(57)【要約】  本発明は、酸化ストレス状態に対するマーカーであり、医療対象の体内におけるＦＯＸＯ転写因子要素の酸化ストレス状態を推測するために使用することができる、ＦＯＸＯ転写因子ファミリーの特定の標的遺伝子に関する。本発明は、さらに、標的遺伝子の発現レベル並びに方法を行うための産物に基づき、ＦＯＸＯ転写要素の酸化ストレス状態を推測する方法、及び、ＦＯＸＯ／ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の活性を推測する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象におけるＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の活性を、前記対象の酸化ストレス状態、好ましくは前記対象におけるＦＯＸＯ転写因子要素の酸化ストレス状態に少なくとも基づき推測する方法であって、
前記対象の酸化ストレス状態、好ましくは前記対象におけるＦＯＸＯ転写因子要素の酸化ストレス状態を、前記対象におけるＳＯＤ２、ＢＮＩＰ３、ＭＸＩ１、ＰＣＫ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、及びＣＡＴを含む群から選択される１つ又は複数の遺伝子の１つ又は複数の発現レベルに基づき推測するステップを含む方法。
【請求項２】
前記対象におけるＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の活性を推測することは、推測された前記対象の酸化ストレス状態及び前記対象におけるＦＯＸＯ転写因子要素の活性レベルに基づく、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記対象における１つ又は複数の遺伝子の１つ又は複数の発現レベルを決定するステップをさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記対象の酸化ストレス状態を推測するステップは、前記対象におけるＳＯＤ２、ＢＮＩＰ３、ＭＸＩ１、ＰＣＫ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、及びＣＡＴを含む群から選択されるＦＯＸＯ標的遺伝子のうち少なくとも４つ、好ましくは全ての１つ又は複数の発現レベルに基づく、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記対象の酸化ストレス状態を推測するステップは、前記対象におけるＳＯＤ２、ＢＮＩＰ３、ＭＸＩ１、及びＰＣＫ１を含む群から選択されるＦＯＸＯ標的遺伝子のうち２つ以上の、好ましくは全ての１つ又は複数の発現レベルに基づく、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記対象の酸化ストレス状態を推測するステップは、前記対象におけるＳＯＤ２、ＢＮＩＰ３、ＭＸＩ１、ＰＣＫ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、及びＣＡＴを含む群から選択される１つのＦＯＸＯ標的遺伝子の発現レベルに基づく、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
酸化ストレス状態は、ＳＯＤ２及び／又はＢＮＩＰ３の１つ又は複数の発現レベルが、対照試料と比較して前記対象の抽出試料において増加する場合、及び／又は、ＭＸＩ１、ＰＣＫ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、及びＣＡＴから選択される１つ又は複数の標的遺伝子の１つ又は複数の発現レベルが、対照試料と比較して前記対象の抽出試料において減少する場合に推測される、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項８】
前記対象におけるＦＯＸＯ転写因子要素の活性レベルは、ＡＧＲＰ、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＢＣＬ６、ＢＮＩＰ３、ＢＴＧ１、ＣＡＴ、ＣＡＶ１、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＧ２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＥＳＲ１、ＦＡＳＬＧ、ＦＢＸＯ３２、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＩＮＳＲ、ＭＸＩ１、ＮＯＳ３、ＰＣＫ１、ＰＯＭＣ、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＰＲＤＸ３、ＲＢＬ２、ＳＯＤ２、及びＴＮＦＳＦ１０を含む群から選択される、前記対象の抽出試料において測定されるＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の１つ又は複数の、好ましくは少なくとも３つの標的遺伝子の発現レベルに少なくとも基づき決定される、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＦＯＸＯ転写因子要素の活性レベルは、少なくとも、
ＡＴＰ８Ａ１、Ｃ１０ｏｒｆ１０、ＣＢＬＢ、ＤＤＢ１、ＤＹＲＫ２、ＥＲＢＢ３、ＥＲＥＧ、ＥＸＴ１、ＦＧＦＲ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦＢＰ１、ＩＧＦＢＰ３、ＬＧＭＮ、ＰＰＭ１Ｄ、ＳＥＭＡ３Ｃ、ＳＥＰＰ１、ＳＥＳＮ１、ＳＬＣ５Ａ３、ＳＭＡＤ４、及びＴＬＥ４を含む群から選択される、及び／又は、ＡＴＧ１４、ＢＩＲＣ５、ＩＧＦＢＰ１、ＫＬＦ２、ＫＬＦ４、ＭＹＯＤ１、ＰＤＫ４、ＲＡＧ１、ＲＡＧ２、ＳＥＳＮ１、ＳＩＲＴ１、ＳＴＫ１１、及びＴＸＮＩＰを含む群から選択される、前記対象の抽出試料において測定されるＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の１つ又は複数、好ましくは少なくとも３つの標的遺伝子の発現レベル、
にさらに基づき決定される、請求項１乃至８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
推測された前記対象におけるＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の活性に基づき、ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路が前記対象において異常に作動しているかどうかを決定するステップをさらに含む、請求項１乃至９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の異常な作動を補正する薬物を前記対象に処方することを推奨するステップをさらに含み、前記推奨は、推測されたＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の活性に基づき、ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路が前記対象において異常に作動していると決定された場合に行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
対象におけるがん又は前がん状態を示すために使用される、請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
推測された前記対象におけるＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の活性に基づく診断、
推測された前記対象におけるＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の活性に基づく予後診断、
推測された前記対象におけるＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の活性に基づく薬物処方、
推測された前記対象におけるＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の活性に基づく薬物有効性の予測、
推測された前記対象におけるＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の活性に基づく有害作用の予測、
薬物有効性のモニタリング、
医薬品開発、
アッセイ開発、
経路研究、
がん進行度分類、
推測された前記対象におけるＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の活性に基づく臨床試験における前記対象の登録、
行われることになる後の試験の選択、及び
コンパニオン診断試験の選択、
の活動のうち少なくとも１つにおいて使用される、請求項１乃至１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１乃至１３のいずれか一項に記載の方法をデジタル処理装置に行わせるためのプログラムコード手段を含むコンピュータプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、バイオインフォマティクス、ゲノム／トランスクリプトームの処理、プロテオミクスの処理、及び関連技術の分野に関する。特に、本発明は、酸化ストレス状態のマーカーであり、医療対象におけるＦＯＸＯ転写因子要素の酸化ストレス状態を推測するために使用することができるＦＯＸＯ転写因子ファミリーの特定の標的遺伝子に関する。本発明は、１つ又は複数のＦＯＸＯ標的遺伝子の１つ又は複数の発現レベルに基づき、医療対象におけるＦＯＸＯ転写因子要素の酸化ストレス状態を推測する方法、並びに、医療対象の抽出試料において測定されたＦＯＸＯ／ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の１つ又は複数の標的遺伝子の発現レベルに基づき、及び、医療対象におけるＦＯＸＯ転写因子要素の推測された酸化ストレス状態に基づき、医療対象におけるＦＯＸＯ／ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の活性を推測する方法にも関する。本発明は、さらに、ＦＯＸＯ標的遺伝子の発現レベルを決定するためのプライマー及び／又はプローブを含む生成物に関する。本発明は、さらに、上記の方法を行うように構成されたデジタルプロセッサと、上記の方法を行うためにデジタル処理装置によって実行可能な命令を記憶する非一時的な記憶媒体と、上記の方法をデジタル処理装置に行わせるためのプログラムコード手段を含むコンピュータプログラムとを含む装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノム／トランスクリプトーム及びプロテオミクスの分析は、腫瘍学等の医学分野における臨床応用を実質的に実現し、またそのような臨床応用への有望な見込みがあり、腫瘍学では、種々のがんが、特定の遺伝子に対するゲノム突然変異／変異、及び／又は、高い若しくは低い発現レベルの特定の組み合わせに関連していることが知られており、これは、例えば細胞増殖及び転移等、がんの増殖及び進化において役割を果たしている。
【０００３】
例えば、乳がん試料における細胞膜上のＨＥＲ２受容体の過剰発現のスクリーニングは、現在、トラスツズマブ等のＨＥＲ２阻害剤に適格な患者を同定するために行われる標準試験である。細胞膜上のＨＥＲ２受容体の過剰発現をもたらすＥＲＢＢ２遺伝子の過剰発現は、全乳がんの約２５％から３０％に発生し、疾患再発の増加及び予後不良に関連している。しかし、ＨＥＲ２受容体の発現は、ＨＥＲ２受容体によって開始されるシグナル伝達が、例えば、下流の細胞シグナル伝達経路によって弱められ得るため、決して腫瘍増殖を駆り立てることに対する決定的な指標ではない。このことは、トラスツズマブで治療したＨＥＲ２陽性乳がん患者における２６％の初回奏効率において反映されているようでもある（非特許文献１）。それ以外に、ＨＥＲ２受容体の下流の細胞シグナル伝達経路も、ＨＥＲ２受容体の下流のタンパク質における突然変異／過剰発現によって活性化され、ＨＥＲ２発現レベルを測定することによって検出されることのない比較的高悪性度の腫瘍タイプをもたらす恐れがある。
【０００４】
例えば乳がん等の腫瘍を有する患者を特徴付ける可能性は、ＨＥＲ２受容体の下流の細胞シグナル伝達経路において発生する作用を研究することによって改善することができるということが示されてきた。従って、標的遺伝子発現の数学的モデリングを使用したＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の活性を推測する方法が、公開された国際特許出願である特許文献１（“Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＰＩ３Ｋ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｕｓｉｎｇ  ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”）において記載されている。
【０００５】
特許文献１によると、標的遺伝子発現の数学的モデリングを使用したＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の活性を推測する方法は：
医療対象の抽出試料において測定されたＦＯＸＯ／ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の１つ又は複数の標的遺伝子の発現レベルに少なくとも基づき、医療対象におけるＦＯＸＯ／ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の活性を推測するステップを含み、
前記推測するステップは：
医療対象の抽出試料におけるＦＯＸＯ転写因子要素の活性レベルを決定するステップであって、ＦＯＸＯ転写因子要素は、ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の１つ又は複数の標的遺伝子の転写を制御し、上記の決定は、ＦＯＸＯ／ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の１つ又は複数の標的遺伝子の発現レベルをＦＯＸＯ転写因子要素の活性レベルに関連付ける数学的モデルを評価することに少なくとも部分的に基づく、ステップ；
決定された医療対象の抽出試料におけるＦＯＸＯ転写因子要素の活性レベルに基づき、医療対象におけるＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の活性を推測するステップ；
を含む。
【０００６】
これに関連して、ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路等、ＨＥＲ２受容体の下流の細胞シグナル伝達経路において発生する作用を同定する適した方法は、細胞シグナル伝達経路のシグナル伝達のアウトプットの測定に基づくことができ、これは、数ある中でも、ＦＯＸＯ転写因子要素等の転写因子（ＴＦ）による標的遺伝子の転写であり、細胞シグナル伝達経路によって制御されるということが認識されてきた。本明細書において標的とされるＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路は、乳がんに関連付けられるだけでなく、多くのタイプのがんにおいて不適切に活性化されることが知られている（非特許文献２）。ＨＥＲ−ファミリーも含むＲＴＫ受容体ファミリーによって制御されると考えられている。続いて、ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路は、多数のプロセスを介して受け取られた１つ又は複数のシグナルを渡す。そのうち２つの主要な部門は、ｍＴＯＲ複合体の活性化と、ＦＯＸＯと呼ばれることが多くある転写因子ファミリーの不活性化である（非特許文献２におけるＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路を示す図を参照されたい）。この方法は、ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路及びＦＯＸＯ  ＴＦファミリーに焦点を合わせ、その活性は、ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の活性と実質的に負の相関を有し、すなわち、ＦＯＸＯの活性は、ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の不活性と実質的に相関し、一方、ＦＯＸＯの不活性は、ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の活性と実質的に相関する。この方法は、（ｉ）医療対象の抽出試料におけるＦＯＸＯ転写因子要素の活性レベルを決定することであって、ここで、この決定は、ＦＯＸＯ転写因子要素によってその転写が制御されるＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の１つ又は複数の標的遺伝子の発現レベルと、ＦＯＸＯ転写因子要素の転写活性レベルとを関連付ける数学的モデルを評価することに少なくとも部分的に基づくことによって、及び、（ｉｉ）決定された医療対象の抽出試料におけるＦＯＸＯ転写因子要素の活性レベルに基づき、医療対象におけるＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の活性を推測することによって、医療対象におけるＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の活性を決定することを可能にする。このことは、ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の調節解除によって少なくとも部分的に駆動され、従ってＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の阻害剤に反応する可能性が高い、例えば乳がん等の腫瘍を有する患者を特徴付ける可能性を改善することを可能にする。
【０００７】
例えば、ＦＯＸＯ転写因子ファミリーのメンバーである核のＦＯＸＯ３転写因子は、正常細胞において活性であり得るが、がん細胞において等、細胞が酸化ストレスを経験する状況においても活性であり得る。いずれの状況においても、ＦＯＸＯは核内に存在する（図１を参照）。ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路が活性化されると、ＦＯＸＯは核から細胞質へと移動され、これが、ＦＯＸＯの不活性に関連する。しかし、これは、ＦＯＸＯが酸化ストレスにより活性化されると可能ではない。
【０００８】
従って、ＦＯＸＯが活性であり且つ核内にあるとわかる状況では、これは、正常細胞であって、ＰＩ３Ｋ経路が不活性であり、ＦＯＸＯが腫瘍抑制状態にあり得るか、又は、細胞が酸化ストレスを経験し、ＰＩ３Ｋ経路が活性であるが核からのＦＯＸＯの移動及び不活性が防がれている状況にあり得る。従って、ＰＩ３Ｋ経路が活性又は不活性であるという推測をより信頼できるものにするために、酸化ストレスから腫瘍抑制ＦＯＸＯ活性を区別する方法を見出すことが望ましい。ＰＩ３Ｋ活性を推測するための決定木が、図２において示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】ＷＯ２０１５／１０１６３５  Ａ１
【特許文献２】ＷＯ２０１３／０１１４７９  Ａ２
【特許文献３】ＷＯ２０１４／１０２６６８  Ａ２
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｌ．Ｖｏｇｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｎｄ  Ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ａｓ  ａ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ａｇｅｎｔ  ｉｎ  Ｆｉｒｓｔ−Ｌｉｎｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ＨＥＲ２−Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ”，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．３，Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２００２，ｐａｇｅｓ  ７１９  ｔｏ  ７２６
【非特許文献２】Ｊｅｆｆｒｅｙ  Ａ．Ｅｎｇｅｌｍａｎ，“Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ＰＩ３Ｋ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ：ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ，ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ  ａｎｄ  ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ”，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｎｏ．９，Ａｕｇｕｓｔ  ２００９，ｐａｇｅｓ  ５５０  ｔｏ  ５６２
【非特許文献３】Ｓａｓｓｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，“ＢＮＩＰ３  ｈａｓ  ａ  ｋｅｙ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｍｕｔａｎｔ  ｈｕｎｔｉｇｔｉｎ”，Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．２４，２０１５，ｐａｇｅｓ  ６５３０−６５３９
【非特許文献４】Ｄｅｌｐｕｅｃｈ  Ｏ，Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  Ｂ，Ｅａｓｔ  Ｐ，Ｅｓｓａｆｉ  Ａ，Ｌａｍ  ＥＷ，Ｂｕｒｇｅｒｉｎｇ  Ｂ，Ｄｏｗｎｗａｒｄ  Ｊ，Ｓｃｈｕｌｚｅ  Ａ．“Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｘｉ１−ＳＲ  ａｌｐｈａ  ｂｙ  ＦＯＸＯ３ａ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｙｃ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｌ．２００７；Ｖｏｌ．２７（１３），ｐａｇｅｓ  ４９１７−３０
【非特許文献５】Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｅｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｗｉｔｈ  ＣＮＳ−ｌｉｎｋｅｄ  ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ＰＧＣ−１−ａｌｐｈａ  ｎｕｌｌ  ｍｉｃｅ”，Ｃｅｌｌ，２００４，Ｖｏｌ．１１９，ｐａｇｅｓ  １２１−１３５
【発明の概要】
【００１１】
本発明の主要な態様によると、上記の問題は、医療対象の抽出試料における１つのＦＯＸＯ標的遺伝子又は２つ以上のＦＯＸＯ標的遺伝子のセットの１つ又は複数の発現レベルに基づき、医療対象におけるＦＯＸＯ転写因子要素の酸化ストレス状態に対するマーカーとして使用するためのＦＯＸＯ標的遺伝子又は２つ以上のＦＯＸＯ標的遺伝子のセットによって解決され、ここで、１つ又は複数の標的遺伝子は、ＳＯＤ２、ＢＮＩＰ３、ＭＸＩ１、ＰＣＫ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、及びＣＡＴを含む群から選択される。
【００１２】
本発明は、特定のＦＯＸＯ標的遺伝子が、「正常」、すなわち腫瘍抑制状態と、「酸化ストレス」状態との間で差次的に発現され、従って、その発現レベルを測定することによって、その２つの状態の区別が可能になるという認識に基づく。
【００１３】
本明細書において、ＦＯＸＯ転写因子（ＴＦ）要素は、ＦＯＸＯ  ＴＦファミリーメンバー、すなわちＦＯＸＯ１、ＦＯＸＯ３、ＦＯＸＯ４、及びＦＯＸＯ６のうち少なくとも１つを有するタンパク質複合体であり、特異的なＤＮＡ配列に結合し、その結果、標的遺伝子の転写を制御する能力を有するものであるとして定義される。
【００１４】
本明細書におけるＦＯＸＯ転写因子要素の酸化ストレス状態は、ＦＯＸＯが活性であり且つ核内にあるが、ＰＩ３Ｋ経路が活性又は不活性であり得る状態を指す。ＰＩ３Ｋ経路が活性である場合、細胞が酸化ストレスを経験しているためにＦＯＸＯの不活性化は発生しない。特に、酸化ストレス状態は、がんの状態又は細胞の前がん段階を指す。
【００１５】
対照的に、本明細書におけるＦＯＸＯ転写因子要素の腫瘍抑制状態は、ＦＯＸＯが核において活性であり、ＰＩ３Ｋ経路が不活性である状態を指す。特に、腫瘍抑制状態は、細胞の正常な健康状態を指す。
【００１６】
本明細書における「ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路」又は「ＰＩ３Ｋ経路」は、好ましくは、経路に関連する転写因子（ＴＦ）複合体の転写活性を最終的に導く細胞シグナル伝達経路を指す。この場合、これらは、上述のＦＯＸＯ  ＴＦファミリーメンバーを含む。従って、この経路は、本発明に関して「ＦＯＸＯ／ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路」とも呼ぶことができる。
【００１７】
「１つ又は複数の標的遺伝子」は、「直接標的遺伝子」及び／又は「間接標的遺伝子」であってもよい。
【００１８】
適した標的遺伝子が、以下において記載される。
【００１９】
ＳＯＤ２（スーパーオキシドジスムターゼ−２）は、ミトコンドリアマトリックス酵素であり、ミトコンドリアにおいて発生する大規模な酸化還元及び電子伝達の反応によって生成される酸素ラジカルを除去する。
【００２０】
ＢＮＩＰ３（ＢｃＬ−２／アデノウイルスＥ１Ｂ−１９−ｋＤａタンパク質相互作用タンパク質３）は、通常は不活性なモノマーとして発現されるが、毒性刺激に続いて、安定したホモ二量体を形成し、ミトコンドリア外膜に組み込まれ、ミトコンドリア膜電位の減少及び細胞死を引き起こす（非特許文献３）。
【００２１】
ＰＣＫ１（ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ）は、糖新生の制御の主目標である。ＰＥＰＣＫ遺伝子の転写は、インスリン、グルココルチコイド、ｃＡＭＰ、及び食事によって制御され、グルコース生成を生理的要求に適合させる。
【００２２】
ＭＸＩ１遺伝子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＭＡＸに結合するベーシック・ヘリックス・ループ・ヘリックス・ロイシンジッパー転写因子をコードし、ＭＹＣ−ＭＡＸヘテロ二量体と類似の配列特異的ＤＮＡ結合複合体を形成する。ＭＸＩ１は、ＭＹＣ機能を弱め、候補腫瘍抑制遺伝子である（非特許文献４）。
【００２３】
ＰＰＡＲＧＣ１Ａは、ミトコンドリア新生及び呼吸、肝臓の糖新生、及び筋線維タイプスイッチを含む代謝プロセスを制御する核内受容体及び他の転写因子のコアクチベーターである（非特許文献５）。
【００２４】
好ましい実施形態によると、本発明は、上記のマーカーとして使用するためのＳＯＤ２、ＢＮＩＰ３、ＭＸＩ１、ＰＣＫ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、及びＣＡＴを含む群から選択される少なくとも４つのＦＯＸＯ標的遺伝子、好ましくは全ての標的遺伝子のセットに関する。
【００２５】
特定の好ましい実施形態によると、本発明は、上記のマーカーとして使用するためのＳＯＤ２、ＢＮＩＰ３、ＭＸＩ１、及びＰＣＫ１を含む群から選択される２つ以上のＦＯＸＯ標的遺伝子、好ましくは全ての標的遺伝子のセットに関する。
【００２６】
本発明の別の態様は、医療対象の抽出試料における１つのＦＯＸＯ標的遺伝子又は２つ以上のＦＯＸＯ標的遺伝子のセットの発現レベルに基づき医療対象におけるＦＯＸＯ転写因子要素の酸化ストレス状態を推測するためのマーカーとしての１つのＦＯＸＯ標的遺伝子又は２つ以上のＦＯＸＯ標的遺伝子のセットの使用に関し、ここで、１つ又は複数の標的遺伝子は、ＳＯＤ２、ＢＮＩＰ３、ＭＸＩ１、ＰＣＫ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、及びＣＡＴを含む群から選択される。
【００２７】
本発明に関して「推測する」という用語は、作成された数式又はモデルを、特定の遺伝子の発現レベル等の試料において測定されたデータセットに適用して、試料の状態に関する情報を導き出す行為を指す。例えば、「推測する」は、試料に対する酸化ストレススコア等のスコアの計算、及び、例えば閾値を適用することによって酸化ストレス状態等の状態を推定することを含んでもよく、ここでスコアは、試料の状態に従って閾値を上回るか又は下回る。
【００２８】
「対象」又は「医療対象」は、ヒト又は動物であってもよい。
【００２９】
抽出試料は、医療対象の組織及び／又は細胞及び／又は体液の試料であってもよく、又は、医療対象から得られる細胞株及び／又は組織培養由来であってもよく、該当する場合、（例えば再生医療目的で）実験室においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養されたものであってもよい。試料は、例えば、がん病変から、又はがんが疑われる病変から、又は転移性腫瘍から、又はがん細胞で汚染された流体が存在する体腔（例えば、胸膜腔又は腹腔、又は膀胱腔等）から、又はがん細胞を含有する他の体液から等、好ましくは生検手順又は他の試料抽出手順を介して得られた試料であり得る。試料が抽出される細胞はまた、血液悪性腫瘍（白血病又はリンパ腫等）由来の腫瘍状の細胞であってもよい。場合によっては、細胞試料はまた、循環腫瘍細胞、すなわち、血流に入った腫瘍細胞であってもよく、適した単離技術、例えば、アフェレーシス又は従来の静脈血回収等を使用して抽出されてもよい。血液は別として、試料が抽出される体液は、尿、消化管内容物、又は血管外遊出物であってもよい。「抽出試料」という用語は、本明細書において使用される場合、対象の組織及び／又は細胞及び／又は体液が対象から採取され、例えば、顕微鏡スライド上に置かれた場合も包含し、本発明の方法を行うために、この試料の一部が、例えば、レーザーキャプチャー法（ＬＣＭ）によって、又はスライドから関心のある細胞をそぎ落とすことによって、又は蛍光標識細胞分取技術によって抽出される場合も包含する。細胞又は組織はまた、正常な非悪性の組織由来、又は、がん以外の疾患組織由来であってもよい。
【００３０】
好ましいのは、医療対象におけるＦＯＸＯ転写因子要素の酸化ストレス状態を推測することが、医療対象の抽出試料におけるＳＯＤ２、ＢＮＩＰ３、ＭＸＩ１、ＰＣＫ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、及びＣＡＴを含む群から選択される少なくとも４つのＦＯＸＯ標的遺伝子、好ましくは、全ての標的遺伝子の発現レベルに基づく上記の使用である。
【００３１】
さらに好ましいのは、医療対象におけるＦＯＸＯ転写因子要素の酸化ストレス状態を推測することが、医療対象の抽出試料におけるＳＯＤ２、ＢＮＩＰ３、ＭＸＩ１、及びＰＣＫ１を含む群から選択される２つ以上のＦＯＸＯ標的遺伝子、好ましくは、全ての標的遺伝子の発現レベルに基づく上記の使用である。
【００３２】
別の主な態様によると、本発明は、医療対象におけるＦＯＸＯ転写因子要素の酸化ストレス状態を推測する方法に関し、推測は：
医療対象の抽出試料における１つ又は複数のＦＯＸＯ標的遺伝子の発現レベルを決定するステップであって、１つ又は複数の標的遺伝子は、ＳＯＤ２、ＢＮＩＰ３、ＭＸＩ１、ＰＣＫ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、及びＣＡＴを含む群から選択される、ステップ；及び、
決定された医療対象の抽出試料における１つ又は複数のＦＯＸＯ標的遺伝子の発現レベルに基づき、医療対象におけるＦＯＸＯ転写因子要素の酸化ストレス状態を推測するステップ；
を含む。
【００３３】
腫瘍抑制状態とは対照的に、ＦＯＸＯ転写因子要素の酸化ストレス状態を決定するために使用される区別の目安になる標的遺伝子セットを、ＦＯＸＯが活性である正常な乳房組織及び正常な結腸組織の試料における標的遺伝子発現プロファイルを、それぞれ乳がん及び結腸がん由来の試料におけるものと比較することによって見つけた。
【００３４】
好ましい実施形態は、推測が、医療対象の抽出試料におけるＳＯＤ２、ＢＮＩＰ３、ＭＸＩ１、ＰＣＫ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、及びＣＡＴを含む群から選択されるＦＯＸＯ標的遺伝子のうち少なくとも４つ、好ましくは全ての１つ又は複数の発現レベルに基づく上記の方法である。
【００３５】
さらなる好ましい実施形態は、推測が、医療対象の抽出試料におけるＳＯＤ２、ＢＮＩＰ３、ＭＸＩ１、及びＰＣＫ１を含む群から選択されるＦＯＸＯ標的遺伝子のうち２つ以上、好ましくは全ての１つ又は複数の発現レベルに基づく上記の方法である。
【００３６】
上記の段落において記載された標的遺伝子は、酸化ストレス状態に関して特に有益であることが分かった。
【００３７】
別の実施形態では、本発明は、ＳＯＤ２及び／又はＢＮＩＰ３の１つ又は複数の発現レベルが対照試料と比較して医療対象の抽出試料において増加した場合、及び／又は、ＭＸＩ１、ＰＣＫ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、及びＣＡＴから選択される１つ又は複数の標的遺伝子の１つ又は複数の発現レベルが対照試料と比較して医療対象の抽出試料において減少した場合に、ＦＯＸＯ転写因子要素の酸化ストレス状態が推測される上記の方法に関する。
【００３８】
好ましい実施形態は、ＳＯＤ２及び／又はＢＮＩＰ３の１つ又は複数の発現レベルが対照試料と比較して医療対象の抽出試料において増加した場合、及び／又は、ＭＸＩ１及び／又はＰＣＫ１の１つ又は複数の発現レベルが対照試料と比較して医療対象の抽出試料において減少した場合に、ＦＯＸＯ転写因子要素の酸化ストレス状態が推測される上記の方法である。
【００３９】
上述のように、腫瘍抑制状態とは対照的に、ＦＯＸＯ転写因子要素の酸化ストレス状態を決定するために使用される区別の目安になる標的遺伝子セットを、ＦＯＸＯが活性である正常な乳房組織及び正常な結腸組織の試料における標的遺伝子発現プロファイルを、それぞれ乳がん及び結腸がん由来の試料におけるものと比較することによって見つけた。
【００４０】
結果は、正常な結腸において活性であるＦＯＸＯと、結腸がんにおいて活性であるＦＯＸＯとの比較が：
−  結腸がんにおけるＳＯＤ２及びＢＮＩＰ３の発現レベルの増加、及び
−  正常な結腸組織におけるＭＸＩ１、ＰＣＫ１、及びＰＰＡＲＧＣ１Ａの発現レベルの増加
を示すように要約することができる。
【００４１】
上記の結果は、乳がんにおいて活性であるＦＯＸＯと、正常な乳房組織において活性であるＦＯＸＯにおいて：
−  乳がんにおけるＳＯＤ２及びＢＮＩＰ３の発現レベルの増加、及び
−  正常な乳房組織におけるＭＸＩ１、ＰＣＫ１、ＣＡＴ、及びＰＰＡＲＧＣ１Ａの発現レベルの増加
と再現可能であった。
【００４２】
結果は、食道がんにおいて活性であるＦＯＸＯと、正常な食道組織において活性であるＦＯＸＯにおいても：
−  食道がんにおけるＳＯＤ２の発現レベルの増加、及び
−  正常な食道組織におけるＭＸＩ１及びＰＰＡＲＧＣ１Ａの発現レベルの増加
と少なくとも部分的に再現可能であった。
【００４３】
従って、本発明の方法は、医療対象におけるがん又は前がんの状態を示すために使用することができ、特に、結腸がん、乳がん、及び食道がんの有無を決定するために使用することができる。
【００４４】
最も区別の目安になる遺伝子は、ＳＯＤ２、ＢＮＩＰ３（どちらもがんにおいて増加）、及び、ＭＸＩ１、ＰＣＫ１（どちらもがんにおいて減少）である。ＰＰＡＲＧＣ１Ａは、乳がんにおいてそれほど有益ではなく、従ってそれほど好ましくはない。
【００４５】
対照試料は、健康な医療対象から抽出された「正常な」組織、細胞、又は体液の試料であってもよく、又は、多数の健康な医療対象から収集された試料にわたる平均発現データを指してもよい。そのような発現データは、公開データベースから得ることができる。
【００４６】
本発明による方法はまた、対象の酸化ストレス状態に少なくとも基づき対象におけるＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の活性を推測する方法であって、
対象におけるＳＯＤ２、ＢＮＩＰ３、ＭＸＩ１、ＰＣＫ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、及びＣＡＴを含む群から選択される１つ又は複数の遺伝子の１つ又は複数の発現レベルに基づき対象の酸化ストレス状態を推測するステップを含む方法であってもよい。
【００４７】
対象の酸化ストレス状態は、好ましくは、対象におけるＦＯＸＯ転写因子要素の酸化ストレス状態である。
【００４８】
当該方法は、好ましくは、医療対象であり得る対象において測定されるＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の１つ又は複数の標的遺伝子の発現レベルに少なくとも基づく。好ましくは、当該方法は、対象の抽出試料を使用して行われ、すなわち、発現レベルが、対象の抽出試料において測定される。
【００４９】
本発明のさらなる態様によると、上記の方法は、例えば、特許文献１に記載されるＦＯＸＯ／ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の活性を推測する方法に組み込むことができ、上記の結果の信頼性を改善することができる。
【００５０】
好ましくは、対象におけるＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の活性を推測することは、従って、推測された対象の酸化ストレス状態及び対象におけるＦＯＸＯ転写因子要素の活性レベルに基づく。
【００５１】
当該方法は、対象における１つ又は複数の遺伝子の１つ又は複数の発現レベルを決定するステップを含んでもよい。
【００５２】
１つ又は複数の遺伝子の発現レベルは、好ましくは、対象の抽出試料において決定される。
【００５３】
好ましくは、対象の酸化ストレス状態を推測することは、対象におけるＳＯＤ２、ＢＮＩＰ３、ＭＸＩ１、ＰＣＫ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、及びＣＡＴを含む群から選択されるＦＯＸＯ標的遺伝子のうち少なくとも４つ、好ましくは全ての１つ又は複数の発現レベルに基づく。
【００５４】
さらに好ましくは、対象の酸化ストレス状態を推測することは、対象におけるＳＯＤ２、ＢＮＩＰ３、ＭＸＩ１、及びＰＣＫ１を含む群から選択されるＦＯＸＯ標的遺伝子のうち２つ以上の、好ましくは全ての１つ又は複数の発現レベルに基づく。
【００５５】
さらに好ましくは、対象の酸化ストレス状態を推測することは、対象におけるＳＯＤ２、ＢＮＩＰ３、ＭＸＩ１、ＰＣＫ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、及びＣＡＴを含む群から選択される１つのＦＯＸＯ標的遺伝子の発現レベルに基づく。
【００５６】
別の好ましい実施形態は、医療対象の抽出試料において測定されたＦＯＸＯ／ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の１つ又は複数の標的遺伝子の発現レベルに少なくとも基づき、医療対象におけるＦＯＸＯ／ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の活性を推測するステップをさらに含む上記の方法であり、推測は：
医療対象の抽出試料におけるＦＯＸＯ転写因子要素の活性レベルを決定するステップであって、ＦＯＸＯ転写因子要素は、ＦＯＸＯ／ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の１つ又は複数の標的遺伝子の転写を制御し、決定は、ＦＯＸＯ／ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の１つ又は複数の標的遺伝子の発現レベルをＦＯＸＯ転写因子要素の活性レベルに関連付ける数学的モデルを評価することに少なくとも部分的に基づく、ステップ；
決定された医療対象の抽出試料におけるＦＯＸＯ転写因子要素の活性レベル、及び、推測された医療対象におけるＦＯＸＯ転写因子要素の酸化ストレス状態に基づき、医療対象におけるＦＯＸＯ／ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の活性を推測するステップ；
を含み、
ＦＯＸＯ／ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の活性を推測することは、数学的モデルを使用してデジタル処理装置によって行われる。
【００５７】
本発明のさらなる好ましい実施態様は、医療対象の抽出試料において測定されたＦＯＸＯ／ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の１つ又は複数の標的遺伝子の発現レベルに少なくとも基づき、医療対象におけるＦＯＸＯ／ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の活性を推測する方法であり、推測は：
医療対象の抽出試料におけるＦＯＸＯ転写因子要素の活性レベルを決定するステップであって、ＦＯＸＯ転写因子要素は、ＦＯＸＯ／ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の１つ又は複数の標的遺伝子の転写を制御し、決定は、ＦＯＸＯ／ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の１つ又は複数の標的遺伝子の発現レベルをＦＯＸＯ転写因子要素の活性レベルに関連付ける数学的モデルを評価することに少なくとも部分的に基づく、ステップ；
医療対象の抽出試料におけるＳＯＤ２、ＢＮＩＰ３、ＭＸＩ１、ＰＣＫ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、及びＣＡＴを含む群から選択される１つ又は複数のＦＯＸＯ標的遺伝子の発現レベルに基づき、医療対象におけるＦＯＸＯ転写因子要素の酸化ストレス状態を推測するステップ；
決定された医療対象の抽出試料におけるＦＯＸＯ転写因子要素の活性レベル、及び、推測された医療対象におけるＦＯＸＯ転写因子要素の酸化ストレス状態に基づき、医療対象におけるＦＯＸＯ／ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の活性を推測するステップ；
を含み、
ＦＯＸＯ／ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の活性を推測することは、数学的モデルを使用してデジタル処理装置によって行われる。
【００５８】
決定されたＦＯＸＯ転写因子要素の活性レベルに頼るだけでなく、推測されたＦＯＸＯ転写因子要素の酸化ストレス状態も含むことによって、推測されるＦＯＸＯ／ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の活性は、上記のようにより信頼できるものとなる。
【００５９】
当業者によって理解されることになるように、いずれの目的に対しても１つ又は複数のＦＯＸＯ標的遺伝子の発現レベルを決定するステップ、ＦＯＸＯ転写因子要素の酸化ストレス状態を推測するステップ、並びに、ＦＯＸＯ転写因子要素の活性レベルを決定するステップは、同じ医療対象からの同じ又は異なる試料、及び／又は、同じ又は異なるプローブを使用して行うことができ、該当する場合は、同じ又は異なる、又は、部分的に重複する標的遺伝子（のセット）に基づいてもよい。ＳＯＤ２、ＢＮＩＰ３、ＭＸＩ１、ＰＣＫ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、及びＣＡＴを含む群から選択される１つ又は複数の標的遺伝子の１つ又は複数の発現レベルのうち１つ、２つ以上、又は全てが決定される場合、結果はいずれの目的に対しても使用することができる。好ましくは、医療対象に対する１つの試料のみが、上記の方法に必要な発現レベルの全てを決定するために使用される。
【００６０】
数学的モデルは、確率モデル、好ましくは特許文献１に記載されるベイジアンネットワークモデルであってもよく、ＦＯＸＯ転写因子要素と、医療対象の組織及び／又は細胞及び／又は体液の抽出試料において測定されたＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の１つ又は複数の標的遺伝子の発現レベルとを関連付ける条件付き確率に少なくとも部分的に基づき、又は、数学的モデルは、医療対象の組織及び／又は細胞及び／又は体液の抽出試料において測定されたＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の１つ又は複数の標的遺伝子の発現レベルの１つ又は複数の線型結合に少なくとも部分的に基づくものであってもよい。特に、ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の活性の推測は、特許文献２（“Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｕｓｉｎｇ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”）において開示されているように、又は、特許文献３（“Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｕｓｉｎｇ  ｌｉｎｅａｒ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ（ｓ）  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ”）において記述されているように行われてもよい。
【００６１】
本発明の好ましい実施形態によると、ＳＯＤ２及び／又はＢＮＩＰ３の１つ又は複数の発現レベルが対照試料と比較して医療対象の抽出試料において増加した場合、及び／又は、ＭＸＩ１、ＰＣＫ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、及びＣＡＴから選択される１つ又は複数の標的遺伝子の１つ又は複数の発現レベルが対照試料と比較して医療対象の抽出試料において減少した場合に、酸化ストレス状態が推測される。
【００６２】
本発明のさらなる好ましい実施形態によると、ＳＯＤ２及び／又はＢＮＩＰ３の１つ又は複数の発現レベルが対照試料と比較して医療対象の抽出試料において増加した場合、及び／又は、ＭＸＩ１及び／又はＰＣＫ１の１つ又は複数の発現レベルが対照試料と比較して医療対象の抽出試料において減少した場合に、酸化ストレス状態が推測される。
【００６３】
好ましくは、酸化ストレス状態は、対象におけるＦＯＸＯ転写因子要素の酸化ストレス状態である。
【００６４】
本発明の好ましい実施形態によると、ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の活性を推測するための１つ又は複数の標的遺伝子は、以下の標的遺伝子を含む群から選択される。
【００６５】
上記の好ましい方法では、対象におけるＦＯＸＯ転写因子要素の活性レベルは、ＡＧＲＰ、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＢＣＬ６、ＢＮＩＰ３、ＢＴＧ１、ＣＡＴ、ＣＡＶｌ、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＧ２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＥＳＲ１、ＦＡＳＬＧ、ＦＢＸＯ３２、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＩＮＳＲ、ＭＸＩ１、ＮＯＳ３、ＰＣＫ１、ＰＯＭＣ、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＰＲＤＸ３、ＲＢＬ２、ＳＯＤ２、及びＴＮＦＳＦ１０を含む群から選択される、対象の抽出試料において測定されるＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の１つ又は複数の、好ましくは少なくとも３つの標的遺伝子の発現レベルに少なくとも基づき決定される。
【００６６】
上記のさらなる好ましい方法では、ＦＯＸＯ転写因子要素の活性レベルは、ＡＴＰ８Ａ１、Ｃ１０ｏｒｆ１０、ＣＢＬＢ、ＤＤＢ１、ＤＹＲＫ２、ＥＲＢＢ３、ＥＲＥＧ、ＥＸＴ１、ＦＧＦＲ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦＢＰ１、ＩＧＦＢＰ３、ＬＧＭＮ、ＰＰＭ１Ｄ、ＳＥＭＡ３Ｃ、ＳＥＰＰ１、ＳＥＳＮ１、ＳＬＣ５Ａ３、ＳＭＡＤ４、及びＴＬＥ４を含む群から選択される、及び／又は、ＡＴＧ１４、ＢＩＲＣ５、ＩＧＦＢＰ１、ＫＬＦ２、ＫＬＦ４、ＭＹＯＤ１、ＰＤＫ４、ＲＡＧ１、ＲＡＧ２、ＳＥＳＮ１、ＳＩＲＴ１、ＳＴＫ１１、及びＴＸＮＩＰを含む群から選択される、対象の抽出試料において測定されるＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の１つ又は複数の、好ましくは少なくとも３つの標的遺伝子の発現レベルに少なくとも基づき決定される。
【００６７】
ＦＯＸＯ転写因子要素の活性レベルは、好ましくは、対象の抽出試料において測定される上記の１つ又は複数の標的遺伝子の１つ又は複数の発現レベルに基づき推測される。
【００６８】
特に好ましいのは、医療対象におけるＦＯＸＯ／ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の活性を推測することが、ＡＧＲＰ、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＢＣＬ６、ＢＮＩＰ３、ＢＴＧ１、ＣＡＴ、ＣＡＶ１、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＧ２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＥＳＲ１、ＦＡＳＬＧ、ＦＢＸＯ３２、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＩＮＳＲ、ＭＸＩ１、ＮＯＳ３、ＰＣＫ１、ＰＯＭＣ、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＰＲＤＸ３、ＲＢＬ２、ＳＯＤ２、及びＴＮＦＳＦ１０を含む群から選択される、医療対象の抽出試料において測定されるＦＯＸＯ／ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の１つ又は複数の、好ましくは少なくとも３つの標的遺伝子の発現レベルに少なくとも基づく、及び／又は、ＦＯＸＯ転写因子要素の酸化ストレス状態を推測することが、医療対象の抽出試料において測定されるＦＯＸＯ転写因子の標的遺伝子、ＳＯＤ２、ＢＮＩＰ３、ＭＸＩ１、及びＰＣＫ１のうち１つ又は複数の、好ましくは全ての発現レベルに基づく方法である。
【００６９】
さらに好ましいのは、医療対象におけるＦＯＸＯ／ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の活性を推測することが、ＡＧＲＰ、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＢＣＬ６、ＢＮＩＰ３、ＢＴＧ１、ＣＡＴ、ＣＡＶｌ、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＧ２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＥＳＲ１、ＦＡＳＬＧ、ＦＢＸＯ３２、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＩＮＳＲ、ＭＸＩ１、ＮＯＳ３、ＰＣＫ１、ＰＯＭＣ、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＰＲＤＸ３、ＲＢＬ２、ＳＯＤ２、及びＴＮＦＳＦ１０を含む群から選択される、医療対象の抽出試料において測定されるＦＯＸＯ／ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の６以上の、好ましくは１０以上の、より好ましくは全ての標的遺伝子の発現レベルに少なくとも基づく実施形態である。
【００７０】
さらに好ましいのは、推測することが、ＡＴＰ８Ａ１、Ｃ１０ｏｒｆ１０、ＣＢＬＢ、ＤＤＢ１、ＤＹＲＫ２、ＥＲＢＢ３、ＥＲＥＧ、ＥＸＴ１、ＦＧＦＲ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦＢＰ１、ＩＧＦＢＰ３、ＬＧＭＮ、ＰＰＭ１Ｄ、ＳＥＭＡ３Ｃ、ＳＥＰＰ１、ＳＥＳＮ１、ＳＬＣ５Ａ３、ＳＭＡＤ４、及びＴＬＥ４を含む群から選択される、医療対象の組織及び／又は細胞及び／又は体液の抽出試料において測定されるＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の少なくとも１つの標的遺伝子の発現レベルにさらに基づく方法である。
【００７１】
さらに好ましいのは、推測することが、ＡＴＧ１４、ＢＩＲＣ５、ＩＧＦＢＰ１、ＫＬＦ２、ＫＬＦ４、ＭＹＯＤ１、ＰＤＫ４、ＲＡＧ１、ＲＡＧ２、ＳＥＳＮ１、ＳＩＲＴ１、ＳＴＫ１１、及びＴＸＮＩＰを含む群から選択される、医療対象の組織及び／又は細胞及び／又は体液の抽出試料において測定されるＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の少なくとも１つの標的遺伝子の発現レベルにさらに基づく方法である。
【００７２】
推測することが、１つ前の段落において特定された群から選択される少なくとも１つの標的遺伝子の発現レベルにも、１つ前の段落よりも前の段落において特定された群から選択される少なくとも１つの標的遺伝子の発現レベルにもさらに基づく場合、いずれの群に関しても先に述べた標的遺伝子ＩＧＦＢＰ１は、その群のうちいずれかにのみ含まれてもよい。
【００７３】
本発明の別の態様は、（本明細書において記載される）方法に関し、当該方法は：
推測された医療対象の組織及び／又は細胞及び／又は体液におけるＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の活性に基づき、ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路が、医療対象の組織及び／又は細胞及び／又は体液において異常に作動しているかどうかを決定するステップをさらに含む。
【００７４】
従って、好ましい実施形態において、上記の方法は、推測された対象におけるＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の活性に基づき、ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路が対象において異常に作動しているかどうかを決定するステップをさらに含む。
【００７５】
「細胞シグナル伝達経路が異常に作動している」という表現は、経路の「活性」が予想されたものではない場合を指し、ここで、「活性」という用語は、標的遺伝子を発現するよう駆り立てる際の転写因子複合体の活性を指し得る。「正常」とは、不活性であると予想される場合に組織内で不活性であり、活性であると予想される場合に活性であることであり得る。さらに、特定のレベルの活性が正常とみなされ、それよりも高い又は低いものは異常とみなされ得る。
【００７６】
本発明は、（本明細書において記載される）方法にも関し、当該方法は：
ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の異常な作動を補正する薬物を医療対象に処方することを推奨するステップをさらに含み、
ここで、推奨するステップは、推測されたＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の活性に基づき、ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路が医療対象の組織及び／又は細胞及び／又は体液において異常に作動していると決定された場合にのみ行われる。
【００７７】
従って、好ましい実施形態によると、本発明の方法は、ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の異常な作動を補正する薬物を対象に処方することを推奨するステップをさらに含み、ここで、推奨するステップは、推測されたＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の活性に基づき、ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路が対象において異常に作動していると決定された場合に行われる。
【００７８】
有利には、上記の方法は、医療対象におけるがん又は前がんの状態を示すために使用することができ、特に、結腸がん、乳がん、及び食道がんの有無を決定するために使用することができる。
【００７９】
本発明は、（本明細書において記載される）方法にも関し、推測することは：
医療対象の組織及び／又は細胞及び／又は体液の抽出試料において測定されるＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の標的遺伝子のセットのうち２、３以上の標的遺伝子の発現レベルに少なくとも基づき、医療対象におけるＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の活性を推測することを含む。
【００８０】
好ましくは、ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の標的遺伝子のセットは、ＡＧＲＰ、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＢＣＬ６、ＢＮＩＰ３、ＢＴＧ１、ＣＡＴ、ＣＡＶ１、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＧ２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＥＳＲ１、ＦＡＳＬＧ、ＦＢＸＯ３２、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＩＮＳＲ、ＭＸＩ１、ＮＯＳ３、ＰＣＫ１、ＰＯＭＣ、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＰＲＤＸ３、ＲＢＬ２、ＳＯＤ２、及びＴＮＦＳＦ１０を含む群から選択される少なくとも９の、好ましくは全ての標的遺伝子を含む。
【００８１】
ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の標的遺伝子のセットが、ＡＴＰ８Ａ１、Ｃ１０ｏｒｆ１０、ＣＢＬＢ、ＤＤＢ１、ＤＹＲＫ２、ＥＲＢＢ３、ＥＲＥＧ、ＥＸＴ１、ＦＧＦＲ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦＢＰ１、ＩＧＦＢＰ３、ＬＧＭＮ、ＰＰＭ１Ｄ、ＳＥＭＡ３Ｃ、ＳＥＰＰ１、ＳＥＳＮ１、ＳＬＣ５Ａ３、ＳＭＡＤ４、及びＴＬＥ４を含む群から選択される少なくとも１つの標的遺伝子をさらに含む方法が特に好ましい。
【００８２】
ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の標的遺伝子のセットが、ＡＴＧ１４、ＢＩＲＣ５、ＩＧＦＢＰ１、ＫＬＦ２、ＫＬＦ４、ＭＹＯＤ１、ＰＤＫ４、ＲＡＧ１、ＲＡＧ２、ＳＥＳＮ１、ＳＩＲＴ１、ＳＴＫ１１、及びＴＸＮＩＰを含む群から選択される少なくとも１つの標的遺伝子をさらに含む方法も特に好ましい。
【００８３】
標的遺伝子のセットが、１つ前の段落において特定された群から選択される少なくとも１つの標的遺伝子も、１つ前の段落よりも前の段落において特定された群から選択される少なくとも１つの標的遺伝子もさらに含む場合、いずれの群に関しても先に述べた標的遺伝子ＩＧＦＢＰ１は、その群のうちいずれかにのみ含まれてもよい。
【００８４】
さらなる態様において、本発明は製品にも関し、当該製品は：
医療対象の抽出試料における１つのＦＯＸＯ標的遺伝子又は２つ以上のＦＯＸＯ標的遺伝子のセット、好ましくは少なくとも４つのＦＯＸＯ標的遺伝子の遺伝子発現レベルを決定するためのプライマー及び／又はプローブであって、１つ又は複数の標的遺伝子は、ＳＯＤ２、ＢＮＩＰ３、ＭＸＩ１、ＰＣＫ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、及びＣＡＴを含む群から選択され、好ましくはＳＯＤ２、ＢＮＩＰ３、ＭＸＩ１、及びＰＣＫ１から選択される、プライマー及び／又はプローブを含み、
任意的に、ＡＧＲＰ、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＢＣＬ６、ＢＴＧ１、ＣＡＶｌ、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＧ２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＥＳＲ１、ＦＡＳＬＧ、ＦＢＸＯ３２、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＩＮＳＲ、ＮＯＳ３、ＰＯＭＣ、ＰＲＤＸ３、ＲＢＬ２、及びＴＮＦＳＦ１０を含む群から選択される、ＦＯＸＯ／ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の、医療対象の抽出試料における上記の遺伝子以外の遺伝子のセットの、好ましくは２つ以上の標的遺伝子の発現レベルを決定するためのプライマー及び／又はプローブをさらに含む。
【００８５】
好ましい実施形態において、上記の製品は、ＰＣＲキット、ＲＮＡ配列決定キット、又はマイクロアレイキットである。
【００８６】
本発明の方法において使用するための材料は、良く知られた手順に従って製造されるキットの調製に理想的には適している。従って、本発明は、開示される遺伝子及び配列の発現を検出するための薬剤を含むキットを提供する。そのようなキットは、任意的に、同定する記述若しくはラベルと共に薬剤を含むか、又は、本発明の方法におけるその使用に関する説明書が提供される。そのようなキットは容器を含んでもよく、それぞれが、例えば、予め製作されたマイクロアレイ、緩衝液、適切なヌクレオチド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ；又は、ｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、ＲＧＴＰ、及びＵＴＰ等）、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、及び１つ又は複数のプライマーを含む、当該方法において利用される（典型的には濃縮された形態の）種々の試薬のうち１つ又は複数を有する。指示のセットも典型的には含まれることになる。
【００８７】
本発明に関して、１つ又は複数の発現レベルは、遺伝子によってコードされるｍＲＮＡの検出を含む方法によって決定されてもよい。
【００８８】
例えば、１つ又は複数のマーカー遺伝子の発現の核酸レベルの測定は、試料から得られた核酸分子（例えば、ＲＮＡ又はｃＤＮＡ等）の精製、続いて、本明細書において先に記載された特異的なオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションによって評価されてもよい。発現レベルの比較は、視覚的に、又は、適切な装置によって成し遂げることができる。ｍＲＮＡ又は発現産物を検出する方法は、当業者には既知である。
【００８９】
或いは、１つ又は複数のマーカー遺伝子の発現の核酸レベルは、ＤＮＡアレイ又はマイクロアレイのアプローチにおいて検出され得る。典型的には、試験されることになる患者由来の試料の核酸は、処理され、好ましくは蛍光標識で標識される。その後、そのような核酸分子は、本発明のマーカー遺伝子に対応する固定化捕獲プローブとのハイブリダイゼーションアプローチにおいて使用されてもよい。マイクロアレイ分析を実行するための適した手段は、当業者には既知である。
【００９０】
標準的な仕組みでは、ＤＮＡアレイ又はマイクロアレイは、多くの遺伝子を検出するために固定化された高密度プローブを含む。アレイ上のプローブは、マーカー遺伝子の配列の１つ又は複数の部分に相補的である。典型的には、ｃＤＮＡ、ＰＣＲ産物、及びオリゴヌクレオチドが、プローブとして有用である。
【００９１】
ＤＮＡアレイ又はマイクロアレイに基づく検出方法は、典型的には、以下のステップを含む：（１）試料からｍＲＮＡを単離し、任意的に、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換し、その後、このＲＮＡ又はｃＤＮＡを標識するステップ。ＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡに変換する方法、及び、核酸を標識する方法は、マイクロアレイ技術のためのマニュアルに記載されている。（２）ステップ１からの核酸をマーカー遺伝子に対するプローブとハイブリダイズさせるステップ。試料からの核酸は、蛍光色素Ｃｙ３（赤）又はＣｙ５（青）等の色素で標識することができる。一般的に、対照試料は、異なる色素で標識される。（３）試料からの核酸とプローブとのハイブリダイゼーションを検出し、調べたマーカー遺伝子に対する試料におけるｍＲＮＡの量を少なくとも定性的に、とりわけ定量的に決定するステップ。試料と対照との発現レベルの差は、信号強度の差に基づき推定することができる。これらは、限定されることなく、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘによって提供されるソフトウェア等、適切なソフトウェアによって測定及び分析することができる。
【００９２】
ＤＮＡアレイ上にスポットされる、使用されるマーカー遺伝子に対応するプローブの数に制限はない。また、マーカー遺伝子は、２つ以上のプローブによって表すことができ、プローブは、遺伝子の異なる部分にハイブリダイズする。プローブは、選択されるマーカー遺伝子ごとに設計される。そのようなプローブは、典型的には、５〜５０のヌクレオチド残基を含むオリゴヌクレオチドである。より長いＤＮＡは、ＰＣＲによって又は化学的に合成することができる。そのようなオリゴヌクレオチドを合成し、それらを基板上に適用する方法は、マイクロアレイの分野において良く知られている。マーカー遺伝子以外の遺伝子も、ＤＮＡアレイ上にスポットすることができる。例えば、発現レベルが有意に変化していない遺伝子のためのプローブをＤＮＡアレイ上にスポットして、アッセイ結果を正規化するか、又は、多数のアレイ又は異なるアッセイのアッセイ結果を比較することができる。
【００９３】
或いは、１つ又は複数のマーカー遺伝子の発現の核酸レベルは、関心のある逆転写転写物に続いて、定量的ＲＴ−ＰＣＲアプローチ、好ましくはリアルタイムＰＣＲアプローチにおいて検出されてもよい。典型的には、第１のステップとして、転写物は、当業者には既知の任意の適した方法に従って、ｃＤＮＡ分子に逆転写される。定量的ＰＣＲアプローチ又はリアルタイムＰＣＲアプローチは、その後、上記のように得られた第１のＤＮＡ鎖に基づき実行されてもよい。
【００９４】
好ましくは、このタイプの主要なＦＲＥＴベースのプローブとしてのＴａｑｍａｎ又はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎプローブが、定量的ＰＣＲ検出のために使用されてもよい。いずれの場合においても、プローブは、関心のある標的領域に隣接する一対の対向するプライマーと組み合わせて使用される内部プローブ、好ましくは、本明細書において先に記載された１つ又は複数のマーカー遺伝子特異的オリゴヌクレオチドのセットとして働く。標的セグメントの増幅後、プローブは、プライマー部位間の識別配列にて生成物に選択的に結合し、その結果、標的頻度の増加に相対してＦＲＥＴシグナル伝達の増加を引き起こすことができる。
【００９５】
好ましくは、本発明による定量的ＰＣＲアプローチに使用されることになるＴａｑｍａｎプローブは、ＦＲＥＴ対で両端が標識される約２２から３０塩基の、先に記載された特定のオリゴヌクレオチドを含んでもよい。典型的には、５′末端は、フルオレセイン（例えばＦＡＭ）等、より短い波長のフルオロフォアを有することになり、３′末端は、一般的に、より長い波長の蛍光クエンチャー（例えばＴＡＭＲＡ等）又は非蛍光クエンチャー化合物（例えばＢｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ等）で標識される。定量的ＰＣＲに使用されることになるプローブ、特に、本明細書において先に記載されたプローブは、プローブが分解された後のレポーター蛍光のクエンチングを回避するために、レポーター色素に隣接する５′末端にてグアニン（Ｇ）を有さないことが好ましい。
【００９６】
本発明による定量的ＰＣＲのアプローチに使用されることになるＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎプローブは、好ましくは、ＦＲＥＴ相互作用を使用してＰＣＲ産物を検出且つ定量化し、各プローブは、５′蛍光標識末端及び３′クエンチャー標識末端を有する。このプローブ構造のヘアピン又はステム−ループ構成は、好ましくは、２つの短い自己結合末端を有するステムと、約２０から３０塩基の長い内部標的特異的領域を有するループとを含む。
【００９７】
本発明に関して同様に利用することができる別の検出機構は、ループ構造のみを有し、短い相補的なステム領域を有さないで作製されるプローブに向けられる。本発明に関して同様に使用することができる定量的ＰＣＲのための別のＦＲＥＴベースのアプローチは、標的上の隣接部位に結合する２つのハイブリダイゼーションプローブの使用に基づき、ここで、第１のプローブは、３′末端にて蛍光ドナー標識を有し、第２のプローブは、その５′末端にて蛍光アクセプター標識を有する。
【００９８】
別の開示される態様によると、装置は、本明細書において記載される本発明による方法を行うように構成されたデジタルプロセッサを含む。
【００９９】
別の開示される態様によると、非一時的記憶媒体は、本明細書において記載される本発明による方法を行うためにデジタル処理装置によって実行可能な命令を記憶する。非一時的記憶媒体は、ハードドライブ若しくは他の磁気記憶媒体、光ディスク若しくは他の光記憶媒体、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、リードオンリーメモリ（ＲＯＭ）、フラッシュメモリ、若しくは他の電子記憶媒体、又は、ネットワークサーバ等、コンピュータ読み取り可能記憶媒体であってもよい。デジタル処理装置は、ハンドヘルド装置（例えば、パーソナルデータアシスタント又はスマートフォン等）、ノートブックコンピュータ、デスクトップコンピュータ、タブレットコンピュータ若しくは装置、又はリモートネットワークサーバー等であってもよい。
【０１００】
別の開示される態様によると、コンピュータプログラムは、デジタル処理装置に本明細書において記載される本発明による方法を行わせるためのプログラムコード手段を含む。デジタル処理装置は、ハンドヘルド装置（例えば、パーソナルデータアシスタント又はスマートフォン等）、ノートブックコンピュータ、デスクトップコンピュータ、タブレットコンピュータ若しくは装置、又は、リモートネットワークサーバー等であってもよい。
【０１０１】
本明細書において記載される本発明は、例えば、
推測された医療対象の組織及び／又は細胞及び／又は体液におけるＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の活性に基づく診断；
推測された医療対象の組織及び／又は細胞及び／又は体液におけるＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の活性に基づく予後診断；
推測された医療対象の組織及び／又は細胞及び／又は体液におけるＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の活性に基づく薬物処方；
推測された医療対象の組織及び／又は細胞及び／又は体液におけるＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の活性に基づく薬物有効性の予測；
推測された医療対象の組織及び／又は細胞及び／又は体液におけるＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の活性に基づく有害作用の予測；
薬物有効性のモニタリング；
医薬品開発；
アッセイ開発；
経路研究；
がん進行度分類；
推測された医療対象の組織及び／又は細胞及び／又は体液におけるＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の活性に基づく臨床試験における医療対象の登録；
行われることになる後の試験の選択；及び
コンパニオン診断試験の選択；
に関連して有利に使用することもできる。
【０１０２】
好ましい実施態様によると、本発明の方法は、従って、以下の活動：
推測された対象におけるＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の活性に基づく診断；
推測された対象におけるＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の活性に基づく予後診断；
推測された対象におけるＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の活性に基づく薬物処方；
推測された対象におけるＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の活性に基づく薬物有効性の予測；
推測された対象におけるＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の活性に基づく有害作用の予測；
薬物有効性のモニタリング；
医薬品開発；
アッセイ開発；
経路研究；
がん進行度分類；
推測された対象におけるＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の活性に基づく臨床試験における対象の登録；
行われることになる後の試験の選択；及び
コンパニオン診断試験の選択；
のうち少なくとも１つにおいて使用される。
【０１０３】
さらなる利点が、添付の図、以下の説明を読み且つ理解することにより、特に、本明細書において以下に提供される詳細な例を読むことにより、当業者には明らかになる。
【０１０４】
本発明の方法、装置、非一時的記憶媒体、及びコンピュータプログラムは、特に従属項に記載されているように、類似及び／又は同じ好ましい実施態様を有するということを理解されたい。
【０１０５】
本発明の好ましい実施形態は、従属項又は上記の実施形態とそれぞれの独立項のいかなる組み合わせであってもよいということを理解されたい。
【０１０６】
本発明の上記及び他の態様が、以下に記載される実施形態から明らかになり、それらを参照して解明されることになる。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】ＦＯＸＯ３が核内に位置する、細胞におけるＦＯＸＯ／ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の概略図である。
【図２】ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の活性を推測するための決定木の概略図である。
【図３】表１において示された全ての遺伝子及びプローブセットを使用した、データセットにおいて特定された各サブグループの酸化ストレススコアを示した図である。
【図４】特許文献１において記載されたＦＯＸＯ活性モデルによって推測されたＦＯＸＯ活性を有した試料のみの酸化ストレススコアを示した図である。
【図５】最も有益な酸化ストレス誘導ＦＯＸＯ標的遺伝子ＳＯＤ２、ＭＸＩ１、ＰＣＫ１、及びＢＮＩＰ３のみを使用することによって得られた酸化ストレススコアを示した図である。
【図６】酸化ストレスノードを加えることによって酸化ストレスを組み込んだＦＯＸＯモデル構造の概略図である。プローブセットを表すノードは、可読性の目的で示されていない。
【図７】実施例２において記載され、データセットＧＳ２０９１６に対して試験した図６において示されているモデルの結果を示した図である。ｘ軸は転写複合体（ＴＣ）ノードが活性である確率を示し、ｙ軸はＯＸＩ（酸化ストレス状態）ノードが活性である確率を示している。黒い丸は正常な結腸試料を表し、空の丸は腺がん試料を表し、十字は結腸がん試料を表している。
【図８】ＦＯＸＯ活性を予測するベイジアン計算モデルを示した図である。Ａ．３つのタイプのノード：転写因子、標的遺伝子、及び標的遺伝子に対応するマイクロアレイプローブセットを含む、細胞シグナル伝達経路の転写プログラムの簡易モデルとして示されるモデリングアプローチの基礎として使用されるベイジアンネットワーク構造を示した図である。Ｂ．４ＯＨＴ誘導性ＦＯＸＯ３．Ａ３−ＥＲ発現構築物を有するＨＵＶＥＣからのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイ２．０  Ｐｌｕｓ発現データを含む、公開ＧＥＯデータセットＧＳＥ１６５７３に対する計算ＦＯＸＯ３モデルのトレーニングを示した図である。各バーは、試料分析結果を表している。縦軸は、ＦＯＸＯが「活性」（横軸より上の値）対「不活性」（横軸より下の値）である確率を示している。
【図９】ＦＯＸＯ及びＰＩ３Ｋ活性が乳がん細胞株において正確に予測されることを示した図である。Ａ．ドキシサイクリン（ｄｏｘ）の非存在下又は存在下で１６時間培養したＭＣＦ７−ＦＯＸＯ３．Ａ３及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１の細胞におけるＦＯＸＯ３発現レベルのウエスタンブロット解析を示した図である。下のＦＯＸＯ３ブロットは、同じブロットのより長い曝露を表している。Ｂ．２０％ＦＢＳ、ＰＩ３Ｋ阻害剤ＬＹ２９４００２、ドキシサイクリン、又はドキシサイクリン及びＬＹ２９４００２の組み合わせで１６時間処理したＭＣＦ７−ＦＯＸＯ３．Ａ３細胞を使用した計算ＦＯＸＯ３モデルの生物学的検証を示した図である。各バーは、１つの試料の分析結果を表している。縦軸は、ＦＯＸＯ３が「活性」（横軸より上の値）対「不活性」（横軸より下の値）である確率を示している。Ｃ．ドキシサイクリンで１６時間処理したＭＣＦ７−ＦＯＸＯ３．Ａ３及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１の細胞を使用した計算ＦＯＸＯ３モデルの生物学的検証を示した図である。各バーは、１つの試料の分析結果を表している。縦軸は、ＦＯＸＯ３が「活性」（横軸より上の値）対「不活性」（横軸より下の値）である確率を示している。
【図１０Ａ】ＰＩ３Ｋ経路を阻害し、ＦＯＸＯ活性を誘導する標的薬物を示した図である。増殖因子経路を標的とする薬物で処理した試料からの公開データセットを示し、ＦＯＸＯ活性スコアは、ｌｏｇ２ｏｄｄｓとして示されている。ウィルコクソン順位統計検定から得られたｐ値が図において示されている。ＧＥＯ  ＧＳＥ５１２１２。肺がん細胞株ＨＣＣ８２７を、（左から右へ）示されているように、溶剤（ＤＭＳＯ）、又は、エルロチニブ、ＡＺＤ６２４４（セルメチニブ）若しくはＢＥＺ２３５で処理した。エルロチニブはＥＧＦＲを阻害し、セルメチニブはＭＥＫ１／ＭＥＫ２を特異的に阻害し、ＢＥＺ２３５はＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲの二重阻害剤である。
【図１０Ｂ】ＰＩ３Ｋ経路を阻害し、ＦＯＸＯ活性を誘導する標的薬物を示した図である。増殖因子経路を標的とする薬物で処理した試料からの公開データセットを示し、ＦＯＸＯ活性スコアは、ｌｏｇ２ｏｄｄｓとして示されている。ウィルコクソン順位統計検定から得られたｐ値が図において示されている。ＧＥＯ  ＧＳＥ３０５１６データセット。トリプルネガティブ（ＢＴ２０）、ＥＲ陽性（ＭＣＦ７）、及びＨＥＲ２陽性乳がん（ＭＤＡ−ＭＢ−４５３）を表す３つの乳がん細胞株を、エルロチニブで（左から右に、示された期間）処理した。
【図１１】結腸、結腸腺腫、及び結腸がんにおけるＦＯＸＯ活性及び細胞局在化を示した図である。Ａ．ＧＳＥ８６７１データセット内の対応する正常な結腸及び結腸腺腫の患者試料における計算ＦＯＸＯモデルの生物学的検証を示した図である。各バーは、１つの試料の分析結果を表している。縦軸は、ＦＯＸＯ３が「活性」（横軸より上の値）対「不活性」（横軸より下の値）である確率を示している。左側のバーは正常な組織を表し、右側のバーは腺腫試料を表している。Ｂ．正常な結腸組織（“ｎｏｒｍａｌ  ｃｏｌｏｎ，ｄｉｓ  ｍｕｃｏｓａ”：腫瘍組織から顕微解剖した正常な粘膜；“ｄｉｓｔａｎｔ  ｃｏｌｏｎ，ｄｉｓ  ｍｕｃｏｓａ”：遠位の健康な組織由来；“ｎｏｒｍａｌ  ｃｏｌｏｎ，ｄｉｓ  ｃｒｙｐｔ”：腫瘍組織から顕微解剖した正常な腺窩；“ｄｉｓｔａｎｔ  ｃｏｌｏｎ，ｄｉｓ  ｃｒｙｐｔ”：遠位の健康な結腸から顕微解剖した腺窩；“ｃｏｌｏｎ，  ｓｕｒｇｅｒｙ”：正常な結腸由来の全層組織）、結腸腺腫（顕微解剖した粘膜、顕微解剖した腺窩、及び完全な外科試料で分別）、及びがん（顕微解剖した粘膜、顕微解剖した腺窩、及び完全な外科試料で分別）患者試料の試料を用いた公開データセット（ＧＳＥ２０９１６）を使用した計算ＦＯＸＯ３モデルの生物学的検証を示した図である。各バーは、１つの試料の分析結果を表している。縦軸は、ＦＯＸＯ３が「活性」（横軸より上の値）対「不活性」（横軸より下の値）である確率を示している。左側のバーは正常な組織を表し、中央のバーは腺腫試料を表し、右側のバーは結腸がんの試料を表している。Ｃ．正常な結腸、結腸腺腫、及び２つのがん患者試料におけるＦＯＸＯ３及びヘマトキシリンの免疫組織化学染色を示した図である。下のパネルは、ブラックボックスによって示される領域の拡大である。
【図１２Ａ】予測されるＦＯＸＯ活性、及び、ＦＯＸＯ活性の腫瘍抑制と酸化ストレスモードとの区別を示した図である。分析のためのより多くの試料数を得るために、ＧＥＯデータベースから多数の公開Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘデータセットをコンパイル及び分析した（結腸：ＧＳＥ１４３３３、ＧＳＥ２０９１６、ＧＳＥ２１０９、ＧＳＥ３７３６４、ＧＳＥ３９０８４、ＧＳＥ４０９６７、ＧＳＥ４１８３、ＧＳＥ８６７１）。各分析した試料に対して、ＦＯＸＯ活性が、Ｌｏｇ２ｏｄｄｓとして示されている。連続的尺度ではあるけれども、ＦＯＸＯ活性スコアが０より高い場合、ＦＯＸＯは原則として活性であるとみなされる。黒の実線のＦＯＸＯ活性試料は、ＦＯＸＯ活性の正常な健康組織試料においてＳＯＤ発現の平均＋２ＳＤよりも高いＳＯＤ２発現レベルを有し、酸化ストレス誘導ＦＯＸＯ活性の可能性が高いことを示している。円は、ＳＯＤ２発現が正常範囲にあるＦＯＸＯ活性試料を示し、ＦＯＸＯが腫瘍抑制モードにおいて活性である可能性が高いことを示している。ＰＩ３Ｋ活性試料の数は、ＦＯＸＯ不活性試料の数＋ＦＯＸＯ活性であるＳＯＤ２高試料の数を表している。詳細な説明については、本文を参照されたい。結腸がんに関して示した図である。
【図１２Ｂ】予測されるＦＯＸＯ活性、及び、ＦＯＸＯ活性の腫瘍抑制と酸化ストレスモードとの区別を示した図である。分析のためのより多くの試料数を得るために、ＧＥＯデータベースから多数の公開Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘデータセットをコンパイル及び分析した（乳房：ＥＭＴＡＢ３６５、ＧＳＥ１０７８０、ＧＳＥ１２２７６、ＧＳＥ１８１４６、ＧＳＥ２１６５３、ＧＳＥ２６９１０、ＧＳＥ４２５６８、ＧＳＥ４５８２７、ＧＳＥ６５３２、ＧＳＥ７３０７、ＧＳＥ２０６８５、ＧＳＥ９１９５、ＧＳＥ１７９０７）。各分析した試料に対して、ＦＯＸＯ活性が、Ｌｏｇ２ｏｄｄｓとして示されている。連続的尺度ではあるけれども、ＦＯＸＯ活性スコアが０より高い場合、ＦＯＸＯは原則として活性であるとみなされる。黒の実線のＦＯＸＯ活性試料は、ＦＯＸＯ活性の正常な健康組織試料においてＳＯＤ発現の平均＋２ＳＤよりも高いＳＯＤ２発現レベルを有し、酸化ストレス誘導ＦＯＸＯ活性の可能性が高いことを示している。円は、ＳＯＤ２発現が正常範囲にあるＦＯＸＯ活性試料を示し、ＦＯＸＯが腫瘍抑制モードにおいて活性である可能性が高いことを示している。ＰＩ３Ｋ活性試料の数は、ＦＯＸＯ不活性試料の数＋ＦＯＸＯ活性であるＳＯＤ２高試料の数を表している。詳細な説明については、本文を参照されたい。乳がんに関して示した図である。Ｐｅｒｏｕによる均一な乳がんのサブタイプに対する詳細については、実施例４における方法を参照されたい。
【図１２Ｃ】予測されるＦＯＸＯ活性、及び、ＦＯＸＯ活性の腫瘍抑制と酸化ストレスモードとの区別を示した図である。分析のためのより多くの試料数を得るために、ＧＥＯデータベースから多数の公開Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘデータセットをコンパイル及び分析した（前立腺：ＧＳＥ２１０９、ＧＳＥ３２９８２、ＧＳＥ３３２５、ＧＳＥ４６６０２、ＧＳＥ５５９４５、ＧＳＥ７３０７）。各分析した試料に対して、ＦＯＸＯ活性が、Ｌｏｇ２ｏｄｄｓとして示されている。連続的尺度ではあるけれども、ＦＯＸＯ活性スコアが０より高い場合、ＦＯＸＯは原則として活性であるとみなされる。黒の実線のＦＯＸＯ活性試料は、ＦＯＸＯ活性の正常な健康組織試料においてＳＯＤ発現の平均＋２ＳＤよりも高いＳＯＤ２発現レベルを有し、酸化ストレス誘導ＦＯＸＯ活性の可能性が高いことを示している。円は、ＳＯＤ２発現が正常範囲にあるＦＯＸＯ活性試料を示し、ＦＯＸＯが腫瘍抑制モードにおいて活性である可能性が高いことを示している。ＰＩ３Ｋ活性試料の数は、ＦＯＸＯ不活性試料の数＋ＦＯＸＯ活性であるＳＯＤ２高試料の数を表している。詳細な説明については、本文を参照されたい。前立腺がんに関して示した図である。
【図１３Ａ】ＰＩ３Ｋ−ＦＯＸＯ経路、及び、ＦＯＸＯ活性の腫瘍抑制と酸化ストレスモードとの区別を示した図であり、ＰＩ３Ｋ−ＦＯＸＯ経路、及び、ＳＯＤ２標的遺伝子発現との関係を示した図である。健康な正常組織において、ＦＯＸＯは、細胞分裂を制御する標的遺伝子の転写を誘導する。ＰＩ３Ｋ経路が、ゲノム突然変異によって又は微小環境からの刺激によって活性化されると、酸化ストレスに付随してＦＯＸＯ活性が遮断され、細胞分裂に対する制御が失われ、細胞代謝が増加する。次に、酸化ストレスは、細胞内のストレス状況の結果から保護する別の機能を有して、ＦＯＸＯの活性化を誘導する。ＦＯＸＯ標的遺伝子発現プロファイルは、次にＳＯＤ２も含むようにわずかに変更される。
【図１３Ｂ】ＰＩ３Ｋ−ＦＯＸＯ経路、及び、ＦＯＸＯ活性の腫瘍抑制と酸化ストレスモードとの区別を示した図であり、組織試料におけるＰＩ３Ｋ活性を決めるための決定木を示した図である。この単純化された決定木は：（１）ＦＯＸＯががん細胞において発現される、及び、（２）健康なＦＯＸＯ活性細胞の混入は制限されているという仮定の下に有効である。
【発明を実施するための形態】
【０１０８】
以下の実施例は、特に好ましい方法及びそれに関連して選択された態様を単に例示している。そこで提供される教示は、例えば、１つ又は複数の細胞シグナル伝達経路の異常な活性を検出、予測及び／又は診断するための、いくつかの試験及び／又はキットを構築するために使用されてもよい。さらに、本明細書において記載される方法を使用することにより、薬物処方を有利にガイドすることができ、薬物有効性（及び／又は有害作用）の薬物予測及びモニタリングを行うことができ、薬物耐性を予測及びモニターすることができ、例えば、（コンパニオン診断試験のような）行われることになる後の１つ又は複数の試験を選択することができる。以下の実施例は、本発明の範囲を限定するとして解釈されるべきではない。
【実施例１】
【０１０９】
ＦＯＸＯ転写因子要素の酸化ストレス状態を推測するための線形スコアを使用した例証的な実施形態
ＦＯＸＯ標的遺伝子ＳＯＤ２、ＢＮＩＰ３、ＰＣＫ１、ＭＸＩ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、及びＣＡＴに基づくシンプルな線形スコアがここでは示されている。各標的遺伝子の発現が、この実施例では上述の遺伝子に関連する各プローブセットに対して、ＦＯＸＯ経路がその腫瘍抑制形態において活性であり、その腫瘍促進形態において活性ではないことが知られている健康な試料におけるその発現と比較される。
【０１１０】
この実施例では、閾値が、健康な組織試料における発現レベルの平均に標準偏差の３倍を加えたものとして定義され、或いは、ＳＯＤ２及びＢＮＩＰ３の場合であるＦＯＸＯ経路の酸化ストレス誘導活性の結果として遺伝子が上方制御される場合、標準偏差の２倍又は他の任意の正数を使用することができる。ＰＣＫ１、ＭＸＩ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、及びＣＡＴの場合である正常なＦＯＸＯ活性において遺伝子が上方制御される場合、閾値は、健康な試料における発現の平均から標準偏差の３倍引かれたものに設定される。次に、酸化ストレスによって上方制御される、及び、腫瘍抑制ＦＯＸＯ活性において上方制御される遺伝子に対して設定された閾値をそれぞれ超える又は下回る全ての発現に対してポイントを加えることによって、スコアが各試料に対して計算される。
【０１１１】
ここでは、正常な結腸試料として描かれた健康な結腸試料、アデノ（線がん）、及び結腸がんを有する結腸試料の公的に入手可能なデータセットＧＳＥ２０９１６を使用したこのスコアの結果が、表１に示されている全ての遺伝子及びプローブセットを使用して示されている。
【０１１２】
【表１】
2020503850.tif 000002
ＧＳＥ２０９１６において特定された各サブグループに対するスコアが図３において示されている。予想どおり、がん試料のスコアは、正常（健康）な試料よりも高く、これは、ＦＯＸＯ酸化ストレススコアが健康な結腸試料（グループ１〜４）におけるスコアよりも明らかに高いため、上述の遺伝子の発現レベルを使用して結腸がん試料（グループ７及び８）における腫瘍促進ＦＯＸＯ活性を検出することができるということを示している。対照的に、腺腫試料（グループ５及び６）の多くも、より高いＦＯＸＯ酸化ストレススコアによって明らかなように、正常な結腸組織と比較して高いＦＯＸＯ酸化ストレススコアを有している。
【０１１３】
図４は、特許文献１に記載のＦＯＸＯ活性モデルを使用して決定されたＦＯＸＯ活性を有したＧＳＥ２０９１６由来の試料のみに対するＦＯＸＯ酸化ストレススコアを描いている。この場合においても、結腸がん試料（グループ７及び８）が、正常又は健康な結腸試料（グループ１〜４）の大多数と比較して高いＦＯＸＯ酸化ストレススコアを有している。ここでも腺がん試料（グループ５）は正常な結腸試料と結腸がん試料の間にあるように思われるが、腺がん試料の３分の１だけが活性な正常ＦＯＸＯ  ＴＦ要素を有すると分かった。
【０１１４】
ＧＳＥ２０９１６由来の全ての試料に対して最も有益な酸化ストレス誘導ＦＯＸＯ標的遺伝子ＳＯＤ２、ＭＸＩ１、ＰＣＫ１、及びＢＮＩＰ３のみを使用することによって得られた結果が、図５において示されている。類似の挙動が観察されている。
【０１１５】
連続的尺度での実際の測定された遺伝子発現レベルに基づくこの離散スコアに替わるものとして、発現値の別の変換が提案される：
−  「ｚ−ｓｃｏｒｅ」、すなわち全ての試料にわたる平均が０で、標準偏差が１となるように調整される連続的発現レベル
−  「ファジー」、すなわち連続的発現レベルが、１／（１＋ｅｘｐ（（ｔｈｒ−ｅｘｐｒ）／ｓｅ））のシグモイド関数を使用して０から１の間の値に変換され、ｅｘｐｒは連続的発現レベルであり、ｔｈｒは上述の閾値であり、ｓｅは０から１の間の差に影響する軟化（ｓｏｆｔｅｎｉｎｇ）パラメータである。
【実施例２】
【０１１６】
特許文献１に記載のベイジアンネットワークを改善する例証的な実施形態
ＦＯＸＯ経路における酸化ストレスをモデル化する代替の方法として、特許文献１に記載のベイジアンネットワークを、酸化ストレス誘導ＦＯＸＯ活性を表す別のモジュールを含むように改善した。酸化ストレス状態を規定する余分なノードが含まれているという事実を除いて、ベイジアンネットワークの構造は同じままである。このノードはＯＸＩと呼ばれ、活性又は不活性の２つの状態を有する。図６は、酸化ストレスノードを加えることによって酸化ストレスを組み込んだＦＯＸＯモデル構造を概略的に示している。プローブセットを表すノードは、可読性の目的で示されておらず；表１は、ＢＮＩＰ３、ＳＯＤ２、ＭＸＩ１、及びＰＣＫ１に関連するプローブセットを示している。ＴＣ（転写複合体）ノードにのみ接続された標的遺伝子に関連するプローブセットは、この実施例では、特許文献１において記載されたものと同じ実施形態である。図６において見られるように、ＦＯＸＯ経路と酸化ストレスの間には有向エッジがある。これによって、不活性なＦＯＸＯ経路と同時に酸化ストレスを有することは可能ではないという知識を組み込むことが可能になる。
【０１１７】
先に記載したように、酸化ストレス誘導ＦＯＸＯ活性に対して最も有益な指標である４つの遺伝子（ＳＯＤ２、ＢＮＩＰ３、ＰＣＫ１、及びＭＸＩ１）がある。従って、ノードＯＸＩと遺伝子ＳＯＤ２、ＢＮＩＰ３、ＰＣＫ１、及びＭＸＩ１との間に、有向エッジが存在し得る。遺伝子ＳＯＤ２及びＢＮＩＰ３は、酸化ストレスがある場合にはより高い発現レベルを有し、これは、ＯＸＩからの有向エッジのみが存在し、ＴＣからの有向エッジは存在しない理由である。遺伝子ＰＣＫ１及びＭＸＩ１は、酸化ストレスＦＯＸＯによっても「正常な」ＦＯＸＯノードによっても影響される。従って、これらの遺伝子はＴＣノードからもＯＸＩノードからも有向エッジを有している。このモデルにおける遺伝子の残りは、ＦＯＸＯ経路のみによって影響され、そのため、ＴＣ状態と標的遺伝子の残りとの間にのみ有向エッジが存在する。ここでは、これら４つのＦＯＸＯ酸化ストレス遺伝子を有するベイジアンネットワークが示されているが、当業者はこれを容易に拡張して、残りの２つの遺伝子ＰＰＡＲＧＣ１Ａ及びＣＡＴも含めることができる。
【０１１８】
特許文献１において見られるように、ネットワークにおける全てのノードが、定量的推論を可能にするために、条件付き確率表（ＣＰＴ）によって定量化されなければならない。遺伝子のＣＰＴ及び表１に示されているプローブセットの較正は、酸化ストレスノードの追加によりわずかに変更される必要がある。特許文献１においては、プローブセットと標的遺伝子ノードの間のエッジのＣＰＴは、経路活性が既知である試料に対して較正されたが、ここでは、酸化ストレス誘導ＦＯＸＯ活性を有することが知られている試料も同様に使用する必要がある。その理由は、酸化ストレスによって影響される遺伝子の発現レベルを区別する必要があるからである。従って、酸化ストレスノードによって影響される遺伝子のプローブセットのみが、経路が不活性試料としてオフにすることが知られている試料、及び、活性のものとして酸化ストレスを有する試料を使用して較正される。ＰＣＫ１及びＭＸＩ１のプローブセットについては、ＦＯＸＯが活性であるが、酸化ストレスがＦＯＸＯ活性の原因ではない状況においてのみ活性である試料においてより高い発現レベルを有するという情報が使用される。従って、酸化ストレス誘導ＦＯＸＯ活性を有することが知られている試料が、これらのプローブセットに対する不活性試料として選ばれ、一方、正常な活性ＦＯＸＯ試料（酸化ストレスなし）が、これらのプローブセットに対する活性なものとして選ばれる。ＦＯＸＯ  ＴＣノードによって影響される遺伝子に属するプローブセットについては、較正のみが同じままである。ＴＣと、標的遺伝子及びＯＸＩ状態からのみエッジを有する遺伝子との間のＣＰＴは、特許文献１におけるものと同じである。ＴＣとＯＸＩの間の新たに定義されたＣＰＴが表２において示されている。この表は、ＴＣがない場合には酸化ストレスは起こりにくいという知識を反映しているが、本願におけるＴＣの場合には酸化ストレスに関する予備知識は入手可能ではない。ＴＣノードからもＯＸＩノードからも有向エッジを有する遺伝子について、別のＣＰＴを定義する必要がある。ＴＣもＯＸＩも２つの状態を有するため、４つの可能性の合計を組み合わせ、従って、この表は８つのエントリを有する。この場合ＰＣＫ１及びＭＸＩ１に対して定義されたこの表は、表３に示されている。
【０１１９】
【表２】
2020503850.tif 000003
【０１２０】
【表３】
2020503850.tif 000004
以下において、データセットＧＳＥ２０９１６からの試料が、そのようなベイジアンネットワークを較正するために使用される。このデータセットは、正常な試料、腺腫試料、腺がん試料、及び結腸がん試料を有する。実験的証拠から、正常な結腸試料においてＦＯＸＯ経路は活性であるが、酸化ストレスは存在しないことが示唆されるため、これらの試料はネットワークの較正を可能にする。本発明者等は、試料ＧＳＭ５２３２９０、ＧＳＭ５２３３１４、ＧＳＭ５２３２８９、及びＧＳＭ５２３３１０を、これらの正常な結腸試料は、特許文献１のＦＯＸＯモデルによって最も活性であると予測されるため選んだ。選んだ酸化ストレス状態ＦＯＸＯ較正試料は、特許文献１のＦＯＸＯモデルによって最も活性であると予測される結腸がん試料：ＧＳＭ５２３３３１、ＧＳＭ５２３３０３、ＧＳＭ５２３３４４、及びＧＳＭ５２３３２３である。最後に、不活性なＦＯＸＯ経路を有する試料が必要とされる。これらの試料：ＧＳＭ５２３３７２、ＧＳＭ５２３３１３、ＧＳＭ５２３３３２、及びＧＳＭ５２３２８３は、特許文献１のＦＯＸＯモデルによって予測されるように、最も不活性ながんであるとして選ばれる。
【０１２１】
図７において、記載されるモデルを、データセットＧＳＥ２０９１６において試験した。このセットにおける各試料について、ＦＯＸＯ経路が活性である確率、ＴＣノードの確率、及び、ＦＯＸＯ経路が酸化ストレス状態にある確率、すなわちＯＸＩノードの確率を計算した。黒い点として示されているほぼ全ての正常な結腸試料は、酸化ストレスを伴わない活性なＦＯＸＯ経路を有すると予測され、これは予想と一致している。腺がん、特に結腸がん試料は、正常な試料と比較してＦＯＸＯ活性と酸化ストレス誘導活性との著しく異なる組み合わせを示している。これは、酸化ストレス活性から正常なＦＯＸＯ活性を区別することが可能であるということを示している。
【０１２２】
これらの結果は、上述のＦＯＸＯ標的遺伝子、ＰＣＫ１、ＭＸＩ１、ＳＯＤ２、及びＢＮＩＰ３が、酸化ストレス誘導活性を示し、言い換えれば、ＦＯＸＯ経路の腫瘍抑制又は腫瘍促進活性を示すということを実証し、そのようなベイジアンネットワークにおいて、ＦＯＸＯ経路の腫瘍抑制、又は、腫瘍促進性であり得る酸化ストレス関連活性をより良く検出することができると解釈することができる。これは、ＦＯＸＯ経路の酸化ストレス誘導活性を示すＦＯＸＯ標的遺伝子のサブセットのノードに依存するＯＸＩノードの付加、並びに、「正常な」ＦＯＸＯ活性結果のノードが、先行技術において言及又は示唆されなかったため、新規の発明的な技術的実施可能性である。
【０１２３】
本明細書において提示される方法は、例えば、ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の（異常な）活性の診断、推測されたＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の活性に基づく予後診断、推測されたＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の活性に基づく臨床試験における医療対象の登録、行われることになる後の１つ又は複数の試験の選択、コンパニオン診断試験の選択、又は臨床決定支援システム等において使用されてもよい。この点について、より詳細に記載する特許文献２（“Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｕｓｉｎｇ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”）、及び、特許文献３（“Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｕｓｉｎｇ  ｌｉｎｅａｒ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ（ｓ）  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ”）が参照される。
【実施例３】
【０１２４】
酸化ストレスを示す遺伝子の選択
異なる組織起源について、ＦＯＸＯ３モデルによって評価された活性ＦＯＸＯ３スコアを有するがん組織と、モデルに従って活性ＦＯＸＯ３スコアを有する対応する正常な組織との間の酸化ストレス関連遺伝子の差次的なｍＲＮＡ発現を決定した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイ（ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０  Ａｒｒａｙ）上で遺伝子特異的プローブセットによって測定された遺伝子発現レベルを、公開ＧＥＯデータセットから得て、そのようなデータセットからのより多くの組織試料にわたって平均した。その後、非悪性の正常な組織由来の酸化ストレス関連遺伝子ＢＮＩＰ３、ＭＸＩ１、ＰＣＫ１、ＰＰＡＲＧＧＣ１、ＳＯＤ２に対する平均ｍＲＮＡ発現レベルを、同じ組織起源由来のがん組織試料又は非がん状態において測定された同じｍＲＮＡのそれぞれの平均レベルから差し引いた。例えば、ＳＯＤ２遺伝子（２つのプローブセット、２１５２２３＿ｓ及び２１６８４１＿ｓ）に対する正常な肺の平均発現レベルを、いくつかの異なる肺がんサブタイプの平均発現レベルから差し引いた。それぞれの遺伝子の各プローブセットについて、差し引かれた組織試料のタイプが表４の左に示され、差し引かれた平均ｍＲＮＡ発現レベルが、右の各遺伝子シンボルの下に示されている。ボックス内の数は差次的な発現のレベルを示し、正の値は、差し引くことで正の結果が得られたことを示し；負のレベルは負の結果を示している。非悪性の状態の結腸腺腫（Ａ）、バレット食道（Ｃ）、及び類内膜子宮内膜（ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｏｉｄ  ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｕｍ）（Ｅ）において、酸化ストレス関連遺伝子は過剰発現しなかった。対照的に、ほとんどのがんタイプ（Ａ−Ｄ、Ｆ−Ｈ）では、酸化ストレス関連遺伝子は、対応する正常な組織と比較して過剰発現される。類似の差し引きの結果が、ＦＯＸＯ３及びＥＳＲ発現レベルについても示されており、これらの転写因子レベルが差次的に発現されなかったことを示している。正常な結腸、結腸腺腫、及び結腸がんからの試料を有するＧＥＯデータセット（Ａ）をリードセットで使用して、酸化ストレス関連遺伝子を発見した。他のＧＥＯデータセット（Ｂ−Ｈ）は、非結腸関連がんタイプ及び非悪性状態における酸化ストレス遺伝子パネルを検証するために提示されている。
【０１２５】
【表４−１】
2020503850.tif 000005
【表４−２】
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【表４−３】
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【表４−４】
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【表４−５】
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【表４−６】
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【表４−７】
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【表４−８】
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【実施例４】
【０１２６】
ＦＯＸＯ活性の２つの機能的状態を区別するためのＳＯＤ２の使用
ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路は、一般的に、がんでは過剰活性化される。腫瘍は、ＰＩ３Ｋ経路阻害剤に対して感受性がある可能性があるが、機能的ＰＩ３Ｋ活性を評価する信頼できる診断テストは欠乏している。ＰＩ３Ｋ経路はＦＯＸＯ転写因子を負に調節するため、ＦＯＸＯ標的遺伝子発現は、ＰＩ３Ｋ活性と逆に相関する。ＦＯＸＯ標的遺伝子ｍＲＮＡレベルを使用したがん組織試料におけるＰＩ３Ｋ活性を推測する知識ベースのベイジアン計算モデルを開発した。様々ながん細胞株において、ＰＩ３Ｋ阻害剤の添加がＦＯＸＯ活性の増加を引き起こし、ＰＩ３Ｋ経路活性の減少を確信させるということをこのモデルを用いて観察した。組織試料において、ＦＯＸＯ活性は、異なる高悪性度の多数のがんタイプにおいて活性であると予測された。細胞酸化ストレスは、がん、及び、ＰＩ３Ｋ経路活性と関連していることが多くあるＦＯＸＯの代替のアクチベーターと関連している。ＳＯＤ２は、ＦＯＸＯ活性化の２つのモード間で差次的に発現することが分かった。健康な組織のＳＯＤ２発現に対する閾値レベルを定義し、閾値を超えると、ＦＯＸＯ活性は酸化ストレス誘導であると考えた。ゆっくりと増殖するＬｕｍｉｎａｌＡ型乳がん及び低いグリーソンの前立腺がんでは、ＦＯＸＯは、典型的には、ＰＩ３Ｋ介在性の様式で活性であり、不活性なＰＩ３Ｋ経路を示した。より高悪性度のＬｕｍｉｎａｌＢ型、ＨＥＲ２型、及びｂａｓａｌ−ｌｉｋｅ型の乳がんでは、ＦＯＸＯは頻繁に、不活性であるか又は酸化ストレスにより誘導されて活性であると分かり、ＰＩ３Ｋ経路活性の可能性が高いことを示した。決定木は、がん試料におけるＰＩ３Ｋ経路活性の評価を容易にする。このｍＲＮＡベースのＦＯＸＯモデルは、ＥｒｂＢ−ＰＩ３Ｋ経路標的薬物の応答予測に使用することができる。
【０１２７】
過去１０年間、がんの全身治療は、従来の化学療法から、個々の患者ベースで選ばれる腫瘍の形質を標的とする薬物の投与へと移行した。この「精密医療」のアプローチは、標的薬物に対する応答を確実に予測するバイオマーカーを要求する（１）。がんの増殖及び転移は、起源のがん細胞タイプとは比較的無関係であるおよそ１０から１２の細胞シグナル伝達経路によって駆動される（２〜４）。そのうちの１つであるＰＩ３Ｋ経路は、主要な細胞増殖因子シグナル伝達経路の１つであり、受容体チロシンキナーゼ増幅、ＰＴＥＮの減少、ＰＩＫ３ＣＡにおける活性化突然変異のようなゲノム変化の結果として、又は、がん細胞の微小環境からの刺激によって、がんにおいて過剰活性化されることが多くある（２）。ＰＩ３Ｋ経路阻害剤は、単独で又は他の標的戦略又は従来の化学療法との併用で、がん治療において使用される（５〜７）。ＰＩ３Ｋ経路突然変異解析に基づく潜在的に応答性の患者の選択にもかかわらず、患者の亜集団のみが薬物に十分に応答する（８，９）。薬物応答の予測を改善し、治療有効性又は現れる抵抗性をモニターするために、機能的ＰＩ３Ｋ活性を測定する試験が必要とされる。
【０１２８】
これまで、経路特異的な転写因子の標的遺伝子ｍＲＮＡレベルを測定することに基づく、がん組織試料におけるシグナル伝達経路活性を評価するための知識ベースの計算アプローチが記述されていた（１０，１１）。現在では、ＦＯＸＯとＰＩ３Ｋ経路活性とのよく知られた逆相関に基づきフォークヘッドボックスＯ（ＦＯＸＯ）転写因子誘導転写を読み出しとして使用する、ＰＩ３Ｋ経路活性の定量的評価のためのｍＲＮＡベースの診断法の開発が報告されている（１２−１６）。このモデルは、ＰＩ３Ｋ経路阻害剤で処理したか又はドキシサイクリン誘導性活性ＦＯＸＯ３構築物を担持する乳がん細胞株及び肺がん細胞株を使用して生物学的に検証された。
【０１２９】
がん組織では、ＦＯＸＯは或いは細胞酸化ストレスによって活性化することができ、これは、ＰＩ３Ｋ経路活性との逆相関に干渉するがんにおける共通の形質である。ＳＯＤ２／ＭｎＳＯＤ  ＦＯＸＯ標的遺伝子レベルを使用して、ＦＯＸＯ活性の２つの機能的状態を区別し、個々の患者のがん試料におけるＰＩ３Ｋ経路活性を評価するための頑強なアプローチを結果として得た。
【０１３０】
方法
ＦＯＸＯ３活性に対する細胞培養ベースのモデル系
ＭＣＦ７及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳がん細胞株を、１０％  ＦＢＳ（Ｌｏｎｚａ）１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００マイクログラム／ｍｌストレプトマイシン（Ｌｏｎｚａ）を含有するＤＭＥＭ−Ｆ１２において培養した。ポリエチレンイミンを使用してＨＥＫ２９３Ｔ細胞に第三世代パッケージングベクターを遺伝子導入すると、レンチウイルス粒子が生成される（１７）。ＭＣＦ７及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、ｐＩＮＤＵＣＥＲ２０−ＦＯＸＯ３．Ａ３を有するレンチウイルスで安定に形質導入し、恒常的活性型のＦＯＸＯ３（ＦＯＸＯ３．Ａ３）のドキシサイクリン誘導発現を可能にした（１３，１８，１９）。細胞を２０％  ＦＢＳ又は１０Ｍ  ＰＩ３Ｋ阻害剤ＬＹ２９４００２（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）で１６時間処理して、それぞれ内在性ＰＩ３Ｋ経路を活性化及び不活性化した。ＦＯＸＯ３．Ａ３発現を、１０ｎｇ／ｍｌのドキシサイクリンで１６時間処理することによって誘導した。
【０１３１】
ＲＮＡ単離及びＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイハイブリダイゼーション
処理した細胞を、指示されたそれぞれのインキュベーションの１６時間後に回収し、ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して単離し、ＳｅｒｖｉｃｅＸＳ（ＧｅｎｏｍｅＳｃａｎ，Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅｓｃａｎ．ｎｌ）及びＥｕｒｏｆｉｎｓ  ＡＲＯＳ  Ｄｅｎｍａｒｋ（ｈｔｔｐ：／／ａｒｏｓａｂ．ｃｏｍ／）によってＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＴ  ＨＧ−Ｕ１３３＋ＰＭ  Ａｒｒａｙ  Ｐｌａｔｅ上でハイブリダイズした。
【０１３２】
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘに対する品質管理
本研究のために行った実験だけでなく、公開ＧＥＯデータベース由来のデータセットの両方からの全てのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイデータについて、広範な品質管理を行った。使用した全てのマイクロアレイは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ１３３Ｐｌｕｓ２．０又はＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ１３３＋ＰＭマイクロアレイからのものであり、これらは、「ランダム効果」サマライゼーション（ｓｕｍｍａｒｉｚａｔｉｏｎ）を用いてｆＲＭＡで処理されている（２３）。原則として、一部のマイナーな再選択があるにもかかわらず、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ１３３＋ＰＭプラットフォームは、ＨＧ−Ｕ１３３Ｐｌｕｓ２．０プラットフォームのパーフェクトマッチ（ｐｅｒｆｅｃｔ  ｍａｔｃｈ）プローブ全てを有する。いずれのマイクロアレイタイプからの処理されたデータも比較できるようにするために、共有プローブのみを有するチップ説明ファイルを使用し、このサブセットの処理パラメータをＨＧ−Ｕ１３３Ｐｌｕｓ２．０  ｆｒｍａｖｅｃｓから取り出して、いずれのプラットフォームからのデータも処理した。
【０１３３】
マイクロアレイ試料の品質管理は、いくつかの品質チェックを使用して行われてきた。これらのチェックには、全てのＰＭプローブの強度の平均値、負又は極端な（＞１６ビット）強度値、ポリＡ  ＲＮＡ（試料調製ｓｐｉｋｅ−ｉｎｓ）及び標識されたｃＲＮＡ（ハイブリダイゼーションｓｐｉｋｅ−ｉｎｓ）対照、ＡＣＴＢ及びＧＡＰＤＨの３′／５′比、ａｆｆｙＱＣＲｅｐｏｒｔパッケージによって決定される正及び負の境界対照（ｂｏｒｄｅｒ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ）の値及び強度中心、並びに、ａｆｆｙパッケージからＡｆｆｙＲＮＡｄｅｇ関数によって決定されるＲＮＡ分解値が含まれる。品質基準を満たさない乳がんデータセット及び結腸がんのデータセットからの試料は、さらなる分析から除外した。
【０１３４】
表５は、使用されたデータセット、及び、現れる図を示している。
【０１３５】
【表５】
2020503850.tif 000013
ウエスタンブロット法
ウエスタンブロット解析を、標準的な６〜１５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して行った。タンパク質を、ＦＯＸＯ３（Ｈ１４４，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）に対して一次ウサギ抗体（１：２０００）を用いて検出した。ブロットを、ＨＲＰ結合二次抗体と共に４℃で１６時間インキュベートした。タンパク質を、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＬＡＳ  ４０００スキャナー（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して高感度の化学発光（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて可視化した。
【０１３６】
免疫蛍光法及び免疫組織化学
免疫蛍光染色のために、細胞を、カバーガラス上で増殖させ、４％パラホルムアルデヒドを使用して固定し、２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び０．１％正常ヤギ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を有するＰＢＳでブロックした。細胞を、ＦＯＸＯ３抗体（Ｆｏｘｏ３Ａ  Ｒａｂｂｉｔ  ＭＡｂ，１：５００  ＣＳＴ−７５Ｄ８）、二次Ａｌｅｘａ５６３結合抗体、及びＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ）と共にインキュベートした。スライドを、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ７１０共焦点顕微鏡で画像化した。
【０１３７】
ＦＯＸＯ３免疫組織化学染色のために、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料の４μｍ切片を脱パラフィンし、再水和した。内在性ペルオキシダーゼ活性を遮断した後、抗原回収を、９５〜９６℃の水浴中ｐＨ９．０のＴＥ緩衝液（Ｄａｋｏ）を用いて２５分間行った。少なくとも１５分間冷却し、ＰＢＳを用いた洗浄ステップの後、試料を、ＰＢＳ中１％  ＢＳＡで１５分間ブロックした。次に、切片を、ＦＯＸＯ３抗体（１：５０，ＣＳＴ−７５Ｄ８）と共に室温で１時間インキュベートした。可視化を、Ｄａｋｏ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎ＋ＴＭ−Ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ−ＨＲＰ（ＤＡＢ）を使用して達成した。対比染色として、Ｇｉｌｌ’ｓ  ２  Ｈｅａｍａｔｏｘｉｌｉｎが使用される。画像を、３Ｄ  Ｈｉｓｔｅｃｈスキャナーで生成した。負の対照は、一次抗体を加えることなく類似の染色手順を受けた切片で構成した。正の対照として、非悪性の扁桃組織が使用される。
【０１３８】
ＦＯＸＯ活性を予測するための計算モデルの開発
ＦＯＸＯ転写活性に対する計算モデルの開発は、上述のように、確率的ベイジアンネットワーク推測に基づいている（１１）。
【０１３９】
シグナル伝達経路モデリングアプローチは、確率的ベイジアンネットワーク推測を使用して、その標的遺伝子の発現プロファイルから経路活性を推測することに基づいている。これまでは、そのようなモデルは、Ｗｎｔ経路及びＥＲ経路の機能的活性を決定するために開発された。ベイジアンネットワークは、上述したように、ＭＡＴＬＡＢのためのＢａｙｅｓ  Ｎｅｔ  Ｔｏｏｌｂｏｘを使用して構築された。モデリングアプローチの基礎として使用されるベイジアンネットワーク構造（図８Ａ）は、３種類のノード：（ａ）転写複合体、（ｂ）標的遺伝子、及び（ｃ）標的遺伝子に対応するマイクロアレイプローブセットを含む細胞シグナル伝達経路の転写プログラムの簡易モデルである。このモデルは、（ｉ）標的遺伝子の発現が転写複合体の活性化にどのように依存しているか、及び（ｉｉ）順に、プローブセットの強度がそれぞれの標的遺伝子の発現にどのように依存しているかについて記述している。
【０１４０】
新しい実験試料に対する定量的推論を可能にするために、実験データを使用してベイジアンネットワークモデルにおける確率的関係を定量的にした。標的遺伝子とそれぞれのプローブセットとの関係を記述するパラメータ（ｉｉ）を、ＦＯＸＯ３活性訓練試料として使用される４−ＯＨＴで１２時間刺激して活性のＦＯＸＯ転写プログラムをもたらした、及び、ＦＯＸＯ３不活性訓練試料として使用される刺激無しのＦＯＸＯ３．Ａ３．ＥＲ構築物の安定の遺伝子導入を行って、ＨＵＶＥＣ細胞株において訓練した（公開データはＧＳＥ１６５７３で入手可能）（２０）。ＰＩ３Ｋ経路では、活性である経路の活性スコアは、活性な転写状態にあるＦＯＸＯ３転写因子の確率とは逆に調整される。転写複合体と標的遺伝子との関係を強化するパラメータ（ｉ）は、異なる組織タイプにわたるモデルの一般化挙動を改善するために、別の箇所で述べたように手動で設定した（１１）。
【０１４１】
モデルが較正されると、底層における観察としてプローブセットの測定値を入力し、モデルにおいてＦＯＸＯ３転写因子の活性確率を後ろから推測することによって、新しい腫瘍試料のマイクロアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ１３３Ｐｌｕｓ２．０）データにおいて使用することができる。モデルをフリーズし、観察としてプローブセットの測定値をモデルに入力し、ＦＯＸＯ転写因子のオッズｐ／（１−ｐ）のｌｏｇ−２値としてＦＯＸＯ転写因子活性スコアを後ろから推測することによって、細胞株及び組織試料のマイクロアレイデータに適用した。試料は、経路活性が０を上回る活性スコアを超え、経路が活性である１対１を超えるオッズと一致する場合、ＦＯＸＯ活性として分類され、活性スコアが０を下回る場合には不活性として分類される。
【０１４２】
ＦＯＸＯ転写複合体と標的遺伝子との関係を強化するパラメータを手動で設定して、異なる組織タイプにわたるモデルの一般化挙動を改善した（１１）。標的遺伝子とそのそれぞれのプローブセットとの関係を記述するパラメータを、誘導性恒常的活性のＦＯＸＯ３．Ａ３−ＥＲを有するヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の公開データセットにおいて較正し、ＦＯＸＯ活性に対する閾値を設定した（ＧＳＥ１６５７３）（２０）。モデルをフリーズし、観察としてプローブセットの測定値をモデルに入力し、ＦＯＸＯ転写因子のオッズｐ／（１−ｐ）のｌｏｇ−２値としてＦＯＸＯ転写因子活性スコアを後ろから推測することによって、細胞株及び組織試料のマイクロアレイデータに適用した。検証の目的で、ＦＯＸＯ活性分析を、記述された実験及び公開ＧＥＯデータセットからの、（特に他に明記しない限り）独立したｆＲＭＡで前処理したＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ１３３Ｐｌｕｓ２．０マイクロアレイデータに対して常に行った。
【０１４３】
ＦＯＸＯ３Ａに対する直接標的遺伝子の同定
最適なパフォーマンスのために、多数の異なる組織タイプにわたって、数学的モデルはＦＯＸＯ転写因子の直接標的遺伝子を有するべきである。残念ながら、ＫＥＧＧ（ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｋｅｇｇ）及びＢｉｏｃａｒｔａ（ｗｗｗ．ｂｉｏｃａｒｔａ．ｃｏｍ）等の経路データベースは不完全であり、この点において一貫性がない（２３）。従って、標的遺伝子は、プロモーター領域エンハンサーモチーフ分析、転写因子結合実験（ＥＭＳＡ及びＣｈＩＰ）、遺伝子プロモータールシフェラーゼレポーター実験、及び差次的ｍＲＮＡ発現解析を含む、それぞれの転写複合体の直接標的遺伝子である個々の遺伝子毎に広範な科学的証拠に基づき手動で選択した。ＦＯＸＯ標的遺伝子に対してＰｕｂＭｅｄを使用してＭＥＤＬＩＮＥデータベースから検索した入手可能な文献を広範に評価した。加えて、ＦＯＸＯファミリーメンバーのうち１つ又は複数によって転写的に制御される、信頼できる証拠の多数の供給源を有した遺伝子のみを選択することによってＴｈｏｍｓｏｎ−Ｒｅｕｔｅｒｓ’Ｍｅｔａｃｏｒｅから標的遺伝子を抽出した。最終的に、標的遺伝子を、先に述べたものと類似の方法論を使用して文献の証拠に従って順位付けした（１１）。ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｏｓ  ａｎｄ  Ｃｏｆｆｅｒ（２４）によって発表されたリストにも含まれている最高位の標的遺伝子のみを、「本物の」標的遺伝子として選択した。
【０１４４】
酸化ストレスに関連するＳＯＤ２レベル
健康な組織のＦＯＸＯ活性試料と腫瘍組織のＦＯＸＯ活性試料との個々のＦＯＸＯ標的遺伝子発現レベルの差を調査するために、健康な組織試料、及び、対応する前悪性又は悪性の腫瘍組織試料由来の公的に入手可能であるマイクロアレイデータセットを使用した（表７）。
【０１４５】
表７は、計算ＦＯＸＯモデルによってＦＯＸＯ活性としてスコア付けされた試料における、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイにおいて指示されたプローブセットによって測定した、２つのＦＯＸＯ３標的遺伝子であるＳＯＤ２及びＢＮＩＰ３の平均発現レベル（イタリック体の標準偏差）を示している。ＧＥＯデータセットの数は表に示されている。Ａ．試料は、５．６を超える（ＦＯＸＯモデルに従い）ＦＯＸＯ３活性確率スコア（０．９８を超える確率）に基づきＧＥＯ試料セットから選択され；Ｂ．試料は、０を超える（ＦＯＸＯモデルに従い）ＦＯＸＯ３活性確率スコアに基づきＧＥＯ試料セットから選択される。
【０１４６】
マイクロアレイ上の異なる遺伝子特異的プローブセットに対して測定したｌｏｇ２スケールにおける正規化強度は、遺伝子発現レベルを反映する。ＦＯＸＯ標的遺伝子発現レベルを、ＦＯＸＯ活性腫瘍の試料と健康な組織試料との間で比較した。
【０１４７】
酸化ストレスの非存在下でのＳＯＤ２発現レベルにおける変動を確立するために、健康で正常な組織の異なるタイプに対して、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＳＯＤ２プローブセット値について平均＋２ＳＤを測定した。ＳＯＤ２  ｍＲＮＡレベルがこれらの閾値レベルを超えるＦＯＸＯ活性試料においては、ＦＯＸＯは酸化ストレス誘発性であると考えられた。
【０１４８】
Ｐｅｒｏｕに従った公開データセットからの乳がん試料の細分類
全ての乳がん試料の内在性乳がんのサブタイプを、Ｐａｒｋｅｒ及び共同研究者によって記述された方法に従ってマイクロアレイデータから決定した（２１，２２）。Ｐａｒｋｅｒ及び共同研究者によって記述された方法論（２１）及びＰｒｏｓｉｇｎａ  Ｐａｃｋｅｔ  Ｉｎｓｅｒｔ（ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ｎａｎｏＳｔｒｉｎｇ．Ｐａｃｋａｇｅ  Ｉｎｓｅｒｔ  Ｐｒｏｓｉｇｎａ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  Ａｓｓａｙ．ｓ．１．：ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｓｉｇｎａ．ｃｏｍ／ｄｏｃｓ／Ｐｒｏｓｉｇｎａ＿Ｐａｃｋｅｔ＿Ｉｎｓｅｒｔ＿ＵＳ．ｐｄｆ，２０１５）を使用して、内在性サブタイプをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイデータから測定した。ＰＡＭ５０に含まれる全５０の遺伝子のｆＲＭＡ正規化遺伝子発現を、ＰＡＭ５０遺伝子に関連するプローブセットを使用してマイクロアレイデータから抽出した。２つ以上のプローブセットが単一の遺伝子と関連している場合に、最も高いバリアンスを有するプローブセットを選択した。ＬｕｍｉｎａｌＡ型、ＬｕｍｉｎａｌＢ型、ＨＥＲ２濃縮型、ｂａｓａｌ−ｌｉｋｅ及びｎｏｒｍａｌ−ｌｉｋｅに対する重心を、所与のサブタイプを有するＧＳＥ２１６５３由来の試料を使用して計算した。次に、これらの重心とのピアソンの相関係数を、全ての試料について計算した。各試料を、最も高い相関を有するサブタイプに割り当てた。
【０１４９】
結果
ＰＩ３Ｋ−ＦＯＸＯ活性に対する計算モデルの開発
組織試料における２６のＦＯＸＯ標的遺伝子ｍＲＮＡレベルから、ＦＯＸＯ転写活性を推測するＦＯＸＯ活性に対するベイジアンネットワークベースの計算モデルを作成した（図８Ａ）。１つの標的遺伝子のｍＲＮＡレベルから転写因子活性を推測することは十分に特異的ではないけれども、典型的には２０から３０の多くの標的遺伝子の発現レベルから活性を推測することは、関連する転写因子活性を定量化するための非常に特異的な方法であると思われる。最適なパフォーマンスのために、多数の異なる組織タイプにわたって、直接標的遺伝子が選択される。ＫＥＧＧ（ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｋｅｇｇ）及びＢｉｏｃａｒｔａ（ｗｗｗ．ｂｉｏｃａｒｔａ．ｃｏｍ）等の経路データベースはこの点において一貫性がないため（２３）、遺伝子は、文献（ＰｕｂＭｅｄ）からの科学的証拠及びＴｈｏｍｓｏｎ−Ｒｅｕｔｅｒｓ’Ｍｅｔａｃｏｒｅに基づき手動で選択し、先に記載したものと類似の方法論を使用してランク付けした（１１）。計算的ＦＯＸＯ経路モデルを構築するために、最高位の順位の遺伝子を選択した（１６，２４）（表６）。誘導性ＦＯＸＯ活性を有するＨＵＶＥＣが、非形質転換の設定におけるＦＯＸＯ活性状態に対する「ｇｒｏｕｎｄ  ｔｒｕｔｈ」の証拠を提供し、モデルのフリーズに先立ちモデルを較正するために使用した（図８Ｂ）。
【０１５０】
ベイジアンモデルの予測は、独立した試料データを含む完全なＨＵＶＥＣデータセットにおける既知の実験的ＦＯＸＯ活性状態と一致している（図８Ｂ）。ＨＵＶＥＣ、４ＯＨＴで処理したＨＵＶＥＣ、及びＨＵＶＥＣ−ＦＯＸＯ３．Ａ３−ＥＲは、増殖細胞において予想されるように、低いＦＯＸＯ活性、従って活性なＰＩ３Ｋシグナル伝達を有すると予測された。４ＯＨＴで処理したＨＵＶＥＣ−ＦＯＸＯ３．Ａ３−ＥＲは、恒常的に活性なＦＯＸＯ３．Ａ３の誘導と一致して、非常に活性なＦＯＸＯを有すると予測される。ＤＮＡ結合能力が低下したＦＯＸＯ３の変異体のバージョンであるＦＯＸＯ３．Ａ３−ＥＲ−Ｈ２１２Ｒを発現するＨＵＶＥＣでは、このモデルは、ＦＯＸＯが未処理細胞では不活性であり、４ＯＨＴで処理した細胞ではＦＯＸＯ３活性が低いことを予測した（２０）。これらの観察は、このモデルがＦＯＸＯによって誘導される転写変化を特異的に検出し、低いレベルのＦＯＸＯ活性に感受性であることを確信させている。
【０１５１】
乳がん細胞株におけるＰＩ３Ｋ−ＦＯＸＯモデルの生物学的検証
較正に続いて、このモデルを、独立した乳がん細胞株において生物学的に検証した。ＥＲ陽性、ＰＩＫ３ＣＡＥ５４５Ｋ変異体ＭＣＦ７、及びトリプルネガティブＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、ドキシサイクリン誘導性ＦＯＸＯ３．Ａ３発現ベクターを用いて安定に形質導入し、ドキシサイクリンで１６時間処理することによって、ＦＯＸＯ３タンパク質発現及び転写活性の迅速且つ制御された誘導を可能にした（図９Ａ）。ＦＯＸＯ３タンパク質を、未処理の細胞及び２０％  ＦＢＳ刺激細胞中の細胞質において主に検出し；ドキシサイクリン、ＰＩ３Ｋ阻害剤ＬＹ２９４００２、及びＬＹ２９４００２と組み合わせたドキシサイクリンで処理した細胞において優性の核局在化に切り替えた。これは、ＦＯＸＯ３の核移行が、この実験的細胞培養系において制御された様式で誘導されたということを示している。この細胞モデルからのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ｍＲＮＡ発現データにおいて、ＦＯＸＯモデルは、未処理（ＰＩ３Ｋ経路活性）における低いＦＯＸＯ活性、及びドキシサイクリン処理（ＰＩ３Ｋ経路不活性）ＭＣＦ−ＦＯＸＯ３．Ａ３及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＦＯＸＯ３．Ａ３細胞における高いＦＯＸＯ活性；２０％ＦＢＳ処理したＭＣＦ７細胞（ＰＩ３Ｋ経路活性）における低いＦＯＸＯ活性、及びドキシサイクリン、ＬＹ２９４００２、及び組み合わされたドキシサイクリン＋ＬＹ２９４００２処理細胞（全てＰＩ３Ｋ経路不活性）における高い活性をそれぞれ予測した（図９Ｂ／Ｃ）。これらの結果を合わせると、計算的ＦＯＸＯモデルは独立したがん細胞株試料において予想されるようにＦＯＸＯ活性を予測したことを確信させる。
【０１５２】
薬物に対する応答を予測及びモニターするための経路モデルの使用
ＦＯＸＯ活性は細胞株においてＰＩ３Ｋ活性と逆に相関するということを前提として、ＦＯＸＯモデルが独立したがん細胞株データセット（ＧＳＥ５１２１２、ＧＳＥ３０５１６）における受容体チロシンキナーゼ活性を標的とする薬物に対する応答を予測する能力を有するかどうかを調査した。ＦＯＸＯ３活性を、エルロチニブ（ＥＧＦＲ阻害剤）、セルメチニブ（ＭＥＫ阻害剤）、又はＢＥＺ２３５（ＰＩ３Ｋ／ＴＯＲ二重阻害剤）で処理したＥＧＦＲ変異体ＨＣＣ８２７肺がん細胞株においてスコア化した。ＦＯＸＯは、未処理の試料において不活性であるとスコア化し、活性なＰＩ３Ｋ経路を示し；３つの薬物のうちいずれかで処理することによって、ＦＯＸＯは活性であるとスコア化し、ＥＧＦＲ阻害剤で最大となり、３つの薬物全てがＰＩ３Ｋ経路の活性を直接的及び／又は間接的に遮断することにおいて効果的であることを確信させた（図１０Ａ）。トリプルネガティブ（ＢＴ２０）、ＥＲ陽性（ＭＣＦ７）、及びＨＥＲ２陽性乳がん（ＭＤＡ−ＭＢ−４５３）を表す３つの乳がん細胞株において、ＦＯＸＯ活性スコアは、エルロチニブで処理した場合に予想通り増加した（図１０Ｂ）。
【０１５３】
健康な結腸及び結腸直腸がん組織の試料におけるＦＯＸＯ活性
患者組織試料において使用した場合のモデルの評価のために、多くの選択された公開データセットを使用した。第一に、ＦＯＸＯ活性モデルを、３２の正常な結腸組織及び３２の腺腫組織の患者生検から得た組織試料（ＧＳＥ８６７１）に適用した。ＦＯＸＯ活性スコアにおける明らかな差を、健康な結腸と腺腫組織との間で観察し、ＦＯＸＯはそれぞれ活性及び不活性であることが示され、結腸腺腫におけるＰＩ３Ｋ経路の活性化が予想されることが示された（図１１Ａ）。
【０１５４】
第二に、ＦＯＸＯモデルを、正常な結腸、良性の結腸腺腫、及び結腸がんの組織を有する患者組織セット（ＧＳＥ２０９１６）に適用した（図１１Ｂ）。正常な結腸組織試料では、ＦＯＸＯは活性であると予測された。大部分の腺腫組織試料では、第１のデータセットにおける知見と一致して、ＦＯＸＯは不活性であると予測され、ＰＩ３Ｋ経路の活性が示された。しかし、結腸がん組織試料の半分では、ＦＯＸＯは活性であると予測された。結腸がんは結腸腺腫から生じると考えられるため、少なくともＰＩ３Ｋ経路活性の頻度は同じであると予想された。
【０１５５】
このように、約３分の１までのがん組織試料において、高いＦＯＸＯ活性スコアが、不活性なＰＩ３Ｋ経路を示すと予想される。残りのＦＯＸＯ活性がん試料においては、ＦＯＸＯ活性が高い別の原因が存在する可能性があり、その１つは、ＦＯＸＯが一般的に活性である健康な細胞の混合である。これを調査するために、組織試料における細胞質及び核のＦＯＸＯ３局在化を決定するためのＦＯＸＯ３免疫組織化学（ＩＨＣ）染色法を開発した。公開データセットＧＳＥ２０９１６（ではあるが同じ試料ではない）において見られるｍＲＮＡベースのＦＯＸＯ活性スコアと一致して、ＦＯＸＯ３は、健康な結腸陰窩細胞では主に細胞質内で見つかったが、健康な粘膜細胞及び他の非腫瘍の健康な細胞では核内に存在していた（図１１Ｂ／Ｃ）。これらの結果は、正常な細胞の混合が偽陽性のＦＯＸＯスコアを引き起こす可能性を示唆している。結腸がん細胞は、核の領域及び細胞質染色を伴う他の領域と共に不均一なＦＯＸＯ３局在化を明示的に表示したけれども、結腸腺腫細胞では、ＦＯＸＯ３は細胞質局在化を示した。
【０１５６】
高悪性度のがん組織において存在する可能性があるＦＯＸＯ活性に対する別のよく記載された原因は、細胞酸化ストレスである（１２，２５）。しかし、正常組織におけるＦＯＸＯ活性の機能は、酸化ストレス中の機能とは明らかに異なり、従って、転写される標的遺伝子の差に反映される可能性がある。
【０１５７】
使用されるＦＯＸＯ標的遺伝子セット内のどの遺伝子が、正常な試料及びがん試料におけるＦＯＸＯ活性を最も良く識別するかを決定するために、標的遺伝子発現レベルを、ＦＯＸＯがモデルにより活性であると予測された正常な結腸組織試料と結腸がん組織試料との間で比較した。ＳＯＤ２及びＢＮＩＰ３遺伝子発現は、正常な結腸組織と比較してＦＯＸＯ活性がん組織試料において非常に増加した（表７）。どちらの遺伝子も酸化ストレスに応答して役割を果たし、これらの状況下でＦＯＸＯによって転写されるため、それらを、ＦＯＸＯ活性の２つのモードを区別する再有力候補にしている（２６，２７）。
【０１５８】
実際に、様々なＦＯＸＯ活性の正常な組織と、対応する前悪性又は悪性の腫瘍組織試料（結腸がん、乳がん、バレット食道、食道がん、膀胱がん、及びグリオーマ）との間でＳＯＤ２及びＢＮＩＰの遺伝子発現レベルを比較することによって、高悪性度のがんタイプ由来のＦＯＸＯ活性試料においてＳＯＤ２の発現レベルの増加、及び、比較的程度は低いがＢＮＩＰ３の発現レベルの増加が確信させられた（表７）。著しく対照的に、２つの良性過剰増殖状態である結腸腺腫及びバレット食道のＦＯＸＯ活性試料において、ＦＯＸＯ活性はＳＯＤ２及びＢＮＩＰ３発現の増加と関連せず、これらの良性腫瘍において、ＦＯＸＯは健康な組織に匹敵するＰＩ３Ｋにより制御される様式で活性化されたことを示した。ＳＯＤ２は、ＦＯＸＯ活性の正常な組織試料と、対応するＦＯＸＯ活性のがんタイプとの間で最も一般化され且つ顕著な差次的発現を示したため、この遺伝子を、ＦＯＸＯ活性の２つのモードを区別する最も信頼できるパラメータとして選択した。ＰＩ３Ｋにより制御される（非酸化ストレス）ＦＯＸＯ活性に対するＳＯＤ２上限閾値レベルを、正常な組織における平均発現レベルを超える２つの標準偏差として定義し、健康な結腸、乳房及び前立腺の組織について計算した。
【０１５９】
その後、ＳＯＤ２発現閾値と組み合わせたＦＯＸＯモデルを、結腸がん、乳がん、及び前立腺がんを有する個々の患者からのデータを有する独立した公的に入手可能なデータセットに適用した。ＳＯＤ２発現が上昇したＦＯＸＯ活性試料では、ＰＩ３Ｋ経路活性は、ＦＯＸＯ活性から直接推測することはできない。また、モデルによってＦＯＸＯが不活性であるとスコア化された場合、ＦＯＸＯ発現に関する知識が、ＰＩ３Ｋ活性に関する結論のために要求される。ＦＯＸＯ３は、がんにおいて最も関連性のあるＦＯＸＯ遺伝子と考えられており、乳房、結腸、前立腺、脳、膀胱、及び食道由来のものを含む、現在まで分析された全てのがんタイプ由来の全ての試料において一貫して発現された（表７）。
【０１６０】
原発性結腸腺腫及びがんの組織試料におけるＦＯＸＯ活性モード（基準又は酸化ストレス）の予測
健康な結腸組織試料の大きなセット（ｎ＝１２１）の分析によって、ＦＯＸＯ活性試料における正常なＳＯＤ２  ｍＲＮＡレベルに対する閾値の設定が可能となった（図１２Ａ）。その後、患者の結腸腺腫及びがんの試料のデータの拡張された独立したセットを収集し、ＦＯＸＯ活性及びＳＯＤ２発現レベルを決定した。正常な結腸試料では、ＦＯＸＯ活性試料の２．６％のみが閾値レベルを超えるＳＯＤ２発現を有した。ＦＯＸＯ活性であった少数の腺腫試料（ｎ＝１２、１６％）では、ＳＯＤ２レベルが半分に（閾値を超えて）上昇した。がん試料では、試料の３分の１がＦＯＸＯ活性であるとスコア化され、そのうち５３．９％がＳＯＤ２発現の上昇を伴っていた。
【０１６１】
原発性乳がん組織試料におけるＦＯＸＯ活性モード（基準対酸化ストレス）の予測
同様に、乳がん患者から収集したデータのセットを分析した。ＦＯＸＯ活性分析に先立ち、ＰＡＭ５０アルゴリズムを使用して全てのがんデータセットにおいて乳がん腫瘍の細分類を行い、全てのデータセットにおけるサブタイプが同様に決定されていることを確実にした（２１）。健康な結腸組織における所見と一致して、ＦＯＸＯは正常な乳房組織において一般的に活性であると予測された（８５％）（図１２Ｂ）。ＬｕｍｉｎａｌＢ、ＨＥＲ２、及びｂａｓａｌ−ｌｉｋｅのサブタイプでは、それぞれ３７％、２３％、及び２０％がＦＯＸＯに対して低くスコア化され、ＰＩ３Ｋ経路活性を示している。ＳＯＤ２の（健康な乳がんでは閾値を超える）上昇に伴い増加するＦＯＸＯ活性試料の割合を、がんのサブタイプの高悪性度の増加と共に観察し：ＬｕｍｉｎａｌＡ型における４．７％からｂａｓａｌ−ｌｉｋｅの乳がんにおける７１．４％までであった。
【０１６２】
原発性前立腺がん試料におけるＦＯＸＯ活性モード（基準対酸化ストレス）の予測
収集された公開患者データセットからの正常な前立腺組織及び原発性前立腺がんの試料において、ＦＯＸＯ活性分析によって、ＦＯＸＯはより低いグリーソンスコアの腫瘍（グリーソン４〜７）を有する患者の９１％において活性であることが示された。高いグリーソンスコア（グリーソン８〜９）を有する患者の試料は少な過ぎて、いかなる比較による結論を導くにも利用可能ではなかった（図１２Ｃ）。興味深いことに、ＦＯＸＯ活性の原発性前立腺がん試料のいずれにおいても、ＳＯＤ２の発現は、正常組織に対して設定された閾値レベルを超えて増加せず、前立腺がんに対して、ＰＩ３Ｋ経路活性はＦＯＸＯ活性スコアから安全に推測することができるということを示している。原発性前立腺がん試料の大部分において、ＰＩ３Ｋ経路は不活性であった。
【０１６３】
活性なＰＩ３Ｋ経路を有する腫瘍の同定
組織試料における機能的ＰＩ３Ｋ経路活性の推測を容易にするために、（１）ＦＯＸＯは、試料由来のがん細胞において発現されるという前提、及び（２）測定されたＦＯＸＯ活性は、がん細胞に由来するという前提に基づき、簡易化された決定木を作成した（図１３Ｂ）。ＰＩ３Ｋ経路は、活性のＦＯＸＯ−酸化ストレスの場合に活性であると仮定すると、各調査したがんタイプに対して、これらの試料を、不活性のＦＯＸＯ（活性のＰＩ３Ｋ経路を示す）を有する試料の数に加えて（図１２、ＦＯＸＯ活性の黒い点）、活性のＰＩ３Ｋ経路を有する腫瘍を有する可能性がある患者の総数／割合を計算することができる（図１２、アスタリスクと共に表において示されている）。このように計算したＰＩ３Ｋ経路活性試料の割合は、正常な組織（結腸、乳房、前立腺）では８から１３％であり、ＬｕｍｉｎａｌＡ型及び正常様乳がん、並びに、低いグリーソンスコアの前立腺がんにおいて非常に類似していた（それぞれ１３％、１５％、１５％）。ＬｕｍｉｎａｌＢ、ＨＥＲ２、及びｂａｓａｌ−ｌｉｋｅ乳がんでは、ＰＩ３Ｋ経路活性を有する試料の割合は、それぞれ４５％、４５％、及び７６％とはるかに高く；結腸腺腫及びがんでは、ほぼ全ての試料がＰＩ３Ｋ経路活性としてスコア化された（それぞれ試料の９２％及び８５％）。
【０１６４】
考察
ＦＯＸＯ及びＰＩ３Ｋの活性を予測するための知識ベースのベイジアンモデル
ＰＩ３Ｋ経路は、がんにおける重要な増殖及び生存の経路であり、ＥｒｂＢ増殖因子シグナル伝達機構の中心的なシグナル伝達部分である。多くの標的薬物は、ＰＩ３Ｋ経路における多数の部位でのＰＩ３Ｋ経路活性を遮断することを目的としている。ＰＩ３Ｋ経路阻害剤に対する応答率を改善することは、がん試料におけるＰＩ３Ｋ経路活性を確実に評価する試験が必要とされる。ＦＯＸＯ転写因子は、ＰＩ３Ｋ経路によって負に制御され、原則としてＰＩ３Ｋ経路活性に対する逆の読み出しとして使用することができる（５，１２，２８）。がん組織試料におけるＰＩ３Ｋ経路活性を測定するために、ＦＯＸＯ転写活性を、手元の組織試料において測定されることになる確立されたＦＯＸＯ標的遺伝子ｍＲＮＡ発現レベルから推測する、計算的な知識ベースのベイジアンネットワークを開発した（１１）。異なるＦＯＸＯメンバーが冗長であり、ＦＯＸＯ１、ＦＯＸＯ３、及びＦＯＸＯ４誘導遺伝子制御の比較分析は、各ＦＯＸＯメンバーの転写特性間の大きな重複を示している（１６，２４，２９）。従って、直接ＦＯＸＯ標的遺伝子の制御に関する知識を組み込んだＦＯＸＯ活性モデルは、一般的なＦＯＸＯ活性予測因子として機能する。
【０１６５】
ＦＯＸＯ誘導性ＨＵＶＥＣにおいてこのベイジアンモデルを較正することは、恒常的に活性のＦＯＸＯ３を有するか又はＰＩ３Ｋ経路標的薬物と共にインキュベートした乳がん細胞株において予想されるようにＦＯＸＯ活性を予測する計算ＦＯＸＯモデルをもたらした。異所性ＦＯＸＯ活性化と比較して、ＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２で処理した細胞ではＦＯＸＯの活性はより少ないとスコア化されるというＭＣＦ７細胞における観察は、異所性発現によって誘導されるより高いＦＯＸＯ３タンパク質レベルによって、及び／又は、ＬＹ２９４００２で処理した場合の正の増殖因子シグナル伝達フィードバックの結果として容易に説明される。ＰＩ３Ｋ経路の薬理学的阻害は、がん細胞における薬物耐性発生の主要な要素を構成する増殖因子シグナル伝達を再建することができる増殖因子フィードバック応答を開始させ得る（６，７，３０）。ＭＣＦ７細胞とは対照的に、未処理のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞では、一部の核のＦＯＸＯタンパク質を検出した。しかし、ＦＯＸＯ活性モデルは、この急速に分裂する細胞株において予想されるように、このＦＯＸＯを転写的に不活性であるとしてスコア化した。従って、ＦＯＸＯの核内存在は、転写活性を推測するために常に使用することができるというものではない。
【０１６６】
３つの乳がん細胞株、並びに、突然変異した過剰活性のＥＧＦＲを有する肺がん細胞において、このモデルは、ＥＧＦＲ阻害剤であるエルロチニブによるＰＩ３Ｋ経路活性の効果的な阻害と関連するＦＯＸＯ活性の増加を同定した。加えて、二重ｍＴＯＲ‐ＰＩ３Ｋ阻害剤（ＢＥＺ２３５）及びＭＥＫ１／２阻害剤（セルメチニブ）を用いた肺がん細胞株の処理も、同様にＦＯＸＯ活性を増加させ、従って、推測されるＰＩ３Ｋ経路活性を減少させた。増殖因子受容体のＥｒｂＢファミリー（ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４）によって開始されるシグナル伝達は、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ及びＲＡＳ−ＭＥＫ−ＥＲＫ−ＭＤＭ２を介したＦＯＸＯの不活性化をもたらす（３１）。
【０１６７】
このように、ベイジアンモデルは、ＰＩ３Ｋ経路活性化に対するこれらの細胞培養ベースのモデルにおいてＦＯＸＯ及びＰＩ３Ｋの活性を頑強に予測し、このモデルの生物学的検証を提供した。しかし、ＥＧＦＲの下流のシグナル伝達経路の異なる要素を標的とする３つの薬物に対する肺がん細胞株の応答における差は、標的薬物に関して最適な選択を行うために、さらなる解析（例えば、ゲノム突然変異解析等）が、ＰＩ３Ｋ経路活性の根底にある原因を確立するためには必要であり得るということを例示している。
【０１６８】
組織試料におけるＦＯＸＯ活性を予測する計算モデル
このモデルを組織材料に適用してＰＩ３Ｋ活性を推測することは、より困難であることが分かった。種々の組織タイプ（結腸、乳房、前立腺、食道、膀胱、脳）由来の健康な組織試料において、ＦＯＸＯは、予想通り、活性であるとスコア化された。結腸腺腫試料では、ＦＯＸＯ活性は減少することが多くあり、ＰＩ３Ｋ経路は活性であると推測され、細胞分裂の制御におけるＦＯＸＯの役割が再び強調された。この状況において、増殖因子により誘導されるＰＩ３Ｋ経路の活性化は、分裂促進的なシグナル伝達を開始させ、ＦＯＸＯ転写活性を遮断する（１２，３２，３３，３４）。
【０１６９】
ＦＯＸＯ活性を制御する異なる機構の区別
がんでは、ＦＯＸＯが活性であり得る状況はより複雑になる。ＰＩ３Ｋ経路が活性化されることが多くある結腸がんにおいても、ＬｕｍｉｎａｌＢ、ＨＥＲ２、及びｂａｓａｌ−ｌｉｋｅの乳がんサブタイプにおいても、試料の大部分は、活性のＦＯＸＯ転写因子を有すると予測された（２，３５）。これは、ＰＩ３Ｋ経路活性を推測するためのＦＯＸＯ活性状態の単純な逆転が、全てのがん組織試料において有効でないことを示唆した。細胞分裂の制御と関連する基準のＦＯＸＯ活性と、増殖因子／ＰＩ３Ｋ活性により誘導される細胞増殖の存在下でのＦＯＸＯ活性との間の差別化要因が必要であった。
【０１７０】
腫瘍抑制因子と考えられているけれども、ＦＯＸＯは、細胞恒常性の制御因子としても機能し、ＤＮＡ損傷、高いレベルの活性酸素種、及び低い栄養素の利用可能性を含む、様々な有害な細胞条件に応答する（１２，３６，３７）。実際に、ＦＯＸＯはＲＯＳから細胞を保護するために酸化ストレスを介した別の様式で活性化され得るため、がん試料では、活性のＰＩ３Ｋ経路が活性のＦＯＸＯ転写と組み合わせて存在し得る（図１３Ａ）。そのような酸化ストレス状態は、低酸素で急速に増殖するがん組織における高頻度の現象である（１２，３８〜４０）。
【０１７１】
ＦＯＸＯは翻訳後修飾を受けて、その転写機能を異なる細胞内条件に適応させる（４１）。ＦＯＸＯの２つの非常に異なる機能的役割は、ＦＯＸＯ標的ｍＲＮＡ発現プロファイルにおける変化に反映されると仮定した。ＢＮＩＰ３及びＳＯＤ２は、計算モデルによって使用され、この毒性状態の結果から細胞を保護するために細胞酸化ストレスの存在下で誘導されることが知られている２つのＦＯＸＯ３標的遺伝子である（２６，２７，４２）。実際に、ＳＯＤ２の高発現も、ＢＮＩＰ３の高発現も、ＦＯＸＯ活性の健康な組織及び良性の過剰増殖性結腸腺腫とは対照的に、多数のＦＯＸＯ活性がん試料と対応する健康な組織試料との間でＦＯＸＯ標的遺伝子発現レベルを比較することによって見出された。これらの結果は、増殖因子シグナル伝達と並行して酸化ストレスが、急速に増殖するがん組織においてＦＯＸＯ活性を代替の経路によって誘導し得るという概念を支持している。２つの遺伝子のうち、ＳＯＤ２発現は、健康な組織と比較した場合、多数のがんタイプからのＦＯＸＯ活性試料において普遍的に上昇しているようであった。基準のＦＯＸＯ活性と酸化ストレス関連ＦＯＸＯ活性との区別を可能にするために、健康な組織におけるＳＯＤ２発現に対する閾値レベルを定義した。この情報をＦＯＸＯモデルに加えることによって、様々なタイプのがんにおけるＰＩ３Ｋ経路活性を推測する信頼性が改善される。
【０１７２】
高悪性度の挙動及び予後に関して明確に定義された乳がん及び前立腺がんのサブタイプにこのルールを適用することによって、初期の臨床検証が可能となった。実際に、ＦＯＸＯ活性スコアにＳＯＤ２発現レベルに関する情報を加えることによって、ＬｕｍｉｎａｌＡ型乳がんにおけるＦＯＸＯ活性及びより低いグリーソンスコアの前立腺がんは、一般に、基準のＦＯＸＯ活性として分類され、推測された不活性のＰＩ３Ｋ経路を伴う。実際に、これらのがんのタイプは、典型的には、より分化され、ゆっくり増殖し、活性のＨＥＲ２−ＰＩ３Ｋ経路の非存在下でＥＲ経路によって駆動される。対照的に、より高悪性度の挙動を有する乳がんサブタイプ、すなわちＬｕｍｉｎａｌＢ型、ＨＥＲ２型、及びｂａｓａｌ−ｌｉｋｅ型では、ＦＯＸＯに対して不活性である（活性のＰＩ３Ｋ経路を示す）か、又は、ＦＯＸＯ活性が増えている試料は、ＦＯＸＯ酸化ストレス活性として分類される。要約すると、高分化のゆっくり増殖する乳がん及び前立腺がんでは、ＦＯＸＯは、一般的に、細胞分裂を制御するために基準のモードで活性であり、より高悪性度のがんでは、ＦＯＸＯは、ＰＩ３Ｋ経路の活性化によって不活性化されたか、又は、酸化ストレスモードで活性であった。興味深いことに、酸化ストレス関連のＦＯＸＯの活性は、通常は細胞死につながる酸化ストレス損傷から細胞を保護することによっても、増殖因子ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ経路を刺激することによっても腫瘍増殖を支持するように実際には機能し得る（４３）。
【０１７３】
個々のがん組織試料におけるＰＩ３Ｋ経路活性を同定するための計算ＦＯＸＯモデルの使用
計算モデルの使用は、個々のがん組織試料における機能的ＰＩ３Ｋ経路活性を評価して、例えばＨＥＲ２−ＰＩ３Ｋ及びＥＧＦＲ経路等のＥｒｂＢ増殖因子シグナル伝達経路に向けられた標的薬物の選択に関する決定を裏付ける、及び／又は、応答をモニターし、さらに、選ばれた薬物に対して現れる耐性を検出することである。ＦＯＸＯ計算モデルを使用して、ＦＯＸＯ活性のモードを示す酸化ストレスＳＯＤ２遺伝子マーカーと組み合わせてＦＯＸＯ活性を評価することによって、ＰＩ３Ｋ経路が活性である可能性を、（いくぶん簡易化された）決定木を使用して高度に特定された遺伝子発現データから得ることができる（図１３Ｂ）。ＦＯＸＯが活性であるとスコア化された場合、ＰＩ３Ｋにより制御されたＦＯＸＯ活性対酸化ストレスにより誘導されたＦＯＸＯ活性を決めるために、ＳＯＤ２の発現レベルが解釈される。ＦＯＸＯ活性が酸化ストレスによって引き起こされる場合、ＰＩ３Ｋ経路の活性に関する根底にある情報は隠されており、公式にはＰＩ３Ｋ経路の活性に関する決定を下すことはできない。しかし、細胞酸化ストレス関連ＦＯＸＯ活性は、悪性度の高いがんにおいて増殖因子経路活性と同時に発生することが（常にそうではない場合）多くある（４，３８）。従って、ＦＯＸＯ活性／ＳＯＤ２高値の存在下では、ＰＩ３Ｋ経路が活性である可能性が高い。ＦＯＸＯ不活性又はＦＯＸＯ活性酸化ストレスであるとしてスコア化された試料を合せると、ＰＩ３Ｋ経路阻害剤の処理の恩恵を受けたと思われるＰＩ３Ｋ活性腫瘍を有する各がんサブタイプグループ内の患者の総数の指標が提供された。低い悪性度のＬｕｍｉｎａｌＡ型及びより低いグリーソンスコアの前立腺がんのグループでは、このように計算したＰＩ３Ｋ活性腫瘍の割合は、健康な組織において見られるもの（約１０％）に近かったが、より高悪性度の乳がんでは、これは、ｂａｓａｌ−ｌｉｋｅ型乳がんのグループにおいて３／４まで増加した。実際に、ＰＩ３Ｋ経路は、おそらくがんにおいて最も頻繁に活性化される経路である。
【０１７４】
組織試料においてＦＯＸＯが活性であると予測され、ＳＯＤ２の発現レベルが正常範囲内にある場合、がん試料の健康な組織細胞による汚染によってＦＯＸＯ活性が引き起こされたことを除外するために、補完的なＩＨＣ染色が必要であり得る。このことを考慮に入れると、ＦＯＸＯモデルは、腫瘍試料における機能的ＰＩ３Ｋ経路活性を決定するための頑強な方法を提供する。異常なＰＩ３Ｋ経路活性の突然変異性の原因を同定するための標的ゲノム解析は、活性なＰＩ３Ｋ経路が推測された患者に限定することができる。このアプローチにより、治療効率の増加を目的とするＥｒｂＢ  ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ｍＴＯＲ経路を標的とする薬物の使用に関する決断が改善されることが予想され、さらに、多くの異なる腫瘍タイプに適用可能であることが予想される。例えば、ネオアジュバント又は「治療機会」の設定における治療反応及び耐性のモニタリングは、医薬品開発中の薬物応答の定量的評価と同様に、別の構想される応用である。
【０１７５】
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４０．ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ  ＭＣ，  ｖａｎ  Ｇｏｇｈ  ＩＪ，  Ｓｍｉｔｓ  ＡＭ，  ｖａｎ  Ｔｒｉｅｓｔ  Ｍ，  Ｄａｎｓｅｎ  ＴＢ，  Ｖｉｓｓｃｈｅｒ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  ｓｍａｌｌ  ＧＴＰａｓｅ  ＲＡＬＡ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｋｉｎａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＦＯＸＯ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ＪＩＰ１  ｓｃａｆｆｏｌｄ  ｃｏｍｐｌｅｘ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２０１３；２８８（３０）：２１７２９−４１．
４１．Ｃａｌｎａｎ  ＤＲ，  Ｂｒｕｎｅｔ  Ａ．  Ｔｈｅ  ＦｏｘＯ  ｃｏｄｅ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２００８；２７（１６）：２２７６−８８．
４２．Ｌｉｎ  Ａ，  Ｙａｏ  Ｊ，  Ｚｈｕａｎｇ  Ｌ，  Ｗａｎｇ  Ｄ，  Ｈａｎ  Ｊ，  Ｌａｍ  ＥＷ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  ＦｏｘＯ−ＢＮＩＰ３  ａｘｉｓ  ｅｘｅｒｔｓ  ａ  ｕｎｉｑｕｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍＴＯＲＣ１  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｕｎｄｅｒ  ｅｎｅｒｇｙ  ｓｔｒｅｓｓ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２０１４；３３（２４）：３１８３−９４．
４３．Ｃｏｏｍａｎｓ  ｄｅ  Ｂｒａｃｈｅｎｅ  Ａ，  Ｄｅｍｏｕｌｉｎ  ＪＢ．  ＦＯＸＯ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ２０１６；７３（６）：１１５９−７２．
【０１７６】
【表６−１】
2020503850.tif 000014
【表６−２】
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【０１７７】
【表７−１】
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【表７−２】
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【表７−３】
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【表７−４】
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【表７−５】
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【表７−６】
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【０１７８】
配列表：
配列番号：          遺伝子：
Ｓｅｑ．  １        ＡＧＲＰ
Ｓｅｑ．  ２        ＡＴＧ１４
Ｓｅｑ．  ３        ＡＴＰ８Ａ１
Ｓｅｑ．  ４        ＢＣＬ２Ｌ１１
Ｓｅｑ．  ５        ＢＣＬ６
Ｓｅｑ．  ６        ＢＩＲＣ５
Ｓｅｑ．  ７        ＢＮＩＰ３
Ｓｅｑ．  ８        ＢＴＧ１
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Ｓｅｑ．  １０      ＣＡＴ
Ｓｅｑ．  １１      ＣＡＶ１
Ｓｅｑ．  １２      ＣＢＬＢ
Ｓｅｑ．  １３      ＣＣＮＤ１
Ｓｅｑ．  １４      ＣＣＮＤ２
Ｓｅｑ．  １５      ＣＣＮＧ２
Ｓｅｑ．  １６      ＣＤＫＮ１Ａ
Ｓｅｑ．  １７      ＣＤＫＮ１Ｂ
Ｓｅｑ．  １８      ＤＤＢ１
Ｓｅｑ．  １９      ＤＹＲＫ２
Ｓｅｑ．  ２０      ＥＲＢＢ３
Ｓｅｑ．  ２１      ＥＲＥＧ
Ｓｅｑ．  ２２      ＥＳＲ１
Ｓｅｑ．  ２３      ＥＸＴ１
Ｓｅｑ．  ２４      ＦＡＳＬＧ
Ｓｅｑ．  ２５      ＦＢＸＯ３２
Ｓｅｑ．  ２６      ＦＧＦＲ２
Ｓｅｑ．  ２７      ＧＡＤＤ４５Ａ
Ｓｅｑ．  ２８      ＩＧＦ１Ｒ
Ｓｅｑ．  ２９      ＩＧＦＢＰ１
Ｓｅｑ．  ３０      ＩＧＦＢＰ３
Ｓｅｑ．  ３１      ＩＮＳＲ
Ｓｅｑ．  ３２      ＫＬＦ２
Ｓｅｑ．  ３３      ＫＬＦ４
Ｓｅｑ．  ３４      ＬＧＭＮ
Ｓｅｑ．  ３５      ＭＸＩ１
Ｓｅｑ．  ３６      ＭＹＯＤ１
Ｓｅｑ．  ３７      ＮＯＳ３
Ｓｅｑ．  ３８      ＰＣＫ１
Ｓｅｑ．  ３９      ＰＤＫ４
Ｓｅｑ．  ４０      ＰＯＭＣ
Ｓｅｑ．  ４１      ＰＰＡＲＧＣ１Ａ
Ｓｅｑ．  ４２      ＰＰＭ１Ｄ
Ｓｅｑ．  ４３      ＰＲＤＸ３
Ｓｅｑ．  ４４      ＲＡＧ１
Ｓｅｑ．  ４５      ＲＡＧ２
Ｓｅｑ．  ４６      ＲＢＬ２
Ｓｅｑ．  ４７      ＳＥＭＡ３Ｃ
Ｓｅｑ．  ４８      ＳＥＰＰ１
Ｓｅｑ．  ４９      ＳＥＳＮ１
Ｓｅｑ．  ５０      ＳＩＲＴ１
Ｓｅｑ．  ５１      ＳＬＣ５Ａ３
Ｓｅｑ．  ５２      ＳＭＡＤ４
Ｓｅｑ．  ５３      ＳＯＤ２
Ｓｅｑ．  ５４      ＳＴＫ１１
Ｓｅｑ．  ５５      ＴＬＥ４
Ｓｅｑ．  ５６      ＴＮＦＳＦ１０
Ｓｅｑ．  ５７      ＴＸＮＩＰ
【図１】
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【図２】
2020503850.tif 000023
【図３】
2020503850.tif 000024
【図４】
2020503850.tif 000025
【図５】
2020503850.tif 000026
【図６】
2020503850.tif 000027
【図７】
2020503850.tif 000028
【図８】
2020503850.tif 000029
【図９】
2020503850.tif 000030
【図１０Ａ】
2020503850.tif 000031
【図１０Ｂ】
2020503850.tif 000032
【図１１】
2020503850.tif 000033
【図１２Ａ】
2020503850.tif 000034
【図１２Ｂ】
2020503850.tif 000035
【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
2020503850.tif 000037
【図１３Ｂ】
2020503850.tif 000038
【配列表】
2020503850000001.app
【国際調査報告】
2020503850.tif 000039
2020503850.tif 000040
2020503850.tif 000041
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2020503850.tif 000043
2020503850.tif 000044
2020503850.tif 000045