(57)【要約】  サイトカインまたはその一部とホスファチジルセリンに対して融合タンパク質を標的化するポリペプチドとを含む融合分子、その医薬組成物、ならびに、病変部位に対してサイトカインまたはその一部を標的化すること、およびサイトカイン処置に対して応答性である疾患または症状を処置することにおける、それらの使用方法が提供される。
2020531409.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
融合分子であって、サイトカインまたはその一部と、融合分子をホスファチジルセリン（ＰＳ）に対して標的化するポリペプチドとを含む、前記融合分子。
【請求項２】
ポリペプチドが、Ｔｙｒｏ３、ＡｘｌおよびＭｅｒ（ＴＡＭ）受容体のＰＳ結合リガンドを含む、請求項1に記載の融合分子。
【請求項３】
ポリペプチドが、成長停止特異的遺伝子６（ＧＡＳ６）またはタンパク質Ｓ（Ｐｒｏｓ１）のＰＳ結合型ドメインを含む、請求項１または請求項２に記載の融合分子。
【請求項４】
ポリペプチドが、Ｇａｓ６のＮ末端Ｇｌａドメインを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の融合分子。
【請求項５】
ポリペプチドが、ＰＳとの結合においてＰＳ結合ドメインのオリゴマー化を促進するドメインをさらに含む、請求項４に記載の融合分子。
【請求項６】
表皮増殖因子（ＥＧＦ）様ドメインをさらに含む、請求項４に記載の融合分子。
【請求項７】
サイトカインまたはその一部が、免疫刺激性サイトカインまたはその一部である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の融合分子。
【請求項８】
免疫刺激性サイトカインまたはその一部が、インターフェロンまたはその一部である、請求項７に記載の融合分子。
【請求項９】
インターフェロンが、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−λ１、インターフェロン−λ２、インターフェロン−λ３、またはそれらの組み合わせもしくは一部から選択される、請求項８に記載の融合分子。
【請求項１０】
サイトカインまたはその一部が、免疫抑制性サイトカインまたはその一部である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の融合分子。
【請求項１１】
サイトカインまたはその一部と、ＰＳに対して融合分子を標的化するポリペプチドとの間にリンカーをさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の融合分子。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の融合分子および薬学的に許容し得る担体を含む、医薬組成物。
【請求項１３】
対象の病変部位に対してサイトカインまたはその一部を標的化する方法であって、請求項１２に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項１４】
病変部位が、ＰＳリッチ領域である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
サイトカインまたはその一部が、免疫刺激性サイトカインまたはその一部である、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
病変部位が、癌、感染または炎症を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
対象の病変部位において、内因性ＰＳリガンドおよび受容体によるＰＳ認識から生じる免疫抑制が阻害されている、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
１種以上のサイトカイン特異的な生物学的活性が、病変部位において活性化されている、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
サイトカインまたはその一部の全身作用が最小化されている、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
サイトカイン処置に対して応答性である疾患、障害または症状を処置する方法であって、処置が必要な対象に、請求項１２に記載の医薬組成物を投与することにより対象の疾患または症状を処置することを含む、前記方法。
【請求項２１】
サイトカイン処置に対して応答性である疾患、障害または症状が、癌、感染または炎症性症状もしくは疾患である、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は、２０１７年７月２４日に出願された米国仮出願番号６２／５３６，１０７による優先権の利益を主張し、その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、サイトカインとホスファチジルセリン（ＰＳ）に対して融合タンパク質を標的化するポリペプチドとを含む融合分子、これら融合分子を含む医薬組成物、ならびに、病変部位に対してサイトカインを標的化すること、およびサイトカイン処置に対して応答性である疾患または症状を処置することにおける、これら融合分子の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
ホスファチジルセリン（ＰＳ）は、アポトーシス細胞、アポトーシスブレブ（bleb）、エクソソーム、ストレス腫瘍細胞および腫瘍血管系の表面において表出される（externalized）陰イオン性リン脂質であるが、腫瘍微小環境においては免疫抑制性の分子である（Birge et al. Cell Death and Differentiation 2016 23:962-978)。低酸素および他の代謝性ストレス、アポトーシス細胞の高いアポトーシス指標、ならびに、腫瘍由来エクソソームの放出による、腫瘍微小環境におけるＰＳの上方制御は、実質的に全ての固形癌で観察されている（He et al. Clin. Cancer Res. 2009 15: 6871-6880）。上方制御されたＰＳは、次に、腫瘍細胞上および浸潤性の骨髄由来食細胞上の、過剰発現したＴｙｒｏ３、ＡｘｌおよびＭｅｒ（ＴＡＭ）受容体と相互作用する。ＰＳ／ＰＳ受容体の会合は、集合的にＰＳ依存性エフェロサイトーシスおよび、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−βなどの免疫抑制性サイトカインの産生を引き起こす。（Huynh et al. J. Clin. Invest. 2002 109:41-50; Rothlin et al. Cell 2007 131: 1124-1136）。
【０００４】
腫瘍微小環境に加えて、ＰＳはまた、感染細胞、特にウイルス感染細胞によっても表出される（Soares et al. Nat. Med. 2008 207:763-776; Dowall et al. J. Immunol. Res. 2015 347903）。さらに、様々な種のエンベロープウイルスは、その表面にＰＳを露出させ、それを用いて、免疫応答を抑制してウイルス抗原に対する寛容を促進させるだけでなく、ウイルスが細胞へ入るためのメカニズムとしてＴＡＭ受容体を利用する（Birge et al. Cell Death. Differ. 2016 23:962-978）。成長停止特異的遺伝子６（ＧＡＳ６）およびタンパク質Ｓ（protein S）（Ｐｒｏｓ１）でオプソニン化されたウイルス粒子は、ＴＡＭと相互作用し、エフェロサイトーシスされ、エンドソーム中で脱殻され、細胞質に入ることが示されている。
【０００５】
しかしながら、ＰＳは、腫瘍微小環境においておよびエンベロープウイルスの表面で、構成的に上昇しているが、通常の生理学的条件下では、胸腺および脾臓などの細胞のターンオーバー速度が速い組織においてさえも、除去されていない（un-cleared）アポトーシス細胞はほとんど観察されない。それゆえに、ＰＳは、正常組織においては検出されない（Gerber et al. Clin. Cancer Res. 2011 17:6888-6896）。
【０００６】
したがって、ＰＳ標的化（PS-targeting）は、ストレス応答の一環としてＰＳが上方制御されている病変を有する部位への、治療剤の局所的送達のための可能な手段として開示されてきた。
【０００７】
米国特許第６，２１１，１４２号は、内因性源（endogenous source）由来のｇａｓ６よりもγカルボキシル化が少ない、機能的に活性なｇａｓ６変異体を含む組成物、ならびに、これを含む製品であって、Ｒｓｅ受容体タンパク質チロシンキナーゼの活性化、および、神経細胞およびグリア細胞などのＲｓｅ受容体を含む細胞の増殖、生存および／または分化の促進のための前記製品を開示している。
【０００８】
カナダ特許発明第２９０９６６９号明細書は、例えば、ＡＸＬ、ＭＥＲまたはＴｙｒｏ３とそのリガンドＧＡＳ６との結合の相互作用（binding interaction）の阻害により、ＡＸＬ、ＭＥＲまたはＴｙｒｏ３タンパク質活性を阻害する医薬組成物の治療用量を投与することにより、哺乳類動物におけるウイルス感染を処置するための組成物および方法を開示している。また、１種以上のＡＸＬ、ＭＥＲおよび／またはＴｙｒｏ３活性の阻害剤、ＧＡＳ６活性の阻害剤、あるいはＡＸＬ、ＭＥＲまたはＴｙｒｏ３−ＧＡＳ６相互作用の阻害剤を投与することにより、哺乳類動物患者におけるホスファチジルセリンを宿す（phosphatidylserine harboring）ウイルス感染を処置、減少または抑制する方法も開示されている。
【０００９】
日本国特許第５４７８２８５号は、ホスファチジルセリンに結合する複合体を用いた、腫瘍血管系の標的化を開示している。開示されている標的化剤には、腫瘍の血管内皮細胞を死滅させることで、腫瘍血管系における凝固を引き起こす、あるいは、腫瘍の血管系を破壊することにより腫瘍壊死および／または腫瘍退縮を引き起こす、抗ホスファチジルセリン抗体もしくはその抗原結合断片、アネキシン、またはホスファチジルセリン結合断片が含まれる。
【００１０】
日本国特許第４７４３６７２号はまた、腫瘍の血管内皮細胞を死滅させる、腫瘍血管系における凝固を引き起こす、あるいは、腫瘍の脈管構造を破壊することにより腫瘍壊死およびまたは腫瘍退縮を引き起こす、癌の処置として、抗ホスファチジルセリン抗体を開示している。
【００１１】
米国特許第６，３１２，６９４号は、腫瘍介入における使用のための、アミノリン脂質が標的とされた、診断および治療抗体−治療剤構造物を開示している。
【００１２】
Kimani et al.（Scientific Reports 2017 7:43908）は、ＡｘｌのＩｇ−１外部ドメインとＧａｓ６のＬｇ−１との境界面におけるＡｘｌの細胞外ドメインを標的とする低分子阻害剤を開示しており、これは、マウス異種移植ＮＯＤ−ＳＣＩＤγモデルにおいて、効果的に、Ｇａｓ６誘導性Ａｘｌ受容体活性化を遮断し、およびＨ１２９９肺癌腫瘍増殖を抑制する。
【００１３】
前臨床試験もまた、ＰＳに高親和性で結合するＰＳ標的化抗体を、直接的に、あるいは血清タンパク質であるβ２−糖タンパク質１と複合させて、集団において行われてきた（DeRose et al. Immunotherapy 2011 3:933-944: Huang et al. Cancer Res. 2005 65:4408-4416）。これらの抗体は、腫瘍微小環境における内皮細胞を標的とすること（Ran et al. Cancer Res. 2002 62:6132-6140）、抗腫瘍活性を示すこと（de Freitas Balanco et al. Curr. Biol. 2001 11:1870-1873）、および、複数の前臨床腫瘍モデルにおいて標準的治療の活性を増強させること（Beck et al. Int. J. Cancer 2005 118:2639-2643; He et al. Clin. Cancer Res. 2009 15:6871-6880）、が示された。
【００１４】
加えて、ＰＳ標的化抗体であるバビツキシマブは、複数の臨床試験において評価されてきた（Chalassani et al. Cancer Med. 2015 4:1051-1059; Digumarti et al. Lung Cancer 2014 86:231-236; and Gerber et al. Clin. Cancer Res. 2011 17:6888-6896）。しかしながら、ＰＳ標的化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）という保証を取り巻く高揚にもかかわらず、最新のPeregrine Pharmaceuticalsの第三相ＳＵＮＲＩＳＥ臨床試験は、ひどく落胆する結果をもたらし、２０１６年には新たな患者の募集をとりやめるという結果となった。さらなる研究では、固形腫瘍の処置に、抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わせてこの抗体の治療的有効性を評価し始めている（ワールドワイドウェブのglobenewswireに .com/news-release/2017/06/05/1008110/0/en/Peregrine-Pharmaceuticals-Presents-Preliminary-Correlative-Analysis-of-PD-L1-Expression-from-SUNRISE-Trial-at-ASCO-2017.htmlを付す、２０１７年６月５日）。
第二世代または次世代の免疫生物学的製剤として、より有効なＰＳ標的化誘導体を開発する必要がある。
【発明の概要】
【００１５】
概要
本発明の側面は、サイトカインと、融合分子をホスファチジルセリン（ＰＳ）に対して標的化するポリペプチドとを含む、融合分子に関する。
一つの非限定的な態様において、融合分子のポリペプチドは、本明細書においてＴＡＭリガンドとも称される、Ｔｙｒｏ３、ＡｘｌおよびＭｅｒ受容体のＰＳ結合リガンドを含む。
【００１６】
一つの非限定的な態様において、融合分子のポリペプチドは、成長停止特異的遺伝子６（growth arrest-specific gene 6）（ＧＡＳ６）またはタンパク質Ｓ（protein S）（Ｐｒｏｓ１）のＰＳ結合型ドメインを含む。
一つの非限定的な態様において、融合分子のサイトカインは、免疫刺激性サイトカインである。
別の非限定的な態様において、融合分子のサイトカインは、免疫抑制性サイトカインである。
【００１７】
本発明の別の側面は、本発明の融合分子を含む医薬組成物に関する。
本発明の別の側面は、本発明の融合分子または本発明の融合分子を含む医薬組成物を投与することにより、対象の病変部位に対してサイトカインを標的化する方法に関する。
【００１８】
本発明の別の側面は、本発明の融合分子または本発明の融合分子を含む医薬組成物を投与することにより、対象の病変部位において、内因性ＰＳリガンドおよび受容体によるＰＳ認識から生じる免疫抑制を阻害する方法に関する。
【００１９】
本発明の別の側面は、本発明の融合分子または本発明の融合分子を含む医薬組成物を投与することにより、１種以上のサイトカイン特異的な生物学的活性を、病変部位において活性化する方法に関する。
本発明の別の側面は、サイトカインを、本発明の融合分子または本発明の融合分子を含む医薬組成物を介して投与することにより、サイトカインの全身作用を最小化する方法に関する。
【００２０】
本発明のさらなる別の側面は、本発明の融合分子または本発明の融合分子を含む医薬組成物を投与することにより、サイトカイン処置に対して応答性である疾患、障害または症状を処置する方法に関する。
一つの非限定的な態様において、本発明により処置される疾患、障害または症状は、癌、感染または炎症性の症状もしくは障害である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、本発明の融合分子の種々の非限定的な態様の略図を提供する。特に、組み換えＩＦＮ融合分子ならびにＰＳ結合ＧｌａドメインおよびＧａｓ６のＥＧＦリピートを含有する組み換えＧａｓ６−ＩＦＮ融合分子の概略図が提供される。Ｇａｓ６−ＩＦＮ融合分子は、免疫抑制性シグナルを、宿主の抗腫瘍免疫を活性化させる免疫原性シグナルに方向転換させるように設計されている。リンカー配列および改変物は、本願中に定義されている。
【００２２】
【図２】図２は、ＩＩＩ型ＩＦＮ（ＩＦＮ−λ）およびＩ型ＩＦＮ（ＩＦＮ−α／β）受容体システムのモデルを描いている。ＩＦＮ−λおよびＩ型ＩＦＮは、異なるヘテロ二量体受容体複合体（receptor complex）を用いる。ＩＦＮ−λは、固有のＩＦＮ−λＲ１およびＩＬ−１０Ｒ２に会合する（engage）のに対し、ＩＦＮ−αＲ１およびＩＦＮ−αＲ２は、活性Ｉ型ＩＦＮ受容体複合体を形成する。ＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−λ受容体の会合は、受容体関連ＪＡＫキナーゼであるＪＡＫ１およびＴｙｋ２のリン酸化をもたらし、これに、ＤＮＡ結合タンパク質ＩＲＦ９と相互作用するＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ２のリン酸化が続き、ＩＦＮ刺激遺伝子因子３（ＩＳＧＦ３）と呼ばれる転写複合体の形成をもたらし、これは、ＩＦＮ刺激応答配列（IFN-stimulated response element）（ＩＳＲＥ）に結合してＩＦＮ刺激遺伝子（ＩＳＧ）の転写を制御する。
【００２３】
【図３】図３は、ＰＳ濃縮（PS-enriched）腫瘍微小環境またはウイルス感染部位における、本発明のＧａｓ６−ＩＦＮ−βおよび／またはＩＦＮ−λ２融合分子について、提唱する免疫原性機能の略図を提供する。（そのＧｌａドメインおよびＥＧＦ様ドメインを介して）Ｇａｓ６は、ＰＳセンサーとして作用し、組織微小環境において表出されるＰＳの程度に対して応答すると提唱されている。Ｇａｓ６は、表出されるＰＳの濃度に応答し、ＰＳ依存的に組織へサイトカインを局在化させるであろう。より低い、表出されるＰＳ濃度では、ＩＦＮ活性は、低い（自然の（native）サイトカイン活性）と予測されるが、（腫瘍微小環境における、もしくはウイルス感染細胞／組織における）より高い濃度では、ＩＦＮ活性は増幅されると予測され、サイトカイン活性を増大させて、向上した抗腫瘍免疫および抗ウイルス応答を引き起こすであろう。図中の説明は、潜在的な標的細胞種、ならびに予測される表現型の結果を明らかにしている。例えば、腫瘍細胞においては、Ｇａｓ６−ＩＦＮの標的化は、ＭＨＣクラスＩ抗原および共刺激分子（co-stimulatory molecule）の発現増加をもたらし、これは腫瘍抗原の発現／提示増加、血管新生抑制ケモカインの産生増加、免疫細胞の浸潤増加をもたらすと予測される。抗原提示細胞においては、Ｇａｓ６−ＩＦＮ融合分子は、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ抗原の発現を増加させるのみならず、樹状細胞の成熟を増大させ、腫瘍抗原の交差提示を増加させると予測される。
【００２４】
【図４】図４は、「第二世代」ＰＳ標的化生物学的製剤の原理を描いている。今までに、表出されるＰＳに結合して本質的にこれをマスクするＰＳ標的化ｍＡｂが開発されている。本明細書において開発されたＧａｓ６−ＩＦＮ融合分子は、ＩＦＮをＰＳリッチ（PS-rich）ＴＭＥに標的化することにより、免疫寛容原性シグナルを免疫原性シグナルに変換するように設計されている。さらに、Ｇａｓ６を標的とするＩＦＮは、ＰＤＬ１を誘導するため、抗ＰＤ１／抗ＰＤＬ１を用いた組み合わせ治療剤としての使用に極めてよく採用される。Ｇａｓ６−ＩＦＮ生物学的製剤の特性は、説明に示されている。
【００２５】
【図５】図５（Ａ）および（Ｂ）は、Ｈｉｓタグが付されたＧａｓ−ＩＦＮタンパク質の作製、発現、および検出を示す。Ｇａｓ６−ＩＦＮ融合分子をクローニングし、（より大きな規模の産生のために）ＨＥＫ２９３、Ｅ０７７１、およびＥｘｐｉ２９３細胞で発現させた。トランスフェクションの４８時間後に回収されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞上清における、細胞上清への組み換え融合分子の分泌を、抗Ｈｉｓ ｍＡｂを用いたイムノブロットにより分析し、予想分子量におけるＨｉｓタグタンパク質の存在を示す（上のパネル；（Ａ））。抗Ｇｌａ ｍＡｂによるイムノブロット（下のパネル；（Ｂ））は、γ−カルボキシル化特異的抗体によりプローブされており、γ−カルボキシル化を示す。述べるように、抗Ｇｌａ特異的ｍＡｂを用いたところ、ビタミンＫの存在下で細胞を増殖させた場合、全てのＧａｓ６融合分子（最後の４レーン）は、γ−カルボキシル化されている（ＰＳ結合の必要条件）。これらの結果は、タンパク質が、本願における特許請求の範囲の必要条件である、ＰＳ結合タンパク質として活性であること示している。
【００２６】
【図６】図６は、組み換えＩＦＮ−λ２、あるいはＧａｓ６（Ｇｌａ＋ＥＧＦ）−ＩＦＮ−λ２融合分子をアポトーシス細胞ありもしくはなしで含有するＨＥＫ２９３Ｔ細胞上清で３０分間処置した、ＩＦＮ−λＲ−γＲ１レポーター細胞株の溶解物のイムノブロットによって、Ｓｔａｔ１活性化（Ｓｔａｔ１のＴｙｒリン酸化、ｐＳｔａｔ１）の程度を検出することにより測定された、本発明のＧａｓ６−ＩＦＮ−λ２融合分子の活性を示す。ｐＳｔａｔ１のイムノブロットは、特に高濃度のＰＳで、融合分子によるＩＦＮ−λ受容体の活性化の、ＰＳ結合依存的な増大を示した（１：１０００−レポーター細胞／アポトーシス細胞（ＡＣ）；レーン７および１０の比較）。
【００２７】
【図７】図７は、タンパク質の精製および検出用にペプチドを標識するリン酸化タグ（phosphotag）およびＣＬＩＰタグを含有するＧａｓ６（Ｇｌａ＋ＥＧＦ）−ＩＦＮ−β−ＩＦＮ−λ２融合分子の概略図を提供する。Ｈｉｓタグタンパク質に加えて、（３２Ｐラベル用の）リン酸化タグおよび（蛍光標識タンパク質用の）ＣＬＩＰタグを、Ｉ型およびＩＩＩ型ＩＦＮを含有する融合分子に工学的に付加した。これら後者のタグは、in vivo標識、有用性、および局在化のために導入した。図の左側は、ＰＳへのＧｌａ結合領域、ＥＧＦリピート、ならびに、ＴＡＭ受容体に結合するがサイトカイン（単数または複数）により置換されているＬＧドメインを含む、Ｇａｓ６のドメイン構造を繰り返し記載している。
【００２８】
【図８】図８は、ワーファリン存在下で調製されたＩＦＮ−β−ＩＦＮ−λ２タンパク質またはＧａｓ６−ＩＦＮ−β−ＩＦＮ−λ２タンパク質とは対照的に、Ｇａｓ６−ＩＦＮ−β−ＩＦＮ−λ２タンパク質は、ＰＳ陽性アポトーシス細胞に結合してこれにより沈降することを示す。Ｇａｓ６−ＩＦＮ−β−ＩＦＮ−λ２タンパク質は、γカルボキシル化に必要なビタミンＫ（vit K）の存在下、およびγカルボキシル化を阻害するワーファリン（War）の存在下において、ＨＥＫ２９３細胞中で産生され、次いで、タンパク質はアポトーシス細胞（ＡＣ）と共にインキュベートされて、続いて、遠心（cent）によりアポトーシス細胞を沈降させた。アポトーシス細胞と共沈されたＩＦＮ活性の存在は、図６に記載された実験と同様のＩＦＮ−λＲ−γＲ１レポーター細胞株の溶解物のイムノブロットによって、Ｓｔａｔ１活性化（ｐＳｔａｔ１）の程度を検出することにより測定した。レーン４、７、および１０を比較すると、ＰＳ陽性アポトーシス細胞とともに共沈した場合には、ビタミンＫと調製された、γカルボキシル化Ｇａｓ６−ＩＦＮ−β−ＩＦＮ−λ２融合分子のみが活性である。
【００２９】
【図９】図９は、ＨｉｓタグＩＦＮ−β−ＩＦＮ−λ２およびＨｉｓタグＧａｓ６−ＩＦＮ−β−ＩＦＮ−λ２の部分精製および検出を示す。左側のパネルは、抗Ｈｉｓ ｍＡｂによるイムノブロッティングを示し、右側のパネルは、クマシーブルー染色およびタンパク質純度のレベルを示す。
【００３０】
【図１０】図１０は、本発明のＧａｓ６−ＩＦＮ−β−ＩＦＮ−λ２融合分子の抗ウイルス活性を示す。ＩＦＮ−β−ＩＦＮ−λ２またはＧａｓ６−ＩＦＮ−β−ＩＦＮ−λ２融合分子を含有するＨＥＫ２９３Ｔ細胞上清で、マウス腸上皮細胞（ｍＩＥＣ）を前処置した。前処置の２４時間後、細胞を水疱性口炎ウイルス（ＶＳＶ）で２４時間処置し、融合分子の抗ウイルス活性を分析した。細胞の生存能は、ＭＴＴアッセイを用いて測定した。
【００３１】
【図１１】図１１は、ＩＦＮ−β−ＩＦＮ−λ２またはＧａｓ６−ＩＦＮ−β−ＩＦＮ−λ２融合分子の相対的抗ウイルス効力を示す。図１０に示される抗ウイルスアッセイの結果を、ＨＥＫ２９３上清中におけるＩＦＮ−β−ＩＦＮ−λ２およびＧａｓ６−ＩＦＮ−β−ＩＦＮ−λ２タンパク質の量当たりに標準化して、それらの相対的抗ウイルス効力（活性／ｍｇ）を決定した。イムノブロットとクマシー染色の両方（図９）は、図１０に示される抗ウイルスアッセイ用の試料を作製するのに用いられたＨＥＫ２９３細胞の上清において、Ｇａｓ６−ＩＦＮ融合分子の量は、ＩＦＮ融合分子の量（５倍）よりも少ないことを示す。これらのアッセイにおいて、融合分子を含有する上清は、同じ希釈係数から始めて用いたため、より低い濃度のＧａｓ６−ＩＦＮ−β−ＩＦＮ−λ２融合分子で標準化した場合には、このアッセイでは、Ｇａｓ６−ＩＦＮ−β−ＩＦＮ−λ２融合分子は、ＩＦＮ−β−ＩＦＮ−λ２融合分子よりも、より活性である（５倍）。
【００３２】
【図１２】図１２は、Ｇａｓ６−ＩＦＮ−β−ＩＦＮ−λ２タンパク質が、マウス腸上皮細胞においてＭＨＣクラスＩ抗原の発現を誘導する能力を保持しており、その免疫原性活性を裏付けていることを示す。ＩＦＮ−β−ＩＦＮ−λ２またはＧａｓ６−ＩＦＮ−β−ＩＦＮ−λ２融合分子を含有する細胞培養上清でマウス腸上皮細胞を７２時間処置し、ＭＨＣクラスＩタンパク質の発現を、ＭＨＣ特異的抗体を用いたフローサイトメトリーにより分析した。
【００３３】
【図１３】図１３は、Ｇａｓ６−ＩＦＮ−β−ＩＦＮ−λ２タンパク質が、マウス腸上皮細胞においてＰＤ−Ｌ１の発現を誘導する能力を保持していることを示す。ＩＦＮ−β−ＩＦＮ−λ２またはＧａｓ６−ＩＦＮ−β−ＩＦＮ−λ２融合分子を含有する細胞培養上清でマウス腸上皮細胞を７２時間処置し、ＭＨＣクラスＩタンパク質の発現をＰＤ−Ｌ１特異的抗体を用いたフローサイトメトリーにより分析した。
【００３４】
【図１４】図１４は、Ｇａｓ６−ＩＦＮ−β−ＩＦＮ−λ２融合分子が単一の実体分子として、別々の実体として共発現させた場合よりも、優れた抗腫瘍活性を有することを示す。マウス乳癌細胞株であるＥＯ７７１細胞に、空ベクター、またはＧａｓ６−ＩＦＮ−β、Ｇａｓ６−ＩＦＮ−λ２もしくはＧａｓ６−ＩＦＮ−β−ＩＦＮ−λ２融合分子のいずれかをコードする発現ベクターを安定的にトランスフェクションし、同系Ｃ５７ＢＬ／６マウスの乳房脂肪体に移植した。Ｇａｓ６−ＩＦＮ−βを構成的に分泌するＥ０７７１細胞０．５ｘ１０５個とＧａｓ６−ＩＦＮ−λ２を構成的に分泌するＥ０７７１細胞０．５ｘ１０５個との各タンパク質の５０：５０の混合物に対して、モック（mock）（空ベクター）のＥＯ７７１細胞１０５個またはＧａｓ６−ＩＦＮ−β−ＩＦＮ−λ２融合分子を構成的に分泌するＥ０７７１細胞１０５個の注射後の、腫瘍増殖（腫瘍体積）測定の結果を示す。ＴＦは、腫瘍のないマウス（腫瘍フリー（tumor-free）マウス）を示す。
【００３５】
【図１５】図１５は、図１４において概要を述べた実験についての、２９日目における各動物の腫瘍体積を示す。
【００３６】
【図１６】図１６は、ＩＦＮ−β−ＩＦＮ−λ２およびＧａｓ６−ＩＦＮ−β−ＩＦＮ−λ２融合分子の同様の抗腫瘍活性を示す。図１４において概要を述べた実験と同様に、モック（空ベクター）のＥＯ７７１細胞１０５個またはＩＦＮ−β−ＩＦＮ−λ２もしくはＧａｓ６−ＩＦＮ−β−ＩＦＮ−λ２融合分子を構成的に分泌するＥ０７７１細胞１０５個の注射後の、腫瘍増殖（腫瘍体積）測定の結果を示す。ＴＦは、腫瘍のないマウス（腫瘍フリーマウス）を示す。
【００３７】
【図１７】図１７は、図１６において概要を述べた実験についての、２９日目における各動物の腫瘍体積を示す。
【００３８】
【図１８】図１８は、本発明のＰＳ標的化融合分子の利点をまとめている。
【００３９】
【図１９Ａ】図１９Ａ〜１９Ｃは、本発明のＧａｓ６−ＩＦＮ−λ２融合分子のＩＦＮ−λ２レポーター活性を示す。図１９Ａは、トランスフェクションの４８時間後に回収されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞上清中に分泌されたＧａｓ６（Ｇｌａ）−ＩＦＮ−λ２およびＧａｓ６（Ｇｌａ＋ＥＧＦ）−ＩＦＮ−λ２融合分子の、予想分子量３７および７０ｋｄにおける、γカルボキシル化特異的抗体によりプローブされたγカルボキシル化を示すイムノブロットである。
【図１９ＢＣ】図１９Ｂおよび１９Ｃは、ＩＦＮ−λＲ−γＲ１レポーター細胞株を、組み換えＩＦＮ−λ２または、アポトーシス細胞ありもしくはなしでＧａｓ６（Ｇｌａ）−ＩＦＮ−λ２（図１９Ｂ）およびＧａｓ６（Ｇｌａ＋ＥＧＦ）−ＩＦＮ−λ２（図１９Ｃ）融合分子を含有するＨＥＫ２９３Ｔ細胞上清で、３０分間、処置した結果を示す。ｐＳｔａｔ１イムノブロットは、融合分子によるＩＦＮ−λ受容体細胞株の活性化の、ホスファチジルセリン結合依存的な増大を示す。
【００４０】
【図２０ＡＢ】図２０Ａ〜２０Ｃは、本発明のＧａｓ６−ＩＦＮ−λ２融合分子のＩＦＮ−λ２機能的活性を示す。図２０Ａにおいては、ヒト網膜色素上皮細胞ＡＲＰＥ１９を、組み換えＩＦＮ−λ２、またはＧａｓ６（Ｇｌａ）−ＩＦＮ−λ２およびＧａｓ６（Ｇｌａ＋ＥＧＦ）−ＩＦＮ−λ２融合分子を含有するＨＥＫ２９３Ｔ細胞上清で、前処置した。前処置の１２時間後、細胞を水疱性口炎ウイルス（ＶＳＶ）で２４時間処置し、融合分子の抗ウイルス活性を分析した。細胞の生存能は、ＭＴＴアッセイを用いて測定した。
【図２０Ｃ】図２０Ａは、融合分子の抗ウイルス活性が組み換えＩＦＮ−λ２と等価であることを示す。図２０Ｂおよび２０Ｃは、組み換えＩＦＮ−λ２または本発明の融合分子により７２時間処置した後のＡＲＰＥ１９細胞のフローサイトメトリーにより決定した、免疫原性タンパク質であるカルレティキュリン（図２０Ｂ）およびＭＨＣクラスＩタンパク質（図２０Ｃ）の発現を示す。
【００４１】
【図２１ＡＢ】図２１Ａおよび２１Ｂは、本発明のＧａｓ６−ＩＦＮ−λ２融合分子の抗腫瘍活性を示す。図２１Ａは、ビタミンＫ（Vit. K）またはγカルボキシル化阻害剤であるワーファリン（Warf）による処置後に、融合分子を安定発現するマウス乳癌細胞株であるＥＯ７７１から分泌されたＧａｓ６（Ｇｌａ）−ＩＦＮ−λ２およびＧａｓ６（Ｇｌａ＋ＥＧＦ）−ＩＦＮ−λ２融合分子の、γカルボキシル化を示すイムノブロットである。図２１Ｂは、０．１ｘ１０６個のＥＯ７７１モックトランスフェクションされた（空ベクター）細胞またはＧａｓ６（Ｇｌａ＋ＥＧＦ）−ＩＦＮ−λ２融合分子分泌細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスの乳房脂肪体に注射した後の、腫瘍体積測定の結果を示す。
【００４２】
詳細な説明
免疫システムは、腫瘍細胞などの病原性細胞、ウイルスおよび炎症性疾患に関与する炎症細胞を除去する潜在的能力を有する一方で、有効な免疫療法にとっての主要な障壁は、臨床的に有意義な応答を誘発する能力である。そのために、宿主は、有効な免疫応答の進展を限定する、内在性の抑制性メカニズムを克服できなければならない。
【００４３】
サイトカインは、様々な免疫機能の強力な制御因子であり、癌、感染ならびに免疫および炎症性疾患を含む広範囲の病変症状を処置するために用いられ得る。多くのサイトカインの全身投与に付随する望ましくない副作用により、サイトカインの局所作用を達成するために病変を有する部位へサイトカインを標的化することは、極めて好ましい。
【００４４】
ホスファチジルセリン（ＰＳ）の表出は、癌細胞自体の特徴であり、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）において制御不全となったＰＳ表出は、広範囲のヒトの癌で観察されており、全ての固形癌の特徴となっている。ＴＭＥにおける制御不全ＰＳは、アポトーシス腫瘍細胞、低酸素および栄養欠乏に起因するストレス腫瘍細胞および様々な腫瘍浸潤細胞、ならびに腫瘍部位におけるストレス血管内皮細胞を含む、様々な細胞種において生じ得る。
【００４５】
さらに、低酸素によるストレス、ならびに感染および／または炎症性症状による栄養欠乏が進行中の細胞もまた、ＰＳを表出する。さらに、エンベロープウイルスは、その表面にＰＳを露出する。
【００４６】
したがって、サイトカインをＰＳリッチ領域に標的化することは、腫瘍部位、ウイルス感染部位、および炎症部位にサイトカインを送達する手段としての役割を果たす一方で、その全身作用を最小化する。
【００４７】
細胞表面上のＰＳ濃度は、細胞のストレスレベルを反映しているとみられ；ＰＳ濃度の変化は、ＰＳ結合ＴＡＭリガンドであるＧａｓ６およびＰｒｏｓ１により活性化される、ＴＡＭ（Ｔｙｒｏ３、ＡｘｌおよびＭｅｒ）として集合的に知られている受容体群により感知される。これらのリガンドは、そのＮ末端Ｇｌａドメインを介してＰＳと相互作用する、架橋分子としての役割を果たし、そのＣ末端ＬＧドメインを介してＴＡＭに結合し、これを活性化する。ＴＡＭの活性化は、厳密にＰＳ依存的であり、ＰＳ濃度は、ＴＡＭ活性化強度のレオスタット（rheostat）として作用する。
【００４８】
本発明は、工学的に作製した二機能性（bifunctional）ＰＳ標的化サイトカイン融合免疫生物学的製剤、ならびに、サイトカインを腫瘍部位、ウイルス感染部位、および炎症部位に対して標的化することにおけるこれらの使用方法を提供する。ＰＳに結合して受動的に腫瘍および骨髄細胞の同種受容体とのＰＳ相互作用を遮断する、ＰＳ標的化ｍＡｂとは異なり、本発明の融合分子は、ＰＳリッチである微小環境において、免疫刺激性サイトカインシグナル伝達の強度を、ＰＳ濃度に合わせることができるように設計されている。したがって、ＰＳの存在下では、これらＰＳ標的化サイトカイン融合分子は、より強くかつ持続するサイトカイン受容体活性化を誘導し、未修飾サイトカインとの比較において、ＰＳ標的化サイトカイン融合分子の増大した生物学的活性をもたらす。
【００４９】
さらに、ＰＳまたはＰＳ相互作用リガンドへの直接的結合により引き起こされ得る、ＰＳ受容体の活性化は、例えば腫瘍進行の間に、通常、確立され維持される免疫抑制状態をもたらす。
【００５０】
本発明のＰＳ標的化サイトカイン融合分子は、サイトカイン特異的活性を介して免疫活性化を提供することにより、ならびに、内因性ＰＳリガンドおよび受容体とのＰＳ結合に競合することにより、その能力を遮断して免疫抑制状態を誘導して、免疫抑制状態に戻して方向転換させると予想される。
【００５１】
したがって、本発明の二機能性ＰＳ標的化サイトカイン融合分子は、ストレス細胞におけるＰＳに結合し、表出ＰＳ密度が高い領域へ免疫刺激性サイトカインシグナル伝達を局在化させると予想される。そうすることで、本発明の融合分子は、免疫抑制性ＰＳ受容体の持続的な会合によって生成される寛容原性シグナルを、ＰＳ−＞サイトカイン受容体軸に由来する免疫原性シグナルに方向転換させると予想される。
【００５２】
それゆえに、本発明により、サイトカインまたはその一部と、融合タンパク質をＰＳに対して標的化するポリペプチドとを含む、融合分子が提供される。開発された本発明の融合分子は、これらが、ＰＳ標的化され局在化されたサイトカイン送達を提供すること；これらが、内因性ＰＳリガンドおよび受容体によるＰＳ認識を遮断すること；ならびに、サイトカイン特異的生物学的活性を活性化させることにより、ＰＳ誘導性の免疫抑制からＰＳレベルに合った免疫活性化へ、免疫活性化バランスを能動的に変化させること、という３つの固有の特徴を備えている。したがって、本発明により、これら融合分子を含む医薬組成物、ならびに、対象の病変部位にサイトカインを標的化すること、対象の病変部位における内因性ＰＳリガンドによるＰＳ認識から生じる免疫抑制を阻害すること、病変部位における１種以上のサイトカイン特異的生物学的活性を活性化させること、サイトカインの全身作用を最小化すること、および／または、サイトカイン処置に対して応答性の疾患、障害もしくは症状を処置すること、における融合分子および医薬組成物の使用方法もまた提供される。一つの非限定的態様においては、本発明により標的化されるおよび／または処置される疾患、障害もしくは症状は、癌、感染または炎症性症状もしくは障害である。
【００５３】
本発明の目的において、用語「融合タンパク質」および「融合分子」は、交換可能に用いられ、異なる源（source）に由来する部分から作られた、ポリペプチド、タンパク質および／または分子を包含することを意味する。かかる融合分子は、別々のタンパク質またはその一部を元々コードしていた２種以上の遺伝子またはその断片を連結させることにより作製される。これら融合遺伝子またはその一部の翻訳は、元々の各タンパク質に由来する機能的特性を有する、単一または複数のポリペプチドをもたらす。一つの非限定的態様においては、融合分子またはタンパク質は、生物学的研究または治療における使用のために、組み換えＤＮＡ技術により人工的に作製される。
【００５４】
本発明の目的においては、「その一部」により、全長サイトカインタンパク質よりも長さがより短い断片であって、全長タンパク質に対して機能活性の少なくとも一部を維持しているおよび／または受容体サブユニットの少なくとも１つに対する結合を維持しているものが意味される。
【００５５】
当業者に既知の様々な免疫刺激性もしくは免疫抑制性サイトカインまたはその一部は、本発明の融合分子に含まれ得る。一つの非限定的態様において、選択されるサイトカインは、病原性ＰＳリッチ部位において所望の活性を有する。一つの非限定的態様において、サイトカインは、インターフェロン（ＩＦＮ）またはその一部である。ＩＦＮは、多能性サイトカインであり、多面的な抗ウイルス応答および抗腫瘍応答の確立において重要な役割を果たす。本発明の融合分子に含まれ得るサイトカインの例には、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）、インターフェロン−λ１（ＩＦＮ−λ１）、インターフェロン−λ２（ＩＦＮ−λ２）、インターフェロン−λ３（ＩＦＮ−λ３）、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン２２（ＩＬ−２２）、インターロイキン３３（ＩＬ−３３）、アンフィレギュリン（amphiregulin）（ＡＲＥＧ）、その組み合わせ、またはその一部が含まれるが、全くこれらに限定されない。ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−λ１、ＩＦＮ−λ−２およびＩＦＮ−λ３などのいくつかのサイトカインは、融合分子のフォールディング（folding）および精製を改善するために置換可能な不対（unpaired）Ｃｙｓ残基を有する。その対応する受容体に対してより低い親和性を有するサイトカイン変異体はまた、その受容体複合体を介してシグナル伝達能力を減少させるために、融合ＰＳ標的化サイトカインタンパク質の作製に用いることができ、融合ＰＳ標的化サイトカインにより活性化された場合には、サイトカイン受容体複合体のＰＳを介したオリゴマー化を介するＰＳ存在下でのそれらの活性化増大を可能にする。
【００５６】
本発明の融合分子は、ＰＳに対して融合分子を標的化するポリペプチドをさらに含む。これら融合分子には、ＰＳに対して融合分子を標的化する様々なポリペプチドが含まれ得る。本発明の融合分子に含まれ得るＰＳ標的化ポリペプチドの例には、脳血管新生阻害剤１（ＢＡＩ１）、アネキシン、特にアネキシンＡ５およびＢ１２、Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチン受容体１、３および４（ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−３およびＴＩＭ−４）、スタビリン１および２、ならびに乳脂肪球−ＥＧＦ因子８タンパク質（ＭＦＧＥ８）が含まれるが、全くこれらに限定されない。一つの非限定的態様において、融合分子は、Ｔｙｒｏ３、Ａｘｌおよび／またはＭｅｒ（ＴＡＭ）受容体のＰＳ結合リガンドを含むポリペプチドを含む。一つの非限定的態様において、融合分子は、成長停止特異的遺伝子６（ＧＡＳ６）またはタンパク質Ｓ（Ｐｒｏｓ１）のＰＳ結合型ドメインを含むポリペプチドを含む。一つの非限定的態様において、融合分子は、Ｇａｓ６またはＰｒｏｓ１のＮ末端Ｇｌａドメインを含むポリペプチドを含む。本発明の融合分子に有用なポリペプチドの非限定的な例には：
【００５７】
シグナルペプチドおよびｐｒｏ−ドメインを有するマウスＧａｓ６のＧｌａドメイン：
MPPPPGPAAALGTALLLLLLASESSHTVLLRAREAAQFLRPRQRRAYQVFEEAKQGHLERECVEEVCSKEEAREVFENDPETEYFYPRYQE（配列番号１）；
【００５８】
ｐｒｏ−ドメインを有しシグナルペプチドを有さないマウスＧａｓ６のＧｌａドメイン：
TVLLRAREAAQFLRPRQRRAYQVFEEAKQGHLERECVEEVCSKEEAREVFENDPETEYFYPRYQE（配列番号２）；
【００５９】
シグナルペプチドおよびｐｒｏ−ドメインを有さないマウスＧａｓ６のＧｌａドメイン：
AYQVFEEAKQGHLERECVEEVCSKEEAREVFENDPETEYFYPRYQE（配列番号３）；
【００６０】
シグナルペプチドおよびｐｒｏ−ドメインを有するヒトＧａｓ６のＧｌａドメイン：
MAPSLSPGPAALRRAPQLLLLLLAAECALAALLPAREATQFLRPRQRRAFQVFEEAKQGHLERECVEELCSREEAREVFENDPETDYFYPRYLD（配列番号４）；
【００６１】
ｐｒｏ−ドメインを有しシグナルペプチドを有さないヒトＧａｓ６のＧｌａドメイン：
ALLPAREATQFLRPRQRRAFQVFEEAKQGHLERECVEELCSREEAREVFENDPETDYFYPRYLD（配列番号５）；
【００６２】
シグナルペプチドおよびｐｒｏ−ドメインを有さないヒトＧａｓ６のＧｌａドメイン：
AFQVFEEAKQGHLERECVEELCSREEAREVFENDPETDYFYPRYLD（配列番号６）；
【００６３】
シグナルペプチドおよびｐｒｏ−ドメインを有するヒトＰｒｏｓ１のＧｌａドメイン：
MRVLGGRCGALLACLLLVLPVSEANFLSKQQASQVLVRKRRANSLLEETKQGNLERECIEELCNKEEAREVFENDPETDYFYPKYLV（配列番号７）；
【００６４】
ｐｒｏ−ドメインを有しシグナルペプチドを有さないヒトＰｒｏｓ１のＧｌａドメイン：
NFLSKQQASQVLVRKRRANSLLEETKQGNLERECIEELCNKEEAREVFENDPETDYFYPKYLV（配列番号８）；および
【００６５】
シグナルペプチドおよびｐｒｏ−ドメインを有さないヒトＰｒｏｓ１のＧｌａドメイン：
ANSLLEETKQGNLERECIEELCNKEEAREVFENDPETDYFYPKYLV（配列番号９）
が含まれる。
【００６６】
さらに、いくつかの態様において、ＰＳに対して融合分子を標的化するポリペプチドは、ＰＳとの結合においてＰＳ結合ドメインのオリゴマー化を促進するドメインをさらに含んでもよい。本発明の融合分子に含まれ得る、ＰＳとの結合においてＰＳ結合ドメインのオリゴマー化を促進するドメインの非限定的な例は、Ｇａｓ６またはＰｒｏｓ１の表皮増殖因子（ＥＧＦ）様ドメインである。非限定的な例には：
【００６７】
ヒトＧＡＳ６のＥＧＦ様ドメイン
CINKYGSPYTKNSGFATCVQNLPDQCTPNPCDRKGTQACQDLMGNFFCLCKAGWGGRLCDKDVNECSQENGGCLQICHNKPGSFHCSCHSGFELSSDGRTCQDIDECADSEACGEARCKNLPGSYSCLCDEGFAYSSQEKACRDVDECLQGRCEQVCVNSPGSYTCHCDGRGGLKLSQDMDTCE（配列番号１０）；および
【００６８】
ヒトＰｒｏｓ１のＥＧＦ様ドメイン
CLRSFQTGLFTAARQSTNAYPDLRSCVNAIPDQCSPLPCNEDGYMSCKDGKASFTCTCKPGWQGEKCEFDINECKDPSNINGGCSQICDNTPGSYHCSCKNGFVMLSNKKDCKDVDECSLKPSICGTAVCKNIPGDFECECPEGYRYNLKSKSCEDIDECSENMCAQLCVNYPGGYTCYCDGKKGFKLAQDQKSCE（配列番号１１）
が含まれる。
【００６９】
したがって、一つの非限定的態様において、本発明の融合分子は、ＧＡＳ６またはＰｒｏｓ１の、Ｎ末端ＰＳ結合型ドメインおよびＥＧＦ様オリゴマー化ドメインを含むポリペプチドを含んでもよい。かかる融合分子の非限定的な例には：
【００７０】
シグナルペプチドおよびｐｒｏ−ドメインを有するヒトＧａｓ６のＧｌａドメインおよびＥＧＦ様ドメイン：
MAPSLSPGPAALRRAPQLLLLLLAAECALAALLPAREATQFLRPRQRRAFQVFEEAKQGHLERECVEELCSREEAREVFENDPETDYFYPRYLDCINKYGSPYTKNSGFATCVQNLPDQCTPNPCDRKGTQACQDLMGNFFCLCKAGWGGRLCDKDVNECSQENGGCLQICHNKPGSFHCSCHSGFELSSDGRTCQDIDECADSEACGEARCKNLPGSYSCLCDEGFAYSSQEKACRDVDECLQGRCEQVCVNSPGSYTCHCDGRGGLKLSQDMDTCE（配列番号１２）；
【００７１】
ｐｒｏ−ドメインを有しシグナルペプチドを有さないヒトＧａｓ６のＧｌａドメインおよびＥＧＦ様ドメイン：
ALLPAREATQFLRPRQRRAFQVFEEAKQGHLERECVEELCSREEAREVFENDPETDYFYPRYLDCINKYGSPYTKNSGFATCVQNLPDQCTPNPCDRKGTQACQDLMGNFFCLCKAGWGGRLCDKDVNECSQENGGCLQICHNKPGSFHCSCHSGFELSSDGRTCQDIDECADSEACGEARCKNLPGSYSCLCDEGFAYSSQEKACRDVDECLQGRCEQVCVNSPGSYTCHCDGRGGLKLSQDMDTCE（配列番号１３）；
【００７２】
シグナルペプチドおよびｐｒｏ−ドメインを有さないヒトＧａｓ６のＧｌａドメインおよびＥＧＦ様ドメイン：
AFQVFEEAKQGHLERECVEELCSREEAREVFENDPETDYFYPRYLDCINKYGSPYTKNSGFATCVQNLPDQCTPNPCDRKGTQACQDLMGNFFCLCKAGWGGRLCDKDVNECSQENGGCLQICHNKPGSFHCSCHSGFELSSDGRTCQDIDECADSEACGEARCKNLPGSYSCLCDEGFAYSSQEKACRDVDECLQGRCEQVCVNSPGSYTCHCDGRGGLKLSQDMDTCE（配列番号１４）：
【００７３】
シグナルペプチドおよびｐｒｏ−ドメインを有するヒトＰｒｏｓ１のＧｌａドメインおよびＥＧＦ様ドメイン：
MRVLGGRCGALLACLLLVLPVSEANFLSKQQASQVLVRKRRANSLLEETKQGNLERECIEELCNKEEAREVFENDPETDYFYPKYLVCLRSFQTGLFTAARQSTNAYPDLRSCVNAIPDQCSPLPCNEDGYMSCKDGKASFTCTCKPGWQGEKCEFDINECKDPSNINGGCSQICDNTPGSYHCSCKNGFVMLSNKKDCKDVDECSLKPSICGTAVCKNIPGDFECECPEGYRYNLKSKSCEDIDECSENMCAQLCVNYPGGYTCYCDGKKGFKLAQDQKSCE（配列番号１５）：
【００７４】
ｐｒｏ−ドメインを有しシグナルペプチドを有さないヒトＰｒｏｓ１のＧｌａドメインおよびＥＧＦ様ドメイン：
NFLSKQQASQVLVRKRRANSLLEETKQGNLERECIEELCNKEEAREVFENDPETDYFYPKYLVCLRSFQTGLFTAARQSTNAYPDLRSCVNAIPDQCSPLPCNEDGYMSCKDGKASFTCTCKPGWQGEKCEFDINECKDPSNINGGCSQICDNTPGSYHCSCKNGFVMLSNKKDCKDVDECSLKPSICGTAVCKNIPGDFECECPEGYRYNLKSKSCEDIDECSENMCAQLCVNYPGGYTCYCDGKKGFKLAQDQKSCE（配列番号１６）；および
【００７５】
シグナルペプチドおよびｐｒｏ−ドメインを有さないヒトＰｒｏｓ１のＧｌａドメインおよびＥＧＦ様ドメイン：
ANSLLEETKQGNLERECIEELCNKEEAREVFENDPETDYFYPKYLVCLRSFQTGLFTAARQSTNAYPDLRSCVNAIPDQCSPLPCNEDGYMSCKDGKASFTCTCKPGWQGEKCEFDINECKDPSNINGGCSQICDNTPGSYHCSCKNGFVMLSNKKDCKDVDECSLKPSICGTAVCKNIPGDFECECPEGYRYNLKSKSCEDIDECSENMCAQLCVNYPGGYTCYCDGKKGFKLAQDQKSCE（配列番号１７）
が含まれる。
【００７６】
本発明のいくつかの非限定的態様においては、融合分子は、Ｉ型およびＩＩＩ型ＩＦＮタンパク質またはその一部を含む。発明の融合分子に用いられるＩ型ＩＦＮタンパク質には、ＩＦＮ−α（アルファ）、ＩＦＮ−β（ベータ）、ＩＦＮ−κ（カッパ）、ＩＦＮ−ε（イプシロン）、およびＩＦＮ−ω（オメガ）またはその一部が含まれるが、これらに限定されない。非限定的な例示の成熟したＩ型ＩＦＮタンパク質は：
【００７７】
ヒトＩＦＮ−α２ａ：
CKSSCSVGCDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRRISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVTETPLMKEDSILAVRKYFQRITLYLKEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSTNLQESLRSKE（配列番号  配列番号１８）；および
【００７８】
ヒトＩＦＮ−β：
MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN（配列番号１９）
である。
【００７９】
ＩＩＩ型ＩＦＮには、ＩＦＮ−λ１、ＩＦＮ−λ２、ＩＦＮ−λ３およびＩＦＮ−λ４ならびにこれらの一部が含まれる。非限定的な例示のＩＩＩ型ＩＦＮタンパク質は：
【００８０】
ヒトＩＦＮ−λ１：
PVPTSKPTPTGKGCHIGRFKSLSPQELASFKKARDALEESLKLKNWSCSSPVFPGNWDLRLLQVRERPVALEAELALTLKVLEAAAGPALEDVLDQPLHTLHHILSQLQACIQPQPTAGPRPRGRLHHWLHRLQEAPKKESAGCLEASVTFNLFRLLTRDLKYVADGNLCLRTSTHPEST（配列番号２０）；および
【００８１】
ヒトＩＦＮ−λ３：
VPVARLRGALPDARGCHIAQFKSLSPQELQAFKRAKDALEESLLLKDCKCRSRLFPRTWDLRQLQVRERPVALEAELALTLKVLEASADTDPALGDVLDQPLHTLHHILSQLRACIQPQPTAGPRTRGRLHHWLYRLQEAPKKESPGCLEASVTFNLFRLLTRDLNCVASGDLCV（配列番号２１）
である。
【００８２】
本発明のいくつかの態様において、融合分子は、サイトカインとＰＳに対して融合分子を標的化するポリペプチとの間のリンカーをさらに含んでもよい。本融合分子における使用のリンカーは、好ましくは柔軟性があり、５〜５０アミノ酸またはさらに好ましくは１０〜３０アミノ酸の範囲の長さを有する。ある態様においては、リンカーエレメントは、グリシン／セリンリンカー、すなわち、実質的にアミノ酸グリシンおよびセリンから構成されるペプチドリンカーである。アミノ酸スレオニンまたはアラニンもまた、リンカー内で用いることができる。融合分子のＮ末端においてＩＦＮなどのサイトカインが例えばＧｌｙですでに終了している場合には、かかるＧｌｙは、リンカー配列におけるリンカーの最初のＧｌｙを形成し得ることは、当業者には明らかであろう。同様に、Ｃ末端においてＩＦＮなどのサイトカインが例えばＰｒｏで始まる場合には、かかるＰｒｏ残基は、リンカー配列におけるリンカーの最後のＰｒｏを形成し得る。特定のリンカー配列の例は、表１に列挙されている。具体的な態様において、本発明の融合分子のリンカーは、配列番号４２に記載されている。
【００８３】
【表１】
2020531409.tif 000003
【００８４】
したがって、一つの非限定的態様においては、本発明の融合分子は、マウスＩＦＮ−βおよびマウスＩＦＮ−λ２タンパク質に融合された、マウスＧＡＳ６のシグナルペプチドおよびｐｒｏ−ドメインを有するＮ末端ＰＳ結合型ドメインとＥＧＦ様オリゴマー化ドメインとを含むポリペプチドを含む。
【００８５】
Ｇａｓ６（Ｇｌａ＋ＥＧＦ）−リンカー−ＩＦＮ−β−リンカー−ＩＦＮ−λ２（Ｇａｓ６（Ｇｌａ＋ＥＧＦ）−ＩＦＮ−β−ＩＦＮ−λ２）：
MPPPPGPAAALGTALLLLLLASESSHTVLLRAREAAQFLRPRQRRAYQVFEEAKQGHLERECVEEVCSKEAREVFENDPETEYFYPRYQECMRKYGRPEEKNPDFAKCVQNLPDQCTPNPCDKKGTHICQDLMGNFFCVCTDGWGGRLCDKDVNECVQKNGGCSQVCHNKPGSFQCACHSGFSLASDGQTCQDIDECTDSDTCGDARCKLPGSYSCLCDEGYTYSSKEKTCQDVDECQQDRCEQTCVNSPGSYTCHCDGRGGLKLSPDMDTCEASGSSGGSSGTSGSSGGSSGTSINYRQLQLQERTNIRKSQELLEQLNGKINLTYRADFKIPMEMTEKMQKSYTAFAIQEMLQNVFLVFRNNFSSTGWNETIVVRLLDELHQQTVFLKTVLEEKQEERLTWEMSSTALHLKSYYWRVQRYLKLMKYNSYAWMVVRAEIFRNFLIIRRLTRNFQNASGSSGGSSGTSGSSGGSSGTSTDPVPRATRLPVEAKDCHIAQFKSLSPKELQAFKKAKDAIEKRLLEKDMRCSSHLISRAWDLKQLQVQERPKALQAEVALTLKVWENMTDSALATILGQPLHTLSHIHSQLQTCTQLQATAEPKPPSRRLSRWLHRLQEAQSKETPGCLEDSVTSNLFRLLTRDLKCVASGDQCV（配列番号４９）。
【００８６】
別の非限定的態様においては、本発明の融合分子は、ヒトＩＦＮ−βおよびヒトＩＦＮ−λ３タンパク質に融合された、ヒトＧＡＳ６のシグナルペプチドおよびｐｒｏ−ドメインを有するＮ末端ＰＳ結合型ドメインとＥＧＦ様オリゴマー化ドメインとを含むポリペプチドを含む。
【００８７】
Ｇａｓ６（Ｇｌａ＋ＥＧＦ）−リンカー−ＩＦＮ−β−リンカー−ＩＦＮ−λ２（Ｇａｓ６（Ｇｌａ＋ＥＧＦ）−ＩＦＮ−β−ＩＦＮ−λ２）：
MAPSLSPGPAALRRAPQLLLLLLAAECALAALLPAREATQFLRPRQRRAFQVFEEAKQGHLERECVEELCSREEAREVFENDPETDYFYPRYLDCINKYGSPYTKNSGFATCVQNLPDQCTPNPCDRKGTQACQDLMGNFFCLCKAGWGGRLCDKDVNECSQENGGCLQICHNKPGSFHCSCHSGFELSSDGRTCQDIDECADSEACGEARCKNLPGSYSCLCDEGFAYSSQEKACRDVDECLQGRCEQVCVNSPGSYTCHCDGRGGLKLSQDMDTCEASGSSGGSSGTSGSSGGSSGTSMSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRNASGSSGGSSGTSGSSGGSSGTSTDPVARLRGALPDARGCHIAQFKSLSPQELQAFKRAKDALEESLLLKDCKCRSRLFPRTWDLRQLQVRERPVALEAELALTLKVLEASADTDPALGDVLDQPLHTLHHILSQLRACIQPQPTAGPRTRGRLHHWLYRLQEAPKKESPGCLEASVTFNLFRLLTRDLNCVASGDLCV（配列番号５０）。
【００８８】
本発明の様々な融合分子の非限定的態様は、図１に描かれている。そこには、ＰＳに対して融合分子を標的化するポリペプチド、リンカーおよびサイトカイン；ＰＳに対して融合分子を標的化するポリペプチド、リンカーおよび２種の異なるサイトカインの組み合わせ；ＰＳに対して融合分子を標的化するポリペプチドであって、それに結合するＰＳとの結合においてＰＳ結合ドメインのオリゴマー化を促進するドメインをさらに含む前記ポリペプチド、リンカーおよびサイトカイン；ならびに、ＰＳに対して融合分子を標的化するポリペプチドであって、それに結合するＰＳとの結合においてＰＳ結合ドメインのオリゴマー化を促進するドメインをさらに含む前記ポリペプチド、リンカーおよび２種の異なるサイトカインの組み合わせ：を含む態様が示されている。
【００８９】
図２は、本明細書において例示されるＩＩＩ型ＩＦＮ（ＩＦＮ−λ）およびＩ型ＩＦＮ（ＩＦＮ−α／β）の受容体システムによる、サイトカイン受容体複合体およびシグナル伝達経路のモデルを描いている。ＩＦＮ−λおよびＩ型ＩＦＮは、異なるヘテロ二量体受容体複合体を用いる。ＩＦＮ−λは、固有のＩＦＮ−λＲ１およびＩＬ−１０Ｒ２に会合するのに対し、ＩＦＮ−αＲ１およびＩＦＮ−αＲ２は、活性Ｉ型ＩＦＮ受容体複合体を形成する。ＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−λ受容体の会合は、受容体関連ＪＡＫキナーゼであるＪＡＫ１およびＴｙｋ２のリン酸化をもたらし、これに、ＤＮＡ結合タンパク質ＩＲＦ９と相互作用するＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ２のリン酸化が続き、ＩＦＮ刺激遺伝子因子３（ＩＳＧＦ３）と呼ばれる転写複合体の形成をもたらし、これは、ＩＦＮ刺激応答配列（ＩＳＲＥ）に結合してＩＦＮ刺激遺伝子（ＩＳＧ）の転写を制御する。
【００９０】
図３は、腫瘍微小環境またはウイルス感染部位などのＰＳリッチ環境における、本発明の融合分子の予測される結合および相互作用についての非限定的態様の略図を提供する。図３に描かれているように、ＰＳ陽性の腫瘍微小環境においては、Ｇａｓ６のＧｌａドメインは、アポトーシス腫瘍細胞または腫瘍血管系におけるＰＳに直接的に結合し、ＩＦＮ−βおよび／またはＩＦＮ−λ２などの免疫刺激性サイトカインは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、腫瘍細胞、内皮細胞および他の腫瘍浸潤細胞上の、それぞれのＩＦＮ−βおよび／またはＩＦＮ−λ受容体に結合するであろう。
【００９１】
ＩＦＮを介した抗腫瘍活性のメカニズムには、ｉ）その増殖を抑制し、そのアポトーシスを促進する、ｉｉ）炎症性サイトカインおよびケモカインの産生を促進して免疫細胞の腫瘍への動員増大をもたらす、ならびにｉｉｉ）ＭＨＣクラスＩ分子および共刺激分子の上方制御ならびに抗原のプロセシングにおける変化（これは腫瘍細胞により提示される腫瘍抗原の変化した多様なレパートリーをもたらす）によって達成される腫瘍細胞による抗原提示を増大させ、次にこれがＴ細胞によるより良好な認識をもたらす、という腫瘍細胞に対する直接的作用が含まれる。ＩＦＮはまた、内皮細胞の増殖を直接的に阻害することにより、および、腫瘍細胞および腫瘍浸潤免疫細胞による血管新生抑制ケモカインの産生促進により、腫瘍血管新生を阻害する。
【００９２】
さらに、ＩＦＮは、免疫細胞における様々な免疫刺激性活性を発揮し、これには、ｉ）１型ヘルパーＴ（Ｔｈ１）細胞応答の刺激をもたらす、プロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）による活性化および増大した抗原提示；ｉｉ）ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に対する直接的作用による、これらの細胞の増殖および分化の刺激；ｉｉｉ）ＮＫ細胞の直接的刺激およびその抗腫瘍活性の促進、が含まれる。
【００９３】
さらに、ＰＳ標的化サイトカインは、Ｇａｓ６およびＰｒｏｓ１などの内因性ＰＳリガンドによるＰＳ結合に競合し、したがって、Ｇａｓ６およびＰｒｏｓ１の、ＴＡＭ受容体を介して免疫抑制性シグナルを誘導する能力を遮断するであろう。本発明の融合分子は、受容体のクラスター形成を誘導し、ＩＦＮ−βおよびＩＦＮ−λ２単独と比較して強力なｐＳｔａｔ１シグナル伝達をもたらすであろう。本発明の融合分子は、それゆえ、免疫抑制性ＰＳ分子への結合および腫瘍微小環境におけるサイトカイン受容体を介した免疫原性シグナル伝達の誘導により、標的化療法および免疫療法という二つの機能を果たすであろう。
【００９４】
本発明のＰＳ標的化分子は、ＰＳに結合するが、むしろ、それらは、ＴＡＭ受容体を介して免疫抑制性経路に関与し、ＩＦＮ受容体を活性化させて宿主の抗腫瘍および抗ウイルス免疫を誘導する（図４）。
【００９５】
Ｇａｓ６の、Ｇｌａドメイン単独またはＧｌａドメインおよびＥＧＦ様ドメインの両方（Ｇｌａ＋ＥＧＦ）のいずれかを含有する、１２種のマウスＧａｓ６−ＩＦＮ融合分子シリーズをクローニングして配列を決定した。６種のマウスＧａｓ６−ＩＦＮ融合分子は、図１に描かれている。他の変異体は、Ｈｉｓタグタンパク質を含んでおり、その精製を容易にするのみならず、タグはin vivoにおけるタンパク質分布を画像化するためにタンパク質を標識することを可能にする（図７）。全てのキメラタンパク質は、続いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞で発現され、条件培地（conditioned media）に分泌されていることが示されたが、高度にカルボキシル化されていることが示されており、これは、細胞がビタミンＫの存在下において培養された場合に、ＰＳに結合する融合分子に必要とされる不可欠な翻訳後修飾である。
【００９６】
図５は、対応する発現プラスミドをトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞の条件培地中におけるいくつかのＨｉｓタグＧａｓ６−ＩＦＮ融合分子の存在を表しており、細胞からのその産生および分泌（図５（Ａ））ならびにγカルボキシル化（図５（Ｂ））を示している。さらに、Ｇａｓ６由来ＥＧＦリピートの存在下では、二量体形成が強く促進されることが観察された。全てのＧａｓ６−ＩＦＮタンパク質は、レポーター細胞株においてＩＦＮシグナル伝達を誘導する能力により示されているように生物学的活性を保持しており、全てのものがγカルボキシル化依存的にＰＳに結合する能力を保持していた。さらに、Ｇａｓ６のＰＳ結合ドメイン（Ｇｌａ−ＥＧＦ様ドメイン）は、ＩＦＮと融合された場合には、アポトーシス細胞の存在下でＩＦＮがより強いシグナル伝達を誘導することを可能にし、Ｇａｓ６−ＩＦＮ融合分子により引き起こされるＩＦＮ応答の強度は、理論的根拠および設計によって意図した通り、ＰＳ濃度の増加によって増強される（図６および８、ならびに１９Ａから１９Ｃ参照）。さらに、ＩＦＮ活性は、Ｇａｓ６−ＩＦＮ融合分子がγカルボキシル化された場合にのみ、アポトーシス細胞と一緒に共沈されるため、γカルボキシル化されたＧａｓ６−ＩＦＮ融合分子のみがアポトーシス細胞と結合する（図８）。
【００９７】
さらに、マウス乳癌細胞Ｅ０７７１細胞を乳房脂肪体に同所性移植した、乳房腫瘍増殖のマウスモデルは、Ｇａｓ６（Ｇｌａ＋ＥＧＦ）−ＩＦＮ−λ２（図２１Ａおよび２１Ｂ参照）およびＧａｓ６（Ｇｌａ＋ＥＧＦ）−ＩＦＮ−βを構成的に発現および分泌するＥＯ７７１腫瘍細胞が、同系免疫コンピテントＣ５７ＢＬ／６マウスの乳房脂肪体に注射された場合、増殖遅滞を示すことを示した。Ｇａｓ６（Ｇｌａ＋ＥＧＦ）−ＩＦＮ−λ２融合分子は、本明細書においてはモックとも称されるコントロールと比較して、腫瘍体積の有意な減少を示した。ＥＯ７７１細胞から分泌されたＧａｓ６（Ｇｌａ＋ＥＧＦ）−ＩＦＮ−λ２融合分子はまた、ＩＦＮ−λレポーター細胞においてＩＦＮ−λ２活性を有することもin vitroで示されている。
【００９８】
さらに、乳房腫瘍増殖のマウスモデルはまた、Ｇａｓ６（Ｇｌａ＋ＥＧＦ）−ＩＦＮ−β−ＩＦＮ−λ２融合分子が、ＩＦＮ−β−ＩＦＮ−λ２融合分子のものと同等の抗癌活性を有することも示した（図１６および１７参照）。このモデルにおいては、Ｇａｓ６（Ｇｌａ＋ＥＧＦ）−ＩＦＮ−β−ＩＦＮ−λ２またはＩＦＮ−β−ＩＦＮ−λ２分子を構成的に発現および分泌するＥＯ７７１乳房腫瘍細胞が、同系免疫コンピテントＣ５７ＢＬ／６マウスの乳房脂肪体に注射された場合、増殖遅滞を示した。Ｇａｓ６（Ｇｌａ＋ＥＧＦ）−ＩＦＮ−β−ＩＦＮ−λ２またはＩＦＮ−β−ＩＦＮ−λ２融合分子のいずれかを発現する腫瘍細胞は、モックトランスフェクションされた腫瘍細胞と比較して、腫瘍体積の有意な減少を示し、各群において８匹のマウスのうち４匹が腫瘍フリーのままであった（図１６および１７）。
【００９９】
さらに、Ｇａｓ６−ＩＦＮ−β−ＩＦＮ−λ２融合分子を発現するＥＯ７７１細胞は、Ｇａｓ６−ＩＦＮ−βおよびＧａｓ６−ＩＦＮ−λ２の各タンパク質を構成的に分泌するＥ０７７１細胞の５０：５０の混合物よりも、in vivoでは非常にゆっくり増殖し、融合Ｇａｓ６−ＩＦＮ−β−ＩＦＮ−λ２分子は、ＰＳ標的化された各Ｉ型およびＩＩＩ型ＩＦＮの組み合わせよりも、より高い抗腫瘍効力を有することが示された。
【０１００】
本発明のＰＳ標的化ＩＦＮ融合分子の抗ウイルス活性は、自然のタンパク質と同等であるか（図２０Ａ；ＩＦＮ−λ２に対するＧａｓ６（Ｇｌａ）−ＩＦＮ−λ２およびＧａｓ６（Ｇｌａ＋ＥＧＦ）−ＩＦＮ−λ２）、または、図１０および１１（ＩＦＮ−β−ＩＦＮ−λ２に対するＧａｓ６（Ｇｌａ＋ＥＧＦ）−ＩＦＮ−β−ＩＦＮ−λ２）において示されているようにＩＦＮ融合分子単独で作用するよりもより強力であるかのいずれかであった。さらに、免疫刺激性タンパク質であるカルレティキュリンおよびＭＨＣクラスＩタンパク質ならびに免疫修飾性ＰＤ−Ｌ１タンパク質の発現により誘導される、本発明の融合分子のＩＦＮ受容体応答を誘導する能力については、それぞれ図１２、２０Ｃ、２０Ｂおよび１３に表されている。
【０１０１】
本発明の融合分子は、既知の発現システムを用いた慣用の組み換え発現方法論により産生することができ、これには大腸菌、酵母、バキュロウイルス、昆虫、植物または哺乳類動物タンパク質発現システムが含まれるがこれらに限定されない。融合分子は、組み換え細胞培養物から、あらゆる有効な方法で回収および精製することができる。例えば、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー。例えば、Lin, et al. (1986) Meth. Enzymol. 119: 183-192参照。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製に用いられる。さらに、本発明の融合分子の産生および単離に用いられ得る方法は、米国特許第６，４３３，１４５号に開示されている。
【０１０２】
加えて、本発明の融合分子は、あらゆる有効な技術を用いて化学的に合成することもできる（例えば、Creighton (1983) Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman & Co., NY; Hunkapiller, et al. (1984) Nature 310:105-111を参照）。例えば、融合分子または融合分子の断片は、ペプチド合成装置を用いて合成することができる。
【０１０３】
本発明はまた、例えば、γカルボキシル化、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護／遮断（blocking）基による誘導体化、タンパク質切断、抗体分子もしくは他の細胞リガンドへの結合などによって、翻訳の間または後に修飾された融合分子をも包含する。臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４による特異的な化学的切断；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；チュニカマイシン存在下における代謝的合成などを含むがこれらに限定されない、既知の技術によって、あらゆる多数の化学的修飾を行うことができる。
【０１０４】
本発明が包含する追加的な翻訳後修飾には、例えば、例として、γカルボキシル化、Ｎ結合またはＯ結合糖鎖、Ｎ末端またはＣ末端のプロセシング、アミノ酸骨格への化学的部分（chemical moiety）の付着、Ｎ結合またはＯ結合糖鎖の化学的修飾、および原核宿主細胞発現の結果としてのＮ末端メチオニン残基の付加または除去が含まれる。融合分子はまた、タンパク質の検出および単離を可能にする、酵素、蛍光、同位体または親和標識などの検出可能な標識により修飾されていてもよい。
【０１０５】
また本発明により、本発明の融合分子の化学的に修飾された誘導体も提供され、これは、ポリペプチドの増加した溶解性、安定性および循環時間または減少した免疫原性などの付加的な利点を提供し得る（米国特許第４，１７９，３３７号参照）。誘導体化のための化学的部分は、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコールなどの水溶性ポリマーから選択され得る。ポリペプチドは、分子内のランダムな位置において、または分子内の予め定められた位置において、修飾されていてもよく、１個、２個、３個以上の付着された化学的部分を含んでもよい。
【０１０６】
ポリマーは、いかなる分子量であってもよく、分岐であってもまたは非分岐であってもよい。ポリエチレングリコールについては、好ましい分子量は、取り扱いおよび製造の容易さから、約１ｋＤａと約１００ｋＤａの間である（用語「約」は、ポリエチレングリコールの調製において、ある分子は、規定の分子量よりもより重く、ある分子はより軽いであろうことを示している）。所望の治療プロファイル（例えば、所望の持続的放出の継続時間、もしあるならば、生物学的活性に対する作用、取り扱いの容易さ、抗原性の程度または欠如、およびポリエチレングリコールの治療タンパク質または類似体に対する他の既知の作用）に応じて、他のサイズを用いてもよい。例えば、ポリエチレングリコールは、約２００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１０，０００、１０，５００、１１，０００、１１，５００、１２，０００、１２，５００、１３，０００、１３，５００、１４，０００、１４，５００、１５，０００、１５，５００、１６，０００、１６，５００、１７，０００、１７，５００、１８，０００、１８，５００、１９，０００、１９，５００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、５０，０００、５５，０００、６０，０００、６５，０００、７０，０００、７５，０００、８０，０００、８５，０００、９０，０００、９５，０００、または１００，０００ｋＤａの平均分子量を有していてもよい。
【０１０７】
上述のように、ポリエチレングリコールは分枝構造を有していてもよい。分枝ポリエチレングリコールは、例えば、米国特許第５，６４３，５７５号；Morpurgo, et al.(1996) Appl. Biochem. Biotechnol. 56:59-72；Vorobjev, et al. (1999) Nucleosides Nucleotides 18:2745-2750；およびCaliceti, et al. (1999) Bioconjug, Chem. 10:638-646に記載されている。
【０１０８】
ポリエチレングリコール分子（または他の化学的部分）は、タンパク質の機能的ドメインまたは抗原性ドメインに対する作用を考慮して、融合分子に付着されるべきである。当業者に利用可能な多数の付着方法があり、例えば、ＰＥＧのＧ−ＣＳＦへのカップリングを教示する欧州特許出願公開第０４０１３８４号明細書、および塩化トレシルを用いたＧＭ−ＣＳＦのペグ化を記載するMalik, et al. (1992) Exp. Hematol. 20:1028-1035参照。例えば、ポリエチレングリコールは、遊離のアミノ基またはカルボキシル基などの反応性基を介しアミノ酸残基によって共有結合され得る。反応性基は、活性化されたポリエチレングリコール分子が結合し得るものである。遊離のアミノ基を有するアミノ酸残基には、リジン残基およびＮ末端アミノ酸残基が含まれてもよく；遊離のカルボキシル基を有するものには、アスパラギン酸残基  グルタミン酸残基およびＣ末端残基が含まれてもよい。スルフヒドリル基もまた、ポリエチレングリコール分子を付着させるための反応性基として用いることができる。治療目的に好ましいのは、Ｎ末端またはリジン基における付着などの、アミノ基における付着である。
【０１０９】
上述のように、ポリエチレングリコールは、多数のアミノ酸残基のうちのいずれかへの結合を介してタンパク質へ付着されていてもよい。例えば、ポリエチレングリコールは、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはシステイン残基への共有結合を介してタンパク質に結合され得る。ポリエチレングリコールを、タンパク質のうちの特定のアミノ酸（例えば、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはシステイン）に、あるいはタンパク質のうちの２種以上のアミノ酸残基（例えば、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、およびこれらの組み合わせ）に、付着させるためには、１種以上の反応化学が用いられてもよい。
【０１１０】
Ｎ末端において化学的に修飾されたタンパク質を特に所望する場合もある。ポリエチレングリコールを説明の通りに用いて、（分子量、分岐などにより）様々なポリエチレングリコール分子から、反応混合物中におけるタンパク質（ポリペプチド）分子に対するポリエチレングリコール分子の割合、行われるべきペグ化反応の種類、および選択されたＮ−末端ペグ化タンパク質を得る方法を選択することができる。Ｎ−末端ペグ化調製物を得る（すなわち、必要に応じて、他のモノペグ化部分からこの部分を分離する）方法は、ペグ化タンパク質分子の集団からのＮ末端ペグ化材料の精製によってもよい。Ｎ末端修飾で化学的に修飾されている選択的タンパク質は、特定のタンパク質における誘導体化に利用可能な１級アミノ基の異なる種（Ｎ末端に対するリジン）の差異的反応性を活用する還元アルキル化により達成され得る。適切な反応条件下では、ポリマーを含有するカルボニル基を用いて、Ｎ末端におけるタンパク質の実質的な選択的誘導体化が実現される。
【０１１１】
上に示したように、本発明の融合分子のペグ化は、いくつもの手段により達成され得る。例えば、ポリエチレングリコールは、直接的にまたはリンカーを介在させてのいずれかでタンパク質に付着させることができる。ポリエチレングリコールをタンパク質に付着させるためのリンカーを用いないシステムは、Delgado et al. (1992) Crit. Rev. Thera. Drug Carrier Sys. 9:249-304; Francis, et al. (1998) Intern. J. Hematol. 68:1-18;米国特許第４，００２，５３１号；米国特許第５，３４９，０５２号；国際公開第９５／０６０５８号公報；および国際公開第９８／３２４６６号公報に記載されている。
【０１１２】
本発明の融合分子に付着されるポリエチレングリコール部分の数（すなわち、置換度）はまた、変化してもよい。例えば、本発明のペグ化タンパク質は、平均で、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１７、２０個以上のポリエチレングリコール分子に結合されていてもよい。同様に、平均置換度は、タンパク質分子あたり、１−３、２−４、３−５、４−６、５−７、６−８、７−９、８−１０、９−１１、１０−１２、１１−１３、１２−１４、１３−１５、１４−１６、１５−１７、１６−１８、１７−１９、または１８−２０個のポリエチレングリコール部分などの範囲内である。置換度を決定する方法は、例えば、Delgado, et al. (1992) Crit. Rev. Thera. Drug Carrier Sys. 9:249-304において議論されている。
【０１１３】
本発明の融合分子は、様々な癌、ウイルス疾患および他の適応症、特に病変部位がＰＳに富んでいる適応症の処置に用いることができる。
【０１１４】
したがって、本発明はまた、対象の病変部位にサイトカインまたはその一部を標的化する、対象の病変部位における内因性ＰＳリガンドおよび受容体によるＰＳ認識から生じる免疫抑制を阻害する、対象の病変部位における１種以上のサイトカイン特異的生物学的活性を活性化させる、対象におけるサイトカインの全身作用を最小化する、および／または、有効量の融合分子もしくは融合分子を含む医薬組成物の対象への投与を介して対象におけるサイトカイン処置に対して応答性の疾患、障害もしくは症状を処置するための、医薬組成物ならびに方法をも提供する。一つの非限定的態様においては、本発明により標的化されるおよび／または処置される疾患、障害もしくは症状は、癌、感染または炎症性症状もしくは障害である。
【０１１５】
本発明の目的においては、「対象」は、哺乳類動物、例えば、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、ヒヒ、オラウータン、サル）、マウス、ブタ、ウシ、ヤギ、ネコ、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター、ウマ、サル、ヒツジ；あるいは、例えば、鳥類（例えば、ニワトリまたはアヒル）または魚類などの非哺乳類脊椎動物、および非哺乳類無脊椎動物を含む、非哺乳類動物が含まれることが意図されている。
【０１１６】
本発明の方法にしたがって、「有効量」は、所望の結果を生み出すのに十分な、融合分子または融合分子を含む医薬組成物の用量または量を意味する。所望の結果には、用量または量を受容する対象における、客観的または主観的な改善が含まれ得る。特に、有効量は、疾患または症状に関連した１種以上の兆候あるいは病徴を、抑制する、緩和する、減少させる、または解消させる量である。処置には、存在する症状の治療、または、インフルエンザなどの感染の一般的な再発を含むがこれに限定されない、予測される感染の予防、および生物兵器攻撃などの状況が要求する緊急的な予防が含まれる。
【０１１７】
いくつかの非限定的態様においては、本発明の方法は、慢性Ｃ型肝炎感染、慢性Ｂ型肝炎感染、ヘルペスウイルス、パピローマウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、呼吸器多核体ウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス、ロタウイルス、ノロウイルス、エンテロウイルス、ジカウイルス、エボラウイルス、デングウイルス、チクングニアウイルス、ハンタウイルスおよびＡＩＤＳ／ＨＩＶなどであるがこれらに限定されない、慢性および急性ウイルス感染；乳房、骨、肝臓、腎臓、肺、首および喉、皮膚、大腸、前立腺、膀胱ならびに膵臓の肉腫、癌腫、およびリンパ腫を含む、固形腫瘍を含むがこれらに限定されない、癌；ならびに、クローン病、多発性硬化症および関節炎、喘息、乾癬、皮膚炎、自己免疫性肺炎または胃腸炎、尖圭コンジローマなどであるがこれらに限定されない、炎症性および／または自己免疫性症状または疾患の処置において用いられる。特定の非限定的態様においては、本発明の融合分子および方法は、ウイルス感染または癌の処置において用いられる。
【０１１８】
あらゆる有効量の本発明の融合分子は、その必要がある対象、例えば、疾患もしくは症状を有するかまたは疾患または症状を獲得する危険性がある対象に、投与されてもよい。一般的な提案としては、用量当たりの非経口投与される薬学的有効量の総量は、患者の体重に対し約１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日であろうが、上述のように、これは治療的裁量にしたがうこととなるだろう。より好ましくは、この用量は、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ／日であり、ヒトに関しては、最も好ましくは、約０．０１と１ｍｇ／ｋｇ／日との間である。継続的に与えられる場合には、組成物は典型的に、１日当たり１〜４回の注射または例えばミニポンプを用いた継続的皮下注入のいずれかにより、約１μｇ／ｋｇ／時間〜約５０μｇ／ｋｇ／時間の投与速度で投与される。静脈内バッグ溶液（bag solution）もまた用いることができる。変化を観察するのに必要な処置の期間および応答が生じるための次の処置の間隔は、所望の効果に依存して変化し得る。
【０１１９】
治療目的には、本発明の融合分子は、好ましくは、薬学的に許容し得る担体との混合物中に融合分子を含有する医薬組成物として提供される。用語「医薬組成物」は、動物またはヒトを含む対象における薬学的使用に適した組成物を意味する。医薬組成物は、一般的に、有効量の活性剤および、例えば、非毒性の固体、半固体または液体の充填剤などの薬学的に許容し得る担体を含む担体、希釈剤、カプセル化物質またはあらゆる種類の製剤の助剤などを含む。
【０１２０】
本発明の融合分子を含有する医薬組成物は、例えば、経口的に、直腸的に、非経口的に、大槽内的に、膣内的に、腹腔内的に、（粉末、軟膏、点滴または経皮パッチによるような）局所的に、口腔内的に、または経口もしくは経鼻スプレーとして、を含む、あらゆる有効な経路により投与され得る。
【０１２１】
本明細書において用いられるように用語「非経口的」は、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下および関節内注射および注入などの投与様式を含む、あらゆる有効な非経口的投与様式をいう。
【０１２２】
組成物はまた、徐放システムにより適切に投与されてもよい。徐放組成物の適した例には、成形品の形態での半透過性ポリマーマトリックス、例えばフィルム、またはマイクロカプセルが含まれる。徐放マトリックスには、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，９１９号、欧州特許出願公開第５８，４８１号明細書）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタミン酸とのコポリマー（Sidman et al. Biopolymers 1983 22:547-556）、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリラート）（Langer et al. J. Biomed. Mater. Res. 1981 15:167-277; Langer Chem. Tech. 1982 12:98-105）、エチレンビニルアセタートまたはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許出願公開第１３３，９８８号明細書）が含まれる。
【０１２３】
徐放組成物はまた、リポソームにより封入されたポリペプチドを含む。本発明のポリペプチドを含有するリポソームは、当該分野において既知の方法により調製される  ドイツ特許出願公開第３，２１８，１２１号明細書；Epstein, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1985 82:3688-3692；Hwang, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1980 77:4030-4034；欧州特許出願公開第５２，３２２号明細書；欧州特許出願公開第３６，６７６号明細書；欧州特許出願公開第８８，０４６号明細書；欧州特許出願公開第１４３，９４９号明細書；欧州特許出願公開第１４２，６４１号明細書；特願昭５８−１１８００８号明細書；米国特許第４，４８５，０４５号；米国特許第４，５４４，５４５号；および欧州特許出願公開第１０２，３２４号明細書。通常、リポソームは、小さい（約２００〜８００オングストローム）単層型であり、脂質含有量は、約３０モルパーセントコレステロールよりも大きく、選択される割合は、有効なポリペプチド療法に合わせて調節される。
【０１２４】
免疫腫瘍学的製剤（ＩＣＩ）として用いられる場合には、本発明の融合分子は、単独で用いられてもよく、または、他のＩＣＩと組み合わせて用いられてもよい。一つの非限定的態様において、本発明の融合分子は、抗ＰＤ−１治療と組み合わせて用いられてもよい。Ｉ型およびＩＩＩ型ＩＦＮはＰＤ−Ｌ１の上方制御を誘導し、この効果が融合分子の抗腫瘍的有効性を減少させ得るため、この組み合わせは特に魅力的である。
【０１２５】
抗ウイルス剤として用いられる場合には、本発明の融合分子は、単独で投与されてもよく、または、ＩＬ−２、ＫＤＩ、リバビリンおよびテモゾロミドなどの、他の既知の抗ウイルス性、免疫修飾性および抗増殖性の治療法と組み合わせて投与されてもよい。
【０１２６】
本発明はまた、本発明の医薬組成物の１種以上の成分が充填された１個以上の容器を含む、医薬のパックまたはキットをも提供する。かかる容器には、医薬もしくは生物学的製剤製品の製造、使用または販売を統制する政府機関により規定された形態の注意書が添えられていてもよく、かかる注意書は、ヒトへの投与に対する機関による製造、使用または販売の承認を反映するものである。加えて、本発明の融合分子は、他の治療化合物と併せて用いられてもよい。
以下の非限定的な例は、本発明をさらに説明するために提供される。
【０１２７】
例
例１：融合分子の合成方法
生物学的評価のために融合分子を作製するため、インタクト（intact）未修飾ＧＡＳ６、ＩＦＮ−λ２、ＩＦＮ−β、および融合ＩＦＮ分子であるＩＦＮ−β−ＩＦＮ−λ２（コントロール）、および６個のＧＡＳ６−ＩＦＮ融合分子であるＧａｓ６（Ｇｌａ）−ＩＦＮ−λ２、Ｇａｓ６（Ｇｌａ）−ＩＦＮ−β、Ｇａｓ６（Ｇｌａ）−ＩＦＮ−β−ＩＦＮ−λ２、Ｇａｓ６（Ｇｌａ＋ＥＧＦ）−ＩＦＮ−λ２、Ｇａｓ６（Ｇｌａ＋ＥＧＦ）−ＩＦＮ−βおよびＧａｓ６（Ｇｌａ＋ＥＧＦ）−ＩＦＮ−β−ＩＦＮ−λ２を発現する哺乳類動物プラスミドを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に一過性にトランスフェクションした。融合分子のＨｉｓタグを付したバージョンおよびリン酸化可能バージョンを発現するプラスミドもまた、製作してＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションした。分泌されたインタクトタンパク質または融合タンパク質を含有する条件培地を、トランスフェクションの４８時間後に回収した。
【０１２８】
例２：イムノブロッティング法
様々なインタクトＧａｓ６およびＩＦＮ分子、ならびにＧａｓ６（Ｇｌａ）、またはＧａｓ６（Ｇｌａ＋ＥＧＦ）ＩＦＮ融合分子を含有する条件培地を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離して、膜に転写し、γカルボキシル化およびＨｉｓタグ特異的な抗体を用いたイムノブロッティングによりγカルボキシル化を評価した。
【０１２９】
例３：γカルボキシル化およびサイトカイン活性の評価
Ｇａｓ６（Ｇｌａ）、またはＧａｓ６（Ｇｌａ＋ＥＧＦ）ＩＦＮ融合タンパク質の活性を、ＩＦＮ−λＲ−γＲ１レポーター細胞株を処置することにより評価した。レポーター細胞を、コントロールとして用いられた組み換えＩＦＮ−λ２、または、アポトーシス細胞ありもしくはなしでＧａｓ６（Ｇｌａ）およびＧａｓ６（Ｇｌａ＋ＥＧＦ）ＩＦＮ融合分子を含有するＨＥＫ２９３Ｔ細胞上清により、３０分間処置した。細胞溶解物を調製し、ＩＦＮ−λ受容体活性化の出力としてのチロシンリン酸化Ｓｔａｔ１（ｐＳｔａｔ１）に特異的な抗体によるイムノブロッティングにより、Ｓｔａｔ１リン酸化を測定した。ｐＳｔａｔ１イムノブロットは、融合分子によるＩＦＮ−λ受容体の活性化の、ホスファチジルセリン結合依存的な増大を示した。さらに、アポトーシス細胞のγカルボキシル化Ｇａｓ６−ＩＦＮ融合分子への結合は、ＩＦＮ活性のアポトーシス細胞との共沈により示された。
【０１３０】
例４：抗ウイルス活性
同数のヒト網膜色素上皮ＡＲＰＥ１９細胞またはマウス腸上皮細胞（ｍＩＥＣ）を、９６穴マイクロタイタープレートの全穴において、１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地中に播種し、３００ｎｇ／ｍｌ〜０．００２ｎｇ／ｍｌの範囲の様々な濃度で組み換えＩＦＮ−λ２により、あるいは、Ｇａｓ６（Ｇｌａ）−ＩＦＮ−λ２およびＧａｓ６（Ｇｌａ＋ＥＧＦ）−ＩＦＮ−λ２融合分子、またはＩＦＮ−β−ＩＦＮ−λ２およびＧａｓ６（Ｇｌａ＋ＥＧＦ）−ＩＦＮ−β−ＩＦＮ−λ２をそれぞれ含有するＨＥＫ２９３Ｔ細胞上清の３倍系列希釈物により、処置した。前処置の２４時間後、細胞に、０．１ｐｆｕ／細胞の濃度で穴に添加された水疱性口炎ウイルス（ＶＳＶ）を負荷し、細胞をさらに２４時間インキュベートして、融合分子の抗ウイルス活性を分析した。細胞生存能を、製造者のプロトコール（Millipore / Sigma）にしたがってＭＴＴアッセイを用いて測定した。
【０１３１】
ＡＲＰＥ−１９細胞またはｍＩＥＣをまた、６穴プレートにおいて１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地中に播種し、未処置で、あるいは、組み換えＩＦＮ−λ２（１００ｎｇ／ｍｌ）により、または、Ｇａｓ６（Ｇｌａ）−ＩＦＮ−λ２、Ｇａｓ６（Ｇｌａ＋ＥＧＦ）−ＩＦＮ−λ２、ＩＦＮ−β−ＩＦＮ−λ２もしくはＧａｓ６（Ｇｌａ＋ＥＧＦ）−ＩＦＮ−β−ＩＦＮ−λ２融合分子を含有するＨＥＫ２９３Ｔ細胞上清の１／１０希釈物により、処置して、７２時間放置した。次いで、細胞を回収し、細胞表面レベルのＭＨＣクラスＩ抗原発現、カルレティキュリン発現またはＰＤ−Ｌ１発現をフローサイトメトリーにより測定した。
【０１３２】
例５：抗腫瘍活性
免疫コンピテントな同系の６〜８週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Jackson Laboratory）に、１０５個の、ＥＯ７７１モック細胞（空ベクターをトランスフェクションしたＥＯ７７１細胞）  ＩＦＮ−β−ＩＦＮ−λ２  Ｇａｓ６（Ｇｌａ＋ＥＧＦ）−ＩＦＮ−β、Ｇａｓ６（Ｇｌａ＋ＥＧＦ）−ＩＦＮ−λ２またはＧａｓ６（Ｇｌａ＋ＥＧＦ）−ＩＦＮ−β−ＩＦＮ−λ２融合分子を分泌する細胞（様々な融合分子を発現するベクターをトランスフェクションしたＥＯ７７１細胞）を、乳房脂肪体に注射した。マウスを、１〜２日おきに注射部位の触診により腫瘍増殖を確認し、腫瘍体積（Ｖ）を、クリッパー（clipper）を用いて腫瘍の長さ（Ｌ）および幅（Ｗ）を測定し、次いで式Ｖ＝（ＬｘＷｘＷ）／２に適用することにより、計算した。
【０１３３】
例６：融合分子の、腫瘍微小環境へ動員され、腫瘍微小環境中に局在する能力の評価
本発明の融合分子が腫瘍微小環境へ動員され、腫瘍微小環境中に局在する能力を保持しているかどうかを調べるため、融合分子が腫瘍部位へ特異的に送達され得るかどうかを決定するための評価を行った。これらの研究には、Pulverer, J.E. et al. （Journal of Virology 2010 84:8626-8638）により記載されている、ルシフェラーゼの発現がＩＦＮ誘導性Ｍｘ２プロモーターにより制御されている、Ｍｘ２ルシフェラーゼレポータートランスジェニック（ＴＧ）マウスが用いられる。これらのレポーターマウスは、Ｉ型またはＩＩＩ型ＩＦＮのいずれかを静脈内注射した場合に、組織特異的にルシフェラーゼを発現する：Ｉ型ＩＦＮは、主に肝臓においてルシフェラーゼ発現を誘導するのに対し、ＩＩＩ型ＩＦＮは胃腸管においてルシフェラーゼ発現を引き起こす（McElrath, C. et al. Cytokine 2016 87:141-141）。
【０１３４】
Ｈｉｓタグタンパク質は、ＨＥＫ２９３細胞において産生され、均一に精製される。インタクトおよび融合ＩＦＮタンパク質を、最初に様々な濃度でレポーターマウスに注射し、ルシフェラーゼの位置および継続時間を、例えばXenogen IVIS 200 Imaging Systemを用い、生存している動物においてモニターする。次に、雌性マウスには、乳房脂肪体にＥ０７７１細胞を注射し、腫瘍が定着した後、マウスにインタクトまたはＧａｓ６融合ＩＦＮ分子を注射して、ルシフェラーゼ発現を生存している動物において評価した。
【０１３５】
生理学的条件下においては、胸腺および脾臓などの細胞のターンオーバー速度が速い組織においてさえも、除去されていないアポトーシス細胞およびＰＳ陽性ストレス細胞はほとんど観察されない。これは、正常なホメオスタシスの一部としてのアポトーシスが起こっている細胞は、非常に効率的におよび強力にエフェロサイトーシスされて、ＰＳが正常組織においては検出されないためである。したがって、本研究により決定された本発明の融合分子のＰＳ標的化は、ストレス応答および癌、ウイルス感染または炎症の一部としてＰＳが上方制御されている部位への、設計された融合分子の局所的送達を示す。
【０１３６】
例７：融合分子の、腫瘍微小環境およびウイルス感染部位へ動員され、腫瘍微小環境およびウイルス感染部位中に局在する能力の評価
均一に精製した後、リン酸化可能なＩＦＮ融合分子を、in vitroで放射性標識し、尾静脈もしくはＳＱ注射により、担癌（tumor-bearing）マウスおよび呼吸器インフルエンザＡウイルスもしくは胃腸ロタウイルスのいずれかに感染したマウスに注射し、標識タンパク質のin vivo分布を、Ｘ線画像化および様々な解剖組織における放射活性分布を測定することにより、モニターした。
【０１３７】
例８：２種のマウスモデルにおける融合分子の抗腫瘍的有効性
本発明の融合分子の腫瘍微小環境を変化させる特性を、２種の独立した、遺伝的に受容可能な、乳癌増殖の同所性移植モデルにおいて比較する。これらのモデルには、（ＢＡＬＢ／ｃマウス系統には）４Ｔ１細胞モデルおよび（Ｃ５７ＢＬ／６マウス系統には）Ｅ０７７１細胞モデルが含まれる。両方のモデルは、低い免疫原性の潜在的能力および肺への自然転移を含むヒト乳癌の側面を再現する、悪性のトリプルネガティブ（triple negative）腫瘍乳癌モデルを反映する。さらに、４Ｔ１およびＥ０７７１細胞の両方は、３種の全てのＴＡＭを発現すると考えられており、これらの癌モデルを、ＰＳ受容体を発現する腫瘍を研究するのに適したものにしている。様々なインタクトまたはＧａｓ６融合ＩＦＮ分子を構成的に発現する４Ｔ１およびＥ０７７１細胞を作製した。同等のレベルのＩＦＮ分子を発現する細胞集団を選択する。
【０１３８】
修飾された細胞の増殖動態は、in vitroで最初に比較する。動物研究には、８週齢同系野生型のＣ５７ＢＬ／６（Ｅ０７７１）またはＢＡＬＢ／ｃ（４Ｔ１）雌性未交尾マウスに、（５０％マトリゲルに再懸濁した）１０５個のマウス乳癌細胞株を、右４番鼠径乳房脂肪体の中心に注射する（ｎ＝１２マウス／群）。原発性腫瘍の体積を、１日おきに評価して記録する。原発性腫瘍が１ｃｍ３に達したとき、マウスを犠牲にし、肺転移を定量化する。肺、骨、脳および他の主要臓器は、秤量して、半分を急速凍結し（snap-frozen）、半分をさらなる生化学的および組織学的分析のために固定し、増殖（Ｋｉ６７）、アポトーシス（Ｔｕｎｎｅｌ）、微小血管（ＣＤ３１）およびＰＡＳＲ染色について研究する。必要に応じて、レーザーマイクロキャプチャー（micro-capture）技術を用いて、潜在的な自然転移を解剖し、生化学的分析を行うこととする。
【０１３９】
例９：ＴＭＥにおける免疫細胞頻度に対する融合分子の効果の評価
ＴＭＥにおける免疫細胞のサブセット（subset）およびこれらが本発明の融合分子によりどのように変化するかを調べることは、免疫応答を変化させることにおけるそれらの役割のメカニズム的な洞察を与える。融合分子は、宿主の抗腫瘍応答に影響を与える阻害性シグナルを元に戻して、ＴＭＥをより免疫競合的な環境へプログラミングし直す（reprogram）であろうと予想される。これらの問題に実験的に取り組むため、NanostringおよびＩＨＣに基づく方法の組み合わせを用いて、ＴＭＥにおいておよび腫瘍境界におけるＰＭＮ、ＤＣ、ＭＰｈ、ＮＫおよびＴ細胞の細胞頻度をプローブする。
【０１４０】
そのため、原発性腫瘍を除去した際に、一部を用いてＩＨＣにより腫瘍境界を調べ、次いで、酵素的消化を行って腫瘍および腫瘍浸潤細胞を単離してＦ４／８０＋ＭＰｈ、ＧＲ１＋好中球、ＣＤ１１＋ＤＣおよびＴ細胞、筋線維芽細胞ならびに内皮細胞（ＰＥＣＡＭ＋細胞）のプロファイリングをする。腫瘍部位における白血球（ＤＣ、ＭＰｈ、ＮＫおよびＴ細胞）浸潤およびＤＣ成熟状態もまた、免疫染色細胞、それに続く、ＤＣに対してＣＤ８６（Alexa 350標識）、ＭＰｈに対してＦ４／８０（Alexa 405標識）、ならびにＴ細胞に対してＣＤ４＋（PE-Cy7標識）およびＣＤ８＋（Alexa 649標識）などの、特異的マーカーを用いたＦＡＣＳ分析（BD LSR II）によって、評価する。加えて、腫瘍関連サイトカインおよびケモカインを、MSD-cytokine array（Meso Scale Diagnostics, Rockville, MD）により定量化する。
【０１４１】
例１０：腫瘍増殖動物モデルにおける融合分子の治療効果の評価
上記モデルにおいて、抗癌治療剤として、最も強力な抗腫瘍的有効性を示す融合分子をさらに試験する。これらの実験のために、融合分子を産生し、Ｈｉｓタグ精製技術を用いて、動物試験に十分な量を、エンドトキシンフリーで精製する。これらの実験のために、元の４Ｔ１およびＥ０７７１腫瘍を定着させて、約０．３ｃｍ３の体積まで増殖させ、動物に、１μｇの選択された精製融合分子を、毎日静脈内注射する。有効な腫瘍抑制が達成された場合には、組換えタンパク質の投与について、低い用量および頻度もまた試験する。
【０１４２】
例１１：ウイルス感染動物モデルにおける融合分子の治療効果の評価
ＰＳ標的化ＩＦＮ融合分子の抗ウイルス効力を、Ａ型インフルエンザ感染マウスモデルを用いて試験する。効力は、インタクトＩＦＮと比較する。マウスに１ＬＤ５０のＡ型インフルエンザウイルスＰＲ８、ＷＳＮ、Ｕｄｏｒｎ株または他の株を感染させる８〜２４時間前に、予防として、様々な用量で（成体の約２０ｍｇの８週齢マウス当たり０．１、０．３、１、３、１０μｇ；ＰＢＳをコントロールモック処置として用いる）マウスにＳＱまたは鼻内（ＩＮ）注射する。生存および体重減少を毎日モニターする。
【０１４３】
加えて、別の実験において、感染後３、６および９日にウイルス力価および肺の組織病変を評価する。組織病変は、病変を評価するのに用いる。ウイルス抗原のＩＨＣ染色は、ウイルス伝播のパターンが処置により変化するかどうかを決定するのに用いる。感染後の生存を増大するための最適なＩＦＮ処置もまた評価する。この実験においては、Ａ型インフルエンザウイルス（１ＬＤ５０  ＰＲ８、ＷＳＮ、Ｕｄｏｒｎ株または他の株）に感染後の処置の効果を複数の投薬レジメンで試験する。上のように、マウスは、様々な用量で（成体の約２０ｍｇの８週齢マウス当たり０．１、０．３、１、３、１０μｇ；ＰＢＳをコントロールモック処置として用いる）ＳＱまたは鼻内（ＩＮ）注射される、ＩＦＮ融合分子、単一のＩＦＮあるいはこれらの組み合わせにより処置する。感染マウスは、下記スケジュール：１、３、５；１〜４；２、４、６；２〜５日、にしたがって処置する。マウスは、上のように分析し、抗ウイルス保護ならびに疾患の進行について計測する。
【０１４４】
例１２：融合分子の、ＴＡＭ受容体を介したインタクトＴＡＭリガンドのシグナル伝達を阻害する能力の評価
ＴＡＭレポーター細胞株（Ｔｙｒｏ３／ＩＦＮ−γＲ１、Ａｘｌ／ＩＦＮ−γＲ１およびＭｅｒｔｋ／ＩＦＮ−γＲ１）を、過剰に与えられたＧａｓ６−ＩＦＮ融合分子の存在下または非存在下で、インタクトγカルボキシル化Ｇａｓ６およびＰｒｏｓ１により処置する。融合分子が内因性インタクトリガンドによるＴＡＭ受容体活性化を遮断する能力を、Ｓｔａｔ１活性化（ｐＳｔａｔ１）の減少を測定することにより評価する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９ＢＣ】
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【図２０ＡＢ】
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【図２０Ｃ】
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【図２１ＡＢ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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