(57)【要約】本明細書では、主鎖、およびスペーサーを介してそれに共有結合により結合している少なくとも１つのコラーゲン結合単位を有する少なくとも１つの分岐または非分岐ペプチドを含むバイオコンジュゲート、ならびにその使用方法が提供される。本開示の一実施形態は、外科的バイパス術の成功率を改善し、かつ／またはその失敗を低減するための方法および関連組成物を提供する。バイパスグラフトは、冠動脈疾患（ＣＡＤ）および末梢動脈疾患（ＰＡＤ）の両方における動脈閉塞の処置の一形態として使用される。
2020526497.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリカンおよびそれに共有結合により結合している、式（Ｉ）：
（（Ｘ１）ｍＸ２）ｎＸ３−Ｌ
（Ｉ）
［式中、
Ｘ１は、コラーゲン結合単位を含むアミノ酸配列であり、
Ｘ２およびＸ３は、独立に、存在しないか、１〜１５個のアミノ酸を有するアミノ酸配列であるか、または部分
【化１７】
2020526497.tif 000027
（式中、ｐおよびｑは、それぞれ独立に、１〜１０の整数である）であり、
Ｌは、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、アルギニン（Ｒ）およびリシン（Ｋ）からなる群から選択される５〜２０個のアミノ酸のスペーサー、または部分
【化１８】
2020526497.tif 000028
であり、
ただし、Ｌは、前記グリカンから最初の５個のアミノ酸の中に少なくとも２つのアルギニン（Ｒ）を含み、Ｌは、前記ペプチドを前記グリカンに共有結合により結合する、必要に応じた連結部分をさらに含み、
ｍは、１または２であり、
ｎは、１または２である］
の少なくとも１つの結合単位を含むバイオコンジュゲート。
【請求項２】
Ｌが、ＧＳＧＲＲ（配列番号：）、ＧＳＧＳＧＲＲ（配列番号：）、ＧＳＧＳＧＳＲＲ（配列番号：）、ＧＳＧＳＧＳＧＲＲ（配列番号：）、ＧＳＧＳＧＳＧＳＲＲ（配列番号：）、ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＲＲ（配列番号：）、ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＲＲ（配列番号：）、ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＲＲ（配列番号：）、ＧＳＲＲＧＳ（配列番号：）、ＧＳＧＲＲＧＳＧ（配列番号：）、ＧＳＧＲＲＲＧＳＧ（配列番号：）、ＧＳＧＲＲＲ（配列番号：）、ＧＳＧＲＲＲＲ（配列番号：）、ＧＳＧＳＧＳＲＲＲ（配列番号：）、ＧＳＧＳＧＳＲＲＲＲ（配列番号：）、ＧＳＧＳＧＳＲＲＲＲＲ（配列番号：）、ＧＳＧＳＧＳＲＲＲＲＲＲ（配列番号：）、およびＧＳＧＳＧＳＧＳＲＲＲ（配列番号：）からなる群から選択される、請求項１に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項３】
グリカンおよびそれに共有結合により結合している、式（Ｉ）の１〜約１０個の結合単位を含む、請求項１に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項４】
グリカンおよびそれに共有結合により結合している、式（Ｉ）の２〜約８個の結合単位を含む、請求項１に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項５】
グリカンおよびそれに共有結合により結合している、式（Ｉ）の約５個の結合単位を含む、請求項１に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項６】
Ｘ２が、ＧＳＧを含むアミノ酸配列であり、
Ｘ３が、ＸＲＲを含むアミノ酸配列であり、Ｘが、存在しないか、またはアミド結合を形成することができる側鎖を有する天然もしくは非天然アミノ酸である、
請求項１〜５のいずれかに記載のバイオコンジュゲート。
【請求項７】
Ｘ２が、ＧＳＧを含むアミノ酸配列であり、
Ｘ３が、ＲＲまたはＫＲＲを含むアミノ酸配列である、
請求項１〜６のいずれかに記載のバイオコンジュゲート。
【請求項８】
式（Ｉ）の前記結合単位が、Ｘ１−ＧＳＧＳＧＳＲＲ−である、先行する請求項のいずれかに記載のバイオコンジュゲート。
【請求項９】
Ｘ１が、３〜約２０個のアミノ酸を含む、先行する請求項のいずれかに記載のバイオコンジュゲート。
【請求項１０】
Ｘ１が、３〜約１０個のアミノ酸を含む、先行する請求項のいずれかに記載のバイオコンジュゲート。
【請求項１１】
Ｘ１が、アミノ酸配列ＧＱＬＹＫＳＩＬＹ（配列番号：）を含む、先行する請求項のいずれかに記載のバイオコンジュゲート。
【請求項１２】
Ｘ１が、アミノ酸配列ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹ（配列番号：）を含む、先行する請求項のいずれかに記載のバイオコンジュゲート。
【請求項１３】
Ｘ１が、アミノ酸配列ＧＥＬＹＫＳＩＬＹ（配列番号：）を含む、先行する請求項のいずれかに記載のバイオコンジュゲート。
【請求項１４】
Ｘ１が、アミノ酸配列ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＱＬＹＫＳＩＬＹ（配列番号：）を含む、先行する請求項のいずれかに記載のバイオコンジュゲート。
【請求項１５】
Ｘ２が、３〜５個のアミノ酸を含み、Ｘ３が、２〜４個のアミノ酸を含む、先行する請求項のいずれかに記載のバイオコンジュゲート。
【請求項１６】
前記グリカンが、約１〜約５０％の機能化、または約５〜約３０％の機能化、または約２５％の機能化を含み、機能化パーセント（％）が、式（Ｉ）の前記結合単位で機能化されている前記グリカン上の二糖単位のパーセントによって決定される、先行する請求項のいずれかに記載のバイオコンジュゲート。
【請求項１７】
前記グリカンが、約２．５％の機能化、または約５％の機能化、または約８％の機能化、または約１０％の機能化、または約１６％の機能化、または約３２％の機能化を含み、機能化パーセント（％）が、式（Ｉ）の前記結合単位で機能化されている前記グリカン上の二糖単位のパーセントによって決定される、請求項１６に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項１８】
前記グリカンが、ヘパリンまたはその誘導体である、先行する請求項のいずれかに記載のバイオコンジュゲート。
【請求項１９】
共有結合によりそれに結合している、式（Ｉ）の約８個の結合単位を含む、先行する請求項のいずれかに記載のバイオコンジュゲート。
【請求項２０】
共有結合によりそれに結合している、式（Ｉ）の約５個の結合単位を含む、先行する請求項のいずれかに記載のバイオコンジュゲート。
【請求項２１】
前記結合単位が、ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧＳＧＳＲＲ−ＮＨＮＨ−（配列番号：）である、請求項１に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項２２】
前記結合単位が、ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＱＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧＳＧＳＲＲ−ＮＨＮＨ−（配列番号：）である、請求項１に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項２３】
前記結合単位が、ＧＱＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧＳＧＳＲＲ−ＮＨＮＨ−（配列番号：）である、請求項１に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項２４】
前記結合単位が、（ＧＱＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧ）２−ＫＳＧＳＲＲ−ＮＨＮＨ−である、請求項１に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項２５】
ＧＱＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧＲＲＧＳＧ（配列番号：）に、１：８の比でコンジュゲートされたヘパリンを含むバイオコンジュゲート。
【請求項２６】
ＧＱＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧＲＲＧＳＧ（配列番号：）に１：５の比でコンジュゲートされたヘパリンを含むバイオコンジュゲート。
【請求項２７】
ヘパリンが、Ｃ末端グリシンを介して前記ペプチドのそれぞれにコンジュゲートされている、先行する請求項のいずれかに記載のバイオコンジュゲート。
【請求項２８】
約４０μｇ／ｍＬ未満または約２０μｇ／ｍＬ未満のＥＣ５０で、Ｉ型コラーゲンに結合する、先行する請求項のいずれかに記載のバイオコンジュゲート。
【請求項２９】
前記連結部分が、ヒドラジド部分（−ＮＨＮＨ−）を含む、先行する請求項のいずれかに記載のバイオコンジュゲート。
【請求項３０】
式（ＩＩ）：
（（Ｘ１）ｍＸ２）ｎＸ３−Ｌ
（ＩＩ）
［式中、
Ｘ１は、コラーゲン結合単位を含むアミノ酸配列であり、
Ｘ２およびＸ３は、独立に、存在しないか、１〜１５個のアミノ酸を有するアミノ酸配列であるか、または部分
【化１９】
2020526497.tif 000029
（式中、ｐおよびｑは、それぞれ独立に、１〜１０の整数である）であり、
Ｌは、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、アルギニン（Ｒ）およびリシン（Ｋ）からなる群から選択される５〜２０個のアミノ酸のスペーサー、または部分
【化２０】
2020526497.tif 000030
であり、
ただし、Ｌは、末端から最初の５個のアミノ酸の中に少なくとも２つのアルギニン（Ｒ）を含み、Ｌは、必要に応じた連結部分をさらに含み、
ｍは、１または２であり、
ｎは、１または２であり、
ただし前記結合単位は、ＲＲＲＫＫＩＱＧＲＳＫＲ（配列番号：）でもＲＲＧＧＲＫＷＧＳＦＥＧ（配列番号：）でもない］
の結合単位。
【請求項３１】
Ｘ２が、グリシン（Ｇ）およびセリン（Ｓ）を含むアミノ酸配列であり、
Ｘ３が、グリシン（Ｇ）およびセリン（Ｓ）を含むアミノ酸配列である、
請求項３０に記載の結合単位。
【請求項３２】
Ｘ２が、ＧＳＧを含むアミノ酸配列であり、
Ｘ３が、ＲＲ、ＫＲＲ、ＧＳＧ、またはＫＧＳＧ（配列番号：）を含むアミノ酸配列である、
請求項３０に記載の結合単位。
【請求項３３】
Ｘ１が、３〜約２０個のアミノ酸を含む、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の結合単位。
【請求項３４】
Ｘ１が、３〜約１０個のアミノ酸を含む、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の結合単位。
【請求項３５】
Ｘ１が、アミノ酸配列ＧＱＬＹＫＳＩＬＹ（配列番号：）を含む、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の結合単位。
【請求項３６】
Ｘ１が、アミノ酸配列ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹ（配列番号：）を含む、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の結合単位。
【請求項３７】
Ｘ１が、５〜１０個のアミノ酸を含み、Ｘ２が、２〜５個のアミノ酸を含み、Ｘ３が、３〜５個のアミノ酸を含む、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の結合単位。
【請求項３８】
アミノ酸配列ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧＳＧＳＲＲ（配列番号：）またはＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧＳＧＳＲＲ−ＮＨＮＨ２（配列番号：）を有するペプチド。
【請求項３９】
アミノ酸配列ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＱＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧＳＧＳＲＲ（配列番号：）またはＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＱＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧＳＧＳＲＲ−ＮＨＮＨ２（配列番号：）を有するペプチド。
【請求項４０】
アミノ酸配列ＧＱＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧＳＧＳＲＲ（配列番号：）またはＧＱＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧＳＧＳＲＲ−ＮＨＮＨ２（配列番号：）を有するペプチド。
【請求項４１】
アミノ酸配列（ＧＱＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧ）２−ＫＳＧＳＲＲまたは（ＧＱＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧ）２−ＫＳＧＳＲＲ−ＮＨＮＨ２を有するペプチド。
【請求項４２】
アミノ酸配列ＧＱＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧＲＲＧＳＧ（配列番号：）を有するペプチド。
【請求項４３】
末梢動脈疾患を処置することを必要とする患者の末梢動脈疾患を処置するための方法であって、有効量の請求項１〜２９のいずれか一項に記載のバイオコンジュゲートを投与することを含む、方法。
【請求項４４】
線維症を処置することを必要とする患者の線維症を処置するための方法であって、有効量の請求項１〜２９のいずれか一項に記載のバイオコンジュゲートを投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、その開示全体が参照によって本明細書に組み込まれる、２０１７年７月７日出願の米国仮特許出願第６２／５３０，０４７号の利益を３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下で主張する。
【０００２】
本明細書では、主鎖、およびスペーサーを介してそれに共有結合により結合している少なくとも１つのコラーゲン結合単位を有する少なくとも１つの分岐または非分岐ペプチドを含むバイオコンジュゲートが提供される。
【背景技術】
【０００３】
組織内で、細胞は、バイオコンジュゲート、コラーゲン、ヒアルロン酸、ラミニン、フィブロネクチンなどのような様々な巨大分子を含有する細胞外マトリックス（ＥＣＭ）によって取り囲まれている。哺乳動物では、バイオコンジュゲートは、細胞外マトリックスの主な構成成分であり、その場でバイオコンジュゲートは、他のバイオコンジュゲート、ヒアルロン酸、および線維マトリックスタンパク質（例えばコラーゲン）と大きい複合体を形成する。哺乳動物が加齢し、ある疾患状態にあると、身体のある特定のエリアにおける（例えば、滑膜関節、硝子体液、脊椎円板、皮膚などにおける）細胞外マトリックスが劣化して、例えば、様々な形態の関節炎、失明などの望ましくない症状を引き起こすおそれがある。さらに、一部の組織傷害、例えば血管傷害、角膜傷害および皮膚創傷によって、細胞外マトリックスおよび／またはコラーゲンを含めたその構成成分が露出する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
驚くべきことに、グリカンとペプチドの間にある特定の連結を有するバイオコンジュゲートは、ある特定のペプチドのそれらの標的への結合の増加をもたらすことが見出された。分岐ペプチドを有することによって、結合が改善されることも見出された。具体的には、ある特定のスペーサーを有するバイオコンジュゲートによって、コラーゲン結合活性が増強された。
【０００５】
本開示は、グリカンおよびそれに共有結合により結合している、式（Ｉ）：
（（Ｘ１）ｍＸ２）ｎＸ３−Ｌ
（Ｉ）
［式中、
Ｘ１は、コラーゲン結合単位を含むアミノ酸配列であり、
Ｘ２およびＸ３は、独立に、存在しないか、１〜１５個のアミノ酸を有するアミノ酸配列であるか、または部分
【化１】
2020526497.tif 000003
（式中、ｐおよびｑは、それぞれ独立に、１〜１０の整数である）であり、
Ｌは、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、アルギニン（Ｒ）およびリシン（Ｋ）からなる群から選択される５〜２０個のアミノ酸のスペーサー、または部分
【化２】
2020526497.tif 000004
であり、
ただし、Ｌは、グリカンから最初の５個のアミノ酸の中に少なくとも２つのアルギニン（Ｒ）を含み、Ｌは、ペプチドをグリカンに共有結合により結合する、必要に応じた連結部分をさらに含み、
ｍは、１または２であり、
ｎは、１または２である］
の少なくとも１つの結合単位を含むバイオコンジュゲートを提供する。
【０００６】
一実施形態では、Ｌは、ＧＳＧＫＲＲＧＳＧ（配列番号：）ではない。
【０００７】
一実施形態では、Ｘ１は、ペプチドのＮ末端であり、Ｘ３は、ペプチドのＣ末端にある。
【０００８】
一実施形態では、式（Ｉ）は、ＲＲＲＫＫＩＱＧＲＳＫＲ（配列番号：）でもＲＲＧＧＲＫＷＧＳＦＥＧ（配列番号：）でもない。
【０００９】
一実施形態では、連結部分は、−ＮＨＮＨ−である。
【００１０】
一実施形態では、式：
Ｌ−ＮＨＮＨ２
［式中、Ｌは、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、アルギニン（Ｒ）およびリシン（Ｋ）からなる群から選択される５〜２０個のアミノ酸のスペーサー、または部分
【化３】
2020526497.tif 000005
であり、
ただし、Ｌは、−ＮＨＮＨ２部分から最初の５個のアミノ酸の中に少なくとも２つのアルギニン（Ｒ）を含む］
の機能化ペプチドが提供される。
【００１１】
一実施形態では、Ｌは、−ＧＳＧＳＧＳＲＲ−ＮＨＮＨ−（配列番号：）である。また、ＧＳＧＳＧＳＲＲ（配列番号：）を含むペプチドが提供される。
【００１２】
本開示はまた、式（ＩＩ）：
（（Ｘ１）ｍＸ２）ｎＸ３−Ｌ
（ＩＩ）
［式中、
Ｘ１は、コラーゲン結合単位を含むアミノ酸配列であり、
Ｘ２およびＸ３は、独立に、存在しないか、１〜１５個のアミノ酸を有するアミノ酸配列であるか、または部分
【化４】
2020526497.tif 000006
（式中、ｐおよびｑは、それぞれ独立に、１〜１０の整数である）であり、
Ｌは、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、アルギニン（Ｒ）およびリシン（Ｋ）からなる群から選択される５〜２０個のアミノ酸のスペーサー、または部分
【化５】
2020526497.tif 000007
であり、
ただし、Ｌは、末端から最初の５個のアミノ酸の中に少なくとも２つのアルギニン（Ｒ）を含み、Ｌは、必要に応じた連結部分をさらに含み、
ｍは、１または２であり、
ｎは、１または２であり、
ただし式（ＩＩ）は、ＲＲＲＫＫＩＱＧＲＳＫＲ（配列番号：）でもＲＲＧＧＲＫＷＧＳＦＥＧ（配列番号：）でもない］
の結合単位を提供する。
【００１３】
ある特定の実施形態では、ｍは１であり、ｎは２である。ある特定の実施形態では、ｍは２であり、ｎは１である。ある特定の実施形態では、ｍは２であり、ｎは２である。
【００１４】
ある特定の実施形態では、Ｘ２およびＸ３は、独立に、存在しないか、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、アルギニン（Ｒ）およびリシン（Ｋ）からなる群から選択される１〜１５個のアミノ酸を有するアミノ酸配列であるか、または部分
【化６】
2020526497.tif 000008
（式中、ｐおよびｑは、それぞれ独立に、１〜１０の整数である）である。ある特定の実施形態では、Ｘ２およびＸ３は、独立に、存在しないか、またはグリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、アルギニン（Ｒ）およびリシン（Ｋ）からなる群から選択される１〜１５個のアミノ酸を有するアミノ酸配列である。
【００１５】
ある特定の実施形態では、ｍおよび／またはｎが１以外である場合、Ｘ２およびＸ３のうちの少なくとも１つは、少なくとも１つのアルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）を含む。ある特定の実施形態では、ｍおよび／またはｎが１以外である場合、Ｘ２およびＸ３は、アルギニン（Ｒ）もリシン（Ｋ）も含まない。
【００１６】
ある特定の実施形態では、Ｌは、ヒドラジドを含む。
【００１７】
本開示のある特定の態様は、添付の図によって図示され得る。それらの図には、以下が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、バイオコンジュゲートである化合物４、化合物８、および化合物１３についてのコラーゲン結合の比較を示す。
【００１９】
【図２】図２は、バイオコンジュゲートである化合物４および化合物１２についてのコラーゲン結合の比較を示す。
【００２０】
【図３】図３は、バイオコンジュゲートである化合物４および化合物１４についてのコラーゲン結合の比較を示す。
【００２１】
【図４】図４は、バイオコンジュゲートである化合物４、化合物８、および化合物１１についてのコラーゲン結合の比較を示す。
【００２２】
【図５】図５は、バイオコンジュゲートである化合物４、化合物９、および化合物１０についてのコラーゲン結合の比較を示す。
【００２３】
【図６】図６は、図１〜図５のバイオコンジュゲートの一部についてのコラーゲン結合の比較を示す。
【図７】図７は、対応するＥＣ５０値を比較する棒グラフを示す。
【００２４】
【図８】図８は、バイオコンジュゲートである化合物４および化合物１１についてのコラーゲン結合の比較を示す。
【００２５】
【図９】図９は、化合物１６、化合物１７、および化合物１８についてのコラーゲン結合の比較を示す。
【００２６】
【図１０】図１０は、バイオコンジュゲートである化合物１８および化合物１９についてのコラーゲン結合の比較を示す。
【００２７】
【図１１】図１１は、化合物２０、化合物４、化合物５、および化合物３についてのコラーゲン結合の比較を示す。
【００２８】
【図１２】図１２のパネルＡおよびＢは、コラーゲンへの血小板結合に対する、化合物１（パネルＡ）と比較した化合物１０（パネルＢ）の効果を示す。
【００２９】
【図１３】図１３は、シリウスレッドによって組織学的に測定される、ビヒクルおよびテルミサルタンと比較した化合物１０の肝臓内コラーゲン含量を示す。
【００３０】
【図１４】図１４は、腎臓および膀胱内の蛍光標識分子の分布を示すＩＶＩＳ画像化を示す。上の画像は、ＩＶ注射の５分後に撮影し、下の画像は、注射の１時間後に撮影した。左の画像は、マウスの腹側であり、右の画像は、背側である。
【００３１】
【図１５】図１５は、コラーゲン結合配列ＧＱＬＹＫＳＩＬＹ（配列番号：）に対する、グリカン（ＧＡＧ）から最初のアルギニン残基の配置の効果を示す。
【００３２】
【図１６】図１６は、ＧＱＬＹＫＳＩＬＹ（配列番号：）コラーゲン結合ドメインに結合させた場合の、コラーゲン結合に対するスペーサー長の効果を示す。
【００３３】
【図１７】図１７は、ＧＱＬＹＫＳＩＬＹ（配列番号：）コラーゲン結合ドメインにおけるコラーゲン結合に対するアミノ酸配列変化の効果を示す。（Ａ）は、アルギニン残基のリシンまたはＤ−アルギニンでの置き換えの効果を示す。（Ｂ）は、ＧＱＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧＳＧＳＲＲ（配列番号：）と比較した、ＧＳＧＳＧＳＲＲ（配列番号：）スペーサーのコラーゲン結合親和性を示す。（Ｃ）は、スペーサー内に特異的配列または化学物質を挿入する効果を示す。ＰＡＰＡＰＲＲ（配列番号：）は、プロリン−アラニン−プロリン−アラニン−プロリン−アルギニン−アルギニンであり、ＡｈｘＲＲは、６−アミノヘキサン酸−アルギニン−アルギニンであり、ＰＥＧ６ＲＲは、（ポリエチレングリコール）６−アルギニン−アルギニンであり、ａｈｘＲＲＡｈｘは、６−アミノヘキサン酸−アルギニン−アルギニン−６−アミノヘキサン酸である。
【００３４】
【図１８】図１８は、スペーサーがない結合配列および対照としてのスペーサー配列と比較した、最適化スペーサー配列を有するＧＱＬＹＫＳＩＬＹ（配列番号：）結合配列の第２のコラーゲン結合アッセイを示す。
【００３５】
【図１９】図１９は、ＧＳＧＳＧＳＲＲ（配列番号：）スペーサー配列を、コラーゲン結合ドメインＷＲＥＰＳＦＳＡＬＳ（配列番号：）、ｖＷＦ−２ｘに付加する効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本開示は、記載される特定の実施形態に限定されず、したがって当然のことながら変わり得ることを理解されたい。また、本開示の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ制限されるので、本明細書で使用される専門用語は、単に特定の実施形態を説明することを目的とし、制限することを意図しないことを理解されたい。
１．定義
【００３７】
別段定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、状況によって別段明示されない限り複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば「１つのペプチド」への言及は、複数のペプチドを含む。
【００３８】
本明細書で使用される場合、以下の用語および略語は、以下の意味を有する。
【表３−１】
2020526497.tif 000009
【表３−２】
2020526497.tif 000010
【表３−３】
2020526497.tif 000011
【００３９】
本明細書で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、組成物および方法が、列挙されている要素を含むが、他を除外しないことを意味することが意図される。「から本質的になる」は、組成物および方法を定義するために使用される場合、記載される目的のために組合せにとって本質的に少しでも重要な他の要素を除外することを意味するものとする。したがって、本明細書で定義される要素から本質的になる組成物は、特許請求される基本的かつ新規な特徴（複数可）に実質的に影響を及ぼさない他の材料またはステップを除外しないはずである。「からなる」は、他の成分の微量な要素よりも多くをおよび実質的な方法ステップを除外することを意味するものとする。これらの移行句のそれぞれによって定義された実施形態は、本開示の範囲内である。
【００４０】
用語「約」は、範囲を含めた数値表示、例えば、温度、時間、量、および濃度の前に使用される場合、（＋）または（−）１０％、５％または１％変わり得る近似を示す。
【００４１】
本明細書で使用される場合、用語「バイオコンジュゲート」、「ペプチドグリカン」および「プロテオグリカン」および「合成プロテオグリカン」は、交換可能に使用され、グリカンおよびそれに共有結合により結合している１つまたは複数のペプチドを含む合成コンジュゲートを指す。グリカン部分は、合成により作製され得るか、または動物源に由来し得る。ペプチドは、ある特定の実施形態では、ヒドラジド−カルボニル連結（すなわち、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−）を介してグリカンに共有結合により結合する。ある特定の実施形態では、ヒドラジド−カルボニル連結は、ペプチド上の末端ヒドラジド基と、グリカン上のカルボニル基との間にある。他の実施形態では、ヒドラジド−カルボニル連結は、ペプチド上の末端カルボニル基と、グリカン上のヒドラジド基との間にある。一部の実施形態では、バイオコンジュゲートという用語には、ペプチドグリカンが含まれる。
【００４２】
本明細書で使用される場合、用語「グリカン」は、グリコシドにより連結した多数の単糖を有する化合物を指す。ある特定の実施形態では、グリカンは、ウロン酸と交互に連結した２−アミノ糖を含むグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）であり、それには、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン、ケラチン、およびデルマタンなどのポリマーが含まれる。したがって、本明細書に記載される実施形態において使用され得るグリカンの非限定的な例として、アルギネート、アガロース、デキストラン、デキストラン硫酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）、デルマタン、デルマタン硫酸（ＤＳ）、ヘパラン硫酸、ヘパリン（Ｈｅｐ）、ケラチン、ケラタン硫酸、およびヒアルロン酸（ＨＡ）（それらの誘導体を含む）が挙げられる。別の実施形態では、グリカンの分子量は、バイオコンジュゲートの効果を調整するために変えられる（例えば、Radek,  K.  A.,  et  al.,  Wound  Repair  Regen.,  2009,  17:  118-126および  Taylor,  K.  R.,  et  al.,  J.  Biol.  Chem.,  2005,  280:5300-5306を参照されたい）。一実施形態では、グリカンは、酸化およびアルカリ脱離によって分解されて（例えば、Fransson,  L.  A.,  et  al.,  Eur.  J.  Biochem.,  1980,  106  :59-69を参照されたい）、より低い分子量（例えば、約１０ｋＤａ〜約５０ｋＤａ）を有する分解されたグリカンを生じる。一部の実施形態では、グリカンは、修飾されていない。ある特定の実施形態では、グリカンは、酸化的に切断されたサッカリド環を含有しておらず、したがって、アルデヒド官能基を含有しておらず、また含有してもいなかった。ある特定の実施形態では、グリカンは、誘導体化される。
【００４３】
本明細書で使用される場合、用語「誘導体化グリカン」は、グリカンの誘導体を含むことが意図される。例えば、誘導体化グリカンには、それらに限定されるものではないが、部分的にＮ−脱硫酸化された誘導体、部分的にＯ−脱硫酸化された誘導体、および／または部分的にＯ−カルボキシメチル化された誘導体などの１つまたは複数の化学的誘導体化が含まれ得る。例えば、本明細書で使用される場合、用語「ヘパリン」は、ヘパリンおよびその誘導体、例えばそれらに限定されるものではないが、部分的にＮ−および／もしくは部分的にＯ−脱硫酸化されたヘパリン誘導体、部分的にＯ−カルボキシメチル化されたヘパリン誘導体、またはそれらの組合せを含むことが意図される。ある特定の実施形態では、ヘパリンは、非酸化ヘパリンであり（すなわち、酸化的に切断されたサッカリド環を含有していない）、アルデヒド官能基を含有していない。
【００４４】
本明細書で使用される場合、用語「結合した」および「共有結合により結合した」は、交換可能に使用することができ、２つの原子による一つまたは複数の電子対の共有を指す。
【００４５】
一実施形態では、本開示のバイオコンジュゲートは、コラーゲンに直接的または間接的かのいずれかで結合する。用語「結合（binding）」または「結合する」は、本明細書で使用される場合、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイ、表面プラズモン共鳴法、ＥＬＩＳＡ、競合的結合アッセイ、等温滴定熱量測定法、ファージディスプレイ、アフィニティークロマトグラフィー、レオロジーまたは免疫組織化学的検査を使用して検出することができる、分子間の相互作用を含むことを意味する。用語はまた、分子間の「結合」相互作用を含むことを意味する。結合は、「直接的」または「間接的」であり得る。「直接的」結合は、分子間の直接的な物理的接触を含む。分子間の「間接的」結合は、１つまたは複数の分子との直接的な物理的接触を同時に有する分子を含む。この結合は、相互作用分子を含む「複合体」の形成をもたらし得る。「複合体」は、共有結合性または非共有結合性の結合、相互作用または力によって一緒に保持された２つまたはそれよりも多い分子の結合を指す。
【００４６】
本明細書で使用される場合、用語「組成物」は、少なくとも１つの薬学的に活性な成分を含有する、治療目的のために所期の患者への投与に適した調製物であって、その任意の固体形態を含めた、調製物を指す。組成物は、化合物の改善された製剤を提供するための少なくとも１つの薬学的に許容される構成成分、例えば適切な担体を含むことができる。ある特定の実施形態では、組成物は、フィルム剤、ゲル剤、パッチ剤、または液体液剤（liquid  solution）として製剤化される。本明細書で使用される場合、用語「局所的に」は、処置される組織および／または器官（内部、またはある場合には外部）の表面に、局部的効果のために組成物を非全身的に投与することを指す。
【００４７】
本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される」は、合理的に慎重な医師が、使用される量および／または処置される疾患もしくは状態およびそれぞれの投与経路を考慮して患者への投与を回避する理由となる特性を、指示された材料が有していないことを示す。典型的な薬学的に許容される材料は、本質的に無菌である。本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される担体」は、ある器官もしくは身体のある一部から、別の器官もしくは身体の別の一部に任意の補助成分もしくは組成物、もしくはその構成成分を運ぶもしくは輸送するのに関与するか、または静脈の内表面に薬剤を送達するための、薬学的に許容される材料、組成物またはビヒクル、例えば液体または固体充填剤、賦形剤、添加剤、溶媒または被包材料を指す。
【００４８】
本明細書で使用される場合、用語「液剤」は、当技術分野で周知の液剤、懸濁剤、エマルジョン、点滴剤、軟膏剤、液体洗浄剤、スプレー剤、およびリポソーム剤を指す。一部の実施形態では、液体液剤は、少量の酸または塩基が添加されるとｐＨの変化に抵抗する水性ｐＨ緩衝剤を含有する。ある特定の実施形態では、液体液剤は、潤滑増強剤を含有する。
【００４９】
本明細書で使用される場合、用語「ポリマー」、「ポリマーマトリックス」または「ポリマー性剤」は、生体適合性ポリマー材料を指す。本明細書に記載されるポリマー材料は、例えば、糖（例えばマンニトール）、ペプチド、タンパク質、ラミニン、コラーゲン、ヒアルロン酸、イオン性および非イオン性水溶性ポリマー；アクリル酸ポリマー；親水性ポリマー、例えばポリエチレンオキシド、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマー、およびポリビニルアルコール；セルロースポリマーおよびセルロースポリマー誘導体、例えばヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、およびエーテル化セルロース；ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、乳酸およびグリコール酸のコポリマー、または天然および合成の両方の他のポリマー性剤を含むことができる。
【００５０】
ある特定の実施形態では、ポリマー性マトリックスは、吸収可能なもの、例えばコラーゲン、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリジオキサノン、およびカプロラクトンなどである。本明細書で使用される場合、用語「吸収可能」は、材料が体内に吸収される能力を指す。他の実施形態では、ポリマーは、吸収可能でないもの、例えばポリプロピレン、ポリエステルまたはナイロンなどである。
【００５１】
本明細書で使用される場合、用語「ｐＨ緩衝剤」は、それに少量の酸または塩基が添加されるとｐＨの変化に抵抗する水性緩衝溶液を指す。ｐＨ緩衝溶液は、典型的に、弱酸およびその共役塩基の混合物を含み、またはその逆も同じである。例えば、ｐＨ緩衝溶液は、リン酸塩、例えばリン酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム二水和物、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム十二水和物、リン酸カリウム、リン酸二水素カリウムおよびリン酸水素二カリウム；ホウ酸およびホウ酸塩、例えばホウ酸ナトリウムおよびホウ酸カリウム；クエン酸およびクエン酸塩、例えばクエン酸ナトリウムおよびクエン酸二ナトリウム；酢酸塩、例えば酢酸ナトリウムおよび酢酸カリウム；炭酸塩、例えば炭酸ナトリウムおよび炭酸水素ナトリウムなどを含むことができる。ｐＨ調整剤は、例えば、塩酸、乳酸、クエン酸、リン酸および酢酸などの酸、ならびに水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウムおよび炭酸水素ナトリウムなどのアルカリ塩基などを含むことができる。一部の実施形態では、ｐＨ緩衝剤は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液（すなわち、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウムを、一部の製剤では、塩化カリウムおよびリン酸カリウムを含有する）である。
【００５２】
本明細書で使用される場合、用語「ペプチド」および「ペプチド配列」は、ペプチド（またはアミド）結合によって連結したアミノ酸の直鎖または分岐鎖を指すことが意図される。一実施形態では、ペプチドは、約３〜約１２０個のアミノ酸、または約３〜約１１０個のアミノ酸、または約３〜約１００個のアミノ酸、または約３〜約９０個のアミノ酸、または約３〜約８０個のアミノ酸、または約３〜約７０個のアミノ酸、または約３〜約６０個のアミノ酸、または約３〜約５０個のアミノ酸、または約３〜約４０個のアミノ酸、または約５〜約１２０個のアミノ酸、または約５〜約１００個のアミノ酸、または約５〜約９０個のアミノ酸、または約５〜約８０個のアミノ酸、または約５〜約７０個のアミノ酸、または約５〜約６０個のアミノ酸、または約５〜約５０個のアミノ酸、または約５〜約４０個のアミノ酸、または約５〜約３０個のアミノ酸、または約５〜約２０個のアミノ酸、または約５〜約１０個のアミノ酸を含む。
【００５３】
本明細書に記載される様々な実施形態では、ペプチドは、結合単位に１つまたは複数の保存的アミノ酸置換を含めることによって修飾され得る。当業者に周知の通り、ペプチドの重要ではない任意のアミノ酸を保存的置換によって変えても、置き換えるアミノ酸の側鎖が、置き換えられたアミノ酸の側鎖と類似の結合および接触を形成することができるはずであるので、そのペプチドの活性は有意には変わらないはずである。非保存的置換も、ペプチドの結合活性に実質的に影響を及ぼさないという条件で可能であり得る。
【００５４】
本明細書で使用される場合、用語「配列同一性」は、２個のペプチド間または２個の核酸分子間のアミノ酸残基またはヌクレオチド同一性のレベルを指す。比較される配列における位置が、同じ塩基またはアミノ酸によって占められている場合には、分子は、その位置において同一である。ペプチド（またはポリペプチドまたはペプチド領域）は、別の配列に対してある特定のパーセンテージ（例えば、少なくとも約６０％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％）の「配列同一性」を有し、そのことは、そのパーセンテージの塩基（またはアミノ酸）が、整列した場合には２つの配列の比較において同じであることを意味する。本願に開示される任意の配列（「参照配列」）では、参照配列に対して少なくとも約６０％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％配列同一性を有する配列も、本開示に含まれることが注目される。同様に、本開示はまた、参照配列と比較して、アミノ酸残基またはヌクレオチドの１つ、２つ、３つ、４つまたは５つの置換、欠失または付加を有する配列を含む。ある特定の実施形態では、本明細書で特定される配列の任意の１つまたは複数において、配列は、それからそれぞれ１つ、２つ、または３つのアミノ付加、欠失および／または置換を有することによって修飾され得る。
【００５５】
当技術分野で周知の通り、アミノ酸の「保存的置換」またはペプチドの「保存的置換変異体」は、１）ペプチドの二次構造、２）アミノ酸の電荷もしくは疎水性、および３）側鎖の嵩高さ、またはこれらの特徴の任意の１つもしくは複数を維持するアミノ酸置換を指す。例示的に、周知の専門用語である「親水性の残基」は、セリンまたはトレオニンに関する。「疎水性の残基」は、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリンまたはアラニンなどに関する。「正電荷の残基」は、リシン、アルギニン、オルニチン、またはヒスチジンに関する。「負電荷の残基」は、アスパラギン酸またはグルタミン酸を指す。「嵩高い側鎖」を有する残基は、フェニルアラニン、トリプトファンまたはチロシンなどを指す。例示的な保存的アミノ酸置換の一覧を、表１に示す。
【表１】
2020526497.tif 000012
【００５６】
一部の実施形態では、本明細書に記載される配列を修飾して、１つもしくは複数のグルタミン酸残基をグルタミンで、および／または１つもしくは複数のアスパラギン酸残基をアスパラギンで置き換えることができる。
コラーゲン結合単位
【００５７】
本明細書で使用される場合、用語「コラーゲン結合単位」は、コラーゲンに結合するペプチドの中のアミノ酸配列を指すことが意図される。「コラーゲン結合」は、化合物がコラーゲンと好都合に結合、または相互作用するように、疎水性、イオン性（荷電）、および／またはファンデルワールス相互作用を含み得る、コラーゲンとの相互作用を示す。この結合（または相互作用）は、共有結合性の結合および一般的官能基との非特異的相互作用とは区別されることが意図され、したがってペプチドは、コラーゲン上でペプチドが結合するその官能基を含有する任意の種と相互作用できる。ペプチドは、当技術分野で公知の任意の方法を使用して、コラーゲンへの結合について試験、および評価することができる。例えば、Li,  Y.,  et  al.,  Current  Opinion  in  Chemical  Biology,  2013,  17:  968-975、Helmes,  B.A.,  et  al.,  J.  Am.  Chem.  Soc.  2009,  131,  11683-11685、およびPetsalaki,  E.,  et  al.,  PLoS  Comput  Biol,  2009,  5(3):  e1000335を参照されたい。一実施形態では、ペプチド、またはペプチドのコラーゲン結合単位は、約１ｍＭ未満、または約９００μＭ未満、または約８００μＭ未満、または約７００μＭ未満、または約６００μＭ未満、または約５００μＭ未満、または約４００μＭ未満、または約３００μＭ未満、または約２００μＭ未満、または約１００μＭ未満の解離定数（Ｋｄ）でコラーゲンに結合する。ある特定の実施形態では、コラーゲン結合単位は、最大約１２０個のアミノ酸を含む。
【００５８】
ペプチドは、コラーゲン原線維形成に通常関与するか、または通常関与しないタンパク質の一部と、アミノ酸相同性を有することができる。一部の実施形態では、これらのペプチドは、小さいロイシンが豊富なバイオコンジュゲートのアミノ酸配列、血小板受容体配列、またはコラーゲン原線維形成を制御するタンパク質に対して相同性または配列同一性を有する。様々な実施形態では、ペプチドは、ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹ（配列番号：）、ＧＥＬＹＫＳＩＬＹ（配列番号：）、ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＣＩＬＹ（配列番号：）、ＧＥＬＹＫＣＩＬＹ（配列番号：）、ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＱＬＹＫＳＩＬＹ（配列番号：）、ＧＱＬＹＫＳＩＬＹ（配列番号：）、ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＱＬＹＫＣＩＬＹ（配列番号：）、ＧＱＬＹＫＣＩＬＹ（配列番号：）、ＲＬＤＧＮＥＩＫＲ（配列番号：）、ＡＨＥＥＩＳＴＴＮＥＧＶＭ（配列番号：）、ＮＧＶＦＫＹＲＰＲＹＦＬＹＫＨＡＹＦＹＰＰＬＫＲＦＰＶＱ（配列番号：）、ＣＱＤＳＥＴＲＴＦＹ（配列番号：）、ＴＫＫＴＬＲＴ（配列番号：）、ＧＬＲＳＫＳＫＫＦＲＲＰＤＩＱＹＰＤＡＴＤＥＤＩＴＳＨＭ（配列番号：）、ＳＱＮＰＶＱＰ（配列番号：）、ＳＹＩＲＩＡＤＴＮＩＴ（配列番号：）、ＫＥＬＮＬＶＹＴ（配列番号：）、ＧＳＩＴ（配列番号：）、ＧＳＩＴＴＩＤＶＰＷＮＶ（配列番号：）、ＧＱＬＹＫＳＩＬＹ（配列番号：）、ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＱＬＹＫＳＩＬＹ（配列番号：）、ＲＶＭＨＧＬＨＬＧＤＤＥ（「ＧＰＶＩ」）（配列番号：）、ＣＲＶＭＨＧＬＨＬＧＤＤＥＣ（環式ＲＶＭＨＧＬＨＬＧＤＤＥまたは「ｃＧＰＶＩ」）（配列番号：）、または配列がコラーゲンに結合することができるという条件で、それらに対して少なくとも約８０％配列同一性、もしくは少なくとも約８３％配列同一性、もしくは少なくとも約８５％配列同一性、もしくは少なくとも約９０％配列同一性、もしくは少なくとも約９５％配列同一性、もしくは少なくとも約９８％配列同一性を有する配列から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００５９】
ある特定の実施形態では、ペプチドは、それぞれ参照によって本明細書に組み込まれるChiang,  T.M.,  et  al.  J.  Biol.  Chem.,  2002,  277:  34896-34901、  Huizinga,  E.G.  et  al.,  Structure,  1997,  5:  1147-1156、  Romijn,  R.A.,  et  al.,  J.  Biol.  Chem.,  2003,  278:  15035-15039、およびChiang,  et  al.,  Cardio.  &  Haemato.  Disorders-Drug  Targets,  2007,  7:  71-75に記載されている通り、フォンビルブランド因子（ｖＷＦ）または血小板コラーゲン受容体のコラーゲン結合ドメイン（複数可）と、少なくとも約８０％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。非限定的な例は、ｖＷＦから得られたＷＲＥＰＳＦＣＡＬＳ（配列番号：）である。
【００６０】
コラーゲン結合親和性（またはコラーゲン結合ドメイン／単位）についてペプチド配列をスクリーニングするための様々な方法が、当技術分野で日常的である。本明細書に開示されるバイオコンジュゲートおよび方法において使用され得る、コラーゲン結合親和性（またはコラーゲン結合単位）を有することが示されている他のペプチド配列には、それらに限定されるものではないが、βＡＷＨＣＴＴＫＦＰＨＨＹＣＬＹＢｉｐ（配列番号：）、βＡＨＫＣＰＷＨＬＹＴＴＨＹＣＦＴＢｉｐ（配列番号：）、βＡＨＫＣＰＷＨＬＹＴＨＹＣＦＴ（配列番号：）など（式中、Ｂｉｐは、ビフェニルアラニンであり、βＡは、ベータ−アラニンである）（Abd-Elgaliel,  W.R.,  et  al.,  Biopolymers,  2013,  100(2),  167-173を参照されたい）、ＧＲＯＧＥＲ（配列番号：）、ＧＭＯＧＥＲ（配列番号：）、ＧＬＯＧＥＮ（配列番号：）、ＧＬＯＧＥＲ（配列番号：）、ＧＬＫＧＥＮ（配列番号：）、ＧＦＯＧＥＲＧＶＥＧＰＯＧＰＡ（配列番号：）など（式中、Ｏは、４−ヒドロキシプロリンである）（Raynal,  N.,  et  al.,  J.  Biol.  Chem.,  2006,  281(7),  3821-3831を参照されたい）、ＨＶＷＭＱＡＰＧＧＧＫ（配列番号：）（Helms,  B.A.,  et  al.,  J.  Am.  Chem.  Soc.  2009,  131,  11683-11685を参照されたい）、ＷＲＥＰＳＦＣＡＬＳ（配列番号：）（Takagi,  J.,  et  al.,  Biochemistry,  1992,  31,  8530-8534を参照されたい）、ＷＹＲＧＲＬ（配列番号：）など（Rothenfluh  D.A.,  et  al.,  Nat  Mater.  2008,  7(3),  248-54を参照されたい）、ＷＴＣＳＧＤＥＹＴＷＨＣ（配列番号：）、ＷＴＣＶＧＤＨＫＴＷＫＣ（配列番号：）、ＱＷＨＣＴＴＲＦＰＨＨＹＣＬＹＧ（配列番号：）など（ＵＳ２００７／０２９３６５６を参照されたい）、ＳＴＷＴＷＮＧＳＡＷＴＷＮＥＧＧＫ（配列番号：）、ＳＴＷＴＷＮＧＴＮＷＴＲＮＤＧＧＫ（配列番号：）など（ＷＯ／２０１４／０５９５３０を参照されたい）、ＣＶＷＬＷＥＱＣ（配列番号：）  環式ＣＶＷＬＷＥＮＣ（配列番号：）、環式ＣＶＷＬＷＥＱＣ（配列番号：）（Depraetere  H.,  et  al.,  Blood.  1998,  92,  4207-4211、およびDuncan  R.,  Nat  Rev  Drug  Discov,  2003,  2(5),  347-360を参照されたい）、ＣＭＴＳＰＷＲＣ（配列番号：）など（Vanhoorelbeke,  K.,  et  al.,  J.  Biol.  Chem.,  2003,  278,  37815-37821を参照されたい）、ＣＰＧＲＶＭＨＧＬＨＬＧＤＤＥＧＰＣ（配列番号：）（Muzzard,  J.,  et  al.,  PLoS  one.  4  (e  5585)  I-  10を参照されたい）、ＫＬＷＬＬＰＫ（配列番号：）（Chan,  J.  M.,  et  al.,  Proc  Natl  Acad  Sci  U.S.A.,  2010,  107,  2213-  2218を参照されたい）、およびＣＱＤＳＥＴＲＴＦＹ（配列番号：）など（ＵＳ２０１３／０２４３７００を参照されたい）、Ｈ−Ｖ−Ｆ／Ｗ−Ｑ／Ｍ−Ｑ−Ｐ／Ａ−Ｐ／Ｋ（Helms,  B.A.,  et  al.,  J.  Am.  Chem.  Soc.,  2009,  131(33),  11683-11685）が含まれ、それぞれ、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【００６１】
本明細書に開示されるバイオコンジュゲートおよび方法において使用され得る、コラーゲン結合親和性（またはコラーゲン結合単位）を有することが示されているさらなるペプチド配列には、それらに限定されるものではないが、ＬＳＥＬＲＬＨＥＮ（配列番号：）、ＬＴＥＬＨＬＤＮＮ（配列番号：）、ＬＳＥＬＲＬＨＮＮ（配列番号：）、ＬＳＥＬＲＬＨＡＮ（配列番号：）、およびＬＲＥＬＨＬＮＮＮ（配列番号：）（Fredrico,  S.,  Angew.  Chem.  Int.  Ed.  2015,  37,  10980-10984を参照されたい）が含まれる。
【００６２】
ある特定の実施形態では、ペプチドは、ＲＶＭＨＧＬＨＬＧＤＤＥ（配列番号：）、Ｄ−アミノ酸ＥＤＤＧＬＨＬＧＨＭＶＲ（配列番号：）、ＲＶＭＨＧＬＨＬＧＮＮＱ（配列番号：）、Ｄ−アミノ酸ＱＮＮＧＬＨＬＧＨＭＶＲ（配列番号：）、ＲＶＭＨＧＬＨＬＧＮＮＱ（配列番号：）、ＧＱＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧ−４Ｋ２Ｋ（配列番号：）（４分岐ペプチド）、ＧＳＧＱＬＹＫＳＩＬＹ（配列番号：）、ＧＳＧＧＱＬＹＫＳＩＬＹ（配列番号：）、ＫＱＬＮＬＶＹＴ（配列番号：）、ＣＶＷＬＷＱＱＣ（配列番号：）、ＷＲＥＰＳＦＳＡＬＳ（配列番号：）、ＧＨＲＰＬＤＫＫＲＥＥＡＰＳＬＲＰＡＰＰＰＩＳＧＧＧＹＲ（配列番号：）、およびＧＨＲＰＬＮＫＫＲＱＱＡＰＳＬＲＰＡＰＰＰＩＳＧＧＧＹＲ（配列番号：）からなる群から選択される１つまたは複数の配列を含む。
【００６３】
コラーゲン結合単位についても同様に、コラーゲンについて選択されたファージディスプレイライブラリーから得られたペプチド配列を生成することができる。ペプチドは、コラーゲンへの結合についてＳＰＲ、ＥＬＩＳＡ、ＩＴＣ、アフィニティークロマトグラフィー、または当技術分野で公知の他の技術などの技術のいずれかによって合成、および評価することができる。一例は、固定化コラーゲンを含有するマイクロプレートでインキュベートされるビオチン修飾ペプチド配列（例えば、ＳＩＬＹｂｉｏｔｉｎ）であり得る。コラーゲンに結合するペプチドの能力を決定するために、ストレプトアビジン発色団を使用して、用量応答結合曲線を生成することができる。
【００６４】
一実施形態では、ペプチドは、コラーゲンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩ、またはＸＩＶ型のいずれか１つまたは複数に結合する１つまたは複数のコラーゲン結合単位を含む。一実施形態では、ペプチドは、約１ｍＭ未満、または約９００μＭ未満、または約８００μＭ未満、または約７００μＭ未満、または約６００μＭ未満、または約５００μＭ未満、または約４００μＭ未満、または約３００μＭ未満、または約２００μＭ未満、または約１００μＭ未満の解離定数（Ｋｄ）でＩ型コラーゲンに結合する。一実施形態では、ペプチドは、約１ｍＭ未満、または約９００μＭ未満、または約８００μＭ未満、または約７００μＭ未満、または約６００μＭ未満、または約５００μＭ未満、または約４００μＭ未満、または約３００μＭ未満、または約２００μＭ未満、または約１００μＭ未満の解離定数（Ｋｄ）でＩＩ型コラーゲンに結合する。一実施形態では、ペプチドは、約１ｍＭ未満、または約９００μＭ未満、または約８００μＭ未満、または約７００μＭ未満、または約６００μＭ未満、または約５００μＭ未満、または約４００μＭ未満、または約３００μＭ未満、または約２００μＭ未満、または約１００μＭ未満の解離定数（Ｋｄ）でＩＩＩ型コラーゲンに結合する。一実施形態では、ペプチドは、約１ｍＭ未満、または約９００μＭ未満、または約８００μＭ未満、または約７００μＭ未満、または約６００μＭ未満、または約５００μＭ未満、または約４００μＭ未満、または約３００μＭ未満、または約２００μＭ未満、または約１００μＭ未満の解離定数（Ｋｄ）でＩＶ型コラーゲンに結合する。
【００６５】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される任意の配列は、任意の１つまたは複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４または５個のアミノ酸）がそれから付加され、それから欠失され、またはそれから置換されるように修飾することができる。一部の実施形態では、配列は、任意の１つまたは複数のアミノ酸がアラニンによって置き換えられるように修飾される。一部の実施形態では、配列は、任意の１つまたは複数のｌ−アミノ酸が、対応するｄ−アミノ酸スキャンによって置き換えられる（is  replaced  the  corresponding  d-amino  acid  scan）ように修飾される。一部の実施形態では、配列は、任意の１つもしくは複数のバリンがロイシンによって置き換えられる、任意の１つもしくは複数のグルタミン酸がグルタミンによって置き換えられる、任意の１つもしくは複数のアスパラギン酸がアスパラギンによって置き換えられる、および／または任意の１つもしくは複数のアルギニンがグルタミンによって置き換えられるように修飾される。
【００６６】
本明細書に記載される実施形態のいずれかでは、コラーゲン結合単位を有するペプチドは、先行する段落に記載される任意のアミノ酸配列、またはこれらのアミノ酸配列のいずれかに対して少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約８３％、もしくは少なくとも約８５％、もしくは少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約１００％相同性を有するアミノ酸配列を含む。様々な実施形態では、本明細書に記載される合成バイオコンジュゲートのペプチド構成成分は、１つまたは複数の保存的アミノ酸置換を含めることによって修飾され得る。当業者に周知の通り、ペプチドの重要ではない任意のアミノ酸を保存的置換によって変えても、置き換えるアミノ酸の側鎖が、置き換えられたアミノ酸の側鎖と類似の結合および接触を形成することができるはずであるので、そのペプチドの活性は有意には変わらないはずである。
【００６７】
ペプチドは、コラーゲンへの結合についてポジティブ選択を利用するファージディスプレイによって選択することもできる。コラーゲン結合単位は、コラーゲンとのその相互作用によって決定する、ならびに分子相互作用を評価するために使用される技術のいずれか（例えば表面プラズモン共鳴法、ＥＬＩＳＡ、競合的結合アッセイ、等温滴定熱量測定法、アフィニティークロマトグラフィー、レオロジーおよび／または免疫組織化学的検査）によって測定することができる。「コラーゲン結合性」とみなされるペプチドは、コラーゲンまたはコラーゲン含有組織と相互作用することができ、したがって相互作用は、公知の化学的反応基に起因しない。相互作用は、ペプチドにおけるアミノ酸残基から生じる疎水性の電荷相互作用に起因し得る。相互作用は、マイクロプレート上にコラーゲンを固定し、コラーゲン結合単位と共にインキュベートした後、発色団を使用するビオチン−アビジンなどの検出技術によって測定することができる。相互作用は、コラーゲン結合単位と共に、またはコラーゲン結合単位（単数または複数）を含有するバイオコンジュゲートと共にインキュベートされた、コラーゲン含有流体、ゲル、または組織への機械的影響によって測定することもできる。
バイオコンジュゲート
【００６８】
本明細書では、グリカンおよびそれに共有結合により結合している、式（Ｉ）：
（（Ｘ１）ｍＸ２）ｎＸ３−Ｌ
（Ｉ）
［式中、
Ｘ１は、コラーゲン結合単位を含むアミノ酸配列であり、
Ｘ２およびＸ３は、独立に、存在しないか、１〜１５個のアミノ酸を有するアミノ酸配列であるか、または部分
【化７】
2020526497.tif 000013
（式中、ｐおよびｑは、それぞれ独立に、１〜１０の整数である）であり、
Ｌは、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、アルギニン（Ｒ）およびリシン（Ｋ）からなる群から選択される３〜２０個のアミノ酸のスペーサー、または部分
【化８】
2020526497.tif 000014
であり、
ただし、Ｌは、グリカンから最初の５個のアミノ酸の中に少なくとも２つのアルギニン（Ｒ）を含み、Ｌは、ペプチドをグリカンに共有結合により結合する、必要に応じた連結部分をさらに含み、
ｍは、１または２であり、
ｎは、１または２である］
の少なくとも１つの結合単位を含むバイオコンジュゲートが提供される。
【００６９】
一実施形態では、グリカンおよびそれに共有結合により結合している、式（Ｉ）：
（（Ｘ１）ｍＸ２）ｎＸ３−Ｌ
（Ｉ）
［式中、
Ｘ１は、コラーゲン結合単位を含むアミノ酸配列であり、
Ｘ２およびＸ３は、独立に、存在しないか、１〜１５個のアミノ酸を有するアミノ酸配列であるか、または部分
【化９】
2020526497.tif 000015
（式中、ｐおよびｑは、それぞれ独立に、１〜１０の整数である）であり、
Ｌは、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、アルギニン（Ｒ）およびリシン（Ｋ）からなる群から選択される３〜２０個のアミノ酸のスペーサー、または部分
【化１０】
2020526497.tif 000016
であり、
ただし、Ｌは、グリカンから最初の５個のアミノ酸の中に少なくとも２つのアルギニン（Ｒ）を含み、Ｌは、ペプチドをグリカンに共有結合により結合する、必要に応じた連結部分をさらに含み、
ｍは、１または２であり、
ｎは、１または２である］
の少なくとも１つの結合単位を含むバイオコンジュゲートが提供される。
【００７０】
一実施形態では、Ｘ１は、ペプチドのＮ末端にあり、Ｘ３は、ペプチドのＣ末端にある。
【００７１】
一実施形態では、式（Ｉ）は、ＲＲＲＫＫＩＱＧＲＳＫＲ（配列番号：）でもＲＲＧＧＲＫＷＧＳＦＥＧ（配列番号：）でもない。
【００７２】
ある特定の実施形態では、ｍは１であり、ｎは２である。ある特定の実施形態では、ｍは２であり、ｎは１である。ある特定の実施形態では、ｍは２であり、ｎは２である。
【００７３】
ある特定の実施形態では、Ｌは、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、アルギニン（Ｒ）およびリシン（Ｋ）からなる群から選択される３〜２０個のアミノ酸のスペーサー、または部分
【化１１】
2020526497.tif 000017
であってよく、
ただし、Ｌは、末端から最初の３個のアミノ酸の中に少なくとも２つのアルギニン（Ｒ）を含み、Ｌは、必要に応じた連結部分をさらに含むことが企図される。
【００７４】
ある特定の実施形態では、Ｘ２およびＸ３は、独立に、存在しないか、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、アルギニン（Ｒ）およびリシン（Ｋ）からなる群から選択される１〜１５個のアミノ酸を有するアミノ酸配列であるか、または部分
【化１２】
2020526497.tif 000018
（式中、ｐおよびｑは、それぞれ独立に、１〜１０の整数である）である。ある特定の実施形態では、Ｘ２およびＸ３は、独立に、存在しないか、またはグリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、アルギニン（Ｒ）およびリシン（Ｋ）からなる群から選択される１〜１５個のアミノ酸を有するアミノ酸配列である。
【００７５】
ある特定の実施形態では、ｍおよび／またはｎが１以外である場合、Ｘ２およびＸ３のうちの少なくとも１つは、少なくとも１つのアルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）を含む。ある特定の実施形態では、ｍおよび／またはｎが１以外である場合、Ｘ２およびＸ３は、アルギニン（Ｒ）もリシン（Ｋ）も含まない。
【００７６】
一部の実施形態では、Ｘ２、Ｘ３、およびＬはまとめて、２つを超えるアルギニンを含む。一部の実施形態では、Ｘ３は、２つまたはそれよりも多いアルギニンを含む。一部の実施形態では、Ｌは、２つを超えるまたはそれよりも多いアルギニンを含む。
【００７７】
一部の実施形態では、Ｘ２は、２〜５個のアミノ酸の長さであり、各アミノ酸は、グリシンおよび／またはセリンから選択される。一部の実施形態では、Ｘ３は、２〜５個のアミノ酸の長さであり、少なくとも２つのアミノ酸は、独立に、アルギニン、リシン、および／またはアミド結合を形成することができる側鎖を有する天然もしくは非天然アミノ酸から選択される。
【００７８】
一部の実施形態では、Ｘ２は、２〜５個のアミノ酸であり、各アミノ酸は、グリシンおよび／またはセリンから選択される。一部の実施形態では、Ｘ３は、２〜５個のアミノ酸であり、各アミノ酸は、グリシンおよび／またはセリンから選択される。
【００７９】
一部の実施形態では、Ｘ２、Ｘ３、および／またはＬにおけるアミノ酸残基の総数は、６個またはそれよりも多い。一部の実施形態では、Ｘ２、Ｘ３、および／またはＬにおけるアミノ酸残基の総数は、８個またはそれよりも多い。一部の実施形態では、Ｘ２、Ｘ３、および／またはＬにおけるアミノ酸残基の総数は、６〜１５個である。
【００８０】
一部の実施形態では、Ｌは、アミノ酸配列ＧＳＧＳＧＳＲＲ（配列番号：）を含む。したがって、ある特定の実施形態では、アミノ酸配列ＧＳＧＳＧＳＲＲ（配列番号：）を含むアミノ酸が提供される。
【００８１】
一部の実施形態では、Ｌは、アミノ酸配列ＧＳＧＳＲＲＧＳ（配列番号：）を含む。したがって、ある特定の実施形態では、アミノ酸配列ＧＳＧＳＲＲＧＳ（配列番号：）を含むアミノ酸が提供される。
【００８２】
一部の実施形態では、Ｌは、ＧＳＧＲＲ（配列番号：）、ＧＳＧＳＧＲＲ（配列番号：）、ＧＳＧＳＧＳＲＲ（配列番号：）、ＧＳＧＳＧＳＧＲＲ（配列番号：）、ＧＳＧＳＧＳＧＳＲＲ（配列番号：）、ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＲＲ（配列番号：）、ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＲＲ（配列番号：）、ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＲＲ（配列番号：）、ＧＳＲＲＧＳ（配列番号：）、ＧＳＧＲＲＧＳＧ（配列番号：）、ＧＳＧＲＲＲＧＳＧ（配列番号：）、ＧＳＧＲＲＲ（配列番号：）、ＧＳＧＲＲＲＲ（配列番号：）、ＧＳＧＳＧＳＲＲＲ（配列番号：）、ＧＳＧＳＧＳＲＲＲＲ（配列番号：）、ＧＳＧＳＧＳＲＲＲＲＲ（配列番号：）、ＧＳＧＳＧＳＲＲＲＲＲＲ（配列番号：）、およびＧＳＧＳＧＳＧＳＲＲＲ（配列番号：）を含む群から選択されるアミノ酸配列である。
【００８３】
また本明細書では、グリカンおよび式Ｘ１−ＧＳＧＳＧＳＲＲ（式中、Ｘ１は、それに共有結合により結合しているコラーゲン結合単位を含むアミノ酸配列である）の少なくとも１つの結合単位を含むバイオコンジュゲートが提供される。
【００８４】
また本明細書では、グリカンおよび式Ｘ１−ＧＳＧＳＧＳＲＲ−ＮＨＮＨ−（式中、Ｘ１は、それに共有結合により結合しているコラーゲン結合単位を含むアミノ酸配列である）の少なくとも１つの結合単位を含むバイオコンジュゲートが提供される。
【００８５】
また本明細書では、グリカンおよび式Ｘ１−ＧＳＧＳＧＳＲＲ（式中、Ｘ１は、それに共有結合により結合しているコラーゲン結合単位を含むアミノ酸配列である）の少なくとも１つの結合単位を含むバイオコンジュゲートが提供される。
【００８６】
また本明細書では、グリカンおよび式Ｘ１−ＧＳＧＳＧＳＲＲ−ＮＨＮＨ−（式中、Ｘ１は、それに共有結合により結合しているコラーゲン結合単位を含むアミノ酸配列である）の少なくとも１つの結合単位を含むバイオコンジュゲートが提供される。
【００８７】
また本明細書では、本明細書に記載される通り、グリカンおよびコラーゲン結合単位を含むバイオコンジュゲートが提供され、Ｌは、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、アルギニン（Ｒ）およびリシン（Ｋ）からなる群から選択される５〜２０個のアミノ酸のスペーサー、部分
【化１３】
2020526497.tif 000019
または正電荷の部分であり、ただしＬは、グリカンから最初の５個のアミノ酸の中に少なくとも２つの正電荷の部分を含み、Ｌは、ペプチドをグリカンに共有結合により結合する、必要に応じた連結部分をさらに含む。
【００８８】
ある特定の実施形態では、ペプチドは、コラーゲン結合単位を含むアミノ酸配列Ｘ１、ならびにペプチド（例えば、直鎖または分岐である）の中の結合単位の数および配置、ならびにグリカンへのコンジュゲーションのための各結合単位とアミノ酸の間の距離を調節するための、Ｘ２、Ｘ３、およびＬのうちの少なくとも１つを含む。
【００８９】
ある特定の実施形態では、式（Ｉ）は、グリカンへの−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（すなわちヒドラジド−カルボニル）連結を含む。ある特定の実施形態では、Ｌは、ヒドラジドを含む。−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−は、Ｌのアミノ酸由来のカルボニル−Ｃ（Ｏ）−基および／またはグリカン由来のカルボニル−Ｃ（Ｏ）−基を含むことができる。
【００９０】
ある特定の実施形態では、グリカン上にアルデヒド結合部位を提供するために、酸化化学反応を利用してグリカン主鎖内のサッカリド環の１つまたは複数を切断することによって、ペプチドをデルマタン硫酸などのグリカンに結合させる。次に、アルデヒド結合部位を使用して、ペプチドをコンジュゲートした（例えば、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｎ＝Ｃ結合を介して）。
【００９１】
ある特定の実施形態では、ペプチドは、ヒドラジド−カルボニル連結を介してグリカンに結合され、ヒドラジド−カルボニルのカルボニル基は、グリカン上に存在する環外カルボニル基である。環外カルボニル基は、ネイティブなグリカン上に存在することができ、または、あるいはグリカンは、このような官能基を含むように修飾され得る。このような方法は、以下にさらに詳説される。このように結合したバイオコンジュゲートによって示された有益な効果（例えば、結合親和性の増加）は、酸化的に切断されたサッカリド環を含有していないグリカンに、少なくとも部分的に起因することが企図される。
【００９２】
ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートは、任意の単一またはモノマー単位の組合せから構成されたポリマー主鎖（例えば、グリカン以外の生体適合性ポリマー）を含むことができ、ただし、本明細書に記載されるペプチド（複数可）がポリマー主鎖に共有結合により結合できるように、その上に少なくとも１つの、ある場合には１〜約５０個の間の、適切な官能基が存在する。ポリマーは、直鎖、分岐であってよく、または側鎖（例えば、１〜５０個のペプチド以外の）を含有することができる。ポリマーは、中性、カチオン性、アニオン性、または双性イオン性であってよい。ある特定の実施形態では、ポリマーは、糖ポリマーである。ポリマーは、例えば式Ａ−Ｂ−Ａのブロックコポリマーを含むコポリマーであってよい。このようなポリマーを提供するための方法は、当技術分野で公知であり、それには、例えばリビング重合が含まれる。一実施形態では、ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）である。別の実施形態では、ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）ではない。ある特定の実施形態では、ポリマーは、グリカンでもナノ粒子でもない。ある特定の実施形態では、ポリマーはグリカンである。
【００９３】
本明細書に記載されるバイオコンジュゲートのある特定の実施形態では、グリカンは、アルギネート、コンドロイチン、デルマタン、デルマタン硫酸、ヘパラン、ヘパラン硫酸、ヘパリン、デキストラン、デキストラン硫酸、またはヒアルロナンであってよい。一実施形態では、グリカンは、デルマタン硫酸である。一実施形態では、グリカンは、デルマタン硫酸ではない。別の実施形態では、グリカンは、コンドロイチン硫酸である。別の実施形態では、グリカンは、ヘパリンである。本明細書に記載されるバイオコンジュゲートでは、例えば約６５０〜７００Ｄａの単一の二糖単位から約５０ｋＤａのグリカンまでの様々な分子量のヘパリンを使用することができる。一部の実施形態では、ヘパリンは、約１０〜約２０ｋＤａである。一部の実施形態では、ヘパリンは、最大約１５、または約１６、または約１７、または約１８、または約１９、または約２０ｋＤａである。
【００９４】
一実施形態では、バイオコンジュゲートは、コラーゲンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩ、またはＸＩＶ型の１つまたは複数に結合するコラーゲン結合単位を有するペプチドを含む。一実施形態では、コラーゲン結合単位は、コラーゲンに結合すると、原線維形成を促進または阻害する。一実施形態では、コラーゲン結合単位は、コラーゲンに結合すると、原線維形成を促進も阻害もしない。一部の実施形態では、ペプチドは、Ｉ型コラーゲンに結合する。他の実施形態では、ペプチドは、ＩＶ型コラーゲンに結合する。ある特定の実施形態では、コラーゲンに対して特定の結合親和性を有する１つまたは複数のペプチドを、本明細書に記載されるバイオコンジュゲートにおいて使用することができる。例えば、合成バイオコンジュゲートは、Ｉ型コラーゲンに結合親和性を有する少なくとも１つのペプチド、およびＩＶ型コラーゲンに結合親和性を有する少なくとも１つのペプチドを含むことができる。別の実施形態では、ペプチドは、Ｉ型コラーゲンに結合親和性を有する。別の実施形態では、ペプチドは、ＩＶ型コラーゲンに結合親和性を有する。ある特定の実施形態では、ペプチドは、ＩＩ型コラーゲンに結合親和性を有する。ある特定の実施形態では、ペプチドは、ＩＩＩ型コラーゲンに結合親和性を有する。ある特定の実施形態では、ペプチドは、１つよりも多い型のコラーゲンに結合し、各コラーゲン型への相対的親和性は、変わり得る。一実施形態では、コラーゲン結合単位は、約１ｍＭ未満、または約９００μＭ未満、または約８００μＭ未満、または約７００μＭ未満、または約６００μＭ未満、または約５００μＭ未満、または約４００μＭ未満、または約３００μＭ未満、または約２００μＭ未満、または約１００μＭ未満の解離定数（Ｋｄ）でコラーゲンに結合する。
【００９５】
グリカンに結合する結合単位の総数は、バイオコンジュゲートの所望の特性に応じて変わり得る。ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートに存在する結合単位の総数は、約１〜約５０、または約１〜約４０、または約１〜約３０、または約１〜約２５、または約２〜約３０、または約２〜約２５、または約３〜約２５、または約４〜約２５、または約５〜約２５、または約５〜約３０、または約１〜約２５、または約２〜約２５、または約１１〜約１４、または約１〜約８、または約１〜約５、または約１、または約２、または約３、または約４、または約５、または約６、または約７、または約８個の結合単位である。一部の実施形態では、バイオコンジュゲートは、約１０〜約４０個の結合単位を含む。他の実施形態では、バイオコンジュゲートは、約５〜約３０個の結合単位を含む。ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートは、約２０個未満の結合単位を含む。ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートは、約１８個未満の結合単位を含む。様々な実施形態では、バイオコンジュゲートは、約４〜約１８個の結合単位を含む。ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートは、約１５個未満の結合単位を含む。ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートは、約１０個未満の結合単位を含む。ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートは、約３０個未満の結合単位を含む。ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートは、約２５個の結合単位を含む。ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートは、約５〜約４０、または約１０〜約４０、または約５〜約２０、または約４〜約１８、または約１０、または約１１、または約１８、または約２０個の結合単位、または約２５個の結合単位、または約３０個の結合単位、または約４０個の結合単位、または約５０個の結合単位を含む。ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートは、約２個の結合単位、約４個の結合単位、または約８個の結合単位を含む。
【００９６】
本明細書に記載される結合単位は、グリカンへのコンジュゲーションのためのヒドラジド部分をさらに含むことができる。ヒドラジド基は、例えばＣ末端、Ｎ末端などの任意の適切な結合点において、またはアミノ酸上の側鎖を介して結合単位に結合することができる。例えば、結合単位が、結合単位のアミノ酸の側鎖を介してグリカンに結合する場合、側鎖は、グルタミン酸またはアスパラギン酸である。ヒドラジドは、ペプチド配列のアミノ酸上に存在するカルボニル基（例えば、Ｃ末端カルボニル基）に結合したヒドラジン（−ＮＨＮＨ２）の間で形成され得る。
【００９７】
ある特定の実施形態では、式（Ｉ）
（（Ｘ１）ｍＸ２）ｎＸ３−Ｌ
（Ｉ）
［式中、Ｘ１およびＬは、本明細書で定義される通りである］の結合単位に共有結合により結合しているグリカンを含むバイオコンジュゲートは、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、およびアミド結合を形成することができる側鎖を有する天然または非天然アミノ酸からなる群から選択される２〜約５個のアミノ酸を含むアミノ酸配列Ｘ２および／またはＸ３を含む。例えば、Ｘ２および／またはＸ３は、ＧＳ（配列番号：）、ＧＳＧ（配列番号：）、ＧＳＧＳ（配列番号：）、ＲＧ（配列番号：）、ＲＧＳ（配列番号：）、ＲＧＳＧ、ＲＧＳＧＳ（配列番号：）、ＲＲ（配列番号：）、ＲＲＧ（配列番号：）、ＲＲＳ（配列番号：）、ＲＲＧＳ（配列番号：）、ＲＲＧＳＧ（配列番号：）、ＲＲＧＳＧＳ（配列番号：）、ＲＧＲ（配列番号：）、ＲＳＲ（配列番号：）、ＲＲＲ（配列番号：）などのようなアミノ酸配列を含むことができる。
【００９８】
ある特定の実施形態では、Ｘ２および／またはＸ３は、１つよりも多い結合部位を含むアミノ酸配列であり（直鎖であっても分岐であってもよい）、したがって１つよりも多いペプチド配列がそれに結合し、したがって分岐構築物を作り出すことができる。さらに、ペプチドは、末端または非末端アミノ酸部分を介してグリカンに結合することができるので、非末端アミノ酸部分を介してグリカンに結合した場合には分岐となる。結合部位は、同じでも異なっていてもよく、アミンまたはカルボン酸部分などの任意の適切な結合部位であってよく、したがって、所望のペプチド配列がそれに結合することができる（例えばアミド結合を介して）。したがって、ある特定の実施形態では、Ｘ２および／またはＸ３のうちの少なくとも１つは、１つまたは複数のリシン、グルタミン酸またはアスパラギン酸残基を含有する。例えば、Ｘ２および／またはＸ３は、それぞれ２、３、または４つの結合部位を提供するＫＧＳＧ（配列番号：）、ＫＫＧＳＧ（配列番号：）、またはＫＫＫＧＳＧ（配列番号：）などのアミノ酸配列である。
【００９９】
ある特定の実施形態では、Ｘ２および／またはＸ３は、追加のペプチドまたはコラーゲン結合単位を連結することができる側鎖を含有する１つまたは複数のアミノ酸を含む。このようなスペーサー中に含めるための例示的なアミノ酸として、それらに限定されるものではないが、リシン、グルタミン酸、アスパラギン酸などが挙げられる。ある特定の実施形態では、Ｘ２および／またはＸ３は、式ＫＸＸ（式中、各Ｘは、独立に、天然または非天然アミノ酸である）の１つまたは複数のアミノ酸配列を含む。分岐構築物を作製するために単独でまたは組み合わせて使用され得るアミノ酸配列の具体例として、それらに限定されるものではないが、ＫＲＲ、ＫＫＫ、（Ｋ）ｎＧＳＧ、および（ＫＲＲ）ｎ−ＫＧＳＧ（式中、ｎは、０〜５、または１、２、３、４もしくは５である）が挙げられる。
【０１００】
Ｘ２および／またはＸ３の模式図を、以下の表に示す。
【表４−１】
2020526497.tif 000020
【表４−２】
2020526497.tif 000021
【０１０１】
ある特定の実施形態では、ヒドラジド基は、ペプチド（複数可）のＮ末端に結合している。ある特定の実施形態では、ヒドラジド基は、ペプチド（複数可）のＣ末端に結合している。ある特定の実施形態では、ヒドラジド基は、グルタミン酸および／またはアスパラギン酸などのペプチド（複数可）のアミノ酸の側鎖に結合している。
【０１０２】
本明細書に記載される実施形態のいずれかでは、グリカン１個当たりのペプチドの数は平均であり、組成物におけるある特定のバイオコンジュゲートは、グリカン１個当たりより多くのペプチドを有することができ、ある特定のバイオコンジュゲートは、グリカン１個当たりより少ないペプチドを有する。したがって、ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるペプチドの数は、バイオコンジュゲートの組成物における平均である。例えば、ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートは、グリカン１個当たりのペプチドの平均数が約５である組成物である。他の実施形態では、グリカン１個当たりのペプチドの平均数は、約６、または約７、または約８、または約９、または約１０、または約１１、または約１２、または約１３、または約１４、または約１５、または約１６、または約１７、または約１８、または約１９、または約２０、または約２５、または約３０である。
【０１０３】
ある特定の実施形態では、グリカン１個当たりのペプチドの数は、ペプチドで機能化されている、グリカン主鎖上の二糖単位のパーセントに基づく「機能化（functionalization）パーセント（％）」として記載することができる。例えば、グリカン上に存在する利用可能な二糖単位の総数は、グリカンの分子量（または平均分子量）（例えば、約２５ｋＤａ〜最大約７０ｋＤａ、またはさらには約１００ｋＤａ）を、単一の二糖単位の分子量（例えば、約５５０〜８００Ｄａ、または約６５０〜７５０Ｄａ）で割ることによって算出することができる。グリカンが従来の「二糖単位」を含有していない実施形態（例えば、アルギン酸）では、本明細書で提示される算出において使用されるグリカン上に存在する利用可能な二糖単位の総数は、グリカンの分子量（または平均分子量）を、単一サッカリド単位の分子量で割り、２を掛けることによって算出することができる。
【０１０４】
一部の実施形態では、グリカン上に存在する利用可能な二糖単位の数は、約１０〜約８０、または約１０〜約７０、または約１５〜約７０、または約２０〜約７０、または約３０〜約７０、または約３５〜約７０、または約４０〜約７０、または約１０〜約７５、または約１５〜約７５、または約２０〜約７５、または約３０〜約７５、または約３５〜約７５、または約４０〜約７５、または約１０〜約５０、または約２０〜約５０、または約２５〜約５０、または約１０〜約３５、または約１５〜約３５、または約２０〜約３５、または約１０〜約３０、または約１５〜約３０、または約２０〜約３０、または約１５、または約２０、または約２５、または約３０、または約３５、または約４０、または約４５、または約５０、または約５５、または約６０、または約６５、または約７０である。
【０１０５】
したがって、ある特定の実施形態では、グリカンは、約１〜約５０、または約５〜約４０％の機能化、または約５〜約３０％の機能化、または約１〜約１５％の機能化、または約１〜約５％の機能化、または約５〜約１５％の機能化、または約１０〜約２５％の機能化、または約２５〜約４０％の機能化、または約３２％の機能化、または約２５％の機能化、または約１６％の機能化、または約１０％の機能化、または約８％の機能化、または約５％の機能化、または約２．５％の機能化を含み、機能化パーセント（％）は、ペプチドで機能化されている、グリカン上の二糖単位のパーセントによって決定される。一部の実施形態では、グリカンの機能化パーセント（％）は、約１％〜約５０％、または約３％〜約４０％、または約５％〜約３０％、または約１０％〜約２０％、または約１％、または約２％、または約５％、または約１０％、または約１５％、または約２０％、または約２５％、または約３０％、または約３５％、または約４０％、または約４５％、または約５０％、または約５５％、または約６０％、または約６５％、または約７０％、または約７５％、または約８０％、または約８５％、または約９０％、または約９５％、または約１００％である。
【０１０６】
ある特定の実施形態では、グリカンは、分岐ペプチドで機能化されている。一部の実施形態では、ペプチドは、２〜４個の分岐を有する。したがって、ある特定の実施形態では、グリカンは、約１〜約５０％の機能化、または約５〜約４０％の機能化、または約５〜約３０％の機能化、または約１〜約１５％の機能化、または約１〜約５％の機能化、または約５〜約１５％の機能化、または約１０〜約２５％の機能化、または約２５〜約４０％の機能化、または約２．５％の機能化、または約５％の機能化、または約８％の機能化、または約１０％の機能化、または約１６％の機能化、または約３２％の機能化を含み、機能化パーセント（％）は、ペプチドで機能化されている、グリカン上の二糖単位のパーセントによって決定される。
【０１０７】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるバイオコンジュゲートおよびペプチドを含む組成物であって、ペプチドがバイオコンジュゲートに密接に会合している（例えば、イオン結合を介して）組成物が提供される。ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲート凝集体は、それによって形成され得る。バイオコンジュゲート凝集体（バイオコンジュゲートおよび非共有結合により結合したペプチドを含む）は、１％〜２００％の機能化（ペプチドで機能化されている、グリカン上の二糖単位のパーセントによって決定される）を含み得ることが企図される。一部の実施形態では、バイオコンジュゲートの機能化パーセント（％）は、約１％〜約５０％、または約３％〜約４０％、または約５％〜約３０％、または約１０％〜約２０％、または約１％、または約２％、または約５％、または約１０％、または約１５％、または約２０％、または約２５％、または約３０％、または約３５％、または約４０％、または約４５％、または約５０％、または約５５％、または約６０％、または約６５％、または約７０％、または約７５％、または約８０％、または約８５％、または約９０％、または約９５％、または約１００％である。
【０１０８】
それらに限定されるものではないが、アルギネート、アガロース、デキストラン、デキストラン硫酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）、デルマタン、デルマタン硫酸（ＤＳ）、ヘパラン硫酸、ヘパリン（Ｈｅｐ）、ケラチン、ケラタン硫酸、およびヒアルロン酸（ＨＡ）を含む任意のグリカンが、本明細書に記載される様々な実施形態において利用され得ることが企図される。グリカンは、天然に存在するものであっても、化学的に誘導されたもの、例えばそれらに限定されるものではないが、部分的にＮ−脱硫酸化された誘導体、部分的にＯ−脱硫酸化された誘導体、および／または部分的にＯ−カルボキシメチル化された誘導体であってもよい。
【０１０９】
一部の実施形態では、グリカンは、修飾されていない。ある特定の実施形態では、グリカンは、酸化的に切断されたサッカリド環を含有しておらず、したがってアルデヒド官能基を含有していない。本明細書に開示されるバイオコンジュゲートによって示された有益な効果は、酸化的に切断されたサッカリド環を含有していないグリカンに少なくとも部分的に起因し得ることが企図される。
【０１１０】
このような連結は、ペプチド上のヒドラジド基およびグリカン上のカルボニル基（例えば、カルボン酸基、またはその活性化誘導体）、または、あるいはグリカン上のヒドラジド基およびペプチド上のカルボニル基（例えば、カルボン酸基、またはその活性化誘導体）をカップリングすることによって生じ得る。ある特定の実施形態では、ヒドラジド−カルボニル連結は、ペプチド（複数可）上の末端ヒドラジド基とグリカン上のカルボニル基との間にある。
【０１１１】
一実施形態では、グリカンは、ヘパリンであり、ヘパリンには、ヘパリン誘導体、例えばそれらに限定されるものではないが、部分的にＮ−および／もしくは部分的にＯ−脱硫酸化されたヘパリン誘導体、部分的にＯ−カルボキシメチル化されたヘパリン誘導体、またはそれらの組合せが含まれ得る。ある特定の実施形態では、ヘパリンは、非酸化ヘパリンであり（すなわち、酸化的に切断されたサッカリド環を含有していない）、アルデヒド官能基を含有していない。ヘパリン誘導体、ならびに／または部分的にＮ−脱硫酸化されたヘパリンおよび／もしくは部分的にＯ−脱硫酸化されたヘパリン（すなわち、２−Ｏおよび／または６−Ｏ−脱硫酸化ヘパリン）などのヘパリン誘導体を提供するための方法は、当技術分野で公知である（例えば、Kariya  et  al.,  J.  Biol.  Chem.,  2000,  275:25949-5958；  Lapierre,  et  al.  Glycobiology,  1996,  6(3):355-366を参照されたい）。Ｐｒｅｓｔｗｉｃｈら（ＵＳ２０１２／０１４２９０７；ＵＳ２０１０／０３３０１４３）に従って調製され得るものなどの部分的にＯ−カルボキシメチル化されたヘパリン（または任意のグリカン）誘導体が、本明細書に開示されるバイオコンジュゲートを提供するために使用され得ることも企図される。
【０１１２】
ある特定の実施形態では、グリカンの分子量は、バイオコンジュゲートの効果を調整するために変えられる（例えば、Radek,  K.  A.,  et  al.,  Wound  Repair  Regen.,  2009,  17:  118-126；およびTaylor,  K.  R.,  et  al.,  J.  Biol.  Chem.,  2005,  280:5300-5306を参照されたい）。別の実施形態では、グリカンは、酸化およびアルカリ脱離によって分解されて（例えば、Fransson,  L.  A.,  et  al.,  Eur.  J.  Biochem.,  1980,  106  :59-69を参照されたい）、より低い分子量（例えば、約１０ｋＤａ〜約５０ｋＤａ）を有する分解されたグリカンを生じる。
【０１１３】
一実施形態では、グリカンは、デルマタン硫酸（ＤＳ）である。ＤＳの生物学的機能は幅広く、それには、内皮細胞およびケラチノサイトの増殖および遊走を促進する成長因子ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−７、およびＦＧＦ−１０の結合および活性化が含まれる。一部の実施形態では、デルマタン硫酸の重量範囲は、約１０ｋＤａ〜約７０ｋＤａである。一実施形態では、デルマタン硫酸の分子量は、約４６ｋＤａである。別の実施形態では、デルマタン硫酸は、酸化およびアルカリ脱離によって分解されて（例えば、Fransson,  L.  A.,  et  al.,  Eur.  J.  Biochem.,  1980,  106:59-69を参照されたい）、低分子量（例えば、約１０ｋＤａ）を有する分解されたデルマタン硫酸を生じる。
【０１１４】
別の実施形態では、グリカンは、ヘパリンである。本明細書に記載されるバイオコンジュゲートでは、約６５０〜７００Ｄａから約５０ｋＤａの単一の二糖単位などの様々な分子量のヘパリンを使用することができる。一部の実施形態では、ヘパリンは、約１０〜約２０ｋＤａである。一部の実施形態では、ヘパリンは、最大約１５、または約１６、または約１７、または約１８、または約１９、または約２０ｋＤａである。ある特定の実施形態では、ヘパリンは、サッカリド環の１つまたは複数を切断しない条件下で酸化され得る（例えば、Wang,  et  al.  Biomacromolecules  2013,  14(7):2427-2432を参照されたい）。
【０１１５】
一実施形態では、バイオコンジュゲートは、グリカンおよび約５〜約１０個、または約５個の結合単位を含み、結合単位は、ＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹ（配列番号：）またはＲＲＡＮＡＡＬＫＡＧＥＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧ（配列番号：）の少なくとも１つの配列を含み、ヒドラジド−カルボニル連結を介してグリカンに結合している。結合単位は、同じペプチド内にあっても異なるペプチド内にあってもよい。ある特定の実施形態では、ヒドラジド−カルボニル連結は、ペプチド上の末端ヒドラジド基と、グリカン上のカルボニル基との間にある。一実施形態では、グリカンは、ヘパリンである。ある特定の実施形態では、ヘパリンは、酸化的に切断されたサッカリド環を含有しておらず、したがってアルデヒド官能基を含有していない。
【０１１６】
一実施形態では、バイオコンジュゲートは、グリカンおよび約５〜約１０個、または約８個、または約５個の結合単位を含み、結合単位は、ＧＱＬＹＫＳＩＬＹ（配列番号：）の少なくとも１つの配列を含み、ヒドラジド−カルボニル連結を介してグリカンに結合している。一実施形態では、バイオコンジュゲートは、グリカンおよび約５〜約１０個、または約８個、または約５個の結合単位を含み、結合単位は、ＧＱＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧＳＧＳＲＲ（配列番号：）の少なくとも１つの配列を含み、ヒドラジド−カルボニル連結を介してグリカンに結合している。一実施形態では、バイオコンジュゲートは、グリカンおよび約５〜約１０個、または約８個、または約５個の結合単位を含み、結合単位は、ＧＱＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧＳＧＳＲＲ−ＮＨＮＨ−（配列番号：）の少なくとも１つの配列を含み、ヒドラジド−カルボニル連結を介してグリカンに結合している。ある特定の実施形態では、ヒドラジド−カルボニル連結は、結合単位上の末端ヒドラジド基と、グリカン上のカルボニル基との間にある。一実施形態では、グリカンは、ヘパリンである。ある特定の実施形態では、ヘパリンは、酸化的に切断されたサッカリド環を含有しておらず、したがってアルデヒド官能基を含有していない。
【０１１７】
コラーゲン結合単位ＧＱＬＹＫＳＩＬＹのＣ末端へのアミノ酸の付加は、結合親和性の増加と正に相関することが判明した（図１７）。グリカンと結合部位との間の距離が大きくなると、結合複合体の領域間の立体障害が低減し得ることが企図される。スペーサーが、結合複合体の領域間の立体反発を低減するのに十分な長さに達すると、スペーサーをさらに増加させることの効果は減少し得る。この閾値を超えてスペーサー長を増加させると、アビディティも低下し得る。
【０１１８】
図１５によって示される通り、スペーサー配列におけるアルギニン残基の配置も、結合親和性に影響を及ぼす。グリカン主鎖のより近くに最初のアルギニンを置くと、結合親和性が増加する。このことは、結合部位を負電荷の主鎖から遮蔽する正電荷に起因し得る。
【０１１９】
一部の実施形態では、コラーゲン結合単位は、配列ＧＱＬＹＫＳＩＬＹ（配列番号：）を含み、１つのアミノ酸は、合成のまたは天然に存在するＤ−またはＬ−アミノ酸残基によって置換される。一部の実施形態では、コラーゲン結合単位は、配列ＸＱＬＹＫＳＩＬＹ（配列番号：）；ＧＸＬＹＫＳＩＬＹ（配列番号：）；ＧＱＸＹＫＳＩＬＹ（配列番号：）；ＧＱＬＸＫＳＩＬＹ；ＧＱＬＹＸＳＩＬＹ；ＧＱＬＹＫＸＩＬＹ（配列番号：）；ＧＱＬＹＫＳＸＬＹ（配列番号：）；ＧＱＬＹＫＳＩＸＹ（配列番号：）；またはＧＱＬＹＫＳＩＬＸ（配列番号：）を含み、Ｘは、任意のアミノ酸残基、ＤまたはＬであり得る。これらの配列のそれぞれの後に、本明細書に列挙される任意の実施形態のスペーサーが続くことができる。一部の実施形態では、Ｘは、Ｌ−アラニンである。一部の実施形態では、スペーサーは、ＧＳＧＳＧＳＲＲ（配列番号：）である。
【０１２０】
一部の実施形態では、結合単位およびスペーサーは、配列ＬＫＡＧＱＬＹＫＳＩＬＹＨＨＬＨＳＧＳＧＳＧＳＲＲ（配列番号：）、ＫＡＧＱＬＹＫＳＩＬＹＨＨＬＨＳＹＧＳＧＳＧＳＲＲ（配列番号：）、ＧＱＬＹＫＳＩＬＹＨＨＬＨＳＹＱＮＳＫＰＧＳＧＳＧＳＲＲ（配列番号：）を含む。
【０１２１】
一部の実施形態では、結合単位およびスペーサーは、配列ＧＱＬＹＫＳＩＬＹＧＱＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧＳＧＳＲＲ（配列番号：）、ＧＱＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧＱＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧＳＧＳＲＲ（配列番号：）、ＧＱＬＹＫＳＩＬＹ−Ａｈｘ−ＧＱＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧＳＧＳＲＲ（配列番号：）、または（ＧＱＬＹＫＳＩＬＹ）２ＫＧＳＧＳＧＳＲＲ（配列番号：）を含む。
２．バイオコンジュゲートの合成
【０１２２】
本明細書で使用されるペプチドは、商業的供給源から購入することができ、または当技術分野で周知の方法（例えば、化学的および／または生物工学的方法）を使用して部分的もしくは完全に合成することができる。ある特定の実施形態では、ペプチドは、当技術分野で周知の固相ペプチド合成プロトコールに従って合成される。別の実施形態では、ペプチドは、周知のＦｍｏｃプロトコールに従って固体支持体上で合成され、トリフルオロ酢酸を用いて支持体から切断され、クロマトグラフィーによって当業者に公知の方法に従って精製される。他の実施形態では、ペプチドは、当業者に周知のバイオテクノロジーの方法を利用して合成される。一実施形態では、所望のペプチドのためのアミノ酸配列情報をコードするＤＮＡ配列を、当業者に公知の組換えＤＮＡ技術によって発現プラスミド（例えば、ペプチドの親和性精製のために親和性タグを組み込むプラスミド）にライゲーションし、プラスミドを、発現のための宿主生物にトランスフェクトし、次にペプチドを、例えば、親和性精製によって宿主生物または成長培地から単離する。組換えＤＮＡ技術方法は、参照によって本明細書に組み込まれるSambrook  et  al.,  “Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual”,  3rd  Edition,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press,  (2001)に記載されており、当業者に周知である。
【０１２３】
スキーム１に示される通り、本明細書に記載されるペプチドは、本明細書に開示される通りカルボン酸部分を介してグリカン（例えば、ヘパリン）１Ａに共有結合により結合して、バイオコンジュゲート１Ｂを提供することができる。ペプチドカップリング反応において典型的である通り、活性化剤を使用して、反応を容易にすることができる。適切なカップリング剤（または活性化剤）は当技術分野で公知であり、それには、例えば、カルボジイミド（例えば、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロペンチルカルボジイミド、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ−ｔ−ブチル−Ｎ−メチルカルボジイミド（ＢＭＣ）、Ｎ−ｔ−ブチル−Ｎ−エチルカルボジイミド（ＢＥＣ）、１，３−ビス（２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−イルメチル）カルボジイミド（ＢＤＤＣ）など）、無水物（例えば、対称型、混合型、または環式無水物）、活性化エステル（例えば、フェニル活性化エステル誘導体、ｐ−ヒドロキサム酸活性化エステル、ヘキサフルオロアセトン（ＨＦＡ）など）、アシルアゾール（ＣＤＩを使用するアシルイミダゾール、アシルベンゾトリアゾールなど）、アシルアジド、酸ハロゲン化物、ホスホニウム塩（ＨＯＢｔ、ＰｙＢＯＰ、ＨＯＡｔなど）、アミニウム／ウロニウム塩（例えば、テトラメチルアミニウム塩、ビスピロリジノアミニウム塩、ビスピペリジノアミニウム塩、イミダゾリウムウロニウム塩、ピリミジニウムウロニウム塩、Ｎ，Ｎ，Ｎ’−トリメチル−Ｎ’−フェニル尿素から得られたウロニウム塩、モルホリノベースのアミニウム／ウロニウムカップリング試薬、アンチモン酸ウロニウム塩など）、有機リン試薬（例えば、ホスフィン酸およびリン酸誘導体）、有機硫黄試薬（例えば、スルホン酸誘導体）、トリアジンカップリング試薬（例えば、２−クロロ−４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４メチルモルホリニウム塩化物、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４メチルモルホリニウムテトラフルオロボレートなど）、ピリジニウムカップリング試薬（例えば、向山試薬、ピリジニウムテトラフルオロボレートカップリング試薬など）、ポリマー支持試薬（例えば、ポリマー結合カルボジイミド、ポリマー結合ＴＢＴＵ、ポリマー結合２，４，６−トリクロロ−１，３，５−トリアジン、ポリマー結合ＨＯＢｔ、ポリマー結合ＨＯＳｕ、ポリマー結合ＩＩＤＱ、ポリマー結合ＥＥＤＱなど）など（例えば、El-Faham,  et  al.  Chem.  Rev.,  2011,  111(11):  6557-6602；  Han,  et  al.  Tetrahedron,  2004,  60:2447-2467を参照されたい）が含まれる。
【０１２４】
一実施形態では、ペプチドカップリング反応は、活性化グリカン中間体を介して、グリカンのカルボン酸部分をカップリング剤（例えば、カルボジイミド試薬、例えばそれらに限定されるものではないが、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）など）と反応させて、Ｏ−アシルイソ尿素中間体を形成することによって進行する。このようなカルボジイミド化学反応は、当技術分野で周知であり、適切なカップリング剤は、商業的供給源から購入することができる。Ｏ−アシルイソ尿素中間体を、所望のペプチドと接触させると、バイオコンジュゲートが得られる。グリカンは、ペプチドが存在する前にまたはペプチドの存在下で活性化剤と接触させることができる。一部の実施形態では、反応は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）またはその誘導体の存在下で行われる。ある特定の実施形態では、ペプチド配列は、グリカン、またはそのＯ−アシルイソ尿素中間体とのカップリング反応を助けるために、反応性部分（例えば、ヒドラジド官能基）を含むように修飾することができる。さらに、ペプチドの１つまたは複数のアミノ酸が反応性官能基（例えば、カルボン酸側鎖）を含有する、ある特定の場合には、１つまたは複数の側鎖を保護してカップリング反応を容易にするために、標準保護基化学を使用することができる。さらに、非アミノ酸スペーサーを、単独で、またはアミノ酸スペーサー（例えば、アミノヘキサン酸）と組み合わせて用いることもできる。
【化１４】
2020526497.tif 000022
【０１２５】
ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートは、修飾グリカン誘導体（例えば、ヘパリン）から得られる（スキーム２）。本明細書に記載されるバイオコンジュゲートにおいて使用するのに適した様々なグリカン誘導体、例えば部分的にＮ−脱硫酸化されたヘパリンおよび部分的にＯ−脱硫酸化されたヘパリン（すなわち、２−Ｏおよび／または６−Ｏ−脱硫酸化ヘパリン、例えば、Kariya  et  al.,  J.  Biol.  Chem.,  2000,  275:25949-5958；  Lapierre,  et  al.  Glycobiology,  1996,  6(3):355-366を参照されたい）は、当技術分野で公知である。例示的な方法は、以下のスキーム２に示されている。スキーム２に示される通り、グリカン（例えば、ヘパリン）１Ａを、適切な脱硫酸化剤、例えば塩基（例えば、ＮａＯＨ）またはシリル化試薬（例えば、Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（ＢＴＳＡ）、Ｎ−メチル−Ｎ−（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド（ＭＴＳＴＦＡ）など）などと反応させて、１つまたは複数の脱硫酸化グリカン誘導体２Ａを提供することができる。当業者に明らかである通り、グリカン誘導体２Ａは、部分的な、完全なまたは混合物の脱硫酸化グリカン誘導体２Ａを得ることができるように、用いる試薬および反応条件に応じて調整され得る。次に、脱硫酸化グリカン誘導体２Ａを、スキーム１について上記の通り、必要に応じてカップリング剤の存在下で、典型的なペプチドカップリング反応条件下でペプチドと反応させて、バイオコンジュゲート２Ｂを提供することができる。さらに、スキーム２に示される通り、少なくとも１つのヒドロキシル基を有するグリカン誘導体（例えば、６−Ｏ−脱硫酸化ヘパリン）を、Ｏ−カルボキシメチル化グリカン誘導体（例えば、６−Ｏ−カルボキシメチル化ヘパリン）２Ｃに変換させることができる（例えば、Prestwichら、ＵＳ２０１２／０１４２９０７およびＵＳ２０１０／０３３０１４３を参照されたい）。スキーム１について上記の通り、必要に応じてカップリング剤の存在下で、典型的なペプチドカップリング反応条件下でペプチドとの２Ｃの反応により、バイオコンジュゲート２Ｄおよび／または２Ｅを提供することができる。
【化１５】
2020526497.tif 000023
【０１２６】
ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートは、スキーム３に従って調製することができる。スキーム３に示される通り、グリカン（例えば、コンドロイチン硫酸「ＣＳ」）を、過ヨウ素酸試薬、例えば過ヨウ素酸ナトリウムを使用して酸化して、ペプチドをグリカンに共有結合により結合するためにアルデヒド官能基をグリカン上に提供する（例えば、「ｏｘ−ＣＳ」）。次に、酸化グリカン（例えば、「ｏｘ−ＣＳ」）のアルデヒド官能基を、Ｎ−［β−マレイミドプロピオン酸］ヒドラジド（ＢＭＰＨ）と反応させて、グリカン中間体（例えば、「ＢＭＰＨ−ＣＳ」）を形成し、グリカン中間体を、少なくとも１つの遊離チオール基（すなわち、−ＳＨ基）を含有するペプチドとさらに反応させて合成ペプチドグリカンを得ることによって、ペプチドを、グリカン（例えば、コンドロイチン硫酸「ＣＳ」）に共有結合により結合させる。
【化１６】
2020526497.tif 000024
３．使用方法
３．１  グラフト不全
【０１２７】
本開示の一実施形態は、外科的バイパス術の成功率を改善し、かつ／またはその失敗を低減するための方法および関連組成物を提供する。バイパスグラフトは、冠動脈疾患（ＣＡＤ）および末梢動脈疾患（ＰＡＤ）の両方における動脈閉塞の処置の一形態として使用される。本明細書で使用される場合、用語「処置すること」は、疾患または障害の１つまたは複数の臨床症状を防止、治癒、逆転、減弱、軽減、最小化、阻害、抑制および／または停止することを指す。米国では、年間およそ５００，０００件の冠動脈バイパスグラフト（ＣＡＢＧ）術および７０，０００件を超える末梢バイパスグラフト術が実施されている。最も一般的には、伏在静脈から自家血管グラフトが採取されることが多い。
【０１２８】
血流を回復するために自家静脈グラフトを用いる外科的バイパスの普及にもかかわらず、ＣＡＤおよびＰＡＤの両方で多数の静脈グラフト不全（ＶＧＦ）がある。末梢だけでは、静脈グラフト不全率は、５年以内に５０％不全レベルに達する。静脈グラフトの５％〜１０％が、技術的因子および急性血栓症に起因して移植直後に不全を生じるが、別の２０％〜３０％の症例において、中期の不全（３〜２４カ月）が生じるおそれがあり、調査監視、再介入術および切断に費用がかかる場合がある。ブリガムアンドウィメンズ病院（the  Brigham  and  Women’s  Hospital）での２０年の経験中、ＣＬＩ患者（ｎ＝１２１９）における静脈グラフト不全の１２カ月間の発生率は、２９％であった。静脈グラフト不全の結果は、再発性虚血症状、衰弱させる手術および四肢喪失を含めて、患者にとって多くの場合重症となっている。現在まで、薬物療法および技術革新は、静脈グラフト不全を低減することに対してほとんど影響を及ぼしていない。
【０１２９】
脆弱な内皮層への静脈グラフト管による傷害は、それが、静脈グラフト採取、保存媒体、バイパスのための過度の準備操作、または虚血および再かん流傷害によって引き起こされたものかにかかわらず、移植後の血管壁内に血小板媒介性の炎症応答をもたらすことが企図される。このような内皮傷害およびＥＣＭ−血小板活性化カスケードは、急性炎症および血栓症による初期のＶＧＦ、または新生内膜過形成による遅発性ＶＧＦをもたらすおそれがある。したがって、移植後の循環血小板への静脈グラフト内皮下マトリックスの曝露を制限することは、急性血管壁炎症を低減し、再上皮形成を改善し、血管閉塞およびＶＧＦをもたらし得る過度の新生内膜過形成を制限する一助となり得る。本明細書に記載されるバイオコンジュゲートは、自家静脈グラフトを用いる外科的バイパスを受ける、心血管疾患を有する患者のための静脈グラフト保存溶液として使用することができる。本明細書に記載されるバイオコンジュゲートおよびバイオコンジュゲートを含む組成物は、冠動脈疾患および／または末梢動脈疾患を処置および／または防止することを必要とする患者の冠動脈疾患および／または末梢動脈疾患を処置および／または防止するために使用することができる。
【０１３０】
したがって、本開示の一実施形態によれば、血管の切片の内壁を、本開示の合成バイオコンジュゲートを含有する溶液と接触させることによって、血管グラフト（例えば、静脈グラフト）を調製するための方法が提供される。接触を実施する一つの方法は、その切片を溶液に浸漬させることである。この接触のための条件は変わり得るが、適量の合成バイオコンジュゲートが内壁に結合するように、合成バイオコンジュゲートの濃度および血管の特徴に応じて容易に決定することができる。このような方法で調製された血管グラフトも、本開示の範囲内である。
【０１３１】
グラフトが調製されると、移植することを必要とする患者に移植することができる。外科的バイパス術は、医療専門家によって容易に行われ得る。グラフト（grant）の内壁に結合した合成バイオコンジュゲートは、移植されると、急性血管壁炎症を低減し、グラフトの再上皮形成を改善し、グラフトの過度の新生内膜過形成を制限する一助になり、グラフト不全を低減することができる。
【０１３２】
一実施形態では、グラフトを、バイパス術の間または後に上記の通り合成バイオコンジュゲートで処置した場合、合成バイオコンジュゲートがグラフトの内壁に結合するように、合成バイオコンジュゲートの溶液をグラフトの内腔に注射することができる。一態様では、注射は、血流がグラフトを通して回復または開始される前に行われる。別の態様では、注射は、血流が回復または開始された直後（例えば、１０分以内、５分以内、または１分以内）に行われる。
【０１３３】
一部の実施形態では、方法は、血管の負の再構築を阻害するのに有効である。虚血または冠状動脈性心疾患としても公知の冠動脈疾患は、冠動脈（心筋に血液を供給する動脈）の内側の平坦な弾性内膜の一部がアテローム性動脈硬化症を発症させ、心臓への血流を事実上制限する場合に生じる。アテローム性動脈硬化症または動脈硬化としても公知の末梢動脈疾患は、循環系の動脈内で生じる障害である。負の再構築には、血管径および内腔径の低減をもたらす刺激に対する、血管の生理的または病理学的応答が含まれる。このような刺激は、例えば、血流変化または血管形成術によってもたらされるおそれがある。一部の実施形態では、本明細書に記載されるバイオコンジュゲートおよびバイオコンジュゲートを含む組成物の注射により、注射なしの血管径と比較して、約１０％、２０％、３０％、４０％、６０％、７０％、８０％、９５％のいずれか、またはそれを超えて血管径が増加する。負の再構築は、例えば、病変部位（または疾患部位）における狭窄径パーセントとして血管造影的に（angiographically）定量することができる。再構築の度合いを決定する別の方法には、血管内超音波（ＩＶＵＳ）を使用する病変内の外弾性板面積を測定することが含まれる。ＩＶＵＳは、外弾性板ならびに血管内腔を画像化することができる技術である。一部の実施形態では、負の再構築は、血管介入術、例えば血管形成術、ステント留置、または粥腫切除術と関連する。したがって、本明細書に記載されるバイオコンジュゲートおよびバイオコンジュゲートを含む組成物は、血管介入術の前、間および／または後に注射することができる。ある特定の実施形態では、大腿膝窩動脈内の狭窄または閉塞を処置することを必要とする患者の大腿膝窩動脈内の狭窄または閉塞を処置する方法であって、バルーン血管形成術の前、間および／または後に溶液を内腔の内壁に適用することを含み、溶液が、有効量の本明細書に記載されるバイオコンジュゲートまたはバイオコンジュゲートを含む組成物を含む、方法が提供される。
【０１３４】
したがって本開示は、血管（例えば、動脈）の負の再構築を阻害することを必要とする個体の血管（例えば、動脈）の負の再構築を阻害する方法であって、血管壁または血管壁を取り囲む組織に、有効量の本明細書に記載されるバイオコンジュゲートまたはバイオコンジュゲートを含む組成物を注射することを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、バイオコンジュゲートまたは組成物は、潜在的なまたは実際の負の再構築の部位にまたはそれに隣接して（例えば、部位から約２、１、または０．５ｃｍ以上離さずに）注射される。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物は、潜在的なまたは実際の負の再構築の部位から離して（例えば、部位から少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ｃｍのいずれか離して）注射される。一部の実施形態では、注射は、針を備えたカテーテルを介して行われる。一部の実施形態では、部位は、冠動脈または末梢動脈である。一部の実施形態では、動脈は、腎臓動脈、大脳動脈、肺動脈、および脚の動脈からなる群から選択される。一部の実施形態では、動脈は、バルーン傷害を受けた動脈である。さらなる例として、それらに限定されるものではないが、腹部大動脈、前脛骨動脈、大動脈弓、弓状動脈、腋窩動脈、上腕動脈、頸動脈、腹腔動脈、腓骨回旋動脈、総肝動脈、総腸骨動脈、深大腿動脈、深掌動脈弓、背側指動脈、背側中足動脈、外頸動脈、外腸骨動脈、顔面動脈、大腿動脈、下腸間膜動脈、内部腸骨動脈、腸管動脈、外側下膝動脈、外側上膝動脈、掌側指動脈、腓骨動脈、膝窩動脈、後脛骨動脈、大腿深動脈、肺動脈、橈骨動脈、腎臓動脈、脾臓動脈、鎖骨下動脈、浅掌動脈弓、上腸間膜動脈、上尺側側副動脈、および／または尺骨動脈が挙げられる。ある特定の実施形態では、動脈は、冠血管系の一部である。
【０１３５】
一実施形態では、上記の方法において使用されるバイオコンジュゲートは、ヘパリンおよび約５〜約１０個、または約５個のペプチドを含み、ペプチドは、ＧＱＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧＳＧＳＲＲ（配列番号：）の少なくとも１つの配列を含む。一実施形態では、上記の方法において使用されるバイオコンジュゲートは、ヘパリンおよび約５〜約１０個、または約５個のペプチドを含み、ペプチドは、ＧＱＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧＳＧＳＲＲ（配列番号：）の少なくとも１つの配列を含み、ヒドラジド−カルボニル連結を介してヘパリンに結合している。
３．２  線維症
【０１３６】
本明細書の一実施形態では、線維症を防止および／または処置するためのバイオコンジュゲートおよび方法が提供される。線維症は、炎症細胞が組織および器官に遊走して、瘢痕化をもたらす細胞の応答を生じる炎症性疾患である。線維症は、典型的に炎症または損傷の結果として、体内の多くの組織において生じ得る。炎症細胞の血管外遊出を防止することによって、線維症を減弱または防止することができる。
【０１３７】
一実施形態では、本明細書で提供されるバイオコンジュゲートおよび方法は、肺線維症を防止および／または処置するために使用することができる。肺の線維症の種類には、嚢胞性線維症および特発性肺線維症などの肺線維症が含まれる。肺線維症は、肺組織内に瘢痕が形成されて重篤な呼吸問題が生じる呼吸器疾患である。瘢痕の形成により、壁が肥厚し、血中への酸素供給が減少する。結果として、患者は永続的息切れに苦しむ。
【０１３８】
一実施形態では、本明細書で提供されるバイオコンジュゲートおよび方法は、肝線維症を処置するために使用することができる。肝線維症は、慢性アルコール曝露、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染、ウィルソン病、アルファ−１−アンチトリプシン欠乏、ヘモクロマトーシス、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、および自己免疫性肝炎を含めた多種多様な状態から生じ得る。慢性ＨＣＶは、慢性肝疾患の主な寄与因子であり、肝臓は、肝臓での繊維組織の形成および瘢痕化によって特徴付けられる持続的な炎症性線維症（inflammatory  and  fibrosis）を誘発する。ＮＡＦＬＤおよびＮＡＳＨも、肝臓に炎症および線維症を引き起こす。
【０１３９】
肝硬変は、長期間の損傷に起因して肝臓が適切に機能しなくなっている肝臓の線維症である。典型的に、疾患は、数カ月または数年にわたってゆっくり進展する。初期には、症状がないことが多い。疾患が悪化するにつれて、人は、疲れ、衰弱、そう痒を感じ、下肢にむくみが生じ、皮膚が黄変し、容易にあざができ、腹部に体液が蓄積し、または皮膚にクモ状血管が生じる場合がある。腹部への体液の蓄積は、自然発生的に感染を受けるおそれがある。他の合併症には、肝性脳症、食道の拡張静脈または拡張胃静脈からの出血、および肝臓がんが含まれる。肝性脳症は、錯乱を、場合により意識不明をもたらす。肝硬変は、肝機能不全をもたらすおそれがある。以下の症状または特色は、肝機能不全の直接的な結果であり、したがって、本開示の組成物および方法によって処置または軽快させることもできる。
【０１４０】
肝星細胞（ＨＳＣ）と腫瘍細胞との直接的な相互作用は、複数の機序を介して腫瘍成長を促進することが示されている。したがって、ＨＳＣの腫瘍を支える役割を低減または排除するためにＨＳＣを標的化することは、肝細胞癌（ＨＣＣ）を防止、阻害または処置するための潜在的な治療戦略をもたらす。ある特定の実施形態では、肝細胞癌（ＨＣＣ）の発症を防止または阻害することを必要とする患者の肝細胞癌（ＨＣＣ）の発症を防止または阻害する方法であって、患者に、有効量の本明細書に記載されるバイオコンジュゲートを投与することを含む、方法が提供される。ある特定の実施形態では、肝細胞癌（ＨＣＣ）の発症は、肝硬変の結果である。ある特定の実施形態では、方法は、肝星細胞増殖および／または線維化表現型遷移を阻害することを含む。ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートは、肝動脈化学塞栓（ＴＡＣＥ）術中などに肝臓に局部投与される。
【０１４１】
クモ状血管腫またはクモ状母斑は、多くのより小さい血管によって取り囲まれた中心細動脈からなる血管病変であり、エストラジオールの増加に起因して生じる。手掌紅斑は、やはりエストロゲンの増加の結果として生じる、手掌の母指球および小指球の発赤である。男性の癌性ではない女性化乳房症または乳腺の大きさの増加は、エストラジオールの増加によって引き起こされ、最大患者の３分の２に生じ得る。性ホルモンの低下である性腺機能低下症は、性交不能症、不妊、性衝動の喪失、および精巣萎縮として現れ、原発性性腺傷害または視床下部／下垂体機能の抑制から生じ得る。性腺機能低下症は、アルコール依存症およびヘモクロマトーシスに起因する肝硬変と関連する。肝臓の大きさは、肝硬変を有するヒトでは肥大している、正常、または縮小している場合がある。
【０１４２】
一実施形態では、本明細書で提供されるバイオコンジュゲートおよび方法は、腎線維症を防止および／または処置するために使用することができる。腎線維症は、腎臓への急性または持続性傷害から生じ得る。傷害は、細胞外マトリックスの過度の沈着をもたらすおそれがある。経時的に、これは腎不全をもたらし、患者が透析または腎臓移植を受ける必要が生じ得る。
【０１４３】
腹膜腔に体液が蓄積する腹水症は、脇腹の鈍麻を生じる。これは、腹囲の増加として目に見える場合がある。肝性口臭は、ジメチルスルフィドの増加から生じる、かび臭い口臭である。黄疸は、ビリルビンの増加に起因する皮膚および粘膜の黄変である。さらに、肝硬変は、血流に対する抵抗性を増大させ、門脈静脈系においてより高い圧力をかけて、門脈圧亢進症を生じる。
【０１４４】
一実施形態では、本明細書で提供されるバイオコンジュゲートおよび方法は、心臓の線維症を防止および／または処置するために使用することができる。心臓の線維症は、心房線維症、心内膜心筋線維症、または心筋梗塞の形態で存在する。神経膠瘢痕は、脳内の線維症である。他の種類の線維症には、限定することなく、関節線維症（膝、肩、他の関節）、クローン病（腸）、デュピュイトラン拘縮（手、指）、ケロイド（皮膚）、縦隔線維症（縦隔の軟組織）、骨髄線維症（骨髄）、ペロニー病（陰茎）、腎性全身性線維症（皮膚）、進行性塊状線維症（肺）、後腹膜線維症（後腹膜の軟組織）、強皮症／全身性硬化症（皮膚、肺）、および癒着性関節包炎（肩）の一部の形態が含まれる。
【０１４５】
本開示の組成物および方法は、これらの疾患、またはこれらの疾患と関連する症状もしくは特色のいずれかを防止および／または処置するのに適していることが企図される。線維症の発症は、コラーゲンおよびグリコサミノグリカンを含めた結合組織を敷く刺激細胞が関与する。本開示のバイオコンジュゲートは、コラーゲンまたはグリコサミノグリカンと相互作用し、したがってこのような過度の結合組織の形成を破壊することができる。バイオコンジュゲートは、内皮バリアを保護することもできる。これは、微小血管傷害に起因して露出した細胞外マトリックスと相互作用することによってであり得る。内皮バリアを保護することにより、炎症細胞が、組織に溢出して（extravating）線維化組織をもたらす過度のＥＣＭ沈着を引き起こすのを防止する。したがって、バイオコンジュゲートは、線維症を防止し、阻害し、遅延させ、かつ／または逆行させることができる。
【０１４６】
ある特定の実施形態では、線維症は、虚血後、感染後、または特発性である（例えば、腎臓、肝臓、心臓、肺）。例えば、Guerrot,  D.,  et  al.  Fibrogenesis  &  tissue  repair  5.Suppl  1  (2012):  S15、および  Yamaguchi,  I.,  et  al.  Nephron  Experimental  Nephrology  120.1  (2012):  e20-e31を参照されたい。ある特定の実施形態では、線維症は、後腹膜線維症である。ある特定の実施形態では、線維症は、皮膚線維症である（例えば、強皮症）。例えば、Maurer,  B.,  et  al.  Annals  of  the  rheumatic  diseases  (2013):  annrheumdis-2013を参照されたい。
【０１４７】
一実施形態では、疾患は、急性尿細管壊死、糖尿病性慢性腎不全、狼瘡腎炎、腎線維症、でも急性糸球体腎炎でもない。一実施形態では、疾患は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、慢性閉塞性肺疾患、喘息、でも気腫でもない。
【０１４８】
ある特定の実施形態では、線維症は、それらに限定されるものではないが、ファブリ病、ゴーシェ病、ニーマン−ピック病、およびハンター症候群（ムコ多糖症）を含めたリソソーム蓄積障害によって引き起こされるか、またはそうでなければそれらに関する。したがって、本明細書のある特定の実施形態では、リソソーム蓄積障害によって引き起こされたか、またはそうでなければそれらに関する線維症を防止することを必要とする患者のリソソーム蓄積障害によって引き起こされたか、またはそうでなければそれらに関する線維症を防止するための方法が提供される。
【０１４９】
本明細書の一実施形態では、線維症の防止または処置のための本明細書に開示されるバイオコンジュゲート（複数可）の使用が提供される。本明細書の一実施形態では、線維症の防止または処置のための医薬の調製のための本明細書に開示されるバイオコンジュゲート（複数可）の使用が提供される。本明細書の一実施形態では、肝線維症の防止または処置のための本明細書に開示されるバイオコンジュゲート（複数可）の使用が提供される。本明細書の一実施形態では、肺線維症の防止または処置のための本明細書に開示されるバイオコンジュゲート（複数可）の使用が提供される。一実施形態では、上記の方法において使用されるバイオコンジュゲートは、ヘパリンおよび約５〜約１０個、または約５個のペプチドを含み、ペプチドは、ＧＱＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧＳＧＳＲＲ（配列番号：）の少なくとも１つの配列、またはそれからそれぞれ１つ、２つ、または３つのアミノの付加、欠失および／または置換を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、上記の方法において使用されるバイオコンジュゲートは、ヘパリンおよび約５〜約１０個、または約５個のペプチドを含み、ペプチドは、ＧＱＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧＳＧＳＲＲ（配列番号：）の少なくとも１つの配列を含む。一実施形態では、ペプチド（複数可）は、ヒドラジド−カルボニル連結を介してヘパリンまたは他のグリカンに結合している。
【０１５０】
本明細書の一実施形態では、肝線維症または肺線維症を防止または処置することを必要とする患者の肝線維症または肺線維症を防止または処置するための方法であって、患者に、ヘパリンおよび約５〜約１０個、または約５個のペプチドを含む有効量のバイオコンジュゲートを投与することを含み、ペプチドは、ＧＱＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧＳＧＳＲＲ（配列番号：）の少なくとも１つの配列を含む、方法が提供される。本明細書の一実施形態では、肝線維症または肺線維症の防止または処置を必要とする患者の肝線維症または肺線維症の防止または処置のための本明細書に開示されるバイオコンジュゲート（複数可）の使用が提供される。一実施形態では、有効量のバイオコンジュゲートが投与される。
【０１５１】
また本明細書では、血管炎を防止および／または処置するための方法が提供される。血管炎は、血管壁の炎症によって定義され、個々の疾患実体の多様な群の病理学的基礎を形成する。血管炎は、自己免疫疾患において一般に観測される難治性病態の１つであり、その多くの症例は、ステロイドおよび免疫抑制剤などの従来使用されている治療方法に対して難治性である。血管炎症候群では、炎症は、様々な大きさの動脈に生じ、発熱、筋肉および関節の疼痛、血管閉塞、皮膚潰瘍、ならびに多発性単神経炎が生じるおそれがある。方法は、大型血管の血管炎（ＬＶＶ）、中型血管の血管炎（ＭＶＶ）、小型血管の血管炎（ＳＶＶ）、多様な（variable）血管の血管炎（ＶＶＶ）、単一器官血管炎（ＳＯＶ）、全身性疾患と関連する血管炎、および／または可能性が高い病因と関連する血管炎を処置するために使用することができる。大型血管の血管炎（ＬＶＶ）の非限定的な例として、高安動脈炎（ＴＡＫ）および巨細胞動脈炎（ＧＣＡ）が挙げられる。中型血管の血管炎（ＭＶＶ）の非限定的な例として、結節性多発動脈炎（ＰＡＮ）および川崎病（ＫＤ）が挙げられる。小型血管の血管炎（ＳＶＶ）の非限定的な例として、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連血管炎（ＡＡＶ）、顕微鏡的多発血管炎（ＭＰＡ）、多発血管炎性肉芽腫症（ウェゲナー）（ＧＰＡ）、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症（チャーグ−ストラウス）（ＥＧＰＡ）、免疫複合体ＳＶＶ、抗糸球体基底膜（抗ＧＢＭ）疾患、クリオグロブリン血症性（gryoglobulinemic）血管炎（ＣＶ）、ＩｇＡ血管炎（ヘノッホ−シェーンライン）（ＩｇＡＶ）、および低補体血症性蕁麻疹様血管炎（ＨＵＶ））（抗Ｃ１ｑ血管炎）が挙げられる。多様な血管の血管炎（ＶＶＶ）の非限定的な例として、ベーチェット病（ＢＤ）およびコーガン症候群（ＣＳ）が挙げられる。単一器官血管炎（ＳＯＶ）の非限定的な例として、皮膚白血球破砕性血管炎、皮膚動脈炎、原発性中枢神経系血管炎、および孤立性大動脈炎が挙げられる。全身性疾患と関連する血管炎の非限定的な例として、狼瘡血管炎、リウマチ性血管炎、およびサルコイド血管炎が挙げられる。可能性が高い病因と関連する血管炎の非限定的な例として、Ｃ型肝炎ウイルス関連クリオグロブリン血症性血管炎、Ｂ型肝炎ウイルス関連血管炎、梅毒関連大動脈炎、薬物関連免疫複合体血管炎、薬物関連ＡＮＣＡ関連血管炎、およびがん関連血管炎が挙げられる。血管炎の他の例として、抗リン脂質症候群、バージャー病（閉塞性血栓血管炎）、クリオグロブリン血症、クリオピリン関連自己炎症性症候群（ＣＡＰＳ）（若年性）、グッドパスチャー、限局性強皮症（若年性）、リウマチ性多発筋痛、レイノー現象、強皮症、シェーグレン症候群、および全身性エリテマトーデスが挙げられる。本明細書に開示されるバイオコンジュゲートおよび方法は、血管炎を阻害および／または処置するために使用することができることが企図される。
【０１５２】
本明細書の一実施形態では、血管炎を防止および／または処置するための方法が提供される。本明細書の一実施形態では、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連血管炎（ＡＡＶ）、顕微鏡的多発血管炎（ＭＰＡ）、多発血管炎性肉芽腫症（ウェゲナー）（ＧＰＡ）、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症（チャーグ−ストラウス）（ＥＧＰＡ）、免疫複合体ＳＶＶ、抗糸球体基底膜（抗ＧＢＭ）疾患、クリオグロブリン血症性血管炎（ＣＶ）、ＩｇＡ血管炎（ヘノッホ−シェーンライン）（ＩｇＡＶ）、および／または低補体血症性蕁麻疹様血管炎（ＨＵＶ））（抗Ｃ１ｑ血管炎）を含めた、小型血管の血管炎を防止および／または処置するための方法が提供される。このような疾患は、小血管（例えば、非常に小さい動脈、細動脈、毛細血管、および小静脈）に影響を及ぼす。
組合せ治療
【０１５３】
一部の実施形態では、本開示の組成物は、線維症を防止または処置するのに有用な第２の薬剤と組み合わせて使用することができる。したがって、一実施形態では、本開示の任意の組成物および１つまたは複数のこのような第２の薬剤を含む、組合せ、組成物、パッケージまたはキットが提供される。一実施形態では、本開示の任意の処置方法は、１つまたは複数のこのような第２の薬剤の投与をさらに含む。
【０１５４】
第２の薬剤は、線維症の症状を防止、処置するか、または代わりに軽快させるのに有用な任意の薬学的または生物学的薬剤であってよい。非限定的な例として、ステロイド、例えばプレドニン、還元剤、例えばＮ−アセチルシステイン、抗線維化薬物、例えばピルフェニドンおよびニンテダニブ、免疫抑制薬、例えばコルチコステロイド、シクロホスファミド、アザチオプリン、メトトレキサート、ペニシラミン、ならびにシクロスポリンＡおよびＦＫ５０６、ならびにコルヒチン、ＩＦＮ−γおよびミコフェノール酸モフェチルのような他の薬剤が挙げられる。
【０１５５】
一部の実施形態では、本開示の組成物は、血管炎を防止または処置するのに有用な第２の薬剤と組み合わせて使用することができる。したがって、一実施形態では、本開示の任意の組成物および１つまたは複数のこのような第２の薬剤を含む、組合せ、組成物、パッケージまたはキットが提供される。一実施形態では、本開示の任意の処置方法は、１つまたは複数のこのような第２の薬剤の投与をさらに含む。
【０１５６】
第２の薬剤は、血管炎の症状を防止、処置するか、または代わりに軽快させるのに有用な任意の薬学的または生物学的薬剤であってよい。非限定的な例として、プレドニゾン、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ）、メチルプレドニゾロン、メトトレキサートナトリウム、Ｍｅｄｒｏｌ（Ｐａｋ）、Ｍｅｄｒｏｌ、デキサメタゾン、プレドニゾロン、ＤｅｘＰａｋ、Ｄｅｌｔａｓｏｎｅ、コルチゾン、Ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ  Ｉｎｔｅｎｓｏｌ、デキサメタゾンリン酸エステルナトリウム、Ｏｒａｐｒｅｄ  ＯＤＴ、Ｔｒｅｘａｌｌ、Ｒｈｅｕｍａｔｒｅｘ、メトトレキサートナトリウム（ＰＦ）、Ｖｅｒｉｐｒｅｄ  ２０、Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ  Ｉｎｔｅｎｓｏｌ、プレドニゾロンリン酸エステルナトリウム、Ｐｅｄｉａｐｒｅｄ、Ｍｉｌｌｉｐｒｅｄ、Ｒａｙｏｓ、Ｍｉｌｌｉｐｒｅｄ、およびＤｏｕｂｌｅＤｅｘが挙げられる。
４．組成物
【０１５７】
一実施形態では、バイオコンジュゲートは、組成物で投与される。本開示は、バイオコンジュゲートおよび薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。水または食塩水を含めた当業者に公知の薬学的に許容される担体が使用され得る。当技術分野で公知の通り、構成成分ならびにそれらの相対量は、所期の使用および送達方法によって決定される。組成物において用いられる賦形剤または担体は、バイオコンジュゲートの所望の効果を低減しないように選択され得る。適切な組成物の例として、水溶液、例えば等張食塩水、５％グルコース中溶液が挙げられる。アルコール、グリコール、エステルおよびアミドなどの他の周知の薬学的に許容される液体担体を用いることができる。ある特定の実施形態では、組成物は、１つまたは複数の添加剤、例えばそれらに限定されるものではないが、イオン強度改変剤、溶解増強剤、糖、例えばマンニトールもしくはソルビトール、ｐＨ緩衝剤、界面活性剤、安定化ポリマー、防腐剤、および／または共溶媒をさらに含む。
【０１５８】
ある特定の実施形態では、組成物は、水溶液である。水溶液は、製剤化の容易さ、ならびに溶液の点滴注入によってこのような組成物を容易に投与する能力に基づいて、組成物製剤で使用するのに適している。ある特定の実施形態では、組成物は、懸濁液、粘性もしくは半粘性ゲル、または他の種類の固体もしくは半固体組成物である。一部の実施形態では、組成物は、当技術分野で十分周知のフォーム、軟膏、液体洗浄液、ゲル、スプレーおよびリポソームの形態である。あるいは、局所投与は、ポンプ−カテーテル系、連続的もしくは選択的放出デバイス、または接着バリアから選択されるデバイスを介する、提供されたバイオコンジュゲートの処置部位への注入である。ある特定の実施形態では、組成物は、静脈または動脈の内壁に直接的に適用されるか、または接触する溶液である。一部の実施形態では、組成物は、ポリマーマトリックスを含む。他の実施形態では、組成物は、吸収可能である。ある特定の実施形態では、組成物は、ｐＨ緩衝剤を含む。一部の実施形態では、組成物は、潤滑増強剤を含有する。
【０１５９】
ある特定の実施形態では、組成物のための薬学的に許容される担体または支持体として、ポリマーマトリックスまたはポリマー材料が用いられる。本明細書に記載されるポリマー材料は、天然または非天然ポリマー、例えば、糖、ペプチド、タンパク質、ラミニン、コラーゲン、ヒアルロン酸、イオン性および非イオン性水溶性ポリマーなど；アクリル酸ポリマー；親水性ポリマー、例えばポリエチレンオキシド、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマー、およびポリビニルアルコール；セルロースポリマーおよびセルロースポリマー誘導体、例えばヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、およびエーテル化セルロース；ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、乳酸およびグリコール酸のコポリマー、または天然および合成の両方の他のポリマー性剤を含むことができる。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される組成物は、フィルム剤、ゲル剤、フォーム剤、またはおよび他の剤形として製剤化される。
【０１６０】
適切なイオン強度改変剤には、例えば、グリセリン、プロピレングリコール、マンニトール、グルコース、デキストロース、ソルビトール、塩化ナトリウム、塩化カリウム、および他の電解質が含まれる。
【０１６１】
ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートの溶解度を増強する必要があり得る。このような場合には、溶解度は、適切な製剤化技術の使用、例えば、マンニトール、エタノール、グリセリン、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ポロキサマー、および当技術分野で公知の他のものなどの溶解度増強組成物の組込みによって増加させることができる。
【０１６２】
ある特定の実施形態では、組成物は、潤滑増強剤を含有する。本明細書で使用される場合、潤滑増強剤は、薬学的に許容される担体の粘度を改変することができる１つまたは複数の薬学的に許容されるポリマー材料を指す。適切なポリマー材料には、それらに限定されるものではないが、イオン性および非イオン性水溶性ポリマー；ヒアルロン酸およびその塩、コンドロイチン硫酸およびその塩、デキストラン、ゼラチン、キトサン、ジェラン、他のバイオコンジュゲートもしくは多糖類、またはそれらの任意の組合せ；セルロースポリマーおよびセルロースポリマー誘導体、例えばヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、およびエーテル化セルロース；コラーゲンおよび改変コラーゲン；ガラクトマンナン、例えばグアーガム、ローカストビーンガムおよびタラガム、ならびに上記の天然ガムおよび構造的な主構成成分としてマンノースおよび／またはガラクトース部分を含有する類似の天然または合成ガム（例えば、ヒドロキシプロピルグアー）から得られた多糖類；トラガントガムおよびキサンタンガムなどのガム；ジェランガム；アルギネートおよびアルギン酸ナトリウム；キトサン；ビニルポリマー；親水性ポリマー、例えばポリエチレンオキシド、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマー、およびポリビニルアルコール；カルボキシビニルポリマーまたは架橋アクリル酸ポリマー、例えばポリマーの「カルボマー」ファミリー、例えば、商標Ｃａｒｂｏｐｏｌ（商標）で商業的に得ることができるカルボキシポリアルキレン；ならびに他の様々な粘性または粘弾性（viscoelastomeric）物質が含まれる。一実施形態では、潤滑増強剤は、ヒアルロン酸、デルマタン、コンドロイチン、ヘパリン、ヘパラン、ケラチン、デキストラン、キトサン、アルギネート、アガロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、およびエーテル化セルロース、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポビドン、カルボマー９４１、カルボマー９４０、カルボマー９７１Ｐ、カルボマー９７４Ｐ、または薬学的に許容されるその塩からなる群から選択される。一実施形態では、潤滑増強剤は、バイオコンジュゲートと並行して適用される。あるいは、一実施形態では、潤滑増強剤は、バイオコンジュゲートに対して逐次的に適用される。一実施形態では、潤滑増強剤は、コンドロイチン硫酸である。一実施形態では、潤滑増強剤は、ヒアルロン酸である。潤滑増強剤は、組成物の粘度を変化させることができる。
【０１６３】
上記の潤滑増強剤の構造、化学的特性および物理的特性に関するさらなる詳細については、例えば、ＵＳ５，４０９，９０４、ＵＳ４，８６１，７６０（ジェランガム）、ＵＳ４，２５５，４１５、ＵＳ４，２７１，１４３（カルボキシビニルポリマー）、ＷＯ９４／１０９７６（ポリビニルアルコール）、ＷＯ９９／５１２７３（キサンタンガム）、およびＷＯ９９／０６０２３（ガラクトマンナン）を参照されたい。典型的に、製剤の所望のｐＨを容易に達成するために、非酸性潤滑増強剤、例えば中性または塩基性剤が用いられる。
【０１６４】
一部の実施形態では、バイオコンジュゲートは、ミネラル、アミノ酸、糖、ペプチド、タンパク質、ビタミン（例えばアスコルビン酸）、またはラミニン、コラーゲン、フィブロネクチン、ヒアルロン酸、フィブリン、エラスチン、またはアグリカン、または成長因子、例えば上皮成長因子、血小板由来成長因子、形質転換成長因子ベータ、または線維芽細胞成長因子、およびグルココルチコイド、例えばデキサメタゾンまたは粘弾性修正剤、例えばイオン性および非イオン性水溶性ポリマー；アクリル酸ポリマー；親水性ポリマー、例えばポリエチレンオキシド、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマー、およびポリビニルアルコール；セルロースポリマーおよびセルロースポリマー誘導体、例えばヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、およびエーテル化セルロース；ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、乳酸およびグリコール酸のコポリマー、または天然および合成の両方の他のポリマー性剤と組み合わせることができる。
【０１６５】
本明細書の組成物において使用するのに適したｐＨ緩衝剤には、例えば、酢酸、ホウ酸、炭酸、クエン酸、およびリン酸緩衝液、ならびに塩酸、水酸化ナトリウム、酸化マグネシウム、リン酸一カリウム、炭酸水素塩、アンモニア、炭酸、塩酸、クエン酸ナトリウム、クエン酸、酢酸、リン酸水素二ナトリウム、ホウ砂、ホウ酸、水酸化ナトリウム、ジエチルバルビツール酸、およびタンパク質、ならびに様々な生物学的緩衝液、例えば、ＴＡＰＳ、Ｂｉｃｉｎｅ、Ｔｒｉｓ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、カコジル酸塩、またはＭＥＳが含まれる。ある特定の実施形態では、保存条件下でｐＨドリフトを防止するために、適切な緩衝系（例えば、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウムまたはホウ酸）が組成物に添加される。一部の実施形態では、緩衝液は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液である（すなわち、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウムを、一部の製剤では、塩化カリウムおよびリン酸カリウムを含有する）。用いられる剤に応じて、特定の濃度は変わる。ある特定の実施形態では、ｐＨを約ｐＨ４〜約ｐＨ８、または約ｐＨ５〜約ｐＨ８、または約ｐＨ６〜約ｐＨ８、または約ｐＨ７〜約ｐＨ８の範囲内に維持するために、ｐＨ緩衝系（例えば、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウムまたはホウ酸）が添加される。一部の実施形態では、緩衝液は、ｐＨを約ｐＨ４〜約ｐＨ８の範囲内に維持するように選択される。一部の実施形態では、ｐＨは、約ｐＨ５〜約ｐＨ８である。一部の実施形態では、緩衝液は、食塩水緩衝液である。ある特定の実施形態では、ｐＨは、約ｐＨ４〜約ｐＨ８、または約ｐＨ３〜約ｐＨ８、または約ｐＨ４〜約ｐＨ７である。一部の実施形態では、組成物は、ポリマー性マトリックス、ｐＨ緩衝剤、潤滑増強剤およびバイオコンジュゲートを含む、フィルム剤、ゲル剤、パッチ剤、または液体液剤の形態であり、組成物は、必要に応じて防腐剤を含有し、前記組成物のｐＨは、約ｐＨ４〜約ｐＨ８の範囲内である。
【０１６６】
より高濃度のバイオコンジュゲートを送達するために、組成物に界面活性剤が用いられる。界面活性剤は、阻害剤を可溶化し、コロイド分散液、例えばミセル溶液、マイクロエマルジョン、エマルジョンおよび懸濁液を安定化するように機能する。適切な界面活性剤は、ポリソルベート、ポロキサマー、ポリオシル４０ステアレート、ポリオキシルヒマシ油、チロキサポール、トリトン、およびソルビタンモノラウレートを含む。一実施形態では、ＴｒｉｔｏｎＸ１１４およびチロキサポールなどの界面活性剤は、１２．４〜１３．２の範囲の親水性／親油性／バランス（ＨＬＢ）を有しており、眼科使用に許容される。
【０１６７】
ある特定の実施形態では、安定化ポリマー、すなわち粘滑剤が組成物に添加される。安定化ポリマーは、イオン性／荷電性の一例、より具体的には、物理的安定性のために（−）１０〜５０ｍＶのゼータ電位を示すことができる負電荷を表面上に担持し、水中分散液を作製することができる（すなわち水溶性の）ポリマーであるべきである。一実施形態では、安定化ポリマーは、約０．１％〜約０．５％ｗ／ｗの範囲のカルボマーおよびＰｅｍｕｌｅｎ（登録商標）、具体的にはＣａｒｂｏｍｅｒ  ９７４ｐ（ポリアクリル酸）などの架橋ポリアクリレートのファミリー由来の１つの高分子電解質または１つを超える場合には複数の高分子電解質を含む。
【０１６８】
一実施形態では、組成物は、血管の細胞外マトリックスへのバイオコンジュゲートの透過性を増加させる剤を含む。好ましくは、透過性を増加させる剤は、塩化ベンザルコニウム、サポニン、脂肪酸、ポリオキシエチレン脂肪エーテル、脂肪酸のアルキルエステル、ピロリドン、ポリビニルピロリドン、ピルビン酸、ピログルタミン酸またはそれらの混合物から選択される。
【０１６９】
バイオコンジュゲートは、それらに限定されるものではないが、エンドトキシンおよび感染病原体を含めた望ましくない汚染物質を除去するために、滅菌することができる。バイオコンジュゲートの構造および生物向性（biotropic）特性に有害な影響を及ぼさない滅菌技術を使用することができる。ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートは、プロピレンオキシドまたはエチレンオキシド処置、滅菌濾過、ガスプラズマ滅菌、ガンマ放射線、電子線、および／または過酢酸などの過酸を用いる滅菌を含めた従来の滅菌技術を使用して消毒および／または滅菌することができる。一実施形態では、バイオコンジュゲートは、１つまたは複数の滅菌過程に供することができる。あるいは、バイオコンジュゲートは、プラスチックラップまたはホイルラップを含めた任意の種類の容器で包むことができ、さらに滅菌することができる。
【０１７０】
一部の実施形態では、使用中の微生物汚染を防止するために、防腐剤が組成物に添加される。組成物に添加される適切な防腐剤は、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、アルキルパラベン、安息香酸アルキル、クロロブタノール、クロロクレゾール、セチルアルコール、脂肪アルコール、例えばヘキサデシルアルコール、水銀の有機金属化合物、例えば酢酸塩、硝酸フェニル水銀またはホウ酸フェニル水銀、ジアゾリジニル尿素、アジピン酸ジイソプロピル、ジメチルポリシロキサン、ＥＤＴＡの塩、ビタミンＥおよびそれらの混合物を含む。ある特定の実施形態では、防腐剤は、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、ベンゾドデシニウム臭化物、メチルパラベン、プロピルパラベン、フェニルエチルアルコール、エデト酸（edentate）二ナトリウム、ソルビン酸、またはポリクオタニウム−１から選択される。ある特定の実施形態では、組成物は、防腐剤を含む。一部の実施形態では、防腐剤は、約０．００１ｗ／ｖ％〜約１．０ｗ／ｖ％のレベルで用いられる。ある特定の実施形態では、組成物は、防腐剤を含有せず、「防腐剤不使用」と呼ばれる。一部の実施形態では、単位用量組成物は無菌であるが、防腐剤不使用である。
【０１７１】
一部の実施形態では、バイオコンジュゲートおよび他の薬剤の別個のまたは逐次的な投与が、組成物の送達を容易にするのに必要である。ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートおよび他の薬剤は、異なる投薬頻度または間隔で投与することができる。例えば、バイオコンジュゲートは、毎日投与することができ、一方他の薬剤は、より低い頻度で投与することができる。さらに、当業者に明らかになる通り、バイオコンジュゲートおよび他の薬剤は、同じ投与経路または異なる投与経路を使用して投与することができる。
【０１７２】
バイオコンジュゲートを投与するための任意の有効なレジメンを使用することができる。例えば、バイオコンジュゲートは、単回用量として、または毎日複数回用量のレジメンとして投与することができる。さらに、毎日の処置の代替として、時間をずらしたレジメン、例えば週１〜５日を使用することができる。
【０１７３】
様々な実施形態では、バイオコンジュゲートは、フィルム剤、ゲル剤、パッチ剤、または液体液剤などによって局所投与することができる。実施形態の一部では、提供される組成物は、緩衝された滅菌水溶液で存在する。ある特定の実施形態では、溶液は、約１〜約１００センチポアズ（ｃｐ）、または約１〜約２００ｃｐ、または約１〜約３００ｃｐ、または約１〜約４００ｃｐの粘度を有する。一部の実施形態では、溶液は、約１〜約１００ｃｐの粘度を有する。ある特定の実施形態では、溶液は、約１〜約２００ｃｐの粘度を有する。ある特定の実施形態では、溶液は、約１〜約３００ｃｐの粘度を有する。ある特定の実施形態では、溶液は、約１〜約４００ｃｐの粘度を有する。ある特定の実施形態では、溶液は、注射可能な液体液剤の形態である。他の実施形態では、組成物は、粘性液体、すなわち数百〜数千ｃｐの粘度のゲル剤または軟膏剤として製剤化される。これらの実施形態では、バイオコンジュゲートは、適切な薬学的に許容される担体に分散または溶解される。
【０１７４】
カテーテルベースの送達のためにバイオコンジュゲートと共に使用するための例示的な組成物は、ａ）本明細書に記載される合成バイオコンジュゲート、ｂ）薬学的に許容される担体、ｃ）ポリマーマトリックス、ｄ）約ｐＨ４〜約ｐＨ８の範囲のｐＨを提供するためのｐＨ緩衝剤、およびｅ）全製剤重量の約０．２５％〜約１０％の濃度範囲の水溶性潤滑増強剤、または任意の個々の構成成分ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）もしくはｅ）、またはａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）もしくはｅ）の任意の組合せを含むことができる。
【０１７５】
例示的な製剤は、ａ）本明細書に記載されるバイオコンジュゲート、ｂ）薬学的に許容される担体、ｃ）ポリマーマトリックス、およびｄ）約ｐＨ４〜約ｐＨ８の範囲のｐＨを提供するためのｐＨ緩衝剤を含むことができ、前記溶液は、液体溶液に関して約３〜約３０ｃｐの粘度を有する。
【０１７６】
本開示によって企図される例示的な組成物は、注射による投与のためのものであってもよく、それには、ゴマ油、トウモロコシ油、綿実油もしくはピーナッツ油、ならびにエリキシル、マンニトール、デキストロース、または滅菌水溶液、および類似の薬学的ビヒクルを伴う水性もしくは油性懸濁液、またはエマルジョンが含まれる。食塩水の水溶液も、注射のために従来使用されているが、本開示の文脈ではあまり好ましくない。エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど（および適切なそれらの混合物）、シクロデキストリン誘導体、および植物油を用いることもできる。例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散剤の場合には必要な粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって、適切な流動性を維持することができる。微生物作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらすことができる。
【０１７７】
注入可能な滅菌液剤は、必要量の構成成分を、必要な場合、上に列挙される他の様々な成分と共に適切な溶媒に組み込み、その後滅菌濾過することによって調製される。一般に、分散液剤は、塩基性分散媒および上に列挙されるものから必要とされる他の成分を含有する無菌ビヒクルに、様々な滅菌活性成分を組み込むことによって調製される。注入可能な滅菌液剤の調製のための滅菌粉剤・散剤（powder）の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥技術であり、それらは、活性成分の粉末と任意の追加の所望の成分を、予め滅菌濾過したその溶液から生成する技術である。
【０１７８】
本明細書に記載されるバイオコンジュゲートを含む医薬組成物の作製では、活性成分は、通常、添加剤もしくは担体によって希釈される、および／またはカプセル、サシェ、紙もしくは他の容器の形態であり得るこのような担体に封入される。添加剤は、賦形剤として働く場合、固体、半固体、または液体の材料（上記の通り）であってよく、活性成分のためのビヒクル、担体または媒体として作用する。したがって、組成物は、例えば最大１０重量％の活性化合物を含有する、フィルム剤、ゲル剤、パッチ剤、粉剤・散剤、ロゼンジ剤、サシェ剤、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁剤、エマルジョン、液剤、シロップ剤、エアロゾル剤（固体としてまたは液体媒体中の）、軟膏剤の形態、軟質および硬質ゼラチンフィルム剤、ゲル剤、パッチ剤、注入可能な滅菌液剤、ならびに無菌パッケージ粉剤・散剤であり得る。
【０１７９】
適切な添加剤の一部の例として、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルギネート、トラガント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、滅菌水、シロップ、およびメチルセルロースが挙げられる。製剤は、滑沢剤、例えばタルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱油；湿潤剤；乳化剤および懸濁化剤；保存剤、例えばヒドロキシ安息香酸メチルおよびヒドロキシ安息香酸プロピル；甘味剤；ならびに香味剤をさらに含むことができる。
【０１８０】
薬物送達のために使用されるフィルムは、当技術分野で周知であり、浸出性不純物を含まない非毒性の非刺激性ポリマー、例えば多糖類（例えば、セルロース、マルトデキストリンなど）を含む。一部の実施形態では、ポリマーは、親水性である。他の実施形態では、ポリマーは、疎水性である。フィルムは、それが適用される組織に接着し、約１週間にわたって体内でゆっくり吸収される。本明細書に記載される薄フィルム剤形において使用されるポリマーは、吸収可能であり、当技術分野で周知の通り十分な剥離、せん断および引張強度を示す。一部の実施形態では、フィルムは、注射可能である。ある特定の実施形態では、フィルムは、外科的介入の前、間または後に患者に投与される。
【０１８１】
本明細書で使用されるゲルは、軟質で弱いものから硬質で丈夫なものまでの範囲の特性を有することができる、固体のゼリー様の材料を指す。当技術分野で周知の通り、ゲルは、流体によってその全体積中に拡張される、非流体のコロイド性網目構造またはポリマー網目構造である。ヒドロゲルは、水が分散媒であるコロイド性ゲルとして時として見出される、親水性のポリマー鎖の網目構造を含む種類のゲルである。ヒドロゲルは、高度に吸収性であり、例えば９０％を超える水などの高い度合いの水を含有することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載されるゲルは、天然または合成ポリマー網目構造を含む。一部の実施形態では、ゲルは、親水性ポリマーマトリックスを含む。他の実施形態では、ゲルは、疎水性ポリマーマトリックスを含む。一部の実施形態では、ゲルは、天然の組織に非常に類似している度合いの可撓性を有する。ある特定の実施形態では、ゲルは、生体適合性であり吸収可能である。ある特定の実施形態では、ゲルは、外科的介入の前、間または後に患者に投与される。
【０１８２】
本明細書で使用される液体液剤は、当技術分野で周知の液剤、懸濁剤、エマルジョン剤、点滴剤、軟膏剤、液体洗浄剤、スプレー剤、リポソーム剤を指す。一部の実施形態では、液体液剤は、少量の酸または塩基が添加されるとｐＨの変化に抵抗する水性ｐＨ緩衝剤を含有する。ある特定の実施形態では、液体液剤は、外科的介入の前、間または後に患者に投与される。
【０１８３】
例示的な製剤は、ａ）本明細書に記載される１つまたは複数のバイオコンジュゲート、ｂ）薬学的に許容される担体、およびｃ）マトリックス網目構造としての親水性ポリマーを含むことができ、前記組成物は、粘性液体、すなわち数百〜数千ｃｐの粘度のゲル剤または軟膏剤として製剤化される。これらの実施形態では、バイオコンジュゲートは、適切な薬学的に許容される担体に分散または溶解される。
【０１８４】
ある特定の実施形態では、バイオコンジュゲートまたはバイオコンジュゲートを含む組成物は、製剤化の前、間または後に凍結乾燥される。したがって本明細書では、本明細書に記載されるバイオコンジュゲートまたはバイオコンジュゲートを含む組成物を含む凍結乾燥組成物も提供される。
５．投薬
【０１８５】
バイオコンジュゲートの適切な投薬量は、標準の方法によって、例えば実験動物モデルでまたは臨床試験で用量応答曲線を確立することによって決定することができ、患者の状態、処置されている疾患状況、投与経路および組織分布、ならびに他の治療的処置の併用の可能性に応じて著しく変わり得る。患者に投与される有効量は、体表面積、患者の体重または質量、および医師による患者状態の評価に基づく。様々な例示的な実施形態では、用量は、約０．０１μｇ〜約１０ｇの範囲である。例えば、全身送達のために、用量は、約１０ｇ、または約５ｇ、または約１ｇであってよい。他の例示的な実施形態では、有効用量は、１用量当たり約１００μｇ〜約１０ｇ、または１用量当たり約１００μｇ〜約１ｇ、または１用量当たり約１００μｇ〜約５００ｍｇ、１用量当たり約０．０１μｇ〜約１００ｍｇ、または１用量当たり約１００μｇ〜約５０ｍｇ、または１用量当たり約５００μｇ〜約１０ｍｇ、または１用量当たり約１ｍｇ〜１０ｍｇ、または１用量当たり約１〜約１００ｍｇ、または１用量当たり約１ｍｇ〜５００ｍｇ、または１用量当たり約１ｍｇ〜２００ｍｇ、または１用量当たり約１０ｍｇ〜１００ｍｇ、または１用量当たり約１０ｍｇ〜７５ｍｇ、または１用量当たり約１０ｍｇ〜５０ｍｇ、または１用量当たり約１０ｍｇ、または１用量当たり約２０ｍｇ、または１用量当たり約３０ｍｇ、または１用量当たり約４０ｍｇ、または１用量当たり約５０ｍｇ、または１用量当たり約６０ｍｇ、または１用量当たり約７０ｍｇ、または１用量当たり約８０ｍｇ、または１用量当たり約９０ｍｇ、または１用量当たり約１００ｍｇの範囲である。本明細書に記載される様々な実施形態のいずれにおいても、有効用量は、１用量当たり約０．０１μｇ〜約１０００ｍｇ、１用量当たり１μｇ〜約１００ｍｇ、１用量当たり約１００μｇ〜約１．０ｍｇ、約５０μｇ〜約６００μｇ、約５０μｇ〜約７００μｇ、約１００μｇ〜約２００μｇ、約１００μｇ〜約６００μｇ、約１００μｇ〜約５００μｇ、約２００μｇ〜約６００μｇ、または約１００μｇ〜約５０ｍｇ、または１用量当たり約５００μｇ〜約１０ｍｇまたは１用量当たり約１ｍｇ〜約１０ｍｇの範囲である。
【０１８６】
一部の実施形態では、組成物は、複数回用量の形態でパッケージされる。したがって、使用中の微生物汚染を防止するために、防腐剤が必要とされる。ある特定の実施形態では、上記の通り、適切な防腐剤を組成物に添加することができる。一部の実施形態では、組成物は、防腐剤を含有する。ある特定の実施形態では、防腐剤は、約０．００１ｗ／ｖ％〜約１．０ｗ／ｖ％のレベルで用いられる。一部の実施形態では、単位用量組成物は無菌であるが、防腐剤不使用である。
【実施例】
【０１８７】
（実施例１）
バイオコンジュゲートの合成
バイオコンジュゲートは、以下のプロトコールに従って調製することができる。適切な反応緩衝液（例えば、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ））を、適切な濃度のカオトロピック剤、例えばブタノール、エタノール、塩化グアニジウム、過塩素酸リチウム、酢酸リチウム、塩化マグネシウム、フェノール、プロパノール、ドデシル硫酸ナトリウム、チオ尿素、または尿素（例えば、約５Ｍ〜約１０Ｍ尿素）を用いて調製する。最終ｐＨを、１ＮのＨＣｌを用いて約４．５〜約６のｐＨに調整する。
【０１８８】
ヒドラジド機能化ペプチド（例えば、表２のペプチド１〜２０）を、反応緩衝液に溶解して３ｍｇ／ｍＬにした。ペプチド溶液を、カップリング反応の前に新しく調製した。対応するビオチン化ペプチドを、反応緩衝液に溶解して３ｍｇ／ｍＬにした。得られたビオチン標識ペプチド溶液を、カップリング反応の前に新しく調製した。グリカン（例えば、ヘパリン（ＭＷａｖｇ＝１６ｋＤａ））を、反応緩衝液に溶解して２０ｍｇ／ｍＬにし、−２０℃で保存するか、またはカップリング反応の前に新しく調製する。ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）を、反応緩衝液に溶解して７５ｍｇ／ｍＬにした直後に、グリカンに添加する。あるいは、バイオコンジュゲートを、非標識ペプチドだけを使用して合成し、必要に応じてビオチンヒドラジドを使用して標識することができる。
【０１８９】
ヘパリンを、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）（５９．３ｍｇまたは水に７５ｍｇ／ｍＬで溶解させた０．７９ｍＬ）を５０モル過剰でヘパリンに添加することによって活性化した。出発材料を、室温で約５分間反応させた。次に、ビオチン標識ペプチドを、活性化ヘパリンに１：１モル比（ヘパリン：標識ペプチド）（１５．３ｍｇまたは反応緩衝液中３ｍｇ／ｍＬの５．１ｍＬ）で添加した。次に、反応混合物を室温で約５分間振とうした。振とうしながら、非標識ペプチドを所与のモル比（ヘパリン：ペプチド、詳細については表２を参照されたい）で反応緩衝液に添加した。次に、構成成分を、振とうしながら室温で約２時間反応させた。割り当てられた時間後、振とうしながら室温で約３０分間、０．５ＭのＮａＯＨ（およそ４．５ｍＬ）を用いてｐＨを８に上昇させることによって、反応をクエンチした。
【０１９０】
得られたバイオコンジュゲートを、ダイアフィルター（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ−ＭｉｄｉＫｒｏｓ  ｍＰＥＳ  １０Ｋ中空管フィルター）を介して５カラム体積（ＣＶ）の反応緩衝液（およそ２５０ｍＬ）を使用した後、１０ＣＶの水（およそ５００ｍＬ）を流速３５ｍＬ／分でＴＭＰと共におよそ１５ｐｓｉで使用して精製した。次に、最終生成物である残余分（retentate）を、−８０℃で凍結させた。必要に応じて、最終生成物を凍結乾燥により乾燥させる。約５個のペプチドを、上に概説される手順を使用してグリカンにコンジュゲートした。
【０１９１】
以下のバイオコンジュゲートを、上記のヘパリンおよび表（表２）に示されるヒドラジド機能化ペプチドから調製した。
【表２−１】
2020526497.tif 000025
【表２−２】
2020526497.tif 000026
【０１９２】
化合物１〜１７および２０を、グリカン１個当たりのペプチドが約１：８、または約１：６の比でペプチドを反応させることによって合成したが、グリカンにコンジュゲートされたペプチドの平均数は、グリカン１個当たりペプチド約５個であることが企図され、これは約２２％のペプチド機能化に相当する。化合物１８は、グリカン１個当たりのペプチドが約１：８、または約１：９、または約１：１２の比でペプチドを反応させることによって合成したが、グリカンにコンジュゲートされたペプチドの平均数は、グリカン１個当たりペプチド約８個であることが企図され、これは約３３％のペプチド機能化に相当する。化合物１９は、グリカン１個当たりのペプチドが約１：４、または約１：３の比でペプチドを反応させることによって合成したが、グリカンにコンジュゲートされたペプチドの平均数は、グリカン１個当たりペプチド約３個であることが企図され、これは約１１％のペプチド機能化に相当する。
（実施例２）
コラーゲン結合プレートアッセイ
【０１９３】
以下の方法を使用して、コラーゲンに対する本明細書に開示されるバイオコンジュゲートの結合親和性を評価する。
【０１９４】
バイオコンジュゲート変異体のコラーゲン結合は、コラーゲンを９６ウェルプレートにコーティングするプレートアッセイによって比較する。コラーゲンを、高結合プレートにおいて、０．０２Ｎ酢酸中５０μｇ／ｍＬで室温において１時間コーティングする。非結合コラーゲンを、１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４ですすぐ。次に、プレートを、１×ＰＢＳ溶液中１％ミルクで室温において１時間ブロッキングする。
【０１９５】
ビオチン化（biotinlyated）ペプチドを含有するバイオコンジュゲート変異体を、１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４中１％ミルクで最終濃度１ｍｇ／ｍＬに溶解する。この溶液から１０倍連続希釈を実施する。次に、分子を、ブロッキングしたコラーゲンコーティングプレート上でインキュベートし、室温で１５分間インキュベートする。次に、プレートを、１％ＢＳＡおよび０．２％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１×ＰＢＳで３回すすぐ。
【０１９６】
結合した分子を、１％ＢＳＡおよび０．２％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１×ＰＢＳに１：５００希釈し、２００μＬ／ウェルで室温において２０分間インキュベートしたストレプトアビジン−ＨＲＰによって検出する。ストレプトアビジン溶液を、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１×ＰＢＳでプレートから３回すすぐ。次に、ＴＭＢ基質溶液を、各ウェルに１００μＬ／ウェル添加し室温で１５分間おき、色の進展を、硫酸溶液１００μＬ（０．１６Ｍ）で停止させた。次に、ウェル中の吸光度を、４５０ｎｍにおいて測定し、結合親和性を吸光度対濃度による用量応答でプロットする。
【０１９７】
この方法を使用して、ＥＣ５０値を比較することによって様々なコラーゲン結合バイオコンジュゲートのコラーゲン結合親和性を比較した。より具体的には、バイオコンジュゲートごとのＥＣ５０値を、化合物４のＥＣ５０と比較した。
【０１９８】
図１は、バイオコンジュゲートである化合物４、化合物８、および化合物１３についてのコラーゲン結合の比較を示す。図１は、アルギニンの数が減少すると、ＥＣ５０が増加することを示す。
【０１９９】
図２は、バイオコンジュゲートである化合物４および化合物１２についてのコラーゲン結合の比較を示す。図２は、アルギニンの数が増加すると、ＥＣ５０が減少することを示す。
【０２００】
図３は、バイオコンジュゲートである化合物４および化合物１４についてのコラーゲン結合の比較を示す。図３は、アルギニンを別の正電荷のアミノ酸（具体的には、リシン）で置換しても、結合ＥＣ５０に影響を及ぼさないことを示す。
【０２０１】
図４は、バイオコンジュゲートである化合物４、化合物８、および化合物１１についてのコラーゲン結合の比較を示す。図４は、アミノ酸の数が減少すると、ＥＣ５０がわずかに増加することを示す。
【０２０２】
図５は、バイオコンジュゲートである化合物４、化合物９、および化合物１０についてのコラーゲン結合の比較を示す。図５は、グリカンのより近くにアルギニン残基を置くと、ＥＣ５０が減少することを示す。
【０２０３】
図１〜図５は、バイオコンジュゲートのペプチド部分における正電荷のアミノ酸残基の量および位置（グリカンに対する）に相関があることを示している。
【０２０４】
図６は、図１〜図５のバイオコンジュゲートである化合物４（バッチ２つ）、化合物６、化合物７、化合物８、および化合物１０についてのコラーゲン結合の比較を示し、図７は、対応するそれらのＥＣ５０値を比較する棒グラフを示す。
【０２０５】
図８は、バイオコンジュゲートである化合物４および化合物１５についてのコラーゲン結合の比較を示す。図８は、ＧＳＧを６−アミノ−１−ヘキサン酸で置換しても、ＥＣ５０に有意に影響を及ぼさないことを示しており、このことは、結合が、特定の配列ではなくペプチドのこの領域における長さに依存することを示している。
【０２０６】
図９は、直鎖バイオコンジュゲート（化合物１６）、環式バイオコンジュゲート（化合物１７）、および化合物１８についてのコラーゲン結合の比較を示す。化合物１８は、コラーゲン結合親和性の有意な増加（より低いＥＣ５０）を示した。
【０２０７】
図１０は、バイオコンジュゲートである化合物１８および化合物１９についてのコラーゲン結合の比較を示す。化合物１９は、コラーゲン結合親和性の増加（より低いＥＣ５０）を示す。
【０２０８】
図１１は、化合物４、化合物５（バッチ２つ）、および化合物３についてのコラーゲン結合の比較を示す。化合物４は、化合物５および化合物３と比較して、コラーゲン結合親和性の有意な増加（より低いＫｄ）を示した。
（実施例３）
血小板凝集
【０２０９】
Ｉ型線維性コラーゲンを、２〜８℃での一晩のインキュベーションによってＩｂｉｄｉμスライドに吸着させた。Ｉｂｉｄｉμスライドを、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）ですすぎ、次に１×ＰＢＳ中１％ＢＳＡでブロッキングした。化合物１０（図１２Ｂに示される）および２ｍｇ／ｍＬの化合物１（１２Ａに示される）を、Ｉｂｉｄｉμスライドに適用し、静置してインキュベートした。１時間後、過剰のコンジュゲートを１×ＰＢＳですすいで流した。新しく採血したヒト全血を、カルセインＡＭ（蛍光性生細胞マーカー）で予め染色した。血液を、シリンジポンプを使用して１０００ｓ−１のせん断速度（sheer  rate）で１０分間、チャネルを横切ってポンプ注入した。血液がＩｂｉｄｉμスライドを横断して流れる間、蛍光顕微鏡を使用して、凝集した蛍光標識血小板を撮影した。図１２は、化合物１０（パネル１２Ｂ）が、Ｉ型線維性コラーゲンへの血小板結合を阻害することを示す。
（実施例４）新生内膜過形成または末梢動脈疾患（ＰＡＤ）の処置または防止のためのバイオコンジュゲート
【０２１０】
新生内膜過形成を、本明細書に記載されるバイオコンジュゲートを送達するウサギ血管形成術モデルで評価する。複数（例えば、６羽）のウサギが研究に登録される。各動物の右および左腸骨動脈の両方に、バルーン血管形成術媒介性傷害をおこさせる。動物を、試験群（ヘパリン−ＳＩＬＹ）またはビヒクル対照（１×ＰＢＳ）に分ける。各群において、両方の腸骨動脈に傷害を施し、バルーン傷害直後に試験物品または対照で処置する。
【０２１１】
損傷後の所与の時間（例えば、２８日）の後、動物を安楽死させ、動脈セグメントを組織学的に評価する。各血管から最も重症の新生内膜応答を有するいくつかの（例えば、３つの）組織学的切片を、典型的に形態計測のために選択する。外弾性板（extranal  elastic  lamina）（ＥＥＬ）、内弾性板（ＩＥＬ）および内腔の断面積を、Ｍｏｖａｔ染色スライドからデジタル形態計測（ＩＰＬａｂソフトウェア、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を用いて測定する。新生内膜の厚さを、最小および最大部位においてＩＥＬから内腔までの距離として測定し、次に平均する。断面積を使用して、以下を算出する。
・内側面積＝ＥＥＬ面積−ＩＥＬ面積
・新生内膜面積＝ＩＥＬ面積−内腔面積
・内側−内膜面積＝ＥＥＬ面積−内腔面積
・狭窄％＝［１−（内腔面積／ＩＥＬ面積）］×１００
【０２１２】
変数の平均を、分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して比較する。０．０５未満のｐ値は、典型的に統計的に有意とみなす。
【０２１３】
本明細書に記載されるバイオコンジュゲートは、新生内膜過形成を阻害するのに有効であり、したがって末梢動脈疾患（ＰＡＤ）を処置または防止するために使用することができることが企図される。
（実施例５）
非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）モデル
【０２１４】
肝線維症に影響を及ぼす化合物の能力を、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）のマウスモデルで試験した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、出生後にストレプトゾトシン２００μｇの単回皮下注射をした。４週齢に始めて、動物に高脂肪食を与えた。動物に、５週目から初めて９週目までの４週間継続的に、食塩水または化合物１０を用いて３回／週で静脈内処置をした。別個の群の動物には、同じ期間中、テルミサルタンの毎日経口投与をした。９週齢目に動物を屠殺し、組織学的および生化学的分析のために肝臓を収集した。
【０２１５】
コラーゲン含量に関する肝臓の組織学的分析を、シリウスレッド染色を使用して実施した。染色を定量し、図１３に提示した。テルミサルタンまたは化合物１０を用いる処置では、ビヒクルで処置した群と比較して、肝臓におけるコラーゲンレベルが低下した。
ｉｎ  ｖｉｖｏ画像化系による分布
【０２１６】
化合物を、蛍光標識を用いて合成した。具体的には、ＣＦ６３３を、１：１の色素対主鎖の合成モル比で、ヒドラジドを介して主鎖に連結した。その分子を１０ｍｇ／ｋｇでヌードマウスに静脈内投薬し、ｉｎ  ｖｉｖｏ画像化系（ＩＶＩＳ）を使用して画像化した。異なる時点において、動物を麻酔し、ＩＶＩＳを使用して画像化して、標識化合物の体内分布を決定した。図１４は、注射の５または６０分後の化合物の局在を示す。化合物は、腎臓および膀胱に局在しているように見えた。
（実施例６）
コラーゲン結合アッセイ２
【０２１７】
ＧＱＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧＳＧＳＲＲ（配列番号：）（化合物１０）を、スペーサーなしのＧＱＬＹＫＳＩＬＹＧＳＧ（配列番号：）（ペプチドＸ）結合ドメイン、およびスペーサー配列単独のＧＳＧＳＧＳＲＲ（配列番号：）（スペーサーＡ）に対する結合親和性について評価し、結果を図１８に示した。スペーサーを付加すると、結合ドメインまたは分離したスペーサーよりも高い結合親和性が得られた。
【０２１８】
コラーゲン上のフォンビルブランド（von  Willebran）結合部位に結合することに起因してｖＷＦ−２ｘとしても公知のＷＲＥＰＳＦＳＡＬＳ（配列番号：）を、ＧＳＧＳＧＳＲＲ（配列番号：）スペーサーを伴う場合および伴わない場合の結合親和性について評価した。ＷＲＥＰＳＦＳＡＬＳＧＳＧＳＧＳＲＲ（配列番号：）  ＷＲＥＰＳＦＳＡＬＳ（配列番号：）およびＧＳＧＳＧＳＲＲ（配列番号：）は、図１９の右上に示されている。コラーゲン結合アッセイでは、スペーサー配列を付加すると、結合親和性の増加が示された。
【０２１９】
５０μｇ／ｍｌのコラーゲンＩ型を、一晩インキュベートすることによって高結合プレートに吸着させた。次に、プレートをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中１％脱脂乳を使用して１時間ブロッキングした。分子希釈物を、ＰＢＳ中１％ＢＳＡで調製し、次に２５℃で１時間インキュベートした。次に、プレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するＰＢＳで洗浄した。１％ＢＳＡ  ＰＢＳによるストレプトアビジン−ＨＲＰの１：５００希釈物を調製し、２０分間プレートに添加した。次に、プレートをＰＢＳで洗浄し、発色のためにＴＭＢ溶液を添加し１０分間おいた。０．１６Ｍ硫酸を使用して発色を停止させ、プレートリーダーを使用して４５０ｍｍにおける吸光度を測定した。化合物１０を、すべてのＥＣ５０結果について参照基準として使用した。
【０２２０】
スペーサー長および化学構造は、全分子のコラーゲン結合親和性に影響を及ぼす。スペーサーは、一般に、主にグリシンおよびセリンと一部のアルギニン残基とのペプチド配列から構成される。グリシンおよびセリン配列であるＧＳＧは、アミノヘキサン酸（Ａｈｘ）で置き換えることができる。アルギニン残基の位置は、結合親和性において重要な役割を果たす。ＧＡＧのより近くにアルギニン残基を置くと、コラーゲン結合が改善される（図１５）。さらに、複数のアルギニン残基を有することによって、コラーゲン結合親和性が増加する。スペーサー長は、より高い結合親和性にポジティブに対応する（図１６）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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