(57)【要約】  吸入用抗生剤、例えばトブラマイシンなど、および少なくとも３７．５ｍｇ／日の吸入用キレート剤、例えばカルシウムＥＤＴＡなどを、それぞれ１回または複数回の投与で投与することにより、対象の肺内の細菌感染症を処置または予防する方法であって、キレート剤および／または抗生剤の投与が８時間以下の期間にわたり投与される、方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
吸入用抗生剤と、少なくとも３７．５ｍｇ／日の吸入用キレート剤とを、それぞれ１回または複数回の投与で投与することにより、対象の肺内の細菌感染症を処置または予防する方法であって、前記キレート剤および／または抗生剤の前記投与または各投与が８時間以下の期間にわたり投与される、方法。
【請求項２】
キレート剤が、
ａ）約１，２００ｍｇ／日までの全用量で提供される、または
ｂ）少なくとも３７．５ｍｇ／日〜１，２００ｍｇ／日の間の全用量で提供される、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記キレート剤がＣａＥＤＴＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記抗生剤が、
ａ）約２，０００ｍｇ／日までの全用量で提供される、または
ｂ）１０ｍｇ／日〜２，０００ｍｇ／日の間の全用量で提供される、
請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記抗生剤が、アミノグリコシド抗生剤、ベータラクタム抗生剤、グリコペプチド抗生剤、コリスチン、アズトレオナムまたはシプロフロキサシンを含むリストから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記アミノグリコシド抗生剤がトブラマイシンである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
感染症の前記処置または予防が、
ｉ）ＦＥＶの増加、
ｉｉ）炎症の低減、
ｉｉｉ）ＭＭＰ活性の低減、および／または
ｉｖ）ヒドロキシルラジカルの産生の低減
をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記キレート剤が、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）と組み合わせられる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ｉ）前記キレート剤が、毎日１〜４回の間投与される、および／または
ｉｉ）前記抗生剤が、毎日１〜４回の間投与される、
請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
対象の肺内の細菌感染症を処置または予防するためのキットであって、
・少なくとも３７．５ｍｇの吸入用キレート剤と、（ｉｉ）使用のための指示であって、少なくとも３７．５ｍｇ／日の前記吸入用キレート剤が吸入用抗生剤と共に送達され、前記キレート剤および／もしくは抗生剤の前記投与もしくは各投与が８時間以下の期間にわたり投与されることを定める指示と、または
・吸入用抗生剤と、（ｉｉ）使用のための指示であって、前記抗生剤が、少なくとも３７．５ｍｇ／日の吸入用キレート剤と共に送達され、前記キレート剤および／もしくは抗生剤の前記投与もしくは各投与が８時間以下の期間にわたり投与されることを定める指示と、または
・少なくとも３７．５ｍｇの吸入用キレート剤および吸入用抗生剤と、（ｉｉ）使用のための指示であって、少なくとも３７．５ｍｇ／日の前記吸入用キレート剤が送達され、前記キレート剤および／もしくは抗生剤の前記投与もしくは各投与が８時間以下の期間にわたり投与されることを定める指示と
を備えるキット。
【請求項１１】
・感染症の処置のための医薬を製造するための吸入用キレート剤であって、前記吸入用キレート剤が吸入用抗生剤と組み合わせて使用され、少なくとも３７．５ｍｇ／日の前記吸入用キレート剤が送達され、前記キレート剤および／もしくは抗生剤の前記投与もしくは各投与が８時間以下の期間にわたり投与される、吸入用キレート剤、または
・感染症の処置のための医薬を製造するための吸入用抗生剤であって、前記吸入用抗生剤が吸入用キレート剤と組み合わせて使用され、少なくとも３７．５ｍｇ／日の前記吸入用キレート剤が送達され、前記キレート剤および／もしくは抗生剤の前記投与もしくは各投与が８時間以下の期間にわたり投与される、吸入用抗生剤、または
・感染症の処置のための医薬を製造するための吸入用キレート剤および吸入用抗生剤であって、少なくとも３７．５ｍｇ／日の前記吸入用キレート剤が送達され、前記キレート剤および／もしくは抗生剤の前記投与もしくは各投与が８時間以下の期間にわたり投与される、吸入用キレート剤および吸入用抗生剤
の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高濃度の吸入用キレート剤を吸入用抗生剤と組み合わせて投与することにより対象の肺内の細菌感染症を処置または予防する方法、および本方法で使用する製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物感染の根絶は、特に宿主防御に障害が起きた場合、困難となり得る。加えて、多くの微生物は、バイオフィルムと呼ばれる極めて組織化された構造を形成し、このバイオフィルム内で微生物はいくつかの機序を介して免疫細胞および抗生剤による死滅から保護されている。これらの機序は、抗生剤浸透の低減、低い代謝活性、生理学的適応、抗生剤分解酵素、および遺伝的に耐性のある変異体に対する選択を含む（Ｓｔｅｗａｒｔ  ＆  Ｃｏｓｔｅｒｔｏｎ  Ｌａｎｃｅｔ．２００１年、３５８巻（９２７６号）：１３５〜１３８頁）。
【０００３】
緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）は、障害が起きた宿主において急性および慢性の感染症を引き起こすグラム陰性細菌の一例である。緑膿菌は集中治療室において共通して見出され、抗生剤による治療介入に対する周知の障害である強いバイオフィルム形成能力を有する。緑膿菌感染症に関与している疾患は、嚢胞性線維症（ＣＦ）、人工呼吸器関連肺炎（ＶＡＰ）、および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を含む（Ｍｏｒａｄａｌｉら、Ｆｒｏｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１７年、７巻：３９頁；Ｈａｓｓｅｔｔら、Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１４年、５２巻（３号）：２１１〜２２６頁）。
【０００４】
緑膿菌などの生物は、ＣＦ呼吸器内で基盤を確立してしまえば、ＣＦ肺環境および菌耐性機序、例えば、バイオフィルム形成および抗生剤中和酵素などを含む問題により、根絶を成功させることが不可能となる。緑膿菌感染症は最終的に慢性となり、感染株は抗菌剤に対して次第に耐性を持ち、持続性の炎症は肺機能を徐々に低減させる（Ｈａｓｓｅｔｔら、Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１４年、５２巻（３号）：２１１〜２２６頁）。処置は改善されているが、現存する薬物は有する効力が限定され、患者は移植手術を最終的に必要とするか、または呼吸不全により死亡する。
【０００５】
肺内の感染症を処置または予防する方法、または少なくとも以前から公知の処置方法を補助するための方法が必要とされる。
【０００６】
本発明は、少なくとも３７．５ｍｇ／日の吸入用キレート剤を、抗生剤と組み合わせて投与することにより、肺内の感染症を処置または予防するための改善されたまたは代替となる方法を提供することを探究している。
【０００７】
背景技術の先行する考察は、本発明の理解を促進することのみを意図している。この考察は、言及された材料のいずれもが、出願の優先日において共通の一般知識の一部である、または一部であったことを承認または許可するものではない。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、吸入用抗生剤と、少なくとも３７．５ｍｇ／日の吸入用キレート剤とを、それぞれ１回または複数回の投与で投与することにより対象の肺内の細菌感染症を処置または予防する方法であって、キレート剤および／または抗生剤のその投与または各投与が８時間以下の期間にわたり投与される方法を提供する。
【０００９】
好ましくは、キレート剤および抗生剤のそれぞれは１日当たり１〜４回の投与で投与される。
【００１０】
好ましくは、３７．５ｍｇ／日〜１，２００ｍｇ／日のキレート剤が投与される。好ましくは、少なくとも５０ｍｇ／日のキレート剤が投与される。キレート剤は、約１，２００ｍｇ／日までの総１日用量を毎日１〜４回の間で投与することができる。好ましくは、キレート剤および／または抗生剤は、１時間以下の期間にわたり投与される。好ましくは、キレート剤はＣａＥＤＴＡである。
【００１１】
好ましくは少なくとも１０ｍｇ／日の抗生剤が投与される、または１０ｍｇ／日〜１，２５０ｍｇ／日の間の抗生剤が投与される。抗生剤は、約１，２５０ｍｇ／日、好ましくは１，０００ｍｇ／日までの総１日用量を毎日１〜４回の間で投与することができる。好ましくは、抗生剤はトブラマイシンである。
【００１２】
本発明は、吸入用抗生剤と、少なくとも３７．５ｍｇ／日の吸入用キレート剤とを、それぞれ１回または複数回の投与で投与することにより対象の肺内の細菌感染症を処置または予防する方法であって、キレート剤および／または抗生剤のその投与または各投与が８時間以下の期間にわたり投与され、処置が炎症を低減させる、方法をさらに提供する。
【００１３】
本発明は、吸入用抗生剤と、少なくとも３７．５ｍｇ／日の吸入用キレート剤とを、それぞれ１回または複数回の投与で投与することにより対象の肺内の細菌感染症を処置または予防する方法であって、キレート剤および／または抗生剤のその投与または各投与が８時間以下の期間にわたり投与され、感染症の処置または予防がＭＭＰ活性の低下または低減を伴うまたはこれをもたらす、方法をさらに提供する。
【００１４】
本発明は、吸入用抗生剤と、少なくとも３７．５ｍｇ／日の吸入用キレート剤とを、それぞれ１回または複数回の投与で投与することにより対象の肺内の細菌感染症を処置または予防する方法であって、キレート剤および／または抗生剤のその投与または各投与が８時間以下の期間にわたり投与され、感染症の処置または予防がヒドロキシルラジカルの産生の低下または低減を伴うまたはこれをもたらす、方法をさらに提供する。
【００１５】
本発明は、吸入用抗生剤と、少なくとも３７．５ｍｇ／日の吸入用キレート剤とを、それぞれ１回または複数回の投与で投与することにより対象の肺内の細菌感染症を処置または予防する方法であって、キレート剤および／または抗生剤のその投与または各投与が８時間以下の期間にわたり投与され、感染症の処置または予防が努力呼気肺活量（ＦＥＶ）の増加をもたらす、方法をさらに提供する。
【００１６】
本発明は、感染症を処置するための、吸入用キレート剤を含む、吸入用製剤（dosage form）であって、吸入用抗生剤と組み合わせて、それぞれ１回または複数回の投与で投与され、少なくとも３７．５ｍｇ／日の吸入用キレート剤が送達され、キレート剤および／または抗生剤のその投与または各投与が８時間以下の期間にわたり投与される。
【００１７】
本発明は、感染症を処置するための、吸入用抗生剤を含む、吸入用製剤であって、吸入用キレート剤と組み合わせて、それぞれ１回または複数回の投与で投与され、少なくとも３７．５ｍｇ／日の吸入用キレート剤が送達され、キレート剤および／または抗生剤のその投与または各投与が８時間以下の期間にわたり投与される。
【００１８】
本発明は、感染症を処置するための、吸入用キレート剤および吸入用抗生剤を含む、吸入用製剤であって、それぞれ１回または複数回の投与で、少なくとも３７．５ｍｇ／日の吸入用キレート剤が送達され、キレート剤および／または抗生剤のその投与または各投与が８時間以下の期間にわたり投与される。
【００１９】
本発明は、（ｉ）少なくとも３７．５ｍｇの吸入用キレート剤と、（ｉｉ）使用のための指示であって、少なくとも３７．５ｍｇ／日の吸入用キレート剤が吸入用抗生剤と共に送達され、キレート剤および／または抗生剤のその投与または各投与が８時間以下の期間にわたり投与されることを定める指示とを備える、対象の肺内の細菌感染症を処置または予防するためのキットを提供する。
【００２０】
本発明は、（ｉ）吸入用抗生剤と、（ｉｉ）使用のための指示であって、抗生剤が少なくとも３７．５ｍｇ／日の吸入用キレート剤と共に送達され、キレート剤および／または抗生剤のその投与または各投与が８時間以下の期間にわたり投与されることを定める指示とを備える、対象の肺内の細菌感染症を処置または予防するためのキットを提供する。
【００２１】
本発明は、（ｉ）少なくとも３７．５ｍｇの吸入用キレート剤および吸入用抗生剤と、（ｉｉ）使用のための指示であって、少なくとも３７．５ｍｇ／日の吸入用キレート剤が送達され、キレート剤および／または抗生剤のその投与または各投与が８時間以下の期間にわたり投与されることを定める指示とを備える、対象の肺内の細菌感染症を処置または予防するためのキットを提供する。
【００２２】
本発明は、感染症の処置のための医薬を製造するための吸入用キレート剤の使用であって、吸入用キレート剤が吸入用抗生剤と組み合わせて使用され、少なくとも３７．５ｍｇ／日の吸入用キレート剤が送達され、キレート剤および／または抗生剤のその投与または各投与が８時間以下の期間にわたり投与される、使用を提供する。
【００２３】
本発明は、感染症の処置のための医薬を製造するための吸入用抗生剤の使用であって、吸入用抗生剤が吸入用キレート剤と組み合わせて使用され、少なくとも３７．５ｍｇ／日の吸入用キレート剤が送達され、キレート剤および／または抗生剤のその投与または各投与が８時間以下の期間にわたり投与される、使用を提供する。
【００２４】
本発明は、感染症の処置のための医薬を製造するための吸入用キレート剤および吸入用抗生剤の使用であって、少なくとも３７．５ｍｇ／日の吸入用キレート剤が送達され、キレート剤および／または抗生剤のその投与または各投与が８時間以下の期間にわたり投与される、使用を提供する。
【００２５】
本発明のさらなる特徴は、いくつかのその非限定的実施形態の以下の説明においてより完全に記載されている。この説明は、単に本発明を例証するという目的のためだけに含まれている。この説明は、上記に提示されたような本発明の広範な概要、開示または説明を制限するものとして理解されるべきではない。添付の図を参照して説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】緑膿菌ＷＡＣＣ９１に対して示されるような、トブラマイシンおよびＣａＥＤＴＡまたは緩衝型ＣａＥＤＴＡの相乗効果を実証する図である。有酸素性条件下での、チェッカーボード式の、浮遊性増殖（ＯＤ６００ｎｍ）の表である。データは、トブラマイシンとＣａＥＤＴＡとの間（図１Ａ）およびトブラマイシンとトリス緩衝型ＣａＥＤＴＡとの間（図１Ｂ）に相乗効果があることを示している。
【図２】緑膿菌ＷＡＣＣ９１に対して示されるような、トブラマイシンおよびＣａＥＤＴＡまたは緩衝型ＣａＥＤＴＡの相乗効果を実証する図である。有酸素性条件下での、チェッカーボード式の、バイオフィルム成長（ＣＶ染色）の表である。データは、トブラマイシンとＣａＥＤＴＡとの間（図２Ａ）の相乗効果を示し、これは、トリス緩衝型ＣａＥＤＴＡ（図２Ｂ）でさらに増強される。
【図３】緑膿菌ＷＡＣＣ９１に対して示されるような、トブラマイシンおよびＣａＥＤＴＡまたは緩衝型ＣａＥＤＴＡの相乗効果を実証する図である。嫌気性条件下での、チェッカーボード式の、浮遊性増殖（ＯＤ６００ｎｍ）の表である。データは、トブラマイシンとＣａＥＤＴＡとの間（図３Ａ）およびトブラマイシンとトリス緩衝型ＣａＥＤＴＡとの間（図３Ｂ）に相乗効果があることを示している。
【図４】緑膿菌ＷＡＣＣ９１に対して示されるような、トブラマイシンおよびＣａＥＤＴＡまたは緩衝型ＣａＥＤＴＡの相乗効果を実証する図である。嫌気性条件下での、チェッカーボード式の、バイオフィルムの表である。データは、トブラマイシンとＣａＥＤＴＡとの間（図４Ａ）およびトブラマイシンとトリス緩衝型ＣａＥＤＴＡとの間（図４Ｂ）に相乗効果があることを示している。
【図５】緑膿菌ＷＡＣＣ９１に対して示されるような、トブラマイシンおよびＣａＥＤＴＡまたは緩衝型ＣａＥＤＴＡの相乗効果を実証する図である。有酸素性および嫌気性条件下でのＣａＥＤＴＡおよび緩衝型ＣａＥＤＴＡの浮遊性細胞およびバイオフィルムに対する作用である。濃度は、示されている通り、トブラマイシン：４μｇ／ｍｌ、ＣａＥＤＴＡ：６．２５ｍＭおよびトリス緩衝液：１２．５ｍＭであった。
【図６】緑膿菌ＷＡＣＣ９１に対して示されるような、トブラマイシンおよびＣａＥＤＴＡまたは緩衝型ＣａＥＤＴＡの相乗効果を実証する図である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの緑膿菌バイオフィルムの代謝で測定した、ＣａＥＤＴＡとトブラマイシンのサブミクロン粒子の相乗効果を示している。緑膿菌バイオフィルムを９６−ウェルマイクロタイタープレート内で成長させ、エアゾール化抗生剤およびＥＤＴＡ粒子に曝露した。図６Ａ：ＣａＥＤＴＡは、トブラマイシン濃度＜１ｍｇ／ｍｌにおいて死滅を実質的に増強する。図６Ｂ：相乗効果は送達モードに依存しない（溶液または乾燥粉末）。
【図７】ＣａＥＤＴＡが緑膿菌に対する様々な抗生剤の効力を増強させることを実証する図である。チェッカーボード式であり、緑膿菌ＷＡＣＣ９１浮遊性細胞と、メチシリンおよびＣａＥＤＴＡとの対比である。
【図８】ＣａＥＤＴＡが緑膿菌に対する様々な抗生剤の効力を増強させることを実証する図である。チェッカーボード式であり、緑膿菌００１−１１Ｒ（ＣＦ臨床的株）浮遊性細胞（図８Ａ）およびバイオフィルム（図８Ｂ）と、カルベニシリンおよびＣａＥＤＴＡとの対比である。
【図９】ＣａＥＤＴＡが緑膿菌に対する様々な抗生剤の効力を増強させることを実証する図である。ＯＤ６００ｎｍ（図９Ａ）およびコロニー形成単位、ＣＦＵ／ｍｌ（図９Ｂ）で測定された、緑膿菌ＷＡＣＣ９１浮遊性細胞と、テトラサイクリンおよび緩衝型ＣａＥＤＴＡとの対比である。
【図１０】ＣａＥＤＴＡが緑膿菌に対する様々な抗生剤の効力を増強させることを実証する図である。ＯＤ６００ｎｍ（図１０Ａ）およびＣＦＵ／ｍｌ（図１０Ｂ）で測定された、緑膿菌ＷＡＣＣ９１と、アズトレオナム（Ａｚａｃｔａｍ）および緩衝型ＣａＥＤＴＡとの対比である。
【図１１】ＣａＥＤＴＡが緑膿菌に対する様々な抗生剤の効力を増強させることを実証する図である。ＯＤ６００ｎｍ（図１１Ａ）およびＣＦＵ／ｍｌ（図１１Ｂ）で測定された、緑膿菌ＷＡＣＣ９１と、エリスロマイシンおよび緩衝型ＣａＥＤＴＡとの対比である。
【図１２】ＣａＥＤＴＡが緑膿菌に対する様々な抗生剤の効力を増強させることを実証する図である。示されている通り、緑膿菌ＷＡＣＣ９１浮遊性細胞と、コリスチンおよび緩衝型ＣａＥＤＴＡとの対比である。
【図１３】他のキレート化剤もまた抗生剤の効力を増強することを実証する図である。チェッカーボード式であり、緑膿菌ＷＡＣＣ９１浮遊性細胞と、トブラマイシンおよびエチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）との対比である。
【図１４】他のキレート化剤もまた抗生剤の効力を増強することを実証する図である。トブラマイシンと、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）との間の相乗効果を示す。図１４Ａ：チェッカーボード式である；図１４Ｂ〜Ｃ：示されている通り、選択された濃度の抗生剤およびキレート化剤に対するＯＤ６００ｎｍおよびコロニーカウント数である。
【図１５】緩衝型ＣａＥＤＴＡは、グラム陽性とグラム陰性の両方の異なる細菌種に対して、様々な臨床的に関連する抗生剤の効力を増強することを実証する図である。バークホルデリアセパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）浮遊性細胞と、トブラマイシンおよびＣａＥＤＴＡとの対比である。図２１Ａ：チェッカーボード式アッセイである；図２１Ｂ：選択された濃度のコロニーカウント数である。
【図１６】緩衝型ＣａＥＤＴＡは、グラム陽性とグラム陰性の両方の異なる細菌種に対して、様々な臨床的に関連する抗生剤の効力を増強することを実証する図である。チェッカーボード式であり、セパシア菌（Ｂ．ｃｅｐａｃｉａ）浮遊性細胞と、シプロフロキサシンおよびＣａＥＤＴＡとの対比である。
【図１７】緩衝型ＣａＥＤＴＡは、グラム陽性とグラム陰性の両方の異なる細菌種に対して、様々な臨床的に関連する抗生剤の効力を増強することを実証する図である。チェッカーボード式であり、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）浮遊性細胞（図１７Ａ）およびバイオフィルム（図１７Ｂ）と、コリスチンおよびＣａＥＤＴＡとの対比である。
【図１８】緩衝型ＣａＥＤＴＡは、グラム陽性とグラム陰性の両方の異なる細菌種に対して、様々な臨床的に関連する抗生剤の効力を増強することを実証する図である。チェッカーボード式であり、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）浮遊性細胞と、テトラサイクリンおよびＣａＥＤＴＡとの対比である。
【図１９】緩衝型ＣａＥＤＴＡは、グラム陽性とグラム陰性の両方の異なる細菌種に対して、様々な臨床的に関連する抗生剤の効力を増強することを実証する図である。チェッカーボード式であり、黄色ブドウ球菌ＭＲＳＡ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＭＲＳＡ）浮遊性細胞と、バンコマイシンおよびＣａＥＤＴＡとの対比である。
【図２０】緩衝型ＣａＥＤＴＡは、グラム陽性とグラム陰性の両方の異なる細菌種に対して、様々な臨床的に関連する抗生剤の効力を増強することを実証する図である。示されている通り、黄色ブドウ球菌ＭＳＳＡ浮遊性細胞と、シプロフロキサシンおよびＣａＥＤＴＡとの対比である。図２０Ａ：ＯＤ６００ｎｍ；図２０Ｂ：ＣＦＵ／ｍｌ。
【図２１】緩衝型ＣａＥＤＴＡは、グラム陽性とグラム陰性の両方の異なる細菌種に対して、様々な臨床的に関連する抗生剤の効力を増強することを実証する図である。示されている通り、黄色ブドウ球菌ＭＲＳＡ浮遊性細胞と、シプロフロキサシンおよびＣａＥＤＴＡとの対比である。図２１Ａ：ＯＤ６００ｎｍ；図２１Ｂ：ＣＦＵ／ｍｌ。
【図２２】ＣａＥＤＴＡは抗生剤の殺菌活性を増加させることを実証する図である。緩衝型ＣａＥＤＴＡ（２０ｍＭ）有りまたは無しの、緑膿菌ＡＴＣＣ２７８５３およびセフタジジム（１２８ｕｇ／ｍｌ）のタイムキルアッセイである。
【図２３】ＣａＥＤＴＡは抗生剤の殺菌活性を増加させることを実証する図である。緩衝型ＣａＥＤＴＡ（２０ｍＭ）有りまたは無しの、セパシア菌ＡＴＣＣ２５４１６およびメロペネム（３２ｕｇ／ｍｌ）のタイムキルアッセイである。
【図２４】ＣａＥＤＴＡのサブミクロン粒子が緑膿菌バイオフィルムを死滅させ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでトブラマイシンと相乗的に作用することを示す図である。緑膿菌バイオフィルムを懸滴のＣＦ粘液中で成長させ、エアゾール化ＥＤＴＡ粒子および／またはトブラマイシンで処理した。小滴中のトブラマイシンの最終濃度は３２５μｇ／ｍｌであった。図２４Ａ：ＢａｃＬｉｇｈｔ  ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤで染色したバイオフィルムの共焦点顕微鏡画像である；図２４Ｂ：処置の定量的作用を示す細菌カウント数である。
【図２５】トブラマイシンに加えて、緩衝型ＣａＥＤＴＡでのＣＦ対象の処置がトブラマイシン単独での処置よりも有効であることを実証する図である。トブラマイシンに加えて、緩衝型ＣａＥＤＴＡでのＣＦ対象の処置が、抗生剤単独での処置より速くＣＦ肺内の細菌量を低減させることを示している。ＣＦ対象を噴霧用ＣａＥＤＴＡ（ＥＤＴＡ）または生理食塩水（プラセボ）で処置し、喀痰された粘液中の細菌量をモニターした（粘液１グラム当たりのコロニー形成単位）。
【図２６】トブラマイシンに加えて、緩衝型ＣａＥＤＴＡでのＣＦ対象の処置がトブラマイシン単独での処置よりも有効であることを実証する図である。処置の開始から、１０週間全体にわたる（処置後４週間）ＣａＥＤＴＡまたはプラセボで処置した患者におけるＦＥＶ１（％ポイント）の平均変化を示している。
【図２７】トブラマイシンに加えて、緩衝型ＣａＥＤＴＡでのＣＦ対象の処置がトブラマイシン単独での処置よりも有効であることを実証する図である。ＦＥＶ１の改善（０〜２週間）と体重との間の関係を示している。
【図２８】トブラマイシンに加えて、緩衝型ＣａＥＤＴＡでのＣＦ対象の処置がトブラマイシン単独での処置よりも有効であることを実証する図である。７５ｍｇの噴霧用ＣａＥＤＴＡによる処置から５分後および２時間後に、３人のＣＦ対象の痰において達成されたＥＤＴＡ濃度を示している。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
［処置または予防の方法］
本発明は、吸入用抗生剤と、少なくとも３７．５ｍｇ／日の吸入用キレート剤とを、それぞれ１回または複数回の投与で投与することにより対象の肺内の細菌感染症を処置または予防する方法であって、キレート剤および／または抗生剤のその投与または各投与が８時間以下の期間にわたり投与される方法を提供する。
【００２８】
好ましくは、対象は動物であり、好ましくは哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。
【００２９】
吸入用ＥＤＴＡは単独では細菌感染症を処置しないことが以前に示されている（Ｂｒｏｗｎら（Ａｍ  Ｊ  Ｄｉｓ  Ｃｈｉｌｄ．１９８５年、１３９巻（８号）：８３６〜９頁）；Ｈａｓｓｅｔｔ（Ｆｒｏｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１６年、７巻：２９１頁））。Ｂｒｏｗｎら（１９８５年）は、緑膿菌に慢性的に感染しているＣＦ小児を、噴霧用ナトリウムＥＤＴＡおよび経口テトラサイクリンで３カ月処置し、肺機能または感染症状態における変化は観察されなかった。ＥＤＴＡは濃度依存性気管支収縮（Ｂｅａｓｌｅｙら（Ｂｒ  Ｍｅｄ  Ｊ（Ｃｌｉｎ  Ｒｅｓ  Ｅｄ）．１９８７年、２９４巻（６５８１号）：１１９７〜８頁））を引き起こすこと、ＥＤＴＡはＦＥＶ１に対する作用がないことが他者により報告された（Ａｓｍｕｓら、（Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１年、１０７巻（１号）：６８〜７２頁））。したがって、高用量の吸入用キレート剤が、対象に対して、例えば、嚢胞性線維症（ＣＦ）、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）または感染症および炎症を引き起こすまたはこれに伴う肺の他の状態を有するものなどに対して任意のプラス効果を有すると信じる根拠は何もない。しかし、本発明は驚くことに、抗生剤と組み合わせた、ある特定の吸入用キレート剤の投与が肺感染症および炎症を処置または予防することができることを見出した。
【００３０】
ＣＦ肺環境は酸性であると一般に信じられている。しかし、ＣＦ肺は正常な肺と同じｐＨを有することが最近になり示されている（Ｓｃｈｕｌｔｚら、「Ａｉｒｗａｙ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｐＨ  ｉｎｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｗｉｔｈ  ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ」Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（８巻：１４０９頁（２０１７年）））。したがって、酸性化亜硝酸を使用する現行の技術、例えば、米国特許出願公開第２０１６／０２６３１５１号において論じられているものなどは、製剤は、酸性化された状態には留まらず、正常な肺のｐＨ７．４に直ちに戻るので、ＣＦにおいて臨床的に働く可能性は低い。
【００３１】
ＣＦ肺の酸性度は正常ではあるが、鉄のレベルは正常な肺とは著しく異なることが判明した。Ｓｔｉｔｅｓら、（Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１９９９年、１６０巻（３号）：７９６〜８０頁）は、鉄のレベルはＣＦ患者の肺内で、ならびに喫煙者の肺内で、健康な個体と比較して大きく上昇していることを示した。この鉄の大部分は、第一鉄の形態、Ｆｅ（ＩＩ）であり、疾患重症度と有意に相関することも示されている（Ｈｕｎｔｅｒら、ＭＢｉｏ．２０１３年、４巻（４号）：１〜８頁）。第一鉄は、組織およびＤＮＡを激しく損傷し得る極めて反応性の高い酸素ラジカルを生成するフェントン反応に参加することができる（Ｊｏｍｏｖａら、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ．、２０１１年、２８３巻（２〜３号）：６５〜８７頁；ＭａｃＮｅｅ、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、２００１年、４２９巻（１〜３号）：１９５〜２０７頁）。
【００３２】
理論に制約されることを望むことなく、本発明の方法は、主要なイオン、例えば、鉄および亜鉛などを細菌から奪うことにより、肺内の感染症を低減させると考えられている。これは、いくつかのレベルで起こり得る：
（ｉ）鉄は細菌増殖および生存に不可欠である。これはバイオフィルム形成の事例に特に当てはまる。バイオフィルム内では鉄の除去が細菌の飢餓および死亡につながるからである、
（ｉｉ）バイオフィルム細胞は、正荷電金属イオンで結び付いている負荷電の多糖およびＤＮＡからなる水和したポリマーマトリックスで囲まれている。カチオン除去は、バイオフィルムの分散を引き起こし、これによって、抗生剤および免疫細胞が個々の細菌に到達可能となる、
（ｉｉｉ）緑膿菌および他のグラム陰性細菌の外膜は、二価カチオンで架橋された負荷電リポ多糖からなる（Ｃｌｉｆｔｏｎら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、２０１５年、３１巻：４０４〜４１２頁）。カチオンの除去は、外膜浸透率および抗生剤感受性を増加させ、この作用はシュードモナス属（Pseudomonas spp.）において特に著しい（Ｖａａｒａ、Ｍ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ、１９９２年、５６巻：３９５〜４１１頁）、ならびに／または
（ｉｖ）宿主における緑膿菌生存の鍵となるのが、分泌される病毒性因子の産生であり、これらのいくつかは、その機能が金属イオンに依存する。これらの例がエラスターゼ（Ｚｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ、Ｏｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｏｈｍａｎ、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１９９２年、１７４巻：４１４０〜４１４７頁）およびβ−ラクタマーゼである（Ｚｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ、Ｆａｊａｒｄｏら、Ｊ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、２０１４年、６９巻：２９７２〜２９７８頁）。
【００３３】
吸入は、局所投与の方法であり、したがって、標的領域、すなわち、肺に到達するのにより有効であり得、吸入用キレート剤および抗生剤の高いおよび局所的な濃度を提供する。吸入は、活性物質の全身曝露による所望しない副作用を回避し、抗生剤耐性の危険性を低減させる。
【００３４】
キレート剤および抗生剤は、１つの単一製剤、または２つの別個の製剤で送達することができる。製剤が別個である場合、製剤は一緒に（同時に）、または逐次的に摂取してもよい。２種の活性物質の製剤の送達の間に、数秒、数分、数時間または数日の一時的なずれがあってもよい。
【００３５】
本発明の組成物は、パファーにより（加圧された定量式吸入器、ドライパウダー吸入器）またはネブライザーにより送達することができる。組成物が１つのデバイス（すなわち、１つのデバイス内にキレート剤と抗生剤の両方）で提供されてもよいし、または２種の活性物質が２つの異なるデバイスから送達されてもよい。例えば、２種の活性物質は、各デバイス内に１種の活性物質を含んだ、２つの別個のパファーで、２つの別個のネブライザーで、またはパファーとネブライザーで送達されてもよい。
【００３６】
吸入用抗生剤と、少なくとも３７．５ｍｇ／日の吸入用キレート剤とを、それぞれ１回または複数回の投与で投与することにより対象の肺内の細菌感染症を処置（treat）または予防する方法であって、キレート剤および／または抗生剤のその投与または各投与が８時間以下の期間にわたり投与される方法は、酸性化亜硝酸の非存在下で提供され得る。
【００３７】
本発明は、吸入用抗生剤、および少なくとも３７．５ｍｇ／日の吸入用キレート剤を、それぞれ１回または複数回の投与で投与することにより対象の肺内の細菌感染症を処置または予防する方法であって、キレート剤および／または抗生剤のその投与または各投与が８時間以下の期間にわたり投与され、感染症の処置または予防がＦＥＶの増加をもたらす、方法をさらに提供する。
【００３８】
本発明は、吸入用抗生剤、および少なくとも３７．５ｍｇ／日の吸入用キレート剤を、それぞれ１回または複数回の投与で投与することにより対象の肺内の細菌感染症を処置または予防する方法であって、キレート剤および／または抗生剤のその投与または各投与が８時間以下の期間にわたり投与され、感染症の処置または予防が、キレート剤の存在による、肺内の細菌により生成されるバイオフィルムの除去または低減に起因する、方法をさらに提供する。
【００３９】
本発明は、吸入用抗生剤、および少なくとも３７．５ｍｇ／日の吸入用キレート剤を、それぞれ１回または複数回の投与で投与することにより対象の肺内の細菌感染症を処置または予防する方法であって、キレート剤および／または抗生剤のその投与または各投与が８時間以下の期間にわたり投与され、感染症の処置または予防が、キレート剤の存在による細菌性外膜浸透率の増加に起因する、方法をさらに提供する。
【００４０】
本発明は、吸入用抗生剤、および少なくとも３７．５ｍｇ／日の吸入用キレート剤を、それぞれ１回または複数回の投与で投与することにより対象の肺内の細菌感染症を処置または予防する方法であって、キレート剤および／または抗生剤のその投与または各投与が８時間以下の期間にわたり投与され、感染症の処置または予防が、キレート剤での金属イオンのキレート化による細菌性病毒性因子の低減に起因する、方法をさらに提供する。
【００４１】
本発明は、吸入用抗生剤、および少なくとも３７．５ｍｇ／日の吸入用キレート剤を、それぞれ１回または複数回の投与で投与することにより対象の肺内の細菌感染症を処置または予防する方法であって、キレート剤および／または抗生剤のその投与または各投与が８時間以下の期間にわたり投与され、炎症の処置または予防がＭＭＰ活性の低下を伴う、方法をさらに提供する。マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）が肺損傷を引き起こすこと（Ｇａｒｒａｔｔら、Ｅｕｒ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｊ．２０１５年、４６巻（２号）：３８４〜９４頁）およびＭＭＰ活性がＺｎ２＋に依存すること（Ｈａｚｒａら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｖｉｓｉｏｎ、２０１２年；１８巻：１７０１〜１７１１頁）は公知である。しかし、肺内のＭＭＰを標的にする過去の試みは不成功であった。本発明は、肺内で亜鉛をキレートする吸入用キレート剤を使用し、よってＭＭＰ誘発性肺損傷を低減させ、炎症を処置または予防する。
【００４２】
本発明は、吸入用抗生剤、および少なくとも３７．５ｍｇ／日の吸入用キレート剤を、それぞれ１回または複数回の投与で投与することにより対象の肺内の細菌感染症を処置または予防する方法であって、キレート剤および／または抗生剤のその投与または各投与が８時間以下の期間にわたり投与され、炎症の処置または予防がヒドロキシルラジカルの産生の低下を伴う、方法をさらに提供する。Ｆｅ（ＩＩ）は、ヒドロキシルラジカルの形成を触媒するので、鉄は肺損傷における主要因子である（Ｓｔｉｔｅｓら、（Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．、１９９９年、１６０巻（３号）：７９６〜８０頁））。Ｆｅ（ＩＩ）はＣＦ肺内で豊富であり、疾患重症度と有意に相関するが（Ｈｕｎｔｅｒら、ＭＢｉｏ．、２０１３年、４巻（４号）：１〜８頁）、抗酸化剤治験は、今までのところ肺機能における著しい改善をもたらすことができでいない。本発明は肺内の鉄をキレート化するために吸入用キレート剤を使用し、よってヒドロキシルラジカル誘発性肺損傷を低減させ、炎症を処置または予防する。
【００４３】
好ましくは、キレート剤は鉄キレート剤または亜鉛キレート剤である。より好ましくは、キレート剤は鉄と亜鉛の両方のキレート化剤である（鉄／亜鉛キレート化剤）。代わりに、キレート剤は、２種またはそれより多くのキレート剤の混合物、例えば、鉄キレート剤と亜鉛キレート剤、または鉄／亜鉛キレート剤と亜鉛キレート剤、または鉄キレート剤と鉄／亜鉛キレート剤の混合物であってよい。
【００４４】
キレート剤は、好ましくは、クエン酸、リン酸塩、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のジナトリウム塩、トリナトリウム塩およびテトラナトリウム塩、ＥＤＴＡのカルシウム塩、エチレングリコール−ビス−（ｂ−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）；１，２−ビス（２−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＢＡＰＴＡ）；エチレン−Ｎ，Ｎ’−ジグリシン（ＥＤＤＡ）；２，２’−（エチレンジイミノ（ｅｔｈｙｌｅｎｄｉｉｍｉｎｏ））−ジブタン酸（ＥＢＤＡ）；ラウロイルＥＤＴＡ；ジラウロイルＥＤＴＡ、トリエチレンテトラミンジヒドロクロリド（ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｉｏｒｉｄｅ）（ＴＲＩＥＮ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＰＴＡ）、トリエチレンテトラミン六酢酸（ＴＴＧ）、デフェロキサミン（ＤＦＯ）、デフェラシロクス（ＤＳＸ）、ジメルカプロール、クエン酸亜鉛、ペニシラミン（ｐｅｎｉｃｉｌａｍｉｎｅ）、サクシマー、エジトロネート、ヘキサメタリン酸ナトリウム、エデト酸カルシウム二ナトリウム、Ｄ−ペニシラミン、ポリフェノール、ガロール、カテコール、ジメルカプロール、テトラチオモリブデート、ラクトフェリン、およびクリオキノールおよびこれらの組合せからなる群から選択される。
【００４５】
好ましくは、キレート剤は薬学的に許容されるキレート剤である。
【００４６】
一実施形態では、キレート剤はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である。別の実施形態では、キレート剤はデフェロキサミン（ＤＦＯ）である。別の実施形態では、キレート剤はデフェラシロクス（ＤＳＸ）である。
【００４７】
好ましくは、キレート剤は、ＥＤＴＡとおよそ同じ鉄親和性、および／またはＥＤＴＡとおよそ同じ亜鉛親和性を有する。２５℃および０．１ＭでのＥＤＴＡに対する生成定数または安定度定数（ｌｏｇ  Ｋ１）は、Ｆｅ２＋に対しては１４．３であり、Ｆｅ３＋に対しては２５．１であり、亜鉛に対しては１６．５である。
【００４８】
一実施形態では、キレート剤はキレート剤のカルシウム塩である。好ましくは、キレート剤はＣａＥＤＴＡである。
【００４９】
一実施形態では、キレート剤は３７．５ｍｇ／投与〜３００ｍｇ／投与の間、約７５ｍｇ／投与〜２００ｍｇ／投与の間、約７５ｍｇ／投与〜１００ｍｇ／投与の間、約５０ｍｇ／投与〜２００ｍｇ／投与の間、好ましくは約３７．５ｍｇ／投与、５０ｍｇ／投与、７５ｍｇ／投与、１００ｍｇ／投与、２００ｍｇ／投与または３００ｍｇ／投与を含有する吸入用投与形態で提供される。キレート剤は、少なくとも３７．５ｍｇ／投与を含有する吸入用投与形態で好ましくは提供される。
【００５０】
１日当たり吸入されるキレート剤の総量は、好ましくは約３７．５ｍｇ／日〜１，２００ｍｇ／日の間、約５０ｍｇ／日〜１，２００ｍｇ／日の間、約１００ｍｇ／日〜１，０００ｍｇ／日の間、約３００ｍｇ／日〜９００ｍｇ／日の間、約４００ｍｇ／日〜８００ｍｇ／日の間、好ましくは約３００ｍｇ／日、５００ｍｇ／日または６００ｍｇ／日、または少なくとも６００ｍｇ／日である。キレート剤は、約１，２００ｍｇ／日まで、好ましくは少なくとも３７．５ｍｇ／日の全用量を投与することができる。
【００５１】
吸入用キレート剤は、８時間、７時間、６時間、５時間、４時間、３時間、２時間、１時間、４５分、３０分、２０分、１５分、１０分、または５分以下の期間にわたり好ましくは送達される。投与が乾燥粉末の送達による場合、吸入用キレート剤は、数秒の期間、例えば、エアゾール剤デバイスまたはドライパウダー吸入器の「パフ」１回当たり１秒にわたり送達することができ、各時間点で、１回または複数回のパフが投与される。
【００５２】
好ましくは吸入用キレート剤および吸入用抗生剤は少なくとも連続２８日間投与される。吸入用キレート剤および吸入用抗生剤は、２日間またはそれよりも多く、３日間、４日間、５日間、６日間または７日間送達することができる。吸入用キレート剤および吸入用抗生剤は、２〜２８日の間、１週間、２週間、３週間または４週間送達することができる。一部の対象は、数日または数週の期間にわたるより高用量またはより頻繁な投与、これに続くより低い用量または維持量の投与で、対象に抗生剤および／またはキレート剤を「負荷する」期間により恩恵を受けることができる。
【００５３】
吸入用キレート剤および吸入用抗生剤は、酸性化亜硝酸の非存在下で提供することができる。
【００５４】
よって、本発明は、
・３７．５ｍｇ／日〜１，２００ｍｇ／日の間の吸入用キレート剤総量を送達する、
・１０ｍｇ／日〜５００ｍｇ／日の間の吸入用抗生剤総量を送達する、
・少なくとも１日当たり１回から１日当たり６回まで、好ましくは１日４回まで投与される、
・両方の活性剤を含有する単一製剤として、もしくは別個の製剤に分けて投与される、および／または
・８時間以下の期間にわたり投与される。
【００５５】
好ましくは、本発明は、
・３７．５ｍｇ／日〜１，２００ｍｇ／日の間の吸入用キレート剤総量を送達する、
・１０ｍｇ／日〜５００ｍｇ／日の間の吸入用抗生剤総量を送達する、
・両方の活性剤を含有する単一製剤として投与される、
・１日当たり１回もしくは２回投与される、
・１回の投与当たり１時間以下の期間にわたり投与される、
・ＣａＥＤＴＡをキレート剤として含有する、および／または
・トブラマイシンを抗生剤として含有する。
【００５６】
ＣａＥＤＴＡなどのキレート剤７５ｍｇが吸入された場合、約０．４ｍＭ〜１．３４ｍＭのキレート剤が５分後、肺からの痰の中に検出され得ることが断定されている。
【００５７】
任意のキレート剤の好ましい量は、薬剤のキレート化能力を、ＣａＥＤＴＡのものと比較し、次いで上に与えた用量範囲にその数をかけることにより計算することができる。結果は、好ましい量のＥＤＴＡにより提供される好ましいレベルのキレート化とおよそ等しいレベルのキレート化を提供するはずである。
【００５８】
好ましくは、抗生剤はトブラマイシンである。しかし、本発明をトブラマイシン限定することを要望するわけではない。他の抗生剤または抗感染剤、例えば、アミノグリコシド、テトラサイクリン、スルホンアミド、ｐ−アミノ安息香酸、ジアミノピリミジン、キノロン、β−ラクタム、β−ラクタムおよびβ−ラクタマーゼ阻害剤、グリコペプチド、クロラフェニコール、マクロライド、ペニシリン、セファロスポリン、コルチコステロイド、プロスタグランジン、シプロフロキサシン、リンコマイシン（linomycin）、クリンダマイシン、スペクチノマイシン、ポリミキシンＢ、コリスチン、バンコマイシン、バシトラシン、イソニアジド、リファンピン、エタンブトール、エチオナミド、アミノサリチル酸、サイクロセリン、カプレオマイシン、スルホン、クロファジミン、サリドマイド、ポリエン抗真菌剤、フルシトシン、イミダゾール、トリアゾール、グリセオフルビン、テルコナゾール、ブトコナゾールシクロピラックス、シクロピロックスオラミン、ハロプロジン、トルナフテート、ナフチフィン、テルビナフィン、またはその任意の組合せからなる群から選択されるものなどを使用することができる。
【００５９】
本発明により包含される抗生剤は、これらに限定されないが、キノロン（例えば、ナリジクス酸、シノキサシン、シプロフロキサシンおよびノルフロキサシンなど）、スルホンアミド（例えば、スルファニルアミド、スルファジアジン、スルファメトキサゾール（ｓｕｌｆａｍｅｔｈａｏｘａｚｏｌｅ）、スルフイソキサゾール、スルファセタミドなど）、アミノグリコシド（例えば、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、アミカシン、ネチルマイシン、カナマイシンなど）、テトラサイクリン（例えば、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、メタサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリンなど）、パラ−アミノ安息香酸、ジアミノピリミジン（例えば、トリメトプリム、多くの場合スルファメトキサゾールと併せて使用されている、ピラジナミドなど）、ペニシリン（例えば、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、アンピシリン、アモキシシリン、バカンピシリン、カルベニシリン、カルベニシリンインダニル、チカルシリン、アズロシリン、メズロシリン、ピペラシリンなど）、ペニシリナーゼ耐性ペニシリン（例えば、メチシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、ナフシリンなど）、第１世代セファロスポリン（例えば、セファドロキシル、セファレキシン、セフラジン、セファロチン、セファピリン、セファゾリンなど）、第２世代セファロスポリン（例えば、セファクロル、セファマンドール、セフォニシド、セフォキシチン、セフォテタン、セフロキシム、セフロキシムアクセチル、セフィネタゾール、セフプロジル、ロラカルベフ、セホラニドなど）、第３世代セファロスポリン（例えば、セフェピム、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフタジジム、セフィキシム、セフポドキシム、セフチブテンなど）、他のβ−ラクタム（例えば、イミペネム、メロペネム、アズトレオナム、クラブラン酸、スルバクタム、タゾバクタムなど）、ベータラクタマーゼ阻害剤（例えば、クラブラン酸など）、クロラムフェニコール、マクロライド（例えば、エリスロマイシン、アジスロマイシン、クラリスロマイシンなど）、リンコマイシン、クリンダマイシン、スペクチノマイシン、ポリミキシンＢ、ポリミキシン（例えば、ポリミキシンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ１（コリスチンＡ）、またはＥ２、コリスチンＢまたはＣなど）コリスチン、バンコマイシン、バシトラシン、イソニアジド、リファンピン、エタンブトール、エチオナミド、アミノサリチル酸、サイクロセリン、カプレオマイシン、スルホン（例えば、ダプソン、スルホキソンナトリウムなど）、クロファジミン、サリドマイド、または脂質封入できる任意の他の抗菌剤を含む。抗感染剤は、ポリエン抗真菌剤（例えば、アムホテリシンＢ、ナイスタチン、ナタマイシンなど）、フルシトシン、イミダゾール（例えば、ミコナゾール、クロトリマゾール、エコナゾール、ケトコナゾールなど）、トリアゾール（例えば、イトラコナゾール、フルコナゾールなど）、グリセオフルビン、テルコナゾール、ブトコナゾールシクロピラックス、シクロピロックスオラミン、ハロプロジン、トルナフテート、ナフチフィン、テルビナフィンを含む抗真菌剤、または任意の他の抗生剤���よびその薬学的に許容される塩およびその組合せを含むことができる。考察および例は、主にトブラマイシンを対象とするが、本出願の範囲がこの抗生剤に限定されることを意図しない。薬物の組合せを使用することができる。
【００６０】
適切な「薬学的に許容される塩」は、慣例的に使用されている無毒性塩、例えば、無機塩基との塩、例えば、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩およびカリウム塩など）、アルカリ土類金属塩（例えば、カルシウム塩およびマグネシウム塩など）、アンモニウム塩；または有機塩基との塩、例えば、アミン塩（例えば、メチルアミン塩、ジメチルアミン塩、シクロヘキシルアミン塩、ベンジルアミン塩、ピペリジン塩、エチレンジアミン塩、エタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、トリス（ヒドロキシメチルアミノ）エタン塩、モノメチル−モノエタノールアミン塩、プロカイン塩およびカフェイン塩など）、塩基性アミノ酸塩（例えば、アルギニン塩およびリシン塩など）、テトラアルキルアンモニウム塩など、あるいは肺血圧降下剤が液体媒体中で溶解性を維持することを可能にする、または液体媒体、好ましくは水性媒体中で調製されるおよび／もしくは効果的に投与される他の塩形態を含む。上記塩は、従来のプロセス、例えば、対応する酸性および塩基から、または塩交換により調製することができる。
【００６１】
例えば、１つの代替の実施形態では、抗生剤は、遊離塩基形態または塩形態（例えば、薬学的に許容される塩として）で利用することができる。適切な薬学的に許容される塩の例は、無機酸付加塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、および硝酸塩など；有機酸付加塩、例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、乳酸塩、グリコール酸塩、リンゴ酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、およびアスコルビン酸塩など；ｗｉｔｈ酸性アミノ酸との塩、例えば、アスパラギン酸塩およびグルタミン酸塩など；アルカリ金属塩、例えば、ナトリウム塩およびカリウム塩など；アルカリ土類金属塩、例えば、マグネシウム塩およびカルシウム塩など；アンモニウム塩；有機塩基性塩、例えば、トリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ピリジン塩、ピコリン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、およびＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩など；ならびに塩基性アミノ酸との塩、例えば、リシン塩およびアルギニン塩などを含む。塩は、場合によっては水和物またはエタノール溶媒和物であってもよい。
【００６２】
エーテルの例は、これらに限定されないが、アルキルエーテル、例えば、低級アルキルエーテル、例えば、メチルエーテル、エチルエーテル、プロピルエーテル、イソプロピルエーテル、ブチルエーテル、イソブチルエーテル、ｔ−ブチルエーテル、ペンチルエーテルおよび１−シクロプロピルエチルエーテルなど；および中級または高級アルキルエーテル、例えば、オクチルエーテル、ジエチルヘキシルエーテル、ラウリルエーテルおよびセチルエーテルなど；不飽和エーテル、例えば、オレイルエーテルおよびリノレニルエーテルなど；低級アルケニルエーテル、例えば、ビニルエーテル、アリルエーテルなど；低級アルキニルエーテル、例えば、エチニルエーテルおよびプロピニルエーテルなど；ヒドロキシ（低級）アルキルエーテル、例えば、ヒドロキシエチルエーテルおよびヒドロキシイソプロピルエーテルなど；低級アルコキシ（低級）アルキルエーテル、例えば、メトキシメチルエーテルおよび１−メトキシエチルエーテルなど；場合によって置換されているアリールエーテル、例えば、フェニルエーテル、トシルエーテル、ｔ−ブチルフェニルエーテル、サリチルエーテル、３，４−ジ−メトキシフェニルエーテルおよびベンズアミドフェニルエーテルなど；ならびにアリール（低級）アルキルエーテル、例えば、ベンジルエーテル、トリチルエーテルおよびベンズヒドリルエーテルなど、あるいは抗生剤が液体媒体中で溶解性を維持することを可能にする、または液体媒体、好ましくは水性媒体中で調製されるおよび／もしくは効果的に投与される他のエーテル形態を含むことができる。
【００６３】
エステルの例は、これらに限定されないが、脂肪族エステル、例えば、低級アルキルエステル、例えば、メチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、イソプロピルエステル、ブチルエステル、イソブチルエステル、ｔ−ブチルエステル、ペンチルエステルおよび１−シクロプロピルエチルエステルなど；低級アルケニルエステル、例えば、ビニルエステルおよびアリルエステルなど；低級アルキニルエステル、例えば、エチニルエステルおよびプロピニルエステルなど；ヒドロキシ（低級）アルキルエステル、例えば、ヒドロキシエチルエステルなど；低級アルコキシ（低級）アルキルエステル、例えば、メトキシメチルエステルおよび１−メトキシエチルエステルなど；ならびに場合によって置換されているアリールエステル、例えば、フェニルエステル、トシルエステル、ｔ−ブチルフェニルエステル、サリチルエステル、３，４−ジ−メトキシフェニルエステルおよびベンズアミドフェニルエステルなど；ならびにアリール（低級）アルキルエステル、例えば、ベンジルエステル、トリチルエステルおよびベンズヒドリルエステルなど、あるいは抗生剤が液体媒体中で溶解性を維持することを可能にする、または液体媒体中、好ましくは水性媒体中で調製されるおよび／もしくは効果的に投与される他のエステル型を含むことができる。
【００６４】
また、本明細書に提供されている製剤および方法において使用するための抗生剤は、１つまたは複数のキラル中心を含有することができる。このようなキラル中心は、（Ｒ）もしくは（Ｓ）配置のいずれかであってよく、またはその混合物であってもよい。よって、本明細書に提供されている製剤に使用するための抗生剤は、エナンチオマーとして純粋な、または立体異性またはジアステレオマーの混合物であってよい。本明細書に提供されている化合物のキラル中心は、ｉｎ  ｖｉｖｏでエピマー化され得ることを理解されたい。よって、当業者であれば、その（Ｒ）形態での化合物の投与は、ｉｎ  ｖｉｖｏでエピマー化された化合物については、その（Ｓ）形態での化合物の投与と同等であることを認識している。
【００６５】
一実施形態では、抗生剤は、１０ｍｇ／投与〜５００ｍｇ／投与の間、約５０ｍｇ／投与〜４００ｍｇ／投与の間、約１００ｍｇ／投与〜４００ｍｇ／投与の間、約２００ｍｇ／投与〜３００ｍｇ／投与の間；好ましくは約１０ｍｇ／投与、２０ｍｇ／投与、３０ｍｇ／投与、５０ｍｇ／投与，２００ｍｇ／投与、２５０ｍｇ／投与、２００ｍｇ／投与または３００ｍｇ／投与を含有する吸入用投与形態で提供される。
【００６６】
１日当たり吸入される抗生剤の総量は、好ましくは約１０ｍｇ／日〜２，０００ｍｇ／日の間、１０ｍｇ／日および１，０００ｍｇ／日、５０ｍｇ／日および２，０００ｍｇ／日、２５０ｍｇ／日および２，０００ｍｇ／日、約３００ｍｇ／日〜１，１００ｍｇ／日の間、約５００ｍｇ／日〜１，０００ｍｇ／日の間、約８００ｍｇ／日〜１，０００ｍｇ／日の間；好ましくは約２００ｍｇ／日、３００ｍｇ／日、５００ｍｇ／日、１，０００ｍｇ／日または１，２５０ｍｇ／日である。
【００６７】
抗生剤は、送達１回当たり８時間、７時間、６時間、５時間、４時間、３時間、２時間、１時間、４５分、３０分、２０分、１５分、１０分、または５分以下の期間にわたり好ましくは送達される。投与が乾燥粉末の送達による場合、吸入用抗生剤は、数秒の期間にわたり、例えば、エアゾール剤デバイスまたはドライパウダー吸入器のパフ１回当たり１秒にわたり好ましくは送達され、各時間点で、１回または複数回のパフが投与される。
【００６８】
抗生剤がトブラマイシンである場合、共通して処方される吸入用トブラマイシンの用量は、ＴＯＢＩ（登録商標）Ｐｏｄｈａｌｅｒ（登録商標）（乾燥粉末）が２８ｍｇ（１１２ｍｇ用量）のパフ４回、毎日２回、合計２２４ｍｇ／日であり、ＯＲ  Ｎｅｂｕｌｉｓｅｄ  ＴＯＢＩ（登録商標）が毎日２回、５ｍｌ中３００ｍｇである。
【００６９】
キレート剤がパファーで送達される場合、好ましくは、各パフは、３７．５ｍｇ／パフ〜３００ｍｇ／パフの間、約７５ｍｇ／パフ〜２００ｍｇ／パフの間、約７５ｍｇ／パフ〜１００ｍｇ／パフの間、約５０ｍｇ／パフ〜２００ｍｇ／パフの間、好ましくは約３７．５ｍｇ／パフ、５０ｍｇ／パフ、７５ｍｇ／パフ、１００ｍｇ／パフ、２００ｍｇ／パフまたは３００ｍｇ／パフを送達する。
【００７０】
代わりに、キレート剤がパファーで送達される場合、好ましくは２回ごとのパフは、３７．５ｍｇ／２×パフ〜３００ｍｇ／２×パフの間、約７５ｍｇ／２×パフ〜２００ｍｇ／２×パフの間、約７５ｍｇ／２×パフ〜１００ｍｇ／２×パフの間、約５０ｍｇ／２×パフ〜２００ｍｇ／２×パフの間；好ましくは約３７．５ｍｇ／２×パフ、５０ｍｇ／２×パフ、７５ｍｇ／２×パフ、１００ｍｇ／２×パフ、２００ｍｇ／２×パフまたは３００ｍｇ／２×パフを送達する。
【００７１】
抗生剤がパファーで送達される場合、好ましくは、各パフは、１０ｍｇ／パフ〜５００ｍｇ／パフの間、約５０ｍｇ／パフ〜４００ｍｇ／パフの間、約１００ｍｇ／パフ〜４００ｍｇ／パフの間、約２００ｍｇ／パフ〜３００ｍｇ／パフの間；好ましくは約１０ｍｇ／パフ、２０ｍｇ／パフ、３０ｍｇ／パフ、５０ｍｇ／パフ、２００ｍｇ／パフ、２５０ｍｇ／パフ、２００ｍｇ／パフまたは３００ｍｇ／パフを送達する。
【００７２】
代わりに、抗生剤がパファーで送達される場合、好ましくは２回ごとのパフは１０ｍｇ／２×パフ〜５００ｍｇ／２×パフの間、約５０ｍｇ／２×パフ〜４００ｍｇ／２×パフの間、約１００ｍｇ／２×パフ〜４００ｍｇ／２×パフの間、約２００ｍｇ／２×パフ〜３００ｍｇ／２×パフの間；好ましくは約１０ｍｇ／２×パフ、２０ｍｇ／２×パフ、３０ｍｇ／２×パフ、５０ｍｇ／２×パフ、２００ｍｇ／２×パフ、２５０ｍｇ／２×パフ、２００ｍｇ／２×パフまたは３００ｍｇ／２×パフを送達する。
【００７３】
組成物がキレート剤と抗生剤の両方を含有する場合、好ましくはキレート剤：抗生剤の比率は約３：１、１：１０、３０：１、３：５または１：１．５である。
【００７４】
好ましくは、感染症は、嚢胞性線維症（ＣＦ）；喘息；慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）；肺高血圧；肺がん；肺線維症；気管支拡張症；急性呼吸促迫症候群；結核；非結核性ミコバクテリア（ＮＴＭ）肺感染症；これらに限定されないが、人工呼吸器関連肺炎、市中感染性肺炎、気管支肺炎、大葉性肺炎を含む肺炎；細菌、例えば、シュードモナス属の種、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、クラミジア（Chlamydia）、マイコプラズマ肺炎（Mycoplasma pneumonia）、ブドウ球菌属の種、クレブシエラ属の種（Klebsiella spp）、大腸菌（E.coli）、ステノトロフォモナス属（Stenotrophomonas spp）、およびアスペルギルス（Aspergillus）、スケドスポリウム（Scedosporium）ならびにカンジダ属の種（Candida sp）を含む真菌による感染症；感染症が、例えば、挿管したもしくは人工呼吸器をつけている患者に生じ得る状態に対する予防的処置もしくは予防；肺移植患者における感染症；気管支炎；百日咳（百日咳）；内耳感染；連鎖球菌の喉感染症；肺炭疽；野兎病；または副鼻腔炎などの肺状態により引き起こされるか、またはこれらを引き起こすか、またはこれらに伴う。
【００７５】
好ましくは、キレート剤および／または抗生剤は、必要とする対象に、１日当たり約１回〜１日当たり約６回の間、より好ましくは１日当たり約２、３または４回投与される。
【００７６】
代わりに、キレート剤および／または抗生剤は、連続的な吸入を介して、ネブライザーを介して、必要とする対象に投与することができる。噴霧されるキレート剤および／または抗生剤は、８時間、６時間、４時間、２時間または１時間送達することができ、これら送達のそれぞれは、２４時間の期間以内に数回繰り返すことができる。
【００７７】
一実施形態では、吸入用キレート剤および抗生剤は、１日１、２、または３回次々に（すなわち逐次的に）投与されるか、または一緒に同時投与される。薬剤が同時投与される場合、２種の化合物は、投与直前に混合することができ、またはこれらの化合物は、内臓式調製物内の１つの均質の混合物として混和することができるが、ただし、物理的および化学的安定性は維持されるものとする。一実施形態では、吸入用キレート剤および抗生剤は１つの医薬製剤として混和され、吸入により対象に投与される。単一の医薬製剤および単一回の処置は、使いやすさを提供し、対象のより良いコンプライアンスをもたらす。
【００７８】
吸入用キレート剤および抗生剤の投与は、エアゾール剤デバイスまたはドライパウダー吸入器から噴霧されるか、または少なくとも１回の、好ましくは数回の「パフ」により通常投与される。例えば、対象は、１日にわたり単回投与、または数回の投与を受けることができる。
【００７９】
１日当たりの総用量は、少なくとも１日当たり１回または１日当たり２回好ましくは投与されるが、１日当たり３回またはそれより多くの投与に分割してもよい。一部の対象は、数日または数週の期間にわたるより高用量またはより頻繁な投与、これに続くより低い用量または維持量の投与で、対象に抗生剤および／またはキレート剤を「負荷する」期間により恩恵を受けることができる。嚢胞性線維症、ＣＯＰＤなどは通常慢性の状態であるため、対象は、長時間にわたりこのような療法を受けると予想されている。
【００８０】
薬物製剤の形態に関わらず、約０．１μｍ〜１２μｍ、または約０．２５μｍ〜６μｍ、好ましくは１μｍ〜６μｍ、より好ましくは約２μｍ〜４μｍの範囲の吸入用小滴または粒子を作り出すことが好ましい。代わりに、粒子は０．１μｍ〜１．０μｍ、０．２μｍ〜０．９μｍ、０．３μｍ〜０．８μｍ、０．４μｍ〜０．７μｍ、または０．５μｍであってよい。比較的に狭い範囲のサイズを有する吸入用粒子を作り出すことによって、ドラッグデリバリーシステムの効率をさらに増加させ、投薬の再現性を改善することが可能である。よって、粒子が０．１μｍ〜１２μｍまたは２μｍ〜６μｍまたは約３〜４μｍの範囲のサイズを有するだけでなく、平均粒径が狭い範囲内であることによって、対象に送達される粒子の８０％またはこれより多くが、平均粒径の±２０％、好ましくは平均粒径の±１０％、より好ましくは±５％の範囲内である粒子直径を有することが好ましい。
【００８１】
「粒径」は、固体粒子、液体粒子（小滴）の寸法を比較するために導入された概念である。小滴およびエアゾール剤に対して、「空気力学的径」および「空気動力学的質量中央粒子径（ＭＭＡＤ）」などの用語が使用される。定義は以下に与える。
【００８２】
「空気力学的径」とは、対象の粒子と同じ限界沈降速度を有する単位−密度球の直径である。呼吸器内でこのような粒子がどこに堆積するかを予測するために使用される。
【００８３】
「空気動力学的質量中央粒子径」は、幾何平均空気力学的径である。５０重量パーセントの粒子はＭＭＡＤより小さく、５０重量％の粒子はより大きい。
【００８４】
粒径測定の実験中、懸濁液は、動いている異なるサイズの無数の数の粒子を含有する。粒径測定機器がこれらの粒子を分析する場合、この機器は、粒子分布曲線を形成し、この曲線は、１ｎｍともなり得る最も小さな粒子から出発して、１００μｍともなり得る最も大きな粒子まで全粒径範囲を包含する。粒径分布曲線では、累積的頻度を粒子に対して計算する。Ｄ１０は、懸濁液中の１０％の数の粒子がこの特定の粒子直径より小さな直径または等しい直径を有するという特定の粒子直径を指す。
【００８５】
Ｄ５０：Ｄ１０と同様に、Ｄ５０は、製剤中の粒子集団の５０％に対するカットオフ直径であり、懸濁液中の５０％の粒子が、この特定の粒子直径より小さな直径または等しい直径を有するという特定の粒子直径を指す。
【００８６】
Ｄ９０：Ｄ９０は、製剤中の粒子集団の９０％に対するカットオフ直径であり、懸濁液中の９０％の粒子が、この特定の粒子直径より小さな直径または等しい直径を有するという特定の粒子直径を指す。
【００８７】
「呼吸器官」という用語は、呼吸において機能する細胞および器官の系を意味するとみなされるものとし、特に、呼吸器の器官、組織および細胞は、肺、鼻、鼻道、副鼻腔、上咽頭、喉頭、気管、気管支、細気管支、呼吸器の細気管支、肺胞管、肺胞嚢、肺胞、肺細胞（１型および２型）、繊毛粘膜上皮、粘膜上皮、扁平上皮細胞、肥満細胞、杯細胞、および上皮内樹状細胞を含む。
【００８８】
本発明の１つの形態では、治療有効量または予防有効量の吸入用抗生剤および治療有効量または予防有効量の少なくとも３７．５ｍｇ／日の吸入用キレート剤を、それぞれ１回または複数回の投与で投与することにより対象の肺内の細菌感染症を処置または予防する方法であって、キレート剤および／または抗生剤のその投与または各投与が８時間以下の期間にわたり投与される方法。
【００８９】
本発明の１つの形態では、治療有効量の吸入用抗生剤および治療有効量の少なくとも３７．５ｍｇ／日の吸入用キレート剤を、それぞれ１回または複数回の投与で投与することにより対象の肺内の細菌感染症を処置する方法であって、キレート剤および／または抗生剤のその投与または各投与が８時間以下の期間にわたり投与される方法。
【００９０】
本発明の１つの形態では、予防有効量の吸入用抗生剤および予防有効量の少なくとも３７．５ｍｇ／日の吸入用キレート剤を、それぞれ１回または複数回の投与で投与することにより対象の肺内の細菌感染症を予防する方法であって、キレート剤および／または抗生剤のその投与または各投与が８時間以下の期間にわたり投与される方法。
【００９１】
本発明の１つの形態では、対象の肺内の細菌感染症を処置または予防する方法は、このような処置を必要とする対象の肺内の細菌感染症を処置または予防することを含む。
【００９２】
「治療有効量」という用語は、本明細書で使用される場合、所望の投与レジメンに従い投与された場合、所望の治療効果を少なくとも部分的に達成する、あるいは感染症および／またはこれに伴う炎症の開始を遅延させる、または進行を阻害する、開始もしくは進行を部分的にもしくは完全に停止するのに十分な製剤の量を意味する。治療有効量は、感染症の開始を遅延する、または進行を阻害する、開始もしくは進行を部分的にもしくは完全に停止する、あるいは病原体微生物（複数可）の抗菌剤感受性を反転または部分的に反転させることをさらに包含し得る。
【００９３】
「予防有効量」という用語は、本明細書で使用される場合、所望の投与レジメンに従い投与された場合、微生物感染および／またはこれに伴う炎症を少なくとも部分的に予防する、またはその開始を遅延させるのに十分な製剤の量を意味する。
【００９４】
本明細書で使用される場合、「処置する」または「処置」は、疾患または状態を阻害すること、すなわち、その発症またはその臨床的または無症候性症状の少なくとも１つを止めるまたは低減させることを指す。「処置する」または「処置」は、疾患または状態を軽減すること、すなわち、疾患または状態またはその臨床的または無症候性症状の少なくとも１つの退縮を引き起こすことをさらに指す。処置することになる対象に対するメリットは、対象および／または医師にとって統計学的に有意であるか、または少なくとも知覚可能である。細菌感染症を処置する状況で、処置という用語は、細菌および／または細菌の増殖による定着を低減または排除することを含み、バイオフィルム形成を低減させるまたは現存するバイオフィルムを破壊することを含む。
【００９５】
上記に基づき、複数の異なる処置および投与の手段を使用して単一の対象を処置することができることは、当業者であれば理解している。よって、このような薬物、例えば、静脈内シプロフロキサシンまたは抗生剤などの投与をすでに受けている対象は、本発明の製剤の吸入から恩恵を受けることができる。一部の対象は、抗生剤と組み合わせて、少なくとも３７．５ｍｇ／日の吸入用キレート剤の投与を、吸入により受けることができる。このような対象は、嚢胞性線維症の症状を有してもよいし、肺感染症を有すると診断されていてもよいし、または少なくとも３７．５ｍｇ／日の吸入用キレート剤を抗生剤と組み合わせて対象に投与することから恩恵を受け得る症状である医学的状態の症状を有していてもよい。本発明はまた診断用に使用することもできる。一実施形態では、例えば、対象は、肺感染症を診断するための手順の一部として、キレート剤および／または抗生剤の投与を受けることができ、この場合、対象の症状の１つまたは複数が、キレート剤および／または抗生剤に応答して改善する。
【００９６】
［製剤］
吸入用製剤は吸入用のエアゾール剤または乾燥粉末形態、または吸入用の噴霧形態であってよい。好ましくは、製剤は肺内の感染症を処置または予防するための吸入に適応している。
【００９７】
キレート剤および抗生剤のそれぞれは、１つの単一製剤、または２つまたはそれより多くの別個の製剤で送達することができる。キレート剤および抗生剤のそれぞれは、例えば、ドライパウダー吸入器の数回のパフで送達することができる。
【００９８】
キレート剤および抗生剤は、１つの単一製剤、または２つの別個の製剤で送達することができる。製剤が別個である場合、製剤は一緒に（同時に）、または逐次的に摂取してもよい。２種の活性物質の製剤の送達の間に、数秒、数分、数時間または数日の一時的なずれがあってもよい。
【００９９】
本発明の組成物は、パファーにより（加圧された定量式吸入器、ドライパウダー吸入器）またはネブライザーにより送達することができる。組成物が１つのデバイス（すなわち、１つのデバイス内にキレート剤と抗生剤の両方）で提供されてもよいし、または２種の活性物質が２つの異なるデバイスから送達されてもよい。例えば、２種の活性物質は、各デバイス内に１種の活性物質を含んだ、２つの別個のパファーで、２つの別個のネブライザーで、またはパファーとネブライザーで送達されてもよい。
【０１００】
吸入用キレート剤および吸入用抗生剤は、酸性化亜硝酸の非存在下で提供することができる。
【０１０１】
一実施形態では、キレート剤はキレート剤のカルシウム塩である。好ましくは、キレート剤はＣａＥＤＴＡである。
【０１０２】
好ましくは、キレート剤は、３７．５ｍｇ／投与〜３００ｍｇ／投与の間、約７５ｍｇ／投与〜２００ｍｇ／投与の間、約７５ｍｇ／投与〜１００ｍｇ／投与の間、約５０ｍｇ／投与〜２００ｍｇ／投与の間；好ましくは約３７．５ｍｇ／投与、５０ｍｇ／投与、７５ｍｇ／投与、１００ｍｇ／投与、２００ｍｇ／投与または３００ｍｇ／投与を含有する吸入用投与形態で提供される。キレート剤は、少なくとも３７．５ｍｇ／投与を含有する吸入用投与形態で好ましくは提供される。
【０１０３】
１日当たり吸入されるキレート剤総量は、好ましくは約３７．５ｍｇ／日〜１，２００ｍｇ／日の間、約５０ｍｇ／日〜１，２００ｍｇ／日の間、約１００ｍｇ／日〜１，０００ｍｇ／日の間、約３００ｍｇ／日〜９００ｍｇ／日の間、約４００ｍｇ／日〜８００ｍｇ／日の間；好ましくは約３００ｍｇ／日、５００ｍｇ／日または６００ｍｇ／日、または少なくとも６００ｍｇ／日である。キレート剤は、約１，２００ｍｇ／日まで、好ましくは少なくとも３７．５ｍｇ／日の全用量を投与することができる。
【０１０４】
吸入用キレート剤は、１回の送達当たり、８時間、７時間、６時間、５時間、４時間、３時間、２時間、１時間、４５分、３０分、２０分、１５分、１０分または５分以下の期間にわたり好ましくは送達される。投与が乾燥粉末投与による場合、吸入用キレート剤は、数秒の期間、例えば、エアゾール剤デバイスまたはドライパウダー吸入器の「パフ」１回当たり１秒にわたり好ましくは送達され、各時間点で、１回または複数回のパフが投与される。
【０１０５】
例えば、５０ｍｇ投与のＣａＥＤＴＡは、４ｍＬの３３ｍＭ噴霧用溶液として投与することができる（分子質量Ｃ１０Ｈ１２ＣａＮ２Ｎａ２Ｏ８は２７４．２７ｇ／モルである）。同様に、７５ｍｇの投与が５０ｍＭで４ｍｌ投与されてもよいし、または１００ｍｇの投与が６６ｍＭで４ｍｌ投与されてもよい。
【０１０６】
好ましくは、抗生剤はトブラマイシンである。
【０１０７】
一実施形態では、抗生剤は、１０ｍｇ／投与〜５００ｍｇ／投与の間、約５０ｍｇ／投与〜４００ｍｇ／投与の間、約１００ｍｇ／投与〜４００ｍｇ／投与の間、約２００ｍｇ／投与〜３００ｍｇ／投与の間；好ましくは約１０ｍｇ／投与、２０ｍｇ／投与、３０ｍｇ／投与、５０ｍｇ／投与、２００ｍｇ／投与、２５０ｍｇ／投与、２００ｍｇ／投与または３００ｍｇ／投与を含有する吸入用投与形態で提供される。
【０１０８】
１日当たり吸入される抗生剤の総量は、好ましくは約１０ｍｇ／日〜２，０００ｍｇ／日の間、１０ｍｇ／日および１，０００ｍｇ／日、５０ｍｇ／日および２，０００ｍｇ／日、２５０ｍｇ／日および２，０００ｍｇ／日、約３００ｍｇ／日〜１，１００ｍｇ／日の間、約５００ｍｇ／日〜１，０００ｍｇ／日の間、約８００ｍｇ／日〜１，０００ｍｇ／日の間；好ましくは約２００ｍｇ／日、３００ｍｇ／日、５００ｍｇ／日、１，０００ｍｇ／日または１，２５０ｍｇ／日である。
【０１０９】
吸入用抗生剤の投与は、投与１回当たり、８時間、７時間、６時間、５時間、４時間、３時間、２時間、１時間、４５分、３０分、２０分、１５分、１０分、または５分以下の期間にわたり好ましくは投与される。投与が乾燥粉末送達による場合、吸入用抗生剤は、数秒の期間、例えば、エアゾール剤デバイスまたはドライパウダー吸入器の「パフ」１回当たり１秒にわたり好ましくは投与され、各時間点で、１回または複数回のパフが投与される。
【０１１０】
好ましくは、キレート剤および／または抗生剤は、必要とする対象に、１日当たり約１回〜１日当たり約６回の間、より好ましくは１日当たり約２回投与される。
【０１１１】
代わりに、キレート剤および／または抗生剤は、必要とする対象に、連続的な吸入を介して、ネブライザーを介して投与することができる。噴霧用製剤は、８時間、６時間、４時間、２時間または１時間送達することができ、これらの送達のそれぞれは、２４時間の期間以内に数回繰り返すことができる。
【０１１２】
本発明の製剤は、使い捨てパッケージおよび携帯用、手持ち式、電池式デバイス、例えば、ＡＥＲｘデバイスなどを使用して対象に投与することができる（米国特許第５，８２３，１７８号、Ａｒａｄｉｇｍ、Ｈａｙｗａｒｄ、Ｃａｌｉｆ．）。代わりに、本発明の製剤は、機械的（非電子）デバイスを使用して行うこともできる。従来のジェット式ネブライザー、超音波ネブライザー、ソフトミスト吸入器、ドライパウダー吸入器（ＤＰＩ）、定量式吸入器（ＭＤＩ）、凝縮エアゾール剤発生器、および他のシステムを含めた他の吸入デバイスを使用して製剤を送達することができる。
【０１１３】
エアゾール剤としての使用のため、本発明の化合物は、溶液または懸濁液中で、加圧したエアゾール剤容器に、従来のアジュバントと共に、適切な噴霧剤、例えば、プロパン、ブタン、またはイソブタンなどの炭化水素噴霧剤などと一緒に包装することができる。ドライパウダー吸入器は、極小容量に圧縮された医薬製剤の乾燥粉末粒子を生成する加圧した空気の供給源を用いて動作可能なシステムである。吸入のため、システムは、単回用量の医薬製剤および単回用量を放出するための選択要素をそれぞれ含有する複数のチャンバーまたはブリスタ−を有する。
【０１１４】
エアゾール剤は、膜の細孔に薬物を押し通すことにより作り出すことができ、この細孔は約０．２５〜６μｍの範囲のサイズを有する（米国特許第５，８２３，１７８号）。細孔がこのサイズを有する場合、細孔を介して脱出してエアゾール剤を作り出す粒子は、０．５〜１２μｍの範囲の直径を有することになる。薬物粒子は、粒子をこのサイズ範囲内に保つことを意図した気流と共に放出することができる。小粒子の生成は、約８００〜約４０００キロヘルツの範囲の振動周波数を提供する振動デバイスの使用により促進することができる。一部の調節は、パラメーター、例えば、薬物が放出される細孔のサイズ、振動周波数、圧力、および製剤の密度および粘度に基づく他のパラメーターなどにおいて行うことができることを、当業者であれば認識しているが、一部の実施形態の目的は約０．５〜１２μｍの範囲の直径を有するエアゾール化した粒子を提供することであることに留意されたい。
【０１１５】
［賦形剤］
本明細書に記載されている製剤の上記で例示された形態は、製剤科学の当業者に周知の方法で製造することができる。さらに、本明細書に記載されている製剤は、本明細書に記載されている製剤の製造および／または投与に役立つ他の任意選択の賦形剤を含むことができる。このような賦形剤の非限定的例は当技術分野で周知であり、製剤の製造および／または投与に役立つ、香味剤、着色剤、パラタント、抗酸化剤、粘度調整剤、等張化剤、薬物担体、持続放出剤、快適助長剤、乳化剤、可溶化補助剤、滑沢剤、結合剤および他の安定化剤を含む。
【０１１６】
好ましくは、本発明の製剤は滅菌である。別の実施形態では、本発明の製剤は安定している。
【０１１７】
さらに、緩衝剤を加えて、製剤のｐＨレベルを調節することができる。好ましくは、本発明の製剤は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ、これはＴＨＡＭとしても公知、またはトロメタミン）を緩衝剤として含有する。ＴＲＩＳは、ＥＤＴＡによる細菌死滅作用を増加させるさらなる作用を有し得る。好ましくは、ＴＲＩＳは、製剤を緩衝すること、細菌感染症の処置または予防におけるＥＤＴＡおよび／または抗生剤の有効性を増加させること、両方のために本発明の製剤に加える。
【０１１８】
さらに、本発明の製剤は、抗菌性保存剤を含有することができる。
【０１１９】
好ましくは、本発明の製剤のｐＨは、約６．５〜８．０の間、より好ましくは約７．０〜７．４の間である。細菌は、ｐＨが落下するほど、抗菌性療法に対する耐性が強くなることが以前に判明している。好ましいｐＨは、製剤、吸入用キレート剤および／または抗生剤に対する菌耐性を回避することを助ける。
【０１２０】
吸入用キレート剤および吸入用抗生剤は、酸性化亜硝酸の非存在下で提供することができる。
【０１２１】
１つの代替の実施形態では、本発明の製剤は保存剤、懸濁剤、湿潤剤、等張化剤および／または希釈剤を含み得る。本明細書に提供されている製剤は、吸入の際に生理学的に許容される、約０．０１％〜約９０％、または約０．０１％〜約５０％、または約０．０１％〜約２５％、または約０．０１％〜約１０％、または約０．０１％〜約５％の１種または複数種の薬理学的に適切な懸濁化流体を含むことができる。本明細書での使用に対して薬理学的に適切な流体は、これらに限定されないが、ヒドロキシル基または他の極性基を含有する化合物を含めた、これらに限定されないが、極性溶媒を含む。溶媒は、これらに限定されないが、水またはアルコール、例えば、エタノール、イソプロパノール、ならびにプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、グリコールエーテル、グリセロールおよびポリオキシエチレンアルコールを含むグリコールなどを含む。極性溶媒はまた、これらに限定されないが、水、１種または複数種の薬学的に許容される塩（複数可）を有する水性生理食塩水、アルコール、グリコールまたはこれらの混合物を含む、プロトン性溶媒を含む。１つの代替の実施形態では、本発明の製剤における使用のための水は、吸入用薬物における使用に対して適用可能な法的要求事項を満たすまたは超えるべきである。
【０１２２】
一実施形態では、本明細書に記載されている製剤は水性であって、０〜９０％の水を含有してもよい。他の実施形態では、本明細書に記載されている水性製剤は２０〜８０％の水を含有し得る。さらなる他の実施形態では、水性製剤は５０〜７０％の水を含有し得る。水は、淡水であり、蒸留させた、滅菌の、鉱質除去されたまたは脱イオン化された水をさらに含み得る。
【０１２３】
代わりに、製剤は、非水性であって、水を含有しないか、またはごくわずかな量の水を含有してもよい（例えば１％未満、０．１％未満、０．０１％未満）。
【０１２４】
一実施形態では、製剤は、１種または複数種の薬学的もしくは生理学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤をさらに含む。
【０１２５】
殺菌に加えてまたは殺菌の代わりに、本発明の製剤は微生物の夾雑の可能性を最小化するために薬学的に許容される保存剤を含有することができる。さらに、薬学的に許容される保存剤を本発明の製剤に使用して、製剤の安定性を増加させることができる。しかし、処置した組織は刺激剤に対して感受性があり得るので、吸入の安全性に対して任意の保存剤を選択しなければならないことに注目されたい。本明細書での使用に対して適切な保存剤は、これらに限定されないが、病原体の粒子との夾雑から溶液を保護するものを含み、フェニルエチルアルコール、塩化ベンズアルコニウムもしくは安息香酸、または安息香酸塩、例えば、安息香酸ナトリウムなどおよびフェニルエチルアルコールが含まれる。ある特定の実施形態では、本明細書の製剤は約０．００１％〜約１０．０％ｗ／ｗの塩化ベンズアルコニウム、または約０．０１％ｖ／ｗのフェニルエチルアルコールを含む。保存剤はまた、約０．００１％〜約１％、好ましくは約０．００２％〜約０．０２％、より好ましくは０．０２％ｗ／ｗの量で存在し得る。
【０１２６】
本明細書に提供されている製剤はまた、約０．００１％〜約９０％、または約０．００１％〜約５０％、または約０．００１％〜約２５％、または約０．００１％〜約１０％、または約０．００１％〜約１％の１種または複数種の乳化剤、湿潤剤、または懸濁剤を含んでもよい。本明細書の使用するためのこのような薬剤は、これらに限定されないが、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルまたはポリソルベート、例えば、これらに限定されないが、ポリエチレンモノオレイン酸ソルビタン（ポリソルベート８０）、ポリソルベート２０（ポリオキシエチレン（２０）モノラウリン酸ソルビタン）、ポリソルベート６５（ポリオキシエチレン（２０）トリステアリン酸ソルビタン）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミタート、ポリオキシエチレン（２０）モノステアリン酸ソルビタンを含めたもの；レシチン；寒天；カラギーナム；ローカストビーンガム；グアーガム；トラガント；アカシア；キサンタンガム；インドゴム；ペクチン；アミド化したペクチン；アンモニウムホスファチド；微結晶性セルロース；メチルセルロース；ヒドロキシプロピルセルロース；ヒドロキシプロピルメチルセルロース；エチルメチルセルロース；カルボキシメチルセルロース；脂肪酸のナトリウム、カリウムおよびカルシウム塩；脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリド；脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリドの酢酸エステル；脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリドの乳酸エステル；脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリドのクエン酸エステル；脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリドの酒石酸エステル；脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリドのモノアセチル酒石酸エステルおよびジアセチル酒石酸エステル；脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリドの混合した酢酸および酒石酸エステル；脂肪酸のスクロースエステル；スクログリセリド；脂肪酸のポリグリセロールエステル；ヒマシ油のポリ凝縮脂肪酸のポリグリセロールエステル；脂肪酸のプロパン−１，２−ジオールエステル；ナトリウムステアロイル−２１アクリレート（ａｃｔｙｌａｔｅ）；カルシウムステアロイル−２−ラクチレート；ステアロイル酒石酸塩；モノステアリン酸ソルビタン；トリステアリン酸ソルビタン；モノラウリン酸ソルビタン；モノオレイン酸ソルビタン；モノパルミチン酸ソルビタン；キラヤ抽出物；大豆油の二量体化脂肪酸のポリグリセロールエステル；酸化的重合した大豆油；およびペクチン抽出物を含む。
【０１２７】
本発明の製剤は、粘膜の乾燥を阻害し、刺激を予防するための約０．００１重量％〜約５重量％の保湿剤を含み得る。ソルビトール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロールまたはその混合物を含めた、様々な薬学的に許容される保湿剤のいずれも利用することができる。
【０１２８】
本発明の製剤は、気管支拡張剤、別の抗炎症剤、界面活性剤、アスピリン、またはエチルアルコールなどのアジュバントをさらに含み得る。
【０１２９】
本発明の製剤に場合によって使用されている気管支拡張剤は、これらに限定されないが、β２−アドレナリン受容体アゴニスト（例えば、アルブテロール、バンブテロール、サルブタモール、サルメテロール、ホルモテロール、アルホルモテロール、レボサルブタモール、プロカテロール、インダカテロール、カルモテロール、ミルベテロール、プロカテロール、テルブタリンなど）、および抗ムスカリン（例えば、トロスピウム、イプラトロピウム、グリコピロニウム、アクリジニウムなど）を含む。薬物の組合せを使用することができる。
【０１３０】
本発明の製剤に場合によって使用してもよい追加の抗炎症剤は、これらに限定されないが、吸入用コルチコステロイド（例えば、ベクロメタゾン、ブデソニド、シクレソニド、フルチカゾン、エチプレドノール、モメタゾンなど）、ロイコトリエン受容体アンタゴニストおよびロイコトリエン合成阻害剤（例えば、モンテルカスト、ジレウトン、イブジラスト、ザフィルルカスト、プランルカスト、アメルバント、タイペルカストなど）、シクロオキシゲナーゼ阻害剤（例えば、イブプロフェン、ケトプロフェン、ケトロラック、インドメタシン、ナプロキセン、ザルトプロフェン、ロルノキシカム、メロキシカム、セレコキシブ、ルミラコキシブ、エトリコキシブ、ピロキシカム、アンピロキシカム、シンノキシカム、ジクロフェナク、フェルビナク、ロルノキシカム、メサラジン、トリフルサール、チノリジン、イグラチモド、パミコグレルなど）を含む。薬物の組合せを使用することができる。抗炎症剤として作用するアスピリンもまた加えることができる。
【０１３１】
抗酸化剤、例えば、グルタチオンおよびビタミンＥ、亜鉛およびＥＤＴＡの亜鉛塩などを加えることができる。
【０１３２】
本発明により包含される界面活性剤は、これらに限定されないが、合成界面活性剤（Ｅｘｏｓｕｒｆ（登録商標））、ジパルミトイルホスファチジルコリンおよびオレイン酸を含む。薬物の組合せを使用することができる。
【０１３３】
エチルアルコール蒸気は、肺内で消泡剤として作用し、痰をより液状化させ、これによって、呼吸を補助し、肺浮腫を低減させることができる。エタノールを本発明の製剤に、０．５％〜６０％の間、より好ましくは１〜４０％の間、１〜２０％の間、または１〜１０％の間になるように加えることができる。エタノールを、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％または６０％になるように加えることができる。
【０１３４】
本発明はまた、吸入用抗生剤と組み合わせて使用される吸入用キレート剤の使用であって、少なくとも３７．５ｍｇ／日の吸入用キレート剤が送達され、キレート剤および／または抗生剤のその投与または各投与が、吸入を介して投与される他の薬物とさらに組み合わせて、８時間以下の期間にわたり投与される使用に関する。これら他の薬物は、適切な送達ベクター、例えば、プラスミドまたはウイルスベクターなどに組み込まれてもよいヌクレオチド配列を含むことができる。他の薬物は、治療用ヌクレオチド配列（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）、粘液の粘弾性を低減させる酵素、例えば、ＤＮａｓｅおよび他の粘液溶解剤など、塩素イオンチャネルを上方調節するもしくは細胞を横断するイオンの流動を増加させる化学物質、ニコチン、Ｐ２Ｙ２アゴニスト、例えば、α−１アンチトリプシン（ＡＡＴ）を含むエラスターゼ阻害剤、Ｎ−アセチルシステイン、抗生剤およびカチオン性ペプチド、例えば、ランチビオティック、具体的には、デュラマイシン、短時間作用性気管支拡張剤（例えば、β２−アドレナリン受容体アゴニスト様アルブテロールまたはインダカテロール）、Ｍ３ムスカリンアンタゴニスト（例えば、イプラトロピウム臭化物）、Ｋ＋−チャネルオープナー、長時間作用性気管支拡張剤（例えば、ホルモテロール、サルメテロール）、ステロイド（例えば、ブデソニド、フルチカゾン、トリアムシノロン、ベクロメタゾン、シクレソニドなど）、キサンチン、ロイコトリエンアンタゴニスト（例えば、モンテルカストナトリウム）、ホスホジエステラーゼ４阻害剤、アデノシン受容体アンタゴニスト、他の様々な抗炎症剤（例えば、Ｓｙｋキナーゼ阻害剤（ＡＶＥ−０９５０）、トリプターゼ阻害剤（ＡＶＥ−８９２３およびＡＶＥ−５６３８）、タキキニンアンタゴニスト（ＡＶＥ−５８８３）、誘導性一酸化窒素シンターゼ阻害剤（ＧＷ−２７４１５０）およびその他）、転写因子デコイ、ＴＬＲ−９アゴニスト、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ＤＮＡ、ＣＧＲＰ、リドカイン、逆β２−アゴニスト、抗感染酸化治療法、サイトカインモジュレーター（例えば、ＣＣＲ３受容体アンタゴニスト（ＧＳＫ−７６６９９４、ＤＰＣ−１６８、ＡＺＤ−３７７８）、ＴＮＦ−α産生阻害剤（ＬＭＰ−１６０およびＹＳ−ＴＨ２）、ならびにＩＬ−４アンタゴニスト（ＡＶＥ−０３０９））、ＩｇＥの小分子阻害剤、細胞接着分子（ＣＡＭ）阻害剤、小分子を標的とするＶＬＡ４受容体もしくはインテグリン．アルファ．４．β．１（例えば、Ｒ−４１１、ＰＳ−４６０６４４、ＤＷ−９０８ｅおよびＣＤＰ−３２３）、カルシニューリンの阻害によりＴ細胞シグナル伝達を遮断するものを含む免疫調節物質（タクロリムス）、ヘパリン中和剤（タラクトフェリンα）、サイトゾルのＰＬＡ２阻害剤（Ｅｆｉｐｌａｄｉｂ）、またはその組合せであってよい。必要とする対象がＣＦを有する場合、対象にはまた、標準的な実施に従い、本発明の製剤と組み合わせて、標準的薬物、例えば、イバカフトル、プルモザイム、マンニトールなど、または他の承認薬物も投与することができる。
【０１３５】
組合せ生成物の送達は、薬物を合わせて１つの安定した製剤にする、または投与の時点で合わせることになる別個の容器内の薬物を提供する、または代わりに逐次的に生成物を送達することにより達成することができる。
【０１３６】
好ましくは、本発明の製剤は安定している。本明細書で使用される場合、本明細書に提供されている製剤の安定性とは、所与の温度で、原薬、例えば、キレート剤および抗生剤の最初の量の少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％が製剤中に存在する時間の長さを指す。例えば、本明細書に提供されている製剤は、約１５℃〜約３０℃の間で貯蔵されてもよく、少なくとも１、２、１２、１８、２４または３６カ月の間依然として安定している。また、製剤は、２５℃での、１、２、１２、１８、２４または３６カ月超の貯蔵後、必要とする対象への投与に対して適切となり得る。また、別の代替の実施形態では、Ａｒｒｈｅｎｉｕｓ速度論を使用して、約１５℃〜約３０℃の間での１、２、１２、１８、２４または３６カ月超の製剤の貯蔵後も、原薬（例えば、キレート剤および抗生剤）の最初の量の８０％超、または８５％超、または９０％超、または９５％超が残存する。
【０１３７】
本明細書で使用される場合、製剤が「長期貯蔵」の間安定しているという記述は、製剤が２５℃において少なくとも１、２または３カ月の利用時間の、予測された貯蔵寿命および５℃において少なくとも１、２または３年の貯蔵時間またはこれと等しい貯蔵時間を有する場合、製剤はそれを必要とする対象への投与に対して適切であることを意味する。本明細書のある特定の実施形態では、Ａｒｒｈｅｎｉｕｓ速度論を使用して、このような貯蔵後、＞８０％または＞８５％または＞９０％または＞９５％のキレート剤および抗生剤は残存することが予測される。
【０１３８】
「感染症」という用語は、本明細書で使用される場合、微生物による定着および／または微生物、特に、細菌の増殖を意味する。細菌は、グラム陰性、例えば、シュードモナス属のメンバーなど、またはグラム陽性、例えば、黄色ブドウ球菌などであってもよい。感染症は明白ではなかったり、または局所的な細胞損傷をもたらしたりすることもある。感染症は、局所的で、無症候性であることもあり、一時的にまたは代わりに、拡大して拡散することにより、急性または慢性の臨床感染にもなり得る。感染症はまた、緑膿菌の嫌気性増殖に伴うタンパク質からの残余抗原、または代わりに緑膿菌タンパク質のタンパク質またはそこからのペプチドから単離するために結合する反応性宿主抗体が宿主内に残存する過去の感染症でもあり得る。感染症はまた、微生物は対象内に存在するが、対象がこの生物に伴う疾患の症状を示さない潜在的感染症でもあり得る。好ましくは、感染症は呼吸器感染症であり、好ましくは、緑膿菌で引き起こされる呼吸器感染症である。
【０１３９】
［医薬を製造するための方法］
本発明は、感染症の処置のための医薬を製造するための吸入用キレート剤の使用であって、吸入用キレート剤が吸入用抗生剤と組み合わせて使用され、少なくとも３７．５ｍｇ／日の吸入用キレート剤が送達され、キレート剤および／または抗生剤のその投与または各投与が８時間以下の期間にわたり投与される使用を提供する。
【０１４０】
本発明は、感染症の処置のための医薬を製造するための吸入用抗生剤の使用であって、吸入用抗生剤が吸入用キレート剤と組み合わせて使用され、少なくとも３７．５ｍｇ／日の吸入用キレート剤が送達され、キレート剤および／または抗生剤のその投与または各投与が８時間以下の期間にわたり投与される使用を提供する。
【０１４１】
本発明は、感染症の処置のための医薬を製造するための吸入用キレート剤および吸入用抗生剤の使用であって、少なくとも３７．５ｍｇ／日の吸入用キレート剤が送達され、キレート剤および／または抗生剤のその投与または各投与が８時間以下の期間にわたり投与される使用を提供する。好ましくは、医薬は酸性化亜硝酸を含有しない。
【０１４２】
好ましくは、キレート剤は、３７．５ｍｇ／日〜１，２００ｍｇ／日の間までの全用量が毎日１〜４回の間投与される。好ましくは、キレート剤は、１時間以下の期間にわたり投与される。好ましくは、キレート剤はＣａＥＤＴＡである。
【０１４３】
好ましくは、抗生剤は、約１０ｍｇ／日〜２，０００ｍｇ／日の間、好ましくは１，０００ｍｇ／日までの全用量が毎日１〜４回の間投与される。好ましくは、抗生剤を含有する製剤は、１時間以下の期間にわたり投与される。好ましくは、抗生剤はトブラマイシンである。
【０１４４】
［キット］
本発明は、（ｉ）少なくとも３７．５ｍｇの吸入用キレート剤と、（ｉｉ）使用のための指示であって、少なくとも３７．５ｍｇ／日の吸入用キレート剤が吸入用抗生剤と共に送達され、キレート剤および／または抗生剤のその投与または各投与が８時間以下の期間にわたり投与されることを定める指示とを含有する、対象の肺内の細菌感染症を処置または予防するためのキットを提供する。
【０１４５】
本発明は、（ｉ）吸入用抗生剤と、（ｉｉ）使用のための指示であって、抗生剤が少なくとも３７．５ｍｇ／日の吸入用キレート剤と共に送達され、キレート剤および／または抗生剤のその投与または各投与が８時間以下の期間にわたり投与されることを定める指示とを含有する、対象の肺内の細菌感染症を処置または予防するためのキットを提供する。
【０１４６】
本発明は、（ｉ）少なくとも３７．５ｍｇの吸入用キレート剤および吸入用抗生剤と、（ｉｉ）使用のための指示であって、少なくとも３７．５ｍｇ／日の吸入用キレート剤が送達され、キレート剤および／または抗生剤のその投与または各投与が８時間以下の期間にわたり投与されることを定める指示とを含有する、対象の肺内の細菌感染症を処置または予防するためのキットを提供する。
【０１４７】
好ましくは、吸入用キレート剤および／または吸入用抗生剤は、酸性化亜硝酸の非存在下で提供される。
【０１４８】
好ましくは、キレート剤は、毎日１〜４回の間、３７．５ｍｇ／日〜１，２００ｍｇ／日の間までの全用量が投与される。好ましくは、キレート剤は、１時間以下の期間にわたり投与される。好ましくは、キレート剤はＣａＥＤＴＡである。
【０１４９】
好ましくは、抗生剤は、毎日１〜４回の間、約１０ｍｇ／日〜２，０００ｍｇ／日の間、好ましくは１，０００ｍｇ／日までの全用量が投与される。好ましくは、抗生剤を含有する製剤は、１時間以下の期間にわたり投与される。好ましくは、抗生剤はトブラマイシンである。
【０１５０】
キレート剤および／または抗生剤は予め測定され、プレミックスされ、および／または予め包装されていてもよい。好ましくは、吸入溶液は滅菌されている。
【０１５１】
本発明のキットはまた、ユーザーコンプライアンスを促進するように設計された指示を含み得る。指示とは、本明細書で使用される場合、任意のラベル、添付文書などを指し、包装材料の１つもしくは複数の表面上に配置してもよいし、または指示は別個のシート上、もしくはその任意の組合せで提供することができる。例えば、一実施形態では、本発明のキットは、本発明の製剤を投与するための指示を含む。一実施形態では、指示は、本発明の製剤が肺感染症の処置に対して適切であることを示す。このような指示はまた、製剤についての指示、ならびにネブライザーまたはドライパウダー吸入器を介した投与についての指示も含み得る。
【０１５２】
吸入用キレート剤および抗生剤は、必要に応じて、医師またはユーザーがそれぞれを医薬製剤に製剤化することができるよう個々に包装することができる。代わりに、吸入用キレート剤および抗生剤を含む医薬製剤を一緒に包装することができ、よって、医師またはユーザーによるデミニマス製剤が必要となる。いずれにしても、包装は、活性成分の化学的、物理的、および見た目に美しい統合性を維持すべきある。
【０１５３】
［通則］
当業者であれば、本明細書に記載されている本発明は、具体的に記載されているもの以外の変更形態および修飾形態の可能性があることを認識している。本発明は、すべてのこのような変更形態および修飾形態を含む。本発明はまた、明細書において言及されたまたは示されたステップ、特徴、製剤および化合物のすべてを、個々にまたは総合的に、ならびにいずれかのおよびすべての組合せまたはいずれか２つのもしくはそれより多くのステップまたは特徴を含む。
【０１５４】
本テキストに引用された各文書、参考文献、特許出願または特許は、それら全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれており、これは、それがリーダーによりこのテキストの一部として読み取られ、考えられるべきであることを意味する。本テキストで引用された文書、参考文献、特許出願または特許が本テキストで繰り返されていないということは、単に簡潔さの理由によるものである。
【０１５５】
本明細書中に記述されている任意の製品に対するまたは本明細書で参照により組み込まれている任意の文書における、任意の製造業者の指示、説明、製品明細書、および製品シートは、本明細書によって参照により本明細書に組み込まれ、本発明の実施において利用することができる。
【０１５６】
本発明は、本明細書に記載されている特定の実施形態のいずれかによっても、範囲が限定されないものとする。これらの実施形態は、例証のみの目的を意図する。機能的に同等の製品、製剤および方法は明確に、本明細書に記載されているように本発明の範囲内である。
【０１５７】
本明細書に記載されている本発明は、１つまたは複数の範囲の値（例えば、サイズ、置換および磁界の強さなど）を含むことができる。値の範囲とは、範囲内のすべての値を含むと考えられ、これには、その範囲を定義する値、および範囲に対する境界を定義する値に直ちに隣接する値と同じまたは実質的に同じ結果をもたらす範囲に隣接する値が含まれる。したがって、特にそれとは反対の指示がない限り、明細書および特許請求の範囲に記載の数値的パラメーターは、本発明により得ようとされる所望の特性に応じて変動し得る近似値である。したがって「約８０％」とは、「約８０％」、さらに「８０％」も意味する。少なくとも、各数値的パラメーターは、有効桁数および普通の四捨五入手法を踏まえて解釈されるべきである。
【０１５８】
本明細書全体にわたり、文脈により他が必要とされない限り、単語「含む（comprise）」または変化形、例えば、「含む（comprises）」または「含んでいる（comprising）」は、述べられている整数または整数の群の包含を意味すると考えられているが、任意の他の整数または整数の群を排除するものではない。本開示および特に特許請求の範囲および／または段落の中で、「含む（comprises）」、「含んだ（comprised）」、「含んでいる（comprising）」などの用語は、米国特許法に帰属する意味を有することができる。例えば、これらは、「含む（includes）」、「含まれた（included）」、「含んでいる（including）」などを意味することができ、「本質的に〜からなっている（consisting essentially of）」および「本質的に〜からなる（consists essentially of）」などの用語は米国特許法に帰する意味を有し、例えば、これらは、明示的に列挙されていない要素を許容するが、従来の技術に見出される、または本発明の基本的もしくは新規の特徴に影響を与える要素を排除することにも注目されたい。
【０１５９】
本明細書で使用されている、選択された用語に対する他の定義は、発明の詳細な説明の中に見出すことができ、全体にわたり適用される。他に定義されない限り、本明細書で使用されているすべての他の科学用語および技術用語は、本発明が属する分野の当業者により共通して理解されているものと同じ意味を有する。「活性剤」という用語は、１種の活性剤を意味してもよいし、または２種もしくはそれより多くの活性剤を包含してもよい。
【０１６０】
以下の実施例は、上に記載された発明を使用する方式をより完全に記載するよう、ならびに本発明の様々な態様を実行するために想定される最も良いモードを記載するように機能する。これらの方法は、本発明の真の範囲を限定するように機能するわけでは決してなく、むしろ例示的目的のために提示されていることを理解されたい。
【実施例】
【０１６１】
本発明のさらなる特徴は、以下の非限定的例においてより完全に説明される。この説明は、本発明を例証する目的のためだけに含まれている。上記に提示されているような本発明の広範な説明に対する制限として理解されるべきではない。
【０１６２】
［抗生剤およびアジュバントのマイクロプレート試験］
増殖法１：各ウェルに、緑膿菌株ＷＡＣＣ９１の一晩培養物２００μＬを播種することにより、ポリスチレン９６−ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）内の、アルギニンおよびＭｇＳＯ４を補充したＭ９媒体中で細胞を増殖させ、３７℃で２４時間インキュベートした。
【０１６３】
増殖法２：グルコース（０．５％ｗ／ｖ）、カザミノ酸（０．２％ｗ／ｖ）およびＭｇＳＯ４（１ｍＭ）を補充したＭ６３媒体中で、緑膿菌の関連株の一晩培養物を３５℃で振盪しながら増殖させた。示されているような抗生剤およびアジュバントの段階希釈と共に、Ｍ６３を含有する９６−ウェルマイクロプレートを、最終容量２００μｌ中でＯＤ６００ｎｍ０．０１に植菌した。プレートは、振盪なしで、３５℃で一晩インキュベートした。
【０１６４】
酸素を除去するために、嫌気性サシェ剤と共に、嫌気性培養物を密閉チャンバー内でインキュベートした。
【０１６５】
浮遊性増殖を、ＯＤ読み取りまたはプレートカウンティングによりモニターした。４０μｌの結晶バイオレット染料（水中１％ｗ／ｖ）を用いて１０分間室温で染色し、２５０μｌの水で２回洗浄し、染料を２５０μｌの５０％エタノールに溶解し、光学密度を５９５ｎｍで読み取ることにより、バイオフィルムを定量化した。
【０１６６】
記載されているように細胞を増殖させ、ピペット操作により浮遊性細胞を除去することにより、バイオフィルムの破壊または死滅をモニターした。付着したバイオフィルムを滅菌ＰＢＳで３回慎重に洗浄し、治療薬（トブラマイシン単独で、または溶液中ＣａＮａ２ＥＤＴＡ、トリス緩衝液と一緒に、または乾燥粉末粒子として）を含有する新鮮培地を加えた。プレートをさらに２４時間インキュベートし、代謝活性を測定した。バイオフィルムを上に記載されているように洗浄し、次いで０．０２％ｗ／ｖのレサズリンを含有する新鮮培地を加えた。プレートを素早く振盪させて、混合し、次いで３７℃で２時間インキュベートした。レサズリンのレサフリンへの変換により反映される代謝活性を、励起波長５３０ｎｍ、検出５９０ｎｍでの蛍光の増加を測定することにより評価した。
【０１６７】
以下の変更とは別に、増殖法１を使用して他の種のチェッカーボード式アッセイを行った。バークホルデリアセパシアを３０℃でインキュベートし、他の細菌を３７℃でインキュベートした。化膿連鎖球菌および肺炎連鎖球菌をＴｏｄｄ  Ｈｅｗｉｔｔ  Ｂｒｏｔｈ中で増殖させ、黄色ブドウ球菌をＶｅａｌ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  Ｂｒｏｔｈ中で増殖させた。
【０１６８】
［実施例１］
高濃度のキレート剤は、緑膿菌浮遊性細胞およびバイオフィルムに対するトブラマイシンの効力を増強する
ＥＤＴＡは、ずっと低い濃度の抗生剤に対して細菌が感受性を有するようにすることができる。緑膿菌ＷＡＣＣ９１の細胞を方法１に従い増殖させて、異なる濃度のトブラマイシンおよびＣａＥＤＴＡに対してチェッカーボード式アッセイで試験した。
【０１６９】
図１は、有酸素性条件で増殖させた緑膿菌浮遊性細胞に対して、ＣａＥＤＴＡが、トブラマイシンのＭＩＣを引き下げ、この作用がトリス緩衝により増強されることを示している。図２は、ＣａＥＤＴＡが緑膿菌バイオフィルム形成を遮断するのに必要なトブラマイシンの濃度を引き下げることを示している。多くの抗生剤は、代謝がより遅いことが原因で、嫌気性条件下での働きが非常に乏しい。これは、嚢胞性線維症を有する患者の慢性肺感染症における際だった難題であり、この場合、細菌はトラップされた気道粘液の嫌気性ポケットの内側にバイオフィルムを形成する。図３および４は、図１および２に見られる作用が嫌気性条件下で、特に緩衝型ＣａＥＤＴＡに対して維持されることを実証している。
【０１７０】
下位ＭＩＣ濃度において、トブラマイシンおよび他の抗生剤が緑膿菌におけるバイオフィルム形成を実際に増加させることは、過去の刊行物から知られている（Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｌ．Ｒ．、Ｄ’Ａｒｇｅｎｉｏ，Ｄ．Ａ．、ＭａｃＣｏｓｓ，Ｍ．Ｊ．、Ｚｈａｎｇ，Ｚ．、Ｊｏｎｅｓ，Ｒ．Ａ．およびＭｉｌｌｅｒ，Ｓ．Ｉ．（２００５年）。「Ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｂｉｏｆｉｌｍ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．」Ｎａｔｕｒｅ、４３６巻、１１７１〜１１７５頁；Ｊｏｎｅｓ，Ｃ．、Ａｌｌｓｏｐｐ，Ｌ．、Ｈｏｒｌｉｃｋ，Ｊ．、Ｋｕｌａｓｅｋａｒａ，Ｈ．およびＦｉｌｌｏｕｘ，Ａ．（２０１３年）「Ｓｕｂｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｋａｎａｍｙｃｉｎ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｔｈｅ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ｔｙｐｅ  ＶＩ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ」ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ８、ｅ８１１３２．）。図５は、実際にトブラマイシン単独に対する事例であるが、ＣａＥＤＴＡを加えると、作用は反転し、有酸素性条件と嫌気性条件の両方で浮遊性およびバイオフィルム成長が低減することを示している。新規バイオフィルムの形成を予防することに加えて、図６は、代謝活性で測定した場合、ＣａＥＤＴＡが現存する緑膿菌バイオフィルムに対するトブラマイシンの効力を増加させることをさらに示している。
【０１７１】
［実施例２］
高濃度のキレート剤は、緑膿菌に対する一連の異なる抗生剤の抗菌効力を増強する
過去の実施例に見られる作用は、アミノグリコシドクラスの抗生剤に属する抗生剤トブラマイシンに特異的ではない。方法２に従い細胞を増殖させ、緩衝型ＣａＥＤＴＡおよび一連の臨床的に関連する、異なる作用形態を有する、異なるクラスの抗生剤を用いてチャレンジした。図７〜１２は、緩衝型ＣａＥＤＴＡが、抗生剤メチシリン（ベータラクタム、図７）、カルベニシリン（カルボキシペニシリン、図８）、テトラサイクリン（テトラサイクリン、図９）、アズトレオナム（モノバクタム；製品Ａｚａｃｔａｍ、図１０）、エリスロマイシン（マクロライド、図１１）、およびコリスチン（ポリミキシン、図１２）の、示されているような緑膿菌浮遊性細胞およびバイオフィルムの感受性を増加させることを示している。
【０１７２】
［実施例３］
異なるキレート剤は、緑膿菌に対するトブラマイシンの効力を増強する
過去の実施例で観察されたように、抗生剤感受性に対するキレート化の作用は、キレート剤ＥＤＴＡに限定されるものではない。方法２に従い細胞を増殖させ、異なる濃度のトブラマイシンでチャレンジした。図１３および１４は、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）およびジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）もまた、ＥＤＴＡに対して観察されたものと同様の濃度依存性方式で、緑膿菌に対するトブラマイシンのＭＩＣを低減させることを示している。
【０１７３】
［実施例４］
高濃度のキレート剤は、様々な細菌性種に対する抗生剤の効力を増強する
キレート剤によって抗生剤に対し細菌が感受性になるのは、緑膿菌に特異的なことではなく、様々な他の細菌性種に対して実証されている。図１５〜２１は、ヒトにおいて肺感染症を引き起こすことが知られている異なる種の細菌が、緩衝型ＣａＥＤＴＡの存在下で臨床的に関連する抗生剤に対して感受性になることを示している。この作用はグラム陰性細菌とグラム陽性細菌の両方に見られ、多くの場合、非常に異なる抗菌剤に応答する。
【０１７４】
バークホルデリアセパシアは、嚢胞性線維症を有する患者において重篤な呼吸器感染を引き起こす可能性があるグラム陰性細菌である（Ｓｉｌｖａ  Ｆｉｌｈｏ，Ｌ．Ｖ．、Ｆｅｒｒｅｉｒａ  Ｆｄｅ，Ａ．、Ｒｅｉｓ，Ｆ．Ｊ．、Ｂｒｉｔｔｏ，Ｍ．Ｃ．，Ｌｅｖｙ、Ｃ．Ｅ．，Ｃｌａｒｋ、Ｏ．およびＲｉｂｅｉｒｏ，Ｊ．Ｄ．（２０１３年）「Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ：ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｒｅｇａｒｄｉｎｇ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｍｐａｃｔ、ｄｉａｇｎｏｓｉｓ、ａｎｄｔｒｅａｔｍｅｎｔ．」Ｊ  Ｂｒａｓ  Ｐｎｅｕｍｏｌ、３９巻、４９５〜５１２頁）。図１５および１６は、２つの異なるクラスの抗生剤、すなわちトブラマイシン（アミノグリコシド）およびシプロフロキサシン（フルオロキノロン）に対するセパシア菌のＭＩＣが緩衝型ＣａＥＤＴＡの存在下で引き下げられることを示している。図１７は、別のグラム陰性の肺の病原体である肺炎桿菌の浮遊性細胞（図１７Ａ）およびバイオフィルム（図１７Ｂ）が、緩衝型ＣａＥＤＴＡの存在下で、抗生剤コリスチンに対して感受性になることを示している。
【０１７５】
グラム陽性細菌に対して、図１８〜２１は、緩衝型ＣａＥＤＴＡの存在下で、テトラサイクリンに対する化膿連鎖球菌（図１８）、バンコマイシンに対する黄色ブドウ球菌ＭＲＳＡ（図１９）、ならびにシプロフロキサシンに対するＭＳＳＡ（図２０）およびＭＲＳＡ（図２１）の浮遊性細胞およびバイオフィルムに対するＭＩＣ値の低減を示している。
【０１７６】
［実施例５］
高濃度のキレート剤は抗生剤による細菌の死滅を増加させる
過去の実施例は、キレート剤が、単独での抗生剤の濃度より低い抗生剤の濃度で、浮遊性細胞およびバイオフィルムの成長を阻止できることを実証している。これは、恐らく抗生剤による死滅の増加の結果である。チャレンジ微生物を固体寒天上で増殖させ、０．９％塩化ナトリウム（ＳＣＩ）中に懸濁させて、チャレンジ懸濁液を作り出した。次いで、およそ１×１０８コロニー形成単位を含有する、０．１ｍＬアリコートのチャレンジ懸濁液を、示されているような適当な抗生剤または抗生剤とキレート化剤を有する１０ｍＬのＣａｔｉｏｎ−Ａｄｊｕｓｔｅｄ  Ｍｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎ  Ｂｒｏｔｈ（ＣａＭＨＢ）に植菌し、十分に混合した。次いで、チャレンジ懸濁液／抗生剤混合物を３５℃で曝露時間の間インキュベートした。各時間点において、０．１ｍＬアリコートを取り出し、プロダクト中和剤を有する９．９ｍＬのＢｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄリン酸緩衝液に入れ、ボルテックスにより十分に混合し、適当な寒天を使用してプレーティングした。手動計数器を使用して回収したコロニーを数えた。
【０１７７】
図２１は、セフタジジムによる緑膿菌の死滅が、緩衝型ＣａＥＤＴＡの存在下でずっと急速になることを示している。図２２はセパシア菌に対するメロペネムの同様の作用を示している。
【０１７８】
［実施例６］
高濃度の噴霧用または乾燥粉末キレート剤は、現実的な条件で成長させた緑膿菌バイオフィルムに対してトブラマイシンによる死滅を増強させる
吸入用治療薬の製剤は噴霧溶液および乾燥粉末を含む。乾式粉砕によりＣａＥＤＴＡ乾燥粉末を調製して、標準的デリバリーデバイスにより分散させることができるサブミクロンサイズの粒子を生成した。
【０１７９】
上皮細胞株から収集した嚢胞性線維症粘液の懸濁液滴を使用して、現実的なｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおいてバイオフィルムを成長させた（Ｈａｌｅｙ，Ｃ．Ｌ．、Ｃｏｌｍｅｒ−Ｈａｍｏｏｄ，Ｊ．Ａ．およびＨａｍｏｏｄ，Ａ．Ｎ．（２０１２年）「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｆｉｌｍ−ｌｉｋｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｆｏｒｍｅｄ  ｂｙ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ｉｎ  ａ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｍｕｃｕｓ  ｍｅｄｉｕｍ」ＢＭＣ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１２巻、１８１頁）。緑膿菌臨床株（ＭＩＣトブラマイシン＞２５６μｇ／ｍｌ）の培養物は、栄養素制限を模倣する炭素源なしで、Ｍ６３中で増殖させて後期静止相に移行させた。
【０１８０】
数滴の粘液（５μｌ）を反転させたＩＢＩＤＩカバースリップから懸濁させ、１０３  ｃｆｕを植菌し、次いで、加湿環境で、３５℃で７２時間インキュベートして、バイオフィルムを発生させた。次いで、液滴を、噴霧用トブラマイシン（２０ｍｇ／ｍｌ）、エアゾール化ＥＤＴＡ粒子（１０ｍｇ／ｍｌ）のいずれか、または両方で、５分間処理した。対照を噴霧用０．９％生理食塩水／水の５０／５０溶液で処理した。処理後、液滴を１６時間インキュベートし、次いでＢａｃＬｉｇｈｔ  ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（１μｌ）で染色し、パラホルムアルデヒド蒸気で３０分間固定した。共焦点顕微鏡を使用して、バイオフィルムを視覚化した。
【０１８１】
図２４Ａは、噴霧用生理食塩水での処理後の、大部分生細胞（グリーン）を有する、厚いおよび強力なバイオフィルムを示している。耐性株で予想された通り、トブラマイシン単独での処理は生存率に対する作用がわずかである。ＣａＥＤＴＡ単独で、ある程度の死滅（赤血球）を引き起こす。トブラマイシンおよびＣａＥＤＴＡの組合せは、際立ってバイオフィルム細胞の大部分を死滅させている。図２４１Ｂは、図２４Ａの顕微鏡法画像の定量的表示を示す。対照バイオフィルムは１×１０８コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍｌであったが、ＥＤＴＡ−トブラマイシン処理したバイオフィルムは、＞６桁低減させ、＜１０２ＣＦＵ／ｍｌまで低減させた。
【０１８２】
アミノグリコシド抗生剤は低い治療指数を有し、これは、治療作用と毒性作用との間に狭い治療域が存在することを意味し、トブラマイシンの場合、腎毒性および聴器毒性を含む。高いピーク濃度を達成するための肺への直接のドラッグデリバリーはまた、肺機能が低減した患者には特に困難となり得る。これは、多くの場合、抑制濃度以下の抗生剤での処置につながり、これにより感染細菌の耐性株が選択される。
【０１８３】
［実施例７］
高用量の吸入用キレート剤は、ＣＦ肺における緑膿菌感染症を低減させる
症状増悪により入院した、年齢≧６才のＣＦを有する患者を、無作為抽出して、静脈内抗生剤および噴霧用トブラマイシンによるこれらの通常処置に加えてＥＤＴＡまたは生理食塩水（プラセボ）を投与する。ＥＤＴＡを、トブラマイシンと一緒に、４ｍｌの５０ｍＭ  ＣａＮａ２ＥＤＴＡ、０．９％生理食塩水中１１１ｍＭトリス、ｐＨ７．１の噴霧用溶液として投与した。無作為抽出後、対象を病院内で２週間処置し、この間患者には１日４回処置を施した（３００ｍｇのＥＤＴＡ／日、または３．３ｍｇＥＤＴＡ／ｋｇ／日まで）。次いで、患者を退院させ、処置を１日２回４週間継続した。患者をさらに４週間モニターし、全実験時間を１０週間とした。
【０１８４】
噴霧用３％高張生理食塩水を８〜１０Ｌ／分、≧５分間用いて痰を誘発させた。処置前に試料を収集し、２、６および１０週の時点で関連プロトコルに従い処理し、−８０℃で貯蔵した。粘液を透明な痰から解離し、Ｓｐｕｔａｌｙｓｉｎ（痰１グラム当たり１ｍｌ）と混合し、ボルテックスし、１時間インキュベートし、次いでＳｋｉｍ  Ｍｉｌｋ  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ貯蔵媒体内に配置し、−８０℃で貯蔵した。
【０１８５】
試料を氷上で解凍し、元の濃度の最大１０〜７まで段階希釈を作製し、２０μＬの各希釈物を、シュードモナス属の種用のＭｃＣｏｎｋｅｙ寒天の３つの培養物プレートのそれぞれの上に配置した。プレートを３５℃で４８時間インキュベートし、細菌をコロニーカウント数で数えた。緑膿菌の識別をグラム染料（ネガティブ）、オキシダーゼ試験（ネガティブ）およびＣ３９０抗生剤に対する耐性でさらに確認した。データは、１ミリリットル当たりのコロニー形成単位（ＣＦＵ／ｍｌ）として表現した。
【０１８６】
図２５は、２および６週の時点での緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｏｎｓａ）（ＭｃＣ）に対するコロニーカウント数の変化を、処置の開始時と比較して示している。処置の２週後、コロニーカウント数の低減は、プラセボ群での４．５倍と比較して、ＥＤＴＡ群では＞４００倍であった。
【０１８７】
［実施例８］
高用量の吸入用キレート剤は、ＦＥＶ１における濃度依存性増加をもたらす
症状増悪により入院した、年齢≧６才のＣＦを有する患者を、無作為抽出して、静脈内抗生剤および噴霧用トブラマイシンによるこれらの通常処置に加えてＥＤＴＡまたは生理食塩水（プラセボ）を投与する。ＥＤＴＡを、トブラマイシンと一緒に、４ｍｌの５０ｍＭ  ＣａＥＤＴＡ、０．９％生理食塩水中１１１ｍＭトリス、ｐＨ７．１の噴霧用溶液として投与した。無作為抽出後、対象を病院内で２週間処置し、この間患者には１日４回処置を施した（３００ｍｇのＥＤＴＡ／日、または３．３ｍｇＥＤＴＡ／ｋｇ／日まで）。次いで、対象を退院させ、処置を１日２回４週間継続した。患者をさらに４週間モニターし、全実験時間を１０週間とした。各実験の臨検において、肺機能をスパイロメトリで測定した。３回の試みのうち最も良いものとしてデータを記録し、結果を予測値の％として表現した。
【０１８８】
図２６は、処置開始後、２、６および１０週の時点での、両方の群に対するＦＥＶ１の平均変化を示している。これは、ＥＤＴＡ群における肺機能の明白な改善を実証しているが、プラセボ群ではわずかな変化しか実証していない。
【０１８９】
図２７は、ＥＤＴＡ群（Ｒ２＝０．７０）におけるＦＥＶ１改善と体重の間の逆の相関関係を示しているが、トブラマイシン単独で処置したプラセボ群には相関関係がないことを示している（Ｒ２＝０．０１）。これは、ＥＤＴＡが、肺機能に対して用量依存性作用（ｍｇ  ＥＤＴＡ／ｋｇ体重）があることを示す。
【０１９０】
喀痰された痰中で達成されたＥＤＴＡの濃度をＬＣ−ＭＳ／ＭＳで測定した。ＥＤＴＡがＣＦ粘液に浸透して、処置するのに最も困難な細菌に到達するのを確認するため、痰を粘液栓から切断し、公知の質量をスモークガラスＨＰＬＣバイアルに配置した。３−Ｃ１３標識ＥＤＴＡ（１０μＭ）を含有するＬＣ−ＭＳ等級メタノール（１ｍｌ）を各バイアルに加え、５分間ボルテックスすることによって混合し、−２０℃で２０分間冷やした。次いで、バイアルを１００ｇで５分間遠心分離して、沈殿したタンパク質を堆積させ、７５４μＬのメタノール抽出物を誘導体化のために採取した。濃塩酸（２４６μｌ）を加え、バイアルをボルテックス混合し、６５℃で６時間インキュベートして、ＥＤＴＡをメチルエステル化した。誘導体化した抽出物（１μｌ）を三連四重極質量分析計検出器を備えたＷａｔｅｒｓ  ｍｉｃｒｏｆｌｏｗ  ＨＰＬＣに注入した。フラグメント化エネルギー１３５．０Ｖにおいて、標識ＥＤＴＡに対してｍ／ｚ１９０．１および非標識ＥＤＴＡに対してｍ／ｚ１８８．０の定量化イオンのカウント数を使用して、試料中に存在する抽出した誘導体化ＥＤＴＡの量を定量した。
【０１９１】
図２８は、処置から５分後の粘液栓におけるＥＤＴＡ濃度がミリモル範囲内にあることを示している。これは、粘液を介した効率的な送達および良好な浸透を実証している。気道表面液体中のピーク濃度は恐らくより高い。ＥＤＴＡは、ずっと低いレベルではあるが、２時間後の粘液中でさらに検出可能であり、これは恐らく分布とクリアランスの組合せによるものであろう。
【０１９２】
［仮想実施例Ｐ１：キレート化剤は、抗生剤と相乗的に作用することで、抗生剤効力を増強する］
抗生剤とキレート化剤との間の相乗効果を試験する方法はチェッカーボード法である。一連の異なる細菌性種を９６−ウェルプレート内でバイオフィルムに成長させ、次いで、異なる濃度のキレート化剤および抗生剤でチャレンジする。比色分析試験を使用して、バイオフィルムレベルおよび代謝活性を示す（Ｂｕｅｎｏ「Ａｎｔｉ−Ｂｉｏｆｉｌｍ  Ｄｒｕｇ  Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｌｏｏｋｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｎｅｗ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ」Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  ２０１４年、Ｓ３；Ｏｒｈａｎら、「Ｓｙｎｅｒｇｙ  ｔｅｓｔ  ｓｂｙ  Ｅ  ｔｅｓｔ  ａｎｄ  ｃｈｅｃｋｅｒｂｏａｒｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ」Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２００５年１月；４３巻（１号）：１４０〜３頁）。
【０１９３】
この実験は、抗生剤またはキレート化剤のそれぞれ単独での濃度の増加と共に、バイオフィルムが濃度依存的に低減することを示し、両方を組み合わせるとバイオフィルムレベルはさらに低減することを示すことが予想される。
【０１９４】
［仮想実施例Ｐ２：緩衝は、抗生剤によるバイオフィルム死滅を倍加させるキレート化剤の能力を増強させる］
一連の異なる細菌性種を９６−ウェルプレート内でバイオフィルムに成長させ、次いで、異なる濃度のキレート化剤および緩衝剤、例えば、トリスなどでチャレンジする。比色分析試験を使用して、バイオフィルムレベルおよび代謝活性を示す。環境の酸性度を変化させながら、細菌性バイオフィルムを、キレート化剤および抗生剤でさらにチャレンジする。
【０１９５】
アミノグリコシド抗生剤は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで、高いｐＨで、浮遊性細胞およびバイオフィルムに対してよりうまく働くこと（Ｌｅｂｅａｕｘら、Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．２０１４年、２１０巻（９号）：１３５７〜６６年）、およびＥＤＴＡなどのキレート化剤の親和性はｐＨと共に増加することが知られている。したがって、本実験は、抗生剤アジュバントとしてのキレート化剤の効力が生理学的ｐＨまたはそれよりも上で最も高いことを示すと予想される。
【０１９６】
［仮想実施例Ｐ３：炎症、肺損傷、および酸化ストレスに対する高用量の噴霧用キレート剤の作用のｉｎ  ｖｉｖｏ実験］
症状増悪により入院した、年齢≧６才のＣＦを有する対象を、無作為抽出して、静脈内抗生剤および噴霧用トブラマイシンによるこれらの通常の処置に加えて噴霧用ＥＤＴＡまたは生理食塩水（プラセボ）を投与する。ＥＤＴＡは、トブラマイシンと一緒に、４ｍｌの５０ｍＭＣａＥＤＴＡ、０．９％生理食塩水中１１１ｍＭトリス、ｐＨ７．１の噴霧用溶液として投与する。
【０１９７】
無作為抽出後、対象を病院内で２週間処置し、この間対象は１日４回の処置を受ける（３００ｍｇＥＤＴＡ／日、または３．３ｍｇＥＤＴＡ／ｋｇ／日まで）。次いで、対象を退院させ、処置を１日２回４週間継続する。対象をさらに４週間モニターし、全実験時間を１０週間とする。８〜１０Ｌ／分で、≧５分間、噴霧用３％高張生理食塩水で誘発させることにより痰を収集する。試料を処置前に収集し、２、６および１０週の時点で、関連するプロトコルに従い処理し、−８０℃で貯蔵する。
【０１９８】
・炎症性マーカーの発現
喀痰された痰をＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）中で貯蔵し、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮＥａｓｙ（登録商標）または同様の抽出キットを使用して全ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに変換し、Ｓｉｖａｎｅｓｏｎら（Ｓｉｖａｎｅｓｏｎ，Ｍ．、Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎ，Ｈ．、Ｖｅｎｔｒｅ，Ｉ．、Ｂｏｒｄｉ，Ｃ．およびＦｉｌｌｏｕｘ，Ａ．（２０１１年）「Ｔｗｏ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｉｎ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ：ａｎ  ｉｎｔｒｉｃａｔｅ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｍｅｄｉａｔｉｎｇ  ｆｉｍｂｒｉａｌ  ａｎｄ  ｅｆｆｌｕｘ  ｐｕｍｐ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、７９巻、１３５３〜１３６６頁）に記載されているようにｑＰＣＲを使用して、炎症性マーカーをモニターし、公知のハウスキーピング遺伝子、例えば、アクチンおよび／またはＧＡＰＤＨなどと比べて定量化する。
【０１９９】
この実験は、プラセボ群と比較して、ＥＤＴＡ群における炎症性マーカーの遺伝子発現の平均的低減を示すことが予想される。
【０２００】
・細胞損傷、遊離鉄および酸化ストレス
喀痰された痰を加工なしにそのまま凍結し、上記の通り炎症性マーカーについてアッセイする。構造的損傷の尺度として、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）およびメタロプロテイナーゼ（ＴＩＭＰ）の組織阻害剤のレベルを、ゼラチンザイモグラフィーおよびイムノアッセイをそれぞれ使用して、以前に記載されている通り測定する（Ｇａｇｇａｒら、Ｅｕｒ  ＲｅｓｐｉｒＪ．２０１１年、３８巻（３号）：７２１〜２７頁；Ｇａｒｒａｔｔら、Ｅｕｒ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｊ．、２０１５年、４６巻（２号）：３８４〜９４頁）。痰の中の鉄の量を以前に記載されている通りＩＣＰ−ＭＳで定量化する（Ｈｕｎｔｅｒら、ＭＢｉｏ．２０１３年、４巻（４号）：１〜８頁）。イムノアッセイを使用して、鉄結合タンパク質の量を評価する。イムノアッセイを使用して、以前に記載されている通りグルタチオン（ＧＳＳＧおよびＧＳＨ）を測定することにより、酸化ストレスを評価する（Ｋｅｔｔｌｅら、Ｅｕｒ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｊ．２０１４年、４４巻（１号）：１２２〜９頁）。
【０２０１】
この実験は、プラセボ群と比較して、ＥＤＴＡ群の中の炎症性マーカーの低減を示すことが予想される。この実験は、ＭＭＰとＴＩＭＰとの間、特にＭＭＰ−９とＴＩＭＰ−１との間のバランスの変化（これは気管支拡張症の進行に伴うものである）を示すことがさらに予想される。
【０２０２】
［仮想実施例Ｐ４：感染症、炎症、および酸化ストレスに対する高用量の乾燥粉末キレート剤の作用のｉｎ  ｖｉｖｏ実験］
乾燥粉末トブラマイシンで処置する必要があるＣＦを有する対象を、４つのコホートに割り当て、１１２ｍｇの乾燥粉末を１日２回、２８日間投与する。加えて、コホート１（患者＞１８才）には上昇する用量の乾燥粉末ＣａＥＤＴＡを投与する（３７．５ｍｇＢＩＤを１週間；７５ｍｇＢＩＤを２週間、１５０ｍｇＢＩＤを１週間）。コホート２（＞１８才）の患者には、ＣａＥＤＴＡ（３７．５ｍｇＢＩＤを１週間；７５ＢＩＤを２週間；７５ｍｇＱＩＤを１週間）を投与する。コホート３の患者（１２〜１８才）には、ＣａＥＤＴＡ（３７．５ｍｇＢＩＤを１週間；７５ｍｇＢＩＤを２週間、１５０ｍｇＢＩＤを１週間）を投与する。最後に、対照コホートはトブラマイシンの投与を単独で２８日間受ける。
【０２０３】
痰試料を毎週収集し、感染症および炎症のマーカーについて評価する。細菌を痰コロニーカウント数によりモニターする。構造的損傷の尺度として、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）およびメタロプロテイナーゼ（ＴＩＭＰ）の組織阻害剤のレベルを、ゼラチンザイモグラフィーおよびイムノアッセイをそれぞれ使用して、以前に記載されている通り測定する（Ｇａｇｇａｒら、Ｅｕｒ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｊ．２０１１年、３８巻（３号）：７２１〜２７頁；Ｇａｒｒａｔｔら、Ｅｕｒ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｊ．２０１５年、４６巻（２号）：３８４〜９４頁）。痰の中の鉄の量を以前に記載されている通りＩＣＰ−ＭＳで定量化する（Ｈｕｎｔｅｒら、２０１３年）。イムノアッセイを使用して、鉄結合タンパク質の量を評価する。ミエロペルオキシダーゼ活性もまた好中球の炎症の尺度として、以前に記載されている通りアッセイする（Ｇａｇｇａｒら、２０１１年）。３−クロロチロシンを強力な酸化剤である次亜塩素酸のバイオマーカーとして測定する。質量分析法を用いた安定同位体希釈ガスクロマトグラフィーを使用してレベルを測定する（Ｇａｇｇａｒら、２０１１年）。市販のイムノアッセイキットを使用して、反応性酸素種（ＲＯＳ）の指標としてタンパク質カルボニルを測定する（Ｇａｇｇａｒら、２０１１年）。イムノアッセイを使用して、以前に記載されている通りグルタチオン（ＧＳＳＧおよびＧＳＨ）を測定することにより、酸化ストレスを評価する（Ｋｅｔｔｌｅら、２０１４年）。炎症性および酸化ストレスマーカー（例えばＩＬ−８、ＩＬ−６、ＴＮＦａ）の遺伝子発現もまたＮａｎｏｓｔｒｉｎｇでモニターし、タンパク質をＥＬＩＳＡで測定する。酸化ストレスはまた、代謝産物を介して、例えば、マロンジアルデヒド（ｍｏｌｏｎｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ）（比色分析アッセイ）または８−イソプラスタン（ＥＬＩＳＡ）などで測定することができる。鉄は、レーザー除去−誘導結合された血漿−質量分析法（ＬＡ−ＩＣＰ−ＭＳ）を使用して、元素分析で測定する。
【０２０４】
この実験は、プラセボ群と比較して、ＥＤＴＡ群における炎症性マーカーの低減および鉄レベルの低下を示すことが予想される。この実験は、ＭＭＰとＴＩＭＰとの間、特にＭＭＰ−９とＴＩＭＰ−１との間のバランスの変化（これは気管支拡張症の進行に伴う）を示すことがさらに予想される。
【０２０５】
この実験は、対照患者と比較して、ＥＤＴＡで処置した対象において、痰の中の細菌量の低減およびＦＥＶ１の増加を示すことがさらに予想される。
【０２０６】
［仮想実施例Ｐ５：炎症、肺損傷、および酸化ストレスに対する高用量の乾燥粉末キレート剤の作用のｉｎ  ｖｉｖｏ実験］
症状増悪により入院した、年齢≧６才のＣＦを有する対象を、無作為抽出して、静脈内抗生剤および噴霧用トブラマイシンによるこれらの通常の処置に加えて乾燥粉末ＥＤＴＡまたは生理食塩水（プラセボ）を投与する。ＥＤＴＡは、トブラマイシンと一緒に、４ｍｌの５０ｍＭ  ＣａＥＤＴＡ、０．９％生理食塩水中１１１ｍＭトリス、ｐＨ７．１の噴霧用溶液として投与する。
【０２０７】
無作為抽出後、対象を病院内で２週間処置し、この間対象には１日４回の処置を施す（３００ｍｇＥＤＴＡ／日、または３．３ｍｇＥＤＴＡ／ｋｇ／日まで）。次いで対象を退院させ、処置を１日２回４週間継続する。対象をさらに４週間モニターし、全実験時間を１０週間とする。８〜１０Ｌ／分で≧５分間、噴霧用３％高張生理食塩水で誘発させることにより痰を収集する。試料を処置前に収集し、２、６および１０週の時点で、関連するプロトコルに従い処理し、−８０℃で貯蔵する。
【０２０８】
・炎症性マーカーの発現
喀痰された痰をＲＮＡｌａｔｅｒ中で貯蔵し、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮＥａｓｙ（登録商標）または同様の抽出キットを使用して全ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに変換し、Ｓｉｖａｎｅｓｏｎら（Ｓｉｖａｎｅｓｏｎ，Ｍ，、Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎ，Ｈ．、Ｖｅｎｔｒｅ，Ｉ．、Ｂｏｒｄｉ，Ｃ．およびＦｉｌｌｏｕｘ，Ａ．（２０１１年）「Ｔｗｏ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｉｎ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ：ａｎ  ｉｎｔｒｉｃａｔｅ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｍｅｄｉａｔｉｎｇ  ｆｉｍｂｒｉａｌ  ａｎｄ  ｅｆｆｌｕｘ  ｐｕｍｐ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、７９巻、１３５３〜１３６６頁）に記載されているようにｑＰＣＲを使用して、炎症性マーカーをモニターし、公知のハウスキーピング遺伝子、例えば、アクチンおよび／またはＧＡＰＤＨなどと比べて定量化する。
【０２０９】
この実験は、プラセボ群と比較して、ＥＤＴＡ群における炎症性マーカーの遺伝子発現の平均的低減を示すことが予想される。
【０２１０】
・細胞損傷、遊離鉄および酸化ストレス
喀痰された痰を加工なしにそのまま凍結し、上記の通り炎症性マーカーについてアッセイする。構造的損傷の尺度として、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）およびメタロプロテイナーゼ（ＴＩＭＰ）の組織阻害剤のレベルを、ゼラチンザイモグラフィーおよびイムノアッセイをそれぞれ使用して、以前に記載されている通り測定する（Ｇａｇｇａｒら、Ｅｕｒ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｊ．２０１１年、３８巻（３号）：７２１〜２７頁；Ｇａｒｒａｔｔら、Ｅｕｒ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｊ．２０１５年、４６巻（２号）：３８４〜９４頁）。痰の中の鉄の量を以前に記載されている通りＩＣＰ−ＭＳで定量化する（Ｈｕｎｔｅｒら、ＭＢｉｏ  ２０１３年、４巻（４号）：１〜８頁）。イムノアッセイを使用して、鉄結合タンパク質の量を評価する。以前に記載されている通りグルタチオン（ＧＳＳＧおよびＧＳＨ）を測定することにより、酸化ストレスを評価する（Ｋｅｔｔｌｅら、Ｅｕｒ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｊ．２０１４年、４４巻（１号）：１２２〜９頁）。
【０２１１】
この実験は、プラセボ群と比較して、ＥＤＴＡ群における炎症性マーカーの低減および鉄レベルの低下を示すことが予想される。この実験は、ＭＭＰとＴＩＭＰとの間、特にＭＭＰ−９とＴＩＭＰ−１との間のバランスの変化（これは、気管支拡張症の進行に伴う）を示すことがさらに予想される。
【０２１２】
この実験は、プラセボ（担体のみ）と比較して、ＥＤＴＡで処置した対象におけるＦＥＶ１の増加を示すことがさらに予想される。
【０２１３】
これは、上記実施例４において実証されている。
【０２１４】
［仮想実施例Ｐ６：炎症、肺損傷、および酸化ストレスに対する高用量のキレート剤の作用のｉｎ  ｖｉｖｏ実験］
嚢胞性線維症対象の単一施設、無作為抽出、二重盲検、クロスオーバー実験を行う。吸入用ＣａＥＤＴＡまたは生理食塩水（プラセボ）での１日２〜４回、２週間の処置に対して対象を無作為抽出する。この後、ウォッシュアウト期間および次いで２週間の他の処置（ＥＤＴＡまたはプラセボ）が続く。
【０２１５】
鉄のレベル、炎症性マーカー、ＭＭＰ／ＴＩＭＰおよびＦＥＶ１を上記の通りモニターする。以前に記載されている通り、好中球の炎症の尺度として、ミエロペルオキシダーゼ活性もまたアッセイする（Ｇａｇｇａｒら、２０１１年）。強力な酸化剤次亜塩素酸のバイオマーカーとして３−クロロチロシンを測定する。質量分析法を用いた安定同位体希釈ガスクロマトグラフィーを使用してレベルを測定する（Ｇａｇｇａｒら、２０１１年）。市販のイムノアッセイキットを使用して、ＲＯＳの指標としてタンパク質カルボニルを測定する（Ｇａｇｇａｒら、２０１１年）。
【０２１６】
この実験は、プラセボと比較して、ＥＤＴＡで処置した対象において、鉄および炎症性マーカーのレベルの低減、ＭＭＰ／ＴＩＭＰのバランスの変化、および平均ＦＥＶ１の増加を示すことが予想される。この実験は、ミエロペルオキシダーゼ活性の低減およびクロロチロシンおよびカルボニルの平均レベルの引き下げを示すことがさらに予想される。
【０２１７】
臨床データは、２週間の３００ｍｇ／日（７５ｍｇＱＩＤ）投与における効力（図２５は細菌カウント数の低減；図２６は肺機能の改善）およびさらに４週間の１５０ｍｇ／日（７５ｍｇＢＩＤ）投与に対する作用の維持を実証している。著しい規模の改善（平均１６％ポイント）を考慮すると、当業者であれば理解されるように、仮想実施例Ｐ４により想定されるように、ずっとより低い用量が、すなわち７５ｍｇ／日（３７．５ｍｇＢＩＤ）が有効である可能性が極めて高い。
【０２１８】
図２８は、７５ｍｇのＣａＥＤＴＡの単回投与が３０分後、粘液栓内側で、１．３４ｍＭまでのＥＤＴＡをもたらすことを示す。したがって、気道表面液体中の濃度は、実質的により高い可能性が最も高い。ｉｎ  ｖｉｔｒｏデータ（図１Ｂおよび２Ｂ）は、ＣａＥＤＴＡが、０．０７８ｍＭ  ＥＤＴＡまで低い濃度、または痰濃度より１７倍低い濃度で有効であることを実証している。よって、１日用量の３７．５（臨床的メリットのある低い用量より４倍低い）が、完全に強化した実験で効力を示すと予想するのが妥当であろう。これは、体重当たりの用量がより高い量で投与される幼い患者に特に当てはまり、一般的にＦＥＶ１においてより大きな治療効果を示す（図２７）。
【０２１９】
基本的本発明の概念から逸脱することなく、開示された発明に関係する上記教示に基づき、本発明の様々な実施形態を実行する、上に記載のモードの多くの変更形態および修飾形態が当業者には明らかである。本発明の上記実施形態は単に例示であり、限定であるとは決して解釈されるべきではなく、すべてのこのような変更形態および修飾形態は、その性質が前述の説明から決定される本発明の範囲内であると考えられるものとする。
【０２２０】
本発明の研究は、Ｃｙｓｔｉｃ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓからの賞金により援助された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【国際調査報告】
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