(57)【要約】  カプシドにコンジュゲートされた抗原を含むワクチン組成物であって、前記カプシドが野生型またはネイティブ配列を含むワクチン組成物が本明細書で提供される。カプシドにコンジュゲートされた抗原を含むワクチン組成物であって、前記カプシドが少なくとも１個の変異、例えば非天然変異を含むワクチン組成物も本明細書で提供される。このような組成物は、とりわけ、病原性感染、炎症性疾患および神経変性疾患およびがんの処置および予防において有用である。
2020531544.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カプシドにコンジュゲートされた抗原を含むワクチン組成物であって、前記カプシドが少なくとも１個の非天然変異を含む、ワクチン組成物。
【請求項２】
前記カプシドが、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の変異を含む、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
前記少なくとも１個の非天然変異がジスルフィド結合変異である、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
前記抗原が、炭水化物抗原、ペプチド、タンパク質、核酸および有機分子抗原からなる群より選択される、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項５】
前記抗原が炭水化物抗原である、請求項４に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
前記炭水化物抗原が、（ａ）ムチン１（ＭＵＣ１）、（ｂ）ムチン４（ＭＵＣ４）、（ｃ）ガングリオシドＧＤ２（ＧＤ２）、（ｄ）フコシルガングリオシドＧＭ１（ＧＭ１）、（ｅ）アセチル化ＧＤ２、（ｆ）ガングリオシドＧＤ３（ＧＤ３）、（ｇ）アセチル化ＧＤ３、（ｈ）フコシルガングリオシドＧＭ２（ＧＭ２）、（ｉ）グロボ−Ｈ、（ｊ）ルイスＡ、（ｋ）ルイスＹ、（ｌ）ポリシアル酸、（ｍ）シアリル−ルイスＡ、（ｎ）Ｔｆ、（ｏ）Ｔｎ、（ｐ）ｓＴｎ、Ｔｎ１およびＴｎ２からなる群より選択される、請求項５に記載のワクチン組成物。
【請求項７】
前記炭水化物抗原がＭＵＣ１である、請求項６に記載のワクチン組成物。
【請求項８】
前記炭水化物抗原がＧＤ２または９−ＮＨＡｃ−ＧＤ２である、請求項６に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
前記カプシドがバクテリオファージカプシドである、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
前記バクテリオファージが、（ａ）：バクテリオファージＱβ；（ｂ）バクテリオファージＲ１７；（ｃ）バクテリオファージｆｒ；（ｄ）バクテリオファージＧＡ；（ｅ）バクテリオファージＳＰ；（ｆ）バクテリオファージＭＳ２；（ｇ）バクテリオファージＭ１１；（ｈ）バクテリオファージＭＸ１；（ｉ）バクテリオファージＮＬ９５；（ｊ）バクテリオファージｆ２；（ｋ）バクテリオファージＰＰ７；（ｌ）バクテリオファージＡＰ２０５；および（ｍ）バクテリオファージＰ２２からなる群より選択される、請求項９に記載のワクチン組成物。
【請求項１１】
前記バクテリオファージがバクテリオファージＱβである、請求項１０に記載のワクチン組成物。
【請求項１２】
前記変異が、Ｎ１０Ｋ、Ａ３８Ｋ、Ａ４０Ｃ、Ａ４０Ｓ、Ｔ７５Ｋ、Ｄ１０２Ｃ、Ｄ１０２ＳまたはＡ１１７Ｋまたはそれらの組み合わせから選択される少なくとも１個の変異を含む、請求項２に記載のワクチン組成物。
【請求項１３】
前記カプシドが、Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２Ｃ、Ａ４０Ｓ／Ｄ１０２ＳまたはＡ４３Ｃ／Ｑ９８Ｃから選択される少なくとも２個の変異を含む、請求項２に記載のワクチン組成物。
【請求項１４】
前記カプシドが、Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２Ｃ／Ｋ１３ＲまたはＡ３８Ｋ／Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２Ｃから選択される少なくとも３個の変異を含む、請求項２に記載のワクチン組成物。
【請求項１５】
被験体におけるがんを予防または処置するための方法であって、前記被験体に請求項１に記載のワクチン組成物を投与することを含む、方法。
【請求項１６】
被験体における病原性感染を予防または処置する方法であって、前記被験体に請求項１に記載のワクチン組成物を投与することを含む、方法。
【請求項１７】
炎症性疾患を予防または処置する方法であって、前記被験体に請求項１に記載のワクチン組成物を投与することを含む、方法。
【請求項１８】
神経変性疾患を予防または処置する方法であって、前記被験体に請求項１に記載のワクチン組成物を投与することを含む、方法。
【請求項１９】
前記病原性感染が細菌感染、真菌感染またはウイルス感染である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記ワクチン組成物を全身投与する、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記全身投与が、経口投与、静脈内投与、皮内投与、腹腔内投与、皮下投与および筋肉内投与からなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記組成物を腫瘍内投与または腫瘍周囲投与する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
前記がんが固形腫瘍である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
前記がんが、口腔がん、乳がん、脳がん、小児がん、卵巣がん、前立腺がん、膵臓がん、肺がん、肝臓がん、咽喉がん、胃がんおよび腎臓がんからなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
前記がんが肺がんである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記がんが乳がんである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記小児がんが神経芽細胞腫である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記被験体が哺乳動物である、請求項１５〜１９８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記哺乳動物がヒトである、請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１７年８月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／５５１，０４５号の優先権を主張する。この出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
政府支援
【０００２】
本発明は、国立衛生研究所により与えられたＣＡ１４８４５１の下、政府支援によりなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
がんの処置および予防のための有効なワクチンの開発は、大きな科学的挑戦である。腫瘍細胞は抗原性であり得るが、大きな障壁は、それらの低い固有免疫原性および腫瘍細胞による免疫抑制のために、腫瘍関連抗原に対する免疫反応が低いことである。その結果として、免疫系を活性化し、腫瘍特異的免疫を生成するための革新的な戦略が必要である。
【０００４】
腫瘍抗原の１つの重要なクラスは、腫瘍関連炭水化物抗原（ＴＡＣＡ）である。遺伝的および／またはエピジェネティックな変化により、腫瘍細胞上の炭水化物の構造および発現レベルは、正常細胞上のものとは有意に異なり、抗がんワクチン開発の魅力的な標的となる。
【０００５】
キャリアシステムは、ＴＡＣＡを免疫系に送達し、強い抗ＴＡＣＡ抗体応答を誘発するために必須である。これは、ＴＡＣＡが典型的にはＢ細胞抗原のみであるためである。一般に、ＴＡＣＡのみの投与はＴ細胞に係合することができず、弱いＢ細胞活性化をもたらして、低いＩｇＭ抗体力価のみを生じる。免疫原性タンパク質、多糖、自己組織化ペプチド高分子、ナノ粒子およびリポソームを含め、ＴＡＣＡのための多くのキャリアシステムが調査されている。これらの中で、複数のＫＬＨ−ＴＡＣＡコンジュゲートが後期臨床試験で評価されているので、ＫＬＨにより例示されるタンパク質キャリアが最も進んでいる。抗ＴＡＣＡ抗体は、ＫＬＨ−ＴＡＣＡコンジュゲートを介して生成され得る。複数の研究により、高レベルの抗ＴＡＣＡ抗体を産生することができるがん患者は、より良好な予後および生存に関連することが示されている。しかしながら、全体的に誘発された抗体力価は、さらなる開発の重要な必要性を強調するほどには十分ではなかったので、患者コホート全体では、ワクチン接種は統計的に有意な保護を示せなかった。
【０００６】
タンパク質キャリアの潜在的な欠点は、グリココンジュゲートにより、高い抗キャリア抗体応答が誘導され得ることである。例として、ＧＤ３−ＫＬＨは３００の抗ＧＤ３  ＩｇＧ力価を生成したが、ＫＬＨのそれは１，８００，０００であった。高い抗キャリア抗体は、抗グリカン抗体の生成を有意に抑制し得る。この現象は、炭水化物ベースの抗微生物疾患ワクチンについて報告されている。理想的なキャリアは、強い抗自己抗体を伴わずに高レベルの抗グリカン抗体を誘導するものであることが示唆されている。
【０００７】
したがって、当技術分野では、がんの処置および予防において免疫反応を活性化する潜在的な治療戦略および組成物を特定する大きな必要性がある。
【０００８】
最近、炭水化物系ベースの抗がんワクチン設計のための新たなクラスの免疫原性キャリアとして、ウイルス様粒子が登場した。ＶＬＰ  Ｑｂは、複数のＴＡＣＡに対する強いＩｇＧ抗体を誘発することができる。しかしながら、タンパク質キャリアとして、Ｑｂはまた、重大な抗キャリア抗体を誘導し得る。本明細書では、本発明者らは、Ｑｂ変異体の構造情報に基づく合理的設計を報告する。ＴＡＣＡとコンジュゲートされると、新規変異体は、抗Ｑｂ抗体応答の有意な減少に関連し、同時に、非常に高いレベルの抗ＴＡＣＡ  ＩｇＧ抗体を誘発する。非常に侵襲的な腫瘍モデルにおける評価により、処置なしの場合には１４日以内にすべてのマウスが死亡したが、化学療法と組み合わせたｍＱｂ−ＴＡＣＡコンジュゲートのワクチン接種は、反復腫瘍チャレンジからの１００％保護をすべてのマウスに提供したことが示された。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
カプシドにコンジュゲートされた抗原を含むワクチン組成物が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物は、野生型カプシドにコンジュゲートされた抗原を含む。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物は、野生型バクテリオファージＱβカプシドにコンジュゲートされた抗原を含む。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物は、野生型またはネイティブ配列を有するバクテリオファージＱβカプシドにコンジュゲートされた抗原を含む。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物は、配列番号１に記載されている野生型または天然配列を有するバクテリオファージＱβカプシドにコンジュゲートされた抗原を含む。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物は、野生型カプシドからの少なくとも１個の変異を有するカプシドにコンジュゲートされた抗原を含む。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物は、野生型バクテリオファージＱβカプシドからの少なくとも１個の変異を有するバクテリオファージＱβカプシドにコンジュゲートされた抗原を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１個の変異は非天然変異を含む。いくつかの実施形態では、非天然変異は非天然アミノ酸変異を含む。
【００１０】
ワクチン組成物の特定の実施形態では、カプシドは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の変異を含む。
【００１１】
ワクチン組成物の特定の実施形態では、少なくとも１個の非天然変異はジスルフィド結合変異である。
【００１２】
ワクチン組成物の特定の実施形態では、抗原は、炭水化物抗原、ペプチド、タンパク質、核酸および有機分子抗原からなる群より選択される。
【００１３】
ワクチン組成物の特定の実施形態では、抗原は炭水化物抗原である。
【００１４】
ワクチン組成物の特定の実施形態では、炭水化物抗原は、（ａ）ムチン１（ＭＵＣ１）、（ｂ）ムチン４（ＭＵＣ４）、（ｃ）ガングリオシドＧＤ２（ＧＤ２）、（ｄ）フコシルガングリオシドＧＭ１（ＧＭ１）、（ｅ）アセチル化ＧＤ２、（ｆ）ガングリオシドＧＤ３（ＧＤ３）、（ｇ）アセチル化ＧＤ３、（ｈ）フコシルガングリオシドＧＭ２（ＧＭ２）、（ｉ）グロボ−Ｈ、（ｊ）ルイスＡ、（ｋ）ルイスＹ、（ｌ）ポリシアル酸、（ｍ）シアリル−ルイスＡ、（ｎ）Ｔｆ、（ｏ）Ｔｎ、（ｐ）ｓＴｎ、Ｔｎ１およびＴｎ２からなる群より選択される。
【００１５】
ワクチン組成物の特定の実施形態では、炭水化物抗原はＭＵＣ１である。
【００１６】
ワクチン組成物の特定の実施形態では、炭水化物抗原は、ＧＤ２または９−ＮＨＡｃ−ＧＤ２である。
【００１７】
ワクチン組成物の特定の実施形態では、カプシドはバクテリオファージカプシドである。
【００１８】
ワクチン組成物の特定の実施形態では、バクテリオファージは、（ａ）：バクテリオファージＱβ；（ｂ）バクテリオファージＲ１７；（ｃ）バクテリオファージｆｒ；（ｄ）バクテリオファージＧＡ；（ｅ）バクテリオファージＳＰ；（ｆ）バクテリオファージＭＳ２；（ｇ）バクテリオファージＭ１１；（ｈ）バクテリオファージＭＸ１；（ｉ）バクテリオファージＮＬ９５；（ｊ）バクテリオファージｆ２；（ｋ）バクテリオファージＰＰ７；（ｌ）バクテリオファージＡＰ２０５；および（ｍ）バクテリオファージＰ２２からなる群より選択される。
【００１９】
ワクチン組成物の特定の実施形態では、バクテリオファージはバクテリオファージＱβである。
【００２０】
ワクチン組成物の特定の実施形態では、変異は、Ｎ１０Ｋ、Ａ３８Ｋ、Ａ４０Ｃ、Ａ４０Ｓ、Ｔ７５Ｋ、Ｄ１０２Ｃ、Ｄ１０２ＳまたはＡ１１７Ｋまたはそれらの組み合わせから選択される少なくとも１個の変異を含む。
【００２１】
ワクチン組成物の特定の実施形態では、カプシドは、Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２Ｃ、Ａ４０Ｓ／Ｄ１０２ＳまたはＡ４３Ｃ／Ｑ９８Ｃから選択される少なくとも２個の変異を含む。
【００２２】
ワクチン組成物の特定の実施形態では、カプシドは、Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２Ｃ／Ｋ１３ＲまたはＡ３８Ｋ／Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２Ｃから選択される少なくとも３個の変異を含む。
【００２３】
被験体におけるがんを予防または処置するための方法であって、前記被験体に、本明細書に記載されるワクチン組成物を投与することを含む方法も本明細書で提供される。
【００２４】
別の態様では、被験体における病原性感染を予防または処置する方法であって、前記被験体に、本明細書に記載されるワクチン組成物を投与することを含む方法が提供される。
【００２５】
さらに別の態様では、炎症性疾患を予防または処置する方法であって、前記被験体に、本明細書に記載されるワクチン組成物を投与することを含む方法が提供される。
【００２６】
さらに別の態様では、神経変性疾患を予防または処置する方法であって、前記被験体に、本明細書に記載されるワクチン組成物を投与することを含む方法が提供される。
【００２７】
本明細書に記載される本発明のいずれかの態様に適用され得る多数の実施形態がさらに提供される。
【００２８】
例えば、いくつかの実施形態では、病原性感染は、細菌感染、真菌感染またはウイルス感染である。
【００２９】
いくつかの実施形態では、ワクチン組成物は全身投与される。
【００３０】
いくつかの実施形態では、全身投与は、経口投与、静脈内投与、皮内投与、腹腔内投与、皮下投与および筋肉内投与からなる群より選択される。
【００３１】
いくつかの実施形態では、組成物は腫瘍内投与または腫瘍周囲投与される。
【００３２】
いくつかの実施形態では、がんは固形腫瘍である。
【００３３】
いくつかの実施形態では、がんは、口腔がん、乳がん、脳がん、小児がん、卵巣がん、前立腺がん、膵臓がん、肺がん、肝臓がん、咽喉がん、胃がんおよび腎臓がんからなる群より選択される。
【００３４】
いくつかの実施形態では、がんは肺がんである。
【００３５】
いくつかの実施形態では、がんは乳がんである。
【００３６】
いくつかの実施形態では、小児がんは神経芽細胞腫である。
【００３７】
いくつかの実施形態では、被験体は哺乳動物である。
【００３８】
いくつかの実施形態では、哺乳動物はヒトである。
【００３９】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになる。しかしながら、この詳細な説明から、本発明の精神および範囲内における様々な変更および改変が当業者に明らかになるので、詳細な説明および具体例は、本発明の好ましい実施形態を示すが、単なる実例として示されていることを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１は、Ｑβカプシドタンパク質のアミノ酸配列全体をカバーする、１５アミノ酸によって配列が重複した８個の合成３０アミノ酸ペプチドを示す。
【００４１】
【図２】図２は、抗ｗｔＱβ  ＩｇＧ抗体とのペプチド断片の結合を示すペプチドスキャニング実験のＥＬＩＳＡ結果を示す。合成ペプチドをＥＬＩＳＡプレートにコーティングした。ｗｔＱβ免疫マウス由来の血清の希釈物（１／６４０００希釈）を添加して、各ペプチド断片に対する認識を試験した。群（−）は、コーティングプロセスにおいてＰＢＳのみを使用した陰性対照群である。
【００４２】
【図３】図３は、Ｂ鎖からのＱｂカプシドタンパク質の各残基の代表的な溶媒接触可能表面積を示す。
【００４３】
【図４】図４は、ＤｉｓｃｏＴｏｐｅ  ２．０  ｓｅｒｖｅｒ８（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＤｉｓｃｏＴｏｐｅ／）からのＢ細胞エピトープ予測を示す。青色の領域は、Ｂ細胞エピトープの可能性が低いことを示し、赤色の領域は、Ｂ細胞エピトープの可能性が高いことを示す。
【００４４】
【図５】図５は、Ｑｂｗｔ、ｍＱｂ  Ａ３８Ｋ、Ａ３８Ｋ／Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２ＣおよびＡ４０Ｃ／Ｄ１０２Ｃの高速タンパク質液体クロマトグラフィーを示す。
【００４５】
【図６】図６は、変異体カプシドのＴＥＭ画像を示す。
【００４６】
【図７】図７は、非還元（酸化）条件（左）および還元条件（右）におけるウイルスカプシドのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【００４７】
【図８】図８Ａおよび８Ｂは、漸増温度におけるλ＝３１０ｎｍのＵＶ吸収により決定したｍＱｂの熱安定性を示す。
【００４８】
【図９】図９Ａおよび９Ｂは、ａ）ジスルフィド形成を伴う残基のβ炭素間の距離；ｂ）Ｃ７４とＣ８０との間のネイティブジスルフィド結合（緑色の残基）およびｍＱｂ  Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２Ｃにおける非ネイティブジスルフィド結合（黄色の残基）からのジスルフィド結合ネットワークを示すＱｂのＸ線結晶構造を示す。
【００４９】
【図１０】図１０は、ＱｂおよびＱｂ変異体へのＴｎ１（プロトタイプＴＡＣＡ）の固定を示す。
【００５０】
【図１１−１】図１１Ａ〜１１Ｃは、変異体ｍＱβ−Ｔｎ１をワクチン接種したマウス群（ｎ＝５）由来の免疫後血清（３５日目）のＥＬＩＳＡ結果を示す。図１１Ａおよび１１Ｂは、それぞれリニアスケールおよびログスケールで示されている免疫後血清の抗Ｔｎ１力価を示す。スチューデントｔ検定により、ｍＱβとｗｔＱβと間の統計的有意差を決定した（＊＊р＜０．０１；＊＊＊р＜０．００１；＊＊＊＊р＜０．０００１）。図１１Ｃは、ＢＳＡ−Ｔｎ１に対するｗｔＱβ−Ｔｎ１、ｍＱβ（Ａ３８Ｋ／Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２Ｃ）−Ｔｎ１およびｍＱβ（Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２Ｃ）−Ｔｎ１免疫により誘発されたＩｇＧサブタイプ抗体（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃおよびＩｇＧ３）の１／８１９２００血清希釈のＥＬＩＳＡ結果からのＯＤ４５０を示す。
【図１１−２】図１１Ａ〜１１Ｃは、変異体ｍＱβ−Ｔｎ１をワクチン接種したマウス群（ｎ＝５）由来の免疫後血清（３５日目）のＥＬＩＳＡ結果を示す。図１１Ａおよび１１Ｂは、それぞれリニアスケールおよびログスケールで示されている免疫後血清の抗Ｔｎ１力価を示す。スチューデントｔ検定により、ｍＱβとｗｔＱβと間の統計的有意差を決定した（＊＊р＜０．０１；＊＊＊р＜０．００１；＊＊＊＊р＜０．０００１）。図１１Ｃは、ＢＳＡ−Ｔｎ１に対するｗｔＱβ−Ｔｎ１、ｍＱβ（Ａ３８Ｋ／Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２Ｃ）−Ｔｎ１およびｍＱβ（Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２Ｃ）−Ｔｎ１免疫により誘発されたＩｇＧサブタイプ抗体（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃおよびＩｇＧ３）の１／８１９２００血清希釈のＥＬＩＳＡ結果からのＯＤ４５０を示す。
【００５１】
【図１２】図１２は、変異体により生成されたｗｔＱβに対する抗体レベルの減少を示す。
【００５２】
【図１３】図１３は、ｍＱβ−Ｔｎコンジュゲートの抗ｗｔＱβ抗体認識の減少を示す競合ＥＬＩＳＡを示す。
【００５３】
【図１４】図１４Ａおよび１４Ｂは、変異体ｍＱβ−Ｔｎ１をワクチン接種したマウス群（ｎ＝５）由来の免疫後血清（３５日目）のＥＬＩＳＡ結果を示す。図１４Ａは、ＢＳＡ−Ｔｎ１に対する１／８１９２００希釈の免疫後血清のＥＬＩＳＡ結果からのＯＤ４５０を示す。図１４Ｂは、対応するキャリアカプシドに対する１／１６３８４００の免疫後血清のＥＬＩＳＡ結果からのＯＤ４５０を示す。スチューデントｔ検定により、ｍＱβとｗｔＱβと間の統計的有意差を決定した。
【００５４】
【図１５】図１５Ａおよび１５Ｂ、Ｑβコンジュゲートによる誘発ＩｇＧ抗体の結合。図１５Ａおよび１５Ｂは、それぞれジャーカット細胞およびＴＡ３Ｈａ細胞に対する誘発抗体の結合認識の蛍光強度中央値のグラフである。
【００５５】
【図１６−１】図１６Ａ〜１６Ｃは、Ｔｎ１およびＴｎ２の化学構造を示す。図１６Ｂおよび図１６Ｃは、ｗｔＱβ−Ｔｎ１およびｍＱβ（Ａ３８Ｋ／Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２Ｃ）−Ｔｎ１からのものと比較した、ｗｔＱβ−Ｔｎ２およびｍＱβ（Ａ３８Ｋ／Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２Ｃ）−Ｔｎ２で免疫したマウス由来の血清のジャーカット細胞に対する細胞結合のＭＦＩを示す。
【図１６−２】図１６Ａ〜１６Ｃは、Ｔｎ１およびＴｎ２の化学構造を示す。図１６Ｂおよび図１６Ｃは、ｗｔＱβ−Ｔｎ１およびｍＱβ（Ａ３８Ｋ／Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２Ｃ）−Ｔｎ１からのものと比較した、ｗｔＱβ−Ｔｎ２およびｍＱβ（Ａ３８Ｋ／Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２Ｃ）−Ｔｎ２で免疫したマウス由来の血清のジャーカット細胞に対する細胞結合のＭＦＩを示す。
【００５６】
【図１７】図１７Ａおよび１７Ｂは、ｗｔＱβ−Ｔｎ２およびｍＱβ（Ａ３８Ｋ／Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２Ｃ）−Ｔｎ２による誘発ＩｇＧ抗体の結合を示すフローサイトメトリーを示す。図１７Ａは、それぞれＴＡ３Ｈａ細胞に対する誘発抗体の結合認識を示すヒストグラムを示す。図１７Ｂは、ＴＡ３Ｈａ細胞に対する誘発抗体の結合認識の蛍光強度中央値を比較するグラフである。
【００５７】
【図１８】図１８は、ｗｔＱβを受けた対照群と対比したｗｔＱβ−Ｔｎ２の保護効果を比較するカプラン・マイヤー生存曲線を示す。
【００５８】
【図１９】図１９Ａおよび１９Ｂは、ｗｔＱβ−Ｔｎ２およびｍＱβ（Ａ３８Ｋ／Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２Ｃ）−Ｔｎ２の保護効果を比較するカプラン・マイヤー生存曲線を示す。図１９Ａは、ＣＰ処置による１回目の腫瘍チャレンジ後の生存を示す（ｎ＝１０）。図１９Ｂは、いかなるさらなる処置もない場合の２回目の腫瘍チャレンジ後の生存を示す（ｎ＝５）。生存の統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアによるログランク検定を使用して決定されている。注：対照実験は、参考文献においてなされている（Ｙｉｎ，Ｚら、ＡＣＳ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１５，１０（１０），２３６４−２３７２）。
【図２０】図２０は、Ｄ１０２の側鎖上のカルボキシル基とＫ１３の側鎖上のアミノ基との間のＨ結合相互作用を示すＱβのＸ線結晶構造を示す。
【００５９】
【図２１−１】図２１Ａおよび２１Ｂは、Ｑβコンジュゲートによる誘発ＩｇＧ抗体の結合を示すフローサイトメトリーを示す。図２１Ａおよび２１Ｂは、それぞれジャーカット細胞およびＴＡ３Ｈａ細胞に対する誘発抗体の結合認識を示すヒストグラムを示す。ｃおよびｄ）それぞれジャーカット細胞およびＴＡ３Ｈａ細胞に対する誘発抗体の結合認識の蛍光強度中央値のグラフ。
【図２１−２】図２１Ａおよび２１Ｂは、Ｑβコンジュゲートによる誘発ＩｇＧ抗体の結合を示すフローサイトメトリーを示す。図２１Ａおよび２１Ｂは、それぞれジャーカット細胞およびＴＡ３Ｈａ細胞に対する誘発抗体の結合認識を示すヒストグラムを示す。ｃおよびｄ）それぞれジャーカット細胞およびＴＡ３Ｈａ細胞に対する誘発抗体の結合認識の蛍光強度中央値のグラフ。
【００６０】
【図２２−１】図２２Ａ〜２２Ｍは、ＭａｘＥｎｄ１アルゴリズムを適用した後の野生型Ｑβ−Ｔｎ１および様々なＱβ変異体−Ｔｎ１の質量スペクトルを示す。図２２ＡはＱβ＿ＷＴ＿Ｔｎ１に対応する。図２２ＢはＱβ＿Ｔ７Ｋ＿Ｔｎ１に対応する。図２２ＣはＱβ＿Ｎ１０Ｋ＿Ｔｎ１に対応する。図２２ＤはＱβ＿Ｋ１３Ｒ／Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２Ｃ＿Ｔｎ１に対応する。図２２ＥはＱβ＿Ａ３８Ｋ＿Ｔｎ１に対応する。図２２ＦはＱβ＿Ａ３８Ｋ／Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２Ｃ＿Ｔｎ１に対応する。図２２ＧはＱβ＿Ａ３８Ｋ／Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２Ｃ＿Ｔｎ２に対応する。図２２ＨはＱβ＿Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２Ｃ＿Ｔｎ１に対応する。図２２ＩはＱβ＿Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２Ｃ＿Ｔｎ２に対応する。図２２ＪはＱβ＿Ａ４０Ｓ／Ｄ１０２Ｓ＿Ｔｎ１に対応する。図２２ＫはＱβ＿Ｔ７５Ｋ＿Ｔｎ１に対応する。図２２ＬはＱβ＿Ａ１１７Ｋ＿Ｔｎ１に対応する。図２２ＭはＱβ＿Ｐ１１９Ｋ＿Ｔｎ１に対応する。
【図２２−２】同上。
【図２２−３】同上。
【図２２−４】同上。
【図２２−５】同上。
【図２２−６】同上。
【図２２−７】同上。
【００６１】
【図２３−１】図２３Ａ〜２３Ｉは、野生型Ｑβ、様々なＱβ変異体およびそれらのＴｎ１誘導体のサイズ排除クロマトグラフィーを示す。図２３ＡはＱβ（ＷＴ）およびＱβ（ＷＴ）−Ｔｎ１に対応する。図２３ＢはＱβ（Ｔ７Ｋ）およびＱβ（Ｔ７Ｋ）−Ｔｎ１に対応する。図２３ＣはＱβ（Ｎ１０Ｋ）およびＱβ（Ｎ１０Ｋ）−Ｔｎ１に対応する。図２３ＤはＱβ（Ａ３８Ｋ）およびＱβ（Ａ３８Ｋ）−Ｔｎ１に対応する。図２３ＥはＱβ（Ａ３８Ｋ／Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２Ｃ）およびＱβ（Ａ３８Ｋ／Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２Ｃ）−Ｔｎ１に対応する。図２３ＦはＱβ（Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２Ｃ）およびＱβ（Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２Ｃ）−Ｔｎ１に対応する。図２３ＧはＱβ（Ｔ７５Ｋ）およびＱβ（Ｔ７５Ｋ）−Ｔｎ１に対応する。図２３ＨはＱβ（Ａ１１７Ｋ）およびＱβ（Ａ１１７Ｋ）−Ｔｎ１に対応する。図２３ＩはＱβ（Ｐ１１９Ｋ）およびＱβ（Ｐ１１９Ｋ）−Ｔｎ１に対応する。
【図２３−２】同上。
【図２３−３】同上。
【００６２】
【図２４】図２４は、２５〜９０℃の様々な温度におけるｗｔＱβのＵＶ可視吸収を示す。最も異なる吸収を提供する推定波長は３１０ｎｍ（破線）である。
【００６３】
【図２５】図２５は、野生型Ｑβおよび様々なＱβ変異体のＴＥＭ画像を示す。
【００６４】
【図２６】図２６は、Ｔｎ１−ＮＨＳおよびＴｎ２−ＮＨＳの合成を示す。
【００６５】
【図２７】図２７は、ネイティブアガロースゲルによるＱβ全カプシドの電気泳動移動度を示す。サンプル（約３０μｇの各カプシドタンパク質）を、被包ＲＮＡの染色試薬（straining  reagent）としてＳＹＢＲ  Ｓａｆｅ  ＤＮＡゲル染色液（gel  strain）を含むＰＢＳ中の０．７％アガロースゲルにロードした。電気泳動を、ＴＥＡバッファー中、４℃で４時間実施した。上パネルは、ＵＶ光により検出されたカプシド中の被包ＲＮＡ染色を示す。中央パネルは、クーマシー染色によりカプシドタンパク質が検出されたことを示す。下パネルは、ｍＱβにおける被包ＲＮＡの存在を確認する２つのパネルの重ね合わせを示す。
【００６６】
【図２８】図２８は、Ｑβムチンコンジュゲートのグラフ描写を示す。
【００６７】
【図２９】図２９は、ＭＵＣ１の構造を示す。
【００６８】
【図３０】図３０は、ウイルス様粒子の構造およびそれらの利用可能なコンジュゲーション部位を示す。
【００６９】
【図３１】図３１は、第１世代Ｑβ−ＭＵＣ１コンジュゲートの合成を示す。
【００７０】
【図３２】図３２は、Ｑβ−ＭＵＣ１が、ＷＴマウスにおいて超高力価のＩｇＧ抗体を誘導したことを示す。
【００７１】
【図３３】図３３は、ＷＴマウスへのＱβ−ＭＵＣ１のワクチン接種が、ＭＵＣ１発現腫瘍細胞に強く結合することができる抗体、およびＭＵＣ１特異的細胞傷害性Ｔ細胞応答をもたらしたことを示す。
【００７２】
【図３４】図３４は、寛容ヒトＭＵＣ１トランスジェニック（Ｔｇ）マウスにおける第１世代Ｑβ−ＭＵＣ１ワクチンが、ＭＵＣ１発現腫瘍細胞と強く結合する抗体を誘発することができなったことを示す。
【００７３】
【図３５】図３５は、エピトープマッピングの分析を示す。
【００７４】
【図３６】図３６は、Ｃ末端遊離カルボン酸が抗体結合に関与することを示す。
【００７５】
【図３７】図３７は、Ｑβ−ＭＵＣ１の再設計を示す。
【００７６】
【図３８】図３８は、第２世代Ｑβ−ＭＵＣ１で免疫したＭＵＣ１．Ｔｇマウス由来の血清が、ａ）組織マイクロアレイ上のヒト乳がん組織への強い結合を示し、ｂ）正常乳房組織とほとんど反応しなかった（１：１０００血清希釈）ことを示す。画像は、３０個のサンプル中の代表的なものであった。ａ）における褐色は、組織への抗体結合によるものであった。ｂ）における褐色染色の欠如は、正常組織への抗体の結合がほとんどないことを示す。スケールバーは５０μｍである。
【００７７】
【図３９】図３９は、特定のＭＵＣ１（グリコール）ペプチド（１〜４）を示す。
【００７８】
【図４０】図４０は、Ｆｍｏｃ化学を使用して固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）により、ＭＵＣ１（グリコール）ペプチドの固相合成を実施したことを示す（スキーム１）。
【００７９】
【図４１】図４１は、Ｑβ−ＭＵＣ１コンジュゲートの合成を示す（スキーム２）。
【００８０】
【図４２】図４２は、３つのパネル図４２Ａ〜４２Ｃを含有する。図４２Ａは、Ｑβ−ＭＵＣ１構築物１１および１４ならびに対照としてのＱβのみで免疫したマウス由来の抗ＭＵＣ１全ＩｇＧおよびＩｇＧサブタイプの力価を示す。１１により誘導された平均ＩｇＧ力価は、低ＭＵＣ１密度を含有する構築物１４またはＱβのみによるものよりも大幅に高かった。図４２Ｂは、１１により誘導された高い抗ＭＵＣ１  ＩｇＧ抗体力価が２００日間を超えて継続したことを示す。図４２Ｃは、それぞれＱβ−ＭＵＣ１構築物１０〜１３で免疫したマウス由来の抗ＭＵＣ１  ＩｇＧ力価を示す。免疫に使用したプレーティングした特定のＭＵＣ１糖ペプチドに対して、すべてのＥＬＩＳＡ測定を実施した。
【００８１】
【図４３】図４３は、ＭＵＣ１糖ペプチドマイクロアレイスクリーニングを示す２つのパネル図４３Ａおよび図４３Ｂを含有し、それらは、生成されたＩｇＧ抗体が、広範なグリカン構造を担持するＭＵＣ１糖ペプチドを認識できたことを示していたが、このことは、幅広いレパートリーの抗体が生成されたことを示唆している。グリコシル化ＭＵＣ１抗原（１３および１１）による免疫は、非グリコシル化カウンターパート（１２および１０）と比較して、糖ペプチドへのより強い結合をもたらした。
【００８２】
【図４４−１】図４４は、抗ＭＵＣ１  ＩｇＧ抗体による腫瘍細胞の特異的認識のフローサイトメトリー分析を示す３つのパネル図４４Ａ〜４４Ｃを含有する。図４４Ａは、それぞれ免疫前血清ならびにワクチン構築物１１および１４で免疫したマウス由来の血清（１：１００希釈）によるＲＭＡ−ＭＵＣ１細胞の結合の平均蛍光強度を示す；抗ＭＵＣ１  ｍＡｂ  ＨＰＭＶ（１：５希釈）により、ＲＭＡ−ＭＵＣ１におけるＭＵＣ１発現を確認した。１１による免疫は、１４免疫マウス由来のものよりも大幅に強くＲＭＡ−ＭＵＣ１に結合することができる抗体を誘導した。図４４Ｂは、１：５０希釈の１０（青色の曲線）、１１（オレンジ色の曲線）、１２（緑色の曲線）および１３（赤色の曲線）で免疫したマウス由来の血清によるＲＭＡ−ＭＵＣ１細胞の結合を示す。灰色のトレースは、免疫前血清からのものであった。すべての免疫後血清は、ＲＭＡ−ＭＵＣ１細胞への強い結合を示した。図４４Ｃは、１：５０希釈の抗ＭＵＣ１血清では、ＭＵＣ１を欠くＲＭＡ細胞への結合がほとんど観察されなかったことを示す。
【図４４−２】図４４は、抗ＭＵＣ１  ＩｇＧ抗体による腫瘍細胞の特異的認識のフローサイトメトリー分析を示す３つのパネル図４４Ａ〜４４Ｃを含有する。図４４Ａは、それぞれ免疫前血清ならびにワクチン構築物１１および１４で免疫したマウス由来の血清（１：１００希釈）によるＲＭＡ−ＭＵＣ１細胞の結合の平均蛍光強度を示す；抗ＭＵＣ１  ｍＡｂ  ＨＰＭＶ（１：５希釈）により、ＲＭＡ−ＭＵＣ１におけるＭＵＣ１発現を確認した。１１による免疫は、１４免疫マウス由来のものよりも大幅に強くＲＭＡ−ＭＵＣ１に結合することができる抗体を誘導した。図４４Ｂは、１：５０希釈の１０（青色の曲線）、１１（オレンジ色の曲線）、１２（緑色の曲線）および１３（赤色の曲線）で免疫したマウス由来の血清によるＲＭＡ−ＭＵＣ１細胞の結合を示す。灰色のトレースは、免疫前血清からのものであった。すべての免疫後血清は、ＲＭＡ−ＭＵＣ１細胞への強い結合を示した。図４４Ｃは、１：５０希釈の抗ＭＵＣ１血清では、ＭＵＣ１を欠くＲＭＡ細胞への結合がほとんど観察されなかったことを示す。
【００８３】
【図４５−１】図４５は、フローサイトメトリー分析を示す３つのパネル図４５Ａ〜４５Ｃを含有し、それらは、Ｑβ−ＭＵＣ１コンジュゲート１０〜１３による免疫が、Ｑβのみで免疫したマウス由来の血清よりも有意に強くＭＵＣ１発現腫瘍細胞のパネルに結合することができるＩｇＧ抗体を誘導したことを示していた。（図４５Ａ）ＲＭＡ−ＭＵＣ１細胞；（図４５Ｂ）Ｂ１６−ＭＵＣ１細胞；および（図４５Ｃ）ＭＣＦ−７細胞への結合の平均蛍光強度。免疫後血清の１：２０希釈物を用いて、結合を試験した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して両側ｔ検定により、ｐ値を決定した。
【図４５−２】図４５は、フローサイトメトリー分析を示す３つのパネル図４５Ａ〜４５Ｃを含有し、それらは、Ｑβ−ＭＵＣ１コンジュゲート１０〜１３による免疫が、Ｑβのみで免疫したマウス由来の血清よりも有意に強くＭＵＣ１発現腫瘍細胞のパネルに結合することができるＩｇＧ抗体を誘導したことを示していた。（図４５Ａ）ＲＭＡ−ＭＵＣ１細胞；（図４５Ｂ）Ｂ１６−ＭＵＣ１細胞；および（図４５Ｃ）ＭＣＦ−７細胞への結合の平均蛍光強度。免疫後血清の１：２０希釈物を用いて、結合を試験した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して両側ｔ検定により、ｐ値を決定した。
【００８４】
【図４６】図４６は、それぞれＱβ対照、Ｑβ−ＭＵＣ１  １０〜１３で免疫したマウス由来の血清により誘導されたＢ１６−ＭＵＣ１細胞に対する補体依存性細胞傷害を示す（＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１）。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して両側ｔ検定により、ｐ値を決定した。
【００８５】
【図４７】図４７は、Ｑβ−ＭＵＣ１構築物による免疫によりＭＵＣ１特異的ＣＴＬ活性が誘発されたことを示す、２つのパネル図４７Ａおよび図４７Ｂを含有する。ＣＴＬ活性をインビトロ（図４７Ａ）およびインビボ（図４７Ｂ）で分析した。Ｑβ（対照）またはコンジュゲート１２、１３で免疫したマウスのリンパ節および脾臓からリンパ球を回収し、フローサイトメトリーにより、ＲＭＡおよびＲＭＡ−ＭＵＣ１細胞に対するそれらの細胞傷害活性を分析した。図４７Ｂは、ＭＵＣ１でパルスした（ＣＦＳＥｈｉｇｈ）またはパルスしなかった（ＣＦＳＥｌｏｗ）ＣＦＳＥ標識同系脾細胞を、Ｑβ（対照）またはＱβ−ＭＵＣ１構築物１２もしくは１３で免疫したマウスに静脈内注射したことを示す。２４時間後、マウスを屠殺し、リンパ節を回収した。フローサイトメトリーによる分析により、ＭＵＣ１パルス標的細胞の有意に高い溶解が示された。両パネルの対照群は、Ｑβのみで免疫したマウスであった。
【００８６】
【図４８】図４８は、特定のＭＵＣ１（グリコール）ペプチド（１〜４）およびＱβ−ＭＵＣ１コンジュゲート（５〜８）を示す。
【００８７】
【図４９】図４９は、２つのパネル図４９Ａおよび図４９Ｂを含有する。図４９Ａは、Ｑβ−ＭＵＣ１  ５で免疫したＷＴおよびＭＵＣ１．Ｔｇマウス由来の免疫後血清の比較は、免疫抗原ＭＵＣ１  １に対してアッセイした場合、ＩｇＧ抗体力価が同様であったことが示された。明確にするために、１つの代表的なマウスからの結果のみが示されている。図４９Ｂは、免疫マウス由来の免疫後血清と共にインキュベートした際のＢ１６−ＭＵＣ１細胞の平均蛍光強度を示す。同様のＩｇＧ力価にもかかわらず、Ｔｇマウス由来の血清は、対応するＷＴマウス由来のものよりも有意に弱くＢ１６−ＭＵＣ１細胞に結合した。
【００８８】
【図５０】図５０は、Ｑβ−ＭＵＣ１  ５免疫ＷＴおよびＭＵＣ１．Ｔｇマウス由来の血清による、ＢＳＡ−ＭＵＣ１コンジュゲートに結合するＩｇＧ抗体のエピトープマッピングを示す。
【００８９】
【図５１】図５１は、メチルエステルへのＭＵＣ１ペプチドのＣ末端の変換が、ＷＴおよびＭＵＣ１．Ｔｇマウスの両方由来の血清によるＭＵＣ１への抗体結合を有意に減少させたことを示す。
【００９０】
【図５２】図５２は、ＭＵＣ１（グリコール）ペプチド２９〜３１の合成を示す。
【００９１】
【図５３】図５３は、ＭＵＣ１（グリコール）ペプチド２９〜３１の固相合成を示す（スキーム３）。
【００９２】
【図５４】図５４は、Ｑβ−ＭＵＣ１コンジュゲート３５〜３７の合成を示す（スキーム４）。
【００９３】
【図５５】図５５は、２つのパネル図５５Ａおよび図５５Ｂを含有し、それらは、様々なコンジュゲートによる抗ＭＵＣ１  ＩｇＧ抗体の特異性のフローサイトメトリー分析を示す。（図５５Ａ）Ａｇ１０４−ＭＵＣ１細胞；（図５５Ｂ）Ｂ１６−ＭＵＣ１細胞への結合を、対応する血清の１：２０希釈物を用いて試験した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して両側ｔ検定により、ｐ値を決定した。
【００９４】
【図５６】図５６は、Ｑβ−ＭＵＣ１  ３７免疫ＭＵＣ１．Ｔｇマウス由来の血清による、ＥＬＩＳＡウェルにコーティングしたＢＳＡ−ＭＵＣ１コンジュゲート９〜２８に結合する抗体のエピトープマッピングを示す。
【００９５】
【図５７】図５７は、ＭＵＣ１ペプチド３８および糖ペプチド３９の合成を示す。
【００９６】
【図５８】図５８は、３つのパネル図５８Ａ〜５８Ｃを含有する。図５８Ａは、ＭＵＣ１（糖）ペプチド３８および３９の固相合成を示す。図５８Ｂは、Ｑβ−ＭＵＣ１コンジュゲート４２、４３の合成を示す。図５８Ｃは、ＫＬＨ−ＭＵＣ１コンジュゲート４４を示す（スキーム５）。
【００９７】
【図５９−１】図５９は、３つのパネル図５９Ａ〜５９Ｃを含有し、それらは、様々なコンジュゲートにより誘発された免疫後血清による細胞結合のフローサイトメトリー分析を示す。（図５９Ａ）Ｂ１６−ＭＵＣ１細胞；（図５９Ｂ）ＭＣＦ−７細胞；および（図５９Ｃ）ＭＣＦ−１０Ａ細胞に結合するＩｇＧ抗体の平均蛍光強度。血清の１：２０希釈物を用いて、結合を試験した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して両側ｔ検定により、ｐ値を決定した。
【図５９−２】図５９は、３つのパネル図５９Ａ〜５９Ｃを含有し、それらは、様々なコンジュゲートにより誘発された免疫後血清による細胞結合のフローサイトメトリー分析を示す。（図５９Ａ）Ｂ１６−ＭＵＣ１細胞；（図５９Ｂ）ＭＣＦ−７細胞；および（図５９Ｃ）ＭＣＦ−１０Ａ細胞に結合するＩｇＧ抗体の平均蛍光強度。血清の１：２０希釈物を用いて、結合を試験した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して両側ｔ検定により、ｐ値を決定した。
【００９８】
【図６０】図６０は、Ｑβ−ＭＵＣ１  ４３およびＫＬＨ−ＭＵＣ１  ４４により誘発されたＩｇＧサブタイプを示す。
【００９９】
【図６１】図６１は、２つのパネル図６１Ａおよび６１Ｂを含有し、それらは、Ｑβ−ＭＵＣ１  ４３が腫瘍細胞に対して有意に高いＣＤＣを示したことを示す。（図６１Ａ）Ｂ１６−ＭＵＣ１細胞または（図６１Ｂ）ＭＣＦ−７細胞に対するＣＤＣを、ＭＴＳアッセイにより決定した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。Ｄ０は免疫前血清であった。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して両側ｔ検定により、ｐ値を決定した。ｎｓ：非有意。
【０１００】
【図６２】図６２は、２つのパネル図６２Ａおよび６２Ｂを含有し、それらは、Ｑβ−ＭＵＣ１  ４３抗血清の存在下では、Ｂ１６−ＭＵＣ１標的細胞のＡＤＣＣが増加することを示す。Ｂ１６−ＭＵＣ１標的細胞（Ｔ）を１００μＣｉの５１Ｃｒで放射標識し、４０μＬの対照またはＱβ−ＭＵＣ１  ４３抗血清で同時に３７℃で２時間パルスした。標的細胞を洗浄し、様々なＥ：Ｔ比の新たに単離した（図６２Ａ）ＮＫまたは（図６２Ｂ）ＬＡＫ細胞（エフェクター、Ｅ）のいずれかをプレーティングした。１６時間後、培養上清を回収し、ガンマカウンターを使用して特異的溶解を分析した。テューキー事後検定による二元配置ＡＮＯＶＡにより、有意性を決定した。＊＊＊ｐ＜０．００１。
【０１０１】
【図６３】図６３は、Ｑβ−ＭＵＣ１  ４３の免疫が、転移性肺腫瘍の形成からＭＵＣ１  Ｔｇ．マウスを有意に保護したことを示す。０日目、１４日目および２８日目に、ＭＵＣ１  Ｔｇ．マウスを、それぞれ、ＭＰＬＡをアジュバントとして加えたＱβ、Ｑβ−ＭＵＣ１  ４３またはＫＬＨ−ＭＵＣ１  ４４で免疫し、３５日目に、尾静脈注射を介して１×１０５個のＢ１６−ＭＵＣ１細胞でチャレンジし、続いて、４回目の免疫を行い、次いで４５日目に、５回目の免疫を行った。腫瘍接種の２１日後に、マウスを屠殺し、肺における腫瘍病巣の数をカウントした。Ｑβ−ＭＵＣ１  ４３のワクチン接種は、ＱβまたはＫＬＨ−ＭＵＣ１  ４４免疫を受けた対照動物と比較して、腫瘍の数を有意に減少させた。各記号は、１匹のマウスを表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して両側ｔ検定により、ｐ値を決定した。
【０１０２】
【図６４】図６４は、Ｑβ−ＭＵＣ１  ４３免疫に加えて抗ＰＤ１遮断処置が固形腫瘍成長を有効に退縮させることを示す。０日目、１４日目および２８日目に、ＭＵＣ１  Ｔｇマウスを、ＭＰＬＡをアジュバントとして加えたＱβまたはＱβ−ＭＵＣ１  ４３で免疫し、３５日目に、皮下接種により５×１０５個のＢ１６−ＭＵＣ１細胞でチャレンジし、続いて、４回目の免疫を行い、次いで４２日目に、５回目の免疫を行い、続いてそれぞれ４３日目および４６日目に、腹腔内注射を介して抗ＰＤ１注射を行った。４９日目に、マウスをＭＰＬＡでさらに免疫し、続いて５０日目および５３日目に、抗ＰＤ１処置を行った。＊ｐ＜０．０５。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して両側ｔ検定により、ｐ値を決定した。
【０１０３】
【図６５】図６５は、２つのパネル図６５Ａ〜６５Ｂを含有し、それらは、Ｑβ−ＭＵＣ１  ４３で免疫したＭＵＣ１  Ｔｇ．マウス由来の血清が、（図６５Ａ）組織マイクロアレイ上のヒト乳がん組織への強い結合を示し、（図６５Ｂ）正常乳房組織とほとんど反応しなかった（１：１０００血清希釈）ことを示した。画像は、３０個のサンプル中の代表的なものであった。（図６５Ａ）における褐色は、組織への抗体結合によるものであった。（図６５Ｂ）における褐色染色の欠如は、正常組織への抗体の結合がほとんどないことを示す。スケールバーは５０μｍである。
【０１０４】
【図６６−１】図６６は、２つのパネル図６６Ａおよび図６６Ｂを含有し、それらは、Ｑβ−変異体−ＭＵＣ１−ＴｎによるＭＵＣ１  Ｔｇ．マウスの免疫を示す。Ｑβ変異体−ＭＵＣ１コンジュゲートによるマウス免疫に使用した免疫プロトコール。これは、野生型Ｑβ−ＭＵＣ１コンジュゲートと同じプロトコールである。
【図６６−２】図６６は、２つのパネル図６６Ａおよび図６６Ｂを含有し、それらは、Ｑβ−変異体−ＭＵＣ１−ＴｎによるＭＵＣ１  Ｔｇ．マウスの免疫を示す。Ｑβ変異体−ＭＵＣ１コンジュゲートによるマウス免疫に使用した免疫プロトコール。これは、野生型Ｑβ−ＭＵＣ１コンジュゲートと同じプロトコールである。
【０１０５】
【図６７】図６７は、Ｑβ変異体−ＭＵＣ１−Ｔｎ由来の血清とのＡｇ１０４  ＭＵＣ１結合を示す。Ｑβ野生型−ＭＵＣ１コンジュゲート対Ｑβ変異体−ＭＵＣ１コンジュゲートによるマウス線維肉腫Ａｇ１０４  ＭＵＣ１細胞の結合の直接比較。研究した２つの変異体は、Ｑβ−Ａ４０ＣＤ１０２Ｃ；およびＱβ−Ａ３８ＫＡ４０ＣＤ１０２Ｃである。
【０１０６】
【図６８】図６８は、Ｑβ変異体−ＭＵＣ１−Ｔｎ由来の血清とのＢ１６ＭＵＣ１結合を示す。Ｑβ野生型−ＭＵＣ１コンジュゲート対Ｑβ変異体−ＭＵＣ１コンジュゲートによるマウス黒色腫細胞Ｂ１６ＭＵＣ１の結合の直接比較。研究した２つの変異体は、Ｑβ−Ａ４０ＣＤ１０２Ｃ；およびＱβ−Ａ３８ＫＡ４０ＣＤ１０２Ｃである。
【０１０７】
【図６９】図６９は、Ｑβ変異体−ＭＵＣ１−Ｔｎ由来の血清とのＭＣＦ−７結合を示す。Ｑβ野生型−ＭＵＣ１コンジュゲート対Ｑβ変異体−ＭＵＣ１コンジュゲートによるヒト乳がん細胞ＭＣＦ−７の結合の直接比較。研究した２つの変異体は、Ｑβ−Ａ４０ＣＤ１０２Ｃ；およびＱβ−Ａ３８ＫＡ４０ＣＤ１０２Ｃである。三重変異体は、有意に高い結合をもたらした。
【０１０８】
【図７０】図７０は、Ｔ＝１カプシドにアセンブルされたＱβ  ＷＴの構造を示す。
【０１０９】
【図７１】図７１は、Ｑβ  Ａ３８ＫＡ４０ＣＤ１０２Ｃアセンブルカプシドの構造を示す；サブユニット間ジスルフィド結合は黄色のスティックで示されている。
【０１１０】
【図７２−１】図７２は、ＭＵＣ１（糖）ペプチド１〜４のＨＰＬＣおよびＨＲＭＳを示す。
【図７２−２】図７２は、ＭＵＣ１（糖）ペプチド１〜４のＨＰＬＣおよびＨＲＭＳを示す。
【図７２−３】図７２は、ＭＵＣ１（糖）ペプチド１〜４のＨＰＬＣおよびＨＲＭＳを示す。
【図７２−４】図７２は、ＭＵＣ１（糖）ペプチド１〜４のＨＰＬＣおよびＨＲＭＳを示す。
【０１１１】
【図７３−１】図７３は、Ｑβ−ＭＵＣ１コンジュゲート１０〜１４のＭＡＬＤＩ質量分析を示す。
【図７３−２】図７３は、Ｑβ−ＭＵＣ１コンジュゲート１０〜１４のＭＡＬＤＩ質量分析を示す。
【図７３−３】図７３は、Ｑβ−ＭＵＣ１コンジュゲート１０〜１４のＭＡＬＤＩ質量分析を示す。
【０１１２】
【図７４−１】図７４は、電気泳動分析およびＱβ−ＭＵＣ１コンジュゲートローディング決定を示す。
【図７４−２】図７４は、電気泳動分析およびＱβ−ＭＵＣ１コンジュゲートローディング決定を示す。
【０１１３】
【図７５】図７５は、Ｑβ−ＭＵＣ１コンジュゲート１０〜１３のＦＰＬＣクロマトグラムを示す。
【０１１４】
【図７６】図７６は、３つのパネル図７６Ａ〜７６Ｃを含有し、それらは、免疫後血清の補体依存性細胞傷害を示す。図７６Ａ；図７６Ｂ；および図７６Ｃは、それぞれＱβ対照およびＱβ−ＭＵＣ１  １０〜１３で免疫したマウス由来の血清により誘導されたＲＭＡ；ＲＭＡ−ＭＵＣ１；およびＭＣＦ−７細胞を示す（＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１）。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して両側ｔ検定により、ｐ値を決定した。免疫後血清は、ＲＭＡ細胞の多くの殺滅を示さなかったが（パネルａ）、ＭＵＣ１発現ＲＭＡ−ＭＵＣ１細胞（図７６Ｂ）およびＭＣＦ−７細胞（図７６Ｃ）の有意に高い殺滅が観察された。
【０１１５】
【図７７】図７７は、ＱβとＭＵＣ１との混合物で免疫した動物由来の血清のＥＬＩＳＡ結果を示す。比較的低い希釈倍率にもかかわらず、ＭＵＣ１への抗血清の有意な結合はなかった。これらの結果に基づいて、誘導された抗ＭＵＣ１  ＩｇＧ抗体力価は４００未満であり、したがって、ＱβとのＭＵＣ１糖ペプチドの共有結合的コンジュゲーションが高い抗体力価の産生に重要であることが示唆された。
【０１１６】
【図７８−１】図７８は、Ｑβ−ＭＵＣ１コンジュゲート１０〜１３により誘導された抗血清の糖ペプチドマイクロアレイスクリーニング結果を示す。Ｑβ−ＭＵＣ１コンジュゲート１０〜１３により誘導された抗血清（コンジュゲート１０誘導性抗血清；コンジュゲート１１誘導性抗血清；コンジュゲート１２誘導性抗血清；およびコンジュゲート１３誘導性抗血清）の糖ペプチドマイクロアレイスクリーニング結果。各群について、４つの抗血清からの結果を示した。グリカン構造の略語が図中に示されている。
【図７８−２】同上。
【図７８−３】同上。
【図７８−４】同上。
【図７８−５】同上。
【０１１７】
【図７９−１】図７９は、３つのパネル図７９Ａ〜７９Ｃを含有し、それらは、ＭＵＣ５ｂ糖ペプチドの精製および特性評価データを示す。図７９Ａは、ＭＵＣ５Ｂ（１３ｍｅｒ）コア２タイプ２：Ｈ２Ｎ−（ＴＥＧ）−ＡＴＰＳＳＴ＊ＰＧＴＴＨＴＰ−ＯＨ（Ｐｅｐ８８）を示す。＊＝
【化１】
2020531544.tif 000003
分析ＨＰＬＣ  Ｒｔ＝１９．０７分（Ａ／Ｂ：（９５：５）→（９５：５）、２００μＬ／分、５分、（９５：５）→（４０：６０）、２００μＬ／分、５５分）；分取ＨＰＬＣ  Ｒｔ＝１２．７３分（Ａ／Ｂ：（９５：５）→（５５：４５）、２０ｍＬ／分、４０分）；ＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳ，ｍ／ｚ：７２９．９９９３（［Ｍ＋３Ｈ］３＋、計算値７２９．９９７４），１０９４．５０１４（［Ｍ＋２Ｈ］２＋，計算値１０９４．４９２３）；収率：４７％（１３．３ｍｇ、６．０８μｍｏｌ）。図７９Ｂは、ＭＵＣ５Ｂ（１３ｍｅｒ）コア２タイプ２：Ｈ２Ｎ−（ＴＥＧ）−ＡＴＰＳＳＴＰＧＴ＊ＴＨＴＰ−ＯＨ（Ｐｅｐ８９）を示す。
分析ＨＰＬＣ  Ｒｔ＝１９．９０分（Ａ／Ｂ：（９５：５）→（９５：５）、２００μＬ／分、５分、（９５：５）→（４０：６０）、２００μＬ／分、５５分）；分取ＨＰＬＣ  Ｒｔ＝１２．７５分（Ａ／Ｂ：（９５：５）→（５５：４５）、２０ｍＬ／分、４０分）；ＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳ，ｍ／ｚ：７２９．９９８３（［Ｍ＋３Ｈ］３＋，計算値７２９．９９７４），１０９４．４９７７（［Ｍ＋２Ｈ］２＋，計算値１０９４．４９２３）；収率：３８％（１１．０ｍｇ、５．０３μｍｏｌ）．
＊＝  
【化２】
2020531544.tif 000004
【０１１８】
図７９Ｃは、ＭＵＣ５Ｂ（１３ｍｅｒ）コア２タイプ２：Ｈ２Ｎ−（ＴＥＧ）−ＡＴ＊ＰＳＳＴＰＧＴＴＨＴＰ−ＯＨ（Ｐｅｐ９０）を示す。分析ＨＰＬＣ  Ｒｔ＝１９．１１分（Ａ／Ｂ：（９５：５）→（９５：５）、２００μＬ／分、５分、（９５：５）→（４０：６０）、２００μＬ／分、５５分）；分取ＨＰＬＣ  Ｒｔ＝１２．７２分（Ａ／Ｂ：（９５：５）→（５５：４５）、２０ｍＬ／分、４０分）；ＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳ，ｍ／ｚ：７２９．９９８５（［Ｍ＋３Ｈ］３＋，計算値７２９．９９７４），１０９４．４９６３（［Ｍ＋２Ｈ］２＋，計算値１０９４．４９２３）；収率：４５％（１２．８ｍｇ、５．８５μｍｏｌ）．
＊＝
【化３】
2020531544.tif 000005
【図７９−２】同上。
【図７９−３】同上。
【０１１９】
【図８０】図８０は、ＥＬ４リンパ腫細胞へのＦＡＣＳ結合を示す。免疫後血清は、リンパ腫細胞への強い結合を示した。結合は、Ｑβ−ＧＭ３ワクチンおよびＱβ−ＧＭ２ワクチンからの免疫後血清よりも強かった。
【０１２０】
【図８１】図８１は、抗ＧＤ２血清が、補体媒介性細胞傷害を介してリンパ腫細胞ＥＬ４の強力な殺滅を示したことを示す。ＭＴＳアッセイにより、ＥＬ４の補体依存性細胞傷害を決定した。ＥＬ４細胞（細胞７０００個／ウェル）をＤＭＥＭ（１０％ウマ血清、１００μｌ）中で２４時間培養し、異なる群の免疫マウス由来の抗血清の１／４０希釈物と共に３７℃で３０分間インキュベートし、次いで、１／１５希釈のウサギ血清補体を含む５０μｌの培養培地を添加し、次いで、３７℃（37  0C）で４時間インキュベートした。ＭＴＳ（２０μｌ）を各ウェルに添加し、３７℃でさらに３時間インキュベートした。ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（０．５％）で培養した細胞を陽性対照として使用した。
【０１２１】
【図８２】図８２は、２つのパネル図８２Ａおよび８２Ｂを含有し、それらは、抗微生物ワクチンのキャリアとしてのＱβを示す。図８２Ａは、合成してバクテリオファージＱβと連結したサルモネラ菌由来の炭水化物の例である。図８２Ｂは、ウサギの免疫後に、非常に高いＩｇＧ力価（＞１０，０００，０００）が得られたことを示す。
【０１２２】
【図８３】図８３は、免疫後血清が、致死的サルモネラ感染からの有意な保護をマウスに提供したことを示す。マウス５匹／群。０／５は、細菌チャレンジを生存したマウスが０匹であることを意味する。
【０１２３】
【図８４】図８４は、２つのパネル図８４Ａおよび８４Ｂを含有する。図８４Ａは、様々な位置においてＴｎ抗原を担持するＭＵＣ１糖ペプチドの蛍光強度の比較を示し、ＰＤＴ＊Ｒ領域におけるグリコシル化が、免疫後血清による最も強い認識をもたらしたことが示された。糖ペプチド１：ＰＡＨＧＶＴ＊ＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡ；２：ＰＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴ＊ＲＰＡＰＧＳＴＡ；３：ＰＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴ＊Ａ；４：ＰＡＨＧＶＴ＊ＳＡＰＤＴ＊ＲＰＡＰＧＳＴＡ；６：ＰＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴ＊ＲＰＡＰＧＳＴ＊Ａ；７：ＰＡＨＧＶＴ＊ＳＡＰＤＴ＊ＲＰＡＰＧＳＴ＊Ａ。図８４Ｂは、ＰＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴ＊ＲＰＡＰＧＳＴＡにおいて様々なグリカンを担持するＭＵＣ１糖ペプチドの蛍光強度の比較を示し、Ｔｎが最も強い認識をもたらしたが、他のグリカンも同様に認識され得ることが示された。グリカン構造：糖ペプチド２：Ｔｎ；９：Ｃ３Ｔ１（略語および構造については、図７８を参照のこと）；１６：Ｃ３Ｔ２；２３：Ｃ４Ｔ１；３０：Ｃ４Ｔ２；４９：Ｔ；５６：Ｃ１Ｔ１；６３：Ｃ１Ｔ２；７０：Ｃ２Ｔ１ｈｅ；７７：Ｃ２Ｔ１ｔｅ；８４：Ｃ２Ｔ２ｈｅ；９１：Ｃ２Ｔ２ｔｅ。
【０１２４】
ヒストグラムを含有するあらゆる図について、個別の各測定値に関する左から右へのバーは、示されているように図の凡例における上から下への図の囲み枠に対応することに留意されたい。
【発明を実施するための形態】
【０１２５】
発明の詳細な説明
Ａ．定義
「ａ」および「ａｎ」という冠詞は、本明細書では、冠詞の文法的対象の１つまたは１つを超える（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。例として、「要素（an  element）」は、１つの要素または１つを超える要素を意味する。
【０１２６】
「投与すること」という用語は、医薬品または組成物を被験体に提供することを意味し、限定されないが、医療専門家による投与および自己投与を含む。
【０１２７】
本明細書で使用される場合、「バクテリオファージ」は、細菌に感染して細菌内で複製するウイルスを指す。特定の実施形態では、バクテリオファージは、限定されないが、バクテリオファージＱβ；（ｂ）バクテリオファージＲ１７；（ｃ）バクテリオファージｆｒ；（ｄ）バクテリオファージＧＡ；（ｅ）バクテリオファージＳＰ；（ｆ）バクテリオファージＭＳ２；（ｇ）バクテリオファージＭ１１；（ｈ）バクテリオファージＭＸ１；（ｉ）バクテリオファージＮＬ９５；（ｊ）バクテリオファージｆ２；（ｋ）バクテリオファージＰＰ７；（ｌ）バクテリオファージＡＰ２０５；および（ｍ）バクテリオファージＰ２２からなる群より選択される。本明細書で使用される場合、「バクテリオファージＱβ」（「バクテリオファージＱｂ」、「Ｑβ」および「Ｑｂ」とも称される）は、大腸菌に感染する多くの低分子ＲＮＡバクテリオファージの１つである。
【０１２８】
本明細書で使用される場合、「がん」という用語は、無制御に増殖し、いくつかの場合では転移する（広がる）傾向がある細胞の異常成長を指す。がんのタイプとしては、限定されないが、転移の有無にかかわらず、任意の病期の固形腫瘍（例えば、膀胱、腸、脳、乳房、子宮内膜、心臓、腎臓、肺、子宮、リンパ組織（リンパ腫）、卵巣、膵または他の内分泌器官（甲状腺）、前立腺、皮膚（黒色腫または基底細胞がん））または血液腫瘍（例えば、白血病およびリンパ腫）が挙げられる。
【０１２９】
がんのさらなる非限定的な例としては、肝細胞癌（ＨＣＣ）、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、肛門がん、虫垂がん、星細胞腫、非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、基底細胞癌、胆管がん、膀胱がん、骨がん（骨肉腫および悪性線維性組織球腫）、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、脳および脊髄腫瘍、乳がん、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、子宮頸がん、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸がん、結腸直腸がん、頭蓋咽頭腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、胚性腫瘍、子宮内膜がん、上衣芽細胞腫、上衣腫、食道がん、ユーイング肉腫ファミリーの腫瘍、眼のがん、網膜芽細胞腫、胆嚢がん、胃（胃）（ｇａｓｔｒｉｃ（ｓｔｏｍａｃｈ））がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、消化管間質細胞腫瘍、胚細胞腫瘍、神経膠腫、毛様細胞白血病、頭頸部がん、肝細胞（肝臓）がん、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、眼内黒色腫、島細胞腫瘍（内分泌膵）、カポジ肉腫、腎臓がん、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭がん、白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、毛様細胞白血病、肝臓がん、肺がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、バーキットリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、リンパ腫、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、髄芽腫、髄上皮腫、黒色腫、中皮腫、口腔がん（mouth  cancer）、慢性骨髄性白血病、骨髄性白血病、多発性骨髄腫、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、口腔がん（oral  cancer）、口腔咽頭がん、骨肉腫、骨の悪性線維性組織球腫、卵巣がん、卵巣上皮がん、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性潜在性腫瘍、膵がん、乳頭腫症、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、中間分化の松果体実質性腫瘍（ｐｉｎｅａｌ  ｐａｒｅｎｃｈｙｍａｌ  ｔｕｍｏｒｓ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）、松果体芽細胞腫およびテント上原始神経外胚葉性腫瘍、下垂体腫瘍、血漿細胞新生物／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺がん、直腸がん、腎臓細胞（腎臓）がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫、ユーイング肉腫ファミリーの腫瘍、肉腫、カポジ、セザリー症候群、皮膚がん、小細胞肺がん、小腸がん、軟組織肉腫、扁平上皮癌、胃（胃）（ｓｔｏｍａｃｈ（ｇａｓｔｒｉｃ）ｃａｎｃｅｒ）がん、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、Ｔ細胞リンパ腫、精巣がん、咽喉がん、胸腺腫および胸腺癌、甲状腺がん、尿道がん、子宮がん、子宮肉腫、膣がん、外陰部がん、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍が挙げられる。特定の実施形態では、本明細書に記載されるワクチンはいずれも、前述のがんのいずれかのがん幹細胞を標的とし（targer）得る。
【０１３０】
本明細書で使用される場合、「炭水化物抗原」は、強い抗体応答を誘発する（elicit  elicit）抗原のクラスを指す。特定の実施形態では、炭水化物抗原は、限定されないが、ムチン（「ＭＵＣ１」）、ガングリオシドＧＤ２（Ａｈｍｅｄ  Ｍら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５８８：２８８−２９７（２０１４）、フコシルＧＭ１、ＧＤ２（アセチル化ＧＤ２を含む）、ＧＤ３（アセチル化ＧＤ３を含む）、ＧＭ２、グロボ−Ｈ、ルイスＡ、ルイスＹ、ムチン（例えば、ＭＵＣ１、ＭＵＣ４）、ポリシアル酸、シアリル−ルイスＡ、サルモネラ菌（または本明細書で提供される細菌性疾患、ウイルス性疾患もしくは病原性疾患のいずれか）由来の炭水化物、Ｔｆ、ＴｎまたはｓＴｎ（Ｔｎ、ＴｆおよびＳＴｎは、ＭＵＣ１などの糖タンパク質で一般に見られる）から選択される。
【０１３１】
「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」または「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔｓ）」という用語は、未処置対照被験体、細胞、生物学的経路もしくは生物学的活性と比較して、または被験体が処置される前の被験体における標的、例えば固形悪性腫瘍の成長と比較して、疾患、障害もしくは状態の発症もしくは進行、生物学的経路の活性または生物学的活性、例えば固形悪性腫瘍の成長を例えば少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％またはさらには１００％減少、抑制、減弱、減退、停止または安定化することを意味する。「減少」という用語は、がん疾患、障害または状態の症状を阻害、抑制、減弱、減退、停止または安定化することを意味する。除外されないが、疾患、障害または状態の処置は、疾患、障害、状態またはそれらに関連する症状が完全に排除されることを必要としないと認識されよう。
【０１３２】
「薬学的に許容され得る」という語句は、本明細書では、信頼され得る医学的判断の範囲内で、合理的なベネフィット／リスク比に見合って、過剰な毒性、刺激、アレルギー応答または他の問題もしくは合併症を伴わずにヒトおよび動物の組織と接触させて使用するために適切な化合物、材料、組成物および／または剤形を指すために用いられる。
【０１３３】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容され得るキャリア」という語句は、ある器官または身体部分から別の器官または身体部分への対象化合物の運搬または輸送に関与する薬学的に許容され得る材料、組成物またはビヒクル、例えば液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤または溶媒被包材料を意味する。各キャリアは、製剤の他の成分と適合性であり、患者にとって傷害性でないという意味で「許容され得る」ものでなければならない。薬学的に許容され得るキャリアとして機能し得る材料のいくつかの例としては、（１）糖、例えばラクトース、グルコースおよびスクロース；（２）デンプン、例えばトウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプン；（３）セルロースおよびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース；（４）トラガント粉末；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）タルク；（８）賦形剤、例えばカカオバターおよび坐剤ワックス；（９）油、例えばラッカセイ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油；（１０）グリコール、例えばプロピレングリコール；（１１）ポリオール、例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール；（１２）エステル、例えばオレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；（１３）寒天；（１４）緩衝剤、例えば水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；（１５）アルギン酸；（１６）発熱物質を含まない水；（１７）等張食塩水；（１８）リンゲル溶液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝溶液；（２１）ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリ酸無水物；ならびに（２２）医薬製剤において用いられる他の非毒性の適合性物質が挙げられる。
【０１３４】
「薬学的に許容され得る塩」は、化合物の比較的非毒性の無機および有機の酸付加塩を指す。
【０１３５】
「予防する」、「予防すること」、「予防」、「予防的処置」などの用語は、疾患、障害もしくは状態を有しないが、疾患、障害もしくは状態を発症するリスクがあるかまたは発症しやすい被験体における疾患、障害もしくは状態を発症する確率を減少させることを指す。
【０１３６】
「被験体」は、医学的目的では、例えば既存の疾患、障害、状態の処置、もしくは疾患、障害もしくは状態の発症を予防するための予防的処置ではヒト被験体を含み得るか、または医学的目的、獣医学的目的もしくは開発目的では動物被験体を含み得る。適切な動物被験体としては、限定されないが、霊長類、例えばヒト、サル、類人猿、テナガザル、チンパンジー、オランウータン、マカクなど；ウシ（ｂｏｖｉｎｅ）、例えばウシ（ｃａｔｔｌｅ）、雄ウシなど；ヒツジ（ｏｖｉｎｅ）、例えばヒツジ（ｓｈｅｅｐ）など；ヤギ（ｃａｐｒｉｎｅ）、例えばヤギ（ｇｏａｔ）など；ブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）、例えばブタ（ｐｉｇ）、雄ブタなど；ウマ（ｅｑｕｉｎｅ）、例えばウマ（ｈｏｒｓｅ）、ロバ、シマウマなど；ヤマネコおよびイエネコを含むネコ（feline）；イヌ（ｄｏｇ）を含むイヌ（ｃａｎｉｎｅ）；ウサギ、ノウサギなどを含むウサギ類；ならびにマウス、ラット、モルモットなどを含む齧歯類を含む哺乳動物が挙げられる。動物は、トランスジェニック動物であり得る。いくつかの実施形態では、被験体は、限定されないが、胎児、新生児、乳児、若年および成人被験体を含むヒトである。さらに、「被験体」は、疾患、障害もしくは状態に罹患しているかまたは罹患していると疑われる患者を含み得る。したがって、「被験体」および「患者」という用語は、本明細書では互換的に使用される。被験体としては、動物疾患モデル（例えば、実験において使用されるラットやマウスなど）も挙げられる。
【０１３７】
「それを必要とする被験体」という用語は、治療または処置が必要と特定された被験体を意味する。
【０１３８】
「全身投与」、「全身投与される」、「末梢投与」および「末梢投与される」という用語は、化合物、薬物または他の材料を中枢神経系に直接以外で投与する、例えば皮下投与し、その結果、それが患者の系に入り、こうして、代謝および他の類似のプロセスに供されることを意味する。
【０１３９】
「治療剤」または「医薬品」という用語は、宿主に対して所望の生物学的効果を有することができる薬剤を指す。
【０１４０】
「治療効果」という用語は、動物、特に哺乳動物、より具体的にはヒトにおける局所的または全身的な効果であって、薬理学的に活性な物質により引き起こされる局所的または全身的な効果を指す。
【０１４１】
本明細書で使用される場合、「治療有効量」および「有効量」という用語は、本発明の化合物、材料または化合物を含む組成物の量であって、任意の医学的処置に適用可能な合理的なベネフィット／リスク比で、動物における細胞の少なくとも下位集団においていくらかの所望の治療効果をもたらすために有効な量を意味する。
【０１４２】
被験体における疾患の「処置」または疾患を有する被験体の「処置」という用語は、疾患の少なくとも１つの症状を低減し、その悪化を予防し、またはその悪化を遅延させるように、被験体を医薬処置、例えば本明細書に記載されるワクチン組成物の投与に供することを指す。
【０１４３】
「腫瘍」、「固形悪性腫瘍」または「新生物」という用語は、細胞の異常なまたは調節されない成長により形成される病変を指す。好ましくは、腫瘍は悪性であり、例えば、がんにより形成されるものである。
Ｂ．カプシド
【０１４４】
カプシドにコンジュゲートされた抗原を含むワクチン組成物が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物は、野生型カプシドにコンジュゲートされた抗原を含む。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物は、野生型バクテリオファージＱβカプシドにコンジュゲートされた抗原を含む。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物は、野生型またはネイティブ配列を有するバクテリオファージＱβカプシドにコンジュゲートされた抗原を含む。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物は、配列番号１に記載されている野生型または天然配列を有するバクテリオファージＱβカプシドにコンジュゲートされた抗原を含む。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物は、野生型カプシドからの少なくとも１個の変異を有するカプシドにコンジュゲートされた抗原を含む。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物は、野生型バクテリオファージＱβカプシドからの少なくとも１個の変異を有するバクテリオファージＱβカプシドにコンジュゲートされた抗原を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１個の変異は非天然変異を含む。いくつかの実施形態では、非天然変異は非天然アミノ酸変異を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるワクチン組成物は、カプシド（例えば、バクテリオファージＱｂ）にコンジュゲートされた抗原（例えば、炭水化物抗原、ポリペプチド、ペプチド、タンパク質および小分子）を含み、前記カプシドは少なくとも１個の変異（例えば、少なくとも１個の点変異、または少なくとも１個の非天然ジスルフィド結合）を含む。いくつかの実施形態では、カプシドは、抗原にコンジュゲートされた場合に、増強された強い免疫反応を誘発し得る十分な長さのカプシドアミノ酸配列の断片または一部である。特定の実施形態では、カプシドポリペプチドはまた、天然に存在するカプシドアミノ酸配列に対応しない（例えば、少なくとも１個の点変異、または少なくとも１個の非天然ジスルフィド結合変異、またはカプシドアミノ酸配列と、非カプシドタンパク質もしくはポリペプチドに対応するアミノ酸配列とを含む融合タンパク質を含む）アミノ酸を含む。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、カプシドはバクテリオファージに由来する。特定の実施形態では、バクテリオファージは、バクテリオファージＱβ；（ｂ）バクテリオファージＲ１７；（ｃ）バクテリオファージｆｒ；（ｄ）バクテリオファージＧＡ；（ｅ）バクテリオファージＳＰ；（ｆ）バクテリオファージＭＳ２；（ｇ）バクテリオファージＭ１１；（ｈ）バクテリオファージＭＸ１；（ｉ）バクテリオファージＮＬ９５；（ｊ）バクテリオファージｆ２；（ｋ）バクテリオファージＰＰ７；（ｌ）バクテリオファージＡＰ２０５；および（ｍ）バクテリオファージＰ２２からなる群より選択される。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、カプシドは、コートタンパク質表Ａに記載されている配列を有する。
表Ａ  カプシドおよび関連ＧｅｎＢａｎｋ番号のリスト
［エシェリキアウイルスＱβ］（ＧｅｎＢａｎｋＡＥＱ２５５５０．１）
コートタンパク質［腸内細菌ファージＭ１１］（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＣ０６２５０．１）
コートタンパク質［腸内細菌ファージＳＰ］（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＥＱ２５５６２．１）
コートタンパク質［腸内細菌ファージＦＩ  ｓｅｎｓｕ  ｌａｔｏ］（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＮＰ＿６９５０２７．１）
カプシドタンパク質［エシェリキアウイルスＦＩ］（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＣＴ６６７５８．１）
コートタンパク質［エシェリキアウイルスＱβ］（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＣＹ０７２２４．１）
Ａ鎖、バクテリオファージＱβカプシド（Ｇｅｎｂａｎｋ  １ＱＢＥ＿Ａ）
カプシドタンパク質［エシェリキアウイルスＱβ］（ＡＣＴ６６７３４．１）
カプシドタンパク質［エシェリキアウイルスＱβ］（ＡＣＴ６６７３０．１）
カプシドタンパク質［エシェリキアウイルスＱβ］（ＡＣＴ６６７４２．１）
リードスルータンパク質［エシェリキアウイルスＱβ］（ＡＣＹ０７２３１．１）
Ａ１タンパク質［エシェリキアウイルスＱβ］（ＡＡＡ１６６６３．１）
リードスルータンパク質［エシェリキアウイルスＱβ］（ＡＥＱ２５５４５．１）
マイナーカプシドタンパク質Ａ１（Ｑ８ＬＴＥ１．２）
リードスルータンパク質［エシェリキアウイルスＱβ］（ＡＣＹ０７２２７．１）
リードスルータンパク質［エシェリキアウイルスＱβ］（ＡＣＹ０７２３５．１）
カプシドタンパク質［エシェリキアウイルスＱβ］（ＡＣＴ６６７３８．１）
リードスルータンパク質［エシェリキアウイルスＱβ］（ＡＥＱ２５５４９．１）
リードスルータンパク質［エシェリキアウイルスＱβ］（ＡＥＱ２５５４１．１）
リードスルータンパク質［エシェリキアウイルスＱβ］（ＡＣＹ０７２２３．１）
リードスルータンパク質［エシェリキアウイルスＱβ］（ＡＣＴ６６７３５．１）
Ｒｎａオペレーターヘアピンを有する複合体のＡ鎖、バクテリオファージＱβコートタンパク質（４Ｌ８Ｈ＿Ａ）
リードスルータンパク質［エシェリキアウイルスＱβ］（ＡＣＴ６６７３１．１）
リードスルータンパク質［エシェリキアウイルスＱβ］（ＡＣＴ６６７４３．１）
リードスルータンパク質［エシェリキアウイルスＱβ］（ＡＣＴ６６７３９．１）
カプシドタンパク質［エシェリキアウイルスＱβ］（ＡＣＴ６６７４６．１）
メジャーコートタンパク質［エシェリキアウイルスＱβ］（ＮＰ＿０４６７５１．１）
リードスルータンパク質［エシェリキアウイルスＱβ］（ＡＣＴ６６７４７．１）
マイナーコートタンパク質［エシェリキアウイルスＱβ］（ＮＰ＿０４６７５０．１）
コートタンパク質［腸内細菌ファージＳＰ］（ＡＣＹ０７２４４．１）
コートタンパク質［腸内細菌ファージＳＰ］（ＡＣＹ０７２４０．１）
Ａ１タンパク質［腸内細菌ファージＭ１１］（ＡＡＣ０６２５１．１）
コートタンパク質［腸内細菌ファージＳＰ］（ＡＥＱ２５５５８．１）
カプシドタンパク質［エシェリキアウイルスＦＩ］（ＡＣＴ６６７６２．１）
メジャーコートタンパク質［エシェリキアウイルスＦＩ］（ＹＰ＿００９２０８１４７．１）
カプシドタンパク質［エシェリキアウイルスＦＩ］（ＡＣＴ６６７５０．１）
コートタンパク質［腸内細菌ファージＳＰ］（ＡＣＹ０７２４８．１）
リードスルータンパク質［腸内細菌ファージＳＰ］（ＡＣＹ０７２５１．１）
リードスルータンパク質［腸内細菌ファージＳＰ］（ＡＥＱ２５５６１．１）
リードスルータンパク質［腸内細菌ファージＳＰ］（ＡＣＹ０７２４３．１）
マイナーカプシドタンパク質Ａ１（Ｐ０９６７７．１）
リードスルータンパク質［腸内細菌ファージＦＩ  ｓｅｎｓｕ  ｌａｔｏ］（ＮＰ＿６９５０２６．１）
カプシドタンパク質［エシェリキアウイルスＦＩ］（ＡＣＴ６６７５４．１）
リードスルータンパク質［腸内細菌ファージＳＰ］（ＡＥＱ２５５５３．１）
リードスルータンパク質［腸内細菌ファージＳＰ］（ＡＣＹ０７２３９．１）
リードスルータンパク質［腸内細菌ファージＳＰ］（ＡＥＱ２５５５７．１）
リードスルータンパク質［エシェリキアウイルスＦＩ］（ＡＣＴ６６７５９．１）
メジャーコートタンパク質［腸内細菌ファージＮＬ９５］（ＡＡＣ１４７０３．１）
リードスルータンパク質［エシェリキアウイルスＦＩ］（ＡＣＴ６６７６３．１）
リードスルータンパク質［腸内細菌ファージＳＰ］（ＡＣＹ０７２４７．１）
Ａ１タンパク質［エシェリキアウイルスＦＩ］（ＹＰ＿００９２０８１４６．１）
リードスルータンパク質［エシェリキアウイルスＦＩ］（ＡＣＴ６６７５１．１）
リードスルータンパク質［エシェリキアウイルスＦＩ］（ＡＣＴ６６７５５．１）
Ａ１タンパク質［腸内細菌ファージＮＬ９５］（ＡＡＣ１４７０４．１）
【０１４７】
いくつかの実施形態では、バクテリオファージＱβカプシドは、配列番号１に記載されている配列を含む。
【化４】
2020531544.tif 000006
【０１４８】
いくつかの実施形態では、バクテリオファージＱβカプシドは、表Ｂに記載されている少なくとも１個の変異を含む。
【０１４９】
表Ｂ．アセンブルしてカプシドを形成する報告されたＱβ変異体。
【表Ｂ−１】
2020531544.tif 000007
【表Ｂ−２】
2020531544.tif 000008
７ａは、Ｆｉｅｄｌｅｒ，Ｊら、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２０１２，１３（８），２３３９−２３４８に対応する；４２ａは、Ｐｒａｓｕｈｎ，Ｄら、ＪＡＣＳ  ２００８，１３０（４），１３２８−１３３４に対応する；４２ｂは、Ｕｄｉｔ，Ａら、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  ２００９，１０（３），５０３−５１０に対応する。４３は、Ｈｏｖｌｉｄ，Ｍ．Ｌら、Ｔｈｅ  Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，２０１４に対応する。
【０１５０】
特定の実施形態では、カプシドは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個の変異を含む。いくつかの実施形態では、変異は非天然ジスルフィド結合変異である。いくつかの実施形態では、カプシドは、限定されないが、以下の変異を含む（表Ｃ）。
表Ｃ：バクテリオファージＱβカプシドのリスト
Ｎ１０Ｋ（配列番号１の１０位のアスパラギンがリジンに変異）
Ｋ１３Ｒ（配列番号１の１３位のリジンがアルギニンに変異）
Ａ３８Ｋ（配列番号１の３８位のアラニンがリジンに変異）
Ａ４０Ｃ（配列番号１の４０位のアラニンがシステインに変異）
Ａ４０Ｓ（配列番号１の４０位のアラニンがセリンに変異）
Ｔ７５Ｋ（配列番号１の７５位のトレオニンがリジンに変異）
Ｄ１０２Ｃ（配列番号１の１０２位のアスパラギン酸がシステインに変異）
Ｄ１０２Ｓ（配列番号１の１０２位のアスパラギン酸がセリンに変異）
Ａ１１７Ｋ（配列番号１の１１７位のアラニンがリジンに変異）
【０１５１】
Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２Ｃ（配列番号１の４０位のアラニンがシステインに変異し、配列番号１の１０２位のアスパラギン酸がシステインに変異した二重変異体）
【０１５２】
Ａ４０Ｓ／Ｄ１０２Ｓ（配列番号１の４０位のアラニンがセリンに変異し、配列番号１の１０２位のアスパラギン酸がセリンに変異した二重変異体）。
【０１５３】
Ａ４３Ｃ／Ｎ９８Ｃ（配列番号１の４３位のアラニンがシステインに変異し、配列番号１の９８位のグルタミンがシステインに変異した二重変異体）。
【０１５４】
Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２Ｃ／Ｋ１３Ｒ（配列番号１の４０位のアラニンがシステインに変異し、配列番号１の１０２位のアスパラギン酸がシステインに変異し、配列番号１の１３位のリジンがアルギニンに変異した三重変異体）
【０１５５】
Ａ３８Ｋ／Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２Ｃ（配列番号１の３８位のアラニンがリジンに変異し、配列番号１の４０位のアラニンがシステインに変異し、配列番号１の１０２位のアスパラギン酸がシステインに変異した三重変異体）。
【０１５６】
さらなる単一点変異は、限定されないが、配列番号１のＫ２、Ｌ４、Ｖ７、Ｎ１０、Ｋ１３、Ｄ１４、Ｋ１６、Ｑ１８、Ｌ２０、Ａ３８、Ｇ４０、Ｅ４６、Ｖ６７、Ｔ７５、Ｖ８５、Ｑ９９、Ｅ１０３、Ａ１１７、Ｐ１１９、Ｌ１２２またはＤ１２７またはそれらの組み合わせにおける点変異を含み得る。
【化５】
2020531544.tif 000009
【化６】
2020531544.tif 000010
【化７】
2020531544.tif 000011
【０１５７】
特定の実施形態では、バクテリオファージＱｂ変異体は、以下の物理的特徴を有し得る。
【０１５８】
表Ｄ：Ｑβ変異体の物理的特徴。
【表Ｄ】
2020531544.tif 000012
【０１５９】
すべてのＱｂ変異体におけるリジンへのネイティブアミノ酸の変異は、変異体カプシドの表面電荷をより正にすることを示す非変性アガロースゲルについては、図２７も参照のこと。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、バクテリオファージＱｂカプシドは、配列番号１〜１５に記載されているアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。本明細書で提供される方法、組成物およびキットのいくつかの実施形態では、Ｑｂ変異体は、表Ｃに記載されている少なくとも１個の変異を有する。いくつかの実施形態では、バクテリオファージＱβカプシドは、野生型またはネイティブ配列を含む。いくつかの実施形態では、バクテリオファージＱβカプシドは、配列番号１に記載されている配列から本質的になる配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｑｂ変異体は、配列番号２〜１５に記載されている変異から本質的になるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、カプシドは、表Ａに記載されているＧｅｎＢａｎｋ番号に記載されているアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【０１６１】
本明細書で提供される方法、組成物およびキットのいくつかの実施形態では、ワクチン組成物は、配列番号１〜１５の８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０からなるアミノ酸配列、またはその生物学的に活性なバリアント、またはその組み合わせ、またはカプシドのアミノ酸配列（例えば、配列番号１〜１５、または表Ａに記載されているＧｅｎＢａｎｋ番号のいずれか）と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一の連続アミノ酸を有するカプシドを含む。いくつかの実施形態では、バクテリオファージＱβカプシドは、野生型またはネイティブ配列を含む。いくつかの実施形態では、バクテリオファージＱβカプシドは、配列番号１に記載されている配列から本質的になる配列を含む。
【０１６２】
当業者に周知であるように、実質的な配列類似性を有するポリペプチドは、宿主動物において同一または非常に類似の免疫反応を引き起こし得る。したがって、いくつかの実施形態では、Ｑｂカプシドの誘導体、同等物、バリアント、断片または変異体またはそれらの断片もまた、本明細書で提供される方法、組成物、およびキットに適切であり得る。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、変化したポリペプチドは、例えば、保存的置換により変化したアミノ酸配列を有し得るが、増強された免疫反応を依然として誘発し、機能的同等物とみなされる。本明細書で使用される場合、「保存的置換」という用語は、別の生物学的に類似の残基によるアミノ酸残基の置き換えを意味する。同じ保存グループ内のアミノ酸は、典型的には、タンパク質の機能に実質的に影響を与えずに互いを代替し得ることは当技術分野で周知である。特定の実施形態によれば、Ｑｂの誘導体、同等物、バリアントまたは変異体は、配列番号１〜１５に記載されている配列、またはその生物学的に活性なバリアント、またはその組み合わせと少なくとも８５％相同である。いくつかの実施形態では、相同性は、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である。いくつかの実施形態では、バクテリオファージＱβカプシドは、野生型またはネイティブ配列を含む。いくつかの実施形態では、バクテリオファージＱβカプシドは、配列番号１に記載されている配列から本質的になる配列を含む。
Ｃ．ワクチン組成物およびその医薬組成物／製剤
【０１６４】
カプシドにコンジュゲートされた抗原を含むワクチン組成物が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物は、野生型カプシドにコンジュゲートされた抗原を含む。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物は、野生型バクテリオファージＱβカプシドにコンジュゲートされた抗原を含む。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物は、野生型またはネイティブ配列を有するバクテリオファージＱβカプシドにコンジュゲートされた抗原を含む。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物は、配列番号１に記載されている野生型または天然配列を有するバクテリオファージＱβカプシドにコンジュゲートされた抗原を含む。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物は、野生型カプシドからの少なくとも１個の変異を有するカプシドにコンジュゲートされた抗原を含む。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物は、野生型バクテリオファージＱβカプシドからの少なくとも１個の変異を有するバクテリオファージＱβカプシドにコンジュゲートされた抗原を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１個の変異は非天然変異を含む。いくつかの実施形態では、非天然変異は非天然アミノ酸変異を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるワクチン組成物は、カプシド（例えば、バクテリオファージＱｂ）にコンジュゲートされた抗原（例えば、炭水化物抗原、ポリペプチド、ペプチド、タンパク質および小分子）を含み、前記カプシドは少なくとも１個の変異（例えば、少なくとも１個の点変異、または少なくとも１個の非天然アミノ酸変異、または少なくとも１個の非天然ジスルフィド結合変異）を含む。カプシドについては、前掲のセクションＢに記載されている。いくつかの実施形態では、抗原は、カプシドにコンジュゲートされた場合に、増強された強い免疫反応を誘発し得る十分な長さの炭水化物抗原の断片または一部である。カプシドは、同じまたは異なる抗原である複数の多重抗原にコンジュゲートされ得る。特定の実施形態では、抗原はタンパク質であり、ペプチドは、限定されないが、ＴＮＦアルファ、ＩＬ１α、ＩＬ１β、タウタンパク質、ＰＣＳＫ９またはアミロイドβから選択される。いくつかの実施形態では、抗原は、限定されないが、ニコチン、コカインまたは高度糖化産物から選択される小分子である。
【０１６５】
特定の実施形態では、抗原ポリペプチドはまた、天然に存在する抗原アミノ酸配列に対応しない（例えば、少なくとも１個の非天然変異を含む）アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、炭水化物抗原は、（ａ）ムチン１（ＭＵＣ１）、（ｂ）ムチン４（ＭＵＣ４）、（ｃ）ガングリオシドＧＤ２（ＧＤ２）、（ｄ）フコシルガングリオシドＧＭ１（ＧＭ１）、（ｅ）アセチル化ＧＤ２、（ｆ）ガングリオシドＧＤ３（ＧＤ３）、（ｇ）アセチル化ＧＤ３、（ｈ）フコシルガングリオシドＧＭ２（ＧＭ２）、（ｉ）グロボ−Ｈ、（ｊ）ルイスＡ、（ｋ）ルイスＹ、（ｌ）ポリシアル酸、（ｍ）シアリル−ルイスＡ、（ｎ）Ｔｆ、（ｏ）Ｔｎ、（ｐ）ｓＴｎ、Ｔｎ１およびＴｎ２からなる群より選択される。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、抗原は、後述の実施例６および９に記載されているようにカプシドにコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物は、ＭＵＣ１にコンジュゲートされたＱｂ変異体である（例えば、図２８）。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物は、ＧＤ２にコンジュゲートされたＱｂ変異体である。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物は、Ｔｎ１またはＴｎ２にコンジュゲートされたＱｂ変異体である（例えば、図１０および１６Ａ）。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、本発明は、治療有効量の１つまたはそれを超えるワクチン組成物（例えば、１つまたはそれを超える上記のとおりのＱｂ野生型またはＱβ変異体、抗原コンジュゲート）を含む薬学的に許容され得る組成物であって、１つまたはそれを超える薬学的に許容され得るキャリア（添加剤）および／または希釈剤と一緒に製剤化された薬学的に許容され得る組成物を提供する。別の態様では、組成物はそれ自体で、または薬学的に許容され得るキャリアと混合して投与され得、また、他の抗がん治療、例えば化学療法剤、スカベンジャー化合物、放射線療法、生物学的療法などと併せて投与され得る。したがって、併用療法は、組成物の逐次投与、同時投与および個別投与または共投与を含み、最初の投与の治療効果は、後続の化合物が投与される場合に完全には消失していない。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのワクチン組成物（例えば、１つまたはそれを超える上記のとおりのＱβ野生型またはＱβ変異体、抗原コンジュゲート）は単独で、または少なくとも１つの抗がん治療薬、化学療法剤、スカベンジャー化合物、抗生物質、抗ウイルス薬、抗真菌薬、抗炎症薬、血管収縮薬および抗凝固薬、がんワクチン用途に有用な抗原、または対応するプロドラッグと組み合わせて被験体に提供され得る。
【０１６８】
本明細書に記載される組成物および処置方法と共に使用するための抗がん治療薬および化学療法剤としては、限定されないが、アルキル化剤、例えばチオテパおよびシクロホスファミド；アルキルスルホネート、例えばブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン；アジリジン、例えばベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、およびウレドーパ；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミドおよびトリメチロロメラミンを含むエチレンイミンおよびメチルアメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅｓ）；アセトゲニン（特に、ブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトテシン（合成アナログトポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成アナログを含む）；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成アナログ、ＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン（sarcodictyin）；スポンジスタチン；ナイトロジェンマスタード、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソウレア、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチン（ranimnustine）；抗生物質、例えばエンジイン抗生物質、例えばカリケアマイシン、特にカリケアマイシンガンマｌＩおよびカリケアマイシンオメガｌ１；ダイネミシンＡを含むダイネミシン；ビスホスホネート、例えばクロドロネート；エスペラマイシン；ならびにネオカルジノスタチン発色団および関連色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団、アクラシノマイシン（ａｃｌａｃｉｎｏｍｙｓｉｎｓ）、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｒｎｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン（ｃａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カラビシン、カミノマイシン（ｃａｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カルジノフィリン、クロモマイシン（ｃｈｒｏｍｏｍｙｃｉｎｉｓ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシンおよびデオキソドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えばマイトマイシンＣ、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシンン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；抗代謝産物、例えばメトトレキセートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸アナログ、例えばデノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセート；プリンアナログ、例えばフルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジンアナログ、例えばアンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン；アンドロゲン、例えばカルステロン、ドロモスタノロンプロピオネート、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎剤（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌｓ）、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補充剤、例えばフロリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビスアントレン；エダトレキセート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン；デメコルシン；ジアジコン；エルフォルミチン；エリプチニウム酢酸塩；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダイニン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）；メイタンシノイド、例えばメイタンシンおよびアンサミトシン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモル（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）；ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸（podophyllinic  acid）；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ多糖複合体）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特に、Ｔ−２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡおよびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えばパクリタキセルおよびドキセタキセル；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；白金配位錯体、例えばシスプラチン、オキサリプラチンおよびカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；イリノテカン（例えば、ＣＰＴ−１１）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロミチン（ｄｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｏｍｉｔｈｉｎｅ）（ＤＭＦＯ）；レチノイド、例えばレチノイン酸；カペシタビン；および上記のいずれかの薬学的に許容され得る塩、酸または誘導体が挙げられる。
【０１６９】
以下に詳細に記載されているように、本発明の医薬組成物は、以下：（１）経口投与、例えば水薬（水性または非水性液剤または懸濁剤）、錠剤、例えば頬側、舌下および全身吸収を目的とするもの、ボーラス、粉剤・散剤（powder）、顆粒剤、舌への適用のためのペースト剤；（２）非経口投与、例えば皮下、筋肉内、静脈内または硬膜外の注射による、例えば滅菌液剤または懸濁剤、または徐放製剤として；（３）局所適用、例えば皮膚に適用されるクリーム剤、軟膏剤または制御放出パッチ剤または噴霧剤として；（４）膣内にまたは直腸内に、例えばペッサリー、クリーム剤またはフォーム剤として；（５）舌下；（６）眼に；（７）経皮；または（８）鼻に、のために適合されたものを含む、固体または液体形態による投与のために特に製剤化され得る。
【０１７０】
上記のように、１つまたはそれを超えるワクチン組成物（例えば、１つまたはそれを超える上記のとおりのＱβ野生型またはＱβ変異体、抗原コンジュゲート）の特定の実施形態は、アミノまたはアルキルアミノなどの塩基性官能基を含有し得るので、薬学的に許容され得る酸と薬学的に許容され得る塩を形成し得る。これらの塩は、投与ビヒクルもしくは剤形製造プロセスでインサイチューで調製され得るか、またはその遊離塩基形態の本発明の精製化合物を適切な有機もしくは無機酸と別々に反応させ、その後の精製中にこのようにして形成された塩を単離することにより調製され得る。代表的な塩としては、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチル酸塩、メシル酸塩、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩、およびラウリルスルホン酸塩などが挙げられる（例えば、Ｂｅｒｇｅら、（１９７７）“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ”，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９を参照のこと）。
【０１７１】
対象化合物の薬学的に許容され得る塩としては、例えば、非毒性有機または無機酸からの化合物の従来の非毒性塩または第４級アンモニウム塩が挙げられる。例えば、このような従来の非毒性塩としては、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸などの無機酸由来の塩；および、例えば、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パルミチン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息酸、サリチル酸、スルファニル酸、２−アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イソチオン酸などの有機酸から調製された塩が挙げられる。
【０１７２】
他の場合では、１つまたはそれを超えるワクチン組成物（例えば、１つまたはそれを超える上記のとおりのＱβ野生型またはＱβ変異体、抗原コンジュゲート）は、１つまたはそれを超える酸性官能基を含有し得るので、薬学的に許容され得る塩基と薬学的に許容され得る塩を形成し得る。同様に、これらの塩は、投与ビヒクルもしくは剤形製造プロセスでインサイチューで調製され得るか、またはその遊離酸形態の精製化合物を適切な塩基、例えば薬学的に許容され得る金属カチオンの水酸化物、炭酸塩もしくは重炭酸塩と、アンモニアと、もしくは薬学的に許容され得る有機第１級、第２級もしくは第３級アミンと別々に反応させることにより調製され得る。代表的なアルカリ塩またはアルカリ土類塩としては、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、およびアルミニウム塩などが挙げられる。塩基付加塩の形成に有用な代表的な有機アミンとしては、エチルアミン、ジエチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミンおよびピペラジンなどが挙げられる（例えば、Ｂｅｒｇｅら、前掲を参照のこと）。
【０１７３】
湿潤剤、乳化剤および滑沢剤、例えばラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム、ならびに着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味料、香味剤および香料、保存剤および抗酸化剤もまた、組成物中に存在し得る。
【０１７４】
薬学的に許容され得る抗酸化剤の例としては、（１）水溶性抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど；（２）油溶性抗酸化剤、例えばパルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなど；および（３）金属キレート剤、例えばクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などが挙げられる。
【０１７５】
１つまたはそれを超えるワクチン組成物（例えば、１つまたはそれを超える上記のとおりのＱβ野生型またはＱβ変異体、抗原コンジュゲート）は、経口、鼻、局所（頬側および舌下を含む）、直腸、膣および／または非経口投与に適切な製剤であり得る。製剤は、単位剤形で好都合に提示され得、製薬の分野で周知の任意の方法により調製され得る。単一剤形を生成するためにキャリア材料と組み合わされ得る有効成分の量は、処置される宿主および特定の投与様式に応じて変動する。単一剤形を生成するためにキャリア材料と組み合わされ得る有効成分の量は、一般に、治療効果をもたらす化合物の量である。
【０１７６】
特定の実施形態では、１つまたはそれを超えるワクチン組成物（例えば、１つまたはそれを超える上記のとおりのＱβ野生型またはＱβ変異体、抗原コンジュゲート）の製剤は、より大きな安定性を可能にするための、より大きな安定性、インビボにおける異なる放出特性、特定の部位へのターゲティング、または被験体もしくは被験体中の標的への１つもしくはそれを超えるワクチン組成物（例えば、１つまたはそれを超える上記のとおりのＱβ野生型またはＱβ変異体、抗原コンジュゲート）のより有効な送達を可能にする任意の他の所望の特徴を可能にするための他のキャリア、例えば限定されないが、リポソーム、ミクロスフェア、ナノスフェア、ナノ粒子、泡沫（bubble）、ミセル形成剤、例えば胆汁酸およびポリマーキャリア、例えばポリエステルおよびポリ酸無水物のキャリアを含み得る。特定の実施形態では、上記製剤は、本発明の化合物を経口的に生体利用可能にする。
【０１７７】
１つまたはそれを超えるワクチン組成物（例えば、１つまたはそれを超える上記のとおりのＱβ野生型またはＱβ変異体、抗原コンジュゲート）の液体投与製剤は、薬学的に許容され得る乳剤、マイクロ乳剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤およびエリキシル剤を含む。有効成分に加えて、液体剤形は、当技術分野で一般に使用される不活性希釈剤、例えば水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、エチルカーボネート、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（特に、綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、およびそれらの混合物などを含み得る。
【０１７８】
不活性希釈剤の他に、経口組成物はまた、アジュバント、例えば湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、甘味料、香味剤、着色剤、香料および保存剤を含み得る。
【０１７９】
懸濁剤は、活性化合物に加えて、例えばエトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天およびトラガカント、およびそれらの混合物のような懸濁化剤を含有し得る。
【０１８０】
経口投与に適切な製剤は、カプセル剤、カシェ剤、丸剤、錠剤、ロゼンジ剤（風味基剤、通常はスクロースおよびアラビアゴムまたはトラガカントを使用）、粉剤・散剤、顆粒剤の形態、または水性もしくは非水性液体の液剤もしくは懸濁剤として、または水中油型もしくは油中水型液体エマルジョンとして、またはエリキシル剤もしくはシロップ剤として、またはトローチ（不活性基剤、例えばゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアラビアゴムを使用）として、および／またはうがい薬などとしての形態であり得、それぞれが所定量の有効成分を含有する。１つまたはそれを超えるワクチン組成物（例えば、１つまたはそれを超える上記のとおりのＱβ野生型またはＱβ変異体、抗原コンジュゲート）はまた、ボーラス、舐剤またはペースト剤として投与され得る。
【０１８１】
固体剤形（例えば、カプセル剤、錠剤、丸剤、糖衣錠、粉剤・散剤、顆粒剤など）では、有効成分は、１つまたはそれを超える薬学的に許容され得るキャリア、例えばクエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウム、および／または以下のいずれかと混合される：（１）充填剤または増量剤、例えばデンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、および／またはケイ酸；（２）結合剤、例えばカルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよび／またはアラビアゴムなど；（３）湿潤剤、例えばグリセロール；（４）崩壊剤、例えば寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモデンプンまたはタピオカデンプン、アルギン酸、ある種のシリケート、および炭酸ナトリウム；（５）溶解遅延剤、例えばパラフィン；（６）吸収促進剤、例えば第４級アンモニウム化合物；（７）湿潤剤、例えばセチルアルコール、グリセロールモノステアレート、および非イオン性界面活性剤など；（８）吸収剤、例えばカオリンおよびベントナイトクレイ；（９）滑沢剤、例えばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびそれらの混合物；ならびに（１０）着色剤。カプセル剤、錠剤および丸剤の場合、組成物はまた、緩衝剤を含み得る。同様のタイプの固体組成物もまた、ラクトースまたは乳糖、ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどのような賦形剤を使用して、軟質および硬質シェルゼラチンカプセル中の充填剤として用いられ得る。
【０１８２】
錠剤は、圧縮または成形により、必要に応じて１つまたはそれを超える副成分と共に作製され得る。圧縮錠剤は、結合剤（例えば、ゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、滑沢剤、不活性希釈剤、保存剤、崩壊剤（例えば、デンプングリコール酸ナトリウムまたは架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）、表面活性剤または分散化剤を使用して調製され得る。成形錠剤は、不活性な液体希釈剤で湿らせた粉末化化合物の混合物を、適切な機械で成形することにより作製され得る。
【０１８３】
錠剤および他の固体剤形、例えば糖衣錠、カプセル剤、丸剤および顆粒剤は、必要に応じて刻み目が入れられ得るか、またはコーティングおよびシェル、例えば腸溶コーティングおよび医薬製剤化の技術分野で周知の他のコーティングを用いて調製され得る。それらはまた、例えば所望の放出プロファイルを提供するように様々な割合のヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、リポソームおよび／またはミクロスフェアを使用して、その中の有効成分の徐放または制御放出を提供するように製剤化され得る。組成物はまた、急速放出のために、例えば凍結乾燥して製剤化され得る。それらは、例えば細菌保持フィルタを通して濾過することにより、または滅菌剤を、使用直前に滅菌水もしくはいくらかの他の滅菌注射用媒体に溶解され得る滅菌固体組成物の形態で組み込むことにより滅菌され得る。これらの組成物はまた、乳白剤を必要に応じて含有し得、それらが有効成分（複数可）のみを放出するか、または必要に応じて遅延様式で胃腸管の特定の部分において優先的に放出する組成物であり得る。使用され得る包埋組成物の例としては、ポリマー物質およびワックスが挙げられる。有効成分はまた、適切な場合には、上記賦形剤の１つまたはそれよりも多くを有するマイクロカプセル化形態であり得る。
【０１８４】
直腸投与または膣投与のための製剤は坐薬として提示され得、１つまたはそれを超える本発明の化合物を、例えば、ココアバター、ポリエチレングリコール、坐薬ワックスまたはサリチレートを含む１つまたはそれを超える適切な非刺激性賦形剤またはキャリアと混合することにより調製され得、これは、室温では固体であるが、体温では液体であるので、直腸または膣腔内で溶融して活性化合物を放出する。
【０１８５】
膣投与に適切な製剤としては、当技術分野で適切であることが公知のキャリアなどを含有するペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォームまたは噴霧製剤も挙げられる。
【０１８６】
１つまたはそれを超えるワクチン組成物（例えば、１つまたはそれを超える上記のとおりのＱβ野生型またはＱβ変異体、抗原コンジュゲート）の局所投与または経皮投与のための剤形としては、粉剤・散剤、スプレー剤、軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、液剤、パッチ剤および吸入剤が挙げられる。活性化合物は、滅菌条件下で、薬学的に許容され得るキャリア、および必要とされ得る任意の保存剤、緩衝剤または噴射剤と混合され得る。
【０１８７】
軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤およびゲル剤は、本発明の活性化合物に加えて、賦形剤、例えば動物および植物の脂肪、油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルクおよび酸化亜鉛、またはそれらの混合物を含有し得る。
【０１８８】
粉剤・散剤およびスプレー剤は、賦形剤、例えばラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムおよびポリアミド粉末、またはこれらの物質の混合物を含有し得る。スプレー剤は、通例の噴射剤、例えばクロロフルオロ炭化水素および揮発性で非置換の炭化水素、例えばブタンおよびプロパンをさらに含有し得る。
【０１８９】
経皮パッチは、制御された送達を身体に提供するさらなる利点を有する。このような剤形は、化合物を、適切な媒体に溶解または分散することにより作製され得る。皮膚を通過する化合物のフラックスを増加させるために、吸収増強剤も使用され得る。このようなフラックスの速度は、速度制御膜を提供するか、または化合物をポリマーマトリックスもしくはゲル中に分散するかのいずれかにより制御され得る。
【０１９０】
眼科用製剤、眼軟膏、粉剤・散剤、液剤などもまた、本発明の範囲内であると企図される。
【０１９１】
非経口投与に適切な医薬組成物は、滅菌等張水性または非水性液剤、分散剤、懸濁剤またはエマルジョン、または使用直前に滅菌注射液剤または分散剤へと再構成され得る滅菌粉剤・散剤を含み得、この滅菌粉剤・散剤は、糖、アルコール、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、製剤を意図するレシピエントの血液と等張にする溶質、または懸濁化剤または増粘剤を含有し得る。
【０１９２】
本発明の医薬組成物において用いられ得る適切な水性および非水性キャリアの例としては、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）および適切なそれらの混合物、オリーブ油などの植物油、およびエチルオレエートなどの注射用有機エステルが挙げられる。適切な流動性は、例えばレシチンなどのコーティング材料の使用により、分散剤の場合には、必要とされる粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により維持され得る。
【０１９３】
特定の実施形態では、上記医薬組成物は、本明細書で提供される方法および組成物にしたがって、当技術分野で公知の他の薬理学的に活性な化合物（「第２の活性剤」）と組み合わされ得る。第２の活性剤は、大きな分子（例えば、タンパク質）または小さな分子（例えば、合成無機、有機金属分子または有機分子）であり得る。一実施形態では、第２の活性剤は、がんの処置を独立してまたは相乗的に助ける。
【０１９４】
別の実施形態では、本発明の組成物は、治療薬またはプロドラッグ、例えば他の化学療法剤、スカベンジャー化合物、抗生物質、抗ウイルス薬、抗真菌薬、抗炎症薬、血管収縮薬および抗凝血薬、がんワクチン適用のために有用な抗原または対応するプロドラッグを含む他の生物学的に活性な物質を含み得る。
【０１９５】
例示的なスカベンジャー化合物としては、限定されないが、チオール含有化合物、例えばグルタチオン、チオ尿素、およびシステイン；アルコール、例えばマンニトール、置換フェノール；キノン、置換フェノール、アリールアミンおよびニトロ化合物が挙げられる。
【０１９６】
化学療法剤および／または他の生物学的に活性な薬剤の様々な形態が使用され得る。これらとしては、限定されないが、生物学的に活性な非荷電分子、分子複合体、塩、エーテル、エステル、アミドなどのような形態が挙げられる。
Ｄ．治療方法
【０１９７】
増強された免疫反応が有益であり得る疾患および状態の処置および／または予防のためのワクチン組成物が本明細書で提供される。このような疾患としては、限定されないが、病原性感染（例えば、細菌感染、ウイルス感染または真菌感染）およびがんが挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるワクチン組成物は、免疫療法として使用され得る。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、ワクチン組成物（例えば、１つまたはそれを超える上記のとおりのＱβ野生型またはＱβ変異体、抗原コンジュゲート）は、限定されないが、持続感染性疾患、増殖性疾患、神経変性疾患、炎症性疾患、がん、心理的疾患、代謝性疾患、自己免疫疾患、性感染病、胃腸疾患、肺疾患、心血管疾患、ストレスおよび疲労関連障害、真菌性疾患、病原性疾患、肥満関連障害、ウイルス感染、細菌感染または物質嗜癖（例えば、コカインおよびニコチン）を含む疾患の処置において有用である。
【０１９９】
ウイルス感染疾患としては、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２）などのレトロウイルス、エプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２などのヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、Ａ型およびＢ型肝炎、ＦＩＶ、レンチウイルス、ペスチウイルス、ウエストナイルウイルス、麻疹ウイルス、天然痘ウイルス、牛痘ウイルス、エボラウイルス、コロナウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、ジャガイモＳウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、モロニーウイルス、ＡＬＶ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）、ジカウイルスまたはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）が挙げられる。
【０２００】
加えて、細菌性疾患、真菌性疾患および他の病原性疾患、例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｂｒｕｇｉａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｃｏｃｃｉｄｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｄｅｎｇｕｅ、Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ、Ｇｏｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｐａｒａｍｅｃｉｕｍ、Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ、Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ、ハマダラカベクター中のＰ．ｖｉｖａｘ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、ＴｏｘｏｐｌａｓｍａおよびＶｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅが挙げられる。例示的な種としては、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｇｒｏｕｐ  Ｂ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｍｉｃｒｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ、Ｇｒａｎｕｌｏｍａ  ｉｎｇｕｉｎａｌｅ、Ｌｙｍｐｈｏｐａｔｈｉａ  ｖｅｎｅｒｅｕｍ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｕｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｃａｎｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｆｅｔｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｆｅｔｕｓ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｐｏｍｏｎａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｏｖｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｆｏｅｔｕｓ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ、Escherichia  coli、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｅｑｕｕｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ  ｏｖｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ  ｅｑｕｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｑｕｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｃｉｌｕｓ  ｓｅｍｉｎｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂｏｖｉｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａｂｓｉｄｉａ  ｒａｍｏｓａ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｅｑｕｉｐｅｒｄｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ；または真菌、例えばＰａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ；または他の病原体、例えばＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍが挙げられる。
【０２０１】
国立アレルギー感染症研究所（ＮＩＡＩＤ）の優先的病原体も挙げられる。これらとしては、カテゴリーＡ病原体、例えば大痘瘡（天然痘）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ（炭疽菌）、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ（ペスト）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ毒素（ボツリヌス中毒）、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ（野兎病）、フィロウイルス（エボラ出血熱、マールブルグ出血熱）、アレナウイルス（ラッサ（ラッサ熱）、フニン（アルゼンチン出血熱）および関連ウイルス）；カテゴリーＢ病原体、例えばＣｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｔｉ（Ｑ熱）、Ｂｒｕｃｅｌｌａ種（ブルセラ症）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉ（鼻疽）、アルファウイルス（ベネズエラ脳脊髄炎、東部および西部ウマ脳脊髄炎）、Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ（トウゴマ）由来のリシン毒素、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのイプシロン毒素；ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓエンテロトキシンＢ、サルモネラ種、志賀赤痢菌、Escherichia  coli株Ｏ１５７：Ｈ７、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ；カテゴリーＣ病原体、例えばニパウイルス、ハンタウイルス、ヤブカ属の蚊媒介性黄熱病、および多剤耐性結核；蠕虫、例えばＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａおよびＴａｅｎｉａ；ならびに原虫、例えばサシチョウバエ媒介のＬｅｉｓｈｍａｎｉａ（例えば、Ｌ．ｍｅｘｉｃａｎａ）、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ、サシガメ媒介のシャーガス病が挙げられる。
【０２０２】
細菌性病原体としては、限定されないが例えば、細菌性病原性グラム陽性球菌が挙げられ、これらとしては、限定されないが、肺炎球菌、ブドウ球菌、および連鎖球菌が挙げられる。病原性グラム陰性球菌としては、髄膜炎菌、および淋菌が挙げられる。病原性腸内グラム陰性桿菌としては、腸内細菌科；シュードモナス、アシネトバクテリア、およびエイケネラ；類鼻疽；サルモネラ菌；細菌性赤痢；ヘモフィルス属；軟性下疳；ブルセラ症；野兎病；エルシニア（パスツレラ）；ストレプトバシラス・モニリフォルミスおよび螺旋菌；リステリア・モノサイトゲネス；ブタ丹毒菌；ジフテリア、コレラ、炭疽；およびドノヴァン症（鼠径部肉芽腫）が挙げられる。病原性嫌気性細菌としては、破傷風；ボツリヌス；他のクロストリジウム属；結核菌、癩菌、および他のマイコバクテリアが挙げられる。病原性スピロヘータ症としては、梅毒；トレポネーマ症；イチゴ腫、ピンタおよび地方病性梅毒；ならびにレプトスピラ症が挙げられる。より高等な病原性細菌および病原性真菌により引き起こされる他の感染症としては、放線菌症；ノカルジア症；クリプトコッカス症、ブラストミセス症、ヒストプラズマ症およびコクシジオイデス真菌症；カンジダ症、アスペルギルス症およびムコール症；スポロトリクム症；パラコクシジオイデス症（ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｄｏｍｙｃｏｓｉｓ）、ペトリエリジオーシス（ｐｅｔｒｉｅｌｌｉｄｉｏｓｉｓ）、トルロプシス症、菌腫および黒色真菌症；ならびに皮膚糸状菌症が挙げられる。リケッチア感染症としては、リケッチアおよびリケッチア症が挙げられる。マイコプラズマおよびクラミジア感染症の例としては、マイコプラズマ肺炎；性病性リンパ肉芽腫症；オウム病；および周産期クラミジア感染症が挙げられる。病原性原生動物および蠕虫ならびにそれによる感染症真核生物（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ）としては、アメーバ症；マラリア；リーシュマニア症；トリパノソーマ症；トキソプラズマ症；ニューモシスチス・カリニ；ジアルジア症；旋毛虫症；フィラリア症；住血吸虫症；線虫類；吸虫または吸虫類；および条虫（条虫類）感染症が挙げられる。
【０２０３】
本明細書で使用される場合、「がん」という用語は、無制御に増殖し、いくつかの場合では転移する（広がる）傾向がある細胞の異常成長を指す。がんのタイプとしては、限定されないが、転移の有無にかかわらず、任意の病期における固形腫瘍（例えば、膀胱、腸、脳、乳房、子宮内膜、心臓、腎臓、肺、子宮、リンパ組織（リンパ腫）、卵巣、膵または他の内分泌器官（甲状腺）、前立腺、皮膚（黒色腫または基底細胞がん）または血液腫瘍（例えば、白血病およびリンパ腫）が挙げられる。
【０２０４】
がんのさらなる非限定的な例としては、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、肛門がん、虫垂がん、星細胞腫、非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、基底細胞癌、胆管がん、膀胱がん、骨がん（骨肉腫および悪性線維性組織球腫）、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、脳および脊髄腫瘍、乳がん、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、子宮頸がん、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸がん、結腸直腸がん、頭蓋咽頭腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、胚性腫瘍、子宮内膜がん、上衣芽細胞腫、上衣腫、食道がん、ユーイング肉腫ファミリーの腫瘍、眼のがん、網膜芽細胞腫、胆嚢がん、胃（胃）がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、消化管間質細胞腫瘍、胚細胞腫瘍、神経膠腫、毛様細胞白血病、頭頸部がん、肝細胞（肝臓）がん、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、眼内黒色腫、島細胞腫瘍（内分泌膵）、カポジ肉腫、腎臓がん、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭がん、白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、毛様細胞白血病、肝臓がん、肺がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、バーキットリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、リンパ腫、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、髄芽腫、髄上皮腫、黒色腫、中皮腫、口腔がん、慢性骨髄性白血病、骨髄性白血病、多発性骨髄腫、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、口腔がん、口腔咽頭がん、骨肉腫、骨の悪性線維性組織球腫、卵巣がん、卵巣上皮がん、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性潜在性腫瘍、膵がん、乳頭腫症、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、中間分化の松果体実質性腫瘍、松果体芽細胞腫およびテント上原始神経外胚葉性腫瘍、下垂体腫瘍、血漿細胞新生物／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺がん、直腸がん、腎臓細胞（腎臓）がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫、ユーイング肉腫ファミリーの腫瘍、肉腫、カポジ、セザリー症候群、皮膚がん、小細胞肺がん、小腸がん、軟組織肉腫、扁平上皮癌、胃（胃）がん、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、Ｔ細胞リンパ腫、精巣がん、咽喉がん、胸腺腫および胸腺癌、甲状腺がん、尿道がん、子宮がん、子宮肉腫、膣がん、外陰部がん、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍が挙げられる。特定の実施形態では、本明細書に記載されるワクチンはいずれも、前述のがんのいずれかのがん幹細胞を標的とし得る。
【０２０５】
本発明はさらに、がん性腫瘍を含むがんを予防し、遅延させ、軽減しおよび／または処置する新規治療方法を提供する。一実施形態では、被験体におけるがんを予防または処置するための方法であって、１つまたはそれを超えるワクチン組成物（例えば、１つまたはそれを超える上記のとおりのＱβ野生型またはＱβ変異体、抗原コンジュゲート）を投与することを含む方法。一実施形態では、処置方法は、被験体（例えば、それを必要とする被験体）に、有効量の１つまたはそれを超えるワクチン組成物（例えば、１つまたはそれを超える上記のとおりのＱβ野生型またはＱβ変異体、抗原コンジュゲート）を投与することを含む。それを必要とする被験体としては、例えば、前がん性腫瘍、がんを含む腫瘍と診断された被験体、または以前の処置に対して難治性であった被験体を含む処置された被験体が挙げられ得る。
【０２０６】
治療剤の「治療有効量」における「有効量」という用語は、所望の生物学的応答を誘発するために必要な薬剤の量を指す。当業者により認識されるように、薬剤の有効量は、所望の生物学的エンドポイント、送達すべき薬剤、医薬組成物の組成、標的組織または細胞などのような要因に応じて変動し得る。より具体的には、「有効量」という用語は、所望の効果をもたらすために、例えば疾患、障害もしくは状態もしくはそれらの１つもしくはそれを超える症状の重症度、持続時間、進行または発症を軽減もしくは改善し；疾患、障害もしくは状態の進行を予防し、疾患、障害もしくは状態の退縮を引き起こし；疾患、障害もしくは状態に関連する症状の再発、発生、発症もしくは進行を予防し；または別の治療の予防もしくは治療効果（複数可）を増強もしくは向上するために十分な量を指す。
【０２０７】
本発明の方法は、任意のがん性または前がん性腫瘍を処置するために使用され得る。特定の実施形態では、がん性腫瘍は高解糖表現型を有する。例えば、高解糖腫瘍は、脳、結腸、泌尿生殖器、肺、腎臓、前立腺、膵、肝臓、食道、胃、造血性、乳房、胸腺、精巣、卵巣、皮膚、骨髄および／または子宮の組織から選択される組織に位置し得る。いくつかの実施形態では、本発明の方法および組成物は、任意のがんを処置するために使用され得る。本発明の方法および組成物により処置され得るがんとしては、限定されないが、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、結腸、食道、胃腸、歯肉、頭部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽腔、首、卵巣、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌、または子宮のがん細胞が挙げられる。加えて、がんは、特に以下の組織学的タイプのものであり得るが、これらに限定されない：悪性新生物；癌；未分化癌；巨細胞およびスピンドル細胞癌；小細胞癌；乳頭癌；扁平上皮癌；リンパ上皮性癌；基底細胞癌；毛質性上皮腫癌；移行細胞癌；乳頭状移行細胞癌；腺癌；悪性ガストリノーマ；胆管がん；肝細胞癌；肝細胞癌および胆管がん併存（combined  hepatocellular  carcinoma  and  cholangiocarcinoma）；小柱腺癌；腺溶嚢胞癌；腺腫様ポリープ中の腺癌；腺癌、家族性結腸ポリポーシス；固形癌；カルチノイド腫瘍；細気管支肺胞腺癌（branchiolo-alveolar  adenocarcinoma）；乳頭状腺癌；色素嫌性癌；好酸性癌；好酸性腺癌；好塩基性癌；明細胞腺癌；顆粒細胞癌；濾胞性腺癌；乳頭状および濾胞性腺癌；非被包硬化性癌；副腎皮質癌；類内膜癌（endometroid  carcinoma）；皮膚付属器癌；アポクリン腺癌；皮脂腺癌；耳垢腺癌；粘表皮癌；嚢胞腺癌；乳頭状嚢胞腺癌；乳頭状漿液嚢胞腺癌；粘液性嚢胞腺癌；粘液性腺癌；印環細胞癌；浸潤管癌（infiltrating  duct  carcinoma）；髄様癌；小葉癌；炎症性癌；乳腺のパジェット病；腺房細胞癌；腺扁平上皮癌；扁平上皮化生を有する腺癌；悪性胸腺腫；悪性卵巣間質腫瘍；悪性莢膜細胞腫；悪性顆粒膜細胞腫瘍；悪性アンドロブラストーマ（and  roblastoma,  malignant）；セルトリ細胞癌；悪性ライディッヒ細胞腫瘍；悪性脂質細胞腫瘍；悪性傍神経節腫、；悪性乳房外傍神経節腫、；褐色細胞腫；グロムス血管肉腫；悪性黒色腫；無色素性黒色腫；表在拡大型黒色腫；巨大色素性母斑の悪性黒色腫（malig  melanoma  in  giant  pigmented  nevus）；類上皮細胞黒色腫；悪性青色母斑；肉腫；線維肉腫；悪性線維性組織球腫；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胎児性横紋筋肉腫；肺胞横紋筋肉腫；間質肉腫；悪性混合腫瘍；ミュラー管混合腫瘍；腎芽細胞腫；肝芽腫；癌肉腫；悪性間葉腫；悪性ブレンナー腫瘍；悪性葉状腫瘍；滑膜肉腫；悪性中皮腫；未分化胚細胞腫；胚性癌；悪性奇形腫；悪性卵巣甲状腺腫；絨毛癌；悪性中腎腫；血管肉腫；悪性血管内皮腫；カポジ肉腫；悪性血管周囲細胞腫；リンパ管肉腫；骨肉腫；皮質近接部骨肉腫；軟骨肉腫；悪性軟骨芽細胞腫；間葉系軟骨肉腫；骨の巨細胞腫瘍；ユーイング肉腫；悪性歯原性腫瘍、；エナメル上皮歯牙肉腫；悪性エナメル上皮腫；エナメル上皮線維肉腫；悪性松果体腫；脊索腫；悪性神経膠腫；上衣腫；星細胞腫；原形質性星細胞腫；線維性星細胞腫；星芽細胞腫；神経膠芽腫；希突起神経膠腫；希突起神経膠芽細胞腫；原始神経外胚葉性腫��（primitive  neuroectodermal）；小脳肉腫；神経節芽腫；神経芽細胞腫；網膜芽細胞腫；嗅神経腫瘍；悪性髄膜腫；神経線維肉腫；悪性神経鞘腫（neurilemmoma,  malignant）；悪性顆粒細胞腫瘍；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキンリンパ腫；側肉芽腫；小リンパ球性悪性リンパ腫；びまん性大細胞型悪性リンパ腫；濾胞性悪性リンパ腫、；菌状息肉症；他の特定の非ホジキンリンパ腫；悪性組織球症；多発性骨髄腫；マスト細胞肉腫；免疫増殖小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；形質細胞白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞白血病；骨髄性白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；マスト細胞白血病；巨核芽球性白血病；骨髄性肉腫；および毛様細胞白血病。特定の実施形態では、本明細書に記載されるワクチンはいずれも、前述のがんのいずれかのがん幹細胞を標的とし得る。
【０２０８】
本明細書に記載される組成物は、経口的に、鼻に、経粘膜的に、眼に、直腸に、膣内に、非経口的に、例えば筋肉内、皮下、髄内注射、ならびに髄腔内、直接心室内、静脈内、関節内、胸骨内、滑膜内、肝内、病巣内、頭蓋内、腹腔内、鼻腔内または眼内注射、槽内に、局所に、粉剤・散剤、軟膏剤または滴剤（点眼薬を含む）により、例えば頬側および舌下に、経皮的に、吸入スプレー、または当技術分野で公知の他の送達様式を含む任意の適切な投与経路により送達され得る。
【０２０９】
本明細書で使用される場合、「全身投与」、「全身投与される」、「末梢投与」および「末梢投与される」という用語は、それが患者の系に入って代謝および他の類似のプロセスに供されるように、本明細書に記載されるワクチン組成物を投与することを意味する。
【０２１０】
本明細書で使用される場合、「非経口投与」および「非経口投与される」という用語は、経腸および局所投与以外の通常は注射による投与様式を意味し、限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内（ｉｎｔａｒｔｅｒｉａｌ）、髄腔内、嚢内、眼窩内、眼内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内および胸骨内の注射および注入を含む。
【０２１１】
特定の実施形態では、医薬組成物は、（例えば、経口または非経口投与により）全身送達される。特定の他の実施形態では、医薬組成物は、腫瘍中に直接注射または腫瘍の血液供給（例えば、動脈または静脈の血液供給）中に直接注射によって局所送達される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、全身的および局所投与の両方により送達される。例えば、腫瘍を有する被験体は、本発明の医薬組成物の経口投与と組み合わせて、本明細書に記載される組成物を含有する組成物を腫瘍または腫瘍の血液供給に直接注射することにより処置され得る。局所投与および全身投与が両方とも使用される場合、局所投与は、全身投与の前に、それと併せておよび／またはその後に行われ得る。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、本発明の主題医薬組成物は、予防的処置または治療的処置の一部として組み込まれた治療有効量の治療剤または他の材料を患者に送達するために十分な量で、送達すべき単一または複数の物質を組み込む。粒子中の活性化合物の所望の濃度は、薬物の吸収、不活性化、および排泄速度ならびに化合物の送達速度に依存する。投与量の値もまた、緩和すべき状態の重症度で変動し得ることに留意すべきである。任意の特定の被験体のために、特定の投与量のレジメンは、個体の要求および組成物の投与者または投与監督者の専門的判断にしたがって、経時的に調整されるべきであることをさらに理解すべきである。典型的には、投与は、当業者に公知の技術を使用して決定される。
【０２１３】
投与量は、患者の体重１ｋｇ当たりの１つまたはそれを超えるワクチン組成物（例えば、１つまたはそれを超える上記のとおりのＱβ野生型またはＱβ変異体、抗原コンジュゲート）の量に基づくものであり得る。例えば、その中に封入された組成物または化合物の量の範囲は、患者の体重１ｋｇ当たり約０．００１、０．０１、０．１、０．５、１、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００または２５０ｍｇまたはそれを超える上記組成物を含むことが企図される。他の量は当業者に公知であり、容易に決定される。
【０２１４】
特定の実施形態では、１つまたはそれを超えるワクチン組成物（例えば、１つまたはそれを超える上記のとおりのＱβ野生型またはＱβ変異体、抗原コンジュゲート）の投与量は、一般に、体重１ｋｇ当たり約０．００１ｍｇ〜約２５０ｍｇの範囲内、具体的には１ｋｇ当たり約５０ｍｇ〜約２００ｍｇの範囲内、より具体的には１ｋｇ当たり約１００ｍｇ〜約２００ｍｇの範囲内である。一実施形態では、投与量は、１ｋｇ当たり約１５０ｍｇ〜約２５０ｍｇの範囲内である。別の実施形態では、投与量は、１ｋｇ当たり約２００ｍｇである。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、医薬組成物中の１つまたはそれを超えるワクチン組成物（例えば、１つまたはそれを超える上記のとおりのＱβ野生型またはＱβ変異体、抗原コンジュゲート）のモル濃度は、約２．５Ｍ、２．４Ｍ、２．３Ｍ、２．２Ｍ、２．１Ｍ、２Ｍ、１．９Ｍ、１．８Ｍ、１．７Ｍ、１．６Ｍ、１．５Ｍ、１．４Ｍ、１．３Ｍ、１．２Ｍ、１．１Ｍ、１Ｍ、０．９Ｍ、０．８Ｍ、０．７Ｍ、０．６Ｍ、０．５Ｍ、０．４Ｍ、０．３Ｍまたは０．２Ｍ未満であるかまたはそれに等しい。いくつかの実施形態では、１つまたはそれを超えるワクチン組成物（例えば、１つまたはそれを超える上記のとおりのＱβ野生型またはＱβ変異体、抗原コンジュゲート）の濃度は、約０．１０ｍｇ／ｍｌ、０．０９ｍｇ／ｍｌ、０．０８ｍｇ／ｍｌ、０．０７ｍｇ／ｍｌ、０．０６ｍｇ／ｍｌ、０．０５ｍｇ／ｍｌ、０．０４ｍｇ／ｍｌ、０．０３ｍｇ／ｍｌまたは０．０２ｍｇ／ｍｌ未満であるかまたはそれに等しい。
【０２１６】
本発明の組成物中の有効成分の実際の投与量レベルは、特定の患者に対する毒性を伴わずに、その患者のための所望の治療反応、組成物、および投与様式を達成するために有効な有効成分の量を得るように変更し得る。
【０２１７】
選択された投与量レベルは、用いられる製剤中の特定の治療剤、またはそれらのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、用いられる特定の治療剤の排泄または代謝の速度、処置の持続時間、用いられる特定の化合物と組み合わせて用いられる他の薬物、化合物および／または材料、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、一般的健康および以前の病歴を含む様々な因子、および医学技術で周知の同様な要因に依存する。
【０２１８】
当技術分野の通常の技術を有する医師または獣医は、必要とされる医薬組成物の有効量を容易に決定して処方し得る。例えば、医師または獣医は、医薬組成物において用いられる本発明の化合物の用量を、所望の治療効果を達成するために必要なものよりも低いレベルで処方および／または投与し、所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増加させ得る。
【０２１９】
一般に、本発明の化合物の適切な日用量は、治療効果をもたらすために有効な最低の用量である化合物のその量である。このような有効用量は、一般に、上記要因に依存する。
【０２２０】
所望であれば、活性化合物の有効な日用量は、１日を通して適切な間隔で、必要に応じて単位剤形で、別々に投与される２、３、４、５、６つまたはそれを超える部分用量として投与され得る。
【０２２１】
所定の患者で最も有効な処置をもたらす任意の特定の化合物の投与の正確な時期および量は、特定の化合物の活性、薬物動態、およびバイオアベイラビリティ、患者の生理学的状態（年齢、性別、疾患のタイプおよびステージ、一般的な身体状態、与えられる投与量に対する応答性および薬物療法のタイプを含む）、投与経路などに依存する。本明細書で提供される指針は、処置を最適化するために、例えば投与の最適の時および／または量を決定するために使用され得、これは、被験体のモニタリングおよび投与量および／またはタイミングの調整からなる日常的実験を超えることを必要としない。
【０２２２】
被験体が処置される間、患者の健康は、２４時間中所定の時間に、１つまたはそれを超える関係のある指標を測定することによりモニタリングされ得る。サプリメント、量、投与の時間および製剤を含む処置のすべての態様は、このようなモニタリングの結果により最適化され得る。患者は、同じパラメータを測定することにより、改善の程度を決定するために定期的に再評価され得、最初のこのような再評価は、典型的には、治療の開始から４週間の終了時に行われ、その後の再評価は、治療中には４〜８週間ごとに、次いでその後は３カ月ごとに行われる。治療は、数カ月間または数年間さえ継続し得、最低１カ月間がヒトのための治療の典型的な長さである。例えば、投与される薬剤の量（複数可）および投与の時間の調整は、これらの再評価に基づいて行われ得る。
【０２２３】
処置は、化合物の最適用量未満であるより少ない投与量で開始され得る。その後、投与量は、最適な治療効果が達成されるまで少しずつ増加され得る。
【０２２４】
上記のように、１つまたはそれを超えるワクチン組成物（例えば、１つまたはそれを超える上記のとおりのＱβ野生型またはＱβ変異体、抗原コンジュゲート）は、放射線療法と組み合わせて投与され得る。放射線療法の最適化線量は、被験体に日線量として与えられ得る。放射線療法の最適化日線量は、例えば約０．２５〜０．５Ｇｙ、約０．５〜１．０Ｇｙ、約１．０〜１．５Ｇｙ、約１．５〜２．０Ｇｙ、約２．０〜２．５Ｇｙおよび約２．５〜３．０Ｇｙであり得る。例示的な日線量は、例えば約２．０〜３．０Ｇｙであり得る。例えば、腫瘍がより低線量の放射線に対して耐性である場合、より高線量の放射線が投与され得る。高線量の放射線は、例えば４Ｇｙに達し得る。さらに、処置過程にわたって投与される放射線の総線量は、例えば約５０〜２００Ｇｙの範囲であり得る。例示的な実施形態では、処置過程にわたって投与される放射線の総線量は、例えば約５０〜８０Ｇｙの範囲である。特定の実施形態では、放射線の線量は、例えば１、２、３、４または５分間の時間間隔で与えられ得、時間量は、放射線源の線量率に依存する。
【０２２５】
特定の実施形態では、最適化放射線の日線量は、例えば約４〜８週間にわたって１週間に４または５日間投与され得る。代替的な実施形態では、最適化放射線の日線量は、約４〜８週間にわたって１週間に７日間毎日投与され得る。特定の実施形態では、放射線の日線量は、単回投与で与えられ得る。あるいは、放射線の日線量は、複数回投与として与えられ得る。さらなる実施形態では、放射線の最適化線量は、日常的に（on  a  daily  base）患者が許容し得るよりも高い線量の放射線であり得る。このように、高線量の放射線は、ただし低頻度の投与レジメンで、患者に投与され得る。
【０２２６】
がん処置で使用され得る放射線のタイプは当技術分野で周知であり、リニア加速器からのまたは放射線源、例えばコバルトもしくはセシウム、陽子および中性子からの電子ビーム高エネルギー光子を含む。例示的なイオン化放射線は、Ｘ線放射線である。
【０２２７】
放射線を投与する方法は、当技術分野で周知である。例示的な方法としては、限定されないが、外照射、内照射および放射性医薬が挙げられる。外照射では、リニア加速器は、高エネルギーＸ線を、がんに罹患している身体領域に送達するために使用される。放射線源は体外に由来するので、外照射は、均一な線量の放射線で広い身体領域を処置するために使用され得る。小線源療法としても公知の内照射療法は、身体における特定の部位に高線量の放射線を送達することを含む。内照射療法の２つの主要なタイプとしては、放射線源を影響を受けた組織（effected  tissue）に置く組織内照射と、放射線源を罹患領域から短い距離の内部体腔に置く腔内照射とが挙げられる。放射性物質もまた、腫瘍特異的抗体への結合により腫瘍細胞に送達され得る。内照射療法で使用される放射性物質は、典型的には、小さなカプセル、ペレット、ワイヤー、チューブまたはインプラントに含められる。対照的に、放射性医薬は、経口投与され得るか、静脈内投与され得るか、または体腔に直接投与され得る非密封放射線源である。
【０２２８】
放射線療法として、リニア加速器またはガンマナイフを使用して正確な量の放射線を小さな腫瘍領域に送達し得る定位的手術または定位的放射線療法と、照射処置前に腫瘍の位置をマッピングするコンピューター支援療法である３次元原体照射療法（３ＤＣＲＴ）とが挙げられ得る。
【０２２９】
対象化合物の毒性および治療的有効性は、例えばＬＤ５０およびＥＤ５０を決定するための細胞培養または実験動物における標準の薬学的手順により決定され得る。大きな治療指数を示す組成物が好ましい。いくつかの実施形態では、ＬＤ５０（致死的投与量）が測定され得、例えば、本明細書に記載される１つまたはそれを超えるワクチン組成物（例えば、１つまたはそれを超える上記のとおりのＱβ野生型またはＱβ変異体、抗原コンジュゲート）では、対照と比べて少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％またはそれを超えて低くなり得る。同様に、ＥＤ５０（すなわち、症状の最高の阻害の半分を達成する濃度）が測定され得、例えば、本明細書に記載される１つまたはそれを超えるワクチン組成物（例えば、１つまたはそれを超える上記のとおりのＱβ野生型またはＱβ変異体、抗原コンジュゲート）では、対照と比べて少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％またはそれを超えて大きくなり得る。また同様に、ＩＣ５０（すなわち、がん細胞に対する最高の細胞傷害性または細胞増殖抑制効果の半分を達成する濃度）が測定され得、例えば、本明細書に記載される１つまたはそれを超えるワクチン組成物（例えば、１つまたはそれを超える上記のとおりのＱβ野生型またはＱβ変異体、抗原コンジュゲート）では、対照と比べて少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％またはそれを超えて大きくなり得る。毒性副作用を示す化合物が使用され得るが、副作用を減少させるために、化合物を所望の部位に向ける送達システムを設計するように注意するべきである。
【０２３０】
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、アッセイにおいて、がん細胞成長の少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはさらに１００％阻害をもたらす。
【０２３１】
上記方法ではいずれも、１つまたはそれを超えるワクチン組成物（例えば、１つまたはそれを超える上記のとおりのＱβ野生型またはＱβ変異体、抗原コンジュゲート）の投与は、ワクチン組成物の投与前の固形悪性腫瘍と比較して、被験体における固形悪性腫瘍の少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはさらに１００％減少をもたらし得る。
【０２３２】
いくつかの実施形態では、１つまたはそれを超えるワクチン組成物（例えば、１つまたはそれを超える上記のとおりのＱβ野生型またはＱβ変異体、抗原コンジュゲート）の治療有効量は、被験体における固形悪性腫瘍の形成を予防するために予防的に投与される。
【０２３３】
いくつかの実施形態では、被験体はヒトである。他の実施形態では、被験体は、哺乳動物などの非ヒトである。
【０２３４】
細胞培養アッセイおよび動物の研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のために一定範囲の投与量の製剤化において使用され得る。任意のサプリメントまたはあるいはその中の任意の成分の投与量は、好ましくは、毒性をほとんどまたは全く伴わないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、用いられる剤形および利用される投与経路に応じてこの範囲内で変動し得る。本発明の薬剤では、治療有効用量は、細胞培養アッセイから最初に推定され得る。用量は、細胞培養で決定されたＩＣ５０を含む循環血漿濃度範囲を達成する動物モデルで製剤化され得る。このような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用され得る。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーにより測定され得る。
【実施例】
【０２３５】
例示
以下の実施例は、本開示の主題の代表的な実施形態の実施について指針を当業者に提供するために含まれている。本開示および当該分野の技術の一般的なレベルを考慮して、当業者は、以下の実施例が単なる例示目的であり、本開示の主題の範囲から逸脱せずに多数の変更、改変および変化が用いられ得ることを認識し得る。以下の実施例は、限定ではなく例示として提供される。
実施例１：材料および方法
ｉ．ＱβＶＬＰの部位特異的変異誘発
【０２３６】
ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）部位特異的変異誘発キットオンラインベースのソフトウェアＰｒｉｍｅｒＸ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｏｒｇ／ｐｒｉｍｅｒｘ／）のマニュアルにおける指針にしたがってプライマーを設計し、これを使用してプライマー配列を生成したが、またはいくつかの場合では前記配列を手動で設計し得る。重ねてＩＤＴ  ＩｎｃのＯｌｉｇｏａｎａｌｙｚｅｒ  ３．１により、適切な％ＧＣおよびＴｍについて、さらに、設計したプライマーを分析した。すべてのプライマーは、ＩＤＴ  Ｉｎｃ．により商業的に合成された。ＰＣＲ反応のために、以下のようにそれぞれ試薬を添加することにより、試薬混合物を調製しサイクリングを設定する：
表１．ＰＣＲ試薬
【表１】
2020531544.tif 000013
表２．ＰＣＲサーモサイクラー設定
【表２】
2020531544.tif 000014
【０２３７】
ＰＣＲ反応後、得られた反応物に１μｌのＤｐｎＩを添加し、３７℃で１時間インキュベートして、テンプレートプラスミドＤＮＡを消化した。染色試薬として臭化エチジウムを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動により、反応の生成物を検証した。次いで、反応物を精製せずに使用して、ＤＨ５α大腸菌を形質転換した。形質転換ＤＨ５α大腸菌培養物を、２０μｇ／ｍＬ硫酸カナマイシンを含むＳＯＢ寒天プレートにプレーティングし、３７℃で一晩インキュベートした。４〜６個のコロニーを選択して、２０ｕｇ／ｍＬのカナマイシンを含む６ｍＬのＳＯＢに接種し、３７℃で一晩インキュベートして大腸菌を増幅させた。ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、細菌培養物由来の変異ＤＮＡプラスミドを抽出した。配列決定のために、抽出したプラスミドをＧＥＮＥＷＩＺに提出した。最高のシーケンシングクオリティスコアを有する正確なＤＮＡ配列を提供する変異プラスミドのプラスミドを、熱ショック法によるＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ大腸菌への形質転換に使用し、次いで、ＤＨ５α大腸菌としてＳＯＢ寒天プレートにプレーティングした。タンパク質発現のために、単一コロニーを選択した。
表３：変異体βＶＬＰの構築に使用したプライマー
【表３−１】
2020531544.tif 000015
【表３−２】
2020531544.tif 000016
ｉｉ．Ｑβウイルスカプシドタンパク質の発現および精製
【０２３８】
変異プラスミドを含むＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ大腸菌の単一コロニーを選択して、２０ｕｇ／ｍＬカナマイシンを含有する５０ｍＬのＳＯＣの開始培養物に接種した。開始培養物を３７℃、２３０ｒｐｍで一晩成長させた。一晩後、次いで、得られた混濁培養物を、抗生物質選択の１Ｌの培養培地に移した。ＯＤ６００が０．７〜１．０になるまで培養を同じ条件で継続し、次いで、１ｍＬの１Ｍイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を培養物に添加して、タンパク質発現を誘導した（最終濃度＝１ｍＭ）。培養を４〜５時間継続した。４〜５時間後、細菌を６，０００ｒｐｍで３０分間ペレット化した。培養培地を廃棄した。ペレットを０．１Ｍ  ＰＢＳ  ｐＨ７に再懸濁した。次いで、プローブソニケーターを用いて、懸濁液中の細菌を氷浴中で溶解させた。超音波発生器を１０分間で３０％の出力に設定し、５秒間のパルスおよび５秒間の停止の間隔とした。溶解物を１４，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。カプシドタンパク質を含有する上清に、１０％（ｗ／ｖ）の最終濃度までＰＥＧ８０００を添加し、ニューテイションミキサー上に４℃で一晩置いて、完全なタンパク質沈殿を可能にした。沈殿物を１４，０００ｒｐｍで２０分間ペレット化した。ペレットを０．１Ｍ  ＰＢＳ  ｐＨ＝７に再懸濁した。混合物がコロイドになるまで、再懸濁溶液を１：１（ｖ／ｖ）のクロロホルム／ｎ−ブタノールと１：１（ｖ／ｖ）混合した。コロイド混合物を７，０００ｒｐｍで１時間遠心分離して、層を分離した。上（水）層を収集した。収集した水層中のウイルスカプシドタンパク質を、スクロース密度勾配１０〜４０％（ｗ／ｖ）によりさらに精製した。凍結融解法（Ｌｕｔｈｅ，Ｄ．Ｓら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９８３，１３５（１），２３０−２３２．）にしたがって、線形（連続）スクロース勾配を調製した。ロードしたスクロース勾配を、スイングバケットローターＳＷ３２ローターを用いて２８，０００ｒｐｍで５時間遠心分離した。チューブの上部を通してＬＥＤ光をあてて、ウイルスカプシドのバンドを視覚化し得る。散乱光からの明青色のバンドを１ｍＬの画分として収集した。カラムＳｕｐｅｒｏｓｅ  ６樹脂１０／３００（空隙容量＝９ｍＬ）を使用してサイズ排除クロマトグラフィーにより、カプシドの純度について、収集画分を分析した。１１〜１５ｍＬ付近の溶出において単一のピークを示す画分を、純粋なＶＬＰを含有する画分として決定した。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  １００ｋ  ＭＷＣＯ遠心フィルタチューブを通した濾過により、収集画分中の残存スクロースを除去し、ＰＢＳバッファーで十分に洗浄した。標準としてウシ血清アルブミンを使用して、Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡプロテインアッセイキットにより、最終溶液中の総タンパク質濃度を定量した。サイズ排除クロマトグラフィー、動的光散乱（ＤＬＳ）および透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）により、粒子のサイズ、均一性、形状および純度について、精製ＶＬＰを特性評価した。野生型Ｑβ（ｗｉｄｅ−ｔｙｐｅ  Ｑβ）と比較した分子量の差異により、変異の結果としてのアミノ酸（複数可）の変化を決定した。ＬＣＭＳ  ＱＴＯＦ  ＥＳＩ質量分析によりタンパク質の���子量を決定し、最大エントロピーデコンボリューションアルゴリズム（ＭａｘＥｎｔ（商標）１）（Ｄａ  Ｒｅｎ，Ｈら、Ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ；Ｗｒｉｇｈｔ，Ｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５４（６３１２）ｐｉｉ：ａａｇ１４６５  ２０１６）により、多重電荷質量スペクトルを単一電荷に変換した。
ｉｉｉ．ＱβまたはｍＱβコンジュゲートの合成および特性評価（Ｙｉｎ，Ｚら、ＡＣＳ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１５，１０（１０），２３６４−２３７２）
【０２３９】
リン酸カリウムバッファー（０．１Ｍ、ｐＨ＝７、５．５ｍＬ）に懸濁した１３．２ｍｇのＶＬＰ  ＱβまたはｍＱβ（５．１ｎｍｏｌの粒子、０．９μｍｏｌのサブユニット、３．６μｍｏｌの反応性アミン）を１５ｍＬファルコンチューブに添加した。０．３５ｍＬのＤＭＳＯを溶液にゆっくりと滴下した。Ｔｎ１−ＮＨＳまたはＴｎ２−ＮＨＳ（０．３５ｍＬ中２０ｍｇ／ｍＬ、０．０１７ｍｍｏｌ、反応性アミンに対して４．７当量）を反応チューブに添加した。反応混合物を回転ミキサー上、室温で一晩回転させた。反応物を０．１Ｍ  ＰＢＳ  ｐＨ＝７で総容量５０ｍＬに希釈した。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  １００ｋ  ＭＷＣＯ遠心フィルタチューブを通した濾過によりＶＬＰコンジュゲートを精製し、ＰＢＳバッファーで十分に洗浄した。精製ＶＬＰコンジュゲートを上記のように特性評価した。ＬＣＭＳ分析からのデコンボリューション質量スペクトルにおけるピークの強度から、各ウイルスカプシドサブユニット上のコンジュゲートＴｎ１またはＴｎ２の平均数を推定した。結果は、図２２Ａ〜２２Ｍに示されている。
ｉｖ．サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
【０２４０】
Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ６  Ｉｎｃｒｅａｓｅ  １０／３００  ＧＬカラムを備えるＡＫＴＡｐｕｒｅ  ２５Ｌシステムにより、ＳＥＣ分析および精製を実施した。０．１Ｍリン酸カリウムバッファーｐＨ＝７を、０．５ｍＬ／分の流速、４℃で溶離液として使用した。波長２８０ｎｍでＵＶ検出器を用いて、カプシドタンパク質を検出した。０．５ｍＬのサンプルを注入した。サンプルを１．５カラム容量で溶出させ、１ｍＬごとに画分を収集した。結果は、図２３Ａ〜２３Ｉに示されている。
ｖ．非変性アガロースゲル
【０２４１】
被包ＲＮＡのための染色試薬としてＳＹＢＲ  Ｓａｆｅ  ＤＮＡゲル染色液を含むＰＢＳ中の０．７％アガロースゲルに、ウイルスカプシドサンプル（３０μｇの各カプシドタンパク質）をロードした。電気泳動を、ＴＥＡ（トリス−酢酸−ＥＤＴＡ）バッファー中、４℃で４時間実施した。ＵＶ光により被包ＲＮＡバンドを可視化した後、その後、ゲルをクーマシーブルー染色で染色して、カプシドタンパク質を検出した。
ｖｉ．温度可変ＵＶ−Ｖｉｓ分光法によるウイルスカプシドの熱安定性測定
【０２４２】
リン酸カリウムバッファー（０．１Ｍ、ｐＨ＝７）中１ｍｇ／ｍＬのＶＬＰを、標準溶液としてのバッファーに対して測定した。サンプルおよび標準バッファーのセルとして、キャップを有する１ｃｍ石英キュベットを使用した。Ｃａｒｙ温度可変コントローラー（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を備えるＶａｒｉａｎ  Ｃａｒｙ  １  Ｂｉｏ  ＵＶ−Ｖｉｓ分光法により、測定を行った。波長を３１０ｎｍに設定したが、これは、この波長が、変性タンパク質を検出するための最も高い感度を与えるためである（図２４）。５℃／分の速度で２５℃から６０℃まで温度を変化させて１℃ごとに吸光度を測定し、次いで、１℃／分の速度で６０℃から９０℃まで温度を変化させて０．５℃ごとに吸光度を測定した。
ｖｉｉ．動的光散乱（ＤＬＳ）および透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）
【０２４３】
Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ｚｓ機器により、流体力学的直径およびゼータ電位を評価した。Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｇｒａｐｈイメージングソフトウェアを有するＧａｔａｎマルチスキャンＣＣＤカメラを使用して、２００ｋＶで動作するＪＥＭ−２２００ＦＳにより、ＴＥＭ画像を収集した。極薄カーボンタイプＡ、４００メッシュ銅グリッドまたは、高分解能ＴＥＭ用のホーリーカーボン支持膜上の極薄Ｃフィルム、４００メッシュＣｕ（Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ，Ｉｎｃ．）上に、サンプルを調製した。水性２％酢酸ウラニルにより、ウイルスカプシドを染色した。結果は、図２５に示されている。
ｖｉｉｉ．免疫研究（Ｙｉｎ，Ｚら、ＡＣＳ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１５，１０（１０），２３６４−２３７２）
【０２４４】
Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから６〜１０週齢の病原体未感染Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスを入手し、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  ｆａｃｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｈｉｇａｎ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙにおいて維持した。すべての動物管理手順および実験プロトコールは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）ｏｆ  Ｍｉｃｈｉｇａｎ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙにより承認されている。０日目に、完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｆ５８８１）中０．１ｍＬの様々なＱβ構築物をエマルジョンとして、１群当たり５匹のマウスの首筋下に皮下注射し、１４日目および２８日目に、不完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｆ５５０６）中０．１ｍＬの様々なＱβ構築物をエマルジョンとして、ブースターを首筋下に皮下投与した。投与したＴｎワクチン構築物はすべて、同じ量のＴｎ抗原（１．９３μｇ）を有する。０日目（免疫前）、７日目および３５日目に、血清サンプルを収集した。心臓脱血により、最終的な脱血を行った。
ｉｘ．酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）
【０２４５】
Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）平底９６ウェルプレートを、ＰＢＳ  ｐＨ＝７．４中ＢＳＡ−Ｔｎ（１０ｕｇ／ｍＬ）または対応するＱβカプシド（１ｕｇ／ｍＬ）により４℃で一晩コーティングした。次いで、コーティングプレートをＰＢＳ／０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）で４回洗浄し、続いて、ＰＢＳ中１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで再び４回洗浄した。０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中マウス血清の１００μｌの希釈物を各ウェルに添加した（競合ＥＬＩＳＡでは、希釈血清を５０μｇのウイルスカプシドと共に３７℃で１時間インキュベートしてから、プレートに添加した）。プレートを３７℃で２時間インキュベートし、洗浄した。０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中１：２０００希釈西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃ、ＩｇＧ３またはＩｇＭ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ＩｇＧ  ＃１１５−０３５−０７１，ＩｇＭ  ＃１１５−０３５−０７５）をそれぞれ各ウェルに添加した。プレートを３７℃で１時間インキュベートし、洗浄し、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）の溶液を添加した。１５分間発色させた後、次いで、０．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４（５０μｌ）の溶液を添加して、反応を停止させた。マイクロプレートオートリーダー（ＢｉｏＲａｄ）を使用して、光学密度を４５０ｎｍで測定した。各実験を少なくとも４回繰り返し、４回反復の平均を使用して力価を計算した。光学密度でプロットしたｌｏｇ１０希釈の回帰分析により、力価を決定した。ＯＤ＝０．３を与える最高希釈度として、力価を計算した。
ｘ．細胞培養
【０２４６】
１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、最小必須培地非必須アミノ酸、ペニシリンＧおよびストレプトマイシンそれぞれ１００  Ｕ／ｍＬを補充したＲＰＭＩ  １６４０中で、ヒトリンパ腫ジャーカット細胞（Ｐｒｏｆｓ．Ｂａｒｂａｒａ  Ｋａｐｌａｎ  ａｎｄ  Ｎｏｒｂｅｒｔ  Ｋａｍｉｎｓｋｉ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙによる寄贈）を培養した。
【０２４７】
マウス乳腺腺癌細胞株ＴＡ３Ｈａ（Ｐｒｏｆ．Ｊｏｈｎ  Ｈｉｌｋｅｎｓ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによる寄贈）を、継代成長させているＡ／Ｊマウスから収集した腹水から単離した。ＲＰＭＩ１６４０、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリンおよび１００Ｕ／ｍＬストレプトマイシンを使用して、細胞を培養した。
ｘｉ．フローサイトメトリー実験
【０２４８】
培養物から細胞を採取した。ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ中５％ＦＢＳ、０．１％ＮａＮ３）に懸濁した細胞を、１：２０希釈マウス血清と共に氷上で３０分間インキュベートした。細胞懸濁液を１６００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離して、未結合抗体を除去した。次いで、細胞結合ＩｇＧ抗体を、ＦＩＴＣとコンジュゲートされたヤギ抗マウスＩｇＧ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，４０５３０５）で、３０分間標識した。過剰な二次抗体を洗い流し、細胞をＦＡＣＳバッファーに懸濁した。ＬＳＲ  ＩＩ（ＢＤ）を用いて細胞の取得を実施し、ＦｌｏｗＪｏ（登録商標）ソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ  Ｉｎｃ．）を用いてデータを分析した。
ｘｉｉ．抗腫瘍免疫保護（腫瘍チャレンジ）
【０２４９】
免疫の３５日目の後、３６日目に、ＴＡ３Ｈａの５，０００個の細胞をＣ５７ＢＬ／６マウス群（ｎ＝１０）に腹腔内注射した。３７日目に、シクロホスファミド（５０ｍｇ／ｋｇ）をマウスに腹腔内注射した。マウスの生存を３０日間モニタリングした。ログランク検定を使用してＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いて、生存の統計分析を実施した。
ｘｉｉｉ．液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣＭＳ）
【０２５０】
以下の手順を用いて、ＬＣＭＳのためのサンプルを調製した：１：１ｖ／ｖの４０μｇ／ｍＬ  ＶＬＰストック溶液および１００ｍＭ  ＤＴＴを混合し、水浴中、３７℃で３０分間インキュベートした。１滴の５０％ギ酸を混合物に添加した。サンプルはＬＣＭＳの準備が整っている。Ｗａｔｅｒｓ  Ｘｅｖｏ  Ｇ２−ＸＳ四重極／飛行時間型ＵＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより、ＬＣＭＳを実施した。４０℃のカラム温度で、水中９５％０．１％ギ酸からＡＣＮ中９５％０．１％ギ酸への勾配溶離液（０．３ｍＬ／分の流速）を使用して、ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ（登録商標）ペプチドＢＥＨ  Ｃ１８カラム，１３０Å，１．７μｍ，２．１ｍｍ×１５０ｍｍにより、液体クロマトグラフィーを行った。アルゴリズムＭａｘＥｎｄ１（Ｄａ  Ｒｅｎ，Ｈら、Ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ）を使用して、多重電荷質量スペクトルを単一電荷に変換した。質量スペクトルの信号強度により、Ｔｎ／サブユニットの平均数を分析した。結果は、図２２Ａ〜２２Ｍに示されている。
ｘｉｖ．透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）の画像
【０２５１】
図２５および上記セクションｖｉｉを参照のこと。
ｘｖ．Ｔｎ１およびＴｎ２の合成
【０２５２】
合成スキームについては、図２６を参照のこと。
【０２５３】
すべての化学物質は試薬グレードであり、特に指定のない限り、製造業者から受領したまま使用した。Ａｇｉｌｅｎｔ−５００Ｍ分光計により１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを記録し、ＭｅｓｔＲｅＮｏｖａバージョン１０．０．２により処理した。
合成手順
Ｎ−（フルオレン−９−イルメトキシカルボニル）−Ｏ−（３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−アジド−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｌ−セリンベンジルエステル（ＳＩ−１１）（Ｌｕｄｅｋ，Ｏら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０１０，３４５（１４），２０７４−２０７８）
【０２５４】
トリクロロアセトイミデートＳＩ−５（４９）（３．０１ｇ、６．３３ｍｍｏｌ）およびＮ−Ｆｍｏｃ−Ｏ−Ｂｎ−セリンＳＩ−１０（Ｍｕｋａｉ，Ｓら、Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ２０１２，４３（２），８５７−８７４）（２．２ｇ、５．２８ｍｍｏｌ）を、反応フラスコ中、窒素ガス下、新たに活性化したモレキュラーシーブ４Ａ（１０ｇ）と混合した。無水ＤＣＭ：ジオキサン（１：１、６０ｍＬ）を添加して混合物を溶解させ、溶液を室温で３０分間撹拌放置した。ＴＭＳＯＴｆ（０．２９７ｍＬ、１．９２５ｍｍｏｌ）を反応物に滴下により添加した。反応物を室温で１時間撹拌放置した。反応のモニタリングにより、いくらかの出発材料ＳＩ−５が残っている場合、さらに０．１当量のＴＭＳＯＴｆをさらに添加し、反応をさらに１時間進行させた。完了後、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を添加して、反応をクエンチした。反応物をＤＣＭで希釈し、０．１Ｍ  ＨＣｌ、次いで水で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、次いで濃縮した。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル；３：１ＥｔＯＡｃ：ヘキサン）により精製して、ＳＩ−１１（アルファ）（２．２３ｇ、５８％）を得た。報告されている文献（Ｌｕｄｅｋ，Ｏら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０１０，３４５（１４），２０７４−２０７８）と比較した生成物のスペクトル分析により、生成物の同一性が確認された。
【化９】
2020531544.tif 000017
【０２５５】
Ｎ−（フルオレン−９−イルメトキシカルボニル）−Ｏ−（３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｌ−セリンベンジルエステル（ＳＩ−１２）（Ｍｉｅｒｍｏｎｔ，Ａら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ−Ａ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２００８，１４（１６），４９３９−４９４７）：
【０２５６】
報告されている文献（Ｍｉｅｒｍｏｎｔ，Ａら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ−Ａ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２００８，１４（１６），４９３９−４９４７）から、合成手順を改変した。化合物ＳＩ−１１（２．４１ｇ、３．３０ｍｍｏｌ）を３：２：１のＴＨＦ：Ａｃ２Ｏ：ＡｃＯＨ（６０ｍＬ）に溶解させた。亜鉛末（２．７２ｇ、４１．２３ｍｍｏｌ）を添加し、次いで、５ｍＬの飽和ＣｕＳＯ４水溶液を添加して亜鉛を活性化した。反応物を室温で約３０分間撹拌した。ＴＬＣによるモニタリングで完了後、反応混合物をＣｅｌｉｔｅ（登録商標）に通して濾過することにより、亜鉛末を除去した。濾液をトルエンと共蒸発させて、粗生成物を濃縮した。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル；１：１ＥｔＯＡｃ：ヘキサン）により精製して、ＳＩ−１２（２．２４ｇ、９１％）を得た。報告されている文献と比較した生成物のスペクトル分析により、生成物の同一性が確認された。
【化１０】
2020531544.tif 000018
【化１１】
2020531544.tif 000019
Ｎ−（フルオレン−９−イルメトキシカルボニル）−Ｏ−（３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｌ−セリン（ＳＩ−１３）（Ｍｉｅｒｍｏｎｔ，Ａら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ−Ａ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２００８，１４（１６），４９３９−４９４７）
【０２５７】
合成手順は、報告されているとおりであった（Ｍｉｅｒｍｏｎｔ，Ａら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ−Ａ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２００８，１４（１６），４９３９−４９４７）。この反応により、生成物ＳＩ−１３（０．８８ｇ、９８％）が得られた。報告されている文献（Ｍｉｅｒｍｏｎｔ，Ａら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ−Ａ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２００８，１４（１６），４９３９−４９４７）と比較した生成物のスペクトル分析により、生成物の同一性が確認された。
Ｎ−（フルオレン−９−イルメトキシカルボニル）−Ｏ−（３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｌ−セリン２−エタノリルアミド（ＳＩ−１４）：
【０２５８】
化合物ＳＩ−１３（１．９０ｇ、２．８９ｍｍｏｌ）を含む１：１無水ＴＨＦ：ＤＣＭを、ＨＢＴＵ（１．２ｇ、３．１８ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（０．４３ｇ、３．１８ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（１．１ｍＬ、６．３７ｍｍｏｌ）を使用して室温で２０分間活性化した。エタノールアミン（０．２２ｍＬ、３．６２ｍｍｏｌ）を反応混合物に添加した。完了後、沈殿物を濾別し、濾液中の粗混合物を乾燥させ、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル；ヘキサン中２〜１０％メタノール）により精製して、１．８ｇ（８９％）を得た。報告されている文献と比較した生成物のスペクトル分析により、生成物の同一性が確認された（Ｍｉｅｒｍｏｎｔ，Ａら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ−Ａ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２００８，１４（１６），４９３９−４９４７）。
【化１２】
2020531544.tif 000020
Ｏ−２−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｌ−セリンまたはＯ−２−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｌ−セリン２−エタノリルアミド（Ｔｎ１またはＴｎ２）：
【０２５９】
合成手順は、報告されている文献（Ｍｉｅｒｍｏｎｔ，Ａら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ−Ａ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２００８，１４（１６），４９３９−４９４７）のとおりであった。化合物ＳＩ  １３（１００ｍｇ、０．１５２ｍｍｏｌ）またはＳＩ−１４（６６０ｍｇ、０．９４ｍｍｏｌ）を、Ｎ２下、０℃で５ｍＬのメタノール中７Ｎアンモニアに添加した。反応物を一晩かけて室温に温めた。完了後、Ｎ２ガスを流すことにより、溶媒を蒸発させた。粗反応混合物をＭｅＯＨに溶解させ、次いで、ＥｔＯＡｃで沈殿させた。濾液を乾燥させて、それぞれＴｎ１（４３．４ｍｇ、９２％）またはＴｎ２（３３０ｍｇ、９９％）を得た。
【化１３】
2020531544.tif 000021
【０２６０】
Ｎ−（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルアジポイル）−Ｏ−２−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｌ−セリンまたはＮ−（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルアジパチル）−Ｏ−２−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｌ−セリン２−エタノリルアミド（Ｔｎ１−ＮＨＳまたはＴｎ２−ＮＨＳ）：
【０２６１】
アジピン酸ジスクシンイミジル（５当量）を含む無水ＤＭＦ（０．５ｍＬ）を、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）に溶解させたＴｎ１（４０ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）またはＴｎ２（６６ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）に添加した。ＤＩＰＥＡ（１当量）を反応混合物に添加した。反応物を２〜３時間撹拌放置した。完了後、乾固までＤＭＦを真空下で蒸発させた。粗生成物をＥｔＯＡｃで２回沈殿させ、次いで、ＥｔＯＡｃ中１０％ＭｅＯＨで３〜５回洗浄して、過剰なジＮＨＳリンカーを除去した。最終沈殿物を真空下で乾燥させて、Ｔｎ１−ＮＨＳ（５０ｍｇ、７２％）を得た。
【化１４】
2020531544.tif 000022
【化１５】
2020531544.tif 000023
【０２６２】
実施例２：Ｑｂは高レベルの抗Ｑｂ  ＩｇＧ抗体を引き出すことができ、異種プライムおよびブースト戦略は、抗ＴＡＣＡ抗体に影響を与えずに抗Ｑｂ抗体応答を減少させる上で有効ではない
【０２６３】
Ｑｂカプシドに対する抗体応答を試験するために、１回のプライムワクチン接種および２回のブーストワクチン接種によるＴＡＣＡベースのワクチンの典型的なプロトコールにしたがって、マウスをＱｂで皮下免疫した。０日目に、プライム注射のための完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中のエマルジョンとしてＱｂを投与し、１４日目および２８日目に、ブースト注射のための不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）中のエマルジョンとして投与した。１回目の免疫後の３５日目に、これらのマウスから血清を収集した。ＥＬＩＳＡ分析により、非常に強い抗Ｑｂ  ＩｇＧレベルが生じたことが示されたが（３，１００，０００の平均ＩｇＧ力価）、これは、Ｑｂが、カプシドそれ自体に対する高レベルの抗体を生成し得ることを裏付けている。
【０２６４】
抗Ｑｂ応答を減少させるための１つの潜在的なアプローチは、複数のタイプのＶＬＰ−ＴＡＣＡコンジュゲートを調製することによる異種プライムおよびブースト戦略である。第１のＴＡＣＡコンジュゲートを使用して免疫系をプライムし、第２のＶＬＰ−ＴＡＣＡコンジュゲートはブースト注射に使用される。この戦略では、様々なキャリアからのＢ細胞エピトープが異なるので、ＴＡＣＡ抗原は、すべての注射に共通する唯一の成分である。したがって、抗ＴＡＣＡ免疫は、ブースト注射から最も利益を受けるはずである。しかしながら、異種プライムおよびブーストプロトコールにおいて、Ｑｂおよび別のＶＬＰ  ＣＰＭＶとの抗ＴＡＣＡコンジュゲートを試験した場合、抗Ｑｂ力価は依然として高レベルであったが、ＴＡＣＡ力価は実際には、ｗｔＱｂ−ＴＡＣＡをプライムおよびブーストの両方に使用した場合よりも低かった。これはおそらく、Ｑｂによる強力な免疫増強と、抗Ｔｎ抗体を生成するＣＰＭＶのより低い能力とによるものである。この考慮により、本発明者らは、Ｑｂ操作に集中するようになった。
実施例３：Ｑｂの主要なＢ細胞エピトープは線形配列内に存在しない
【０２６５】
抗Ｑｂ抗体は、Ｂ細胞によるＱβカプシド上のＢ細胞エピトープの認識（これは、抗Ｑｂ  Ｂ細胞の活性化および増殖ならびにその後の抗体産生をもたらす）から生じる。これらのＢ細胞エピトープを同定するために、本発明者らは、最初に、ペプチドスクリーニングを実施した（図１）。Ｑｂカプシドは、１３２個のアミノ酸残基を含有する単量体コートタンパク質の１８０コピーから構成される。本発明者らは、１５アミノ酸が重複する配列を有する８個の３０アミノ酸ペプチドを合成し、これらは、Ｑｂコートタンパク質の全配列をカバーしていた。ペプチドを個別にＥＬＩＳＡウェルに固定し、Ｑｂ免疫マウス由来の血清を各ウェルに添加して、ポリクローナル抗体によるペプチドの認識を試験した。図２に示されているように、合成ペプチドはいずれも、インタクトなカプシドと比較して、免疫後血清中の抗Ｑｂ  ＩｇＧ抗体への強い結合を示さなかった。これらの結果は、ＱｂのＢ細胞エピトープが線形配列内に存在しないことを示唆している。むしろ、それらは立体構造的である可能性が最も高い（すなわち、残基は、一次配列では遠く離れているが、三次構造では互いに近い）。
実施例４：抗Ｑｂ抗体レベルを減少させるためのＱｂ変異体の設計
【０２６６】
Ｑｂのエピトープを同定するために、１つの可能なアプローチは、１３２個のアミノ酸残基すべてを変異させ、抗Ｑｂ抗体への結合が減少したタンパク質をスクリーニングすることである。しかしながら、これは、多数の変異体を生成およびスクリーニングする、時間がかかりかつ大きな労働力を要するプロセスを必要とする。構造をより良く理解するために、本発明者らは、Ｑｂの結晶構造を取得した。ほぼ原子分解能の結晶構造は、本発明者らの変異体設計の有益な指針を提供する。
【０２６７】
本発明者らは、Ｂ細胞受容体の大きなサイズ（抗体のものに類似する）により、Ｂ細胞エピトープはＱｂカプシドの外表面上に存在する可能性が最も高く、嵩高いＢ細胞受容体と結合し得るように溶媒に十分に曝露されていると想定する。正２０面体ウイルスカプシド構造のデータベースであるＶＩＰＥＲｄｂにおいてＱｂをスクリーニングして、そのアクセス可能な表面プロファイルを決定した。図３に示されているように、アスパラギン１０（Ｎ１０）、リジン１６（Ｋ１６）、アラニン３８（Ａ３８）、トレオニン７５（Ｔ７５）、グルタミン酸１０３（Ｅ１０３）は中でも、外部溶媒への高いアクセス性を有する残基である。ＶＩＰＥＲｄｂの他に、不連続Ｂ細胞エピトープを予測するためのプログラムであるＤｉｓｃｏＴｏｐｅ２．０（Ｈａｓｔｅ  Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ｐら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００６，１５（１１），２５５８−２５６７）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＤｉｓｃｏＴｏｐｅ／）を使用して別の検索を実施したところ、Ｋ２、Ｋ１３、Ｋ１６、Ａ３８およびＴ７５は、Ｂ細胞エピトープの可能性が高い領域に存在することが示唆される。これらの予測は、ＶＩＰＥＲｄｂデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｖｉｐｅｒｄｂ．ｓｃｒｉｐｐｓ．ｅｄｕ／）から予測されるアクセス可能な表面プロファイルとよく相関するが（図４）、これは、これらの残基の変異がＱｂの固有Ｂ細胞エピトープを破壊し得る可能性があることを示唆している。
【０２６８】
変異体設計の別の要因は、偶然の発見に基づくものであった。Ｑｂのサブユニットを架橋した二活性化アジピン酸エステル＃でＱｂ−炭水化物コンジュゲートを処理した場合、有意に高い抗炭水化物抗体応答が得られた。二官能性リンカー＃による架橋の位置を制御することは困難であったので、本発明者らは、システインをＱｂのサブユニット間の境界面近くに導入すると、サブユニットを架橋するジスルフィド結合が形成され、抗ＴＡＣＡ抗体応答が増強され得る可能性があると仮説を立てる。しかしながら、サブユニット間相互作用に直接関与する残基の変異を回避して、ウイルスカプシドアセンブリの妨害を防止するべきである。
【０２６９】
前述の考慮に基づいて、アラニン３８（Ａ３８）、トレオニン７５（Ｔ７５）およびグルタミン酸１０３（Ｅ１０３）を、リジン（Ｋ）への変異に選択した（図３および４）。リジンは、将来のＴＡＣＡ官能化のためのさらなる部位であり得るので、変異標的として選択する。アラニン４０（Ａ４０）およびアスパラギン酸１０２（Ｄ１０２）を、システインへの変異のための部位として選択した。Ｑｂカプシド（ＰＤＢコード：１ＱＢＥ）の結晶構造の分析により、隣接コートタンパク質単量体上のＡ４０およびＤ１０２は、可能なジスルフィド結合形成のための空間において互いに近いことが明らかになった。Ｋ２およびＫ１６は、アミド形成によりｗｔＱｂを官能化する場合には誘導体化部位である可能性が最も高いので変異させていない。
【０２７０】
設計変異体をクローニングし、次いで、大腸菌において組換え発現させた。Ｅ１０３Ｋはナノ粒子にアセンブリすることができなかったが、Ａ３８Ｋ、Ｔ７５Ｋ、Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２ＣおよびＡ３８Ｋ／Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２Ｃ変異体は、優れた収率でナノ粒子カプシドを形成した。興味深いことに、ｍＱｂ粒子のほとんどは、野生型カプシドのもの（２８．８ｎｍ）に類似の流体力学的直径を有するが、Ａ３８Ｋ変異体は著しく小さく、平均直径は２６．６ｎｍであることが注目される。すべてのｍＱｂカプシドの特徴は、表４に要約されている。
【０２７１】
表４．Ｑｂ変異体の物理的特性評価。
【表４】
2020531544.tif 000024
【０２７２】
実施例５：Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２Ｃ変異を有するｍＱｂカプシドは、より高い熱安定性を有する
【０２７３】
さらなるジスルフィド結合を形成するＡ４０Ｃ／Ｄ１０２Ｃの可能性を試験するために、変異体を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動分析に供した（図Ｘ）。Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２Ｃ変異を含有するＱｂ変異体はすべて、おそらくはサブユニットの多量体化により、スタッキングゲルにおいて高分子量タンパク質バンドを示した。Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２Ｃを欠く変異体は、野生型Ｑｂと類似のゲルパターンを示した。還元条件下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでは、すべてのカプシドが、単量体および二量体に対応する位置に現れている大部分のタンパク質と同様に現れ、これは、Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２Ｃを含有するｍＱｂでは、Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２Ｃジスルフィド結合が形成されたことを示している。
【０２７４】
次に、カプシドの溶液を徐々に加熱することによりカプシドの融解温度を測定することにより、カプシド安定性に対するさらなるジスルフィド結合の効果を評価した。ｗｔＱｂは、加熱により変性し始めた場合に７８℃の融解温度を有する。ｍＱｂ  Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２Ｃカプシドは有意に高い安定性を有し、その融解温度は８３℃まで増加する。Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２Ｃと化学的に類似するがジスルフィド結合を形成することができない二重変異体Ａ４０Ｓ／Ｄ１０２Ｓの融解温度は、低下して野生型レベル（７６℃）まで戻ったが、これは、カプシドを安定化するためのジスルフィド結合の重要性を裏付けている。ｍＱｂ  Ａ３８Ｋ（融解Ｔ：７３℃）をｍＱｂ  Ａ３８Ｋ／Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２Ｃ（融解Ｔ：７９℃）と比較した場合、同様の安定化効果が観察された。ワクチン構築物は、免疫系に対してより長い刺激を提供し得る可能性があるので、カプシドのより高い熱安定性はより良い抗体応答に寄与し得る。
実施例６：新たなｍＱβは抗キャリア免疫反応を減少させ得るが、ＴＡＣＡ抗原に対する抗体のレベルをさらに有意に増強し得る。
【０２７５】
ＴＡＣＡおよびキャリアそれ自体に対する免疫の誘導におけるｍＱｂの効力を評価するために、同一の反応条件下で、表面露出リジンのアミノ基とＮＨＳ−Ｔｎ１との間のアミド形成を介して、プロトタイプＴＡＣＡであるＴｎ１をｗｔＱｂおよびＱｂ変異体とコンジュゲートさせた。Ｔｎは、ヒト癌の９０％において検出され（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｇ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８４；２２４：１１９８−２０６）、最も特異的なヒトがん関連構造の１つとみなされる（Ｈａｋｏｍｏｒｉ  Ｓ．Ａｂｅｒｒａｎｔ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎｓ．Ａｄｖ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９８９；５２：２５７−３１．）魅力的なＴＡＣＡである。ＬＣ−ＭＳ法は、還元条件下でサブユニットを解離することにより、カプシド１個当たりの固定化Ｔｎの平均数を定量するために開発された。ＬＣ−ＥＳＩ  ＭＳにより、改変タンパク質サブユニットの分子量を決定し、最大エントロピーデコンボリューションアルゴリズムにより、多重電荷質量スペクトルを単一電荷に変換した。ＬＣ−ＭＳ分析により、野生型Ｑｂ（ｗｔＱｂ）−Ｔｎ１コンジュゲートは、カプシド１個当たり平均３３２個のＴｎ１を含有していたことが示された。Ａ３８Ｋ、Ｔ７５Ｋ、Ａ１１７Ｋ、Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２ＣおよびＡ３８Ｋ／Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２ＣにおけるＴｎ１の数は、３９０個〜４９８個の範囲であった。ＬＣ−ＭＳから得られた定量結果は、Ｑｂ−ＴＡＣＡ特性評価のために以前に利用されたマイクロ流体キャピラリーゲル電気泳動分析法からのもの（Ｙｉｎ  Ｚら、ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１３，８，１２５３−１２６２）と同程度である。ＬＣ−ＭＳ法はより定量的であり、すべての変異体のアミノ酸配列も確認された。
【０２７６】
表５．Ｑｂ粒子の各カプシドにコンジュゲートしたＴｎ１の平均数およびＱｂ−Ｔｎ１コンジュゲートの収量。
【表５】
2020531544.tif 000025
【０２７７】
抗体応答の誘発におけるｍＱｂ−Ｔｎ１コンジュゲートの能力をインビボで評価した。前述のＱｂ免疫プロトコールにしたがって、様々なｍＱβ−Ｔｎ１コンジュゲートを（すべて１．９μｇの等用量のＴｎで）マウス（ｎ＝５）にワクチン接種した。３５日目に、免疫マウス由来の血清を収集した。
【０２７８】
最初の分析を実施して、ＥＬＩＳＡによりＢＳＡ−Ｔｎ１コンジュゲートに対してアッセイした抗Ｔｎ抗体の力価を決定した。ｗｔＱｂは、抗Ｔｎ  ＩｇＧ抗体を生成する強力なプラットフォームであり、平均力価は３，３００，０００であった。ＴｎなしでｗｔＱｂを投与したマウスは、１，０００の抗Ｔｎ力価しか示さなかったので、Ｑｂ−Ｔｎの免疫増強効果はＴｎに特異的である。ＫＬＨとの単量体Ｔｎコンジュゲートは有意な抗Ｔｎ力価を誘導することができなかったが、これは、ワクチンキャリアとしてのＱｂの力を強調している。
【０２７９】
ｍＱｂの場合、Ｔ７５Ｋ変異体は、ｗｔＱｂと同程度の抗Ｔｎ  ＩｇＧ力価をもたらした。Ａ３８Ｋ、Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２ＣおよびＡ３８Ｋ／Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２Ｃの３個の変異体は、より優れた抗Ｔｎ  ＩｇＧ応答を誘導した。これらの変異体による平均抗Ｔｎ  ＩｇＧ力価は１桁近く高く、３０，０００，０００に達した。本発明者らの知る限り、これは、これまでに報告されている最も高い抗Ｔｎ力価である。抗体サブタイプ分析により、ｍＱｂ対ｗｔＱｂにより誘導される類似のＩｇＧサブタイプパターンが示された。すべての主要なＩｇＧサブタイプは、ＩｇＧ１よりもＩｇＧ２優先で誘導されたが、これは、Ｔｈ１応答に対するＴ細胞依存性免疫反応バイアスを示している（図１１Ａ〜１１Ｃ）。
【０２８０】
バリアントｍＱβ−Ｔｎ１をワクチン接種したマウス群（ｎ＝５）由来の免疫後血清（３５日目）のＥＬＩＳＡ結果。ａおよびｂ）それぞれ線形およびログスケールで示されている免疫後血清の抗Ｔｎ１力価。スチューデントｔ検定により、ｍＱβとｗｔＱβとの間の統計的有意差を決定した（＊＊р＜０．０１；＊＊＊р＜０．００１；＊＊＊＊р＜０．０００１）
【０２８１】
ＢＳＡ−Ｔｎ１に対するｗｔＱβ−Ｔｎ１、ｍＱβ（Ａ３８Ｋ／Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２Ｃ）−Ｔｎ１およびｍＱβ（Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２Ｃ）−Ｔｎ１免疫により誘発されたＩｇＧサブタイプ抗体（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃおよびＩｇＧ３）の１／８１９２００血清希釈のＥＬＩＳＡ結果からのＯＤ４５０。
【０２８２】
次に、本発明者らは、Ｑｂカプシドの変異が抗ｗｔＱｂ抗体による認識を減少させ得るかを試験した。ｗｔＱｂ−Ｔｎ、Ａ３８Ｋ−Ｔｎ、Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２Ｃ−ＴｎおよびＡ３８Ｋ／Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２Ｃ−Ｔｎにより誘発されるＩｇＧ抗体のｗｔＱｂ認識能力を、ＥＬＩＳＡウェルに固定したｗｔＱｂに対して測定した。図１２に示されているように、ｍＱｂ−Ｔｎコンジュゲートはすべて、ｗｔＱｂ−Ｔｎと比較して有意に少ない抗ｗｔＱｂ抗体を誘発した。
【０２８３】
ｗｔＱｂ認識の減少をさらに確認するために、競合ＥＬＩＳＡアッセイを設定した。ｗｔＱβ免疫マウス由来の血清を、それぞれｗｔＱβ、ｍＱβ（例えば、Ａ３８ＫおよびＡ４０Ｃ／Ｄ１０２Ｃ）またはｍＱβ−Ｔｎコンジュゲートと共にインキュベートした。次いで、これらのプレインキュベート血清を、ｗｔＱβでコーティングした個々のＥＬＩＳＡウェルに添加した。抗ｗｔＱβ抗体により認識され得るウイルスカプシドは、血清中の抗体との結合について固定化ｗｔＱβと競合し、ウェル中の吸光度の減少がもたらされる。予想どおり、遊離ｗｔＱｂは固定化ｗｔＱｂと効率的に競合し、ウェル中の吸光度レベルを、競合なしの場合のウェルのわずか５％まで低下させた。変異体はすべて、抗ｗｔＱｂ抗体による認識の減少を示した。例えば、ｍＱｂ（Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２Ｃ）と共にプレインキュベートした血清を含むウェルは、ｗｔＱｂを含むものと比較して２．５倍の吸光度を示した（図１３）。固定化Ｔｎが、免疫認識のためのＱｂのＢ細胞エピトープをさらに遮蔽し得るｍＱβ（Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２Ｃ）−Ｔｎコンジュゲートでは、この効果はより顕著になった。これらの結果は、変異がｗｔＱｂのいくつかのエピトープを成功裏に除去したことを示唆している。
【０２８４】
次に、変異は、抗ＴＡＣＡ抗体の生成と競合する新たなＢ細胞エピトープを作り得る可能性があるので、変異体キャリアそれ自体に対してｍＱｂにより誘発される抗体応答を分析した。ｍＱｂ−Ｔｎはすべて、ｗｔＱｂにより誘発される抗ｗｔＱｂ抗体のレベルと比較して、各キャリアに対するＩｇＧ抗体の誘導はより少なかった。Ａ３８Ｋ、Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２ＣおよびＡ３８Ｋ／Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２ＣのＴｎコンジュゲートからの抗Ｔｎ抗体応答との相関は、抗キャリア対抗Ｔｎ抗体の興味深い逆傾向を示した。より低い抗キャリア抗体応答をもたらすワクチン構築物は、より高いレベルの抗Ｔｎ  ＩｇＧを誘発した（図１４Ａ、１４Ｂ）。
実施例７：ｍＱｂ−Ｔｎは、Ｔｎ発現腫瘍細胞と強く結合することができる抗Ｔｎ抗体を誘導した
【０２８５】
抗がんワクチンの基礎を作るために、がん細胞表面上のＴｎを認識する抗Ｔｎ抗体の能力を、２つの代表的なＴｎ発現細胞株（すなわち、ヒトリンパ腫ジャーカット細胞およびマウス乳がん細胞ＴＡ３Ｈａ）を使用して評価した。ｍＱｂ−Ｔｎコンジュゲートはすべて、腫瘍細胞と強く結合することができるＩｇＧ抗体を生成した。図２１Ａおよび２１Ｂに示されているように、ｗｔＱｂ免疫Ｔｎマウス由来の血清による腫瘍細胞結合と比較して、ＴｎとのＡ３８ＫおよびＡ４０Ｃ／Ｄ１０２Ｃコンジュゲートは、ジャーカット細胞に対する大幅に強い認識を有する抗体を誘導した。３つのｍＱｂ  Ａ３８Ｋ、Ａ３８Ｋ／Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２ＣおよびＡ４０Ｃ／Ｄ１０２Ｃ  Ｔｎコンジュゲートは、ＴＡ３Ｈａ細胞へのより高い結合を有する抗体をもたらした。
【０２８６】
その合成容易性により、免疫原性評価のための代表的なＴｎ構造としてＴｎ１（図１６Ａ）を使用した。免疫原構築物を最適化するために、Ｔｎ２を合成したところ、ｍＱβ（Ａ３８Ｋ／Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２Ｃ）−Ｔｎ２およびｍＱβ（Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２Ｃ）−Ｔｎ２は、それぞれｍＱβ（Ａ３８Ｋ／Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２Ｃ）−Ｔｎ１、ｍＱβ（Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２Ｃ）−Ｔｎ１（図１６Ｂおよび１６Ｃ）で免疫したマウス由来の血清と比較して高い親和性で腫瘍細胞に結合する抗Ｔｎ抗体を誘導したので、Ｔｎ２（図１６Ａ）はＴｎ１よりも優れていることが見出された。ｍＱｂ−Ｔｎ２コンジュゲートはまた、ｗｔＱｂ−Ｔｎ２免疫動物由来のものよりも強く腫瘍細胞と結合する傾向がある抗体を生成したが、これは、ｍＱｂの増強効果がＴｎ１に限定されないことを実証している。
実施例８：ｍＱｂ−Ｔｎコンジュゲートは、腫瘍チャレンジからのマウスの完全な保護を提供した
【０２８７】
優れた抗Ｔｎ抗体を誘発する能力により、腫瘍チャレンジ研究のための代表的なキャリアとしてｍＱｂ  Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２Ｃを選択した。腹腔注射したわずか５，０００個の腫瘍細胞が、腫瘍成長により１４日以内にすべてのマウスを殺すために十分であったので、Ｃ５７／Ｂｌ６マウスにおける非常に侵襲性の腫瘍としてマウス乳腺腺癌細胞ＴＡ３Ｈａを使用する。それぞれ１．９μｇの等用量のＴｎで、マウスをｗｔＱβ、ｗｔＱβ−Ｔｎ２およびｍＱβ（Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２Ｃ）−Ｔｎ２で免疫した。腫瘍チャレンジの前−３６日目、−２２日目および−８日目に、ワクチン構築物を投与した。０日目に、５，０００個のＴＡ３Ｈａ細胞をすべてのマウスに注射した。１日後、ｗｔＱβ−Ｔｎ２群およびｍＱβ（Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２Ｃ）−Ｔｎ２免疫マウス群に、５０ｍｇ／ｋｇの用量でシクロホスファミド（ＣＰ）（これは、乳がん処置のために臨床的に適用される治療薬である）を投与した。
【０２８８】
すべてのマウスの生存をモニタリングした。ｗｔＱｂで免疫したマウスは、１１日目までに１００％の死亡率を示した。ｗｔＱｂ−Ｔｎによるワクチン接種は、腫瘍チャレンジからマウスの２０％を保護した。ＣＰとｗｔＱｂ−Ｔｎ免疫の組み合わせは、生存率を４０％に改善した。面白いことに、ＣＰと組み合わせてＱｂ（Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２Ｃ）−Ｔｎで免疫したマウスは、腫瘍発生から完全に保護され、１００％の生存であり、腫瘍接種の３０日後、マウスはいずれも、腫瘍成長のいかなる徴候も示さなかった（図１８）。さらに、１回目の腫瘍チャレンジの３０日後、Ｑｂ（Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２Ｃ）−Ｔｎ群のマウスを５，０００個のＴＡ３Ｈａ細胞で再チャレンジした。いかなるさらなるワクチン接種またはＣＰ処置もない場合においても、すべてのマウスは２回目の腫瘍チャレンジを生存し、腫瘍再発はなかった（図１９Ａおよび１９Ｂ）。
考察
【０２８９】
複数の臨床研究により、がん患者の予後は、ＴＡＣＡ構築物によるワクチン接種後に生成される抗ＴＡＣＡ抗体のレベルと相関し得ることが示されている。ＶＬＰ  Ｑｂは、抗ＴＡＣＡ抗体応答を大きく増強することにより、ＴＡＣＡキャリアとして大きな将来性を示している。Ｑｂの優位性について、いくつかの潜在的な理由がある：１）Ｑｂは、炭水化物抗原を規則的に提示して、グリカン特異的Ｂ細胞の強力な活性化をもたらすことができる高度に組織化した３Ｄ構造を有する；２）Ｑｂは、ヘルパーＴ細胞を活性化して、Ｂ細胞応答をブーストし得る。図１８、１９Ａ、１９Ｂに示されているように、ｗｔＱｂおよびＴｎのコンジュゲートは、ＣＰ処置と組み合わせてマウスの４０％を保護し得るが、処置なしのまたはＣＰのみを投与したマウスは、大幅に低い生存率を有していた。より良い腫瘍保護効率を提供するために、より高いレベルの抗ＴＡＣＡ抗体が必要であるが、キャリアＱｂの操作によりこれを達成した。
【０２９０】
キャリアに対する既存の免疫は、コンジュゲートハプテンに対する体液性応答を増強または抑制し得るが（Ｐｏｂｒｅら、Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０１４，３２，１４２３）、Ｑｂで事前に免疫されており、したがって既存の抗Ｑｂ  ＩｇＧ抗体の力価が高いマウスは、Ｑｂ−ペプチドコンジュゲートで免疫すると、大幅に少ない抗ペプチド抗体を産生したことが報告されている。本発明者らの経験は、この観察結果と一致している。抗原性トリアゾールを含有するＱｂ−Ｔｎ構築物は、おそらくは抗トリアゾール抗体の干渉により、トリアゾールを含まない同様のＱｂ−Ｔｎ構築物と比較して大幅に低い力価の抗Ｔｎ抗体をもたらした。Ｑｂはまた、高力価の抗キャリア抗体を生成し得る。動態研究により、抗Ｑｂ抗体は、グリカンに対するものよりも早く産生されたことが示された。したがって、抗Ｑｂ抗体もまた、所望の抗ＴＡＣＡ抗体の生成に干渉し得る。
【０２９１】
Ｑｂによる抗グリカン抗体の抑制について、複数の考えられる理由がある：１）抗Ｑｂ抗体は、ＴＡＣＡに対するものよりも早く生成されるので、ブースト注射中に、既存の抗Ｑｂ抗体がワクチン構築物と結合して、グリカン特異的Ｂ細胞によるグリカンエピトープの認識を立体的に妨げ得る；２）抗Ｑｂ抗体はワクチン構築物と結合して構築物を隔離し、グリカン特異的Ｂ細胞と相互作用する構築物の利用可能性を減少させ得る；３）抗Ｑｂ  Ｂ細胞は、Ｔ細胞刺激のための限られたヘルパーＴ細胞について抗ＴＡＣＡ  Ｂ細胞と競合し得る。したがって、抗Ｑｂ抗体の減少は、免疫系が所望のＴＡＣＡグリカンに集中することを可能にし、従って、抗グリカン応答を増強し得る。
【０２９２】
特に、エピトープが主に立体構造的であり、Ｑｂの場合のように線形配列内に存在しない場合には、Ｂ細胞エピトープの実験的同定は困難であり得る。ＫＬＨなどの非晶質タンパク質と比較したＱｂの主な利点の１つは、Ｑｂの結晶構造が高分解能で得られていることである。これは、抗キャリア抗体応答を減少させるための変異体設計のための非常に有益な指針を提供する。構造ベースの分析から、高い溶媒曝露を有する残基であって、Ｂ細胞エピトープである可能性があり、固有Ｂ細胞エピトープを破壊するための変異の標的として機能する残基を同定した。加えて、カプシドアセンブリの破壊を回避するために、クロスサブユニットジスルフィド結合の導入のための部位を同定した。その結果として、設計された多くのＱｂ変異体が発現され、大腸菌においてナノ粒子カプシドを高収率で形成した。
【０２９３】
Ｔｎとのコンジュゲーションにより、Ａ３８Ｋ、Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２ＣおよびＡ３８Ｋ／Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２Ｃを含む複数のｍＱｂは、抗Ｔｎ  ＩｇＧ抗体の誘発においてｗｔＱｂよりも優れていることが見出され、最も高い平均抗Ｔｎ力価は、ｗｔＱｂ−Ｔｎによるものよりも５倍高い３０，０００，０００に達した。さらに、Ａ３８ＫおよびＡ４０Ｃ／Ｄ１０２ＣなどのＱｂ変異体とのＴｎコンジュゲートで免疫したマウス由来の血清は、ｗｔＱｂ−Ｔｎのものと比較して、ヒトおよびマウスの両方のがん細胞とより強く結合することができた。これは、抗体が、そのネイティブな環境において（すなわち、腫瘍細胞の表面上で）Ｔｎを認識し得ることを示唆しており、これは、抗がんワクチンにとって申し分ない前兆である。
【０２９４】
変異体のいくつかにより誘導されるより高い力価の抗Ｔｎ  ＩｇＧ抗体およびより少ない抗カプシド抗体に寄与する複数の複合要因が存在し得る。Ａ３８は、Ｂ細胞により認識すると予測される領域に存在するので、Ａ３８Ｋなどの変異は、ｗｔＱｂの潜在的なＢ細胞エピトープを直接除去し得る。これは、抗ｗｔＱｂポリクローナル抗体の結合について固定化ｗｔＱｂと競合するｍＱｂの能力の減少により裏付けられる（図１３）。別の要因は、Ａ４０ＣおよびＤ１０２Ｃ変異を含有するｍＱｂの熱安定性の増強である。新たなジスルフィド結合がこれらのカプシドに導入されるので、これらの変異体は、変異を有しない対応するカプシドと比較してより安定である。ワクチン構築物のより高い安定性は、インビボにおけるワクチンの半減期を増加させて、免疫系の刺激を延長し得る。
【０２９５】
興味深いことに、ｍＱｂ  Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２Ｃは、ｗｔＱｂと対比してさらなるリジンを含有しないが、この変異体に導入され得るＴｎの平均数（Ｔｎの４３６コピー）は、ｗｔＱｂのもの（３３２のＴｎ）よりも大幅に多く、これは、変異体上の単量体コートタンパク質当たり平均０．６個を超えるＴｎ分子に対応する（各カプシドについて１８０個の単量体がある）ことが注目される。
【０２９６】
ｗｔＱｂの結晶構造により、Ｑｂの外表面上の３つのリジン（Ｋ２、Ｋ１３およびＫ１６）およびアミド形成に利用可能なＮ末端があることが示された。Ｋ２残基は、３重対称軸周囲に緊密にクラスタ化されているので、おそらくは立体障害により反応する可能性が低い。Ｄ１０２の側鎖カルボン酸は、Ｋ１３のε−アミノ基に近い（約４Å）。結果として、Ｋ１３は、Ｄ１０２とイオン結合または水素結合で係合し得るので、Ｔｎ１とのアミド形成に対するより低い反応性を有し、ｗｔＱｂ−Ｔｎコンジュゲートではほとんどが依然として官能化されない。これは、フルオレセインのＮＨＳエステルで処理した場合、ＱｂのＫ１３Ｒ変異体が、ｗｔＱｂと比較して少ない数のコンジュゲート分子を有しなかったという観察結果と一致する（Ｂｒｏｗｎ，Ｓ．Ｄ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｑβ：Ａ  Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  Ｎａｎｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｔｈｅ  Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，，２０１０  ＰｈＤ  ｔｈｅｓｉｓ）。Ｄ１０２をシステインに変異させた場合（これはおそらく、Ｋ１３との相互作用の低下につながる）、Ｋ１３の側鎖のアミノ基は、ＮＨＳ−Ｔｎ１と反応するために利用可能になり得る。Ｋ１３の誘導体化を確認するために、三重変異体Ｋ１３Ｒ／Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２Ｃを調製し、カプシドをＮＨＳ−Ｔｎ１と同一の反応条件下で処理した。三重変異体Ｋ１３Ｒ／Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２ＣにコンジュゲートしたＴｎの数は、ｗｔＱｂのレベルに近い３２８まで低下した。Ｋ１３は、Ｂ細胞エピトープである可能性が高いフレキシブルで高度に露出したループに位置する。この領域の立体構造変化は、Ｂ細胞認識を減少させ得る可能性がある。加えて、ＴｎによるＫ１３の官能化は、抗Ｑｂ抗体によるエピトープの結合を遮断し、抗キャリア抗体応答をさらに減少させ得る可能性がある。
【０２９７】
抗Ｔｎ抗体に影響を与える可能性がある別の要因は、カプシド当たりのＴｎの数である。本発明者らは、Ｔｎの低（７８のＴｎ）および中（１５０のＴｎ）密度を有するＱｂが、抗Ｔｎ抗体の誘導において、高Ｔｎ（３４０のＴｎ）密度を有するものよりも大幅に低効率であったことを以前に報告した。高いローディングレベル（＞３００）では、Ｔ７５Ｋ変異体は、Ａ１１７Ｋ−Ｔｎ（３９０のＴｎ）よりも多い平均数（４４７のＴｎ）のＴｎ１／カプシドを有するが、より低い力価の抗Ｔｎ１抗体を誘導するので、カプシド当たりのＴｎの数は、抗Ｔｎ抗体力価の決定において重要な役割を果たさないようであった。Ｂａｃｈｍａｎｎらもまた、カプシド当たりのペプチド抗原のコピー数の１３から９４への増加が、抗ペプチド抗体のレベルを有意に増強したが、コピー数が１４２を超えると抗体力価が安定したことを示した（Ｊｅｇｅｒｌｅｈｎｅｒ，Ａら、Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０１０，２８（３３），５５０３−５５１２））。
【０２９８】
腫瘍発生からのマウスの保護におけるｍＱｂ  Ａ４０Ｃ／Ｄ１０２Ｃ−Ｔｎ構築物の有効性を、非常に侵襲性の腫瘍であるＴＡ３Ｈａ腫瘍モデルにおいて試験した。いかなる処置もない場合、マウスはすべて、わずか５，０００個の腫瘍細胞の接種の１１日後に腫瘍により死亡した。ＣＰまたはｗｔＱｂ−Ｔｎワクチン接種は単独で、腫瘍保護においてあまり有効ではなく、それぞれ２０％および１２．５％の生存率であった。ＣＰとｗｔＱｂ−Ｔｎとの組み合わせは、生存を４０％に有意に増強した。投与した用量では、ＣＰは腫瘍細胞を直接死滅させないが（Ｈｕｂｅｒｔ，Ｐら、（２０１１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７１，５１３４−５１４３）、それは、抗体が結合した腫瘍細胞を死滅させ得るエフェクター細胞の一種であるナチュラルキラー細胞の活性をブーストするのを支援し得る。４５  ｗｔＱｂ−Ｔｎと比較して、ｍＱｂ−Ｔｎは大幅に有効であり、ＣＰと組み合わせた場合、ＴＡ３Ｈａ腫瘍からのマウスの完全な保護を提供した。さらに、ワクチン接種マウスはすべて、いかなるさらなる処置もない場合においても２回目の腫瘍チャレンジを生存しており、これは、ワクチン接種により長期の免疫が生じたことを示唆している。
【０２９９】
Ｔｎは、抗がんワクチンの開発のための魅力的な標的である。その弱い免疫原性により、特にＴｎの単量体形態については、高力価の抗Ｔｎ  ＩｇＧ抗体を誘発することが困難であった。ＴｎとのＫＬＨコンジュゲートは、有意な量の抗Ｔｎ抗体を誘導することができなかった。これを克服するために、２つの一般的なアプローチを採用した：１）Ｔｎの構造を改変して、それを免疫系に対してより外来性にする；２）抗原として二量体または三量体Ｔｎを使用する。Ｑｂプラットフォームの力は、抗原としての単量体Ｔｎの使用を可能にする。本発明者らの知る限り、ｍＱｂ−Ｔｎにより誘導される抗Ｔｎ  ＩｇＧ抗体の平均力価は、報告されている最高のものであったが、これは、Ｑｂプラットフォームの力を強調している。
【０３００】
Ｑｂは、複数の臨床試験において、ニコチン（抗喫煙ワクチン）、インターロイキン（抗炎症）およびアミロイドｂを含む広範な抗原のキャリアとして利用されており、優れた安全性プロファイルを有する（Ｊｅｇｅｒｌｅｈｎｅｒ  Ａら、Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０１０，２８，５５０３）。本研究では、本発明者らはＴＡＣＡに取り組んだが、ｍＱｂに関連する抗キャリア応答の減少は、それをワクチンキャリアとして広く使用する場合に、ｍＱｂについては、キャリア干渉があまり問題ではないことを示唆している。これは強力な抗体増強能力と相まって、ｍＱｂを、サブユニットベースのワクチン開発のための非常に魅力的なプラットフォームにする。
実施例９：ＭＵＣ１ベースの抗がんワクチンの合理的設計
【０３０１】
ＭＵＣ１の異常グリコシル化は、多くの種類のがんにおける特徴である。正常な内皮細胞では、ＭＵＣ１上の主要なＯ−グリカンは、コア−２型構造をベースとする。がん細胞上のＭＵＣ１  Ｏ−グリカンは切断されており、あまり分枝しておらず、優勢な構造として重度にシアリル化されたコア−１グリカン（これは、ペプチド骨格を免疫認識のために利用しやすくする）を有する（図２９）。
【０３０２】
その重要性により、ＭＵＣ１は、ＮＣＩ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐにより最上位のがんワクチン標的の１つとして位置付けられた。
【０３０３】
臨床試験では、いくつかのＭＵＣ１コンジュゲートワクチン（ＭＵＣ１−マンナンまたはＭＵＣ１−ＫＬＨ）が評価されている。有意な抗体が誘導されたが、乳がん細胞を認識することができず、これは、野生型マウスにおける前臨床研究とは全く異なる。
【０３０４】
ＭＵＣ１ベースの抗がんワクチンを開発するために、本発明者らは、ＭＵＣ１糖ペプチドを送達するための強力なキャリアとしてウイルス様粒子を探索した。
【０３０５】
ウイルス様粒子は、均一で明確な構造、炭水化物抗原の組織化された高密度提示の可能性、および幅広い反応条件に対する安定性を含め、伝統的なタンパク質キャリアよりも多くの潜在的な利点を有する。本発明者らが試験したいくつかのウイルス様粒子の中でも、バクテリオファージＱβは、抗ＴＡＣＡ  ＩｇＧ応答の誘発に関して優れている。加えて、臨床研究では、バクテリオファージＱβは耐容性良好であることが示されている（図３０）。Ｑβ−ＭＵＣ１コンジュゲートの合成スキームは、図３１に示されている。
【０３０６】
フロイントアジュバントを用いて、野生型（ＷＴ）Ｃ５７Ｂｌ６マウスにおいて、免疫を実施した。マウスをＱβ−ＭＵＣ１で２週間おきに３回ワクチン接種した。超高力価で長期にわたる抗ＭＵＣ１  ＩｇＧ抗体応答が得られた（図３２）。
【０３０７】
Ｑβ−ＭＵＣ１によるＷＴマウスのワクチン接種は、ＭＵＣ１発現腫瘍細胞に強く結合することができる抗体、およびＭＵＣ１特異的な細胞傷害性Ｔ細胞応答をもたらした。図３３Ａは、腫瘍細胞との免疫後血清の結合を示す（１：５０希釈）。灰色曲線（Ｑｂ免疫ＷＴマウス由来の血清）および色付き曲線（Ｑｂ−ＭＵＣ１免疫ＷＴマウス由来の血清）。Ｑｂ−ＭＵＣ１免疫ＷＴマウス由来の血清により、ＭＵＣ１発現ＲＭＡ−ＭＵＣ１細胞への強い結合が観察された。ＲＭＡ細胞への弱い結合は、結合がＭＵＣ１依存的であったことを示唆している。図３３Ｂは、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）アッセイを示す。Ｑβ−ＭＵＣ１で免疫したマウスは、インビトロおよびインビボでＭＵＣ１発現細胞に対して有意に高い溶解能力を示した。
【０３０８】
寛容ヒトＭＵＣ１トランスジェニック（Ｔｇ）マウスにおける第１世代Ｑｂ−ＭＵＣ１ワクチンは、ＭＵＣ１発現腫瘍細胞との強い結合のための抗体を誘発することができなかった（図３４）。ヒトＭＵＣ１  Ｔｇマウスは、ヒトにおいて見られるＭＵＣ１に対する免疫寛容環境を模倣する。Ｔｇマウスでは、高い抗ＭＵＣ１  ＩｇＧ抗体が誘発されたが、抗体は、ＷＴマウス由来のものと対比して大幅に弱く、ＭＵＣ１発現腫瘍細胞と結合した。
【０３０９】
エピトープマッピングにより、ＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧ領域のエピトープに対しては、Ｔｇマウスにより抗体応答がほとんど生成されなかったことが示された（図３５）。この結果はまた、ＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧ領域外のエピトープに対する抗体が腫瘍細胞認識にあまり寄与しないことを示唆していた。
【０３１０】
免疫原のＣ末端をウイルス様粒子にコンジュゲートしてＭＵＣ１ペプチドを短縮した第２世代ワクチンを開発した（図３６）。第２世代Ｑβ−ＭＵＣ１で免疫したＭＵＣ１．Ｔｇマウス由来の血清は、ａ）組織マイクロアレイ上のヒト乳がん組織への強い結合を示したが、ｂ）正常乳房組織とほとんど反応しなかった（図３７および３８）。
【０３１１】
ＷＴマウスおよびＭＵＣ１  Ｔｇマウス由来の抗体を比較するエピトープマッピングにより、本発明者らは、以下を実証した。ＭＵＣ１  Ｔｇマウスでは、ＭＵＣ１のすべてのエピトープが等しく寛容性であるわけではない。非ＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧ領域に対する抗体応答は、腫瘍細胞上のＭＵＣ１との結合にはあまり寄与しない。ＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧ領域に対する抗体応答は、様々な腫瘍細胞株の認識を大きく改善した。合理的なＭＵＣ１エピトープ設計は、抗ＭＵＣ１免疫反応の質を有意に改善し、腫瘍チャレンジからのマウス生存を増加させた。
実施例１０：実施例１１〜１５の材料および方法
一般的な実験手順および合成方法
【０３１２】
すべての化学物質は試薬グレードであり、特に注記がない限り、製造業者から受領したまま使用した。１０，０００および１００，０００分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）の遠心フィルタユニットは、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから購入した。タンパク質液体クロマトグラフィーでは、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ−６カラムのＧＥ  ＡＥＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用した。Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ２１００  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ８０マイクロ流体チップ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、マイクロ流体キャピラリーゲル電気泳動を実施した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析では、各ウイルスサンプル（１０μＬ、１ｍｇ／ｍＬ）を変性させ、Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｃ１８ピペットチップ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してクリーニングした。混合物（０．６μＬ）およびマトリックス溶液（０．６μＬ、５０％アセトニトリル中飽和シナピン酸、０．１％トリフルオロ酢酸）をＭＡＬＤＩプレート上にスポットし、風乾させ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ  Ｖｏｙａｇｅｒ  ＤＥ  Ｐｒｏ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）により分析した。標準としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて、クーマシープラスタンパク質試薬（ブラッドフォードアッセイ、Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、タンパク質濃度を測定した。
【０３１３】
ＲＭＡ細胞、ＲＭＡ−ＭＵＣ１およびＭＣＦ−７細胞は、Ｐｒｏｆ．Ｏｌｉｖｅｒａ  Ｊ．Ｆｉｎｎ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ）による厚意の提供であった。Ｂ１６−ＭＵＣ１細胞は、Ｐｒｏｆ．Ｓａｎｄｒａ  Ｊ．Ｇｅｎｄｌｅｒ（Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃ）による厚意の提供であった。１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬ／１００μｇ／ｍＬ  Ｐｅｎ／Ｓｔｅｐ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび０．３ｍｇ／ｍＬ  Ｇ４１８を補充したＤＭＥＭ中で、ＲＭＡ細胞、ＲＭＡ−ＭＵＣ１細胞およびＢ１６−ＭＵＣ１細胞を培養した。Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、非必須アミノ酸およびピルビン酸ナトリウム、ウシインスリン（１０μｇ／ｍＬ）ならびにＦＢＳ（１０％）、１００Ｕ／ｍＬ／１００μｇ／ｍＬ
【０３１４】
Ｐｅｎ／Ｓｔｅｐを有するイーグル最小必須培地中で、ＭＣＦ−７細胞を培養した。
ＭＵＣ１（糖）ペプチドの合成
【０３１５】
２−クロロトリチル樹脂上でＦｍｏｃベースの固相支持ペプチド合成を使用して、ＭＵＣ１（糖）ペプチドを合成した。ＤＭＦ中２０％ピペリジンにより、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃを脱保護した。ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ（４．９当量）およびＤＩＰＥＡ（１０当量）を使用し、Ｆｍｏｃアミノ酸（５当量）を用いて、または、ＨＡＴＵ／ＨＯＡｔ（１．９当量）およびＤＩＰＥＡ（４当量）を使用し、Ｆｍｏｃ−ＴｎビルディングブロックＦｍｏｃ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔｈｒ５（２当量）を用いて、アミノ酸カップリングを行った。ＴＦＡ／ＴＩＰＳ／Ｈ２Ｏ＝９５／２．５／２．５により、樹脂からペプチドを２時間切断した。過剰なＴＦＡを蒸発させた。ジエチルエーテルによりペプチドを沈殿させ、遠心分離して固体をペレット化した。ペプチドをさらに３回再沈殿させた。Ｔｎのアセチル保護基を除去するために、粗糖ペプチドを５％（ｖ／ｖ）酢酸ヒドラジンで２時間処理した。粗反応物をｐＨ７に中和した。勾配溶媒ＣＨ３ＣＮおよびＨ２Ｏ（０．１％ＴＦＡ）を用い、２分で０〜５％、２〜３０分で５〜３０％および３０〜３５分で３０％の勾配の逆相カラムＳＵＰＥＲＣＯＳＩＬ  ＬＣ１８，２５ｃｍ×１０ｍｍ  ５μｍを使用して、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＨＰＬＣ（ＬＣ−８Ａ液体クロマトグラフポンプ、ＤＧＵ−１４Ａ、脱ガス器およびＳＰＤ−１０Ａ  ＵＶ−Ｖｉｓ検出器）により、脱保護（糖）ペプチドを精製した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより、生成物を同定した。ＨＰＬＣおよびＨＲＭＳスペクトルは、図７２に示されている。
ＭＵＣ５Ｂ糖ペプチド合成の一般的な方法
【０３１６】
Ｆｍｏｃ−ＳＰＰＳ戦略（Ｐｅｔｔ，Ｃら、（２０１７）Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．２３，３８７５）にしたがって、１３μｍｏｌスケールでＭＵＣ５Ｂ糖ペプチドを合成した。樹脂切断（ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＴＩＰＳ１５：１：１）後、粗ペプチドをＣ−１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｅｐ−Ｐａｋ，１ｇ）に通過させた。ＮａＯＨを含む水／メタノール（ｐＨ１１．５）を用いて、グリカン上のすべてのＯ−アセテートを慎重に除去した（これは、徹底的なＨＰＬＣモニタリングを必要とした）。最後に、Ｃ−１８カラムの分取ＨＰＬＣにより、すべての糖ペプチドを精製した。ＨＰＬＣ溶離液は、バッファーＡ（水＋０．１％ＴＦＡ）およびバッファーＢ（８４％アセトニトリル＋０．１％ＴＦＡ）の勾配から構成されていた。
Ｑβ−ＭＵＣ１コンジュゲートの合成および特性評価
【０３１７】
報告されている手順３７を用いて、Ｑβ当たり５４０個のアルキンを有するアルキン改変Ｑβ７を調製した。Ｑβ−アルキン７の溶液（０．１Ｍ  ｐＨ＝７．０リン酸カリウムバッファー中２．２０ｍｇ／ｍＬ、１．５ｍＬ、サブユニット中０．２３４μｍｏｌ、反応性アルキン中０．７０７μｍｏｌ）に１０Ｘ  ＰＢＳ（０．０７４ｍＬ）でスパイクした。次いで、ＭＵＣ１（糖）ペプチド（１０〜１３では：ＤＭＳＯ中１０ｍＭ、０．２２２ｍＬ、２．２３μｍｏｌ、タンパク質単量体当たり９．５当量（これは、アルキン当たり約３．１５当量である）；低ローディング１４では：ＤＭＳＯ中１０ｍＭ、０．０５８ｍＬ、０．５８μｍｏｌ、タンパク質単量体当たり２．５当量（これは、アルキン当たり約０．８２当量である））、予混合Ｃｕリガンド溶液（ＣｕＳＯ４、水中５０ｍＭ、０．０１９ｍＬ、０．９μｍｏｌ＋ＴＨＰＴＡリガンド８、水中５０ｍＭ、０．０９３ｍＬ、４．６μｍｏｌ）、アミノグアニジン（水中１００ｍＭ、０．２３１ｍＬ、０．０２３ｍｍｏｌ、タンパク質単量体当たり１００当量）およびアスコルビン酸ナトリウム（水中１００ｍＭ、０．２３１ｍＬ、０．０２３ｍｍｏｌ、タンパク質単量体当たり１００当量）を逐次添加した。反応容器を３回反転させて試薬を確実に混合し、次いで、室温で１６時間インキュベートした。ＭＡＬＤＩ−ＭＳにより、反応進行をでモニタリングした。完了後、以下のように、３−アジドプロパノール９との別の一連のＣｕＡＡＣコンジュゲーションにより、トリアゾールプロパノールとして残存アルキン基をキャップした。粗黄金色溶液に、３−アジド−プロパノール９（ＤＭＳＯ中１００ｍＭ溶液から６７．４μＬ、６．７４μｍｏｌ）、ＴＨＰＴＡ（Ｈ２Ｏ中５０ｍＭ溶液から２３５μＬ、１１．８μｍｏｌ）、ＣｕＳＯ４（Ｈ２Ｏ中５０ｍＭ溶液から４７μＬ、２．３５μｍｏｌ）、アミノグアニジン（Ｈ２Ｏ中１００ｍＭ溶液から２３５μＬ、２３．５μｍｏｌ）およびアスコルビン酸ナトリウム（Ｈ２Ｏ中１００ｍＭ溶液から２３５μＬ、２３．５μｍｏｌ）を添加した。反応物を短時間反転させ、室温で１６時間インキュベートした。０．１Ｍリン酸カリウム（３×１５ｍＬ）に対するＡｍｉｃｏｎ  ｕｌｔｒａ  １００，０００  ＭＷカットオフ遠心濾過により、生成物を精製した。ＢＳＡ標準に対するブラッドフォードアッセイにより、総タンパク質濃度を定量した。電気泳動分析およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより、粒子当たりのＭＵＣ１の平均ローディングを決定した（図７３および７４）。ＣｕＡＡＣコンジュゲーション後の粒子安定性は、ＦＰＬＣにより示されている（図７５）。
【０３１８】
マウスの免疫。
【０３１９】
６〜１０週齢の病原体未感染Ｃ５７ＢＬ６雌マウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒから購入し、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  ｆａｃｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｈｉｇａｎ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙにおいて維持した。Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）ｏｆ  Ｍｉｃｈｉｇａｎ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの指針にしたがって、すべての動物実験を実施した。０日目に、製造業者の指示にしたがって、完全フロイントアジュバント中０．１ｍＬの様々なＱβ−ＭＵＣ１構築物をエマルジョンとして、Ｃ５７ＢＬ６マウスの首筋下に皮下注射した。１４日目および２８日目に、不完全フロイントアジュバントと混合してブースターを首筋下に皮下投与した。０日目（免疫前）、７日目および３５日目に、血清サンプルを収集した。
ＥＬＩＳＡによる抗体力価およびサブタイプの評価
【０３２０】
最初に、９６ウェルＮｕｎｃマイクロタイタープレートを、対応するＭＵＣ１（糖）ペプチド（１０μｇ／ｍＬ、１００μＬ／ウェル）を含むＮａＨＣＯ３／Ｎａ２ＣＯ３バッファー（ｐＨ＝９．５）の溶液でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートをＰＢＳＴ（４×２００μＬ）で洗浄し、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ（２００μＬ／ウェル）で室温で１時間ブロッキングし、ＰＢＳＴ（４×２００μＬ）で洗浄し、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中の免疫マウス由来抗血清の連続希釈物（１００μＬ／ウェル、各希釈物について４ウェル）と共にインキュベートした。プレートを３７℃で２時間インキュベートし、次いで、ＰＢＳＴ（４×２００μＬ）で洗浄した。０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中のＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウス  ＩｇＧ、ＩｇＧ＋Ｍ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃまたはＩｇＧ３（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）の１：２０００希釈物（１００μＬ）をウェルにそれぞれ添加して、生成された抗体のサブタイプを決定した。プレートを３７℃で１時間インキュベートした。アルミホイルで覆った５０ｍＬ遠心チューブ中、ＴＭＢ（５ｍｇ）をＤＭＳＯ（２ｍＬ）およびクエン酸バッファー（１８ｍＬ）の混合物に溶解させることにより、酵素基質の溶液を調製した。Ｈ２Ｏ２（２０μＬ）を添加し、ボルテックスすることにより混合物をホモジナイズした。プレートをＰＢＳＴ（４×２００μＬ）で洗浄し、酵素基質の溶液を添加した（２００μＬ）。１５分間発色させ、０．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４（５０μＬ）を添加して、反応をクエンチした。マイクロプレートリーダーを使用して、吸光度を４５０ｎｍで測定した。光学密度でプロットしたｌｏｇ１０希釈の回帰分析により、力価を決定した。ＯＤ＝０．３を与える最高希釈倍率として、力価を報告した。
マイクロアレイスポッティングおよびインキュベーション
【０３２１】
糖ペプチド（以前に記載されているＭＵＣ１合成１および図７９に記載されているＭＵＣ５Ｂ合成）および糖タンパク質（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）を溶解させ、スポッティングバッファー（１５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４バッファー、ｐＨ８．５）中５０ｍＭのスポッティング濃度に希釈した。ｉＴｗｏ  ４００スポッター（Ｍ２  Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、マイクロアレイをスポットした。圧電駆動液滴生成により、液滴を生じさせた。スポッター設定を調整して、１００ｐＬ±３ｐＬの単一液滴からマイクロアレイスライド上に基質スポットを生成した。アミン反応性ＮＨＳエステル改変Ｎｅｘｔｅｒｉｏｎ（登録商標）スライドＨ（Ｓｃｈｏｔｔ，Ｍａｉｎｚ，Ｇｅｒｍａｎｙ）マイクロアレイスライドを使用した。スポッティング中、スポッティングチャンバー内の湿度を５０〜６０％に保った。スポッティングプロセス後、マイクロアレイスライドを９０〜９９％の相対湿度に一晩保って、表面固定化を完了した。使用するまで、スライドを−２０℃未満で保存した。
フローサイトメトリーによる腫瘍細胞への抗体結合の検出
【０３２２】
ＲＭＡ細胞、ＲＭＡ−ＭＵＣ１細胞、Ｂ１６−ＭＵＣ１細胞またはＭＣＦ−７細胞を、それぞれ細胞成長培地中、５％ＣＯ２下、３７℃で培養した。細胞成長培地中の細胞の混合物をコニカル遠心チューブに移し、１，６００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した。ペレットを成長培地（１０ｍＬ）に再懸濁した。血球計により、細胞の数を決定した。３．０×１０５個の細胞の懸濁液を各ＦＡＣＳチューブに添加し、これを１，６００ｒｐｍで５分間遠心分離して、上清を除去した。細胞をＦＡＣＳバッファー（０．１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ中２％ＦＢＳ）で洗浄し、ＦＡＣＳバッファー（１００μＬ）中の様々な希釈度の抗血清と共に氷上で３０分間インキュベートした。インキュベートした細胞をＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、続いて、これをＦＩＴＣ抗マウスＩｇＧ（１００μＬのＦＡＣＳバッファー中２μＬ）と共に氷上で３０分間インキュベートした。細胞を２回洗浄し、ＬＳＲ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）による分析の前にＦＡＣＳバッファーに再懸濁した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアにより、データを処理する。
補体依存性細胞傷害
【０３２３】
ＭＴＳアッセイにより、Ｂ１６−ＭＵＣ１、ＲＭＡ、ＲＭＡ−ＭＵＣ１またはＭＣＦ−７細胞の補体依存性細胞傷害を決定した。Ｂ１６−ＭＵＣ１、ＲＭＡ、ＲＭＡ−ＭＵＣ１またはＭＣＦ−７腫瘍細胞（細胞７，０００個／ウェル）を、ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）中で１２〜４８時間（Ｂ１６−ＭＵＣ１の場合には１２時間、ＲＭＡまたはＲＭＡ−ＭＵＣ１の場合には２４時間、ＭＣＦ−７の場合には４８時間）培養し、５０μＬの培養培地中の異なる免疫マウス群由来の抗血清の希釈物（Ｂ１６−ＭＵＣ１の場合には１／４０、ＲＭＡまたはＲＭＡ−ＭＵＣ１の場合には１／２００、ＭＣＦ−７の場合には１／４０）と共に３７℃で３０分間インキュベートした。５０μＬの培養培地中の希釈したウサギ血清補体（Ｂ１６ＭＵＣ１の場合には１／５、ＲＭＡまたはＲＭＡ−ＭＵＣ１の場合には１／１５、ＭＣＦ−７の場合には１／１５）を添加し、次いで、３７℃で４時間インキュベートした。ＭＴＳ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ；Ｐｒｏｍｅｇａ，２０μＬ）を各ウェルに添加し、３７℃でさらに３時間インキュベートした。各ウェルの光吸収を４９０ｎｍで測定した。培地のみで培養した細胞を陽性対照（最大ＯＤ）として使用し、培養培地を陰性対照（最小ＯＤ）として使用した。すべてのデータを４回反復で実施した。以下のように、細胞傷害を計算した：細胞傷害（％）＝（ＯＤ陽性対照−ＯＤ実験）／（ＯＤ陽性対照−ＯＤ陰性対照）×１００。
インビトロＣＴＬアッセイ
【０３２４】
ＲＭＡまたはＲＭＡ−ＭＵＣ１細胞（５〜６×１０６個）を回収し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ（ＲＭＡ−ＭＵＣ１細胞の場合は５００μＬ、ＲＭＡ細胞の場合は９５０μＬ）に懸濁した。２μＬのＣＦＳＥストック溶液（５ｍＭ）を１ｍＬの冷ＰＢＳに添加して、１０μＭ溶液を作製した。インキュベーター中で１０分間にわたって、５００μＬの１０μＭ  ＣＦＳＥ溶液を（最終ＣＦＳＥ濃度５μＭで）ＲＭＡ−ＭＵＣ１細胞に添加し、５０μＬの１０μＭ  ＣＦＳＥ溶液を（最終ＣＦＳＥ濃度０．５μＭで）ＲＭＡ細胞に添加し、次いで、１０ｍＬの培養培地を各チューブに添加し、室温で１０分間インキュベートした。細胞を遠心分離し、培養培地で１回洗浄し、細胞０．１×１０６個／ｍＬに調整した。脾臓またはリンパ節細胞を分離し、ＲＰＭＩ培地に懸濁し、細胞数を２．５×１０６個／ｍＬに調整した。５０μＬのＲＭＡおよびＲＭＡ−ＭＵＣ１細胞、１００μＬの脾臓またはリンパ節細胞をそれぞれ９６ウェルプレートに添加し、マルチプルチャンネルピペットにより少なくとも４回上下にピペッティングすることにより十分に混合し、次いで、インキュベーター中で６時間インキュベートした。ＦＡＣＳ分析の前に、４μＬの７−ＡＡＤを各チューブに添加した。以下のように、腫瘍細胞溶解の割合を計算した：ＲＭＡの溶解％＝（ＣＦＳＥｌｏ７ＡＡＤ＋／ＣＦＳＥｌｏ）×１００％、ＲＭＡ−ＭＵＣ１の溶解％＝（ＣＦＳＥｈｉ７ＡＡＤ＋／ＣＦＳＥｈｉ）×１００％。
インビボＣＴＬアッセイ
【０３２５】
正常マウス由来の脾細胞を回収し、細胞の半分をそれぞれ１０μＭのＭＵＣ１（糖）ペプチド３または４と共に１時間インキュベートした。ＭＵＣ１ペプチドパルスリンパ節細胞を高濃度のＣＦＳＥ（２．５μＭ、ＣＦＳＥｈｉ）で標識し、非ＭＵＣ１ペプチドパルス脾細胞を低濃度のＣＦＳＥ（０．２５μＭ、ＣＦＳＥｌｏ）で標識した。得られたＭＵＣ１ペプチドパルスＣＦＳＥｈｉ標識細胞をＣＦＳＥｌｏ標識細胞と混合し（１：１）、次いで、尾静脈によりＱβ−ＭＵＣ１免疫マウスに注射した（２００μＬ、合計２００万個の細胞）。２４時間後、リンパ節を分離し、４μＬの７−ＡＡＤを単一懸濁液に添加した。ＦＡＣＳ分析により、生存ＣＦＳＥｈｉおよびＣＦＳＥｌｏ細胞の数を決定した。
実施例１１：Ｑβ−ＭＵＣ１コンジュゲートの合成
【０３２６】
ＭＵＣ１は、ＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡＨＧＶＴＳＡの配列を有する２０個のアミノ酸残基の可変数のタンデムリピートからなる大きな細胞外Ｎ末端ドメインを有する（Ｔａｎｇ，  ＣＫら、（２００８）Ｅｘｐ．Ｒｅｖ．Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ７：９５１−９６２；Ｈａｔｔｒｕｐ，Ｃ．Ｌら、（２００８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．７０，４３１−４５７）。各タンデムリピート内の５つのセリンおよびトレオニン残基は、グリコシル化され得る可能性がある。本明細書に記載されるワクチン研究では、タンデムリピート領域の１つの全長をカバーする骨格として２０〜２２個のアミノ酸残基を含有するＭＵＣ１（糖）ペプチド１〜４を設計した。ペプチド１および３は、ＭＵＣ１−ＳＴＡおよびＭＵＣ１−ＤＴＲと表記される反復領域の２つの可能な配列を表す（ＳＴＡおよびＤＴＲは、Ｃ末端に最も近いトレオニンを含有する３つのアミノ酸配列である）。免疫反応に対するグリコシル化の影響の可能性を立証するために、Ｃ末端に最も近いトレオニン残基にＧａｌＮＡｃを組み込んで、ＭＵＣ１−ＳＴＡ−ＴｎおよびＭＵＣ１−ＤＴＲ−Ｔｎと表記されるＭＵＣ１糖ペプチド２および４を生じさせた。ＧａｌＮＡｃ改変ＭＵＣ１は、がんにおいて広く発現され（Ｂｅａｔｓｏｎ，Ｒら、（２０１５）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  １０，ｅ０１２５９９４）、ＣＴＬエピトープとして機能し得る可能性があるので（Ｖｌａｄ，Ａ．Ｍら、（２００２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９６，１４３５−１４４６；Ａｐｏｓｔｏｌｏｐｏｕｌｏｓ，Ｖら、（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００，１５０２９−１５０３４４０−４１）、ＧａｌＮＡｃ改変ＭＵＣ１に焦点をあわせた。
Ｆｍｏｃ化学を使用して固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）により、ＭＵＣ１（糖）ペプチドの合成を実施した（スキーム１）。
ペプチド鎖へのＦｍｏｃ保護アミノ酸のカップリングを、（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−
【０３２７】
１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）／ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）を用いて行った。
【０３２８】
糖ペプチド合成では、Ｆｍｏｃ保護ＧａｌＮＡｃ−トレオニン５（Ｆｍｏｃ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔｈｒ）（Ｓｕｎｇｓｕｗａｎ，Ｓら、（２０１５）ＡＣＳ  Ａｐｐｌ．Ｍａｔｅｒ．Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  ７，１７５３５−１７５４４）をビルディングブロックとして使用し、これを、１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウム３−オキシドヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）／１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）により媒介されるペプチド鎖に導入した。（糖）ペプチドのアセンブリ後、Ｎ末端Ｆｍｏｃ基を除去し、アジド末端リンカーである
【０３２９】
アジド−ＰＥＧ３−ＮＨＳ６（Ｍａｒｔｉｎ，Ａ．Ｌら、（２００８）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１９，２３７５−２３８４）をＮ末端に組み込んだ。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）／Ｈ２Ｏにより、得られた（糖）ペプチドを樹脂から切断し、Ｈ２Ｏ中５％ヒドラジンにより、糖部分のＯ−アセテートを除去した。Ｃ１８逆相ＨＰＬＣ精製により、３０〜４０％の収率で所望のＭＵＣ１（糖）ペプチド１〜４を得た。
Ｑβ−ＶＬＰへのＭＵＣ１のライゲーションを、バイオコンジュゲーションのために最適化された銅触媒による
【０３３０】
アジド−アルキン付加環化（ＣｕＡＡＣ）反応（Ｈｏｎｇ，Ｖら、（２００９）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４８，９８７９−９８８３）を用いて実施した。アジド改変ＭＵＣ１ペプチド１〜４は、ＴＨＰＴＡリガンド８とともにＣｕ＋触媒により促進されて、アルキン官能化Ｑβ７とカップリングした（Ｙｉｎ，Ｚら、（２０１３）ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．８，１２５３−１２６２）（スキーム２）。それぞれコンジュゲート１０〜１３について、Ｑβ上に導入した（糖）ペプチドの平均数は２５７個、１４０個、２４８個および１７１個であった（推定分布±１５％）（図７２〜７５）。大過剰の３−アジド１−プロパノール９を使用して、第２のＣｕＡＡＣ反応により、Ｑβカプシド上の未反応アルキン基をキャップした。抗原密度効果の分析のために、Ｑβ−アルキン７とのＭＵＣ１糖ペプチド２のコンジュゲーション中の試薬濃度および反応時間を減少させることにより、カプシド当たり平均３０コピーのＭＵＣ１糖ペプチド２を保持してＱβ−ＭＵＣ１  １４も合成した。
実施例１２：Ｑβ−ＭＵＣ１コンジュゲートはロバストな力価の抗ＭＵＣ１  ＩｇＧ抗体を生成し得、高密度のＭＵＣ１は高レベルのＩｇＧに重要である
手持ちのＱβ−ＭＵＣ１コンジュゲートを用いて、それらの免疫反応誘導能力を調査した。Ｃ５７ＢＬ６マウス群を、注射当たりの総ＭＵＣ１濃度を等しくして前記コンジュゲートで隔週に３回免疫（すなわち、０日目、１４日目および２８日目に注射）した。最終ブーストの１週間後（３５日目）に血清サンプルを採取し、免疫に使用した特定のＭＵＣ１糖ペプチド構造に対する酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）により、抗体力価およびサブタイプを決定した。
【０３３１】
本発明者らが調査した第１のパラメータは、Ｑβ−ＭＵＣ１構築物１１および１４を比較することによる抗体応答に対する局所抗原密度の効果である（図４２）。Ｑβ−ＭＵＣ１  １１により誘発された抗ＭＵＣ１抗体応答は主にＩｇＧであった。産生された平均総ＩｇＧ力価は１，０１３，３００であり、これは、Ｑβのみで免疫した対照マウスからの力価よりも５００倍高かった。興味深いことに、同じ総量のＭＵＣ１を受けたにもかかわらず、Ｑβ−ＭＵＣ１  １４で免疫したマウスは、ＭＵＣ１の局所密度がより高いＱβ−ＭＵＣ１  １１を受けたもののわずか２０％の平均ＩｇＧ抗体力価を示した。さらに、１１によるＩｇＧ力価の群内変動は、１４により誘導されたものよりも小さかった。
【０３３２】
ＩｇＧ力価のサブタイピングにより、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ２ｃを含むＩｇＧのすべての主要なサブタイプが誘発されたことが示された（図４２Ａ）。構築物１１はまた、炭水化物抗原により伝統的に誘導されるマウスのＩｇＧ抗体のサブタイプである大量のＩｇＧ３抗体を産生した（Ｋｌａｕｓ，Ｔら、（２０１５）Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．６，３０９３８；Ｇｒｅｅｎｓｐａｎ，Ｎ．Ｓら、（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １３，１６４−１６８）。次に、ＭＵＣ１抗体生成の動態および抗体持続性を調べた。１回目の免疫の２１日後、構築物１１に対するＩｇＧ抗体応答はピーク値に近づいた。超高ＩｇＧ力価は６カ月間を超えて維持したが、これは、長期にわたる免疫反応を誘導するための糖ペプチドのキャリアとしてのＱβの力を強調している（図４２Ｂ）。
【０３３３】
ＭＵＣ１キャリアとしてのＱβの一般性を立証するために、１１と同じ免疫プロトコールにしたがって、他のＱβ−ＭＵＣ１構築物を試験した。図４２Ｃに示されているように、これらのＱβ−ＭＵＣ１ワクチンはすべて、Ｑβ−ＭＵＣ１  １１のものと同程度の一貫した高い抗ＭＵＣ１  ＩｇＧ力価を誘発し、Ｑβ−ＭＵＣ１  １３で免疫したマウスからの平均ＩｇＧ力価は２，０００，０００を超えた。陰性対照として、ＷＴ  Ｃ５７ＢＬ６マウス群を、共有結合的コンジュゲーションを有しないＱβと混合したＭＵＣ１糖ペプチドで免疫した。（図７７）に示されているように、誘導された抗ＭＵＣ１  ＩｇＧ抗体力価は４００未満であったので、これは、ＱβとのＭＵＣ１糖ペプチドの共有結合的コンジュゲーションが高い抗体力価の産生に重要であることを示唆している。
実施例１３：Ｑβ−ＭＵＣ１コンジュゲート１０〜１３により誘導された抗体のマイクロアレイ分析
【０３３４】
結合特異性をより良く理解するために、ムチン−５糖ペプチド、ブタ胃およびウシ顎下腺由来のムチンならびにいくつかの他の糖タンパク質に加えて様々なＭＵＣ１糖ペプチドを含む（糖）ペプチドマイクロアレイに対して、Ｑβ−ＭＵＣ１  １０〜１３ワクチン接種からの免疫後血清をスクリーニングした（図７８）（Ｐｅｔｔ，Ｃら、（２０１７）Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．２３，３８７５−３８８４）。マイクロアレイ上には、それぞれ１つのＭＵＣ１タンデムリピートＰＡＨＧＶＴ＊ＳＡＰＤＴ＊ＲＰＡＰＧＳＴ＊Ａ（＊は、潜在的なグリコシル化部位を示す）を有する７２個のＭＵＣ１糖ペプチドがある。グリカン構造は多様であり、これは、Ｔｎ、トムゼン・フリーデンライヒ（Ｔ）抗原、ならびにいくつかのコア１、コア２およびコア３オリゴ糖を含む（図７８）。マイクロアレイスライドを個々のマウス血清と共にインキュベートし、十分な洗浄により未結合抗体を除去した。次いで、蛍光標識二次抗体をマイクロアレイに添加して、個々のアレイ成分に結合した血清抗体の相対量を定量した。
【０３３５】
図７８に示されているように、Ｑβ−ＭＵＣ１コンジュゲート１０〜１３により誘導された抗体は、Ｔｎ、Ｔ、コア１、コア２およびコア３または混合グリカンを有するほぼすべてのＭＵＣ１糖ペプチドに対して幅広く強い認識を示した。これは、幅広いレパートリーの抗ＭＵＣ１  ＩｇＧ抗体がワクチン接種により誘発されたことを示唆しており、腫瘍細胞表面上のＭＵＣ１タンパク質のグリコシル化は一般に不均一であるので、これは、抗がんワクチン開発にとっては申し分ない前兆である。ムチン−５糖ペプチドまたはいかなる他のタンパク質にもほとんど結合しなかったので、前記抗体はＭＵＣ１に特異的であった。マイクロアレイ結合プロファイルの綿密な検査により、興味深い結合傾向が明らかになった。ＭＵＣ１糖ペプチド１５〜１７のＰＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴ＊ＲＰＡＰＧＳＴＡは、ペプチド鎖の中央のトレオニンに結合したグリカン構造のみが異なっていた（＊は、グリコシル化の位置を表す。１５の場合にはＴｎ、１６の場合にはＴ、および１７の場合にはコア２六糖Ｃ２Ｔ２Ｈｅｘ；グリカン構造については、図Ｓ７を参照のこと）。Ｔ抗原およびコア２六糖のサイズは、Ｔｎと比較して大きなサイズにもかかわらず、３つの糖ペプチドはすべてよく認識された（図４３Ａ）。免疫原Ｑβ−ＭＵＣ１  １３は、そのＭＵＣ１のＤＴＲ領域においてＴｎを含有しており、Ｑβ−ＭＵＣ１により誘導された抗体は、グリカンを欠くＱβ−ＭＵＣ１  １２と比較して大幅に強い糖ペプチド１５〜１７への結合を示した。糖ペプチド１８〜２０のＰＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴ＊Ａに対する１１（ＳＴＡ領域におけるグリコシル化）対１０により誘導された抗体で、同じ現象が観察された（＊は、グリコシル化の位置を表す。１８の場合にはＴｎ、１９の場合にはＴおよび２０の場合にはコア２六糖。図４３Ｂ）。
実施例１４：Ｑβ−ＭＵＣ１コンジュゲートにより誘導されたＩｇＧ抗体はＭＵＣ１発現腫瘍細胞に結合することができ、補体媒介性細胞傷害により腫瘍細胞を選択的に死滅させる
【０３３６】
有効なワクチンのためには、生成された抗体が、そのネイティブ環境において、すなわち腫瘍細胞上で発現される抗原を認識し得ることが重要である。これを立証するために、ＭＵＣ１  トランスフェクトマウスリンパ腫細胞ＲＭＡ−ＭＵＣ１を使用して、フローサイトメトリー研究を実施した。１：５希釈の市販の抗ＭＵＣ１  ｍＡｂ  ＨＰＭＶとの細胞結合により確認されるように、ＲＭＡ−ＭＵＣ１細胞は、細胞表面上でヒトＭＵＣ１を発現する（図４４Ａ）。
【０３３７】
免疫後血清によるＲＭＡ−ＭＵＣ１細胞の認識を試験するために、ＲＭＡ−ＭＵＣ１細胞を血清と共にインキュベートした。未結合抗体を洗い流した後、細胞を蛍光標識抗ＩｇＧ二次抗体で処理した。免疫前マウス由来の血清は、ＲＭＡ−ＭＵＣ１細胞にほとんど結合しなかった（図４４Ａ）。対照的に、免疫後血清は、１：１００希釈であってもＲＭＡ−ＭＵＣ１細胞の良好な認識を示した（図４４Ａ）。Ｑβに対するＭＵＣ１密度の影響に関するＥＬＩＳＡ結果と一致して、ワクチン構築物１１による免疫後のマウス血清では、１４（低いＭＵＣ１密度）と対比して強い結合が観察された（図４４Ａ）。免疫後血清は、ＭＵＣ１導入遺伝子を欠くＲＭＡ細胞の有意な認識を示さず、抗体の特異性を実証しているので、腫瘍細胞への１１により誘導された抗体の結合はＭＵＣ１依存的であった（図４４Ｂおよび４４Ｃ）。
【０３３８】
ＲＭＡ−ＭＵＣ１細胞の他に、腫瘍細胞認識の一般性を試験するために、マウス黒色腫Ｂ１６−ＭＵＣ１細胞および乳がんＭＣＦ−７細胞への結合を、免疫後血清で測定した。４つのＱβ−ＭＵＣ１構築物１０〜１３のいずれかで免疫したマウスは、試験したすべてのＭＵＣ１発現腫瘍細胞を強く認識することができる抗体を産生した（図４５）。非グリコシル化ペプチド３を有する構築物１２により誘導された抗体は、ＭＵＣ１発現腫瘍細胞への弱い結合を示したが、これは、ＰＤＴ＊ＲドメインにおけるＭＵＣ１糖ペプチドのＴｎグリコシル化が、より強い腫瘍細胞結合のための抗体の生成に寄与することを示唆している。
【０３３９】
ＭＵＣ１発現腫瘍細胞の強い認識により、腫瘍細胞を死滅させる免疫後血清の能力を測定した。ＭＵＣ１発現腫瘍細胞を免疫後血清およびウサギ補体と共にインキュベートすると、対照血清で処理した細胞と比較して有意に高い割合の腫瘍細胞死がもたらされた（図４６および図７６。免疫後血清は、腫瘍細胞を効率的かつＭＵＣ１依存的に死滅させることができた。
実施例１５：Ｑβ−ＭＵＣ１による免疫は、インビトロおよびインビボでＭＵＣ１特異的ＣＴＬを誘導し得る
【０３４０】
ＭＵＣ１は、そのタンデムリピート領域内にいくつかのＣＴＬエピトープを含有することが公知である（Ｖｌａｄ，Ａ．Ｍら、（２００２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９６，１４３５−１４４６；Ａｐｏｓｔｏｌｏｐｏｕｌｏｓ，Ｖら、（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００，１５０２９−１５０３４；Ｒｅｄｄｉｓｈ，  Ｍら、（１９９８）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７６，８１７−８２３）。１つのＱβカプシドが数百のコピーのＭＵＣ１を送達し得るので、Ｑβ−ＭＵＣ１構築物が、免疫マウスにおいてＭＵＣ１特異的ＣＴＬ応答を誘発し得るかを試験した。
【０３４１】
最初に、インビトロＣＴＬアッセイを使用して、ＭＵＣ１特異的細胞溶解活性を測定した。構築物１２および１３で免疫したマウスから、ならびにＱβのみで免疫した対照マウスから、脾臓およびリンパ節を回収した。脾細胞およびリンパ節細胞を単離し、それぞれＲＭＡ−ＭＵＣ１およびＲＭＡ細胞と共にインキュベートし、腫瘍細胞の生存率を測定した。図４６Ａに示されているように、Ｑβのみを投与したマウス由来の細胞は、ＲＭＡおよびＲＭＡ−ＭＵＣ１細胞のいずれの有意な死ももたらさなかったが、これは、抗腫瘍ＣＴＬ応答の生成においてＱβそれ自体が有効ではなかったことを示している。比較すると、Ｑβ−ＭＵＣ１免疫マウス由来のリンパ節細胞は、ＲＭＡ細胞よりも有意に高いＲＭＡ−ＭＵＣ１細胞溶解をもたらしたが、これは、Ｑβ−ＭＵＣ１によりＭＵＣ１依存性ＣＴＬ活性が生成されたことを示唆している（図４７Ａ）。免疫マウス由来の脾臓細胞を用いて、同様の現象が観察されている。
【０３４２】
ＣＴＬのインビボ細胞傷害アッセイを行った。ナイーブマウス由来の脾細胞を回収し、２つの異なる濃度のカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識した（Ｊｅｄｅｍａ，Ｉら、（２００４）Ｂｌｏｏｄ  １０３，２６７７−２６８２）。ＣＦＳＥｈｉｇｈ細胞をＭＵＣ１（糖）ペプチド３または４の混合物でパルスし、同じ数の非パルスＣＦＳＥｌｏｗ細胞と混合し、Ｑβ−ＭＵＣ１構築物１２および１３で免疫したマウスに静脈内注射した。図４７Ｂに示されているように、ＣＦＳＥｈｉｇｈ細胞は、ＭＵＣ１と共にインキュベートしなかったＣＦＳＥｌｏｗ細胞よりも大幅に多く溶解されたが、これは、Ｑβ−ＭＵＣ１ワクチン接種がＭＵＣ１に対して特異的なＣＴＬの活性化および拡大をもたらしたことを示唆している。
実施例１６：実施例１７〜２６の材料および方法｛ＦＨ：これはＴｇ原稿に対応する｝
【０３４３】
マウスの免疫。ＭＵＣ１  Ｔｇ．雄マウスをＣ５７Ｂｌ／６Ｗｔ雌マウスと交配させることにより、ヒトＭＵＣ１遺伝子の１０．６ｋｂゲノムＳａｃＩＩ断片を有するＭＵＣ１  Ｔｇ．マウスを作製し、約５０％の収率で遺伝子型決定により同定した。６〜１０週齢のＭＵＣ１  Ｔｇ．雌マウスを、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  ｆａｃｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｈｉｇａｎ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙにおいて維持し、研究に使用した。Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）ｏｆ  Ｍｉｃｈｉｇａｎ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの指針にしたがって、すべての動物実験を実施した。０日目に、製造業者の指示にしたがって、完全フロイントアジュバント中０．１ｍＬの様々なＱβ−ＭＵＣ１ワクチンをエマルジョンとして、ＭＵＣ１  Ｔｇ．雌マウスの首筋下に皮下注射した。１４日目および２８日目に、不完全フロイントアジュバントと混合してブースターを首筋下に皮下投与した。投与したＭＵＣ１ワクチンコンジュゲートはすべて、同じ量のＧａｌＮＡｃ（１．９μｇ）を有する。０日目（免疫前）、７日目および３５日目に、血清サンプルを収集した。心臓脱血により、最終的な脱血を行った。
【０３４４】
ＥＬＩＳＡによる抗体力価の評価。Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）平底９６ウェルプレートを、対応するＭＵＣ１（糖）ペプチド（１０μｇ／ｍＬ、１００μＬ／ウェル）を含むＮａＨＣＯ３／Ｎａ２ＣＯ３バッファー（０．０５Ｍ、ｐＨ９．６）の溶液でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。コーティングプレートをＰＢＳ／０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）（４×２００μＬ）で洗浄し、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ（１００μＬ／ウェル）により室温で１時間ブロッキングした。プレートをＰＢＳＴ（４×２００μＬ）で再び洗浄し、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中マウス血清の連続希釈物（１００μＬ／ウェル、各希釈物について４ウェル）と共にインキュベートした。プレートを３７℃で２時間インキュベートし、次いで、ＰＢＳＴ（４×２００μＬ）で洗浄した。０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中のＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）の１：２０００希釈物（１００μＬ）をそれぞれウェルに添加して、生成された抗体の力価を決定した。プレートを３７℃で１時間インキュベートする。アルミホイルで覆った５０ｍＬ遠心チューブ中、ＴＭＢ（５ｍｇ）をＤＭＳＯ（２ｍＬ）およびクエン酸バッファー（１８ｍＬ）の混合物に溶解させることにより、酵素基質の溶液を調製した。Ｈ２Ｏ２（２０μＬ）を添加し、ボルテックスすることにより混合物をホモジナイズした。プレートをＰＢＳＴ（４×２００μＬ）で洗浄し、酵素基質の溶液を添加した（２００μＬ）。１５分間発色させ、０．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４（５０μＬ）を添加して、反応をクエンチした。マイクロプレートリーダーを使用して、吸光度を４５０ｎｍで測定した。光学密度でプロットしたｌｏｇ１０希釈の回帰分析により、力価を決定した。ＯＤ＝０．３を与える最高希釈倍率として、力価を報告した。
【０３４５】
フローサイトメトリーによる腫瘍細胞への抗体結合の検出。Ｂ１６−ＭＵＣ１細胞、Ａｇ１０４−ＭＵＣ１細胞、ＭＣＦ−７細胞またはＭＣＦ−１０Ａ細胞を、それぞれ細胞成長培地中、５％ＣＯ２下、３７℃で培養した。細胞成長培地中の細胞の混合物をコニカル遠心チューブに移し、１，６００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した。ペレットを成長培地（１０ｍＬ）に再懸濁した。血球計により、細胞の数を決定した。３．０×１０５個の細胞の懸濁液を各ＦＡＣＳチューブに添加し、これを１，６００ｒｐｍで５分間遠心分離して、上清を除去した。細胞をＦＡＣＳバッファー（０．１％ＮａＮ３を含むＰＢＳ中１％ＦＢＳ）で洗浄し、ＰＢＳ中のマウス血清の１：２０希釈物（１００μＬ）と共に氷上で３０分間インキュベートした。インキュベートした細胞をＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、続いて、これをＦＩＴＣ抗マウスＩｇＧ（２μＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ）と共に氷上で３０分間インキュベートした。細胞を２回洗浄し、ＬＳＲ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）による分析の前にＦＡＣＳバッファーに再懸濁した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアにより、データを処理する。
【０３４６】
補体依存性細胞傷害。ＭＴＳアッセイにより、Ｂ１６−ＭＵＣ１またはＭＣＦ−７細胞の補体依存性細胞傷害を決定した。Ｂ１６−ＭＵＣ１またはＭＣＦ−７細胞（細胞７０００個／ウェル）を１２〜４８時間（Ｂ１６−ＭＵＣ１の場合には１２時間、ＭＣＦ−７の場合には４８時間）培養し、５０μＬの培養培地中の異なる免疫ＭＵＣ１  Ｔｇ．マウス群由来のマウス血清の希釈物（Ｂ１６−ＭＵＣ１の場合には１／４０、ＭＣＦ−７の場合には１／４０）と共に３７℃で３０分間インキュベートし、５０μＬの培養培地中の希釈したウサギ血清補体（Ｂ１６−ＭＵＣ１の場合には１／５、ＭＣＦ−７の場合には１／１５）を添加し、次いで、３７℃で４時間インキュベートした。ＭＴＳ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ；Ｐｒｏｍｅｇａ，２０μＬ）を各ウェルに添加し、３７℃でさらに３時間インキュベートした。ＭＴＳアッセイの光吸収を４９０ｎｍで測定した。培地のみで培養した細胞を陽性対照（最大ＯＤ）として使用し、培養培地を陰性対照（最小ＯＤ）として使用した。すべてのデータを４回反復で実施した。以下のように、細胞傷害を計算した：細胞傷害（％）＝（ＯＤ陽性対照−ＯＤ実験）／（ＯＤ陽性対照−ＯＤ陰性対照）×１００。
【０３４７】
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害。標準的な方法により、初代ＮＫ細胞およびＬＡＫ細胞を生成した。簡潔に言えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の脾細胞を処理し、ＣＤ４５Ｒマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）で直接標識した。次いで、抗ＮＫ１．１およびＴＣＲβ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して、Ｂ２２０−脾細胞をＦＡＣＳ選別し、９５％超のＮＫ１．１＋ＴＣＲ−であった集団を単離した。すべてのモノクローナル抗体はＢｉｏｌｅｇｅｎｄ製であった。５００  Ｕ／ｍＬ  ｒｈＩＬ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ）を含む完全ＩＭＤＭ（Ｇｉｂｃｏ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）に精製ＮＫ細胞をプレーティングし、８日間維持してＬＡＫ細胞を生成した。ＡＤＣＣアッセイでは、新たに単離して増やしたＬＡＫ細胞を使用した。Ｂ１６−ＭＵＣ１細胞を、Ｑβ免疫ＭＵＣ１  Ｔｇ．マウス由来の対照血清またはＱβ−ＭＵＣ１  ２７免疫ＭＵＣ１  Ｔｇ．マウス由来の研究血清のいずれかおよび１００μＣｉ５１Ｃｒ（Ｎａ２ＣｒＯ４）（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）と共に３７℃で２時間インキュベートした。細胞を広範に洗浄し、様々な数のＮＫ細胞またはＬＡＫ細胞と共にプレーティングした（細胞２０００個／ウェル／１００μＬ）。１６時間後、培養上清を回収し、ＭｉｃｒｏＢｅｔａ２ガンマカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）のＬｕｍａＰｌａｔｅｓ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）により、５１Ｃｒカウント毎分（ｃｐｍ）について分析した。記載されているように、特異的溶解率を計算した（Ｄａｓら、（２０１３）Ｂｌｏｏｄ  １２１，３３８６−３３９５）。
【０３４８】
乳がん組織マイクロアレイの免疫学染色。ＵＳ  Ｂｉｏｌａｂ（ＢＲＥ０６０−０３）の乳癌組織アレイを実施し、抗原性エピトープを露出させるために、１０ｍＭクエン酸バッファー（ｐＨ６．０）で抗原回復を９５〜１００℃で１０分間行った。スライドを室温に移して２０分間冷却し、ＰＢＳで洗浄し（２×、各５分間）、ブロッキングバッファー（ＰＢＳ中５％ＢＳＡ）と共に室温で１時間インキュベートした。次いで、スライドを、Ｑα−ＭＵＣ１  ４３免疫ＭＵＣ１  Ｔｇ．マウス由来の希釈マウス血清（１：１０００）と共に室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し（２×、各５分間）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートされた希釈ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体（１／１０００）で室温で３０分間染色した。スライドをＰＢＳで洗浄し（２×、各５分間）、発色させるために、所望の色強度が達成されるまで、ＤＡＢ基質溶液と共に５分間未満インキュベートし、続いて、ＰＢＳで洗浄し（３×、各２分間）、ヘマトキシリンで１〜２分間染色した。組織中の抗体染色の褐色を顕微鏡法下で観察した。
【０３４９】
がん免疫療法研究。肺転移モデルでは、０日目に、ＭＰＬＡ（２０μＬ、ＤＭＳＯ中１ｍｇ／ｍＬ）と混合したＰＢＳ中０．２ｍＬのＱβ−ＭＵＣ１  ４３，ＫＬＨ−ＭＵＣ１  ４４またはＱβを、６〜１０週齢の病原体未感染ＭＵＣ１  Ｔｇ．雌マウスの首筋下に皮下注射した。１４日目および２８日目に、ＭＰＬＡと混合してブースターを首筋下に皮下投与した。３５日目に、マウス当たりＢ１６−ＭＵＣ１細胞１×１０５個の静脈内注射により、ワクチン接種マウスをチャレンジし、続いて、ＭＰＬＡと混合したコンジュゲートによる４回目の免疫を行った。４５日目に、ＭＰＬＡと混合したワクチンによる５回目の免疫をマウスに行った。５６日目に、墨色インク（ＰＢＳ中５０％）の気管内注射により、肺転移を数えた。墨色インク注射肺をフェケット溶液（３００ｍｌの７０％ＥｔＯＨ、３０ｍｌの３７％ホルムアルデヒド、５ｍｌの氷酢酸）で洗浄し、次いで、新鮮なフェケット溶液に一晩入れた。次いで、黒色の肺背景に対する白色の腫瘍結節をカウントした。
【０３５０】
コンビナトリアル免疫療法では、０日目、１４日目および２８日目に、６〜１０週齢の病原体未感染ＭＵＣ１  Ｔｇ．雌マウスを、ＭＰＬＡをアジュバントとして加えたＱβまたはＱβ−ＭＵＣ１  ４３で免疫し、３５日目に、皮下接種により５×１０５個のＢ１６−ＭＵＣ１細胞でチャレンジし、続いて、４回目の免疫を行い、次いで４２日目に、５回目の免疫を行い、続いてそれぞれ４３日目および４６日目に、腹腔内注射を介して抗ＰＤ１（１００μｇ／マウス、クローン：ＲＭＰ１−１４，ＢｉｏＸｃｅｌｌ）処置を行った。４９日目に、マウスにＭＰＬＡによる６回目の免疫を行い、続いて５０日目および５３日目に、抗ＰＤ１処置を行った。式：体積（ｍｍ３）＝１／２（長さ×幅×高さ）（Ｔｏｍａｙｋｏ，Ｍ．Ｍら、（１９８９）Ｃａｎｃｅｒ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ２４，１４８−１５４）により、腫瘍体積を決定した。腫瘍体積が１６００ｍｍ３を超えるか、または腫瘍の潰瘍形成が観察されたら、マウスを安楽死させた。
実施例１７：免疫寛容ＭＵＣ１トランスジェニックマウスにおける免疫ＭＵＣ１構造に対する高いＩｇＧ力価の産生にもかかわらず、第１世代Ｑβ−ＭＵＣ１構築物５〜８は、強い腫瘍細胞結合のためのＩｇＧ抗体を誘発することができなかった
【０３５１】
ＭＵＣ１ベースのワクチン設計では、本発明者らの第１世代アプローチは、タンデムリピート領域の１つの全長をカバーする骨格として２０〜２２個のアミノ酸残基を含有するＭＵＣ１（糖）ペプチド１〜４に基づくものであった。銅触媒アジド−アルキン付加環化（ＣｕＡＡｃ）反応により、Ｎ末端アジド基を介して、ＭＵＣ１（糖）ペプチドをキャリアとしてのバクテリオファージＱβにコンジュゲートした（Ｑβ−ＭＵＣ１コンジュゲート５〜８）。野生型（ＷＴ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスに投与した場合、これらの構築物は超強力な抗ＭＵＣ１  ＩｇＧ応答を誘発し、免疫ＭＵＣ１構造に対してＥＬＩＳＡアッセイにより評価した平均力価は２，０００，０００を超えた。さらに、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）アッセイにより分析した場合、産生された抗体は、複数のＭＵＣ１発現腫瘍細胞を認識することができた。得られたこれらの有望な結果を用いて、ヒトＭＵＣ１トランスジェニック（ＭＵＣ１．Ｔｇ）マウスにおいて、これらの構築物をさらに研究した。
【０３５２】
上述のように、マウスムチンの配列はヒトＭＵＣ１のものとは異なるものであり、ヒトＭＵＣ１は、マウスにおいて良好な免疫原性を有する外来抗原である。その結果として、ヒトＭＵＣ１発現腫瘍は免疫系により拒絶されるので、野生型マウスでは、それらは成長することができない。ヒトにおけるＭＵＣ１に対する寛容状態を模倣するために、発生的に調節されかつ組織特異的な方法でヒトＭＵＣ１を内因的に発現するヒトＭＵＣ１トランスジェニックＣ５７ＢＬ／６マウス（ＭＵＣ１．Ｔｇ）を繁殖させた。ＭＵＣ１．Ｔｇマウスにおける免疫細胞によるＭＵＣ１発現レベルおよびパターンならびにＭＵＣ１寛容は、ヒトにおけるものと同様であるので、ＭＵＣ１．Ｔｇマウスは、ワクチン評価のための適切なモデルである。野生型マウスとは異なり、未処置ＭＵＣ１．Ｔｇマウスは、ＭＵＣ１発現腫瘍細胞を拒絶し得ないが、これは、ヒトＭＵＣ１に対する免疫寛容を裏付けている。
【０３５３】
ＷＴマウス研究の場合のように、２週間おきの１回のプライム注射および２回のブースター注射を用いた同じ免疫プロトコールにしたがって、Ｑβ−ＭＵＣ１  ５〜８のコンジュゲートを用いてＭＵＣ１．Ｔｇマウスにワクチン接種した。１回目の注射後３５日目に、マウスから血清を収集し、分析した。ＥＬＩＳＡにより、対応するＭＵＣ１（糖）ペプチド１〜４に対してアッセイしたところ、ＷＴマウス由来のものと同様に、高レベルの抗ＭＵＣ１  ＩｇＧが生成されたことが示された（図４９Ａ）。次いで、ＦＡＣＳ分析を行って、Ａｇ１０４−ＭＵＣ１線維肉腫、Ｂ１６−ＭＵＣ１黒色腫およびＭＣＦ−７乳がん細胞を含むＭＵＣ１発現腫瘍細胞のパネルの結合を試験した。腫瘍細胞を、Ｑβ−ＭＵＣ１  ５〜８免疫Ｔｇ．マウス由来の免疫後血清と共にインキュベートし、続いて、ＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ二次抗体で染色した。良好なＩｇＧ力価にもかかわらず、ＦＡＣＳの結果により、これらの血清は、野生型マウス由来のものの３％未満の結合レベルで、ＭＵＣ１発現腫瘍細胞への大幅に弱い結合を示したことが示された（図４９Ｂ）。ＭＵＣ１．Ｔｇマウスにおいて誘導された腫瘍細胞に対する低い反応性の観察結果は、ＭＵＣ１ベースのワクチンの臨床研究からの結果と類似する。以前、本発明者らは、Ｑβ−ＭＵＣ１  ７および８が、ＷＴマウスにおいてＭＵＣ１特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答を生成することができたことを報告した。しかしながら、Ｔｇマウスにおいて評価した場合、これらの構築物は、がん細胞に対する有意なＣＴＬベースの細胞傷害を誘発しなかった（データは示さず）。生成された抗体による弱い腫瘍細胞結合および低いＣＴＬ活性は、Ｑβ−ＭＵＣ１  ５〜８が、免疫寛容ＭＵＣ１．Ｔｇマウスにおける腫瘍発生に対する保護の提供において有効でないであろうことを示唆している。ＣＴＬ応答および抗体応答は両方とも腫瘍保護に重要であり得るが、本発明者らは、保護抗体を誘発するためにＱβ−ＭＵＣ１の設計に最初に集中することを選択した。
実施例１８：ＷＴおよびＴｇマウス由来の誘導抗体のエピトーププロファイリングは、エピトープ設計に関する重要な洞察を提供した
【０３５４】
第１世代Ｑβ−ＭＵＣ１ワクチンで免疫したＴｇマウス由来の抗体による弱い腫瘍細胞認識をより良く理解するために、本発明者らは、これらの抗体のエピトープスキャニングを実施した。２０個のＭＵＣ１ペプチドのライブラリを合成し、これらはそれぞれ、７アミノ酸が重複する配列を有する８個のアミノ酸残基を含有し、１つのＭＵＣ１タンデムリピートの全長をカバーしていた。次いで、これらのペプチドを、多価プラットフォームとしてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とコンジュゲートさせて、２０個のＢＳＡ−ＭＵＣ１コンジュゲート９〜２８を得た。
【０３５５】
エピトープマッピングでは、個々のＢＳＡ−ＭＵＣ１コンジュゲートでコーティングしたＥＬＩＳＡウェルを、Ｑβ−ＭＵＣ１  ５免疫ＭＵＣ１．Ｔｇマウス由来の免疫後血清と共にインキュベートした。各ＭＵＣ１エピトープの認識の相対レベルをＥＬＩＳＡにより定量したところ、血清は、２つの主要領域（すなわち、ＨＧＶＴＳＡＰＤおよびＰＧＳＴＡＰＰＡ）および隣接アミノ酸残基への結合を示したことが示された（右パネル図５０）。これらの結果は、ＨＧＶＴＳＡＰＤおよびＰＧＳＴＡＰＰＡがＭＵＣ１ペプチド１内のエピトープであり、Ｔｇマウスにおける抗体応答を支配することを示唆している。免疫後血清による強い腫瘍細胞結合の欠如は、ＨＧＶＴＳＡＰＤまたはＰＧＳＴＡＰＰＡに対する抗体のレベルが十分に高くはなかったためであり得る。あるいは、ＨＧＶＴＳＡＰＤおよびＰＧＳＴＡＰＰＡ以外のエピトープが、腫瘍細胞結合に重要であり得る。
【０３５６】
ＭＵＣ１の重要なエピトープに関する洞察を得るために、ＷＴマウス由来の免疫後血清のエピトーププロファイルをＢＳＡ−ＭＵＣ１ペプチド結合から取得し、ＭＵＣ１．Ｔｇマウス由来のものと比較した。興味深いことに、ＷＴマウス対Ｔｇマウスでは、ＨＧＶＴＳＡＰＤおよびＰＧＳＴＡＰＰＡ領域への抗体結合のレベルは同程度であったが、これは、ＥＬＩＳＡにおける同様のＩｇＧ力価の観察結果と一致する（図４９Ａ）。しかしながら、ＷＴマウス血清は、ＳＡＰＤＴＲＰＡＰ領域への大幅に強い結合を示した（図５０、左パネル）。これは、ＳＡＰＤＴＲＰＡＰが、抗体による強い腫瘍細胞認識に必要な重要なエピトープであり得、ＨＧＶＴＳＡＰＤおよびＡＰＧＳＴＡＰＰなどの他の領域への認識は有意には寄与し得ないことを示唆している。
実施例１９：ＭＵＣ１ペプチドの遊離Ｃ末端に対して抗体が誘発された
【０３５７】
免疫マウス由来の免疫後血清のエピトープスキャニング中に、ＭＵＣ１ペプチドの遊離Ｃ末端は、抗体認識に重要であることが見出された。図５１に示されているように、コンジュゲートＱβ−ＭＵＣ１  ５ワクチン接種ＷＴおよびＴｇマウス由来の血清は、ＡＰＧＳＴＡＰＰ領域への同様の強い認識を示した。しかしながら、このペプチドのＣ末端をメチルエステルとしてキャップした場合、結合は大幅に減少した（図５１）。ＭＵＣ１の他の地域について、同様の現象が観察された。これは、ＭＵＣ１ペプチド１〜４の遊離Ｃ末端がエピトープ認識に有意に寄与したことを示唆している。ＭＵＣ１のタンデムリピート領域は、本質的に遊離Ｃ末端を含有しないので、免疫抗原の遊離Ｃ末端に対する抗体応答は、ＭＵＣ１発現腫瘍細胞の結合に寄与しないであろう。
実施例２０：Ｃ末端から連結したＭＵＣ１を有する第２世代のＱβ−ＭＵＣ１コンジュゲート３５〜３７の合成および評価
【０３５８】
ＭＵＣ１の遊離Ｃ末端の干渉を除去するために、本発明者らの第２世代ワクチンは、そのＣ末端を介してＱβにコンジュゲートしたＭＵＣ１（糖）ペプチドを有する。加えて、ＳＡＰＤＴＲＰＡＰ領域に対する抗体は腫瘍細胞結合に重要であると考えられたので、Ｎ末端のより近くに移動したＳＡＰＤＴＲＰＡＰ（これは、Ｂ細胞結合により利用しやすいであろう）を有するＭＵＣ１ペプチド配列２９を設計した。さらに、グリコシル化の効果を調べるために、ＧａｌＮＡｃ部分をＳＡＰＤＴＲＰＡＰ領域のトレオニン残基に導入して、糖ペプチド３０を得た。Ｒｙａｎ，Ｓ．Ｏら、（２０１０）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７０，５７８８−５７９６；ｖｏｎ  Ｍｅｎｓｄｏｒｆｆ−Ｐｏｕｉｌｌｙ，Ｓら、（２０１１）Ｃａｎｃｅｒｓ  ３，３０７３−３１０３）。その遊離Ｎ末端を除いて３０と同じ構造を有する糖ペプチド３１も設計した。
【０３５９】
Ｆｍｏｃ化学を使用して固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）により、ＭＵＣ１（糖）ペプチド２９〜３１の合成を実施した（図５３）。バイオコンジュゲーションを容易にするために、アジドリジンをＮα−Ｆｍｏｃ−Ｎε−アジド−Ｌ−リジン（Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｎ３）−ＯＨビルディングブロック３２）を用いてＣ末端の近くに導入した。糖ペプチド合成では、Ｆｍｏｃ保護ＧａｌＮＡｃ−トレオニン３３（Ｆｍｏｃ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔｈｒ）（Ｓｕｎｇｓｕｗａｎ，Ｓら、（２０１５）ＡＣＳ  Ａｐｐｌ．Ｍａｔｅｒ．Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  ７，１７５３５−１７５４４）をグリコシルアミノ酸カセットとして使用した。（糖）ペプチドのアセンブリ後、Ｎ末端Ｆｍｏｃ基を除去し、遊離で放置し（糖ペプチド３１の場合）、または無水酢酸でキャップした（２９〜３０）。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）／Ｈ２Ｏにより、得られた（糖）ペプチドを樹脂から切断した。Ｃ１８逆相ＨＰＬＣ精製により、所望のＭＵＣ１（糖）ペプチド２９〜３１を３０〜４０％の収率で生成した。
【０３６０】
ＣｕＡＡＣ反応を用いて、Ｑβ−ＶＬＰへのＭＵＣ１  ２９〜３１のライゲーションを実施した（Ｈｏｎｇ，Ｖら、（２００９）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４８，９８７９−９８８３）。アジド改変ＭＵＣ１  ２９〜３１を、Ｃｕ２＋触媒およびリガンド３４により促進して、アルキン官能化Ｑβとカップリングさせた（図５４）。コンジュゲート３５〜３７について、Ｑβ上に導入した（糖）ペプチドの数は平均２７０個であった。過剰な３−アジド１−プロパノール３８を使用して、第２のＣｕＡＡＣ反応により、Ｑβカプシド上の未反応アルキン基をキャップした。
【０３６１】
得られたＱβ−ＭＵＣ１コンジュゲート３５〜３７を用いて、ＭＵＣ１．Ｔｇマウスの免疫を実施した。ＥＬＩＳＡ力価は、免疫抗原に対する抗体のレベルを測定するだけであるので、免疫後血清の本発明者らの分析は、免疫反応の質の尺度として腫瘍細胞結合に主に集中した。３６および３７免疫からの血清による腫瘍細胞への同様の結合が観察されたが（図５５）、これは、ＭＵＣ１（糖）ペプチドのＮ末端のアミノ基が遊離であるか、またはアセトアミドとして保護されているかのいずれかであり得、抗ＭＵＣ１抗体の産生に大きな影響を及ぼさないことを示唆している。第１世代ワクチンと比較して、Ｑβ−ＭＵＣ１  ３６および３７は両方とも、腫瘍細胞へのより高い結合を有する抗体を誘発した（図５５Ａ〜５５Ｂ）。したがって、Ｃ末端を介したＭＵＣ１ペプチドの接続は、誘導抗体による腫瘍細胞結合を有意に増強することができた。
【０３６２】
腫瘍結合の増強により、第２世代ワクチンで免疫したマウスの結合エピトープを、ＢＳＡ−ＭＵＣ１コンジュゲート９〜２８を用いてマッピングした。図５６に示されているように、ＳＡＰＤＴＲＰＡ領域への有意な結合が観察された（ペプチドスキャニング結果のダブルチェック）。興味深いことに、ＨＧＶＴＳＡＰＤへの抗体結合は大幅に減少したが、それが抗原のＣ末端に位置していたとしても、ＡＰＧＳＴＡＰＰ領域を認識する有意なレベルの抗体が依然として存在しており、これは、ＡＰＧＳＴＡＰＰが免疫優性であり、Ｂ細胞認識およびその後の抗体産生についてＳＡＰＤＴＲＰＡと競合し得ることを示唆している。
実施例２１：第３世代Ｑβ−ＭＵＣ１コンジュゲート４２〜４３およびＫＬＨ−ＭＵＣ１コンジュゲート４４の合成
【０３６３】
抗体応答を所望の領域にさらに集中させるために、第３世代免疫原の設計では、ＭＵＣ１ペプチドを短縮して、ＨＧＶＴＳＡＰＤおよびＡＰＧＳＴＡＰＰ領域の両方を除去した。加えて、他の炭水化物ベースのワクチンに関する本発明者らの過去の研究において、本発明者らは、ＣｕＡＡＣ反応により形成されたリンカー中のトリアゾール部分が、所望の炭水化物抗原に対する抗体生成に有害であったことを発見した。したがって、フレキシブルなアルキルアミドリンカーを選択して、ＭＵＣ１（糖）ペプチドをＱβキャリアに連結した。
【０３６４】
ｐ−ニトロフェニルカーボネート官能化ワング樹脂から開始して、最初にこれにＦｍｏｃ−１，４−ジアミノブタン４０をロードし、続いてペプチド／糖ペプチド伸長を行うＳＰＰＳを使用して、ＭＵＣ１ペプチド３８および糖ペプチド３９を合成した（図５８Ａ）。Ｎ末端のキャッピング、脱保護および樹脂からの切断後、遊離（糖）ペプチドをアジピン酸ビス（４−ニトロフェニル）エステル４１と共にインキュベートし、ＭＵＣ１（糖）ペプチド３８および３９を生成した。次いで、アミド結合を介してＭＵＣ１（糖）ペプチド３８および３９をＱβとライゲーションして、Ｑβ−ＭＵＣ１  ４２、４３を得た（図５８Ｂ）。
実施例２２：ＭＵＣ１．ＴｇマウスにおいてＱβ−ＭＵＣ１  ４３により誘導された抗体は、第２世代Ｑβ−ＭＵＣ１  ３７およびＫＬＨ−ＭＵＣ１  ４４と比較して、ＭＵＣ１発現腫瘍細胞への最も強い結合を示した。
【０３６５】
ＭＵＣ１  Ｔｇ．マウスをＱβ−ＭＵＣ１  ４２、４３およびＫＬＨ−ＭＵＣ１  ４４で免疫した。フローサイトメトリーにより、ＭＵＣ１発現Ｂ１６−ＭＵＣ１細胞およびＭＣＦ−７細胞に対して分析したところ、Ｑβ−ＭＵＣ１  ４３は、ＭＵＣ１  Ｔｇ．マウスにおいて、３７を含むすべての他のＱβ−ＭＵＣ１構築物よりも大幅に強く腫瘍細胞と結合することができるＩｇＧ抗体を誘導することが見出された（図５９Ａおよび５９Ｂ）。これは、免疫原からの非必須ＭＵＣ１エピトープの除去が、抗体応答の質を有意に改善し得ることを示している。さらに、免疫後抗体は、正常細胞株ＭＣＦ−１０Ａの認識をあまり示さなかったが、これは、抗体による良好な腫瘍選択性を示唆している（図５９Ｃ）。ＫＬＨ−ＭＵＣ１  ４４と比較して、Ｑβ−ＭＵＣ１  ４３免疫は、ＫＬＨ−ＭＵＣ１  ４４免疫ＭＵＣ１  Ｔｇ．マウス由来のものよりも３倍高いＩｇＧ抗体力価および２倍高い腫瘍細胞結合を誘導した（図５９Ａおよび５９Ｂ）。これらの結果は、抗体産生について、ＱβがＫＬＨよりも優れており、Ｑβ−ＭＵＣ１  ４３が、さらなる評価のための優れたワクチン候補であることを示している。
実施例２３：糖ペプチドマイクロアレイの結果により、抗体認識におけるＭＵＣ１−Ｔｎ選択性が裏付けられた。
【０３６６】
誘導抗体の結合プロファイルをプローブするために、Ｑβ−ＭＵＣ１  ４３またはＫＬＨ−ＭＵＣ１  ４４またはＱβで免疫したＭＵＣ１  Ｔｇ．マウス由来の免疫前血清および免疫後血清を、ＭＵＣ１糖ペプチドマイクロアレイに対してスクリーニングした。この糖ペプチドアレイは、１つのタンデムリピートＰＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡの骨格配列を有する７２個のＭＵＣ１糖ペプチドを含有していた。Ｔｎ、Ｔおよびコア１〜３グリカンを含むグリカンを糖ペプチドの様々な位置に結合させた。加えて、ムチン−５（ＭＵＣ５）糖ペプチドおよび糖タンパク質（フェチュイン、トランスフェリン、ブタ胃およびウシ顎下腺由来のムチンを含む）がアレイに固定されている。スライドを個々のマウス血清と共にインキュベートした。十分な洗浄による未結合抗体の除去後、蛍光標識抗マウスＩｇＧ二次抗体を添加して、個々のアレイ成分に結合した血清ＩｇＧ抗体の量を半定量した。
【０３６７】
ＥＬＩＳＡからのより高い抗ＭＵＣ１力価と一致して、Ｑβ−ＭＵＣ１コンジュゲートは、ＫＬＨ−ＭＵＣ１と比較して平均で大幅に強いアレイ成分結合を生じさせた。広範なＭＵＣ１糖ペプチドが良好に認識されたが、これは、幅広いレパートリーの抗体が誘導されたことを示唆している。ＭＵＣ５糖ペプチドまたは他の糖タンパク質に対する交差反応性は観察されなかったが、これは、抗体応答がＭＵＣ１糖ペプチドに特異的であったことを示唆している。
【０３６８】
マイクロアレイデータの綿密な検査は、結合（ｂｉｎｉｄｎｇ）の興味深い構造依存性を明らかにしている。そのＰＤＴＲ領域においてＴｎを有する糖ペプチドは、ＰＤＴ＊Ｒ構造を欠くものよりも大幅に強く結合していた。例えば、糖ペプチド１〜３はすべて、同じタンパク質骨格および１つのＴｎを含有するが、これら３つの配列におけるＴｎの位置は異なる。そのＰＤＴＲ領域においてＴｎを有する糖ペプチド２は、１および３よりも、免疫後血清への最も強い結合を示す（図８４Ａ）。糖ペプチド４、６および７は、骨格において複数のＴｎ（そのＰＤＴＲ領域におけるＴｎを含む）を含有する。それらはすべて、免疫後血清により良好に認識された。これらの結果は、誘導された抗体が、免疫抗原ＭＵＣ１  ３９に含まれるＰＤＴ＊Ｒ領域に対して高い優先度を有する優れた部位選択性を有することを示唆している。
【０３６９】
ＰＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴ＊ＲＰＡＰＧＳＴＡと様々なグリカン構造との比較により、糖ペプチド２を有するＴｎが最も強く結合したが、二糖Ｔからコア３五糖の範囲の他のグリカンを有する糖ペプチドも同様に認識され得ることが示された（図８４Ｂ）。腫瘍関連ＭＵＣ１のグリコシル化は不均一であり得るので、複数の糖ペプチドを認識するＱβ−ＭＵＣ１  ３９誘導性抗体の能力は、腫瘍認識にとっては申し分ない前兆である。
実施例２３：Ｑβ−ＭＵＣ１  ４３により誘導された抗体は、補体媒介性細胞傷害（ＣＤＣ）および抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）機構の両方を介して、優れた殺腫瘍活性を示した。
【０３７０】
Ｑβ−ＭＵＣ１  ４３免疫マウス由来の血清による強い腫瘍認識により、腫瘍細胞を死滅させるそれらの能力をインビトロで測定した。Ｂ１６−ＭＵＣ１細胞（図６１Ａ）およびＭＣＦ−７細胞（図６１Ｂ）を免疫後血清およびウサギ補体と共にインキュベートしたところ、Ｑβ−ＭＵＣ１  ４３免疫血清は、他の血清で処置した細胞と比較して有意に高い割合の腫瘍細胞を死滅させた。ＭＵＣ１のＴｎグリコシル化は、免疫後血清のＣＤＣ効力を有意に増強した。
【０３７１】
ＡＤＣＣは、抗体がもたらす別の重要な腫瘍細胞殺滅様式である。ＭＵＣ１発現Ｂ１６−ＭＵＣ１標的細胞に対するエフェクター細胞としてナチュラルキラー（ＮＫ）細胞またはリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞のいずれかを使用して、ＡＤＣＣアッセイを設定した。図６２に示されているように、様々な標的細胞対エフェクター細胞比の下において、Ｑβ免疫マウス由来の対照血清とは対照的に、Ｑβ−ＭＵＣ１  ４３免疫マウス由来の血清から、より強い細胞傷害が観察された。
実施例２４：Ｑβ−ＭＵＣ１  ４３のワクチン接種は、転移モデルにおいて有意な腫瘍保護を示した。
【０３７２】
Ｑβ−ＭＵＣ１  ４３により誘発された高レベルのＩｇＧおよび強い腫瘍結合により、本発明者らは、腫瘍転移が患者生存の大きな障害であるので、転移モデルにおいて腫瘍保護を試験した。アジュバントとしてＦＤＡ承認ＭＰＬＡを用いて、ＭＵＣ１．ＴｇマウスをＱβ−ＭＵＣ１  ４３またはＱβ（対照）で免疫した。尾静脈を介してＢ１６−ＭＵＣ１黒色腫細胞を注射し、腫瘍接種の２１日後に、肺における腫瘍病巣の数を決定した。面白いことに、Ｑβ−ＭＵＣ１  ４３は、Ｑβ対照と対比して、腫瘍ロードの顕著な減少をもたらした（ｐ＝０．０００３）（図６３）。このモデルにおいて、ＫＬＨ−ＭＵＣ１  ４４の有効性も評価した。この転移モデルでは、ＫＬＨ−ＭＵＣ１  ４４による免疫はいくらかの腫瘍保護を示したが、腫瘍ロードの減少については、Ｑβ−ＭＵＣ１  ４３よりも有意に低い有効性であり（ｐ＝０．０３７）（図６３）、これは、抗ＭＵＣ１  ＩｇＧ抗体および腫瘍保護を誘導するためのキャリアとして、ＱβがＫＬＨと比較して優れていることを裏付けている。
実施例２５：Ｑβ−ＭＵＣ１  ４３のワクチン接種は、固形腫瘍モデルにおいて有意な腫瘍保護を提供した。
【０３７３】
Ｑβ−ＭＵＣ１  ４３による転移性腫瘍からのＭＵＣ１．Ｔｇマウスの保護の成功により、固形腫瘍モデルを試験した。腫瘍微小環境内では、有意な免疫抑制があり得るので、固形腫瘍は処置困難であることが公知である。プログラム細胞死１（ＰＤ−１）およびそのリガンド（ＰＤ−Ｌ１）は、重要な阻害性チェックポイント分子である（Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｄ．Ｍ．（２０１２）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  １２，２５２−２６４）。最近、本発明者らは、ＰＤ−１が抗ＴＡＣＡ抗体応答の抑制において大きな役割を果たすことを示した（Ｌｅｙｖａ，Ｍ．Ａら、（２０１６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．４，１０２７−１０３７）。抗ＰＤ−１ｍＡｂはＰＤ−１の機能を中和し得ることが公知であるので、本発明者らは、固形腫瘍に対する保護について、抗ＰＤ−１ｍＡｂとＱβ−ＭＵＣ１  ４３免疫との組み合わせを試験した。ＭＵＣ１．ＴｇマウスをＱβ−ＭＵＣ１  ４３またはＱβ（対照）およびＭＰＬＡアジュバントで免疫した。次いで、Ｂ１６−ＭＵＣ１黒色腫細胞を皮下移植し、続いて、さらなる免疫および抗ＰＤ−１  ｍＡｂ投与を行った。面白いことに、Ｑβ−ＭＵＣ１  ４３免疫を受けた群は、腫瘍成長が大幅に減少していた（図６４）。
実施例２６：ＭＵＣ１．ＴｇマウスにおけるＱβ−ＭＵＣ１  ４３誘導性血清によるヒト乳がん対正常組織への結合における高い選択性
【０３７４】
ヒト患者へのＱβ−ＭＵＣ１  ４３の橋渡しの可能性（translational  potential）を試験するために、本発明者らは、乳がん患者由来のがん組織を含む乳がん組織マイクロアレイであって、同じ患者由来の正常隣接乳房組織がアレイ上に一緒に固定された乳がん組織マイクロアレイを入手した。Ｑβ−ＭＵＣ１  ４３免疫ＭＵＣ１．Ｔｇマウス由来の血清を使用して組織を染色したところ、これは、乳がん組織と強く結合した（図６５Ａ）。全く対照的に、同じ条件下において、正常乳房組織はほとんど染色されなかった（図６５Ｂ）。これは、ＭＵＣ１発現ヒトがん組織の認識における誘導抗体の顕著な選択性を強調している。
実施例２７：Ｑβ抗がんワクチン候補
【０３７５】
ＭＵＣ１に加えて、本発明者らはまた、ＧＤ２および９−ＮＨＡｃ−ＧＤ２とのＱβコンジュゲートを調査した。ＧＤ２は、リンパ腫、神経芽細胞腫細胞および乳がん幹細胞上で過剰発現されることが公知である。Ｑβ−ＧＤ２およびＱβｂ−９−ＮＨＡｃ−ＧＤ２コンジュゲートは、リンパ腫、神経芽細胞腫および乳がんに対する潜在的なワクチンであり得る。Ｑβ抗がんワクチンもまた、がん幹細胞を標的とし得る。ＧＤ２および９−ＮＨＡｃ−ＧＤ２のＱβコンジュゲートで免疫したマウスは、ＥＬ４リンパ腫細胞と強く結合することができるＩｇＧ抗体を産生した（図８０）。ＥＬ４結合のレベルは、Ｑβ−ＧＭ３およびＱβ−ＧＭ２免疫マウス由来の抗体よりも大幅に強かった（図８０）。さらに、Ｑβ−ＧＤ２およびＱβｂ−９−ＮＨＡｃ−ＧＤ２免疫マウス由来の血清は、補体媒介細胞傷害を介して、リンパ腫細胞ＥＬ４の強い殺滅を示した（図８１）。
【化８】
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実施例２８：潜在的な抗サルモネラワクチンとしてのＱβサルモネラグリカンコンジュゲート
【０３７６】
本発明者らはまた、サルモネラ由来のグリカンとのＱβコンジュゲートを調査した（図８２Ａ）。サルモネラグリカンのＱβコンジュゲートで免疫したマウスは、高力価で持続的なＩｇＧ抗体を産生した（図８２Ｂ）。免疫後血清は、致死的なサルモネラ感染からの有意な保護をマウスに提供した（図８３）。
参照による組み込み
【０３７７】
本明細書で言及される刊行物、特許出願、特許および他の参考文献はすべて、本開示の主題が関係する分野の当業者の水準を示すものである。刊行物、特許出願、特許および他の参考文献はすべて、個々の各刊行物、特許出願、特許および他の参考文献が参照により組み込まれると具体的かつ個別に示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。多数の特許出願、特許および他の参考文献が本明細書で言及されているが、このような参考文献は、これらの文書のいずれかが当技術分野における共通の一般知識の一部を形成するという承認を構成するものではないと理解されよう。
均等物
【０３７８】
理解を明確にするために、例示および実施例により、前述の主題をある程度詳細に説明したが、添付の特許請求の範囲内において、特定の変更および改変を実施し得ることが当業者により理解されよう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２２Ｅ】
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【図２２Ｆ】
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【図２２Ｇ】
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【図２２Ｈ】
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【図２２Ｉ】
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【図２２Ｊ】
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【図２２Ｋ】
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【図２２Ｌ】
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【図２２Ｍ】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２３−３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４−１】
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【図４４−２】
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【図４５−１】
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【図４５−２】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９−１】
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【図５９−２】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５Ａ】
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【図６５Ｂ】
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【図６６−１】
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【図６６−２】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２−１】
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【図７２−２】
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【図７２−３】
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【図７２−４】
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【図７３−１】
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【図７３−２】
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【図７３−３】
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【図７４−１】
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【図７４−２】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８−１】
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【図７８−２】
2020531544.tif 000137
【図７８−３】
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【図７８−４】
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【図７８−５】
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【図７９Ａ】
2020531544.tif 000141
【図７９Ｂ】
2020531544.tif 000142
【図７９Ｃ】
2020531544.tif 000143
【図８０】
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【図８１】
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【図８２】
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【図８３】
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【図８４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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