(57)【要約】  本開示の実施形態は、高さが平均細胞径の２０〜８０％である圧縮間隙を規定する圧縮面および圧縮面の間に配置される複数の緩和空間を有する微小流路に、細胞および分子を供給するステップと；微小流路に細胞培地を流すステップであって、細胞培地が微小流路を流れる際に、複数の細胞が、対流による細胞内輸送プロセスによる処理を受け、このプロセスは、複数の細胞を圧縮し、この圧縮によって、複数の細胞の細胞内体積の減少（Ｖｌｏｓｓ）が起こる工程、および複数の細胞を第１の緩和空間まで通過させ、そこで複数の細胞が体積を増加させ（Ｖｇａｉｎ）、複数の分子の一部を吸収する工程を含む、ステップと、を含む、対流による細胞内輸送のための方法を含み得る。【選択図】図１ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対流による細胞内輸送のための方法であって、
複数の細胞を含む細胞培地および複数の分子を微小流路に供給するステップを含み、
該微小流路は、
互いに対して実質的に平面状に広がる第１の壁および第２の壁であって、該第１の壁は、複数の圧縮面を有していて、各圧縮面は該第１の壁から外方に突出し、該圧縮面と該第２の壁との間に圧縮間隙を規定しており、該圧縮間隙の高さは、平均細胞径の２０〜８０％である、第１の壁および第２の壁、ならびに
前記圧縮面の間に配置された複数の緩和空間、を含み、
前記細胞培地を、ある流速で前記微小流路に流すステップであって、前記細胞培地が前記微小流路を流れる際に、前記複数の細胞が、対流による細胞内輸送プロセスによる処理を受け、該プロセスは、
第１の圧縮間隙において前記複数の細胞を圧縮し、該圧縮によって、該複数の細胞の細胞内体積の減少（Ｖｌｏｓｓ）が起こる工程、および
前記複数の細胞を第１の緩和空間まで通過させ、そこで該複数の細胞が体積を増加させ（Ｖｇａｉｎ）、前記複数の分子の一部を吸収する工程を含む、ステップと、
排出口において前記複数の細胞を回収するステップと、を含む、方法。
【請求項２】
前記複数の圧縮面は、前記微小流路の中心流路軸に対して斜め方向を向いた複数の隆起を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記複数の隆起のうちの少なくとも１つの隆起が形成する角度は、前記微小流路の中心軸に対して３０度である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記複数の隆起のうちの少なくとも１つの隆起が形成する角度は、前記微小流路の中心軸に対して４５度である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記複数の隆起のうちの少なくとも１つの隆起が形成する隆起角度は、前記微小流路の中心軸に対して２０〜９０度である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記複数の隆起は、前記微小流路内において、山形様式で配置される、請求項２〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記複数の分子は、高分子、ナノ粒子、デキストラン、プラスミド、ｍＲＮＡ、抗体、ビーズ、またはウイルスのうちの少なくとも１種である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記高分子の平均サイズは、３ｋＤａ〜６ＭＤａである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記微小流路は、注入口を少なくとも１つ含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記複数の緩和空間の幅は、１００〜３００ミクロンである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記複数の圧縮面は、隆起を１〜２１個含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記複数の圧縮面は、隆起を１〜７個含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記複数の圧縮面は、実質的に直交している、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記流速は、１００〜５００ｍｍ／秒である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
Ｖｌｏｓｓは、平均細胞体積の５％〜３０％である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
Ｖｌｏｓｓは、平均細胞体積の２５％である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
Ｖｌｏｓｓは、前記細胞が最初に圧縮面に衝突してから測定を始めて約１０マイクロ秒で生じる、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
Ｖｇａｉｎは、Ｖｌｏｓｓの２５％〜１００％である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
ＶｇａｉｎがＶｌｏｓｓの約１００％となるのは、４〜１００ミリ秒後である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
細胞内輸送のための方法であって、
複数の細胞および複数の分子を微小流路に適用するステップを含み、
該微小流路は、
第１の圧縮間隙を規定する第１の直交面、
第２の圧縮間隙を規定する第２の直交面、および
前記第１の直交面と第２の直交面との間に配置される緩和空間、を含み、
前記複数の細胞を、１００〜５００ｍｍ／秒の流速で前記微小流路に流すステップと、
前記第１の直交面において、前記細胞に圧縮力を加えるステップであって、該圧縮力によって、該細胞の第１の体積の減少（Ｖｌｏｓｓ１）を起こす、ステップと、
前記複数の細胞を第１の緩和空間に通すステップであって、該複数の細胞の第１の体積の増加（Ｖｇａｉｎ１）を起こす、ステップと、
前記第２の直交面において、前記細胞に圧縮力を加えるステップであって、該圧縮力によって、該細胞の第２の体積の減少（Ｖｌｏｓｓ２）を起こす、ステップと、
回収地点において前記複数の細胞を回収するステップであって、該複数の細胞を回収した際に、該細胞の第２の体積の増加（Ｖｇａｉｎ２）を起こす、ステップと、を含み、
Ｖｇａｉｎ１およびＶｇａｉｎ２のうちの少なくとも一方が生じる際に、前記複数の細胞は、前記複数の分子の一部を吸収する、方法。
【請求項２１】
前記第１の直交面および第２の直交面のうちの少なくとも一方は、前記微小流路の中心流路軸に対して斜め方向を向いた隆起を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記微小流路の中心軸に対して前記隆起が形成する角度は、３０度である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記微小流路の中心軸に対して前記隆起が形成する角度は、４５度である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記微小流路の中心軸に対して前記隆起が形成する角度は、２０〜９０度である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記複数の分子は、高分子、ナノ粒子、デキストラン、プラスミド、ｍＲＮＡ、抗体、ビーズ、またはウイルスのうちの少なくとも１種である、請求項２０〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記高分子の平均サイズは、３ｋＤａ〜６ＭＤａである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記高分子の平均サイズは、１ｎｍ〜１００ｎｍである、請求項２０〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記微小流路は、注入口を少なくとも１つ含む、請求項２０〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記緩和空間の幅は、１００〜３００ミクロンである、請求項２０〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記圧縮間隙の高さは、平均細胞径の２０〜８０％である、請求項２０〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
Ｖｌｏｓｓ１およびＶｌｏｓｓ２の少なくとも一方は、平均細胞体積の５％〜３０％である、請求項２０〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
Ｖｌｏｓｓ１およびＶｌｏｓｓ２の少なくとも一方は、平均細胞体積の２５％である、請求項２０〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
Ｖｌｏｓｓ１およびＶｌｏｓｓ２の少なくとも一方は、前記細胞が最初に圧縮面に衝突してから測定を始めて約１０マイクロ秒後で生じる、請求項２０〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
Ｖｇａｉｎ１およびＶｇａｉｎ２のうちの少なくとも一方は、Ｖｌｏｓｓ１および／またはＶｌｏｓｓ２の２５％〜１００％である、請求項２０〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
ＶｇａｉｎがＶｌｏｓｓ１およびＶｌｏｓｓ２の少なくとも一方の約１００％となるのは、４〜１００ミリ秒後である、請求項２０〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
細胞内輸送のためのシステムであって、
微小流路であって、
互いに対して実質的に平面状に広がる第１の壁および第２の壁であって、該第１の壁は、複数の圧縮面を有していて、各圧縮面は該第１の壁から外方に突出し、該圧縮面と該第２の壁の表面との間に圧縮間隙を規定している、第１の壁および第２の壁、ならびに
前記圧縮面の間に配置された複数の緩和空間、を含む、微小流路と、
複数の細胞および複数の分子を含む細胞培地であって、該細胞培地は、ある流速で前記微小流路を流れ、該細胞培地が該微小流路を流れる際に、該複数の細胞が、対流による細胞内輸送プロセスによる処理を受け、該プロセスは、
第１の圧縮間隙において前記複数の細胞を圧縮し、該圧縮によって、該細胞の体積の減少（Ｖｌｏｓｓ）が起こる工程、および
前記複数の細胞を第１の緩和空間まで通過させ、そこで該複数の細胞が体積を増加させ（Ｖｇａｉｎ）、前記複数の分子の一部を吸収する工程、を含む、細胞培地と、を含み、
前記圧縮間隙の高さは、平均細胞径の２０〜８０％である、システム。
【請求項３７】
前記複数の圧縮面は、前記微小流路の中心流路軸に対して斜め方向を向いた複数の隆起を含む、請求項３６に記載のシステム。
【請求項３８】
前記複数の隆起のうちの少なくとも１つの隆起が形成する角度は、前記微小流路の中心軸に対して３０度である、請求項３７に記載のシステム。
【請求項３９】
前記複数の隆起のうちの少なくとも１つの隆起が形成する角度は、前記微小流路の中心軸に対して４５度である、請求項３７に記載のシステム。
【請求項４０】
前記複数の隆起のうちの少なくとも１つの隆起が形成する角度は、前記微小流路の中心軸に対して２０〜９０度である、請求項３７に記載のシステム。
【請求項４１】
前記複数の隆起は、前記微小流路内において、山形様式で配置される、請求項３６〜４０のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項４２】
前記複数の分子は、高分子、ナノ粒子、デキストラン、プラスミド、ｍＲＮＡ、抗体、ビーズ、またはウイルスのうちの少なくとも１種である、請求項３６〜４１のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項４３】
前記高分子の平均サイズは、３ｋＤａ〜６ＭＤａである、請求項４２に記載のシステム。
【請求項４４】
前記微小流路は、注入口を少なくとも１つ含む、請求項３６〜４３のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項４５】
前記複数の緩和空間の幅は、１００〜３００ミクロンである、請求項３６〜４４のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項４６】
前記複数の圧縮面は、隆起を１〜２１個含む、請求項３６〜４５のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項４７】
前記複数の圧縮面は、隆起を７〜１４個含む、請求項３６〜４６のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項４８】
前記複数の圧縮面は、実質的に直交している、請求項３６〜４７のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項４９】
前記流速は、１００〜５００ｍｍ／秒である、請求項３６〜４８のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項５０】
Ｖｌｏｓｓは、平均細胞体積の５％〜３０％である、請求項３６〜４９のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項５１】
Ｖｌｏｓｓは、平均細胞体積の２５％である、請求項３６〜５０のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項５２】
Ｖｌｏｓｓは、前記細胞が最初に圧縮面に衝突してから測定を始めて約１０マイクロ秒で生じる、請求項３６〜５１のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項５３】
Ｖｇａｉｎは、Ｖｌｏｓｓの２５％〜１００％である、請求項３６〜５２のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項５４】
ＶｇａｉｎがＶｌｏｓｓの約１００％となるのは、４〜１００ミリ秒後である、請求項３６〜５３のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項５５】
平均径が３ｋＤａ〜６ＭＤａである複数の高分子を含む細胞であって、該細胞は、
細胞培地および複数の分子を微小流路に供給するステップであって、該細胞培地は、前記細胞を含み、該微小流路は、
互いに対して実質的に平面状に広がる第１の壁および第２の壁であって、該第１の壁は、複数の圧縮面を有していて、各圧縮面は該第１の壁から垂直に突出し、該圧縮面と該第２の壁との間に圧縮間隙を規定しており、該圧縮間隙の高さは、平均細胞径の２０〜８０％である、第１の壁および第２の壁、ならびに
前記圧縮面の間に配置された複数の緩和空間、を含む、ステップと、
前記細胞培地を、ある流速で前記微小流路に流すステップであって、前記細胞培地が前記微小流路を流れる際に、前記細胞が、対流による細胞内輸送プロセスによる処理を受け、該プロセスは、
第１の圧縮間隙において前記細胞を圧縮し、該圧縮によって、該複数の細胞の体積の減少が起こる（Ｖｌｏｓｓ）工程、および
前記細胞を第１の緩和空間まで通過させ、そこで該細胞が体積を増加させ（Ｖｇａｉｎ）、前記複数の分子の一部を吸収する工程を含む、ステップと、
排出口において前記細胞を回収するステップと、を含むプロセスによって形成される、細胞。
【請求項５６】
前記複数の圧縮面は、前記微小流路の中心流路軸に対して斜め方向を向いた複数の隆起を含む、請求項５５に記載の細胞。
【請求項５７】
前記複数の隆起のうちの少なくとも１つの隆起が形成する角度は、前記微小流路の中心軸に対して３０度である、請求項５６に記載の細胞。
【請求項５８】
前記複数の隆起のうちの少なくとも１つの隆起が形成する角度は、前記微小流路の中心軸に対して４５度である、請求項５６に記載の細胞。
【請求項５９】
前記複数の隆起のうちの少なくとも１つの隆起が形成する角度は、前記微小流路の中心軸に対して２０〜９０度である、請求項５６に記載の細胞。
【請求項６０】
前記複数の隆起は、前記微小流路内において、山形様式で配置される、請求項５６〜５９のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項６１】
前記複数の分子は、高分子、ナノ粒子、デキストラン、プラスミド、ｍＲＮＡ、抗体、ビーズ、またはウイルスのうちの少なくとも１種である、請求項５６〜６０のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項６２】
前記高分子の平均サイズは、３ｋＤａ〜６ＭＤａである、請求項５６〜６１のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項６３】
前記微小流路は、注入口を少なくとも１つ含む、請求項５６〜６２のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項６４】
前記複数の緩和空間の幅は、１００〜３００ミクロンである、請求項５６〜６３のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項６５】
前記複数の圧縮面は、隆起を１〜２１個含む、請求項５６〜６４のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項６６】
前記複数の圧縮面は、隆起を１〜７個含む、請求項５６〜６４のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項６７】
前記複数の圧縮面は、実質的に直交している、請求項５６〜６６のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項６８】
前記流速は、１００〜５００ｍｍ／秒である、請求項５６〜６７のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項６９】
Ｖｌｏｓｓは、平均細胞体積の５％〜３０％である、請求項５６〜６８のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項７０】
Ｖｌｏｓｓは、平均細胞体積の２５％である、請求項５６〜６９のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項７１】
Ｖｌｏｓｓは、前記細胞が最初に圧縮面に衝突してから測定を始めて約１０マイクロ秒で生じる、請求項５６〜７０のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項７２】
Ｖｇａｉｎは、Ｖｌｏｓｓの２５％〜１００％である、請求項５６〜７１のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項７３】
ＶｇａｉｎがＶｌｏｓｓの約１００％となるのは、４〜１００ミリ秒後である、請求項５６〜７２のいずれか１項に記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
［関連出願への相互参照］
２０１７年１１月８日に出願された本出願は、「分子および粒子の輸送のために細胞を圧縮して細胞内への小孔を開く隆起付微小流路（Ridged Microchannels for Compressing and Opening Pores Into cells for Molecular and Particle Delivery）」という名称の、２０１６年１１月８日に出願された米国仮特許出願第６２／４１９，０４１号に基づく優先権を主張するものであり、その内容および本質の全体が、以下に完全に記載されているかのように、参照により本明細書に援用される。
【０００２】
［連邦政府が助成する研究への陳述］
本発明は、全米科学財団によって授与された補助金番号ＤＧＥ−１６５００４４、およびＮＩＨによって授与された補助金番号ＩＲ２１ＣＡ１９１２４３−０１Ａ１のもと、政府の助成を受けて成されたものである。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
細胞内分子輸送は、細胞製造用途、特に、遺伝子導入および遺伝子編集において重要である。細胞内分子輸送のための公知の方法では、非常に大きな高分子（＞５００ｋＤａ）の細胞への輸送効率は非常に低くなり、かつ細胞核への輸送は含まれない。さらに、これらの方法では、このような装置の処理能力を低下させる装置の詰まりが発生する。
【０００４】
細胞は、体積を変化させることなく、その形状を実質的に変化させることができる。約１０マイクロ秒から１秒よりも長い時間スケール範囲にわたって、最大８５％ひずみまでの著しい変形が加えられる細胞操作では、細胞の変形および形状変化は起こるが、細胞の体積変化は起こらない。
【発明の概要】
【０００５】
本開示の実施形態は、対流による細胞内輸送のための方法を含み得、該方法は、細胞培地および複数の分子を微小流路に供給するステップであって、該細胞培地は、複数の細胞を含み、該微小流路は、互いに対して実質的に平面状に広がる第１の壁および第２の壁であって、該第１の壁は、複数の圧縮面を有していて、各圧縮面は該第１の壁から外方に突出し、該圧縮面と該第２の壁との間に圧縮間隙を規定しており、該圧縮間隙の高さは、平均細胞径の２０〜８０％である、第１の壁および第２の壁、ならびに前記圧縮面の間に配置された複数の緩和空間、を含む、ステップと；前記細胞培地を、ある流速で前記微小流路に流すステップであって、前記細胞培地が前記微小流路を流れる際に、前記複数の細胞が、対流による細胞内輸送プロセスによる処理を受け、該プロセスは、第１の圧縮間隙において前記複数の細胞を圧縮し、該圧縮によって、該複数の細胞の細胞内体積の減少（Ｖｌｏｓｓ）が起こること、および前記複数の細胞を第１の緩和空間まで通過させ、そこで該複数の細胞が体積を増加させ（Ｖｇａｉｎ）、前記複数の分子の一部を吸収することを含む、ステップと；排出口において前記複数の細胞を回収するステップと、を含む、方法である。
【０００６】
本開示の実施形態は、細胞内輸送のための方法を含み得、該方法は、複数の細胞および複数の分子を微小流路に適用するステップであって、該微小流路は、第１の圧縮間隙を規定する第１の直交面、第２の圧縮間隙を規定する第２の直交面、および前記第１の直交面と第２の直交面との間に配置される緩和空間、を含む、ステップと；前記複数の細胞を、１００〜５００ｍｍ／秒の流速で前記微小流路に流すステップと；前記第１の直交面において、前記細胞に圧縮力を加えるステップであって、該圧縮力によって、該細胞の第１の体積の減少（Ｖｌｏｓｓ１）を起こす、ステップと；前記複数の細胞を第１の緩和空間に通すステップであって、該複数の細胞の第１の体積の増加（Ｖｇａｉｎ１）を起こす、ステップと；前記第２の直交面において、前記細胞に圧縮力を加えるステップであって、該圧縮力によって、該細胞の第２の体積の減少（Ｖｌｏｓｓ２）を起こす、ステップと；回収地点において前記複数の細胞を回収するステップであって、該複数の細胞を回収した際に、該細胞の第２の体積の増加（Ｖｇａｉｎ２）を起こす、ステップと、を含み、Ｖｇａｉｎ１およびＶｇａｉｎ２のうちの少なくとも一方が生じる際に、前記複数の細胞は、前記複数の分子の一部を吸収する、方法である。
【０００７】
本開示の実施形態は、細胞内輸送のためのシステムを含み得、該システムは、微小流路であって、互いに対して実質的に平面状に広がる第１の壁および第２の壁であって、該第１の壁は、複数の圧縮面を有していて、各圧縮面は該第１の壁から外方に突出し、該圧縮面と該第２の壁の表面との間に圧縮間隙を規定している、第１の壁および第２の壁、ならびに前記圧縮面の間に配置された複数の緩和空間、を含む、微小流路と；複数の細胞および複数の分子を含む細胞培地であって、該細胞培地は、ある流速で前記微小流路を流れ、該細胞培地が該微小流路を流れる際に、該複数の細胞が、対流による細胞内輸送プロセスによる処理を受け、該プロセスは、第１の圧縮間隙において前記複数の細胞を圧縮し、該圧縮によって、該細胞の体積の減少（Ｖｌｏｓｓ）が起こること、および前記複数の細胞を第１の緩和空間まで通過させ、そこで該複数の細胞が体積を増加させ（Ｖｇａｉｎ）、前記複数の分子の一部を吸収すること、を含む、細胞培地と、を含み、前記圧縮間隙の高さは、平均細胞径の２０〜８０％である、システムである。
【０００８】
本開示の実施形態は、平均直径が３ｋＤａ〜６ＭＤａの複数の高分子を含有する細胞を含み得、該細胞は、細胞培地および複数の分子を微小流路に供給するステップであって、該細胞培地は、前記細胞を含み、該微小流路は、互いに対して実質的に平面状に広がる第１の壁および第２の壁であって、該第１の壁は、複数の圧縮面を有していて、各圧縮面は該第１の壁から垂直に突出し、該圧縮面と該第２の壁との間に圧縮間隙を規定しており、該圧縮間隙の高さは、平均細胞径の２０〜８０％である、第１の壁および第２の壁、ならびに前記圧縮面の間に配置された複数の緩和空間、を含む、ステップと；前記細胞培地を、ある流速で前記微小流路に流すステップであって、前記細胞培地が前記微小流路を流れる際に、前記細胞が、対流による細胞内輸送プロセスによる処理を受け、該プロセスは、第１の圧縮間隙において前記細胞を圧縮し、該圧縮によって、該複数の細胞の体積の減少が起こる（Ｖｌｏｓｓ）こと、および前記細胞を第１の緩和空間まで通過させ、そこで該細胞が体積を増加させ（Ｖｇａｉｎ）、前記複数の分子の一部を吸収することを含む、ステップと；排出口において前記複数の細胞を回収するステップと、を含むプロセスによって形成される、細胞である。
【０００９】
いくつかの実施形態では、上述したシステムまたは方法のいずれにおいても、前記圧縮面は、前記微小流路の中心流路軸に対して斜め方向を向いた複数の隆起を含み得る。いくつかの実施形態では、隆起が形成する角度は、前記微小流路の中心軸に対して３０度であり得る。他の実施形態では、隆起が形成する角度は、前記微小流路の中心軸に対して４５度であり得る。他の実施形態では、前記隆起が形成する角度は、前記微小流路の中心軸に対して２０度〜９０度であり得る。上述したシステムまたは方法のいずれにおいても、いくつかの実施形態では、前記微小流路は、複数の隆起を含み得、該複数の隆起は、該微小流路内において山形様式で配置され得る。いくつかの実施形態では、前記複数の圧縮面は、隆起を１〜２１個含み得る。他の実施形態では、前記複数の圧縮面は、隆起を１〜７個含み得る。
【００１０】
いくつかの実施形態では、上述したシステムまたは方法のいずれにおいても、前記分子は、高分子、ナノ粒子、デキストラン、プラスミド、ｍＲＮＡ、抗体、ビーズ、またはウイルスのうちの少なくとも１種を含み得る。いくつかの実施形態では、前記高分子の平均サイズは、３ｋＤａ〜６ＭＤａであり得る。
【００１１】
いくつかの実施形態では、上述したシステムまたは方法のいずれにおいても、前記微小流路は、少なくとも１つの注入口を含み得る。いくつかの実施形態では、上述したシステムまたは方法のいずれにおいても、前記複数の緩和空間は、１００〜３００ミクロンであり得る。いくつかの実施形態では、上述したシステムまたは方法のいずれにおいても、前記複数の圧縮面は、実質的に直交し得る。いくつかの実施形態では、前記複数の圧縮間隙は、平均細胞径の２０〜８０％であり得る。
【００１２】
いくつかの実施形態では、上述したシステムまたは方法のいずれにおいても、前記流速は、１００〜５００ｍｍ／秒であり得る。
【００１３】
いくつかの実施形態では、上述したシステムまたは方法のいずれにおいても、前記Ｖｌｏｓｓは、平均細胞体積の５％〜３０％であり得る。他の実施形態では、Ｖｌｏｓｓは、平均細胞体積の２５％であり得る。いくつかの実施形態では、上述したシステムまたは方法のいずれにおいても、前記Ｖｌｏｓｓは、前記細胞が最初に圧縮面に衝突してから測定を始めて約１０マイクロ秒で生じ得る。いくつかの実施形態では、上述したシステムまたは方法のいずれにおいても、前記Ｖｇａｉｎは、Ｖｌｏｓｓの２５％〜１００％であり得る。いくつかの実施形態では、ＶｇａｉｎがＶｌｏｓｓの約１００％となるのは、４〜１００ミリ秒後であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１ａ】図１ａは、本開示の１つ以上の実施形態に従う、圧縮面のもとで圧縮されている細胞の断面図を示す。
【図１ｂ】図１ｂは、本開示の１つ以上の実施形態に従う、複数の斜め方向の隆起を有する、二排出口微小流路を示す概略図である。
【図１ｃ】図１ｃは、本開示の１つ以上の実施形態に従う、山形様式の隆起を有する様々な微小流路を示す。
【図１ｄ】図１ｄは、本開示の１つ以上の実施形態に従う、山形様式の隆起を有する様々な微小流路を示す。
【図１ｅ】図１ｅは、本開示の１つ以上の実施形態に従う、三排出口微小流路を示す。
【図２】図２は、本開示の１つ以上の実施形態に従う、装置および細胞体積測定の特性を示す様々な図およびグラフ表示を示す。
【図３】図３は、本開示の１つ以上の実施形態に従う、遺伝子発現の比較を示し、これは、細胞の生存率および完全性は、本開示のシステムおよび方法の影響を受けないということを示す。
【図４ａ】図４ａおよび図４ｂは、本開示の１つ以上の実施形態に従う、隆起間隙、体積変化百分率、流速、および隆起間の時間に基づいて分子輸送の特性を示す様々な図およびグラフ表示を示す。
【図４ｂ】図４ａおよび図４ｂは、本開示の１つ以上の実施形態に従う、隆起間隙、体積変化百分率、流速、および隆起間の時間に基づいて分子輸送の特性を示す様々な図およびグラフ表示を示す。
【図５ａ】図５ａは、本開示の１つ以上の実施形態に従う、様々なグラフ表示を示し、圧縮間隙が小さくなるにつれて細胞内分子輸送が向上することを示す。
【図５ｂ】図５ｂは、本開示の１つ以上の実施形態に従う、様々なグラフ表示を示し、流動状態が速いほど分子輸送が低下することを示す。
【図６ａ】図６ａ〜図６ｈは、本開示の１つ以上の実施形態に従う、様々なグラフ表示を示し、これらは、分子サイズ、隆起数、および流速を含む様々な特性を調査したものである。
【図６ｂ】図６ａ〜図６ｈは、本開示の１つ以上の実施形態に従う、様々なグラフ表示を示し、これらは、分子サイズ、隆起数、および流速を含む様々な特性を調査したものである。
【図６ｃ】図６ａ〜図６ｈは、本開示の１つ以上の実施形態に従う、様々なグラフ表示を示し、これらは、分子サイズ、隆起数、および流速を含む様々な特性を調査したものである。
【図６ｄ】図６ａ〜図６ｈは、本開示の１つ以上の実施形態に従う、様々なグラフ表示を示し、これらは、分子サイズ、隆起数、および流速を含む様々な特性を調査したものである。
【図６ｅ】図６ａ〜図６ｈは、本開示の１つ以上の実施形態に従う、様々なグラフ表示を示し、これらは、分子サイズ、隆起数、および流速を含む様々な特性を調査したものである。
【図６ｆ】図６ａ〜図６ｈは、本開示の１つ以上の実施形態に従う、様々なグラフ表示を示し、これらは、分子サイズ、隆起数、および流速を含む様々な特性を調査したものである。
【図６ｇ】図６ａ〜図６ｈは、本開示の１つ以上の実施形態に従う、様々なグラフ表示を示し、これらは、分子サイズ、隆起数、および流速を含む様々な特性を調査したものである。
【図６ｈ】図６ａ〜図６ｈは、本開示の１つ以上の実施形態に従う、様々なグラフ表示を示し、これらは、分子サイズ、隆起数、および流速を含む様々な特性を調査したものである。
【図７】図７は、本開示の１つ以上の実施形態に従う、細胞の体積交換を包含する機械モデルの開発を示す。
【図８】図８は、本開示の１つ以上の実施形態に従う、Ｋ５６２細胞の緩和時間に対する圧縮回数の効果を示すグラフ表示である。
【図９】図９は、本開示の１つ以上の実施形態に従う、様々な図およびグラフ表示を示し、これらは、細胞への種々の分子の輸送が成功したことを示す。
【図１０】図１０は、本開示の１つ以上の実施形態に従う、ＥＧＦＰプラスミドを用いたＫ５６２細胞のトランスフェクションのフローサイトメトリーの結果を示す。
【図１１】図１１は、本開示の１つ以上の実施形態に従う、１００ｎｍの蛍光粒子のＫ５６２細胞への輸送の共焦点顕微鏡画像を示す。
【図１２】図１２は、本開示の１つ以上の実施形態に従う、細胞へ輸送されたプライマリー白血球およびＥＧＦＰ ｍＲＮＡの輸送を示すグラフ表示である。
【図１３ａ】図１３ａは、対流による輸送に基づいて作動する装置における、様々な高分子の細胞内輸送を比較したグラフ表示を示す。
【図１３ｂ】図１３ｂは、拡散による輸送に基づいて作動する装置における、様々な高分子の細胞内輸送を比較したグラフ表示を示す。
【図１４ａ】図１４ａは、対流による輸送に基づいて作動する装置において、流速および輸送百分率を比較したグラフ表示を示す。
【図１４ｂ】図１４ｂは、拡散による輸送に基づいて作動する装置において、流速および輸送百分率を比較したグラフ表示を示す。
【図１５ａ】図１５ａは、対流による輸送に基づいて作動する装置における、高分子の細胞内輸送を比較したグラフ表示を示す。
【図１５ｂ】図１５ｂは、拡散による輸送に基づいて作動する装置における、高分子の細胞内輸送を比較したグラフ表示を示す。
【図１６ａ】図１６ａは、対流による輸送に基づいて作動する装置における、デキストランの細胞内輸送を比較したグラフ表示を示す。
【図１６ｂ】図１６ｂは、拡散による輸送に基づいて作動する装置における、デキストランの細胞内輸送を比較したグラフ表示を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本開示の好ましい実施形態を詳細に説明するが、他の実施形態を検討することは、理解されるべきである。したがって、本開示の範囲を、以下の記述で説明された、または図面に示された、詳細な構成要素の構造および配置に限定することを意図するものではない。本開示は、他の実施形態が可能であり、かつ様々な方法で実現または実行することが可能である。また、好ましい実施形態について説明する際に、明確性のために、特定の専門用語が用いられる。
【００１６】
また、本明細書および添付の請求の範囲において使用される、単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」および「その（the）」は、文脈が明らかに他のものを指示していない限り、複数の指示対象を含むことに留意が必要である。
【００１７】
また、好ましい実施形態について説明する際に、明確性のために、専門用語が用いられる。各用語が、当業者によって理解される最も広い意味を意図したものであって、同様の様式で作動して同様の目的を達成する技術的等価物をすべて含むことが意図される。
【００１８】
本明細書において、範囲は、ある特定の「おおよその（about）」または「大体の（approximately）」値から、および／または、他の特定の「おおよその（about）」または「大体の（approximately）」値までとして表現され得る。このような範囲を表現する場合、別の実施形態は、ある特定の値から、および／または、他の特定の値まで、を含む。
【００１９】
「含む（comprising）」または「含有する（containing）」または「含む（including）」という語句は、少なくとも指定された化合物、元素、粒子、または方法ステップが、組成または物品または方法の中にあることを意味するが、他の化合物、物質、粒子、方法ステップの存在を、たとえこのような他の化合物、物質、粒子、方法ステップが指定されたものと同じ機能を持っているとしても、除外することはない。
【００２０】
また、１つ以上の方法ステップについての言及は、追加的方法ステップまたは明白に特定されたそれらのステップ間の中間的方法ステップの存在を除外しないことが、理解されるべきである。また、同様に、装置またはシステム中の１つ以上の構成要素についての言及は、追加的構成要素または明白に特定されたそれらの構成要素間の中間的構成要素の存在を除外しないことが、理解されるべきである。
【００２１】
本開示の実施形態は、超高速の時間スケールにおける大規模な変形に応じて、細胞が一過性の（最大３０％までの）細胞体積変化という挙動を示すということを、細胞の生存率を損なうことなく実現することができる。分子および／または粒子の細胞への細胞内輸送のための公知の方法は、分子および／または粒子の拡散による細胞への輸送に依拠するものであり、細胞体積変化に依拠するものではない。このような拡散による輸送は、むしろ、細胞膜に微小孔を生じさせるために、剪断力および／または圧縮力を利用する。細胞膜は、細胞内輸送のための操作を行いやすいが、高い細胞生存率を維持し、かつ細胞の損傷または細胞死を回避するためには、このような操作は、規模（例えば、力の量、小孔のサイズ、および圧縮回数）と輸送可能な分子の種類（例えば、数百キロダルトンを超える高分子の輸送ではなく、より小さい分子の輸送）との両方において、限定される。さらに、細胞内と細胞外との間に外部濃度の差がなければ、細胞内輸送を容易にする様式では、拡散は起こらない。体積流および相当する「対流による」体積の再回復を得る機構についての説明はない。実際、当該技術分野において、細胞の体積（細胞、例えば細胞の細胞質内の液体）を大幅に減らすことは、相当な細胞の損傷および細胞死なしでは不可能であると考えられる。驚くべきことに、本開示の実施形態は、相当量の嵩体積の移動を実現することができ、これにより、高い細胞生存率での細胞内分子輸送を、容易に向上することができる。
【００２２】
さらに、拡散による輸送を行うための公知の微小流体装置は、高い剪断力で作動することで細胞膜の小孔の生成を容易にして、拡散による輸送を行うために、狭い狭窄部を用いる必要があるため、詰まりがちである。高流速と組み合わせて高剪断力を用いることで細胞の詰まりを抑えようと試みると、細胞の損傷および細胞死が起こり得る。また、高剪断力に繰り返し曝されると、細胞の損傷および細胞死が起こり得る。
【００２３】
本開示の実施形態は、急激な体積減少をもたらすことができ、回復中の流体の移動によって、高い細胞生存率で、様々な高分子が高い処理能力で輸送される。さらに、様々な高分子を様々な異なる細胞種類に輸送するのに、本開示の実施形態を用いることができる。本開示の実施形態は、詰まりをより少なくして、より高い処理能力で輸送を行うという利点を有する。また、本開示の実施形態は、高分子の輸送に用いられることもあるマイクロインジェクションやナノニードルインジェクションほどには特化されていない器具を用いて、分子および／または粒子の輸送を実現することができる。本開示の実施形態は、拡散による輸送に基づく微小流体装置よりも、細胞死や細胞凝集の危険性を低くし得る。
【００２４】
本開示の実施形態は、分子の対流による細胞内輸送のための方法、システム、および装置を含み得る。対流による細胞内輸送のための方法は、以下のステップ、すなわち、１）複数の細胞を含む細胞培地と、複数の分子とを、微小流路に供給するステップと；２）ある流速で細胞培地を微小流路に流すステップと；３）細胞培地が微小流路を流れる際に、対流による細胞内輸送プロセスを適用するステップと；４）第１の圧縮間隙において複数の細胞を圧縮するステップであって、この圧縮によって複数の細胞の細胞内体積の減少（Ｖｌｏｓｓ）を起こす、ステップと；５）第１の直交面において細胞に圧縮力を加えるステップであって、この圧縮力によって細胞の第１の体積の減少（Ｖｌｏｓｓ１）を起こす、ステップと；複数の細胞を第１の緩和空間まで通過させるステップであって、複数の細胞の体積の回復（ＶｇａｉｎまたはＶｇａｉｎ１）を起こす、ステップと；６）細胞に圧縮力を加えるステップであって、この圧縮力によって細胞の第２の体積の減少（Ｖｌｏｓｓ２）を起こす、ステップと；７）排出口において複数の細胞を回収するステップと；８）排出口において複数の細胞を回収するステップであって、複数の細胞を回収した際に、細胞の第２の体積の回復（Ｖｇａｉｎ２）を起こす、ステップと、のうちの１つ以上を含み得る。
【００２５】
いくつかの実施形態では、対流による細胞内輸送のための方法は、複数の細胞を含む細胞培地と、複数の分子とを、微小流路に供給するステップと；ある流速で細胞培地を微小流路に流すステップであって、細胞培地が微小流路を流れる際に、複数の細胞が、対流による細胞内輸送プロセスによって処理され、該プロセスは、第１の圧縮間隙において複数の細胞を圧縮して、この圧縮によって複数の細胞の細胞内体積の減少（Ｖｌｏｓｓ）を起こすこと、および複数の細胞を第１の緩和空間まで通過させて、そこで複数の細胞が体積を増加（Ｖｇａｉｎ）させ、複数の分子の一部を吸収することを含む、ステップと；排出口において複数の細胞を回収するステップと、を含み得る。
【００２６】
いくつかの実施形態では、対流による分子の細胞内輸送のための方法は、複数の細胞を微小流路に供給するステップと；複数の細胞を微小流路に流すステップと；細胞に圧縮力を加えるステップであって、この圧縮力によって細胞の第１の体積の減少（Ｖｌｏｓｓ１）を起こす、ステップと；複数の細胞を第１の緩和空間に通すステップであって、複数の細胞の第１の体積の増加（Ｖｇａｉｎ１）を起こす、ステップと；細胞に圧縮力を加えるステップであって、この圧縮力によって細胞の第２の体積の減少（Ｖｌｏｓｓ２）を起こす、ステップと；排出口において複数の細胞を回収するステップであって、複数の細胞を回収した際に、細胞の第２の体積の増加（Ｖｇａｉｎ２）を起こす、ステップと、を含み得る。
【００２７】
本開示の実施形態は、分子の細胞内輸送のためのシステムを１つ以上含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、システムは、微小流路と、複数の細胞及び複数の分子を含む細胞培地と、を含んでいてもよく、細胞培地は、ある流速で微小流路を流れ、細胞培地が微小流路を流れる際に、複数の細胞が、対流による細胞内輸送プロセスによって処理され、該プロセスは、第１の圧縮間隙において複数の細胞を圧縮して、この圧縮によって複数の細胞の細胞内体積の減少（Ｖｌｏｓｓ）を起こすこと、および複数の細胞を第１の緩和空間まで通過させ、そこで複数の細胞が体積を増加（Ｖｇａｉｎ）させ、複数の分子の一部を吸収することを含む。
【００２８】
上述したシステムおよび方法のいずれも、先に述べた方法またはシステムのいずれかによって形成され、平均径が１ｎｍ〜１５０ｎｍである複数の高分子を含む、細胞を含んでいてもよい。上述したシステムおよび方法のいずれにおいても、複数の高分子を、複数の細胞に輸送することができる。複数の高分子のサイズは、均一であってもよいし、多様であってもよい。例えば、複数の高分子のうちの任意の分子は、１ｎｍ〜１００ｎｍ、５ｎｍ〜１００ｎｍ、１０ｎｍ〜１００ｎｍ、２０ｎｍ〜１００ｎｍ、３０ｎｍ〜１００ｎｍ、４０ｎｍ〜１００ｎｍ、５０ｎｍ〜１００ｎｍ、６０ｎｍ〜１００ｎｍ、７５ｎｍ〜１００ｎｍ、８０ｎｏ〜１００ｎｍ、８５ｎｍ〜１００ｎｍ、９０ｎｍ〜１００ｎｍ、１１０ｎｍ〜１２０ｎｍであり得る。いくつかの実施形態では、高分子のサイズは、３ｋＤａ〜６ＭＤａ、１０ｋＤａ〜６ＭＤａ、１５ｋＤａ〜６ＭＤａ、２０ｋＤａ〜６ＭＤａ、２５ｋＤａ〜６ＭＤａ、３０ｋＤａ〜６ＭＤａ、４０ｋＤａ〜６ＭＤａ、５０ｋＤａ〜６ＭＤａ、６０ｋＤａ〜６ＭＤａ、７０ｋＤａ〜６ＭＤａ、７５ｋＤａ〜６ＭＤａ、８０ｋＤａ〜６ＭＤａ、９０ｋＤａ〜６ＭＤａ、１００ｋＤａ〜６ＭＤａ、２５０ｋＤａ〜６ＭＤａ、５００ｋＤａ〜６ＭＤａ、７５０ｋＤａ〜６ＭＤａ、１ＭＤａ〜５ＭＤａ、２ＭＤａ〜４ＭＤａ、３ＭＤａの範囲に分布し得る。
【００２９】
上述したシステムおよび方法のいずれも、対流による分子の様々な細胞種類への細胞内輸送を実現することができる。このような細胞種類としては、卵母細胞、精子、ライディヒ細胞、胚性幹細胞、羊膜細胞、胚盤胞、桑実胚、および接合子などの生殖器系の細胞；末梢血白血球、脾臓白血球、リンパ節白血球、ハイブリドーマ細胞、Ｔ細胞（細胞毒性／サプレッサＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、および初回刺激を受けたＴ細胞）、Ｂ細胞（メモリーＢ細胞およびナイーブＢ細胞）、単球、マクロファージ、顆粒球（好塩基球、好酸球、および好中球）、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルサプレッサ細胞、胸腺細胞、および樹状細胞などの白血球；造血幹細胞（ＣＤ３４＋）、前赤芽球、正赤芽球、前骨髄球、網状赤血球、赤血球、プレ赤血球、骨髄芽球、赤芽球、巨核球、Ｂ細胞前駆体、Ｔ細胞前駆体、胸腺細胞、マクロファージ、マスト細胞、および血小板などの造血系の細胞；脂肪細胞、線維芽細胞、外膜細網細胞、内皮細胞、未分化間充織細胞、ならびに扁平上皮細胞、縁上皮細胞、立方上皮細胞、円柱上皮細胞、扁平角化細胞および扁平非角化細胞などの上皮細胞や周皮細胞などの間質細胞；筋細胞（心筋細胞、横紋筋細胞、および平滑筋細胞）、骨芽細胞、破骨細胞、骨細胞、滑膜細胞、軟骨芽細胞、軟骨細胞、軟骨内線維芽細胞、および軟骨膜線維芽細胞などの骨格および筋肉系の細胞；星細胞（原形質性星細胞および繊維製星細胞)、小グリア細胞、希突起神経膠細胞、およびニューロンなどの神経系の細胞；十二指腸の壁細胞、酵素原細胞、および銀親和細胞、ポリペプチド産生内分泌細胞（ＡＰＵＤ）、ランゲルハンス島（アルファ細胞、ベータ細胞、およびデルタ細胞）、幹細胞、ならびにクッパー細胞などの消化管細胞；ケラチン生成細胞、ランゲルハンス細胞、およびメラニン形成細胞などの皮膚細胞；成長ホルモン細胞、乳腺刺激細胞、生殖腺刺激細胞、甲状腺刺激細胞、副腎皮質刺激細胞、およびメラノサイト刺激細胞などの下垂体および視床下部の細胞；甲状腺細胞（Ｃ細胞および上皮細胞）などの副腎および他の内分泌腺の細胞；副腎細胞；ならびに腫瘍細胞などを挙げ得るが、これらに限定されない。
【００３０】
細胞は、バーキットリンパ腫細胞、絨毛癌細胞、腺癌細胞、非ホジキンＢ細胞リンパ腫細胞および非ホジキンＴ細胞リンパ腫細胞、線維肉腫細胞、神経芽細胞腫細胞、形質細胞腫細胞、横紋筋肉腫細胞、咽頭の癌細胞、腎腺癌、肝臓癌細胞、線維肉腫細胞、骨髄腫細胞、骨肉腫細胞、奇形腫細胞、奇形腫ケラチン生成細胞、肺癌細胞、結腸腺癌細胞、肺腺腫細胞、腎癌細胞、直腸腺癌細胞、慢性骨髄性白血病細胞、回盲部腺癌細胞、毛様細胞白血病細胞、急性骨髄性白血病細胞、直腸癌細胞、盲腸癌細胞および盲腸腺癌細胞、白血病−盲腸腺癌細胞、膵癌、ウィルムス腫瘍細胞、前立腺腺癌細胞、腎平滑筋芽腫細胞、膀胱癌細胞、プラズマ細胞腫細胞、奇形癌細胞、乳癌、子宮頸部扁平上皮細胞癌、卵巣奇形癌、骨髄腫細胞、Ｔ細胞リンパ腫細胞およびＢ細胞リンパ腫細胞、無色素性黒色腫細胞、子宮頸部癌細胞、横紋筋肉腫、肝臓癌、骨髄性甲状腺癌細胞、悪性黒色腫細胞、膠芽腫細胞、プラズマ細胞性白血病、子宮内膜腺癌、扁平上皮細胞癌、膵臓腺癌、星細胞腫、胃腺癌、肺粘液性類表皮癌細胞、脊髄性白血病細胞、ＥＢＶ−形質転換Ｂ細胞、腎細胞腺癌、急性白血病、Ｂ細胞プラズマ細胞種、急性リンパ球性白血病、皮膚Ｔリンパ腫、Ｔ細胞性白血病、急性リンパ芽球性白血病、ＨＩＶ＋Ｔ細胞、髄芽腫、鎌状赤血球病由来のＢ細胞、急性単球性白血病、副腎皮質癌、ボーズ黒色腫、ならびに肝細胞癌であってもよい。 
【００３１】
上述したシステムおよび方法のいずれにおいても、複数の細胞は、上記細胞またはその派生物のいずれかを含んでいてもよい。ここで述べるシステムおよび方法は、生物学的な細胞に関して述べているが、ここで開示されるこれらのシステムおよび方法は、生物学的な細胞以外の様々な物質を用いて実現することができ、いくつかの実施形態では、上述したシステムおよび方法は、ナノ粒子などの様々な粒子、様々な細胞内プローブセンサー（例えば、分子ビーコンおよびスマートフレア（SmartFlare））、様々なウイルス（例えば、レンチウイルス）、および量子ドットを用いて実現することができるということが、理解される。
【００３２】
さらに、上述したシステムおよび方法のいずれも、細胞培地などの流体に懸濁された、上述した細胞のいずれかを含み得る。細胞培地は、複数の細胞を懸濁することができ、かつ炭素源（例えば、グルコース）、水、種々の塩、ならびにアミノ酸源および窒素源（例えば、ビーフエキストラクト、イーストエキストラクトなど）のうちの１つ以上の物質を追加的に含むことができる任意の液体であり得る。さらに、培地は、プレートカウント寒天、栄養寒天、またはトリプチケースソイ寒天などの他の栄養素を含んでいてもよい。
【００３３】
上述したシステムおよび方法のいずれも、細胞および／または細胞培地を微小流路に流すことを含み得る。上述したシステムおよび方法のいくつかの実施形態では、互いに対して実質的に平面状に広がる第１の壁および第２の壁によって、微小流路を規定することができる。微小流路は、第１の壁から突出する複数の圧縮面を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、複数の圧縮面は、第１の壁から外方へ、第２の壁に向かって突出し得る。いくつかの実施形態では、複数の圧縮面は、第２の壁から外方へ、第１の壁に向かって突出し得る。いくつかの実施形態では、複数の圧縮面は、第１の壁および第２の壁のいずれかから外方へ、第１の壁および第２の壁のいずれかに向かって突出し得る。例えば、いくつかの実施形態では、圧縮面は、壁の一方または両方から垂直に突出し得る。他の実施形態では、複数の圧縮面は、第１の壁および／または第２の壁からある角度で突出し得る。いくつかの実施形態では、複数の圧縮面は、第１の壁および第２の壁の両方から外方へ突出し得る。例えば、複数の圧縮面のそれぞれは、第２の壁から外方へ突出している複数の第２の圧縮面に向かって、第１の壁から外方へ突出し得る。さらに、上述したシステムおよび方法のいくつかの実施形態では、複数の圧縮面は、複数の圧縮間隙を規定し得る。いくつかの実施形態では、複数の圧縮面は、複数の直交面であってもよい。したがって、いくつかの実施形態では、上述したシステムおよび方法の微小流路は、第１の圧縮間隙を規定する第１の直交面と、第２の圧縮間隙を規定する第２の直交面とを含んでいてもよい。
【００３４】
上述したシステムおよび方法の、対流による細胞内輸送を実現するための例示的な微小流路１００を、図１ａ〜図１ｅに示す。上述したシステムおよび方法は、図１ａ〜図１ｅに関して以下で説明する特徴の一部を含んでいてもよいし、すべてを含んでいてもよい。図１ａに示すように、微小流路１００は、第１の平面壁１１０と、第２の平面壁１２０とを含み得る。第１の平面壁１１０は、第１の平面壁１１０から外方へ突出する複数の圧縮面１３０を含み得る。微小流路１００は、微小流路１００に複数の細胞１８０と複数の粒子１９０とを流し入れるために備えられた１つ以上の注入口１４０を含み得る。いくつかの実施形態では、図１ｂに示すように、１つ以上の注入口１４０は、微小流路１００に流体のシース流を送り出すためのシース流注入口１４５ａ、１４５ｂを含んでいてもよい。微小流路１００は、複数の細胞１８０の一部を回収するための複数の排出口１５０を含み得る。
【００３５】
微小流路は、複数の圧縮面１３０を含み得る。いくつかの実施形態では、複数の圧縮面１３０は、図１ｂに示すように、複数の隆起を含み得る。いくつかの実施形態では、複数の圧縮面１３０は、図１ｂに示すように、中心流路軸に対して斜め方向に向いていてもよい。中心流路軸は、微小流路１００の中心部近傍に位置し得、かつ微小流路１００を流れる一次流に平行に延びる軸を含み得る。図１ｂに示すように、いくつかの実施形態では、複数の圧縮面１３０は、複数の隆起のうちのそれぞれ次の隆起に対して平行に延び得る。複数の圧縮面１３０は、直線状であってもよいが、必ずしもその必要はない。例えば、複数の圧縮面１３０は、矩形、円柱形、台形、または三角形などの任意の形状であり得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、複数の圧縮面は、直交している。例えば、いくつかの実施形態では、複数の圧縮面は、少なくとも１つの直角部を有していてもよい。いくつかの実施形態では、図１ｃおよび図２ｄに示すように、複数の圧縮面１３０は、山形様式を形成していてもよい。さらに、当業者には理解されるように、複数の圧縮面は、少なくとも１つの隆起を含み得るが、すべてが隆起である必要はない。
【００３６】
複数の圧縮面１３０は、圧縮面１３０と対向する壁１２０の表面との間に、圧縮間隙１７０を規定してもよい。例えば、複数の圧縮面１３０が第１の平面壁１１０から突出している実施形態では、複数の圧縮面１３０は、圧縮面１３０と、第２の平面壁１２０上の圧縮面１３０と対向する表面との間に、圧縮間隙１７０を規定してもよい。本明細書において、表面とは、例えば、壁が他に対応する隆起または突起を有していない、対向する壁の最も近い部分または直近の部分を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、第２の平面壁１２０は、複数の圧縮面１３０を含み得、対向する表面が、例えば、対向圧縮面１３０であり得る。したがって、圧縮面１３０と第２の壁１２０の表面との間に形成される空間として、または対向する壁の対向する圧縮面の間の空間として、圧縮間隙１７０を規定することができる。いくつかの実施形態では、対向する隆起は、互いに一直線上に配置され得る。
【００３７】
図１ａ〜図１ｅに関して、微小流路の第１の壁および第２の壁を平面状であるとして説明しているが、必ずしもその必要はない。例えば、上述したシステムおよび方法のいずれにおいても、第１の壁および第２の壁は、実質的に平面状であり得る。換言すると、それらは、微小流路の長さにわたって収束または発散するように、互いに近づくまたは離れるようにわずかに傾かせることができる。いくつかの実施形態では、それらは、わずかという程度よりも大きく収束または発散し得る。さらに、第１の壁を微小流路の上部に配向させ、第２の壁を微小流路の底部に配向させることができるが、そのように配置する必要はなく、第１の壁を微小流路の底部に配向させることができ、かつ第２の壁を微小流路の上部に配向させてもよいと考えられる。
【００３８】
圧縮間隙１７０のサイズは、装置の設計に基づいて、任意に大きくしたり小さくしたりすることができる。いくつかの実施形態では、細胞の平均径の観点から、圧縮間隙１７０のサイズを規定することができる。理解されるように、細胞上の２点間の最大距離として、細胞径を規定することができる。いくつかの実施形態では、圧縮間隙の高さは、平均細胞径に対する百分率に基づいて規定されてもよい。例えば、圧縮間隙１７０の高さは、平均細胞径の約１０％〜約８０％であってもよいし、約１０％〜約５０％であってもよいし、約１０％〜約４０％であってもよいし、約１０％〜約３０％であってもよいし、約１０％〜約２０％であってもよいし、約２０％〜約３０％であってもよいし、約３０％〜約４０％であってもよいし、約４０％〜約５０％であってもよいし、約５０％〜約６０％であってもよい。いくつかの実施形態では、圧縮間隙１７０の高さは、平均細胞径の約１５％であってもよいし、約２０％であってもよいし、約２５％であってもよいし、約３０％であってもよいし、約３５％であってもよいし、約４０％であってもよいし、約４５％であってもよいし、約５０％であってもよいし、約５５％であってもよいし、約６０％であってもよいし、約６５％であってもよいし、約７０％であってもよいし、約７５％であってもよいし、約８０％であってもよい。平均細胞サイズとは、選別装置に流された細胞の最大断面寸法の平均を指すことができ、これを用いて算出することができる。いくつかの実施形態では、光学顕微鏡法、共焦点顕微鏡法、コールター計数器、およびフローサイトメトリーなどを含むがそれらに限定されない、現在公知の、または将来見出される、様々な手段を用いて平均細胞径を計測することができる。
【００３９】
図１ａおよび図１ｂに示すように、複数の圧縮面１３０は、緩和空間１６０によって区切られていてもよい。緩和空間１６０は、複数の圧縮面の第１の圧縮面と、複数の圧縮面の第２の圧縮面との間に形成される空間または流路の幅を含み得る。いくつかの実施形態では、緩和空間１６０は、５０〜約１０００ミクロンであってもよいし、５０〜７５０ミクロンであってもよいし、５０〜５００ミクロンであってもよいし、５０〜４００ミクロンであってもよいし、５０〜３５０ミクロンであってもよいし、１００〜３００ミクロンであってもよいし、１００〜７５０ミクロンであってもよいし、１００〜５００ミクロンであってもよいし、１００〜４００ミクロンであってもよいし、１００〜３００ミクロンであってもよいし、１００〜２５０ミクロンであってもよいし、１２５〜２５０ミクロンであってもよい。緩和空間１６０は、少なくとも５０ミクロン、少なくとも約１００ミクロン、少なくとも１２５ミクロン、少なくとも１５０ミクロン、少なくとも２５０ミクロン、または少なくとも３００ミクロンであり得る。緩和空間１６０は、２０ミクロン以下、１００ミクロン以下、２００ミクロン以下、３００ミクロン以下、１０００ミクロン以下、７５０ミクロン以下、５００ミクロン以下、５０〜３５０ミクロン、１００〜３００ミクロン、１００〜２５０ミクロン、１２５〜２５０ミクロン、または少なくとも３００ミクロンであり得る。
【００４０】
複数の圧縮面１３０は、図１ｂに示すように、ある角度（α）をとってもよい。圧縮面１３０の下で流体力学的な循環を生じさせるために、ある角度で複数の圧縮面１３０を傾斜させることができ、かつ流れ方向に対して垂直に細胞を圧縮および変形させるように、圧縮面１３０を設計することができる。圧縮面１３０の角度は、細胞の軌道にも影響を与え得る。この角度は、微小流路に流される細胞の種類、緩和空間１６０、および微小流路１００に流される培地の流速などのパラメータの１つ以上に応じて変化してもよいが、パラメータはこれらに限定されない。したがって、角度を調整することによって、圧縮面１３０に沿う細胞の移動が容易になる場合がある。例えば、角度を調整することによって、微小流路１００の詰まりを防ぐために、死細胞または損傷細胞を微小流路１００の側方に移動させることが容易になる場合がある。
【００４１】
この角度は、装置設計に基づいて、大きくされてもよいし、小さくされてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、この角度は、２０〜９０度、２０〜７５度、３０〜６０度、３０〜４５度、４５〜６０度、少なくとも３０度、少なくとも４５度、少なくとも６０度、少なくとも７５度であり得る。各圧縮面の角度は、微小流体装置の長手方向において、同じであってもよいし、異なっていてもよい。圧縮面１３０が直線状でない例では、直線状でない隆起に直線状に適合する線に基づいて、角度を測定することができる。
【００４２】
微小流路１１０における圧縮面１３０の数は、任意に増やしたり減らしたりすることができる。いくつかの実施形態では、微小流路１１０は、圧縮面１３０を１〜１００個含み得る。いくつかの実施形態では、微小流路１１０は、圧縮面１３０を少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０個、含み得る。いくつかの実施形態では、微小流路１１０は、圧縮面１３０を１００個以下、７５個以下、５０個以下、または４０個以下、含み得る。いくつかの実施形態では、微小流路１１０は、圧縮面１３０を５〜５０個、７〜４０個、または７〜２１個、含み得る。いくつかの実施形態では、微小流路１１０は、圧縮面１３０を約１４個含み得る。
【００４３】
複数の圧縮面１３０は、厚さで記述され得る。厚さは、一次流の方向における圧縮面の線寸法として規定され得る。厚さは、任意に大きくしたり、小さくしたりすることができる。いくつかの実施形態では、厚さは、約７〜約３０ミクロン、約７〜約２０ミクロン、約７〜約１８ミクロン、約７〜約１６ミクロン、約７〜約１１ミクロン、約７〜約９ミクロン、約２０〜約３０ミクロン、約２２〜約２８ミクロン、約２４〜約２８ミクロン、約１８〜約２１ミクロン、約１６〜約２２ミクロン、または約８〜約１１ミクロンであり得る。いくつかの実施形態では、厚さは、少なくとも約９ミクロン、少なくとも約１１ミクロン、および少なくとも約１６ミクロンであり得る。
【００４４】
微小流路１００は、注入口１４０を１つ以上有し得る。１つ以上の注入口１４０は、微小流路１００の第１の側壁に配置されてもよい。いくつかの実施形態では、微小流路１００は、細胞注入口１４０と、シース流注入口１４５ａ、１４５ｂとを有し得る。いくつかの実施形態では、第１のシース流注入口１４５ａと第２のシース流注入口１４５ｂとの間に、細胞注入口を配置することができ、または第１のシース流注入口１４５ａａで、細胞注入口を囲むことができる。いくつかの実施形態では、１つ以上のシース流注入口１４５ａ、１４５ｂの下流に、細胞注入口１４０を配置することができ、または１つ以上のシース流注入口１４５ａ、１４５ｂと一直線上に配置することができる。シース流体は、細胞培地の流体力学的収束を可能とすることができる。細胞流注入口１４７の近傍、または細胞流注入口１４７の上流に、１つ以上のシース流注入口１４５ａ、１４５ｂを配置することができる。注入口に細胞を収束させることは、シース流体が層流に到達するまで、シース流注入口１４５ａ、１４５ｂにシース流体を供給することと、その後引き続き、細胞培地を細胞注入口１４７から導入することとを含み得る。例えば、シリンジポンプによる注入によって、細胞を細胞注入口１４７に導入することができる。
【００４５】
様々な方法で上述の微小流路１００を構築することができる。ある例示的で限定しない実施形態では、永久鋳型上でのポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）のレプリカ成形を用いて、微小流路を作成することができる。４インチ径のシリコンウエハ上におけるフォトレジストの二段階フォトリソグラフィパターン成形によって、鋳型を作成することができる。鋳型からＰＤＭＳを除去した後、ＰＤＭＳの側壁に注入口の穴と排出口の穴を打ち抜くことができ、その後、微小流体流路を形成するために、ＰＤＭＳをガラス基板に接着することができる。さらに、いくつかの実施形態では、図１ｄに示すように、本システムおよび方法は、上述の方法を多く、同時に行うことを可能にするために、２つ以上の微小流路を含み得る。
【００４６】
ある流速で、複数の細胞１８０を微小流路１００に流すことができる。先に述べたシステムおよび方法のいずれにおいても、流速は、任意に上げたり下げたりすることができる。本明細書において、流速とは、注入口または排出口における細胞培地の速度を指すことができる。流速は、約３〜約１０００ｍｍ／秒、約３〜約５００ｍｍ／秒、約３〜約２５０ｍｍ／秒、約３〜約１００ｍｍ／秒、約３〜約５０ｍｍ／秒、約３〜約２５ ｍｍ／秒であり得る。流速は、少なくとも約３ｍｍ／秒、少なくとも約２０ｍｍ／秒、少なくとも約５０ｍｍ／秒、少なくとも約１００ｍｍ／秒、または少なくとも約５００ｍｍ/秒であり得る。流速は、約３ｍｍ／秒、約２０ｍｍ／秒、約５００ｍｍ／秒、または約１０００ｍｍ／秒であり得る。設計上の好みに基づいて、流路の長さおよび／または緩和空間のサイズの関数として、流速を調整することもできる。例えば、流路を長くすることによって、より速い流速を可能とすることができる。同じようなサイズの装置で速度を上げると、装置内の圧力が高まることになり得る。微小流路を長くすることによって、より速い流速を可能にしながら、圧力の上昇に対応することができる。例えば、空間がより大きいと、細胞が移動し隆起流路内で二次流に曝される距離を長くすることができるので、緩和空間を大きくすることで、流速を上げることが可能になる。したがって、緩和空間を大きくすることによって、緩和時間を長くすることと、より速い流速にもかかわらず、ある種の細胞が確実に側方変位することとが可能になる。いくつかの実施形態では、ある流速で、複数の細胞１８０を微小流路１００に流すことができる。流速は、３〜１５００ｍｍ／秒であり得る。
【００４７】
微小流路は、複数の細胞の一部を回収するための複数の排出口１５０ａ、１５０ｂを含み得る。図１ｂに示すように、一方の排出口では、複数の粒子を細胞内に輸送することに成功した処理済細胞１８３が回収されてもよく、これについては以下でより詳細に説明する。さらに、図１ｂに示すように、別の排出口では、死細胞または損傷細胞１８５が回収されてもよい。二排出口システムおよび二次流の形態（例えば、次の圧縮空間の間の緩和空間）を有することによって、ここで述べるシステムおよび方法は、システムが詰まる危険性なく、処理能力の高い分子輸送を実現することができる。他の実施形態では、微小流路１００は、排出口を２つ以上含み得る。例えば、図１ｅは、注入口を１つと排出口１５０を３つ有する実施形態を示す。いくつかの実施形態では、微小流路１００は、排出口を少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つ、含み得る。排出口の数は、２つ、３つ、４つ、または５つであり得る。したがって、本システムは、例えば、粘弾性、剛性、または弾力性などの生体力学的特性による選別、あるいは細胞接着物で微小流路を被覆することによる接着などの選別機能を、分子輸送に加えて実現してもよいと考えられる。
【００４８】
上述した排出口はいずれも、細胞を貯留するため、および／または細胞をチャンバの方向に、もしくはチャンバに直接、分注するため、のウェルまたはチャンバを含み得る。他の実施形態では、以下で説明するように、排出口をさらに、集積チップを介して、または毛細管を介して、追加的な処理ステップと一体化することができる。さらに、細胞を回収した後、上述したシステムおよび方法のいずれも、フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡法、機能アッセイ（例えば、アポトーシス、細胞周期、生存率、増殖、血管形成など）、分光学、免疫アッセイ、およびマイクロプレーティングなどを含むがそれらに限定されない、現在公知の、または将来見出される、分析手段を用いて細胞を分析する追加的なステップを含み得る。さらに、いくつかの実施形態では、電極カウンタおよび顕微鏡法によって、微小流路および細胞を分析することができる。
【００４９】
先に述べたように、上述したシステムおよび方法のいずれも、ある流速で、複数の細胞を微小流路１００に流すことを含み得る。微小流路１００を流れる際に、細胞は、対流による細胞内輸送プロセスによって処理され得る。複数の細胞の１回以上の圧縮と、その後の緩和期間とによって、このプロセスを特徴付けることができる。例えば、先に述べたように、対流による細胞内輸送プロセスは、第１の圧縮間隙において複数の細胞を圧縮し、この圧縮によって複数の細胞の細胞内体積の減少（Ｖｌｏｓｓ）を起こすことと、複数の細胞を第１の緩和空間まで通過させ、そこで複数の細胞が体積を増加（Ｖｇａｉｎ）させ、複数の分子の一部を吸収することとを含み得る。当業者には理解されるように、対流による細胞内輸送プロセスは、圧縮面及び緩和空間の数に応じて、１回以上起こり得る。
【００５０】
上述したシステムおよび方法のいずれも、細胞膜を横切る嵩体積流を含み得、その結果、圧縮面によって圧縮される際に、細胞の細胞質が嵩体積流によって細胞外へ輸送されるような、圧縮力が細胞に急激に加わる。このような細胞外への移動は、Ｖｌｏｓｓとして特徴付けられてもよい。いくつかの実施形態では、圧縮前の初期細胞体積を単位として、Ｖｌｏｓｓを特徴付けることができる。いくつかの実施形態では、光学顕微鏡法、共焦点顕微鏡法、コールター計数器、およびフローサイトメトリーなどを含むが、それらに限定されない、現在公知の、または将来見出される、様々な手段を用いて圧縮前の初期細胞体積を計測することができる。一実施形態では、Ｖｌｏｓｓは、細胞の初期体積の３０％であってもよいし、２５％であってもよいし、２０％であってもよいし、１５％であってもよいし、１０％であってもよい。いくつかの実施形態では、Ｖｌｏｓｓは、細胞の初期体積の少なくとも１０％であってもよいし、少なくとも１５％であってもよいし、少なくとも２０％であってもよいし、少なくとも２５％であってもよいし、少なくとも３０％であってもよい。細胞へと戻る体積の移動は、Ｖｇａｉｎとして特徴付けられてもよい。上述したシステムおよび方法のいずれにおいても、Ｖｇａｉｎは、Ｖｌｏｓｓの少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％であり得るように、Ｖｌｏｓｓを単位として表され得る。上述したシステムおよび方法のいずれにおいても、Ｖｌｏｓｓは、少なくとも１マイクロ秒、少なくとも２マイクロ秒、少なくとも３マイクロ秒、少なくとも４マイクロ秒、少なくとも５マイクロ秒、少なくとも６マイクロ秒、少なくとも７マイクロ秒、少なくとも８マイクロ秒、少なくとも９マイクロ秒、少なくとも１０マイクロ秒、少なくとも１５マイクロ秒、少なくとも２０マイクロ秒、少なくとも２５マイクロ秒、少なくとも３０マイクロ秒、少なくとも４５マイクロ秒、少なくとも５０マイクロ秒で生じ得る。さらに、上述したシステムおよび方法のいずれも、細胞に対し、圧縮面の数に基づいて、複数回の体積の減少および複数回の体積の増加を起こし得る。いくつかの実施形態では、細胞は、１〜１００ミリ秒、４〜１００ミリ秒、１０〜１００ミリ秒、１５〜１００ミリ秒、２０〜１００ミリ秒、２５〜１００ミリ秒、３０〜１００ミリ秒、４０〜１００ミリ秒、５０〜１００ミリ秒、６０〜１００ミリ秒、７５〜１００ミリ秒、８０〜１００ミリ秒、および９０〜１００ミリ秒で、Ｖｌｏｓｓを１００％回復してもよい。さらに、Ｖｌｏｓｓを１００％回復するのにかかる時間は、細胞種類によって異なる場合があり、そのため、その時間は、多かれ少なかれ細胞の種類に依存する場合があるということが考えられる。したがって、複数の細胞では、Ｖｌｏｓｓ１、Ｖｌｏｓｓ２、Ｖｌｏｓｓ３、Ｖｌｏｓｓ７、Ｖｌｏｓｓ１４、Ｖｌｏｓｓ２１や、最大ＶｌｏｓｓＮまでが生じてもよい。したがって、複数の細胞では、圧縮面の数に対応する緩和空間の数に応じて、Ｖｇａｉｎ１、Ｖｇａｉｎ２、Ｖｇａｉｎ３、Ｖｇａｉｎ７、Ｖｇａｉｎ１４、Ｖｇａｉｎ１や、最大ＶｇａｉｎＮまでが生じてもよい。
【００５１】
さらに、上述した方法のいずれにおいても、対流による細胞内輸送プロセスは、細胞外分子の細胞内輸送を含み得る。分子は、粒子、高分子、ナノ粒子、デキストラン、プラスミド、ｍＲＮＡ、またはビーズなどの様々な物質を含んでいてもよいが、これらに限定されない。
【００５２】
上述した実施形態では、微小流路内で細胞を圧縮することについて説明したが、上述したシステムおよび方法のいずれにおいても、壁への細胞の慣性的接触（細胞と壁との間での衝突や押し付け、その他の強制的な接触を含む）、流体などの非固体の力場または音場による急速な圧縮などの他の手法による一過性の体積変化を生じさせることができ得るということが、理解される。
【実施例】
【００５３】
本開示を、以下の実施例によって、さらに説明および実証する。しかしながら、本明細書にあるこれらの実施例およびその他の実施例の使用は、単なる例示であり、本開示または例示的な用語の範囲および意味を限定するものでは決してない。また、本開示は、ここで述べる特定の好ましい実施形態のいずれにも限定されない。実際に、本明細書を読めば、本開示の多くの変更および修正が当業者には明らかであり、本開示の趣旨または範囲から離れることなく、このような修正を行うことができる。したがって、本開示は、請求の範囲が権利を与えられる均等物の全範囲と共に、添付の請求の範囲の用語によってのみ限定されるものである。
【００５４】
実施例１
方法
装置設計
微小流体装置の設計では、多くの細胞を素早く処理するために、単一の大きい流路内の傾斜した隆起の形態である狭窄部を用いた。大きい流路によって、狭窄部を通過する細胞の速度を流体力学的抵抗力によって維持しつつ、多数の細胞が各隆起の下を同時に通過する事が可能になり、多くの狭窄部の後でも、細胞の処理をすぐに続けることができた。傾斜した隆起は、生育不能細胞および細胞凝集体用の回避機構としても働き、そうでなければ、装置が詰まるか、または処理済細胞集団が希釈されたであろう。したがって、この設計は、局所的な詰まりがあったとしても効果的に機能し、すばやく自然にきれいになった。本装置の複数流路設計は、詰まることなく、１０分で５千万個の細胞を処理することに成功した。
【００５５】
微小流体流路の製造
本装置の微小流体機能は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）上に成形され、ガラス基板にプラズマ接着された。標準的な二段階フォトリソグラフィを用いて、シリコンウエハ上に再利用可能なＳＵ−８鋳型を作成した。緩和状態の細胞の平均径（１４．５±１．５μｍ）の５０〜６０％の狭窄間隙を、最適な輸送用に用いたが、平均細胞径の４０〜１３０％の間隙についても検討した。細胞注入口からの流れは、狭窄部を通過するように細胞を誘導し、細胞が圧縮されることなく優先的に隆起の周囲を流れるのを防止した。本装置を製造するために、ＰＤＭＳと架橋剤とを１０：１の比率で混合し、ＳＵ−８鋳型に流し込んで、レプリカ成形によって微小流体流路機能を形成した。その後、真空容器でＰＤＭＳを脱気し、６０℃で６時間硬化させた。次に、冷却したＰＤＭＳを鋳型から取り外し、生検パンチを用いて排出口および注入口を打ち抜いた。次に、プラズマ接着機（ＰＤＣ−３２Ｇ、ハリック社（Harrick））を用いて、超音波処理したガラススライドにＰＤＭＳを接着し、６０℃の乾燥器中で１時間置いた。冷却後、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて、４℃で一晩インキュベートして、流路の不動態化を行った。
【００５６】
細胞培養
ＡＴＣＣから入手したＫ５６２細胞（ＣＣＬ−２４３）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリン−ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ−１６４０中で培養した。ＰＣ３前立腺癌細胞（ＣＲＬ−１４３５）を、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシンを添加したＦ−１２Ｋ中で培養した。３７℃、５％ＣＯ２で、細胞を培養した。ＰＣ３細胞は、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡを用いて継代した。密度勾配遠心分離によって、プライマリー白血球を全ドナー血液から単離した。全ドナー血液を、フィコール（Ficoll）密度遠心分離媒体と共に、７００ＲＣＦで１０分間遠心分離し、濃縮された白血球帯（バフィコート）を回収した。
【００５７】
微小流体実験の準備
０．１％ＢＳＡ、０．０４％ＥＤＴＡ、および微量のトゥイーン（Tween）２０を添加したＤＰＢＳ（−／−）からなる細胞流入緩衝液を用いて、実験を通して単一細胞懸濁液を維持した。ＢＳＡ、ＥＤＴＡ、およびトゥイーンを含まない純粋なＤＰＢＳ（−／−）および無血清ＲＰＭＩ−１６４０を用いて行った実験によって、これらの試薬が分子輸送に対して観察可能な影響を与えないということを確認した。Ｏｐｔｉ−ＭＥＭおよび無血清ＲＰＭＩ−１６４０を、トランスフェクションおよびＲＮＡプローブの輸送実験にそれぞれ用いた。培地から細胞を単離し、任意濃度の標的分子と共に、約５×１０６個／ｍＬの濃度で緩衝液に再懸濁した。細胞−緩衝液の懸濁液を、シリンジポンプを用いて速度を制御しながら微小流体装置に注入した。排出口から回収した後、ＤＰＢＳ（−／−）を用いて細胞を２回洗浄し、細胞の外側に残った分子を除去した。
【００５８】
高速ビデオ顕微鏡法
高速カメラアタッチメント（ファントム（Phantom）ｖ７．３、ビジョン・リサーチ社（Vision Research））を取り付けた倒立明視野顕微鏡（エクリプス（Eclipse）Ｔｉ、ニコン社（Nikon））のステージ上で、実験を行った。処理中、装置の様々な部分において、細胞の高速ビデオ（〜５，０００ｆｐｓ）を撮影した。
【００５９】
細胞体積変化のビデオ分析
装置内で細胞の体積を測定するために、ビデオデータから細胞の面積を測定し、細胞変形モデルに基づく体積仮説を適用した。照合に用いた手動測定と共に、カスタム細胞追跡アルゴリズムを用いて、細胞の軌跡および面積をビデオにおいて自動で追跡した。追跡した各細胞について、アルゴリズムによって、細胞が見られるビデオフレームをすべて確認し、それが占める位置およびピクセル数（面積）を抽出した。各手動測定において、細胞の最大投影境界を表す最も鮮やかなグレースケール強度勾配のピクセルに合致する楕円を選択した。各画像の長さスケールを、公知の隆起寸法に基づいて較正し、これによって、ピクセル数の面積への変換を可能にした。各細胞について、装置の隆起領域に進入する前の細胞の面積を測定して、未圧縮の体積を求め、各隆起の下に完全に入った時の面積を測定して、圧縮体積を求めた。乱れていない細胞の体積を、楕円形の投影領域を長軸周りに回転させた楕円体として得、これによって、乱れていない細胞について合理的な最小の体積を得た。圧縮された細胞の測定値を得るために、隆起および流路底の制約部と交差する楕円体の体積を表す圧縮された細胞の面積および同等に減少させた頂部に同様の回転楕円体手順を適用した。これは、間隙がより小さい場合には円柱状に近づき、間隙がより大きい場合には乱れていない楕円体状へと戻るため、圧縮された細胞について合理的な最大体積とみなされた。
【００６０】
フローサイトメトリー
ＢＤアキュリ（Accuri）Ｃ６フローサイトメーターを用いて、蛍光標的分子の細胞取り込みの特徴を調べた。ＦＩＴＣ−デキストランまたはＧＦＰ ＲＮＡもしくはＧＦＰプラスミドで処理した試料を、波長４８８ｎｍのレーザーで励起し、５３３／３０フィルターを用いて発光を検出した。シアニン−３で処理した試料を、４８８ｎｍのレーザーで励起し、５８５／４０フィルターによって検出した。２μＭのＥｔｈＤ−１溶液３４、３５を用いた染色によって、細胞の生存率を検討した。ＥｔｈＤ−１で染色した細胞を６４０ｎｍで励起し、６７０ＬＰフィルターを用いて検出した。
【００６１】
共焦点顕微鏡法
ツァイス（Zeiss）ＬＳＭ７００を用いて、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）−デキストランを用いた細胞の共焦点顕微鏡法を行い、輸送されたデキストラン分子の分子内局在性を確認した。４０Ｘ水レンズを装着したツァイス７１０ＮＬＯを用いて、Ｃｙ３−プラスミドおよび１００ｎｍナノ粒子を含むＫ５６２細胞を撮像した。製造者のプロトコルに従い、これらの細胞をＤｉＯによる膜染色およびヘキスト（Hoechst）による核染色によって染色した。
【００６２】
原子間力顕微鏡法
倒立光学顕微鏡（ニコンＴｉ）を組み合わせてＭＦＰ−３Ｄ ＡＦＭを用いて、ＡＦＭプローブを視覚的に各細胞の中心に合わせることによって、圧縮を繰り返した際の各細胞の粘性緩和を測定した。この検討において用いたプローブは、公称ばね定数が０．０３Ｎ／ｍのＭＬＣＴ−Ｏ１０−Ｄプローブである。ＡＦＭの片持ち梁は、直径１５μｍのＰＭＭＡ微小球を介して細胞と相互作用した。ガラス表面に対して熱振動法を行うことによって、片持ち梁の較正を行った。培地中のＫ５６２細胞は、セルタック（Cell-Tak）を用いて、ガラス製フルオロディッシュ（Fluorodish）の表面に接着された。１０μｍとなるように圧入の深さを選択して、微小流体流路の５μｍの間隙によって加えられるひずみをシミュレートした。圧縮後、２秒間、均一な圧入を維持しつつ、プローブに作用する粘性力の減衰から、細胞の緩和定数を得た。
【００６３】
結果
微小流体的細胞変形
急激かつ短時間、細胞を正確に圧縮するように微小流路内に繰り返された、断面矩形状の隆起を通過する微小流体流によって、細胞が変形した。流体力によって、複数の狭窄部を通過する際の細胞速度が高く維持されたが、一方で、傾斜した隆起によって、詰まりの原因となる死細胞および細胞集団が除去された。
【００６４】
図２（ａ）は、斜め方向の隆起を有する微小流体流路の配置の外形測定図を示す。矢印は、細胞の流れの方向を示す。細胞が矩形状の隆起に衝突すると、細胞が隆起の下で圧縮されて、細胞径よりも小さい間隙に沿うようになるため、急激な形状変化が観察された（図２（ａ））。測定された細胞の速度（〜１００ｍｍ／秒）での、隆起の鋭い縁部（光学外形測定によって求めた場合に１μｍ未満）による細胞の回旋によって、細胞の圧縮時間を求めた。この間、細胞は、垂直方向の圧縮速度が１ｍ／秒のオーダーである場合には、最大７０％まで垂直方向に圧縮されることが観察された。高速ビデオ分析によって、矩形隆起の鋭い変形構造による急激な形状変化を量的に分析した（図２（ｂ））。図２（ｂ）は、隆起を通過する単一細胞（輪郭を赤で示す）が複数個所に存在している状態を重ね合わせて示す。
【００６５】
細胞の体積変化の測定
微小流体流路内の各細胞の高速ビデオによる面積分析と組み合わせて、コンピュータによる細胞変形モデルを用いて、流路内の何点かにおいて、細胞体積の変化を評価した（図２（ｃ））。図２（ｃ）は、装置内における単一細胞の画像分析を示す。圧縮前と、その後、各隆起の下に全体が押し込められた際とに、Ｋ５６２骨髄腫細胞の面積測定を行った（図２（ｃｉ））。圧縮前、各細胞を楕円体に近似したが、各隆起の下における細胞の形状は、細胞変形モデルによって求めたように、切頭楕円体に近似された（図２（ｃｉｉ）、図２（ｃｉｉｉ））。圧縮された細胞の高さは、外形測定によって他と関係なく測定された隆起間隙と等しかった。隆起間における細胞の形状および向きが不確実であるため、隆起間における細胞の体積は、その面積測定から推定することはできない。
【００６６】
既知の間隙およびモデル化された細胞の形状から、圧縮前および圧縮中の細胞の体積を求めた。様々な位置における細胞面積測定を重ね合わせると、面積変化は微妙であり、このことは、隆起による垂直方向の制約が体積変化の主な原因であることを示唆している（図２（ｃｉｖ））。圧縮された細胞と体積が同じである球状の細胞の図を圧縮前の細胞に投影すると、体積変化が視覚化される（図２（ｃｖ））。楕円体から切頭楕円体への急速な形状変化のために、細胞は、第１の隆起において最も著しく体積の減少が生じた（図２（ｃｖｉ））。微小流体装置の間隙サイズを小さくすると、圧縮前の細胞と第１の隆起の下で圧縮された細胞との間の体積の減少がより大きくなった（図２（ｄ））。図２（ｄ）は、第１の隆起の下で減少した細胞の体積の百分率が、装置の隆起間隙が小さいほど増加するということを示しており、ここでｎ＞２５０であり、バーは四分位数範囲である。細胞の体積は、続けて圧縮を経る度にわずかに減少していき、約８個の隆起を通過した後、体積が平衡に達した（図２（ｅ））。図２（ｅ）は、流路内の異なり隆起位置における正規化された細胞の体積を示しており、ここでｎ≧４５であり、バーは標準偏差である。
【００６７】
体積は、圧縮中、最大で３０％分減少することが観察されたが、細胞は、その完全性、生存率、および関連する遺伝子発現にほとんど影響することなく、素早く元のサイズまで回復した。微小流処理後、細胞増殖速度を変化させることなく、細胞の培養および増殖に成功した。処理後３０分未満のフローサイトメトリー分析によって、圧縮実験は、細胞の前方散乱測定に無視できる程度の影響しか与えないということが示された（図２（ｆ））。図２（ｆ）は、フローサイトメトリーによる前方散乱測定によって、装置は最小限の影響しか及ぼさないことが示され、また、生存染色によって、装置による処理は細胞死を５％未満しか引き起こさないということが示された、ということを示しており、ここでｎ＝２である。処理済細胞のエチジウムホモダイマー−１（ＥｔｈＤ−１）染色によって、無装置群と比較して細胞死が５％未満であったことが示された（図２ｆ）。ＲＴ ＰＣＲを用いて、微小流路における圧縮が、アポトーシス遺伝子、細胞骨格遺伝子、および他のシグナル伝達遺伝子の発現に影響を及ぼさないということをさらに定量化した（図３）。アポトーシス遺伝子の発現を含む、急速な圧縮後の細胞生存率に関する別個の詳細な検討は、この観察と一致した。図３は、細胞の生存率および完全性に関連する遺伝子の発現は、ここで述べるシステムおよび方法の影響を受けないということを示す。ＲＴ ＰＣＲによって、アポトーシス関連遺伝子および細胞骨格遺伝子のＲＮＡ発現は、微小流処理の影響を受けないということを示した。発現データは、ＫＲＴ１０に対して正規化した。これらの結果は、細胞が、短時間の体積減少の後、正常な体積および機能を回復することを示唆した。
【００６８】
分子輸送による体積交換の特性の決定
圧縮された細胞の体積減少は、サイトゾルの一部が細胞内部から放出されたことを示していた。一方、細胞体積の回復には、細胞外の流体が細胞へ入ることが必要となる。ビデオ分析では、隆起間における細胞体積の評価をすることはできないので、蛍光ラベルされたデキストラン（シグマ・アルドリッチ社（Sigma-Aldrich））を追跡分子として用いて、膜内外の流体輸送によって、体積交換の動力学の特性をさらに決定してもよい。圧縮実験の直前に、様々なサイズのデキストランを細胞懸濁液に添加した。各圧縮後の細胞の緩和によって、分散した蛍光分子を輸送しつつ細胞外の流体が細胞内部へ入り、分子は、連続した圧縮後に細胞内部に部分的に残存して、体積交換の指標となると仮定した。
【００６９】
共焦点画像化によって、ここで開示するシステムおよび方法による分子輸送が細胞内部全体に分散することが見出され、このことは、エンドサイトーシスによる輸送ではないということを示唆している（図４ａ）。図４ａは、２０００ｋＤａのＴＲＩＴＣ−デキストランと共に輸送された単一細胞の共焦点顕微鏡画像を示し、細胞内部全体にわたって蛍光が拡散している。スケールバーは５μｍである。より小さい隆起間隙によるより大きい圧縮によって、蛍光分子の輸送が向上した（図４ｂ（ｉ）および図５ａ）。図４ｂ（ｉ）は、細胞が通過する隆起間隙のサイズが小さくなると、分子輸送が向上することを示す。図４ｂ（ｉｉ）は、圧縮間隙が小さくなると、細胞内分子輸送が向上することを示す。フローサイトメトリーの結果から、様々な隆起間隙の装置による２０００ｋＤａのＦＩＴＣ−デキストランのＫ５６２細胞における輸送についてわかる。ネガティブコントロールの細胞は、ＦＩＴＣ−デキストランへの曝露は行わなかった。蛍光シグナルは、間隙のサイズと関連する測定した体積の減少に対して、正の相関を示した（図４ｂ（ｉｉ））。図４ｂ（ｉｉ）は、体積変化が大きくなると、分子輸送がより向上することを示す。Ｋ５６２細胞は、２０００ｋＤａのＦＩＴＣ−デキストランと共に、隆起を７個備える装置で処理された。より小さい間隙寸法（５．６μｍ）を用いて細胞への輸送を測定すると、検討された条件では、細胞が隆起の下のより小さい間隙を通過せず、むしろ隆起周辺を流れてしまうために、この輸送は悪化した。Ｋ５６２細胞の直径（１４．５±１．５μｍ）よりも間隙が大きい隆起では、体積変化が起こらず、細胞小孔を誘導して分子の拡散による輸送を可能にするために流体の剪断力による機械的穿孔を用いる既存の研究と一致する様式で、２０００ｋＤａのデキストラン高分子の輸送が低下したことを示した（図４ｂ（ｉ））。
【００７０】
連続した狭窄部間を移動する際の細胞緩和時間を変化させることは、体積の回復、ひいては分子輸送に影響を及ぼし得るということを、体積減少と分子輸送との相関に基づいて、仮定した。隆起間隔または流速のいずれかを変更することによって、隆起間における緩和時間を制御した。流速を上げると、輸送は低下したが、一方、隆起間の間隔を２００μｍとすると、一貫して、間隔を１００μｍとした場合よりも輸送は向上した（図４ｂ（ｉｉｉ）および図５ｂ）。図４ｂ（ｉｖ）は、流速が速い条件では、分子輸送が低下することを示す。フローサイトメトリーの結果から、（ａ）隆起間隙が１００μｍの装置および（ｂ）隆起間隔が２００μｍの装置による、２０００ｋＤａのＦＩＴＣ−デキストランのＫ５６２細胞における様々な流速での輸送についてわかる。ネガティブコントロールの細胞は、ＦＩＴＣ−デキストランへの曝露は行わなかった。
【００７１】
その結果、隆起間における緩和時間を増加させると、流速および隆起間隔が異なっているにもかかわらず、輸送は向上した（図４ｂ（ｉｖ））。また、隆起間における細胞緩和時間が、ある期間（〜１ミリ秒）を超えると、分子輸送は収穫逓減を示すということが観察され、これは緩和の飽和点を示唆している（図４ｂ（ｉｖ））。図４ｂ（ｉｖ）に示すように、全体的な傾向としては、平衡が観察されるまでは、隆起間における緩和時間が長くなるにつれて、輸送が向上した。この結果は、流速が速くなるにつれて向上していく拡散による輸送とは、対照的である。
【００７２】
対流による分子輸送の特性の決定
細胞内輸送が細胞の体積変化によって起こることをさらに確認するために、本方法を検討して分子サイズに影響を受けるかを確かめた。拡散速度は、分子サイズに反比例するので、拡散による輸送では、典型的には、より大きい高分子に対する効率はより低くなる。対照的に、上述した方法では、検討した範囲においては、分子サイズにかかわらず、細胞内輸送の効率が高い（細胞の９０％以上が分子を取り込む）ことが証明された（図６ａ、図６ｂ）。この検討では、おおよそ小分子薬剤の分子量（ＭＷ）である４ｋＤａから２０００ｋＤａにわたり、体積あたりの質量が等しい分子を用いた。このサイズに依存しない輸送は、分子の取り込みが、膜小孔を通る分子拡散ではなく、主に、細胞の体積回復による細胞外からの物質の移流によって実現されているという仮説を支持するものであった。
【００７３】
複数の隆起を用いると、体積交換および細胞への分子輸送が大きく向上した。隆起数と分子輸送との間で、正の非線形相関が観察され、この実験条件では１４個の隆起で飽和に達した（図６ｃ、図６ｄ）。また、最終的な分子輸送は、細胞外濃度に線形従属することが見出され（図６ｅ、図６ｆ）、このことは、細胞内分子濃度および細胞外分子濃度の飽和に達したことを示す。
【００７４】
上述したシステムおよび方法によって、サイトゾルが細胞外分子濃度と平衡に達するという仮説をさらに調査するために、デキストランを含まない緩衝液で先のデキストラン陽性細胞を処理して、細胞内からデキストランを除去した。まず、上述したシステムおよび方法によって、２０００ｋＤａのＦＩＴＣ−デキストランをＫ５６２細胞に輸送し、その後、これら輸送済の細胞を、ＦＩＴＣを含まない緩衝液に再懸濁して、除去群として装置で再処理した。除去群では、平均蛍光強度が装置なし群と一致することが見出され、このことは、本方法が先に輸送されている分子を除去するのに非常に効果的であることを示す（図６ｇ）。これらの結果は、上述したシステムおよび方法によって、分子濃度の平衡が達成され、細胞内部から未結合分子を除去することができるという主張を支持するものであり、これは、拡散による輸送では証明されない能力である。
【００７５】
上述したシステムおよび方法を行っている間に輸送が起こる時間スケールを求めるために、装置の流路内での短時間（０．１秒未満）の細胞圧縮の間、および装置を離れた直後に起こる輸送の相対量を分析するように、実験を設計した。標的輸送分子である２０００ｋＤａのＦＩＴＣ−デキストランと共に、Ｋ５６２細胞を流路に流し、その後、流路から出た後に、排出口の試料を、分子を含まない溶液槽ですぐに希釈することで輸送を抑制することによって、流路内での輸送を判定した。標的分子の非存在下で細胞を流路に流し、その後、流路を離れた直後に、分子に富む溶液槽に細胞を曝露することによって、流路後の輸送を区分けした。流路を通過する０．１秒未満の間に、８０％を越える細胞に分子が輸送されたが、一方、圧縮されながら通過した直後にデキストランを供給した場合は、排出口のウェルにおいて１０分よりも長くインキュベートした後であっても、輸送が起こった細胞は、わずか約３３％であった。装置なしコントロールの場合の１０％を閾値として用いて、正の輸送としての蛍光の下限を定義した（図６ｈ）。主に流路内での圧縮中に多くの輸送が起こるということは、上述したシステムおよび方法が、圧縮および緩和の間の流体交換によって大きい高分子を輸送するということを支持するものである。
【００７６】
体積交換および分子輸送のモデル化
体積変化と細胞内輸送との関係をより理解するために、体積交換事象が繰り返されることによる分子輸送の単純な数学的モデルを構築した。このモデルでは、細胞内部および細胞外部は、よく混合された非圧縮性の液体であると仮定する。したがって、隆起の下で細胞が体積ＶＣまで圧縮されると、それに相当する体積の液体が細胞から流出して、標的分子の細胞内濃度で決まる質量分、その分子種が運び出される。逆に、細胞が減少した分の体積を回復する場合は、細胞外の分子種が、その細胞外濃度および時間依存的な細胞の体積回復Ｖ（ｔ）で決まる速度で、取り込まれる（図７（ａ））。細胞の蛍光強度は、細胞内の分子濃度に比例すると仮定して、モデルおよび実験結果における細胞内分子輸送の量を表すのに、細胞の蛍光強度を用いた（図７（ａ））。
【００７７】
各圧縮後の細胞の体積回復を、Ｖ（ｔ）＝（Ｖｃ−Ｖ０）・ｅ−ｔ／τ＋Ｖ０としてモデル化した。ここで、Ｖ０は、細胞の元の（未圧縮の）体積であり、Ｖｃは、隆起の下における細胞の体積（隆起の数には影響されないと仮定する）であり、τは、細胞が減少した体積を６６．７％まで回復する時間であり、ｔは、最後の圧縮後に経過した時間である。体積がＶｃである細胞は、隆起間隙と等しい高さの切頭球状に近似される。実験結果（図６ｈ）に基づいて、輸送の大部分は、細胞が装置を離れる前、圧縮直後に起こると仮定した。したがって、最後の隆起から１ミリ秒よりも長く経過した後に起こる輸送については無視した。
【００７８】
可変緩和モデルの場合、緩和時間τ（Ｚ）＝（τ０−τ∞）・ｅ−ζＺ＋τ∞は、多くの圧縮後の緩和を特徴付ける、圧縮回数（Ｚ）、細胞の初期緩和定数（τ０）、および最終緩和定数（τ∞）の関数である。分子輸送の実験データに適合させた場合、τは、減衰定数ζで表されるように、隆起数が増加するにつれて減少する。
【００７９】
一定数の隆起後に細胞に輸送された分子の量を算出するために、各隆起の貢献を順に考慮した。最初の２つの隆起間における細胞の体積の増加を、［ΔＶ］ｉｎｃ=Ｖ（ｔ＝ｔ＿ｔｒａｎｓｉｔ，ｚ＝０）−Ｖ＿ｃとして算出した。ここで、ｔ＿ｔｒａｎｓｉｔは、隆起間隔および流体の流速によって算出された、細胞が２つの隆起間を移動するのにかかる時間である。次いで、最初の２つの隆起間において細胞に取り込まれた分子の量を、［Δｎ］＿ｇａｉｎ=Ｃ＿０・［ΔＶ］＿ｉｎｃとする。ここで、Ｃ０は、分子の外部濃度である。細胞が第２の隆起に衝突すると、Ｖｃまで圧縮され、いくらかの量の分子が細胞から押し出される。その量は、［Δｎ］＿ｌｏｓｓ＝ｎ／Ｖ（ｔ＝ｔ＿ｔｒａｎｓｉｔ，ｚ＝０）・［ΔＶ］＿ｉｎｃであり、ここで、ｎは、現在の隆起における細胞内の分子の総量である。その後、後続の各隆起においてこの手順を繰り返し（ｚを増加させつつ）、複数回の圧縮後の細胞内濃度を求める。
【００８０】
モデルと実験データとの比較を可能にするために、τ０、τ∞、およびζの値を、図６ｄに表す実験データに対して非線形回帰を行うことによって推定した。各隆起に対する中央蛍光強度値（デキストランまたはここで開示するシステムおよび方法に決して曝露されていないコントロール細胞由来のデータを用いて校正された）のみを用いて、適合させた。また、モデルの予測を、実験データおよびモデル予測をその最大値まで正規化することによって、（同じパラメータを用いつつ）他のデータセットと比較した。正規化の前に、回帰に用いたのと同種のコントロールを用いて、図７（ｃ）の実験データを校正し、デキストランに曝露されたが装置内を流されていないコントロール細胞を用いて、図７（ｄ）の実験データを校正した。
【００８１】
細胞がケルビン・フォークト粘弾性物質として挙動し、圧縮後に膨張して指数関数的に元の体積Ｖ０に近づくモデルを考えた。漸近的な回復を、指数関数Ｖ（ｔ）＝（Ｖｃ−Ｖ０）・ｅ−ｔ／τ＋Ｖ０で表した。ここで、ｔは、最後の圧縮後に経過した時間である（図７（ａ））。隆起毎に一定の体積交換を仮定した。ここで、係数τは、細胞が減少した体積を６６．７％まで回復する時間であり、圧縮回数には影響されない。しかしながら、分子輸送実験の結果は、隆起毎の一定の体積交換とは矛盾することが見出された（図７（ｂ））。
【００８２】
次に、連続して圧縮されるにつれて体積交換が増加するモデル（図７（ｂ））を考えた。緩和時間（τ）が圧縮を繰り返すにつれて減少し、漸近的に何らかの最終値に近づくと仮定した。その後、このモデルを、多くの隆起後、（τ）が約１秒である初期値から０．１ミリ秒まで減少する実験データに適合させた。先の実験は、細胞の緩和は、実際には、異なる圧縮条件によって、１０秒超のように遅い時間スケールや、約１０マイクロ秒のように速い時間スケールで生じることを示唆するものである。上述したシステムおよび方法による実験結果は、隆起数が増加するにつれて非線形的な正の従属が観察され、線形的な従属が供給源濃度に応じて生じ、間隙の閾サイズが輸送に必要である、分子輸送のモデルと矛盾しない（図７（ｂ）〜図７（ｄ））。図７（ｂ）〜図７（ｄ）は、実験で観察された中央蛍光強度（点）とモデルにおける予測（実線）との比較を示す。原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）による細胞緩和測定によって、細胞の形状回復が、実際には、数回の圧縮後に、より急速に起こり得るということが観察された（図８）。この結果および現在の検討に基づいて、複数の隆起による圧縮の繰り返しによって、より速い細胞の変形および回復をもたらす、細胞の生物物理学的な変化が引き起こされ得ると仮定した。
【００８３】
上述した方法の細胞内輸送への適用
上述したシステムおよび方法を適用することによって、微小流体輸送プラットフォーム、特に、拡散による輸送を主に利用するプラットフォームの重大な制限に対処することができる。トランスフェクション試薬のための非常に効率のよい輸送プラットフォームとして、上述したシステムおよび方法を利用することの可能性を証明するために、シアニン−３（マイラス社（Mirus））ラベルされた非コードプラスミドのＫ５６２細胞への輸送を成功させた。細胞を、ＤｉＯによる膜染色およびヘキストによる核染色によって染色し、Ｃｙ３−プラスミドの細胞内局在を視覚化した（図９（ａ））。共焦点顕微鏡法を用いて、プラスミドが細胞内部へ入っていることが示された。共焦点顕微鏡法では、膜染色および核染色によって、Ｃｙ３−ラベルされたプラスミドが、細胞内部全体に拡散により輸送されたことが示された。スケールバーは５μｍである。概念実証トランスフェクション実験では、ＥＧＦＰ ｍＲＮＡ（トリリンク社（TriLink））およびＥＧＦＰプラスミド（オズ・バイオサイエンス社（OZ Biosciences））をＫ５６２細胞へ輸送した後に、ＥＧＦＰの発現を誘導することに成功した（図９（ｂ）および図１０）。図１０は、ＥＧＦＰプラスミドを用いてトランスフェクションを行ったＫ５６２細胞のフローサイトメトリーの結果を示す。機械的伝播のみを用いて、ＥＧＦＰプラスミド（オズ・バイオサイエンス社）によるＫ５６２細胞のトランスフェクションを行った。ネガティブコントロールの細胞は、ＥＧＦＰプラスミドへの曝露は行わなかった。
【００８４】
スマートフレア・ライブ・セル（SmartFlare Live Cell）ＲＮＡプローブ（ミリポア社（Millipore））を輸送して、Ｋ５６２細胞および接着性のＰＣ３前立腺癌細胞においてＧＡＰＤＨ ＲＮＡを検出することによって、上述したシステムおよび方法の細胞内ラベリングおよび細胞内分析への適用の可能性を検討した。ＰＣ３細胞への輸送は、確立された２４時間のエンドサイトーシス法と拮抗的であり、３０分よりも短い時間で完了した（図９（ｃ））。重要なことには、エンドサイトーシスではスマートフレア粒子を取り込まないＫ５６２細胞では、上述したシステムおよび方法を用いた輸送に成功したことが示された（図９（ｄ））。ＰＣ３細胞およびＫ５６２細胞への輸送に成功したことによって、接着性細胞および非接着性細胞の両方への輸送に対する本方法の堅調性が証明された。
【００８５】
また、本方法が非常に大きな粒子を輸送する能力を有することの証明として、直径１００ｎｍの蛍光ビーズのＫ５６２細胞への輸送も成功した（図１１）。細胞工学への適用に取り組むために、上述したシステムおよび方法を用いて、全血から単離したプライマリー末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）への巨大高分子のトランスフェクションおよび輸送を行った（図９ｅおよび図１２）。図１１は、１００ｎｍの蛍光粒子のＫ５６２細胞への輸送を示す。微小流体装置による処理後に内部へ輸送された蛍光粒子（赤色）を、共焦点顕微鏡法によって示す。図１２は、ドナー血液から単離し、ＥＧＦＰ ｍＲＮＡによるトランスフェクションを行ったプライマリー白血球のフローサイトメトリーの結果を示す。プライマリー白血球は、ドナー血液から単離され、機械的伝播のみを用いて、ＥＧＦＰ ｍＲＮＡ（トリリンク社）によるトランスフェクションを行った。ネガティブコントロールの細胞は、ＥＤＦＰ ｍＲＮＡへの曝露は行わなかった。さらに、傾斜した隆起を設計することによって、細胞の詰まりを回避することができるので、上述したシステムおよび方法を用いる処理は、複数流路へと容易にスケールアップして、詰まることなく、１０分で５千万個の細胞を処理することに成功した。複数の細胞種類のトランスフェクションおよび細胞内ラベリングの成功が証明されたことで、このプラットフォームが、多くの細胞工学的用途のための確立された輸送技術と競合する可能性が明らかにされた（表１）。
【表１】
2020503847.tif 000003
【００８６】
考察
急速で短時間の大きいひずみ圧縮を正確に誘導するために微小流体技術を用いることで、細胞の完全性、生存率、および機能が維持される一過性の細胞体積交換という驚くべき現象が明らかになった。最初、急に体積が減少し、その後、急速に体積を回復するという細胞の挙動が見出された。さらに、より小さい狭窄部によって加えられるより大きいひずみによって、誘導される体積変化がより大きいものになるということが見出された。また、体積交換の増大には、細胞が各隆起間において減少した体積を回復する時間が十分なものとなるように間隔を空けて配置された複数の隆起が必要とされるということもわかった。体積変化および緩和のこのような効果を、細胞に分子を輸送する新しい手法として用いた。具体的には、急速な圧縮による体積の減少は、細胞の緩和と併用されて、対流によって体積および分子を細胞内部へもたらすように作用する。
【００８７】
このような細胞の驚くべき挙動の物理的な原因については、隆起によって細胞に加えられる適切な力を考慮することで説明することができる。隆起の下における段階的な形式の慣性による急な圧縮は、液滴が表面にはねるのに類似した様式で膜を破壊する、細胞への高速（１ｍ／秒程度）な垂直方向の衝撃に相当する。隆起の下において、細胞が続いて物理的に圧縮されることで、細胞内部の液体に運動量が急速に移行して、ある液量が細胞外へと流出する。この短時間の圧縮状態によって、細胞が迅速な時間スケールで緩和し、圧縮後に体積を回復する。観察された急速な回復は、短時間の圧縮後に、短い時間スケール（０．５秒未満）で細胞質が急速に多孔質弾性的に回復するように振る舞うことと一致している。最初の体積減少にもかかわらず、上述したシステムおよび方法が細胞の生存率に最小の影響しか及ぼさないことは、細胞体積を調節して溶質を維持する細胞骨格の能力によって説明することができるであろう。
【００８８】
上述した研究において、上述したシステムおよび方法は、移流が優位な分子駆動機構を用いて、高い生存率を維持しつつ、多くの細胞種類に対して幅広いサイズおよび構造の分子を効率的に輸送するということがわかった。微小流体的な手法は、化学的処理、ウイルス処理、または電気的処理の使用に関連する、細胞状態の有害な変化という禁止的な欠点の多くを回避する。用いやすさと、様々な細胞種類へ多くの生体関連高分子を輸送するのに成功したということとによって、広範囲にわたる非常に有用な生物医学的用途への可能性が大きいことが証明された。
【００８９】
結論
本研究では、複数回の急速で大きいひずみ圧縮によって、細胞の生存率に影響を及ぼすことなく、細胞の体積変化および緩和が生じるという細胞の新規の挙動が見出された。このような体積交換によって、細胞外分子が、対流によって細胞内部へ移動するということがわかった。上述したシステムおよび方法によって、処理能力の高い巨大高分子および粒子の輸送を含む、微小流による分子輸送への新規の応用が可能となる。様々な生物工学的用途向けのほぼ普遍的な細胞内輸送プラットフォームとして機能する大きな可能性を秘めた新規の細胞現象が、上述したシステムおよび方法によって明らかになった。
【００９０】
実施例２
上述したシステムおよび方法は、機構および能力の両方において、現在の拡散性機械的穿孔プラットフォームとは異なるものであることも示された。拡散性微小流機械的穿孔法は、段階的な狭窄部を用いて、滑らかな細胞流れを容易にし、ひいては、よりゆっくりとした変形を容易にする様式で、細胞に剪断応力を付加した。圧縮によって細胞膜上に剪断力が生じ、これによって、膜穿孔および細胞外分子の細胞内への拡散が起こる。拡散は、普遍的な輸送機構であるが、拡散率と分子サイズとの反比例的関係のために、輸送に制約がかかる。実際に、拡散的手法による微小流機械的穿孔では、巨大高分子の輸送効率が限定されることが示された。
【００９１】
圧縮間隙が１０．２μｍである微小流路を用いて、ここで述べるシステムおよび方法を拡散による輸送手法と比較した。
【００９２】
例えば、図１３ａおよび図１３ｂに示すように、拡散による輸送手法（図１３ｂ）では、ここで述べるシステムおよび方法（図１３ａ）における小分子および大分子の同様の輸送と比較して、分子サイズが大きくなるにつれて、輸送が低下することが示されている。さらに、図１４ａおよび図１４ｂに示すように、流速が上がるにつれて輸送が向上した、拡散に基づく設計（図１４ｂ）と比較して、より遅い流速であっても、ここで述べるシステムおよび方法（図１４ａ）を用いることによって、輸送の向上が実現された。この点は重要である。何故なら、拡散に基づく設計は、剪断力に依拠するものであって、流速が速くなると、細胞の破壊や細胞死をもたらし得るためである。さらには、装置内で起こる輸送を切り分けることによって、ここで述べるシステムおよび方法の場合は、標準的なプロトコルによる輸送の９０％が装置内で起こり得る（図１５ａ）が、拡散に基づく設計では、図１５ｂに示すように、輸送は膜破壊後に起こるということが証明された。
【００９３】
さらに、上述したシステムおよび方法によって、図１６ａに示すように、体積交換の繰り返しによって、ほぼ完全な均質化が達成され、また除去が完全に行われる。対照的に、拡散に依拠する先行技術の装置では、図１６ｂに示すように、均質化は起こらず、除去は不完全であった。これらの研究では、細胞を、標準的な輸送プロトコルを用いて輸送し、０．３ｍｇ／ｍＬの２ＭＤａ ＦＩＴＣ−デキストランと共に、装置に１回流した。除去の場合は、輸送細胞の少なくとも一部を、今回はデキストランなしで新規装置にもう１回流した。装置／コントロールの場合は、装置に流すことなく、細胞をＦＩＴＣ−デキストランに曝露した。
【００９４】
さらには、上述したシステムおよび方法では、詰まりの防止が向上している。傾斜した隆起の設計によって、大きな細胞凝集体、死細胞、巨大細胞、および未処理細胞は、自動的かつ迅速に分類され、除去される。
【００９５】
可能な実施形態をいくつか上述したが、本開示の実施形態は、そのように限定されるものではない。これらの例示的な実施形態は、網羅的であること、または本開示の範囲を限定することを意図するものではないが、その代わり、当業者が本開示を実行し得るように、本開示の原理を説明するために選択され、かつ説明された。実際に、本明細書で説明したもの以外の様々な本開示の変更が、前述の説明から、当業者には明らかであろう。このような変更は、添付の請求の範囲内に含まれることが意図される。
【００９６】
また、本開示の実施形態は、本明細書に開示されている特定の配合物、処理ステップ、および物質に限定されるものではない。なぜなら、このような配合物、処理ステップ、および物質は、いくらか異なっていてもよいからである。さらに、本明細書で用いた専門用語は、例示的な実施形態を説明する目的でのみ用いており、限定することを意図するものではない。何故なら、本開示の様々な実施形態の範囲は、添付の請求の範囲およびその等価物によってのみ限定されるためである。
【００９７】
本開示の原理にしたがって構築された装置、システム、もしくは方法を必要とする特定の設計仕様または制約に応じて、具体的な構成、物質の選択、ならびに様々な要素のサイズおよび形状を変更することができる。このような変更は、本開示の範囲に含まれることが意図される。したがって、ここで開示される実施形態は、すべての点で例示的なものであって限定的なものではないとみなされ、当業者であれば、添付の請求の範囲で定義されるように、変形および変更を本開示の範囲内で行うことができるということが理解されるであろう。したがって、本開示の範囲は、前記の明細書の記載および上述の実施形態よりも、以下の請求の範囲に示されるものであり、請求の範囲と均等の範囲内での全ての変更は、請求の範囲に含まれる。
【図１ａ】
2020503847.tif 000004
【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図１ｅ】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図６ｄ】
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【図６ｅ】
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【図６ｆ】
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【図６ｇ】
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【図６ｈ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１６ａ】
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【図１６ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年7月16日(2019.7.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対流による細胞内輸送のための方法であって、
複数の細胞を含む細胞培地および複数の分子を微小流路に供給するステップを含み、
該微小流路は、
互いに対して実質的に平面状に広がる第１の壁および第２の壁、ならびに複数の圧縮面と、
前記複数の圧縮面の間に配置された複数の緩和空間と、を含み、
該複数の圧縮面は該第１の壁から外方に突出し、該複数の圧縮面と該第２の壁との間に複数の圧縮間隙を規定しており、
該複数の圧縮間隙の高さであって、該第２の壁に垂直に測定された高さは、該複数の細胞の平均細胞径の２０〜８０％であり、
前記細胞培地を、ある流速で前記微小流路に流すステップであって、前記細胞培地が前記微小流路を流れる際に、前記複数の細胞が、対流による細胞内輸送プロセスによる処理を受け、該プロセスは、
前記複数の圧縮間隙の第１の圧縮間隙において前記複数の細胞を圧縮し、該圧縮によって、該複数の細胞の細胞内体積の減少（Ｖｌｏｓｓ）が起こる工程、および
前記複数の細胞を前記複数の緩和空間の第１の緩和空間まで通過させ、そこで該複数の細胞の体積の増加（Ｖｇａｉｎ）が起こり、前記細胞培地から前記複数の分子の一部を吸収する工程を含む、ステップと、
排出口において前記複数の細胞を回収するステップと、を含む、方法。
【請求項２】
前記複数の圧縮面は、前記微小流路の中心流路軸に対して斜め方向を向いた複数の隆起によって形成される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記複数の隆起のうちの少なくとも１つの隆起が形成する隆起角度は、前記微小流路の中心軸に対して２０〜９０度である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記複数の隆起は、前記微小流路内において、山形様式で配置される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記複数の分子は、高分子、ナノ粒子、デキストラン、プラスミド、ｍＲＮＡ、抗体、ビーズ、ウイルス、及びそれらの組合せからなる群から選ばれるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記複数の分子は、平均サイズが３ｋＤａ〜６ＭＤａである高分子を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記複数の圧縮面の隣接した２個の間における、前記複数の緩和空間の少なくとも１つの幅は、１００〜３００ミクロンである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記複数の圧縮面と前記第１の壁との間に延びる隆起の表面の少なくとも１つは、前記複数の圧縮面の対応するものに対して実質的に直交している、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記流速は、３〜５００ｍｍ／秒である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞内体積の減少（Ｖｌｏｓｓ）は、前記複数の細胞の平均細胞体積の５％〜３０％である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞内体積の減少（Ｖｌｏｓｓ）は、前記複数の細胞の各細胞が最初に前記複数の圧縮面の一つに衝突してから１マイクロ秒から１０００ミリ秒の間に生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記体積の増加（Ｖｇａｉｎ）は、前記細胞内体積の減少（Ｖｌｏｓｓ）の２５％〜１００％である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記体積の増加（Ｖｇａｉｎ）が前記細胞内体積の減少（Ｖｌｏｓｓ）の少なくとも１０％となるのは、４〜１００ミリ秒後である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞培地が前記微小流路を通って流れる際に、粘弾性、剛性、弾力性、及び接着の１以上に基づいて、前記複数の細胞を選別するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記対流による細胞内輸送プロセスは、
前記複数の圧縮間隙の第２の圧縮間隙において前記複数の細胞を圧縮し、該第２の圧縮間隙における該圧縮によって、該複数の細胞の細胞内体積の第２の減少（Ｖｌｏｓｓ２）が起こる工程、および
前記複数の細胞を前記複数の緩和空間の第２の緩和空間まで通過させ、そこで該複数の細胞の体積の第２の増加（Ｖｇａｉｎ２）が起こり、前記第２の緩和空間に存在している間に前記細胞培地から前記複数の分子の第２の部分を吸収する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記体積の増加（Ｖｇａｉｎ）および前記第２の体積の増加（Ｖｇａｉｎ２）のうちの少なくとも一方は、前記細胞内体積の減少（Ｖｌｏｓｓ）および前記第２の細胞内体積の減少（Ｖｌｏｓｓ２）の一方の少なくとも１０％である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
複数の細胞への細胞内輸送のためのシステムであって、
互いに対して実質的に平面状に広がる第１の壁および第２の壁、ならびに複数の圧縮面と、
前記複数の圧縮面の間に配置された複数の緩和空間と、を含む微小流路を含み、
該複数の圧縮面は該第１の壁から外方に突出し、該複数の圧縮面と該第２の壁との間に複数の圧縮間隙を規定しており、
該複数の圧縮間隙の高さであって、該第２の壁に垂直に測定された高さは、該複数の細胞の平均細胞径の２０〜８０％であり、
前記複数の圧縮面は不動態化されている、システム。
【請求項１８】
前記複数の圧縮面の少なくとも１つは、細胞接着物を含む、請求項１７に記載のシステム。
【請求項１９】
前記複数の圧縮面は、前記微小流路の中心流路軸に対して斜め方向を向いた複数の隆起によって形成される、請求項１７に記載のシステム。
【請求項２０】
前記複数の隆起は、前記微小流路内において、山形様式で配置される、請求項１９に記載のシステム。
【国際調査報告】
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