変領域が配列番号２、１９または２５で示される、請求項１または２に記載の抗体。 
【請求項４】
前記重鎖の可変領域が配列番号４で示され、前記軽鎖の可変領域が配列番号２で示される、請求項２または３に記載の抗体。 
【請求項５】
キメラ抗体である、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項６】
ＩｇＧである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項７】
抗体断片である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項８】
Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ及び単一ドメイン分子からなる群から選択される、請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
二重特異性抗体である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１０】
前記二重特異性抗体が抗ＣＤ３または抗ＣＤ１６を含む、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
前記抗ＣＤ３がｓｃＦｖを含む、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体と、治療薬部分とを含む、抗体複合体。
【請求項１３】
前記治療薬部分が、細胞傷害性部分、毒性部分、サイトカイン部分及び薬物からなる群から選択される、請求項１２に記載の抗体複合体。
【請求項１４】
前記治療薬部分が細胞を含む、請求項１２に記載の抗体複合体。
【請求項１５】
前記細胞が、αβＴ細胞、γδＴ細胞、ＮＫ、ＣＩＫ、ＮＫＴ、マクロファージ及びＢ細胞からなる群から選択される、請求項１４に記載の抗体複合体。
【請求項１６】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体をコードする核酸配列を含む、単離ポリヌクレオチド。
【請求項１７】
シス作用性調節エレメントに機能可能に繋げられた請求項１６に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項１８】
ウイルスベクターである、請求項１７に記載の発現ベクター。
【請求項１９】
請求項１６に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１７に記載の発現ベクターを含む、細胞。
【請求項２０】
請求項１〜１１のいずれかに記載の抗体、請求項１２または１３に記載の抗体複合体、請求項１７または１８に記載の発現ベクター、または請求項１９に記載の細胞を含む、医薬組成物。
【請求項２１】
メラノーマまたは神経膠芽腫の治療用である、請求項２０に記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
2020530259.tif 000010
2020530259.tif 000011