(57)【要約】  本明細書では、免疫療法的適用における使用のための細胞タグをコードするポリヌクレオチドと、細胞の活性を調節するための、ポリヌクレオチドによる細胞タグを含むシステムとが開示される。本明細書で記載される組成物、方法、およびシステムは、対象における遺伝子操作細胞の活性を調節するためのツールをもたらす。
2020527937.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくともＨＥＲ１ドメインＩＩＩまたはその断片と、トランケート型ＨＥＲ１ドメインＩＶとからなるトランケート型非免疫原性ＨＥＲ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、前記ＨＥＲ１ポリペプチドが、抗ＨＥＲ１抗体に結合し、
前記ＨＥＲ１ポリペプチドが、操作細胞内で発現される、
ポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記トランケート型ＨＥＲ１ドメインＩＶが、前記ＨＥＲ１ドメインＩＶのうちの、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％のトランケーションを含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記トランケート型ＨＥＲ１ドメインＩＶが、配列番号２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、および２０９に示される配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または９９．５％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記トランケート型ＨＥＲ１ドメインＩＶが、配列番号２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、および２０９に示される配列を含むポリペプチド配列を含む、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記ＨＥＲ１ドメインＩＩＩまたはその断片が、配列番号２００に示される配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または９９．５％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記ＨＥＲ１ドメインＩＩＩが、配列番号２００に示される配列を含むポリペプチド配列を含む、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
ＣＤ２８膜貫通ドメインと、前記ＨＥＲ１ポリペプチドを、前記ＣＤ２８膜貫通ドメインへと共役するためのペプチドリンカーとをさらにコードする、請求項１から６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
配列番号５７に示される配列を含むポリペプチド配列を含むポリペプチド構築物をコードする、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
前記抗ＨＥＲ１抗体が、リツキシマブ、セツキシマブ、フツキシマブ、デパツキシズマブ、イムガツズマブ、ラプリツキシマブ、マツズマブ、ネシツムマブ、ニモツズマブ、パニツムマブ、およびザルツムマブのうちの少なくとも１つを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
抗ＣＤ２０抗体に結合するトランケート型非免疫原性ＣＤ２０ポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドであって、
前記トランケート型非免疫原性ＣＤ２０ポリペプチドが、内因性受容体に結合しない、
ポリヌクレオチド。
【請求項１１】
前記ＣＤ２０ポリペプチドが、配列番号１０９に示される配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または９９．５％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
前記ＣＤ２０ポリペプチドが、配列番号１０９の配列を含むポリペプチド配列を含む、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
前記ＣＤ２０ポリペプチドが、天然ＣＤ２０の、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の結合効率で、前記抗ＣＤ２０抗体に結合する、請求項１０から１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
前記抗ＣＤ２０抗体が、リツキシマブ、トシツモマブ、ベルツズマブ、アフツズマブ、ブロンツベトマブ、およびオビヌツズマブのうちの少なくとも１つを含む、請求項１３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
抗ＣＤ５２抗体に結合するトランケート型非免疫原性ＣＤ５２ポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドであって、
前記トランケート型非免疫原性ＣＤ５２ポリペプチドが、内因性受容体に結合せず、
前記非免疫原性ＣＤ５２ポリペプチドが、操作細胞内で発現される、
ポリヌクレオチド。
【請求項１６】
前記ＣＤ５２ポリペプチドが、配列番号１４３に示される配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または９９．５％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７】
前記ＣＤ５２ポリペプチドが、配列番号１４３に示される配列を含むポリペプチド配列を含む、請求項１６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８】
少なくとも１つの異種遺伝子をコードする、少なくとも１つの配列をさらに含む細胞内で発現される、請求項１０から１７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９】
前記少なくとも１つの異種遺伝子が、誘導性プロモーターによりモジュレートされる、請求項１８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０】
前記少なくとも１つの異種遺伝子が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、およびサイトカインのうちの少なくとも１つを含む、請求項１８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２１】
前記少なくとも１つの異種遺伝子が、ＣＡＲを含み、前記ＣＡＲが、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＢＣＭＡ、ＣＤ４４、α−葉酸受容体、ＣＡＩＸ、ＣＤ３０、ＲＯＲ１、ＣＥＡ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、葉酸結合性タンパク質、ＧＤ２、ＧＤ３、ＩＬ−１３Ｒ−ａ２、ＫＤＲ、ＥＤＢ−Ｆ、メソテリン、ＣＤ２２、ＥＧＦＲ、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−１６、ＭＡＧＥ−Ａ１、ｈ５Ｔ４、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ−７２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１２３、およびＶＥＧＦ−Ｒ２のうちの少なくとも１つに結合する、請求項２０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２２】
前記少なくとも１つの異種遺伝子が、サイトカインを含む、請求項１８から２０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２３】
前記サイトカインが、ＩＬ−１５、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、およびＩＬ−１５とＩＬ−ＩＬ−１５Ｒαとの融合体のうちの少なくとも１つを含む、請求項２２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２４】
前記サイトカインが、分泌形態である、請求項２３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２５】
前記サイトカインが、膜結合形態である、請求項２３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２６】
請求項１０から２５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２７】
レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、または非ウイルスベクターである、請求項２６に記載のベクター。
【請求項２８】
前記非ウイルスベクターが、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである、請求項２７に記載のベクター。
【請求項２９】
ゲノム編集により、操作細胞へと組み込まれる、請求項１０から２５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３０】
前記ゲノム編集が、少なくとも部位特異的セリンリコンビナーゼ系の使用を含む、請求項２９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３１】
請求項１０から２５および２９から３０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む操作細胞。
【請求項３２】
Ｔ細胞またはＮＫ細胞である、請求項３１に記載の操作細胞。
【請求項３３】
細胞表面ポリペプチドと、膜貫通二量体化ドメインと
を含むポリペプチド構築物であって、
前記膜貫通二量体化ドメインが、前記細胞表面ポリペプチドの二量体化を誘導し、
前記細胞表面ポリペプチドが、所定の抗体またはその変異体もしくは断片に結合する、
ポリペプチド構築物。
【請求項３４】
前記細胞表面ポリペプチドが、ＨＥＲ１ポリペプチド、ＬＮＧＦＲポリペプチド、ＣＤ２０ポリペプチド、またはＣＤ５２ポリペプチドのうちの少なくとも１つを含む、請求項３３に記載のポリペプチド構築物。
【請求項３５】
前記細胞表面ポリペプチドが、ＨＥＲ１ポリペプチドを含み、前記ＨＥＲ１ポリペプチドが、配列番号２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、または２１７に示される配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または９９．５％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項３４に記載のポリペプチド構築物。
【請求項３６】
前記ＨＥＲ１ポリペプチドが、配列番号２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、または２１７に示される配列を含むポリペプチド配列を含む、請求項３５に記載のポリペプチド構築物。
【請求項３７】
前記細胞表面ポリペプチドが、ＣＤ２０ポリペプチドを含み、前記ＣＤ２０ポリペプチドが、配列番号２１８、配列番号２１９、または配列番号２２０に示される配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または９９．５％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項３４に記載のポリペプチド構築物。
【請求項３８】
前記ＣＤ２０ポリペプチドが、配列番号２１８、配列番号２１９、または配列番号２２０に示される配列を含むポリペプチド配列を含む、請求項３７に記載のポリペプチド構築物。
【請求項３９】
前記細胞表面ポリペプチドが、ＬＮＧＦＲポリペプチドを含み、前記ＬＮＧＦＲポリペプチドが、配列番号１５６、配列番号１５８、または配列番号１６０に示される配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または９９．５％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項３４に記載のポリペプチド構築物。
【請求項４０】
前記細胞表面ポリペプチドが、ＬＮＧＦＲポリペプチドを含み、前記ＬＮＧＦＲポリペプチドが、配列番号１５６、配列番号１５８、または配列番号１６０に示される配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または９９．５％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項３４に記載のポリペプチド構築物。
【請求項４１】
前記細胞表面ポリペプチドが、内因性受容体に結合しない、請求項３３から４０のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
【請求項４２】
前記膜貫通二量体化ドメインが、相補的な二量体化ドメインと共に、ホモ二量体またはヘテロ二量体を形成しうる、請求項３３から４１のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
【請求項４３】
前記膜貫通二量体化ドメインが、少なくとも１つのシステイン残基を含む、請求項３３から４２のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
【請求項４４】
前記膜貫通二量体化ドメインが、グリコホリンＡ膜貫通ドメインまたはその断片もしくは変異体、グリコホリンＡ−インテグリンβ３キメラ膜貫通ドメインまたはその断片もしくは変異体、またはＣＤ３ゼータ膜貫通ドメインを含む、請求項３３から４３のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
【請求項４５】
前記細胞表面ポリペプチドが、少なくともＨＥＲ１ポリペプチドを含む、請求項４４に記載のポリペプチド構築物。
【請求項４６】
操作細胞内で発現される、請求項３３から４５のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
【請求項４７】
前記操作細胞が、動物細胞である、請求項４６に記載のポリペプチド構築物。
【請求項４８】
前記動物細胞が、ヒト細胞である、請求項４７に記載のポリペプチド構築物。
【請求項４９】
前記ヒト細胞が、Ｔ細胞またはＮＫ細胞である、請求項４８に記載のポリペプチド構築物。
【請求項５０】
前記操作細胞が、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼをさらに含む、請求項４６から４９のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
【請求項５１】
前記操作細胞が、少なくとも１つの、さらなる外因性ポリペプチドをさらに発現する、請求項４６から５０のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
【請求項５２】
前記操作細胞が、少なくとも１つの、外因性受容体ポリペプチドまたはその断片をさらに発現する、請求項４６から５０のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
【請求項５３】
前記操作細胞が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、およびサイトカインのうちの少なくとも１つをさらに発現する、請求項４６から５０のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
【請求項５４】
前記操作細胞が、少なくとも１つのＣＡＲをさらに発現し、前記ＣＡＲが、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＢＣＭＡ、ＣＤ４４、α−葉酸受容体、ＣＡＩＸ、ＣＤ３０、ＲＯＲ１、ＣＥＡ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、葉酸結合性タンパク質、ＧＤ２、ＧＤ３、ＩＬ−１３Ｒ−ａ２、ＫＤＲ、ＥＤＢ−Ｆ、メソテリン、ＣＤ２２、ＥＧＦＲ、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−１６、ＭＡＧＥ−Ａ１、ｈ５Ｔ４、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ−７２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１２３、およびＶＥＧＦ−Ｒ２のうちの少なくとも１つに結合する、請求項５３に記載のポリペプチド構築物。
【請求項５５】
前記操作細胞が、少なくとも１つの組換えサイトカインをさらに発現する、請求項５２から５３のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
【請求項５６】
前記組換えサイトカインが、ＩＬ−１５、ｍｂＩＬ−１５、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、またはＩＬ−２１である、請求項５５に記載のポリペプチド構築物。
【請求項５７】
ゲノム編集により、前記操作細胞へと組み込まれたポリヌクレオチドによりコードされる、請求項４６から５６のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
【請求項５８】
前記ゲノム編集が、少なくとも部位特異的セリンリコンビナーゼ系の使用を含む、請求項５７に記載のポリペプチド構築物。
【請求項５９】
前記細胞表面ポリペプチドを、前記膜貫通二量体化ドメインと融合させるリンカーを含む、請求項３３から５８のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
【請求項６０】
請求項３３から５９のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物を含む、ポリペプチドのホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項６１】
膜貫通二量体化ドメインと融合させた非免疫原性細胞表面ポリペプチド
を含むポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチドであって、前記膜貫通二量体化ドメインが、前記細胞表面ポリペプチドの二量体化を誘導する、
ポリヌクレオチド。
【請求項６２】
前記細胞表面ポリペプチドが、内因性受容体に結合しない、請求項６１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６３】
前記細胞表面ポリペプチドが、任意の内因性シグナル伝達機能またはトラフィッキング機能を含有しない、請求項６１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６４】
少なくとも１つの異種遺伝子をコードする、少なくとも１つの配列をさらに含む細胞内で発現された、請求項６１から６３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６５】
前記少なくとも１つの異種遺伝子が、誘導性プロモーターによりモジュレートされる、請求項６４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６６】
前記少なくとも１つの異種遺伝子が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、およびサイトカインのうちの少なくとも１つを含む、請求項６４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６７】
前記少なくとも１つの異種遺伝子が、前記ＣＡＲを含み、前記ＣＡＲが、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＢＣＭＡ、ＣＤ４４、α−葉酸受容体、ＣＡＩＸ、ＣＤ３０、ＲＯＲ１、ＣＥＡ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、葉酸結合性タンパク質、ＧＤ２、ＧＤ３、ＩＬ−１３Ｒ−ａ２、ＫＤＲ、ＥＤＢ−Ｆ、メソテリン、ＣＤ２２、ＥＧＦＲ、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−１６、ＭＡＧＥ−Ａ１、ｈ５Ｔ４、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ−７２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１２３、およびＶＥＧＦ−Ｒ２のうちの少なくとも１つに結合する、請求項６６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６８】
前記少なくとも１つの異種遺伝子が、サイトカインを含む、請求項６６から６７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６９】
前記サイトカインが、ＩＬ−１５、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、およびＩＬ−１５とＩＬ−ＩＬ−１５Ｒαとの融合体のうちの少なくとも１つを含む、請求項６８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７０】
前記サイトカインが、分泌形態である、請求項６８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７１】
前記サイトカインが、膜結合形態である、請求項６８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７２】
２Ａ、ＧＳＧ−２Ａ、ＧＳＧリンカー（配列番号１６）、ＳＧＳＧリンカー（配列番号１８）、フューリンリンク変異体、およびそれらの誘導体を含むポリペプチドリンカーをコードする、少なくとも１つの配列を含む、請求項６１から７１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７３】
前記２Ａリンカーが、ｐ２Ａリンカー、Ｔ２Ａリンカー、Ｆ２Ａリンカー、またはＥ２Ａリンカーである、請求項７２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７４】
前記ポリペプチド構築物が、細胞を濃縮するか、細胞を選択するか、または前記細胞表面ポリペプチドを発現する細胞における細胞死を誘導するタグとして作用する、請求項６１から７３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７５】
前記細胞表面ポリペプチドが、ＨＥＲ１ポリペプチド、ＬＮＧＦＲポリペプチド、ＣＤ２０ポリペプチド、およびＣＤ５２ポリペプチドのうちの少なくとも１つを含む、請求項６１から７４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７６】
前記膜貫通二量体化ドメインが、グリコホリンＡ膜貫通ドメインまたはその断片もしくは変異体、グリコホリンＡ−インテグリンβ３キメラ膜貫通ドメインまたはその断片もしくは変異体、またはＣＤ３ゼータ膜貫通ドメインを含む、請求項６１から７５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７７】
請求項６１から７６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項７８】
レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、または非ウイルスベクターである、請求項７７に記載のベクター。
【請求項７９】
前記非ウイルスベクターが、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである、請求項７８に記載のベクター。
【請求項８０】
ゲノム編集により、操作細胞へと組み込まれる、請求項６１から７６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８１】
前記ゲノム編集が、少なくとも部位特異的セリンリコンビナーゼ系の使用を含む、請求項８０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８２】
対象における遺伝子操作細胞の活性を調節する方法であって、
前記対象へ、膜貫通二量体化ドメインと融合させた細胞表面ポリペプチドを含むポリペプチド構築物をコードする、ある量の遺伝子操作細胞を提供するステップであって、前記膜貫通二量体化ドメインが、前記細胞表面ポリペプチドの二量体化を誘導し、前記細胞表面ポリペプチドが、所定の結合パートナーまたはその変異体もしくは断片に結合する、ステップと；
前記遺伝子操作細胞に結合し、それにより、前記遺伝子操作細胞の活性を調節するのに十分な量で、前記対象へ、前記所定の結合パートナーを提供するステップと
を含む方法。
【請求項８３】
前記細胞表面ポリペプチドが、非免疫原性ポリペプチドである、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記細胞表面ポリペプチドが、ＨＥＲ１ポリペプチド、ＬＮＧＦＲポリペプチド、ＣＤ２０ポリペプチド、およびＣＤ５２ポリペプチドのうちの少なくとも１つを含む、請求項８２から８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
前記細胞表面ポリペプチドが、内因性受容体に結合しない、請求項８２から８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
前記膜貫通二量体化ドメインが、相補的な二量体化ドメインと共に、ホモ二量体またはヘテロ二量体を形成しうる、請求項８２から８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
前記膜貫通二量体化ドメインが、少なくとも１つのシステイン残基を含む、請求項８２から８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
前記膜貫通二量体化ドメインが、グリコホリンＡ膜貫通ドメインまたはその断片もしくは変異体、グリコホリンＡ−インテグリンβ３キメラ膜貫通ドメインまたはその断片もしくは変異体、またはＣＤ３ゼータ膜貫通ドメインを含む、請求項８２から８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
前記結合パートナーが、抗体、またはその細胞表面ポリペプチド結合性領域を含む、請求項８２から８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
前記抗体が、モノクローナル抗体、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、ダイアボディー、およびラクダ科動物抗体のうちの少なくとも１つを含む、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記抗体が、リツキシマブ、セツキシマブ、アレムツズマブ、パニツムマブ、およびネシツムマブのうちの少なくとも１つを含む、請求項８９に記載の方法。
【請求項９２】
前記遺伝子操作細胞が、Ｔ細胞およびＮＫ細胞のうちの少なくとも１つを含む、請求項８２から９１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
前記遺伝子操作細胞のうちの少なくとも１つが、少なくとも１つの、さらなる外因性ポリペプチドをさらに発現する、請求項８２から９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
前記遺伝子操作細胞のうちの少なくとも１つが、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、およびサイトカインのうちの少なくとも１つをさらに発現する、請求項８２から９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
前記遺伝子操作細胞のうちの少なくとも１つが、少なくとも１つのＣＡＲをさらに発現し、前記ＣＡＲが、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＢＣＭＡ、ＣＤ４４、α−葉酸受容体、ＣＡＩＸ、ＣＤ３０、ＲＯＲ１、ＣＥＡ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、葉酸結合性タンパク質、ＧＤ２、ＧＤ３、ＩＬ−１３Ｒ−ａ２、ＫＤＲ、ＥＤＢ−Ｆ、メソテリン、ＣＤ２２、ＥＧＦＲ、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−１６、ＭＡＧＥ−Ａ１、ｈ５Ｔ４、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ−７２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１２３、およびＶＥＧＦ−Ｒ２のうちの少なくとも１つに結合する、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記遺伝子操作細胞のうちの少なくとも１つが、少なくとも１つの組換えサイトカインをさらに発現する、請求項９４に記載の方法。
【請求項９７】
前記組換えサイトカインが、ＩＬ−１５、ｍｂＩＬ−１５、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、およびＩＬ−２１のうちの少なくとも１つを含む、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記所定の結合パートナーを、サイトカインストームまたは全身性炎症性応答と関連する、少なくとも１つの症状の軽減を引き起こすのに十分な量で提供する、請求項８２から９７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９９】
前記所定の結合パートナーを、腫瘍溶解症候群と関連する、少なくとも１つの症状の軽減を引き起こすのに十分な量で提供する、請求項８２から９８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
前記ポリペプチド構築物が、ゲノム編集により、前記操作細胞へと組み込まれたポリヌクレオチドによりコードされる、請求項８２から９９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０１】
前記ゲノム編集が、少なくとも部位特異的セリンリコンビナーゼ系の使用を含む、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
請求項１〜２５、２９〜３０、６１〜７６、および８０〜８１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド。
【請求項１０３】
がんを処置する方法であって、対象へ、有効量の、請求項１〜２５、２９〜３０、６１〜７６、および８０〜８１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む操作細胞を投与するステップを含む方法。
【請求項１０４】
前記操作細胞上で発現させたポリペプチドへの結合が可能な、少なくとも１つの結合パートナーを投与するステップをさらに含む、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記結合パートナーが、抗体である、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
対象における遺伝子操作細胞の活性を調節する方法であって、
前記対象へ、第１のトランケート型非免疫原性ポリペプチドと、第２のトランケート型非免疫原性ポリペプチドとを含むキメラポリペプチドである細胞表面ポリペプチドを含むポリペプチド構築物をコードする、ある量の遺伝子操作細胞を提供するステップであって、前記細胞表面ポリペプチドが、少なくとも１つの所定の結合パートナーまたはその変異体もしくは断片に結合する、ステップと；
前記遺伝子操作細胞に結合し、それにより、前記遺伝子操作細胞の活性を調節するのに十分な量で、前記対象へ、前記所定の結合パートナーを提供するステップと
を含む方法。
【請求項１０７】
前記第１のトランケート型非免疫原性ポリペプチドが、ＥＧＦＲファミリーのメンバーの断片または誘導体を含む、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記第２のトランケート型非免疫原性ポリペプチドが、ＥＧＦＲファミリーのメンバーの断片または誘導体を含む、請求項１０６または１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
前記第１のトランケート型非免疫原性ポリペプチドが、ＨＥＲ１ポリペプチドを含む、請求項１０６から１０８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１０】
前記ＨＥＲ１ポリペプチドが、配列番号２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、または２１７に示される配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または９９．５％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
前記ＨＥＲ１ポリペプチドが、配列番号２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、または２１７に示される配列を含むポリペプチド配列を含む、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
前記ＨＥＲ１ポリペプチドが、配列番号２１１に示される配列を含むポリペプチド配列を含む、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
前記第２のトランケート型非免疫原性ポリペプチドが、ＨＥＲ２ポリペプチド、ＥｒｂＢ３ポリペプチド、またはＥｒｂＢ４ポリペプチドを含む、請求項１０９から１１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１４】
前記ポリペプチド構築物が、配列番号８９、配列番号９３、配列番号９７、配列番号１０１、または配列番号１０５に示される配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または９９．５％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
前記少なくとも１つの所定の結合パートナーが、前記ＨＥＲ１ポリペプチドに結合する、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１６】
前記少なくとも１つの所定の結合パートナーが、リツキシマブ、セツキシマブ、フツキシマブ、デパツキシズマブ、イムガツズマブ、ラプリツキシマブ、マツズマブ、ネシツムマブ、ニモツズマブ、パニツムマブ、およびザルツムマブのうちの少なくとも１つを含む、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
前記少なくとも１つの所定の結合パートナーが、前記第２のトランケート型非免疫原性ポリペプチドに結合する、第２の所定の結合パートナーをさらに含む、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
前記第２のトランケート型非免疫原性ポリペプチドが、ＨＥＲ２ポリペプチドであり、前記第２の所定の結合パートナーが、ペルツズマブである、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
前記ポリペプチド構築物が、シグナルペプチドをさらに含む、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１２０】
前記ポリペプチド構築物が、膜貫通ドメインをさらに含む、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１２１】
前記膜貫通ドメインが、膜貫通二量体化ドメインを含む、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
前記膜貫通二量体化ドメインが、グリコホリンＡ膜貫通ドメイン、グリコホリンＡ−インテグリンβ３キメラ膜貫通ドメイン、またはＣＤ３ゼータ膜貫通ドメインを含む、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２３】
前記膜貫通二量体化ドメインが、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、または配列番号３２に示される配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または９９．５％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２４】
前記膜貫通二量体化ドメインが、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、または配列番号３２に示されるポリペプチド配列を含む、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２５】
前記第１のトランケート型非免疫原性ポリペプチドが、ＣＤ２０ポリペプチドを含む、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１２６】
前記ＣＤ２０ポリペプチドが、配列番号２１８、配列番号２１９、または配列番号２２０に示される配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または９９．５％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
前記ＣＤ２０ポリペプチドが、配列番号２１８、配列番号２１９、または配列番号２２０に示される配列を含むポリペプチド配列を含む、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
前記少なくとも１つの所定の結合パートナーが、リツキシマブ、トシツモマブ、ベルツズマブ、アフツズマブ、ブロンツベトマブ、およびオビヌツズマブのうちの少なくとも１つを含む、請求項１２５から１２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２９】
ＨＥＲ１ドメインＩＩＩと、トランケート型ＨＥＲ１ドメインＩＶとからなるトランケート型非免疫原性ＨＥＲ１ポリペプチドであって、抗ＨＥＲ１抗体に結合するＨＥＲ１ポリペプチドと；
ＣＤ２８膜貫通ドメインと；
前記ＨＥＲ１ポリペプチドを、前記ＣＤ２８膜貫通ドメインへと共役するためのペプチドリンカーと
を含むポリペプチド構築物であって、
操作細胞内で発現される、
ポリペプチド構築物。
【請求項１３０】
前記ＨＥＲ１ドメインＩＩＩが、配列番号２００に示される配列を含むポリペプチド配列を含み、前記ＨＥＲ１ドメインＩＶが、配列番号２０３に示される配列を含むポリペプチド配列を含む、請求項１２９に記載のポリペプチド構築物。
【請求項１３１】
前記ＣＤ２８膜貫通ドメインが、配列番号３６に示される配列を含むポリペプチド配列を含み、前記ペプチドリンカーが、Ｇ４Ｓペプチドリンカー（配列番号２２１）を含む、請求項１３０に記載のポリペプチド構築物。
【請求項１３２】
前記Ｇ４Ｓペプチドリンカー（配列番号２２１）が、配列番号２２に示される配列を含むポリペプチド配列を含む、請求項１３１に記載のポリペプチド構築物。
【請求項１３３】
配列番号５７に示される配列を含むポリペプチド配列を含む、請求項１３２に記載のポリペプチド構築物。
【請求項１３４】
前記抗ＨＥＲ１抗体が、リツキシマブ、セツキシマブ、フツキシマブ、デパツキシズマブ、イムガツズマブ、ラプリツキシマブ、マツズマブ、ネシツムマブ、ニモツズマブ、パニツムマブ、およびザルツムマブのうちの少なくとも１つを含む、請求項１２９から１３３のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
【請求項１３５】
抗ＣＤ２０抗体に結合するトランケート型非免疫原性ＣＤ２０ポリペプチド
を含むポリペプチド構築物であって、
操作細胞内で発現されるポリペプチド構築物。
【請求項１３６】
配列番号１０９に示される配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または９９．５％の同一性を有する、請求項１３５に記載のポリペプチド構築物。
【請求項１３７】
配列番号１０９に示される配列を含むポリペプチド配列を含む、請求項１３６に記載のポリペプチド構築物。
【請求項１３８】
前記抗ＣＤ２０抗体が、リツキシマブ、トシツモマブ、ベルツズマブ、アフツズマブ、ブロンツベトマブ、およびオビヌツズマブのうちの少なくとも１つを含む、請求項１３５から１３７のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、２０１７年６月７日に出願された米国特許仮出願第６２／５１６，６３９号明細書の利益を主張する。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットにおいて、電子的に提出され、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる配列表を含有する。２０１８年５月３０日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、５０４７１＿７０８＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、４６４，４４５バイトのサイズである。
【背景技術】
【０００３】
細胞療法は、従来型の医薬により十分に処置されえない疾患を処置するのに有望である。輸血は、最初の種類の、血液悪性腫瘍を処置する細胞療法であった。細胞の単離技術、誘導技術、および遺伝子導入技術における近年の進歩は、多様な疾患、例えば、がん、心血管疾患、皮膚疾患、神経疾患、および眼科疾患の処置のための、多様な細胞型（初代細胞および不死化細胞）の遺伝子改変を可能としている。多くの場合、治療目的の選択された細胞の拡大を可能とするのに必要な純度を達成するには、患者における輸注の前に、遺伝子改変された細胞療法製品を濃縮し、かつ／または非遺伝子改変細胞型または他の細胞型を消失させることが、極めて重要である。加えて、例えば、サイトカイン、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を使用する養子細胞免疫療法は、腫瘍細胞の殺滅の方向付けに成功するのに、極めて有望であることが示されている。この新規の技術は、有望であるが、改変免疫細胞の、腫瘍を保有する個体への投与は、安全性問題、例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法の場合、毒性、腫瘍溶解、およびサイトカイン放出症候群（すなわち、「サイトカインストーム」）を伴わないことはなかった。養子Ｔ細胞免疫療法によりもたらされる治療的可能性を十分に利用するために、治療時に、サイトカインストームなどの副作用を制御することが不可欠である。
【０００４】
参照による組込み
本明細書で言及される、全ての刊行物、特許、および特許出願は、各個別の刊行物、特許、または特許出願が、参照により具体的かつ個別に組み込まれることが指し示された場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【０００５】
上記の欠損のうちの１または複数に対処するように、細胞内で発現させうるポリペプチド構築物およびポリヌクレオチドが提供される。
【０００６】
ポリペプチド構築物およびポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチド、天然ポリペプチドのトランケート型変異体を含むポリペプチド構築物が提供される。一部の実施形態では、ポリペプチド構築物は、膜貫通ドメインもしくはその断片、シグナルペプチド、および／またはペプチドリンカーをさらに含みうる。本明細書ではまた、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド構築物を発現する操作細胞（engineered cell）も提示される。操作細胞は、ポリペプチド構築物を、細胞表面において発現し、これにより、一部の実施形態では、操作細胞を固有に同定する、細胞マーカー（または「細胞タグ」）をもたらしうる。
【０００７】
本明細書ではさらに、ポリペプチド構築物およびポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチド、天然ポリペプチドのトランケート型変異体と膜貫通ドメインとを含むポリペプチド構築物が提示される。ある特定の実施形態では、トランケート型変異体は、細胞外ドメインまたはその部分と、膜貫通ドメインまたはその部分とを含む。一部の実施形態では、ポリペプチド構築物は、異なる天然タンパク質に由来する膜貫通ドメインと、トランケート型変異体とを含みうる。場合によって、ポリペプチド構築物のトランケート型変異体である膜貫通ドメインは、１回膜貫通型膜貫通ドメインである。他の場合には、ポリペプチド構築物の膜貫通ドメインは、複数回膜貫通型膜貫通ドメインである。
【０００８】
本明細書では、ポリペプチド構築物およびポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチド、細胞表面ポリペプチド（例えば、膜貫通ドメインへと融合させたトランケート型変異体）を、細胞表面において、第２の細胞表面ポリペプチドへと共役する（coupling）ことが可能な、膜貫通二量体化ドメインを含むポリペプチド構築物が提示される。ある特定の実施形態では、膜貫通二量体化ドメインを介して、細胞表面ポリペプチドを共役することは、非二量体化立体配置と比べて、細胞表面ポリペプチドに由来するシグナルを増幅しうる。
【０００９】
本明細書ではなおさらに、ポリペプチド構築物およびポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチド、異なる天然タンパク質に由来するドメインまたはその断片を含むポリペプチド構築物が提示される。一部の実施形態では、本明細書で記載されるポリペプチド構築物は、天然ポリペプチドのトランケート型変異体、膜貫通ドメイン、トランケート型変異体を、膜貫通ドメインへと接続する、任意選択のペプチドリンカー、およびポリペプチド構築物を、細胞表面へと方向付けるシグナルペプチドを含みうる。例えば、一部の実施形態では、ポリペプチド構築物は、トランケート型変異体またはその断片へと、直接的にまたは間接的に融合させた膜貫通ドメインまたはその断片と異なる天然タンパク質に由来するトランケート型変異体またはその断片を含有する。一部の実施形態では、本明細書で記載されるポリペプチド構築物の特定のドメイン（例えば、細胞外ドメイン）は、キメラであり、異なる天然タンパク質に由来するアミノ酸配列を含有する。
【００１０】
場合によって、細胞表面ポリペプチドと、膜貫通二量体化ドメインとを含むポリペプチド構築物であって、膜貫通二量体化ドメインが、細胞表面ポリペプチドの二量体化を誘導し、細胞表面ポリペプチドが、所定の抗体またはその変異体もしくは断片に結合する、ポリペプチド構築物を含む方法および組成物が提示される。本明細書ではまた、本明細書で記載されるポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチド配列も提示される。
【００１１】
本明細書では、ＨＥＲ１、ＣＤ２０、ＬＮＧＦＲ、およびＣＤ５２などのポリペプチドのトランケート型変異体を含む細胞タグを含む方法および組成物が提示される。場合によって、ポリペプチドのトランケート型変異体は、内因性受容体に結合しない。開示されるトランケート型非免疫原性ポリペプチドは、細胞タグとして、例えば、細胞マーカー、枯渇マーカー、または殺滅タグとして使用することができる。
【００１２】
本明細書では、本明細書で記載されるポリペプチド構築物またはポリヌクレオチドを発現する操作細胞を含む組成物が提示される。場合によって、操作細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、および／またはサイトカインのうちの少なくとも１つをさらに発現する。
【００１３】
本明細書では、対象（例えば、免疫療法を受ける）における遺伝子操作細胞の活性を調節する方法であって、対象へと、本明細書で開示されるポリヌクレオチド構築物をコードする遺伝子操作細胞を提供し、対象へと、細胞に結合し、これらの活性を調節する、所定の結合パートナーをさらに提供するステップを含む方法が提示される。また、方法における使用のためのシステムおよびキットも提示される。
【００１４】
細胞表面ポリペプチドと、膜貫通二量体化ドメインとを含むポリペプチド構築物であって、前記膜貫通二量体化ドメインが、前記細胞表面ポリペプチドの二量体化を誘導し、前記細胞表面ポリペプチドが、所定の抗体またはその変異体もしくは断片に結合する、ポリペプチド構築物が提供される。
【００１５】
一部の実施形態では、前記細胞表面ポリペプチドは、ＨＥＲ１ポリペプチド、ＬＮＧＦＲポリペプチド、ＣＤ２０ポリペプチド、およびＣＤ５２ポリペプチドのうちの少なくとも１つを含む。場合によって、前記細胞表面ポリペプチドは、ＨＥＲ１ポリペプチドを含み、前記ＨＥＲ１ポリペプチドは、配列番号２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、または２１７に示される配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または９９．５％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。一部の場合には、前記ＨＥＲ１ポリペプチドは、配列番号２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、または２１７に示される配列を含むポリペプチド配列を含む。
【００１６】
一部の実施形態では、前記細胞表面ポリペプチドは、ＣＤ２０ポリペプチドを含み、前記ＣＤ２０ポリペプチドは、配列番号２１８、配列番号２１９、または配列番号２２０に示される配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または９９．５％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。場合によって、前記ＣＤ２０ポリペプチドは、配列番号２１８、配列番号２１９、または配列番号２２０に示される配列を含むポリペプチド配列を含む。
【００１７】
一部の実施形態では、前記細胞表面ポリペプチドは、ＬＮＧＦＲポリペプチドを含み、前記ＬＮＧＦＲポリペプチドは、配列番号１５６、配列番号１５８、または配列番号１６０に示される配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または９９．５％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。場合によって、前記細胞表面ポリペプチドは、ＬＮＧＦＲポリペプチドを含み、前記ＬＮＧＦＲポリペプチドは、配列番号１５６、配列番号１５８、または配列番号１６０に示される配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または９９．５％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。
【００１８】
一部の場合には、前記細胞表面ポリペプチドは、内因性受容体に結合しない。場合によって、前記膜貫通二量体化ドメインは、相補的な二量体化ドメインと共に、ホモ二量体またはヘテロ二量体を形成しうる。一部の場合には、前記膜貫通二量体化ドメインは、少なくとも１つのシステイン残基を含む。一部の実施形態では、前記膜貫通二量体化ドメインは、グリコホリンＡ膜貫通ドメインまたはその断片もしくは変異体、グリコホリンＡ−インテグリンβ３キメラ膜貫通ドメインまたはその断片もしくは変異体、あるいはＣＤ３ゼータ膜貫通ドメインを含む。場合によって、このような細胞表面ポリペプチドは、少なくともＨＥＲ１ポリペプチドを含む。
【００１９】
場合によって、前記ポリペプチド構築物を、操作細胞内で発現させる。一部の実施形態では、前記操作細胞は、動物細胞である。一部の場合には、前記動物細胞は、ヒト細胞である。一部の実施形態では、前記ヒト細胞は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞である。場合によって、前記操作細胞は、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼをさらに含む。
【００２０】
一部の場合には、前記操作細胞は、少なくとも１つの、さらなる外因性ポリペプチドをさらに発現する。場合によって、前記操作細胞は、少なくとも１つの、外因性受容体ポリペプチドまたはその断片をさらに発現する。一部の場合には、前記操作細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、およびサイトカインのうちの少なくとも１つをさらに発現する。一部の実施形態では、前記操作細胞は、少なくとも１つのＣＡＲをさらに発現し、前記ＣＡＲは、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＢＣＭＡ、ＣＤ４４、α−葉酸受容体、ＣＡＩＸ、ＣＤ３０、ＲＯＲ１、ＣＥＡ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、葉酸結合性タンパク質、ＧＤ２、ＧＤ３、ＩＬ−１３Ｒ−ａ２、ＫＤＲ、ＥＤＢ−Ｆ、メソテリン、ＣＤ２２、ＥＧＦＲ、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−１６、ＭＡＧＥ−Ａ１、ｈ５Ｔ４、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ−７２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１２３、およびＶＥＧＦ−Ｒ２のうちの少なくとも１つに結合する。
【００２１】
場合によって、前記操作細胞は、少なくとも１つの組換えサイトカインをさらに発現する。一部の場合には、前記組換えサイトカインは、ＩＬ−１５、ｍｂＩＬ−１５、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、およびＩＬ−２１のうちの少なくとも１つを含む。一部の実施形態では、前記ポリペプチド構築物は、ゲノム編集により、前記操作細胞へと組み込まれたポリヌクレオチドによりコードされる。場合によって、前記ゲノム編集は、少なくとも部位特異的セリンリコンビナーゼ系の使用を含む。一部の場合には、前記ポリペプチド構築物は、前記細胞表面ポリペプチドを、前記膜貫通二量体化ドメインと融合させるリンカーを含む。場合によって、ポリペプチドのホモ二量体またはヘテロ二量体は、ポリペプチド構築物を含む。
【００２２】
膜貫通二量体化ドメインと融合させた非免疫原性細胞表面ポリペプチドを含むポリペプチド構築物であって、前記膜貫通二量体化ドメインが、前記細胞表面ポリペプチドの二量体化を誘導する、ポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチドが提供される。一部の実施形態では、前記細胞表面ポリペプチドは、内因性受容体に結合しない。場合によって、前記細胞表面ポリペプチドは、任意の内因性シグナル伝達機能またはトラフィッキング機能を含有しない。
【００２３】
一部の場合には、前記ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの異種遺伝子をコードする、少なくとも１つの配列を含む。一部の実施形態では、前記少なくとも１つの異種遺伝子は、誘導性プロモーターによりモジュレートされる。場合によって、前記少なくとも１つの異種遺伝子は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、およびサイトカインのうちの少なくとも１つを含む。一部の実施形態では、前記少なくとも１つの異種遺伝子は、前記ＣＡＲを含み、前記ＣＡＲは、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＢＣＭＡ、ＣＤ４４、α−葉酸受容体、ＣＡＩＸ、ＣＤ３０、ＲＯＲ１、ＣＥＡ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、葉酸結合性タンパク質、ＧＤ２、ＧＤ３、ＩＬ−１３Ｒ−ａ２、ＫＤＲ、ＥＤＢ−Ｆ、メソテリン、ＣＤ２２、ＥＧＦＲ、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−１６、ＭＡＧＥ−Ａ１、ｈ５Ｔ４、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ−７２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１２３、およびＶＥＧＦ−Ｒ２のうちの少なくとも１つに結合する。
【００２４】
一部の実施形態では、前記少なくとも１つの異種遺伝子は、サイトカインを含む。場合によって、前記サイトカインは、ＩＬ−１５、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、およびＩＬ−１５とＩＬ−１５Ｒαとの融合体のうちの少なくとも１つを含む。一部の実施形態では、前記サイトカインは、分泌形態である。一部の場合には、前記サイトカインは、膜結合形態である。
【００２５】
一部の実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、２Ａ、ＧＳＧ−２Ａ、ＧＳＧリンカー（配列番号１６）、ＳＧＳＧリンカー（配列番号１８）、フューリンリンク変異体、およびそれらの誘導体からなる群から選択されるポリペプチドリンカーを含む、少なくとも１つの配列を含む。一部の実施形態では、前記２Ａリンカーは、ｐ２Ａリンカー、Ｔ２Ａリンカー、Ｆ２Ａリンカー、またはＥ２Ａリンカーである。
【００２６】
一部の場合には、前記ポリペプチド構築物は、細胞を濃縮するか、細胞を選択するか、または前記細胞表面分子を発現する細胞における細胞死を誘導するタグとして作用する。場合によって、前記細胞表面ポリペプチドは、ＨＥＲ１ポリペプチド、ＬＮＧＦＲポリペプチド、ＣＤ２０ポリペプチド、およびＣＤ５２ポリペプチドのうちの少なくとも１つを含む。一部の実施形態では、前記膜貫通二量体化ドメインは、グリコホリンＡ膜貫通ドメインまたはその断片もしくは変異体、グリコホリンＡ−インテグリンβ３キメラ膜貫通ドメインまたはその断片もしくは変異体、あるいはＣＤ３ゼータ膜貫通ドメインを含む。
【００２７】
場合によって、ベクターは、ポリヌクレオチドを含む。一部の場合には、前記ベクターは、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、または非ウイルスベクターである。一部の実施形態では、非ウイルスベクターは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである。場合によって、前記ポリヌクレオチドは、ゲノム編集により、操作細胞へと組み込まれる。場合によって、前記ゲノム編集は、少なくとも部位特異的セリンリコンビナーゼ系の使用を含む。
【００２８】
対象における遺伝子操作細胞の活性を調節する方法であって、前記対象へと、膜貫通二量体化ドメインと融合させた細胞表面ポリペプチドを含むポリペプチド構築物をコードする、ある量の遺伝子操作細胞を提供するステップであって、前記膜貫通二量体化ドメインが、前記細胞表面ポリペプチドの二量体化を誘導し、前記細胞表面ポリペプチドが、所定の結合パートナーまたはその変異体もしくは断片に結合する、ステップと；前記遺伝子操作細胞に結合し、それにより、前記遺伝子操作細胞の活性を調節するのに十分な量で、前記対象へと、前記所定の結合パートナーを提供するステップとを含む方法が提供される。
【００２９】
一部の実施形態では、前記細胞表面ポリペプチドは、非免疫原性ポリペプチドである。一部の実施形態では、前記細胞表面ポリペプチドは、ＨＥＲ１ポリペプチド、ＬＮＧＦＲポリペプチド、ＣＤ２０ポリペプチド、およびＣＤ５２ポリペプチドのうちの少なくとも１つを含む。一部の場合には、前記細胞表面ポリペプチドは、内因性受容体に結合しない。場合によって、前記膜貫通二量体化ドメインは、相補的な二量体化ドメインと共に、ホモ二量体またはヘテロ二量体を形成しうる。一部の実施形態では、前記膜貫通二量体化ドメインは、少なくとも１つのシステイン残基を含む。一部の場合には、前記膜貫通二量体化ドメインは、グリコホリンＡ膜貫通ドメインまたはその断片もしくは変異体、グリコホリンＡ−インテグリンβ３キメラ膜貫通ドメインまたはその断片もしくは変異体、あるいはＣＤ３ゼータ膜貫通ドメインを含む。
【００３０】
場合によって、前記結合パートナーは、抗体、またはその細胞表面ポリペプチド結合性領域を含む。一部の実施形態では、前記抗体は、モノクローナル抗体、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、ダイアボディー、およびラクダ科動物（camelid）抗体のうちの少なくとも１つを含む。一部の場合には、前記抗体は、リツキシマブ、セツキシマブ、アレムツズマブ、パニツムマブ、およびネシツムマブのうちの少なくとも１つを含む。
【００３１】
場合によって、前記遺伝子操作細胞は、Ｔ細胞およびＮＫ細胞のうちの少なくとも１つを含む。一部の実施形態では、前記遺伝子操作細胞のうちの少なくとも１つは、少なくとも１つの、さらなる外因性ポリペプチドをさらに発現する。一部の場合には、前記遺伝子操作細胞のうちの少なくとも１つは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、およびサイトカインのうちの少なくとも１つをさらに発現する。場合によって、前記遺伝子操作細胞のうちの少なくとも１つは、少なくとも１つのＣＡＲをさらに発現し、前記ＣＡＲは、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＢＣＭＡ、ＣＤ４４、α−葉酸受容体、ＣＡＩＸ、ＣＤ３０、ＲＯＲ１、ＣＥＡ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、葉酸結合性タンパク質、ＧＤ２、ＧＤ３、ＩＬ−１３Ｒ−ａ２、ＫＤＲ、ＥＤＢ−Ｆ、メソテリン、ＣＤ２２、ＥＧＦＲ、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−１６、ＭＡＧＥ−Ａ１、ｈ５Ｔ４、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ−７２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１２３、およびＶＥＧＦ−Ｒ２のうちの少なくとも１つに結合する。
【００３２】
一部の実施形態では、前記遺伝子操作細胞のうちの少なくとも１つは、少なくとも１つの組換えサイトカインをさらに発現する。一部の場合には、前記組換えサイトカインは、ＩＬ−１５、ｍｂＩＬ−１５、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、およびＩＬ−２１のうちの少なくとも１つを含む。場合によって、前記所定の結合パートナーを、サイトカインストームまたは全身性炎症性応答と関連する、少なくとも１つの症状の軽減を引き起こすのに十分な量で提供する。一部の実施形態では、前記所定の結合パートナーを、腫瘍溶解症候群と関連する、少なくとも１つの症状の軽減を引き起こすのに十分な量で提供する。一部の場合には、前記ポリペプチド構築物は、ゲノム編集により、前記操作細胞へと組み込まれたポリヌクレオチドによりコードされる。場合によって、前記ゲノム編集は、少なくとも部位特異的セリンリコンビナーゼ系の使用を含む。
【００３３】
抗ＣＤ２０抗体に結合するトランケート型非免疫原性ＣＤ２０ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、前記トランケート型非免疫原性ＣＤ２０ポリペプチドが、内因性受容体に結合しない、ポリヌクレオチドが提供される。
【００３４】
一部の実施形態では、前記ＣＤ２０ポリペプチドは、配列番号１０９に示される配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または９９．５％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。場合によって、前記ＣＤ２０ポリペプチドは、配列番号１０９の配列を含むポリペプチド配列を含む。一部の場合には、前記ＣＤ２０ポリペプチドは、天然（native）ＣＤ２０の、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の結合効率で、前記抗ＣＤ２０抗体に結合する。一部の実施形態では、前記抗ＣＤ２０抗体は、リツキシマブ、セツキシマブ、トシツモマブ、ベルツズマブ、アフツズマブ、ブロンツベトマブ、およびオビヌツズマブのうちの少なくとも１つを含む。
【００３５】
少なくともＨＥＲ１ドメインＩＩＩまたはその断片と、トランケート型ＨＥＲ１ドメインＩＶとからなるトランケート型非免疫原性ＨＥＲ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、前記ＨＥＲ１ポリペプチドが、抗ＨＥＲ１抗体に結合し、前記ＨＥＲ１ポリペプチドが、操作細胞内で発現される、ポリヌクレオチドが提供される。
【００３６】
一部の実施形態では、前記トランケート型ＨＥＲ１ドメインＩＶは、前記ＨＥＲ１ドメインＩＶのうちの、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％のトランケーションを含む。
【００３７】
場合によって、前記トランケート型ＨＥＲ１ドメインＩＶは、配列番号２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、または２０９に示される配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または９９．５％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。一部の場合には、前記トランケート型ＨＥＲ１ドメインＩＶは、配列番号２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、または２０９に示される配列を含むポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、前記ＨＥＲ１ドメインＩＩＩまたはその断片は、配列番号２００に示される配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または９９．５％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。場合によって、前記ＨＥＲ１ドメインＩＩＩは、配列番号２００に示される配列を含むポリペプチド配列を含む。
【００３８】
一部の場合には、前記ポリヌクレオチドは、ＣＤ２８膜貫通ドメインと、前記ＨＥＲ１ポリペプチドを、前記ＣＤ２８膜貫通ドメインへと共役するためのペプチドリンカーとをさらにコードする。場合によって、前記ポリヌクレオチドは、配列番号５７に示される配列を含むポリペプチド配列を含むポリペプチド構築物をコードする。一部の実施形態では、前記抗ＨＥＲ１抗体は、リツキシマブ、セツキシマブ、フツキシマブ、デパツキシズマブ、イムガツズマブ、ラプリツキシマブ、マツズマブ、ネシツムマブ、ニモツズマブ、パニツムマブ、およびザルツムマブのうちの少なくとも１つを含む。
【００３９】
抗ＣＤ５２抗体に結合するトランケート型非免疫原性ＣＤ５２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、前記トランケート型非免疫原性ＣＤ５２ポリペプチドが、内因性受容体に結合せず、前記ＣＤ５２ポリペプチドが、操作細胞内で発現される、ポリヌクレオチドが提供される。
【００４０】
場合によって、前記ＣＤ５２ポリペプチドは、配列番号１４３に示される配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または９９．５％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。一部の場合には、前記ＣＤ５２ポリペプチドは、配列番号１４３に示される配列を含むポリペプチド配列を含む。
【００４１】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドを、少なくとも１つの異種遺伝子をコードする、少なくとも１つの配列をさらに含む細胞内で発現させる。一部の実施形態では、前記少なくとも１つの異種遺伝子は、誘導性プロモーターによりモジュレートされる。一部の場合には、前記少なくとも１つの異種遺伝子は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、およびサイトカインのうちの少なくとも１つを含む。一部の実施形態では、前記少なくとも１つの異種遺伝子は、ＣＡＲを含み、前記ＣＡＲは、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＢＣＭＡ、ＣＤ４４、α−葉酸受容体、ＣＡＩＸ、ＣＤ３０、ＲＯＲ１、ＣＥＡ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、葉酸結合性タンパク質、ＧＤ２、ＧＤ３、ＩＬ−１３Ｒ−ａ２、ＫＤＲ、ＥＤＢ−Ｆ、メソテリン、ＣＤ２２、ＥＧＦＲ、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−１６、ＭＡＧＥ−Ａ１、ｈ５Ｔ４、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ−７２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１２３、およびＶＥＧＦ−Ｒ２のうちの少なくとも１つに結合する。
【００４２】
一部の実施形態では、前記少なくとも１つの異種遺伝子は、サイトカインを含む。一部の実施形態では、前記サイトカインは、ＩＬ−１５、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、およびＩＬ−１５とＩＬ−ＩＬ−１５Ｒαとの融合体のうちの少なくとも１つを含む。場合によって、前記サイトカインは、分泌形態である。一部の場合には、前記サイトカインは、膜結合形態である。
【００４３】
一部の実施形態では、ベクターは、前記ポリヌクレオチドを含む。場合によって、前記ベクターは、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、または非ウイルスベクターである。一部の場合には、前記非ウイルスベクターは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである。一部の実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、ゲノム編集により、操作細胞へと組み込まれる。一部の場合には、前記ゲノム編集は、少なくとも部位特異的セリンリコンビナーゼ系の使用を含む。場合によって、操作細胞は、ポリヌクレオチドをコードする。場合によって、操作細胞は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞である。場合によって、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドをコードする。
【００４４】
本明細書ではさらに、がんを処置する方法であって、対象へと、有効量の、ポリヌクレオチドを含む操作細胞を投与するステップを含む方法が提示される。一部の実施形態では、方法は、前記操作細胞上で発現させたポリペプチドへの結合が可能な、少なくとも１つの結合パートナーを投与するステップをさらに含む。場合によって、前記結合パートナーは、抗体である。
【００４５】
本明細書では、対象における遺伝子操作細胞の活性を調節する方法であって、前記対象へと、第１のトランケート型非免疫原性ポリペプチドと、第２のトランケート型非免疫原性ポリペプチドとを含むキメラポリペプチドである細胞表面ポリペプチドを含むポリペプチド構築物をコードする、ある量の遺伝子操作細胞を提供するステップであって、前記細胞表面ポリペプチドが、少なくとも１つの所定の結合パートナーまたはその変異体もしくは断片に結合する、ステップと；前記遺伝子操作細胞に結合し、これにより、これらの活性を調節するのに十分な量で、前記対象へと、前記所定の結合パートナーを提供するステップとを含む方法が提示される。
【００４６】
一部の実施形態では、前記第１のトランケート型非免疫原性ポリペプチドは、ＥＧＦＲファミリーのメンバーの断片または誘導体を含む。場合によって、前記第２のトランケート型非免疫原性ポリペプチドは、ＥＧＦＲファミリーのメンバーの断片または誘導体を含む。一部の場合には、前記第１のトランケート型非免疫原性ポリペプチドは、ＨＥＲ１ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、前記ＨＥＲ１ポリペプチドは、配列番号２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、または２１７に示される配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または９９．５％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、前記ＨＥＲ１ポリペプチドは、配列番号２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、または２１７に示される配列を含むポリペプチド配列を含む。場合によって、前記ＨＥＲ１ポリペプチドは、配列番号２１１に示される配列を含むポリペプチド配列を含む。
【００４７】
場合によって、前記第２のトランケート型非免疫原性ポリペプチドは、ＨＥＲ２ポリペプチド、ＥｒｂＢ３ポリペプチド、およびＥｒｂＢ４ポリペプチドのうちの少なくとも１つを含む。一部の実施形態では、前記ポリペプチド構築物は、配列番号８９、配列番号９３、配列番号９７、配列番号１０１、または配列番号１０５に示される配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または９９．５％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。
【００４８】
一部の実施形態では、前記少なくとも１つの所定の結合パートナーは、前記ＨＥＲ１ポリペプチドに結合する。一部の場合には、前記少なくとも１つの所定の結合パートナーは、リツキシマブ、セツキシマブ、フツキシマブ、デパツキシズマブ、イムガツズマブ、ラプリツキシマブ、マツズマブ、ネシツムマブ、ニモツズマブ、パニツムマブ、およびザルツムマブのうちの少なくとも１つを含む。場合によって、前記少なくとも１つの所定の結合パートナーは、前記第２のトランケート型非免疫原性ポリペプチドに結合する、第２の所定の結合パートナーをさらに含む。場合によって、前記第２のトランケート型非免疫原性ポリペプチドは、ＨＥＲ２ポリペプチドであり、前記第２の所定の結合パートナーは、ペルツズマブである。
【００４９】
一部の場合には、前記ポリペプチド構築物は、シグナルペプチドをさらに含む。一部の場合には、前記ポリペプチド構築物は、膜貫通ドメインをさらに含む。一部の実施形態では、前記膜貫通ドメインは、膜貫通二量体化ドメインを含む。場合によって、前記膜貫通二量体化ドメインは、グリコホリンＡ膜貫通ドメイン、グリコホリンＡ−インテグリンβ３キメラ膜貫通ドメイン、またはＣＤ３ゼータ膜貫通ドメインを含む。場合によって、前記膜貫通二量体化ドメインは、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、または配列番号３２に示される配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または９９．５％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、前記膜貫通二量体化ドメインは、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、または配列番号３２に示される配列を含むポリペプチド配列を含む。
【００５０】
一部の場合には、前記第１のトランケート型非免疫原性ポリペプチドは、ＣＤ２０ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、前記ＣＤ２０ポリペプチドは、配列番号２１８、配列番号２１９、または配列番号２２０に示される配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または９９．５％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。場合によって、前記ＣＤ２０ポリペプチドは、配列番号２１８、配列番号２１９、または配列番号２２０に示される配列を含むポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、前記少なくとも１つの所定の結合パートナーは、リツキシマブ、トシツモマブ、ベルツズマブ、アフツズマブ、ブロンツベトマブ、およびオビヌツズマブのうちの少なくとも１つを含む。
【００５１】
ＨＥＲ１ドメインＩＩＩと、トランケート型ＨＥＲ１ドメインＩＶとからなるトランケート型非免疫原性ＨＥＲ１ポリペプチドであって、抗ＨＥＲ１抗体に結合するＨＥＲ１ポリペプチドと；ＣＤ２８膜貫通ドメインと；前記ＨＥＲ１ポリペプチドを、前記ＣＤ２８膜貫通ドメインへと共役するためのペプチドリンカーとを含むポリペプチド構築物であって、操作細胞内で発現されるポリペプチド構築物が提供される。
【００５２】
一部の実施形態では、前記ＨＥＲ１ドメインＩＩＩは、配列番号２００に示される配列を含むポリペプチド配列を含み、前記ＨＥＲ１ドメインＩＶは、配列番号２０３に示される配列を含むポリペプチド配列を含む。一部の場合には、前記ＣＤ２８膜貫通ドメインは、配列番号３６に示される配列を含むポリペプチド配列を含み、前記ペプチドリンカーは、Ｇ４Ｓペプチドリンカー（配列番号２２１）を含む。場合によって、前記Ｇ４Ｓペプチドリンカー（配列番号２２１）は、配列番号２２に示される配列を含むポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、前記ポリペプチド構築物は、配列番号５７に示される配列を含むポリペプチド配列を含む。
【００５３】
場合によって、前記抗ＨＥＲ１抗体は、リツキシマブ、セツキシマブ、フツキシマブ、デパツキシズマブ、イムガツズマブ、ラプリツキシマブ、マツズマブ、ネシツムマブ、ニモツズマブ、パニツムマブ、およびザルツムマブのうちの少なくとも１つを含む。
【００５４】
抗ＣＤ２０抗体に結合するトランケート型非免疫原性ＣＤ２０ポリペプチドを含むポリペプチド構築物であって、操作細胞内で発現されるポリペプチド構築物が提供される。
【００５５】
一部の実施形態では、前記ポリペプチド構築物は、配列番号１０９に示される配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または９９．５％の同一性を有する。場合によって、前記ポリペプチド構築物は、配列番号１０９に示される配列を含むポリペプチド配列を含む。一部の場合には、前記抗ＣＤ２０抗体は、リツキシマブ、トシツモマブ、ベルツズマブ、アフツズマブ、ブロンツベトマブ、およびオビヌツズマブのうちの少なくとも１つを含む。
【００５６】
本開示の特徴は、特に、付属の特許請求の範囲において明示されている。本開示の特徴および利点についてのよりよい理解は、本開示の原理が用いられる、例示的な実施形態を明示する、以下の詳細な記載および付属の図面を参照することにより得られるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】リツキシマブを使用するフローサイトメトリーにより検出される、全長ＣＤ２０細胞タグ（配列番号１０７に対応する）、およびトランケート型ＣＤ２０（配列番号１０９に対応するＣＤ２０ｔ１および配列番号１１５に対応するＣＤ２０ｔ４）の２つの形態の、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞内の、対照細胞タグと比較した発現レベルを示す図である。影を付した領域が、モックトランスフェクト対照細胞を描示するのに対し、影を付していない領域は、トランスフェクト細胞からの細胞タグの発現を描示する。各トランスフェクションは、三連で実施した。
【図２】両方の遺伝子をコードするＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンベクターを共トランスフェクトされたヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）内（右パネル）の、ＣＤ２０ｔ１細胞タグ（配列番号１０９に対応する；ｙ軸）、およびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ；ｘ軸）の、非トランスフェクト細胞内（左パネル）と比較した共発現を示す図である。
【図３】ＣＤ２０ｔ−１をトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞系内の、リツキシマブにより誘導される、特異的で用量依存的な、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用（誘導倍数により表される；ｙ軸）を示す図である。非トランスフェクト親Ｊｕｒｋａｔ細胞および非特異的抗体セツキシマブは、活性を示さなかった。
【図４Ａ】本明細書で記載されるポリペプチド構築物についての実施形態を例示する概略図である。上パネルは、ポリペプチド構築物を、細胞表面へと方向付けるためのシグナルペプチドと、天然ポリペプチドのトランケート型変異体と、任意選択のリンカーと、膜貫通（ＴＭ）ドメインとを含むポリペプチド構築物についての実施形態を示す。下パネルは、本明細書で記載される操作細胞内で発現させたポリペプチド構築物についての実施形態を例示する。ポリペプチド構築物は、任意選択のペプチドリンカーを介して、細胞外指向性トランケート型変異体と融合させた膜貫通（ＴＭ）ドメインにより、細胞表面へとアンカリングさせる。ある実施形態では、示されるリンカーは、トランケート型変異体を、細胞表面から方向付け、伸長させ、これにより、抗体または結合パートナー（抗トランケート型変異体抗体により表される）の、トランケート型変異体のエピトープへの結合を最適化する伸長部として用いられる。
【図４Ｂ】本明細書で記載されるポリペプチド構築物についての実施形態を例示する概略図である。図４ｂでは、図４Ａによるトランケート型変異体および任意選択のリンカーを、ＨＥＲ（ｍ）ドメインＩＩＩおよびＨＥＲ（ｎ）ドメインＩＶで置きかえる［ｍおよびｎは、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＥｒｂＢ３、およびＥｒｂＢ４を含む、ＥＧＦＲ／ＨＥＲファミリーの任意のメンバーを表す（すなわち、ｍ＝１〜４であり、ｎ＝１〜４であるが、ｎとｍとは等しくない）］。ある実施形態では、示される、ＨＥＲ（ｍ）ドメインＩＩＩおよびＨＥＲ（ｎ）ドメインＩＶの各々は、異なる抗体（すなわち、それぞれ、抗ＨＥＲ（ｍ）抗体および抗ＨＥＲ（ｎ）抗体）により認識される、異なるエピトープを提示する。
【図４Ｃ】図４ＢのＨＥＲ（ｍ）ドメインＩＩＩが、抗ＥＧＦＲ抗体により認識されるＥＧＦＲドメインＩＩＩであって、Ｃ末端において、ＨＥＲ２、ＥｒｂＢ３、またはＥｒｂＢ４のドメインＩＶに続き、ＴＭドメインへと融合させたＥＧＦＲドメインＩＩＩに対応する、具体的実施形態を例示する概略図である。
【図４Ｄ】異なるＥＧＦＲ−Ｅｒｂ４キメラ（配列番号１０１に対応するトランケート型ＥＧＦＲ−ＥｒｂＢ４（ＪＭ−ａ）、および配列番号１０５に対応するトランケート型ＥＧＦＲ−ＥｒｂＢ４（ＪＭ−ｂ））をトランスフェクトし、アイソタイプ対照（「アイソタイプ」）と比較した、抗ＨＥＲ１ｔ抗体で染色した（「染色」）ヒトドナーＰＢＭＣ内、およびＨＥＲ１ｔをトランスフェクトされていないモック細胞内で発現させたトランケート型ＨＥＲ１（ＨＥＲ１ｔ）ポリペプチドの発現を示す図である。
【図４Ｅ】異なるＨＥＲ１ｔ変異体（配列番号５７に対応するＨＥＲ１ｔ１、配列番号５９に対応するＨＥＲ１ｔ２、配列番号６１に対応するＨＥＲ１ｔ３、配列番号６３に対応するＨＥＲ１ｔ４、配列番号６５に対応するＨＥＲ１ｔ５、配列番号６７に対応するＨＥＲ１ｔ６、および配列番号６９に対応するＨＥＲ１ｔ７）をトランスフェクトされたヒトドナーＰＢＭＣ内の、ＨＥＲ１ｔポリペプチドの、ＨＥＲ１ｔをトランスフェクトされていないモック細胞と比較した発現を示す図である。
【図５Ａ】ＨＥＲ１ｔまたはＣＡＲをトランスフェクトされていない対照細胞内（左パネル）と比較した、両方のタンパク質をコードするレンチウイルスベクターを共トランスフェクトされた細胞内（右パネル）のフローサイトメトリーにより測定される、ＨＥＲ１ｔ１の発現（配列番号５７に対応する；ｙ軸）およびＣＡＲの発現（ｘ軸）の、抗体ベースの検出を示す図である。
【図５Ｂ】ＣＡＲ単独（左パネル）およびＨＥＲ１ｔ１と併せたＣＡＲ（右パネル）をコードする、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンベクターをトランスフェクトされ、アイソタイプ対照（上パネル）と比較した、抗ＨＥＲ１抗体およびＣＡＲ特異的タンパク質（下パネル）により染色された細胞内の、ＨＥＲ１ｔ１（配列番号５７に対応する；ｙ軸）およびＣＡＲ（ｘ軸）のレベルを示す図である。
【図６】ＮＫ細胞内（左）、ＣＤ１６  ＮＫ細胞内（中）、ならびにＣＡＲおよびＨＥＲ１ｔ１をトランスフェクトされたＣＤ１６  ＮＫ細胞内（右）の、セツキシマブおよびアレムツズマブにより媒介されるＡＤＣＣ活性（特異的殺滅％として表される；ｙ軸）を示す図である。セツキシマブは、ＨＥＲ１ｔ１の存在下における特異的ＡＤＣＣを示した。
【図７】図７Ａは、遺伝子改変ＳＵＰ−Ｔ１レポーター細胞系（ＳＵＰ−Ｔ１／ＣＡＲ−ＨＥＲ１ｔ１）内のフローサイトメトリーにより測定されるＣＡＲおよびＨＥＲ１ｔ１細胞タグ（配列番号５７に対応する）の発現を示す図である。ＳＵＰ−Ｔ１／ＣＡＲ−ＨＥＲ１ｔ１細胞系を、ＦＡＣＳにより分取して、フローサイトメトリーにより検出されたＨＥＲ１ｔ１発現の高レベル（中パネル）または中レベル（右パネル）について濃縮した。左パネルは、フローサイトメトリーのために、アイソタイプ抗体対照を使用する、ＳＵＰ−Ｔ１／ＣＡＲ−ＨＥＲ１ｔ１の染色を示す。図７Ｂは、ＨＥＲ１ｔ１発現およびセツキシマブの用量レベルに依存する、セツキシマブにより誘導される、ＳＵＰ−Ｔ１／ＣＡＲ−ＨＥＲ１ｔ１細胞系の特異的ＡＤＣＣ（誘導倍数により表される；ｙ軸）を示す図である。非特異的抗体リツキシマブは、ＳＵＰ−Ｔ１／ＣＡＲ−ＨＥＲ１ｔ１に対するＡＤＣＣを示さなかった。
【図８】遺伝子改変されたＳＵＰ−Ｔ１細胞系内の、ＨＥＲ１ｔ１細胞タグの発現を示すウェスタンブロット解析を示す図である。レーン１：ＩＰ抗体のみ；レーン２：Ｊｕｒｋａｔ細胞のみ；レーン３：ＳＵＰＴ１／ＨＥＲ１ｔ１（高レベルのＨＥＲ１ｔ１）；レーン４：ＳＵＰＴ１／ＨＥＲ１ｔ１（低レベルのＨＥＲ１ｔ１）；レーン５：全長ＨＥＲ１を発現するＡ４３１細胞；レーン６：マーカーである。太字矢印は、Ａ４３１を除く全ての細胞系内で、セツキシマブによりプルダウンされたタンパク質を指示する。ＨＥＲ１ｔ１は、配列番号５７に対応する。
【図９】セツキシマブまたは非特異的抗体であるリツキシマブの存在下における、ＡＤＣＣ（左パネル）およびＣＤＣ（右パネル）による、ＨＥＲ１ｔ１細胞タグを共発現するＣＤ１９  ＣＡＲ−Ｔ細胞の消失の有効性を示す図である。
【図１０】本明細書で記載されるポリペプチド構築物についての、異なる実施形態を示す概略図である。第１世代トランケート型細胞タグ（上）は、任意選択のペプチドリンカーにより接続されたトランケート型変異体と、非二量体化膜貫通ドメイン（ＴＭ）とを含む。次世代トランケート型細胞タグ（下パネル）は、細胞表面上の、トランケート型変異体の二量体化を容易とする、膜貫通二量体化ドメイン（ＴＭ−Ａ）を含む。いずれの場合にも、抗トランケート型変異体抗体は、トランケート型変異体上のエピトープに結合する。
【図１１】ＣＤ１９  ＣＡＲと、ＨＥＲ１ｔ細胞タグとを共発現するように改変された初代Ｔ細胞内の、ＣＤ１９  ＣＡＲの発現レベルを裏付ける図である。用いられるＨＥＲ１ｔ細胞タグは、ＣＤ１９  ＣＡＲ単独を発現する（親に対する％）Ｔ細胞と比較して、膜貫通二量体化ドメインを伴うトランケート型ＨＥＲ１ポリペプチド（変異体である、配列番号７１に対応するＨＥＲ１ｔ８、配列番号７５に対応するＨＥＲ１ｔ９、および配列番号７９に対応するＨＥＲ１ｔ１０）、および膜貫通二量体化ドメインを伴わないトランケート型ＨＥＲ１ポリペプチド（配列番号５７に対応するＨＥＲ１ｔ１）を含む。
【図１２】ＣＤ１９  ＣＡＲと、ＨＥＲ１ｔ細胞タグとを共発現するように改変された初代Ｔ細胞内の、ＨＥＲ１ｔ細胞タグの発現レベルを裏付ける図である。用いられるＨＥＲ１ｔ細胞タグは、ＣＤ１９  ＣＡＲ単独を発現する（親に対する％）Ｔ細胞と比較して、膜貫通二量体化ドメインを伴うトランケート型ＨＥＲ１ポリペプチド（変異体である、配列番号７１に対応するＨＥＲ１ｔ８、配列番号７５に対応するＨＥＲ１ｔ９、および配列番号７９に対応するＨＥＲ１ｔ１０）、および二量体化ドメインを伴わないトランケート型ＨＥＲ１ポリペプチド（配列番号５７に対応するＨＥＲ１ｔ１）を含むポリペプチド構築物を含む。
【図１３Ａ】図１３Ａおよび１３Ｂは、セツキシマブにより媒介される、二量体化ドメインを伴うトランケート型ＨＥＲ１ポリペプチド（変異体である、配列番号７１に対応するＨＥＲ１ｔ８、配列番号７５に対応するＨＥＲ１ｔ９、および配列番号７９に対応するＨＥＲ１ｔ１０）を含むポリペプチド構築物を共発現するＣＤ１９  ＣＡＲ−Ｔ標的細胞に対するＡＤＣＣ（特異的溶解％により表される；ｙ軸）の、二量体化ドメインを伴わないトランケート型ＨＥＲ１ポリペプチド（配列番号５７に対応するＨＥＲ１ｔ対照）を含むポリペプチド構築物によるＡＤＣＣよりも優れた効果を示す図である。ＮＫ細胞を、エフェクター細胞として用いた。リツキシマブを、ＡＤＣＣアッセイのための非特異的抗体対照として用いた。
【図１３Ｂ】同上。
【図１４】セツキシマブ媒介性ＡＤＣＣによる、ＨＥＲ１ｔ１を発現する遺伝子改変Ｔ細胞（ＣＤ１９  ＣＡＲ−ｍｂＩＬ−１５−Ｔ細胞）の選択的消失を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
以下の記載および例は、本発明の実施形態について、詳細に例示する。本発明は、本明細書で記載される特定の実施形態に限定されず、そのようなものとして、変動しうることを理解されたい。当業者は、本発明には、多数の変動および改変がなされ、これらは、その範囲内に包含されることを認識するであろう。
【００５９】
全ての用語は、それらが、当業者により理解される通りに理解されることを意図する。そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本開示が関連する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。
【００６０】
本明細書で使用される節の小見出しは、構成上の目的だけのものであり、記載される主題を限定するものと見なすべきではない。
【００６１】
本発明の多様な特色は、単一の実施形態の文脈で記載しうるが、特色はまた、個別に提示される場合もあり、任意の適切な組合せで提示される場合もある。逆に、本明細書では、明確さのために、本発明を、個別の実施形態の文脈で記載しうるが、本発明はまた、単一の実施形態でも、実施することができる。
【００６２】
以下の定義は、当技術分野における定義を補完し、本出願へと方向付けられ、いかなる関連または非関連の案件、例えば、共同所有される、いかなる特許または出願にも帰属しない。本明細書で記載される方法および材料と、同様または同等である、任意の方法および材料を、本開示の試験の実施において使用しうるが、本明細書では、好ましい材料および方法について記載する。したがって、本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態について記載することだけを目的とするものであり、限定的であることを意図するものではない。
【００６３】
本出願では、そうでないことが別段に言明されない限りにおいて、単数形の使用は、複数形を含む。本明細書で使用される通り、そうでないことが文脈により明確に指示されない限りにおいて、単数形の「ある（a）」、「ある（an）」、および「その」は、複数の指示対象を含むことに注意しなければならない。本出願では、そうでないことが言明されない限りにおいて、「または」の使用は、「および／または」を意味する。さらに、「〜を含むこと」という用語のほか、「〜を含む（include）」、「〜を含む（includes）」、および「含まれた」など、他の形態の使用は、限定的ではない。
【００６４】
本明細書における、「一部の実施形態」、「ある実施形態」、「一実施形態」、または「他の実施形態」への言及は、実施形態との関連で記載される、特定の特色、構造、または特徴が、本発明の、少なくとも一部の実施形態には含まれるが、全ての実施形態には、必ずしも含まれないことを意味する。
【００６５】
本明細書および特許請求の範囲で使用される「〜を含むこと（comprising）」（「〜を含む（comprise）」および「〜を含む（comprises）」など、「〜を含むこと（comprising）」の任意の形態）、「〜を有すること」（「〜を有する（have）」および「〜を有する（has）」など、「〜を有すること」の任意の形態）、「〜を含むこと（including）」（「〜を含む（include）」および「〜を含む（includes）」など、「〜を含むこと（including）」の任意の形態）、または「〜を含有すること」（「〜を含有する（contain）」および「〜を含有する（contains）」など、「〜を含有すること」の任意の形態）という語は、包含的またはオープンエンドであり、さらなる、列挙されていない要素または方法ステップを除外しない。本明細書で論じられる任意の実施形態は、本発明の任意の方法または組成物に関して実施することが可能であり、この逆も成り立つことが想定される。さらに、本発明の組成物を使用して、本発明の方法を達成することができる。
【００６６】
本明細書で使用される基準数値およびその文法的同等物に関する、「約」という用語およびその文法的同等物は、数値自体と、この数値±１０％の範囲の値とを含みうる。例えば、「約１０」という量は、９〜１１の、任意の量を含む。例えば、基準数値との関係における「約」という用語はまた、値±この値から１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％の範囲も含む。
【００６７】
「単離」とは、その天然環境からの核酸の摘出を意味する。「精製」とは、所与の核酸が、天然から摘出されたもの（ゲノムＤＮＡおよびｍＲＮＡを含む）であれ、合成されたもの（ｃＤＮＡを含む）であれ、かつ／または検査室条件下で増幅されたのであれ、純度が増大しており、この場合、「純度」とは、相対的用語であり、「絶対純度」ではないことを意味する。一方、核酸およびタンパク質は、希釈剤またはアジュバントと共に製剤化される場合があるが、実際的な目的では、単離されているものとしうることを理解されたい。例えば、核酸は、細胞への導入のために使用する場合、許容可能な担体または希釈剤と混合することが典型的である。
【００６８】
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」とは、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドである、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。この用語は、分子の一次構造だけを指す。したがって、この用語は、二本鎖ＤＮＡおよび一本鎖ＤＮＡ、三重鎖ＤＮＡのほか、二本鎖ＲＮＡおよび一本鎖ＲＮＡも含む。この用語はまた、例えば、ポリヌクレオチドのメチル化および／またはキャッピングによる修飾形態、ならびにポリヌクレオチドの非修飾形態も含みうる。用語はまた、天然のものではないヌクレオチドまたは合成ヌクレオチドのほか、ヌクレオチド類似体を含む分子を含むことも意図する。
【００６９】
「ポリペプチド」は、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語と互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。「成熟タンパク質」とは、全長タンパク質であり、任意選択で、グリコシル化または所与の細胞内環境内のタンパク質に典型的な他の修飾を含むタンパク質である。
【００７０】
本明細書で開示されるポリペプチドおよびタンパク質（これらの機能的部分および機能的変異体を含む）は、１または複数の、天然のアミノ酸の代わりに、合成アミノ酸を含みうる。当技術分野では、このような合成アミノ酸が公知であり、例えば、アミノシクロヘキサンカルボン酸、ノルロイシン、α−アミノ ｎ−デカン酸、ホモセリン、Ｓ−アセチルアミノメチルシステイン、ｔｒａｎｓ−３−ヒドロキシプロリンおよびｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリン、４−アミノフェニルアラニン、４−ニトロフェニルアラニン、４−クロロフェニルアラニン、４−カルボキシフェニルアラニン、β−フェニルセリン、β−ヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、α−ナフチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、インドリン−２−カルボン酸、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、アミノマロン酸、アミノマロン酸モノアミド、Ｎ’−ベンジル−Ｎ’−メチルリシン、Ｎ’，Ｎ’−ジベンジルリシン、６−ヒドロキシリシン、オルニチン、α−アミノシクロペンタンカルボン酸、α−アミノシクロヘキサンカルボン酸、α−アミノシクロヘプタンカルボン酸、α−（２−アミノ−２−ノルボルナン）カルボン酸、α，γ−ジアミノ酪酸、α，β−ジアミノプロピオン酸、ホモフェニルアラニン、およびα−ｔｅｒｔ−ブチルグリシンを含む。本開示は、操作細胞内の、本明細書で記載されるポリペプチドの発現が、ポリペプチド構築物の、１または複数のアミノ酸の翻訳後修飾と関連しうることをさらに想定する。翻訳後修飾の非限定例は、リン酸化、アセチル化およびホルミル化を含むアシル化、グリコシル化（Ｎ連結型およびＯ連結型を含む）、アミド化、ヒドロキシル化、メチル化およびエチル化を含むアルキル化、ユビキチン化、ピロリドンカルボン酸の付加、ジスルフィド架橋の形成、硫酸化、ミリストイル化、パルミトイル化、イソプレニル化、ファルネシル化、ゲラニル化、グリピオン化、リポイル化、およびヨード化を含む。
【００７１】
本明細書で使用される「抗体」とは、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を指す。全抗体は、典型的に、４つのポリペプチド：重（Ｈ）鎖ポリペプチドの２つの同一なコピー、および軽（Ｌ）鎖ポリペプチドの２つの同一なコピーからなる。重鎖の各々は、１つのＮ末端の可変（ＶＨ）領域と、３つのＣ末端の定常（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）領域とを含有し、各軽鎖は、１つのＮ末端の可変（ＶＬ）領域と、１つのＣ末端の定常（ＣＬ）領域とを含有する。軽鎖および重鎖の各対の可変領域は、抗体の抗原結合性部位を形成する。ＶＨ領域と、ＶＬ領域とは、各領域が、それらの配列が比較的保存されている、４つのフレームワーク領域を含む、共通の一般的な構造を有する。フレームワーク領域は、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）により接続されている。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３として公知である、３つのＣＤＲは、抗原への結合の一因となる、抗体の「超可変領域」を形成する。
【００７２】
「抗原認識部分またはドメイン」とは、抗原に特異的に結合する分子または分子の部分を指す。一部の実施形態では、抗原認識部分は、抗体、抗体様分子、またはこれらの断片であり、抗原は、腫瘍抗原である。
【００７３】
「抗体様分子」は、例えば、パートナーに選択的に結合することが可能な、Ｉｇスーパーファミリーのメンバーであるタンパク質でありうる。ＭＨＣ分子およびＴ細胞受容体は、このような分子である。一部の実施形態では、抗体様分子は、ＴＣＲである。一部の実施形態では、ＴＣＲは、そのＭＨＣへの結合アフィニティーを増大させるように改変されている。
【００７４】
本明細書では、「抗体の断片」、「抗体断片」、「抗体の機能的断片」、および「抗原結合性部分」という用語を、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の、１または複数の断片または部分を意味するように、互換的に使用する（一般に、Holliger et al., Nat. Biotech., 23(9):1126-1129 (2005)を参照されたい）。抗体断片は、例えば、１もしくは複数のＣＤＲ、可変領域（またはその部分）、定常領域（またはその部分）、またはこれらの組合せを含むことが所望される。抗体断片の例は、（ｉ）ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン、およびＣＨ１ドメインからなる一価断片である、Ｆａｂ断片；（ｉｉ）ストーク領域におけるジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片である、Ｆ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）抗体の単一のアームのＶＬドメインおよびＶＨドメインからなる、Ｆｖ断片；（ｉｖ）２つのドメインを、単一のポリペプチド鎖として合成することを可能とする合成リンカーにより接合された、Ｆｖ断片の２つのドメイン（すなわち、ＶＬおよびＶＨ）からなる一価分子である、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）（例えば、Bird et al., Science, 242: 423-426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883 (1988); and Osbourn et al., Nat. Biotechnol., 16: 778 (1998)を参照されたい）；ならびに（ｖ）各ポリペプチド鎖が、同じポリペプチド鎖上のＶＨとＶＬとの間の対合を可能とするには短すぎるペプチドリンカーにより、ＶＬへと接続されたＶＨを含み、これにより、２つの機能的な抗原結合性部位を有する二量体分子を作出するように、異なるＶＨ−ＶＬポリペプチド鎖上の相補的ドメインの間の対合を駆動する、ポリペプチド鎖の二量体である、ダイアボディーを含むがこれらに限定されない。当技術分野では、抗体断片が公知であり、例えば、米国特許第８，６０３，９５０号明細書において、より詳細に記載されている。
【００７５】
核酸および／または核酸配列は、天然または人工で、共通の先祖核酸または先祖核酸配列に由来する場合、「相同」である。タンパク質および／またはタンパク質配列は、それらのコードＤＮＡが、天然または人工で、共通の先祖核酸または先祖核酸配列に由来する場合、相同である。相同な分子は、相同体と称する場合がある。例えば、本明細書で記載される、任意の天然タンパク質は、任意の利用可能な突然変異誘発法により修飾することができる。発現させると、この突然変異核酸は、元の核酸によりコードされるタンパク質と相同なポリペプチドをコードする。相同性は一般に、２つまたはこれを超える核酸またはタンパク質（またはこれらの配列）の間の配列同一性から推定される。相同性を確立するのに有用な配列の間の同一性の、正確な百分率は、問題の核酸およびタンパク質と共に変動するが、少なくとも２５％の配列同一性を使用して、相同性を確立する。高レベルの配列同一性、例えば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、もしくは９９％、またはこれを超える配列同一性もまた、相同性を確立するのに使用することができる。
【００７６】
ポリペプチドの、２つの核酸配列またはアミノ酸配列の文脈において、「同一」または「配列同一性」という用語は、指定された比較域にわたり、最大の照応関係についてアライメントされた場合に同じである、２つの配列内の残基を指す。一部の実施形態では、本明細書におけるポリペプチドは、例えば、デフォルトパラメータを使用する、ＢＬＡＳＴＰ（もしくはＣＬＵＳＴＡＬ、または他の任意の利用可能なアライメントソフトウェア）により測定される通り、基準ポリペプチドまたはその断片と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９８％の９９％、または１００％同一である。同様に、核酸はまた、出発核酸に照らして記載することもでき、例えば、それらは、例えば、デフォルトパラメータを使用する、ＢＬＡＳＴＮ（もしくはＣＬＵＳＴＡＬ、または他の任意の利用可能なアライメントソフトウェア）により測定される通り、基準核酸またはその断片と５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９８％、９９％、または１００％同一でありうる。１つの分子が、大型の分子に対して、ある特定の百分率の配列同一性を有するという場合、これは、２つの分子が最適にアライメントされれば、小型の分子内の、前記百分率の残基は、２つの分子が最適にアライメントされた順序に従い、大型の分子内にマッチ残基を見出すことを意味する。
【００７７】
「トランスポゾン」または「転移性エレメント」（ＴＥ）とは、ゲノム内のその位置を変化させ、場合によって、突然変異を創出または保存し、細胞のゲノムサイズを変更する、ベクターＤＮＡ配列である。転移は、ＴＥの重複を結果としてもたらすことが多い。クラスＩのＴＥは、２段階でコピーされる：まず、クラスＩのＴＥは、ＤＮＡからＲＮＡへと転写され、次いで、産生されたＲＮＡは、ＤＮＡへと逆転写される。次いで、この、コピーされたＤＮＡは、ゲノム内の新たな位置へと挿入される。逆転写ステップは、ＴＥ自身によりコードされうる、逆転写酵素により触媒される。レトロトランスポゾンの特徴は、ＨＩＶなどのレトロウイルスと同様である。クラスＩＩのＴＥによるカットアンドペースト転移機構は、ＲＮＡ中間体を伴わない。転移は、いくつかのトランスポザーゼ酵素により触媒される。あるトランスポザーゼは、ＤＮＡ内の任意の標的部位に非特異的に結合するのに対し、他のトランスポザーゼは、特異的ＤＮＡ配列標的に結合する。トランスポザーゼは、標的部位において、互い違いの（staggered）切断をもたらす結果として、５’側または３’側における、一本鎖のＤＮＡ突出（粘着（sticky）末端）をもたらす。このステップは、ＤＮＡトランスポゾンを切り出し、次いで、ＤＮＡトランスポゾンは、新たな標的部位へとライゲーションされるが、この過程は、ギャップを埋めるＤＮＡポリメラーゼの活性と、糖リン酸骨格をつなぎ合わせるＤＮＡリガーゼの活性とを伴う。これは、標的部位の重複を結果としてもたらす。ＤＮＡトランスポゾンの挿入部位は、標的ＤＮＡ内が互い違いに切断され、ＤＮＡポリメラーゼにより埋められることにより創出されうる短い直接的なリピート、ならびにそれらに続く、トランスポザーゼによるＴＥの切出しに重要な一連の逆位リピートにより同定されうる。細胞周期のＳ期において、ドナー部位は既に複製されているが、標的部位はまだ複製されていない場合に転移が生じるとカットアンドペーストＴＥは重複される。転移は、クラスＩ  ＴＥおよびクラスＩＩ  ＴＥのいずれにおいても、「自律型」または「非自律型」として分類することができる。自律型ＴＥが、それ自身で移動しうるのに対し、非自律型ＴＥは、移動するのに、別のＴＥの存在を必要とする。これは、非自律型ＴＥが、トランスポザーゼ（クラスＩＩの場合）または逆転写酵素（クラスＩの場合）を欠くためであることが多い。
【００７８】
「トランスポザーゼ」とは、トランスポゾンの末端に結合し、カットアンドペースト機構または複製性転移機構による、トランスポゾンの、ゲノムの別の部分への移動を触媒する酵素を指す。一部の実施形態では、トランスポザーゼの触媒活性を用いて、遺伝子を、ベクターからゲノムへと移動させることができる。
【００７９】
本明細書で開示または想定される核酸配列およびベクターは、細胞へと、「トランスフェクション」、「形質転換」、「ヌクレオフェクション」または「形質導入」により導入することができる。本明細書で使用される「トランスフェクション」、「形質転換」、または「形質導入」とは、物理的方法または化学的方法を使用することによる、１または複数の外因性ポリヌクレオチドの、宿主細胞への導入を指す。当技術分野では、多くのトランスフェクション法が公知であり、例えば、リン酸カルシウムＤＮＡ共沈殿法（例えば、Murray E. J. (ed.), Methods in Molecular Biology, Vol. 7, Gene Transfer and Expression Protocols, Humana Press (1991)を参照されたい）；ＤＥＡＥ−デキストラン法；電気穿孔法；カチオン性リポソーム媒介性トランスフェクション法；タングステン粒子促進型遺伝子銃法（Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990));リン酸ストロンチウム共沈殿法（Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987)）；およびヌクレオフェクション（Trompeter et al., J. Immunol. Methods 274:245-256 (2003)）を含む。ファージベクターまたはウイルスベクターは、それらの多くが市販されている、適切なパッケージング細胞内で、感染性粒子を増殖させた後で、宿主細胞へと導入することができる。
【００８０】
本明細書で使用される「腫瘍抗原」とは、腫瘍細胞内で産生されるかまたは過剰発現する、任意の抗原性物質を指す。腫瘍抗原は、例えば、宿主における免疫応答を誘発しうる。代替的に、本開示の目的では、腫瘍抗原は、健常細胞および腫瘍細胞のいずれもが発現するが、ある特定の腫瘍型を同定するため、適切な治療標的であるタンパク質でありうる。
【００８１】
「プロモーター」とは、コード配列の転写を誘発する、ポリヌクレオチドの領域を指す。プロモーターは、ＤＮＡの、同じ鎖上の、遺伝子の転写開始部位の近傍であり、かつ、上流に（センス鎖の５’側領域に向かって）位置する。あるプロモーターが、細胞内の全ての状況において活性であるので、構成的であるのに対し、他のプロモーター、例えば、誘導性プロモーターは、特異的刺激に応答して調節され、活性となる。
【００８２】
「プロモーター活性」という用語は、その活性が測定されるプロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列の発現の程度を指す。プロモーター活性は、例えば、ノーザンブロット解析により、産生されるＲＮＡ転写物の量を決定することにより、直接的に測定することもでき、プロモーターに連結されたレポーター核酸配列など、連結された核酸配列によりコードされる産物の量を決定することにより、間接的に測定することもできる。
【００８３】
本明細書で使用される「誘導性プロモーター」とは、転写調節因子、例えば、生物因子または非生物因子の存在または非存在により、活性へと誘導されるプロモーターを指す。誘導性プロモーターは、それらに作動可能に連結した遺伝子の発現が、生物または特に、組織の発生の、ある特定の段階において、オンまたはオフにされうるため、有用である。誘導性プロモーターの例は、アルコール調節性プロモーター、テトラサイクリン調節性プロモーター、ステロイド調節性プロモーター、金属調節性プロモーター、発症機序調節性プロモーター、温度調節性プロモーター、および光調節性プロモーターである。一部の実施形態では、誘導性プロモーターは、遺伝子スイッチの一部である。
【００８４】
本明細書で使用される「エンハンサー」という用語は、例えば、それが作動可能に連結された核酸配列の転写を増大させるＤＮＡ配列を指す。エンハンサーは、核酸配列のコード領域から、何キロベースも離れて位置することが可能であり、調節因子の結合、ＤＮＡのメチル化パターン、またはＤＮＡ構造の変化を媒介しうる。当技術分野では、様々な異なる供給源に由来する、多数のエンハンサーが周知であり、クローニングされたポリヌクレオチドとして、またはクローニングされたポリヌクレオチド内で利用可能である（例えば、ＡＴＣＣなどの寄託先のほか、他の商業的供給源または個人的供給源から）。プロモーター（一般に使用されるＣＭＶプロモーターなど）を含む、多数のポリヌクレオチドはまた、エンハンサー配列も含む。エンハンサーは、コード配列の上流に位置する場合もあり、この中に位置する場合もあり、この下流に位置する場合もある。「Ｉｇエンハンサー」という用語は、免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座内にマップされるエンハンサー領域に由来するエンハンサーエレメント（このようなエンハンサーは、例えば、重鎖（ミュー）５’側エンハンサー、軽鎖（カッパ）５’側エンハンサー、カッパイントロンエンハンサーおよびミューイントロンエンハンサー、ならびに３’側エンハンサーを含む）を指す（一般に、Paul W. E. (ed), Fundamental Immunology, 3rd Edition, Raven Press, New York (1993), pages 353-363、および米国特許第５，８８５，８２７号明細書を参照されたい）。
【００８５】
本明細書で使用される「コード配列」とは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのセグメントを指す。領域または配列には、５’末端の近傍では、開始コドンが結合し、３’末端の近傍では、終止コドンが結合する。コード配列はまた、オープンリーディングフレームと称することもできる。
【００８６】
本明細書で使用される「作動可能に連結された」とは、ＤＮＡセグメントの、別のＤＮＡセグメントへの、物理的な連結および／または機能的な連結であって、セグメントが、それらの意図される方式で機能することを可能とするような連結を指す。遺伝子産物をコードするＤＮＡ配列は、それが、例えば、プロモーター、エンハンサー、および／またはサイレンサーなどの調節配列に、ＤＮＡ配列の転写のモジュレーションを、直接的または間接的に可能とする方式で連結されている場合に、調節配列に作動可能に連結されている。例えば、ＤＮＡ配列は、それが、プロモーターの転写開始部位に対して、下流において、転写開始部位に対して、適正なリーディングフレーム内で、プロモーターへとライゲーションされており、ＤＮＡ配列を通して、転写の伸長が進行することを可能とする場合に、プロモーターに作動可能に連結されている。エンハンサーまたはサイレンサーは、それが、それぞれ、ＤＮＡ配列の転写を増加または減少させるように、ＤＮＡ配列へとライゲーションされている場合に、遺伝子産物をコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結されている。エンハンサーおよびサイレンサーは、ＤＮＡ配列のコード領域の上流に位置する場合もあり、この下流に位置する場合もあり、この中に埋め込まれている場合もある。シグナル配列が、ポリペプチドの分泌に参与するプレタンパク質として発現する場合、シグナル配列のＤＮＡは、ポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結されている。ＤＮＡ配列の、調節配列への連結は、典型的に、適切な制限部位におけるライゲーションにより、または当業者に公知の制限エンドヌクレアーゼを使用して、配列内に挿入された、アダプターまたはリンカーを介して達せられる。
【００８７】
「転写調節因子」という用語は、ある特定の環境条件下で、プロモーター駆動性ＤＮＡ配列の転写を防止もしくは阻害するように作用する生化学的エレメント（例えば、リプレッサータンパク質または核阻害性タンパク質）、または、ある特定の環境条件下で、プロモーター駆動性ＤＮＡ配列の転写を可能とするか、もしくは刺激するように作用する生化学的エレメント（例えば、インデューサーまたはエンハンサー）を指す。
【００８８】
「誘導」という用語は、転写調節因子によりもたらされる、核酸配列の転写、プロモーターの活性、および／またはプロモーターの発現の、何らかの転写基礎レベルと比べた上昇を指す。
【００８９】
「標的」遺伝子または「異種」遺伝子または「目的の遺伝子（ＧＯＩ）」とは、遺伝子導入により宿主細胞へと導入される遺伝子を指す。
【００９０】
本明細書で使用される「リコンビナーゼ」とは、規定された部位の間の部位特異的組換えを容易としうる酵素群であって、部位が、単一のＤＮＡ分子上で物理的に隔てられているか、または部位が、別個のＤＮＡ分子上に存在する、酵素群を指す。規定された組換え部位のＤＮＡ配列は、必ずしも同一ではない。組換えの開始は、タンパク質−ＤＮＡ間相互作用に依存し、酵素群内には、ファージの組込みおよび切出し（例えば、λインテグラーゼ、ΦＣ３１）、環状プラスミドの切断（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）（例えば、Ｔｎ３、ガンマデルタ、Ｃｒｅ、Ｆｌｐ）、代替的遺伝子の発現のためのＤＮＡの反転（例えば、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、Ｐｉｎ）、発生時における遺伝子（例えば、アナベナ属（Anabaena）による窒素固定遺伝子）のアセンブリ、および転移（例えば、ＩＳ６０７トランスポゾン）を触媒する、多数のタンパク質が存在する。大半の部位特異的リコンビナーゼは、進化的類縁性および機構的類縁性に基づき、２つのファミリーのうちの１つに収まる。これらは、λインテグラーゼファミリーまたはチロシンリコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅ、Ｆｌｐ、ＸｅｒＤ）、およびレゾルバーゼ／インテグラーゼファミリー、またはセリンリコンビナーゼファミリー（例えば、ΦＣ３１、ＴＰ９０１−１、Ｔｎ３、ガンマデルタ）である。
【００９１】
「組換え接合部位」とは、本明細書で記載されるリコンビナーゼ酵素により認識される、特異的ポリヌクレオチド配列である。典型的に、１つの部位が、標的核酸（例えば、真核生物または原核生物の染色体またはエピソーム）内に存在し、別の部位が、標的組換え部位において統合される核酸上に存在する、２つの異なる部位（「相補的部位」と称する）が関与する。本明細書では、それぞれ、細菌標的およびファージドナーに由来する、接合（または組換え）部位を指す、「ａｔｔＢ」および「ａｔｔＰ」という用語が使用されるが、特定の酵素のための組換え部位は、異なる名称を有しうる。組換え部位は、典型的に、コア領域またはスペーサー領域により隔てられた、左側アームおよび右側アームを含む。したがって、ａｔｔＢ組換え部位は、ＢＯＢ’［配列中、ＢおよびＢ’は、それぞれ、左側アームおよび右側アームであり、Ｏは、コア領域である］からなる。同様に、ａｔｔＰとは、ＰＯＰ’［配列中、ＰおよびＰ’は、アームであり、Ｏは、ここでもまた、コア領域である］である。ａｔｔＢ部位と、ａｔｔＰ部位との組換え時、および標的における、同時の核酸の組込み時に、組み込まれるＤＮＡを挟む組換え部位を、「ａｔｔＬ」および「ａｔｔＲ」と称する。したがって、上記の用語法を使用する、ａｔｔＬ部位およびａｔｔＲ部位は、それぞれ、ＢＯＰ’およびＰＯＢ’’からなる。本明細書における一部の表示では、「Ｏ」を省き、ａｔｔＢおよびａｔｔＰを、例えば、それぞれ、ＢＢ’およびＰＰ’と呼ぶ。
【００９２】
「遺伝子編集」または「ゲノム編集」という用語は、生物のゲノム内のＤＮＡのヌクレオチドの挿入、欠失、または置きかえを指す。典型的に、ゲノム編集は、ゲノムの所定の位置において、部位特異的二本鎖切断を創出しうる、操作ヌクレアーゼを使用する。本開示は、ゲノムを編集するための任意の手段を想定する。ゲノム編集法の非限定的な例は、ＣＲＩＳＰＲ、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ、およびＡｔｔＳｉｔｅ部位特異的セリンリコンビナーゼ系を含む。本明細書では、「ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集系」（CRISPR gene editing system）または「ＣＲＩＳＰＲ系」（CRISPR system）とは、ＤＮＡ配列の変化を、ゲノムの特異的領域へとターゲティングするための、任意のＲＮＡ誘導型のＣａｓタンパク質媒介性過程を指す。本明細書では、「Ａｒｇｏｎａｕｔｅ遺伝子編集系」とは、ＤＮＡ配列の変化を、ゲノムの特異的領域へとターゲティングするための、任意の一本鎖ＤＮＡ誘導型のＡｒｇｏｎａｕｔｅエンドヌクレアーゼ媒介性過程を指す。本明細書では、「ＡｔｔＳｉｔｅ遺伝子編集系」または「部位特異的セリンリコンビナーゼ遺伝子編集系」または「部位特異的セリンリコンビナーゼ系」とは、第１の組換え接合部位および第２の組換え接合部位を含む真核細胞を用意するステップと；第１の組換え接合部位および第２の組換え接合部位を、原核細胞のリコンビナーゼポリペプチドと接触させる結果として、組換え部位の間の組換えをもたらすステップとを含み、リコンビナーゼポリペプチドが、第１の組換え接合部位と、第２の組換え接合部位との組換えを媒介することが可能であり、第１の組換え接合部位が、ファージゲノム組換え接合部位（ａｔｔＰ）、または細菌ゲノム組換え接合部位（ａｔｔＢ）であり、第２の組換え接合部位が、ａｔｔＢまたはａｔｔＰであり、第１の組換え接合部位が、ａｔｔＢである場合、第２の組換え接合部位が、ａｔｔＰであり、第１の組換え接合部位が、ａｔｔＰである場合、第２の組換え接合部位が、ａｔｔＢであるという条件で、リコンビナーゼが、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）のファージリコンビナーゼ、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）のファージリコンビナーゼ、枯草菌（Bacillus subtilis）のファージリコンビナーゼ、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）のファージリコンビナーゼ、およびスメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）のファージリコンビナーゼからなる群から選択される、任意の工程を指す。ＡｔｔＳｉｔｅセリンリコンビナーゼ系についての実施形態の例は、その全てが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９，０３４，６５０号明細書において提示されている。
【００９３】
本明細書で、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドなどの分子に言及して使用される「内因性」という用語は、野生型の細胞または生物において見出されうる分子の、天然の形態を指す。生物において内因的に見出される分子は、典型的に、天然のものではない、本明細書で記載される操作分子と対比することができる。例えば、操作分子は、天然のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの変異体を含みうる。一部の実施形態では、天然のポリペプチドの変異体は、天然のポリペプチドのトランケート型変異体である。本明細書では、「トランケート型変異体」という用語は、アミノ酸による１または複数の配列および／またはドメインを、タンパク質またはポリペプチドの内因性変化形と比べて逸失している、タンパク質またはポリペプチドを指す。例えば、本明細書で記載されるポリペプチド構築物へと組み込まれたトランケート型変異体は、通常、内因性タンパク質内に存在するドメイン（例えば、細胞内シグナル伝達ドメイン、膜貫通ドメイン、リガンド結合ドメインなど）に対応するアミノ酸の配列を逸失している場合がある。トランケート型ポリペプチドの天然変化形は、マウス、ラット、ウサギ、およびヒトなどの哺乳動物種を含む、任意の生物に由来しうる。本明細書で記載される操作ポリヌクレオチドおよび操作ポリペプチドは、操作細胞内で発現させうる。本明細書では、操作細胞は、その天然状態または内因性状態から改変された細胞である。操作細胞の例は、天然ポリペプチドのトランケート型変異体または天然ポリヌクレオチドのトランケート型変異体をコードするように改変された（例えば、細胞へのポリヌクレオチドのトランスフェクションにより）、本明細書で記載される細胞である。
【００９４】
ポリペプチド構築物
本明細書では、ポリペプチド構築物、これをコードするポリヌクレオチド、ポリペプチド構築物およびポリヌクレオチドを保有し、かつ／または発現する操作細胞、ならびに操作細胞の活性を調節する方法が開示される。本明細書で記載される操作細胞は、サイトカイン、キメラ抗原受容体、およびＴ細胞受容体をコードし、かつ発現するように操作された免疫エフェクター細胞を含みうる。
【００９５】
本明細書で、操作細胞またはその中で発現させるポリペプチド構築物に言及して使用される場合の「〜を調節すること」または「調節」という用語は、一般に、対象への投与の後における、操作細胞の活性または量の調節を指す。一部の実施形態では、操作細胞の活性の調節とは、対象における操作細胞の枯渇を指す。一部の実施形態では、操作細胞の活性の調節とは、対象へと、ある量の、操作細胞上で発現させたポリペプチド構築物に結合する抗体または結合パートナーを投与する結果としての、対象における、一部の操作細胞の枯渇を指す。一部の実施形態では、操作細胞の活性の調節とは、抗体または結合パートナーの、前記操作細胞上で発現させるか、またはこれと関連する、本明細書で記載されるポリペプチド構築物への結合を介して、細胞死を活性化させる結果としての、操作細胞の枯渇を指す。一部の実施形態では、操作細胞の活性の調節とは、操作細胞内のＡＤＣＣ経路またはＣＤＣ経路を活性化させることを指す。
【００９６】
本明細書で開示されるポリペプチド、ポリヌクレオチド、および操作細胞は、まとめて、従来型の免疫療法の有効性を改善し、特に、養子細胞療法の有効性を改善するのに使用しうる、一連の治療的ツールを表す。例えば、本明細書で記載される操作細胞は、細胞表面において、新規の細胞タグとして、ポリペプチド構築物をコードし、これを発現しうる。一部の実施形態では、細胞タグは、細胞タグを発現する細胞を、操作細胞として、標識化するか、マークするか、またはＦｌａｇタグ付けする（flag）、細胞マーカーとして機能しうる。複数の実施形態では、細胞タグを、内因性タンパク質により認識されるエピトープを欠くように操作した場合、このような細胞タグは、例えば、養子細胞免疫療法時に、生物において、操作細胞を、他の細胞から固有に識別するように機能しうる。
【００９７】
他の例では、本明細書で記載されるポリペプチド、ポリヌクレオチド、および操作細胞を使用して、安全性が懸念される（例えば、サイトカインストームの発生に対する潜在的可能性に起因して）場合に、対象における免疫療法の毒性を、最小化するか、または消失させることができる。本明細書で記載される細胞タグは、免疫療法時に導入される抗体により認識されて、これにより、治療的アウトプットを緩徐化し、かつ／または治療の可能な副作用を軽減する細胞機構を誘導する、１または複数のエピトープを含みうる。一部の実施形態では、抗体は、エピトープに結合して、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を誘導する。したがって、本明細書で記載される細胞タグは、医療従事者が、治療的アウトプットを制御し、これにより、治療の有効性および安全性を最適化することを可能とする、操作細胞に固有の枯渇マーカーまたは「キルタグ」をもたらしうる。
【００９８】
本明細書で記載される免疫療法的手段は、養子細胞療法的介入に対する制御への潜在的可能性をもたらすことにより、従来型の免疫療法を改善する。一部の実施形態では、操作細胞は、操作細胞の表面で、二量体化または多量体化することが可能なポリペプチド構築物を発現させることにより、細胞枯渇戦略に対して感作されうる。このような二量体化ポリペプチドまたは多量体化ポリペプチドを使用して、枯渇シグナルを増幅し、これにより、治療と関連する副作用を受けやすいか、またはこれを被りつつある対象における操作免疫細胞療法を、迅速に下方調節するか、または消失させることができる。二量体化ポリペプチド構築物または多量体化ポリペプチド構築物を発現する操作細胞の投与は、細胞枯渇による介入に対する、さらなる制御および最適化をもたらしうる。さらなる実施形態では、本明細書で開示されるポリヌクレオチド構築物の、誘導性プロモーターを用いる「キルスイッチ」（または「自殺スイッチ」）系としての実装は、特定のポリペプチド構築物を発現させる時点に対する制御を可能とし、これにより、転写レベルおよび翻訳後レベルの両方において、免疫療法に対する、さらなる制御点を付与しうる。
【００９９】
別の実施形態では、本明細書で記載される細胞タグを使用して、このような細胞タグを特異的に発現する操作細胞を濃縮することができる。例えば、治療目的の選択された細胞の拡大を可能とするのに必要な純度を達成するために、細胞タグを使用して、このような細胞タグのみを発現するある特定の操作細胞を単離するように、ある特定の操作細胞を濃縮することができる。必要に応じて、ＦＡＣ、カラムによる精製、または磁気ビーズベースの方法など、多様な方法を用いることができる。
【０１００】
本明細書で開示されるポリペプチド構築物は、１もしくは複数のドメインまたはこれらの特異的断片を含みうる。典型的に、ポリペプチド構築物は、それらの各々が、所望される特定の特性を、ポリペプチド構築物へと付与するように機能する、シグナルペプチド配列、細胞外ドメイン、ペプチドリンカー、および膜貫通ドメインを含みうる。例えば、ポリペプチド構築物は、ポリペプチド構築物を、翻訳後に、細胞表面へと方向付ける、シグナルペプチドと；ポリペプチドドメインを、細胞へとアンカリングする膜貫通ドメインと；天然ポリペプチドのトランケート型変異体を含みうる、細胞外部分と；膜貫通ドメインを、細胞外部分へと接続するペプチドリンカーとを含みうる。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、ポリペプチドの細胞外部分を、細胞外マトリックス内に配置し、これにより、この部分を、細胞タグの機能性を付与する（例えば、抗体に結合するためのアクセスを与えるエピトープを提示するか、または伸長させる）のに利用可能とする、細胞外のペプチド伸長部として機能する。ある特定の実施形態では、上記のドメインのうちの１または複数は、ポリペプチド構築物内に存在しない場合もある。例えば、本明細書で記載されるポリペプチド構築物を、ペプチドリンカードメインを欠くように操作することができる。他の実施形態では、ポリペプチド構築物は、異なるタンパク質に由来する（すなわち、ポリペプチド構築物は、キメラである）、１または複数のドメインを含む。
【０１０１】
本明細書で、ポリペプチド構築物の部分に言及して使用される場合の「細胞外」という用語は、細胞膜の外側に位置するポリペプチドのアミノ酸を指す。一部の実施形態では、細胞外部分は、細胞表面ポリペプチドと称することができる。典型的に、細胞表面ポリペプチドの部分（例えば、遠位部分）は、遠位において、細胞の細胞膜から、細胞外腔へと伸長または突出する。一部の場合には、伸長部分は、伸長部分の構造と相補的であり、かつこれに特異的な構造を有する抗体または抗原認識ポリペプチドに結合し、これにより、これらに認識される。細胞表面ポリペプチドは、細胞表面において天然に見出される、ポリペプチドまたはその断片のほか、天然では、細胞表面において見出されない、ポリペプチドまたはその断片（例えば、天然ポリペプチドのトランケート型変異体）を包含しうる。
【０１０２】
細胞外部分または細胞表面ポリペプチドは、天然ポリペプチドのトランケート型変異体を含みうる。トランケート型変異体は、例えば、細胞膜（例えば、膜貫通ドメインへと接続されるか、またはこれと隣接するリンカーを介して）の外側から、細胞外腔へと伸長しうる。ある特定の実施形態では、トランケート型変異体は、ポリペプチドの天然変化形では、細胞内ドメインおよび／または膜貫通ドメインに寄与するアミノ酸を逸失している。トランケート型変異体は、細胞タグの細胞外部分をもたらすように、任意の形で、内因性ポリペプチドから修飾することができる。例えば、トランケート型変異体は、通常、抗原または受容体などの内因性タンパク質により認識されうる、細胞外ドメイン内のエピトープを含むように機能するアミノ酸を低減するか、または消失させるように修飾することができる。通常、（例えば、細胞シグナル伝達経路内で）細胞外分子とのインターフェースをなすアミノ酸を除去することにより、トランケート型変異体を、細胞表面において、非反応性であるか、または免疫学的／エピトープ的にサイレントとすることもでき、内因性分子との、その反応性もしくは結合を、低減もしくは最小化することもできる。本明細書では、天然エピトープを除去する、天然ポリペプチドに対する、任意の修飾であって、細胞外ドメインの全部または一部のトランケーション、およびエピトープの一部を形成するか、またはエピトープの一部を形成するように翻訳後修飾される、１または複数のアミノ酸の除去を含む修飾が想定される。
【０１０３】
本明細書で記載されるトランケート型変異体は、内因性シグナル伝達経路に関して、エピトープ的にサイレントであるが、トランケート型変異体は、通常、本明細書で記載される操作細胞に対応する細胞表面に接触しない分子（例えば、抗体）による認識が可能な、１または複数のエピトープを含みうる。一部の実施形態では、トランケート型変異体のエピトープに特異的な抗体または結合パートナーを、外因的に（例えば、養子細胞を使用する免疫療法時に）導入する。この点で、導入される抗体またはその断片による認識が可能な、トランケート型変異体のエピトープは、休眠エピトープまたは静止エピトープと称することができる。すなわち、養子免疫療法に使用される操作細胞の細胞表面に組み込まれる細胞タグは、適正な分子を、対象へと導入して、細胞タグ誘因か、またはこれ活性化させる（すなわち、エピトープの認識を介して）まで、休眠状態にあるエピトープを含有しうる。このようなエピトープは、治療が所望される通りに進行している場合には、操作細胞の治療アウトプットに干渉しない（すなわち、エピトープが、サイレントまたは静止を維持する）が、任意の理由で、免疫療法を緩和する必要がある場合には、細胞のアウトプットを下方調節するように活性化させうる誘因をもたらす。本開示は、このような細胞の消失（例えば、ＡＤＣＣ、またはＣＤＣを介する）を介して、タグを発現する操作細胞の治療的アウトプットを抑制するように、細胞タグのエピトープを認識することが可能な、任意の抗体または低分子の使用を想定する。細胞タグの細胞外ドメイン（例えば、トランケート型変異体）のエピトープを認識するのに使用されうる抗体の非限定的な例は、リツキシマブ、セツキシマブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、アファチニブ、ブリガチニブ、イコチニブ、オシメルチニブ、パニツムマブ、ザルツムマブ、ニモツズマブ、マツズマブ、アフツズマブ、ブロンツベトマブ、オビヌツズマブ、イブリツモマブチウキセタン、トシツモマブ、オファツムマブ、オカラツズマブ、オクレリズマブ、ＴＲＵ−０１５（Ｔｒｕｂｉｏｎ）、ベルツズマブ（ＩＭＭＵ−１０６）、アレムツズマブ、ＡＮＴ１０３４、ＨＩ１８６（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）、ＹＴＨ３４．５（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）、およびＹＴＨ６６．９ＨＬ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、トラスツズマブ、およびペルツズマブを含む。
【０１０４】
本明細書で想定されるトランケート型変異体を作製するのに、内因性ポリペプチドに対して施されうる修飾の別の例は、通常、細胞内シグナル伝達経路および／またはトラフィッキング経路に寄与または参与する、１または複数のアミノ酸を除去することである。シグナル伝達ドメインを除去する、内因性ポリペプチドのトランケーションは、その休眠状態において、細胞の機能（例えば、養子細胞療法時の養子細胞内の）に干渉しない、休眠的で誘導性の細胞マーカーとしての細胞タグの機能を強化する。
【０１０５】
一部の実施形態では、ポリペプチド構築物の細胞表面ポリペプチドは、受容体チロシンキナーゼのトランケート型変異体を含みうる。非限定的な例は、ＥＧＦ受容体ファミリー（例えば、ＨＥＲ１のトランケート型変異体）、ＰＤＧＦ受容体ファミリー、ＶＥＧＦ受容体ファミリー、インスリン受容体ファミリー、ＦＧＦ受容体ファミリー、Ｔｒｋ受容体ファミリー、およびＥｐｈ受容体ファミリーの受容体に由来するトランケート型変異体を含む。他の実施形態では、細胞表面ポリペプチドは、ＣＤタンパク質（例えば、ＣＤ２０またはＣＤ５２）のトランケート型変異体、またはＬＮＦＧＲ（ＣＤ２７１）のトランケート型変異体を含みうる。
【０１０６】
ある特定の実施形態では、細胞タグの細胞表面ポリペプチドは、天然ポリペプチドまたは内因性ポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達部分を除去するように改変されたトランケート型変異体を含みうる。膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達部分のトランケーションは、ポリペプチドの細胞表面部分または細胞外部分を、その内因性文脈から解放し、例えば、異なる天然タンパク質に由来する膜貫通ドメイン（例えば、リンカーを介して）へと融合させた細胞表面ポリペプチドを含むキメラポリペプチド構築物への組込みに利用可能とする。このようなキメラポリペプチド構築物は、細胞表面ポリペプチド（例えば、トランケート型変異体）に、ポリペプチドの内因形と比較して、変更された活性または特徴を付与しうる。一部の実施形態では、細胞表面ポリペプチドは、キメラポリペプチド構築物内で発現させると、二量体化が可能である。
【０１０７】
本開示は、複数の異なるポリペプチド構築物を、同じ操作細胞内で発現させうることを想定する。例えば、本明細書で開示される細胞は、細胞表面ポリペプチドおよび／または膜貫通ドメインの識別が異なる、複数のポリペプチド構築物を発現しうる。
【０１０８】
本明細書で記載されるポリペプチド構築物は、天然ポリペプチドのトランケート型変異体と、細胞表面ポリペプチドへと融合させた膜貫通ドメインと、任意選択で、トランケート型変異体を、膜貫通ドメインへと接続するリンカーと、細胞タグを、操作細胞の細胞表面へと方向付けるシグナルペプチドとを含む細胞表面ポリペプチドを含みうる。
【０１０９】
シグナルペプチド
シグナルペプチドは、新たに合成されるタンパク質またはポリペプチドのＮ末端に位置することが典型的なアミノ酸配列であって、タンパク質またはポリペプチドを、細胞表面へと方向付けるアミノ酸配列である。一部の実施形態では、シグナルペプチドは、細胞膜へと挿入される（例えば、膜貫通ドメインを介して）ポリペプチドを、細胞表面へと方向付ける。一部の実施形態では、本明細書で記載されるポリペプチド構築物は、シグナルペプチドと共に合成されるが、次いで、成熟ポリペプチド構築物が、シグナルペプチドのアミノ酸配列を欠くように、翻訳後プロセシングされて、シグナルペプチドを切断する。他の実施形態では、シグナルペプチド配列は、切断されず、成熟ポリペプチド構築物内に残存する。
【０１１０】
本開示は、ポリペプチド構築物を、細胞表面へと方向付け、かつ／またはトラフィッキングすることが可能な、任意の、公知または未知のシグナルペプチドを含むポリペプチド構築物を提示する。例えば、一部の実施形態では、ポリペプチド構築物は、ＧＭＣＳＦＲα、Ｉｇカッパ、免疫グロブリンＥ、ＣＤ８α、ＴＶＢ２（Ｔ２１Ａ）、ＣＤ５２、または低アフィニティー神経増殖因子受容体（ＬＮＧＦＲ、ＴＮＦＲＳＦ１６）のシグナルペプチドに対応するシグナル配列を含む。
【０１１１】
複数の実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、または配列番号１３からなるリストから選択されるヌクレオチド配列との、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる。複数の実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、および配列番号１４からなるリストから選択されるアミノ酸配列との、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１１２】
ペプチドリンカー
本明細書で記載されるポリペプチド構築物は、ポリペプチド構築物のドメインまたはその断片を、ポリペプチド構築物の、異なるドメインまたはその断片へと接続するペプチドリンカーを含みうる。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、ポリペプチド構築物の膜貫通ドメインを、ポリペプチド構築物の細胞表面ポリペプチド（例えば、天然ポリペプチドのトランケート型変異体）へと接続する。例えば、ポリペプチド構築物は、ＧＳＧリンカー（配列番号１６）、ＳＧＳＧリンカー（配列番号１８）、（Ｇ４Ｓ）３リンカー（配列番号２０）、（Ｇ４Ｓ）４リンカー（配列番号２２）、および／またはホイットローリンカーを含むペプチドリンカーを含みうる。
【０１１３】
本明細書では、膜貫通ドメインを、細胞表面ポリペプチド（例えば、トランケート型変異体）へと連結する、任意の長さまたはサイズのペプチドリンカーが提示される。例えば、一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、トランケート型変異体と、膜貫通ドメインとの距離を、ポリペプチドの天然非トランケート形と、その内因性膜貫通ドメインとの間で生じる距離とほぼ同じ距離に維持するサイズである。複数の実施形態では、本明細書で記載されるトランケート型変異体を、異なるサイズのＧ４Ｓリンカー（Ｇ４Ｓ）ｎ［配列中、ｎ＝０、１、２、３、４、５］（配列番号２２２）を介して、膜貫通ドメインへと連結して、ＨＥＲ１ｔと、膜貫通タンパク質との「天然」の距離を維持する。例えば、同じ天然ポリペプチドの、２つの異なるトランケート型変異体が、異なる長さである場合、両方のトランケート型変異体を、細胞表面から、ほぼ同じ距離に配置するために、長さの短いトランケート型変異体を、大きなサイズのリンカーで補完することができる。
【０１１４】
ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーを使用して、膜貫通ドメイン以外のドメインまたはその部分を、併せて連結することができる。例えば、ペプチドリンカーは、細胞表面ポリペプチドの、２つのタンパク質部分を接続しうる。場合によって、細胞表面ポリペプチドは、キメラポリペプチドであることが可能であり、ペプチドリンカーを介して接続されうる、複数の天然ポリペプチドに由来するトランケート型変異体を含む。例は、ＥＧＦＲファミリー（例えば、ＨＥＲ２、ＥｒｂＢ３、およびＥｒｂＢ４）の別のメンバーの、１または複数のトランケート型変異体と合わせた、ＨＥＲ１ｔを含むポリペプチド構築物である。他の場合には、細胞表面ポリペプチドは、ペプチドリンカーを介して接続された、２コピーまたはこれを超えるトランケート型変異体のコンカタマー（例えば、ＳＧＳリンカーを介して連結された、２コピーのＣＤ２０トランケート型ポリペプチドを含む配列番号１２３）を含みうる。
【０１１５】
複数の実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号１５；配列番号１７；配列番号１９；配列番号２１；および配列番号２３からなるリストから選択されるヌクレオチド配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる。複数の実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号１６；配列番号１８；配列番号２０；配列番号２２；および配列番号２４からなるリストから選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１１６】
膜貫通ドメイン
本明細書で記載されるポリペプチド構築物は、細胞膜へと挿入されて、ポリペプチド構築物を、細胞表面にアンカリングしうる膜貫通ドメインを含みうる。本開示は、任意の公知もしくは未知の膜貫通ドメインまたはその断片のうちの１または複数を含むポリペプチド構築物を提示する。一部の実施形態では、ポリペプチド構築物の膜貫通ドメインは、１または複数の天然タンパク質に由来し、かつ／またはこれと相同な膜貫通ドメインを含みうる。一部の実施形態では、ポリペプチド構築物の膜貫通ドメインは、単一の天然タンパク質の膜貫通ドメインに対応するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチド構築物の膜貫通ドメインは、２つまたはこれを超える天然タンパク質に由来するアミノ酸配列を含む、キメラ膜貫通ドメインを含む。
【０１１７】
本明細書で記載されるポリペプチド構築物は、１回膜貫通型（single-pass）または複数回膜貫通型（multi-pass）である膜貫通ドメインを含みうる。ＣＤ８αは、１回膜貫通型膜貫通ドメインを有するタンパク質の例である。一部の実施形態では、本明細書で開示されるポリペプチド構築物は、ＣＤ８αタンパク質に由来する膜貫通ドメインまたはその断片に対応し、かつ／またはこれと相同な膜貫通ドメインを含む。複数の実施形態では、ポリペプチド構築物の膜貫通ドメインは、配列番号３３のヌクレオチド配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる。複数の実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号３４のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１１８】
複数回膜貫通型タンパク質の例は、ＣＤ２８である。一部の実施形態では、ポリペプチド構築物の膜貫通ドメインは、ＣＤ２８タンパク質に由来する膜貫通ドメインまたはその断片に対応し、かつ／またはこれと相同な膜貫通ドメインを含みうる。複数の実施形態では、ポリペプチド構築物の膜貫通ドメインは、配列番号３５のヌクレオチド配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる。複数の実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号３６のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１１９】
一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、膜貫通二量体化ドメインである。本明細書では、「膜貫通二量体化ドメイン」とは、細胞の細胞膜内で、第２の膜貫通ドメインまたはその断片と、物理的に相互作用するか、または「二量体化すること」が可能な、膜貫通ドメインまたはその断片を指す。典型的に、膜貫通二量体化ドメインは、膜貫通二量体化ドメインを介して、第２のポリペプチドと二量体化する、第１のポリペプチド構築物内に含まれる。第１のポリペプチドの膜貫通二量体化ドメインを、その遠位（細胞外指向性）末端において、第１の細胞表面ポリペプチドと融合させ、第２のポリペプチドの膜貫通二量体化ドメインを、その遠位末端において、第２の細胞表面ポリペプチドと融合させる場合、細胞膜内の、第１の膜貫通ドメインと、第２の膜貫通ドメインとの物理的相互作用は、第１の細胞表面ポリペプチドと、第２の細胞表面ポリペプチドとの二量体化を結果としてもたらしうる。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、多量体化して、三量体、四量体、または多量体を形成しうる。
【０１２０】
ある特定の実施形態では、膜貫通二量体化ドメインは、細胞外誘導剤（例えば、リガンドまたは細胞表面ポリペプチドのエピトープに特異的な抗体）を必要とせずに、細胞表面ポリペプチドの二量体化を誘導する。例えば、膜貫通二量体化ドメインは、細胞の細胞膜内の、第２の膜貫通二量体化ドメインと、自発的に、物理的に相互作用または共役することにより、細胞表面ポリペプチドの二量体化を誘導しうる。したがって、本明細書で記載されるポリペプチド構築物を発現する細胞は、本明細書で記載される抗体、タンパク質、リガンド、または分子を含む、任意の細胞外細胞表面結合剤の投与の前に、細胞の細胞表面上に、二量体化させた細胞表面ポリペプチドを提示しうることが理解されるであろう。膜貫通二量体化ドメインを介する、細胞表面ポリペプチドの二量体化は、二量体化させた細胞表面ポリペプチドが、リガンドまたは抗体に接触し、これらを認識する場合に、細胞の応答を増強するように、このようなポリペプチド構築物を発現する細胞を利用しうる。例えば、ポリペプチド構築物が、ＨＥＲ１ｔを含む細胞表面ポリペプチドを含む場合、ＨＥＲ１ｔ細胞表面ポリペプチドの対を、セツキシマブなどのＣＤＣ誘導剤またはＡＤＣＣ誘導剤との接触前または接触時に二量体化させることができる。セツキシマブ結合性細胞表面ポリペプチドの二量体化立体配置の結果として、苦痛時（例えば、サイトカインストーム中）の結合剤の投与は、細胞傷害性効果を増幅し、これにより、細胞を殺滅する可能性を増大させうる。一部の実施形態では、細胞表面ポリペプチド（例えば、二量体化させた細胞表面ポリペプチド）に結合して、本明細書で開示されるポリペプチド構築物を発現する操作細胞内で、細胞応答を誘導する薬剤は、外因的に施され、かつ／または内因的には存在しない。本開示は、ＨＥＲ１ｔ、ＬＮＧＦＲｔ、ＣＤ２０ｔ、およびＣＤ５２ｔなど、天然ポリペプチドのトランケート型変異体を含む、任意の細胞表面ポリペプチドの二量体化を容易とする、膜貫通二量体化ドメインを提示する。
【０１２１】
一部の実施形態では、膜貫通二量体化ドメインは、第２の膜貫通ドメインとの共有結合的連結を形成して、細胞表面ポリペプチドの二量体化を誘導する。一部の実施形態では、共有結合的接続は、隣接する膜貫通ドメインの各々の中に存在するシステインアミノ酸の間で形成される、ジスルフィド結合の形態である。他の実施形態では、細胞膜内の膜貫通二量体化ドメインは、第２の膜貫通ドメインとの非共有結合的接続を形成して、細胞表面ポリペプチドの二量体化を誘導する。
【０１２２】
本明細書で記載されるポリペプチド構築物は、別の膜貫通二量体化ドメインと物理的に相互作用する、膜貫通二量体化ドメインを有しうる。このような場合に、それぞれの第１のポリペプチド構築物および第２のポリペプチド構築物の、第１の膜貫通二量体化ドメインおよび第２の膜貫通二量体化ドメインは、同じアミノ酸配列（すなわち、膜貫通二量体化ドメインに関して、ホモ二量体）を有する場合もあり、異なるアミノ酸配列（すなわち、膜貫通二量体化ドメインに関して、ヘテロ二量体）を有する場合もある。ある特定の実施形態では、二量体化ポリペプチド対の、それぞれの各膜貫通二量体化ドメインは、第１の膜貫通二量体化ドメイン内および第２の膜貫通二量体化ドメイン内の、対応するシステイン残基の間のジスルフィド架橋の形成を媒介する、少なくとも１つのシステイン残基を含む。
【０１２３】
ポリペプチド構築物の膜貫通ドメインは、タンパク質であるグリコホリンＡのアミノ酸配列に対応し、かつ／またはこれと相同なアミノ酸配列を含みうる。一部の実施形態では、本明細書で記載されるポリペプチド構築物へと組み込まれた、グリコホリンＡのアミノ酸配列は、グリコホリンＡの膜貫通ドメインまたはその断片を含む。一部の実施形態では、ポリペプチド構築物の膜貫通ドメインは、通常、グリコホリンＡ膜貫通ドメインに隣接する、１または複数のアミノ酸を含みうる。一部の実施形態では、グリコホリンＡ膜貫通ドメインの全部または一部を含むポリペプチド構築物は、グリコホリンＡ膜貫通ドメインの全部または一部を含む、第２のポリペプチド構築物と二量体化すること（例えば、ホモ二量体化すること）が可能である。このような場合に、グリコホリンＡから、ポリペプチド構築物へと組み込まれたアミノ酸配列は、膜貫通二量体化ドメインを規定しうる。例えば、グリコホリンＡ二量体化ドメインは、二量体化モチーフであるＧＸＸＸＧを含みうる。
【０１２４】
一部の実施形態では、ポリペプチド構築物は、グリコホリンＡの、少なくともアミノ酸Ｅ９１〜Ｒ１１６を含む膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、ポリペプチド構築物は、グリコホリンＡの、少なくともアミノ酸Ｉ９２〜Ｉ１１４を含む膜貫通ドメインを含む。複数の実施形態では、ポリペプチド構築物は、配列番号２５および配列番号２７からなるリストから選択されるヌクレオチド配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされた、グリコホリンＡドメインまたはその断片に対応する膜貫通ドメインを含む。複数の実施形態では、ポリペプチド構築物は、配列番号２６および配列番号２８からなるリストから選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有する、グリコホリンＡドメインまたはその断片に対応する膜貫通ドメインを含む。
【０１２５】
本明細書で記載されるポリペプチド構築物は、２つまたはこれを超える天然ポリペプチドに由来するアミノ酸配列のキメラである膜貫通ドメインを含みうる。例えば、膜貫通ドメインは、第２のタンパク質に由来するアミノ酸配列へと連結されるか、または融合させたグリコホリンＡドメインまたはその部分に対応するアミノ酸配列を含みうる。一部の実施形態では、このようなキメラ膜貫通ドメインは、第２の膜貫通ドメイン（例えば、キメラまたは非キメラ）との二量体化が可能であり、したがって、膜貫通二量体化ドメインをもたらすことが可能である。例えば、グリコホリンＡ膜貫通ドメインまたはその断片に対応するアミノ酸配列を、インテグリンβ３のドメインまたはその断片に対応するアミノ酸配列へと融合させて、ポリペプチド構築物のキメラ膜貫通ドメインを形成することができる。一部の実施形態では、ポリペプチド構築物は、インテグリンβ３のアミノ酸Ａ７３７〜Ｗ７４１へと融合させたグリコホリンＡのアミノ酸Ｉ９２〜Ｌ１０９を含む膜貫通ドメインを含む。複数の実施形態では、ポリペプチド構築物は、配列番号２９のヌクレオチド配列との、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりによりコードされた、グリコホリンＡ−インテグリンβ３キメラ配列に対応する膜貫通ドメインを含む。複数の実施形態では、ポリペプチド構築物は、配列番号３０のアミノ酸配列との、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有する膜貫通ドメインを含む。
【０１２６】
ポリペプチド構築物の膜貫通ドメインは、ＣＤ３ゼータ鎖の膜貫通ドメイン内のアミノ酸配列に対応し、かつ／またはこれと相同なアミノ酸配列を含みうる。一部の実施形態では、ＣＤ３ゼータ鎖の膜貫通ドメインまたはその断片を含むポリペプチド構築物は、ＣＤ３ゼータ鎖の膜貫通ドメインまたはその断片を含む、第２のポリペプチド構築物と二量体化すること（例えば、ホモ二量体化すること）が可能である。このような場合に、ＣＤ３ゼータ鎖膜貫通ドメインに対応するアミノ酸配列は、膜貫通二量体化ドメインを規定しうる。一部の実施形態では、ポリペプチド構築物は、配列番号３１のヌクレオチド配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされた膜貫通ドメインを含む。他の実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号３１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる。複数の実施形態では、ポリペプチド構築物は、配列番号３２のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有する膜貫通ドメインを含む。
【０１２７】
他の実施形態では、本明細書におけるポリヌクレオチド構築物の膜貫通ドメインは、タンパク質であるＣＴＬＡ４（細胞傷害性Ｔリンパ球タンパク質４）および／もしくはＬＮＧＦＲ（ＴＮＦＲＳＦ１６）に由来する膜貫通ドメインまたはその断片に対応し、かつ／またはこれと相同なアミノ酸配列を含みうる。例えば、ポリペプチド構築物は、配列番号３７および配列番号３９からなるリストから選択されるヌクレオチド配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされた膜貫通ドメインを含みうる。複数の実施形態では、ポリペプチド構築物は、配列番号３８および配列番号４０からなるリストから選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有する膜貫通ドメインを含む。
【０１２８】
トランケート型変異体
本明細書で記載されるポリペプチド構築物は、膜貫通ドメインへと連結された細胞表面ポリペプチドを含みうる。ある特定の実施形態では、細胞表面ポリペプチドは、天然ポリペプチドのトランケート型変異体を含む。本明細書では、多種多様な天然ポリペプチドが、ポリペプチド構築物へと組み込まれるトランケート型変異体を産生する、前駆体または基質として提示される。各天然ポリペプチド前駆体は、本明細書で記載されるポリペプチド構築物における使用のための、多数の可能なトランケート型変異体をもたらすように、複数の異なるトランケーションにさらにかけることができる。
【０１２９】
前駆体の例は、表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲまたはＨＥＲ１）アイソフォーム前駆体（例えば、配列番号５０）；受容体チロシンタンパク質キナーゼＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）アイソフォーム前駆体（例えば、配列番号５１）；受容体チロシンタンパク質キナーゼＥｒｂＢ３（ＨＥＲ３）アイソフォーム１前駆体（例えば、配列番号５２）、受容体チロシンタンパク質キナーゼＥｒｂＢ４（ＨＥＲ４）アイソフォームＪＭ−ａ／ＣＶＴ−１前駆体（例えば、配列番号５３）、受容体チロシンタンパク質キナーゼＥｒｂＢ４（ＨＥＲ４）アイソフォームＪＭ−ｂアイソフォームＸ７（例えば、配列番号５４）、ＣＤ２０前駆体（例えば、配列番号１０８）、ＣＤ５２前駆体、およびＬＮＧＦＲ前駆体（例えば、配列番号１５４）を含む。
【０１３０】
ある特定の実施形態では、細胞表面ポリペプチドは、トランケート型ＨＥＲ１ポリペプチド（本明細書では、ＨＥＲ１ｔまたはＥＧＦＲｔと称する）を含む。天然ＨＥＲ１は、ドメインＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶを含む細胞外領域、膜貫通ドメイン、ならびに細胞内チロシンキナーゼおよび調節領域を含む。ＡＤＣＣを誘導することが可能な、ある特定の抗体（例えば、パニツムマブおよびセツキシマブ）は、内因性ＨＥＲ１のドメインＩＩＩに結合することが公知である。
【０１３１】
本明細書では、内因性ＨＥＲ１の、任意のアミノ酸、ドメイン、または断片がトランケートされたＨＥＲ１ポリペプチドを含むポリペプチド構築物が提示される。本明細書では、ＨＥＲ１ポリペプチドは、ＨＥＲ１ｔポリペプチドを含みうる。一部の実施形態では、ＨＥＲ１ポリペプチドは、ＨＥＲ１ｔポリペプチドからなるか、またはこれから本質的になる。他の実施形態では、ＨＥＲ１ポリペプチドは、他のＨＥＲ１ドメイン（例えば、ＨＥＲ１膜貫通ドメイン）に加えて、ＨＥＲ１ｔポリペプチドを含みうる。複数の実施形態では、ＨＥＲ１ポリペプチドは、チロシンキナーゼドメインおよび調節性領域を含む、ＨＥＲ１内に通常見出される、細胞内ドメインまたはその断片を欠く場合がある。一部の実施形態では、ＨＥＲ１ポリペプチドは、ＨＥＲ１内に通常見出される、膜貫通ドメインまたはその断片を欠く場合がある。一部の実施形態では、ＨＥＲ１ポリペプチドは、ＨＥＲ１内で通常見出される、ドメインＩ、ドメインＩＩ、およびドメインＩＶの全部または一部を含む、ＨＥＲ１内に通常見出される、細胞外ドメインまたはその断片を欠く場合がある。
【０１３２】
一部の実施形態では、細胞表面ポリペプチドは、ＨＥＲ１内に通常見出されるドメインＩＩＩを欠くＨＥＲ１ｔポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＨＥＲ１ｔポリペプチドは、内因性ＨＥＲ１タンパク質のドメインＩＩＩの全部または一部からなるか、またはこれらから本質的になる。一部の実施形態では、ＨＥＲ１ｔポリペプチドは、内因性ＨＥＲ１タンパク質のドメインＩＩＩの全部からなるか、またはこれらから本質的になる。ある実施形態では、細胞表面ポリペプチドへと組み込まれたＨＥＲ１ｔドメインＩＩＩは、配列番号１９９のヌクレオチド配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる。ある実施形態では、細胞表面ポリペプチドへと組み込まれたＨＥＲ１ｔドメインＩＩＩは、配列番号２００のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有する。
【０１３３】
一部の実施形態では、細胞表面ポリペプチドへと組み込まれたＨＥＲ１ｔポリペプチドは、内因性ＨＥＲ１のドメインＩＶまたはその断片を含む。内因性ＨＥＲ１ドメインＩＶは、配列番号２０１のヌクレオチド配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされうる。ある実施形態では、内因性ＨＥＲ１ｔドメインＩＶは、配列番号２０２のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有する。他の実施形態では、細胞表面ポリペプチドへと組み込まれたＨＥＲ１ｔポリペプチドは、トランケート型ドメインＩＶを含みうる。ＨＥＲ１ｔトランケート型ドメインＩＶは、天然ＨＥＲ１のうちの、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％のトランケーションを含みうる。ある実施形態では、細胞表面ポリペプチドへと組み込まれたＨＥＲ１ｔトランケート型ドメインＩＶは、配列番号２０３、配列番号 配列番号２０４、配列番号２０５、配列番号２０６、配列番号２０７、配列番号２０８、および配列番号２０９からなるリストから選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有する。
【０１３４】
本明細書で記載されるポリペプチド構築物は、ＨＥＲ１ドメインＩＩＩおよびドメインＩＶを含むＨＥＲ１ｔポリペプチドを含みうる。ある実施形態では、ＨＥＲ１ｔポリペプチドは、配列番号２１０のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有するＨＥＲ１ドメインＩＩＩおよびドメインＩＶを含む。
【０１３５】
本明細書で記載されるポリペプチド構築物は、ＨＥＲ１のドメインＩＩＩと、ドメインＩＶの断片とを含むＨＥＲ１ｔポリペプチドを含みうる。ある実施形態では、ＨＥＲ１ｔポリペプチドは、配列番号２１１、配列番号２１２、配列番号２１３、配列番号２１４、配列番号２１５、配列番号２１６、および配列番号２１７からなるリストから選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有する。
【０１３６】
天然ＨＥＲ１はまた、ドメインＩＶ内の、複数のジスルフィド結合対も含有する。一部の実施形態では、ＨＥＲ１ｔトランケート型ドメインＩＶは、ジスルフィド結合対を保存する位置において、トランケーションを含みうる。さらなる実施形態では、本明細書で記載されるＨＥＲ１ｔ変異体を、異なるサイズのＧ４Ｓリンカー（Ｇ４Ｓ）ｎ［配列中、ｎ＝０、１、２、３、４、５］（配列番号２２２）を介して、膜貫通ドメインへと連結して、ＨＥＲ１ｔと、膜貫通タンパク質との「天然」の距離を維持する。さらなる実施形態では、このリンカーは、ＥＧＦリガンドの活性化をもたらすＥＧＦＲ受容体の二量体化において役割を果たすので、ドメインＩＶとＥＧＦＲ膜貫通ドメインとの間の７残基のリンカーを、さらに除去することができる。
【０１３７】
本明細書で記載される、細胞表面ポリペプチドへと組み込まれたＨＥＲ１ｔポリペプチドは、外因的に導入された結合パートナーまたは抗体により認識されうるエピトープを含みうる。一部の実施形態では、ＨＥＲ１ｔポリペプチドには、本明細書で記載されるポリペプチド構築物を発現する細胞の、ターゲティングされた枯渇を容易とするために、セツキシマブ結合性ドメインを組み込みうる。枯渇は、例えば、ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣから生じる細胞死に起因しうる。ＨＥＲ１ｔを含む細胞表面ポリペプチド上のエピトープに結合し、かつ／またはこれを認識するように内因的に導入されうる分子の非限定的な例は、セツキシマブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、アファチニブ、ブリガチニブ、イコチニブ、オシメルチニブ、パニツムマブ、ザルツムマブ、ニモツズマブ、およびマツズマブを含みうる。多様な実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、ダイアボディー、またはラクダ科動物抗体でありうる。別の実施形態では、抗体を、薬物または毒素へとコンジュゲートさせることができる。
【０１３８】
本明細書で記載されるポリペプチド構築物へと組み込まれる細胞表面ポリペプチドは、複数の異なる天然ポリペプチドのトランケート型変異体を含みうる。例えば、細胞表面ポリペプチドは、ＥＧＦＲファミリーに由来する複数のトランケート型ポリペプチドを含むポリペプチドキメラを含みうる。図４Ｂは、細胞タグの機能性を付与する、ポリペプチド構築物についての実施形態を例示するが、この場合、細胞表面ポリペプチドは、ＨＥＲ／ＥＧＦＲファミリーの１つのメンバー（ＨＥＲ（ｍ））のドメインＩＩＩと、ＨＥＲ／ＥＧＦＲファミリーの異なるメンバー（ＨＥＲ（ｎ））に由来するドメインＩＶまたはその断片とを含む。本明細書では、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＥｒｂＢ３、およびＥｒｂＢ４のうちの、２つまたはこれを超えるものに由来する細胞外ドメインの任意の組合せを含むキメラ細胞表面ポリペプチドが提示される。図４Ｃは、ドメインＩＩＩが、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ１に由来する、具体的な場合を描示する。このようなキメラ細胞表面ポリペプチドの利点は、各個別のトランケーションが、養子細胞治療時に、外因的に導入される抗体により認識されうるエピトープを保存しながら、内因性分子に結合する傾向がある、それぞれの天然ポリペプチドのエピトープを除去しうることである。例えば、キメラ細胞表面ポリペプチドが、ＥＧＦＲに由来するドメインＩＩＩと、ＨＥＲ２に由来するドメインＩＶとを含む場合、ポリペプチドを発現する操作細胞は、抗体である、セツキシマブ（ＥＧＦＲに由来するドメインＩＩＩを認識する）、およびトラスツズマブ（ＨＥＲ２に由来するドメインＩＶを認識する）の両方に対して、感受性でありうる。したがって、本明細書で記載されるキメラ細胞表面ポリペプチドは、複数の抗生剤／結合パートナーに対する結合部位をもたらすことにより、免疫療法時に免疫細胞の挙動を制御する、さらなる機構をもたらす。例えば、養子細胞療法時に副作用を被る対象が、キメラ細胞表面ポリペプチド内のトランケート型変異体のうちの１つにおけるエピトープをターゲティングする、投与された抗生剤（例えば、セツキシマブ）に応答しない状況下では、異なる抗体（例えば、トラスツズマブ）を、対象へと投与して、キメラ細胞表面ポリペプチドの、他のトランケート型変異体上の、異なるエピトープを介して、同じ操作細胞をターゲティングすることができる。
【０１３９】
一部の実施形態では、キメラ細胞表面ポリペプチドを、ＥＧＦＲファミリーメンバーと相同な膜貫通ドメインと融合させることができる。例えば、膜貫通ドメインは、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＥｒｂＢ３、またはＥｒｂＢ４に由来する膜貫通ドメインに対応しうる。他の実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、および配列番号４０に対応する膜貫通ドメインを含む、非ＥＧＦＲ膜貫通ドメインと相同でありうる。
【０１４０】
一部の実施形態では、キメラ細胞表面ポリペプチドは、ＨＥＲ１ｔポリペプチドと、トランケート型ＨＥＲ２（ＨＥＲ２ｔ）ポリペプチドまたはその断片とのキメラを含みうる。例えば、ポリペプチド構築物は、ＨＥＲ１ドメインＩＩＩを含む、ＨＥＲ１ｔ／ＥＧＦＲｔポリペプチドと、ＨＥＲ２ドメインＩＶを含むＨＥＲ２ｔポリペプチドと、ＨＥＲ２膜貫通ドメインとを含みうる。ある実施形態では、ＨＥＲ２膜貫通ドメインへと融合させたＥＧＦＲ−ＨＥＲ２キメラ細胞表面ポリペプチドは、配列番号８８および配列番号９２（デルタ１６）からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされうる。ある実施形態では、ＨＥＲ２膜貫通ドメインへと融合させたＥＧＦＲ−ＨＥＲ２キメラ細胞表面ポリペプチドは、配列番号８９および配列番号９３（デルタ１６）からなる群から選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有する。
【０１４１】
一部の実施形態では、キメラ細胞表面ポリペプチドは、ＨＥＲ１ｔポリペプチドと、トランケート型ＥｒｂＢ３（ＥｒｂＢ３ｔ）ポリペプチドまたはその断片とのキメラを含みうる。例えば、ポリペプチド構築物は、ＨＥＲ１ドメインＩＩＩを含む、ＨＥＲ１ｔ／ＥＧＦＲｔポリペプチドと、ＥｒｂＢ３ドメインＩＶを含むＥｒｂＢ３ｔポリペプチドと、ＥｒｂＢ３膜貫通ドメインとを含みうる。ある実施形態では、ＥｒｂＢ３膜貫通ドメインへと融合させたＥＧＦＲ−ＥｒｂＢ３キメラ細胞表面ポリペプチドは、配列番号９６のヌクレオチド配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされうる。ある実施形態では、ＥｒｂＢ３膜貫通ドメインへと融合させたＥＧＦＲ−ＥｒｂＢ３キメラ細胞表面ポリペプチドは、配列番号９７のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有する。
【０１４２】
一部の実施形態では、キメラ細胞表面ポリペプチドは、ＨＥＲ１ｔポリペプチドと、トランケート型ＥｒｂＢ４（ＥｒｂＢ４ｔ）ポリペプチドまたはその断片とのキメラを含みうる。例えば、ポリペプチド構築物は、ドメインＩＩＩを含む、ＨＥＲ１ｔ／ＥＧＦＲｔポリペプチドと、ＥｒｂＢ４ドメインＩＶを含むＥｒｂＢ４ｔポリペプチドと、ＥｒｂＢ４膜貫通ドメインとを含みうる。一部の実施形態では、ＥｒｂＢ４ｔポリペプチドは、ＥｒｂＢ４  ＪＭ−ａの代替転写物によりコードされるＥｒｂＢ４  ＪＭ−ａ細胞外膜近傍ドメインを含みうる。一部の実施形態では、ＥｒｂＢ４ｔポリペプチドは、ＥｒｂＢ４  ＪＭ−ｂの代替転写物によりコードされるＥｒｂＢ４  ＪＭ−ｂ細胞外膜近傍ドメインを含みうる。ある実施形態では、ＥｒｂＢ４膜貫通ドメインへと融合させたキメラ細胞表面ポリペプチドは、配列番号１００（ＥＧＦＲ−ＥｒｂＢ４（ＪＭ−ａ））および配列番号１０４（ＥＧＦＲ−ＥｒｂＢ４（ＪＭ−ｂ））からなるリストから選択されるヌクレオチド配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされうる。ある実施形態では、ＥｒｂＢ４膜貫通ドメインへと融合させたＥＧＦＲ−ＥｒｂＢ４キメラ細胞表面ポリペプチドは、配列番号１０１（ＥＧＦＲ−ＥｒｂＢ４（ＪＭ−ａ））および配列番号１０５（ＥＧＦＲ−ＥｒｂＢ４（ＪＭ−ｂ））からなるリストから選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有する。
【０１４３】
本明細書で記載されるポリペプチド構築物は、シグナルペプチドと、ＨＥＲ１ｔポリペプチド（例えば、ＨＥＲ１ｔのみを含むか、またはＨＥＲ１ｔを含むキメラポリペプチド）を含む細胞表面ポリペプチドと、膜貫通ドメインと、任意選択で、リンカーとの任意の組合せを含みうる。例えば、ポリペプチド構築物は、ＨＥＲ１ｔポリペプチドまたはＨＥＲ１ｔを含むキメラポリペプチドを含む細胞表面ポリペプチドであって、リンカー（例えば、１または複数（例えば、１〜４）コピーのＧ４Ｓ（配列番号２２１））を介して、ＣＤ２８膜貫通ドメインの誘導体または断片へと連結されるか、または融合させた細胞表面ポリペプチドを含みうる。一部の実施形態では、細胞表面ポリペプチドは、配列番号５６（ＨＥＲ１ｔ１）；配列番号５８（ＨＥＲ１ｔ２）；配列番号６０（ＨＥＲ１ｔ３）；配列番号６２（ＨＥＲ１ｔ４）；配列番号６４（ＨＥＲ１ｔ５）；配列番号６６（ＨＥＲ１ｔ６）；配列番号６８（ＨＥＲ１ｔ７）；配列番号７２（ＨＥＲ１ｔ８）；配列番号７６（ＨＥＲ１ｔ９）；配列番号８０（ＨＥＲ１ｔ１０）；および配列番号８４（ＨＥＲ１ｔ１１）からなるリストから選択されるヌクレオチド配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるＨＥＲ１ｔポリペプチドを含みうる。一部の実施形態では、細胞表面ポリペプチドは、配列番号５５（ＨＥＲ１ｔ）；配列番号５７（ＨＥＲ１ｔ１）；配列番号５９（ＨＥＲ１ｔ２）；配列番号６１（ＨＥＲ１ｔ３）；配列番号６３（ＨＥＲ１ｔ４）；配列番号６５（ＨＥＲ１ｔ５）；配列番号６７（ＨＥＲ１ｔ６）；配列番号６９（ＨＥＲ１ｔ７）；配列番号７３（ＨＥＲ１ｔ８）；配列番号７７（ＨＥＲ１ｔ９）；配列番号８１（ＨＥＲ１ｔ１０）；および配列番号８５（ＨＥＲ１ｔ１１）からなるリストから選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＥＲ１ｔポリペプチドを含みうる。
【０１４４】
一部の実施形態では、ポリペプチド構築物は、シグナルペプチド、ＨＥＲ１ｔポリペプチドまたはＨＥＲ１ｔポリペプチドを含むキメラポリペプチドを含む細胞表面ポリペプチド、膜貫通二量体化ドメインを含む膜貫通ドメイン、および膜貫通ドメインと、細胞表面ポリペプチドとを接続するリンカーを含みうる。例えば、ポリペプチド構築物は、Ｉｇカッパシグナルペプチド、ＨＥＲ１の特定のトランケート型変異体、リンカー（例えば、（Ｇ４Ｓ）４（配列番号２２））、および膜貫通二量体化ドメイン（例えば、グリコホリンＡのＩ９２〜Ｉ１１４またはＣＤ３ゼータに由来する膜貫通ドメインを含む）を含みうる。複数の実施形態では、ＨＥＲ１ｔポリペプチドと、膜貫通二量体化ドメインとを含むポリペプチド構築物は、配列番号７０（グリコホリンＡ；ＨＥＲ１ｔ８）；配列番号７４（グリコホリンＡ；ＨＥＲ１ｔ９）；配列番号７８（グリコホリンＡ；ＨＥＲ１ｔ１０）；および配列番号８２（ＣＤ３ゼータ；ＨＥＲ１ｔ１１）からなるリストから選択されるヌクレオチド配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる。複数の実施形態では、ＨＥＲ１ｔポリペプチドと、膜貫通二量体化ドメインとを含むポリペプチド構築物は、配列番号７１（グリコホリンＡ；ＨＥＲ１ｔ８）；配列番号７５（グリコホリンＡ；ＨＥＲ１ｔ９）；配列番号７９（グリコホリンＡ；ＨＥＲ１ｔ１０）；および配列番号８３（ＣＤ３ゼータ；ＨＥＲ１ｔ１１）からなるリストから選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１４５】
別の実施形態では、ポリペプチド構築物は、ＨＥＲ２膜貫通ドメインへと連結された、ＨＥＲ１ｔ−ＨＥＲ２ｔキメラを含む、細胞表面ポリペプチドを含みうる。トランケート型ＨＥＲ１ｔ−ＨＥＲ２ｔキメラおよび膜貫通ドメインを、ポリペプチド構築物を、細胞表面へと方向付ける、シグナルペプチド（例えば、ＧＭＣＳＦＲα）へとさらに接続することができる。ある実施形態では、ポリペプチド構築物は、配列番号８６および配列番号９０（デルタ１６）からなるリストから選択されるヌクレオチド配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる。ある実施形態では、ポリペプチド構築物は、配列番号８７および配列番号９１（デルタ１６）からなるリストから選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【０１４６】
別の例では、ポリペプチド構築物は、ＥｒｂＢ３膜貫通ドメインへと連結された、ＨＥＲ１ｔ−ＥｒｂＢ３ｔキメラを含む、細胞表面ポリペプチドを含みうる。ある実施形態では、ＨＥＲ１ｔ−ＥｒｂＢ３ｔキメラおよび膜貫通ドメインを、ポリペプチド構築物を、細胞表面へと方向付ける、シグナルペプチド（例えば、ＧＭＣＳＦＲα）へとさらに接続する。ある実施形態では、ポリペプチド構築物は、配列番号９４のヌクレオチド配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる。ある実施形態では、ポリペプチド構築物は、配列番号９５のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【０１４７】
さらに別の例では、ポリペプチド構築物は、ＥｒｂＢ４膜貫通ドメインへと連結された、ＨＥＲ１ｔ−ＥｒｂＢ４ｔキメラを含む、細胞表面ポリペプチドを含みうる。ある実施形態では、ＨＥＲ１ｔ−ＥｒｂＢ４ｔキメラおよび膜貫通ドメインを、ポリペプチド構築物を、細胞表面へと方向付ける、シグナルペプチド（例えば、ＧＭＣＳＦＲα）へとさらに接続する。ある実施形態では、ポリペプチド構築物は、配列番号９８（ＪＭ−ａ変異体）および配列番号１０２（ＪＭ−ｂ変異体）からなるリストから選択されるヌクレオチド配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる。ある実施形態では、ポリペプチド構築物は、配列番号９９（ＪＭ−ａ変異体）および配列番号１０３（ＪＭ−ｂ変異体）からなるリストから選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【０１４８】
ＨＥＲ１ｔポリペプチドを含むポリペプチド構築物は、ポリペプチド構築物を、細胞表面へと方向付けることが可能な、任意のシグナルペプチドを含みうる。例えば、ＨＥＲ１ｔポリペプチドを含む細胞表面ポリペプチド（例えば、配列番号２００、配列番号２１０、配列番号２１１、配列番号２１２、配列番号２１３、配列番号２１４、配列番号２１５、配列番号２１６および配列番号２１７からなるリストから選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む）を、配列番号２（ＧＭＣＳＦＲα）、配列番号４（Ｉｇカッパ）、配列番号６（免疫グロブリンＥ）、配列番号８（ＣＤ８α）、配列番号１０（ＴＶＢ２）、配列番号１２（ＣＤ５２）、または配列番号１４（ＬＮＦＧＲ）からなるリストから選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むシグナルペプチドと融合させることができる。
【０１４９】
ＨＥＲ１ｔポリペプチドを含むポリペプチド構築物は、二量体化ドメインを含まない膜貫通ドメインを含む、任意の膜貫通ドメインを含みうる。例えば、ＨＥＲ１ｔポリペプチドを含む細胞表面ポリペプチド（例えば、配列番号２００、配列番号２１０、配列番号２１１、配列番号２１２、配列番号２１３、配列番号２１４、配列番号２１５、配列番号２１６および配列番号２１７からなるリストから選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む）は、配列番号２６（グリコホリンＡ  Ｅ９１〜Ｒ１１６）、配列番号２８（グリコホリンＡ  Ｉ９２〜Ｉ１１４）、配列番号３０（グリコホリンＡ（Ｉ９２〜Ｌ１０９）．インテグリンβ３（Ａ７３７〜Ｗ７４１）、配列番号３２（ＣＤ３ゼータ鎖）、配列番号３４（ＣＤ８α）、配列番号３６（ＣＤ２８）、配列番号３８（ＣＴＬＡ４）および配列番号４０（ＬＮＧＦＲ）からなるリストから選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を含む膜貫通ドメインへと連結することができる。
【０１５０】
ＨＥＲ１ｔポリペプチドを含むポリペプチド構築物は、任意のペプチドリンカーを含みうる（または、一部の実施形態では、ペプチドリンカーを含みえない）。例えば、ＨＥＲ１ｔを含む細胞表面ポリペプチド（例えば、配列番号２００、配列番号２１０、配列番号２１１、配列番号２１２、配列番号２１３、配列番号２１４、配列番号２１５、配列番号２１６および配列番号２１７からなるリストから選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む）を、配列番号１６（ＧＳＧ）、配列番号１８（ＳＧＳＧ）、配列番号２０（（Ｇ４Ｓ）３）、配列番号２２（（Ｇ４Ｓ）４）および配列番号２４（ホイットロー）からなるリストから選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドリンカーと融合させることができる。
【０１５１】
細胞表面ポリペプチドには、トランケート型ＣＤポリペプチドを組み込みうる。例えば、細胞表面ポリペプチドは、トランケート型ＣＤ２０ポリペプチド（本明細書では、ＣＤ２０ｔと称する）を含みうる。天然ＣＤ２０ポリペプチドは、４回膜貫通ドメインサブファミリーＡメンバー１（ＭＳ４Ａ１）遺伝子によりコードされる、複数回膜貫通型膜貫通タンパク質である。ある特定の実施形態では、全長ＣＤ２０は、配列番号１０６のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、全長ＣＤ２０アミノ酸配列は、配列番号１０７のアミノ酸配列に対応しうる。一部の実施形態では、ＣＤ２０は、アミノ酸５７〜７８、８５〜１０５、１２１〜１４１、および１８９〜２０９を包含する、４つの膜貫通ドメイン膜貫通部分を含む。一部の実施形態では、ＣＤ２０は、アミノ酸７９〜８４および１４２〜１８８を包含する、２つの細胞外ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＤ２０は、アミノ酸１〜５６、１０６〜１２０、および２１０〜２９７を包含する、３つの細胞質ドメインを含む。
【０１５２】
本明細書では、内因性ＣＤ２０の、任意のアミノ酸、ドメイン、または断片がトランケートされたＣＤ２０ポリペプチドを含むポリペプチド構築物が提示される。本明細書では、ＣＤ２０ポリペプチドは、ＣＤ２０ｔポリペプチドを含みうる。一部の実施形態では、ＣＤ２０ポリペプチドは、ＣＤ２０ｔポリペプチドからなるか、またはこれから本質的になる。他の実施形態では、ＣＤ２０ポリペプチドは、別のＣＤ２０ドメインまたはその部分（例えば、ＣＤ２０膜貫通ドメインおよび／または細胞質ドメイン）に加えて、ＣＤ２０ｔポリペプチドを含みうる。例えば、ＣＤ２０ポリペプチドは、細胞内細胞質（例えば、シグナル伝達）ドメインもしくはその部分、膜貫通（例えば、ヘリックス）ドメインもしくはその部分、および／または細胞外ドメインもしくはその部分をトランケートすることができる。一部の実施形態では、ＣＤ２０ポリペプチドは、野生型ポリペプチドと比べて、複数のドメインまたはドメインの複数の部分を逸失している場合がある。ある実施形態では、ＣＤ２０ポリペプチドは、内因性ＣＤ２０のＭ１〜Ｅ２６３（配列番号１０９；ＣＤ２０ｔ１）、内因性ＣＤ２０のＭ１１７〜Ｎ２１４（配列番号１１１（ＣＤ２０ｔ２）、内因性ＣＤ２０のＭ１〜Ｎ２１４（配列番号１１５；ＣＤ２０ｔ４）、内因性ＣＤ２０のＶ８２〜Ｎ２１４（配列番号１１７；ＣＤ２０ｔ５）、または内因性ＣＤ２０のＶ８２〜Ｉ１８６（配列番号１１９、ＣＤ２０ｔ６）を含む。
【０１５３】
ある実施形態では、ＣＤ２０ｔポリペプチドは、細胞外ドメインまたはその断片を含みうる。ある実施形態では、ＣＤ２０ｔポリペプチドは、配列番号２１８、配列番号２１９、および配列番号２２０からなるリストから選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有する。一部の実施形態では、ＣＤ２０ｔポリペプチドは、膜貫通ドメインまたはその断片へと連結することができる。ある実施形態では、ポリペプチド構築物は、ＣＤ２０膜貫通ドメインへと連結されたＣＤ２０ｔポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＣＤ２０膜貫通ドメインへと連結されたＣＤ２０ｔポリペプチドを含むポリペプチド構築物は、配列番号１０８（Ｍ１〜Ｅ２６３をコードするＣＤ２０ｔ１）；配列番号１１０（Ｍ１１７〜Ｎ２１４をコードするＣＤ２０ｔ２）；配列番号１１４（Ｍ１〜Ｎ２１４をコードするＣＤ２０ｔ４）；配列番号１１６（Ｖ８２〜Ｎ２１４をコードするＣＤ２０ｔ５）；配列番号１１８（Ｖ８２〜Ｉ１８６をコードするＣＤ２０ｔ６）；配列番号１３２（Ｍ１〜Ａ５４およびＣ１１１〜Ｐ２９７をコードするＣＤ２０ｔ１３）；配列番号１３４（Ｍ１〜Ａ５４およびＣ１１１〜Ｅ２８１をコードするＣＤ２０ｔ１４）；配列番号１３６（Ｍ１〜Ａ５４およびＣ１１１〜Ｅ２６３をコードするＣＤ２０ｔ１５）；配列番号１３８（Ｍ１〜Ａ５４およびＣ１１１〜Ｖ２２８をコードするＣＤ２０ｔ１６）；および配列番号１４０（Ｍ１〜Ｖ８およびＣ１１１〜Ｐ２９７をコードするＣＤ２０ｔ１７）からなるリストから選択されるヌクレオチド配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる。ある実施形態では、ＣＤ２０膜貫通ドメインへと連結されたＣＤ２０ｔポリペプチドを含むポリペプチド構築物は、配列番号１０９（ＣＤ２０ｔ１：Ｍ１〜Ｅ２６３）；配列番号１１１（ＣＤ２０ｔ２：Ｍ１１７〜Ｎ２１４）；配列番号１１５（ＣＤ２０ｔ４：Ｍ１〜Ｎ２１４）；配列番号１１７（ＣＤ２０ｔ５：Ｖ８２〜Ｎ２１４）；配列番号１１９（ＣＤ２０ｔ６：Ｖ８２〜Ｉ１８６）；配列番号１３３（ＣＤ２０ｔ１３：Ｍ１〜Ａ５４およびＣ１１１〜Ｐ２９７）；配列番号１３５（ＣＤ２０ｔ１４：Ｍ１〜Ａ５４およびＣ１１１〜Ｅ２８１）；配列番号１３７（ＣＤ２０ｔ１５：Ｍ１〜Ａ５４およびＣ１１１〜Ｅ２６３）；配列番号１３９（ＣＤ２０ｔ１６：Ｍ１〜Ａ５４およびＣ１１１〜Ｖ２２８）；および配列番号１４１（ＣＤ２０ｔ１７：Ｍ１〜Ｖ８およびＣ１１１〜Ｐ２９７）からなるリストから選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含みうる。
【０１５４】
一部の実施形態では、ＣＤ２０ｔポリペプチドは、Philip et al., (2014), “A highly compact epitope-based marker/suicide gene for easier and safer T-cell therapy,” Blood: 124: 1277-1287において記載されている通り、内因性ＣＤ２０のリツキシマブ結合性ミモトープの、少なくとも１つのコピーを保持しうる。一部の実施形態では、ＣＤ２０ｔの、１または複数コピーのリツキシマブ結合性エピトープを、抗ＣＤ３４モノクローナル抗体の結合を容易とする、ＣＤ３４の、アミノ末端の４０アミノ酸など、１または複数のＣＤ３４由来のアミノ酸配列と融合させることができる。一部の実施形態では、ＣＤ２０ｔポリペプチドは、除去された複数のドメイン、または除去された複数のドメインの部分を有しうる。
【０１５５】
ＣＤ２０ｔポリペプチドを組み込んだ細胞表面ポリペプチドは、外因的に導入された抗体または結合パートナーにより認識されうるエピトープを含みうる。例えば、細胞表面ポリペプチド内に含まれるＣＤ２０ｔポリペプチドには、本明細書で記載されるポリペプチド構築物を発現する細胞の、ターゲティングされた枯渇（例えば、ＣＤＣおよび／または抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性ＡＤＣＣを介する）を容易とするために、リツキシマブ結合性ドメインを組み込みうる。ＣＤ２０ｔポリペプチドを含む細胞表面ポリペプチドのエピトープに結合しうるように使用される抗体の非限定的な例は、リツキシマブ、ｈＯＵＢＭ３／６、アフツズマブ、ブロンツベトマブ、オビヌツズマブ、イブリツモマブチウキセタン、トシツモマブ、オファツムマブ、オカラツズマブ、オクレリズマブ、ＴＲＵ−０１５（Ｔｒｕｂｉｏｎ）、およびベルツズマブ（ＩＭＭＵ−１０６）を含む。多様な実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、ダイアボディー、またはラクダ科動物抗体でありうる。他の実施形態では、抗体を、薬物または毒素へとコンジュゲートさせることができる。一部の実施形態では、ＣＤ２０ｔポリペプチドは、内因性ＣＤ２０の細胞外ドメイン内で見出されるエピトープを含む。一部の実施形態では、ＣＤ２０ｔポリペプチドのエピトープは、内因性ＣＤ２０のアミノ酸１７０〜１８５を含む。一部の実施形態では、ＣＤ２０ｔポリペプチドのエピトープは、内因性ＣＤ２０のアミノ酸１７０〜１７３および１８２〜１８５を含む。
【０１５６】
さらなる実施形態では、ＣＤ２０ｔポリペプチドを含む細胞表面ポリペプチドは、１または複数のさらなるポリペプチドのトランケート型変異体についてキメラである。例えば、キメラ細胞表面ポリペプチドは、ＣＤ２０ｔポリペプチドと、トランケート型ＣＤ８α（ＣＤ８αｔ）ポリペプチドとを含みうる。
【０１５７】
細胞表面ポリペプチドは、複数のＣＤ２０ｔ連結配列を、コンカタマーとして、併せてさらに含みうる。例えば、細胞表面ポリペプチドは、連続で繰り返される、同じＣＤ２０ｔアミノ酸配列を含む場合もあり、併せて接続された、異なるＣＤ２０ｔ変異体を含む場合もある。一部の実施形態では、ＣＤ２０ｔアミノ酸配列を、細胞表面ポリペプチド内で、ペプチドリンカーにより併せて連結する。ある実施形態では、ＳＧＳリンカーまたはＳＧ４Ｓリンカー（配列番号２２３）を使用して、ＳＧ４Ｓリンカー（配列番号２２３）により、ＣＤ２８膜貫通ドメインへと連結された細胞表面ポリペプチドをさらに含む、細胞表面ポリペプチド内の、反復するＣＤ２０アミノ酸配列を、併せて連結することができる（例えば、配列番号１２３（ＳＧＳリンカー）および配列番号１２９（ＳＧ４Ｓリンカー（配列番号２２３）を参照されたい）。
【０１５８】
本明細書で記載されるポリペプチド構築物は、シグナルペプチドと、ＣＤ２０ｔポリペプチド（例えば、ＣＤ２０ｔのみを含むか、またはＣＤ２０ｔキメラポリペプチド）を含む細胞表面ポリペプチドと、膜貫通ドメインと、任意選択で、リンカーとの任意の組合せを含みうる。例えば、ポリペプチド構築物は、ＣＤ２０ｔポリペプチドを含む細胞表面ポリペプチドを、膜貫通ドメインへと接続するか、または融合させるＳＧ４Ｓリンカー（配列番号２２３）を含みうる。ある特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２０、ＣＤ２８、またはＣＤ８αに由来する膜貫通ドメインまたはその断片に由来するか、またはこれと相同である。ある実施形態では、ＣＤ２０ｔを含むポリペプチド構築物は、配列番号１１２（ＣＤ２０ｔ（Ｋ１４２〜Ｓ１８８）およびＣＤ８α（Ｉ１８３〜Ｔ２０３）膜貫通ドメインをコードするＣＤ２０ｔ３）；配列番号１２０（ＣＤ２０ｔ（Ｐ１６０〜Ｑ１８７）、ＳＧ４Ｓリンカー（配列番号２２３）、およびＣＤ２８（Ｉ９６〜Ｄ１７２）膜貫通ドメインをコードするＣＤ２０ｔ７）；配列番号１２２（ＣＤ２０ｔコンカタマー（ＳＧＳリンカーにより隔てられたＰ１６０〜Ｑ１８７）、ＳＧ４Ｓリンカー（配列番号２２３）、およびＣＤ２８（Ｉ９６〜Ｄ１７２）膜貫通ドメインをコードするＣＤ２０ｔ８）；配列番号１２４（ＣＤ２０ｔ（Ｐ１６０〜Ｑ１８７）、ＳＧ４Ｓリンカー（配列番号２２３）、およびＣＤ８α（Ｐ１２０〜Ｖ２０１）膜貫通ドメインをコードするＣＤ２０ｔ９）；配列番号１２６（ＣＤ２０ｔ（Ｃ１６７〜Ｃ１８３）、ＳＧ４Ｓリンカー（配列番号２２３）、およびＣＤ２８（Ｉ９６〜Ｄ１７２）膜貫通ドメインをコードするＣＤ２０ｔ１０；配列番号１２８（ＣＤ２０コンカタマー（ＳＧ４Ｓリンカー（配列番号２２３）により隔てられたＣ１６７〜Ｃ１８３）、ＳＧ４Ｓリンカー（配列番号２２３）、およびＣＤ２８（Ｉ９６〜Ｄ１７２）膜貫通ドメインをコードするＣＤ２０ｔ１１）；および配列番号１３０（ＣＤ２０ｔ（Ｃ１６７〜Ｃ１８３）、ＳＧ４Ｓリンカー（配列番号２２３）、およびＣＤ８α（Ｐ１２０〜Ｖ２０１）膜貫通ドメインをコードするＣＤ２０ｔ１２）からなるリストから選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる。ある実施形態では、ＣＤ２０ｔを含むポリペプチド構築物は、配列番号１１３（ＣＤ２０ｔ３；ＣＤ２０ｔ（Ｋ１４２〜Ｓ１８８）およびＣＤ８α（Ｉ１８３〜Ｔ２０３）膜貫通ドメイン）；配列番号１２１（ＣＤ２０ｔ（Ｐ１６０〜Ｑ１８７）、ＳＧ４Ｓリンカー（配列番号２２３）、およびＣＤ２８（Ｉ９６〜Ｄ１７２）膜貫通ドメインをコードするＣＤ２０ｔ７）；配列番号１２３（ＣＤ２０ｔコンカタマー（ＳＧＳリンカーにより隔てられたＰ１６０〜Ｑ１８７）、ＳＧ４Ｓリンカー（配列番号２２３）、およびＣＤ２８（Ｉ９６〜Ｄ１７２）膜貫通ドメインをコードするＣＤ２０ｔ８）；配列番号１２５（ＣＤ２０ｔ（Ｐ１６０〜Ｑ１８７）、ＳＧ４Ｓリンカー（配列番号２２３）、およびＣＤ８α（Ｐ１２０〜Ｖ２０１）膜貫通ドメインをコードするＣＤ２０ｔ９）；配列番号１２７（ＣＤ２０ｔ（Ｃ１６７〜Ｃ１８３）、ＳＧ４Ｓリンカー（配列番号２２３）、およびＣＤ２８（Ｉ９６〜Ｄ１７２）膜貫通ドメインをコードするＣＤ２０ｔ１０）；配列番号１２９（ＣＤ２０コンカタマー（ＳＧ４Ｓリンカー（配列番号２２３）により隔てられたＣ１６７〜Ｃ１８３）、ＳＧ４Ｓリンカー（配列番号２２３）、およびＣＤ２８（Ｉ９６〜Ｄ１７２）膜貫通ドメインをコードするＣＤ２０ｔ１１）；および配列番号１３１（ＣＤ２０ｔ（Ｃ１６７〜Ｃ１８３）、ＳＧ４Ｓリンカー（配列番号２２３）、およびＣＤ８α（Ｐ１２０〜Ｖ２０１）膜貫通ドメインをコードするＣＤ２０ｔ１２）からなるリストから選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１５９】
ＣＤ２０ｔポリペプチドを含むポリペプチド構築物は、ポリペプチド構築物を、細胞表面へと方向付けることが可能な、任意のシグナルペプチドを含みうる。例えば、ＣＤ２０ｔポリペプチドを含むポリペプチド構築物（例えば、配列番号２１８、配列番号２１９、および配列番号２２０からなるリストから選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド）を、配列番号２（ＧＭＣＳＦＲα）、配列番号４（ＩＧカッパ）、配列番号６（免疫グロブリンＥ）、配列番号８（ＣＤ８α）、配列番号１０（ＴＶＢ２）、配列番号１２（ＣＤ５２）、または配列番号１４（ＬＮＦＧＲ）からなるリストから選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むシグナルペプチドと融合させることができる。
【０１６０】
ＣＤ２０ｔポリペプチドを含むポリペプチド構築物は、二量体化ドメインを含むか、または二量体化ドメインを含まない膜貫通ドメインを含む、任意の膜貫通ドメインを含みうる。例えば、ＣＤ２０ｔポリペプチドを含むポリペプチド構築物（例えば、配列番号２１８、配列番号２１９、および配列番号２２０からなるリストから選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド）を、配列番号２６（グリコホリンＡ  Ｅ９１〜Ｒ１１６）、配列番号２８（グリコホリンＡ  Ｉ９２〜Ｉ１１４）、配列番号３０（グリコホリンＡ  （Ｉ９２〜Ｌ１０９）．インテグリンβ３（Ａ７３７〜Ｗ７４１）、配列番号３２（ＣＤ３ゼータ鎖）、配列番号３４（ＣＤ８α）、配列番号３６（ＣＤ２８）、配列番号３８（ＣＴＬＡ４）および配列番号４０（ＬＮＧＦＲ）からなるリストから選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む膜貫通ドメインと融合させることができる。ＣＤ２０ｔを含むポリペプチド構築物は、ＣＤ２８および／またはＣＤ８αに由来するか、またはこれと相同な膜貫通ドメインをさらに含みうる。
【０１６１】
ＣＤ２０ｔポリペプチドを含むポリペプチド構築物は、任意のペプチドリンカーを含みうる（または、一部の実施形態では、ペプチドリンカーを含みえない）。例えば、ＣＤ２０ｔポリペプチドを含むポリペプチド構築物（例えば、配列番号２１８、配列番号２１９、および配列番号２２０からなるリストから選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド）を、配列番号１６（ＧＳＧ）、配列番号１８（ＳＧＳＧ）、配列番号２０（（Ｇ４Ｓ）３）、配列番号２２（（Ｇ４Ｓ）４）および配列番号２４（ホイットロー）からなるリストから選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドリンカーと融合させることができる。
【０１６２】
トランケートされ、本明細書で記載される細胞タグへと組み込まれうるＣＤポリペプチドの別の例は、ＣＤ５２である。ＣＤ５２は、そのＣ末端において、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーへと連結された、１２アミノ酸のペプチドとして、ヒトにおいて内因的に生じる。一部の実施形態では、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）を使用して、本明細書で記載されるポリペプチドを、細胞表面へとアンカリングすることができる。
【０１６３】
本明細書では、内因性ＣＤ５２の、任意のアミノ酸、ドメイン、または断片がトランケートされたＣＤ５２ポリペプチドを含むポリペプチド構築物が提示される。本明細書では、ＣＤ５２ポリペプチドは、トランケート型ＣＤ５２（ＣＤ５２ｔ）ポリペプチドを含みうる。一部の実施形態では、ＣＤ５２ポリペプチドは、ＣＤ５２ｔポリペプチドを含む細胞表面ポリペプチドからなるか、またはこれらから本質的になる。他の実施形態では、ＣＤ５２ポリペプチドは、他のＣＤ５２ドメイン（例えば、ＣＤ５２シグナルペプチド）に加えて、ＣＤ５２ｔポリペプチドを含む、細胞表面ポリペプチドを含みうる。
【０１６４】
本明細書では、トランケート型ＣＤ５２ｔポリペプチドを含む、細胞表面ポリペプチドを含むポリペプチド構築物が提示される。一部の実施形態では、トランケート型変異体を、細胞表面へと方向付けるために、ＣＤ５２シグナルペプチドを、ＣＤ５２ｔポリペプチドへと連結する。一部の実施形態では、ＣＤ５２ｔポリペプチドを含む細胞表面ポリペプチドには、外因的に導入された抗体または結合パートナーにより認識されうる、１または複数のエピトープを組み込みうる。例えば、ＣＤ５２ｔポリペプチドには、１または複数のアレムツズマブ結合性ドメインを組み込み、これにより、本明細書で記載されるポリペプチド構築物を発現する細胞の、ターゲティングされた枯渇が容易となりうる。一部の実施形態では、ターゲティングされた枯渇は、アレムツズマブにより媒介されたＣＤＣおよび／もしくＡＤＣＣ、またはアレムツズマブによる認識の細胞傷害性効果を媒介する、別の細胞機構から生じうる。ＣＤ５２ｔポリペプチドを含む細胞表面ポリペプチドを認識しうる、抗ＣＤ５２分子の非限定的な例は、アレムツズマブ、ＡＮＴ１０３４、ＨＩ１８６（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）、ＹＴＨ３４．５（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）、およびＹＴＨ６６．９ＨＬ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を含む。多様な実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、ダイアボディー、またはラクダ科動物抗体でありうる。ある実施形態では、ＣＤ５２エピトープをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１４２のヌクレオチド配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。ある実施形態では、ＣＤ５２エピトープは、配列番号１４３のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有する。
【０１６５】
本明細書で記載されるポリペプチド構築物は、抗体または結合パートナーにより認識されうる、複数のエピトープを有しうる。例えば、ＣＤ５２ｔポリペプチドの場合、ＣＤ５２ｔポリペプチドを含むポリペプチド構築物は、結合パートナー（例えば、アレムツズマブ）に特異的な、複数のエピトープを含みうる。ある実施形態では、ＣＤ５２ｔポリペプチドは、複数コピー（例えば、少なくとも２コピー、少なくとも３コピー、少なくとも４コピー、少なくとも５コピー、少なくとも６コピー、または少なくとも１０コピー）の、配列番号１４３に示されるアミノ酸配列を含む。アミノ酸配列の各コピーまたは各リピートは、ポリペプチド構築物内で、リンカー（例えば、ホイットローリンカー）により隔てることができる。ある実施形態では、ポリペプチド構築物は、膜貫通ドメイン（例えば、ＣＤ２８膜貫通ドメインまたはその断片）へと連結された（例えば、１または複数コピーの（Ｇ４Ｓ）リンカー（配列番号２２１）を介して）、ホイットローリンカーと融合させた、１または複数コピーのＣＤ５２ｔポリペプチドへと連結されたＣＤ５２シグナルペプチドを含む。ある実施形態では、ＣＤ５２ｔポリペプチドを含むポリペプチド構築物は、配列番号１４４（ＣＤ５２ｔ１；１コピーのエピトープ／リンカーをコードする；）、配列番号１４６（ＣＤ５２ｔ２；２コピーのエピトープ／リンカーをコードする）、および配列番号１４８（ＣＤ５２ｔ３；３コピーのエピトープ／リンカーをコードする）からなるリストから選択されるヌクレオチド配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる。ある実施形態では、ＣＤ５２ｔポリペプチドを含むポリペプチドは、配列番号１４５（ＣＤ５２ｔ１；１コピーのエピトープ／リンカーをコードする）、配列番号１４７（ＣＤ５２ｔ２；２コピーのエピトープ／リンカーをコードする）、および配列番号１４９（ＣＤ５２ｔ３；３コピーのエピトープ／リンカーをコードする）からなるリストから選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有する。
【０１６６】
ＣＤ５２ｔポリペプチドを含むポリペプチド構築物は、二量体化ドメインを含むか、または二量体化ドメインを含まない膜貫通ドメインを含む、任意の膜貫通ドメインを含みうる。例えば、ＣＤ５２ｔポリペプチドを含む細胞表面ポリペプチドを、リンカー（例えば、３×ＧＳリンカー（配列番号２２４））を介して、膜貫通二量体化ドメインを含む膜貫通ドメイン（例えば、グリコホリンＡまたはグリコホリンＡ−インテグリンβ３の膜貫通ドメインに由来するか、またはこれと相同な）と融合させることができる。ある実施形態では、ＣＤ５２ｔポリペプチドを含むポリペプチド構築物は、配列番号１５０（ＣＤ５２ｔ４；ＣＤ５２シグナルペプチド、３×ＧＳペプチドリンカー（配列番号２２４）、およびグリコホリンＡ膜貫通ドメイン）、配列番号１５１（ＣＤ５２ｔ５；ＣＤ５２シグナルペプチド、３×ＧＳペプチドリンカー（配列番号２２４）、およびグリコホリンＡ膜貫通ドメイン）、および配列番号１５２（ＣＤ５２ｔ６；ＣＤ５２シグナルペプチド、３×ＧＳリンカー（配列番号２２４）、およびグリコホリンＡ−インテグリンβ３膜貫通ドメイン）からなるリストから選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有する。
【０１６７】
複数の実施形態では、ＣＤ５２ｔポリペプチドを含むポリペプチド構築物（例えば、配列番号１４５、配列番号１４７、および配列番号１４９からなるリストから選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列をもたらすように、ＣＤ５２シグナルペプチドへと連結しうる配列番号１４３）は、配列番号２６（グリコホリンＡ  Ｅ９１〜Ｒ１１６）、配列番号２８（グリコホリンＡ  Ｉ９２〜Ｉ１１４）、配列番号３０（グリコホリンＡ（Ｉ９２〜Ｌ１０９）．インテグリンβ３（Ａ７３７〜Ｗ７４１）、配列番号３２（ＣＤ３ゼータ鎖）、配列番号３４（ＣＤ８α）、配列番号３６（ＣＤ２８）、配列番号３８（ＣＴＬＡ４）および配列番号４０（ＬＮＧＦＲ）からなるリストから選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む膜貫通ドメインへと連結することができる。
【０１６８】
ＣＤ５２ｔポリペプチドを含むポリペプチド構築物は、ポリペプチド構築物を、細胞表面へと方向付けることが可能な、任意のシグナルペプチドを含みうる。ある実施形態では、ＣＤ５２ｔポリペプチドを、ＣＤ５２のシグナルペプチドへと連結する（例えば、ポリペプチド構築物は、配列番号１４５、配列番号１４７、および配列番号１４９からなるリストから選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む）。一部の実施形態では、ポリペプチド構築物は、配列番号２（ＧＭＣＳＦＲα）、配列番号４（ＩＧカッパ）、配列番号６（免疫グロブリンＥ）、配列番号８（ＣＤ８α）、配列番号１０（ＴＶＢ２）、配列番号１２（ＣＤ５２）、または配列番号１４（ＬＮＦＧＲ）からなるリストから選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むシグナルペプチドへと連結されたＣＤ５２ｔポリペプチド（例えば、配列番号１４３）を含む。
【０１６９】
ＣＤ５２ｔポリペプチドを含むポリペプチド構築物は、任意のペプチドリンカーを含みうる（または、一部の実施形態では、ペプチドリンカーを含みえない）。例えば、ＣＤ５２ｔを含む細胞表面ポリペプチド（例えば、配列番号１４３のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む）を、配列番号１６（ＧＳＧ）、配列番号１８（ＳＧＳＧ）、配列番号２０（（Ｇ４Ｓ）３）、配列番号２２（（Ｇ４Ｓ）４）および配列番号２４（ホイットロー）からなるリストから選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドリンカーと融合させることができる。
【０１７０】
他の実施形態では、細胞表面ポリペプチドは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリーに由来するポリペプチドのトランケート形を含みうる。例えば、ＬＮＧＦＲは、タンパク質のシステイン残基の間のジスルフィド結合の形成に部分的に起因して、フォールディングされた構造を呈する細胞外ドメインを有する１回膜貫通型Ｉ型膜貫通糖タンパク質である。ある実施形態では、ＬＮＧＦＲまたはその部分をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１５３、配列番号１５５（ＬＮＧＦＲ細胞外ドメインのＫ２９〜Ｎ２５０をコードする）、配列番号１５７（ジスルフィド結合を形成することが可能な、システイン残基２、３、４を含むＥ６５〜Ｎ２５０をコードする）、および配列番号１５９（ジスルフィド結合を形成することが可能な、システイン残基３、４を含むＲ１０８〜Ｎ２５０をコードする）からなるリストから選択されるヌクレオチド配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。ある実施形態では、ＬＮＧＦＲは、配列番号１５４、配列番号１５６（ＬＮＧＦＲ細胞外ドメインのＫ２９〜Ｎ２５０を含む）、配列番号１５８（ジスルフィド結合を形成することが可能な、システイン残基２、３、４を含むＥ６５〜Ｎ２５０を含む）、および配列番号１６０（ジスルフィド結合を形成することが可能な、システイン残基３、４を含むＲ１０８〜Ｎ２５０を含む）からなるリストから選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有する。
【０１７１】
本明細書では、内因性ＬＮＧＦＲの、任意のアミノ酸、ドメイン、または断片がトランケートされたＬＮＧＦＲポリペプチドを含むポリペプチド構築物が提示される。本明細書では、ＬＮＧＦＲポリペプチドは、ＬＮＧＦＲｔポリペプチドを含みうる。一部の実施形態では、ＬＮＧＦＲポリペプチドは、ＬＮＧＦＲｔポリペプチドを含む細胞表面ポリペプチドからなるか、またはこれらから本質的になる。他の実施形態では、ＬＮＧＦＲポリペプチドは、他のＬＮＧＦＲドメイン（例えば、ＬＮＧＦＲ膜貫通ドメイン）に加えて、ＬＮＧＦＲｔポリペプチドを含む、細胞表面ポリペプチドを含みうる。
【０１７２】
ポリペプチド構築物は、野生型タンパク質と比べて、任意のドメインまたはその断片をトランケートされた、トランケート型ＬＮＧＦＲ（本明細書にＬＮＧＦＲｔ）ポリペプチドを含みうる。例えば、ＬＮＧＦＲｔポリペプチドは、膜貫通ドメインもしくはその部分、細胞内ドメインもしくはその部分、または細胞外ドメインもしくはその部分のうちの１または複数をトランケートすることができる。一部の実施形態では、ＬＮＧＦＲｔポリペプチドは、そのリガンド（例えば、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴＦ３、およびＮＴＦ４）のための天然結合ドメインを形成する、１または複数のＴＮＦＲ−Ｃｙｓリピートをトランケートすることができる。ある実施形態では、ポリペプチド構築物は、全細胞外ドメイン（配列番号１５６）を含むＬＮＧＦＲｔポリペプチドを含む。ある実施形態では、ＬＮＧＦＲｔポリペプチドを含むポリペプチド構築物を、ＬＮＧＦＲ膜貫通ドメインと融合させる。ある実施形態では、ＬＮＧＦＲ膜貫通ドメインへと連結された、ＬＮＧＦＲｔポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１６１のヌクレオチド配列（ＬＮＧＦＲｔ１）に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。ある実施形態では、ＬＮＧＦＲ膜貫通ドメインへと連結された、ＬＮＧＦＲｔポリペプチドは、配列番号１６２のアミノ酸配列（ＬＮＧＦＲｔ１）に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有する。
【０１７３】
ＬＮＧＦＲｔポリペプチドを含むポリペプチド構築物は、二量体化ドメインを含むか、または二量体化ドメインを含まない膜貫通ドメインを含む、任意の膜貫通ドメインを含みうる。例えば、ポリペプチド構築物は、ＬＮＧＦＲ膜貫通ドメインまたはその断片へと連結されたＬＮＧＦＲｔポリペプチドを含みうる。他の実施形態では、ＬＮＧＦＲｔポリペプチドを、二量体化が可能な膜貫通ドメインを含む、異なるポリペプチドに由来する膜貫通ドメインまたはその断片と（例えば、リンカーを介して）融合させることができる。ある実施形態では、ＬＮＧＦＲｔポリペプチドを含むポリペプチド構築物は、配列番号１６３（ＬＮＧＦＲｔ２；全ＬＮＧＦＲ細胞外ドメイン；ＧＳリンカーおよびＣＤ２８膜貫通ドメイン）；配列番号１６４（ＬＮＧＦＲｔ３；システイン残基２〜４、ＧＳペプチドリンカー、およびＣＤ２８膜貫通ドメインを含む、ＬＮＧＦＲ細胞外ドメインの断片）、配列番号１６５（ＬＮＧＦＲｔ３；システイン残基３〜４、ＧＳペプチドリンカー、およびＣＤ２８膜貫通ドメインを含む、ＬＮＧＦＲ細胞外ドメインの断片）；配列番号１６６（ＬＮＧＦＲｔ５；システイン残基３〜４、ＧＳリンカー、およびグリコホリンＡ膜貫通ドメインを含む、ＬＮＧＦＲ細胞外ドメインの断片）、配列番号１６７（ＬＮＧＦＲｔ６；システイン残基３〜４、ＧＳリンカー、およびグリコホリンＡ膜貫通ドメインを含む、ＬＮＧＦＲ細胞外ドメインの断片）；および配列番号１６８（ＬＮＧＦＲｔ７；システイン残基３〜４、ＧＳリンカー、およびグリコホリンＡ−インテグリンβ３膜貫通ドメインを含む、ＬＮＧＦＲ細胞外ドメインの断片）からなるリストから選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有する。
【０１７４】
一部の実施形態では、ＬＮＧＦＲｔポリペプチドを含むポリペプチド構築物を、配列番号２６（グリコホリンＡ  Ｅ９１〜Ｒ１１６）、配列番号２８（グリコホリンＡ  Ｉ９２〜Ｉ１１４）、配列番号３０（グリコホリンＡ（Ｉ９２〜Ｌ１０９）．インテグリンβ３（Ａ７３７〜Ｗ７４１）、配列番号３２（ＣＤ３ゼータ鎖）、配列番号３４（ＣＤ８α）、配列番号３６（ＣＤ２８）、配列番号３８（ＣＴＬＡ４）、および配列番号４０（ＬＮＧＦＲ）からなるリストから選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む膜貫通ドメインと融合させることができる。
【０１７５】
ＬＮＧＦＲｔポリペプチドを含むポリペプチド構築物は、ポリペプチド構築物を、細胞表面へと方向付けることが可能な、任意のシグナルペプチドを含みうる。例えば、ＬＮＧＦＲｔポリペプチドを含む細胞表面ポリペプチドを、配列番号２（ＧＭＣＳＦＲα）、配列番号４（ＩＧカッパ）、配列番号６（免疫グロブリンＥ）、配列番号８（ＣＤ８α）、配列番号１０（ＴＶＢ２）、配列番号１２（ＣＤ５２）、または配列番号１４（ＬＮＦＧＲ）からなるリストから選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むシグナルペプチドと融合させることができる。
【０１７６】
ＬＮＧＦＲｔポリペプチドを含むポリペプチド構築物は、任意のペプチドリンカーを含みうる（または、一部の実施形態では、ペプチドリンカーを含みえない）。例えば、ＬＮＧＦＲｔポリペプチドを含む細胞表面ポリペプチドを、配列番号１６（ＧＳＧ）、配列番号１８（ＳＧＳＧ）、配列番号２０（（Ｇ４Ｓ）３）、配列番号２２（（Ｇ４Ｓ）４）、および配列番号２４（ホイットロー）からなるリストから選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドリンカーと融合させることができる。
【０１７７】
ポリヌクレオチド構築物
ベクター
本明細書で記載されるポリペプチド構築物は、ベクターを介して、操作細胞へと組み込まれた、１または複数のポリヌクレオチドによりコードされうる。本明細書では、「発現ベクター」または「ベクター」とは、細胞内のポリヌクレオチドの複製の自律的単位として挙動する（すなわち、それ自身の制御下における複製が可能である）か、または宿主細胞の染色体への挿入により複製が可能となる、任意の遺伝子エレメント、例えば、プラスミド、染色体、ウイルス、トランスポゾンであって、接合させたセグメントの複製および／または発現をもたらすように、それへと、別のポリヌクレオチドセグメントを接合させた遺伝子エレメントである。適切なベクターは、プラスミド、トランスポゾン、バクテリオファージ、およびコスミドを含むがこれらに限定されない。ベクターは、所望の宿主細胞中へのベクターのライゲーションまたは挿入を実施し、接合させたセグメントの発現を実施するのに必要なポリヌクレオチド配列を含有しうる。このような配列は、宿主生物に応じて異なり、転写を実施するプロモーター配列、転写を増加させるエンハンサー配列、リボソーム結合性部位の配列、および転写翻訳終結配列を含む。代替的に、発現ベクターは、ベクターの、宿主細胞のＤＮＡ配列へのライゲーションまたは組込みを伴わずに、その中でコードされる核酸配列の産物を、直接発現させることが可能でありうる。
【０１７８】
ベクターはまた、「選択用マーカー遺伝子」も含みうる。本明細書で使用される「選択用マーカー遺伝子」という用語は、核酸配列を発現する細胞を、対応する選択用薬剤の存在下で、これと順方向または逆方向に、特異的に選択することを可能とする核酸配列を指す。当技術分野では、適切な選択用マーカー遺伝子が公知であり、例えば、国際特許出願公開第１９９２／０８７９６号パンフレットおよび同第１９９４／２８１４３号パンフレット、Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 3567 (1980)、O’Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 1527 (1981)、Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 2072 (1981)、Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol., 150:1 (1981)、Santerre et al., Gene, 30: 147 (1984)、Kent et al., Science, 237: 901-903 (1987)、Wigler et al., Cell, 11: 223 (1977)、Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48: 2026 (1962)、Lowy et al., Cell, 22: 817 (1980)、ならびに米国特許第５，１２２，４６４号明細書および同第５，７７０，３５９号明細書において記載されている。
【０１７９】
一部の実施形態では、ベクターは、宿主細胞内で複製することが可能であり、適切な選択的圧の存在下で、宿主細胞内のＤＮＡの染色体外セグメントとして存続する、「エピソーム発現ベクター」または「エピソーム」である（例えば、Conese et al., Gene Therapy, 11:1735-1742 (2004)を参照されたい）。代表的な、市販のエピソーム発現ベクターは、エプスタイン−バー核抗原１（ＥＢＮＡ１）およびエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）複製起点（ｏｒｉＰ）を用いるエピソームプラスミドを含むがこれらに限定されない。ベクターである、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４、ｐＲＥＰ７、ならびにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）製のｐｃＤＮＡ３．１およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（ＬａＪｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）製のｐＢＫ−ＣＭＶは、ＥＢＮＡ１およびｏｒｉＰの代わりに、Ｔ抗原およびＳＶ４０の複製起点を使用する、エピソームベクターの非限定的な例を表す。
【０１８０】
本明細書では、シグナルペプチドと、膜貫通ドメインと、天然ポリペプチドのトランケート型変異体を含む細胞表面ポリペプチドと、任意選択で、膜貫通ドメインを、細胞表面ポリペプチドへと接続するペプチドリンカーとを含みうるポリペプチド構築物が提示される。例えば、図４Ａは、細胞タグの機能性を有するポリペプチド構築物についての実施形態を例示する。トランケート型変異体は、膜貫通ドメインへと接続されるペプチドリンカーを介して細胞外マトリックスへと伸長する。トランケート型変異体は、トランケート型変異体／細胞タグを認識し、これに結合しうる、抗トランケート型変異体抗体（例えば、外因的に付加された）に対する、１または複数のエピトープを含みうる。一部の実施形態では、抗体の、トランケート型変異体への結合は、例えば、サイトカイン、ＴＣＲ、および／またはＣＡＲなど、１または複数のさらなる分子を発現するように細胞を操作した、養子細胞治療時に有益でありうる、細胞の枯渇（例えば、ＡＤＣＣを介する）を結果としてもたらしうる。一部の実施形態では、異なるポリペプチド構築物は、一定の膜貫通ドメインおよびシグナルペプチドを含むが、ポリペプチド構築物へと組み込まれたトランケート型変異体の識別を変動させる。例えば、異なるポリペプチド構築物は、同じ天然ポリペプチドの、異なるトランケート型変異体を含みうる。２つのポリペプチド構築物に、同じ天然ポリペプチドの、異なるトランケート型変異体が組み込まれている場合、ポリペプチド構築物は、ポリペプチド構築物内の、ペプチドリンカーの存在／非存在、またはペプチドリンカーの長さに基づき、さらに異なりうる。一部の実施形態では、各ポリペプチド構築物のペプチドリンカーは、特定のトランケート型変異体の遠位末端と、細胞表面との、比較的一定の距離を維持するサイズである。
【０１８１】
本明細書では、ポリヌクレオチドを使用して、免疫療法時における使用のためのポリペプチド構築物の構築を容易とするための、ポリヌクレオチドおよび方法が提示される。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、シグナルペプチドおよび膜貫通ドメイン（例えば、膜貫通二量体化ドメインを含むかまたは欠く）をコードする配列を含むベクターを含みうる。ベクターは、インサートが、特定のトランケート型変異体と、任意選択で、ペプチドリンカーとをコードするヌクレオチド配列を含むように、シグナルペプチドと、膜貫通ドメインとの間に、インサートをクローニングすることをもたらしうる。代替的に、シグナルペプチドと、特定のトランケート型変異体と、任意選択で、リンカーとをコードするポリヌクレオチドを含み、トランケート型変異体またはリンカーのコード配列と隣接する膜貫通ドメインをコードするヌクレオチド配列の挿入をもたらすベクターを提供することもできる。結果として得られるポリペプチド構築物内の、１または複数の特定のドメインを、一定に維持するが、ポリペプチド構築物の間で可変的でありうるドメインの出し入れを可能とする、一連のベクターを提示することにより、本開示は、シグナルペプチドと、トランケート型変異体と、膜貫通ドメインと、リンカーとの、任意の組合せを含むポリペプチド構築物の作製を容易とする。
【０１８２】
ベクターの修飾
本明細書で記載される方法および組成物に有用なポリヌクレオチドベクターは、「医薬品および医薬部外品の製造管理および品質管理の基準」（ＧＭＰ）に適合するベクターでありうる。例えば、ＧＭＰベクターは、非ＧＭＰベクターより純粋でありうる。場合によって、純度は、バイオバーデンにより測定することができる。例えば、バイオバーデンは、ベクター組成物中の、好気性細菌、嫌気性細菌、芽胞形成菌、真菌、またはこれらの組合せの存在または非存在でありうる。場合によって、純粋なベクターは、低内毒素または内毒素非含有でありうる。純度は、二本鎖プライマーウォーキングシーケンシングによってもまた測定することができる。プラスミドの同一性は、ベクターの純度を決定する源泉でありうる。本発明のＧＭＰベクターは、非ＧＭＰベクターより、１０％〜９９％純粋でありうる。ＧＭＰベクターは、バイオバーデン、内毒素、シーケンシング、またはこれらの組合せの存在により測定される通り、非ＧＭＰベクターより、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％純粋でありうる。
【０１８３】
場合によって、第１の遺伝子プログラムの終点におけるターミネーター配列を使用する。ターミネーター配列は、第２の遺伝子プログラムを開始する前に転写物が終結することを確実にしうる。例えば、発現ベクターは、転写の終結およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含有しうる。このような配列は、真核生物またはウイルスの、ＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’側非翻訳領域から入手可能であり、時に、３’側非翻訳領域からも入手可能である。これらの領域は、ｍＲＮＡの非翻訳部分内の、ポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含有しうる。発現ベクターを含む細胞を、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏの、所望のポリペプチドの発現をもたらす条件下で増殖させる。
【０１８４】
場合によって、スペーサー配列は、ベクター内のポリヌクレオチドによりコードされる、第１のポリペプチドの末端において使用することができる。他の場合には、スペーサー配列は、ベクター内の、第２の遺伝子の末端において使用することができる。スペーサー配列はまた、ベクター内で、第１の遺伝子および第２の遺伝子に後続して使用することもできる。
【０１８５】
これらのベクターを使用して、目的の遺伝子、または目的の遺伝子の部分によりコードされるポリペプチドを発現させることができる。遺伝子または遺伝子の部分は、ウイルス法または非ウイルス法の任意の方法を使用して挿入することができる。例えば、方法は、非ウイルスベースの技法でありうる。
【０１８６】
構築物によりコードされる、さらなる特徴
本明細書で開示されるポリヌクレオチドは、上記で記載したポリヌクレオチド構築物に加えて、またはこれと共に、１または複数のタンパク質をコードしうる。例えば、一部の実施形態では、ポリペプチド構築物は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、および／またはサイトカインへと連結することができる。
【０１８７】
キメラ受容体
本明細書で記載される一部の実施形態は、細胞表面上で発現したキメラ受容体をコードする、ポリヌクレオチドを含む。一部の場合には、キメラ受容体は、抗原、例えば、腫瘍関連抗原または腫瘍特異的抗原などの腫瘍抗原の認識およびこれへの結合を可能とする抗原結合性領域を含む。一部の場合には、抗原結合性領域は、抗体または結合性断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）３、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、ｄｓＦｖ、ダイアボディー、ミニボディー、およびナノボディーまたはこれらの結合性断片を含む。場合によって、抗原結合性領域は、ｓｃＦｖを含む。場合によって、キメラ受容体は、ｓｃＦｖ（例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ））を含む。一部の場合には、キメラ抗原受容体は、パターン認識受容体を含む。他の場合には、キメラ受容体は、操作Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む。
【０１８８】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
一部の実施形態では、本明細書で記載されるポリペプチド構築物を発現する細胞はまた、１または複数のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）も発現する。
【０１８９】
本明細書で記載されるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、外因性の特異性を、免疫エフェクター細胞へとグラフトする、操作受容体である。一部の場合には、ＣＡＲは、抗原結合性ドメイン、ストーク領域、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメイン（エンドドメイン）を含む細胞外ドメイン（エクトドメイン）を含む。一部の場合には、細胞内ドメインは、１または複数の細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む。一部の場合には、本明細書で記載されるＣＡＲは、Ｔ細胞活性化のための、抗原結合性ドメイン、ストーク領域、膜貫通ドメイン、１または複数の共刺激ドメイン、およびシグナル伝達ドメインを含む。
【０１９０】
複数の実施形態では、本開示のＣＡＲは、そうでなければ、抗原結合性部分と称する、標的特異的結合エレメントを含む。複数の実施形態では、腫瘍細胞上の所定の抗原に特異的に結合する、所望の抗原結合性部分を操作することにより、目的の腫瘍抗原をターゲティングするように、本開示のＣＡＲを操作する。本開示の文脈では、「腫瘍抗原」または「過剰増殖性障害抗原」または「過剰増殖性障害と関連する抗原」とは、がんなど、特異的な過剰増殖性障害に共通する抗原を指す。
【０１９１】
抗原結合性ドメインは、モノクローナル抗体の相補性決定領域、モノクローナル抗体の可変領域、および／またはこれらの抗原結合性断片を含みうる。相補性決定領域（ＣＤＲ）とは、抗原受容体（例えば、免疫グロブリンおよびＴ細胞受容体）タンパク質の可変ドメイン内に見出される、短いアミノ酸配列であって、抗原の構造と相補的であり、したがって、受容体に、この特定の抗原に対するその特異性をもたらす構造を呈するアミノ酸配列である。抗原受容体の各ポリペプチド鎖は、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）を含有しうる。一部の場合には、抗原結合性ドメインは、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、またはｓｃＦｖを含む。場合によって、抗原結合性ドメインは、ｓｃＦｖである。場合によって、抗原結合性ドメインは、Ｆａｂである。場合によって、抗原結合性ドメインは、Ｆａｂ’である。場合によって、抗原結合性ドメインは、Ｆ（ａｂ’）２である。場合によって、抗原結合性ドメインは、Ｆｖである。
【０１９２】
一部の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＢＣＭＡ、ＣＤ１２３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、α−葉酸受容体、ＣＡＩＸ、ＣＤ３０、ＲＯＲ１、ＣＥＡ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、葉酸結合性タンパク質、ＧＤ２、ＧＤ３、ＩＬ−１３Ｒ−ａ２、ＫＤＲ、ＥＤＢ−Ｆ、メソテリン、ＣＤ２２、ＥＧＦＲ、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−１６、ＭＡＧＥ−Ａ１、ｈ５Ｔ４、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ−７２、またはＶＥＧＦ−Ｒ２におけるエピトープに結合する抗原結合性ドメインを含む。一部の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＢＣＭＡ、ＣＤ４４、α−葉酸受容体、ＣＡＩＸ、ＣＤ３０、ＲＯＲ１、ＣＥＡ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、葉酸結合性タンパク質、ＧＤ２、ＧＤ３、ＩＬ−１３Ｒ−ａ２、ＫＤＲ、ＥＤＢ−Ｆ、メソテリン、ＣＤ２２、ＥＧＦＲ、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−１６、ＭＡＧＥ−Ａ１、ｈ５Ｔ４、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ−７２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１２３、およびＶＥＧＦ−Ｒ２上のエピトープに結合する抗原結合性ドメインを含む。一部の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、ＣＤ１９またはＣＤ３３上のエピトープに結合する抗原結合性ドメインを含む。一部の場合には、本明細書で記載されるＣＡＲは、ＣＤ１９上のエピトープに結合する抗原結合性ドメインを含む。場合によって、本明細書で記載されるＣＡＲは、ＣＤ３３上のエピトープに結合する抗原結合性ドメインを含む。さらなる実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲまたはキメラ受容体または抗原結合性ポリペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２、ミエリン希突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、ＭＡｄＣＡＭ１、ＳＤＦ１、またはＩＩ型コラーゲン上のエピトープに結合する、自己抗原結合性領域または抗原結合性領域を含む。
【０１９３】
一部の実施形態では、本明細書で記載されるポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび方法を、がんなどの過剰増殖性疾患、自己免疫疾患の処置、またはウイルス感染、細菌感染、または寄生虫感染など、感染の処置のために使用することができる。一部の態様では、抗原は、がん細胞内、自己免疫細胞内、またはウイルス、細菌、もしくは寄生虫に感染した細胞内で増大する抗原である。ターゲティングされうる病原体は、限定せずに述べると、マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）属、トリパノソーム、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ＨＳＶ、ＨＰＶ、ＲＳＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶ、ＪＣウイルス、ＢＫウイルス、またはエボラ病原体を含む。自己免疫疾患は、移植片対宿主病、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、セリアック病、クローン病、シェーグレン症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性硬化症、視神経脊髄炎、強直性脊椎炎、１型糖尿病、円形脱毛症、血管炎、側頭動脈炎、水疱性類天疱瘡、乾癬、尋常性天疱瘡、または自己免疫性ブドウ膜炎を含みうる。
【０１９４】
ＣＡＲにより本質的に認識される病原体は、任意の種類の病原体でありうるが、一部の実施形態では、病原体は、真菌、細菌、またはウイルスである。例示的なウイルス性病原体は、アデノウイルス科（Adenoviridae）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＲＳ（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ）ウイルス（ＲＳＶ）、ＪＣウイルス、ＢＫウイルス、ＨＰＶ、ＨＳＶ、ＨＨＶファミリーのウイルス、肝炎ファミリーのウイルス、ピコルナウイルス科（Picornaviridae）、ヘルペスウイルス科（Herpesviridae）、ヘパドナウイルス科（Hepadnaviridae）、フラビウイルス科（Flaviviridae）、レトロウイルス科（Retroviridae）、オルトミクソウイルス科（Orthomyxoviridae）、パラミクソウイルス科（Paramyxoviridae）、パポバウイルス科（Papovaviridae）、ポリオーマウイルス属（Polyomavirus）、ラブドウイルス科（Rhabdoviridae）、およびトガウイルス科（Togaviridae）の病原体を含む。例示的な病原性ウイルスは、天然痘、インフルエンザ、耳下腺炎、麻疹、水痘、エボラ、および風疹を引き起こす。例示的な病原性真菌は、カンジダ属（Candida）、アスペルギルス属（Aspergillus）、クリプトコッカス属（Cryptococcus）、ヒストプラズマ属（Histoplasma）、ニューモシスチス属（Pneumocystis）、およびスタキボトリス属（Stachybotrys）を含む。例示的な病原性細菌は、ストレプトコッカス属（Streptococcus）、シュードモナス属（Pseudomonas）、赤痢菌属（Shigella）、カンピロバクター属（Campylobacter）、スタフィロコッカス属（Staphylococcus）、ヘリコバクター属（Helicobacter）、大腸菌（E. coli）、リケッチア属（Rickettsia）、バチルス属（Bacillus）、ボルデテラ属（Bordetella）、クラミジア属（Chlamydia）、スピロヘータ門（Spirochetes）、およびサルモネラ属（Salmonella）を含む。一部の実施形態では、病原体受容体であるデクチン１を使用して、アスペルギルス（Aspergillus）属など、真菌の細胞壁上の炭水化物構造を認識するＣＡＲを作出することができる。別の実施形態では、ウイルス決定基（例えば、ＣＭＶおよびエボラに由来する糖タンパク質）を認識する抗体に基づき、ウイルス感染およびウイルス病態を阻止するＣＡＲを作ることができる。
【０１９５】
一部の実施形態では、「ストーク」領域または「スペーサー」領域もしくは「ヒンジ」領域を使用して、抗原結合性ドメインを、膜貫通ドメインへと連結する。一部の場合には、「ストークドメイン」または「ストーク領域」は、ポリペプチド鎖内で、膜貫通ドメインを、細胞外ドメインまたは細胞質ドメインへと連結するように機能する、任意のオリゴヌクレオチドまたはポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ストークドメインは、抗原結合性ドメインが、抗原認識を容易とするように、異なる方向を向くことを可能とするのに十分な程度に可撓性である。場合によって、ストーク領域は、ＩｇＧ１に由来するヒンジ領域を含む。代替的な場合に、ストーク領域は、免疫グロブリンのＣＨ２ＣＨ３領域と、任意選択で、ＣＤ３の一部とを含む。場合によって、ストーク領域は、国際公開第２０１６／０７３７５５号パンフレットにおいて記載されている、ＣＤ８αヒンジ領域、ＩｇＧ４−Ｆｃの１２アミノ酸のヒンジ領域（ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ（配列番号２２５））、またはＩｇＧ４ヒンジ領域を含む。
【０１９６】
膜貫通ドメインは、天然供給源に由来する場合もあり、組換え供給源に由来する場合もある。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合性タンパク質または膜貫通タンパク質に由来しうる。適切な膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体の、アルファ鎖、ベータ鎖、またはゼータ鎖の膜貫通領域を含む場合もあり、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ζ、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、またはＣＤ１５４に由来する膜貫通領域を含む場合もある。代替的に、膜貫通ドメインは、合成の場合もあり、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を含みうる。一部の実施形態では、合成膜貫通ドメインの、一方または両方の末端では、フェニルアラニン、トリプトファン、およびバリンのトリプレットが見出される。任意選択で、一部の実施形態では、２〜１０アミノ酸の間の長さである、短いオリゴヌクレオチドリンカーまたはポリペプチドリンカーは、ＣＡＲの膜貫通ドメインと、細胞質シグナル伝達ドメインとの間の連結を形成しうる。一部の実施形態では、リンカーは、グリシン−セリンリンカーである。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α膜貫通ドメインまたはＣＤ３ζ膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α膜貫通ドメインを含む。他の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ３ζ膜貫通ドメインを含む。さらに他の実施形態では、膜貫通ドメインは、膜貫通二量体化ドメインを含む。
【０１９７】
細胞内ドメインは、１または複数の共刺激ドメインを含みうる。例示的な共刺激ドメインは、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはこれらの断片もしくは組合せを含むがこれらに限定されない。場合によって、本明細書で記載されるＣＡＲは、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはこれらの断片もしくは組合せから選択される共刺激ドメインのうちの１もしくは複数、または２つもしくはこれを超えるものを含む。場合によって、本明細書で記載されるＣＡＲは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはこれらの断片もしくは組合せから選択される共刺激ドメインのうちの１もしくは複数、または２つもしくはこれを超えるものを含む。場合によって、本明細書で記載されるＣＡＲは、ＣＤ８、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、またはこれらの断片もしくは組合せから選択される共刺激ドメインのうちの１もしくは複数、または２つもしくはこれを超えるものを含む。場合によって、本明細書で記載されるＣＡＲは、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、またはこれらの断片もしくは組合せから選択される共刺激ドメインのうちの１もしくは複数、または２つもしくはこれを超えるものを含む。場合によって、本明細書で記載されるＣＡＲは、共刺激ドメインであるＣＤ２８および４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、またはこれらのそれぞれの断片を含む。場合によって、本明細書で記載されるＣＡＲは、共刺激ドメインであるＣＤ２８およびＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはこれらのそれぞれの断片を含む。場合によって、本明細書で記載されるＣＡＲは、共刺激ドメインであるＣＤ８およびＣＤ２８、またはこれらのそれぞれの断片を含む。場合によって、本明細書で記載されるＣＡＲは、共刺激ドメインであるＣＤ２８、またはその断片を含む。場合によって、本明細書で記載されるＣＡＲは、共刺激ドメインである４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、またはその断片を含む。場合によって、本明細書で記載されるＣＡＲは、共刺激ドメインであるＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはその断片を含む。場合によって、本明細書で記載されるＣＡＲは、共刺激ドメインであるＣＤ８、またはその断片を含む。
【０１９８】
本開示のＣＡＲの、細胞質ドメインとしてまた公知の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲを入れた免疫細胞の正常エフェクター機能のうちの少なくとも１つの活性化の一因となる。「エフェクター機能」という用語は、細胞の特化機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞傷害活性の場合もあり、サイトカインの分泌を含むヘルパー活性の場合もある。したがって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達し、特化機能を実施するように、細胞を方向付ける、タンパク質の部分を指す。通常、細胞内シグナル伝達ドメインの全体が用いられうるが、多くの場合、鎖全体を使用することは必要でない。細胞内シグナル伝達ドメインのトランケートされた部分を使用し、エフェクター機能シグナルを伝達する限りにおいて、このようなトランケートされた部分を、無傷鎖の代わりに使用することができる。したがって、細胞内シグナル伝達ドメインという用語とは、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な、細胞内シグナル伝達ドメインの、任意のトランケートされた部分を含むことが意図される。一部の実施形態では、細胞内ドメインは、Ｔ細胞活性化のためのシグナル伝達ドメインをさらに含む。場合によって、Ｔ細胞活性化のためのシグナル伝達ドメインは、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、またはＣＤ６６ｄに由来するドメインを含む。場合によって、Ｔ細胞活性化のためのシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζに由来するドメインを含む。
【０１９９】
ＣＡＲに関して使用される場合の「機能的部分」という用語は、本開示のＣＡＲの、任意の部分または断片であって、機能的部分がその一部であるＣＡＲ（親ＣＡＲ）の生物学的活性を保持する部分または断片を指す。親ＣＡＲをコードする核酸配列に関して、ＣＡＲの機能的部分をコードする核酸配列は、親ＣＡＲのうちの、例えば、約１０％、２５％、３０％、５０％、６８％、８０％、９０％、９５％、またはこれを超える親ＣＡＲを含むタンパク質をコードしうる。
【０２００】
本明細書で使用される「機能的変異体」という用語は、基準ポリペプチドに対する、実質的または著明な配列同一性または配列類似性を有するポリペプチドまたはタンパク質を指し、それがその変異体である、基準ポリペプチドの生物学的活性を保持する。機能的変異体は、例えば、本明細書で記載されるＣＡＲ（親ＣＡＲ）の変異体であって、標的細胞を、親ＣＡＲと同様の程度、これと同程度、またはこれより高い程度に認識する能力を保持する変異体を包含する。親ＣＡＲをコードする核酸配列に照らして、ＣＡＲの機能的変異体をコードする核酸配列は、親ＣＡＲをコードする核酸配列と、例えば、約１０％同一、約２５％同一、約３０％同一、約５０％同一、約６５％同一、約８０％同一、約９０％同一、約９５％同一、または約９９％同一でありうる。
【０２０１】
本明細書で開示されるポリヌクレオチド構築物は、操作細胞内で、ＣＡＲと共発現させることができる。一部の実施形態では、ポリペプチド構築物およびＣＡＲは、単一の転写物によりコードされうる。トランケート型変異体と、ＣＡＲとを、同じ転写物内に含むポリペプチド構築物をコードすることの利点は、ＣＡＲタンパク質を作り出す操作細胞はまた、ポリペプチド構築物も作り出した可能性が高いことである。したがって、免疫療法時に、ＣＡＲの発現を減少させる（例えば、治療の副作用を軽減する）介入が必要とされる場合、ポリペプチド構築物を、ＣＡＲと共発現する操作細胞を、本明細書で開示されるトランケート型変異体により付与される細胞タグをターゲティングする外因性抗体の投与に、比較的短い時間枠で応答するように、プライミングすることができる。
【０２０２】
ＣＤ１９特異的ＣＡＲ
ＣＤ１９とは、免疫グロブリンスーパーファミリーの細胞表面糖タンパク質である。一部の場合には、ＣＤ１９は、膵臓がん、肝臓がん、および前立腺がんなど、充実性腫瘍内で検出されている。
【０２０３】
一部の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲの抗原結合性部分は、ＣＤ１９に特異的である。ＣＤ１９特異的ＣＡＲは、細胞表面上で発現すると、Ｔ細胞の特異性を、ヒトＣＤ１９へとリダイレクトする。複数の実施形態では、抗原結合性ドメインは、標的抗原特異的な、抗ＣＤ１９モノクローナル抗体の、可変ドメイン軽鎖（ＶＬ）および可変ドメイン重鎖（ＶＨ）であって、グリシン−セリンリンカーまたはホイットローリンカーなどの可撓性リンカーにより接続されたＶＬおよびＶＨを含む単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）を含む。複数の実施形態では、ｓｃＦｖは、ＳＪ２５Ｃ１および／またはＦＭＣ６３である。複数の実施形態では、ｓｃＦｖは、ヒト化ｓｃＦｖである。一部の実施形態では、抗原結合性部分は、例えば、Ｎ末端からＣ末端へと、ＶＨ−リンカー−ＶＬまたはＶＬ−リンカー−ＶＨと、方向性をもって連結されたＶＨおよびＶＬを含みうる。
【０２０４】
一部の実施形態では、本明細書では、抗原結合性ドメインが、ＣＤ１９を結合するｓｃＦｖを含む、ＣＤ１９特異的ＣＡＲが記載される。一部の場合には、抗原結合性ドメインは、ＣＤ１９上のエピトープを認識する。
【０２０５】
一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、ＪＣＡＲ０１４、ＪＣＡＲ０１５、ＪＣＡＲ０１７、または１９−２８ｚ  ＣＡＲ（Ｊｕｎｏ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）によってもまた認識される、ＣＤ１９上のエピトープを認識する。一部の実施形態では、本明細書では、抗原結合性ドメインが、ＪＣＡＲ０１４、ＪＣＡＲ０１５、ＪＣＡＲ０１７、または１９−２８ｚ  ＣＡＲ（Ｊｕｎｏ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）によってもまた認識される、ＣＤ１９上のエピトープを認識する、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞が記載される。一部の場合には、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ８アルファ膜貫通ドメインまたはＣＤ３ζ膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメイン；ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはこれらの断片もしくは組合せから選択される、１または複数の共刺激ドメイン；およびＣＤ３ζに由来するシグナル伝達ドメインをさらに含む。
【０２０６】
一部の実施形態では、本明細書で記載されるＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ｓｃＦｖの抗原結合性ドメインを含み、抗原結合性ドメインは、ＪＣＡＲ０１４、ＪＣＡＲ０１５、ＪＣＡＲ０１７、または１９−２８ｚ  ＣＡＲ（Ｊｕｎｏ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）によってもまた認識される、ＣＤ１９上のエピトープを認識する。一部の場合には、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ８アルファ膜貫通ドメインまたはＣＤ３ζ膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメイン；ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはこれらの断片もしくは組合せから選択される、１または複数の共刺激ドメイン；およびＣＤ３ζに由来するシグナル伝達ドメインをさらに含む。
【０２０７】
一部の実施形態では、本明細書で記載されるＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、米国特許出願公開第２０１６０１５２７２３号明細書において記載されている抗ＣＤ１９抗体を含む。
【０２０８】
一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、ＫＴＥ−Ｃ１９（Ｋｉｔｅ  Ｐｈａｒｍａ，Ｉｎｃ．）によってもまた認識される、ＣＤ１９上のエピトープを認識する。一部の実施形態では、本明細書では、抗原結合性ドメインが、ＫＴＥ−Ｃ１９によってもまた認識される、ＣＤ１９上のエピトープを認識する、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞が記載される。一部の場合には、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ８アルファ膜貫通ドメインまたはＣＤ３ζ膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメイン；ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはこれらの断片もしくは組合せから選択される、１または複数の共刺激ドメイン；およびＣＤ３ζに由来するシグナル伝達ドメインをさらに含む。
【０２０９】
一部の実施形態では、本明細書で記載されるＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ｓｃＦｖの抗原結合性ドメインを含み、抗原結合性ドメインは、ＫＴＥ−Ｃ１９によってもまた認識される、ＣＤ１９上のエピトープを認識する。一部の場合には、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ８アルファ膜貫通ドメインまたはＣＤ３ζ膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメイン；ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはこれらの断片もしくは組合せから選択される、１または複数の共刺激ドメイン；およびＣＤ３ζに由来するシグナル伝達ドメインをさらに含む。
【０２１０】
一部の実施形態では、本明細書で記載されるＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、国際公開第２０１５１８７５２８号パンフレットにおいて記載されている抗ＣＤ１９抗体、またはその断片もしくは誘導体を含む。
【０２１１】
一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、ＣＴＬ０１９（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）によってもまた認識される、ＣＤ１９上のエピトープを認識する。一部の実施形態では、本明細書では、抗原結合性ドメインが、ＣＴＬ０１９によってもまた認識される、ＣＤ１９上のエピトープを認識する、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞が記載される。一部の場合には、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ８アルファ膜貫通ドメインまたはＣＤ３ζ膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメイン；ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはこれらの断片もしくは組合せから選択される、１または複数の共刺激ドメイン；およびＣＤ３ζに由来するシグナル伝達ドメインをさらに含む。
【０２１２】
一部の実施形態では、本明細書で記載されるＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ｓｃＦｖの抗原結合性ドメインを含み、抗原結合性ドメインは、ＣＴＬ０１９によってもまた認識される、ＣＤ１９上のエピトープを認識する。一部の場合には、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ８アルファ膜貫通ドメインまたはＣＤ３ζ膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメイン；ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはこれらの断片もしくは組合せから選択される、１または複数の共刺激ドメイン；およびＣＤ３ζに由来するシグナル伝達ドメインをさらに含む。一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、ＵＣＡＲＴ１９（Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ）によってもまた認識される、ＣＤ１９上のエピトープを認識する。一部の実施形態では、本明細書では、抗原結合性ドメインが、ＵＣＡＲＴ１９によってもまた認識される、ＣＤ１９上のエピトープを認識する、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞が記載される。一部の場合には、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ８アルファ膜貫通ドメインまたはＣＤ３ζ膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメイン；ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはこれらの断片もしくは組合せから選択される、１または複数の共刺激ドメイン；およびＣＤ３ζに由来するシグナル伝達ドメインをさらに含む。
【０２１３】
一部の実施形態では、本明細書で記載されるＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ｓｃＦｖの抗原結合性ドメインを含み、抗原結合性ドメインは、ＵＣＡＲＴ１９によってもまた認識される、ＣＤ１９上のエピトープを認識する。一部の場合には、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ８アルファ膜貫通ドメインまたはＣＤ３ζ膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメイン；ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはこれらの断片もしくは組合せから選択される、１または複数の共刺激ドメイン；およびＣＤ３ζに由来するシグナル伝達ドメインをさらに含む。
【０２１４】
一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、ＢＰＸ−４０１（Ｂｅｌｌｉｃｕｍ）によってもまた認識される、ＣＤ１９上のエピトープを認識する。一部の実施形態では、本明細書では、抗原結合性ドメインが、ＢＰＸ−４０１によってもまた認識される、ＣＤ１９上のエピトープを認識する、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞が記載される。一部の場合には、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ８アルファ膜貫通ドメインまたはＣＤ３ζ膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメイン；ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはこれらの断片もしくは組合せから選択される、１または複数の共刺激ドメイン；およびＣＤ３ζに由来するシグナル伝達ドメインをさらに含む。
【０２１５】
一部の実施形態では、本明細書で記載されるＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ｓｃＦｖの抗原結合性ドメインを含み、抗原結合性ドメインは、ＢＰＸ−４０１によってもまた認識される、ＣＤ１９上のエピトープを認識する。一部の場合には、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ８アルファ膜貫通ドメインまたはＣＤ３ζ膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメイン；ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはこれらの断片もしくは組合せから選択される、１または複数の共刺激ドメイン；およびＣＤ３ζに由来するシグナル伝達ドメインをさらに含む。
【０２１６】
場合によって、抗原結合性ドメインは、ブリナツモマブ（Ａｍｇｅｎ）、コルツキシマブラブタンシン（ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ  Ｉｎｃ．／Ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ）、ＭＯＲ２０８（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ  ＡＧ／Ｘｅｎｃｏｒ  Ｉｎｃ．）、ＭＥＤＩ−５５１（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ）、デニンツズマブマホドチン（Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、Ｂ４（またはＤＩ−Ｂ４）（Ｍｅｒｃｋ  Ｓｅｒｏｎｏ）、タプリツモマブパプトックス（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ＸｍＡｂ  ５８７１（Ａｍｇｅｎ／Ｘｅｎｃｏｒ，Ｉｎｃ．）、ＭＤＸ−１３４２（Ｍｅｄａｒｅｘ）またはＡＦＭ１１（Ａｆｆｉｍｅｄ）によってもまた認識される、ＣＤ１９上のエピトープを認識する。一部の場合には、ＣＤ１９特異的ＣＡＲは、ＣＤ８アルファ膜貫通ドメインまたはＣＤ３ζ膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメイン；ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはこれらの断片もしくは組合せから選択される、１または複数の共刺激ドメイン；およびＣＤ３ζに由来するシグナル伝達ドメインをさらに含む。
【０２１７】
本明細書で記載される一部の実施形態は、抗原結合性ドメインが、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、またはｓｃＦｖを含む、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞を含む。一部の場合には、抗原結合性ドメインは、ＣＤ１９上のエピトープを認識する。場合によって、抗原結合性ドメインは、ブリナツモマブ（Ａｍｇｅｎ）、コルツキシマブ・ラブタンシン（ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ  Ｉｎｃ．／Ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ）、ＭＯＲ２０８（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ  ＡＧ／Ｘｅｎｃｏｒ  Ｉｎｃ．）、ＭＥＤＩ−５５１（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ）、デニンツズマブ・マホドチン（Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、Ｂ４（またはＤＩ−Ｂ４）（Ｍｅｒｃｋ  Ｓｅｒｏｎｏ）、タプリツモマブ・パプトックス（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ＸｍＡｂ  ５８７１（Ａｍｇｅｎ／Ｘｅｎｃｏｒ，Ｉｎｃ．）、ＭＤＸ−１３４２（Ｍｅｄａｒｅｘ）またはＡＦＭ１１（Ａｆｆｉｍｅｄ）によってもまた認識される、ＣＤ１９上のエピトープを認識する。一部の場合には、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ８α膜貫通ドメインまたはＣＤ３ζ膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメイン；ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはこれらの断片もしくは組合せから選択される、１または複数の共刺激ドメイン；およびＣＤ３ζに由来するシグナル伝達ドメインをさらに含む。
【０２１８】
場合によって、本明細書で記載されるＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ｓｃＦｖの抗原結合性ドメインを含み、抗原結合性ドメインは、ブリナツモマブ（Ａｍｇｅｎ）、コルツキシマブ・ラブタンシン（ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ  Ｉｎｃ．／Ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ）、ＭＯＲ２０８（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ  ＡＧ／Ｘｅｎｃｏｒ  Ｉｎｃ．）、ＭＥＤＩ−５５１（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ）、デニンツズマブ・マホドチン（Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、Ｂ４（またはＤＩ−Ｂ４）（Ｍｅｒｃｋ  Ｓｅｒｏｎｏ）、タプリツモマブ・パプトックス（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ＸｍＡｂ  ５８７１（Ａｍｇｅｎ／Ｘｅｎｃｏｒ，Ｉｎｃ．）、ＭＤＸ−１３４２（Ｍｅｄａｒｅｘ）またはＡＦＭ１１（Ａｆｆｉｍｅｄ）によってもまた認識される、ＣＤ１９上のエピトープを認識する。一部の場合には、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ８アルファ膜貫通ドメインまたはＣＤ３ζ膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメイン；ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはこれらの断片もしくは組合せから選択される、１または複数の共刺激ドメイン；およびＣＤ３ζに由来するシグナル伝達ドメインをさらに含む。
【０２１９】
ある実施形態では、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１６９（ＣＤ１９−ＣＤ３ζ  ＣＡＲをコードする）、配列番号１７１（ＣＤ１９−ＣＤ１３７−ＣＤ３ζ  ＣＡＲをコードする）、配列番号１７３（ＣＤ１９−ＣＤ２８−ＣＤ３ζ  ＣＡＲをコードする）、および配列番号１７５（ＩｇＧ４  Ｆｃスペーサーをさらに含むＣＤ１９−ＣＤ２８−ＣＤζ  ＣＡＲをコードする）からなるリストから選択されるヌクレオチド配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。ある実施形態では、ＣＡＲを含むアミノ酸配列は、配列番号１７０（ＣＤ１９−ＣＤ３ζ  ＣＡＲ）、配列番号１７２（ＣＤ１９−ＣＤ１３７−ＣＤ３ζ  ＣＡＲ）、配列番号１７４（ＣＤ１９−ＣＤ２８−ＣＤ３ζ  ＣＡＲ）、および配列番号１７６（ＩｇＧ４  Ｆｃスペーサーをさらに含むＣＤ１９−ＣＤ２８−ＣＤ３ζ  ＣＡＲ）からなるリストから選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有する。
【０２２０】
一部の実施形態では、本明細書で開示されるポリヌクレオチドは、細胞表面ポリペプチド（例えば、ＨＥＲ１ｔ）へと接続される、抗ＣＤ１９  ＣＡＲおよび切断可能Ｔ２Ａリンカーをコードする、コドン最適化ｃＤＮＡ配列を含みうる。例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球を操作して、細胞質ＣＤ３−ζドメインへと融合させた細胞質共刺激（ＣＤ２８）ドメインを介してシグナル伝達する、ＣＤ１９特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現させることができる。このポリペプチドには、Ｃ末端の２Ａ切断可能リンカーに続いて、例えば、一部の実施形態では、トランケート型ヒトＨＥＲ１（ＨＥＲ１ｔ）、トランケート型ＣＤ２０（ＣＤ２０ｔ）、トランケート型ＣＤ５２（ＣＤ５２ｔ）、またはトランケート型ＬＮＧＦＲ（ＬＮＧＦＲｔ）を含む細胞外細胞タグをさらに組み込みうる。他の実施形態では、ポリペプチドは、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ（例えば、Ｐ２Ａ切断可能リンカーを介して連結された）に先行するトランケート型変異体を含むポリペプチド構築物を含みうる。
【０２２１】
本開示は、ＣＡＲおよび本明細書で記載される任意のポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチドおよびポリペプチドを提示する。ある実施形態では、抗ＣＤ１９  ＣＡＲ、切断可能Ｔ２Ａリンカーと細胞表面ポリペプチドとを組み込んだポリペプチド構築物は、配列番号１８１（ＣＤ１９−ＣＤ２８−ＣＤ３ζ  ＣＡＲ．Ｐ２Ａ．Ｉｇカッパシグナルペプチド．配列番号５６によるＨＥＲ１ｔ１）および配列番号１８５（ＣＤ１９−ＣＤ１３７−ＣＤ３ζ  ＣＡＲ．Ｅ２Ａ.Ｉｇカッパシグナルペプチド．配列番号６８によるＨＥＲ１ｔ７）からなるリストから選択されるヌクレオチド配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる。
【０２２２】
ある実施形態では、抗ＣＤ１９  ＣＡＲ、切断可能Ｔ２Ａリンカーと細胞表面ポリペプチドとを組み込んだポリペプチド構築物は、配列番号１７９（ＣＤ１９−ＣＤ１３７−ＣＤ３ζ  ＣＡＲ．Ｔ２Ａ.Ｉｇカッパシグナルペプチド．配列番号５５によるＨＥＲ１ｔ）、配列番号１８０（ＣＤ１９−ＣＤ１３７−ＣＤ３ζ  ＣＡＲ．Ｔ２Ａ.Ｉｇカッパシグナルペプチド．配列番号５５によるＨＥＲ１ｔ）、配列番号１８２（ＣＤ１９−ＣＤ２８−ＣＤ３ζ  ＣＡＲ．Ｐ２Ａ．Ｉｇカッパシグナルペプチド．配列番号５７によるＨＥＲ１ｔ１）、配列番号１８３（Ｉｇカッパシグナルペプチド．ＨＥＲ１ｔ１.Ｐ２Ａ．ＣＤ８αシグナルペプチド．ＣＤ１９−ＣＤ２８−ＣＤ３ζ  ＣＡＲ［配列中、ＨＥＲ１ｔ１は、配列番号５７である］）、配列番号１８４（ＣＤ１９−ＣＤ２８−ＣＤ３ζ  ＣＡＲ．フューリン−Ｔ２Ａ．Ｉｇカッパシグナルペプチド．配列番号５７によるＨＥＲ１ｔ１）、配列番号１８６（ＣＤ１９−ＣＤ１３７−ＣＤ３ζ  ＣＡＲ．Ｅ２Ａ.Ｉｇカッパシグナルペプチド．配列番号６９によるＨＥＲ１ｔ７）、配列番号１８７（ＣＤ１９−ＣＤ２８−ＣＤ３ζ  ＣＡＲ．フューリン−Ｔ２Ａ．Ｉｇカッパシグナルペプチド．配列番号７３によるＨＥＲ１ｔ８）、配列番号１８８（ＣＤ１９−ＣＤ１３７−ＣＤ３ζ  ＣＡＲ．Ｅ２Ａ.Ｉｇカッパシグナルペプチド．配列番号７３によるＨＥＲ１ｔ８）、配列番号１８９（ＣＤ１９−ＣＤ２８−ＣＤ３ζ  ＣＡＲ．フューリン−Ｔ２Ａ．Ｉｇカッパシグナルペプチド．配列番号７７によるＨＥＲ１ｔ９）、配列番号１９０（ＣＤ１９−ＣＤ１３７−ＣＤ３ζ  ＣＡＲ．Ｅ２Ａ.Ｉｇカッパシグナルペプチド．配列番号７７によるＨＥＲ１ｔ９）、配列番号１９１（ＣＤ１９−ＣＤ２８−ＣＤ３ζ  ＣＡＲ．フューリン−Ｔ２Ａ．Ｉｇカッパシグナルペプチド．配列番号８１によるＨＥＲ１ｔ１０）、配列番号１９２（ＣＤ１９−ＣＤ１３７−ＣＤ３ζ  ＣＡＲ．Ｅ２Ａ.Ｉｇカッパシグナルペプチド．配列番号８１によるＨＥＲ１ｔ１０）、配列番号１９４（ＣＤ１９−ＣＤ２８−ＣＤ３ζ  ＣＡＲ．Ｐ２Ａ．ＣＤ２０）、配列番号１９５（ＣＤ１９−ＣＤ２８−ＣＤ３ζ  ＣＡＲ．Ｐ２Ａ．配列番号１０９によるＣＤ２０ｔ１）、配列番号１９６（ＣＤ１９−ＣＤ２８−ＣＤ３ζ  ＣＡＲ．Ｐ２Ａ．配列番号１１５によるＣＤ２０ｔ４）、配列番号１９７（ＣＤ５２ｔ３．Ｐ２Ａ．ＣＤ８αシグナルペプチド．ＣＤ１９−ＣＤ２８−ＣＤ３ζ  ＣＡＲ［配列中、ＣＤ５２ｔ３は、配列番号１４９である］）、および配列番号１９８（Ｉｇカッパシグナルペプチド．ＬＮＧＦＲｔ４．Ｐ２Ａ．ＣＤ８αシグナルペプチド．ＣＤ１９−ＣＤ２８−ＣＤ３ζ  ＣＡＲ［配列中、ＬＮＧＦＲｔ４は、配列番号１６５である］）からなるリストから選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有する。
【０２２３】
操作Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）
一部の実施形態では、本明細書で記載されるポリヌクレオチドによりコードされるキメラ受容体は、操作Ｔ細胞受容体を含む。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、Ｔ細胞の表面上で対合して、ヘテロ二量体の受容体を形成する、２つの鎖（αβまたはγδ）から構成される。一部の場合には、αβ  ＴＣＲは、体内の大半のＴ細胞上で発現し、特異的ＭＨＣ拘束抗原の認識に関与することが公知である。α鎖およびβ鎖の各々は、２つのドメイン：タンパク質を、細胞膜へとアンカリングし、ＣＤ３シグナル伝達装置の不変サブユニットと関連する定常ドメイン（Ｃ）と；相補性決定領域（ＣＤＲ）と称する、６回ループを介して、抗原認識を付与する可変ドメイン（Ｖ）とから構成される。一部の場合には、各Ｖドメインは、３つのＣＤＲ、例えば、ＣＤＲ３を超可変領域とする、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。これらのＣＤＲは、主要組織適合性複合体によりコードされるタンパク質とそれに結合された抗原性ペプチド間で形成される複合体（ｐｅｐＭＨＣ）（例えば、ＨＬＡ−Ａ複合体、ＨＬＡ−Ｂ複合体、ＨＬＡ−Ｃ複合体、ＨＬＡ−ＤＰＡ１複合体、ＨＬＡ−ＤＰＢ１複合体、ＨＬＡ−ＤＱＡ１複合体、ＨＬＡ−ＤＱＢ１複合体、ＨＬＡ−ＤＲＡ複合体、またはＨＬＡ−ＤＲＢ１複合体）と相互作用する。一部の場合には、定常ドメインは、定常ドメインを、可変ドメインへと接続する接合領域をさらに含む。場合によって、ベータ鎖は、接合領域の一部を構成する、短い多様性領域をさらに含む。
【０２２４】
場合によって、このようなＴＣＲは、特異的腫瘍抗原、例えば、ＮＹ−ＥＳＯ、ＭａｇｅＡ３、Ｔｉｔｉｎと反応性である。他の場合には、このようなＴＣＲは、患者の腫瘍内で発現する、特異的ネオ抗原（すなわち、腫瘍が発現する、患者特異的な、体細胞性の、非同義突然変異）と反応性である。場合によって、操作ＴＣＲは、アフィニティー増強されうる。
【０２２５】
一部の実施形態では、ＴＣＲは、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（ＩＭＧＴ）によるＴＣＲ命名法を使用して記載され、ＩＭＧＴによる、ＴＣＲ配列についての公開データベースへとリンクする。例えば、それらのフレームワーク配列、ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、およびＣＤＲ３配列により識別される、いくつかの種類のアルファ鎖可変（Ｖα）領域と、いくつかの種類のベータ鎖可変（Ｖβ）領域とが存在しうる。このようにして、Ｖαの種類は、ＩＭＧＴ命名法では、固有のＴＲＡＶ数により言及されうる。例えば、「ＴＲＡＶ２１」は、固有のフレームワーク配列およびＣＤＲ１配列およびＣＤＲ２配列、ならびにＴＣＲから、ＴＣＲへと保存されるアミノ酸配列により、部分的に規定されるが、また、ＴＣＲから、ＴＣＲへと変動するアミノ酸配列も含むＣＤＲ３配列を有するＴＣＲＶα領域を規定する。同様に、「ＴＲＢＶ５−１」は、固有のフレームワーク配列およびＣＤＲ１配列およびＣＤＲ２配列を有するが、ＣＤＲ３配列は、部分的に規定されているに過ぎない、ＴＣＲＶβ領域を規定する。
【０２２６】
場合によって、ベータ鎖多様性領域は、ＩＭＧＴ命名法では、ＴＲＢＤという略号で言及される。
【０２２７】
一部の場合には、ＩＭＧＴ命名法により規定される固有の配列は、広く公知であり、ＴＣＲの分野に携わる者に閲覧可能である。例えば、これらは、ＩＭＧＴによる公開データベースおよび“T cell Receptor Factsbook”, (2001) LeFranc and LeFranc, Academic Press, ISBN 0-12-441352-8において見出すことができる。
【０２２８】
一部の実施形態では、αβヘテロ二量体ＴＣＲは、例えば、細胞質ドメインおよび膜貫通ドメインの両方を有する全長鎖としてトランスフェクトされる。場合によって、ＴＣＲは、例えば、国際公開第２００６／０００８３０号パンフレットにおいて記載されている、それぞれの定常ドメインの残基の間に導入されたジスルフィド結合を含有する。
【０２２９】
一部の場合には、本明細書で記載されるＴＣＲは、単鎖フォーマットである（例えば、国際公開第２００４／０３３６８５号パンフレットを参照されたい）。単鎖フォーマットは、Ｖα−Ｌ−Ｖβ型、Ｖβ−Ｌ−Ｖα型、Ｖα−Ｃα−Ｌ−Ｖβ型、Ｖα−Ｌ−Ｖβ−Ｃβ型、Ｖα−Ｃα−Ｌ−Ｖβ−Ｃβ型のαβ  ＴＣＲポリペプチド［フォーマット中、ＶαおよびＶβは、それぞれ、ＴＣＲα可変領域およびＴＣＲβ可変領域であり、ＣαおよびＣβは、それぞれ、ＴＣＲα定常領域およびＴＣＲβ定常領域であり、Ｌは、リンカー配列である］を含む。ある特定の実施形態では、本開示の単鎖ＴＣＲは、国際公開第２００４／０３３６８５号パンフレットにおいて記載されている、それぞれの定常ドメインの残基の間に導入されたジスルフィド結合を有しうる。
【０２３０】
本明細書で記載されるＴＣＲは、検出用標識、治療剤、またはＰＫ修飾部分と会合させることができる。
【０２３１】
診断を目的とする、例示的な検出用標識は、蛍光標識、放射性標識、酵素、核酸プローブ、および造影試薬を含むがこれらに限定されない。
【０２３２】
本開示は、ＴＣＲおよび本明細書で記載される任意のポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチドおよびポリペプチドを提示する。一部の実施形態では、本明細書で開示されるポリヌクレオチドは、細胞表面ポリペプチド（例えば、ＨＥＲ１ｔ）へと接続される、ＴＣＲおよび切断可能Ｔ２Ａリンカーをコードする、コドン最適化ｃＤＮＡ配列を含みうる。例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球を操作して、Ｃ末端の２Ａ切断可能リンカーに続いて、例えば、一部の実施形態では、トランケート型ヒトＨＥＲ１（ＨＥＲ１ｔ）、トランケート型ＣＤ２０（ＣＤ２０ｔ）、トランケート型ＣＤ５２（ＣＤ５２ｔ）、またはトランケート型ＬＮＧＦＲ（ＬＮＧＦＲｔ）を含む細胞外細胞タグをさらに組み込んだＴＣＲポリペプチドを発現させることができる。他の実施形態では、ポリペプチドは、ＴＣＲ（例えば、Ｐ２Ａ切断可能リンカーを介して連結された）に先行するトランケート型変異体を含むポリペプチド構築物を含みうる。
【０２３３】
サイトカイン
本明細書では、ポリペプチドである細胞タグと、サイトカインまたはその変異体もしくは誘導体とをコードするポリヌクレオチド、ならびにこれらを組み込む方法およびシステムが提示される。サイトカインは、細胞シグナル伝達に関与する、約５〜２０ｋＤａの間の低分子タンパク質の類型である。一部の実施形態では、サイトカインは、膜結合型の場合もあり、分泌型の場合もある。他の実施形態では、サイトカインは、細胞内サイトカインでありうる。一部の場合には、サイトカインは、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、コロニー刺激因子、または腫瘍壊死因子を含む。一部の実施形態では、ケモカインは、細胞の遊走を導く、化学誘引物質としての役割を果たし、４つのサブファミリー：ＣＸＣ、ＣＣ、ＣＸ３Ｃ、およびＸＣへと分類される。非限定的な例示的ケモカインは、ＣＣサブファミリー：ＣＣＬ１、ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１）、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９（またはＣＣＬ１０）、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、およびＣＣＬ２８；ＣＸＣサブファミリー：ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、およびＣＸＣＬ１７；ＸＣサブファミリー：ＸＣＬ１およびＸＣＬ２；ならびにＣＸ３ＣサブファミリーであるＣＸ３ＣＬ１に由来するケモカインを含む。
【０２３４】
インターフェロン（ＩＦＮ）は、Ｉ型インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−ε、ＩＦＮ−κ、およびＩＦＮ−ω）、ＩＩ型インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−γ）、およびＩＩＩ型インターフェロンを含む。一部の実施形態では、ＩＦＮ−αは、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１３、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６、ＩＦＮＡ１７、およびＩＦＮＡ２１を含む、約１３の亜型へとさらに分類される。
【０２３５】
インターロイキンは、白血球（leukocyte）または白血球（white blood cell）により発現され、Ｔリンパ球およびＢリンパ球ならびに造血細胞の発生および分化を促進する。例示的なインターロイキンは、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８（ＣＸＣＬ８）、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ＩＬ−３５、およびＩＬ−３６を含む。
【０２３６】
一部の実施形態では、インターロイキンは、ｍｂＩＬ−１５を含む。一部の実施形態では、ｍｂＩＬ−１５は、本明細書で記載される改変エフェクター細胞を用いて共発現させることができる、膜結合型キメラＩＬ−１５である。一部の実施形態では、ｍｂＩＬ−１５は、全長ＩＬ−１５Ｒα、またはこれらの機能的な断片もしくは変異体とインフレームで融合させた、全長ＩＬ−１５（例えば、天然ＩＬ−１５ポリペプチド）、またはこれらの断片もしくは変異体を含む。場合によって、ＩＬ−１５を、ＩＬ−１５Ｒαへと、リンカーを介して、間接的に連結する。場合によって、ｍｂＩＬ−１５は、Hurton et al., “Tethered IL-15 augments antitumor activity and promotes a stem-cell memory subset in tumor-specific T cells,” PNAS 2016において記載されている通りである。ある実施形態では、ｍｂＩＬ−１５は、配列番号１７７のヌクレオチド配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる。ある実施形態では、ｍｂＩＬ−１５は、配列番号１７８のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有する。
【０２３７】
別の態様では、インターロイキンは、ＩＬ−１２を含みうる。一部の実施形態では、ＩＬ−１２は、単鎖ＩＬ−１２（ｓｃＩＬ−１２）、プロテアーゼ感受性ＩＬ−１２、不安定化ＩＬ−１２、膜結合型ＩＬ−１２、挿入ＩＬ−１２である。一部の場合には、ＩＬ−１２変異体は、それらの全てが参照によりそれらの全体に組み込まれる、ＷＯ２０１５／０９５２４９、ＷＯ２０１６／０４８９０３、ＷＯ２０１７／０６２９５３に記載されている通りである。
【０２３８】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）とは、アポトーシスをモジュレートするサイトカインの群である。一部の場合には、ＴＮＦファミリー内には、ＴＮＦα、リンホトキシンアルファ（ＬＴ−アルファ）、リンホトキシンベータ（ＬＴ−ベータ）、Ｔ細胞抗原であるｇｐ３９（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＦＡＳＬ、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、およびＴＮＦ放出型アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）を含むがこれらに限定されない、約１９のメンバーが存在する。
【０２３９】
コロニー刺激因子（ＣＳＦ）とは、造血幹細胞の表面上の受容体タンパク質と相互作用する、分泌糖タンパク質であって、その後、細胞の増殖および特異的種類の血液細胞への分化をモジュレートする分泌糖タンパク質である。一部の場合には、ＣＳＦは、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、またはプロメガポエチンを含む。
【０２４０】
一部の実施形態では、サイトカインは、本明細書で記載されるキメラ抗原受容体および／またはＴＣＲと共に共発現される膜結合型サイトカインである。
【０２４１】
一部の実施形態では、１または複数の本明細書で記載される方法は、サイトカインの投与をさらに含む。一部の場合には、サイトカインは、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、コロニー刺激因子、または腫瘍壊死因子を含む。一部の場合には、１または複数の本明細書で記載される方法は、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、コロニー刺激因子、または腫瘍壊死因子から選択されるサイトカインの投与をさらに含む。一部の場合には、１または複数の本明細書で記載される方法は、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＦＮγ、またはＴＮＦ−αから選択されるサイトカインの投与をさらに含む。
【０２４２】
一部の実施形態では、本明細書で開示されるポリヌクレオチドは、細胞表面ポリペプチド（例えば、ＨＥＲ１ｔ）へと接続される、サイトカインおよび切断可能Ｔ２Ａリンカーをコードする、コドン最適化ｃＤＮＡ配列を含みうる。例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球を操作して、サイトカインを含むポリペプチドを発現させ、２Ａ切断可能リンカーに続いて、例えば、一部の実施形態では、トランケート型ヒトＨＥＲ１（ＨＥＲ１ｔ）、トランケート型ＣＤ２０（ＣＤ２０ｔ）、トランケート型ＣＤ５２（ＣＤ５２ｔ）、またはトランケート型ＬＮＧＦＲ（ＬＮＧＦＲｔ）を含む細胞外細胞タグをさらに組み込むことができる。他の実施形態では、ポリペプチドは、サイトカイン（例えば、Ｐ２Ａ切断可能リンカーを介して連結された）に先行するトランケート型変異体を含むポリペプチド構築物を含みうる。
【０２４３】
本開示は、サイトカインおよび本明細書で記載される任意のポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチドを提示する。ある実施形態では、サイトカイン、切断可能Ｔ２Ａリンカー、および細胞表面ポリペプチドを組み込んだポリペプチド構築物は、配列番号１９３のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性（膜結合型ＩＬ−１５．Ｔ２Ａ．配列番号５７によるＨＥＲ１ｔ１）を有する。
【０２４４】
ＩＲＥＳおよびリンカー
また、本明細書で記載されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現および機能性を容易とする、リンカーおよびＩＲＥＳエレメントを含む構築物も開示される。
【０２４５】
ＩＲＥＳエレメント
本明細書で使用される「内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）」という用語は、内部リボソーム進入部位を意味することが意図されうる。ＩＲＥＳ配列を含むベクター内では、第１の遺伝子が、その独自の５’−ＵＴＲを伴う機構である、キャップ依存性のリボソーム走査により翻訳されうるのに対し、後続の遺伝子の翻訳は、リボソームの、ＩＲＥＳへの直接的な動員により、キャップ非依存的に達せられうる。ＩＲＥＳ配列は、真核リボソームが結合し、５’キャップ末端に結合せずに、翻訳を開始することを可能としうる。ＩＲＥＳ配列は、１つの転写物からの、複数の遺伝子の発現を可能としうる（Mountford and Smith 1995）。
【０２４６】
本明細書で使用される「キャップ（ＣＡＰ）」または「キャップ（ｃａｐ）」という用語は、一般に、真核生物ｍＲＮＡの５’末端へと、３’−５’連結された、７−メチルグアノシン（７ｍｅＧ−ｐｐｐ−Ｇ）である修飾ヌクレオチドであって、このｍＲＮＡからのタンパク質の発現時に、正常な翻訳開始経路内で必要とされるエレメントとして用いられる修飾ヌクレオチドを指す。
【０２４７】
ある特定の場合には、ＩＲＥＳ領域は、ピコルナウイルス、脳心筋炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスのＩＲＥＳ配列など、ウイルスに由来しうる。他の場合には、ＩＲＥＳ領域は、脳心筋炎ウイルスに由来しうる。本明細書で使用される「ＥＭＣＶ」または「脳心筋炎ウイルス」という用語は、ピコルナウイルス科（Picornaviridae）の属の、脳心筋炎ウイルス種の、任意のメンバーである単離株または株を指す。例は、ＥＭＣＶ−Ｒ（リュッカート）株ウイルス、コロンビアＳＫウイルスである。場合によって、真核開始因子４Ｇ、免疫グロブリン重鎖結合性タンパク質、ｃ−ｍｙｃがん原遺伝子、血管内皮増殖因子、線維芽細胞増殖因子１のＩＲＥＳ、またはこれらの任意の組合せまたは修飾など、細胞性ＩＲＥＳエレメントを使用することができる。場合によって、細胞性ＩＲＥＳは、ウイルスＩＲＥＳと比較した場合の、遺伝子発現の増大を有しうる。
【０２４８】
ウイルスのＩＲＥＳ配列、細胞性ＩＲＥＳ配列、またはこれらの組合せを、ベクター内で用いることができる。ＩＲＥＳは、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）またはポリオウイルス（ＰＶ）に由来しうる。場合によって、ＩＲＥＳエレメントは、ポリオウイルス（ＰＶ）、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、ブタテッショウウイルス１（ＰＴＶ−１）、愛知ウイルス（ＡｉＶ）、セネカバレーウイルス（ＳＶＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、豚コレラウイルス（ＣＳＦＶ）、ヒト免疫不全ウイルス２（ＨＩＶ−２）、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ−１）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、マウス乳がんウイルス（ＭＭＴＶ）、潜伏期ヒトサイトメガロウイルス（ｐＵＬ１３８）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＮＡ−１）、ヘルペスウイルスマレック病（ＭＤＶＲＬＯＲＦ９）、ＳＶ４０ポリシストロニック１９Ｓ（ＳＶ４０１９Ｓ）、ムギクビレアブラムシ（Rhopalosiphum padi）ウイルス（ＲｈＰＶ）、クリケット麻痺ウイルス（ＣｒＰＶ）、ウスジロエダシャク（Ectropis obliqua）ピコルナ様ウイルス（ＥｏＰＶ）、チャバネアオカメムシ（Plautia stali）腸ウイルス（ＰＳＩＶ）、サシガメ属（Triatoma）ウイルス（ＴｒＶ）、ミツバチ麻痺病シシストウイルス（ＩＡＰＶ、ＫＢＶ）、ブラックカラン復帰ウイルス（ＢＲＶ）、テンジクアオイ属（Pelargonium）斑入りウイルス（ＰＦＢＶ）、ハイビスカス退緑斑ウイルス（ＨＣＲＳＶ）、アブラナ科感染トバモウイルス（ＣｒＴＭＶ）、ジャガイモ葉巻ウイルス（ＰＬＲＶ）、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）、ジアルジアウイルス（ＧＬＶ）、リーシュマニア属（Leishmania）ＲＮＡウイルス１（ＬＲＶ−１）、およびこれらの組合せまたは修飾からなる群から選択される。場合によって、ＩＲＥＳは、Ａｐａｆ−１、ＸＩＡＰ、ＨＩＡＰ２／ｃ−ＩＡＰ１、ＤＡＰ５、Ｂｃｌ−２、ｃ−ｍｙｃ、ＣＡＴ−１、ＩＮＲ、分化ＬＥＦ−１、ＰＤＧＦ２、ＨＩＦ−１ａ、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ２、ＢｉＰ、ＢＡＧ−１、ＣＩＲＰ、ｐ５３、ＳＨＭＴ１、ＰＩＴＳＬＲＥｐ５８、ＣＤＫ１、Ｒｐｒ、ｈｉｄ、ｈｓｐ７０、ｇｒｉｍ、ｓｋｌ、Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ、ｄＦｏｘＯ、ｄＩｎＲ、Ａｄｈ−Ａｄｈｒ、ＨＳＰ１０１、ＡＤＨ、ＵＲＥ−２，ＧＰＲ１、ＮＣＥ１０２、ＹＭＲ１８１ａ、ＭＳＮ１、ＢＯＩ１、ＦＬＯ８、ＧＩＣ１、およびこれらの任意の組合せまたは修飾からなる群から選択される。
【０２４９】
ある特定の実施形態では、ＩＲＥＳは、配列番号４９のヌクレオチド配列との、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、９９．５％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むＥＭＣＶ  ＩＲＥＳである。
【０２５０】
ＩＲＥＳエレメントを、２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の間に組み入れる場合、翻訳の開始は、第１のＯＲＦ内の、カノニカルの５’−ｍ７ＧｐｐｐＮキャップ依存性機構、およびＩＲＥＳエレメントの下流における、第２のＯＲＦ内の、キャップ非依存性の機構により生じうる。
【０２５１】
場合によって、遺伝子を、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）により連結することができる。ＩＲＥＳは、複数の遺伝子の、同時的な発現を可能としうる。例えば、ＩＲＥＳ配列は、単一のｍＲＮＡ転写物からの、複数のタンパク質の産生を許容しうる。リボソームは、ＩＲＥＳに、５’キャップ非依存的に結合し、翻訳を開始することが可能である。
【０２５２】
場合によって、ＩＲＥＳ配列は、５００塩基対でありうるか、またはほぼこの長さでありうる。ＩＲＥＳ配列は、３００塩基対〜１０００塩基対でありうる。例えば、ＩＲＥＳは、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、または１０００塩基対の長さでありうる。
【０２５３】
場合によって、ＩＲＥＳ配列を含む、ベクター内の下流遺伝子の発現を、低減することができる。例えば、ＩＲＥＳ配列に後続する遺伝子は、ＩＲＥＳ配列に先行する遺伝子に対して、発現が低減されうる。発現の低減は、先行する遺伝子に対する、１％〜９９％の低減でありうる。
【０２５４】
リンカー
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドリンカーは、本明細書で記載されるポリヌクレオチド内で用いることができる。ポリヌクレオチドリンカーは、本明細書で記載されるポリヌクレオチドを含むベクターと適合性である末端構造を創出するように付加されうる、所望の制限部位を含有する、ＤＮＡの二本鎖セグメントでありうる。場合によって、ポリヌクレオチドリンカーは、本明細書で記載されるポリヌクレオチドを含むベクターを修飾するために有用でありうる。例えば、ポリヌクレオチドリンカーを含む、ベクターの修飾は、複数のクローニング部位の変化、またはポリヒスチジンテールの付加でありうる。ポリヌクレオチドリンカーはまた、平滑末端インサートＤＮＡの末端を、制限酵素により切断され、粘着末端を伴うベクターへのクローニングに適応させるのに使用することもできる。ポリヌクレオチドリンカーの使用は、ベクターへの平滑末端ライゲーションより効率的な場合があり、後段の適用において、インサートを、ベクターから放出する方法をもたらしうる。場合によって、インサートは、治療適用に有用なポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列でありうる。
【０２５５】
ポリヌクレオチドリンカーは、オリゴマーでありうる。ポリヌクレオチドリンカーは、ＤＮＡ二本鎖、ＤＮＡ一本鎖、またはこれらの組合せでありうる。場合によって、リンカーは、ＲＮＡでありうる。場合によって、ポリヌクレオチドリンカーは、Ｔ４リガーゼにより、本明細書で記載されるポリヌクレオチドを含むベクターへとライゲーションすることができる。ライゲーションを容易とするために、過剰量のポリヌクレオチドリンカーを、インサートおよびベクターを含む組成物へと添加することができる。場合によって、リンカーを導入する前に、インサートおよびベクターを前処理する。例えば、メチラーゼによる前処理により、インサートＤＮＡの望ましくない切断を防止することができる。
【０２５６】
複数の実施形態では、ポリヌクレオチドリンカーは、ブタテッショウウイルス１２Ａ領域（Ｐ２Ａ）（配列番号４１）；Ａ型ウマ鼻炎ウイルス２Ａ領域（Ｅ２Ａ）（配列番号４３）；トセア・アシグナ（Thosea asigna）ウイルス２Ａ領域（Ｔ２Ａ）（配列番号４５）；または口蹄疫ウイルス２Ａ領域（Ｆ２Ａ）（配列番号４７）のヌクレオチド配列との、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、９９．５％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【０２５７】
ある特定の実施形態では、本明細書で記載されるポリヌクレオチドによりコードされる、２つまたはこれを超えるポリペプチドは、介在リンカーポリペプチドをコードする介在配列により隔てることができる。本明細書では、ポリヌクレオチドによりコードされる、２つまたはこれを超えるポリペプチドを隔てるアミノ酸配列を指す、「介在リンカーポリペプチド」という用語は、膜貫通ドメインを、細胞表面ポリペプチド（例えば、天然ポリペプチドのトランケート型変異体を含む）へと接続するように、本明細書で開示されるポリペプチド構築物内に、任意選択で組み入れられる、アミノ酸の配列を指す、「ペプチドリンカー」という用語と区別される。ある特定の場合には、介在リンカーポリペプチドは、易切断性介在リンカーポリペプチドである。一部の実施形態では、目的のポリペプチドは、易切断性介在リンカーポリペプチドにより連結された、融合タンパク質として発現する。ある特定の実施形態では、易切断性介在リンカーポリペプチドは、Ｆ／Ｔ２Ａ、Ｔ２Ａ、ｐ２Ａ、２Ａ、ＧＳＧ−ｐ２Ａ、ＧＳＧリンカー（配列番号１６）、およびフューリンリンク変異体のうちの、任意の１または複数でありうる。
【０２５８】
複数の実施形態では、介在リンカーポリペプチドは、ブタテッショウウイルス１２Ａ領域（Ｐ２Ａ）（配列番号４１）；Ａ型ウマ鼻炎ウイルス２Ａ領域（Ｅ２Ａ）（配列番号４４）；トセア・アシグナ（Thosea asigna）ウイルス２Ａ領域（Ｔ２Ａ）（配列番号４６）；または口蹄疫ウイルス２Ａ領域（Ｆ２Ａ）（配列番号４８）と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、９９．５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸配列を含む。
【０２５９】
場合によって、ウイルス２Ａ配列を使用することができる。２Ａエレメントは、５〜１００塩基対を有するＩＲＥＳより短くなりうる。場合によって、２Ａ配列は、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または１００ヌクレオチドの長さを有しうる。２Ａを連結された遺伝子は、単一のオープンリーディングフレーム内で発現させることができ、「自己切断」は、２ＡポリペプチドＣ末端の、最後の２つのアミノ酸であるＧ−Ｐ間で、共翻訳的に生じることが可能であり、等量の共発現タンパク質をもたらす。
【０２６０】
ウイルス２Ａ配列は、約２０アミノ酸でありうる。場合によって、ウイルス２Ａ配列は、コンセンサスモチーフである、Ａｓｐ−Ｖａｌ／Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（配列番号２２９）を含有しうる。コンセンサスモチーフ配列は、共翻訳的に作用しうる。例えば、グリシン残基とプロリン残基との、正常なペプチド結合の形成を防止することができ、これは、リボソームスキッピングおよび新生ポリペプチドの切断を結果としてもたらしうる。この効果は、等モルレベルで、複数の遺伝子をもたらしうる。
【０２６１】
２Ａペプチドは、単一のオープンリーディングフレーム内の、複数のタンパク質の、その後、リボソームスキッピング機構を介して、個別のポリペプチドへと切断されうる、ポリペプチドへの翻訳を可能としうる（Funston, Kallioinen et al. 2008）。一部の実施形態では、２Ａ配列は、Ｆ／Ｔ２Ａ、Ｔ２Ａ、ｐ２Ａ、２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２Ａ、およびＢｍＣＰＶ２Ａ、ＢｍＩＦＶ２Ａ、ならびにこれらの任意の組合せを含みうる。
【０２６２】
場合によって、ベクターは、ＩＲＥＳ配列および２Ａポリヌクレオチドリンカー配列を含みうる。他の場合には、２Ａペプチドと連結された、複数の遺伝子の発現は、２Ａペプチドに前置されたスペーサー配列（ＧＳＧ（配列番号１６））により容易とすることができる。場合によって、構築物は、スペーサー、リンカー、アダプター、プロモーター、またはこれらの組合せを組み合わせうる。例えば、構築物は、異なる２Ａペプチドと共に、スペーサー（ＳＧＳＧ（配列番号１８）またはＧＳＧ（配列番号１６））およびフューリン介在ポリペプチドリンカー（Ｒ−Ａ−Ｋ−Ｒ（配列番号２３０））切断部位を有しうる。スペーサーは、Ｉ−Ｃｅｕｉでありうる。場合によって、リンカーは、操作することができる。例えば、リンカーは、疎水性などの化学的特徴を含むようにデザインすることができる。場合によって、少なくとも２つのリンカー配列は、同じタンパク質をもたらしうる。他の場合には、複数のリンカーを、ベクター内で使用することができる。
【０２６３】
ある特定の場合には、介在リンカーポリペプチドは、アミノ酸配列「ＲＡＫＲ（配列番号２３０）」を含みうる。ある特定の場合には、フューリン介在リンカーポリペプチドは、「ＡＧＡＧＣＴＡＡＧＡＧＧ（配列番号２３１）」を含むポリヌクレオチド配列によりコードされうる。
【０２６４】
ある特定の場合には、介在リンカーポリペプチドは、下記の表に開示された配列を含むリンカーでありうる。
【０２６５】
【表１】
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【０２６６】
一部の実施形態では、リンカーは、本明細書で記載されるポリヌクレオチド内で用いることができる。リンカーは、可撓性リンカー、非可撓性リンカー、ｉｎ  ｖｉｖｏ切断可能リンカー、またはこれらの任意の組合せでありうる。場合によって、リンカーは、機能的ドメインを、併せて連結する（可撓性リンカーおよび非可撓性リンカーの場合のように）場合もあり、ｉｎ  ｖｉｖｏ切断可能リンカーの場合のように、機能的ドメインを、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて放出する場合もある。
【０２６７】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドリンカーおよび介在リンカーポリペプチドは、生物学的活性を改善することが可能であり、発現収量を増大させ、所望の薬物動態プロファイルを達成しうる。
【０２６８】
場合によって、本明細書で記載される介在リンカーポリペプチド配列は、可撓性リンカーを含みうる。可撓性リンカーは、接合されるドメインが、ある程度の移動または相互作用を必要とする場合に適用することができる。可撓性リンカーは、小型、非極性（例えば、Ｇｌｙ）、または極性（例えば、ＳｅｒまたはＴｈｒ）のアミノ酸から構成されうる。可撓性リンカーは、Ｇｌｙ残基およびＳｅｒ残基の連なりから主になる配列（「ＧＳ」リンカー）を有しうる。可撓性リンカーの例は、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎの配列（配列番号２２１、例えば、配列番号２０または２２）を有しうる。コピー数である「ｎ」を調整することにより、この例示的ＧＳリンカーの長さを最適化して、機能的ドメインの適切な分離を達成することもでき、必要なドメイン間相互作用を維持することもできる。ＧＳリンカーのほかに、他の可撓性リンカーも、組換え融合タンパク質に用いることができる。場合によって、可撓性リンカーはまた、ＧｌｙおよびＳｅｒなど、小型アミノ酸または極性アミノ酸に富む場合もあるが、可撓性を維持するように、ＴｈｒおよびＡｌａなど、さらなるアミノ酸を含有する場合もある。他の場合には、ＬｙｓおよびＧｌｕなどの極性アミノ酸を使用して、可溶性を改善することができる。
【０２６９】
本明細書で記載されるリンカー配列内に組み入れられる可撓性リンカーは、良好な可撓性および可溶性をもたらすように、ＧｌｙおよびＳｅｒなど、小型アミノ酸または極性アミノ酸に富む場合がある。可撓性リンカーは、ある特定の移動または相互作用が、融合タンパク質ドメインに所望される場合に適切でありうる。加えて、可撓性リンカーは、非可撓性構造を有さない場合もあるが、機能的ドメイン間の距離を保持する、受動的リンカーとして用いられる場合もある。可撓性リンカーの長さを調整して、適正なフォールディングを可能とすることもでき、融合タンパク質の最適な生物学的活性を可能とすることもできる。
【０２７０】
本明細書で記載される介在リンカーポリペプチドは、場合によって、非可撓性リンカーをさらに含みうる。非可撓性リンカーを用いて、ポリペプチドのドメイン間で、一定の距離を維持することができる。非可撓性リンカーの例は、少数を挙げれば、アルファヘリックス形成リンカー、Ｐｒｏに富む配列、（ＸＰ）ｎ、Ｘ−Ｐｒｏ骨格（配列番号２３９）、Ａ（ＥＡＡＡＫ）ｎＡ（配列番号２４０）（ｎ＝２〜５）でありうる。非可撓性リンカーは、場合によって、αヘリックス構造を取ることにより、または複数のＰｒｏ残基を含有することにより、比較的剛直な構造を呈しうる。
【０２７１】
場合によって、本明細書で記載される介在リンカーポリペプチドは、切断可能でありうる。他の場合には、介在リンカーポリペプチドは、切断可能ではない。切断可能でないリンカーは、機能的ドメインを、ｉｎ  ｖｉｖｏ過程またはｅｘ  ｖｉｖｏ過程を通して１つの分子として作用するように、共有結合的に、併せて接合しうる。介在リンカーポリペプチドはまた、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、切断可能でもありうる。例えば、切断可能な介在リンカーポリペプチドは、遊離の機能的ドメインを、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、放出するように導入することができる。介在リンカーポリペプチドは、例えば、還元剤およびプロテアーゼの存在により切断されうる。例えば、ジスルフィド結合の還元を用いて、切断可能な介在リンカーポリペプチドを作製することができる。ジスルフィド介在リンカーポリペプチドの場合、グルタチオンなどのチオールとのジスルフィド交換を介する切断イベントが切断をもたらしうるであろう。他の場合には、組換え融合タンパク質内の介在リンカーポリペプチドの、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける切断はまた、ｉｎ  ｖｉｖｏの、病理学的状態（例えば、がんまたは炎症）下の、特異的細胞内もしくは組織内で発現させうるか、またはある特定の細胞コンパートメント内に拘束されうるプロテアーゼによっても実行することができる。場合によって、切断可能な介在リンカーポリペプチドは、ターゲティングされた切断を可能としうる。例えば、多くのプロテアーゼの特異性は、拘束されたコンパートメント内の、介在リンカーポリペプチドの、緩徐な切断をもたらしうる。切断可能な介在リンカーポリペプチドはまた、ヒドラゾン、ペプチド、ジスルフィド、またはチオエーテル（thioesther）も含みうる。例えば、ヒドラゾンは、血清中の安定性を付与しうる。他の場合には、ヒドラゾンは、酸性区画内の切断を可能としうる。酸性区画は、最大で約７のｐＨを有しうる。リンカーはまた、チオエーテルも含みうる。チオエーテルは、非還元性でありうる、および／または細胞内タンパク質分解のためにデザインすることができる。
【０２７２】
リンカーは、操作リンカーでありうる。リンカーをデザインする方法は、コンピュータ計算による方法でありうる。場合によって、コンピュータ計算による方法は、グラフ法を含みうる。コンピュータ計算法を使用して、データベースから導出された三次元ペプチド構造のライブラリーから、適切なペプチドを検索することができる。例えば、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）を使用して、リンカーの選択されたアミノ酸の間の間隔の距離を測ることができる。
【０２７３】
一部の実施形態では、フューリンポリペプチドおよび２Ａポリペプチドを含むポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチドが提供されるが、この場合、フューリンポリペプチドおよび２Ａポリペプチドが、少なくとも３つの疎水性アミノ酸を含む介在リンカーポリペプチドにより接続されている。場合によって、少なくとも３つの疎水性アミノ酸は、グリシン（Ｇｌｙ）（Ｇ）、アラニン（Ａｌａ）（Ａ）、バリン（Ｖａｌ）（Ｖ）、ロイシン（Ｌｅｕ）（Ｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）（Ｉ）、プロリン（Ｐｒｏ）（Ｐ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）（Ｆ）、メチオニン（Ｍｅｔ）（Ｍ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）（Ｗ）からなるリストから選択される。
【０２７４】
ポリペプチド構築物の発現
一部の実施形態では、本明細書で記載されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドを、例えば、ウイルス送達系および非ウイルス送達系の構成的プロモーター（下記を参照されたい）を使用して構成的に発現させることができる。他の実施形態では、本明細書で提示されるポリペプチド構築物、ポリヌクレオチド、および方法を、遺伝子スイッチ系により実行することができる。「遺伝子スイッチ（gene switch）」という用語は、プロモーターと関連する応答エレメントの組合せを指し、例えば、１または複数のリガンドの存在下で、応答エレメントおよびプロモーターを組み込んだ遺伝子の発現をモジュレートする、ＥｃＲベースの系を指す。緊密に調節された誘導性遺伝子発現系または遺伝子スイッチは、遺伝子治療、細胞内の、大スケールのタンパク質の作製、細胞ベースのハイスループットのスクリーニングアッセイ、機能的なゲノミクス、ならびにトランスジェニック植物およびトランスジェニック動物における形質の調節など、多様な適用に有用である。このような誘導性遺伝子発現系は、リガンド誘導性異種遺伝子発現系を含みうる。
【０２７５】
ＥｃＲベースの遺伝子スイッチの初期形は、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）ＥｃＲ（ＤｍＥｃＲ）ポリペプチドおよびマウス（Mus musculus）ＲＸＲ（ＭｍＲＸＲ）ポリペプチドを使用し、これらの受容体が、ステロイドであるポナステロンＡの存在下で、哺乳動物細胞系およびトランスジェニックマウスにおいて、レポーター遺伝子をトランス活性化させることを示した（Christopherson et al., 1992；No et al., 1996）。その後、Suhr et al., 1998は、非ステロイド系のエクジソンアゴニストであるテブフェノジドが、外因性ヘテロ二量体パートナーの非存在下で、カイコ（Bombyx mori）ＥｃＲ（ＢｍＥｃＲ）を介して、哺乳動物細胞内のレポーター遺伝子の、高レベルのトランス活性化を誘導することを示した。
【０２７６】
ＰＣＴ国際特許出願／米国出願第９７／０５３３０号明細書（国際公開第９７／３８１１７号パンフレット）およびＰＣＴ国際特許出願／米国出願第９９／０８３８１号明細書（国際公開第９９／５８１５５号パンフレット）は、外因性遺伝子の発現をモジュレートするための方法であって、外因性遺伝子およびエクジソン応答エレメントを含むＤＮＡ構築物が、それに対するリガンドの存在下で、かつ、任意選択で、サイレントパートナーとして作用することが可能な受容体の存在下で、エクジソン応答エレメントに結合して、遺伝子発現を誘導するエクジソン受容体を含む、第２のＤＮＡ構築物により活性化する方法について開示している。この例では、エクジソン受容体を、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）から単離した。典型的に、このような系は、最適の活性化をもたらすために、サイレントパートナー、好ましくはレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）の存在を必要とする。哺乳動物細胞内では、昆虫エクジソン受容体（ＥｃＲ）は、哺乳動物レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）と、ヘテロ二量体化し、これにより、標的遺伝子または異種遺伝子の発現を、リガンド依存的に調節するのに使用することが可能である。ＰＣＴ国際特許出願／米国出願第９８／１４２１５号明細書（国際公開第９９／０２６８３号パンフレット）は、カイコガであるカイコ（Bombyx mori）から単離されたエクジソン受容体が、外因性の二量体パートナーを必要とせずに、哺乳動物系内で機能的であることについて開示している。
【０２７７】
米国特許第６，２６５，１７３号明細書は、受容体のステロイド／甲状腺スーパーファミリーの多様なメンバーを、遺伝子発現系における使用のための、ＵＳＰの、少なくとも二量体化ドメインを含むキイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）ウルトラスピラクル受容体（ＵＳＰ）またはその断片と組み合わせうることについて開示している。米国特許第５，８８０，３３３号明細書は、植物において使用された、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）のＥｃＲおよびウルトラスピラクル（ＵＳＰ）によるヘテロ二量体系であって、トランス活性化ドメインおよびＤＮＡ結合性ドメインが、２つの異なるハイブリッドタンパク質上に位置する、ヘテロ二量体系について開示している。これらの場合の各々では、トランス活性化ドメインおよびＤＮＡ結合性ドメイン（ＰＣＴ国際特許出願／米国出願第９８／１４２１５号明細書における通りに、天然のＥｃＲとして、またはＰＣＴ国際特許出願／米国出願第９７／０５３３０号明細書における通りに、修飾ＥｃＲとして）を、単一の分子へと組み込み、ＵＳＰまたはＲＸＲである、他のヘテロ二量体パートナーを、それらの天然状態において使用した。
【０２７８】
ＰＣＴ国際特許出願／米国出願第０１／０９０５号明細書は、トランス活性化ドメインと、ＤＮＡ結合ドメインとを２つの異なるタンパク質上に置くことにより互いから隔てた、エクジソン受容体ベースの誘導性遺伝子発現系が、リガンドの非存在下で、バックグラウンド活性の大幅な低減を結果としてもたらし、リガンドの存在下で、バックグラウンドを上回る活性の著明な増大を結果としてもたらすことについて開示している。この２ハイブリッド系は、ＰＣＴ出願／米国出願第９７／０５３３０号明細書およびＰＣＴ出願／米国出願第９８／１４２１５号明細書の出願において開示されている、２つの系と比較して、著明に改善された誘導性遺伝子発現モジュレーション系である。２ハイブリッド系は、ＤＮＡ結合性ドメインが、遺伝子上のＤＮＡ結合性部位に結合すると、トランス活性化ドメインが、プロモーターを、より効果的に活性化させるように、相互作用タンパク質の対が、転写活性化ドメインを、ＤＮＡ結合性ドメインに対して、より好適な位置に置く能力を利用すると考えられる（例えば、米国特許第５，２８３，１７３号明細書を参照されたい）。２ハイブリッド遺伝子発現系は、核内受容体ポリペプチドへと融合させたＤＮＡ結合性ドメインをコードする、第１の遺伝子発現カセット、および異なる核内受容体ポリペプチドへと融合させたトランス活性化ドメインをコードする、第２の遺伝子発現カセットである、２つの遺伝子発現カセットを含む。リガンドの存在下では、第１のポリペプチドの、第２のポリペプチドとの相互作用を促進するコンフォメーション変化が誘導され、これにより、ＤＮＡ結合性ドメインと、トランス活性化ドメインとの二量体化が結果としてもたらされると考えられる。ＤＮＡ結合性ドメインおよびトランス活性化ドメインは、２つの異なる分子上に存在するので、リガンドの非存在下では、バックグラウンド活性が、大幅に低減される。
【０２７９】
エクジソン受容体（ＥｃＲ）とは、核内受容体スーパーファミリーのメンバーであり、サブファミリー１、群Ｈ（本明細書では、「群Ｈ核内受容体」と称する）へと分類される。各群のメンバーは、Ｅ（リガンド結合）ドメイン内で、４０〜６０％のアミノ酸同一性を共有する（Laudet et al., A Unified Nomenclature System for the Nuclear Receptor Subfamily, 1999; Cell 97: 161-163）。エクジソン受容体に加えて、この核内受容体サブファミリー１、群Ｈの他のメンバーは、ユビキタス受容体（ＵＲ）、オーファン受容体１（ＯＲ−１）、ステロイドホルモン核内受容体１（ＮＥＲ−１）、ＲＸＲ相互作用性タンパク質１５（ＲＩＰ−１５）、肝臓ｘ受容体β（ＬＸＲβ）、ステロイドホルモン受容体様タンパク質（ＲＬＤ−１）、肝臓ｘ受容体（ＬＸＲ）、肝臓ｘ受容体α（ＬＸＲα）、ファルネソイドｘ受容体（ＦＸＲ）、受容体相互作用性タンパク質１４（ＲＩＰ−１４）、およびファルネソール受容体（ＨＲＲ−１）を含む。
【０２８０】
場合によって、誘導性プロモーターは、Ｉｎｔｒｅｘｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製のＲＨＥＯＳＷＩＴＣＨ（登録商標）遺伝子スイッチなど、低分子リガンド誘導性の、２つのポリペプチドによる、エクジソン受容体ベースの遺伝子スイッチでありうる。場合によって、遺伝子スイッチは、それらの各々が、参照によりその全体において組み込まれる、ＰＣＴ／米国出願第２００１／００９０５０号明細書（国際公開第２００１／０７０８１６号パンフレット）；米国特許第７，０９１，０３８号明細書；同第７，７７６，５８７号明細書；同第７，８０７，４１７号明細書；同第８，２０２，７１８号明細書；ＰＣＴ／米国出願第２００１／０３０６０８号明細書（国際公開第２００２／０２９０７５号パンフレット）；米国特許第８，１０５，８２５号明細書；同第８，１６８，４２６号明細書；ＰＣＴ／1J５第２００２／００５２３５号明細書（国際公開第２００２／０６６６１３号パンフレット）；米国特許出願公開第１０／４６８，２００号明細書（米国公開第２０１２０１６７２３９号明細書）；ＰＣＴ／米国出願第２００２／００５７０６号明細書（国際公開第２００２／０６６６１４号パンフレット）；米国特許第７，５３１，３２６号明細書；同第８，２３６，５５６号明細書；同第８，５９８，４０９号明細書；ＰＣＴ／米国出願第２００２／００５０９０号明細書（国際公開第２００２／０６６６１２号パンフレット）；米国特許第８，７１５，９５９号明細書（米国公開第２００６０１００４１６号明細書）；ＰＣＴ／米国出願第２００２／００５２３４号明細書（国際公開第２００３／０２７２６６号パンフレット）；米国特許第７，６０１，５０８号明細書；同第７，８２９，６７６号明細書；同第７，９１９，２６９号明細書；同第８，０３０，０６７号明細書；ＰＣＴ／米国出願第２００２／００５７０８号明細書（国際公開第２００２／０６６６１５号パンフレット）；米国特許出願公開第１０／４６８，１９２号明細書（米国公開第２０１１０２１２５２８号明細書）；ＰＣＴ／米国出願第２００２／００５０２６号明細書（国際公開第２００３／０２７２８９号パンフレット）；米国特許第７，５６３，８７９号明細書；同第８，０２１，８７８号明細書；同第８，４９７，０９３号明細書；ＰＣＴ／米国出願第２００５／０１５０８９号明細書（国際公開第２００５／１０８６１７号パンフレット）；米国特許第７，９３５，５１０号明細書；同第８，０７６，４５４号明細書；ＰＣＴ／米国出願第２００８／０１１２７０号明細書（国際公開第２００９／０４５３７０号パンフレット）；米国特許出願公開第１２／２４１，０１８号明細書（米国公開第２００９０１３６４６５号明細書）；ＰＣＴ／米国出願第２００８／０１１５６３号明細書（国際公開第２００９／０４８５６０号パンフレット）；米国特許出願公開第１２／２４７，７３８号明細書（米国公開第２００９０１２３４４１号明細書）；ＰＣＴ／米国出願第２００９／００５５１０号明細書（国際公開第２０１０／０４２１８９号パンフレット）；米国特許出願公開第１３／１２３，１２９号明細書（米国公開第２０１１０２６８７６６号明細書）；ＰＣＴ／米国出願第２０１１／０２９６８２号明細書（国際公開第��０１１／１１９７７３号パンフレット）；米国特許出願公開第１３／６３６，４７３号明細書（米国公開第２０１３０１９５８００号明細書）；ＰＣＴ／米国出願第２０１２／０２７５１５号明細書（国際公開第２０１２／１２２０２５号パンフレット）；および米国特許第９，４０２，９１９号明細書において記載されている系のうちのいずれかの、エクジソンベースの受容体による構成要素から選択しうるが、これらに限定されない。
【０２８１】
改変エフェクター細胞
細胞タグとして、エフェクター細胞内で機能することが可能な、１または複数のポリペプチド構築物を発現するように改変されたエフェクター細胞が提供される。
【０２８２】
本明細書で使用される「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」とは、細胞媒介性免疫において、中心的な役割を果たす、リンパ球の種類である。「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」は、細胞表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在により、Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）など、他のリンパ球と区別されうる。
【０２８３】
一部の実施形態では、改変エフェクター細胞は、Ｔ細胞および／またはナチュラルキラー細胞を含む改変免疫細胞である。Ｔ細胞またはＴリンパ球は、細胞媒介性免疫に関与する白血球の亜型である。例示的なＴ細胞は、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ＴＨ１７細胞、ステムセルメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞、エフェクターＴ細胞、調節性Ｔ細胞、またはナチュラルキラーＴ細胞を含む。
【０２８４】
ヘルパーＴ細胞（ＴＨ細胞）は、Ｂ細胞の、血漿細胞およびメモリーＢ細胞への成熟、ならびに細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージの活性化を含む免疫過程において、他の白血球を支援する。場合によって、ＴＨ細胞は、細胞表面上のＣＤ４糖タンパク質の発現のために、ＣＤ４＋  Ｔ細胞として公知である。ヘルパーＴ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上で発現する、ＭＨＣクラスＩＩ分子により、ペプチド抗原を提示されると、活性化する。活性化すると、ヘルパーＴ細胞は、急速に分裂し、活性の免疫応答を調節するか、またはこれらを支援する、サイトカインと呼ばれる、小型のタンパク質を分泌する。これらの細胞は、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ１７、Ｔｈ９、またはＴＦＨを含む、いくつかの亜型であって、異なるサイトカインを分泌して、異なる種類の免疫応答を容易とする、いくつかの亜型のうちの１つへと分化しうる。ＡＰＣからのシグナル伝達は、Ｔ細胞を、特定の亜型へと方向付ける。一部の実施形態では、本明細書に、分泌型サイトカインは、組換えサイトカインでありうる。
【０２８５】
細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＣ細胞またはＣＴＬ）は、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を破壊し、また、移植片拒絶にも関与している。これらの細胞はまた、それらの表面上において、ＣＤ８糖タンパク質を発現するので、ＣＤ８＋  Ｔ細胞としても公知である。これらの細胞は、全ての有核細胞の表面上に存在する、ＭＨＣクラスＩ分子と会合する抗原に結合することにより、それらの標的を認識する。調節性Ｔ細胞により分泌される、ＩＬ−１０、アデノシン、および他の分子を介して、ＣＤ８＋細胞は、アネルギー状態へと不活化される場合があり、これにより、自己免疫疾患を防止する。
【０２８６】
メモリーＴ細胞は、感染が消失した後で、長期にわたり存続する、抗原特異的Ｔ細胞のサブセットである。メモリーＴ細胞は、それらのコグネイト抗原へと再曝露されると、多数のエフェクターＴ細胞へと急速に拡大増殖し、これにより、免疫系に、過去の感染に対する「メモリー」をもたらす。メモリーＴ細胞は、亜型：ステムセルメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ細胞）および２種類のエフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ細胞およびＴＥＭＲＡ細胞）を含む。メモリー細胞は、ＣＤ４＋細胞の場合もあり、ＣＤ８＋細胞の場合もある。メモリーＴ細胞は、細胞表面タンパク質である、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、および／またはＣＣＲ７を発現しうる。
【０２８７】
かつては、サプレッサーＴ細胞として公知であった、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）は、免疫寛容の維持において役割を果たす。調節性Ｔ細胞の主要な役割は、Ｔ細胞媒介性免疫を遮断して、免疫反応を終了させ、胸腺内の陰性選択過程を回避した自己反応性Ｔ細胞を抑制することである。
【０２８８】
ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）は、適応免疫系を、自然免疫系と橋渡しする。主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子により提示されるペプチド抗原を認識する従来のＴ細胞と異なり、ＮＫＴ細胞は、ＣＤ１ｄと呼ばれる分子により提示される糖脂質抗原を認識する。活性化すると、これらの細胞は、Ｔｈ細胞およびＴｃ細胞の両方に帰せられた機能（すなわち、サイトカインの産生および細胞溶解性／細胞殺滅分子の放出）を果たしうる。ＮＫＴ細胞はまた、一部の腫瘍細胞およびヘルペスウイルスに感染した細胞を認識し、これらを消失させることも可能である。
【０２８９】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞とは、自然免疫系の、細胞傷害性リンパ球の種類である。場合によって、ＮＫ細胞は、ウイルス感染および／または腫瘍形成に対する、最前線の防御をもたらす。ＮＫ細胞は、感染細胞上またはがん性細胞上に提示されたＭＨＣを検出することが可能であり、サイトカイン放出を誘発し、その後、溶解およびアポトーシスを誘導する。ＮＫ細胞はさらに、抗体および／またはＭＨＣの非存在下で、ストレス細胞を検出することが可能であり、これにより、迅速な免疫応答を可能とする。
【０２９０】
ウイルスのベースの送達系
本開示はまた、本明細書で記載される核酸を挿入したウイルスのベースの系などの送達系も提供する。代表的なウイルス発現ベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベースのベクター（例えば、Ｃｒｕｃｅｌｌ，Ｉｎｃ．（Ｌｅｉｄｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から市販されている、アデノウイルスベースのＰｅｒ．Ｃ６系）、レンチウイルスベースのベクター（例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）製の、レンチウイルスベースのｐＬＰＩ）、レトロウイルスベクター（例えば、ｐＣＦＢ−ＥＧＳＨを付加したｐＦＢ−ＥＲＶ）、およびヘルペスウイルスベースのベクターを含むがこれらに限定されない。ある実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。レンチウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクターは、トランス遺伝子の、娘細胞における、長期にわたる、安定的な組込みおよびその繁殖を可能とするので、長期にわたる遺伝子導入を達成するのに適するツールである。レンチウイルスベクターは、肝細胞などの非増殖性細胞に形質導入しうるという点で、マウス白血病ウイルスなど、がんレトロウイルスに由来するベクターに優る追加の利点を有する。レンチウイルスベクターはまた、低免疫原性という追加の利点も有する。さらなる実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクターである。さらなる実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターである。一般に、かつ、複数の実施形態では、適切なベクターは、少なくとも１つの生物において機能的な複製起点、プロモーター配列、好都合な制限エンドヌクレアーゼ部位、および１または複数の選択用マーカー（例えば、国際公開第０１／９６５８４号パンフレット、国際公開第０１／２９０５８号パンフレット、および米国特許第６，３２６，１９３号明細書）を含有する。
【０２９１】
さらなる適切なベクターは、宿主細胞のＤＮＡへと、ランダムに組み込まれる場合もあり、発現ベクターと、宿主細胞の染色体との特異的組換えを可能とする組換え部位を含む場合もある、組込み用発現ベクターを含む。このような組込み用発現ベクターは、宿主細胞の染色体の内因性発現制御配列を用いて、所望のタンパク質の発現をもたらしうる。部位特異的に組み込むベクターの例は、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）（例えば、ｐｃＤＮＡ（商標）５／ＦＲＴ）製のｆｌｐ−ｉｎ系、またはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（ＬａＪｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）製のｐＥｘｃｈａｎｇｅ−６  Ｃｏｒｅ  Ｖｅｃｔｏｒｓにおいて見出されうるｃｒｅ−ｌｏｘ系などのｃｒｅ−ｌｏｘ系の構成要素を含む。宿主細胞染色体へとランダムに組み込まれるベクターの例は、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）製のｐｃＤＮＡ３．１（Ｔ抗原の非存在下で導入される場合）、およびＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）製のｐＣＩまたはｐＦＮ１０Ａ（ＡＣＴ）ＦＬＥＸＩ（商標）を含む。さらなるプロモーターエレメント、例えば、エンハンサーは、転写開始の頻度を調節する。典型的に、プロモーターエレメントは、開始部位の３０〜１１０ｂｐ上流の領域内に位置するが、多数のプロモーターは、開始部位の下流にも、機能的なエレメントを含有することが近年示されている。エレメントが、互いに対して逆位であるか、または移動している場合にも、プロモーター機能が保存されるように、プロモーターエレメントの間のスペーシングは、柔軟であることが多い。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターでは、活性が減衰し始める前に、プロモーターエレメントの間のスペーシングが、５０ｂｐの距離まで増大する場合がある。個別のエレメントは、転写を活性化させるように、プロモーターに応じて、共作動的に機能する場合もあり、独立に機能する場合もあると考えられる。
【０２９２】
適切なプロモーターの１つの例は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即初期プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それへと作動的に連結された、任意のポリヌクレオチド配列の、高レベルの発現を駆動することが可能である、強力な構成的プロモーター配列である。
【０２９３】
適切なプロモーターの別の例は、ヒト伸長成長因子１アルファ１（ｈＥＦ１ａ１）である。複数の実施形態では、本開示のＣＡＲおよび／またはＴＣＲを含むベクター構築物は、ｈＥＦ１ａ１機能的変異体を含む。
【０２９４】
しかし、サルウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＬＴＲ（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン−バーウイルス即初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーターのほか、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、およびクレアチンキナーゼプロモーターなどであるがこれらに限定されない、ヒト遺伝子プロモーターを含むがこれらに限定されない、他の構成的プロモーター配列もまた、使用することができる。さらに、本開示は、構成的プロモーターの使用に限定されないものとする。誘導性プロモーターもまた、本開示の一部として想定される。誘導性プロモーターの使用は、このような発現が所望される場合に、それが作動的に連結されたポリヌクレオチド配列の発現をオンにするか、または発現が所望されない場合に、発現をオフにすることが可能な分子スイッチをもたらす。誘導性プロモーターの例は、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、およびテトラサイクリンプロモーターを含むがこれらに限定されない。
【０２９５】
ＣＡＲもしくはＴＣＲポリペプチドまたはその部分の発現を評価するために、細胞へと導入される発現ベクターはまた、ウイルスベクターを介してトランスフェクトまたは感染させることが求められる細胞集団からの、発現細胞の同定および選択を容易とする、選択用マーカー遺伝子もしくはレポーター遺伝子またはこれらの両方も含有しうる。他の態様では、選択用マーカーは、別個のＤＮＡ片上に保有され、共トランスフェクション手順で使用さる場合もある。選択用マーカーおよびレポーター遺伝子のいずれも、宿主細胞内の発現を可能とするように、適切な調節配列で挟むことができる。有用な選択用マーカーは、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）およびアンピシリン耐性遺伝子などの抗生剤耐性遺伝子を含む。一部の実施形態では、トランケート型表皮増殖因子受容体（ＨＥＲ１ｔ）タグを、選択用マーカー遺伝子として使用することができる。
【０２９６】
レポーター遺伝子を、トランスフェクトされた可能性がある細胞を同定し、調節配列の機能性について査定するために使用することができる。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエントの生物または組織において存在しないか、またはこれらにより発現せず、その発現が、何らかの、容易に検出可能な特性、例えば、酵素活性により顕在化されるポリペプチドをコードする遺伝子である。ＤＮＡを、レシピエント細胞へと導入した後の適切な時点において、レポーター遺伝子の発現についてアッセイする。適切なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子、または緑色蛍光タンパク質遺伝子（例えば、Ui-Tei et al., FEBS Letters 479: 79-82 (2000)）を含むことができる。適切な発現系が周知であり、公知の技法を使用して調製することもでき、市販品を購入することもできる。一般に、最高レベルのレポーター遺伝子の発現を示す、最小の５’側フランキング領域を伴う構築物は、プロモーターとして同定される。このようなプロモーター領域は、レポーター遺伝子へと連結することができ、薬剤を、プロモーター駆動型転写をモジュレートする能力について査定するのに使用することができる。
【０２９７】
いくつかの実施形態では、ベクターは、トランス遺伝子の発現を駆動するｈＥＦ１ａ１プロモーター、転写を増強するウシ成長ホルモンポリＡ配列、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）のほか、ｐＦＵＧＷプラスミドに由来するＬＴＲ配列を含む。
【０２９８】
当技術分野では、遺伝子を細胞へと導入し発現させる方法が公知である。発現ベクターの文脈では、ベクターを、当技術分野における任意の方法により、宿主細胞、例えば、哺乳動物細胞、細菌細胞、酵母細胞、または昆虫細胞へと、たやすく導入することができる。例えば、発現ベクターは、宿主細胞へと、物理的手段により導入することもでき、化学的手段により導入することもでき、生物学的手段により導入することもできる。
【０２９９】
ポリヌクレオチドを、宿主細胞へと導入するための物理的方法は、リン酸カルシウム沈殿法、リポフェクション法、遺伝子銃法、マイクロインジェクション法、電気穿孔法などを含む。当技術分野では、ベクターおよび／または外因性核酸を含む細胞を作製するための方法が周知である。例えば、Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001))を参照されたい。複数の実施形態では、ポリヌクレオチドを、宿主細胞へと導入するための方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションまたはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）トランスフェクションである。
【０３００】
目的のポリヌクレオチドを、宿主細胞へと導入するための生物学的方法は、ＤＮＡベクターおよびＲＮＡベクターの使用を含む。ウイルスベクターと、とりわけ、レトロウイルスベクターとは、遺伝子を、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞へと挿入するための、最も広く使用される方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスなどに由来しうる。例えば、米国特許第５，３５０，６７４号明細書および同第５，５８５，３６２号明細書を参照されたい。
【０３０１】
ポリヌクレオチドを、宿主細胞へと導入するための化学的手段は、高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油エマルジョン、ミセル、混合型ミセル、およびリポソームを含む脂質ベースの系などのコロイド分散系を含む。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおける、送達媒体としての使用のための、例示的なコロイド状系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。
【０３０２】
ウイルス送達系を用いる場合、例示的な送達媒体は、リポソームである。核酸の、宿主細胞への導入（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｖｏにおける）のために、脂質製剤の使用が想定される。別の態様では、核酸は、脂質と会合させることができる。脂質と会合させた核酸は、リポソームの脂質二重層内に散在する、水性のリポソーム内部に封入することもでき、リポソームおよびオリゴヌクレオチドのいずれとも会合する連結分子を介して、リポソームへと接合させることもでき、リポソーム内に取り込むこともでき、リポソームと複合体化させることもでき、脂質を含有する溶液中に分散させることもでき、脂質と混合することもでき、脂質と組み合わせることもでき、脂質中の懸濁液として含有することもでき、ミセルと共に含有するかもしくは複合体化させることもでき、または他の形で脂質と会合させることもできる。脂質、脂質／ＤＮＡ、または脂質／発現ベクターに関連する組成物は、溶液中の、任意の特定の構造に限定されない。例えば、組成物は、ミセルとしての二重層構造内に存在する場合もあり、「コラプシング」構造を伴う二重層構造内に存在する場合もある。組成物はまた、単に、溶液中に散在させることもでき、おそらく、サイズまたは形状が均質ではない凝集物を形成しうる。脂質とは、天然脂質の場合もあり、合成脂質の場合もある、脂肪性物質である。例えば、脂質は、天然では、細胞質内で発生する脂肪性液滴のほか、長鎖脂肪族炭化水素、ならびに脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、およびアルデヒドなど、それらの誘導体を含有する化合物のクラスを含む。
【０３０３】
使用に適する脂質は、市販元から購入することができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）は、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．から購入することができ、ジセチルリン酸（「ＤＣＰ」）は、Ｋ  ＆  Ｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎ．Ｙ．）から購入することができ、コレステロール（「Ｃｈｏｉ」）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇから購入することができ、ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）および他の脂質は、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、Ａｌａ．）から購入することができる。クロロホルムまたはクロロホルム／メタノール中の脂質原液は、約−２０℃で保存することができる。クロロホルムは、メタノールよりたやすく蒸発するので、唯一の溶媒として使用される。「リポソーム」とは、封入された脂質の二重層または脂凝集物の作出により形成される、様々な単一の脂質媒体および多層性脂質媒体を包含する、一般的な用語である。リポソームは、リン脂質二重層膜および内部の水性媒質を伴う小胞構造を有するものとして特徴づけることができる。多層性リポソームは、水性媒質により分離された複数の脂質層を有する。多層性リポソームは、リン脂質を、過剰量の水溶液中に懸濁させると、自発的に形成される。脂質成分は、閉止構造を形成する前に、自己転移を経、脂質二重層の間に、水および溶解させた溶質を取り込む（Ghosh et al., Glycobiology 5: 505-10 (1991)）。しかし、溶液中に通常の小胞構造と異なる構造を有する組成物もまた、包含される。例えば、脂質は、ミセル構造を取る場合もあり、脂質分子による不均質の凝集物として存在する場合もある。また、リポフェクタミン−核酸複合体も想定される。
【０３０４】
非ウイルスベースの送達系
場合によって、本明細書で記載される細胞タグをコードするポリヌクレオチドはまた、ＤＮＡ配列を、脊椎動物の染色体へと導入するための、合成ＤＮＡトランスポゾン系を指す、「Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）トランスポゾン系」など、非ウイルスベースの送達系を使用して、Ｔ細胞へと導入することもできる。ＳＢトランスポゾン系の、一部の例示的な実施形態については、例えば、米国特許第６，４８９，４５８号明細書および同第８，２２７，４３２号明細書において記載されている。Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン系は、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）トランスポザーゼおよびＳＢトランスポゾンから構成される。複数の実施形態では、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン系は、ＳＢ１１トランスポゾン系、ＳＢ１００Ｘトランスポゾン系、またはＳＢ１１０トランスポゾン系を含みうる。
【０３０５】
ＤＮＡトランスポゾンは、１つのＤＮＡ部位から、別のＤＮＡ部位へと、単純なカットアンドペースト方式で転座する。転移は、規定されたＤＮＡセグメントを、１つのＤＮＡ分子から切り出し、同じＤＮＡ分子内もしくはゲノム内、または異なるＤＮＡ分子内もしくはゲノム内の別の部位へと移動させる、正確な過程である。他のＴｃ１／ｍａｒｉｎｅｒ型トランスポザーゼと同様、ＳＢトランスポザーゼも、トランスポゾンを、レシピエントＤＮＡ配列内の、ＴＡジヌクレオチド塩基対へと挿入する。挿入部位は、同じＤＮＡ分子内の別の部位の場合もあり、別のＤＮＡ分子（または染色体）内の場合もある。ヒトゲノムを含む哺乳動物ゲノムには、約２億カ所のＴＡ部位が存在する。ＴＡ挿入部位は、トランスポゾン組込みの過程において、重複される。このＴＡ配列の重複は、転移の顕著な特徴であり、一部の実験では、機構を確認するのに使用される。トランスポザーゼは、トランスポゾン内でコードされる場合もあり、トランスポザーゼは、別の供給源、例えば、ＤＮＡ供給源またはｍＲＮＡ供給源により供給される場合もあり、この場合、トランスポゾンは、非自律型エレメントとなる。非自律型トランスポゾンは、挿入の後、独立では切出しおよび再挿入を行いえないため、遺伝子ツールとして最も有用である。ＳＢトランスポゾンは、脊椎動物のゲノムへの遺伝子の導入および遺伝子治療のための非ウイルスベクターとして使用することが想定されている。略述すると、Ｔ細胞を遺伝子改変するように、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）系（Hackett et al., Mol Ther 18:674-83, (2010)）を適合させた（Cooper et al., Blood 105:1622-31, (2005)）。これは、２つのステップ：（ｉ）Ｔ細胞の特異性をリダイレクトするためのＳＢトランスポゾン［すなわち、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）およびＳＢトランスポザーゼを発現するＤＮＡプラスミドのエレクトロトランスファー（Jin et al., Gene Ther 18:849-56, (2011)、Kebriaei et al., Hum Gene Ther 23:444-50, (2012)）、ならびに（ｉｉ）Ｋ５６２細胞株に由来するデザイナー人工抗原提示細胞（ＡａＰＣ）（ＡａＰＣ（Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｐｒｏｐａｇａｔｉｎｇ  Ｃｅｌｌ）としてもまた公知である）に接する形での、組込み配列を安定的に発現するＴ細胞の繁殖および拡大増殖を伴った。一実施形態では、ＳＢトランスポゾン系は、膜結合型ＩＬ−１５および／またはキメラ抗原受容体をコードするコード配列を含む。このような系については、例えば、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、Singh et al., Cancer Res (8):68 (2008). April 15, 2008およびMaiti et al., J Immunother. 36(2): 112-123 (2013)において記載されている。ある特定の実施形態では、ＣＡＲまたはＴＣＲ、およびサイトカイン、およびポリペプチド細胞タグを含むＳＢトランスポゾンを発現させるＤＮＡプラスミドを、エフェクター細胞へと電気穿孔し、次いで、さらなる繁殖および拡大を伴わずに、患者へと輸注する。
【０３０６】
一部の実施形態では、本明細書で記載される改変エフェクター細胞内の、ＣＡＲまたはＴＣＲまたはサイトカイン、および１または複数のポリペプチドである細胞タグをコードするポリヌクレオチドは、１または複数のトランスポゾンＤＮＡプラスミドベクター内でコードされ、ＳＢトランスポザーゼは、別個のベクター内でコードされる。複数の実施形態では、ポリペプチドである細胞タグは、トランスポゾンＤＮＡプラスミドベクター内でコードされ、ＣＡＲまたはＴＣＲまたはサイトカインは、第２のトランスポゾンＤＮＡプラスミドベクター内でコードされ、ＳＢトランスポザーゼは、第３のＤＮＡプラスミドベクター内でコードされる。一部の実施形態では、ＣＡＲまたはＴＣＲおよびサイトカインおよびポリペプチドである細胞タグは、単一のトランスポゾン内でコードされる。
【０３０７】
一部の実施形態では、本明細書で記載されるポリペプチドは、細胞の枯渇経路を誘導するように、ポリペプチド構築物を認識する、ＦＤＡで承認された抗体または任意の抗体の投与を介して、輸注されたＣＡＲ−Ｔ細胞の枯渇を可能とすることにより、安全性機構をもたらす。一部の実施形態では、本明細書で記載されるＨＥＲ１ｔ変異体は、導入されたセツキシマブに結合し、細胞の枯渇を可能とすることにより、安全性機構をもたらす。一部の実施形態では、また、ＣＤ２０ｔ変異体も、ＦＤＡで承認されたリツキシマブ療法の投与を介して、輸注されたＣＡＲ−Ｔ細胞の枯渇を可能とすることにより、安全性機構をもたらす。
【０３０８】
外因性核酸を、宿主細胞へと導入するか、または細胞を、本開示の阻害剤へと、他の形で曝露するのに使用される方法にかかわらず、宿主細胞内の組換えＤＮＡ配列の存在を確認するために、様々なアッセイを実施することができる。このようなアッセイは、例えば、サザンブロット法およびノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲなど、当業者に周知の分子アッセイ；例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット）、または薬剤を同定するための、本明細書で記載されるアッセイであって、本開示の範囲内に収まるアッセイにより、特定のペプチドの有無を検出するアッセイなどの「生化学的」アッセイを含む。
【０３０９】
複数の実施形態では、ＳＢ１１トランスポゾン系、ＳＢ１００Ｘトランスポゾン系、ＳＢ１１０トランスポゾン系、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン系（例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Wilson et al, “PiggyBac Transposon-mediated Gene Transfer in Human Cells,” Molecular Therapy 15:139-145 (2007)を参照されたい）、および／またはｐｉｇｇｙＢａｔトランスポゾン系（例えば、Mitra et al., “Functional characterization of piggyBat from the bat Myotis lucifugus unveils an active mammalian DNA transposon,” Proc. Natl. Acad. Sci USA 110:234-239 (2013)を参照されたい）を使用して、本明細書で説明される改変エフェクター細胞および他の遺伝子エレメントを、細胞へと送達する。さらなるトランスポザーゼおよびトランスポゾン系については、それらの各々が、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第６，４８９，４５８号明細書、同第６，６１３，７５２号明細書、同第７，１４８，２０３号明細書、同第７，９８５，７３９号明細書、同第８，２２７，４３２号明細書、同第９，２２８，１８０号明細書、米国特許公開第２０１１／０１１７０７２号明細書、Mates et al., Nat Genet, 41(6):753-61 (2009). doi: 10.1038/ng.343. Epub 2009 May 3, Gene Ther., 18(9):849-56 (2011). doi: 10.1038/gt.2011.40. Epub 2011 Mar 31 およびIvics et al., Cell. 91(4):501-10, (1997)において提示されている。さらなる適切な非ウイルス系は、宿主細胞のＤＮＡへと、ランダムに組み込まれる場合もあり、発現ベクターと、宿主細胞の染色体との特異的組換えを可能とする組換え部位を含む場合もある、組込み用発現ベクターを含みうる。トランス遺伝子の、所定の遺伝子座への組込みのターゲティングが、多くの適用に所望される目標である。まず、部位特異的リコンビナーゼの第１の組換え部位を、ゲノム部位に、ランダムに、または所定の位置に挿入する。続いて、細胞に、目的の遺伝子またはＤＮＡ、ならびに第２の組換え部位およびリコンビナーゼの供給源（リコンビナーゼを発現させる、発現プラスミド、ＲＮＡ、タンパク質、またはウイルス）を保有するプラスミドをトランスフェクトする。第１の組換え部位と第２の組換え部位との組換えは、プラスミドＤＮＡの組込みをもたらす。
【０３１０】
このような組込み用発現ベクターは、宿主細胞の染色体の内因性発現制御配列を用いて、所望のタンパク質の発現をもたらしうる。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチド上の配列であって、組込み部位を挟む配列と相同な配列の存在により、組込みのターゲティングを促進する。例えば、本明細書で記載されるドナーポリヌクレオチドを使用する、組込みのターゲティングは、従来のトランスフェクション法、例えば、相同組換えにより、遺伝子のノックアウトまたはノックインを創出するのに使用される技法に従い達成することができる。他の実施形態では、ドナーポリヌクレオチド上の配列であって、組込み部位を挟む配列と相同な配列の存在、および部位特異的リコンビナーゼの存在下で、細胞を、ドナーポリヌクレオチドと接触させることの両方により、組込みのターゲティングを促進する。部位特異的リコンビナーゼ、または、単に、リコンビナーゼとは、その適合性の組換え部位の間の、保存的な部位特異的組換えを触媒するポリペプチドを意味する。本明細書で使用される部位特異的リコンビナーゼは、天然ポリペプチドのほか、活性を保持する誘導体、変異体、および／または断片、ならびに天然ポリヌクレオチド、活性を保持するリコンビナーゼをコードする誘導体、変異体、および／または断片を含む。
【０３１１】
本明細書ではまた、１または複数の遺伝子発現カセットを含む、宿主細胞内において異種遺伝子を組み込むための系も提示される。場合によって、系は、第１のポリペプチド構築物をコードする、第１のポリヌクレオチドを含む、第１の遺伝子発現カセットを含む。他の場合には、系は、第２のポリペプチド構築物をコードする、第２のポリヌクレオチドを含む、第２の遺伝子発現カセットを含みうる。さらに他の場合には、系は、第３の遺伝子発現カセットを含みうる。一実施形態では、系は、前記宿主細胞を、セリンリコンビナーゼの存在下で、少なくとも前記第１の遺伝子発現カセットと接触させると、前記異種遺伝子が、前記宿主細胞へと組み込まれるように、組換え接合部位およびセリンリコンビナーゼを含む。
【０３１２】
場合によって、系は、前記宿主細胞を、前記リガンドの存在下で接触させると、前記異種遺伝子が、前記宿主細胞内で発現するように、リガンドをさらに含む。１つの場合には、系はまた、組換え接合部位も含む。場合によって、１つの組換え接合部位は、ファージゲノム組換え接合部位（ａｔｔＰ）または細菌ゲノム組換え接合部位（ａｔｔＢ）である。１つの場合には、宿主細胞は、真核細胞である。別の場合には、宿主細胞は、ヒト細胞である。さらなる場合には、宿主細胞は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞である。
【０３１３】
一実施形態では、上記で記載した系内の異種遺伝子は、ＣＡＲを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＢＣＭＡ、ＣＤ４４、α−葉酸受容体、ＣＡＩＸ、ＣＤ３０、ＲＯＲ１、ＣＥＡ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、葉酸結合性タンパク質、ＧＤ２、ＧＤ３、ＩＬ−１３Ｒ−ａ２、ＫＤＲ、ＥＤＢ−Ｆ、メソテリン、ＣＤ２２、ＥＧＦＲ、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−１６、ＭＡＧＥ−Ａ１、ｈ５Ｔ４、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ−７２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１２３、およびＶＥＧＦ−Ｒ２のうちの少なくとも１つに結合する。
【０３１４】
別の実施形態では、系は、サイトカインを含む異種遺伝子を含む。一部の場合には、サイトカインは、ＩＬ−１５、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、およびＩＬ−１５とＩＬ−ＩＬ−１５Ｒαとの融合体のうちの少なくとも１つを含む。一部の実施形態では、系は、本明細書で記載される、少なくとも１つの細胞タグを含む異種遺伝子を含む。一部の実施形態では、前記細胞タグは、ＨＥＲ１ポリペプチド、ＬＮＧＦＲポリペプチド、ＣＤ２０ポリペプチド、およびＣＤ５２ポリペプチドのうちの少なくとも１つを含む。一部の実施形態では、ｍｂＩＬ−１５は、細胞タグと共にコードされる。細胞タグの例は、トランケート型の、ＨＥＲ１ポリペプチド、ＬＮＧＦＲポリペプチド、ＣＤ２０ポリペプチド、ＣＤ５２ポリペプチド、あるいは枯渇スイッチもしくはキルスイッチ、またはエンリッチメントマーカーとしての使用のための、他の任意の適切な細胞タグを含みうる。
【０３１５】
さらなる実施形態では、前記系は、１または複数のベクター内に含有される。１つの場合には、系は、１つのベクター内に含有される。１つの場合には、第１の遺伝子発現カセット、第２の遺伝子発現カセット、および組換え接合部位は、１つのベクター内に含有される。１つの場合には、第１の遺伝子発現カセット、第２の遺伝子発現カセット、第３の遺伝子発現カセット、および組換え接合部位は、１つのベクター内に含有される。別の場合には、セリンリコンビナーゼは、ＳＦ３７０である。他の場合には、セリンリコンビナーゼは、別個のベクター内にある。
【０３１６】
リコンビナーゼは、標的細胞へと、ターゲティングベクターの導入の前に導入することもでき、これと共時的に導入することもでき、この後で導入することもできる。リコンビナーゼは、例えば、リポソーム、粒子のコーティング、またはマイクロインジェクションを使用して、細胞へと、タンパク質として直接導入することができる。代替的に、適切な発現ベクターを使用して、リコンビナーゼをコードするＤＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡである、ポリヌクレオチドを、細胞へと導入することもできる。上記で記載したターゲティングベクターの構成要素は、目的のリコンビナーゼをコードする配列を含有する発現カセットの構築において有用である。しかし、リコンビナーゼの発現は、他の方式で、例えば、リコンビナーゼの発現を、調節可能なプロモーター（すなわち、その発現を選択的に誘導または抑制しうるプロモーター）の制御下に置くことにより調節することもできる。
【０３１７】
本発明の実施における使用のためのリコンビナーゼは、組換えにより作製することもでき、既に記載された通りに精製することもできる。所望のリコンビナーゼ活性を有するポリペプチドは、当技術分野で公知の方法であって、タンパク質の硫酸アンモニウム沈殿の方法、サイズ分画、アフィニティークロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィー、ヘパリンアガロースアフィニティークロマトグラフィー（例えば、Thorpe & Smith, Proc. Nat. Acad. Sci. 95:5505-5510, 1998）を含むがこれらに限定されないタンパク質精製の方法により、所望の純度まで精製することができる。
【０３１８】
一実施形態では、リコンビナーゼを、任意の適切な方法による組換えが所望される組換え接合部位を含有する真核細胞へと導入することができる。当技術分野では、例えば、マイクロインジェクションまたは他の方法により、機能的タンパク質を、細胞へと導入する方法が周知である。精製リコンビナーゼタンパク質の導入は、タンパク質の一過性の存在、およびその機能を確保するが、これは、好ましい実施形態であることが多い。代替的に、リコンビナーゼをコードする遺伝子は、細胞を形質転換するのに使用される発現ベクターであって、リコンビナーゼをコードするポリヌクレオチドを、真核細胞内のポリヌクレオチドの発現を媒介するプロモーターに作動可能に連結した、発現ベクター内に含まれうる。リコンビナーゼポリペプチドはまた、リコンビナーゼポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡによっても、真核細胞へと導入することができる。リコンビナーゼは、核酸断片の、改変されるゲノムへの挿入に必要であるような時間の間だけ存在することが一般に好ましい。したがって、大半の発現ベクターと関連する永続性の欠如は、有害ではないと予測される。リコンビナーゼ遺伝子を、目的の外因性ポリヌクレオチドの導入の前に導入することもでき、これと同時に導入することもでき、この後で導入することもできる。一実施形態では、リコンビナーゼ遺伝子は、挿入されるポリヌクレオチドを保有するベクター内に存在し、リコンビナーゼ遺伝子はなお、ポリヌクレオチド内にも、組み入れることができる。他の実施形態では、リコンビナーゼ遺伝子を、トランスジェニックの真核生物へと導入する。リコンビナーゼを、構成的に、あるいは細胞特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、発生特異的プロモーター、細胞小器官特異的プロモーター、または低分子誘導性プロモーターもしくは低分子抑制性プロモーター下で発現させる、トランスジェニック細胞またはトランスジェニック動物を作製することができる。リコンビナーゼはまた、他のペプチド、タンパク質、核局在化シグナルペプチド、シグナルペプチド、または細胞小器官特異的シグナルペプチド（例えば、ミトコンドリア内またはクロロプラスト内の組換えを容易とする、ミトコンドリアまたはクロロプラストにおけるトランジットペプチド）との融合タンパク質としても発現させることができる。
【０３１９】
例えば、リコンビナーゼは、インテグラーゼファミリーまたはリゾルバーゼファミリーに由来しうる。リコンビナーゼのインテグラーゼファミリーは、１００を超えるメンバーを有し、例えば、ＦＬＰ、Ｃｒｅ、およびラムダインテグラーゼを含む。インテグラーゼファミリーはまた、チロシンファミリーまたはラムダインテグラーゼファミリーとも称し、ＤＮＡのホスホジエステル結合に対する求核攻撃のために、チロシンの触媒性ヒドロキシル基を使用する。典型的に、チロシンファミリーのメンバーはまず、ＤＮＡにニックを入れ、これにより、その後、二重鎖切断を形成する。チロシンファミリーインテグラーゼの例は、Ｃｒｅインテグラーゼ、ＦＬＰインテグラーゼ、ＳＳＶ１インテグラーゼ、およびラムダ（λ）インテグラーゼを含む。セリンリコンビナーゼファミリーとしてもまた公知の、リゾルバーゼファミリーでは、保存性セリン残基が、ＤＮＡ標的部位への共有結合性連結を形成する（Grindley, et al., (2006) Ann Rev Biochem 16:16）。
【０３２０】
一実施形態では、リコンビナーゼは、ＳＰβｃ２リコンビナーゼ、ＳＦ３７０．１リコンビナーゼ、Ｂｘｂ１リコンビナーゼ、Ａ１１８リコンビナーゼ、およびΦＲｖ１リコンビナーゼからなる群から選択されるリコンビナーゼをコードする核酸配列を含む、単離ポリヌクレオチド配列である。セリンリコンビナーゼの例については、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第９，０３４，６５２号明細書において詳細に記載されている。
【０３２１】
一実施形態では、部位特異的組換えのための方法は、第１の組換え部位および第２の組換え部位を用意するステップと、第１の組換え部位および第２の組換え部位を、原核細胞のリコンビナーゼポリペプチドと接触させる結果として、組換え部位の間の組換えをもたらすステップとを含み、リコンビナーゼポリペプチドは、第１の組換え部位と、第２の組換え部位との組換えを媒介することが可能であり、第１の組換え部位は、ａｔｔＰまたはａｔｔＢであり、第２の組換え部位は、ａｔｔＢまたはａｔｔＰであり、第１の組換え接合部位が、ａｔｔＢである場合、第２の組換え接合部位は、ａｔｔＰであり、第１の組換え接合部位が、ａｔｔＰである場合、第２の組換え接合部位は、ａｔｔＢであるという条件で、リコンビナーゼは、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）のファージリコンビナーゼ、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）のファージリコンビナーゼ、枯草菌（Bacillus subtilis）のファージリコンビナーゼ、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）のファージリコンビナーゼ、およびスメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）のファージリコンビナーゼからなる群から選択される。さらなる実施形態は、部位特異的リコンビナーゼの、ゲノムが改変される細胞への導入を提供する。一実施形態は、真核細胞内の部位特異的組換えを得るための方法であって、第１の組換え接合部位および第２の組換え接合部位を含む真核細胞を用意するステップと、第１の組換え接合部位および第２の組換え接合部位を、原核細胞のリコンビナーゼポリペプチドと接触させる結果として、組換え接合部位の間の組換えをもたらすステップとを含み、リコンビナーゼポリペプチドが、第１の組換え接合部位と、第２の組換え接合部位との組換えを媒介することが可能であり、第１の組換え接合部位が、ファージゲノムの組換え接合部位（ａｔｔＰ）、または細菌ゲノムの組換え接合部位（ａｔｔＢ）であり、第２の組換え接合部位が、ａｔｔＢまたはａｔｔＰであり、第１の組換え接合部位が、ａｔｔＢである場合、第２の組換え接合部位が、ａｔｔＰであり、第１の組換え接合部位が、ａｔｔＰである場合、第２の組換え接合部位が、ａｔｔＢであるという条件で、リコンビナーゼが、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）のファージリコンビナーゼ、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）のファージリコンビナーゼ、枯草菌（Bacillus subtilis）のファージリコンビナーゼ、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）のファージリコンビナーゼ、およびスメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）のファージリコンビナーゼからなる群から選択される、方法に関する。ある実施形態では、リコンビナーゼは、Ａ１１８リコンビナーゼ、ＳＦ３７０．１リコンビナーゼ、ＳＰβｃ２リコンビナーゼ、ΦＲｖ１リコンビナーゼ、およびＢｘｂ１リコンビナーゼからなる群から選択される。一実施形態では、組換えは、組込みを結果としてもたらす。
【０３２２】
免疫エフェクター細胞の供給源
ある特定の態様では、本明細書で記載される実施形態は、リダイレクトされた、抗原特異的免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはＮＫ  Ｔ細胞）を作り出し、かつ／またはこれを拡大増殖させる方法であって、細胞に、ポリペプチド構築物をコードするＤＮＡ（またはＲＮＡ）構築物を含有する発現ベクターによりトランスフェクトし、次いで、任意選択で、細胞を、フィーダー細胞、組換え抗原、または受容体に対する抗体で刺激して、細胞を増殖させるステップを含む方法を含む。ある特定の態様では、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現するように操作された細胞（または細胞集団）は、幹細胞、ｉＰＳ細胞、免疫エフェクター細胞、またはこれらの細胞の前駆細胞である。
【０３２３】
免疫エフェクター細胞の供給源は、同種供給源および自家供給源の両方を含みうる。場合によって、免疫エフェクター細胞は、幹細胞または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から分化させることもできる。したがって、実施形態に従い操作するための細胞は、臍帯血、末梢血、ヒト胚性幹細胞、またはｉＰＳＣから単離することができる。例えば、同種Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体を含むように（そして、任意選択で、機能的なＴＣＲを欠くように）改変することができる。一部の態様では、免疫エフェクター細胞は、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に由来するＴ細胞などの初代ヒトＴ細胞である。ＰＢＭＣは、末梢血から回収することもでき、Ｇ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）による刺激の後で、骨髄または臍帯血から回収することもできる。トランスフェクションまたは形質導入（例えば、ＣＡＲ発現構築物の）の後、細胞を、速やかに輸注することもでき、凍結保存することもできる。ある特定の態様では、トランスフェクションの後、細胞は、細胞への遺伝子導入後、約１、２、３、４、５日間またはこれを超える日数以内に、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、バルク集団として、数日間、数週間、または数カ月間にわたり繁殖させることができる。さらなる態様では、トランスフェクションの後、トランスフェクト細胞を、クローニングし、組み込まれるか、またはエピソーム内に維持された、単一の発現カセットまたはプラスミドの存在、およびキメラ抗原受容体の発現を裏付けるクローンを、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて拡大増殖させる。拡大増殖のために選択されたクローンは、抗原を発現する標的細胞を特異的に認識し、溶解させる能力を裏付ける。組換えＴ細胞は、ＩＬ−２または共通のガンマ鎖に結合する他のサイトカイン（例えば、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、および他のサイトカイン）を伴う刺激により拡大増殖させることができる。組換えＴ細胞は、人工抗原提示細胞を伴う刺激により拡大増殖させることができる。組換えＴ細胞は、人工抗原提示細胞に接する形で拡大増殖させることもでき、Ｔ細胞表面上のＣＤ３を架橋する、ＯＫＴ３などの抗体により拡大増殖させることもできる。組換えＴ細胞のサブセットは、磁気ビーズベースの単離法および／または蛍光活性化細胞分取技術の使用により、さらに選択することができ、ＡａＰＣと共にさらに培養することができる。さらなる態様では、遺伝子改変細胞は、凍結保存することができる。
【０３２４】
Ｔ細胞はまた、末梢血、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位に由来する組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍（腫瘍浸潤リンパ球）を含む、多数の供給源からも得ることができる。本開示の、ある特定の実施形態では、当技術分野において入手可能な、任意の数のＴ細胞株を使用することができる。本開示の、ある特定の実施形態では、Ｔ細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）分離など、当業者に公知の、任意の数の技法を使用して、対象から回収された血液単位から得ることができる。複数の実施形態では、個体の循環血液に由来する細胞は、アフェレーシスにより得る。アフェレーシス生成物は、典型的に、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球、および血小板を含むリンパ球を含有する。一実施形態では、アフェレーシスにより回収された細胞を洗浄して、血漿画分を除去し、細胞を、その語における加工ステップのために、適切な緩衝液中または培地中に入れる。本開示の一実施形態では、細胞を、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄する。代替的な実施形態では、洗浄液は、カルシウムを欠き、マグネシウムを欠く場合もあり、全てではないが、多くの二価カチオンを欠く場合もある。カルシウムの非存在下における初期活性化ステップは、活性化の強化をもたらす。当業者がたやすく理解する通り、洗浄ステップは、製造元の指示書に従い、半自動式「フロースルー」型遠心分離機（例えば、Ｃｏｂｅ  ２９９１細胞プロセッサー、Ｂａｘｔｅｒ  ＣｙｔｏＭａｔｅ、またはＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｅｌｌ  Ｓａｖｅｒ  ５）を使用することなど、当業者に公知の方法により達することができる。洗浄の後、細胞を、例えば、Ｃａ２＋非含有ＰＢＳ、Ｍｇ２＋非含有ＰＢＳ、Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ  Ａ、または緩衝液を伴うかもしくは伴わない、他の生理食塩液溶液など、様々な生体適合性の緩衝液中に再懸濁させることができる。代替的に、アフェレーシス試料の、所望されない構成要素を除去し、細胞を、培養培地中に、直接再懸濁させることもできる。
【０３２５】
別の実施形態では、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（登録商標）勾配を介する遠心分離、または対向流遠心溶出により、赤血球を溶解させ、単球を枯渇させることにより、Ｔ細胞を、末梢血リンパ球から単離する。ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、およびＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞など、Ｔ細胞の特異的亜集団も、陽性選択法または陰性選択法により、さらに単離することができる。別の実施形態では、ＣＤ１４＋細胞を、Ｔ細胞集団から枯渇させる。例えば、一実施形態では、Ｔ細胞を、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ−４５０  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔなどの、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（すなわち、３×２８）コンジュゲートビーズを伴う、所望のＴ細胞陽性選択に十分な時間にわたるインキュベーションにより単離する。一実施形態では、時間は、約３０分間である。さらなる実施形態では、時間は、３０分間〜３６時間、またはこれより長い時間、およびこれらの間の任意の整数値の時間の範囲である。さらなる実施形態では、時間は、少なくとも１、２、３、４、５、または６時間である。さらに別の実施形態では、時間は、１０〜２４時間である。一実施形態では、インキュベーション時間は、２４時間である。白血病を伴う患者からのＴ細胞の単離ための、２４時間など、長いインキュベーション時間の使用は、細胞収率を増大させうる。腫瘍組織または免疫障害個体から、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を単離する状況など、Ｔ細胞が、他の細胞型と比較して少数である、任意の状況においては、より長いインキュベーション時間を使用してＴ細胞を単離することができる。さらに、長いインキュベーション時間の使用は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の捕捉効率も増加させうる。したがって、単に、時間を短くするかまたは長くすることにより、Ｔ細胞を、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズに結合させることが可能となり、かつ／またはビーズの、Ｔ細胞に対する比（本明細書で、さらに記載される通り）を増加もしくは減少させることにより、Ｔ細胞の亜集団を、培養の開始時、もしくは工程中の他の時点において、優先的に、陽性もしくは陰性に選択することができる。加えて、ビーズ上または他の表面上の、抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８抗体の比を増加または減少させることにより、Ｔ細胞の亜集団を、培養の開始時、または他の所望の時点において、優先的に、陽性または陰性に選択することができる。当業者は、本開示の文脈では、複数ラウンドにわたる選択もまた、使用しうることを認識するであろう。ある特定の実施形態では、選択手順を実施し、「選択されなかった」細胞を、活性化工程および拡大増殖工程において使用することも所望でありうる。「選択されなかった」細胞はまた、さらなるラウンドにわたる選択にかけることもできる。
【０３２６】
陰性選択によるＴ細胞集団の濃縮は、陰性選択された細胞に固有の表面マーカーを指向する抗体の組合せにより達することができる。１つの方法は、陰性選択された細胞上に存在する細胞表面マーカーを指向する、モノクローナル抗体のカクテルを使用する、細胞分取および／または陰性の磁気免疫接着もしくはフローサイトメトリーを介する選択である。例えば、ＣＤ４＋細胞を、陰性選択により濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルは、典型的に、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ−ＤＲ、およびＣＤ８に対する抗体を含む。ある特定の実施形態では、典型的に、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＧＩＴＲ＋、およびＦｏｘＰ３＋を発現する調節性Ｔ細胞を、濃縮または陽性選択することが所望でありうる。代替的に、ある特定の実施形態では、調節性Ｔ細胞を、抗ＣＤ２５コンジュゲートビーズまたは他の同様の選択法により枯渇させることができる。
【０３２７】
陽性選択または陰性選択により、所望の細胞集団を単離するために、細胞の濃度および表面（例えば、ビーズなどの粒子）を変動させることができる。ある特定の実施形態では、ビーズと細胞とを、併せて混合する容量を著明に減少させて（すなわち、細胞の濃度を増加させて）、細胞とビーズとの最大の接触を確保することが所望でありうる。例えば、一実施形態では、１ｍｌ当たりの細胞２０億個の濃度を使用する。一実施形態では、１ｍｌ当たりの細胞１０億個の濃度を使用する。さらなる実施形態では、１ｍｌ当たり細胞１億個超を使用する。さらなる実施形態では、１ｍｌ当たりの細胞１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万、または５０００万個の細胞濃度を使用する。さらに別の実施形態では、１ｍｌ当たりの細胞７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万、または１億個の細胞濃度を使用する。さらなる実施形態では、１ｍｌ当たりの細胞１億２５００万または１億５０００万個の濃度を使用しうる。高濃度の使用は、細胞の収量、細胞の活性化、および細胞の拡大増殖の増大を結果としてもたらしうる。さらに、高細胞濃度の使用は、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞、または多くの腫瘍細胞（すなわち、白血病性血液、腫瘍組織など）が存在する試料に由来する細胞など、目的の標的抗原の発現が低度でありうる細胞の、より効率的な捕捉を可能とする。このような細胞集団は、治療的価値を有する可能性があり、得ることが所望であろう。例えば、高細胞濃度の使用は、ＣＤ２８の発現が通常低度である、ＣＤ８＋Ｔ細胞の、より効率的な選択を可能とする。
【０３２８】
関連する実施形態では、低濃度の細胞を使用することが所望でありうる。Ｔ細胞と表面（例えば、ビーズなどの粒子）との混合物を、著明に希釈することにより、粒子と細胞との相互作用を最小化する。これは、粒子に結合する、高量の所望の抗原を発現する細胞を選択する。例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、高レベルのＣＤ２８を発現し、希釈濃度のＣＤ８＋Ｔ細胞より効率的に捕捉される。一実施形態では、使用される細胞濃度は、１ｍｌ当たりの細胞５×１０６個である。他の実施形態では、使用される濃度は、１ｍｌ当たりの細胞約１×１０５個〜１ｍｌ当たりの細胞１×１０６個、およびこれらの間の任意の整数値でありうる。
【０３２９】
他の実施形態では、細胞は、速度を変動させて、２〜１０℃または室温で、長さを変動させる時間にわたり、ロテーター上でインキュベートすることができる。
【０３３０】
刺激されるＴ細胞はまた、洗浄ステップの後で、凍結させることもできる。血漿および血小板を除去する洗浄ステップの後で、細胞を、凍結用溶液中に懸濁させることができる。当技術分野では、多くの凍結用溶液および凍結パラメータが公知であり、この文脈でも有用であろうが、１つの方法は、２０％のＤＭＳＯおよび８％のヒト血清アルブミンを含有するＰＢＳ、もしくは１０％のデキストラン４０および５％のデキストロース、２０％のヒト血清アルブミン、ならびに７．５％のＤＭＳＯを含有する培養培地、もしくは３１．２５％のＰｌａｓｍａｌｙｔｅ−Ａ、３１．２５％のデキストロース５％、０．４５％のＮａＣｌ、１０％のデキストラン４０および５％のデキストロース、２０％のヒト血清アルブミン、ならびに７．５％のＤＭＳＯ、または例えば、ＨｅｓｐａｎおよびＰｌａｓｍａｌｙｔｅ  Ａを含有する、他の適切な細胞凍結用培地の使用を伴い、次いで、細胞を、１分間当たり１℃の速度で、−８０℃へと凍結させ、液体窒素保管タンクの蒸気相中で保存する。制御型凍結の他の方法を使用しうるほか、−２０℃または液体窒素中における速やかな非制御型凍結も使用しうる。
【０３３１】
ある特定の実施形態では、凍結保存された細胞を、本明細書で記載される通りに、融解させ、洗浄し、本開示の方法を使用する活性化の前に、室温で、１時間にわたり休眠させる。
【０３３２】
本開示の文脈ではまた、本明細書で記載される、拡張細胞が必要とされうる時点より前の時期における、血液試料またはアフェレーシス生成物の、対象からの回収も想定される。したがって、拡大増殖させる細胞の供給源は、任意の必要な時点において回収することができ、Ｔ細胞など、所望の細胞を、本明細書で記載されるＴ細胞療法などのＴ細胞療法から利益を得る、任意の数の疾患または状態のためのＴ細胞療法におけるその後の使用のために、単離し、凍結させることができる。一実施形態では、血液試料またはアフェレーシスを、一般に、健常対象から採取する。ある特定の実施形態では、血液試料またはアフェレーシスを、一般に、疾患を発症する危険性があるが、疾患をいまだ発症していない健常対象から採取し、目的の細胞を、その後の使用のために単離し、凍結させる。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞を、その後の時点において、拡大増殖させ、凍結させ、使用することができる。ある特定の実施形態では、試料を、患者から、本明細書で記載される特定の疾患についての診断の直後であるが、任意の処置の前において回収する。さらなる実施形態では、細胞を、ナタリズマブ、エファリズマブ、抗ウイルス剤、化学療法、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸塩、およびＦＫ５０６などの免疫抑制剤、抗体、またはＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体、シトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、および照射など、他の免疫除去剤などの薬剤による処置を含むがこれらに限定されない、任意の数の妥当な処置モダリティーの前に、対象に由来する血液試料またはアフェレーシスから単離する。これらの薬物は、カルシウム依存性ホスファターゼである、カルシニューリン（シクロスポリンおよびＦＫ５０６）を阻害するか、または、増殖因子誘導性シグナル伝達に重要なｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害する（ラパマイシン）（Liu et al., Cell 66:807-815, (1991)、Henderson et al., Immun 73:316-321, (1991)、Bierer et al., Curr. Opin. Immun 5:763-773, (1993)）。さらなる実施形態では、細胞を、患者のために単離し、骨髄移植または幹細胞移植、フルダラビンなどの化学療法剤、外部ビーム放射線療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミド、またはＯＫＴ３もしくはＣＡＭＰＡＴＨなどの抗体を使用するＴ細胞除去療法を伴う（例えば、その前に、それと同時に、またはその後で）その後の使用のために凍結させる。別の実施形態では、細胞を、あらかじめ単離し、ＣＤ２０と反応する薬剤、例えば、ＲｉｔｕｘａｎなどのＢ細胞除去療法の後における処置のためのその後の使用のために凍結させることができる。
【０３３３】
本開示の、さらなる実施形態では、Ｔ細胞を、処置後における患者から直接得る。この点で、ある特定のがん処置、特に、免疫系を損なう薬物による処置の後であって、患者が通常、処置から回復する期間中の、処置の直後である、処置の後において、得られるＴ細胞お品質は、最適でありうるか、またはｅｘ  ｖｉｖｏにおいて拡大増殖するそれらの能力について改善されうることが観察されている。同様に、本明細書で記載される方法を使用する、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける操作の後、これらの細胞は、生着の延長、およびｉｎ  ｖｉｖｏにおける拡大増殖に好ましい状態でありうる。したがって、本開示の文脈内では、この回復期において、Ｔ細胞、樹状細胞、または他の造血系列の細胞を含む血液細胞を回収することが想定される。さらに、ある特定の実施形態では、動員（例えば、ＧＭ−ＣＳＦによる動員）レジメンおよびコンディショニングレジメンを使用して、対象において、とりわけ、治療後における規定された時間窓において、特定の細胞型の再増殖、再循環、再生、および／またはぞうが好適となる条件を創出することができる。例示的な細胞型は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、および免疫系の他の細胞を含む。
【０３３４】
Ｔ細胞の活性化および拡大増殖
ある特定の実施形態では、本明細書で記載されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含むＴ細胞は、任意選択で、一般に、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号明細書；同第６，５３４，０５５号明細書；同第６，９０５，６８０号明細書；同第６，６９２，９６４号明細書；同第５，８５８，３５８号明細書；同第６，８８７，４６６号明細書；同第６，９０５，６８１号明細書；同第７，１４４，５７５号明細書；同第７，０６７，３１８号明細書；同第７，１７２，８６９号明細書；同第７，２３２，５６６号明細書；同第７，１７５，８４３号明細書；同第５，８８３，２２３号明細書；同第６，９０５，８７４号明細書；同第６，７９７，５１４号明細書；同第６，８６７，０４１号明細書；および米国特許出願公開第２００６０１２１００５号明細書において記載されている方法を使用して、活性化し、拡大することができる。
【０３３５】
「養子Ｔ細胞移入」とは、腫瘍特異的Ｔ細胞の単離およびｅｘ  ｖｉｖｏにおける拡大増殖であって、ワクチン接種単独または患者の天然の腫瘍応答により得られうる数の細胞より大きな数のＴ細胞を達成する、単離および拡大増殖を指す。次いで、それらの免疫系に、がんに攻撃し、これらを死滅させうるＴ細胞を介して、残りの腫瘍を圧倒する能力をもたらそうとする試みにおいて、がんを伴う患者へと、腫瘍特異的Ｔ細胞を輸注する。がん処置のための、養子Ｔ細胞療法の多くの形態であって、腫瘍浸潤リンパ球またはＴＩＬを培養する形態と、１つの特定のＴ細胞またはクローンを単離および拡大増殖させる形態とが使用されており、なお、腫瘍を強力に認識し、これらに攻撃するように操作されたＴ細胞を使用する形態も使用されている。
【０３３６】
場合によって、本明細書で記載されるＴ細胞を、Ｔ細胞の表面上の共刺激分子を刺激する、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体と関連するシグナルおよびリガンドを刺激する薬剤を、それへと接合させた表面と接触させることにより拡大増殖させる。特に、Ｔ細胞集団は、本明細書で記載される通り、表面上に固定化させた、抗ＣＤ３抗体、もしくはその抗原結合性断片、または抗ＣＤ２抗体との接触、あるいはカルシウムイオノフォアを伴う、タンパク質キナーゼＣ活性化因子（例えば、ブリオスタチン）との接触などにより刺激することができる。Ｔ細胞表面上のアクセサリー分子を共刺激するために、アクセサリー分子に結合するリガンドを使用する。例えば、Ｔ細胞の集団は、Ｔ細胞の増殖を刺激するために適切な条件下で、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と接触させることができる。ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を刺激するには、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と接触させることができる。抗ＣＤ２８抗体の例は、９．３、Ｂ−Ｔ３、ＸＲ−ＣＤ２８（Ｄｉａｃｌｏｎｅ、Ｂｅｓａｎｃｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）を含み、当技術分野で一般に公知の他の方法と同様に使用することができる（Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, (1998)、Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, (1999)、Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, (1999)）。
【０３３７】
ある特定の実施形態では、Ｔ細胞のための一次刺激シグナルおよび共刺激シグナルは、異なるプロトコールによりもたらされる。例えば、各シグナルをもたらす薬剤は、溶液中とする場合もあり、表面へと共役させる場合もある。表面へと共役させる場合、薬剤は、同じ表面へと共役させることもでき（すなわち、「シス」構成）、別個の表面へと共役させることもできる（すなわち、「トランス」構成）。代替的に、１つの薬剤を、表面へと共役させ、他の薬剤を、溶液中とすることもできる。一実施形態では、共刺激シグナルをもたらす薬剤を、細胞表面に結合させ、一次活性化シグナルをもたらす薬剤を、溶液とするか、または表面へと共役させる。ある特定の実施形態では、いずれの薬剤も、溶液中とする。別の実施形態では、薬剤は、可溶性形態であることが可能であり、次いで、Ｆｃ受容体もしくは抗体、または薬剤に結合する他の結合剤を発現する細胞などの表面へと架橋される。この点で、本開示における、Ｔ細胞の活性化および拡大増殖における使用のために想定される人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）については、例えば、米国特許出願公開第２００４０１０１５１９号明細書および同２００６００３４８１０号明細書を参照されたい。
【０３３８】
一実施形態では、２つの薬剤を、同じビーズ上に、すなわち、「シス」であるか、または別個のビーズへと、すなわち、「トランス」である、ビーズ上に固定化させる。例を目的として述べると、一次活性化シグナルをもたらす薬剤は、抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合性断片であり、共刺激シグナルをもたらす薬剤は、抗ＣＤ２８抗体またはその抗原結合性断片であり、両方の薬剤を、等分子量で、同じビーズへと、共固定化させる。一実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞の拡大増殖およびＴ細胞の増殖のために、ビーズへと結合させた各抗体の、１：１の比を使用する。本開示のある特定の態様では、ビーズへと結合させた抗ＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比を、１：１の比を使用して観察される拡大増殖と比較した、Ｔ細胞の拡大増殖の増大が観察されるように使用する。特定の一実施形態では、１：１の比を使用して観察される拡大増殖と比較した、約１〜約３倍の増大が観察される。一実施形態では、ビーズへと結合させたＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比は、１００：１〜１：１００、およびこれらの間の全ての整数値の範囲である。本開示の一態様では、抗ＣＤ３抗体より多くの抗ＣＤ２８抗体を、粒子へと結合させる、すなわち、ＣＤ３：ＣＤ２８の比は、１未満である。本開示のある特定の実施形態では、抗ＣＤ２８抗体の、ビーズへと結合させた抗ＣＤ３に対する比は、２：１を超える。特定の一実施形態では、ビーズへと結合させたＣＤ３：ＣＤ２８の、１：１００の比を使用する。別の実施形態では、ビーズへと結合させたＣＤ３：ＣＤ２８の、１：７５の比を使用する。さらなる実施形態では、ビーズへと結合させたＣＤ３：ＣＤ２８の、１：５０の比を使用する。別の実施形態では、ビーズへと結合させたＣＤ３：ＣＤ２８の、１：３０の比を使用する。複数の実施形態では、ビーズへと結合させたＣＤ３：ＣＤ２８の、１：１０の比を使用する。別の実施形態では、ビーズへと結合させたＣＤ３：ＣＤ２８の、１：３の比を使用する。さらに別の実施形態では、ビーズへと結合させたＣＤ３：ＣＤ２８の、３：１の比を使用する。
【０３３９】
１：５００〜５００：１、およびこれらの間の任意の整数値である、粒子の、細胞に対する比を使用して、Ｔ細胞または他の標的細胞を刺激することができる。当業者がたやすく理解しうる通り、粒子の、細胞に対する比は、標的細胞と比べた粒子サイズに依存しうる。例えば、小型サイズのビーズが、少数の細胞だけに結合しうるのに対し、大型のビーズは、多くの細胞に結合しうるであろう。ある特定の実施形態では、細胞の、粒子に対する比は、１：１００〜１００：１、およびこれらの間の任意の整数値の範囲であり、さらなる実施形態では、比は、１：９〜９：１、およびこれらの間の任意の整数値を含み、これらもまた、Ｔ細胞を刺激するのに使用しうる。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８共役粒子の、Ｔ細胞に対する比であって、Ｔ細胞の刺激を結果としてもたらす比は、上記で言及した通り、変動しうるが、ある特定の値は、１：１００、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、および１５：１を含み、１つの比は、少なくとも１：１の、Ｔ細胞当たりの粒子である。一実施形態では、１：１またはこれ未満の、粒子の、細胞に対する比を使用する。特定の一実施形態では、粒子：細胞比は、１：５である。さらなる実施形態では、粒子の、細胞に対する比は、刺激日に応じて変動しうる。例えば、一実施形態では、粒子の、細胞に対する比は、１日目には、１：１〜１０：１であり、さらなる粒子を、細胞へと、その後、最長１０日間にわたり、毎日または隔日で追加し、最終的な比を１：１〜１：１０とする（追加日における細胞カウントに基づく）。特定の一実施形態では、粒子の、細胞に対する比は、第１の刺激日には、１：１であり、第３の刺激日および第５の刺激日には、１：５へと調整される。別の実施形態では、粒子を、１日目における、１：１の最終比、ならびに第３の刺激日および第５の刺激日における１：５へと、毎日または隔日で追加する。別の実施形態では、粒子の、細胞に対する比は、第１の刺激日には、２：１であり、第３の刺激日および第５の刺激日には、１：１０へと調整される。別の実施形態では、粒子を、１日目における、１：１の最終比、ならびに第３の刺激日および第５の刺激日における１：１０へと、毎日または隔日で追加する。当業者は、様々な他の比も、本開示における使用に適しうることを理解するであろう。特に、比は、粒子のサイズ、ならびに細胞のサイズおよび種類に応じて変動するであろう。
【０３４０】
本開示のさらなる実施形態では、Ｔ細胞などの細胞を、薬剤コーティングビーズと組み合わせ、その後、ビーズと細胞とを分離し、次いで、細胞を培養する。代替的な実施形態では、培養の前に、薬剤コーティングビーズと、細胞とを分離せず、併せて培養する。さらなる実施形態では、ビーズおよび細胞を、まず、磁力などの力を適用することにより濃縮する結果として、細胞表面マーカーのライゲーションの増加をもたらし、これにより、細胞の刺激を誘導する
【０３４１】
例を目的として述べると、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８を接合させた常磁性ビーズ（３×２８ビーズ）を、Ｔ細胞に接触させることにより、細胞表面タンパク質をライゲーションさせることができる。一実施形態では、細胞（例えば、Ｔ細胞１０４〜１０９個）と、ビーズ（例えば、比を１：１とする、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ−４５０  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔ常磁性ビーズ、またはＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ製のＭＡＣＳ（登録商標）ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ）とを、緩衝液中、例えば、ＰＢＳ（カルシウムおよびマグネシウムなどの二価カチオンを伴わない）中で組み合わせる。ここでもまた、当業者は、任意の細胞濃度を使用しうることをたやすく理解することができる。例えば、標的細胞は、試料中で極めて稀であり、試料のうちの０．０１％だけを含む場合もあり、全試料（すなわち、１００％）が、目的の標的細胞を含む場合もある。したがって、任意の細胞数が、本開示の文脈内にある。ある特定の実施形態では、粒子と細胞とを、併せて混合する容量を著明に減少させて（すなわち、細胞の濃度を増大させて）、細胞と粒子との最大の接触を確保することが所望でありうる。例えば、一実施形態では、約１ｍｌ当たりの細胞２０億個の濃度を使用する。別の実施形態では、１ｍｌ当たり細胞１億個超を使用する。さらなる実施形態では、１ｍｌ当たりの細胞１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万、または５０００万個の細胞濃度を使用する。さらに別の実施形態では、１ｍｌ当たりの細胞７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万、または１億個の細胞濃度を使用する。さらなる実施形態では、１ｍｌ当たりの細胞１億２５００万または１億５０００万個の濃度を使用しうる。高濃度の使用は、細胞の収量、細胞の活性化、および細胞の拡大増殖の増大を結果としてもたらしうる。さらに、高細胞濃度の使用は、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞など、目的の標的抗原の発現が低度でありうる細胞の、より効率的な捕捉を可能とする。ある特定の実施形態では、このような細胞集団は、治療的価値を有する可能性があり、得ることが所望であろう。例えば、高細胞濃度の使用は、ＣＤ２８の発現が通常低度である、ＣＤ８＋Ｔ細胞の、より効率的な選択を可能とする。
【０３４２】
本開示の一実施形態では、混合物を、数時間（約３時間）〜約１４日間またはこれらの間の任意の整数値時間にわたり培養することができる。別の実施形態では、混合物を、２１日間にわたり培養することができる。本発明の一実施形態では、ビーズおよびＴ細胞を、併せて、約８日間にわたり培養する。別の実施形態では、ビーズおよびＴ細胞を、併せて、２〜３日間にわたり培養する。Ｔ細胞の培養期間が、６０日間またはこれを超えるように、数サイクルにわたる刺激もまた、所望でありうる。Ｔ細胞の培養に適切な条件は、増殖および生存に必要な因子であって、血清（例えば、ウシ胎仔血清またはヒト血清）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インスリン、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＴＧＦβ、およびＴＮＦ−アルファ、または当業者に公知である、細胞の増殖のための、他の任意の添加剤を含む因子を含有しうる、適切な培地（例えば、最小必須培地またはＲＰＭＩ培地１６４０、またはＸ−ｖｉｖｏ  １５（Ｌｏｎｚａ））を含む。細胞の増殖のための、他の添加剤は、界面活性剤、プラズマネート、およびＮ−アセチルシステインおよび２−メルカプトエタノールなどの還元剤を含むがこれらに限定されない。培地は、ＲＰＭＩ  １６４０、ＡＩＭ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、アルファ−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｘ−Ｖｉｖｏ  １５およびＸ−Ｖｉｖｏ  ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ、アミノ酸の添加、ピルビン酸ナトリウム、ならびにビタミン、無血清もしくは適量の血清（または血漿）の補充、または規定されたセットのホルモン、ならびに／あるいはＴ細胞の増殖および拡大増殖に十分な量のサイトカインを含みうる。抗生剤、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンは、実験培養物に限り組み入れ、対象へと輸注される細胞培養物には組み入れない。標的細胞は、増殖を支援するのに必要な条件、例えば、適切な温度（例えば、３７℃）および雰囲気（例えば、空気＋５％のＣＯ２）下で維持する。
【０３４３】
変動させる刺激時間へと曝露されたＴ細胞は、異なる特徴を呈しうる。例えば、典型的な血液生成物またはアファレーシスされた末梢血単核細胞生成物は、細胞傷害性Ｔ細胞集団またはサプレッサーＴ細胞集団（ＴＣ、ＣＤ８＋）より多くのヘルパーＴ細胞集団（ＴＨ、ＣＤ４＋）を有する。ＣＤ３受容体およびＣＤ２８受容体を刺激することによる、ｅｘ  ｖｉｖｏにおけるＴ細胞の拡大増殖は、約８〜９日目の前には、主にＴＨ細胞からなるが、約８〜９日目の後では、ますます多くのＴＣ細胞の集団を含むＴ細胞の集団をもたらす。したがって、処置の目的に応じて、対象に、主にＴＨ細胞を含むＴ細胞集団を輸注することも、有利でありうる。同様に、ＴＣ細胞の抗原特異的サブセットを単離した場合、このサブセットを、より大きな程度で拡大増殖させることが有益でありうる。
【０３４４】
さらに、ＣＤ４マーカーおよびＣＤ８マーカーに加えて、他の表現型マーカーも、著明に変動するが、大部分は、細胞拡大増殖工程の経過中において、再現可能な形で変動する。したがって、このような再現性は、特殊な目的のためのＴ細胞生成物の活性化を調整する能力を可能とする。
【０３４５】
場合によって、実施形態の免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）を、ＡａＰＣ  （ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｒｏｐａｇａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ）と共に共培養して、細胞の拡大増殖を支援する。ＡａＰＣはまた、人工抗原提示細胞（ＡａＰＣ）と称することもできる。例えば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、実施形態の治療用組成物および細胞療法用生成物の調製において有用である。一態様では、ＡａＰＣは、遺伝子改変されたＫ５６２細胞でありうる。抗原提示系の調製および使用に関する、一般的な指針については、例えば、それらの各々が参照により組み込まれる、米国特許第６，２２５，０４２号明細書、同第６，３５５，４７９号明細書、同第６，３６２，００１号明細書、および同第６，７９０，６６２号明細書、米国特許出願公開第２００９／００１７０００号明細書および同第２００９／０００４１４２号明細書、ならびに国際公開第２００７／１０３００９号パンフレットを参照されたい。実施形態についてのなおさらなる態様では、遺伝子改変されたＣＡＲ細胞の培養は、ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞の拡大増殖を刺激する、樹状細胞またはＡａＰＣ  （ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｒｏｐａｇａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ）の存在下で、遺伝子改変されたＣＡＲ細胞を培養することを含む。なおさらなる態様では、ＡａＰＣは、ＡａＰＣの表面上で発現したＣＡＲ結合性抗体またはその断片を含む。ＡａＰＣは、場合によって、Ｔ細胞を活性化させるかまたは共刺激する、さらなる分子を含みうる。さらなる分子は、場合によって、膜結合型Ｃγサイトカインを含みうる。なおまださらなる態様では、ＡａＰＣは、不活化させているかもしくは照射されているか、または感染性物質について調べられ、これを含まないことが確認されている。なおさらなる態様では、ＡａＰＣの存在下におけるトランスジェニックＣＡＲ細胞の培養は、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、および／またはＩＬ−２などの可溶性サイトカインを含む培地中で、トランスジェニックＣＡＲ細胞を培養することを含む。細胞を、約１０：１〜約１：１０、約３：１〜約１：５、約１：１〜約１：３（免疫エフェクター細胞対ＡａＰＣ）、またはこの中で導出可能な任意の範囲の比で培養することができる。例えば、Ｔ細胞およびＡａＰＣの共培養は、約１：１、約１：２または約１：３の比でありうる。
【０３４６】
一態様では、ＡａＰＣは、ＣＤ１３７Ｌを発現しうる。一部の態様では、ＡａＰＣは、ＣＡＲ細胞によりターゲティングされる抗原をさらに発現しうる。他の態様では、ＡａＰＣは、ＣＤ１９、ＣＤ６４、ＣＤ８６、またはｍＩＬ１５をさらに発現しうる。ある特定の態様では、ＡａＰＣは、例えば、ＯＫＴ３および／またはＵＣＨＴ１など、少なくとも１つの抗ＣＤ３抗体クローンを発現しうる。一態様では、ＡａＰＣを処理して（例えば、照射するか、またはマイトマイシンＣで処理して）、それらの増殖可能性を消失させることができる。一態様では、ＡａＰＣは、感染性物質について調べられ、これを含まないことが確認されている場合がある。当技術分野では、このようなＡａＰＣを作製するための方法が公知である。一態様では、ＡａＰＣを伴うＣＡＲ改変Ｔ細胞集団の培養は、細胞を、約１０：１〜約１：１０、約３：１〜約１：５、約１：１〜約１：３（Ｔ細胞対ＡａＰＣ）、またはこの中で導出可能な任意の範囲の比で培養することを含みうる。例えば、Ｔ細胞およびＡａＰＣの共培養は、約１：１、約１：２または約１：３の比でありうる。一態様では、培養するステップは、アミノビスホスホネート（例えば、ゾレドロン酸）と共に培養することをさらに含みうる。
【０３４７】
さらなる態様では、ＣＡＲ−Ｔ細胞の集団を、７、１４、２１、２８、３５、４２日間、４９、５６、６３、または７０日間を超えない日数にわたり培養および／または刺激する。一部の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞の集団を、少なくとも０、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０日間、またはこれを超える期間にわたり培養および／または刺激する。一部の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞の集団を、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０日間、またはこれを超える期間にわたり培養および／または刺激する。一部の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞の集団を、少なくとも７、１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３日間、またはこれを超える期間にわたり培養および／または刺激する。他の実施形態では、刺激は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の、ＡａＰＣとの共培養であって、ＣＡＲ陽性Ｔ細胞の増殖を促進する共培養を含む。別の態様では、遺伝子改変されたＣＡＲ細胞の集団を、刺激１回、刺激２回、刺激３回、刺激４回、刺激５回、刺激５回、刺激６回、刺激７回、刺激８回、刺激９回、または刺激１０回を超えない回数にわたり刺激する。場合によって、遺伝子改変された細胞を、ＡａＰＣの存在下にあるｅｘ  ｖｉｖｏでは培養しない。一部の特殊な場合には、実施形態の方法は、トランスフェクションステップおよび／または培養するステップの後で、細胞集団を、ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）について濃縮するステップをさらに含む。濃縮するステップは、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）と、ＣＡＲを発現する細胞について分取することとを含みうる。さらなる態様では、ＣＡＲを発現する細胞について分取することは、ＣＡＲ結合性抗体の使用を含む。濃縮するステップはまた、ＣＤ５６＋細胞の枯渇も含みうる。実施形態についての、なおまださらなる態様では、方法は、遺伝子改変されたＣＡＲ細胞の集団についての凍結保存試料をさらに含む。
【０３４８】
場合によって、ＡａＰＣを、さらなるプロセシングを伴わずに、ペプチドの、ＭＨＣ分子との直接的な結合を可能とする、最適な長さのペプチドと共にインキュベートする。代替的に、細胞は、目的の抗原（すなわち、ＭＨＣ非依存型の抗原認識の場合）を発現しうる。さらに、場合によって、ＡＰＣは、特異的なＣＡＲポリペプチドまたは一般的なＣＡＲポリペプチド（例えば、ｕＡａＰＣ（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｒｏｐａｇａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ）に結合する抗体を発現しうる。このような方法については、参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１４／１９０２７３号パンフレットにおいて開示されている。ペプチド−ＭＨＣ分子または目的の抗原に加えて、ＡａＰＣ系はまた、少なくとも１つの外因性支援分子も含みうる。任意の適切な数および組合せの支援分子を利用することができる。支援分子は、共刺激分子および接着分子などの支援分子から選択することができる。例示的な共刺激分子は、ＣＤ７０およびＢ７．１（Ｂ７．１は、かつては、Ｂ７として公知であり、また、ＣＤ８０としても公知であった）を含み、これらは、とりわけ、Ｔ細胞の表面上のＣＤ２８分子および／またはＣＴＬＡ−４分子に結合し、これにより、例えば、Ｔ細胞の拡大増殖、Ｔｈ１の分化、短期的なＴ細胞の生存、およびインターロイキン（ＩＬ）２など、サイトカインの分泌に影響を及ぼす。接着分子は、セレクチンなどの炭水化物結合性糖タンパク質、インテグリンなどの膜貫通結合生糖タンパク質、カドヘリンなどのカルシウム依存性タンパク質、および例えば、細胞間または細胞−マトリックス間の接触を促進する、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）などの、１回膜貫通免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリータンパク質を含みうる。例示的な接着分子は、ＬＦＡ−３およびＩＣＡＭ−１などのＩＣＡＭ、を含む。共刺激分子および接着分子を含む、例示的な支援分子の選択、クローニング、調製、および発現に有用な技法、方法、および試薬については、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，２２５，０４２号明細書、同第６，３５５，４７９号明細書、および同第６，３６２，００１号明細書において例示されている。
【０３４９】
ＡａＰＣとなるように選択される細胞は、好ましくは、細胞内抗原プロセシング、細胞内ペプチドトラフィッキング、および／またはＭＨＣクラスＩ分子もしくはクラスＩＩ分子の細胞内ペプチドローディングを欠損させているか、あるいは。変温性（すなわち、哺乳動物細胞株より、温度刺激に対する感受性が小さい）であるか、あるいは欠損および変温特性の両方を有する。好ましくは、ＡａＰＣとなるように選択される細胞はまた、細胞へと導入される、外因性のＭＨＣクラスＩ分子またはクラスＩＩ分子、および支援分子の構成要素に対する、少なくとも１つの内因性対応物（例えば、内因性のＭＨＣクラスＩ分子もしくはクラスＩＩ分子、および／または上記で記載した内因性支援分子）を発現する能力も欠く。さらに、ＡａＰＣは、ＡａＰＣを作出するための、それらの改変の前に、細胞が保有していた欠損および変温特性を保持することが好ましい。例示的なＡａＰＣは、昆虫細胞株など、ＴＡＰ（ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）欠損細胞株を構成するか、またはこれに由来する。例示的な変温性昆虫細胞株は、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ２細胞株などのショウジョウバエ（Drosophila）属細胞株（例えば、Schneider 1972を参照されたい）である。Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ２細胞の調製、増殖、および培養のための例示的な方法は、米国特許第６，２２５，０４２号明細書、同第６，３５５，４７９号明細書、および同第６，３６２，００１号明細書において提示されている。
【０３５０】
一実施形態ではまた、ＡａＰＣを、凍結融解サイクルにもかける。例示的な凍結融解サイクルでは、凍結が、迅速に生じるように、ＡａＰＣを含有する、適切なレセプタクルを、適量の液体窒素、固体二酸化炭素（すなわち、ドライアイス）、または同様の低温材料と接触させることにより、ＡａＰＣを凍結させることができる。次いで、凍結させたＡＰＣを、ＡａＰＣの、低温材料からの摘出、および周囲の室温条件への曝露により、または微温水浴もしくは手の温熱を利用して、融解時間の短縮を促進する、促進融解工程により融解させる。加えて、融解の前に、ＡａＰＣを、凍結させ、長ｆ時間にわたり保存することができる。凍結させたＡａＰＣはまた、融解させ、次いで、さらなる使用の前に、凍結乾燥させることもできる。好ましくは、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、および他の保存剤など、凍結融解手順に有害な影響を及ぼしうる保存剤は、凍結融解サイクルを経るＡａＰＣを含有する培地には非含有とするか、またはこのような保存剤を本質的に欠く培地へのＡａＰＣの導入などにより、本質的に除去する。
【０３５１】
さらなる実施形態では、不活化の後で、細胞の増殖、複製、または核酸の発現が本質的に生じないように、異種核酸およびＡａＰＣに内因性の核酸を、架橋により不活化させることができる。一実施形態では、ＡａＰＣを、外因性ＭＨＣおよび支援分子の発現、このような分子の、ＡａＰＣ表面上の提示、ならびに提示されたＭＨＣ分子への、選択された、１または複数のペプチドのローディングの後の時点において不活化させる。したがって、このような、選択されたペプチドをロードした不活化ＡａＰＣは、増殖または複製が本質的に不可能とされているが、選択されたペプチドの提示機能は保持する。好ましくは、架橋はまた、ＡａＰＣの抗原提示細胞機能を、実質的に低下させずに、細菌およびウイルスなどの汚染微生物を本質的に含まない、ＡａＰＣももたらす。したがって、架橋は、ＡａＰＣを使用して開発される細胞療法製品の安全性に関する懸念を軽減する一助となる一方、重要なＡａＰＣ機能を維持する。架橋およびＡａＰＣに関する方法については、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００９００１７０００号明細書を参照されたい。
【０３５２】
ある特定の実施形態では、操作抗原提示細胞（ＡＰＣ）がさらに提供される。ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、免疫エフェクター細胞を繁殖させるのに、このような細胞を、例えば、上記で記載した通りに使用することができる。さらなる態様では、操作ＡＰＣ自体を、患者へと投与し、これにより、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける免疫エフェクター細胞の拡大増殖を刺激することができる。実施形態の操作ＡＰＣ自体を、治療剤として使用することができる。他の実施形態では、操作ＡＰＣを、標的抗原に特異的な内因性免疫エフェクター細胞の活性化を刺激し、かつ／または標的抗原に特異的な、養子導入された免疫エフェクター細胞の活性を増加させるか、もしくは存続を延長しうる治療剤として使用することができる。
【０３５３】
本明細書で使用される「操作ＡＰＣ」という用語は、少なくとも第１のトランス遺伝子を含み、第１のトランス遺伝子が、ＨＬＡをコードする細胞を指す。このような操作ＡＰＣは、抗原が、ＨＬＡと複合したＡＰＣの表面上に提示されるように、抗原の発現のための第２のトランス遺伝子をさらに含みうる。一部の態様では、操作ＡＰＣは、抗原を提示した細胞型（例えば、樹状細胞）でありうる。さらなる態様では、操作ＡＰＣは、Ｔ細胞またはＴ細胞の前駆細胞など、通常、抗原を提示しない細胞型（「Ｔ−ＡＰＣ」と称する）から作製することができる。したがって、一部の態様では、実施形態の操作ＡＰＣは、ＨＬＡが、標的抗原のエピトープと複合した操作ＡＰＣの表面上で発現するように、標的抗原をコードする第１のトランス遺伝子と、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）をコードする第２のトランス遺伝子とを含む。ある特定の具体的な態様では、操作ＡＰＣ内で発現するＨＬＡは、ＨＬＡ−Ａ２である。
【０３５４】
一部の態様では、実施形態の操作ＡＰＣは、共刺激分子をコードする、少なくとも第３のトランス遺伝子をさらに含みうる。共刺激分子は、膜結合型Ｃγサイトカインでありうる、共刺激サイトカインでありうる。ある特定の態様では、共刺激サイトカインは、膜結合型ＩＬ−１５などのＩＬ−１５である。一部のさらなる態様では、操作ＡＰＣは、編集（または欠失）遺伝子を含みうる。例えば、ＰＤ−１、ＬＩＭ−３、ＣＴＬＡ−４、またはＴＣＲなどの阻害性遺伝子は、遺伝子の発現を低減するかまたは消失させるように編集することができる。実施形態の操作ＡＰＣは、任意の目的の標的抗原をコードするトランス遺伝子をさらに含みうる。例えば、標的抗原は、感染性疾患抗原または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）でありうる。
【０３５５】
ＰＯＣ（ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−ｃａｒｅ）
本開示の一実施形態では、本明細書で記載される免疫エフェクター細胞を、ＰＯＣ（ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−ｃａｒｅ）施設で改変する。場合によって、ＰＯＣ（ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−ｃａｒｅ）施設は、処置を必要とする対象の近隣の病院または機関（例えば、医療機関）にある。対象は、アフェレーシスを受け、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）またはＰＢＭＣの部分集団は、例えば、湿式分級またはＦｉｃｏｌｌ分離により濃縮することができる。濃縮されたＰＢＭＣまたはＰＢＭＣの部分集団は、さらなる加工の前に、任意の適切な低温保存液中で低温保存することができる。１つの場合には、ヒト血清アルブミンを含有する緩衝液を使用して、湿式分級工程を実施する。Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞は、本明細書で記載される選択法により単離することができる。１つの場合には、Ｔ細胞についての選択法は、Ｔ細胞上のＣＤ３およびＣＤ８に特異的なビーズを含む。１つの場合には、ビーズは、常磁性ビーズでありうる。採取された免疫エフェクター細胞は、改変の前に、任意の適切な低温保存用溶液中で低温保存することができる。免疫エフェクター細胞は、輸注に先立ち、最大で２４時間、３６時間、４８時間、７２時間、または９６時間にわたり融解させることができる。融解させた細胞は、改変の前に、細胞培養緩衝液、例えば、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充した細胞培養緩衝液（例えば、ＲＰＭＩ）、またはＩＬ−２およびＩＬ−２１などのサイトカインを含む緩衝液に入れることができる。別の態様では、採取された免疫エフェクター細胞は、低温保存を必要とせずに、速やかに改変することができる。
【０３５６】
場合によって、キメラ受容体、本明細書で記載される１もしくは複数の細胞タグ、および／またはサイトカインを、免疫エフェクター細胞へと操作／導入することにより、免疫エフェクター細胞を改変し、次いで、対象へと、迅速に輸注する。場合によって、免疫エフェクター細胞の供給源は、同種供給源および自家供給源の両方を含みうる。１つの場合には、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞でありうる。１つの場合には、キメラ受容体は、ＣＤ１９  ＣＡＲでありうる。別の場合には、キメラ受容体は、ＣＤ３３  ＣＡＲでありうる。さらなる場合には、キメラ受容体は、ＭＵＣ１６  ＣＡＲでありうる。別の場合には、サイトカインは、ｍｂＩＬ−１５でありうる。１つの場合には、ｍｂＩＬ−１５は、配列番号１７８のｍｂＩＬ−１５、またはその変異体もしくは断片である。１つの場合には、細胞タグは、配列番号５７でありうる。さらに別の場合には、ｍｂＩＬ−１５の発現は、本明細書で記載される、リガンド誘導性遺伝子スイッチ発現系によりモジュレートされる。例えば、ベレジメクスなどのリガンドを、対象へと送達して、ｍｂＩＬ−１５の発現をモジュレートすることができる。別の態様では、ベレジメクスを、５ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ、または１００ｍｇで提供する。さらなる態様では、低用量のベレジメクスを、例えば、０．５ｍｇ、１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、または２０ｍｇで提供する。一実施形態では、ベレジメクスを、改変免疫エフェクター細胞を輸注する０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１日前に、対象へと投与する。さらなる実施形態では、ベレジメクスを、改変免疫エフェクター細胞の輸注後、有効期間にわたり、約１２時間ごとに１回、約２４時間ごとに１回、約３６時間ごとに１回、または約４８時間ごとに１回、対象へと投与する。一実施形態では、ベレジメクス投与のための有効期間は、約７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０日間である。他の実施形態では、休薬期間後の休眠期間の後、または対象が、再発を被る場合に、ベレジメクスを再投与することができる。
【０３５７】
対象に対する副作用が観察されるか、または処置が必要とされない、ある特定の場合には、例えば、セツキシマブを介して、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける、改変免疫エフェクター細胞の、条件付けアブレーションのために、本明細書で記載されるトランケート型表皮増殖因子受容体タグ（ＨＥＲ１ｔ変異体）などの細胞タグを含む細胞タグを活性化させることができる。
【０３５８】
一部の実施形態では、このような免疫エフェクター細胞を、構築物により、電気穿孔を介して改変する。１つの場合には、電気穿孔を、Ｌｏｎｚａ製のＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）電気穿孔器などの電気穿孔器により実施する。他の実施形態では、上述の構築物を含むベクターは、非ウイルスベクターまたはウイルスベクターである。１つの場合には、非ウイルスベクターは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン−トランスポザーゼ系を含む。１つの場合には、特異的配列を使用して、免疫エフェクター細胞に電気穿孔する。例えば、免疫エフェクター細胞に、１つのトランスポゾンに続く、トランスポザーゼをコードするＤＮＡに続く、第２のトランスポゾンを電気穿孔することができる。別の場合には、免疫エフェクター細胞に、全てのトランスポゾンと、トランスポザーゼとを、同時に電気穿孔することができる。別の場合には、免疫エフェクター細胞に、トランスポザーゼに続き、両方のトランスポゾンまたは１つのトランスポゾンを、同時に電気穿孔することができる。逐次的な電気穿孔を経ながら、免疫エフェクター細胞を、次の電気穿孔ステップの前に、ある時間にわたり、休眠させることができる。
【０３５９】
場合によって、改変免疫エフェクター細胞は、繁殖ステップおよび活性化ステップを経ない。場合によって、改変免疫エフェクター細胞は、インキュベーションステップまたは培養ステップ（例えば、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける繁殖）を経ない。ある特定の場合には、輸注の前に、改変免疫エフェクター細胞を、ＩＬ−２およびＩＬ２１を含む緩衝液に入れる。他の場合には、輸注の前に、改変免疫エフェクター細胞を、細胞培養緩衝液、例えば、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充した細胞培養緩衝液（例えば、ＲＰＭＩ）に入れるか、またはこの中で休眠させる。輸注の前に、改変免疫エフェクター細胞を、採取し、洗浄し、生理食塩緩衝液中で、対象への輸注のための調製物に製剤化することができる。
【０３６０】
１つの場合には、輸注の前に、対象を、リンパ枯渇させている。他の場合には、リンパ枯渇は、必要とされず、改変免疫エフェクター細胞は、対象へと、迅速に、輸注される。例示的なリンパ枯渇レジメンを、下記の表２および３に一覧する。
【０３６１】
【表２】
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【０３６２】
【表３】
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【０３６３】
さらなる場合には、対象は、最小リンパ枯渇を受ける。本明細書における最小リンパ枯渇とは、リンパ枯渇レジメン後１日、２日、または３日以内に対象に輸注しうるような、低減型リンパ枯渇プロトコールを指す。１つの場合には、低減型リンパ枯渇プロトコールは、低用量のフルダラビンおよび／またはシクロホスファミドを含みうる。別の場合には、低減型リンパ枯渇プロトコールは、短期間、例えば、１日間または２日間にわたるリンパ枯渇を含みうる。
【０３６４】
一実施形態では、キメラ受容体およびサイトカインを、免疫エフェクター細胞へと操作／導入することにより、免疫エフェクター細胞を改変し、次いで、対象へと、迅速に輸注する。他の場合には、キメラ受容体およびサイトカインを、細胞へと操作／導入することにより、免疫エフェクター細胞を改変し、次いで、少なくとも０、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３，２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０時間以内に、対象へと輸注する。他の場合には、キメラ受容体およびサイトカインを、免疫エフェクター細胞へと操作／導入することにより、免疫エフェクター細胞を改変し、次いで、０日間、＜１日間、＜２日間、＜３日間、＜４日間、＜５日間、＜６日間、または＜７日間以内に、対象へと輸注する。
【０３６５】
一部の実施形態では、ある量の改変エフェクター細胞を、それを必要とする対象へと投与し、その量を、有効性およびサイトカイン関連毒性を誘導する潜在的可能性に基づき決定する。別の実施形態では、改変エフェクター細胞は、ＣＡＲ＋細胞およびＣＤ３＋細胞である。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞約１０４〜約１０９個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞約１０４〜約１０５個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞約１０５〜約１０６個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞約１０６〜約１０７個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞＞１０４個、かつ、≦約１０５個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞＞１０５個、かつ、≦約１０６個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞＞１０６個、かつ、≦約１０７個を含む。一実施形態では、１ｋｇ当たりの改変免疫エフェクター細胞＞１０２個であるが、≦１０４個の低用量を輸注することができる。
【０３６６】
一実施形態では、腫瘍組織への、直接的な局所送達を介して、改変免疫エフェクター細胞を、がんへとターゲティングする。例えば、卵巣がんでは、改変免疫エフェクター細胞を、腹部または腹腔へと、腹腔内（ＩＰ）送達することができる。このようなＩＰ送達は、ポートまたは化学療法薬の送達のために留置された既存のポートを介して実施することができる。改変免疫エフェクター細胞の、他の局所送達法は、切除腔へのカテーテル輸注、超音波誘導型腫瘍内注射、肝動脈輸注、または胸膜内送達を含みうる。
【０３６７】
一実施形態では、それを必要とする対象は、ＩＰを介して送達される、１回目の改変免疫エフェクター細胞の投与に続く、ＩＶを介して送達される、２回目の改変免疫エフェクター細胞の投与で治療を開始することができる。さらなる実施形態では、２回目の改変免疫エフェクター細胞の投与に、ＩＶまたはＩＰを介して送達されうる、後続の投与を後続させることができる。一実施形態では、１回目および２回目またはさらに後続の投与の間の持続期間は、約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０日間でありうる。一実施形態では、１回目および２回目またはさらに後続の投与の間の持続期間は、約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６カ月間でありうる。別の実施形態では、１回目および２回目またはさらに後続の投与の間の持続期間は、約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０年間でありうる。
【０３６８】
別の実施形態では、カテーテルは、改変免疫エフェクター細胞の、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回の投与のための、さらなる投与のために、腫瘍部位または転移部位に留置することができる。場合によって、改変エフェクター細胞の投与は、１ｋｇ当たりの改変免疫エフェクター細胞約１０２〜約１０９個を含みうる。毒性が観察される場合には、改変エフェクター細胞の投与は、１ｋｇ当たりの改変免疫エフェクター細胞約１０２〜約１０５個を含みうる。場合によって、改変エフェクター細胞の投与は、１ｋｇ当たりの改変免疫エフェクター細胞約１０２個で始めることができ、後続の用量は、１ｋｇ当たりの改変免疫エフェクター細胞約１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、または１０９個へと増大させることができる。
【０３６９】
他の実施形態では、操作細胞の増殖および／または生存を刺激する方法は、細胞試料を、対象から得るステップと、細胞試料の細胞に、１または複数のトランスポゾンを含む、１または複数のポリヌクレオチドをトランスフェクトするステップとを含む。一実施形態では、トランスポゾンは、操作細胞の集団をもたらすように、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、サイトカイン、１または複数の細胞タグ、および前記１または複数のポリヌクレオチドを、前記細胞のゲノムへと組み込むのに有効なトランスポザーゼをコードする。ある実施形態では、トランスポゾンは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、サイトカイン、１または複数の細胞タグ、サイトカインのリガンド誘導性制御のための遺伝子スイッチポリペプチド、および前記１または複数のポリヌクレオチドを、前記細胞のゲノムへと組み込んで、操作細胞の集団をもたらすのに有効なトランスポザーゼをコードする。ある実施形態では、遺伝子スイッチポリペプチドは、ｉ）第１の核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたＤＮＡ結合性ドメインを含む、第１の遺伝子スイッチポリペプチド、およびｉｉ）第２の核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたトランス活性化ドメインを含む、第２の遺伝子スイッチポリペプチドを含む。一部の実施形態では、第１の遺伝子スイッチポリペプチドと、第２の遺伝子スイッチポリペプチドとは、リンカーにより接続されている。１つの場合には、操作細胞の、対象への投与の前に、リンパ枯渇が必要とされない。
【０３７０】
１つの場合には、操作細胞を、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて繁殖させる方法は、細胞試料を、対象から得るステップと、細胞試料の細胞に、１または複数のトランスポゾンを含む、１または複数のポリヌクレオチドをトランスフェクトするステップとを含む。一実施形態では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、サイトカイン、１または複数の細胞タグ；および前記１または複数のポリヌクレオチドを、前記細胞のゲノムへと組み込むのに有効なトランスポザーゼを含むトランスポゾンを、細胞の試料へと電気穿孔して、操作細胞の集団をもたらす。さらなる実施形態では、トランスポゾンは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、サイトカイン、１または複数の細胞タグ、サイトカインのリガンド誘導性制御のための遺伝子スイッチポリペプチド、および前記１または複数のポリヌクレオチドを、前記細胞のゲノムへと組み込んで、操作細胞の集団をもたらすのに有効なトランスポザーゼをコードする。ある実施形態では、遺伝子スイッチポリペプチドは、ｉ）第１の核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたＤＮＡ結合性ドメインを含む、第１の遺伝子スイッチポリペプチド、およびｉｉ）第２の核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたトランス活性化ドメインを含む、第２の遺伝子スイッチポリペプチドを含む。一部の実施形態では、第１の遺伝子スイッチポリペプチドと、第２の遺伝子スイッチポリペプチドとは、リンカーにより接続されている。別の実施形態では、単一のトランスポゾンは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、サイトカイン、本明細書で記載される、ＨＥＲ１ｔまたは任意の変異体など、１または複数の細胞タグを含みうる。１つの場合には、操作細胞の、対象への投与の前に、リンパ枯渇が必要とされない。
【０３７１】
別の実施形態では、それを必要とする対象の、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける操作細胞の存続を増強する方法は、細胞試料を、対象から得るステップと、細胞試料の細胞に、１または複数のトランスポゾンを含む、１または複数のポリヌクレオチドをトランスフェクトするステップとを含む。一実施形態では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、サイトカイン、１または複数の細胞タグ；および前記１または複数のポリヌクレオチドを、前記細胞のゲノムへと組み込むのに有効なトランスポザーゼを含むトランスポゾンを、細胞の試料へと電気穿孔して、操作細胞の集団をもたらす。別の実施形態では、単一のトランスポゾンは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、サイトカイン、本明細書で記載される、ＨＥＲ１ｔまたは任意の変異体など、１または複数の細胞タグを含みうる。場合によって、１または複数のトランスポゾンは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、サイトカイン、１または複数の細胞タグ、サイトカインのリガンド誘導性制御のための遺伝子スイッチポリペプチド、およびＤＮＡを、前記細胞のゲノムへと組み込んで、操作細胞の集団をもたらすのに有効なトランスポザーゼをコードする。場合によって、遺伝子スイッチポリペプチドは、ｉ）第１の核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたＤＮＡ結合性ドメインを含む、第１の遺伝子スイッチポリペプチド、およびｉｉ）第２の核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたトランス活性化ドメインを含む、第２の遺伝子スイッチポリペプチドを含み、第１の遺伝子スイッチポリペプチドと、第２の遺伝子スイッチポリペプチドとは、リンカーにより接続されている。１つの場合には、操作細胞の、対象への投与の前に、リンパ枯渇が必要とされない。
【０３７２】
別の実施形態では、充実性腫瘍を伴う対象を処置する方法は、細胞試料を、対象から得るステップと、試料の細胞に、１または複数のトランスポゾンを含む、１または複数のポリヌクレオチドをトランスフェクトするステップと、操作細胞の集団を、対象へと投与するステップとを含む。１つの場合には、操作細胞の、対象への投与の前に、リンパ枯渇が必要とされない。場合によって、１または複数のトランスポゾンは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、サイトカイン、１または複数の細胞タグ、およびＤＮＡを、細胞のゲノムへと組み込むのに有効なトランスポザーゼをコードする。場合によって、１または複数のトランスポゾンは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、サイトカイン、１または複数の細胞タグ、サイトカインのリガンド誘導性制御のための遺伝子スイッチポリペプチド、およびＤＮＡを、細胞のゲノムへと組み込むのに有効なトランスポザーゼをコードする。場合によって、遺伝子スイッチポリペプチドは、ｉ）第１の核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたＤＮＡ結合性ドメインを含む、第１の遺伝子スイッチポリペプチド、およびｉｉ）第２の核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたトランス活性化ドメインを含む、第２の遺伝子スイッチポリペプチドを含み、第１の遺伝子スイッチポリペプチドと、第２の遺伝子スイッチポリペプチドとは、リンカーにより接続されている。場合によって、細胞は、電気穿孔を介してトランスフェクトされる。場合によって、遺伝子スイッチポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、プロモーターによりモジュレートされる。場合によって、プロモーターは、組織特異的プロモーターもしくはＥＦ１Ａプロモーター、またはこれらの機能的な変異体である。場合によって、組織特異的プロモーターは、Ｔ細胞特異的応答エレメントまたはＮＦＡＴ応答エレメントを含む。場合によって、サイトカインは、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒ、またはＩＬ−１５変異体の融合体のうちの少なくとも１つを含む。場合によって、サイトカインは、分泌形態にある。場合によって、サイトカインは、膜結合形態にある。場合によって、細胞は、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｔ細胞、またはＴ細胞前駆細胞である。場合によって、細胞は、対象へと（例えば、対象に、操作細胞を輸注することにより）投与される。場合によって、方法は、有効量のリガンド（例えば、ベレジメクス）を投与して、サイトカインの発現を誘導するステップをさらに含む。場合によって、ＣＡＲは、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＢＣＭＡ、ＣＤ４４、α−葉酸受容体、ＣＡＩＸ、ＣＤ３０、ＲＯＲ１、ＣＥＡ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、葉酸結合性タンパク質、ＧＤ２、ＧＤ３、ＩＬ−１３Ｒ−ａ２、ＫＤＲ、ＥＤＢ−Ｆ、メソテリン、ＣＤ２２、ＥＧＦＲ、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−１６、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＵＣ−１６、ｈ５Ｔ４、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ−７２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１２３、およびＶＥＧＦ−Ｒ２のうちの少なくとも１つに結合することが可能である。場合によって、トランスポザーゼは、サケ科型Ｔｃ１様トランスポザーゼである。場合によって、トランスポザーゼは、ＳＢ１１またはＳＢ１���０ｘトランスポザーゼである。他の場合には、トランスポザーゼは、ＰｉｇｇｙＢａｃである。場合によって、細胞タグは、ＨＥＲ１ｔ１のうちの少なくとも１つを含む。
【０３７３】
適応
一部の実施形態では、本明細書で記載されるポリヌクレオチドをコードする改変エフェクター細胞を、障害、例えば、がんまたは感染性疾患を有する対象へと投与する方法が開示される。場合によって、がんは、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＢＣＭＡ、ＣＤ１２３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、α−葉酸受容体、ＣＡＩＸ、ＣＤ３０、ＲＯＲ１、ＣＥＡ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、葉酸結合性タンパク質、ＧＤ２、ＧＤ３、ＩＬ−１３Ｒ−ａ２、ＫＤＲ、ＥＤＢ−Ｆ、メソテリン、ＣＤ２２、ＥＧＦＲ、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−１６、ＭＡＧＥ−Ａ１、ｈ５Ｔ４、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ−７２、またはＶＥＧＦ−Ｒ２の発現と関連するがんである。
【０３７４】
一部の実施形態では、本明細書で記載されるポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドをコードする改変エフェクター細胞を、ＣＤ１９の過剰発現と関連するがんを有する対象へと投与する方法が開示される。一部の実施形態では、本明細書では、改変エフェクター細胞を、ＣＤ３３の過剰発現と関連するがんを有する対象へと投与する方法が開示される。一部の実施形態では、本明細書では、改変エフェクター細胞を、ＣＤ４４、ＢＣＭＡ、ＣＤ１２３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、α−葉酸受容体、ＣＡＩＸ、ＣＤ３０、ＲＯＲ１、ＣＥＡ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、葉酸結合性タンパク質、ＧＤ２、ＧＤ３、ＩＬ−１３Ｒ−ａ２、ＫＤＲ、ＥＤＢ−Ｆ、メソテリン、ＣＤ２２、ＥＧＦＲ、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−１６、ＭＡＧＥ−Ａ１、ｈ５Ｔ４、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ−７２、またはＶＥＧＦ−Ｒ２の過剰発現と関連するがんを有する対象へと投与する方法が開示される。場合によって、がんは、転移性がんである。他の場合には、がんは、再発性がんまたは不応性がんである。
【０３７５】
場合によって、がんは、充実性腫瘍または血液悪性腫瘍である。一部の場合には、がんは、充実性腫瘍である。他の場合には、がんは、血液悪性腫瘍である。場合によって、がんは、転移性がんである。場合によって、がんは、再発性がんまたは不応性がんである。
【０３７６】
一部の場合には、がんは、充実性腫瘍である。例示的な充実性腫瘍は、肛門がん；虫垂がん；胆管がん（すなわち、胆管癌）；膀胱がん；脳腫瘍；乳がん；子宮頸がん；結腸がん；原発不明がん（ＣＵＰ）；食道がん；眼がん；卵管がん；消化器がん；腎臓がん；肝臓がん；肺がん；髄芽腫；黒色腫；口腔がん；卵巣がん；膵臓がん；上皮小体疾患；陰茎がん；下垂体腫瘍；前立腺がん；直腸がん；皮膚がん；胃がん；精巣がん；咽頭がん；甲状腺がん；子宮がん；膣がん；または外陰がんを含むがこれらに限定されない。
【０３７７】
一部の場合には、がんは、血液悪性腫瘍である。場合によって、血液悪性腫瘍は、リンパ腫、白血病、骨髄腫、またはＢ細胞性悪性腫瘍を含む。場合によって、血液悪性腫瘍は、リンパ腫、白血病、または骨髄腫を含む。一部の場合には、例示的な血液悪性腫瘍は、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、高危険性ＣＬＬ、非ＣＬＬ／ＳＬＬ性リンパ腫、前リンパ球性白血病（ＰＬＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、ワルデンシュトロームマクログロブリン血症、多発性骨髄腫、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、非バーキット高悪性度Ｂ細胞リンパ腫、縦隔原発Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＬ）、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、脾辺縁帯リンパ腫、形質細胞骨髄腫、形質細胞腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、またはリンパ腫様肉芽腫症を含む。一部の実施形態では、血液悪性腫瘍は、骨髄性白血病を含む。一部の実施形態では、血液悪性腫瘍は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）または慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を含む。
【０３７８】
一部の場合には、本明細書では、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、高危険性ＣＬＬ、非ＣＬＬ／ＳＬＬ性リンパ腫、前リンパ球性白血病（ＰＬＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、ワルデンシュトロームマクログロブリン血症、多発性骨髄腫、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、非バーキット高悪性度Ｂ細胞リンパ腫、縦隔原発Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＬ）、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、脾辺縁帯リンパ腫、形質細胞骨髄腫、形質細胞腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、またはリンパ腫様肉芽腫症から選択される血液悪性腫瘍を有する対象へと、本明細書で記載される改変エフェクター細胞を投与する方法が開示される。一部の場合には、本明細書では、ＡＭＬまたはＣＭＬから選択される血液悪性腫瘍を有する対象へと、改変エフェクター細胞を対象に投与する方法が開示される。
【０３７９】
他の場合には、本明細書では、感染性疾患に起因する感染を有する対象へと投与する方法が開示される。感染性疾患は、細菌感染、ウイルス感染、または真菌感染から生じる疾患でありうる。他の場合には、例示的ウイルス性病原体は、アデノウイルス科（Adenoviridae）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＲＳＶ（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ）、ＪＣウイルス、ＢＫウイルス、ＨＳＶ、ＨＨＶ科のウイルス、ピコルナウイルス科（Picornaviridae）、ヘルペスウイルス科（Herpesviridae）、ヘパドナウイルス科（Hepadnaviridae）、フラビウイルス科（Flaviviridae）、レトロウイルス科（Retroviridae）、オルトミクソウイルス科（Orthomyxoviridae）、パラミクソウイルス科（Paramyxoviridae）、パポバウイルス科（Papovaviridae）、ポリオーマウイルス属（Polyomavirus）、ラブドウイルス科（Rhabdoviridae）、およびトガウイルス科（Togaviridae）の病原体を含む。例示的な病原性ウイルスは、天然痘、インフルエンザ、流行性耳下腺炎、麻疹、水痘、エボラ熱、および風疹を引き起こす。例示的な病原性真菌は、カンジダ属（Candida）、アスペルギルス属（Aspergillus）、クリプトコッカス属（Cryptococcus）、ヒストプラズマ属（Histoplasma）、ニューモシスチス属（Pneumocystis）、およびスタキボトリス属（Stachybotrys）を含む。例示的な病原性細菌は、連鎖球菌属（Streptococcus）、シュードモナス属（Pseudomonas）、赤痢菌属（Shigella）、カンピロバクター属（Campylobacter）、ブドウ球菌属（Staphylococcus）、ヘリコバクター属（Helicobacter）、大腸菌（E. coli）、リケッチア属（Rickettsia）、バチルス属（Bacillus）、ボルデテラ属（Bordetella）、クラミジア属（Chlamydia）、スピロヘータ綱（Spirochetes）、およびサルモネラ属（Salmonella）を含む。
【０３８０】
改変エフェクター細胞の用量
一部の実施形態では、ある量の改変エフェクター細胞を、それを必要とする対象へと投与するが、量は、サイトカインと関連する傷害作用を誘導する有効性および潜在的可能性に基づき決定する。場合によって、改変免疫エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変免疫エフェクター細胞約１０２〜約１０９個を含む。場合によって、改変免疫エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変免疫エフェクター細胞約１０３〜約１０９個を含む。場合によって、改変免疫エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変免疫エフェクター細胞約１０４〜約１０９個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞約１０５〜約１０９個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞約１０５〜約１０８個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞約１０５〜約１０７個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞約１０６〜約１０９個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞約１０６〜約１０８個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞約１０７〜約１０９個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞約１０５〜約１０６個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞約１０６〜約１０７個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞約１０７〜約１０８個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞約１０８〜約１０９個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞約１０９個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞約１０８個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞約１０７個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞約１０６個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞約１０５個を含む。
【０３８１】
一部の実施形態では、改変エフェクター細胞は、改変Ｔ細胞である。一部の場合には、改変Ｔ細胞は、ＣＡＲ−Ｔ細胞である。場合によって、ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０２〜約１０４個を含む。場合によって、ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０５〜約１０９個を含む。場合によって、ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０５〜約１０８個を含む。場合によって、ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０５〜約１０７個を含む。場合によって、ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０６〜約１０９個を含む。場合によって、ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０６〜約１０８個を含む。場合によって、ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０７〜約１０９個を含む。場合によって、ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０５〜約１０６個を含む。場合によって、ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０６〜約１０７個を含む。場合によって、ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０７〜約１０８個を含む。場合によって、ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０８〜約１０９個を含む。一部の場合には、ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０９個を含む。一部の場合には、ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０８個を含む。一部の場合には、ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０７個を含む。一部の場合には、ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０６個を含む。一部の場合には、ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０５個を含む。
【０３８２】
一部の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞である。場合によって、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０２〜約１０９個を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞である。場合によって、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０３〜約１０９個を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞である。場合によって、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０４〜約１０９個を含む。場合によって、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０５〜約１０９個を含む。場合によって、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０５〜約１０８個を含む。場合によって、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０５〜約１０７個を含む。場合によって、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０６〜約１０９個を含む。場合によって、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０６〜約１０８個を含む。場合によって、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０７〜約１０９個を含む。場合によって、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０５〜約１０６個を含む。場合によって、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０６〜約１０７個を含む。場合によって、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０７〜約１０８個を含む。場合によって、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０８〜約１０９個を含む。場合によって、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０９個を含む。場合によって、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０８個を含む。場合によって、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０７個を含む。場合によって、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０６個を含む。場合によって、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０５個を含む。一部の場合には、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０４個を含む。一部の場合には、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０３個を含む。一部の場合には、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０２個を含む。
【０３８３】
一部の実施形態では、改変Ｔ細胞は、操作ＴＣＲ  Ｔ−細胞である。場合によって、操作ＴＣＲ  Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＴＣＲ細胞約１０２〜約１０９個を含む。場合によって、操作ＴＣＲ  Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＴＣＲ細胞約１０３〜約１０９個を含む。場合によって、操作ＴＣＲ  Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＴＣＲ細胞約１０４〜約１０９個を含む。場合によって、操作ＴＣＲ  Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＴＣＲ細胞約１０５〜約１０９個を含む。場合によって、操作ＴＣＲ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＴＣＲ細胞約１０５〜約１０８個を含む。場合によって、操作ＴＣＲ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＴＣＲ細胞約１０５〜約１０７個を含む。場合によって、操作ＴＣＲ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＴＣＲ細胞約１０６〜約１０９個を含む。場合によって、操作ＴＣＲ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＴＣＲ細胞約１０６〜約１０８個を含む。場合によって、操作ＴＣＲ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＴＣＲ細胞約１０７〜約１０９個を含む。場合によって、操作ＴＣＲ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＴＣＲ細胞約１０５〜約１０６個を含む。場合によって、操作ＴＣＲ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＴＣＲ細胞約１０６〜約１０７個を含む。場合によって、操作ＴＣＲ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＴＣＲ細胞約１０７〜約１０８個を含む。場合によって、操作ＴＣＲ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＴＣＲ細胞約１０８〜約１０９個を含む。一部の場合には、操作ＴＣＲ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＴＣＲ細胞約１０９個を含む。一部の場合には、操作ＴＣＲ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＴＣＲ細胞約１０８個を含む。一部の場合には、操作ＴＣＲ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＴＣＲ細胞約１０７個を含む。一部の場合には、操作ＴＣＲ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＴＣＲ細胞約１０６個を含む。一部の場合には、操作ＴＣＲ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＴＣＲ細胞約１０５個を含む。一部の場合には、操作ＴＣＲ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＴＣＲ細胞約１０４個を含む。一部の場合には、操作ＴＣＲ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＴＣＲ細胞約１０３個を含む。一部の場合には、操作ＴＣＲ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＴＣＲ細胞約１０２個を含む。
【０３８４】
医薬組成物および剤形
一部の実施形態では、対象における投与のための、本明細書で開示されるポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む組成物が開示される。場合によって、本明細書では、本明細書で開示されるポリヌクレオチドまたはポリペプチドをコードし、任意選択で、サイトカインおよび／またはさらなる治療剤を含有する、改変エフェクター細胞組成物が開示される。一部の場合には、本明細書にはまた、エフェクター細胞を改変するための細胞タグを発現させるための、ポリペプチド構築物をコードするベクターも含まれる。
【０３８５】
一部の場合には、改変エフェクター細胞またはポリペプチド構築物およびキメラ抗原受容体をコードするベクターによる医薬組成物を、活性化合物の、薬学的に使用されうる調製物への加工を容易とする、賦形剤および補助剤を含む、１または複数の生理学的に許容される担体を使用する、常套的な形で製剤化する。適正な製剤は、選択される投与経路に依存する。本明細書で記載される医薬組成物の概要については、例えば、Remington: The Science and Practice ofPharmacy, Nineteenth Ed (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995); Hoover, John E., Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975; Liberman, H.A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980; and Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Seventh Ed. (Lippincott Williams & Wilkins 1999)において見出される。
【０３８６】
医薬組成物は、任意選択で、例だけを目的として述べると、常套的な、混合工程、溶解工程、顆粒化工程、糖衣錠作製工程、微粒化工程、乳化工程、カプセル化工程、封入工程、または圧縮工程などによる、常套的な形で製造される。
【０３８７】
ある特定の実施形態では、組成物はまた、酢酸、ホウ酸、クエン酸、乳酸、リン酸、および塩酸などの酸；水酸化ナトリウム、リン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、およびトリス−ヒドロキシメチルアミノメタンなどの塩基を含む、１または複数のｐＨ調整剤または緩衝剤；ならびにクエン酸塩／デキストロース、炭酸水素ナトリウム、および塩化アンモニウムなどの緩衝液も含みうる。このような酸、塩基、および緩衝剤は、組成物のｐＨを、許容可能な範囲で維持するのに必要とされる量で組み入れられる。
【０３８８】
他の実施形態では、組成物はまた、組成物のオスモル濃度を、許容可能な範囲に収めるのに必要とされる量の、１または複数の塩も含みうる。このような塩は、ナトリウムカチオン、カリウムカチオン、またはアンモニウムカチオンと、塩化物アニオン、クエン酸アニオン、アスコルビン酸アニオン、ホウ酸アニオン、リン酸アニオン、重炭酸アニオン、硫酸アニオン、チオ硫酸アニオン、または亜硫酸水素アニオンとを有する塩を含み、適切な塩は、塩化ナトリウム塩、塩化カリウム塩、チオ硫酸ナトリウム塩、亜硫酸水素ナトリウム塩、および硫酸アンモニウム塩を含む。
【０３８９】
本明細書で記載される医薬組成物は、経口投与経路、非経口（例えば、静脈内、皮下、筋内、脳内、脳室内、関節内、腹腔内、または頭蓋内）投与経路、鼻腔内投与経路、口腔内投与経路、舌下投与経路、または直腸内投与経路を含むがこれらに限定されない、任意の適切な投与経路により投与される。一部の場合には、医薬組成物を、非経口（例えば、静脈内、皮下、筋内、脳内、脳室内、関節内、腹腔内、または頭蓋内）投与のために製剤化する。
【０３９０】
本明細書で記載される医薬組成物を、処置される個体による経口の服用のための、水性経口分散液、液体、ゲル、シロップ、エリキシル、スラリー、懸濁液など、固体経口剤形、エアゾール剤、制御放出製剤、即時融解製剤、発泡製剤、凍結乾燥製剤、錠剤、粉剤、丸剤、糖衣錠剤、カプセル剤、遅延放出製剤、持続放出製剤、パルス放出製剤、多粒子製剤、即時放出製剤と制御放出製剤との混合剤を含むがこれらに限定されない、任意の適切な剤形へと製剤化する。一部の実施形態では、医薬組成物を、カプセル剤へと製剤化する。一部の実施形態では、医薬組成物を、溶液（例えば、静脈内投与のための）へと製剤化する。場合によって、医薬組成物を、輸注液として製剤化する。場合によって、医薬組成物を、注射液として製剤化する。
【０３９１】
本明細書で記載される、固体の医薬の剤形は、任意選択で、本明細書で記載される化合物と、適合性の担体、結合剤、充填剤、懸濁剤、香味剤、甘味剤、崩壊剤、分散剤、界面活性剤、滑沢剤、着色剤、希釈剤、可溶化剤、湿潤剤、可塑化剤、安定化剤、浸透増強剤、保湿剤、消泡剤、抗酸化剤、防腐剤、または１もしくは複数のこれらの組合せなど、１または複数の薬学的に許容される添加剤とを含む。
【０３９２】
さらなる他の態様では、Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th Edition (2000)において記載されている手順など、標準的なコーティング手順を使用して、組成物の周囲に、薄膜コーティングを提供する。一部の実施形態では、組成物を、粒子（例えば、カプセルによる投与のための）へと製剤化し、粒子の一部または全部をコーティングする。一部の実施形態では、組成物を、粒子（例えば、カプセルによる投与のための）へと製剤化し、粒子の一部または全部をマイクロカプセル化する。一部の実施形態では、組成物を、粒子（例えば、カプセルによる投与のための）へと製剤化し、粒子の一部または全部をマイクロカプセル化せず、アンコーティングする。
【０３９３】
ある特定の実施形態では、本明細書で提示される組成物はまた、微生物活性を阻害する、１または複数の保存剤も含みうる。適切な保存剤は、メルフェンおよびチオメルサールなどの水銀含有物質；安定化二酸化塩素；ならびに塩化ベンザルコニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、および塩化セチルピリジニウムなどの四級アンモニウム化合物を含む。
【０３９４】
本明細書で言及される「増殖性疾患」とは、細胞の過剰な増殖および細胞内マトリックスの過剰な代謝回転が、がんを含むいくつかの疾患の発症機序に著明に寄与する、という統一的概念が提示されていることを意味する。
【０３９５】
本明細書で使用される「患者」とは、生理学的状態、例えば、がんまたは自己免疫状態または感染症を伴うか、またはこれを有するかもしくは発症することが疑われると診断された哺乳動物対象を指す。一部の実施形態では、「患者」という用語は、がんを発症する可能性が平均より高い哺乳動物対象を指す。例示的な患者は、ヒト、類人猿、イヌ、ブタ、ウシ、ネコ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、齧歯動物、および本明細書で開示される療法から利益を得うる、他の哺乳動物でありうる。例示的なヒト患者は、男性および／または女性でありうる。
【０３９６】
本明細書では、「〜を投与すること」とは、本開示の組成物を、患者に提供することを指す。例を目的として、限定せずに述べると、組成物の投与、例えば、注射は、静脈内（ｉ．ｖ．）注射、皮下（ｓ．ｃ．）注射、皮内（ｉ．ｄ．）注射、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射、または筋内（ｉ．ｍ．）注射により実施することができる。１または複数のこのような経路を利用することができる。非経口投与は、例えば、ボーラス注射による場合もあり、時間経過にわたる、漸次的な灌流による場合もある。代替的に、または共時的に、投与は、経口経路による投与でありうる。加えて、投与はまた、ボーラスまたは細胞ペレットのデポ手術による場合もあり、医療用デバイスの設置による場合もある。
【０３９７】
本明細書では、「それを必要とする患者」または「それを必要とする対象」を、例えば、がんなどの増殖性障害であるがこれらに限定されない、疾患または障害を伴うと診断されているか、またはこれを有することか疑われる患者または対象と称する。一実施形態では、患者または対象は、充実性腫瘍または白血病を有するか、またはこれを発症する可能性が高い。一部の実施形態では、白血病は、例えば、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）でありうる。
【０３９８】
本開示の組成物は、本発明の核酸配列を発現する宿主細胞、または本発明の核酸配列を含むベクターを、増殖性障害を処置または防止するのに有効な量で含みうる。本明細書で使用される「処置」、「〜を処置すること」などの用語は、所望の薬理学的効果および／または生理学的効果を得ることを指す。複数の実施形態では、効果は、治療的である、すなわち、効果は、疾患および／または疾患に帰せられうる有害症状を、部分的または完全に治癒させる。この目的で、本発明方法は、本発明の核酸配列を発現する宿主細胞、または本発明の核酸配列を含むベクターを含む、「治療有効量」の組成物を投与するステップを含む。
【０３９９】
「治療有効量」とは、所望の治療結果を達成するのに必要な投与量において、必要な期間にわたり有効な量を指す。治療有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに個体において所望の応答を誘発する、本発明の核酸配列の能力などの因子に従い変動しうる。
【０４００】
代替的に、薬理学的効果および／または生理学的効果は、「予防的」な場合もある、すなわち、効果は、疾患またはその症状を、完全に、または部分的に予防する場合もある。
【０４０１】
「予防有効量」とは、所望の予防結果（例えば、疾患の発症の防止）を達成するのに必要な投与量において、必要な期間にわたり有効な量を指す。
【０４０２】
「消泡剤」は、加工時における発泡であって、水性分散液の凝固、薄膜完成品中の気泡を結果としてもたらすか、または、一般に、加工を損なう発泡を低減する。例示的な抗発泡剤は、シリコンエマルジョン（ｓｉｌｉｃｏｎ  ｅｍｕｌｓｉｏｎ）またはセスキオレイン酸（sesquoleate）ソルビタンを含む。
【０４０３】
「抗酸化剤」は、例えば、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、およびトコフェロールを含む。ある特定の実施形態では、抗酸化剤は、必要とされる場合、化学的安定性を増強する。
【０４０４】
本明細書で記載される製剤は、抗酸化剤、金属キレート化剤、チオールを含有する化合物、および他の一般的な安定化剤から利益を得る場合がある。このような安定化剤の例は、（ａ）約０．５％〜約２％ｗ／ｖのグリセロール、（ｂ）約０．１％〜約１％ｗ／ｖのメチオニン、（ｃ）約０．１％〜約２％ｗ／ｖのモノチオグリセロール、（ｄ）約１ｍＭ〜約１０ｍＭのＥＤＴＡ、（ｅ）約０．０１％〜約２％ｗ／ｖのアスコルビン酸、（ｆ）０．００３％〜約０．０２％ｗ／ｖのポリソルベート８０、（ｇ）０．００１％〜約０．０５％ｗ／ｖのポリソルベート２０、（ｈ）アルギニン、（ｉ）ヘパリン、（ｊ）硫酸デキストラン、（ｋ）シクロデキストリン、（ｌ）ポリ硫酸ペントサン、および他のヘパリノイド、（ｍ）マグネシウムおよび亜鉛などの二価カチオン、または（ｎ）これらの組合せを含むがこれらに限定されない。
【０４０５】
「結合剤」は、凝集性の性質を付与し、例えば、アルギン酸およびその塩；カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース（例えば、Ｍｅｔｈｏｃｅｌ（登録商標））、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース（例えば、Ｋｌｕｃｅｌ（登録商標））、エチルセルロース（例えば、Ｅｔｈｏｃｅｌ（登録商標））、および結晶セルロース（例えば、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標））などのセルロース誘導体；微晶質デキストロース；アミロース；ケイ酸マグネシウムアルミニウム；多糖酸；ベントナイト；ゼラチン；ポリビニルピロリドン／酢酸ビニルコポリマー；クロスポビドン；ポビドン；デンプン；アルファデンプン；トラガント、デキストリン、スクロース（例えば、Ｄｉｐａｃ（登録商標））、グルコース、デキストロース、糖蜜、マンニトール、ソルビトール、キシリトール（例えば、Ｘｙｌｉｔａｂ（登録商標））、およびラクトースなどの糖；アカシア、トラガント、ガッティガム、イサポールハスクの粘液、ポリビニルピロリドン（例えば、Ｐｏｌｙｖｉｄｏｎｅ（登録商標）ＣＬ、Ｋｏｌｌｉｄｏｎ（登録商標）ＣＬ、Ｐｏｌｙｐｌａｓｄｏｎｅ（登録商標）ＸＬ−１０）、カラマツ由来のアラビノガラクタン（arabogalactan）、Ｖｅｅｇｕｍ（登録商標）、ポリエチレングリコール、蝋、アルギン酸ナトリウムなどの天然ガムまたは合成ガムを含む。
【０４０６】
「担体」または「担体材料」は、医薬中で一般に使用される任意の賦形剤を含み、イブルチニブおよび抗がん剤の化合物など、本明細書で開示される化合物との適合性、ならびに所望の剤形の放出プロファイル特性に基づき選択されるものとする。例示的な担体材料は、例えば、結合剤、懸濁剤、崩壊剤、充填剤、界面活性剤、可溶化剤、安定化剤、滑沢剤、保湿剤、希釈剤などを含む。「薬学的に適合性の担体材料」は、アカシア、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、グリセロリン酸カルシウム、カルシウム乳酸、マルトデキストリン、グリセリン、ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、コレステロール、コレステロールエステル、カゼイン酸ナトリウム、ダイズレシチン、タウロコール酸、ホスファチジルコリン、塩化ナトリウム、リン酸三カルシウム、リン酸二カリウム、セルロースおよびセルロースコンジュゲート、糖、ステアロイル乳酸ナトリウム、カラギーナン、モノグリセリド、ジグリセリド、アルファデンプンなどを含みうるがこれらに限定されない。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Nineteenth Ed (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995)、Hoover, John E., Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975、Liberman, H.A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980、およびPharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Seventh Ed. (Lippincott Williams & Wilkins1999)を参照されたい。
【０４０７】
「分散剤」および／または「粘性モジュレーティング剤」は、液体培地または顆粒化法またブレンド法を介して、薬物の拡散および均質性を制御する材料を含む。一部の実施形態では、これらの薬剤はまた、コーティングマトリックスまたはエローディングマトリックスの有効性も促進する。例示的な拡散促進剤／分散剤は、例えば、親水性ポリマー、電解質、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６０またはＴｗｅｅｎ（登録商標）８０、ＰＥＧ、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ；市販品では、Ｐｌａｓｄｏｎｅ（登録商標）として公知である）、ａｎｄ例えば、ヒドロキシプロピルセルロース（例えば、ＨＰＣ、ＨＰＣ−ＳＬ、およびＨＰＣ−Ｌ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（例えば、ＨＰＭＣ  Ｋ１００、ＨＰＭＣ  Ｋ４Ｍ、ＨＰＭＣ  Ｋ１５Ｍ、およびＨＰＭＣ  Ｋ１００Ｍ）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（carboxymethylcellulose sodium）、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ステアリン酸酢酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣＡＳ）、非晶質セルロースなど、炭水化物ベースの分散剤、ケイ酸マグネシウムアルミニウム、トリエタノールアミン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ビニルピロリドン／酢酸ビニルコポリマー（Ｓ６３０）、酸化エチレンおよびホルムアルデヒドを伴う、４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェノールポリマー（チロキサポールとしてもまた公知である）、ポロキサマー（例えば、酸化エチレンと、酸化プロピレンとのブロックコポリマーである、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ  Ｆ６８（登録商標）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ  Ｆ８８（登録商標）、およびＰｌｕｒｏｎｉｃｓ  Ｆ１０８（登録商標））；およびポロキサミン（例えば、酸化プロピレンおよび酸化エチレンの、エチレンジアミンへの逐次的付加から導出される四官能性ブロックコポリマーである、Ｐｏｌｏｘａｍｉｎｅ  ９０８（登録商標）（ＢＡＳＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）としてもまた公知のＴｅｔｒｏｎｉｃ  ９０８（登録商標））、ポリビニルピロリドンＫ１２、ポリビニルピロリドンＫ１７、ポリビニルピロリドンＫ２５、またはポリビニルピロリドンＫ３０、ポリビニルピロリドン／酢酸ビニルコポリマー（Ｓ−６３０）、ポリエチレングリコール（例えば、ポリエチレングリコールは、約３００〜約６０００、または約３３５０〜約４０００、または約７０００〜約５４００の分子量を有しうる）、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ポリソルベート８０、アルギン酸ナトリウム、例えば、トラガントガムおよびアカシアガム、グアルガムなどのガム、キサンタンガムを含むキサンタン、糖、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース誘導体、ポリソルベート８０、アルギン酸ナトリウム、モノラウリン酸ポリエトキシル化ソルビタン、モノラウリン酸ポリエトキシル化ソルビタン、ポビドン、カルボマー、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、アルギン酸塩、キトサン、およびこれらの組合せを含む。セルロースまたはトリエチルセルロースな��の可塑化剤もまた、分散剤として使用することができる。特に、リポソーム分散液中および自己乳化分散液中で有用な分散剤は、ジミリストイルホスファチジルコリン、鶏卵に由来する天然ホスファチジルコリン、鶏卵に由来する天然ホスファチジルグリセロール、コレステロール、およびイソプロピルミリスチン酸である。
【０４０８】
１または複数のエロージョン促進剤の、１または複数の拡散促進剤との組合せもまた、本組成物中で使用することができる。
【０４０９】
「希釈剤」という用語は、送達の前に、目的の化合物を希釈するのに使用される化合物を指す。希釈剤はまた、より安定的な環境をもたらしうるため、化合物を安定化させるのにも使用することができる。当技術分野では、緩衝液中に溶解させた塩（これはまた、ｐＨの制御または維持ももたらしうる）を、リン酸緩衝生理食塩液溶液を含むがこれらに限定されない希釈剤として用いる。ある特定の実施形態では、希釈剤は、組成物のバルクを増大させて、圧縮を容易とするか、またはカプセルの充填のための均質なブレンドに十分なバルクを創出する。このような化合物は、例えば、ラクトース、デンプン、マンニトール、ソルビトール、デキストロース、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）などの結晶セルロース；二塩基性リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム二水和物；リン酸三カルシウム、リン酸カルシウム；無水ラクトース、噴霧乾燥ラクトース；アルファデンプン、Ｄｉ−Ｐａｃ（登録商標）（Ａｍｓｔａｒ）などの圧縮糖；マンニトール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ステアリン酸酢酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、スクロースベースの希釈剤、粉砂糖；一塩基性硫酸カルシウム一水和物、硫酸カルシウム二水和物；乳酸カルシウム三水和物、デキストレート（dextrate）；加水分解シリアル固形、アミロース；粉末セルロース、炭酸カルシウム；グリシン、カオリン；マンニトール、塩化ナトリウム；イノシトール、ベントナイトなどを含む。
【０４１０】
「充填剤」は、ラクトース、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、二塩基性リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、結晶セルロース、セルロース  粉末、デキストロース、デキストレート（dextrate）、デキストラン、デンプン、アルファデンプン、スクロース、キシリトール、ラクチトール、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウム、ポリエチレングリコールなどの化合物を含む。
【０４１１】
「滑沢剤」および「流動促進剤」とは、材料の接着または摩擦を防止、低減、または阻害する化合物である。例示的な滑沢剤は、例えば、ステアリン酸、水酸化カルシウム、滑石、フマル酸ステアリルナトリウム、鉱物油などの炭化水素、または水素化ダイズ油（Ｓｔｅｒｏｔｅｘ（登録商標））などの水素化植物油、高脂肪酸、ならびにアルミニウム、カルシウム、マグネシウム、亜鉛など、それらのアルカリ金属塩およびアルカリ土類金属塩、ステアリン酸、ステアリン酸ナトリウム、グリセロール、滑石、蝋、Ｓｔｅａｒｏｗｅｔ（登録商標）、ホウ酸、安息香酸ナトリウム、ナトリウム酢酸、塩化ナトリウム、ロイシン、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ−４０００）、またはＣａｒｂｏｗａｘ（商標）などのメトキシポリエチレングリコール、ナトリウムオレイン酸、安息香酸ナトリウム、ベヘン酸グリセリル、ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸マグネシウムまたはラウリル硫酸ナトリウム、Ｓｙｌｏｉｄ（商標）、Ｃａｂ−Ｏ−Ｓｉｌ（登録商標）などのコロイド状シリカ、トウモロコシデンプンなどのデンプン、シリコーン油、界面活性剤などを含む。
【０４１２】
「可塑化剤」とは、マイクロカプセル化材料を軟化させるのに使用される化合物、またはマイクロカプセル化材料の脆性を低下させるフィルムコーティングである。適切な可塑化剤は、例えば、ＰＥＧ  ３００、ＰＥＧ  ４００、ＰＥＧ  ６００、ＰＥＧ  １４５０、ＰＥＧ  ３３５０、およびＰＥＧ  ８００などのポリエチレングリコール、ステアリン酸、プロピレングリコール、オレイン酸、トリエチルセルロース、およびトリアセチンを含む。一部の実施形態では、可塑化剤はまた、分散剤または保湿剤としても機能しうる。
【０４１３】
「可溶化剤」は、トリアセチン、クエン酸トリエチル、オレイン酸エチル、カプリル酸エチル、ラウリル硫酸ナトリウム、ナトリウムドクセート（doccusate）、ビタミンＥ  ＴＰＧＳ、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、Ｎ−ヒドロキシエチルピロリドン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルシクロデキストリン、エタノール、ｎ−ブタノール、イソプロピルアルコール、コレステロール、胆汁塩、ポリエチレングリコール２００〜６００、グリコフロール、トランスクトール、プロピレングリコール、およびジメチルイソソルビドなどの化合物を含む。
【０４１４】
「安定化剤」は、任意の抗酸化薬剤、緩衝液、酸、保存剤などの化合物を含む。
【０４１５】
「懸濁剤」は、ポリビニルピロリドン、例えば、ポリビニルピロリドンＫ１２、ポリビニルピロリドンＫ１７、ポリビニルピロリドンＫ２５、またはポリビニルピロリドンＫ３０、ビニルピロリドン／酢酸ビニルコポリマー（Ｓ６３０）、ポリエチレングリコール（例えば、ポリエチレングリコールは、約３００〜約６０００、または約３３５０〜約４０００、または約７０００〜約５４００の分子量を有しうる）、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ステアリン酸酢酸ヒドロキシメチルセルロース、ポリソルベート８０、ヒドロキシエチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、例えば、トラガントガムおよびアカシアガム、グアルガムなどのガム、キサンタンガムを含むキサンタン、糖、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースなどのセルロース誘導体、ポリソルベート８０、アルギン酸ナトリウム、モノラウリン酸ポリエトキシル化ソルビタン、モノラウリン酸ポリエトキシル化ソルビタン、ポビドンなどの化合物を含む。
【０４１６】
「界面活性剤」は、ラウリル硫酸ナトリウム、ナトリウムドクセート（docusate）、Ｔｗｅｅｎ  ６０またはＴｗｅｅｎ  ８０、トリアセチン、ビタミンＥ  ＴＰＧＳ、モノオレイン酸ソルビタン、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ポリソルベート（ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ）、ポロキサマー、胆汁塩、モノステアリン酸グリセリン、酸化エチレンと酸化プロピレンとのコポリマー、例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）（ＢＡＳＦ）などの化合物を含む。他の一部の界面活性剤は、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステルおよび植物油、例えば、ポリオキシエチレン（６０）水素化ヒマシ油；ならびにポリオキシエチレンアルキルエーテルおよびアルキルフェニルエーテル、例えば、オクトキシノール１０、オクトキシノール４０を含む。一部の実施形態では、界面活性剤は、物理的安定性を増強するか、または他の目的で、組み入れることができる。
【０４１７】
「粘性増強剤」は、例えば、メチルセルロース、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ステアリン酸酢酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボマー、ポリビニルアルコール、アルギン酸塩、アカシア、キトサン、およびこれらの組合せを含む。
【０４１８】
「保湿剤」は、オレイン酸、モノステアリン酸グリセリン、ソルビタンモノオレイン酸、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミン、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ナトリウムドクセート（docusate）、オレイン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ナトリウムドクセート（doccusate）、トリアセチン、Ｔｗｅｅｎ  ８０、ビタミンＥ  ＴＰＧＳ、アンモニウム塩などの化合物を含む。
【０４１９】
キット／製品
本明細書の、ある特定の実施形態では、本明細書で記載される、１または複数の方法による使用のためのキットおよび製品が開示される。このようなキットは、バイアル、試験管など、１または複数の容器であって、容器の各々が、本明細書で記載される方法において使用される個別のエレメントのうち１つを含む容器を受容するように区画化されたキャリングケース、パッケージ、または容器を含む。適切な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、および試験管を含む。一実施形態では、容器は、ガラスまたはプラスチックなど、様々な材料から形成されている。
【０４２０】
本明細書で提示される製品は、パッケージング材料を含有する。医薬パッケージング材料の例は、ブリスターパック、ボトル、試験管、バッグ、容器、ボトル、ならびに選択される製剤と、意図される投与方式および処置方式とに適する、任意のパッケージング材料を含むがこれらに限定されない。
【０４２１】
例えば、容器は、本明細書で記載される、トランケート型非免疫原性ポリペプチド（例えば、ＣＤ２０またはＣＤ５２）のうちの１または複数を発現するポリペプチド構築物をコードする細胞を含む。任意選択で、細胞は、加えて、１または複数の異種遺伝子、例えば、ＣＡＲ、Ｔ細胞受容体、および／またはサイトカインをコードする遺伝子を含有しうる。このようなキットは、任意選択で、本明細書で記載される方法におけるその使用に関する記載または表示または指示書の内容確認を含む。
【０４２２】
キットは、典型的に、内容物を列挙する表示、および／または使用のための指示書、ならびに使用のための指示書を伴う添付文書を含む。典型的に、指示書のセットもまた、組み入れられると予想される。
【０４２３】
一部の実施形態では、表示は、容器上に貼付されているか、または容器に付随する。一実施形態では、表示を形成する文字、数、または他の記号が、容器自体へと接着されているか、鋳造されているか、またはエッチングされている場合、表示は容器上に貼付されており、表示はまた、容器を保持する、レセプタクルまたはキャリングケース内に、例えば、パッケージ添付文書として存在する場合、容器に付随する。一実施形態では、表示は、内容物が、具体的な治療適用に使用されるものであることを指し示すのに使用される。表示はまた、内容物の、本明細書で記載される方法などにおける使用のための指示も指し示す。
【０４２４】
配列
本明細書で提示される実施形態に含まれる、ある特定の配列の代表的なリストを、下記に提示する。
【０４２５】
【表４−１】
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【０４２６】
【表４−２】
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【０４２７】
【表４−３】
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【０４２８】
【表４−４】
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【０４２９】
【表４−５】
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【０４３０】
【表４−６】
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【０４３１】
【表４−７】
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【０４３２】
【表４−８】
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【０４３３】
【表４−９】
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【０４３４】
【表４−１０】
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【０４３５】
【表４−１１】
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【０４３６】
【表４−１２】
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【０４３７】
【表４−１３】
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【０４３８】
【表４−１４】
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【０４３９】
【表４−１５】
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【０４４０】
【表４−１６】
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【０４４１】
【表４−１７】
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【０４４２】
【表４−１８】
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【０４４３】
【表４−１９】
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【０４４４】
【表４−２０】
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【０４４５】
【表４−２１】
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【０４４６】
【表４−２２】
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【０４４７】
【表４−２３】
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【０４４８】
【表４−２４】
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【０４４９】
【表４−２５】
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【０４５０】
【表４−２６】
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【０４５１】
【表４−２７】
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【０４５２】
【表４−２８】
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【０４５３】
【表４−２９】
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【０４５４】
【表４−３０】
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【０４５５】
【表４−３１】
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【０４５６】
【表４−３２】
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【０４５７】
【表４−３３】
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【０４５８】
【表４−３４】
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【０４５９】
【表４−３５】
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【実施例】
【０４６０】
これらの例は、例示的な目的だけで提示されるものであり、本明細書で提示される特許請求の範囲を限定しようとするものではない。
【０４６１】
[実施例１]
トランケート型ＣＤ２０（ＣＤ２０ｔ）ポリペプチド構築物の、細胞タグとしての発現および活性
ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に、抗ＣＤ２０抗体リツキシマブに対して、野生型ＣＤ２０、トランケート型ＣＤ２０細胞タグのほか、陽性対照をトランスフェクトした。発現は、リツキシマブを使用するフローサイトメトリーにより測定した。図１に示す通り、ＣＤ２０トランケート型変異体であるＣＤ２０ｔ１（配列番号１０９）は、リツキシマブにより検出する場合、変異体であるＣＤ２０ｔ４（配列番号１１５）と比べて、ロバストな発現を呈した。これらのデータは、ＣＤ２０内因性ポリペプチド内の特定のトランケーションのみが、細胞タグとしてのＣＤ２０ｔの使用に適合性でありうることを指し示す。
【０４６２】
ＣＡＲおよびＣＤ２０ｔ１細胞タグのほか、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ＢｅａｕｔｙトランスポザーゼプラスミドをコードするＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンを使用して、ヒトＰＢＭＣにヌクレオフェクトした。フローサイトメトリーを使用して、ＣＡＲと、ＣＤ２０ｔとの共発現を測定した。図２は、ＣＤ２０ｔ１（配列番号１０９；ｙ軸）と、ＣＡＲ（ｘ軸）とを、ＣＡＲ−ＣＤ２０ｔ１構築物から共発現されることを、非トランスフェクト細胞と比較して示す。
【０４６３】
特異的抗ＣＤ２０抗体により誘導される、トランケート型ＣＤ２０細胞タグのＡＤＣＣ
Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞系を、ＣＤ２０ｔ１細胞タグを安定的に発現するように改変した。ＣＤ２０ｔ１の発現は、フローサイトメトリーを使用するリツキシマブ染色により確認した。ＣＤ２０ｔ１を発現するＪｕｒｋａｔ標的細胞を特異的に消失させるリツキシマブの能力は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害アッセイにより測定した。図３は、リツキシマブにより誘導される、ＣＤ２０ｔ１発現細胞系に対するＡＤＣＣ活性を示す。これと比較して、抗ＥＧＦＲセツキシマブによる処置は、ＡＤＣＣ活性に対する効果を及ぼさなかった。
【０４６４】
[実施例２]
トランケート型ＨＥＲ１（ＨＥＲ１ｔ）ポリペプチド構築物の、細胞タグとしての発現
キメラ細胞タグの発現
新規のキメラ細胞タグは、ＨＥＲ１遺伝子のドメインＩＩＩと、ＨＥＲ２遺伝子、ＨＥＲ３遺伝子、またはＨＥＲ４遺伝子のドメインＩＶとを使用することにより作出した。ＨＥＲ１−ＥｒＢＢ４キメラ細胞タグを、ヒト初代細胞内で発現させた。ＨＥＲ１遺伝子のドメインＩＩＩを、ＥｒｂＢ４遺伝子変異体であるＪＭ−ａまたはＪＭ−ｂのドメインＩＶ、およびＥｒｂＢ４遺伝子のＴＭドメインと遺伝子融合させて、キメラ細胞タグを作出した。ＧＭＣＳＦアルファシグナルペプチドを、シグナルペプチドとして用いて、キメラ細胞タグを、細胞表面へと方向付けた。ＨＥＲ１−ＥｒｂＢ４細胞タグ（配列番号１０１に対応するトランケート型ＥＧＦＲ−ＥｒｂＢ４（ＪＭ−ａ）、および配列番号１０５に対応するトランケート型ＥＧＦＲ−ＥｒｂＢ４（ＪＭ−ｂ））を、ｐＣＤＮＡ３．１ベクター骨格内に対照ＨＥＲ１ｔ細胞タグと共にクローニングし、電気穿孔により、初代ヒトＰＢＭＣへとトランスフェクトした。ＨＥＲ１−ＥｒｂＢ４細胞タグの発現は、抗ＨＥＲ１特異的抗体であるセツキシマブを使用するフローサイトメトリーにより、ＣＤ３＋Ｔ細胞内で確認した。図４Ｄに示す通り、形質導入Ｔ細胞は、トランスフェクション後において、高レベルのキメラ細胞タグを発現した。アイソタイプ抗体染色ならびに非トランスフェクトモック細胞は、セツキシマブ染色の、細胞タグに対する特異性を示した。
【０４６５】
トランケート型ＨＥＲ１ｔ細胞タグの発現
多様なトランケート型細胞タグを、図４Ａに示す概略図内に描示される通りに構築した。トランケート型ＨＥＲ１ｔ変異体（配列番号５７に対応するＨＥＲ１ｔ１、配列番号５９に対応するＨＥＲ１ｔ２、配列番号６１に対応するＨＥＲ１ｔ３、配列番号６３に対応するＨＥＲ１ｔ４、配列番号６５に対応するＨＥＲ１ｔ５、配列番号６７に対応するＨＥＲ１ｔ６、および配列番号６９に対応するＨＥＲ１ｔ７）を、ＨＥＲ１ｔ対照細胞タグと共に、ｐＣＤＮＡ３．１ベクター骨格内にクローニングして、発現について調べた。電気穿孔により、初代ヒトＰＢＭＣにおいて、これらの発現ベクターをトランスフェクトした。トランケート型細胞タグの発現は、抗ＨＥＲ１特異的抗体であるセツキシマブを使用するフローサイトメトリーにより、ＣＤ３＋Ｔ細胞内で確認した。図４Ｅに示す通り、Ｔ細胞は、トランスフェクション後において、高レベルの細胞タグを発現した。アイソタイプ抗体染色ならびに非トランスフェクトモック細胞は、セツキシマブ染色の、細胞タグに対する特異性を示した。
【０４６６】
ＣＡＲ単独またはＣＡＲならびにトランケート型ＨＥＲ１ｔ１細胞タグをコードする自己不活化レンチウイルスベクターを作出して、両方の遺伝子の共発現を査定した。レンチウイルスベクターを、活性化ヒト汎Ｔ細胞へと形質導入し、ＣＡＲおよびＨＥＲ１ｔ１の両方の発現を、形質導入後において、ＣＡＲ特異的抗原−Ｆｃ融合タンパク質および抗ＨＥＲ１抗体であるセツキシマブのそれぞれを使用するフローサイトメトリーにより測定した。図５Ａおよび図５Ｂの右パネルに示す通り、形質導入Ｔ細胞は、ＣＡＲ（ｘ軸）およびＨＥＲ１ｔ（ｙ軸）の両方を共発現した。図５Ａの左パネルは、非形質導入Ｔ細胞内で観察される、最小のバックグラウンド染色を示した。図５Ｂの左パネルは、ＣＡＲのみをコードするレンチウイルスベクターを、Ｔ細胞へと形質導入した場合に、ＣＡＲの発現は裏付けたが、ＨＥＲ１ｔの発現は裏付けなかった。
【０４６７】
トランケート型ＨＥＲ１ｔ細胞タグを発現する細胞系についてのウェスタンブロット解析
ＳＵＰ−Ｔ１細胞系を、ＨＥＲ１ｔ１（ＳＵＰ−Ｔ１／ＨＥＲ１ｔ１）を発現するように遺伝子改変した。ＳＵＰ−Ｔ１／ＨＥＲ１ｔ１細胞系を、フローサイトメトリーにより測定される、高レベルまたは低レベルのＨＥＲ１ｔ１発現について、ＦＡＣＳにより分取した。トランケート型ＨＥＲ１ｔ細胞タグの発現は、ウェスタンブロット解析により、ＳＵＰ−Ｔ１／ＨＥＲ１ｔ１（高）細胞系内およびＳＵＰ−Ｔ１／ＨＥＲ１ｔ１（低）細胞系内で確認した。抗ＨＥＲ１抗体であるセツキシマブを、ＳＵＰ−Ｔ１／ＣＡＲ／ＨＥＲ１ｔ１細胞系抽出物または対照（ＪｕｒｋａｔａｎｄＡ４３１）細胞系抽出物と共にインキュベートして、抗体が、ＨＥＲ１に由来する細胞タグタンパク質に結合することを可能とした。次いで、プロテインＡ／Ｇ共役アガロースビーズを使用して、抗体／抗原複合体を沈殿させた。次いで、この試料を、抗ＨＥＲ１抗体を使用するウェスタンブロット解析のために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。図８に示すウェスタンブロットは、ＳＵＰＴ１／ＨＥＲ１ｔ１細胞系内のＨＥＲ１ｔ１の発現を確認する。ＨＥＲ１ｔ１の強度は、ＳＵＰ−Ｔ１／ＨＥＲ１ｔ１（低）細胞系内で、ＳＵＰ−Ｔ１／ＨＥＲ１ｔ１（高）細胞系と比較して低度である。全長ＨＥＲ１は、Ａ４３１陽性対照細胞系内で検出した。非改変Ｊｕｒｋａｔ細胞系内では、ＨＥＲ１の発現が検出されなかった。図８：レーン１：ＩＰ抗体のみ；レーン２：Ｊｕｒｋａｔ細胞のみ；レーン３：ＳＵＰＴ１／ＨＥＲ１ｔ１（高レベルのＨＥＲ１ｔ１）；レーン４：ＳＵＰＴ１／ＨＥＲ１ｔ１（低レベルのＨＥＲ１ｔ１）；レーン５：全長ＨＥＲ１を発現するＡ４３１細胞；レーン６：マーカーである。太字矢印は、全長ＨＥＲ１を指すレーン５を除くレーンにおいて、セツキシマブにより沈殿したタンパク質を指示する。
【０４６８】
[実施例３]
抗ＨＥＲ１抗体による、トランケート型ＨＥＲ１ｔ細胞タグを発現する細胞に対するＡＤＣＣおよびＣＤＣ
ＮＫ細胞系を使用して、ＡＤＣＣアッセイにおける、ＨＥＲ１ｔ１細胞タグの機能性を評価した。親ＮＫ細胞系を、ＣＤ１６受容体の変異体を発現させて、ＡＤＣＣを誘導するように改変した。ＣＤ１６＋ＮＫ細胞系を、ＣＡＲと、ＨＥＲ１ｔ１細胞タグとを共発現するように、さらに改変した。親ＮＫ細胞系、ＣＤ１６＋ＮＫ細胞系、およびＣＤ１６＋／ＣＡＲ＋／ＨＥＲ１ｔ１＋ＮＫ細胞系を、抗ＨＥＲ１セツキシマブ、またはＮＫ細胞上のＣＤ５２に結合することが可能な、陽性対照のアレムツズマブの存在下で、ＡＤＣＣについて解析した。図６に示す通り、ＣＤ１６への抗体の結合は、エフェクター機能を誘導するので、予測される通り、ＮＫ細胞が、ＣＤ１６を発現する場合に限り、ＡＤＣＣは観察された。さらに、これらの細胞が、ＨＥＲ１ｔ細胞タグを発現するのであれ、発現しないのであれ、ＣＤ１６を発現する限りにおいて、アレムツズマブは、ＮＫ細胞に対するＡＤＣＣを誘導することが可能であった。これに対し、セツキシマブは、ＨＥＲ１ｔ１およびＣＤ１６の両方を発現する場合に限り、ＡＤＣＣを誘導したので、特異性が確認された。
【０４６９】
レポーター細胞系であるＳＵＰ−Ｔ１（ヒトＴリンパ球細胞系）を、ＣＡＲおよびＨＥＲ１ｔ１（ＳＵＰ−Ｔ１／ＣＡＲ／ＨＥＲ１ｔ１）を共発現するように遺伝子改変した。ＳＵＰ−Ｔ１／ＣＡＲ−ＨＥＲ１ｔ１細胞系を、フローサイトメトリーにより測定されたＨＥＲ１ｔ１発現の高レベルまたは中レベルについて、ＦＡＣＳにより分取して、抗ＨＥＲ１抗体を使用するＡＤＣＣについて、細胞表面上の細胞タグ密度の効果を査定した。図７Ａは、分取されたＳＵＰ−Ｔ１／ＣＡＲ／ＨＥＲ１ｔ１集団内の、ＣＡＲおよびＨＥＲ１ｔ１の発現レベルを示す。図７Ａの左パネルは、フローサイトメトリーにより、アイソタイプ抗体のみによる染色を示し、中パネルは、高ＨＥＲ１ｔ発現を示し、右パネルは、中ＨＥＲ１ｔ発現を示す。ＣＡＲおよびＨＥＲ１ｔ１遺伝子は、同じ転写物から発現されるので、ＨＥＲ１ｔ１に基づき細胞を分取することは、ＣＡＲの発現にも、同様の形で影響を及ぼした。ＳＵＰ−Ｔ１／ＣＡＲ／ＨＥＲ１ｔ１の高細胞系および中細胞系について、セツキシマブ、または対照としての非特異的リツキシマブを使用するＡＤＣＣアッセイで調べた。アッセイには、５：１のエフェクター（Ｅ）細胞対ＨＥＲ１ｔ１＋標的（Ｔ）細胞比を用いた。ＡＤＣＣは、レポーター遺伝子発現の誘導倍数として定量化した。図７Ｂに示す通り、セツキシマブは、ＨＥＲ１ｔ１発現細胞系に対するＡＤＣＣを、用量依存的に、特異的に誘導した。さらに、ＡＤＣＣの誘導は、細胞表面上の、ＨＥＲ１ｔ１発現のレベルに依存した。
【０４７０】
ヒトドナーＰＢＭＣに、ＣＤ１９  ＣＡＲおよびＨＥＲ１ｔ１細胞タグを、ＳＢ１１トランスポザーゼと共に発現させて、Ｔ細胞の特異性をリダイレクトする、２つのＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンベクターを、電気穿孔によりトランスフェクトした。トランスフェクションの１日後（１日目）、細胞をカウントし、フローサイトメトリーにより、ＣＡＲ発現を測定した。ＣＡＲ  Ｔ細胞を、γ照射される（１００Ｇｙ）か、またはマイトマイシンＣで処理された、１：１比のＡａＰＣにより、４刺激サイクルにわたり刺激した。使用したＡａＰＣ細胞は、ＣＤ１９抗原を発現するＫ５６２−ＡａＰＣであった。培養物に、第１のラウンドの刺激には、ＩＬ−２１（３０ｎｇ／ｍｌ）だけを補充し、その後、残りの刺激には、組換えヒトＩＬ−２（５０ＩＵ／ｍｌ）およびＩＬ−２１（３０ｎｇ／ｍｌ）（Ｐｅｐｒｏ  Ｔｅｃｈ）を補充した。Ｔ細胞培養物を、７日間にわたり持続することが典型的な、各刺激サイクルの終了時に表現型解析した。プロテインＬまたはＣＤ１９  ＣＡＲを認識する抗イディオタイプ抗体を用いる、マルチパラメータのフローサイトメトリーにより、培養物を、ＣＡＲ発現について、表現型解析した。セツキシマブが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ＣＤ１９  ＣＡＲ＋／ＨＥＲ１ｔ１＋Ｔ細胞を特異的に消失させる能力について、ＡＤＣＣアッセイおよび補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）アッセイにおいて調べた。５μｇ／ｍｌのセツキシマブまたはリツキシマブを伴う、ＣＳＦＥで標識されたＣＤ１９  ＣＡＲ＋／ＨＥＲ１ｔ１＋Ｔ標的細胞（Ｔ）（ウェル１つ当たりの細胞５×１０４個）を、ＣＤ１６＋ＮＫエフェクター細胞系（Ｅ）（ウェル１つ当たりの細胞２．５×１０５個）と共に、５：１のＥ：Ｔ比で、２〜２４時間にわたり、三連でインキュベートした。ＣＤＣアッセイには、熱不活化（ＨＩ）を伴う１０％のウサギ血清、およびＨＩを伴わない同血清、ならびに熱不活化（ＨＩ）を伴う３０％のヒト血清、およびＨＩを伴わない同血清を用いた。細胞を、ＤＡＰＩにより染色し、データは、ｉＱＵＥ  Ｓｃｒｅｅｎｅｒ  ｐｌｕｓ測定器により収集した。生細胞カウントは、各条件について報告した。図９（左パネル）に示す通り、ＡＤＣＣアッセイにおける低生細胞カウントにより明らかな通り、セツキシマブは、ＣＤ１９  ＣＡＲ＋／ＨＥＲ１ｔ１＋Ｔ細胞に対する特異的細胞傷害作用を誘導した。図９（右パネル）に示す通り、ＣＤＣアッセイにおける低生細胞カウントにより明らかな通り、セツキシマブは、ヒト血清またはウサギ血清を熱不活化しなかった場合、ＣＤ１９  ＣＡＲ＋／ＨＥＲ１ｔ１＋Ｔ細胞に対する特異的細胞傷害作用を誘導した。
【０４７１】
[実施例４]
次世代キルスイッチ／細胞タグ構築物は、ＡＤＣＣおよびＣＤＣを増強する
図１０は、トランケート型細胞タグを含む、第１世代ポリペプチド構築物のデザインと、次世代ポリペプチド構築物のデザインとを比較する概略図である。第１世代トランケート型細胞タグ（上）は、任意選択のペプチドリンカーにより接続されたトランケート型変異体と、非二量体化膜貫通ドメイン（ＴＭ）とを含む。次世代トランケート型細胞タグ（下パネル）は、細胞表面上で多量体化することが可能な細胞タグを作出する多量体化ドメインを含む。図１０の下パネルで描示される例は、細胞表面上で、細胞タグの二量体を誘導する、ホモ二量体化が可能な膜貫通ドメイン（ＴＭ−Ａ）を用いる。細胞表面ポリペプチドのホモ二量体化が示されているが、細胞を、異なる細胞表面ポリペプチドを有するポリペプチド構築物を共発現するように操作する場合は、細胞表面におけるヘテロ二量体の形成もまた可能である。第１世代ポリペプチド構築物および次世代ポリペプチド構築物のいずれにおいても、抗トランケート型変異体抗体または別の結合性ドメインは、トランケート型変異体を認識し、これに結合する。このような次世代構築物のために、細胞表面ポリペプチドの二量体化は、第１世代構築物の場合を超えて、アビディティーを増大させ、抗体の結合により誘導されるシグナル伝達効果を増幅しうるほか、多量体細胞タグを使用する細胞の精製および分取を改善しうる。
【０４７２】
ヒトドナーＰＢＭＣに、ＣＤ１９  ＣＡＲおよび第１世代ＨＥＲ１ｔ細胞タグまたは次世代ＨＥＲ１ｔ細胞タグを、ＳＢ１１トランスポザーゼと共に共発現させて、Ｔ細胞の特異性をリダイレクトするようにデザインされた、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンベクターを、電気穿孔によりトランスフェクトした（０日目）。トランスフェクションの１日後（１日目）、細胞をカウントし、フローサイトメトリーにより、ＣＡＲ発現を測定した。ＣＡＲ  Ｔ細胞を、γ照射される（１００Ｇｙ）か、またはマイトマイシンＣで処理された、１：１比のＡａＰＣにより、４刺激サイクルにわたり刺激した。使用したＡａＰＣ細胞は、ＣＤ１９抗原を発現するＫ５６２−ＡａＰＣであった。第１ラウンドの刺激には、培養物に、ＩＬ−２１（３０ｎｇ／ｍｌ）のみを補充し、その後、残りの刺激には、組換えヒトＩＬ−２（５０ＩＵ／ｍｌ）およびＩＬ−２１（３０ｎｇ／ｍｌ）（Ｐｅｐｒｏ  Ｔｅｃｈ）を補充した。各刺激サイクルの終了時に、Ｔ細胞培養物を、表現型解析したが、これは、典型的に、７日間続いた。培養物を、ＣＤ１９  ＣＡＲを認識する、プロテインＬまたは抗イディオタイプ抗体、および多様なトランケート型ＨＥＲ１ｔ細胞タグを認識する、抗ＨＥＲ１抗体であるセツキシマブを用いる、マルチパラメータのフローサイトメトリーにより、ＣＡＲの発現について表現型解析した。図１１は、次世代ＨＥＲ１ｔ変異体を含むポリペプチド構築物（例えば、配列番号７１に対応するＨＥＲ１ｔ８、配列番号７５に対応するＨＥＲ１ｔ９、および配列番号７９に対応するＨＥＲ１ｔ１０）内のＣＤ１９  ＣＡＲの発現が、時間経過にわたり、第１世代ポリペプチド構築物（配列番号５７に対応するＨＥＲ１ｔ１）およびＨＥＲ１ｔを発現しない対照細胞系と比較して変動しないことを裏付ける。多様な培養物中の、ＣＤ１９  ＣＡＲを発現するＣＤ３＋Ｔ細胞の百分率を、表４に示す。
【０４７３】
【表５】
2020527937.tif 000041
【０４７４】
図１２は、膜貫通二量体化ドメインを伴う、次世代ＨＥＲ１ｔ変異体を含むポリペプチド構築物（変異体である、配列番号７１に対応するＨＥＲ１ｔ８、配列番号７５に対応するＨＥＲ１ｔ９、および配列番号７９に対応するＨＥＲ１ｔ１０）を発現する細胞系が、時間経過にわたり、第１世代ＨＥＲ１ｔポリペプチド構築物（配列番号５７に対応するＨＥＲ１ｔ１）を発現する細胞系と同様のＨＥＲ１ｔ発現レベルを示すことを示す。ＣＡＲのみのトランスポゾンをトランスフェクトされた培養物中では、ＨＥＲ１ｔ発現は、検出されなかった。表５が、多様な培養物中の、ＨＥＲ１ｔ変異体を発現するＣＤ３＋Ｔ細胞の百分率を示すのに対し、表６は、１４、２１、および２８日目における、図１２による、ＨＥＲ１ｔの平均値蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。
【０４７５】
【表６】
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【０４７６】
【表７】
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【０４７７】
次世代ＨＥＲ１ｔ変異体を発現するＣＤ１９  ＣＡＲ−Ｔ細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、セツキシマブに誘導されるＡＤＣＣについて調べ、有効性について、第１世代ＨＥＲ１ｔデザインと比較した。ＣＤ１９  ＣＡＲ−Ｔ標的細胞（Ｔ）を、ＨＥＲ１ｔ変異体を発現するＣＡＲ−Ｔ細胞には、０．０００５μＭのＣＦＳＥで標識化し、ＨＥＲ１ｔを伴わないＣＡＲ−Ｔ細胞には、０．０１μＭのＣＦＳＥで標識化した。標的細胞を、１ｍｌ当たりの細胞０．８×１０６個で懸濁させ、１：１の比で混合し、ウェル１つ当たり５０μｌ当たりの細胞４×１０４個（各々、ウェル１つ当たり５０μｌ当たりの細胞２×１０４個ずつ）で播種した。次に、ＣＤ１６＋ＮＫエフェクター細胞（Ｅ）を、回収し、洗浄し、１ｍｌ当たりの細胞０．２×１０６個で再懸濁させた。次いで、細胞を、ウェル１つ当たり１００μｌ当たりの細胞２×１０４個（Ｅ：Ｔ＝０．５：１）で播種した。リツキシマブ抗体またはセツキシマブ抗体は、抗体を欠く対照溶液と共に、０．４μｇ／ｍｌで調製し、溶液を、ウェルへと、以下：（ｉ）リツキシマブ（抗ＣＤ２０）対照：各ウェル内０．１μｇ／ｍｌの最終濃度で、ウェル１つ当たり５０μｌ；（ｉｉ）セツキシマブ（抗ＨＥＲ１）：各ウェル内０．１μｇ／ｍｌの最終濃度で、ウェル１つ当たり５０μｌ；（ｉｉｉ）対照溶液（抗体を伴わない）：各ウェル内０μｇ／ｍｌの最終濃度で、ウェル１つ当たり５０μｌの通りに添加した。各ウェル内の最終容量を、２００μｌへと調整した。溶液を、十分に混合し、４、８、１６、および２４時間にわたり培養した。インキュベーションの後、細胞を洗浄し、Ｈｕｍａｎ  Ｆｃ  Ｂｌｏｃｋの存在下で、ＣＤ３−ＢＶ７８６により染色した。次いで、細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液により、２回にわたり洗浄し、７ＡＡＤを含有する、５０μｌのＦＡＣ緩衝液中に、１０分間にわたり再懸濁させ、次いで、解析した。図１３Ａ〜１３Ｂは、セツキシマブの存在下で、細胞表面ポリペプチド上に、潜在的な二量体化ＨＥＲ１ｔ変異体を含む、次世代ＨＥＲ１ｔポリペプチド構築物（ＨＥＲ１ｔ８、ＨＥＲ１ｔ９、およびＨＥＲ１ｔ１０）が、ＡＤＣＣの、非二量体化膜貫通ドメイン（ＨＥＲ１ｔ対照）を含むポリペプチド構築物と比べた改善を媒介することを裏付ける。
【０４７８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究を行って、セツキシマブが、ＣＤ１９ＣＡＲ−ｍｂＩＬ１５−Ｔ細胞に対するＡＤＣＣを誘導する能力を確認した。ＣＤ１９ＣＡＲ−ｍｂＩＬ１５−Ｔ細胞は、ＣＤ１９  ＣＡＲおよびｍｂＩＬ１５−ＨＥＲ１ｔトランスポゾンおよびＳＢ１１トランスポザーゼのエレクトロトランスファーにより作出した。ＡＤＣＣアッセイのために、遺伝子改変Ｔ細胞を、ｅｘ  ｖｉｖｏの、照射されたＣＤ１９＋フィーダー細胞上で、数量的に拡大した。ｍｂＩＬ１５−ＨＥＲ１ｔトランスポゾンがバイシストロニックデザインになっているため、ｍｂＩＬ１５を発現させると、ＣＤ１９  ＣＡＲ−ｍｂＩＬ１５−Ｔ細胞は、ＨＥＲ１ｔ１を共発現した。同じＣＤ１９＋フィーダー細胞を使用して、ＣＤ１９  ＣＡＲトランスポゾンおよびＳＢ１１トランスポザーゼのトランスフェクションにより作出された、ｍｂＩＬ１５−ＨＥＲ１ｔの発現を欠く、陰性対照のＣＤ１９  ＣＡＲ＋ｍｂＩＬ１５−ＨＥＲ１ｔｎｅｇＴ細胞を、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、数量的に拡大した。内因性ＦｃＲを発現する、拡大された同種ＮＫ細胞を、エフェクター細胞として使用し、標識化ＣＡＲ＋Ｔ細胞と共に、１０μｇ／ｍＬのセツキシマブ、または陰性対照として用いられる抗ＣＤ２０抗体（リツキシマブ）の存在下、１０：１のＥ：Ｔ比で、一晩にわたり共培養した。抗体による処置後に、培養物中に残存するｍｂＩＬ１５−ＨＥＲ１ｔ＋Ｔ細胞を、フローサイトメトリーにより決定して、殺滅パーセントを計算した。セツキシマブの添加は、ＣＤ１９−ｍｂＩＬ１５−ＣＡＲ  Ｔ細胞のうちの、＞９０％のｍｂＩＬ１５−ＨＥＲ１ｔ＋集団の消失を結果としてもたらした（図１４）。リツキシマブは、ＣＤ１９−ｍｂＩＬ１５−ＣＡＲ−Ｔ細胞の、低レベルの非特異的消失を示した。セツキシマブは、ＣＡＲ＋ｍｂＩＬ１５−ＨＥＲ１ｔｎｅｇＴ細胞の、有意なレベルの溶解を呈することができなかったことから、ＨＥＲ１ｔ特異的な作用機構が確認される。この実験で用いられた、１０μｇ／ｍＬの濃度のセツキシマブは、セツキシマブを投与された患者において、既に報告された範囲内である。これらのデータは、望ましくない臨床作用の発生に起因して必要とされる場合に、ＣＤ１９  ＣＡＲ−ｍｂＩＬ１５−Ｔ細胞を枯渇させる、セツキシマブの使用を支持する。
【０４７９】
ｉｎ  ｖｉｖｏ研究は、ＮＳＧマウスにおいて行った。０日目に、ＣＡＲ−ＨＥＲ１ｔ１Ｔ細胞５×１０６個およびＫＨＹＧ−１−ＣＤ１６ｈｉｇｈ細胞５×１０６個を、各マウスへと、腹腔内（ＩＰ）注射した。同じ日に、マウスを無作為化し、生理食塩液またはセツキシマブ（０．５ｍｇ：ＩＰ）で処置した。腹腔内洗浄液を、１日目に採取し、フローサイトメトリー評価を実施して、両方の群内のマウスに由来するＣＡＲ−ＨＥＲ１ｔ１  Ｔ細胞の頻度について評価した。ＣＡＲ−ＨＥＲ１ｔ１  Ｔ細胞の絶対細胞カウントもまた実施した。データ（示さない）は、生理食塩液で処置されたマウスとは対照的に、ＨＥＲ１ｔ１タグを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞を特異的に消失させる、セツキシマブの能力を裏付ける。
【０４８０】
本明細書では、本開示の好ましい実施形態を示し、それらについて記載してきたが、当業者には、このような実施形態が、例だけを目的として提示されていることが明らかであろう。今や、本開示から逸脱しない限りにおいて、当業者は、多数の変更、変化、および代用に想到するであろう。本明細書で記載される実施形態、またはこれらの実施形態、もしくはその中で記載される態様のうちの１または複数の組合せに対する、多様な代替物を、本開示の実施において利用しうることを理解されたい。以下の特許請求の範囲は、本開示の範囲を規定するものであり、これらの特許請求の範囲の範囲内にある方法および構造、ならびにそれらの均等物は、その対象となることが意図される。
【図１】
2020527937.tif 000044
【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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