(57)【要約】【解決手段】本発明は、哺乳動物対象の神経臨床適応症を治療するための組成物、手段及びキットを開示する。組成物は、とりわけ、抗炎症剤とダイサー活性化剤との相乗的組み合わせ、好ましくは、セレコキシブとシプロフロキサシンとの組合せを含む。更に、本発明は、運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）、ＡＬＳ、ＦＴＤ（前頭側頭型認知症）、黄斑変性（ＡＭＤ）、自閉症、並びにパーキンソン病及びアルツハイマー病などの神経変性疾患を含む神経疾患の治療方法に用いる前述の組成物を開示する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗炎症剤とダイサー活性化剤との相乗的組合せを含む、哺乳動物対象の神経臨床適応症を治療するための組成物。
【請求項２】
臨床適応症が神経疾患である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
臨床適応症が運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
臨床適応症が自閉症である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
臨床適応症が黄斑変性である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
臨床適応症が運動ニューロンの軸索障害である、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
臨床適応症が自発運動障害である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
臨床適応症がパーキンソン病である、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
臨床適応症がアルツハイマー病である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
抗炎症剤が非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
ＮＳＡＩＤがＣＯＸ‐２阻害剤である、請求項７に記載の組成物。
【請求項１２】
ＮＳＡＩＤがセレコキシブである、請求項７に記載の組成物。
【請求項１３】
ダイサー活性化剤がシプロフロキサシンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
ダイサー活性化剤がシプロフロキサシン‐ＨＣｌである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
ダイサー活性化剤がエノキサシンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
運動ニューロン疾患が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、遺伝性痙性対麻痺（ＨＳＰ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、及び致死性先天性拘縮症候群（ＬＣＣＳ）のうちの１種、並びにこれらの任意の組合せからなる群より選択される、請求項３に記載の組成物。
【請求項１７】
抗炎症剤対ダイサー活性化剤の比が約１０：１から約１：１０００（ｗｔ／ｗｔ）の範囲である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
抗炎症剤対ダイサー活性化剤の比が約１００：１から約１：１０００（ｗｔ／ｗｔ）の範囲である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
抗炎症剤対ダイサー活性化剤の比が約１：１から約１：２００の範囲である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
抗炎症剤対ダイサー活性化剤の比が約１：１から約１：５０の範囲である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
抗炎症剤対ダイサー活性化剤の比が約１：１から約１：１０の範囲である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２２】
抗炎症剤対ダイサー活性化剤の比が約１：１０から約１：２００の範囲である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２３】
抗炎症剤対ダイサー活性化剤の比が約１：１０から約１：５０の範囲である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２４】
抗炎症剤対ダイサー活性化剤の比が約１０：１から約１：１の範囲である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２５】
抗炎症剤が、抗炎症性の臨床効果について示される用量よりも低い用量で投与される、請求項１に記載の組成物。
【請求項２６】
ヒトのセレコキシブ用量が１日当たり約１０ｍｇから約８００ｍｇの範囲であり、ヒトのシプロフロキサシン用量が１日当たり約５０ｍｇから約２０００ｍｇの範囲である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２７】
抗炎症剤が、ステロイド類、コルチコステロイド類又はＮＳＡＩＤからなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項２８】
ダイサー活性化剤がキノロン又はフルオロキノロンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項２９】
キノロンが、２‐キノロン、４‐キノロン、フルオロキノロン類、ロメフロキサシン、オフロキサシン、ノルフロキサシン、ガチフロキサシン、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、シプロフロキサシン、ゲミフロキサシン、デラフロキサシン、シノキサシン、ナリジクス酸、トロバフロキサシン、スパルフロキサシン、及びこれらの任意の組合せからなる群より選択される、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３０】
ＮＳＡＩＤが、ＣＯＸ‐２阻害剤、ＣＯＸ‐１阻害剤、ＣＯＸ阻害剤、アスピリン、セレコキシブジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラク、ナブメトン、ナプロキセンメロキシカム、メフェナム酸メクロフェナメート、オキサプロジン、ピロキシカム、サルサラート、スリンダクフェノプロフェン、フルルビプロフェン、トルメチン、及びこれらの任意の組合せからなる群より選択される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項３１】
錠剤、カプセル剤、丸剤、凍結乾燥、粉末、乳剤、顆粒化粉末、クリーム、軟膏、ペースト、ローションゲル、液体、溶液、パッチ、及びこれらの任意の組合せからなる群より選択される手法により投与可能なように構成された、請求項１に記載の組成物。
【請求項３２】
高速放出、徐放、持続放出、制御放出、及びこれらの任意の組合せからなる群より選択される手法により投与可能なように構成された、請求項１に記載の組成物。
【請求項３３】
更に、可溶化剤、安定剤、緩衝剤、浸透圧調整剤、充填剤、増粘剤／減粘剤、界面活性剤、キレート剤、アジュバント、及びこれらの任意の組合せからなる群より選択される成分を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３４】
抗炎症剤とダイサー活性化剤の両方を含む、哺乳動物対象の神経臨床適応症の相乗的治療のためのキット。
【請求項３５】
抗炎症剤とダイサー活性化剤の両方を含んだ投与単位を含む、哺乳動物対象の神経臨床適応症の相乗的治療のためのキット。
【請求項３６】
抗炎症剤とダイサー活性化剤との相乗的組合せを投与することを含む、哺乳動物対象の神経臨床適応症の治療方法。
【請求項３７】
臨床適応症が神経疾患である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３８】
臨床適応症が運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
臨床適応症が自閉症である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
臨床適応症が黄斑変性である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
臨床適応症が運動ニューロンの軸索障害である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
臨床適応症が自発運動障害である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４３】
臨床適応症がパーキンソン病である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４４】
臨床適応症がアルツハイマー病である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４５】
抗炎症剤が非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４６】
ＮＳＡＩＤがＣＯＸ‐２阻害剤である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４７】
ＮＳＡＩＤがセレコキシブである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
ダイサー活性化剤がシプロフロキサシンである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
ダイサー活性化剤がシプロフロキサシン‐ＨＣｌである、請求項３７に記載の方法。
【請求項５０】
ダイサー活性化剤がエノキサシンである、請求項３７に記載の方法。
【請求項５１】
運動ニューロン疾患が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、遺伝性痙性対麻痺（ＨＳＰ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、及び致死性先天性拘縮症候群（ＬＣＣＳ）のうちの１種、並びにこれらの任意の組合せからなる群より選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項５２】
抗炎症剤対ダイサー活性化剤の比が約１０：１から約１：１０００（ｗｔ／ｗｔ）の範囲である、請求項３７に記載の方法。
【請求項５３】
抗炎症剤対ダイサー活性化剤の比が約１００：１から約１：１０００（ｗｔ／ｗｔ）の範囲である、請求項３７に記載の方法。
【請求項５４】
抗炎症剤対ダイサー活性化剤の比が約１：１から約１：２００の範囲である、請求項３７に記載の方法。
【請求項５５】
抗炎症剤対ダイサー活性化剤の比が約１：１から約１：５０の範囲である、請求項３７に記載の方法。
【請求項５６】
抗炎症剤対ダイサー活性化剤の比が約１：１から約１：１０の範囲である、請求項３７に記載の方法。
【請求項５７】
抗炎症剤対ダイサー活性化剤の比が約１：１０から約１：２００の範囲である、請求項３７に記載の方法。
【請求項５８】
抗炎症剤対ダイサー活性化剤の比が約１：１０から約１：５０の範囲である、請求項３７に記載の方法。
【請求項５９】
抗炎症剤対ダイサー活性化剤の比が約１０：１から約１：１の範囲である、請求項３７に記載の方法。
【請求項６０】
抗炎症剤が、抗炎症性の臨床効果について示される用量よりも低い用量で投与される、請求項３７に記載の方法。
【請求項６１】
ヒトのセレコキシブ用量が１日当たり約１０ｍｇから約８００ｍｇの範囲であり、ヒトのシプロフロキサシン用量が１日当たり約５０ｍｇから約２０００ｍｇの範囲である、請求項３７に記載の方法。
【請求項６２】
抗炎症剤が、ステロイド類、コルチコステロイド類又はＮＳＡＩＤからなる群より選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項６３】
ダイサー活性化剤がキノロン又はフルオロキノロンである、請求項３７に記載の方法。キノロンが、２‐キノロン、４‐キノロン、フルオロキノロン類、ロメフロキサシン、オフロキサシン、ノルフロキサシン、ガチフロキサシン、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、シプロフロキサシン、ゲミフロキサシン、デラフロキサシン、シノキサシン、ナリジクス酸、トロバフロキサシン、スパルフロキサシン、及びこれらの任意の組合せからなる群より選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項６４】
ＮＳＡＩＤが、ＣＯＸ‐２阻害剤、ＣＯＸ‐１阻害剤、ＣＯＸ阻害剤、アスピリン、セレコキシブジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラク、ナブメトン、ナプロキセンメロキシカム、メフェナム酸メクロフェナメート、オキサプロジン、ピロキシカム、サルサラート、スリンダクフェノプロフェン、フルルビプロフェン、トルメチン、及びこれらの任意の組合せからなる群より選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項６５】
経口、局所、皮膚、経皮、静脈内、皮下、筋肉内、関節内、坐剤、脳室内、吸入、エアロゾル、舌下、及びこれらの任意の組合せからなる群より選択される手法により、抗炎症剤とダイサー活性化剤との相乗的組合せを投与することを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項６６】
高速放出、徐放、持続放出、制御放出、及びこれらの任意の組合せからなる群より選択される手法により、抗炎症剤とダイサー活性化剤との相乗的組合せを投与することを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項６７】
１つずつ、非同時、順次及び同時からなる群より選択される手法により、抗炎症剤とダイサー活性化剤との相乗的組合せを投与することを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項６８】
単回投与、１日１回投与、１日２回投与、連続投与、注入、及びこれらの任意の組合せからなる群より選択される手法により、抗炎症剤とダイサー活性化剤との相乗的組合せを投与することを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項６９】
組成物が、錠剤、カプセル剤、丸剤、凍結乾燥、粉末、乳剤、顆粒化粉末、クリーム、軟膏、ペースト、ローションゲル、液体、溶液、パッチ、及びこれらの任意の組合せからなる群より選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項７０】
組成物が、更に、可溶化剤、安定剤、緩衝剤、浸透圧調整剤、充填剤、増粘剤／減粘剤、界面活性剤、キレート剤、アジュバント、及びこれらの任意の組合せからなる群より選択される成分を含む、請求項３７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物対象の神経臨床適応症を治療するための組成物、手段及びキットに関する。組成物は、とりわけ、抗炎症剤とダイサー（DICER）活性化剤との相乗的組合せを含む。具体的には、本発明は、運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）、ＡＬＳ、ＦＴＤ（前頭側頭型認知症）、黄斑変性（ＡＭＤ）、自閉症、並びにパーキンソン病及びアルツハイマー病などの神経変性疾患を含む神経疾患に関係する。
【背景技術】
【０００２】
運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）は、病因学的に不均質な障害群であって、下位運動ニューロン及び／又は上位運動ニューロンの選択的な変性にそれぞれ起因する筋力低下及び／又は痙性麻痺を特徴としている。
【０００３】
現在研究されているＭＮＤは、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、遺伝性痙性対麻痺（ＨＳＰ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、及び致死性先天性拘縮症候群（lethal congenital contracture syndrome）（ＬＣＣＳ）であるが、ＡＬＳが最も一般的な成人発症型のＭＮＤである。中枢性障害のいくつかの例としては、脳血管障害、パーキンソン病、多発性硬化症、ハンチントン病、及びクロイツフェルト・ヤコブ病が挙げられる。脊髄性筋萎縮症は下位運動ニューロンの障害であるのに対し、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、上位運動ニューロンと下位運動ニューロンの混合性障害である。参考文献として本明細書に援用される、Dion, P. A., Daoud, H., & Rouleau, G. A. (2009). Genetics of motor neuron disorders: new insights into pathogenic mechanisms. Nature Reviews Genetics, 10(11), 769を参照されたい。
【０００４】
ＡＬＳは、ＭＮＤの例として本明細書に示されているが、上位運動ニューロンと下位運動ニューロンの両方の神経変性、進行性筋障害、筋萎縮、診断からおよそ５年以内の死を特徴とする神経変性疾患である。
【０００５】
ＡＬＳの臨床的に区別できない形態は、既知の変異がない状態では散発性疾患として生じるか、又は遺伝子変異によって始まり得る。家族性症例の約３分の２は、染色体９オープンリーディングフレーム７２（Ｃ９ＯＲＦ７２）、Ｃｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）、fused in sarcoma/translocated in liposarcoma（ＦＵＳ／ＴＬＳ）、ＴＡＲ‐ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ４３）である４つの遺伝子の変異によって、トリガーされる。参考文献として本明細書に援用される、Volonte, Apolloni, S., & Parisi, C. (2015). MicroRNAs: newcomers into the ALS picture. CNS & Neurological Disorders-Drug Targets (Formerly Current Drug Targets-CNS & Neurological Disorders), 14(2), 194-207を参照されたい。
【０００６】
前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）は、神経変性の病気であって、主に前頭葉及び／又は側頭葉に関与する進行性ニューロン欠損と、紡錘形ニューロンの７０％を超える一般的な欠損とを特徴とするが、他のニューロン型はインタクトなままである。近年の複数の研究結果には、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の病因に対する注目すべき見識が示されており、ＡＬＳとＦＴＤの間の機構的な関連と、ＡＬＳと他の神経変性疾患、例えば、小脳萎縮、筋緊張性ジストロフィーや封入体筋炎との間の機構的な関連とが明らかにされている。参考文献として本明細書に援用される、Robberecht, Wirn, and Thomas Philips. "The changing scene of amyotrophic lateral sclerosis." Nature Reviews Neurosciencel4.4 (2013): 248を参照されたい。
【０００７】
ＡＬＳの病因はまだ明らかではない。次の節に詳述するように、幾つかの病因的要素としては、炎症とマイクロＲＮＡの関与が挙げられる。
【０００８】
炎症：動物学的及び病理学的研究は、炎症がＡＬＳの病態に影響を与え、非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）が予防となるかも知れないことを示唆している。ＡＬＳの典型的な特徴は、神経炎症（neuroinflammation）である。神経炎症はシクロオキシゲナーゼ‐２（ＣＯＸ‐２）によって促進され、ＣＯＸ‐２の活性は非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）によって阻害され得る。ＮＳＡＩＤは、ＡＬＳのトランスジェニックマウスモデルの生存期間を延ばしたが、臨床試験の結果には、ＡＬＳ疾患の進行に対する選択的ＣＯＸ‐２阻害剤セレコキシブの保護効果が見いだされなかった（参考文献として本明細書に援用される、Cudkowicz ME, et al (2006). Trial of celecoxib in amyotrophic lateral sclerosis. Ann Neurol.; 60:22-31を参照）。加えて、ＮＳＡＩＤ使用とＡＬＳ（ｎ＝１１１症例）に関する症例対照研究によって、発症前のＮＳＡＩＤ使用がリスクを軽減するか、又はALSの発症を遅らせることができるかを評価することでは、決定的な結果は得られなかった。参考文献として本明細書に援用される、Popat RA, et al. (2007), Effect of non-steroidal anti-inflammatory medications on the risk of amyotrophic lateral sclerosis. Amyotroph Lateral Scler.;8:157-63、及びFondell, Elinor et al. "Non-Steroidal- Anti-Inflammatory Drugs and Amyotrophic Lateral Sclerosis: Results from 5 Prospective Cohort Studies," Amyotrophic lateral sclerosis : official publication of the World Federation of Neurology Research Group on Motor Neuron Diseases 13.6 (2012): 573-579を参照されたい。
【０００９】
マイクロＲＮＡ：ＡＬＳの原因は、その影響を受ける人もいれば、受けない人もいるという理由により、分かっていない。ただし、専門家の統一見解は、種々の細胞における分子変化が疾患の発生及び進行に関与している、ということである。例えば、運動ニューロン死は、ＲＮＡ分子のプロセシングを含む種々の細胞欠陥によって引き起こされる。
【００１０】
正常な老化又は神経変性疾患中においては、神経の生存及び機能は、タンパク質の恒常性によって異なっており、タンパク質の恒常性は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）経路を含む複数の機構によって調節される。マイクロＲＮＡは、真核生物遺伝子発現の転写後調節に関与する内因性の小さなノンコーディングＲＮＡ分子のサブセットである。長い一次転写物として産生され、これらの転写物は細胞質に輸送され、更に修飾されて成熟ｍｉＲＮＡが得られ、これらの生合成の各段階は、調節の可能性がある段階である。中枢神経系（ＣＮＳ）のｍｉＲＮＡ関連経路の調節異常は、重度の神経損傷及び細胞死と関連しており、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）などの神経変性障害の発生につながる可能性がある。参考文献として本明細書に援用される、Rinchetti, P., Rizzuti, M., Faravelli, I, & Corti, S. (2017). MicroRNA metabolism and Dysregulation in amyotrophic lateral sclerosis. Molecular neurobiology, 1-14を参照されたい。
【００１１】
更に、種々の細胞型では、重要なｍｉＲＮＡプロセシング酵素であるダイサーが存在しないことにより、細胞自律的機構及び非細胞自律的機構を介して神経変性が生じる。特定のｍｉＲＮＡの欠損は、幾つかのモデル生物の神経変性も引き起こす。一方、ｍｉＲＮＡの発現は、様々な神経変性疾患の患者において誤調節される。故に、ｍｉＲＮＡ経路は複数の年齢依存性神経変性疾患の発生に不可欠と考えられるが、基礎となる機構についての本発明者らの理解は初歩的なものにとどまる。Gascon, E., & Gao, F.-B. (2012). Cause or Effect: Misregulation of microRNA Pathways in Neurodegeneration. Frontiers in Neuroscience, 6, 48は、参考文献として本明細書に援用される。
【００１２】
ｍｉＲＮＡの生合成の欠損は、インビボにおいて脊髄運動ニューロンの変性を引き起こすことが示されている（参考文献として本明細書に援用される、Haramati, Sharon, et al. "miRNA malfunction causes spinal motor neuron disease. " Proceedings of the National Academy of Sciences 107.29 (2010): 13111-13116を参照）。加えて、ｍｉＲＮＡレベルの減少は、家族性及び散発性のヒトＡＬＳの複数の形態について共通の分子共通性質であることと、小分子であるエノキサシンによるダイサー活性の向上は、独立した２つのＡＬＳマウスモデルにおいてインビボで有益であることとが実証された。参考文献として本明細書に援用される、Emde, Anna et al "Dysregulated miRNA Biogenesis Downstream of Cellular Stress and ALS-causing Mutations: A New Mechanism for ALS. " The EMBO Journal 34.21 (2015): 2633-2651を参照されたい。
【００１３】
治療：患者の管理には主に、対症療法、例えば、痙縮への筋弛緩剤の使用、及び構音障害への言語療法が介在する。参考文献として本明細書に援用される、Hardiman, O., et al (2017). Amyotrophic lateral sclerosis. Nature Reviews Disease Primers, 3, 17071を参照されたい。
【００１４】
リルゾール治療は、臨床試験によりＡＬＳの進行を緩やかに遅らせることが示された後、１９９５年に承認された。別の薬剤であるエダラボンがＡＬＳ治療向けにＦＤＡによって承認されるまでに２２年が経過した。参考文献として本明細書に援用される、Brooks, B. R., et al (2018). Edaravone in the Treatment of Amyotrophic Lateral Sclerosis: Efficacy and Access to Therapy - A Roundtable Discussion. The American journal of managed care, 24(9 Suppl), S175-S186を参照されたい。
【００１５】
加齢黄斑変性：加齢黄斑変性（ＡＭＤ）は、米国及び他の先進国における失明の主な原因である。推定１０００万人の米国人がＡＭＤを患っており、その範囲は、がんを抱えて生活する１２００万人（Hayat et al., 2007）、又はアルツハイマー病を抱える５００万人に匹敵する。ＡＭＤの有病率は年齢とともに徐々に増加し、４０歳の人口の２％が、そして８０歳までに４人に１人が罹患している。
【００１６】
ＡＭＤには、「萎縮（dry）」型と「滲出（wet）」型の２種類がある。萎縮性ＡＭＤは通常、ある程度の視力障害を引き起こし、重度の失明に進行することもある慢性疾患である。これに対して、滲出性ＡＭＤは、ＡＭＤ患者の１０〜１５％しか罹患せず、不意に明らかになり、治療せずに放置すると失明に急速に進行する。ＡＭＤ患者は通常、最初に萎縮型を発病するため、滲出性ＡＭＤは萎縮性ＡＭＤを背景として生じ、それ故に、萎縮性ＡＭＤは、滲出性ＡＭＤの危険因子か、更には前駆状態と考えることができる。
【００１７】
無症候性であるＡＭＤの初期では、ドルーゼン（drusen）と呼ばれる不溶性細胞外凝集体が網膜に蓄積する。地図状萎縮（ＧＡ）としても知られている萎縮性ＡＭＤの後期では、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞と、その上に重なり栄養補助のためにＲＰＥに依存する光感知網膜光受容体（light-sensing retinal photoreceptors）の変性の散在した又はコンフルエントな領域が特徴である。ＡＭＤの他の後期形態である滲出型では、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）が代表的であって、外側網膜の下にある脈絡膜から外側網膜へ、未成熟な血管が新たに広がる。これらの未成熟な血管は、網膜の下に又は網膜内に流体を漏出させる。
【００１８】
ｍｉＲＮＡプロセシング酵素ＤＩＣＥＲ１は、ＲＰＥ細胞の健康状態の重要な決定因子である。
【００１９】
ＤＩＣＥＲ１には、炎症と全体的な（コーディングとノンコーディング）ＲＮＡ発現とに対する影響を含む複数の機構を介してＲＰＥ細胞の健康状態及び機能を調節することにおいて役割がある。リボヌクレアーゼであるＤＩＣＥＲ１は、ＧＡ患者のＲＰＥにおいて特異的に減少し、更に、ＤＩＣＥＲ１のこの病理学的減少には、ＲＰＥ細胞に対して毒性であるノンコーディングＡｌｕ ＲＮＡの異常な過剰を伴っていた。参考文献として本明細書に援用される、Ambati, J., & Fowler, B. J. (2012). Mechanisms of age-related macular degeneration. Neuron, 75(1), 26-39を参照されたい。
【００２０】
加えて、ダイサーの発現減少と関係するＧＡでは、ダイサーの阻害により、短い散在反復配列（ＳＩＮＥ）に由来する約３００‐ｎｔのＡｌｕリピートＲＮＡが蓄積する。この蓄積は細胞傷害性であり、インターフェロンを媒介としたカスパーゼ８依存性アポトーシスをトリガーする。ＡｌｕリピートＲＮＡをマウスの眼内に注入すると、ＧＡが生成する。この状態は、ＡｌｕリピートＲＮＡのダイサー切断によって解放され、このことは、ＲＮＡのダイサー依存性分解が解毒作用に重要であることを示唆している。ＡｌｕリピートＲＮＡのダイサープロセシングは、宿主のインフラマソームの活性化を防止する。ＤＲ２ ＡｌｕリピートＲＮＡは、ダイサー依存条件下で２８‐６５‐ｎｔリピート誘導ｓｍａｌｌ ＲＮＡ（ｒｉＲＮＡ）にプロセシングされる。これらのｒｉＲＮＡは、ＡＧＯ３と結合することにより安定化し、ｍＲＮＡデキャッピング複合体をリクルートし、それによって、翻訳が阻止され、Ｎａｎｏｇ及びＴｄｇｆ１ ｍＲＮＡのような重要な幹細胞転写物が分解される。参考文献として本明細書に援用される、Song, M. S., & Rossi, J. J. (2017). Molecular mechanisms of Dicer: endonuclease and enzymatic activity. Biochemical Journal, 474(10), 1603-1618を参照されたい。
【００２１】
ＡＬＳ疾患の希少性は、臨床経過における有意な患者間及び患者内の変動性と、信頼性のあるバイオマーカーの不足とともに、ＡＬＳを治療するのに有効な薬剤の開発を困難にさせている。ＡＬＳの安全且つ有効な治療への要求は、依然として満たされていない。
【００２２】
ＡＭＤの治療への要求もほとんど満たされておらず、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）は、世界的な視覚罹患率の重要な原因であり、２０４０年までに２億８８００万人が罹患すると予測されている。抗血管内皮増殖因子（抗ＶＥＧＦ）剤による治療の出現は、血管新生ＡＭＤの治療に革命をもたらした（しかし、その進行を遅らせる地図状萎縮（ＧＡ）の治療には、同様のブレークスルーはなかった。）。分子モデル及び遺伝子モデルに基づく、疾患機構のイメージ化及び新たな理解の進歩は、それまでほとんど満たされていなかった要求に応えることを目的とする、ＧＡの新規実験的治療選択肢の開発への道を開いた。参考文献として本明細書に援用される、Kandasamy, R., Wickremasinghe, S., & Guymer, R. (2017). New Treatment Modalities for Geographic Atrophy. Asia-Pacific journal of ophthalmology (Philadelphia, Pa.), 6(6), 508-513を参照されたい。
【発明の概要】
【００２３】
本発明は、臨床適応症、運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）、ＡＬＳ、ＦＴＤ（前頭側頭型認知症）、黄斑変性（ＡＭＤ）及び自閉症を含む神経疾患を治療するための、抗炎症剤及びダイサー活性化剤による方法及び組成物に関する。
【００２４】
本明細書では、「臨床適応症（clinical indications）」という用語は以後、一般に神経疾患を意味する。
【００２５】
本明細書では、「神経疾患（neuronal diseases）」という用語は以後、一般に、運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）、ＦＴＤ（前頭側頭型認知症）、黄斑変性（ＡＭＤ）、アルツハイマー病、パーキンソン病及び自閉症を意味する。
【００２６】
本明細書では、「運動ニューロン疾患（motor neuron diseases）」又は「ＭＮＤ」という用語は以後、一般に、とりわけ、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、遺伝性痙性対麻痺（ＨＳＰ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、及び致死性先天性拘縮症候群（ＬＣＣＳ）を含む疾患群を意味する。
【００２７】
本明細書では、「抗炎症剤（anti-inflammatory drugs）」という用語は以後、一般に、非限定的な物として、とりわけ、ステロイド類、コルチコステロイド類、又は非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）を含む薬剤群を意味する。
【００２８】
本明細書では、「シクロオキシゲナーゼ（Cyclooxygenase）」又は「ＣＯＸ」という用語は以後、一般に、トロンボキサン、及びプロスタサイクリンなどのプロスタグランジン類を含むプロスタノイド類の、アラキドン酸からの形成に関与する酵素（具体的には、アイソザイムのファミリー）を意味する。主なＣＯＸ阻害剤は、非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）である。
【００２９】
本明細書では、「低用量（low dose）」という用語は、抗炎症剤の治療上有効な用量を意味し、この用量は、治療効果を奏するのに必要な通常又は従来の用量よりも少ない。
【００３０】
典型的なＣＯＸ阻害剤は選択的ではなく、全ての種類のＣＯＸを阻害する。プロスタグランジン及びトロンボキサン合成の結果として生じる阻害は、炎症軽減効果、並びに解熱効果、抗血栓効果及び鎮痛効果を有する。
【００３１】
本明細書では、「非ステロイド性抗炎症剤（non-steroidal anti-inflammatory drugs）」又は「ＮＳＡＩＤ」という用語は以後、一般に、とりわけ、ＣＯＸ‐２阻害剤、ＣＯＸ‐１阻害剤、ＣＯＸ阻害剤、アスピリン、セレコキシブジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラク、ナブメトン、ナプロキセンメロキシカム、メフェナム酸メクロフェナメート、オキサプロジン、ピロキシカム、サルサラート、スリンダクフェノプロフェン、フルルビプロフェン、及びトルメチンを含む薬剤群を意味する。
【００３２】
本明細書では、「ダイサー（ＤＩＣＥＲ）」という用語は以後、一般に、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）及びプレマイクロＲＮＡ（プレｍｉＲＮＡ）をそれぞれ低分子干渉ＲＮＡ及びマイクロＲＮＡと呼ばれる短い二本鎖ＲＮＡ断片に切断する酵素を意味する。これらの断片は、およそ２０〜２５塩基対の長さであり、３´末端に２塩基のオーバーハングがある。ダイサーは、ＲＮＡ干渉に不可欠なＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）の活性化を促進する。ＲＩＳＣは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分解することが可能なエンドヌクレアーゼである触媒成分アルゴノートを有する。
【００３３】
本発明の１つの目的は、抗炎症剤とダイサー活性化剤の組合せを投与することを含む、哺乳動物対象の神経臨床適応症の治療方法である。
【００３４】
本発明の別の目的は、臨床適応症が神経疾患である上述のうちの何れかに定義された方法を開示することである。
【００３５】
本発明の１つの目的は、抗炎症剤とダイサー活性化剤との相乗的組合せを含む、哺乳動物対象の神経臨床適応症を治療するための組成物を開示することである。
【００３６】
本発明の別の目的は、臨床適応症が神経疾患である上述のうちの何れかに定義された組成物を開示することである。
【００３７】
本発明の別の目的は、臨床適応症が運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）である上述のうちの何れかに定義された組成物を開示することである。
【００３８】
本発明の別の目的は、臨床適応症が自閉症である上述のうちの何れかに定義された組成物を開示することである。
【００３９】
本発明の別の目的は、臨床適応症が黄斑変性である上述のうちの何れかに定義された組成物を開示することである。
【００４０】
本発明の別の目的は、臨床適応症が運動ニューロンの軸索障害である上述のうちの何れかに定義された組成物を開示することである。
【００４１】
本発明の別の目的は、臨床適応症が自発運動障害である上述のうちの何れかに定義された組成物を開示することである。
【００４２】
本発明の別の目的は、臨床適応症がパーキンソン病である上述のうちの何れかに定義された組成物を開示することである。
【００４３】
本発明の別の目的は、臨床適応症がアルツハイマー病である上述のうちの何れかに定義された組成物を開示することである。
【００４４】
本発明の別の目的は、抗炎症剤が非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）である上述のうちの何れかに定義された組成物を開示することである。
【００４５】
本発明の別の目的は、ＮＳＡＩＤがＣＯＸ‐２阻害剤である上述のうちの何れかに定義された組成物を開示することである。
【００４６】
本発明の別の目的は、ＮＳＡＩＤがセレコキシブである上述のうちの何れかに定義された組成物を開示することである。
【００４７】
本発明の別の目的は、ダイサー活性化剤がシプロフロキサシンである上述のうちの何れかに定義された組成物を開示することである。
【００４８】
本発明の別の目的は、ダイサー活性化剤がシプロフロキサシン‐ＨＣｌである上述のうちの何れかに定義された組成物を開示することである。
【００４９】
本発明の別の目的は、ダイサー活性化剤がエノキサシンである上述のうちの何れかに定義された組成物を開示することである。
【００５０】
本発明の別の目的は、運動ニューロン疾患が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、遺伝性痙性対麻痺（ＨＳＰ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、及び致死性先天性拘縮症候群（ＬＣＣＳ）のうちの１種、並びにこれらの任意の組合せからなる群より選択される上述のうちの何れかに定義された組成物を開示することである。
【００５１】
本発明の別の目的は、抗炎症剤対ダイサー活性化剤の比が約１０：１から約１：１０００（ｗｔ／ｗｔ）の範囲である上述のうちの何れかに定義された組成物を開示することである。
【００５２】
本発明の別の目的は、抗炎症剤対ダイサー活性化剤の比が約１００：１から約１：１０００（ｗｔ／ｗｔ）の範囲である上述のうちの何れかに定義された組成物を開示することである。
【００５３】
本発明の別の目的は、抗炎症剤対ダイサー活性化剤の比が約１：１から約１：２００の範囲である上述のうちの何れかに定義された組成物を開示することである。
【００５４】
本発明の別の目的は、抗炎症剤対ダイサー活性化剤の比が約１：１から約１：５０の範囲である上述のうちの何れかに定義された組成物を開示することである。
【００５５】
本発明の別の目的は、抗炎症剤対ダイサー活性化剤の比が約１：１から約１：１０の範囲である上述のうちの何れかに定義された組成物を開示することである。
【００５６】
本発明の別の目的は、抗炎症剤対ダイサー活性化剤の比が約１：１０から約１：２００の範囲である上述のうちの何れかに定義された組成物を開示することである。
【００５７】
本発明の別の目的は、抗炎症剤対ダイサー活性化剤の比が約１：１０から約１：５０の範囲である上述のうちの何れかに定義された組成物を開示することである。
【００５８】
本発明の別の目的は、抗炎症剤対ダイサー活性化剤の比が約１０：１から約１：１の範囲である上述のうちの何れかに定義された組成物を開示することである。
【００５９】
本発明の別の目的は、抗炎症剤が抗炎症性の臨床効果について示される用量よりも低い用量で投与される上述のうちの何れかに定義された組成物を開示することである。
【００６０】
本発明の別の目的は、ヒトのセレコキシブ用量が１日当たり約１０ｍｇから約８００ｍｇの範囲であり、ヒトのシプロフロキサシン用量が１日当たり約５０ｍｇから約２０００ｍｇの範囲である上述のうちの何れかに定義された組成物を開示することである。
【００６１】
本発明の別の目的は、抗炎症剤が、ステロイド類、コルチコステロイド類又はＮＳＡＩＤからなる群より選択される上述のうちの何れかに定義された組成物を開示することである。
【００６２】
本発明の別の目的は、ダイサー活性化剤がキノロン又はフルオロキノロンである上述のうちの何れかに定義された組成物を開示することである。
【００６３】
本発明の別の目的は、キノロンが、２‐キノロン、４‐キノロン、フルオロキノロン類、ロメフロキサシン、オフロキサシン、ノルフロキサシン、ガチフロキサシン、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、シプロフロキサシン、ゲミフロキサシン、デラフロキサシン、シノキサシン、ナリジクス酸、トロバフロキサシン、スパルフロキサシン、及びこれらの任意の組合せからなる群より選択される上述のうちの何れかに定義された組成物を開示することである。
【００６４】
本発明の別の目的は、ＮＳＡＩＤが、ＣＯＸ‐２阻害剤、ＣＯＸ‐１阻害剤、ＣＯＸ阻害剤、アスピリン、セレコキシブジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラク、ナブメトン、ナプロキセンメロキシカム、メフェナム酸メクロフェナメート、オキサプロジン、ピロキシカム、サルサラート、スリンダクフェノプロフェン、フルルビプロフェン、トルメチン、及びこれらの任意の組合せからなる群より選択される上述のうちの何れかに定義された組成物を開示することである。
【００６５】
本発明の別の目的は、組成物が、錠剤、カプセル剤、丸剤、凍結乾燥、粉末、乳剤、顆粒化粉末、クリーム、軟膏、ペースト、ローションゲル、液体、溶液、パッチ、及びこれらの任意の組合せからなる群より選択される手法により投与可能なように構成された、上述のうちの何れかに定義された組成物を開示することである。
【００６６】
本発明の別の目的は、組成物が、高速放出、徐放、持続放出、制御放出、及びこれらの任意の組合せからなる群より選択される手法により投与可能なように構成された、上述のうちの何れかに定義された組成物を開示することである。
【００６７】
本発明の別の目的は、更に、可溶化剤、安定剤、緩衝剤、浸透圧調整剤（tonicity modifiers）、充填剤、増粘剤／減粘剤（viscosity enhancers/reducers）、界面活性剤、キレート剤、アジュバント、及びこれらの任意の組合せからなる群より選択される成分を含む上述のうちの何れかに定義された組成物を開示することである。
【００６８】
本発明の１つの目的は、抗炎症剤とダイサー活性化剤の両方を含む、哺乳動物対象の神経臨床適応症の相乗的治療のためのキットを開示することである。
【００６９】
本発明の別の目的は、抗炎症剤とダイサー活性化剤の両方を含んだ投与単位を含む、哺乳動物対象の神経臨床適応症の相乗的治療のためのキットを開示することである。
【００７０】
本発明の１つの目的は、抗炎症剤とダイサー活性化剤との相乗的組合せを投与することを含む、哺乳動物対象の神経臨床適応症の治療方法を開示することである。
【００７１】
本発明の別の目的は、臨床適応症が神経疾患である上述のうちの何れかに定義された方法を開示することである。
【００７２】
本発明の別の目的は、臨床適応症が運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）である上述のうちの何れかに定義された方法を開示することである。
【００７３】
本発明の別の目的は、臨床適応症が自閉症である上述のうちの何れかに定義された方法を開示することである。
【００７４】
本発明の別の目的は、臨床適応症が黄斑変性である上述のうちの何れかに定義された方法を開示することである。
【００７５】
本発明の別の目的は、臨床適応症が運動ニューロンの軸索障害である上述のうちの何れかに定義された方法を開示することである。
【００７６】
本発明の別の目的は、臨床適応症が自発運動障害である上述のうちの何れかに定義された方法を開示することである。
【００７７】
本発明の別の目的は、臨床適応症がパーキンソン病である上述のうちの何れかに定義された方法を開示することである。
【００７８】
本発明の別の目的は、臨床適応症がアルツハイマー病である上述のうちの何れかに定義された方法を開示することである。
【００７９】
本発明の別の目的は、抗炎症剤が非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）である上述のうちの何れかに定義された方法を開示することである。
【００８０】
本発明の別の目的は、ＮＳＡＩＤがＣＯＸ‐２阻害剤である上述のうちの何れかに定義された方法を開示することである。
【００８１】
本発明の別の目的は、ＮＳＡＩＤがセレコキシブである上述のうちの何れかに定義された方法を開示することである。
【００８２】
本発明の別の目的は、ダイサー活性化剤がシプロフロキサシンである上述のうちの何れかに定義された方法を開示することである。
【００８３】
本発明の別の目的は、ダイサー活性化剤がシプロフロキサシン‐ＨＣｌである上述のうちの何れかに定義された方法を開示することである。
【００８４】
本発明の別の目的は、ダイサー活性化剤がエノキサシンである上述のうちの何れかに定義された方法を開示することである。
【００８５】
本発明の別の目的は、運動ニューロン疾患が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、遺伝性痙性対麻痺（ＨＳＰ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、及び致死性先天性拘縮症候群（ＬＣＣＳ）のうちの１種、並びにこれらの任意の組合せからなる群より選択される上述のうちの何れかに定義された方法を開示することである。
【００８６】
本発明の別の目的は、抗炎症剤対ダイサー活性化剤の比が約１０：１から約１：１０００（ｗｔ／ｗｔ）の範囲である上述のうちの何れかに定義された方法を開示することである。
【００８７】
本発明の別の目的は、抗炎症剤対ダイサー活性化剤の比が約１００：１から約１：１０００（ｗｔ／ｗｔ）の範囲である上述のうちの何れかに定義された方法を開示することである。
【００８８】
本発明の別の目的は、抗炎症剤対ダイサー活性化剤の比が約１：１から約１：２００の範囲である上述のうちの何れかに定義された方法を開示することである。
【００８９】
本発明の別の目的は、抗炎症剤対ダイサー活性化剤の比が約１：１から約１：５０の範囲である上述のうちの何れかに定義された方法を開示することである。
【００９０】
本発明の別の目的は、抗炎症剤対ダイサー活性化剤の比が約１：１から約１：１０の範囲である上述のうちの何れかに定義された方法を開示することである。
【００９１】
本発明の別の目的は、抗炎症剤対ダイサー活性化剤の比が約１：１０から約１：２００の範囲である上述のうちの何れかに定義された方法を開示することである。
【００９２】
本発明の別の目的は、抗炎症剤対ダイサー活性化剤の比が約１：１０から約１：５０の範囲である上述のうちの何れかに定義された方法を開示することである。
【００９３】
本発明の別の目的は、抗炎症剤対ダイサー活性化剤の比が約１０：１から約１：１の範囲である上述のうちの何れかに定義された方法を開示することである。
【００９４】
本発明の別の目的は、抗炎症剤が、抗炎症性の臨床効果について示された用量よりも低い用量で投与される上述のうちの何れかに定義された方法を開示することである。
【００９５】
本発明の別の目的は、ヒトのセレコキシブ用量が１日当たり約１０ｍｇから約８００ｍｇの範囲であり、ヒトのシプロフロキサシン用量が１日当たり約５０ｍｇから約２０００ｍｇの範囲である上述のうちの何れかに定義された方法を開示することである。
【００９６】
本発明の別の目的は、抗炎症剤が、ステロイド類、コルチコステロイド類又はＮＳＡＩＤからなる群より選択される上述のうちの何れかに定義された方法を開示することである。
【００９７】
本発明の別の目的は、ダイサー活性化剤がキノロン又はフルオロキノロンである上述のうちの何れかに定義された方法を開示することである。
【００９８】
本発明の別の目的は、キノロンが、２‐キノロン、４‐キノロン、フルオロキノロン類、ロメフロキサシン、オフロキサシン、ノルフロキサシン、ガチフロキサシン、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、シプロフロキサシン、ゲミフロキサシン、デラフロキサシン、シノキサシン、ナリジクス酸、トロバフロキサシン、スパルフロキサシン、及びこれらの任意の組合せからなる群より選択される上述のうちの何れかに定義された方法を開示することである。
【００９９】
本発明の別の目的は、ＮＳＡＩＤが、ＣＯＸ‐２阻害剤、ＣＯＸ‐１阻害剤、ＣＯＸ阻害剤、アスピリン、セレコキシブジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラク、ナブメトン、ナプロキセンメロキシカム、メフェナム酸メクロフェナメート、オキサプロジン、ピロキシカム、サルサラート、スリンダクフェノプロフェン、フルルビプロフェン、トルメチン、及びこれらの任意の組合せからなる群より選択される上述のうちの何れかに定義された方法を開示することである。
【０１００】
本発明の別の目的は、経口、局所、皮膚、経皮、静脈内、皮下、筋肉内、関節内、坐剤、脳室内、吸入、エアロゾル、舌下、及びこれらの任意の組合せからなる群より選択される手法により、抗炎症剤とダイサー活性化剤との相乗的組合せを投与することを含む上述のうちの何れかに定義された方法を開示することである。
【０１０１】
本発明の別の目的は、高速放出、徐放、持続放出、制御放出、及びこれらの任意の組合せからなる群より選択される手法により、抗炎症剤とダイサー活性化剤との相乗的組合せを投与することを含む上述のうちの何れかに定義された方法を開示することである。
【０１０２】
本発明の別の目的は、１つずつ、非同時、順次及び同時からなる群より選択される手法により、抗炎症剤とダイサー活性化剤との相乗的組合せを投与することを含む上述のうちの何れかに定義された方法を開示することである。
【０１０３】
本発明の別の目的は、単回投与、１日１回投与、１日２回投与、連続投与、注入、及びこれらの任意の組合せからなる群より選択される手法により、抗炎症剤とダイサー活性化剤との相乗的組合せを投与することを含む上述のうちの何れかに定義された方法を開示することである。
【０１０４】
本発明の別の目的は、組成物が、錠剤、カプセル剤、丸剤、凍結乾燥、粉末、乳剤、顆粒化粉末、クリーム、軟膏、ペースト、ローションゲル、液体、溶液、パッチ、及びこれらの任意の組合せからなる群より選択される上述のうちの何れかに定義された方法を開示することである。
【０１０５】
本発明の別の目的は、更に、可溶化剤、安定剤、緩衝剤、浸透圧調整剤、充填剤、増粘剤／減粘剤、界面活性剤、キレート剤、アジュバント、及びこれらの任意の組合せからなる群より選択される成分を含む上述のうちの何れかに定義された方法を開示することである。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
以下に、本発明を次の図面とともに説明する。
【０１０７】
【図１】処置プロトコルを示すスキーム。
【図２】野生型及び処置ＳＯＤ１幼魚と比較した、誘発段階（challenge phase）からの回復における非処置ＳＯＤ１ Ｇ９３Ｒの移動距離の変化（％）。
【図３】非処置ＳＯＤ１変異体（ＭＵＴ）と比較した、実験の全３段階におけるシプロフロキサシンとセレコキシブの組合せにより処置されたＳＯＤ１変異体の自発運動。
【図４】非処置ＳＯＤ１変異体と比較した、測定全期間中におけるシプロフロキサシンとセレコキシブの組合せにより処置されたＳＯＤ１変異体の自発運動。
【図５】１分間の時間ビン（time bin）ごとの９６匹のＳＯＤ１変異体と野生型幼魚の測定及び算出された移動距離。
【図６】ＳＯＤ１変異体の自発運動は、全測定期間中、野生型と比較して有意な減少を示した。
【図７】ＳＯＤ１変異体の自発運動は、実験の３段階全てにおいて野生型と比較して有意な減少を示した。
【図８】リルゾール処置ＳＯＤ１変異体の自発運動は、実験の３段階全てにおいて非処置ＳＯＤ１変異体と比較して有意な上昇を示した。
【図９】非処置ＳＯＤ１変異体と比較した、実験の全３段階におけるセレコキシブ処置ＳＯＤ１変異体の自発運動。
【図１０】非処置ＳＯＤ１変異体と比較した、実験の全３段階におけるシプロフロキサシン処置ＳＯＤ１変異体の自発運動。
【図１１】実験の全３段階における、異なる濃度のシプロフロキサシンにより処置されたＳＯＤ１変異体の自発運動の概要。
【図１２】非処置ＳＯＤ１変異体と比較した、実験の全３段階におけるエノキサシン処置ＳＯＤ１変異体の自発運動。
【図１３】非処置ＳＯＤ１変異体と比較した、実験の全３段階における規準化エノキサシン処置ＳＯＤ１変異体と規準化シプロフロキサシン処置ＳＯＤ１変異体の自発運動。
【図１４】シプロフロキサシン及びセレコキシブの投与により、ＳＯＤ１変異魚は軸索障害から回復した。ゼブラフィッシュ幼魚の胴体における個々の運動ニューロンの形態学的解析；解析には、Ｓ１０〜Ｓ１２部分が用いられた。左のパネル‐野生型、中央のパネル‐非処置ＳＯＤ１変異魚、左のパネル‐１μΜセレコキシブ＋１００μΜシプロフロキサシン処置ＳＯＤ１変異魚。上のパネル‐抗アセチル化チューブリン抗体により免疫染色された６ｄｐｆゼブラフィッシュ幼魚の胴体における分岐運動ニューロンの３Ｄ再構成アポトーム（apotome）ｚスタック（z-stack）画像。中間及び下のパネル‐Ｉｍａｒｉｓソフトウェアのフィラメント解析［Ｂｉｔｐｌａｎｅ社、黄色の単一運動ニューロン中枢部（backbone）］によりトレースされた運動ニューロンの中枢部（着色処理）。ｎ＝１５；対照及び処置ＳＯＤ１変異体、並びにｎ＝１１；野生型魚。
【図１５Ａ】シプロフロキサシンとセレコキシブとの組合せにより、ＳＯＤ１変異魚は運動ニューロン軸索障害からほぼ完全に回復した。運動ニューロンの軸索投射の長さ及び分岐の状況（Aspects）は、Ｉｍａｒｉｓソフトウェア（Ｂｉｔｐｌａｎｅ社）を用いて算出され、グラフ中にプロットされている。
【図１５Ｂ】同上。
【図１５Ｃ】同上。
【発明を実施するための形態】
【０１０８】
本発明は、抗炎症剤とダイサー活性化剤との組合せを含む、哺乳動物対象の神経疾患を治療するための組成物を開示する
【０１０９】
本発明は、ＭＮＤ（ＡＬＳを含む）及び前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）のための治療用組成物及び治療方法を開示し、ＭＮＤと診断された患者に対して有効治療を提示することを目的とする。本明細書に示されている方法は、ＡＬＳのインビボ及びインビトロ薬理学的モデルを用いることにより、ＡＬＳ発病において神経保護効果を有する抗炎症剤に加えて、ｍｉＲＮＡの役割を強調する。参考文献として本明細書に援用される、Berthod, Frangois, and Francois Gros-Louis. "In vivo and in vitro models to study amyotrophic lateral sclerosis." Amyotrophic Lateral Sclerosis, InTech, 2012を参照されたい。
【０１１０】
本発明は、治療として、ダイサーエンハンサー（DICER enhancer）であるキノロンと、抗炎症剤との組合せを開示する。
【０１１１】
非限定的例は、キノロンとして、マイクロＲＮＡ生合成をアップレギュレートして、ダイサー活性を高めることが可能なシプロフロキサシン、具体的にはフルオロキノロンと、ＣＯＸ‐２選択的非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）としてのセレコキシブである。
【０１１２】
キノロン類は、新規作用機構を有する広域抗菌剤である。これらの薬剤は、合成化合物として、抗菌活性、薬物動態特性、及び薬物安全性を最適化するように広範囲に開発されてきた。キノロン類は、幅広い潜在的用途、及び広い活性スペクトルを有する。シプロフロキサシンが緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）に対して最も強力なキノロンであることは変わらない。参考文献として本明細書に援用される、Walker, R. C. (1999, October). The fluoroquinolones. In Mayo Clinic Proceedings (Vol. 74, No. 10, pp. 1030-1037)を参照されたい。
【０１１３】
キノロン類は、ＮＳＡＩＤと合わせると相乗的又は相加的な毒性をもたらす。報告によれば、キノロン類と非ステロイド性ＮＳＡＩＤの同時投与は、ＣＮＳ刺激を増加させるとのことであった。キノロン類とＮＳＡＩＤの同時投与は、ＣＮＳ刺激及び痙攣発作のリスクを高めることが報告されている。ＣＮＳ障害患者、若しくは発作発生の素因となる可能性のある他の危険因子を有する患者、又は発作の閾値を下げる薬剤を服用している患者は、キノロンも服用している場合、ＮＳＡＩＤの使用に適した候補ではない可能性がある。ＮＳＡＩＤを併用する人は、キノロンを慎重に使用する。
【０１１４】
従って、先行技術に対する前述した内容は、本発明の新規主張に反する。当該主張は、提案された２種の薬剤の組合せが、発作発生の素因となる可能性のある危険因子を有していないＡＬＳ患者にとって、おそらく継続的治療のために薬剤放出を延長する新しい製剤によって、肯定的且つ有意で驚くべき結果をもたらす、というものである。
【０１１５】
具体的には、抗炎症剤とエノキサシンの併用治療によって誘発されるてんかん発作活性が、慢性電極埋め込みラットにおいて調査された。フェルビナクエチル及びアスピリンＤＬ‐リジンは、脳室内に注入した場合、顕著な挙動変化を示すことなく、ＥＥＧにおいて棘徐波複合を示したが、比較的高い用量が必要であった。一方、エノキサシンは、５０及び１００マイクログラムの用量において、途切れない高電圧棘徐波複合を特徴とする、強力なてんかん発生活性を誘発した。同時に、ラットは運動亢進、飛び上がり及び激しい痙攣を示した。エノキサシン（経口）とフェルビナクエチル（静脈内）の併用治療は、高電圧棘徐波複合の途切れないバーストを特徴とする、強力なてんかん発作活性を引き起こした。動物は、挙動上、前肢のクローヌス、頭のうなずき、及び全身の痙攣を示した。エノキサシン（脳室内）とフェルビナクエチル（静脈内又は脳室内）の併用治療後、運動亢進と飛び上がり及び激しい痙攣と関連して、高電圧棘徐波複合も観察された。エノキサシンとフェルビナクエチルの同時治療は、脳室内に注入すると、てんかん発生活性を生じた、と結論づけられる。参考文献として本明細書に援用される、Kamei, Chiaki, et al. "Epileptogenic activity induced by combined treatment with antiinflammatory drugs and enoxacin and its inhibition by a calcium antagonist, nicardipine." Methods and findings in experimental and clinical pharmacology 18.9 (1996): 579-588を参照されたい。
【０１１６】
本発明は、ＳＯＤ１ Ｇ９３Ｒ変異体及び野生型魚を用いて、ＡＬＳの利用可能な処置と比較して、抗炎症剤及びダイサー活性化剤の効果を評価した（処置プロトコルについては、図１を参照）。
【０１１７】
本発明は、シプロフロキサシンとセレコキシブの両方により、具体的には１μΜのセレコキシブ及び１００μΜのシプロフロキサシンの濃度において処置されたＳＯＤ１変異魚における相乗効果を具体的に示す。これらの濃度では、非処置変異体と比較して、遊泳能力に劇的な効果があった（図２、図３）。
【０１１８】
処置ＳＯＤ１変異幼魚の移動距離は、非処置ＳＯＤ１変異幼魚の遊泳行動と比較して２９％上昇した（図４）。処置ＳＯＤ１魚の挙動が野生型魚の挙動に非常によく似ているほど、効果は十分に著しかった（図５）。
【０１１９】
本発明の組合せは、抗炎症剤とダイサー活性化剤の比が約１０：１から約１：１０００の範囲にある。具体的には、次のとおりである。
【０１２０】
本明細書において用いられる「約」という用語は、±１０％を意味する。
ａ．組合せは、抗炎症剤とダイサー活性化剤の比が約１００：１から約１：１０００の範囲にある。
ｂ．組合せは、抗炎症剤とダイサー活性化剤の比が約１：１から約１：２００の範囲にある。
ｃ．組合せは、抗炎症剤とダイサー活性化剤の比が約１：１から約１：５０の範囲にある。
ｄ．組合せは、抗炎症剤とダイサー活性化剤の比が約１：１から約１：１０の範囲にある。
ｅ．組合せは、抗炎症剤とダイサー活性化剤の比が約１：１０から約１：２００の範囲にある。
ｆ．組合せは、抗炎症剤とダイサー活性化剤の比が約１：１０から約１：５０の範囲にある。
ｇ．組合せは、抗炎症剤とダイサー活性化剤の比が約１０：１から約１：１の範囲にある。
【実施例】
【０１２１】
＜実施例１＞
本試験では、上位ＡＬＳ関連遺伝子スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）用トランスジェニックゼブラフィッシュを利用した。ＳＯＤ１ Ｇ９３Ｒ変異魚は、先に、神経筋接合部の欠陥、持久力の低下、運動ニューロンの欠損、及び筋肉の病態を含む、ＡＬＳの主な表現型を再現することが示されている。参考文献として本明細書に援用される、Ramesh T, Lyon AN, Pineda RH, et al. A genetic model of amyotrophic lateral sclerosis in zebrafish displays phenotypic hallmarks of motoneuron disease. Disease models & mechanisms 2010; 3:652-62を参照されたい。ＳＯＤ１変異は、自発運動に関連する行動欠陥を引き起こした。ＳＯＤ１変異動物は、野生型と比較して、自発的遊泳時、明暗誘発（light/ dark challenge）時に遊泳能力の有意な減少を示し、その誘発からの回復を示すストレスの第２のピーク後には最も劇的な減少を示した（図５〜図７）。野生型幼魚の移動距離を全期間にわたって平均し、それはＳＯＤ１変異体の遊泳行動と比較して４４％上昇した（図６）。
【０１２２】
正の対照として、ＳＯＤ１変異魚をリルゾールにより処置した（図８）。リルゾールは、長年にわたりＡＬＳ患者において疾患修飾効果があることが示された、唯一の確立された薬剤であることから本試験で選択した。参考文献として本明細書に援用される、Bensimon G, Lacomblez L, Meininger V, Group tARS. A Controlled Trial of Riluzole in Amyotrophic Lateral Sclerosis. New England Journal of Medicine 1994;330:585-91を参照されたい。リルゾールにより処置されたＳＯＤ１変異動物は、ＳＯＤ１変異体の遊泳行動と比較して、３６％の有意な上昇を示した。
【０１２３】
次の一連の実験では、異なる濃度のセレコキシブによりＳＯＤ１変異魚を処置した（図９）。セレコキシブの毒性は、ＳＯＤ１変異体と野生型動物の両方において、心臓血管毒性及び死亡を含め、高濃度（３０μΜ）で顕著であった。低いセレコキシブ濃度によるＳＯＤ１変異幼魚の処置は、１０μΜ（０．３％ＤＭＳＯバックグラウンド）、及び５μΜ（０．１％ＤＭＳＯをバックグラウンド）において、わずかな自発運動低下を示した。これらの濃度よりも低い濃度では、毒性は認められず、全体的な形態及び挙動は正常であった。重要なことに、結果は、セレコキシブ毒性がＡＬＳ対象と健康な対象の両方において同様であり、ＳＯＤ１変異体は薬剤に対して高い感受性を示さないことを示している（第ＩＩＩ節）。
【０１２４】
全体として、全ての用量において処置は、遊泳行動を著しく向上させなかった。１μΜでは、非処置ＳＯＤ１変異体の遊泳行動と比較して、遊泳活性が６％増加した。
【０１２５】
次いで、５００、２００、１００、５０、１０及び１μΜの濃度のシプロフロキサシンにより、ＳＯＤ１変異魚を処置した（図１０、図１４）。シプロフロキサシンの全用量は魚に安全であり、全体的な又はわずかな形態学的及び行動毒性を示さなかった。高い濃度は、ＳＯＤ１変異体の遊泳能力に正の効果があり、１００μΜの濃度が最大の成果を示した。そのレベルでは、ＳＯＤ１変異幼魚の移動距離は、非処置ＳＯＤ１変異体の遊泳行動と比較して１８％上昇した。
【０１２６】
シプロフロキサシンにより処置されたＳＯＤ１変異魚は、そのファミリーメンバーであるエノキサシンの同用量による処置と類似性を示した（図１０）。エノキサシン処置ＳＯＤ１変異幼魚の移動距離は、非処置ＳＯＤ１変異体の遊泳行動と比較して２０％上昇した。
【０１２７】
次に、種々の濃度でシプロフロキサシンとセレコキシブの両方により、ＳＯＤ１変異魚を処置した。１μΜセレコキシブ及び１００μΜシプロフロキサシンの濃度において最大の効果が見られ、これらの濃度では、非処置変異体と比較して、遊泳能力に劇的な効果があった（図３）。処置ＳＯＤ１変異魚の移動距離は、非処置ＳＯＤ１変異体の遊泳行動と比較して２９％上昇した（図４）。処置ＳＯＤ１魚の挙動が野生型魚の挙動に非常によく似ているほど、効果は十分に著しかった。
【０１２８】
魚の運動能力に対する処置の明確な効果を要約するために、最後の１０分間の移動距離を平均した（図２）。さらなる筋肉及び神経学的ストレスの付加後に、誘発段階からのこの回復は、筋持久力の強化を特定することを目的とする。野生型動物は、この期間中、ＳＯＤ１変異魚と比較して長い距離を泳いだ（１１６％の上昇）。リルゾールは魚の遊泳能力を明らかに増加させた（３９．７％）が、１００μＭのシプロフロキサシンと１μＭのセレコキシブとの組合せにより、有意な相乗効果が見られた（７２％、図２）。図２は、誘発段階からの回復における、野生型及び処置ＳＯＤ１幼魚と比較した、非処置ＳＯＤ１ Ｇ９３Ｒの移動距離の変化（％）を示している。
【０１２９】
これらの自発運動アッセイの説得力のある結果に続いて、形態学的アッセイを実施し、１００μΜのシプロフロキサシンと１μΜのセレコキシブとの組合せによる処置後の運動ニューロンの形態を解析した（図１４〜図１５）。野生型ゼブラフィッシュは主に正常な運動ニューロンを示し、長く適度に分岐した軸索を有していたのに対し、ＳＯＤ１変異体は重度の軸索障害を示し、非常に複雑な分岐線維を有していた。１μΜセレコキシブと１００μΜシプロフロキサシンの組合せにより処置すると、ＳＯＤ１変異幼魚は変異体の形態の有意な回復を示し、ほぼ正常な軸索の形態を得た（図１４〜図１５）。驚くべきことに、シプロフロキサシンとセレコキシブとの組合せにより、ＳＯＤ１変異魚は運動ニューロン軸索障害からほぼ完全に回復した。
【０１３０】
シプロフロキサシンとセレコキシブの組合せは、これらの前臨床研究から示されているように、ＡＬＳ患者の神経病理及び変性に影響を及ぼし、疾患を遅らせるか又は阻害し得る。
【０１３１】
＜実施例２＞
＜ａ．方法＞
魚‐成魚及び幼魚のゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）を、２８．５℃でＲｕｓｓｅｋ−Ｂｌｕｍ研究所の魚施設（Ｄｅａｄ  Ｓｅａ  ＆  Ａｒａｖａ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ；  Ｙａｉｒ  ｓｔａｔｉｏｎ，  Ｃｅｎｔｒａｌ  Ａｒａｖａ）において維持し、確立された手順に従って飼育した25。動物のプロトコルは、ベン・グリオン大学動物使用管理委員会（the Ben Gurion University Committee on Use and Care of Animals）によって承認された。本試験では、Ｔｇ（ｓｏｄ１：ｓｏｄ１Ｇ９３Ｒ又は野生型；ｈｓｐ７０：ＤｓＲｅｄ）トランスジェニック系統を用いた。参考文献として本明細書に援用される、Ramesh T, Lyon AN, Pineda RH, et al. A genetic model of amyotrophic lateral sclerosis in zebrafish displays phenotypic hallmarks of motoneuron disease. Disease models & mechanisms 2010;3:652-62を参照されたい。トランスジェニック変異体Ｓｏｄ１を発現するゼブラフィッシュを発生させるために、内因性ｓｏｄ１プロモーター及びｓｏｄ１遺伝子を含有するゼブラフィッシュゲノム領域を用いた。Ｓｏｄ１を、グリシン９３をアルギニン（Ｇ９３Ｒ）に変化させることによって変異させ、この変異は、家族性ＡＬＳにおいて変異することが多い保存アミノ酸に影響を及ぼす。参考文献として本明細書に援用される、Orrell R, de Belleroche J, Marklund S, Bowe F, Hallewell R. A novel SOD mutant and ALS. Nature 1995;374:504、及びElshafey A, Lanyon WG, Connor JM. Identification of a new missense point mutation in exon 4 of the Cu/Zn superoxide dismutase (SOD-1) gene in a family with amyotrophic lateral sclerosis. Human molecular genetics 1994;3:363-4を参照されたい。
【０１３２】
材料及び可溶性‐セレコキシブ：高濃度のセレコキシブ（セレコキシブＢＰ／ＥＰ；バッチ番号ＣＬＸ／００８／０４／１７；２５ｇｒ；Ｐｒｕｄｅｎｃｅ  Ｐｈａｒｍａ  Ｃｈｅｍ社、インド）を達成するために、その粉末を、１００％ＤＭＳＯの１００ｍＭの保存液に溶解させた。粉末は１００％ＤＭＳＯ中で完全に溶解したが、１００ｍＭセレコキシブ保存液をゼブラフィッシュ飼育バッファ（raising buffer）（ＤＢ）中で最終濃度１００μΜ（１：１０００）に希釈しながら、材料を沈殿させると、粒子及びクラウド（clouds）が生じた。次いで、セレコキシブを１００％ＤＭＳＯの１０ｍＭの保存液に溶解させた。粉末は１００％ＤＭＳＯ中で完全に溶解し、ＤＢ中で最終濃度３０μＭに希釈（１：３３３．３希釈）すると、材料は、クラッシング（crashing）することなくバッファ中に留まった。材料を最も高い計画濃度においてＤＢに加え、２８℃のインキュベーター内でペトリ皿に保存し、実験の正確な条件をシミュレートした。ＤＢ中３０μΜセレコキシブの最終ＤＭＳＯ濃度は、０．３％であった。保存液の検査では、肉眼でも顕微鏡下でも凝集物が見られず、透明な溶液を示した。最終希釈ＤＢ溶液では、凝集物は２４又は４８時間後も観察されなかった。分光光度計の吸収を、調製後０、２４及び４８時間において観察した。
【０１３３】
材料及び可溶性‐シプロフロキサシン：高濃度のシプロフロキサシン（シプロフロキサシン塩酸塩Ｐｈ，Ｅｕｒ；バッチ番号ＣＰ２０５１７１２４；２５ｇｒ；Ｎｅｕｌａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社、インド）を達成するために、その粉末を、ｄｄＨ２Ｏの１００ｍＭの保存液に溶解させた。粉末はｄｄＨ２Ｏ中で完全に溶解し、ＤＢ中で最終濃度１００μΜに希釈（１：１０００希釈）すると、完全に溶解した。ＤＢ中１００μΜシプロフロキサシンの最終ＤＭＳＯ濃度は、０．１％であった。保存液の検査では、肉眼でも顕微鏡下でも凝集物が見られず、透明な黄色の溶液を示した。最終希釈ＤＢ溶液では、凝集物は２４又は４８時間後も観察されなかった。対照試料のｐＨを調整する（ＤＢ中０．１％ＤＭＳＯ；ｐＨ６．７２）ために、１００μＭシプロフロキサシンの溶液（ｐＨ６．３２）に１２μｌの１００ｍＭ ＮａＯＨを加えた。ＤＢ中の低濃度シプロフロキサシンにはＮａＯＨを加える必要はなかった。分光光度計の吸収を、調製後０、２４及び４８時間にて分析した（図３）。溶液の淡黄色により、吸収値は高くなった。最も高い濃度の混合物（１００μΜシプロフロキサシン＋３０μΜセレコキシブ＋ＮａＯＨ）の吸収を、調製後０、２４及び４８時間において分光光度計により測定した。
【０１３４】
３０μΜセレコキシブの吸収は、調製後０、２４及び４８時間においてそれぞれ０．０１７、０．０１３及び０．０２１である対照（ＤＢ）と比較して異なっていた。１００μΜシプロフロキサシンの吸収は、溶液の透明な淡黄色により、調製後０、２４及び４８時間においてそれぞれ０．１２３、０．１４９及び０．１５５の対照と比較して、差を示した。最も高い濃度の混合物（１００μΜシプロフロキサシン＋３０μΜセレコキシブ）の吸収は、調製後０、２４及び４８時間においてそれぞれ０．１６、０．１５４及び０．１３１の対照と比較して、差を示した。
【０１３５】
全ての実験の基礎として用いられているゼブラフィッシュ飼育バッファ（ＤＢ）は、次の最終濃度のものを含有する：ｄｄＨ２Ｏ中１．７４ｍＭのＮａＣｌ、０．２１ｍＭのＫＣｌ、０．１２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１８ｍＭのＣａ（ＮＯ３）２、０．１５ｍＭのＨＥＰＥＳ、最終ｐＨ＝６．７。
【０１３６】
処置プロトコル：ＳＯＤ１ Ｇ９３Ｒ変異体又は野生型魚を、容認及び承認されたプロトコルに従って収集し、飼育した。参考文献として本明細書に援用される、Westerfield M. The Zebrafish Book: a Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio) 2000を参照されたい。幼魚の形態を毎日観察した（心拍数、全体的な形態及び挙動）。
【０１３７】
図１は、処置プロトコルを示すスキームである。
【０１３８】
２４０匹の幼魚を同一の産卵バッチから選択して、異なる３つの処置と対照とに導入した（それぞれの処置当たりｎ＝６０）。血液脳関門（ＢＢＢ）が完全に閉じ、運動ニューロン（ＭＮ）及び神経筋接合部（ＮＭＪ）が完全に発達したときに、受精後３及び５日（ｄｐｆ）においてそれぞれ１回目及び２回目の処置を実施した。材料を遊泳用水（ＤＢ）中に投与した。６日目に、幼魚を、自動ダニオビジョン（商標）システムを用いる行動解析に供した。解析に続いて、幼魚を固定し、全胚免疫組織化学法（whole-mount immunohistochemistry procedure）を実施して、高解像度形態学的解析に用いた。処置プロトコルは、図１に詳述されている。
【０１３９】
毒性解析：魚を投与日及び翌日に観察して、毒性を観察した。急性毒性を、アポトーシス／壊死及び循環系障害（心拍数、形態、出血及び浮腫）について評価した。頭、眼及び全体的な形態学的及び行動毒性を、容認された手順に従って記録した。
【０１４０】
行動解析  ゼブラフィッシュ幼魚の自動ハイスループット追跡システムである、Ｎｏｌｄｕｓ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社［ヴァーヘニンゲン、オランダ］のダニオビジョン（商標）を、明暗条件の制御を含めて、測定、及び結果の解析に用いた。単一の幼魚をそれぞれ単一のウェル内に入れ、同じ量の遊泳用水を加えて均一なバックグラウンドを確保した。毎秒３０回のダイナミックサブトラクション（dynamic subtraction）を用いて、それぞれの動物のｘ、ｙ位置を試験した。ｘ、ｙ位置から、それぞれの幼魚の移動距離（ｍｍ）を算出し、１分間の時間ビンごとに平均した（１分当たり１８００の測定値の平均）。さらなる筋肉及び神経学的ストレスを付加するために、本発明者らが適用した環境の変化に従って、行動プロファイルを３段階で測定した。自発的遊泳、明暗誘発（視運動性反応）及び誘発行動からの回復を記録し、解析した。同じ処置の全ての動物、すなわち、野生型（ＷＴ）、非処置ＳＯＤ１変異体、又は処置ＳＯＤ１変異体を、さらなるストレスに対する反応を調べるために、１分間の時間ビンごとに平均し、次いで、非処置ＳＯＤ１変異体の遊泳行動と比較した相対数を得るために、全期間にわたって算出した。用いた統計解析は、不等分散を仮定した２つの試料によるスチューデントの対応のあるｔ検定（両側）であった。報告した全てのＰ値は両側であり、有意水準を０．０５（＊）、０．０１から０．００１（＊＊）、及び０．００１未満（＊＊＊）に設定した。
【０１４１】
形態学的解析：確立された免疫組織化学法を用い、抗アセチル化チューブリン抗体を使用して、６ｄｐｆ処置及び非処置ＳＯＤ１ Ｇ９３Ｒ又は野生型において、全胚染色を行った。抗アセチル化チューブリンにより染色された脊髄運動ニューロンの軸索投射（部分１０〜１２）は、Ｚｅｉｓｓ社のアポトーム顕微鏡を用いて画像化した。３Ｄ再構成画像を、Ｉｍａｒｉｓ画像解析ソフトウェア（Ｂｉｔｐｌａｎｅ社）を使用する定量化に用いた。
【０１４２】
＜ｂ．結果＞
＜Ｉ．トランスジェニックＳＯＤ１変異幼魚は、自発運動の障害を示す＞
ＡＬＳ誘発性ＳＯＤ１ Ｇ９３Ｒ変異を発現するゼブラフィッシュ幼魚は、異常な運動軸索投射を伴う自発運動の障害を有することが先に示されていたが、そうでなければ正常な肉眼形態を有する。参考文献として本明細書に援用される、Lemmens R, Van Hoecke A, Hersmus N, et al. Overexpression of mutant superoxide dismutase 1 causes a motor axonopathy in the zebrafish. Human molecular genetics 2007;16:2359-65、及びRamesh T, Lyon AN, Pineda RH, et al. A genetic model of amyotrophic lateral sclerosis in zebrafish displays phenotypic hallmarks of motoneuron disease. Disease models & mechanisms 2010;3:652-62を参照されたい。
【０１４３】
これらの幼魚の運動機能障害についての本発明者らの理解を検証し、練り上げるために、材料と方法の節に説明されているように、ダニオビジョンシステムを用いて映像解析を行った。２回の生物学的反復を実施し、４８匹の生物のそれぞれの自発運動を解析した。図５は、１分間の時間ビンごとの９６匹のＳＯＤ１変異体と幼魚の測定及び算出された移動距離を表している。
【０１４４】
解析されたパラメータは、幼魚の移動距離（ｍｍ）であった。最初のグラフでは、全ての動物、ＳＯＤ１変異体又は野生型（ＷＴ）の遊泳行動を１分間の時間ビンごとに平均して、さらなるストレスに対する反応が予想どおりか否かを確認した（図５）。
【０１４５】
平均した全ての時点において、野生型幼魚が泳いだ距離（ｍｍ）は、ＳＯＤ１変異魚と比較して有意に高かった。自発的遊泳時、明暗誘発後、及び誘発からの回復後（図５）。
【０１４６】
次に、ＳＯＤ１変異体の遊泳行動と比較した相対数を得るために、全ての野生型幼魚が１分間の時間ビンにおいて泳いだ距離（ｍｍ）を全期間にわたって平均した（図６）。
【０１４７】
実験全体を通じて、ＳＯＤ１変異幼魚が泳いだ距離（ｍｍ）は、野生型幼魚と比較して有意に減少した。野生型幼魚は、ＳＯＤ１変異体よりもおよそ４５％長い距離を泳いだ（図６）。
【０１４８】
図６は、ＳＯＤ１変異体の自発運動が、全測定期間中に、野生型と比較して有意な減少を示したことを示している。
【０１４９】
実験の種々の段階において、野生型と比較したＳＯＤ１変異体の自発運動を解析するために、ストレスに対する種々の反応後に、実験のそれぞれの部分ごとの移動距離を算出した（図７）。図７は、ＳＯＤ１変異体の自発運動が、実験の３段階全てにおいて、野生型と比較して有意な減少を示したことを示している。
【０１５０】
遊泳環境の変化が適用されると、さらなる筋肉及び神経学的ストレスが付与される。自発的遊泳時（実験の０〜１０分）、及び明暗誘発時（視運動性反応；１０〜２０分）に、ＳＯＤ１変異体の自発運動は、野生型と比較して有意な減少を示した。野生型幼魚は、ＳＯＤ１変異体よりも２２〜２８％長く泳いだ。ストレスの２つのピーク（ｔ＝１０、２０分）の後、誘発からの回復の挙動が明らかであった。幼魚は動きを止めた後、自発的遊泳の値まで徐々に回復した。この段階において、ＳＯＤ１変異体はあまり効果的に回復せず、自発的遊泳行動が低下した。この段階では、野生型幼魚は、ＳＯＤ１変異体よりも１１６％長い距離を泳いだ。
【０１５１】
＜ＩＩ．検証‐リルゾールにより処置されたトランスジェニックＳＯＤ１変異幼魚は、自発運動の上昇を示す＞
慢性グルタミン酸興奮毒性は毒性レベルまで蓄積し、ＡＬＳの神経細胞死の一因となり得る。これは、複雑な効果を有するがグルタミン酸のシナプス前放出を阻止すると考えられる薬剤であるリルゾールを用いた臨床試験を実施するための合理的な根拠をもたらした。リルゾールは、治療を受けた参加者の生存期間の適度な延長を実証し（最長２〜３か月）、選択された患者の人工呼吸器依存性又は気管切開の開始を遅らせる。参考文献として本明細書に援用される、Bensimon G, Lacomblez L, Meininger V, Group tARS. A Controlled Trial of Riluzole in Amyotrophic Lateral Sclerosis. New England Journal of Medicine 1994;330:585-91を参照されたい。
【０１５２】
ゼブラフィッシュモデルに新規ＡＬＳ治療法を確認する可能性があるか否かを判断するために、ＳＯＤ１変異ゼブラフィッシュ幼魚の神経ストレスを改善する抗興奮毒性剤リルゾールの能力を試験した。リルゾールは、長年にわたりＡＬＳ患者において疾患修飾効果があることが示された、唯一の確立された薬剤であるため、そして標準治療であるため、本試験に選択した。
【０１５３】
ＳＯＤ１変異ゼブラフィッシュにおいて試験され毒性を示さなかった用量である１μΜの最終濃度で、リルゾールをＳＯＤ１変異幼魚の遊泳用水に投与した。参考文献として本明細書に援用される、McGown A, Shaw DPJ, Ramesh T. ZNStress: a high-throughput drug screening protocol for identification of compounds modulating neuronal stress in the transgenic mutant sod1G93R zebrafish model of amyotrophic lateral sclerosis. Molecular neurode generation 2016;11:56を参照されたい。
【０１５４】
この濃度のリルゾールによりＳＯＤ１変異体を処置すると、抑制性介在ニューロンの神経ストレスが減少した。参考文献として本明細書に援用される、McGown A, McDearmid JR, Panagiotaki N, et al. Early interneuron dysfunction in ALS: insights from a mutant sodl zebrafish model. Annals of Neurology 2013;73:246-58を参照されたい。
【０１５５】
リルゾールにより処置すると、実験の全ての段階において、ＳＯＤ１変異幼魚が泳いだ距離（ｍｍ）は、非処置ＳＯＤ１変異魚と比較して高くなった。
【０１５６】
非処置ＳＯＤ１変異体の遊泳行動と比較した相対数を得るために、全てのリルゾール処置ＳＯＤ１変異幼魚が１分間の時間ビンにおいて泳いだ距離（ｍｍ）を全期間にわたって平均した。リルゾール処置ＳＯＤ１変異体の自発運動は、測定全期間中、非処置ＳＯＤ１変異体と比較して有意な上昇を示した。
【０１５７】
実験全体を通じて、リルゾール処置ＳＯＤ１変異幼魚が泳いだ距離（ｍｍ）は、非処置ＳＯＤ１変異幼魚と比較して有意に高かった（３６．８％の上昇）。
【０１５８】
実験の種々の段階において、野生型と比較したＳＯＤ１変異体の自発運動を解析するために、ストレスに対する種々の反応後に、実験のそれぞれの部分ごとの移動距離を算出した（図８）。
【０１５９】
図８は、リルゾール処置ＳＯＤ１変異体の自発運動が、実験の３段階全てにおいて、非処置ＳＯＤ１変異体と比較して有意な上昇を示したことを示している。
【０１６０】
リルゾールによる処置によって、実験の全ての段階において、自発運動は常に上昇した。リルゾール処置ＳＯＤ１変異体の自発運動は、自発的遊泳時に（３８％増加）、明暗誘発時に（３２％増加）、及誘発からの回復時に（３９．７％）、非処置ＳＯＤ１変異幼魚と比較して有意な増加を示した。
【０１６１】
＜ＩＩＩ．ＡＬＳ（ＳＯＤ１変異体）モデルにおけるセレコキシブによる処置の毒性及び有効性＞
試験される最初の材料は、マクロファージをその神経保護状態に維持する際に神経炎症モジュレーターとしての役割を果たすことが示唆されたＣＯＸ２阻害剤セレコキシブであった（参考文献として本明細書に援用される、Aid S, Bosetti F. Targeting cyclooxygenases-1 and -2 in neuroinflammation: therapeutic implications. Biochimie 2011;93:46-51を参照）。セレコキシブを、３つの最終濃度、３０μＭ、１０μΜ及び１μΜで、ＳＯＤ１変異幼魚の遊泳用水に加えた。溶解度の制約により、実験は、全ての試料（対照試料を含む）において、０．３％ＤＭＳＯのバックグラウンドにより実施した。
【０１６２】
第ＩＩＩ節の要約：０．３％ＤＭＳＯをバックグラウンドとして用いた間、セレコキシブは、３０μΜの濃度において心臓血管毒性及び死を引き起こした。１０μΜのセレコキシブ処置では、実験の特定の段階において、わずかな自発運動の減少が明らかであった。ＤＭＳＯをバックグラウンドとして０．１％に減らすと、セレコキシブによってもたらされる毒性が増加した。全体的な形態及び挙動は正常であったが、１０μΜ未満のセレコキシブにおいて自発運動能力の低下が観察され、５μＭでは自発運動能力の低下は明らかであった。
【０１６３】
スーパーオキシドジスムターゼ酵素は、中心的な抗酸化触媒であって、Ｏ２−を基質として用い（Ｏ２−は、相当程度の生物学的損傷を引き起こす。）、そのレベルを通常の分子酸素（Ｏ２）又は過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）に減らす抗酸化触媒である。参考文献として本明細書に援用される、Halliwell B, Gutteridge JMC. [1] Role of free radicals and catalytic metal ions in human disease: An overview. Methods in Enzymology: Academic Press; 1990:1-85を参照されたい。インビボでは、セレコキシブは、チトクロームＰ４５０（ＣＹＰ４５０）２Ｃ９及び３Ａ４によって不活性代謝物ヒドロキシセレコキシブに酸化され、その後、ヒドロキシセレコキシブは、カルボキシセレコキシブ及びセレコキシブグルクロニドに変換される。参考文献として本明細書に援用される、Gong L, Thorn CF, Bertagnolli MM, Grosser T, Altman RB, Klein TE. Celecoxib pathways: pharmacokinetics and pharmacodynamics. Pharmacogenetics and Genomics 2012;22:310-8を参照されたい。ＤＭＳＯレベルに依存する毒性の変化を示す結果は、ＳＯＤ１変異体のセレコキシブ毒性からの保護における・ＯＨの強力なスカベンジャーＤＭＳＯの役割を示唆する、考えられる仮説によって説明することができる。
【０１６４】
それにもかかわらず、セレコキシブの全ての濃度を用いても、実質的な有効性は認められなかった。
【０１６５】
＜ＩＶ：ＡＬＳ（ＳＯＤ１変異体）モデルにおけるシプロフロキサシンによる処置の毒性及び有効性＞
試験される２番目の材料は、先にダイサー活性を高めることが示唆されたシプロフロキサシンであった。ｍｉＲＮＡの異常なレベルは、家族性及び散発性のヒトＡＬＳの複数形態の基礎となる一般的な分子機構であり、ダイサー活性の向上はインビボにおいて有益であることが分かった。参考文献として本明細書に援用される、Emde A, Eitan C, Liou LL, et al. Dysregulated miRNA biogenesis downstream of cellular stress and ALS-causing mutations: a new mechanism for ALS. The EMBO journal 2015;34:2633-51を参照されたい。
【０１６６】
シプロフロキサシンを、３つの最終濃度、１μＭ、１０μΜ及び１００μΜでＳＯＤ１変異幼魚の遊泳用水に加えた。実験は、全ての試料（対照試料を含む。）において、０．１％ＤＭＳＯのバックグラウンドにより実施した。シプロフロキサシンの全ての用量において、薬剤により引き起こされた形態又は死亡の影響は観察されなかった。
【０１６７】
第ＩＶ節の要約：異なる全てのシプロフロキサシン処置群の移動距離の割合を比較する、それぞれの実験の規格化された値を、非処置ＳＯＤ１変異幼魚と比較した。２つの主な観察情報を得ることができる。第一に、シプロフロキサシン処置は、高い用量であっても、ＳＯＤ１変異幼魚に対して毒性がなかった。第二に、これらの試験条件下では、１００μΜのシプロフロキサシン濃度がＡＬＳモデルの自発運動に影響を及ぼすのに最も強力であったと考えられる。
【０１６８】
実験の３段階をリファインしたシプロフロキサシン処置ＳＯＤ１幼魚と非処置ＳＯＤ１幼魚の移動距離の割合を表す全ての規格化された値の概要は、予期しない結果を示した（図１１）。
【０１６９】
１、１０、５０、１００、２００及び５００μΜのシプロフロキサシンによる処置は、暗い条件下でのＳＯＤ１変異幼魚の自発運動に対してほとんど効果がなかった（図１１）。光の第２段階、ストレスからの回復段階では、５０、１００、２００及び５００μΜのシプロフロキサシンによる処置は、最終的に定常に達する用量依存曲線を示した。ＡＮＯＶＡ及びｔ検定の静的試験では、２００μＭと５００μΜのシプロフロキサシン処置の間で統計的に有意な変化を示さなかった（示されている統計は、非処置からの有意性である）。
【０１７０】
自発的遊泳期間中、シプロフロキサシンの１００μΜの用量のみが、遊泳行動を上昇させた（図１１）。次の考えられる２つの説明は、２００及び５００μΜのシプロフロキサシン処置がＳＯＤ１変異体の自発的遊泳を高めなかったという事実の根底にあり得る：高いシプロフロキサシン濃度遊泳能力へのわずかな負荷、又は、それほど妥当ではないが、遊泳媒体中のＮａＣｌ塩レベルの上昇（或いは、両方）。ｐＨレベルを対照群（シプロフロキサシンなし）のレベルに調整するためにＮａＯＨを、５０及び１００μＭシプロフロキサシン処置において０．０６ｍＭの最終濃度まで、２００μＭ及び５００μＭシプロフロキサシン処置において０．１３５ｍＭ及び０．３２ｍＭの最終濃度までそれぞれ加えた。
【０１７１】
図１１は、実験の全３段階における、異なる濃度のシプロフロキサシンにより処置されたＳＯＤ１変異体の自発運動の概要を示している。
【０１７２】
＜Ｖ．ＡＬＳ（ＳＯＤ１変異体）モデルにおけるセレコキシブとシプロフロキサシンとの組合せによる処置の毒性及び有効性＞
マクロファージをその神経保護状態に維持する際に神経炎症モジュレーターとしての役割を果たすことが示唆されたＣＯＸ２阻害剤セレコキシブと、ダイサー活性を高めてｍｉＲＮＡの異常なレベルを減弱させることが以前に示唆されているシプロフロキサシンとの組合せ（参考文献として本明細書に援用される、Emde A, Eitan C, Liou LL, et al. Dysregulated miRNA biogenesis downstream of cellular stress and ALS-causing mutations: a new mechanism for ALS. The EMBO journal 2015;34:2633-51を参照）は、両方ともＡＬＳの基礎となる２つの主な機構に対処するため、関心対象であった。更に、両方の薬剤の相乗活性が実証されている。参考文献として本明細書に援用される、Dey R, Sultana S, Bishayi B. Combination treatment of celecoxib and ciprofloxacin attenuates live S. aureus induced oxidative damage and inflammation in murine microglia via regulation of cytokine balance. J Neuroimmunol 2018;316:23-39を参照されたい。
【０１７３】
セレコキシブの使用に毒性の制限があるため、１、４、及び１０μΜのセレコキシブと最も強力な濃度のシプロフロキサシン（１００μΜ）とを併用することに決定した。全ての試料において、０．１％ＤＭＳＯのバックグラウンドで実験を実施した。
【０１７４】
用いた全ての組合せ（１００μΜシプロフロキサシン＋１μΜセレコキシブ；１００μΜシプロフロキサシン＋４μΜセレコキシブ；１００μΜシプロフロキサシン＋１０μΜセレコキシブ）において、循環系障害（心拍数、形態、出血及び浮腫）又は死亡は観察されなかった。最も高い濃度のセレコキシブとシプロフロキサシン（１００μΜシプロフロキサシン＋１０μΜセレコキシブ）によるＳＯＤ１変異幼魚の処置は、顕微鏡下での遊泳能力にはっきりとした効果があった。幼魚が泳いだ距離は短く、動作の間に横に倒れた。低いセレコキシブ用量（１００μΜシプロフロキサシン＋１μΜセレコキシブ；１００μΜシプロフロキサシン＋４μΜセレコキシブ）を含む組合せにより処置されたＳＯＤ１変異幼魚では、動作の明らかな異常は認められなかった。
【０１７５】
エソビジョン（Etho Vision）ソフトウェアを用いて、処置された幼魚が１分間の時間ビンごとに移動した平均距離を解析した。
【０１７６】
１００＋１０混合物（１００μΜシプロフロキサシン＋１０μΜセレコキシブ）により処置されたＳＯＤ１変異幼魚では、顕微鏡下で異常な動作が明らかに観察され、自発的遊泳及び明暗誘発期間中に幼魚が泳いだ距離は短かった。最も低いセレコキシブ濃度を含む混合物１００＋１混合物（１００μＭシプロフロキサシン＋１μΜセレコキシブ）は、全ての行動反応プロファイルにおいて、ＳＯＤ１変異体の遊泳能力を大幅に向上させた。
【０１７７】
次に、非処置ＳＯＤ１変異体の遊泳行動と比較した相対数を得るために、全ての幼魚が１分間の時間ビンにおいて同じ処置から泳いだ距離（ｍｍ）を全期間にわたって平均した（図４）。図４は、測定全期間中について、非処置ＳＯＤ１変異体と比較した、シプロフロキサシンとセレコキシブとの組合せにより処置されたＳＯＤ１変異体の自発運動を表している。
【０１７８】
全体として、１００＋１混合物により処置されたＳＯＤ１変異体は、遊泳能力の劇的で有意な向上を示した（２８．８％、図４）。１００＋４混合物により処置されたＳＯＤ１変異体は、１０＋１混合物よりも低いものの、遊泳能力の有意な向上を示した（１４．９％）。１００＋１０混合物により処置されたＳＯＤ１変異体は、遊泳行動の有意な減少を示した（２０．７％の減少、図４）。
【０１７９】
実験のそれぞれの部分ごとの移動距離を算出し、非処置ＳＯＤ１変異体の遊泳行動と比較した（図３）。図３は、実験の全３段階における、非処置ＳＯＤ１変異体と比較した、シプロフロキサシンとセレコキシブとの組合せにより処置されたＳＯＤ１変異体の自発運動を表している。実験の３つの段階全てにおいて、異なる組合せの有効性は用量に依存し、セレコキシブの用量が混合物中で減少するにつれて効力が高まった（図３）。１００＋１混合物により処置されたＳＯＤ１変異体は、自発的遊泳時（２５．３％）、明暗誘発時（１１．８％）に遊泳能力の際立った向上を示し、誘発からの回復時（７２．２％）には最も劇的な向上を示した。
【０１８０】
１００＋４混合物により処置されたＳＯＤ１変異体は、自発的遊泳時（１４．５％）及びチャレンジからの回復時（４２．８％）に、少ないがそれでも有意な遊泳能力の増加を示した。１００＋１０混合物による処置は、自発的遊泳時（３１．４％減少）及び明暗誘発時（２９．４％減少）のＳＯＤ１変異幼魚の自発運動を統計的に有意に減少させた。チャレンジからの回復時に、１００＋１０混合物でも１７．７％の増加が認められた（図３）。
【０１８１】
１００μΜシプロフロキサシンと１μΜセレコキシブとの組合せによりＳＯＤ１変異体の遊泳能力が大幅に向上したため、形態学的アッセイを用いてＳＯＤ１変異幼魚に対する効果を更に確認することに決定した。
【０１８２】
＜ＶＩ：ＡＬＳ（ＳＯＤ１変異体）モデルにおけるセレコキシブとシプロフロキサシンとの組合せによる処置後の腹側運動ニューロン（ventral motor neuron）の形態学的解析＞
ＴＤＰ‐４３、ＦＵＳ、Ｃ９ｏｒｆ７２、Ｓｑｓｔｍ１、ＥＰＨＡ４及びＳＯＤ１などの異なるＡＬＳ関連遺伝子において変異したＡＬＳゼブラフィッシュモデルは、秩序がなく過度に分岐した運動ニューロン軸索と遊泳障害とから構成される運動軸索表現型を示す。参考文献として本明細書に援用される、Kabashi E, Bercier V, Lissouba A, et al. FUS and TARDBP but Not SOD1 Interact in Genetic Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis. PLoS genetics 2011;7:el002214; .Lemmens R, Van Hoecke A, Hersmus N, et al. Overexpression of mutant superoxide dismutase 1 causes a motor axonopathy in the zebrafish. Human molecular genetics 2007 ; 16:2359-65 ;Lattante S, de Calbiac H, Le Ber I, Brice A, Ciura S, Kabashi E. Sqstm1 knock-down causes a locomotor phenotype ameliorated by rapamycin in a zebrafish model of ALS/FTLD. Human molecular genetics 2015;24:1682-90; Sorana C, Serena L, Isabelle LB, et al. Loss of function of C9orf72 causes motor deficits in a zebrafish model of amyotrophic lateral sclerosis. Annals of neurology 2013;74:180-7; Van Hoecke A, Schoonaert L, Lemmens R, et al. EPHA4 is a disease modifier of amyotrophic lateral sclerosis in animal models and in humans. Nature medicine 2012;18:1418; Sakowski SA, Lunn JS, Busta AS, et al. Neuromuscular effects of G93A-SOD1 expression in zebrafish. Molecular neurodegeneration 2012;7:44; .Armstrong GAB, Liao M, You Z, Lissouba A, Chen BE, Drapeau P. Homology Directed Knockin of Point Mutations in the Zebrafish tardbp and fus Genes in ALS Using the CRISPR/Cas9 System. PloS one 2016;11:e0150188を参照されたい。
【０１８３】
免疫染色、アポトーム顕微鏡、及びＩｍａｒｉｓ画像解析ソフトウェアを用いて、野生型、非処置ＳＯＤ１ Ｇ９３Ｒ変異体、及び1００μΜシプロフロキサシン＋１μΜセレコキシブの組合せにより処置されたＳＯＤ１ Ｇ９３Ｒ変異体の運動ニューロンの形態を特徴づけた（図１４）。
【０１８４】
野生型ゼブラフィッシュは主に正常な運動ニューロンを示し、長く適度に分岐した軸索を有していた（図１４、左のパネル）。
【０１８５】
ＳＯＤ１ Ｇ９３Ｒ変異幼魚は、全て同一の産卵バッチから生じ、２群に分けられ、処置され（半分はＤＭＳＯのみにより処置され、半分は混合物により処置され）、染色され、画像化された。ＡＬＳモデルＳＯＤ１変異対照群（非処置、０．１％ＤＭＳＯ）は、重度の軸索障害を示し、非常に複雑な分岐線維を有していた（図１４、中央のパネル）。驚くべきことに、１μΜセレコキシブと１００μΜシプロフロキサシンとの組合せにより処置されたＳＯＤ１変異幼魚の半分は、変異体の形態の有意な回復を示し、ほぼ正常な軸索形態を得た（図１４、左のパネル）。
【０１８６】
要約すると、図１４は、シプロフロキサシン及びセレコキシブの投与により、ＳＯＤ１変異魚が軸索障害から回復したことを示している。ゼブラフィッシュ幼魚の胴体における個々の運動ニューロンの形態学的解析；解析には、Ｓ１０〜Ｓ１２部分を用いた。左のパネル‐野生型、中央のパネル‐非処置ＳＯＤ１変異魚、左のパネル‐１μΜセレコキシブ＋１００μΜシプロフロキサシン処置ＳＯＤ１変異魚。上のパネル‐抗アセチル化チューブリン抗体により免疫染色された６ｄｐｆゼブラフィッシュ幼魚の胴体における分岐運動ニューロンの３Ｄ再構成アポトーム ｚスタック画像。中間及び下のパネル‐Ｉｍａｒｉｓソフトウェアのフィラメント解析（Ｂｉｔｐｌａｎｅ社、白色の単一運動ニューロン中枢部）によりトレースされた運動ニューロンの中枢部（着色処理）。ｎ＝１５；対照及び処置ＳＯＤ１変異体、並びにｎ＝１１；野生型魚。
【０１８７】
Ｉｍａｒｉｓソフトウェアを用いて高解像度画像解析を実施し、軸索形態の異なるパラメータを比較した（図１５）。調べた全てのパラメータは、ショール解析による面積、分岐レベル、分岐点（接合部）、区域、長さ、及びこれらの広がりを含め、非処置ＳＯＤ１変異体と比較して、１μΜセレコキシブ及び１００μΜシプロフロキサシン処置ＳＯＤ１変異魚の軸索障害の減少を示し、野生型の軸索の形態への有意な回復を示した（図１５）。
【０１８８】
シプロフロキサシンとセレコキシブとの組合せにより、ＳＯＤ１変異魚は運動ニューロン軸索障害からほぼ完全に回復した。要約すると、図１５は、シプロフロキサシンとセレコキシブとの組合せにより、ＳＯＤ１変異魚が運動ニューロン軸索障害からほぼ完全に回復したことを表している。運動ニューロンの軸索投射の長さ及び分岐の状況は、Ｉｍａｒｉｓソフトウェア（Ｂｉｔｐｌａｎｅ社）を用いて算出され、グラフ中にプロットされている。
【０１８９】
＜ＶＩＩ．ＡＬＳ（ＳＯＤ１変異体）モデルにおけるエノキサシンとシプロフロキサシンによる処置の有効性の比較＞
エノキサシンは、ｓｉＲＮＡを媒介としたｍＲＮＡ分解を高め内因性ｍｉＲＮＡの生合成を促進する、キノロンファミリーの小分子である。参考文献として本明細書に援用される、Melo S, Villanueva A, Moutinho C, et al. Small molecule enoxacin is a cancer-specific growth inhibitor that acts by enhancing TAR RNA-binding protein 2-mediated microRNA processing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2011; 108:4394-9.、及びShan G, Li Y, Zhang J, et al. A small molecule enhances RNA interference and promotes microRNA processing. Nature biotechnology 2008;26:933-40を参照されたい。エノキサシンにより処置すると、インビトロとインビボの両方においてＡＬＳモデルは成果を示した。参考文献として本明細書に援用される、Emde A, Eitan C, Liou LL, et al. Dysregulated miRNA biogenesis downstream of cellular stress and ALS-causing mutations: a new mechanism for ALS. The EMBO journal 2015;34:2633-51.、及びShan G, Li Y, Zhang J, et al. A small molecule enhances RNA interference and promotes microRNA processing. Nature biotechnology 2008;26:933-40を参照されたい。別のキノロンファミリーメンバーであるシプロフロキサシンは市販されており、相当なＲＮＡｉ増強活性を有することが示された。インビトロＲＮＡｉレポーターアッセイでは、その効果はエノキサシンよりもわずかに劣っていた。参考文献として本明細書に援用される、Shan G, Li Y, Zhang J, et al. A small molecule enhances RNA interference and promotes microRNA processing. Nature biotechnology 2008;26:933-40を参照されたい。本試験では、シプロフロキサシンは、ＳＯＤ１変異幼魚の遊泳活性の有意な向上を示した（図１０）。
【０１９０】
エノキサシンのように、シプロフロキサシンがインビボにおいてＡＬＳモデルに寄与し得るという仮説を検討するために、本発明者らは、ＳＯＤ１ Ｇ９３Ｒゼブラフィッシュ変異体の運動能力に対するエノキサシンとシプロフロキサシンの効果を比較することに着手した。
【０１９１】
エノキサシンを、２つの最終濃度、１０μＭ及び１００μＭにより、ＳＯＤ１変異幼魚の遊泳用水に加えた。全ての試料において、０．１％ＤＭＳＯのバックグラウンドで実験を実施した。
【０１９２】
エノキサシンの両方の用量において、薬剤により引き起こされた形態又は死亡の影響は観察されなかった。処置された幼魚が１分間の時間ビンごとに移動した平均距離を解析した。１００μΜエノキサシンにより処置すると、ＡＬＳ幼魚の自発運動が増加した。１０μΜシプロフロキサシンの投与は、実験を通して処置変異幼魚の自発運動に有意な影響を及ぼさなかった。シプロフロキサシンにより処置された幼魚でも、非常に似た用量効果が見られた。
【０１９３】
実験全体を通じて、１０μΜエノキサシン処置ＳＯＤ１変異幼魚が泳いだ距離（ｍｍ）は、非処置ＳＯＤ１変異幼魚と比較して変化しなかった。１００μΜエノキサシンにより処置されたＳＯＤ１変異体は、遊泳行動の大幅な増加を示した（１９．９％）。同様に、実験全体を通じて、１０μΜシプロフロキサシン処置ＳＯＤ１変異幼魚が泳いだ距離（ｍｍ）は、非処置ＳＯＤ１変異幼魚と比較して変化しなかったのに対し、１００μΜシプロフロキサシンにより処置されたＳＯＤ１変異体は、遊泳行動の大幅な増加を示した（１７．８％）。
【０１９４】
実験のそれぞれの部分ごとの移動距離を算出し、非処置ＳＯＤ１変異体の遊泳行動と比較した（図１２）。１０μΜエノキサシンによる処置は、自発的遊泳時、明暗誘発時、及び第２の誘発からの回復時に、ＳＯＤ１変異幼魚の自発運動に対してほとんど効果がなかった。１００μΜエノキサシンによる処置は、自発的遊泳（２０．１％）、明暗誘発（２１％）、及び誘発からの回復後（１７．６％、図１２）の段階において、自発運動の有意な増加を示した。
【０１９５】
図１２は、実験の全３段階における、非処置ＳＯＤ１変異体と比較した、エノキサシン処置ＳＯＤ１変異体の自発運動を表している。
【０１９６】
同様に、１０μΜシプロフロキサシンによる処置は、３つの実験段階全てにおいてＳＯＤ１変異幼魚の自発運動に対しほとんど効果がなかった（図１０）。１００μΜシプロフロキサシンによる処置は、自発的遊泳（２６．２％）及び誘発からの回復後（３３．５％）の段階において、自発運動の有意な増加を示した。
【０１９７】
この部を結論づけるために、１００μΜシプロフロキサシンと１００μΜエノキサシンによる処置の間の比較を図１３に示す。図１３は、実験の全３段階における、非処置ＳＯＤ１変異体と比較した、規準化エノキサシン処置ＳＯＤ１変異体と規準化シプロフロキサシン処置ＳＯＤ１変異体の自発運動を表している。
【０１９８】
第一に、エノキサシンとシプロフロキサシンの両方により、同じ濃度範囲において、ＳＯＤ１変異幼魚の自発運動が同様に全体的に増加した。第二に、シプロフロキサシンによりＳＯＤ１変異体を処置すると、自発的遊泳時と誘発からの回復時の両方で、エノキサシン処置と比較して自発運動が上昇した（図１３）。
【０１９９】
＜実施例３＞
自閉症：神経系の接続特異性を確立する一般的な戦略は、ニューロンが過増殖軸索突起及び樹状突起を発達させ、続いて突起のサブセットを選択的に剪定することである。例えば、哺乳動物の皮質のＶ層からの長距離投射ニューロンは、発達初期において脊髄と上丘の両方に軸索枝を送る。発達後期では、運動皮質ニューロンは上丘への枝を選択的に剪定するが、視覚皮質ニューロンは脊髄への枝を選択的に剪定する。軸索剪定は、脊椎動物と無脊椎動物の両方の神経回路の精密化に広く用いられており、神経変性疾患の病因の一因ともなり得る。参考文献として本明細書に援用される、Watts, R. J., Hoopfer, E. D., & Luo, L. (2003). Axon pruning during Drosophila metamorphosis: evidence for local degeneration and requirement of the ubiquitin-proteasome system. Neuron, 38(6), 871-885を参照されたい。
【０２００】
自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）は、社会的相互作用の障害、コミュニケーション障害、反復行動、及び狭くて強い関心を特徴とする神経発達障害である。
【０２０１】
樹状突起棘密度の増加がＡＳＤ患者の脳において見られ、異常なシナプス構造がＡＳＤモデルマウスにおいて観察された。
【０２０２】
先の段落において説明したように、出生後のシナプス発達は、哺乳動物の大脳皮質におけるシナプスの形成と除去の同時進行によって、動的に調節される。発達初期に形成された、余分で不要なシナプスはその後除去され、シナプスのサブセットが維持及び強化される。従って、シナプスの形成と除去の正確な調節は脳の正常な発達に重要であるが、シナプス除去が減少すること、それによってシナプスが過剰になることは、ＡＳＤなどの神経発達障害と関連すると考えられている。参考文献として本明細書に援用される、Kim, H-J et al. "Deficient Autophagy in Microglia Impairs Synaptic Pruning and Causes Social Behavioral Defects. " Molecular Psychiatry 22.11 (2017): 1576-1584を参照されたい。
【０２０３】
本発明は、ＳＯＤ１ Ｇ９３Ｒゼブラフィッシュ変異体における非常に複雑な分岐運動ニューロンを主に特徴とする、重度の軸索障害を開示する。本発明の組成物、具体的には、シプロフロキサシンとセレコキシブとの組合せは、この運動ニューロン軸索障害からの回復、並びに、全体的な分岐とともに、分岐レベル、分岐点及び分岐面積の有意な減少を示した。これらの知見は、出生後のシナプス発達に不可欠な分岐の減少に似ており、自閉症の考えられる治療様式を示唆している（図１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃを参照）。
【０２０４】
＜実施例４＞
フルオロキノロンと抗炎症剤との組合せは、経口投与、静脈内投与又は局所投与の何れかに向けて製剤化される。
【０２０５】
本発明の製剤は、とりわけ、非限定的な物として、所望の濃度、有効用量、投与計画及び治療回数を有する製剤を更に開発するための付加的な成分又は医薬賦形剤を含む。これらの成分としては、とりわけ、可溶化剤、安定剤、緩衝剤、浸透圧調整剤、充填剤、増粘剤／減粘剤、界面活性剤、キレート剤及びアジュバントが挙げられる。
【０２０６】
経口投与：経口薬剤は、錠剤又はカプセル剤として服用される。
【０２０７】
錠剤：錠剤の溶解は、粒径及び結晶形によって大きく影響を受け得る。溶解時間は、速い効果（速い溶解）又は持続放出（作用の持続時間を延長するか、若しくは初期の高い血漿レベルを回避する、遅い溶解速度）のために変更することができる。
【０２０８】
カプセル剤：カプセルは、活性物質を封入したゼラチン状の外被である。カプセル剤は、吸収を遅らせるために、摂取後数時間そのままの状態を保つように設計することができる。カプセル剤は、同じ用量において迅速且つ持続的な吸収をもたらすように、徐放性粒子と速放性粒子との混合物も含有していてもよい。
【０２０９】
経口持続放出：カプセル剤又は錠剤による経口持続放出は、非限定的な物として、不溶性多孔質マトリックスであって、溶解する薬剤が、吸収され得る前にマトリックスから出口をつくる必要がある不溶性多孔質マトリックスに、持続放出製剤であって、マトリックスが膨潤してゲルを形成しそこから薬剤が出る持続放出製剤に有効成分を埋め込むことによって、又は、浸透圧制御放出経口送達システムであって、活性化合物が、一方の端部にレーザーにより穴が開けられた透水性膜に包まれている浸透圧制御放出経口送達システムによって、達成される。水が膜を通過すると、薬剤は穴から押し出されて消化管に入り、そこで吸収され得る。
【０２１０】
液剤：液体製剤は、治療剤の経口投与用の剤形として広く用いられている。液体製剤は、選択された溶媒系に治療剤及び種々の賦形剤が溶解している液状の製剤と定義される。液体製剤は均一であり、すなわち、治療剤及び賦形剤が溶媒中に溶解している。
【０２１１】
非経口投与：非経口投与は、静脈内、皮下、筋肉内及び関節内投与を用いて行われる。薬剤は、液体により、又は不安定な場合は凍結乾燥形態により、保存される。
【０２１２】
局所投与：局所製剤は、とりわけ、クリーム、軟膏、ペースト、ローション又はゲルを含む。
【０２１３】
経皮送達：経皮送達は、例えば経皮パッチによって達成される。
【０２１４】
別の投与経路は、坐剤、脳室内、筋肉内、吸入、エアロゾル及び舌下である。
【０２１５】
＜実施例５＞
本発明の組成物は、重量／重量の１日当たりのヒト用量として、組合せの前述した比で用いられる。
【０２１６】
【表１】
2020527542.tif 000003
【０２１７】
＜実施例６＞
＜セレコキシブとシプロフロキサシンとの組合せによる治療効果を評価するための臨床試験の概要＞
本明細書では、「Ｐｒｉｍｅ  Ｃ」という用語は以後、一般に、セレコキシブとシプロフロキサシンとの組合せを含む組成物を意味する。
【０２１８】
【表２】
2020527542.tif 000004
【表３】
2020527542.tif 000005
【表４】
2020527542.tif 000006
【０２１９】
本発明の特定の実施形態に関して上述したが、実施形態の説明は本発明の例示であり、限定を意図するものではないことを理解されたい。当業者であれば、本発明の真意及び範囲から逸脱することなく、種々の変更及び応用を着想することが可能である。
【図１】
2020527542.tif 000007
【図２】
2020527542.tif 000008
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【国際調査報告】
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