(57)【要約】本明細書では、トランスフェリン受容体に結合するポリペプチド、かかるポリペプチドを含むＦｃ二量体及び融合タンパク質、ならびにかかるポリペプチドを使用して組成物をトランスフェリン受容体発現細胞にターゲティングする方法が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランスフェリン受容体に特異的に結合するポリペプチドであって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３、８４、１９１、４３、及び８２のうちのいずれか１つの配列との少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含み、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に１５３位にＧｌｕ、１５７位にＴｙｒまたはＰｈｅ、１５９位にＴｈｒ、１６０位にＧｌｕ、１６１位にＴｒｐ、１６２位にＶａｌ、Ｓｅｒ、またはＡｌａ、１６３位にＡｓｎ、１８６位にＴｈｒまたはＳｅｒ、１８８位にＧｌｕ、１８９位にＧｌｕ、及び１９４位にＰｈｅを含む、前記ポリペプチド。
【請求項２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に１３９位にＴｒｐを更に含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に７位にＡｌａ、８位にＡｌａ、及び１３９位にＴｒｐを更に含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に７位にＡｌａ、８位にＡｌａ、１３９位にＴｒｐ、２０１位にＬｅｕ、及び２０７位にＳｅｒを更に含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に１３９位にＳｅｒ、１４１位にＡｌａ、及び１８０位にＶａｌを更に含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に７位にＡｌａ、８位にＡｌａ、１３９位にＳｅｒ、１４１位にＡｌａ、及び１８０位にＶａｌを更に含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に７位にＡｌａ、８位にＡｌａ、１３９位にＳｅｒ、１４１位にＡｌａ、１８０位にＶａｌ、２０１位にＬｅｕ、及び２０７位にＳｅｒを更に含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３の配列との少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含み、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に１５３位にＧｌｕ、１５７位にＴｙｒ、１５９位にＴｈｒ、１６０位にＧｌｕ、１６１位にＴｒｐ、１６２位にＶａｌ、１６３位にＡｓｎ、１８６位にＴｈｒ、１８８位にＧｌｕ、１８９位にＧｌｕ、及び１９４位にＰｈｅを含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に１３９位にＴｒｐを更に含む、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３の配列を含む、請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に７位にＡｌａ、８位にＡｌａ、及び１３９位にＴｒｐを更に含む、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３４の配列を含む、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に７位にＡｌａ、８位にＡｌａ、１３９位にＴｒｐ、２０１位にＬｅｕ、及び２０７位にＳｅｒを更に含む、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６０の配列を含む、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に１３９位にＳｅｒ、１４１位にＡｌａ、及び１８０位にＶａｌを更に含む、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３９の配列を含む、請求項１５に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に７位にＡｌａ、８位にＡｌａ、１３９位にＳｅｒ、１４１位にＡｌａ、及び１８０位にＶａｌを更に含む、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４０の配列を含む、請求項１７に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に７位にＡｌａ、８位にＡｌａ、１３９位にＳｅｒ、１４１位にＡｌａ、１８０位にＶａｌ、２０１位にＬｅｕ、及び２０７位にＳｅｒを更に含む、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６３の配列を含む、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４の配列との少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含み、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に１５３位にＧｌｕ、１５７位にＴｙｒ、１５９位にＴｈｒ、１６０位にＧｌｕ、１６１位にＴｒｐ、１６２位にＳｅｒ、１６３位にＡｓｎ、１８６位にＳｅｒ、１８８位にＧｌｕ、１８９位にＧｌｕ、及び１９４位にＰｈｅを含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に１３９位にＴｒｐを更に含む、請求項２１に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４５の配列を含む、請求項２２に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に７位にＡｌａ、８位にＡｌａ、及び１３９位にＴｒｐを更に含む、請求項２１に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４６の配列を含む、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に７位にＡｌａ、８位にＡｌａ、１３９位にＴｒｐ、２０１位にＬｅｕ、及び２０７位にＳｅｒを更に含む、請求項２１に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６７の配列を含む、請求項２６に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に１３９位にＳｅｒ、１４１位にＡｌａ、及び１８０位にＶａｌを更に含む、請求項２１に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５１の配列を含む、請求項２８に記載のポリペプチド。
【請求項３０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に７位にＡｌａ、８位にＡｌａ、１３９位にＳｅｒ、１４１位にＡｌａ、及び１８０位にＶａｌを更に含む、請求項２１に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５２の配列を含む、請求項３０に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に７位にＡｌａ、８位にＡｌａ、１３９位にＳｅｒ、１４１位にＡｌａ、１８０位にＶａｌ、２０１位にＬｅｕ、及び２０７位にＳｅｒを更に含む、請求項２１に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７０の配列を含む、請求項３２に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９１の配列との少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含み、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に１５３位にＧｌｕ、１５７位にＰｈｅ、１５９位にＴｈｒ、１６０位にＧｌｕ、１６１位にＴｒｐ、１６２位にＳｅｒ、１６３位にＡｓｎ、１８６位にＳｅｒ、１８８位にＧｌｕ、１８９位にＧｌｕ、及び１９４位にＰｈｅを含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に１３９位にＴｒｐを更に含む、請求項３４に記載のポリペプチド。
【請求項３６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３２の配列を含む、請求項３５に記載のポリペプチド。
【請求項３７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に７位にＡｌａ、８位にＡｌａ、及び１３９位にＴｒｐを更に含む、請求項３４に記載のポリペプチド。
【請求項３８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３３の配列を含む、請求項３７に記載のポリペプチド。
【請求項３９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に７位にＡｌａ、８位にＡｌａ、１３９位にＴｒｐ、２０１位にＬｅｕ、及び２０７位にＳｅｒを更に含む、請求項３４に記載のポリペプチド。
【請求項４０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０９の配列を含む、請求項３９に記載のポリペプチド。
【請求項４１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に１３９位にＳｅｒ、１４１位にＡｌａ、及び１８０位にＶａｌを更に含む、請求項３４に記載のポリペプチド。
【請求項４２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３８の配列を含む、請求項４１に記載のポリペプチド。
【請求項４３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に７位にＡｌａ、８位にＡｌａ、１３９位にＳｅｒ、１４１位にＡｌａ、及び１８０位にＶａｌを更に含む、請求項３４に記載のポリペプチド。
【請求項４４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３９の配列を含む、請求項４３に記載のポリペプチド。
【請求項４５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に７位にＡｌａ、８位にＡｌａ、１３９位にＳｅｒ、１４１位にＡｌａ、１８０位にＶａｌ、２０１位にＬｅｕ、及び２０７位にＳｅｒを更に含む、請求項３４に記載のポリペプチド。
【請求項４６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１２の配列を含む、請求項４５に記載のポリペプチド。
【請求項４７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３の配列との少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含み、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に１５３位にＧｌｕ、１５７位にＴｙｒ、１５９位にＴｈｒ、１６０位にＧｌｕ、１６１位にＴｒｐ、１６２位にＳｅｒ、１６３位にＡｓｎ、１８６位にＴｈｒ、１８８位にＧｌｕ、１８９位にＧｌｕ、及び１９４位にＰｈｅを含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に１３９位にＴｒｐを更に含む、請求項４７に記載のポリペプチド。
【請求項４９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６９の配列を含む、請求項４８に記載のポリペプチド。
【請求項５０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に７位にＡｌａ、８位にＡｌａ、及び１３９位にＴｒｐを更に含む、請求項４７に記載のポリペプチド。
【請求項５１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７０の配列を含む、請求項５０に記載のポリペプチド。
【請求項５２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に７位にＡｌａ、８位にＡｌａ、１３９位にＴｒｐ、２０１位にＬｅｕ、及び２０７位にＳｅｒを更に含む、請求項４７に記載のポリペプチド。
【請求項５３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８１の配列を含む、請求項５２に記載のポリペプチド。
【請求項５４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に１３９位にＳｅｒ、１４１位にＡｌａ、及び１８０位にＶａｌを更に含む、請求項４７に記載のポリペプチド。
【請求項５５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７５の配列を含む、請求項５４に記載のポリペプチド。
【請求項５６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に７位にＡｌａ、８位にＡｌａ、１３９位にＳｅｒ、１４１位にＡｌａ、及び１８０位にＶａｌを更に含む、請求項４７に記載のポリペプチド。
【請求項５７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７６の配列を含む、請求項５６に記載のポリペプチド。
【請求項５８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に７位にＡｌａ、８位にＡｌａ、１３９位にＳｅｒ、１４１位にＡｌａ、１８０位にＶａｌ、２０１位にＬｅｕ、及び２０７位にＳｅｒを更に含む、請求項４７に記載のポリペプチド。
【請求項５９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８４の配列を含む、請求項５８に記載のポリペプチド。
【請求項６０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８２の配列との少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含み、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に１５３位にＧｌｕ、１５７位にＴｙｒ、１５９位にＴｈｒ、１６０位にＧｌｕ、１６１位にＴｒｐ、１６２位にＡｌａ、１６３位にＡｓｎ、１８６位にＴｈｒ、１８８位にＧｌｕ、１８９位にＧｌｕ、及び１９４位にＰｈｅを含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に１３９位にＴｒｐを更に含む、請求項６０に記載のポリペプチド。
【請求項６２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２１の配列を含む、請求項６１に記載のポリペプチド。
【請求項６３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に７位にＡｌａ、８位にＡｌａ、及び１３９位にＴｒｐを更に含む、請求項６０に記載のポリペプチド。
【請求項６４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２２の配列を含む、請求項６３に記載のポリペプチド。
【請求項６５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に７位にＡｌａ、８位にＡｌａ、１３９位にＴｒｐ、２０１位にＬｅｕ、及び２０７位にＳｅｒを更に含む、請求項６０に記載のポリペプチド。
【請求項６６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５３の配列を含む、請求項６５に記載のポリペプチド。
【請求項６７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に１３９位にＳｅｒ、１４１位にＡｌａ、及び１８０位にＶａｌを更に含む、請求項６０に記載のポリペプチド。
【請求項６８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２７の配列を含む、請求項６７に記載のポリペプチド。
【請求項６９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に７位にＡｌａ、８位にＡｌａ、１３９位にＳｅｒ、１４１位にＡｌａ、及び１８０位にＶａｌを更に含む、請求項６０に記載のポリペプチド。
【請求項７０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２８の配列を含む、請求項６９に記載のポリペプチド。
【請求項７１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に７位にＡｌａ、８位にＡｌａ、１３９位にＳｅｒ、１４１位にＡｌａ、１８０位にＶａｌ、２０１位にＬｅｕ、及び２０７位にＳｅｒを更に含む、請求項６０に記載のポリペプチド。
【請求項７２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５６の配列を含む、請求項７１に記載のポリペプチド。
【請求項７３】
前記配列のアミノ末端の最初の３個のアミノ酸「ＰＣＰ」を含まない、請求項１〜７２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項７４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４７の配列を含む、トランスフェリン受容体に特異的に結合するポリペプチド。
【請求項７５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４８の配列を含む、トランスフェリン受容体に特異的に結合するポリペプチド。
【請求項７６】
抗体重鎖可変領域を更に含む、請求項１〜７５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項７７】
Ｎ末端からＣ末端にかけて、抗体重鎖可変領域、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、及び請求項１〜７５のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む、ポリペプチド。
【請求項７８】
（ａ）請求項１〜７７のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む第１のＦｃポリペプチドと、
(ｂ)（ａ）の第１のＦｃポリペプチドと二量体化することが可能な第２のＦｃポリペプチドと
を含む、Ｆｃポリペプチド二量体またはその二量体フラグメント。
【請求項７９】
ＴｆＲ結合について一価である、請求項７８に記載のＦｃポリペプチド二量体。
【請求項８０】
前記第２のＦｃポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５１〜３５６のうちのいずれか１つの配列を含む、請求項７８または７９に記載のＦｃポリペプチド二量体。
【請求項８１】
前記第１のＦｃポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３、１３４、及び２６０のうちのいずれか１つの配列を含み、前記第２のＦｃポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５４〜３５６のうちのいずれか１つの配列を含む、請求項７８〜８０のいずれか１項に記載のＦｃポリペプチド二量体。
【請求項８２】
前記第１のＦｃポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４５、１４６、及び２６７のうちのいずれか１つの配列を含み、前記第２のＦｃポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５４〜３５６のうちのいずれか１つの配列を含む、請求項７８〜８０のいずれか１項に記載のＦｃポリペプチド二量体。
【請求項８３】
前記第１のＦｃポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３２、２３３、及び３０９のうちのいずれか１つの配列を含み、前記第２のＦｃポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５４〜３５６のうちのいずれか１つの配列を含む、請求項７８〜８０のいずれか１項に記載のＦｃポリペプチド二量体。
【請求項８４】
前記第１のＦｃポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６９、１７０、及び２８１のうちのいずれか１つの配列を含み、前記第２のＦｃポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５４〜３５６のうちのいずれか１つの配列を含む、請求項７８〜８０のいずれか１項に記載のＦｃポリペプチド二量体。
【請求項８５】
前記第１のＦｃポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２１、１２２、及び２５３のうちのいずれか１つの配列を含み、前記第２のＦｃポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５４〜３５６のうちのいずれか１つの配列を含む、請求項７８〜８０のいずれか１項に記載のＦｃポリペプチド二量体。
【請求項８６】
前記第１のＦｃポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３９、１４０、及び２６３のうちのいずれか１つの配列を含み、前記第２のＦｃポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５１〜３５３のうちのいずれか１つの配列を含む、請求項７８〜８０のいずれか１項に記載のＦｃポリペプチド二量体。
【請求項８７】
前記第１のＦｃポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５１、１５２、及び２７０のうちのいずれか１つの配列を含み、前記第２のＦｃポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５１〜３５３のうちのいずれか１つの配列を含む、請求項７８〜８０のいずれか１項に記載のＦｃポリペプチド二量体。
【請求項８８】
前記第１のＦｃポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３８、２３９、及び３１２のうちのいずれか１つの配列を含み、前記第２のＦｃポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５１〜３５３のうちのいずれか１つの配列を含む、請求項７８〜８０のいずれか１項に記載のＦｃポリペプチド二量体。
【請求項８９】
前記第１のＦｃポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７５、１７６、及び２８４のうちのいずれか１つの配列を含み、前記第２のＦｃポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５１〜３５３のうちのいずれか１つの配列を含む、請求項７８〜８０のいずれか１項に記載のＦｃポリペプチド二量体。
【請求項９０】
前記第１のＦｃポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２７、１２８、及び２５６のうちのいずれか１つの配列を含み、前記第２のＦｃポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５１〜３５３のうちのいずれか１つの配列を含む、請求項７８〜８０のいずれか１項に記載のＦｃポリペプチド二量体。
【請求項９１】
（ａ）前記第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３４の配列を含み、かつ前記第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５５の配列を含むか、または、
（ｂ）前記第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３４の配列を含み、かつ前記第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５６の配列を含むか、または、
（ｃ）前記第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６０の配列を含み、かつ前記第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５５の配列を含むか、または、
（ｄ）前記第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６０の配列を含み、かつ前記第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５６の配列を含むか、または、
（ｅ）前記第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４０の配列を含み、かつ前記第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５２の配列を含むか、または、
（ｆ）前記第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４０の配列を含み、かつ前記第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５３の配列を含むか、または、
（ｇ）前記第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６３の配列を含み、かつ前記第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５２の配列を含むか、または、
（ｈ）前記第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６３の配列を含み、かつ前記第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５３の配列を含む、
請求項７８〜８０のいずれか１項に記載のＦｃポリペプチド二量体。
【請求項９２】
（ａ）前記第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４６の配列を含み、かつ前記第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５５の配列を含むか、または、
（ｂ）前記第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４６の配列を含み、かつ前記第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５６の配列を含むか、または、
（ｃ）前記第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６７の配列を含み、かつ前記第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５５の配列を含むか、または、
（ｄ）前記第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６７の配列を含み、かつ前記第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５６の配列を含むか、または、
（ｅ）前記第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５２の配列を含み、かつ前記第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５２の配列を含むか、または、
（ｆ）前記第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５２の配列を含み、かつ前記第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５３の配列を含むか、または、
（ｇ）前記第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７０の配列を含み、かつ前記第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５２の配列を含むか、または、
（ｈ）前記第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７０の配列を含み、かつ前記第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５３の配列を含む、
請求項７８〜８０のいずれか１項に記載のＦｃポリペプチド二量体。
【請求項９３】
（ａ）前記第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３３の配列を含み、かつ前記第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５５の配列を含むか、または、
（ｂ）前記第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３３の配列を含み、かつ前記第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５６の配列を含むか、または、
（ｃ）前記第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０９の配列を含み、かつ前記第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５５の配列を含むか、または、
（ｄ）前記第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０９の配列を含み、かつ前記第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５６の配列を含むか、または、
（ｅ）前記第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３９の配列を含み、かつ前記第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５２の配列を含むか、または、
（ｆ）前記第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３９の配列を含み、かつ前記第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５３の配列を含むか、または、
（ｇ）前記第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１２の配列を含み、かつ前記第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５２の配列を含むか、または、
（ｈ）前記第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１２の配列を含み、かつ前記第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５３の配列を含む、
請求項７８〜８０のいずれか１項に記載のＦｃポリペプチド二量体。
【請求項９４】
（ａ）前記第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７０の配列を含み、かつ前記第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５５の配列を含むか、または、
（ｂ）前記第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７０の配列を含み、かつ前記第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５６の配列を含むか、または、
（ｃ）前記第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８１の配列を含み、かつ前記第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５５の配列を含むか、または、
（ｄ）前記第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８１の配列を含み、かつ前記第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５６の配列を含むか、または、
（ｅ）前記第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７６の配列を含み、かつ前記第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５２の配列を含むか、または、
（ｆ）前記第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７６の配列を含み、かつ前記第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５３の配列を含むか、または、
（ｇ）前記第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８４の配列を含み、かつ前記第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５２の配列を含むか、または、
（ｈ）前記第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８４の配列を含み、かつ前記第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５３の配列を含む、
請求項７８〜８０のいずれか１項に記載のＦｃポリペプチド二量体。
【請求項９５】
（ａ）前記第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２２の配列を含み、かつ前記第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５５の配列を含むか、または、
（ｂ）前記第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２２の配列を含み、かつ前記第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５６の配列を含むか、または、
（ｃ）前記第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５３の配列を含み、かつ前記第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５５の配列を含むか、または、
（ｄ）前記第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５３の配列を含み、かつ前記第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５６の配列を含むか、または、
（ｅ）前記第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２８の配列を含み、かつ前記第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５２の配列を含むか、または、
（ｆ）前記第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２８の配列を含み、かつ前記第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５３の配列を含むか、または、
（ｇ）前記第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５６の配列を含み、かつ前記第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５２の配列を含むか、または、
（ｈ）前記第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５６の配列を含み、かつ前記第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５３の配列を含む、
請求項７８〜８０のいずれか１項に記載のＦｃポリペプチド二量体。
【請求項９６】
前記第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４７の配列を含み、前記第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５０の配列を含む、請求項７８〜８０のいずれか１項に記載のＦｃポリペプチド二量体。
【請求項９７】
前記第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４８の配列を含み、前記第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４９の配列を含む、請求項７８〜８０のいずれか１項に記載のＦｃポリペプチド二量体。
【請求項９８】
ＴｆＲ結合について二価である、請求項７８に記載のＦｃポリペプチド二量体。
【請求項９９】
前記第２のＦｃポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４７または３４８の配列を含む、請求項９８に記載のＦｃポリペプチド二量体。
【請求項１００】
前記第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４７の配列を含み、前記第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４８の配列を含む、請求項９８または９９に記載のＦｃポリペプチド二量体。
【請求項１０１】
前記第１のＦｃポリペプチド及び第２のＦｃポリペプチドが、同じＴｆＲ結合部位を含む、請求項９８〜１００のいずれか１項に記載のＦｃポリペプチド二量体。
【請求項１０２】
（ａ）抗原に結合することが可能な抗体可変領域、またはその抗原結合フラグメントと、
（ｂ）請求項７８〜１０１のいずれか１項に記載のＦｃポリペプチド二量体と
を含む、Ｆｃポリペプチド二量体−Ｆａｂ融合タンパク質。
【請求項１０３】
前記抗体可変領域がＦａｂドメインの一部を形成する、請求項１０２に記載のＦｃポリペプチド二量体−Ｆａｂ融合タンパク質。
【請求項１０４】
前記抗体可変領域が、２つの抗体重鎖可変領域及び２つの抗体軽鎖可変領域、またはそれらのそれぞれのフラグメントを含む、請求項１０２または１０３に記載のＦｃポリペプチド二量体−Ｆａｂ融合タンパク質。
【請求項１０５】
請求項１〜７７のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項１０６】
請求項１０５に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１０７】
請求項１０５に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項１０８】
トランスフェリン受容体に特異的に結合するポリペプチドを作製するための方法であって、請求項１０５に記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが発現される条件下で宿主細胞を培養することを含む、前記方法。
【請求項１０９】
請求項１〜７７のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項７８〜１０１のいずれか１項に記載のＦｃポリペプチド二量体、または請求項１０２〜１０４のいずれか１項に記載のＦｃポリペプチド二量体−Ｆａｂ融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項１１０】
内皮を通過して組成物をトランスサイトーシスさせるための方法であって、前記内皮を、請求項１〜７７のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項７８〜１０１のいずれか１項に記載のＦｃポリペプチド二量体、または請求項１０２〜１０４のいずれか１項に記載のＦｃポリペプチド二量体−Ｆａｂ融合タンパク質を含む組成物と接触させることを含む、前記方法。
【請求項１１１】
前記内皮が血液脳関門（ＢＢＢ）である、請求項１１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年８月１０日出願の米国特許仮出願第６２／５４３，６５８号、２０１７年１１月８日出願の米国特許仮出願第６２／５８３，３１４号、及び２０１８年２月１５日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１８３７１号に基づく優先権を主張するものであり、当該出願の開示内容をあらゆる目的でそれらの全容にわたって本明細書に参照により援用するものである。
【背景技術】
【０００２】
背景
タンパク質を操作して通常は結合しない標的に結合させるための様々な方法が開発されている。例えば、ライブラリーを作製して所望の結合活性または酵素活性によって操作されたタンパク質についてスクリーニングすることができる。
【０００３】
トランスフェリン受容体は、他の機能の中でもとりわけ細胞内への鉄の輸送に必要とされ、細胞内の鉄濃度に応じて調節されるトランスフェリンの輸送タンパク質である。トランスフェリン受容体は、血液脳関門の内皮をはじめとする内皮で発現し、様々ながん細胞及び炎症性細胞で高レベルに発現する。トランスフェリンは、血液脳関門を通過する同族リガンドのトランスサイトーシスを媒介する受容体の１つである。そのため、トランスフェリン受容体は、細胞内のエンドサイトーシスのためまたは細胞を通過するトランスサイトーシスのために細胞内に物質を導入するための望ましい標的となり得る。
【発明の概要】
【０００４】
概要
本発明者らは、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に結合可能なＣＨ３ドメインを含むポリペプチドを開発した。これらのポリペプチドは、新規なＴｆＲ結合部位を生成するＣＨ３ドメイン内の置換により操作されている。ＴｆＲは血液脳関門（ＢＢＢ）で高度に発現し、ＴｆＲはトランスフェリンを血液から脳内に自然に移動させる。これらのポリペプチドはＴｆＲに結合することから、これらのポリペプチドもまた、ＢＢＢを通過して輸送され得て、これらのポリペプチドを更に利用して、結合させた治療剤（例えば、治療ポリペプチド、Ｆａｂのような抗体可変領域、及び小分子など）をＢＢＢを通過して輸送することができる。このアプローチは、治療剤の脳への取り込みを大幅に改善することができるため、脳への送達が効果的である障害及び疾病を治療するうえで極めて有用である。
【０００５】
一態様では、本開示は、トランスフェリン受容体に特異的に結合するポリペプチドであって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３、８４、１９１、４３、及び８２のうちのいずれか１つの配列との少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含み、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に１５３位にＧｌｕ、１５７位にＴｙｒまたはＰｈｅ、１５９位にＴｈｒ、１６０位にＧｌｕ、１６１位にＴｒｐ、１６２位にＶａｌ、Ｓｅｒ、またはＡｌａ、１６３位にＡｓｎ、１８６位にＴｈｒまたはＳｅｒ、１８８位にＧｌｕ、１８９位にＧｌｕ、及び１９４位にＰｈｅを有する、ポリペプチドに関する。
【０００６】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に１３９位にＴｒｐを更に含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に７位にＡｌａ、８位にＡｌａ、及び１３９位にＴｒｐを更に含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に７位にＡｌａ、８位にＡｌａ、１３９位にＴｒｐ、２０１位にＬｅｕ、及び２０７位にＳｅｒを更に含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に１３９位にＳｅｒ、１４１位にＡｌａ、及び１８０位にＶａｌを更に含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に７位にＡｌａ、８位にＡｌａ、１３９位にＳｅｒ、１４１位にＡｌａ、及び１８０位にＶａｌを更に含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に７位にＡｌａ、８位にＡｌａ、１３９位にＳｅｒ、１４１位にＡｌａ、１８０位にＶａｌ、２０１位にＬｅｕ、及び２０７位にＳｅｒを更に含む。
【０００７】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列のアミノ末端の最初の３個のアミノ酸「ＰＣＰ」を含まない（例えば、ポリペプチドは、アミノ末端の最初の３個のアミノ酸「ＰＣＰ」を含まずに、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３、８４、１９１、４３、及び８２のうちのいずれか１つの配列との少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む）。
【０００８】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、抗体重鎖可変領域を更に含む。
【０００９】
別の態様では、本開示は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３の配列との少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む、トランスフェリン受容体に特異的に結合するポリペプチドであって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に１５３位にＧｌｕ、１５７位にＴｙｒ、１５９位にＴｈｒ、１６０位にＧｌｕ、１６１位にＴｒｐ、１６２位にＶａｌ、１６３位にＡｓｎ、１８６位にＴｈｒ、１８８位にＧｌｕ、１８９位にＧｌｕ、及び１９４位にＰｈｅを含む、ポリペプチドに関する。
【００１０】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に１３９位にＴｒｐを更に含む。特定の実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３の配列を含む。
【００１１】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に７位にＡｌａ、８位にＡｌａ、及び１３９位にＴｒｐを更に含む。特定の実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３４の配列を含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に７位にＡｌａ、８位にＡｌａ、１３９位にＴｒｐ、２０１位にＬｅｕ、及び２０７位にＳｅｒを更に含む。特定の実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６０の配列を含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に１３９位にＳｅｒ、１４１位にＡｌａ、及び１８０位にＶａｌを更に含む。特定の実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３９の配列を含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に７位にＡｌａ、８位にＡｌａ、１３９位にＳｅｒ、１４１位にＡｌａ、及び１８０位にＶａｌを更に含む。特定の実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４０の配列を含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に７位にＡｌａ、８位にＡｌａ、１３９位にＳｅｒ、１４１位にＡｌａ、１８０位にＶａｌ、２０１位にＬｅｕ、及び２０７位にＳｅｒを更に含む。特定の実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６３の配列を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列のアミノ末端の最初の３個のアミノ酸「ＰＣＰ」を含まない（例えば、ポリペプチドは、アミノ末端の最初の３個のアミノ酸「ＰＣＰ」を含まずに、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３、１３３、１３４、２６０、１３９、１４０及び２６３のうちのいずれか１つの配列との少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む）。
【００１７】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、抗体重鎖可変領域を更に含む。
【００１８】
別の態様では、本開示は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４の配列との少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む、トランスフェリン受容体に特異的に結合するポリペプチドであって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に１５３位にＧｌｕ、１５７位にＴｙｒ、１５９位にＴｈｒ、１６０位にＧｌｕ、１６１位にＴｒｐ、１６２位にＳｅｒ、１６３位にＡｓｎ、１８６位にＳｅｒ、１８８位にＧｌｕ、１８９位にＧｌｕ、及び１９４位にＰｈｅを有する、ポリペプチドに関する。
【００１９】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に１３９位にＴｒｐを更に含む。特定の実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４５の配列を含む。
【００２０】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に７位にＡｌａ、８位にＡｌａ、及び１３９位にＴｒｐを更に含む。特定の実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４６の配列を含む。
【００２１】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に７位にＡｌａ、８位にＡｌａ、１３９位にＴｒｐ、２０１位にＬｅｕ、及び２０７位にＳｅｒを更に含む。特定の実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６７の配列を含む。
【００２２】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に１３９位にＳｅｒ、１４１位にＡｌａ、及び１８０位にＶａｌを更に含む。特定の実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５１の配列を含む。
【００２３】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に７位にＡｌａ、８位にＡｌａ、１３９位にＳｅｒ、１４１位にＡｌａ、及び１８０位にＶａｌを更に含む。特定の実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５２の配列を含む。
【００２４】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に７位にＡｌａ、８位にＡｌａ、１３９位にＳｅｒ、１４１位にＡｌａ、１８０位にＶａｌ、２０１位にＬｅｕ、及び２０７位にＳｅｒを更に含む。特定の実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７０の配列を含む。
【００２５】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列のアミノ末端の最初の３個のアミノ酸「ＰＣＰ」を含まない（例えば、ポリペプチドは、アミノ末端の最初の３個のアミノ酸「ＰＣＰ」を含まずに、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４、１４５、１４６、２６７、１５１、１５２及び２７０のうちのいずれか１つの配列との少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む）。
【００２６】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、抗体重鎖可変領域を更に含む。
【００２７】
別の態様では、本開示は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９１の配列との少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む、トランスフェリン受容体に特異的に結合するポリペプチドであって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に１５３位にＧｌｕ、１５７位にＰｈｅ、１５９位にＴｈｒ、１６０位にＧｌｕ、１６１位にＴｒｐ、１６２位にＳｅｒ、１６３位にＡｓｎ、１８６位にＳｅｒ、１８８位にＧｌｕ、１８９位にＧｌｕ、及び１９４位にＰｈｅを含む、ポリペプチドに関する。
【００２８】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に１３９位にＴｒｐを更に含む。特定の実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３２の配列を含む。
【００２９】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に７位にＡｌａ、８位にＡｌａ、及び１３９位にＴｒｐを更に含む。特定の実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３３の配列を含む。
【００３０】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に７位にＡｌａ、８位にＡｌａ、１３９位にＴｒｐ、２０１位にＬｅｕ、及び２０７位にＳｅｒを更に含む。特定の実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０９の配列を含む。
【００３１】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に１３９位にＳｅｒ、１４１位にＡｌａ、及び１８０位にＶａｌを更に含む。特定の実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３８の配列を含む。
【００３２】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に７位にＡｌａ、８位にＡｌａ、１３９位にＳｅｒ、１４１位にＡｌａ、及び１８０位にＶａｌを更に含む。特定の実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３９の配列を含む。
【００３３】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に７位にＡｌａ、８位にＡｌａ、１３９位にＳｅｒ、１４１位にＡｌａ、１８０位にＶａｌ、２０１位にＬｅｕ、及び２０７位にＳｅｒを更に含む。特定の実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１２の配列を含む。
【００３４】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列のアミノ末端の最初の３個のアミノ酸「ＰＣＰ」を含まない（例えば、ポリペプチドは、アミノ末端の最初の３個のアミノ酸「ＰＣＰ」を含まずに、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９１、２３２、２３３、３０９、２３８、２３９及び３１２のうちのいずれか１つの配列との少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む）。
【００３５】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、抗体重鎖可変領域を更に含む。
【００３６】
別の態様では、本開示は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３の配列との少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む、トランスフェリン受容体に特異的に結合するポリペプチドであって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に１５３位にＧｌｕ、１５７位にＴｙｒ、１５９位にＴｈｒ、１６０位にＧｌｕ、１６１位にＴｒｐ、１６２位にＳｅｒ、１６３位にＡｓｎ、１８６位にＴｈｒ、１８８位にＧｌｕ、１８９位にＧｌｕ、及び１９４位にＰｈｅを含む、ポリペプチドに関する。
【００３７】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に１３９位にＴｒｐを更に含む。特定の実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６９の配列を含む。
【００３８】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に７位にＡｌａ、８位にＡｌａ、及び１３９位にＴｒｐを更に含む。特定の実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７０の配列を含む。
【００３９】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に７位にＡｌａ、８位にＡｌａ、１３９位にＴｒｐ、２０１位にＬｅｕ、及び２０７位にＳｅｒを更に含む。特定の実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８１の配列を含む。
【００４０】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に１３９位にＳｅｒ、１４１位にＡｌａ、及び１８０位にＶａｌを更に含む。特定の実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７５の配列を含む。
【００４１】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に７位にＡｌａ、８位にＡｌａ、１３９位にＳｅｒ、１４１位にＡｌａ、及び１８０位にＶａｌを更に含む。特定の実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７６の配列を含む。
【００４２】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に７位にＡｌａ、８位にＡｌａ、１３９位にＳｅｒ、１４１位にＡｌａ、１８０位にＶａｌ、２０１位にＬｅｕ、及び２０７位にＳｅｒを更に含む。特定の実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８４の配列を含む。
【００４３】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列のアミノ末端の最初の３個のアミノ酸「ＰＣＰ」を含まない（例えば、ポリペプチドは、アミノ末端の最初の３個のアミノ酸「ＰＣＰ」を含まずに、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３、１６９、１７０、２８１、１７５、１７６及び２８４のうちのいずれか１つの配列との少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む）。
【００４４】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、抗体重鎖可変領域を更に含む。
【００４５】
別の態様では、本開示は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８２の配列との少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む、トランスフェリン受容体に特異的に結合するポリペプチドであって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に１５３位にＧｌｕ、１５７位にＴｙｒ、１５９位にＴｈｒ、１６０位にＧｌｕ、１６１位にＴｒｐ、１６２位にＡｌａ、１６３位にＡｓｎ、１８６位にＴｈｒ、１８８位にＧｌｕ、１８９位にＧｌｕ、及び１９４位にＰｈｅを含む、ポリペプチドに関する。
【００４６】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に１３９位にＴｒｐを更に含む。特定の実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２１の配列を含む。
【００４７】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に７位にＡｌａ、８位にＡｌａ、及び１３９位にＴｒｐを更に含む。特定の実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２２の配列を含む。
【００４８】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に７位にＡｌａ、８位にＡｌａ、１３９位にＴｒｐ、２０１位にＬｅｕ、及び２０７位にＳｅｒを更に含む。特定の実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５３の配列を含む。
【００４９】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に１３９位にＳｅｒ、１４１位にＡｌａ、及び１８０位にＶａｌを更に含む。特定の実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２７の配列を含む。
【００５０】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に７位にＡｌａ、８位にＡｌａ、１３９位にＳｅｒ、１４１位にＡｌａ、及び１８０位にＶａｌを更に含む。特定の実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２８の配列を含む。
【００５１】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に７位にＡｌａ、８位にＡｌａ、１３９位にＳｅｒ、１４１位にＡｌａ、１８０位にＶａｌ、２０１位にＬｅｕ、及び２０７位にＳｅｒを更に含む。特定の実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５６の配列を含む。
【００５２】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列のアミノ末端の最初の３個のアミノ酸「ＰＣＰ」を含まない（例えば、ポリペプチドは、アミノ末端の最初の３個のアミノ酸「ＰＣＰ」を含まずに、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８２、１２１、１２２、２５３、１２７、１２８及び２５６のうちのいずれか１つの配列との少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む）。
【００５３】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、抗体重鎖可変領域を更に含む。
【００５４】
別の態様では、本開示は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４７の配列を含む、トランスフェリン受容体に特異的に結合するポリペプチドに関する。別の態様では、本開示は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４８の配列を含む、トランスフェリン受容体に特異的に結合するポリペプチドに関する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、抗体重鎖可変領域を更に含む。
【００５５】
別の態様では、本開示は、Ｎ末端からＣ末端にかけて、抗体重鎖可変領域、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、及び本明細書に記載のポリペプチドを含むポリペプチドに関する。
【００５６】
別の態様では、本開示は、
（ａ）本明細書に記載されるポリペプチドを含む第１のＦｃポリペプチドと、
(ｂ)（ａ）の第１のＦｃポリペプチドと二量体化することが可能な第２のＦｃポリペプチドと
を含む、Ｆｃポリペプチド二量体またはその二量体フラグメントに関する。
【００５７】
いくつかの実施形態では、二量体はＴｆＲ結合について一価である。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５１〜３５６のうちのいずれか１つの配列を含む。
【００５８】
特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３、１３４、及び２６０のうちのいずれか１つの配列を含み、第２のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５４〜３５６のうちのいずれか１つの配列を含む。
【００５９】
特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４５、１４６、及び２６７のうちのいずれか１つの配列を含み、第２のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５４〜３５６のうちのいずれか１つの配列を含む。
【００６０】
特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３２、２３３、及び３０９のうちのいずれか１つの配列を含み、第２のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５４〜３５６のうちのいずれか１つの配列を含む。
【００６１】
特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６９、１７０、及び２８１のうちのいずれか１つの配列を含み、第２のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５４〜３５６のうちのいずれか１つの配列を含む。
【００６２】
特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２１、１２２、及び２５３のうちのいずれか１つの配列を含み、第２のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５４〜３５６のうちのいずれか１つの配列を含む。
【００６３】
特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３９、１４０、及び２６３のうちのいずれか１つの配列を含み、第２のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５１〜３５３のうちのいずれか１つの配列を含む。
【００６４】
特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５１、１５２、及び２７０のうちのいずれか１つの配列を含み、第２のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５１〜３５３のうちのいずれか１つの配列を含む。
【００６５】
特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３８、２３９、及び３１２のうちのいずれか１つの配列を含み、第２のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５１〜３５３のうちのいずれか１つの配列を含む。
【００６６】
特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７５、１７６、及び２８４のうちのいずれか１つの配列を含み、第２のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５１〜３５３のうちのいずれか１つの配列を含む。
【００６７】
特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２７、１２８、及び２５６のうちのいずれか１つの配列を含み、第２のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５１〜３５３のうちのいずれか１つの配列を含む。
【００６８】
特定の実施形態では、二量体の第１及び第２のＦｃポリペプチドは、以下の配列を含む。すなわち、
（ａ）第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３４の配列を含み、かつ第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５５の配列を含むか、または、
（ｂ）第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３４の配列を含み、かつ第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５６の配列を含むか、または、
（ｃ）第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６０の配列を含み、かつ第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５５の配列を含むか、または、
（ｄ）第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６０の配列を含み、かつ第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５６の配列を含むか、または、
（ｅ）第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４０の配列を含み、かつ第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５２の配列を含むか、または、
（ｆ）第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４０の配列を含み、かつ第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５３の配列を含みか、または、
（ｇ）第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６３の配列を含み、かつ第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５２の配列を含むか、または、
（ｈ）第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６３の配列を含み、かつ第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５３の配列を含む。
【００６９】
特定の実施形態では、二量体の第１及び第２のＦｃポリペプチドは、以下の配列を含む。すなわち、
（ａ）第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４６の配列を含み、かつ第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５５の配列を含むか、または、
（ｂ）第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４６の配列を含み、かつ第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５６の配列を含むか、または、
（ｃ）第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６７の配列を含み、かつ第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５５の配列を含むか、または、
（ｄ）第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６７の配列を含み、かつ第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５６の配列を含むか、または、
（ｅ）第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５２の配列を含み、かつ第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５２の配列を含むか、または、
（ｆ）第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５２の配列を含み、かつ第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５３の配列を含むか、または、
（ｇ）第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７０の配列を含み、かつ第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５２の配列を含むか、または、
（ｈ）第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７０の配列を含み、かつ第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５３の配列を含む。
【００７０】
特定の実施形態では、二量体の第１及び第２のＦｃポリペプチドは、以下の配列を含む。すなわち、
（ａ）第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３３の配列を含み、かつ第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５５の配列を含むか、または、
（ｂ）第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３３の配列を含み、かつ第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５６の配列を含むか、または、
（ｃ）第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０９の配列を含み、かつ第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５５の配列を含むか、または、
（ｄ）第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０９の配列を含み、かつ第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５６の配列を含むか、または、
（ｅ）第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３９の配列を含み、かつ第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５２の配列を含むか、または、
（ｆ）第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３９の配列を含み、かつ第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５３の配列を含むか、または、
（ｇ）第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１２の配列を含み、かつ第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５２の配列を含むか、または、
（ｈ）第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１２の配列を含み、かつ第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５３の配列を含む。
【００７１】
特定の実施形態では、二量体の第１及び第２のＦｃポリペプチドは、以下の配列を含む。すなわち、
（ａ）第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７０の配列を含み、かつ第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５５の配列を含むか、または、
（ｂ）第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７０の配列を含み、かつ第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５６の配列を含むか、または、
（ｃ）第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８１の配列を含み、かつ第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５５の配列を含むか、または、
（ｄ）第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８１の配列を含み、かつ第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５６の配列を含むか、または、
（ｅ）第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７６の配列を含み、かつ第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５２の配列を含むか、または、
（ｆ）第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７６の配列を含み、かつ第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５３の配列を含むか、または、
（ｇ）第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８４の配列を含み、かつ第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５２の配列を含むか、または、
（ｈ）第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８４の配列を含み、かつ第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５３の配列を含む。
【００７２】
特定の実施形態では、二量体の第１及び第２のＦｃポリペプチドは、以下の配列を含む。すなわち、
（ａ）第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２２の配列を含み、かつ第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５５の配列を含むか、または、
（ｂ）第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２２の配列を含み、かつ第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５６の配列を含むか、または、
（ｃ）第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５３の配列を含み、かつ第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５５の配列を含むか、または、
（ｄ）第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５３の配列を含み、かつ第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５６の配列を含むか、または、
（ｅ）第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２８の配列を含み、かつ第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５２の配列を含むか、または、
（ｆ）第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２８の配列を含み、かつ第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５３の配列を含むか、または、
（ｇ）第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５６の配列を含み、かつ第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５２の配列を含むか、または、
（ｈ）第１のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５６の配列を含み、かつ第２のＦｃポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５３の配列を含む。
【００７３】
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列のアミノ末端の最初の３個のアミノ酸「ＰＣＰ」を含まない（例えば、第１のＦｃポリペプチドは、アミノ末端の最初の３個のアミノ酸「ＰＣＰ」を含まない配列を含む）。
【００７４】
特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４７の配列を含みかつ第２のＦｃポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５０の配列を含む。特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４８の配列を含み、かつ第２のＦｃポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４９の配列を含む。
【００７５】
いくつかの実施形態では、二量体はＴｆＲ結合について二価である。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４７または３４８の配列を含む。特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４７の配列を含み、かつ第２のＦｃポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４８の配列を含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２のＦｃポリペプチドは、同じＴｆＲ結合部位を含む。
【００７６】
別の態様では、本開示は、
（ａ）抗原に結合することが可能な抗体可変領域、またはその抗原結合フラグメントと、
（ｂ）本明細書に記載されるＦｃポリペプチド二量体と
を含む、Ｆｃポリペプチド二量体−Ｆａｂ融合タンパク質に関する。
【００７７】
いくつかの実施形態では、抗体可変領域配列は、Ｆａｂドメインの一部を形成する。特定の実施形態では、抗体可変領域は、２つの抗体重鎖可変領域及び２つの抗体軽鎖可変領域、またはそれらのそれぞれのフラグメントを含む。
【００７８】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載されるポリペプチドをコードした核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供される。別の態様では、本開示は、トランスフェリン受容体に特異的に結合するポリペプチドを作製するための方法であって、そのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが発現される条件下で宿主細胞を培養することを含む、方法に関する。
【００７９】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載されるポリペプチド、Ｆｃポリペプチド二量体、及び／またはＦｃポリペプチド二量体−Ｆａｂ融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物に関する。
【００８０】
別の態様では、本開示は、内皮を通過して組成物をトランスサイトーシスさせるための方法であって、内皮を、本明細書に記載されるポリペプチド、Ｆｃポリペプチド二量体、及び／またはＦｃポリペプチド二量体−Ｆａｂ融合タンパク質を含む組成物と接触させることを含む、方法に関する。
【００８１】
いくつかの実施形態では、内皮は血液脳関門（ＢＢＢ）である。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】３回の分取ラウンド後の結合集団の濃縮を示す、酵母でのＣＨ３Ｃクローンの選択のＦＡＣＳプロットを示す。分取ラウンド１及び２では、ビオチン化ＴｆＲを、酵母とインキュベートする前にストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７に予めロードした。分取ラウンド３では、ビオチン化ＴｆＲを最初に酵母とインキュベートし、二次検出用にストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７を加えた。すべての分取ラウンドで、酵母ディスプレイコンストラクト上のＣ末端Ｍｙｃタグに対するニワトリ抗ｃ−Ｍｙｃ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒより入手）を使用して発現を監視した。
【図２】ホロ−Ｔｆの存在下または非存在下でのＴｆＲに対するＣＨ３Ｃクローンの結合を示す。クローンは、Ｆｃ−Ｆａｂ融合体フォーマットでアッセイした。ＴｆＲに結合する可変領域を有する標準的抗体であるＡｂ２０４をこのアッセイのポジティブコントロールとして用いた。（Ａ）ＥＬＩＳＡプレートにコーティングしたヒトＴｆＲに対するＣＨ３Ｃ変異体の結合を示す。（Ｂ）５μＭのホロ−Ｔｆの存在下でＥＬＩＳＡプレートにコーティングしたヒトＴｆＲに対するＣＨ３Ｃ変異体の結合を示す。（Ｃ）ＥＬＩＳＡプレートにコーティングしたカニクイザルＴｆＲに対するＣＨ３Ｃ変異体の結合を示す。
【図３】ヒトＴｆＲを内因性に発現する２９３Ｆ細胞に対するＣＨ３Ｃクローンの結合を示す。細胞を９６ウェルＶ底プレート中に分配し、Ｆｃ−Ｆａｂ融合結合タンパク質としてフォーマット化した異なる濃度のＣＨ３Ｃクローンを加えた。４℃で１時間のインキュベーション後、各プレートを遠心し、洗浄してから、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７二次抗体と、４℃で３０分間インキュベートした。細胞を更に洗浄した後、各プレートをＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）ＩＩフローサイトメーターで読み取り、ＡＰＣ（６４７ｎｍ）チャンネルの蛍光中央値をＦｌｏｗＪｏ（登録商標）ソフトウェアを使用して求めた。
【図４】ヒトＴｆＲを内因性に発現するＨＥＫ２９３細胞内へのＣＨ３Ｃ．３の内在化を示す。１μＭ濃度のＣＨ３Ｃ．３またはコントロールを３７℃及び８％ＣＯ２濃度で３０分間加えた後、細胞を洗浄し、透過処理し、抗ヒトＩｇＧ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８二次抗体で染色した。更なる洗浄後、細胞を蛍光顕微鏡法でイメージングし、斑点の数を定量した。（Ａ）顕微鏡法のデータを示す。（Ｂ）ウェル１個当たりの斑点の数のグラフを示す。
【図５】ＣＨ３Ｃソフトライブラリーの選択スキームを示す。初期ライブラリーをＭＡＣＳによりヒト（Ｈ）またはカニクイザル（Ｃ）ＴｆＲに対して分取した。次いで得られた酵母プールを分割し、それぞれを最初のＦＡＳ分取ラウンドと同様にヒトまたはカニクイザルＴｆＲに対して分取した。得られた各プールを別の分取ラウンド用に再び分割した。最後に、ＨＨＨ及びＣＣＣプールを別に維持し、両方の標的種がみられた他のプールを最終的にプールした。
【図６】ヒト及びカニクイザルＴｆＲに対する最初のソフトランダム化ライブラリーから特定されたＣＨ３Ｃクローンの結合を示す。ポジティブコントロールは高親和性の抗ＴｆＲ抗体であるＡｂ２０４、及び低親和性の抗ＴｆＲ抗体であるＡｂ０８４とした。（Ａ）ヒトＴｆＲに対する結合を示す。（Ｂ）カニクイザルＴｆＲに対する結合を示す。
【図７】ホロ−Ｔｆの存在下または非存在下でヒトＴｆＲに対する最初のソフトランダム化ライブラリーから特定されたＣＨ３Ｃクローンの結合を示す。クローンは、Ｆｃ−Ｆａｂ融合体フォーマットとした。高親和性の抗ＴｆＲ抗体であるＡｂ２０４をこのアッセイのポジティブコントロールとして用いた。（Ａ）ＥＬＩＳＡプレートにコーティングしたヒトＴｆＲに対するＣＨ３Ｃ変異体の結合を示す。（Ｂ）５μＭのホロ−Ｔｆの存在下でＥＬＩＳＡプレートにコーティングしたヒトＴｆＲに対するＣＨ３Ｃ変異体の結合を示す。
【図８】２９３Ｆ細胞に対する最初のソフトランダム化ライブラリーから特定されたＣＨ３Ｃクローンの結合を示す。細胞を９６ウェルＶ底プレート中に分配し、Ｆｃ−Ｆａｂ融合タンパク質としてフォーマット化した異なる濃度のＣＨ３Ｃクローンを加えた。４℃で１時間のインキュベーション後、各プレートを遠心し、洗浄してから、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７二次抗体と、４℃で３０分間インキュベートした。細胞を更に洗浄した後、各プレートをＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）ＩＩフローサイトメーターで読み取り、ＡＰＣ（６４７ｎｍ）チャンネルの蛍光中央値をＦｌｏｗＪｏ（登録商標）ソフトウェアを使用して求めた。
【図９】ＣＨＯ−Ｋ１細胞に対する最初のソフトランダム化ライブラリーから特定されたＣＨ３Ｃクローンの結合を示す。細胞を９６ウェルＶ底プレート中に分配し、Ｆｃ−Ｆａｂ融合体としてフォーマット化した異なる濃度のＣＨ３Ｃクローンを加えた。４℃で１時間のインキュベーション後、各プレートを遠心し、洗浄してから、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７二次抗体と、４℃で３０分間インキュベートした。細胞を更に洗浄した後、各プレートをＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）ＩＩフローサイトメーターで読み取り、ＡＰＣ（６４７ｎｍ）チャンネルの蛍光中央値をＦｌｏｗＪｏ（登録商標）ソフトウェアを使用して求めた。（Ａ）ヒトＴｆＲを過剰発現したＣＨＯ−Ｋ１細胞を示す。（Ｂ）カニクイザルＴｆＲを過剰発現したＣＨＯ−Ｋ１細胞を示す。（Ｃ）ヒトＴｆＲを発現しないＣＨＯ−Ｋ１親細胞を示す。
【図１０】ＴｆＲのアピカルドメインを示す。（Ａ）ヒトＴｆＲタンパク質のアピカルドメインの位置を示す。挿入図は、ヒトＴｆＲとカニクイザルＴｆＲ間で異なる７個の残基の拡大図を示す。（Ｂ）ヒトＴｆＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）とカニクイザルＴｆＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１）間で異なる７個の残基を含む配列アラインメントを示す。コンセンサス配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４２である。
【図１１】ファージにディスプレイされたアピカルドメインに対するＣＨ３Ｃクローンの結合を示す。（Ａ）異なるＴｆＲアピカルドメイン変異体のＭｙｃ発現を示し、各変異体の発現レベルが同様かつ正規化されていたことを示す。（Ｂ）野生型及び変異体ヒトＴｆＲアピカルドメインに対するＣＨ３Ｃ．１８の結合を示し、Ｒ２０８Ｇ変異体に対する低い結合を示す。（Ｃ）野生型及び変異体ヒトＴｆＲアピカルドメインに対するＣＨ３Ｃ．３５の結合を示し、Ｒ２０８Ｇ変異体に対する低い結合を示す。（Ｄ）野生型のヒト及びカニクイザルＴｆＲアピカルドメイン、ならびにＧ２０８Ｒ変異体カニクイザルアピカルドメインに対するＣＨ３Ｃ．１８の結合を示し、変異体に対する結合の回復を示す。（Ｅ）野生型のヒト及びカニクイザルＴｆＲアピカルドメイン、ならびにＧ２０８Ｒ変異体カニクイザルアピカルドメインに対するＣＨ３Ｃ．３５の結合を示し、変異体に対する結合の回復を示す。
【図１２】変異した位置を野生型残基に戻すことによるＣＨ３Ｃ変異体のパラトープマッピングを示す。（Ａ）復帰変異体についてヒトＴｆＲに対するＥＬＩＳＡ結合によるＣＨ３Ｃ．３５のパラトープマッピングを示す。（Ｂ）復帰変異体についてカニクイザルＴｆＲに対するＥＬＩＳＡ結合によるＣＨ３Ｃ．３５のパラトープマッピングを示す。（Ｃ）復帰変異体についてヒトＴｆＲに対するＥＬＩＳＡ結合によるＣＨ３Ｃ．１８のパラトープマッピングを示す。（Ｄ）復帰変異体についてカニクイザルＴｆＲに対するＥＬＩＳＡ結合によるＣＨ３Ｃ．１８のパラトープマッピングを示す。
【図１３】ＣＨ３Ｃのコンセンサス変異ライブラリーの設計を示す。（Ａ）ＣＨ３Ｃ．３５様配列に基づくコンセンサスライブラリーを示す。（Ｂ）ＣＨ３Ｃ．１８様配列に基づくコンセンサスライブラリーを示す。（Ｃ）ＣＨ３Ｃ．１８及びＣＨ３Ｃ．３５に基づくギャップライブラリーを示す。（Ｄ）ＣＨ３Ｃ．１８に基づいた芳香族ライブラリーを示す。
【図１４】ヒトまたはカニクイザルＴｆＲに対するコンセンサス変異ライブラリーからのＣＨ３Ｃ変異体の結合ＥＬＩＳＡを示す。新たな変異体（すなわち、ＣＨ３Ｃ．３．２−１、ＣＨ３Ｃ．３．２−５、及びＣＨ３Ｃ．３．２−１９）がカニクイザル及びヒトＴｆＲに対して同様の結合ＥＣ５０値を有していたのに対して、親クローンＣＨ３Ｃ．１８及びＣＨ３Ｃ．３５はカニクイザルＴｆＲに対してヒトＴｆＲに有意に高いＥＣ５０値を有していた。（Ａ）ＣＨ３Ｃ．３．２−１のデータを示す。（Ｂ）ＣＨ３Ｃ．３．２−１９のデータを示す。（Ｃ）ＣＨ３Ｃ．３．２−５のデータを示す。（Ｄ）ＣＨ３Ｃ．１８のデータを示す。（Ｅ）ＣＨ３Ｃ．３５のデータを示す。
【図１５】ヒト（ＨＥＫ２９３）及びサル（ＬＬＣ−ＭＫ２）細胞におけるコンセンサス成熟ライブラリーからのＣＨ３Ｃ変異体の内在化を示す。ヒト及びカニクイザルＴｆＲに対して同様の親和性を有するクローンＣＨ３Ｃ．３．２−５及びＣＨ３Ｃ３．２−１９は、ヒトＴｆＲによりよく結合したクローンＣＨ３Ｃ．３５と比較して、サル細胞への有意に高い取り込みを示した。抗ＢＡＣＥ１抗体であるＡｂ１０７をネガティブコントロールとして使用した。（ＢＡＣＥ１はＨＥＫ２９３細胞でもＭＫ２細胞でも発現されない）。抗ＴｆＲ抗体であるＡｂ２０４をポジティブコントロールとして使用した。
【図１６】ＣＨ３構造上に示されたＮＮＫウォーク残基のマップを示す（出典ＰＤＢ  ４Ｗ４Ｏ）。黒色の表面は、元のＣＨ３Ｃレジスターを示し、灰色の表面はＮＮＫウォーク構造に組み込まれた４４個の残基を示し、リボンは野生型の骨格を示す。
【図１７】ＮＮＫウォークライブラリーの３回の分取ラウンド後の濃縮された酵母集団を示す。酵母を抗ｃ−Ｍｙｃで染色し、発現（ｘ軸）、及びＴｆＲアピカルドメイン（２００ｎＭのカニクイザルまたは２００ｎＭのヒト）への結合（ｙ軸）について監視した。ここに示したデータは、両方のＴｆＲアピカルドメインのオーソログへの高い結合性を明らかに示している。
【図１８】ＣＨ３Ｃ．３５．２１変異体のＦＡＣＳデータを示す。酵母を抗ｃ−Ｍｙｃで染色し、発現（ｘ軸）、及びヒトＴｆＲアピカルドメイン（２００ｎＭ）への結合（ｙ軸）について監視した。（Ａ）クローンＣＨ３Ｃ．３５．２１のＦＡＣＳデータを示す。（Ｂ）クローンＣＨ３Ｃ．３５．２１の１１個の位置を野生型に復帰変異させるか（ＦＡＣＳプロットの上列）、または２０種類すべてのアミノ酸のＮＮＫライブラリーとして発現させた（ＦＡＣＳプロットの下列、分取を行う前）変異体のＦＡＣＳデータを示す。
【図１９】ヒト及びカニクイザルＴｆＲに結合する二価及び一価のＣＨ３ＣポリペプチドのＥＬＩＳＡによる比較を示す。（Ａ）ヒトＴｆＲに結合する二価のＣＨ３Ｃポリペプチドを示す。（Ｂ）カニクイザルＴｆＲに結合する二価のＣＨ３Ｃポリペプチドを示す。（Ｃ）ヒトＴｆＲに結合する一価のＣＨ３Ｃポリペプチドを示す。（Ｄ）カニクイザルＴｆＲに結合する一価のＣＨ３Ｃポリペプチドを示す。
【図２０】一価のＣＨ３Ｃポリペプチドの細胞結合を示す。（Ａ）２９３細胞を示す。（Ｂ）（Ａ）に示される２９３細胞に対する結合の拡大図を示す。（Ｃ）ヒトＴｆＲを安定的にトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１細胞を示す。（Ｄ）（Ｃ）に示されるヒトＴｆＲを安定的にトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１細胞に対する結合の拡大図を示す。（Ｅ）カニクイザルＴｆＲを安定的にトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１細胞を示す。
【図２１】ＨＥＫ２９３細胞内の一価及び二価ＣＨ３Ｃポリペプチドの内在化を示す。
【図２２】ＣＨ３Ｃポリペプチドの結合速度論を示す。（Ａ）ヒトＴｆＲに対するＣＨ３Ｃ．３５．Ｎ１６３の結合のデータを示す。（Ｂ）ヒトＴｆＲに対するＣＨＣ３．３５の結合のデータを示す。（Ｃ）ヒトＴｆＲに結合するＣＨＣ３．３５．Ｎ１６３の一価の結合のデータを示す。（Ｄ）ヒトＴｆＲに対するＣＨＣ３．３５の一価の結合のデータを示す。（Ｅ）カニクイザルＴｆＲに対するＣＨ３Ｃ．３５．Ｎ１６３の結合のデータを示す。（Ｆ）カニクイザルＴｆＲに対するＣＨＣ３．３５の結合のデータを示す。（Ｇ）カニクイザルＴｆＲに結合するＣＨＣ３．３５．Ｎ１６３の一価の結合のデータを示す。（Ｈ）カニクイザルＴｆＲに対するＣＨＣ３．３５の一価の結合のデータを示す。
【図２３】ＣＨ３Ｃポリペプチドの結合速度論を示す。（Ａ）ヒトＴｆＲに対するＣＨ３Ｃ．３．２−１の結合のデータを示す。（Ｂ）ヒトＴｆＲに対するＣＨ３Ｃ．３．２−５の結合のデータを示す。（Ｃ）ヒトＴｆＲに対するＣＨ３Ｃ．３．２−１９の結合のデータを示す。（Ｄ）カニクイザルＴｆＲに対するＣＨ３Ｃ．３．２−１の結合のデータを示す。（Ｅ）カニクイザルＴｆＲに対するＣＨ３Ｃ．３．２−５の結合のデータを示す。（Ｆ）カニクイザルＴｆＲに対するＣＨ３Ｃ．３．２−１９の結合のデータを示す。
【図２４】ヒトＴｆＲ細胞外ドメインの存在下（下のトレース）または非存在下（上のトレース）でのｐＨ５．５におけるＦｃＲｎに対するポリペプチド−Ｆａｂ融合体の結合を示す。（Ａ）クローンＣＨ３Ｃ．３５のデータを示す。（Ｂ）クローンＣＨ３Ｃ．３５．１９のデータを示す。（Ｃ）クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０のデータを示す。（Ｄ）クローンＣＨ３Ｃ．３５．２１のデータを示す。（Ｅ）クローンＣＨ３Ｃ．３５．２４のデータを示す。
【図２５】野生型マウスにおけるＣＨ３Ｃポリペプチドの薬物動態学（ＰＫ）分析を示す。すべてのポリペプチド−Ｆａｂ融合体は、より速いクリアランスを示したＣＨ３Ｃ．３．２−５を除き、野生型Ｆｃ−Ｆａｂ融合体（すなわち、抗ＲＳＶ抗体であるＡｂ１２２、及び抗ＢＡＣＥ１抗体であるＡｂ１５３）と同等のクリアランスを示した。
【図２６】マウスの脳組織における脳の薬物動態学／薬力学（ＰＫ／ＰＤ）データを示す。キメラｈｕＴｆＲヘテロ接合体マウス（ｎ＝４／群）に４２ｍｇ／ｋｇのＡｂ１５３または一価ＣＨ３Ｃ．３５．Ｎ１６３（「ＣＨ３Ｃ．３５．Ｎ１６３＿一価」として示される）のいずれかを静脈内投与し、野生型マウス（ｎ＝３）に５０ｍｇ／ｋｇのコントロールヒトＩｇＧ１（「ｈｕＩｇＧ１」として示される）を静脈内投与した。棒グラフは平均±ＳＤを表す。
【図２７】５０ｍｇ／ｋｇのポリペプチドによる処理の２４時間後にｈＴｆＲアピカル＋／＋マウスにみられるＩｇＧの濃度を示す。（Ａ）血漿中のＩｇＧの濃度を示す。（Ｂ）脳組織中のＩｇＧの濃度を示す。
【図２８】アミロイドβタンパク質５０（Ａβ４０）の低下により測定される、２４時間後のｈＴｆＲアピカル＋／＋マウスに投与されたポリペプチドの標的結合を示す。（Ａ）血漿中のＡβ４０濃度を示す。（Ｂ）脳組織中のＡβ４０濃度を示す。
【図２９】ＣＨ３Ｃ．３．１８ＦｃとＴｆＲアピカルドメイン（ＡＤ）の複合体のサイズ分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。レーン１：分子量マーカーレーン２：サイズ排除クロマトグラフィー後の低減されたＣＨ３Ｃ．１８Ｆｃ−ＡＤ複合体。
【図３０】本発明のポリペプチドとトランスフェリン受容体との結合を示す。（Ａ）クローンＣＨ３Ｃ．１８とトランスフェリン受容体のアピカルドメインとの結合界面を示す。（Ｂ）図３０Ａに示される結合面の拡大図を示す。
【図３１】ＣＨ３Ｃ．１８とＴｆＲアピカルドメインとの相互作用を示す。（Ａ）ＴｆＲアピカルドメイン及びＣＨ３Ｃ．１８Ｆｃの構造的構成（上）、ならびにＴｆＲアピカルドメイン及びＣＨ３Ｃ．１８Ｆｃの結合表面（５Å以内）（下）を示す。共複合体構造を解像度３．６Åで解像した。この構造では、ＣＨ３Ｃ．１８に結合したＴｆＲアピカルドメインのエピトープをみることができる。詳細には、アピカルドメインのＮ末端領域がＣＨ３Ｃ  Ｆｃ結合に関与しており、構造はＣＨ３Ｃ．１８Ｆｃ及びＴｆＲアピカルドメインの突然変異誘発データと符合している。また、ＣＨ３Ｃ．１８ライブラリーの側鎖はいずれもＴｆＲと接触している（５Å以内）。ＣＨ３Ｃ．１８ライブラリーの残基：Ｌ１５７、Ｈ１５９、Ｖ１６０、Ｗ１６１、Ａ１６２、Ｖ１６３、Ｐ１８６、Ｔ１８９、及びＷ１９４。非ライブラリー残基：Ｆ１９６及びＳ１５６。（Ｂ）ＣＨ３Ｃ．１８ＦｃとＴｆＲアピカルドメインとの主要な相互作用を示す。ＣＨ３Ｃ．１８Ｆｃ上のＷ１６１とアピカルドメイン上のＲ２０８とのカチオン−π相互作用が中心的な結合相互作用である。ＣＨ３Ｃ．１８のＷ３８８またはアピカルドメインのＲ２０８の変異は、ＣＨ３Ｃ．１８Ｆｃとアピカルドメインとの結合を妨げる。これと一致して、ヒトからカニクイザルへのＦ２０８Ｇ変異は、カニクイザルの低い親和性を説明する。更に、ヒトアピカルドメインで保存されていない残基（Ｎ２９２及びＥ２９４（カニクイザルのＫ２９２及びＤ２９４））が近くにある。したがって、ＣＨ３Ｃ．１８ＦｃのＱ１９２を変異させることでヒト結合に対してカニクイザルの結合性を選択的に高めることができる。
【図３２】本発明のポリペプチドとトランスフェリン受容体との結合を示す。（Ａ）クローンＣＨ３Ｃ．１８の残基（Ａ鎖）とトランスフェリン受容体のアピカルドメインの残基（Ｄ鎖）との間の水素結合及び非結合接触を示す。（Ｂ）クローンＣＨ３Ｃ．１８の残基（Ｂ鎖）とトランスフェリン受容体のアピカルドメインの残基（Ｃ鎖）との間の水素結合及び非結合接触を示す。
【図３３】ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４のアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４３〜３４６）のアラインメントを示す。
【図３４】本発明のポリペプチドとトランスフェリン受容体との結合を示す。（Ａ）ＴｆＲアピカルドメイン及びＣＨ３Ｃ．３５Ｆｃの構造的構成（上）、ならびにＴｆＲアピカルドメイン及びＣＨ３Ｃ．３５Ｆｃの結合表面（５Å以内）（下）を示す。共複合体構造を解像度３．４Åで解像した。この構造では、ＣＨ３Ｃ．３５に結合したＴｆＲアピカルドメインのエピトープをみることができる。ＣＨ３Ｃ．３５ライブラリーの側鎖はいずれもＴｆＲと接触している（５Å以内）。ＣＨ３Ｃ．３５ライブラリーの残基：Ｙ１５７、Ｔ１５９、Ｅ１６０、Ｗ１６１、Ｓ１６２、Ｔ１８６、Ｅ１８９、及びＷ１９４。非ライブラリー残基：Ｆ１９６、Ｓ１５６、Ｑ１９２。（Ｂ）及び（Ｃ）（Ａ）に示されるクローンＣＨ３Ｃ．３５とトランスフェリン受容体のアピカルドメインとの結合相互作用の拡大図を示す。
【図３５】（Ａ）ＣＨ３Ｃ．３５ＦｃとＴｆＲ−ＡＤとの複合体と、ＣＨ３Ｃ．１８ＦｃとＴｆＲ−ＡＤとの複合体との重ね合わせ構造を示す。（Ｂ）（Ａ）の重ね合わせ構造の拡大図を示す。
【図３６】本発明のポリペプチドとトランスフェリン受容体との結合を示す。（Ａ）クローンＣＨ３Ｃ．３５の残基（Ａ鎖）とトランスフェリン受容体のアピカルドメインの残基（Ｄ鎖）との間の水素結合及び非結合接触を示す。（Ｂ）クローンＣＨ３Ｃ．３５の残基（Ｂ鎖）とトランスフェリン受容体のアピカルドメインの残基（Ｃ鎖）との間の水素結合及び非結合接触を示す。
【図３７】カニクイザルにおけるＡｂ１５３のＦａｂドメインに融合したＣＨ３Ｃバリアントを含むＦｃ−Ｆａｂ融合ポリペプチドの血漿ＰＫ及びＡβ４０低下を示す。（Ａ）Ａｂ２１０及びＣＨ３Ｃ．３５．９：Ａｂ１５３が、コントロールのＩｇＧ（Ａｂ１２２）及びＡｂ１５３と比較してＴｆＲ媒介性のクリアランスによって、より速いクリアランスを示したことを示す。（Ｂ）いずれもＢＡＣＥ１に結合してこれを阻害するＡｂ１５３、Ａｂ２１０、及びＣＨ３Ｃ．３５．９：Ａｂ１５３が、血漿中で有意なＡβ４０の低下を示したことを示す。
【図３８】カニクイザルにおけるＡｂ１５３のＦａｂドメインに融合したＣＨ３Ｃバリアントを含むＦｃ−Ｆａｂ融合ポリペプチドによる脳脊髄液（ＣＳＦ）のＡβ及びｓＡＰＰβ／ｓＡＰＰαの有意な低下を示す。（Ａ）Ａｂ２１０及びＣＨ３Ｃ．３５．９：Ａｂ１５３を投与した動物は、Ａｂ１５３及びコントロールＩｇＧ（Ａｂ１２２）と比較してＣＳＦ中のＡβ４０の約７０％の低下を示したことを示す。（Ｂ）Ａｂ２１０及びＣＨ３Ｃ．３５．９：Ａｂ１５３を投与した動物は、Ａｂ１５３及びコントロールＩｇＧ（Ａｂ１２２）と比較してｓＡＰＰβ／ｓＡＰＰα比の約７５％の低下を示したことを示す。ｎ＝４／群。折れ線グラフは平均±ＳＥＭを表す。
【図３９】（Ａ）及び（Ｂ）は、抗ＢＡＣＥ１＿Ａｂ１５３、ＣＨ３Ｃ３５．２１：Ａｂ１５３、ＣＨ３Ｃ３５．２０：Ａｂ１５３、またはＣＨ３Ｃ３５：Ａｂ１５３ポリペプチド融合体の単回の５０ｍｇ／ｋｇの全身注射後のｈＴｆＲアピカル＋／＋ノックイン（ＫＩ）マウスの血漿（Ａ）及び脳ライセート（Ｂ）中のｈｕＩｇＧ１濃度を示す（平均±ＳＥＭ、ｎ＝５／群）。（Ｃ）は、抗ＢＡＣＥ１＿Ａｂ１５３、ＣＨ３Ｃ３５．２１：Ａｂ１５３、ＣＨ３Ｃ３５．２０：Ａｂ１５３、またはＣＨ３Ｃ３５：Ａｂ１５３ポリペプチド融合体の単回の５０ｍｇ／ｋｇの全身注射後のｈＴｆＲアピカル＋／＋ＫＩマウスの脳ライセート中の内因性マウスＡβの濃度を示す（平均±ＳＥＭ、ｎ＝５／群）。（Ｄ）は、抗ＢＡＣＥ１＿Ａｂ１５３、ＣＨ３Ｃ３５．２１：Ａｂ１５３、ＣＨ３Ｃ３５．２０：Ａｂ１５３、またはＣＨ３Ｃ３５：Ａｂ１５３ポリペプチド融合体の単回の５０ｍｇ／ｋｇの全身注射後のｈＴｆＲアピカル＋／＋ＫＩマウスの脳ライセート中のアクチンに対して正規化した脳ＴｆＲタンパク質のウェスタンブロットによる定量化を示す（平均±ＳＥＭ、ｎ＝５／群）。
【図４０】（Ａ）及び（Ｂ）は、抗ＢＡＣＥ１＿Ａｂ１５３、ＣＨ３Ｃ．３５．２３：Ａｂ１５３、またはＣＨ３Ｃ．３５．２３．３：Ａｂ１５３ポリペプチド融合体の単回の５０ｍｇ／ｋｇの全身注射後のｈＴｆＲアピカル＋／＋ＫＩマウスの血漿（Ａ）及び脳ライセート（Ｂ）中のｈｕＩｇＧ１濃度を示す（平均±ＳＥＭ、ｎ＝５／群）。（Ｃ）は、抗ＢＡＣＥ１＿Ａｂ１５３、ＣＨ３Ｃ．３５．２３：Ａｂ１５３、またはＣＨ３Ｃ．３５．２３．３：Ａｂ１５３ポリペプチド融合体の単回の５０ｍｇ／ｋｇの全身注射後のｈＴｆＲアピカル＋／＋ＫＩマウスの脳ライセート中の内因性マウスＡβの濃度を示す（平均±ＳＥＭ、ｎ＝５／群）。（Ｄ）は、抗ＢＡＣＥ１＿Ａｂ１５３、ＣＨ３Ｃ．３５．２３：Ａｂ１５３、またはＣＨ３Ｃ．３５．２３．３：Ａｂ１５３ポリペプチド融合体の単回の５０ｍｇ／ｋｇの全身注射後のｈＴｆＲアピカル＋／＋ＫＩマウスの脳ライセート中のアクチンに対して正規化した脳ＴｆＲタンパク質のウェスタンブロットによる定量化を示す（平均±ＳＥＭ、ｎ＝４／群）。
【図４１】示されるタンパク質の単回の３０ｍｇ／ｋｇ用量の投与後のカニクイザルにおける２８日間のＰＫＰＤ研究を示す。（Ａ）及び（Ｂ）は、血清中の血清ｈｕＩｇＧ１及び血漿中の血漿Ａβ濃度を示し、経時的な投与化合物の末梢曝露及び血漿Ａβ濃度に対する結果的な影響を示す。（Ｃ）及び（Ｄ）は、投与後のカニクイザルのＣＳＦ中のＡβ及びｓＡＰＰβ／ｓＡＰＰαを示す（平均±ＳＥＭ、ｎ＝４〜５／群）。
【図４２】示される各タンパク質の単回の３０ｍｇ／ｋｇ用量の投与後のカニクイザルにおける末梢血中の、投与前濃度に対する血中網状赤血球（Ａ）、絶対血清鉄濃度（Ｂ）、及び絶対赤血球数（Ｃ）を示す（平均±ＳＥＭ、ｎ＝４〜５／群）。
【図４３】１４日間にわたる単回の１０ｍｇ／ｋｇ静脈内注射後のｈＦｃＲｎノックインマウスにおける、示される各タンパク質の末梢ＰＫ分析（血漿ｈｕＩｇＧ１濃度（Ａ）及びクリアランス値（Ｂ））を示す（平均±ＳＥＭ、ｎ＝３／群）。
【図４４】ＴｆＲ結合ＣＨ３Ｃ．１８変異体の蛍光強度の中央値を示す。
【発明を実施するための形態】
【００８３】
詳細な説明
Ｉ．序論
本明細書では、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に結合するポリペプチドを開示する。本発明は、Ｆｃ領域内の特定のアミノ酸を改変することでＦｃポリペプチド内にＴｆＲに特異的な新規な結合部位を生成することができるという発見に一部基づいたものである。ＴｆＲは血液脳関門（ＢＢＢ）で高度に発現し、また、ＴｆＲはトランスフェリンを血液から脳に自然に移動させるという事実を利用して、これらのポリペプチドを用いてＢＢＢを通過して治療剤（例えば、治療ポリペプチド、Ｆａｂのような抗体可変領域、及び小分子）を輸送することができる。このアプローチは、治療剤の脳への取り込みを大幅に改善することができるため、脳への送達が効果的である障害及び疾病を治療するうえで極めて有用である。
【００８４】
一態様では、本発明は、ＣＨ３ドメインポリペプチド内の特定のアミノ酸の組を置換することでトランスフェリン受容体に結合するポリペプチドを生成することができるという発見に一部基づいたものである。したがって、一態様では、本明細書において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に１５７位、１５９位、１６０位、１６１位、１６２位、１６３位、１８６位、１８９位、及び１９４位を含むアミノ酸の組に複数の置換を有するトランスフェリン受容体結合ポリペプチドが提供される。この組のアミノ酸位置の４個〜すべての位置のうちの任意の位置を置換することができる。本開示の目的では、置換はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として決められる。したがって、あるアミノ酸は、そのアミノ酸が天然に存在するＣＨ３ドメインポリペプチド内のその位置に存在する場合であっても、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の対応する位置のアミノ酸と異なる場合には置換とみなされる。
【００８５】
更なる態様では、本明細書において、組成物をトランスフェリン受容体発現細胞にターゲティングする（例えば、組成物をその細胞に送達する、または組成物を血液脳関門のような内皮を通過して送達する）、治療方法及びトランスフェリン受容体結合ポリペプチドを使用する方法が提供される。
【００８６】
ＩＩ．定義
本明細書で使用される単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」には、内容によってそうでない旨が明確に示されない限り、複数の指示対象が含まれる。したがって、例えば、「ポリペプチド」と言った場合、２つ以上のそのような分子を含み得る、といった具合である。
【００８７】
本明細書で使用するところの「約」及び「およそ」なる用語は、数値または範囲において特定される量を修飾して用いられる場合、その数値、及び例えば±２０％、±１０％、または±５％といった、当業者には周知のその値からの妥当な偏差が、記載される値の想定される意味の範囲内にあることを示す。
【００８８】
本発明との関連で使用するところの「トランスフェリン受容体」または「ＴｆＲ」とは、トランスフェリン受容体タンパク質１のことを指す。ヒトトランスフェリン受容体１のポリペプチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８に記載されている。他の種由来のトランスフェリン受容体タンパク質１の配列も知られている（例えば、チンパンジー（アクセッション番号ＸＰ＿００３３１０２３８．１）、アカゲザル（ＮＰ＿００１２４４２３２．１）、イヌ（ＮＰ＿００１００３１１１．１）、ウシ（ＮＰ＿００１１９３５０６．１）、マウス（ＮＰ＿０３５７６８．１）、ラット（ＮＰ＿０７３２０３．１）、及びニワトリ（ＮＰ＿９９０５８７．１））。「トランスフェリン受容体」なる用語には、トランスフェリン受容体タンパク質１の染色体座の遺伝子によってコードされる例示的な参照配列（例えばヒト配列）の対立遺伝子変異体も包含される。完全長のトランスフェリン受容体タンパク質は、短いＮ末端細胞内領域、膜貫通領域、及び大きな細胞外ドメインを含んでいる。細胞外ドメインは、プロテアーゼ様ドメイン、螺旋状ドメイン、及びアピカルドメインの３つのドメインによって特徴付けられる。ヒトトランスフェリン受容体１のアピカルドメイン配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０に記載されている。
【００８９】
本明細書で使用するところの「ＣＨ３ドメイン」及び「ＣＨ２ドメイン」なる用語は、免疫グロブリンの定常領域ドメインポリペプチドのことを指す。ＩｇＧ抗体との関連において、ＣＨ３ドメインポリペプチドとは、ＥＵ番号付けスキームに従って番号付けした場合に約３４１位〜約４４７位のアミノ酸のセグメントのことを指し、ＣＨ２ドメインポリペプチドとは、ＥＵ番号付けスキームに従って番号付けした場合に約２３１位〜約３４０位のアミノ酸のセグメントのことを指す。ＣＨ２及びＣＨ３ドメインポリペプチドは、ＩＭＧＴ（ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ）番号付けスキームによって番号付けすることもでき、その場合、ＩＭＧＴ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｃｈａｒｔ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ（ＩＭＧＴウェブサイト）に従えば、ＣＨ２ドメインの番号付けは１〜１１０であり、ＣＨ３ドメインの番号付けは１〜１０７である。ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、免疫グロブリンのＦｃ領域の一部である。ＩｇＧ抗体との関連において、Ｆｃ領域とは、ＥＵ番号付けスキームに従って番号付けした場合に、約２３１位〜約４４７位までのアミノ酸のセグメントのことを指す。本明細書で使用するところの「Ｆｃ領域」なる用語は、抗体のヒンジ領域の少なくとも一部も含み得る。例示的なヒンジ領域配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７に記載されている。
【００９０】
ＣＨ３及びＣＨ２ドメインに関して「野生型」、「天然」、及び「天然に存在する」なる用語は、本明細書では、天然に存在する配列を有するドメインのことを指して用いられる。
【００９１】
本発明との関連において、突然変異体ポリペプチドまたは突然変異体ポリヌクレオチドに関して「突然変異体」なる用語は、「変異体」と互換的に用いられる。所定の野生型ＣＨ３またはＣＨ２ドメイン参照配列に関して、変異体は、天然に存在する対立遺伝子変異体を含むことができる。「天然に存在しない」ＣＨ３またはＣＨ２ドメインとは、自然界で細胞内に存在せず、天然ＣＨ３ドメインまたはＣＨ２ドメインのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの遺伝子改変（例えば、遺伝子操作技術または突然変異導入法を用いた）によって生成される変異体または突然変異体ドメインのことを指す。「変異体」は、野生型に対して少なくとも１つのアミノ酸変異を含むあらゆるドメインを含む。突然変異は、置換、挿入、及び欠失を含み得る。
【００９２】
「アミノ酸」なる用語は、天然に存在するアミノ酸及び合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体のことを指す。
【００９３】
天然に存在するアミノ酸とは、遺伝子コードによってコードされるもの、及び、例えばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、及びＯ−ホスホセリンなどの後で修飾されたアミノ酸である。「アミノ酸類似体」とは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造（すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基に結合したα炭素）を有する化合物（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムなど）のことを指す。かかる類似体は、修飾されたＲ基（例えばノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造を保持している。「アミノ酸模倣体」とは、アミノ酸の一般的化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様に機能する化合物のことを指す。
【００９４】
天然に存在するα−アミノ酸としては、これらに限定されるものではないが、アラニン（Ａｌａ）、システイン（Ｃｙｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、アルギニン（Ａｒｇ）、リシン（Ｌｙｓ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、プロリン（Ｐｒｏ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、バリン（Ｖａｌ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、及びこれらの組み合わせが挙げられる。天然に存在するα−アミノ酸の立体異性体としては、これらに限定されるものではないが、Ｄ−アラニン（Ｄ−Ａｌａ）、Ｄ−システイン（Ｄ−Ｃｙｓ）、Ｄ−アスパラギン酸（Ｄ−Ａｓｐ）、Ｄ−グルタミン酸（Ｄ−Ｇｌｕ）、Ｄ−フェニルアラニン（Ｄ−Ｐｈｅ）、Ｄ−ヒスチジン（Ｄ−Ｈｉｓ）、Ｄ−イソロイシン（Ｄ−Ｉｌｅ）、Ｄ−アルギニン（Ｄ−Ａｒｇ）、Ｄ−リシン（Ｄ−Ｌｙｓ）、Ｄ−ロイシン（Ｄ−Ｌｅｕ）、Ｄ−メチオニン（Ｄ−Ｍｅｔ）、Ｄ−アスパラギン（Ｄ−Ａｓｎ）、Ｄ−プロリン（Ｄ−Ｐｒｏ）、Ｄ−グルタミン（Ｄ−Ｇｌｎ）、Ｄ−セリン（Ｄ−Ｓｅｒ）、Ｄ−スレオニン（Ｄ−Ｔｈｒ）、Ｄ−バリン（Ｄ−Ｖａｌ）、Ｄ−トリプトファン（Ｄ−Ｔｒｐ）、Ｄ−チロシン（Ｄ−Ｔｙｒ）、及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【００９５】
本明細書では、アミノ酸は、それらの一般的に知られる３文字記号によるか、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会により推奨される１文字記号で呼称される。
【００９６】
「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」なる用語は、本明細書ではアミノ酸残基のポリマーを呼称するうえで互換的に使用される。かかる用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学模倣体であるようなアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマー及び天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用される。アミノ酸ポリマーは、全体がＬ−アミノ酸であってもよいか、全体がＤ−アミノ酸であってもよいか、またはＬ−アミノ酸とＤ−アミノ酸との混合物であってもよい。
【００９７】
「保存的置換」、「保存的変異」、または「保存的に改変された変異体」なる用語は、あるアミノ酸の、類似の特性を有するものとして分類され得る別のアミノ酸による置換を生じる変化のことを指す。このようにして定義される保存的アミノ酸のグループのカテゴリーの例としては、Ｇｌｕ（グルタミン酸またはＥ）、Ａｓｐ（アスパラギン酸またはＤ）、Ａｓｎ（アスパラギンまたはＮ）、Ｇｌｎ（グルタミンまたはＱ）、Ｌｙｓ（リシンまたはＫ）、Ａｒｇ（アルギニンまたはＲ）、及びＨｉｓ（ヒスチジンまたはＨ）を含む「荷電／極性基」；Ｐｈｅ（フェニルアラニンまたはＦ）、Ｔｙｒ（チロシンまたはＹ）、Ｔｒｐ（トリプトファンまたはＷ）、及び（ヒスチジンまたはＨ）を含む「芳香族基」；ならびに、Ｇｌｙ（グリシンまたはＧ）、Ａｌａ（アラニンまたはＡ）、Ｖａｌ（バリンまたはＶ）、Ｌｅｕ（ロイシンまたはＬ）、Ｉｌｅ（イソロイシンまたはＩ）、Ｍｅｔ（メチオニンまたはＭ）、Ｓｅｒ（セリンまたはＳ）、Ｔｈｒ（スレオニンまたはＴ）、及びＣｙｓ（システインまたはＣ）を含む「脂肪族基」を挙げることができる。各グループ内にサブグループを特定することもできる。例えば、荷電または極性アミノ酸のグループは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓを含む「正に荷電したサブグループ」、Ｇｌｕ及びＡｓｐを含む「負に荷電したサブグループ」、ならびにＡｓｎ及びＧｌｎを含む「極性サブグループ」を含むサブグループに更に分割することができる。別の例では、芳香族または環状基を、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ及びＴｒｐを含む「窒素環サブグループ」、ならびにＰｈｅ及びＴｙｒを含む「フェニルサブグループ」を含むサブグループに更に分割することができる。更に別の例では、脂肪族基を、例えば、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、及びＡｌａを含む「脂肪族非極性サブグループ」、ならびにＭｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、及びＣｙｓを含む「脂肪族弱極性サブグループ」などのサブグループに更に分割することができる。保存的変異のカテゴリーの例としては、上記のサブグループ内のアミノ酸のアミノ酸置換、例えば、これらに限定されるものではないが、正電荷を維持できるようにＬｙｓをＡｒｇに、またはその逆；負電荷を維持できるようにＧｌｕをＡｓｐに、またはその逆；遊離−ＯＨを維持できるようにＳｅｒをＴｈｒに、またはその逆；遊離−ＮＨ２を維持できるようにＧｌｎをＡｓｎに、またはその逆が挙げられる。いくつかの実施形態では、例えば活性部位において疎水性アミノ酸を天然に存在する疎水性アミノ酸に置換することで疎水性が保たれる。
【００９８】
２個以上のポリペプチド配列との関連で「同一」または「同一性」なる用語は、配列比較アルゴリズムを用いて、またはマニュアルアラインメント及び目視による検査により測定した場合に比較ウインドウ、または指定された領域にわたって最大の一致となるように比較及びアラインした場合に特定の領域にわたって同じであるか、または例えば、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％もしくはそれ以上一致しているアミノ酸残基の特定の割合（％）を有する２個以上の配列またはサブ配列のことを指す。
【００９９】
ポリペプチドの配列比較では、一般的に１つのアミノ酸配列が、候補配列を比較する参照配列の役割を果たす。例えば、視覚的アラインメントまたは既知のアルゴリズムを用いた公開されているソフトウェアを使用するなど、当業者に利用可能な様々な方法を用いてアラインメントを行って最大のアラインメントを得ることができる。かかるプログラムとしては、ＢＬＡＳＴプログラム、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ．）、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）が挙げられる。最大のアラインメントを得るためにアラインメントで用いられるパラメータは、当業者によって決めることができる。本出願の目的におけるポリペプチド配列の配列比較では、デフォルトのパラメータを用いて２個のタンパク質配列をアラインするためのＢＬＡＳＴＰアルゴリズムの標準タンパク質ＢＬＡＳＴを用いる。
【０１００】
あるポリペプチド配列中の所定のアミノ酸残基を特定することとの関連で使用される場合、「〜に対応する」、「〜を基準として決められる」、または「〜を基準として番号付けされる」なる用語は、所定のアミノ酸配列を特定の参照配列と最大限アラインして比較した場合にその参照配列の残基の位置を指す。したがって、例えば、あるポリペプチド中のアミノ酸残基は、その残基が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と最適にアラインされた場合にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１中のそのアミノ酸とアラインする際にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸１１４〜２２０の領域中のアミノ酸に「対応する」。参照配列とアラインされるポリペプチドは、参照配列と同じ長さである必要はない。
【０１０１】
本明細書で使用するところの「結合親和性」とは、２個の分子間、例えばポリペプチドの１個の結合部位とポリペプチドが結合する標的、例えばトランスフェリン受容体との間の非共有結合相互作用の強さのことを指す。したがって、例えば、この用語は、特に示されないかまたは文脈から明らかでない限り、ポリペプチドとその標的との間の１：１の相互作用のことを指す場合がある。結合親和性は、解離速度定数（ｋｄ、時間−１）を結合速度定数（ｋａ、時間−１Ｍ−１）で割ったもののことを指す平衡解離定数（ＫＤ）を測定することにより定量化することができる。ＫＤは、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）システムなどの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法；ＫｉｎＥｘＡ（登録商標）などのカイネティック排除アッセイ；及びバイオレイヤー干渉法（例えば、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）Ｏｃｔｅｔ（登録商標）プラットフォームを使用）を使用して、複合体形成及び解離の速度論を測定することによって求めることができる。本明細書で使用するところの「結合親和性」には、ポリペプチドとその標的と間の１：１の相互作用を反映したもののように正式な結合親和性だけでなく、強い結合を反映し得るＫＤが計算された見かけ上の親和性も含まれる。
【０１０２】
本明細書に記載される改変ＣＨ３ドメインを含むポリペプチドについて言う場合、標的、例えばＴｆＲに「特異的に結合する」または「選択的に結合する」なる用語は、そのポリペプチドが、構造的に異なる標的と結合するよりも強いアフィニティー、より強いアビディティー、及び／またはより長い時間で標的と結合する結合反応のことを指す。典型的な実施形態では、ポリペプチドは、同じ親和性アッセイ条件下でアッセイした場合に無関係の標的と比較して特定の標的、例えばＴｆＲに対して少なくとも５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍、１００倍、１０００倍、１００００倍、またはそれよりも高い親和性を有する。本明細書で使用するところの特定の標的（例えば、ＴｆＲ）「特異的結合」、「に特異的に結合する」、または「に対して特異的である」なる用語は、例えば、結合する標的に対する平衡解離定数ＫＤが例えば、１０−４Ｍ以下、例えば、１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、または１０−１２Ｍである分子によって示され得る。いくつかの実施形態では、改変されたＣＨ３ドメインポリペプチドは、種間で保存されている（例えば、種間で構造的に保存されている）、例えば、非ヒト霊長類とヒト種との間で保存されている（例えば、非ヒト霊長類とヒト種との間で構造的に保存されている）ＴｆＲのエピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはヒトＴｆＲだけに結合することができる。
【０１０３】
本明細書で互換的に使用される「対象」、「個人」、及び「患者」なる用語は、これらに限定されるものではないが、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類（例えば、ラット、マウス、及びモルモット）、ウサギ、ウシ、ブタ、ウマ、及び他の哺乳動物種を含む哺乳動物のことを指す。一実施形態では、患者はヒトである。
【０１０４】
「治療」、「治療する」、及びこれに類する用語は、本明細書では、所望の薬理学的及び／または生理学的作用を得ることを一般的に意味して用いられる。「治療する」または「治療」は、軽減、寛解、患者の生存率の改善、生存期間もしくは生存率の増大、症状の消失または傷害、疾患、もしくは状態を患者にとってより耐容できるものとすること、変性もしくは低下の速度の遅延、または患者の物理的もしくは精神的な健康の改善などのあらゆる客観的もしくは主観的なパラメータを含む、傷害、疾患、または状態の治療もしくは改善における奏功のあらゆる兆候のことを指す場合がある。症状の治療または改善は、客観的または主観的なパラメータに基づいたものであってよい。治療の効果は、治療を受けていない個人または個人の集団と、または治療前もしくは治療期間の異なる時点において同じ患者と比較することができる。
【０１０５】
「薬学的に許容される賦形剤」とは、これらに限定されないが、バッファー、担体、または防腐剤などの、ヒトまたは動物における使用に生物学的または薬理学的に適合した非活性医薬成分のことを指す。
【０１０６】
本明細書で使用するところの薬剤の「治療量」または「治療有効量」とは、対象の疾患の症状を治療、緩和、軽減、またはその重症度を低減する薬剤の量である。薬剤の「治療量」または「治療有効量」は、患者の生存率を改善し、生存期間もしくは生存率を増大させ、症状を消失させ、傷害、疾患、もしくは状態をより耐容できるものとし、変性もしくは低下の速度を遅くし、または患者の物理的もしくは精神的な健康を改善することができる。
【０１０７】
「投与する」なる用語は、薬剤、化合物、または組成物を生物学的作用が望ましい部位に送達する方法のことを指す。これらの方法としては、これらに限定されるものではないが、局所投与、非経口投与、静脈内投与、皮内投与、筋肉内投与、髄腔内投与、結腸投与、直腸投与、または腹腔内投与が挙げられる。一実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは静脈内投与される。
【０１０８】
ＩＩＩ．トランスフェリン受容体結合ポリペプチド
このセクションでは、トランスフェリン受容体に結合し、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過して輸送されることが可能な、本発明によるポリペプチドの作製について述べる。
【０１０９】
一態様では、ポリペプチドがトランスフェリン受容体に特異的に結合することを可能とするような改変を有するＣＨ３ドメインを含むポリペプチドが提供される。かかる改変は、ＣＨ３ドメインの表面に存在する特定のアミノ酸の組に導入される。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインを含むポリペプチドは、トランスフェリン受容体のアピカルドメイン内のエピトープに特異的に結合する。
【０１１０】
当業者には、例えばＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤなどの他の免疫グロブリンアイソタイプのＣＨ３ドメインを、これらのドメイン内で上記に述べた特定のアミノ酸の組に対応するアミノ酸を特定することにより同様に改変することができる点は理解される。改変は、例えば、非ヒト霊長類、サル、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ブタ、ニワトリなどの他の種に由来する免疫グロブリンからの対応するドメインに行うこともできる。
【０１１１】
ＣＨ３トランスフェリン受容体結合ポリペプチド
いくつかの実施形態では、改変されるドメインはＩｇＧのＣＨ３ドメインのようなヒトＩｇのＣＨ３ドメインである。ＣＨ３ドメインは、いずれのＩｇＧのサブタイプ、すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４から得られるものであってもよい。ＩｇＧ抗体との関連において、ＣＨ３ドメインとは、ＥＵ番号付けスキームに従って番号付けした場合に、約３４１位〜約４４７位までのアミノ酸のセグメントのことを指す。トランスフェリン受容体結合のための対応するアミノ酸位置の組を特定する目的でのＣＨ３ドメイン内の位置は、特に指定されない限り、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３を基準として決められるか、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸１１４〜２２０を基準として決められる。置換もまた、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として決められ、すなわち、あるアミノ酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の対応する位置のアミノ酸に対して置換であるとみなされる。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１は、部分的なヒンジ領域の配列であるＰＣＰをアミノ酸１〜３として含んでいる。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準としたＣＨ３ドメイン内の位置の番号付けは、これらの最初の３個のアミノ酸を含む。
【０１１２】
上記に述べたように、本発明に基づいて改変することができるＣＨ３ドメインの残基の組は、本明細書ではＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けされる。例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のＣＨ３ドメインなどの任意のＣＨ３ドメインが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の記載される位置の残基に対応する残基の組に改変（例えばアミノ酸置換）を有することができる。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヒトＩｇＧ１のアミノ酸配列とヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４とのアラインメントを図３３に示す。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の任意の特定の位置に対応するＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４の配列のそれぞれの位置は容易に決めることができる。
【０１１３】
一実施形態では、トランスフェリン受容体に特異的に結合する改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、トランスフェリン受容体のアピカルドメインと、完全長のヒトトランスフェリン受容体配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）の２０８位を含むエピトープにおいて結合するが、この位置は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０に記載されるヒトトランスフェリン受容体のアピカルドメイン配列の１１位に対応している。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０は、ヒトトランスフェリン受容体１のユニプロテイン（ｕｎｉｐｒｏｔｅｉｎ）配列Ｐ０２７８６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）のアミノ酸１９８〜３７８に対応している。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、トランスフェリン受容体のアピカルドメインと、完全長のヒトトランスフェリン受容体配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）の１５８、１８８、１９９、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、及び／または２９４位を含むエピトープにおいて結合する。改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、受容体に対するトランスフェリンの結合をブロックまたは他の形で阻害することなくトランスフェリン受容体に結合し得る。いくつかの実施形態では、トランスフェリンのＴｆＲに対する結合は、実質的に阻害されない。いくつかの実施形態では、トランスフェリンのＴｆＲに対する結合は、約５０％未満（例えば、約４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％未満）阻害される。いくつかの実施形態では、トランスフェリンのＴｆＲに対する結合は、約２０％未満（例えば、約１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％未満）阻害される。このような結合特異性を示す例示的なＣＨ３ドメインポリペプチドとしては、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸１１４〜２２０を基準として決めた場合に１５７、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１８６、１８９、及び１９４位にアミノ酸置換を有するポリペプチドが挙げられる。
【０１１４】
ＣＨ３のトランスフェリン受容体と結合する組：１５７、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１８６、１８９、及び１９４
いくつかの実施形態では、本発明による改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１５７位、１５９位、１６０位、１６１位、１６２位、１６３位、１８６位、１８９位、及び１９４位を含むアミノ酸位置の組に少なくとも３個または少なくとも４個、一般的には５個、６個、７個、８個、または９個の置換を含む。これらの位置に導入することができる例示的な置換を表１に示す。いくつかの実施形態では、１６１及び／または１９４位のアミノ酸は芳香族アミノ酸（例えば、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、またはＴｙｒ）である。いくつかの実施形態では、１６１位のアミノ酸はＴｒｐである。いくつかの実施形態では、１６１位のアミノ酸はＧｌｙである。いくつかの実施形態では、１９４位の芳香族アミノ酸はＴｒｐまたはＰｈｅである。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、トランスフェリン受容体に特異的に結合する改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、以下のようなＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対する置換を有する少なくとも１つの位置を含む。すなわち、１５７位にＬｅｕ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、またはＶａｌ；１５９位にＬｅｕ、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、またはＰｒｏ；１６０位にＶａｌ、Ｐｒｏ、または酸性アミノ酸；１６１位に芳香族アミノ酸、例えばＴｒｐまたはＧｌｙ（例えばＴｒｐ）；１６２位にＶａｌ、Ｓｅｒ、またはＡｌａ；１８６位に酸性アミノ酸、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、またはＰｒｏ；１８９位にＴｈｒまたは酸性アミノ酸；または１９４位にＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、またはＰｈｅ。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、上記の組の中の位置の１つ以上において特定のアミノ酸の保存的置換、例えば、同じ電荷に基づくグループ分け、疎水性に基づくグループ分け、側鎖の環構造に基づくグループ分け（例えば、芳香族アミノ酸）、またはサイズに基づくグループ分け、及び／または極性かまたは非極性かによるグループ分けの中のアミノ酸を含み得る。したがって、例えば、Ｉｌｅが１５７位、１５９位、及び／または１８６位に存在してよい。いくつかの実施形態では、１６０、１８６、及び１８９位のうちの１つ、２つ、またはそれぞれにおける酸性アミノ酸はＧｌｕである。他の実施形態では、１６０、１８６、及び１８９位のうちの１つ、２つ、またはそれぞれにおける酸性アミノ酸はＡｓｐである。いくつかの実施形態では、１５７、１５９、１６０、１６１、１６２、１８６、１８９、及び１９４位のうちの２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つすべてがこのパラグラフで指定されるアミノ酸置換を有する。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１６３位に天然のＡｓｎを含む。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１６３位にＧｌｙ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、またはＡｓｐを含む。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１５３、１６４、１６５、及び１８８を含む位置に１個、２個、３個、または４個の置換を更に含む。いくつかの実施形態では、１５３位にＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、またはＧｌｎが存在してよい。いくつかの実施形態では、１６４位にＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、またはＰｈｅが存在してよい。いくつかの実施形態では、１６５位にＧｌｎ、Ｐｈｅ、またはＨｉｓが存在してよい。いくつかの実施形態では、１８８位にＧｌｎが存在してよい。
【０１１７】
特定の実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは以下のうちから選択される２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の位置を含む。すなわち、１５３位にＴｒｐ、Ｌｅｕ、またはＧｌｕ；１５７位にＴｙｒまたはＰｈｅ；１５９位にＴｈｒ；１６０位にＧｌｕ；１６１位にＴｒｐ；１６２位にＳｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、またはＡｓｎ；１６３位にＳｅｒまたはＡｓｎ；１８６位にＴｈｒまたはＳｅｒ；１８８位にＧｌｕまたはＳｅｒ；１８９位にＧｌｕ；及び／または１９４位にＰｈｅ。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは以下、すなわち、１５３位にＴｒｐ、Ｌｅｕ、またはＧｌｕ；１５７位にＴｙｒまたはＰｈｅ；１５９位にＴｈｒ；１６０位にＧｌｕ；１６１位にＴｒｐ；１６２位にＳｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、またはＡｓｎ；１６３位にＳｅｒまたはＡｓｎ；１８６位にＴｈｒまたはＳｅｒ；１８８位にＧｌｕまたはＳｅｒ；１８９位にＧｌｕ；及び／または１９４位にＰｈｅの１１個の位置のすべてを含む。
【０１１８】
特定の実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１５７位にＬｅｕまたはＭｅｔを、１５９位にＬｅｕ、Ｈｉｓ、またはＰｒｏを、１６０位にＶａｌを、１６１位にＴｒｐを、１６２位にＶａｌまたはＡｌａを、１８６位にＰｒｏを、１８９位にＴｈｒを、及び／または１９４位にＴｒｐを含む。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１６４位にＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、またはＰｈｅを更に含む。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１５３位にＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、またはＧｌｎを、及び／または１６５位にＧｌｎ、Ｐｈｅ、またはＨｉｓを更に含む。いくつかの実施形態では、１５３位にＴｒｐが存在し、及び／または１６５位にＧｌｎが存在する。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１５３位にＴｒｐを有さない。
【０１１９】
他の実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１５７位にＴｙｒを、１５９位にＴｈｒを、１６０位にＧｌｕまたはＶａｌを、１６１位にＴｒｐを、１６２位にＳｅｒを、１８６位にＳｅｒまたはＴｈｒを、１８９位にＧｌｕを、及び／または１９４位にＰｈｅを含む。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１６３位に天然のＡｓｎを含む。特定の実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１５３位にＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、またはＧｌｎを、及び／または１８８位にＧｌｕを更に含む。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１５３位にＴｒｐを、及び／または１８８位にＧｌｕを更に含む。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、以下の置換のうちの１つ以上を含む。すなわち、１５３位にＴｙｒ、１５９位にＴｈｒ、１６１位にＴｒｐ、１６２位にＶａｌ、１８６位にＳｅｒまたはＴｈｒ、１８８位にＧｌｕ、及び／または１９４位にＰｈｅ。
【０１２１】
更なる実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは以下、すなわち、１８７位がＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、またはＰｒｏ、１９７位がＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、またはＬｙｓ、及び１９９位がＳｅｒ、Ｔｒｐ、またはＧｌｙ、から選択される１つ、２つ、または３つの位置を更に含む。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、トランスフェリン受容体に特異的に結合する改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜２９、３９〜１０２、及び１８２〜１９５のうちのいずれか１つのアミノ酸１１４〜２２０との少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、かかる改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜２９、３９〜１０２、及び１８２〜１９５のうちのいずれか１つのアミノ酸１５７〜１６３及び／または１８６〜１９４を含む。いくつかの実施形態では、かかる改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜２９、３９〜１０２、及び１８２〜１９５のうちのいずれか１つのアミノ酸１５３〜１６３及び／または１８６〜１９４を含む。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜２９、３９〜１０２、及び１８２〜１９５のうちのいずれか１つのアミノ酸１５３〜１６３及び／または１８６〜１９９を含む。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、トランスフェリン受容体に特異的に結合する改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、同一性パーセントが１５７位、１５９位、１６０位、１６１位、１６２位、１６３位、１８６位、１８９位、及び１９４位の組を含まないことを条件として、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸１１４〜２２０との少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜２９、３９〜１０２、及び１８２〜１９５のいずれか１つに記載されるアミノ酸１５７〜１６３及び／またはアミノ酸１８６〜１９４を含む。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜２９、３９〜１０２、及び１８２〜１９５のうちのいずれか１つの１５３、１５７、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９４、１９７、及び１９９位に対応する位置のうちの少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６個が欠失も置換もされていないことを条件として、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜２９、３９〜１０２、及び１８２〜１９５のうちのいずれか１つとの少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有する。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜２９、３９〜１０２、及び１８２〜１９５のうちのいずれか１つとの少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有し、また、以下の位置、すなわち、１５３位にＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、またはＧｌｕ；１５７位にＬｅｕ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、またはＶａｌ；１５９位にＬｅｕ、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、またはＰｒｏ；１６０位にＶａｌ、Ｐｒｏ、または酸性アミノ酸；１６１位に芳香族アミノ酸、例えばＴｒｐ；１６２位にＶａｌ、Ｓｅｒ、またはＡｌａ；１６３位にＳｅｒまたはＡｓｎ；１６４位にＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、またはＰｈｅ；１６５位にＧｌｎ、Ｐｈｅ、またはＨｉｓ；１８６位に酸性アミノ酸、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、またはＰｒｏ；１８７位にＬｙｓ、Ａｒｇ、ＧｌｙまたはＰｒｏ；１８８位にＧｌｕまたはＳｅｒ；１８９位にＴｈｒまたは酸性アミノ酸；１９４位にＴｒｐ、Ｔｙｒ、ＨｉｓまたはＰｈｅ；１９７位にＳｅｒ、Ｔｈｒ、ＧｌｕまたはＬｙｓ；及び、１９９位にＳｅｒ、Ｔｒｐ、またはＧｌｙのうちの少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６個を含む。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、本発明による改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１５３位、１５７位、１５９位、１６０位、１６２位、１６３位、１８６位、１８８位、１８９位、１９４位、１９７位、及び１９９位含むアミノ酸位置の組に１つ以上の置換を含み、ただし、置換及び位置はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の配列を基準として決められる。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインは、１５３位にＧｌｕ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒを、１５７位に芳香族アミノ酸（例えば、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、またはＴｒｐ）、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、またはＶａｌを、１５９位にＴｈｒ、Ａｓｎ、またはＶａｌを、１６０位にＧｌｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、またはＶａｌを、１６２位に脂肪族アミノ酸（例えば、Ａｌａ、Ｉｌｅ、またはＶａｌ）、Ｓｅｒ、またはＴｈｒを、１６３位にＳｅｒ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、またはＴｈｒを、１８６位にＴｈｒ、Ｈｉｓ、またはＳｅｒを、１８８位にＧｌｕ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、またはＡｒｇを、１８９位にＧｌｕ またはＡｒｇを、１９４位にＰｈｅ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、またはＴｒｐを、１９７位にＳｅｒ、Ｔｈｒ、またはＴｒｐを、かつ、１９９位にＳｅｒ、Ｃｙｓ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、またはＴｒｐを含む。特定の実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１６の配列を含むことができる。特定の実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１４の配列を含むことができる。特定の実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１５の配列を含むことができる。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１５３位にＧｌｕ、Ｌｅｕ、またはＴｒｐを、１５７位に芳香族アミノ酸を、１５９位にＴｈｒを、１６０位にＧｌｕを、１６２位に脂肪族アミノ酸またはＳｅｒを、１６３位にＳｅｒまたはＡｓｎを、１８６位にＴｈｒまたはＳｅｒを、１８８位にＧｌｕまたはＳｅｒを、１８９位にＧｌｕを、１９４位にＰｈｅ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、またはＴｒｐを、１９７位にＳｅｒを、１９９位にＳｅｒを含み、ただし、置換及び位置はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３を基準として決められる。具体的な実施形態では、１５７位の芳香族アミノ酸はＴｙｒまたはＰｈｅであり、１６２位の脂肪族アミノ酸はＡｌａまたはＶａｌである。特定の実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１９の配列を含むことができる。特定の実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１７の配列を含むことができる。特定の実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１８の配列を含むことができる。
【０１２８】
更なる実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１５３位にＧｌｕ、Ｌｅｕ、またはＴｒｐを、１５７位にＴｙｒまたはＰｈｅを、１５９位にＴｈｒを、１６０位にＧｌｕを、１６２位にＡｌａ、Ｖａｌ、またはＳｅｒを、１６３位にＳｅｒまたはＡｓｎを、１８６位にＴｈｒまたはＳｅｒを、１８８位にＧｌｕまたはＳｅｒを、１８９位にＧｌｕを、１９４位にＰｈｅを、１９７位にＳｅｒを、１９９位にＳｅｒを含むことができ、ただし、置換及び位置はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３を基準として決められる。特定の実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２２の配列を含むことができる。特定の実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２０の配列を含むことができる。特定の実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２１の配列を含むことができる。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、本発明による改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１５３位、１５７位、１５９位、１６０位、１６２位、１６３位、１８６位、１８８位、１８９位、１９４位、１９７位、及び１９９位を含むアミノ酸位置の組に１つのみの置換を含み、各置換及び各位置はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１の配列を基準として決められる。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１５３位にＧｌｕ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒを含む。改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１５３位にＧｌｕを含むことができる。改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１５３位にＬｅｕを含むことができる。改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１５３位にＳｅｒを含むことができる。改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１５３位にＶａｌを含むことができる。改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１５３位にＴｒｐを有することができる。改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１５３位にＴｙｒを含むことができる。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１５７位にＴｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、またはＶａｌを含む。改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１５７位にＴｙｒを含むことができる。改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１５７位にＰｈｅを含むことができる。改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１５７位にＴｒｐを含むことができる。改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１５７位にＭｅｔを含むことができる。改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１５７位にＰｒｏを含むことができる。改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１５７位にＶａｌを含むことができる。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１５９位にＴｈｒ、Ａｓｎ、またはＶａｌを含む。改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１５９位にＴｈｒを含むことができる。改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１５９位にＡｓｎを含むことができる。改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１５９位にＶａｌを含むことができる。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１６０位にＧｌｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、またはＶａｌを含む。改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１６０位にＧｌｕを含むことができる。改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１６０位にＩｌｅを含むことができる。改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１６０位にＰｒｏを含むことができる。改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１６０位にＶａｌを含むことができる。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１６２位にＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒを含む。改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１６２位にＡｌａを含むことができる。改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１６２位にＩｌｅを含むことができる。改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１６２位にＶａｌを含むことができる。改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１６２位にＳｅｒを含むことができる。改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１６２位にＴｈｒを含むことができる。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１６３位にＳｅｒ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、またはＴｈｒを含む。改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、��６３位にＳｅｒを含むことができる。改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１６３位にＡｓｎを含むことができる。改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１６３位にＡｒｇを含むことができる。改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１６３位にＴｈｒを含むことができる。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１８６位にＴｈｒ、Ｈｉｓ、またはＳｅｒを含む。改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１８６位にＴｈｒを含むことができる。改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１８６位にＨｉｓを含むことができる。改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１８６位にＳｅｒを含むことができる。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１８８位にＧｌｕ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、またはＡｒｇを含む。改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１８８位にＧｌｕを含むことができる。改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１８８位にＳｅｒを含むことができる。改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１８８位にＡｓｐを含むことができる。改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１８８位にＧｌｙを含むことができる。改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１８８位にＴｈｒを含むことができる。改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１８８位にＰｒｏを含むことができる。改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１８８位にＧｌｎを含むことができる。改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１８８位にＡｒｇを含むことができる。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１８９位にＧｌｕ、またはＡｒｇを含む。改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１８９位にＧｌｕを含むことができる。改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１８９位にＡｒｇを含むことができる。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１９４位にＰｈｅ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、またはＴｒｐを含む。改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１９４位にＰｈｅを含むことができる。改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１９４位にＨｉｓを含むことができる。改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１９４位にＬｙｓを含むことができる。改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１９４位にＴｙｒを含むことができる。改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１９４位にＴｒｐを含むことができる。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１９７位にＳｅｒ、Ｔｈｒ、またはＴｒｐを含む。改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１９７位にＳｅｒを含むことができる。改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１９７位にＴｈｒを含むことができる。改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１９７位にＴｒｐを含むことができる。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１９９位にＳｅｒ、Ｃｙｓ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、またはＴｒｐを含む。改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１９９位にＳｅｒを含むことができる。改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１９９位にＣｙｓを含むことができる。改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１９９位にＰｒｏを含むことができる。改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１９９位にＭｅｔを含むことができる。改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１９９位にＴ��ｐを含むことができる。改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２３〜３３４のうちのいずれか１つの配列を有することができる。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、本発明による改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１５３位、１５７位、１５９位、１６０位、１６２位、１６３位、１６４位、１８６位、１８９位、及び１９４位を含むアミノ酸位置の組に１つ以上の置換を含み、置換及び位置はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９の配列を基準として決められる。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインは、１５３位にＧｌｕまたはＴｒｐを、１５７位にＶａｌ、Ｔｒｐ、Ｌｅｕ、またはＴｙｒを、１５９位にＬｅｕ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、またはＨｉｓを、１６０位にＰｒｏ、Ｖａｌ、またはＧｌｕを、１６２位にＡｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、またはＧｌｙを、１６３位にＬｅｕ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、またはＧｌｕを、１６４位にＴｈｒ、Ｐｈｅ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、またはＴｙｒを、１８６位にＬｅｕ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、またはＰｒｏを、１８９位にＧｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、またはＡｓｎを、かつ、１９４位にＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、またはＨｉｓを含む。特定の実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３７の配列を含むことができる。特定の実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３５の配列を含むことができる。特定の実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３６の配列を含むことができる。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１５３位にＧｌｕまたはＴｒｐを、１５７位にＴｒｐ、Ｌｅｕ、またはＴｙｒを、１５９位にＴｈｒまたはＨｉｓを、１６０位にＶａｌを、１６２位にＡｌａ、Ｓｅｒ、またはＶａｌを、１６３位にＶａｌ、Ａｓｎ、またはＴｈｒを、１６４位にＧｌｎまたはＴｙｒを、１８６位にＰｒｏを、１８９位にＴｈｒまたはＡｓｎを、１９４位にＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、またはＨｉｓを含み、置換及び位置はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９の配列を基準として決められる。特定の実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４０の配列を含むことができる。特定の実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３８の配列を含むことができる。特定の実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３９の配列を含むことができる。
【０１３２】
更なる実施形態では、トランスフェリン受容体結合ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜２９、３９〜１０２、及び１８２〜１９５のうちのいずれか１つのアミノ酸１５７〜１９４、アミノ酸１５３〜１９４、またはアミノ酸１５３〜１９９を含む。更なる実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜２９、３９〜１０２、及び１８２〜１９５のうちのいずれか１つのアミノ酸１５７〜１９４との、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜２９、３９〜１０２、及び１８２〜１９５のうちのいずれか１つのアミノ酸１５３〜１９４とのもしくはアミノ酸１５３〜１９９との少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜２９、３９〜１０２、及び１８２〜１９５のうちのいずれか１つを含む。更なる実施形態では、ポリペプチドは、アミノ末端の最初の３個のアミノ酸「ＰＣＰ」を含まない、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜２９、３９〜１０２、及び１８２〜１９５のうちのいずれか１つを含む。更なる実施形態では、ポリペプチドは、アミノ末端の最初の３個のアミノ酸「ＰＣＰ」を含まずに決められた、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜２９、３９〜１０２、及び１８２〜１９５のうちのいずれか１つとの少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。
【０１３４】
改変ＣＨ３ドメインを含む例示的なポリペプチド
本発明の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、Ｆｃ領域の別のドメインと連結することができる。いくつかの実施形態では、本発明の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドをＣＨ２ドメインと連結することができるが、これは、天然に存在するＣＨ２ドメイン、または通常はＣＨ２ドメインのＣ末端にある変異体ＣＨ２ドメインであってよい。いくつかの実施形態では、ＣＨ２ドメインに連結された改変ＣＨ３ドメインを含むポリペプチドは、抗体の部分的または完全なヒンジ領域を更に含むことにより、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドが、部分的または完全なヒンジ領域を有するＦｃ領域の一部となるようなフォーマットを生じる。ヒンジ領域は、いずれの免疫グロブリンサブクラスまたはアイソタイプからのものであってもよい。例示的な免疫グロブリンのヒンジの１つとして、ＩｇＧ１のヒンジ領域、例えば、ヒトＩｇＧ１ヒンジアミノ酸配列
2020530293.tif 000002
などのＩｇＧヒンジ領域がある。更なる実施形態では、ヒンジまたは部分的なヒンジ領域を有するＦｃフォーマットとすることができるポリペプチドを、別の部分、例えばＦａｂフラグメントと更に連結することにより、トランスフェリン受容体と結合するＦｃ−Ｆａｂ融合体が作製される。いくつかの実施形態では、トランスフェリン受容体と結合するＦｃ−Ｆａｂ融合体は、改変ＣＨ３ドメインポリペプチド、ヒンジ領域、及びＦａｂフラグメントを更に含む。このＦａｂフラグメントは、対象となるあらゆる標的、例えば治療上の神経学的標的に対するものとすることができ、その場合、Ｆａｂは、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドのトランスフェリン受容体との結合によって媒介される、血液脳関門を通過するトランスサイトーシスによって標的に送達される。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、トランスフェリン受容体結合ポリペプチドと連結されたＦａｂフラグメントは、タウタンパク質（例えば、ヒトタウタンパク質）またはそのフラグメントに結合することができる。いくつかの実施形態では、Ｆａｂフラグメントは、リン酸化タウタンパク質、非リン酸化タウタンパク質、タウタンパク質のスプライスアイソフォーム、Ｎ末端が切断されたタウタンパク質、Ｃ末端が切断されたタウタンパク質、及び／またはそれらのフラグメントに結合することができる。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、トランスフェリン受容体結合ポリペプチドと連結されたＦａｂフラグメントは、β−セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）タンパク質（例えば、ヒトＢＡＣＥ１タンパク質）またはそのフラグメントに結合することができる。いくつかの実施形態では、Ｆａｂフラグメントは、ＢＡＣＥ１タンパク質の１つ以上のスプライスアイソフォームまたはそのフラグメントに結合することができる。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、トランスフェリン受容体結合ポリペプチドと連結されたＦａｂフラグメントは、骨髄細胞上に発現するトリガー受容体２（ＴＲＥＭ２）タンパク質（例えば、ヒトＴＲＥＭ２タンパク質）またはそのフラグメントに結合することができる。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、トランスフェリン受容体結合ポリペプチドと連結されたＦａｂフラグメントは、α−シヌクレインタンパク質（例えば、ヒトα−シヌクレインタンパク質）またはそのフラグメントに結合することができる。いくつかの実施形態では、Ｆａｂフラグメントは、モノマー性α−シヌクレイン、オリゴマー性α−シヌクレイン、α−シヌクレインフィブリル、可溶性α−シヌクレイン、及び／またはこれらのフラグメントに結合することができる。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、本発明の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドを含むＦｃ−Ｆａｂ融合体は、二量体のサブユニットである。いくつかの実施形態では、二量体はヘテロ二量体である。いくつかの実施形態では、二量体はホモ二量体である。いくつかの実施形態では、二量体は、トランスフェリン受容体に結合する１個のポリペプチドを含む（すなわちトランスフェリン受容体との結合について一価である）。いくつかの実施形態では、二量体は、トランスフェリン受容体に結合する第２のポリペプチドを含む。第２のポリペプチドは、Ｆｃ−Ｆａｂ融合体中に存在する同じ改変ＣＨ３ドメインポリペプチドを含むことにより二価の結合ホモ二量体を与えてもよく、または本発明の第２の改変ＣＨ３ドメインポリペプチドが第２のトランスフェリン受容体結合部位を与えてもよい。いくつかの実施形態では、二量体は、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドを含む第１のサブユニットと、どちらもトランスフェリン受容体には結合しないＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む第２のサブユニットを含む。
【０１４０】
トランスフェリン受容体結合ポリペプチドは、Ｆａｂ以外の異なる対象となるポリペプチドと融合させてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、トランスフェリン受容体結合ポリペプチドは、トランスフェリン受容体発現細胞にターゲティングするか、またはトランスサイトーシスにより内皮、例えば血液脳関門を通過して送達させるうえで望ましい異なるポリペプチドと融合させることができる。いくつかの実施形態では、トランスフェリン受容体結合ポリペプチドは、可溶性タンパク質、例えば、受容体の細胞外ドメインもしくは成長因子、サイトカイン、または酵素と融合される。
【０１４１】
尚も他の実施形態では、トランスフェリン受容体結合ポリペプチドは、タンパク質の精製に有用なペプチドまたはタンパク質、例えば、ポリヒスチジン、エピトープタグ、例えばＦＬＡＧ、ｃ−Ｍｙｃ、ヘマグルチニンタグなど、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、またはマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）と融合させることができる。場合により、トランスフェリン受容体結合ポリペプチドと融合されたペプチドまたはタンパク質は、第Ｘａ因子またはトロンビンの切断部位のようなプロテアーゼ切断部位を有することができる。
【０１４２】
本発明のトランスフェリン受容体結合ポリペプチドは、例えば、ポリペプチドのフォーマットに基づいた、広範囲の結合親和性を有することができる。例えば、いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインを含むポリペプチドは、１ｐＭ〜１０μＭの範囲にわたるトランスフェリン受容体結合の親和性を有する。いくつかの実施形態では、親和性は一価のフォーマットで測定することができる。他の実施形態では、親和性は、例えば、ポリペプチド−Ｆａｂ融合タンパク質を構成する二量体として、二価のフォーマットで測定することができる。
【０１４３】
結合親和性、結合速度論、及び交差反応性を分析するための方法は当該技術分野では周知のものである。これらの方法としては、これらに限定されるものではないが、固相結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ）、免疫沈降法、表面プラズモン共鳴（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））、速度論的排除アッセイ（ｋｉｎｅｔｉｃ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ａｓｓａｙｓ）（例えば、ＫｉｎＥｘＡ（登録商標））、フローサイトメトリー、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）、バイオレイヤー干渉法（例えば、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｉｎｃ．，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ））、及びウェスタンブロット分析が挙げられる。いくつかの実施形態では、結合親和性及び／または交差反応性を調べるためにＥＬＩＳＡが用いられる。ＥＬＩＳＡアッセイを行うための方法は当該技術分野では周知のものであり、下記実施例のセクションでも述べる。いくつかの実施形態では、結合親和性、結合速度論、及び／または交差反応性を調べるために表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）が用いられる。いくつかの実施形態では、結合親和性、結合速度論、及び／または交差反応性を調べるために速度論的排除アッセイが用いられる。いくつかの実施形態では、結合親和性、結合速度論、及び／または交差反応性を調べるためにバイオレイヤー干渉法アッセイが用いられる。
【０１４４】
改変ＣＨ３ドメインポリペプチドを含むＦｃ領域内の更なる変異
トランスフェリン受容体を結合してＢＢＢを通過する輸送を開始するように改変された、本明細書で提供されるポリペプチドは、例えば、血清安定性を高めるため、エフェクター機能を調節するため、グリコシル化に影響を及ぼすため、ヒトにおける免疫原性を低下させるため、及び／または、ポリペプチドのノブ・アンド・ホール型のヘテロ二量化を可能とするためなど、更なる変異を含んでもよい。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、本発明によるポリペプチドは、対応する野生型Ｆｃ領域（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のＦｃ領域）との少なくとも約７５％、少なくとも約７６％、少なくとも約７７％、少なくとも約７８％、少なくとも約７９％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有する。
【０１４６】
本発明によるポリペプチドは、例えば、グリコシル化に影響を及ぼすため、血清半減期を長くするため、またはＣＨ３ドメインについては、改変ＣＨ３ドメインを構成するポリペプチドのノブ・アンド・ホール型のヘテロ二量化を可能とするためなど、指定されたアミノ酸の組の外側に導入される他の変異を含んでもよい。一般的に、この方法では、第１のポリペプチドの界面に突起（「ノブ」）を、第２のポリペプチドの界面に対応した穴（「ホール」）を導入することで、突起が穴の中に位置してヘテロ二量体の形成を促し、ホモ二量体の形成を妨げることができることを伴う。突起は、第１のポリペプチドの界面の小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）に置換することによって形成される。突起と同じ、または同様の大きさの相補的な穴が、大きなアミノ酸側鎖をより小さなもの（例えば、アラニンまたはスレオニン）に置換することによって第２のポリペプチドの界面に形成される。このような更なる変異は、トランスフェリン受容体に対する改変ＣＨ３ドメインの結合に負の影響を及ぼさないポリペプチド内の位置に導入される。
【０１４７】
二量体化のためのノブ・アンド・ホール型のアプローチの例示的な一実施形態では、二量体化しようとする第１のＦｃポリペプチドサブユニットの、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の１３９位に対応する位置が、天然のスレオニンの代わりにトリプトファンを有し、二量体の第２のＦｃポリペプチドサブユニットが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の１８０位に対応する位置に天然のチロシンの代わりにバリンを有する。Ｆｃポリペプチドの第２のサブユニットは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の１３９位に対応する位置の天然のスレオニンがセリンに置換され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の１４１位に対応する位置の天然のロイシンがアラニンに置換される置換を更に含んでもよい。
【０１４８】
本明細書に記載されるポリペプチドは、ヘテロ二量体化のための他の改変（例えば、自然に帯電しているＣＨ３−ＣＨ３界面内の接触残基の静電的操作、または疎水性パッチ改変など）を含むように操作することもできる。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、血清半減期を延ばすための改変を導入することができる。例えば、いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の２５位に対応する位置にＴｙｒを、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の２７位に対応する位置にＴｈｒを、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の２９位に対応する位置にＧｌｕを有するＣＨ２ドメインを含む。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、変異、例えば置換を、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として決めた場合の１７〜３０位、５２〜５７位、８０〜９０位、１５６〜１６３位、及び２０１〜２０８位のうちの１つ以上に導入する。いくつかの実施形態では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として決めた場合の２４位、２５位、２７位、２８位、２９位、８０位、８１位、８２位、８４位、８５位、８７位、１５８位、１５９位、１６０位、１６２位、２０１位、２０６位、２０７位、または２０９位に１つ以上の変異を導入する。いくつかの実施形態では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として決めた場合の２５位、２７位、及び２９位のうちの１つ、２つ、または３つに変異を導入する。いくつかの実施形態では、変異は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２５Ｙ、Ｓ２７Ｔ、及びＴ２９Ｅである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、変異Ｍ２５Ｙ、Ｓ２７Ｔ、及びＴ２９Ｅを更に含む。いくつかの実施形態では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として決めた場合の２０１位及び２０７位の１つまたは２つに変異を導入する。いくつかの実施形態では、変異は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２０１Ｌ及びＮ２０７Ｓである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、Ｍ２０１Ｌを伴うかまたは伴わずに変異Ｎ２０７Ｓを更に含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ８０位、Ｅ１５３位、及びＮ２０７位の１つ、２つ、または３つすべてに置換を含む。いくつかの実施形態では、変異はＴ８０Ｑ及びＮ２０７Ａである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、変異Ｔ８０Ａ、Ｅ１５３Ａ、及びＮ２０７Ａを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ２３位及びＭ２０１位に置換を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、変異Ｔ２３Ｑ及びＭ２０１Ｌを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２０１位及びＮ２０７位に置換を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、置換Ｍ２０１Ｌ及びＮ２０７Ｓを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、Ｎ２０７ＳまたはＮ２０７Ａの置換を含む。
【０１５１】
Ｆｃのエフェクター機能
いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインを含むＦｃ領域はエフェクター機能を有し、すなわち、このＦｃ領域は、エフェクター機能を媒介するエフェクター細胞で発現したＦｃ受容体に結合する際に特定の生物学的機能を誘導する能力を有する。エフェクター細胞としては、これらに限定されるものではないが、単核球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、好酸球、マスト細胞、血小板、Ｂ細胞、大顆粒リンパ球、ランゲルハンス細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及び細胞傷害性Ｔ細胞が挙げられる。
【０１５２】
抗体エフェクター機能の例としては、これらに限定されるものではないが、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞介在性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞介在性食作用（ＡＤＣＰ）、細胞表面受容体のダウンレギュレーション（例えば、Ｂ細胞受容体）、及びＢ細胞活性化が挙げられる。エフェクター機能は抗体クラスによって異なり得る。例えば、天然のヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ３抗体は、免疫系細胞上に存在する適当なＦｃ受容体に結合する際にＡＤＣＣ及びＣＤＣ活性を誘発することができ、天然のヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４は、免疫細胞上に存在する適当なＦｃ受容体に結合する際にＡＤＣＰ機能を誘発することができる。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、エフェクター機能を低下させる更なる改変を有することができる。あるいは、いくつかの実施形態では、本発明の改変ＣＨ３ドメインを含むポリペプチドは、エフェクター機能を高める更なる改変を有することができる。
【０１５４】
エフェクター機能を調節する例示的なＦｃポリペプチド変異としては、これらに限定されるものではないが、ＣＨ２ドメイン内の置換、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の７及び８位に対応する位置における置換が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＣＨ２ドメイン内の置換は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の７及び８位のＡｌａを含む。いくつかの実施形態では、ＣＨ２ドメイン内の置換は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の７及び８位のＡｌａ、ならびに１０２位のＧｌｙを含む。
【０１５５】
エフェクター機能を調節する更なるＦｃポリペプチド変異としては、これらに限定されるものではないが、２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９位における１つ以上の置換を含む（ＥＵ番号付けスキームでは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合に１１、３８、４２、４３、７０、１００、及び１０２位に相当する）。例示的な置換（ＥＵ番号付けスキームで番号付けした場合）には以下のものが含まれる。すなわち、３２９位は、プロリンがグリシンもしくはアルギニンまたはＦｃのプロリン３２９とＦｃγＲＩＩＩのトリプトファン残基Ｔｒｐ８７及びＴｒｐ１１０との間に形成されるＦｃ／Ｆｃγ受容体界面を壊すだけの充分な大きさを有するアミノ酸残基に置換された変異を有することができる。更なる例示的な置換としては、Ｓ２２８Ｐ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ、及びＰ３３１Ｓが挙げられる。複数の置換が存在してもよく、例えば、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域のＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ、ヒトＩｇＧ４のＦｃ領域のＳ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅ、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域のＬ２３４Ａ及びＧ２３７Ａ、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＧ２３７Ａ、ヒトＩｇＧ２のＦｃ領域のＶ２３４Ａ及びＧ２３７Ａ、ヒトＩｇＧ４のＦｃ領域のＬ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、及びＥ３１８Ａ、ならびにヒトＩｇＧ４のＦｃ領域のＳ２２８Ｐ及びＬ２３６Ｅが挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、ＡＤＣＣを調節する１つ以上のアミノ酸置換（例えば、ＥＵ番号付けスキームに従って、Ｆｃ領域の２９８、３３３、及び／または３３４位の置換）を有することができる。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、ＡＤＣＣを増大または減少させる１つ以上のアミノ酸置換を有してもよく、またはＣ１ｑ結合及び／またはＣＤＣを変化させる変異を有してもよい。
【０１５７】
更なる変異を含む例示的なポリペプチド
本明細書に記載されるポリペプチド（例えば、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．２、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．３、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．４、ＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２、ＣＨ３Ｃ．３５．２３、ＣＨ３Ｃ．３５．２１、ＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１、ＣＨ３Ｃ．２３．２．１、及びＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１のうちのいずれか１つ）は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｗ）、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ７Ａ、Ｌ８Ａ、及び／またはＰ１０２Ｇ（例えば、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ））、及び／または血清安定性を高める変異（例えば、（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２５Ｙ、Ｓ２７Ｔ、及びＴ２９Ｅ、または（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ２０１Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０７Ｓ）を含む更なる変異を含むことができる。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチド（例えば、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．２、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．３、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．４、ＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２、ＣＨ３Ｃ．３５．２３、ＣＨ３Ｃ．３５．２１、ＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１、ＣＨ３Ｃ．２３．２．１、及びＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１のうちのいずれか１つ）は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｗ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜２９、３９〜１０２、及び１８２〜１９５のうちのいずれか１つの配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜２９、３９〜１０２、及び１８２〜１９５のうちのいずれか１つの配列を有するポリペプチドは、ノブ変異を有するように改変することができる。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチド（例えば、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．２、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．３、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．４、ＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２、ＣＨ３Ｃ．３５．２３、ＣＨ３Ｃ．３５．２１、ＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１、ＣＨ３Ｃ．２３．２．１、及びＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１のうちのいずれか１つ）は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ７Ａ、Ｌ８Ａ、及び／またはＰ１０２Ｇ（例えば、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ））、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜２９、３９〜１０２、及び１８２〜１９５のうちのいずれか１つの配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜２９、３９〜１０２、及び１８２〜１９５のうちのいずれか１つの配列を有するポリペプチドは、ノブ変異、及びエフェクター機能を調節する変異を有するように改変することができる。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチド（例えば、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．２、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．３、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．４、ＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２、ＣＨ３Ｃ．３５．２３、ＣＨ３Ｃ．３５．２１、ＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１、ＣＨ３Ｃ．２３．２．１、及びＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１のうちのいずれか１つ）は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｗ）、血清安定性を高める変異（例えば、（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２５Ｙ、Ｓ２７Ｔ、及びＴ２９Ｅ、または（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２０１Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０７Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜２９、３９〜１０２、及び１８２〜１９５のうちのいずれか１つの配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜２９、３９〜１０２、及び１８２〜１９５のうちのいずれか１つの配列を有するポリペプチドは、ノブ変異、及び血清安定性を高める変異を有するように改変することができる。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチド（例えば、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．２、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．３、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．４、ＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２、ＣＨ３Ｃ．３５．２３、ＣＨ３Ｃ．３５．２１、ＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１、ＣＨ３Ｃ．２３．２．１、及びＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１のうちのいずれか１つ）は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ７Ａ、Ｌ８Ａ、及び／またはＰ１０２Ｇ（例えば、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ））、血清安定性を高める変異（例えば、（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２５Ｙ、Ｓ２７Ｔ、及びＴ２９Ｅ、または（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ２０１Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０７Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜２９、３９〜１０２、及び１８２〜１９５のうちのいずれか１つの配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜２９、３９〜１０２、及び１８２〜１９５のうちのいずれか１つの配列を有するポリペプチドは、ノブ変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清安定性を高める変異を有するように改変することができる。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチド（例えば、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．２、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．３、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．４、ＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２、ＣＨ３Ｃ．３５．２３、ＣＨ３Ｃ．３５．２１、ＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１、ＣＨ３Ｃ．２３．２．１、及びＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１のうちのいずれか１つ）は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜２９、３９〜１０２、及び１８２〜１９５のうちのいずれか１つの配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜２９、３９〜１０２、及び１８２〜１９５のうちのいずれか１つの配列を有するポリペプチドは、ホール変異を有するように改変することができる。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチド（例えば、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．２、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．３、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．４、ＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２、ＣＨ３Ｃ．３５．２３、ＣＨ３Ｃ．３５．２１、ＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１、ＣＨ３Ｃ．２３．２．１、及びＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１のうちのいずれか１つ）は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ７Ａ、Ｌ８Ａ、及び／またはＰ１０２Ｇ（例えば、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ））、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜２９、３９〜１０２、及び１８２〜１９５のうちのいずれか１つの配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜２９、３９〜１０２、及び１８２〜１９５のうちのいずれか１つの配列を有するポリペプチドは、ホール変異、及びエフェクター機能を調節する変異を有するように改変することができる。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチド（例えば、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．２、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．３、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．４、ＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２、ＣＨ３Ｃ．３５．２３、ＣＨ３Ｃ．３５．２１、ＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１、ＣＨ３Ｃ．２３．２．１、及びＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１のうちのいずれか１つ）は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖ）、血清安定性を高める変異（例えば、（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２５Ｙ、Ｓ２７Ｔ、及びＴ２９Ｅ、または（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ２０１Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０７Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜２９、３９〜１０２、及び１８２〜１９５のうちのいずれか１つの配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜２９、３９〜１０２、及び１８２〜１９５のうちのいずれか１つの配列を有するポリペプチドは、ホール変異、及び血清安定性を高める変異を有するように改変することができる。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチド（例えば、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．２、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．３、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．４、ＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２、ＣＨ３Ｃ．３５．２３、ＣＨ３Ｃ．３５．２１、ＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１、ＣＨ３Ｃ．２３．２．１、及びＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１のうちのいずれか１つ）は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ７Ａ、Ｌ８Ａ、及び／またはＰ１０２Ｇ（例えば、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ））、血清安定性を高める変異（例えば、（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２５Ｙ、Ｓ２７Ｔ、及びＴ２９Ｅ、または（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ２０１Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０７Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜２９、３９〜１０２、及び１８２〜１９５のうちのいずれか１つの配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜２９、３９〜１０２、及び１８２〜１９５のうちのいずれか１つの配列を有するポリペプチドは、ホール変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清安定性を高める変異を有するように改変することができる。
【０１６６】
クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｗ）、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０９の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０９の配列を有する。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ７Ａ、Ｌ８Ａ、及び／またはＰ１０２Ｇ（例えば、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ））、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１０または１１１の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異及びエフェクター機能を調節する変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１０または１１１の配列を有する。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｗ）、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２５Ｙ、Ｓ２７Ｔ、及びＴ２９Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１２の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１２の配列を有する。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｗ）、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ２０１Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０７Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４５の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４５の配列を有する。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ７Ａ、Ｌ８Ａ、及び／またはＰ１０２Ｇ（例えば、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ））、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２５Ｙ、Ｓ２７Ｔ、及びＴ２９Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１３または１１４の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１３または１１４の配列を有する。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ７Ａ、Ｌ８Ａ、及び／またはＰ１０２Ｇ（例えば、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ））、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ２０１Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０７Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４６または２４７の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４６または２４７の配列を有する。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１５の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１５の配列を有する。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ７Ａ、Ｌ８Ａ、及び／またはＰ１０２Ｇ（例えば、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ））、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１６または１１７の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異及びエフェクター機能を調節する変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１６または１１７の配列を有する。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖ）、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２５Ｙ、Ｓ２７Ｔ、及びＴ２９Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８の配列を有する。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖ）、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ２０１Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０７Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４８の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４８の配列を有する。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ７Ａ、Ｌ８Ａ、及び／またはＰ１０２Ｇ（例えば、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ））、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２５Ｙ、Ｓ２７Ｔ、及びＴ２９Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１９または１２０の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１９または１２０の配列を有する。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ７Ａ、Ｌ８Ａ、及び／またはＰ１０２Ｇ（例えば、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ））、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ２０１Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０７Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４９または２５０の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４９または２５０の配列を有する。
【０１７８】
クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｗ）、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２１の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２１の配列を有する。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ７Ａ、Ｌ８Ａ、及び／またはＰ１０２Ｇ（例えば、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ））、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２２または１２３の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異及びエフェクター機能を調節する変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２２または１２３の配列を有する。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｗ）、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２５Ｙ、Ｓ２７Ｔ、及びＴ２９Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２４の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２４の配列を有する。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｗ）、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ２０１Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０７Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５２の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５２の配列を有する。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ７Ａ、Ｌ８Ａ、及び／またはＰ１０２Ｇ（例えば、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ））、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２５Ｙ、Ｓ２７Ｔ、及びＴ２９Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２５または１２６の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２５または１２６の配列を有する。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ７Ａ、Ｌ８Ａ、及び／またはＰ１０２Ｇ（例えば、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ））、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ２０１Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０７Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５３または２５４の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５３または２５４の配列を有する。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２７の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２７の配列を有する。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ７Ａ、Ｌ８Ａ、及び／またはＰ１０２Ｇ（例えば、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ））、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２８または１２９の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異及びエフェクター機能を調節する変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２８または１２９の配列を有する。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖ）、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２５Ｙ、Ｓ２７Ｔ、及びＴ２９Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３０の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３０の配列を有する。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖ）、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ２０１Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０７Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５５の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５５の配列を有する。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ７Ａ、Ｌ８Ａ、及び／またはＰ１０２Ｇ（例えば、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ））、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２５Ｙ、Ｓ２７Ｔ、及びＴ２９Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１または１３２の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１または１３２の配列を有する。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ７Ａ、Ｌ８Ａ、及び／またはＰ１０２Ｇ（例えば、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ））、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ２０１Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０７Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５６または２５７の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５６または２５７の配列を有する。
【０１９０】
クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．３
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．３は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｗ）、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３の配列を有する。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．３は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ７Ａ、Ｌ８Ａ、及び／またはＰ１０２Ｇ（例えば、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ））、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３４または１３５の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異及びエフェクター機能を調節する変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３４または１３５の配列を有する。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．３は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｗ）、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２５Ｙ、Ｓ２７Ｔ、及びＴ２９Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３６の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３６の配列を有する。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．３は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｗ）、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ２０１Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０７Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５９の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５９の配列を有する。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．３は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ７Ａ、Ｌ８Ａ、及び／またはＰ１０２Ｇ（例えば、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ））、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２５Ｙ、Ｓ２７Ｔ、及びＴ２９Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３７または１３８の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３７または１３８の配列を有する。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．３は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ７Ａ、Ｌ８Ａ、及び／またはＰ１０２Ｇ（例えば、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ））、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ２０１Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０７Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６０または２６１の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６０または２６１の配列を有する。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．３は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３９の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．３は、ホール変異、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３９の配列を有する。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．３は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ７Ａ、Ｌ８Ａ、及び／またはＰ１０２Ｇ（例えば、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ））、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４０または１４１の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異及びエフェクター機能を調節する変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４０または１４１の配列を有する。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．３は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖ）、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２５Ｙ、Ｓ２７Ｔ、及びＴ２９Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４２配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４２の配列を有する。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．３は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖ）、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ２０１Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０７Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６２の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６２の配列を有する。
【０２００】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．３は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ７Ａ、Ｌ８Ａ、及び／またはＰ１０２Ｇ（例えば、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ））、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２５Ｙ、Ｓ２７Ｔ、及びＴ２９Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４３または１４４の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４３または１４４の配列を有する。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．３は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ７Ａ、Ｌ８Ａ、及び／またはＰ１０２Ｇ（例えば、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ））、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ２０１Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０７Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６３または２６４の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６３または２６４の配列を有する。
【０２０２】
クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．４
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．４は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｗ）、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４５の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．４は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４５の配列を有する。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．４は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ７Ａ、Ｌ８Ａ、及び／またはＰ１０２Ｇ（例えば、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ））、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４６または１４７の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異及びエフェクター機能を調節する変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．４は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４６または１４７の配列を有する。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．４は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｗ）、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２５Ｙ、Ｓ２７Ｔ、及びＴ２９Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４８の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．４は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４８の配列を有する。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．４は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｗ）、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ２０１Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０７Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６６の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．４は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６６の配列を有する。
【０２０６】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．４は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ７Ａ、Ｌ８Ａ、及び／またはＰ１０２Ｇ（例えば、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ））、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２５Ｙ、Ｓ２７Ｔ、及びＴ２９Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４９または１５０の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．４は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４９または１５０の配列を有する。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．４は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ７Ａ、Ｌ８Ａ、及び／またはＰ１０２Ｇ（例えば、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ））、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ２０１Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０７Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６７または２６８の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．４は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６７または２６８の配列を有する。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．４は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５１の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．４は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５１の配列を有する。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．４は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ７Ａ、Ｌ８Ａ、及び／またはＰ１０２Ｇ（例えば、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ））、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５２または１５３の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異及びエフェクター機能を調節する変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．４は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５２または１５３の配列を有する。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．４は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖ）、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２５Ｙ、Ｓ２７Ｔ、及びＴ２９Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５４の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．４は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５４の配列を有する。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．４は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖ）、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ２０１Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０７Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６９の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．４は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６９の配列を有する。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．４は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ７Ａ、Ｌ８Ａ、及び／またはＰ１０２Ｇ（例えば、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ））、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２５Ｙ、Ｓ２７Ｔ、及びＴ２９Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５５または１５６の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．４は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５５または１５６の配列を有する。
【０２１３】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．４は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ７Ａ、Ｌ８Ａ、及び／またはＰ１０２Ｇ（例えば、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ））、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ２０１Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０７Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７０または２７１の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．４は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７０または２７１の配列を有する。
【０２１４】
クローンＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｗ）、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５７の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５７の配列を有する。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ７Ａ、Ｌ８Ａ、及び／またはＰ１０２Ｇ（例えば、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ））、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５８または１５９の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異及びエフェクター機能を調節する変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５８または１５９の配列を有する。
【０２１６】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｗ）、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２５Ｙ、Ｓ２７Ｔ、及びＴ２９Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６０の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６０の配列を有する。
【０２１７】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｗ）、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ２０１Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０７Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７３の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７３の配列を有する。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ７Ａ、Ｌ８Ａ、及び／またはＰ１０２Ｇ（例えば、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ））、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２５Ｙ、Ｓ２７Ｔ、及びＴ２９Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６１または１６２の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６１または１６２の配列を有する。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ７Ａ、Ｌ８Ａ、及び／またはＰ１０２Ｇ（例えば、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ））、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ２０１Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０７Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７４または２７５の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７４または２７５の配列を有する。
【０２２０】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６３の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６３の配列を有する。
【０２２１】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ７Ａ、Ｌ８Ａ、及び／またはＰ１０２Ｇ（例えば、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ））、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６４または１６５の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異及びエフェクター機能を調節する変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６４または１６５の配列を有する。
【０２２２】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖ）、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２５Ｙ、Ｓ２７Ｔ、及びＴ２９Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６６の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６６の配列を有する。
【０２２３】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖ）、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ２０１Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０７Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７６の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７６の配列を有する。
【０２２４】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ７Ａ、Ｌ８Ａ、及び／またはＰ１０２Ｇ（例えば、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ））、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２５Ｙ、Ｓ２７Ｔ、及びＴ２９Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６７または１６８の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６７または１６８の配列を有する。
【０２２５】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ７Ａ、Ｌ８Ａ、及び／またはＰ１０２Ｇ（例えば、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ））、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ２０１Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０７Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７７または２７８の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７７または２７８の配列を有する。
【０２２６】
クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｗ）、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６９の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６９の配列を有する。
【０２２７】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ７Ａ、Ｌ８Ａ、及び／またはＰ１０２Ｇ（例えば、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ））、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７０または１７１の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異及びエフェクター機能を調節する変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７０または１７１の配列を有する。
【０２２８】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｗ）、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２５Ｙ、Ｓ２７Ｔ、及びＴ２９Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７２の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７２の配列を有する。
【０２２９】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｗ）、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ２０１Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０７Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８０の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８０の配列を有する。
【０２３０】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ７Ａ、Ｌ８Ａ、及び／またはＰ１０２Ｇ（例えば、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ））、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２５Ｙ、Ｓ２７Ｔ、及びＴ２９Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７３または１７４の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７３または１７４の配列を有する。
【０２３１】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ７Ａ、Ｌ８Ａ、及び／またはＰ１０２Ｇ（例えば、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ））、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ２０１Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０７Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８１または２８２の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８１または２８２の配列を有する。
【０２３２】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７５の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７５の配列を有する。
【０２３３】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ７Ａ、Ｌ８Ａ、及び／またはＰ１０２Ｇ（例えば、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ））、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７６または１７７の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異及びエフェクター機能を調節する変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７６または１７７の配列を有する。
【０２３４】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖ）、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２５Ｙ、Ｓ２７Ｔ、及びＴ２９Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７８の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７８の配列を有する。
【０２３５】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖ）、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ２０１Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０７Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８３の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８３の配列を有する。
【０２３６】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ７Ａ、Ｌ８Ａ、及び／またはＰ１０２Ｇ（例えば、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ））、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２５Ｙ、Ｓ２７Ｔ、及びＴ２９Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７９または１８０の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７９または１８０の配列を有する。
【０２３７】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ７Ａ、Ｌ８Ａ、及び／またはＰ１０２Ｇ（例えば、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ））、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ２０１Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０７Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８４または２８５の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８４または２８５の配列を有する。
【０２３８】
クローンＣＨ３Ｃ．３５．２１
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２１は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｗ）、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９６の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９６の配列を有する。
【０２３９】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２１は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ７Ａ、Ｌ８Ａ、及び／またはＰ１０２Ｇ（例えば、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ））、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９７または１９８の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異及びエフェクター機能を調節する変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９７または１９８の配列を有する。
【０２４０】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２１は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｗ）、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２５Ｙ、Ｓ２７Ｔ、及びＴ２９Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９９の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９９の配列を有する。
【０２４１】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２１は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｗ）、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ２０１Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０７Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８７の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８７の配列を有する。
【０２４２】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２１は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ７Ａ、Ｌ８Ａ、及び／またはＰ１０２Ｇ（例えば、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ））、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２５Ｙ、Ｓ２７Ｔ、及びＴ２９Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２００または２０１の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２００または２０１の配列を有する。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２１は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ７Ａ、Ｌ８Ａ、及び／またはＰ１０２Ｇ（例えば、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ））、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ２０１Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０７Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８８または２８９の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８８または２８９の配列を有する。
【０２４４】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２１は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０２の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０２の配列を有する。
【０２４５】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２１は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ７Ａ、Ｌ８Ａ、及び／またはＰ１０２Ｇ（例えば、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ））、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０３または２０４の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異及びエフェクター機能を調節する変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０３または２０４の配列を有する。
【０２４６】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２１は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖ）、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２５Ｙ、Ｓ２７Ｔ、及びＴ２９Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０５の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０５の配列を有する。
【０２４７】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２１は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖ）、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ２０１Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０７Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９０の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９０の配列を有する。
【０２４８】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２１は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ７Ａ、Ｌ８Ａ、及び／またはＰ１０２Ｇ（例えば、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ））、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２５Ｙ、Ｓ２７Ｔ、及びＴ２９Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０６または２０７の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０６または２０７の配列を有する。
【０２４９】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２１は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ７Ａ、Ｌ８Ａ、及び／またはＰ１０２Ｇ（例えば、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ））、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ２０１Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０７Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９１または２９２の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９１または２９２の配列を有する。
【０２５０】
クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｗ）、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０８の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０８の配列を有する。
【０２５１】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ７Ａ、Ｌ８Ａ、及び／またはＰ１０２Ｇ（例えば、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ））、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０９または２１０の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異及びエフェクター機能を調節する変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０９または２１０の配列を有する。
【０２５２】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｗ）、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２５Ｙ、Ｓ２７Ｔ、及びＴ２９Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１１の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１１の配列を有する。
【０２５３】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｗ）、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ２０１Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０７Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９４の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９４の配列を有する。
【０２５４】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ７Ａ、Ｌ８Ａ、及び／またはＰ１０２Ｇ（例えば、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ））、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２５Ｙ、Ｓ２７Ｔ、及びＴ２９Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１２または２１３の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１２または２１３の配列を有する。
【０２５５】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ７Ａ、Ｌ８Ａ、及び／またはＰ１０２Ｇ（例えば、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ））、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ２０１Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０７Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９５または２９６の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９５または２９６の配列を有する。
【０２５６】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１４の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１４の配列を有する。
【０２５７】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ７Ａ、Ｌ８Ａ、及び／またはＰ１０２Ｇ（例えば、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ））、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１５または２１６の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異及びエフェクター機能を調節する変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１５または２１６の配列を有する。
【０２５８】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖ）、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２５Ｙ、Ｓ２７Ｔ、及びＴ２９Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１７の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１７の配列を有する。
【０２５９】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖ）、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ２０１Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０７Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９７の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９７の配列を有する。
【０２６０】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ７Ａ、Ｌ８Ａ、及び／またはＰ１０２Ｇ（例えば、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ））、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２５Ｙ、Ｓ２７Ｔ、及びＴ２９Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１８または２１９の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１８または２１９の配列を有する。
【０２６１】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ７Ａ、Ｌ８Ａ、及び／またはＰ１０２Ｇ（例えば、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ））、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ２０１Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０７Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９８または２９９の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９８または２９９の配列を有する。
【０２６２】
クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２．１
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２．１は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｗ）、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２０の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２０の配列を有する。
【０２６３】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２．１は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ７Ａ、Ｌ８Ａ、及び／またはＰ１０２Ｇ（例えば、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ））、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２１または２２２の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異及びエフェクター機能を調節する変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２１または２２２の配列を有する。
【０２６４】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２．１は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｗ）、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２５Ｙ、Ｓ２７Ｔ、及びＴ２９Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２３の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２３の配列を有する。
【０２６５】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２．１は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｗ）、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ２０１Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０７Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０１の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０１の配列を有する。
【０２６６】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２．１は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ７Ａ、Ｌ８Ａ、及び／またはＰ１０２Ｇ（例えば、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ））、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２５Ｙ、Ｓ２７Ｔ、及びＴ２９Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２４または２２５の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２４または２２５の配列を有する。
【０２６７】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２．１は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ７Ａ、Ｌ８Ａ、及び／またはＰ１０２Ｇ（例えば、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ））、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ２０１Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０７Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０２または３０３の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０２または３０３の配列を有する。
【０２６８】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２．１は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２６の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２６の配列を有する。
【０２６９】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２．１は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ７Ａ、Ｌ８Ａ、及び／またはＰ１０２Ｇ（例えば、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ））、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２７または２２８の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異及びエフェクター機能を調節する変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２７または２２８の配列を有する。
【０２７０】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２．１は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖ）、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２５Ｙ、Ｓ２７Ｔ、及びＴ２９Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２９の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２９の配列を有する。
【０２７１】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２．１は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖ）、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ２０１Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０７Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０４の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０４の配列を有する。
【０２７２】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２．１は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ７Ａ、Ｌ８Ａ、及び／またはＰ１０２Ｇ（例えば、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ））、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２５Ｙ、Ｓ２７Ｔ、及びＴ２９Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３０または２３１の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３０または２３１の配列を有する。
【０２７３】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２．１は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ７Ａ、Ｌ８Ａ、及び／またはＰ１０２Ｇ（例えば、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ））、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ２０１Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０７Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０５または３０６の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０５または３０６の配列を有する。
【０２７４】
クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｗ）、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３２の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３２の配列を有する。
【０２７５】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ７Ａ、Ｌ８Ａ、及び／またはＰ１０２Ｇ（例えば、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ））、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３３または２３４の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異及びエフェクター機能を調節する変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３３または２３４の配列を有する。
【０２７６】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｗ）、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２５Ｙ、Ｓ２７Ｔ、及びＴ２９Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３５の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３５の配列を有する。
【０２７７】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｗ）、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ２０１Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０７Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０８の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０８の配列を有する。
【０２７８】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ７Ａ、Ｌ８Ａ、及び／またはＰ１０２Ｇ（例えば、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ））、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２５Ｙ、Ｓ２７Ｔ、及びＴ２９Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３６または２３７の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３６または２３７の配列を有する。
【０２７９】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１は、ノブ変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ７Ａ、Ｌ８Ａ、及び／またはＰ１０２Ｇ（例えば、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ））、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ２０１Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０７Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０９または３１０の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ノブ変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０９または３１０の配列を有する。
【０２８０】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３８の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３８の配列を有する。
【０２８１】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ７Ａ、Ｌ８Ａ、及び／またはＰ１０２Ｇ（例えば、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ））、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３９または２４０の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異及びエフェクター機能を調節する変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３９または２４０の配列を有する。
【０２８２】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖ）、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２５Ｙ、Ｓ２７Ｔ、及びＴ２９Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４１の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４１の配列を有する。
【０２８３】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖ）、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ２０１Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０７Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３１の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１１の配列を有する。
【０２８４】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ７Ａ、Ｌ８Ａ、及び／またはＰ１０２Ｇ（例えば、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ））、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＭ２５Ｙ、Ｓ２７Ｔ、及びＴ２９Ｅ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２または２４３の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２または２４３の配列を有する。
【０２８５】
いくつかの実施形態では、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１は、ホール変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合のＬ７Ａ、Ｌ８Ａ、及び／またはＰ１０２Ｇ（例えば、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ））、血清安定性を高める変異（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けした場合の、Ｍ２０１Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０７Ｓ）、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１２または３１３の配列との少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ホール変異、エフェクター機能を調節する変異、及び血清安定性を高める変異を有するクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１２または３１３の配列を有する。
【０２８６】
ＶＩ．結合体
いくつかの実施形態では、本発明による改変ＣＨ３ドメインを含むトランスフェリン受容体結合ポリペプチドは、リンカーを介して薬剤（例えば、細胞内に内在化させようとする、及び／または血液脳関門のような内皮を通過してトランスサイトーシスさせようとする薬剤）と連結される。リンカーは、ポリペプチドに薬剤を連結するのに適したいずれのリンカーであってもよい。いくつかの実施形態では、連結は酵素によって切断可能なものである。特定の実施形態では、連結は中枢神経系に存在する酵素によって切断可能なものである。
【０２８７】
いくつかの実施形態では、リンカーはペプチドリンカーである。ペプチドリンカーは、薬剤とトランスフェリン受容体結合ポリペプチドとの互いに対する回転を可能とするように構成することができ、及び／またはプロテアーゼによる消化に対して耐性を有するものである。いくつかの実施形態では、リンカーは、例えば、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａなどのアミノ酸を含む柔軟なリンカーであってよい。かかるリンカーは、周知のパラメータを用いて設計することができる。例えば、リンカーは、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリピートのような繰り返し配列を有することができる。
【０２８８】
異なる実施形態において、周知の化学架橋試薬及びプロトコールを用いて結合体を作製することができる。例えば、当業者には周知の、ポリペプチドを対象となる薬剤と架橋するうえで有用な多くの化学架橋剤が存在する。例えば、架橋剤は、分子を段階的に連結するために使用することができるヘテロ二官能性架橋剤である。ヘテロ二官能性架橋剤は、タンパク質を結合するためのより特異的な連結方法の設計を可能とし、それにより、ホモタンパク質ポリマーのような不要な副反応の発生を低減するものである。広範な種類のヘテロ二官能性架橋剤が当該技術分野で周知であり、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）またはその水溶性類似体であるＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルポキシレート（ＳＭＣＣ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、４−スクシンイミジルオキシカルボニル−ａ−メチル−ａ−（２−ピリジルジチオ）−トルエン（ＳＭＰＴ）、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、及びスクシンイミジル６−［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート］ヘキサノエート（ＬＣ−ＳＰＤＰ）が挙げられる。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド部分を有するこれらの架橋剤は、より高い水溶性を一般的に有するＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド類似体として得ることができる。更に、連結鎖内にジスルフィド架橋を有するこれらの架橋剤は、代わりにアルキル誘導体として合成することもでき、これによりインビボでのリンカー切断の量を低減させることができる。ヘテロ二官能性架橋剤以外にも、ホモ二官能性及び光反応性架橋剤を含む、他の多くの架橋剤が存在する。スベリン酸ジスクシンイミジル（ＤＳＳ）、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）、及びピメルイミド酸ジメチル二塩酸塩（ＤＭＰ）は、有用なホモ二官能性架橋剤の例であり、ビス−［Ｂ−（４−アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィド（ＢＡＳＥＤ）、及びＮ−スクシンイミジル−６（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエート（ＳＡＮＰＡＨ）は、有用な光反応性架橋剤の例である。
【０２８９】
対象となる薬剤は、細胞毒性剤、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子、化学的部分などを含む治療剤であってよい。いくつかの実施形態では、薬剤は、ペプチドまたは小分子治療剤もしくは造影剤であってよい。いくつかの実施形態では、小分子は、１０００Ｄａ未満、７５０Ｄａ未満、または５００Ｄａ未満である。
【０２９０】
対象となる薬剤は、トランスフェリン受容体結合ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端領域に連結するか、または、薬剤がトランスフェリン受容体結合ポリペプチドのトランスフェリン受容体に対する結合を妨げない限り、ポリペプチドの任意の領域に結合させることができる。
【０２９１】
Ｖ．核酸、ベクター、及び宿主細胞
本明細書に記載される改変トランスフェリン受容体結合ポリペプチドは、通常は組換え法を用いて調製される。したがって、いくつかの態様において、本発明は、本明細書に記載されるポリペプチドを含むポリペプチドのいずれかをコードする核酸配列を含む単離核酸、及び該ポリペプチドをコードする核酸を複製し、及び／または該ポリペプチドを発現させるために使用される核酸が導入された宿主細胞を提供するものである。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、真核細胞、例えばヒト細胞である。
【０２９２】
別の態様では、本明細書に記載されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが提供される。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であってよい。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはＤＮＡである。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドはｃＤＮＡである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはＲＮＡである。
【０２９３】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは核酸コンストラクト内に含まれる。いくつかの実施形態では、コンストラクトは複製可能なベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、プラスミド、ウイルスベクター、ファージミド、酵母染色体ベクター、及び非エピソーム性の哺乳動物ベクターから選択される。
【０２９４】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、発現コンストラクト内の１つ以上の調節ヌクレオチド配列と機能的に連結される。一連の実施形態では、核酸発現コンストラクトは、表面発現ライブラリーとしての使用に適合される。いくつかの実施形態では、ライブラリーは、酵母での表面発現に適合される。いくつかの実施形態では、ライブラリーは、ファージでの表面発現に適合される。別の一連の実施形態では、核酸発現コンストラクトは、ミリグラムまたはグラム量でのポリペプチドの単離を可能とする系でのポリペプチドの発現に適合される。いくつかの実施形態では、系は哺乳動物細胞発現系である。いくつかの実施形態では、系は酵母細胞発現系である。
【０２９５】
組換えポリペプチドを製造するための発現ビヒクルとしては、プラスミド及び他のベクターが挙げられる。例えば、適当なベクターとしては以下の種類のプラスミド、すなわち、ｐＢＲ３２２由来プラスミド、ｐＥＭＢＬ由来プラスミド、ｐＥＸ由来プラスミド、ｐＢＴａｃ由来プラスミド、及び、大腸菌などの原核生物で発現させるためのｐＵＣ由来プラスミドが挙げられる。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ−ｎｅｏ、及びｐＨｙｇ由来ベクターは、真核生物のトランスフェクションに適した哺乳動物用発現ベクターの例である。あるいは、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ−１）などのウイルスの誘導体、またはエプスタイン・バール・ウイルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来、及びｐ２０５）を真核生物におけるポリペプチドの一過性発現に使用することもできる。いくつかの実施形態では、バキュロウイルス発現系の使用により組換えポリペプチドを発現させることが望ましい場合もある。そのようなバキュロウイルス発現系としては、ｐＶＬ由来ベクター（ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、及びｐＶＬ９４１など）、ｐＡｃＵＷ由来ベクター（ｐＡｃＵＷ１など）、及びｐＢｌｕｅＢａｃ由来ベクターが挙げられる。更なる発現系としては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、及び他のウイルス発現系が挙げられる。
【０２９６】
ベクターは、任意の適当な宿主細胞に形質転換することができる。いくつかの実施形態では、例えば細菌または酵母細胞のような宿主細胞を表面発現ライブラリーとしての使用に適合させることができる。一部の細胞では、ベクターは宿主細胞内で発現されて比較的大量のポリペプチドを発現させる。そのような宿主細胞としては、哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、及び原核細胞が挙げられる。いくつかの実施形態では、細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、ＮＳ０細胞、Ｙ０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、またはＨｅｌａ細胞などの哺乳動物細胞である。
【０２９７】
トランスフェリン受容体結合ポリペプチドをコードした発現ベクターをトランスフェクトした宿主細胞を、ポリペプチドの発現を生じさせるような適当な条件下で培養することができる。ポリペプチドは、細胞の混合物及びポリペプチドを含有する培地から分泌させ、単離することができる。あるいは、ポリペプチドを細胞質中、または膜画分中に保持し、細胞を回収、溶解して、所望の方法によってポリペプチドを単離してもよい。
【０２９８】
ＶＩ．治療方法
本発明によるトランスフェリン受容体結合ポリペプチドは、多くの適応症で治療的に使用することができる。いくつかの実施形態では、トランスフェリン受容体結合ポリペプチドは、トランスフェリン受容体を発現する標的細胞型に治療剤を送達するために使用される。いくつかの実施形態では、トランスフェリン受容体結合ポリペプチドは、治療成分を、脳によって取り込まれるように例えば血液脳関門のような内皮を通過して輸送するために使用することができる。
【０２９９】
いくつかの実施形態では、本発明のトランスフェリン受容体結合ポリペプチドは、例えば、治療剤と結合させて治療剤を送達することで治療剤を脳または中枢神経系（ＣＮＳ）の疾患のような神経疾患を治療するために使用することができる。例示的な疾患としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭型認知症、血管性認知症、レビー小体型認知症、ピック病、原発性年齢関連タウオパチー、または進行性核上性麻痺が挙げられる。いくつかの実施形態では、疾患は、タウオパチー、プリオン病（例えば、ウシ海綿状脳症、スクレイピー、クロイツフェルトヤコブ病、クールー病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、慢性消耗病、及び致死性家族性不眠症など）、球麻痺、運動ニューロン病、または神経系ヘテロ変性疾患（カナバン病、ハンチントン病、神経セロイドリポフスチノーシス、アレキサンダー病、トゥレット症候群、メンケス縮れ毛症候群、コケイン症候群、ハレルフォルデン・スパッツ症候群、ラフォラ疾患、レット症候群、肝レンズ核変性症、レッシュナイハン症候群、フリードライヒ運動失調症、脊髄性筋萎縮症、及びウンフェルリヒト・ルントボルク症候群など）であり得る。いくつかの実施形態では、疾患は脳卒中または多発性硬化症である。いくつかの実施形態では、患者は無症状の場合もあるが、脳またはＣＮＳの疾患に関連したマーカーを有する。いくつかの実施形態では、神経疾患を治療するための薬剤の製造における本発明のトランスフェリン受容体結合ポリペプチドの使用が提供される。
【０３００】
いくつかの実施形態では、本発明のトランスフェリン受容体結合ポリペプチドはがんの治療に用いられる。特定の実施形態では、がんは、神経膠腫、多形膠芽腫、髄膜腫、星状細胞腫、聴神経腫、軟骨腫、乏突起神経膠腫、髄芽腫、神経節膠腫、シュヴァン鞘腫、神経繊維腫、神経芽細胞腫、または硬膜外、髄内もしくは硬膜内の腫瘍などのＣＮＳの原発性がんである。いくつかの実施形態では、がんは固形腫瘍であり、他の実施形態では、がんは非固形腫瘍である。固形腫瘍がんとしては、中枢神経系の腫瘍、乳癌、前立腺癌、皮膚癌（基底細胞癌、細胞癌、扁平上皮細胞癌、及び黒色腫）、子宮頸癌、子宮癌、肺癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、星状細胞腫、神経膠腫、膵癌、中皮腫、胃癌、肝癌、結腸癌、直腸癌、腎芽腫を含む腎癌、膀胱癌、食道癌、喉頭癌、耳下腺癌、胆道癌、子宮内膜癌、腺癌、小細胞癌、神経芽細胞腫、副腎皮質癌、上皮癌、デスモイド腫瘍、線維形成性小円形細胞腫瘍、内分泌腫瘍、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍、胚細胞腫瘍、肝芽腫、肝細胞癌、非横紋筋肉腫性軟部組織肉腫、骨肉腫、末梢性未分化神経外胚葉性腫瘍、網膜芽細胞腫、及び横紋筋肉腫が挙げられる。いくつかの実施形態では、がんを治療するための薬剤の製造における本発明のトランスフェリン受容体結合ポリペプチドの使用が提供される。
【０３０１】
いくつかの実施形態では、本発明のトランスフェリン受容体結合ポリペプチドは自己免疫疾患または炎症性疾患の治療に用いることができる。かかる疾患の例としては、これらに限定されるものではないが、強直性脊椎炎、関節炎、変形性関節症、関節リウマチ、癬性関節炎、ぜんそく、強皮症、脳卒中、アテローム性動脈硬化症、クローン病、大腸炎、潰瘍性大腸炎、皮膚炎、憩室炎、線維症、特発性肺線維症、線維筋痛症、肝炎、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、狼瘡、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、腎炎、多発性硬化症、及び、潰瘍性大腸炎が挙げられる。いくつかの実施形態では、自己免疫疾患または炎症性疾患を治療するための薬剤の製造における本発明のトランスフェリン受容体結合ポリペプチドの使用が提供される。
【０３０２】
いくつかの実施形態では、本発明のトランスフェリン受容体結合ポリペプチドは、冠状動脈疾患、心臓発作、異常心律動または不整脈、心不全、心臓弁膜症、先天性心疾患、心筋疾患、心筋症、心膜疾患、大動脈疾患、マルファン症候群、脈管疾患、及び血管疾患などの心臓血管疾患の治療に使用することができる。いくつかの実施形態では、心臓血管疾患を治療するための薬剤の製造における本発明のトランスフェリン受容体結合ポリペプチドの使用が提供される。
【０３０３】
いくつかの実施形態では、本方法は、対象に１つ以上の更なる治療剤を投与することを更に含む。例えば、脳または中枢神経系の疾患を治療するためのいくつかの実施形態では、本方法は、対象に神経保護剤、例えば、抗コリン作動薬、ドーパミン作動薬、グルタミン酸作動薬、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害薬、カンナビノイド、カスパーゼ阻害剤、メラトニン、抗炎症剤、ホルモン（例えば、エストロゲンまたはプロゲステロン）、またはビタミンを投与することを含むことができる。いくつかの実施形態では、本方法は、対象に神経疾患の認知または行動症状の治療に使用するための薬剤（例えば、抗うつ剤、ドーパミンアゴニスト、または抗精神病薬）を投与することを含む。
【０３０４】
本発明のトランスフェリン受容体結合ポリペプチドは、治療有効量または用量で対象に投与される。例示的な用量としては、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ、または約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、または約１０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの日用量の範囲を用いることができる。しかしながら、用量は、選択される投与経路、組成物の配合、患者の応答、状態の重症度、対象の体重、及び処方する医師の判断をはじめとするいくつかの因子によって異なり得る。用量は、個々の患者の必要に応じて時間と共に増量または減量させることができる。いくつかの実施形態では、患者に初期に低用量を投与し、その後、患者にとって耐容できる有効用量に増量する。有効量の決定は充分に当業者の能力の範囲内である。
【０３０５】
異なる実施形態において、本発明のトランスフェリン受容体結合ポリペプチドは非経口投与される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは静脈内投与される。静脈内投与は、注入により、例えば約１０〜３０分間にわたって、または少なくとも１時間、２時間、もしくは３時間にわたって行うことができる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、静脈内ボーラスとして投与される。注入とボーラス投与との組み合わせを用いることもできる。
【０３０６】
いくつかの非経口の実施形態では、トランスフェリン受容体結合ポリペプチドは、腹腔内、皮下、皮内、または筋肉内投与される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは皮内または筋肉内投与される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、例えば硬膜外投与などにより髄腔内に投与されるか、または脳室内に投与される。
【０３０７】
他の実施形態では、トランスフェリン受容体結合ポリペプチドは、経口投与、肺内投与、鼻腔内投与、眼内投与、または局所投与することができる。肺内投与は、例えば、吸入器またはネブライザーを使用して、エアゾール化剤と配合して用いることもできる。
【０３０８】
ＶＩＩ．医薬組成物及びキット
別の態様では、本発明によるトランスフェリン受容体結合ポリペプチドを含む医薬組成物及びキットが提供される。
【０３０９】
医薬組成物
本発明で使用するための製剤を調製するためのガイダンスは、当業者には周知の医薬品及び製剤用の任意の数のハンドブックにみることができる。
【０３１０】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載されるトランスフェリン受容体結合ポリペプチドを含み、更に、１種類以上の薬学的に許容される担体及び／または賦形剤を含む。薬学的に許容される担体には、生理学的適合性を有し、好ましくは活性剤の活性を妨げない、または他の形で阻害しないあらゆる溶媒、分散媒、またはコーティングが含まれる。様々な薬学的に許容される賦形剤が周知である。
【０３１１】
いくつかの実施形態では、担体は、静脈内、髄腔内、脳室内、筋肉内、経口、腹腔内、経皮、局所、または皮下投与に適したものである。薬学的に許容される担体は、例えば組成物を安定させるかまたはポリペプチドの吸収を増大もしくは減少させる作用を有する１つ以上の生理学的に許容される化合物を含むことができる。生理学的に許容される化合物としては、例えば、グルコース、スクロース、またはデキストランなどの炭水化物、アスコルビン酸またはグルタチオンなどの酸化防止剤、キレート剤、低分子量タンパク質、活性剤のクリアランスもしくは加水分解を低減する組成物、または賦形剤もしくは他の安定化剤及び／またはバッファーを挙げることができる。他の薬学的に許容される担体及びそれらの製剤も当該技術分野で利用可能である。
【０３１２】
本明細書に記載される医薬組成物は、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠製造、乳化、カプセル化、封入、または凍結乾燥プロセスにより、当業者には周知の方法で製造することができる。以下の方法及び賦形剤はあくまで例示的なものであり、いかなる意味でも限定的なものではない。
【０３１３】
経口投与のために、トランスフェリン受容体結合ポリペプチドは、当該技術分野では周知の薬学的に許容される担体と組み合わせることによって製剤化することができる。かかる担体は、化合物を、治療される患者によって経口摂取される、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、エマルション、親油性及び親水性懸濁液、液剤、ゲル、シロップ剤、スラリー剤、及び懸濁液などとして製剤化することを可能とする。経口用の医薬製剤は、ポリペプチドを、固体賦形剤と混合し、得られた混合物を場合に応じて粉砕し、任意で、適当な助剤を加えた後、顆粒の混合物を処理して錠剤または糖衣コアを得ることによって得ることができる。適当な賦形剤としては、例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖類などの充填剤；例えばトウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、及び／またはポリビニルピロリドンなどのセルロース調製物が挙げられる。必要に応じて、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸、もしくはアルギン酸ナトリウムなどのその塩などの崩壊剤を加えることができる。
【０３１４】
上記に開示したように、本明細書に記載されるトランスフェリン受容体結合ポリペプチドは、注射により、例えばボーラス注射または連続注入により非経口投与されるように製剤化することができる。注射用には、ポリペプチドを植物油または他の同様の油類、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸またはプロピレングリコールのエステルなどの水性または非水性溶媒中に、必要に応じて、可溶化剤、等張化剤、懸濁化剤、乳化剤、安定化剤、及び防腐剤などの従来の添加剤と共に、溶解、懸濁、または乳化することによってポリペプチドを製剤として配合することができる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、水溶液、好ましくはハンクス液、リンゲル液、または生理学的食塩水バッファーのような生理学的適合性を有するバッファー中に配合することができる。注射用の製剤は、単位剤形、例えば、防腐剤が添加されたアンプル中、または複数用量容器中で与えることができる。組成物は、油性または水性溶媒中の懸濁液、溶液、またはエマルションの形態などを取ることができ、懸濁化剤、安定化剤、及び／または分散剤などの配合剤を含むことができる。
【０３１５】
いくつかの実施形態では、トランスフェリン受容体結合ポリペプチドは、例えば、活性剤を含んだ固体疎水性ポリマーの半透性マトリクス中で、持続放出、制御放出、長期放出、タイミングを計った放出、または遅延放出製剤として送達用に調製される。持続放出材料の様々な種類が確立されており、当業者に周知である。長期放出製剤としては、フィルムコーティングされた錠剤、多粒子またはペレットシステム、親水性または親油性材料を用いたマトリクス技術、及び細孔形成賦形剤を含んだワックスベースの錠剤が挙げられる。持続放出送達システムは、それらの設計に応じて、時間単位または日単位で、例えば、４、６、８、１０、１２、１６、２０、２４時間またはそれ以上の時間にわたって化合物を放出することができる。通常、持続放出製剤は、天然に存在する、または合成ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドンのようなポリマー性ビニルピロリドン；カルボキシビニル親水性ポリマー；メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、及びヒドロキシプロピルメチルセルロースのような疎水性及び／または親水性ヒドロコロイド；ならびにカルボキシポリメチレンを使用して調製することができる。
【０３１６】
一般的に、インビボ投与に使用される医薬組成物は無菌である。滅菌処理は、例えば、熱滅菌、蒸気滅菌、滅菌濾過、または放射線照射などの当該技術分野では周知の方法によって行うことができる。
【０３１７】
本発明の医薬組成物の用量及び所望の薬剤濃度は、想定される特定の用途に応じて異なり得る。適当な用量及び投与経路の決定は、充分に当業者の技能の範囲内にある。適当な用量については、上記のセクションＶＩＩでも述べられている。
【０３１８】
キット
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるトランスフェリン受容体結合ポリペプチドを含むキットが提供される。いくつかの実施形態では、キットは、脳または中枢神経系（ＣＮＳ）の疾患などの神経疾患の予防または治療に使用される。
【０３１９】
いくつかの実施形態では、キットは、１つ以上の更なる治療剤を更に含む。例えば、いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載されるトランスフェリン受容体結合ポリペプチドを含み、更に、神経疾患の治療に使用するための１つ以上の更なる治療剤を含む。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載される方法を実施するための説明（すなわち、プロトコール）を含む使用説明書を更に含む（例えば、血液脳関門を通過して組成物を投与するためにキットを使用するための指示）。使用説明書は通常は文書または印刷物を含むが、これらに限定されない。かかる使用説明書を格納し、これをエンドユーザーに伝達することが可能な任意の媒体が本明細書では考慮される。かかる媒体としては、これらに限定されるものではないが、電子的記憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、及び光学媒体（例えばＣＤ−ＲＯＭ）などが挙げられる。かかる媒体は、そのような使用説明書を提供するインターネットサイトのアドレスを含んでもよい。
【実施例】
【０３２０】
ＶＩＩＩ．実施例
本発明を、特定の実施例によってより詳細に説明する。以下の実施例はあくまで例示の目的で示されるものにすぎず、本発明をいかなる形でも限定しようとするものではない。当業者には、実質的に同じ結果を生じるように変更または改変することができる様々な重要でないパラメータが容易に認識されよう。用いられる数値（例えば、量、温度など）に関して精度を確実とするべく努力に努めてはいるが、ある程度の実験的誤差及び偏差は存在し得る。本発明の実施では、特に断らない限りは、当該技術分野の技術の範囲内で、タンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術、及び薬理学の従来の方法を用いている。かかる技術は文献に充分な説明がなされている。更に、当業者には、特定のライブラリーに適用される操作の方法は、本明細書に記載される他のライブラリーにも適用できることが明らかなはずである。
【０３２１】
実施例１  ＴｆＲ標的の作製
トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）細胞外ドメイン（ＥＣＤ）をコードするＤＮＡ（ヒト（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）またはカニクイザル（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３）の残基１２１〜７６０）を、Ｃ末端の切断可能なＨｉｓ及びＡｖｉタグを有する哺乳動物発現ベクターにクローニングした。このプラスミドをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、発現させた。細胞外ドメインをＮｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーを用いて回収した上清から精製した後、サイズ排除クロマトグラフィーにより凝集タンパク質を除去した。収率は培養物１Ｌ当たり約５ｍｇであった。タンパク質を１０ｍＭ  Ｋ３ＰＯ４（ｐＨ６．７）、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、及び２０％グリセロール中で保存し、−２０℃で凍結した。
【０３２２】
並べ替えたＴｆＲアピカルドメインをコードするＤＮＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０４）（ヒトまたはカニクイザルＴｆＲの残基３２６〜３７９及び１９４〜２９６）を、精製を行うためのＮ末端のＨｉｓタグ及びインビボでのビオチン化のためのＡｖｉタグを有するｐＥＴ２８ベクターにクローニングした。このプラスミドを、ＢｉｒＡ発現ベクターと共にＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に同時形質転換した。細胞を対数期までＬＢ培地中、３７℃で増殖させた後、１ｍＭイソプロピル１−チオ−β−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導してから、１８℃で一晩培養した。細胞を溶解し、可溶性画分をＮｉ−ＮＴＡカラムにかけてアフィニティー精製した後、サイズ排除クロマトグラフィーを行って凝集タンパク質を除去した。収率は培養物１Ｌ当たり約１０ｍｇであった。タンパク質を５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、及び１ｍＭ  ＤＴＴ中で保存し、−２０℃で凍結した。
【０３２３】
精製したＴｆＲのＥＣＤをＥＺ−ｌｉｎｋ  ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃより入手）を用いてビオチン化した。５倍モル過剰のビオチンを反応に使用した。過剰のビオチンをＰＢＳに対して重点的に透析することによって除去した。
【０３２４】
Ａｖｉタグを有するＴｆＲのＥＣＤ及びアピカルドメインを、ＢｉｒＡ−５００（Ａｖｉｄｉｔｙ，ＬＬＣより販売されるＢｉｒＡビオチン−タンパク質リガーゼ標準反応キット）を使用してビオチン化した。反応後、標識したタンパク質をサイズ排除クロマトグラフィーによって更に精製して過剰のＢｉｒＡ酵素を除去した。最終的な材料を１０ｍＭ  Ｋ３ＰＯ４（ｐＨ６．７）、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、及び２０％グリセロール中で保存し、−２０℃で凍結した。
【０３２５】
実施例２  操作されたトランスフェリン受容体結合ポリペプチドの設計及び特性分析
本実施例は、本明細書のポリペプチドの設計、作製、及び特性分析について述べる。本実施例の目的、及びクローン配列において同じであるアミノ酸同士を比較する目的で、「保存的」変異とは、特定されたクローンのすべてに生じるものとみなされる（保存的アミノ酸置換ではない）のに対し、「半保存的」変異とは、クローンの５０％超において生じるものである。
【０３２６】
特に断らない限り、このセクションにおけるアミノ酸残基の位置は、アミノ末端にヒンジ領域からの３つの残基ＰＣＰを有するヒトＩｇＧ１野生型Ｆｃ領域であるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に基づいて番号付けされる。
【０３２７】
ポリペプチドＦｃ領域ドメインライブラリーの設計
改変を行うための特定の溶媒露出表面パッチを選択し、選択されたパッチのアミノ酸組成をランダム化によって変化させた表面ディスプレイライブラリーを構築し、次に標準的な発現ディスプレイ技術を用いて表面にディスプレイされた配列変異体を所望の機能性についてスクリーニングすることにより、新たな分子認識手段をポリペプチドＦｃ領域に組み込んだ。本明細書で使用するところの「ランダム化」なる用語には、部分ランダム化及び所定のヌクレオチドまたはアミノ酸混合比での配列変化が含まれる。ランダム化を行うために選択される一般的な表面露出パッチは、約６００〜１５００平方Åの面積を有し、アミノ酸約７〜１５個で構成されるものとした。
【０３２８】
クローンレジスター
以下のレジスターは、本明細書に記載される方法に従って設計及び作製した。本明細書で使用するところの「レジスター」なる用語は、変化させることが可能な（例えば、レジスター内の列記された位置におけるアミノ酸の置換、挿入、及び／または欠失を生じるポリペプチドコーディング遺伝子配列への変異の導入により）連続表面を形成する一連の表面露出アミノ酸残基のことを指す。
【０３２９】
ＣＨ３レジスターＣ
ＣＨ３Ｃレジスター（表１）は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に記載されるヒトＩｇＧ１のＦｃ領域のアミノ酸配列を基準として番号付けした場合にアミノ酸位置１５７、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１８６、１８９、及び１９４を含むものであった。ＣＨ３Ｃレジスターの各位置は、いずれもＦｃγＲ及びＦｃＲｎ結合部位から離れている２個のループの溶媒露出残基を含むことにより、連続表面を形成している。
【０３３０】
ファージディスプレイライブラリーの作製
野生型ヒトＦｃ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）をコードする鋳型ＤＮＡを合成し、ファージミドベクターに組み込んだ。ファージミドベクターは、ｏｍｐＡまたはｐｅｌＢリーダー配列、ｃ−Ｍｙｃ及び６×Ｈｉｓエピトープタグに融合されたＦｃインサート、ならびにアンバー終止コドンに続くＭ１３コートタンパク質ｐＩＩＩを含むものであった。
【０３３１】
ランダム化を行うための対応する位置に「ＮＮＫ」三重コドンを含むプライマーを作製した（ただし、Ｎは任意のＤＮＡ塩基（すなわち、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ）であり、ＫはＧまたはＴである）。あるいは、「ソフト」ランダム化用のプライマーを用い、７０％が野生型塩基に一致し、１０％ずつが他の３つの塩基に一致した塩基のミックスをそれぞれのランダム化位置に使用した。ランダム化の各領域に相当するＦｃ領域のフラグメントのＰＣＲ増幅を行ってから、ＳｆｉＩ制限部位を含んだエンドプライマーを用いてアセンブルした後、ＳｆｉＩで消化してファージミドベクターにライゲートすることにより、ライブラリーを作製した。あるいは、Ｋｕｎｋｅｌ法による突然変異誘発を行うためのプライマーを使用した。Ｋｕｎｋｅｌ突然変異誘発を行う方法は、当業者には周知であろう。Ｋｕｎｋｅｌ産物のライゲート産物をＴＧ１株のエレクトロコンピテントな大腸菌細胞（Ｌｕｃｉｇｅｎ（登録商標）より入手したもの）に形質転換した。回復後の大腸菌細胞にＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージを感染させ、一晩増殖させた後、ライブラリーファージを５％ＰＥＧ／ＮａＣｌで沈殿させ、１５％グリセロールを含むＰＢＳ溶液に再懸濁し、使用時まで凍結した。一般的なライブラリーサイズは、形質転換体約１０９〜約１０１１個の範囲であった。ｐＩＩＩ融合ＦｃとｐＩＩＩに結合されていない可溶性Ｆｃとの対合によってファージ上にＦｃ二量体をディスプレイさせた（後者はｐＩＩＩの手前のアンバー終止コドンのために生成される）。
【０３３２】
酵母ディスプレイライブラリーの作製
野生型ヒトＦｃ配列をコードする鋳型ＤＮＡを合成し、酵母ディスプレイベクターに組み込んだ。ＣＨ３ライブラリーについて、ＦｃポリペプチドをＡｇａ２ｐ細胞壁タンパク質上にディスプレイさせた。いずれのベクターも、Ｋｅｘ２切断配列を有するプレプロリーダーペプチド、及びＦｃの末端に融合されたｃ−Ｍｙｃエピトープタグを含んでいた。
【０３３３】
フラグメントの増幅をそのベクターについて相同末端を有するプライマーを用いて行った点以外は、ファージライブラリーについて述べたのと同様の方法を用いて酵母ディスプレイライブラリーをアセンブルした。新たに調製したエレクトロコンピテントな酵母（すなわちＥＢＹ１００株）に直線化したベクター及びアセンブルしたライブラリーインサートを電気穿孔法により導入した。電気穿孔法は当業者には周知のものであろう。選択的ＳＤ−ＣＡＡ培地中での回復後、酵母をコンフルエンスにまで増殖させ、２回分割した後、ＳＤ−ＣＡＡ培地に移すことによってタンパク質発現を誘導した。一般的なライブラリーサイズは、形質転換体約１０７〜約１０９個の範囲であった。Ｆｃの二量体が、隣接してディスプレイされたＦｃ単量体の対合によって形成された。
【０３３４】
ファージ選択の一般的方法
ファージ法は、Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｂａｒｂａｓ，２００１）より採用した。更なるプロトコールの詳細は、この参照文献より入手することができる。
【０３３５】
プレート分取法
ヒトＴｆＲ標的をＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）マイクロタイタープレート（通常、１〜１０μｇ／ｍＬのＰＢＳ溶液を２００μＬ）に４℃で一晩コーティングした。特に断らない限り、すべての結合は室温で行った。ファージライブラリーを各ウェルに加え、一晩インキュベートして結合を行った。マイクロタイターウェルを０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳでよく洗い、各ウェルを酸（通常、５００ｍＭ  ＫＣｌ、または１００ｍＭ  グリシン、ｐＨ２．７を含む５０ｍＭ  ＨＣｌ）と３０分間インキュベートとすることにより結合したファージを溶出した。溶出されたファージを１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）で中和し、ＴＧ１細胞及びＭ１３／ＫＯ７ヘルパーファージを用いて増幅し、５０μｇ／ｍＬのカルベニシリン及び５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含んだ２ＹＴ培地中、３７℃で一晩増殖させた。標的の入ったウェルから溶出されたファージの力価を、標的の入っていないウェルから回収されたファージの力価と比較して濃縮度を評価した。次に結合の際のインキュベーション時間を短縮し、洗浄時間及び洗浄の回数を増やすことによって選択のストリンジェンシーを高めた。
【０３３６】
ビーズ分取法
ヒトＴｆＲの標的を、ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ（商標）より入手したもの）を用いて遊離アミンを介してビオチン化した。ビオチン化反応には、３〜５倍モル過剰のビオチン試薬をＰＢＳ中で用いた。反応をＴｒｉｓで停止した後、ＰＢＳ中に重点的に透析した。ビオチン化された標的をストレプトアビジンでコーティングした磁気ビーズ（すなわち、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒより入手したＭ２８０ストレプトアビジンビーズ）上に固定した。ファージディスプレイライブラリーを、標的をコーティングしたビーズと室温で１時間インキュベートした。この後、結合しなかったファージを除去し、ビーズをＰＢＳＴで洗浄した。結合したファージを、５００ｍＭ  ＫＣｌ（または０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．７）を含む５０ｍＭ  ＨＣｌと３０分間インキュベートすることにより溶出した後、プレート分取について上記に述べたように中和して、増殖させた。
【０３３７】
３〜５ラウンドのパニングを行った後、ファージ上で、または大腸菌のペリプラズム中に可溶性のＦｃを発現させることにより単一のクローンをスクリーニングした。かかる発現法は、当業者には周知のものであろう。個々のファージ上清またはペリプラズム抽出物を、標的またはネガティブコントロールをコーティングし、ブロッキングしたＥＬＩＳＡプレートに曝露した後、ペリプラズム抽出物についてはＨＲＰ結合ヤギ抗Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈより入手したもの）を用いて、またはファージについては抗Ｍ１３（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて検出し、次いでＴＭＢ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒより入手したもの）で発色させた。Ｏｄ４５０値がバックグラウンドの約５倍よりも大きいウェルを陽性クローンとみなしてシークエンシングし、その後、一部のクローンを可溶性Ｆｃフラグメントとして発現させるか、またはＦａｂフラグメントと融合させた。
【０３３８】
酵母選択の一般的方法
ビーズ分取（磁気細胞分離（ＭＡＣＳ））法
Ａｃｋｅｒｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．２００９  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２５（３），７７４に記載されるのと同様にしてＭＡＣＳ及びＦＡＣＳ選択を行った。ストレプトアビジン磁気ビーズ（例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒより販売されるＭ−２８０ストレプトアビジンビーズ）を、ビオチン化標的で標識し、酵母とインキュベートした（通常５〜１０×のライブラリー多様性）。結合しなかった酵母を除去し、ビーズを洗浄し、結合した酵母を選択培地中で増殖させ、後の選択のラウンド用に誘導した。
【０３３９】
蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）法
酵母を抗ｃ−Ｍｙｃ抗体で標識して発現及びビオチン化標的（分取ラウンドに応じて濃度が変化する）を監視した。一部の実験では、標的をストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７と予め混合して相互作用のアビディティーを高めた。他の実験では、結合後のビオチン化標的を検出し、ストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７で洗浄した。結合を有するシングレットの酵母をＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩＩ細胞分取装置を使用して分取した。分取した酵母を選択培地中で増殖させた後、後の選択ラウンド用に誘導した。
【０３４０】
濃縮された酵母集団が得られた後、酵母をＳＤ−ＣＡＡアガープレートに播種し、シングルコロニーを増殖させ、発現を誘導した後、上記に述べたように標識して標的に結合する傾向を決定した。次いで、陽性のシングルクローンを標的の結合についてシークエンシングした後、一部のクローンを可溶性のＦｃフラグメントとして発現させるか、またはＦａｂフラグメントと融合させた。
【０３４１】
スクリーニングの一般的方法
ＥＬＩＳＡによるスクリーニング
クローンをパニングの結果産物から選択し、９６ウェルディープウェルプレートの個々のウェル中で増殖させた。各クローンに自己誘導培地（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅより入手したもの）を用いてペリプラズムでの発現を誘導するか、またはファージ上に個々のＦｃ変異体をファージディスプレイするためにヘルパーファージを感染させた。培地を一晩増殖させ、遠心して大腸菌をペレット化した。ファージＥＬＩＳＡでは、ファージを含む上清を直接使用した。ペリプラズムでの発現では、ペレットを２０％スクロースに再懸濁した後、水で４：１に希釈し、４℃で１時間振盪した。プレートを遠心して固形物をペレット化し、上清をＥＬＩＳＡに使用した。
【０３４２】
ＥＬＩＳＡプレートに標的をコーティングし（通常、０．５ｍｇ／ｍｌで一晩）、次いで１％ＢＳＡでブロッキングした後、ファージまたはペリプラズム抽出物を加えた。１時間のインキュベーションを行い、非結合タンパク質を洗い流した後、ＨＲＰ結合二次抗体（すなわち、可溶性ＦｃまたはファージディスプレイＦｃに対してそれぞれ抗Ｆｃまたは抗Ｍ１３）を加え、３０分間インキュベートした。各プレートを再び洗浄した後、ＴＭＢ試薬で発色させ、２Ｎの硫酸でクエンチした。プレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ（登録商標））を用いて４５０ｎｍの吸光度を定量し、適用可能な場合にはＰｒｉｓｍソフトウェアを使用して結合曲線をプロットした。試験したクローンの吸光度シグナルをネガティブコントロール（Ｆｃを欠いているファージまたはペリプラズム抽出物）と比較した。一部のアッセイでは、可溶性のホロトランスフェリンを結合ステップの間に、通常は大幅なモル過剰量（１０倍過剰超）で加える。
【０３４３】
フローサイトメトリーによるスクリーニング
Ｆｃ変異体ポリペプチド（ファージ上で、ペリプラズム抽出物中で、またはＦａｂフラグメントとの可溶性の融合体として発現させたもの）を、９６ウェルＶ底プレート中で細胞に加え（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ（ＰＢＳＡ）中、ウェル１個当たり約１００，０００細胞）、４℃で１時間インキュベートした。この後、各プレートを遠心し、培地を除去してから細胞をＰＢＳＡで１回洗浄した。二次抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒより入手したもの））を含むＰＢＳＡ中に細胞を再懸濁した。３０分後、プレートを遠心し、培地を除去し、細胞をＰＢＳＡで１〜２回洗浄した後、プレートをフローサイトメーター（すなわち、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）ＩＩフローサイトメーター）で読み取った。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して各条件について蛍光の中央値を計算し、結合曲線をＰｒｉｓｍソフトウェアを用いてプロットした。
【０３４４】
ＣＨ３Ｃクローンの作製及び特性分析
トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に対するＣＨ３Ｃライブラリーを用いた選択
ＣＨ３Ｃに対する酵母ライブラリーを上記に述べたようにＴｆＲに対してパニングし、分取した。最初の３回の分取ラウンドの集団濃縮ＦＡＣＳプロットを図１に示す。更なる２ラウンドの分取後、１種類のクローンをシークエンシングし、４個の固有の配列（すなわち、クローンＣＨ３Ｃ．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、ＣＨ３Ｃ．２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、ＣＨ３Ｃ．３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、及びＣＨ３Ｃ．４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７））を特定した。これらの配列は、１６１位に保存的Ｔｒｐを有し、いずれも１９４位に芳香族残基（すなわち、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＨｉｓ）を有していた。他の位置では高い多様性がみられた。
【０３４５】
第１世代ＣＨ３Ｃクローンの特性分析
ＣＨ３Ｃライブラリーから選択した４種類のクローンを、ＣＨＯまたは２９３細胞でＦａｂフラグメントとのＦｃ融合体として発現させ、プロテインＡ及びサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した後、ＥＬＩＳＡによりホロＴｆの存在下または非存在下でカニクイザル及びヒトＴｆＲに対する結合についてスクリーニングした。図２に示されるように、各クローンはいずれもヒトＴｆＲに結合し、結合は過剰量（５μＭ）のホロＴｆの添加によって影響されなかった。しかしながら、各クローンはカニクイザルＴｆＲにはそれほど結合しなかった。ヒトＴｆＲを内因性に発現する２９３Ｆ細胞に対する結合についてもクローンを試験した。図３は、各クローンは２９３Ｆ細胞に結合したものの、全体的な結合は高親和性のポジティブコントロールと比較して大幅に弱かったことを示している。
【０３４６】
次に、クローンＣＨ３Ｃ．３がＴｆＲ発現細胞内に内在化するかについて試験を行った。接着性ＨＥＫ２９３細胞を９６ウェルで約８０％コンフルエンスにまで増殖させ、培地を除去し、以下の各試料を１μＭの濃度で加えた。すなわち、ＣＨ３Ｃ．３抗ＴｆＲベンチマークポジティブコントロール抗体（Ａｂ２０４）、抗ＢＡＣＥ１ベンチマークネガティブコントロール抗体（Ａｂ１０７）、及びヒトＩｇＧアイソタイプコントロール（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈより入手したもの）。細胞を３７℃及び８％ＣＯ２濃度で３０分間インキュベートした後、洗浄し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００で透過処理し、抗ヒトＩｇＧ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８二次抗体で染色した。更なる洗浄後、細胞をハイコンテント蛍光顕微鏡（すなわちＯｐｅｒａ  Ｐｈｅｎｉｘ（商標）システム）下でイメージングし、図４に示されるように細胞１個当たりの斑点の数を定量した。１μＭでは、クローンＣＨ３Ｃ．３は、抗ＴｆＲポジティブコントロールと同様の内在化の傾向を示したが、ネガティブコントロールは内在化を示さなかった。
【０３４７】
ＣＨ３Ｃクローンの二次操作
ヒトＴｆＲに対する初期のＣＨ３Ｃのヒットの親和性を改善し、カニクイザルＴｆＲに対する結合を導入する試みとして更なるライブラリーを作製した。ソフトランダム化のアプローチを用い、ＤＮＡオリゴを作製して最初の４つのヒットのそれぞれに基づいてソフト突然変異誘発を導入した。レジスターの第１の部分
2020530293.tif 000003
とレジスターの第２の部分
2020530293.tif 000004
を別々のフラグメントにより構築することにより、ソフトランダム化された各レジスターをＰＣＲ増幅でシャッフルした（例えば、クローンＣＨ３Ｃ．１からのレジスターの第１の部分が、クローンＣＨ３Ｃ．１、ＣＨ３Ｃ．２、ＣＨ３Ｃ．３、及びＣＨ３Ｃ．４からのレジスターの第２の部分と混合される、といった具合）。各フラグメントをすべて混合してから、表面発現及び選択を行うために酵母に導入した。
【０３４８】
選択スキームを図５に示す。１ラウンドのＭＡＣＳと３ラウンドのＦＡＣＳの後、個々のクローンをシークエンシングした（クローンＣＨ３Ｃ．１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）、ＣＨ３Ｃ．１８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）、ＣＨ３Ｃ．２１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、ＣＨ３Ｃ．２５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）、ＣＨ３Ｃ．３４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）、ＣＨ３Ｃ．３５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）、ＣＨ３Ｃ．４４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、及びＣＨ３Ｃ．５１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５））。選択されたクローンは２つの大きな配列グループに分類された。グループ１のクローン（すなわち、クローンＣＨ３Ｃ．１８、ＣＨ３Ｃ．２１、ＣＨ３Ｃ．２５、及びＣＨ３Ｃ．３４）は、１５７位に半保存的Ｌｅｕを、１５９位にＬｅｕまたはＨｉｓを、１６０及び１６２位にそれぞれ保存的及び半保存的Ｖａｌを、１８６、１８９、及び１９４位にそれぞれ半保存的Ｐ−Ｔ−Ｗモチーフを有していた。グループ２のクローンは、１５７位に保存的Ｔｙｒを、１５９〜１６３位にモチーフＴＸＷＳＸ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４１）を、１８６、１８９、及び１９４位にそれぞれ保存的モチーフＳ／Ｔ−Ｅ−Ｆを有していた。クローンＣＨ３Ｃ．１８及びＣＨ３．３５を、それぞれの配列グループの代表的な構成員として更なる研究で使用した。クローンＣＨ３Ｃ．５１は、そのレジスターの第１の部分はグループ１から、そのレジスターの第２の部分はグループ２からのものを有する点が着目された。
【０３４９】
ソフト突然変異誘発ライブラリーからのＣＨ３Ｃクローンの結合特性分析
ソフト突然変異誘発ライブラリーからの各クローンをＦｃ−Ｆａｂ融合ポリペプチドとして再フォーマット化し、上記に述べたように発現させ、精製した。図７に示されるように、これらの変異体は、最初のライブラリーセレクションからの最も上のクローン（ＣＨ３Ｃ．３）と比較してヒトＴｆＲに対する改善されたＥＬＩＳＡ結合を有し、また、ホロＴｆと競合もしなかった。下記表２に示されるＥＣ５０値は、ホロＴｆの存在または非存在によって実験の誤差の範囲を超えて大きく影響されなかった。
【０３５０】
（表２）ホロＴｆの存在下または非存在下でのＴｆＲに対するＣＨ３Ｃ変異体のＥＬＩＳＡ結合のＥＣ５０値（ｎＭ）
2020530293.tif 000005
【０３５１】
注目すべき点として、クローンＣＨ３Ｃ．３５は、高親和性の抗ＴｆＲコントロール抗体Ａｂ２０４と概ね同程度にヒトＴｆＲに結合した。図８に示されるように、ソフトランダム化ライブラリーから選択された各クローンは、２９３Ｆ細胞に対しても改善された細胞結合を有していた。同様な細胞結合アッセイにおいて、これらのクローンを、その表面に高いレベルのヒトまたはカニクイザルＴｆＲを安定的に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞に対する結合について試験した。ソフトランダム化ライブラリーから選択された各クローンは、カニクイザルＴｆＲ（図９（Ｂ））と同程度に、ヒトＴｆＲを発現する細胞に結合した（図９（Ａ））が、親ＣＨＯ−Ｋ１細胞には結合しなかった（図９（Ｃ））。その大きさ及び結合ＥＣ５０値は、ヒトＴｆＲと比較してカニクイザルＴｆＲでは大幅に低かった。データを下記表３に要約する。
【０３５２】
（表３）細胞に結合するＣＨ３ＣクローンのＥＣ５０及び最大ＭＦＩ（蛍光強度中央値）値
2020530293.tif 000006
【０３５３】
エピトープマッピング
操作されたＣＨ３Ｃ  Ｆｃ領域がＴｆＲのアピカルドメインに結合するかを調べるため、ＴｆＲアピカルドメイン（ヒト及びカニクイザルについてそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０及び３１）をファージの表面で発現させた。アピカルドメインを適正にフォールディングしてディスプレイするには、ループの１つを短縮する必要があり、配列を環状に並び替える必要があった。ファージ上で発現された配列は、ヒト及びカニクイザルでそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２及び３３として特定される。クローンＣＨ３Ｃ．１８及びＣＨ３Ｃ．３５をＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、上記に述べたファージＥＬＩＳＡプロトコールに従った。要約すると、１％ＰＢＳＡによる洗浄及びブロッキング後、ファージディスプレイの各希釈液を加え、室温で１時間インキュベートした。次いで各プレートを洗浄し、抗Ｍ１３−ＨＲＰを加え、更なる洗浄後、各プレートをＴＭＢ基質で発色させ、２ＮのＮ２ＳＯ４でクエンチした。このアッセイではＣＨ３Ｃ．１８及びＣＨ３Ｃ．３５の両方ともアピカルドメインに結合した。
【０３５４】
カニクイザルＴｆＲに対する結合はヒトＴｆＲに対する結合よりも大幅に弱いことが知られているため、カニクイザルとヒトのアピカルドメインのアミノ酸の相違の１つ以上が、結合の差の要因となっている可能性が高いと仮説を立てた。したがって、ヒトの残基を対応するカニクイザル残基に置き換えた６つの一連の点突然変異をヒトＴｆＲのアピカルドメインに導入した。これらの変異体をファージ上にディスプレイさせ、ファージ濃度をＯＤ２６８により正規化し、ＣＨ３Ｃ．１８及びＣＨ３Ｃ．３５に対する結合をファージＥＬＩＳＡ滴定により試験した（図１１（Ｂ）及び（Ｃ））。抗Ｍｙｃ抗体９Ｅ１０への捕捉は、すべての変異体のディスプレイレベルが同様であったことを示した（図１１（Ａ））。ヒトＴｆＲ変異に対する結合によって、Ｒ２０８Ｇ変異の強い影響が明らかに示され、この残基がエピトープの重要部分であり、カニクイザル残基によってこの位置で負の影響が及ぼされることが示唆された。ファージにディスプレイさせたカニクイザルアピカルドメインにＧ２０８Ｒ変異を導入したところ、この変異がカニクイザルアピカルドメインに対する結合を著しく改善することが示された（図１１（Ｄ）及び（Ｅ））。これらの結果は、各ＣＨ３ＣクローンがＴｆＲのアピカルドメインに結合したこと、及び２０８位が結合に重要であるのに対して２４７、２９２、３６４、３７０、及び３７２位は重要度が大幅に低かったことを示すものである。
【０３５５】
パラトープマッピング
Ｆｃドメイン内のどの残基がＴｆＲへの結合に最も重要であるかを理解するため、各変異体のＴｆＲ結合レジスター内の１個の位置を野生型に復帰変異させた変異体ＣＨ３Ｃ．１８及びＣＨ３Ｃ．３５の一連のクローンを作製した。得られた変異体を組換えによりＣＨ３Ｃ  Ｆｃ−Ｆａｂ融合体として発現させ、ヒトまたはカニクイザルＴｆＲに対する結合について試験した（図１２）。ＣＨ３Ｃ．３５では、１６１及び１９４位は結合に絶対的に重要であり、これらのいずれかの野生型への復帰変異はヒトＴｆＲに対する結合を完全に消失させた。驚くべきことに、１６３位を野生型に復帰変異させることで、カニクイザルＴｆＲへの結合が顕著に上昇したのに対して、ヒトへの結合に影響はほとんどなかった。これに対して、残基１６３の野生型への復帰変異はＣＨ３Ｃ．１８ではほとんど影響がなかったが、この変異体では１８９及び１９４位の復帰変異がヒトＴｆＲへの結合を完全に消失させた。どちらの変異体においても、他の単一の復帰変異はヒトＴｆＲへの結合に若干の（負の）影響を示したのに対して、多くの場合でカニクイザルＴｆＲに対する結合は消失した。
【０３５６】
カニクイザルＴｆＲに対する結合を改善するための更なる操作
カニクイザルＴｆＲに対するＣＨ３Ｃ変異体の親和性を更に高めるために更なるライブラリーを調製した。これらのライブラリーは、理論上の多様性に関しておよそ１０７種類よりも少ないクローンとなるように設計されており、酵母表面ディスプレイを用いて多様性空間全体を網羅することが可能なものであった。これらのライブラリーの設計を図１３（Ａ）〜（Ｄ）に示す。４つのライブラリーの設計を用い、すべてのライブラリーはＮＮＫまたは他の縮重コドン位置で縮重オリゴを使用して作製し、上記に述べたようにオーバーラップＰＣＲにより増幅した。
【０３５７】
第１のライブラリーは、ＣＨ３Ｃ．３５様配列のコンセンサスに基づいたものとした（図１３（Ａ））。この場合、１５７〜１６１位をＹＧＴＥＷ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）として一定に保つ一方で、１６２、１６３、１８６、１８９、及び１９４位を飽和突然変異誘発を用いて変異させた。
【０３５８】
第２のライブラリーは、ＣＨ３Ｃ．１８様配列のコンセンサスに基づいたものとした（図１３（Ｂ））。この場合、１５７位をＬｅｕ及びＭｅｔに限定し、１５９位をＬｅｕ及びＨｉｓに限定し、１６０位をＶａｌとして一定に保ち、１６１位をＴｒｐ及びＧｌｙに限定し、１６２位をＶａｌ及びＡｌａに限定し、１６３位を完全にランダム化し、１６４位をレジスターに追加して完全にランダム化し、１８６位をソフトランダム化し、１８９位を完全にランダム化し、１９４位を芳香族アミノ酸及びＬｅｕに限定した。
【０３５９】
第３のライブラリーでは、新たなランダム化された位置をライブラリーに追加した（図１３（Ｃ））。ＣＨ３Ｃ．１８及びＣＨ３Ｃ．３５をそれぞれ出発レジスターとする２つのバージョンを作製し、次いで、Ｅ１５３、Ｅ１５５、Ｙ１６４、Ｓ１８８、及びＱ１９２の更なる位置を飽和突然変異誘発によりランダム化した。
【０３６０】
第４のライブラリーは、ＣＨ３Ｃ．１８の特定の位置を一定に保ったが、コンセンサスライブラリーよりも低いバイアスで他の位置を変異させた（図１３（Ｄ））。１６０、１６１、及び１８６位を固定し、１５７、１５９、１６２、１６３、及び１８９位を飽和突然変異誘発によりランダム化し、１９４位は変異させたが芳香族残基及びＬｅｕに限定した。
【０３６１】
上記に述べたように、各ライブラリーを酵母でカニクイザルＴｆＲに対して４〜５ラウンド選択し、単一のクローンをシークエンシングしてポリペプチド−Ｆａｂ融合体に変換した。カニクイザルＴｆＲへの結合における最大の濃縮が第２のライブラリー（すなわちＣＨ３．１８親の誘導体）から観察されたが、ヒトＴｆＲへの結合に若干の低下もみられた。
【０３６２】
ＣＨ３Ｃ成熟クローンの結合の特性分析
上記に述べたように、精製したＣＨ３Ｃ  Ｆｃ−Ｆａｂ融合変異体と、プレートにコーティングしたヒトまたはカニクイザルＴｆＲとの結合ＥＬＩＳＡを行った。ＣＨ３Ｃ．１８成熟ライブラリーからの変異体であるＣＨ３Ｃ３．２−１、ＣＨ３Ｃ．３．２−５、及びＣＨ３Ｃ．３．２−１９がヒト及びカニクイザルＴｆＲとおおよそ等しいＥＣ５０値で結合したのに対して、親クローンのＣＨ３Ｃ．１８及びＣＨ３Ｃ．３５は、カニクイザルＴｆＲに対してヒトＴｆＲに、１０倍よりも高い結合を示した（図１４）。
【０３６３】
次に、新規なポリペプチドがヒト及びサルの細胞内に内在化するかについて試験を行った。「第１世代ＣＨ３Ｃクローンの特性分析」と題したセクションで上記に述べたプロトコールを用いて、ヒトＨＥＫ２９３細胞及びアカゲザルＬＬＣ−ＭＫ２細胞における内在化を試験した。図１５に示されるように、ヒト及びカニクイザルＴｆＲに対して同様に結合した変異体であるＣＨ３Ｃ．３．２−５及びＣＨ３Ｃ．３．２−１９は、ＣＨ３Ｃ．３５と比較して顕著に改善された内在化をＬＬＣ−ＭＫ２において示した。
【０３６４】
ＣＨ３Ｃクローンの更なる操作
更なる親和性成熟クローンであるＣＨ３Ｃ．１８及びＣＨ３Ｃ．３５に対する更なる操作において、骨格（すなわちレジスター以外の）位置に更なる変異を加えて、直接的相互作用、第２水和殻相互作用、または構造的安定化を介して結合を向上させた。これは、「ＮＮＫウォーク」または「ＮＮＫパッチ」ライブラリーの作製、及びこれらのライブラリーからの選択を行うことによって実現された。ＮＮＫウォークライブラリーでは、パラトープの近傍の残基に１つずつＮＮＫ変異を導入した。ＦｃｇＲＩに結合したＦｃ（ＰＤＢ  ＩＤ：４Ｗ４Ｏ）の構造をみることにより、図１６に示されるように、元のライブラリーレジスターの近くの４４個の残基が調査の候補として特定された。詳細には、以下の残基、すなわち、Ｋ２１、Ｒ２８、Ｑ１１５、Ｒ１１７、Ｅ１１８、Ｑ１２０、Ｔ１３２、Ｋ１３３、Ｎ１３４、Ｑ１３５、Ｓ１３７、Ｋ１４３、Ｅ１５３、Ｅ１５５、Ｓ１５６、Ｇ１５８、Ｙ１６４、Ｋ１６５、Ｔ１６６、Ｄ１７２、Ｓ１７３、Ｄ１７４、Ｓ１７６、Ｋ１８２、Ｌ１８３、Ｔ１８４、Ｖ１８５、Ｋ１８７、Ｓ１８８、Ｑ１９１、Ｑ１９２、Ｇ１９３、Ｖ１９５、Ｆ１９６、Ｓ１９７、Ｓ１９９、Ｑ２１１、Ｓ２１３、Ｓ２１５、Ｌ２１６、Ｓ２１７、Ｐ２１８、Ｇ２１９、及びＫ２２０をＮＮＫ突然変異誘発の標的とした。Ｋｕｎｋｅｌ突然変異誘発を用いてこれらの４４種類のシングルポイントＮＮＫライブラリーを作製し、他の酵母ライブラリーについて上記に述べたように各産物をプールして電気穿孔法により酵母に導入した。
【０３６５】
これらのミニライブラリー（それぞれ１個の位置を変異させ、２０種類の変異体を生じる）の組み合わせによって小さいライブラリーが作製され、このライブラリーを、酵母表面ディスプレイを用いてより高い親和性の結合を生じる位置について選択した。ＴｆＲアピカルドメインタンパク質を用い、上記に述べたように選択を行った（図１７）。３ラウンドの分取の後、濃縮された酵母ライブラリーからのクローンをシークエンシングしたところ、特定の点突然変異がアピカルドメインタンパク質に対する結合を顕著に改善させるいくつかの「ホットスポット」位置が特定された。ＣＨ３Ｃ．３５では、これらの変異として、Ｅ１５３（Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、またはＧｌｎに変異させた）及びＳ１８８（Ｇｌｕに変異させた）が含まれた。ＣＨ３Ｃ．３５の単一変異体及び複合変異体の配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１〜２３、３９〜４４、及び１００〜１０２に記載される。ＣＨ３Ｃ．１８では、これらの変異には、Ｅ１５３（Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＬｅｕに変異させた）及びＫ１６５（Ｇｌｎ、Ｐｈｅ、またはＨｉｓに変異させた）が含まれた。ＣＨ３Ｃ．１８の単一変異体の配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５〜５０に記載される。
【０３６６】
「ＮＮＫパッチ」アプローチは、ＣＨ３Ｂライブラリーについて上記に述べたものと似ているが、各パッチはＣＨ３レジスターに直接隣接している。クローンＣＨ３Ｃ．３５を出発点として使用して以下のライブラリーを作製した。すなわち、
ＣＨ３Ｃパッチ１：アミノ酸位置：Ｋ２１、Ｒ２８、Ｙ１６４、Ｋ１６５、及びＴ１６６；
ＣＨ３Ｃパッチ２：アミノ酸位置：Ｑ１１５、Ｒ１１７、Ｅ１１８、Ｑ１２０、及びＫ１４３；
ＣＨ３Ｃパッチ３：アミノ酸位置：Ｔ１３２、Ｋ１３３、Ｎ１３４、Ｑ１３５、及びＳ１３７；
ＣＨ３Ｃパッチ４：アミノ酸位置：Ｅ１５３、Ｅ１５５、Ｓ１５６、及びＧ１５８；
ＣＨ３Ｃパッチ５：アミノ酸位置：Ｄ１７２、Ｓ１７３、Ｄ１７４、Ｓ１７６、及びＫ１８２；
ＣＨ３Ｃパッチ６：アミノ酸位置：Ｌ１８３、Ｔ１８４、Ｖ１８５、Ｋ１８７、及びＳ１８８；
ＣＨ３Ｃパッチ７：アミノ酸位置：Ｑ１９１、Ｑ１９２、Ｇ１９３、Ｖ１９５、及びＦ１９６；
ＣＨ３Ｃパッチ８：アミノ酸位置：Ｓ１９７、Ｓ１９９、Ｑ２１１、Ｓ２１３、及びＳ２１５；ならびに
ＣＨ３Ｃパッチ９：アミノ酸位置：Ｌ２１６、Ｓ２１７、Ｐ２１８、Ｇ２１９、及びＫ２２０。
ＴｆＲアピカルドメインタンパク質を用い、上記に述べたように選択を行った。しかしながら、結合が向上したクローンは特定されなかった。
【０３６７】
ＣＨ３Ｃ．３５の親和性を改善するための更なる成熟ライブラリー
ＮＮＫウォークライブラリーから変異の組み合わせを特定する一方でこれらの周辺にいくつかの更なる位置を追加するための更なるライブラリーを、上記の酵母ライブラリーについて述べたように作製した。このライブラリーでは、ＹｘＴＥＷＳＳ及びＴｘｘＥｘｘｘｘＦモチーフを一定に保ち、以下の６つの位置、すなわちＥ１５３、Ｋ１６５、Ｋ１８７、Ｓ１８８、Ｓ１９７、及びＳ１９９を完全にランダム化した。位置Ｅ１５３及びＳ１８８は、これらの位置がＮＮＫウォークライブラリーにおいて「ホットスポット」であったことから含めた。位置Ｋ１６５、Ｓ１９７、及びＳ１９９は、これらの位置が結合領域の位置を決定し得るコアの部分を構成することから含め、Ｋ１８７は、１８８位に隣接していることから選択した。
【０３６８】
このライブラリーを、上記に述べたように、カニクイザルＴｆＲのアピカルドメインのみによって分取した。５ラウンドの後に濃縮されたプールをシークエンシングし、特定された固有のクローンのＣＨ３領域の配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１〜６８に記載される。
【０３６９】
ＣＨ３Ｃ．３５．２１の元のレジスター内の許容される多様性及びホットスポットの調査
次のライブラリーは、主要な結合パラトープ内の許容される多様性の全体像を調べるために設計した。用いたアプローチは、ＮＮＫウォークライブラリーと同様のものであった。元のレジスター位置（１５７、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１８６、１８９、及び１９４）のそれぞれ、ならびに２個のホットスポット（１５３及び１８８）をＮＮＫコドンで個々にランダム化することにより、酵母上で一連の単一位置飽和突然変異誘発ライブラリーを作製した。更に、それぞれの位置を個々に野生型残基に復帰変異させ、これらの個々のクローンを酵母上にディスプレイさせた。図１８は、野生型復帰変異及び単一位置のＮＮＫライブラリーと比較した親クローンＣＨ３Ｃ．３５．２１の結合を示す。１５３、１６２、１６３、及び１８８位は、野生型残基に復帰変異させた際にＴｆＲに対する相当の結合を維持した唯一の位置であった点が着目された（１８６位の野生型への復帰変異で若干の残留はあるものの大幅に消失した結合が認められた）。
【０３７０】
単一位置のＮＮＫライブラリーを、ヒトＴｆＲアピカルドメインに対して３ラウンドで分取して、結合したもののうち、上位の約５％を回収し、次いで少なくとも１６種類のクローンを各ライブラリーからシークエンシングした。これらの結果は、ＣＨ３Ｃ．３５クローンと関連して、各位置でどのアミノ酸がヒトＴｆＲに対する結合を大きく低下させることなく許容され得るかを示している。以下に要約を示す。
位置１５３：Ｔｒｐ、Ｌｅｕ、またはＧｌｕ；
位置１５７：ＴｙｒまたはＰｈｅ；
位置１５９：Ｔｈｒのみ；
位置１６０：Ｇｌｕのみ；
位置１６１：Ｔｒｐのみ；
位置１６２：Ｓｅｒ、Ａｌａ、またはＶａｌ（野生型のＡｓｎ残基は若干の結合を維持するようにみえたが、その後のライブラリー分取ではそのようにみえなかった点が着目された）；
位置１６３：ＳｅｒまたはＡｓｎ；
位置１８６：ＴｈｒまたはＳｅｒ；
位置１８８：ＧｌｕまたはＳｅｒ；
位置１８９：Ｇｌｕのみ；及び
位置１９４：Ｐｈｅのみ。
【０３７１】
上記の残基は、１個の変化として、または組み合わせでクローンＣＨ３Ｃ．３５内に置換された場合にＴｆＲアピカルドメインに対する結合を維持するパラトープの多様性を表す。これらの位置に変異を有するクローンが表４に示されており、これらのクローンのＣＨ３ドメインの配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０〜４４、６７、及び６９〜９９に記載される。
【０３７２】
一価のポリペプチドＦａｂ融合体
一価のＴｆＲ結合ポリペプチド−Ｆａｂ融合体の作製
Ｆｃドメインは自然でホモ二量体を形成するが、一方のＦｃ単位がＴ１３９Ｗのノブ変異（ＥＵ番号付けスキームを用いた場合に３６６位に相当）を有し、他方のＦｃ単位がＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖのホール変異（ＥＵ番号付けスキームを用いた場合にそれぞれ３６６、３６８、及び４０７位に相当）を有する「ノブ・イン・ホール」として知られる一連の非対称的変異によって２個のＦｃフラグメントの選択的ヘテロ二量体化を生じ得る。いくつかの実施形態では、本発明の改変ＣＨ３ドメインは、１３９位にＴｒｐを含む。いくつかの実施形態では、本発明の改変ＣＨ３ドメインは、１３９位にＳｅｒを、１４１位にＡｌａを、１８０位にＶａｌを含む。ヘテロ二量体のＴＦＲ結合ポリペプチドを、２種類のプラスミド（すなわち、ノブＦｃとホールＦｃ）の一過性の同時トランスフェクションにより２９３またはＣＨＯ細胞で発現させる一方で、ポリペプチド−Ｆａｂ融合体を３種類のプラスミド（すなわち、ノブ−Ｆｃ−Ｆａｂ重鎖、ホール−Ｆｃ−Ｆａｂ−重鎖、及び一般的な軽鎖）の一過性の同時トランスフェクションにより発現させた。分泌されたヘテロ二量体ポリペプチドまたはポリペプチド−Ｆａｂ融合体の精製を、ホモ二量体におけるのと同じように行った（すなわち、プロテインＡを使用した２カラム精製に続いてサイズ排除クロマトグラフィーを行い、その後、必要に応じて濃縮及びバッファー交換を行う）。質量分析または疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いて形成されたホモ二量体（例えば、ノブ−ノブ、またはホール−ホールで対合したＦｃ）に対するヘテロ二量体の量を決定した。典型的な調製物では、ポリペプチドの９５％超、しばしば９８％超がヘテロ二量体であった。明確さのため、この方法で作製されたすべての一価ＴｆＲ結合物（Ｆｃホモ二量体）を、ＺＺがポリペプチドの名前であるものとし、「．一価」が一価のＴｆＲ結合を示すものとして「ＺＺ．一価」と命名した。特に断らない限り、ヘテロ二量体ポリペプチド及びポリペプチド−Ｆａｂ融合体において、ＴｆＲ結合を与える変異には「ノブ」変異が含まれたのに対して、ＴｆＲに結合しないＦｃ領域は「ホール」領域とともに用いた。ある場合では、これらのコンストラクトには、Ｌ７Ａ／Ｌ８Ａ、Ｍ２５Ｙ／Ｓ２７Ｔ／Ｔ２９Ｅ、Ｎ２０７Ｓ、または改変されたＦｃγＲもしくはＦｃＲｎ結合に対してそれぞれＮ２０７Ｓ／Ｍ２０１Ｌなど、Ｆｃの特性を変化させる更なる変異も含まれていた。
【０３７３】
ＣＨ３Ｃ．一価Ｆｃポリペプチドの結合の特性分析
一価のＣＨ３Ｃポリペプチドの結合を、上記に述べた方法の改法を用いてＥＬＩＳＡで測定した。ストレプトアビジンをＰＢＳ中、１μｇ／ｍＬで一晩、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートにコーティングした。洗浄後、プレートをＰＢＳ中、１％ＢＳＡでブロッキングした後、ビオチン化したヒトまたはカニクイザルＴｆＲを１μｇ／ｍＬで加え、３０分間インキュベートした。更に洗浄した後、ポリペプチドを各プレートに連続希釈で加え、１時間インキュベートした。各プレートを洗浄し、二次抗体（すなわち、抗κ−ＨＲＰ、１：５０００）を３０分間加え、プレートを再び洗浄した。各プレートをＴＭＢ基質で発色させ、２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４でクエンチした後、ＢｉｏＴｅｋ（登録商標）プレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を読み取った。結果を図１９に示すが、これはスタンダード（すなわち、二価のＴｆＲ結合）と一価のＴｆＲ結合ポリペプチドとを直接比較したものである。Ａｂ２０４は、高親和性の抗ＴｆＲコントロール抗体である。
【０３７４】
ヒトＴｆＲを内因性に発現する２９３Ｆ細胞、及びヒトＴｆＲまたはカニクイザルＴｆＲを安定的にトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１細胞に対する結合について更に試験を行った（図２０）。
【０３７５】
一般的に、一価のポリペプチドでは二価のポリペプチドと比較してヒトＴｆＲに対して大幅に低下した結合が観察され、一価のポリペプチドではカニクイザルに対する結合は弱すぎてこれらのアッセイで検出されなかった。
【０３７６】
次に、ＣＨ３Ｃポリペプチドの一価のバージョンが、ヒトＴｆＲを発現するＨＥＫ２９３細胞内に内在化するかどうかについて試験した。内在化アッセイについて上記に述べた方法を用いた。二価と一価のポリペプチドを比較した図２１に示されるように、一価のペプチドも内在化することができたが、全体的なシグナルは、恐らくは結合アフィニティー／アビディティーの喪失のために対応する二価のバージョンよりも弱かった。
【０３７７】
バイオレイヤー干渉法によって測定したＣＨ３Ｃポリペプチドの結合速度論
結合速度論を、抗ＢＡＣＥ１  Ｆａｂに融合されたいくつかの一価及び二価ＣＨ３Ｃポリペプチド変異体について測定し、バイオレイヤー干渉法を用いてそれらの二価の相当物と比較した（すなわち、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ＲＥＤシステムを用いた）。ＴｆＲをストレプトアビジンセンサー上に捕捉し、次いでＣＨ３Ｃポリペプチドを結合させて洗い流した。センサーグラムを１：１の結合モデルにフィッティングしたところ、二価ポリペプチドのＫＤ（ａｐｐ）値は、ＴｆＲ二量体に対する強い結合を示した。結果を、表５ならびに図２２及び２３に示す。
【０３７８】
（表５）Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ＲＥＤを用いたＣＨ３Ｃポリペプチドの速度論
2020530293.tif 000007
ｎ．ｄ．＝低すぎる結合シグナルのために測定されず。
【０３７９】
一価のフォーマットに変換されたポリペプチドは、アビディティーの喪失により、有意に弱いＫＤ（ａｐｐ）値を有した。ＥＬＩＳＡによって上記でヒト及びカニクイザルＴｆＲに対して同様の結合を有することが示されたクローンＣＨ３Ｃ．３．２−１、ＣＨ３Ｃ．３．２−５、及びＣＨ３Ｃ．３．２−１９は、ヒトＴｆＲとカニクイザルＴｆＲ間で極めて近いＫＤ（ａｐｐ）値も有していた。これらのポリペプチドの一価の形態を試験することを試みたが、このアッセイにおける結合は弱すぎて速度論パラメータは計算できなかった。
【０３８０】
実施例３  Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）を用いた更なるＣＨ３Ｃ変異体の結合の特性分析
組換えＴｆＲのアピカルドメインのクローン変異体の親和性をＢｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００装置を使用して表面プラズモン共鳴により測定した。Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）シリーズＳ  ＣＭ５のセンサーチップを抗ヒトＦａｂとともに固定化した（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅより販売されるヒトＦａｂ捕捉キット）。５μｇ／ｍＬのポリペプチド−Ｆａｂ融合体を各フローセル上に１分間捕捉させ、ヒトまたはカニクイザルアピカルドメインの連続３倍希釈液を流速３０μＬ／分で室温で注入した。各試料を４５秒間の結合及び３分間の解離により分析した。それぞれの注入後、１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．１）を用いてチップを再生した。結合応答を、無関連のＩｇＧを同様の密度で捕捉させたフローセルからのＲＵを引くことによって補正した。Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖ３．１．を用いて平衡状態の応答を濃度に対してフィッティングすることによって、安定状態の親和性を得た。
【０３８１】
組換えＴｆＲ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のクローン変異体の親和性を求めるため、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）シリーズＳ  ＣＭ５センサーチップをストレプトアビジンとともに固定化した。ビオチン化したヒトまたはカニクイザルＴｆＲのＥＣＤを各フローセル上に１分間捕捉させ、各クローン変異体の連続３倍希釈液を流速３０μＬ／分で室温で注入した。各試料を４５秒間の結合及び３分間の解離により分析した。結合応答を、同様の密度でＴｆＲ  ＥＣＤを有さないフローセルからのＲＵを引くことによって補正した。Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖ３．１．を用いて平衡状態の応答を濃度に対してフィッティングすることによって、安定状態の親和性を得た。
【０３８２】
結合親和性を表６に要約する。親和性は安定状態のフィッティングにより得た。
【０３８３】
（表６）更なるＣＨ３Ｃ変異体の結合親和性
2020530293.tif 000008
【０３８４】
更なるＣＨ３Ｃ変異体としてＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．２．１、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１、ＣＨ３Ｃ．３５．Ｓ４１３、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．３．１、ＣＨ３Ｃ．３５．Ｎ３９０．１、及びＣＨ３Ｃ．３５．２３．６．１を作製し、ヒトＴｆＲに対するそれらの結合親和性を上記に述べたものと同じプロトコールに従って測定した。ＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．２．１、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１、ＣＨ３Ｃ．３５．Ｓ４１３、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．３．１、ＣＨ３Ｃ．３５．Ｎ３９０．１、及びＣＨ３Ｃ．３５．２３．６．１の結合親和性は、それぞれ６２０ｎＭ、６９０ｎＭ、７５０ｎＭ、１７００ｎＭ、１９００ｎＭ、２０００ｎＭ、及び２１００ｎＭである。
【０３８５】
実施例４  ＦｃＲｎに対するＣＨ３Ｃ変異体の結合特性
ＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）ストレプトアビジンバイオセンサーを用いたＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ＲＥＤ３８４装置を使用してＦｃＲｎ結合アッセイを行った。ビオチン化した組換えＢＡＣＥ１をカイネティックバッファー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）より入手したもの）中で１０μｇ／ｍＬの濃度に希釈し、個々のバイオセンサー上に１分間捕捉させた。次にベースラインをカイネティックバッファー中で１分間、確立した。１０μｇ／ｍＬのポリペプチド−Ｆａｂ融合体（抗ＢＡＣＥ１  Ｆａｂアームを有するもの）を、１μＭのヒトＴｆＲのＥＣＤの存在下または非存在下でセンサーチップに結合させた。固定化したポリペプチド−Ｆａｂ融合体に対する組換えヒトＦｃＲｎ（ｐＨ５．５）の結合を、３分間の結合及び３分間の分離を行って分析した。
【０３８６】
これらの実験から得られたセンサーグラム（図２４）は、各ポリペプチド−Ｆａｂ融合体変異体が酸性ｐＨ（ｐＨ５．５）でＦｃＲｎと結合すること、及びＴｆＲとの結合がＦｃＲｎとの結合を顕著に阻害しなかったことを示している。
【０３８７】
実施例５  ＣＨ３Ｃ変異体の薬物動態学的／薬力学的特性分析
本実施例では、マウスの血漿中及び脳組織中での本発明のＣＨ３Ｃ変異体ポリペプチドの薬物動態学的／薬力学的（ＰＫ／ＰＤ）特性分析について述べる。
【０３８８】
野生型マウス血漿中でのＣＨ３Ｃの薬物動態学
ポリペプチド−Ｆａｂ融合体はヒトＴｆＲにのみ結合し、マウスＴｆＲには結合しないことから、ＴｆＲ媒介性クリアランスを有さないモデルにおけるインビボ安定性を示すために野生型マウスでいくつかのＣＨ３Ｃ変異体の薬物動態学（ＰＫ）を試験した。研究計画を下記表７に示す。６〜８週齢のＣ５７Ｂｌ６マウスに静脈内投与し、表７に示される時点において顎下瀉血により生存中瀉血が行われた。血液をＥＤＴＡ血漿チューブに採取し、１４，０００ｒｐｍで５分間遠心した後、血漿を後の分析用に単離した。
【０３８９】
（表７）ＰＫ研究計画
2020530293.tif 000009
【０３９０】
Ａｂ１２２は、マウスで正常なＰＫを有する抗ＲＳＶコントロールとして使用した。Ａｂ１５３は、マウスで正常なＰＫを有する抗ＢＡＣＥ１コントロールとして使用した。この研究では、Ａｂ１５３のＦａｂアームを各ポリペプチドに融合した。
【０３９１】
マウス血漿中のポリペプチド濃度を、ジェネリックのヒトＩｇＧアッセイ（ＭＳＤ（登録商標）ヒトＩｇＧキット＃Ｋ１５０ＪＬＤ−４）を製造者の指示に従って使用して定量した。要約すると、予めコーティングしたプレートをＭＳＤ（登録商標）Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ａで３０分間ブロッキングした。血漿試料を、Ｈａｍｉｌｔｏｎ（登録商標）ＮＩＭＢＵＳリキッドハンドリング装置を使用して１：２５００で希釈し、ブロッキングしたプレートに二つ組で加えた。投与溶液も同じプレート上で分析して適正な用量を確認した。標準曲線として０．７８〜２００ｎｇ／ｍＬのＩｇＧを、４パラメータロジスティック回帰を用いてフィッティングした。図２５及び表８は、これらのデータの分析結果を示す。大幅に速いクリアランス及び短い半減期を有していたＣＨ３Ｃ．３．２−５を除き、ＣＨ３Ｃポリペプチド変異体のすべてが、標準Ａｂ１２２と同等のクリアランス及び半減期の値を有していた。興味深い点として、この変異体はＣＨ３Ｃ．３．２−１９（Ｎ１６３Ｄ）の点変異体であり、後者は正常なＰＫプロファイルを有していた。
【０３９２】
（表８）ＣＨ３Ｃポリペプチド−Ｆａｂ融合体のＰＫパラメータ
2020530293.tif 000010
【０３９３】
野生型マウスにおける更なるＰＫ研究
下記表９の研究計画に従って野生型マウスで第２のＰＫ研究を行った（すべてのポリペプチド−Ｆａｂ融合体はＡｂ１５３  Ｆａｂと融合させたもの）。
【０３９４】
（表９）
2020530293.tif 000011
【０３９５】
マウス及び試料を上記の研究で述べたように処理した。データを表１０に示す。
【０３９６】
（表１０）ＣＨ３Ｃ．３５ポリペプチド−Ｆａｂ融合体のクリアランス値
2020530293.tif 000012
【０３９７】
クリアランス値から明らかなように、これらのポリペプチド−Ｆａｂ融合体は、標準コントロール抗体と比較して野生型マウスで同様のクリアランスを示した。
【０３９８】
野生型マウスの脳組織における一価ＣＨ３Ｃ．３５．Ｎ１６３のＰＫ／ＰＤの評価
マウスＴｆｒｃ遺伝子内でヒトＴｆｒｃアピカルドメインを発現するトランスジェニックマウスを、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を用いて作製した。得られたキメラＴｆＲを内因性プロモーターの制御下でインビボで発現させた。
【０３９９】
キメラｈｕＴｆＲアピカルヘテロ接合体マウス（ｎ＝４／群）に４２ｍｇ／ｋｇのＡｂ１５３または一価ＣＨ３Ｃ．３５．Ｎ１６３のいずれかを静脈内投与し、野生型マウス（ｎ＝３）に５０ｍｇ／ｋｇのコントロールヒトＩｇＧ１を静脈内投与した。Ａｂ１５３は、マウスで正常なＰＫを有するコントロールとして使用した。すべてのマウスを投与２４時間後にＰＢＳで灌流した。灌流に先立ち、血液をＥＤＴＡ血漿チューブ中に心穿刺により採取し、１４，０００ｒｐｍで５分間遠心した。次いで、後のＰＫ及びＰＤ分析用に血漿を単離した。灌流後の脳を摘出し、脳半球（ｈｅｍｉ−ｂｒａｉｎ）を分離して組織重量の１０倍のＰＢＳ中、１％ＮＰ−４０（ＰＫ用）または５Ｍ  ＧｕＨＣｌ（ＰＤ用）中でホモジナイズした。
【０４００】
図２６は、脳のＰＫ研究の結果を示す。取り込みは、一価ＣＨ３Ｃ．３５．Ｎ１６３のグループで、Ａｂ１５３及びコントロールヒトＩｇＧ１グループよりも大きかった。
【０４０１】
ｈＴｆＲアピカル＋／＋マウスにおけるポリペプチド−Ｆａｂ融合体の脳及び血漿中のＰＫＰＤ：ＣＨ３Ｃ．３５．２１及びＣＨ３Ｃ．３５．Ｎ１５３
表１１の研究計画に示されるように、５０ｍｇ／ｋｇの抗ＢＡＣＥ１抗体Ａｂ１５３、抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１二重特異性抗体Ａｂ１１６、Ａｂ１５３のＦａｂと融合したＣＨ３Ｃ．３５．２１．一価、またはＡｂ１５３のＦａｂと融合したＣＨ３Ｃ．３５．Ｎ１５３．二価のいずれかを、ホモ接合体ｈＴｆＲアピカル＋／＋マウスに静脈内注射した。この研究では、すべてのＦｃはエフェクター機能を除去するようにＬＡＬＡＰＧ変異を有していた。
【０４０２】
（表１１）単一ポイントの脳及び血漿ＰＫＰＤ研究の研究計画
2020530293.tif 000013
【０４０３】
２４時間後、血液を心穿刺により採取し、マウスをＰＢＳで灌流した。脳組織を組織重量の１０倍のＰＢＳ中、１％ＮＰ−４０を含む溶解バッファー中でホモジナイズした。凝固を防止するために血液をＥＤＴＡチューブ中に採取し、１４，０００ｒｐｍで７分間遠心して血漿を単離した。マウス血漿及び脳ライセート中のポリペプチド濃度を、ジェネリックのヒトＩｇＧアッセイ（ＭＳＤヒトＩｇＧキット＃Ｋ１５０ＪＬＤ）を製造者の指示に従って使用して定量した。要約すると、予めコーティングしたプレートをＭＳＤ  Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ａで３０分間ブロッキングした。血漿試料を、Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｎｉｍｂｕｓリキッドハンドリング装置を使用して１：１０，０００で希釈し、ブロッキングしたプレートに二つ組で加えた。脳試料を１％ＮＰ４０溶解バッファー中でホモジナイズし、ライセートをＰＫ分析用に１：１０に希釈した。投与溶液も同じプレート上で分析して適正な用量を確認した。標準曲線として０．７８〜２００ｎｇ／ｍＬのＩｇＧを、４パラメータロジスティック回帰を用いてフィッティングした。
【０４０４】
２４時間後のＴｆＲ結合ポリペプチドの血漿濃度は、抗ＢＡＣＥ１の濃度よりも低かったが、これは、末梢で発現したｈＴｆＲアピカルとの結合を介したこの抗体のクリアランスによるものと考えられる（図２７（Ａ））。脳では、抗ＢＡＣＥ１と比較して抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１の濃度に有意な増加が認められた（図２７（Ｂ））。最大の増加はＣＨ３Ｃ．３５．２１．一価で観察されたが、脳での取り込みは、ＣＨ３Ｃ３５．Ｎ１５３．二価でも抗ＢＡＣＥと比較して有意に改善した。操作されたＴｆＲ結合ポリペプチドのこのような顕著な蓄積は、血液脳関門におけるＴｆＲ媒介性トランスサイトーシスによるものであり、したがって、ＴｆＲとの結合性をＦｃ領域に遺伝子操作によって組み込むことの有用性を証明するものである。
【０４０５】
アミロイド前駆体タンパク質ＡＰＰの切断のＢＡＣＥ１阻害を、血漿及び脳における抗体活性の薬力学的読出し値として用いた。脳組織を組織重量の１０倍の５Ｍグアニジン−ＨＣｌ中でホモジナイズし、次いでＰＢＳ中０．２５％カゼインバッファー中で１：１０に希釈した。サンドイッチＥＬＩＳＡを用いて血漿及び脳ライセート中のマウスＡβ４０濃度を測定した。３８４ウェルＭａｘｉＳｏｒｐプレートに、Ａβ４０ペプチドのＣ末端に特異的なポリクローナル捕捉抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ＃ＡＢＮ２４０）を一晩コーティングした。カゼインで希釈したグアニジン脳ライセートをＥＬＩＳＡプレート上で更に１：２に希釈し、検出抗体としてビオチン化Ｍ３．２を同時に加えた。血漿を１：５の希釈度で分析した。各試料を４℃で一晩インキュベートした後、ストレプトアビジン−ＨＲＰ、次いでＴＭＢ基質を加えた。標準曲線として０．７８〜５０ｐｇ／ｍＬのｍｓＡβ４０を、４パラメータロジスティック回帰を用いてフィッティングした。
【０４０６】
すべてのポリペプチドで抗ＢＡＣＥ１  Ｆａｂアームが存在することにより、血漿中のアミロイドβタンパク質（Ａβ）は、非処理の野生型マウスと比較してすべてのポリペプチドで同様の程度で低下した（図２８（Ａ））。抗ＢＡＣＥ１と比較して、ＴｆＲ結合ポリペプチドによる処置は、ｈＴｆＲアピカル＋／＋マウスにおけるＡβの大きな低下を生じ、脳におけるＢＡＣＥ１と標的の結合が得られたことを示した（図２８（Ｂ））。脳における標的結合のレベルは、操作したポリペプチド融合体と抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１二重特異性抗体とで同様であった。
【０４０７】
ｈＴｆＲアピカル＋／＋マウスにおけるポリペプチド−Ｆａｂ融合体の脳及び血漿中のＰＫＰＤ：ＣＨ３Ｃ．３５．２１、ＣＨ３Ｃ．３５．２０、ＣＨ３Ｃ．３５、ＣＨ３Ｃ．３５．２３、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．３
ＰＫ及び脳での取り込みに対するＴｆＲ結合親和性の影響を評価するため、Ｂｉａｃｏｒｅによって測定されるアピカルヒトＴｆＲに対する結合親和性の異なる抗ＢＡＣＥ１  Ａｂ１５３及びＴｆＲ結合ポリペプチド融合体（ＣＨ３Ｃ．３５．２１：Ａｂ１５３、ＣＨ３Ｃ．３５．２０：Ａｂ１５３、ＣＨ３Ｃ．３５：Ａｂ１５３融合体）を作製した。ヒトＴｆＲに対するＣＨ３Ｃ．３５．２１：Ａｂ１５３、ＣＨ３Ｃ．３５．２０：Ａｂ１５３、ＣＨ３Ｃ．３５：Ａｂ１５３融合体の結合親和性はそれぞれ、１００ｎＭ、１７０ｎＭ、及び６２０ｎＭである。ｈＴｆＲアピカル＋／＋マウスノックインマウスに、５０ｍｇ／ｋｇのＡｂ１５３または各ポリペプチド−Ｆａｂ融合体を全身投与し、血漿ＰＫ及び脳ＰＫＰＤを投与の１、３、及び７日後に評価した。脳及び血漿ＰＫＰＤ分析を上記のセクションで述べたように行った。末梢組織でのＴｆＲの発現により、ＣＨ３Ｃ．３５．２１：Ａｂ１５３、ＣＨ３Ｃ．３５．２０：Ａｂ１５３、及びＣＨ３Ｃ．３５：Ａｂ１５３融合体は、Ａｂ１５３単独と比較して血漿中のより速やかなクリアランスを示したが、これは、標的媒介性のクリアランスと一致し、インビボでのＴｆＲ結合を示すものである（図３９（Ａ））。印象的な点として、ＣＨ３Ｃ．３５．２１：Ａｂ１５３、ＣＨ３Ｃ．３５．２０：Ａｂ１５３、及びＣＨ３Ｃ．３５：Ａｂ１５３融合体の脳内濃度は、Ａｂ１５３と比較して有意に増大し、同じ時点におけるＡｂ１５３がわずかに約３ｎＭであったのと比較して投与後１日目に３０ｎｍよりも高い最大脳内濃度が得られた（図３９（Ｂ））。ＣＨ３Ｃ．３５．２１：Ａｂ１５３、ＣＨ３Ｃ．３５．２０：Ａｂ１５３、及びＣＨ３Ｃ．３５：Ａｂ１５３融合体の脳曝露の増大は、Ａｂ１５３を投与したマウスにおけるＡβ濃度と比較して、マウスの脳で約５５〜６０％低い内因性のマウスＡβ濃度を生じた（図３９（Ｃ））。ＣＨ３Ｃ．３５．２１：Ａｂ１５３、ＣＨ３Ｃ．３５．２０：Ａｂ１５３、及びＣＨ３Ｃ．３５：Ａｂ１５３融合体の濃度が脳で高い状態に保たれた一方で、このようなより低い脳のＡβ濃度は維持され、７日目までに曝露が低減された際にＡｂ１５３で処置したマウスと同様の濃度に戻った。経時的な脳曝露の低下は、ＣＨ３Ｃ．３５．２１：Ａｂ１５３、ＣＨ３Ｃ．３５．２０：Ａｂ１５３、及びＣＨ３Ｃ．３５：Ａｂ１５３融合体の末梢曝露の低下と相関しており、インビボでの明確なＰＫ／ＰＤの関係を示した（図３９（Ａ）と３９（Ｃ）とを比較）。更に、全体の脳のＴｆＲ濃度は、この単回の高用量の投与後にＡｂ１５３処理マウスとポリペプチド−Ｆａｂ融合体処理マウスとで同等であり、脳におけるＴｆＲ発現に対して、ポリペプチド−Ｆａｂ融合体の脳曝露の増加が有意な影響を及ぼさないことを示している（図３９（Ｄ））。
【０４０８】
ＴｆＲ結合ポリペプチド−Ｆａｂ融合体のより広い親和性範囲でのＰＫと脳での取り込みとの関係を更に評価するため、ｈＴｆＲとの結合についてより広い親和性範囲を有する更なる融合体を作製した。ヒトＴｆＲに対するＣＨ３Ｃ．３５．２３：Ａｂ１５３及びＣＨ３Ｃ．３５．２３．３：Ａｂ１５３融合体の結合親和性は、それぞれ４２０ｎＭ及び１４４０ｎＭである。ｈＴｆＲアピカル＋／＋ノックインマウスに上記に述べたように投与を行った。血漿のＰＫ及び脳のＰＫＰＤを投与の１、４、７、及び１０日後に評価した。ポリペプチド−Ｆａｂ融合体の末梢でのＰＫはｈＴｆＲ親和性に依存しており、より親和性の高いＣＨ３Ｃ．３５．２３：Ａｂ１５３融合体は、大幅に低い親和性を有するＣＨ３Ｃ．３５．２３．３：Ａｂ１５３融合体と比較してより速やかなクリアランスを示した（図４０（Ａ））。ＣＨ３Ｃ．３５．２３：Ａｂ１５３及びＣＨ３Ｃ．３５．２３．３：Ａｂ１５３融合体はいずれも、Ａｂ１５３単独と比較して有意に高い脳曝露を有し、ＣＨ３Ｃ．３５．２３：Ａｂ１５３は投与後１日目に脳内で約３６ｎＭに達した（図４０（Ｂ））。血漿中濃度が同様であったにもかかわらず、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．３：Ａｂ１５３融合体のこの最大の脳での取り込みは、ＣＨ３．３５．２３：Ａｂ１５３融合体の脳での取り込みよりも低く、これは恐らくは後者の融合体のｈＴｆＲに対する親和性が約３．５倍低いことによるものと考えられる。興味深い点として、親和性のより低い融合体が１０日目までにより持続した末梢曝露を与えたことから、その脳曝露も親和性のより高いＣＨ３Ｃ．３５．２３：Ａｂ１５３融合体よりも高かった。このことは、親和性のより低いＴｆＲ結合ポリペプチド−Ｆａｂ融合体では脳Ｃｍａｘはより低いがＰＫは経時的により持続するというトレードオフを示している。Ａβ４０の有意に低い濃度が、抗ＢＡＣＥ１単独と比較して抗ＢＡＣＥ１ポリペプチド融合体を投与したマウスの脳で観察された（図４０（Ｃ））。このＡβ４０低下の持続時間は、脳におけるｈｕＩｇＧ１曝露の経時的なレベルと一致していた（図４０（Ｂ））。印象的な点として、ＣＨ３Ｃ．３５：Ａｂ１５３融合体を投与したマウスは、単回投与の７〜１０日後まで持続的な脳のＡβ４０の低下を示した。全体的な脳のＴｆＲ濃度は、ＣＨ３Ｃ．３５：Ａｂ１５３融合体に対してＡｂ１５３を投与したマウス間で投与後１日目に同等であった（図４０（Ｄ））。これらのデータは共に、ＴｆＲ結合ポリペプチド融合体が抗ＢＡＣＥ１の脳曝露を増大させることにより単回投与後に脳のＡβ４０を有意に低下させ得ることを示すものである。
【０４０９】
実施例６  ＣＨ３Ｃ．１８Ｆｃ及びトランスフェリン受容体アピカルドメインの結晶化
本実施例では、ＣＨ３Ｃ．１８とトランスフェリン受容体のアピカルドメイン（ＴｆＲ−ＡＤ）との間の結合界面の結晶化及び分析について述べる。
【０４１０】
発現
ヒトトランスフェリン受容体のアピカルドメイン（ＴｆＲ−ＡＤ）及び操作されたヒトＦｃ（ＣＨ３Ｃ．１８  Ｆｃ）を、Ｅｘｐｉ２９３細胞内で、細胞２．５×１０６個／ｍＬの初期細胞密度で発現させた（それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０４及び１０５）。必要に応じて、２００ｍＬ以上の体積中で発現を行った。グリコシル化阻害剤であるキフネンシンをトランスフェクションの２０時間後に２５μＭの最終濃度で加えた。発現培養物を、細胞生存率が顕著に低下するトランスフェクションの３〜４日後に回収した。
【０４１１】
精製
発現させたＴｆＲ−ＡＤ及びＣＨ３Ｃ．１８  Ｆｃを、それぞれプロテインＡ及びＮｉ−ＮＴＡ樹脂を用いて精製した後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００  ２６／６０ゲル濾過カラムでサイズ排除クロマトグラフィーにかけた。以下のバッファーを使用した。
プロテインＡ洗浄バッファー：２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ；
プロテインＡ溶出バッファー：３０ｍＭグリシン、ｐＨ２．５（溶出液を１Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ９．０の入ったチューブに回収して溶出液を直ちに中和した）；
Ｎｉ−ＮＴＡ洗浄バッファー：３０ｍＭ  ＴｒｉｓｐＨ８．０、１０ｍＭイミダゾール、及び２００ｍＭ  ＮａＣｌ；
Ｎｉ−ＮＴＡ溶出バッファー：３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、及び２５０ｍＭイミダゾール；ならびに
サイズ排除バッファー（ＳＥＣ）：３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、及び３％グリセロール。
【０４１２】
複合体の形成及び精製
精製したＴｆＲ−ＡＤ及びＣＨ３Ｃ．１８  Ｆｃを過剰量のアピカルドメインと混合し、室温で１時間インキュベートし、上記に述べたＳＥＣバッファーを使用してＳｕｐｅｒｄｅｘ２００  ２６／６０ゲル濾過カラムでサイズ排除クロマトグラフィーを用いて複合体を精製した。サイジングによって、一方が複合体（保持容量＝１８０ｍｌ）に対応し、他方が過剰のアピカルドメイン（保持容量＝２４０ｍｌ）に対応した、２つの主要なピークが予想通り得られた。ピーク画分をクマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって分析した（図２９）。
【０４１３】
結晶化
シッティングドロップ蒸気拡散法により、１５℃及び室温（ＲＴ）で、８．５ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で複合体の初期結晶化スクリーニングを行った。２５％ＰＥＧ３３５０、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．５、及び０．２Ｍ  ＭｇＣｌ２を含む条件で細い針状の結晶のシャワーが観察された。これらの結晶を、２０％ＰＴＧ３３５０を用いた以外は同じ条件で種結晶として用いてマウントできるサイズの単一の細い針結晶を生成させた。
【０４１４】
Ｘ線データの収集
２０％（ｖ／ｖ）エチレングリコールを添加した結晶化母液を用いて液体窒素中に直接浸漬することによって結晶をフラッシュ冷却した。Ｒａｙｏｎｉｘ３００高速検出器を用い、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ（ＡＰＳ）のＳＥＲ−ＣＡＴのビームラインでＸ線強度のデータを収集した。結晶は３．６Åに回折し、２個の複合体分子が非対称単位中にある六角形の空間群Ｐ６４に属した（表１２）。データをＨＫＬ２０００プログラムを使用してインデックス付けし、積分して、スケーリングした。２個の結晶から収集したデータをマージして３．６Åのデータを生成した。
【０４１５】
（表１２）ＣＨ３Ｃ．１８  Ｆｃ−ＴｆＲ−ＡＤ複合体構造の結晶データ
2020530293.tif 000014
【０４１６】
構造決定及び精密化
複合体の結晶構造を、ＣＨ３Ｃ．１８  Ｆｃの二量体及びＴｆＲ−ＡＤの単量体を初期探索モデルとして用いてＰＨＡＳＥＲによる分子置換により決定した。このモデルを、ＲＥＦＭＡＣを用いて剛体精密化に続いて制限精密化を行って精密化した。結晶学的計算はすべて、ＣＣＰ４プログラムスイートを用いて実行した（www.ccp4.ac.uk/）。グラフィックプログラムＣＯＯＴを使用して複合体の電子密度へのモデル構築を行った。複合体分子の電子密度は、特にＣＨ３Ｃ．１８  Ｆｃ−ＴｆＲ−ＡＤの界面において良好であった（２Ｆｏ−Ｆｃマップを１．２シグマレベルに合わせた）。モデル構築及び精密化を繰り返し行った後、データの低い分解能及び無秩序化したＣＨ２ドメインのため、高いＲ及びｆｒｅｅＲが認められた（Ｒ／ｆｒｅｅＲ＝０．３０／０．３９）。他の利用可能なＦｃ構造に見られたＣＨ２の無秩序は、ＣＨ２とＣＨ３ドメインとの間の柔軟なエルボー角によるものであった。
【０４１７】
結合界面の相互作用
ＣＨ３Ｃ．１８  ＦｃとＴｆＲ−ＡＤとの結合界面が図３０（Ａ）及び図３０（Ｂ）ならびに図３１（Ａ）及び３１（Ｂ）に示されている。図３２（Ａ）及び図３２（Ｂ）に示されるように、
ＣＨ３Ｃ．１８のＴｒｐ１５４と、ＴｆＲ−ＡＤのＡｒｇ２０８；
ＣＨ３Ｃ．１８のＧｌｕ１５５と、ＴｆＲ−ＡＤのＡｒｇ２０８；
ＣＨ３Ｃ．１８のＳｅｒ１５６と、ＴｆＲ−ＡＤのＡｒｇ２０８及びＬｅｕ２１２；
ＣＨ３Ｃ．１８のＬｅｕ１５７と、ＴｆＲ−ＡＤのＳｅｒ１９９及びＡｓｎ２１５；
ＣＨ３Ｃ．１８のＨｉｓ１５９と、ＴｆＲ−ＡＤのＬｙｓ１８８、Ｓｅｒ１９９、及びＡｒｇ２０８；
ＣＨ３Ｃ．１８のＶａｌ１６０と、ＴｆＲ−ＡＤのＧｌｙ２０７及びＡｒｇ２０８；
ＣＨ３Ｃ．１８のＴｒｐ１６１と、ＴｆＲ−ＡＤのＡｒｇ２０８、Ｖａｌ２１０、及びＬｅｕ２１２；
ＣＨ３Ｃ．１８のＡｌａ１６２と、ＴｆＲ−ＡＤのＡｒｇ２０８；
ＣＨ３Ｃ．１８のＶａｌ１６３と、ＴｆＲ−ＡＤのＬｅｕ２０９；
ＣＨ３Ｃ．１８のＳｅｒ１８８と、ＴｆＲ−ＡＤのＴｙｒ２１１；
ＣＨ３Ｃ．１８のＴｈｒ１８９と、ＴｆＲ−ＡＤのＴｙｒ２１１及びＬｅｕ２１２；
ＣＨ３Ｃ．１８のＧｌｎ１９２と、ＴｆＲ−ＡＤのＬｙｓ１５８及びＧｌｕ２９４；
ＣＨ３Ｃ．１８のＴｒｐ１９４と、ＴｆＲ−ＡＤのＬｅｕ２１２、Ｖａｌ２１３、Ｇｌｕ２１４、及びＡｓｎ２１５；ならびに
ＣＨ３Ｃ．１８のＰｈｅ１９６と、ＴｆＲ−ＡＤのＡｒｇ２０８
の間で相互作用が認められた。更に、実施例２の「パラトープマッピング」と題したセクションで述べ、また、図３２（Ａ）及び図３２（Ｂ）に示されるように、ＣＨ３Ｃレジスターの外側のいくつかの位置もＴｆＲに対する結合に関与している。
【０４１８】
実施例７  ＣＨ３Ｃ．３５  Ｆｃ及びトランスフェリン受容体アピカルドメインの結晶化
本実施例では、ＣＨ３Ｃ．３５とトランスフェリン受容体のアピカルドメイン（ＴｆＲ−ＡＤ）との間の結合界面の結晶化及び分析について述べる。
【０４１９】
発現
ヒトトランスフェリン受容体のアピカルドメイン（ＴｆＲ−ＡＤ）及び操作されたヒトＦｃ（ＣＨ３Ｃ．３５  Ｆｃ）を、ＣＨＯ細胞内で、細胞２．５×１０６個／ｍＬの初期細胞密度で発現させた（それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０４及び１８１）。必要に応じて、５００ｍＬ以上の体積中で発現を行った。発現培養物を、細胞生存率が顕著に低下するトランスフェクションの３〜４日後に回収した。
【０４２０】
精製
発現させたＴｆＲ−ＡＤ及びＣＨ３Ｃ．３５  Ｆｃを、それぞれプロテインＡ及びＮｉ−ＮＴＡ（Ｓｉｇｍａ）樹脂を用いて精製した後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００  ２６／６０ゲル濾過カラムでサイズ排除クロマトグラフィーにかけた。以下のバッファーを使用した。
プロテインＡ溶出バッファー：３０ｍＭグリシン、ｐＨ２．５（溶出液を１Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ９．０の入ったチューブに回収して溶出液を直ちに中和した）；
Ｎｉ−ＮＴＡ溶出バッファー：３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、及び２５０ｍＭイミダゾール；ならびに
サイズ排除バッファー（ＳＥＣ）：３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＫＣｌ、３％グリセロール、及び０．０１％アジ化ナトリウム。
【０４２１】
複合体の形成及び精製
精製したＴｆＲ−ＡＤ及びＣＨ３Ｃ．３５  Ｆｃを過剰量のアピカルドメインと混合し、室温で１時間インキュベートし、上記に述べたＳＥＣバッファーを使用してＳｕｐｅｒｄｅｘ２００  ２６／６０ゲル濾過カラムでサイズ排除クロマトグラフィーを用いて複合体を精製した。
【０４２２】
結晶化
シッティングドロップ蒸気拡散法により、４℃、１５℃、及び室温（ＲＴ）で、複合体の初期結晶化スクリーニングを行った。２５％ＰＥＧ３３５０、０．１Ｍ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ｐＨ６．５、及び０．２Ｍ  ＬｉＳＯ４を含む条件で細い針状の結晶のシャワーが観察された。これらの結晶を、２０％ＰＴＧ３３５０を用いた以外は同じ条件で種結晶として用いて単一の細い針結晶を生成させ、シーディングを連続して４回繰り返してマウントできるサイズの結晶を生成させた。
【０４２３】
Ｘ線データの収集
２０％（ｖ／ｖ）エチレングリコールを添加した結晶化母液を用いて液体窒素中に直接浸漬することによって結晶をフラッシュ冷却した。ＰＩＬＡＴＵＳ検出器を用い、Ｄｉａｍｏｎｄ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅ（ＤＬＳ）のＩＯ４ビームラインでＸ線強度のデータを収集した。５ミクロンのサイズのマイクロフォーカスビームをデータ収集に使用した。結晶は3．38Åに回折し、２個の複合体分子が非対称単位中にある六角形の空間群Ｐ６４に属した（表１３）。ＣＣＰ４スイートプログラム（Ｘｉａ２−ＸＤＳ及びＸＳＣＡＬＥ）を使用してデータをインデックス付けし、積分して、スケーリングした。
【０４２４】
（表１３）ＣＨ３Ｃ．３５  Ｆｃ−ＴｆＲ−ＡＤ複合体構造の結晶データ
2020530293.tif 000015
【０４２５】
構造決定及び精密化
複合体の結晶構造を、ＣＨ３Ｃ．３５Ｆｃ−ＡＤ  ＴｆＲ複合体を探索モデルとして用いてＰＨＡＳＥＲによる分子置換により決定した。このモデルを、ＲＥＦＭＡＣを用いて剛体精密化に続いて制限精密化を行って精密化した。結晶学的計算はすべて、ＣＣＰ４プログラムスイートを用いて実行した。グラフィックプログラムＣＯＯＴを使用して複合体の電子密度へのモデル構築を行った。複合体分子の電子密度は、特にＣＨ３Ｃ．３５  Ｆｃ−ＴｆＲ−ＡＤの界面において良好であった。
【０４２６】
結合界面の相互作用
ＣＨ３Ｃ．３５  ＦｃとＴｆＲ−ＡＤとの結合界面が図３４（Ａ）〜３４（Ｃ）に示されている。図３４（Ａ）は、３．４ÅにおけるＣＨ３Ｃ．３５  ＦｃとＴｆＲ−ＡＤとの複合体を示す。図３４（Ｂ）は、ＣＨ３Ｃ．３５  Ｆｃ内の残基Ｗ１６１がＴｆＲ−ＡＤ内の残基Ｌ２０９、Ｌ２１２、及びＹ２１１によって安定化されていることを示す。図３４（Ｃ）は、ＣＨ３Ｃ．３５  Ｆｃ内の残基Ｅ１６０とＴｆＲ−ＡＤ内の残基Ｒ２０８間の中心的結合相互作用としての塩橋を示す。この相互作用は、ＦｃポリペプチドのヒトＴｆＲに対する結合親和性（２０８位のＡｒｇ）とカニクイザルＴｆＲに対する結合親和性（２０８位のＧｌｙ）との差を一部説明し得る。図３５（Ａ）は、ＣＨ３Ｃ．３５  ＦｃとＴｆＲ−ＡＤとの複合体と、ＣＨ３Ｃ．１８  ＦｃとＴｆＲ−ＡＤとの複合体（実施例６で述べたもの）とを重ね合わせた構造を示し、ＣＨ３Ｃ．１８とＣＨ３Ｃ．３５との間で大きなＦｃ骨格のコンフォメーション変化がみられないことを示している。図３５（Ｂ）は、図３５（Ａ）の重ね合わせ構造の拡大図を示す。ＣＨ３Ｃ．３５  Ｆｃ／ＴｆＲ−ＡＤ複合体のＴｆＲ−ＡＤ内の残基２０６〜２１２は、ＣＨ３Ｃ．１８  Ｆｃ／ＴｆＲ−ＡＤ複合体のＴｆＲ−ＡＤ内の残基とは異なるコンフォメーションを取っていた。ＴｆＲ−ＡＤ内の残基Ｒ２０８は、ＣＨ３Ｃ．１８  Ｆｃ／ＴｆＲ−ＡＤ複合体の表面内に埋もれているようにみえるが、ＣＨ３Ｃ．３５  Ｆｃ／ＴｆＲ−ＡＤ複合体では溶媒に露出しているようにみえる。更に、ＣＨ３Ｃ．３５  Ｆｃ／ＴｆＲ−ＡＤ複合体のＴｆＲ−ＡＤの残基Ｌ２０９は、１８０°回転されて表面に結合しているようにみえるが、ＣＨ３Ｃ．１８  Ｆｃ／ＴｆＲ−ＡＤ複合体では表面から離れているようにみえる。
【０４２７】
図３６Ａ及び図３６Ｂに示されるように、
ＣＨ３Ｃ．３５のＴｈｒ１５９と、ＴｆＲ−ＡＤのＧｌｙ２０７、Ａｒｇ２０８、Ｌｙｓ１８８、及びＬｅｕ２０９；
ＣＨ３Ｃ．３５のＧｌｕ１６０と、ＴｆＲ−ＡＤのＡｒｇ２０８及びＬｅｕ２０９；
ＣＨ３Ｃ．３５のＳｅｒ１６２と、ＴｆＲ−ＡＤのＡｒｇ２０８及びＬｅｕ２０９；
ＣＨ３Ｃ．３５のＳｅｒ１５６と、ＴｆＲ−ＡＤのＬｅｕ２０９；
ＣＨ３Ｃ．３５のＴｒｐ１６１と、ＴｆＲ−ＡＤのＬｅｕ２０９、Ｔｙｒ２１１、及びＬｅｕ２１２；
ＣＨ３Ｃ．３５のＧｌｕ１８９と、ＴｆＲ−ＡＤのＴｙｒ２１１及びＬｅｕ２１２；
ＣＨ３Ｃ．３５のＰｈｅ１９４と、ＴｆＲ−ＡＤのＬｅｕ２１２、Ａｓｎ２１５、及びＶａｌ２１３；
ＣＨ３Ｃ．３５のＴｙｒ１５７と、ＴｆＲ−ＡＤのＬｅｕ２１２、Ａｓｎ２１５、及びＳｅｒ１９９；
ＣＨ３Ｃ．３５のＧｌｎ１９２と、ＴｆＲ−ＡＤのＶａｌ２１３及びＬｙｓ１５８；ならびに
ＣＨ３Ｃ．３５のＰｈｅ１９６と、ＴｆＲ−ＡＤのＶａｌ２１３及びＬｅｕ２１２との間で相互作用が認められた。
【０４２８】
更に、実施例２の「パラトープマッピング」と題したセクションで述べ、また、図３６（Ａ）及び図３６（Ｂ）に示されるように、ＣＨ３Ｃレジスターの外側のいくつかの位置もＴｆＲに対する結合に関与している。
【０４２９】
実施例８  カニクイザルにおけるＣＨ３Ｃ変異体を含むＦｃ−Ｆａｂ融合ポリペプチドの薬物動態学的／薬力学的研究
本実施例では、カニクイザルにおける本発明のＣＨ３Ｃ変異体ポリペプチドを含むＦｃ−Ｆａｂ融合体の薬物動態学的／薬力学的研究（ＰＫ／ＰＤ）特性分析について述べる。
【０４３０】
研究計画
Ａｂ１２２（コントロールＩｇＧとしての抗ＲＳＶ抗体）、Ａｂ１５３（抗ＢＡＣＥ１抗体）、Ａｂ２１０（抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１二重特異性抗体）、または、Ａｂ１５３のＦａｂドメインに融合させたＣＨ３Ｃ変異体ポリペプチドを含むＦｃ−Ｆａｂ融合ポリペプチドの単一の３０ｍｇ／ｋｇ用量を、２〜４歳の雄のカニクイザルに静脈内投与して血漿中ＰＫ、血漿中ＰＤ（Ａβ４０）、及び脳脊髄液（ＣＳＦ）中ＰＤ（Ａβ４０）を２９日間にわたって評価した（ｎ＝４／群）。ベースラインを確立するため、投与前のＣＳＦ及び血液試料を投与７日前に各動物から採取した。投与後、ＣＳＦをＩＴ−Ｌカテーテルにより、投与の１２、２４、４８、７２、及び９６時間後に、また、試験日の８、１１、１５、１８、２２、２５、及び２９日目にＰＤ分析用に採取した。血液試料を、血漿及び血清中ＰＫ用に投与の０．２５、１、６、１２、２４、７２時間後、また、試験日の８、１１、１５、１８、２２、２５、及び２９日目に採取した。
【０４３１】
表１４は、研究計画のアウトラインを示したものである。「ＣＨ３Ｃ．３５．２１．１６：Ａｂ１５３」は、Ａｂ１５３のＦａｂドメインに融合させたクローンＣＨ３Ｃ．３５．２１．１６を含む一価のＦｃ−Ｆａｂ融合ポリペプチドである。「ＣＨ３Ｃ．３５．２１：Ａｂ１５３」は、Ａｂ１５３のＦａｂドメインに融合させたクローンＣＨ３Ｃ．３５．２１を含む一価のＦｃ−Ｆａｂ融合ポリペプチドである。「ＣＨ３Ｃ．３５．９：Ａｂ１５３」は、Ａｂ１５３のＦａｂドメインに融合させたクローンＣＨ３Ｃ．３５．２１を含む二価のＦｃ−Ｆａｂ融合ポリペプチドである。「ＣＨ３Ｃ．３５．８：Ａｂ１５３」は、Ａｂ１５３のＦａｂドメインに融合させたクローンＣＨ３Ｃ．３５．２０を含む二価のＦｃ−Ｆａｂ融合ポリペプチドである。「ＬＡＬＡＰＧ」は、抗体またはＦｃ−Ｆａｂ融合ポリペプチドが、Ｆｃ配列中に変異Ｌ７Ａ、Ｌ８Ａ、及びＰ１０２Ｇを含むことを示す（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けしたとき）。「ＬＡＬＡＰＧ．ＹＴＥ」は、Ｆｃ−Ｆａｂ融合ポリペプチドが、Ｆｃ配列中に変異Ｌ７Ａ、Ｌ８Ａ、Ｐ１０２Ｇ、Ｍ２５Ｙ、Ｓ２７Ｔ、及びＴ２９Ｅを含むことを示す（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けしたとき）。
【０４３２】
（表１４）
2020530293.tif 000016
【０４３３】
方法
ヒトＩｇＧのＰＫアッセイ
カニクイザル血清中の抗体またはＦｃ−Ｆａｂ融合ポリペプチドの濃度を、ヒトＩｇＧ特異的サンドイッチＥＬＩＳＡを用いて定量した。３８４ウェルＭａｘｉＳｏｒｐプレートに、ヒトＩｇＧのＦｃに特異的な抗体を一晩コーティングした。血清試料を１：１００、１：１，０００、１：１０，０００、及び１：１００，０００に希釈し、ブロッキングしたプレートに加えた。検出抗体は、ポリクローナル抗ヒトＩｇＧサル吸収抗体とした。各抗体またはＦｃ−Ｆａｂ融合ポリペプチドに対して個々に標準曲線を作成し（４８〜２０００００ｐｇ／ｍＬのＩｇＧ）、アッセイの血清中の定量下限（ＬＬＯＱ）は２０ｎｇ／ｍＬである。
【０４３４】
ＰＤアッセイ
カニクイザルＣＳＦ中の可溶性のＡＰＰα／β濃度を、ＭｅｓｏＳｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）ｍｕｌｔｉｐｌｅｘキット（ＭＳＤ＃Ｋ１５１２０Ｅ）を使用して測定した。２種類の異なる抗体がｓＡＰＰαまたはｓＡＰＰβのいずれかを特異的に捕捉し、次に、両方の被検物質を、ＳＵＬＦＯタグで標識した抗ＡＰＰマウスモノクローナル抗体で検出した。カニクイザルのＡβ４０濃度を、ＭＳＤ  ｕｌｔｒａ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅキット（ＭＳＤ＃Ｋ１５１ＦＴＥ）を使用して測定した。このアッセイではｈｕＡβ特異的６Ｅ１０抗体を捕捉分子として使用し、ペプチドのＣ末端に対して特異的な抗Ａβ４０抗体を検出分子として用いた。いずれのアッセイも製造者の指示に従って行った。要約すると、予めコーティングしたプレートをＭＳＤ  Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ａで１時間ブロッキングした。ＣＳＦ試料を１：５に希釈し、ブロッキングしたプレートに二つ組で加えた後、４℃で一晩インキュベートした。次に、それぞれの検出抗体を加え、各プレートをＳｅｃｔｏｒ  Ｓ６００装置で読み取った。標準曲線として０．９２〜３７５０ｐｇ／ｍＬのｈｕＡβ４０及び０．１〜１００ｎｇ／ｍＬのｓＡＰＰα／βの両方を、４パラメータロジスティック回帰を用いてフィッティングした。このアッセイでは、Ａβ４０のＬＬＯＱは７３ｐｇ／ｍＬであり、ｓＡＰＰα／βでは０．５ｎｇ／ｍＬであった。
【０４３５】
結果
投与後最初の７日間からの中間の血漿ＰＫは、Ａｂ２１０及びＣＨ３Ｃ．３５．９：Ａｂ１５３で、それらの末梢におけるＴｆＲに対する結合のため、予想された標的媒介性クリアランスを示した（図３７（Ａ））。Ａｂ１５３及びＡｂ２１０抗体の両方、ならびにＣＨ３Ｃ．３５．９：Ａｂ１５３は、コントロールＩｇＧと比較して血漿中Ａβ４０の顕著で持続的な低下をもたらし（図３７（Ｂ））、これら３種類の分子のすべてが同程度にインビボのＢＡＣＥ１活性を阻害する能力を有することが確認された。ＣＳＦ中では、Ａｂ２１０及びＣＨ３Ｃ．３５．９：Ａｂ１５３の両方が、コントロールＩｇＧと比較してＣＳＦ中のＡβ４０及びｓＡＰＰβ／ｓＡＰＰα比を、それぞれ約７０％及び約７５％にまで低下させる能力を有した（図３８（Ａ）及び３８（Ｂ））。ＴｆＲに結合しない抗ＢＡＣＥ１抗体であるＡｂ１５３は、コントロールＩｇＧと比較してＣＳＦ中のＡβ４０及びｓＡＰＰβ／ｓＡＰＰα比に与えた影響は最小であった。これらの結果は、ＣＨ３Ｃ変異体ポリペプチド（例えば、クローンＣＨ３Ｃ．３５．９）によるＴｆＲへの結合が、ＣＨ３Ｃ変異体ポリペプチドを抗ＢＡＣＥ１抗体のＦａｂドメインに融合させたＦｃ−Ｆａｂ融合体（例えば、ＣＨ３Ｃ．３５．９：Ａｂ１５３）のＣＮＳ中への浸透量を高めることによってＣＳＦ中のＡβ４０及びｓＡＰＰβ／ｓＡＰＰαの生成を阻害することを示すものである。
【０４３６】
血清中ＰＫ、血漿中Ａβ、及びＣＳＦ中Ａβ濃度を、単回投与後４週間にわたって更に評価した。マウスで観察された結果と同様、ＴｆＲに結合するＦｃ−Ｆａｂ融合体（ＣＨ３Ｃ．３５．２１．１６：Ａｂ１５３  ＬＡＬＡＰＧ、ＣＨ３Ｃ．３５．２１．１６：Ａｂ１５３  ＬＡＬＡＰＧＹＴＥ、及びＣＨ３Ｃ．３５．２１：Ａｂ１５３  ＬＡＬＡＰＧＹＴＥ）の末梢血清ＰＫは、末梢組織のＴｆＲに対する結合により、Ａｂ１２２及びＡｂ１５３と比較してより速やかなクリアランスを示した（図４１（Ａ））。Ａｂ１５３及びＣＨ３Ｃ：Ａｂ１５３融合体はいずれも、コントロールＩｇＧ＿Ａｂ１２２と比較して血漿中Ａβ濃度を約５０％よりも大きく低下させた（図４１（Ｂ））。最大のＡβは、Ａｂ１５３とＣＨ３Ｃ：Ａｂ１５３融合体とで同様であり、Ｆｃの改変が、インビボでＡＰＰの切断を阻害する抗ＢＡＣＥ１  Ｆａｂの能力に影響しなかったことを示している（図４１（Ｂ））。血漿中Ａβの持続時間は、Ａｂ１５３及びＣＨ３Ｃ：Ａｂ１５３の曝露と経時的に相関していた。ＣＳＦ中では、３種類のＦｃ−Ｆａｂ融合体のすべてが、コントロールＩｇＧ＿Ａｂ１２２と比較してＡβ４０及びｓＡＰＰβ／ｓＡＰＰα比を約７０％にまで有意に低下させる能力を有したのに対して、Ａｂ１５３を投与した動物では有意な低下は認められなかった（図４１（Ｃ）及び４１（Ｄ））。これらの結果は、ＣＨ３Ｃ変異体ポリペプチド（例えば、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２１．１６及びＣＨ３Ｃ．３５．２１）によるＴｆＲへの結合が、ＣＨ３Ｃ変異体ポリペプチドを抗ＢＡＣＥ１抗体のＦａｂドメインに融合させたＦｃ−Ｆａｂ融合体（例えば、ＣＨ３Ｃ．３５．２１．１６：Ａｂ１５３及びＣＨ３Ｃ．３５．２１：Ａｂ１５３）のＣＮＳ中への浸透量を高めることによってＣＳＦ中のＡβ４０及びｓＡＰＰβ／ｓＡＰＰαの生成を阻害することを示すものである。
【０４３７】
未成熟赤血球ではＴｆＲが高レベルに発現していることから、末梢血の臨床病理学的な性質を研究期間の全体を通じて評価することによって網状赤血球数、血清鉄、及び赤血球数を評価した。血清鉄値の評価では、色素源としてＴＰＴＺ［２，４，６−トリ−（２−ピリジル）−５−トリアジン］を使用する方法の変法を用いた。酸性培地中、トランスフェリンに結合した鉄を遊離第二鉄イオンとアポトランスフェリンとに解離させた。塩酸とアスコルビン酸ナトリウムで第二鉄イオンを第一鉄状態に還元した。次いで、第一鉄イオンをＴＰＴＺと反応させて青色の複合体を形成させ、これを６００／８００ｎｍで重クロム酸塩を用いて測定した。吸光度の増加は、トランスフェリンに結合した鉄の存在量に正比例していた。これを、Ｂｅｃｋｍａｎ／Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＡＵ６４０ｅ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎａｌｙｚｅｒで行った。絶対網状赤血球数及びＲＢＣの形態をＳｉｅｍｅｎｓ  Ａｄｖｉａ１２０自動血液検査システムにより分析した。Ｆｃ−Ｆａｂ融合体は、それらの投与前の値と比較して網状赤血球数に影響を及ぼさなかった（図４２（Ａ））。更に、血清鉄及び赤血球数も影響はみられなかった（図４２（Ｂ）及び４２（Ｃ））。これらのデータは共に、改変ＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド−Ｆａｂ融合体が、非ヒト霊長類において抗体の脳曝露を安全かつ効果的に増大させることで安定した薬力学的応答（すなわち、ＣＳＦ中のＡβの低下）を生じることを示すものである。
【０４３８】
実施例９  Ｍ２０１Ｌ及びＮ２０７Ｓ変異を含むＣＨ３Ｃ．３５の薬物動態学的分析
本実施例では、変異Ｍ２０１Ｌ及びＮ２０７ＳがＣＨ３Ｃ．３５と両立することについて述べる。
【０４３９】
血清安定性を高める変異である、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準として番号付けしたＭ２０１Ｌ及びＮ２０７Ｓ（ＥＵ番号付けによればＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、「ＬＳ」変異とも呼ばれる）が、ＴｆＲ結合Ｆｃ改変と両立するかどうかを評価するために、ヒトＦｃＲｎノックインマウスにＡｂ１５３＿ＬＡＬＡＰＧ、Ａｂ１５３＿ＬＡＬＡ．ＬＳ、ＣＨ３Ｃ．３５．２１：Ａｂ１５３＿ＬＡＬＡ．ＬＳ、またはＡｂ１５３＿ＬＡＬＡＰＧ．ＹＴＥを１０ｍｇ／ｋｇで投与した。１４日間にわたる血漿中ＰＫの評価は、血清安定性変異を有さないＡｂ１５３＿ＬＡＬＡＰＧと比較してＡｂ１５３＿ＬＡＬＡ．ＬＳ、ＣＨ３Ｃ．３５．２１：Ａｂ１５３＿ＬＡＬＡ．ＬＳ、及びＡｂ１５３＿ＬＡＬＡＰＧ．ＹＴＥにおいて同様の約２倍の改善を示した（図４３（Ａ）及び４３（Ｂ））。このことは、ＴｆＲ結合を生じるこれらの更なるＦｃの変異が、インビボでｈｕＩｇＧ１の半減期を改善するＬＳ変異の性質に影響しないことを示している。
【０４４０】
実施例１０  ＣＨ３Ｃ．３５．２１の１アミノ酸置換
本実施例では、ＣＨ３Ｃ．３５．２１の１アミノ酸変異体のライブラリーの構築について述べる。
【０４４１】
方法
ＣＨ３Ｃ．３５．２１の１アミノ酸置換をそれぞれが有するＣＨ３Ｃ．３５．２１変異体のライブラリーを、Ｋｕｎｋｅｌ突然変異誘発法（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．８２（２）：４８８−９２，１９８５）を用いて構築した。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に従って番号付けした、ＣＨ３Ｃ．３５．２１の位置Ｗ１５３、Ｙ１５７、Ｔ１５９、Ｅ１６０、Ｗ１６１、Ｓ１６２、Ｓ１６３、Ｋ１６５、Ｔ１８６、Ｋ１８７、Ｅ１８８、Ｅ１８９、Ｆ１９４、Ｓ１９７、及びＳ１９９（ＥＵ番号付けスキームに従って番号付けしたＷ３８０、Ｙ３８４、Ｔ３８６、Ｅ３８７、Ｗ３８８、Ｓ３８９、Ｓ３９０、Ｋ３９２、Ｔ４１３、Ｋ４１４、Ｅ４１５、Ｅ４１６、Ｆ４２１、Ｓ４２４、及びＳ４２６）のそれぞれを、個々に縮重変異原性オリゴを使用してＮＮＫコドンに変異させた。ライブラリー中に元のＣＨ３Ｃ．３５．２１クローンが得られないように野生型ＩｇＧ１をコードした一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）Ｋｕｎｋｅｌ鋳型を使用した。２種類の変異原性オリゴ（一方がＮＮＫを有し、他方が他のＣＨ３Ｃ．３５．２１領域をコードしたもの）を組み合わせて使用することで、両方のオリゴが組み込まれた場合にＣＨ３Ｃ．３５．２１のアミノ酸配列を生じるが、所望のライブラリー位置にＮＮＫコドンが組み込まれるようにした。鋳型は野生型Ｆｃであるため、１個のオリゴが挿入されるかまたはオリゴが挿入されない場合にはＴｆＲに結合せず、したがって、これらのコンストラクトは分析から容易に除外された。同様にＮＮＫ位置から生じた終止コトンも除外された。ライブラリーをＥＢＹ１００酵母にトランスフェクトした。各ライブラリーから８個のコロニーをシークエンシングして、ナイーブライブラリーが所望の位置のランダム化を確実に含むようにした。
【０４４２】
酵母ディスプレイ及びフローサイトメトリーによって測定された、環状に並び替えられたＴｆＲアピカルドメイン結合集団の上位約１０％をあるＴｆＲ濃度で回収し、親和性を区別するための最良の範囲を与えた。各位置について１２種類のクローンの配列を得た。異なる集団での各ライブラリーに対して、より良好に規定された高、中、及び低ゲートで同じ実験を行った。回収された集団のそれぞれについて３６種類のクローンをシークエンシングした。更に、変異体の結合を、対応するアミノ酸位置に野生型の残基を有する対応する変異体の結合と比較するため、同じ位置のアミノ酸を、同様の方法で変異原性オリゴを使用して野生型ＩｇＧ１残基に復帰変異させた。
【０４４３】
表１５は、ＣＨ３Ｃ．３５．２１変異体のライブラリーを示す。各変異体は、ＣＨ３Ｃ．３５．２１の１アミノ酸置換を含んでいた。例えば、１つの変異体はＷ３８０Ｅを含んでよく、残りの位置のアミノ酸はＣＨ３Ｃ．３５．２１のものと同じである。表１５に示される各位置は、ＥＵ番号付けスキームに従って番号付けされたものである。
【０４４４】
（表１５）ＣＨ３Ｃ．３５．２１の１アミノ酸変異体
2020530293.tif 000017
【０４４５】
実施例１１  ＣＨ３Ｃ．１８変異体の構築
本実施例では、ＣＨ３Ｃ．１８変異体のライブラリーの構築について述べる。
【０４４６】
単一のクローンを単離し、０．２％グルコースを一晩添加したＳＧ−ＣＡＡ培地中で一晩増殖させてＣＨ３Ｃ．１８変異体の表面での発現を誘導した。各クローンについて、２００万個の細胞をＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ（ｐＨ７．４）中で３回洗浄した。細胞をビオチン化した標的として２５０ｎＭのヒトＴｆＲ、２５０ｎＭのカニクイザルＴｆＲ、または２５０ｎＭの無関連のビオチン化タンパク質により１時間、４℃で振盪しながら染色した後、同じバッファーで２回洗浄した。細胞をニュートラアビジン−Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ６４７（ＡＦ６４７）で３０分間、４℃で染色した後、再び２回洗浄した。発現を、抗ｃ−ｍｙｃ抗体を抗ニワトリＡｌｅｘｆｌｕｏｒ４８８（ＡＦ４８８）二次抗体と共に用いて測定した。細胞を再懸濁し、ＡＦ６４７及びＡＦ４８８の蛍光強度中央値（ＭＦＩ）をＢＤ  ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩで測定した。各集団のＴｆＲ結合集団についてＭＦＩを計算し、ヒトＴｆＲ、カニクイザルＴｆＲ、またはコントロールとの結合と共にプロットした（図４４）。
【０４４７】
表１６は、ＣＨ３Ｃ．１８変異体のライブラリーを示す。各列は、各位置に示されるアミノ酸置換を有する変異体を表し、残りの位置のアミノ酸はＣＨ３Ｃ．１８のものと同じである。表１６に示される各位置は、ＥＵ番号付けスキームに従って番号付けされたものである。
【０４４８】
（表１６）ＣＨ３Ｃ．１８変異体
2020530293.tif 000018
【０４４９】
不一致がある場合、表（例えば、表９）に記載される各クローンのアミノ酸置換が、配列表に記載される配列中にみられるアミノ酸に優先してそのクローンのレジスター位置におけるアミノ酸置換を決定する。
【０４５０】
本明細書に述べられる実施例及び実施形態はあくまで例示的な目的のものに過ぎず、これらを考慮することで様々な改変または変更が当業者に示唆され、かかる改変及び変更は本出願の趣旨及び範囲、ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれるものである点は理解されよう。本明細書に引用される配列アクセッション番号の配列をここに参照によって援用する。
【０４５１】
（表１）ＣＨ３Ｃレジスターの位置及び変異
2020530293.tif 000019
【０４５２】
（表４）ＣＨ３Ｃ．３５．２１のレジスター内の許容される多様性の探索及びホットスポットの位置
2020530293.tif 000020
【０４５３】
非公式な配列表
2020530293.tif 000021
2020530293.tif 000022
2020530293.tif 000023
2020530293.tif 000024
2020530293.tif 000025
2020530293.tif 000026
2020530293.tif 000027
2020530293.tif 000028
2020530293.tif 000029
2020530293.tif 000030
2020530293.tif 000031
2020530293.tif 000032
2020530293.tif 000033
2020530293.tif 000034
2020530293.tif 000035
2020530293.tif 000036
2020530293.tif 000037
2020530293.tif 000038
2020530293.tif 000039
2020530293.tif 000040
2020530293.tif 000041
2020530293.tif 000042
2020530293.tif 000043
2020530293.tif 000044
2020530293.tif 000045
2020530293.tif 000046
2020530293.tif 000047
2020530293.tif 000048
2020530293.tif 000049
2020530293.tif 000050
2020530293.tif 000051
2020530293.tif 000052
2020530293.tif 000053
【図１】
2020530293.tif 000054
【図２】
2020530293.tif 000055
【図３】
2020530293.tif 000056
【図４】
2020530293.tif 000057
【図５】
2020530293.tif 000058
【図６】
2020530293.tif 000059
【図７】
2020530293.tif 000060
【図８】
2020530293.tif 000061
【図９】
2020530293.tif 000062
【図１０】
2020530293.tif 000063
【図１１】
2020530293.tif 000064
【図１２Ａ】
2020530293.tif 000065
【図１２Ｂ】
2020530293.tif 000066
【図１２Ｃ】
2020530293.tif 000067
【図１２Ｄ】
2020530293.tif 000068
【図１３】
2020530293.tif 000069
【図１４】
2020530293.tif 000070
【図１５】
2020530293.tif 000071
【図１６】
2020530293.tif 000072
【図１７】
2020530293.tif 000073
【図１８Ａ】
2020530293.tif 000074
【図１８Ｂ】
2020530293.tif 000075
【図１９Ａ】
2020530293.tif 000076
【図１９Ｂ】
2020530293.tif 000077
【図１９Ｃ】
2020530293.tif 000078
【図１９Ｄ】
2020530293.tif 000079
【図２０Ａ】
2020530293.tif 000080
【図２０Ｂ】
2020530293.tif 000081
【図２０Ｃ】
2020530293.tif 000082
【図２０Ｄ】
2020530293.tif 000083
【図２０Ｅ】
2020530293.tif 000084
【図２１】
2020530293.tif 000085
【図２２Ａ】
2020530293.tif 000086
【図２２Ｂ】
2020530293.tif 000087
【図２２Ｃ】
2020530293.tif 000088
【図２２Ｄ】
2020530293.tif 000089
【図２２Ｅ】
2020530293.tif 000090
【図２２Ｆ】
2020530293.tif 000091
【図２２Ｇ】
2020530293.tif 000092
【図２２Ｈ】
2020530293.tif 000093
【図２３Ａ】
2020530293.tif 000094
【図２３Ｂ】
2020530293.tif 000095
【図２３Ｃ】
2020530293.tif 000096
【図２３Ｄ】
2020530293.tif 000097
【図２３Ｅ】
2020530293.tif 000098
【図２３Ｆ】
2020530293.tif 000099
【図２４Ａ】
2020530293.tif 000100
【図２４Ｂ】
2020530293.tif 000101
【図２４Ｃ】
2020530293.tif 000102
【図２４Ｄ】
2020530293.tif 000103
【図２４Ｅ】
2020530293.tif 000104
【図２５】
2020530293.tif 000105
【図２６】
2020530293.tif 000106
【図２７】
2020530293.tif 000107
【図２８】
2020530293.tif 000108
【図２９】
2020530293.tif 000109
【図３０Ａ】
2020530293.tif 000110
【図３０Ｂ】
2020530293.tif 000111
【図３１】
2020530293.tif 000112
【図３２Ａ】
2020530293.tif 000113
【図３２Ｂ】
2020530293.tif 000114
【図３３】
2020530293.tif 000115
【図３４】
2020530293.tif 000116
【図３５】
2020530293.tif 000117
【図３６Ａ】
2020530293.tif 000118
【図３６Ｂ】
2020530293.tif 000119
【図３７】
2020530293.tif 000120
【図３８】
2020530293.tif 000121
【図３９Ａ】
2020530293.tif 000122
【図３９Ｂ】
2020530293.tif 000123
【図３９Ｃ】
2020530293.tif 000124
【図３９Ｄ】
2020530293.tif 000125
【図４０Ａ】
2020530293.tif 000126
【図４０Ｂ】
2020530293.tif 000127
【図４０Ｃ】
2020530293.tif 000128
【図４０Ｄ】
2020530293.tif 000129
【図４１Ａ】
2020530293.tif 000130
【図４１Ｂ】
2020530293.tif 000131
【図４１Ｃ】
2020530293.tif 000132
【図４１Ｄ】
2020530293.tif 000133
【図４２】
2020530293.tif 000134
【図４３】
2020530293.tif 000135
【図４４】
2020530293.tif 000136
【配列表】
2020530293000001.app
【国際調査報告】
2020530293.tif 000137
2020530293.tif 000138
2020530293.tif 000139
2020530293.tif 000140