(57)【要約】  本発明は、ＲＯＢＯ２に特異的に結合する抗体およびその抗原結合断片、ならびにその使用および方法を提供する。【図２】2020524988.tif 000040
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｒｏｕｎｄａｂｏｕｔ受容体２（ＲＯＢＯ２）のＩｇドメイン１内、またはドメイン１およびドメイン２内のエピトープに結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片であって、前記エピトープが、配列番号１の番号付けに従ったアミノ酸残基アルギニン１００（Ｒ１００）を含む、抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
前記エピトープが、配列番号１の番号付けに従ったＶ９６、Ｇ９８、Ｒ９９、およびＳ１０１からなる群から選択される１つまたは複数の残基をさらに含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３】
前記エピトープが、配列番号１の番号付けに従ったＥ６９、Ｅ７２、Ｒ７９、Ｈ８１、Ｒ８２、Ｒ９４、およびＰ１０３からなる群から選択される１つまたは複数の残基をさらに含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４】
前記エピトープが、配列番号１の番号付けに従ったＫ６６、Ｄ６７、Ｒ７０、Ｖ７１、Ｔ７３、Ｄ７４、Ｄ７７、Ｐ７８、Ｈ９７、およびＫ１０２からなる群から選択される１つまたは複数の残基をさらに含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５】
Ｒ１００がＫで置き換えられているエピトープに対するその結合親和性（ＫＤ）値の多くとも１００分の１であるＫＤ値で前記エピトープに結合する、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６】
Ｒｏｕｎｄａｂｏｕｔ受容体１（ＲＯＢＯ１）にほとんど結合しない、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項７】
配列番号１の番号付けに従ったＲ１００がＫで置き換えられＫ１０２がＲで置き換えられているＲＯＢＯ２突然変異体に結合しない、請求項６に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項８】
配列番号９の番号付けに従ったＲＯＢＯ１のアミノ酸残基Ｋ１３７がＲで置き換えられＲＯＢＯ１のアミノ酸残基Ｒ１３９がＫで置き換えられているＲＯＢＯ１突然変異体に結合する、請求項６に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項９】
Ｋａｂａｔの番号付けに従った（ｉ）重鎖のＴ３０、Ｇ３１、Ｙ３２、Ｙ３３、Ｅ９５、Ｇ９７、およびＤ９９、ならびに（ｉｉ）軽鎖のＹ３２およびＹ９２からなる群から選択される以下のパラトープ残基の１つまたは複数をさらに含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１０】
Ｋａｂａｔの番号付けに従った（ｉ）重鎖のＧ２６、Ｔ２８、Ｗ５０、Ｋ５３、Ｄ９８、Ｄ１０１、およびＩ１０２、ならびに（ｉｉ）軽鎖のＳ９１、Ｇ９３、およびＴ９６からなる群から選択される以下のパラトープ残基の１つまたは複数をさらに含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１１】
Ｋａｂａｔの番号付けに従った（ｉ）重鎖のＥ１、Ｖ２、Ｙ２７、Ｈ３５、Ｔ７３、Ｒ９４、およびＳ９６、ならびに（ｉｉ）軽鎖のＹ４９、Ｑ５５、およびＳ５６からなる群から選択される以下のパラトープ残基の１つまたは複数をさらに含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１２】
（ａ）以下のように、ＲＯＢＯ２上の少なくとも１つのエピトープ残基（配列番号１に従った番号付け）の３．８Å以内にある少なくとも１つのパラトープ残基（Ｋａｂａｔに従った番号付け）を含む：エピトープ残基Ａｒｇ９４は、パラトープ残基Ｈ／Ａｓｐ９８の３．８Å以内にあり、エピトープ残基Ｇｌｙ９８は、パラトープ残基Ｈ／Ｇｌｙ９７およびＨ／Ａｓｐ９９の３．８Å以内にあり、エピトープ残基Ａｒｇ９９は、パラトープ残基Ｈ／Ａｓｐ９９、Ｌ／Ｔｙｒ３２、およびＬ／Ｔｙｒ９２の３．８Å以内にあり、エピトープ残基Ａｒｇ１００は、パラトープ残基Ｈ／Ｔｙｒ３３、Ｈ／Ｔｒｐ５０、Ｈ／Ｇｌｕ９５、Ｌ／Ｓｅｒ９１、およびＬ／Ｔｙｒ９２の３．８Å以内にあり、エピトープ残基Ｓｅｒ１０１は、パラトープ残基Ｈ／Ｔｙｒ３２、Ｈ／Ｔｙｒ３３、Ｈ／Ｇｌｕ９５、Ｈ／Ｓｅｒ９６、およびＨ／Ｇｌｙ９７の３．８Å以内にあり、エピトープ残基Ｌｙｓ１０２は、パラトープ残基Ｈ／Ｇｌｙ３１の３．８Å以内にあり、そして、エピトープ残基Ｐｒｏ１０３は、パラトープ残基Ｈ／Ｇｌｙ３１およびＨ／Ｔｙｒ３２の３．８Å以内にある、
（ｂ）以下のように、ＲＯＢＯ２のエピトープ残基（配列番号１に従った番号付け）と水素結合を形成し得る少なくとも１つのパラトープ残基（Ｋａｂａｔに従った番号付け）を含む：エピトープ残基Ａｒｇ９４は、パラトープ残基Ｈ／Ａｓｐ９８と水素結合を形成し得、エピトープ残基Ａｒｇ９９は、パラトープ残基Ｈ／Ａｓｏ９９およびＬ／Ｔｙｒ９２と水素結合を形成し得、エピトープ残基Ａｒｇ１００は、パラトープ残基Ｈ／Ｇｌｕ９５、Ｌ／Ｓｅｒ９１、およびＬ／Ｔｙｒ９２と水素結合を形成し得、そして、エピトープ残基Ｓｅｒ１０１は、パラトープ残基Ｈ／Ｇｌｕ９５およびＨ／Ｇｌｙ９７と水素結合を形成し得る、
（ｃ）以下のように、ＲＯＢＯ２のエピトープ残基（配列番号１に従った番号付け）と塩橋を形成し得る少なくとも１つのパラトープ残基（Ｋａｂａｔに従った番号付け）を含む：エピトープ残基Ａｒｇ９４は、パラトープ残基Ｈ／Ａｓｐ９８と塩橋を形成し得、そしてエピトープ残基Ａｒｇ１００は、パラトープ残基Ｈ／Ｇｌｕ９５と塩橋を形成し得る、または
（ｄ）以下のように、エピトープ残基（配列番号１に従った番号付け）との相互作用に起因したＢＳＡにおける変化がゼロではない少なくとも１つのパラトープ残基（Ｋａｂａｔに従った番号付け）を含む：エピトープ残基Ａｒｇ９４は、パラトープ残基Ｈ／Ａｓｐ９８およびＬ／Ｔｙｒ４９と相互作用し、エピトープ残基Ｖａｌ９６は、パラトープ残基Ｈ／Ｇｌｙ９７と相互作用し、エピトープ残基Ｈｉｓ９７は、パラトープ残基Ｈ／Ｇｌｙ９７と相互作用し、エピトープ残基Ｇｌｙ９８は、パラトープ残基Ｈ／Ｇｌｙ９７と相互作用し、エピトープ残基Ａｒｇ９９は、パラトープ残基Ｈ／Ａｓｐ９９、Ｌ／Ｔｙｒ３２、およびＬ／Ｔｙｒ９２と相互作用し、エピトープ残基Ａｒｇ１００は、パラトープ残基Ｈ／Ｔｙｒ３３、Ｈ／Ｔｒｐ５０、Ｈ／Ｇｌｕ９５、Ｌ／Ｓｅｒ９１、Ｌ／Ｔｙｒ９２、およびＬ／Ｓｅｒ９３と相互作用し、エピトープ残基Ｓｅｒ１０１は、パラトープ残基Ｈ／Ｔｙｒ３２、Ｈ／Ｔｙｒ３３、Ｈ／Ｇｌｕ９５、Ｈ／Ｓｅｒ９６、およびＨ／Ｇｌｙ９７と相互作用し、エピトープ残基Ｌｙｓ  １０２は、パラトープ残基Ｈ／Ｇｌｙ３１と相互作用し、そしてエピトープ残基Ｐｒｏ１０３は、パラトープ残基Ｈ／Ｇｌｙ３１およびＨ／Ｔｙｒ３２と相互作用する、
請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１３】
（ｉ）
（ａ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＨ相補性決定領域１（ＣＤＲ−Ｈ１）、
（ｂ）配列番号２５または４４のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ−Ｈ２、および
（ｃ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ−Ｈ３
を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、
ならびに
（ｉｉ）
（ａ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＶＬ相補性決定領域１（ＣＤＲ−Ｌ１）、
（ｂ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ−Ｌ２、および
（ｃ）配列番号３１または４７のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ−Ｌ３
を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む、ＲＯＢＯ２に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１４】
ＶＬフレームワーク配列およびＶＨフレームワーク配列を含み、（ｉ）ＶＬフレームワーク配列およびＶＨフレームワーク配列の一方または両方が、それが由来する元であるヒト生殖細胞系フレームワーク配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり、かつ（ｉｉ）前記ヒト生殖細胞系ＶＬフレームワーク配列が、フレームワーク配列：ＤＰＫ９、ＤＰＫ１２、ＤＰＫ１８、ＤＰＫ２４、ＨＫ１０２＿Ｖ１、ＤＰＫ１、ＤＰＫ８、ＤＰＫ３、ＤＰＫ２１、Ｖｇ＿３８Ｋ、ＤＰＫ２２、ＤＰＫ１５、ＤＰＬ１６、ＤＰＬ８、Ｖ１−２２、Ｖλコンセンサス、Ｖλ１コンセンサス、Ｖλ３コンセンサス、ＶΚコンセンサス、ＶΚ１コンセンサス、ＶΚ２コンセンサス、またはＶΚ３コンセンサスであり、かつ（ｉｉｉ）前記ヒト生殖細胞系ＶＨフレームワーク配列が、フレームワーク配列：ＤＰ５４、ＤＰ４７、ＤＰ５０、ＤＰ３１、ＤＰ４６、ＤＰ７１、ＤＰ７５、ＤＰ１０、ＤＰ７、ＤＰ４９、ＤＰ５１、ＤＰ３８、ＤＰ７９、ＤＰ７８、ＤＰ７３、ＶＨ３コンセンサス、ＶＨ５コンセンサス、ＶＨ１コンセンサス、またはＶＨ４コンセンサスである、請求項１３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１５】
（ｉ）配列番号３２、４３、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、および１３２のいずれか１つに少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに（ｉｉ）配列番号３９、４６、および１３３のいずれか１つに少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むＶＬを含む、請求項１３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１６】
（ｉ）配列番号３２、４３、および１２６〜１３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに（ｉｉ）配列番号３９、４６、および１３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、請求項１３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１７】
（ｉ）配列番号１２７のアミノ酸配列を含むＶＨ、および（ｉｉ）配列番号１３３のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、請求項１３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１８】
ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のＦｃドメインであるＦｃドメインを含む、請求項１３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１９】
（ｉ）配列番号３８、４５、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、および１４０のいずれか１つに少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む重鎖、ならびに（ｉｉ）配列番号４２、４８、および１４１のいずれか１つに少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むＬＣを含む、請求項１３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２０】
（ｉ）配列番号３８、４５、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、および１４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖、ならびに（ｉｉ）配列番号４２、４８、および１４１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣを含む、請求項１３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２１】
（ｉ）配列番号１３５のアミノ酸配列を含む重鎖、ならびに（ｉｉ）配列番号１４１のアミノ酸配列を含むＬＣを含む、請求項１３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２２】
ａ．ＡＴＣＣに寄託されかつＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２３２６５を有するプラスミドのインサート、
ｂ．ＡＴＣＣに寄託されかつＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２３７００を有するプラスミドのインサート、
ｃ．配列番号１４３の配列を含む単離された核酸、
ｄ．配列番号１４５の配列を含む単離された核酸、
によってコードされるＶＨ配列を含み、
ａ．ＡＴＣＣに寄託されかつＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２３２６６を有するプラスミドのインサート、
ｂ．ＡＴＣＣに寄託されかつＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２３７０１を有するプラスミドのインサート、
ｃ．配列番号１４４の配列を含む単離された核酸、
ｄ．配列番号１４６の配列を含む単離された核酸、
によってコードされるＶＬ配列をさらに含む、請求項１３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２３】
請求項１３に記載の抗体またはその抗原結合断片と、ＲＯＢＯ２への結合について競合する抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２４】
請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片をコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項２５】
請求項２４に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項２６】
請求項２４に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
【請求項２７】
請求項２５に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２８】
（ｉ）
（ａ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＨ相補性決定領域１（ＣＤＲ−Ｈ１）、
（ｂ）配列番号２５または４４のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ−Ｈ２、および
（ｃ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ−Ｈ３
を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、
ならびに
（ｉｉ）
（ａ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＶＬ相補性決定領域１（ＣＤＲ−Ｌ１）、
（ｂ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ−Ｌ２、および
（ｃ）配列番号３１または４７のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ−Ｌ３
を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む、ＲＯＢＯ２に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片をコードする単離された核酸。
【請求項２９】
請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片、および薬学的に許容できる担体または賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項３０】
治療有効量の請求項１に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、または請求項２９に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、腎臓疾患を処置する方法。
【請求項３１】
前記腎臓疾患が、糸球体疾患、巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、または腎症である、請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる、２０１７年６月９日に出願された米国仮特許出願第６２／５１７，２３３号の利益を請求する。
【０００２】
配列表
本願は配列表を含み、これは、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出されており、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる。２０１８年５月１４日に作成された前記ＡＳＣＩＩのコピーはＰＣＦＣ−００４２−ＷＯ１＿ＳＬ．ｔｘｔという名であり、サイズは３６０，６６６バイトである。
【０００３】
共同研究契約の契約者
本発明は、共同研究契約の以下に列挙する契約者またはそれを代理するものによってなされた。共同研究契約は、本発明がなされた日またはそれ以前に効力を有しており、また、本発明は、共同研究契約の範囲内で行われた活動の結果としてなされた。共同研究契約の契約者は、ＢＯＳＴＯＮ  ＭＥＤＩＣＡＬ  ＣＥＮＴＥＲ  ＣＯＲＰ．およびＰＦＩＺＥＲ  ＩＮＣ．である。
【背景技術】
【０００４】
慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）は、末期の腎不全をもたらすことが多い、世界的な公衆衛生上の課題である。ＣＫＤは、推定で米国の人口の１３％、すなわち≒２７００万人、および世界中で５億を超える人が罹患している。ＣＫＤの流行は増大を続けることが予測されており、それは、糖尿病および肥満が一般集団で蔓延しているためである。ＵＳにおける約５０万人のＣＫＤ患者（世界中で≒７００万人）が末期の腎臓疾患（ＥＳＲＤ）に進行し、生存のために透析または腎臓移植が必要となるであろう。ＥＳＲＤの罹患率および死亡率は高く、米国人では毎年少なくとも４００億ドルの費用がかかっている。
【０００５】
タンパク尿（すなわち、尿中アルブミンレベル＞３０ｍｇ／日として一般に定義される、尿における過剰な血清タンパク質の存在）は、糖尿病を有する患者および有さない患者におけるＣＫＤの早期のバイオマーカー、危険因子、および代理アウトカムである。ＣＫＤの初期段階の間のタンパク尿のレベルを低減させるための処置は、ＥＳＲＤへの進行を遅らせることができる。しかし、タンパク尿を伴うＣＫＤ患者にとって現在利用可能な処置は存在しない。
【０００６】
ポドサイトは、糸球体基底膜の外表面を被覆するための一次および二次突起を伸ばす、特別な上皮細胞である。隣接するポドサイトから出ている、アクチンに富んだ、指状嵌入する二次突起（すなわち、足突起）は、タンパク質の透過に対する最終的な障壁を形成する半多孔質のスリット膜によって架橋されている濾過スリットを生成する。タンパク尿は、糖尿病性のおよび非糖尿病性の腎臓疾患におけるポドサイトの損傷の臨床的徴候である。ポドサイトの分子成分における遺伝性の、先天的な、または後天的な異常がタンパク尿をもたらすことを示す研究が発表される数は増え続けている。ネフリンおよびポドシンなどのポドサイトのスリット膜タンパク質の遺伝子突然変異はタンパク尿性腎臓疾患の遺伝形式に関連するが、スリット膜を形成し、スリット膜に会合するタンパク質が、単なる受動的な構造的障壁を超えたものであることが、次第に明らかになってきている。それどころか、多くの証拠が、これらのタンパク質が、アクチン細胞骨格との相互作用を介してポドサイトの足突起の構造および機能に影響し得るバランスの取れたシグナル伝達ネットワークを形成することを示唆している。
【０００７】
Ｒｏｕｎｄａｂｏｕｔ受容体２（ＲＯＢＯ２、Ｒｏｕｎｄａｂｏｕｔ  Ｇｕｉｄａｎｃｅ受容体２またはＲｏｕｎｄａｂｏｕｔホモログ２とも呼ばれる）は、ＳＬＩＴリガンドの受容体であり、ＳＬＩＴ−ＲＯＢＯ２シグナル伝達は、神経系の発生の際に軸索回路形成を制御するための化学反発性のガイダンスキューとしてまず特徴付けされた。最近のデータによって、ＲＯＢＯ２が腎臓内の糸球体ポドサイトの基底表面で発現するポドサイトタンパク質でもあることが示されている。ＲＯＢＯ２は、糸球体濾過障壁においてネフリンと複合体を形成し、ネフリンによって誘発されるアクチンダイナミクスを阻害するための負の調節因子として作用する。ＲＯＢＯ２の喪失は、ポドサイトのアクチン／ミオシンダイナミクスを改変し、かつ、糸球体基底膜への接着を増大させる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
多くの糸球体疾患（巣状分節性糸球体硬化症を含む）に罹患している患者には、現在、腎機能を維持するために利用可能な治療法が存在しない。さらに、タンパク尿を伴うＣＫＤ患者にとって現在利用可能な処置も存在しない。したがって、ＲＯＢＯ２−ＳＬＩＴシグナル伝達を調節し、それによってポドサイトの機能を維持するかまたは調節し、タンパク尿を減少させる可能性がある治療が必要であると考えられるようになって久しい。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、ＲＯＢＯ２に特異的に結合する抗体（およびその抗原結合断片）、ならびにその使用および関連する方法を提供する。当業者であれば、通常の実験を使用すれば、本明細書において記載される本発明の具体的な実施形態の多くの均等物を認識するか、または確認することができよう。このような均等物は、以下の実施形態（Ｅ）によって包含されるものである。
【００１０】
Ｅ１．Ｒｏｕｎｄａｂｏｕｔ受容体２（ＲＯＢＯ２）のＩｇドメイン１内、またはＩｇドメイン１およびＩｇドメイン２内のエピトープに結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片であって、前記エピトープが、配列番号１の番号付けに従った残基Ｒ１００を含む、抗体またはその抗原結合断片。
【００１１】
Ｅ２．前記エピトープが、配列番号１の番号付けに従ったＶ９６、Ｇ９８、Ｒ９９、およびＳ１０１からなる群から選択される１つまたは複数の残基をさらに含む、Ｅ１の抗体またはその抗原結合断片。
【００１２】
Ｅ３．前記エピトープが、配列番号１の番号付けに従った残基Ｖ９６、Ｇ９８、Ｒ９９、およびＳ１０１をさらに含む、Ｅ１またはＥ２の抗体またはその抗原結合断片。
【００１３】
Ｅ４．前記エピトープが、配列番号１の番号付けに従ったＥ６９、Ｅ７２、Ｒ７９、Ｈ８１、Ｒ８２、Ｒ９４、およびＰ１０３からなる群から選択される１つまたは複数の残基を含む、Ｅ１〜Ｅ３のいずれか１つの抗体またはその抗原結合断片。
【００１４】
Ｅ５．前記エピトープが、配列番号１の番号付けに従ったＥ６９、Ｅ７２、Ｒ７９、Ｈ８１、Ｒ８２、Ｒ９４、およびＰ１０３からなる群から選択される１つまたは複数の残基を含む、Ｅ１〜Ｅ４のいずれか１つの抗体またはその抗原結合断片。
【００１５】
Ｅ６．Ｒ１００がＫで置き換えられているエピトープにほとんど結合しない、Ｅ１〜Ｅ５のいずれか１つの抗体またはその抗原結合断片。
【００１６】
Ｅ７．配列番号１の番号付けに従ったアミノ酸残基Ｒ１００がＫで置き換えられアミノ酸残基Ｋ１０２がＲで置き換えられている突然変異エピトープ（ＲＯＢＯ２−ＫＳＲ）にほとんど結合しない、Ｅ１〜Ｅ６のいずれか１つの抗体またはその抗原結合断片。
【００１７】
Ｅ８．Ｒ１００がＫで置き換えられているエピトープに対するその結合親和性（ＫＤ）値の多くとも１００分の１、多くとも２００分の１、多くとも３００分の１、多くとも４００分の１、多くとも５００分の１、多くとも６００分の１、多くとも７００分の１、多くとも８００分の１、多くとも９００分の１、または多くとも１０００分の１であるＫＤ値で前記エピトープに結合する、Ｅ１〜Ｅ６のいずれか１つの抗体またはその抗原結合断片。
【００１８】
Ｅ９．ＲＯＢＯ１にほとんど結合しない、Ｅ１〜Ｅ８のいずれか１つの抗体またはその抗原結合断片。
【００１９】
Ｅ１０．配列番号９の番号付けに従ったＲＯＢＯ１のアミノ酸残基Ｋ１３７がＲで置き換えられＲＯＢＯ１のアミノ酸残基Ｒ１３９がＫで置き換えられている突然変異体ＲＯＢＯ１（ＲＯＢＯ１−ＲＳＫ）に特異的に結合する、Ｅ１〜Ｅ８のいずれか１つの抗体またはその抗原結合断片。
【００２０】
Ｅ１１．ＲＯＢＯ１に対するそのＫＤ値の多くとも１００分の１、多くとも２００分の１、多くとも３００分の１、多くとも４００分の１、多くとも５００分の１、多くとも６００分の１、多くとも７００分の１、多くとも８００分の１、多くとも９００分の１、または多くとも１０００分の１である結合親和性（ＫＤ）値でＲＯＢＯ２に結合する、Ｅ１〜Ｅ８のいずれか１つの抗体またはその抗原結合断片。
【００２１】
Ｅ１２．前記ＫＤ値が、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００機器を場合により使用して、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定される、Ｅ８またはＥ１１の抗体またはその抗原結合断片。
【００２２】
Ｅ１３．前記ＫＤ値が、ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔ機器を場合により使用して、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）によって測定される、Ｅ８またはＥ１１の抗体またはその抗原結合断片。
【００２３】
Ｅ１４．前記ＲＯＢＯ１がヒトＲＯＢＯ１である、Ｅ９〜Ｅ１３のいずれか１つの抗体またはその抗原結合断片。
【００２４】
Ｅ１５．前記ＲＯＢＯ１が配列番号１３を含む、Ｅ１４の抗体またはその抗原結合断片。
【００２５】
Ｅ１６．前記ＲＯＢＯ２がヒトＲＯＢＯ２である、Ｅ１〜Ｅ１５のいずれか１つの抗体またはその抗原結合断片。
【００２６】
Ｅ１７．前記ＲＯＢＯ２が配列番号５を含む、Ｅ１６の抗体またはその抗原結合断片。
【００２７】
Ｅ１８．
（ａ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＨ相補性決定領域１（ＣＤＲ−Ｈ１）、
（ｂ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＶＨ相補性決定領域２（ＣＤＲ−Ｈ２）、および
（ｃ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＨ相補性決定領域３（ＣＤＲ−Ｈ３）
を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、Ｅ１〜Ｅ１７のいずれか１つの抗体またはその抗原結合断片。
【００２８】
Ｅ１９．配列番号３２のＣＤＲ−Ｈ１配列、ＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＣＤＲ−Ｈ３配列を含む、Ｅ１〜Ｅ１８のいずれか１つの抗体またはその抗原結合断片。
【００２９】
Ｅ２０．
（ａ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、
（ｂ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および
（ｃ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３
を含むＶＨを含む、ＲＯＢＯ２に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片。
【００３０】
Ｅ２１．ヒト生殖細胞系ＶＨ３フレームワーク配列に由来するＶＨフレームワークを含む、Ｅ１〜Ｅ２０のいずれか１つの抗体またはその抗原結合断片。
【００３１】
Ｅ２２．ヒト生殖細胞系ＶＨ１フレームワーク配列に由来するＶＨフレームワークを含む、Ｅ１〜Ｅ２０のいずれか１つの抗体またはその抗原結合断片。
【００３２】
Ｅ２３．ヒト生殖細胞系ＶＨ５フレームワーク配列に由来するＶＨフレームワークを含む、Ｅ１〜Ｅ２０のいずれか１つの抗体またはその抗原結合断片。
【００３３】
Ｅ２４．ヒトＶＨ生殖細胞系コンセンサスフレームワーク配列を含む、Ｅ１〜Ｅ２０のいずれか１つの抗体またはその抗原結合断片。
【００３４】
Ｅ２５．ＤＰ５４、ＤＰ４７、ＤＰ５０、ＤＰ３１、ＤＰ４６、ＤＰ７１、ＤＰ７５、ＤＰ１０、ＤＰ７、ＤＰ４９、ＤＰ５１、ＤＰ３８、ＤＰ７９、ＤＰ７８、ＤＰ７３、ＶＨ１コンセンサス、ＶＨ２コンセンサス、ＶＨ３コンセンサス、ＶＨ４コンセンサス、およびＶＨ５コンセンサスからなる群から選択されるヒト生殖細胞系ＶＨ配列に由来するＶＨフレームワーク配列を含む、Ｅ１〜Ｅ２４のいずれか１つの抗体またはその抗原結合断片。
【００３５】
Ｅ２６．ＤＰ５４、ＤＰ４７、ＤＰ５０、ＤＰ３１、ＤＰ４６、ＤＰ４９、およびＤＰ５１からなる群から選択されるヒト生殖細胞系ＶＨ配列に由来するフレームワークＶＨ配列を含む、Ｅ１〜Ｅ２５のいずれか１つの抗体またはその抗原結合断片。
【００３６】
Ｅ２７．ＤＰ５４、ＤＰ４７、ＤＰ５０、およびＤＰ３１からなる群から選択されるヒト生殖細胞系ＶＨ配列に由来するフレームワークＶＨ配列を含む、Ｅ１〜Ｅ２６のいずれか１つの抗体またはその抗原結合断片。
【００３７】
Ｅ２８．ヒト生殖細胞系ＤＰ５４配列に由来するＶＨフレームワーク配列を含む、Ｅ１〜Ｅ２７のいずれか１つの抗体またはその抗原結合断片。
【００３８】
Ｅ２９．
（ａ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＶＬ相補性決定領域１（ＣＤＲ−Ｌ１）、
（ｂ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＶＬ相補性決定領域２（ＣＤＲ−Ｌ２）、および
（ｃ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＶＬ相補性決定領域３（ＣＤＲ−Ｌ３）
を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、Ｅ１〜Ｅ２８のいずれか１つの抗体またはその抗原結合断片。
【００３９】
Ｅ３０．配列番号３９のＣＤＲ−Ｌ１配列、ＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＣＤＲ−Ｌ３配列を含む、Ｅ１〜Ｅ２９のいずれか１つの抗体またはその抗原結合断片。
【００４０】
Ｅ３１．配列番号３２のＣＤＲ−Ｈ１配列、ＣＤＲ−Ｈ２配列、およびＣＤＲ−Ｈ３配列、ならびに配列番号３９のＣＤＲ−Ｌ１配列、ＣＤＲ−Ｌ２配列、およびＣＤＲ−Ｌ３配列を含む、ＲＯＢＯ２に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片。
【００４１】
Ｅ３２．
（ｉ）
（ａ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、
（ｂ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および
（ｃ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３
を含むＶＨ、
ならびに
（ｉｉ）
（ａ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、
（ｂ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および
（ｃ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３
を含むＶＬ
を含む、ＲＯＢＯ２に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片。
【００４２】
Ｅ３３．ヒト生殖細胞系ＶΚフレームワーク配列に由来するＶＬフレームワークを含む、Ｅ１〜Ｅ３２のいずれか１つの抗体またはその抗原結合断片。
【００４３】
Ｅ３４．ヒト生殖細胞系Ｖλフレームワーク配列に由来するＶＬフレームワークを含む、Ｅ１〜Ｅ３２のいずれか１つの抗体またはその抗原結合断片。
【００４４】
Ｅ３５．ヒトＶＬ生殖細胞系コンセンサスフレームワーク配列を含む、Ｅ１〜Ｅ３２のいずれか１つの抗体またはその抗原結合断片。
【００４５】
Ｅ３６．ＤＰＫ９、ＤＰＫ１２、ＤＰＫ１８、ＤＰＫ２４、ＨＫ１０２＿Ｖ１、ＤＰＫ１、ＤＰＫ８、ＤＰＫ３、ＤＰＫ２１、Ｖｇ＿３８Ｋ、ＤＰＫ２２、ＤＰＫ１５、ＤＰＬ１６、ＤＰＬ８、Ｖ１−２２、Ｖλコンセンサス、Ｖλ１コンセンサス、Ｖλ３コンセンサス、ＶΚコンセンサス、ＶΚ１コンセンサス、ＶΚ２コンセンサス、およびＶΚ３コンセンサスからなる群から選択されるヒト生殖細胞系ＶＬ配列に由来するＶＬフレームワーク配列を含む、Ｅ１〜Ｅ３５のいずれか１つの抗体またはその抗原結合断片。
【００４６】
Ｅ３７．ヒト生殖細胞系ＶΚ１配列に由来するＶＬフレームワーク配列を含む、Ｅ１〜Ｅ３３、Ｅ３５、およびＥ３６のいずれか１つの抗体またはその抗原結合断片。
【００４７】
Ｅ３８．ＤＰＫ９、ＨＫ１０２＿Ｖ１、ＤＰＫ１、およびＤＰＫ８からなる群から選択されるヒト生殖細胞系ＶＬ配列に由来するＶＬフレームワーク配列を含む、Ｅ１〜Ｅ３６のいずれか１つの抗体またはその抗原結合断片。
【００４８】
Ｅ３９．ヒト生殖細胞系ＤＰＫ９配列に由来するＶＬフレームワーク配列を含む、Ｅ１〜Ｅ３６のいずれか１つの抗体またはその抗原結合断片。
【００４９】
Ｅ４０．ＶＬフレームワーク配列およびＶＨフレームワーク配列を含み、ＶＬフレームワーク配列またはＶＨフレームワーク配列の一方または両方が、それが由来する元であるヒト生殖細胞系フレームワーク配列と少なくとも９０％同一である、Ｅ１〜Ｅ３９のいずれか１つの抗体またはその抗原結合断片。
【００５０】
Ｅ４１．ＶＬフレームワーク配列およびＶＨフレームワーク配列を含み、ＶＬフレームワーク配列またはＶＨフレームワーク配列の一方または両方が、それが由来する元であるヒト生殖細胞系フレームワーク配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である、Ｅ１〜Ｅ４０のいずれか１つの抗体またはその抗原結合断片。
【００５１】
Ｅ４２．ＶＬフレームワーク配列およびＶＨフレームワーク配列を含み、ＶＬフレームワーク配列またはＶＨフレームワーク配列の一方または両方が、それが由来する元であるヒト生殖細胞系フレームワーク配列と同一である、Ｅ１〜Ｅ４１のいずれか１つの抗体またはその抗原結合断片。
【００５２】
Ｅ４３．配列番号３２、４３、４９、５５、７０、７３、７６、７９、８２、８５、８８、１１５、１１９、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、および１３２のいずれか１つに少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むＶＨを含む、実施形態Ｅ１〜Ｅ４２のいずれか１つの抗体またはその抗原結合断片。
【００５３】
Ｅ４４．配列番号３２および１２６〜１３２のいずれか１つに少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一なアミノ酸配列を含むＶＨを含む、Ｅ１〜Ｅ４３のいずれか１つの抗体またはその抗原結合断片。
【００５４】
Ｅ４５．配列番号３２および１２６〜１３２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨを含む、Ｅ１〜Ｅ４４のいずれか１つの抗体またはその抗原結合断片。
【００５５】
Ｅ４６．配列番号３９、４６、５２、５８、６１、６４、６７、９１、９４、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、および１３３に少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むＶＬを含む、Ｅ１〜Ｅ４５のいずれか１つの抗体またはその抗原結合断片。
【００５６】
Ｅ４７．配列番号３９または１３３に少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一なアミノ酸配列を含むＶＨを含む、Ｅ１〜Ｅ４６のいずれか１つの抗体またはその抗原結合断片。
【００５７】
Ｅ４８．配列番号３９または１３３のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、Ｅ１〜Ｅ４７のいずれか１つの抗体またはその抗原結合断片。
【００５８】
Ｅ４９．Ｆｃドメインを含む、Ｅ１〜Ｅ４８のいずれか１つの抗体またはその抗原結合断片。
【００５９】
Ｅ５０．Ｆｃドメインが、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１もしくはＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、またはＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４）のＦｃドメインである、Ｅ４９の抗体またはその抗原結合断片。
【００６０】
Ｅ５１．ＦｃドメインがＩｇＧのＦｃドメインである、Ｅ５０の抗体またはその抗原結合断片。
【００６１】
Ｅ５２．ＩｇＧが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４からなる群から選択される、Ｅ５１の抗体またはその抗原結合断片。
【００６２】
Ｅ５３．ＩｇＧがＩｇＧ１である、Ｅ５２の抗体またはその抗原結合断片。
【００６３】
Ｅ５４．配列番号３８、４５、５１、５７、７２、７５、７８、８１、８４、８７、９０、１１８、１２１、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、および１４０のいずれか１つに少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む重鎖を含む、Ｅ１〜Ｅ５３のいずれか１つの抗体またはその抗原結合断片。
【００６４】
Ｅ５５．配列番号３８、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、および１４０のいずれか１つに少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一なアミノ酸を含む重鎖を含む、Ｅ１〜Ｅ５４のいずれか１つの抗体またはその抗原結合断片。
【００６５】
Ｅ５６．配列番号３８、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、および１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む重鎖を含む、Ｅ１〜Ｅ５５のいずれか１つの抗体またはその抗原結合断片。
【００６６】
Ｅ５７．配列番号４２、４８、５４、６０、６３、６６、６９、９３、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、および１４１のいずれか１つに少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、Ｅ１〜Ｅ５６のいずれか１つの抗体またはその抗原結合断片。
【００６７】
Ｅ５８．配列番号４２または１４１に少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一なアミノ酸配列を含むＬＣを含む、Ｅ１〜Ｅ５７のいずれか１つの抗体またはその抗原結合断片。
【００６８】
Ｅ５９．配列番号４２または１４１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、Ｅ１〜Ｅ５８のいずれか１つの抗体またはその抗原結合断片。
【００６９】
Ｅ６０．ＡＴＣＣに寄託されかつＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２３２６５またはＰＴＡ−１２３７００を有するプラスミドによってコードされるＶＨ配列を含む、Ｅ１〜Ｅ５９のいずれか１つの抗体またはその抗原結合断片。
【００７０】
Ｅ６１．ＡＴＣＣに寄託されかつＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２３２６６またはＰＴＡ−１２３７０１を有するプラスミドによってコードされるＶＬ配列を含む、Ｅ１〜Ｅ６０のいずれか１つの抗体またはその抗原結合断片。
【００７１】
Ｅ６２．ＡＴＣＣに寄託されかつＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２３２６５またはＰＴＡ−１２３７００を有するプラスミドによってコードされるＶＨを含む抗体またはその抗原結合断片。
【００７２】
Ｅ６３．ＡＴＣＣに寄託されかつＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２３２６６またはＰＴＡ−１２３７０１を有するプラスミドによってコードされるＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片。
【００７３】
Ｅ６４．ＡＴＣＣに寄託されかつＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２３２６５を有するプラスミドによってコードされるＶＨ、およびＡＴＣＣに寄託されかつＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２３２６６を有するプラスミドによってコードされるＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片。
【００７４】
Ｅ６５．ＡＴＣＣに寄託されかつＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２３７００を有するプラスミドによってコードされるＶＨ、およびＡＴＣＣに寄託されかつＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２３７０１を有するプラスミドによってコードされるＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片。
【００７５】
Ｅ６６．ＡＴＣＣに寄託されかつＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２３７００を有するプラスミドによってコードされるＶＨ、およびＡＴＣＣに寄託されかつＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２３２６６を有するプラスミドによってコードされるＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片。
【００７６】
Ｅ６７．ＡＴＣＣに寄託されかつＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２３２６５を有するプラスミドによってコードされるＶＨ、およびＡＴＣＣに寄託されかつＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２３７０１を有するプラスミドによってコードされるＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片。
【００７７】
Ｅ６８．Ｅ１〜Ｅ６７のいずれか１つの抗体またはその抗原結合断片と、ＲＯＢＯ２への結合について競合する抗体またはその抗原結合断片。
【００７８】
Ｅ６９．Ａｂｃｓ３５、９３Ｈ２、Ａｂ１、Ａｂ３、Ａｂ９、Ａｂ１３、Ａｂ１７、Ａｂ２１、Ａｂ２２、Ａｂ２５、Ａｂ２９、Ａｂ３２、Ａｂ４０、Ａｂ４５、Ａｂ４６、Ａｂ５８、Ａｂ８３、Ａｂ９６、Ａｂ１１２、Ａｂ１２３、Ａｂｃｓ１、Ａｂｃｓ２、Ａｂｃｓ４、Ａｂｃｓ５、Ａｂｃｓ１２、Ａｂｃｓ２０、Ａｂｃｓ２５、Ａｂｃｓ４０、Ａｂｃｓ５０、Ａｂｃｓ５５、ＣＴＩＲ２−１、ＣＴＩＲ２−２、ＣＴＩＲ２−３、ＣＴＩＲ２−４、ＣＴＩＲ２−５、ＣＴＩＲ２−６、ＣＴＩＲ２−７、ＣＴＩＲ２−８、ＣＴＩＲ２−９、ＣＴＩＲ２−１０、ＣＴＩＲ２−１１、ＣＴＩＲ２−１２、ＣＴＩＲ２−１３、ＣＴＩＲ２−１４、ＣＴＩＲ２−１５、ＣＴＩＲ２−１６、Ａｂｃｓ３５−Ａ、Ａｂｃｓ３５−Ｂ、Ａｂｃｓ３５−Ｃ、Ａｂｃｓ３５−Ｄ、Ａｂｃｓ３５−Ｅ、Ａｂｃｓ３５−Ｆ、Ａｂｃｓ３５−Ｇ、Ａｂｃｓ３５−Ｈ、Ａｂｃｓ３５−Ｉ、Ａｂｃｓ３５−Ｊ、Ａｂｃｓ３５−Ｋ、Ａｂｃｓ３５−Ｌ、Ａｂｃｓ３５−Ｍ、Ａｂｃｓ３５−Ｎ、およびＡｂｃｓ３５−Ｏからなる群から選択される抗体と、ＲＯＢＯ２への結合について競合する抗体またはその抗原結合断片。
【００７９】
Ｅ７０．Ａｂｃｓ３５、Ａｂｃｓ３５−Ａ、Ａｂｃｓ３５−Ｂ、Ａｂｃｓ３５−Ｃ、Ａｂｃｓ３５−Ｄ、Ａｂｃｓ３５−Ｅ、Ａｂｃｓ３５−Ｆ、Ａｂｃｓ３５−Ｇ、Ａｂｃｓ３５−Ｈ、Ａｂｃｓ３５−Ｉ、Ａｂｃｓ３５−Ｊ、Ａｂｃｓ３５−Ｋ、Ａｂｃｓ３５−Ｌ、Ａｂｃｓ３５−Ｍ、Ａｂｃｓ３５−Ｎ、およびＡｂｃｓ３５−Ｏからなる群から選択される抗体と、ＲＯＢＯ２への結合について競合する抗体またはその抗原結合断片。
【００８０】
Ｅ７１．Ｅ１〜Ｅ６７のいずれか１つの抗体またはその抗原結合断片と実質的に同一のエピトープに結合する、ＲＯＢＯ２に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片。
【００８１】
Ｅ７２．Ａｂｃｓ３５、９３Ｈ２、Ａｂ１、Ａｂ３、Ａｂ９、Ａｂ１３、Ａｂ１７、Ａｂ２１、Ａｂ２２、Ａｂ２５、Ａｂ２９、Ａｂ３２、Ａｂ４０、Ａｂ４５、Ａｂ４６、Ａｂ５８、Ａｂ８３、Ａｂ９６、Ａｂ１１２、Ａｂ１２３、Ａｂｃｓ１、Ａｂｃｓ２、Ａｂｃｓ４、Ａｂｃｓ５、Ａｂｃｓ１２、Ａｂｃｓ２０、Ａｂｃｓ２５、Ａｂｃｓ４０、Ａｂｃｓ５０、Ａｂｃｓ５５、ＣＴＩＲ２−１、ＣＴＩＲ２−２、ＣＴＩＲ２−３、ＣＴＩＲ２−４、ＣＴＩＲ２−５、ＣＴＩＲ２−６、ＣＴＩＲ２−７、ＣＴＩＲ２−８、ＣＴＩＲ２−９、ＣＴＩＲ２−１０、ＣＴＩＲ２−１１、ＣＴＩＲ２−１２、ＣＴＩＲ２−１３、ＣＴＩＲ２−１４、ＣＴＩＲ２−１５、ＣＴＩＲ２−１６、Ａｂｃｓ３５−Ａ、Ａｂｃｓ３５−Ｂ、Ａｂｃｓ３５−Ｃ、Ａｂｃｓ３５−Ｄ、Ａｂｃｓ３５−Ｅ、Ａｂｃｓ３５−Ｆ、Ａｂｃｓ３５−Ｇ、Ａｂｃｓ３５−Ｈ、Ａｂｃｓ３５−Ｉ、Ａｂｃｓ３５−Ｊ、Ａｂｃｓ３５−Ｋ、Ａｂｃｓ３５−Ｌ、Ａｂｃｓ３５−Ｍ、Ａｂｃｓ３５−Ｎ、およびＡｂｃｓ３５−Ｏからなる群から選択される抗体と実質的に同一のエピトープに結合する、ＲＯＢＯ２に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片。
【００８２】
Ｅ７３．Ａｂｃｓ３５、Ａｂｃｓ３５−Ａ、Ａｂｃｓ３５−Ｂ、Ａｂｃｓ３５−Ｃ、Ａｂｃｓ３５−Ｄ、Ａｂｃｓ３５−Ｅ、Ａｂｃｓ３５−Ｆ、Ａｂｃｓ３５−Ｇ、Ａｂｃｓ３５−Ｈ、Ａｂｃｓ３５−Ｉ、Ａｂｃｓ３５−Ｊ、Ａｂｃｓ３５−Ｋ、Ａｂｃｓ３５−Ｌ、Ａｂｃｓ３５−Ｍ、Ａｂｃｓ３５−Ｎ、およびＡｂｃｓ３５−Ｏからなる群から選択される抗体と実質的に同一のエピトープに結合する、ＲＯＢＯ２に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片。
【００８３】
Ｅ７４．Ａｂｃｓ３５、９３Ｈ２、Ａｂ１、Ａｂ３、Ａｂ９、Ａｂ１３、Ａｂ１７、Ａｂ２１、Ａｂ２２、Ａｂ２５、Ａｂ２９、Ａｂ３２、Ａｂ４０、Ａｂ４５、Ａｂ４６、Ａｂ５８、Ａｂ８３、Ａｂ９６、Ａｂ１１２、Ａｂ１２３、Ａｂｃｓ１、Ａｂｃｓ２、Ａｂｃｓ４、Ａｂｃｓ５、Ａｂｃｓ１２、Ａｂｃｓ２０、Ａｂｃｓ２５、Ａｂｃｓ４０、Ａｂｃｓ５０、Ａｂｃｓ５５、ＣＴＩＲ２−１、ＣＴＩＲ２−２、ＣＴＩＲ２−３、ＣＴＩＲ２−４、ＣＴＩＲ２−５、ＣＴＩＲ２−６、ＣＴＩＲ２−７、ＣＴＩＲ２−８、ＣＴＩＲ２−９、ＣＴＩＲ２−１０、ＣＴＩＲ２−１１、ＣＴＩＲ２−１２、ＣＴＩＲ２−１３、ＣＴＩＲ２−１４、ＣＴＩＲ２−１５、ＣＴＩＲ２−１６、Ａｂｃｓ３５−Ａ、Ａｂｃｓ３５−Ｂ、Ａｂｃｓ３５−Ｃ、Ａｂｃｓ３５−Ｄ、Ａｂｃｓ３５−Ｅ、Ａｂｃｓ３５−Ｆ、Ａｂｃｓ３５−Ｇ、Ａｂｃｓ３５−Ｈ、Ａｂｃｓ３５−Ｉ、Ａｂｃｓ３５−Ｊ、Ａｂｃｓ３５−Ｋ、Ａｂｃｓ３５−Ｌ、Ａｂｃｓ３５−Ｍ、Ａｂｃｓ３５−Ｎ、およびＡｂｃｓ３５−Ｏからなる群から選択される抗体と同一のエピトープに結合する、ＲＯＢＯ２に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片。
【００８４】
Ｅ７５．
（ｉ）Ａｂｃｓ３５および９３Ｈ２から選択される抗体と実質的に同一のエピトープに結合する、ならびに
（ｉｉ）ＲＯＢＯ１に結合しないが、配列番号９の番号付けに従ったアミノ酸残基Ｋ１３７がＲで置き換えられアミノ酸残基Ｒ１３９がＫで置き換えられているＲＯＢＯ１−ＲＳＫ突然変異体には結合する、
ＲＯＢＯ２に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片。
【００８５】
Ｅ７６．Ｆｃ融合タンパク質、モノボディ、マキシボディ、二官能性抗体、ｓｃＦａｂ、ｓｃＦｖ、またはペプチボディである、Ｅ１〜Ｅ７５のいずれか１つの抗体またはその抗原結合断片。
【００８６】
Ｅ７７．約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約９００ｐＭ未満、約８００ｐＭ未満、約７００ｐＭ未満、約６００ｐＭ未満、約５００ｐＭ未満、約４００ｐＭ未満、約３００ｐＭ未満、約２５０ｐＭ未満、約２００ｐＭ未満、約１５０ｐＭ未満、約１００ｐＭ未満、約５０ｐＭ未満、約４０ｐＭ未満、約３０ｐＭ未満、約２５ｐＭ未満、約２０ｐＭ未満、約１５ｐＭ未満、約１０ｐＭ未満、約５ｐＭ未満、または約１ｐＭ未満のＫＤ値でＲＯＢＯ２に結合する、Ｅ１〜７６の抗体またはその抗原結合断片。
【００８７】
Ｅ７８．（ａ）ＳＬＩＴおよびＲＯＢＯ２の結合を阻害する、（ｂ）ｓｒＧＡＰ１およびＲＯＢＯ２の結合もしくはＮｃｋおよびＲＯＢＯ２の結合を低減させる、ならびに／または（ｃ）ＲＯＢＯ２依存性のＳＬＩＴ−Ｎ活性を阻害する、Ｅ１〜７７の抗体またはその抗原結合断片。
【００８８】
Ｅ７９．Ｅ１〜Ｅ７８のいずれか１つの抗体またはその抗原結合断片をコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【００８９】
Ｅ８０．配列番号１４３のヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【００９０】
Ｅ８１．配列番号１４４のヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【００９１】
Ｅ８２．配列番号１４５のヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【００９２】
Ｅ８３．配列番号１４６のヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【００９３】
Ｅ８４．ＡＴＣＣに寄託されかつ受託番号ＰＴＡ−１２３２６５を有するプラスミドのインサートのヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【００９４】
Ｅ８５．ＡＴＣＣに寄託されかつ受託番号ＰＴＡ−１２３２６６を有するプラスミドのインサートのヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【００９５】
Ｅ８６．ＡＴＣＣに寄託されかつ受託番号ＰＴＡ−１２３７００を有するプラスミドのインサートヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【００９６】
Ｅ８７．ＡＴＣＣに寄託されかつ受託番号ＰＴＡ−１２３７０１を有するプラスミドのインサートのヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【００９７】
Ｅ８８．Ｅ７９〜Ｅ８７のいずれか１つの核酸を含むベクター。
【００９８】
Ｅ８９．Ｅ７９〜Ｅ８７のいずれか１つの核酸を含む宿主細胞。
【００９９】
Ｅ９０．Ｅ８９のベクターを含む宿主細胞。
【０１００】
Ｅ９１．哺乳動物細胞である、Ｅ９０の宿主細胞。
【０１０１】
Ｅ９２．ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、またはＳｐ２．０細胞である、Ｅ９１の宿主細胞。
【０１０２】
Ｅ９３．抗体またはその抗原結合断片を作製する方法であって、Ｅ８９〜Ｅ９２のいずれか１つの宿主細胞を、前記抗体または抗原結合断片が前記宿主細胞によって発現される条件下で培養することを含む方法。
【０１０３】
Ｅ９４．前記抗体またはその抗原結合断片を単離することをさらに含む、Ｅ９３の方法。
【０１０４】
Ｅ９５．Ｅ１〜Ｅ７８のいずれか１つの抗体またはその抗原結合断片、および薬学的に許容できる担体または賦形剤を含む医薬組成物。
【０１０５】
Ｅ９６．治療有効量の実施形態Ｅ１〜Ｅ７８のいずれか１つの抗体もしくはその抗原結合断片、またはＥ９５の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、ＲＯＢＯ２の活性を低減させる方法。
【０１０６】
Ｅ９７．治療有効量のＥ１〜Ｅ７８のいずれか１つの抗体もしくはその抗原結合断片、またはＥ９５の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、腎臓疾患を処置する方法。
【０１０７】
Ｅ９８．治療有効量のＥ１〜Ｅ７８のいずれか１つの抗体もしくはその抗原結合断片、またはＥ９５の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、ポドサイトの機能を維持または調節する方法。
【０１０８】
Ｅ９９．治療有効量のＥ１〜Ｅ７８のいずれか１つの抗体もしくはその抗原結合断片、またはＥ９５の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、糸球体疾患を処置する方法。
【０１０９】
Ｅ１００．治療有効量のＥ１〜Ｅ７８のいずれか１つの抗体もしくはその抗原結合断片、またはＥ９５の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）を処置する方法。
【０１１０】
Ｅ１０１．治療有効量のＥ１〜Ｅ７８のいずれか１つの抗体もしくはその抗原結合断片、またはＥ９５の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、腎症を処置する方法。
【０１１１】
Ｅ１０２．前記腎症がＩｇＡ腎症である、Ｅ１０１の方法。
【０１１２】
Ｅ１０３．前記対象がヒトである、Ｅ９６〜Ｅ１０２のいずれか１つの方法。
【０１１３】
Ｅ１０４．前記抗体もしくはその抗原結合断片または医薬組成物を静脈内に投与することを含む、Ｅ９６〜Ｅ１０３のいずれか１つの方法。
【０１１４】
Ｅ１０５．前記抗体もしくはその抗原結合断片または医薬組成物を皮下に投与することを含む、Ｅ９６〜Ｅ１０３のいずれか１つの方法。
【０１１５】
Ｅ１０６．前記抗体もしくはその抗原結合断片または医薬組成物が、おおよそ週に２回、週に１回、２週間ごとに１回、３週間ごとに１回、４週間ごとに１回、５週間ごとに１回、６週間ごとに１回、７週間ごとに１回、８週間ごとに１回、９週間ごとに１回、１０週間ごとに１回、月に２回、月に１回、２カ月ごとに１回、３カ月ごとに１回、または４カ月ごとに１回投与される、Ｅ９６〜Ｅ１０５のいずれか１つの方法。
【０１１６】
Ｅ１０７．薬剤として使用するための、Ｅ１〜Ｅ７８のいずれか１つの抗体もしくはその抗原結合断片、またはＥ９５の医薬組成物。
【０１１７】
Ｅ１０８．対象におけるＲＯＢＯ２の活性の低減において使用するための、Ｅ１〜Ｅ７８のいずれか１つの抗体もしくはその抗原結合断片、またはＥ９５の医薬組成物。
【０１１８】
Ｅ１０９．対象におけるポドサイト機能の維持または調節において使用するための、Ｅ１〜Ｅ７８のいずれか１つの抗体もしくはその抗原結合断片、またはＥ９５の医薬組成物。
【０１１９】
Ｅ１１０．対象における糸球体疾患（ＦＳＧＳなど）の処置において使用するための、Ｅ１〜Ｅ７８のいずれか１つの抗体もしくはその抗原結合断片、またはＥ９５の医薬組成物。
【０１２０】
Ｅ１１１．対象における腎症（ＩｇＡ腎症など）の処置において使用するための、Ｅ１〜Ｅ７８のいずれか１つの抗体もしくはその抗原結合断片、またはＥ９５の医薬組成物。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】Ａｂｃｓ３５がヒトＲＯＢＯ２に高い親和性で結合することを実証する図である。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して、Ａｂｃｓ３５のＫＤは０．２６８ｎＭであると判定された。まず、８点からなるＡｂｃｓ３５の２倍連続希釈物を、ＣＭ５チップ上で３００ＲＵに固定した。センサーを次いで、ＲＯＢＯ２  Ｉｇ１，Ｉｇ２−Ｈｉｓに曝露した。会合および解離を経時的に追跡した。
【図２】組換えタンパク質を利用しての、ＲＯＢＯ２のＲＳＫエピトープへのＡｂｃｓ３５の結合の特異性を実証する図である。Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄ  ＡＨＣ（抗ヒトＩｇＧ  ＦＣ）センサーにＡｂｃｓ３５をロードした。ロードしたセンサーを次いで、ヒトＲＯＢＯ２  Ｉｇ１−２、ラットＲＯＢＯ２  Ｉｇ１−２、ＲＯＢＯ１内のＲＳＫがＫＳＲに突然変異したヒトＲＯＢＯ２  Ｉｇ１−２、またはＲＯＢＯ１  Ｉｇ１−２に曝露し、次いで、センサーを、いかなるＲＯＢＯ１タンパク質もＲＯＢＯ２タンパク質も含まないＰＢＳのみに移した。矢印は、試験対象のＲＯＢＯタンパク質の各々についての曲線を示す。ヒトおよびラットのＲＯＢＯ２タンパク質はＡｂｃｓ３５に結合したが、その一方で、ＲＯＢＯ１およびＲＯＢＯ２−ＫＳＲタンパク質はＡｂｃｓ３５に結合しなかった。
【図３】ヒトＲＯＢＯ２に対するＡｂｃｓ３５の用量依存性の結合、およびＲＯＢＯ２におけるＲＳＫエピトープの特異的認識を示す図である。１１点からなる３倍連続希釈物をＡｂｃｓ３５で作製し、ヒトＲＯＢＯ２（陽性対照、黒い丸印）、ＲＯＢＯ２のＲＳＫモチーフを含むように突然変異されたヒトＲＯＢＯ１（灰色の丸印）、またはＲＯＢＯ１のＫＳＲモチーフを含むように突然変異されたＲＯＢＯ２（黒いダイヤ印）のいずれかを過剰発現するＨＥＫ２９３細胞への結合を評価した。用量依存性の結合は、ネイティブなＲＯＢＯ２またはＲＯＢＯ１−ＲＳＫでのみ見られるが、ＲＯＢＯ２−ＫＳＲでは見られず、このことは、Ａｂｃｓ３５がＲＯＢＯ２に、具体的にはＲＯＢＯ２内のＲＳＫモチーフに結合することを示している。
【図４】Ａｂｃｓ３５がカニクイザルおよびラットのＲＯＢＯ２オルソログの両方と交差反応することを実証する図である。１１点からなる３倍連続希釈物をＡｂｃｓ３５で作製し、対照ＨＥＫ２９３細胞（黒いダイヤ印）、またはヒトＲＯＢＯ２（塗りつぶされた黒い丸印）、カニクイザルＲＯＢＯ２（塗りつぶされた灰色の丸印）、もしくはラットＲＯＢＯ２（白抜きの灰色の丸印）を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞への結合を評価するために使用した。用量依存性の結合は、ヒト、カニクイザル、またはラットのＲＯＢＯ２を発現する細胞で見られるが、対照ＨＥＫ２９３細胞では見られず、このことは、Ａｂｃｓ３５が両オルソログを認識することを示している。
【図５】ホモジニアス時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）によって評価された、ＲＯＢＯ２へのＳＬＩＴ２−Ｎの結合の用量依存性の阻害を実証する図である。親９３Ｈ２および親和性が成熟したＡｂｃｓ３５の両方が、ＳＬＩＴ２−Ｎの結合を中和する。
【図６】神経細胞移動のＳＬＩＴ２−Ｎ介在性の阻害の用量依存性の阻害を示す図である。表５に記載するように、ＳＶＺ神経組織細胞の外植片を、１ｎＭのＳＬＩＴ２−Ｎの存在下で一晩培養し、Ａｂｃｓ３５の量を滴定した。Ａｂｃｓ３５は、用量依存性の様式で神経細胞移動を回復し得、神経細胞移動のＲＯＢＯ２依存性のＳＬＩＴ２−Ｎ介在性の阻害を基本的に逆転させた。
【図７】ラット受身ヘイマン腎炎モデルにおけるＡｂｃｓ３５のインビボでの有効性（Ａｂｃｓ３５を処置することでのタンパク尿の阻害）を実証する図である。示した群のそれぞれにおいて１２頭の動物を、示した用量のＡｂｃｓ３５または関連のない対照モノクローナル抗体で、０日目でのモデルの誘発の前日に開始して３日間ごとに１回、皮下に処置した。Ｙ軸は、ポドサイトの損傷の指標である尿中へのタンパク質の漏出の尺度としての、尿中のクレアチニンに対するアルブミンの比（ｍｇ／ｍｇ）を示す。Ｌｅｗｉｓラットに、ラット腎臓刷子縁に対して作製されたヒツジ抗血清（抗Ｆｘ１ａ、基底膜、およびポドサイト）を注射した。ラットは、ラットポドサイトに結合したヒツジ血清に対する免疫応答を示すようになる。ポドサイトが損傷し、消失するにつれて、タンパク尿は増大する。最大用量のＡｂｃｓ３５で処置すると、タンパク尿は、対照抗体での処置と比較して、反復測定ＡＮＯＶＡ統計分析によって、０．００１未満のｐ値で、最大３９％低減した。用量の効果もまた、０．００１未満のｐ値で統計的に有意であった。
【図８】Ａｂｃｓ３５での処置が、受身ヘイマン腎炎モデルにおいてポドサイトの下部構造に対する損傷を低減させることを実証する図である。示した群のそれぞれにおいて１２頭の動物を、示した用量のＡｂｃｓ３５または関連のない対照モノクローナル抗体で、図７に示すように０日目でのモデルの誘発の前日に開始して３日間ごとに１回、２５ｍｇ／ｋｇで皮下に処置して、１００％の標的カバレージを達成するようにした。１６日目に動物を屠殺した後、選択された腎臓試料を、透過型電子顕微鏡を使用してデジタル画像化した。反復することなく、２００倍の倍率で見られた最初の３つの糸球体の３つのループ状毛細血管を、５０００倍および１万倍の倍率で画像化した。ＩｍａｇｅＪソフトウェア（バージョン１．４７ｖ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を使用して手動でトレースし、高倍率の透過型電子顕微鏡の画像で、糸球体基底膜（ＧＢＭ）の単位長さ当たりの隣接した足突起（ＦＰ）の幅を測定した。Ａｂｃｓ３５で処置した動物のポドサイトの足突起は、対照抗体で処置した動物よりも有意に短く（両側Ｔ検定によると０．０１未満のｐ値）、このことは、Ａｂｃｓ３５で処置した動物のポドサイトの足突起がそれほど消失しておらず、糸球体の損傷から保護されていることを示している。
【図９】ヒトＲＯＢＯ２およびＲＯＢＯ１のＩｇ１ドメインおよびＩｇ２ドメインのアラインメントを示す図である。これらの配列は、配列番号１の番号付けに従ったＲＯＢＯ２の残基３１から２２０、および配列番号９の番号付けに従ったＲＯＢＯ１の６８から２５７である。１００から１０２のＲＯＢＯ２のＲＳＫモチーフ、および１３７〜１３９のＲＯＢＯ１のＫＳＲモチーフには下線が引かれている。上：配列番号１の残基３１〜２２０、下：配列番号９の残基６８から２５７。
【図１０】残基６８〜１６４（配列番号９に従った番号付け）のＲＯＢＯ１とアラインした、残基３１から１２７（配列番号１に従った番号付け）のヒトＲＯＢＯ２のＩｇ１ドメインのアラインメントを示す図である。９３Ｈ２抗体がＲＯＢＯ２を特異的に認識するがＲＯＢＯ１は特異的に認識しないようになる可能性がある、ＲＯＢＯ２とＲＯＢＯ１との間で異なるアミノ酸残基が、強調されている。
【図１１】ＲＯＢＯ２−ＳＬＩＴ２およびＲＯＢＯ２−９３Ｈ２のアラインされた結晶構造を示す図であり、これは、ＲＯＢＯ２とわずかに相互作用するにすぎない９３Ｈ２の軽鎖が、ＲＯＢＯ２とＳＬＩＴ２との間の相互作用を阻害するために必要な構造的障害をもたらしていることを明らかにしている。
【図１２】９３Ｈ２とＲＯＢＯ２  Ｉｇ１、特にＲＯＢＯ２の近い「ＲＳＫ」配列（残基１００〜１０２）との間の特異的なアミノ酸残基の相互作用を示す図である。
【図１３】９３Ｈ２のＦａｂと複合体を形成したＲＯＢＯ２のＩｇ１ドメインの結晶構造を示す図である。この構造は、結晶格子の非対称の各単位で環様の立体構造に配置された、ＲＯＢＯ２−９３Ｈ２複合体の６つのコピーから構成される。
【図１４】ＳＬＩＴタンパク質およびＲＯＢＯタンパク質のドメインを示すグラフィック表示である。
【図１５】ＨＴＲＦアッセイにおける、ＲＯＢＯ２発現細胞へのＳＬＩＴ２Ｎの結合の用量依存性の阻害を示す図である。生殖細胞突然変異の導入は、ＳＬＩＴ２の結合を中和する抗体の能力に対して有意な影響を有していなかった。
【図１６】図１６Ａ：Ａｂｃｓ３５（黒い丸印）およびＡｂｃｓ３５−Ｊ（灰色の四角印）がほぼ同一の結合プロファイルを有することを実証する図である。ヒトＲＯＢＯ２が示されている。    図１６Ｂ：Ａｂｃｓ３５（黒い丸印）およびＡｂｃｓ３５−Ｊ（灰色の四角印）がほぼ同一の結合プロファイルを有することを実証する図である。カニクイザルＲＯＢＯ２が示されている。    図１６Ｃ：Ａｂｃｓ３５（黒い丸印）およびＡｂｃｓ３５−Ｊ（灰色の四角印）がほぼ同一の結合プロファイルを有することを実証する図である。ラットＲＯＢＯ２が示されている。    図１６Ｄ：Ａｂｃｓ３５（黒い丸印）およびＡｂｃｓ３５−Ｊ（灰色の四角印）がほぼ同一の結合プロファイルを有することを実証する図である。ヒトＲＯＢＯ１が示されている。    図１６Ｅ：Ａｂｃｓ３５（黒い丸印）およびＡｂｃｓ３５−Ｊ（灰色の四角印）がほぼ同一の結合プロファイルを有することを実証する図である。ＲＯＢＯ２  ＲＳＫエピトープを含むＲＯＢＯ１が示されている。    図１６Ｆ：Ａｂｃｓ３５（黒い丸印）およびＡｂｃｓ３５−Ｊ（灰色の四角印）がほぼ同一の結合プロファイルを有することを実証する図である。ＲＯＢＯ１  ＫＳＲエピトープを含むＲＯＢＯ２が示されている。
【図１７】Ａｂｃｓ３５またはＡｂｃｓ３５−Ｊのいずれかの存在下での神経細胞移動の用量依存性の阻害を示す図である。ＩＣ５０値は、抗体の効力において有意差がないことを示している。
【発明を実施するための形態】
【０１２２】
１．概説
これまでの研究によって、ＳＬＩＴ２／ＲＯＢＯ２が、ネフリン誘発性のアクチンポリマー化を阻害し、相殺する、腎臓ポドサイトにおける負のシグナルであることが示されている。ＲＯＢＯ２のポドサイト特異的なノックアウトは、タンパク尿動物モデルにおける糸球体の不良を有意に低減させ、ポドサイトの足突起の構造を保護し、マウスを腎毒性血清（ＮＴＳ）誘発性の重度のタンパク尿から保護する。ＲＯＢＯ２の喪失欠損はまた、ミオシンダイナミクスの調節に起因して、高血圧性腎症の高塩（ＤＯＣＡ）モデルにおいて膠芽腫（ＧＢＭ）へのポドサイトの接着を維持する。これらのデータと、ＲＯＢＯ２染色体の転座を有する患者がタンパク尿を有さないという知見とから、本発明者らは、ＳＬＩＴ２−ＲＯＢＯ２シグナル伝達経路を遮断すると、ネフリン誘発性のアクチンポリマー化が増大して、タンパク尿が低減し得ると考えるに至った。ＲＯＢＯ２シグナル伝達の遮断はまた、ネフリン誘発性のアクチンポリマー化を上方調節することによって、タンパク尿疾患における糸球体濾過障壁を回復させ得る。このようにして、ＲＯＢＯ２へのＳＬＩＴリガンドの結合を阻害する中和抗体は、腎臓保護効果をもたらし得る。
【０１２３】
ＲＯＢＯ２特異的抗体を得ることの１つの特定の困難性は、ＲＯＢＯ２およびＲＯＢＯ１が、特にそのリガンド結合ドメインＩｇ１およびＩｇ２において、高程度の配列類似性を有することである（図９および１０における配列アラインメントを参照されたい）。ＲＯＢＯ１およびＲＯＢＯ２のＳＬＩＴ結合ドメイン（Ｉｇ１およびＩｇ２）における残基の９３％が、同一であるかまたは類似している。驚くべきことに、本明細書において開示および例示するように、本発明者らは、ＲＯＢＯ２における固有のエピトープを同定し、ＲＯＢＯ２に特異的に結合するがＲＯＢＯ１には結合しないモノクローナル抗体を生産した。特に、この固有のエピトープは、抗体の特異性を決定する鍵となる残基である残基Ｒ１００（配列番号１で示されるヒトＲＯＢＯ２の番号付けに従う）を含む。実施例５で示すように、ＲＯＢＯ２（ＲＳＫ）の残基１００〜１０２をＲＯＢＯ１（ＫＳＲ）の対応する残基に突然変異させると、ＲＯＢＯ２特異的抗体の結合が無効となるが、その一方で、ＲＯＢＯ１（ＫＳＲ）の対応する残基をＲＯＢＯ２（ＲＳＫ）に突然変異させると、ＲＯＢＯ２特異的抗体は、突然変異したＲＯＢＯ１に結合するようになる。Ｓ１０１がＲＯＢＯ２とＲＯＢＯ１との間で保存されている／同一であるため、また、結晶構造が、Ｋ１０２の側鎖が抗体−抗原界面から離れた方向に向いていることを示しているため（これは、Ｋ１０２がＲＯＢＯ２−抗体相互作用に直接関与していないことを意味する）、本発明者らのデータは、Ｒ１００がＲＯＢＯ２特異的抗体の結合特異性を単独で駆動しているという考えを明らかにサポートしている。
【０１２４】
このＲＯＢＯ２特異的なエピトープの発見は、非常に驚くべきである。Ｒ１００は単独でＲＯＢＯ２特異性に関与しているというだけではなく、ほとんどのケースにおいて、ＲからＫへの置換は「保存的な」置換である（両方が、正に荷電した側鎖を有している）と考えられており、結合に実質的に影響しない。これは、ここでは当てはまらない。ＲをＫに突然変異させると、抗原−抗体の結合が無効になり、このことは、この位置にあるＲ残基の重要性を説明している。
【０１２５】
２．定義
ＲＯＢＯ２における具体的なアミノ酸残基の位置を、配列番号１（ヒトＲＯＢＯ２）に従って番号付けする。しかし、本発明は、配列番号１に限定されない。他のＲＯＢＯ２ホモログ、アイソフォーム、変異体、または断片の対応する残基を、当技術分野において知られている配列アラインメントまたは構造アラインメントに従って同定することができる。例えば、アラインメントは、手動で、またはデフォルトパラメータを使用してＣｌｕｓｔａｌＷ２もしくは「ＢＬＡＳＴ  ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」などの周知の配列アラインメントプログラムを使用することによって、行うことができる。
【０１２６】
抗体
抗体の「抗原結合断片」は、抗原に特異的に結合する能力を保持する（好ましくは実質的に同一の結合親和性で）、完全長抗体の断片を指す。抗原結合断片の例としては、（ｉ）ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン、およびＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片、（ｉｉ）ヒンジ領域にあるジスルフィド架橋によって連結した２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体のシングルアームのＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４〜５４６）、ならびに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、ジスルフィド結合したＦｖ（ｄｓＦｖ）、および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、およびイントラボディが含まれる。さらに、Ｆｖ断片２つのドメインであるＶＬおよびＶＨは、別個の遺伝子によってコードされているが、ＶＬ領域およびＶＨ領域が対合して一価の分子を形成している単一のタンパク質鎖（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている）としてこれらを作ることを可能にする合成リンカーによる組換え方法を使用して、前記ＶＬおよびＶＨを繋げることができる。例えば、Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３〜４２６（１９８８）、およびＨｕｓｔｏｎら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９〜５８８３を参照されたい。ダイアボディなどの他の形態の一本鎖抗体もまた包含される。ダイアボディは、ＶＨドメインおよびＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖上で発現している二価の二重特異的抗体であるが、同一鎖上でこれらの２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用しており、そのため、これらのドメインは別の鎖の相補的なドメインと対合しなくてはならず、２つの抗原結合部位が生じる（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４〜６４４８；Ｐｏｌｊａｋら、１９９４、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１〜１１２３を参照されたい）。
【０１２７】
抗体の「可変ドメイン」は、単独のまたは組み合わせた、抗体軽鎖の可変領域（ＶＬ）または抗体重鎖の可変領域（ＶＨ）を指す。当技術分野において知られているように、重鎖および軽鎖の可変領域はそれぞれ、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって接続された４つのフレームワーク領域（ＦＲ）からなり、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。
【０１２８】
「相補性決定領域」（ＣＤＲ）は、Ｋａｂａｔの定義、Ｃｈｏｔｈｉａの定義、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａの両方の蓄積の定義、ＡｂＭの定義、接触の定義、Ｎｏｒｔｈの定義、ならびに／もしくは立体構造の定義、または当技術分野において周知のＣＤＲ決定方法のいずれかに従って同定することができる。例えば、Ｋａｂａｔら、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版（超可変領域）；Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７〜８８３（構造的ループ構造）を参照されたい。ＣＤＲを構成する特定の抗体におけるアミノ酸残基の同一性は、当技術分野において周知の方法を使用して決定することができる。ＣＤＲのＡｂＭの定義は、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａの間の折衷であり、Ｏｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェア（Ａｃｃｅｌｒｙｓ（登録商標））を使用する。ＣＤＲの「接触」の定義は、観察される抗原接触に基づき、ＭａｃＣａｌｌｕｍら、１９９６、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６２：７３２〜７４５で示されている。ＣＤＲの「立体構造」の定義は、抗原結合に対するエンタルピーの寄与をもたらす残基に基づく（例えば、Ｍａｋａｂｅら、２００８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２８３：１１５６〜１１６６を参照されたい）。Ｎｏｒｔｈは、ＣＤＲ定義の異なる好ましいセットを使用する、同定された正準的なＣＤＲ立体構造を有する（Ｎｏｒｔｈら、２０１１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０６：２２８〜２５６）。ＣＤＲの「立体構造の定義」として本明細書において言及される別のアプローチにおいて、ＣＤＲの位置は、抗原結合に対するエンタルピーの寄与をもたらす残基として同定され得る（Ｍａｋａｂｅら、２００８、Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３：１１５６〜１１６６）。さらに他のＣＤＲ境界の定義は、上記のアプローチの１つに厳密に従わなくてもよいが、それでも、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲの少なくとも一部と重複し、しかし、特定の残基または残基群またはさらにはＣＤＲ全体が抗原結合に有意には影響しないという予測または実験上の知見に照らして、短くまたは長くされてもよい。本明細書において使用する場合、ＣＤＲは、アプローチの組み合わせを含む、当技術分野において知られている任意のアプローチによって定義されるＣＤＲを指し得る。本明細書において使用される方法は、これらのアプローチのいずれかに従って定義されたＣＤＲを利用し得る。２つ以上のＣＤＲを含む任意の所与の実施形態では、ＣＤＲ（または抗体の他の残基）は、Ｋａｂａｔの定義、Ｃｈｏｔｈｉａの定義、Ｎｏｒｔｈの定義、伸長の定義、ＡｂＭの定義、接触の定義、および／または立体構造の定義のいずれかに従って定義され得る。
【０１２９】
可変ドメイン内の残基は、抗体の編集物の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインに使用される番号付けシステムであるＫａｂａｔに従って番号付けする。Ｋａｂａｔら、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤを参照されたい。この番号付けシステムを使用して、実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲもしくはＣＤＲの短縮、または可変ドメインのＦＲもしくはＣＤＲ内への挿入に対応する、より少ないまたは追加のアミノ酸を含有し得る。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後ろの単一のアミノ酸インサート（Ｋａｂａｔに従った残基５２ａ）、ならびに重鎖のＦＲの残基８２の後ろの挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔに従った残基８２ａ、８２ｂ、および８２ｃ）を含み得る。残基のＫａｂａｔ番号付けは、抗体の配列と「標準的な」Ｋａｂａｔ番号付けされた配列との相同領域でのアラインメントによって、所与の抗体について決定され得る。Ｋａｂａｔ番号付けを割り当てるための様々なアルゴリズムが利用可能である。Ａｂｙｓｉｓ（ｗｗｗ．ａｂｙｓｉｓ．ｏｒｇ）のバージョン２．３．３リリースにおいて実行されるアルゴリズムが、可変領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３にＫａｂａｔ番号付けを割り当てるために、本明細書において使用される。ＡｂＭの定義がＣＤＲ−Ｈ１には使用される。
【０１３０】
抗体内の具体的なアミノ酸残基の位置もまた、Ｋａｂａｔに従って番号付けすることができる。
【０１３１】
「フレームワーク」（ＦＲ）残基は、ＣＤＲ残基以外の抗体可変ドメイン残基である。ＶＨまたはＶＬドメインフレームワークは、以下の構造：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４の、ＣＤＲが点在している４つのフレームワーク小領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４を含む。
【０１３２】
「エピトープ」は、抗体が特異的に結合する、抗原の区域または領域、例えば、抗体と相互作用する残基を含む区域または領域を指す。エピトープは、直鎖状または立体構造であり得る。
【０１３３】
用語「パラトープ」は、視点を逆転させることによって「エピトープ」の上記の定義から派生し、抗原の結合に関与する抗体分子の区域または領域、例えば、抗原と相互作用する残基を含む区域または領域を指す。パラトープは、直鎖状または立体構造であり得る（ＣＤＲ内の不連続な残基など）。
【０１３４】
所与の抗体／抗原結合対についてのエピトープ／パラトープは、様々な実験的および計算的なエピトープマッピング方法を使用して、異なる詳細さのレベルで定義および特徴付けすることができる。実験的方法としては、突然変異生成、Ｘ線結晶学、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法、水素／重水素交換質量分析（ＨＸ−ＭＳ）、および様々な競合結合方法が含まれる。各方法は固有の原理に依拠するため、エピトープの記載は、それが決定された方法に密接にリンクする。したがって、所与の抗体／抗原対についてのエピトープ／パラトープは、採用したマッピング方法に応じて異なって定義される。
【０１３５】
その最も詳細なレベルでは、抗体（Ａｂ）と抗原（Ａｇ）との間の相互作用についてのエピトープ／パラトープは、Ａｇ−Ａｂ相互作用において存在する原子の接触を規定する空間座標、および結合熱力学に対するそれらの相対的な寄与についての情報によって定義され得る。１つのレベルでは、エピトープ／パラトープの残基は、ＡｇとＡｂとの間の原子の接触を規定する空間座標によって特徴付けされ得る。一態様では、エピトープ／パラトープの残基は、具体的な基準、例えば、Ａｂ内の原子とＡｇ内の原子との間の距離（例えば、コグネート抗体の重原子および抗原の重原子から約４Å以下の距離（本明細書の実施例において使用される３．８Åなど））によって定義され得る。別の態様では、エピトープ／パラトープの残基は、コグネート抗体／抗原との、またはこれもコグネート抗体／抗原に水素結合している水分子との（水が介在する水素結合）水素結合相互作用に関与するものと特徴付けされ得る。別の態様では、エピトープ／パラトープの残基は、コグネート抗体／抗原の残基と塩橋を形成するものとして特徴付けされ得る。さらに別の態様では、エピトープ／パラトープの残基は、コグネート抗体／抗原との相互作用に起因する埋没表面積（ＢＳＡ）の変化がゼロではない残基として特徴付けされ得る。あまり詳細ではないレベルでは、エピトープ／パラトープは、例えば他のＡｂとの競合結合による機能を介して特徴付けされ得る。エピトープ／パラトープはまた、別のアミノ酸による置換によってＡｂとＡｇとの間の相互作用の特徴が改変されるアミノ酸残基を含むものとして、より一般的に定義され得る（例えば、アラニンスキャニング）。
【０１３６】
抗体、例えば１つのＦａｂ断片または２つのＦａｂ断片と、その抗原との間の複合体の空間座標によって定義される、Ｘ線に由来する結晶構造の文脈において、別段の特定がない限り、エピトープ残基は、（ｉ）コグネート抗体の重原子から約４Åの距離以内（例えば、３．８Å）にある重原子（すなわち、非水素原子）を有する、（ｉｉ）コグネート抗体の残基との、もしくはこれもコグネート抗体に水素結合している水分子との（水が介在する水素結合）水素結合に関与する、（ｉｉｉ）コグネート抗体の残基への塩橋に関与する、ならびに／または（ｉｖ）コグネート抗体との相互作用に起因する埋没表面積（ＢＳＡ）の変化がゼロではない、ＲＯＢＯ２残基を指す。通常、相互作用が最小の残基を含めることを避けるために、カットオフがＢＳＡに対して行われる。したがって、別段の特定がない限り、カテゴリー（ｉｖ）下のエピトープ残基は、２０Å２以上のＢＳＡを有する場合、または抗体がＲＯＢＯ２に結合すると静電気的な相互作用に関与する場合に選択される。同様に、Ｘ線に由来する結晶構造の文脈において、別段の特定がない限り、または文脈と矛盾しない限り、パラトープ残基は、（ｉ）ＲＯＢＯ２の重原子から約４Åの距離以内にある重原子（すなわち、非水素原子）を有する、（ｉｉ）ＲＯＢＯ２の残基と、もしくはこれもＲＯＢＯ２に水素結合している水分子との（水が介在する水素結合）水素結合に関与する、（ｉｉｉ）ＲＯＢＯ２の残基への塩橋に関与する、ならびに／または（ｉｖ）ＲＯＢＯ２との相互作用に起因する埋没表面積の変化がゼロではない、抗体残基を指す。この場合も、別段の特定がない限り、カテゴリー（ｉｖ）下のパラトープ残基は、２０Å２以上のＢＳＡを有する場合、または抗体がＲＯＢＯ２に結合すると静電気的な相互作用に関与する場合に選択される。（ｉ）の距離または（ｉｖ）のＢＳＡによって同定された残基は、「接触」残基と呼ばれることが多い。
【０１３７】
エピトープの記載および定義が、使用するエピトープマッピング方法に依存し、異なる詳細さのレベルで得られるという事実から、同一のＡｇ上にある異なるＡｂについてのエピトープの比較も同様に、異なる詳細さのレベルで行うことができることになる。例えば、例えばＸ線構造から決定された、アミノ酸レベルについて記載されたエピトープは、同一のアミノ酸残基セットを含んでいれば、同一であるとされる。競合結合によって特徴付けされたエピトープは、対応する抗体の結合が相互排他的であれば、すなわち、１つの抗体の結合が他方の抗体の同時のまたは連続的な結合を排除すれば、重複しているとされ、エピトープは、抗原が両方の対応する抗体の結合を同時に提供することができれば、別個である（固有である）とされる。
【０１３８】
所与の抗体／抗原対のエピトープおよびパラトープは、通常の方法によって同定することができる。例えば、エピトープの全体的な位置は、本明細書の先のいずれかの箇所においてより完全に記載されているように、異なる断片または変異体ＲＯＢＯ２ポリペプチドに結合する抗体の能力を評価することによって決定することができる。抗体内の特異的な残基と接触するＲＯＢＯ２内の具体的な残基もまた、実施例において記載されているものなどの、通常の方法を使用して決定することができる。例えば、抗体／抗原複合体を結晶化することができる。結晶構造を決定および使用して、抗体と抗原との間の相互作用の具体的部位を同定することができる。
【０１３９】
エピトープに「優先的に結合する」または「特異的に結合する」（本明細書において区別せずに使用される）抗体は、当技術分野において良く理解されている用語であり、このような特異的または優先的な結合を決定するための方法もまた、当技術分野において周知である。分子は、別の細胞または物質と反応または会合するよりも、より頻繁に、より迅速に、より長い期間、および／またはより大きな親和性で、特定の細胞または物質と反応または会合すれば、「特異的結合」または「優先的結合」を示すとされる。抗体は、他の物質に結合するよりも、より大きな親和性、親和力で、より容易に、および／またはより長い期間結合すれば、標的に「特異的に結合する」または「優先的に結合する」。例えば、ＲＯＢＯ２エピトープに特異的または優先的に結合する抗体は、他のＲＯＢＯ２エピトープまたは非ＲＯＢＯ２エピトープに結合するよりも、より大きな親和性、親和力で、より容易に、および／またはより長い期間、このエピトープに結合する抗体である。この定義を読むことによって、例えば、第１の標的に特異的または優先的に結合する抗体（または部分もしくはエピトープ）は、第２の標的に対して特異的または優先的であってもなくてもよいことも理解される。このようにして、「特異的結合」または「優先的結合」は、排他的な結合を必ずしも必要としない（しかし、含み得る）。一般に、結合への言及は優先的結合を意味するが、必ずしもそうではない。「特異的結合」または「優先的結合」には、特異的分子を認識し、それに結合するが、試料中の他の分子には実質的に認識も結合もしない化合物、例えば、タンパク質、核酸、抗体などが含まれる。例えば、試料中のそのコグネート抗原を認識し、それに結合するが、試料中の他の分子には実質的に認識も結合もしない抗体は、コグネート抗原に特異的に結合する。したがって、指定されたアッセイ条件下では、特定された結合部分（例えば、抗体またはその抗原結合部分）は、特定の標的分子に優先的に結合し、試験試料中に存在する他の成分には大量には結合しない。
【０１４０】
様々なアッセイフォーマットを、目的の分子に特異的に結合する抗体またはペプチドを選択するために使用することができる。例えば、固相ＥＬＩＳＡ免疫アッセイ、免疫沈降、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、Ｏｃｔｅｔ（商標）（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｉｎｃ．、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）、およびウェスタンブロット分析は、抗原と特異的に反応する抗体、またはコグネートリガンドもしくは結合パートナーと特異的に結合する受容体もしくはそのリガンド結合部分を同定するために使用され得る多くのアッセイの中の一部である。典型的には、特異的または選択的な反応は、バックグラウンドシグナルまたはノイズの少なくとも２倍であり、より典型的には、バックグラウンドの１０倍を超え、さらに具体的には、抗体は、平衡解離定数（ＫＤ）値が≦１μＭである場合、例えば≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１００ｐＭ、≦１０ｐＭ、または≦１ｐＭである場合には、抗原に「特異的に結合する」とされる。
【０１４１】
用語「競合する」は、抗体に関して本明細書において使用される場合、抗原への第１の抗体またはその抗原結合部分の結合が、その後の第２の抗体またはその抗原結合部分による同一の抗原の結合を低減させることを意味する。通常、第１の抗体の結合は、立体障害、立体構造の変化、または共通のエピトープ（またはその部分）への結合を生じ、その結果、同一の抗原への第２の抗体の結合が低減する。標準的な競合アッセイを、２つの抗体が互いに競合するかどうかを判定するために使用することができる。抗体の競合についての１つの適切なアッセイは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を使用して、典型的にはバイオセンサーシステム（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）システムなど）を使用して相互作用の程度を測定し得る、Ｂｉａｃｏｒｅ技術の使用を伴う。例えば、ＳＰＲを、インビトロでの競合的結合阻害アッセイにおいて使用して、１つの抗体が第２の抗体の結合を阻害する能力を判定することができる。抗体の競合を測定するための別のアッセイは、ＥＬＩＳＡに基づくアプローチを使用する。
【０１４２】
さらに、その競合に基づく「結合」抗体についてのハイスループットプロセスは、国際特許出願第ＷＯ２００３／４８７３１号において記載されている。競合は、１つの抗体（または断片）がＲＯＢＯ２への別の抗体（または断片）の結合を低減させれば存在する。例えば、異なる抗体を連続的に添加する、連続的な結合競合アッセイを使用することができる。第１の抗体は、飽和に近い結合に達するまで添加することができる。次いで、第２の抗体を添加する。ＲＯＢＯ２への第２の抗体の結合が検出されなければ、または、第１の抗体の非存在下で行う並行なアッセイ（この値は１００％と示され得る）と比較して有意に低減していれば（例えば、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％の低減）、２つの抗体は互いに競合しているとみなされる。ＳＰＲによる典型的な抗体競合アッセイ（およびオーバーラップエピトープ分析）が実施例において提供される。
【０１４３】
用語「処置」には、予防的および／または治療的処置が含まれる。状態の臨床的兆候の前に処置が行われれば、処置は予防的であるとみなされる。治療的処置としては、例えば、疾患の重症度の改善もしくは低減、または疾患の長さの短縮が含まれる。
【０１４４】
「約」または「およそ」は、測定可能な数値変数と組み合わせて使用される場合、示された変数値、および示された値の実験誤差（例えば、平均の９５％信頼区間以内）または示された値の±１０％の大きい方以内の全ての変数値を指す。数値範囲は、その範囲を規定する数値を含む。
【０１４５】
結合親和性
抗体の結合親和性は、特定の抗原−抗体相互作用の解離速度を指すＫＤ値として表すことができる。ＫＤは、会合速度または「オン速度（ｋｏｎ）」に対する、「オフ速度（ｋｏｆｆ）」とも呼ばれる解離速度の比である。したがって、ＫＤはｋｏｆｆ／ｋｏｎに等しく、モル濃度（Ｍ）として表され、ＫＤが小さいほど、結合の親和性は強い。抗体のＫＤ値は、当技術分野において良く確立された方法を使用して決定することができる。Ｋｄを測定するための１つの典型的な方法は、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを典型的には使用する、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。ＢＩＡｃｏｒｅ動態分析は、その表面上に分子（例えば、エピトープ結合ドメインを含む分子）が固定されたチップによる抗原の結合およびこのチップからの抗原の解離を分析することを含む。抗体のＫｄを決定するための別の方法は、Ｂｉｏ−Ｌａｙｅｒ干渉法を使用すること、典型的にはＯＣＴＥＴ（登録商標）技術（Ｏｃｔｅｔ  ＱＫｅシステム、ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用することによる。あるいは、またはさらに、Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｂｏｉｓｅ、Ｉｄ．）から入手可能なＫｉｎＥｘＡ（登録商標）（結合平衡除外法）アッセイもまた使用することができる。
【０１４６】
一部の態様では、ＫＤ値は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定される。ＲＯＢＯ２は、例えば固体表面上に固定され得る。ＲＯＢＯ２は、例えば共有結合（アミン結合など）によって、チップに固定され得る。チップは、ＣＭ５センサーチップであり得る。
【０１４７】
分析物がリガンドに結合すると、センサー表面上のタンパク質の蓄積によって、屈折率が増大する。この屈折率の変化はリアルタイムで測定され（動態分析実験におけるサンプリングは０．１秒ごとに行われる）、結果は、時間に対する応答単位（ＲＵ）としてプロットされる（センサーグラムと呼ばれる）。重要なことに、ランニング緩衝液および試料緩衝液の屈折率に差がある場合、応答（バックグラウンド応答）もまた生成する。このバックグラウンド応答は、実際の結合応答を得るために、センサーグラムから指し引かなければならない。バックグラウンド応答は、分析物を、リガンドを有さない、または関連のないリガンドがセンサー表面に固定されている対照または参照フローセルを通して注入することによって記録される。結合相互作用の会合および解離をリアルタイムで測定することによって、会合速度定数および解離速度定数ならびに対応する親和性定数の計算が可能になる。１ＲＵは、立方ｍｍ当たりの１ｐｇのタンパク質の結合に相当する。１立方ｍｍの分析物の結合当たり５０ｐｇを超えることが、良好な再現可能な応答を得るために実際には一般的に必要である。８５から３７０ＲＵの間のＲＯＢＯ２が固定され得る。８５から２２５ＲＵの間のＲＯＢＯ２が固定され得る。
【０１４８】
ＲＯＢＯ２からの抗体の解離は、約３６００秒にわたりモニタリングされ得る。ＳＰＲ分析を行うことができ、データを約１５℃から約３７℃の間で収集する。ＳＰＲ分析を行うことができ、データを約２５℃から３７℃の間で収集する。ＳＰＲ分析を行うことができ、データを約３７℃で収集する。ＳＰＲ分析を行うことができ、データを３７℃で収集する。ＫＤ値を、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ２００機器を使用してＳＰＲによって測定することができる。ＳＰＲの速度および親和性を、得られたセンサーグラムデータをＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン１．０において１：１モデルにフィットさせることによって、決定することができる。収集率は約１Ｈｚであり得る。
【０１４９】
抗体のＫＤを決定するための別の方法は、Ｂｉｏ−Ｌａｙｅｒ干渉法（ＢＬＩ）を使用すること、典型的にはＯＣＴＥＴ（登録商標）技術（Ｏｃｔｅｔ  ＱＫｅシステム、ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用することによる。一部の実施形態では、バイオセンサー分析が使用される。典型的には、一方の相互作用物がバイオセンサーの表面上に固定され（抗体などの「リガンド」）、他方は溶液内に残る（抗原などの「分析物」）。アッセイは、アッセイ緩衝液を使用して最初のベースラインまたは平衡ステップで開始される。次に、リガンド（抗体など）が、直接的な固定、または捕捉に基づく方法のいずれかによって、バイオセンサーの表面上に固定される（ローディング）。リガンドが固定された後、バイオセンサーを、アッセイのドリフトを評価するためのベースラインステップのために緩衝溶液に浸し、リガンドのロードレベルを判定する。ベースラインステップの後、バイオセンサーを、リガンドの結合パートナーである分析物を含有する溶液に浸す（会合）。このステップにおいて、固定されたリガンドに対する分析物の結合相互作用を測定する。分析物が会合した後、バイオセンサーを、分析物を有さない緩衝溶液に浸し、結合した分析物がリガンドから離れるようにする（解離）。一連のアッセイステップを次いで、試験対象の各分析物について、新たなまたは再生されたバイオセンサーで反復する。各結合応答を測定し、センサーグラムトレースでリアルタイムに報告する。機器は、Ｏｃｔｅｔ  ＱＫｅシステム、Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ９６システム、Ｏｃｔｅｔ  ＱＫ３８４システム、またはＲＥＤ３８４システムであり得る。
【０１５０】
３．Ｒｏｕｎｄａｂｏｕｔ（ＲＯＢＯ）受容体
分泌されたＳＬＩＴ糖タンパク質およびそのＲｏｕｎｄａｂｏｕｔ（ＲＯＢＯ）受容体は、重要な軸索ガイダンス分子として元々同定されていた。これらは、神経系の組み立ての間の軸索の不適切な位置への移動を予防することにおいて進化の過程で保存された役割を有する反発性のキューとして機能する。さらに、ＳＬＩＴ−ＲＯＢＯ相互作用は、細胞移動、細胞死、および血管新生の調節に関与し、このようにして、肺、腎臓、肝臓、および乳房などの他の組織の発生の際に重要な役割を有する。
【０１５１】
無脊椎動物は単一のＳＬＩＴタンパク質を有するが、その一方で、脊椎動物は、ＳＬＩＴ１、ＳＬＩＴ２、およびＳＬＩＴ３と名付けられた３つの相同なＳＬＩＴを有する。ＳＬＩＴは、細胞外マトリックスと会合する分泌タンパク質である。全てのＳＬＩＴのタンパク質配列は高程度の保存を示し、同一の構造、すなわち、Ｎ末端シグナルペプチド、Ｄ１〜Ｄ４と呼ばれるロイシンに富んだ４つのタンデム反復ドメイン（ＬＲＲ）、６つの上皮成長因子（ＥＧＦ）様ドメイン、ラミニンＧ様ドメイン、さらなる１つの（無脊椎動物）または３つの（脊椎動物）ＥＧＦ様ドメイン、およびＣ末端システインノットドメインを有する（図１４）。ＳＬＩＴＳは切断されて、機能が未知の短いＣ末端断片（ＳＬＩＴ−Ｃ産物）、および、活性でありＲＯＢＯへの結合を仲介する、長いＮ末端断片（ＳＬＩＴ−Ｎ産物）を生じ得る。本明細書において記載されるＳＬＩＴリガンドおよび切断産物（例えば、ＳＬＩＴ−Ｎ）は、ＲＯＢＯ２の活性、およびＲＯＢＯ２抗体の中和効果を評価するために使用することができる。
【０１５２】
ＲＯＢＯ１／Ｄｕｔｔ１、ＲＯＢＯ２、ＲＯＢＯ３／Ｒｉｇ−１、およびＲＯＢＯ４／Ｍａｇｉｃ  Ｒｏｕｎｄａｂｏｕｔという４つのＲＯＢＯ受容体が、脊椎動物において特徴付けされている。ＲＯＢＯ１、ＲＯＢＯ２、およびＲＯＢＯ３は、細胞接着分子を連想させる共通の細胞外ドメイン構造を有する。この領域は、５つの免疫グロブリン様（Ｉｇ）ドメインと、それに続く、３つのフィブロネクチンタイプ３（ＦＮ３）反復とを含む（図１４）。ＳＬＩＴのＤ２  ＬＲＲドメイン、ならびにＲＯＢＯのＩｇ１およびＩｇ２ドメインは、進化の過程で保存されており、結合に関与する。ＲＯＢＯのＩｇ１およびＩｇ２ドメインは合わせて、ＳＬＩＴ結合ドメインとも呼ばれる。
【０１５３】
典型的なＲＯＢＯ配列を表１１に示す。完全長ヒトＲＯＢＯ２前駆体の配列を配列番号１として示す。前駆体のシグナルペプチド（配列番号１の残基１〜２１）は切断されて、成熟ＲＯＢＯ２を生じる。残基２２〜８５９は細胞外ドメインから、残基８６０〜８８０は膜貫通ドメインから、および残基８８１〜１３７８は細胞質ドメインから。
【０１５４】
他のＲＯＢＯタンパク質の機能的ドメインは既知であるか、または本明細書において記載されるヒトＲＯＢＯ２に対する配列アラインメントによって決定することができる。
【０１５５】
ＲＯＢＯ−ＳＬＩＴが結合すると、Ｒｈｏ  ＧＴＰａｓｅおよびその調節因子（ＧＡＰおよびＧＥＦ）が、下流のシグナル伝達経路に関与する。ＳＬＩＴの存在下では、ＳＬＩＴ−ＲＯＢＯ  Ｒｈｏ  ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質１（ｓｒＧＡＰ１）がＲＯＢＯのＣＣ３ドメインに結合し、ＲｈｏＡおよびＣｄｃ４２を不活化する。これらのエフェクタータンパク質は、他のアウトカムの間でもとりわけ、反発、細胞骨格ダイナミクスの制御、および細胞極性を仲介し得る。ＳＬＩＴの存在下では、Ｖｉｌｓｅ／ＣｒｏｓｓＧＡＰもまた、ＲＯＢＯのＣＣ２ドメインに結合し得、Ｒａｃ１およびＣｄｃ４２を阻害する。Ｒａｃ１はまた、ＲＯＢＯのＣＣ２−３ドメインに結合するアダプタータンパク質Ｄｒｅａｄｌｏｃｋｓ（Ｄｏｃｋ）を介する、ＧＥＦタンパク質であるＳｏｎ  ｏｆ  ｓｅｖｅｎｌｅｓｓ（Ｓｏｓ）の動員によって活性化される。これは、ＲＯＢＯ  ＣＣ２−３ドメインにも結合するＲａｃ１およびｐ２１活性化キナーゼ（Ｐａｋ）の下流の標的を活性化する。ＲＯＢＯのこれらの下流シグナル伝達パートナーは、反発および細胞骨格ダイナミクスを制御する。チロシンキナーゼＡｂｅｌｓｏｎ（Ａｂｌ）もまた、ＲＯＢＯ  ＣＣ３ドメインに結合し得、ＣＣ１ドメインのリン酸化を介してＲＯＢＯシグナル伝達と拮抗し、細胞の接着を仲介する。Ａｂｌの基質であるＥｎａｂｌｅｄ（Ｅｎａ）もまた、ＲＯＢＯ  ＣＣ１およびＣＣ２ドメインに結合する。全てのこれらの下流のＲＯＢＯ−ＳＬＩＴ分子は、ＲＯＢＯ２の活性およびＲＯＢＯ２抗体の中和効果を評価するために使用することができる。
【０１５６】
腎臓では、ＲＯＢＯ２は、アダプタータンパク質Ｎｃｋを介してネフリンと複合体を形成する。アクチンポリマー化を促進するネフリンの役割とは対照的に、ＳＬＩＴ−ＲＯＢＯ２シグナル伝達は、ネフリンによって誘発されるアクチンポリマー化を阻害する。したがって、ＲＯＢＯ２細胞内ドメインおよびＮｃｋの結合は、ＲＯＢＯ２の活性およびＲＯＢＯ２抗体の中和効果を評価するために使用することができる。
【０１５７】
一部の態様では、ＲＯＢＯ２は、ヒトＲＯＢＯ２である。一部の態様では、野生型ＲＯＢＯ２の配列は、配列番号１である。一部の態様では、ＲＯＢＯ２は、ラットＲＯＢＯ２である。一部の態様では、ＲＯＢＯ２は、マウスＲＯＢＯ２である。一部の態様では、ＲＯＢＯ２は、霊長類ＲＯＢＯ２である。一部の態様では、ＲＯＢＯ２は、ａｐｅ  ＲＯＢＯ２である。一部の態様では、ＲＯＢＯ２は、サルＲＯＢＯ２である。一部の態様では、ＲＯＢＯ２は、カニクイザルＲＯＢＯ２である。
【０１５８】
典型的なヒトＳＬＩＴ２の配列を表１１に示す（配列番号１４２）。前駆体のシグナルペプチド（配列番号１４２の残基１〜３０）は切断されて、成熟ＳＬＩＴ２を生じる。残基３１〜１１３１はＳＬＩＴ−Ｎ産物から、および残基１１２２〜１５２９はＳＬＩＴ−Ｃ産物から。他のＳＬＩＴタンパク質の機能的ドメインは既知であるか、または本明細書において記載されるヒトＳＬＩＴ２に対する配列アラインメントによって決定することができる。
【０１５９】
４．ＲＯＢＯ２に対する抗体
一部の態様では、本発明は、ＲＯＢＯ２抗体を提供する。一部の実施形態では、抗体は、ＲＯＢＯ２に特異的に結合するが、その近いファミリーメンバーであるＲＯＢＯ１にはほとんど結合しない。本発明の典型的な抗体の配列を表１１に示す。実施例において示すように、ある特定の実施形態では、本発明の抗体は、ＲＯＢＯ２へのＳＬＩＴの結合を阻害し、したがって、「中和」抗体または「遮断」抗体と呼ばれる。中和抗体または遮断抗体とは、ＲＯＢＯ２へのその結合が（ｉ）ＲＯＢＯ２もしくはＲＯＢＯ２断片とそのリガンドであるＳＬＩＴとの間の相互作用を阻害する、および／または（ｉｉ）ＲＯＢＯ２の少なくとも１つの生物学的機能の阻害をもたらす抗体を意味する。本発明の抗体による中和を判定するためのアッセイは、本明細書のいずれかの箇所において記載されており、および／または当技術分野において既知である。
【０１６０】
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、実質的に同一のアッセイ条件下で、ＲＯＢＯ１についてのその結合親和性（ＫＤ）値の多くとも１００分の１であるＫＤ値で、ＲＯＢＯ２に結合する。例えば、ＲＯＢＯ１についてのＫＤに対するＲＯＢＯ２についてのＫＤの比は、１：１００以下、１：２５０以下、１：５００以下、１：１０００以下、１：２５００以下、１：５０００以下、または１：１万以下であり得る。
【０１６１】
実施例において示すように、ＲＯＢＯ２特異的抗体によって標的化されたヒトＲＯＢＯ２における主要な結合エピトープは、Ｉｇ１ドメイン内の柔軟なループ（配列番号１の残基Ｈ９７〜Ｐ１０３）である（図１２）。同様に結合に寄与するさらなるマイナーなエピトープ残基は、ＲＯＢＯ２の別個のループ（Ｅ７２〜Ｈ８１）を介する（配列番号１）。しかし、後者のエピトープへの結合は任意である。
【０１６２】
結晶構造の研究はまた、抗体とＲＯＢ２との間の主要な界面の安定性がＲＯＢＯ２のＲ９９およびＲ１００の寄与を大きく受けることを示す（図１２）。Ｒ９９はＲＯＢＯ１とＲＯＢＯ２との間で保存されているため、Ｒ１００は、本発明の典型的な抗体である抗体９３Ｈ２の結合特異性を決定する単独の残基であると考えられる。すなわち、Ｒ１００が、対応するＲＯＢＯ１残基であるＫ１３７で置き換えられると、この突然変異は、ＲＯＢＯ２特異的抗体の結合を無効にする。逆に、ＲＯＢＯ１  Ｋ１３７の対応する残基をＲ（配列番号１のＲ１００に対応する）に突然変異すると、ＲＯＢＯ２特異的抗体は、突然変異したＲＯＢＯ１（本明細書において「ＲＯＢＯ１−ＲＳＫ」と呼ばれる、表１４を参照されたい）に結合するようになる。したがって、一態様では、本発明は、ＲＯＢＯ２のＩｇドメイン１内、またはＩｇドメイン１およびＩｇドメイン２内のエピトープであって残基Ｒ１００を含むエピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片を提供する。ある特定の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、配列番号１の番号付けに従ったＫ１００を含む突然変異エピトープに結合しない。
【０１６３】
本発明の抗体は、配列番号１の番号付けに従ったＲＯＢＯ２のアミノ酸残基１００〜１０２にあるＲＳＫモチーフに対する優れた感度を実証する。さらに具体的には、配列番号１の番号付けに従ったＲＯＢＯ２のアミノ酸残基１００〜１０２にあるＲＳＫモチーフが、対応するＲＯＢＯ１−ＫＳＲモチーフ、すなわち、配列番号９の番号付けに従ったアミノ酸残基Ｋ１３７、Ｓ１３８、およびＲ１３９で置き換えられると、この突然変異は、本発明のＲＯＢＯ２特異的抗体の結合を無効にする。さらに、ＲＯＢＯ１の対応する残基（配列番号９の番号付けに従ったＫ１３７およびＲ１３９）を配列番号１の番号付けに従ったＲＯＢＯ２の残基Ｒ１００およびＫ１０２に突然変異すると、本発明のＲＯＢＯ２特異的抗体は、本明細書においてＲＯＢＯ１−ＲＳＫと呼ばれる突然変異したＲＯＢＯ１に結合するようになる。したがって、一態様では、本発明は、ＲＯＢＯ２のＩｇドメイン１内、またはＩｇドメイン１およびＩｇドメイン２内のエピトープであって残基Ｒ１００、Ｓ１０１、および場合によってＫ１０２（Ｋ１０２は任意である、表１０Ａを参照されたい）を含むエピトープに結合するが、配列番号１の番号付けに従ったＲ１００がＫで置き換えられ、Ｋ１０２がＲで置き換えられ、およびＳ１０１は不変のままである突然変異したＲＯＢＯ２エピトープには結合しない（突然変異したＲＯＢＯ２は、本明細書において「ＲＯＢＯ２−ＫＳＲ」と呼ばれる）抗体またはその抗原結合断片を提供する。さらに、本発明の抗体は、配列番号９のアミノ酸配列に従ったアミノ酸残基Ｋ１３７およびＲ１３９がＲ１３７およびＫ１３９でそれぞれ置き換えられている、ＲＯＢＯ１突然変異体に結合する（突然変異したＲＯＢＯ１は、本明細書において「ＲＯＢＯ１−ＲＳＫ」と呼ばれる）。したがって、驚くべきことに、本発明の抗体は、野生型ＲＯＢＯ２に結合し、野生型ＲＯＢＯ１に結合せず、ＲＯＢＯ２−ＫＳＲ突然変異体に結合せず、しかし、ＲＯＢＯ１−ＲＳＫ突然変異体に結合する。本発明は、したがって、野生型ＲＯＢＯ２に結合し、ＲＯＢＯ１に結合せず、しかしＲＯＢＯ１−ＲＳＫ突然変異体に結合する抗体を包含する。
【０１６４】
【表１】
2020524988.tif 000003
【０１６５】
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、実質的に同一のアッセイ条件下で、Ｒ１００がＫで置き換えられているＲＯＢＯ２エピトープについてのその結合親和性（ＫＤ）値の多くとも１００分の１であるＫＤ値を有する、Ｒ１００を含むＲＯＢＯ２エピトープに結合する。例えば、Ｒ１００がＫによって置き換えられているＲＯＢＯ２エピトープについてのＫＤに対する、Ｒ１００を含むＲＯＢＯ２エピトープについてのＫＤの比は、１：１００以下、１：２５０以下、１：５００以下、１：１０００以下、１：２５００以下、１：５０００以下、または１：１万以下であり得る。
【０１６６】
ある特定の実施形態では、エピトープは、Ｒ１００に加えて、残基Ｖ９６、Ｇ９８、Ｒ９９、およびＳ１０１の１つまたは複数をさらに含み得る。表１０Ａを参照されたい（「主要な」残基）。ある特定の実施形態では、エピトープは、抗体−抗原相互作用に寄与すると考えられる１つまたは複数の残基：Ｅ６９、Ｅ７２、Ｒ７９、Ｈ８１、Ｒ８２、Ｒ９４、およびＰ１０３をさらに含み得る。表１０Ａを参照されたい（「寄与」残基）。ある特定の実施形態では、エピトープは、抗体−抗原相互作用に「任意」であると考えられる１つまたは複数の残基：Ｋ６６、Ｄ６７、Ｒ７０、Ｖ７１、Ｔ７３、Ｄ７４、Ｄ７７、Ｐ７８、Ｈ９７、およびＫ１０２をさらに含み得る。表１０Ａを参照されたい（「任意の」残基）。
【０１６７】
抗体またはその抗原結合断片は、Ａｂｃｓ３５、９３Ｈ２、Ａｂ１、Ａｂ３、Ａｂ９、Ａｂ１３、Ａｂ１７、Ａｂ２１、Ａｂ２２、Ａｂ２５、Ａｂ２９、Ａｂ３２、Ａｂ４０、Ａｂ４５、Ａｂ４６、Ａｂ５８、Ａｂ８３、Ａｂ９６、Ａｂ１１２、Ａｂ１２３、Ａｂｃｓ１、Ａｂｃｓ２、Ａｂｃｓ４、Ａｂｃｓ５、Ａｂｃｓ１２、Ａｂｃｓ２０、Ａｂｃｓ２５、Ａｂｃｓ４０、Ａｂｃｓ５０、Ａｂｃｓ５５、ＣＴＩＲ２−１、ＣＴＩＲ２−２、ＣＴＩＲ２−３、ＣＴＩＲ２−４、ＣＴＩＲ２−５、ＣＴＩＲ２−６、ＣＴＩＲ２−７、ＣＴＩＲ２−８、ＣＴＩＲ２−９、ＣＴＩＲ２−１０、ＣＴＩＲ２−１１、ＣＴＩＲ２−１２、ＣＴＩＲ２−１３、ＣＴＩＲ２−１４、ＣＴＩＲ２−１５、ＣＴＩＲ２−１６、Ａｂｃｓ３５−Ａ、Ａｂｃｓ３５−Ｂ、Ａｂｃｓ３５−Ｃ、Ａｂｃｓ３５−Ｄ、Ａｂｃｓ３５−Ｅ、Ａｂｃｓ３５−Ｆ、Ａｂｃｓ３５−Ｇ、Ａｂｃｓ３５−Ｈ、Ａｂｃｓ３５−Ｉ、Ａｂｃｓ３５−Ｊ、Ａｂｃｓ３５−Ｋ、Ａｂｃｓ３５−Ｌ、Ａｂｃｓ３５−Ｍ、Ａｂｃｓ３５−Ｎ、およびＡｂｃｓ３５−Ｏ、その抗原結合断片、ならびにその突然変異体、変異体、誘導体、および実質的に類似の変形からなる群から選択され得る。
【０１６８】
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、以下のパラトープ残基：（ｉ）重鎖のＴ３０、Ｇ３１、Ｙ３２、Ｙ３３、Ｅ９５、Ｇ９７、およびＤ９９、ならびに（ｉｉ）軽鎖のＹ３２およびＹ９２、の１つまたは複数を含む。表１０Ｂを参照されたい（「主要な」残基）。ある特定の実施形態では、パラトープは、抗体−抗原相互作用に寄与すると考えられる１つまたは複数の残基：（ｉ）重鎖のＧ２６、Ｔ２８、Ｗ５０、Ｋ５３、Ｄ９８、Ｄ１０１、およびＩ１０２、ならびに（ｉｉ）軽鎖のＳ９１、Ｇ９３、およびＴ９６をさらに含み得る。表１０Ｂを参照されたい（「寄与」残基）。ある特定の実施形態では、パラトープは、抗体−抗原相互作用に「任意」であると考えられる１つまたは複数の残基：（ｉ）重鎖のＥ１、Ｖ２、Ｙ２７、Ｈ３５、Ｔ７３、Ｒ９４、およびＳ９６、ならびに（ｉｉ）軽鎖のＹ４９、Ｑ５５、およびＳ５６をさらに含み得る。表１０Ｂを参照されたい（「任意の」残基）。
【０１６９】
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、以下のパラトープ残基（カットオフが２０Å２のＢＳＡに基づく、Ｋａｂａｔの番号付け）：（ｉ）重鎖のＧｌｙ３１、Ｔｙｒ３２、Ｔｙｒ３３、Ｔｒｐ５０、Ｇｌｕ９５、Ｇｌｙ９７、Ａｓｐ９８、およびＡｓｐ９９、（ｉｉ）軽鎖のＴｙｒ３２、Ｔｙｒ４９、Ｓｅｒ９１、Ｔｙｒ９２、およびＳｅｒ９３、の１つまたは複数を含む。
【０１７０】
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、以下のパラトープ残基（カットオフがないＢＳＡに基づく、Ｋａｂａｔの番号付け）：（ｉ）重鎖のＧｌｙ３１、Ｔｙｒ３２、Ｔｙｒ３３、Ｈｉｓ３５、Ｔｒｐ５０、Ｇｌｕ９５、Ｓｅｒ９６、Ｇｌｙ９７、Ａｓｐ９８、およびＡｓｐ９９、（ｉｉ）軽鎖のＴｙｒ３２、Ｔｙｒ４９、Ｓｅｒ９１、Ｔｙｒ９２、Ｓｅｒ９３、およびＴｈｒ９６、の１つまたは複数を含む。
【０１７１】
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、１つまたは複数の以下のパラトープ残基（Ｈ結合に基づく、Ｋａｂａｔの番号付け）：（ｉ）重鎖のＧｌｕ９５、Ｇｌｙ９７、Ａｓｐ９８、およびＡｓｐ９９、（ｉｉ）軽鎖のＳｅｒ９１およびＴｙｒ９２を含む。
【０１７２】
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、１つまたは複数の以下のパラトープ残基（塩橋に基づく、Ｋａｂａｔの番号付け）：重鎖のＧｌｕ９５およびＡｓｐ９８を含む。
【０１７３】
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、１つまたは複数の以下のパラトープ残基（距離＜３．８Åに基づく、Ｋａｂａｔの番号付け）：（ｉ）重鎖のＧｌｙ３１、Ｔｙｒ３２、Ｔｙｒ３３、Ｔｒｐ５０、Ｇｌｕ９５、Ｓｅｒ９６、Ｇｌｙ９７、Ａｓｐ９８、およびＡｓｐ９９、（ｉｉ）軽鎖のＴｙｒ３２、Ｓｅｒ９１、およびＴｙｒ９２を含む。
【０１７４】
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、
（ａ）以下のように、ＲＯＢＯ２上の少なくとも１つのエピトープ残基（配列番号１に従った番号付け）の３．８Å以内にある少なくとも１つのパラトープ残基（Ｋａｂａｔに従った番号付け）を含む：エピトープ残基Ａｒｇ９４は、パラトープ残基Ｈ／Ａｓｐ９８の３．８Å以内にあり、エピトープ残基Ｇｌｙ９８は、パラトープ残基Ｈ／Ｇｌｙ９７およびＨ／Ａｓｐ９９の３．８Å以内にあり、エピトープ残基Ａｒｇ９９は、パラトープ残基Ｈ／Ａｓｐ９９、Ｌ／Ｔｙｒ３２、およびＬ／Ｔｙｒ９２の３．８Å以内にあり、エピトープ残基Ａｒｇ１００は、パラトープ残基Ｈ／Ｔｙｒ３３、Ｈ／Ｔｒｐ５０、Ｈ／Ｇｌｕ９５、Ｌ／Ｓｅｒ９１、およびＬ／Ｔｙｒ９２の３．８Å以内にあり、エピトープ残基Ｓｅｒ１０１は、パラトープ残基Ｈ／Ｔｙｒ３２、Ｈ／Ｔｙｒ３３、Ｈ／Ｇｌｕ９５、Ｈ／Ｓｅｒ９６、およびＨ／Ｇｌｙ９７の３．８Å以内にあり、エピトープ残基Ｌｙｓ１０２は、パラトープ残基Ｈ／Ｇｌｙ３１の３．８Å以内にあり、そして、エピトープ残基Ｐｒｏ１０３は、パラトープ残基Ｈ／Ｇｌｙ３１およびＨ／Ｔｙｒ３２の３．８Å以内にある、
（ｂ）以下のように、ＲＯＢＯ２のエピトープ残基（配列番号１に従った番号付け）と水素結合を形成し得る少なくとも１つのパラトープ残基（Ｋａｂａｔに従った番号付け）を含む：エピトープ残基Ａｒｇ９４は、パラトープ残基Ｈ／Ａｓｐ９８と水素結合を形成し得、エピトープ残基Ａｒｇ９９は、パラトープ残基Ｈ／Ａｓｏ９９およびＬ／Ｔｙｒ９２と水素結合を形成し得、エピトープ残基Ａｒｇ１００は、パラトープ残基Ｈ／Ｇｌｕ９５、Ｌ／Ｓｅｒ９１、およびＬ／Ｔｙｒ  ９２と水素結合を形成し得、そして、エピトープ残基Ｓｅｒ１０１は、パラトープ残基Ｈ／Ｇｌｕ９５およびＨ／Ｇｌｙ９７と水素結合を形成し得る、
（ｃ）以下のように、ＲＯＢＯ２のエピトープ残基（配列番号１に従った番号付け）と塩橋を形成し得る少なくとも１つのパラトープ残基（Ｋａｂａｔに従った番号付け）を含む：エピトープ残基Ａｒｇ９４は、パラトープ残基Ｈ／Ａｓｐ９８と塩橋を形成し得、そしてエピトープ残基Ａｒｇ１００は、パラトープ残基Ｈ／Ｇｌｕ９５と塩橋を形成し得る、または
（ｄ）以下のように、エピトープ残基（配列番号１に従った番号付け）との相互作用に起因したＢＳＡにおける変化がゼロではない少なくとも１つのパラトープ残基（Ｋａｂａｔに従った番号付け）を含む：エピトープ残基Ａｒｇ９４は、パラトープ残基Ｈ／Ａｓｐ９８およびＬ／Ｔｙｒ４９と相互作用し、エピトープ残基Ｖａｌ９６は、パラトープ残基Ｈ／Ｇｌｙ９７と相互作用し、エピトープ残基Ｈｉｓ９７は、パラトープ残基Ｈ／Ｇｌｙ９７と相互作用し、エピトープ残基Ｇｌｙ９８は、パラトープ残基Ｈ／Ｇｌｙ９７と相互作用し、エピトープ残基Ａｒｇ９９は、パラトープ残基Ｈ／Ａｓｐ９９、Ｌ／Ｔｙｒ３２、およびＬ／Ｔｙｒ９２と相互作用し、エピトープ残基Ａｒｇ１００は、パラトープ残基Ｈ／Ｔｙｒ３３、Ｈ／Ｔｒｐ５０、Ｈ／Ｇｌｕ９５、Ｌ／Ｓｅｒ９１、Ｌ／Ｔｙｒ９２、およびＬ／Ｓｅｒ９３と相互作用し、エピトープ残基Ｓｅｒ１０１は、パラトープ残基Ｈ／Ｔｙｒ３２、Ｈ／Ｔｙｒ３３、Ｈ／Ｇｌｕ９５、Ｈ／Ｓｅｒ９６、およびＨ／Ｇｌｙ９７と相互作用し、エピトープ残基Ｌｙｓ  １０２は、パラトープ残基Ｈ／Ｇｌｙ３１と相互作用し、そしてエピトープ残基Ｐｒｏ１０３は、パラトープ残基Ｈ／Ｇｌｙ３１およびＨ／Ｔｙｒ３２と相互作用する。
【０１７５】
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、以下の重鎖ＣＤＲ配列：（ｉ）配列番号２４を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２５を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号２６を含むＣＤＲ−Ｈ３、ならびに／または（ｉｉ）以下の軽鎖ＣＤＲ配列：配列番号２９を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３０を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号３１を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む。
【０１７６】
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、以下の重鎖ＣＤＲ配列：（ｉ）配列番号２４を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４４を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号２６を含むＣＤＲ−Ｈ３、ならびに／または（ｉｉ）以下の軽鎖ＣＤＲ配列：配列番号２９を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３０を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号４７を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む。
【０１７７】
ある特定の実施形態では、本明細書において記載される抗体またはその抗原結合断片は、以下の重鎖ＣＤＲ配列：（ｉ）配列番号２４と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、もしくは少なくとも９５％の同一性を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２５もしくは配列番号４４と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、もしくは少なくとも９５％の同一性を有するＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号２６と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、もしくは少なくとも９５％の同一性を有するＣＤＲ−Ｈ３、ならびに／または（ｉｉ）以下の軽鎖ＣＤＲ配列：配列番号２９と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、もしくは少なくとも９５％の同一性を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３０と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、もしくは少なくとも９５％の同一性を有するＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号３１もしくは配列番号４７と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、もしくは少なくとも９５％の同一性を有するＣＤＲ−Ｌ３を含む。
【０１７８】
ある特定の実施形態では、配列番号２９と比較して、１０以下、９つ以下、８つ以下、７つ以下、６つ以下、５つ以下、４つ以下、３つ以下、２つ以下、または１つ以下の置換がＣＤＲ−Ｌ１で行われている。ある特定の実施形態では、配列番号３０と比較して、６つ以下、５つ以下、４つ以下、３つ以下、３つ以下、２つ以下、または１つ以下の置換がＣＤＲ−Ｌ２で行われている。ある特定の実施形態では、配列番号３１または配列番号４７と比較して、６つ以下、５つ以下、４つ以下、３つ以下、３つ以下、２つ以下、または１つ以下の置換がＣＤＲ−Ｌ３で行われている。一部の実施形態では、配列番号２４と比較して、９つ以下、８つ以下、７つ以下、６つ以下、５つ以下、４つ以下、３つ以下、２つ以下、または１つ以下の置換がＣＤＲ−Ｈ１で行われている。一部の実施形態では、配列番号２５または配列番号４４と比較して、１８以下、１７以下、１６以下、１５以下、１４以下、１３以下、１２以下、１１以下、または１０以下、９つ以下、８つ以下、７つ以下、６つ以下、５つ以下、４つ以下、３つ以下、２つ以下、または１つ以下の置換がＣＤＲ−Ｈ２で行われている。一部の実施形態では、配列番号２６と比較して、９つ以下、８つ以下、７つ以下、６つ以下、５つ以下、４つ以下、３つ以下、２つ以下、または１つ以下の置換がＣＤＲ−Ｈ３で行われている。ある特定の実施形態では、置換は、結合親和性（ＫＤ）の値を、１０００倍を超えて、１００倍を超えて、または１０倍を超えて変化させることはない。ある特定の実施形態では、置換は、表１に従った保存的な置換である。ある特定の実施形態では、置換は、表１０Ｂで示すように、主要なパラトープ残基または寄与パラトープ残基の１つではない。ある特定の実施形態では、置換は、表１０Ｂで示すように、主要なパラトープ残基、寄与パラトープ残基、または任意のパラトープ残基の１つではない。
【０１７９】
【表２】
2020524988.tif 000004
【０１８０】
抗体またはその抗原結合断片は、ヒト生殖細胞系ＶＨフレームワーク配列を含むＶＨフレームワークを含み得る。ＶＨフレームワーク配列は、ヒトＶＨ３生殖細胞系、ＶＨ１生殖細胞系、ＶＨ５生殖細胞系、またはＶＨ４生殖細胞系に由来し得る。好ましいヒト生殖細胞系重鎖フレームワークは、ＶＨ１、ＶＨ３、またはＶＨ５生殖細胞系に由来するフレームワークである。例えば、以下の生殖細胞系由来のＶＨフレームワークを使用することができる：ＩＧＨＶ３−２３、ＩＧＨＶ３−７、またはＩＧＨＶ１−６９（生殖細胞系の名称は、ＩＭＧＴの生殖細胞系の定義に基づく）。好ましいヒト生殖細胞系軽鎖フレームワークは、ＶΚまたはＶλ生殖細胞系に由来するフレームワークである。例えば、以下の生殖細胞系由来のＶＬフレームワークを使用することができる：ＩＧＫＶ１−３９またはＩＧＫＶ３−２０（生殖細胞系の名称は、ＩＭＧＴの生殖細胞系の定義に基づく）。あるいは、またはさらに、フレームワーク配列は、ヒトＶλ１コンセンサス配列、ＶΚ１コンセンサス配列、ＶΚ２コンセンサス配列、ＶΚ３コンセンサス配列、ＶＨ３生殖細胞系コンセンサス配列、ＶＨ１生殖細胞系コンセンサス配列、ＶＨ５生殖細胞系コンセンサス配列、またはＶＨ４生殖細胞系コンセンサス配列のフレームワークなどの、ヒト生殖細胞系コンセンサスフレームワーク配列であり得る。ヒト生殖細胞系フレームワークの配列は、Ｖ−ベース、ＩＭＧＴ、ＮＣＢＩ、またはＡｂｙｓｉｓなどの様々な公開データベースから入手可能である。
【０１８１】
抗体またはその抗原結合断片は、ヒト生殖細胞系ＶＬフレームワーク配列を含むＶＬフレームワークを含み得る。ＶＬフレームワークは、１つまたは複数のアミノ酸の置換、付加、または欠失を含み得るが、それが由来した元である生殖細胞系との機能的および構造的類似性は依然として保持している。一部の態様では、ＶＬフレームワークは、ヒト生殖細胞系ＶＬフレームワーク配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である。一部の態様では、抗体またはその抗原結合断片は、ヒト生殖細胞系ＶＬフレームワーク配列と比較して１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個のアミノ酸の置換、添加、または欠失を含むＶＬフレームワークを含む。
【０１８２】
ヒト生殖細胞系ＶＬフレームワークは、ＤＰＫ９のフレームワークであり得る（ＩＭＧＴ名：ＩＧＫＶ１−３９）。ヒト生殖細胞系ＶＬフレームワークは、ＤＰＫ１２のフレームワークであり得る（ＩＭＧＴ名：ＩＧＫＶ２Ｄ−２９）。ヒト生殖細胞系ＶＬフレームワークは、ＤＰＫ１８のフレームワークであり得る（ＩＭＧＴ名：ＩＧＫＶ２−３０）。ヒト生殖細胞系ＶＬフレームワークは、ＤＰＫ２４のフレームワークであり得る（ＩＭＧＴ名：ＩＧＫＶ４−１）。ヒト生殖細胞系ＶＬフレームワークは、ＨＫ１０２＿Ｖ１のフレームワークであり得る（ＩＭＧＴ名：ＩＧＫＶ１−５）。ヒト生殖細胞系のＶＬフレームワークは、ＤＰＫ１のフレームワークであり得る（ＩＭＧＴ名：ＩＧＫＶ１−３３）。ヒト生殖細胞系のＶＬフレームワークは、ＤＰＫ８のフレームワークであり得る（ＩＭＧＴ名：ＩＧＫＶ１−９）。ヒト生殖細胞系のＶＬフレームワークは、ＤＰＫ３のフレームワークであり得る（ＩＭＧＴ名：ＩＧＫＶ１−６）。ヒト生殖細胞系のＶＬフレームワークは、ＤＰＫ２１のフレームワークであり得る（ＩＭＧＴ名：ＩＧＫＶ３−１５）。ヒト生殖細胞系のＶＬフレームワークは、Ｖｇ＿３８Ｋのフレームワークであり得る（ＩＭＧＴ名：ＩＧＫＶ３−１１）。ヒト生殖細胞系のＶＬフレームワークは、ＤＰＫ２２のフレームワークであり得る（ＩＭＧＴ名：ＩＧＫＶ３−２０）。ヒト生殖細胞系のＶＬフレームワークは、ＤＰＫ１５のフレームワークであり得る（ＩＭＧＴ名：ＩＧＫＶ２−２８）。ヒト生殖細胞系のＶＬフレームワークは、ＤＰＬ１６のフレームワークであり得る（ＩＭＧＴ名：ＩＧＬＶ３−１９）。ヒト生殖細胞系のＶＬフレームワークは、ＤＰＬ８のフレームワークであり得る（ＩＭＧＴ名：ＩＧＬＶ１−４０）。ヒト生殖細胞系のＶＬフレームワークは、Ｖ１−２２フレームワークであり得る（ＩＭＧＴ名：ＩＧＬＶ６−５７）。ヒト生殖細胞系のＶＬフレームワークは、ヒトＶλコンセンサス配列のフレームワークであり得る。ヒト生殖細胞系のＶＬフレームワークは、ヒトＶλ１コンセンサス配列のフレームワークであり得る。ヒト生殖細胞系のＶＬフレームワークは、ヒトＶλ３コンセンサス配列のフレームワークであり得る。ヒト生殖細胞系のＶＬフレームワークは、ヒトＶΚコンセンサス配列のフレームワークであり得る。ヒト生殖細胞系のＶＬフレームワークは、ヒトＶΚ１コンセンサス配列のフレームワークであり得る。ヒト生殖細胞系のＶＬフレームワークは、ヒトＶΚ２コンセンサス配列のフレームワークであり得る。ヒト生殖細胞系のＶＬフレームワークは、ヒトＶΚ３コンセンサス配列のフレームワークであり得る。
【０１８３】
抗体またはその抗原結合断片は、ヒト生殖細胞系ＶＨフレームワーク配列を含むＶＨフレームワークを含み得る。ＶＨフレームワークは、１つまたは複数のアミノ酸の置換、付加、または欠失を含み得るが、それが由来した元である生殖細胞系との機能的および構造的類似性は依然として保持している。一部の態様では、ＶＨフレームワークは、ヒト生殖細胞系ＶＨフレームワーク配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である。一部の態様では、抗体またはその抗原結合断片は、ヒト生殖細胞系ＶＨフレームワーク配列と比較して１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個のアミノ酸の置換、添加、または欠失を含むＶＨフレームワークを含む。
【０１８４】
ヒト生殖細胞系ＶＨフレームワークは、ＤＰ５４またはＩＧＨＶ３−７のフレームワークであり得る。ヒト生殖細胞系ＶＨフレームワークは、ＤＰ４７またはＩＧＨＶ３−２３のフレームワークであり得る。ヒト生殖細胞系ＶＨフレームワークは、ＤＰ７１またはＩＧＨＶ４−５９のフレームワークであり得る。ヒト生殖細胞系ＶＨフレームワークは、ＤＰ７５またはＩＧＨＶ１−２＿０２のフレームワークであり得る。ヒト生殖細胞系のＶＨフレームワークは、ＤＰ１０またはＩＧＨＶ１−６９のフレームワークであり得る。ヒト生殖細胞系のＶＨフレームワークは、ＤＰ７またはＩＧＨＶ１−４６のフレームワークであり得る。ヒト生殖細胞系のＶＨフレームワークは、ＤＰ４９またはＩＧＨＶ３−３０のフレームワークであり得る。ヒト生殖細胞系のＶＨフレームワークは、ＤＰ５１またはＩＧＨＶ３−４８のフレームワークであり得る。ヒト生殖細胞系のＶＨフレームワークは、ＤＰ３８またはＩＧＨＶ３−１５のフレームワークであり得る。ヒト生殖細胞系のＶＨフレームワークは、ＤＰ７９またはＩＧＨＶ４−３９のフレームワークであり得る。ヒト生殖細胞系のＶＨフレームワークは、ＤＰ７８またはＩＧＨＶ４−３０−４のフレームワークであり得る。ヒト生殖細胞系のＶＨフレームワークは、ＤＰ７３またはＩＧＨＶ５−５１のフレームワークであり得る。ヒト生殖細胞系のＶＨフレームワークは、ＤＰ５０またはＩＧＨＶ３−３３のフレームワークであり得る。ヒト生殖細胞系のＶＨフレームワークは、ＤＰ４６またはＩＧＨＶ３−３０−３のフレームワークであり得る。ヒト生殖細胞系のＶＨフレームワークは、ＤＰ３１またはＩＧＨＶ３−９のフレームワークであり得る。ヒト生殖細胞系のＶＨフレームワークは、ヒトＶＨ生殖細胞系のコンセンサス配列のフレームワークであり得る。ヒト生殖細胞系のＶＨフレームワークは、ヒトＶＨ３生殖細胞系のコンセンサス配列のフレームワークであり得る。ヒト生殖細胞系のＶＨフレームワークは、ヒトＶＨ５生殖細胞系のコンセンサス配列のフレームワークであり得る。ヒト生殖細胞系のＶＨフレームワークは、ヒトＶＨ１生殖細胞系のコンセンサス配列のフレームワークであり得る。ヒト生殖細胞系のＶＨフレームワークは、ヒトＶＨ４生殖細胞系のコンセンサス配列のフレームワークであり得る。
【０１８５】
ある特定の実施形態では、本明細書において記載される抗体またはその抗原結合断片は、（ｉ）配列番号３２と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一なアミノ酸配列を含むＶＨ、および／または（ｉｉ）配列番号３９と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一なアミノ酸配列を含むＶＬを含む。これらのＶＬ配列およびＶＨ配列の任意の組み合わせもまた、本発明によって包含される。
【０１８６】
ある特定の実施形態では、本明細書において記載される抗体またはその抗原結合断片は、（ｉ）配列番号１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、および１３２からなる群の１つと少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一なアミノ酸配列を含むＶＨ、および／または（ｉｉ）配列番号１３３と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一なアミノ酸配列を含むＶＬを含む。これらのＶＨ配列およびＶＬ配列の任意の組み合わせもまた、本発明によって包含される。
【０１８７】
一部の実施形態では、本明細書において記載される抗体またはその抗原結合断片は、（ｉ）配列番号４３、４９、５５、７０、７３、７６、７９、８２、８５、８８、１１５、および１１９からなる群の１つと少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一なアミノ酸配列を含むＶＨ、および／または（ｉｉ）配列番号４６、５２、５８、６１、６４、６７、９１、９４、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、および１１３のいずれかと少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一なアミノ酸配列を含むＶＬを含む。これらのＶＬ配列およびＶＨ配列の任意の組み合わせもまた、本発明によって包含される。
【０１８８】
ある特定の実施形態では、本明細書において記載される抗体またはその抗原結合断片は、（ｉ）配列番号２４を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２５を含むＣＤＲ−Ｈ２、配列番号２６を含むＣＤＲ−Ｈ３、配列番号２９を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３０を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号３１を含むＣＤＲ−Ｌ３、ならびに（ｉｉ）ヒト生殖細胞系ＤＰＫ９のフレームワーク配列と少なくとも６６％、少なくとも７４％、少なくとも７６％、少なくとも８０％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、または少なくとも９９％同一な配列を含むＶＬフレームワーク、およびヒト生殖細胞系ＤＰ−７５のフレームワーク配列と少なくとも７３％、少なくとも７５％、少なくとも７９％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、または少なくとも９９％同一な配列を含むＶＨフレームワークを含む。ある特定の実施形態では、ＶＨフレームワークは、ＤＰ−７５である。他の類似のフレームワーク領域もまた、配列番号２４、２５、および２６のＣＤＲを含む本発明の有利な抗体または抗体断片を送達すると予測され、これには、ＤＰ−７５のＦＷ領域とそれぞれ９９％、９４％、９４％、９４％、９３％、９０％、９０％、７９％、７５％、７３％、および７３％の配列同一性を有し、共通の構造的特徴：（Ａ）ＣＤＲの真下の残基（バーニヤゾーン）：Ｈ２、Ｈ４７、Ｈ４８、Ｈ４９、Ｈ６７、Ｈ６９、Ｈ７１、Ｈ７３、Ｈ９３、Ｈ９４、（Ｂ）ＶＨ／ＶＬ鎖パッキング残基：Ｈ３７、Ｈ３９、Ｈ４５、Ｈ４７、Ｈ９１、Ｈ９３、および（Ｃ）正準的なＣＤＲ構造支持残基：Ｈ２４、Ｈ７１、Ｈ９４（全て、Ｋａｂａｔの番号付け）、において４つ以下のアミノ酸が異なる、ＤＰ−８、ＤＰ−１５、ＤＰ−１４、ＤＰ−７、ＤＰ−２５、ＤＰ−１０、ＤＰ−８８、ＩＧＨＶ７−４−１＊０２、ＤＰ−７３、ＩＧＨＶ５−１０−１＊０１、およびＩＧＨＶ５−１０−１＊０４が含まれる。特に好ましいものは、ＤＰ−７５とそれぞれ９９％、９４％、９４％、９４％、および９３％の同一性を有し、これらの共通の構造的特徴において１つ以下のアミノ酸が異なる、ＤＰ−８、ＤＰ−１５、ＤＰ−１４、ＤＰ−７、およびＤＰ−２５のフレームワーク領域である。
【０１８９】
ある特定の実施形態では、ＶＬフレームワークは、ＤＰＫ９である。他の類似のフレームワーク領域もまた、配列番号２９、３０、および３１のＣＤＲを含む本発明の有利な抗体を送達すると予測され、これには、ＤＰ−９のＦＷ領域とそれぞれ９９％、９７％、９７％、９６％、８０％、７６％、６６％、９７％、９７％、９６％、７６％、および７４％の配列同一性を有し、共通の構造的特徴：（Ａ）ＣＤＲの真下の残基（バーニヤゾーン）：Ｌ２、Ｌ４、Ｌ３５、Ｌ３６、Ｌ４６、Ｌ４７、Ｌ４８、Ｌ４９、Ｌ６４、Ｌ６６、Ｌ６８、Ｌ６９、Ｌ７１、（Ｂ）ＶＨ／ＶＬ鎖パッキング残基：Ｌ３６、Ｌ３８、Ｌ４４、Ｌ４６、Ｌ８７、および（Ｃ）正準的なＣＤＲ構造支持残基：Ｌ２、Ｌ４８、Ｌ６４、Ｌ７１（全て、Ｋａｂａｔの番号付け）、において１つ以下のアミノ酸が異なる、ＤＰＫ５、ＤＰＫ４、ＤＰＫ１、ＩＧＫＶ１−５＊０１、ＤＰＫ２４、ＤＰＫ２１、ＤＰＫ１５、ＩＧＫＶ１−１３＊０２、ＩＧＫＶ１−１７＊０１、ＤＰＫ８、ＩＧＫＶ３−１１＊０１、およびＤＰＫ２２が含まれる。特に好ましいものは、ＤＰＫ９とそれぞれ９９％、９７％、９７％、９６％、８０％、７６％、および６６％の同一性を有し、これらの共通の構造的特徴においてアミノ酸が異ならない、ＤＰＫ５、ＤＰＫ４、ＤＰＫ１、ＩＧＫＶ１−５＊０１、ＤＰＫ２４、ＤＰＫ２１、およびＤＰＫ１５のフレームワーク領域である。
【０１９０】
ある特定の実施形態では、本明細書において記載される抗体またはその抗原結合断片は、Ｆｃドメインを含む。Ｆｃドメインは、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１もしくはＩｇＡ２）、ＩｇＧ、ＩｇＥ、またはＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４）に由来し得る。一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの野生型配列を含む。一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、生物学的活性を改変する１つまたは複数の突然変異を含む。例えば、突然変異を、エフェクター活性を低減させるため（例えば、ＷＯ２００５／０６３８１５）、および／または組換えタンパク質の生産の間の均質性を増大させるために、Ｆｃドメイン内に導入することができる。一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインであり、以下のエフェクターヌル突然変異：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＧ２３７Ａ（ＥＵインデックスに従った番号付け）の１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、ＦｃドメインのＣ末端位置内に位置するリジンは、組換えタンパク質の生産の間の均質性を増大させるために欠失させられる。一部の実施形態では、ＦｃドメインのＣ末端位置内に位置するリジンは存在している。
【０１９１】
ある特定の実施形態では、本明細書において記載される抗体またはその抗原結合断片は、（ｉ）配列番号３４のいずれかと少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一な重鎖ＣＨ１ドメイン、（ｉｉ）配列番号３６のいずれかと少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一な重鎖ＣＨ２ドメイン、（ｉｉｉ）配列番号３７のいずれかと少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一な重鎖ＣＨ３ドメイン、および／または（ｉｖ）配列番号４１と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一な軽鎖ＣＬドメインを含む。これらのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＬ配列の任意の組み合わせもまた、本発明によって包含される。
【０１９２】
ある特定の実施形態では、本明細書において記載される抗体またはその抗原結合断片は、（ｉ）配列番号３８と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一なアミノ酸配列を含むＨＣ、および／または（ｉｉ）配列番号４２と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一なアミノ酸配列を含むＬＣを含む。これらのＨＣおよびＬＣ配列の任意の組み合わせもまた、本発明によって包含される。
【０１９３】
ある特定の実施形態では、本明細書において記載される抗体またはその抗原結合断片は、（ｉ）配列番号４５と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一なアミノ酸配列を含むＨＣ、および／または（ｉｉ）配列番号４８と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一なアミノ酸配列を含むＬＣを含む。これらのＨＣおよびＬＣ配列の任意の組み合わせもまた、本発明によって包含される。
【０１９４】
ある特定の実施形態では、本明細書において記載される抗体またはその抗原結合断片は、（ｉ）配列番号３８、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、および１４０のいずれか１つと少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一なアミノ酸配列を含むＨＣ、および／または（ｉｉ）配列番号４２もしくは１４１と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一なアミノ酸配列を含むＬＣを含む。これらのＨＣおよびＬＣ配列の任意の組み合わせもまた、本発明によって包含される。
【０１９５】
本発明によって同様に提供されるものは、本明細書において提供される抗体のいずれか１つ（またはその抗原結合断片）などの、本明細書において記載される抗体またはその抗原結合断片のいずれかとヒトＲＯＢＯ２への結合について競合する抗体またはその抗原結合断片である。例えば、ヒトＲＯＢＯ２への抗体またはその抗原結合部分の結合が、その後のＡｂｃｓ３５によるヒトＲＯＢＯ２への結合を妨害する場合、この抗体またはその抗原結合部分は、ヒトＲＯＢＯ２の結合についてＡｂｃｓ３５と競合する。
【０１９６】
本発明によって同様に提供されるものは、本明細書において提供される抗体のいずれか１つまたはその抗原結合断片などの、本明細書において記載される抗体またはその抗原結合断片のいずれかと同一のヒトＲＯＢＯ２エピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片である。例えば、抗体競合アッセイ（およびオーバーラップエピトープ分析）は、本明細書において詳細に記載するように、ＳＰＲまたはＢＬＩによって評価することができる。
【０１９７】
本発明によって提供される抗体および抗原結合断片としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｃなど）、キメラ抗体、二重特異的抗体、ヘテロコンジュゲート抗体、一本鎖（ＳｃＦｖ）、その突然変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、ヒト化抗体、ならびに、抗体のグリコシル化変異体、抗体のアミノ酸配列変異体、および共有結合によって修飾された抗体を含む、所要の特異性を有する抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子のあらゆる他の修飾された立体構造が含まれる。抗体および抗原結合断片は、マウス、ラット、ヒト、またはあらゆる他の生物由来であり得る（キメラ抗体またはヒト化抗体を含む）。一部の実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。一部の実施形態では、抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である。ある特定の実施形態では、抗体は、ヒト抗体である。ある特定の実施形態では、抗体は、ヒト化抗体である。
【０１９８】
抗体の結合親和性は、特定の抗原−抗体相互作用の解離速度を指すＫＤ値として表すことができる。ＫＤは、会合速度または「オン速度（ｋｏｎ）」に対する、「オフ速度（ｋｏｆｆ）」とも呼ばれる解離速度の比である。したがって、ＫＤは、ｋｏｆｆ／ｋｏｎ（解離／会合）に等しく、モル濃度（Ｍ）として表され、ＫＤが小さいほど、結合の親和性が強い。抗体のＫＤ値は、当技術分野において良く確立された方法を使用して決定することができる。別段の特定がない限り、「結合親和性」は、一価の相互作用（固有の活性、例えば、一価の相互作用を介する抗原への抗体の結合）を指す。
【０１９９】
ある特定の実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、約１×１０−６Ｍ以下、例えば、約１×１０−７Ｍ以下、約９×１０−８Ｍ以下、約８×１０−８Ｍ以下、約７×１０−８Ｍ以下、約６×１０−８Ｍ以下、約５×１０−８Ｍ以下、約４×１０−８Ｍ以下、約３×１０−８Ｍ以下、約２×１０−８Ｍ以下、約１×１０−８Ｍ以下、約９×１０−９Ｍ以下、約８×１０−９Ｍ以下、約７×１０−９Ｍ以下、約６×１０−９Ｍ以下、約５×１０−９Ｍ以下、約４×１０−９Ｍ以下、約３×１０−９Ｍ以下、約２×１０−９Ｍ以下、約１×１０−９Ｍ以下、約９×１０−１０Ｍ以下、約８×１０−１０Ｍ以下、約７×１０−１０Ｍ以下、約６×１０−１０Ｍ以下、約５×１０−１０Ｍ以下、約４×１０−１０Ｍ以下、約３×１０−１０Ｍ以下、約２×１０−１０Ｍ以下、約１×１０−１０Ｍ以下、約９×１０−１１Ｍ以下、約８×１０−１１Ｍ以下、約７×１０−１１Ｍ以下、約６×１０−１１Ｍ以下、約５×１０−１１Ｍ以下、約４×１０−１１Ｍ以下、約３×１０−１１Ｍ以下、約２×１０−１１Ｍ以下、約１×１０−１１Ｍ以下、約９×１０−１２Ｍ以下、約８×１０−１２Ｍ以下、約７×１０−１２Ｍ以下、約６×１０−１２Ｍ以下、約５×１０−１２Ｍ以下、約４×１０−１２Ｍ以下、約３×１０−１２Ｍ以下、約２×１０−１２Ｍ以下、約１×１０−１２Ｍ以下、約９×１０−１３Ｍ以下、約８×１０−１３Ｍ以下、約７×１０−１３Ｍ以下、約６×１０−１３Ｍ以下、約５×１０−１３Ｍ以下、約４×１０−１３Ｍ以下、約３×１０−１３Ｍ以下、約２×１０−１３Ｍ以下、約１×１０−１３Ｍ以下、約１×１０−７Ｍから約１×１０−１４Ｍ、約９×１０−８Ｍから約１×１０−１４Ｍ、約８×１０−８Ｍから約１×１０−１４Ｍ、約７×１０−８Ｍから約１×１０−１４Ｍ、約６×１０−８Ｍから約１×１０−１４Ｍ、約５×１０−８Ｍから約１×１０−１４Ｍ、約４×１０−８Ｍから約１×１０−１４Ｍ、約３×１０−８Ｍから約１×１０−１４Ｍ、約２×１０−８Ｍから約１×１０−１４Ｍ、約１×１０−８Ｍから約１×１０−１４Ｍ、約９×１０−９Ｍから約１×１０−１４Ｍ、約８×１０−９Ｍから約１×１０−１４Ｍ、約７×１０−９Ｍから約１×１０−１４Ｍ、約６×１０−９Ｍから約１×１０−１４Ｍ、約５×１０−９Ｍから約１×１０−１４Ｍ、約４×１０−９Ｍから約１×１０−１４Ｍ、約３×１０−９Ｍから約１×１０−１４Ｍ、約２×１０−９Ｍから約１×１０−１４Ｍ、約１×１０−９Ｍから約１×１０−１４Ｍ、約１×１０−７Ｍから約１×１０−１３Ｍ、約９×１０−８Ｍから約１×１０−１３Ｍ、約８×１０−８Ｍから約１×１０−１３Ｍ、約７×１０−８Ｍから約１×１０−１３Ｍ、約６×１０−８Ｍから約１×１０−１３Ｍ、約５×１０−８Ｍから約１×１０−１３Ｍ、約４×１０−８Ｍから約１×１０−１３Ｍ、約３×１０−８Ｍから約１×１０−１３Ｍ、約２×１０−８Ｍから約１×１０−１３Ｍ、約１×１０−８Ｍから約１×１０−１３Ｍ、約９×１０−９Ｍから約１×１０−１３Ｍ、約８×１０−９Ｍから約１×１０−１３Ｍ、約７×１０−９Ｍから約１×１０−１３Ｍ、約６×１０−９Ｍから約１×１０−１３Ｍ、約５×１０−９Ｍから約１×１０−１３Ｍ、約４×１０−９Ｍから約１×１０−１３Ｍ、約３×１０−９Ｍから約１×１０−１３Ｍ、��２×１０−９Ｍから約１×１０−１３Ｍ、または約１×１０−９Ｍから約１×１０−１３Ｍの親和性（ＫＤ）値を有する。
【０２００】
ＫＤの値は、周知の方法によって直接決定することができ、例えばＣａｃｅｃｉら、（１９８４、Ｂｙｔｅ  ９：３４０〜３６２）で示されているものなどの方法によって、複雑な混合物についてであっても計算することができる。例えば、ＫＤは、Ｗｏｎｇ  ＆  Ｌｏｈｍａｎ（１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５４２８〜５４３２）によって開示されているものなどのダブルフィルターニトロセルロースフィルター結合アッセイを使用して確立することができる。例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、ＲＩＡ、およびフローサイトメトリー分析、および本明細書のいずれかの箇所において例示される他のアッセイを含む、標的抗原への抗体などのリガンドの結合能力を評価するための他の標準的なアッセイが、当技術分野において知られている。
【０２０１】
結合親和性（ＫＤ）値を測定するための１つの典型的な方法は、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを典型的には使用する、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。ＳＰＲは、例えばＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）システムを使用して、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の改変を検出することによって生体特異性の相互作用をリアルタイムで分析することを可能にする、光学的な現象を指す。ＢＩＡｃｏｒｅ動態分析は、その表面上に分子（例えば、抗原結合ドメインを含む分子）が固定されたチップへの抗原の結合およびこのチップからの抗原の解離、または抗原が固定されたチップからの抗体もしくはその抗原結合断片の解離を分析することを含む。
【０２０２】
ある特定の実施形態では、ＳＰＲの測定は、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００またはＴ２００機器を使用して行われる。例えば、表面プラズモン共鳴のための標準的なアッセイ条件は、ＳＰＲチップ上のおよそ１００〜５００応答単位（ＲＵ）のＩｇＧの抗体固定に基づき得る。精製された標的タンパク質を、緩衝液中でさまざまな最終濃度まで希釈し、Ｋａの計算を可能にするために、必要流量（例えば、１０〜１００μｌ／分）で注入する。解離は、オフ速度が確立されるまで進められ、その後、３ＭのＭｇＣｌ２（または２０ｍＭのＮａＯＨ）でチップ表面が再生される。センサーグラムを次いで、動態評価ソフトウェアパッケージを使用して分析する。典型的な実施形態では、ＳＰＲアッセイは、実施例において示すような条件に従う。
【０２０３】
ある特定の実施形態では、結合親和性（ＫＤ）値は、溶液に基づく動態排除アッセイ（ＫｉｎＥｘＡ（商標））を使用して測定される。特定の実施形態では、ＫｉｎＥｘＡ測定は、ＫｉｎＥｘＡ（商標）３２００機器（Ｓａｐｉｄｙｎｅ）を使用して行われる。動態排除アッセイ（ＫｉｎＥｘＡ（商標））は、抗原／抗体相互作用の平衡解離定数および会合速度定数および解離速度定数を測定し得る多目的の免疫アッセイプラットフォーム（基本的に、フロー分光蛍光光度計）である。ＫｉｎＥｘＡ（商標）は、平衡が得られた後に行われるため、これは、相互作用のオフ速度が非常に遅い可能性がある高い親和性相互作用のＫＤの測定に使用するために有利な技術である。ＫｉｎＥｘＡ（商標）方法論は、全体として、Ｄｒａｋｅら（２００４）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２８、３５〜４３において記載されているように行うことができる。
【０２０４】
抗体のＫＤを決定するための別の方法は、Ｂｉｏ−Ｌａｙｅｒ干渉法（ＢＬＩ）を使用すること、典型的には、ＦｏｒｔｅＢｉｏのＯＣＴＥＴ（登録商標）技術（例えば、Ｏｃｔｅｔ  ＱＫｅシステム）を使用することによる。典型的な実施形態では、Ｏｃｔｅｔアッセイは、実施例において示すような条件に従う。ある特定の実施形態では、ＢＬＩの測定は、以下に従って行われる：専売されている抗ヒト抗体（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）で被覆したセンサーチップを、ランニング緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する１０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ）など）中に１２０秒間浸すことによってＢＬＩシグナルを安定化させる。抗体を次いで、センサーをランニング緩衝溶液（緩衝液は、１〜１０ｕｇ／ｍＬの抗体を含有し得る）中に３００秒間浸すことによって捕捉する。シグナルを次いで、センサーチップをランニング緩衝液中に戻して１２０秒間浸すことによって安定化させる。チップを次いで、コグネート抗原を含有する溶液中に移す。抗体−抗原の結合を１８０秒間にわたり測定し、その後、センサーチップをランニング緩衝液に移して、受容体の解離を１８０秒間にわたりモニタリングする。ＲＯＢＯのケースでは、抗原の典型的には７点からなる用量応答（２倍希釈で１〜２ｎＭの範囲であり得る）が測定される。さらに、抗体を捕捉していないセンサーチップを抗原に曝露して、センサーチップへの受容体の非特異的な結合をモニタリングする。第２の参照タイプもまた、抗体が捕捉されたチップを含むが、その後に曝露されるランニング緩衝液は、抗原を伴わないもののみである。このことによって、非特異的な結合と、システムノイズ、および抗ヒトＦｃセンサーチップから解離する抗体に起因する、根底にあるベースラインドリフトとの両方を排除するための、二重参照が可能になる。生データは二重参照を差し引かれ、次いで、１：１のラングミュア型結合モデルにフィットさせて、親和性パラメータおよび動態パラメータを決定する。
【０２０５】
一般に、抗ＲＯＢＯ２抗体は、ＲＯＢＯ２の活性を効果的に遮断するために、高い親和性でＲＯＢＯ２に結合する。抗ＲＯＢＯ２抗体が低いナノモル濃度およびピコモル濃度範囲、例えば約１×１０−８Ｍ以下の結合親和性（ＫＤ）を有することが望ましい。
【０２０６】
活性アッセイ
ある特定の実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、ＲＯＢＯ２−ＳＬＩＴシグナル伝達の少なくとも１つの活性を低減させる中和抗体である。このような活性としては、当技術分野において知られている他のＲＯＢＯ２−ＳＬＩＴ活性の中でもとりわけ、限定はしないが、ＲＯＢＯ２とＳＬＩＴリガンドとの間の結合、細胞内ドメインＲＯＢＯ２への細胞内シグナル伝達分子（ｓｒＧＡＰ１またはＮｃｋなど）の結合、ならびに／またはＲＯＢＯ２−ＳＬＩＴシグナル伝達の下流の活性（アクチンポリマー化、ポドサイトの接着、および／もしくは神経細胞移動のＳＬＩＴ２−Ｎ介在性の阻害など）が含まれる。抗体またはその抗原結合断片がＲＯＢＯ２の活性を低減させるかどうかは、多くのアッセイによって評価することができる。例えば、アッセイは、抗体またはその抗原結合断片が、（ａ）ＲＯＢＯ２へのＳＬＩＴの結合を阻害するかどうか、（ｂ）ｓｒＧＡＰ１とＲＯＢＯ２との結合もしくはＮｃｋとＲＯＢＯ２との結合を低減させるかどうか、および／または（ｃ）ＲＯＢＯ２依存性のＳＬＩＴ２−Ｎ活性を阻害するかどうかを判定するために使用することができる。
【０２０７】
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ＲＯＢＯ２へのＳＬＩＴリガンドの結合を阻害する（例えば、ＲＯＢＯ２に対する抗体とＳＬＩＴとの間の競合的結合によって評価することができる）。例えば、アッセイは、（ｉ）抗体またはその抗原結合断片の存在下でのＲＯＢＯ２とＳＬＩＴとの結合と、（ｉｉ）抗体またはその抗原結合断片の非存在下でのＲＯＢＯ２とＳＬＩＴとの結合とを比較することができる。ＲＯＢＯ２とＳＬＩＴとの結合の低減は、抗ＲＯＢＯ２抗体またはその抗原結合断片の存在下では、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％であり得る。抗体またはその抗原結合断片の非存在下での、ＲＯＢＯ２へのＳＬＩＴの予想される結合は、１００％と示され得る。
【０２０８】
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ＲＯＢＯ２へのＳＬＩＴの結合を、約１×１０−７Ｍ以下、約１×１０−８Ｍ以下、約１×１０−９Ｍ以下、約１×１０−１０Ｍ以下、約１×１０−１１Ｍ以下、約１×１０−１２Ｍ以下、約１×１０−１３Ｍ以下、約１×１０−１４Ｍ以下、約１×１０−１５Ｍ以下、約１×１０−７Ｍから約５×１０−１４Ｍ、約１×１０−７Ｍから約１×１０−１４Ｍ、約１×１０−７Ｍから約５×１０−１３Ｍ、約１×１０−７Ｍから約１×１０−１３Ｍ、約１×１０−７Ｍから約５×１０−１２Ｍ、または約１×１０−７Ｍから約１×１０−１２Ｍの半最大阻害（ＩＣ５０）で阻害する。ＩＣ５０は、ＳＬＩＴまたはＲＯＢＯ２の断片、例えば、ＳＬＩＴ−Ｎ、ならびにＲＯＢＯ２のＩｇドメイン１、またはＲＯＢＯ２のＩｇドメイン１および２を使用して評価することができる。
【０２０９】
抗体またはその抗原結合断片の阻害活性はまた、アクチンポリマー化、ポドサイトの接着、および／または神経細胞移動のＳＬＩＴ２−Ｎ介在性の阻害などの、ＲＯＢＯ２依存性のＳＬＩＴ−Ｎ活性のレベルを測定することによって評価することができる。例えば、アッセイは、（ｉ）ＲＯＢＯ２、ＳＬＩＴ、および抗体またはその抗原結合断片の存在下での神経細胞移動と、（ｉｉ）ＲＯＢＯ２、ＳＬＩＴの存在下であるが抗体またはその抗原結合断片の非存在下での神経細胞移動とを比較することができる。神経細胞移動の低減は、抗ＲＯＢＯ２抗体またはその抗原結合断片の存在下で、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％であり得る。抗体またはその抗原結合断片の非存在下での、ベースラインの神経細胞移動は、１００％と示され得る。
【０２１０】
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、アクチンポリマー化、ポドサイトの接着、および／または神経細胞移動のＳＬＩＴ２−Ｎ介在性の阻害などの、ＲＯＢＯ２依存性のＳＬＩＴ−Ｎ活性を、約１×１０−７Ｍ以下、約１×１０−８Ｍ以下、約１×１０−９Ｍ以下、約１×１０−１０Ｍ以下、約１×１０−１１Ｍ以下、約１×１０−１２Ｍ以下、約１×１０−１３Ｍ以下、約１×１０−１４Ｍ以下、約１×１０−１５Ｍ以下、約１×１０−７Ｍから約５×１０−１４Ｍ、約１×１０−７Ｍから約１×１０−１４Ｍ、約１×１０−７Ｍから約５×１０−１３Ｍ、約１×１０−７Ｍから約１×１０−１３Ｍ、約１×１０−７Ｍから約５×１０−１２Ｍ、または約１×１０−７Ｍから約１×１０−１２Ｍの半最大阻害（ＩＣ５０）で阻害する。ある特定の実施形態では、約１×１０−１０Ｍから約１×１０−１３ＭのＩＣ５０が好ましい。ある特定の実施形態では、約５×１０−１１Ｍから約５×１０−１２ＭのＩＣ５０が好ましい。
【０２１１】
ある特定の実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片の特徴は、例えば治療物質としてのその強度、薬理学的活性、および潜在的な有効性を評価するために、他の生物学的活性アッセイを使用してさらに評価される。このようなアッセイは、当技術分野において知られており、抗体の使用目的に応じる。例としては、例えば、毒性アッセイ、免疫原性アッセイ、安定性アッセイ、および／またはＰＫ／ＰＤプロファイリングが含まれる。
【０２１２】
抗ＲＯＢＯ２抗体を生産する核酸および方法
本発明はまた、本明細書において記載される、抗体部分および修飾抗体を含む本発明の抗体のいずれかをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、本明細書において記載されるポリヌクレオチドのいずれかを作製する方法を提供する。ポリヌクレオチドは、当技術分野において知られている手順によって作製することおよび発現させることができる。
【０２１３】
一態様では、本発明は、以下のＲＯＢＯ２抗体：Ａｂｃｓ３５、９３Ｈ２、Ａｂ１、Ａｂ３、Ａｂ９、Ａｂ１３、Ａｂ１７、Ａｂ２１、Ａｂ２２、Ａｂ２５、Ａｂ２９、Ａｂ３２、Ａｂ４０、Ａｂ４５、Ａｂ４６、Ａｂ５８、Ａｂ８３、Ａｂ９６、Ａｂ１１２、Ａｂ１２３、Ａｂｃｓ１、Ａｂｃｓ２、Ａｂｃｓ４、Ａｂｃｓ５、Ａｂｃｓ１２、Ａｂｃｓ２０、Ａｂｃｓ２５、Ａｂｃｓ４０、Ａｂｃｓ５０、Ａｂｃｓ５５、ＣＴＩＲ２−１、ＣＴＩＲ２−２、ＣＴＩＲ２−３、ＣＴＩＲ２−４、ＣＴＩＲ２−５、ＣＴＩＲ２−６、ＣＴＩＲ２−７、ＣＴＩＲ２−８、ＣＴＩＲ２−９、ＣＴＩＲ２−１０、ＣＴＩＲ２−１１、ＣＴＩＲ２−１２、ＣＴＩＲ２−１３、ＣＴＩＲ２−１４、ＣＴＩＲ２−１５、ＣＴＩＲ２−１６、Ａｂｃｓ３５−Ａ、Ａｂｃｓ３５−Ｂ、Ａｂｃｓ３５−Ｃ、Ａｂｃｓ３５−Ｄ、Ａｂｃｓ３５−Ｅ、Ａｂｃｓ３５−Ｆ、Ａｂｃｓ３５−Ｇ、Ａｂｃｓ３５−Ｈ、Ａｂｃｓ３５−Ｉ、Ａｂｃｓ３５−Ｊ、Ａｂｃｓ３５−Ｋ、Ａｂｃｓ３５−Ｌ、Ａｂｃｓ３５−Ｍ、Ａｂｃｓ３５−Ｎ、およびＡｂｃｓ３５−Ｏおよびその抗原結合部分のいずれかをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドまたは組成物を提供する。
【０２１４】
本発明はまた、Ａｂｃｓ３５、９３Ｈ２、Ａｂ１、Ａｂ３、Ａｂ９、Ａｂ１３、Ａｂ１７、Ａｂ２１、Ａｂ２２、Ａｂ２５、Ａｂ２９、Ａｂ３２、Ａｂ４０、Ａｂ４５、Ａｂ４６、Ａｂ５８、Ａｂ８３、Ａｂ９６、Ａｂ１１２、Ａｂ１２３、Ａｂｃｓ１、Ａｂｃｓ２、Ａｂｃｓ４、Ａｂｃｓ５、Ａｂｃｓ１２、Ａｂｃｓ２０、Ａｂｃｓ２５、Ａｂｃｓ４０、Ａｂｃｓ５０、Ａｂｃｓ５５、ＣＴＩＲ２−１、ＣＴＩＲ２−２、ＣＴＩＲ２−３、ＣＴＩＲ２−４、ＣＴＩＲ２−５、ＣＴＩＲ２−６、ＣＴＩＲ２−７、ＣＴＩＲ２−８、ＣＴＩＲ２−９、ＣＴＩＲ２−１０、ＣＴＩＲ２−１１、ＣＴＩＲ２−１２、ＣＴＩＲ２−１３、ＣＴＩＲ２−１４、ＣＴＩＲ２−１５、ＣＴＩＲ２−１６、Ａｂｃｓ３５−Ａ、Ａｂｃｓ３５−Ｂ、Ａｂｃｓ３５−Ｃ、Ａｂｃｓ３５−Ｄ、Ａｂｃｓ３５−Ｅ、Ａｂｃｓ３５−Ｆ、Ａｂｃｓ３５−Ｇ、Ａｂｃｓ３５−Ｈ、Ａｂｃｓ３５−Ｉ、Ａｂｃｓ３５−Ｊ、Ａｂｃｓ３５−Ｋ、Ａｂｃｓ３５−Ｌ、Ａｂｃｓ３５−Ｍ、Ａｂｃｓ３５−Ｎ、およびＡｂｃｓ３５−Ｏからなる群から選択される抗体と実質的に同一のエピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドまたは組成物を提供する。
【０２１５】
本発明はまた、ＲＯＢＯ２への結合について、Ａｂｃｓ３５、９３Ｈ２、Ａｂ１、Ａｂ３、Ａｂ９、Ａｂ１３、Ａｂ１７、Ａｂ２１、Ａｂ２２、Ａｂ２５、Ａｂ２９、Ａｂ３２、Ａｂ４０、Ａｂ４５、Ａｂ４６、Ａｂ５８、Ａｂ８３、Ａｂ９６、Ａｂ１１２、Ａｂ１２３、Ａｂｃｓ１、Ａｂｃｓ２、Ａｂｃｓ４、Ａｂｃｓ５、Ａｂｃｓ１２、Ａｂｃｓ２０、Ａｂｃｓ２５、Ａｂｃｓ４０、Ａｂｃｓ５０、Ａｂｃｓ５５、ＣＴＩＲ２−１、ＣＴＩＲ２−２、ＣＴＩＲ２−３、ＣＴＩＲ２−４、ＣＴＩＲ２−５、ＣＴＩＲ２−６、ＣＴＩＲ２−７、ＣＴＩＲ２−８、ＣＴＩＲ２−９、ＣＴＩＲ２−１０、ＣＴＩＲ２−１１、ＣＴＩＲ２−１２、ＣＴＩＲ２−１３、ＣＴＩＲ２−１４、ＣＴＩＲ２−１５、ＣＴＩＲ２−１６、Ａｂｃｓ３５−Ａ、Ａｂｃｓ３５−Ｂ、Ａｂｃｓ３５−Ｃ、Ａｂｃｓ３５−Ｄ、Ａｂｃｓ３５−Ｅ、Ａｂｃｓ３５−Ｆ、Ａｂｃｓ３５−Ｇ、Ａｂｃｓ３５−Ｈ、Ａｂｃｓ３５−Ｉ、Ａｂｃｓ３５−Ｊ、Ａｂｃｓ３５−Ｋ、Ａｂｃｓ３５−Ｌ、Ａｂｃｓ３５−Ｍ、Ａｂｃｓ３５−Ｎ、およびＡｂｃｓ３５−Ｏからなる群から選択される抗体と競合する抗体またはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドまたは組成物を提供する。
【０２１６】
本発明はまた、（ｉ）配列番号３２、４３、１２６〜１３２、（ｉｉ）配列番号３９、４６、１３３、および（ｉｉｉ）そのあらゆる組み合わせ、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする配列を含むポリヌクレオチドまたは組成物を提供する。
【０２１７】
本発明はまた、配列番号１４３、１４４、１４５、１４６、およびそのあらゆる組み合わせのいずれかから選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドまたは組成物を提供する。
【０２１８】
本発明はまた、前記核酸配列を含むポリヌクレオチドまたは組成物であって、ポリヌクレオチドが、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２３２６５、ＰＴＡ−１２３２６６、ＰＴＡ−１２３７００、およびＰＴＡ−１２３７０１を有するＡＴＣＣに寄託されたプラスミドのＤＮＡインサートの配列を含む、ポリヌクレオチドまたは組成物を提供する。
【０２１９】
別の態様では、本発明は、抗ＲＯＢＯ２抗体をコードするポリヌクレオチドおよびその変異体であって、このような変異体ポリヌクレオチドが、限定はしないが配列番号１４３、１４４、１４５、および１４６の核酸を含む核酸などの本明細書において開示されている任意の核酸と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、ポリヌクレオチドおよびその変異体を提供する。
【０２２０】
別の態様では、本発明は、核酸配列が配列番号１４３〜１４６のいずれか１つで示される、ポリヌクレオチドを含む。
【０２２１】
一実施形態では、ＶＨドメインおよびＶＬドメインもしくはその抗原結合部分、または完全長ＨＣもしくはＬＣは、別個のポリヌクレオチドによってコードされる。あるいは、ＶＨおよびＶＬもしくはその抗原結合部分の両方、またはＨＣおよびＬＣの両方が、単一のポリヌクレオチドによってコードされる。
【０２２２】
任意のこのような配列に相補的なポリヌクレオチドもまた、本開示によって包含される。ポリヌクレオチドは、一本鎖（コードもしくはアンチセンス）または二本鎖であり得、ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、または合成ＤＮＡ）またはＲＮＡ分子であり得る。ＲＮＡ分子としては、イントロンを含み、１対１の様式でＤＮＡ分子に対応する、ＨｎＲＮＡ分子、およびイントロンを含まないｍＲＮＡ分子が含まれる。さらなるコード配列または非コード配列が本開示のポリヌクレオチド内に存在し得るが、必ずしも存在していなくてもよく、ポリヌクレオチドは他の分子および／または支持材料に連結していてよいが、必ずしも連結していなくてもよい。
【０２２３】
ポリヌクレオチドは、ネイティブ配列（すなわち、抗体またはその部分をコードする内在性配列）を含み得るか、またはこのような配列の変異体を含み得る。ポリヌクレオチド変異体は、コードされるポリペプチドの免疫反応性がネイティブな免疫反応性分子と比較して弱まらないような、１つまたは複数の置換、付加、欠失、および／または挿入を含む。コードされるポリペプチドの免疫反応性に対する影響は、一般に、本明細書において記載するように評価することができる。一部の実施形態では、変異体は、ネイティブな抗体またはその部分をコードするポリヌクレオチド配列と、少なくとも約７０％の同一性を示し、一部の実施形態では少なくとも約８０％の同一性、一部の実施形態では少なくとも約９０％の同一性、また一部の実施形態では少なくとも約９５％の同一性を示す。これらの量は限定的なものではなく、言及されたパーセンテージ間の増加が、開示の一部として具体的に想起される。
【０２２４】
２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列は、以下に記載するような最大対応でアラインした場合に２つの配列内のヌクレオチドまたはアミノ酸の配列が同一であれば、「同一である」とされる。２つの配列の間の比較は、比較ウィンドウにわたり配列を比較して、配列が類似している局所的領域を同定し、比較することによって、典型的には行われる。「比較ウィンドウ」は、本明細書において使用する場合、２つの配列を最適にアラインした後に配列と参照配列とを同数の連続する位置について比較することができる、少なくとも約２０、通常は３０から約７５、または４０から約５０の連続する位置からなるセグメントを指す。
【０２２５】
比較対象の配列の最適なアラインメントは、デフォルトパラメータを使用して、バイオインフォマティクスソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ（登録商標），Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＬａｓｅｒｇｅｎｅ（登録商標）パッケージソフトのＭｅｇＡｌｉｇｎ（登録商標）プログラムを使用して行うことができる。このプログラムは、以下の参考文献において記載されているいくつかのアラインメントスキームを搭載している：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．、１９７８、Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．Ｉｎ  Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（編）、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、ＷＡＳＨＩＮＧＴＯＮ  ＤＣ、第５巻、補遺３、３４５〜３５８頁；Ｈｅｉｎ  Ｊ．、１９９０、Ｕｎｉｆｉｅｄ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ、６２６〜６４５頁、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１８３巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．およびＳｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．、１９８９、ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１〜１５３；Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．およびＭｕｌｌｅｒ  Ｗ．、１９８８、ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１〜１７；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．、１９７１、Ｃｏｍｂ．Ｔｈｅｏｒ．１１：１０５；Ｓａｎｔｏｕ，Ｎ．、Ｎｅｓ，Ｍ．、１９８７、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４：４０６〜４２５；Ｓｎｅａｔｈ，Ｐ．Ｈ．Ａ．およびＳｏｋａｌ，Ｒ．Ｒ．、１９７３、Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ｔｈｅ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ、Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ；Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．、１９８３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：７２６〜７３０。
【０２２６】
一部の実施形態では、「配列同一性のパーセンテージ」は、２つの最適にアラインされた配列を、少なくとも２０の位置からなる比較ウィンドウにわたり比較することによって決定され、ここで、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の部分は、２つの配列の最適なアラインメントのためには、参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して２０パーセント以下の、通常は５〜１５パーセント、または１０から１２パーセントの付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。パーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両配列内に存在する位置の数を決定して、マッチする位置の数を得、マッチする位置の数を参照配列内の位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）で割り、その結果に１００をかけて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。
【０２２７】
変異体はまた、またはあるいは、ネイティブ遺伝子またはその部分もしくは相補体に実質的に相同である。このようなポリヌクレオチド変異体は、中程度にストリンジェントな条件下で、ネイティブな抗体をコードする天然のＤＮＡ配列（または相補配列）にハイブリダイズし得る。
【０２２８】
適切な「中程度にストリンジェントな条件」は、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）からなる溶液中で事前洗浄すること、５０℃〜６５℃で５×ＳＳＣと一晩ハイブリダイズすること、その後、６５℃で２０分間、０．１％ＳＤＳを含有する２×、０．５×、および０．２×ＳＳＣのそれぞれで２回洗浄することを含む。
【０２２９】
本明細書において使用する場合、「高度にストリンジェントな条件」または「高いストリンジェンシー条件」は、（１）洗浄のために低いイオン強度および高い温度を、例えば、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを５０℃で利用し、（２）ハイブリダイゼーションの間に、ホルムアミド、例えば５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドなどの変性剤と、０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％ポリビニルピロリドン／ｐＨ６．５の５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液と、７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムとを４２℃で利用し、または（３）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハート液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍＬ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％硫酸デキストランを４２℃で利用し、４２℃の０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）および５５℃の５０％ホルムアミド中で洗浄し、その後、５５℃のＥＤＴＡを含有する０．１×ＳＳＣからなる高ストリンジェンシー洗浄を行うものである。当業者には、温度、イオン強度などを、必要に応じて、プローブの長さなどの因子に適応するように調節するための方法が認識されよう。
【０２３０】
当業者には、遺伝子コードの縮重の結果として、本明細書において記載されるポリペプチドをコードする多くのヌクレオチド配列が存在することが理解されよう。これらのポリヌクレオチドの一部は、任意のネイティブ遺伝子のヌクレオチド配列に対する相同性が最小である。それでも、コドン使用頻度の差に起因して変化するポリヌクレオチドが、本開示によって具体的に検討される。さらに、本明細書において提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子は、本開示の範囲内である。対立遺伝子は、ヌクレオチドの欠失、付加、および／または置換などの１つまたは複数の突然変異の結果として改変されている内在性遺伝子である。得られたｍＲＮＡおよびタンパク質は、改変された構造または機能を有し得るが、必ずしも有していなくてもよい。対立遺伝子は、標準的な技術（ハイブリダイゼーション、増幅、および／またはデータベース配列の比較など）を使用して同定することができる。
【０２３１】
本開示のポリヌクレオチドは、化学合成、組換え方法、またはＰＣＲを使用して得ることができる。化学的なポリヌクレオチド合成の方法は、当技術分野において周知であり、本明細書において詳細に記載する必要はない。当業者は、本明細書において提供される配列および市販のＤＮＡ合成装置を使用して、所望のＤＮＡ配列を生産することができる。
【０２３２】
組換え方法を使用してポリヌクレオチドを調製するために、所望の配列を含むポリヌクレオチドを、適切なベクター内に挿入することができ、このベクターを次に、本明細書においてさらに論じられるように、複製および増幅のために適切な宿主細胞内に導入することができる。ポリヌクレオチドは、当技術分野において知られている任意の手段によって宿主細胞内に挿入することができる。細胞は、直接的な取り込み、エンドサイトーシス、トランスフェクション、Ｆ−交配、またはエレクトロポレーションによって外来ポリヌクレオチドを導入することによって形質転換される。導入されると、外来ポリヌクレオチドは、細胞内で非組み込みベクター（プラスミドなど）として維持され得るか、または宿主細胞ゲノム内に組み込まれ得る。このように増幅されたポリヌクレオチドは、当技術分野において周知の方法によって宿主細胞から単離することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９を参照されたい。
【０２３３】
あるいは、ＰＣＲは、ＤＮＡ配列の再生を可能にする。ＰＣＲ技術は、当技術分野において周知であり、米国特許第４，６８３，１９５号、米国特許第４，８００，１５９号、米国特許第４，７５４，０６５号、および米国特許第４，６８３，２０２号、ならびにＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ、Ｍｕｌｌｉｓら編、Ｂｉｒｋａｕｓｗｅｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、１９９４において記載されている。
【０２３４】
ＲＮＡは、単離されたＤＮＡを適切なベクター内で使用し、それを適切な宿主細胞内に挿入することによって得ることができる。細胞が複製し、ＤＮＡがＲＮＡに転写されると、ＲＮＡは、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９において示されているような当業者に周知の方法を使用して単離することができる。
【０２３５】
適切なクローニングベクターは、標準的な技術に従って構築することができるか、または当技術分野において利用可能な多くのクローニングベクターから選択することができる。選択されるクローニングベクターは使用対象の宿主細胞に従って変化し得るが、有用なクローニングベクターは、一般に、自己複製する能力を有し、特定の制限エンドヌクレアーゼにとっての単一の標的を有し得、かつ／またはベクターを含むクローンの選択において使用され得るマーカーの遺伝子を有し得る。適切な例としては、プラスミドおよび細菌ウイルス、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（例えば、ｐＢＳ  ＳＫ＋）およびその誘導体、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ＲＰ４、ファージＤＮＡ、ならびにシャトルベクター、例えばｐＳＡ３およびｐＡＴ２８が含まれる。これらのおよび多くの他のクローニングベクターは、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎなどの商業的供給業者から入手することができる。
【０２３６】
発現ベクターがさらに提供される。発現ベクターは、概して、本開示に従ったポリヌクレオチドを含む複製可能なポリヌクレオチド構築物である。発現ベクターが宿主細胞内でエピソームとしてまたは染色体ＤＮＡの不可欠な部分として複製可能でなければならないことは当然である。適切な発現ベクターとしては、限定はしないが、プラスミド、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスを含むウイルスベクター、コスミド、およびＰＣＴ公開第ＷＯ８７／０４４６２号において開示されている発現ベクターが含まれる。ベクター成分としては、一般に、限定はしないが、シグナル配列、複製起点、１つまたは複数のマーカー遺伝子、適切な転写制御エレメント（プロモーター、エンハンサー、およびターミネーターなど）の１つまたは複数が含まれ得る。発現（すなわち、翻訳）のためには、リボソーム結合部位、翻訳開始部位、および停止コドンなどの、１つまたは複数の翻訳制御エレメントもまた、通常は必要である。
【０２３７】
目的のポリヌクレオチドを含むベクターおよび／またはポリヌクレオチド自体は、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、または他の物質を利用する、エレクトロポレーション、トランスフェクション；微粒子銃；リポフェクション；および感染（例えば、ベクターがワクシニアウイルスなどの感染性物質である場合）を含む、多くの適切な手段のいずれかによって、宿主細胞内に導入することができる。ベクターまたはポリヌクレオチドの導入の選択は、宿主細胞の特徴に応じることが多い。
【０２３８】
典型的な宿主細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、酵母細胞、昆虫細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはさもなければ免疫グロブリンタンパク質を生産しない骨髄腫細胞が含まれる。好ましい宿主細胞としては、当技術分野において周知の多くの細胞の中でも、ＣＨＯ細胞、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞、またはＳｐ２．０細胞が含まれる。
【０２３９】
抗体断片はまた、完全長抗体のタンパク質分解もしくは他の分解によって、組換え方法によって、または化学合成によって生産することができる。抗体のポリペプチド断片、特に、最大約５０アミノ酸の短めのポリペプチドは、化学合成によって都合良く作製することができる。タンパク質およびペプチドを化学合成する方法は、当技術分野において知られており、市販されている。
【０２４０】
本発明の抗体またはその抗原結合断片は、親和性成熟し得る。例えば、親和性成熟した抗体は、当技術分野において知られている手順によって生産することができる（Ｍａｒｋｓら、１９９２、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：７７９〜７８３；Ｂａｒｂａｓら、１９９４、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、ＵＳＡ  ９１：３８０９〜３８１３；Ｓｃｈｉｅｒら、１９９５、Ｇｅｎｅ、１６９：１４７〜１５５；Ｙｅｌｔｏｎら、１９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５５：１９９４〜２００４；Ｊａｃｋｓｏｎら、１９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５４（７）：３３１０〜９；Ｈａｗｋｉｎｓら、１９９２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２６：８８９〜８９６；およびＷＯ２００４／０５８１８４）。
【０２４１】
５．製剤および使用
本発明の抗体またはその抗原結合断片は、医薬組成物として製剤することができる。医薬組成物はさらに、凍結乾燥製剤または水性溶液の形態で、薬学的に許容できる担体、賦形剤、および／または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、２０００、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＷｉｌｋｉｎｓ編、Ｋ．Ｅ．Ｈｏｏｖｅｒ）を含み得る。本明細書において使用する場合、「薬学的に許容できる担体」または「薬学的に許容できる賦形剤」としては、活性成分と組み合わせた場合に、成分の生物学的活性を保持させ、かつ対象の免疫系と非反応性である、任意の材料が含まれる。例としては、限定はしないが、リン酸緩衝溶液、水、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、および様々なタイプの湿潤剤などの、標準的な薬学的担体のいずれかが含まれる。エアロゾルまたは非経口投与のための好ましい希釈剤は、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）または通常（０．９％）生理食塩水である。このような担体を含む組成物は、周知の従来の方法によって製剤される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９９０；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔhe  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、２０００を参照されたい）。
【０２４２】
許容できる担体、賦形剤、または安定剤は、投薬量および濃度でレシピエントに対して無毒であり、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルアルコールもしくはベンジルアルコール；メチルパラベンもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストランを含む単糖、二糖、および他の糖質；ＥＤＴＡなどのキレート剤；ショ糖、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ならびに／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含み得る。薬学的に許容できる賦形剤は、本明細書においてさらに記載される。
【０２４３】
診断的使用
本発明の抗体またはその抗原結合断片は、様々な治療目的または診断目的で使用することができる。例えば、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、親和性精製剤として（例えば、ＲＯＢＯ２をインビトロで精製するための）、診断薬として（例えば、特異的な細胞、組織、または血清におけるＲＯＢＯ２の発現を検出するため）使用することができる。ＲＯＢＯ２の典型的な診断アッセイは、例えば、患者から得た試料を、検出可能な標識またはレポーター分子で標識されている本発明の抗ＲＯＢＯ２抗体と接触させることを含み得る。
【０２４４】
本発明は、本明細書において開示されている抗体を、試料、細胞、組織、または患者内のＲＯＢＯ２を可視化するための診断イメージング方法として使用することを包含する。例えば、抗体をイメージング剤にコンジュゲートさせて抗体の存在を検出できるようにし、それによってＲＯＢＯ２の存在を検出することができる。
【０２４５】
治療的使用
本発明の抗体またはその抗原結合断片の典型的な治療的使用としては、糸球体疾患、ＦＳＧＳなどの腎臓疾患を処置することが含まれる。本発明の抗体またはその抗原結合断片はまた、予防的処置においても使用することができる（例えば、疾患の症候は示していないが、糸球体疾患、ＦＳＧＳなどの腎臓疾患に罹患しやすい対象への投与）。
【０２４６】
別の態様では、本発明は、疾患、障害、または状態の非存在下での尿中のタンパク質レベルと比較して増大した尿中のタンパク質レベルによって仲介される、またはその増大した尿中のタンパク質レベルを伴う、任意の障害、疾患、または状態の処置を含む。このような疾患、障害、または状態としては、限定はしないが、ループス腎炎、ＩｇＡ腎症、膜性腎症（ＭＮ）、微小変化群（ＭＣＤ）、線維症（肝線維症など）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、タンパク尿、アルブミン尿、糸球体腎炎、糖尿病性腎症、ネフローゼ症候群、巣状糸球体硬化症、急性腎不全、急性尿細管間質性腎炎、腎盂腎炎、腎臓移植片拒絶、および逆流性腎症が含まれる。
【０２４７】
治療用途では、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、従来の技術によって、例えば、静脈内に（ボーラスとして、または一定期間にわたる連続注入による）、筋肉内に、腹腔内に、脳脊髄内に、皮下に、関節内に、滑液嚢内に、髄腔内に、経口的に、局所的に、または吸入によって、哺乳動物、特にヒトに投与することができる。本発明の抗体またはその抗原結合断片はまた、腫瘍内経路、腫瘍周辺経路、病変内経路、または病変周辺経路によって適切に投与される。
【０２４８】
したがって、一態様では、本発明は、それを必要とする対象（例えば、ヒト）に治療有効量の本発明の抗体またはその抗原結合断片を投与することを含む、ＲＯＢＯ２の活性を低減させる方法を提供する。
【０２４９】
別の態様では、本発明は、それを必要とする対象（例えば、ヒト）に治療有効量の本発明の抗体またはその抗原結合断片を投与することを含む、ポドサイトの機能を維持または調節する方法を提供する。
【０２５０】
ある特定の実施形態では、対象は、腎臓疾患に罹患しているか、または腎臓疾患に罹患しやすい。ある特定の実施形態では、腎臓疾患は、糸球体疾患である。ある特定の実施形態では、腎臓疾患は、ＦＳＧＳである。
【０２５１】
ある特定の実施形態では、対象は、腎症に罹患しているか、または腎症に罹患しやすい。
【０２５２】
投薬および投与
ある特定の実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、皮下に投与される。ある特定の実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、静脈内に投与される。
【０２５３】
医薬組成物は、それを必要とする対象に、腎臓疾患の重症度で変化し得る頻度で投与され得る。予防的治療のケースでは、頻度は、腎臓疾患に対する対象の感受性または傾向に応じて変化し得る。
【０２５４】
組成物は、必要とする患者に、ボーラスとして、または連続注入によって投与することができる。例えば、Ｆａｂ断片として存在する抗体のボーラス投与は、体重１ｋｇ当たり０．００２５から１００ｍｇ、１ｋｇ当たり０．０２５から０．２５ｍｇ、１ｋｇ当たり０．０１０から０．１０ｍｇ、または１ｋｇ当たり０．１０〜０．５０ｍｇの量であり得る。連続注入では、Ｆａｂ断片として存在する抗体は、１分間当たり体重１ｋｇ当たり０．００１から１００ｍｇ、１分間当たり１ｋｇ当たり０．０１２５から１．２５ｍｇ、１分間当たり１ｋｇ当たり０．０１０から０．７５ｍｇ、１分間当たり１ｋｇ当たり０．０１０から１．０ｍｇ、または１分間当たり１ｋｇ当たり０．１０〜０．５０ｍｇで、１〜２４時間、１〜１２時間、２〜１２時間、６〜１２時間、２〜８時間、または１〜２時間の時間にわたり投与され得る。
【０２５５】
完全長抗体（完全な定常領域を有する）として存在する抗体の投与では、投薬量は、約１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ以上、約２ｍｇ／ｋｇ以上、約３ｍｇ／ｋｇ以上、約４ｍｇ／ｋｇ以上、約５ｍｇ／ｋｇ以上、約６ｍｇ／ｋｇ以上、約７ｍｇ／ｋｇ以上、約８ｍｇ／ｋｇ以上、約９ｍｇ／ｋｇ以上、約１０ｍｇ／ｋｇ以上、約１１ｍｇ／ｋｇ以上、約１２ｍｇ／ｋｇ以上、約１３ｍｇ／ｋｇ以上、約１４ｍｇ／ｋｇ以上、約１５ｍｇ／ｋｇ以上、約１６ｍｇ／ｋｇ以上、約１７ｍｇ／ｋｇ以上、約１９ｍｇ／ｋｇ以上、または約２０ｍｇ／ｋｇ以上であり得る。投与の頻度は、状態の重症度に応じる。頻度は、週に３回から２週間または３週間ごとに１回の範囲であり得る。
【０２５６】
さらに、組成物は、皮下注射を介して患者に投与することができる。例えば、１から１００ｍｇの用量の抗ＲＯＢＯ２抗体が、週に２回、週に１回、２週間ごとに１回、３週間ごとに１回、４週間ごとに１回、５週間ごとに１回、６週間ごとに１回、７週間ごとに１回、８週間ごとに１回、９週間ごとに１回、１０週間ごとに１回、月に２回、月に１回、２カ月ごとに１回、または３カ月ごとに１回投与される皮下注射または静脈内注射を介して、患者に投与され得る。例えば、抗体Ａｂｃｓ３５は、約１９日間の推定される半減期を有し、皮下（ＳＣ）投与後の生物学的利用能はおよそ６０％である。この半減期は、毎週または２〜６週間ごと、例えば、２週間ごとに１回または４週間ごとに１回の皮下注射または静脈内注射をサポートする。
【０２５７】
ある特定の実施形態では、ヒトにおける抗ＲＯＢＯ２抗体の半減期は、約５日間、約６日間、約７日間、約８日間、約９日間、約１０日間、約１１日間、約１２日間、約１３日間、約１４日間、約１５日間、約１６日間、約１７日間、約１８日間、約１９日間、約２０日間、約２１日間、約２２日間、約２３日間、約２４日間、約２５日間、約２６日間、約２７日間、約２８日間、約２９日間、約３０日間、約５日間から約４０日間、約５日間から約３５日間、約５日間から約３０日間、約５日間から約２５日間、約１０日間から約４０日間、約１０日間から約３５日間、約１０日間から約３０日間、約１０日間から約２５日間、約１５日間から約４０日間、約１５日間から約３５日間、約１５日間から約３０日間、または約１５日間から約２５日間である。
【０２５８】
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、２〜６週間ごとに、約０．１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇから約８ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇから約８ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇから約８ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇから約８ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇから約８ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１．０ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２．０ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ、約３．０ｍｇ／ｋｇ、約３．５ｍｇ／ｋｇ、約４．０ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇ、約５．０ｍｇ／ｋｇ、約５．５ｍｇ／ｋｇ、約６．０ｍｇ／ｋｇ、約６．５ｍｇ／ｋｇ、約７．０ｍｇ／ｋｇ、約７．５ｍｇ／ｋｇ、約８．０ｍｇ／ｋｇ、約８．５ｍｇ／ｋｇ、約９．０ｍｇ／ｋｇ、約９．５ｍｇ／ｋｇ、または約１０．０ｍｇ／ｋｇの用量で、皮下または静脈内に投与される。
【０２５９】
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、２〜６週間ごとに、約３．０ｍｇ／ｋｇの用量で、皮下または静脈内に投与される。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、２〜６週間ごとに、約２．０ｍｇ／ｋｇから約１０．０ｍｇ／ｋｇの用量で、皮下または静脈内に投与される。
【０２６０】
１つの典型的な実施形態では、医薬組成物は、２週間ごとに皮下投与される。
【０２６１】
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、２〜６週間ごとに、約１０．０ｍｇ／ｋｇの用量で、皮下または静脈内に投与される。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、２〜６週間ごとに、約１．０ｍｇ／ｋｇから約１０．０ｍｇ／ｋｇの用量で、皮下または静脈内に投与される。
【０２６２】
１つの典型的な実施形態では、医薬組成物は、毎月、静脈内投与される。
【０２６３】
本発明の抗体またはその抗原結合断片は、単剤療法として、または例えば腎臓疾患を処置するための他の治療法と組み合わせて、使用することができる。腎臓疾患を処置するための他の治療法は、当技術分野において周知であり、本明細書において列挙していない。
【０２６４】
６．キット
本発明はまた、本発明の抗体またはその抗原結合断片および使用のための指示を含むキットまたは製品を提供する。したがって、一部の実施形態では、容器、抗ＲＯＢＯ２アンタゴニスト抗体を含む容器内の組成物、およびそれを必要とする患者を処置するための治療有効量の抗ＲＯＢＯ２アンタゴニスト抗体を投与するための指示を含有する包装挿入物を含むキットまたは製品が提供される。
【０２６５】
ある特定の実施形態では、キットは、乾燥したタンパク質を有する第１の容器および水性製剤を有する第２の容器の両方を含み得る。ある特定の実施形態では、単一のおよび複数のチャンバを有する充填済みシリンジ（例えば、液体シリンジおよびリオシリンジ）を含むキットが含まれる。
【０２６６】
本発明の抗体またはその抗原結合断片の使用に関する指示は、一般に、目的の処置のための投薬量、投与スケジュール、および投与経路についての情報を含む。容器は、単位用量、バルク包装（例えば、多用量包装）、または小単位用量であり得る。本発明のキットにおいて提供される指示は、典型的には、ラベルまたは包装挿入物（例えば、キットに含まれる紙片）上の文書による指示であるが、機械可読の指示（例えば、磁気ディスクまたは光学式記憶ディスクに記録された指示）もまた許容できる。
【０２６７】
本発明のキットは、適切な包装の中にある。適切な包装としては、限定はしないが、バイアル、ボトル、瓶、柔軟な包装（例えば、密封されたマイラーまたはプラスチック袋）などが含まれる。吸入器、経鼻投与装置（例えば、アトマイザー）、またはミニポンプなどの注入装置などの特定の装置と組み合わせて使用するための包装もまた検討される。キットは、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は、静脈内溶液用の袋、または皮下注射針が貫通可能なストッパーを有するバイアルであり得る）。容器もまた、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は、静脈内溶液用の袋、または皮下注射針が貫通可能なストッパーを有するバイアルであり得る）。容器は、第２の薬学的に活性な作用物質をさらに含み得る。
【０２６８】
キットは、緩衝液および説明情報などのさらなる構成要素を提供してもよい。通常、キットは、容器、および容器上のまたは容器に伴うラベルまたは包装挿入物を含む。
【０２６９】
７．生物の寄託
本発明の代表的な材料は、２０１６年６月２３日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．２０１１０−２２０９、ＵＳＡに寄託された。ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２３２６５を有するベクターＡｂｃｓ３５−ＶＨは、抗体Ａｂｃｓ３５の重鎖可変領域をコードするＤＮＡインサートを含み、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２３２６６を有するベクターＡｂｃｓ３５−ＶＬは、抗体Ａｂｃｓ３５の軽鎖可変領域をコードするＤＮＡインサートを含む。さらに、本発明のさらなる代表的な材料が、２０１６年１２月２０日に、ＡＴＣＣに寄託された。ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２３７００を有するベクターＡｂｃｓ３５−Ｊ−ＶＨは、抗体Ａｂｃｓ３５−Ｊの重鎖可変領域をコードするＤＮＡインサートを含み、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２３７０１を有するベクターＡｂｃｓ３５−Ｊ−ＶＬは、抗体Ａｂｃｓ３５−Ｊの軽鎖可変領域をコードするＤＮＡインサートを含む。寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約、およびそれに準ずる規則（ブダペスト条約）の規定の下で行われた。これにより、寄託物の生存状態での培養が寄託日から３０年にわたり維持されることが保証される。寄託物は、ブダペスト条約に基づいてＡＴＣＣによって利用可能とされ、また、関連する米国特許が認められた際、または米国もしくは外国の特許出願のいずれかが公開された際のいずれか早い方に、寄託物の培養による子孫が公共に対して永久にかつ無制限に利用可能となることを保証し、かつ、米国特許商標庁が３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．セクション１２２およびそれに従った長官の裁定（８８６  ＯＧ  ６３８を特に参照して、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．セクション１．１４を含む）に従って特許付与を決定した者に対して子孫の利用可能性を保証する、Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．とＡＴＣＣとの間での合意に従うものである。
【０２７０】
本願の譲受人であるＰｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．は、寄託されている材料の培養物が適切な条件下での培養時に死亡した場合または紛失した場合または破壊された場合には、この材料が、通知に基づいて、別の同一材料で早急に置き換えられるということに同意している。寄託された材料の利用可能性は、いずれかの政府がその特許法に従ってその権限の下で認めた権利に違反した本発明の実施許諾であると解釈されるものではない。
【実施例】
【０２７１】
典型的な方法および材料が本明細書において記載されるが、本明細書において記載されるものに類似のまたはそれに等しい方法および材料もまた、本発明の実施または試験において使用することができる。材料、方法、および例は、例示的なものにすぎず、限定することを意図したものではない。
【０２７２】
（実施例１）
抗Ｒｏｂｏ２抗体の生成
Ａｂｃｓ３５は、ＳＬＩＴ２リガンドの結合を中和するＲＯＢＯ２タンパク質に対する完全ヒトＩｇＧ１抗体である。単一のＲＯＢＯ２特異的抗体クローンである９３Ｈ２を単離し、以下に記載するように、複数ラウンドの親和性成熟を使用して、親和性をおよそ３７ｎＭから０．２６８ｎＭまで増大させた。
【０２７３】
ファージディスプレイによる抗ＲＯＢＯ２抗体の選択
抗ＲＯＢＯ２  ｓｃｆｖを、抗体ファージディスプレイライブラリーから、ヒトＲＯＢＯ２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）でスクリーニングすることによって選択した。ヒトＲＯＢＯ２  ＥＣＤを、製造者のプロトコルに従って、スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）でビオチン化した。このビオチン化されたＲＯＢＯ２  ＥＣＤを使用して、結合剤をｓｃｆｖ抗体ファージディスプレイライブラリーから選択し、次いで、標準的な方法を使用して、ストレプトアビジンで被覆した磁性Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上に捕捉した。以下の低下濃度の標的（ＲＯＢＯ２  ＥＣＤ）で、３ラウンドの選択を行った：２００ｎＭ（第１ラウンド）、１００ｎＭ（第２ラウンド）、および５０ｎＭ（第３ラウンド）。関連するＲＯＢＯ１タンパク質にほとんど結合しなかった、ＲＯＢＯ２に特異的な抗体を得るために、全ての選択を、以下の増大濃度のヒトＲＯＢＯ１  ＥＣＤの存在下で行った：５０ｎＭ（第１ラウンド）、１００ｎＭ（第２ラウンド）、および２００ｎＭ（第３ラウンド）。このスクリーニングから、１１０のｓｃｆｖのヒットをＲＯＢＯ２  ＥＣＤへの結合として同定し、これを、標準的な方法を使用してＩｇＧに変換した。
【０２７４】
ＲＯＢＯ２  ＥＣＤおよびＲＯＢＯ１  ＥＣＤへのヒトＩｇＧの結合を測定するためのＥＬＩＳＡ。
ＥＬＩＳＡプレートを１μｇのＲＯＢＯ２  ＥＣＤまたは１μｇのＲＯＢＯ１  ＥＣＤで被覆し、標準的なＥＬＩＳＡプロトコルに従った。抗体を抗ヒトＩｇＧ  ＨＲＰ二次抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で検出し、ＥＬＩＳＡを３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンで可視化し、吸光度を、Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で、４５０ｎｍで読み取った。ｓｃｆｖからＩｇＧ１に再フォーマットした後、抗体クローン９３Ｈ２が、ＲＯＢＯ２への特異的結合を示した唯一のものであり、そのＲＯＢＯ１への結合は最小であった。
【０２７５】
９３Ｈ２  ｍＡｂの親和性成熟。
親和性および効力を増大させるために、２つのアプローチを適用した。まず、９３Ｈ２にフォーカスしたファージディスプレイライブラリーを、スプライスオーバーラップ伸長ＰＣＲによって生成した。９３Ｈ２にフォーカスしたファージディスプレイライブラリーは、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、およびＶＬ−ＣＤＲ３をそれぞれ突然変異させることを目的とした突然変異誘発性プライマーを含むＮＮＫコドンを使用して構築した５つの突然変異生成ライブラリーからなるものであった。全部の組み合わせ多様性が１．１×１０９である得られたライブラリーを、ファージ上にディスプレイさせ、ＲＯＢＯ２  Ｉｇ１−Ｉｇ２の結合について選択した。５つのライブラリーをレスキューした後、２ラウンドの選択を行った。第１ラウンドでは、２００ｐＭのヒトＲＯＢＯ２  Ｉｇ１−Ｉｇ２を溶液中で使用してファージを３０分にわたり室温で結合させ、その後、ストレプトアビジン磁性ビーズでの捕捉を行った。ＲＯＢＯ２に特異的な抗体を得るために、選択は、２００ｎＭのヒトＲＯＢＯ１の存在下で行った。オフ速度が遅いＲＯＢＯ２特異的なｓｃｆｖを得るために、洗浄したビーズを、ビオチン化されていないＲＯＢＯ２  Ｉｇ１−Ｉｇ２と一晩インキュベートした。第２ラウンドでは、２ｎＭのビオチン化されたＲＯＢＯ２  Ｉｇ１−Ｉｇ２を、第１ラウンドで得たアウトプットファージと溶液中で３０分間にわたりインキュベートし、その後、ストレプトアビジン磁性ビーズでの捕捉を行った。
【０２７６】
アウトプットファージプールの全部で３８００のクローンを、細菌ペリプラズムフォーマットにおいて、標準的なプロトコルを使用して、ヒトＲＯＢＯ２  Ｉｇ１−Ｉｇ２タンパク質結合ＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。１１０を超える、ＲＯＢＯ２に特異的に結合する変異体を同定し、完全長ヒトＩｇＧに再フォーマットした。
【０２７７】
第２のアプローチは、ＲＯＢＯ２  Ｉｇ１に複合した９３Ｈ２の分解した結晶構造に基づいて設計された（図１２）。第１のアプローチについて記載したものと同一のライブラリースクリーニングパラダイムに従った。全部で２７のＩｇＧ変異体を、上記のアッセイを使用するスクリーニングのために生成した。
【０２７８】
スクリーニングした全てのクローンから、親和性が最適化された上位２０のクローンを同定し、これらは、それぞれが単一の固有の突然変異を軽鎖に有する、重鎖ライブラリーからの１５のクローン、軽鎖ライブラリーからの３つのクローン、および構造に基づくライブラリーからの２つのクローンからなるものであった。
【０２７９】
Ｏｃｔｅｔ技術を使用して、Ａｂ９６およびＡｂ１２３は、それぞれ１．２ｎＭおよび１．４ｎＭの相対Ｋｄ値でＲＯＢＯ２  Ｉｇ１−Ｉｇ２に結合することが示され、９３Ｈ２のＫｄ（３７ｎＭ）よりも２５〜３０倍の向上を示した。Ａｂ９６およびＡｂ１２３と、有利な親和性の増強を有する別の１８のクローンとに、さらなる重鎖および軽鎖シャッフリングを行った。
【０２８０】
最良の親和性成熟クローン（Ａｂｃｓ３５）はこのプロセスから生じ、クローンＡｂ９６の重鎖可変ドメインおよびＡｂ１２３の軽鎖可変ドメインを含む。Ｏｃｔｅｔ法およびＳＰＲ法の両方を使用すると、Ａｂｃｓ３５抗体は、Ｋｄ＝２７９ｐＭでＲＯＢＯ２  Ｉｇ１−２に結合し、≒３００倍の親和性の向上を示す。
【０２８１】
（実施例２）
ＲＯＢＯ２特異的中和抗体の同定および特徴付け
親和性成熟の作戦の結果生じた抗体を、ＳＬＩＴ２−Ｎの結合の中和、ＲＯＢＯ１と比較したＲＯＢＯ２への選択的結合、およびＳＬＩＴ２−Ｎの機能的活性の阻害についての多くのアッセイによってスクリーニングした（表２を参照されたい）。ＲＯＢＯ２−ＳＬＩＴ２−Ｎのホモジニアス時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）アッセイを使用して、ＲＯＢＯ２へのＳＬＩＴ２−Ｎの結合を遮断し得る抗体を同定した。このアッセイにおいて、テルビウム（Ｔｂ）標識されたＳＮＡＰタグ付けされたＲＯＢＯ２を発現するＨＥＫ２９３細胞を、５ｎＭのｄ２標識されたＳＬＩＴ−２Ｎと、１ｎＭの抗ＲＯＢＯ２抗体の存在下で１時間にわたりインキュベートした。インキュベーションした後、６６５ｎｍおよび６２０ｎｍでの蛍光を、Ｅｎｖｉｓｉｏｎマルチラベルプレートリーダーで測定した。ＨＴＲＦ比を以下のように計算した：６６５ｎｍでの蛍光／６２０ｎｍでの蛍光×１万。最大シグナルは、抗体の非存在下、ｄ２標識されたＳＬＩＴ２−Ｎありでの、Ｔｂ標識されたＲＯＢＯ２細胞のＨＴＲＦ比として定義し、最低シグナルは、Ｔｂ標識されたＲＯＢＯ２を発現するＨＥＫ２９３細胞のみのＨＴＲＦ比として定義した。１ナノモル濃度（ｎＭ）の親抗体である９３Ｈ２は、ＨＴＲＦアッセイを遮断することができず、したがって、この濃度を、９３Ｈ２よりも高い親和性でクローンを同定するために選択した（表２、ＨＴＲＦ比の欄）。ＳＬＩＴ２−Ｎの結合の単一点での中和を実証した抗体を次いで、ＨＴＲＦアッセイの用量依存性の中和について評価して、より低い阻害濃度５０（ＩＣ５０、半最大シグナル阻害が観察される濃度）でクローンを同定した。９３Ｈ２および親親和性成熟抗体（Ａｂシリーズ）を、７点からなる、最大濃度が１０００ｎＭの１０倍連続希釈物で評価した。鎖（Ａｂｃシリーズ）またはＣＤＲシャッフリング（ＣＴＩＲ−２シリーズ）に由来する抗体を、１１点からなる、最大濃度が１５００ｎＭの５倍連続希釈物において評価した（表２のＨＴＲＦ  ＩＣ５０）。
【０２８２】
親９３Ｈ２抗体は、非常にＲＯＢＯ２特異的であり、したがって、単一点での中和活性を有する親和性成熟抗体をフローサイトメトリーによってスクリーニングして、ＲＯＢＯ２の選択性が維持されていることを確認した。ＲＯＢＯ２の選択性を評価するために、ヒトＲＯＢＯ１またはＲＯＢＯ２のいずれかを過剰発現するヒト胚性腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞を、単一の濃度の選択された抗体と、３０分間にわたり４℃でインキュベートした。９３Ｈ２および親親和性成熟抗体（Ａｂシリーズ）を０．１μｇ／ｍｌの示された抗体で染色し、鎖（Ａｂｃｓシリーズ）またはＣＤＲシャッフリング（ＣＴＩＲ−２シリーズ）に由来する抗体を２．５μｇ／ｍｌの示された抗体で染色した。抗体の結合を、蛍光色素にコンジュゲートした抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２二次抗体を使用して検出し、試料をＦｏｒｔｅｓｓａサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。ＲＯＢＯ２選択性倍率を、ＲＯＢＯ２細胞での幾何平均蛍光強度（Ｇｅｏ  ＭＦＩ）／ＲＯＢＯ１細胞でのＧｅｏ  ＭＦＩとして計算した。３を超える変化倍率を、ＲＯＢＯ２特異的であるとみなした（表２、選択性倍率）。一部の親和性成熟クローン、例えば、Ａｂｃｓ  ５５、ＣＴＩ−Ｒ２−１０、およびＣＴＩＲ２−１３は、ＲＯＢＯ１反応性が増大していた。
【０２８３】
表２は、ＲＯＢＯ１および／またはＲＯＢＯ２に対する抗体をスクリーニングするために使用して、ＲＯＢＯ２を高い親和性で特異的に認識したがＲＯＢＯ１は認識しなかった抗体を同定した、アッセイの概要である。行ったアッセイは、親抗体が中和しなかった条件下でアッセイを中和し得たクローンを同定するための単一点の中和のホモジニアス時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）アッセイを含んでいた。抗体を選択するために、完全用量曲線を同一のアッセイで行った。ネイティブな、表面に発現されたタンパク質の認識、およびＲＯＢＯ２選択性を、フローサイトメトリーによって評価した。抗体を、単一の濃度で、ヒトＲＯＢＯ１またはＲＯＢＯ２のいずれかを過剰発現するヒト胚性腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞への結合について試験した。抗体が、表面に発現されたタンパク質への結合を実証した場合、選択性倍率を、ＲＯＢＯ２細胞での幾何平均蛍光強度（Ｇｅｏ  ＭＦＩ）をＲＯＢＯ１細胞でのＧｅｏ  ＭＦＩによって割ることによって決定した。３を超える値を有するものはいずれも、ＲＯＢＯ２に対して選択的であるとみなされた。各抗体に対して行われた様々なスクリーニングアッセイのアウトカムは、最後の欄で強調されている。
【０２８４】
最後の選択スクリーニングは、ＲＯＢＯ２依存性のＳＬＩＴ２−Ｎ活性の機能的な中和であった。ＳＬＩＴ２−ＲＯＢＯ２の相互作用は、発生の際の軸索移動の鍵となる調節因子である。ＳＬＩＴ２が脳室下帯ニューロンにとって化学反発性であること、およびこの活性がＲＯＢＯ２依存性であることが知られている。ラットの脳室下帯（ＳＶＺ）の神経組織外植片を単離し、コラーゲンマトリックスに包埋した。ＳＬＩＴ２−Ｎの存在下で、神経細胞移動は阻害される（ＳＶＺａアッセイ）。抗体を、ＳＶＺａアッセイにおいて、神経細胞移動を回復させる用量依存性の能力について評価した。組織外植片を、１ｎＭのＳＬＩＴ２−Ｎの存在下で、滴定量の選択ＲＯＢＯ２特異的抗体あり、またはなしでインキュベートした。インキュベーションした後、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２で染色した。広視野の蛍光画像を、１０倍の高ＮＡ対物レンズを有するＯｐｅｒｅｔｔａ  Ｈｉｇｈ  Ｃｏｎｔｅｎｔ  Ｉｍａｇｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で得た。５％のオーバーラップを有する、ウェル当たり９つの視野を得て、ウェルの中央区域全体を捉えた。各視野について、各平面間の距離が１μｍの６つの平面からなるＡ  Ｚ−スタックを得て、組織外植片の最深長を捉えた。分析は、Ｖｏｌｏｃｉｔｙソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で行った。各ウェルの全ての視野を互いにステッチした。中央の組織外植片の区域、および組織外植片の外側の各核を、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２染色によって検出した。個々の核を計数し、各核の中央から組織外植片の最も近い縁までの距離をμｍ単位で測定した。ウェル内の核の平均移動距離に核の数をかけて、各ウェルについての総移動距離を得た。ＳＶＺａアッセイにおいて、全ての選択された親和性成熟抗体は、親９３Ｈ２抗体よりも低いＩＣ５０を有しており（表５）、Ａｂｃｓ３５が、０．０２７ｎＭの最も低いＩＣ５０を有していた（図６）。
【０２８５】
【表３−１】
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【０２８６】
【表３−２】
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【０２８７】
【表３−３】
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【０２８８】
（実施例３）
Ａｂｃｓ３５およびＡｂｃｓ２５のインビトロでの薬理学。
いくつかの基準に基づいて、Ａｂｃｓ２５およびＡｂｃｓ３５を、さらなる特徴付けのために選択した。フローサイトメトリーを使用して、親９３Ｈ２と比較した、ヒトＲＯＢＯ２に対する結合のＥＣ５０の向上を評価した。ＲＯＢＯ２の選択性倍率について上記で記載したように（実施例２）、６．７ｎＭで開始して、１１点からなる３倍連続希釈物を各抗体について作製し、ＨＥＫ２９３を過剰発現するヒトＲＯＢＯ２を染色するために使用した。Ａｂｃｓ２５およびＡｂｃｓ３５の両方が、より低いＥＣ５０で、ヒトＲＯＢＯ２に対するより高い親和性結合を実証した（表３）。ヒトＲＯＢＯ２への結合の向上を測定することに加えて、カニクイザルＲＯＢＯ２およびラットＲＯＢＯ２の両方への高い親和性での結合を確実に維持することが重要であった。カニクイザルＲＯＢＯ２またはラットＲＯＢＯ２のいずれかを過剰発現するＨＥＫ２９３細胞を使用して、９３Ｈ２、Ａｂｃｓ２５、およびＡｂｃｓ３５の相対的な用量依存性の結合を、上記のように評価した。カニクイザルおよびラットＲＯＢＯ２の両方への高い親和性での結合は、Ａｂｃｓ２５およびＡｂｃｓ３５において維持された（表４）。Ａｂｃｓ３５のＫＤは、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、０．２６８ｎＭであると判定された。簡潔に述べると、Ａｂｃｓ３５を、ＣＭ５チップ上で３００共鳴単位（ＲＵ）に固定した。ＲＯＢＯ２  Ｉｇ１−Ｉｇ２−Ｈｉｓ（ＲＯＢＯ２）の会合を５分間にわたり測定し、解離を１０分間にわたり追跡した。ＲＯＢＯ２の８点からなる２倍連続希釈物を使用して、ＫＤを決定した（図１）。
【０２８９】
表３は、親ＲＯＢＯ２特異的抗体、９３Ｈ２、ならびに２つの選択された親和性成熟クローンであるＡｂｃｓ３５およびＡｂｃｓ２５の、細胞への抗体結合の半最大シグナルが観察される濃度である有効濃度５０（ＥＣ５０）値の概要である。ＥＣ５０を、ヒトＲＯＢＯ２、またはＲＯＢＯ２のＲＳＫエピトープを含むＲＯＢＯ１の突然変異形態を過剰発現するいずれかの細胞に対する用量依存性の結合を評価することによって決定した。
【０２９０】
【表４】
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【０２９１】
表４は、ヒト、カニクイザル、またはラットのＲＯＢＯ２オルソログのいずれかに対する、親ＲＯＢＯ２特異的抗体である９３Ｈ２、ならびに２つの選択された親和性成熟クローンであるＡｂｃｓ３５およびＡｂｃｓ２５のＥＣ５０値の概要である。ＥＣ５０を、ヒトＲＯＢＯ２、カニクイザルＲＯＢＯ２、またはラットＲＯＢＯ２のいずれかを過剰発現するＨＥＫ２９３細胞に対する用量依存性の結合を評価することによって決定した。
【０２９２】
【表５】
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【０２９３】
表５は、選択されたＲＯＢＯ２特異的抗体による神経細胞移動のＳＬＩＴ２−Ｎ介在性の阻害の中和についての（ＳＶＺａアッセイ）、半最大シグナル阻害が観察される濃度である阻害濃度５０（ＩＣ５０）値の概要である。ＳＶＺａアッセイは、ラットの脳室下帯（ＳＶＺ）からの神経組織外植片の単離を伴う。コラーゲンマトリックスに包埋されると、神経細胞は外植片の外部へ移動する。ＳＬＩＴ２−Ｎの存在下で、神経細胞移動は阻害され、この移動はＲＯＢＯ２依存性である。中和抗ＲＯＢＯ２抗体の存在下では、神経細胞移動は回復される。組織外植片を、１ｎＭのＳＬＩＴ２−Ｎの存在下で、滴定量の選択されたＲＯＢＯ２特異的抗体の存在下または非存在下でインキュベートし、移動のＳＬＩＴ２−Ｎ介在性の阻害の回復を評価した。ＳＬＩＴ２−Ｎ活性の用量依存性の阻害が、広範なＩＣ５０にわたり試験した全ての抗体で見られた。Ａｂｃｓ３５、Ａｂｃｓ２５、およびＣＴＩＲ２−１５の値は、２つの独立した実験の平均を表し、その一方で、他のものは単一の実験に相当する。
【０２９４】
【表６】
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【０２９５】
（実施例４）
インビボでの薬理学
ラットをＡｂｃｓ３５で処置すると、タンパク尿が低減し、ポドサイトの足突起のアーキテクチャが保護される。図７および８で示すように、ポドサイト駆動性の糸球体慢性腎臓疾患のモデルである受身ヘイマン腎炎モデルのラットを処置すると、タンパク尿の量が用量依存性の様式で低減した。簡潔に述べると、Ｌｅｗｉｓラットに、ラット腎臓刷子縁に対して作られたヒツジ抗血清（抗Ｆｘ１ａ（Ｐｒｏｂｅｔｅｘ  Ｉｎｃ）、基底膜およびポドサイト）を注射する。ラットは、ラットポドサイトに結合したヒツジ血清に対する免疫応答を示すようになる。補体活性化は次いで、ポドサイトを消失させ、３日目から１２日目の間にタンパク尿を増大させ、その後は横ばいとなる。このメカニズムは、ポドサイトタンパク質ＰＬＡ２Ｒ（全ケースの７０％において）に対する自己抗体が補体会合の後にポドサイトの消失およびネフローゼ域タンパク尿を生じさせる、膜性腎症で見られるメカニズムに非常に類似している。ラットを、モデル開始の２４時間前に、糸球体ＲＯＢＯ２のおよそ８０、９０、および９９％を網羅するための用量範囲（１、５、および２５ｍｇ／ｋｇ）で前処理し、その後、７２時間ごとに処理した。タンパク尿の最大の低減は３９％であり、および反復測定ＡＮＯＶＡ統計分析によって、ｐ値が０．０００３の用量応答が確認された。補体ＩＨＣスコアリングによって判定したところ、腎臓における免疫複合体の蓄積の低減はなく、このことは、応答がポドサイト保護効果に起因するものであったことを示している。ポドサイトの機能および構造の調節における信頼性をさらに提供するために、ポドサイトの下部構造の電子顕微鏡写真の定量分析を行った（以下に記載するように）。指状嵌入している足突起のスリット隔膜間の距離を、複数のループ状毛細血管について計算し、足突起の平均幅を決定した。消失したポドサイトの足突起の幅は、正常な消失していないポドサイトの足突起の幅よりも大きい。図８で示すように、２５ｍｇ／ｋｇ用量のＡｂｃｓ３５で処置した動物の足突起の幅は、対照抗体で処理した動物よりも有意に小さかった（１９％の低減）。このデータは、タンパク尿の低減がポドサイト下部構造の改変に起因するものであったという仮説をサポートした。
【０２９６】
回収、試料採取、および切片化：浸漬（４％ホルムアルデヒド／１％グルタルアルデヒド）によって固定された完全（ｆｕｌｌ  ｆａｃｅ）試料腎臓（動物当たり１つの腎臓）を受け取り、皮質のみを含めるように刈り込み、腎臓につき５つの試料をエポキシ樹脂に包埋した。各腎臓の第１の包埋された試料を切片化した。これが３つの糸球体を含有していれば、この試料を薄片化し、イメージングした。この第１の試料が糸球体を含有していなければ、その腎臓の他の包埋試料を連続的に切片化し、同様に評価して、３つの糸球体を有する試料を見出した。
【０２９７】
観察およびイメージング：選択された腎臓試料を、透過型電子顕微鏡（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｈ−７１００）およびデジタルＣＣＤカメラシステム（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）を使用してデジタルイメージングした。反復せずに、２００倍の倍率で見られた最初の３つの糸球体の３つのループ状毛細血管を、５０００倍および１万倍の倍率でイメージングした。この結果、腎臓当たり１８のデジタル画像を得た（すなわち、腎臓試料当たり３つの糸球体×糸球体当たり３つの区域×２つの倍率）。盲検様式での評価を可能にするために、各画像を、研究番号、動物番号、試料番号、および倍率のみにより特定した。
【０２９８】
ポドサイトの足突起の幅およびスリット膜の密度の測定。ＩｍａｇｅＪソフトウェア（バージョン１．４７ｖ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、ＵＳＡ）を使用して、糸球体基底膜（ＧＢＭ）の単位長さ当たりの隣接した足突起の幅を手動でトレースし、高倍率の透過型電子顕微鏡画像で測定する。
【０２９９】
（実施例５）
ＲＯＢＯ２特異的なエピトープの同定
材料の調製、結晶化、データの収集、および構造の決定：
ＲＯＢＯ２  Ｉｇ１ドメインの精製。６×ヒスチジンタグをＣ末端に有するＲＯＢＯ２のＩｇ１ドメインを、哺乳動物細胞で一時的に発現させ、Ｎｉ  Ｅｘｃｅｌカラムを介してイミダゾール勾配溶出で精製した。タンパク質をさらに精製して、ＨｉＬｏａｄ  ２６／２００  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してサイズ排除クロマトグラフィーを介して均質にした。
【０３００】
９３Ｈ２  Ｆａｂの生成。抗ＲＯＢＯ２  ｍＡｂ  ９３Ｈ２を、製造者のプロトコル（Ｔｈｅｒｍｏ／Ｐｉｅｒｃｅ）に従って、固定パパインで１２時間にわたり消化した。タンパク質Ａ５０（Ｐｏｒｏｓ）を使用して、Ｆａｂを消化されたプールから分離した。Ｆａｂを次いでさらに精製して、ＨｉＬｏａｄ  ２６／２００  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してサイズ排除クロマトグラフィーを介して均質にした。
【０３０１】
複合体の生成。９３Ｈ２  ＦａｂおよびＲＯＢＯ２のＩｇ１ドメインを１：１．１の比で混合して複合体を形成した。ＨｉＬＯＡＤ  ２６／２００  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する最終的なサイズ排除ステップを行って、過剰なＲＯＢＯ２を分離した。精製された複合体を、結晶化の準備のために、１０．６ｍｇ／ｍｌに濃縮した。
【０３０２】
結晶化。ＲＯＢＯ２のＩｇ１ドメインと複合体を形成した９３Ｈ２  Ｆａｂの結晶を、以下の条件下で得た：１００ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．６、１００ｍＭの硫酸リチウム、１２％ＰＥＧ６０００。この条件によって、２．９Åで回折する平面状の結晶が得られた。
【０３０３】
データの収集。結晶を一時的に凍結防止処理し、シンクロトロンデータの収集を、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ（ＡＰＳ）の１７  ＩＤビームラインで遠隔的に行った。イメージフレームを、ソフトウェアＡｕｔｏＰＲＯＣ（Ｇｌｏｂａｌ  Ｐｈａｓｉｎｇ  Ｌｔｄ）を使用して処理した。データは、以下の単位胞を有する空間群Ｐ２１に属する：非対称単位当たり６つの複合体で、ａ＝７６．４６Å、ｂ＝２２１．８５Å、ｃ＝１２９．３１Å、ｂ＝９５．８６°。
【０３０４】
構造の決定および精密化。分子置換サーチモデルは、９３Ｈ２  Ｆａｂの可変ドメインおよび定常ドメイン、ならびにＰｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｂａｎｋを介して公開されているＲＯＢＯ１のＩｇ１ドメイン（アクセスｉｄ：２Ｖ９Ｑ）の相同性モデルから構成される。サーチを複数回行った後、複合体の６つのコピーの全ての分子置換の解を、高い信頼性で、結晶格子内に置いた。モデルを再構築した後、ソフトウェアａｕｔｏＢＵＳＴＥＲ（Ｇｌｏｂａｌ  Ｐｈａｓｉｎｇ  Ｌｔｄ）を使用して精密化を行い、２．９４Åでの最終的な精密化Ｒ／Ｒｆｒｅｅ因子は、それぞれ０．１６４６および０．２２５１であった。構造は良好な幾何学にあり、結合のＲＭＳＤは０．０１０Åであり、角度のＲＭＳＤは１．２３°である。
【０３０５】
抗体−抗原界面および突然変異生成の研究
図１０は、ＳＬＩＴ１／ＳＬＩＴ２の主要な認識部位であるＲＯＢＯ２およびＲＯＢＯ１のＩｇ１ドメインが、９６．２％の配列類似性（１０２／１０６）および９２．５％の配列同一性（９８／１０６）を示すことを示す。２つのフレームワークが事実上同一であることを考えると、ＲＯＢＯ２に排他的に結合し得るがＲＯＢＯ１には結合しない任意の最良の抗体は、ＲＯＢＯ２上の以下の８つの残基（ＲＯＢＯ１における対応する残基は括弧内に列挙している）：Ｖ４０（Ｌ）、Ｔ４８（Ａ）、Ｄ６７（Ｇ）、Ｒ１００（Ｋ）、Ｋ１０２（Ｒ）、Ｓ１０７（Ｖ）、Ｒ１２２（Ｈ）、およびＮ１２３（Ｄ）の少なくとも１つを区別することができなくてはならない。
【０３０６】
９３Ｈ２  ｍＡｂのＦａｂと複合体を形成したＲＯＢＯ２のＩｇ１ドメインの結晶構造を、非対称単位当たり６コピーの複合体で、２．９４オングストロームで決定した。結晶充填環境の差に起因して、複合体の６つのコピーは２つの異なる立体構造にグループ化され得、ＲＯＢＯ２と９３Ｈ２との間の結合界面の立体構造の多様性についてのさらなる理解を提供する。
【０３０７】
ＲＯＢＯ２−ＳＬＩＴ２およびＲＯＢＯ２−９３Ｈ２の結晶構造をアラインすることによって、ＲＯＢＯ２とわずかに相互作用するにすぎない９３Ｈ２の軽鎖が、ＲＯＢＯ２とＳＬＩＴ２との間の相互作用を防ぐために必要な構造的障害となることが明らかになる（図１１）。ＲＯＢＯ２の、９３Ｈ２との結合親和性がＳＬＩＴ２との結合親和性よりも高い場合、９３Ｈ２は、ＲＯＢＯ２−ＳＬＩＴ２の相互作用およびその下流のシグナル伝達を防ぐために十分な立体遮断を提供する。
【０３０８】
９３Ｈ２によって標的化されるＲＯＢＯ２のＩｇ１ドメイン上の主要な結合エピトープは、ＲＯＢＯ２の柔軟なループ（残基Ｈ９７〜Ｐ１０３）である（図１２）。９３Ｈ２の結合に寄与するさらなるマイナーなエピトープは、ＲＯＢＯ２の別個のループ（Ｅ７２〜Ｈ８１）を介する。しかし、異なる立体構造の複合体において明らかにされるように、後者のエピトープへの結合は任意である。これは、ＲＯＢＯ２に対する９３Ｈ２の特異性を説明するための決定要因ではない。
【０３０９】
９３Ｈ２とＲＯＢ２との間の主要な界面の安定性は、ＲＯＢＯ２のＲ９９およびＲ１００の寄与を大きく受ける（図１２）。Ｒ１００は、重鎖のＥ９５ならびに９３Ｈ２の軽鎖のＳ９１およびＹ９２のカルボニル基との広範囲に及ぶ水素結合を形成して、認識を強固にする。ＲＯＢＯ２のＲ９９はまた、重鎖のＤ９９および軽鎖のＹ９２と接触して、相互作用をさらに安定化させる。Ｒ９９はＲＯＢＯ１とＲＯＢＯ２との間で保存されているため、Ｒ１００は、ＲＯＢＯ２に対する９３Ｈ２の結合特異性を決定する唯一の残基である。
【０３１０】
突然変異生成の研究は、構造の観察および予測をさらに裏付ける：ＲＳＫのＲＯＢＯ２の残基１００〜１０２をＫＳＲに突然変異することによって、突然変異体ＲＯＢＯ２の、９３Ｈ２と相互作用する能力が無効となり、その一方で、ＫＳＲのＲＯＢＯ１の残基１００〜１０２をＲＳＫに突然変異することによって、この突然変異体ＲＯＢＯ１がＲＯＢＯ２特異的な９３Ｈ２と相互作用することが可能になる（以下に記載する研究）。Ｓ１０１はＲＯＢＯ２およびＲＯＢＯ１の間で保存され、Ｋ１０２の側鎖はＲＯＢＯ２相互作用を伴わないため（界面から離れた箇所を指している）、Ｒ１００がＲＯＢＯ２に対する９３Ｈ２の結合特異性を唯一駆動していることが明らかになる。
【０３１１】
上記の結晶構造に基づいて、以下の実験を行って、９３Ｈ２および／または親和性成熟クローンＡｂｃｓ３５のエピトープ特異性を確認した。Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄを使用して、エピトープ特異性を生化学的に確認した。１０μｇ／ｍｌのＡｂｃｓ３５を、ＡＨＣセンサー上に６０秒間捕捉させた。１００ｎＭで調製された、組換えヒトＲＯＢＯ２  Ｉｇ１−Ｉｇ２、ラットＲＯＢＯ１  Ｉｇ１−Ｉｇ２、ＲＯＢＯ１  ＫＳＲ配列を含むヒトＲＯＢＯ２（ＲＯＢＯ２−ＫＳＲ突然変異体）、およびヒトＲＯＢＯ１  Ｉｇ１−Ｉｇ２を使用して、捕捉されたＡｂｃｓ３５と相互作用させた。会合時間は１００秒間であり、次いで、解離を２０秒間にわたって追跡した。Ａｂｃｓ３５はヒトおよびラットＲＯＢＯ２に特異的に結合したが、ヒトＲＯＢＯ１にもＲＯＢＯ２−ＫＳＲ突然変異タンパク質にも結合しなかった（図２）。
【０３１２】
Ａｂｃｓ３５と、９３Ｈ２およびＡｂｃｓ２５とのＲＳＫ特異性もまた、フローサイトメトリーを使用する細胞ベースの結合アッセイにおいて確認した。ＲＯＢＯ１のＫＳＲ配列を含むＲＯＢＯ２（ＲＯＢＯ２−ＫＳＲ）、またはＲＯＢＯ２のＲＳＫ配列を含むＲＯＢＯ１（ＲＯＢＯ１−ＲＳＫ）を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞を生成した。上記の実施例３において記載したように、用量依存性の結合を評価した。Ａｂｃｓ３５は、ヒトＲＯＢＯ２を発現する細胞およびＲＯＢＯ１−ＲＳＫ細胞に対する特異的結合を実証したが、突然変異体ＲＯＢＯ２−ＫＳＲタンパク質を発現する細胞に対する結合は観察されなかった（図３）。Ａｂｃｓ３５と共に、９３Ｈ２およびＡｂｃｓ２５は、突然変異体ＲＯＢＯ１−ＲＳＫタンパク質を発現する細胞に対する用量依存性のかつ特異的な結合を実証し、Ａｂｃｓ２５およびＡｂｃｓ３５は、親９３Ｈ２よりも高い親和性を有していた（表３）。
【０３１３】
エピトープおよびパラトープの分析
９３Ｈ２のＦａｂと複合体を形成したＲＯＢＯ２のＩｇ１ドメインの全体的な結晶構造を図１３に示す。非対称単位は、結晶格子内に環様の立体構造に配置された、ＲＯＢＯ２−９３Ｈ２複合体の６つのコピーを含む。この配置によって、６つのわずかに異なる局所環境で同一の複合体を可視化することが可能になる。結晶構造と溶液の挙動との間の一部のさらなる差が、２つの環境における溶液の条件（ｐＨなど）の差に起因して生じ得る。構造において、鎖Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｊ、Ｍ、およびＰが抗体重鎖の例であり、鎖Ｂ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、および、Ｑが抗体軽鎖の例であり、鎖Ｃ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｏ、およびＲがＲＯＢＯ２  Ｉｇ１ドメインの例である。主要なＦａｂ／抗原相互作用は、以下の６つ鎖群の間で生じる：（Ａ、Ｂ、Ｃ）、（Ｄ、Ｅ、Ｆ）、（Ｇ、Ｈ、Ｉ）、（Ｊ、Ｋ、Ｌ）、（Ｍ、Ｎ、Ｏ）、および（Ｐ、Ｑ、Ｒ）。７１位から８１位の抗原残基は、構造の６つの独立したコピーの間で著しい柔軟性を示す。ＰＱＲコピーが両抗体鎖について最も低いＢ因子を有するが、ＡＢＣバージョンの複合体における抗原Ｉｇ１ドメインは、以前に公開されたＲＯＢＯ２構造（ＰＤＢエントリー２Ｖ９Ｒ；Ｍｏｒｌｏｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２００７、１０３、１４９２３〜８）と比較して最も低いＲＭＳｄ（≒０．６Ａ）を有する。複合体の６つのコピー全てが、溶液中で生じる柔軟な挙動の関連するスナップショットを含み得るが、６つのコピーのうちのより多くで生じる相互作用は、エネルギー的に有利であり得、したがって、より重要であり得る。
【０３１４】
構造を、Ｃｏｎｔａｃｔｓパネルを使用して、Ｍａｅｓｔｒｏ  １０（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ，ＬＬＣ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ）で視覚化して、ＲＯＢＯ２とＦａｂとの間の原子内接触距離がこの２つの原子のファンデルワールス半径の合計の≦１．３倍である相互作用を位置決定した。表６は、抗体と接触するＲＯＢＯ２残基を示し、複合体の６つのコピーのうちのいくつが抗体と相互作用する残基を示すか、および、どのＦａｂ鎖が関与するかを示す（異なる複合体間の結晶充填相互作用、例えば、［Ａ、Ｂ、Ｃ］と［Ｄ、Ｅ、Ｆ］との間の相互作用は含まれないことに留意されたい）。ＲＯＢＯ２の６９位〜８２位および１３１位〜１４０位のアミノ酸は、非対称単位の複合体の少なくとも半数において、抗体と接触する複数の残基を含み、９３Ｈ２の結合のためのエピトープをほぼ規定する
【０３１５】
表７は、ＲＯＢＯ２と接触する９３Ｈ２残基、これらがＣＤＲ内にあるかどうか、および構造内の６つのＲＯＢＯ２コピーのいずれが相互作用を示すかを示す。３つの重鎖ＣＤＲの全てが６つのコピーの全てにおいて接触するが、軽鎖ではＣＤＲ−１およびＣＤＲ−３のみが６つのコピーの全てと接触する。複合体の少なくとも一部のコピーにおいて、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ７３、およびＬ４９に接触するＲＯＢＯ２とのフレームワーク接触も存在する。表７は、接触が複合体の少なくとも１つにおいて９３Ｈ２側鎖を伴うかどうかをさらに示す。２つのケースにおいて（Ｈ９６およびＬ９３）、ＲＯＢＯ２との接触は、側鎖によってではなく残基骨格によって排他的に起きる。
【０３１６】
表６および７において同定されたエピトープ残基およびパラトープ残基の重要性をさらに特徴付けすることが可能である。例えば、接触が主に骨格となされる場合、または接触がエネルギー的にニュートラルである場合、残基は、広範な突然変異を許容し得る。側鎖全体と他の結合パートナーとの著しい接触、またはコンピュータによる進化シミュレーションにおける高度な保存は、特定の残基の重要性が他の残基と比較して高い可能性があることの証拠である。９３Ｈ２の結晶構造について、本発明者らは、抗体／抗原の接触に関与する残基への側鎖の接触を調べた。本発明者らはまた、ＭＯＤＥＬＬＥＲソフトウェアパッケージ（Ｗｅｂｂ  ＆  Ｓａｌｉ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、５．６．１〜５．６．３２、２０１４）を使用して、９３Ｈ２の結晶構造を使用してＡｂｃｓ３５−Ｊの可変ドメイン（配列番号１２７および１３３）の相同性モデルを構築した。上記のように、９３Ｈ２／ＲＯＢＯ２複合体のＰＱＲコピーは、最も低いＢ因子を有していたが、ＡＢＣコピーは、以前に公開されたバージョンのＲＯＢＯ２ドメインに、より密接に類似していた。したがって、本発明者らは、１つはＡＢＣ複合体を鋳型として使用し、１つはＰＱＲ複合体を鋳型として使用して、２つの相同性モデルを構築した。界面における最も重要な残基を同定するための代替的なアプローチとして、本発明者らは、これらの相同性モデルの鍵となる領域を、環境依存性の水素結合のスコアリングを無効にし、０．２２８のボルツマンウェイトを使用する、Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｋｏｒｔｅｍｍｅ（ＰＬＯＳ  Ｏｎｅ、２０１１、ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００２０４５１、およびＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．４０２、２（１７）、４６０〜７４（２０１０））によって記載されているような、Ｒｏｓｅｔｔａソフトウェアパッケージにおける配列を最適化するための遺伝的アルゴリズムに供した。全部で５０または１００の骨格変異体を、各残基クラスター（それぞれ、８個以下の残基を含む）につき、世代当たり骨格変異体当たり５０００または２万配列で、遺伝的アルゴリズムの５世代にわたりシミュレートした（最大８残基からなるクラスターには小さい方の数を使用したが、その一方で、９残基を有していた単一クラスターのサンプリングを増大させるためには、大きい方の数を使用した）。プロトコルのアウトプットには、どのアミノ酸が各サンプリングされた位置で最も頻繁に生じるかについての統計が含まれる。アミノ酸がランダムに分布していた場合、２０のアミノ酸が存在するため、各々は、およそ５％の頻度で存在することになる。一般に、しかし、１つまたはいくつかの残基は５％よりも有意に高い頻度で存在し、このことは、特異的なアミノ酸に対する構造的または結合的優先性を示す。表８は、野生型残基が＞１０％の頻度を有していたＲＯＢＯ２残基を列挙しており、これは、既存の残基が抗体／抗原相互作用に好ましいものの１つであることを示している。一部の残基は、シミュレーションのための複数の残基クラスターの一部として選択され、したがって、複数��シミュレートされた。このようなケースにおいて、表８は、代表的な結果を示す。シミュレーションに関与する一部の残基は、抗体−抗原界面に直接関与しない第２層の残基であり、直接的に接触していた隣接する残基のバリエーションを高めることを可能にするためだけに含まれていた。しかし、直接的に接触することが観察された残基（すなわち、表６の残基）のみが、表８に含めるか検討された。一部の残基（Ａｓｐ７７など）は、ＲＯＢＯ２の立体構造の差に起因して、一方の相同性モデル（ＡＢＣ複合体に基づく）をシミュレートする場合、高い頻度を有していたが、他方のモデル（ＰＱＲ複合体に基づく）をシミュレートする場合は、高い頻度を有していなかった。
【０３１７】
Ａｂｃｓ３５−Ｊ抗体残基の類似性の分析が表９に示され、この表は、既存の抗体残基が＞１０％の頻度を有していた抗体残基を列挙しており、このことは、既存の残基が抗体／抗原相互作用に好ましいものの１つであることを示している。抗原と接触していることが認められる残基（すなわち、表７に示されているもの）のみが表９に示される。
【０３１８】
抗体／抗原界面における残基の重要性の全体的な質的ランキングを、その各々がより高い重要性を示す以下の基準に基づいて確立した：（Ａ）表６および７で示すような、結晶構造の非対称単位における６つの独立して精密化された複合体で見られる一貫した相互作用、（Ｂ）表７における抗体について示されているような、抗体／抗原の結合における側鎖の関与、特に、末端側鎖の原子または側鎖の水素結合を伴うケース、（Ｃ）表８および９で示すような、コンピュータによる遺伝的アルゴリズムの配列最適化における高い配列保存、ならびに（Ｄ）上記のような突然変異生成の研究。これらの基準の２つの以上を満たす残基は、「主要な」役割を有すると定義され得、その一方で、重要性が低い他の残基は、「寄与する」役割（中程度の重要性）または「任意の」役割（低い重要性）を有すると定義され得る。基準（Ａ）および（Ｃ）を満たすが骨格相互作用のみを界面に与えるアミノ酸は、それが広い特異性を伴って多くの抗体に一般に存在し、それが正準的なＣＤＲ立体構造をサポートするということを主たる理由としてシミュレーションにおいて保存される場合は、依然として、「主要な」役割までは有さないと判断され得る。このような残基の例はＴｙｒ（Ｈ２７）であり、このケースでは、側鎖は、ごく稀にＲＯＢＯ２と偶発的な接触を生じ、それはＣβ側鎖原子を介してのみである。ＲＯＢＯ２残基のランキングを表１０Ａに示し、抗体についてのランキングを表１０Ｂに示す。表６〜９で既に捕捉されていない、何らかの鍵となる特徴があれば、各表のコメント欄に示す。
【０３１９】
【表７】
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【０３２０】
【表８】
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【０３２１】
【表９】
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【０３２２】
【表１０】
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【０３２３】
【表１１】
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【０３２４】
【表１２】
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【０３２５】
さらに、エピトープ／パラトープ残基に一般的に用いられる基準には、（ｉ）コグネート抗体の重原子から約４Åの距離以内にある重原子（すなわち、非水素原子）を有する残基、（ｉｉ）コグネート抗体の残基と、もしくはこれもコグネート抗体に水素結合している水分子との（水が介在する水素結合）水素結合に関与する残基、（ｉｉｉ）コグネート抗体の残基への塩橋に関与する残基、または（ｉｖ）ＢＳＡが２０Å２以上の、もしくは抗体が抗原に結合する場合の静電気的相互作用に関与する残基が含まれる。これらの相互作用は、以下のようにまとめられる。
【０３２６】
【表１３】
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【０３２７】
【表１４】
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【０３２８】
【表１５】
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【０３２９】
【表１６】
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【０３３０】
【表１７】
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【０３３１】
（実施例６）
生殖細胞系抗体の特徴付け
Ａｂｃｓ−ＡからＡｂｃｓ−Ｏと名付けられた（表１２）、Ａｂｃｓ３５に基づくさらなる生殖細胞系抗体を生成した。これらの生殖細胞系抗体は、Ａｂｃｓ３５内のある特定の非生殖細胞系残基（重鎖の３残基および軽鎖の１残基）が、対応するヒト生殖細胞系残基で置き換えられた。
【０３３２】
フレームワーク領域内に生殖細胞系配列を導入するための突然変異を有する抗体を、以下の多くのインビトロアッセイで評価した：１）ＳＰＲ、２）ＳＬＩＴ２−Ｎ：ＲＯＢＯ２相互作用の中和、３）ＲＯＢＯ２オルソログ、ＲＯＢＯ１ホモログ、およびＲＯＢＯ２の特異的ＲＳＫモチーフへの結合、ならびに４）ＳＬＩＴ２−Ｎの存在下での神経細胞移動の回復。
【０３３３】
親和性を、実施例３において記載されているような標準的ＳＰＲ方法によって測定した。簡潔に述べると、抗体を、ＣＭ５チップ上の特定量の共鳴単位（ＲＵ）に固定した。ＲＯＢＯ２  Ｉｇ１−Ｉｇ２−Ｈｉｓ（ＲＯＢＯ２）の会合および解離を、一定期間にわたり追跡する。抗体を１０ｎＭ、１ｎＭ、および０．１ｎＭの濃度で使用して、ＫＤを決定した。表１３は、導入された生殖細胞系突然変異によって与えられたＫＤの変化を示す。
【０３３４】
【表１８】
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【０３３５】
ＲＯＢＯ２へのＳＬＩＴ２−Ｎの結合の中和を、実施例２において記載したようなＲＯＢＯ２：ＳＬＩＴ２−Ｎホモジニアス時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）アッセイによって評価した。簡潔に述べると、ＨＴＲＦアッセイを、以下のように行った：テルビウム（Ｔｂ）で標識されたＳＮＡＰタグ付けされたＲＯＢＯ２を発現するＨＥＫ２９３細胞を、抗ＲＯＢＯ２抗体の存在下で、ｄ２標識されたＳＬＩＴ−２Ｎと１時間インキュベートした。インキュベーションした後、６６５ｎｍおよび６２０ｎｍでの蛍光を、Ｅｎｖｉｓｉｏｎマルチラベルプレートリーダーで測定した。ＨＴＲＦ比を以下のように計算した：６６５ｎｍでの蛍光／６２０ｎｍでの蛍光×１万。最大シグナルを、抗体の非存在下、ｄ２標識されたＳＬＩＴ２−Ｎありでの、Ｔｂ標識されたＲＯＢＯ２細胞のＨＴＲＦ比として定義し、最小シグナルを、Ｔｂ標識されたＲＯＢＯ２を発現するＨＥＫ２９３細胞のみのＨＴＲＦ比として定義した。図１５は、全ての生殖細胞系抗体によるＨＴＲＦシグナルのほとんど区別不可能な用量依存性の阻害を示し、表１４は、各生殖細胞系抗体について決定されたＩＣ５０値を含む表である。これらのデータは、生殖細胞系突然変異の導入がＳＬＩＴ２の結合を中和する抗体の能力に対する有意な影響を有していたことを示す。
【０３３６】
【表１９】
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【０３３７】
ヒトＲＯＢＯ２、カニクイザルおよびラットのオルソログ、ヒトＲＯＢＯ１についての、Ａｂｃｓ３５と比較したＡｂｃｓ３５−Ｊの結合プロファイル、ならびに、ＲＯＢＯ１のＫＳＲに対してはないがＲＯＢＯ２のＲＳＫエピトープに対する特異性を判定した。結合を、実施例２（ホモログ特異性）、実施例３（オルソログ反応性）、および実施例５（ＲＳＫエピトープ対ＫＳＲエピトープの特異性）において記載したように、フローサイトメトリーによって評価した。簡潔に述べると、１）ヒトＲＯＢＯ１、２）ヒトＲＯＢＯ２、３）カニクイザルＲＯＢＯ２、４）ラットＲＯＢＯ２、５）ＲＯＢＯ１  ＫＳＲモチーフを含む突然変異体ＲＯＢＯ２、または６）ＲＯＢＯ２のＲＳＫモチーフを含む突然変異体ＲＯＢＯ１という６つのＲＯＢＯ分子のうち１つを過剰発現するヒト胚性腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞を、滴定量の選択された抗体とインキュベートした。抗体の結合を、蛍光色素にコンジュゲートした抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２二次抗体を使用して検出し、試料を、Ｆｏｒｔｅｓｓａサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。表１５は、ヒト、カニクイザル、ラットのＲＯＢＯ２、またはＲＯＢＯ２  ＲＳＫエピトープについて、Ａｂｃｓ３５−ＪとＡｂｃｓ３５とを比較した結合親和性に有意差がなかったことを実証している。図１６Ａ〜１６Ｆは、ヒトＲＯＢＯ２（図１６Ａ）、カニクイザルＲＯＢＯ２（図１６Ｂ）、ラットＲＯＢＯ２（図１６Ｃ）、ヒトＲＯＢＯ１（図１６Ｄ）、ＲＯＢＯ２  ＲＳＫエピトープを含むＲＯＢＯ１（図１６Ｅ）、またはＲＯＢＯ１  ＫＳＲエピトープを含むＲＯＢＯ２（図１６Ｆ）に対するＡｂｃｓ３５（黒い丸印）またはＡｂｃｓ３５−Ｊ（灰色の四角印）の結合プロファイルを示す。
【０３３８】
【表２０】
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【０３３９】
Ａｂｃｓ３５と比較した、Ａｂｃｓ３５−ＪのＳＬＩＴ２活性の機能的中和を、ＳＶＺアッセイにおいて評価した。実施例２で記載したように、組織外植片を、１ｎＭのＳＬＩＴ２−Ｎの存在下で、滴定量の選択ＲＯＢＯ２特異的抗体あり、またはなしでインキュベートする。インキュベーションした後、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２で染色した。データの取得は、Ｏｐｅｒｅｔｔａ  Ｈｉｇｈ  Ｃｏｎｔｅｎｔ  Ｉｍａｇｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で行い、Ｖｏｌｏｃｉｔｙソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用した分析を使用して、移動した細胞の数を判定した。図１７で見ることができるように、Ａｂｃｓ３５−ＪとＡｂｃｓ３５との比較で、ＳＶＺａアッセイにおける細胞移動を阻害する強度に差はなかった。
【０３４０】
本発明をこうして、上記の代表的な実施形態を参照して広く開示し、説明してきた。当業者には、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な修正が本発明に対してなされ得ることが認識されよう。全ての公報、特許出願、および特許は、個々の公報、特許出願、または特許が参照することによってその全体が組み込まれることが具体的かつ個別に示されているかのごとく、参照することによって本明細書に組み込まれる。参照によって組み込まれるテキストに含まれる定義は、それらが本開示における定義と矛盾する限りにおいて排除される。
【０３４１】
明確性のために別個の実施形態の文脈で記載されている、本発明のある特定の特徴はまた、単一の実施形態において組み合わせて提供され得ることを理解されたい。逆に、簡潔性のために単一の実施形態の文脈で記載されている、本発明の様々な特徴はまた、別個に、または任意の適切な部分的組み合わせでも提供され得る。
【０３４２】
本発明の１つの実施形態に関して論じられるいかなる限定も、本発明のあらゆる他の実施形態に適用され得ることが、具体的に検討される。さらに、本発明のいかなる組成物も、本発明のあらゆる方法において使用され得、また、本発明のいかなる方法も、本発明のあらゆる組成物を生産または利用するために使用され得る。特に、単独の請求項または１つもしくは複数のさらなる請求項と組み合わせた請求項において記載されている本発明の任意の態様、および／あるいは明細書の態様は、特許請求の範囲および／または明細書および／または配列表および／または図面のいずれかの箇所で示されている本発明の他の態様と組み合わせ可能であると理解される。
【０３４３】
本明細書において見られる具体的な例が本発明の範囲に含まれない場合に限り、前記具体的な例は特許請求の範囲から明確に除外され得る。
【０３４４】
特許請求の範囲における用語「または」の使用は、代替的なもののみを指すことが明確に示されていない限り、または代替的なものが相互排他的でない限り、「および／または」を意味するために使用されるが、本開示は、代替的なもののみおよび「および／または」を指す定義をサポートする。本発明の明細書において使用する場合、「ａ」または「ａｎ」は、別段の指示が明らかにない限り、１つまたは複数を意味し得る、本発明の特許請求の範囲において使用する場合、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と組み合わせて使用する場合、語「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは２つ以上を意味し得る。本明細書において使用する場合、「別の」は、少なくとも２つめ以上を意味し得る。本明細書において別段の定義がない限り、本発明に関連して使用される科学的および技術的用語は、当業者によって一般に理解されている意味を有する。さらに、文脈により別段の要求がない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含む。語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ／ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および語「有する／含む（ｈａｖｉｎｇ／ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、本発明に関して本明細書において使用する場合、言及した特徴、整数、ステップ、または成分の存在を特定するために使用されるが、１つもしくは複数の他の特徴、整数、ステップ、成分、もしくはその群の存在または追加を排除するものではない。
【０３４５】
開示された教示を様々な適用、方法、および組成物に関して記載してきたが、様々な変更および修正が、本明細書における教示および以下の特許請求の範囲に記載される発明から逸脱することなくなされ得ることが理解されよう。例は、開示される教示をより良く説明するために提供され、本明細書において提供される教示の範囲を限定することを意図したものではない。本教示はこれらの典型的な実施形態に関して記載されているが、不要な実験を行うことなく、これらの典型的な実施形態の多くの変形および修正が可能である。全てのこのような変形および修正は、本教示の範囲内である。
【０３４６】
本発明の態様または実施形態がマーカッシュグループまたは他の代替的なグルーピングに関して記載されている場合、本発明は、列挙されているグループ全体を丸ごと包含するだけではなく、グループの各メンバーを個別に、また、メイングループの全ての考えられるサブグループ、グループメンバーの１つまたは複数が欠けているメイングループも包含する。本発明はまた、特許請求の範囲に記載される発明におけるグループメンバーのいずれかの１つまたは複数を明確に排除することも想定する。
【０３４７】
特許、特許出願、文書、テキスト本などを含む、本明細書において引用される全ての参考文献、およびその中で引用される参考文献は、それらがすでにそうされていない限りにおいて、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる。限定はしないが、定義される用語、用語の使用法、記載される技術などを含む、組み込まれる文献および類似の材料の１つまたは複数が、本願と異なるかまたは矛盾する場合には、本願が優先される。
【０３４８】
明細書および実施例は、本発明のある特定の具体的な実施形態を詳述し、本発明者らによって検討される最良の態様を説明する。しかし、いかに詳細にそれらが文中において記載されているように見えたとしても、本発明は多くの手段で実施され得るものであり、本発明は、添付の特許請求の範囲およびその任意の均等物に従って解釈されるべきであることを理解されたい。
【０３４９】
【表２１−１】
2020524988.tif 000025
【０３５０】
【表２１−２】
2020524988.tif 000026
【０３５１】
【表２１−３】
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【０３５２】
【表２１−４】
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【０３５３】
【表２１−５】
2020524988.tif 000029
【０３５４】
【表２１−６】
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【０３５５】
【表２１−７】
2020524988.tif 000031
【０３５６】
【表２１−８】
2020524988.tif 000032
【０３５７】
【表２１−９】
2020524988.tif 000033
【０３５８】
【表２１−１０】
2020524988.tif 000034
【０３５９】
【表２１−１１】
2020524988.tif 000035
【０３６０】
【表２１−１２】
2020524988.tif 000036
【０３６１】
【表２１−１３】
2020524988.tif 000037
【０３６２】
【表２２−１】
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【０３６３】
【表２２−２】
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【受託番号】
【０３６４】
ＰＴＡ−１２３２６５
ＰＴＡ−１２３７００
ＰＴＡ−１２３２６６
ＰＴＡ−１２３７０１
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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