(57)【要約】配座が束縛されたシアニンフルオロフォア、ならびにその化合物を作製および使用する方法が記載される。配座が束縛されたシアニンフルオロフォアは、式（Ｉ）2020531497.tif 000099による化学構造、またはその立体異性体もしくは薬学的に許容される塩を有し、式中、Ａは、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）2020531497.tif 000100であり、ここで、各「＊」は、Ａの結合点を示す。本開示はまた、本明細書で開示されるような、少なくとも１つの配座が束縛されたシアニンフルオロフォアを含む医薬組成物を含む。
2020531497.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化７５】
2020531497.tif 000079
［式中、Ａは、
【化７６】
2020531497.tif 000080
であり、各「＊」は、Ａの結合点を示し、
【化７７】
2020531497.tif 000081
によって表される結合は、原子価の要件を満たすために必要とされるように、単結合または二重結合であり、
Ｒ１〜Ｒ９およびＲ１１は、独立に、Ｈ、スルホネート、−Ｎ（Ｒａ）２、重水素、アルキル、ヘテロアルキル、アルキルスルホネート、アミノアルキル、−Ｃ（Ｏ）ＯＲａ、トリチル、またはコンジュゲート可能な部分、標的化剤もしくは薬物を含む基であり、ここで、各Ｒａは、独立に、Ｈ、重水素、アルキル、またはヘテロアルキルであり、
Ｒ１０は、Ｈ、重水素、Ｏ、アルキル、アリール、アミノ、スルホネート、トリフレート、−Ｃ（Ｏ）ＯＲｂ、−ＯＲｂ、−Ｎ（Ｒｂ）２、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、トリチル、またはコンジュゲート可能な部分、標的化剤もしくは薬物を含む基であり、ここで、各Ｒｂは、独立に、Ｈ、重水素、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、
Ｙ１およびＹ２は、独立に、Ｃ（Ｒｃ）２、Ｎ（Ｒｄ）、Ｓ、Ｏ、またはＳｅであり、ここで、各Ｒｃは、独立に、アルキル、Ｈ、重水素、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｘＯＨ［ｘは、≧２の整数である］、トリチル、またはコンジュゲート可能な部分、標的化剤もしくは薬物を含む基であり、各Ｒｄは、独立に、Ｈ、重水素、アルキル、またはヘテロアルキルである］
による化学構造を有する化合物、またはその立体異性体もしくは薬学的に許容される塩。
【請求項２】
Ｒ３およびＲ６のうちの少なくとも１つが、スルホネート、−Ｃ（Ｏ）ＯＲａ、またはコンジュゲート可能な部分、標的化剤もしくは薬物を含む基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｙ１およびＹ２が、Ｃ（Ｒｃ）２であり、各Ｒｃが、独立に、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、−（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）Ｒｅ、またはＨであり、ｎが、≧１の整数であり、Ｒｅが、コンジュゲート可能な部分、標的化剤または薬物である、請求項１または請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
式中、
Ｙ１およびＹ２が、Ｃ（ＣＨ３）２であり、または
Ｒ３およびＲ６が、スルホネートであり、一方のＲｃが、−（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）Ｒｅである、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７、およびＲ８が、Ｈである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
前記コンジュゲート可能な部分が、
【化７８】
2020531497.tif 000082
（式中、ｙは、≧１の整数である）、またはホスホロアミダイト基である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
式ＩＩまたは式ＩＩＩ：
【化７９】
2020531497.tif 000083
による化学構造を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
各Ｒｃが、−ＣＨ３であるか、
Ｒ３およびＲ６が、スルホネートであるか、
一方のＲｃが、コンジュゲート可能な部分、標的化剤または薬物を含む基であるか、または
Ｒ３およびＲ６が、スルホネートであり、一方のＲｃが、コンジュゲート可能な部分、標的化剤または薬物を含む基である、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
前記化合物が、式ＩＩによる化学構造を有し、Ｒ１〜Ｒ１０が、Ｈであるか、
前記化合物が、式ＩＩによる化学構造を有し、Ｒ９およびＲ１０が、Ｈであり、Ｒ３およびＲ６のうちの少なくとも１つが、コンジュゲート可能な部分、標的化剤もしくは薬物を含む基であるか、
前記化合物が、式ＩＩＩによる化学構造を有し、Ｒ１〜Ｒ９およびＲ１１が、Ｈであり、Ｒ１０が、Ｈ、Ｏ、トリフレート、アリール、−ＯＲｂもしくは−Ｎ（Ｒｂ）２であるか、または
前記化合物が、式ＩＩＩによる化学構造を有し、Ｒ９およびＲ１１が、Ｈであり、Ｒ３、Ｒ６、およびＲ１０のうちの少なくとも１つが、コンジュゲート可能な部分、標的化剤もしくは薬物を含む基である、請求項７または請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ７〜Ｒ１１が、Ｈであり、Ｒ３およびＲ６が、独立に、−ＳＯ３または−ＣＯ２Ｒａである、請求項７または８に記載の化合物。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化合物および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項１２】
Ａが
【化８０】
2020531497.tif 000084
である、請求項１に記載の化合物を作製するための方法であって、
式ＩＶによる化合物を含む溶液を、３−ブテン−１−イルトリフルオロメタンスルホネートと合わせて、式Ｖによる化合物を生成するステップと、
【化８１】
2020531497.tif 000085
式Ｖによる化合物および式ＶＩによる化合物を含む溶液を、Ｎ−（（１Ｅ，３Ｚ）−３−（フェニルアミノ）プロパ−１−エン−１−イル）アニリンまたはＮ−（（１Ｅ，３Ｅ）−３−（フェニルイミノ）プロパ−１−エン−１−イル）アニリンと合わせて、式ＶＩＩによる化合物を形成するステップと、
【化８２】
2020531497.tif 000086
【化８３】
2020531497.tif 000087
式ＶＩＩによる化合物を含む溶液を、ルテニウム触媒の存在下で、３，３−ジメトキシ−１−プロペンと合わせて、式ＶＩＩＩによる化合物を提供するステップと、
【化８４】
2020531497.tif 000088
式ＶＩＩＩによる化合物を、（ｉ）酸性化ＣＨＣｌ３または（ｉｉ）ＣＨ２Ｃｌ２中ＢＢｒ３と合わせて、式ＩＸによる化合物を提供するステップと
【化８５】
2020531497.tif 000089
を含む、方法。
【請求項１３】
Ａが
【化８６】
2020531497.tif 000090
である、請求項１に記載の化合物を作製するための方法であって、
式ＩＶによる化合物を含む溶液を、３−ブテン−１−イルトリフルオロメタンスルホネートと合わせて、式Ｖによる化合物を生成するステップと、
【化８７】
2020531497.tif 000091
式Ｘによる化合物を含む溶液を、３−ブテン−１−イルトリフルオロメタンスルホネートと合わせて、式ＸＩによる化合物を生成するステップと、
【化８８】
2020531497.tif 000092
式Ｖによる化合物および式ＸＩによる化合物を含む溶液［ここで、式Ｖおよび式ＸＩによる化合物は、同じであっても異なっていてもよい］を、（１Ｅ，４Ｅ）−１，５−ビス（ジメチルアミノ）−ペンタ−１，４−ジエン−３−オンと合わせて、式ＸＩＩによる化合物を生成するステップと、
【化８９】
2020531497.tif 000093
式ＸＩＩによる化合物を含む溶液を、ルテニウム触媒の存在下で、３，３−ジメトキシ−１−プロペンと合わせて、式ＸＩＩＩによる化合物を提供するステップと、
【化９０】
2020531497.tif 000094
式ＸＩＩＩによる化合物を、酸性化テトラヒドロフランの溶液と合わせて、式ＸＩＶによる化合物を提供するステップと
【化９１】
2020531497.tif 000095
を含む、方法。
【請求項１４】
式ＸＩＶによる化合物を含む溶液を、トリフルオロメタンスルホン酸無水物（Ｔｆ２Ｏ）と合わせて、式ＸＶによる化合物を提供するステップ
【化９２】
2020531497.tif 000096
をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
式ＸＶによる化合物を含む溶液を、パラジウム触媒の存在下で、Ｒｇ−Ｃ６Ｈ４−Ｂ（ＯＨ）２と合わせて、式ＸＶＩによる化合物を提供するステップ
【化９３】
2020531497.tif 000097
［式中、Ｒｇは、Ｒａ、−ＣＯＯＲａ、または−ＯＲａであり、ここでＲａは、Ｈ、重水素、アルキルまたはヘテロアルキルである］、あるいは
式ＸＶによる化合物を含む溶液を、式ＮＨ（Ｒ２０）（Ｒ２１）を有するアミンと合わせて、式ＸＶＩＩによる化合物を提供するステップ
【化９４】
2020531497.tif 000098
（式中、Ｒ２０およびＲ２１は、独立に、Ｈ、重水素、アルキル、ヘテロアルキル、アリールまたはヘテロアリールである）
をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
Ｒ１〜Ｒ１１のうちの少なくとも１つが標的化剤を含む請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化合物を使用するための方法であって、
前記化合物を、前記標的化剤と結合することが可能である標的を含む試料と、前記標的化剤と前記標的を結合させるのに有効な条件下で合わせるステップと、
前記標的に結合した前記化合物を可視化することによって、前記標的を画像化するステップであって、好ましくは前記化合物を可視化することが、可視または近赤外範囲の波長と選択された強度を有する所定量の光の標的化された適用により、前記試料に照射することを含み、ここで、前記所定量の光は、前記化合物の蛍光を生じさせるのに十分であり、さらに、前記化合物によって放出された任意の蛍光を検出することを含む、ステップ
を含む、方法。
【請求項１７】
前記標的を画像化する前に、前記化合物を還元剤と合わせるステップをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記試料が、対象内の標的領域であり、前記方法が、
前記化合物、または前記化合物を含む医薬組成物を、前記対象に投与するステップと、
その後、前記対象の標的化部分に、前記量の光の標的化された適用によって、前記化合物に照射するステップと、
前記対象の前記標的化部分における前記化合物からの任意の蛍光を検出するステップと
をさらに含む、請求項１６または請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記標的領域が、腫瘍部位であり、前記対象の前記標的化部分が、前記腫瘍部位を含み、前記方法が、前記対象の前記標的化部分における前記蛍光を検出した後に、前記対象から前記腫瘍の少なくとも一部を切除するステップをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
活性酸素種を検出するための方法であって、
請求項１〜１０のいずれか一項による化合物を還元剤と合わせて、還元化合物を提供するステップと、
試料を前記還元化合物と接触させるステップであって、前記試料中に活性酸素種（ＲＯＳ）が存在する場合、それにより前記還元化合物が酸化されて、請求項１〜１０のいずれか一項による化合物が再生される、ステップと、
前記試料に、可視または近赤外範囲の波長と選択された強度を有する所定量の光を照射するステップであって、前記所定量の光は、前記ＲＯＳによって前記還元化合物が酸化されて、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化合物が再生される場合に蛍光を生じさせるのに十分である、ステップと、
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化合物によって放出された任意の蛍光を検出するステップであって、ここで、蛍光は、前記試料中のＲＯＳの存在を示す、ステップと
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる２０１７年８月２４日出願の米国仮特許出願第６２／５４９，５６６号に対する優先権を主張する。
【０００２】
分野
配座が束縛されたシアニンフルオロフォア、ならびに配座が束縛されたシアニンフルオロフォアを作製および使用する方法が開示される。
【背景技術】
【０００３】
光活性化局在性顕微鏡法（photoactivated  localization  microscopy）（ＰＡＬＭ）および直接確率的光学的再構築顕微鏡法（direct  stochastic  optical  reconstruction  microscopy）（ｄＳＴＯＲＭ）のような単一分子局在性顕微鏡法（single  molecule  localization  microscopy）（ＳＭＬＭ）技術は、ほぼ分子レベルでの分解能での細胞構成成分の三次元（３Ｄ）画像化を可能にする。ＳＭＬＭの位置決定精度、したがって構造的分解能は、単一分子放射体強度の逆平方根に比例する。結果的に、ＳＭＬＭフルオロフォアは、オン状態で高い光子収率を提供すると同時に、オフ状態では低いバックグラウンド蛍光を示すかバックグラウンド蛍光を示さないはずである。
【０００４】
インドシアニンは、最も有用な蛍光性小分子のなかでも、連続する２つの炭素の同族体化により可視から近赤外（近ＩＲ）までの独特な範囲を有するものである。Ｃｙ５およびＡｌｅｘａ  ６４７を含む遠赤変種は、ｄＳＴＯＲＭ法の最も一般的な化学的構成成分である。しかし、蛍光量子収率（ΦＦ）は中程度であり、典型的に水溶液中０．２未満である。シアニン励起状態失活には、光子放出と広範囲に競合するｔｒａｎｓ−からｃｉｓ−のポリエン回転が伴う。スペクトルの緑色領域で発光する一連のトリメチンでは、この経路は、縮合６員環をポリメチン架橋に沿って導入して量子収率を劇的に改善する合成戦略によって阻まれてきた。しかし、その合成戦略は、複雑な縮合四環または五環系の合成が必要となる遠赤シアニンには適用することができない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
配座が束縛されたシアニンフルオロフォア、ならびに配座が束縛されたシアニンフルオロフォアを作製および使用する方法の実施形態が開示される。開示される化合物の実施形態は、式Ｉ：
【化１】
2020531497.tif 000003
［式中、Ａは、
【化２】
2020531497.tif 000004
であり、各「＊」は、Ａの結合点を示し、
【化３】
2020531497.tif 000005
によって表される結合は、原子価の要件を満たすために必要とされるように、単結合または二重結合であり、Ｒ１〜Ｒ９およびＲ１１は、独立に、Ｈ、重水素、アルキル、ヘテロアルキル、−Ｎ（Ｒａ）２、スルホネート、アルキルスルホネート、アミノ、アミノアルキル、−Ｃ（Ｏ）ＯＲａ、トリチル、またはコンジュゲート可能な部分、標的化剤もしくは薬物を含む基であり、ここで、各Ｒａは、独立に、Ｈ、重水素、アルキル、またはヘテロアルキルであり、Ｒ１０は、Ｈ、重水素、Ｏ、アルキル、アリール、アミノ、スルホネート、トリフレート、−Ｃ（Ｏ）ＯＲｂ、−ＯＲｂ、−Ｎ（Ｒｂ）２、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、トリチル、またはコンジュゲート可能な部分、標的化剤もしくは薬物を含む基であり、ここで、各Ｒｂは、独立に、Ｈ、重水素、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、Ｙ１およびＹ２は、独立に、Ｃ（Ｒｃ）２、Ｎ（Ｒｄ）、Ｓ、Ｏ、またはＳｅであり、ここで、各Ｒｃは、独立に、Ｈ、重水素、アルキル、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｘＯＨ（ｘは、≧２の整数である）、トリチル、またはコンジュゲート可能な部分、標的化剤もしくは薬物を含む基であり、各Ｒｄは、独立に、Ｈ、重水素、アルキル、またはヘテロアルキルである］
による化学構造、またはその立体異性体もしくは薬学的に許容される塩を有する。
【０００６】
一部の実施形態では、化合物は、式ＩＡ、ＩＢ、ＩＣ、またはＩＤ：
【化４】
2020531497.tif 000006
による化学構造を有する。
【０００７】
ある特定の実施形態では、化合物は、式ＩＩまたは式ＩＩＩ：
【化５】
2020531497.tif 000007
による化学構造を有する。
【０００８】
医薬配座の実施形態は、式Ｉによる化合物および薬学的に許容される担体を含む。
【０００９】
式Ｉによる配座が束縛されたペンタメチンシアニン化合物を作製するための方法の実施形態は、化学選択的オレフィンメタセシスを通じて利用される、ジアルデヒド前駆体の環化カスケードを介して進行する。ジアルデヒドは、分子内マイケル付加を受けた後、ジヒドロピラン環形成カスケードを受ける。式Ｉによる配座が束縛されたヘプタメチンシアニン化合物を作製するための方法の実施形態は、インドレン前駆体または２つの別個のインドレニン前駆体をビスビニル性アミドと合わせて、ペンダント末端アルケニル基を含むヘプタメチンシアニンを提供し、その後それをジアルデヒドに変換することを含む。環化反応では、配座が束縛されたヘプタメチンシアニン化合物が生成される。
【００１０】
式Ｉによる化合物の実施形態は、画像化適用のために使用することができる。標的薬剤を含む式Ｉによる化合物を使用するための方法の一部の実施形態は、化合物を、標的化剤と結合することが可能である標的を含む試料と合わせるステップと、化合物を可視化することによって、標的を画像化するステップとを含む。一部の実施形態では、化合物を可視化することは、可視または近赤外範囲の波長と選択された強度を有する所定量の光の標的化された適用により、試料に照射すること（ここで、所定量の光は、化合物の蛍光を生じさせるのに十分である）、および化合物によって放出された任意の蛍光を検出するステップを含む。先の実施形態のいずれかまたはすべてでは、化合物を試料と合わせるステップは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｖｏで実施することができる。先の実施形態のいずれかまたはすべてでは、その方法は、標的を画像化する前に、化合物を還元剤と合わせるステップをさらに含むことができる。先の実施形態のいずれかまたはすべてでは、試料は、組織試料、生物学的流体、または対象内の標的領域であり得る。一部の実施形態では、試料は、対象内の標的領域であり、その方法は、化合物、またはその化合物を含む医薬組成物を、対象に投与するステップと、その後、対象の標的化部分への所定量の光の標的化された適用によって、化合物に照射するステップと、対象の標的化部分における化合物からの任意の蛍光を検出するステップとをさらに含む。ある特定の実施形態では、標的領域は、腫瘍部位であり、対象の標的化部分は、その腫瘍部位を含み、その方法は、対象の標的化部分における蛍光を検出した後に、対象から腫瘍の少なくとも一部を切除するステップをさらに含む。
【００１１】
独立な実施形態では、活性酸素種を検出するための方法は、式Ｉによる化合物を還元剤と合わせて、還元化合物を提供するステップと、試料を還元化合物と接触させるステップであって、試料中に活性酸素種（ＲＯＳ）が存在する場合、それにより還元化合物が酸化されて、式Ｉによる化合物が再生される、ステップと、試料に、可視または近赤外範囲の波長と選択された強度を有する所定量の光を照射するステップであって、所定量の光は、ＲＯＳによって還元化合物が酸化されて、式Ｉによる化合物が再生される場合に蛍光を生じさせるのに十分である、ステップと、式Ｉによる化合物によって放出された任意の蛍光を検出するステップであって、ここで、蛍光は、試料中のＲＯＳの存在を示す、ステップを含む。
【００１２】
本発明の先のおよび他の目的、特色および利点は、添付の図面を参照しながら記載される以下の詳細な説明から、より明らかになろう。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、配座が束縛されたペンタメチンシアニンフルオロフォアを作製するための例示的な逆合成経路である。
【００１４】
【図２】図２は、非置換の配座が束縛されたペンタメチンシアニンフルオロフォアを調製するための例示的な合成スキームである。
【００１５】
【図３】図３は、コンジュゲート可能な配座が束縛されたペンタメチンシアニンフルオロフォアを調製するための例示的な合成スキームである。
【００１６】
【図４】図４は、例示的な配座が束縛されたペンタメチンシアニンフルオロフォア（化合物４）の化学構造およびＮＭＲ分析を示す。
【００１７】
【図５】図５は、化合物４のジアステレオマーおよびそれらの関連エネルギーを示す。
【００１８】
【図６】図６は、例示的な配座が束縛された、ファロイジンとコンジュゲートしたペンタメチンシアニンフルオロフォア（化合物７）の化学構造およびＮＭＲ分析を示す。
【００１９】
【図７】図７は、エタノール中の化合物４（四角）および１０（丸）からの蛍光発光の温度依存を示すグラフである。
【００２０】
【図８】図８は、ＮａＢＨ４による還元（１：１のＤＭＳＯ：ＭｅＯＨ中２．５ｍＭ）後の、４：１のＰＢＳ（５０ｍＭ、ｐＨ７．４）：ＤＭＳＯ中の化合物４（四角）および１０（丸）の２０μＭ溶液の紫外線回収率を示すグラフである。吸光度は、３６５ｎｍ照射（５ｍＷ／ｃｍ２）の時間関数として、λｍａｘ（化合物４については６４０ｎｍ、化合物１０については６６０ｎｍ）で測定した。
【００２１】
【図９】図９は、化合物７およびＡＦ６４７（各１０μＭ）の吸光度に対するＴＣＥＰ添加の効果を示すグラフである。Ｔｒｉｓ（０．２０Ｍ、ｐＨ９．０）中ＴＣＥＰ濃度の関数としての、λｍａｘ（化合物７については６７０ｎｍ、ＡＦ６４７については６５０ｎｍ）における吸光度。
【００２２】
【図１０】図１０は、配座が束縛されたファロイジン−ペンタメチンシアニンフルオロフォアコンジュゲートである化合物９を用いた、Ｕ２ＯＳ（ヒト骨肉腫上皮）細胞におけるＦ−アクチンのカラー３Ｄ  ＴＲＡＢＩ＿ＢＰ  ＳＭＬＭ画像である。
【００２３】
【図１１】図１１は、図１０の画像から算出した、横方向および軸方向の位置決定精度を示す。印はデータ点を示し、実線はデータへのガウスフィットを示す。
【００２４】
【図１２】図１２は、標準ｄＳＴＯＲＭ光スイッチング緩衝液における、化合物９３Ｄ（左）について示されたデータの単一フレーム（黒色）および追跡（灰色）中央値と、化合物９（中央）およびＡＦ６４７（右）の２Ｄ画像モードの同等の測定値に関する、単一分子光子強度の比較を示す棒グラフである。
【００２５】
【図１３】図１３は、化合物９３Ｄ（６．９ｎｍ）、化合物９２Ｄ（５．２ｎｍ）およびＡＦ６４７２Ｄ（５．９ｎｍ）の実験的に決定された横方向の位置決定精度を示す棒グラフである。
【００２６】
【図１４】図１４は、化合物を注射し、その後、皮膚の外表面に望ましい波長の光を標的化された送達をすることによって、開示される式Ｉによる化合物を使用するための方法の一実施形態を示す概略図である。
【００２７】
【図１５】図１５は、ビス−スルホン化された配座が束縛されたペンタメチンシアニンフルオロフォアを調製するための例示的な合成スキームである。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本開示は、配座が束縛されたシアニンフルオロフォア、ならびに配座が束縛されたシアニンフルオロフォアを作製および使用する方法の実施形態に関する。有利には、配座が束縛されたシアニンフルオロフォアは、遠赤および近赤外範囲の発光極大を有し、かつ／または配座が束縛されていない対応するシアニンフルオロフォアと比較して、赤方偏移している吸収および／もしくは発光極大を有する。
Ｉ．定義および略語
【００２９】
以下の用語および略語の説明は、本開示をより的確に説明し、本開示を実施する際に当業者を導くために提供される。本明細書で使用される場合、文脈によって別段明示されない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」を意味し、単数形「ａ」または「ａｎ」または「ｔｈｅ」は、複数の参照物を含む。用語「または」は、文脈によって別段明らかに示されない限り、記載された代替要素の単一要素、または２つもしくはそれよりも多い要素の組合せを指す。
【００３０】
別段説明されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者に一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されるものに類似のまたはそれと等価な方法および材料を、本開示の実施または試験において使用することができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。材料、方法、および例は、単に例示的なものであり、限定することを意図しない。本開示の他の特色は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかである。
【００３１】
別段指定されない限り、本明細書または特許請求の範囲で使用される場合、構成成分の量、分子量、パーセンテージ、温度、時間などを表すすべての数は、用語「約」によって修飾されると理解されるべきである。したがって、暗示的にであれ明確にであれ、別段指定されない限り、記載される数値パラメーターは近似値であり、その近似値は、求められる所望の特性および／または標準試験条件／方法の下での検出限界に応じて変わり得る。実施形態を論じられている従来技術と直接的かつ明確に区別する場合、これらの実施形態における数値は、用語「約」が記載されない限り近似ではない。
【００３２】
化学における一般用語の定義は、John  Wiley  &  Sons,Inc.によって刊行されたRichard  J.Lewis,Sr.(ed.),Hawley's  Condensed  Chemical  Dictionary,1997(ISBN  0-471-29205-2)に見出すことができる。分子生物学における一般用語の定義は、Oxford  University  Pressによって刊行されたBenjamin  Lewin,Genes  VII,2000(ISBN  019879276X)；Blackwell  Publishersによって刊行されたKendrew  et  al.(eds.),The  Encyclopedia  of  Molecular  Biology,1994(ISBN  0632021829)；およびWiley,John  &  Sons,Inc.によって刊行されたRobert  A.Meyers(ed.),Molecular  Biology  and  Biotechnology:a  Comprehensive  Desk  Reference,1995(ISBN  0471186341)、ならびに他の類似の参考文献に見出すことができる。
【００３３】
本開示の様々な実施形態の再検討を容易にするために、特別な用語を以下に説明する。
【００３４】
脂肪族：実質的に炭化水素系の化合物またはそのラジカル（例えば、ヘキサンラジカルについてはＣ６Ｈ１３）であり、アルカン、アルケン、アルキンが含まれ、環式のものが含まれ、さらに、直鎖および分岐鎖配置、ならびにすべての立体異性体および位置異性体も同様に含まれる。別段明確に記載されない限り、脂肪族基は、１〜２５個の炭素原子、例えば１〜１５個、１〜１０個、１〜６個、または１〜４個の炭素原子を含有する。用語「低級脂肪族」は、１〜１０個の炭素原子を含有する脂肪族基を指す。脂肪族鎖は、置換または非置換であり得る。「非置換脂肪族」として明確に言及されない限り、脂肪族基は、非置換であっても置換されていてもよい。脂肪族基は、１つまたは複数の置換基（脂肪族鎖のメチレン炭素ごとに２つまでの置換基、または脂肪族鎖の−Ｃ＝Ｃ−二重結合の炭素ごとに１つまでの置換基、または末端メチン基の炭素については１つまでの置換基）で置換されていてもよい。例示的な置換基として、それに限定されるものではないが、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルアミノ、アルキルチオ、アシル、アルデヒド、アミド、アミノ、アミノアルキル、アリール、アリールアルキル、カルボキシル、シアノ、シクロアルキル、ジアルキルアミノ、ハロ、ハロ脂肪族、ヘテロ脂肪族、ヘテロアリール、ヘテロシクロ脂肪族、ヒドロキシル、オキソ、スルホンアミド、スルフヒドリル、チオアルコキシ、または他の官能基が挙げられる。
【００３５】
アルコキシ：構造−ＯＲ（ここで、Ｒは、置換または非置換アルキルである）を有する基。メトキシ（−ＯＣＨ３）は、例示的なアルコキシ基である。置換アルコキシでは、Ｒは、非干渉性の置換基で置換されているアルキルである。
【００３６】
アルコキシカルボニル：構造−（Ｏ）Ｃ−Ｏ−Ｒ（ここで、Ｒは、置換または非置換アルキルである）を有する基。
【００３７】
アルキル：飽和炭素鎖を有する炭化水素基。その鎖は、分岐、非分岐、または環式（シクロアルキル）であってよい。低級アルキルという用語は、鎖が１〜１０個の炭素原子を含むことを意味する。別段特定されない限り、アルキルという用語は、置換および非置換アルキルを包含する。
【００３８】
アルキルスルホネート：構造−Ｒ−ＳＯ３−（ここで、Ｒは、置換または非置換アルキルである）を有する基。
【００３９】
アミノ：構造−Ｎ（Ｒ）Ｒ’（ここで、ＲおよびＲ’は、独立に、水素、ハロアルキル、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール（例えば、必要に応じて置換されているフェニルもしくはベンジル）、ヘテロアリール、アルキルスルファノ、または他の官能基である）を有する基。「第一級アミノ」基は、−ＮＨ２である。「一置換アミノ」は、上記の通り置換されているラジカル−Ｎ（Ｈ）Ｒを意味し、それには、例えば、メチルアミノ、（１−メチルエチル）アミノ、フェニルアミノなどが含まれる。「二置換アミノ」は、上記の通り置換されているラジカル−Ｎ（Ｒ）Ｒ’を意味し、それには、例えば、ジメチルアミノ、メチルエチルアミノ、ジ（１−メチルエチル）アミノなどが含まれる。アミノという用語はまた、荷電三置換アミノ基、例えば、−Ｎ（Ｒ）（Ｒ’）Ｒ’’＋（ここで、Ｒ、Ｒ’、およびＲ’’は、独立に、水素、ハロアルキル、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール（例えば、必要に応じて置換されているフェニルもしくはベンジル）、ヘテロアリール、アルキルスルファノ、または他の官能基である）を包含する。
【００４０】
アミノアルキル：化学官能基−ＲＮＨ２または−ＲＮＨ３＋（ここで、Ｒは、アルキル基である）。「置換アミノアルキル」は、アミノ基が置換されていることを意味し、例えば、−ＲＮ（Ｒ’）Ｒ’’または−ＲＮ（Ｒ’）（Ｒ’’）Ｒ’’’＋（ここで、Ｒ’、Ｒ’’、およびＲ’’’は、独立に、水素、ハロアルキル、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール（例えば、必要に応じて置換されているフェニルもしくはベンジル）、ヘテロアリール、アルキルスルファノ、または他の官能基である）を意味する。
【００４１】
抗体：免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の断片によって実質的にコードされた１つまたは複数のポリペプチドを含むタンパク質（またはタンパク質複合体）。認識されている免疫グロブリン遺伝子には、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンおよびミュー定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖は、カッパまたはラムダのいずれかに分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンとして分類され、それによって、それぞれ免疫グロブリンクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥが定義される。鳥類および爬虫類では、ＩｇＹ抗体は、哺乳動物ＩｇＧと同等である。
【００４２】
免疫グロブリン（抗体）の基本構造単位は、一般に四量体である。各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一の対から構成され、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のＮ末端は、主に抗原認識に関与する約１００〜１１０個またはそれよりも多いアミノ酸の可変領域を画定する。用語「可変軽鎖」（ＶＬ）および「可変重鎖」（ＶＨ）は、それぞれ、これらの軽鎖および重鎖を指す。
【００４３】
ＩｇＹ抗体の構造は、哺乳動物ＩｇＧの構造に類似しており、２つの重鎖（「ニュー」鎖；およそ６７〜７０ｋＤａ）および２つの軽鎖（２２〜３０ｋＤａ）を有する。ＩｇＹ分子の分子量は、約１８０ｋＤａであるが、しばしば、ゲル上では約３％炭水化物の存在に起因してスメアとして泳動する。ＩｇＹ抗体の重鎖（Ｈ）は、４つの定常ドメインおよび抗原結合部位を含有する１つの可変ドメインから構成される。
【００４４】
本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、インタクトな免疫グロブリンおよびいくつかの十分に特徴付けられた断片を含む。例えば、標的タンパク質（またはタンパク質もしくは融合タンパク質内のエピトープ）に結合するＦａｂ、Ｆｖ、および単鎖Ｆｖ（ＳＣＦｖ）も、そのタンパク質（またはエピトープ）のための特異的結合剤となる。これらの抗体断片は、以下の通り定義される。（１）Ｆａｂ、抗体全体を酵素パパインで消化して、インタクトな軽鎖および１つの重鎖の一部を得ることによって生成された、抗体分子の一価の抗原結合性断片を含有する断片、（２）Ｆａｂ’、抗体全体をペプシンで処理し、その後還元して、インタクトな軽鎖および重鎖の一部を生産することによって得られた抗体分子の断片（抗体分子１つ当たり２つのＦａｂ’断片が得られる）、（３）（Ｆａｂ’）２、抗体全体を酵素ペプシンで処理し、その後の還元を行わないことによって得られた抗体の断片、（４）Ｆ（ａｂ’）２、２つのジスルフィド結合によって一緒に保持された２つのＦａｂ’断片の二量体、（５）Ｆｖ、２つの鎖として発現された、軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含有する遺伝子操作された断片、ならびに（６）単鎖抗体、遺伝的に融合した一本鎖分子として適したポリペプチドリンカーによって連結された、軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域を含有する遺伝子操作された分子。これらの断片を作製する方法は、慣用的である（例えば、Harlow  and  Lane,Using  Antibodies:A  Laboratory  Manual,CSHL,New  York,1999を参照されたい）。本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、部位特異的コンジュゲーションを容易にするための１つまたは複数の非天然（すなわち、天然に存在しない）アミノ酸（例えば、ｐ−アセチル−フェニルアラニン）を含む抗体を含む。
【００４５】
本開示の方法において使用するための抗体は、モノクローナルであってもポリクローナルであってもよく、例えば、標的抗原などの標的に特異的に結合する。単なる例として、モノクローナル抗体は、Kohler  and  Milstein（Nature  256:495-97,1975）の古典的方法またはその誘導的方法に従って、マウスハイブリドーマから調製することができる。モノクローナル抗体生成についての詳細な手順は、Harlow  and  Lane,Using  Antibodies:A  Laboratory  Manual,CSHL,New  York,1999に記載されている。
【００４６】
抗原：動物内での抗体生成またはＴ細胞応答を刺激することができる化合物、組成物、または物質であり、動物内に注射または吸収される組成物を含む。抗原は、異種免疫原によって誘導されるものを含む、特異的液性免疫または細胞性免疫の生成物と反応する。本明細書で使用される場合、「標的抗原」は、標的化剤によって認識され、結合される抗原（抗原のエピトープを含む）である。「特異的結合」は、排他的結合を必要としない。一部の実施形態では、抗原は、細胞または組織抽出物から得られる。一部の実施形態では、標的抗原は、腫瘍細胞上の抗原である。抗原は、全長タンパク質である必要はない。使用が企図される抗原には、タンパク質の任意の免疫原性断片、例えば、抗体が特異的に結合することができる少なくとも１つのエピトープを有する任意の抗原が含まれる。
【００４７】
アリール：別段特定されない限り、単一の環（例えば、フェニル）または少なくとも１つの環が芳香族である複数の縮合した環（例えば、キノリン、インドール、ベンゾジオキソールなど）を有する、６〜１５個の炭素原子の一価の芳香族炭素環式基（ただし、結合点は、アリール基の芳香族部分の原子を介しており、結合点の芳香族部分は、その芳香環内に炭素だけを含有している）。任意の芳香環部分がヘテロ原子を含有している場合、その基は、ヘテロアリールであり、アリールではない。アリール基は、単環式、二環式、三環式または四環式である。別段特定されない限り、アリールという用語は、置換および非置換アリールを包含する。
【００４８】
生物学的試料：本明細書で使用される場合、「生物学的試料」は、対象（例えば、ヒトまたは動物対象）あるいは他の種類の生物、例えば植物、細菌または昆虫から得られた試料を指す。対象由来の生物学的試料には、それに限定されるものではないが、細胞、組織、血清、血液、血漿、尿、唾液、脳脊髄液（ＣＳＦ）または他の体液が含まれる。本明細書に開示される方法の特定の例では、生物学的試料は、組織試料である。
【００４９】
配座が束縛された：用語「配座が束縛された」は、本明細書で使用される場合、中心のコンジュゲートされたポリメチン架橋領域の可撓性を分子が喪失するように修飾されているシアニン化合物を指す。用語「固定された（rigidized）」は、「配座が束縛された」と同義である。
【００５０】
コンジュゲート可能な部分：分子を別の分子に、例えば薬物または標的化剤、例えば抗体にコンジュゲート（すなわち、カップリングまたは結合）することができる分子の一部。
【００５１】
ｄＳＴＯＲＭ：直接確率的光学的再構築顕微鏡法。
【００５２】
薬物：本明細書で使用される場合、用語「薬物」は、対象に投与された場合に生理学的効果を有し、疾患の処置、緩和、治癒、防止もしくは診断における使用を意図されるか、または身体的もしくは精神的健全性をその他の方法で増強するために使用される物質を指す。用語「小分子薬物」は、分子量＜１，０００ダルトンを有する薬物を指す。
【００５３】
抗がん薬は、悪性腫瘍を処置するために使用される薬物である。例示的な抗がん薬として、それに限定されるものではないが、アビラテロン、アクチノマイシンＤ、アルトレタミン、アミホスチン、アナストロゾール、アスパラギナーゼ、ベキサロテン、ビカルタミド、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル  シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、コンブレタスタチンＡ４、シクロホスファミド、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダウノルビシン、デガレリクス、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキソルビシン、ズオカルマイシンＤＭ、エピルビシン、エチニルエストラジオール、エトポシド、エキセメスタン、５−フルオロウラシル、フルダラビン、フルタミド、フォリン酸、フルベストラント、ゲムシタビン、ゴセレリン、イバンドロン酸、イダルビシン、イフォスファミド、イリノテカン、ランレオチド、レナリドミド、レトロゾール、リュープロレリン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メスナ、メトトレキセート、オクトレオチド、パミドロネート、ペメトレキセド、マイトマイシン（mitocmycin）、ミトタン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペントスタチン（pentastatin）、ピポブロマン（pipbroman）、プリカマイシン、プロカルバジン、ラルチトレキセド、スチルベストロール、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、トポテカン、トリプトレリン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、およびゾレドロン（zolendronic）酸が挙げられる。
【００５４】
有効量または治療有効量：１人の対象または所与のパーセンテージの対象に有益なまたは治療的な効果をもたらすのに十分な量。
【００５５】
エピトープ：抗原決定基。エピトープは、抗原性である、すなわち特異的免疫応答を惹起する、分子上の特定の化学基、または連続的もしくは非連続的ペプチド配列である。抗体は、抗体の三次元構造およびマッチする（または同族の）エピトープに基づいて、特定の抗原性エピトープに結合する。
【００５６】
遠赤：遠赤光は、一般に７００〜８５０ｎｍの範囲の波長を有する光であるとみなされる。
【００５７】
ヘテロ脂肪族：少なくとも１つのヘテロ原子を有する、すなわち１つまたは複数の炭素原子が少なくとも１つの孤立電子対を有する原子、典型的に窒素、酸素、リン、ケイ素、または硫黄で置き換えられている、脂肪族化合物または基。ヘテロ脂肪族化合物または基は、置換または非置換、分岐または非分岐、環式または非環式であってよく、それには、「複素環」、「ヘテロシクリル」、「ヘテロシクロ脂肪族」、または「複素環式」基が含まれる。
【００５８】
ヘテロアルキル：少なくとも１つのヘテロ原子、例えばＮ、Ｏ、Ｓ、またはＳ（Ｏ）ｎ（ここで、ｎは、１または２である）を含有する、上記で定義される通りのアルキル基。別段特定されない限り、ヘテロアルキルという用語は、置換および非置換ヘテロアルキルを包含する。
【００５９】
ヘテロアリール：少なくとも１つのヘテロ原子を有する、すなわち環中の１つまたは複数の炭素原子が少なくとも１つの孤立電子対を有する原子、典型的に窒素、酸素、リン、ケイ素、または硫黄で置き換えられている、芳香族化合物または基。別段特定されない限り、ヘテロアリールという用語は、置換および非置換ヘテロアリールを包含する。
【００６０】
リガンド：生物学的効果を有する、受容体に結合する分子。
【００６１】
リンカー：２つの部分の間に位置する分子または原子団。本明細書で使用される場合、用語「リンカー」は、シアニンフルオロフォアと標的化剤もしくは反応基との間に位置する原子団、またはシアニンフルオロフォアと薬物との間に位置する原子団を指す。
【００６２】
近赤外（近ＩＲ、ＮＩＲ）：６５０〜２５００ｎｍの範囲内の波長。別段特定されない限り、用語「近赤外」および「ＮＩＲ」は、本明細書で使用される場合、６５０〜９００ｎｍの範囲内の波長を指す。
【００６３】
ＰＡＬＭ：光活性化局在性顕微鏡法。
【００６４】
ＰＢＳ：リン酸緩衝食塩水。
【００６５】
薬学的に許容される担体：本開示において有用な薬学的に許容される担体（ビヒクル）は、従来のものである。Remington:The  Science  and  Practice  of  Pharmacy,The  University  of  the  Sciences  in  Philadelphia,Editor,Lippincott,Williams,&  Wilkins,Philadelphia,PA,21st  Edition(2005)は、本明細書に開示される１つまたは複数の配座が束縛されたシアニンフルオロフォアの薬学的送達に適した組成物および製剤を記載している。
【００６６】
一般に、担体の性質は、用いられる特定の投与形式に応じて変わる。例えば、非経口製剤は、通常、ビヒクルとして薬学的および生理的に許容される流体、例えば水、生理食塩水、平衡塩溶液、ブドウ糖水溶液、グリセロールなどを含む、注射可能な流体を含む。一部の例では、薬学的に許容される担体は、対象への投与（例えば、非経口、筋肉内、または皮下注射による）に適するように無菌にされ得る。生物学的に中性の担体に加えて、投与される医薬組成物は、少量の非毒性補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、防腐剤、およびｐＨ緩衝剤など、例えば酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートを含有することができる。
【００６７】
薬学的に許容される塩：開示される配座が束縛されたシアニンフルオロフォアの生物学的に適合可能な塩であり、その塩は、当技術分野で周知の様々な有機および無機対イオンから誘導され、その単なる例として、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、テトラアルキルアンモニウムなどが挙げられ、分子が塩基性官能基を含有する場合には、有機または無機酸の塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、酒石酸塩、メシル酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、シュウ酸塩などが挙げられる。薬学的に許容される酸付加塩は、遊離塩基の生物学的有効性を保持すると同時に、生物学的にも、または他の点でも望ましくないことがない酸パートナー、例えば無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸など、ならびに有機酸、例えば酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸などによって形成される塩である。薬学的に許容される塩基付加塩には、無機塩基から誘導された塩、例えばナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウムなどの塩が含まれる。例示的な塩は、アンモニウム、カリウム、ナトリウム、カルシウム、およびマグネシウム塩である。薬学的に許容される非毒性有機塩基から誘導された塩には、それに限定されるものではないが、第一級、第二級および第三級アミン、天然に存在する置換アミンを含む置換アミン、環状アミンおよび塩基性イオン交換樹脂、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、２−ジメチルアミノエタノール、２−ジエチルアミノエタノール、ジシクロヘキシルアミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルカミン、テオブロミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、Ｎ−エチルピペリジン、ポリアミン樹脂などの塩が含まれる。例示的な有機塩基は、イソプロピルアミン、ジエチルアミン、エタノールアミン、トリメチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、コリン、およびカフェインである（例えば、参照によって本明細書に組み込まれるS.M.Berge,et  al.,“Pharmaceutical  Salts,”J.Pharm.Sci.,1977;66:1-19を参照されたい）。
【００６８】
ホスホロアミダイト：一般式（ＲＯ）２ＰＮＲ２を有する基。ホスホロアミダイトは、置換基として、一般式−ＲＯ−Ｐ（ＯＲ）ＮＲ２（ここで、各Ｒは、独立に、脂肪族、例えば置換または非置換アルキルである）を有する。
【００６９】
保護基：有機化合物を合成する場合、しばしば特定の官能基は、必要とされる試薬または化学的環境を耐え抜くことはできない。これらの基は、保護されなければならない。保護基（protecting  group）または保護用の基（protective  group）は、その後の化学反応における化学選択性を得るために、官能基の化学修飾によって分子に導入される。様々な例示的な保護基または保護用の基は、参照によって本明細書に組み込まれるGreene's  Protective  Groups  in  Organic  Synthesis,Peter  G.M.Wuts  and  Theodora  W.Greene(October  30,2006)に開示されている。
【００７０】
ＳＭＬＭ：単一分子局在性顕微鏡法。
【００７１】
特異的結合パートナー：関与する分子の三次元構造に応じて決まる、特異的な非共有結合性の相互作用によって相互作用する一対の分子のメンバー。特異的結合パートナーの例示的な対には、抗原／抗体、ハプテン／抗体、受容体／リガンド、核酸鎖／相補的核酸鎖、基質／酵素、阻害剤／酵素、炭水化物／レクチン、ビオチン／アビジン（例えば、ビオチン／ストレプトアビジン）、およびウイルス／細胞受容体が含まれる。
【００７２】
ＳＴＯＲＭ：確率的光学的再構築顕微鏡法。
【００７３】
置換基：反応の結果として分子内の別の分子を置き換える原子または原子団。用語「置換基」は、典型的に、親炭化水素鎖または親炭化水素環上の１つの水素原子、または置換基が二重結合によって結合する場合には２つの水素原子を置き換える原子または原子団を指す。用語「置換基」はまた、分子との複数の結合点を有する原子団を包含することができ、例えば、置換基は、親炭化水素鎖または親炭化水素環上の２つまたはそれよりも多い水素原子を置き換える。このような場合、置換基は、別段特定されない限り、親炭化水素鎖または親炭化水素環に対して任意の空間的配向で結合することができる。例示的な置換基として、例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルアミノ、アルキルチオ、アシル、アルデヒド、アミド、アミノ、アミノアルキル、アリール、アリールアルキル、アリールアミノ、カーボネート、カルボキシル、シアノ、シクロアルキル、ジアルキルアミノ、ハロ、ハロ脂肪族（例えば、ハロアルキル）、ハロアルコキシ、ヘテロ脂肪族、ヘテロアリール、ヘテロシクロ脂肪族、ヒドロキシル、イソシアノ、イソチオシアノ、オキソ、スルホンアミド、スルフヒドリル、チオ、およびチオアルコキシ基が挙げられる。
【００７４】
置換されている：１つまたは複数の置換基がカップリングしている基本化合物、例えばアリールまたは脂肪族化合物またはそのラジカル（各置換基は、典型的に、基本化合物上の水素原子を置き換える）。単なる例として、それに限定されるものではないが、置換されているアリール化合物は、アリールベースの閉環にカップリングされた脂肪族基、例えばトルエンを有することができる。やはり単なる例として、それに限定されるものではないが、長鎖炭化水素は、それに結合したヒドロキシル基を有することができる。
【００７５】
スルホネート含有基：ＳＯ３−を含む基。スルホネート含有基という用語は、−ＳＯ３−および−ＲＳＯ３−基（ここで、Ｒは、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールである）を含む。
【００７６】
標的：標的化剤を含む開示される配座が束縛されたシアニンフルオロフォアが特異的に結合できる、所期の分子。標的の例として、組織試料中に存在するタンパク質および核酸配列が含まれる。標的領域は、標的分子が位置するか、または潜在的に位置する可能性がある領域である。
【００７７】
標的化剤：標的部位、例えば対象の体内の標的化された位置、例えば特定の器官、小器官、生理学的系、組織、または病理部位、例えば腫瘍、感染領域もしくは組織傷害領域への、優先的なまたは標的化された送達を促進する薬剤。標的化剤は、様々な機序、例えば標的部位内での選択的濃縮によって、または特異的結合パートナーとの結合によって機能する。適切な標的化剤には、それに限定されるものではないが、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、糖タンパク質および他のグリコシル化分子、オリゴヌクレオチド、リン脂質、リポタンパク質、アルカロイド、ならびにステロイドが含まれる。例示的な標的化剤として、抗体、抗体断片、アフィボディ、アプタマー、アルブミン、サイトカイン、リンホカイン、増殖因子、成長因子、ホルモン、酵素、免疫モジュレーター、受容体タンパク質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アビジン、ナノ粒子などが挙げられる。標的化剤の中で特に有用なものは、抗体、核酸配列、および受容体リガンドであるが、特異的結合パートナーの任意の対を、この目的で容易に用いることができる。
【００７８】
ＴＣＥＰ：トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン、還元剤。
【００７９】
ＴＲＡＢＩ：経時的ラジアル開口（radial-aperture）ベース強度推定。
【００８０】
処置する／処置：本明細書で使用される場合、用語「処置する」および「処置」は、状態、すなわち障害または疾患と関連する少なくとも１つの徴候または症候を阻害または低減することを意味する。腫瘍に関して、処置は、腫瘍成長の阻害および／または腫瘍体積の低減を意味することができる。処置は、例えば腫瘍の一部もしくはすべての臨床症候の重症度の低減、腫瘍の進行の緩徐（例えば、腫瘍を有する対象を延命することによって）、腫瘍再発回数の低減、対象の全体的健康もしくは福祉の改善、または特定の障害もしくは疾患に特異的な当技術分野で周知の他のパラメーターをもたらすことができる。
【００８１】
トリチル：置換または非置換トリフェニルメチル基、例えばＰｈ３Ｃ−ＯＲ−またはＰｈ３ＣＲ−（ここで、Ｒは脂肪族である）。各フェニル基およびＲは、独立に、置換または非置換であってよい。
【００８２】
ＴＳＴＵ：Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）ウロニウムテトラフルオロボレート、カップリング剤。
ＩＩ．配座が束縛されたシアニンフルオロフォア
【００８３】
開示される配座が束縛されたシアニンフルオロフォアの実施形態は、式Ｉ：
【化６】
2020531497.tif 000008
［式中、Ａは、
【化７】
2020531497.tif 000009
であり、各「＊」は、Ａの結合点を示す］
による化学構造、またはその立体異性体もしくは薬学的に許容される塩を有する。
【化８】
2020531497.tif 000010
によって表される結合は、原子価の要件を満たすために必要とされるように、単結合または二重結合である。Ｒ１〜Ｒ９およびＲ１１は、独立に、Ｈ、重水素、アルキル、ヘテロアルキル、−Ｎ（Ｒａ）２、スルホネート、アルキルスルホネート、アミノ、アミノアルキル、トリチル、−Ｃ（Ｏ）ＯＲａ、またはコンジュゲート可能な部分、標的化剤もしくは薬物を含む基であり、ここで、各Ｒａは、独立に、Ｈ、重水素、アルキルまたはヘテロアルキルである。Ｒ１０は、Ｈ、重水素、Ｏ、アルキル、アリール、アミノ、スルホネート、−Ｃ（Ｏ）ＯＲｂ、−ＯＲｂ、−Ｎ（Ｒｂ）２、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、トリチル、またはコンジュゲート可能な部分、標的化剤もしくは薬物を含む基であり、ここで、各Ｒｂは、独立に、Ｈ、重水素、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、またはヘテロアリールである。Ｙ１およびＹ２は、独立に、Ｃ（Ｒｃ）２、Ｎ（Ｒｄ）、Ｓ、Ｏ、またはＳｅであり、ここで、各Ｒｃは、独立に、Ｈ、重水素、アルキル、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｘＯＨ（ｘは、≧２の整数である）、トリチル、またはコンジュゲート可能な部分、標的化剤もしくは薬物を含む基であり、各Ｒｄは、独立に、Ｈ、重水素、アルキル、またはヘテロアルキルである。一部の例では、トリチル基は、式−（ＣＨ２）３ＯＣ（Ｐｈ２）（ｐ−メトキシフェニル）を有する。
【００８４】
開示される実施形態のいずれかでは、アルキルスルホネートまたはアミノアルキル基のアルキル基またはアルキル部分は、低級アルキル（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、メチル、エチル、Ｃ３アルキル、Ｃ４アルキル、Ｃ５アルキル、Ｃ６アルキル、Ｃ７アルキル、Ｃ８アルキル、Ｃ９アルキル、Ｃ１０アルキルであってよい。ヘテロアルキル基は、炭素原子およびヘテロ原子を含めて、１〜１０、１〜５、または１〜３原子の鎖長、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、または１０原子の鎖長を有することができる。
【００８５】
一部の実施形態では、配座が束縛されたシアニンフルオロフォアは、式ＩＡ〜ＩＤのいずれか１つによる化学構造またはその薬学的に許容される塩を有し、式中、Ｒ１〜Ｒ１１、Ｙ１、およびＹ２は、既に記載されている通りである。
【化９】
2020531497.tif 000011
【００８６】
ある特定の実施形態では、配座が束縛されたシアニンフルオロフォアは、式ＩＩまたは式ＩＩＩによる化学構造、またはその立体異性体もしくは薬学的に許容される塩を有し、式中、Ｒ１〜Ｒ１１およびＲｃは、既に記載されている通りである。
【化１０】
2020531497.tif 000012
【００８７】
先の実施形態のいずれかまたはすべてでは、Ｒ１〜Ｒ９およびＲ１１は、独立に、Ｈ、重水素、アルキル、ヘテロアルキル、−Ｎ（Ｒａ）２、スルホネート、アルキルスルホネート、アミノ、アミノアルキル、−Ｃ（Ｏ）ＯＲａ、またはコンジュゲート可能な部分、標的化剤もしくは薬物を含む基であり、ここで、Ｒａは、Ｈ、重水素、アルキルまたはヘテロアルキルである。一部の実施形態では、Ｒ３およびＲ６のうちの少なくとも１つは、スルホネート、−Ｃ（Ｏ）ＯＲａ、トリチル、またはコンジュゲート可能な部分、標的化剤もしくは薬物を含む基である。先の実施形態のいずれかまたはすべてでは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７、およびＲ８は、Ｈであってよい。先の実施形態のいずれかまたはすべてでは、Ｒ９は、Ｈであってよい。先の実施形態のいずれかまたはすべてでは、Ｒ１およびＲ８、Ｒ２およびＲ７、Ｒ３およびＲ６、Ｒ４およびＲ５、ならびに／またはＲ９およびＲ１１は、同じであってもよい。ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ７〜Ｒ１１は、Ｈであり、Ｒ３およびＲ６は、独立に、−ＳＯ３または−ＣＯ２Ｒａである。一部の例では、Ｒ３およびＲ６は、スルホネートである。
【００８８】
先の実施形態のいずれかまたはすべてでは、Ｒ１０は、Ｈ、重水素、Ｏ、アルキル、アリール、アミノ、スルホネート、トリフレート、（−ＯＳ（Ｏ）２ＣＦ３）、−Ｃ（Ｏ）ＯＲｂ、−ＯＲｂ、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、トリチル、またはコンジュゲート可能な部分、標的化剤もしくは薬物を含む基であり、ここで、Ｒｂは、Ｈ、重水素、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、またはヘテロアリールである。一部の実施形態では、Ｒ１０は、Ｈ、重水素、Ｏ、アルキル、アリール、アミノ、スルホネート、トリフレート、（−ＯＳ（Ｏ）２ＣＦ３）、−Ｃ（Ｏ）ＯＲｂ、−ＯＲｂ、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、またはコンジュゲート可能な部分、標的化剤もしくは薬物を含む基であり、ここで、Ｒｂは、Ｈ、重水素、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、またはヘテロアリールである。ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、Ｈ、Ｏ、アリール、−ＯＲｂ、−Ｎ（Ｒｂ）２、またはトリフレートである。先の実施形態のいずれかまたはすべてでは、化合物が式ＩＩによる構造を有する場合、Ｒ１０は、Ｈであってよい。先の実施形態のいずれかまたはすべてでは、化合物が式ＩＩＩによる構造を有する場合、Ｒ１１は、Ｈであってよい。
【００８９】
先の実施形態のいずれかまたはすべてでは、Ｙ１およびＹ２は、独立に、Ｃ（Ｒｃ）２、Ｎ（Ｒｄ）、Ｓ、Ｏ、またはＳｅであり、ここで、各Ｒｃは、独立に、Ｈ、重水素、アルキル、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｘＯＨ（ｘは、≧２の整数である）、トリチル、またはコンジュゲート可能な部分、標的化剤もしくは薬物を含む基であり、各Ｒｄは、独立に、Ｈ、重水素、アルキル、ヘテロアルキル、またはトリチルである。一部の実施形態では、Ｙ１およびＹ２は、Ｃ（Ｒｃ）２であり、各Ｒｃは、独立に、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、−（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）Ｒｅ、またはＨであり、ここで、ｎは、≧１の整数であり、Ｒｅは、コンジュゲート可能な部分または標的化剤である。先の実施形態のいずれかまたはすべてでは、少なくとも一方のＲｃは、Ｈ以外であってよい。先の実施形態のいずれかまたはすべてでは、各Ｒｃは、同じであってもよく、または各Ｒｄは、同じであってもよい。一実施形態では、Ｙ１は、Ｃ（Ｒｃ）２であり、ここで一方のＲｃは、コンジュゲート可能な部分、標的化剤または薬物を含む基であり、他方のＲｃは、Ｈ、重水素、またはアルキルであり、Ｙ２は、Ｃ（Ｒｃ）２であり、ここで、各Ｒｃは、独立に、Ｈまたはアルキルである。独立な実施形態では、Ｙ１は、Ｃ（Ｒｃ）２であり、ここで、一方のＲｃは、コンジュゲート可能な部分、標的化剤または薬物を含む基であり、他方のＲｃは、Ｈまたはアルキルであり、Ｙ２は、Ｃ（Ｒｃ）２であり、ここで、一方のＲｃは、トリチルであり、他方のＲｃは、Ｈまたはアルキルである。別の独立な実施形態では、Ｙ２は、Ｃ（Ｒｃ）２であり、ここで、一方のＲｃは、コンジュゲート可能な部分、標的化剤または薬物を含む基であり、他方のＲｃは、Ｈ、重水素、またはアルキルであり、Ｙ１は、Ｃ（Ｒｃ）２であり、ここで、各Ｒｃは、独立に、Ｈまたはアルキルである。さらに別の独立な実施形態では、Ｙ２は、Ｃ（Ｒｃ）２であり、一方のＲｃは、コンジュゲート可能な部分、標的化剤または薬物を含む基であり、他方のＲｃは、Ｈまたはアルキルであり、Ｙ１は、Ｃ（Ｒｃ）２であり、ここで、一方のＲｃは、トリチルであり、他方のＲｃは、Ｈまたはアルキルである。Ｒｃがアルキルである、先の実施形態のいずれかまたはすべてでは、アルキルは、メチルであってよい。
【００９０】
独立な実施形態では、化合物は、式ＩＩによる化学構造を有し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ８、およびＲｃは、前述の通りであり、Ｒ９およびＲ１０は、Ｈであり、Ｒ３およびＲ６のうちの少なくとも１つは、コンジュゲート可能な部分、標的化剤または薬物を含む基である。別の独立な実施形態では、化合物は、式ＩＩによる化学構造を有し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７、およびＲ８は、前述の通りであり、Ｒ９およびＲ１０は、Ｈであり、Ｒ３およびＲ６は、スルホネートであり、少なくとも一方のＲｃは、コンジュゲート可能な部分、標的化剤または薬物を含む基である。別の独立な実施形態では、化合物は、式ＩＩＩによる化学構造を有し、Ｒ１〜Ｒ９およびＲ１１は、Ｈであり、Ｒ１０は、Ｈ、Ｏ、トリフレート、アリール、−ＯＲｂまたは−Ｎ（Ｒｂ）２である。さらに別の独立な実施形態では、化合物は、式ＩＩＩによる化学構造を有し、Ｒ１〜Ｒ９およびＲ１１は、Ｈであり、Ｒ１０は、コンジュゲート可能な部分、標的化剤または薬物を含む基である。別の独立な実施形態では、化合物は、式ＩＩＩによる化学構造を有し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７、およびＲ８は、前述の通りであり、Ｒ３およびＲ６は、スルホネートであり、Ｒ９およびＲ１１は、Ｈであり、Ｒ１０は、Ｈ、Ｏ、トリフレート、アリール、−ＯＲｂまたは−Ｎ（Ｒｂ）２であり、少なくとも一方のＲｃは、コンジュゲート可能な部分、標的化剤または薬物を含む基である。特定の操作理論に拘泥するものではないが、一部の実施形態では、例えば、Ｒ３およびＲ６にスルホネート基を含むことによって、スルホネート基を含まない化合物と比較して、水性媒体中での化合物の凝集を低減し、改善された抗体標識特性を示し、かつ／または改善された蛍光発光を示すことができる。
【００９１】
先の実施形態のいずれかまたはすべてでは、式Ｉ、ＩＡ〜ＩＤ、ＩＩ、またはＩＩＩによる化合物は、コンジュゲート可能な部分、標的化剤または薬物を含む少なくとも１つの基を含むことができる。コンジュゲート可能な部分または標的化剤を含む例示的な基には、それに限定されるものではないが、−（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）Ｒｅ、−（ＣＨ２）ｎＮ（Ｈ）Ｒｅ、−（ＣＨ２）ｎＮ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒｅ、−（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｒｅ、−（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）ＳＲｅ、−Ｃ（Ｏ）Ｒｅ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｒｅ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）Ｒｅ  −Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒｅ、−Ｎ（Ｈ）Ｒｅ、または−ＳＲｅが含まれ、ここで、ｍは、≧１の整数であり、ｎは、≧１の整数であり、Ｒｅは、コンジュゲート可能な部分または標的化剤である。
【００９２】
適切なコンジュゲート可能な部分には、それに限定されるものではないが、
【化１１】
2020531497.tif 000013
（式中、ｙは、≧１の整数である）、およびホスホロアミダイトが含まれる。一部の例では、ホスホロアミダイトは、式−（ＣＨ２）３ＯＰ（Ｏ（ＣＨ２）ＣＮ）（Ｎ（ｉ−Ｐｒ）２）を有し、ここで、ｉ−Ｐｒは、イソプロピルである。ある特定の実施形態では、化合物が、分子の半分にホスホロアミダイト基を含む場合、その化合物は、分子の残りの半分にトリチル基も含むことができる。例えば、Ｙ１が、ホスホロアミダイト基で置換されている場合、Ｙ２は、トリチル基で置換されていてもよい。
【００９３】
例示的な標的化剤には、それに限定されるものではないが、抗体、リガンド、ペプチド、核酸鎖などが含まれる。一部の例では、標的化剤は、Ｆ−アクチンに結合する二環式ヘプタペプチドである、ファロイジンである。ある特定の例では、標的化剤は、抗体である。例示的な抗体には、標的分子を認識し、結合することができる抗体、例えば疾患、感染、または環境曝露と関連するバイオマーカーが含まれる。バイオマーカーには、それに限定されるものではないが、タンパク質、ペプチド、脂質、代謝産物、および核酸が含まれる。一部の実施形態では、抗体は、腫瘍細胞の内部もしくはその表面にだけ見出されるタンパク質などの腫瘍バイオマーカー、または１つもしくは複数のがんと関連する細胞表面受容体を認識し、結合することができる。例えば、パニツムマブは、ヒト上皮増殖因子受容体１（ＨＥＲ１）を認識し、結合する、ヒトモノクローナル抗体であり、ＨＥＲ１は、数々の腫瘍型において過剰発現し、一部の炎症性疾患とも関連する。トラスツズマブおよびペルツズマブは、一部の乳がんに過剰発現するＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体に結合するモノクローナル抗体である。ブレンツキシマブは、古典的ホジキンリンパ腫および全身性退形成大細胞型リンパ腫に発現する細胞膜タンパク質ＣＤ３０を標的にするモノクローナル抗体である。
【００９４】
薬物を含む例示的な基には、それに限定されるものではないが、式−Ｌ１−Ｃ（Ｏ）−Ｘ１−薬物を有する基が含まれ、ここで、Ｌ１は、リンカー部分であるか、または存在せず、Ｘ１は、Ｏ、Ｎ（Ｈ）、またはＮ（ＣＨ３）である。一実施形態では、Ｌ１は、存在しない。別の実施形態では、Ｌ１は、Ｏである。独立な実施形態では、Ｌ１は、置換または非置換の脂肪族またはヘテロ脂肪族部分を含む少なくとも１つの置換基で置換されているアリールまたはヘテロアリールであり、ここで、アリールまたはヘテロアリール環は、配座が束縛されたシアニンフルオロフォアの残部との結合部位であり、置換基は、−Ｃ（Ｏ）−Ｘ１−薬物部分に結合する。一部の実施形態では、薬物を含む基は、
【化１２】
2020531497.tif 000014
であり、式中、Ｘ１は、Ｏ、Ｎ（Ｈ）、またはＮ（ＣＨ３）であり、Ｒ１２〜Ｒ１９は、独立に、Ｈ、アルキル、−ＮＯ２、−ＮＲｆ２、−ＮＲｆ３＋、アルコキシ、またはスルホネートであり、ここで、各Ｒｆは、独立に、Ｈ、ハロ、またはアルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１２〜Ｒ２３は、Ｈである。一部の例では、薬物を含む基は、−Ｃ（Ｏ）−Ｘ１−薬物である。薬物は、基の残部にコンジュゲートすることができる任意の薬物であってよい。一部の実施形態では、薬物は、小分子薬物、例えば分子量＜１，０００ダルトンを有する薬物である。ある特定の実施形態では、薬物部分は、抗がん薬である。
【００９５】
式Ｉによる化合物の非限定的な例として、以下が挙げられる。
【化１３】
2020531497.tif 000015
【化１４】
2020531497.tif 000016
【００９６】
開示される配座が束縛されたシアニンフルオロフォアの実施形態は、対応する制限されていないペンタメチンおよびヘプタメチンシアニンと比較して、量子収率の改善および／または蛍光寿命の延長を示す。一部の実施形態では、量子収率および／または蛍光寿命は、対応する制限されていないシアニンフルオロフォアの量子収率および／または蛍光寿命を、少なくとも１．１倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、または少なくとも５倍上回る。量子収率および／または蛍光寿命は、対応する制限されていないシアニンフルオロフォアの量子収率および／または蛍光寿命を１．１〜１０倍、例えば１．５〜８倍、１．５〜５倍、または２〜５倍上回っていてもよい。有利には、吸収および発光の最大波長は、対応する制限されていないシアニンフルオロフォアと比較して赤方偏移することができる。ある特定の実施形態では、λｍａｘおよび／またはλｅｍは、対応する制限されていないシアニンフルオロフォアのλｍａｘおよび／またはλｅｍ値と比較して、少なくとも１０ｎｍ、少なくとも２０ｎｍ、または少なくとも３０ｎｍ、例えば１０〜５０ｎｍ、１０〜４０ｎｍ、１０〜３０ｎｍ、または１０〜２０ｎｍ、赤方偏移する。さらに、開示される配座が束縛されたシアニンフルオロフォアの一部の実施形態は、既存の遠赤および／または近ＩＲシアニンと比較して優れた効率で、水素化物の還元から回収される。ある特定の実施形態では、これらの特性により、ＰＡＬＭ様のＳＭＬＭが、多量のチオール（脱酸素化緩衝剤）に頼ることなく、優れた光子カウントを提供することが可能になる。
ＩＩＩ．医薬組成物
【００９７】
本開示はまた、本明細書で開示されるような、少なくとも１つの配座が束縛されたシアニンフルオロフォアを含む医薬組成物を含む。医薬組成物の一部の実施形態は、薬学的に許容される担体および少なくとも１つの配座が束縛されたシアニンフルオロフォアを含む。有用な薬学的に許容される担体および賦形剤は、当技術分野で公知である。
【００９８】
１つまたは複数の配座が束縛されたシアニンフルオロフォアを含む医薬組成物は、例えば、投与形式および／または画像化される位置に応じて、様々な方式で製剤化することができる。非経口製剤は、薬学的かつ生理的に許容される流体ビヒクル、例えば水、生理食塩水、他の平衡塩溶液、ブドウ糖水溶液、グリセロールなどである注射可能な流体を含むことができる。賦形剤には、例えば非イオン性可溶化剤、例えばＣｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）、またはタンパク質、例えばヒト血清アルブミンもしくは血漿調製物が含まれ得る。所望に応じて、投与される医薬組成物は、非毒性補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、防腐剤、およびｐＨ緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートを含有することもできる。
【００９９】
医薬組成物の形態は、選択される投与形式によって決定される。開示される医薬組成物の実施形態は、例えば、局所、眼、経口、口腔内頬側、全身、経鼻、注射、経皮、直腸、膣内などを含む実質的に任意の投与形式に適した形態、または吸入もしくは吹送による投与に適した形態をとることができる。一般に、開示される医薬組成物の実施形態は、注射、全身、または経口により投与される。
【０１００】
有用な注射可能な調製物には、水性または油性ビヒクル中の活性化合物（単数または複数）の無菌の懸濁液、溶液またはエマルジョンが含まれる。組成物は、製剤化剤、例えば懸濁化剤、安定化剤および／または分散化剤を含有することもできる。注射のための製剤は、単位剤形で、例えば、アンプルまたは多回用量容器で提示することができ、添加された防腐剤を含有することができる。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンなどの形態をとることができ、製剤化剤、例えば懸濁化剤、安定化剤および／または分散化剤を含有することができる。例えば、非経口投与を、ボーラス注射または持続注入によって行うことができる。あるいは、配座が束縛されたシアニンフルオロフォアは、使用前に適切なビヒクル、例えば滅菌水を用いて再構成するための、粉末形態であってもよい。
【０１０１】
全身製剤には、注射、例えば皮下、静脈内、筋肉内、髄腔内または腹腔内注射による投与のために設計された製剤、および経皮、経粘膜、経口または肺への投与のために設計された製剤が含まれる。
【０１０２】
経口製剤は、液体（例えば、シロップ、液剤または懸濁液）、あるいは固体（例えば、散剤、錠剤、またはカプセル）であり得る。経口製剤は、内皮バリアを横断するための標的リガンドとカップリングさせることができる。一部の配座が束縛されたシアニンフルオロフォア製剤は、例えば二糖と一緒に噴霧乾燥によって乾燥させて、配座が束縛されたシアニンフルオロフォアの粉末を形成することができる。固体組成物は、従来の手段によって、薬学的に許容される賦形剤、例えば結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、充填剤（例えば、ラクトース、マンニトール、微結晶性セルロースまたはリン酸水素カルシウム）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）、崩壊剤（例えば、バレイショデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）、あるいは湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）を用いて調製される。錠剤は、当技術分野で周知の方法によって、例えば、糖、フィルムまたは腸溶コーティングを用いてコーティングすることができる。このような剤形を調製する実際の方法は、当業者に公知であり、または明らかになろう。
【０１０３】
経口投与のための液体調製物は、例えば、エリキシル、溶液、シロップまたは懸濁液の形態をとることができる。このような液体調製物は、従来の手段によって、薬学的に許容される添加剤、例えば懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用脂）、乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）、非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）または分画植物油）、および防腐剤（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピル、またはソルビン酸）を用いて調製することができる。調製物は、適宜、緩衝塩、防腐剤、香味剤、着色剤および甘味剤を含有することもできる。経口投与のための調製物は、周知の通り、フルオロフォアを制御放出するために適切に製剤化することができる。
【０１０４】
直腸および膣内投与経路では、配座が束縛されたシアニンフルオロフォア（単数または複数）は、溶液（停留浣腸のため）坐剤、または従来の坐剤基剤、例えばカカオバターもしくは他のグリセリドを含有する軟膏として製剤化することができる。
【０１０５】
経鼻投与、または吸入もしくは吹送による投与では、配座が束縛されたシアニンフルオロフォア（単数または複数）は、エアロゾルスプレーまたはミストの形態で、加圧パックまたはネブライザーから、適切な噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、フルオロカーボン、二酸化炭素または他の適切なガスを使用して好都合に送達することができる。加圧エアロゾルの場合、投与量単位は、定量を送達するための弁を提供することによって決定することができる。
【０１０６】
本明細書に記載される配座が束縛されたシアニンフルオロフォアを含む医薬組成物のある特定の実施形態は、正確な投与量の個々の投与に適した単位剤形に製剤化することができる。医薬組成物は、所望に応じて、配座が束縛されたシアニンフルオロフォアを含有する１つまたは複数の単位剤形を含有することができるパックまたはディスペンサーデバイスで提示することができる。パックは、例えば、金属またはプラスチック箔、例えばブリスターパックを含むことができる。パックまたはディスペンサーデバイスは、投与のための使用説明書を伴うことができる。
【０１０７】
投与される配座が束縛されたシアニンフルオロフォアの量は、処置を受ける対象、標的（例えば、腫瘍のサイズ、位置、および特徴）、および投与様式に少なくとも部分的に応じて決まり、医薬組成物および／または造影剤投与の分野の当業者に公知の通りに決定することができる。これらの範囲内で、投与される製剤は、対象に投与した後に適切な手段によって配座が束縛されたシアニンフルオロフォアを可視化することができるのに有効な量の、本明細書に開示される配座が束縛されたシアニンフルオロフォアを含有する。ある特定の実施形態では、配座が束縛されたシアニンフルオロフォアは、分子に結合した薬物を含み、投与される製剤は、処置を受ける対象に治療上有効な用量の薬物を提供するのに有効な量の、配座が束縛されたシアニンフルオロフォアに結合した薬物を含有する。
【０１０８】
一部の実施形態では、医薬組成物は、配座が束縛されたシアニンフルオロフォア以外の第２の薬剤を含む。第２の薬剤は、例えば、抗腫瘍剤または血管新生阻害剤であり得る。
ＩＶ．合成
【０１０９】
配座が束縛されたトリメチンシアニン色素はこれまでに、還流条件下でマイルドな酸の溶液（例えば、酢酸）中で、またはより穏やかな条件下でより強い鉱酸溶液中でトリメチンシアニン色素を処理し、その結果、「固定された」カルボシアニン色素をその溶液から沈殿させることによって合成されている（例えば、国際公開第９９／３１１８１号を参照されたい）。しかし、この合成戦略は、遠赤および近ＩＲシアニン、例えばペンタメチンおよびヘプタメチンシアニンに拡大することができない。今までに、式Ｉによる配座が束縛されたシアニンフルオロフォアを作製するための合成戦略は、公知ではなかった。
【０１１０】
本明細書では、配座が束縛されたペンタメチンおよびヘプタメチンシアニンフルオロフォアを作製するための方法の実施形態が開示される。配座が束縛されたペンタメチンシアニンフルオロフォア、すなわちＡが
【化１５】
2020531497.tif 000017
である、式Ｉによる化合物を作製するための方法の実施形態は、化学選択的オレフィンメタセシスを通して利用される、保護されたジアルデヒド前駆体の環化カスケードを介して進行する。図１は、配座が束縛されたペンタメチンシアニンフルオロフォアを作製するための逆合成経路の一実施形態を示している。非常に重要な反応では、保護されたジアルデヒドは、分子内マイケル付加を受けた後、ジヒドロピラン環形成カスケードを受ける。シアニンポリエンは、求核性オレフィン化方法と適合性がないので、重要な課題は、感受性α，β−不飽和アルデヒドモチーフ（または合成等価物）の化学選択的導入である。交差メタセシス反応は、最終的に、不飽和アセタールを導入するのに適した方法を提供することが見出された。
【０１１１】
図２は、非置換の配座が束縛されたペンタメチンシアニンフルオロフォアの一実施形態を調製するための例示的な合成スキームを示す。前駆体１は、以下により詳細に記載される通り、Ｎ−アルキル化インドレニンから調製される。ジクロロメタン中でグラブス第２世代触媒およびアクロレインジメチルアセタールを使用する交差メタセシスによって、精製後に化合物３が得られた。化合物３は、加熱した（例えば、７０℃）酸性化クロロホルム溶液中で四環化を受けて、化合物４を単一ジアステレオマーとして提供する。あるいは、冷却した（例えば、−７８℃）三臭化ホウ素のジクロロメタン溶液中の化合物３の反応によって、化合物４および別の化合物が得られ、その別の化合物を、１：３のメタノール：０．３Ｍ  ＨＣｌの加熱（例えば、６０℃）溶液中で、化合物４に変換することができる。
【０１１２】
図３は、配座が束縛されたペンタメチンシアニンフルオロフォアのコンジュゲート可能なバリアントを作製するための例示的な合成スキームを示す。ホベイダ（Hoyveda）−グラブス第２世代触媒を使用する交差メタセシスは、化合物５および化合物２の間で室温において効率的に進行して、化合物６を提供し、それを大規模に精製することなく使用することができる。化合物６の四環化は、冷却した（例えば、−７８℃）三臭化ホウ素のジクロロメタン溶液中で進行して、化合物７を含む混合物を提供する。１：３のメタノール：０．３Ｍ  ＨＣｌの加熱した（例えば、６０℃）溶液中で平衡化することによって、メチルエステル６が得られ、それをけん化し、精製した後、化合物７が得られる。バイオコンジュゲーションに適した化合物を調製するために、化合物７を、アミドカップリングシーケンスを介してカルボン酸８に変換することができる。図３の例では、ファロイジンを、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド−エステル作製およびアミド結合形成によって分子にコンジュゲートさせて、ファロイジンコンジュゲート９を提供した。
【０１１３】
一部の実施形態では、その方法は、式ＩＶによる化合物を含む溶液を、３−ブテン−１−イルトリフルオロメタンスルホネートと合わせて、式Ｖによる化合物を生成するステップを含む。
【化１６】
2020531497.tif 000018
【０１１４】
式Ｖによる化合物および式ＶＩによる化合物を含む溶液を、Ｎ−（（１Ｅ，３Ｚ）−３−（フェニルアミノ）プロパ−１−エン−１−イル）アニリン（N-((1E,3Z)-3-(phenylamino)propo-1-en-1-yl)aniline）またはＮ−（（１Ｅ，３Ｅ）−３−（フェニルイミノ）プロパ−１−エン−１−イル）アニリン（例えば、マロンアルデヒドビス（フェニルイミン）一塩酸塩）と合わせて、式ＶＩＩによる化合物を形成する。
【化１７】
2020531497.tif 000019
【０１１５】
式ＶＩＩによる化合物を含む溶液を、ルテニウム触媒（例えば、グラブス第２世代触媒である１，３−ビス（２，４，６−トリメチルフェニル）−２−イミダゾリジニリデン）−ジクロロ（フェニルメチレン）（トリシクロヘキシルホスフィン）ルテニウム、またはホベイダ−グラブス第２世代触媒である１，３−ビス−（２，４，６−トリメチルフェニル）−２−イミダゾリジニリデン）−ジクロロ（ｏ−イソプロポキシフェニルメチレン）ルテニウム）の存在下で、３，３−ジメトキシ−１−プロペンと合わせて、式ＶＩＩＩによる化合物を提供する。
【化１８】
2020531497.tif 000020
【０１１６】
式ＶＩＩＩによる化合物を、（ｉ）ＣＨＣｌ３およびＨ２ＳＯ４の混合物、または（ｉｉ）ＣＨ２Ｃｌ２中ＢＢｒ３と合わせて、式ＩＸによる化合物を提供する。
【化１９】
2020531497.tif 000021
【０１１７】
配座が束縛されたヘプタメチンシアニンフルオロフォア、すなわちＡが
【化２０】
2020531497.tif 000022
である、式Ｉによる化合物を作製するための方法の実施形態は、式ＩＶによる化合物を含む溶液を、３−ブテン−１−イルトリフルオロメタンスルホネートと合わせて、式Ｖによる化合物を生成するステップと、式Ｘによる化合物を含む溶液を、３−ブテン−１−イルトリフルオロメタンスルホネートと合わせて、式ＸＩによる化合物を生成するステップとを含む。
【化２１】
2020531497.tif 000023
【０１１８】
一部の実施形態では、対称性の配座が束縛されたシアニンフルオロフォアを生成することが望ましい場合がある。このような実施形態では、式ＩＶおよびＸによる化合物は同じであり、それにより、式ＶおよびＸＩによる同じ化合物が生成される。これらの実施形態では、式ＩＶ／Ｘによる化合物を含む溶液を、３−ブテン−１−イルトリフルオロメタンスルホネートと合わせて、式Ｖ／ＸＩによる化合物を生成する単一ステップを実施することができる。
【０１１９】
式Ｖによる化合物および式ＸＩによる化合物（式Ｖによる化合物と異なる場合）を含む溶液を、（１Ｅ，４Ｅ）−１，５−ビス（ジメチルアミノ）−ペンタ−１，４−ジエン−３−オンと合わせて、式ＸＩＩによる化合物を生成する。
【化２２】
2020531497.tif 000024
【０１２０】
式ＸＩＩによる化合物を含む溶液を、ルテニウム触媒（例えば、グラブス第２世代触媒である１，３−ビス（２，４，６−トリメチルフェニル）−２−イミダゾリジニリデン）−ジクロロ（フェニルメチレン）（トリシクロヘキシルホスフィン）ルテニウム、またはホベイダ−グラブス第２世代触媒である１，３−ビス−（２，４，６−トリメチルフェニル）−２−イミダゾリジニリデン）−ジクロロ（ｏ−イソプロポキシフェニルメチレン）ルテニウム）の存在下で、３，３−ジメトキシ−１−プロペンと合わせて、式ＸＩＩＩによる化合物を提供する。
【化２３】
2020531497.tif 000025
【０１２１】
式ＸＩＩＩによる化合物を含む溶液を、酸性テトラヒドロフラン溶液（例えば、テトラヒドロフラン中１Ｎ  ＨＣｌ）と合わせて、式ＸＩＶによる化合物を提供する。
【化２４】
2020531497.tif 000026
【０１２２】
式ＸＩＶのケトン基を、所望に応じて修飾して、構造変異体を提供することができる。最初にケトン基をトリフレートに変換した後、いくつかの変異体を作製することができる。トリフレート基を、式ＸＩＶによる化合物を含む溶液を、トリフルオロメタンスルホン酸無水物（Ｔｆ２Ｏ）と合わせることによって導入して、式ＸＶによる化合物を提供する。
【化２５】
2020531497.tif 000027
【０１２３】
一実施形態では、トリフレート基を、式ＸＶによる化合物を含む溶液を、パラジウム触媒の存在下で、Ｒｇ−Ｃ６Ｈ４−Ｂ（ＯＨ）２と合わせることによって、アリール基で置き換えて、式ＸＶＩ：
【化２６】
2020531497.tif 000028
（式中、Ｒｇは、Ｒａ、−ＣＯＯＲａ、または−ＯＲａであり、Ｒａは、Ｈ、重水素、アルキルまたはヘテロアルキルである）
による化合物を提供する。
【０１２４】
別の実施形態では、トリフレート基を、式ＸＶによる化合物を含む溶液を、式ＮＨ（Ｒ２０）（Ｒ２１）を有するアミンと合わせることによって、アミノ基で置き換えて、式ＸＶＩＩ：
【化２７】
2020531497.tif 000029
（式中、Ｒ２０およびＲ２１は、独立に、Ｈ、重水素、アルキル、ヘテロアルキル、アリールまたはヘテロアリールである）による化合物を提供する。このプロセスは、パラジウム触媒の存在下または非存在下で実施することができる。
【０１２５】
一部の例では、Ｒ２０は、−（ＣＲｈ２）ｎ−ＣＨ２ＯＨであり、ここで、各Ｒｈは、独立に、Ｈ、重水素、ハロ、アルキル、またはアリールであり、ｎは、１、２、３、または４であり、Ｒ２１は、Ｈ、重水素、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、またはヘテロアリールである。このような化合物は、式ＸＶＩＩａによる構造を有する。
【化２８】
2020531497.tif 000030
【０１２６】
ある特定の実施形態では、各Ｒｈは、Ｈであり、かつ／またはＲ２１は、Ｈである。先の実施形態のいずれかまたはすべてでは、ｎは、１または２であってよい。
【０１２７】
一部の実施形態では、式ＸＶＩＩａによる化合物は、塩基条件下で求電子試薬と反応した場合、Ｎ−からＯ−への転位を受けることができる。したがって、ある特定の例では、式ＸＶＩＩａによる化合物を含む溶液を、求電子性基Ｒ２２を含む化合物と塩基条件下で合わせて、式ＸＶＩＩＩによる化合物を提供する。
【化２９】
2020531497.tif 000031
【０１２８】
適切な求電子性基Ｒ２２には、それに限定されるものではないが、マレイミジル含有基、スクシンイミジル含有基、必要に応じて置換されているアルコキシ、必要に応じて置換されているアルキルカルボニル、必要に応じて置換されているアルコキシカルボニル、生体分子含有基、またはそれらの組合せが含まれる。例示的なマレイミジル含有基およびスクシンイミジル含有基は、環の窒素に結合したカルボニル、アルキルカルボニル、アルコキシ、またはアルコキシカルボニル基をさらに含むことができる。一部の実施形態では、Ｒ２２は、転位に関与する２つの基の組合せによって形成され、例えば、グルタル酸無水物およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドを合わせて、スクシンイミジル含有基−（Ｏ）Ｃ（ＣＨ２）３Ｃ（Ｏ）Ｏ−ＮＣ４Ｈ４Ｏ２を形成することができる。
【０１２９】
反応のための例示的な溶媒として、それに限定されるものではないが、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、水、およびそれらの組合せが挙げられる。
【０１３０】
適切な塩基には、無機および有機塩基が含まれる。例示的な塩基には、それに限定されるものではないが、炭酸塩（例えば、Ｋ２ＣＯ３、Ｎａ２ＣＯ３）、炭酸水素塩（例えば、ＫＨＣＯ３、ＮａＨＣＯ３）、水酸化物（例えば、ＫＯＨ、ＮａＯＨ）、および有機アミン（例えば、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ、ＥＤＡＣ、またはＥＤＣＩ）、およびＮ−［（ジメチルアミノ）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ−［４，５−ｂ］ピリジン−１−イルメチレン］−Ｎ−メチルメタンアミニウムヘキサフルオロホスフェートＮ−オキシド（ＨＡＴＵ））が含まれる。
【０１３１】
Ｒ２２を含む例示的な化合物として、それに限定されるものではないが、クロロホルメート、環状無水物、アルキルハロゲン化物、カルボン酸、およびテトラフルオロボレートが挙げられる。一部の実施形態では、カルボン酸は、式ＸＶＩＩａによる化合物を含む溶液に添加する前にＨＡＴＵおよびＤＩＰＥＡで事前に活性化されたカルボン酸などの、活性化カルボン酸である。
【０１３２】
有効な条件には、室温（２０〜２６℃）から１００℃の範囲の反応温度における、数分から数時間の範囲の時間にわたる反応が含まれ得る。ある特定の例では、反応温度は、室温から９０℃の範囲であり、時間は１０分から１８時間の範囲である。一例では、溶液は、マイクロ波照射を反応温度で照射される。様々な実施形態では、溶液は、穏やかに撹拌されるか、激しく撹拌されるか、または撹拌されない。反応は、密封容器中、不活性雰囲気（例えば、アルゴン、窒素）下で進行することができる。反応の完了は、それに限定されるものではないが、視覚的な変色またはＬＣ／ＭＳを含む任意の適切な手段によってモニタリングすることができる。式ＸＶＩＩＩによる化合物は、適切な手段によって回収され、必要に応じて精製される。一部の実施形態では、化合物は、抽出、沈殿、蒸発、イオン交換、クロマトグラフィー（例えば、シリカゲルクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ）、およびそれらの組合せによって回収され、かつ／または精製される。
【０１３３】
本明細書に開示される化合物の一部の実施形態は、生体分子などの標的化剤にさらにコンジュゲートするのに適している。例えば、Ｒ２２がスクシンイミジル部分、マレイミジル部分、−ＣＯＯＨ、または−ＣＯＯ−で終端する場合、生体分子は、当業者に公知の方法によって、例えば、Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネートによって媒介されるバイオコンジュゲーション反応を介して、配座が束縛されたシアニンフルオロフォアにコンジュゲートすることができる。適切な生体分子には、それに限定されるものではないが、抗体、ペプチド、アミノ酸、タンパク質、およびハプテンが含まれる。
Ｖ．使用方法
【０１３４】
開示される式Ｉによる化合物の実施形態は、生細胞の位置決定および追跡適用に有用となり得る。さらに、開示される化合物の一部の実施形態は、活性酸素種（ＲＯＳ）を感知するのに有用となり得る。ある特定の実施形態では、スルホネートまたは他の極性官能基を含むことにより、抗体の標識を容易にすることができる。さらに、開示される化合物の一部の実施形態は、細胞透過性であってもよく、これは生細胞研究にとって利点である。研究上の、診断上の、およびセラノスティック（theranostic）な使用は、本開示の範囲内である。
【０１３５】
式Ｉによる化合物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、およびｉｎ  ｖｉｖｏでの位置決定および追跡適用において利用することができる。一部の実施形態では、Ｒ１〜Ｒ１１、Ｙ１、またはＹ２のいずれかにおいて少なくとも１つの標的化剤を含む式Ｉによる化合物を、標的化剤と結合することが可能である標的を含む試料と合わせ、その標的を、化合物を可視化することによって画像化する。試料は、例えば、組織試料、生物学的流体（例えば、血液、尿、唾液）、または対象内の標的領域、例えば既知のもしくは疑わしい腫瘍の位置であってよい。有利には、化合物を試料と合わせることは、標的化剤および標的を結合させるのに有効な条件（温度、ｐＨ、濃度など）下で実施される。数秒から数日の範囲となり得る、結合が生じるのに有効な期間が経過した後、化合物は可視化される。可視化の前に、過剰の非結合化合物は、例えば標的に結合した化合物分子を撹乱することなく、非結合化合物を除去するのに有効な条件下で試料を洗浄することによって、または非結合化合物がｉｎ  ｖｉｖｏの標的領域から排除されるのに十分な期間（例えば数時間または数日）待つことによって、試料から除去することができる。ある特定の実施形態では、式Ｉによる化合物は、可視化の前に還元される。適切な還元剤には、それに限定されるものではないが、水素化物、例えば水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）が含まれる。還元は、以下に示される通り、部分Ａにおいて生じる。
【化３０】
2020531497.tif 000032
【０１３６】
一部の実施形態では、可視化は、可視、遠赤、または近赤外範囲の波長と選択された強度を有する所定量の光の標的化された適用により、試料または対象の標的化部分に照射すること（ここで、所定量の光は、化合物の蛍光を生じさせるのに十分である）、ならびに化合物によって放出された任意の蛍光を検出することを含む。有利には、光は、式Ｉによる化合物の最大吸収波長のまたはそれに近い波長を有する。例えば、試料は、６００ｎｍ〜２５００ｎｍ、例えば６００〜９００ｎｍ、または６００〜７００ｎｍの範囲内の波長を有する光を照射され得る。一部の実施形態では、光源は、レーザーである。適切な光強度は、標的部位および適用方法に応じて、１ｍＷ／ｃｍ２〜１０００ｍＷ／ｃｍ２、例えば１〜７５０ｍＷ／ｃｍ２または３００〜７００ｍＷ／ｃｍ２の範囲であり得る。近赤外光源は、Ｔｈｏｒｌａｂｓ（Ｎｅｗｔｏｎ、ＮＪ）、Ｌａｓｅｒ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ、ＵＳＡ（Ｈｕｄｓｏｎ、ＮＨ）、ＰｒｏＰｈｏｔｏｎｉｘ（Ｓａｌｅｍ、ＮＨ）などを含む商業的供給源から得ることができる。一部の実施形態では、遠赤またはＮＩＲ光の有効量は、１０〜２５０Ｊ、例えば１０〜２００Ｊ、１０〜１５０Ｊ、または１０〜１００Ｊである。
【０１３７】
一部の実施形態では、可視化には、蛍光透視法、単一分子局在性顕微鏡法（ＳＭＬＭ）、光活性化局在性顕微鏡法（ＰＡＬＭ）、確率的光学的再構築顕微鏡法（ＳＴＯＲＭ）、直接確率的光学的再構築顕微鏡法（ｄＳＴＯＲＭ）、二方向画像化（ＢＰ）、経時的ラジアル開口ベース強度推定（ＴＲＡＢＩ）、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、およびそれらの組合せなどの技術が含まれ得る。
【０１３８】
一部の実施形態では、有効量の式Ｉによる化合物またはこの化合物を含む医薬組成物は、対象内の標的（例えば、腫瘍）に結合したフルオロフォアを可視化することによって検出および／または評価することができる状態を有すると疑われる対象に投与される。有利には、式Ｉによる化合物は、対象内の標的に結合することができる標的化剤を含むことができる。投与は、任意の適切な方法、例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、腫瘍内もしくは皮下注射、または経口、鼻腔内もしくは舌下投与によって実施される。その後、投与された化合物は、対象の標的領域への、遠赤または近赤外範囲の波長と選択された強度を有する所定量の光の標的化された適用によって照射され、ここで、所定量の光は、式Ｉによる化合物を励起するのに十分である。標的領域（例えば、腫瘍近くの領域）に照射する場合、遠赤またはＮＩＲ光の有効量は、１〜２５０Ｊ／ｃｍ２、例えば１〜２５０Ｊ／ｃｍ２、例えば５〜２５０Ｊ／ｃｍ２、１０〜２５０Ｊ／ｃｍ２、１０〜２００Ｊ／ｃｍ２、１０〜１５０Ｊ／ｃｍ２、１０〜１００Ｊ／ｃｍ２、または３０〜１００Ｊ／ｃｍ２であり得る。対象の標的化部分における化合物からの任意の蛍光を検出し、それによって、対象はその状態を有すると診断される。
【０１３９】
ある特定のセラノスティックな実施形態では、その状態は、腫瘍であり、対象の標的化部分は、その腫瘍部位を含む。投与された化合物は、腫瘍を、化合物の蛍光を誘導するのに十分な波長および強度を有する光に曝露することによって可視化される。照射は、対象の標的化領域に光を外部から適用することによって実施することができる。遠赤またはＮＩＲ光は、数センチメートルの深さまで組織に経皮的に透過することができる。他の実施形態では、照射は、光の内部適用によって、例えば内視鏡、光ファイバーカテーテル、または埋込式蛍光デバイスを使用することによって実施することができる。内部適用は、腫瘍などの標的組織が、外部から光を適用するのに適していない深さに位置する場合に使用することができる。例えば内視鏡は、光を、肺、胃、または膀胱内に送達するために使用することができる。一部の例では、腫瘍部位は、腫瘍を光に曝露する前に、外科的切開に曝露される。腫瘍は、蛍光領域を指針として使用して切除することができる。一実施形態では、治療有効量の化合物またはこの化合物を含む医薬組成物を対象に投与する前に、腫瘍の少なくとも一部が対象から切除される。独立な実施形態では、治療有効量の化合物またはこの化合物を含む医薬組成物は、腫瘍またはその一部を外科手術によって切除する前に、対象に投与される。
【０１４０】
光を適用するための表面領域は、一般に、標的組織、例えば腫瘍もしくは腫瘍の一部、または標的組織外部の皮膚領域を含むように選択される。外部光の標的化された適用がｉｎ  ｖｉｖｏ生物学的試料にとって望ましい場合、表面領域は、適切な光アプリケーター、例えばマイクロレンズ、フレネルレンズ、またはディフューザー配置を使用することによって制御することができる。内部光の適用の標的化では、望ましい内視鏡または光ファイバーカテーテルの直径を選択することができる。一部の適用では、光散乱溶液を充填した留置カテーテルを、標的組織近くの内部に置くことができ、そのカテーテルに光ファイバー光源を挿入することができる（例えば、Madsen  et  al.,Lasers  in  Surgery  and  Medicine  2001,29,406-412を参照されたい）。
【０１４１】
別の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏ評価を実施して、式Ｉによる化合物が、この化合物によって可視化され得る状態を有するか、または有すると疑われる対象から得られた組織試料に有効に結合するかどうかを決定することができる。化合物は、その状態の指標となるか、またはその状態と関連する標的分子に結合するか、または会合することができると考えられる標的化剤を含む。非限定的な一例では、標的化剤は、標的受容体に結合することができる受容体リガンドまたは抗体である。化合物は、組織試料と合わせられ、その後、試料は、有効量の近ＩＲ光を照射される。一実施形態では、組織試料は、過剰の非結合化合物を除去するために洗浄され、組織試料の蛍光が評価される。蛍光は、化合物が組織試料に結合したことを示す。
【０１４２】
ある特定の実施形態では、式Ｉによる化合物は、細胞内の形状および／または構造を可視化するために利用することができる。式Ｉによる化合物は、細胞、例えば固定または透過性細胞内の望ましい構成成分に結合することができる標的化剤を含むことができる。例えば、化合物は、Ｆ−アクチンに結合する標的化剤として、ファロイジンを含むことができる。Ｆ−アクチンの可視化は、細胞の全体的な形状および構造を示すのに有用である。
【０１４３】
独立な実施形態では、式Ｉによる化合物は、試料中のスーパーオキシドおよび水酸化物ラジカルを含む活性酸素種（ＲＯＳ）の存在を検出し、かつ／または測定するために利用することができる。ＲＯＳは、がんおよびアテローム性動脈硬化症などの様々な炎症性疾患に関与している。ＲＯＳの検出は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｖｏで実施することができる。ある特定の実施形態では、化合物は、試料を化合物と接触させる前に還元することができる。試料中に存在するＲＯＳは、化合物を酸化して、フルオロフォアを再構築することができ、そのフルオロフォアは任意の適切な方法によって検出される。蛍光は、試料中のＲＯＳの存在を示す。蛍光の強度は、試料中のＲＯＳの濃度と相関し得る。
【実施例】
【０１４４】
ＶＩ．実施例
一般材料および方法
商業的に得たすべての試薬を、受け取ったまま使用した。２，３，３−トリメチルインドリン（Ｓ１）、マロンアルデヒドビス（フェニルイミン）一塩酸塩、グラブス第２世代触媒およびホベイダ−グラブス第２世代触媒は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。アクロレインジメチルアセタール（２）は、ＴＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａ（Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＯＲ）から購入した。４−ヒドラジニル安息香酸（Ｓ５）は、Ｏａｋｗｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｅｓｔｉｌｌ、ＳＣ）に発注した。２−（２−ブロモエチル）−１，３−ジオキソランは、Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ（Ｇｅｅｌ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）から購入した。ＮＨ２−ＰＥＧ８−ＣＯＯＨは、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）から購入した。アミノファロイジントシレートは、Ｅｎｚｏ，Ｉｎｃ．（Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ、ＮＹ）から購入した。化合物Ｓ２、Ｓ４、およびＳ８は、公知の手順に従って合成した（Hanessian  et  al.,J.Am.Chem.Soc.2004,126(19),6064-71；Hall  et  al.,Nucleic  Acids  Res.2012,40(14),e108；Park  et  al.,Bioconjugate  Chem.2012,23(3),350-362）。順相（６０Å、２０〜４０μｍ、ＲｅｄｉＳｅｐ（登録商標）Ｒｆ  Ｇｏｌｄ（登録商標）シリカまたは６０Å、３５〜７０μｍ、ＲｅｄｉＳｅｐ（登録商標）Ｒｆシリカ）および逆相（１００Å、２０〜４０ミクロン粒径、ＲｅｄｉＳｅｐ（登録商標）Ｒｆ  Ｇｏｌｄ（登録商標）逆相Ｃ１８またはＣ１８Ａｑ）フラッシュカラムクロマトグラフィーを、ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）Ｒｆ  ２００ｉ（Ｔｅｌｅｄｙｎｅ  Ｉｓｃｏ，Ｉｎｃ．、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ）で実施した。逆相分取ＨＰＬＣを、Ａｇｉｌｅｎｔ  １２６０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＩＩ  ＬＣシステムを使用し、Ｗａｔｅｒｓ，Ｃｏ（Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）から得たＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８カラム（１００Å、５μｍ、１０×１５０ｍｍ）を利用して実施した。高分解能ＬＣ／ＭＳ分析を、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ  ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ−ＸＬハイブリッド質量分析計システムで、Ｉｏｎ  ＭＡＸ  ＡＰＩエレクトロスプレーイオン源を負イオンモードで用いて実施した。分析ＬＣ／ＭＳを、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＬＣＭＳ−２０２０シングル四重極を使用し、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｉｎｃ（Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）から得たＫｉｎｅｔｅｘ  Ｃ１８カラム（１００Å、２．６μｍ、２．１×５０ｍｍ）を利用して実施した。泳動では、０〜９０％ＭｅＣＮ／０．１％ギ酸水溶液の勾配を流速０．２ｍＬ／分で４．５分にわたって用いた。１Ｈ  ＮＭＲおよび１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルを、Ｂｒｕｋｅｒ分光計（４００もしくは５００ＭＨｚ、または１００もしくは１２５ＭＨｚ）で記録し、重水素化溶媒シグナルと比較して記録する。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルのデータを、以下の通り記録する。化学シフト（δｐｐｍ）、多重度、カップリング定数（Ｈｚ）、および積分。１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルのデータを、化学シフトに関して記録する。吸光度曲線は、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＵＶ−２５５０分光光度計をＵＶＰｒｏｂｅ  ２．３２ソフトウェアによって操作して得た。モル吸光係数（ε）は、ＰＢＳ（５０ｍＭ、ｐＨ７．４）またはメタノール（ＭｅＯＨ）中、ベールの法則を��用して吸光度対濃度のプロットから決定した。測定を、室温で維持した１０ｍｍ経路長の石英キュベット（Ｈｅｌｌｍａ  １１１−ＱＳ）で実施した。記録値は平均である（ｎ≧３）。蛍光トレースを、ＰＴＩ  ＱｕａｎｔａＭａｓｔｅｒ定常状態蛍光光度計をＦｅｌｉｘＧＸ  ４．２．２ソフトウェアによって操作し、４ｎｍの励起および発光スリット幅、ならびに０．１ｓ積分速度で記録した。Ｑｕａｎｔａｕｒｕｓ−ＱＹ分光計（浜松、モデルＣ１１３７４）を使用して、絶対的蛍光量子収率（ΦＦ）を決定した（Suzuki  et  al.,Phys.Chem.Chem.Phys.11  2009,9850-9860）。この機器は、試料によって吸収された光子および放出された光子を測定するために積分球を使用する。測定は、ＭｅＯＨまたはＰＢＳ（５０ｍＭ、ｐＨ７．４）中２５０ｎＭの濃度で実施し、自己吸収補正を、機器のソフトウェアを使用して実施した。記録値は平均である（ｎ≧５）。データ分析および曲線フィッティングを、ＭＳ  Ｅｘｃｅｌ  ２０１１およびＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７を使用して実施した。光強度測定を、Ｓ１２０ＶＣ標準Ｓｉフォトダイオード出力センサー（２００〜１１００ｎｍ、５０ｎＷ〜５０ｍＷ）を備えたＴｈｏｒｌａｂｓ  ＰＭ２００光出力およびエネルギーメーターで実施した。略語については、ＪＯＣ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ａｂｂｒｅｖｉａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ａｃｒｏｎｙｍｓ（http://pubs.acs.org/paragonplus/submission/joceah/-joceah_abbreviations.pdf）を参照されたい。
【０１４５】
単一分子画像化を、他所（van  de  Linde  et  al.,Nature  Protocols  2011,6:991）に記載されている通り、高度斜光を用いる特注の対物型ＴＩＲＦセットアップで実施した。ノーズピースステージ（ＩＸ２−ＮＰＳ、Ｏｌｙｍｐｕｓ）および６０×油浸対物レンズ（ＮＡ  １．４５  ＰｌａｎＡｐｏ、Ｏｌｙｍｐｕｓ）を備えた倒立顕微鏡法（ＩＸ７１、Ｏｌｙｍｐｕｓ）を使用した。ＴＲＡＢＩ−二方向画像化を、他所（Franke  et  al.,Nature  Methods  2017  14:41）に記載されている通り実施した。手短には、５０／５０ビームスプリッタ（Ｃａｉｒｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）および焦点面が３００ｎｍ離れている２つのＥＭＣＣＤカメラ（Ｉｘｏｎ  ８９７およびＩｘｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ８９７、Ａｎｄｏｒ）を備えた、２倍拡大率の２チャネル画像スプリッタ（ＴｗｉｎＣａｍ、Ｃａｉｒｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用した。カメラを、パルスジェネレータ（ＤＧ５３５、Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって同期した。３Ｄ較正実験を、ＬＶＰＺＴサーボコントローラー（Ｅ−６６２、Ｐｈｙｓｉｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｅ）で駆動されるピエゾスキャナ（Ｐｉｆｏｃ、Ｐｈｙｓｉｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｅ）を用いて対物レンズを移動させることによって実施した。ＴＲＡＢＩ−二方向画像化由来のＺ座標は、屈折率ミスマッチについて倍率０．７１（緩衝液の屈折率ｎｂ＝１．３４および基質（ガラス）ｎｓ＝１．５２、開口数ＮＡ＝１．４５）によって補正した。
（実施例１）
配座が束縛されたペンタメチンシアニンフルオロフォアの例示的な合成
【化３１】
2020531497.tif 000033
【０１４６】
（Ｓ３）：２，３，３−トリメチルインドリン（Ｓ１、２．０ｇ、１２．５ｍｍｏｌ、１．０当量）のＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ、０．２５Ｍ）中の溶液に、０℃でＳ２（３．０ｇ、１５ｍｍｏｌ、１．２当量）を添加した。溶液を室温に加温し、１時間静置した。反応体積をおよそ１０ｍＬに低減し、次に順相クロマトグラフィー（２４ｇのシリカカラム、０〜１５％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）によって精製して、Ｓ３（２．５ｇ、６．９ｍｍｏｌ、５５％）を濃紫色の固体として得た。1H  NMR  (400  MHz,  CDCl3)  δ  7.71  -  7.65  (m,  1H),  7.62  -  7.54  (m,  3H),  5.82  (ddt,  J  =  17.3,  10.1,  7.3  Hz,  1H),  5.07  (ddd,  J  =  10.1,  1.5,  0.9  Hz,  1H),  4.90  (dq,  J  =  17.0,  1.4  Hz,  1H),  4.65  (t,  J  =  6.7  Hz,  2H),  2.82  (s,  3H),  2.74  (q,  J  =  6.9  Hz,  2H),  1.57  (s,  6H).13C  NMR  (101  MHz,  CDCl3)  δ  196.7,  141.6,  140.7,  132.2,  130.1,  129.5,  123.2,  120.3,  115.4,  54.6,  47.6,  32.2,  23.2,  14.9.  C15H20N  (M+)のＨＲＭＳ（ＥＳＩ）計算値  214.1590、実測値  214.1588.
【化３２】
2020531497.tif 000034
【０１４７】
（１）：Ｓ３（１．０ｇ、５．０ｍｍｏｌ、１．０当量）、Ｓ４（１．３ｇ、５．０ｍｍｏｌ、１．０当量）、マロンアルデヒドビス（フェニルイミン）一塩酸塩（１．３ｇ、５．０ｍｍｏｌ、１．０当量）、およびＥｔ３Ｎ（３．６ｍＬ、２５ｍｍｏｌ、５当量）のＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）中の溶液に、Ａｃ２Ｏ（１．４ｍＬ、１５ｍｍｏｌ、３当量）を添加した。溶液を室温で２時間静置した。次に、その濃青色の溶液に、ＮａＩ水溶液（５０ｍＬ、０．４Ｍ）を添加した。混合物を１８時間激しく撹拌し、ＣＨ２Ｃｌ２（２×１００ｍＬ）で分離し、ＮａＨＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮した。得られた青色の残留物を、順相カラムクロマトグラフィー（４０ｇのシリカカラム、２５〜７５％酢酸エチル／ＣＨ２Ｃｌ２）によって精製して、１（２番目に溶出するピーク）を青色の固体（１．２０ｇ、１．９ｍｍｏｌ、３８％）として得た。1H  NMR  (400  MHz,  CD3OD)  δ  8.27  (td,  J  =  13.1,  3.0  Hz,  2H),  7.51  (d,  J  =  7.4  Hz,  2H),  7.43  (t,  J  =  7.7  Hz,  2H),  7.32  (d,  J  =  8.0  Hz,  2H),  7.28  (t,  J  =  7.5  Hz,  2H),  6.65  (t,  J  =  12.4  Hz,  1H),  6.34  (dd,  J  =  13.7,  6.1  Hz,  2H),  5.92  (ddt,  J  =  17.2,  10.1,  7.1  Hz,  1H),  5.14  -  5.03  (m,  2H),  5.01  (t,  J  =  3.9  Hz,  1H),  4.25  (dt,  J  =  14.6,  7.0  Hz,  4H),  4.02  -  3.81  (m,  4H),  2.62  (q,  J  =  7.0  Hz,  2H),  2.21  (td,  J  =  7.1,  3.9  Hz,  2H),  1.74  (s,  12H).  13C  NMR  (101  MHz,  CD3OD)  δ  173.6,  173.2,  154.1,  154.0,  142.1,  142.1,  141.2,  141.2,  133.7,  128.3,  128.2,  125.2,  124.8,  124.8,  120.0,  122.0,  117.4,  110.9,  110.6,  103.5,  103.1,  101.6,  64.7,  49.2,  49.2,  42.7,  38.6,  31.6,  30.2,  26.7,  26.3.Ｃ３４Ｈ４１Ｎ２Ｏ２（Ｍ＋）のＨＲＭＳ（ＥＳＩ）計算値  ５０９．３１６３、実測値  ５０９．３１５７。
【化３３】
2020531497.tif 000035
【０１４８】
（３）：１（８０ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ、１．０当量）およびグラブス第２世代触媒（３３ｍｇ、０．０３９ｍｍｏｌ、０．３当量）のＣＨ２Ｃｌ２（１６ｍＬ、０．０１Ｍ）中の濃青色の溶液に、アクロレインジメチルアセタール（２、１４９μＬ、１．３ｍｍｏｌ、１０当量）を、真空で脱気した後、アルゴン下で添加した。この反応物を４０℃においてアルゴンおよび静的真空（およそ１時間当たり１回再適用した）下で５．５時間還流させた。室温に冷却した後、飽和ＮａＣｌ水溶液（２０ｍＬ）を添加し、１８時間激しく撹拌した。次に、二相混合物を分離し、ＣＨ２Ｃｌ２（３×２０ｍＬ）で抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で蒸発させた。濃青色の残留物を、順相クロマトグラフィー（１２ｇのシリカカラム、０〜２０％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）によって精製して、３（２番目に溶出するピーク、３７ｍｇ、０．０６０ｍｍｏｌ、４８％）を得た。不純生成物を含有していた最初に溶出するピークを合わせ、飽和ＮａＣｌ水溶液（２０ｍＬ）と共に再び一晩撹拌した。ＣＨ２Ｃｌ２中での有機抽出および順相精製を繰り返して、３（１１ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ、１４％）を得た。両方のカラムから精製した生成物を合わせて、３（４８ｍｇ、０．０７８ｍｍｏｌ、６２％）を青色の固体として得た。1H  NMR  (500  MHz,  CD3OD)  δ  8.27  (td,  J  =  13.1,  5.9  Hz,  2H),  7.53  -  7.49  (m,  2H),  7.46  -  7.40  (m,  2H),  7.36  -  7.25  (m,  4H),  6.64  (t,  J  =  12.4  Hz,  1H),  6.33  (d,  J  =  13.7  Hz,  2H),  5.91  (dt,  J  =  14.9,  7.2  Hz,  1H),  5.44  (dd,  J  =  15.6,  5.1  Hz,  1H),  5.00  (t,  J  =  3.8  Hz,  1H),  4.59  (d,  J  =  5.1  Hz,  1H),  4.26  (dt,  J  =  10.8,  7.0  Hz,  4H),  3.92  (dt,  J  =  51.0,  7.0  Hz,  4H),  3.16  (s,  6H),  2.65  (q,  J  =  6.7  Hz,  2H),  2.21  (q,  J  =  7.0  Hz,  2H),  1.74  (d,  J  =  3.2  Hz,  12H).  13C  NMR  (101  MHz,  CD3OD)  δ  173.5,  173.4,  154.1,  142.2,  142.1,  141.2,  141.2,  130.4,  130.0,  128.3,  128.3,  125.3,  124.8,  124.8,  122.0,  122.0,  110.9,  110.7,  103.5,  103.1,  103.0,  101.6,  64.7,  51.9,  49.2,  49.2,  42.5,  38.6,  30.2,  30.0,  26.6,  26.3.Ｃ３７Ｈ４７Ｎ２Ｏ４（Ｍ＋）のＨＲＭＳ（ＥＳＩ）計算値  ５８３．３５３０、実測値  ５８３．３５３６。
【化３４】
2020531497.tif 000036
【０１４９】
（４）：封止バイアル中、Ｈ２ＳＯ４水溶液（３．５Ｍ、１．３ｍＬ）を、３（３７ｍｇ、０．０５９ｍｍｏｌ）のＣＨＣｌ３（５．０ｍＬ）中の濃青色の溶液に添加した。この二相混合物（１：４の２０％Ｈ２ＳＯ４／ＣＨＣｌ３）を７０℃で３時間撹拌し、その時点でＬＣ／ＭＳ分析によって出発材料の完全な消費が明らかになった。得られた溶液を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２０ｍＬ）でクエンチし、ＣＨ２Ｃｌ２（４×１０ｍＬ）で抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させ、青緑色の残留物を、順相クロマトグラフィー（１２ｇのシリカ金カラム、０〜１５％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）で精製した。得られた生成物を１：１のＮａＩ水溶液（１．０Ｍ、１５ｍＬ）およびＣＨ２Ｃｌ２（１５ｍＬ）に溶解させ、室温で５時間激しく撹拌した。二相混合物を分離し、ＣＨ２Ｃｌ２（３×１０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２）で抽出し、真空中で乾燥させた。得られた残留物を、シリカを充填したピペットから溶出し（１０％ＭｅＯＨ／９０％ＣＨ２Ｃｌ２）、減圧下で蒸発させて、４（８．６４ｍｇ、０．０１４ｍｍｏｌ、２４％）を青色の固体として得た。
【０１５０】
化合物４は、ＮＭＲ分析によって帰属したｓｙｎ−ｓｙｎ環接合点立体化学を有する単一ジアステレオマーであった（図４）。算出は、Ｓｐａｒｔａｎ’１４（Ｗａｖｅｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）を使用して実施した。分子力学および半経験的モデルを除き、Ｓｐａｒｔａｎで使用した算出方法は、Shao  et  al.（Phys.Chem.Chem.Phys.2016,8:3172）により実証されている。配座分布を、ＭＭＦＦレベルで実施した。先のステップにおける３つの最低エネルギーの配座異性体（最低エネルギーの２０ｋＪ／ｍｏｌ以内）を、Ｂ３ＬＹＰ／６−３１Ｇ（ｄ）、ＥｔＯＨ溶媒を使用して幾何構造最適化に供した。（１つをｓｙｎ−ｓｙｎについて、２つをｓｙｎ−ａｎｔｉについて、３つをａｎｔｉ−ｓｙｎについて、３つをａｎｔｉ−ａｎｔｉについて）。得られた最小値を図４に示す。環接合点（位置１２、１４、および１５）に位置する３つすべてのメチンプロトンは、ｓｙｎ，ｓｙｎジアステレオマーと合致する、高磁場軸方向のα−窒素プロトン（３．８８（ｔｑ、Ｊ＝１３．３、４．５Ｈｚ、２Ｈ）−位置１０および１７）との１Ｄ−ＮＯＥＳＹ相互作用を示した。さらに、これらのプロトンはいずれも、低磁場エカトリアルα−窒素プロトン（４．４０〜４．２４（ｍ，２Ｈ）−位置１０および１７）に対してＮＯＥを示さなかったが、それは任意の他のジアステレオマー構造のうちの少なくとも１つのメチンプロトンについても予測される。また、ｓｙｎ−ｓｙｎジアステレオマーの形成と合致して、α−酸素プロトン（位置１４および１５）は、ほぼ同じカップリング定数を示したが、このことは、これらのプロトンが類似の環系にあることを示している。
【化３５】
2020531497.tif 000037
【０１５１】
（４）：アルゴン下で脱気し、−７８℃に冷却した（ドライアイスおよびアセトン浴）、３（１１．０ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ、１当量）の無水ＣＨ２Ｃｌ２（１．８ｍＬ、０．０１Ｍ）中の溶液に、ＢＢｒ３（１．０Ｍ  ＣＨ２Ｃｌ２溶液０．２１ｍＬ、０．２１ｍｍｏｌ、１２当量）をゆっくり添加した。反応物の色は、ＢＢｒ３添加を行うと、濃青色から赤褐色に急速に遷移した。アルゴン下で−７８℃において２時間撹拌した後、ＮａＨＣＯ３水溶液（０．５Ｍ、５ｍＬ）を添加して反応をクエンチすると、急速に青色に戻った。室温に加温したら、追加のＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）を提供し、二相混合物を４５分間激しく撹拌した。次に、薄緑色／黄色の水層をＣＨ２Ｃｌ２（３×５ｍＬ）で抽出し、合わせた濃青色の有機溶液をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で蒸発させた。この青色の残留物は、４および第２の化合物のジアステレオマー混合物を含有していた（約１：１〜約２：１の変動比で得られた）。分離不可能な混合物が、単一の［Ｍ］＋イオンシグナル、ジヒドロピラン領域の複雑なＮＭＲシグナル、および単一の遠赤ＵＶ−ｖｉｓ吸光度最大値を示した。以下の通り混合物を平衡化して、均質な化合物４を得た。混合物をＭｅＯＨ（０．９ｍＬ）およびＨＣｌ水溶液（０．３Ｍ、２．７ｍＬ）に溶解させ、６０℃で２０分間撹拌した。室温に冷却した後、ＮａＨＣＯ３水溶液（０．５Ｍ、５ｍＬ）およびＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）を添加して、二相混合物を形成し、それを３０分間激しく撹拌した。薄緑色／黄色の水層をＣＨ２Ｃｌ２（１０×５ｍＬ）で抽出し、合わせた有機溶液をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮した。青色の残留物を、ＣＨ２Ｃｌ２（１５ｍＬ）およびＮａＩ水溶液（０．５Ｍ、１０ｍＬ）に溶解させ、室温で１３時間激しく撹拌した。二相混合物を分離し、ＣＨ２Ｃｌ２（２×１０ｍＬ）で抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。真空中で乾燥させた後、残留物を順相クロマトグラフィー（４ｇのシリカ金カラム、０〜１０％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）によって精製して、４の青色の固体を単一ジアステレオマー（５．７ｍｇ、０．００９５ｍｍｏｌ、５３％）として得た。1H  NMR  (400  MHz,  CD3OD)  δ  7.93  (s,  1H),  7.86  (s,  1H),  7.57  -  7.36  (m,  4H),  7.37  -  7.16  (m,  4H),  4.67  (dd,  J  =  11.5,  5.0  Hz,  1H),  4.61  (dd,  J  =  11.4,  5.0  Hz,  1H),  4.40  -  4.24  (m,  2H),  3.88  (tq,  J  =  13.3,  4.5  Hz,  2H),  2.84  (tt,  J  =  12.3,  4.1  Hz,  1H),  2.58  (dt,  J  =  11.7,  4.5  Hz,  1H),  2.49  (dt,  J  =  11.7,  4.5  Hz,  1H),  2.41  (dt,  J  =  13.3,  4.2  Hz,  1H),  2.01  (qd,  J  =  12.6,  5.4  Hz,  1H),  1.82  (dd,  J  =  12.6,  5.0  Hz,  1H),  1.78  -  1.74  (m,  12H),  1.48  (q,  J  =  11.8  Hz,  1H).  13C  NMR  (126  MHz,  CD3OD)  δ  169.2,  165.8,  143.3,  142.0,  142.0,  141.5,  141.1,  140.3,  128.7,  128.3,  128.3,  125.3,  124.5,  121.9,  121.9,  114.0,  111.4,  110.2,  109.6,  72.2,  70.2,  49.1,  48.3,  42.9,  40.7,  35.1,  31.1,  27.2,  26.7,  26.7,  26.6,  26.1,  26.0.Ｃ３３Ｈ３５Ｎ２Ｏ（Ｍ＋）のＨＲＭＳ（ＥＳＩ）計算値  ４７５．２７３７、実測値  ４７５．２７４４。計算的分析は、ａｎｔｉ−環接合点を含有する最低エネルギーのジアステレオマーが、ポリエンのＣ５’に隣接している化合物４に対するジアステレオマーであったことを示している（図５）。化合物３をＭｅＯＨ：ＨＣｌ平衡化条件に供するだけで、ごく微量���化合物４が提供されたことが分かった。
【化３６】
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【０１５２】
（Ｓ６）：以下を３つの別個の封止バイアルに入れた。４−ヒドラジニル−安息香酸（Ｓ５、６１０ｍｇ、４．０ｍｍｏｌ、１．０当量）、３−メチル−２−ブタノン（４３０μＬ、４．０ｍｍｏｌ、１．０当量）、ＫＨＳＯ４（１．５ｇ、１２ｍｍｏｌ、３．０当量）およびＭｅＯＨ（１５ｍＬ）。各バイアルをマイクロ波によって１６０℃に２時間加熱した。３つのバイアルを合わせた内容物を、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１００ｍＬ）とＣＨ２Ｃｌ２（２×１００ｍＬ）との間に分離し、乾燥させ（ＮａＨＳＯ４）、減圧下で濃縮した。得られた残留物を、順相クロマトグラフィー（４０ｇのシリカカラム、３０〜１００％酢酸エチル／ヘキサン）によって精製して、Ｓ６（１．４ｇ、６．３ｍｍｏｌ、５３％）を黄褐色の油状物として提供した。1H  NMR  (400  MHz,  CDCl3)  δ  8.06  (dd,  J  =  8.1,  1.7  Hz,  1H),  7.99  (d,  J  =  1.6  Hz,  1H),  7.58  (d,  J  =  8.1  Hz,  1H),  3.95  (s,  3H),  2.34  (s,  3H),  1.36  (s,  6H).  13C  (126  MHz,  CDCl3)  δ  191.7,  167.3,  157.7,  145.7,  130.1,  126.9,  122.7,  119.6,  53.9,  52.1,  22.9,  15.7.Ｃ１３Ｈ１６ＮＯ２（ＭＨ＋）のＨＲＭＳ（ＥＳＩ）計算値  ２１８．１１７６、実測値  ２１８．１１７３。
【化３７】
2020531497.tif 000039
【０１５３】
（Ｓ７）：密封容器中、Ｓ６（６．０ｇ、２８ｍｍｏｌ、１．０当量）を、ＭｅＣＮ（８０ｍＬ）中で２−（２−ブロモエチル）−１，３−ジオキソラン（５．０ｍＬ、４１ｍｍｏｌ、１．５当量）、ＮａＨＣＯ３（４．６ｇ、５５ｍｍｏｌ、２．０当量）、およびＮａＩ（６．２ｇ、４１ｍｍｏｌ、１．５当量）と合わせた。反応物を９５℃で１４．５時間撹拌すると、溶液の色が橙色から褐色に遷移した。粗製生成物をセライトで濾過し、減圧下で濃縮し、残留物を逆相カラムクロマトグラフィー（１５０ｇのＣ１８金カラム、０〜８０％ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ）によって精製して、Ｓ７（２．８ｇ、８．９ｍｍｏｌ、３２％）を濃緑色の油状物として得た。1H  NMR  (400  MHz,  CDCl3)  δ  7.90  (dd,  J  =  8.3,  1.8  Hz,  1H),  7.75  (d,  J  =  1.7  Hz,  1H),  6.62  (d,  J  =  8.3  Hz,  1H),  4.93  (t,  J  =  4.5  Hz,  1H),  4.09  (d,  J  =  2.3  Hz,  1H),  4.04  -  3.84  (m,  8H),  3.72  (t,  J  =  7.2  Hz,  2H),  2.03  (td,  J  =  7.5,  4.5  Hz,  2H),  1.36  (s,  6H).  13C  NMR  (126  MHz,  CDCl3)  δ  167.6,  160.7,  149.8,  137.6,  131.1,  123.3,  120.2,  104.7,  102.5,  76.4,  65.1,  51.79,  43.81,  37.39,  30.23,  30.01.Ｃ１８Ｈ２３ＮＯ４（ＭＨ＋）のＨＲＭＳ（ＥＳＩ）計算値  ３１８．１７００、実測値  ３１８．１６９５。
【化３８】
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【０１５４】
（Ｓ９）：ＭｅＣＮ（５０ｍＬ、０．３８Ｍ）中、Ｓ８（４．６ｇ、１９ｍｍｏｌ、１．０当量）の不均質混合物に、新しく調製したニートな３−ブテニルトリフレート（Ｓ２、５．１ｇ、２５ｍｍｏｌ、１．３当量）を室温でゆっくり添加した。１５分後、得られた濃色の混合物を、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（５０ｍＬ）で処理した。得られた混合物を、セライトを介して濾過し、その得られた溶液の体積を、ロータリーエバポレーターで低減した（約５０ｍＬ）。この溶液を、逆相クロマトグラフィー（１５０ｇのＣ１８Ａｑ金カラム、０〜１５％ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ）で精製して、クリーンなＳ９（２．２ｇ、７．４ｍｍｏｌ、４０％）を桃色の固体として得た。1H  NMR  (400  MHz,  DMSO-d6)  δ  7.35  (dd,  J  =  8.0,  1.7  Hz,  1H),  7.33  (d,  J  =  1.5  Hz,  1H),  6.57  (d,  J  =  8.1  Hz,  1H),  5.83  (ddt,  J  =  17.1,  10.2,  7.0  Hz,  1H),  5.06  (dq,  J  =  17.2,  1.4  Hz,  1H),  4.98  (dd,  J  =  10.1,  2.1  Hz,  1H),  3.94  (d,  J  =  1.8  Hz,  1H),  3.90  (d,  J  =  1.8  Hz,  1H),  3.60  (t,  J  =  7.1  Hz,  2H),  2.31  (q,  J  =  6.9  Hz,  2H),  1.26  (s,  6H).13C  NMR  (126  MHz,  DMSO-d6)  δ  160.9,  145.9,  139.5,  136.3,  136.1,  125.9,  120.0,  117.3,  104.4,  75.2,  44.0,  41.2,  30.5,  30.2.Ｃ１５Ｈ１９ＮＯ３Ｓ（ＭＨ＋）のＨＲＭＳ（ＥＳＩ）計算値  ２９４．１１５８、実測値  ２９４．１１５５。
【化３９】
2020531497.tif 000041
【０１５５】
（９）：Ｓ９（２．４ｇ、７．７ｍｍｏｌ、１．５当量）、Ｓ７（１．５ｇ、５．１ｍｍｏｌ、１当量）、マロンアルデヒドビス（フェニルイミン）一塩酸塩（１．６ｇ、６．１ｍｍｏｌ、１．２当量）、およびＥｔ３Ｎ（３．６ｍＬ、２６ｍｍｏｌ、５当量）のＭｅＯＨ（２６ｍＬ）中の溶液に、無水酢酸（１．０ｍＬ、１０ｍｍｏｌ、２当量）を添加した。室温で撹拌しながら、追加の無水酢酸（１．０ｍＬ、１０ｍｍｏｌ、２当量）を、反応の最初の１．５時間にわたって、およそ３０分ごとに添加して、合計３．９ｍＬ（４１ｍｍｏｌ、８当量）にした。反応中、溶液の色は、赤色から緑色、紫色、最後に濃青色に遷移した。合計４時間の反応時間が経過した後、ＬＣ／ＭＳ分析によって、Ｓ７が完全に消費され、３種類の可能なシアニン生成物の、およそ２：１：１比の非対称性の所望の生成物と望ましくない対称性シアニンの混合物が明らかになった。濃青色の溶液を、２：１のジエチルエーテル／ヘキサン（１８０ｍＬ）中で沈殿させ、遠心分離し（６８００ｒｐｍ、８分）、上清を除去した。この磨砕を３回実施し、真空中で乾燥させた後、濃青色の残留物を、逆相クロマトグラフィー（１５０ｇの金Ｃ１８カラム、０〜８０％ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ）を用いて精製して、５（０．７２ｇ、１．１ｍｍｏｌ、２２％）を濃青色の固体として得た。1H  NMR  (400  MHz,  CD3OD)  δ  8.35  (dt,  J  =  17.0,  13.0  Hz,  2H),  8.14  -  8.06  (m,  2H),  7.97  -  7.89  (m,  2H),  7.44  (d,  J  =  8.3  Hz,  1H),  7.34  (d,  J  =  8.3  Hz,  1H),  6.72  (t,  J  =  12.4  Hz,  1H),  6.48  (d,  J  =  13.9  Hz,  1H),  6.34  (d,  J  =  13.4  Hz,  1H),  5.90  (ddt,  J  =  17.2,  10.2,  7.1  Hz,  1H),  5.10  -  5.02  (m,  2H),  4.99  (t,  J  =  3.8  Hz,  1H),  4.30  (t,  J  =  6.9  Hz,  2H),  4.26  (t,  J  =  7.0  Hz,  2H),  3.98  -  3.84  (m,  7H),  2.64  (q,  J  =  7.1  Hz,  2H),  2.21  (td,  J  =  7.0,  3.8  Hz,  2H),  1.77  (d,  J  =  5.6  Hz,  12H).  13C  NMR  (126  MHz,  CD3OD)  δ  175.8,  172.6,  166.6,  155.8,  154.2,  146.4,  143.2,  142.7,  141.4,  141.1,  133.4,  130.5,  126.7,  125.8,  123.0,  120.0,  117.8,  111.1,  110.0,  105.5,  103.6,  101.6,  64.7,  51.3,  49.7,  48.6,  48.2,  43.1,  38.5,  31.7,  30.0,  26.4.Ｃ３６Ｈ４３Ｎ２Ｏ７Ｓ（ＭＨ＋）のＨＲＭＳ（ＥＳＩ）計算値  ６４７．２７８５、実測値  ６４７．２７７６。
【化４０】
2020531497.tif 000042
【０１５６】
（１０）：５（１２０ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ、１．０当量）およびホベイダ（Hoyveyda）−グラブス触媒第２世代（５８ｍｇ、０．０９３ｍｍｏｌ、０．５当量）の無水ＣＨ２Ｃｌ２（９．３ｍＬ）中の溶液に、アクロレインジメチルアセタール（２、１１０μＬ、０．９５ｍｍｏｌ、５．０当量）をアルゴン下で添加した。青色の溶液を、閉じた還流冷却器を用いてアルゴンおよび静的真空（およそ３０分ごとに再適用した）下で室温において５時間撹拌した。得られた青色の混合物を、１：１のジエチルエーテル／ヘキサン（４５ｍＬ）中で沈殿させ、遠心分離し（７５００ｒｐｍ、５分）、デカンテーションした。この沈殿を繰り返した後、ペレットを高真空下で乾燥させて、６（１３０ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ、９７％）を濃青色の固体として得、それをさらに精製することなく使用した。1H  NMR  (500  MHz,  CD3OD)  δ  8.36  (q,  J  =  13.7  Hz,  2H),  8.13  -  8.08  (m,  2H),  7.95  -  7.90  (m,  2H),  7.46  -  7.41  (m,  1H),  7.35  (dd,  J  =  8.3,  2.2  Hz,  1H),  6.72  (t,  J  =  12.4  Hz,  1H),  6.48  (d,  J  =  13.8  Hz,  1H),  6.35  (d,  J  =  13.4  Hz,  1H),  5.90  (ddd,  J  =  14.6,  7.6,  6.5  Hz,  1H),  5.49  -  5.37  (m,  1H),  4.99  (t,  J  =  3.8  Hz,  1H),  4.58  (dd,  J  =  5.3,  1.0  Hz,  1H),  4.32  (t,  J  =  6.9  Hz,  2H),  4.26  (t,  J  =  7.1  Hz,  2H),  4.01  -  3.79  (m,  7H),  3.37  (s,  3H),  2.66  (td,  J  =  8.0,  7.4,  5.3  Hz,  2H),  2.21  (td,  J  =  7.0,  4.0  Hz,  2H),  1.81  -  1.75  (m,  12H).  13C  NMR  (126  MHz,  MeOD)  δ  175.7,  172.7,  166.6,  155.7,  154.2,  146.3,  143.3,  142.7,  141.4,  141.2,  130.8,  130.6,  129.7,  126.7,  126.7,  125.9,  123.0,  120.0,  111.1,  110.1,  105.6,  103.7,  102.8,  101.6,  64.7,  51.3,  49.6,  48.6,  48.4,  48.2,  43.1,  38.6,  30.0,  26.3.Ｃ３９Ｈ４８Ｎ２Ｏ９Ｓ（ＭＨ＋）のＨＲＭＳ（ＥＳＩ）計算値  ７２１．３１５３、実測値  ７２１．３１４４。
【化４１】
2020531497.tif 000043
【０１５７】
（Ｓ１０）：６（０．１３ｇ、０．１８ｍｍｏｌ、１当量）のＣＨ２Ｃｌ２（１２ｍＬ、０．０１５Ｍ）中の濃青色の溶液を、−７８℃に冷却し（ドライアイスおよびアセトン浴）、アルゴン下で脱気した。ＢＢｒ３（１．０Ｍ  ＣＨ２Ｃｌ２溶液２．１ｍＬ、２．１ｍｍｏｌ、１２当量）をゆっくり添加すると、反応物の色が赤褐色に遷移した。温度を−７８℃に維持しながら、反応物をアルゴン下で４時間にわたって撹拌し、その時点で、Ｈ２Ｏ（１０ｍＬ）を添加することによって反応をクエンチすると、すぐに青色に戻った。ＬＣ／ＭＳ分析によって、出発材料が完全に消費されたことが明らかになった。室温に加温した後、有機溶媒を減圧下で蒸発させた。残りの青色の水溶液を、逆相クロマトグラフィー（３０ｇのＣ１８金カラム、０〜６０％ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ）によって精製して、化合物Ｓ１０のジアステレオマー混合物（５７ｍｇ、０．０９４ｍｍｏｌ、５３％）を濃青色の固体として得た。Ｃ３５Ｈ３６Ｎ２Ｏ６Ｓ（ＭＨ＋）のＨＲＭＳ（ＥＳＩ）計算値  ６１３．２３６７、実測値  ６１３．２３６０。
【化４２】
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【０１５８】
（７）：Ｓ１０のジアステレオマー混合物（４３ｍｇ、０．０７０ｍｍｏｌ）を、ＭｅＯＨ（５．８ｍＬ）およびＨＣｌ水溶液（０．３０Ｍ、１７ｍＬ）に溶解させた。この反応混合物を６０℃に７時間加熱し、その間に色が濃青色から緑青色に遷移した。室温に冷却した後、反応物を減圧下で乾燥させて、ＮＭＲ分析によって確認される通り、Ｓ１０の単一ジアステレオマーを得た。この平衡化したメチルエステル中間体の粗製固体を、ＭｅＯＨ（３．５ｍＬ）およびＬｉＯＨ水溶液（２．０Ｍ、３．５ｍＬ）に再溶解させた。得られた青色の溶液を、室温で２．５時間撹拌し、その時点で、ＬＣ／ＭＳ分析によって７への完全な変換が明らかになった。飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（３．０ｍＬ）を添加して、反応をクエンチした。ＭｅＯＨを真空中で除去した後、粗製の水性混合物を、逆相クロマトグラフィー（３０ｇのＣ１８金カラム、０〜７０％ＭｅＣＮと０．０５％ギ酸／Ｈ２Ｏと０．０５％ギ酸）によって精製して、７（３４ｍｇ、０．０５７ｍｍｏｌ、８２％）を青色の固体として得た。1H  NMR  (500  MHz,  DMSO-d6)  δ  8.08  (s,  1H),  8.04  (s,  1H),  7.99  (s,  1H),  7.95  (d,  J  =  8.2  Hz,  1H),  7.89  (s,  1H),  7.69  (d,  J  =  8.1  Hz,  1H),  7.36  (d,  J  =  8.2  Hz,  1H),  7.23  (d,  J  =  8.3  Hz,  1H),  4.57  (dd,  J  =  11.4,  4.7  Hz,  1H),  4.51  (dd,  J  =  11.3,  4.6  Hz,  1H),  4.34  (d,  J  =  10.3  Hz,  1H),  4.24  (d,  J  =  9.5  Hz,  1H),  3.89  (t,  J  =  11.7  Hz,  1H),  3.80  (t,  J  =  12.9  Hz,  1H),  2.75  (t,  J  =  12.4  Hz,  1H),  2.43  (d,  J  =  12.2  Hz,  1H),  2.35  (dd,  J  =  7.0,  4.5  Hz,  1H),  2.28  (d,  J  =  12.9  Hz,  1H),  1.88  (dd,  J  =  12.2,  5.0  Hz,  1H),  1.77  -  1.62  (m,  13H),  1.34  (q,  J  =  11.8  Hz,  1H).  13C  NMR  (126  MHz,  DMSO-d6)  δ  169.4,  166.3,  162.4,  145.1,  143.9,  142.9,  140.4,  140.0,  139.3,  138.6,  129.2,  128.4,  124.9,  122.1,  118.8,  114.4,  109.7,  109.3,  107.9,  70.2,  68.4,  48.2,  46.3,  42.1,  39.4,  33.5,  29.2,  26.3,  25.9,  25.6,  25.4.  C35H36N2O6S  (MH+)のＨＲＭＳ（ＥＳＩ）計算値  599.2210、実測値  599.2204.化合物７は、ＮＭＲ分析によって帰属したｓｙｎ−ｓｙｎ環接合点立体化学を有する単一ジアステレオマーであった（図６）。環接合点（位置１２、１４、および１５）に位置しているすべての３つのメチンプロトンは、ｓｙｎ，ｓｙｎジアステレオマーと合致する、高磁場軸方向のα−窒素プロトン（３．８８（ｔｑ、Ｊ＝１３．３、４．５Ｈｚ、２Ｈ）−位置１０および１７）との１Ｄ−ＮＯＥＳＹ相互作用を示した。さらに、これらのプロトンはいずれも、低磁場エカトリアルα−窒素プロトン（４．４０〜４．２４（ｍ，２Ｈ）−位置１０および１７）に対してＮＯＥを示さなかったが、それは任意の他のジアステレオマー構造のうちの少なくとも１つのメチンプロトンについても予測される。また、ｓｙｎ−ｓｙｎジアステレオマーの形成と合致して、α−酸素プロトン（位置１４および１５）は、ほぼ同じカップリング定数を示したが、このことは、これらのプロトンが類似の環系にあることを示している。
【化４３】
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【０１５９】
（Ｓ１１）：７（６．０ｍｇ、０．０１０ｍｍｏｌ、１当量）のＤＭＦ（０．２０ｍＬ、０．０５Ｍ）中の溶液に、ＴＳＴＵ（４．５ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ、１．５当量）およびＤＩＰＥＡ（１．８μＬ、０．０２０ｍｍｏｌ、２当量）を添加した。この青色の溶液を室温で１．５時間撹拌し、その時点で、ＬＣ／ＭＳ分析によってＳ１１への完全な変換が明らかになった。次に、混合物をエーテル（１４ｍＬ）中で沈殿させ、遠心分離し（６０００ｒｐｍ、５分）、上清をデカンテーションした。このエーテル洗浄を繰り返した後、濃青色の固体を真空中で乾燥させて、Ｓ１１（６．９ｍｇ、０．００９８ｍｍｏｌ、９８％）を得、それをさらに精製することなく使用した。
【化４４】
2020531497.tif 000046
【０１６０】
（８）：Ｓ１１（３．０ｍｇ、０．００４３ｍｍｏｌ、１当量）のＤＭＦ（０．１５ｍＬ、０．０３Ｍ）中の溶液に、ＮＨ２−ＰＥＧ８−ＣＯＯＨ（２．３ｍｇ、０．００５３ｍｍｏｌ、１．２当量）およびＤＩＰＥＡ（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、３．８μＬ、０．０２２ｍｍｏｌ、５当量）を添加した。この青色の溶液を室温で１．５時間撹拌し、その時点で、ＬＣ／ＭＳ分析によってＳ１２の完全な消費が明らかになった。得られた溶液を、１：１のエーテルおよびヘキサン（１４ｍＬ）中で沈殿させ、遠心分離し（４０００ｒｐｍ、５分）、上清を除去した。この磨砕を繰り返し、得られた青色の残留物を、逆相クロマトグラフィー（５．５ｇのＣ１８Ａｑ金カラム、０〜７０％ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏと０．０５％ギ酸）によって精製して、８（２．３ｍｇ、０．００２３ｍｍｏｌ、５４％）を青色の固体として得た。Ｃ５３Ｈ７１Ｎ３Ｏ１５Ｓ（ＭＨ＋）のＨＲＭＳ（ＥＳＩ）計算値  １０２２．４６７９、実測値  １０２２．４６７９。
【化４５】
2020531497.tif 000047
【０１６１】
（Ｓ１２）：８（３．４ｍｇ、０．００３３ｍｍｏｌ、１当量）のＤＭＦ（０．１７ｍＬ、０．０２Ｍ）中の溶液に、ＴＳＴＵ（１．５ｍｇ、０．００５０ｍｍｏｌ、１．５当量）およびＤＩＰＥＡ（１．７μＬ、０．０１０ｍｍｏｌ、３当量）を添加した。この青色の反応混合物を、室温で２時間撹拌し、その時点で、ＬＣ／ＭＳ分析によって完全な変換が明らかになった。溶液を１：１のエーテル／ヘキサン（１４ｍＬ）中で沈殿させ、遠心分離し（６５００ｒｐｍ、５分）、上清をデカンテーションした。この沈殿を繰り返した後、青色の残留物を減圧下で乾燥させて、Ｓ１２（３．４ｍｇ、０．００３０ｍｍｏｌ、９１％）を得、それをさらに精製することなく使用した。
【化４６】
2020531497.tif 000048
【化４７】
2020531497.tif 000049
【０１６２】
（９）：Ｓ１２（０．９８ｍｇ、８．８×１０−４ｍｍｏｌ、１当量）のＤＭＳＯ（０．１２μＬ、０．００８Ｍ）中の溶液に、アミノファロイジントシレート（０．８０ｍｇ、８．８×１０−４ｍｍｏｌ、１当量）およびＤＩＰＥＡ（０．７３μＬ、０．００４２ｍｍｏｌ、５当量）を添加した。この溶液を室温で１時間撹拌し、その時点で、ＬＣ／ＭＳ分析によって、アミノファロイジントシレートの消費が明らかになった。青色の反応混合物を、１．５：１のエーテル／ヘキサン（１．４ｍＬ）中で沈殿させ、遠心分離し（６０００ｒｐｍ、３０秒）、上清を除去した。この磨砕を合計３回実施した。減圧下で乾燥させた後、青色の残留物を、逆相分取ＨＰＬＣ（２０〜９５％ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏと０．１％ギ酸）によって精製し、凍結乾燥して、９（１．２ｍｇ、６．６×１０−４ｍｍｏｌ、７６％）を青色の固体として得た。Ｃ８８Ｈ１１８Ｎ１２Ｏ２４Ｓ２（［Ｍ＋２Ｈ＋］＋２）のＨＲＭＳ（ＥＳＩ）計算値  ８９６．３９８４、実測値  ８９６．３９７１。
（実施例２）
配座が束縛されたヘプタメチンシアニンフルオロフォアの例示的な合成
【化４８】
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【０１６３】
インドレニンおよびビスビニル性アミドを、１０：１のＥｔＯＨ／ＡｃＯＨ中で合わせ、７０℃に加熱した。２時間後、混合物をＣＨ２Ｃｌ２および飽和重炭酸ナトリウムで抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮し、次に順相クロマトグラフィーで精製して、生成物を提供した。
【化４９】
2020531497.tif 000051
【０１６４】
ケトンのＣＨ２Ｃｌ２溶液に、１０当量のアクロレインジメチルアセタールおよび０．４当量のＨＧ−２を添加した。溶液を室温で１８時間維持し、濃縮し、順相クロマトグラフィーによって精製して、生成物を提供した。
【化５０】
2020531497.tif 000052
【０１６５】
ケトンのＴＨＦ溶液を、１Ｎ  ＨＣｌで処理した。３０分後、混合物をＣＨ２Ｃｌ２および飽和重炭酸ナトリウムで抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮し、次に精製することなく次のステップで使用した。
【化５１】
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【０１６６】
ケトン、ＣＨ２Ｃｌ２、およびピリジンを−７８℃に冷却し、Ｔｆ２Ｏ（トリフルオロメタンスルホン酸無水物）を添加した。溶液を室温に加温し、ＣＨ２Ｃｌ２および飽和重炭酸ナトリウムで抽出した。順相クロマトグラフィーで精製して、生成物を提供した。
【化５２】
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【０１６７】
トリフレート、ボロン酸、およびＰｄ（ＰＰｈ３）４を、１：１のｉＰｒＯＨ：Ｈ２Ｏに溶解させ、９０℃に加熱した。１８時間後、混合物をＣＨ２Ｃｌ２および飽和重炭酸ナトリウムで抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮し、次に順相クロマトグラフィーで精製して、生成物を提供した。
（実施例３）
配座が束縛されたシアニンフルオロフォアの特徴付け
【０１６８】
配座が束縛された化合物４および７の分光学的特性を、制限されていない化合物１０の分光学的特性と比較した。
【化５３】
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【表１】
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ａメタノール中、ｂｐＨ７．４のＰＢＳ中、ｃＨ２Ｏ中
【０１６９】
化合物４および７は、配座の束縛の特徴的な特色を示した。量子収率は、化合物１０による０．１５（ＭｅＯＨ）から、それぞれ化合物４および７による０．６９（ＭｅＯＨ）および０．５５（ＰＢＳ）に増大する（表１）。このことは、どちらの場合もおよそ２５ｎｍのλｍａｘの偏移と共に生じる。蛍光寿命および量子収率は共に、光異性化を受ける従来のペンタメチンシアニン１０とは異なり、大部分が溶媒粘度に非感受性である（表２）。
【表２】
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＊積分球による参照ΦＦ−他のΦＦ値は、比較方法によって算出した
【０１７０】
さらに、化合物４の発光（四角）は、やはり化合物１０（丸）とは異なり、温度に対して非感受性である（図７）。このことはやはり、高温であるほど効率的になる化合物１０の光異性化に起因している。制限されていないシアニン１０と比較して、化合物４および７の実質的により長い寿命は、蛍光寿命画像化顕微鏡法（ＦＬＩＭ）の著しい潜在可能性を示している。
（実施例４）
配座が束縛されたシアニンフルオロフォアを用いる単一分子局在性顕微鏡法
【０１７１】
単一分子局在性顕微鏡法（ＳＭＬＭ）の中心的な特色は、蛍光性状態と非蛍光性状態との間のフルオロフォアの光活性化または変換である。この文脈では、（１）チオール−および（２）ホスフィン−ポリエン付加物の可逆的形成、ならびに（３）イミン様Ｃ２−Ｎ二重結合の逐次的な還元／酸化の３つの形式のシアニン反応性が適用される。
【０１７２】
実施例３の化合物４、７、および１０を評価した。最も際立つことには、ＮａＢＨ４による還元後、ＵＶ光によって誘導された化合物４の再生は、制限されていないシアニンと比較して、劇的に増強された。２．０当量のＮａＢＨ４（１：１のＤＭＳＯ：ＭｅＯＨ中２．５ｍＭ）による化合物４の還元、その後のＵＶ光（３６５ｎｍ、５ｍＷ／ｃｍ２）を用いた４：１のＰＢＳ（５０ｍＭ、ｐＨ７．４）：ＤＭＳＯ中２０μＭ溶液の光分解によって、５分後に化合物４（四角）で最大シアニン吸光度の３８％が回収されたが、化合物１０（丸）では、３０分後の最大回収率はわずか６％であった（図８）。吸光度は、３６５ｎｍ照射（５ｍＷ／ｃｍ２）の時間関数として、λｍａｘ（化合物４については６４０ｎｍ、化合物１０については６６０ｎｍ）で測定した。
【０１７３】
ホスフィンおよびチオール付加物の形成を、化学的および単一分子画像化の文脈でも評価した。ＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）を、化合物７およびＡＦ６４７（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃを介して利用可能）（各１０μＭ）に添加した（Vaughan  et  al.,JACS  2013,135(4):1197-1200）。Ｔｒｉｓ（０．２０Ｍ、ｐＨ９．０）中のＴＣＥＰ濃度の関数として、λｍａｘ（化合物７については６７０ｎｍ、ＡＦ６４７については６５０ｎｍ）における吸光度。化合物７（丸）は、ポリエン−ヘテロ原子付加物の形成に抵抗性であるように見えた（図９）。
（実施例５）
配座が束縛されたファロイジンコンジュゲートの結合および可視化
【０１７４】
実施例３のファロイジンコンジュゲート９を初期広視野研究で適用して、細胞Ｆ−アクチンを可視化した。これらの研究には、広く使用されている商業的に利用可能なＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７−ファロイジンコンジュゲート（ＡＦ６４７−ファロイジン）との比較が含まれていた。化合物９の還元およびＵＶ−活性化（３７０ｎｍ）によって、ＡＦ６４７−ファロイジンと比較して回収が劇的に改善された。化合物９の光安定性は、ＡＦ６４７−ファロイジンの光安定性とほとんど区別することができなかった。
【０１７５】
ファロイジンコンジュゲート９を、３Ｄ  ＰＡＬＭ様の超解画像化を用いて、二方向画像化スキーム（ＢＰ）（Ram  et  al.,J.,Biophys  J  2008,95:6025）をＴＲＡＢＩ（Franke  et  al.Nat  Methods  2017,14:41）と組み合わせて利用して評価して、単一分子強度を正確に定量すると同時にＴＲＡＢＩ−ＢＰ画像化を実施した。標識化および還元（２６ｍＭ  ＮａＢＨ４）、その後の非脱気リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中での画像化によって、Ｕ２ＯＳ（ヒト骨肉腫上皮）細胞におけるアクチン細胞骨格の高品質３Ｄ超解画像を提供した（図１０）。フレーム当たり平均５１８１の光子（中央値）を、単一の活性化色素から検出すると同時に、連続フレームにおいて活性な放射体を追跡することによって、光退色または非蛍光性形態への変換の前に、６９６１の合成光子数（中央値）を得た。これは、実験的に測定された、横方向に５〜７ｎｍおよび軸方向に約２０ｎｍの位置決定精度に相当する。６４０ｎｍまたは６６０ｎｍのいずれかによる励起を用いることができ、後者は光子収率をいくらか改善する。ＵＶレーザーは回収を促進することができるが、単に励起レーザー（６４０または６６０のいずれか）を使用して得られた光活性化は、ＳＭＬＭに適した放射体密度を生じさせるのに十分であった。ＳＭＬＭ実験では、４０５ｎｍの光を非常にごく短期間適用した場合、還元状態の回収は、ほぼ定量的に進行した。それに対して、ＡＦ６４７−ファロイジンを還元／回収の順に供した場合、再構築を得ることができなかった。還元的方法を使用して化合物９により得られた画像を、標準ｄＳＴＯＲＭ緩衝液条件下でＡＦ６４７と比較した。コンジュゲート９は、ＡＦ６４７−ファロイジンと比較して、わずかに改善された場合には類似の光子カウント（９：フレーム当たり３７２１、追跡５１０７、ＡＦ６４７：フレーム当たり３４２２、追跡３７３７）、ならびにそれぞれ５．２ｎｍおよび５．９ｎｍの位置決定精度を示した（図１１〜１３）。図１１は、図１０の画像から算出した、横方向および軸方向の位置決定精度を示す。図１２は、標準ｄＳＴＯＲＭ光スイッチング緩衝液における、化合物９３Ｄ（左）について示されたデータの単一フレーム（黒色）および追跡（灰色）中央値と、化合物９（中央）およびＡＦ６４７（右）の２Ｄ画像モードの同等の測定値に関する、単一分子光子強度の比較を示す棒グラフである。図１３は、化合物９３Ｄ（６．９ｎｍ）、化合物９２Ｄ（５．２ｎｍ）およびＡＦ６４７２Ｄ（５．９ｎｍ）の実験的に決定された横方向の位置決定精度を示す棒グラフである。
（実施例６）
配座が束縛されたシアニンフルオロフォアを用いる腫瘍可視化
【０１７６】
腫瘍を有する対象を、処置のために同定し、選択する。対象は、臨床所見に基づき、かつ／または腫瘍の存在を証明するための試験を実施することによって選択することができる。
【０１７７】
式Ｉによる化合物、その薬学的に許容される塩、またはその医薬組成物を、臨床医によって有効であると決定された用量で投与することによって、対象を処置する。化合物を、任意の適切な手段、例えば静脈内または皮下注射によって投与する。一部の例では、化合物は、腫瘍に直接注射される。
【０１７８】
可視化は、腫瘍に化合物を結合させるのに十分な時間が経過した後に実施することができる。例えば、照射は、化合物投与の数時間後から数日後、例えば化合物投与の１〜７日後に実施することができる。対象の標的化部分に、シアニンフルオロフォアの蛍光を誘導するのに適した波長と選択された強度を有する有効量の光の適用を標的化し、それによってシアニンフルオロフォアを励起することによって、投与した化合物に照射する。有利には、照射の標的となる対象の部分は、腫瘍に近接している。化合物の蛍光は、蛍光画像化の分野の当業者に公知の任意の適切な方法によって検出される。蛍光ガイド手術を使用して、組織切除の位置および程度を決定する。
【０１７９】
一部の場合では、対象は、腫瘍を有すると疑われ、腫瘍の存在は、対象に化合物を投与し、疑わしい腫瘍部位における化合物の蛍光をモニタリングすることによって確認される。疑わしい腫瘍部位における化合物および蛍光の蓄積により、腫瘍が存在すると診断される。
【０１８０】
図１４を参照すると、腫瘍１１０を有する対象１００は、腫瘍細胞表面上の抗原または受容体を認識し、結合することができる抗体またはリガンドを含む式Ｉによる化合物で処置することができる。図１４に示される例では、化合物１２０は、静脈内注射を介して投与される。抗体またはリガンド部分が腫瘍に結合するにつれて化合物が腫瘍部位に優先的に蓄積する時間が経過するのを待つ。その後、対象の標的部分に、外部光アプリケーター１３０を使用して、望ましい波長の有効量の遠赤またはＮＩＲ光エネルギーを選択的に照射する。光アプリケーター１３０は、腫瘍１１０の領域に限定された標的領域に光を適用し、それによって化合物の蛍光を生じさせる。腫瘍は、蛍光を検出することによって可視化される。
【０１８１】
治療有効量の第２の薬剤を、式Ｉによる化合物またはその塩と併用投与することができる。化合物（またはその塩）および第２の薬剤は、別個に、または単一組成物中で一緒に投与することができる。第２の薬剤は、同じ経路または異なる経路によって投与することができる。同時に投与する場合、化合物（またはその塩）および第２の薬剤は、単一の医薬組成物に組み合わせることができ、または２つの医薬組成物として同時に投与することができる。第２の薬剤は、例えば、抗腫瘍剤または血管新生阻害剤であってもよい。
（実施例６）
ビス−スルホン化された配座が束縛されたシアニンフルオロフォアの合成
【０１８２】
配座が束縛されたシアニン色素１７の合成は、図１５に記載されている。ラセミ体のメチル６−メチル−７−オキソオクタノエート１１から出発して、フィッシャーインドール合成を、４−ヒドラジニルベンゼンスルホン酸（4-hydrazineylbenzenesulfonic  acid）を用いて行って、１２を収率７６％で生成した。その後のＮ−アルキル化を、２−（２−ヨードエチル）−１，３−ジオキソランの存在下で、９５℃において実施して、生成物３を収率５１％で得た。シアニン骨格を、化合物１３、１−（ブタ−３−エン−１−イル）−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドール−１−イウム−５−スルホネートカリウム塩、およびＮ−（（１Ｅ，３Ｅ）−３−（フェニルイミノ）プロパ−１−エン−１−イル）アニリンの３つの部分を反応させることによって形成して、所望の生成物１４を収率２４％で得た。交差メタセシスを、アクロレインジメチルアセタールを用いて、ホベイダ−グラブス触媒およびＢｕ４ＮＢｒの下で実施して、１５を生成した。非常に重要な分子内マイケル付加関連環化反応カスケードを、ＢＢｒ３およびＢｕ４ＮＢｒの存在下で進行させて、ジアステレオマー混合物を得、それをＨＣｌ／ＭｅＯＨの平衡化条件下で６０℃において２つのジアステレオマー１６に変換した。収率は、３つのステップで４１％であった。メチルエステルをＬｉＯＨで加水分解して、逆相Ｃ−１８カラム精製後に、最終生成物１７を収率４３％で得た。
実験の詳細
【０１８３】
ナトリウム３−（５−メトキシ−５−オキソペンチル）−２，３−ジメチル−３Ｈ−インドール５−スルホネート（１２）。メチル６−メチル−７−オキソオクタノエート（１．８６ｇ、１０ｍｍｏｌ）を、撹拌したｐ−ヒドラジノベンゼンスルホン酸（２．２４ｇ、１０ｍｍｏｌ）の酢酸（６ｍＬ）中の溶液に添加した。溶液を４時間加熱還流し、次に室温に冷却した。溶媒を蒸発させた。Ｎａ２ＣＯ３（１．０６ｇ、１０ｍｍｏｌ）を、メタノール（１５ｍＬ）に溶解させた残留物に添加した。得られた混合物を室温で１５時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、残留物を、逆相カラムクロマトグラフィーによって精製して、１２（２．７２ｇ、７．６ｍｍｏｌ、７６％）を得た。1H  NMR  (400  MHz,  CD3OD):  δ  7.84-7.80  (m,  2H),  7.46  (d,  1H,  J  =  7.8  Hz),  3.57  (s,  3H),  2.28  (s,  3H),  2.16  (dt,  2H,  J  =  7.4,  2.3  Hz),  2.04-1.84  (m,  2H),  1.50-1.41  (m,  2H),  1.34  (s,  3H),  0.74-0.56(m,  2H).  LC-MS  (ESI)  340  (M+).
【０１８４】
１−（２−（１，３−ジオキソラン−２−イル）エチル）−３−（５−メトキシ−５−オキソペンチル）−２，３−ジメチル−３Ｈ−インドール−１−イウム−５−スルホネート，ナトリウム塩（１３）。密封容器中、化合物１２（２．２５ｇ、６．２３ｍｍｏｌ）を、ＣＨ３ＣＮ（２０ｍＬ）中、２−（２−ブロモエチル）−１，３−ジオキソラン（１．１ｍＬ、９．３４ｍｍｏｌ）、ＮａＨＣＯ３（１．５７ｇ、１８．６ｍｍｏｌ）、およびＮａＩ（１．４０ｇ、９．３４ｍｍｏｌ）と合わせた。反応物を、９５℃においてアルゴン雰囲気下で１５時間撹拌すると、溶液の色が褐色に変化した。粗製生成物を減圧下で濃縮し、残留物を逆相カラムクロマトグラフィーによって精製して、１３（１．４５ｇ、３．１４ｍｍｏｌ、５１％）を得た。1H  NMR  (400  MHz,  CD3OD):  δ  7.61  (d,  1H,  J  =  7.8  Hz),  7.50  (s,  1H),  6.62  (d,  1H,  J  =  7.8  Hz),  4.97  (m,  1H),  4.03-3.93  (m,  4H),  3.71-3.65  (m,  2H),  3.58  (s,  3H),  2.19-2.10  (m,  3H),  2.06-2.20  (m,  2H),  1.96-1.90  (m,  2H),  1.56-1.46  (m,  2H),  1.43  (s,  3H),  1.05-0.82  (m,  2H).  LC-MS  (ESI)  440  (M+).
【０１８５】
１−（２−（１，３−ジオキソラン−２−イル）エチル）−２−（（１Ｅ，３Ｅ）−５−（（Ｅ）−１−（ブタ−３−エン−１−イル）−３，３−ジメチル−５−スルホナトインドリン−２−イリデン）ペンタ−１，３−ジエン−１−イル）−３−（５−メトキシ−５−オキソペンチル）−３−メチル−３Ｈ−インドール−１−イウム−５−スルホネート（１４）。無水酢酸（０．８７ｍＬ、９．２１ｍｍｏｌ）を、１３（２．１０ｇ、４．５４ｍｍｏｌ）、１−（ブタ−３−エン−１−イル）−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドール−１−イウム−５−スルホネート，カリウム塩（１．５１ｇ、４．５４ｍｍｏｌ）、マロンアルデヒドビス（フェニルイミン）一塩酸塩（１．２１ｇ、５．４５ｍｍｏｌ）、およびＥｔ３Ｎ（３．２ｍＬ、２２．７ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（２３ｍＬ）中の溶液に添加した。室温で撹拌しながら、追加の無水酢酸（０．８７ｍＬ、９．２１）を、最初の１．５時間中３０分ごとに添加し、合計３．４８ｍＬ（３６．８ｍｍｏｌ）にした。反応中、溶液の色は、赤色から緑色、紫色、最後に濃青色に遷移した。合計１５時間の反応時間が経過した後、ＬＣ／ＭＳ分析によって、３種類の可能なシアニン生成物の、およそ２：１：１比の非対称性の所望の生成物と望ましくない対称性シアニンの混合物が明らかになった。２：１のジエチルエーテル／ヘキサン溶液（１８０ｍＬ）を添加すると、沈殿物が形成され、それを遠心分離によって収集した。この固体を、２：１のジエチルエーテル／ヘキサンと共に３回磨砕し、真空中で乾燥させた後、濃青色の残留物を、逆相クロマトグラフィーを用いて精製して、１４（９４６ｍｇ、１．０９ｍｍｏｌ、２４％）を濃青色の固体として得た。1H  NMR  (400  MHz,  CD3OD):  δ  8.35-8.25  (m,  2H),  7.89-7.85  (m,  4H),  7.35  (dd,  2H,  J  =  20.1,  8.4  Hz  ),  6.72  (m,  1H),  6.40  (t,  2H,  J  =  12.9  Hz  ),  5.89  (m,  1H),  5.04-4.95  (m  3H),  4.26-4.23  (m,  4H),  3.96-3.93  (m,  2H),  3.85-3.81  (m,  2H),  3.53  (s,  3H),  2.62-2.57  (m,  2H),  2.47  (s,  1H),  2.23-2.12  (m,  5H),  1.74  (s,  3H),  1.73  (s,  3H),  1.70  (s,  3H),  1.50-1.42  (m,  2H),  0.93  (m,  1H),  0.63  (m,  1H).  LC-MS  (ESI)  769  (M+).
【０１８６】
（７ａＳ，８ａＲ，９ａＳ）−２０−（５−メトキシ−５−オキソペンチル）−１７，１７，２０−トリメチル−６，７，７ａ，８ａ，９，９ａ，１０，１１，１７，２０−デカヒドロベンゾ［２’，３’］インドリジノ［８’，７’：５，６］ピラノ［２，３−ｇ］インドロ［２，１−ａ］イソキノリン−５−イウム−２，１５−ジスルホネート（１６）。アクロレインジメチルアセタール（１．１６ｍＬ、０．９８ｍｍｏｌ）を、４（８５０ｍｇ、０．９８ｍｍｏｌ）、ホベイダ−グラブス触媒第２世代（３１３ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）およびテトラブチルアンモニウムブロミド（９４６ｍｇ、２．９４ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）中の溶液に添加した。フラスコを排気し、アルゴンで５時間、およそ３０分ごとにフラッシュした。溶液をさらに１０時間撹拌した。１：１のジエチルエーテル／ヘキサン（３６０ｍＬ）溶液を、青色の混合物に添加し、沈殿物を遠心分離によって収集した。２回目の沈殿および遠心分離の後、ペレットを高真空下で乾燥させて、１５（６９４ｍｇ、収率７５％）を濃青色の固体として得、それをさらに精製することなく使用した。１５（６９４ｍｇ、０．７４ｍｍｏｌ）およびテトラブチルアンモニウムブロミド（７１４ｍｇ、２．２２ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（４９ｍＬ）中の濃青色の溶液を脱気し、アルゴン下で−７８℃に冷却した。ＢＢｒ３溶液（８．６ｍＬ、８．６ｍｍｏｌ、ＣＨ２Ｃｌ２中１．０Ｍ）をゆっくり添加すると、反応物の色が赤褐色に遷移した。反応物を、アルゴン下で−７８℃の温度において４時間撹拌し、その時点で、Ｈ２Ｏ（４０ｍＬ）を添加することによって反応をクエンチすると、すぐに青色に戻った。室温に加温した後、有機溶媒を減圧下で蒸発させた。残りの青色の水溶液を、逆相クロマトグラフィーによって精製して、ジアステレオマー混合物の生成物（３６７ｍｇ）を得た。ジアステレオマー混合物（３６７ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）を、ＭｅＯＨ（４１ｍＬ）およびＨＣｌ水溶液（０．３０Ｍ、１２０ｍＬ）に溶解させた。この反応混合物を、６０℃に７時間加熱し、その間に色が濃青色から緑青色に遷移した。溶媒を蒸発させた後、粗製混合物を、逆相クロマトグラフィーによって精製して、６（２９４ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ、収率４１％）を青色の固体として得た。1H  NMR  (400  MHz,  d6-DMSO):  δ  8.00  (s,  1H),  7.93  (s,  1H),  7.82  (d,  1H,  J  =  1.2  Hz),  7.72  (m,  1H),  7.64  (dd,  1H,  J  =  8.2,  1.6  Hz),  7.60  (dd,  1H,  J  =  8.2,  1.6  Hz),  7.26  (d,  1H,  J  =  8.2  Hz),  7.16  (dd,  1H,  J  =  8.2,  2.0  Hz),  4.56  (dd,  1H,  J  =  11.3,  5.1  Hz),  4.48  (m,  1H),  4.30-4.18  (m,  2H),  3.84-3.77  (m,  2H),  3.26  (s,  -OMe),  3.45  (s,  -OMe),  2.70  (m,  1H),  2.46-2.30  (m,  3H),  2.28-2.12  (m,  4H),  1.83  (m,  1H),  1.70  (s,  3H),  1.69  (s,  3H),  1.65  (s,  3H),  1.45-1.28  (m,  3H),  0.82  (m,  1H),  0.57  (m,  1H).  LC-MS  (ESI)  735  (M+).
【０１８７】
５−（（７ａＳ，８ａＲ，９ａＳ）−１７，１７，２０−トリメチル−２，１５−ジスルホナト−６，７，７ａ，８ａ，９，９ａ，１０，１１，１７，２０−デカヒドロベンゾ［２’，３’］インドリジノ［８’，７’：５，６］ピラノ［２，３−ｇ］インドロ［２，１−ａ］イソキノリン−５−イウム−２０−イル）ペンタノエート（１７）。化合物１６（２３９ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）を、ＭｅＯＨ（１４ｍＬ）およびＬｉＯＨ水溶液（２．０Ｍ、１４ｍＬ）に溶解させた。得られた青色の溶液を、室温で２．５時間撹拌した。飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１２．０ｍＬ）を添加して、反応をクエンチした。ＭｅＯＨを真空中で除去した後、粗製の水性混合物を、逆相クロマトグラフィーによって精製して、１７（１０１ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ、収率４３％）を青色の固体として得た。1H  NMR  (400  MHz,  d6-DMSO):  δ  8.01  (d,  1H,  J  =  3.9  Hz),  7.92  (s,  1H),  7.82  (d,  1H,  J  =  1.2  Hz),  7.72  (m,  1H),  7.63  (dd,  1H,  J  =  8.2,  1.6  Hz),  7.60  (dd,  1H,  J  =  8.2,  1.6  Hz),  7.25  (d,  1H,  J  =  8.2  Hz),  7.16  (dd,  1H,  J  =  8.4,  3.7  Hz),  4.56  (m,  1H),  4.48  (td,  1H,  ),  4.30-4.19  (m,  2H),  3.84-3.76  (m,  2H),  2.70  (m,  1H),  2.42-2.30  (m,  3H),  2.26-2.17  (m,  2H),  2.08-2.01  (m,  2H),  1.84  (m,  1H),  1.69  (s,  3H),  1.68  (s,  3H),  1.65  (s,  3H),  1.40-1.30  (m,  3H),  0.83  (m,  1H),  0.63  (m,  1H).  LC-MS  (ESI)  721  (M+).
ＶＩＩ．代表的な実施形態
【０１８８】
ある特定の代表的な実施形態を、以下の番号付きの項目に開示する。
【０１８９】
１．式Ｉ：
【化５４】
2020531497.tif 000058
［式中、Ａは、
【化５５】
2020531497.tif 000059
であり、各「＊」は、Ａの結合点を示し、
【化５６】
2020531497.tif 000060
によって表される結合は、原子価の要件を満たすために必要とされるように、単結合または二重結合であり、Ｒ１〜Ｒ９およびＲ１１は、独立に、Ｈ、重水素、アルキル、ヘテロアルキル、−Ｎ（Ｒａ）２、スルホネート、アルキルスルホネート、アミノ、アミノアルキル、−Ｃ（Ｏ）ＯＲａ、またはコンジュゲート可能な部分、標的化剤もしくは薬物を含む基であり、ここで、Ｒａは、Ｈ、重水素、アルキル、またはヘテロアルキルであり、Ｒ１０は、Ｈ、重水素、Ｏ、アルキル、アリール、アミノ、スルホネート、トリフレート、−Ｃ（Ｏ）ＯＲｂ、−ＯＲｂ、−Ｎ（Ｒｂ）２、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、またはコンジュゲート可能な部分、標的化剤もしくは薬物を含む基であり、ここで、各Ｒｂは、独立に、Ｈ、重水素、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、Ｙ１およびＹ２は、独立に、Ｃ（Ｒｃ）２、Ｎ（Ｒｄ）、Ｓ、Ｏ、またはＳｅであり、ここで、各Ｒｃは、独立に、Ｈ、重水素、アルキル、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｘＯＨ（ｘは、≧２の整数である）、またはコンジュゲート可能な部分、標的化剤もしくは薬物を含む基であり、各Ｒｄは、独立に、Ｈ、重水素、アルキル、またはヘテロアルキルである］
による化学構造を有する化合物、またはその立体異性体もしくは薬学的に許容される塩。
【０１９０】
２．式ＩＡ、ＩＢ、ＩＣ、またはＩＤ：
【化５７】
2020531497.tif 000061
による化学構造を有する、項目１の化合物。
【０１９１】
３．Ｒ３およびＲ６のうちの少なくとも１つが、スルホネート、−Ｃ（Ｏ）ＯＲａ、またはコンジュゲート可能な部分、標的化剤もしくは薬物を含む基である、項目１または項目２の化合物。
【０１９２】
４．Ｙ１およびＹ２が、Ｃ（Ｒｃ）２であり、各Ｒｃが、独立に、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、−（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）Ｒｅ、またはＨであり、ｎが、≧１の整数であり、Ｒｅが、コンジュゲート可能な部分、標的化剤または薬物である、項目１〜３のいずれか１つの化合物。
【０１９３】
５．Ｙ１およびＹ２が、Ｃ（ＣＨ３）２である、項目４の化合物。
【０１９４】
６．Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７、およびＲ８が、Ｈである、項目１〜５のいずれか１つの化合物。
【０１９５】
７．式ＩＩまたは式ＩＩＩ：
【化５８】
2020531497.tif 000062
による化学構造を有する、項目１〜６のいずれか１つの化合物。
【０１９６】
８．各Ｒｃが、−ＣＨ３である、項目７の化合物。
【０１９７】
９．上記化合物が式ＩＩによる化学構造を有し、Ｒ１〜Ｒ１０が、Ｈである、項目７または項目８の化合物。
【０１９８】
１０．Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ７〜Ｒ１１が、Ｈであり、Ｒ３およびＲ６が、独立に、−ＳＯ３または−ＣＯ２Ｒａである、項目７または項目８の化合物。
【０１９９】
１１．上記化合物が式ＩＩによる化学構造を有し、Ｒ９およびＲ１０が、Ｈであり、Ｒ３およびＲ６のうちの少なくとも１つが、コンジュゲート可能な部分、標的化剤または薬物を含む基である、項目７または項目８の化合物。
【０２００】
１２．上記化合物が式ＩＩＩによる化学構造を有し、Ｒ１〜Ｒ９およびＲ１１が、Ｈであり、Ｒ１０が、Ｈ、Ｏ、トリフレート、アリール、−ＯＲｂまたは−Ｎ（Ｒｂ）２である、項目７または項目８の化合物。
【０２０１】
１３．上記化合物が式ＩＩＩによる化学構造を有し、Ｒ９およびＲ１１が、Ｈであり、Ｒ３、Ｒ６、およびＲ１０のうちの少なくとも１つが、コンジュゲート可能な部分、標的化剤または薬物を含む基である、項目７または項目８の化合物。
【０２０２】
１４．項目１〜１３のいずれか１つによる化合物および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【０２０３】
１５．Ａが
【化５９】
2020531497.tif 000063
である、項目１による化合物を作製するための方法であって、
式ＩＶによる化合物を含む溶液を、３−ブテン−１−イルトリフルオロメタンスルホネートと合わせて、式Ｖによる化合物を生成するステップと、
【化６０】
2020531497.tif 000064
式Ｖによる化合物および式ＶＩによる化合物を含む溶液を、Ｎ−（（１Ｅ，３Ｚ）−３−（フェニルアミノ）プロパ−１−エン−１−イル）アニリンと合わせて、式ＶＩＩによる化合物を形成するステップと、
【化６１】
2020531497.tif 000065
【化６２】
2020531497.tif 000066
式ＶＩＩによる化合物を含む溶液を、ルテニウム触媒の存在下で、３，３−ジメトキシ−１−プロペンと合わせて、式ＶＩＩＩによる化合物を提供するステップと、
【化６３】
2020531497.tif 000067
式ＶＩＩＩによる化合物を、（ｉ）ＣＨＣｌ３およびＨ２ＳＯ４の混合物、または（ｉｉ）ＣＨ２Ｃｌ２中ＢＢｒ３と合わせて、式ＩＸによる化合物を提供するステップと
【化６４】
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を含む、方法。
【０２０４】
１６．ルテニウム触媒が、（１，３−ビス−（２，４，６−トリメチルフェニル）−２−イミダゾリジニリデン）ジクロロ（ｏ−イソプロポキシフェニルメチレン）ルテニウムである、項目１５の方法。
【０２０５】
１７．Ａが
【化６５】
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である、項目１による化合物を作製するための方法であって、
式ＩＶによる化合物を含む溶液を、３−ブテン−１−イルトリフルオロメタンスルホネートと合わせて、式Ｖによる化合物を生成するステップと、
【化６６】
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式Ｘによる化合物を含む溶液を、３−ブテン−１−イルトリフルオロメタンスルホネートと合わせて、式ＸＩによる化合物を生成するステップと、
【化６７】
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式Ｖによる化合物および式ＸＩによる化合物を含む溶液（ここで、式Ｖおよび式ＸＩによる化合物は、同じであっても異なっていてもよい）を、（１Ｅ，４Ｅ）−１，５−ビス（ジメチルアミノ）−ペンタ−１，４−ジエン−３−オンと合わせて、式ＸＩＩによる化合物を生成するステップと、
【化６８】
2020531497.tif 000072
式ＸＩＩによる化合物を含む溶液を、ルテニウム触媒の存在下で、３，３−ジメトキシ−１−プロペンと合わせて、式ＸＩＩＩによる化合物を提供するステップと、
【化６９】
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式ＸＩＩＩによる化合物を、テトラヒドロフラン中１ＮのＨＣｌの溶液と合わせて、式ＸＩＶによる化合物を提供するステップと
【化７０】
2020531497.tif 000074
を含む、方法。
【０２０６】
１８．ルテニウム触媒が、（１，３−ビス−（２，４，６−トリメチルフェニル）−２−イミダゾリジニリデン）ジクロロ（ｏ−イソプロポキシフェニル−メチレン）ルテニウムである、項目１７の方法。
【０２０７】
１９．式ＸＩＶによる化合物を含む溶液を、トリフルオロメタンスルホン酸無水物（Ｔｆ２Ｏ）と合わせて、式ＸＶによる化合物を提供するステップ
【化７１】
2020531497.tif 000075
をさらに含む、項目１７の方法。
【０２０８】
２０．式ＸＶによる化合物を含む溶液を、パラジウム触媒の存在下で、Ｒｇ−Ｃ６Ｈ４−Ｂ（ＯＨ）２と合わせて、式ＸＶＩによる化合物を提供するステップ
【化７２】
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（式中、Ｒｇは、Ｒａ、−ＣＯＯＲａ、または−ＯＲａであり、ここでＲａは、Ｈ、重水素、アルキルまたはヘテロアルキルである）
をさらに含む、項目１９の方法。
【０２０９】
２１．式ＸＶによる化合物を含む溶液を、式ＮＨ（Ｒ２０）（Ｒ２１）を有するアミンと合わせて、式ＸＶＩＩによる化合物を提供するステップ
【化７３】
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（式中、Ｒ２０およびＲ２１は、独立に、Ｈ、重水素、アルキル、ヘテロアルキル、アリールまたはヘテロアリールである）
をさらに含む、項目１９の方法。
【０２１０】
２２．（ｉ）Ｒ２０が、−（ＣＲｈ２）ｎ−ＣＨ２ＯＨであり、ここで、各Ｒｈが、独立に、Ｈ、重水素、ハロ、アルキル、またはアリールであり、ｎが、１、２、３、または４であり、（ｉｉ）Ｒ２１が、Ｈ、重水素、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、上記方法が、式ＸＶＩＩによる化合物を含む溶液を、求電子性基Ｒ２２を含む化合物と塩基条件下で合わせて、式ＸＶＩＩＩによる化合物を提供するステップ
【化７４】
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をさらに含む、項目２１の方法。
【０２１１】
２３．Ｒ１〜Ｒ１１のうちの少なくとも１つが標的化剤を含む項目１〜１３のいずれか１つによる化合物を使用するための方法であって、化合物を、標的化剤と結合することが可能である標的を含む試料と、標的化剤と標的を結合させるのに有効な条件下で合わせるステップと、標的に結合した化合物を可視化することによって、標的を画像化するステップとを含む、方法。
【０２１２】
２４．化合物を可視化することが、可視または近赤外範囲の波長と選択された強度を有する所定量の光の標的化された適用により、試料に照射することを含み、ここで、所定量の光は、化合物の蛍光を生じさせるのに十分であり、さらに、化合物によって放出された任意の蛍光を検出することを含む、項目２３の方法。
【０２１３】
２５．化合物を試料と合わせるステップが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｖｏで実施される、項目２３または項目２４の方法。
【０２１４】
２６．標的を画像化する前に、化合物を還元剤と合わせるステップをさらに含む、項目２３〜２５のいずれか１つの方法。
【０２１５】
２７．試料が、組織試料、生物学的流体、または対象内の標的領域である、項目２３〜２６のいずれか１つの方法。
【０２１６】
２８．試料が、対象内の標的領域であり、前記方法が、化合物、または化合物を含む医薬組成物を、対象に投与するステップと、その後、対象の標的化部分への所定量の光の標的化された適用によって、化合物に照射するステップと、対象の標的化部分における化合物からの任意の蛍光を検出するステップとをさらに含む、項目２７の方法。
【０２１７】
２９．標的領域が、腫瘍部位であり、対象の標的化部分が、腫瘍部位を含み、対象の標的化部分における蛍光を検出した後に、対象から腫瘍の少なくとも一部を切除するステップをさらに含む、項目２８の方法。
【０２１８】
３０．活性酸素種を検出するための方法であって、項目１〜１３のいずれか１つによる化合物を還元剤と合わせて、還元化合物を提供するステップと、試料を還元化合物と接触させるステップであって、試料中に活性酸素種（ＲＯＳ）が存在する場合、それにより還元化合物が酸化されて、項目１〜１３のいずれか１つによる化合物が再生される、ステップと、試料に、可視または近赤外範囲の波長と選択された強度を有する所定量の光を照射するステップであって、所定量の光は、還元化合物がＲＯＳによって酸化されて、項目１〜１３のいずれか１つに記載の化合物が再生される場合に蛍光を生じさせるのに十分である、ステップと、項目１〜１３のいずれか１つに記載の化合物によって放出された任意の蛍光を検出するステップであって、ここで、蛍光は、試料中のＲＯＳの存在を示す、ステップを含む、方法。
【０２１９】
開示される発明の原理を適用することができる多くの実施形態が存在する可能性を考慮して、例示される実施形態は、単に本発明の好ましい例であり、本発明の範囲を制限すると解釈されるべきでないことを認識されたい。むしろ、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲によって定義される。したがって、本発明者らは、本発明のすべてがこれらの特許請求の範囲および趣旨に含まれることを主張する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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