(57)【要約】骨髄増殖性白血病（ＭＰＬ）タンパク質に結合する分子およびその使用方法が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＰＬに結合する第１の標的化部分およびホスファターゼ、例えばタンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）、例えば受容体タンパク質チロシンホスファターゼ（ＲＰＴＰ）に結合する第２の標的化部分を含む、多重特異性分子。
【請求項２】
前記ホスファターゼおよびＭＰＬが、同じ細胞、例えば骨髄線維症細胞で発現される、請求項１に記載の多重特異性分子。
【請求項３】
前記ホスファターゼが、ＭＰＬまたはＭＰＬと直接的または間接的に相互作用する分子（例えば、ＭＰＬと直接的または間接的に相互作用するチロシンキナーゼ、例えばＪＡＫ２またはＳｒｃ）を脱リン酸化することができる、請求項１または２に記載の多重特異性分子。
【請求項４】
前記ホスファターゼが、ＣＤ４５、ＲＰＴＰμ、ＲＰＴＰκ、ＲＰＴＰρ、ＲＰＴＰ
【化３】
2020522254.tif 000024
、白血球抗原関連チロシンホスファターゼ（ＬＡＲ）、ＲＰＴＰσ、ＲＰＴＰδ、ＲＰＴＰβ、ＣＤ１４８、ＳＡＰ１、ＲＰＴＰＯ、ＲＰＴＰＱ／ＰＴＰＳ３１、ＲＰＴＰα、ＲＰＴＰε、ＲＰＴＰζ、ＲＰＴＰγ、ＰＣ−ＰＴＰ、ＩＡ２、およびＩＡ２βからなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の多重特異性分子。
【請求項５】
前記ホスファターゼがＣＤ４５であり、場合により、ホスファターゼに結合する前記標的化部分が、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４５ＲＣ、ＣＤ４５ＲＡＢ、ＣＤ４５ＲＡＣ、ＣＤ４５ＲＢＣ、ＣＤ４５ＲＯ、またはＣＤ４５Ｒ（ＡＢＣ）のうちの１つ以上に結合する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の多重特異性分子。
【請求項６】
ＭＰＬに結合する前記第１の標的化部分が、
（ｉ）表１の重鎖可変ドメイン配列のいずれかに由来する１つ、２つ、もしくは３つのＣＤＲ、または密接に関連するＣＤＲ、例えば、表１の重鎖可変ドメイン配列のいずれかの前記ＣＤＲ配列のいずれかに由来する、少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、２つ、３つ、もしくは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるＣＤＲ、
（ｉｉ）表１の重鎖可変ドメインアミノ酸配列のいずれかから選択される重鎖可変ドメイン配列、またはそれと実質的に同一（例えば、それと９５％〜９９．９％同一）の、もしくは少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、５、１０、または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）表１の軽鎖可変ドメイン配列のいずれかに由来する１つ、２つ、もしくは３つのＣＤＲ、または密接に関連するＣＤＲ、例えば、表１の軽鎖可変ドメイン配列のいずれかの前記ＣＤＲ配列のいずれかに由来する、少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、２つ、３つ、もしくは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるＣＤＲ、あるいは
（ｉｖ）表１の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列のいずれかから選択される軽鎖可変ドメイン配列、またはそれと実質的に同一（例えば、それと９５％〜９９．９％同一）の、もしくは少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、５、１０、または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の多重特異性分子。
【請求項７】
ホスファターゼに結合する前記第２の標的化部分がＣＤ４５に結合し、前記第２の標的化部分が、
（ｉ）表３の重鎖可変ドメイン配列のいずれかに由来する１つ、２つ、もしくは３つのＣＤＲ、または密接に関連するＣＤＲ、例えば、表３の重鎖可変ドメイン配列のいずれかの前記ＣＤＲ配列のいずれかに由来する、少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、２つ、３つ、もしくは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるＣＤＲ、
（ｉｉ）表３の重鎖可変ドメインアミノ酸配列のいずれかから選択される重鎖可変ドメイン配列、またはそれと実質的に同一（例えば、それと９５％〜９９．９％同一）の、もしくは少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、５、１０、または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）表３の軽鎖可変ドメイン配列のいずれかに由来する１つ、２つ、もしくは３つのＣＤＲ、または密接に関連するＣＤＲ、例えば、表３の軽鎖可変ドメイン配列のいずれかの前記ＣＤＲ配列のいずれかに由来する、少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、２つ、３つ、もしくは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるＣＤＲ、あるいは
（ｉｖ）表３の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列のいずれかから選択される軽鎖可変ドメイン配列、またはそれと実質的に同一（例えば、それと９５％〜９９．９％同一）の、もしくは少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、５、１０、または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜３、５、または６のいずれか一項に記載の多重特異性分子。
【請求項８】
ホスファターゼに結合する前記第２の標的化部分がＣＤ１４８に結合し、前記第２の標的化部分が、
（ｉ）表４の重鎖可変ドメイン配列のいずれかに由来する１つ、２つ、もしくは３つのＣＤＲ、または密接に関連するＣＤＲ、例えば、表４の重鎖可変ドメイン配列のいずれかの前記ＣＤＲ配列のいずれかに由来する、少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、２つ、３つ、もしくは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるＣＤＲ、
（ｉｉ）表４の重鎖可変ドメインアミノ酸配列のいずれかから選択される重鎖可変ドメイン配列、またはそれと実質的に同一（例えば、それと９５％〜９９．９％同一）の、もしくは少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、５、１０、または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）表４の軽鎖可変ドメイン配列のいずれかに由来する１つ、２つ、もしくは３つのＣＤＲ、または密接に関連するＣＤＲ、例えば、表４の軽鎖可変ドメイン配列のいずれかの前記ＣＤＲ配列のいずれかに由来する、少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、２つ、３つ、もしくは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるＣＤＲ、あるいは
（ｉｖ）表４の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列のいずれかから選択される軽鎖可変ドメイン配列、またはそれと実質的に同一（例えば、それと９５％〜９９．９％同一）の、もしくは少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、５、１０、または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜３.または６のいずれか一項に記載の多重特異性分子。
【請求項９】
ホスファターゼに結合する前記第２の標的化部分がＬＡＲに結合し、前記第２の標的化部分が、
（ｉ）表５の重鎖可変ドメイン配列のいずれかに由来する１つ、２つ、もしくは３つのＣＤＲ、または密接に関連するＣＤＲ、例えば、表５の重鎖可変ドメイン配列のいずれかの前記ＣＤＲ配列のいずれかに由来する、少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、２つ、３つ、もしくは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるＣＤＲ、
（ｉｉ）表５の重鎖可変ドメインアミノ酸配列のいずれかから選択される重鎖可変ドメイン配列、またはそれと実質的に同一（例えば、それと９５％〜９９．９％同一）の、もしくは少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、５、１０、または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）表５の軽鎖可変ドメイン配列のいずれかに由来する１つ、２つ、もしくは３つのＣＤＲ、または密接に関連するＣＤＲ、例えば、表５の軽鎖可変ドメイン配列のいずれかの前記ＣＤＲ配列のいずれかに由来する、少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、２つ、３つ、もしくは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるＣＤＲ、あるいは
（ｉｖ）表５の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列のいずれかから選択される軽鎖可変ドメイン配列、またはそれと実質的に同一（例えば、それと９５％〜９９．９％同一）の、もしくは少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、５、１０、または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜３、または６のいずれか一項に記載の多重特異性分子。
【請求項１０】
前記多重特異性分子が、エフェクター部分をさらに含み、例えば、前記エフェクター部分が、免疫細胞エンゲージャー、サイトカイン分子、サイトカインアンタゴニスト、例えばＴＧＦ−βアンタゴニスト、酵素、毒素、または標識剤のうちの１つ以上から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の多重特異性分子。
【請求項１１】
前記エフェクター部分が、免疫細胞エンゲージャー（例えば、抗ＣＤ３抗体分子）である、請求項１０に記載の多重特異性分子。
【請求項１２】
前記エフェクター部分が、ＴＧＦ−βアンタゴニスト、例えば、ＴＧＦβに結合することができるＴＧＦβ受容体、またはその機能的断片もしくは変異型、例えばＴＧＦβ受容体Ｉ型の細胞外ドメインまたはＴＧＦβ受容体ＩＩ型の細胞外ドメインを含むポリペプチドである、請求項１０に記載の多重特異性分子。
【請求項１３】
前記ＴＧＦβアンタゴニストが、表６の任意のアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一（例えば、それと７５％、８−０％、８５％、９０％、９５％、または９９．９％同一）の、もしくは少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、５、１０、１５、または２０個以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存置換）であるアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の多重特異性分子。
【請求項１４】
第１のＭＰＬ標的化部分を含み、前記第１のＭＰＬ標的化部分がＭＰＬに結合する、多重特異性分子（例えば、多重特異性または多機能性抗体分子）。
【請求項１５】
前記多重特異性分子が、ＭＰＬ活性を低減、例えば阻害する、請求項１４に記載の多重特異性分子。
【請求項１６】
ＭＰＬに結合する第２のＭＰＬ標的化部分を含む、請求項１４または１５に記載の多重特異性分子。
【請求項１７】
前記第１および前記第２のＭＰＬ標的化部分が、同じエピトープに結合する（例えば、重複するエピトープに結合する）、請求項１６に記載の多重特異性分子。
【請求項１８】
前記第１および前記第２のＭＰＬ標的化部分が、単一のＭＰＬタンパク質上の異なるエピトープに結合する（例えば、非重複エピトープに結合する）、請求項１６に記載の多重特異性分子。
【請求項１９】
二重パラトープ抗体分子である、請求項１８に記載の多重特異性分子。
【請求項２０】
単一のＭＰＬ標的化部分、例えばＭＰＬに対するハーフアーム抗体（例えば第１の免疫グロブリン定常ドメイン（例えば第１のＦｃ定常領域（例えば第１のＣＨ２−ＣＨ３）に融合したＦａｂまたは単鎖Ｆｖ）を含む、ＭＰＬ結合分子であって、ＭＰＬ活性を低減する、例えば阻害する、ＭＰＬ結合分子。
【請求項２１】
一価である、請求項２０に記載のＭＰＬ結合分子。
【請求項２２】
第２の免疫グロブリン定常ドメイン、例えば第２の重鎖定常領域、例えば第２のＦｃ定常領域、例えば第２のＣＨ２−ＣＨ３をさらに含む、請求項２０または２１に記載のＭＰＬ結合分子。
【請求項２３】
免疫細胞エンゲージャー、サイトカイン分子、または腫瘍標的化分子（例えば、ＭＰＬ以外の腫瘍標的を標的とする腫瘍標的化分子）のうちの１つ以上をさらに含む、請求項１４〜２２のいずれか一項に記載の多重特異性分子またはＭＰＬ結合分子。
【請求項２４】
前記腫瘍標的化分子が、抗ＣＤ４１抗体分子または抗ＣＤ１７７抗体分子である、請求項２３に記載の多重特異性分子またはＭＰＬ結合分子。
【請求項２５】
抗ＰＤＬ１抗体分子、抗ＣＤ３抗体分子、抗ＴＧＦβ抗体分子、ＴＧＦβトラップポリペプチド（例えば、ＴＧＦβに結合することができるＴＧＦβ受容体の一部を含むポリペプチド）、抗ＩＬ１β抗体分子、ＩＬ１βトラップポリペプチド（例えば、ＩＬ１βに結合することができるＩＬ１β受容体の一部を含むポリペプチド）、抗ＣＸＣＬ１０抗体分子、抗ＭＳ４Ａ３抗体分子、抗ＯＬＦＭ４抗体分子、抗ＣＤ６６ｂ抗体分子、抗ｃＫｉｔ抗体分子、抗ＦＬＴ３抗体分子、または抗ＣＤ１３３抗体分子（またはそれらの任意の組み合わせ）をさらに含む、請求項１４〜２４のいずれか一項に記載の多重特異性分子またはＭＰＬ結合分子。
【請求項２６】
ＭＰＬの前記細胞外ドメインに結合する、請求項１４〜２５のいずれか一項に記載の多重特異性分子またはＭＰＬ結合分子。
【請求項２７】
前記分子に結合した前記ＭＰＬと第２のＭＰＬタンパク質との会合を防止する、請求項１４〜２６のいずれか一項に記載の多重特異性分子またはＭＰＬ結合分子。
【請求項２８】
ＭＰＬタンパク質の二量体化、細胞内リン酸化、またはＪＡＫ２キナーゼ経路の活性化のうちの１つ、２つ以上を低減する（例えば防止する）、請求項１４〜２７のいずれか一項に記載の多重特異性分子またはＭＰＬ結合分子。
【請求項２９】
前記ＭＰＬ活性がＭＰＬリガンド、例えばＴＰＯの存在下で低減する、請求項１５〜２８のいずれか一項に記載の多重特異性分子またはＭＰＬ結合分子。
【請求項３０】
前記第１および前記第２のＭＰＬ標的化部分の前記ＭＰＬに対する親和性、例えば合わせた親和性が、その対応する抗原結合部位に対する各標的化部分の前記親和性（単独または多重特異性分子の一部としてのいずれか）以上である、請求項１６〜１９または２３〜２９のいずれか一項に記載の多重特異性分子またはＭＰＬ結合分子。
【請求項３１】
前記第１および前記第２のＭＰＬ標的化部分の前記ＭＰＬに対する前記親和性、例えば前記合わせた親和性が、その対応する抗原結合部位に対する各標的化部分（単独または多重特異性分子の一部としてのいずれか）の前記親和性よりも少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、７５倍、または１００倍大きい、請求項３０に記載の多重特異性分子またはＭＰＬ結合分子。
【請求項３２】
ＭＰＬタンパク質発現細胞、例えばがん細胞または造血細胞に対する前記第１および前記第２のＭＰＬ標的化部分の前記親和性、例えば前記合わせた親和性が、ＭＰＬタンパク質発現細胞、例えばがん細胞または造血細胞に対するリガンド、例えばＭＰＬタンパク質の天然リガンド（例えばＴＰＯ）の前記親和性以上である、請求項１６〜１９または２３〜２９のいずれか一項に記載の多重特異性分子またはＭＰＬ結合分子。
【請求項３３】
ＭＰＬタンパク質発現細胞、例えばがん細胞または造血細胞に対する前記第１および前記第２のＭＰＬ標的化部分の前記親和性、例えば前記合わせた親和性が、ＭＰＬタンパク質発現細胞、例えばがん細胞または造血細胞に対する前記リガンド、例えばＭＰＬタンパク質の天然リガンド（例えばＴＰＯ）の前記親和性よりも少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、７５倍、または１００倍大きい、請求項３２に記載の多重特異性分子またはＭＰＬ結合分子。
【請求項３４】
前記ＭＰＬ標的化部分が、全長抗体、または抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ‘）２、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ、単一ドメイン抗体、ハーフアーム抗体、ダイアボディ（ｄＡｂ）、二価の抗体、一価の抗体、または二重特異性抗体もしくはその断片、その単一ドメイン変異型、またはラクダ抗体）である、請求項１４〜３３のいずれか一項に記載の多重特異性分子またはＭＰＬ結合分子。
【請求項３５】
前記免疫グロブリン定常領域（例えばＦｃ領域）が、２つのＭＰＬ標的化部分、例えば非重複抗原結合部位を有するＭＰＬ標的化部分に結合、例えば共有結合される、請求項１４〜１９または２３〜３４のいずれか一項に記載の多重特異性分子。
【請求項３６】
前記ＭＰＬ標的化部分が、カッパもしくはラムダの軽鎖定常領域、またはその断片から選択される軽鎖定常領域を含む、請求項１４〜３５のいずれか一項に記載の多重特異性分子またはＭＰＬ結合分子。
【請求項３７】
第１のＭＰＬ標的化部分および第２のＭＰＬ標的化部分を含み、前記第１のＭＰＬ標的化部分が、カッパ軽鎖定常領域またはその断片を含み、前記第２のＭＰＬ標的化部分が、ラムダ軽鎖定常領域またはその断片を含む、請求項１４〜１９または２３〜３６のいずれか一項に記載の多重特異性分子。
【請求項３８】
第１のＭＰＬ標的化部分および第２のＭＰＬ標的化部分を含み、前記第１のＭＰＬ標的化部分および前記第２のＭＰＬ標的化部分が、共通の軽鎖可変領域を含む、請求項１４〜１９または２３〜３７のいずれか一項に記載の多重特異性分子。
【請求項３９】
二量体化ドメイン、例えば、第１および第２の免疫グロブリン鎖定常領域（例えばＦｃ領域）の界面を含む、請求項１４〜３８のいずれか一項に記載の多重特異性分子またはＭＰＬ結合分子。
【請求項４０】
前記二量体化ドメインが、例えば、操作されていない界面と比べて二量体化を増加または減少させるように操作、例えば突然変異される、請求項３９に記載の多重特異性分子またはＭＰＬ結合分子。
【請求項４１】
前記免疫グロブリン鎖定常領域（例えばＦｃ領域）の前記二量体化が、例えば操作されていない界面と比べて、ヘテロ多量体：ホモ多量体の比が大きくなるように、空洞−突起の対合（「ノブ・イン・ホール」）、静電相互作用、または鎖交換のうちの１つ以上で、第１および第２のＦｃ領域のＦｃ界面を提供することにより増強される、請求項４０に記載の多重特異性分子またはＭＰＬ結合分子。
【請求項４２】
前記免疫グロブリン鎖定常領域（例えばＦｃ領域）が、例えばヒトＩｇＧ１のＦｃ領域の３４７、３４９、３５０、３５１、３６６、３６８、３７０、３９２、３９４、３９５、３９７、３９８、３９９、４０５、４０７、または４０９のうちの１つ以上から選択される位置にアミノ酸置換を含む、請求項３９または４０に記載の多重特異性分子またはＭＰＬ結合分子。
【請求項４３】
前記免疫グロブリン鎖定常領域（例えばＦｃ領域）が、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、またはＹ４０７Ｖ（例えば空洞またはホールに対応）、もしくはＴ３６６Ｗ（例えば突起またはノブに対応）、またはそれらの組み合わせから選択されるアミノ酸置換を含む、請求項３９〜４２のいずれか一項に記載の多重特異性分子またはＭＰＬ結合分子。
【請求項４４】
第１の抗原結合ドメインと、第２の抗原結合ドメインと、を含む、多重特異性分子であって、
ｉ）前記第１および前記第２の抗原結合ドメインが、単一のＭＰＬタンパク質上の異なるエピトープに結合する（例えば、非重複エピトープに結合する）か、または
ｉｉ）前記第１の抗原結合ドメインがＭＰＬに結合し、前記第２の抗原結合ドメインがＭＰＬ以外の抗原、例えばＭＰＬ以外の腫瘍抗原に結合し、
前記第１の抗原結合ドメインが、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含み、前記第２の抗原結合ドメインが、第３のポリペプチドおよび第４のポリペプチドを含み、
ａ）前記第１のポリペプチドが、例えば、Ｎ−からＣ−の配向で、第１の重鎖可変領域（ＶＨ）、第１の重鎖定常領域１（ＣＨ１）、および場合により、前記第１と第３のポリペプチドとの会合を促進する第１の領域、例えば第１のＦｃ領域（例えば第１のＣＨ２−ＣＨ３）を含み、
ｂ）前記第２のポリペプチドが、例えば、Ｎ−からＣ−の配向で、第１の軽鎖可変領域（ＶＬ）および第１の軽鎖定常領域（ＣＬ）を含み、
ｃ）前記第３のポリペプチドが、例えば、Ｎ−からＣ−の配向で、第２の重鎖可変領域（ＶＨ）、第２の重鎖定常領域１（ＣＨ１）、および場合により、前記第１と第３のポリペプチドとの会合を促進する第２の領域、例えば第２のＦｃ領域（例えば第２のＣＨ２−ＣＨ３）を含み、
ｄ）前記第４のポリペプチドが、例えば、Ｎ−からＣ−の配向で、第２の軽鎖可変領域（ＶＬ）および第２の軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む、多重特異性分子。
【請求項４５】
第１の抗原結合ドメインと、第２の抗原結合ドメインと、を含む、多重特異性分子であって、
ｉ）前記第１および前記第２の抗原結合ドメインが、単一のＭＰＬタンパク質上の異なるエピトープに結合する（例えば、非重複エピトープに結合する）か、または
ｉｉ）前記第１の抗原結合ドメインがＭＰＬに結合し、前記第２の抗原結合ドメインがＭＰＬ以外の抗原、例えばＭＰＬ以外の腫瘍抗原に結合し、
前記第１の抗原結合ドメインが、第１のポリペプチドを含み、前記第２の抗原結合ドメインが、第２のポリペプチドを含み、
ａ）前記第１のポリペプチドが、例えば、Ｎ−からＣ−の配向で、第１の重鎖可変領域（ＶＨ）および第１の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む第１のｓｃＦｖ領域、ならびに場合により、前記第１と第２のポリペプチドとの会合を促進する第１の領域、例えば第１のＦｃ領域（例えば第１のＣＨ２−ＣＨ３）を含み、
ｂ）前記第２のポリペプチドが、例えば、Ｎ−からＣ−の配向で、第２のＶＨおよび第２のＶＬを含む第２のｓｃＦｖ領域、ならびに場合により、前記第１と第２のポリペプチドとの会合を促進する第２の領域、例えば第２のＦｃ領域（例えば第２のＣＨ２−ＣＨ３）を含む、多重特異性分子。
【請求項４６】
ＭＰＬ結合分子であって、
ｉ）第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含む単一のＭＰＬ標的化部分と、
ｉｉ）第３のポリペプチドと、を含み、
ａ）前記第１のポリペプチドが、例えば、Ｎ−からＣ−の配向で、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域１（ＣＨ１）、ならびに場合により、前記第１と第３のポリペプチドとの会合を促進する第１の領域、例えば第１のＦｃ領域（例えば第１のＣＨ２−ＣＨ３）を含み、
ｂ）前記第２のポリペプチドが、例えば、Ｎ−からＣ−の配向で、軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）を含み、
ｂ）前記第３のポリペプチドが、例えば、Ｎ−からＣ−の配向で、前記第１と第３のポリペプチドとの会合を促進する第２の領域、例えば第２のＦｃ領域（例えば第２のＣＨ２−ＣＨ３）を含む、ＭＰＬ結合分子。
【請求項４７】
重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むｓｃＦｖを含む単一のＭＰＬ標的化部分を含む、ＭＰＬ結合分子であって、
ｉ）免疫グロブリン定常ドメイン、例えばＦｃ定常領域、例えばＣＨ２−ＣＨ３をさらに含み、かつ／または
ｉｉ）ＭＰＬ活性を低減、例えば阻害する、ＭＰＬ結合分子。
【請求項４８】
１つまたは２つのＭＰＬ標的化部分を含むＭＰＬ結合分子であって、前記ＭＰＬ結合分子がＭＰＬ活性を低減し、前記１つまたは２つのＭＰＬ標的化部分が、
（ｉ）表１の重鎖可変ドメイン配列のいずれかに由来する１つ、２つ、もしくは３つのＣＤＲ、または密接に関連するＣＤＲ、例えば、表１の重鎖可変ドメイン配列のいずれかの前記ＣＤＲ配列のいずれかに由来する、少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、２つ、３つ、もしくは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるＣＤＲ、あるいは
（ｉｉ）表１の重鎖可変ドメインアミノ酸配列のいずれかから選択される重鎖可変ドメイン配列、またはそれと実質的に同一（例えば、それと９５％〜９９．９％同一）の、もしくは少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、５、１０、または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるアミノ酸配列を含む、ＭＰＬ結合分子。
【請求項４９】
前記１つまたは２つのＭＰＬ標的化部分が、
（ｉ）表１の軽鎖可変ドメイン配列のいずれかに由来する１つ、２つ、もしくは３つのＣＤＲ、または密接に関連するＣＤＲ、例えば、表１の軽鎖可変ドメイン配列のいずれかの前記ＣＤＲ配列のいずれかに由来する、少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、２つ、３つ、もしくは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるＣＤＲ、あるいは
（ｉｉ）表１の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列のいずれかから選択される軽鎖可変ドメイン配列、またはそれと実質的に同一（例えば、それと９５％〜９９．９％同一）の、もしくは少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、５、１０、または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるアミノ酸配列をさらに含む、請求項４８に記載のＭＰＬ結合分子。
【請求項５０】
野生型ＪＡＫ２に関連するＭＰＬよりも、突然変異したＪＡＫ２（例えば、Ｖ６１７Ｆ突然変異を含むＪＡＫ２）に関連するＭＰＬに優先的に結合する、請求項１４〜４９のいずれか一項に記載の多重特異性分子またはＭＰＬ結合分子。
【請求項５１】
ｉ）前記多重特異性分子またはＭＰＬ結合分子が、前記多重特異性分子またはＭＰＬ結合分子が野生型ＪＡＫ２に関連するＭＰＬに結合する場合よりも大きい親和性、例えば、少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、７５倍、または１００倍大きい親和性で突然変異したＪＡＫ２（例えば、Ｖ６１７Ｆ突然変異を含むＪＡＫ２）に関連するＭＰＬに結合し、
ｉｉ）前記多重特異性分子またはＭＰＬ結合分子は、ＭＰＬが突然変異したＪＡＫ２（例えば、Ｖ６１７Ｆ突然変異を含むＪＡＫ２）と関連する場合にＭＰＬにのみ存在するエピトープに結合するが、ＭＰＬが野生型ＪＡＫ２と関連する場合には結合しない、請求項５０に記載の多重特異性分子またはＭＰＬ結合分子。
【請求項５２】
野生型ＪＡＫ２に関連するＭＰＬよりも、突然変異したＪＡＫ２（例えば、Ｖ６１７Ｆ突然変異を含むＪＡＫ２）に関連するＭＰＬに優先的に結合する、ＭＰＬ結合分子。
【請求項５３】
ｉ）前記ＭＰＬ結合分子は、前記ＭＰＬ結合分子が野生型ＪＡＫ２に関連するＭＰＬに結合する場合よりも大きい親和性、例えば、少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、７５倍、または１００倍大きい親和性で突然変異したＪＡＫ２（例えば、Ｖ６１７Ｆ突然変異を含むＪＡＫ２）に関連するＭＰＬに結合し、
ｉｉ）前記ＭＰＬ結合分子は、ＭＰＬが突然変異したＪＡＫ２（例えば、Ｖ６１７Ｆ突然変異を含むＪＡＫ２）と関連する場合にＭＰＬにのみ存在するエピトープに結合するが、ＭＰＬが野生型ＪＡＫ２と関連する場合には結合しない、請求項５２に記載のＭＰＬ結合分子。
【請求項５４】
ホスファターゼ、例えばタンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）、例えば受容体タンパク質チロシンホスファターゼ（ＲＰＴＰ）に結合する標的化部分をさらに含む、請求項１４〜５３のいずれか一項に記載の多重特異性分子またはＭＰＬ結合分子。
【請求項５５】
前記ホスファターゼおよびＭＰＬが、同じ細胞、例えば骨髄線維症細胞で発現される、請求項５４に記載の多重特異性分子またはＭＰＬ結合分子。
【請求項５６】
前記ホスファターゼが、ＭＰＬまたはＭＰＬと直接的または間接的に相互作用する分子（例えば、ＭＰＬと直接的または間接的に相互作用するチロシンキナーゼ、例えばＪＡＫ２またはＳｒｃ）を脱リン酸化することができる、請求項５４または５５に記載の多重特異性分子またはＭＰＬ結合分子。
【請求項５７】
前記ホスファターゼが、ＣＤ４５、ＲＰＴＰμ、ＲＰＴＰκ、ＲＰＴＰρ、ＲＰＴＰ
【化４】
2020522254.tif 000025
、白血球抗原関連チロシンホスファターゼ（ＬＡＲ）、ＲＰＴＰσ、ＲＰＴＰδ、ＲＰＴＰβ、ＣＤ１４８、ＳＡＰ１、ＲＰＴＰＯ、ＲＰＴＰＱ／ＰＴＰＳ３１、ＲＰＴＰα、ＲＰＴＰε、ＲＰＴＰζ、ＲＰＴＰγ、ＰＣ−ＰＴＰ、ＩＡ２、およびＩＡ２βからなる群から選択される、請求項５４〜５６のいずれか一項に記載の多重特異性分子またはＭＰＬ結合分子。
【請求項５８】
前記ホスファターゼがＣＤ４５であり、場合により、ホスファターゼに結合する前記標的化部分が、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４５ＲＣ、ＣＤ４５ＲＡＢ、ＣＤ４５ＲＡＣ、ＣＤ４５ＲＢＣ、ＣＤ４５ＲＯ、またはＣＤ４５Ｒ（ＡＢＣ）のうちの１つ以上に結合する、請求項５４〜５６のいずれか一項に記載の多重特異性分子またはＭＰＬ結合分子。
【請求項５９】
前記ホスファターゼがＣＤ１４８である、請求項５４〜５６のいずれか一項に記載の多重特異性分子またはＭＰＬ結合分子。
【請求項６０】
前記ホスファターゼがＬＡＲである、請求項５４〜５６のいずれか一項に記載の多重特異性分子またはＭＰＬ結合分子。
【請求項６１】
請求項１〜６０のいずれか一項に記載の多重特異性分子またはＭＰＬ結合分子をコードする、単離された核酸分子。
【請求項６２】
請求項６１に記載の単離された核酸分子を含む、ベクター、例えば発現ベクター。
【請求項６３】
請求項６１に記載の核酸分子または請求項６２に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項６４】
請求項１〜６０のいずれか一項に記載の多重特異性分子またはＭＰＬ結合分子を作製、例えば産生する方法であって、好適な条件下、例えば、遺伝子発現および／またはホモまたはヘテロ二量体化に好適な条件下で、請求項６３に記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。
【請求項６５】
請求項１〜６０のいずれか一項に記載の多重特異性分子またはＭＰＬ結合分子と、薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤と、を含む、医薬組成物。
【請求項６６】
がんを治療する方法であって、それを必要とする対象に請求項１〜６０のいずれか一項に記載の多重特異性分子またはＭＰＬ結合分子を投与することを含み、前記多重特異性抗体が、前記がんの治療に有効な量で投与される、方法。
【請求項６７】
前記がんが、血液癌、Ｂ細胞またはＴ細胞悪性腫瘍、例えば、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（例えば、Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、有毛細胞白血病）、骨髄線維症、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、または急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）から選択される、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記がんが骨髄線維症である、請求項６６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１７年５月３１日に提出されたＵＳ第６２／５１２，８６７号、２０１７年６月２０日に提出されたＵＳ第６２／５２２，４８０号、および２０１７年９月８日に提出されたＵＳ第６２／５５５，８４３号の優先権を主張し、それらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０１８年５月２４日に作成された上記のＡＳＣＩＩコピーの名称はＥ２０７０−７０１０ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズは１５０，４０４バイトである。
【背景技術】
【０００３】
トロンボポエチン受容体（ＴＰＯＲ）またはＣＤ１１０（分化抗原群１１０）としても知られる骨髄増殖性白血病（ＭＰＬ）タンパク質は、その天然リガンドであるトロンボポイエチン（ＴＰＯ）の、ＭＰＬの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）への結合によって活性化される二量体タンパク質である。リガンドが結合すると、ＭＰＬ受容体の二量体化が誘導され、ＭＰＬの立体構造変化が起こり、細胞内リン酸化およびＪＡＫ２キナーゼ経路の活性化を含む細胞内プロセシングシグナルの活性化が続く。
【０００４】
ＭＰＬアゴニストは当該技術分野で既知であり、ＭＰＬタンパク質の２つの受容体細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を架橋することにより機能すると考えられている。しかしながら、本明細書に開示されるものなどのＭＰＬアンタゴニストの必要性は依然として出る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本明細書では、とりわけ、第１のＭＰＬ標的化部分を含む多重特異性分子（例えば、多重特異性または多機能性抗体分子）が提供され、この第１のＭＰＬ標的化部分はＭＰＬに結合する。いくつかの実施形態では、多重特異性分子は、ＭＰＬ活性を低減、例えば阻害する。いくつかの実施形態では、多重特異性分子は、ＭＰＬに結合する第２のＭＰＬ標的化部分を含む。いくつかの実施形態では、第１および第２のＭＰＬ標的化部分は、同じエピトープに結合する（例えば、重複するエピトープに結合する）。いくつかの実施形態では、第１のＭＰＬ標的化部分の第１のＭＰＬタンパク質への結合は、第２のＭＰＬ標的化部分の第２のＭＰＬタンパク質への結合を低減（例えば、防止）する。いくつかの実施形態では、第１および第２のＭＰＬ標的化部分は、単一のＭＰＬタンパク質上の異なるエピトープに結合する（例えば、非重複エピトープに結合する）。いくつかの実施形態では、多重特異性分子は、二重パラトープ抗体分子である（例えば、同じＭＰＬタンパク質上の２つの異なるエピトープ（例えば、非重複エピトープ）に結合する）。
【０００６】
実施形態では、多重特異性分子は、免疫細胞エンゲージャー、サイトカイン分子、または腫瘍標的化分子（例えば、ＭＰＬ以外の腫瘍標的を標的とする第２の腫瘍標的化分子）のうちの１つ以上をさらに含み得る。実施形態では、多重特異性分子は、腫瘍標的化分子を含み、この腫瘍標的化分子は、抗ＣＤ４１抗体分子または抗ＣＤ１７７抗体分子である。いくつかの実施形態では、多重特異性分子は、抗ＰＤＬ１抗体分子、抗ＣＤ３抗体分子、抗ＴＧＦβ抗体分子、ＴＧＦβトラップポリペプチド（例えば、ＴＧＦβに結合することができるＴＧＦβ受容体の一部を含むポリペプチド）、抗ＩＬ１β抗体分子、ＩＬ１βトラップポリペプチド（例えば、ＩＬ１βに結合することができるＩＬ１β受容体の一部を含むポリペプチド）、抗ＣＸＣＬ１０抗体分子、抗ＭＳ４Ａ３抗体分子、抗ＯＬＦＭ４抗体分子、抗ＣＤ６６ｂ抗体分子、抗ｃＫｉｔ抗体分子、抗ＦＬＴ３抗体分子、または抗ＣＤ１３３抗体分子（またはそれらの任意の組み合わせ）をさらに含む。
【０００７】
別の実施形態では、多重特異性分子またはＭＰＬ結合分子は、単一のＭＰＬ標的化部分、例えばＭＰＬに対するハーフアーム抗体（例えば第１の免疫グロブリン定常ドメイン（例えば第１のＦｃ定常領域（例えば第１のＣＨ２−ＣＨ３）に融合したＦａｂまたは単鎖Ｆｖ）であるか、またはそれを含む。場合により、ハーフアーム抗体は、第２の免疫グロブリン定常ドメイン、例えば第２の重鎖定常領域、例えば第２のＦｃ定常領域、例えば第２のＣＨ２−ＣＨ３）に二量体化（例えばホモまたはヘテロ二量体化）される。実施形態では、ＭＰＬ標的化部分および／または第２の免疫グロブリン定常ドメインは、免疫細胞エンゲージャー、サイトカイン分子、または腫瘍標的化分子（例えば、ＭＰＬ以外の腫瘍標的を標的とする第２の腫瘍標的化分子）のうちの１つ以上をさらに含み得る。加えて、前述の多重特異性分子をコードする核酸、前述の分子を産生する方法、および前述の分子を使用してがんを治療する方法が開示される。
【０００８】
したがって、一態様では、本開示は、ＭＰＬに結合する（例えば、それを標的とする）、例えばＭＰＬの１つ以上の領域に結合する多重特異性または多機能性分子（例えば、多重特異性または多機能性ポリペプチド）を特徴とする。実施形態では、多重特異性分子は、ＭＰＬに結合する部分、例えば、抗体分子またはリガンド（本明細書では「ＭＰＬ標的化部分」とも呼ばれる）を含む。一実施形態では、多重特異性分子はＭＰＬの細胞外ドメインに結合する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される多重特異性分子は、単一のＭＰＬタンパク質に結合し、第２のＭＰＬタンパク質との会合を防止する。実施形態では、多重特異性分子は、ＭＰＬ活性を低減、例えば阻害し、例えば、ＭＰＬタンパク質の二量体化、細胞内リン酸化、またはＪＡＫ２キナーゼ経路の活性化のうちの１つ、２つ以上を低減（例えば、防止）する。実施形態では、ＭＰＬ活性は、ＭＰＬリガンド、例えばＴＰＯの存在下で低減される。いくつかの実施形態では、多重特異性分子は、ＴＰＯのＭＰＬへの結合を遮断する。
【０００９】
実施形態では、多重特異性分子は、単一のＭＰＬタンパク質（例えば、同じＭＰＬタンパク質）上の２つ以上のエピトープ（例えば、２つ以上の非重複エピトープ）に結合する。
【００１０】
一実施形態では、多重特異性分子は、２つのＭＰＬ標的化部分、例えば、ＭＰＬタンパク質の細胞外ドメイン上の第１のエピトープに結合する第１のＭＰＬ標的化部分、および同じＭＰＬタンパク質の細胞外ドメイン上の第２のエピトープに結合する第２のＭＰＬ標的化部分を含む。いくつかの実施形態では、第１および第２のエピトープは異なる。いくつかの実施形態では、２つのＭＰＬ標的化部分、例えば、第１および第２のＭＰＬ標的化部分は、ＭＰＬタンパク質の細胞外ドメイン上の異なるエピトープに結合する。一実施形態では、多重特異性分子は、同じＭＰＬタンパク質上の２つの異なるエピトープ（例えば、非重複エピトープ）に結合し、例えば、二重パラトープ分子であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、多重特異性分子は、２つの結合特異性または機能を含み、例えば、それは二重特異性または二機能性分子である。
【００１１】
本明細書に開示される多重特異性分子のいずれかのいくつかの実施形態では、第１および第２のＭＰＬ標的化部分のＭＰＬに対する親和性、例えば合わせた親和性は、その対応する抗原結合部位に対する各標的化部分（単独または多重特異性分子の一部としてのいずれか）の親和性以上である。例えば、第１および第２のＭＰＬ標的化部分のＭＰＬに対する親和性、例えば合わせた親和性は、その対応する抗原結合部位に対する各標的化部分（単独または多重特異性分子の一部としてのいずれか）の親和性よりも少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、７５倍、または１００倍大きい。
【００１２】
前述の多重特異性分子のいずれかのさらに他の実施形態では、ＭＰＬタンパク質発現細胞、例えば、がん細胞または造血細胞に対する第１および第２のＭＰＬ標的化部分の親和性、例えば合わせた親和性は、第１のＭＰＬ標的化部分または第２のＭＰＬ標的化部分の一方のみを有する類似の多重特異性または多機能性分子の親和性以上である。例えば、ＭＰＬタンパク質発現細胞、例えばがん細胞または造血細胞に対する第１および第２のＭＰＬ標的化部分の親和性、例えば合わせた親和性は、第１のＭＰＬ標的化部分または第２のＭＰＬ標的化部分の一方のみを有する類似の多重特異性または多機能性分子の親和性よりも少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、７５倍、または１００倍大きい。
【００１３】
前述の多重特異性分子のいずれかのさらに他の実施形態では、ＭＰＬタンパク質発現細胞、例えばがん細胞または造血細胞に対する第１および第２のＭＰＬ標的化部分の親和性、例えば合わせた親和性は、ＭＰＬタンパク質発現細胞、例えばがん細胞または造血細胞に対するリガンド、例えばＭＰＬタンパク質の天然リガンド（例えばＴＰＯ）の親和性以上である。例えば、ＭＰＬタンパク質発現細胞、例えばがん細胞または造血細胞に対する第１および第２のＭＰＬ標的化部分の親和性、例えば合わせた親和性は、ＭＰＬタンパク質発現細胞、例えばがん細胞または造血細胞に対するリガンド、例えばＭＰＬタンパク質の天然リガンド（例えばＴＰＯ）の親和性よりも少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、７５倍、または１００倍大きい。
【００１４】
他の実施形態では、多重特異性分子は、単一のＭＰＬ標的化部分、例えば、ＭＰＬに対するハーフアーム抗体を含む。いくつかの実施形態では、多重特異性分子は、免疫グロブリン定常ドメイン（例えば、第１のＦｃ定常領域（例えば、第１のＣＨ２−ＣＨ３））に結合、例えば融合したＦａｂを含む。場合により、ハーフアーム抗体は、第２の免疫グロブリン定常ドメイン、例えば第２の重鎖定常領域、例えば第２のＦｃ定常領域、例えば第２のＣＨ２−ＣＨ３に二量体化（例えばホモまたはヘテロ二量体化）される。
【００１５】
いっくつかの実施形態では、多重特異性分子は、約１０ｎＭ未満、より典型的には１０〜１００ｐＭの解離定数でＭＰＬ抗原に結合するＭＰＬ標的化抗体分子を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、多重特異性分子は、ＭＰＬ抗原上の立体構造または線状エピトープに結合するＭＰＬ標的化抗体分子を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、多重特異性分子は、単一特異性抗体分子、二重特異性抗体分子、または三重特異性抗体分子であるＭＰＬ標的化抗体分子を含む。
【００１８】
いくつかの実施形態では、多重特異性分子は、一価の抗体分子、二価の抗体分子、または三価の抗体分子であるＭＰＬ標的化抗体分子を含む。
【００１９】
いくつかの実施形態では、多重特異性分子は、例えば同じＭＰＬ分子上の２つまたは３つの異なるエピトープに結合する、二重パラトープ抗体分子または三重パラトープ抗体分子であるＭＰＬ標的化抗体分子を含む。
【００２０】
いくつかの実施形態では、ＭＰＬ標的化抗体分子は、全長抗体（例えば、少なくとも１つ、好ましくは２つの完全な重鎖、および少なくとも１つ、好ましくは２つの完全な軽鎖を含む抗体）、または抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ‘）２、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ、単一ドメイン抗体、ハーフアーム抗体、ダイアボディ（ｄＡｂ）、二価の抗体、一価の抗体、または二重特異性抗体もしくはその断片、その単一ドメイン変異型、またはラクダ科抗体）である。
【００２１】
いくつかの実施形態では、多重特異性分子、例えばＭＰＬ標的化抗体分子は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４、またはそれらの断片から選択される重鎖定常領域を含む。
【００２２】
いくつかの実施形態では、多重特異性分子、例えばＭＰＬ標的化抗体分子は、カッパもしくはラムダの軽鎖定常領域、またはそれらの断片から選択される軽鎖定常領域を含む。
【００２３】
いくつかの実施形態では、多重特異性分子は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４の重鎖定常領域、より具体的にはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４の重鎖定常領域から選択される免疫グロブリン定常領域（例えばＦｃ領域）をさらに含む。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン定常領域（例えばＦｃ領域）は、ＭＰＬ標的化部分に結合、例えば共有結合される。
【００２４】
いくつかの実施形態では、免疫グロブリン定常領域（例えばＦｃ領域）は、２つのＭＰＬ標的化部分、例えば非重複抗原結合部位を有するＭＰＬ標的化部分に結合、例えば共有結合される。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン鎖定常領域（例えばＦｃ領域）は、Ｆｃ受容体結合、抗体グリコシル化、システイン残基の数、エフェクター細胞機能、または補体機能のうちの１つ以上を増加または減少させるように操作、例えば突然変異される。
【００２５】
いくつかの実施形態では、多重特異性分子は、カッパもしくはラムダの軽鎖定常領域、またはそれらの断片から選択される軽鎖定常領域を含むＭＰＬ標的化部分を含む。
【００２６】
いくつかの実施形態では、多重特異性分子は、第１のＭＰＬ標的化部分および第２のＭＰＬ標的化部分を含み、この第１のＭＰＬ標的化部分は、カッパ軽鎖定常領域またはその断片を含み、第２のＭＰＬ標的化部分は、ラムダ軽鎖定常領域、またはその断片を含む。
【００２７】
いくつかの実施形態では、多重特異性分子は、第１のＭＰＬ部分および第２のＭＰＬ標的化部分を含み、この第１のＭＰＬ標的化部分および第２のＭＰＬ標的化部分は、共通の軽鎖可変領域を含む。
【００２８】
いくつかの実施形態では、多重特異性分子は、二量体化ドメイン、例えば、第１および第２の免疫グロブリン鎖定常領域（例えばＦｃ領域）の界面を含む。実施形態では、二量体化ドメインは、例えば、操作されていない界面と比べて二量体化を増加または減少させるように操作、例えば突然変異される。実施形態では、二量体化ドメインは、例えば、操作されていない界面と比べて二量体化を増加させるように操作、例えば突然変異される。
【００２９】
いくつかの実施形態では、免疫グロブリン鎖定常領域（例えばＦｃ領域）の二量体化は、例えば操作されていない界面と比べて、ヘテロ多量体：ホモ多量体の比が大きくなるように、空洞−突起の対合（「ノブ・イン・ホール」）、静電相互作用、または鎖交換のうちの１つ以上で、第１および第２のＦｃ領域のＦｃ界面を提供することにより増強される。
【００３０】
いくつかの実施形態では、免疫グロブリン鎖定常領域（例えばＦｃ領域）は、例えばヒトＩｇＧ１のＦｃ領域の３４７、３４９、３５０、３５１、３６６、３６８、３７０、３９２、３９４、３９５、３９７、３９８、３９９、４０５、４０７、または４０９のうちの１つ以上から選択される位置にアミノ酸置換を含む。
【００３１】
いくつかの実施形態では、免疫グロブリン鎖定常領域（例えばＦｃ領域）は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、またはＹ４０７Ｖ（例えば空洞またはホールに対応）、もしくはＴ３６６Ｗ（例えば突起またはノブに対応）、またはそれらの組み合わせから選択されるアミノ酸置換を含む。
【００３２】
いくつかの実施形態では、多重特異性分子は、少なくとも２つ、例えば少なくとも２つ、３つ、または４つの非隣接ポリペプチド鎖を含む。いくつかの実施形態では、多重特異性または多機能性ＭＰＬアンタゴニスト分子は、２つの非隣接ポリペプチド鎖を含む。いくつかの実施形態では、多重特異性または多機能性ＭＰＬアンタゴニスト分子は、３つの非隣接ポリペプチド鎖を含む。いくつかの実施形態では、多重特異性または多機能性ＭＰＬアンタゴニスト分子は、４つの非隣接ポリペプチド鎖を含む。
【００３３】
いくつかの実施形態では、多重特異性分子は、以下の非隣接ポリペプチド：
ｉ）例えば、Ｎ−からＣ−の配向で、ＭＰＬ標的化部分、例えばＭＰＬ抗原に結合する例えば抗体分子（例えば第１の抗原ドメインの第１の部分、例えばＦａｂ分子の第１のＶＨ−ＣＨ１）、および場合により、第１と第３のポリペプチドとの会合を促進するドメイン、例えばＦｃ分子を含む、第１のポリペプチドと、
ｉｉ）例えば、Ｎ−からＣ−の配向で、ＭＰＬ標的化部分、例えばＭＰＬ抗原（例えば第１のＶＨ−ＣＨ１により結合される同じ抗原）に結合する例えば抗体分子（例えば第１の抗原ドメインの第２の部分、例えばＦａｂ分子の第１のＶＬ−ＣＬ）を含む、第２のポリペプチドと、
ｉｉｉ）例えば、Ｎ−からＣ−の配向で、ＭＰＬ標的化部分、例えばＭＰＬ抗原に結合する例えば抗体分子（例えば第２の抗原ドメインの第１の部分、例えばＦａｂ分子の第１のＶＨ−ＣＨ１）、および場合により、第１と第３のポリペプチドとの会合を促進するドメイン、例えばＦｃ分子を含む、第３のポリペプチドと、
ｉｖ）例えば、Ｎ−からＣ−の配向で、ＭＰＬ標的化部分、例えばＭＰＬ抗原（例えば第２のＶＨ−ＣＨ１により結合される同じ抗原に結合する例えば抗体分子（例えば第２の抗原ドメインの第２の部分、例えばＦａｂ分子の第１のＶＬ−ＣＬ）を含む、第４のポリペプチドと、を含む。
【００３４】
いくつかの実施形態では、多重特異性分子は、以下の非隣接ポリペプチド：
ｉ）例えば、Ｎ−からＣ−の配向で、ＭＰＬ標的化部分、例えばＭＰＬ抗原に結合する例えば抗体分子（例えば第１の抗原ドメインの第１の部分、例えばｓｃＦｖ分子の第１のＶＨ）、および例えばＭＰＬ抗原（例えば第１のＶＨにより結合される同じ抗原）に同様に結合する第１の抗原ドメインの第２部分、例えばｓｃＦｖ分子の第１のＶＬ）、ならびに場合により、第１と第２のポリペプチドとの会合を促進するドメイン、例えばＦｃ分子を含む、第１のポリペプチドと、
ｉｉ）例えば、Ｎ−からＣ−の配向で、ＭＰＬ標的化部分、例えばＭＰＬ抗原に結合する例えば抗体分子（例えば第２の抗原ドメインの第２の部分、例えばｓｃＦｖ分子の第２のＶＨ）、および例えばＭＰＬ抗原（例えば第２のＶＨにより結合される同じ抗原）に同様に結合する第２の抗原ドメインの第２部分、例えばｓｃＦｖ分子の第２のＶＬ）、ならびに場合により、第１と第２のポリペプチドとの会合を促進するドメイン、例えばＦｃ分子を含む、第２のポリペプチドと、を含む。
【００３５】
いくつかの実施形態では、多重特異性分子は、以下の非隣接ポリペプチド：
ｉ）例えば、Ｎ−からＣ−の配向で、ＭＰＬ標的化部分、例えばＭＰＬ抗原に結合する例えば抗体分子（例えば第１の抗原ドメインの第１の部分、例えばＦａｂ分子の第１のＶＨ−ＣＨ１）、および場合により、第１と第３のポリペプチドとの会合を促進するドメイン、例えばＦｃ分子を含む、第１のポリペプチドと、
ｉｉ）例えば、Ｎ−からＣ−の配向で、ＭＰＬ標的化部分、例えばＭＰＬ抗原（例えば第１のＶＨ−ＣＨ１により結合される同じ抗原）に結合する例えば抗体分子（例えば第１の抗原ドメインの第２の部分、例えばＦａｂ分子の第１のＶＬ−ＣＬ）を含む、第２のポリペプチドと、
ｉｉｉ）例えば、Ｎ−からＣ−の配向で、第１と第３のポリペプチドとの会合を促進するドメイン、例えばＦｃ分子を含む、第３のポリペプチドと、を含む。
【００３６】
いくつかの実施形態では、多重特異性分子は、以下の非隣接ポリペプチド：
ｉ）例えば、Ｎ−からＣ−の配向で、ＭＰＬ標的化部分、例えばＭＰＬ抗原に結合する例えば抗体分子（例えば第１の抗原ドメインの第１の部分、例えばｓｃＦｖ分子の第１のＶＨ）、および例えばＭＰＬ抗原（例えば第１のＶＨにより結合される同じ抗原）に同様に結合する第１の抗原ドメインの第２部分、例えばｓｃＦｖ分子の第１のＶＬ）、ならびに場合により、第１と第２のポリペプチドとの会合を促進するドメイン、例えばＦｃ分子を含む、第１のポリペプチドを含む。
【００３７】
一態様では、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインを含む多重特異性分子が本明細書に開示され、この第１および第２の抗原結合ドメインは、単一のＭＰＬタンパク質上の異なるエピトープに結合し（例えば、非重複エピトープに結合する）、第１の抗原結合ドメインは、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含み、第２の抗原結合ドメインは、第３のポリペプチドおよび第４のポリペプチドを含み、
ａ）第１のポリペプチドは、例えば、Ｎ−からＣ−の配向で、第１の重鎖可変領域（ＶＨ）、第１の重鎖定常領域１（ＣＨ１）、および場合により、第１と第３のポリペプチドとの会合を促進する第１の領域、例えば第１のＦｃ領域（例えば第１のＣＨ２−ＣＨ３）を含み、
ｂ）第２のポリペプチドは、例えば、Ｎ−からＣ−の配向で、第１の軽鎖可変領域（ＶＬ）および第１の軽鎖定常領域（ＣＬ）を含み、
ｃ）第３のポリペプチドは、例えば、Ｎ−からＣ−の配向で、第２の重鎖可変領域（ＶＨ）、第２の重鎖定常領域１（ＣＨ１）、および場合により、第１と第３のポリペプチドとの会合を促進する第２の領域、例えば第２のＦｃ領域（例えば第２のＣＨ２−ＣＨ３）を含み、
ｄ）第４のポリペプチドは、例えば、Ｎ−からＣ−の配向で、第２の軽鎖可変領域（ＶＬ）および第２の軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む。
【００３８】
一態様では、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインを含む多重特異性分子が本明細書に開示され、この第１の抗原結合ドメインはＭＰＬに結合し、第２の抗原結合ドメインは、ＭＰＬ以外の抗原、例えばＭＰＬ以外の腫瘍抗原に結合し、第１の抗原結合ドメインは、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含み、第２の抗原結合ドメインは、第３のポリペプチドおよび第４のポリペプチドを含み、
ａ）第１のポリペプチドは、例えば、Ｎ−からＣ−の配向で、第１の重鎖可変領域（ＶＨ）、第１の重鎖定常領域１（ＣＨ１）、および場合により、第１と第３のポリペプチドとの会合を促進する第１の領域、例えば第１のＦｃ領域（例えば第１のＣＨ２−ＣＨ３）を含み、
ｂ）第２のポリペプチドは、例えば、Ｎ−からＣ−の配向で、第１の軽鎖可変領域（ＶＬ）および第１の軽鎖定常領域（ＣＬ）を含み、
ｃ）第３のポリペプチドは、例えば、Ｎ−からＣ−の配向で、第２の重鎖可変領域（ＶＨ）、第２の重鎖定常領域１（ＣＨ１）、および場合により、第１と第３のポリペプチドとの会合を促進する第２の領域、例えば第２のＦｃ領域（例えば第２のＣＨ２−ＣＨ３）を含み、
ｄ）第４のポリペプチドは、例えば、Ｎ−からＣ−の配向で、第２の軽鎖可変領域（ＶＬ）および第２の軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む。
【００３９】
一態様では、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインを含む多重特異性分子が本明細書に開示され、この第１および第２の抗原結合ドメインは、単一のＭＰＬタンパク質上の異なるエピトープに結合し（例えば、非重複エピトープに結合する）、第１の抗原結合ドメインは、第１のポリペプチドを含み、第２の抗原結合ドメインは、第２のポリペプチドを含み、
ａ）第１のポリペプチドは、例えば、Ｎ−からＣ−の配向で、第１の重鎖可変領域（ＶＨ）および第１の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む第１のｓｃＦｖ領域、ならびに場合により、第１と第２のポリペプチドとの会合を促進する第１の領域、例えば第１のＦｃ領域（例えば第１のＣＨ２−ＣＨ３）を含み、
ｂ）第２のポリペプチドは、例えば、Ｎ−からＣ−の配向で、第２のＶＨおよび第２のＶＬを含む第２のｓｃＦｖ領域、ならびに場合により、第１と第２のポリペプチドとの会合を促進する第２の領域、例えば第２のＦｃ領域（例えば第２のＣＨ２−ＣＨ３）を含む。
【００４０】
一態様では、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインを含む多重特異性分子が本明細書に開示され、この第１の抗原結合ドメインはＭＰＬに結合し、第２の抗原結合ドメインは、ＭＰＬ以外の抗原、例えばＭＰＬ以外の腫瘍抗原に結合し、第１の抗原結合ドメインは、第１のポリペプチド含み、第２の抗原結合ドメインは、第２のポリペプチドを含み、
ａ）第１のポリペプチドは、例えば、Ｎ−からＣ−の配向で、第１の重鎖可変領域（ＶＨ）および第１の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む第１のｓｃＦｖ領域、ならびに場合により、第１と第２のポリペプチドとの会合を促進する第１の領域、例えば第１のＦｃ領域（例えば第１のＣＨ２−ＣＨ３）を含み、
ｂ）第２のポリペプチドは、例えば、Ｎ−からＣ−の配向で、第２のＶＨおよび第２のＶＬを含む第２のｓｃＦｖ領域、ならびに場合により、第１と第２のポリペプチドとの会合を促進する第２の領域、例えば第２のＦｃ領域（例えば第２のＣＨ２−ＣＨ３）を含む。
【００４１】
一態様では、
ｉ）第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含む単一のＭＰＬ標的化部分と、
ｉｉ）第３のポリペプチドと、を含み、
ａ）第１のポリペプチドが、例えば、Ｎ−からＣ−の配向で、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域１（ＣＨ１）、ならびに場合により、第１と第３のポリペプチドとの会合を促進する第１の領域、例えば第１のＦｃ領域（例えば第１のＣＨ２−ＣＨ３）を含み、
ｂ）第２のポリペプチドが、例えば、Ｎ−からＣ−の配向で、軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）を含み、
c）第３のポリペプチドが、例えば、Ｎ−からＣ−の配向で、第１と第３のポリペプチドとの会合を促進する第２の領域、例えば第２のＦｃ領域（例えば第２のＣＨ２−ＣＨ３）を含むＭＰＬ結合分子が本明細書に開示される。
【００４２】
一態様では、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むｓｃＦｖを含む単一のＭＰＬ標的化部分を含む、ＭＰＬ結合分子が開示され、
ｉ）ＭＰＬ結合分子は、免疫グロブリン定常ドメイン、例えばＦｃ定常領域、例えばＣＨ２−ＣＨ３をさらに含み、かつ／または
ｉｉ）ＭＰＬ結合分子は、ＭＰＬ活性を低減、例えば阻害する。
【００４３】
一態様では、野生型ＪＡＫ２に関連するＭＰＬよりも、突然変異したＪＡＫ２（例えば、Ｖ６１７Ｆ突然変異を含むＪＡＫ２）に関連するＭＰＬに優先的に結合する、多重特異性分子またはＭＰＬ結合分子が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、多重特異性分子またはＭＰＬ結合分子は、多重特異性分子またはＭＰＬ結合分子が野生型ＪＡＫ２に関連するＭＰＬに結合する場合よりも大きい親和性、例えば、少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、７５倍、または１００倍大きい親和性で突然変異したＪＡＫ２（例えば、Ｖ６１７Ｆ突然変異を含むＪＡＫ２）に関連するＭＰＬに結合する。いくつかの実施形態では、多重特異性分子またはＭＰＬ結合分子は、ＭＰＬが突然変異したＪＡＫ２（例えば、Ｖ６１７Ｆ変突然異を含むＪＡＫ２）と関連する場合にＭＰＬにのみ存在するエピトープに結合するが、ＭＰＬが野生型ＪＡＫ２と関連する場合には結合しない。
【００４４】
例示的なＭＰＬ標的化部分
一実施形態では、ＭＰＬ標的化部分は、ＭＰＬに結合する抗体分子（例えばＦａｂまたはｓｃＦｖ）を含む。いくつかの実施形態では、ＭＰＬに対する抗体分子は、表１の重鎖可変ドメイン配列のいずれかに由来する１つ、２つ、もしくは３つのＣＤＲ、または密接に関連するＣＤＲ、例えば、表１の重鎖可変ドメイン配列のいずれかのＣＤＲ配列のいずれかに由来する、少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、２つ、３つ、もしくは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、ＭＰＬに対する抗体分子は、表１の重鎖可変ドメインアミノ酸配列のいずれかから選択される重鎖可変ドメイン配列、またはそれと実質的に同一（例えば、それと９５％〜９９．９％同一）の、もしくは少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、５、１０、または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるアミノ酸配列を含む。
【００４５】
あるいは、または本明細書に開示されるＭＰＬに対する重鎖と組み合わせて、ＭＰＬに対する抗体分子は、表１の軽鎖可変ドメイン配列のいずれかに由来する１つ、２つ、もしくは３つのＣＤＲ、または密接に関連するＣＤＲ、例えば、表１の軽鎖可変ドメイン配列のいずれかのＣＤＲ配列のいずれかに由来する、少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、２つ、３つ、もしくは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、ＭＰＬに対する抗体分子は、表１の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列のいずれかから選択される軽鎖可変ドメイン配列、またはそれと実質的に同一（例えば、それと９５％〜９９．９％同一）の、もしくは少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、５、１０、または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるアミノ酸配列を含む。
【００４６】
一実施形態では、ＭＰＬ標的化部分は、ＭＰＬに結合する抗体分子（例えばＦａｂまたはｓｃＦｖ）を含む。いくつかの実施形態では、ＭＰＬに対する抗体分子は、配列番号１の重鎖可変ドメイン配列（表１を参照されたい）に由来する１つ、２つ、もしくは３つのＣＤＲ、または密接に関連するＣＤＲ、例えば、配列番号１のＣＤＲ配列に由来する、少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、２つ、３つ、もしくは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるＣＤＲを含む。
【００４７】
実施形態では、ＭＰＬに対する抗体分子は、配列番号１の重鎖可変ドメイン配列、またはそれと実質的に同一（例えば、それと９５％〜９９．９％同一）の、もしくは配列番号１のアミノ酸配列に対して、少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、５、１０、または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるアミノ酸配列を含む。
【００４８】
実施形態では、ＭＰＬに対する抗体分子はＦａｂであり、配列番号６９のアミノ酸配列（表２を参照されたい）、またはそれと実質的に同一（例えば、それと９５％〜９９．９％同一）の、もしくは配列番号６９のアミノ酸配列に対して、少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、５、１０、または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるアミノ酸配列を有する重鎖定常領域（ＣＨ１）をさらに含む。
【００４９】
あるいは、または本明細書に開示されるＭＰＬに対する重鎖と組み合わせて、ＭＰＬに対する抗体分子は、配列番号２の軽鎖可変ドメイン配列（表１を参照されたい）に由来する１つ、２つ、もしくは３つのＣＤＲ、または密接に関連するＣＤＲ、例えば、配列番号２のＣＤＲ配列に由来する、少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、２つ、３つ、もしくは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるＣＤＲを含む。
【００５０】
いくつかの実施形態では、ＭＰＬに対する抗体分子は、配列番号２の軽鎖可変ドメイン配列、またはそれと実質的に同一（例えば、それと９５％〜９９．９％同一）の、もしくは配列番号２のアミノ酸配列に対して、少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、５、１０、または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるアミノ酸配列を含む。
【００５１】
いくつかの実施形態では、ＭＰＬに対する抗体分子はＦａｂであり、アミノ酸配列の配列番号７０（表２を参照されたい）、またはそれと実質的に同一（例えば、それと９５％〜９９．９％同一）の、もしくは配列番号７０のアミノ酸配列に対して、少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、５、１０、または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域（ＣＬ（カッパ））をさらに含む。
【００５２】
いくつかの実施形態では、ＭＰＬに対する抗体分子はＦａｂであり、配列番号７１のアミノ酸配列（表２を参照されたい）、またはそれと実質的に同一（例えば、それと９５％〜９９．９％同一）の、もしくは配列番号７１のアミノ酸配列に対して、少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、５、１０、または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域（ＣＬ（ラムダ））をさらに含む。
【００５３】
他の実施形態では、ＭＰＬに対する抗体分子は、表１に示される可変ドメインの対のいずれか、例えば、同じ抗体分子に由来する可変重および可変軽ドメイン、例えば、配列番号３の可変重ドメインおよび配列番号４の可変軽ドメインの、重鎖可変ドメインに由来する１つ、２つ、もしくは３つのＣＤＲ、および軽鎖可変ドメイン配列に由来する１つ、２つ、もしくは３つのＣＤＲを含む。
【００５４】
実施形態では、ＭＰＬに対する抗体分子は、配列番号３の重鎖可変ドメイン配列、またはそれと実質的に同一（例えば、９５％〜９９．９％同一）の、もしくは配列番号３のアミノ酸配列に対して、少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、５、１０、または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるアミノ酸配列、および配列番号４の軽鎖可変ドメイン配列、またはそれと実質的に同一（例えば、９５％〜９９．９％同一）の、もしくは配列番号４のアミノ酸配列に対して、少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、５、１０、または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるアミノ酸配列を含む。
【００５５】
実施形態では、ＭＰＬに対する抗体分子は、配列番号４９の配列、またはそれと実質的に同一（例えば、それと９５％〜９９．９％同一）の、もしくは配列番号４９のアミノ酸配列に対して、少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、５、１０、または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるアミノ酸配列を含む単鎖Ｆｖである。
【００５６】
実施形態では、抗体分子は、
（ｉ）配列番号６９のアミノ酸配列（表２を参照されたい）、またはそれと実質的に同一（例えば、それと９５％〜９９．９％同一）の、もしくは配列番号６９のアミノ酸配列に対して、少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、５、１０、または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるアミノ酸配列を有する、重鎖定常領域（ＣＨ１）、
（ｉｉ）配列番号７０のアミノ酸配列（表２を参照されたい）、またはそれと実質的に同一（例えば、それと９５％〜９９．９％同一）の、もしくは配列番号７０のアミノ酸配列に対して、少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、５、１０、または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるアミノ酸配列を有する、軽鎖定常領域（ＣＬ（カッパ））、あるいは
（ｉｉｉ）配列番号７１のアミノ酸配列（表２を参照されたい）、またはそれと実質的に同一（例えば、それと９５％〜９９．９％同一）の、もしくは配列番号７１のアミノ酸配列に対して、少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、５、１０、または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるアミノ酸配列を有する、軽鎖定常領域（ＣＬ（ラムダ））をさらに含む。
【００５７】
実施形態では、ＭＰＬに対する抗体分子は、配列番号５０〜５６のいずれか、またはそれと実質的に同一（例えば、それと９５％〜９９．９％同一）の、もしくは配列番号５０〜５６のアミノ酸配列に対して、少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、５、１０、または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるアミノ酸配列を含む単鎖Ｆｖである。
【００５８】
ＭＰＬおよびホスファターゼに結合する多重特異性分子
ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の調節解除は、骨髄線維症を含むいくつかの血液腫瘍における腫瘍発生の主要なメディエーターである。ＣＤ４５はＭＰＬの下流のＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路を負に調節する。一態様では、本発明は、ＣＤ４５とＭＰＬとを同時ライゲートする多重特異性分子（例えば、ＭＰＬに結合する第１の標的化部分およびＣＤ４５に結合する第２の標的化部分を含む多重特異性分子）を開示する。理論に拘束されることを望むものではないが、そのような多重特異性分子は、ＭＰＬ細胞内ドメインの内側に固定されたＪＡＫ２キナーゼの脱リン酸化を増強し、したがって、悪性細胞のＭＰＬ／ＪＡＫ２経路を下方調節する。
【００５９】
一態様では、ＭＰＬに結合する第１の標的化部分、およびホスファターゼ、例えばタンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）、例えば受容体タンパク質チロシンホスファターゼ（ＲＰＴＰ）に結合する第２の標的化部分を含む多重特異性分子が本明細書に開示される。一実施形態では、ホスファターゼおよびＭＰＬは、同じ細胞、例えば骨髄線維症細胞で発現される。
【００６０】
一実施形態では、ホスファターゼ（例えば受容体タンパク質チロシンホスファターゼ（ＲＰＴＰ））は、ＭＰＬ／ＪＡＫ２経路を調節することができる。一実施形態では、ホスファターゼは、ＭＰＬまたはＭＰＬと直接的または間接的に相互作用する分子（例えば、ＭＰＬと直接的または間接的に相互作用するチロシンキナーゼ、例えばＪＡＫ２またはＳｒｃ）を脱リン酸化することができる。理論に拘束されることを望むものではないが、ホスファターゼ（例えばタンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）、例えば受容体タンパク質チロシンホスファターゼ（ＲＰＴＰ）、例えば、ＣＤ４５、ＣＤ１４８、またはＬＡＲ）が本明細書に開示される多重特異性分子によりＭＰＬに近接する場合、ホスファターゼは、ＭＰＬまたはＭＰＬと直接的または間接的に相互作用する分子（例えば、ＭＰＬと直接的または間接的に相互作用するチロシンキナーゼ、例えばＪＡＫ２またはＳｒｃ）を脱リン酸化し、それにより、下流シグナル伝達経路を負に調節する。
【００６１】
一実施形態では、ホスファターゼは、ＣＤ４５、ＲＰＴＰμ、ＲＰＴＰκ、ＲＰＴＰρ、ＲＰＴＰ
【化１】
2020522254.tif 000002
、白血球抗原関連チロシンホスファターゼ（ＬＡＲ）、ＲＰＴＰσ、ＲＰＴＰδ、ＲＰＴＰβ、ＣＤ１４８、ＳＡＰ１、ＲＰＴＰＯ、ＲＰＴＰＱ／ＰＴＰＳ３１、ＲＰＴＰα、ＲＰＴＰε、ＲＰＴＰζ、ＲＰＴＰγ、ＰＣ−ＰＴＰ、ＩＡ２、およびＩＡ２βからなる群から選択される。一実施形態では、ホスファターゼはＣＤ４５である。一実施形態では、ホスファターゼはＣＤ１４８である。一実施形態では、ホスファターゼは白血球抗原関連チロシンホスファターゼ（ＬＡＲ）である。
【００６２】
一実施形態では、第２の標的化部分はＣＤ４５の細胞外ドメインに結合する。一実施形態では、第２の標的化部分は、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４５ＲＣ、ＣＤ４５ＲＡＢ、ＣＤ４５ＲＡＣ、ＣＤ４５ＲＢＣ、ＣＤ４５ＲＯ、またはＣＤ４５Ｒ（ＡＢＣ）のうちの１つ以上に結合する。一実施形態では、第２の標的化部分は、１つのＣＤ４５アイソフォームに特異的に結合する。一実施形態では、第２の標的化部分は、２つ以上のＣＤ４５アイソフォームに結合する。一実施形態では、第２の標的化部分は、全てのＣＤ４５アイソフォームに結合する。一実施形態では、第２の標的化部分は、骨髄線維症細胞で発現されるＣＤ４５アイソフォームに結合する。一実施形態では、第２の標的化部分は、ＭＰＬと同じ細胞により発現されるＣＤ４５アイソフォームに結合する。
【００６３】
一実施形態では、ＭＰＬに結合する第１の標的化部分は、
（ｉ）表１の重鎖可変ドメイン配列のいずれかに由来する１つ、２つ、もしくは３つのＣＤＲ、または密接に関連するＣＤＲ、例えば、表１の重鎖可変ドメイン配列のいずれかのＣＤＲ配列のいずれかに由来する、少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、２つ、３つ、もしくは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるＣＤＲ、
（ｉｉ）表１の重鎖可変ドメインアミノ酸配列のいずれかから選択される重鎖可変ドメイン配列、またはそれと実質的に同一（例えば、それと９５％〜９９．９％同一）の、もしくは少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、５、１０、または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）表１の軽鎖可変ドメイン配列のいずれかに由来する１つ、２つ、もしくは３つのＣＤＲ、または密接に関連するＣＤＲ、例えば、表１の軽鎖可変ドメイン配列のいずれかのＣＤＲ配列のいずれかに由来する、少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、２つ、３つ、もしくは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるＣＤＲ、あるいは
（ｉｖ）表１の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列のいずれかから選択される軽鎖可変ドメイン配列、またはそれと実質的に同一（例えば、それと９５％〜９９．９％同一）の、もしくは少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、５、１０、または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるアミノ酸配列を含む。
【００６４】
一実施形態では、ホスファターゼに結合する第２の標的化部分はＣＤ４５に結合し、第２の標的化部分は、
（ｉ）表３の重鎖可変ドメイン配列のいずれかに由来する１つ、２つ、もしくは３つのＣＤＲ、または密接に関連するＣＤＲ、例えば、表３の重鎖可変ドメイン配列のいずれかのＣＤＲ配列のいずれかに由来する、少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、２つ、３つ、もしくは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるＣＤＲ、
（ｉｉ）表３の重鎖可変ドメインアミノ酸配列のいずれかから選択される重鎖可変ドメイン配列、またはそれと実質的に同一（例えば、それと９５％〜９９．９％同一）の、もしくは少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、５、１０、または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）表３の軽鎖可変ドメイン配列のいずれかに由来する１つ、２つ、もしくは３つのＣＤＲ、または密接に関連するＣＤＲ、例えば、表３の軽鎖可変ドメイン配列のいずれかのＣＤＲ配列のいずれかに由来する、少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、２つ、３つ、もしくは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるＣＤＲ、あるいは
（ｉｖ）表３の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列のいずれかから選択される軽鎖可変ドメイン配列、またはそれと実質的に同一（例えば、それと９５％〜９９．９％同一）の、もしくは少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、５、１０、または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるアミノ酸配列を含む。
【００６５】
一実施形態では、ホスファターゼに結合する第２の標的化部分はＣＤ１４８に結合し、第２の標的化部分は、
（ｉ）表４の重鎖可変ドメイン配列のいずれかに由来する１つ、２つ、もしくは３つのＣＤＲ、または密接に関連するＣＤＲ、例えば、表４の重鎖可変ドメイン配列のいずれかのＣＤＲ配列のいずれかに由来する、少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、２つ、３つ、もしくは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるＣＤＲ、
（ｉｉ）表４の重鎖可変ドメインアミノ酸配列のいずれかから選択される重鎖可変ドメイン配列、またはそれと実質的に同一（例えば、それと９５％〜９９．９％同一）の、もしくは少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、５、１０、または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）表４の軽鎖可変ドメイン配列のいずれかに由来する１つ、２つ、もしくは３つのＣＤＲ、または密接に関連するＣＤＲ、例えば、表４の軽鎖可変ドメイン配列のいずれかのＣＤＲ配列のいずれかに由来する、少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、２つ、３つ、もしくは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるＣＤＲ、あるいは
（ｉｖ）表４の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列のいずれかから選択される軽鎖可変ドメイン配列、またはそれと実質的に同一（例えば、それと９５％〜９９．９％同一）の、もしくは少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、５、１０、または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるアミノ酸配列を含む。
【００６６】
一実施形態では、ホスファターゼに結合する第２の標的化部分はＬＡＲに結合し、第２の標的化部分は、
（ｉ）表５の重鎖可変ドメイン配列のいずれかに由来する１つ、２つ、もしくは３つのＣＤＲ、または密接に関連するＣＤＲ、例えば、表５の重鎖可変ドメイン配列のいずれかのＣＤＲ配列のいずれかに由来する、少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、２つ、３つ、もしくは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるＣＤＲ、
（ｉｉ）表５の重鎖可変ドメインアミノ酸配列のいずれかから選択される重鎖可変ドメイン配列、またはそれと実質的に同一（例えば、それと９５％〜９９．９％同一）の、もしくは少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、５、１０、または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）表５の軽鎖可変ドメイン配列のいずれかに由来する１つ、２つ、もしくは３つのＣＤＲ、または密接に関連するＣＤＲ、例えば、表５の軽鎖可変ドメイン配列のいずれかのＣＤＲ配列のいずれかに由来する、少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、２つ、３つ、もしくは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるＣＤＲ、あるいは
（ｉｖ）表５の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列のいずれかから選択される軽鎖可変ドメイン配列、またはそれと実質的に同一（例えば、それと９５％〜９９．９％同一）の、もしくは少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、５、１０、または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるアミノ酸配列を含む。
【００６７】
追加の部分
本明細書に開示される多重特異性分子は、免疫細胞エンゲージャー、サイトカイン分子、サイトカインアンタゴニスト、例えばＴＧＦ−βアンタゴニスト、間質修飾因子、酵素、毒素、標識剤、または腫瘍標的化分子（例えば、ＭＰＬ以外の腫瘍標的を標的とする第２の腫瘍標的化分子）のうちの１つ以上をさらに含み得る。
【００６８】
一態様では、
（ｉ）２つのＭＰＬ標的化部分、例えば、ＭＰＬタンパク質の細胞外ドメイン上の第１のエピトープに結合する第１のＭＰＬ標的化部分、およびＭＰＬタンパク質の細胞外ドメイン上の第２のエピトープに結合する第２のＭＰＬ標的化部分（第１および第２のエピトープは重複しない）、ならびに
（ｉｉ）免疫細胞エンゲージャー、例えば、ＮＫ細胞エンゲージャー、Ｔ細胞エンゲージャー、Ｂ細胞エンゲージャー、樹状細胞エンゲージャー、もしくはマクロファージ細胞エンゲージャー、または例えば、少なくとも２つの非隣接ポリペプチドを含むサイトカイン分子（例えば多鎖サイトカイン）（例えば、サイトカイン分子は、２つの鎖、例えば、アルファおよびベータ鎖（例えばＩＬ−１２）を含む）、または腫瘍標的化分子（例えば、ＭＰＬ以外の腫瘍標的を標的とする第２の腫瘍標的分子）から選択される任意の２つまたはそれらの組み合わせを含む多重特異性分子が本明細書に提供される。
【００６９】
一態様では、
（ｉ）ＭＰＬに結合する第１の標的化部分、
（ｉｉ）ホスファターゼ、例えばタンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）、例えば受容体タンパク質チロシンホスファターゼ（ＲＰＴＰ）、例えば、ＣＤ４５、ＣＤ１４８、またはＬＡＲに結合する第２の標的化部分、および
（ｉｉｉ）免疫細胞エンゲージャー、例えばＴ細胞エンゲージャー、例えば抗ＣＤ３抗体分子を含む多重特異性分子が本明細書に提供される。
【００７０】
一態様では、
（ｉ）ＭＰＬに結合する第１の標的化部分、
（ｉｉ）ホスファターゼ、例えばタンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）、例えば受容体タンパク質チロシンホスファターゼ（ＲＰＴＰ）、例えば、ＣＤ４５、ＣＤ１４８、またはＬＡＲに結合する第２の標的化部分、および
（ｉｉｉ）ＴＧＦ−βアンタゴニスト、例えば、ＴＧＦβに結合することができるＴＧＦβ受容体、またはその機能的断片もしくは変異型、例えばＴＧＦβ受容体Ｉ型の細胞外ドメインまたはＴＧＦβ受容体ＩＩ型の細胞外ドメインを含むポリペプチドを含む多重特異性分子が本明細書に提供される。
【００７１】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストは、表６の任意のアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一（例えば、それと７５％、８−０％、８５％、９０％、９５％、または９９．９％同一）の、もしくは少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、５、１０、１５、または２０個以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存置換）であるアミノ酸配列を含む。
【００７２】
いくつかの実施形態では、免疫細胞エンゲージャーは、ＮＫ細胞への結合およびその活性化を媒介するＮＫ細胞エンゲージャーを含む。他の実施形態では、免疫細胞エンゲージャーは、ＮＫ細胞への結合を媒介するが、その活性化は媒介しないＮＫ細胞エンゲージャーを含む。例示的なＮＫ細胞エンゲージャーは、抗体分子、例えば、抗原結合ドメイン、またはＮＫｐ３０、ＮＫｐ４０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、ＤＮＡＭ１、ＤＡＰ１０、ＣＤ１６（例えば、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、またはその両方）、ＣＲＴＡＭ、ＣＤ２７、ＰＳＧＬ１、ＣＤ９６、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＮＫｐ８０、ＣＤ２４４（ＳＬＡＭＦ４または２Ｂ４とも呼ばれる）、ＳＬＡＭＦ６、ＳＬＡＭＦ７、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＫＩＲ３ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ５、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ｃ、NＫＧ２Ｅ、もしくはＣＤ１６０に結合（例えばそれらを活性化するリガンドから選択され得る。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞エンゲージャーは、抗体分子、例えばＮＫｐ３０またはＮＫｐ４６に結合する抗原結合ドメインである。
【００７３】
いくつかの実施形態では、免疫細胞エンゲージャーは、Ｔ細胞への結合およびその活性化を媒介するＴ細胞エンゲージャーを含む。他の実施形態では、免疫細胞エンゲージャーは、Ｔ細胞への結合を媒介するが、その活性化は媒介しないＴ細胞エンゲージャーを含む。
【００７４】
多重特異性分子の他の実施形態では、ＮＫ細胞エンゲージャーはリガンドであり、場合により、リガンドは免疫グロブリン定常領域、例えばＦｃ領域をさらに含む。例えば、ＮＫｐ４４またはＮＫｐ４６のリガンドはウイルスＨＡであり、ＤＡＰ１０のリガンドはＮＫＧ２Ｄの共受容体であり、ＣＤ１６のリガンドは、ＣＤ１６ａ／ｂリガンド、例えば抗体Ｆｃ領域をさらに含むＣＤ１６ａ／ｂリガンドである。
【００７５】
他の実施形態では、免疫細胞エンゲージャーは、Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、または樹状細胞のうちの１つ以上への結合、またはそれらの活性化、またはその両方を媒介する。
【００７６】
多重特異性分子の他の実施形態では、Ｔ細胞エンゲージャーは、ＣＤ３、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲζ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ４０、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＤＲ３、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＴＩＭ１、ＳＬＡＭ、ＣＤ２、またはＣＤ２２６のアゴニストである。他の実施形態では、Ｔ細胞エンゲージャーは、ＣＤ３、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲζ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ４０、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＤＲ３、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＴＩＭ１、ＳＬＡＭ、ＣＤ２、またはＣＤ２２６に結合するが、それらを活性化しない。
【００７７】
いくつかの実施形態では、免疫細胞エンゲージャーは、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）もしくはＣＤ７０リガンド、ＣＤ４０もしくはＣＤ７０に結合する抗体分子、ＯＸ４０に対する抗体分子、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）、Ｔｏｌｌ様受容体のアゴニスト（例えばＴＬＲ４、例えば構成的に活性なＴＬＲ４（ｃａＴＬＲ４）またはＴＬＲ９アゴニスト）、４１ＢＢ、ＣＤ２アゴニスト、ＣＤ４７、またはＳＴＩＮＧアゴニスト、またはそれらの組み合わせのうちの１つ以上から選択されるＢ細胞、マクロファージ、および／または樹状細胞エンゲージャーを含む。
【００７８】
いくつかの実施形態では、Ｂ細胞エンゲージャーは、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、もしくはＣＤ７０リガンド、またはＯＸ４０、ＣＤ４０、もしくはＣＤ７０に結合する抗体分子である。
【００７９】
他の実施形態では、マクロファージ細胞エンゲージャーは、ＣＤ２アゴニスト、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、ＯＸ４０、ＣＤ４０、もしくはＣＤ７０に結合する抗体分子、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）のアゴニスト（例えばＴＬＲ４、例えば構成的に活性なＴＬＲ４（ｃａＴＬＲ４）またはＴＬＲ９アゴニスト）、ＣＤ４７、またはＳＴＩＮＧアゴニストである。
【００８０】
さらに他の実施形態では、樹状細胞エンゲージャーは、ＣＤ２アゴニスト、ＯＸ４０抗体、ＯＸ４０Ｌ、４１ＢＢアゴニスト、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニストもしくはその断片（例えばＴＬＲ４、例えば構成的に活性なＴＬＲ４（ｃａＴＬＲ４））、ＣＤ４７アゴニスト、またはＳＴＩＮＧアゴニストである。例えば、ＳＴＩＮＧアゴニストは、環状ジヌクレオチド、例えば、環状ジＧＭＰ（ｃｄＧＭＰ）、環状ジＡＭＰ（ｃｄＡＭＰ）、またはそれらの組み合わせを、場合により２’，５’または３’，５’リン酸結合とともに含み得る。ＳＴＩＮＧアゴニストは、例えば既知の技法により、多重特異性または多機能性ＭＰＬアンタゴニスト分子に共有結合され得る。
【００８１】
他の実施形態では、多重特異性分子は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）、もしくはインターフェロンガンマ、またはそれらの断片もしくは変異型、または前述のサイトカインのいずれかの組み合わせから選択されるサイトカイン分子を含み得る。サイトカインは、単量体または二量体であり得る。例えば、サイトカイン分子は、受容体二量体化ドメイン、例えばＩＬ１５Ｒアルファ二量体化ドメインをさらに含み得る。他の実施形態では、サイトカイン分子（例えばＩＬ−１５）および受容体二量体化ドメイン（例えばＩＬ１５Ｒアルファ二量体化ドメイン）は共有結合されず、例えば、非共有結合される。
【００８２】
本明細書に開示される多重特異性分子のいずれかのいくつかの実施形態では、第２の腫瘍標的化部分、例えばＭＰＬ以外の標的を標的とする腫瘍標的化部分は、メソセリン、ＰＤＬ１、ＨＥＲ３、ＩＧＦ１Ｒ、ＦＡＰ、ＣＤ４７、またはＣＤ１２３から選択されるがん抗原に対する抗体分子から選択される。例えば、腫瘍標的化部分は、メソセリンまたはＰＤＬ１に結合する抗体分子（例えばＦａｂまたはｓｃＦｖ）を含み得る。いくつかの実施形態では、腫瘍標的化部分はＰＤＬ１に結合し、ＰＤＬ１とＰＤ１との相互作用を阻害する。他の実施形態では、腫瘍標的化部分はＰＤＬ１に結合し、ＰＤ  Ｌ１とＰＤ１との相互作用を阻害しない。
【００８３】
いくつかの実施形態では、多重特異性分子は、３つまたは４つの結合特異性または機能を含み、例えば三重特異性または四重特異性分子である。いくつかの実施形態では、多重特異性または多機能性分子は、（ｉ）少なくとも２つの腫瘍標的化部分、免疫細胞エンゲージャー、およびサイトカイン分子、（ｉｉ）腫瘍標的化部分、免疫細胞エンゲージャー、および間質修飾部分、あるいは（ｉｉｉ）ＭＰＬ、メソセリン、ＰＤＬ１、ＨＥＲ３、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、またはインスリン成長因子１Ｒ（ＩＧＦ１Ｒ）、ＣＤ４７もしくはＣＤ１２３から選択される２つのがん抗原に結合する少なくとも２つの腫瘍標的化部分（但し、２つのがん抗原はＦＡＰおよびＩＧＦ１Ｒではないことを条件とする）、ならびにサイトカイン分子を含む。
【００８４】
いくつかの実施形態では、免疫グロブリン定常領域（例えばＦｃ領域）は、ＭＰＬ標的化部分、免疫細胞エンゲージャー、またはサイトカイン分子のうちの１つ以上に結合、例えば共有結合される。
【００８５】
いくつかの実施形態では、多重特異性分子は、リンカー、例えば、ＭＰＬ標的化部分とサイトカイン分子、ＭＰＬ標的化部分と免疫細胞エンゲージャー、サイトカイン分子もしくはおよび免疫グロブリン鎖定常領域（例えばＦｃ領域）、標的化部分と免疫グロブリン鎖定常領域、または免疫細胞エンゲージャーと免疫グロブリン鎖定常領域のうちの１つ以上との間にリンカーをさらに含む。
【００８６】
いくつかの実施形態では、リンカーは、切断可能なリンカー、切断不可能なリンカー、ペプチドリンカー、柔軟なリンカー、剛性リンカー、らせんリンカー、または非らせんリンカーから選択される。いくつかの実施形態では、リンカーはペプチドリンカーである。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーはＧｌｙおよびＳｅｒを含む。
【００８７】
いくつかの実施形態では、多重特異性または多機能性ポリペプチドは、第１および第２の非隣接ポリペプチドを含む二重特異性分子であり、
（ｉ）第１のポリペプチドは、例えば、Ｎ−からＣ−の配向で、場合によりリンカーを介して、サイトカイン分子、間質修飾部分、もしくは免疫細胞エンゲージャー、例えば抗体分子、例えば免疫細胞抗原に結合するｓｃＦｖに接続される、例えばがん抗原、例えば、固形腫瘍、間質、もしくは血液学的抗原に結合する、腫瘍標的化部分、例えば抗体分子（例えば第１の抗原ドメインの第１の部分、例えばＦａｂ分子の第１のＶＨ−ＣＨ１）を含み、
（ｉｉ）第２のポリペプチドは、例えば、Ｎ−からＣ−の配向で、例えばがん抗原、例えば、固形腫瘍、間質、もしくは血液学的抗原（例えば第１のＶＨ−ＣＨ１により結合される同じ腫瘍または間質抗原）に結合する第１の抗原ドメインの第２の部分、例えばＦａｂの第１のＶＬ−ＣＬを含む。
【００８８】
いくつかの実施形態では、多重特異性または多機能性ポリペプチドは、第１および第２の非隣接ポリペプチドを含む二重特異性分子であり、
（ｉ）第１のポリペプチドは、例えば、Ｎ−からＣ−の配向で、場合によりリンカーを介して、第１と第２のポリペプチドとの間の会合を促進する第１のドメイン（例えば第１の免疫グロブリン定常ドメイン（例えば本明細書に記載される第１のＦｃ分子）に接続される、例えばがん抗原、例えば、固形腫瘍、間質、もしくは血液学的抗原に結合する、腫瘍標的化部分、例えば抗体分子（例えば第１の抗原ドメインの第１の部分、例えばＦａｂ分子の第１のＶＨ−ＣＨ１）を含み、
（ｉｉ）第２のポリペプチドは、例えば、Ｎ−からＣ−の配向で、場合によりリンカーを介して、第１と第２のポリペプチドとの間の会合を促進する第２のドメイン（例えば第２の免疫グロブリン定常ドメイン（例えば本明細書に記載される第２のＦｃ分子）に接続される、サイトカイン分子、間質修飾部分、もしくは免疫細胞エンゲージャー（例えば免疫細胞抗原に結合する抗体分子、例えばｓｃＦｖ）を含み、
（ｉｉｉ）第３のポリペプチドは、例えば、Ｎ−からＣ−の配向で、がん抗原に結合する第１の抗原ドメインの第２の部分、例えばＦａｂの第１のＶＬ−ＣＬを含む。
【００８９】
いくつかの実施形態では、多重特異性分子は、
ａ）第１と第２のポリペプチドとの会合を促進するドメイン、例えばＦｃ分子を含む第１のポリペプチド、ならびにＭＰＬ標的化部分または免疫細胞エンゲージャーから選択されるポリペプチドと、
ｂ）ＭＰＬ標的化部分または免疫細胞エンゲージャーから選択される第２のポリペプチドと、
ｃ）第１と第３のポリペプチドとの会合を促進するドメイン、例えばＦｃ分子を含む第３のポリペプチド、ならびにＭＰＬ標的化部分、免疫細胞エンゲージャー、またはサイトカイン分子から選択されるポリペプチドと、
ｄ）場合により、ＭＰＬ標的化部分または免疫細胞エンゲージャーから選択される第４のポリペプチドと、を含み、
この多重特異性または多機能性ＭＰＬアンタゴニスト分子は、１つのＭＰＬ標的化部分および免疫細胞エンゲージャーもしくはサイトカイン分子、または２つのＭＰＬ標的部分を含む。
【００９０】
いくつかの実施形態では、多重特異性分子は、
ＭＰＬ標的化部分および免疫細胞エンゲージャー、
ＭＰＬ標的化部分およびサイトカイン分子、または
２つのＭＰＬ標的化部分を含み、
二量体化ドメインをさらに含む。
【００９１】
いくつかの実施形態では、多重特異性分子は、１つのＭＰＬ標的化部分および免疫細胞エンゲージャーを含み、このＭＰＬ標的化部分はＭＰＬに結合する抗体分子であり、免疫細胞エンゲージャーはＮＫｐ４６またはＮＫｐ３０に結合する。
【００９２】
いくつかの実施形態では、多重特異性分子は、１つのＭＰＬ標的化部分およびサイトカイン分子を含み、このＭＰＬ標的化部分はＭＰＬに結合する抗体分子であり、サイトカインはＩＬ２である。
【００９３】
いくつかの実施形態では、多重特異性分子は２つのＭＰＬ標的化部分を含み、このＭＰＬ標的化部分は、非重複抗原結合部位を有する２つの抗体分子、例えばＭＰＬタンパク質上の非重複エピトープに結合する抗体分子である。
【００９４】
いくつかの実施形態では、多重特異性分子は、以下の非隣接ポリペプチド：
ｉ）例えば、Ｎ−からＣ−の配向で、ＭＰＬ標的化部分、例えばＭＰＬ抗原に結合する例えば抗体分子（例えば第１の抗原ドメインの第１の部分、例えばＦａｂ分子の第１のＶＨ−ＣＨ１）、第１と第３のポリペプチドとの会合を促進するドメイン、例えばＦｃ分子を含む、第１のポリペプチドと、
ｉｉ）例えば、Ｎ−からＣ−の配向で、ＭＰＬ標的化部分、例えばＭＰＬ抗原（例えば第１のＶＨ−ＣＨ１により結合される同じ抗原）に結合する例えば抗体分子（例えば第１の抗原ドメインの第２の部分、例えばＦａｂ分子の第１のＶＬ−ＣＬ）を含む、第２のポリペプチドと、
ｉｉｉ）例えば、Ｎ−からＣ−の配向で、第１と第３のポリペプチドとの会合を促進するドメイン、例えばＦｃ分子およびサイトカイン分子を含む第３のポリペプチドと、を含む。
【００９５】
いくつかの実施形態では、多重特異性分子は、以下の非隣接ポリペプチド：
ｉ）例えば、Ｎ−からＣ−の配向で、ＭＰＬ標的化部分、例えばＭＰＬ抗原に結合する例えば抗体分子（例えば第１の抗原ドメインの第１の部分、例えばＦａｂ分子の第１のＶＨ−ＣＨ１）、第１と第３のポリペプチドとの会合を促進するドメイン、例えばＦｃ分子を含む、第１のポリペプチドと、
ｉｉ）例えば、Ｎ−からＣ−の配向で、ＭＰＬ標的化部分、例えばＭＰＬ抗原（例えば第１のＶＨ−ＣＨ１により結合される同じ抗原）に結合する例えば抗体分子（例えば第１の抗原ドメインの第２の部分、例えばＦａｂ分子の第１のＶＬ−ＣＬ）を含む、第２のポリペプチドと、
ｉｉｉ）例えば、Ｎ−からＣ−の配向で、免疫細胞エンゲージャー、例えば免疫細胞エンゲージャーに結合する例えば抗体分子（例えば第２の抗原ドメインの第１の部分、例えばＦａｂ分子の第１のＶＨ−ＣＨ１）、第１と第３のポリペプチドとの会合を促進するドメイン、例えばＦｃ分子を含む、第３のポリペプチドと、
ｉｖ）例えば、Ｎ−からＣ−の配向で、免疫細胞エンゲージャー、例えば免疫細胞エンゲージャー（例えば第２のＶＨ−ＣＨ１により結合される同じ抗原）に結合する例えば抗体分子（例えば、第２の抗原ドメインの第２の部分、例えばＦａｂ分子の第１のＶＬ−ＣＬ）を含む、第４のポリペプチドと、を含む。
【００９６】
核酸、宿主細胞、ベクター、および方法
別の態様では、本開示は、本明細書に記載される任意の多重特異性分子をコードする単離された核酸分子を提供する。
【００９７】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載される多重特異性分子のいずれかをコードするヌクレオチド配列、またはそれと実質的に相同（例えば、それに少なくとも９５％同一）なヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する。
【００９８】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載される任意の核酸分子のうちの１つ以上を含むベクター、例えば発現ベクターを提供する。
【００９９】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載される核酸分子またはベクターを含む宿主細胞を提供する。
【０１００】
別の態様では、本開示は、好適な条件下、例えば、遺伝子発現および／またはホモもしくはヘテロ二量体化に好適な条件下で、本明細書に記載される宿主細胞を培養することを含む、本明細書に記載される多重特異性分子を作製、例えば産生する方法を提供する。
【０１０１】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載される多重特異性分子および薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤を含む医薬組成物を提供する。
【０１０２】
別の態様では、本開示は、がんを治療する方法を提供し、それを必要とする対象に本明細書に記載される多重特異性または多機能性分子を投与することを含み、この多重特異性抗体は、がん、例えば血液癌、例えば骨髄線維症を治療するのに有効な量で投与される。
【０１０３】
本明細書に記載される多重特異性分子を使用して治療することができる例示的ながんとしては、Ｂ細胞またはＴ細胞悪性腫瘍、例えば、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（例えば、Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、有毛細胞白血病）、骨髄線維症、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、および急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）を含むがこれらに限定されない、腫瘍、例えば血液癌が挙げられるが、これに限定されない。一実施形態では、がんは骨髄線維症である。
【０１０４】
他の実施形態では、がんは、固形腫瘍癌、または転移病変である。いくつかの実施形態では、固形腫瘍癌は、膵臓癌（例えば膵臓腺癌）、乳癌、結腸直腸癌、肺癌（例えば、小細胞または非小細胞肺癌）、皮膚癌、卵巣癌、または肝臓癌のうちの１つ以上である。いくつかの実施形態では、がんは血液癌である。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、本方法は、第２の治療処置を施すことをさらに含む。いくつかの実施形態では、第２の治療処置は、治療薬（例えば、化学療法薬、生物学的薬剤、ホルモン療法）、放射線、または手術を含む。いくつかの実施形態では、治療薬は、化学療法薬、または生物学的薬剤から選択される。
【０１０６】
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または同等の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、好適な方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先される。加えて、材料、方法、および例は、単に例示であり、限定することを意図していない。
【０１０７】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】図１Ａ〜１Ｄは、その不活性型（図１Ａ）の、またはリガンドもしくは抗体断片によって結合された（図１Ｂ〜１Ｄ）ＴＰＯ受容体としても知られるＭＰＬ受容体の模式図を示す。本明細書に記載される例示的なＭＰＬ結合分子は、図１Ｃ〜１Ｄに示される。
【発明を実施するための形態】
【０１０９】
本明細書では、１つ以上の結合特異性（または機能性）を含む多重特異性分子（本明細書では「多機能性分子」とも呼ばれる）が開示され、この分子は、ＭＰＬ発現細胞、例えばがん細胞に選択的に局在する結合特異性を含む（例えば、それはＭＰＬ標的化部分を含む）。理論に拘束されることを望むものではないが、本明細書に記載される多重特異性または多機能性分子は、単一のＭＰＬタンパク質に結合し、例えばＴＰＯの存在下でもＭＰＬ二量体化を阻害し、これによりＭＰＬ生物活性を低減することができる。実施形態では、本明細書に記載される多重特異性または多機能性分子は、単一のＭＰＬポリペプチドのＥＣＤ上の１つ以上のエピトープに結合することにより、ＭＰＬ二量体化、例えばＴＰＯ媒介ＭＰＬ二量体化を拮抗する。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される多重特異性分子またはＭＰＬ結合分子は、１つのＭＰＬタンパク質ＥＣＤ上の１つのエピトープにのみ結合する単一のハーフアーム抗体を含む（図１Ｃを参照されたい）。他の実施形態では、本明細書に開示される多重特異性分子またはＭＰＬ結合分子は、同じＭＰＬタンパク質ＥＣＤ上の２つのエピトープに結合する二重特異性、例えば二重パラトープ抗体分子を含む（図１Ｄを参照されたい）。理論に拘束されることを望むものではないが、多重特異性分子またはＭＰＬ結合分子は、天然のリガンドＴＰＯの存在下でも、その後の活性化に必要な立体構造変化を遮断することができると予想される。本明細書に開示される多重特異性分子またはＭＰＬ結合分子は、二価の抗ＭＰＬ抗体、例えば二価のアゴニスト抗体を一価（ハーフアーム）の抗体分子に変換するか、または２つの異なる抗体、例えばＭＰＬ上の２つの異なるエピトープに結合するアゴニスト抗体を組み合わせ、それらを単一の二重特異性、例えば、二重パラトープのアンタゴニスト抗体分子に変換することによるいずれかによって設計することができる。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、図１Ｃおよび１Ｄに示される多重特異性分子またはＭＰＬ結合分子は、免疫細胞エンゲージャー、サイトカイン分子、または腫瘍標的化分子（例えばＭＰＬ以外の腫瘍標的を標的とする腫瘍標的化分子）のうちの１つ以上をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、図１Ｃおよび１Ｄに示される多重特異性分子またはＭＰＬ結合分子は、抗ＣＤ４１抗体分子、抗ＣＤ１７７抗体分子、抗ＰＤＬ１抗体分子、抗ＣＤ３抗体分子、抗ＴＧＦβ抗体分子、ＴＧＦβトラップポリペプチド（例えば、ＴＧＦβに結合することができるＴＧＦβ受容体の一部を含むポリペプチド）、抗ＩＬ１β抗体分子、ＩＬ１βトラップポリペプチド（例えば、ＩＬ１βに結合することができるＩＬ１β受容体の一部を含むポリペプチド）、抗ＣＸＣＬ１０抗体分子、抗ＭＳ４Ａ３抗体分子、抗ＯＬＦＭ４抗体分子、抗ＣＤ６６ｂ抗体分子、抗ｃＫｉｔ抗体分子、抗ＦＬＴ３抗体分子、または抗ＣＤ１３３抗体分子のうちの１つ以上をさらに含む。
【０１１２】
したがって、本明細書では、とりわけ、単一のＭＰＬタンパク質（例えば、同じＭＰＬタンパク質）上の１つ以上の領域、例えば１つ以上のエピトープに結合する多重特異性分子（例えば、多重特異性または多機能性抗体分子）が提供される。一実施形態では、多重特異性分子は、２つのＭＰＬ標的化部分であるか、またはそれを含み、例えば、それは二重パラトープ分子であり、例えば、同じＭＰＬタンパク質上の２つの異なるエピトープ（例えば、非重複エピトープ）に結合する。実施形態では、二重パラトープ分子は、免疫細胞エンゲージャー、サイトカイン分子、または腫瘍標的化分子（例えば、ＭＰＬ以外の腫瘍標的を標的とする第２の腫瘍標的化分子）のうちの１つ以上をさらに含み得る。
【０１１３】
別の実施形態では、多重特異性分子は、単一のＭＰＬ標的化部分、例えば、ＭＰＬに対するハーフアーム抗体（例えば免疫グロブリン定常ドメイン（例えば第１のＦｃ定常領域（例えば第１のＣＨ２−ＣＨ３）に融合したＦａｂ）であるか、またはそれを含む。場合により、ハーフアーム抗体は、第２の免疫グロブリン定常ドメイン、例えば第２の重鎖定常領域、例えば第２のＦｃ定常領域）に二量体化（例えばホモまたはヘテロ二量体化）される。実施形態では、ＭＰＬ標的化部分および／または第２の免疫グロブリン定常ドメインは、免疫細胞エンゲージャー、サイトカイン分子、または腫瘍標的化分子（例えば、ＭＰＬ以外の腫瘍標的を標的とする第２の腫瘍標的化分子）のうちの１つ以上をさらに含み得る。
【０１１４】
ＪＡＫ２のいくつかの異なる点突然変異、欠失、または挿入が血液疾患に関連している。Ｈａａｎ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．２０１０；１４（３）：５０４−５２７（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。ＪＡＫ２のＪＨ２ドメインにおける突然変異は、エクソン１４、エクソン１６、およびエクソン１２によってコードされた３つの領域に集中している。ＪＡＫ２のＪＨ１ドメインにおける疾患関連突然変異も同定されている。１つの突然変異、Ｖ６１７Ｆ（位置６１７でのバリンからフェニルアラニンへの変化）は、ＴＰＯなどのサイトカインに対して造血細胞をより敏感にする。ＪＨ２−ＪＨ１自己抑制相互作用を不安定化することに加えて、Ｖ６１７Ｆは、シグナル伝達に重要なＪＨ２媒介の正の相互作用も促進する可能性があると仮定されている。Ｓｉｌｖｅｎｎｏｉｎｅｎ  ａｎｄ  Ｈｕｂｂａｒｄ，Ｂｌｏｏｄ．２０１５  Ｍａｙ  ２８；１２５（２２）：３３８８−３３９２（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。理論に拘束されることを望むものではないが、Ｖ６１７Ｆ突然変異などのＪＡＫ２における突然変異は、ＭＰＬなどのサイトカイン受容体の立体構造変化を引き起こす可能性があり、そのような立体構造変化は、本明細書に開示されるＭＰＬ結合分子または多重特異性分子によって認識され得る。一実施形態では、本明細書に開示されるＭＰＬ結合分子または多重特異性分子は、非がん性細胞上で発現されるＭＰＬよりもがん細胞上で発現されるＭＰＬに優先的に結合する（例えば、より大きい親和性で、例えば、ＭＰＬ結合分子または多重特異性分子が非がん性細胞上で発現されるＭＰＬに結合する場合よりも、少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、７５倍、または１００倍大きい親和性でがん細胞上で発現されるＭＰＬに結合する）。一実施形態では、本明細書に開示されるＭＰＬ結合分子または多重特異性分子は、野生型ＪＡＫ２に関連するＭＰＬよりも突然変異したＪＡＫ２（例えば、Ｖ６１７Ｆ突然変異を含むＪＡＫ２）に関連するＭＰＬに優先的に結合する（例えば、多重特異性分子またはＭＰＬ結合分子が野生型ＪＡＫ２に関連するＭＰＬに結合する場合よりも大きい親和性、例えば、少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、７５倍、または１００倍大きい親和性で突然変異したＪＡＫ２（例えば、Ｖ６１７Ｆ突然変異を含むＪＡＫ２）に関連するＭＰＬに結合する）。一実施形態では、本明細書に開示されるＭＰＬ結合分子または多重特異性分子は、野生型ＪＡＫ２を発現する細胞上で発現されるＭＰＬよりも突然変異したＪＡＫ２（例えばＶ６１７Ｆ突然変異を含むＪＡＫ２）を発現する細胞上で発現されるＭＰＬに優先的に結合する（例えば、多重特異性分子またはＭＰＬ結合分子が野生型ＪＡＫ２を発現する細胞上で発現されるＭＰＬに結合する場合よりも大きい親和性、例えば、少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、７５倍、または１００倍大きい親和性で突然変異したＪＡＫ２（例えば、Ｖ６１７Ｆ突然変異を含むＪＡＫ２）を発現する細胞上で発現されるＭＰＬに結合する）。一実施形態では、本明細書に開示されるＭＰＬ結合分子または多重特異性分子は、ＭＰＬが突然変異したＪＡＫ２（例えば、Ｖ６１７Ｆ突然変異を含むＪＡＫ２）と関連する場合にＭＰＬにのみ存在するエピトープに結合するが、ＭＰＬが野生型ＪＡＫ２と関連する場合には結合しない。
【０１１５】
加えて、前述の多重特異性分子をコードする核酸、前述の分子を産生する方法、および前述の分子を使用してがんを治療する方法が開示される。
【０１１６】
定義
ある特定の用語を以下に定義する。
【０１１７】
本明細書で使用される場合、冠詞「ａ」および「ａｎ」は、冠詞の文法上の目的語の１つまたは２つ以上、例えば、少なくとも１つを指す。本明細書で「含む」という用語とともに使用される場合の「ａ」または「ａｎ」という用語の使用は「１つ」を意味する場合があるが、「１つ以上」、「少なくとも１つ」、および「１つまたは２つ以上」の意味とも一致する。
【０１１８】
本明細書で使用される場合、「約」および「およそ」は、一般に、測定値の性質または精度を所与として、測定された量について許容可能な誤差の程度を意味する。例示的な誤差の程度は、所与の値の範囲の２０パーセント（％）以内、典型的には１０％以内、より典型的には５％以内である。
【０１１９】
本明細書で使用される場合、例えば、抗体分子、サイトカイン分子、受容体分子で使用される「分子」という用語は、未修飾（例えば天然に存在する）分子の少なくとも１つの機能および／または活性が残存する限り、全長の天然に存在する分子、ならびに変異型、例えば機能変異型（例えば、切り詰め、断片、突然変異（例えば実質的に類似の配列）、またはそれらの誘導体化形態を含む。
【０１２０】
「機能性変異体」という用語は、天然に存在する配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するか、または実質的に同一のヌクレオチド配列によってコードされ、かつ天然に存在する配列の１つ以上の活性を有することができるポリペプチドを指す。
【０１２１】
本明細書で使用される場合、「抗体分子」という用語は、少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む、タンパク質、例えば免疫グロブリン鎖またはその断片を指す。抗体分子は、抗体（例えば、全長抗体）および抗体断片を包含する。一実施形態では、抗体分子は、全長抗体の抗原結合断片もしくは機能性断片、または全長免疫グロブリン鎖を含む。例えば、全長抗体は、天然に存在するか、または正常な免疫グロブリン遺伝子断片の組換えプロセス）によって形成される免疫グロブリン（Ｉｇ）分子（例えばＩｇＧ抗体）である。実施形態では、抗体分子は、抗体断片などの、免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な抗原結合部分を指す。抗体断片、例えば機能断片は、抗体の一部、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、可変断片（Ｆｖ）、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、または単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。機能抗体断片は、インタクトな（例えば全長）抗体によって認識されるものと同じ抗原に結合する。「抗体断片」または「機能断片」という用語は、重鎖および軽鎖の可変領域からなる「Ｆｖ」断片、または軽および重可変領域がペプチドリンカーによって接続される組換え単鎖ポリペプチド分子（「ｓｃＦｖタンパク質」）などの、可変領域からなる単離された断片も含む。いくつかの実施形態では、抗体断片は、Ｆｃ断片または単一のアミノ酸残基などの抗原結合活性を有しない抗体の部分を含まない。例示的な抗体分子には、全長抗体および抗体断片、例えば、ｄＡｂ（ドメイン抗体）、単鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２断片、ならびに単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）が含まれる。
【０１２２】
本明細書で使用される場合、「二重パラトープ抗体」という用語は、同じ標的受容体上の２つの異なるエピトープに結合する抗体分子、例えばＭＰＬ受容体上の２つの異なるエピトープに結合する抗体を指す。
【０１２３】
「非重複結合部位」、例えば「非重複エピトープ」という用語は、互いに異なる結合部位、例えばエピトープ（例えば、線状または立体構造エピトープ）を含む。いくつかの実施形態では、非重複結合部位、例えばエピトープは、互いに結合について競合しない２つの異なる結合剤、例えば抗体分子によって結合される。他の実施形態では、非重複結合部位、例えばエピトープは、部分的に重複する、例えば、互いに結合するために競合する２つの異なる抗体分子によって結合される。
【０１２４】
本明細書で使用される場合、「免疫グロブリン可変ドメイン配列」は、免疫グロブリン可変ドメインの構造を形成し得るアミノ酸配列を指す。例えば、この配列は、天然に存在する可変ドメインのアミノ酸配列の全部または一部を含んでもよい。例えば、この配列は、１つ、２つ、またはそれ以上のＮ末端アミノ酸またはＣ末端アミノ酸を含む場合も含まない場合もあり、あるいはタンパク質構造の形成と適合する他の改変を含んでもよい。
【０１２５】
実施形態では、抗体分子は単一特異性であり、例えば、単一のエピトープに対する結合特異性を含む。いくつかの実施形態では、抗体分子は、多重特異性であり、例えば、それは複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第１のエピトープに対して結合特異性を有し、第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第２のエピトープに対して結合特異性を有する。いくつかの実施形態では、抗体分子は二重特異性抗体分子である。本明細書で使用される場合、「二重特異性抗体分子」は、２つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ以上）のエピトープおよび／または抗原に対して特異性を有する抗体分子を指す。
【０１２６】
本明細書で使用される場合、「抗原」（Ａｇ）は、例えば、ある特定の免疫細胞の活性化および／または抗体生成を伴う免疫応答を誘発することができる分子を指す。ほとんど全てのタンパク質またはペプチドを含む任意の高分子が抗原であり得る。抗原は、ゲノム組換えまたはＤＮＡから得ることができる。例えば、免疫応答を誘発することができるタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分ヌクレオチド配列を含む任意のＤＮＡは「抗原」をコードする。実施形態では、抗原は、遺伝子の全長ヌクレオチド配列によってのみコードされる必要はなく、また抗原は遺伝子によってコードされる必要も全くない。実施形態では、抗原は合成され得るか、または生物学的試料、例えば組織試料、腫瘍試料、細胞、もしくは他の生物学的成分を有する流体から得ることができる。本明細書で使用される場合、「腫瘍抗原」または交換可能に「がん抗原」は、免疫応答を誘発することができるがん、例えばがん細胞もしくは腫瘍微小環境上に存在するか、またはそれと関連する任意の分子を含む。本明細書で使用される場合、「免疫細胞抗原」には、免疫応答を誘発することができる免疫細胞上に存在するか、またはそれと関連する任意の分子が含まれる。
【０１２７】
抗体分子の「抗原結合部位」または「結合部分」は、抗原結合に関与する抗体分子の一部、例えば免疫グロブリン（Ｉｇ）分子を指す。実施形態では、抗原結合部位は、重鎖（Ｈ）および軽鎖（Ｌ）の可変（Ｖ）領域のアミノ酸残基によって形成される。超可変領域と呼ばれる重鎖および軽鎖の可変領域内の高度に多岐にわたる３つのストレッチは、「フレームワーク領域」（ＦＲ）と呼ばれるより保存された隣接ストレッチ間に配置される。ＦＲは、免疫グロブリンの超可変領域の間、およびそれに隣接して天然に見られるアミノ酸配列である。実施形態では、抗体分子において、軽鎖の３つの超可変領域および重鎖の３つの超可変領域は、３次元空間で互いに対して配置されて、結合抗原の３次元表面に相補的な抗原結合表面を形成する。重鎖および軽鎖の各々の３つの超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と呼ばれる。フレームワーク領域およびＣＤＲは、例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２およびＣｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７において定義および記載されている。各可変鎖（例えば、可変重鎖および可変軽鎖）は典型的には、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成され、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、アミノ酸順にＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４に配置される。
【０１２８】
本明細書で使用される場合、「がん」は、あらゆる種類の発がんプロセスおよび／またはがん性成長を包含し得る。実施形態では、がんには、原発腫瘍、ならびに転移組織、または悪性に形質転換された細胞、組織、もしくは臓器が含まれる。実施形態では、がんは、がんの全ての組織病理学および病期、例えば侵襲性／重症度の病期を包含する。実施形態では、がんには、再発性および／または耐性がんが含まれる。「がん」および「腫瘍」という用語は交換可能に使用され得る。例えば、両方の用語は、固形および液性腫瘍を包含する。本明細書で使用される場合、「がん」または「腫瘍」という用語には、前悪性ならびに悪性のがんおよび腫瘍が含まれる。
【０１２９】
本明細書で使用する場合、「免疫細胞」は、免疫系で機能する、例えば感染および異物の物質から保護するための様々な細胞のいずれかを指す。実施形態では、この用語には、白血球、例えば、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、および単球が含まれる。自然白血球には、食細胞（例えば、マクロファージ、好中球、および樹状細胞）、マスト細胞、好酸球、好塩基球、ナチュラルキラー細胞が含まれる。自然白血球は、病原体を同定し、接触により大きな病原体を攻撃するか、または微生物を飲み込んで殺傷するかのいずれかによって排除し、適応免疫応答の活性化のメディエーターである。適応免疫系の細胞は、リンパ球と呼ばれる特殊な種類の白血球である。Ｂ細胞およびＴ細胞は重要な種類のリンパ球であり、骨髄の造血幹細胞に由来する。Ｂ細胞は体液性免疫応答に関与しているが、Ｔ細胞は細胞媒介免疫応答に関与している。「免疫細胞」という用語には、免疫エフェクター細胞が含まれる。
【０１３０】
本明細書で使用される場合、「免疫エフェクター細胞」という用語は、免疫応答、例えば免疫エフェクター応答の促進に関与する細胞を指す。免疫エフェクター細胞の例としては、Ｔ細胞、例えばアルファ／ベータＴ細胞およびガンマ／デルタＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫ  Ｔ）細胞、ならびにマスト細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３１】
「エフェクター機能」または「エフェクター応答」という用語は、細胞の特殊機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、サイトカインの分泌を含む細胞溶解活性またはヘルパー活性であり得る。
【０１３２】
本発明の組成物および方法は、特定の配列、またはそれと実質的に同一または類似の配列、例えば特定の配列と少なくとも８５％、９０％、９５％以上同一の配列を有するポリペプチドおよび核酸を包含する。アミノ酸配列の文脈において、「実質的に同一」という用語は、本明細書では、第１および第２のアミノ酸配列が共通の構造ドメインおよび／または共通の機能活性を有することができるように、第２のアミノ酸配列の整列されたアミノ酸残基と、ｉ）同一、またはｉｉ）その保存的置換である十分なまたは最小数のアミノ酸残基を含む第１のアミノ酸を指すように使用される。例えば、参照配列、例えば本明細書に提供される配列と少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する共通の構造ドメインを含むアミノ酸配列。
【０１３３】
ヌクレオチド配列の文脈において、「実質的に同一」という用語は、本明細書では、第１および第２のヌクレオチド配列が共通の機能的活性を有するポリペプチドをコードするか、または共通の構造的ポリペプチドドメインもしくは共通の機能的ポリペプチド活性をコードするように、第２の核酸配列の整列されたヌクレオチドと同一である十分なまたは最小数のヌクレオチドを含む第１の核酸配列を指すように使用される。例えば、参照配列、例えば本明細書に提供される配列と少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列。
【０１３４】
配列間の相同性または配列同一性の計算（これらの用語は本明細書では交換可能に使用される）は、次のように行われる。
【０１３５】
２つのアミノ酸配列、または２つの核酸配列のパーセント同一性を決定するために、最適な比較目的のために配列を整列させる（例えば、最適な整列のために、ギャップが第１および第２のうちの１つまたは両方のアミノ酸または核酸に導入され得、比較目的のための非相同配列は無視され得る）。好ましい実施形態では、比較目的のために整列された参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％である。次に、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列の位置が、第２の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められている場合、分子はその位置で同一である（本明細書で使用される場合、アミノ酸または核酸の「同一性」はアミノ酸または核酸の「相同性」と同等である）。
【０１３６】
２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適な整列のために導入される必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮して、配列で共有される同一の位置の数の関数である。
【０１３７】
配列の比較および２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。好ましい実施形態では、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６、もしくは４のギャップ重みおよび１、２、３、４、５、または６の長さ重みを使用して、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３）アルゴリズムを使用して決定される。さらに別の好ましい実施形態では、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスならびに４０、５０、６０、７０、または８０のギャップ重みおよび１、２、３、４、５、または６の長さ重みを使用して、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）のＧＡＰプログラムを使用して決定される。特に好ましいパラメータのセット（および特に指定のない限り使用されるべきもの）は、ギャップペナルティ１２、ギャップ拡張ペナルティ４、およびフレームシフトギャップペナルティ５のＢｌｏｓｓｕｍ６２スコアリングマトリックスである。
【０１３８】
２つのアミノ酸またはヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＰＡＭ１２０重み残基表、ギャップ長ペナルティ１２、およびギャップペナルティ４を使用して、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＥ．Ｍｅｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ（（１９８９）  ＣＡＢＩＯＳ，４：１１−１７）のアルゴリズムを使用して決定することができる。
【０１３９】
本明細書に記載される核酸およびタンパク質配列は、例えば他のファミリーメンバーまたは関連配列を同定するために、公共データベースに対して検索を行うための「クエリ配列」として使用することができる。そのような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して行うことができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて行い、本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて行い、本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためにギャップのある整列を得るには、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２に記載されるように、ギャップのあるＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびギャップのあるＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータ（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）を使用することができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい。
【０１４０】
本発明の分子は、追加の保存的または非必須アミノ酸置換を有してもよく、それらはそれらの機能に実質的な影響を及ぼさないことが理解される。
【０１４１】
「アミノ酸」という用語は、天然または合成にかかわらず、アミノ官能性および酸官能性の両方を含み、天然に存在するアミノ酸のポリマーに含まれることができる、全ての分子を包含することを意図している。例示的なアミノ酸としては、天然に存在するアミノ酸、その類似体、誘導体、および同族体、変異型側鎖を有するアミノ酸類似体、ならびに前述のいずれかのいずれかの全ての立体異性体が挙げられる。本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、Ｄ−またはＬ−光学異性体およびペプチド模倣物の両方を含む。
【０１４２】
「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基で代置されるものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。
【０１４３】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」（単鎖の場合）という用語は、本明細書では交換可能に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは、線状または分岐していてもよく、修飾されたアミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸によって中断されてもよい。本用語には、修飾されたアミノ酸ポリマー、例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識成分とのコンジュゲートなどの任意の他の操作も包含される。ポリペプチドは、天然源から単離することができるか、真核生物または原核生物の宿主から組換え技術により産生することができるか、または合成手順の産物であり得る。
【０１４４】
「核酸」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、または「ポリヌクレオチド配列」、および「ポリヌクレオチド」という用語は交換可能に使用される。それらは、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはそれらの類似体のいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得、一本鎖の場合、コード鎖または非コード（アンチセンス）鎖であり得る。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体などの修飾されたヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、標識成分とのコンジュゲーションなどにより、重合後にさらに修飾され得る。核酸は、組換えポリヌクレオチド、または天然に存在しないか、もしくは非天然の配置で別のポリヌクレオチドに結合されるかのいずれかのゲノム、ｃＤＮＡ、半合成、または合成起源のポリヌクレオチドであり得る。
【０１４５】
本明細書で使用される「単離された」という用語は、その元のまたは自生の環境（例えば、それが天然に存在する場合は天然の環境）から取り出された物質を指す。例えば、生きている動物中にある天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されないが、自然系において共存する物質のいくつかまたは全てから人間の介入によって分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離される。そのようなポリヌクレオチドは、ベクターの一部であり得、かつ／またはそのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、組成物の一部であり、かつそのようなベクターまたは組成物が、それが天然に見出される環境の一部ではないという点で、やはり単離され得る。
【０１４６】
本発明の様々な態様を以下でさらに詳細に記載する。追加の定義は、本明細書全体を通して詳述される。
【０１４７】
ＭＰＬ標的化部分
本開示は、とりわけ、細胞、例えば腫瘍または造血細胞に分子を指向する１つ以上のＭＰＬ特異的標的化部分を含む、例えば含むように操作される、多重特異性分子（例えば二重特異性体、例えば二重パラトープ分子）を提供する。
【０１４８】
「ＭＰＬ」は、ＣＤ１１０またはＴＰＯＲ（トロンボポイエチン受容体）としても知られる骨髄増殖性白血病タンパク質（ＭＰＬ）を指し、ヒトＭＰＬタンパク質ならびにその種、アイソフォーム、および他の配列変異型に関する。したがって、ＭＰＬは、天然の全長タンパク質であり得るか、または天然タンパク質の少なくとも１つの生物活性、例えば血小板産生を保持する切り詰められた断片または配列変異型（例えば、天然に存在するアイソフォーム、または組換え変異型）であり得る。ＭＰＬタンパク質には、２つの細胞外サイトカイン受容体ドメインおよび２つの細胞内サイトカイン受容体ボックスモチーフを有する。ＭＰＬは、主にヒト造血細胞上で発現し、例えば巨核球形成を調節する（ｒｅｖｉｅｗｅｄ  ｉｎ  Ｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｐｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｎ  ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｐｌａｔｅｌｅｔｓ  ｉｓ  ｄｉｓｐｅｎｓａｂｌｅ  ｆｏｒ  ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｓｉｓ  ｂｕｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｔｏ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ｍｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ”，ＰＮＡＳ，Ｖｏｌ．１１１，Ｉｓｓｕｅ  １６，５８８４−５８８９，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１４０４３５４１１１において概説される）。
【０１４９】
ＭＰＬの天然リガンドであるトロンボポエチン（ＴＰＯ）のＭＰＬの細胞外ドメインへの結合は、細胞内リン酸化およびＪＡＫ２キナーゼ経路の活性化をもたらす立体構造変化をもたらすＭＰＬ二量体化を誘導する。ＭＰＬ生物活性は、抗ＭＰＬ抗体、例えば、ＵＳ７，９９３，６４２、ＵＳ６，３４２，２２０、ＵＳ８，０３４，９０３、およびＵＳ２０１２／０２６９８１４Ａ１（それらの内容全体は参照により本明細書に組み込まれる）に記載される抗体で調節することができる。
【０１５０】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される多重特異性分子は、ＭＰＬ標的化部分を含む。ＭＰＬ標的化部分は、抗体分子（例えば、本明細書に記載される抗原結合ドメイン）、受容体もしくは受容体断片、またはリガンドもしくはリガンド断片、またはそれらの組み合わせから選択することができる。いくつかの実施形態では、ＭＰＬ標的化部分は、がんまたは造血細胞（例えばがんまたは造血細胞の表面上に存在する分子、例えば抗原）と会合する、例えばそれに結合する。ある特定の実施形態では、ＭＰＬ部分は、本明細書に開示される多重特異性分子をがんまたは造血細胞に標的化、例えば指向する。いくつかの実施形態では、がんは血液癌、例えば骨髄線維症である。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、多重特異性分子、例えばＭＰＬ標的化部分は、細胞、例えばがんまたは造血細胞の表面上のＭＰＬ抗原に結合する。ＭＰＬ抗原は、原発腫瘍細胞またはその転移病変上に存在し得る。いくつかの実施形態では、がんは血液癌、例えば骨髄線維症である。例えば、ＭＰＬ抗原は、腫瘍、例えば、制限された腫瘍灌流、圧迫血管、または線維性腫瘍間質のうちの１つ以上を有することにより代表されるクラスの腫瘍上に存在し得る。
【０１５２】
例示的なＭＰＬ標的化部分
本明細書に記載の多重特異性分子は、ＵＳ７，９９３，６４２、ＵＳ６，３４２，２２０、ＵＳ８，０３４，９０３、およびＵＳ２０１２／０２６９８１４Ａ１（それらの内容全体は参照により本明細書に組み込まれる）に記載される抗ＭＰＬ抗体またはその抗原結合断片を含むＭＰＬ標的化部分を含み得る。
【０１５３】
一実施形態では、ＭＰＬ標的化部分は、ＭＰＬに結合する抗体分子（例えばＦａｂまたはｓｃＦｖ）を含む。いくつかの実施形態では、ＭＰＬに対する抗体分子は、表１の重鎖可変ドメイン配列のいずれかに由来する１つ、２つ、もしくは３つのＣＤＲ、または密接に関連するＣＤＲ、例えば、表１のＣＤＲ配列のいずれかに由来する、少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、２つ、３つ、もしくは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、ＭＰＬに対する抗体分子は、表１のアミノ酸配列のいずれかから選択される重鎖可変ドメイン配列、またはそれと実質的に同一（例えば、それと９５％〜９９．９％同一）の、もしくは少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、５、１０、または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるアミノ酸配列を含む。
【０１５４】
あるいは、または本明細書に開示されるＭＰＬに対する重鎖と組み合わせて、ＭＰＬに対する抗体分子は、表１の軽鎖可変ドメイン配列のいずれかに由来する１つ、２つ、もしくは３つのＣＤＲ、または密接に関連するＣＤＲ、例えば、表１のＣＤＲ配列のいずれかに由来する、少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、２つ、３つ、もしくは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、ＭＰＬに対する抗体分子は、表１のアミノ酸配列のいずれかから選択される軽鎖可変ドメイン配列、またはそれと実質的に同一（例えば、それと９５％〜９９．９％同一）の、もしくは少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、５、１０、または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるアミノ酸配列を含む。
【０１５５】
一実施形態では、ＭＰＬ標的化部分は、ＭＰＬに結合する抗体分子（例えばＦａｂまたはｓｃＦｖ）を含む。いくつかの実施形態では、ＭＰＬに対する抗体分子は、配列番号１の重鎖可変ドメイン配列（表１を参照されたい）に由来する１つ、２つ、もしくは３つのＣＤＲ、または密接に関連するＣＤＲ、例えば、配列番号１のＣＤＲ配列に由来する、少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、２つ、３つ、もしくは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるＣＤＲを含む。
【０１５６】
実施形態では、ＭＰＬに対する抗体分子は、配列番号１）の重鎖可変ドメイン配列、またはそれと実質的に同一（例えば、それと９５％〜９９．９％同一）の、もしくは配列番号１のアミノ酸配列に対して、少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、５、１０、または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるアミノ酸配列を含む。
【０１５７】
実施形態では、ＭＰＬに対する抗体分子はＦａｂであり、配列番号６９のアミノ酸配列（表２を参照されたい）、またはそれと実質的に同一（例えば、それと９５％〜９９．９％同一）の、もしくは配列番号６９のアミノ酸配列に対して、少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、５、１０、または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるアミノ酸配列を有する重鎖定常領域（ＣＨ１）をさらに含む。
【０１５８】
あるいは、または本明細書に開示されるＭＰＬに対する重鎖と組み合わせて、ＭＰＬに対する抗体分子は、配列番号２の軽鎖可変ドメイン配列（表１を参照されたい）に由来する１つ、２つ、もしくは３つのＣＤＲ、または密接に関連するＣＤＲ、例えば、配列番号２のＣＤＲ配列に由来する、少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、２つ、３つ、もしくは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるＣＤＲを含む。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、ＭＰＬに対する抗体分子は、配列番号２の軽鎖可変ドメイン配列、またはそれと実質的に同一（例えば、それと９５％〜９９．９％同一）の、もしくは配列番号２のアミノ酸配列に対して、少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、５、１０、または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるアミノ酸配列を含む。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、ＭＰＬに対する抗体分子はＦａｂであり、アミノ酸配列の配列番号７０（表２を参照されたい）、またはそれと実質的に同一（例えば、それと９５％〜９９．９％同一）の、もしくは配列番号７０のアミノ酸配列に対して、少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、５、１０、または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域（ＣＬ（カッパ））をさらに含む。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、ＭＰＬに対する抗体分子はＦａｂであり、配列番号７１のアミノ酸配列（表２を参照されたい）、またはそれと実質的に同一（例えば、それと９５％〜９９．９％同一）の、もしくは配列番号７１のアミノ酸配列に対して、少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、５、１０、または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域（ＣＬ（ラムダ））をさらに含む。
【０１６２】
他の実施形態では、ＭＰＬに対する抗体分子は、表１に示される可変ドメインの対のいずれか、例えば、同じ抗体分子に由来する可変重および可変軽ドメイン、例えば、配列番号３の可変重ドメインおよび配列番号４の可変軽ドメインの、重鎖可変ドメインに由来する１つ、２つ、もしくは３つのＣＤＲ、および軽鎖可変ドメイン配列に由来する１つ、２つ、もしくは３つのＣＤＲを含む。
【０１６３】
実施形態では、ＭＰＬに対する抗体分子は、配列番号３の重鎖可変ドメイン配列、またはそれと実質的に同一（例えば、９５％〜９９．９％同一）の、もしくは配列番号３のアミノ酸配列に対して、少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、５、１０、または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるアミノ酸配列、および配列番号４の軽鎖可変ドメイン配列、またはそれと実質的に同一（例えば、９５％〜９９．９％同一）の、もしくは配列番号４のアミノ酸配列に対して、少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、５、１０、または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるアミノ酸配列を含む。
【０１６４】
実施形態では、ＭＰＬに対する抗体分子は、配列番号４９の配列、またはそれと実質的に同一（例えば、それと９５％〜９９．９％同一）の、もしくは配列番号４９のアミノ酸配列に対して、少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、５、１０、または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるアミノ酸配列を含む単鎖Ｆｖである。
【０１６５】
実施形態では、抗体分子は、
（ｉ）配列番号６９のアミノ酸配列（表２を参照されたい）、またはそれと実質的に同一（例えば、それと９５％〜９９．９％同一）の、もしくは配列番号６９のアミノ酸配列に対して、少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、５、１０、または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるアミノ酸配列を有する、重鎖定常領域（ＣＨ１）、
（ｉｉ）配列番号７０のアミノ酸配列（表２を参照されたい）、またはそれと実質的に同一（例えば、それと９５％〜９９．９％同一）の、もしくは配列番号７０のアミノ酸配列に対して、少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、５、１０、または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるアミノ酸配列を有する、軽鎖定常領域（ＣＬ（カッパ））、あるいは
（ｉｉｉ）配列番号７１のアミノ酸配列（表２を参照されたい）、またはそれと実質的に同一（例えば、それと９５％〜９９．９％同一）の、もしくは配列番号７１のアミノ酸配列に対して、少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、５、１０、または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるアミノ酸配列を有する、軽鎖定常領域（ＣＬ（ラムダ））をさらに含む。
【０１６６】
実施形態では、ＭＰＬに対する抗体分子は、配列番号５０〜５６のいずれか、またはそれと実質的に同一（例えば、それと９５％〜９９．９％同一）の、もしくは配列番号５０〜５６のアミノ酸配列に対して、少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、５、１０、または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるアミノ酸配列を含む単鎖Ｆｖである。
【表１−１】
2020522254.tif 000003
【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【表１−７】
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【表１−８】
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【表２−１】
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【表２−２】
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【０１６７】
ホスファターゼ標的化部分
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される多重特異性分子は、ホスファターゼ標的化部分を含む。一実施形態では、多重特異性分子は、ＭＰＬに結合する第１の標的化部分（例えば本明細書に開示されるＭＰＬ標的化部分）、およびホスファターゼ、例えばタンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）、例えば受容体タンパク質チロシンホスファターゼ（ＲＰＴＰ）に結合する第２の標的化部分を含む。一実施形態では、ホスファターゼおよびＭＰＬは同じ細胞で発現される。一実施形態では、ホスファターゼは、ＭＰＬまたはＭＰＬと直接的または間接的に相互作用する分子（例えば、ＭＰＬと直接的または間接的に相互作用するチロシンキナーゼ、例えばＪＡＫ２またはＳｒｃ）を脱リン酸化することができる。一実施形態では、ホスファターゼは、ＣＤ４５、ＲＰＴＰμ、ＲＰＴＰκ、ＲＰＴＰρ、ＲＰＴＰ
【化２】
2020522254.tif 000013
、白血球抗原関連チロシンホスファターゼ（ＬＡＲ）、ＲＰＴＰσ、ＲＰＴＰδ、ＲＰＴＰβ、ＣＤ１４８、ＳＡＰ１、ＲＰＴＰＯ、ＲＰＴＰＱ／ＰＴＰＳ３１、ＲＰＴＰα、ＲＰＴＰε、ＲＰＴＰζ、ＲＰＴＰγ、ＰＣ−ＰＴＰ、ＩＡ２、およびＩＡ２βからなる群から選択される。一実施形態では、ホスファターゼはＣＤ４５である。一実施形態では、ホスファターゼはＣＤ１４８である。一実施形態では、ホスファターゼはＬＡＲである。
【０１６８】
ＣＤ４５標的化部分
受容体型チロシン−タンパク質ホスファターゼＣ、白血球共通抗原（ＬＣＡ）、またはＴ２００としても知られるＣＤ４５は、遺伝子ＰＴＰＲＣによりコードされる。ＣＤ４５には、代替スライスによって産生されるいくつかのアイソフォーム、例えば、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４５ＲＣ、ＣＤ４５ＲＡＢ、ＣＤ４５ＲＡＣ、ＣＤ４５ＲＢＣ、ＣＤ４５ＲＯ、およびＣＤ４５Ｒ（ＡＢＣ）がある。
【０１６９】
一実施形態では、本明細書に開示される多重特異性分子は、ＣＤ４５アイソフォームに結合する標的化部分を含む。一実施形態では、本明細書に開示される多重特異性分子は、１つのＣＤ４５アイソフォームに特異的に結合する標的化部分を含む。一実施形態では、本明細書に開示される多重特異性分子は、２つ以上のＣＤ４５アイソフォームに結合する標的化部分を含む。一実施形態では、本明細書に開示される多重特異性分子は、全てのＣＤ４５アイソフォームに結合する標的化部分を含む。
【０１７０】
例示的なＣＤ４５標的化部分
例示的なＣＤ４５標的化部分は、例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、ＵＳ５２７３７３８、ＵＳ７２６５２１２、ＵＳ７８２５２２２、ＵＳ２００４／００９６９０１、ＷＯ２００５／０２６２１０、ＷＯ２０１６／１８７５１４、およびＷＯ２０１７／００９４７３に開示されている。
【０１７１】
一実施形態では、ＣＤ４５標的化部分は、ＣＤ４５に結合する抗体分子（例えばＦａｂまたはｓｃＦｖ）を含む。
【０１７２】
一実施形態では、ＣＤ４５標的化部分は、抗体ＢＣ８または９．４のＣＤＲ配列、重鎖もしくは軽鎖可変領域配列、または重鎖もしくは軽鎖配列、あるいはそれらと７０、７５、８０、８５、９０、もしくは９９％の同一性を共有する配列のうちの１つ以上を含む。抗体ＢＣ８または９．４を産生するハイブリドーマは、それぞれ受託番号ＨＢ１０５０７およびＨＢ１０５０８でＡＴＣＣに寄託された。一実施形態では、ＣＤ４５標的化部分は、抗体クローン３０−Ｆ１１または５Ｂ１（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）のＣＤＲ配列、重鎖もしくは軽鎖可変領域配列、または重鎖もしくは軽鎖配列、あるいはそれらと７０、７５、８０、８５、９０、もしくは９９％の同一性を共有する配列のうちの１つ以上を含む。一実施形態では、ＣＤ４５標的化部分は、抗体ＹＴＨ−２４、ＹＴＨ−２４／５４、ＹＴＨ−２５．４、またはＹＴＨ−５４．１２のＣＤＲ配列、重鎖もしくは軽鎖可変領域配列、または重鎖もしくは軽鎖配列、あるいはそれらと７０、７５、８０、８５、９０、もしくは９９％の同一性を共有する配列のうちの１つ以上を含む。一実施形態では、ＣＤ４５標的化部分は、抗体ＹＡＭＬ５６８のＣＤＲ配列、重鎖もしくは軽鎖可変領域配列、または重鎖もしくは軽鎖配列、あるいはそれらと７０、７５、８０、８５、９０、もしくは９９％の同一性を共有する配列のうちの１つ以上を含む。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、ＣＤ４５標的化部分は、表３の重鎖可変ドメイン配列のいずれかに由来する１つ、２つ、もしくは３つのＣＤＲ、または密接に関連するＣＤＲ、例えば、表３のＣＤＲ配列のいずれかに由来する、少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、２つ、３つ、もしくは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４５標的化部分は、表３のアミノ酸配列のいずれかから選択される重鎖可変ドメイン配列、またはそれと実質的に同一（例えば、それと９５％〜９９．９％同一）の、もしくは少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、５、１０、または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるアミノ酸配列を含む。
【０１７４】
あるいは、または本明細書に開示されるＣＤ４５に対する重鎖と組み合わせて、ＣＤ４５標的化部分は、表３の軽鎖可変ドメイン配列のいずれかに由来する１つ、２つ、もしくは３つのＣＤＲ、または密接に関連するＣＤＲ、例えば、表３のＣＤＲ配列のいずれかに由来する、少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、２つ、３つ、もしくは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４５標的化部分は、表３のアミノ酸配列のいずれかから選択される軽鎖可変ドメイン配列、またはそれと実質的に同一（例えば、それに９５％〜９９．９％同一）の、もしくは少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、５、１０、または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるアミノ酸配列を含む。
【表３−１】
2020522254.tif 000014
【表３−２】
2020522254.tif 000015
【表３−３】
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【表３−４】
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【０１７５】
ＣＤ１４８標的化部分
受容体型チロシン−タンパク質ホスファターゼｅｔａ（Ｒ−ＰＴＰ−ｅｔａ）または密度増強ホスファターゼ１（ＤＥＰ−１）としても知られるＣＤ１４８は、遺伝子ＰＴＰＲＪによってコードされる。
【０１７６】
一実施形態では、本明細書に開示される多重特異性分子は、ＣＤ１４８に結合する標的化部分を含む。
【０１７７】
例示的なＣＤ１４８標的化部分
例示的なＣＤ１４８標的化部分は、例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、ＵＳ２００９／０２６３３８３およびＵＳ７１９５７６２に開示されている。
【０１７８】
一実施形態では、ＣＤ１４８標的化部分は、ＣＤ１４８に結合する抗体分子（例えばＦａｂまたはｓｃＦｖ）を含む。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、ＣＤ１４８標的化部分は、表４の重鎖可変ドメイン配列のいずれかに由来する１つ、２つ、もしくは３つのＣＤＲ、または密接に関連するＣＤＲ、例えば、表４のＣＤＲ配列のいずれかに由来する、少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、２つ、３つ、もしくは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１４８標的化部分は、表４のアミノ酸配列のいずれかから選択される重鎖可変ドメイン配列、またはそれと実質的に同一（例えば、それと９５％〜９９．９％同一）の、もしくは少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、５、１０、または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるアミノ酸配列を含む。
【０１８０】
あるいは、または本明細書に開示されるＣＤ１４８に対する重鎖と組み合わせて、ＣＤ１４８標的化部分は、表４の軽鎖可変ドメイン配列のいずれかに由来する１つ、２つ、もしくは３つのＣＤＲ、または密接に関連するＣＤＲ、例えば、表４のＣＤＲ配列のいずれかに由来する、少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、２つ、３つ、もしくは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１４８標的化部分は、表４のアミノ酸配列のいずれかから選択される軽鎖可変ドメイン配列、またはそれと実質的に同一（例えば、それに９５％〜９９．９％同一）の、もしくは少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、５、１０、または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるアミノ酸配列を含む。
【表４−１】
2020522254.tif 000018
【表４−２】
2020522254.tif 000019
【０１８１】
ＬＡＲ標的化部分
受容体型チロシン−タンパク質ホスファターゼＦとしても知られる白血球抗原関連チロシンホスファターゼ（ＬＡＲ）は、遺伝子ＰＴＰＲＦによってコードされる。
【０１８２】
一実施形態では、本明細書に開示される多重特異性分子は、ＬＡＲに結合する標的化部分を含む。
【０１８３】
例示的なＬＡＲ標的化部分
例示的なＬＡＲ標的化部分は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、ＵＳ７８５８０８６、ＵＳ６８４６９１２、およびＵＳ６８５２４８６に開示されている。
【０１８４】
一実施形態では、ＬＡＲ標的化部分は、ＬＡＲに結合する抗体分子（例えばＦａｂまたはｓｃＦｖ）を含む。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、ＬＡＲ標的化部分は、表５の重鎖可変ドメイン配列のいずれかに由来する１つ、２つ、もしくは３つのＣＤＲ、または密接に関連するＣＤＲ、例えば、表５のＣＤＲ配列のいずれかに由来する、少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、２つ、３つ、もしくは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、ＬＡＲ標的化部分は、表５のアミノ酸配列のいずれかから選択される重鎖可変ドメイン配列、またはそれと実質的に同一（例えば、それと９５％〜９９．９％同一）の、もしくは少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、５、１０、または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるアミノ酸配列を含む。
【０１８６】
あるいは、または本明細書に開示されるＬＡＲに対する重鎖と組み合わせて、ＬＡＲ標的化部分は、表５の軽鎖可変ドメイン配列のいずれかに由来する１つ、２つ、もしくは３つのＣＤＲ、または密接に関連するＣＤＲ、例えば、表５のＣＤＲ配列のいずれかに由来する、少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、２つ、３つ、もしくは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、ＬＡＲ標的化部分は、表５のアミノ酸配列のいずれかから選択される軽鎖可変ドメイン配列、またはそれと実質的に同一（例えば、それに９５％〜９９．９％同一）の、もしくは少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、５、１０、または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存的置換）であるアミノ酸配列を含む。
【表５】
2020522254.tif 000020
【０１８７】
ＴＧＦβアンタゴニスト
本開示は、ＴＧＦβアンタゴニスト、例えば、ＴＧＦβに結合することができるＴＧＦβ受容体、またはその機能断片もしくは変異型を含むポリペプチドを含む多重特異性分子も提供する。一実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストはＴＧＦβ受容体の細胞外ドメインを含む。一実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストは、ＴＧＦβ受容体Ｉ型の細胞外ドメイン、またはその機能断片もしくは変異型を含む。アクチビン受容体様キナーゼ５（ＡＬＫ−５）またはセリン／スレオニン−プロテインキナーゼ受容体Ｒ４（ＳＫＲ４）としても知られるＴＧＦβ受容体Ｉ型は、遺伝子ＴＧＦＢＲ１によってコードされる。一実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストは、ＴＧＦβ受容体ＩＩ型の細胞外ドメイン、またはその機能断片もしくは変異型を含む。ＴＧＦβ受容体ＩＩ型は遺伝子ＴＧＦＢＲ２によってコードされる。一実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストは、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３からなる群から選択されるＴＧＦβに結合する。一実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストは、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３の全てに結合する。一実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストはＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３に結合する。
【０１８８】
例示的なＴＧＦβアンタゴニスト
例示的なＴＧＦβアンタゴニストは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、ＵＳ８９９３５２４、ＵＳ９６７６８６３、ＵＳ９６１１３０６、ＵＳ８３１８１３５、およびＷＯ２０１７／０３７７６３４に開示されている。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストは、表６の任意のアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一（例えば、それと７５％、８−０％、８５％、９０％、９５％、または９９．９％同一）の、もしくは少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、５、１０、１５、または２０個以下の改変（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば保存置換）であるアミノ酸配列を含む。
【表６−１】
2020522254.tif 000021
【表６−２】
2020522254.tif 000022
【０１９０】
腫瘍標的化部分
本開示は、とりわけ、分子を腫瘍細胞に指向する、１つまたは２つの腫瘍特異性標的化部分、例えばＭＰＬおよびＭＰＬ以外の標的に結合する腫瘍標的化部分を含むか、または含むように操作される多重特異性（例えば、二重、三重、四重特異性）分子を提供する。
【０１９１】
本明細書で使用される場合、「腫瘍標的化部分」は、がん細胞内の標的を認識またはそれと会合する、例えばそれに結合する結合剤を指す。腫瘍標的化部分は、がん抗原（例えば、ＭＰＬ、腫瘍、および／または間質抗原）に結合する、抗体分子、受容体分子（例えば、全長受容体、その受容体断片、または融合体（例えば、受容体−Ｆｃ融合体））、またはリガンド分子（例えば、全長リガンド、そのリガンド断片、もしくは融合体（例えば、リガンド−Ｆｃ融合体））であり得る。実施形態では、腫瘍標的化部分は、標的腫瘍に特異的に結合する、例えば、標的腫瘍に優先的に結合する。例えば、腫瘍標的化部分が抗体分子である場合、それは、約１０ｎＭ未満、より典型的には１０〜１００ｐＭの解離定数でがん抗原（例えば、ＭＰＬ、腫瘍抗原、および／または間質抗原）に結合する。
【０１９２】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される多重特異性分子は、腫瘍標的化部分、例えば、ＭＰＬ以外の標的に結合する腫瘍標的化部分を含む。腫瘍標的化部分は、抗体分子（例えば、本明細書に記載される抗原結合ドメイン）、受容体もしくは受容体断片、またはリガンドもしくはリガンド断片、またはそれらの組み合わせから選択することができる。いくつかの実施形態では、腫瘍標的化部分は、腫瘍細胞（例えば腫瘍細胞の表面上に存在する分子、例えば抗原）と会合する、例えばそれに結合する。ある特定の実施形態では、腫瘍標的化部分は、例えば、本明細書に開示される多重特異性分子をがん（例えば、がんまたは腫瘍細胞）に標的化、例えば指向する。いくつかの実施形態では、がんは、血液癌、固形癌、転移癌、またはそれらの組み合わせから選択される。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、多重特異性分子、例えば腫瘍標的化部分は、固形腫瘍抗原または間質抗原に結合する。固形腫瘍抗原または間質抗原は、固形腫瘍またはその転移病変上に存在し得る。いくつかの実施形態では、固形腫瘍は、膵臓癌（例えば膵臓腺癌）、乳癌、結腸直腸癌、肺癌（例えば、小細胞または非小細胞肺癌）、皮膚癌、卵巣癌、または肝臓癌のうちの１つ以上から選択される。一実施形態では、固形腫瘍は線維性または線維形成性固形腫瘍である。例えば、固形腫瘍抗原または間質抗原は、腫瘍、例えば、制限された腫瘍灌流、圧迫血管、または線維性腫瘍間質のうちの１つ以上を有することにより代表されるクラスの腫瘍上に存在し得る。
【０１９４】
ある特定の実施形態では、固形腫瘍抗原は、ＰＤＬ１、ＣＤ４７、メソセリン、ガングロシド２（ＧＤ２）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＭＳＡ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、Ｒｏｎキナーゼ、ｃ−Ｍｅｔ、未成熟ラミニン受容体、ＴＡＧ−７２、ＢＩＮＧ−４、カルシウム活性化クロライドチャネル２、サイクリン−Ｂ１、９Ｄ７、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＥｐｈＡ３、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、テロメラーゼ、ＳＡＰ−１、サバイビン、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１、ＰＲＡＭＥ、ＳＳＸ−２、メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１、Ｇｐ１００／ｐｍｅｌ１７、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１／−２、ＭＣ１Ｒ、β−カテニン、ＢＲＣＡ１／２、ＣＤＫ４、ＣＭＬ６６、フィブロネクチン、ｐ５３、Ｒａｓ、ＴＧＦ−Β受容体、ＡＦＰ、ＥＴＡ、ＭＡＧＥ、ＭＵＣ−１、ＣＡ−１２５、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、β−カテニン、ＣＤＫ４、ＣＤＣ２７、ＣＤ４７、αアクチニン−４、ＴＲＰ１／ｇｐ７５、ＴＲＰ２、ｇｐ１００、メラン−Ａ／ＭＡＲＴ１、ガングリオシド、ＷＴ１、ＥｐｈＡ３、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＣＤ２０、ＭＡＲＴ−２、ＭＡＲＴ−１、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＭ１、ＭＵＭ２、ＭＵＭ３、ＮＡ８８−１、ＮＰＭ、ＯＡ１、ＯＧＴ、ＲＣＣ、ＲＵＩ１、ＲＵＩ２、ＳＡＧＥ、ＴＲＧ、ＴＲＰ１、ＴＳＴＡ、葉酸受容体アルファ、Ｌ１−ＣＡＭ、ＣＡＩＸ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ｇｐＡ３３、ＧＤ３、ＧＭ２、ＶＥＧＦＲ、インターグリン（インテグリンアルファＶベータ３、インテグリンアルファ５ベータ１）、炭水化物（Ｌｅ）、ＩＧＦ１Ｒ、ＥＰＨＡ３、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、またはＲＡＮＫＬのうちの１つ以上から選択される。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、固形腫瘍抗原は、ＰＤＬ１、メソセリン、ＣＤ４７、ＧＤ２、ＰＭＳＡ、ＰＳＣＡ、ＣＥＡ、Ｒｏｎキナーゼ、またはｃ−Ｍｅｔから選択される。
【０１９６】
他の実施形態では、多重特異性分子、例えば腫瘍標的化部分は、血液癌、例えば白血病またはリンパ腫の表面上に存在する分子、例えば抗原に結合する。いくつかの実施形態では、血液癌はＢ細胞またはＴ細胞の悪性腫瘍である。いくつかの実施形態では、血液癌は、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（例えば、Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、有毛細胞白血病）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、多発性骨髄腫、または急性リンパ球性白血病のうちの１つ以上から選択される。実施形態では、がんは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）または骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）以外のものである。実施形態では、血液学的抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、またはＣＤ２０から選択される。実施形態では、血液学的抗原はＣＤ３３以外のものである。ＣＤ１９、実施形態では、血液学的抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ４７、ＣＤ１２３、ＣＤ２０、ＣＤ９９、ＣＤ３０、ＢＣＭＡ、ＣＤ３８、ＣＤ２２、ＳＬＡＭＦ７、またはＮＹ−ＥＳＯ１から選択される。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される多重特異性分子のいずれかも、
（Ｉ）
（ａ）メソセリン、ＧＤ２、ＰＭＳＡ、ＣＥＡ、Ｒｏｎキナーゼ、もしくはｃ−Ｍｅｔから選択される固形腫瘍抗原に対する抗体分子、および／または
（ｂ）間質抗原に対する抗体分子は、ＦＡＰ、ヒアルロン酸、コラーゲンＩＶ、テネイシンＣ、もしくはテネイシンＷから選択されるか、あるいは
（ｃ）固形腫瘍抗原に対する抗体分子と間質抗原に対する抗体分子との組み合わせを含む腫瘍標的化部分をさらに含み得る。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、多機能性分子は間質修飾部分を含む。本明細書で使用される場合、「間質修飾部分」は、間質の成分を改変する、例えば分解させることができる薬剤、例えばタンパク質（例えば酵素）を指す。実施形態では、間質の成分は、例えばＥＣＭ成分、例えばグリコサミノグリカン、例えばヒアルロナン（ヒアルロン酸またはＨＡとしても知られる）、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン、デルマタン硫酸、ヘパリン硫酸、ヘパリン、エンタクチン、テネイシン、アグリカンおよびケラチン硫酸、または細胞外タンパク質、例えば、コラーゲン、ラミニン、エラスチン、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、およびビトロネクチンから選択される。
【０１９９】
サイトカイン分子
いくつかの実施形態では、多重特異性分子はサイトカイン分子をさらに含む。本明細書で使用される場合、「サイトカイン分子」は、サイトカインの全長、断片、または変異型を指し、サイトカインは、受容体ドメイン、例えばサイトカイン受容体二量体化ドメイン、または天然に存在するサイトカインの少なくとも１つの活性を誘発する、サイトカイン受容体のアゴニスト、例えばサイトカイン受容体に対する抗体分子（例えばアゴニスト抗体）をさらに含む。いくつかの実施形態では、サイトカイン分子は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）、もしくはインターフェロンガンマ、またはそれらの断片もしくは変異型、または前述のサイトカインのいずれかの組み合わせから選択される。サイトカイン分子は、単量体または二量体であり得る。実施形態では、サイトカイン分子は、サイトカイン受容体二量体化ドメインをさらに含み得る。他の実施形態では、サイトカイン分子は、サイトカイン受容体のアゴニスト、例えば、ＩＬ−１５ＲａまたはＩＬ−２１Ｒから選択されるサイトカイン受容体に対する抗体分子（例えばアゴニスト抗体）である。
【０２００】
サイトカインは一般に、例えばシグナル伝達経路を介して細胞活性に影響を与えるポリペプチドである。したがって、多重特異性または多機能性ポリペプチドのサイトカインは有用であり、細胞膜の外側からシグナルを伝達して細胞内の応答を調節する受容体媒介シグナル伝達と関連付けることができる。サイトカインは、免疫応答のメディエーターであるタンパク質性シグナル伝達化合物である。それらは、増殖、分化、および細胞生存／アポトーシスを含む多くの異なる細胞機能を制御し、サイトカインは、ウイルス感染および自己免疫疾患を含むいくつかの病態生理学的プロセスにも関与する。サイトカインは、自然（単球、マクロファージ、樹状細胞）および適応（ＴおよびＢ細胞）免疫系の両方の様々な細胞によって、様々な刺激下で合成される。サイトカインは、炎症促進性および抗炎症性の２つのグループに分類され得る。ＩＦＮγ、ＩＬ−１、ＩＬ−６、およびＴＮＦ−アルファを含む炎症促進性サイトカインは、主に自然免疫細胞およびＴｈ１細胞に由来する。ＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、およびＩＬ−５を含む抗炎症性サイトカインは、Ｔｈ２免疫細胞から合成される。
【０２０１】
本開示は、とりわけ、１つ以上のサイトカイン分子、例えば免疫調節性（例えば炎症促進性）サイトカインおよびその変異型、例えば機能変異型を含む、例えばそれを含むように操作された多重特異性（例えば、二重、三重、四重特異性）タンパク質を提供する。したがって、いくつかの実施形態では、サイトカイン分子はインターロイキンまたはその変異型、例えばその機能変異型である。いくつかの実施形態では、インターロイキンは炎症促進性インターロイキンである。いくつかの実施形態では、インターロイキンは、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、またはインターフェロンガンマから選択される。いくつかの実施形態では、サイトカイン分子は炎症促進性サイトカインである。
【０２０２】
ある特定の実施形態では、サイトカインは単鎖サイトカインである。ある特定の実施形態では、サイトカインは多鎖サイトカインである（例えば、サイトカインは２つ以上（例えば２つ）のポリペプチド鎖を含む）。例示的な多鎖サイトカインはＩＬ−１２である。
【０２０３】
有用なサイトカインの例としては、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α、およびＴＮＦβが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、多重特異性または多機能性ポリペプチドのサイトカインは、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、およびＴＧＦ−βの群から選択されるサイトカインである。
【０２０４】
一実施形態では、多重特異性または多機能性ポリペプチドのサイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＦＮ−α、およびＩＦＮ−γの群から選択されるサイトカインである。ある特定の実施形態では、サイトカインは、Ｎ−および／またはＯ−グリコシル化部位を除去するために突然変異される。グリコシル化の排除により、組換え産生で得られる産物の均一性が増加する。
【０２０５】
一実施形態では、多重特異性または多機能性ポリペプチドのサイトカインはＩＬ−２である。具体的な実施形態では、ＩＬ−２サイトカインは、活性化Ｔリンパ球細胞における増殖、活性化Ｔリンパ球細胞における分化、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）活性、活性化Ｂ細胞における増殖、活性化Ｂ細胞における分化、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞における増殖、ＮＫ細胞における分化、活性化Ｔ細胞またはＮＫ細胞によるサイトカイン分泌、およびＮＫ／リンパ球活性化キラー（ＬＡＫ）抗腫瘍細胞傷害性からなる群から選択される細胞応答のうちの１つ以上を誘発することができる。別の特定の実施形態では、ＩＬ−２サイトカインは、ＩＬ−２受容体の．アルファ．−サブユニットに対する結合親和性が低減した変異体ＩＬ−２サイトカインである。
【０２０６】
上記の実施形態のいずれかによるＩＬ−２または変異体ＩＬ−２サイトカインは、発現または安定性の増加などのさらなる利点を提供する追加の突然変異を含み得る。例えば、１２５位のシステインをアラニンなどの中性アミノ酸で代置して、ジスルフィド架橋ＩＬ−２二量体の形成を回避することができる。したがって、ある特定の実施形態では、本発明による多重特異性または多機能性ポリペプチドのＩＬ−２または変異体ＩＬ−２サイトカインは、ヒトＩＬ−２の残基１２５に対応する位置に追加のアミノ酸突然変異を含む。一実施形態では、上記追加のアミノ酸突然変異は、アミノ酸置換Ｃ１２５Ａである。
【０２０７】
別の実施形態では、多重特異性または多機能性ポリペプチドのサイトカインはＩＬ−１５である。具体的な実施形態では、上記ＩＬ−１５サイトカインは、ＩＬ−１５受容体のα−サブユニットに対する結合親和性が低減した変異体ＩＬ−１５サイトカインである。理論に拘束されることを望むものではないが、ＩＬ−１５受容体の．アルファ．−サブユニットへの結合が低減した変異体ＩＬ−１５ポリペプチドは、身体全体の線維芽細胞への結合能が低減し、野生型ＩＬ−１５ポリペプチドと比較して薬物動態および毒性プロファイルが改善される。記載される変異体ＩＬ−２および変異体ＩＬ−１５のエフェクター部分などの毒性が低減したサイトカインの使用は、Ｆｃドメインの存在により長い血清半減期を有する本発明による多重特異性または多機能性ポリペプチドにおいて特に有利である。一実施形態では、本発明による多重特異性または多機能性ポリペプチドの変異体ＩＬ−１５サイトカインは、突然変異していない変異体ＩＬ−１５サイトカインと比較して、変異体ＩＬ−１５サイトカインの、ＩＬ−１５受容体の．アルファ．−サブユニットに対する親和性を低減または消失させるが、変異体ＩＬ−１５サイトカインの中間親和性ＩＬ−１５／ＩＬ−２受容体（ＩＬ−１５／ＩＬ−２受容体の．ベータ．−サブユニットおよび．ガンマ．−サブユニットからなる）に対する親和性を保持する少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含む。一実施形態では、アミノ酸突然変異はアミノ酸置換である。具体的な実施形態では、変異体ＩＬ−１５サイトカインは、ヒトＩＬ−１５の残基５３に対応する位置にアミノ酸置換を含む。より具体的な実施形態では、変異体ＩＬ−１５サイトカインは、アミノ酸置換Ｅ５３Ａを含むヒトＩＬ−１５である。一実施形態では、変異体ＩＬ−１５サイトカインは、ヒトＩＬ−１５の位置７９に対応する位置にアミノ酸突然変異をさらに含み、これはＩＬ−１５のＮ−グリコシル化部位を排除する。特に、上記追加のアミノ酸突然変異は、アスパラギン残基をアラニン残基に代置するアミノ酸置換である。一実施形態では、ＩＬ−１５サイトカインは、活性化Ｔリンパ球細胞における増殖、活性化Ｔリンパ球細胞における分化、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）活性、活性化Ｂ細胞における増殖、活性化Ｂ細胞における分化、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞における増殖、ＮＫ細胞における分化、活性化Ｔ細胞またはＮＫ細胞によるサイトカイン分泌、およびＮＫ／リンパ球活性化キラー（ＬＡＫ）抗腫瘍細胞傷害性からなる群から選択される細胞応答のうちの１つ以上を誘発することができる。
【０２０８】
多重特異性または多機能性ポリペプチドのエフェクター部分として有用な変異体サイトカイン分子は、当該技術分野で周知の遺伝的または化学的方法を使用して、欠失、置換、挿入、または修飾により調製することができる。遺伝的方法には、コード化ＤＮＡ配列の部位特異的変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成などが含まれ得る。正しいヌクレオチド変化は、例えば配列決定により検証することができる。置換または挿入には、天然および非天然のアミノ酸残基伴う場合がある。アミノ酸修飾には、グリコシル化部位または炭水化物付着などの付加または除去などの化学修飾の周知の方法が含まれる。
【０２０９】
一実施形態では、多重特異性または多機能性ポリペプチドのサイトカイン、特に単鎖サイトカインはＧＭ−ＣＳＦである。具体的な実施形態では、ＧＭ−ＣＳＦサイトカインは、顆粒球、単球、または樹状細胞の増殖および／または分化を誘発することができる。一実施形態では、多重特異性または多機能性ポリペプチドのサイトカイン、特に単鎖サイトカインはＩＦＮ−αである。具体的な実施形態では、ＩＦＮ−αサイトカインは、ウイルス感染細胞におけるウイルス複製の阻害、および主要組織適合性複合体Ｉ（ＭＨＣ  Ｉ）の発現の上方調節からなる群から選択される細胞応答のうちの１つ以上を誘発することができる。別の具体的な実施形態では、ＩＦＮ−αサイトカインは腫瘍細胞の増殖を阻害することができる。一実施形態では、多重特異性または多機能性ポリペプチドのサイトカイン、特に単鎖サイトカインはＩＦＮγである。具体的な実施形態では、ＩＦＮ−γサイトカインは、マクロファージ活性の増加、ＭＨＣ分子の発現の増加、およびＮＫ細胞活性の増加の群から選択される細胞応答のうちの１つ以上を誘発することができる。一実施形態では、多重特異性または多機能性ポリペプチドのサイトカイン、特に単鎖サイトカインはＩＬ−７である。具体的な実施形態では、ＩＬ−７サイトカインはＴおよび／またはＢリンパ球の増殖を誘発することができる。一実施形態では、多重特異性または多機能性ポリペプチドのサイトカイン、特に単鎖サイトカインはＩＬ−８である。具体的な実施形態では、ＩＬ−８サイトカインは好中球の走化性を誘発することができる。一実施形態では、多重特異性または多機能性ポリペプチドのサイトカイン、特に単鎖サイトカインはＭＩＰ−１αである。具体的な実施形態では、ＭＩＰ−１αサイトカインは、単球およびＴリンパ球細胞において走化性を誘発することができる。一実施形態では、多重特異性または多機能性ポリペプチドのサイトカイン、特に単鎖サイトカインはＭＩＰ−１βである。具体的な実施形態では、ＭＩＰ−１βサイトカインは単球およびＴリンパ球細胞において走化性を誘発することができる。一実施形態では、多重特異性または多機能性ポリペプチドのサイトカイン、特に単鎖サイトカインはＴＧＦ−βである。具体的な実施形態では、ＴＧＦ−βサイトカインは、単球における走化性、マクロファージにおける走化性、活性化マクロファージにおけるＩＬ−１発現の上方調節、および活性化Ｂ細胞におけるＩｇＡ発現の上方調節からなる群から選択される細胞応答のうちの１つ以上を誘発することができる。
【０２１０】
一実施形態では、本発明の多重特異性または多機能性ポリペプチドは、対照サイトカインよりも少なくとも約１倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、５．５倍、６倍、６．５倍、７倍、７．５倍、８倍、８．５倍、９倍、９．５倍、または１０倍大きい解離定数（ＫＤ）でサイトカイン受容体に結合する。別の実施形態では、多重特異性または多機能性ポリペプチドは、２つ以上のエフェクター部分を含む対応する多重特異性または多機能性ポリペプチドよりも少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍大きいＫＤでサイトカイン受容体に結合する。別の実施形態では、多重特異性または多機能性ポリペプチドは、２つ以上のサイトカインを含む対応する多重特異性または多機能性ポリペプチドよりも約１０倍大きい解離定数ＫＤでサイトカイン受容体に結合する。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される多重特異性分子はサイトカイン分子を含む。実施形態では、サイトカイン分子は、サイトカインの全長、断片、もしくは変異型、サイトカイン受容体ドメイン、例えばサイトカイン受容体二量体化ドメイン、またはサイトカイン受容体のアゴニスト、例えばサイトカイン受容体に対する抗体分子（例えばアゴニスト抗体）を含む。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、サイトカイン分子は、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、もしくはインターフェロンガンマ、またはそれらの断片もしくは変異型、または前述のサイトカインのいずれかの組み合わせから選択される。サイトカイン分子は、単量体または二量体であり得る。実施形態では、サイトカイン分子は、サイトカイン受容体二量体化ドメインをさらに含み得る。
【０２１３】
他の実施形態では、サイトカイン分子は、サイトカイン受容体のアゴニスト、例えば、ＩＬ−１５ＲａまたはＩＬ−２１Ｒから選択されるサイトカイン受容体に対する抗体分子（例えばアゴニスト抗体）である。
【０２１４】
免疫細胞エンゲージャー
本明細書に開示される多重特異性分子の免疫細胞エンゲージャーは、免疫細胞、例えば免疫エフェクター細胞への結合および／またはその活性化を媒介することができる。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、またはマクロファージ細胞エンゲージャー、またはそれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、免疫細胞エンゲージャーは、Ｔ細胞エンゲージャー、ＮＫ細胞エンゲージャー、Ｂ細胞エンゲージャー、樹状細胞エンゲージャー、またはマクロファージ細胞エンゲージャー、またはそれらの組み合わせのうちの１つ、２つ、３つ、または全てから選択される。免疫細胞エンゲージャーは、免疫系のアゴニストであり得る。いくつかの実施形態では、免疫細胞エンゲージャーは、抗体分子、リガンド分子（例えば、免疫グロブリン定常領域、例えば、Ｆｃ領域をさらに含むリガンド）、小分子、ヌクレオチド分子であり得る。
【０２１５】
「免疫細胞エンゲージャー」は、免疫細胞、例えば免疫応答に関与する細胞に結合し、かつ／またはそれを活性化する１つ以上の結合特異性を指す。実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、および／またはマクロファージ細胞から選択される。免疫細胞エンゲージャーは、免疫細胞抗原（例えば、ＮＫ細胞抗原、Ｂ細胞抗原、樹状細胞抗原、および／またはマクロファージ細胞抗原）に結合する、抗体分子、受容体分子（例えば、全長受容体、その受容体断片、または融合体（例えば、受容体−Ｆｃ融合体））、またはリガンド分子（例えば、全長リガンド、そのリガンド断片、もしくは融合体（例えば、リガンド−Ｆｃ融合体））であり得る。実施形態では、免疫細胞エンゲージャーは、標的免疫細胞に特異的に結合し、例えば、標的免疫細胞に優先的に結合する。例えば、免疫細胞エンゲージャーが抗体分子である場合、約１０ｎＭ未満、より典型的には１０〜１００ｐＭの解離定数で免疫細胞抗原（例えば、ＮＫ細胞抗原、Ｂ細胞抗原、樹状細胞抗原、および／またはマクロファージ細胞抗原）に結合する。
【０２１６】
ナチュラルキラー細胞エンゲージャー
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、抗体非依存様式で腫瘍およびウイルス感染細胞を認識し破壊する。ＮＫ細胞の調節は、ＮＫ細胞表面上の受容体を活性化および阻害することにより媒介される。活性化受容体の１つのファミリーは、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、およびＮＫｐ４６を含む天然の細胞傷害性受容体（ＮＣＲ）である。ＮＣＲは、がん細胞上のヘパラン硫酸を認識することにより、腫瘍の標的化を開始する。ＮＫＧ２Ｄは、活性化キラー（ＮＫ）細胞に刺激性および共刺激性両方の自然免疫応答を提供し、細胞傷害活性をもたらす受容体である。ＤＮＡＭ１は、細胞間接着、リンパ球シグナル伝達、細胞傷害性、ならびに細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）およびＮＫ細胞により媒介されるリンホカイン分泌に関与する受容体である。ＤＡＰ１０（ＨＣＳＴとしても知られる）は、ＫＬＲＫ１と会合してリンパ球および骨髄細胞で活性化受容体ＫＬＲＫ１−ＨＣＳＴを形成する膜貫通アダプタータンパク質である。この受容体は、ＭＨＣクラスＩ鎖関連ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢなどの細胞表面リガンド、およびＵ（場合によりＬ１）６結合タンパク質（ＵＬＢＰ）を発現する標的細胞に対する細胞傷害性の誘発において主要な役割を果たし、ＫＬＲＫ１−ＨＣＳＴ受容体は、腫瘍に対する免疫監視において役割を果たし、また腫瘍細胞の細胞溶解に必要である。実際、ＫＬＲＫ１リガンドを発現しないメラノーマ細胞は、ＮＫ細胞により媒介される免疫監視から免れる。ＣＤ１６はＩｇＧのＦｃ領域の受容体であり、複合または凝集したＩｇＧおよび単量体ＩｇＧにも結合し、それによって抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）および食作用などの他の抗体依存性応答を媒介する。
【０２１７】
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞エンゲージャーは、ウイルス血球凝集素（ＨＡ）であり、ＨＡはインフルエンザウイルスの表面上に見られる糖タンパク質である。上気道の細胞または赤血球など、膜にシアル酸を含む細胞へのウイルスの結合に関与する。ＨＡは少なくとも１８の異なる抗原を有する。これらのサブタイプは、Ｈ１〜Ｈ１８と名づけられている。ＮＣＲはウイルスタンパク質を認識することができる。ＮＫｐ４６は、インフルエンザのＨＡおよびセンダイウイルスおよびニューカッスル病ウイルスを含むパラミクソウイルスのＨＡ−ＮＡと相互作用することができることが示されている。ＮＫｐ４６に加えて、ＮＫｐ４４は異なるインフルエンザサブタイプのＨＡと機能的に相互作用することもできる。
【０２１８】
本開示は、とりわけ、ＮＫ細胞への結合および／またはその活性化を媒介する１つ以上のＮＫ細胞エンゲージャーを含むように操作される多重特異性（例えば、二重、三重、四重特異性）タンパク質を提供する。したがって、いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞エンゲージャーは、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、ＤＮＡＭ１、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ１６（例えば、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、またはその両方）、ＣＲＴＡＭ、ＣＤ２７、ＰＳＧＬ１、ＣＤ９６、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＮＫｐ８０、ＣＤ２４４（ＳＬＡＭＦ４または２Ｂ４としても知られる）、ＳＬＡＭＦ６、ＳＬＡＭＦ７、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＫＩＲ３ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ５、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、またはＣＤ１６０に結合する（例えば活性化する）抗原結合ドメインまたはリガンドから選択される。
【０２１９】
Ｔ細胞エンゲージャー
本開示は、とりわけ、Ｔ細胞への結合および／またはその活性化を媒介する１つ以上のＴ細胞エンゲージャーを含むように操作される多重特異性（例えば、二重、三重、四重特異性）タンパク質を提供する。したがって、いくつかの実施形態では、Ｔ細胞エンゲージャーは、ＣＤ３、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲζ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ４０、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＤＲ３、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＴＩＭ１、ＳＬＡＭ、ＣＤ２、またはＣＤ２２６のうちの１つ以上に結合する（例えば、いくつかの実施形態では活性化する）抗原結合ドメインまたはリガンドから選択される。他の実施形態では、Ｔ細胞エンゲージャーは、ＣＤ３、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲζ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ４０、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＤＲ３、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＴＩＭ１、ＳＬＡＭ、ＣＤ２、またはＣＤ２２６のうちの１つ以上に結合し、それらを活性化しない抗原結合ドメインまたはリガンドから選択される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞エンゲージャーはＣＤ３に結合する。
【０２２０】
Ｂ細胞、マクロファージ、および樹状細胞のエンゲージャー
概して、Ｂリンパ球としても知られるＢ細胞は、リンパ球のサブタイプの白血球の一種である。それらは、抗体を分泌することにより、適応免疫系の体液性免疫成分において機能する。加えて、Ｂ細胞は抗原を提示し（プロフェッショナルな抗原提示細胞（ＡＰＣ）としても分類される）、サイトカインを分泌する。マクロファージは白血球の一種で、食作用により細胞残屑、異物、微生物、がん細胞を飲み込み消化する。食作用に加えて、それらは、非特異的防御（自然免疫）において重要な役割を果たし、リンパ球などの他の免疫細胞を動員することにより特定の防御機構（適応免疫）を開始するのにも役立つ。例えば、それらはＴ細胞に対する抗原提示者として重要である。炎症の増加および免疫系の刺激以外に、マクロファージは重要な抗炎症の役割も果たし、サイトカインの放出を通じて免疫反応を減少させることができる。樹状細胞（ＤＣ）は、抗原材料のプロセシングの際に機能し、それを細胞表面上で免疫系のＴ細胞に提示する抗原提示細胞である。
【０２２１】
本開示は、とりわけ、Ｂ細胞、マクロファージ、および／もしくは樹状細胞への結合および／またはそれらの活性化を媒介する１つ以上のＢ細胞、マクロファージ、および／または樹状細胞エンゲージャーを含む、例えば、それらを含むように操作される多重特異性（例えば、二重、三重、四重特異性）タンパク質を提供する。
【０２２２】
したがって、いくつかの実施形態では、免疫細胞エンゲージャーは、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）もしくはＣＤ７０リガンド、ＣＤ４０もしくはＣＤ７０に結合する抗体分子、ＯＸ４０に対する抗体分子、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）、Ｔｏｌｌ様受容体のアゴニスト（例えば、本明細書に記載される、例えばＴＬＲ４、例えば構成的に活性なＴＬＲ４（ｃａＴＬＲ４）またはＴＬＲ９アゴニスト）、４１ＢＢ、ＣＤ２、ＣＤ４７、またはＳＴＩＮＧアゴニスト、またはそれらの組み合わせのうちの１つ以上から選択されるＢ細胞、マクロファージ、および／または樹状細胞エンゲージャーを含む。
【０２２３】
いくつかの実施形態では、Ｂ細胞エンゲージャーは、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、もしくはＣＤ７０リガンド、またはＯＸ４０、ＣＤ４０もしくはＣＤ７０に結合する抗体分子である。
【０２２４】
いくつかの実施形態では、マクロファージエンゲージャーはＣＤ２アゴニストである。いくつかの実施形態では、マクロファージエンゲージャーは、ＣＤ４０Ｌ、またはＣＤ４０に結合する抗原結合ドメインもしくはリガンド、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト（例えば、本明細書に記載されるような）、例えばＴＬＲ９もしくはＴＬＲ４（例えば、ｃａＴＬＲ４（構成的に活性なＴＬＲ４）、ＣＤ４７、またはＳＴＩＮＧアゴニストに結合する抗原結合ドメインである。いくつかの実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、環状ジヌクレオチド、例えば環状ジ−ＧＭＰ（ｃｄＧＭＰ）または環状ジ−ＡＭＰ（ｃｄＡＭＰ）である。いくつかの実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストはビオチン化される。
【０２２５】
いくつかの実施形態では、樹状細胞エンゲージャーはＣＤ２アゴニストである。いくつかの実施形態では、樹状細胞エンゲージャーは、ＯＸ４０Ｌ、４１ＢＢ、ＴＬＲアゴニスト（例えば本明細書に記載されるような）（例えば、ＴＬＲ９アゴニスト、ＴＬＲ４（例えばｃａＴＬＲ４（構成的に活性なＴＬＲ４））、ＣＤ４７、またはおよびＳＴＩＮＧアゴニストのうちの１つ以上に結合するリガンド、受容体アゴニスト、または抗体分子である。いくつかの実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、環状ジヌクレオチド、例えば環状ジ−ＧＭＰ（ｃｄＧＭＰ）または環状ジ−ＡＭＰ（ｃｄＡＭＰ）である。いくつかの実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストはビオチン化される。
【０２２６】
他の実施形態では、免疫細胞エンゲージャーは、Ｂ細胞、マクロファージ、および／または樹状細胞のうちの１つ以上への結合またはそれらの活性化を媒介する。例示的な、Ｂ細胞、マクロファージ、および／または樹状細胞エンゲージャーは、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）もしくはＣＤ７０リガンド、ＣＤ４０もしくはＣＤ７０に結合する抗体分子、ＯＸ４０に対する抗体分子、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト（例えばＴＬＲ４、例えば構成的に活性なＴＬＲ４（ｃａＴＬＲ４）またはＴＬＲ９アゴニスト）、４１ＢＢアゴニスト、ＣＤ２、ＣＤ４７、またはＳＴＩＮＧアゴニスト、またはそれらの組み合わせのうちの１つ以上から選択される。
【０２２７】
いくつかの実施形態では、Ｂ細胞エンゲージャーは、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、もしくはＣＤ７０リガンド、またはＯＸ４０、ＣＤ４０もしくはＣＤ７０に結合する抗体分子のうちの１つ以上から選択される。
【０２２８】
他の実施形態では、マクロファージ細胞エンゲージャーは、ＣＤ２アゴニスト、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、ＯＸ４０、ＣＤ４０もしくはＣＤ７０に結合する抗体分子、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニストもしくはその断片（例えばＴＬＲ４、例えば構成的に活性なＴＬＲ４（ｃａＴＬＲ４））、ＣＤ４７アゴニスト、またはＳＴＩＮＧアゴニストのうちの１つ以上から選択される。
【０２２９】
他の実施形態では、樹状細胞エンゲージャーは、ＣＤ２アゴニスト、ＯＸ４０抗体、ＯＸ４０Ｌ、４１ＢＢアゴニスト、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニストもしくはその断片（例えばＴＬＲ４、例えば構成的に活性なＴＬＲ４（ｃａＴＬＲ４））、ＣＤ４７アゴニスト、またはＳＴＩＮＧアゴニストのうちの１つ以上から選択される。
【０２３０】
さらに他の実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、環状ジヌクレオチド、例えば、環状ジＧＭＰ（ｃｄＧＭＰ）、環状ジＡＭＰ（ｃｄＡＭＰ）、またはそれらの組み合わせを、場合により２’，５’または３’，５’リン酸結合とともに含む。
【０２３１】
Ｔｏｌｌ様受容体
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は、進化的に保存された受容体であり、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａのＴｏｌｌタンパク質のホモログであり、病原性微生物により排他的に発現される病原体関連微生物パターン（ＰＡＭＰ）、または壊死細胞または死細胞から放出される内因性分子である損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）として知られる高度に保存された構造モチーフを認識する。ＰＡＭＰには、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）、ペプチドグリカン（ＰＧＮ）、およびリポペプチドなどの様々な細菌細胞壁成分、ならびにフラジェリン、細菌ＤＮＡ、およびウイルス二本鎖ＲＮＡが含まれる。ＤＡＭＰには、熱ショックタンパク質などの細胞内タンパク質、ならびに細胞外マトリックスからのタンパク質断片が含まれる。対応するＰＡＭＰまたはＤＡＭＰによるＴＬＲの刺激は、ＡＰ−１、ＮＦ−κＢ、インターフェロン調節因子（ＩＲＦ）などの転写因子の活性化をもたらすシグナル伝達カスケードを開始する。ＴＬＲによるシグナル伝達は、適応免疫応答を指向するインターフェロン（ＩＦＮ）、炎症促進性サイトカイン、およびエフェクターサイトカインの産生を含む、様々な細胞応答をもたらす。ＴＬＲはいくつかの炎症性および免疫障害に関係しており、がんにおいて役割を果たす（Ｒａｋｏｆｆ−Ｎａｈｏｕｍ  Ｓ．＆  Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ  Ｒ．，２００９．Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔ  Ｒｅｖｓ  Ｃａｎｃｅｒ  ９：５７−６３。）
【０２３２】
ＴＬＲは、ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）を含む細胞外ドメインと、Ｔｏｌｌ／ＩＬ−１受容体（ＴＩＲ）ドメインと呼ばれる保存領域を含む細胞質尾部を特徴とするＩ型膜貫通タンパク質である。１０のヒトＴＬＲおよび１２のマウスＴＬＲが特徴付けられており、ＴＬＲ１〜ＴＬＲ１０はヒトであり、ＴＬＲ１〜ＴＬＲ９、ＴＬＲ１１、ＴＬＲ１２、およびＴＬＲ１３はマウスであり、ＴＬＲ１０のホモログは偽遺伝子である。ＴＬＲ２は、細菌のリポタンパク質、リポマンナン、およびリポテイコ酸を含む、グラム陽性菌由来の様々なＰＡＭＰの認識に不可欠である。ＴＬＲ３は、ウイルス由来の二本鎖ＲＮＡに関係している。ＴＬＲ４は、主にリポ多糖によって活性化される。ＴＬＲ５は細菌のフラジェリンを検出し、ＴＬＲ９は非メチル化ＣｐＧ  ＤＮＡへの応答に必要である。最後に、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８は小さな合成抗ウイルス分子を認識し、一本鎖ＲＮＡがそれらの天然のリガンドであると報告された。ＴＬＲ１１は、尿路病原性Ｅ．ｃｏｌｉおよびＴｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉのプロフィリン様タンパク質を認識することが報告されている。ＴＬＲの特異性のレパートリーは、ＴＬＲが互いにヘテロ二量体化する能力によって明らかに拡張される。例えば、ＴＬＲ２およびＴＬＲ６の二量体は、ジアシル化リポタンパク質への応答に必要であるが、ＴＬＲ２およびＴＬＲ１は相互作用してトリアシル化リポタンパク質を認識する。ＴＬＲの特異性は、ＬＰＳに応答してＴＬＲ４と複合体を形成するＭＤ−２およびＣＤ１４など、様々なアダプターおよびアクセサリー分子によっても影響を受ける。
【０２３３】
ＴＬＲシグナル伝達は、少なくとも２つの異なる経路：炎症性サイトカインの産生をもたらすＭｙＤ８８依存性経路と、ＩＦＮ−βの刺激および樹状細胞の成熟に関連するＭｙＤ８８非依存性経路とからなる。ＭｙＤ８８依存性経路は、ＴＬＲ３を除く全てのＴＬＲに共通である（Ａｄａｃｈｉ  Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，１９９８．Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＭｙＤ８８  ｇｅｎｅ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ｌｏｓｓ  ｏｆ  ＩＬ−１−  ａｎｄ  ＩＬ−１８−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．９（１）：１４３−５０）。ＰＡＭＰまたはＤＡＭＰによる活性化により、ＴＬＲはヘテロまたはホモ二量体化して、細胞質ＴＩＲドメインを介したアダプタータンパク質の動員を誘導する。個々のＴＬＲは、異なるアダプター分子の使用により異なるシグナル伝達応答を誘導する。ＴＬＲ４およびＴＬＲ２シグナル伝達には、アダプターＴＩＲＡＰ／Ｍａｌが必要であり、これは、ＭｙＤ８８依存性経路に関与している。ＴＬＲ３は、アダプターＴＲＩＦ／ＴＩＣＡＭ−１を介して、ＭｙＤ８８非依存様式で、二本鎖ＲＮＡに応答してＩＦＮ−βの産生を誘発する。ＴＲＡＭ／ＴＩＣＡＭ−２は、ＭｙＤ８８非依存性経路に関与する別のアダプター分子であり、機能はＴＬＲ４経路に制限される。
【０２３４】
ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９はウイルス核酸を認識し、Ｉ型ＩＦＮを誘導する。Ｉ型ＩＦＮの誘導をもたらすシグナル伝達機構は、活性化されたＴＬＲに応じて異なる。それらは、抗ウイルス防御、細胞成長、および免疫調節に重要な役割を果たすことが知られている転写因子のファミリーであるインターフェロン調節因子ＩＲＦを伴う。３つのＩＲＦ（ＩＲＦ３、ＩＲＦ５、およびＩＲＦ７）は、ウイルス媒介ＴＬＲシグナル伝達の直接的なトランスデューサーとして機能する。ＴＬＲ３およびＴＬＲ４はＩＲＦ３およびＩＲＦ７を活性化し、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８はＩＲＦ５およびＩＲＦ７を活性化する（Ｄｏｙｌｅ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，２００２．ＩＲＦ３  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ａ  ＴＬＲ３／ＴＬＲ４−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｇｒａｍ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．１７（３）：２５１−６３）。さらに、ＴＬＲ９リガンドＣｐＧ−Ａにより刺激されるＩ型ＩＦＮ産生は、ＰＩ（３）ＫおよびｍＴＯＲにより媒介されることが示されている（Ｃｏｓｔａ−Ｍａｔｔｉｏｌｉ  Ｍ．＆  Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ  Ｎ．２００８．ＲＡＰｐｉｎｇ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｉｎ  ｐＤＣｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｍＴＯＲ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：１０９７−１０９９）。
【０２３５】
ＴＬＲ−９
ＴＬＲ９は、ＤＮＡ分子の非メチル化ＣｐＧ配列を認識する。ＣｐＧ部位は、細菌ゲノムまたはウイルスＤＮＡと比較して脊椎動物ゲノムでは比較的まれである（約１％）。ＴＬＲ９は、Ｂリンパ球、単球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、形質細胞様樹状細胞などの免疫系の多数の細胞によって発現される。ＴＬＲ９は、エンドソームコンパートメント内で細胞内に発現し、ＣｐＧモチーフが豊富なＤＮＡに結合することにより、ウイルスおよび細菌感染の免疫系に警告するように機能する。ＴＬＲ９シグナルは、Ｉ型インターフェロンおよびＩＬ−１２などのサイトカインの産生をもたらす炎症促進性反応を開始する細胞の活性化をもたらす。
【０２３６】
ＴＬＲアゴニスト
ＴＬＲアゴニストは、１つ以上のＴＬＲ、例えば、ヒトＴＬＲ−１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のうちの１つ以上を作動させることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の補助剤はＴＬＲアゴニストである。いくつかの実施形態では、ＴＬＲアゴニストは、ヒトＴＬＲ−９を特異的に作動させる。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ−９アゴニストはＣｐＧ部分である。本明細書で使用される場合、ＣｐＧ部分は、配列：５’−Ｃ−ホスフェート−Ｇ−３’、すなわち、１つのホスフェートのみによって分離されたシトシンおよびグアニンを有する線状ジヌクレオチドである。
【０２３７】
いくつかの実施形態では、ＣｐＧ部分は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０以上のＣｐＧジヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＣｐＧ部分は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０のＣｐＧジヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、ＣｐＧ部分は、１〜５、１〜１０、１〜２０、１〜３０、１〜４０、１〜５０、５〜１０、５〜２０、５〜３０、１０〜２０、１０〜３０、１０〜４０、または１０〜５０  ＣｐＧジヌクレオチドを有する。
【０２３８】
いくつかの実施形態では、ＴＬＲ−９アゴニストは合成ＯＤＮ（オリゴデオキシヌクレオチド）である。ＣｐＧ  ＯＤＮは、特定の配列構成（ＣｐＧモチーフ）において非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む短い合成一本鎖ＤＮＡ分子である。ＣｐＧ  ＯＤＮは、ゲノム細菌ＤＮＡに見られる天然のホスホジエステル（ＰＯ）骨格とは対照的に、部分的または完全にホスホロチオエート化された（ＰＳ）骨格を有する。ＣｐＧ  ＯＤＮには、クラスＡ、Ｂ、およびＣの３つの主要なクラスがあり、それらの免疫刺激活性は異なる。ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮは、ＰＯ中心ＣｐＧ含有パリンドロームモチーフおよびＰＳ修飾された３’ポリ−Ｇストリングを特徴とする。それらはｐＤＣからの高いＩＦＮ−α産生を誘導するが、ＴＬＲ９依存性ＮＦ−κＢシグナル伝達および炎症促進性サイトカイン（例えばＩＬ−６）産生の弱い刺激因子である。ＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮは、１つ以上のＣｐＧジヌクレオチドを有する完全なＰＳ骨格を含む。それらは、Ｂ細胞およびＴＬＲ９依存性ＮＦ−κＢシグナル伝達を強く活性化するが、ＩＦＮ−α分泌を強く刺激しない。ＣｐＧ−Ｃ  ＯＤＮは、クラスＡおよびＢの両方の機能を兼ね備える。それらは、完全なＰＳ骨格およびＣｐＧ含有パリンドロームモチーフを含む。ＣクラスのＣｐＧ  ＯＤＮは、ｐＤＣからの強いＩＦＮ−α産生ならびにＢ細胞刺激を誘導する。
【０２３９】
例示的な多重特異性分子
本開示は、とりわけ、第１のＭＰＬ標的化部分、および
（ｉ）第２のＭＰＬ標的化部分、例えば、その結合部位が第１のＭＰＬ標的化部分の結合部位と重複しない第２のＭＰＬ標的化部分、
（ｉｉ）免疫細胞エンゲージャー（例えば、ＮＫ細胞エンゲージャー、Ｂ細胞エンゲージャー、樹状細胞エンゲージャー、またはマクロファージ細胞エンゲージャーのうちの１つ、２つ、３つ、または全てから選択される）、
（ｉｉｉ）サイトカイン分子、または
（ｉｖ）腫瘍標的化分子、例えば、ＭＰＬ以外の標的に対する腫瘍標的化分子のうちのいずれも含まない、１つ、２つ、もしくは３つを含む新規多重特異性分子に関する。
【０２４０】
理論に拘束されることなく、本明細書に開示される多重特異性分子は、がん細胞で、免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、またはマクロファージから選択される免疫エフェクター細胞）を標的とする（例えば、局在化する、架橋する、および／または活性化する）ことが予想される。本明細書に記載される多重特異性分子を使用して免疫細胞の近接および／または活性を増加させることによって、がん細胞に対する免疫応答が増強され、それにより、より効果的ながん治療が提供されると予想される。したがって、本明細書では、とりわけ、前述の部分を含む多重特異性分子（例えば、多重特異性抗体分子）、それをコードする核酸、前述の分子を産生する方法、および前述の分子を使用してがんを治療する方法が提供される。
【０２４１】
いくつかの実施形態では、多重特異性分子は、単鎖抗体分子、例えば、単一ドメイン抗体、ｓｃＦｖ、ラクダ科またはサメ抗体、および第２の部分を含む。いくつかの実施形態では、多重特異性分子は、場合によりリンカーを介して第２の部分に接続されるｓｃＦｖのＮからＣの配向のＶＨからＶＬを含み、ｓｃＦｖは第１の結合特異性を形成することができる。いくつかの実施形態では、第２部分は、Ｎ−からＣ−の配向のｓｃＦｖのＶＨ領域の前、またはＮ−からＣ−の配向のｓｃＦｖのＶＬ領域の後に位置し、第２の部分は、第２の結合特異性を形成することができる。他の実施形態では、多重特異性分子は、場合によりリンカーを介して第２の部分に接続されるｓｃＦｖのＮからＣの配向のＶＬからＶＨを含み、ｓｃＦｖは第１の結合特異性を形成することができる。いくつかの実施形態では、第２の部分は、Ｎ−からＣ−の配向のｓｃＦｖのＶＬ領域の前、またはＮ−からＣ−の配向のｓｃＦｖのＶＨ領域の後に位置し、第２の部分は、第２の結合特異性を形成することができる。実施形態では、ｓｃＦｖは、腫瘍標的化部分（例えば、がん抗原、例えば、固形腫瘍、間質、または血液学的抗原に結合する）であり得るか、または免疫細胞エンゲージャー（例えば、免疫細胞抗原に結合する）であり得る。他の実施形態では、第２の部分は、腫瘍標的化部分（例えば、ｓｃＦｖが腫瘍標的化部分ではない実施形態において）、免疫細胞エンゲージャー（例えば、ｓｃＦｖが免疫細胞エンゲージャーではない実施形態において）、またはサイトカイン分子（例えば、本明細書に記載されるような）である。実施形態では、パートナーＡは、例えば本明細書に記載される、抗体分子（例えば、単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）またはＦａｂ）、受容体分子、リガンド分子（例えば、受容体リガンドまたはサイトカイン分子）であり得る。一実施形態では、腫瘍標的化部分はがん細胞抗原に対するｓｃＦｖであり、第２の部分はサイトカイン分子または免疫細胞エンゲージャーから選択される。いくつかの実施形態では、第２の部分は、第２の抗体分子（例えば、第２のｓｃＦｖまたはＦａｂ）、受容体分子、リガンド分子（例えば、受容体リガンドまたはサイトカイン分子）である。
【０２４２】
いくつかの実施形態では、多重特異性分子は、単鎖抗体分子、例えば、単一ドメイン抗体、ｓｃＦｖ、ラクダ科またはサメ抗体、および第２の部分を含む。いくつかの実施形態では、多重特異性分子は、場合によりリンカーを介して第２の部分および／または第３の部分に接続されるｓｃＦｖのＮからＣの配向のＶＨからＶＬを含み、ｓｃＦｖは第１の結合特異性を形成することができる。いくつかの実施形態では、第２または第３の部分は、それぞれ、Ｎ−からＣ−の配向のｓｃＦｖのＶＨ領域の前に位置し、第３の部分はＮ−からＣ−の配向のｓｃＦｖのＶＬ領域の後に位置し、第２および第３の部分は、第２および第３の結合特異性を形成することができる。他の実施形態では、多重特異性分子は、場合によりリンカーを介して第２の部分および／または第３の部分に接続されるｓｃＦｖのＮからＣの配向のＶＬからＶＨを含む。いくつかの実施形態では、第２の部分は、Ｎ−からＣ−の配向のｓｃＦｖのＶＬ領域の前に位置し、第３の部分はＮ−からＣ−の配向のｓｃＦｖのＶＨ領域の後に位置し、第２および第３の部分は、第２および第３の結合特異性を形成することができる。実施形態では、前述の多重特異性分子のいずれかのｓｃＦｖは、腫瘍標的化部分（例えば、がん抗原、例えば、固形腫瘍、間質、または血液学的抗原に結合する）であり得るか、または免疫細胞エンゲージャー（例えば、免疫細胞抗原に結合する）であり得る。実施形態では、第２の部分および第３の部分は、腫瘍標的化部分、免疫細胞エンゲージャー、またはサイトカイン分子（例えば、本明細書に記載されるような）から独立して選択される。実施形態では、パートナーＡおよび／またはパートナーＢは、例えば本明細書に記載される、抗体分子（例えば、単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖまたはＦａｂ）、受容体分子、またはリガンド分子（例えば、受容体リガンドまたはサイトカイン分子）であり得る。一実施形態では、腫瘍標的化部分はがん細胞抗原に対するｓｃＦｖであり、第２の部分および第３の部分はサイトカイン分子または免疫細胞エンゲージャーから独立して選択される。いくつかの実施形態では、第２の部分および第３の部分は、第２の抗体分子（例えば、第２のｓｃＦｖまたはＦａｂ）、受容体分子、またはリガンド分子（例えば、受容体リガンドまたはサイトカイン分子）から独立して選択される。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、多重特異性分子は、ＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩ）に結合するＮＫ細胞エンゲージャーの単鎖ポリペプチド（すなわちｓｃＦｖ）、および腫瘍標的化部分、すなわちＣＤ３３を標的とするｓｃＦｖからならない。他の実施形態では、多重特異性分子は、ＣＤ１６に結合するｓｃＦｖの単鎖ポリペプチド、ＩＬ−１５サイトカイン、およびＣＤ３３を標的とするｓｃＦｖからならない。
【０２４４】
実施形態では、多重特異性分子は二重特異性または二機能性分子であり、第１および第２のポリペプチド（ｉ）および（ｉｉ）は非隣接であり、例えば２つの別個のポリペプチド鎖である。
【０２４５】
実施形態では、第２の部分は、例えば本明細書に記載される、抗体分子（例えば、単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）またはＦａｂ）、受容体分子、リガンド分子（例えば、受容体リガンドまたはサイトカイン分子）であり得る。一実施形態では、多重特異性分子はＦａｂ分子を含み、第２の部分は、第２の抗体分子（例えば、ｓｃＦｖまたは第２のＦａｂ）、受容体分子、もしくは受容体リガンド分子、またはサイトカイン分子から選択される。一実施形態では、腫瘍標的化部分はがん細胞抗原に対するＦａｂであり、第２の部分はサイトカイン分子または免疫細胞エンゲージャーから選択される。いくつかの実施形態では、第２の部分は、第２の抗体分子（例えば、第２のｓｃＦｖまたはＦａｂ）、受容体分子、もしくは受容体リガンド分子、またはサイトカイン分子である。
【０２４６】
実施形態では、多重特異性分子は二重特異性または二機能性分子であり、第１および第２のポリペプチド（ｉ）および（ｉｉ）は非隣接であり、例えば２つの別個のポリペプチド鎖である。実施形態では、第２の部分は、例えば本明細書に記載される、抗体分子（例えば、単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）またはＦａｂ）、受容体分子、またはリガンド分子（例えば、受容体リガンドまたはサイトカイン分子）であり得る。一実施形態では、多重特異性分子はＦａｂ分子を含み、第２の部分は、第２の抗体分子（例えば、ｓｃＦｖまたは第２のＦａｂ）、受容体分子、またはリガンド分子（例えばサイトカイン分子）から選択される。一実施形態では、腫瘍標的化部分はがん細胞抗原に対するＦａｂであり、第２の部分はサイトカイン分子または免疫細胞エンゲージャーから選択される。いくつかの実施形態では、第２の部分は、第２の抗体分子（例えば、第２のｓｃＦｖまたはＦａｂ）、受容体分子、受容体リガンド分子、またはサイトカイン分子である。
【０２４７】
一実施形態では、多重特異性分子は、少なくとも２つ、または少なくとも３つ、または少なくとも４つの非隣接ポリペプチドを含み、
（ｉ）第１のポリペプチドは、Ｎ−からＣ−の配向に第１の免疫グロブリン定常領域（例えばＣＨ３領域に接続されたＣＨ２）（例えば第１のＦｃ領域）を含み、
（ｉｉ）第２のポリペプチドは、Ｎ−からＣ−の配向に第２の免疫グロブリン定常領域（例えばＣＨ３領域に接続されたＣＨ２）（例えば第２のＦｃ領域）を含む。
【０２４８】
実施形態では、多重特異性分子は二重特異性または二機能性分子であり、第１および第２のポリペプチド（ｉ）および（ｉｉ）は非隣接であり、例えば２つの別個のポリペプチド鎖である。いくつかの実施形態では、第１および第２のポリペプチド（ｉ）および（ｉｉ）は、例えばヒトＩｇＧ１のＦｃ領域の３４７、３４９、３５０、３５１、３６６、３６８、３７０、３９２、３９４、３９５、３９７、３９８、３９９、４０５、４０７、または４０９のうちの１つ以上から選択される位置に対合したアミノ酸置換を含む。例えば、第１の免疫グロブリン鎖定常領域（例えば、第１のＦｃ領域）は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、またはＹ４０７Ｖ（例えば空洞またはホールに対応する）から選択されるアミノ酸置換を含むことができ、第２の免疫グロブリン鎖定常領域（例えば第２のＦｃ領域）は、Ｔ３６６Ｗ（例えば突起またはノブに対応する）を含む。いくつかの実施形態では、第１および第２のポリペプチドは、ヘテロ二量体の第１および第２のＦｃ領域の第１および第２のメンバーである。
【０２４９】
実施形態では、第１および第２の結合特異性は各々、例えば本明細書に記載される、抗体分子（例えば、単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）またはＦａｂ）、受容体分子、リガンド分子（例えば、受容体リガンドまたはサイトカイン分子）から独立して選択される。実施形態では、第１および第２の結合特異性は、第１もしくは第２のポリペプチドのいずれか、またはポリペプチドの各々（例えば、ヘテロ二量体Ｆｃ分子の一方または両方のメンバー）に接続される。一実施形態では、第１の結合特異性は、第１のポリペプチドのＮ末端（例えば第１のＦｃ分子の−ＣＨ２−ＣＨ３−領域）に接続され、第２の結合特異性は、第２のポリペプチドのＮ末端（例えば第２のＦｃ分子の−ＣＨ２−ＣＨ３−領域）に接続される。あるいは、第１の結合特異性（例えばバートナーＡ）は、第１のポリペプチドのＣ末端（例えば第１のＦｃ分子の−ＣＨ２−ＣＨ３−領域）に接続され、第２の結合特異性は、第２のポリペプチドのＣ末端（例えば第２のＦｃ分子の−ＣＨ２−ＣＨ３−領域）に接続される。あるいは、第１の結合特異性は、第１のポリペプチドのＮ末端（例えば第１のＦｃ分子の−ＣＨ２−ＣＨ３−領域）に接続され、第２の結合特異性（例えばパートナーＢ）は、第２のポリペプチドのＣ末端（例えば第２のＦｃ分子の−ＣＨ２−ＣＨ３−領域）に接続される。他の実施形態では、第２の結合特異性は、第１のポリペプチドのＮ末端（例えば第１のＦｃ分子の−ＣＨ２−ＣＨ３−領域）に接続され、第１の結合特異性は、第２のポリペプチドのＣ末端（例えば第２のＦｃ分子の−ＣＨ２−ＣＨ３−領域）に接続される。一実施形態では、第１の−ＣＨ２−ＣＨ３領域は突起またはノブを含み、第２の−ＣＨ２−ＣＨ３領域は空洞またはホール）を含む。
【０２５０】
いくつかの実施形態では、二重特異性分子の第１および第２の結合特異性は各々、腫瘍標的化部分、サイトカイン分子、Ｔ細胞エンゲージャー、ＮＫ細胞エンゲージャー、Ｂ細胞エンゲージャー、樹状細胞エンゲージャー、またはマクロファージ細胞エンゲージャーから独立して選択され得る。いくつかの実施形態では、第１の結合特異性は腫瘍標的化部分であり、第２の結合特異性は、サイトカイン分子、ＮＫ細胞エンゲージャー、Ｔ細胞エンゲージャー、Ｂ細胞エンゲージャー、樹状細胞エンゲージャー、またはマクロファージ細胞エンゲージャーから選択される。
【０２５１】
いくつかの実施形態では、第１の結合特異性は腫瘍標的化部分であり、第２の結合特異性は、サイトカイン分子、ＮＫ細胞エンゲージャー、Ｔ細胞エンゲージャー、Ｂ細胞エンゲージャー、樹状細胞エンゲージャー、またはマクロファージ細胞エンゲージャーから選択される。
【０２５２】
一実施形態では、多重特異性分子は、２つの非隣接の第１および第２のポリペプチドを含む二重特異性分子である。実施形態では、第１および第２のポリペプチドは、それぞれ、例えば本明細書に記載される、抗体分子（例えば、単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）またはＦａｂ）、受容体分子、リガンド分子（例えば、受容体リガンドまたはサイトカイン分子）から独立して選択される第１および第２の結合部位を含む。いくつかの実施形態では、第１および第２の結合特異性は各々、例えば本明細書に記載される、ＭＰＬ、腫瘍標的化部分、サイトカイン分子、ＮＫ細胞エンゲージャー、Ｔ細胞エンゲージャー、Ｂ細胞エンゲージャー、樹状細胞エンゲージャー、またはマクロファージ細胞エンゲージャーから独立して選択される。
【０２５３】
別の実施形態では、多重特異性分子は、２つまたは少なくとも３つの非隣接の第１および第２のポリペプチドを含む二重特異性分子であり、
（ｉ）第１のポリペプチドは、Ｎ−からＣ−の配向に第１の結合特異性、例えば、場合によりリンカーを介して第１の免疫グロブリン定常領域（例えばＣＨ３領域に接続されたＣＨ２）（例えば第１のＦｃ領域）に接続された第１の抗体分子を含み、
（ｉｉ）第２のポリペプチドは、Ｎ−からＣ−の配向に第２の免疫グロブリン定常領域（例えばＣＨ３領域に接続されたＣＨ２）（例えば第２のＦｃ領域）を含み、
（場合により）（ｉｉｉ）第３ポリペプチドは、第１の抗体分子または第２の抗体分子の一部を含む。
【０２５４】
実施形態では、第１および第２のポリペプチドは、それぞれ、例えば本明細書に記載される、抗体分子（例えば、単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）またはＦａｂ）、受容体分子、リガンド分子（例えば、受容体リガンドまたはサイトカイン分子）から独立して選択される第１および第２の結合特異性（例えば部位）を含む。いくつかの実施形態では、第１および第２の結合特異性は各々、例えば本明細書に記載される、腫瘍標的化部分、サイトカイン分子、ＮＫ細胞エンゲージャー、Ｔ細胞エンゲージャー、Ｂ細胞エンゲージャー、樹状細胞エンゲージャー、またはマクロファージ細胞エンゲージャーから独立して選択される。
【０２５５】
いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、Ｎ−から−Ｃに以下の構成を有する：
（ａ）第１の抗原ドメインの第１の部分、例えば、場合によりリンカーを介して第１の免疫グロブリン定常領域（例えばＣＨ３領域に接続されたＣＨ２）（例えば第１のＦｃ領域）に接続された、例えばがん抗原、例えば固形腫瘍、間質、または血液学的抗原（例えばＭＰＬ）に結合するＦａｂ分子の第１のＶＨ−ＣＨ１、
（ｂ）サイトカイン分子、または場合によりリンカーを介して第２の免疫グロブリン定常領域（例えばＣＨ３領域に接続されたＣＨ２）（例えば第２のＦｃ領域）に接続された免疫細胞エンゲージャーから選択される第２の結合特異性（例えば第２の結合部位）、および
（ｃ）第３のポリペプチドは、Ｎ−から−Ｃに以下の構成を有する：例えばがん抗原、例えば、固形腫瘍、間質、または血液学的抗原（例えば第１のＶＨ−ＣＨ１により結合される同じがん抗原）に結合する第１の抗原ドメインの第２の部分、例えばＦａｂの第１のＶＬ−ＣＬ。
【０２５６】
実施形態では、第１の免疫グロブリン定常領域（例えば第１のＣＨ２−ＣＨ３領域）は、例えば本明細書に記載されるような突起またはノブを含む。
【０２５７】
実施形態では、第２の免疫グロブリン定常領域（例えば第２のＣＨ２−ＣＨ３領域）は、空洞またはホールを含む。実施形態では、第１および第２の免疫グロブリン定常領域は、二重特異性分子のヘテロ二量体化を促進する。
【０２５８】
他の実施形態では、多重特異性分子は、第１、第２、および第３の非隣接ポリペプチドを含み、
場合によりリンカーを介して、第１と第２のポリペプチドとの間の会合を促進する第１のドメイン（例えば第１の免疫グロブリン定常ドメイン（例えば本明細書に記載される第１のＦｃ分子）に接続される、例えばＭＰＬ抗原に結合する、ｎ  ＭＰＬ標的化部分、例えば抗体分子（例えば第１の抗原ドメインの第１の部分、例えばＦａｂ分子の第１のＶＨ−ＣＨ１）、
（ｉｉ）第２のポリペプチドは、例えば、Ｎ−からＣ−の配向で、場合によりリンカーを介して、第１と第２のポリペプチドとの間の会合を促進する第２のドメイン（例えば第２の免疫グロブリン定常ドメイン（例えば本明細書に記載される第２のＦｃ分子）に接続される、サイトカイン分子または免疫細胞エンゲージャー（例えば免疫細胞抗原に結合する抗体分子、例えばｓｃＦｖ）を含み、
（ｉｉｉ）第３のポリペプチドは、例えば、Ｎ−からＣ−の配向で、例えばＭＰＬ抗原（例えば第１のＶＨ−ＣＨ１により結合される同じＭＰＬ抗原）に結合する第１の抗原ドメインの第２の部分、例えばＦａｂの第１のＶＬ−ＣＬを含む。
【０２５９】
いくつかの実施形態では、多重特異性分子は、場合によりリンカーを介して第１のＦｃ分子に接続されたＦａｂ分子標的化ＭＰＬ、場合によりリンカーを介して第２のＦｃ分子に接続されたサイトカインまたは免疫細胞エンゲージャー（例えばｓｃＦｖ）を含む。実施形態では、多重特異性分子は二重特異性分子である。
【０２６０】
実施形態では、第１のポリペプチドのＭＰＬ標的化部分は、腫瘍標的化分子の軽鎖可変ドメイン（例えばＦａｂ）を含み、第２のポリペプチドの腫瘍標的化部分は、ＭＰＬ標的化分子の重鎖可変ドメイン（例えば、Ｆａｂ）を含む。
【０２６１】
他の実施形態では、第１のポリペプチドの第１のＭＰＬ標的化部分は、ＭＰＬ標的化分子の重鎖可変ドメイン（例えばＦａｂ）を含み、第２のポリペプチドの第２のＭＰＬ標的化部分は、ＭＰＬ標的化分子の軽鎖可変ドメイン（例えば、Ｆａｂ）を含む。
【０２６２】
他の実施形態では、第１のポリペプチドの第１のＭＰＬ標的化部分は、ＭＰＬ標的化分子の軽鎖可変ドメイン（例えばＦａｂ）を含み、第２のポリペプチドの第２のＭＰＬ標的化部分は、ＭＰＬ標的化分子の重鎖可変ドメイン（例えば、Ｆａｂ）を含む。
【０２６３】
他の実施形態では、第１のポリペプチドのＭＰＬ標的化部分は、ＭＰＬ標的化ｓｃＦｖを含み、第２のポリペプチドのＭＰＬ標的化部分は、ＭＰＬ標的化ｓｃＦｖを含む。
【０２６４】
リンカー
本明細書に開示される多重特異性分子は、リンカー、例えば、標的化部分とサイトカイン分子、標的化部分と免疫細胞エンゲージャー、サイトカイン分子と免疫細胞エンゲージャー、サイトカイン分子と免疫グロブリン鎖定常領域（例えばＦｃ領域）、標的化部分と免疫グロブリン鎖定常領域、または免疫細胞エンゲージャーと免疫グロブリン鎖定常領域のうちの１つ以上との間にリンカーをさらに含み得る。実施形態では、切断可能なリンカー、切断不可能なリンカー、ペプチドリンカー、柔軟なリンカー、剛性リンカー、らせんリンカー、もしくは非らせんリンカー、またはそれらの組み合わせから選択されるリンカー。
【０２６５】
一実施形態では、多重特異性分子は、１つ、２つ、３つ、または４つのリンカー、例えばペプチドリンカーを含み得る。一実施形態では、ペプチドリンカーは、ＧｌｙおよびＳｅｒ、例えば、ＧＧＧＧＳ（配列番号１１７）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１１８）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１１９）、またはＤＶＰＳＧＰＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１２０）から選択されるペプチドリンカーを含む。
【０２６６】
抗体分子
一実施形態では、抗体分子は、がん抗原、例えば腫瘍抗原に結合する。いくつかの実施形態では、がん抗原は、例えば哺乳類、例えばヒトのがん抗原である。他の実施形態では、抗体分子は、免疫細胞抗原、例えば哺乳類、例えばヒトの免疫細胞抗原に結合する。例えば、抗体分子は、がん抗原または免疫細胞抗原上のエピトープ、例えば線状または立体構造エピトープに特異的に結合する。
【０２６７】
一実施形態では、抗体分子は、単一特異性抗体分子であり、単一のエピトープに結合する。例えば、それぞれが同じエピトープに結合する複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列を有する単一特異性抗体分子。
【０２６８】
一実施形態では、抗体分子は、多重特異性抗体分子であり、例えば、これは複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、これら複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列のうちの第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第１のエピトープに対して結合特異性を有し、これら複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列のうちの第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第２のエピトープに対して結合特異性を有する。一実施形態では、第１のエピトープと第２のエピトープとは、同じ抗原、例えば、同じタンパク質（または多量体タンパク質のサブユニット）上にある。一実施形態では、第１のエピトープと第２のエピトープとは重複する。一実施形態では、第１のエピトープと第２のエピトープとは重複しない。一実施形態では、第１のエピトープと第２のエピトープとは、異なる抗原、例えば、異なるタンパク質（または多量体タンパク質の異なるサブユニット）上にある。一実施形態では、多重特異性抗体分子は、第３、第４、または第５の免疫グロブリン可変ドメインを含む。一実施形態では、多重特異性抗体分子は、二重特異性抗体分子、三重特異性抗体分子、または四重特異性抗体分子である。
【０２６９】
一実施形態では、多重特異性抗体分子は二重特異性抗体分子である。二重特異性抗体は、２つ以下の抗原に対して特異性を有する。二重特異性抗体分子は、第１のエピトープに対して結合特異性を有する第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列と、第２のエピトープに対する結合特異性を有する第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列とによって特徴付けられる。一実施形態では、第１のエピトープと第２のエピトープとは、同じ抗原、例えば、同じタンパク質（または多量体タンパク質のサブユニット）上にある。一実施形態では、第１のエピトープと第２のエピトープとは重複する。一実施形態では、第１のエピトープと第２のエピトープとは重複しない。一実施形態では、第１のエピトープと第２のエピトープとは、異なる抗原、例えば、異なるタンパク質（または多量体タンパク質の異なるサブユニット）上にある。一実施形態では、二重特異性抗体分子は、第１のエピトープに対して結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列および軽鎖可変ドメイン配列と、第２のエピトープに対して結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列および軽鎖可変ドメイン配列とを含む。一実施形態において、二重特異性抗体分子は、第１のエピトープに対して結合特異性を有する半抗体と、第２のエピトープに対して結合特異性を有する半抗体とを含む。一実施形態では、二重特異性抗体分子は、第１のエピトープに対して結合特異性を有する半抗体またはその断片と、第２のエピトープに対して結合特異性を有する半抗体またはその断片とを含む。一実施形態では、二重特異性抗体分子は、第１のエピトープに対して結合特異性を有するｓｃＦｖもしくはＦａｂまたはそれらの断片と、第２のエピトープに対して結合特異性を有するｓｃＦｖもしくはＦａｂまたはそれらの断片とを含む。
【０２７０】
一実施形態では、抗体分子は、ダイアボディ、および一本鎖分子、ならびに抗体の抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ）を含む。例えば、抗体分子は、重（Ｈ）鎖可変ドメイン配列（本明細書ではＶＨと略記する）および軽（Ｌ）鎖可変ドメイン配列（本明細書ではＶＬと略記する）を含み得る。一実施形態では、抗体分子は、重鎖および軽鎖（本明細書では半抗体と称する）を含むかまたはそれらからなる。別の例では、抗体分子は、２つの重（Ｈ）鎖可変ドメイン配列および２つの軽（Ｌ）鎖可変ドメイン配列を含み、それによって２つの抗原結合部位を形成し、これは、例えば、全抗体または組み換えＤＮＡ技術を使用してデノボ合成された抗体の修飾によって産生されてもよい、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ、Ｆｄ、Ｆｄ’、Ｆｖ、一本鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、単一可変ドメイン抗体、ダイアボディ（Ｄａｂ）（二価および二重特異性）、およびキメラ（例えば、ヒト化）抗体である。これらの機能性抗体断片は、それらのそれぞれの抗原または受容体と選択的に結合する能力を保持している。抗体および抗体断片は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＥを含むがこれらに限定されない任意のクラスの抗体、ならびに任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４）の抗体に由来し得る。抗体分子の調製物はモノクローナルまたはポリクローナルであり得る。抗体分子はまた、ヒト、ヒト化、ＣＤＲ移植、またはインビトロで生成された抗体であり得る。抗体は、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４から選択される、重鎖定常領域を有し得る。抗体はまた、例えばカッパまたはラムダから選択される軽鎖を有し得る。「免疫グロブリン」（Ｉｇ）という用語は、本明細書において「抗体」という用語と互換的に使用される。
【０２７１】
抗体分子の抗原結合断片の例には以下が含まれる：（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなる一価の断片であるＦａｂ断片、（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結した２つのＦａｂ断片を含む二価の断片であるＦ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるダイアボディ（ｄＡｂ）断片、（ｖｉ）ラクダ科動物またはラクダ化可変ドメイン、（ｖｉｉ）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）（例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３を参照されたい）、（ｖｉｉｉ）単一ドメイン抗体。これらの抗体断片は、当業者に既知の従来の技術を使用して得られ、断片は、インタクトな抗体と同じ様式で有用性についてスクリーニングされる。
【０２７２】
抗体分子は、インタクトな分子およびその機能断片を含む。抗体分子の定常領域は、抗体の特性を修飾するために（例えば、Ｆｃ受容体結合、抗体グリコシル化、システイン残基の数、エフェクター細胞機能、または補体機能のうちの１つ以上を増加または減少させるために）、改変、例えば突然変異させることができる。
【０２７３】
抗体分子は単一ドメイン抗体でもあり得る。単一ドメイン抗体は、相補性決定領域が単一ドメインポリペプチドの一部である抗体を含み得る。例としては、重鎖抗体、軽鎖を天然に含まない抗体、従来の４本鎖抗体に由来する単一ドメイン抗体、操作された抗体、および抗体に由来するもの以外の単一ドメイン足場が挙げられるが、これらに限定されない。単一ドメイン抗体は、当該技術分野の単一ドメイン抗体のうちのいずれかであっても、いずれかの将来の単一ドメイン抗体であってもよい。単一ドメイン抗体は、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、魚類、サメ、ヤギ、ウサギ、およびウシを含むがこれらに限定されない任意の種に由来し得る。本発明の別の態様によれば、単一ドメイン抗体は、軽鎖を欠く重鎖抗体として知られる天然に存在する単一ドメイン抗体である。そのような単一ドメイン抗体は、例えば、ＷＯ９４０４６７８に開示されている。明確化を理由に、軽鎖を天然に含まない重鎖抗体に由来するこの可変ドメインは、本明細書では、それを四本鎖免疫グロブリンの従来のＶＨと区別するために、ＶＨＨまたはナノボディとする。そのようなＶＨＨ分子は、ラクダ科動物種、例えば、ラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、アルパカ、およびグアナコにおいて作られた抗体に由来し得る。ラクダ科動物以外の他の種は、軽鎖を天然に含まない重鎖抗体を産生し得る。そのようなＶＨＨは本発明の範囲内である。
【０２７４】
ＶＨおよびＶＬ領域は、「フレームワーク領域」（ＦＲまたはＦＷ）と呼ばれるより保存されている領域が散在する「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域に細分することができる。
【０２７５】
フレームワーク領域およびＣＤＲの範囲は、いくつかの方法（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２、Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７を参照されたい）、およびＯｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって使用されているＡｂＭ定義によって、正確に定義されている。概して、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｏｍａｉｎｓ．Ｉｎ：  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ（Ｅｄ．：Ｄｕｅｂｅｌ，Ｓ．ａｎｄ  Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）を参照されたい。
【０２７６】
本明細書で使用される「相補性決定領域」および「ＣＤＲ」という用語は、抗原特異性および結合親和性を授ける抗体可変領域内のアミノ酸の配列を指す。一般に、各重鎖可変領域に３つのＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）があり、各軽鎖可変領域に３つのＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）がある。
【０２７７】
所与のＣＤＲの正確なアミノ酸配列境界は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１），“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（「Ｋａｂａｔ」付番スキーム）、Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）ＪＭＢ  ２７３，９２７−９４８（「Ｃｈｏｔｈｉａ」付番スキーム）に記載されるものを含むいくつかの既知のスキームのうちのいずれかを使用して決定され得る。本明細書で使用される場合、「Ｃｈｏｔｈｉａ」番号スキームに従って定義されるＣＤＲは、「超可変ループ」とも称されることがある。
【０２７８】
例えば、Ｋａｂａｔの下では、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）中のＣＤＲアミノ酸残基は、３１〜３５（ＨＣＤＲ１）、５０〜６５（ＨＣＤＲ２）、および９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）と付番され、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）中のＣＤＲアミノ酸残基は、２４〜３４（ＬＣＤＲ１）、５０〜５６（ＬＣＤＲ２）、および８９〜９７（ＬＣＤＲ３）と付番される。Ｃｈｏｔｈｉａの下では、ＶＨ中のＣＤＲアミノ酸は、２６〜３２（ＨＣＤＲ１）、５２〜５６（ＨＣＤＲ２）、および９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）と付番され、ＶＬ中のアミノ酸残基は、２６〜３２（ＬＣＤＲ１）、５０〜５２（ＬＣＤＲ２）、および９１〜９６（ＬＣＤＲ３）と付番される。
【０２７９】
各ＶＨおよびＶＬは典型的には、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲを含み、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序でアミノ末端からカルボキシ末端に配置される。
【０２８０】
抗体分子は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。
【０２８１】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一分子組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性および親和性を示す。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術によって、またはハイブリドーマ技術を使用しない方法（例えば、組み換え方法）によって作製することができる。
【０２８２】
抗体は、組換えによって産生される、例えば、ファージディスプレイによってまたはコンビナトリアル法によって産生され得る。
【０２８３】
抗体を生成するためのファージディスプレイおよびコンビナトリアル法は当該技術分野において既知である（例えば、Ｌａｄｎｅｒらの米国特許第５，２２３，４０９号、Ｋａｎｇらの国際公開第ＷＯ９２／１８６１９号、Ｄｏｗｅｒらの国際公開第ＷＯ９１／１７２７１号、Ｗｉｎｔｅｒらの国際公開第ＷＯ９２／２０７９１号、Ｍａｒｋｌａｎｄらの国際公開第ＷＯ９２／１５６７９号、Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇらの国際公開第ＷＯ９３／０１２８８号、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらの国際公開第ＷＯ９２／０１０４７号、Ｇａｒｒａｒｄらの国際公開第ＷＯ９２／０９６９０号、Ｌａｄｎｅｒらの国際公開第ＷＯ９０／０２８０９号、Ｆｕｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７０−１３７２、Ｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｈｕｍ  Ａｎｔｉｂｏｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３：８１−８５、Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１、Ｇｒｉｆｆｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ  １２：７２５−７３４、Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２６：８８９−８９６、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８、Ｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）ＰＮＡＳ  ８９：３５７６−３５８０、Ｇａｒｒａｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７３−１３７７、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １９：４１３３−４１３７、およびＢａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）ＰＮＡＳ  ８８：７９７８−７９８２に記載されているとおりであり、これらの全ての内容は参照により本明細書に組み込まれる）。
【０２８４】
一実施形態では、抗体は、完全ヒト抗体（例えば、ヒト免疫グロブリン配列から抗体を産生するように遺伝子操作されたマウスで作製された抗体）、または非ヒト抗体、例えば、齧歯類（マウスまたはマウス）、ヤギ、霊長類（例えば、サル）、ラクダ抗体である。好ましくは、非ヒト抗体は齧歯類（マウスまたはラット抗体）である。齧歯類抗体を産生する方法は当該技術分野において既知である。
【０２８５】
ヒトモノクローナル抗体は、マウス系ではなくヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスを使用して生成することができる。目的の抗原で免疫したこれらのトランスジェニックマウスからの脾細胞を使用して、ヒトタンパク質由来のエピトープに特異的な親和性を有するヒトｍＡｂを分泌するハイブリドーマを産生させる（例えば、Ｗｏｏｄらの国際出願第ＷＯ９１／００９０６号、ＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらのＰＣＴ公開第ＷＯ９１／１０７４１号、Ｌｏｎｂｅｒｇらの国際出願第ＷＯ９２／０３９１８号、Ｋａｙらの国際出願第９２／０３９１７号、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．１９９４  Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９、Ｇｒｅｅｎ，Ｌ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．１９９４  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．７：１３−２１、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．１９９４  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９３  Ｙｅａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ７：３３−４０、Ｔｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９３  ＰＮＡＳ  ９０：３７２０−３７２４、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９１  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２１：１３２３−１３２６を参照されたい）。
【０２８６】
抗体分子は、可変領域、またはその一部、例えばＣＤＲが、非ヒト生物、例えばラットまたはマウスにおいて生成されるものであり得る。キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、およびヒト化抗体は、本発明の範囲内である。非ヒト生物、例えばラットまたはマウスにおいて生成され、次いで例えば可変フレームワークまたは定常領域において修飾されて、ヒトにおける抗原性を減少させる抗体分子は、本発明の範囲内である。
【０２８７】
「事実上ヒト」のタンパク質は、中和抗体応答、例えば、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答を実質的に引き起こさないタンパク質である。ＨＡＭＡは、ある数の状況、例えば、抗体分子が繰り返し投与される場合、例えば、慢性または再発性の疾患状態の治療において、問題となり得る。ＨＡＭＡ応答は、血清からの抗体クリアランスの増大により（例えば、Ｓａｌｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３２：１８０−１９０（１９９０）を参照されたい）、またアレルギー反応の可能性により（例えば、ＬｏＢｕｇｌｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，５：５１１７−５１２３（１９８６）を参照されたい）、繰り返しの抗体投与を無効にする可能性がある。
【０２８８】
キメラ抗体は、当該技術分野で既知の組換えＤＮＡ技法によって産生され得る（Ｒｏｂｉｎｓｏｎらの国際特許公開第ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９号、Ａｋｉｒａらの欧州特許出願第１８４，１８７号、Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．の欧州特許出願第１７１，４９６号、Ｍｏｒｒｉｓｏｎらの欧州特許出願第１７３，４９４号、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒらの国際出願第ＷＯ８６／０１５３３号、Ｃａｂｉｌｌｙらの米国特許第４，８１６，５６７号、Ｃａｂｉｌｌｙらの欧州特許出願第１２５，０２３号、Ｂｅｔｔｅｒら（１９８８  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３）、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）ＰＮＡＳ  ８４：３４３９−３４４３、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１−３５２６、Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）ＰＮＡＳ  ８４：２１４−２１８、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．４７：９９９−１００５、Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４４６−４４９、およびＳｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｊ．Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８０：１５５３−１５５９を参照されたい）。
【０２８９】
ヒト化またはＣＤＲ移植抗体は、ドナーＣＤＲで代置された少なくとも１つまたは２つ、しかし一般的には３つ全てのレシピエントＣＤＲ（重および／または軽免疫グロブリン鎖）を有することになる。抗体は、非ヒトＣＤＲの少なくとも一部で代置されてもよく、またはＣＤＲの一部のみが非ヒトＣＤＲで代置されてもよい。必要なのは、抗原への結合に必要とされるＣＤＲの数を代置することだけである。好ましくは、ドナーは、齧歯類抗体、例えば、ラットまたはマウス抗体となり、レシピエントは、ヒトフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークとなる。典型的には、ＣＤＲを提供する免疫グロブリンは「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供する免疫グロブリンは「アクセプター」と呼ばれる。一実施形態では、ドナー免疫グロブリンは非ヒト（例えば、齧歯類）である。アクセプターフレームワークは、天然に存在する（例えば、ヒト）フレームワークもしくはコンセンサスフレームワーク、またはそれと約８５％以上、好ましくは９０％、９５％、９９％、もしくはそれ以上同一の配列である。
【０２９０】
本明細書で使用される場合、「コンセンサス配列」という用語は、関連配列のファミリー中で最も頻繁に存在するアミノ酸（またはヌクレオチド）から形成される配列を指す（例えば、Ｗｉｎｎａｋｅｒ，Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ（Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ  １９８７を参照されたい）。タンパク質のファミリーにおいて、コンセンサス配列中の各位置は、ファミリー中のその位置で最も頻繁に存在するアミノ酸によって占められている。２つのアミノ酸が同じ頻度で存在する場合、いずれもコンセンサス配列に含めることができる。「コンセンサスフレームワーク」は、コンセンサス免疫グロブリン配列中のフレームワーク領域を指す。
【０２９１】
抗体は、当該技術分野で既知の方法によってヒト化することができる（例えば、それらの全ての内容は参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２−１２０７、Ｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４、およびＱｕｅｅｎらのＵＳ５，５８５，０８９、ＵＳ５，６９３，７６１、およびＵＳ５，６９３，７６２を参照されたい）。
【０２９２】
ヒト化またはＣＤＲ移植抗体は、ＣＤＲ移植またはＣＤＲ置換によって産生することができ、免疫グロブリン鎖の１つ、２つ、または全てのＣＤＲを代置することができる。例えば、米国特許第５，２２５，５３９号、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．１９８６  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５５２−５２５、Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９８８  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４、Ｂｅｉｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９８８Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３−４０６０、Ｗｉｎｔｅｒ  ＵＳ  ５，２２５，５３９（それらの全ての内容は参照により本明細書に明示的に組み込まれる）を参照されたい。Ｗｉｎｔｅｒは、本発明のヒト化抗体を調製するために使用され得るＣＤＲ移植法について記載している（その内容は参照により明示的に組み込まれる、１９８７年３月２６日に出願された英国特許出願第ＧＢ２１８８６３８Ａ号、ＷｉｎｔｅｒのＵＳ５，２２５，５３９）。
【０２９３】
特定のアミノ酸が、置換、欠失、または付加されているヒト化抗体分子も、本発明の範囲内である。ドナーからアミノ酸を選択するための基準は、ＵＳ５，５８５，０８９、例えば、ＵＳ５，５８５，０８９の第１２〜１６欄、例えば、ＵＳ５，５８５，０８９の第１２〜１６欄に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。抗体をヒト化するための他の技法は、１９９２年１２月２３日に公開されたＰａｄｌａｎらのＥＰ５１９５９６Ａ１に記載されている。
【０２９４】
抗体分子は一本鎖抗体であり得る。一本鎖抗体（ｓｃＦＶ）は操作されてもよい（例えば、Ｃｏｌｃｈｅｒ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８８０：２６３−８０、およびＲｅｉｔｅｒ，Ｙ．（１９９６）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２：２４５−５２を参照されたい）。一本鎖抗体を二量体化または多量体化して、同じ標的タンパク質の異なるエピトープに対して特異性を有する多価抗体を生成することができる。
【０２９５】
さらに他の実施形態では、抗体分子は、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、およびＩｇＥの重鎖定常領域から選択される、特に、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４の（例えば、ヒト）重鎖定常領域から選択される、重鎖定常領域を有する。別の実施形態では、抗体分子は、例えばカッパまたはラムダの（例えば、ヒト）軽鎖定常領域から選択される軽鎖定常領域を有する。定常領域は、抗体の特性を修正するために（例えば、Ｆｃ受容体結合、抗体グリコシル化、システイン残基の数、エフェクター細胞機能、および／または補体機能のうちの１つ以上を増加または減少させるために）、改変する、例えば、突然変異させることができる。一実施形態では、抗体はエフェクター機能を有し、補体結合することができる。他の実施形態では、抗体は、エフェクター細胞を動員せず、また補体結合もしない。別の実施形態では、抗体は、Ｆｃ受容体に結合する能力が低下しているか、または全く有しない。例えば、抗体は、Ｆｃ受容体への結合を支持しない、アイソタイプもしくはサブタイプ、断片、または他の変異体であり、例えば、抗体は変異誘発されたまたは欠失したＦｃ受容体結合領域を有する。
【０２９６】
抗体定常領域を改変するための方法は、当該技術分野において既知である。機能が改変された、例えば、細胞上のＦｃＲなどのエフェクターリガンドまたは補体のＣ１成分に対する親和性が改変された抗体は、抗体の定常部分の少なくとも１つのアミノ酸残基を異なる残基で代置することによって産生させることができる（例えば、それらの全ての内容は参照により本明細書に組み込まれる、ＥＰ３８８，１５１Ａ１、米国特許第５，６２４，８２１号、および米国特許第５，６４８，２６０号を参照されたい）。マウスまたは他の種の免疫グロブリンに適用された場合にこれらの機能を低下させるかまたは排除し得る、類似の種類の変化が記載され得る。
【０２９７】
抗体分子は、誘導体化されるか、別の機能性分子（例えば、別のペプチドまたはタンパク質）に結合され得る。本明細書で使用される場合、「誘導体化」抗体分子は、修飾されたものである。誘導体化の方法には、蛍光部分、放射性ヌクレオチド、毒素、酵素、またはビオチンなどの親和性リガンドの添加が含まれるが、これらに限定されない。したがって、本発明の抗体分子は、免疫接着分子を含む、本明細書に記載される抗体の誘導体化およびその他の方法で修飾された形態を含むことを意図している。例えば、抗体分子は、別の抗体（例えば、二重特異性抗体またはダイアボディ）、検出可能な薬剤、細胞障害剤、医薬品、および／または抗体もしくは抗体部分と別の分子（ストレプトアビジンコア領域またはポリヒスチジンタグなど）との会合を媒介することができるタンパク質もしくはペプチドなどの１つ以上の他の分子実体に機能的に（化学結合、遺伝子融合、非共有結合またはその他の方法によって）結合され得る。
【０２９８】
誘導体化抗体分子の１つの種類は、（例えば二重特異性抗体を創出するために、同じ種類または異なる種類の）２つ以上の抗体を架橋することによって産生される。適切な架橋剤には、好適なスペーサー（例えば、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）またはホモ二官能性（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）によって分離された２つの明確な反応基を有するヘテロ二官能性のものが含まれる。そのようなリンカーは、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌから入手可能である。
【０２９９】
多重特異性抗体分子
本明細書で定義される多重特異性および多機能性分子の例示的な構造は、全体にわたって記載される。例示的な構造は、Ｗｅｉｄｌｅ  Ｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）  Ｔｈｅ  Ｉｎｔｒｉｇｕｉｎｇ  Ｏｐｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｏｒｍａｔｓ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ＆  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  １０：１−１８  （２０１３）およびＳｐｉｅｓｓ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｆｏｒｍａｔｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６７：９５−１０６にさらに記載されており、それらの各々の完全な内容は参照により本明細書に組み込まれる）。
【０３００】
実施形態では、多重特異性抗体分子は、異なる部位が異なる抗原に特異的である、２つ以上の抗原結合部位を含み得る。実施形態では、多重特異性抗体分子は、同じ抗原上の１つ超（例えば２つ以上）のエピトープに結合することができる。実施形態では、多重特異性抗体分子は、標的細胞（例えばがん細胞）に特異的な抗原結合部位と、免疫エフェクター細胞に特異的な異なる抗原結合部位とを含む。一実施形態では、多重特異性抗体分子は二重特異性抗体分子である。二重特異性抗体分子は、５つの異なる構造群：（ｉ）二重特異性免疫グロブリンＧ（ＢｓＩｇＧ）、（ｉｉ）追加の抗原結合部分が付加されたＩｇＧ、（ｉｉｉ）二重特異性抗体断片、（ｉｖ）二重特異性融合タンパク質、および（ｖ）二重特異性抗体コンジュゲートに分類することができる。
【０３０１】
ＢｓＩｇＧは各抗原に対して一価の形式である。例示的なＢｓＩｇＧの形式としては、ｃｒｏｓｓＭａｂ、ＤＡＦ（２イン１）、ＤＡＦ（４イン１）、ＤｕｔａＭａｂ、ＤＴ−ＩｇＧ、ノブ・イン・ホール共通ＬＣ、ノブインホールアセンブリ、電荷対、Ｆａｂアーム交換、ＳＥＥＤｂｏｄｙ、ｔｒｉｏｍａｂ、ＬＵＺ−Ｙ、Ｆｃａｂ、κλ体、直交Ｆａｂが挙げられるが、これらに限定されない。Ｓｐｉｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６７（２０１５）：９５−１０６を参照されたい。例示的なＢｓＩｇＧとしては、抗ＣＤ３アームおよび抗ＥｐＣＡＭアームを含むカツマクソマブ（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｔｒｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａ，Ｎｅｏｐｈａｒｍ）、およびＣＤ３およびＨＥＲ２を標的とするエルツマキソマブ（Ｎｅｏｖｉｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＢｓＩｇＧはヘテロ二量体化のために操作される重鎖を含む。例えば、「ノブイントゥホール」戦略、ＳＥＥＤプラットフォーム、一般的な重鎖（例えばκλボディで）、およびヘテロ二量体Ｆｃ領域の使用を使用して、ヘテロ二量体化のために重鎖を操作することができる。Ｓｐｉｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６７（２０１５）：９５−１０６を参照されたい。ＢｓＩｇＧのホモ二量体の重鎖対合を回避するために使用されてきた戦略には、ノブ・イン・ホール、ｄｕｏｂｏｄｙ、ａｚｙｍｅｔｒｉｃ、電荷対、ＨＡ−ＴＦ、ＳＥＥＤｂｏｄｙ、および差次的プロテインＡ親和性が含まれる。同上を参照されたい。ＢｓＩｇＧは、異なる宿主細胞において成分抗体を別個に発現させ、その後ＢｓＩｇＧに精製／アセンブリすることにより産生され得る。ＢｓＩｇＧは、単一の宿主細胞での成分抗体の発現によっても産生することができる。ＢｓＩｇＧは、親和性クロマトグラフィーを使用して、例えばプロテインＡおよび連続ｐＨ溶出を使用して精製することができる。
【０３０２】
追加の抗原結合部分が付加されたＩｇＧは、二重特異性抗体分子の別の形式である。例えば、重鎖または軽鎖のいずれかのＮまたはＣ末端に、単一特異性ＩｇＧに追加の抗原結合単位を付加することにより、二重特異性を有するように単一特異性ＩｇＧを操作することができる。例示的な追加の抗原結合単位としては、単一ドメイン抗体（例えば、可変重鎖または可変軽鎖）、操作されたタンパク質足場、および対合した抗体可変ドメイン（例えば、単鎖可変断片または可変断片）が挙げられる。同上を参照されたい。付加されたＩｇＧ形式の例としては、二重可変ドメインＩｇＧ（ＤＶＤ−Ｉｇ）、ＩｇＧ（Ｈ）−ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−（Ｈ）ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｌ）−ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−（Ｌ）ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｌ，Ｈ）−Ｆｖ、ＩｇＧ（Ｈ）−Ｖ、Ｖ（Ｈ）−ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｌ）−Ｖ、Ｖ（Ｌ）−ＩｇＧ、ＫＩＨ  ＩｇＧ−ｓｃＦａｂ、２ｓｃＦｖ−ＩｇＧ、ＩｇＧ−２ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ４−Ｉｇ、ｚｙｂｏｄｙ、およびＤＶＩ−ＩｇＧ（４イン１）が挙げられる。Ｓｐｉｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６７（２０１５）：９５−１０６を参照されたい。ＩｇＧ−ｓｃＦｖの例は、ＩＧＦ−１ＲおよびＨＥＲ３に結合するＭＭ−１４１（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）である。ＤＶＤ−Ｉｇの例としては、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βに結合するＡＢＴ−９８１（ＡｂｂＶｉｅ）ならびにＴＮＦおよびＩＬ−１７Ａに結合するＡＢＴ−１２２（ＡｂｂＶｉｅ）が挙げられる。
【０３０３】
二重特異性抗体断片（ＢｓＡｂ）は、抗体定常ドメインの一部または全てを欠く二重特異性抗体分子の形式である。例えば、一部のＢｓＡｂはＦｃ領域を欠く。実施形態では、二重特異性抗体断片は、単一の宿主細胞においてＢｓＡｂの効率的な発現を可能にするペプチドリンカーにより接続された重鎖および軽鎖領域を含む。例示的な二重特異性抗体断片としては、ナノボディ、ナノボディ−ＨＡＳ、ＢｉＴＥ、ダイアボディ、ＤＡＲＴ、ＴａｎｄＡｂ、ｓｃＤｉａｂｏｄｙ、ｓｃＤｉａｂｏｄｙ−ＣＨ３、ダイアボディ−ＣＨ３、トリプルボディ、ミニ抗体、ミニボディ、ＴｒｉＢｉミニボディ、ｓｃＦｖ−ＣＨ３  ＫＩＨ、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−ＣＨ−ＣＬ−ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）２−ｓｃＦｖ２、ｓｃＦｖ−ＫＩＨ、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ、四価のＨＣＡｂ、ｓｃＤｉａｂｏｄｙ−Ｆｃ、Ｄｉａｂｏｄｙ−Ｆｃ、タンデム型ｓｃＦｖ−Ｆｃ、およびイントラボディが挙げられるが、これらに限定されない。同上を参照されたい。例えば、ＢｉＴＥ形式はタンデム型ｓｃＦｖを含み、成分ｓｃＦｖはＴ細胞上のＣＤ３およびがん細胞上の表面抗原に結合する。
【０３０４】
二重特異性融合タンパク質には、例えば、さらなる特異性および／または機能性を追加するために、他のタンパク質に結合された抗体断片が含まれる。二重特異性融合タンパク質の例は、ＨＬＡ提示ペプチドを認識する親和性成熟Ｔ細胞受容体に結合した抗ＣＤ３  ｓｃＦｖを含むｉｍｍＴＡＣである。実施形態では、ドックアンドロック（ＤＮＬ）法を使用して、より高い原子価の二重特異性抗体分子を生成することができる。また、アルブミン結合タンパク質またはヒト血清アルブミンへの融合により、抗体断片の血清半減期を延長することができる。同上を参照されたい。
【０３０５】
実施形態では、化学的コンジュゲーション、例えば、抗体および／または抗体断片の化学的コンジュゲーションを使用して、ＢｓＡｂ分子を創出することができる。同上を参照されたい。例示的な二重特異性抗体コンジュゲートとしては、低分子量薬物が各Ｆａｂアームまたは抗体もしくはその断片の単一の反応性リジンに部位特異的にコンジュゲートされるＣｏｖＸ体形式が挙げられる。実施形態では、コンジュゲーションは、低分子量薬物の血清半減期を改善する。例示的なＣｏｖＸ体はＣＶＸ−２４１（ＮＣＴ０１００４８２２）であり、これはＶＥＧＦまたはＡｎｇ２のいずれかを阻害する２つの短いペプチドにコンジュゲートした抗体を含む。同上を参照されたい。
【０３０６】
抗体分子は、宿主系における、例えば少なくとも１つ以上の成分の組換え発現によって産生され得る。例示的な宿主系としては、真核細胞（例えば、ＣＨＯ細胞などの哺乳類細胞、またはＳＦ９もしくはＳ２細胞などの昆虫細胞）、および原核細胞（例えばＥ．ｃｏｌｉ）が挙げられる。二重特異性抗体分子は、異なる宿主細胞において成分を別個に発現させ、その後精製／アセンブリすることにより産生され得る。あるいは、抗体分子は、単一の宿主細胞において成分を発現させることにより産生され得る。二重特異性抗体分子の精製は、親和性クロマトグラフィーなどの様々な方法、例えばプロテインＡおよび連続ｐＨ溶出を使用して行うことができる。他の実施形態では、親和性タグ、例えば、ヒスチジン含有タグ、ｍｙｃタグ、またはストレプトアビジンタグを精製に使用することができる。
【０３０７】
ＣＤＲグラフト足場
実施形態では、抗体分子はＣＤＲグラフト化足場ドメインである。実施形態では、足場ドメインは、フィブロネクチンドメイン、例えばフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインに基づく。フィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆｎ３）ドメインの全体的な折り畳みは、最小機能性抗体断片である抗体重鎖の可変ドメインの折り畳みと密接に関連している。Ｆｎ３の末端には３つのループがあり、ＢＣ、ＤＥ、およびＦＧループの位置は、抗体のＶＨドメインのＣＤＲ１、２、および３の位置にほぼ対応する。Ｆｎ３にはジスルフィド結合がなく、したがって、抗体およびそれらの断片とは異なり、Ｆｎ３は還元条件下で安定している（例えば、ＷＯ９８／５６９１５、ＷＯ０１／６４９４２、ＷＯ００／３４７８４を参照されたい）。Ｆｎ３ドメインは、本明細書に記載される抗原／マーカー／細胞に結合するドメインを選択するために、（例えば、本明細書に記載されるＣＤＲまたは超可変ループを使用して）修飾されるか、または変更され得る。
【０３０８】
実施形態では、足場ドメイン、例えば折り畳みドメインは、抗体、例えば、モノクローナル抗体の重鎖可変ドメインから３つのベータ鎖を削除することにより創出される「ミニボディ」足場に基づく（例えば、Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．７：９およびＭａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，ＥＭＢＯＪ．１３：５３０３−５３０９を参照されたい）。「ミニボディ」を使用して、２つの超可変ループを提示することができる。実施形態では、足場ドメインは、Ｖ様ドメイン（例えば、Ｃｏｉａ  ｅｔ  ａｌ．ＷＯ９９／４５１１０を参照されたい）、または２つのジスルフィド結合によって一緒に保持された７４残基の６本鎖ベータシートサンドイッチであるテンダミスタチン由来のドメインである（例えば、ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ  ａｎｄ  Ｈｏｅｓｓ，１９９５，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５０：４６０を参照されたい）。例えば、テンダミスタチンのループは、本明細書に記載されるマーカー／抗原／細胞に結合するドメインを選択するために、（例えば、ＣＤＲまたは超可変ループを使用して）修飾されるか、または変更され得る。別の例示的な足場ドメインは、ＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインに由来するベータサンドイッチ構造である（例えば、ＷＯ００／６００７０を参照されたい）。
【０３０９】
他の例示的な足場ドメインとしては、Ｔ細胞受容体、ＭＨＣタンパク質、細胞外ドメイン（例えば、フィブロネクチンＩＩＩ型リピート、ＥＧＦリピート）、プロテアーゼ阻害剤（例えば、クニッツドメイン、エコチン、ＢＰＴＩなど）、ＴＰＲリピート、トリフォイル構造、ジンクフィンガードメイン、ＤＮＡ結合タンパク質、特に単量体のＤＮＡ結合タンパク質、ＲＮＡ結合タンパク質、酵素、例えばプロテアーゼ（特に不活性化されたプロテアーゼ）、ＲＮａｓｅ、シャペロン、例えばチオレドキシン、および熱ショックタンパク質、ならびに細胞内シグナル伝達ドメイン（ＳＨ２およびＳＨ３ドメインなど）が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２００４／０００９５３０およびＵＳ７，５０１，１２１を参照されたい。
【０３１０】
実施形態では、足場ドメインは、例えば、以下の基準：（１）アミノ酸配列、（２）いくつかの相同ドメインの配列、（３）３次元構造、および／または（４）ｐＨ、温度、塩分、有機溶媒、酸化剤濃度の範囲にわたる安定性データのうちの１つ以上によって評価および選択される。実施形態では、足場ドメインは、小さく、安定したタンパク質ドメイン、例えば、１００、７０、５０、４０、または３０未満のアミノ酸のタンパク質である。ドメインは、１つ以上のジスルフィド結合を含み得るか、または金属、例えば亜鉛をキレート化してもよい。
【０３１１】
抗体ベースの融合
抗体のＮまたはＣ末端に付加された追加の結合実体を含む様々な形式を生成することができる。単鎖またはジスルフィド安定化ＦｖもしくはＦａｂとのこれらの融合により、各抗原に対して二価の結合特異性を有する四価の分子が生成される。ｓｃＦｖおよびｓｃＦａｂとＩｇＧとを組み合わせることより、３つ以上の異なる抗原を認識することができる分子の産生が可能になる。
【０３１２】
抗体−Ｆａｂ融合体
抗体−Ｆａｂ融合体は、第１の標的に対する従来の抗体と、抗体重鎖のＣ末端に融合した、第２の標的に対するＦａｂとを含む二重特異性抗体である。一般的に、抗体およびＦａｂは共通の軽鎖を有する。抗体融合体は、（１）標的融合体のＤＮＡ配列を操作し、（２）融合タンパク質を発現するために、好適な宿主細胞に標的ＤＮＡをトランスフェクトすることにより産生することができる。Ｃｏｌｏｍａ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １５：１５９により記載されるように、抗体−ｓｃＦｖ融合体はＣＨ３ドメインのＣ末端とｓｃＦｖのＮ末端との間の（Ｇｌｙ）−Ｓｅｒリンカーにより結合され得るようである。
【０３１３】
抗体−ｓｃＦｖ融合体
抗体−ｓｃＦｖ融合体は、従来の抗体と、抗体重鎖のＣ末端に融合した独自の特異性のｓｃＦｖとを含む二重特異性抗体である。ｓｃＦｖは、直接またはリンカーペプチドを介してのいずれかでｓｃＦｖの重鎖を介してＣ末端に融合され得る。抗体融合体は、（１）標的融合体のＤＮＡ配列を操作し、（２）融合タンパク質を発現するために、好適な宿主細胞に標的ＤＮＡをトランスフェクトすることにより産生することができる。Ｃｏｌｏｍａ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １５：１５９により記載されるように、抗体−ｓｃＦｖ融合体はＣＨ３ドメインのＣ末端とｓｃＦｖのＮ末端との間の（Ｇｌｙ）−Ｓｅｒリンカーにより結合され得るようである。
【０３１４】
可変ドメイン免疫グロブリンＤＶＤ
関連する形式は、二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ）であり、これは、短いリンカー配列によってＶドメインのＮ末端上の第２の特異性のＶＨおよびＶＬドメインで構成される。
【０３１５】
他の例示的な多重特異性抗体形式には、例えば、以下のＵＳ２０１６／０１１４０５７Ａ１、ＵＳ２０１３／０２４３７７５Ａ１、ＵＳ２０１４／００５１８３３、ＵＳ２０１３／００２２６０１、ＵＳ２０１５／００１７１８７Ａ１、ＵＳ２０１２／０２０１７４６Ａ１、ＵＳ２０１５／０１３３６３８Ａ１、ＵＳ２０１３／０２６６５６８Ａ１、ＵＳ２０１６／０１４５３４０Ａ１、ＷＯ２０１５／１２７１５８Ａ１、ＵＳ２０１５／０２０３５９１Ａ１、ＵＳ２０１４／０３２２２２１Ａ１、ＵＳ２０１３／０３０３３９６Ａ１、ＵＳ２０１１／０２９３６１３、ＵＳ２０１３／００１７２００Ａ１、ＵＳ２０１６／０１０２１３５Ａ１、ＷＯ２０１５／１９７５９８Ａ２、ＷＯ２０１５／１９７５８２Ａ１、ＵＳ９３５９４３７、ＵＳ２０１５／００１８５２９、ＷＯ２０１６／１１５２７４Ａ１、ＷＯ２０１６／０８７４１６Ａ１、ＵＳ２００８／００６９８２０Ａ１、ＵＳ９１４５５８８Ｂ、ＵＳ７９１９２５７、およびＵＳ２０１５／０２３２５６０Ａ１に記載されるものが含まれる。完全な抗体−Ｆａｂ／ｓｃＦａｂ形式を利用する例示的な多重特異性分子には、以下のＵＳ９３８２３２３Ｂ２、ＵＳ２０１４／００７２５８１Ａ１、ＵＳ２０１４／０３０８２８５Ａ１、ＵＳ２０１３／０１６５６３８Ａ１、ＵＳ２０１３／０２６７６８６Ａ１、ＵＳ２０１４／０３７７２６９Ａ１、ＵＳ７７４１４４６Ｂ２、およびＷＯ１９９５／００９９１７Ａ１に記載されるものが含まれる。ドメイン交換形式を利用する例示的な多重特異性分子には、以下のＵＳ２０１５／０３１５２９６Ａ１、ＷＯ２０１６／０８７６５０Ａ１、ＵＳ２０１６／００７５７８５Ａ１、ＷＯ２０１６／０１６２９９Ａ１、ＵＳ２０１６／０１３０３４７Ａ１、ＵＳ２０１５／０１６６６７０、ＵＳ８７０３１３２Ｂ２、ＵＳ２０１０／０３１６６４５、ＵＳ８２２７５７７Ｂ２、ＵＳ２０１３／００７８２４９に記載されるものが含まれる。
【０３１６】
Ｆｃ含有実体（ミニ抗体）
ミニ抗体としても知られるＦｃ含有実体は、ｓｃＦｖを定常重領域ドメイン３のＣ末端（ＣＨ３−ｓｃＦｖ）および／または特異性の異なる抗体のヒンジ領域（ｓｃＦｖ−ヒンジ−Ｆｃ）に融合することにより生成することができる。ＩｇＧのＣＨ３ドメインのＣ末端に融合したジスルフィド安定化可変ドメイン（ペプチドリンカーなし）を有する三価の実体も作製することができる。
【０３１７】
Ｆｃ含有多重特異性分子
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される多重特異性分子は、免疫グロブリン定常領域（例えばＦｃ領域）を含む。例示的なＦｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４の重鎖定常領域、より具体的には、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４の重鎖定常領域から選択され得る。
【０３１８】
いくつかの実施形態では、免疫グロブリン鎖定常領域（例えばＦｃ領域）は、Ｆｃ受容体結合、抗体グリコシル化、システイン残基の数、エフェクター細胞機能、または補体機能のうちの１つ以上を増加または減少させるように改変、例えば突然変異される。
【０３１９】
他の実施形態では、第１および第２の免疫グロブリン鎖定常領域（例えば第１および第２のＦｃ領域）の界面は、例えば、操作されていない界面、例えば天然に存在する界面と比べて、二量体化を増加または減少させるように改変、例えば突然変異される。例えば、免疫グロブリン鎖定常領域（例えばＦｃ領域）の二量体化は、例えば操作されていない界面と比べて、ヘテロ多量体対ホモ多量体の比が大きくなるように、突起−空洞の対合（「ノブ・イン・ホール」）、静電相互作用、または鎖交換のうちの１つ以上で、第１および第２のＦｃ領域のＦｃ界面を提供することにより増強され得る。
【０３２０】
いくつかの実施形態では、多重特異性分子は、例えばヒトＩｇＧ１のＦｃ領域の３４７、３４９、３５０、３５１、３６６、３６８、３７０、３９２、３９４、３９５、３９７、３９８、３９９、４０５、４０７、または４０９のうちの１つ以上から選択される位置に対合したアミノ酸置換を含む。例えば、免疫グロブリン鎖定常領域（例えばＦｃ領域）は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、またはＹ４０７Ｖ（例えば空洞またはホールに対応する）から選択されるアミノ酸置換と、Ｔ３６６Ｗ（例えば突起またはノブに対応する）との対を含み得る。
【０３２１】
他の実施形態では、多機能性分子は、半減期拡張剤、例えばヒト血清アルブミンまたはヒト血清アルブミンに対する抗体分子を含む。
【０３２２】
ヘテロ二量体化抗体分子および作製方法
誤った重鎖対合の問題に対処するために、多重特異性抗体を産生する様々な方法が開示されている。例示的な方法を以下に記載する。例示的な多重特異性抗体形式および上記多重特異性抗体の作製方法は、例えば、Ｓｐｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６７（２０１５）９５−１０６；およびＫｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ  ｍＡｂｓ  ４：６，６５３−６６３；Ｎｏｖｅｍｂｅｒ／Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２０１２（それらの各々の全内容は参照により本明細書に組み込まれる）にも開示されている。
【０３２３】
ヘテロ二量体化二重特異性抗体は、天然のＩｇＧ構造に基づいており、２つの結合アームは異なる抗原を認識する。定義された一価（および同時）抗原結合を可能にするＩｇＧ由来の形式は、軽鎖の誤対合を最小限に抑える技術（例えば一般的な軽鎖）と組み合わせた、強制重鎖ヘテロ二量体化によって生成される。強制重鎖ヘテロ二量体化は、例えば、ノブ・イン・ホールまたは鎖交換操作ドメイン（ＳＥＥＤ）を使用して得ることができる。
【０３２４】
ノブ・イン・ホール
ＵＳ５，７３１，１１６、ＵＳ７，４７６，７２４、およびＲｉｄｇｗａｙ、Ｒｉｄｇｗａｙ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）  Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ９（７）：６１７−６２１に記載されるように、ノブ・イン・ホールは、（１）抗体のうちの一方または両方のＣＨ３ドメインを突然変異させてヘテロ二量体化を促進すること、および（２）ヘテロ二量体化を促進する条件下で突然変異させた抗体を組み合わせることを広く伴う。「ノブ」または「突起」は、典型的には、親抗体の小さなアミノ酸をより大きなアミノ酸（例えばＴ３６６ＹまたはＴ３６６Ｗ）で代置することによって創出され、「ホール」または「空洞」は、親抗体のより大きな残基をより小さなアミノ酸（例えば、Ｙ４０７Ｔ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、および／またはＹ４０７Ｖ）で代置することによって創出される。
【０３２５】
Ｆｃドメインを含む二重特異性抗体の場合、特定の突然変異を重鎖の定常領域に導入して、Ｆｃ部分の正しいヘテロ二量体化を促進することが利用され得る。いくつかのそのようはな技術は、Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｍＡｂｓ（２０１２）４：６，１−１１）において概説されており、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。これらの技術には、抗体重鎖のうちの１つのＣＨ３ドメインのうちの一方にかさ高い残基を導入することを伴う「ノブイントゥホール」（ＫｉＨ）アプローチが含まれる。このかさ高い残基は、重鎖の正しい対合を促進するように、対合した重鎖の他方のＣＨ３ドメインの相補的な「ホール」に収まる（例えばＵＳ７６４２２２８を参照されたい）。
【０３２６】
例示的なＫｉＨ突然変異には、「ノブ」重鎖のＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、および「ホール」重鎖のＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖが含まれる。追加の任意の安定化Ｆｃシステイン突然変異とともに、他の例示的なＫｉＨ突然変異は表７に提供される。
【表７】
2020522254.tif 000023
【０３２７】
他のＦｃ突然変異は、一方の鎖のＣＨ３ドメインの３つの負の荷電残基が他方の鎖のＣＨ３ドメインの３つの正の荷電残基と対合することを同定したＩｇａｗａおよびＴｓｕｎｏｄａによって提供される。これらの特定の荷電残基対は、Ｅ３５６−Ｋ４３９、Ｅ３５７−Ｋ３７０、Ｄ３９９−Ｋ４０９、およびその逆も同様である。単独で、または新たに同定されたジスルフィド架橋と組み合わせて、鎖Ａに次の３つの突然変異：Ｅ３５６Ｋ、Ｅ３５７ＫおよびＤ３９９Ｋのうちの少なくとも２つ、ならびに鎖ＢにＫ３７０Ｅ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４３９Ｅを導入することにより、それらは、同時にホモ二量体化を抑制しながら、非常に効率的なヘテロ二量体化を優先することができた（Ｍａｒｔｅｎｓ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｏｎｅ−ａｒｍｅｄ  ａｎｔｉｃ−  Ｍｅｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００６；１２：６１４４−５２；ＰＭＩＤ：１７０６２６９１）。Ｘｅｎｃｏｒは、構造計算および配列情報の組み合わせに基づいて４１の変異型対を定義し、その後、最大ヘテロ二量体化についてスクリーニングし、鎖ＡのＳ３６４Ｈ、Ｆ４０５Ａ（ＨＡ）と鎖ＢのＹ３４９Ｔ、Ｔ３９４Ｆ（ＴＦ）との組み合わせを定義した（Ｍｏｏｒｅ  ＧＬ  ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒｍａｔ  ｅｎａｂｌｅｓ  ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｂｉｖａｌｅｎｔ  ａｎｄ  ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ  ｃｏ−ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｔａｒｇｅｔ  ａｎｔｉｇｅｎｓ．ＭＡｂｓ  ２０１１；３：５４６−５７；ＰＭＩＤ：２２１２３０５５）。
【０３２８】
多重特異性抗体のヘテロ二量体化を促進する他の例示的なＦｃ突然変異には、以下の参考文献：ＷＯ２０１６／０７１３７７Ａ１、ＵＳ２０１４／００７９６８９Ａ１、ＵＳ２０１６／０１９４３８９Ａ１、ＵＳ２０１６／０２５７７６３、ＷＯ２０１６／０７１３７６Ａ２、ＷＯ２０１５／１０７０２６Ａ１、ＷＯ２０１５／１０７０２５Ａ１、ＷＯ２０１５／１０７０１５Ａ１、ＵＳ２０１５／０３５３６３６Ａ１、ＵＳ２０１４／０１９９２９４Ａ１、ＵＳ７７５０１２８Ｂ２、ＵＳ２０１６０２２９９１５Ａ１、ＵＳ２０１５／０３４４５７０Ａ１、ＵＳ８００３７７４Ａ１、ＵＳ２０１５／０３３７０４９Ａ１、ＵＳ２０１５／０１７５７０７Ａ１、ＵＳ２０１４／０２４２０７５Ａ１、ＵＳ２０１３／０１９５８４９Ａ１、ＵＳ２０１２／０１４９８７６Ａ１、ＵＳ２０１４／０２００３３１Ａ１、ＵＳ９３０９３１１Ｂ２、ＵＳ８５８６７１３、ＵＳ２０１４／００３７６２１Ａ１、ＵＳ２０１３／０１７８６０５Ａ１、ＵＳ２０１４／０３６３４２６Ａ１、ＵＳ２０１４／００５１８３５Ａ１、およびＵＳ２０１１／００５４１５１Ａ１に記載されているものが含まれ、それらの各々の内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０３２９】
安定化システイン突然変異はまた、ＫｉＨおよび他のＦｃヘテロ二量体化促進変異型と組み合わせて使用されてきた。例えばＵＳ７１８３０７６を参照されたい。他の例示的なシステイン修飾には、例えば、ＵＳ２０１４／０３４８８３９Ａ１、ＵＳ７８５５２７５Ｂ２、およびＵＳ９０００１３０Ｂ２に開示されているものが含まれる。
【０３３０】
鎖交換操作ドメイン（ＳＥＥＤ）
鎖交換操作ドメイン（ＳＥＥＤ）Ｃ（Ｈ）３ヘテロ二量体を考案することによる、二重特異性および非対称融合タンパク質の設計を支持するヘテロ二量体Ｆｃプラットフォームが知られている。これらのヒトＩｇＧおよびＩｇＡ  Ｃ（Ｈ）３ドメインの誘導体は、ヒトＩｇＡおよびＩｇＧ  Ｃ（Ｈ）３配列の交互セグメントで構成される相補的なヒトＳＥＥＤ  Ｃ（Ｈ）３ヘテロ二量体を創出する。得られるＳＥＥＤ  Ｃ（Ｈ）３ドメインの対は、哺乳類細胞で発現すると優先的に会合してヘテロ二量体を形成する。ＳＥＥＤｂｏｄｙ（Ｓｂ）融合タンパク質は、［ＩｇＧ１ヒンジ］−Ｃ（Ｈ）２−［ＳＥＥＤ  Ｃ（Ｈ）３］からなり、１つ以上の融合パートナーに遺伝的に結合される場合がある（例えば、Ｄａｖｉｓ  ＪＨ  ｅｔ  ａｌ．ＳＥＥＤｂｏｄｉｅｓ：ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｓｔｒａｎｄ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｄｏｍａｉｎ  （ＳＥＥＤ）  ＣＨ３  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｓ  ｉｎ  ａｎ  Ｆｃ  ａｎａｌｏｇｕｅ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ｂｉｎｄｅｒｓ  ｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｆｕｓｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  ２０１０；２３：１９５−２０２、ＰＭＩＤ：２０２９９５４２、およびＵＳ８８７１９１２を参照されたい。それらの各々の内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。
【０３３１】
Ｄｕｏｂｏｄｙ
正しい重鎖対合を有する二重特異性抗体を産生する「Ｄｕｏｂｏｄｙ」技術が知られている。ＤｕｏＢｏｄｙ技術には、産生後交換反応で安定した二重特異性ヒトＩｇＧ１抗体を生成するための３つの基本ステップを伴う。最初のステップでは、各々第３の定常（ＣＨ３）ドメインに単一の一致した突然変異を含む２つのＩｇＧ１が、標準の哺乳類組換え細胞株を使用して別個に産生される。その後、これらのＩｇＧ１抗体は、回収および精製のための標準的なプロセスに従って精製される。産生および精製（産生後）後、２つの抗体を調整された実験室条件下で組換えることにより、非常に高い収率（通常＞９５％）で二重特異性抗体産物が得られる（例えば、Ｌａｂｒｉｊｎ  ｅｔ  ａｌ，ＰＮＡＳ  ２０１３；１１０（１３）：５１４５−５１５０およびＬａｂｒｉｊｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ２０１４；９（１０）：２４５０−６３を参照されたい（それらの各々の内容は参照により本明細書に組み込まれる））。
【０３３２】
静電相互作用
ホモ二量体の形成が静電気的に好ましくないような荷電アミノ酸によるＣＨ３アミノ酸変化を使用して多重特異性抗体を作製する方法が開示されている。ＥＰ１８７０４５９およびＷＯ２００９／０８９００４は、宿主細胞における異なる抗体ドメインの共発現によるヘテロ二量体形成を優先する他の戦略を記載している。これらの方法では、ホモ二量体の形成が静電気的に好ましくなく、ヘテロ二量体化が静電気的に好ましいように、重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）（両方のＣＨ３ドメインのＣＨ３−ＣＨ３界面）を構成する１つ以上の残基が荷電アミノ酸で代置される。静電相互作用を使用して多重特異性分子を作製するさらなる方法は、以下のＵＳ２０１０／００１５１３３、ＵＳ８５９２５６２Ｂ２、ＵＳ９２０００６０Ｂ２、ＵＳ２０１４／０１５４２５４Ａ１、およびＵＳ９３５８２８６Ａ１を含む参考文献に記載されており、それらの各々の内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０３３３】
共通の軽鎖
二重特異性ＩｇＧの均一な調製物を生成するには、軽鎖の誤対合を避ける必要がある。これを達成する１つの方法は、共通の軽鎖の原理を使用することである。つまり、１つの軽鎖を共有するがまだ別個の特異性のある２つのバインダーを組み合わせる。単量体の混合物からの所望の二重特異性抗体の形成を増強する例示的な方法は、二重特異性抗体のヘテロマー可変重鎖領域の各々と相互作用する共通の可変軽鎖を提供することによるものである。例えば、ＵＳ７１８３０７６Ｂ２、ＵＳ２０１１／０１７７０７３Ａ１、ＥＰ２８４７２３１Ａ１、ＷＯ２０１６／０７９０８１Ａ１、およびＥＰ３０５５３２９Ａ１に開示されている、共通の軽鎖を有する二重特異性抗体を産生する組成物および方法が開示されており、それらの各々の内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０３３４】
ＣｒｏｓｓＭａｂ
軽鎖の誤対合を低減するもう１つのオプションは、二重特異性抗体の半分のＦａｂのＣＨ１およびＣＬドメインを交換することにより、非特異的なＬ鎖の誤対合を回避するＣｒｏｓｓＭａｂ技術である。このような交差変異型は結合特異性および親和性を保持するが、２つのアームを非常に異なるものにし、Ｌ鎖の誤対合を防ぐ。ＣｒｏｓｓＭａｂ技術（上記のＫｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．で概説される）は、正しい対合の形成を促進するために、重鎖と軽鎖との間のドメインスワッピングを伴う。簡潔に、２つの異なる軽鎖−重鎖の対を使用して２つの抗原に結合することができる二重特異性ＩｇＧ様ＣｒｏｓｓＭａｂ抗体を構築するために、２段階の修飾プロセスを適用する。最初に、二量体化界面は、ヘテロ二量体化アプローチ、例えばノブイントゥホール（ＫｉＨ）技術を使用して各重鎖のＣ末端内に操作されて、１つの抗体（例えば抗体Ａ）および第２の抗体（例えば抗体Ｂ）からの２つの異なる重鎖のヘテロ二量体のみが効率的に形成されることを確実にする。次に、１つの抗体の定常重１（ＣＨ１）と定常軽（ＣＬ）ドメインを交換し（抗体Ａ）、可変重（ＶＨ）ドメインと可変軽（ＶＬ）ドメインとを一致させる。ＣＨ１およびＣＬドメインの交換は、修飾された抗体（抗体Ａ）の軽鎖が修飾された抗体（抗体Ａ）の重鎖とのみ効率的に二量体化し、未修飾の抗体（抗体Ｂ）の軽鎖が未修飾の抗体（抗体Ｂ）の重鎖とのみ効率的に二量体化し、したがって、所望の二重特異性ＣｒｏｓｓＭａｂのみが効率的に形成されることを確実にした（例えば、Ｃａｉｎ，Ｃ．ＳｃｉＢＸ  ４（２８）；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｃｉｂｘ．２０１１．７８３を参照されたい、その内容は参照により本明細書に組み込まれる）。
【０３３５】
共通の重鎖
単量体の混合物からの所望の二重特異性抗体の形成を増強する例示的な方法は、二重特異性抗体のヘテロマー可変軽鎖領域の各々と相互作用する共通の可変重鎖を提供することによるものである。例えば、ＵＳ２０１２／０１８４７１６、ＵＳ２０１３／０３１７２００、およびＵＳ２０１６／０２６４６８５Ａ１に開示されている、共通の重鎖を有する二重特異性抗体を産生する組成物および方法が開示されており、それらの各々の内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０３３６】
アミノ酸修飾
正しい軽鎖対合を有する多重特異性抗体を産生する代替の組成物および方法には、様々なアミノ酸修飾が含まれる。例えば、Ｚｙｍｅｗｏｒｋｓは、ＣＨ１および／またはＣＬドメインに１つ以上のアミノ酸修飾、ＶＨおよび／またはＶＬドメインに１つ以上のアミノ酸修飾、またはそれらの組み合わせを有するヘテロ二量体について説明しており、これは、軽鎖と重鎖との間の界面の一部であり、ヘテロ二量体対の２つの重鎖と２つの軽鎖が細胞内で同時発現される場合、第１のヘテロ二量体の重鎖が他方ではなく軽鎖のうちの一方と優先的に対合されるように各重鎖と所望の軽鎖との間に優先的な対合を創出する（例えばＷＯ２０１５／１８１８０５を参照されたい）。他の例示的な方法は、ＷＯ２０１６／０２６９４３（Ａｒｇｅｎ−Ｘ）、ＵＳ２０１５／０２１１００１、ＵＳ２０１４／００７２５８１Ａ１、ＵＳ２０１６／００３９９４７Ａ１、およびＵＳ２０１５／０３６８３５２に記載されている。
【０３３７】
ラムダ／カッパ形式
ラムダ軽鎖ポリペプチドおよびカッパ軽鎖ポリペプチドを含む多重特異性分子（例えば多重特異性抗体分子）は、ヘテロ二量体化を可能にするように使用でされ得る。ラムダ軽鎖ポリペプチドおよびカッパ軽鎖ポリペプチドを含む二重特異性抗体分子を生成する方法は、２０１６年９月２３日に出願されたＵＳＳＮ６２／３９９，３１９（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されている。
【０３３８】
実施形態では、多重特異性分子は、多重特異性抗体分子、例えば２つの結合特異性を含む抗体分子、例えば二重特異性抗体分子を含む。多重特異性抗体分子は、
第１のエピトープに特異的なラムダ軽鎖ポリペプチド１（ＬＬＣＰ１）、
第１のエピトープに特異的な重鎖ポリペプチド１（ＨＣＰ１）、
第２のエピトープに特異的なカッパ軽鎖ポリペプチド２（ＫＬＣＰ２）、および
第２のエピトープに特異的な重鎖ポリペプチド２（ＨＣＰ２）を含む。
【０３３９】
「ラムダ軽鎖ポリペプチド１（ＬＬＣＰ１）」は、その用語が本明細書で使用される場合、同族重鎖可変領域と組み合わされたとき、そのエピトープへの特異的結合を媒介し、ＨＣＰ１と複合体を形成するように、十分な軽鎖（ＬＣ）配列を含むポリペプチドを指す。一実施形態では、それはＣＨ１領域の全てまたは断片を含む。一実施形態では、ＬＬＣＰ１は、ＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、ＬＣ−ＣＤＲ３、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４、およびＣＨ１、またはそのエピトープの特異的結合を媒介し、ＨＣＰ１と複合体を形成するのに十分なそれらからの配列を含む。ＬＬＣＰ１は、そのＨＣＰ１とともに、第１のエピトープに特異性を提供する（ＫＬＣＰ２は、そのＨＣＰ２とともに、第２のエピトープに特異性を提供する）。本明細書の他の箇所に記載されるように、ＬＬＣＰ１はＨＣＰ２よりもＨＣＰ１に対してより高い親和性を有する。
【０３４０】
「カッパ軽鎖ポリペプチド２（ＫＬＣＰ２）」は、その用語が本明細書で使用される場合、同族重鎖可変領域と組み合わされたとき、そのエピトープへの特異的結合を媒介し、ＨＣＰ２と複合体を形成することができるように、十分な軽鎖（ＬＣ）配列を含むポリペプチドを指す。一実施形態では、それはＣＨ１領域の全てまたは断片を含む。一実施形態では、ＫＬＣＰ２は、ＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、ＬＣ−ＣＤＲ３、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４、およびＣＨ１、またはそのエピトープの特異的結合を媒介し、ＨＣＰ２と複合体を形成するのに十分なそれらからの配列を含む。ＫＬＣＰ２は、そのＨＣＰ２とともに、第２のエピトープに特異性を提供する（ＬＬＣＰ１は、そのＨＣＰ１とともに、第１のエピトープに特異性を提供する）。
【０３４１】
「重鎖ポリペプチド１（ＨＣＰ１）」は、その用語が本明細書で使用される場合、同族ＬＬＣＰ１と組み合わされたとき、そのエピトープへの特異的結合を媒介し、ＨＣＰ１と複合体を形成することができるように、十分な重鎖（ＨＣ）配列、例えばＨＣ可変領域配列を含むポリペプチドを指す。一実施形態では、それはＣＨ１領域の全てまたは断片を含む。一実施形態では、それはＣＨ２および／またはＣＨ３領域の全てまたは断片を含む。一実施形態では、ＨＣＰ１は、ＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、ＨＣ−ＣＤＲ３、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３、または（ｉ）そのエピトープの特異的結合を媒介し、ＬＬＣＰ１と複合体を形成する、（ｉｉ）本明細書に記載されるように、ＫＬＣＰ２とは対照的にＬＬＣＰ１に対して優先的に複合体を形成する、かつ（ｉｉｉ）本明細書に記載されるように、ＨＣＰ１の別の分子とは対照的に対してＨＣＰ２に優先的に複合体を形成するのに十分なそれらからの配列を含む。ＨＣＰ１は、そのＬＬＣＰ１とともに、第１のエピトープに特異性を提供する（ＫＬＣＰ２は、そのＨＣＰ２とともに、第２のエピトープに特異性を提供する）。
【０３４２】
「重鎖ポリペプチド２（ＨＣＰ２）」は、その用語が本明細書で使用される場合、同族ＬＬＣＰ１と組み合わされたとき、そのエピトープへの特異的結合を媒介し、ＨＣＰ１と複合体を形成することができるように、十分な重鎖（ＨＣ）配列、例えばＨＣ可変領域配列を含むポリペプチドを指す。一実施形態では、それはＣＨ１領域の全てまたは断片を含む。一実施形態では、それはＣＨ２および／またはＣＨ３領域の全てまたは断片を含む。一実施形態では、ＨＣＰ１は、ＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、ＨＣ−ＣＤＲ３、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３、または（ｉ）そのエピトープへの特異的結合を媒介し、ＫＬＣＰ２と複合体を形成する、（ｉｉ）本明細書に記載されるように、ＬＬＣＰ１とは対照的にＫＬＣＰ２に対して優先的に複合体を形成する、かつ（ｉｉｉ）本明細書に記載されるように、ＨＣＰ２の別の分子とは対照的にＨＣＰ１に対して優先的に複合体を形成するのに十分なそれらからの配列を含む。ＨＣＰ２は、そのＫＬＣＰ２とともに、第２のエピトープに特異性を提供する（ＬＬＣＰ１は、そのＨＣＰ１とともに、第１のエピトープに特異性を提供する）。
【０３４３】
本明細書に開示される多重特異性抗体分子のいくつかの実施形態では、
ＬＬＣＰ１は、ＨＣＰ２よりもＨＣＰ１に対してよりも高い親和性を有し、かつ／または
ＫＬＣＰ２は、ＨＣＰ１よりもＨＣＰ２に対してより親和性を有する。
【０３４４】
実施形態では、ＨＣＰ１に対するＬＬＣＰ１の親和性は、ＨＣＰ２に対するその親和性よりも十分に大きいため、予め選択された条件下、例えば水性緩衝液において、例えば生理食塩水においてｐＨ７、例えばｐＨ７で、または生理学的条件下で、少なくとも７５％、８０、９０、９５、９８、９９、９９．５、または９９．９％の多重特異性抗体分子分子は、ＬＬＣＰ１を、ＨＣＰ１と複合体形成させるか、またはＨＣＰ１と相互作用させる。
【０３４５】
本明細書に開示される多重特異性抗体分子のいくつかの実施形態では、
ＨＣＰ１は、ＨＣＰ１の第２の分子よりもＨＣＰ２に対して大きい親和性を有し、かつ／または
ＨＣＰ２は、ＨＣＰ２の第２の分子よりもＨＣＰ１に対して大きい親和性を有する。
【０３４６】
実施形態では、ＨＣＰ２に対するＨＣＰ１の親和性は、ＨＣＰ１の第２の分子に対するその親和性よりも十分に大きいため、予め選択された条件下、例えば水性緩衝液において、例えば生理食塩水においてｐＨ７、例えばｐＨ７で、または生理学的条件下で、少なくとも７５％、８０、９０、９５、９８、９９、９９．５、または９９．９％の多重特異性抗体分子分子は、ＨＣＰ１を、ＨＣＰ２と複合体形成させるか、またはＨＣＰ１と相互作用させる。
【０３４７】
別の態様では、多重特異性抗体分子を作製または産生する方法が本明細書で開示される。本方法は、
（ｉ）第１の重鎖ポリペプチド（例えば、第１の重鎖可変領域（第１のＶＨ）、第１のＣＨ１、第１の重鎖定常領域（例えば、第１のＣＨ２、第１のＣＨ３、またはその両方）のうちの１つ、２つ、３つ、または全てを含む重鎖ポリペプチド）を提供することと、
（ｉｉ）第２の重鎖ポリペプチド（例えば、第２の重鎖可変領域（第２のＶＨ）、第２のＣＨ１、第２の重鎖定常領域（例えば、第２のＣＨ２、第２のＣＨ３、またはその両方）のうちの１つ、２つ、３つ、または全てを含む重鎖ポリペプチド）を提供することと、
（ｉｉｉ）第１の重鎖ポリペプチド（例えば第１のＶＨ）と優先的に会合するラムダ鎖ポリペプチド（例えば、ラムダ軽可変領域（ＶＬλ）、ラムダ軽定常鎖（ＶＬλ）、またはその両方）を提供することと、
（ｉｖ）第２の重鎖ポリペプチド（例えば第２のＶＨ）と優先的に会合するカッパ鎖ポリペプチド（例えば、ラムダ軽可変領域（ＶＬκ）、ラムダ軽定常鎖（ＶＬκ）、またはその両方）を提供することとを、
（ｉ）〜（ｉｖ）が関連する条件下で含む。
【０３４８】
実施形態では、第１および第２の重鎖ポリペプチドは、ヘテロ二量体化を増強するＦｃ界面を形成する。
【０３４９】
実施形態では、（ｉ）〜（ｉｖ）（例えば、（ｉ）〜（ｉｖ）をコードする核酸）は、単一の細胞、例えば単一の哺乳類細胞、例えばＣＨＯ細胞に導入される。実施形態では、（ｉ）〜（ｉｖ）は細胞内で発現される。
【０３５０】
実施形態では、（ｉ）〜（ｉｖ）（例えば、（ｉ）〜（ｉｖ）をコードする核酸）は、異なる細胞、例えば異なる哺乳類細胞、例えば２つ以上のＣＨＯ細胞に導入される。実施形態では、（ｉ）〜（ｉｖ）は細胞内で発現される。
【０３５１】
一実施形態では、本方法は、例えば、ラムダおよび／またはカッパ特異的精製、例えば親和性クロマトグラフィーを使用して、細胞発現抗体分子を精製することをさらに含む。
【０３５２】
実施形態では、本方法は、細胞発現多重特異性抗体分子を評価することをさらに含む。例えば、精製された細胞発現多重特異性抗体分子は、質量分析を含む当該技術分野で既知の技法により分析することができる。一実施形態では、精製された細胞発現抗体分子は、切断、例えばパパインで消化されてＦａｂ部分をもたらし、質量分析を使用して評価される。
【０３５３】
実施形態では、本方法は、例えば少なくとも７５％、８０、９０、９５、９８、９９、９９．５または９９．９％の高収率で、正しく対合したカッパ／ラムダ多重特異性、例えば二重特異性抗体分子を産生する。
【０３５４】
他の実施形態では、以下を含む多重特異性、例えば二重特異性抗体分子：
（ｉ）第１の重鎖ポリペプチド（ＨＣＰ１）（例えば、第１の重鎖可変領域（第１のＶＨ）、第１のＣＨ１、第１の重鎖定常領域（例えば、第１のＣＨ２、第１のＣＨ３、またはその両方）のうちの１つ、２つ、３つ、または全てを含む重鎖ポリペプチド）（例えば、ＨＣＰ１は第１のエピトープに結合する）、
（ｉｉ）第２の重鎖ポリペプチド（ＨＣＰ２）（例えば、第２の重鎖可変領域（第２のＶＨ）、第２のＣＨ１、第２の重鎖定常領域（例えば、第２のＣＨ２、第２のＣＨ３、またはその両方）のうちの１つ、２つ、３つ、または全てを含む重鎖ポリペプチド）（例えば、ＨＣＰ２は第２のエピトープに結合する）、
（ｉｉｉ）第１の重鎖ポリペプチド（例えば第１のＶＨ）と優先的に会合するラムダ鎖ポリペプチド（ＬＬＣＰ１）（例えば、ラムダ軽可変領域（ＶＬｌ）、ラムダ軽定常鎖（ＶＬｌ）、またはその両方）（例えば、ＬＬＣＰ１は第１のエピトープに結合する）、および
（ｉｖ）第２の重鎖ポリペプチド（例えば第２のＶＨ）と優先的に会合するカッパ鎖ポリペプチド（ＫＬＣＰ２）（例えば、ラムダ軽可変領域（ＶＬκ）、ラムダ軽定常鎖（ＶＬκ）、またはその両方）（例えば、ＫＬＣＰ２は第２のエピトープに結合する）。
【０３５５】
実施形態では、第１および第２の重鎖ポリペプチドは、ヘテロ二量体化を増強するＦｃ界面を形成する。実施形態では、多重特異性抗体分子は、Ｆｃ定常ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン（ノブ修飾を有する）に接続された第１重鎖可変領域にヘテロ二量体化されたハイブリッドＶＬ１−ＣＬ１を含む第１結合特異性と、Ｆｃ定常ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン（ホール修飾を有する）に接続された第２の重鎖可変領域にヘテロ二量体化されたハイブリッドＶＬｋ−ＣＬｋを含む第２結合特異性とを有する。
【０３５６】
核酸
本発明はまた、本明細書に記載されるように、抗体分子の重鎖および軽鎖可変領域ならびにＣＤＲまたは超可変ループをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を特徴とする。例えば、本発明は、本明細書に開示される抗体分子のうちの１つ以上から選択される抗体分子の重鎖および軽鎖可変領域をそれぞれコードする第１および第２の核酸を特徴とする。核酸は、本明細書の表に記載の、またはそれと実質的に同一の配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％以上同一の配列、または本明細書の表に示される配列と３、６、１５、３０、または４５ヌクレオチド以下異なるヌクレオチド配列を含み得る。
【０３５７】
ある特定の実施形態では、核酸は、本明細書の表に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域からの少なくとも１つ、２つ、もしくは３つのＣＤＲまたは超可変ループをコードするヌクレオチド配列、あるいはそれと実質的に相同な配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％以上同一の、および／または１つ以上の置換、例えば保存的置換を有する配列）を含み得る。他の実施形態では、核酸は、本明細書の表に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域からの少なくとも１つ、２つ、もしくは３つのＣＤＲまたは超可変ループをコードするヌクレオチド配列、あるいはそれと実質的に相同な配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％以上同一の、および／または１つ以上の置換、例えば保存的置換を有する配列）を含み得る。さらに別の実施形態では、核酸は、本明細書の表に記載のアミノ酸配列を有する重鎖および軽鎖可変領域からの少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは６つのＣＤＲまたは超可変ループをコードするヌクレオチド配列、あるいはそれと実質的に相同な配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％以上同一の、および／または１つ以上の置換、例えば保存的置換を有する配列）を含み得る。
【０３５８】
ある特定の実施形態では、核酸は、本明細書の表に記載のヌクレオチド配列を有する重鎖可変領域からの少なくとも１つ、２つ、もしくは３つのＣＤＲまたは超可変ループをコードするヌクレオチド配列、それと実質的に相同な配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％以上同一の、および／または本明細書に記載される厳密な条件下でハイブリダイズすることができる配列）を含み得る。別の実施形態では、核酸は、本明細書の表に記載のヌクレオチド配列を有する軽鎖可変領域からの少なくとも１つ、２つ、もしくは３つのＣＤＲまたは超可変ループをコードするヌクレオチド配列、あるいはそれと実質的に相同な配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％以上同一の、および／または本明細書に記載される厳密な条件下でハイブリダイズすることができる配列）を含み得る。さらに別の実施形態では、核酸は、本明細書の表に記載のヌクレオチド配列を有する重鎖および軽鎖可変領域からの少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは６つのＣＤＲまたは超可変ループをコードするヌクレオチド配列、あるいはそれと実質的に相同な配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％以上同一の、および／または本明細書に記載される厳密な条件下でハイブリダイズすることができる配列）を含み得る。
【０３５９】
別の態様では、本出願は、本明細書に記載される核酸を含む宿主細胞およびベクターを特徴とする。核酸は、以下により詳細に記載されるように、同じ宿主細胞または別個の宿主細胞に存在する単一のベクターまたは別個のベクターに存在し得る。
【０３６０】
ベクター
本明細書に記載される抗体分子をコードするヌクレオチド配列を含むベクターが本明細書でさらに提供される。一実施形態では、ベクターは、本明細書に記載される抗体分子をコードするヌクレオチドを含む。一実施形態では、ベクターは本明細書に記載されるヌクレオチド配列を含む。ベクターには、ウイルス、プラスミド、コスミド、ラムダファージ、または酵母人工染色体（ＹＡＣ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０３６１】
多数のベクター系を用いることができる。例えば、１つのクラスのベクターは、例えばウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ラウス肉腫ウイルス、ＭＭＴＶ、またはＭＯＭＬＶ）、またはＳＶ４０ウイルスなどの動物ウイルスに由来するＤＮＡ要素を利用する。別のクラスのベクターは、セムリキ森林ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、およびフラビウイルスなどのＲＮＡウイルスに由来するＲＮＡ要素を利用する。
【０３６２】
加えて、ＤＮＡをそれらの染色体に安定して組み込んだ細胞は、トランスフェクトされた宿主細胞の選択を可能にする１つ以上のマーカーを導入することによって選択され得る。マーカーは、例えば、栄養要求性宿主に対する原栄養性、殺生物剤耐性（例えば抗生物質）、または銅などの重金属に対する耐性などを提供し得る。選択可能なマーカー遺伝子は、発現されるＤＮＡ配列に直接結合されるか、または同時形質転換によって同じ細胞に導入されるかのいずれかであり得る。ｍＲＮＡの最適な合成には、追加の要素が必要になる場合もある。これらの要素には、スプライスシグナル、ならびに転写プロモーター、エンハンサー、および終結シグナルが含まれる場合がある。
【０３６３】
発現ベクターまたは構築物を含むＤＮＡ配列が発現のために調製されると、発現ベクターが適切な宿主細胞にトランスフェクトまたは導入され得る。これを達成するために、例えば、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、レトロウイルス形質導入、ウイルストランスフェクション、遺伝子銃、脂質ベースのトランスフェクション、または他の従来の技法などの様々な技法を用いることができる。プロトプラスト融合の場合、細胞を培地で成長させ、適切な活性についてスクリーニングする。得られるトランスフェクトされた細胞を培養し、産生された抗体分子を回収する方法および条件は、当業者に既知であり、本説明に基づいて、用いられる特定の発現ベクターおよび哺乳類宿主細胞に応じて変更または最適化することができる。
【０３６４】
細胞
別の態様では、本出願は、本明細書に記載される核酸を含む宿主細胞およびベクターを特徴とする。核酸は、同じ宿主細胞または別個の宿主細胞に存在する単一のベクターまたは別個のベクターに存在し得る。宿主細胞は、真核細胞、例えば哺乳類細胞、昆虫細胞、酵母細胞、または原核細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉであり得る。例えば、哺乳類細胞は、培養細胞または細胞株であり得る。例示的な哺乳類細胞には、リンパ球細胞系（例えば、ＮＳＯ）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＣＯＳ細胞、卵母細胞、およびトランスジェニック動物からの細胞、例えば乳腺上皮細胞が含まれる。
本発明はまた、本明細書に記載される抗体分子をコードする核酸を含む宿主細胞を提供する。
【０３６５】
一実施形態では、宿主細胞は、抗体分子をコードする核酸を含むように遺伝子操作される。
【０３６６】
一実施形態では、宿主細胞は、発現カセットを使用することにより遺伝子操作される。「発現カセット」という句は、そのような配列と適合性のある宿主における遺伝子の発現に影響を与えることができるヌクレオチド配列を指す。そのようなカセットは、プロモーター、イントロンを伴うまたは伴わないオープンリーディングフレーム、および終結シグナルを含み得る。例えば誘導性プロモーターなどの、発現をもたらすのに必要または有用な追加の因子も使用され得る。
【０３６７】
本発明は、本明細書に記載されるベクターを含む宿主細胞も提供する。
【０３６８】
細胞は、真核細胞、細菌細胞、昆虫細胞、またはヒト細胞であり得るが、これらに限定されない。好適な真核細胞には、ベロ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ細胞、およびＭＤＣＫＩＩ細胞が含まれるが、これらに限定されない。好適な昆虫細胞には、Ｓｆ９細胞が含まれるが、これに限定されない。
【０３６９】
使用および併用療法
本明細書に記載される方法は、本明細書に記載される多重特異性分子を使用して、例えば本明細書に記載される医薬組成物を使用して、対象のがんを治療することを含む。また、対象のがんの症状を低減または寛解させる方法、ならびにがんの成長を阻害し、かつ／または１つ以上のがん細胞を死滅させる方法も提供される。実施形態では、本明細書に記載される方法は、本明細書に記載されるもので、または本明細書に記載される医薬組成物を投与された対象の腫瘍の大きさおよび／またはがん細胞の数を減少させる。
【０３７０】
実施形態では、がんは血液癌である。実施形態では、血液癌は白血病またはリンパ腫である。本明細書で使用される場合、「血液癌」とは、造血またはリンパ系組織の腫瘍、例えば、血液、骨髄、またはリンパ節に影響を及ぼす腫瘍を指す。例示的な血液悪性腫瘍としては、白血病（例えば、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、有毛細胞白血病、急性単球性白血病（ＡＭｏＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、若年性骨髄単球性白血病（ＪＭＭＬ）、または大顆粒リンパ球性白血病）、リンパ腫（例えば、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫（例えば古典的ホジキンリンパ腫または結節性リンパ球優勢ホジキンリンパ腫）、菌状息肉腫、非ホジキンリンパ腫（例えば、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（例えば、バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫（ＣＬＬ／ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、またはマントル細胞リンパ腫）またはＴ細胞非ホジキンリンパ腫（菌状息肉腫、未分化大細胞型リンパ腫、または前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫））、原発性中枢神経系リンパ腫、セザリー症候群、ワルデンストレームマクログロブリン血症）、慢性骨髄増殖性新生物、ランゲルハンス細胞組織球症、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、骨髄異形成症候群、骨髄線維症、または骨髄異形成／骨髄増殖性新生物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３７１】
実施形態では、がんは固形癌である。例示的な固形癌としては、卵巣癌、直腸癌、胃癌、精巣癌、肛門領域のがん、子宮癌、結腸癌、直腸癌、腎細胞癌、肝臓癌、肺の非小細胞癌、小腸癌、食道癌、黒色腫、カポジ肉腫、内分泌系のがん、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚または眼内の悪性黒色腫、子宮癌、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、類表皮癌、子宮頸部扁平上皮癌のがん、卵管癌、子宮内膜癌、膣癌、軟部組織の肉腫、尿道癌、外陰部癌、陰茎癌、膀胱癌、腎臓または尿管のがん、腎盂癌、脊椎軸腫瘍、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、上記がんの転移病変、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３７２】
実施形態では、多重特異性分子（または医薬組成物）は、治療または予防される疾患に適切な様式で投与される。投与の量および頻度は、患者の状態、患者の疾患の種類および重症度などの要因によって決定される。適切な投与量は臨床試験によって決定され得る。例えば、「有効量」または「治療量」が示される場合、投与される医薬組成物（または多重特異性分子）の正確な量は、腫瘍の大きさ、感染または転移の程度、対象の年齢、体重、および状態の個人差を考慮して医師により決定され得る。実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物は、１０４〜１０９細胞／ｋｇ体重、例えば１０５〜１０６細胞／ｋｇ体重（これらの範囲内の全ての整数値を含む）の投与量で投与され得る。実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物は、これらの投与量で複数回投与することができる。実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物は、免疫療法に記載される注入技法を使用して投与され得る（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ．３１９：１６７６，１９８８を参照されたい）。
【０３７３】
実施形態では、多重特異性分子または医薬組成物は、対象に非経口投与される。実施形態では、細胞は、対象に静脈内、皮下、腫瘍内、結節内、筋肉内、皮内、または腹腔内投与される。実施形態では、細胞は、腫瘍またはリンパ節に直接投与、例えば注射される。実施形態では、細胞は、注入（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ．３１９：１６７６，１９８８に記載されているように）または静脈内プッシュとして投与される。実施形態では、細胞は、注射可能なデポ製剤として投与される。
実施形態では、対象は哺乳動物である。実施形態では、対象は、ヒト、サル、ブタ、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、ラット、またはマウスである。実施形態では、対象はヒトである。実施形態では、対象は、例えば１８歳未満、例えば１７歳、１６歳、１５歳、１４歳、１３歳、１２歳、１１歳、１０歳、９歳、８歳、７歳、６歳、５歳、４歳、３歳、２歳、１歳未満、またはそれ以下の小児対象である。実施形態では、対象は、例えば少なくとも１８歳、例えば少なくとも１９歳、２０歳、２１歳、２２歳、２３歳、２４歳、２５歳、２５〜３０歳、３０〜３５歳、３５〜４０歳、４０〜５０歳、５０〜６０歳、６０〜７０歳、７０〜８０歳、または８０〜９０歳の成人である。
【０３７４】
併用療法
本明細書で開示される多重特異性分子は、第２の治療薬または手順と組み合わせて使用することができる。
【０３７５】
実施形態では、多重特異性分子および第２の治療薬または手順は、対象ががんと診断された後、例えばがんが対象から排除される前に投与／実施される。実施形態では、多重特異性分子および第２の治療薬または手順は、同時にまたは同時発生的に投与／実施される。例えば、第２の送達が開始されるとき、１つの治療の送達はまだ行われており、例えば、治療の施行が重複する。実施形態では、多重特異性分子および第２の治療薬または手順は、順次投与／実施される。例えば、１つの治療の送達は、他の治療の送達が始まる前に終わる。
【０３７６】
実施形態では、併用療法は、いずれかの薬剤単独での単独療法よりも効果的な治療をもたらし得る。実施形態では、第１および第２の治療の組み合わせは、第１または第２の治療単独よりも効果的である（例えば、症状および／またはがん細胞の大幅な低減をもたらす）。実施形態では、併用療法は、単独療法として投与されるとき、同様の効果を達成するために通常必要とされる第１または第２の治療の用量と比較して、より低い用量の第１または第２の治療の使用を可能にする。実施形態では、併用療法は、部分的に相加的な効果、完全に相加的な効果、または相加的な効果よりも大きい。
【０３７７】
一実施形態では、多重特異性分子は、療法、例えばがん療法（例えば、抗がん剤、免疫療法、光線力学療法（ＰＤＴ）、手術、および／または放射線のうちの１つ以上）と組み合わせて投与される。「化学療法薬（ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）」、「化学療法薬（ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）」、および「抗がん剤」という用語は、本明細書で互換的に使用される。多重特異性分子および治療、例えばがん治療の投与は、順次（重複するかまたは重複しない）または同時であり得る。多重特異性分子の投与は、治療の過程（例えばがん治療）の間、継続的または断続的であり得る。本明細書に記載のある特定の療法は、がんおよび非がん性疾患の治療に使用することができる。例えば、ＰＤＴの有効性は、本明細書に記載される方法および組成物を使用して、がん性および非がん性状態において増強され得る（例えば、Ａｇｏｓｔｉｎｉｓ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（２０１１）  ＣＡ  ＣａｎｃｅｒＪ．Ｃｌｉｎ．６１：２５０−２８１に概説されている）。
【０３７８】
抗がん療法
他の実施形態では、多重特異性分子は、低分子量または小分子量の化学療法薬と組み合わせて投与される。例示的な低分子量または小分子量の化学療法薬としては、１３−シス−レチノイン酸（イソトレチノイン、ＡＣＣＵＴＡＮＥ（登録商標））、２−ＣｄＡ（２−クロロデオキシアデノシン、クラドリビン、ＬＥＵＳＴＡＴＩＮ（商標））、５−アザシチジン（アザシチジン、ＶＩＤＡＺＡ（登録商標））、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ、フルオロウラシル、ＡＤＲＵＣＩＬ（登録商標））、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ、メルカプトプリン、ＰＵＲＩＮＥＴＨＯＬ（登録商標））、６−ＴＧ（６−チオグアニン、チオグアニン、ＴＨＩＯＧＵＡＮＩＮＥ  ＴＡＢＬＯＩＤ（登録商標））、アブラキサン（パクリタキセルタンパク質−結合）、アクチノマイシン−Ｄ（ダクチノマイシン、ＣＯＳＭＥＧＥＮ（登録商標））、アリトレチノイン（ＰＡＮＲＥＴＩＮ（登録商標））、オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ、トレチノイン、ＶＥＳＡＮＯＩＤ（登録商標））、アルトレタミン（ヘキサメチルメラミン、ＨＭＭ、ＨＥＸＡＬＥＮ（登録商標））、アメトプテリン（メトトレキサート、メトトレキサートナトリウム、ＭＴＸ、ＴＲＥＸＡＬＬ（商標）、ＲＨＥＵＭＡＴＲＥＸ（登録商標））、アミフォスチン（ＥＴＨＹＯＬ（登録商標））、アラビノシルシトシン（Ａｒａ−Ｃ、シタラビン、ＣＹＴＯＳＡＲ−Ｕ（登録商標））、三酸化ヒ素（ＴＲＩＳＥＮＯＸ（登録商標））、アスパラギナーゼ（Ｅｒｗｉｎｉａ  Ｌ−アスパラギナーゼ、Ｌ−アスパラギナーゼ、ＥＬＳＰＡＲ（登録商標）、ＫＩＤＲＯＬＡＳＥ（登録商標））、ＢＣＮＵ（カルムスチン、ＢｉＣＮＵ（登録商標））、ベンダムスチン（ＴＲＥＡＮＤＡ（登録商標））、ベキサロテン（ＴＡＲＧＲＥＴＩＮ（登録商標））、ブレオマイシン（ＢＬＥＮＯＸＡＮＥ（登録商標））、ブスルファン（ＢＵＳＵＬＦＥＸ（登録商標）、ＭＹＬＥＲＡＮ（登録商標））、カルシウムロイコボリン（シトロボラム因子、フォリン酸、ロイコボリン）、カンプトテシン−１１（ＣＰＴ−１１、イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））、カルボプラチン（ＰＡＲＡＰＬＡＴＩＮ（登録商標））、カルムスチンウエハー（カルムスチンインプラントを含むプロリフェプロスパン（ｐｒｏｌｉｆｅｐｒｏｓｐａｎ）２０）、ＧＬＩＡＤＥＬ（登録商標）ウエハー）、ＣＣＩ−７７９（テムシロリムス、ＴＯＲＩＳＥＬ（登録商標））、ＣＣＮＵ（ロムスチン、ＣｅｅＮＵ）、ＣＤＤＰ（シスプラチン、ＰＬＡＴＩＮＯＬ（登録商標）、ＰＬＡＴＩＮＯＬ−ＡＱ（登録商標））、クロラムブシル（Ｌｕｋｅｒａｎ）、シクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）、ＮＥＯＳＡＲ（登録商標））、ダカルバジン（ＤＩＣ、ＤＴＩＣ、イミダゾールカルボキサミド、ＤＴＩＣ−ＤＯＭＥ（登録商標））、ダウノマイシン（ダウノルビシン、ダウノルビシン塩酸塩、ルビドマイシン塩酸塩、ＣＥＲＵＢＩＤＩＮＥ（登録商標））、デシタビン（ＤＡＣＯＧＥＮ（登録商標））、デキサゾキサン（ＺＩＮＥＣＡＲＤ（登録商標））、ＤＨＡＤ（ミトキサントロン、ＮＯＶＡＮＴＲＯＮＥ（登録商標））、ドセタ��セル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））、ドキソルビシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）、ＲＵＢＥＸ（登録商標））、エピルビシン（ＥＬＬＥＮＣＥ（商標））、エストラムスチン（ＥＭＣＹＴ（登録商標））、エトポシド（ＶＰ−１６、リン酸エトポシド、ＴＯＰＯＳＡＲ（登録商標）、ＶＥＰＥＳＩＤ（登録商標）、ＥＴＯＰＯＰＨＯＳ（登録商標））、フロクスウリジン（ＦＵＤＲ（登録商標））、フルダラビン（ＦＬＵＤＡＲＡ（登録商標））、フルオロウラシル（クリーム）（ＣＡＲＡＣ（商標）、ＥＦＵＤＥＸ（登録商標）、ＦＬＵＯＲＯＰＬＥＸ（登録商標））、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））、ヒドロキシ尿素（ＨＹＤＲＥＡ（登録商標）、ＤＲＯＸＩＡ（商標）、ＭＹＬＯＣＥＬ（商標））、イダルビシン（ＩＤＡＭＹＣＩＮ（登録商標））、イホスファミド（ＩＦＥＸ（登録商標））、イクサベピロン（ＩＸＥＭＰＲＡ（商標））、ＬＣＲ（ロイロクリスチン、ビンクリスチン、ＶＣＲ、ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標）、ＶＩＮＣＡＳＡＲ  ＰＦＳ（登録商標））、Ｌ−ＰＡＭ（Ｌ−サルコリシン、メルファラン、フェニルアラニンマスタード、ＡＬＫＥＲＡＮ（登録商標））、メクロレタミン（メクロレタミン塩酸塩、ムスチン、ナイトロジェンマスタード、ＭＵＳＴＡＲＧＥＮ（登録商標））、メスナ（ＭＥＳＮＥＸ（商標））、マイトマイシン（マイトマイシン−Ｃ、ＭＴＣ、ＭＵＴＡＭＹＣＩＮ（登録商標））、ネララビン（ＡＲＲＡＮＯＮ（登録商標））、オキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（商標））、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、ＯＮＸＡＬ（商標））、ペガスパルガーゼ（ＰＥＧ−Ｌ−アスパラギナーゼ、ＯＮＣＯＳＰＡＲ（登録商標））、ＰＥＭＥＴＲＥＸＥＤ（ＡＬＩＭＴＡ（登録商標））、ペントスタチン（ＮＩＰＥＮＴ（登録商標））、プロカルバジン（ＭＡＴＵＬＡＮＥ（登録商標））、ストレプトゾシン（ＺＡＮＯＳＡＲ（登録商標））、テモゾロミド（ＴＥＭＯＤＡＲ（登録商標））、テニポシド（ＶＭ−２６、ＶＵＭＯＮ（登録商標））、ＴＥＳＰＡ（チオホスホアミド、チオテパ、ＴＳＰＡ、ＴＨＩＯＰＬＥＸ（登録商標））、トポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標））、ビンブラスチン（硫酸ビンブラスチン、ビンカロイコブラスチン、ＶＬＢ、ＡＬＫＡＢＡＮ−ＡＱ（登録商標）、ＶＥＬＢＡＮ  （登録商標））、ビノレルビン（酒石酸ビノレルビン、ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））、およびボリノスタット（ＺＯＬＩＮＺＡ（登録商標））が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３７９】
別の実施形態では、多重特異性分子は、生物製剤とともに投与される。がんの治療に有用な生物製剤は当該技術分野で既知であり、本発明の結合分子は、例えば、そのような既知の生物製剤とともに投与することができる。例えば、ＦＤＡは、乳癌の治療のために、以下の生物製剤を承認した：ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（トラスツズマブ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ．；ＨＥＲ２陽性乳癌において抗腫瘍活性を有するＡヒト化モノクローナル抗体）、ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標）（フルベストラント、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＬＰ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｄｅｌ．；乳癌の治療に使用されるエストロゲン−受容体アンタゴニスト）、ＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）（アナストロゾール、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＬＰ；アロマターゼを遮断する非ステロイド性アロマターゼ阻害剤、エストロゲンを作るために必要な酵素）、Ａｒｏｍａｓｉｎ（登録商標）（エキセメスタン、Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．；乳癌の治療に使用される不可逆的なステロイド性アロマターゼ不活性化剤）、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）（レトロゾール、Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｅａｓｔ  Ｈａｎｏｖｅｒ，Ｎ．Ｊ．；乳癌の治療のための、ＦＤＡにより承認された非ステロイド性アロマターゼ阻害剤）、およびＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）（タモキシフェン、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＬＰ；乳癌の治療のための、ＦＤＡにより承認された非ステロイド性抗エストロゲン）。本発明の結合分子を組み合わせることができる他の生物製剤には、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）（ベバシズマブ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．；血管新生を阻害するために設計された最初のＦＤＡ承認療法）およびＺＥＶＡＬＩＮ（登録商標）  （イブリツモマブチウキセタン、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．；Ｂ細胞リンパ腫の治療用に現在承認されている放射性標識モノクローナル抗体）が含まれる。
【０３８０】
加えて、ＦＤＡは、結腸直腸癌の治療のために、以下の生物製剤を承認した：ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）（セツキシマブ、ＩｍＣｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，およびＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．；上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に対するモノクローナル抗体である）、ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）（イマチニブメシレート；プロテインキナーゼ阻害剤）、およびＥＲＧＡＭＩＳＯＬ（登録商標）（レバミゾール塩酸塩、Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＬＰ，Ｔｉｔｕｓｖｉｌｌｅ，Ｎ．Ｊ．；デュークスステージＣの結腸癌を有する患者における外科的切除後の５−フルオロウラシルと組み合わせた補助治療として１９９０年にＦＤＡにより承認された免疫調節剤）。
【０３８１】
肺癌の治療のための例示的な生物製剤としては、ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）（エルロチニブＨＣＬ、ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，Ｎ．Ｙ．；ヒト上皮成長因子受容体１（ＨＥＲ１）経路を標的とするように設計された小分子）が挙げられる。
【０３８２】
多発性骨髄腫の治療のための例示的な生物製剤としては、ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標）ベルケイド（ボルテゾミブ、Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｍａｓｓ．；プロテアソーム阻害剤）が挙げられる。さらなる生物製剤としては、ＴＨＡＬＩＤＯＭＩＤ（登録商標）（サリドマイド、Ｃｌｅｇｅｎｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｒｒｅｎ，Ｎ．Ｊ．；免疫調節剤であり、骨髄腫細胞の成長および生存ならびに抗血管新生を阻害する能力を含む複数の作用を有するようである）が挙げられる。
【０３８３】
さらなる例示的ながん治療用抗体としては、３Ｆ８、アバゴボマブ（ａｂａｇｏｖｏｍａｂ）、アデカツムマブ（ａｄｅｃａｔｕｍｕｍａｂ）、アフツズマブ（ａｆｕｔｕｚｕｍａｂ）、アラシズマブペゴール、アレムツズマブ（ＣＡＭＰＡＴＨ（登録商標）、ＭＡＢＣＡＭＰＡＴＨ（登録商標））、アルツモマブペンテタート（ａｌｔｕｍｏｍａｂ  ｐｅｎｔｅｔａｔｅ）（ＨＹＢＲＩ−ＣＥＡＫＥＲ（登録商標））、アナツモマブマフェナトキス（ａｎａｔｕｍｏｍａｂ  ｍａｆｅｎａｔｏｘ）、アンルキンズマブ（ＩＭＡ−６３８）、アポリズマブ、アルシツモマブ（ＣＥＡ−ＳＣＡＮ（登録商標））、バビツキシマブ、ベクツモマブ（ＬＹＭＰＨＯＳＣＡＮ（登録商標））、ベリムマブ（ＢＥＮＬＹＳＴＡ（登録商標）、ＬＹＭＰＨＯＳＴＡＴ−Ｂ（登録商標））、ベシレソマブ（ＳＣＩＮＴＩＭＵＮ（登録商標））、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））、ビバツズマブメルタンシン、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブベドチン、カンツズマブメルタンシン、カプロマブペンデチド（ＰＲＯＳＴＡＳＣＩＮＴ（登録商標））、カツマキソマブ（ＲＥＭＯＶＡＢ（登録商標））、ＣＣ４９、セツキシマブ（Ｃ２２５、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標））、シタツズマブボガトクス（ｃｉｔａｔｕｚｕｍａｂ  ｂｏｇａｔｏｘ）、シクスツムマブ、クリバツズマブテトラキセタン、コナツムマブ、ダセツズマブ、デノスマブ（ＰＲＯＬＩＡ（登録商標））、デキズマブ、クリバツズマブテトラキセブマツ、エドコロマブ（ＰＡＮＯＲＥＸ（登録商標））、デツモマブ、エクロメキシマブ、エドレコロマブ（ＰＡＮＯＲＥＸ（登録商標））、エロツズマブ、エピツモマブシツキセタン、エプラツズマブ、エルツマキソマブ（ＲＥＸＯＭＵＮ（登録商標））、エタラシズマブ、ファルレツズマブ、フィギツムマブ、フレソリムマブ、ガリキシマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン（ＭＹＬＯＴＡＲＧ（登録商標））、ギレンツキシマブ、グレンバツムマブべドチン、イブリツモマブ（イブリツモマブチウキセタン、ＺＥＶＡＬＩＮ（登録商標））、イゴボマブ（ＩＮＤＩＭＡＣＩＳ−１２５（登録商標））、インテツムマブ、イノツズマブオゾガマイシン、イピリムマブ、イラツムマブ、ラベツズマブ（ＣＥＡ−ＣＩＤＥ（登録商標））、レキサツムマブ、リンツズマブ、ルカツムマブ、ルミリキシマブ、マパツムマブ、マツズマブ、ミラツズマブ、ミンレツモマブ、ミツモマブ、ナコロマブタフェナトクス（ｎａｃｏｌｏｍａｂ  ｔａｆｅｎａｔｏｘ）、ナプツモマブエスタフェナトクス（ｎａｐｔｕｍｏｍａｂ  ｅｓｔａｆｅｎａｔｏｘ）、ネシツムマブ、ニモツズマブ（ＴＨＥＲＡＣＩＭ（登録商標）、ＴＨＥＲＡＬＯＣ（登録商標））、ノフェツモマブメルペンタン（ＶＥＲＬＵＭＡ（登録商標））、オファツムマブ（ＡＲＺＥＲＲＡ（登録商標））、オララツマブ、オポルツズマブモナトクス、オレゴボマブ（ＯＶＡＲＥＸ（登録商標））、パニツムマブ（ＶＥＣＴＩＢＩＸ（登録商標））、ペムツモマブ（ＴＨＥＲＡＧＹＮ（登録商標））、ペルツズマブ（ＯＭＮＩＴＡＲＧ（登録商標））、ピンツモマブ、プリツムマブ、ラムシルマブ、ラニビズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標））、リロツムマブ、リツキシマ��（ＭＡＢＴＨＥＲＡ（登録商標）、ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））、ロバツムマブ、サツモマブペンデチド、シブロツズマブ、シルツキシマブ、ソンツズマブ、タカツズマブテトラキセタン（ＡＦＰ−ＣＩＤＥ（登録商標））、タプリツモマブパプトクス、テナツモマブ、ＴＧＮ１４１２、チシリムマブ（トレメリムマブ）、チガツズマブ、ＴＮＸ−６５０、トシツモマブ（ＢＥＸＸＡＲ（登録商標））、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））、トレメリムマブ、ツコツズマブセルモロイキン、ベルツズマブ、ボロシキシマブ、ボツムマブ（ＨＵＭＡＳＰＥＣＴ（登録商標））、ザルツムマブ（ＨＵＭＡＸ−ＥＧＦＲ（登録商標））、およびザノリムマブ（ＨＵＭＡＸ−ＣＤ４（登録商標））が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３８４】
他の実施形態では、多重特異性分子は、ウイルス性がん治療薬と組み合わせて投与される。例示的なウイルス性がん治療薬としては、ワクシニアウイルス（ｖｖＤＤ−ＣＤＳＲ）、がん胎児性抗原発現麻疹ウイルス、組換えワクシニアウイルス（ＴＫ−欠失＋ＧＭ−ＣＳＦ）、セネカバレーウイルス−００１、ニューカッスルウイルス、コクサッキーウイルスＡ２１、ＧＬ−ＯＮＣ１、ＥＢＮＡ１  Ｃ末端／ＬＭＰ２キメラタンパク質発現組換え修飾ワクシニアアンカラワクチン、がん胎児性抗原発現麻疹ウイルス、Ｇ２０７腫瘍溶解性ウイルス、ｐ５３を発現する修飾ワクシニアウイルスアンカラワクチン、ＯｎｃｏＶＥＸ  ＧＭ−ＣＳＦ修飾単純ヘルペス１型ウイルス、鶏痘ウイルスワクチンベクター、組換えワクシニア前立腺特異抗原ワクチン、ヒトパピローマウイルス１６／１８  Ｌ１ウイルス様粒子／ＡＳ０４ワクチン、ＭＶＡ−ＥＢＮＡ１／ＬＭＰ２  Ｉｎｊ．ワクチン、４価のＨＰＶワクチン、４価のヒトパピローマウイルス（６型、１１型、１６型、１８型）組換えワクチン（ＧＡＲＤＡＳＩＬ（登録商標））、組換え鶏痘ＣＥＡ（６Ｄ）／ＴＲＩＣＯＭワクチン；組換えワクシニア−ＣＥＡ（６Ｄ）−ＴＲＩＣＯＭワクチン、組換え修飾ワクシニアアンカラ−５Ｔ４ワクチン、組換え鶏痘−ＴＲＩＣＯＭワクチン、腫瘍溶解性ヘルペスウイルスＮＶ１０２０、ＨＰＶ  Ｌ１  ＶＬＰワクチンＶ５０４、ヒトパピローマウイルス二価（１６型および１８型）ワクチン（ＣＥＲＶＡＲＩＸ（登録商標））、単純ヘルペスウイルスＨＦ１０、Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３遺伝子、組換えワクシニアＤＦ３／ＭＵＣ１ワクチン、組換えワクシニア−ＭＵＣ−１ワクチン、組換えワクシニア−ＴＲＩＣＯＭワクチン、ＡＬＶＡＣ  ＭＡＲＴ−１ワクチン、ヒトプレプロエンケファリン（ＮＰ２）を発現する複製欠損単純ヘルペスウイルスＩ型（ＨＳＶ−１  ）ベクター、野生型レオウイルス、レオウイルス３型ディアリング（ＲＥＯＬＹＳＩＮ（登録商標））、腫瘍溶解性ウイルスＨＳＶ１７１６、エプスタイン−バーウイルス標的抗原をコードする組換え修飾ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ベースのワクチン、組換え鶏痘−前立腺特異的抗原ワクチン、組換えワクシニア前立腺特異的抗原ワクチン、組換えワクシニア−Ｂ７．１ワクチン、ｒＡｄ−ｐ５３遺伝子、Ａｄ５−ｄｅｌｔａ２４ＲＧＤ、ＨＰＶワクチン５８０２９９、ＪＸ−５９４（チミジンキナーゼ欠損ワクシニアウイルス＋ＧＭ−ＣＳＦ）、ＨＰＶ−１６／１８  Ｌ１／ＡＳ０  ４、鶏痘ウイルスワクチンベクター、ワクシニアチロシナーゼワクチン、ＭＥＤＩ−５１７  ＨＰＶ−１６／１８  ＶＬＰ  ＡＳ０４ワクチン、単純ヘルペスウイルスＴＫ９９ＵＮのチミジンキナーゼを含むアデノウイルスベクター、ＨｓｐＥ７、ＦＰ２５３／フルダラビン、ＡＬＶＡＣ（２）黒色腫多抗原治療用ワクチン、ＡＬＶＡＣ−ｈＢ７．１、カナリアポックス−ｈＩＬ−１２黒色腫ワクチン、Ａｄ−ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３、ｒＡｄ−ＩＦＮ  ＳＣＨ  ７２１０１５、ＴＩＬ−Ａｄ−ＩＮＦｇ、Ａｄ−ＩＳＦ３５、およびコクサッキーウイルスＡ２１（ＣＶＡ２１、ＣＡＶＡＴＡＫ（登録商標））が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３８５】
他の実施形態では、多重特異性分子はナノ医薬品（ｎａｎｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）と組み合わせて投与される。例示的ながんナノ医薬品としては、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）（パクリタキセル結合アルブミンナノ粒子）、ＣＲＬＸ１０１（線状シクロデキストリンベースのポリマーにコンジュゲートしたＣＰＴ）、ＣＲＬＸ２８８（ドセタキセルと生分解性ポリマーポリ（乳酸−コ−グリコール酸）とをコンジュゲートする）、シタラビンリポソーム（リポソームＡｒａ−Ｃ、ＤＥＰＯＣＹＴ（商標））、ダウノルビシンリポソーム（ＤＡＵＮＯＸＯＭＥ（登録商標））、ドキソルビシンリポソーム（ＤＯＸＩＬ（登録商標）、ＣＡＥＬＹＸ（登録商標））、カプセル化ダウノルビシンクエン酸リポソーム（ＤＡＵＮＯＸＯＭＥ（登録商標））、およびＰＥＧ抗ＶＥＧＦアプタマー（ＭＡＣＵＧＥＮ（登録商標））が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３８６】
いくつかの実施形態では、多重特異性分子はパクリタキセルまたはパクリタキセル製剤、例えばＴＡＸＯＬ（登録商標）、タンパク質結合パクリタキセル（例えばＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標））と組み合わせて投与される。例示的なパクリタキセル製剤としては、ナノ粒子アルブミン結合パクリタキセル（ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）、Ａｂｒａｘｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅにより販売）、ドコサヘキサエン酸結合パクリタキセル（ＤＨＡ−パクリタキセル、タキソプレキシン、Ｐｒｏｔａｒｇａにより販売）、ポリグルタメート結合パクリタキセル（ＰＧ−パクリタキセル、パクリタキセルポリグルメクス、ＣＴ−２１０３、ＸＹＯＴＡＸ、Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃにより販売）、腫瘍活性化プロドラッグ（ＴＡＰ）、ＡＮＧ１０５（Ａｎｇｉｏｐｅｐ−２がパクリタキセルの３つの分子に結合、ＩｍｍｕｎｏＧｅｎにより販売）、パクリタキセルＥＣ−１（パクリタキセルがｅｒｂＢ２認識ペプチドＥＣ−１に結合；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ（２００７）  ８７：２２５−２３０を参照されたい）、およびグルコースコンジュゲートパクリタキセル（例えば、２’−パクリタキセル２−グルコピラノシルコハク酸メチル、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（２００７）  １７：６１７−６２０を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３８７】
がんを治療するための例示的なＲＮＡｉおよびアンチセンスＲＮＡ剤としては、ＣＡＬＡＡ−０１、ｓｉＧ１２Ｄ  ＬＯＤＥＲ（Ｌｏｃａｌ  Ｄｒｕｇ  ＥｌｕｔｅＲ）、およびＡＬＮ−ＶＳＰ０２が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３８８】
他のがん治療薬としては、サイトカイン（例えば、アルデスロイキン（ＩＬ−２、インターロイキン２、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標））、アルファインターフェロン（ＩＦＮ−アルファ、インターフェロンアルファ、ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）Ａ（インターフェロンアルファ−２ｂ）、ＲＯＦＥＲＯＮ−Ａ（登録商標）（インターフェロンアルファ−２ａ））、エポエチンアルファ（ＰＲＯＣＲＩＴ（登録商標））、フィルグラスチム（Ｇ−ＣＳＦ、顆粒球−コロニー刺激因子、ＮＥＵＰＯＧＥＮ（登録商標））、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、サルグラモスティム、ＬＥＵＫＩＮＥ（商標））、ＩＬ−１１（インターロイキン−１１、オプレルベキン、ＮＥＵＭＥＧＡ（登録商標））、インターフェロンアルファ−２ｂ（ＰＥＧコンジュゲート）（ＰＥＧインターフェロン、ＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮ（商標））、およびペグフィルグラスチム（ＮＥＵＬＡＳＴＡ（商標））、ホルモン療法薬（例えば、アミノグルテチミド（ＣＹＴＡＤＲＥＮ（登録商標））、アナストロゾール（ＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標））、ビカルタミド（ＣＡＳＯＤＥＸ（登録商標））、エキセメスタン（ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標））、フルオキシメステロン（ＨＡＬＯＴＥＳＴＩＮ（登録商標））、フルタミド（ＥＵＬＥＸＩＮ（登録商標））、フルベストラント（ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標））、ゴセレリン（ＺＯＬＡＤＥＸ（登録商標））、レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ（登録商標））、ロイプロリド（ＥＬＩＧＡＲＤ（商標）、ＬＵＰＲＯＮ（登録商標）、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（登録商標）、ＶＩＡＤＵＲ（商標））、メゲストロール（酢酸メゲストロール、ＭＥＧＡＣＥ（登録商標））、ニルタミド（ＡＮＡＮＤＲＯＮ（登録商標）、ＮＩＬＡＮＤＲＯＮ（登録商標））、オクトレオチド（酢酸オクトレオチド、ＳＡＮＤＯＳＴＡＴＩＮ（登録商標）、ＳＡＮＤＯＳＴＡＴＩＮ  ＬＡＲ（登録商標））、ラロキシフェン（ＥＶＩＳＴＡ（登録商標））、ロミプロスチム（ＮＰＬＡＴＥ（登録商標））、タモキシフェン（ＮＯＶＡＬＤＥＸ（登録商標））、およびトレミフェン（ＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標））、ホスホリパーゼＡ２阻害剤（例えば、アナグレリド（ＡＧＲＹＬＩＮ（登録商標））、生物学的反応調節剤（例えば、ＢＣＧ（ＴＨＥＲＡＣＹＳ（登録商標）、ＴＩＣＥ（登録商標））、およびダルベポエチンアルファ（ＡＲＡＮＥＳＰ（登録商標））、標的治療薬（例えば、ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標））、ダサチニブ（ＳＰＲＹＣＥＬ（商標））、デニロイキンジフチトクス（ＯＮＴＡＫ（登録商標））、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標））、エベロリムス（ＡＦＩＮＩＴＯＲ（登録商標））、ゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ（登録商標））、メシル酸イマチニブ（ＳＴＩ−５７１、ＧＬＥＥＶＥＣ（商標））、ラパチニブ（ＴＹＫＥＲＢ（登録商標））、ソラフェニブ（ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標））、およびＳＵ１１２４８（スニチニブ、ＳＵＴＥＮＴ（登録商標））、免疫調節薬および抗血管新生薬（例えば、ＣＣ−５０１３（レナリドマイド、ＲＥＶＬＩＭＩＤ（登録商標））、およびサリドマイド（ＴＨＡＬＯＭＩＤ（登録商標））、グルココルチコス��ロイド（例えば、コルチゾン（ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾンリン酸ナトリウム、ヒドロコルチゾンコハク酸ナトリウム、ＡＬＡ−ＣＯＲＴ（登録商標）、ＨＹＤＲＯＣＯＲＴ  ＡＣＥＴＡＴＥ（登録商標））、リン酸ヒドロコルトンＬＡＮＡＣＯＲＴ（登録商標）、ＳＯＬＵ−ＣＯＲＴＥＦ（登録商標））、デカドロン（デキサメタゾン、酢酸デキサメタゾン、デキサメタゾンリン酸ナトリウム、Ｄ  ＥＸＡＳＯＮＥ（登録商標）、ＤＩＯＤＥＸ（登録商標）、ＨＥＸＡＤＲＯＬ（登録商標）、ＭＡＸＩＤＥＸ（登録商標））、メチルプレドニゾロン（６−メチルプレドニゾロン、酢酸メチルプレドニゾロン、メチルプレドニゾロンコハク酸ナトリウム、ＤＵＲＡＬＯＮＥ（登録商標）、ＭＥＤＲＡＬＯＮＥ（登録商標）、ＭＥＤＲＯＬ（登録商標）、Ｍ−ＰＲＥＤＮＩＳＯＬ（登録商標）、ＳＯＬＵ−ＭＥＤＲＯＬ（登録商標））、プレドニゾロン（ＤＥＬＴＡ−ＣＯＲＴＥＦ（登録商標）、ＯＲＡＰＲＥＤ（登録商標）、ＰＥＤＩＡＰＲＥＤ（登録商標）、ＰＲＥＬＯＮＥ（登録商標））、およびプレドニゾン（ＤＥＬＴＡＳＯＮＥ（登録商標）、ＬＩＱＵＩＤ  ＰＲＥＤ（登録商標）、ＭＥＴＩＣＯＲＴＥＮ（登録商標）、ＯＲＡＳＯＮＥ（登録商標））、ならびにビスホスホネート（例えば、パミドロネート（ＡＲＥＤＩＡ（登録商標））、およびゾレドロン酸（ＺＯＭＥＴＡ（登録商標））が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３８９】
いくつかの実施形態では、多重特異性分子は、チロシンキナーゼ阻害剤（例えば受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）阻害剤）と組み合わせて使用される。例示的なチロシンキナーゼ阻害剤としては、上皮成長因子（ＥＧＦ）経路阻害剤（例えば上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）経路阻害剤（例えばＶＥＧＦ、ＶＥＧＦトラップ、血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤（例えば、ＶＥＧＦＲ−１阻害剤、ＶＥＧＦＲ−２阻害剤、ＶＥＧＦＲ−３阻害剤）に対する抗体）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）経路阻害剤（例えば、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）阻害剤（例えばＰＤＧＦＲ−β阻害剤））、ＲＡＦ−１阻害剤、ＫＩＴ阻害剤、およびＲＥＴ阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＡＨＣＭ剤と組み合わせて使用される抗がん剤は、アキシチニブ（ＡＧ０１３７３６）、ボスチニブ（ＳＫＩ−６０６）、セジラニブ（ＲＥＣＥＮＴＩＮ（商標）、ＡＺＤ２１７１）、ダサチニブ（ＳＰＲＹＣＥＬ（登録商標）、ＢＭＳ−３５４８２５）、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標））、ゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ（登録商標））、イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標）、ＣＧＰ５７１４８Ｂ、ＳＴＩ−５７１）、ラパチニブ（ＴＹＫＥＲＢ（登録商標）、ＴＹＶＥＲＢ（登録商標））、レスタウルチニブ（ＣＥＰ−７０１）、ネラチニブ（ＨＫＩ−２７２）、ニロチニブ（ＴＡＳＩＧＮＡ（登録商標））、セマキサニブ（セマキサニブ、ＳＵ５４１６）、スニチニブ（ＳＵＴＥＮＴ（登録商標）、ＳＵ１１２４８）、トセラニブ（ＰＡＬＬＡＤＩＡ（登録商標））、バンデタニブ（ＺＡＣＴＩＭＡ（登録商標）、ＺＤ６４７４）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７、ＰＴＫ／ＺＫ）、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））、リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））、セツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標））、パニツムマブ（ＶＥＣＴＩＢＩＸ（登録商標））、ラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標））、ニロチニブ（ＴＡＳＩＧＮＡ（登録商標））、ソラフェニブ（ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標））、アレムツズマブ（ＣＡＭＰＡＴＨ（登録商標））、ゲムツズマブオゾガマイシン（ＭＹＬＯＴＡＲＧ（登録商標））、ＥＮＭＤ−２０７６、ＰＣＩ−３２７６５、ＡＣ２２０、乳酸ドビチニブ（ＴＫＩ２５８、ＣＨＩＲ−２５８）、ＢＩＢＷ２９９２（ＴＯＶＯＫ（商標））、ＳＧＸ５２３、ＰＦ−０４２１７９０３、ＰＦ−０２３４１０６６、ＰＦ−２９９８０４、ＢＭＳ−７７７６０７、ＡＢＴ−８６９、ＭＰ４７０、ＢＩＢＦ１１２０（ＶＡＲＧＡＴＥＦ（登録商標）、ＡＰ２４５３４、ＪＮＪ−２６４８３３２７、ＭＧＣＤ２６５、ＤＣＣ−２０３６、ＢＭＳ−６９０１５４、ＣＥＰ−１１９８１、チボザニブ（ＡＶ−９５１）、ＯＳＩ−９３０、ＭＭ−１２１、ＸＬ−１８４、ＸＬ−６４７、ＸＬ２２８、ＡＥＥ７８８、ＡＧ−４９０、ＡＳＴ−６、ＢＭＳ−５９９６２６、ＣＵＤＣ−１０１、ＰＤ１５３０３５、ペリチニブ（ＥＫＢ−５６９）、バンデタニブ（ｚａｃｔｉｍａ）、ＷＺ３１４６、ＷＺ４００２、ＷＺ８０４０、ＡＢＴ���８６９（リニファニブ）、ＡＥＥ７８８、ＡＰ２４５３４（ポナチニブ）、ＡＶ−９５１（チボザニブ）、アキシチニブ、ＢＡＹ７３−４５０６（レゴラフェニブ）、ブリバニブアラニネート（ＢＭＳ−５８２６６４）、ブリバニブ（ＢＭＳ−５４０２１５）、セジラニブ（ＡＺＤ２１７１）、ＣＨＩＲ−２５８（ドビチニブ）、ＣＰ６７３４５１、ＣＹＣ１１６、Ｅ７０８０、Ｋｉ８７５１、マシチニブ（ＡＢ１０１０）、ＭＧＣＤ−２６５、二リン酸モテサニブ（ＡＭＧ−７０６）、ＭＰ−４７０、ＯＳＩ−９３０、パゾパニブ塩酸塩、ＰＤ１７３０７４、ｎソラフェニブトシレート（Ｂａｙ４３−９００６）、ＳＵ５４０２、ＴＳＵ−６８（ＳＵ６６６８）、バタラニブ、ＸＬ８８０（ＧＳＫ１３６３０８９、ＥＸＥＬ−２８８０）からなる群から選択される。選択されたチロシンキナーゼ阻害剤は、スニチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、またはソラフェニブから選択される。一実施形態では、チロシンキナーゼ阻害剤はスニチニブである。
【０３９０】
一実施形態では、多重特異性分子は、抗血管新生剤、または血管標的剤もしくは血管破壊剤のうちの１つ以上と組み合わせて投与される。例示的な抗血管新生剤としては、とりわけ、ＶＥＧＦ阻害剤（例えば抗ＶＥＧＦ抗体（例えばベバシズマブ）、ＶＥＧＦ受容体阻害剤（例えばイトラコナゾール）、細胞増殖および／または内皮細胞の移動の阻害剤（例えばカルボキシアミドトリアゾール、ＴＮＰ−４７０）、血管新生刺激因子の阻害剤（例えばスラミン）が挙げられるが、これらに限定されない。血管標的剤（ＶＴＡ）または血管破壊剤（ＶＤＡ）は、中心壊死を引き起こすがん腫瘍の脈管構造（血管）を損傷させるように設計される（例えば、Ｔｈｏｒｐｅ，Ｐ．Ｅ．（２００４）  Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｖｏｌ．１０：４１５−４２７に概説されている）。ＶＴＡは低分子であり得る。例示的な小分子ＶＴＡとしては、微小管不安定化薬（例えば、コンブレタスタチンＡ−４リン酸二ナトリウム（ＣＡ４Ｐ）、ＺＤ６１２６、ＡＶＥ８０６２、Ｏｘｉ４５０３）およびバジメザン（ＡＳＡ４０４）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３９１】
免疫チェックポイント阻害剤
他の実施形態では、本明細書に記載される方法は、多重特異性分子と組み合わせた免疫チェックポイント阻害剤の使用を含む。本方法は、インビボでの治療プロトコルで使用され得る。
【０３９２】
実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤はチェックポイント分子を阻害する。例示的なチェックポイント分子としては、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０）、ＢＴＬＡ、ＫＩＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、およびＡ２ａＲが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｐａｒｄｏｌｌ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  １２．４（２０１２）：２５２−６４（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【０３９３】
実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１阻害剤、例えば、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、またはピジリズマブなどの抗ＰＤ−１抗体である。ニボルマブ（ＭＤＸ−１１０６、ＭＤＸ−１１０６−０４、ＯＮＯ−４５３８、またはＢＭＳ−９３６５５８とも呼ばれる）は、ＰＤ１を特異的に阻害する完全ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体である。例えば、ＵＳ８，００８，４４９およびＷＯ２００６／１２１１６８を参照されたい。ペンブロリズマブ（ランブロリズマブ、ＭＫ−３４７５、ＭＫ０３４７５、ＳＣＨ−９００４７５、またはＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）とも呼ばれる；Ｍｅｒｃｋ）は、ＰＤ−１に結合するヒト化ＩｇＧ４モノクローナル抗体である。例えば、Ｈａｍｉｄ，Ｏ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３６９（２）：１３４−４４、ＵＳ８，３５４，５０９、およびＷＯ２００９／１１４３３５を参照されたい。ピジリズマブ（ＣＴ−０１１またはＣｕｒｅ  Ｔｅｃｈとも呼ばれる）は、ＰＤ１に結合するヒト化ＩｇＧ１ｋモノクローナル抗体である。例えば、ＷＯ２００９／１０１６１１を参照されたい。一実施形態では、ＰＤ−１の阻害剤は、それと実質的に同一または同様の配列、例えば、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、またはピジリズマブの配列と少なくとも８５％、９０％、９５％以上同一の配列を有する抗体分子である。さらなる抗ＰＤ１抗体、例えばＡＭＰ  ５１４（Ａｍｐｌｉｍｍｕｎｅ）は、例えば、ＵＳ８，６０９，０８９、ＵＳ２０１０／０２８３３０、および／またはＵＳ２０１２／０１１４６４９に記載されている。
【０３９４】
いくつかの実施形態では、ＰＤ−１阻害剤は、イムノアドヘシン、例えば定常領域（例えば免疫グロブリンのＦｃ領域）に融合されたＰＤ−１リガンド（例えばＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２）の細胞外／ＰＤ−１結合部分を含むイムノアドヘシンである。実施形態では、ＰＤ−１阻害剤は、Ｂ７−Ｈ１とＰＤ−１との間の相互作用を遮断するＰＤ−Ｌ２  Ｆｃ融合可溶性受容体であるＡＭＰ−２２４（Ｂ７−ＤＣＩｇ、例えばＷＯ２０１１／０６６３４２およびＷＯ２０１０／０２７８２７に記載される）である。
【０３９５】
実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−Ｌ１阻害剤、例えば抗体分子である。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１阻害剤は、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＥＤＩ−４７３６、ＭＳＢ−００１０７１８Ｃ、またはＭＤＸ−１１０５である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体はＭＳＢ００１０７１８Ｃ（Ａ０９−２４６−２とも呼ばれる；Ｍｅｒｃｋ  Ｓｅｒｏｎｏ）であり、これはＰＤ−Ｌ１に結合するモノクローナル抗体である。例示的なヒト化抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、例えばＷＯ２０１３／０７９１７４に記載されている。一実施形態では、ＰＤ−Ｌ１阻害剤は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、例えばＹＷ２４３．５５．Ｓ７０である。ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０抗体は、例えばＷＯ２０１０／０７７６３４に記載されている。一実施形態では、ＰＤ−Ｌ１阻害剤はＭＤＸ−１１０５（ＢＭＳ−９３６５５９とも呼ばれる）であり、これは、例えばＷＯ２００７／００５８７４に記載されている。一実施形態では、ＰＤ−Ｌ１阻害剤はＭＤＰＬ３２８０Ａ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）であり、これはＰＤ−Ｌ１に対するヒトＦｃ最適化ＩｇＧ１モノクローナル抗体である。例えば、米国特許第７，９４３，７４３号および米国特許公開第２０１２／００３９９０６号を参照されたい。一実施形態では、ＰＤ−Ｌ１の阻害剤は、それと実質的に同一または同様の配列、例えば、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＥＤＩ−４７３６、ＭＳＢ−００１０７１８Ｃ、またはＭＤＸ−１１０５の配列と少なくとも８５％、９０％、９５％以上同一の配列を有する抗体分子である。
【０３９６】
実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−Ｌ２阻害剤、例えばＡＭＰ−２２４（ＰＤ１とＢ７−Ｈ１との間の相互作用を遮断するＰＤ−Ｌ２  Ｆｃ融合可溶性受容体であるである。例えば、ＷＯ２０１０／０２７８２７およびＷＯ２０１１／０６６３４２を参照されたい。
【０３９７】
一実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＬＡＧ−３阻害剤、例えば抗ＬＡＧ−３抗体分子である。実施形態では、抗ＬＡＧ−３抗体はＢＭＳ−９８６０１６（ＢＭＳ９８６０１６とも呼ばれる；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）である。ＢＭＳ−９８６０１６および他のヒト化抗ＬＡＧ−３抗体は、例えば、ＵＳ２０１１／０１５０８９２、ＷＯ２０１０／０１９５７０、およびＷＯ２０１４／００８２１８に記載されている。
【０３９８】
実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、例えば米国特許第８，５５２，１５６号、ＷＯ２０１１／１５５６０７、ＥＰ２５８１１１３、および米国特許公開第２０１４／０４４７２８号に記載される、ＴＩＭ−３阻害剤、例えば抗ＴＩＭ３抗体分子である。
実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ−４阻害剤、例えば抗ＣＴＬＡ−４抗体分子である。例示的な抗ＣＴＬＡ４抗体としては、トレメリムマブ（以前はチシリムマブとして知られていたＰｆｉｚｅｒから入手可能なＩｇＧ２モノクローナル抗体、ＣＰ−６７５，２０６）、イピリムマブ（ＭＤＸ−０１０としても知られる、ＣＡＳ番号４７７２０２−００−９）が挙げられる。他の例示的な抗ＣＴＬＡ−４抗体は、例えば米国特許第５，８１１，０９７号に記載されている。
【０３９９】
参照による組み込み
本明細書で言及される全ての出版物および特許は、各個々の出版物または特許が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されるかのように、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０４００】
等価物
当業者は、本明細書に記載される本発明の具体的な実施形態に対する多くの同等物を認識するか、または日常的な実験のみを使用して確認することができるであろう。そのような同等物は、添付の特許請求の範囲に包含されることが意図されている。
【図１】
2020522254.tif 000026
【配列表】
2020522254000001.app
【国際調査報告】
2020522254.tif 000027
2020522254.tif 000028
2020522254.tif 000029
2020522254.tif 000030
2020522254.tif 000031