(57)【要約】  ヒトまたは動物の微生物／細菌感染、好ましくはＢ．アントラシスまたはＣ．パーフリンジェンスまたはジアルジア感染の治療に使用するための抗微生物剤または抗細菌剤としてのテルミナリアフェルジナンジアナ（Ｔ．フェルジナンジアナ）の抽出物を含む組成物または薬剤。抽出物は、Ｔ．フェルジナンジアナ葉抽出物であり得るか、それを含み得る。抽出物は、エラグ酸またはトリメチルエラグ酸などの少なくとも１つの抗酸化物を含むことができ、少なくとも１つのタンニンおよび／または少なくとも１つのフラボンおよび／またはケブル酸、コリラゲン、ケブリン酸またはケブラジン酸および／または少なくとも１つのフラボンまたはフラビノイドを含むことができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトまたは動物の細菌感染の治療に使用するための組成物であって、前記組成物が、抗微生物剤または抗細菌剤としてテルミナリアフェルジナンジアナ（Ｔ．フェルジナンジアナ）に由来する抽出物を含有する薬剤を含む組成物。
【請求項２】
Ｔ．フェルジナンジアナ葉抽出物を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記Ｔ．フェルジナンジアナ葉抽出物に加えて、Ｔ．フェルジナンジアナ果実抽出物をさらに含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記Ｔ．フェルジナンジアナ葉抽出物が、メタノール抽出物もしくはエタノール抽出物、水抽出物、酢酸エチル抽出物、クロロホルム抽出物またはヘキサン抽出物のうち１つ以上を含む、請求項２または請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記Ｔ．フェルジナンジアナ葉抽出物が、ある割合の少なくとも１つの抗酸化物を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
前記少なくとも１つの抗酸化物が、エラグ酸またはトリメチルエラグ酸のうち１つ以上を含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物、前記薬剤または前記抽出物が、丸剤形態、カプセル形態で、または液体として提供される、請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
少なくとも１つのタンニンおよび／または少なくとも１つのフラボンを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
ケブル酸、コリラゲン、ケブリン酸およびケブラジン酸のうち１つ、または２つ以上の組合せを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
少なくとも１つのフラボンまたはフラビノイドを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
ヒトまたは動物のＢ．アントラシスまたはＣ．パーフリンジェンスまたはジアルジア感染の治療に使用するための、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
ヒトまたは動物の細菌感染の治療に使用するための抗微生物剤または抗細菌剤としてのテルミナリアフェルジナンジアナ（Ｔ．フェルジナンジアナ）の抽出物を含む薬剤。
【請求項１３】
ヒトまたは動物のＢ．アントラシスまたはＣ．パーフリンジェンスまたはジアルジア感染の治療に使用するために提供される、請求項１２に記載の薬剤。
【請求項１４】
ヒトまたは動物の微生物または細菌感染の治療用薬剤に使用するためのテルミナリアフェルジナンジアナ（Ｔ．フェルジナンジアナ）の抽出物。
【請求項１５】
ヒトまたは動物のＢ．アントラシスまたはＣ．パーフリンジェンスまたはジアルジア感染の治療に使用するための、請求項１４に記載の抽出物。
【請求項１６】
ヒトまたは動物の細菌感染の治療に使用するための薬剤または組成物の調製におけるテルミナリアフェルジナンジアナ（Ｔ．フェルジナンジアナ）の抽出物の使用。
【請求項１７】
前記抽出物がＴ．フェルジナンジアナ葉抽出物を含む、請求項１６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、テルミナリアフェルジナンジアナ（Ｔｅｒｍｉｎａｌｉａ  ｆｅｒｄｉｎａｎｄｉａｎａ）（Ｔ．フェルジナンジアナ）の天然抽出物および／または派生物に関する。
【０００２】
本発明は、特に、単独ではないが、テルミナリアフェルジナンジアナの葉の抽出物および／または派生物を利用する。
【０００３】
本発明は、ヒトおよび動物の感染症の治療に使用するためなど、抗細菌性または抗微生物性の製品または使用に用途を見出す。
【背景技術】
【０００４】
以下、参照を容易にするために、テルミナリアフェルジナンジアナはＴ．フェルジナンジアナと呼ばれ得る。
【０００５】
Ｔ．フェルジナンジアナは小さな落葉樹であり、オーストラリア北部の亜熱帯の森林地帯、典型的にはノーザン・テリトリーおよび西オーストラリア州全体にわたって広く自生している。
【０００６】
Ｔ．フェルジナンジアナは小さなプラムのような果実を豊富に産出する。この果実は非常に高いビタミンＣ含有量を有することが知られており、抗酸化物、葉酸および鉄の供給源である。この果実と果実の抽出物とは、食品、栄養補助食品および医薬品に使用されている。
【０００７】
Ｔ．フェルジナンジアナの果実の最も一般的な用途は、高級ジャム、ソース、ジュース、アイスクリーム、化粧品、香料および医薬品である。
【０００８】
Ｔ．フェルジナンジアナ果実抽出物用の化粧品ビヒクルの例が、欧州特許文献、欧州特許第１５８１５１３号明細書に提案されている。別の特許文献、米国特許第７１７５８６２号明細書は、Ｔ．フェルジナンジアナ植物の果実から、アスコルビン酸（ビタミンＣ）、抗酸化物および植物化学物質を含有する粉末を製造する方法を開示している。米国特許第７１７５８６２号明細書は、人体のフリーラジカルを低減するための粉末化されたＴ．フェルジナンジアナ果実の使用に言及している。
【０００９】
Ｔ．フェルジナンジアナ果実は、抗微生物特性を有することも知られている。オーストラリア北部原産の果実として、この果実は、オーストラリア先住民が食物および薬剤として使用するという長い歴史を有する。この果実は、高栄養食品の供給源として、オーストラリア先住民によって長い狩猟の旅の間に食べられていた。Ｔ．フェルジナンジアナの薬効成分は十分に理解されておらず、完全に評価されていない。
【００１０】
Ｔ．フェルジナンジアナ果肉の抗微生物特性の評価について報告しているＩ．Ｅ．ＣｏｃｋおよびＳ．Ｍｏｈａｎｔｙによる試験が、Ｐｈａｒｍａｃｇｎｏｓｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２０１１［ｖｏｌ  ３｜ｉｓｓｕｅ  ２０］に発表された。その試験では、Ｔ．フェルジナンジアナ果肉の細菌増殖阻害能に焦点が合わせられ、Ｔ．フェルジナンジアナ果実の他の医学的に重要な生物活性を検討するために追加の試験が必要であることが認識された。
【００１１】
果実の増殖阻害活性が報告されているにもかかわらず、多くの病原体の増殖を阻害する能力については未だ評価されていない。
【００１２】
特に、Ｔ．フェルジナンジアナの葉抽出物の抗細菌特性は依然として理解されていない。
【００１３】
多くの細菌は、ヒトおよび動物に感染することができる。クロストリジウム・パーフリンジェンスなどの一部の細菌は、嫌気的に活性である。バチルス・アントラシスなどの他の細菌は、好気的または嫌気的に活性である。
【００１４】
クロストリジウム・パーフリンジェンスは、筋組織に特異的な壊死性損傷の状態である筋壊死を引き起こす。筋壊死は、Ｃ．パーフリンジェンスまたは無数の土壌伝播性の嫌気性細菌による感染症によく認められる。細菌は、特異的な外毒素によって筋壊死を引き起こす。これらの微生物は日和見性であり、一般に、重大な皮膚損傷を介して体内に入る。土壌伝播性細菌による壊疽性感染症は、滅菌されていない野外での手術、および重篤な噴出性出血を伴う創傷の治療の基本的性質のため、２０世紀に入っても兵士の戦傷ではよく見られた。
【００１５】
クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃ．パーフリンジェンス）は、内生胞子を形成するグラム陽性菌であり、クロストリジウム性筋壊死および壊孔性腸炎を含む様々な疾患の病原体である。
【００１６】
Ｃ．パーフリンジェンス細菌は、厳密に嫌気的に増殖し（ただし、耐気性である）、自然の微生物叢の一部として環境中に遍在的に存在する。この細菌は、多くの場合、ヒトおよび他の脊椎動物の消化管にも存在する。
【００１７】
過酷な環境などのストレス下で、または必要な栄養が枯渇すると、Ｃ．パーフリンジェンスは内生胞子を生成することができ、細胞増殖に適した状態に戻るまで、防御機構として内生胞子を代謝的に休眠状態に置く。
【００１８】
Ｃ．パーフリンジェンス細菌の環境的堅牢性は、重要な臨床的意義を有し、無酸素状態下では多種多様な疾患の原因となり、その一部は極めて致死的である。
【００１９】
クロストリジウム性筋壊死（またはガス壊疽）は、骨格筋の急速に進行する極めて致死的な感染症であり、外毒素を産生するいくつかのクロストリジウム種によって引き起こされる。クロストリジウム性筋壊死は、クロストリジウム属の多くの種（Ｃ．セプティカム、Ｃ．ヒストリチクムまたはＣ．ノビイを含む）によって引き起こされるが、ガス壊疽の主な原因はＣ．パーフリンジェンスによるものであり、報告された症例の大部分（そのような症例の８０％〜９０％と言われている）ではＣ．パーフリンジェンスが原因病原体と推定されている。
【００２０】
Ｃ．パーフリンジェンス細菌は嫌気性条件に依存しているため、外傷または術後のいずれかの結果として、主に深部組織で感染が起こる。その後、関連する外毒素が産生され、外毒素は周囲組織を壊死させ、筋肉の分解を引き起こす。迅速な治療が行われない限り、その後の症状には、急性腎不全、ショック、昏睡、最終的には死が含まれ得る。
【００２１】
Ｃ．パーフリンジェンスによるガス壊疽の治療での現在の戦略には、抗生物質療法と積極的な外科的デブリドマンとの組合せが含まれる。
【００２２】
迅速な治療が行われないと、ガス壊疽は極めて致死的であるため、宿主の死亡の可能性を減らすために壊死組織の除去が必要となることが多い。最近では効果的なワクチンの製造が重要視されているが、これは治癒的治療よりも予防的手段と考えられているため、感染が始まると用をなさなくなる。さらに、病原体の散発的で日和見的な性質により、誰がワクチン接種を受けるべきか予測することが困難になる。
【００２３】
したがって、現在、ガス壊疽治療の主要な方法は、感染が検出されるとすぐにペニシリンとクリンダマイシンとの組合せを投与することを含む。この細菌は抗生物質に依然として比較的感受性であるが、抗生物質耐性Ｃ．パーフリンジェンスの報告が出てきたため、ガス壊疽治療のための代替化学療法の選択肢を発見し開発する必要性がかつてないほど高まっている。
【００２４】
人獣共通感染症は、ヒトと動物との間で間接的または直接的に伝染する可能性のある疾患であり、健康と経済の両観点から大きな負担となっている。このような疾患は家畜および野生動物の両方からヒトに広がる可能性があり、直接接触、動物の分泌物による飲料水の汚染、または汚染された食肉製品の摂取によって伝染する可能性がある。これらの疾患は、集団免疫、および感染した個体の隔離という従来有効な戦略が実行不可能であるため、感染の制御および治療に対して異例の一連の問題を引き起こす。
【００２５】
さらに、他の方法では識別することができない症状を言葉で表現することができるヒトとは異なり、感染した動物が気付かれないまま疾患の蔓延の一因となることがある。１９４０年から２００４年にかけて、あらゆる新興感染症の約６０％が人獣共通感染症であり、その大部分が野生生物に由来するものであったと考えられている。したがって、異種間治療の開発は、人獣共通感染症の効果的な制御および根絶に重要な役割を果たす。
【００２６】
例として、炭疽の病原体であるバチルス・アントラシス（Ｂ．アントラシス）は、主に土壌に存在する胞子形成グラム陽性菌である。バチルス属の他の微生物と同様に、Ｂ．アントラシスは内生胞子を産生することができ、内生胞子は、条件が再び増殖に適した状態になるまで数年間休眠状態を維持することができる。これらの芽胞は代謝的に不活性であり、温度、乾燥および酵素的破壊など、栄養細胞を死滅させる環境条件を生き延びることができる。
【００２７】
ヒトの炭疽病の４つの形態は、以下の人体への侵入経路に基づいて認識される。１．皮膚は、最も一般的な形態であり（９５％）、局所的な炎症性黒色壊死性病変（焼痂）を引き起こす。２．吸入は、まれではあるが極めて致死的な形態であり、インフルエンザ様症状、胸部不快感、発汗、および身体の痛みを特徴とする。３．消化管は、まれではあるが致死的な（２５％の死を引き起こす）形態であり、炭疽菌芽胞の摂取に起因する。症状には、発熱および悪寒、頸部腫脹、嚥下痛、嗄声、悪心および嘔吐（特に血性嘔吐）、下痢、紅潮および充血、ならびに腹部膨張が挙げられる。４．注射。症状は皮膚炭疽の症状に似ているが、注射による炭疽は皮膚炭疽よりも全身に速く広がる可能性があり、認識し治療するのが難しい場合がある。
【００２８】
栄養性のＢ．アントラシス細胞はこの疾患に関連する毒素を産生するが、一般に、吸入、摂取、または開放創との直接接触によって芽胞が宿主に導入されると感染が始まる。内部移行すると、芽胞は生存可能な細胞に戻り、増殖し、致死性の炭疽毒素を産生し始める。
【００２９】
この疾患は、注意深い監視と強力な根絶措置とによって、国際的に様々な程度に管理されてきた。しかし、炭疽は世界中で風土性であり、感染が起こると多くの場合致死的となる。
【００３０】
炭疽治療の現在の戦略には、典型的には、感染と闘うための抗生物質療法と、関連症状を管理するための支持療法との組合せが含まれる。
【００３１】
抗生物質の静脈内または経口投与は、一般に炭疽の管理に有効であるが、細菌が薬剤耐性を発現し得るという固有のリスクが常に存在する。このように、新薬の発見は、新規化合物の設計および合成、または既存の自然資源内の抗菌薬の調査のいずれかを通じて、非常に重要である。
【００３２】
ジアルジア症は、世界中のヒトおよび家畜の感染性下痢の主な原因である。ジアルジア症は、ジアルジア属の原虫の消化管感染によって引き起こされる。この疾患の化学療法治療に使用することができる薬物の範囲は限られており、そのような薬物は臨床診断後にのみ使用され、予防には使用されない。
【００３３】
これらの薬物の大部分は、ジアルジア原虫の一部の生活環に対して効果がなく、毒性であり、不快な副作用を有し、開発途上国では入手が限られている場合がある。治療の失敗と寄生虫抵抗性とによって、ジアルジア症のための効果がさらに大きく、重篤な副作用がさらに少ない新たな化学療法治療を開発する重要性が浮き彫りにされている。
【００３４】
植物の薬効が非常に効果的であり得ることから、天然植物由来化合物を用いたジアルジア症の治療は魅力的な展望である。
【００３５】
薬用植物の抗微生物効果は多くの文化によって長い間認識されており、ジアルジア症の治療用などの新たな抗微生物剤、および抗Ｂ．アントラシス剤の開発では、活性化合物を同定するための植物化学的分析が有望である。
【００３６】
このように、自然資源の開発は、炭疽、ジアルジア症を引き起こす細菌、またはクロストリジウムなどの病原微生物の管理に有効な化合物を発見する点で大きな可能性を提供する。
【００３７】
このような前述の細菌および細菌感染を念頭に置いて、本発明は開発されている。
〔先行技術文献〕
〔特許文献〕
〔特許文献１〕欧州特許第１５８１５１３号明細書
〔特許文献２〕米国特許第７１７５８６２号明細書
〔非特許文献〕
〔非特許文献１〕Ｐｈａｒｍａｃｇｎｏｓｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２０１１［ｖｏｌ  ３｜ｉｓｓｕｅ  ２０］
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３８】
本発明の１つ以上の形態ならびにＴ．フェルジナンジアナ果実および葉抽出物を評価する方法／試験によれば、Ｔ．フェルジナンジアナ葉抽出物を含有する製品が、細菌、例えば、グラム陽性嫌気性菌クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃ．パーフリンジェンス）もしくはバチルス・アントラシス（Ｂ．アントラシス）またはジアルジア属、例えば、ジアルジア・デュオデナリス（Ｇｉａｒｄｉａ  ｄｕｏｄｅｎａｌｉｓ）などの微生物の増殖を阻害するのに有効であることが分かった。
【課題を解決するための手段】
【００３９】
本発明の一態様は、ヒトまたは動物の微生物または細菌感染の治療用薬剤に使用するためのテルミナリアフェルジナンジアナ（Ｔ．フェルジナンジアナ）の抽出物を提供する。
【００４０】
本発明のさらなる態様は、テルミナリアフェルジナンジアナ（Ｔ．フェルジナンジアナ）の抽出物を含む薬剤を提供する。
好ましくは、抽出物はＴ．フェルジナンジアナ葉抽出物を含む。
【００４１】
ヒトまたは動物の微生物または細菌感染の治療に使用するための薬剤に使用する組成物であって、薬剤が、抗細菌剤としてテルミナリアフェルジナンジアナ（Ｔ．フェルジナンジアナ）の葉に由来する抽出物を含有する組成物。
【００４２】
薬剤または組成物は、１つ以上の丸剤、錠剤、カプセル剤として、または液体形態で使用するために提供されてもよい。
【００４３】
薬剤は、Ｔ．フェルジナンジアナ葉抽出物に加えて、Ｔ．フェルジナンジアナ果実抽出物を含んでもよい。
【００４４】
好ましくは、Ｔ．フェルジナンジアナ葉抽出物は、メタノール／エタノール抽出物、水性抽出物、酢酸エチル抽出物、クロロホルム抽出物またはヘキサン抽出物のうち１つ以上を含む。
【００４５】
Ｔ．フェルジナンジアナ葉抽出物は、ある割合の少なくとも１つの抗酸化物を含んでもよい。
【００４６】
少なくとも１つの抗酸化物は、エラグ酸またはトリメチルエラグ酸のうち１つ以上を含んでもよい。
【００４７】
ヒトまたは動物の細菌感染の治療に使用するための抗微生物剤として提供される抽出物、組成物または薬剤。
【００４８】
好ましくは、抽出物、薬剤または組成物は、Ｔ．フェルジナンジアナ葉抽出物を含む丸剤形態、カプセル形態で、または液体として提供される。
【００４９】
抽出物、薬剤または組成物は、少なくとも１つのタンニンおよび／または少なくとも１つのフラボンを含んでもよい。
【００５０】
抽出物、薬剤または組成物は、ケブル酸（ｃｈｅｂｕｌｉｃ  ａｃｉｄ）、コリラゲン（ｃｏｒｉｌａｇｅｎ）、ケブリン酸（ｃｈｅｂｕｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）およびケブラジン酸のうち１つ、または２つ以上の組合せを含んでもよい。
【００５１】
抽出物、薬剤または組成物は、少なくとも１つのフラボンまたはフラビノイドを含んでもよい。
【００５２】
抽出物、薬剤または組成物は、１つ以上の抗酸化物を含んでもよい。少なくとも１つの抗酸化物はエラグ酸を含んでもよい。エラグ酸は、エラグ酸脱水物および／またはトリメチルエラグ酸を含んでもよい。
【００５３】
本発明のさらなる態様は、テルミナリアフェルジナンジアナ（Ｔ．フェルジナンジアナ）の葉に由来する抽出物を含有する抗微生物組成物を提供する。
【００５４】
好ましくは、抽出物または薬剤は、ヒトまたは動物のＢ．アントラシスまたはＣ．パーフリンジェンスまたはジアルジア感染の治療に使用するための薬剤の状態で提供される。
【００５５】
本発明のさらなる態様は、ヒトまたは動物の微生物または細菌感染の治療に使用するための薬剤または組成物の調製に対するテルミナリアフェルジナンジアナ（Ｔ．フェルジナンジアナ）抽出物の使用を提供する。使用は、Ｔ．フェルジナンジアナ葉抽出物を含む抽出物を含んでもよい。
【００５６】
本発明の１つ以上の実施形態は、添付の図面および表を参照して以下に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】阻害領域（ｍｍ）として測定された、Ｃ．パーフリンジェンス環境分離株に対するＴ．フェルジナンジアナ果実および葉植物抽出物の増殖阻害活性のチャートを示す。
【００５８】
【図２】２４時間曝露後のＡｒｔｅｍｉａ  ｆｒａｎｃｉｓｃａｎａ  ｎａｕｐｌｉｉに対する、このオーストラリアの植物抽出物（２０００μｇ／ｍＬ）および重クロム酸カリウム対照（１０００μｇ／ｍＬ）の致死率のチャートを示す。
【００５９】
【図３】図３ａは、Ｔ．フェルジナンジアナ葉メタノール抽出物の２μｌ注入の陽イオンＲＰ−ＨＰＬＣ全化合物クロマトグラム（ｔｏｔａｌ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ）（ＴＣＣ）を示す。図３ｂは、Ｔ．フェルジナンジアナ葉メタノール抽出物の２μｌ注入の陰イオンＲＰ−ＨＰＬＣ全化合物クロマトグラム（ＴＣＣ）を示す。
【００６０】
【図４】図４ａは、Ｔ．フェルジナンジアナ葉酢酸エチル抽出物の２μｌ注入の陽イオンＲＰ−ＨＰＬＣ全化合物クロマトグラム（ＴＣＣ）を示す。図４ｂは、Ｔ．フェルジナンジアナ葉酢酸エチル抽出物の２μｌ注入の陰イオンＲＰ−ＨＰＬＣ全化合物クロマトグラム（ＴＣＣ）を示す。
【００６１】
【図５】メタノール抽出物および／または酢酸エチル抽出物中に検出されたＴ．フェルジナンジアナ葉タンニン化合物の化学構造を示す。（ａ）ケブル酸、（ｂ）プロトカテク酸、（ｃ）エラグ酸二水和物、（ｄ）プニカラギン、（ｅ）エラグ酸、（ｆ）ケブラジン酸、（ｇ）カスタラギン、（ｈ）コリラギン、（ｉ）プニカリン、（ｊ）ケブリン酸、（ｋ）プニカリン、（ｌ〜ｍ）トリメチルエラグ酸異性体。
【００６２】
【図６】阻害領域（ｍｍ）として測定された、Ｂ．アントラシス環境分離株に対するＴ．フェルジナンジアナ植物抽出物の増殖阻害活性のチャートを示す。ＦＷ＝Ｔ．フェルジナンジアナ果実水抽出物、ＦＭ＝Ｔ．フェルジナンジアナ果実メタノール抽出物、ＦＣ＝Ｔ．フェルジナンジアナ果実クロロホルム抽出物、ＦＨ＝Ｔ．フェルジナンジアナ果実ヘキサン抽出物、ＦＥ＝Ｔ．フェルジナンジアナ果実酢酸エチル抽出物、ＬＷ＝Ｔ．フェルジナンジアナ葉水抽出物、ＬＭ＝Ｔ．フェルジナンジアナ葉メタノール抽出物、ＬＣ＝Ｔ．フェルジナンジアナ葉クロロホルム抽出物、ＬＨ＝Ｔ．フェルジナンジアナ葉ヘキサン抽出物、ＬＥ＝Ｔ．フェルジナンジアナ葉酢酸エチル抽出物、ＰＣ＝ペニシリン（２μｇ）、ＡＭＰ＝アンピシリン（１０μｇ）。結果は、平均阻害領域±ＳＥＭとして表されている。
【００６３】
【図７】２４時間曝露後のＡｒｔｅｍｉａ  ｆｒａｎｃｉｓｃａｎａ  ｎａｕｐｌｉｉに対するＴ．フェルジナンジアナ果実および葉植物抽出物（２０００μｇ／ｍＬ）ならびに重クロム酸カリウム対照（１０００μｇ／ｍＬ）の致死率のチャートを示す。ＦＷ＝Ｔ．フェルジナンジアナ果実水抽出物、ＦＭ＝Ｔ．フェルジナンジアナ果実メタノール抽出物、ＦＣ＝Ｔ．フェルジナンジアナ果実クロロホルム抽出物、ＦＨ＝Ｔ．フェルジナンジアナ果実ヘキサン抽出物、ＦＥ＝Ｔ．フェルジナンジアナ果実酢酸エチル抽出物、ＬＷ＝Ｔ．フェルジナンジアナ葉水抽出物、ＬＭ＝Ｔ．フェルジナンジアナ葉メタノール抽出物、ＬＣ＝Ｔ．フェルジナンジアナ葉クロロホルム抽出物、ＬＨ＝Ｔ．フェルジナンジアナ葉ヘキサン抽出物、ＬＥ＝Ｔ．フェルジナンジアナ葉酢酸エチル抽出物、ＰＣ＝重クロム酸カリウム対照、ＳＷ＝海水対照。結果は、平均死亡率（％）±ＳＥＭとして表されている。
【００６４】
【図８】Ｔ．フェルジナンジアナ果実酢酸エチル抽出物の０．５μＬ注入のヘッドスペースガスクロマトグラムを表すチャートを示す。抽出物を乾燥させ、分析のためにメタノールに再懸濁した。
【００６５】
【図９】Ｔ．フェルジナンジアナ葉メタノール抽出物の０．５μＬ注入のヘッドスペースガスクロマトグラムを表すチャートを示す。抽出物を乾燥させ、分析のためにメタノールに再懸濁した。
【００６６】
【図１０】図１０ａ〜ｎは、１つ以上のフランおよび／またはタンニンなど、葉および果実抽出物に存在する化合物の例を示す。
【００６７】
【図１１】図１１ａ〜ｋは、本発明の少なくとも１つの実施形態による、抗ジアルジア活性と一致する特性を有するＴ．フェルジナンジアナ葉に存在する化合物の例を示す。
【００６８】
【図１２】未処理対照の百分率として測定された、ジアルジア・デュオデナリス栄養体の３つの株に対するＴ．フェルジナンジアナ抽出物および純粋化合物の阻害活性を示す。
【００６９】
【図１３】図１３ａ〜ｃは、（ａ）ヒツジＳ２  Ｇ．デュオデナリス株、（ｂ）参照メトロニダゾール感受性（ＡＴＣＣ２０３３３３）Ｇ．デュオデナリス株および（ｃ）参照メトロニダゾール耐性（ＡＴＣＣ  ＰＲＡ−２５１）Ｇ．デュオデナリス株に対して様々な比率で試験した没食子酸とアスコルビン酸との組合せのアイソボログラムを示す。
【００７０】
【図１４】図１４ａ〜ｃは、増殖阻害活性とＤＰＧＡ軸との関連のアイソボログラムを示す。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
本発明の１つ以上の実施形態について、Ｔ．フェルジナンジアナの抽出物および／または派生物を得るための１つ以上の方法を以下に説明する。ただし、本発明の一般性は、以下の特定の説明の特定の範囲によって限定されるものではないことを理解および認識されたい。
【００７２】
Ｔ．フェルジナンジアナの果実および葉を使用して、溶媒抽出物および水性抽出物を調製した。
【００７３】
クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃ．パーフリンジェンス）
【００７４】
Ｃ．パーフリンジェンスの臨床株に対するディスク拡散アッセイを用いて、増殖阻害活性についてＴ．フェルジナンジアナ果実および葉の溶媒および水性抽出物を調査した。
【００７５】
それらの最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）値を決定して、それらの効果を定量および比較した。
【００７６】
Ａｒｔｅｍｉａ  ｆｒａｎｃｉｓｃａｎａ  ｎａｕｐｌｉｉバイオアッセイを使用して毒性を決定した。粗Ｔ．フェルジナンジアナ果実および葉抽出物中の個々の成分の同定および特性評価のために、非標的高速液体クロマトグラフィー‐四重極飛行時間型（ＨＰＬＣ−ＱＴＯＦ）質量分析（３つの化合物データベースに対するスクリーニングを用いた）によって活性抽出物を分析した。
【００７７】
Ｃ．パーフリンジェンスに対するディスク拡散アッセイでは、Ｔ．フェルジナンジアナ果実および葉のメタノール抽出物およびＴ．フェルジナンジアナ果実および葉の水抽出物、ならびに葉の酢酸エチル抽出物が増殖阻害活性を示した。
【００７８】
一般に、葉抽出物は、対応する果実抽出物よりも強力な増殖阻害剤であったが、果実水抽出物の方が水性葉抽出物よりも実質的に大きい効果を有した。
【００７９】
メタノール葉抽出物および酢酸エチル葉抽出物は特に強力な増殖阻害剤であり、ＭＩＣ値はそれぞれ２０６および１１７μｇ／ｍｌであった。
【００８０】
果実のメタノール抽出物も良好な効果を示し、ＭＩＣは７１６μｇ／ｍｌ．ｌであった。
【００８１】
対照的に、果実および葉の両方のクロロホルム抽出物およびヘキサン抽出物は、増殖阻害活性を完全に欠いていた。
【００８２】
Ａｒｔｅｍｉａ  ｆｒａｎｓｉｓｃａｎａバイオアッセイでは、Ｔ．フェルジナンジアナ抽出物はいずれも非毒性または低毒性であった。葉メタノール抽出物および葉酢酸エチル抽出物の非バイアス植物化学的分析では、多様なガロ‐およびエラギ‐タンニンの高い相対レベルの存在が明らかにされた。
【００８３】
Ｔ．フェルジナンジアナ抽出物の低毒性と、Ｃ．パーフリンジェンスに対する葉メタノール抽出物および酢酸エチル抽出物の強力な増殖阻害生物活性とは、クロストリジウム性筋壊死および壊孔性腸炎の治療および予防のための薬剤としてのそれらの可能性を示している。メタボロームプロファイリング試験では、これらの抽出物には多様なタンニンが含有されていたことが示されている。
【００８４】
植物供給源および抽出：Ｔ．フェルジナンジアナの果実、葉および果肉を得た。果肉は輸送前に凍結し、処理するまで−１０℃で保存した。葉は脱水機で広範囲に脱水し、乾燥した材料を−３０°Ｃで保存した。果実および葉の材料は、使用前に完全に乾燥させ、粗粉末に粉砕した。脱イオン水、メタノール、クロロホルム、ヘキサンまたは酢酸エチルのいずれか５０ｍＬ中、粉砕粉末１ｇの質量を、４°Ｃで２４時間、穏やかに撹拌しながら広範囲に抽出した。抽出物を濾紙（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｎｏ．５４）により濾過し、室温で空気乾燥させた。濃縮器中で回転蒸発により水性抽出物を凍結乾燥させた。得られたペレットを１０ｍＬの脱イオン水（０．５％ＤＭＳＯを含有する）に溶解した。抽出物を０．２２μｍフィルター（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）に通し、使用するまで４℃で保存した。
【００８５】
定性的な植物化学的試験：先に記載されたアッセイによって、トリテルペノイド、タンニン、サポニン、フィトステロイド（ｐｈｙｔｏｓｔｅｒｏｉｄ）、フェノール化合物、フラボノイド、強心配糖体、アントラキノンおよびアルカロイドの存在について、抽出物の植物化学的分析を実施した。
【００８６】
抗酸化能：改変された２，２−ジフェニル−１−ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）フリーラジカル消去法を使用して、各試料の抗酸化能を評価した。アスコルビン酸（１ウェル当たり０〜２５μｇ）を参照として使用し、５１５ｎｍで吸光度を測定および記録した。試験はいずれも各プレート上の対照と並行して完了し、いずれも３連で実施した。各抽出物について、ＤＰＰＨフリーラジカル消去能に基づく抗酸化能を決定し、抽出された元の植物材料１グラム当たりのアスコルビン酸当量（μｇ）として表した。
【００８７】
抗細菌スクリーニング：臨床クロストリジウム・パーフリンジェンススクリーニング：Ｃ．パーフリンジェンスの臨床株を得た。
【００８８】
抗微生物活性の評価：改変されたディスク拡散アッセイを使用して、Ｔ．フェルジナンジアナ植物のあらゆる葉および果実抽出物の抗微生物活性を決定した。要約すると、１０ｍＬの新鮮なチオグリコレート培地中で、１００μＬのＣ．パーフリンジェンスを細胞数が約１０８個／ｍＬになるまで増殖させた。１００μＬの体積の細菌懸濁液を栄養寒天プレート上に広げ、６ｍｍの滅菌濾紙ディスクを使用して、抗細菌活性について抽出物を試験した。ディスクに１０μＬのＴ．フェルジナンジアナ抽出物を含浸させ、乾燥させ、接種プレート上に置いた。プレートを４℃で２時間静置した後、３０℃で２４時間インキュベートした。最も近い整数ミリメートルまで阻害領域の直径を測定した。各アッセイは、少なくとも３連で実施した。本明細書では平均値（±ＳＥＭ）が報告されている。ペニシリン（２μｇ）およびアンピシリン（１０μｇ）の標準ディスクを得、抗細菌活性を比較するための陽性対照として使用した。１０μＬの蒸留水を含浸させたフィルターディスクを陰性対照として使用した。
【００８９】
最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）の決定：抽出物の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）は、前述のように決定した。要約すると、Ｔ．フェルジナンジアナ果実および葉植物抽出物を脱イオン水に希釈し、様々な濃度にわたって試験した。ディスクに１０μＬの抽出物希釈液を含浸させ、乾燥させ、接種プレート上に置いた。上記で概説したようにアッセイを実施し、阻害領域対濃度のグラフをプロットした。ＭＩＣ値の決定には線形回帰を使用した。
【００９０】
毒性スクリーニング：毒性スクリーニングの参照毒素：蒸留水（４ｍｇ／ｍＬ）中で重クロム酸カリウム（Ｋ２Ｃｒ２Ｏ７）を調製し、Ａｒｔｅｍｉａ  ｆｒａｎｃｉｓｃａｎａ  ｎａｕｐｌｉｉバイオアッセイに使用するために人工海水で連続希釈した。
【００９１】
Ａｒｔｅｍｉａ  ｆｒａｎｃｉｓｃａｎａ  ｎａｕｐｌｉｉ毒性スクリーニング
【００９２】
改変されたＡｒｔｅｒｍｉａ  ｆｒａｎｃｉｓｃａｎａ  ｎａｕｐｌｉｉ致死率アッセイを使用して毒性を試験した。要約すると、約４３（平均４３．２、ｎ＝１５５、ＳＤ  １４．５）のＡ．ｆｒａｎｃｉｓｃａｎａ  ｎａｕｐｌｉｉを含有する４００μＬの海水を４８ウェルプレートのウェルに加え、直ちにバイオアッセイに使用した。４００μＬの体積の参照毒素または希釈した植物抽出物をウェルに移し、人工光（１０００ルクス）下、２５±１℃でインキュベートした。各プレートについて陰性対照（４００μＬの海水）を３連で操作した。全処理を少なくとも３連で実施した。ウェルを定期的にチェックし、死亡数を計数した。１０秒以内に付属肢の動きが検出されなければ、ｎａｕｐｌｉｉは死亡したと考えられた。２４時間後、すべてのｎａｕｐｌｉｉを殺処分し、計数して、１ウェル当たりの総死亡率（％）を決定した。プロビット分析を使用して、各処理について９５％信頼限界を伴うＬＣ５０を計算した。
【００９３】
非標的ＨＰＬＣ−ＭＳ  ＱＴＯＦ分析：クロマトグラフィー分離のために、カラム（２．１  ｘ  １００ｍｍ、粒径１．８μｍ）を備えたＨＰＬＣシステムに２μＬの試料を注入した。移動相は、（Ａ）超純水および（Ｂ）９５：５アセトニトリル／水からなり、流速は０．７ｍＬ／分であった。正モードの質量分析には０．１％（ｖ／ｖ）氷酢酸、負モードの分析には５ｍＭ酢酸アンモニウムを用いて、両移動相を修飾した。試験に用いたクロマトグラフ条件は、５％  Ｂでの最初の５分間のアイソクラティックな泳動、５分から３０分まで５％から１００％までの（Ｂ）のグラジエントの適用、次いで１００％での３分間のアイソクラティックな泳動からなっていた。正および負モードで、エレクトロスプレーイオン化源を備えた四重極飛行時間型質量分析計（ＱＴＯＦ  ＭＳ）を用いて質量分析を行った。
【００９４】
既知の定性分析ソフトウェアを使用してデータを分析した。ソフトウェアパッケージ中の「Ｆｉｎｄ  ｂｙ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｆｅａｔｕｒｅ」アルゴリズムを用いて、各溶媒抽出系を用いたブランクを分析して、１０，０００カウントを超える存在量を有する分子の化合物リストを生成した。次いで、これを除外リストとして用いて、抽出物の分析からバックグラウンド汚染化合物を除去した。次いで、「Ｆｉｎｄ  ｂｙ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｆｅａｔｕｒｅ」関数を用いて同じパラメータを用いて各抽出物を分析し、抽出物中の化合物の推定リストを生成した。以下の３つの正確な質量データベースに対して、化合物リストをスクリーニングした。この試験のために特に作成された治療上重要な既知の植物化合物のデータベース（８００種の化合物）、既知のメタボロミクスデータベース（２４，７６８種の化合物）および既知の法医学毒性学データベース（７，５０９種の化合物）。ソフトウェアパッケージ中のＦｉｎｄ  Ｆｏｒｍｕｌａ関数を用いて、同定されていない化合物の実験式を決定した。
【００９５】
統計分析：データは、少なくとも３つの独立した実験の平均値±ＳＥＭとして表されている。
【００９６】
液体抽出収率および定性的な植物化学的スクリーニング
【００９７】
様々な溶媒を使用して、Ｔ．フェルジナンジアナ植物抽出物（１ｇ）から、１８ｍｇ〜４８３ｍｇ（果実抽出物）および５８ｍｇ〜４７１ｍｇ（葉抽出物）の範囲の乾燥植物抽出物を得た（表１を参照）。
【００９８】
表１：Ｔ．フェルジナンジアナ抽出物の乾燥抽出物の質量、脱イオン水中での再懸濁後の濃度、定性的な植物化学的スクリーニングおよび抗酸化能
【表１】
2020518670.tif 000003
【００９９】
上記の表１では、＋＋＋は大きな応答を示し、＋＋は中程度の応答を示し、＋は軽微な応答を示し、−はアッセイで応答がなかったことを示す。ＫＦＷ＝Ｔ．フェルジナンジアナ果実水抽出物、ＫＦＭ＝Ｔ．フェルジナンジアナ果実メタノール抽出物、ＫＦＣ＝Ｔ．フェルジナンジアナ果実クロロホルム抽出物、ＫＦＨ＝Ｔ．フェルジナンジアナ果実ヘキサン抽出物、ＫＦＥ＝Ｔ．フェルジナンジアナ果実酢酸エチル抽出物、ＫＬＷ＝Ｔ．フェルジナンジアナ葉水抽出物、ＫＬＭ＝Ｔ．フェルジナンジアナ葉メタノール抽出物、ＫＬＣ＝Ｔ．フェルジナンジアナ葉クロロホルム抽出物、ＫＬＨ＝Ｔ．フェルジナンジアナ葉ヘキサン抽出物、ＫＬＥ＝Ｔ．フェルジナンジアナ葉酢酸エチル抽出物。抗酸化能は、ＤＰＰＨの還元によって決定され、抽出された植物材料１ｇ当たりのアスコルビン酸当量（ｍｇ）として表されている。
【０１００】
水抽出物およびメタノール抽出物では、低度から中程度の収率が得られたクロロホルム、酢酸エチルおよびヘキサンの対応物に比べて抽出物の収率が大幅に高かった。乾燥抽出物を１０ｍＬの脱イオン水（１％ＤＭＳＯを含有する）に再懸濁し、表１に示す濃度を得た。
【０１０１】
抗酸化物の含有量：植物抽出物（表１）の抗酸化能は、抽出された乾燥植物材料１グラム当たりアスコルビン酸当量０．４ｍｇ（ヘキサン葉抽出物）から最高６６０ｍｇ（メタノール果実抽出物）までの範囲であった。一般に、水抽出物およびメタノール抽出物は、対応するクロロホルム抽出物、ヘキサン抽出物および酢酸エチル抽出物よりも高い抗酸化能を有した。
【０１０２】
抗微生物活性：果実および葉の粗抽出物がＣ．パーフリンジェンスの増殖を阻害する能力を決定するために、ディスク拡散アッセイを使用して１０μＬの各抽出物をスクリーニングした。
【０１０３】
図１のチャートに示すように、スクリーニングされた１０種の抽出物のうち５種の抽出物（５０％）によって細菌増殖が強く阻害された。
【０１０４】
葉メタノール抽出物は、増殖の最も強力な阻害剤であり（阻害領域により判断）、阻害領域は１６±０．６ｍｍであった。これは、それぞれ１２．３±０．３および１３±１．０ｍｍの阻害領域を有するペニシリン（２μｇ）およびアンピシリン対照（１０μｇ）と比較して有利である。
【０１０５】
果実メタノール抽出物、ならびに葉水抽出物および葉酢酸エチル抽出物の両方も、Ｃ．パーフリンジェンスの増殖を良好に阻害し、≧９ｍｍの阻害領域を示した。
【０１０６】
典型的には、葉抽出物は、対応する果実抽出物の対応物よりも強力なＣ．パーフリンジェンス増殖の阻害剤であった。
【０１０７】
図１は、阻害領域（ｍｍ）として測定された、Ｃ．パーフリンジェンス環境分離株に対するＴ．フェルジナンジアナ果実および葉植物抽出物の増殖阻害活性のチャートを示す。ＫＦＷ＝Ｔ．フェルジナンジアナ果実水抽出物、ＫＦＭ＝Ｔ．フェルジナンジアナ果実メタノール抽出物、ＫＦＣ＝Ｔ．フェルジナンジアナ果実クロロホルム抽出物、ＫＦＨ＝Ｔ．フェルジナンジアナ果実ヘキサン抽出物、ＫＦＥ＝Ｔ．フェルジナンジアナ果実酢酸エチル抽出物、ＫＬＷ＝Ｔ．フェルジナンジアナ葉水抽出物、ＫＬＭ＝Ｔ．フェルジナンジアナ葉メタノール抽出物、ＫＬＣ＝Ｔ．フェルジナンジアナ葉クロロホルム抽出物、ＫＬＨ＝Ｔ．フェルジナンジアナ葉ヘキサン抽出物、ＫＬＥ＝Ｔ．フェルジナンジアナ葉酢酸エチル抽出物、ＰＣ＝ペニシリン（２μｇ）、ＡＭＰ＝アンピシリン（１０μｇ）。結果は、平均阻害領域±ＳＥＭとして表されている。
【０１０８】
Ｔ．フェルジナンジアナ抽出物に対するＭＩＣ値の決定により、抗微生物効果をさらに定量した（表２）。
【０１０９】
以下の表２は、Ａｒｔｅｍｉａ  ｎａｕｐｌｉｉバイオアッセイでのＴ．フェルジナンジアナ果実および葉抽出物の最小発育阻止濃度（μｇ／ｍＬ）と、ＬＣ５０値（μｇ／ｍＬ）とを示す（数字は、３連で決定された平均ＭＩＣおよびＬＣ５０値を示す。−は、阻害がなかったことを示す）。
【表２】
2020518670.tif 000004
【０１１０】
水抽出物およびメタノール抽出物（果実および葉の両方）、ならびに葉の酢酸エチル抽出物は、Ｃ．パーフリンジェンスの増殖を阻害するのに有効であり、ＭＩＣ値は一般に＜１０００μｇ／ｍｌ（＜１０μｇはディスクに含浸）であった。
【０１１１】
葉メタノール抽出物および葉酢酸エチル抽出物は特に強力であり、ＭＩＣ値はそれぞれ２０６μｇ／ｍＬ（約２．１μｇはディスクに注入）および１１７μｇ／ｍＬ（約１．２μｇはディスクに注入）であった。
【０１１２】
これらの結果は、それぞれ２μｇおよび１０μｇの用量で試験されたペニシリンおよびアンピシリン対照の増殖阻害活性と比較して良好である。
【０１１３】
果実メタノール抽出物も、Ｃ．パーフリンジェンスの強力な増殖阻害剤であった（ＭＩＣ値は７１６μｇ／ｍｌ）。
【０１１４】
効力は弱いが、果実水抽出物も良好な増殖阻害活性を示した（ＭＩＣ値は１１９２μｇ／ｍｌ）。
【０１１５】
対照的に、クロロホルム抽出物およびヘキサン抽出物の両方、ならびに果実酢酸エチル抽出物は、活性を示さなかったか、このアッセイでは低い効果を示すにとどまった。
【０１１６】
毒性の定量：アッセイでは、最初に２０００μｇ／ｍＬの用量で全抽出物をスクリーニングした（図２を参照）。
【０１１７】
バイオアッセイでは、参照毒素として重クロム酸カリウムも試験した。重クロム酸カリウム参照毒素は、死亡の発現が急速であり、曝露の最初の３時間以内にｎａｕｐｌｉｉの死を引き起こし、４〜５時間以内に１００％の死亡率を示した（結果は省略）。
【０１１８】
あらゆる水抽出物およびメタノール抽出物、ならびに葉酢酸エチル抽出物は、２４時間の時点で＞９０％の死亡率を示した。
【０１１９】
他の抽出物は、葉クロロホルム抽出物を除き、２４時間の時点で＜１０％の死亡率を示した。
【０１２０】
死亡の開始に対する毒素濃度の影響をさらに定量するために、抽出物を人工海水で連続希釈して、２４時間の時点でＡｒｔｅｍｉａ  ｆｒａｎｃｉｓｃａｎａ  ｎａｕｐｌｉｉバイオアッセイで一連の濃度にわたって試験した。Ａ．ｆｒａｎｃｉｓｃａｎａに対するＴ．フェルジナンジアナ抽出物のＬＣ５０値を表２に示す。全試験濃度で＜５０％の死亡率が認められたため、ヘキサン抽出物またはクロロホルム抽出物についても、果実酢酸エチル抽出物についてもＬＣ５０値は報告していない。
【０１２１】
このアッセイでは、Ａｒｔｅｍｉａ  ｎａｕｐｌｉｉに対してＬＣ５０が１０００μｇ／ｍｌを超える抽出物は非毒性であると定義されている。果実酢酸エチル抽出物のみが＜１０００μｇ／ｍｌのＬＣ５０値を有したため、他の抽出物はいずれも非毒性と考えられた。葉酢酸エチル抽出物のＬＣ５０値は＜１０００μｇ／ｍｌであるが、７６７μｇ／ｍｌの値は低度から中程度の毒性を示している。
【０１２２】
図２は、２４時間曝露後のＡｒｔｅｍｉａ  ｆｒａｎｃｉｓｃａｎａ  ｎａｕｐｌｉｉに対する、このオーストラリアの植物抽出物（２０００μｇ／ｍＬ）および重クロム酸カリウム対照（１０００μｇ／ｍＬ）の致死率のチャートを示す。ＫＦＷ＝Ｔ．フェルジナンジアナ果実水抽出物、ＫＦＭ＝Ｔ．フェルジナンジアナ果実メタノール抽出物、ＫＦＣ＝Ｔ．フェルジナンジアナ果実クロロホルム抽出物、ＫＦＨ＝Ｔ．フェルジナンジアナ果実ヘキサン抽出物、ＫＦＥ＝Ｔ．フェルジナンジアナ果実酢酸エチル抽出物、ＫＬＷ＝Ｔ．フェルジナンジアナ葉水抽出物、ＫＬＭ＝Ｔ．フェルジナンジアナ葉メタノール抽出物、ＫＬＣ＝Ｔ．フェルジナンジアナ葉クロロホルム抽出物、ＫＬＨ＝Ｔ．フェルジナンジアナ葉ヘキサン抽出物、ＫＬＥ＝Ｔ．フェルジナンジアナ葉酢酸エチル抽出物、ＰＣ＝重クロム酸カリウム対照、ＳＷ＝海水対照。結果は、平均死亡率（％）±ＳＥＭとして表されている。
【０１２３】
メタノール抽出物にはエタノール抽出物が含まれることが理解されよう。
【０１２４】
ＨＰＬＣ−ＭＳ  ＱＴＯＦ分析：葉メタノール抽出物および葉酢酸エチル抽出物は最も高い抗細菌効果を有したため（ＭＩＣにより決定）、追加の植物化学的分析の最も有望な抽出物と考えられた。葉メタノール抽出物および葉酢酸エチル抽出物の化合物プロファイルの決定にも、Ｔ．フェルジナンジアナ葉抽出物の分析に先に使用された最適化されたＨＰＬＣ−ＭＳ  ＱＴＯＦパラメータを使用した。それぞれ図３ａ、図３ｂおよび図４ａ、図４ｂに、メタノール抽出物および酢酸エチル抽出物の全化合物クロマトグラムを示す。
【０１２５】
Ｔ．フェルジナンジアナメタノール抽出物の陽イオン（図３ａ）および陰イオン（図３ｂ）全化合物クロマトグラムでは、極性化合物の溶出に対応するクロマトグラムの初期段階で複数のオーバーラップするピークが明らかにされた。
【０１２６】
抽出化合物のほとんどは、クロマトグラムの１２分以内に溶出した（約３２％のアセトニトリルに相当）。
【０１２７】
ただし、両クロマトグラムでの１２〜１６分、および２４〜３０分（５１〜６６％アセトニトリル）のいくつかの顕著なピークは、この抽出物中の化合物の極性の広範囲な広がりを示している。
【０１２８】
葉の酢酸エチル陽イオン（図４ａ）クロマトグラムは、明らかなピークは少ないものの、対応するメタノール抽出物と同様の溶出プロファイルを有した。
【０１２９】
このクロマトグラムでのピークの多くは、メタノール抽出物での同様の溶出量のピークに対応し、多くの化合物が両溶媒によって抽出されたことを示した。
【０１３０】
対照的に、葉の酢酸エチル陰イオンクロマトグラムでは、はるかに少ないピークが示された（図４ｂ）。
【０１３１】
ただし、このモードでの陰イオンのイオン化により、このクロマトグラムは陽イオンクロマトグラムよりも顕著なバックグラウンド吸収レベルを有し、一部のピークの信号がマスクされる可能性があった。
【０１３２】
図４ａは、Ｔ．フェルジナンジアナ葉酢酸エチル抽出物の２μｌ注入の陽イオンＲＰ−ＨＰＬＣ全化合物クロマトグラム（ＴＣＣ）を示す。図４ｂは、Ｔ．フェルジナンジアナ葉酢酸エチル抽出物の２μｌ注入の陰イオンＲＰ−ＨＰＬＣ全化合物クロマトグラム（ＴＣＣ）を示す。
【０１３３】
Ｔ．フェルジナンジアナ葉メタノール抽出物および／または酢酸エチル抽出物について、合計で５４の独特な質量シグナルが認められた（表３）。
【０１３４】
検出された５４の独特な分子量シグナルはいずれも、「Ｍｅｔｌｉｎ」メタボロミクス、法医学毒性学（Ａｇｉｌｅｎｔ）および植物化学物質（この研究室で開発された）データベースとの比較により推定的に同定された。
【０１３５】
１７種および８種の化合物は、それぞれメタノール抽出物および酢酸エチル抽出物にのみ検出された。残りの２９種の化合物は両抽出物に存在していた。
【０１３６】
タンニン化合物の多様性は注目に値し、葉メタノール抽出物および葉酢酸エチル抽出物では、１４種のタンニン化合物が推定的に同定された。
【０１３７】
特に、ケブル酸（図５ａ）、プロトカテク酸（図５ｂ）、エラグ酸脱水物（図５ｃ）、プニカラギン（図５ｄ）、エラグ酸（図５ｅ）、ケブラジン酸（図５ｆ）、カスタラギン（図５ｇ）、コリラギン（図５ｈ）、プニカリン（図５ｉ）、ケブリン酸（図５ｊ）、プニカリン（図５ｋ）、トリメチルエラグ酸異性体（図５Ｉおよび図５ｍ）が推定的に同定された。
【０１３８】
表３は、Ｔ．フェルジナンジアナ葉メタノール抽出物および酢酸エチル抽出物の定性的ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析、実験式の解明、ならびに化合物の推定的な同定を示している。
【表３】
2020518670.tif 000005
【表４】
2020518670.tif 000006
【０１３９】
上記の表３では、＋および−は、化合物が検出された関連するイオン化モードを指す。ＫＬＭ＝Ｔ．フェルジナンジアナ葉メタノール抽出物、ＫＬＥ＝Ｔ．フェルジナンジアナ酢酸エチル抽出物。
【０１４０】
Ｔ．フェルジナンジアナ葉メタノール抽出物およびＴ．フェルジナンジアナ葉酢酸エチル抽出物中のエラギタンニンの多様性は特に注目に値した。
【０１４１】
エラグ酸ならびに脱水およびトリメチル化誘導体からだけでなく、さらに複雑で高分子量の化合物（ｊ）ケブリン酸およびプニカリンも推定的に同定した。ケブリン酸およびプニカリンは、これらの抽出物のＣ．パーフリンジェンス増殖阻害活性に寄与する可能性がある。
【０１４２】
エラギタンニンは広範囲な細菌群の増殖の強力な阻害剤として同定されていると考えられており、ＭＩＣ値は６２．５μｇ／ｍｌと低い。
【０１４３】
Ｔ．フェルジナンジアナ抽出物は、Ａｒｔｅｍｉａ  ｆｒａｎｃｉｓｃａｎａに対して低い毒性を示すことが示されている。実際、葉の酢酸エチル抽出物（ＭＩＣ  ７６７μｇ／ｍＬ）を除いて、あらゆる抽出物のＬＣ５０値は１０００μｇ／ｍＬを十分に超えたため、非毒性である。
【０１４４】
バチルス・アントラシス（Ｂ．アントラシス）
【０１４５】
ディスク拡散アッセイを使用して、Ｂ．アントラシスの増殖を阻害する能力を調査した。
【０１４６】
果実および葉の抽出物の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）値を決定して、それらの効果を定量および比較した。
【０１４７】
Ａｒｔｅｍｉａ  ｆｒａｎｃｉｓｃａｎａ  ｎａｕｐｌｉｉバイオアッセイを使用して毒性を決定した。
【０１４８】
粗Ｔ．フェルジナンジアナ抽出物中の個々の成分の同定および特性評価のために、既知の非標的ガスクロマトグラフィー／質量分析−ＧＣ−ＭＳヘッドスペース分析（化合物データベースに対するスクリーニングを用いた）を使用して、最も強力なＴ．フェルジナンジアナ果実および葉抽出物を調査した。
【０１４９】
結果：Ｂ．アントラシスに対するディスク拡散アッセイでは、Ｔ．フェルジナンジアナ果実および葉の溶媒抽出物は良好な増殖阻害活性を示した。
【０１５０】
果実の酢酸エチル抽出物およびＴ．フェルジナンジアナ葉のメタノール抽出物は特に強力な増殖阻害剤であり、ＭＩＣ値はそれぞれ４５１および３７７μｇ／ｍＬであった。
【０１５１】
果実のメタノール抽出物およびクロロホルム抽出物、ならびに葉の水抽出物もまた、Ｂ．アントラシス増殖の良好な阻害剤であった（ＭＩＣ値はそれぞれ１８００および１４１４μｇ／ｍＬ）。
【０１５２】
果実の水抽出物および葉のクロロホルム抽出物は、低い阻害活性のみを有した。
【０１５３】
他の抽出物はいずれも、増殖阻害活性を完全に欠いていた。
【０１５４】
さらに、Ａｒｔｅｍｉａ  ｆｒａｎｓｉｓｃａｎａバイオアッセイでは、増殖阻害活性を有する抽出物はいずれも非毒性であり、ＬＣ５０値は＞１０００μｇ／ｍＬであった。最も活性の高い抽出物（果実の酢酸エチルおよび葉のメタノール）の非バイアスＧＣ−ＭＳ植物化学的分析では、Ｂ．アントラシスの増殖を阻害するこれらの抽出物の能力に寄与する可能性のあるいくつかの化合物が推定的に同定され、強調された。
【０１５５】
Ｔ．フェルジナンジアナ果実酢酸エチル抽出物および葉メタノール抽出物の低毒性、ならびにＢ．アントラシスに対するそれらの強力な増殖阻害生物活性は、炭疽の治療および予防のための薬剤としてのこれまで実現されていないそれらの適合性を示している。
【０１５６】
定性的な植物化学的試験：アルカロイド、アントラキノン、強心配糖体、フラボノイド、フェノール化合物、フィトステロイド、サポニン、タンニンおよびトリテルペノイドの存在について、抽出物の植物化学的分析を実施した。
【０１５７】
抗酸化能：改変されたＤＰＰＨフリーラジカル消去法を使用して、各試料の抗酸化能を評価した。
【０１５８】
アスコルビン酸（１ウェル当たり０〜２５μｇ）を参照として使用し、５１５ｎｍで吸光度を記録した。
【０１５９】
試験はいずれも各プレート上の対照と並行して完了し、いずれも３連で実施した。各抽出物について、ＤＰＰＨフリーラジカル消去能に基づく抗酸化能を決定し、抽出された元の植物材料１グラム当たりのアスコルビン酸当量（μｇ）として表した。
【０１６０】
抗細菌スクリーニング：環境バチルス・アントラシススクリーニング：バチルス・アントラシスの環境株を単離し、同定した。増殖試験はいずれも、改変ペプトン／酵母抽出物（ＰＹＥ）寒天：１ｇ／Ｌのペプトン、１．５ｇ／Ｌの酵母抽出物、７．５ｇ／ＬのＮａＣｌ、１ｇ／Ｌの過硫酸アンモニウム、２．４ｇ／ＬのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．５）および必要な場合は１６ｇ／Ｌのｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｇａｒを使用して実施した。インキュベーションは３０℃で行い、ストック培養物を継代培養し、４℃のＰＹＥ培地で維持した。
【０１６１】
抗微生物活性の評価：改変されたディスク拡散アッセイを使用して、全植物抽出物の抗微生物活性を決定した。要約すると、１０ｍＬの新鮮な栄養ブロス培地中で、１００μＬの試験細菌を細胞数が約１０８個／ｍＬになるまで増殖させた。
【０１６２】
１００μＬの体積の細菌懸濁液を栄養寒天プレート上に広げ、５ｍｍの滅菌濾紙ディスクを使用して、抗細菌活性について抽出物を試験した。ディスクに１０μＬの試験試料を含浸させ、乾燥させ、接種プレート上に置いた。プレートを４℃で２時間静置した後、３０℃で２４時間インキュベートした。
【０１６３】
最も近い整数ミリメートルまで阻害領域の直径を測定した。
【０１６４】
各アッセイは、少なくとも３連で実施した。この試験では平均値（±ＳＥＭ）が報告されている。ペニシリン（２μｇ）およびアンピシリン（１０μｇ）の標準ディスクを得、抗細菌活性の陽性対照として使用した。１０μＬの蒸留水を含浸させたフィルターディスクを陰性対照として使用した。
【０１６５】
最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）の決定：抽出物の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）は、前述のように決定した。
【０１６６】
要約すると、植物抽出物を脱イオン水に希釈し、様々な濃度にわたって試験した。ディスクに１０μＬの抽出物希釈液を含浸させ、乾燥させ、接種プレート上に置いた。
【０１６７】
上記で概説したようにアッセイを実施し、阻害領域対濃度のグラフをプロットした。ＭＩＣ値は線形回帰を使用して決定した。
【０１６８】
毒性スクリーニング：毒性スクリーニングの参照毒素：蒸留水（４ｍｇ／ｍＬ）中で重クロム酸カリウム（Ｋ２Ｃｒ２Ｏ７）を調製し、Ａｒｔｅｍｉａ  ｆｒａｎｃｉｓｃａｎａ  ｎａｕｐｌｉｉバイオアッセイに使用するために人工海水で連続希釈した。
【０１６９】
Ａｒｔｅｍｉａ  ｆｒａｎｃｉｓｃａｎａ  ｎａｕｐｌｉｉ毒性スクリーニング：改変されたＡ．ｆｒａｎｃｉｓｃａｎａ  ｎａｕｐｌｉｉ致死率アッセイを使用して毒性を試験した。要約すると、約４３（平均４３．２、ｎ＝１５５、ＳＤ  １４．５）のＡ．ｆｒａｎｃｉｓｃａｎａ  ｎａｕｐｌｉｉを含有する４００μＬの海水を４８ウェルプレートのウェルに加え、直ちにバイオアッセイに使用した。
【０１７０】
４００μＬの体積の参照毒素または希釈した植物抽出物をウェルに移し、人工光（１０００ルクス）下、２５±１℃でインキュベートした。各プレートについて陰性対照（４００μＬの海水）を３連で操作した。全処理を少なくとも３連で実施した。
【０１７１】
ウェルを定期的にチェックし、死亡数を計数した。
【０１７２】
１０秒以内に付属肢の動きが観察されなければ、ｎａｕｐｌｉｉは死亡したと考えられた。２４時間後、すべてのｎａｕｐｌｉｉを殺処分し、計数して、１ウェル当たりの総死亡率（％）を決定した。プロビット分析を使用して、各処理について９５％信頼限界を伴うＬＣ５０を計算した。
【０１７３】
非標的ＧＣ−ＭＳヘッドスペース分析：質量選択検出器システムを使用して、分離および定量を実施した。要約すると、このシステムは、ジビニルベンゼン／カルボワックス／ポリジメチルシロキサン（ＤＶＢ／ＣＡＲ／ＰＤＭＳ）を利用する固相マイクロ抽出繊維（ＳＰＭＥ）処理システムを取り付けたオートサンプラーを備えていた。５％フェニル、９５％ジメチルポリシロキサン（３０ｍ  ×  ０．２５ｍｍ  ｉｄ  ×  ０．２５ｕｍ）キャピラリーカラムを使用して、クロマトグラフィー分離を行った。０．７９ｍｌ／分の流速で、ヘリウム（９９．９９９％）をキャリアガスとして使用した。インジェクターの温度は２３０℃に設定した。
【０１７４】
サンプリングには、５秒間５００ｒｐｍでの撹拌相からなるＳＰＭＥサイクルを利用した。
【０１７５】
試料に繊維を１０分間曝露して吸収させ、２５０°Ｃで１分間かけて注入ポート内で脱着させた。初期カラム温度を３０°Ｃに２分間保持し、５分かけて１４０°Ｃに上昇させ、次いで３分かけて２７０°Ｃに上昇させ、分析中その温度に保持した。
【０１７６】
ＧＣ‐ＭＳ界面を２００°Ｃに維持し、スプリットレスモードで注入した後、１分間シグナルは得られなかった。質量分析計は、７０  ｅＶの電子イオン化モードで動作させた。次いで、総イオンカウント（ＴＩＣ）モードで分析対象物を記録した。ＴＩＣは、４５〜４５０ｍ／ｚの質量範囲を利用して、１分後、４５分間にわたり取得した。
【０１７７】
統計分析：データは、少なくとも３つの独立した実験の平均値±ＳＥＭとして表されている。
【０１７８】
結果
【０１７９】
液体抽出収率および定性的な植物化学的スクリーニング：様々な溶媒を用いて、様々な乾燥Ｔ．フェルジナンジアナ果実および葉植物材料（１ｇ）を抽出して、１８ｍｇ（果実ヘキサン抽出物）から４８３ｍｇ（果実水抽出物）の範囲の乾燥植物抽出物を得た（表４）。
【０１８０】
メタノール抽出物および水抽出物では、低度から中程度の収率が得られたクロロホルム、ヘキサンおよび酢酸エチルの対応物と比較して、乾燥抽出物の収率が大幅に高かった。乾燥抽出物を１０ｍＬの脱イオン水（１％ＤＭＳＯを含有する）に再懸濁し、表４に示す抽出物濃度を得た。
【０１８１】
表４：Ｔ．フェルジナンジアナ抽出物の乾燥抽出物の質量、脱イオン水中での再懸濁後の濃度、定性的な植物化学的スクリーニングおよび抗酸化能
【表５】
2020518670.tif 000007
【０１８２】
上記の表４では、＋＋＋は大きな応答を示し、＋＋は中程度の応答を示し、＋は軽微な応答を示し、−はアッセイで応答がなかったことを示す。ＦＷ＝Ｔ．フェルジナンジアナ果実水抽出物、ＦＭ＝Ｔ．フェルジナンジアナ果実メタノール抽出物、ＦＣ＝Ｔ．フェルジナンジアナ果実クロロホルム抽出物、ＦＨ＝Ｔ．フェルジナンジアナ果実ヘキサン抽出物、ＦＥ＝Ｔ．フェルジナンジアナ果実酢酸エチル抽出物、ＬＷ＝Ｔ．フェルジナンジアナ葉水抽出物、ＬＭ＝Ｔ．フェルジナンジアナ葉メタノール抽出物、ＬＣ＝Ｔ．フェルジナンジアナ葉クロロホルム抽出物、ＬＨ＝Ｔ．フェルジナンジアナ葉ヘキサン抽出物、ＬＥ＝Ｔ．フェルジナンジアナ葉酢酸エチル抽出物。抗酸化能は、ＤＰＰＨの還元によって決定され、抽出された植物材料１ｇ当たりのアスコルビン酸当量（ｍｇ）として表されている。
【０１８３】
抗微生物活性：Ｔ．フェルジナンジアナ果実および葉の粗植物抽出物がＢ．アントラシスの増殖を阻害する能力を決定するために、ディスク拡散アッセイを使用して各抽出物のアリコート（１０μＬ）をスクリーニングした。
【０１８４】
スクリーニングされた１０種の抽出物のうち７種の抽出物（７０％）によって細菌増殖が強く阻害された（図６）。
【０１８５】
葉メタノール抽出物は、Ｂ．アントラシス増殖の最も強力な阻害剤であり（阻害領域により判断）、阻害領域は１５．３±０．６ｍｍであった。これは、それぞれ８．３±０．６および１０．０±０．７の阻害領域を有するペニシリン（２μｇ）およびアンピシリン対照（１０μｇ）と比較して有利である。
【０１８６】
果実メタノール抽出物、ならびに葉酢酸エチル抽出物および葉水抽出物の両方も、Ｂ．アントラシスの増殖を良好に阻害し、≧８ｍｍの阻害領域を示した。
【０１８７】
一般に、葉抽出物は、それらの果実抽出物の対応物よりも強力なＢ．アントラシス増殖の阻害剤であった。
【０１８８】
Ｔ．フェルジナンジアナ抽出物に対するＭＩＣ値の決定により、抗微生物効果をさらに定量した（表５）。
【０１８９】
抽出物のほとんどはＢ．アントラシスの増殖を阻害するのに有効であり、いくつかの抽出物ではＭＩＣ値は＜１０００μｇ／ｍｌであった（＜１０μｇはディスクに含浸）。
【０１９０】
果実酢酸エチル抽出物および葉メタノール抽出物は特に強力であり、ＭＩＣ値はそれぞれ４５１μｇ／ｍＬ（約４．５μｇはディスクに注入）および３７７μｇ／ｍＬ（約３．８μｇはディスクに注入）であった。
【０１９１】
これらの結果は、それぞれ２μｇおよび１０μｇの用量で試験されたペニシリンおよびアンピシリン対照の増殖阻害活性と比較して良好である。
【０１９２】
果実メタノール抽出物も、強力なＢ．アントラシス増殖阻害剤であった（ＭＩＣ値は８７７μｇ／ｍｌ）。
【０１９３】
効力は弱いが、果実クロロホルム抽出物および葉水抽出物も良好な増殖阻害活性を示した（ＭＩＣ値はそれぞれ１８００および１４１４μｇ／ｍｌ）。
【０１９４】
対照的に、果実水抽出物およびヘキサン抽出物、ならびに葉のクロロホルム、ヘキサンおよび酢酸エチル抽出物は、活性を示さなかったか、このアッセイでは低い効果を示すにとどまった。
【０１９５】
以下の表５は、Ａｒｔｅｍｉａ  ｎａｕｐｌｉｉバイオアッセイでのＴ．フェルジナンジアナ果実および葉抽出物の最小発育阻止濃度（μｇ／ｍＬ）と、ＬＣ５０値（μｇ／ｍＬ）とを示している。
【表６】
2020518670.tif 000008
【０１９６】
毒性の定量：アッセイでは、最初に２０００μｇ／ｍＬの用量で全抽出物をスクリーニングした（図７を参照）。比較のために、バイオアッセイでは、参照毒素である重クロム酸カリウム（１０００μｇ／ｍＬ）も試験した。
【０１９７】
重クロム酸カリウム参照毒素は、死亡の発現が急速であり、曝露の最初の３時間以内にｎａｕｐｌｉｉの死を引き起こし、４〜５時間後に１００％の死亡率を示した（結果は示さず）。
【０１９８】
あらゆるメタノール抽出物および水抽出物は、葉酢酸エチル抽出物と同様に、２４時間の時点で＞９０％の死亡率を示した。葉クロロホルム抽出物を除き、残りの抽出物は２４時間の時点で＜１０％の死亡率を示した。
【０１９９】
死亡率の誘導に対する毒素濃度の影響をさらに定量するために、抽出物を人工海水で連続希釈して、２４時間の時点でＡｒｔｅｍｉａ  ｎａｕｐｌｉｉバイオアッセイで様々な濃度にわたって試験した。
【０２００】
表５は、Ａ．ｆｒａｎｃｉｓｃａｎａに対するＴ．フェルジナンジアナ抽出物のＬＣ５０値を示している。全試験濃度で５０％未満の死亡率が認められたため、クロロホルム抽出物およびヘキサン抽出物についても、酢酸エチル果実抽出物についてもＬＣ５０値は報告していない。
【０２０１】
このアッセイでは、Ａｒｔｅｍｉａ  ｎａｕｐｌｉｉに対してＬＣ５０が１０００μｇ／ｍｌを超える抽出物は非毒性であると定義されている。
【０２０２】
果実酢酸エチル抽出物のみが＜１０００μｇ／ｍｌのＬＣ５０を有し、他の抽出物はいずれも非毒性と考えられた。葉の酢酸エチル抽出物のＬＣ５０値は１０００μｇ／ｍｌ未満であるが、７６７μｇ／ｍｌの値は低度から中程度の毒性を示している。
【０２０３】
Ｔ．フェルジナンジアナ果実および葉抽出物の非標的ＧＣ−ＭＳヘッドスペース分析：果実酢酸エチル抽出物および葉メタノール抽出物はＢ．アントラシスに対して最大の増殖阻害効果を有したため（ＭＩＣにより決定、表５を参照）、追加の植物化学的分析の最も有望な抽出物と考えられた。最適化されたＧＣ−ＭＳパラメータを開発し、これらの抽出物の植物化学組成を検討するために使用した。
【０２０４】
それぞれ図８および図９に、果実酢酸エチル抽出物および葉メタノール抽出物について得られたガスクロマトグラムを示す。果実酢酸エチル抽出物では、約１５．１分（３，３−ジメチル−ヘキサン、相対存在量７．１％）、約１９．７分（２−メチル−２−フェニル−オキシラン、相対存在量１４．６％）、約２０．９分（ｍ−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルベンゼン、相対存在量２２％）および約２８．９分（３，５−ビス（１，１−ジメチルエチル）−フェノール、相対存在量１９．４％）にいくつかの主要なピークが認められた。１０〜２５分のクロマトグラムの中間段階では、多数のオーバーラップするピークも明らかであった。Ｔ．フェルジナンジアナ果実酢酸エチル抽出物について、合計で４２の独特な質量シグナルが認められた（表６）。これらの化合物についてはいずれも、推定的な実験式および同定を達成した。
【０２０５】
以下の表６は、Ｔ．フェルジナンジアナ果実酢酸エチル抽出物の定性的ＧＣ−ＭＳ分析、実験式の解明、および各化合物の推定的な同定を示している。
【表７】
2020518670.tif 000009
【表８】
2020518670.tif 000010
【０２０６】
葉メタノール抽出物（図９）のガスクロマトグラムでは、果実酢酸エチル抽出物（図８）よりも明らかなピークが実質的に少なかった。葉メタノール抽出物のクロマトグラムでは、合計で１９の独特な質量シグナルが認められた。
【０２０７】
約１１．３分（メトキシ−フェニル−オキシム、相対存在量２２．７％）、１３．７分（１−オクテン−３−オール、相対存在量２．４％）、１４．４分（２−（１，１−ジメチルエトキシ）−エタノール、相対存在量２７．７％）、１９．５分（２−メチル−２−フェニル−オキシラン、相対存在量１１．４％）および２１．５分（３，５−ジメチル−ベンズアルデヒド、相対存在量１５．６％）にいくつかの主要なピークが存在した。
【０２０８】
クロマトグラム全体を通して、いくつかの小さなピークも明らかであった。１９の独特な質量シグナルのうち、１６の化合物について推定的な実験式および同定を達成した。
【０２０９】
以下の表７は、Ｔ．フェルジナンジアナ葉メタノール抽出物の定性的ＧＣ−ＭＳ分析、実験式の解明、および各化合物の推定的な同定を示している。
【表９】
2020518670.tif 000011
【０２１０】
表７に示されている相対存在量は、全クロマトグラフピーク下の総面積の％として表されるピーク下の面積の尺度である。
【０２１１】
最も強力なＢ．アントラシス増殖阻害Ｔ．フェルジナンジアナ抽出物（果実酢酸エチル抽出物および葉メタノール抽出物）の定性的ＧＣ−ＭＳヘッドスペース分析では、多くの興味深い化合物が同定された。
【０２１２】
フラン化合物、１−（２−フラニル）−エタノン（図１０ａ）および２−（５−メチル−５−ビニルテトラヒドロフラン−２−イル）炭酸エチル（図１０ｂ）の存在は注目に値する。ニトロフランは、核酸合成の阻害を介して作用する抗微生物機構が特によく研究されている。
【０２１３】
同様に、合成フラン誘導体（ロダニン部分の付加により修飾された）は多剤耐性菌群の増殖の強力な阻害剤であり、いくつかの種に対して２μｇ／ｍＬという低いＭＩＣ値を示すことが知られている。
【０２１４】
Ｔ．フェルジナンジアナ抽出物に存在する２つのフラン誘導体の抗細菌活性に関する報告は知られておらず、この２つのフラン誘導体が本抽出物の有効性に寄与する可能性が高いことは妥当である。
【０２１５】
他の植物化学物質クラスもこれらの抽出物の増殖阻害特性に寄与する可能性が高い。植物化学的スクリーニングでは、ポリフェノール、フラボノイド、サポニンおよびテルペンがＴ．フェルジナンジアナ抽出物中に存在したことが示されている。
【０２１６】
これらの各試験では、Ｔ．フェルジナンジアナ抽出物中に、没食子酸（図５ｃ）およびエラグ酸（図５ｄ）およびそれらのメチル化誘導体、ケブル酸（図５ｅ）、ガロイルピロガロール（ｇａｌｌｏｙｌ  ｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ）（図５ｆ）、コリラゲン（図５ｇ）、プニカリン（図５ｈ）、カスタラギン（図５ｉ）ならびにケブラジン酸（図５ｊ）が検出された。これらのタンニンは、様々な細菌種に対して強力な広域スペクトルの増殖阻害活性を有する。
【０２１７】
ガロタンニンは、阻害特性が特によく報告されている。ガロタンニンは、細胞表面タンパク質との相互作用および細胞内酵素との相互作用を含む複数の機構を介して機能する。
【０２１８】
エラギタンニンも細胞タンパク質と相互作用し、細菌細胞壁の破壊を誘発する。
【０２１９】
レスベラトロール（図１０ｋ）およびグリコシル化レスベラトロール誘導体ピセイド（図１０Ｉ）、ジエチルスチルベストロールモノサルフェート（図１０ｍ）ならびにコンブレタスタチンＡ１（図１０ｎ）が推定的に同定された。コンブレタスタチンＡ１の同定は、コンブレタスタチンが癌細胞の増殖を阻害し、細胞内チューブリンと結合することによりアポトーシスを誘導し、それにより微小管形成を破壊する強力な能力により、近年多くの関心を集めていることから特に興味深いものであった。
【０２２０】
図１０（１０ａ〜ｎ）は、（ａ）１−（２−フラニル）−エタノン、（ｂ）２−（５−メチル−５−ビニルテトラヒドロフラン−２−イル）炭酸エチル、（ｃ）没食子酸、（ｄ）エラグ酸、（ｅ）ケブル酸、（ｆ）ガロイルピロガロール、（ｇ）コリラゲン、（ｈ）プニカリン、（ｉ）カスタラギン、（ｊ）ケブラジン酸、（ｋ）レスベラトロール、（Ｉ）ピセイド、（ｍ）ジエチルスチルベストロールモノサルフェート、（ｎ）コンブレタスタチンＡ１のそれぞれの化学構造を示している。
【０２２１】
いくつかの重要なテルペノイドもＴ．フェルジナンジアナ抽出物中に同定されている。
【０２２２】
Ｔ．フェルジナンジアナ葉酢酸エチル抽出物を除いて、本明細書で報告された知見は、Ｔ．フェルジナンジアナ抽出物がＡｒｔｅｍｉａ  ｆｒａｎｃｉｓｃａｎａ  ｎａｕｐｌｉｉに対して非毒性であり、ＬＣ５０値が実質的に＞１０００μｇ／ｍＬであることを示している。
【０２２３】
Ａｒｔｅｍｉａ  ｎａｕｐｌｉｉに対するＬＣ５０値が＞１０００μｇ／ｍＬである抽出物は、非毒性であると定義される。顕著な死亡率をもたらした葉酢酸エチル抽出物であっても、その中程度のＬＣ５０値のために低度から中程度の毒性と考えられた。
【０２２４】
毒性調査により、これらの抽出物がＢ．アントラシス増殖阻害剤として使用するのに安全であり得ることが示されているが、これらの抽出物の安全性をさらに評価するには、ヒト細胞株を使用した試験が必要である。
【０２２５】
ジアルジア増殖の阻害剤および／またはジアルジア症の制御としてのＴ．フェルジナンジアナ抽出物。
【０２２６】
特に非限定的な特定の例として、Ｔ．フェルジナンジアナ抽出物および純粋化合物によるジアルジア・デュオデナリス増殖の阻害を以下に記載する。本発明の１つ以上の形態は、ジアルジア・デュオデナリス（別名ジアルジア・ランブリス（Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉｓ）およびジアルジア・インテスティナリス）のみの制御または阻害に限定されるものではなく、他のジアルジアおよび微生物／細菌株の制御または阻害に限定されることを理解されたい。
【０２２７】
例として図１２に示す試験結果に示すように、未処理対照の百分率として測定された、ジアルジア・デュオデナリス栄養体の３つの株などに対するＴ．フェルジナンジアナ抽出物および純粋化合物の阻害活性を試験した。
【０２２８】
Ｇ．デュオデナリス増殖を阻害する能力について、強力なＧ．デュオデナリス増殖阻害活性を有するＴ．フェルジナンジアナ果実抽出物中に同定された１１種の化合物群を調査した。
【０２２９】
１１種の化合物のうち８種が、３つすべてのＧ．デュオデナリス株の増殖を阻害した。
【０２３０】
ＤＰＧＡは最も強力な抗ジアルジア化合物であり、ＩＣ５０値は１２６μΜ（３８ｍｇ／ｍＬ）と低値であった。特に、ＤＰＧＡは、メトロニダゾール感受性株について決定されたのと同等の効力でメトロニダゾール耐性Ｇ．デュオデナリス株を阻害した。
【０２３１】
さらに、アスコルビン酸と組み合わせて試験した場合、ＤＰＧＡの効力は、メトロニダゾール感受性Ｇ．デュオデナリス株については約１７μΜ（５ｍｇ／ｍＬ）、耐性株については４０μΜ（１２ｍｇ／ｍＬ）まで大幅に増強された。
【０２３２】
Ｔ．フェルジナンジアナタンニン（没食子酸およびケブル酸）もＧ．デュオデナリス増殖の阻害剤であり、アスコルビン酸と組み合わせて試験した場合、活性レベルが高まることが見出された。
【０２３３】
試験した化合物（およびアスコルビン酸との組合せ）はいずれも低い毒性を示し、化合物はいずれもほとんど違反なくＬｉｐｉｎｓｋｉのルールオブファイブに適合し、ジアルジア症の治療および予防のための薬物リードおよび化学療法としてのそれらの可能性を示した。
【０２３４】
増殖阻害活性を有するあらゆる抽出物中にプリン類似体（図１１ａ）が同定された。
【０２３５】
興味深いことに、ジアルジア・デュオデナリスは自らのプリンヌクレオチドまたはピリミジンヌクレオチドを合成することができず、核酸合成のためにヌクレオチドを供給するサルベージ経路に依存していることが多くの試験で報告されている。
【０２３６】
さらに、Ｇ．デュオデナリスはプリンヌクレオチド間の相互変換ができないため、複製のために正しいプリンヌクレオチドを必要とする。実際、プリン類似体はＧ．デュオデナリスの増殖を阻害し、ジアルジア症の潜在的な化学療法剤として注目されている。
【０２３７】
図１１ａから図１１ｋは、抗増殖性のＴ．フェルジナンジアナ果実メタノール抽出物およびＴ．フェルジナンジアナ果実水抽出物に対して報告されている化合物のそれぞれの化学構造を示している。（ａ）プリン、（ｂ）没食子酸、（ｃ）ケブル酸、（ｄ）リボノラクトン、（ｅ）アスコルビン酸、（ｆ）グルコノラクトン、（ｇ）グルコヘパトン酸（ｇｌｕｃｏｈｅｐａｔｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）−１，４−ラクトン、（ｈ）キナ酸、（ｉ）オイジャボン酸（ｅｕｊａｖｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、（ｊ）５−（４−ヒドロキシ−２，５−ジメチルフェノキシ）−２，２−ジメチル−ペンタン酸（ＨＭＤＰ）、（ｋ）２，３−ジヒドロキシフェニルＢ−Ｄ−グルコピラノシドウロン酸（ＤＰＧＡ）。
【０２３８】
生物活性Ｔ．フェルジナンジアナ抽出物中には大量の天然タンニンが認められ、特に没食子酸（図１１ｂ）およびケブル酸（図１１ｃ）が高レベルである。
【０２３９】
ガロタンニンは、細胞表面のリポタイコ酸とプロリンに富む膜タンパク質との結合を介して、およびグルコシルトランスフェラーゼ酵素を阻害することにより、複数の微生物種の増殖を阻害する。
【０２４０】
ラクトン部分としてＴ．フェルジナンジアナの抽出物中に存在するリボノラクトン（図１１ｄ）、アスコルビン酸（図１１ｅ）、グルコノラクトン（図１１ｆ）およびグルコヘパトン酸−１，４−ラクトン（図１１ｇ）は、現在使用されている抗ジアルジア化学療法薬の多くがラクトン含有化合物、特にラクトン置換ニトロイミダゾール（例えば、メトロニダゾール、セクロニダゾール、チニダゾール、オルニダゾールおよびアルベンダゾール）であることから価値がある。
【０２４１】
ラクトン部分を含有する化合物は、ジアルジアの脂質脱アシル化／再アシル化経路を遮断し、それによって増殖を阻害すると理解されている。ジアルジア種はｄｅ  ｎｏｖｏ経路によって脂質を合成することができないため、脱アシル化／再アシル化反応による膜および細胞脂質の合成のために宿主の消化管前駆体脂質を使用しなければならない。
【０２４２】
したがって、Ｔ．フェルジナンジアナ抽出物中のラクトン含有化合物は、脂質代謝経路の阻害を介してＧ．デュオデナリス増殖阻害に寄与すると理解することができる。
【０２４３】
Ｔ．フェルジナンジアナ抽出物中にはキナ酸（図１１ｈ）が認められた。置換キナ酸化合物は、Ｇ．デュオデナリス細胞内でロイシルｔＲＮＡシンターゼ活性を遮断することができる。各ｔＲＮＡに正しいアミノ酸を結合することによる遺伝コードの翻訳にはアミノアシル−ｔＲＮＡシンターゼが不可欠であるため、ロイシル−ｔＲＮＡシンターゼ活性が遮断されると、Ｌｅｕ−ｔＲＮＡ生成が無効になり、ひいてはタンパク質合成が阻害される。したがって、キナ酸は、Ｔ．フェルジナンジアナ果実抽出物の抗ジアルジア活性にも寄与すると理解することができる。
【０２４４】
オイジャボン酸（図１１ｉ）、５−（４−ヒドロキシ−２，５−ジメチルフェノキシ）−２，２−ジメチル−ペンタン酸（ＨＭＤＰ）（図１１ｊ）および２，３−ジヒドロキシフェニルＢ−Ｄ−グルコピラノシドウロン酸（ＤＰＧＡ）（図１１ｋ）もまた抗ジアルジア化合物である。
【０２４５】
さらに、Ｔ．フェルジナンジアナ果実は比較的高いアスコルビン酸含有量を有するため、アスコルビン酸が個々の成分の増殖阻害活性を変更および／または強化するのに有効である可能性がある。
【０２４６】
このため、化合物をいずれもアスコルビン酸と組み合わせて評価して、これらの成分の活性に対するその効果を定量した。
【０２４７】
Ｔ．フェルジナンジアナ果実の抽出収率および定性的な植物化学的スクリーニング。
【０２４８】
メタノールおよび脱イオン水を用いて１ｇの乾燥Ｔ．フェルジナンジアナ果実を抽出すると、比較的多量の乾燥抽出物が得られた（それぞれ、メタノール抽出物では３７０μｇ／ｍＬ、水抽出物では２９０μｇ／ｍＬ）。乾燥抽出物を１０ｍＬの脱イオン水（０．５％ＤＭＳＯを含有する）に再懸濁し、以下の表８に示す抽出物濃度を得た。
【０２４９】
【表１０】
2020518670.tif 000012
【０２５０】
定性的な植物化学的試験（表８）では、両抽出物が高レベルのフェノールおよびフラボノイド、ならびに中レベルから高レベルのタンニンを含有していたことが示された。低レベルから中レベルのサポニンも存在していた。低レベルのトリテルペンおよびアルカロイドが存在していた。
【０２５１】
また、いくつかの純粋なＴ．フェルジナンジアナ果実化合物は、３００μｇ／ｍＬの用量で試験した場合、Ｇ．デュオデナリス栄養体の増殖を顕著に阻害した（図１２）。
【０２５２】
ＤＰＧＡは特に優れた増殖阻害剤であり、栄養体の増殖を１００％遮断することが認められた。
【０２５３】
ＤＰＧＡは、感受性株に対するのと同様にメトロニダゾール耐性Ｇ．デュオデナリス株に対しても有効であり、ＤＰＧＡがメトロニダゾールとは異なる機構によりジアルジア増殖を阻害し得ることが示された。
【０２５４】
他の化合物のいくつかも、Ｇ．デュオデナリス栄養体の増殖を顕著に阻害したが、効果は低かった。没食子酸（約５０％の増殖阻害）、ケブル酸（約４０％阻害）、キナ酸（約３０％阻害）、オイジャボン酸（約２０％抑制）および５−（４−ヒドロキシ−２，５−ジメチルフェノキシ）−２，２−ジメチルペンタン酸（約２０％阻害）はそれぞれ、メトロニダゾール耐性株を含む３つのＧ．デュオデナリス株をいずれも阻害した。
【０２５５】
他の２つのＴ．フェルジナンジアナ果実化合物（アスコルビン酸は約１５％阻害、グルコヘパトン酸ラクトンは約３０％阻害）もメトロニダゾール感受性Ｇ．デュオデナリス株を顕著に阻害したが、メトロニダゾール耐性Ｇ．デュオデナリス株に関しては無効な阻害剤であった。
【０２５６】
プリン、リボラクトン（ｒｉｂｏｌａｃｔｏｎｅ）およびグルコノラクトンは、いずれのＧ．デュオデナリス株の増殖にも顕著な影響を及ぼさなかった。
【０２５７】
果実メタノール抽出物およびＴ．フェルジナンジアナ果実水抽出物は強力な阻害活性を示し、それぞれ（未処理対照と比較して）ジアルジアの増殖を１００％阻害した。
【０２５８】
Ｇ．デュオデナリスの増殖を５０％阻害するのに必要な濃度（ＩＣ５０）を決定することにより、抽出物の効果をさらに評価した。水抽出物はＧ．デュオデナリス増殖の特に優れた阻害剤であり、ＩＣ５０は１４３μｇ／ｍＬであった。メタノール抽出物もまた、効力は弱いが、優れた抗ジアルジア活性（７０４μｇ／ｍＬ）を示した。
【０２５９】
図１２：未処理対照の百分率として測定された、ジアルジア・デュオデナリス栄養体の３つの株に対するＴ．フェルジナンジアナ抽出物および純粋化合物の阻害活性。ＮＣ＝陰性対照、Ｍ＝メタノール抽出物、Ｗ＝水抽出物、１＝プリン、２＝没食子酸、３＝ケブル酸、４＝リボラクトン、５＝アスコルビン酸、６＝グルコノラクトン、７＝グルコヘパトン酸ラクトン、８＝キナ酸、９＝オイジャボン酸、１０＝ＨＭＤＰ、１１＝ＤＰＧＡ、ＰＣ＝メトロニダゾール対照（５０μｇ／ｍｌ）。結果は３連の内部決定（ｎ＝９）による３つの独立した実験の平均±ＳＥＭとして表されており、＊、＃およびΛは、それぞれヒツジＳ２、ＡＴＣＣ  ２０３３３３およびＡＴＣＣ  ＰＲＡ−２５１  Ｇ．デュオデナリス株について、未処理対照と有意に異なる結果を示す（ｐ＜０．０１）。
【０２６０】
純粋なＴ．フェルジナンジアナ化合物のＩＣ５０の定量
【０２６１】
Ｇ．デュオデナリス栄養体に対するＩＣ５０値を決定するために、純粋なＴ．フェルジナンジアナ化合物の抗増殖活性を様々な濃度にわたりさらに試験した（表９）。
【表１１】
2020518670.tif 000013
【０２６２】
ほとんどの化合物は、中程度から低度のＧ．デュオデナリス阻害活性のみをもたらし、ＩＣ５０値は＞１０００μｇ／ｍＬであった。ＤＰＧＡは、他の化合物よりも実質的に強力なＧ．デュオデナリス増殖の阻害剤であり、この様々な株に対するＩＣ５０値は３８〜７２μｇ／ｍＬ（１２６〜２３８μΜ）の範囲であった。興味深いことに、ＤＰＧＡはＴ．フェルジナンジアナ水抽出物およびＴ．フェルジナンジアナメタノール抽出物の比較的少量の成分であり、全抽出物の質量（結果は示さず）の実質的に０．１％未満を占め、したがって、ＤＰＧＡ単独では粗水性抽出物の強力な活性（１４３μｇ／ｍＬ）を説明できそうにない。代わりに、抽出物中の他の化合物が、抗増殖性Ｔ．フェルジナンジアナ化合物のうち１つ以上の活性を相乗させる可能性が高い。
【０２６３】
Ｔ．フェルジナンジアナ果実は非常に高いアスコルビン酸含有量を有するため、アスコルビン酸がＴ．フェルジナンジアナ化合物のうち１つ以上と相乗的に相互作用し得る可能性がある。このため、これらの化合物をアスコルビン酸と組み合わせてさらに調査して、起こりうる相互作用を同定した。
【０２６４】
Ｇ．デュオデナリス増殖に対するＴ．フェルジナンジアナ化合物とアスコルビン酸との組合せ効果
【０２６５】
Ｔ．フェルジナンジアナ抽出物成分とアスコルビン酸との間に様々な組合せ効果が観察された（表９）。
【０２６６】
特に注目すべきは、２つの組合せが相乗的な相互作用をもたらしたことである（没食子酸＋アスコルビン酸、ＤＰＧＡ＋アスコルビン酸）。いくつかの組合せでは、いずれかの化合物単独の活性と比較して、活性が約１０倍増加した。アスコルビン酸と組み合わせたＤＰＧＡに関する活性の増加はヒツジＳ２  Ｇ．デュオデナリス株に対して特に顕著であり、ＩＣ５０値は、単独での４７μｇ／ｍＬ（１５６μＭ）から、アスコルビン酸と組み合わせると５μｇ／ｍＬ（１７μＭ）に減少した。メトロニダゾール感受性参照Ｇ．デュオデナリス株（ＡＴＣＣ２０３３３３）に対して同様の効力の増加が記録され、ＩＣ５０は、単独での３８μｇ／ｍＬ（１２６μΜ）から、アスコルビン酸と組み合わせると６μｇ／ｍＬ（２０μＭ）に減少した。ＤＰＧＡ＋アスコルビン酸の組合せはまた、メトロニダゾール耐性Ｇ．デュオデナリス株（ＡＴＣＣ  ＰＲＡ−２５１）に対してはわずかに効力が弱いが、１２μｇ／ｍＬ（４０μΜ）の臨床的に重要なＩＣ５０値をもたらした。あらゆるＧ．デュオデナリス株に対する没食子酸＋アスコルビン酸の組合せについても、効力の実質的な増加が記録された。単独での１１５０μｇ／ｍＬ（６７９５μΜ）から、アスコルビン酸と組み合わせた際の１４６μｇ／ｍＬ（８５８μΜ）までのヒツジＳ２株に対するＩＣ５０の減少は、顕著であった。この組合せは、他のＧ．デュオデナリス株に対しても相乗的であった。興味深いことに、ＩＣ５０値はメトロニダゾール感受性Ｇ．デュオデナリス株とメトロニダゾール耐性Ｇ．デュオデナリス株との間で類似しており、いずれもＩＣ５０値は約２５０μｇ／ｍＬ（１４６９μΜ）であった。
【０２６７】
他の組合せの大部分は相加効果をもたらした。したがって、これらの組合せは、単独で使用した際のいずれの成分よりも増強した効果をもたらすため、ジアルジア症の治療にも有益である可能性がある。
【０２６８】
その他の組合せ（グルコヘパトン酸ラクトン）は非相互作用的であった。この組合せは、いずれかの化合物単独を上回る顕著な治療上の利点をもたらすことはないが、成分は互いの効果に拮抗しないため、２つの成分を同時投与しても有害ではないと考えられる。特に、どの組合せも拮抗作用を生じなかった。
【０２６９】
没食子酸とアスコルビン酸との相乗的な相互作用
【０２７０】
没食子酸／アスコルビン酸の組合せが相乗的な相互作用をもたらしたことから（表９）、様々な没食子酸：アスコルビン酸比にわたるアイソボログラム分析を使用してこの組合せをさらに検討して、相乗効果を得るための理想的な比率を特定した。
【０２７１】
３つのＧ．デュオデナリス株いずれに対しても同様の感受性プロファイルが明らかであった。
【０２７２】
いずれの場合にも、データはアスコルビン酸軸よりも没食子酸軸と密接に相関し、抗増殖活性が没食子酸に最も依存していることが示された。
【０２７３】
ただし、没食子酸を３０〜６０％含む比率は相乗的な応答を誘発し、それよりも低い（≦２０％）および高い比率（≦７０％）は一般に相加効果をもたらした。
【０２７４】
これらの応答は個々の成分単独のいずれかよりも大きいため、ジアルジア症の治療に有益であろう。
【０２７５】
ΣＦＩＣ５０式を用いて相乗効果が決定されたため、相乗効果は、個々の成分単独の少なくとも４倍超の応答として定義される。したがって、相乗的応答を誘発する比率は、他の比率と比較して、抗ジアルジア療法としてはるかに好ましい。このため、ジアルジア症治療のための理想的な没食子酸／アスコルビン酸比は、好ましくは、３０〜６０％の没食子酸を含有する組合せを含むことができる。
【０２７６】
図１３ａから図１３ｃに示すように、（ａ）ヒツジＳ２  Ｇ．デュオデナリス株、（ｂ）参照メトロニダゾール感受性（ＡＴＣＣ２０３３３３）Ｇ．デュオデナリス株および（ｃ）参照メトロニダゾール耐性（ＡＴＣＣ  ＰＲＡ−２５１）Ｇ．デュオデナリス株に対して様々な比率で試験した没食子酸とアスコルビン酸との組合せのアイソボログラム。ＧＡ＝没食子酸、ＡＡ＝アスコルビン酸。結果は、それぞれ３回の繰り返しから構成される３つの独立した実験の平均ＦＩＣ５０値を表す（すなわち、各比率について９つのデータポイント）。０．５／０．５ラインの上または下にある比率は、相乗的であると考えられる（ΣＦＩＣ５０≦０．５）。０．５／０．５と１．０／１．０のラインの間の点はいずれも相加的であると考えられる（ΣＦＩＣ５０＞０．５〜１．０）。
【０２７７】
２，３−ジヒドロキシフェニル−Ｂ−グルコピラノシドウロン酸（ＤＰＧＡ）とアスコルビン酸との相乗的な相互作用
【０２７８】
ＤＰＧＡもまた、アスコルビン酸と組み合わせて試験すると、相乗的なＧ．デュオデナリス増殖阻害をもたらした（表９）。
【０２７９】
増殖阻害活性とＤＰＧＡ軸との関連は、没食子酸よりもさらに顕著であり（図１４ａ〜図１４ｃ）、この化合物が、この組合せの抗増殖活性にとってアスコルビン酸よりも重要であることが示された。これは、アスコルビン酸のＩＣ５０の約５％としてＤＰＧＡのＩＣ５０を報告する化合物のＩＣ５０データと一致している（表９）。したがって、成分を別個に試験した場合、ＤＰＧＡはアスコルビン酸の約２０倍強力なＧ．デュオデナリス増殖阻害剤である。興味深いことに、≦６０％のＤＰＧＡを含むあらゆる組合せは、メトロニダゾール感受性Ｇ．デュオデナリス株の増殖を相乗的に阻害した（図１４ａおよび図１４ｂ）。このため、ＤＰＧＡの効果を効果的に相乗させるには、≧４０％のアスコルビン酸が必要である。
【０２８０】
メトロニダゾール耐性Ｇ．デュオデナリス株に対する増殖阻害アイソボログラムは、異なる傾向を示している（図１４ｃ）。組合せ比の大部分は、この株に対して相加的な相互作用をもたらした。組合せの増殖阻害活性の方がいずれかの成分単独の増殖阻害活性よりも大きいため、これらの比率は、ジアルジア症の治療に依然として有益であろう。ただし、これらの比率では治療効果は増加するが、増加は比較的わずかである。対照的に、３０〜５０％のＤＰＧＡを含む組合せでは、効力が実質的に増加した（単独で試験した化合物の合計と比較して効力が≧４倍増加した）。したがって、メトロニダゾール耐性Ｇ．デュオデナリス株に対するジアルジア症の治療および予防のための理想的な相乗的な比率は、アスコルビン酸と組み合わせた場合、３０〜５０％のＤＰＧＡであることが特定された。
【０２８１】
図１４ａから図１４ｃは、（ａ）ヒツジＳ２  Ｇ．デュオデナリス株、（ｂ）参照メトロニダゾール感受性（ＡＴＣＣ２０３３３３）Ｇ．デュオデナリス株および（ｃ）参照メトロニダゾール耐性（ＡＴＣＣ  ＰＲＡ−２５１）Ｇ．デュオデナリス株に対して様々な比率で試験したＤＰＧＡとアスコルビン酸との組合せのアイソボログラムを示す。ＤＰＧＡ＝２，３−ジヒドロキシフェニル−Ｂ−グルコピラノシドウロン酸、ＡＡ＝アスコルビン酸。結果は、それぞれ３回の繰り返しから構成される３つの独立した実験の平均ＦＩＣ５０値を表す（すなわち、各比率について９つのデータポイント）。０．５／０．５ラインの上または下にある比率は、相乗的であると考えられる（ΣＦＩＣ５０≦０．５）。０．５／０．５と１．０／１．０のラインの間の点はいずれも相加的であると考えられる（ΣＦＩＣ５０＞０．５〜１．０）。
【０２８２】
毒性の定量
【０２８３】
Ａｒｔｅｍｉａ  ｎａｕｐｌｉｉ致死率アッセイ（ＡＬＡ）およびヒト皮膚線維芽細胞アッセイ（ＨＤＦ）の両方を使用して、様々な濃度にわたって全抽出物をスクリーニングした（表１０）。
【０２８４】
比較のために、参照毒素である重クロム酸カリウム（１０００μｇ／ｍＬ）も試験した。プリン、リボラクトン、グルコノラクトン、グルコヘパトン酸ラクトン、キナ酸、オイジャボン酸、ＨＭＤＰまたはＤＰＧＡについては、両アッセイで試験したこれらの化合物の全濃度で５０％未満の死亡率が認められたため、ＬＣ５０値は報告していない。
【０２８５】
したがって、これらの化合物はいずれも非毒性と考えられた。対照的に、没食子酸、ケブル酸およびアスコルビン酸は、２４時間の曝露後に両アッセイで明らかな毒性を示した。しかし、本発明者らの試験で検出された毒性が一般に酸性成分と相関していたことは注目に値する。酸性ｐＨはミトコンドリアタンパク質の合成速度を抑制する可能性があり、Ａｒｔｅｍｉａ  ｎａｕｐｌｉｉおよびＨＤＦ細胞の増殖および発達に致命的になる可能性がある。実際、過去の試験では、アスコルビン酸を多く含む抽出物が誤った毒性の判定を与える可能性があることが報告されている。したがって、このアッセイでは、これらの化合物の毒性が過大評価されている可能性がある。
【０２８６】
表１０：Ａｒｔｅｍｉａ致死率アッセイ（ＡＬＡ）およびヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）細胞毒性アッセイにより決定された、Ｔ．フェルジナンジアナ化合物の単独およびアスコルビン酸との組合せの毒性。
【表１２】
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【０２８７】
治療指数および薬物様特性
【０２８８】
Ｔ．フェルジナンジアナ化合物の治療剤としての適合性を決定するために、Ｌｉｐｉｎｓｋｙのルールオブファイブを参照して、それらの薬物様特性を検討した。
【０２８９】
化合物はいずれも、≦１０のＨ結合アクセプター、＜５００Ｄａの分子量および≦５のオクタノール水分配係数を有した。また、化合物の大部分は、≦５のＨ結合ドナーを有した。
【０２９０】
このルールに違反した化合物（ケブル酸およびＤＰＧＡのみ）には、単独およびアスコルビン酸との組合せの両方で最大のＧ．デュオデナリス抗増殖活性を有する化合物（ＤＰＧＡ）が含まれていた。ＤＰＧＡおよびケブル酸はともに６つのＨ結合ドナーを有するため、１つのＨ結合ドナーだけＬｉｐｉｎｓｋｙのルールオブファイブを超えている。ただし、他のあらゆるカテゴリーでのそれらの適合性から、これらの化合物は良好な薬物様特性を有すると考えられた。
【０２９１】
また、純粋化合物および組合せについて、治療指数（Ｔｌ）を計算した。プリン、リボラクトン、グルコノラクトン、グルコヘパトン酸ラクトン、キナ酸、オイジャボン酸、ＨＭＤＰおよびＤＰＧＡについては、これらの化合物はいずれの試験濃度でも毒性を示さなかったため、Ｔｌを計算することができなかった。しかし、ＤＰＧＡを除いて、これらの化合物は一般に低いＧ．デュオデナリス抗増殖活性しか示さなかったため、治療にはほとんど役立たなかった。ＤＰＧＡの場合、この明らかな毒性の欠如は、この化合物が高いＴｌを有し、したがって有望な薬物リードであることを示している。ＤＰＧＡを試験した用量範囲を拡張して、さらに高い濃度を試験してＬＣ５０を決定するならば、Ｔｌは比較的高いであろう。
【０２９２】
没食子酸のＴｌには興味深い傾向が認められた。この化合物単独のＴｌは、その明らかな毒性のために比較的低く（０．３）、没食子酸単独の治療可能性が限られている可能性があることが示された。しかし、没食子酸のＴｌをアスコルビン酸と組み合わせて決定すると、実質的に２．３に増加した。したがって、アスコルビン酸はＤＰＧＡと組み合わせて二重の利点をもたらす可能性がある。アスコルビン酸は、ＤＰＧＡの抗増殖活性を相乗するとともに、細胞をその毒性から保護し得る。
【表１３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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