(57)【要約】本発明は、式Ｉに従うピロロピリミジン化合物、ならびに疼痛、炎症状態、心血管疾患、神経変性疾患、神経疾患、Ｉ型糖尿病の合併症、がん、及び／または線維性疾患の予防及び／または処置における当該化合物の使用に関する。特定的な態様において、本発明化合物は、ＡＳＫ阻害剤、特定的にはＡＳＫ１阻害剤である。また、本発明は、本発明化合物及び本発明化合物を含む薬学的組成物を生成するための方法、ならびに疼痛、炎症状態、心血管疾患、神経変性疾患、神経疾患、Ｉ型糖尿病の合併症、がん、及び／または線維性疾患の予防及び／または処置における本発明化合物の使用も提供する。【化１】2020530833.tif 000058【選択図】図１
2020530833.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：の化合物：
【化１】
2020530833.tif 000055
（式中、
Ｒ１は、Ｈ、ＣＨ３、Ｆ、またはＣｌであり、
Ｘは、Ｎ、ＣＨ、またはＣ−ＣＮであり、
Ｒ２は、ＣＨ３またはハロゲンである）
またはその薬学的に許容される塩、もしくは溶媒和物、もしくは溶媒和物の薬学的に許容される塩、またはその生物学的に活性な代謝産物。
【請求項２】
Ｒ１がＦである、請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項３】
Ｒ２がＣＨ３である、請求項１または２に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項４】
ＸがＣＨである、請求項１、２、または３に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項５】
ＸがＣ−ＣＮである、請求項１、２、または３に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項６】
ＸがＮである、請求項１、２、または３に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項７】
前記化合物が以下から選択される、請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩：
２−アミノ−５−フルオロ−Ｎ−［１−（５−メチル−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）−４−ピペリジル］ピリジン−４−カルボキサミド、
２−アミノ−５−メチル−Ｎ−［１−（５−メチル−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）−４−ピペリジル］ピリジン−４−カルボキサミド、
２−アミノ−５−クロロ−Ｎ−［１−（５−メチル−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）−４−ピペリジル］−ピリジン−４−カルボキサミド、
２−アミノ−Ｎ−［１−（５−クロロ−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）−４−ピペリジル］ピリジン−４−カルボキサミド、
２−アミノ−Ｎ−［１−（５−クロロ−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）−４−ピペリジル］−５−フルオロ−ピリジン−４−カルボキサミド、
２−アミノ−Ｎ−［１−（５−シアノ−３−メチル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−４−イル）−４−ピペリジル］−５−フルオロ−ピリジン−４−カルボキサミド、及び
２−アミノ−Ｎ−［１−（３−クロロ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−４−イル）−４−ピペリジル］−５−フルオロ−ピリジン−４−カルボキサミド。
【請求項８】
請求項１−７のいずれか１項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
【請求項９】
医薬における使用のための、請求項１−７のいずれか１項に記載の化合物もしくはその薬学的に許容される塩、または請求項８に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
疼痛、炎症状態、心血管疾患、神経変性疾患、神経疾患、糖尿病の合併症、がん、及び／または線維性疾患の予防及び／または処置における使用のための、請求項１−７のいずれか１項に記載の化合物もしくはその薬学的に許容される塩、または請求項８に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
請求項１に記載の式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩、もしくは溶媒和物、もしくは溶媒和物の薬学的に許容される塩、またはその生物学的に活性な代謝産物を調製するためのプロセスであって、
（ａ）式ＩＩの化合物：
【化２】
2020530833.tif 000056
（式中、Ｘ及びＲ２は、請求項１で定義されている通りである）
を式ＩＩＩの化合物：
【化３】
2020530833.tif 000057
（式中、Ｒ１は、請求項１で定義されている通りである）
またはその保護誘導体と反応させることと、
（ｂ）式Ｉの化合物の保護誘導体を脱保護することと、
（ｃ）式Ｉの化合物またはその保護誘導体を、さらなる式Ｉの化合物またはその保護誘導体に相互転換することと、
（ｄ）任意選択で、式Ｉの化合物の薬学的に許容される塩を形成することと
を含む、前記プロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疼痛、炎症状態、心血管疾患、神経変性疾患、神経疾患、糖尿病の合併症、がん、及び／または線維性疾患の予防及び／または処置におけるピロロピリミジン化合物及びその使用に関する。特定的な態様において、本発明化合物は、ＡＳＫ阻害剤、特定的にはＡＳＫ１阻害剤である。また、本発明は、本発明化合物及び本発明化合物を含む薬学的組成物を生成するための方法、ならびに疼痛、炎症状態、心血管疾患、神経変性疾患、神経疾患、糖尿病の合併症、がん、及び／または線維性疾患の予防及び／または処置における本発明化合物の使用も提供する。
【背景技術】
【０００２】
アポトーシスシグナル調節キナーゼ（ＡＳＫ１）は、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）及びリポ多糖（ＬＰＳ）などの炎症促進性分子、小胞体ストレス、酸化ストレス、遺伝毒性ストレス、フリーラジカル、Ｆａｓリガンド、及びカルシウム過負荷を含めたストレス刺激への応答を誘発するマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）シグナリング経路上にある、遍在的に発現されたＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼである（Ｔａｋｅｄａ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ（２００８）  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｈａｒａｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ２４８  ｐｐ１９９−２２５；Ｎａｇａｉ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ（２００７）  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４０  ｐｐ１−６）。
【０００３】
ＡＳＫ１は、ＭＡＰキナーゼキナーゼ（ＭＫＫ）を通じてシグナリングを行う複数のＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼ（ＭＡＰ３Ｋ）のうちの１つである。ＡＳＫ１シグナリングの場合、ＭＫＫ３及びＭＫＫ６はｐ３８経路を活性化し、ＭＫＫ４及びＭＫＫ７はＪＮＫ経路を活性化する（Ｄａｖｉｓ  ＲＪ（２０００）  Ｃｅｌｌ  １０３  ｐｐ２３９−２５２；Ｉｃｈｉｊｏ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ（１９９７）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５  ｐｐ９０−９４）。そのため、ＡＳＫ１の阻害剤は、ｐ３８及びＪＮＫの両方を通じてシグナリング経路を抑制する潜在可能性を有する。
【０００４】
可溶性ＴＮＦ受容体の使用：Ｆｃ融合タンパク質（エタネルセプト）は、炎症性疼痛の臨床において有効であり、また神経因性疼痛の前臨床モデルにおいても有効である（Ｈａｏ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ（２００７）  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １４  ｐｐ１０１０−１０１６）ことが示されており、このことは、ＴＮＦ−αが疼痛応答におけるキーとなる媒介物質であることを意味する。ＩＬ−６は、ＴＮＦ−αシグナリングのキーとなる下流媒介物質であり、抗ＩＬ−６療法をリウマチ性関節炎の有効な治療アプローチとして支持する臨床的エビデンスが存在する（Ｒｏｃｈｅは、２００８年５月にアクテムラ／トシリズマブにおけるポジティブな第ＩＩＩ相試験結果を発表している）。
【０００５】
機能的ＡＳＫ１を有しない複数の細胞（ＡＳＫ１ノックアウトマウスから単離、または遺伝子サイレンシング後）が、ＴＮＦ−α誘発性アポトーシスに対する耐性を有する（Ｔｏｂｉｕｍｅ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ（２００１）  ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ  ２  ｐｐ２２２−２２８）。そのため、ＡＳＫ１は、ＴＮＦ−α経路において重要であり、ＡＳＫ１阻害を介してＴＮＦ−αシグナリング経路を分断することが疼痛軽減などの有益な下流効果につながるという仮説を裏付ける。ｐ３８及び／またはＪＮＫを炎症促進性媒介物質及びその後の疼痛応答の生成と結びつける強力なエビデンスが存在する（Ｊｉ  Ｒ−Ｒ  ａｎｄ  Ｓｕｔｅｒ  ＭＲ（２００７）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐａｉｎ  ３  ｐｐ３３−４１；Ｃｈｅｎｇ  ＨＴ  ｅｔ  ａｌ（２００８）  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １５５  ｐｐ９４８−９５８；Ｊｉ  Ｒ−Ｒ  ａｎｄ  Ｇａｏ  Ｙ−Ｊ（２００８）  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｌｅｔｔ  ４３７  ｐｐ１８０−１８３）。ＡＳＫ１活性化は、ｐ３８及びＪＮＫの両方の活性化につながり得るため、ＡＳＫ１の阻害は、ｐ３８阻害剤単体よりも強力である潜在可能性を有し、またシグナリングカスケードにおいてより上方にあることから、望ましくない傾向の可能性を限定し得る。
【０００６】
線維症は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の過剰な沈着が存在する創傷治癒プロセスである。ＥＣＭは、コラーゲン、非コラーゲン糖タンパク質、マトリックス結合成長因子、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、及びマトリックス細胞タンパク質から構成され、これらは正常組織及び線維性組織の両方のスキャフォールディングをもたらす。
【０００７】
非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、発展途上国における慢性肝疾患の最も一般的な原因である（Ｙｏｕｎｏｓｓｉ  ＺＭ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ  ２０１１；９：５２４−３０及びＣｏｈｅｎ  ＪＣ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１１；３３２：１５１９−２３）。当該疾患は、２つのカテゴリー：非アルコール性脂肪肝（または単純な肝脂肪化）及び非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）に大別することができる。以前は、肝脂肪化は主に非進行性であり、一方ＮＡＳＨはＮＡＦＬＤの進行性形態であると考えられていたが、最近の連続生検の研究からのエビデンスにより、肝脂肪化またはＮＡＳＨの患者は、続いて進行性の線維症及び肝硬変へと疾患が進行するリスクが増大することが実証されている（Ｓｉｎｇｈ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ  ２０１５；１３：６４３−５４及びＭｃＰｈｅｒｓｏｎ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ  ２０１５；６２：１１４８−５５）。
【０００８】
酸化ストレスは、ＮＡＳＨにおける肝星細胞（ＨＳＣ）の活性化で主要な役割を担うことが知られており（Ｂｉａｎ  Ｚ，＆  Ｍａ  Ｘ．Ｆｒｏｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２０１２；３：２４８及びＫｏｅｋ  ＧＨ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ  ２０１１；４１２：１２９７−３０５）、抗酸化剤は、肝細胞傷害に対し防止効果を発揮するだけでなく、線維形成の減少（Ｓｅｒｖｉｄｄｉｏ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ  ２０１３；６５：９５２−６８）、細胞の抗酸化防御有効性に影響を及ぼすバリアントがＮＡＦＬＤ線維症のリスクに影響するという遺伝子関連性の研究によって支持されている作用に対し、直接的に寄与し得る（Ａｌ−Ｓｅｒｒｉ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ  ２０１２；５６：４４８−５４）。
【０００９】
アポトーシスシグナル調節キナーゼ１（ＡＳＫ１）は、高血糖、ＴＧＦ−β、及びＲＯＳを含めた様々な刺激によって活性化されるキナーゼである（Ｋａｒｎｉｋ  Ｓ，Ｃｈａｒｌｔｏｎ  ＭＲ，Ｌｉ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｌｉｖｅｒ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ２０１５，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  １３−１７，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，２０１５）。ＡＳＫ１は、ｐ３８経路及びＪＮＫ１経路を活性化することにより、アポトーシス、線維症、及び代謝機能不全を誘発する。ＡＳＫ１経路は、ヒトＮＡＳＨ肝生検で活性化されていることが示されている（Ｋａｒｎｉｋ  Ｓ，Ｔｈｅ  Ｌｉｖｅｒ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ２０１４，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ７−１１，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，２０１４）。さらに、６ヵ月のＮＡＳＨヒト臨床試験において、ＡＳＫ１阻害剤セロンセルチブは、肝線維症ステージ、肝硬変への進行、肝硬化度、及び肝脂肪含量の低減をもたらすことが示されている（Ｌｏｏｍｂａ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｌｉｖｅｒ  ｍｅｅｔｉｎｇ  ２０１６，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  １１−１５，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，２０１６）。
【００１０】
ＷＯ２００８／０１６１３１は、糖尿病及び炎症性疾患の処置における使用のための縮合複素環式ＡＳＫ１阻害剤を開示している。ＷＯ２００４／０４８５６５は、がん及び変性疾患の処置において有用であり得るＡＳＫ１活性を有する新規ペプチドについて説明している。ＷＯ２００９／１２３９８６及びＷＯ２００９／０２７２８３は、いずれもＡＳＫ１阻害剤について説明している。ＷＯ２００８／０７５１７２は、ｈ−ＰＧＤＳの阻害剤としてのニコチンアミド誘導体、及びプロスタグランジンＤ２媒介疾患を処置するためのその使用を開示している。ＷＯ２００１／３９７７７は、アデノシンＡ１、Ａ２ａ、及びＡ３受容体に特異的な化合物を開示している。ＥＰ２０５８３０９は、縮合複素環式化合物を開示している。
【００１１】
本発明は、ＡＳＫ１キナーゼの阻害剤であり、かつ疼痛、炎症状態、心血管疾患、神経変性疾患、神経疾患、糖尿病の合併症、がん、及び／または線維性疾患の予防及び／または処置において有用であり得る一連のピロロピリミジン誘導体について説明する。
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、疼痛及び／または線維性疾患の処置及び／または予防に有用であり得る新規のピロロピリミジン及びピロロピリミジン化合物の同定に基づく。特定的な態様において、本発明化合物は、ＡＳＫ阻害剤、特定的にはＡＳＫ１阻害剤である。また、本発明は、このような化合物及びこのような化合物を含む薬学的組成物を生成するための方法、ならびに疼痛、炎症状態、心血管疾患、神経変性疾患、神経疾患、糖尿病の合併症、がん、及び／または線維性疾患の予防及び／または処置における当該化合物の使用も提供する。
【００１３】
したがって、本発明の第１の態様において、式Ｉ：
【化１】
2020530833.tif 000003
を有する本発明化合物が提供される
（式中、
Ｒ１は、Ｈ、ＣＨ３、Ｆ、またはＣｌであり、
Ｘは、Ｎ、ＣＨ、またはＣ−ＣＮであり、
Ｒ２は、ＣＨ３またはハロゲンである）。
【００１４】
特定的な態様において、本発明化合物は、ＡＳＫキナーゼファミリー、特定的にはＡＳＫ１に対する選択性を示し得る。さらなる特定的な態様において、本発明化合物は、その他のキナーゼ酵素、特定的にはＪＡＫ２に対する低い活性を示し得る。このような選択性は、薬物安全性の改善をもたらし得、及び／またはオフターゲット関連リスクを低減し得る。
【００１５】
さらなる態様において、本発明は、本発明化合物と、薬学的担体、賦形剤、または希釈剤とを含む薬学的組成物を提供する。特定的な態様において、薬学的組成物は、追加的に、本発明化合物との組合せにおける使用に好適なさらなる治療活性成分を含み得る。より特定的な態様において、さらなる治療活性成分は、疼痛及び／または線維性疾患の予防及び／または処置のための薬剤である。
【００１６】
さらに、本発明化合物は、本明細書で開示されている薬学的組成物及び処置方法で有用であり、調製及び使用の際に薬学的に許容されるものである。
【００１７】
本発明のさらなる態様において、本発明は、本明細書に挙げられている状態の中から選択される状態、特定的には疼痛及び／または線維性疾患に罹患している哺乳類、特定的にはヒトを処置する方法であって、有効量の、本明細書に記載されているような本発明の薬学的組成物または化合物を投与することを含む、方法を提供する。
【００１８】
また、本発明は、医薬における使用のための、本発明化合物と、好適な薬学的担体、賦形剤、または希釈剤とを含む薬学的組成物も提供する。特定的な態様において、薬学的組成物は、疼痛及び／または線維性疾患の予防及び／または処置における使用のためのものである。
【００１９】
特定的な態様において、本発明化合物は、疼痛の予防及び／または処置における使用のために提供される。
【００２０】
追加的な態様において、本発明は、本明細書で後ほど開示する代表的な合成プロトコル及び経路を用いて本発明化合物を合成するための方法を提供する。
【００２１】
その他の目的及び利点は、この後の発明を実施するための形態を検討することにより当業者には明らかとなる。
【００２２】
本発明化合物が、生物学的に活性な代謝産物をもたらすように代謝され得ることは理解されよう。
【００２３】
発明の詳細な説明
定義
以下の用語は、下記に提示される意味を有するように意図されており、本発明の説明及び意図される範囲を理解するのに有用である。
【００２４】
化合物、当該化合物を含有する薬学的組成物、及び当該化合物及び組成物を使用する方法を含み得る本発明を説明する際に、以下の用語は、存在する場合、別段の指示がない限り、以下の意味を有する。また、本明細書に記載される場合、いかに定義される部分のいずれについても、様々な置換基で置換され得ること、そして、それぞれの定義が、このような置換された部分を以下に示す範囲内に含むように意図されていることも理解されたい。別段の明記がない限り、「置換された」という用語は、以下に示すように定義されるものとする。さらに、「基」及び「ラジカル」という用語は、本明細書で使用する場合、互換的であるとみなされ得ることを理解されたい。
【００２５】
「ａ」及び「ａｎ」という冠詞は、本明細書では、冠詞の文法的対象の１つまたは複数（すなわち、少なくとも１つ）を指すように使用され得る。例として、「（１つの）アナログ」とは、１つのアナログまたは複数のアナログを意味する。
【００２６】
「アミノ」とは、−ＮＨ２ラジカルを指す。
【００２７】
「ハロ」または「ハロゲン」とは、フルオロ（Ｆ）、クロロ（Ｃｌ）、ブロモ（Ｂｒ）、及びヨード（Ｉ）を指す。特定的なハロ基は、フルオロまたはクロロのいずれかである。
【００２８】
「薬学的に許容される」とは、連邦政府もしくは州政府の規制機関により、または米国以外の国の対応機関により承認済みまたは承認可能であること、あるいは哺乳類、より特定的にはヒトにおける使用のために米国薬局方またはその他の一般に認識されている薬局方に収載されていることを意味する。
【００２９】
「薬学的に許容される塩」とは、薬学的に許容され、かつ所望される親化合物の薬理学的活性を所持する本発明化合物の塩を意味する。特定的には、このような塩は無毒性であり、無機または有機の酸付加塩及び塩基付加塩であり得る。具体的には、このような塩としては、以下のものが挙げられる：（１）酸付加塩、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸で形成された酸付加塩；もしくは、酢酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、シクロペンタンプロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、乳酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、３−（４−ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、１，２−エタン−ジスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４−クロロベンゼンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、４−トルエンスルホン酸、ショウノウスルホン酸、４−メチルビシクロ［２．２．２］−オクタ−２−エン−１−カルボン酸、グルコヘプトン酸、３−フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、第３級ブチル酢酸、ラウリル硫酸、グルコン酸、グルタミン酸、ヒドロキシナフトエ酸、サリチル酸、ステアリン酸、ムコン酸などの有機酸で形成された酸付加塩；あるいは、（２）親化合物中に存在する酸性プロトンが、金属イオン、例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類イオン、もしくはアルミニウムイオンによって置き換えられている場合に、または、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、Ｎ−メチルグルカミンなどの有機塩基と配位結合する場合に、形成される塩。さらに、塩としては、単に例として、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、テトラアルキルアンモニウムなどが挙げられ、また、化合物が塩基性の官能基を含有する場合は、無毒性の有機酸または無機酸の塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、酒石酸塩、メシル酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、シュウ酸塩などが挙げられる。「薬学的に許容されるカチオン」という用語は、酸性官能基における許容されるカチオン性対イオンを指す。このようなカチオンは、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、テトラアルキルアンモニウムなどのカチオンにより例示される。
【００３０】
「薬学的に許容されるビヒクル」とは、本発明化合物と共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、または担体を指す。
【００３１】
「プロドラッグ」とは、切断可能な基を有し、かつ加溶媒分解によりまたは生理的条件下においてｉｎ  ｖｉｖｏで薬学的活性を有する本発明化合物になる、本発明化合物の誘導体を含めた化合物を指す。このような例としては、以下に限定されないが、コリンエステル誘導体など、及びＮ−アルキルモルフィンエステルなどが挙げられる。
【００３２】
「溶媒和物」とは、通常は加溶媒分解により、溶媒と会合する化合物の形態を指す。この物理的会合は、水素結合を含む。従来的な溶媒としては、水、ＥｔＯＨ、酢酸などが挙げられる。本発明の化合物は、例えば、結晶形態で調製される場合もあれば、溶媒和または水和して調製される場合もある。好適な溶媒和物としては、水和物などの薬学的に許容される溶媒和物が挙げられ、さらに、定比溶媒和物及び不定比溶媒和物の両方が挙げられる。あるいくつかの場合において、溶媒和物は、例えば、１つ以上の溶媒分子が結晶性固体の結晶格子に組み込まれる場合に単離可能となる。「溶媒和物」は、溶液相及び単離可能な溶媒和物の両方を包含する。代表的な溶媒和物としては、水和物、エタノレート、メタノレートが挙げられる。
【００３３】
「対象」は、ヒトを含む。「ヒト」、「患者」、及び「対象」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
【００３４】
「有効量」とは、疾患を処置するために対象に投与するときに、当該疾患に対する当該処置をもたらすのに十分である化合物の量を意味する。「有効量」は、化合物、疾患、及びその重症度、ならびに処置を行う対象の年齢、体重などに応じて変動し得る。
【００３５】
「防止する」または「防止」とは、疾患または障害を獲得または発生するリスクを低減する（すなわち、疾患の発症に先立って、疾患原因の病原体に曝露される恐れのある、または疾患の素因がある対象において、疾患の臨床症状のうちの少なくとも１つが発生しないようにする）ことを指す。
【００３６】
「予防」という用語は、「防止」に関連するものであり、疾患の処置または治癒ではなく防止を目的とする措置または手順を指す。予防的措置の非限定的な例としては、ワクチンの投与；例えば運動抑制によって血栓症のリスクがある入院患者への低分子量ヘパリン投与；及びマラリアが風土病であるかまたはマラリアに罹患するリスクが高い地理的領域に訪問する前の抗マラリア剤（例えば、クロロキン）の投与が挙げられ得る。
【００３７】
一実施形態において、任意の疾患または障害に対する「処置する」または「処置」とは、その疾患または障害を改善すること（すなわち、疾患を抑止すること、または疾患における臨床症状のうちの少なくとも１つの発症、程度、もしくは重症度を低減すること）を指す。別の実施形態において、「処置する」または「処置」とは、患者に認識できない可能性のある少なくとも１つの身体的パラメーターを改善することを指す。また別の実施形態において、「処置する」または「処置」とは、疾患または障害の調節を、身体的（例えば、認識できる症状の安定化）、生理的（例えば、身体的パラメーターの安定化）のいずれかまたは両方で行うことを指す。さらなる実施形態において、「処置する」または「処置」は、疾患の進行を遅くすることに関する。
【００３８】
本明細書で使用する場合、「疼痛」という用語は、炎症性疼痛、特定的には、慢性関節疼痛（例えば、リウマチ性関節炎、変形性関節炎、リウマチ性脊椎炎、痛風性関節炎（痛風）、及び若年性関節炎）を指し、これには、疾患修飾及び関節構造保存の特性；筋骨格性疼痛；腰部及び頸部の疼痛；捻挫及び挫傷；神経因性疼痛；交感神経性に維持された疼痛；筋炎；がん及び線維筋痛症に関連する疼痛；片頭痛に関連する疼痛；インフルエンザまたはその他のウイルス感染症（例えば、一般的な風邪）に関連する疼痛；リウマチ熱；腸機能障害（例えば、非潰瘍性消化不良、非心臓性胸痛、及び過敏性腸症候群）に関連する疼痛；心筋虚血に関連する疼痛；術後疼痛；頭痛；歯痛；ならびに月経困難症が含まれる。より特定的には、当該用語は慢性関節疼痛を指す。より特定的には、当該用語は、リウマチ性関節炎、変形性関節炎、及び痛風性関節炎（痛風）を指す。
【００３９】
本明細書で使用する場合、「心血管疾患（複数可）」という用語は、心臓もしくは血管またはこの両方に影響を及ぼす疾患を指す。特定的には、心血管疾患としては、不整脈（心房性もしくは心室性または両方）；アテローム性動脈硬化症及びその続発症；アンギナ；心臓リズム障害；心筋虚血；心筋梗塞；心臓瘤または血管瘤；血管炎；卒中；四肢、臓器、または組織の末梢閉塞性動脈症；脳、心臓、腎臓、もしくはその他の臓器または組織の虚血の後の再灌流傷害；動脈圧の著明な降下に関連するショック状態（例えば、内毒素ショック、外科的ショック、外傷性ショック、または敗血症性ショック）；肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）、高血圧症、心臓弁膜疾患、心不全、異常血圧；ショック；血管収縮（片頭痛に関連するものを含む）；血管異常；静脈瘤療法、単一の臓器または組織に限定された機能不全、機能性または器質性の静脈不全；心臓肥大、心室線維症、及び心筋リモデリングが挙げられる。より特定的には、この用語は、アテローム性動脈硬化症、肺動脈高血圧症、心不全、急性冠動脈症候群、心臓肥大、心室線維症、及び心筋リモデリングを指す。
【００４０】
本明細書で使用する場合、「神経因性疼痛」または「神経因性疼痛を伴う症候群」という用語は、文脈による別段の定めがない限り、中枢性神経因性疼痛及び末梢性神経因性疼痛の両方を含み、この用語は、糖尿病性神経障害；坐骨神経痛；非特異的腰痛；多発性硬化症疼痛；線維筋痛症；ＨＩＶ関連神経障害；ヘルペス後神経痛；三叉神経痛；及び身体的外傷、切断術、がん、毒素、化学療法誘発性神経障害、または慢性炎症状態に起因する疼痛を含む。神経因性疼痛の症状には、自発的な鋭い電撃痛、または継続的な灼熱痛が含まれる。加えて、「麻痺感（ｐｉｎｓ  ａｎｄ  ｎｅｅｄｌｅｓ）」などの正常な無痛感覚に関連する疼痛（対性知覚麻痺及び知覚異常）、触覚に対する感受性増大（知覚過敏）、無害な刺激の後の有痛性感覚（動的、静的、もしくは熱的アロディニア）、有害な刺激に対する感受性増大（熱的、寒冷的、もしくは機械的痛覚過敏）、刺激除去後の痛覚持続（痛覚異常鋭敏）、または選択的感覚経路における不在もしくは欠損（痛覚減退症）も含まれる。
【００４１】
本明細書で使用する場合、「炎症状態（複数可）」という用語は、リウマチ性関節炎、変形性関節炎、若年性特発性関節炎、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、皮膚状態（例えば、日焼け、熱傷、湿疹、皮膚炎、乾癬）、眼疾患（例えば、緑内障、網膜炎、網膜症、ぶどう膜炎、及び眼組織への急性的傷害（例えば、結膜炎））、肺障害（例えば、アレルギー性気道疾患（例えば、喘息、鼻炎）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、気管支炎、気腫、呼吸窮迫症候群、ハト愛好者病、及び農夫肺）、消化管障害（例えば、炎症性腸疾患、例えば、クローン病もしくは潰瘍性大腸炎、アフタ性潰瘍、アトピー性胃炎、バリアロフォーム（ｖａｒｉａｌｏｆｏｒｍｅ）胃炎、セリアック病、限局性回腸炎、過敏性腸症候群、胃食道逆流症、下痢、及び／または便秘）、エンドトキシン駆動疾患状態（例えば、バイパス手術後の合併症、または例えば慢性心不全に寄与する慢性エンドトキシン状態）、血管疾患などの炎症性構成要素を伴う臓器移植及びその他の状態、脂肪性肝炎、片頭痛、結節性動脈周囲炎、甲状腺炎、再生不良性貧血、ホジキン病、強皮症（ｓｃｌｅｒｏｄｏｍａ）、重症筋無力症、多発性硬化症、サルコイドーシス（ｓｏｒｃｏｉｄｏｓｉｓ）、ネフローゼ症候群、ベーチェット症候群、多発性筋炎、歯肉炎、心筋虚血、発熱、全身性エリテマトーデス、多発性筋炎、腱炎、滑液包炎、ならびにシェーグレン症候群を含めた状態の群を指す。特定的には、この用語は、リウマチ性関節炎、変形性関節炎、アレルギー性気道疾患（例えば、喘息）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、及び炎症性腸疾患を指す。より特定的には、この用語は、リウマチ性関節炎、変形性関節炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、及び炎症性腸疾患を指す。
【００４２】
本明細書で使用する場合、「喘息」という用語は、任意の原因（内因性、外因性、または両方；アレルギー性または非アレルギー性）の気道収縮に関連する肺のガス流の変動によって特徴づけられる任意の肺の障害を指す。喘息という用語は、原因を示す１つ以上の形容詞と共に使用され得る。
【００４３】
本明細書で使用する場合、「神経変性疾患」という用語は、神経変性に起因するまたはそれを含む状態を指し、神経変性としては、認知症、特定的には変性性認知症（老人性認知症、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病及びクロイツフェルト・ヤコブ病、ＡＬＳ及び運動ニューロン疾患を含む）；血管性認知症（多発梗塞性認知症を含む）；ならびに頭蓋内占拠性病変に関連する認知症；外傷；感染症及び関連する状態（ＨＩＶ感染を含む）；末梢神経障害、多発性硬化症、網膜症、緑内障、黄斑変性症、脳虚血及び外傷性脳傷害、ならびに加齢に関連する軽度認知障害、特定的には加齢に伴う記憶障害（Ａｇｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｍｅｍｏｒｙ  Ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ）が挙げられる。
【００４４】
本明細書で使用する場合、「糖尿病の合併症」という用語は、Ｉ型またはＩＩ型糖尿病に関連する状態を指し、このような状態としては、血管または微小血管の変化に関する状態、例えば、糖尿病性網膜症、糖尿病性微小血管症、糖尿病性腎症（糖尿病性腎疾患（ＤＫＤ）とも呼ばれる）、黄斑変性症、緑内障、ネフローゼ症候群、糖尿病性心筋症、再生不良性貧血、ぶどう膜炎、川崎病、及びサルコイドーシス、ならびに糖尿病または肥満に関連し得る脂肪代謝の障害、例えば、肝脂肪症が挙げられる。より特定的には、この用語は、糖尿病性網膜症、糖尿病性微小血管症、糖尿病性腎症、及び肝脂肪症を指す。
【００４５】
本明細書で使用する場合、「がん」という用語は、皮膚または身体の臓器（例えば、限定されないが、乳房、前立腺、肺、腎臓、膵臓、胃、もしくは腸）における悪性または良性の細胞成長を指す。がんは、隣接する組織に浸潤し、遠隔の臓器、例えば、骨、肝臓、肺、または脳に拡散（転移）する傾向がある。本明細書で使用する場合、がんという用語は、転移性腫瘍細胞タイプ（例えば、以下に限定されないが、黒色腫、リンパ腫、白血病、線維肉腫、横紋筋肉腫、及びマスト細胞腫）と、組織癌腫タイプ（例えば、以下に限定されないが、結腸直腸癌、前立腺癌、小細胞肺癌及び非小細胞肺癌、乳癌、膵臓癌、膀胱癌、腎臓癌、胃癌、神経膠芽腫、原発性肝臓癌、卵巣癌、前立腺癌、ならびに子宮平滑筋腫）とを共に含む。特定的には、「がん」という用語は、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄球性白血病、副腎皮質癌、肛門癌、虫垂癌、星細胞腫、非定型性奇形腫／ラブドイド腫瘍、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌（骨肉腫及び悪性線維性組織球腫）、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、脳及び脊髄の腫瘍、乳癌、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、子宮頸癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸癌、結腸直腸癌、頭蓋咽頭腫、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、胎児性腫瘍、子宮内膜癌、上衣芽腫、上衣細胞腫、食道癌、ユーイング肉腫ファミリーの腫瘍、眼癌、網膜芽腫、胆嚢癌、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）（胃（ｓｔｏｍａｃｈ））癌、胃腸管カルチノイド腫瘍、胃腸管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胃腸管間質細胞腫瘍、生殖細胞腫瘍、神経膠腫、ヘアリー細胞白血病、頭頸部癌、肝細胞（肝臓）癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼球内黒色腫、膵島細胞腫瘍（膵内分泌部）、カポシ肉腫、腎臓癌、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭癌、白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄球性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、ヘアリー細胞白血病、肝臓癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、バーキットリンパ腫、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、リンパ腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、髄芽腫、髄様上皮腫、黒色腫、中皮腫、口癌、慢性骨髄性白血病、骨髄球性白血病、多発性骨髄腫、上咽頭癌、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、口腔癌、中咽頭癌、骨肉腫、骨の悪性線維性組織球腫、卵巣癌、卵巣上皮癌、卵巣生殖細胞腫瘍、卵巣低悪性潜在腫瘍、膵臓癌、乳頭腫、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、中間型松果体実質腫瘍、松果体芽腫及びテント上原始神経外胚葉性腫瘍、下垂体腫瘍、形質細胞新生物／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞（腎臓）癌、網膜芽腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、肉腫、ユーイング肉腫ファミリーの腫瘍、肉腫、カポジ、セザリー症候群、皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、胃（ｓｔｏｍａｃｈ）（胃（ｇａｓｔｒｉｃ））癌、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、精巣癌、咽喉癌、胸腺腫及び胸腺癌、甲状腺癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、腟癌、外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ならびにウィルムス腫瘍を指す。別の特定的な実施形態において、がんという用語は、膵臓癌、肝臓癌、肝細胞癌（ＨＣＣ）、乳癌、または結腸癌を指す。特定的には、がんは、肝細胞癌、黒色腫、胃癌、脂肪肉腫、及び酸化ストレスにより引き起こされるがん（例えば、頸椎症性脊髄症）を指す。
【００４６】
本明細書で使用する場合、「線維性疾患」という用語は、細胞外マトリックスの過剰な生成、沈着、及び収縮に起因する過剰な瘢痕により特徴づけられる疾患、ならびに細胞及び／またはフィブロネクチン及び／またはコラーゲンの異常な蓄積及び／または線維芽細胞動員の増加に関連する疾患を指し、以下に限定されないが、個々の臓器または組織、例えば、心臓、腎臓、肝臓、関節、肺、胸膜組織、腹膜組織、皮膚、角膜、網膜、筋骨格、及び消化管の線維症が挙げられる。特定的には、線維性疾患という用語は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）；嚢胞性線維症、種々の病因のその他のびまん性実質性肺疾患（医原性薬物誘発性線維症、職業及び／または環境誘発性線維症、肉芽腫性疾患（サルコイドーシス、過敏性肺炎）、膠原血管病、肺胞タンパク質症、ランゲルハンス細胞肉芽腫症、リンパ管平滑筋腫症、遺伝性疾患（ヘルマンスキー・パドラック症候群、結節性硬化症、神経線維腫症、代謝貯蔵障害、家族性間質性肺疾患を含む）；放射線誘発性線維症；慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）；強皮症；ブレオマイシン誘発性肺線維症；慢性喘息；珪肺症；アスベスト誘発性肺線維症；急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）；腎線維症；尿細管間質性線維症；糸球体腎炎；巣状分節性糸球体硬化症；ＩｇＡ腎症；高血圧；アルポート症候群；腸線維症；肝臓維症；肝硬変；アルコール誘発性肝線維症；毒物／薬物誘発性肝線維症；血色素症；非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）；胆管傷害；原発性胆汁性肝硬変；感染誘発性肝線維症；ウイルス誘発性肝線維症；及び自己免疫性肝炎；角膜瘢痕；肥厚性瘢痕；デュピュイトラン病、ケロイド、皮膚線維症；皮膚強皮症；全身性硬化症、脊髄の外傷／線維症；骨髄線維症；血管再狭窄；アテローム性動脈硬化症；動脈硬化症；ウェゲナー肉芽腫症；ペイロニー病、または慢性リンパ球球性を指す。特定的な実施形態において、線維性疾患は、肝線維症、肺線維症、または腎線維症などの個別の臓器または組織の疾患である。特定的な実施形態において、線維性疾患は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、糖尿病性腎疾患（ＤＫＤ）、及び非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）から選択される。
【００４７】
「本発明化合物（複数可）」及びこれに相当する表現は、本明細書に記載されるような式（複数可）の化合物を包含することを意味し、この表現は、薬学的に許容される塩、及び溶媒和物（例えば、水和物）、ならびに文脈により許容される場合は薬学的に許容される塩の溶媒和物を含む。同様に、中間体への言及は、中間体自体が特許請求されているかされていないかにかかわらず、文脈により許容される場合はその塩及び溶媒和物を包含することを意味する。
【００４８】
本明細書中で範囲（例えば、以下に限定されないがＣ１−８アルキル）が言及される場合、範囲の引用は、当該範囲の各メンバーの提示とみなされるべきである。
【００４９】
その他の本発明化合物の誘導体は、その酸形態及び酸誘導体形態のいずれにおいても活性を有するが、酸感受性形態では、しばしば、哺乳類生体における可溶性、組織適合性、または遅延放出という利点がもたらされる。
【００５０】
本明細書で使用する場合、「同位体バリアント」という用語は、化合物を構成する原子のうちの１つ以上において人為的な割合の同位体を含有する化合物を指す。例えば、ある化合物の「同位体バリアント」は、例えば、ジュウテリウム（２ＨまたはＤ）、炭素−１３（１３Ｃ）、窒素（１５Ｎ）などの１つ以上の非放射性同位体を含有し得る。このような同位体置換が行われる化合物において、以下の原子は、存在する場合は様々なものとなる場合があり、そのため例えば、任意の水素は２Ｈ／Ｃとなる場合があり、任意の炭素は１３Ｃとなる場合があり、または任意の窒素は１５Ｎとなる場合があること、そして、このような原子の存在及び配置は当業者の技能範囲内で決定され得ることは理解されよう。同様に、本発明は、例えば、得られる化合物が薬物及び／または基質の組織分布試験に使用され得る場合における、放射性同位体を伴った同位体バリアントの調製を含み得る。放射性同位体であるトリチウム（すなわち、３Ｈ）及び炭素−１４（すなわち１４Ｃ）は、組込みが容易であることと検出手段が迅速であることとの観点から、とりわけこの目的に有用である。さらに、１１Ｃ、１８Ｆ、１５Ｏ、及び１３Ｎなどのポジトロン放出同位体で置換された化合物が調製され得、このような化合物は、基質受容体占有率を検査するためのポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）試験に有用と考えられる。
【００５１】
別段の指示がない限り、本明細書及び請求項内の特定的な化合物の説明または呼称は、その個別の鏡像異性体及び混合物の両方、ラセミまたはその他のものを含むように意図されている。立体化学の決定及び立体異性体の分離のための方法は、当技術分野で周知されている。
【００５２】
本発明化合物が、生物学的に活性な代謝産物をもたらすように代謝され得ることは理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】実施例３．１のラットモデルにおいて、経口で与えられた２つの異なる用量の化合物１がＣＦＡ誘発性痛覚過敏に及ぼす効果を示している。
【００５４】
【図２】実施例３．２のラットモデルにおいて、経口で与えられた１０ｍｇ／ｋｇの化合物１がＭＩＡ誘発性痛覚過敏に及ぼす効果を示している。
【００５５】
【図３】５ｍｇ／ｋｇ／１日１回、１５ｍｇ／ｋｇ／１日１回、及び１５ｍｇ／ｋｇ／１日２回の化合物１が線維症のＣＦＡＨＦＤモデルからのマウス肝臓試料における線維症関連遺伝子のパネルの発現レベルに及ぼす効果を示している（実施例３．１０）。図３Ａ：ＰＡＩ１、図３Ｂ：ＴＩＭＰ１、図３Ｃ：ＣＯＬ１Ａ１、図３Ｄ：ＣＴＧＦ、図３Ｅ：ＡＣＴＡ２、及び図３Ｆ：ＴＧＦβ。データは７３日目からのものであり、平均±ＳＥＭ、ＣＤＡＨＦＤ食餌＋ビヒクルに対する＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１（マン・ホイットニー検定）として提示されている。
【００５６】
【図４】５ｍｇ／ｋｇ／１日１回、１５ｍｇ／ｋｇ／１日１回、及び１５ｍｇ／ｋｇ／１日２回の化合物１が線維症のＣＦＡＨＦＤモデルからのマウス肝臓試料における炎症関連遺伝子のパネルの発現レベルに及ぼす効果を示している（実施例３．１０）。図４Ａ：ＴＮＦα、図４Ｂ：ＩＬ１０、及び図４Ｃ：ＣＣＬ２。データは７３日目からのものであり、平均±ＳＥＭ、ＣＤＡＨＦＤ食餌＋ビヒクルに対する＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１（マン・ホイットニー検定）として提示されている。
【００５７】
【図５】５ｍｇ／ｋｇ／１日１回、１５ｍｇ／ｋｇ／１日１回、及び１５ｍｇ／ｋｇ／１日２回の化合物１が線維症のＣＦＡＨＦＤモデルからのマウス肝臓組織のヒドロキシプロリンレベルに及ぼす効果を示している（実施例３．１０）。データは７３日目からのものであり、平均±ＳＥＭ、ＣＤＡＨＦＤ食餌＋ビヒクルに対する＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１（マン・ホイットニー検定）として提示されている。
【００５８】
【図６】５ｍｇ／ｋｇ／１日１回、１５ｍｇ／ｋｇ／１日１回、及び１５ｍｇ／ｋｇ／１日２回の化合物１の効果を、線維症のＣＦＡＨＦＤモデルからのシリウスレッド線維症定量化を用いて示している（実施例３．１０）。データは７３日目からのものであり、平均±ＳＥＭ、ＣＤＡＨＦＤ食餌＋ビヒクルに対する＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１（マン・ホイットニー検定）として提示されている。
【００５９】
【図７】５ｍｇ／ｋｇ／１日１回、１５ｍｇ／ｋｇ／１日１回、及び１５ｍｇ／ｋｇ／１日２回の化合物１が線維症のＣＦＡＨＦＤモデルからのＦ４／８０定量化に及ぼす効果を示している（実施例３．１０）。データは７３日目からのものであり、平均±ＳＥＭ、ＣＤＡＨＦＤ食餌＋ビヒクルに対する＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１（マン・ホイットニー検定）として提示されている。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
本発明は、疼痛、炎症状態、心血管疾患、神経変性疾患、神経疾患、糖尿病の合併症、がん、及び／または線維性疾患の予防及び／または処置に有用であり得る新規のピロロピリミジン及びピロロピリミジン化合物の同定に基づく。特定的な態様において、本発明化合物は、ＡＳＫ阻害剤、特定的にはＡＳＫ１阻害剤である。
【００６１】
また、本発明は、これらの化合物、これらの化合物を含む薬学的組成物、ならびに本発明化合物を投与することにより、疼痛、炎症状態、心血管疾患、神経変性疾患、神経疾患、糖尿病の合併症、がん、及び／または線維性疾患を処置するための方法も提供する。
【００６２】
したがって、本発明の第１の態様において、式Ｉ：
【化２】
2020530833.tif 000004
を有する本発明化合物が提供される
（式中、
Ｒ１は、Ｈ、ＣＨ３、Ｆ、またはＣｌであり、
Ｘは、Ｎ、ＣＨ、またはＣ−ＣＮであり、
Ｒ２は、ＣＨ３またはハロゲンである）。
【００６３】
一実施形態において、Ｒ１はＦである。
【００６４】
一実施形態において、Ｒ１はＦであり、Ｒ２はＣＨ３である。
【００６５】
一実施形態において、ＸはＣＨである。代替的な実施形態において、ＸはＣ−ＣＮである。代替的な実施形態において、ＸはＮである。
【００６６】
一実施形態において、ＸはＮであり、Ｒ１はＦである。特定的な実施形態において、ＸはＮであり、Ｒ１はＦであり、Ｒ２はＣＨ３である。さらなる実施形態において、Ｒ２は、ＣＨ３またはＣｌである。またさらなる実施形態において、Ｒ２はＣＨ３である。
【００６７】
一実施形態において、本発明化合物は、以下から選択される：
２−アミノ−５−フルオロ−Ｎ−［１−（５−メチル−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）−４−ピペリジル］ピリジン−４−カルボキサミド（化合物１）、
２−アミノ−５−メチル−Ｎ−［１−（５−メチル−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）−４−ピペリジル］ピリジン−４−カルボキサミド（化合物２）、
２−アミノ−５−クロロ−Ｎ−［１−（５−メチル−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）−４−ピペリジル］−ピリジン−４−カルボキサミド（化合物３）、
２−アミノ−Ｎ−［１−（５−クロロ−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）−４−ピペリジル］ピリジン−４−カルボキサミド（化合物４）、
２−アミノ−Ｎ−［１−（５−クロロ−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）−４−ピペリジル］−５−フルオロ−ピリジン−４−カルボキサミド（化合物５）、
２−アミノ−Ｎ−［１−（５−シアノ−３−メチル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−４−イル）−４−ピペリジル］−５−フルオロ−ピリジン−４−カルボキサミド（化合物６）、及び
２−アミノ−Ｎ−［１−（３−クロロ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−４−イル）−４−ピペリジル］−５−フルオロ−ピリジン−４−カルボキサミド（化合物７）。
【００６８】
一実施形態において、本発明化合物は同位体バリアントである。
【００６９】
一態様において、本明細書に記載の実施形態のいずれか１つに従う本発明化合物は、遊離塩基として存在する。
【００７０】
一態様において、本明細書に記載の実施形態のいずれか１つに従う本発明化合物は、薬学的に許容される塩である。
【００７１】
一態様において、本明細書に記載の実施形態のいずれか１つに従う本発明化合物は、化合物の溶媒和物である。
【００７２】
一態様において、本明細書に記載の実施形態のいずれか１つに従う本発明化合物は、化合物の薬学的に許容される塩の溶媒和物である。
【００７３】
具体的な実施形態において、本明細書の実施形態のいずれか１つに従う本発明化合物は、ＡＳＫ１活性に関するｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞アッセイで、構造的に同様な化合物との比較において、活性の改善を示す。特定的な実施形態において、本発明化合物は、実施例２．３に記載されているような末梢血単核球（ＰＢＭＣ）中のＡＳＫ１活性に対する細胞アッセイにおいて、活性改善を示す。
【００７４】
代替的な実施形態において、本明細書の実施形態のいずれか１つに従う本発明化合物は、Ｃｙｐ活性の誘発の減少を示し得る。特定的には、本発明化合物は、構造的に同様な化合物との比較において、Ｃｙｐ３Ａ４活性の誘発の減少を示し得る。
【００７５】
代替的な実施形態において、本明細書の実施形態のいずれか１つに従う本発明化合物は、Ｃｙｐ活性の阻害の減少を示し得る。特定的には、本発明化合物は、構造的に同様な化合物との比較において、Ｃｙｐ３Ａ４活性の阻害の減少を示し得る。より特定的には、本発明化合物は、Ｃｙｐ阻害において１０μＭ超のＩＣ５０を示し得る。
【００７６】
各実施形態における指定された基が概して上記で別々に収載されている一方で、本発明化合物は、上記式、及び本明細書に提示された他の式におけるいくつかのまたは各々の実施形態が、各変数において、それぞれ指示されている特定的なメンバーまたは基のうちの１つ以上から選択される基を含む。そのため、本発明は、全てのこのような実施形態の組合せを本発明の範囲内に含むように意図されている。
【００７７】
各実施形態における指定された基が概して上記で別々に収載されている一方で、本発明化合物は、１つ以上の変数（例えば、Ｒ基）が、上記に収載された式（複数可）のいずれかに従う１つ以上の実施形態から選択される化合物であり得る。そのため、本発明は、任意の本開示の実施形態からの全ての変数の組合せを本発明の範囲内に含むように意図されている。
【００７８】
代替的に、指定された変数のうちの１つ以上が基または実施形態から除外されることも、本明細書により企図されている。
【００７９】
あるいくつかの態様において、本発明は、上記の式に従う化合物のプロドラッグ及び誘導体を提供する。「プロドラッグ」とは、代謝的に切断可能な基を有し、かつ加溶媒分解によりまたは生理的条件下においてｉｎ  ｖｉｖｏで薬学的活性を有する本発明化合物になる、本発明化合物の誘導体である。このような例としては、以下に限定されないが、コリンエステル誘導体など、及びＮ−アルキルモルフィンエステルなどが挙げられる。
【００８０】
その他の本発明化合物の誘導体は、その酸形態及び酸誘導体形態のいずれにおいても活性を有するが、酸感受性形態は、しばしば、哺乳類生体における可溶性、組織適合性、または遅延放出という利点をもたらす。プロドラッグとしては、当業者に周知されている酸誘導体、例えば、親酸と好適なアルコールとの反応によって調製されるエステル、または親酸化合物と置換もしくは非置換のアミンとの反応によって調製されるアミド、または酸無水物、または混合無水物が挙げられる。本発明化合物にぶら下がった酸性基から誘導される単純な脂肪族または芳香族のエステル、アミド、及び無水物は、好ましいプロドラッグである。いくつかの場合には、（アシルオキシ）アルキルエステルまたは（（アルコキシカルボニル）オキシ）アルキルエステルなどの二重エステル型プロドラッグの調製が望ましい。特定的に有用なのは、本発明化合物のＣ１−Ｃ８アルキル、Ｃ２−Ｃ８アルケニル、アリール、Ｃ７−Ｃ１２置換アリール、及びＣ７−Ｃ１２アリールアルキルのエステルである。
【００８１】
医薬組成物
本発明化合物は、薬として用いられる場合、典型的には薬学的組成物の形態で投与される。このような組成物は、薬学分野で周知されている方式で調製することができ、式Ｉに従う、少なくとも１つの本発明の活性化合物を含む。概して、本発明化合物は、薬学的に有効な量で投与される。実際に投与される化合物の量は、典型的には、治療の対象となる状態、選択された投与経路、投与される実際の本発明化合物、個々の患者の年齢、体重、及び応答、患者の症状の重症度などを含めた関連する状況に照らし、医師により決定される。
【００８２】
本発明の薬学的組成物は、経口、経直腸、経皮、皮下、関節内、静脈内、及び鼻腔内を含めた様々な経路によって投与され得る。意図される送達経路に応じて、本発明化合物は、好ましくは、注射用もしくは経口用組成物のいずれかとして、または膏薬として、ローションもしくはパッチとして、全て経皮投与用に製剤化される。
【００８３】
経口投与用の組成物は、バルクの溶液もしくは懸濁液、またはバルク粉末の形態をとり得る。しかし、より一般的には、組成物は、的確な投薬を容易にするために単位剤形で提示される。「単位剤形」という用語は、ヒト対象及び他の哺乳動物用の単位薬用量として好適な物理的に別々の単位を指し、各単位は、好適な薬学的賦形剤、ビヒクル、または担体と共に所望される治療効果をもたらすように算出された、所定量の活性材料を含有する。典型的な単位剤形としては、予め充填された計量済み液体組成物のアンプルもしくはシリンジ、または固体組成物の場合はピル、錠剤、カプセルなどが挙げられる。このような組成物において、式Ｉに従う本発明化合物は、通常、少量の構成成分（約０．１から約５０重量％、または好ましくは約１から約４０重量％）であり、残りは、様々なビヒクルまたは担体、及び所望される投薬形態の形成に役立つ処理助剤である。
【００８４】
経口投与に好適な液体形態は、バッファー、懸濁剤及び分配剤（ｄｉｓｐｅｎｓｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、着色剤、香味料などを伴って好適な水性または非水性のビヒクルを含み得る。固体形態は、例えば、任意の以下の成分、または同様の性質の本発明化合物を含み得る：微結晶性セルロース、トラガカントゴム、もしくはゼラチンなどの結合剤；デンプンもしくはラクトースなどの賦形剤；アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、もしくはトウモロコシデンプンなどの崩壊剤；スクロースもしくはサッカリンなどの甘味剤；またはペパーミントもしくはオレンジ香味物質などの香味剤。
【００８５】
注射用組成物は、典型的には、注射用の無菌食塩水もしくはリン酸緩衝食塩水、または当技術分野で公知のその他の担体をベースとする。前述のように、このような組成物中における式Ｉに従う本発明の活性化合物は、典型的には少量の構成成分であり、多くの場合約０．０５から１０重量％であり、残りは注射用担体などである。
【００８６】
経皮用組成物は、典型的には、活性成分（複数可）を含有する局所用の軟膏またはクリームとして、概して、約０．０１から約２０重量％、好ましくは約０．１から約２０重量％、好ましくは約０．１から約１０重量％、より好ましくは約０．５から約１５重量％の範囲の量で、製剤化される。活性成分は、軟膏として製剤化される場合、典型的にはパラフィン性または水混和性いずれかの軟膏基剤と組み合わされる。代替的に、活性成分は、水中油型クリーム基剤を用いてクリームに製剤化されてもよい。このような経皮用製剤は、当技術分野で周知されており、概して、活性成分または製剤の安定性の皮膚浸透を強化するための追加的成分を含む。全てのこのような公知の経皮用製剤及び成分は、本発明の範囲内に含まれる。
【００８７】
本発明化合物は、経皮用デバイスによって投与されてもよい。したがって、経皮投与は、リザーバーもしくは多孔質膜タイプ、または様々な固体マトリックスのパッチを用いて遂行され得る。
【００８８】
上述の経口投与用、注射用、または局所投与用組成物のための構成成分は、単なる代表例である。その他の材料及び処理技法などについては、参照により本明細書に援用されるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８５，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａのＰａｒｔ  ８に記載されている。
【００８９】
本発明化合物は、持続放出形態で、または持続放出薬物送達システムから投与されてもよい。代表的な持続放出材料の説明については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓに見いだすことができる。
【００９０】
以下の製剤例は、本発明に従って調製され得る代表的な薬学的組成物を例示するものである。ただし、本発明は、以下の薬学的組成物に限定されない。
【００９１】
製剤１（錠剤）
式Ｉに従う本発明化合物を、乾燥粉末として、乾燥ゼラチン結合剤とおよそ１：２の重量比で混合することができる。滑沢剤として少量のステアリン酸マグネシウムを添加してもよい。混合物を、錠剤プレスにおいて２４０−２７０ｍｇの錠剤（式Ｉに従う本発明の活性化合物は１錠当たり８０−９０ｍｇ）に形成することができる。
【００９２】
製剤２（カプセル）
式Ｉに従う本発明化合物を、乾燥粉末として、デンプン希釈剤とおよそ１：１の重量比で混合することができる。混合物を、２５０ｍｇのカプセル（式Ｉに従う本発明の活性化合物は１カプセル当たり１２５ｍｇ）に充填することができる。
【００９３】
製剤３（液体）
式Ｉに従う本発明化合物（１２５ｍｇ）を、スクロース（１．７５ｇ）及びキサンタンガム（４ｍｇ）と混合し、得られた混合物をブレンドし、Ｎｏ．１０メッシュＵ．Ｓ．ふるいに通し、次いで事前に作製した微結晶性セルロース及びカルボキシメチルセルロースナトリウム（１１：８９、５０ｍｇ）の水中溶液と混合することができる。安息香酸ナトリウム（１０ｍｇ）、香味料、及び着色料を水で希釈し、撹拌しながら添加することができる。次いで、十分な水を撹拌しながら添加することができる。さらに、次いで十分な水を添加して、５ｍＬの総量を得ることができる。
【００９４】
製剤４（錠剤）
式Ｉに従う本発明化合物を、乾燥粉末として、乾燥ゼラチン結合剤とおよそ１：２の重量比で混合することができる。滑沢剤として少量のステアリン酸マグネシウムを添加してもよい。混合物を、錠剤プレスにおいて４５０−９００ｍｇの錠剤（式Ｉに従う本発明の活性化合物は１５０−３００ｍｇ）に形成することができる。
【００９５】
製剤５（注射）
式Ｉに従う本発明化合物を、緩衝無菌食塩水注射用水性媒体に溶解または懸濁して、およそ５ｍｇ／ｍＬの濃度とすることができる。
【００９６】
製剤６（局所用）
ステアリルアルコール（２５０ｇ）及び白色ワセリン（２５０ｇ）を約７５℃で融解し、次いで、式Ｉに従う本発明化合物（５０ｇ）、メチルパラベン（０．２５ｇ）、プロピルパラベン（０．１５ｇ）、ラウリル硫酸ナトリウム（１０ｇ）、及びプロピレングリコール（１２０ｇ）の水（約３７０ｇ）に溶解した混合物を添加し、得られた混合物を凝結するまで撹拌することができる。
【００９７】
治療方法
一実施形態において、本発明は、医薬における使用のための、本発明化合物、または本発明化合物を含む薬学的組成物を提供する。特定的な実施形態において、本発明は、疼痛、炎症状態、心血管疾患、神経変性疾患、神経疾患、糖尿病の合併症、がん、及び／または線維性疾患の予防及び／または処置における使用のための、本発明化合物または本発明化合物を含む薬学的組成物を提供する。
【００９８】
別の実施形態において、本発明は、疼痛、炎症状態、心血管疾患、神経変性疾患、神経疾患、糖尿病の合併症、がん、及び／または線維性疾患の予防及び／または処置における使用のための医薬品の製造における使用のための、本発明化合物、または本発明化合物を含む薬学的組成物を提供する。
【００９９】
一実施形態において、本発明は、本発明化合物と、別の治療剤とを含む薬学的組成物を提供する。特定的な実施形態において、他の治療剤は、疼痛、炎症状態、心血管疾患、神経変性疾患、神経疾患、糖尿病の合併症、がん、及び／または線維性疾患の予防及び／または処置のための薬剤である。
【０１００】
追加的な処置方法態様において、本発明は、疼痛、炎症状態、心血管疾患、神経変性疾患、神経疾患、糖尿病の合併症、がん、及び／または線維性疾患の予防及び／または処置の方法であって、有効量の、本発明化合物、または当該状態の処置もしくは予防のための本明細書に記載の薬学的組成物のうちの１つ以上を投与することを含む、方法を提供する。
【０１０１】
追加的な処置方法態様において、本発明は、疼痛、炎症状態、心血管疾患、神経変性疾患、神経疾患、糖尿病の合併症、がん、及び／または線維性疾患に罹患している哺乳類の予防及び／または処置の方法であって、有効量の、本発明化合物、または当該状態の処置もしくは予防のための本明細書に記載の薬学的組成物のうちの１つ以上を投与することを含む、方法を提供する。
【０１０２】
一実施形態において、本発明は、疼痛の予防及び／または処置における使用のための、本発明化合物、または本発明化合物を含む薬学的組成物を提供する。特定的な実施形態において、疼痛は、慢性関節疼痛から選択される。慢性関節疼痛の具体的な実施形態は、変形性関節炎、リウマチ性関節炎、リウマチ性脊椎炎、痛風性関節炎（痛風）、及び／または若年性関節炎の疼痛である。
【０１０３】
別の実施形態において、本発明は、疼痛の予防及び／または処置における使用のための医薬品の製造における使用のための、本発明化合物、または本発明化合物を含む薬学的組成物を提供する。特定的な実施形態において、疼痛は、慢性関節疼痛から選択される。慢性関節疼痛の具体的な実施形態は、変形性関節炎、リウマチ性関節炎、リウマチ性脊椎炎、痛風性関節炎（痛風）、及び／または若年性関節炎の疼痛である。
【０１０４】
追加的な処置方法態様において、本発明は、疼痛に罹患している哺乳類の予防及び／または処置の方法であって、有効量の、本発明化合物、または当該状態の処置もしくは予防のための本明細書に記載の薬学的組成物のうちの１つ以上を投与することを含む、方法を提供する。特定的な実施形態において、疼痛は、慢性関節疼痛から選択される。慢性関節疼痛の具体的な実施形態は、変形性関節炎、リウマチ性関節炎、リウマチ性脊椎炎、痛風性関節炎（痛風）、及び／または若年性関節炎の疼痛である。
【０１０５】
一実施形態において、本発明は、炎症状態の予防及び／または処置における使用のための、本発明化合物、または本発明化合物を含む薬学的組成物を提供する。特定的な実施形態において、炎症状態は、リウマチ性関節炎、変形性関節炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、及び炎症性腸疾患から選択される。より特定的には、炎症状態は、変形性関節炎である。
【０１０６】
別の実施形態において、本発明は、炎症状態の予防及び／または処置における使用のための医薬品の製造における使用のための、本発明化合物、または本発明化合物を含む薬学的組成物を提供する。特定的な実施形態において、炎症状態は、リウマチ性関節炎、変形性関節炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、及び炎症性腸疾患から選択される。より特定的には、炎症状態は、変形性関節炎である。
追加的な処置方法態様において、本発明は、炎症状態に罹患している哺乳類の予防及び／または処置の方法であって、有効量の、本発明化合物、または当該状態の処置もしくは予防のための本明細書に記載の薬学的組成物のうちの１つ以上を投与することを含む、方法を提供する。特定的な実施形態において、炎症状態は、リウマチ性関節炎、変形性関節炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、及び炎症性腸疾患から選択される。より特定的には、炎症状態は、変形性関節炎である。
【０１０７】
一実施形態において、本発明は、心血管疾患の予防及び／または処置における使用のための、本発明化合物、または本発明化合物を含む薬学的組成物を提供する。特定的な実施形態において、心血管疾患は、アテローム性動脈硬化症、肺動脈高血圧症、心不全、急性冠動脈症候群、心臓肥大、心室線維症、及び心筋リモデリングから選択される。
【０１０８】
別の実施形態において、本発明は、心血管疾患の予防及び／または処置における使用のための医薬品の製造における使用のための、本発明化合物、または本発明化合物を含む薬学的組成物を提供する。特定的な実施形態において、心血管疾患は、アテローム性動脈硬化症、肺動脈高血圧症、心不全、急性冠動脈症候群、心臓肥大、心室線維症、及び心筋リモデリングから選択される。
【０１０９】
追加的な処置方法態様において、本発明は、心血管疾患に罹患している哺乳類の予防及び／または処置の方法であって、有効量の、本発明化合物、または当該疾患の処置もしくは予防のための本明細書に記載の薬学的組成物のうちの１つ以上を投与することを含む、方法を提供する。特定的な実施形態において、心血管疾患は、アテローム性動脈硬化症、肺動脈高血圧症、心不全、急性冠動脈症候群、心臓肥大、心室線維症、及び心筋リモデリングから選択される。
【０１１０】
一実施形態において、本発明は、神経変性疾患の予防及び／または処置における使用のための、本発明化合物、または本発明化合物を含む薬学的組成物を提供する。特定的な実施形態において、神経変性疾患は、変性性認知症、アルツハイマー病、多発性硬化症、及び網膜症から選択される。
【０１１１】
別の実施形態において、本発明は、神経変性疾患の予防及び／または処置における使用のための医薬品の製造における使用のための、本発明化合物、または本発明化合物を含む薬学的組成物を提供する。特定的な実施形態において、神経変性疾患は、変性性認知症、アルツハイマー病、多発性硬化症、及び網膜症から選択される。
【０１１２】
追加的な処置方法態様において、本発明は、神経変性疾患に罹患している哺乳類の予防及び／または処置の方法であって、有効量の、本発明化合物、または当該疾患の処置もしくは予防のための本明細書に記載の薬学的組成物のうちの１つ以上を投与することを含む、方法を提供する。特定的な実施形態において、神経変性疾患は、変性性認知症、アルツハイマー病、多発性硬化症、及び網膜症から選択される。
【０１１３】
一実施形態において、本発明は、神経疾患の予防及び／または処置における使用のための、本発明化合物、または本発明化合物を含む薬学的組成物を提供する。特定的な実施形態において、神経疾患は、神経因性疼痛、認知症、多発性硬化症、及び網膜症から選択される。
【０１１４】
別の実施形態において、本発明は、神経疾患の予防及び／または処置における使用のための医薬品の製造における使用のための、本発明化合物、または本発明化合物を含む薬学的組成物を提供する。特定的な実施形態において、神経変性疾患は、神経因性疼痛、認知症、多発性硬化症、及び網膜症から選択される。
【０１１５】
追加的な処置方法態様において、本発明は、神経疾患に罹患している哺乳類の予防及び／または処置の方法であって、有効量の、本発明化合物、または当該疾患の処置もしくは予防のための本明細書に記載の薬学的組成物のうちの１つ以上を投与することを含む、方法を提供する。特定的な実施形態において、神経変性疾患は、神経因性疼痛、認知症、多発性硬化症、及び網膜症から選択される。
【０１１６】
一実施形態において、本発明は、糖尿病の合併症の予防及び／または処置における使用のための、本発明化合物、または本発明化合物を含む薬学的組成物を提供する。特定的な実施形態において、合併症は、糖尿病性網膜症、糖尿病性微小血管症、糖尿病性腎症、及び肝脂肪症から選択される。
【０１１７】
別の実施形態において、本発明は、糖尿病の合併症の予防及び／または処置における使用のための医薬品の製造における使用のための、本発明化合物、または本発明化合物を含む薬学的組成物を提供する。特定的な実施形態において、合併症は、糖尿病性網膜症、糖尿病性微小血管症、糖尿病性腎症、及び肝脂肪症から選択される。
【０１１８】
追加的な処置方法態様において、本発明は、糖尿病の合併症に罹患している哺乳類の予防及び／または処置の方法であって、有効量の、本発明化合物、または当該合併症の処置もしくは予防のための本明細書に記載の薬学的組成物のうちの１つ以上を投与することを含む、方法を提供する。特定的な実施形態において、合併症は、糖尿病性網膜症、糖尿病性微小血管症、糖尿病性腎症、及び肝脂肪症から選択される。
【０１１９】
一実施形態において、本発明は、がんの予防及び／または処置における使用のための、本発明化合物、または本発明化合物を含む薬学的組成物を提供する。
【０１２０】
別の実施形態において、本発明は、がんの予防及び／または処置における使用のための医薬品の製造における使用のための、本発明化合物、または本発明化合物を含む薬学的組成物を提供する。
【０１２１】
追加的な処置方法態様において、本発明は、がんに罹患している哺乳類の予防及び／または処置の方法であって、有効量の、本発明化合物、または当該がんの処置もしくは予防のための本明細書に記載の薬学的組成物のうちの１つ以上を投与することを含む、方法を提供する。
【０１２２】
一実施形態において、本発明は、線維性疾患の予防及び／または処置における使用のための、本発明化合物、または本発明化合物を含む薬学的組成物を提供する。特定的な実施形態において、線維性疾患は、肝線維症、肺線維症、または腎線維症などの個別の臓器または組織の疾患である。特定的な実施形態において、線維性疾患は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、糖尿病性腎疾患（ＤＫＤ）、及び非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）から選択される。
【０１２３】
別の実施形態において、本発明は、線維性疾患の予防及び／または処置における使用のための医薬品の製造における使用のための、本発明化合物、または本発明化合物を含む薬学的組成物を提供する。特定的な実施形態において、線維性疾患は、肝線維症、肺線維症、または腎線維症などの個別の臓器または組織の疾患である。特定的な実施形態において、線維性疾患は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、糖尿病性腎疾患（ＤＫＤ）、及び非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）から選択される。
【０１２４】
追加的な処置方法態様において、本発明は、線維性疾患に罹患している哺乳類の予防及び／または処置の方法であって、有効量の、本発明化合物、または当該疾患の処置もしくは予防のための本明細書に記載の薬学的組成物のうちの１つ以上を投与することを含む、方法を提供する。特定的な実施形態において、線維性疾患は、肝線維症、肺線維症、または腎線維症などの個別の臓器または組織の疾患である。特定的な実施形態において、線維性疾患は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、糖尿病性腎疾患（ＤＫＤ）、及び非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）から選択される。
【０１２５】
注射用量レベルは、約０．１ｍｇ／ｋｇ／ｈから少なくとも１０ｍｇ／ｋｇ／ｈ、または約１から約１２０ｈ、特に２４から９６ｈの範囲である。また、的確な定常状態レベルを達成するために、約０．１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上のプレロードボーラスも投与され得る。４０から８０ｋｇのヒト患者に対する最大総用量は、約１ｇ／日を超えないものと考えられる。
【０１２６】
変性状態などの長期状態の予防及び／または処置については、処置レジメンは、通常、数ヵ月または数年に及ぶため、患者の利便性及び忍容性のために経口投薬が好ましい。経口投薬の場合、１日に１から４回（１−４回）の規則的用量、１日に１から３回（１−３回）の規則的用量、典型的には１日に１から２回（１−２回）の規則的用量、最も典型的には１日に１回の規則的用量が代表的なレジメンである。代替的に、効果が長時間続く薬物については、経口投薬の場合、２週間に１回、１週間に１回、及び１日に１回が代表的なレジメンである。特定的には、薬用量レジメンは、１−１４日ごと、より特定的には１−１０日ごと、さらに特定的には１−７日ごと、最も特定的には１−３日ごとであり得る。
【０１２７】
これらの投薬パターンを用いて、各用量は、約１から約１０００ｍｇの本発明化合物を提供し、特定的な用量は、各々が約１０から約５００ｍｇ、特に約３０から約２５０ｍｇを提供する。
【０１２８】
経皮的用量は、概して、注射用量を用いて達成されるのと同様のまたはより低い血液レベルをもたらすように選択される。
【０１２９】
本発明化合物は、状態の発症を防止するのに使用される場合、当該状態を発生するリスクのある患者に、典型的には医師の助言に基づきかつ医師の監視下で、上記の薬用量レベルで投与されることになる。特定的な状態を発生するリスクがある患者としては、概して、当該状態の家族歴を有する患者、または遺伝子検査もしくはスクリーニングにより、当該状態の発生に対し特定的に感受性を有することが同定された患者が挙げられる。
【０１３０】
本発明化合物は、単独の活性薬剤として投与されてもよく、または他の治療剤と組み合わせて投与されてもよく、この他の治療剤には、同じまたは同様な治療活性を実証しており、かつこのような組合せ投与に対し安全かつ有効であると判定されている他の本発明化合物が含まれる。具体的な実施形態において、２つ（またはそれ以上）の薬剤の同時投与により、使用すべき各薬剤の用量の顕著な低下が可能になり、それにより、観察される副作用の低減が可能になる。
【０１３１】
一実施形態において、本発明化合物、または本発明化合物を含む薬学的組成物は、医薬品として投与される。具体的な実施形態において、当該薬学的組成物はさらに、さらなる活性成分を含む。
【０１３２】
一実施形態において、本発明の化合物は、炎症状態の処置及び／または予防のための別の治療剤と同時投与され、特定的な薬剤としては、以下に限定されないが、免疫調節剤（例えば、アザチオプリン）、コルチコステロイド（例えば、プレドニソロンまたはデキサメタゾン）、シクロホスファミド、シクロスポリンＡ、タクロリムス、ミコフェノール酸モフェチル、ムロモナブ−ＣＤ３（ＯＫＴ３、例えば、Ｏｒｔｈｏｃｏｌｏｎｅ（登録商標））、ＡＴＧ、アスピリン、アセトアミノフェン、イブプロフェン、ナプロキセン、及びピロキシカムが挙げられる。
【０１３３】
一実施形態において、本発明化合物は、関節炎（例えば、リウマチ性関節炎）の処置及び／または予防のための別の治療剤と同時投与され、特定的な薬剤としては、以下に限定されないが、鎮痛剤、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、ステロイド、合成の疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）（例えば、限定されないが、メトトレキサート、レフルノミド、スルファサラジン、オーラノフィン、金チオリンゴ酸ナトリウム、ペニシラミン、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、アザチオプリン、トファシチニブ、バリシチニブ、フォスタマチニブ、及びシクロスポリン）、ならびに生物学的ＤＭＡＲＤ（例えば、限定されないが、インフリキシマブ、エタネルセプト、アダリムマブ、リツキシマブ、及びアバタセプト）が挙げられる。
【０１３４】
同時投与は、当業者には明らかであるように、２つ以上の治療剤を同じ処置レジメンの一部として患者に送達する任意の手段を含む。２つ以上の薬剤は、単一の製剤において、すなわち単一の薬学的組成物として同時に投与されてもよいが、これは必須ではない。これらの薬剤は、異なる製剤で、かつ異なる時間に投与されてもよい。
【０１３５】
化学合成手順
全般
本発明のさらなる態様によれば、式Ｉの化合物を調製するためのプロセスが提供される。本明細書におけるスキームは、本発明化合物の合成に使用され得る合成スキームの例である。本明細書のスキームにおいて、反応性基は、保護基を用いて保護され、十分に確立された技法に従って脱保護され得る。
【０１３６】
本発明のさらなる態様によれば、本明細書で定義されているような式Ｉの化合物を調製するためのプロセスであって、
（ａ）式ＩＩの化合物：
【化３】
2020530833.tif 000005
（式中、Ｘ及びＲ２は、本明細書で定義されている通りである）
を式ＩＩＩの化合物：
【化４】
2020530833.tif 000006
（式中、Ｒ１は、本明細書で定義されている通りである）
またはその保護誘導体と反応させることと、
（ｂ）式Ｉの化合物の保護誘導体を脱保護することと、
（ｃ）式Ｉの化合物またはその保護誘導体を、さらなる式Ｉの化合物またはその保護誘導体に相互転換することと、
（ｄ）任意選択で、式Ｉの化合物の薬学的に許容される塩を形成することと
を含む、プロセスが提供される。
【０１３７】
式ＩＩ及びＩＩＩの化合物は、本明細書のスキーム１Ａ、１Ｂ、１Ｃに記載の手順及び化合物１から７を調製するための手順に従って調整され得る。
【０１３８】
本発明化合物は、以下の一般的方法及び手順を用いて、容易に入手可能な出発物質から調製され得る。典型的なまたは好ましいプロセス条件（すなわち、反応温度、時間、反応体のモル比、溶媒、圧力など）が示されている場合は、別段の明記がない限り、他のプロセス条件も使用され得ることが理解されよう。最適な反応条件は、使用する特定的な反応体または溶媒によって変動し得るが、このような条件は、当業者により、通例的な最適化手順によって決定することができる。
【０１３９】
加えて、当業者には明らかであるように、あるいくつかの官能基が望ましくない反応を起こすことを防ぐために従来の保護基が必要になる場合がある。特定的な官能基のための好適な保護基の選択、ならびに保護及び脱保護のための好適な条件の選択は、当技術分野で周知されている。
【０１４０】
上記及び比較例で定義されているような本発明化合物の調製に関し、以下の方法が詳細に提示されている。本発明化合物は、有機合成分野の当業者により、公知または市販の出発材料及び試薬から調製され得る。
【０１４１】
全ての試薬は商用グレードであり、別段の明記がない限り、さらなる精製なしでそのまま使用される。不活性雰囲気下で行われる反応には市販の無水溶媒が使用される。別段の指定がない限り、その他の全ての場合には試薬グレード溶媒が使用される。カラムクロマトグラフィーは、シリカゲル６０（３５−７０μｍ）で実施される。薄層クロマトグラフィーは、プレコーティングシリカゲル６０Ｆ−２５４プレート（厚さ０．２５ｍｍ）を用いて行われる。ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ  ＤＰＸ  ３００ＭＨｚ（５ｍｍ  ＢＢＩプローブ搭載）、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＶ４００ＭＨｚ（５ｍｍ  ＰＡＢＢＯプローブ搭載）、Ｂｒｕｋｅｒ  ＤＲＸ  ５００ＭＨｚ（５ｍｍ  ＰＡＢＢＩプローブ搭載）、及びＢｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ＩＩＩ  ６００分光計（５ｍｍ  ＲＴ  ＢＢＩプローブ搭載）に記録される。試料は、別段の明記がない限り、ＤＭＳＯ−ｄ６またはＣＤＣｌ３を溶媒として用いて２５℃にて記録される。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルの化学シフト（δ）は、内部基準としてのテトラメチルシラン（δ０．００）に対する百万分率（ｐｐｍ）で報告される。
【０１４２】
エレクトロスプレーＭＳスペクトルは、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＰＤＡ検出器及びＳＱＤ質量分析計を伴ったＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣで得られる。使用カラム：Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８  １．７μｍ、２．１×５０ｍｍカラムまたはＡｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＣＳＨ  Ｃ１８  １．７μｍ、２．１×５０ｍｍカラムを伴ったＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８  １．７μｍ、２．１×５ｍｍ  ＶａｎＧｕａｒｄプレカラム。全ての方法はＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏグラジエントを使用する。ＭｅＣＮ及びＨ２Ｏは、０．１％  ギ酸または１０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３のいずれかを含有する。
【０１４３】
分取精製ＨＰＬＣについては、Ｗａｔｅｒｓ  Ｍａｓｓ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ａｕｔｏｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを使用する。システムは、Ｗａｔｅｒｓ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｍａｎａｇｅｒ  ２７６７、Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｆｌｕｉｄ  Ｏｒｇａｎｉｚｅｒ、Ｗａｔｅｒｓ  Ｂｉｎａｒｙ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｍｏｄｕｌｅ  ２５４５、Ｗａｔｅｒｓ  ５１５  ＨＰＬＣ  Ｐｕｍｐ、Ｗａｔｅｒｓ  Ｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅ  Ａｒｒａｙ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ２９９８、及びＷａｔｅｒｓ  Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＺＱ  ＭＳ  ｄｅｔｅｃｔｏｒから構成される。使用ソフトウェア：ＦｒａｃｔｉｏｎＬｙｎｘ及びＭａｓｓＬｙｎｘ  ｖ４．１。一般的なＨＰＬＣ法パラメーター：Ｈ２Ｏ中０．１％のギ酸及びＭｅＣＮ、または１０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３  ｐＨ＝１０及びＭｅＣＮのグラジエント移動相。カラムＸＢｒｉｄｇｅ  ３０×１５０ｍｍ、５μｍ。ＰＤＡ検出器設定：波長：２１０−４００ｎｍ、解像度：１．２ｎｍ、サンプリングレート：１．０ポイント／秒、フィルター応答：１。マイクロ波加熱はＢｉｏｔａｇｅ  Ｉｎｉｔｉａｔｏｒで実施する。
実験セクションで使用される略語リスト：
【表１】
2020530833.tif 000007
2020530833.tif 000008
2020530833.tif 000009
【０１４４】
質量指向型自動化ＨＰＬＣ
適用可能な場合、以下の装置及び条件を用いて質量指向型自動化ＨＰＬＣによる精製を行った。
ハードウェア：
Ｗａｔｅｒｓ  ２５２５  Ｂｉｎａｒｙ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｍｏｄｕｌｅ
Ｗａｔｅｒｓ  ５１５  Ｍａｋｅｕｐ  Ｐｕｍｐ
Ｗａｔｅｒｓ  Ｐｕｍｐ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｍｏｄｕｌｅ
Ｗａｔｅｒｓ  ２７６７  Ｉｎｊｅｃｔ  Ｃｏｌｌｅｃｔ
Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｌｕｍｎ  Ｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｍａｎａｇｅｒ
Ｗａｔｅｒｓ  ２９９６  Ｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅ  Ａｒｒａｙ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ
Ｗａｔｅｒｓ  ＺＱ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ
Ｇｉｌｓｏｎ  ２０２  ｆｒａｃｔｉｏｎ  ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ
Ｇｉｌｓｏｎ  Ａｓｐｅｃ  ｗａｓｔｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ
ソフトウェア：  Ｗａｔｅｒｓ  ＭａｓｓＬｙｎｘ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ４  ＳＰ２
カラム：使用カラムはＷａｔｅｒｓ  Ａｔｌａｎｒｉｓとした。寸法は１９ｍｍ×１００ｍｍ（スモールスケール）及び３０ｍｍ×１００ｍｍ（ラージスケール）である。固定相の粒子サイズは５μｍである。
酸性法：
溶媒：
Ａ：水性溶媒＝水＋０．１％ギ酸
Ｂ：有機溶媒＝アセトニトリル＋０．１％ギ酸
メイクアップ溶媒＝メタノール：水  ８０：２０
ニードルリンス溶媒＝メタノール
方法：
【０１４５】
目的化合物の分析的保持時間に応じて５つの方法を使用した。各方法の実行時間は１３．５分で、１０分のグラジエントと、その後の３．５分のカラムフラッシュ及び再平衡化ステップとが含まれた。
ラージ／スモールスケール  １．０−１．５（ＨＰＬＣ）、０．４−０．６（ＵＰＬＣ）＝５−３０％  Ｂ
ラージ／スモールスケール  １．５−２．２（ＨＰＬＣ）、０．６−０．９（ＵＰＬＣ）＝１５−５５％  Ｂ
ラージ／スモールスケール  ２．２−２．９（ＨＰＬＣ）、０．９−１．２（ＵＰＬＣ）＝３０−８５％  Ｂ
ラージ／スモールスケール  ２．９−３．６（ＨＰＬＣ）、１．２−１．４（ＵＰＬＣ）＝５０−９９％  Ｂ
ラージ／スモールスケール  ３．６−５．０（ＨＰＬＣ）、１．４−２．０（ＵＰＬＣ）＝８０−９９％  Ｂ（これを６分、この後に７．５分のフラッシュ及び再平衡化）
流量：上記方法の全てにおいて、流量は２０ｍＬ／分（スモールスケール）または４０ｍＬ／分（ラージスケール）のいずれかである。
高ｐＨ法：
カラム：ＨＰＬＣ分析は、周囲温度にてＸＢｒｉｄｇｅ  Ｃ１８カラム（内径１００ｎｍ×１９ｎｍ、パッキング直径５μｍ）で行った。
溶媒：
Ａ：水中１０ｍＭの重炭酸アンモニウム、アンモニア溶液でｐＨ１０に調整。
Ｂ：アセトニトリル。
【０１４６】
方法：
目的化合物の分析的保持時間に応じて５つの方法を使用した。これらの方法の実行時間は１５分で、１０分のグラジエントと、その後の５分のカラムフラッシュ及び再平衡化ステップとが含まれた。
ラージ／スモールスケール  １．０−１．５（ＨＰＬＣ）、０．４−０．６（ＵＰＬＣ）＝１−３０％  Ｂ
ラージ／スモールスケール  １．５−２．２（ＨＰＬＣ）、０．６−０．９（ＵＰＬＣ）＝１５−５５％  Ｂ
ラージ／スモールスケール  ２．２−２．９（ＨＰＬＣ）、０．９−１．２（ＵＰＬＣ）＝３０−８５％  Ｂ
ラージ／スモールスケール  ２．９−３．６（ＨＰＬＣ）、１．２−１．４（ＵＰＬＣ）＝５０−９９％  Ｂ
ラージ／スモールスケール  ３．６−５．０（ＨＰＬＣ）、１．４−２．０（ＵＰＬＣ）＝８０−９９％  Ｂ（これを６分、この後に７．５分のフラッシュ及び再平衡化）
流量：上記方法の全てにおいて、流量は２０ｍｌ／分（スモールスケール）または４０ｍｌ／分（ラージスケール）のいずれかである
【０１４７】
液体クロマトグラフィー／質量分析
下記に示す方法で指定されている装置及び条件を用いて、液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）による上記実施例の分析を行った。
液体クロマトグラフィー：
方法の説明：ギ酸一般的分析ＵＰＬＣオープンアクセスＬＣ／ＭＳ
２分間法
ＬＣ／ＭＳシステム：Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ及びＳＱＤ質量分析計の併用
ＬＣ条件
カラム：Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８（内径５０ｍｍ×２．１ｍｍ、パッキング直径１．７μｍ）
カラム温度：４０℃
溶媒：Ａ＝水中ギ酸０．１％  ｖ／ｖ溶液
Ｂ＝アセトニトリル中ギ酸０．１％  ｖ／ｖ溶液
注入量：２μｌ
勾配表：
【表２】
2020530833.tif 000010
停止時間：２分
ＵＶ条件
ＰＤＡ範囲：２１０ｎｍ−３５０ｎｍ
【０１４８】
ＵＶ検出は２１０ｎｍから３５０ｎｍの波長からのシグナルの和とした
取得レート：４０Ｈｚ
ＭＳ条件
イオン化モード：交互（正及び負のエレクトロスプレー（ＥＳ＋／ＥＳ−）のスキャン）
スキャン範囲：１００から１０００ＡＭＵ
スキャン時間：０．１５
インタースキャン遅延：
ＭＳインタースキャン（ｉｎｔｅｒ−ｓｃａｎａｎ）：０．０２秒
極性／モードスイッチインタースキャン：０．０２秒
方法の説明：重炭酸アンモニウム一般的分析ＵＰＬＣオープンアクセスＬＣ／ＭＳ  ２分間法
ＬＣ／ＭＳシステム：Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ及びＳＱＤ質量分析計の併用
ＬＣ条件
カラム：Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８（内径５０ｍｍ×２．１ｍｍ、パッキング直径１．７μｍ））
カラム温度：  ４０℃
溶媒：Ａ＝ＮＨ４ＨＣＯ３の１０ｍＭ水性溶液（アンモニアでｐＨ１０に調整）
Ｂ＝アセトニトリル
注入量：１μｌ
勾配表：
【表３】
2020530833.tif 000011
停止時間：２分
ＵＶ条件
ＰＤＡ範囲：２１０ｎｍ−３５０ｎｍ
ＵＶ検出は２１０ｎｍから３５０ｎｍの波長からのシグナルの和とした
取得レート：４０Ｈｚ
ＭＳ条件
イオン化モード：交互（正及び負のエレクトロスプレー（ＥＳ＋／ＥＳ−）のスキャン）
スキャン範囲：１００から１０００ＡＭＵ
スキャン時間：  ０．１５
インタースキャン遅延：
ＭＳインタースキャン：０．０２秒
極性／モードスイッチインタースキャン：０．０２秒
本発明化合物の合成的調製
スキーム１Ａ  中間体Ａの合成
【化５】
2020530833.tif 000012
スキーム１Ｂ  中間体Ｂの合成
【化６】
2020530833.tif 000013
スキーム１Ｃ  化合物１の合成
【化７】
2020530833.tif 000014
【０１４９】
１．１  化合物１：  ２−アミノ−５−フルオロ−Ｎ−［１−（５−メチル−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）−４−ピペリジル］ピリジン−４−カルボキサミド
１．１．１  ステップ１：２−ブロモ−５−フルオロ−ピリジン−４−カルボン酸メチルの合成
【化８】
2020530833.tif 000015
０℃に冷却した２−ブロモ−５−フルオロ−ピリジン−４−カルボン酸（１０．０ｇ、４５．５ｍｍｏｌ）のメタノール（３００ｍＬ）中溶液に、塩化チオニル（１６．５ｍＬ、２２７．３ｍｍｏｌ）を３０分かけて滴下添加した。反応混合物を周囲温度にて２４時間撹拌した。トルエン（４０ｍＬ）を反応混合物に添加した。メタノールを蒸発させた後、塩化チオニルを蒸留除去した。残りのトルエンをロータリー・エバポレーター上で蒸発させて粗生成物を得、これをジクロロメタン（３０ｍＬ）に溶解し、減圧下で蒸発させて、２−ブロモ−５−フルオロ−ピリジン−４−カルボン酸メチル（１０．３ｇ）を得た。ＬＣＭＳ： ＭＷ （計算値）： ２３２．９；ＭＳ （ＥＳ＋， ｍ／ｚ）： ２３４， ２３６ （Ｍ＋Ｈ）＋．
【０１５０】
１．１．２  代替的な合成手順：
０℃に冷却した２−ブロモ−５−フルオロ−ピリジン−４−カルボン酸（１０．０ｇ、４５．５ｍｍｏｌ）のメタノール（３５ｍＬ）及びトルエン（６５ｍＬ）中溶液に、（トリメチルシリル）ジアゾメタン（ジエチルエーテル中２．０Ｍの溶液；４５．５ｍＬ、９０．９ｍｍｏｌ）を３０分かけて滴下添加した。反応混合物を周囲温度にて撹拌した。２時間後、反応混合物を減圧下で蒸発させて粗生成物を得、これを酢酸エチル（５０ｍＬ）に溶解し、水（１００ｍＬ）及びブライン（５０ｍＬ）でそれぞれ洗浄し、相分離フィルターで濾過し、減圧下で蒸発させて、２−ブロモ−５−フルオロ−ピリジン−４−カルボン酸メチル（１０．４６ｇ）を得た。ＬＣＭＳ：  ＭＷ  （計算値）：  ２３２．９；ＭＳ  （ＥＳ＋，  ｍ／ｚ）：  ２３４，  ２３６  （Ｍ＋Ｈ）＋．
【０１５１】
１．１．３  ステップ２：２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−５−フルオロ−ピリジン−４−カルボン酸メチルの合成
【化９】
2020530833.tif 000016
２−ブロモ−５−フルオロ−ピリジン−４−カルボン酸メチル（１０．３ｇ、４４．０ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン（１５０ｍＬ）中溶液に、カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（６．１８ｇ、５２．８ｍｍｏｌ）、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）（０．８６ｇ、０．８８ｍｍｏｌ）、４，５−ビス（ジフェニルホスフィノ）−９，９−ジメチルキサンテン（１．０２ｇ、１．７６ｍｍｏｌ）、及び炭酸セシウム（２０．０８ｇ、６１．６ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物をアルゴンでパージし、超音波処理し、キャップ形成し、９０℃にて２４時間撹拌した。反応混合物を冷却し、セライトパッドで濾過し、酢酸エチルで洗浄した。母液を水（２×１００ｍＬ）及びブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、減圧下で蒸発させて粗生成物を得、これを酢酸エチルで粉砕して２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−５−フルオロ−ピリジン−４−カルボン酸メチル（８．４３ｇ）を得た。ＬＣＭＳ： ＭＷ （計算値）： ２７０．１；ＭＳ （ＥＳ＋， ｍ／ｚ）： ２１５．４１ （Ｍ＋Ｈ−５６）＋．
【０１５２】
１．１．４  代替的な合成手順（２−（（ジフェニルメチレン）アミノ）−５−フルオロイソニコチン酸メチル中間体）：
【化１０】
2020530833.tif 000017
２−ブロモ−５−フルオロ−ピリジン−４−カルボン酸メチル（３０８ｍｇ、１．３２ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン（６ｍＬ）中脱気及びアルゴンパージ懸濁液に、ベンゾフェノンイミン（０．２６６ｍＬ、１．５８ｍｍｏｌ）、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）（２４．１ｍｇ、０．０２６ｍｍｏｌ）、４，５−ビス（ジフェニルホスフィノ）−９，９−ジメチルキサンテン（３０．５ｍｇ、０．０５３ｍｍｏｌ）、及び炭酸セシウム（６０２．０ｍｇ、０．０５３ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物をアルゴンでフラッシュし、超音波処理し、キャップ形成し、１００℃にて１６時間撹拌した。反応混合物を冷却し、酢酸エチル（１５ｍＬ）で希釈し、水（１５ｍＬ）、ブライン（１５ｍＬ）で洗浄し、減圧下で蒸発させて２−（（ジフェニルメチレン）アミノ）−５−フルオロイソニコチン酸メチル（２３０ｍｇ）を得た。ＬＣＭＳ： ＭＷ （計算値）： ３３４．１；ＭＳ （ＥＳ＋， ｍ／ｚ）： ３３５．３４ （Ｍ＋Ｈ）＋．
【０１５３】
１．１．５  ステップ３：２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−５−フルオロ−ピリジン−４−カルボン酸の合成
【化１１】
2020530833.tif 000018
２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−５−フルオロ−ピリジン−４−カルボン酸メチル（８．４３ｇ、３１．１９ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（１００ｍＬ）中懸濁液に、水酸化リチウム（２．９８ｇ、１２４．７６ｍｍｏｌ）及び水（５０ｍＬ）を添加した。反応混合物を周囲温度にて終夜撹拌した。翌日、テトラヒドロフランを減圧下で蒸発させ、水層のｐＨを４に調整した。形成された沈殿物を濾過し、トルエン（４×２０ｍＬ）と共に同時蒸発させ、真空オーブン内で４０℃にて５時間乾燥して、２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−５−フルオロ−ピリジン−４−カルボン酸（７．７９ｇ）を得た。ＬＣＭＳ：  ＭＷ  （計算値）：  ２５６．０８；ＭＳ  （ＥＳ＋，  ｍ／ｚ）：  ２０１．４  （Ｍ＋Ｈ−５６）＋．
【０１５４】
１．１．６  ステップ４：４−クロロ−５−メチル−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンの合成
【化１２】
2020530833.tif 000019
５−ブロモ−４−クロロ−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン（１０．０ｇ、４３．０ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦ（３５０ｍＬ）に溶解し、アルゴン雰囲気下で−７８℃に冷却した。ｎ−ＢｕＬｉ（ヘキサン中２．５Ｍ、３８ｍＬ、９４．６ｍｍｏｌ）を１時間かけて滴下添加した。添加完了後、溶液を４０分間撹拌し、ヨードメタン（４．３ｍＬ、６８．８ｍｍｏｌ）を添加した。溶液をゆっくりと室温に到達させた。水（２０ｍＬ）を添加し、溶媒を真空中で除去して褐色のスラリーを得、これを水（２００ｍＬ）に溶解し、酢酸エチル（３×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物をブライン（１５０ｍＬ）で洗浄し、無水でＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、濃縮して粗製化合物を得、これを酢酸エチルで粉砕して、４−クロロ−５−メチル−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］（５．３２ｇ）を得た。ＬＣＭＳ： ＭＷ （計算値）： １６７．０３；ＭＳ （ＥＳ＋， ｍ／ｚ）： １６８．３７ （Ｍ＋Ｈ）＋．
【０１５５】
１．１．７  ステップ５：Ｎ−［１−（５−メチル−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）−４−ピペリジル］−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルの合成
【化１３】
2020530833.tif 000020
４−クロロ−５−メチル−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン（１０．０ｇ、５９．７ｍｍｏｌ）の１−メチル−２−ピロリジノン（４０ｍＬ）中溶液に、Ｎ−（４−ピペリジル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１７．９５ｇ、８９．６ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２５．２ｍＬ、１４９．３ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を１５０℃にて３時間撹拌した。反応混合物を冷却し、冷水（３００ｍＬ）に注いだ。混合物に酢酸エチル（４０ｍＬ）を添加し、周囲温度にて３０分間撹拌した。形成された沈殿物を濾過し、水及びジエチルエーテルで洗浄し、真空オーブン内で４０℃にて終夜乾燥した。乾燥により、Ｎ−［１−（５−メチル−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）−４−ピペリジル］−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１９．９１ｇ）を得た。ＬＣＭＳ： ＭＷ （計算値）： ３３１．２；ＭＳ （ＥＳ＋， ｍ／ｚ）： ３３２．７ （Ｍ＋Ｈ）＋．
【０１５６】
１．１．８  ステップ６：１−（５−メチル−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）ピペリジン−４−アミンの合成
【化１４】
2020530833.tif 000021
０℃に冷却したＮ−［１−（５−メチル−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）−４−ピペリジル］カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（３８．９ｇ、１１７．３ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン（２００ｍＬ）中懸濁液に、ＨＣｌ（ジオキサン中４Ｍ溶液）（２９０ｍＬ）を添加した。反応混合物を周囲温度にて撹拌した。２３時間後、反応混合物を減圧下で蒸発させ、トルエン（２００ｍＬ）と共に同時蒸発させ、真空オーブン内で４０℃にて終夜乾燥した。乾燥により、１−（５−メチル−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）ピペリジン−４−アミン（４７．６８ｇ）をＨＣｌ塩として得た。ＬＣＭＳ： ＭＷ （計算値）： ２３１．１５；ＭＳ （ＥＳ＋， ｍ／ｚ）： ２３２．６ （Ｍ＋Ｈ）＋．
【０１５７】
１．１．１  ステップ７：Ｎ−［５−フルオロ−４−［［１−（５−メチル−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）−４−ピペリジル］カルバモイル］−２−ピリジル］カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルの合成
【化１５】
2020530833.tif 000022
２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−５−フルオロ−ピリジン−４−カルボン酸（１４．２５ｇ、５５．６ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１３０ｍＬ）中懸濁液に、ＨＡＴＵ（１９．０３ｇ、５０．１ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を周囲温度にて２０分間撹拌し、これに１−（５−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）ピペリジン−４−アミン×２ＨＣｌ（１６．９２ｇ、５５．６ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（４７．５６ｍＬ、２７８．１ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を周囲温度にて撹拌した。３時間後、反応を完了した。反応混合物を氷冷水（１．２Ｌ）に注いだ。形成された沈殿物を濾過し、次いでアセトニトリルで洗浄し、真空オーブン内で４０℃にて４時間乾燥して、Ｎ−［５−フルオロ−４−［［１−（５−メチル−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）−４−ピペリジル］カルバモイル］−２−ピリジル］カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１９．２６ｇ）を得た。ＬＣＭＳ： ＭＷ （計算値）： ４６９．２２；ＭＳ （ＥＳ＋， ｍ／ｚ）： ４７０．７ （Ｍ＋Ｈ）＋．
【０１５８】
１．１．１０  ステップ８：２−アミノ−５−フルオロ−Ｎ−［１−（５−メチル−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）−４−ピペリジル］ピリジン−４−カルボキサミドの合成
【化１６】
2020530833.tif 000023
０℃に冷却したＮ−［５−フルオロ−４−［［１−（５−メチル−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）−４−ピペリジル］カルバモイル］−２−ピリジル］カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（２５．７６ｇ、５４．９ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（３００ｍＬ）中懸濁液に、ＨＣｌ（ジオキサン中４Ｍ溶液）（１３０ｍＬ）を滴下添加した。数分後、ゴム状の残渣が形成された。追加量のジクロロメタン（２００ｍＬ）を反応混合物に添加した。ゴム状の残渣を超音波処理により破砕した（４５分後）。反応混合物を周囲温度にて終夜撹拌した。翌日、沈殿物を濾過し、水、アセトニトリル、及びメタノールで洗浄し、真空オーブン内で４０℃にて５時間、次いで周囲温度にて終夜乾燥した。乾燥により、２−アミノ−５−フルオロ−Ｎ−［１−（５−メチル−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）−４−ピペリジル］ピリジン−４−カルボキサミド（１３．６５ｇ）を得た。ＬＣＭＳ： ＭＷ （計算値）： ３６９．１７；ＭＳ （ＥＳ＋， ｍ／ｚ）： ３７０．７７ （Ｍ＋Ｈ）＋．
１Ｈ ＮＭＲ （６００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６）： δ ＝ １．５９ − １．７０ （ｍ， Ｊ ＝ １２．３， ３．７ Ｈｚ， ２ Ｈ）， １．９３ （ｄｄ， Ｊ ＝ １２．６， ２．７ Ｈｚ， ２ Ｈ）， ２．３４ （ｓ， ３Ｈ）， ３．０６ （ｔ， Ｊ ＝ １１．４ Ｈｚ， ２ Ｈ）， ３．９４ （ｄ， Ｊ ＝ １３．２ Ｈｚ， ２ Ｈ）， ３．９５ − ４．０３ （ｍ， Ｊ ＝ １１．２， １１．２， ７．５， ４．２， ４．２ Ｈｚ， １ Ｈ）， ６．０２ （ｓ， ２ Ｈ）， ６．５１ （ｄ， Ｊ ＝ ４．８ Ｈｚ， １ Ｈ）， ７．０５ （ｓ， １ Ｈ）， ７．９１ （ｄ， Ｊ ＝ １．５ Ｈｚ， １ Ｈ）， ８．１９ （ｓ， １ Ｈ）， ８．４６ （ｄ， Ｊ ＝ ７．７ Ｈｚ， １ Ｈ）， １１．５１ （ｂｒ． ｓ．， １ Ｈ） ｐｐｍ．
【０１５９】
１．２  化合物２：（２−アミノ−５−メチル−Ｎ−［１−（５−メチル−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）−４−ピペリジル］ピリジン−４−カルボキサミド）
１．２．１  ステップ１：２−アミノ−５−メチル−ピリジン−４−カルボン酸メチルの合成
【化１７】
2020530833.tif 000024
２−アミノ−５−ブロモ−ピリジン−４−カルボン酸メチル（２００ｍｇ、０．８７ｍｍｏｌ）、Ｓ−Ｐｈｏｓ（４．６ｍｇ、３．２ｍｍｏｌ）、リン酸三カリウム（３６９．３ｍｇ、１．７４ｍｍｏｌ）、及びジアセトキシパラジウム（１９．５ｇ、０．０１１ｍｍｏｌ）を合わせ、脱気し、Ｎ２でバックフィルし、次いでＤＭＳＯ（４ｍｌ）及びトリメチルボロキシン（４６７．５μＬ、３．２ｍｍｏｌ）に室温にて溶解した。次いで混合物を８０℃に加熱し、終夜撹拌した。１６時間後、混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、Ｈ２Ｏで洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、セライトに吸収させ、真空中で濃縮して粗生成物を得、これを、Ｂｉｏｔａｇｅ精製デバイスを介し４ｇのＫＰ−Ｓｉｌ  Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍカラム（流量９ｍｌ／分、溶媒ＡとしてＤＣＭ、溶媒ＢとしてＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝２０：１）で精製した。適切な画分を収集して、２−アミノ−５−メチル−ピリジン−４−カルボン酸メチル（１６７．０３ｍｇ）を得た。ＬＣＭＳ： ＭＷ （計算値）： １６６．０７；ＭＳ （ＥＳ＋， ｍ／ｚ）： １６７．０３ （Ｍ＋Ｈ）＋．
【０１６０】
１．２．２  ステップ２：２−アミノ−５−メチル−ピリジン−４−カルボン酸の合成
【化１８】
2020530833.tif 000025
２−アミノ−５−メチル−ピリジン−４−カルボン酸メチル（１２５ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（２／２）に溶解し、ＮａＯＨ（１ｍ溶液、０．７５μＬ）を添加した。次いで混合物を６０℃に加熱し、１時間撹拌した。１時間後、ＭｅＯＨを蒸発させ、水性の残渣をＥｔＯＡｃで抽出した。水層に残った所望の生成物を終夜凍結乾燥した。
凍結乾燥後、混合物をアセトンに溶解し、濾過し、母液を蒸発させて２−アミノ−５−メチル−ピリジン−４−カルボン酸（５５ｍｇ）を得た。ＬＣＭＳ： ＭＷ （計算値）： １５２．０６；ＭＳ （ＥＳ＋， ｍ／ｚ）： １５３．０２ （Ｍ＋Ｈ）＋．
【０１６１】
１．２．３  ステップ３：２−アミノ−５−メチル−Ｎ−［１−（５−メチル−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）−４−ピペリジル］ピリジン−４−カルボキサミドの合成
【化１９】
2020530833.tif 000026
０℃の２−アミノ−５−メチル−ピリジン−４−カルボン酸（３３ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１ｍＬ）中溶液に、ＥＤＣ×ＨＣｌ（５４．８ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（１１１．１μＬ、０．６４ｍｍｏｌ）を添加し、３０分間撹拌した。次いでＨＯＢｔ×Ｈ２Ｏ（３５．６ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）及び１−（５−メチル−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）ピペリジン−４−アミン（５０．２ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温にて終夜撹拌した。翌日、反応混合物を水（５ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（３×５ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をブライン（１０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、真空中で濃縮して粗生成物を得、これをＢｉｏｔａｇｅ精製デバイスを介し４ｇのＫＰ−Ｓｉｌ  Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍカラム（流量９ｍｌ／分、弱溶媒としてＤＣＭ、強溶媒としてＤＣＭ：ＭｅＯＨ：ＮＨ４ＯＨ＝９０：１．５：０．１５）で精製した。適切な画分を収集して、２−アミノ−５−メチル−Ｎ−［１−（５−メチル−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）−４−ピペリジル］ピリジン−４−カルボキサミド（８ｍｇ）を得た。ＬＣＭＳ： ＭＷ （計算値）： ３６５．２０；ＭＳ （ＥＳ＋， ｍ／ｚ）： ３６６．２３ （Ｍ＋Ｈ）＋． １Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６） δ １１．５１ （ｂｒ． ｓ．， １Ｈ）， ８．３５ （ｄ， Ｊ＝８．０１ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．１７ （ｓ， １Ｈ）， ７．７５ （ｓ， １Ｈ）， ７．０５ （ｓ， １Ｈ）， ６．３５ （ｓ， １Ｈ）， ５．８１ （ｓ， ２Ｈ）， ３．９５ （ｍ， ３Ｈ）， ３．０５ （ｔ， Ｊ＝１１．４１ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．３４ （ｓ， ３Ｈ）， ２．０６ （ｓ， ３Ｈ）， １．９２ （ｄ， Ｊ＝９．５８ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．５６−１．７０ （ｍ， ２Ｈ） ｐｐｍ．
【０１６２】
１．３  化合物３：２−アミノ−５−クロロ−Ｎ−［１−（５−メチル−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）−４−ピペリジル］−ピリジン−４−カルボキサミド
１．３．１  ステップ１：３−クロロ−１−オキソ−ピリジン−４−カルボン酸の合成
【化２０】
2020530833.tif 000027
３−クロロピリジン−４−カルボン酸（６２０ｍｇ、３．９４ｍｍｏｌ）を酢酸（２ｍＬ）に溶解し、３０％水性Ｈ２Ｏ２（６ｍＬ）を添加した。反応混合物を８０℃にて３８時間加熱した。完了後、反応混合物は濃縮されて半分の体積になった。形成された結晶を濾去し、真空乾燥機内で乾燥して３−クロロ−１−オキソ−ピリジン−４−カルボン酸（４２０ｍｇ）を得た。ＬＣＭＳ： ＭＷ （計算値）： １７２．９９；ＭＳ （ＥＳ＋， ｍ／ｚ）： １７４．３３ （Ｍ＋Ｈ）＋．
【０１６３】
１．３．２  ステップ２：３−クロロ−Ｎ−［１−（５−メチル−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）−４−ピペリジル］−１−オキソ−ピリジン−４−カルボキサミドの合成
【化２１】
2020530833.tif 000028
０℃の３−クロロ−１−オキソ−ピリジン−４−カルボン酸（５２ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１ｍＬ）中溶液に、ＥＤＣ×ＨＣｌ（７４．８ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（１６１μＬ、０．８７ｍｍｏｌ）を添加し、３０分間撹拌した。次いでＨＯＢｔ×Ｈ２Ｏ（５５．１ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）及び１−（５−メチル−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）ピペリジン−４−アミン（６９．４ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温にて終夜撹拌した。翌日、反応混合物を蒸発乾固させた。油状の残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（弱溶離剤：ＤＣＭ、強溶離剤：ＤＣＭ：ＭｅＯＨ：ＮＨ４ＯＨ＝９０：５：０．１）により精製して、３−クロロ−Ｎ−［１−（５−メチル−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）−４−ピペリジル］−１−オキソ−ピリジン−４−カルボキサミド（８７ｍｇ）を得た。ＬＣＭＳ： ＭＷ （計算値）： ３８６．１３；ＭＳ （ＥＳ＋， ｍ／ｚ）： ３８７．４９ （Ｍ＋Ｈ）＋．
【０１６４】
１．３．３  ステップ３：２−アミノ−５−クロロ−Ｎ−［１−（５−メチル−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）−４−ピペリジル］ピリジン−４−カルボキサミドの合成
【化２２】
2020530833.tif 000029
０℃の３−クロロ−Ｎ−［１−（５−メチル−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）−４−ピペリジル］−１−オキソ−ピリジン−４−カルボキサミド（８７ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）及びｔｅｒｔ−ブチルアミン（０．１６０ｍＬ、１．５３ｍｍｏｌ）のクロロホルム（１０ｍＬ）及びベンゾトリフルオリド（１ｍＬ）の混合物中溶液に、ｐ−トルエンスルホン酸無水物（２６０ｍｇ、０．５７ｍｍｏｌ）を数回に分けて温度を５℃に維持しながら添加した。１０分後に反応が完了した。トリフルオロ酢酸（５ｍＬ）及び反応混合物の溶液を８０℃にて３時間撹拌した。溶媒を真空下で低減し、残渣をジクロロメタンで希釈し、４０％  ＮａＯＨでクエンチしてｐＨ９−１０にした。水層をジクロロメタン（４×１５ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（弱溶離剤：ＤＣＭ、強溶離剤：ＤＣＭ：ＭｅＯＨ：ＮＨ４ＯＨ＝９０：９：０．５）により精製して、２−アミノ−５−クロロ−Ｎ−［１−（５−メチル−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）−４−ピペリジル］ピリジン−４−カルボキサミド（９．０５ｍｇ）を得た。ＬＣＭＳ： ＭＷ （計算値）： ３８５．１４；ＭＳ （ＥＳ＋， ｍ／ｚ）： ３８６．５４ （Ｍ＋Ｈ）＋． １Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６） δ １１．５２ （ｂｒ． ｓ．， １Ｈ）， ８．５２ （ｄ， Ｊ＝７．６３ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．２０ （ｓ， １Ｈ）， ７．９１ （ｄ， Ｊ＝４．８８ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．０６ （ｓ， １Ｈ）， ６．５２ （ｄ， Ｊ＝４．８８ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．４２ （ｓ， ２Ｈ）， ３．９４ （ｍ， ３Ｈ）， ３．０８ （ｔ， Ｊ＝１１．４４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．３４ （ｓ， ３Ｈ）， １．９５ （ｄ， Ｊ＝９．７７ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．５７−１．７１ （ｍ， ２Ｈ） ｐｐｍ．
【０１６５】
１．４  化合物４：２−アミノ−Ｎ−［１−（５−クロロ−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）−４−ピペリジル］ピリジン−４−カルボキサミド
１．４．１  ステップ１：４，５−ジクロロ−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンの合成
【化２３】
2020530833.tif 000030
４−クロロ−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン（２．０ｇ、１３．０４ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（８０ｍＬ）中溶液にＮ−クロロスクシンイミド（１．７ｇ、１３．０４ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を３日還流した。反応混合物を水に溶解し、ＥｔＯＡｃ（３×５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させて４，５−ジクロロ−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン（１．０８ｇ）を得た。ＬＣＭＳ： ＭＷ （計算値）： １８６．９７；ＭＳ （ＥＳ＋， ｍ／ｚ）： １８７．９８ （Ｍ＋Ｈ）＋．
【０１６６】
１．４．２  ステップ２：Ｎ−（５−クロロ−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルの合成
【化２４】
2020530833.tif 000031
Ｎ−（４−ピペリジル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（８９５．３ｍｇ、４．４７ｍｍｏｌ）及び４，５−ジクロロ−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン（１０８０ｍｇ、５．３６ｍｍｏｌ）をＮＭＰ（８ｍｌ）に溶解し、ＤＩＰＥＡ（２．３３ｍｌ、１３．４ｍｍｏｌ）を滴下添加した。反応混合物を室温にて３日撹拌した。混合物を水に溶解し、ＥｔＯＡｃ（３×１５ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を乾燥し、濃縮して粗生成物を得、これをアセトニトリルで再結晶させてＮ−（５−クロロ−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
（１．４２ｇ）を得た。ＬＣＭＳ： ＭＷ （計算値）： ３５１．１５；ＭＳ （ＥＳ＋， ｍ／ｚ）： ３５２．２２ （Ｍ＋Ｈ）＋．
【０１６７】
１．４．３  ステップ３．１−（５−クロロ−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）ピペリジン−４−アミンの合成
【化２５】
2020530833.tif 000032
Ｎ−［１−（５−クロロ−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）−４−ピペリジル］カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（２．０ｇ、５．６９ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１０ｍＬ）中溶液にトリフルオロ酢酸（３．３ｍＬ）を添加し、得られた溶液を室温にて２時間撹拌した。完了したら溶媒を蒸発させ、粗生成物を予め条件調整した（４０ｍＬのＭｅＯＨ）ＳＣＸカラムに入れた（２０ｇ）。カラムをＭｅＯＨ（２×４０ｍＬ）で洗浄し、次いで７ＮのＮＨ３／ＭｅＯＨ（１００ｍＬ）で洗浄した。溶媒を蒸発させて１−（５−クロロ−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）ピペリジン−４−アミン（１．３ｇ）を得た。ＬＣＭＳ： ＭＷ （計算値）： ２５１．０９；ＭＳ （ＥＳ＋， ｍ／ｚ）： ２５２．１０ （Ｍ＋Ｈ）＋．
【０１６８】
１．４．４  ステップ４．２−アミノ−Ｎ−［１−（５−クロロ−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）−４−ピペリジル］−ピリジン−４−カルボキサミドの合成
【化２６】
2020530833.tif 000033
０℃の２−アミノピリジン−４−カルボン酸（２００ｍｇ、１．４５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（４ｍＬ）中溶液に、ＥＤＣ×ＨＣｌ（３６２．３ｍｇ、１．８９ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（７３２μＬ、４．２１ｍｍｏｌ）を添加し、３０分間撹拌した。次いでＨＯＢｔ×Ｈ２Ｏ（２６６．４ｍｇ、１．７４ｍｍｏｌ）及び１−（５−クロロ−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）ピペリジン−４−アミン（５４６．２３ｍｇ、２．１７ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で終夜撹拌し、水（１０ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（３×１０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をブライン（２０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、真空中で濃縮した。粗製物を、Ｂｉｏｔａｇｅ精製デバイスを介し１２ｇのＫＰ−Ｓｉｌ  Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍカラム（弱溶媒としてＤＣＭ、強溶媒としてＤＣＭ：ＭｅＯＨ：ＮＨ４ＯＨ＝９０：１．５：０．１５）で精製した。適切な画分を収集して生成物を得、これをアセトニトリルで粉砕して２−アミノ−Ｎ−［１−（５−クロロ−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）−４−ピペリジル］−ピリジン−４−カルボキサミド（１６２．１ｍｇ）を得た。ＬＣＭＳ： ＭＷ （計算値）： ３７１．１３；ＭＳ （ＥＳ＋， ｍ／ｚ）： ３７２．１８ （Ｍ＋Ｈ）＋． １Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６） δ １２．１５ （ｂｒ． ｓ．， １Ｈ）， ８．３９ （ｄ， Ｊ＝７．３２ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．２７ （ｓ， １Ｈ）， ７．９７ （ｄ， Ｊ＝４．８８ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．４９ （ｓ， １Ｈ）， ６．７７−６．８７ （ｍ， ２Ｈ）， ６．０９ （ｂｒ． ｓ．， ２Ｈ）， ４．２１ （ｄ， Ｊ＝１２．２１ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．０５ （ｄ， Ｊ＝７．３２ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．１０ （ｔ， Ｊ＝１２．３６ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．９１ （ｄ， Ｊ＝１０．６８ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．７４ （ｍ， ２Ｈ） ｐｐｍ．
【０１６９】
１．５  化合物５：２−アミノ−Ｎ−［１−（５−クロロ−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）−４−ピペリジル］−５−フルオロ−ピリジン−４−カルボキサミドの合成
【化２７】
2020530833.tif 000034
０℃の２−（ベンズヒドリリデンアミノ）−５−フルオロ−ピリジン−４−カルボン酸（４３．０ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（５ｍＬ）中溶液に、ＥＤＣ×ＨＣｌ（３２．６ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（６６．１μＬ、０．３８ｍｍｏｌ）を添加し、３０分間撹拌した。次いでＨＯＢｔ×Ｈ２Ｏ（２４．５ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）及び１−（５−クロロ−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）ピペリジン−４−アミン（５０．３ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温にて終夜撹拌した。溶媒を蒸発乾固した。粗製物を分取ＬＣ−ＭＳを介し精製した。適切な画分を収集し、終夜凍結乾燥して、２−アミノ−Ｎ−［１−（５−クロロ−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）−４−ピペリジル］−５−フルオロ−−５−ピリジン−４−カルボキサミド（１７ｍｇ）を得た。ＬＣＭＳ： ＭＷ （計算値）： ３８９．１２；ＭＳ （ＥＳ＋， ｍ／ｚ）： ３９０．３９ （Ｍ＋Ｈ）＋． １Ｈ ＮＭＲ （６００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６） δ １２．１５ （ｂｒ． ｓ．， １Ｈ）， ８．４７ （ｄ， Ｊ＝７．７０ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．２５ （ｓ， １Ｈ）， ７．９１ （ｓ， １Ｈ）， ７．４７ （ｓ， １Ｈ）， ６．５１ （ｄ， Ｊ＝４．４０ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．０２ （ｓ， ２Ｈ）， ４．１４ （ｄ， Ｊ＝１２．６５ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．０２ （ｍ， １Ｈ）， ３．１３ （ｔ， Ｊ＝１１．８３ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．９３ （ｄ， Ｊ＝１０．８２ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．６７ （ｍ， ２Ｈ） ｐｐｍ．
【０１７０】
１．６  化合物６：２−アミノ−Ｎ−［１−（５−シアノ−３−メチル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−４−イル）−４−ピペリジル］−５−フルオロ−ピリジン−４−カルボキサミドの合成
１．６．１  ３−ブロモ−４−クロロ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ〕ピリジン−５−カルボニトリルの合成
【化２８】
2020530833.tif 000035
４−クロロ−１Ｈ−ピロロ（３，２−ｂ）ピリジン−５−カルボニトリル（３ｇ、１６．８９ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２０ｍＬ）中撹拌溶液にＮ−ブロモスクシンイミド（３．３ｇ、１８．５８２ｍｍｏｌ）を添加した。得られた溶液を室温にて２０分間撹拌した。反応混合物を水（５０ｍＬ）で希釈し、酢酸エチル（２×２５ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、真空中で濃縮した。得られた粉末をＥｔＯＡｃで粉砕し、乾燥して３−ブロモ−４−クロロ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−カルボニトリル（１．５ｇ）を得た。ＬＣＭＳ： ＭＷ （計算値）： ２５６．４９；ＭＳ （ＥＳ＋， ｍ／ｚ）： ２５７．９３ （Ｍ＋Ｈ）＋．
【０１７１】
１．６．２  ４−クロロ−３−メチル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ〕ピリジン−５−カルボニトリルの合成
【化２９】
2020530833.tif 000036
アルゴン下−７８℃の３−ブロモ−４−クロロ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−カルボニトリル（１．５ｇ、５．８５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（４８ｍＬ）中溶液に、ブチルリチウム溶液（５．２ｍＬ、１２．８７ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を２０分間撹拌した。次いでヨードメタン（５９０μＬ、９．３６ｍｍｏｌ）を滴下添加し、反応物を氷浴中で室温に温めた。反応物を水（３０ｍＬ）でクエンチし、ｐＨを７に調整した。ＴＨＦを蒸発させ、水を添加した。得られた固体を濾過し、水で洗浄し、ＥｔＯＡｃで粉砕して４−クロロ−３−メチル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−カルボニトリル（８１３ｍｇ）を得た。ＬＣＭＳ： ＭＷ （計算値）： １９１．６；ＭＳ （ＥＳ＋， ｍ／ｚ）： １９２．０５ （Ｍ＋Ｈ）＋．
【０１７２】
１．６．３  Ｎ−［１−（５−シアノ−３−メチル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−４−イル）−４−ピペリジル］カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルの合成
【化３０】
2020530833.tif 000037
４−クロロ−３−メチル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−カルボニトリル（８１３ｍｇ、４．２４ｍｍｏｌ）、４−ｂｏｃ−アミノピペリジン（１．２７ｇ、６．３６ｍｍｏｌ）、及びＤＩＰＥＡ（１．８５ｍＬ、１０．６１ｍｍｏｌ）のＮＭＰ（５ｍＬ）中混合物を１５０℃にて３時間撹拌し、撹拌を室温にて週末にわたり継続した。反応混合物を水（１１０ｍＬ）及びジエチルエーテルで希釈した。得られた固体を濾過し、水及びジエチルエーテルで洗浄し、乾燥してＮ−［１−（５−シアノ−３−メチル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−４−イル）−４−ピペリジル］カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１．２８ｇ）を得た。ＬＣＭＳ： ＭＷ （計算値）： ３５５．４３；ＭＳ （ＥＳ＋， ｍ／ｚ）： ３５６．３０ （Ｍ＋Ｈ）＋．
【０１７３】
１．６．４  ４−（４−アミノ−１−ピペリジル）−３−メチル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−カルボニトリルの合成
【化３１】
2020530833.tif 000038
Ｎ−［１−（５−シアノ−３−メチル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−４−イル）−４−ピペリジル］カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１．２８ｇ、３．６ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（４０ｍＬ）中溶液に、トリフルオロ酢酸（５．５ｍＬ、７２．０３ｍｍｏｌ）を添加した。得られた溶液を室温にて１時間撹拌した。反応混合物をＳＣＸカラムに装填した（２０ｇ、１００ｍＬのＭｅＯＨで予め条件調整）。ＭｅＯＨ（２００ｍＬ）をカラムに通し、化合物をＭｅＯＨ：ＭｅＯＨ＝１：４（３００ｍＬ）において７ＮのＮＨ３で溶離した。濾液を真空中で濃縮して４−（４−アミノ−１−ピペリジル）−３−メチル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ〕ピリジン−５−カルボニトリル（１．０６ｇ）を得た。ＬＣＭＳ： ＭＷ （計算値）： ２５５．３２；ＭＳ （ＥＳ＋， ｍ／ｚ）： ２５６．２１ （Ｍ＋Ｈ）＋．
【０１７４】
１．６．５  ２−アミノ−Ｎ−［１−（５−シアノ−３−メチル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−４−イル）−４−ピペリジル］−５−フルオロ−ピリジン−４−カルボキサミドの合成
【化３２】
2020530833.tif 000039
０℃の２−アミノ−５−フルオロ−ピリジン−４−カルボン酸（６６．０ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１ｍＬ）中溶液に、ＥＤＣ×ＨＣｌ（５０．０ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（１０１μＬ、０．５８ｍｍｏｌ）を添加し、３０分間撹拌した。ＨＯＢｔ×Ｈ２Ｏ（３７．０ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）及び４−（４−アミノ−１−ピペリジル）−３−メチル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−カルボニトリル（１０８．０ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温にて終夜撹拌した。溶媒を蒸発乾固した。粗製物を、Ｂｉｏｔａｇｅ精製デバイスを介し４ｇのＫＰ−Ｓｉｌ  Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍカラム（弱溶媒としてＤＣＭ、強溶媒としてＤＣＭ：ＭｅＯＨ：＝１０：１）で精製した。適切な画分を収集して、２−アミノ−Ｎ−［１−（５−シアノ−３−メチル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−４−イル）−４−ピペリジル］−５−フルオロ−ピリジン−４−カルボキサミド（１．２７ｍｇ）を得た。ＬＣＭＳ： ＭＷ （計算値）： ３９３．４２；ＭＳ （ＥＳ＋， ｍ／ｚ）： ３９４．５３ （Ｍ＋Ｈ）＋． １Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６） δ １１．８２ （ｂｒ． ｓ．， １Ｈ）， ８．５５ （ｄ， Ｊ＝７．３２ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．２３ （ｓ， １Ｈ）， ７．９３ （ｓ， １Ｈ）， ７．２４ （ｓ， １Ｈ）， ６．５４ （ｄ， Ｊ＝４．２７ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．０４ （ｂｒ． ｓ．， ２Ｈ）， ３．９７ （ｂｒ． ｓ．， １Ｈ）， ３．６２ （ｄ， Ｊ＝１２．２１ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．４０ （ｍ， ２Ｈ）， ２．４１ （ｓ， ３Ｈ）， １．９７ （ｄ， Ｊ＝１１．２９ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．７２−１．８３ （ｍ， ２Ｈ） ｐｐｍ．
【０１７５】
化合物７：２−アミノ−Ｎ−［１−（３−クロロ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−４−イル）−４−ピペリジル］−５−フルオロ−ピリジン−４−カルボキサミドの合成
１．７．１  Ｎ−［１−（１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−４−イル）−４−ピペリジル］カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルの合成
【化３３】
2020530833.tif 000040
４−クロロ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（４．０ｇ、２６．２０ｍｍｏｌ）、Ｎ−（４−ピペリジル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（７．８ｇ、３９．３０ｍｍｏｌ）、及びＤＩＰＥＡ（１１．４ｍＬ、６５．５０ｍｍｏｌ）のＮＭＰ（２８ｍＬ）中混合物を１５０℃にて７２時間撹拌した。反応混合物を水で希釈し、ＥｔＯＡｃで抽出した（４回）。合わせた有機層を乾燥し、濃縮して粗生成物を得、これをアセトニトリルで再結晶させてＮ−［１−（１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−４−イル）−４−ピペリジル］カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１．８８ｇ）を得た。ＬＣＭＳ： ＭＷ （計算値）： ３１６．４１；ＭＳ （ＥＳ＋， ｍ／ｚ）： ３１７．２２ （Ｍ＋Ｈ）＋．
【０１７６】
１．７．２  Ｎ−［１−（３−クロロ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−４−イル）−４−ピペリジル］カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルの合成
【化３４】
2020530833.tif 000041
Ｎ−［１−（１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−４−イル）−４−ピペリジル］カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（３１６ｍｇ、１ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＣＭ（１０ｍｌ）に溶解し、Ｎ−クロロスクシンイミド（１４７ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を４０℃にて撹拌した。１６時間後、反応混合物に水を添加し、ＤＣＭで抽出した（３回）。合わせた有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、相分離器で濾過し、蒸発させて粗製化合物を得、これをＢｉｏｔａｇｅ精製デバイスを介し４ｇのＫＰ−Ｓｉｌ  Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍカラム（流量１０ｍｌ／分、溶媒ＡとしてＤＣＭ、溶媒ＢとしてＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝７：３）で精製した。方法：０−５％Ｂ  ４ＣＶ；２０％  ４ＣＶ；２０−４０％Ｂ  ５ＣＶ；４０％Ｂ  ５ＣＶ；４０−６０％Ｂ  ４ＣＶ；６０％Ｂ  ４ＣＶ。適切な画分を収集して、Ｎ−［１−（３−クロロ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−４−イル）−４−ピペリジル］カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１５０ｍｇ）を得た。ＬＣＭＳ： ＭＷ （計算値）： ３５０．８５；ＭＳ （ＥＳ＋， ｍ／ｚ）： ３５１．４３ （Ｍ＋Ｈ）＋．
【０１７７】
１．７．３  １−（３−クロロ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−４−イル）ピペリジン−４−アミンの合成
【化３５】
2020530833.tif 000042
０℃のＮ−［１−（３−クロロ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−４−イル）−４−ピペリジル］カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（３２０ｍｇ、１．８ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１０ｍＬ）中混合物に、ＴＦＡ（１．５ｍＬ）を添加した。反応混合物を室温にて１時間撹拌した。完了後、溶媒を蒸発させ、粗生成物を予め（ＭｅＯＨで）条件調整したＳＣＸカラムに入れた（５ｇ）。カラムをＭｅＯＨ（２×５ｍｌ）で洗浄し、次に７Ｎ  ＮＨ３／ＭｅＯＨ（１０ｍｌ）で洗浄して、１−（３−クロロ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−４−イル）ピペリジン−４−アミンを得た。
【０１７８】
（１０８ｍｇ）ＬＣＭＳ： ＭＷ （計算値）： ２５０．７３；ＭＳ （ＥＳ＋， ｍ／ｚ）： ２５１．３８ （Ｍ＋Ｈ）＋．
【０１７９】
１．７．４  ２−アミノ−Ｎ−［１−（３−クロロ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−４−イル）−４−ピペリジル］−５−フルオロ−ピリジン−４−カルボキサミドの合成
【化３６】
2020530833.tif 000043
０℃の２−アミノ−５−フルオロ−ピリジン−４−カルボン酸（６６．０ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１ｍＬ）中溶液に、ＥＤＣ×ＨＣｌ（７０．０ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（１４１μＬ、０．８１ｍｍｏｌ）を添加し、３０分間撹拌した。次いでＨＯＢｔ×Ｈ２Ｏ（５２．０ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）及び１−（３−クロロ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−４−イル）ピペリジン−４−アミン（１０８．０ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温にて終夜撹拌した。反応混合物を水（１０ｍＬ）で希釈し、生成物を沈殿させた。結晶を濾去し、真空乾燥機内で６５℃にて３時間乾燥した。濾液をＥｔＯＡｃ（４×５ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、真空中で乾燥して粗製物を得た。粗製物を、Ｂｉｏｔａｇｅ精製デバイスを介し４ｇのＫＰ−Ｓｉｌ  Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍカラム（弱溶媒としてＤＣＭ、強溶媒としてＥ１）で精製した。適切な画分を収集して、２−アミノ−Ｎ−［１−（３−クロロ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−４−イル）−４−ピペリジル］−５−フルオロ−ピリジン−４−カルボキサミド（７．７７ｍｇ）を得た。ＬＣＭＳ： ＭＷ （計算値）： ３８８．８；ＭＳ （ＥＳ＋， ｍ／ｚ）： ３８９．４７ （Ｍ＋Ｈ）＋． １Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６） δ １１．８１ （ｂｒ． ｓ．， １Ｈ）， ８．５１ （ｄ， Ｊ＝７．６３ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．０６ （ｄ， Ｊ＝５．１９ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．９２ （ｓ， １Ｈ）， ７．４５ （ｓ， １Ｈ）， ６．４７−６．６４ （ｍ， ２Ｈ）， ６．０３ （ｓ， ２Ｈ）， ３．９４ （ｍ， １Ｈ）， ３．５０−３．６４ （ｍ， ２Ｈ）， ２．８７ （ｔ， Ｊ＝１１．４４ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．９６ （ｄ， Ｊ＝１０．３８ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．７２−１．８７ （ｍ， ２Ｈ） ｐｐｍ．
【０１８０】
生物学的実施例
２．ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ
２．１  ＡＳＫ１／２生化学アッセイ（ＩＭＡＰテクノロジー）
ＩＭＡＰ（登録商標）テクノロジーは、基質ペプチド配列を考慮することなく幅広い種類のキナーゼ、ホスファターゼ、及びホスホジエステラーゼに適用可能な均一アッセイを提供する。本アッセイは、シンプルな混合及び読取りの手順であり、これにより酵素活性の的確な定量が可能になる。ＩＭＡＰは、ホスホ基と三価金属含有ナノ粒子（ビーズ）との特定の高親和性相互作用に基づいた、キナーゼ、ホスファターゼ、及びホスホジエステラーゼ活性を査定するための包括的な非抗体ベースプラットフォームである。酵素反応は、蛍光標識基質を用いて実施する。ＩＭＡＰ結合システムの追加によって酵素反応は停止し、ビーズとリン酸化基質との結合が開始する。酵素活性と相互関連する基質とビーズとの結合は、ＦＰまたはＴＲ−ＦＲＥＴのいずれかを読出しとして用いて検出することができる。
【０１８１】
アポトーシスシグナル調節キナーゼ（ＡＳＫ１）はＭＡＰ３Ｋ５の別名でも知られ、キナーゼのマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼキナーゼ（ＭＡＰ３Ｋ）ファミリーのメンバーである。ＡＳＫ１は、ＭＡＰ２ＫのＭＫＫ４／７及びＭＫＫ３／６を通じて（それぞれ）Ｊｎｋ経路及びｐ３８経路を活性化する。このＡＳＫ１  ＩＭＡＰアッセイは、以下のＩＭＡＰペプチド：ＲＰ７１４０−Ｔ２（５ＴＡＭＲＡ−ＧＴＦＲＡＡＩＲＲＬＡＡＲＲＲ−ＯＨ、配列番号１）を使用する。本アッセイは、ＡＴＰ競合阻害剤に対し感受性であるように、ＡＴＰにおけるＫｍ（１５０ｍＭ）で動作するように構成されている。最終アッセイ条件は１５０ｍＭのＡＴＰ、１ｍＭのＤＴＴ、２００ｎＭのペプチド、及び６ｎＭのＡＳＫ１（総タンパク質）である。結合試薬は、１：２００の最終希釈率における１００％  Ａで構成される。
【０１８２】
溶媒：
ＫＩＴ  ＩＭＡＰ  ＦＰ、カタログ番号Ｒ８１２７；反応バッファー−Ｔｗｅｅｎ（５倍濃縮）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、カタログ番号Ｒ７４３６；Ｈ２Ｏで１：５希釈、ＤＴＴ含有（１Ｍのストックから１ｍＭ）；プログレッシブ結合バッファー（ＰＢＢ）Ａ（５倍濃縮）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、カタログ番号Ｒ７２８２；プログレッシブ結合試薬（ＰＢ試薬）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、カタログ番号Ｒ７２８４；酵素溶液（反応バッファー中２倍のＡｓｋ１）；基質溶液（反応バッファー中２倍のペプチド基質、及び反応バッファー中２×１５０μＭのＡＴＰ）；ビーズバッファー（Ｈ２Ｏで１：５希釈したプログレッシブ結合バッファーＡ）；ビーズ溶液（１：２００のプログレッシブ結合試薬（２倍）を含有するビーズバッファー）
【０１８３】
実験
１００％  ＤＭＳＯ中１００ｎＬの試験化合物を３８４ウェルプレートに添加した。用量応答実験用に、化合物の４分の１希釈物（２５μＭのトップ最終濃度）を使用した。対照ウェル以外の各ウェルに３μｌのｈＡＳＫ１（６ｎＭ）、ｈＡＳＫ２（２５ｎＭ）、またはｒＡＳＫ１（１５ｎＭ）を添加し、対照ウェルに３μｌのバッファーを添加した。３μＬの基質溶液を各ウェルに添加し、プレートを室温で４時間インキュベートした。この後、６μＬのＩＭＡＰ（商標）ビーズ溶液（プログレッシブ結合バッファーＡ＋ＰＢ試薬；最終希釈１：１００）を各ウェルに添加し、１０００ｒｐｍにて１分間スピンした。次いでプレートを室温にて２時間インキュベートし、その後にプレートをＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダーで読み取った。
【０１８４】
データ分析
ＩＣ５０データの計算、曲線及びＱＣ分析は、Ｅｘｃｅｌツール及びＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアｖ．５．０３を使用することにより行った。簡潔に述べると、個々の濃度−効果曲線は、最小二乗（通常）適合を用いて試験化合物の試験濃度（Ｘ）ｖｓ．対応する阻害パーセント値（Ｙ）の対数をプロットすることにより生成する。値が平均±１＊ＳＤより大きい場合のみ、高／低対照からの最大１／４ポイントが除外可能である。ＩＣ５０計算に使用した適合式＝ｌｏｇ（阻害剤）ｖｓ．応答−可変傾斜（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｓｌｏｐｅ）（４つのパラメーター）。計算結果：計算１：ＦＰ測定におけるｍＰ値＝１０００＊（Ｓ−Ｇ＊Ｐ）／（Ｓ＋Ｇ＊Ｐ）［式中、Ｓ＝＜ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ２またはＦＰ−ＢｏｄｉｐｙＴＡＭＲＡ＿Ｅｘ５３１−Ｅｍ５７９−ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ（１）  ｃｈａｎｎｅｌ  ２＞、Ｐ＝＜ｄｅｔｅｃｔｏｒ  １またはＦＰ−ＢｏｄｉｐｙＴＡＭＲＡ＿Ｅｘ５３１−Ｅｍ５７９−ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ（１）  ｃｈａｎｎｅｌ  １＞、Ｇ＝Ｇ−ｆａｃｔｏｒ］。Ｇａｉｎ＝１００。トップ制約（ｔｏｐ  ｃｏｎｓｔｒａｉｎ）は、トップ値が正しく計算されない場合のみ使用する。
【０１８５】
最小値は、−３０％Ｉ未満または３０％Ｉより大きい場合に制約される。最大値は、７０％Ｉ未満または１３０％Ｉより大きい場合に制約される。Ｚ’−Ｆａｃｔｏｒ  Ｔａｒｇｅｔ≧０．４。ヒル勾配範囲０．５から５。
【０１８６】
本発明の例示化合物を、実施例２．１の方法に従って試験した。結果を以下に示す。
【表４】
2020530833.tif 000044
【０１８７】
２．２  ＡＳＫ１／２生化学アッセイ（ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎテクノロジー）
ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎテクノロジーの説明
タンパク質基質（ＭＫＫ７）におけるリン酸化の程度を測定するＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎテクノロジーを用いて、ＡＳＫ１及びＡＳＫ２の生化学的活性も定量化した。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎテクノロジーは、基質と２つのタイプのビーズ（アクセプター及びドナー）との結合に基づく。１つのビーズとの結合は、基質タンパク質のタグを通じて行われる。第２のビーズとの結合は、抗体と基質のリン酸化部位とのリン酸化部位特異的結合を通じて行われる。これにより、アクセプタービーズ及びドナービーズが近接したサンドイッチが形成される。ドナービーズが６８０ｎｍ範囲の光に励起された場合、一重項酸素が放出され、６２０ｎｍ範囲のアクセプターからの発光を引き起こし、この発光は好適なプレートリーダーを用いて検出することができる。
【０１８８】
ＡＳＫ１／２  ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイの説明
ＡＳＫ１／２  ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイは、ＧＳＴタグの使用を通じて、全長の不活性ＭＫＫ７タンパク質をグルタチオンドナービーズに結合することにより可能になる。次いで、ＭＫＫ７上のリン酸化部位（Ｓｅｒ２７１／Ｔｈｒ２７５）がリン酸化部位特異的抗体に認識される。リン酸化部位特異的抗体は、プロテインＡ相互作用を通じてＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアクセプタービーズに結合する。ＡＳＫ１及びＡＳＫ２によるＭＫＫ７のリン酸化は、次にドナービーズ及びアクセプタービーズが近接するのを促進し、その結果一重項酸素がＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎシグナルの生成をもたらす。
ＡＳＫ１／２  ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ試薬、条件、及びプロトコル
・Ｎ末端６Ｈｉｓ−Ａｖｉタグ付き全長ヒトＡＳＫ１タンパク質。
・Ｎ末端６Ｈｉｓ−Ａｖｉタグ付き全長ＡＳＫタンパク質の２量体（リジン７０９がメチオニンで置き換えられた不活性酵素）及び６Ｈｉｓ−ＦＬＡＧタグ付き全長ＡＳＫタンパク質。
・ヒトＭＫＫ７不活性（Ｃａｒｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号：０７−１４７−１０）。
・Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＭＫＫ７（Ｓｅｒ１７１／Ｔｈｒ２７５）抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  カタログ番号：４１７１）。
・プロテインＡアクセプタービーズ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号：６７６０１３７）。
・グルタチオンドナービーズ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号：６７６５３０１）。
・アデノシン三リン酸、ＡＴＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号：Ｖ９１５Ｂ）。
・反応バッファー：５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＣＨＡＰＳ、ｐＨ７．２。
・停止バッファー：５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、６０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＣＨＡＰＳ、ｐＨ７．２。
【０１８９】
本アッセイは、以下の条件（最終濃度）を用いて実行するように構成した：１５０μＭ  ＡＴＰ；４００ｎＭ  ＭＫＫ７；０．８ｎＭ  ＡＳＫ１及び２ｎＭ  ＡＳＫ２。
【０１９０】
実験
１００％  ＤＭＳＯ中１００ｎＬの試験化合物（出発濃度６μＭ、３倍系列希釈による１１通りの濃度）を少量用３８４ウェルプレートに添加した。対照ウェル以外の各ウェルに２．５μｌのＡＳＫ１またはＡＳＫ２を添加し、対照ウェルに２．５μｌのバッファーを添加した。２．５μｌのＭＫＫ７溶液を全てのウェルに添加した。プレートを室温にて６０分間インキュベートした。プロテインＡアクセプタービーズ及びリン酸特異的抗体を３０分間インキュベートし、次いで２．５μｌのプロテインＡアクセプタービーズ／リン酸特異的抗体混合物（２．５μｇ／ｍｌのアクセプタービーズ最終濃度及び１／８００抗体最終希釈）を各ウェルに添加した。プレートを室温にて６０分間インキュベートし、次いで２．５μｌのＧＳＨドナービーズ（１０μｇ／ｍｌのアクセプタービーズ最終濃度）を各ウェルに添加した。プレートを室温にてさらに６０分間インキュベートし、その後にプレートをＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｅｎｓｐｉｒｅプレートリーダーで読み取った。
【０１９１】
データ分析
ＩＣ５０データの計算、曲線及びＱＣ分析は、Ｅｘｃｅｌツール及びＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアｖ．５．０３を使用することにより行った。簡潔に述べると、個々の濃度−効果曲線は、最小二乗（通常）適合を用いて試験化合物の試験濃度（Ｘ）ｖｓ．対応する阻害パーセント値（Ｙ）の対数をプロットすることにより生成した。ＩＣ５０計算に使用した適合式＝ｌｏｇ（阻害剤）ｖｓ．応答−可変傾斜（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｓｌｏｐｅ）（４つのパラメーター）。
【０１９２】
本発明の例示化合物を、実施例２．２の方法に従って試験した。結果を以下に示す。
【表５】
2020530833.tif 000045
【０１９３】
２．３  ＡＳＫ１／２細胞アッセイ
ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＡＳＫ１／２活性は、ウェスタンブロット法を用いてＨ２Ｏ２刺激ＰＢＭＣ中のホスホ−ＭＫＫ３タンパク質の量を定量することによりアッセイした。ＭＫＫ３は、ｐ３８活性化経路におけるＡＳＫ１／２触媒リン酸化の直接的基質であることが示された。
２．３．１  材料及びアッセイ条件
・Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ、カタログ番号：１１１４５４５）
・塩化アンモニウムライセートバッファーｐＨ７．４（１０倍濃縮）
−ＮＨ４Ｃｌ  −  最終濃度１．５Ｍ（Ｋｅｍｉｋａ、カタログ番号０１３７４０７）
−ＮａＨＣＯ３  −  最終濃度１００ｍＭ（Ｋｅｍｉｋａ、カタログ番号１４１１００７）
−Ｎａ２ＥＤＴＡ  −  最終濃度１０ｍＭ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ；カタログ番号Ｅ−４８８４）
・ＲＰＭＩ  １６４０（Ｌｏｎｚａ  カタログ番号ＢＥ１２−１１５Ｆ／Ｕ１）
・ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ  カタログ番号Ｆ７５２４、熱不活化３０分／５６℃）
・ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｄ２６５０）
・細胞溶解バッファー（ｐＨ７．４）：ＰＢＳ＋１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ；カタログ番号Ｘ１００）  −  １０ｍｌ
−Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓｔｏｐ  −  １錠（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号４６９３１２４００１）
プロテアーゼ阻害剤  −  １錠（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号４９０６８３７００１）
・過酸化水素溶液  ３％  ｗ／ｗ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｈ−６５２０）
・ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｐ４４１７−１００ＴＡＢ）
・マイクロプレート、９６ウェル、ｐｐ、ｖ底、透明（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ；カタログ番号６５１２０１）
・組織培養プレート、６ウェル、平底、低蒸発蓋付き（Ｆａｌｃｏｎ、カタログ番号３５３２２４）
・５０ｍＬファルコンチューブ（ＴＰＰ、カタログ番号９１０５０）
・Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号２３２２５）
・Ｉｍｍｕｌｏｎ（登録商標）Ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ（商標）９６ウェルプレート１Ｂ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号３３５５）
・Ｗｅｓ  １２−２３０ｋＤａマスターキット（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｉｍｐｌｅ、カタログ番号ＰＳ−ＭＫ１４）
・ＭＫＫ３（Ｄ４Ｃ３）ウサギｍＡｂ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号８５３５）
・Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＭＫＫ３（Ｓｅｒ１８９）／ＭＫＫ６（Ｓｅｒ２０７）（Ｄ８Ｅ９）ウサギｍＡｂ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号１２２８０）
【０１９４】
本アッセイは、以下の条件を用いて実行するように構成した：試験化合物濃度範囲：１−０．００１４μＭ（７つの３倍系列希釈）；Ｈ２Ｏ２濃度：３ｍＭ
【０１９５】
２．３．２  実験
ＰＢＭＣをバフィーコートから単離するため、バフィーコートをＰＢＳに１：１希釈し、次いで希釈バフィーコート（２５ｍＬ）をファルコンチューブ内の２０ｍＬのＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐの上面に慎重にピペットで移した。次いでチューブを４００ｘｇにて３５分間スピンさせた。次いで上方の血漿層を慎重に除去し、ＭＮＣ含有層を残した。次いでＭＮＣ含有層を新たなチューブに移し、ＰＢＳを添加して５０ｍＬの総量とし、次いでチューブを１０分間スピンする（２００ｘｇ、２５℃）。次いで得られたペレットを２ｍＬのＰＢＳに再懸濁し、洗浄ステップを繰り返した。最終ペレットを最大５０ｍＬの塩化アンモニウムライセートバッファーに再懸濁し、穏やかに混合し、１０分間遠心処理し（２００ｘｇ、２５℃）、２−３ｍＬの細胞培地に再懸濁し、細胞培地中で最大５０ｍＬに希釈した。自動セルカウンターを用いて細胞培地中１／２０希釈の細胞密度を定量した。
【０１９６】
６ウェルプレート内の１０％  ＦＢＳを追加したＲＰＭＩ  １６４０細胞培地１ｍＬに、ウェル当たり１０×１０６のＰＢＭＣを播種した。ＤＭＳＯ中化合物の３倍系列希釈物７セットを、９０ウェルｖ底プレートにおいて１ｍＭから開始して調製した。ＤＭＳＯ化合物溶液を細胞培地中１００倍に希釈した。２００μＬの１００倍希釈化合物溶液を各ウェルに添加し、対照ウェルは細胞培地中で調製した２００μＬの１％  ＤＭＳＯを含有した。細胞培地中７．５ｍＭ  Ｈ２Ｏ２を調製し、８００μＬを陰性対照ウェル以外の各ウェルに添加し、陰性対照ウェルには８００μＬの細胞培地を添加した。細胞を３７℃、５％  ＣＯ２、９５％湿度にて３０分間インキュベートした。細胞を２ｍＬ  エッペンドルフチューブに移し、３００ｘｇ及び４℃にて１０分間遠心処理し、次いで１ｍＬ  ＰＢＳで洗浄し、細胞ペレットを１００μＬの溶解バッファーに再懸濁し、氷上で３０分間インキュベートした。その後、細胞ライセートを１００００ｘｇ及び４℃にて５分間遠心処理し、次いで上清を−２０℃にて保管した。
【０１９７】
試料を細胞溶解バッファー中５倍に希釈し、９０ウェルＩｍｍｕｌｏｎ  １Ｂプレートにおいて、ＢＣＡタンパク質アッセイキットを製造業者の指示に従って用いて、総タンパク質濃度を定量した。
【０１９８】
Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｉｍｐｌｅ  Ｗｅｓマスターキット及びデバイスを製造業者の指示に従って用いて、ウェスタンブロットアッセイを実施した。総タンパク質の０．５ｍｇ／ｍＬを試料ごとに装填し、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＭＫＫ３及びＭＫＫ３抗体を３００倍に希釈した。
【０１９９】
Ｃｏｍｐａｓｓ  ２．７．１ソフトウェアを用いてウェスタンブロットの結果を分析し、各試料におけるｐｈｏｓｐｈｏ−ＭＫＫ３量をＭＫＫ３量で割った。以下の式を用いて対照を基準にデータを正規化することにより、阻害パーセンテージを計算した。
［（試料−低対照）／（高対照−低対照）］＊１００
【０２００】
化合物のＩＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア、非線形回帰（曲線適合）、ｌｏｇ（阻害剤）ｖｓ．応答−可変傾斜（４つのパラメーター）を用いて阻害パーセンテージ及び化合物濃度の対数をプロットすることにより定量した。
【０２０１】
本発明の例示化合物を、実施例２．３の方法に従って試験した。結果を以下に示す。
【表６】
2020530833.tif 000046
【０２０２】
２．４  ＡＳＫ１／２ヒト全血アッセイ
ＥＬＩＳＡを用いて、ＬＰＳで刺激したヒト全血中で産生されるＣＣＬ２サイトカインの量を定量することにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＡＳＫ１／２活性をアッセイした。文献には、非刺激及びＬＰＳ刺激条件下において、ＡＳＫ１ノックアウトマウスからの血清中でＣＣＬ２産生が減少することが記載されている。
２．４．１  材料及びアッセイ条件
・ＲＰＭＩ  １６４０（Ｌｏｎｚａ  カタログ番号ＢＥ１２−１１５Ｆ／Ｕ１）
・ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｄ２６５０）
・Ｅ．ｃｏｌｉ由来リポ多糖（ＬＰＳ）（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｌ４３９１）
・マイクロプレート、９６ウェル、ｐｐ、ｖ底、透明（Ｇｒｅｉｎｅｒ；カタログ番号６５１２０１）
・Ｍａｓｔｅｒ  ｂｌｏｃｋ  ９６ウェル、２ｍｌ（Ｇｒｅｉｎｅｒ、カタログ番号７８０２７１）
・Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅマイクロプレート、９６ウェル、ｐｓ、ｕ底、透明、蓋付き（Ｇｒｅｉｎｅｒ、カタログ番号６５０１８０）
・５０ｍＬファルコンチューブ（ＴＰＰ、カタログ番号９１０５０）
・Ｉｍｍｕｌｏｎ  ２ＨＢ  ９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号３４５５）
・スクロース（Ｋｅｍｉｋａ、カタログ番号１８００４０８）
・ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カタログ番号ＯＲ０３Ｌ）
・硫酸（Ｋｅｍｉｋａ、カタログ番号１８１６５０１）
・抗ｈＣＣＬ２抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＭＡＢ６７９）、１ｍｌのＰＢＳに溶解
・抗ｈＣＣＬ２検出抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＢＡＦ２７９）、１ｍｌのＰＢＳに溶解
・組換えｈＣＣＬ２（標準、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号３６６−６Ｃ）
・洗浄バッファー（ＰＢＳ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）
−ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ４４１７）
−Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ２２８７）
・２０ｍｌの基質：１８ｍｌ  Ｈ２Ｏ＋２  ｍｌ  １Ｍ酢酸ナトリウム＋２００μｌ  ＴＭＢミックス＋２．５μｌ  ３０％  Ｈ２Ｏ２
−酢酸ナトリウム（Ｋｅｍｉｋａ、カタログ番号１４４１９０８）
−ＴＭＢミックス（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｔ２８８５）
−過酸化水素（Ｍｅｒｃｋ、カタログ番号１．０８５９７）
・コーティングバッファー（１５ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３（×Ｈ２Ｏ）＋３５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３）
−炭酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｓ−２１２７）
−重炭酸ナトリウム（Ｋｅｍｉｋａ、カタログ番号１４１１００７）
・アッセイバッファー（ＰＢＳ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０＋１％  ＢＳＡ）
−ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ２１５３）
【０２０３】
２．４．２  実験
クエン酸塩抗凝固剤を用いて全血を収集した。１００μＬを、自動セルカウンターを用いた細胞数の定量に使用した。
【０２０４】
３００μＬの全血を２ｍＬ  ｍａｓｔｅｒ  ｂｌｏｃｋ  ９６ウェルプレートに添加した。ＤＭＳＯ中化合物の３倍系列希釈物６つを、９０ウェルｖ底プレートにおいて１０ｍＭから開始して調製した。ｖ底プレートからの０．６μＬの調製化合物または０．６μＬのＤＭＳＯ（陽性及び陰性対照ウェル）を、血液入りのｍａｓｔｅｒ  ｂｌｏｃｋプレートに添加した。無血清培地中２ｎｇ／ｍＬ  ＬＰＳを調製し、３００μＬを、試験ウェル用の血液入りのｍａｓｔｅｒ  ｂｌｏｃｋプレートの各ウェルに添加した。３００μＬの培地を陰性対照ウェルに添加した。プレートを全血と共にＣＯ２インキュベーター内で終夜インキュベートした（３７℃、５％  ＣＯ２、９５％湿度）。次いでプレートを１５００ｘｇにて７分間遠心処理し、上清をＣＣＬ２サイトカインの定量用に９６ウェルｕ底プレートに移すか、または上清を今後の試験用に−２０℃にて保管した。
【０２０５】
ＥＬＩＳＡを実施する前の日に、Ｉｍｍｕｌｏｎ  ２ＨＢプレートをウェル当たり１００μＬのコーティングバッファー中２５０倍希釈抗ｈＣＣＬ２抗体でコーティングした。次いで、プレートを４℃にて終夜インキュベートした。プレートをウェル当たり３００μＬの洗浄バッファーで３回洗浄し、これを各ステップ後に繰り返した。２００μＬのブロッキング（アッセイバッファー＋５％スクロース）を各ウェルに添加し、３７℃にて６０分間インキュベートした。アッセイバッファー中ｈＣＣＬ２標準物質の２倍系列希釈物７セットを、２０００ｐｇ／ｍＬから開始して２連で調製した。アッセイバッファーのみを含有するブランクウェルを調製した。試験試料（上清）をアッセイバッファー中１０倍に希釈してプレートに添加した。プレート中の全ての最終体積は１００μＬであった。プレートを３７℃にて６０分間インキュベートした。ウェル当たり１００μＬのアッセイバッファー中５００倍希釈抗ｈＣＣＬ２検出抗体を添加し、プレートを３７℃にて４５分間インキュベートした。ウェル当たり１００μＬのアッセイバッファー中５０ｎｇ／ｍＬのストレプトアビジン−ＨＲＰを添加し、プレートを３７℃にて３０分間インキュベートした。ウェル当たり１００μＬの調製済み基質溶液を添加し、プレートを室温にてインキュベートし、ウェル中で青色が発色するまで光から保護した。発色を停止させるため、ウェル当たり１００μＬの１Ｍ硫酸を添加した。プレートリーダーで４５０ｎｍにおけるプレートの吸光度を読み取った。
【０２０６】
２．４．３  データ分析
ＥＬＩＳＡ結果（４５０ｎｍにおける吸光度）をＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌソフトウェアを用いて分析した。全ての値からブランクの平均値を差し引いた。標準物質の系列希釈（ｐｇ／ｍＬ）をｘ軸、これに対し対応する吸光度の値をｙ軸として、標準曲線をプロットした。試料中のサイトカイン量（ｐｇ／ｍＬ）を標準曲線から計算した。以下の式を用いて対照を基準にデータを正規化することにより、阻害パーセンテージを計算した。
［（試料−低対照）／（高対照−低対照）］＊１００
【０２０７】
化合物のＩＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア、非線形回帰（曲線適合）、ｌｏｇ（阻害剤）ｖｓ．応答−可変傾斜（４つのパラメーター）を用いて阻害パーセンテージ及び化合物濃度の対数をプロットすることにより定量した。
【０２０８】
３．ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ
３．１  荷重法を用いて査定した、ラットにおけるＣＦＡ（完全フロイントアジュバント）誘発性過感受性
完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）の足底注射は、過感受性及び浮腫を誘発する炎症性反応を引き起こし、臨床的な炎症性疼痛のいくつかの態様を模倣する。荷重を測定する装置及びプレチスモメーターを用いて３つの効果を調べた。
【０２０９】
３．１．１  荷重
ナイーブなラットは、２本の後肢間で体重を均等に分配する。しかし、注射を受けた（左）後肢が炎症及び／または有痛性である場合、罹患肢に加わる体重が少なくなるように体重が再分配される（損傷肢にかかる重量の減少）。ラット両足圧力差痛覚測定器（ｉｎｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ  ｔｅｓｔｅｒ）（Ｌｉｎｔｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＵＫ）を用いて、各後肢にかかる荷重を測定した。
【０２１０】
ラットを両脚圧力差痛覚測定器に配置し、後肢を別々のセンサー上に置き、両後肢が発揮する平均の力を４秒にわたり記録した。
【０２１１】
ベースライン荷重及び足体積を読み取り、ＣＦＡの注射を介して過感受性を誘発した（ベースライン荷重及び足体積の記録は、侵襲を誘発する前に行った）。ラット左後肢の足底内に対しＣＦＡの足底内注射（１００μＬの１ｍｇ／ｍＬ溶液）を行うことにより、炎症性過感受性を誘発した。
【０２１２】
動物（オス、スプレーグドーリーラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，ＵＫ）、２１２−２６０ｇ）に対し、ラテン方格設計における荷重ＣＦＡウインドウに従って、ランクづけ及び処置群へのランダム割付けを行った。動物を、ＣＦＡから２４時間後、ビヒクル、化合物１  １０ｍｇ／ｋｇ、またはインドメタシン１０ｍｇ／ｋｇ（１０Ｌｌ／ｋｇ用量体積）のいずれかで処置した。処置から１、２、及び４時間後に荷重を測定した。荷重（ｇ）の読取りは左右両後肢に対し行い、差を計算した。データは、疼痛に対する過感受性の反転％（平均±ｓ．ｅ．ｍ．）として表現する。足体積（ｍＬｌ）の読取りを左後肢に対し行った。データは、浮腫に対する反転％（平均±ｓ．ｅ．ｍ．）として表現した。ＩｎＶｉｖｏＳｔａｔ（ｉｎｖｉｖｏｓｔａｔ．ｃｏ．ｕｋ，Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）を用いた反復測定ＡＮＯＶＡ及びその後の計画比較検定による統計的分析を実施した。ｐ＜０．０５を有意とみなした。
【０２１３】
化合物１及びインドメタシン（１０ｍｇ／ｋｇ）は、投与後に試験した全ての時点において過感受性応答を有意に阻害した。
【０２１４】
３．２  ラットにおけるＭＩＡ誘発性痛覚過敏（ｉｎ  ｖｉｖｏ慢性疼痛モデル）
ヨード酢酸一ナトリウム（ＭＩＡ）をスプレーグドーリーラットの同側の膝に関節内投与すると、最初に炎症性応答を伴うロバストで持続性の痛覚過敏及びアロディニアがもたらされる。この動物モデルにおけるこれらの徴候の発生は、臨床的に意義があると考えられており、変形性関節炎（ＯＡ）またはリウマチ性関節炎などの基礎的状態に関連する慢性炎症性疼痛を呈する患者が示す症状を反映していると考えられている（Ｂｏｖｅ  ＳＥ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ２００３；１１（１１）：８２１−３０；Ｆｅｒｎｉｈｏｕｇｈ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐａｉｎ  ２００４；１１２（１−２）：８３−９３；Ｋａｌｂｈｅｎ  ＤＡ．Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ  １９８７；１４  Ｓｐｅｃ  Ｎｏ：１３０−１）。
【０２１５】
荷重
ナイーブなラットは、２本の後肢間で体重を均等に分配する。しかし、注射を受けた（左）後膝が炎症及び／または有痛性である場合、罹患肢に加わる体重が少なくなるように体重が再分配される（損傷肢にかかる重量の減少）。ラット両足圧力差痛覚測定器（Ｌｉｎｔｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＵＫ）を用いて、各後肢にかかる荷重を測定する。
【０２１６】
ラット（スプレーグドーリー、オス、１０匹の群）における変形性関節炎（ＯＡ）を、左後肢の膝関節へのＭＩＡ溶液（Ｓｉｇｍａ、Ｉ２５１２）、２５μＬの８０ｍｇ／ｍＬ、（２ｍｇ）の注射を介し誘発した。３、５、７、９、１２、及び１６日目に、慢性疼痛の発生のためのＭＩＡ注射の後、荷重を査定した。３日目に荷重測定を行い、動物に対し、ラテン方格設計における荷重ＣＦＡウインドウに従って、ランク付け及び処置群へのランダム割付けを行った。
【０２１７】
動物の処置は、０．５％メチルセルロース中化合物１  １０ｍｇ／ｋｇまたはビヒクル（０．５％メチルセルロース）１０ｍＬ／ｋｇを経口で３日目に行い、それから毎日１６日目まで行った。荷重測定は、３日目は投薬から１、２、及び４時間後に行い、５、７、９、１２、及び１６日目は投薬から２時間後に行った。
【０２１８】
荷重（ｇ）の読取りは左右両後肢に対し行い、差を計算した。データは、同側／対側の比率％として表現される（（左荷重／右荷重）＊１００）（平均±ｓ．ｅ．ｍ．）。
【０２１９】
計算：同側の読取り値／対側の読取り値×１００。ナイーブ荷重の差：投薬前の荷重の差は、ＭＩＡウインドウとして定義した。
【０２２０】
統計的分析：ＩｎＶｉｖｏＳｔａｔ（ｉｎｖｉｖｏｓｔａｔ．ｃｏ．ｕｋ）を用いた反復測定ＡＮＯＶＡ及びその後の計画比較検定（ｐ＜０．０５を有意とみなした）。各時点において処置群をビヒクル対照群と比較することにより、データを分析した。
【０２２１】
１０ｍｇ／ｋｇで投薬した場合の化合物１において、投薬から１時間後から１２日目まで（投薬後９日）有意かつ著明な過感受性の反転が見られた。１０ｍｇ／ｋｇで投与した化合物１は、同じ時点におけるビヒクルと比較して有意な反転を示し、陽性対照のセレコキシブに匹敵した。
【０２２２】
３．３  肝線維症のＣＣｌ４モデル（プロトコル１）
この試験の目的は、ＣＣｌ４中毒による肝線維症のモデルを査定することであった。組織診断、生化学、イメージング、及び異なる時点における遺伝子発現の探索による肝線維症の査定により、この疾患の発症及び見込みのある陽性参照物質の効果を評価する。Ｓｔａｒｋｅｌ  Ｐ．，Ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ，Ｂｅｓｔ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ＆  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ２５：３１９−３３３，２０１１
【０２２３】
３．３．１  試験群：
本試験は、５週齢のオスＢａｌｂＣ  Ｊマウス（Ｊａｎｖｉｅｒ  Ｌａｂ）を用いて実施する。
【表７】
2020530833.tif 000047
３．３．２  材料：
・ＣＣｌ４：四塩化炭素ＡＣＲＯＳ  ９９．８％、ＣＡＳ＝５６−２３−５、ロットＡ０２９３９００
・オリーブ油、ＳＩＧＭＡ  Ｏ１５１４−５００ｍＬ、ロット番号ＢＣＢＱ４８８５Ｖ
・ｃｏｌＦ（ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｒｅｆ  ６３４６、ロット１３Ｙ３９、使用期限０５／２０１７
ストック溶液は、１００μＬのＤＭＳＯに希釈し（６．８ｍＭ）４℃にて保管
イメージングの１５分前にｐｐｉ水中１：１７０希釈を動物に注射（１００μＬ、静脈洞内）
・ＣＣｌ４をオリーブ油で１／２に希釈し、週当たり２回０．６ｍＬ／ｋｇにて腹腔内投与した。
【０２２４】
３．３．２  試料及び結果
血液を血清チューブに収集し、試料を３０００ｔ／分にて５分間遠心処理し、ＡＳＴ、ＡＬＴ、ＡＬＰ、及び総ビリルビン評価用に−２０℃にて凍結させた。肝臓右中葉の試料も採取し、速やかに１ｍＬのＲＮＡｌａｔｅｒと共にエッペンドルフチューブ（２ｍＬ丸底）に入れ（安全ロックチューブ）４℃にて保管する。
【０２２５】
肝臓を回収し秤量する。直ちに肝臓内のｃｏｌＦ結合のｅｘ  ｖｉｖｏイメージングを実施する（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｘｔｒｅｍｅ）。ａＳＭＡについての組織学的評価及びｃｏｌ  Ｉ  ＩＨＣ定量化のために、肝臓をホルムアルデヒド（バイアル２５ｍＬ−６０ｃｃ）に入れる。
【０２２６】
脾臓を今後の分析用に秤量する。
【０２２７】
９種の線維症遺伝子のパネルを遺伝子発現分析に使用する。
【０２２８】
３．４  肝線維症のＣＣｌ４モデル（プロトコル２）
この試験の目的は、ＣＣｌ４中毒による肝線維症のモデルを査定することであった。組織診断、生化学、イメージング、及び異なる時点における遺伝子発現の探索による肝線維症の査定により、この疾患の発症及び見込みのある陽性参照物質の効果を評価する。Ｓｔａｒｋｅｌ  Ｐ．，Ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ，Ｂｅｓｔ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ＆  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ２５：３１９−３３３，２０１１
【０２２９】
３．４．１  試験群：
本試験は、８週齢のオスＢａｌｂ／Ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｉｔａｌｙ）を用いて実施する。
【表８】
2020530833.tif 000048
３．４．２  材料：
・ＣＣｌ４（液体）を０．０６ｍＬ／ｍｌの濃度にてオリーブ油に添加する。溶液を０．６ｍＬ／ｋｇの用量にて腹腔内投与する。適用体積は１０ｍＬ／ｋｇとする。
・試験化合物をメチルセルロース（ＭＣ  ０．５％）に溶解／懸濁する。
【０２３０】
３．４．３  試料及び結果
定常状態ＰＫの試料採取用に、血液をＨｅ−リチウムチューブに収集して血漿を生成する。全ての血液試料を、収集から３０分以内に遠心分離（５，０００ｒｐｍ、４℃にて１０分間）により処理して血漿を得る。次いで、分析を行うまで試料を−８０℃にて保管する。
【０２３１】
頸静脈の切断により、最終血液試料をＫ２ＥＤＴＡマイクロチューブに採取する。全ての血液試料を、収集から３０分以内に遠心分離（３５００ｒｐｍ、４℃にて１０分間）により処理して血漿を得る。分析を行うまで、各血液試料からの血漿を−８０℃にて保管する。
【０２３２】
肝臓を回収し、左側葉の一部をＲＮＡ遺伝子発現分析、ＯＨプロリン測定の切片用に保管し、残りは病理組織学的評価用に１０％ホルマリンに入れる。
【０２３３】
５種の線維症遺伝子のパネル（Ｃｏｌ１、Ｔｉｍｐ１、Ｐａｉ１、Ｓｎａｉｌ１、Ａｃｔａ２）を遺伝子発現分析に使用する。
【０２３４】
３．５  脂肪性肝炎及び線維症のメチオニン及びコリン欠乏モデル
ＭＣＤは、脂肪性肝炎及び線維症における新規のマウスモデルであり、食餌：メチオニン及びコリン欠乏（ＭＣＤ）により誘発される。（Ｗｅｈｒ  ｅｔ  ａｌ  ２０１３  Ｊ  ｉｍｍｕｎｏｌ，１９０（１０）：５２２６−３６；Ｂａｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，５９（３）：１０６０−７２；Ｇａｕｔｈｅｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１４  ＥＭＢＯ，６（８）：１０６２−７４）．
【０２３５】
３．５．１  試験群及び用量レジメン：
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｊａｎｖｉｅｒ  Ｌａｂｓ（Ｆｒａｎｃｅ））を以下に示すような群に分ける。マウスは誘発フェーズ開始時点で８週齢（＞２０ｇｒ）である。
【表９】
2020530833.tif 000049
３．５．２  材料及び化合物
・ＭＣＤ食餌（コリン及びメチオニンなし）  Ｒｅｆ  ＥＦＴＤ．９０２６２  ＭＣＤ  ｍｏｄ．ｂａｔｃｈ  ８２０６４２３、Ｓｓｎｉｆｆ，Ｓｏｅｓｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ−
・メチルセルロース０．５％、ＶＷＲ、
・ＰＥＧ４００：Ｐ３２６５，Ｓｉｇｍａ
・Ｃｒｙｏｍｏｌｄ（登録商標）Ｓｔａｎｄａｒｄ  ２５×２０×５ｍｍ（Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｃ，４５５７）
・Ｏ．Ｃ．Ｔ．（商標）化合物クリオモルド（Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｃ，４５８３）
・試料保存用ホルマリン（メタノールで４％緩衝）
【０２３６】
３．５．３  化合物調製：
化合物を、撹拌下で適切なビヒクル（上の表を参照）に溶解／懸濁する。調製後、溶液／懸濁液を一定の磁気撹拌下、暗中室温にて保つ。投薬の際は１０ｍＬ／ｋｇの量を使用し、溶液の濃度を動物の体重に応じて調整する。
【０２３７】
３．５．４  プロトコル：
誘発フェーズは３週間とする。空腹時グルコースは提供しない。マウスにＭＣＤ対照食餌またはＭＣＤ食餌を与える。
【０２３８】
処置フェーズ中、マウスは誘発フェーズと同様にＭＣＤ対照食餌またはＭＣＤ食餌で維持する。均質な割当てを確実に行うため、マウスを体重に応じてランダムに処置群に割付ける。評価フェーズ中、マウスに１日１回または２回試験化合物を投薬する。
【０２３９】
３．６  予防的ブレオマイシン誘発性肺線維症１４日マウスモデル
この試験の目的は、マウスにおけるブレオマイシン誘発性肺線維症の１４日モデルにおいて、３つの異なる用量における試験化合物の有効性を試験することである。
【０２４０】
３．６．１  動物
この試験は、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｉｔａｌｙが供給するＣ５２７ＢＬ／６Ｎオスマウスに対し行う。マウスを少なくとも５日間、１２時間の明期サイクル下、２２℃、５５％相対湿度、１時間当たり１５〜２０回の換気に維持された環境に順化させる。マウス用ペレット飼料及び水は自由に摂取させる。
【０２４１】
実験開始の少なくとも１日前に、全ての動物を、下記の表に示すような群にランダムに割付ける。
【０２４２】
全ての動物関連研究は、２０１０／６３／ＥＵならびに科学的研究及びその他の目的における実験動物の使用を規制する国の立法（Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｇａｚｅｔｔｅ  ５５／１３）に従って行う。
３．６．２  試験群
【表１０】
2020530833.tif 000050
【０２４３】
３．６．３  材料
試験溶液用の溶媒は、０．５ｇのヒドロキシエチルセルロース（Ｎａｔｒｏｓｏｌ）を５００ｍＬの蒸留水（Ａｑｕａ  ｄｉｓｔｉｌｌａｔｅ）に添加し（０．１％）、磁気スターラーで５時間、加熱を伴わずに持続的に撹拌することにより調製する。
【０２４４】
麻酔液は、１ｍＬのＮａｒｋｅｔａｎ（Ｎａｒｋｅｔａｎ  １０，Ｖｅｔｏｑｕｉｎｏｌ，Ｂｅｒｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，０３６０５８７７５３５９８２）及び０．５ｍＬのＲｏｍｐｕｎ（Ｒｏｍｐｕｎ、２％：Ｂａｙｅｒ，Ｌｅｖｅｒｋｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を９ｍＬの食塩水に添加することにより調製する。得られた溶液を１０ｍＬ／ｋｇにて投与する。
【０２４５】
鼻腔内（ｉ．ｎ．）曝露用の溶液を調製するため、ブレオマイシン（ブレオマイシン硫酸塩、Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ；ＣＡＳ番号９０４１−９３−４；カタログ番号ＢＭＬ−ＡＰ３０２−００１０）の０．８ｍｇ／ｍＬストック溶液を解凍し、３３０μＬの食塩水に希釈する。
【０２４６】
ｉ．ｎ．投与の前に、上述の麻酔液でマウスの腹腔内に麻酔をかける。
【０２４７】
新鮮なピルフェニドン製剤を０．１％  Ｎａｔｒｏｓｏｌ製剤において毎日調製し、５ｍｇ／ｍＬの最終濃度にする。投薬の前に動物を秤量し、投与するピルフェニドンの量を１０ｍｇ／ｋｇ体重に対応するように個別の体重に従って調整し、１日２回の経口投与を、２回の投与間に７．５時間の間隔を置いて行う。
【０２４８】
最後に、試験化合物溶液は、好適な量の当該試験化合物をＰＥＧ４００（最終体積の２０％）に溶解し、次いでＭＣ  ０．５％（最終体積の８０％）に溶解して１ｍｇ／ｍＬ、０．３ｍｇ／ｍＬ、及び０．１ｍｇ／ｍＬの最終濃度に到達させることにより調製し、このようにして１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、及び１ｍｇ／ｋｇの用量のための化合物がもたらされる。投薬の前に動物を秤量し、投与する量を個別の体重に応じて調整する。
【０２４９】
試験用量の適用体積は１０ｍＬ／ｋｇ体重に対応し、試験化合物は１日２回、２回の投与間に７．５時間の間隔を置いて腹腔内投与する。
【０２５０】
３．６．４  試験
動物は１日２回臨床検査を受ける。臨床徴候及びパラメーターのリストはヒトのエンドポイント表に示される。０日目から毎日動物を秤量する。
【０２５１】
１４日目のピルフェニドンまたは試験化合物の投薬から２時間後に、マウスを過剰用量の麻酔で屠殺する。
【０２５２】
肺を切除し、個別に秤量する。全ての群に対し、全右肺上葉をシリカビーズを含有するＰｒｅｃｅｌｌｙｓチューブに入れ、液体窒素で直ちにスナップ凍結し、遺伝子発現分析に供する。
【０２５３】
残りの全ての肺は、今後の病理組織学的評価用に１０％緩衝ホルマリンを含有する印付きの瓶に入れる。
【０２５４】
３．６．５  試料分析、データ処理、及び統計的評価
ＭＳ  Ｅｘｃｅｌを用いて体重データ及び肺重量データを処理する。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン５．０４）を用いて統計的分析及びグラフ提示を実施する。
【０２５５】
肺重量には一元配置ＡＮＯＶＡまたはマン・ホイットニー検定を用いる。
【０２５６】
体重変化には二元配置ＡＮＯＶＡを用いる。
【０２５７】
群間の差は、ｐ＜０．０５の場合に統計的に有意とみなす。
【０２５８】
病理組織学的評価用に、全肺（試料採取した上右肺を除く）をパラフィン包埋し、マロリーのトリクロームで染色する。
【０２５９】
肺の組織学的変化をＡｓｈｓｏｆｔスコアのＭａｔｓｕｓｅ改変版を用いて査定する（Ａｓｈｓｏｆｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８；Ｍａｔｓｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９）。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン５．０４）を用いて統計的分析及びグラフ提示を実施する。マン・ホイットニー検定を用いる。
【０２６０】
群間の差は、ｐ＜０．０５の場合に統計的に有意とみなす。
【表１１】
2020530833.tif 000051
【０２６１】
３．６．６  ＰＫ分析（第７群）
３．６．６．１  プロトコル
第７群の動物（ｎ＝１０）はＰＫ試験のみに含め、臨床徴候スコア付けに供さない。
【０２６２】
これらの動物に対し、０日目の処置開始時に疾患を誘発し、７日目に試験化合物を最初に投与してから１時間、３時間、６時間、８時間、２４時間後に順次屠殺する。
【０２６３】
各時点において、尾静脈から収集した血液試料（５０μＬ）をＬｉ−ヘパリン抗凝固チューブに入れ、分離するまで氷上に保つ。収集から最大３０分以内に血液試料を４℃にて１０分間、２０００ｇで遠心処理し、得られた血漿試料をポリプロピレンチューブに分取した（１×２５μＬ）。分析を行うまで試料を−２０℃にて保管する。
【０２６４】
各動物から採血した後の屠殺時に肺組織を収集し、次いで秤量し、ポリプロピレンチューブに入れてから凍結する。分析を行うまで試料を−８０℃にて保管する。
【０２６５】
３．６．６．２  血漿濃度及び薬物動態解析
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを介し、血漿及び肺の濃度を測定する。タンパク質沈殿を介し、試料をＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析用に調製する。定量下限未満（ＬＬＯＱ）で測定された血漿濃度は定量限界未満（ＢＬＱ）として報告する。
【０２６６】
血漿中の試験化合物濃度をｎｇ／ｍＬとして表現する。
【０２６７】
平均血漿濃度を計算する。平均計算のため、ＬＬＯＱを下回る濃度をゼロに設定する。そのため、平均値はＢＬＱになる場合がある。少なくとも３つの血漿濃度値がＬＬＯＱを上回る場合に、標準偏差（ＳＤ）、平均値の標準誤差（ＳＥ）、及び変動係数（ＣＶ、％）を集計する。
【０２６８】
ＰｈｏｅｎｉｘＴＭ  ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）６．３（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて個々の血漿濃度に対するノンコンパートメント解析を実施して、少なくとも以下の薬物動態パラメーターを定量する：
【０２６９】
最高血漿濃度、対応時間を伴うＣｍａｘ（μｇ／ｍＬ）、ｔｍａｘ（ｈ）、
【０２７０】
最終定量可能濃度までの時間曲線に対する血漿濃度下面積ＡＵＣ０−ｔまたは２４時間までのＡＵＣ０−２４ｈ（μ．ｈ／ｍＬ）（化合物が用量後２４時間まで定量可能である場合）、及び／または無限までのＡＵＣ０−∞（μ．ｈ／ｍＬ）を、リニアアップ／ログダウン（ｌｉｎｅａｒ  ｕｐ／ｌｏｇ  ｄｏｗｎ）の台形則に従って計算する。必要と考えられる場合は部分的ＡＵＣが計算され得る。定量下限未満（ＢＬＱ）の濃度はゼロに設定する。定量可能な時点が３つ未満の場合はＡＵＣを計算しない。％ＡＵＣｅｘｔｒａ＜２０％の場合はＡＵＣ０−∞とみなす。
【０２７１】
見かけ上の終末消失半減期ｔ１／２（ｈ）は、ｔｍａｘを除いた３つ以上の時点が線形回帰のために使用され、かつ調整済みＲ２＞０．８０の場合のみに報告する。
【０２７２】
正規化されたＡＵＣ及びＣｍａｘ用量。
【０２７３】
平均薬物動態パラメーターを計算する。少なくとも３つの値が利用可能である場合は標準偏差（ＳＤ）及び変動係数（ＣＶ、％）を集計する。
【０２７４】
３．７  ＣＩＡモデル
３．７．１  材料
完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）及び不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）をＤｉｆｃｏから購入する。ウシＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、及びＥｎｂｒｅｌを、Ｃｈｏｎｄｒｅｘ（Ｌ’Ｉｓｌｅ−ｄ’Ａｂｅａｕ，Ｆｒａｎｃｅ）、Ｓｉｇｍａ（Ｐ４２５２，Ｌ’Ｉｓｌｅ−ｄ’Ａｂｅａｕ，Ｆｒａｎｃｅ）、Ｗｙｅｔｈ（２５ｍｇ注射用シリンジ、Ｆｒａｎｃｅ）、Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）からそれぞれ入手する。使用する他の全ての試薬は試薬グレードとし、全ての溶媒は分析グレードとする。
【０２７５】
３．７．２  動物
Ｄａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉラット（オス、７−８週齢）をＨａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｍａｉｓｏｎ−Ａｌｆｏｒｔ，Ｆｒａｎｃｅ）から入手する。ラットを１２時間明期／暗期サイクル（０７００−１９００）で飼育する。温度を２２℃に維持し、飼料及び水を自由に摂取させる。
【０２７６】
３．７．３  コラーゲン誘発性関節炎（ＣＩＡ）
実験の１日前に、０．０５Ｍの酢酸を用いてＣＩＩ溶液（２ｍｇ／ｍＬ）を調製し、４℃にて保管する。免疫化の直前に、等体積のアジュバント（ＩＦＡ）及びＣＩＩを、氷水浴中で予冷したガラス瓶内でホモジナイザーにより混合する。エマルジョンが形成されない場合は付加的なアジュバント及び均質化持続が必要となる場合がある。１日目に、各ラットの尾の基部に０．２ｍＬのエマルジョンを皮内注射し、９日目に、２回目のブースター皮内注射（ＣＦＡ  ０．１ｍＬ食塩水中２ｍｇ／ｍＬのＣＩＩ溶液）を実施する。この免疫化法は、公表された方法（Ｊｏｕ  ｅｔ  ａｌ．２００５；Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．２００４）から改変したものである。
【０２７７】
３．７．４  試験設計
化合物の治療効果をラットＣＩＡモデルにおいて試験する。ラットを均等な群にランダムに分け、各群が１０匹のラットを含むようにする。全てのラットを１日目に免疫化し、９日目にブーストする。治療的投薬は１６日目から３０日目まで続ける。陰性対照群をビヒクルで処置し、陽性対照群をＥｎｂｒｅｌで処置する（１０ｍｇ／ｋｇ、３回／週、皮下）。典型的には、目的化合物の試験は４回用量、例えば、０．３、１、３、及び１０ｍｇ／ｋｇ、経口で行う。
【０２７８】
３．７．５  関節炎の臨床的査定
関節炎を文献に記載の方法に従ってスコア化する（Ｋｈａｃｈｉｇｉａｎ  ２００６  Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．２００６；１（５）：２５１２−６；Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２００７，Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，１５０，ｐｐ８６２−８７２；Ｎｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．２００４，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ，５０（１０），ｐｐ３３６５−３３７６）。４本の足の各々の膨脹を以下のような関節炎スコアでランク付けする：０−症状なし；１−軽度、ただし明確な赤み及び１つのタイプの関節（例えば、足首もしくは手首）の膨脹、または明らかな赤み及び個々の指に限定された膨脹（罹患した指の数にかかわらず）；２−中等度の赤み及び２つ以上のタイプの関節の膨脹；３−重度の赤み及び指を含めた足全体の膨脹；４−複数の関節を伴って最大限に炎症化した肢（動物当たりの最大累積臨床関節炎スコアは１６）（Ｎｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．２００４）。
【０２７９】
複数の試験のメタ分析を可能にするために、臨床スコア値を以下のように正規化してもよい：
【０２８０】
臨床スコアのＡＵＣ（ＡＵＣスコア）：１日目から１４日までの曲線下面積（ＡＵＣ）を各個々のラットに対し計算する。各動物のＡＵＣを、その動物のデータを得た試験でビヒクルに対し得られた平均ＡＵＣで割り、１００を掛ける（すなわち、ＡＵＣは、試験ごとの平均ビヒクルＡＵＣのパーセンテージとして表現される）。
【０２８１】
１日目から１４日までの臨床スコアの増加（エンドポイントスコア）：各動物における臨床スコア差を、その動物のデータを得た試験でビヒクルに対し得られた平均臨床スコア差で割り、１００を掛ける（すなわち、差は、試験ごとのビヒクルに対する平均臨床スコア差のパーセンテージとして表現される）。
【０２８２】
３．７．６  関節炎発症後の体重変化（％）
臨床的には、体重損失は関節炎に関連する（Ｒａｌｌ  ＆  Ｒｏｕｂｅｎｏｆｆ  ２００４  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ（Ｏｘｆｏｒｄ）；４３（１０）：１２１９−２３；Ｓｈｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２００５  Ｐａｉｎ；１１６（１−２）：８−１６；Ｗａｌｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．２００４  Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．；３１（１）：２３−９）。そのため、関節炎発症後の体重変化は、ラットモデルにおける治療効果を評価するための非特異的エンドポイントとして使用することができる。関節炎発症後の体重変化（％）は以下のように計算する：
【数１】
2020530833.tif 000052
【０２８３】
３．７．７  放射線医学
各個々の動物の後肢に対し、Ｘ線写真を撮影する。ランダムな盲検的識別番号を各写真に割り当て、２名の独立した採点者が以下のような放射線医学的Ｌａｒｓｅｎスコアシステムを用いて骨のびらんの重症度をランク付けする：０−正常、非損傷の骨輪郭及び正常な関節空間；１−わずかな異常、外側の中足骨のうちの任意の１つまたは２つがわずかな骨のびらんを示す；２−明らかな早期異常、外側の中足骨のうちの任意の３つから５つが骨のびらんを示す；３−中間の破壊性異常、全ての外側の中足骨が明らかな骨のびらんを示し、さらに内部の中足骨のうちの任意の１つまたは２つが明らかな骨のびらんを示す；４−重度の破壊性異常、全ての中足骨が明らかな骨のびらんを示し、内側の中足骨関節の少なくとも１つが完全にびらん状態であり、いくつかの骨関節輪郭は部分的に保存されている；４−断節性の異常、骨の輪郭を伴わない。このスコア付けシステムは、文献のプロトコル（Ｂｕｓｈ  ｅｔ  ａｌ．２００２，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ，４６（３），８０２−８０５；Ｊｏｕ  ｅｔ  ａｌ．２００５，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ，５２（１），３３９−４４；Ｓａｌｖｅｍｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．２００１，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ，４４（１２），２９０９−２１；Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．２００４，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ，５０（７），２３３８−４６）からの改変である。
【０２８４】
３．７．８  組織診断
放射線医学的分析の後、マウスの後肢を１０％リン酸緩衝ホルマリン（ｐＨ７．４）に固定し、精細な組織診断のために迅速な骨脱灰剤（ＥＵＲＯＢＩＯ，Ｌｅｓ  Ｕｌｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）で脱灰し、パラフィン包埋する。関節炎関節の広範な評価を確実に行うため、少なくとも４つの連続切片（５μｍ厚さ）を切り、各連続切片の間を１００μｍとする。切片をヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色する。滑膜の炎症ならびに骨及び軟骨の損傷に対する組織学的検査を二重盲検で実施する。各足において、４点尺度を用いて４つのパラメーターを査定する。このパラメーターは、細胞浸潤、バンヌスの重症度、軟骨のびらん、及び骨のびらんである。スコア付けは以下のように実施する。１−正常、２−軽度、３−中等度、４−著明。４つのスコアを合計し、追加的スコア、すなわち「ＲＡ総スコア」として表す。
３．７．９  踵骨（かかとの骨）のマイクロコンピューター断層撮影（μＣＴ）分析
【０２８５】
ＲＡで観察される骨の分解は、特に皮質骨で生じ、μＣＴ分析によって明らかになり得る（Ｏｓｔｅ  ｅｔ  ａｌ．  ２００７；Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．２００４）。踵骨のスキャン及び３Ｄボリューム再構築の後に、骨分解を、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで骨の縦軸に対し垂直に分離している、スライドごとに存在する不連続的な物体の数として測定する。骨が分解するほど、より多くの不連続的な物体が測定される。踵骨に沿って均等に分配した（約１０．８μｍ間隔）１０００枚の切片を分析する。
【０２８６】
３．７．１０  定常状態ＰＫ
７日目以降、後眼窩洞にて、抗凝固剤としてのリチウムヘパリンを用いて、以下の時点にて血液試料を収集する：用量前、１、３、及び６時間。全血試料を遠心処理し、得られた血漿試料を未定の分析に−２０℃にて保管する。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法により、各試験化合物の血漿濃度を定量する。質量分析計は正エレクトロスプレーモードで操作する。ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ（登録商標），Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）を用いて薬物動態パラメーターを計算し、用量前血漿レベルは２４時間血漿レベルに等しいと想定する。
【０２８７】
３．８  ＭＡＢモデル
ＭＡＢモデルは、治療薬によるＲＡ類似炎症性応答の調節に対する迅速な査定を可能にする。Ｋｈａｃｈｉｇｉａｎ，２００６．ＤＢＡ／Ｊマウスに、コラーゲンＩＩに対し向けられたｍＡｂのカクテルを静脈内注射する。１日後、化合物の処置を開始する。３日後、マウスは腹腔内ＬＰＳ注射（５０μｇ／マウス）を受け、急速な炎症発生がもたらされる。化合物処置は、ｍＡｂ注射から１０日後まで継続する。炎症は、足の膨脹を測定し、各足の臨床スコアを記録することにより読み取る。炎症の重症度を示すために、四肢の累積臨床関節炎スコアが提示される。各肢に対し、０−４の尺度（４が最も重度の炎症）を用いたスコア付けシステムを適用する。
０  症状なし
１  軽度、ただし明確な赤み及び１つのタイプの関節（例えば、足首もしくは手首）の膨脹、または明らかな赤み及び個々の指に限定された膨脹（罹患した指の数にかかわらず）
２  中等度の赤み及び２つ以上のタイプの関節の膨脹
３  重度の赤み及び指を含めた足全体の膨脹
４  複数の関節を伴って最大限に炎症化した肢
【０２８８】
３．９  ｉｎ  ｖｉｖｏ半月板切除（ＭＮＸ）ラットモデル
３．９．１  ＭＮＸラットモデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ有効性
メスのＬｅｗｉｓ半月板切除ラット（ＭＮＸ）モデルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を試験した。ＭＮＸラットモデルは、十分に検証された変形性関節炎の疾患モデルである（Ｂｅｎｄｅｌｅ，２００１，Ｊ  Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌ  Ｎｅｕｒｏｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔ，１（４），３７７−８５；Ｊａｎｕｓｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ，１０，７８５−９１；Ｐｒｉｔｚｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ，１４，１３−２９）。
【０２８９】
３．９．２  手術及び投薬
０日目に各ラットの右足に対し、内側側副靭帯の横断による半月板切除によって変形性関節炎を誘発し。４ｍｍの靭帯を除去する。半月板の内部部分を垂直方向に横断して２つのフラップにし、これを滑膜腔の前及び後に向かって押す。シャム動物は麻酔のみを受け、皮膚及び筋肉を切開し、次いで縫合する。１日目に、均質な分配を行うため、ラットを体重に応じてランダムに処置群（群当たりｎ＝２０）に割付ける。Ｃ２から２１日目まで、ラットに経口（ｐｏ）で１日１回（ｑｄ）または１日２回（ｂｉｄ）、メチルセルロース（ＭＣ）０．５％またはＨＰβＣＤ  １０％  ｐＨ３．０で製剤化した化合物を投与する。
【０２９０】
３．９．３  定常状態ＰＫの定量（ｓｓＰＫ）
処置から少なくとも７日後、定常状態血漿曝露を定量するために、投与後の４つの時点：０、１、３、及び６時間（２４時間は、用量前試料に等しいと想定する）で血液を試料採取する。
【０２９１】
３．９．４  組織診断
屠殺時に、各ラットの右脛骨を収集し、組織学的解析用に処理する。４％ホルムアルデヒド中の固定から４８時間後、脛骨をＯｓｔｅｏｓｏｆｔ中で７日間脱灰し、半分に切って２つの部分にしてから向かい合わせてパラフィン包埋する。５つの連続切片を２００μｍ間隔で切り、約１．５ｍｍの骨の中央部を網羅する。１つの連続スライドを、形態学的評価及びＯＡＲＳＩスコア付けのためにサフラニンＯ及び薄緑色で染色する。他の連続スライドは、軟骨細胞密度測定のためにＤＡＰＩと共にマウントする。
【０２９２】
脛骨プラトーにおける変形性関節炎を反映する軟骨傷害の程度を、軟骨びらんのグレード分類及びステージ分類に基づいたＯＡＲＳＩ法を用いて評価及びスコア付けする（Ｐｒｉｔｚｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２００６）。２名の異なる読取り担当者により、盲検的方式でＯＡＲＳＩスコア付けを評定する。各脛骨に対し、１つのスコアが、５つの切片のＯＡＲＳＩスコアの中央値とされる。
【０２９３】
統計的分析のため、群の中央値を、階層化されたクラスカル・ウォリス検定及びその後のダネット多重比較事後検定で比較する。
【０２９４】
有意水準：ＭＮＸビヒクルに対し、ｎｓ：統計的に有意ではない；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。統計的分析を試験の全ての群に行う。
【０２９５】
３．１０  非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の食餌誘導性マウスモデル
このモデルは、ＮＡＳＨを誘発するために、６０ｋｃａｌ％脂肪及び０．１％メチオニンからなるコリン欠乏Ｌ−アミノ酸規定高脂肪食（ＣＤＡＨＦＤ）を使用する。
【０２９６】
３．１０．１  試験群及び用量レジメン：
Ｃ５７／ＢＬ６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）を以下に示すような群に分ける。マウスは誘発フェーズ開始時点で８週齢（＞２０ｇｒ）である。
【表１２】
2020530833.tif 000053
３．１０．２  材料及び化合物
・ＣＤＡＨＦＤ；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ  Ｉｎｃ．，Ｒｅｆ．Ｎｏ．Ａ０６０７１３０２
・対照食餌：ｎｏｒｍａｌ  ｄｉｅｔ（ＶＲＦ  １，Ｐ），Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｄｉｅｔｓ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ
３．１０．３  処置プロトコル：
誘発フェーズ：４週間
【０２９７】
非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を誘発するため、動物にコリン欠乏Ｌ−アミノ酸規定高脂肪食（ＣＤＡＨＦＤ）を与える。
処置フェーズ：６週間
【０２９８】
マウスを処置群にランダムに割付け、評価フェーズまで、上記の表に提示されるスケジュールに従って処置する。
【０２９９】
３．１０．４  試料採取
定常状態ＰＫの試料採取：血液をＫ２−ＥＤＴＡチューブに収集して血漿を生成する。全ての血液試料を、収集から３０分以内に遠心分離（５，０００ｒｐｍ、４℃にて１０分間）により処理して血漿を得る。各血液試料からの血漿を液体窒素で迅速に凍結し、分析を行うまで−８０℃にて冷凍庫で保管する。
【０３００】
最終血液試料：プロテアーゼ阻害剤を含有する血清調製物のために血液をチューブに収集する。全ての血液試料を、遠心分離（３，５００ｒｐｍ、４℃にて１５分間）により処理する。得られた血清試料のアリコートを、さらなる分析を行うまで−８０℃にて凍結保管する。
【０３０１】
組織試料：肝臓を回収し、左側葉の一部をＲＮＡ遺伝子発現分析、ＴＧアッセイ、ＯＨプロリン測定の切片用に保管し、残りは病理組織学的評価用に１０％ホルマリンに入れる。病理組織学的評価は、線維症の程度を評価するためにシリウスレッドで染色した切片と、マクロファージ蓄積を査定するためにＦ４／８０で染色した切片とを含む。
【０３０２】
６つの線維症遺伝子（Ｃｏｌ１Ａ１、Ｔｉｍｐ１、Ｐａｉ１、ＣＴＧＦ、ＴＧＦβ、及びＡｃｔａ２）、炎症遺伝子（ＴＮＦα、ＩＬ１０、及びＣＣＬ２）、ならびに２つのハウスキーピング遺伝子を遺伝子発現分析に使用する。
【０３０３】
３．１０．５  結果
化合物１は、このモデルで試験した場合、少なくとも試験対象の最高用量において、線維症遺伝子パネルにおけるＰａｉ１、ＴＩＭＰ１、ＣＴＧＦ、及びＴＧＦβの発現レベル（図３）に対し、ならびに炎症パネルにおける３つの遺伝子全て（図４）に対し、有意な効果を示した。加えて、化合物１は、１５ｍｇ／ｋｇ／１日１回及び１５ｍｇ／ｋｇ／１日２回におけるヒドロキシプロリンレベルに対する有意な効果（図５）、１５ｍｇ／ｋｇ／１日１回及び１５ｍｇ／ｋｇ／１日２回におけるシリウスレッドの線維症定量化に対する有意な効果（図６）、ならびに１５ｍｇ／ｋｇ／１日２回におけるＦ４／８０定量化に対する有意な効果（図７）を示した。
【０３０４】
４  ＣＹＰ阻害
ヒトシトクロームＰ４５０アイソエンザイム（ＣＹＰ１Ａ２、２Ｃ９、２Ｃ１９、２Ｄ６、及び３Ａ４）に対する試験化合物の阻害潜在可能性を、ｃＤＮＡ発現ヒトシトクロームＰ４５０アイソエンザイム及び経口代謝産物に代謝される非蛍光基質を用いて査定する。
【０３０５】
化合物を３．３及び１０μＭで試験し、最終ＤＭＳＯ濃度を０．３％とする。化合物を１５分間酵素と共にインキュベートしてから、補因子基質ミックスを添加する。ＣＹＰ３Ａ４（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，４５６２０２）、ＣＹＰ２Ｃ９（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，４５６２５８）、ＣＹＰ２Ｃ１９（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，４５６２５９）、及びＣＹＰ１Ａ２（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，４５６２０３）のアッセイのための補因子ミックス中の最終反応濃度は以下の通り：０．４Ｕ／ｍＬグルコース−６−リン酸−デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ，Ｒｏｃｈｅ，１０１６５８７５００１）、３．３ｍＭ  ＭｇＣｌ２（Ｓｉｇｍａ，Ｍ２６７０）、３．３ｍＭ  Ｄ−グルコース−６−リン酸（Ｓｉｇｍａ，Ｇ７８７９）、及び１．３ｍＭ  ＮＡＤＰ＋（Ｓｉｇｍａ，Ｎ０５０５）。ＣＹＰ２Ｄ６（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，４５６２１７）については、本アッセイにおける最終濃度は、０．４Ｕ／ｍｌ  Ｇ６ＰＤＨ、０．４１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．４１ｍＭ  Ｄ−グルコース−６−リン酸、及び８．２μＭ  ＮＡＤＰ＋とする。酵素及び基質の濃度を０で報告する。インキュベート期間後、停止溶液を添加することにより、反応を停止させる。基質としてのＤＢＦを用いた実験については、２Ｎ  ＮａＯＨ停止溶液を使用し、一方他の全ての基質については、停止溶液は８０％  ＭｅＣＮ／２０％  ０．５Ｍトリス塩基とする。
【０３０６】
蛍光の読取りは、直ちに（ＣＥＣ、ＡＭＭＣ、ＢＦＣの場合）または２０分後（ＤＢＦを基質として使用するＣＹＰ２Ｃ９及びＣＹＰ３Ａ４の場合）、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）リーダーで適切な励起及び発光波長にて行う（０参照）。
【０３０７】
次いで、試験化合物によるＣＹＰの阻害パーセンテージを、ブランク試料を基準にデータを正規化することにより計算する：１００％阻害は、酵素／基質ミックスの添加前にブランク試料が停止し、０％阻害は、酵素反応が生じた後に（５０分）ブランク試料が停止するということである。
試験した各ＣＹＰ４５０アイソエンザイムに使用した阻害アッセイ条件
【表１３】
2020530833.tif 000054
ＡＭＭＣ：アミノエチル−７−メトキシ−４−メチルクマリン
ＢＦＣ：７−ベンジルオキシ−４−トリフルオロメチルクマリン
ＣＥＣ：３−シアノ−７−エトキシクマリン
ＤＢＦ：ジベンジルフルオレセイン
【０３０８】
５  時間依存的ＣＹＰ３Ａ４阻害
プールされたＨＬＭにおいて査定される、化合物による時間依存的ＣＹＰ３Ａ４阻害を、Ｇｒｉｍｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  ２００９，３７，１３５５−１３７０及びｄｒａｆｔ  ＦＤＡ  Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ（Ｄｒｕｇ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  −  Ｓｔｕｄｙ  Ｄｅｓｉｇｎ，  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｄｏｓｉｎｇ，ａｎｄ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ），２００６（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｃｄｅｒ／ｇｕｉｄａｎｃｅ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍ）に従ってＩＣ５０定量を介して定量する。テストステロンをプローブ基質として使用し、トロレアンドマイシンを陽性対照として使用する。
【図１】
2020530833.tif 000059
【図２】
2020530833.tif 000060
【図３−０１】
2020530833.tif 000061
【図３−０２】
2020530833.tif 000062
【図３−０３】
2020530833.tif 000063
【図４−０１】
2020530833.tif 000064
【図４−０２】
2020530833.tif 000065
【図５】
2020530833.tif 000066
【図６】
2020530833.tif 000067
【図７】
2020530833.tif 000068
【配列表】
2020530833000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年7月1日(2020.7.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2020530833000001.app
【国際調査報告】
2020530833.tif 000069
2020530833.tif 000070