(57)【要約】  本発明は、糖タンパク質を研究するのに有用な酵素及びその組み合わせ、並びに対応する使用方法に関する。具体的には、本発明は、追加のプロテアーゼ及び／又はグリコシダーゼ、好ましくは、Ｏ−糖タンパク質特異的エンドプロテアーゼ及び／又はＯ−グリコシダーゼを含むシアリダーゼ組成物に関する。【選択図】図１
2020522242.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むか、若しくは配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）前記配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含むか、若しくは前記配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は
（ｃ）前記配列番号２のアミノ配列の断片若しくは前記配列番号２のアミノ酸配列と８５％同一であるアミノ酸の断片であるアミノ酸配列を含むか、若しくは前記配列番号２のアミノ配列の断片若しくは前記配列番号２のアミノ酸配列と８５％同一であるアミノ酸の断片であるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
から独立して選択される第１のシアリダーゼを含む組成物であって、
任意で、前記第１のシアリダーゼが、Ｎ末端における追加のメチオニン及び／又はＣ末端におけるヒスチジンタグを含み、前記タグが、リンカーによってＣ末端に連結され得る組成物。
【請求項２】
（ｄ）配列番号５のアミノ酸配列を含むか、若しくは配列番号５のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｅ）前記配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含むか、若しくは前記配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は
（ｆ）前記配列番号５の配列の断片若しくは前記配列番号５のアミノ酸配列と８５％同一であるアミノ酸の断片であるアミノ酸配列を含むか、若しくは前記配列番号５の配列の断片若しくは前記配列番号５のアミノ酸配列と８５％同一であるアミノ酸の断片であるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
から独立して選択される第２のシアリダーゼを更に含み、
任意で、前記第２のシアリダーゼが、Ｎ末端における追加のメチオニン及び／又はＣ末端におけるヒスチジンタグを含み、前記タグが、リンカーによってＣ末端に連結され得る、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
糖タンパク質、好ましくはネイティブな非変性状態の糖タンパク質におけるシアル酸結合の９０％超を加水分解することができる、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
好ましくは１：１比で、配列番号３のアミノ酸配列からなるシアリダーゼ及び配列番号６のアミノ酸配列からなるシアリダーゼを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記第１のシアリダーゼ及び／若しくは前記第２のシアリダーゼが、高度に精製又は単離された形態で存在する；並びに／又は前記組成物中の２つ以下のポリペプチドが、アッカーマンシア・ムシニフィラから得られたシアリダーゼである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
任意で高度に精製又は単離された形態で存在する、グリコシダーゼ及び／又はプロテアーゼを更に含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記グリコシダーゼが、
ａ．配列番号９のアミノ酸配列を含むか、若しくは配列番号９のアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は
ｂ．前記配列番号９と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含むか、若しくは前記配列番号９と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
ｃ．前記配列番号９の配列の断片若しくは前記配列番号９の配列と８５％同一である配列の断片であるアミノ酸配列を含むか、若しくは前記配列番号９の配列の断片若しくは前記配列番号９の配列と８５％同一である配列の断片であるアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は
ｄ．任意でＵｎｉｐｒｏｔエントリーＢ５ＵＢ７２バージョン２２のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、大便連鎖球菌由来のＯ−グリコシダーゼ
から選択されるＯ−グリコシダーゼであり、
任意で、前記グリコシダーゼが、配列番号１０のアミノ酸配列からなる、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記プロテアーゼが、
ａ．配列番号１１のアミノ酸配列を含むか、若しくは配列番号１１のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
ｂ．前記配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含むか、若しくは前記配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は
ｃ．前記配列番号１１の配列の断片若しくは前記配列番号１１のアミノ酸配列と８５％同一である配列の断片であるアミノ酸配列を含むか、若しくは前記配列番号１１の配列の断片若しくは前記配列番号１１のアミノ酸配列と８５％同一である配列の断片であるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
から選択されるＯ−糖タンパク質特異的エンドプロテアーゼであり
任意で、前記プロテアーゼが、配列番号１２のアミノ酸配列からなる、請求項６又は７に記載の組成物。
【請求項９】
糖タンパク質を改変する方法であって、前記糖タンパク質を含有するサンプルを請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物と接触させることを含み、任意で、得られた生成物を分析する、方法。
【請求項１０】
前記分析が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ、レクチンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、又は質量分析を含む任意の好適な手段によって、前記生成物を分離及び／又は検出及び／又は単離することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記組成物が、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物であり、前記方法が、前記糖タンパク質を前記組成物と接触させる前又は後に、前記サンプルをプロテアーゼ又はグリコシダーゼと同時に接触させることを含む、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記グリコシダーゼが、Ｏ−グリコシダーゼ、任意で請求項７に記載のＯ−グリコシダーゼである、及び／又は前記プロテアーゼが、エンドプロテアーゼ、任意で請求項８に記載のエンドプロテアーゼである、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖タンパク質を研究するのに有用な酵素及びその組み合わせ、並びに対応する使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質のグリコシル化は、シグナル伝達、輸送、タンパク質分解活性からの保護、接着、炎症反応、微生物のコロニー形成等を含む、ヒトにおける多くの生理学的機能において中心的役割を果たす。タンパク質に結合しているグリカン鎖の大部分は、Ｏ結合型であろうとＮ結合型であろうと、末端シアル酸で修飾される。最も外側のグリカン又は糖タンパク質である場合、その有無は、例えば免疫グロブリンにおける炎症潜在力を含む下流の効果にとって重要であることが多い。タンパク質におけるシアル酸は、所与のタンパク質における有無及び個々の構造的変化の両方の観点で異質である。また、これらは、一般的に負に荷電しており、このことが、質量スペクトル分析を複雑にしている。これによって、糖タンパク質の研究が困難になると共に、糖タンパク質のバッチが相同な物質で機能することを確認する製造業者の能力が低下する。これらの問題を克服するために、グリカンの複雑さが低減するようにＣＨＯ細胞を遺伝的に改変する試みが行われているが、これは機能に影響を及ぼす可能性がある。化学的アプローチも使用されているが、これは、タンパク質にダメージを与えることが多い。糖タンパク質からシアル酸を除去するための別のアプローチが必要とされている。更に、シアル酸が除去されたら、残りのグリカン鎖、特にＯ結合型であるものについて研究するためのより多くのツールが必要とされている。
【発明の概要】
【０００３】
本発明は、
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むか若しくはからなるポリペプチド；
（ｂ）該配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含むか若しくはからなるポリペプチド；又は
（ｃ）該配列番号２の配列の断片若しくは該配列番号２のアミノ酸配列と８５％同一であるアミノ酸の断片であるアミノ酸配列を含むか若しくはからなるポリペプチド；
から独立して選択される第１のシアリダーゼを含む組成物であって、
任意で、該第１のシアリダーゼが、Ｎ末端における追加のメチオニン及び／又はＣ末端におけるヒスチジンタグを含み、該タグが、リンカーによってＣ末端に連結され得る組成物を提供する。
【０００４】
また、本発明は、
（ｄ）配列番号５のアミノ酸配列を含むか若しくはからなるポリペプチド；
（ｅ）該配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含むか若しくはからなるポリペプチド；又は
（ｆ）該配列番号５の配列の断片若しくは該配列番号５のアミノ酸配列と８５％同一であるアミノ酸の断片であるアミノ酸配列を含むか若しくはからなるポリペプチド；
から独立して選択される第２のシアリダーゼを更に含む、上に定義された組成物であって、
任意で、該第２のシアリダーゼが、Ｎ末端における追加のメチオニン及び／又はＣ末端におけるヒスチジンタグを含み、該タグが、リンカーによってＣ末端に連結され得る組成物を提供する。
【０００５】
組成物は、任意で高度に精製又は単離された形態で存在する、グリコシダーゼ及び／又はプロテアーゼを更に含んでいてもよい。
【０００６】
また、本発明は、糖タンパク質を改変する方法であって、
糖タンパク質を含有するサンプルを上に定義されたと接触させることを含み、任意で、得られた生成物を分析する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】アッカーマンシア（Akkermansia）シアリダーゼの発現及び精製。本明細書ではＡｍ０７０７及びＡｍ１７５７と表される４つのシアリダーゼ全てが良好に発現し、高い均質性を有するように精製することができた。値（ｍｇ／ｍＬ）は、Ｈｉｓ精製後に得られた濃度を示す。
【図２】様々なシアル酸結合に対するシアリダーゼ活性。２つのシアリダーゼ生成物（Ａｍ１７５７及びミックス（Ａｍ１７５７及びＡｍ０７０７））を３つの異なる基質（指定された３種のシアル酸結合を表す）と共に３０分間インキュベートし、その後、遊離シアル酸の量を測定した。
【図３】Ａｍ０７０７及びＡｍ１７５７にとって最適な条件を決定した。イオン、ＮａＣｌ、及びｐＨを含む、２−３シアリルラクトース基質を使用してシアリダーゼの酵素活性に影響を与える条件について調べ、１５分間インキュベートした後に遊離シアル酸を定量した。
【図４】糖タンパク質の併用シアリダーゼ処理は、単一のシアリダーゼを使用するよりも効率的である。シアリダーゼをフェチュイン０．５μｇと共に６０分間インキュベートした後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して分離した。Ｓｍｉｘは、Ａｍ０７０７及びＡｍ１７５７を両方含有し、一方、ウェルシュ菌（C. perfringens）シアリダーゼをベンチマーク比較として使用した。製造業者の指示書に従ってインキュベートしたベンチマーク生成物を除いて、全ての反応を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．８中３７℃で行った。
【図５】ＧＶＳ＿Ｓｍｉｘは、現行の市販されているシアリダーゼよりも優れている。Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ製の幾つかの既存の市販シアリダーゼ（各セットにおける最初の３つのカラム）を、ＡＭ１７５７＋Ａｍ０７０７混合物（ＧＶＳ＿Ｓｍｉｘ）、並びに個々にＡＭ１７５７及びＡｍ０７０７の酵素のそれぞれと一緒に試験した。それぞれを特定のシアリダーゼ基質（指定された３種のシアル酸結合を表す）と共に３７℃で３０分間インキュベートした後、分析した。ＦＵ（蛍光単位）は、遊離したシアル酸の量を表す。
【図６】ＧＶＳ＿Ｓｍｉｘは、フェチュインを完全にアシアリル化することができる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＳＮＡブロッティングは、Ｓｍｉｘ（ＡＭ１７５７＋Ａｍ０７０７混合物）及び２つのＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ製品（ＮＥＢ  Ａ及びＮＥＢ  Ｏ）が、フェチュインにおける２−３及び２−６のシアル酸結合を完全にアシアリル化できることを示す。２つの２−３特異的酵素Ａｍ１７５７及びＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  ＮＥＢ  Ｓは、フェチュインを完全にアシアリル化することはできなかった。
【図７】ＧＶＳ＿Ｓｍｉｘ（ＡＭ１７５７＋Ａｍ０７０７混合物；バーの最初のセット）は、３つの試験した市販製品（バーの最後の３セット）全てと同等か又はそれ以上のレベルで、ネイティブタンパク質からシアル酸を放出させた。Ａｍ１７５７酵素のみについても示す（バーの２番目のセット）。タンパク質をそのそれぞれのバッファ中でシアリダーゼと混合し、１５分間インキュベートした後、シアル酸発色バッファを添加した。全てのインキュベートを、それぞれのバッファ（ＧＶＳ＿Ｓｍｉｘについては、これは２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．８であった）中３７℃で行った。
【図８】Ｏ−グリコシダーゼの組み換え発現。（Ａ）Ｓ．オラリス（S. oralis）及びビフィズス菌（B. bifidum）由来のＯ−グリコシダーゼを発現させ、アフィニティ精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。（Ｂ）４℃で０〜６日間保存したＳ．オラリスＯ−グリコシダーゼの安定性アッセイ。
【図９Ａ】Ｏ−グリコシダーゼは、コア１、２、及び３のタイプのｐＮＰで標識されたＯ−グリカンを加水分解することができる。様々な濃度のＳ．オラリス（Ｓ．ｏ）及びビフィズス菌（Ｂ．ｂ）由来のＯ−グリコシダーゼを（Ａ）コア１、（Ｂ）コア２、及び（Ｃ）コア３のＯ−グリカンと共にインキュベートし、ｐＮＰの放出を、吸光度ＡＴ４０５ｎｍの変化として測定した。
【図９Ｂ】Ｏ−グリコシダーゼは、コア１、２、及び３のタイプのｐＮＰで標識されたＯ−グリカンを加水分解することができる。様々な濃度のＳ．オラリス（Ｓ．ｏ）及びビフィズス菌（Ｂ．ｂ）由来のＯ−グリコシダーゼを（Ａ）コア１、（Ｂ）コア２、及び（Ｃ）コア３のＯ−グリカンと共にインキュベートし、ｐＮＰの放出を、吸光度ＡＴ４０５ｎｍの変化として測定した。
【図９Ｃ】Ｏ−グリコシダーゼは、コア１、２、及び３のタイプのｐＮＰで標識されたＯ−グリカンを加水分解することができる。様々な濃度のＳ．オラリス（Ｓ．ｏ）及びビフィズス菌（Ｂ．ｂ）由来のＯ−グリコシダーゼを（Ａ）コア１、（Ｂ）コア２、及び（Ｃ）コア３のＯ−グリカンと共にインキュベートし、ｐＮＰの放出を、吸光度ＡＴ４０５ｎｍの変化として測定した。
【図１０】Ｓ．オラリスのグリコシダーゼは、ＭｇＣｌ２が補給された塩基性ｐＨにおいてより高い活性を有する。Ｏ−グリコシダーゼを、様々なｐＨ（Ａ）で、様々なイオン（Ｂ）及び様々な濃度のＭｇＣｌ２（Ｃ）と共にインキュベートして、最適バッファを決定した。
【図１１】Ｏ−グリコシダーゼ活性は、時間及び用量依存性である。ＴＮＦαＲ（１μｇ）を、対照としてＧＶＳ＿Ｓｍｉｘシアリダーゼ混合物のみと共に（ＴＮＦαＲ（Ｓｍｉｘ）と表示されたレーン）、又は図示されている様々な量のＳ．オラリス（Ｓｏ）由来のＯ−グリコシダーゼと組み合わせてＧＶＳ＿Ｓｍｉｘシアリダーゼ混合物と共に（「＋５μｇ  Ｓｏ等」）インキュベートした。表示されている添加したＯ−グリコシダーゼの量は、ナノドロップから得られた値に依拠している。しかし、断片化が原因で、実際の添加した完全長タンパク質の量は、記載の値の約１０〜２０％に近い。これらサンプルを、２ｍＭ  ＣａＣｌ２を補給したが、ＭｇＣｌ２は含まない２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０中でインキュベートした。
【図１２】Ｏ−グリコシダーゼは、調べたネイティブ糖タンパク質全てに対して作用することができる。様々なネイティブタンパク質（Ｐ）を、シアリダーゼのＧＶＳ＿Ｓｍｉｘ混合物（Ｓｍｉｘ）、並びにＳ．オラリス（Ｓｏ−ｇｌｙｋ）及びビフィズス菌（Ｂｂ−ｇｌｙｋ）由来のＯ−グリコシダーゼと共にインキュベートした。一晩インキュベートし、その後、生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
【図１３】Ｓ．オラリスのＯ−グリコシダーゼは、ネイティブ糖タンパク質に対する作用については市販製品に優る。ネイティブＴＮＦαＲを、対照としてＧＶＳ＿Ｓｍｉｘシアリダーゼ混合物のみと共に（ＴＮＦαＲ（Ｓｍｉｘ）と表示されたレーン）、又は図示されている様々な量のＳ．オラリス（Ｓｏ）由来のＯ−グリコシダーゼと組み合わせてＧＶＳ＿Ｓｍｉｘシアリダーゼ混合物と共に（「＋Ｓｏ（０．５μｇ）」等）、又は製造業者によってそれと共に供給されたシアリダーゼと組み合わせて図示されている量の市販のＯ−グリコシダーゼ（ＮＥＢ）と共に（「＋ＮＥＢ（３μＬ）」等）インキュベートした。全ての酵素を、そのそれぞれのバッファ中で１時間又は１６時間、ＴＮＦαＲと共にインキュベートした。最高用量のＳ．オラリスのグリコシダーゼ（「Ｓｏ（０．５μｇ）」）は、モル濃度において市販のＯ−グリコシダーゼ（ＮＥＢ）０．３μＬとほぼ等しい。ＮＥＢで処理されたサンプルにおける低分子量の明確なバンド（ゲルの最上部）は、添付のシアリダーゼである。
【図１４】グリカン組成は活性に影響を与える。基質をシアリダーゼ（Ｓ）及び／又はガラクトシダーゼ（Ｇ）と共にインキュベートした後、Ｏ−グリコシダーゼ（Ｓｏ）を添加し；最適なバッファ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０）中３７℃で一晩インキュベートした。
【図１５】最終生成物は競合的である。Ｏ−グリコシダーゼの酵素：基質１：４０比、並びにシアリダーゼ混合物中Ａｍ１７５７＋Ａｍ０７０７について１：４０＋１：４０の酵素基質比を使用して（３つの酵素は全て２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．８中）（Ｓｍｉｘ／Ｏ−ｇｌｙｋと表示されたレーン）、Ｓ．オラリスのＯ−グリコシダーゼの活性を、市販のＯ−グリコシダーゼ＋シアリダーゼの組み合わせ（ＮＥＢ（Ｏ−ｇｌｙｋキット）と表示されたレーン）と比較した。Ｓ．オラリスのＯ−グリコシダーゼ＋シアリダーゼミックス（「＋ＧＶＳ」）によるＴＮＦαＲからのＯ−グリカンの除去を、ＣｏｎＡ（Ｎ結合型グリカン）及びジャカリン（Ｏ結合型グリカン）、対照としての未処理ＴＮＦαＲを使用して、レクチンブロッティングで検証した。
【図１６】Ｏ−グリコシダーゼ＋シアリダーゼのバンドル（Ｓｍｉｘ／Ｏ−ｇｌｙｋ）は、多種多様な糖タンパク質に対して活性である。２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．８中その最終濃度で添加された酵素及び製剤（１：４０）を、３７℃で４時間、糖タンパク質と共にインキュベートし、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。
【図１７】特定のシアル酸結合がＯ−グリコシダーゼ活性に影響を与える。２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．８中その最終濃度で添加された酵素（Ａｍ１７５７、Ａｍ０７０７、又はＳｍｉｘ）及び製剤（１：４０）を、３７℃で１５分間〜４時間、ＴＮＦαＲと共にインキュベートし、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。
【図１８】Ｓ．オラリスのＯ−グリコシダーゼは、強力なシアリダーゼに少なくとも部分的に起因して優れている。Ｓ．オラリスのＯ−グリコシダーゼ（ＧＶＳ  Ｏ−ｇｌｙｋ）又は市販のＯ−グリコシダーゼ（ＮＥＢ  Ｏ−ｇｌｙｋ）を、ＧＶＳ＿Ｓｍｉｘシアリダーゼ混合物（ＧＶＳシアリダーゼ）又は市販のシアリダーゼ（ＮＥＢ  Ａ、ＮＥＢ  Ｓ、ＮＥＢ  Ｏ）と共にインキュベートした。適切なバッファを使用し（例えば、ＧＶＳについては２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．８）、各セットの酵素をＥｎｂｒｅｌ（エタネルセプト）と共に３７℃で４時間インキュベートした後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで生成物を分離した。
【図１９】２−３結合型シアル酸は、Ｏ−糖タンパク質特異的エンドプロテアーゼ活性（ＬＳ）の効率を制限する。糖タンパク質基質としてＥｎｂｒｅｌを使用して、ＬＳを多様なシアリダーゼのセットと共に３０分間〜２０時間同時にインキュベートしたところ、２−３特異的シアルジアーゼ（sialdiase）１７５７の存在下では又はミックス（０７０７＋１７５７）を用いるとより効率が高くなることが明らかになったが、広域スペクトルシアリダーゼ０７０７は、一見したところＬＳの完全活性に必須ではないので、このことは、２−６（及び２−８）結合がＬＳ活性に関係がないことを示唆している。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
配列の簡単な説明
配列番号１、２、及び３は、それぞれ、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）から単離されたシアリダーゼのアミノ酸配列である。配列番号１は、Ｎ末端にシグナルモチーフを含む野生型配列である。配列番号２は、シグナルモチーフが除去された野生型配列である。配列番号３は、追加のＮ末端メチオニン及びＣ末端リンカー＋Ｈｉｓ６タグを含むことを除いて配列番号２と同一である。配列番号２の配列を含む任意の配列（配列番号１〜３のそれぞれを含む）を本明細書ではＡｍ０７０７と称する場合もある。
【０００９】
配列番号４、５、及び６は、それぞれ、アッカーマンシア・ムシニフィラから単離された別のシアリダーゼのアミノ酸配列である。配列番号４は、Ｎ末端にシグナルモチーフを含む野生型配列である。配列番号５は、シグナルモチーフが除去された野生型配列である。配列番号６は、追加のＮ末端メチオニン及びＣ末端リンカー＋Ｈｉｓ６タグを含むことを除いて配列番号５と同一である。配列番号５の配列を含む任意の配列（配列番号４〜６のそれぞれを含む）を本明細書ではＡｍ１７５７と称する場合もある。
【００１０】
配列番号８、９、及び１０は、それぞれ、Ｓ．オラリスから単離されたシアリダーゼのアミノ酸配列である。配列番号７は、Ｎ末端にシグナルモチーフ、そして、Ｃ末端にＬＰＸＴＧ壁アンカーモチーフを含む野生型配列である。配列番号８は、シグナルモチーフが除去された野生型配列である。配列番号９は、シグナルモチーフ及び壁アンカーモチーフが除去された野生型配列である。配列番号１０は、追加のＮ末端メチオニン及びＣ末端リンカー＋Ｈｉｓ６タグを含むことを除いて配列番号９と同一である。配列番号９の配列を含む任意の配列（配列番号７〜１０のそれぞれを含む）を本明細書では「Ｏ−ｇｌｙｋ」又は「Ｓｏ」と称する場合もある。
【００１１】
配列番号１１は、Ｏ−糖タンパク質特異的エンドプロテアーゼのアミノ酸配列である。
【００１２】
配列番号１２は、Ｏ−糖タンパク質特異的エンドプロテアーゼ活性を有する例示的なポリペプチドのアミノ酸配列である。配列番号１１と比べて、これは、追加のＮ末端メチオニン及びＣ末端リンカー＋Ｈｉｓ６タグを含む。この配列からなるポリペプチドを本明細書ではＬＳと称する場合もある。
【００１３】
配列番号１３は、配列番号１０のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしている例示的な核酸配列である。
【００１４】
発明の詳細な説明
開示される生成物及び方法の様々な用途は、当技術分野における具体的なニーズに応じて調整できることを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、本発明の特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定を意図するものではないことも理解されたい。上記であろうと下記であろうと、本明細書に引用される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００１５】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、特に明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。従って、例えば、「ポリペプチド（a polypeptide）」に対する言及は、「複数のポリペプチド（polypeptides）」等を含む。
【００１６】
本明細書は、特に、シアリダーゼ、Ｏ−グリコシダーゼ、及びＯ−糖タンパク質特異的エンドプロテアーゼであるポリペプチドに関連する。従って、ポリペプチドという用語の一般的使用をこれら種類の酵素のそれぞれに適用することができる。
【００１７】
一般的なポリペプチドの特徴
「ポリペプチド」は、本明細書では、２つ以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸アナログ、又は他のペプチドミメティックの化合物を指すために、その最も広い意味で使用される。従って、用語「ポリペプチド」は、短いペプチド配列を含み、より長いポリペプチド及びタンパク質も含む。用語「タンパク質」、「ペプチド」、及び「ポリペプチド」は、互換的に使用することができる。本明細書で使用するとき、用語「アミノ酸」とは、Ｄ型又はＬ型の光学異性体の両方を含む、天然及び／又は非天然、すなわち、合成のアミノ酸、並びにアミノ酸アナログ、及びペプチドミメティックを指す。
【００１８】
ポリペプチドは、組み換え法又は合成法を含む好適な方法によって生成され得る。例えば、ポリペプチドは、Ｆｍｏｃ固相化学、Ｂｏｃ固相化学、又は液相ペプチド合成等の、当技術分野において公知の標準的な方法を使用して直接合成することができる。あるいは、ポリペプチドは、細胞、典型的には細菌細胞を、該ポリペプチドをコードしている核酸分子又はベクターで形質転換することによって生成することもできる。細菌宿主細胞における発現によるポリペプチドの生成については、以下に記載し、実施例に例示する。本発明は、本発明のポリペプチドをコードしている核酸分子及びベクターを提供する。また、本発明は、このような核酸又はベクターを含む宿主細胞を提供する。本明細書に開示されるポリペプチドをコードしている例示的なポリヌクレオチド分子を配列番号１３として提供する。この配列は、３’末端にＮ末端メチオニン（ＡＴＧ）のコドンを、そして、５’末端の終止コドン（ＴＡＡ）の前にＧＳＧＬＥリンカー及び６×Ｈｉｓタグのコドンを含むが、これらは任意で除外されてもよい。追加のメチオニン及びタグを任意で含めることについては、以下により詳細に論じる。
【００１９】
用語「核酸分子」及び「ポリヌクレオチド」は、本明細書では互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチド又はこれらのアナログのいずれかである、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドの非限定的な例は、遺伝子、遺伝子断片、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ｃＤＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマーを含む。本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードしており、単離又は実質的に単離された形態で提供され得る。実質的に単離されたとは、任意の周囲媒体からポリペプチドが完全にではないがかなりの割合単離され得ることを意味する。ポリヌクレオチドは、その意図する用途に干渉しない担体又は希釈剤と混合されてもよく、それでもなお実質的に単離されたとみなされ得る。選択されたポリペプチドを「コードしている」核酸配列は、例えば発現ベクターにおいて適切な調節配列の制御下におかれたとき、インビボでポリペプチドに転写（ＤＮＡの場合）及び翻訳（ｍＲＮＡの場合）される核酸分子である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端における開始コドン及び３’（カルボキシ）末端における翻訳終止コドンによって決定される。本発明の目的のために、このような核酸配列は、ウイルス由来のｃＤＮＡ、原核生物又は真核生物のｍＲＮＡ、ウイルス又は原核生物のＤＮＡ又はＲＮＡ由来のゲノム配列、及び更には合成ＤＮＡ配列を含んでいてよいが、これらに限定されない。転写終結配列は、コード配列の３’側に位置していてよい。
【００２０】
ポリヌクレオチドは、一例としてＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）に記載されている通り、当技術分野において周知の方法に従って合成することができる。本発明の核酸分子は、挿入された配列に動作可能に連結され、それによって、インビボで本発明のポリペプチドを発現することができる制御配列を含む発現カセットの形態で提供され得る。次に、これら発現カセットは、典型的には、ベクター（例えば、プラスミド又は組み換えウイルスベクター）内に提供される。このような発現カセットを宿主被験体に直接投与してもよい。あるいは、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを宿主被験体に投与してもよい。好ましくは、遺伝子ベクターを使用してポリヌクレオチドを調製及び／又は投与する。好適なベクターは、十分な量の遺伝情報を保有し、本発明のポリペプチドを発現することができる任意のベクターであってよい。
【００２１】
従って、本発明は、このようなポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む。このような発現ベクターは、分子生物学の技術分野においてルーチン的に構築され、例えば、本発明のペプチドを発現させるために、プラスミドＤＮＡ、並びに適切なイニシエータ、プロモータ、エンハンサ、及び他のエレメント、例えば、必要になる場合がありかつ正確な配向で配置されたポリアデニル化シグナルの使用を伴っていてよい。他の好適なベクターは、当業者には明らかであろう。これに関する更なる例として、Ｓａｍｂｒｏｏｋらを参照する。
【００２２】
また、本発明は、本発明のポリペプチドを発現するように改変された細胞を含む。このような細胞は、典型的には、原核細胞、例えば大腸菌（E. coli）等の細菌細胞を含む。このような細胞は、本発明のポリペプチドを生成するための常法を使用して培養してよい。
【００２３】
ポリペプチドの生成、単離、又は精製を支援するために、該ポリペプチドを誘導体化又は改変してもよい。例えば、本発明のポリペプチドが細菌宿主細胞における組み換え発現によって生成される場合、ポリペプチドの配列は、発現を改善するためにＮ末端に追加のメチオニン（Ｍ）残基を含んでいてよい。別の例として、分離手段に直接かつ特異的に結合することができるリガンドを付加することによって、本発明のポリペプチドを誘導体化又は改変してもよい。あるいは、結合対の一方のメンバーを付加することによってポリペプチドを誘導体化又は改変してもよく、分離手段は、結合対の他方のメンバーを付加することによって誘導体化又は改変された試薬を含む。任意の好適な結合対を使用してよい。本発明において使用するためのポリペプチドが結合対の一方のメンバーの付加によって誘導体化又は改変される好ましい実施形態では、ポリペプチドは、好ましくは、ヒスチジンでタグ付けされるか又はビオチンでタグ付けされる。典型的には、ヒスチジン又はビオチンのタグのアミノ酸コード配列は遺伝子レベルで含まれ、ポリペプチドは大腸菌において組み換え的に発現する。ヒスチジン又はビオチンのタグは、典型的には、ポリペプチドのいずれかの末端、好ましくはＣ末端に存在する。該タグは、ポリペプチドに直接連結されてもよく、任意の好適なリンカー配列、例えば、３個、４個、若しくは５個のアミノ酸によって間接的に連結されてもよい。リンカーは、典型的には、主に、グリシン及びセリンの残基からなっていてよい。ヒスチジンタグは、典型的には６個のヒスチジン残基からなるが、典型的には最大７アミノ酸、最大８アミノ酸、最大９アミノ酸、最大１０アミノ酸、又は最大２０アミノ酸だけこれよりも長くてもよく、例えば５アミノ酸、４アミノ酸、３アミノ酸、２アミノ酸、又は１アミノ酸だけこれよりも短くてもよい。
【００２４】
ポリペプチドは、実質的に単離又は精製された形態で提供されてもよい。すなわち、ポリペプチドが発現した細胞からの細胞抽出物中に存在する他の成分の大部分から単離されている。実質的に精製されたとは、ポリペプチドが、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は好ましくは少なくとも９０％均質になるまで精製されたと理解される。純度レベルは、任意の好適な手段によって評価することができるが、典型的には、サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に続いてクマシーブルー検出を含む。ポリペプチドは、該ポリペプチドの意図する目的に干渉しない担体、希釈剤、又は保存剤と混合されてもよく、それでもなお実質的に単離又は精製されたとみなされ得る。ポリペプチドが追加の活性成分、例えば別のポリペプチドと共に組成物で提供される場合、各該ポリペプチドは、それぞれの意図する目的に適切な比で混合される前に、高レベルの均質性になるまで個々に精製される。例えば、２つのポリペプチドは、１：１比で組み合わせられる前に、少なくとも９０％均質になるまでそれぞれ精製され得る。
【００２５】
ポリペプチド（又はその混合物）は、使用前に水溶液で再構成するのに好適な、凍結乾燥された形態で提供されてもよい。凍結乾燥組成物は改善された安定性を有するので、ポリペプチドをより長く貯蔵することが可能になる。凍結乾燥された形態のポリペプチド（又はその混合物）を調製する方法であって、好適なバッファ、例えば、Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）中で該ポリペプチド（又は混合物）をフリーズドライすることを含む方法が、本明細書に提供される。ポリペプチドは、典型的には、フリーズドライ前に実質的に精製される。得られる凍結乾燥された形態のポリペプチド（又は混合物）も提供される。ポリペプチド（又は混合物）の溶液を調製する方法であって、凍結乾燥された形態の該ポリペプチド（又は混合物）を提供することと、好適な担体又は希釈剤、例えば水で再構成することとを含む方法も提供される。
【００２６】
ポリペプチドは、当技術分野において公知の方法を使用して、例えば、Ｄａｔｔａ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｚｙｍｅ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ：ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  ｓｕｐｐｏｒｔ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ，３  Ｂｉｏｔｅｃｈ，３（１）：１−９（２０１３）に記載の通り固定化することができる。例えば、ポリペプチドは、吸着、共有結合、親和性固定化、又は封入によって固定化してよい。支持体として使用することができる材料は、例えば、アガロース、コラーゲン、ゼラチン、セルロース、ペクチン、セファロース等の天然支持体、セラミック、シリカ、ガラス、活性炭、若しくは炭等の無機材料、又は合成ポリマーを含むが、これらに限定されない。例えば、ポリペプチドをセファロース上に固定してもよい。
【００２７】
シアリダーゼ
機能的特徴
グリカン鎖を改変するために化学的及び遺伝的アプローチを使用することに加えて、幾つかの酵素（グリコシダーゼ）は、シアル酸を他のグリカンに結合させる結合に対して作用することができる。シアリダーゼ又はノイラミニダーゼと呼ばれるこれら酵素は、特定の種類のシアル酸結合に対して高度の特異性を示す。ヒト糖タンパク質内には一般的に３つの異なる結合タイプがみられるが、アルファ（２−３）結合が主要な形態であり、続いて、アルファ（２−６）及びアルファ（２−８）である。本明細書では、簡略化するために、これら結合タイプを２−３、２−６、及び２−８の結合と称する場合もある。２−３結合は、シアル酸六炭糖の位置番号２における炭素原子が、酸素原子を介して、結合するグリカンの六炭糖の３位における炭素に結合することを意味する。対応して、２−６結合又は２−８結合は、それぞれ、結合するグリカンの六炭糖の６位又は８位に結合することを意味する。
【００２８】
大部分の公知のシアリダーゼは、２−３結合に特異的である（それを非常に高い活性で切断する）か、又はより広い範囲の結合、典型的には２−３、２−６、及び２−８の結合の全てを切断することができる。これら異なる種類のシアリダーゼを、それぞれ、狭域スペクトル又は広域スペクトルと称する場合もある。広域スペクトルシアリダーゼは、典型的には、２−３結合に対して高い活性を示し、２−６結合に対しては活性が低下し、そして、２−８結合に対する活性は非常に低い。２−８結合を効率的に切断する酵素は、当該分野において比較的稀である（更に言えば知られていない）。
【００２９】
シアリダーゼの酵素活性は、実施例に記載するもの等の任意の好適な方法によって評価することができる。好適な方法は、公知のシアリダーゼ又はシアリダーゼと思われるものを、全体では２−３、２−６、及び２−８型の結合を含む１つ以上の低分子等の標準的なシアリダーゼ基質と共にインキュベートすることを含んでいてよい。このような低分子は、２−３’−シアリルラクトース、２−６’−シアリルラクトース、及びコロミン酸（２−８’）を含む。このような分子に対するシアリダーゼ活性によって遊離シアル酸が生じ、これは、常法によって定量することができる。あるいは、基質として糖タンパク質を使用してシアリダーゼ活性を評価することもできる。任意の得られる切断生成物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ又はレクチンブロット等の常法を使用して検出及び定量することができる。
【００３０】
構造的特徴
本発明者らは、共生腸内細菌アッカーマンシア・ムシニフィラから幾つかのシアリダーゼを同定し、特性評価した。本明細書ではＡｍ０７０７と称されるシアリダーゼのうちの１つは、予想外なことに、２−８結合に対して高い活性を有するが、２−３及び２−６の結合も切断することができる。従って、広域スペクトルシアリダーゼであるとみなすことができる。本明細書ではＡｍ１７５７と称される別のシアリダーゼは、２−３結合に対してのみ高い活性を有する。従って、狭域スペクトルシアリダーゼであるとみなすことができる。
【００３１】
第１のシアリダーゼ（Ａｍ０７０７）の完全野生型一次構造（アミノ酸配列）を配列番号１に示す。シグナルモチーフを除去した配列を配列番号２に示す。第１のシアリダーゼは、配列番号２の配列を含んでいてもよく、から本質的になっていてもよく、からなっていてもよく、典型的には、４００アミノ酸以下である。
【００３２】
第２のシアリダーゼ（Ａｍ１７５７）の完全野生型一次構造（アミノ酸配列）を配列番号４に示す。シグナルモチーフを除去した配列を配列番号５に示す。第２のシアリダーゼは、配列番号５の配列を含んでいてもよく、から本質的になっていてもよく、からなっていてもよく、典型的には、６００アミノ酸以下である。
【００３３】
あるいは、該第１及び／又は該第２のシアリダーゼは、それぞれ独立して、酵素活性が保持されている限り、そのそれぞれの変異体によって置換されてもよい。該シアリダーゼの変異体は、それぞれ、配列番号２又は５の配列のアミノ酸配列と少なくとも５０％同一である、該アミノ酸配列の変異体を含んでいてもよく、から本質的になっていてもよく、からなっていてもよい。変異体配列は、該アミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であってよい。同一性レベルは、好ましくは、少なくとも８５％以上である。ある配列に対する同一性は、該配列の少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、若しくは少なくとも５００、若しくはそれ以上の連続するアミノ酸の領域にわたって測定してもよく、より好ましくは該配列の完全長にわたって測定してもよい。変異体は、典型的には、参照配列よりも５０アミノ酸以下長いか又は短い長さであり、好ましくは、参照配列とほぼ（又は正確に）同じ長さである。
【００３４】
アミノ酸の同一性は、任意の好適なアルゴリズムを使用して計算することができる。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．Ｆ．（１９９３）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｖｏｌ  ３６：２９０−３００；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ，Ｆ  ｅｔ  ａｌ（１９９０）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３−１０に記載の通り、ＰＩＬＥＵＰ及びＢＬＡＳＴのアルゴリズムを使用して、同一性を計算するか又は配列を並べることができる（典型的には、そのデフォルト設定で）等価な又は対応する配列を同定する等）。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通して公的に入手可能である。このアルゴリズムは、まず、データベース配列における同じ長さのワードとアラインメントしたときに幾つかの正の値の閾値スコアＴに一致するか又は満たす、クエリー配列における長さＷの短いワードを同定することによって、高スコア配列対（ＨＳＰ）を同定することを含む。Ｔは、近傍ワードスコア閾値（neighbourhood word score threshold）と称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ、上記）。これら初期近傍ワードヒットは、それを含有するＨＳＰを見つけるための検索を始めるためのシードとして作用する。累積アラインメントスコアが増加し得る限り、ワードヒットを各配列に沿って両方向に拡張する。各方向におけるワードヒットの拡張は、累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ減少したとき；１つ以上の負のスコアの残基アラインメントの累積に起因して累積スコアがゼロ以下になったとき；又はいずれかの配列の末端に達したときに停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、及びＸが、アラインメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５−１０９１９を参照されたい）アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、及び両鎖の比較を使用する。
【００３５】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計的解析を実施する；例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７を参照されたい。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は最小和確率（the smallest sum probability）（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのポリヌクレオチド又はアミノ酸の配列間の一致が偶然生じる確率の指標を提供する。例えば、第１の配列の第２の配列に対する比較における最小和確率が約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、ある配列が別の配列と類似しているとみなされる。あるいは、ＵＷＧＣＧパッケージは、同一性を計算するために使用することができる（例えば、そのデフォルト設定で使用される）ＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２，３８７−３９５）。
【００３６】
シアリダーゼの配列は、それぞれの配列番号の配列と比べて改変、例えば、アミノ酸の付加、欠失、又は置換が行われた、該配列番号の変異体を含んでいてよい。特に指定しない限り、改変は、好ましくは、保存的アミノ酸置換である。保存的置換は、アミノ酸を類似の化学的構造、類似の化学的特性、又は類似の側鎖体積の他のアミノ酸に置き換える。導入されるアミノ酸は、置き換えられるアミノ酸と類似の極性、親水性、疎水性、塩基性、酸性、中性、又は電荷を有していてよい。あるいは、保存的置換は、既存の芳香族又は脂肪族のアミノ酸の代わりに、芳香族又は脂肪族の別のアミノ酸を導入してもよい。保存的アミノ酸変化は当技術分野において周知であり、以下の表Ａ１に定義する２０種の主なアミノ酸の特性に従って選択してよい。アミノ酸が類似の極性を有する場合、これは、表Ａ２中のアミノ酸側鎖のヒドロパシースケールを参照することによって決定することができる。本発明のシアリダーゼの配列は、１０個以下、２０個以下、３０個以下、４０個以下、５０個以下、又は６０個以下の保存的置換が行われたそれぞれの配列番号の変異体を含んでいてよい。
【００３７】
【表１】
2020522242.tif 000003
【００３８】
【表２】
2020522242.tif 000004
【００３９】
あるいは、シアリダーゼは、上記の通り、それぞれの配列番号又はその変異体のより短い断片によって置換されてもよい。断片は、酵素活性を保持している、切断された形態の該配列番号であると説明することができる。このような断片は、対応する配列番号よりも短く、典型的には、少なくとも１００アミノ酸長、少なくとも１５０アミノ酸長、少なくとも２００アミノ酸長、少なくとも２５０アミノ酸長、少なくとも３００アミノ酸長、少なくとも３５０アミノ酸長、少なくとも４００アミノ酸長、少なくとも４５０アミノ酸長、又は少なくとも５００アミノ酸長である。
【００４０】
本明細書に記載される任意のシアリダーゼは、任意で、Ｎ末端における追加のメチオニン及び／又はＣ末端におけるヒスチジン若しくは他のタグを含んでいてもよい。このような追加の配列は、発現及び／又は精製に役立ち得る。ヒスチジンタグは、好ましくは、６個のヒスチジン残基からなる。ヒスチジンタグは、好ましくは、典型的にはアミノ酸の短い配列、例えば３〜５個のアミノ酸であるリンカーによってＣ末端に連結される。リンカーは、典型的には、主にグリシン及びセリンの残基からなり、好ましくは、配列ＧＳＧを含んでいてよい。例えば、ＧＳＧ及びＧＳＧＬＥが好適なリンカーである。
【００４１】
従って、まとめると、第１のシアリダーゼは、
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むか若しくはからなるポリペプチド；
（ｂ）該配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含むか若しくはからなるポリペプチド；又は
（ｃ）該配列番号２の配列の断片若しくは該配列番号２のアミノ酸配列と８５％同一であるアミノ酸の断片であるアミノ酸配列を含むか若しくはからなるポリペプチド；
であり、第２のシアリダーゼは、
（ｄ）配列番号５のアミノ酸配列を含むか若しくはからなるポリペプチド；
（ｅ）該配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含むか若しくはからなるポリペプチド；又は
（ｆ）該配列番号５の配列の断片若しくは該配列番号５のアミノ酸配列と８５％同一であるアミノ酸の断片であるアミノ酸配列を含むか若しくはからなるポリペプチド；
であり、
任意で、該第１及び／又は該第２のシアリダーゼは、Ｎ末端における追加のメチオニン及び／又はＣ末端におけるヒスチジンタグを含み、該タグは、リンカーによってＣ末端に連結され得る。
【００４２】
例示的な第１のシアリダーゼは、配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。例示的な第２のシアリダーゼは、配列番号６のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
【００４３】
シアリダーゼ組成物
シアリダーゼ組成物は、好ましくは実質的に単離又は精製された形態の、少なくとも１つのシアリダーゼを含む。上記ポリペプチドに関する一般的な記載のように、これは、典型的には、シアリダーゼが発現した細胞からの細胞抽出物中に存在する他の成分の大部分から単離されていることを意味する。実質的に精製されたとは、シアリダーゼが、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は好ましくは少なくとも９０％均質になるまで精製されたと理解される。純度レベルは、任意の好適な手段によって評価することができるが、典型的には、サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に続いてクマシーブルー検出を含む。シアリダーゼは、該シアリダーゼの意図する目的に干渉しない担体、希釈剤、又は保存剤と混合されてもよく、それでもなお実質的に単離又は精製されたとみなされ得る。シアリダーゼ組成物は、追加の活性成分、例えば、別のシアリダーゼ又は別の酵素を含んでいてもよく、この場合、各該成分は、それぞれの意図する目的に適切な比で混合される前に、高レベルの均質性になるまで個々に精製される。本発明の好ましいシアリダーゼ組成物では、該組成物は、少なくとも９０％均質になるまでそれぞれ精製され、互いに対して１：１比で存在する、第１のシアリダーゼ及び第２のシアリダーゼを含む。このような組成物は、追加の活性成分、例えば、シアリダーゼではない別の酵素を含んでいてもよい。他の酵素は、プロテアーゼ及び／又はグリコシダーゼであってよい。プロテアーゼは、好ましくは、Ｏ−糖タンパク質特異的エンドプロテアーゼである。グリコシダーゼは、好ましくは、Ｏ−グリコシダーゼである。両方の種類の酵素については、以下でより詳細に論じる。
【００４４】
シアリダーゼ組成物がシアリダーゼではない活性成分を含む場合、他の酵素に対する合計シアリダーゼ含量（例えば、第１＋第２のシアリダーゼ）の好ましい比は１：１である。例えば、組成物が２０００ユニットの別の酵素を含む場合、該組成物は２０００ユニットのシアリダーゼも含み、２つのシアリダーゼが存在する場合、該２０００ユニットは、１０００ユニットの第１のシアリダーゼ及び１０００ユニットの第２のシアリダーゼを含む。
【００４５】
シアリダーゼ組成物は（一般にポリペプチドと同様に）、使用前に水溶液で再構成するのに好適な、凍結乾燥された形態で提供されてもよい。凍結乾燥組成物は改善された安定性を有するので、シアリダーゼ（複数可）をより長く貯蔵することが可能になる。凍結乾燥された形態のシアリダーゼ組成物を調製する方法であって、好適なバッファ、例えば、Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）中で１つ以上のシアリダーゼをフリーズドライすることを含む方法が、本明細書に提供される。バッファは、好ましくは、典型的には３００ｍＭ以下、２５０ｍＭ以下、２００ｍＭ以下、又は１５０ｍＭ以下の低濃度のＮａＣｌを含む。ＮａＣｌ濃度は、好ましくは、約１５０ｍＭ、例えば１２５ｍＭ〜１７５ｍＭである。シアリダーゼは、典型的には、フリーズドライ前に実質的に精製される。得られる凍結乾燥された形態の組成物も提供される。溶液であるシアリダーゼ組成物を調製する方法であって、凍結乾燥された形態の該組成物を提供することと、好適な担体又は希釈剤、例えば水で再構成することとを含む方法も提供される。
【００４６】
第１のシアリダーゼが、珍しいことに、２−８結合に対して高い活性を有することが、本発明者らによって判明した。従って、本発明は、
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むか若しくはからなるポリペプチド；
（ｂ）該配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含むか若しくはからなるポリペプチド；又は
（ｃ）該配列番号２の配列の断片若しくは該配列番号２のアミノ酸配列と８５％同一であるアミノ酸の断片であるアミノ酸配列を含むか若しくはからなるポリペプチド；
から独立して選択される第１のシアリダーゼを含む組成物であって、
任意で、該第１のシアリダーゼが、Ｎ末端における追加のメチオニン及び／又はＣ末端におけるヒスチジンタグを含み、該タグが、リンカーによってＣ末端に連結され得る組成物を提供する。
【００４７】
該組成物は、好ましくは高い効率で、２−８シアル酸結合を切断する方法において使用するためのものであってよい。このような組成物の例は、配列番号３のアミノ酸配列からなるシアリダーゼを含む。
【００４８】
また、第１のシアリダーゼ（Ａｍ０７０７）及び第２のシアリダーゼ（Ａｍ１７５７）の組み合わせが、珍しいことに高い効率で２−３、２−６、及び２−８の結合を加水分解し、それによって、任意の糖タンパク質のシアル酸の実質的に全て（典型的には、＞９０％）を効率的に除去できることが、本発明者らによって判明した。また、組み合わせは、驚くべきことに、ネイティブ（すなわち、変性していない）状態の糖タンパク質に対しても有効である。従って、本発明は、第１のシアリダーゼを含む上記組成物であって、
（ｄ）配列番号５のアミノ酸配列を含むか若しくはからなるポリペプチド；
（ｅ）該配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含むか若しくはからなるポリペプチド；又は
（ｆ）該配列番号５の配列の断片若しくは該配列番号５のアミノ酸配列と８５％同一であるアミノ酸の断片であるアミノ酸配列を含むか若しくはからなるポリペプチド；
から独立して選択される第２のシアリダーゼを更に含み、
任意で、該第２のシアリダーゼが、Ｎ末端における追加のメチオニン及び／又はＣ末端におけるヒスチジンタグを含み、該タグが、リンカーによってＣ末端に連結され得る組成物を提供する。第１及び第２のシアリダーゼは、好ましくは、互いに対して１：１比で存在していてよい。
【００４９】
該組成物は、好ましくは高い効率で、糖タンパク質を完全にアシアリル化するか、又は糖タンパク質におけるシアル酸結合の＞９０％（９０％超）を切断する方法において使用するためのものであってよい。糖タンパク質は、好ましくは、ネイティブ状態である。すなわち、いかなる形態の変性条件にも曝されたことがない。
【００５０】
本発明のシアリダーゼ組成物の例は、好ましくは１：１比で、配列番号３のアミノ酸配列からなるシアリダーゼ及び配列番号６のアミノ酸配列からなるシアリダーゼを含む。
【００５１】
シアリダーゼ組成物のシアリダーゼ活性は、個々のシアリダーゼについて、上記と同じ方法を使用して評価することができる。しかし、好ましくは、基質として非変性糖タンパク質を使用して評価される。この結果を、基質を例示的なシアリダーゼ又はその混合物、例えば、配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号６のアミノ酸配列からなるポリペプチドとの１：１混合物等と接触させたときに同じアッセイで得られた結果と比較してよい。このようなシアリダーゼ混合物１ユニットは、典型的には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってモニタリングしたとき、３７℃で２時間、３７℃の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ６．８中でインキュベートしたときに糖タンパク質（フェチュイン）１μｇのうちの≧９０％からシアル酸を加水分解するのに必要な量である。これは、高効率を表すとみなされる。
【００５２】
Ｏ−グリコシダーゼ
また、本発明者らは、特に上記シアリダーゼ組成物と組み合わせて使用したときにＯ結合型グリカンを効率的に加水分解する、哺乳類の口道に存在する共生細菌ストレプトコッカス・オラリス由来のＯ−グリコシダーゼを同定し、特性評価した。Ｏ−グリコシダーゼは、本明細書では「Ｏ−ｇｌｙｋ」又は「Ｓｏ」と称される場合もある。シグナル配列及びＬＰＴＸＧ細胞壁アンカーモチーフを含むＯ−ｇｌｙｋの野生型配列を、配列番号７として提供する。シグナル配列を欠いているＯ−ｇｌｙｋの野生型配列を、配列番号８として提供する。シグナル配列及び細胞壁アンカーモチーフのＣ末端部を欠いているＯ−ｇｌｙｋの野生型配列を、配列番号９として提供する。Ｎ末端における追加のメチオニン及び／又はＣ末端におけるヒスチジン若しくは他のタグを含めるために、これら配列を任意で改変してもよい。このような追加の配列は、（例えば、大腸菌における）発現及び／又は精製に役立ち得る。ヒスチジンタグは、好ましくは、６個のヒスチジン残基からなる。ヒスチジンタグは、好ましくは、典型的にはアミノ酸の短い配列、例えば３〜５個のアミノ酸であるリンカーによってＣ末端に連結される。リンカーは、典型的には、主にグリシン及びセリンの残基からなり、好ましくは、配列ＧＳＧを含んでいてよい。例えば、ＧＳＧ及びＧＳＧＬＥが好適なリンカーである。Ｎ末端に追加のメチオニン、そして、Ｃ末端にＧＳＧＬＥリンカー及びＨｉｓ６タグを有する例示的なＯ−ｇｌｙｋ配列を、配列番号１０として提供する。本開示における「Ｏ−ｇｌｙｋ」又は「Ｓｏ」に対する任意の言及は、配列番号７、８、９、又は１０のいずれをも意味し得るが、好ましくは、配列番号９のアミノ酸配列を含むか又はからなり、典型的には、２０７０アミノ酸以下であるポリペプチドを指す。最も好ましいのは、配列番号１０のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
【００５３】
また、本発明者らは、上記シアリダーゼ組成物の作用が他のＯ−グリコシダーゼの活性も増強することを見出した。従って、本発明は、また、糖タンパク質を改変する方法であって、糖タンパク質のサンプルを、上記シアリダーゼ組成物及びＯ−グリコシダーゼの両方と接触させることを含む方法を提供する。また、本発明は、任意でＯ−グリコシダーゼも含む、上記シアリダーゼ組成物を提供する。該方法及び該組成物では、該Ｏ−グリコシダーゼは、配列番号９のアミノ酸配列を含んでいてもよく、からなっていてもよく、又は任意の他のＯ−グリコシダーゼ、例えば、大便連鎖球菌（Enterococcus faecalis）等の腸内細菌から得られる酵素であってもよい。大便連鎖球菌由来の好ましいＯ−グリコシダーゼは、ＵｎｉｐｒｏｔエントリーＢ５ＵＢ７２バージョン２２のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。他の好適なＯ−グリコシダーゼは、国際公開第２００９１２９０８６号に記載されているもの、特に、国際公開第２００９１２９０８６号の７ページに記載され、図５に示されている通りのＥｎｇＥＦ、ＥｎｇＰＡ、及び切断型ＥｎｇＡＡを含む。
【００５４】
本明細書における開示のいずれかでは、酵素活性が保持されている限り、配列番号９の配列を含むＯ−グリコシダーゼをその変異体によって置換してもよい。Ｏ−グリコシダーゼの変異体は、配列番号９の配列のアミノ酸配列の変異体を含んでいてもよく、から本質的になっていてもよく、からなっていてもよい。該配列番号の変異体は、保持されるべき関連する酵素活性がＯ−グリカンに対する加水分解活性であることを除いて、シアリダーゼに関して上に記載した通り定義され得る。
【００５５】
あるいは、Ｏ−グリコシダーゼは、上記の通り、配列番号９又はその変異体のより短い断片によって置換されてもよい。断片は、酵素活性を保持している、切断された形態の該配列番号であると説明することができる。このような断片は、配列番号３よりも短く、典型的には、少なくとも３００アミノ酸長、少なくとも４００アミノ酸長、少なくとも５００アミノ酸長、少なくとも６００アミノ酸長、少なくとも８００アミノ酸長、少なくとも１０００アミノ酸長、少なくとも１２００アミノ酸長、少なくとも１３００アミノ酸長、少なくとも１４００アミノ酸長、又は少なくとも１５００アミノ酸長である。
【００５６】
本明細書に記載される任意のＯ−グリコシダーゼは、任意で、Ｎ末端における追加のメチオニン及び／又はＣ末端におけるヒスチジン若しくは他のタグを含んでいてもよい。このような追加の配列は、発現及び／又は精製に役立ち得る。ヒスチジンタグは、好ましくは、６個のヒスチジン残基からなる。ヒスチジンタグは、好ましくは、典型的にはアミノ酸の短い配列、例えば３〜５個のアミノ酸であるリンカーによってＣ末端に連結される。リンカーは、典型的には、主にグリシン及びセリンの残基からなり、好ましくは、配列ＧＳＧを含んでいてよい。例えば、ＧＳＧ及びＧＳＧＬＥが好適なリンカーである。この種の例示的なＯ−グリコシダーゼは、配列番号１０のアミノ酸配列からなる。
【００５７】
Ｏ−グリコシダーゼの酵素活性は、実施例に記載するもの等の任意の好適な方法によって評価することができる。好適な方法は、公知のＯ−グリコシダーゼ又はＯ−グリコシダーゼと思われるものを、全体ではＯ−グリカンコア領域を含む１つ以上の低分子等の標準的な基質と共にインキュベートすることを含んでいてよい。このような低分子は、４−メチルウンベリフェロン（４ＭＵ）基質及びｐＮＰ基質を含み、ｐＮＰの放出が活性を示す。あるいは、活性は、基質として糖タンパク質を使用して評価することもできる。任意の得られる切断生成物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ又はレクチンブロット等の常法を使用して検出及び定量することができる。糖タンパク質を基質として使用する場合、上記のシアリダーゼ組成物による前処理（又は同時処理）が必要になる場合がある。この結果を、基質を例示的なＯ−グリコシダーゼ、例えば、配列番号１０のアミノ酸配列からなるポリペプチドと接触させたときに同じアッセイで得られた結果と比較してよい。配列番号１０のポリペプチド１ユニットは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってモニタリングしたとき、３７℃で２時間、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ６．８中のシアリダーゼ混合物１ユニットと組み合わせてＴＮＦαＲ１μｇの＞９０％からＯ−グリカンを除去するのに必要な量として定義される（好ましいシアリダーゼ混合物については、上記の通りである）。試験ポリペプチドは、好ましくは、同量存在するときに類似の活性レベルを達成する。例示的なアッセイについては実施例にも記載する。
【００５８】
上記Ｏ−グリコシダーゼを含む組成物は、溶液中で、又は溶解して再構成するための凍結乾燥された形態で提供されてもよい。Ｏ−グリコシダーゼは、Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水ｐＨ７．６中で凍結乾燥してよい。
【００５９】
Ｏ−グリカン特異的エンドプロテアーゼ
また、本発明者らは、上記シアリダーゼ組成物の作用が、Ｏ−グリカン特異的エンドプロテアーゼ、特に、典型的には３７５アミノ酸以下であり、好ましくは配列番号１２のアミノ酸配列からなるポリペプチドである配列番号１１のアミノ酸配列を含むＯ−グリカン特異的エンドプロテアーゼの活性を増強することも見出した。
【００６０】
従って、本発明は、また、糖タンパク質を改変する方法であって、糖タンパク質のサンプルを、上記シアリダーゼ組成物及びＯ−グリカン特異的エンドプロテアーゼの両方と接触させることを含む方法を提供する。また、本発明は、任意でＯ−グリカン特異的エンドプロテアーゼも含む、上記シアリダーゼ組成物を提供する。該方法及び該組成物では、該Ｏ−グリカン特異的エンドプロテアーゼは、配列番号１２のものであってよい。
【００６１】
本明細書における開示のいずれかでは、酵素活性が保持されている限り、配列番号１１の配列のＯ−グリカン特異的エンドプロテアーゼをその変異体によって置換してもよい。エンドプロテーゼの変異体は、配列番号１１の配列のアミノ酸配列の変異体を含んでいてもよく、から本質的になっていてもよく、からなっていてもよい。該配列番号の変異体は、保持されるべき関連する酵素活性がＯ−糖タンパク質に対する加水分解活性であることを除いて、シアリダーゼに関して上に記載した通り定義され得る。
【００６２】
あるいは、エンドプロテーゼは、上記の通り、配列番号３又はその変異体のより短い断片によって置換されてもよい。断片は、酵素活性を保持している、切断された形態の該配列番号であると説明することができる。このような断片は、配列番号１１よりも短く、典型的には、少なくとも１００アミノ酸長、少なくとも１５０アミノ酸長、少なくとも２００アミノ酸長、少なくとも２５０アミノ酸長、少なくとも３００アミノ酸長、少なくとも３５０アミノ酸長、少なくとも４００アミノ酸長、少なくとも４５０アミノ酸長、又は少なくとも５００アミノ酸長である。
【００６３】
本明細書に記載される任意のエンドプロテアーゼは、任意で、Ｎ末端における追加のメチオニン及び／又はＣ末端におけるヒスチジン若しくは他のタグを含んでいてもよい。このような追加の配列は、発現及び／又は精製に役立ち得る。ヒスチジンタグは、好ましくは、６個のヒスチジン残基からなる。ヒスチジンタグは、好ましくは、典型的にはアミノ酸の短い配列、例えば３〜５個のアミノ酸であるリンカーによってＣ末端に連結される。リンカーは、典型的には、主にグリシン及びセリンの残基からなり、好ましくは、配列ＧＳＧを含んでいてよい。例えば、ＧＳＧ及びＧＳＧＬＥが好適なリンカーである。この種の例示的なエンドプロテアーゼは、配列番号１２のアミノ酸配列からなる。
【００６４】
エンドプロテアーゼの酵素活性は、任意の好適なアッセイによって評価することができる。例えば、標準的なＯ−糖タンパク質基質、例えばＩｇＡ分子を、試験ポリペプチドと共にインキュベートしてよい。次いで、出発物質及び反応生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び／又は質量分析によって分析して、切断生成物（もし存在すれば）の存在を判定してよく、必要に応じて、該生成物を更に特性評価してもよい。Ｏ−グリコシル化されていない糖タンパク質基質、例えばＩｇＧ１分子をネガティブコントロールとして使用してよい。この結果を、基質を例示的なポリペプチド、例えば、配列番号１２のアミノ酸配列からなるポリペプチドと接触させたときに同じアッセイで得られた結果と比較してよい。
【００６５】
上記Ｏ−グリカン特異的エンドプロテアーゼを含む組成物は、溶液中で、又は溶解して再構成するための凍結乾燥された形態で提供されてもよい。Ｏ−グリカン特異的エンドプロテアーゼは、Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水ｐＨ７．６中で凍結乾燥してよい。
【００６６】
使用方法
本発明は、本発明の組成物中の酵素が、存在する任意の基質に対して作用するのに好適な条件下で、サンプルを該組成物と共にインキュベートする任意の方法を提供する。該方法は、任意で、得られた生成物の分析を含んでいてもよい。該分析は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ、レクチンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、又は質量分析を含む任意の好適な手段によって、生成物を分離及び／又は検出及び／又は単離することを含んでいてよい。
【００６７】
好適な条件は、少なくとも２０分間、少なくとも３０分間、少なくとも４０分間、少なくとも５０分間、少なくとも６０分間、少なくとも７０分間、少なくとも８０分間、少なくとも９０分間、又は少なくとも１２０分間、少なくとも３時間、少なくとも５時間、少なくとも１０時間、少なくとも１２時間、又は少なくとも一晩、本発明の組成物と共にインキュベートすることを含む。インキュベートは、好ましくは室温で、より好ましくは約２０℃、約２５℃、約３０℃、約３５℃、約４０℃、又は約４５℃、最も好ましくは約３７℃で行われる。方法は、任意の好適なｐＨ下で実施してよい。好適なｐＨ値は、例えば、約３．０、約３．５、約４、約４．５、約５、約５．５、約６、約６．５、約７、約７．５、約８、約８．５、約９、又は約９．５のｐＨを含む。好ましいｐＨは、５．６〜６．８の範囲内である。方法は、任意の好適なバッファ、例えば、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で実施してよい。バッファは、好ましくは、典型的には３００ｍＭ以下、２５０ｍＭ以下、２００ｍＭ以下、又は１５０ｍＭ以下の低濃度のＮａＣｌを含む。ＮａＣｌ濃度は、好ましくは、約１５０ｍＭ、例えば１２５ｍＭ〜１７５ｍＭである。
【００６８】
サンプルのタンパク質含量に対する本発明の組成物中の酵素の近似比は、１：１、２：１、４：１、６：１、１０：１、１５：１、２０：１、１：２、１：４、又は１：６、１：１０、１：１５、１：２０、１：４０、１：５０、又は１：１００であってよい。
【００６９】
以下は、本発明の特に好ましい方法である。
【００７０】
糖タンパク質を改変する方法であって、該糖タンパク質を含有するサンプルを本発明の組成物と接触させることと、任意で、得られた生成物を分析することとを含む方法。該分析は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ、レクチンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、又は質量分析を含む任意の好適な方法によって、生成物を分離及び／又は検出及び／又は単離することを含んでいてよい。
【００７１】
特定の実施形態では、方法は、シアリダーゼのみを含む本発明の組成物とサンプルを接触させることと、任意で、生成物を分離し、次いで、該生成物をプロテアーゼ及び／又はグリコシダーゼ等の別の酵素と接触させることとを含んでいてよい。この方法は、他の酵素を添加する前にシアル酸を除去するためのサンプルの「前処理」と説明することができる。この実施形態の変形では、他の酵素を、別々ではあるがシアリダーゼ組成物と同時にサンプルに添加してよく、「同時処理」と説明することができる。別の変形では、他の酵素はシアリダーゼ組成物中に存在する。他の酵素は、好ましくは、例えば本明細書に記載されるＯ−グリカン特異的エンドプロテアーゼ又はＯ−グリコシダーゼである。
【００７２】
以下の実施例は、本発明を説明する。
【実施例】
【００７３】
実施例１−シアリダーゼ
材料及び方法
シアリダーゼの発現及び精製
アッカーマンシア・ムシニフィラで同定された遺伝子（Ａｍ０７０５、Ａｍ０７０７、Ａｍ１７５７、Ａｍ２０５８）を、ベクターｐＥＴ２１ａ（＋）において大腸菌で良好に発現するようにコドン最適化した。ベクターをＢＬ２１（ＤＥ３）Ｓｔａｒ細胞に形質転換した。大腸菌を２００ｒｐｍで３７℃のＬＢ中においてルーチン的に培養した。プラスミドの存在下で、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを添加した。一晩インキュベートした後、培養物を新鮮ＬＢ（ａｍｐ）で１：２０希釈し、ＯＤ６２０が約０．７〜０．８になるまで成長させ、その後、１ｍＭ  ＩＰＴＧを添加することによって組み換えタンパク質発現を誘導し、５時間発現を継続させた後、細胞を収集し、凍結させた。凍結細胞を解凍し、Ｈｉｓ結合バッファ（２０ｍＭ  ＮａＰ  ｐＨ７．４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール）に溶解させ（resolved）、細胞内タンパク質を放出させるために超音波処理した。遠心分離によって細胞残屑を除去した。滅菌濾過した上清をニッケルカラムでアフィニティ精製し、ＰＤ−２５カラムにおいて２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０に再緩衝した。Ｎａｎｏｄｒｏｐを使用してタンパク質の濃度を決定し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを通して純度を推定した。
【００７４】
低分子を使用する活性評価
２−３’−シアリルラクトース、２−６’−シアリルラクトース、及びコロミン酸（２−８’；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を基質として使用して、酵素の加水分解特異性を判定した。酵素（０．０５μｇ）を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．８中基質（２５μＭ）と混合し、３７℃で３０分間インキュベートし、その後、製造業者の指示書（Ｓｉａｌｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ａｂｃａｍ）に従って混合物中の遊離シアル酸を定量した。
【００７５】
タンパク質基質を使用する活性評価
ＴＮＦαＲ、ＥＰＯ、Ｅｎｂｒｅｌ、及びフェチュイン（０．５μｇ）を様々な濃度の試験したシアリダーゼ（１：４０）又は市販のシアリダーゼ（ＮＥＢ製、製造業者に従う）と共に混合し、３０分間インキュベートし、その後、タンパク質を４〜２０％Ｎｏｖｅｘ勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離及び／又はＳＮＡレクチンブロットで分析した。
【００７６】
レクチンブロット
分離されたタンパク質を、Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  Ｔｕｒｂｏ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ）を使用してＰＶＤＦメンブレンに転写した。メンブレンをレクチンバッファでブロッキングし、続いて、一次結合剤（ＳＮＡ−ビオチン）及び二次結合剤（ＨＲＰ−ストレプトアビジン；ＶｅｃｔｏｒＬａｂｓ）と共にインキュベートし、その間に洗浄工程を行った。Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）キットによって化学発光させ、ＣｈｅｍｉＤｏｃ（ＢｉｏＲａｄ）で検出した。
【００７７】
最適な酵素条件
ＮａＣｌ（０〜１．５Ｍ）及びイオン（２ｍＭ  ＣａＣｌ２、２ｍＭ  ＺｎＣｌ２、５ｍＭ  ＥＤＴＡ）の影響について調べるために、シアリダーゼを、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０中２−３’シアリルラクトース（２５μＭ）と共にインキュベートした。最適ｐＨについては、シアリダーゼを酢酸バッファ（４．６及び５．６）及びＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファ（６．８、７．４、８．０、及び８．８）中でインキュベートした。全てのサンプルを室温で１５分間インキュベートし、その後、製造業者の指示書に従って、混合物をシアル酸定量キット（Ａｂｃａｍ）に１：１添加した。全ての値を、各群内の最高活性に関して相対活性として表した。
【００７８】
定評のあるバイオテクノロジー企業製の公知のシアリダーゼとの比較
アッカーマンシア・ムシニフィラのシアリダーゼ、シアリダーゼ混合物、及び定評のあるブランドから購入したシアリダーゼ（ＮＥＢ  Ｐ０７４３Ｓ、Ｐ０７２０Ｓ、及びＰ０７２２Ｓ）を、製造業者の指示書に従って、シアル酸定量バッファ（１：１比）と共に、それぞれの最適なバッファ中で２−３’及び２−６’のシアリルラクトース、並びにコロミン酸と共に２０分間インキュベートした。
【００７９】
結果
全てのアッカーマンシア・ムシニフィラのシアリダーゼは、良好に発現し、Ｈｉｓカラムで精製することができる
アッカーマンシアとアノテーションが付けられたシアリダーゼＡｍ０７０５、Ａｍ０７０７、Ａｍ１７５８、及びＡｍ２０５８を大腸菌で組み換え的に発現させ、Ｈｉｓカラムで高純度になるまで精製した（図１）。タンパク質は良好に発現し、そのレベルは、大腸菌培養物１Ｌあたり７０〜１５０ｍｇの精製された酵素の間でばらついていた。更に、シアリダーゼはＴｒｉｓバッファに高度に可溶性であり、それほど沈殿することなく＞３ｍｇ／ｍＬに濃縮することができた。
【００８０】
シアリダーゼのうちの３つだけが、様々なタンパク質基質に対する活性を示す
様々なＯ及びＮ結合型糖タンパク質に対する精製されたシアリダーゼの初期スクリーニング中、Ａｍ０７０５を除く全てのシアリダーゼが強力な活性を示した（データは割愛する）。Ａｍ２０５８の活性は一定していなかったことから、Ａｍ０７０７及びＡｍ０７０７／１７５７の混合物（ミックス、１：１）の特性評価を継続した。
【００８１】
シアリダーゼは異なる特異性を有する
幾つかのシアリダーゼは結合特異性を示し、特定のシアル酸結合（例えば、２−３、２−６、及び／又は２−８）を加水分解する限られた能力を有していた。４つのアッカーマンシア・ムシニフィラのシアリダーゼが様々な結合に作用する能力について調べるために、１種の結合しか存在しない特定の基質（２−３’−シアリルラクトース、２−６’−シアリルラクトース、及びコロミン酸）と共に該シアリダーゼをインキュベートし、遊離シアル酸を定量した（図２）。Ａｍ１７５７は、２−３結合に対して高い特異的活性を有していたが、Ａｍ０７０７は、全ての試験した結合に対してより広いが低い活性を有していた。Ａｍ０７０７とＡｍ１７５７との組み合わせ（ミックス）からは、より優れた広域スペクトル生成物が得られた（図２）。
【００８２】
シアリダーゼは、ＮａＣｌ感受性であり、二価カチオンに依存する
シアリダーゼ活性を最適化するために必要な条件について更に調べるために、イオン、ｐＨ、及びＮａＣｌに対するシアリダーゼの依存性について調べた。２つのシアリダーゼは同様に挙動し、ＥＤＴＡ及びＺｎ２＋に対して高い感受性を有していたが、Ｃａ２＋に依存していた。酵素は、中性〜塩基性のｐＨにおいてより高い活性を有し、ＮａＣｌの存在下でその活性の多くを失った（図３）。
【００８３】
シアリダーゼの混合物は、加水分解の全体的な効率を増大させる
特性評価されたシアリダーゼは相補的活性を有しており、Ａｍ１７５７は高い２−３結合加水分解活性を有し、Ａｍ０７０７は２−６、８結合にも作用したので、２つの酵素の比を変化させることによって、ネイティブ糖タンパク質における全てのシアル酸結合に対して２つの酵素の混合物が高い効率を示し得るかどうかについて調べた。１：４０  Ａｍ０７０７と共に１：４０  Ａｍ１７５７を含有する混合物は、フェチュインにおける全てのシアル酸を急速に（＜１５分間）加水分解した（図４）。
【００８４】
低分子基質に対するシアリダーゼのベンチマーキング
シアリダーゼ混合物（ＧＶＳ＿Ｓｍｉｘ）の効率を単一の酵素及びブランド競合製品と比較するために、本発明の酵素をＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）製の３つの市販シアリダーゼと比較した。これらは、アルスロバクター・ウレアファシェンス（Arthrobacter ureafaciens）由来の広域スペクトルシアリダーゼ（ＮＥＢ  Ａ、アルスロバクター・ウレアファシェンス由来の酵素α２−３，６，８，９ノイラミニダーゼＡ、カタログ番号Ｐ０７２２Ｓ；２−３、２−６、２−８、及び２−９の結合を切断）、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）由来の狭域スペクトルシアリダーゼ（ＮＥＢ  Ｓ、肺炎連鎖球菌由来の酵素α２−３ノイラミニダーゼＳ、カタログ番号Ｐ０７４３Ｓ；２−３結合のみを切断）、及びウェルシュ菌（Clostridium perfringens）由来の汎用シアリダーゼ（ＮＥＢ  Ｏ、ウェルシュ菌由来の酵素α２−３，６，８ノイラミニダーゼＯ、カタログ番号Ｐ０７２０Ｓ、２−３、２−６、２−８の結合を切断）であった。製造業者によって示唆されている通り酵素を添加し、３７℃で３０分間基質と共にインキュベートした（図５）。
【００８５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって判定したとき、様々なサンプル中のシアリダーゼの量は、ＮＥＢよりもＧＶＳ＿Ｓｍｉｘにおいてより低く、ノイラミニダーゼＡは恐らく例外である。ノイラミニダーゼＳは、糖タンパク質におけるシアル酸結合を全て加水分解する限られた能力を示したが、ノイラミニダーゼＡ及びノイラミニダーゼＯは、フェチュインに存在する全てのシアル酸を加水分解した（図６）。同様に、合成低分子基質に対する活性について観察したとき、Ｓｍｉｘは糖タンパク質における全てのシアル酸結合を加水分解して、完全なアシアリル化の指標である狭いタンパク質バンドが生成された。２−６結合も２−８結合も加水分解することができない、Ａｍ１７５７処理されたサンプルは、Ｓｍｉｘで処理されたサンプルよりも高分子量として移動した。シアル酸を標識したＳＮＡブロッティングで加水分解が確認され、このことは、全ての広域スペクトルシアリダーゼはフェチュインに存在する全てのシアル酸を効率的に除去するが、２−３特異的酵素（例えば、ノイラミニダーゼＳ及びＡｍ１７５７）はわずかなシアル酸しか除去しないことを示唆している（図６）。
【００８６】
Ｓｍｉｘは、ネイティブタンパク質からシアル酸を効率的に放出させることができる
Ｓｍｉｘは、ＮＥＢ製品と同等又はそれ以上の効率で小さな半合成基質に対して作用することができたが（図５）、様々なシアル酸結合を有するネイティブタンパク質に対する活性についても調べることは避けられなかった。２−３及び２−６結合型のシアル酸を両方有しているので、モデルタンパク質としてフェチュインを選択した。ＳＮＡブロッティングを使用して、選択した濃度のＳｍｉｘが、ＮＥＢ  Ａ及びＯと同様にフェチュインから全てのシアル酸を完全に除去できることが明らかになった（図６）。２つの２−３特異的酵素Ａｍ１７５７及びＮＥＢ  Ｓは、予想通り、フェチュインを完全にアシアリル化することはできなかった。
【００８７】
３つのＮＥＢシアリダーゼと比べてＳｍｉｘ及びＡｍ１７５７がネイティブタンパク質からシアル酸を放出させる能力をより定量的に判定するために、様々な糖タンパク質基質（ＴＮＦαＲ、ＩｇＡ、プラスミノーゲン、及びアバタセプト［Ｏｒｅｎｃｉａ］）を各シアリダーゼと共に１５＋１５分間インキュベートし、放出されたシアル酸を定量した。特定の基質はその他の基質よりも加水分解がより困難であることが証明されているが、ＧＶＳ＿Ｓｍｉｘは全ての場合においてＮＥＢ製品と少なくとも同等であり（図７）、全ての基質に対して高い活性を示した点で最も一貫性が高いことが立証された。Ａｍ１７５７及び各ＮＥＢ製品の個々の酵素は、１つの又は別の個々の基質に対してより高い活性を有していたが、ＧＶＳ＿Ｓｍｉｘのみが一貫して全ての基質に対して高い活性を示したので、このことからグリカン分析にとって非常に魅力的なツールとなった。
【００８８】
実施例２−Ｏ−グリコシダーゼ
材料及び方法
エンド−Ｏ−グリコシダーゼの発現及び精製
ストレプトコッカス・オラリスのエンド−Ｎ−アセチル−ガラクトサミニダーゼを、ベクターｐＥＴ２１ａ（＋）において大腸菌で良好に発現するようにコドン最適化した。ベクターをＢＬ２１（ＤＥ３）Ｓｔａｒ細胞に形質転換した。大腸菌を２００ｒｐｍで３７℃のＬＢ中においてルーチン的に培養した。プラスミドの存在下で、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを添加した。一晩インキュベートした後、培養物を新鮮ＬＢ（ａｍｐ）で１：２０希釈し、ＯＤ６２０が約０．７〜０．８になるまで成長させ、その後、１ｍＭ  ＩＰＴＧを添加することによって組み換えタンパク質発現を誘導し、５時間発現を継続させた後、細胞を収集し、凍結させた。凍結細胞を解凍し、Ｈｉｓ結合バッファ（２０ｍＭ  ＮａＰ  ｐＨ７．４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール）に溶解させ（resolved）、細胞内タンパク質を放出させるために超音波処理した。遠心分離によって細胞残屑を除去した。滅菌濾過した上清をニッケルカラムでアフィニティ精製し、ＰＤ−２５カラムにおいてＰＢＳに再緩衝した。Ｎａｎｏｄｒｏｐを使用してタンパク質の濃度を決定し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを通して純度を推定した。タンパク質の配列を配列番号３として提供する。
【００８９】
低分子を使用する活性評価
Ｏ−グリカンコア領域の４−メチルウンベリフェロン（４ＭＵ）基質及びｐＮＰ基質を基質として使用して、酵素の加水分解活性を判定した。酵素（１μｇ）を基質（２ｍＭ）と混合し、３７℃で１５〜１２０分間インキュベートし、その時間中、蛍光及び吸光度（４０５ｎｍ）をそれぞれ記録した。
【００９０】
タンパク質基質を使用する活性評価
ＴＮＦαＲ、ＥＰＯ、Ｅｎｂｒｅｌ、フェチュイン、ＩｇＡ、Ｏｒｅｎｃｉａ、及びプラスミノーゲン（０．５μｇ）を、Ｓｍｉｘ（１：４０＋１：４０）又はＡｍ１７５７（１：４０）の存在の有り無しで、０〜２４時間Ｏ−グリコシダーゼ（１：４０）と混合した。タンパク質を４〜２０％Ｎｏｖｅｘ勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。
【００９１】
最適な酵素条件
ＮａＣｌ（０〜１．５Ｍ）及びイオン（２ｍＭ  ＣａＣｌ２、２ｍＭ  ＺｎＣｌ２、５ｍＭ  ＥＤＴＡ）依存性について調べるために、酵素をそれぞれの基質（４ＭＵ又はｐＮＰ）と共にインキュベートした。最適ｐＨについては、酵素を酢酸バッファ（５０ｍＭ  ｐＨ４．６及び５．６）及びＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファ（２０ｍＭ  ｐＨ６．８、７．４、８．０、及び８．８）中でインキュベートした。全てのサンプルを３７℃で１５分間インキュベートした。全ての値を、各群内の最高活性に関して相対活性として表した。
【００９２】
市販酵素との比較
同定された酵素、及び定評のあるブランドから市販されている酵素（大便連鎖球菌由来のＮＥＢ  Ｏ−グリコシダーゼ、カタログ番号Ｐ０７３３Ｓ、バンドル番号Ｅ０５４０Ｓとしても）をそれぞれの基質及び最適化されたバッファと共にインキュベートし、ネイティブ条件下で様々な糖タンパク質と共に０〜２４時間インキュベートした後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。
【００９３】
結果
ストレプトコッカス・オラリスのエンド−α−Ｎ−アセチル−ガラクトサミニダーゼの発現／精製
発見フェーズ（discovery phase）中、いずれも高分子量の細菌タンパク質（＞２００ｋＤａ）であるＳ．オラリス及びビフィズス菌（Bifidobacterium bifidum）由来の２つの異なるエンド−α−Ｎ−アセチル−ガラクトサミニダーゼについて検討した。ビフィズス菌グリコシダーゼは高度に不安定であったか、又は発現及びアフィニティ精製後に高度の断片化部分が少なくとも生じた。Ｓ．オラリスについても特定の断片化が可視化され得たが、はるかにより少なかった（図８Ａ）。更に、この酵素は、更に分解することが全くなく、４℃で最長１週間安定であった（図８Ｂ）。しかし、発現レベル（約５〜１０ｍｇ／Ｌ）はかなり低い。更なる分析によって、断片化が超音波処理に起因することが示唆された。
【００９４】
Ｏ−グリコシダーゼは、合成ｐＮＰ標識コア１〜３のＯ−グリコシダーゼに対して作用することができる
２つのＯ−グリコシダーゼの分析を続けたところ、コア１グリカンに対する著しい選択性が明らかになり、コア２及び３に対する活性ははるかに低かった（図９）。重要なことに、Ｓ．オラリス由来のグリコシダーゼは、ビフィズス菌由来の対応する遺伝子よりも著しく高い活性を示したので、主にＳ．オラリスのＯ−グリコシダーゼに重点的に取り組むことに決めた。
【００９５】
ＭｇＣｌ２の添加は、Ｓ．オラリスのＯ−グリコシダーゼの活性を著しく増大させる
Ｏ−グリコシダーゼについての最適条件を決定するために、様々なｐＨ及びイオン下で、様々な条件において酵素をｐＮＰコア１基質と共にインキュベートした（図１０）。Ｏ−グリコシダーゼは、中性〜わずかに塩基性のｐＨで高い活性を示し、Ｚｎ２＋の存在によって完全に阻害されたが、８ｍＭ以下のＭｇＣｌ２の存在下で増大した活性を有していた（図１０Ｃ）。
【００９６】
Ｓ．オラリスのＯ−グリコシダーゼは、ネイティブ糖タンパク質からグリカンを加水分解することができる
全てのＯ−グリカンの加水分解を媒介するのに必要な反応速度及び用量について調べるために、実施例１で特性評価したシアリダーゼ混合物（Ａｍ１７５７：Ａｍ０７０７の１：１ミックス）又はシアリダーゼ混合物のみと組み合わせて、様々な量のＯ−グリコシダーゼと共にネイティブＴＮＦαＲを１〜１２時間インキュベートした。図１１に示す通り、比較的低濃度の酵素（例えば、約０．１μｇ、１：１０）でさえも、１時間以内に基質を加水分解することができた。インキュベート時間を１２時間まで延長した結果、高濃度のシアリダーゼでは、１：５０の比で酵素が基質を完全に加水分解する能力が得られた。幾つかの態様では、酵素は「無か全か（nothing or all）」酵素であるので、半分加水分解された糖タンパク質はほとんど生じず、加水分解されていないか又は完全に加水分解されたタンパク質が生じることに留意するのが重要である。
【００９７】
Ｓ．オラリスのＯ−グリコシダーゼは、様々なネイティブ糖タンパク質に対して作用することができる。
Ｏ−グリコシダーゼがＴＮＦαＲに対してのみ作用するのか、幾つかのネイティブな糖タンパク質に作用することができるのかを更に調べるために、７つの異なる糖タンパク質を加水分解酵素の組み合わせと共にインキュベートした（図１２）。Ｓ．オラリスのＯ−グリコシダーゼ及びビフィズス菌酵素（シアリダーゼと組み合わせて）は、一晩インキュベートした後にネイティブタンパク質を全て加水分解することができたが、プラスミノーゲンに対する活性は、タンパク質の分子量が高いことから評価が困難であった。しかし、末端シアル酸が活性を阻害したため、両酵素はシアリダーゼの存在に強く依存していた。
【００９８】
Ｓ．オラリスのＯ−グリコシダーゼは、ネイティブ糖タンパク質の加水分解においてＮＥＢ製品のポートフォリオよりも優れている。
既存の市販製品に対するＳ．オラリスのグリコシダーゼの活性を比較するために、１時間又は１６時間、様々な量のグリコシダーゼを使用してそのＴＮＦαＲを加水分解する能力を比較した。約１：５の酵素：基質比を使用すると、Ｓ．オラリスのグリコシダーゼは１時間でその基質を完全に加水分解することができた。１：１酵素：基質比でさえも、ＮＥＢ  Ｏ−グリコシダーゼは全てのＯ結合型グリカンを加水分解することができず、幾つかの容易にアクセス可能なグリカンに対してしか作用しなかった。更にインキュベート（例えば、１６時間）することによって、Ｓ．オラリスのグリコシダーゼの最大効果を依然として維持しながら、１：５０酵素：基質比が可能になった。しかし、ＮＥＢ  Ｏ−グリコシダーゼは、生成物を完全に脱グリコシル化することができず、このことは、変性がその機能にとって重要であることを示すが、Ｓ．オラリスのＯ−グリコシダーゼ生成物は、ネイティブタンパク質に対しても高い活性を有する（図１３）。Ｓ．オラリスのＯ−グリコシダーゼはネイティブタンパク質に対して作用することができるだけでなく、変性したタンパク質からグリカンを加水分解することもできる（データは割愛する）。
【００９９】
グリカン組成は、Ｏ−グリコシダーゼの活性に影響を与える
Ｏ−グリコシダーゼ活性にとっての特定のグリカンの必要性について更に研究するために、ＴＮＦαＲを様々な酵素と共にプレインキュベートして個々のグリカンを除去した後、Ｏ−グリコシダーゼを添加した。ガラクトースの存在と同様に、末端シアル酸の除去が活性にとって重要であったが、このことは、Ｏ−グリコシダーゼが単一の（末端）ＧａｌＮＡｃｓを除去できないことを示す（図１４）。
【０１００】
Ｏ−グリコシダーゼは、ネイティブタンパク質からのＯ−グリカンの除去において非常に効率的である
Ｏ−ｇｌｙｋ＋Ｓｍｉｘの複合組成物の最終濃度を決定したら（１：４０）、競合するブランド製品（ＮＥＢ）との比較を繰り返した。ＮＥＢ製品を使用するとＴＮＦαＲにおいて若干の加水分解を検出することはできるが、加水分解が完全ではなく、１２時間後でさえも完全ではないことは明らかである。これとは対照的に、Ｏ−ｇｌｙｋ＋Ｓｍｉｘの複合組成物では、４時間以内に糖タンパク質が完全に加水分解され、これは、レクチンブロットによって裏付けられた（図１５）。
【０１０１】
同様に、Ｅｎｂｒｅｌは同一のパターンを示し、Ｏ−ｇｌｙｋ＋Ｓｍｉｘの複合組成物はそれを完全に加水分解することができたが、ＮＥＢ製品はできなかった。しかし、フェチュイン（feutin）については、両製品が一見すると等しく効率的であった（図１６）。
【０１０２】
２−３及び２−６結合型シアル酸は、いずれもＯ−グリコシダーゼの活性を阻害する
Ｏ−グリコシダーゼ活性についての２−３又は２−６結合型シアル酸の相互作用を評価するために、２−３特異的又は広域スペクトルのシアリダーゼ（例えば、それぞれＡｍ１７５７及びＳｍｉｘ）の両方と共にＯ−グリコシダーゼをインキュベートした。予備データは、Ａｍ１７５７及びＡｍ０７０７が糖タンパク質から等量のシアル酸を放出できることを示唆しているが、Ａｍ１７５７（又はＳｍｉｘ）で糖タンパク質を処理した結果、基質（ＴＮＦαＲ）がより速く加水分解された。しかし、完全に加水分解するためには、広域スペクトルシアリダーゼで糖タンパク質を処理すること、また、２−６（又は２−８）シアル酸を除去することが重要であった（図１７）。
【０１０３】
ＧＶＳ  Ｏ−グリコシダーゼバンドルのネイティブ活性は、非常に効率的なシアリダーゼ活性に起因する
Ｏ−ｇｌｙｋ＋Ｓｍｉｘの複合組成物における個々の成分の影響を判定するために、Ｏ−ｇｌｙｋ及びＮＥＢを４つの異なるシアリダーゼ製品（ＧＶＳ＿Ｓｍｉｘ、ＮＥＢ  Ａ、ＮＥＢ  Ｓ、及びＮＥＢ  Ｏ）と共にインキュベートした。Ｏ−ｇｌｙｋ＋Ｓｍｉｘの複合組成物は、Ｅｎｂｒｅｌから全てのＯ−グリカンを効率的に加水分解した（図１８）が、シアリダーゼをＮＥＢ製品のいずれかに変更した結果、Ｏ−ｇｌｙｋの活性が著しく低下し、ＮＥＢシアリダーゼＡが最も強力であった。しかし、ＮＥＢ  Ｏ−グリコシダーゼバンドル（ＮＥＢシアリダーゼＯとＮＥＢ  Ｏ−グリコシダーゼ）は、ＥｎｂｒｅｌもＴＮＦαＲも加水分解することができなかった（図１５、１６）が、ＮＥＢシアリダーゼＯの代わりにＧＶＳ＿Ｓｍｉｘを使用することによって、糖タンパク質の完全な加水分解が観察され、このことは、Ｏ−ｇｌｙｋ＋Ｓｍｉｘの複合組成物の効率が、糖タンパク質における２−３及び２−６の結合を全て加水分解するシアリダーゼの能力に少なくとも部分的に依存することを示唆している。
【０１０４】
実施例３−Ｏ−糖タンパク質特異的エンドプロテアーゼ
配列番号１２からなるポリペプチドのエンドプロテーゼ活性は特定のシアル酸結合に少なくとも部分的に依存しているので、最大効果を得るためには２−３及び２−６結合型のシアル酸を両方除去する必要があることが、本発明者らによって最近判明した。エンドプロテアーゼ活性に対する特定のシアル酸結合の個々の役割を決定するために、エンドプロテアーゼと組み合わせて様々なシアリダーゼと共にエタネルセプトを３０分間〜２０時間インキュベートした。エンドプロテアーゼ活性を増強するには、２−３結合を除去すれば十分であると思われた（図１９）。使用したシアリダーゼは、（１）Ａｍ０７０７＝配列番号３のポリペプチド；（２）Ａｍ１７５７＝配列番号６のポリペプチド；ミックス＝（１）と（２）との１：１の組み合わせ。
【０１０５】
配列
配列番号１−シアリダーゼ、Ａｍ０７０７−野生型（下線はシグナル配列）
MTWLLCGRGKWNKVKRMMNSVFKCLMSAVCAVALPAFGQEEKTGFPTDRAVTVFSAGEGNPYASIRIPALLSIGKGQLLAFAEGRYKNTDQGENDIIMSVSKNGGKTWSRPRAIAKAHGATFNNPCPVYDAKTRTVTVVFQRYPAGVKERQPNIPDGWDDEKCIRNFMIQSRNGGSSWTKPQEITKTTKRPSGVDIMASGPNAGTQLKSGAHKGRLVIPMNEGPFGKWVISCIYSDDGGKSWKLGQPTANMKGMVNETSIAETDNGGVVMVARHWGAGNCRRIAWSQDGGETWGQVEDAPELFCDSTQNSLMTYSLSDQPAYGGKSRILFSGPSAGRRIKGQVAMSYDNGKTWPVKKLLGEGGFAYSSLAMVEPGIVGVLYEENQEHIKKLKFVPITMEWLTDGEDTGLAPGKKAPVLK
【０１０６】
配列番号２−シアリダーゼ、Ａｍ０７０７−シグナル無しの野生型
QEEKTGFPTDRAVTVFSAGEGNPYASIRIPALLSIGKGQLLAFAEGRYKNTDQGENDIIMSVSKNGGKTWSRPRAIAKAHGATFNNPCPVYDAKTRTVTVVFQRYPAGVKERQPNIPDGWDDEKCIRNFMIQSRNGGSSWTKPQEITKTTKRPSGVDIMASGPNAGTQLKSGAHKGRLVIPMNEGPFGKWVISCIYSDDGGKSWKLGQPTANMKGMVNETSIAETDNGGVVMVARHWGAGNCRRIAWSQDGGETWGQVEDAPELFCDSTQNSLMTYSLSDQPAYGGKSRILFSGPSAGRRIKGQVAMSYDNGKTWPVKKLLGEGGFAYSSLAMVEPGIVGVLYEENQEHIKKLKFVPITMEWLTDGEDTGLAPGKKAPVLK
【０１０７】
配列番号３−シアリダーゼ、Ａｍ０７０７−追加のＮ末端メチオニン及びＣ末端リンカー＋Ｈｉｓ６タグを有する（太字及び下線）
2020522242.tif 000005
【０１０８】
配列番号４−シアリダーゼ、Ａｍ１７５７−野生型（下線はシグナル配列）
MKNLLFALLTGSFCCCYAQQKAAPVPEPEVVATPPADAGRGLIRVDSREIRHYSGTRKEPDYLVSRDNGKTWEMKAAPAGYPPNYGGIPKESPAIVRNPLTREFIRVQPIGGFVFLSRGGLDGKWLAVTNDGKLEEDWKDPEKRKNLKKLGGIMRTPVFVNKGRRVIVPFHNMGGGTKFHISDDGGLTWHVSRNGVTSPRHEARPPHQGVRWFNNAVEATVLEMKDGTLWALARTSQDQAWQAFSKDYGETWSKPEPSRFFGTLTMNTLGRLDDGTIVSLWTNTMALPENATAGNGTWEDVFTNRDSHHIAMSGDEGKTWYGFREIILDEHRNHPGYATLDGPEDRGKHQSEMVQLDKNRILISLGQHKNHRRLVIVDRRWVGAKTRATQTGKDLDSQWTIHTYIPQKKGHCSYNRKPSAELVQDPSGGTKKVLQIKRLDDPELVNEKSNVDYRNGGATWNFPNGTTGLVKFRFRVVDGEQADDSGLQVSLTDRLFNACDSTTKDYALFTFPIRLKPAPHLLLGMKKVPFTPGAWHEISLLWQGGQAVVSLDGKKAGTLKMANKSPNGASYIHFISTGSQPDAGILLDTVNARVK
【０１０９】
配列番号５−シアリダーゼ、Ａｍ１７５７−シグナル無しの野生型
QQKAAPVPEPEVVATPPADAGRGLIRVDSREIRHYSGTRKEPDYLVSRDNGKTWEMKAAPAGYPPNYGGIPKESPAIVRNPLTREFIRVQPIGGFVFLSRGGLDGKWLAVTNDGKLEEDWKDPEKRKNLKKLGGIMRTPVFVNKGRRVIVPFHNMGGGTKFHISDDGGLTWHVSRNGVTSPRHEARPPHQGVRWFNNAVEATVLEMKDGTLWALARTSQDQAWQAFSKDYGETWSKPEPSRFFGTLTMNTLGRLDDGTIVSLWTNTMALPENATAGNGTWEDVFTNRDSHHIAMSGDEGKTWYGFREIILDEHRNHPGYATLDGPEDRGKHQSEMVQLDKNRILISLGQHKNHRRLVIVDRRWVGAKTRATQTGKDLDSQWTIHTYIPQKKGHCSYNRKPSAELVQDPSGGTKKVLQIKRLDDPELVNEKSNVDYRNGGATWNFPNGTTGLVKFRFRVVDGEQADDSGLQVSLTDRLFNACDSTTKDYALFTFPIRLKPAPHLLLGMKKVPFTPGAWHEISLLWQGGQAVVSLDGKKAGTLKMANKSPNGASYIHFISTGSQPDAGILLDTVNARVK
【０１１０】
配列番号６−シアリダーゼ、Ａｍ１７５７−追加のＮ末端メチオニン及びＣ末端リンカー＋Ｈｉｓ６タグを有する（太字及び下線）
2020522242.tif 000006
【０１１１】
配列番号７−Ｓ．オラリス野生型由来のＯ−グリコシダーゼ（下線はシグナル配列；太字下線はＬＰＸＴＧ細胞壁アンカーモチーフのＣ末端エレメント）
2020522242.tif 000007
【０１１２】
配列番号８−シグナル配列が除去されたＳ．オラリス野生型由来のＯ−グリコシダーゼ（太字下線はＬＰＸＴＧ細胞壁アンカーモチーフのＣ末端エレメント）
2020522242.tif 000008
【０１１３】
配列番号９−シグナル配列及びＬＰＸＴＧ細胞壁アンカーモチーフのＣ末端エレメントが両方除去されたＳ．オラリス野生型由来のＯ−グリコシダーゼ
DQARVGSTDNLPSELADLDKKASDEGHDFDKEAAAQNPGSAETTEGPQTEEELLAQEKEKSEKPSNLPKELEDKLEKAEDNGREVDKDQLAQDTGKLVPEDVAKTTNGELNYGATVKIKTPSGEGSGIVVAKDLVLTVSHNFIKDSQEGNIRKVVDNDQGDGDIYSISYPGLPDVKFSKKDIIHWDREGYLKGFKNDLALVRLRTVLENTPVEVTKKPVVKKIGDKLHVFGYPEGKLNPIVNTTVDFAEPYGEGVQGIGYQGGKPGASGGGIFDTEGKLVGVHQNGVVGKRSGGILFSPAQLKWIQDHMQGISSVKPADLEEKEKPAEEKPKEDKPAAAKPETPKAVTPEWQTVANKEQQGTVTIREEKGVRYNQLSSTAQNDNDGKPALFEKQGLTVDANGNATVDLTFKDDSEKGKSRFGVFLKFKDTKNNVFVGYDQGGWFWEYKTPGNSTWYKGNRVAAPEPGSVNRLSITLKSDGQLNASNNDVNLFDTVTLPGAVNENLKNEKKILLKAGTYSNDRTVVSVKTDNQEGVKADDTPAQKETGPAVDDSKVTYDTIQSKVLKAVIDQAFPRVKEYTLNGHTLPGQVQQFNQVFINNHRITPEVTYKKINETTAEYLMKLRDDAHLINAEMTVRLQVVDNQLHFDVTKIVNHNQVTPGQKIDDERKLLSTISFLGNALVSVSSDQAGAKFDGATMSNNTHVSGDDHIDVTNPMKDLAKGYMYGFVSTDKLAAGVWSNSQNSYGGGSNDWTRLTAYKETVGNANYVGIHSSEWQWEKAYKGIVFPEYTKELPSAKVVITEDANADNKVDWQDGAIAYRSIMNNPQGWEKVKDITAYRIAMNFGSQAQNPFLMTLDGIKKINLHTDGLGQGVLLKGYGSEGHDSGHLNYADIGKRIGGVEDFKTLIEKAKKYGAHLGIHVNASETYPESKYFNENILRKNPDGSYSYGWNWLDQGINIDAAYDLAHGRLARWEDLKKKLGEGLDFIYVDVWGNGQSGDNGAWATHVLAKEINKQGWRFAIEWGHGGEYDSTFQHWAADLTYGGYTNKGINSAITRFIRNHQKDSWVGDYRSYGGAANYPLLGGYSMKDFEGWQGRSDYNGYVTNLFAHDVMTKYFQHFTVSKWENGTPVTMTDNGSTYKWTPEMKVELVDAAGNKVVVTRKSNDVNSPQYRERTVTLNGRVIQDGSAYLTPWNWDANGKKLPTEKEKMYYFNTQAGATTWTLPSDWANSKVYLYKLTDQGKTEEQELTVTDGKITLDLLANQPYVLYRSKQTNPEMSWSEGMHIYDQGFNSGTLKHWTISGDASKAEIVKSQGANEMLRIQGNKSKVSLTQKLTGLKPNTKYAVYVGVDNRSNAKASITVNTGEKEVTTYTNKSLALNYIKAYAHNNRRENATVDDTSYFQNMYAFFTTGSDVSNVTLTLSREAGDEATYFDEIRTFENNSSMYGDKHDTGQGTFKQDFENVAQGIFPFVVGGVEGVEDNRTHLSEKHDPYTQRGWNGKKVDDVIEGNWSLKTNGLVSRRNLVYQTIPQNFRFEAGKTYRVTFEYEAGSDNTYAFVVGKGEFQSGRRGTQASNLEMHELPNTWTDSKKAKKVTFLVTGAETGDTWVGIYSTGNASNTRGDAGGNANFRGYNDFMMDNLQIEEITLTGKMLTENALKNYLPTVAMTNYTKESMDALKEAVFNLSQADDDISVEEARAEIAKIEALKNALVQKKTALVAEDFESLDAPAQPGEGLENAFDGNVSSLWHTSWNGGDVGKPATMVLKEPTEITGLRYVPRASDSNGNLRDVKLVVTDESGKEHTFNVTDWPNNNKPKDIDFGKTIKAKKIVLTGTKTYGDGGDKYQSAAELIFTRPQVAETPLDLSGYEAALAKAQKLTDKDNQEEVASVQASMKYATDNHLLTERMVAYFADYLNQLKDSATKPDAPTSSKGEEQPPVLDVPEFKGGVNATEAAVHEVPEFKGGVNAVQALVHELPEYKGGANAVLAAANEVPEYKGGANAVEALVNEKPAYTGVLATAGDQAAPTVEKPEYPLTPSPVADTKTPGAKDEEKLPA
【０１１４】
配列番号１０−追加のＮ末端Ｍｅｔ、Ｃ末端ＧＳＧＬＥ−Ｈｉｓ６ｔａｇ（太字下線）を有し、シグナル配列及びＬＰＸＴＧ細胞壁アンカーモチーフのＣ末端エレメントが除去された、Ｓ．オラリス由来のＯ−グリコシダーゼ
2020522242.tif 000009
【０１１５】
配列番号１１−Ｏ−糖タンパク質特異的エンドプロテアーゼ
EVTVPDALKDRIALKKTARQLNIVYFLGSDTEPVPDYERRLSELLLYLQQFYGKEMQRHGYGARSFGLDIKSPGRVNIIEYKAKNPAAHYPYENGGGWKAAQELDEFFKAHPDRKKSQHTLIIMPTWNDEKNGPDNPGGVPFYGMGRNCFALDYPAFDIKHLGQKTREGRLLTKWYGGMAHELGHGLNLPHNHQTASDGKKYGTALMGSGNYTFGTSPTFLTPASCALLDACEVFSVTPSQQFYEGKPEVEVGDVAISFKGDQILVSGNYKSPQTVKALNVYIQDPPYAVNQDYDAVSFSRRLGKKSGKFSMKIDKKELEGLNNNEFRISLMFILANGLHMQKHFTFHWDALQDYRDGSKS
【０１１６】
配列番号１２−Ｏ−糖タンパク質特異的エンドプロテアーゼ（ＬＳ）
MEVTVPDALKDRIALKKTARQLNIVYFLGSDTEPVPDYERRLSELLLYLQQFYGKEMQRHGYGARSFGLDIKSPGRVNIIEYKAKNPAAHYPYENGGGWKAAQELDEFFKAHPDRKKSQHTLIIMPTWNDEKNGPDNPGGVPFYGMGRNCFALDYPAFDIKHLGQKTREGRLLTKWYGGMAHELGHGLNLPHNHQTASDGKKYGTALMGSGNYTFGTSPTFLTPASCALLDACEVFSVTPSQQFYEGKPEVEVGDVAISFKGDQILVSGNYKSPQTVKALNVYIQDPPYAVNQDYDAVSFSRRLGKKSGKFSMKIDKKELEGLNNNEFRISLMFILANGLHMQKHFTFHWDALQDYRDGSKSGSGHHHHHH
【０１１７】
配列番号１３−配列番号１０をコード
ATGGACCAAGCGCGTGTGGGTAGCACCGATAACCTGCCGAGCGAGCTGGCGGATCTGGACAAGAAAGCGAGCGACGAAGGCCACGATTTTGACAAAGAGGCGGCGGCGCAGAACCCGGGTAGCGCGGAAACCACCGAAGGTCCGCAGACCGAGGAAGAGCTGCTGGCGCAAGAAAAAGAGAAGAGCGAGAAGCCGAGCAACCTGCCGAAAGAACTGGAGGATAAACTGGAAAAGGCGGAGGACAACGGTCGTGAAGTGGATAAAGACCAGCTGGCGCAAGACACCGGCAAGCTGGTGCCGGAGGATGTTGCGAAAACCACCAACGGTGAACTGAACTACGGCGCGACCGTTAAAATTAAGACCCCGAGCGGCGAGGGTAGCGGTATTGTGGTTGCGAAGGACCTGGTGCTGACCGTTAGCCACAACTTCATTAAGGATAGCCAGGAAGGTAATATCCGTAAAGTGGTTGATAACGACCAAGGCGATGGTGACATCTACAGCATTAGCTATCCGGGCCTGCCGGACGTTAAGTTCAGCAAGAAAGATATCATCCACTGGGACCGTGAGGGTTACCTGAAAGGCTTCAAGAACGATCTGGCGCTGGTGCGTCTGCGTACCGTTCTGGAAAACACCCCGGTTGAGGTGACCAAGAAACCGGTGGTTAAGAAAATTGGTGACAAGCTGCACGTGTTTGGTTATCCGGAGGGCAAACTGAACCCGATCGTGAACACCACCGTTGATTTCGCGGAACCGTACGGCGAGGGTGTTCAGGGCATTGGTTATCAAGGTGGCAAACCGGGCGCGAGCGGTGGCGGTATCTTTGACACCGAAGGCAAGCTGGTTGGCGTGCACCAGAACGGTGTGGTTGGCAAACGTAGCGGCGGTATTCTGTTCAGCCCGGCGCAACTGAAGTGGATTCAGGACCACATGCAAGGTATCAGCAGCGTGAAACCGGCGGATCTGGAAGAGAAAGAGAAGCCGGCGGAAGAGAAACCGAAGGAAGACAAGCCGGCGGCGGCGAAGCCGGAAACCCCGAAAGCGGTTACCCCGGAGTGGCAAACCGTGGCGAACAAGGAACAGCAAGGTACCGTTACCATCCGTGAAGAGAAAGGCGTGCGTTACAACCAGCTGAGCAGCACCGCGCAAAACGATAACGACGGCAAGCCGGCGCTGTTTGAGAAACAGGGTCTGACCGTTGACGCGAACGGCAACGCGACCGTGGATCTGACCTTCAAGGACGATAGCGAAAAAGGCAAGAGCCGTTTCGGCGTTTTTCTGAAATTCAAGGACACCAAAAACAACGTTTTTGTGGGTTACGATCAAGGCGGTTGGTTCTGGGAGTATAAGACCCCGGGTAACAGCACCTGGTACAAGGGTAACCGTGTGGCGGCGCCGGAACCGGGTAGCGTGAACCGTCTGAGCATTACCCTGAAAAGCGACGGCCAGCTGAACGCGAGCAACAACGATGTGAACCTGTTCGACACCGTTACCCTGCCGGGTGCGGTGAACGAAAACCTGAAGAACGAGAAGAAAATCCTGCTGAAAGCGGGCACCTACAGCAACGACCGTACCGTGGTTAGCGTTAAGACCGATAACCAGGAAGGTGTGAAAGCGGACGATACCCCGGCGCAAAAGGAAACCGGTCCGGCGGTGGACGATAGCAAGGTTACCTACGACACCATTCAGAGCAAAGTGCTGAAGGCGGTTATCGATCAAGCGTTTCCGCGTGTGAAAGAGTATACCCTGAACGGTCACACCCTGCCGGGTCAGGTTCAGCAATTTAACCAAGTGTTCATTAACAACCACCGTATCACCCCGGAAGTGACCTATAAGAAAATTAACGAAACCACCGCGGAGTACCTGATGAAGCTGCGTGACGATGCGCACCTGATCAACGCGGAAATGACCGTGCGTCTGCAGGTGGTTGATAACCAACTGCACTTCGACGTGACCAAAATTGTTAACCACAACCAGGTTACCCCGGGTCAAAAGATTGACGATGAGCGTAAACTGCTGAGCACCATCAGCTTTCTGGGCAACGCGCTGGTTAGCGTGAGCAGCGATCAAGCGGGTGCGAAGTTTGATGGTGCGACCATGAGCAACAACACCCACGTTAGCGGTGACGATCACATCGATGTGACCAACCCGATGAAAGACCTGGCGAAGGGTTACATGTATGGCTTTGTTAGCACCGACAAGCTGGCGGCGGGTGTGTGGAGCAACAGCCAAAACAGCTACGGCGGTGGCAGCAACGATTGGACCCGTCTGACCGCGTATAAAGAAACCGTTGGTAACGCGAACTACGTGGGCATTCACAGCAGCGAATGGCAGTGGGAGAAAGCGTACAAGGGTATCGTGTTCCCGGAATATACCAAGGAGCTGCCGAGCGCGAAAGTGGTTATCACCGAGGATGCGAACGCGGACAACAAAGTGGATTGGCAGGACGGTGCGATTGCGTACCGTAGCATCATGAACAACCCGCAAGGCTGGGAAAAAGTTAAGGACATTACCGCGTATCGTATCGCGATGAACTTTGGTAGCCAGGCGCAAAACCCGTTCCTGATGACCCTGGACGGCATCAAGAAAATTAACCTGCACACCGATGGCCTGGGTCAGGGCGTTCTGCTGAAGGGTTATGGTAGCGAGGGTCATGACAGCGGTCACCTGAACTACGCGGATATCGGTAAACGTATTGGTGGCGTGGAAGACTTTAAGACCCTGATTGAGAAAGCGAAGAAATACGGTGCGCACCTGGGCATCCACGTTAACGCGAGCGAAACCTACCCGGAGAGCAAGTATTTCAACGAAAACATTCTGCGTAAAAACCCGGACGGTAGCTACAGCTATGGCTGGAACTGGCTGGATCAGGGTATCAACATTGATGCGGCGTACGACCTGGCGCATGGCCGTCTGGCGCGTTGGGAGGACCTGAAGAAAAAGCTGGGTGAAGGCCTGGATTTTATCTATGTTGACGTGTGGGGTAACGGTCAGAGCGGTGATAACGGTGCGTGGGCGACCCATGTGCTGGCGAAAGAGATTAACAAGCAAGGTTGGCGTTTTGCGATCGAATGGGGCCACGGTGGCGAGTACGACAGCACCTTCCAGCACTGGGCGGCGGATCTGACCTACGGTGGCTATACCAACAAGGGTATCAACAGCGCGATTACCCGTTTCATCCGTAACCACCAGAAAGATAGCTGGGTTGGCGACTACCGTAGCTATGGTGGCGCGGCGAACTACCCGCTGCTGGGTGGCTATAGCATGAAGGACTTTGAGGGTTGGCAAGGCCGTAGCGATTACAACGGTTATGTTACCAACCTGTTCGCGCACGACGTGATGACCAAGTACTTTCAGCACTTCACCGTTAGCAAATGGGAAAACGGTACCCCGGTGACCATGACCGATAACGGCAGCACCTATAAGTGGACCCCGGAAATGAAAGTGGAGCTGGTTGACGCGGCGGGTAACAAGGTGGTTGTGACCCGTAAAAGCAACGATGTGAACAGCCCGCAGTACCGTGAGCGTACCGTTACCCTGAACGGTCGTGTGATCCAAGACGGCAGCGCGTATCTGACCCCGTGGAACTGGGATGCGAACGGTAAAAAGCTGCCGACCGAAAAAGAGAAGATGTACTATTTTAACACCCAAGCGGGTGCGACCACCTGGACCCTGCCGAGCGACTGGGCGAACAGCAAGGTTTACCTGTATAAACTGACCGATCAGGGCAAGACCGAGGAGCAAGAACTGACCGTGACCGATGGCAAAATTACCCTGGACCTGCTGGCGAACCAGCCGTACGTTCTGTATCGTAGCAAGCAAACCAACCCGGAAATGAGCTGGAGCGAGGGTATGCACATCTACGACCAAGGTTTCAACAGCGGCACCCTGAAACACTGGACCATTAGCGGCGATGCGAGCAAGGCGGAGATCGTGAAAAGCCAGGGTGCGAACGAAATGCTGCGTATCCAAGGCAACAAAAGCAAGGTTAGCCTGACCCAGAAGCTGACCGGTCTGAAACCGAACACCAAGTACGCGGTTTATGTGGGCGTTGACAACCGTAGCAACGCGAAAGCGAGCATTACCGTTAACACCGGTGAAAAAGAGGTGACCACCTACACCAACAAGAGCCTGGCGCTGAACTACATCAAAGCGTATGCGCACAACAACCGTCGTGAGAACGCGACCGTGGACGATACCAGCTACTTCCAGAACATGTATGCGTTCTTTACCACCGGTAGCGACGTGAGCAACGTTACCCTGACCCTGAGCCGTGAAGCGGGCGATGAGGCGACCTATTTTGACGAAATTCGTACCTTCGAGAACAACAGCAGCATGTACGGTGATAAGCACGACACCGGTCAGGGCACCTTTAAACAAGATTTCGAAAACGTTGCGCAAGGTATCTTCCCGTTTGTTGTGGGTGGCGTGGAAGGCGTTGAGGACAACCGTACCCACCTGAGCGAGAAGCACGATCCGTACACCCAGCGTGGTTGGAACGGCAAAAAGGTGGACGATGTTATTGAGGGTAACTGGAGCCTGAAAACCAACGGCCTGGTTAGCCGTCGTAACCTGGTGTACCAGACCATCCCGCAAAACTTCCGTTTTGAGGCGGGCAAGACCTACCGTGTGACCTTTGAATATGAGGCGGGCAGCGACAACACCTATGCGTTTGTTGTGGGTAAAGGCGAATTCCAGAGCGGTCGTCGTGGCACCCAAGCGAGCAACCTGGAAATGCACGAGCTGCCGAACACCTGGACCGATAGCAAAAAGGCGAAAAAGGTGACCTTCCTGGTTACCGGTGCGGAAACCGGTGACACCTGGGTGGGTATCTACAGCACCGGCAACGCGAGCAACACCCGTGGTGATGCGGGTGGCAACGCGAACTTTCGTGGCTATAACGATTTCATGATGGACAACCTGCAAATCGAAGAGATTACCCTGACCGGCAAGATGCTGACCGAAAACGCGCTGAAAAACTATCTGCCGACCGTTGCGATGACCAACTACACCAAGGAAAGCATGGACGCGCTGAAAGAGGCGGTTTTCAACCTGAGCCAGGCGGACGATGACATCAGCGTGGAAGAGGCGCGTGCGGAAATCGCGAAGATTGAGGCGCTGAAAAACGCGCTGGTTCAGAAAAAGACCGCGCTGGTTGCGGAAGATTTTGAGAGCCTGGATGCGCCGGCGCAACCGGGTGAAGGCCTGGAGAACGCGTTCGACGGTAACGTTAGCAGCCTGTGGCACACCAGCTGGAACGGTGGCGATGTTGGCAAGCCGGCGACCATGGTGCTGAAAGAACCGACCGAGATCACCGGTCTGCGTTATGTGCCGCGTGCGAGCGATAGCAACGGCAACCTGCGTGACGTTAAGCTGGTTGTGACCGATGAAAGCGGTAAAGAGCACACCTTTAACGTGACCGACTGGCCGAACAACAACAAACCGAAGGATATTGACTTCGGCAAAACCATTAAGGCGAAAAAGATCGTTCTGACCGGTACCAAGACCTACGGCGATGGTGGCGACAAATATCAGAGCGCGGCGGAGCTGATCTTTACCCGTCCGCAAGTGGCGGAAACCCCGCTGGATCTGAGCGGTTACGAAGCGGCGCTGGCGAAAGCGCAGAAGCTGACCGATAAGGACAACCAGGAAGAGGTGGCGAGCGTTCAAGCGAGCATGAAATATGCGACCGACAACCACCTGCTGACCGAACGTATGGTTGCGTACTTCGCGGATTATCTGAACCAACTGAAGGATAGCGCGACCAAACCGGATGCGCCGACCAGCAGCAAGGGTGAAGAACAGCCGCCGGTGCTGGATGTTCCGGAGTTTAAAGGTGGCGTGAACGCGACCGAGGCGGCGGTGCACGAAGTTCCGGAGTTCAAGGGTGGCGTGAACGCGGTTCAGGCGCTGGTTCACGAACTGCCGGAGTATAAAGGTGGCGCGAACGCGGTTCTGGCGGCGGCGAACGAAGTGCCGGAGTACAAGGGTGGCGCGAACGCGGTGGAAGCGCTGGTTAACGAGAAACCGGCGTATACCGGTGTTCTGGCGACCGCGGGCGACCAGGCGGCGCCGACCGTGGAAAAACCGGAGTACCCGCTGACCCCGAGCCCGGTTGCGGACACCAAAACCCCGGGTGCGAAAGATGAAGAGAAGCTGCCGGCGGGTAGCGGCCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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