(57)【要約】  本発明は、タンパク質、例えばFc融合タンパク質または抗体の精製方法であって、前記タンパク質と不純物とを含むサンプルから、ヒドロキシアパタイトおよび／またはフルオロアパタイト含有材料上でのクロマトグラフィーを含む、３本のクロマトグラフィーカラム法の使用を通して精製する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質と不純物とを含有するサンプルからタンパク質を精製する方法であって、
(a)タンパク質と不純物とを含有するサンプルを、プロテインＡクロマトグラフィー材料（樹脂または膜のいずれか）と、該タンパク質が該クロマトグラフィー材料に結合し、かつ該不純物の少なくとも一部分が該クロマトグラフィー材料に結合しないような条件下で、接触させる工程；
(b)前記プロテインＡクロマトグラフィー材料から前記タンパク質を溶出させて溶出液を取得する工程；
(c)第一の混合モードクロマトグラフィー材料（樹脂または膜のいずれか）上に、前記タンパク質が該クロマトグラフィー材料に結合せず、かつ残りの不純物の少なくとも一部分が該クロマトグラフィー材料に結合するような条件下で、工程(b)の溶出液をロードする工程；
(d)回収される素通り液が工程(b)の溶出液よりも低レベルの不純物を含むような条件下で、前記タンパク質を含む素通り液を回収する工程；
(e)工程(d)のタンパク質を含む回収された素通り液を、第二の混合モードクロマトグラフィー材料（樹脂または膜のいずれか）上に、該タンパク質が該クロマトグラフィー材料に結合せず、かつ残りの不純物の少なくとも一部分が該クロマトグラフィー材料に結合するような条件下で、ロードする工程；および
(f)回収される素通り液が工程(d)の回収された素通り液よりも低レベルの不純物を含むような条件下で、前記タンパク質を含む素通り液を回収する工程
を含む方法。
【請求項２】
単量体形のタンパク質を取得する方法であって、
(a)単量体形、凝集形または断片化形のタンパク質を含有する試料を、プロテインＡクロマトグラフィー材料（樹脂または膜のいずれか）と、単量体形の該タンパク質が該クロマトグラフィー材料に結合し、かつ該凝集形と断片化形の少なくとも一部分が該クロマトグラフィー材料に結合しないような条件下で、接触させる工程；
(b)前記プロテインＡクロマトグラフィー材料から単量体形の前記タンパク質を溶出させて溶出液を取得する工程；
(c)第一の混合モードクロマトグラフィー材料（樹脂または膜のいずれか）上に、単量体形の前記タンパク質が該クロマトグラフィー材料に結合せず、かつ残りの凝集形と断片化形の少なくとも一部分が該クロマトグラフィー材料に結合するような条件下で、工程(b)の溶出液をロードする工程；
(d)回収される素通り液が工程(b)の溶出液よりも低レベルの凝集形と断片化形を含むような条件下で、単量体形の前記タンパク質を含む素通り液を回収する工程；
(e)工程(d)の単量体形のタンパク質を含む回収された素通り液を、第二の混合モードクロマトグラフィー材料（樹脂または膜のいずれか）上に、単量体形の該タンパク質が該クロマトグラフィー材料に結合せず、かつ残りの凝集形と断片化形の少なくとも一部分が該クロマトグラフィー材料に結合するような条件下で、ロードする工程；および
(f)回収される素通り液が工程(d)の回収された素通り液よりも低レベルの凝集形と断片化形を含むような条件下で、単量体形の前記タンパク質を含む素通り液を回収する工程
を含む方法。
【請求項３】
前記タンパク質がFc融合タンパク質または抗体である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記タンパク質が組換え哺乳動物細胞において生産されたものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
工程(c)または(e)の混合モードクロマトグラフィー材料が、次の機能：カチオン交換、アニオン交換、疎水性相互作用、親水性相互作用、水素結合、π−π結合および金属親和性、のうちの２以上の組み合わせを提供する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
工程(c)の混合モードクロマトグラフィー材料が、Capto（登録商標）-MMCおよびCapto（登録商標）-adhereから成る群より選択され、そして工程(e)の混合モードクロマトグライー材料が、ヒドロキシアパタイトベースのリガンド、ヒドロキシフルオロアパタイトベースのリガンド、またはフルオロアパタイトベースのリガンドから成る群より選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
工程(e)の混合モードクロマトグラフィー材料が、CFT I型またはCFT II型のフルオロアパタイトリガンドである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
工程(a)においてプロテインＡクロマトグラフィー材料と接触させるべき、タンパク質を含むサンプルが、水溶液中のものである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記プロテインＡクロマトグラフィー材料が、工程(a)の前に、20〜30 mMのリン酸ナトリウムおよび100〜200 mMの濃度の塩を含みかつ6.5〜約7.5の範囲のpHを有する水性緩衝液を用いて平衡化される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
工程(b)の溶出が、40〜70 mMの酢酸を含み3.0〜約3.5の範囲のpHの溶出バッファーを用いて実施される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
工程(b)の溶出液をロードする前に、工程(c)の混合モードクロマトグラフィー材料が、30〜50 mMのリン酸ナトリウム、80〜120 mMの濃度の塩、および7.5〜約8.5の範囲のpHを含む水性緩衝液を用いて平衡化される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
工程(d)の回収された素通り液をロードする前に、工程(e)の混合モードクロマトグラフィー材料が、1〜10 mMのリン酸ナトリウム、場合により130〜200 mMの濃度の塩、および7.0〜約8.0の範囲のpHを含む水性緩衝液を用いて平衡化される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記塩が塩化ナトリウムである、請求項９、１１および１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記不純物が、精製すべきタンパク質の凝集体もしくは断片またはそれらの混合物、１つ以上の宿主細胞タンパク質、エンドトキシン、ウイルス、核酸分子、脂質、多糖、およびそれらの任意組み合わせから成る群の少なくとも１つより選択される、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Fc融合タンパク質または抗体などのタンパク質を、ヒドロキシアパタイトおよび／またはフルオロアパタイトを含有する材料上でのクロマトグラフィーを含む、３種のクロマトグラフィーカラムの使用を通して、前記タンパク質と不純物とを含むサンプルから該タンパク質を精製する方法に関する。本発明は、本発明の方法により得られる精製タンパク質を含有する医薬組成物にも関する。
【背景技術】
【０００２】
融合タンパク質や抗体などのタンパク質を治療用途に向けて生産する時には、毒性となり得ることからプロセス関連不純物（製造工程由来不純物）を除去することが重要である。プロセス関連不純物は、典型的にはHCP（宿主タンパク質）、DNAおよびrPA（残留プロテインＡ）から成る。HCPは重大な不純物の源であり、分子量、等電点および構造の面でそれらの複雑性と不均一性が高いために、深刻な課題を突き付けうる。よって、ごく低レベルのHCPだけを示す治療用タンパク質を取得することが必要であり、下流（ダウンストリーム）工程（すなわち精製工程）の間にHCPを低減する技術の最適化に特に重点が置かれるだろう。更に、下流工程は、対応する上流（アップストリーム）工程により生産される品質と適合するような形で調整しなければならない。凝集体やタンパク質断片のような生成物関連の不純物も、どんな種類の治療タンパク質についても最小レベルに抑えなければならない。
【０００３】
バイオシミラーを創出しようと目指す者にとって、考慮されるべきさらなる要因として、電荷変異体がある。実際、酸性および塩基性電荷変異体の含有量は、「標準規格品（Reference Product）」により規定されるバイオシミラーのコリドー（回廊）内になければならない。電荷変異体が上流並びに下流工程により変動しうるということを考慮すると、下流工程はこの課題に適合させなければならない。
【０００４】
その上、どんな種類の治療用タンパク質に関しても、精製は各プロセス工程での、プロセス関連のタンパク損失を最小にし、かつ許容できる収率を目標とすべきである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
品質基準に従って、精製工程によるタンパク損失を最小に抑えながら、生成物およびプロセス関連不純物の全体のクリアランス(clearance)を保証する、最適な精製順序を発見することが必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一態様では、本発明は、Fc融合タンパク質または抗体などのタンパク質を含有するサンプルから、前記タンパク質を精製する方法であって、次の工程：(a)タンパク質と不純物とを含有するサンプルを、プロテインＡクロマトグラフィー材料（樹脂または膜のいずれか）と、該タンパク質が該クロマトグラフィー材料に結合し、かつ該不純物の少なくとも一部分が該クロマトグラフィー材料に結合しないような条件下で、接触させ；(b)前記プロテインＡクロマトグラフィー材料から前記タンパク質を溶出させて溶出液を取得し；(c)第一の混合モードのクロマトグラフィー材料（樹脂または膜のいずれか）上に、前記タンパク質が該クロマトグラフィー材料に結合せず、かつ残りの不純物の少なくとも一部分が該クロマトグラフィー材料に結合するような条件下で、工程(b)の溶出液をロードし；(d)回収される素通り液（flowthrough）が工程(b)の溶出液よりも低レベルの不純物を含むような条件下で、前記タンパク質を含む素通り液を回収し；(e)工程(d)のタンパク質を含む回収された素通り液を、第二の混合モードのクロマトグラフィー材料（樹脂または膜のいずれか）上に、該タンパク質が該クロマトグラフィー材料に結合せず、かつ残りの不純物の少なくとも一部分が該クロマトグラフィー材料に結合するような条件下で、ロードし；そして(f)回収される素通り液が、工程(d)の回収された素通り液よりも低レベルの不純物を含むような条件下で、前記タンパク質を含む素通り液を回収することを含む方法が提供される。
【０００７】
別の態様では、本発明は、単量体形のタンパク質を取得する方法であって、次の工程：(a)単量体形、凝集形または断片化形のタンパク質を含有する試料を、プロテインＡクロマトグラフィー材料（樹脂または膜のいずれか）と、単量体形の該タンパク質が該クロマトグラフィー材料に結合し、かつ該凝集形と断片化形の少なくとも一部分が該クロマトグラフィー材料に結合しないような条件下で、接触させ；(b)前記プロテインＡクロマトグラフィー材料から単量体形の前記タンパク質を溶出させ、溶出液を得て；(c)第一の混合モードのクロマトグラフィー材料（樹脂または膜のいずれか）上に、単量体形の前記タンパク質が該クロマトグラフィー材料に結合せず、かつ残りの凝集形と断片化形の少なくとも一部分が該クロマトグラフィー材料に結合するような条件下で、工程(b)の溶出液をロードし；(d)回収される素通り液が工程(b)の溶出液よりも低レベルの凝集形と断片化形を含むような条件下で、単量体形の前記タンパク質を含む素通り液を回収し；(e)工程(d)の単量体形のタンパク質を含む回収された素通り液を、第二の混合モードのクロマトグラフィー材料（樹脂または膜のいずれか）上に、単量体形の該タンパク質が該クロマトグラフィー材料に結合せず、かつ残りの凝集形と断片化形の少なくとも一部分が該クロマトグラフィー材料に結合するような条件下で、ロードし；そして(f)回収される素通り液が工程(d)の回収された素通り液より低レベルの凝集形と断片化形を含むような条件下で、単量体形の前記タンパク質を含む素通り液を回収することを含む方法が提供される。
【０００８】
本発明に従って精製すべきタンパク質（目的のタンパク質とも称する）は、Fc融合タンパク質（目的のFc融合タンパク質とも称する）または抗体（目的の抗体とも称する）であることができる。Fc融合タンパク質は、好ましくはFc部分を含むか、または抗体成分に基づいた融合タンパク質である。目的の抗体はキメラ抗体、ヒト化抗体または完全ヒト抗体、または他の種の抗体、例えばSEEDbodyであることができる。
【０００９】
本発明の混合モードクロマトグラフィー材料（クロマトグラフィー支持体とも称する）は、樹脂または膜の形態をとることができ、そして次の機能：カチオン交換、アニオン交換、疎水性相互作用、親水性相互作用、水素結合の２つ以上の組み合わせを示す。好ましくは、工程(c)の混合モードクロマトグラフィー材料は、例えば、Capto（登録商標）-MMCまたはCapto（登録商標）-adhereから成る群より選択され、そして工程(e)の混合モードクロマトグラフィー材料は、ヒドロキシアパタイトおよび／またはフルオロアパタイトから成る群より選択される。
定義
【００１０】
用語「抗体」およびその複数形の「抗体」は、特に、ポリクローナル抗体、アフィニティー精製ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、および抗原結合フラグメントを包含する。抗体は免疫グロブリンとしても知られる。遺伝子操作された完全抗体またはフラグメント、例えばキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒトまたは完全ヒト抗体、並びに合成抗原結合ペプチドおよびポリペプチドも含まれる。SEEDbodyも含まれる。用語SEEDbody〔SEEDはStrand-Exchange Engineered Domain（鎖交換改変ドメイン）の意で複数形はSEEDbodies〕は、ヒトIgGおよびIgA CH3ドメインの誘導体を含む特定のタイプの抗体を指し、ヒトIgGとIgA CH3配列の交互のセグメントから構成される相補的ヒトSEED CH3ヘテロ二量体を構築する。それらは非対称の融合タンパク質である。SEEDbodiesとSEED技術は、Davis他、2010（[1]または米国特許8,871,912号明細書[2]）に記載されており、それらの全内容が参考として組み込まれる。
【００１１】
用語「モノクローナル抗体」は、独特の親細胞のクローンである抗体をいう。用語「ヒト化」免疫グロブリン（または「ヒト化抗体」）は、ヒトフレームワーク領域と非ヒト（通常はマウスまたはラット）免疫グロブリン由来の１つ以上のCDRとを含む免疫グロブリンを指す。CDRを提供する非ヒト免疫グロブリンは「供与体（ドナー）」と呼ばれ、そしてフレームワークを提供するヒト免疫グロブリンは「受容体（アクセプター）」と呼ばれ（非ヒトCDRをヒトフレームワークと定常領域上にグラフトすることによるヒト化、または完全非ヒト可変ドメインをヒト定常領域上に組み込むことによるヒト化（キメラ化））と呼ばれる。定常領域はその完全体で存在する必要はないが、もしそうならば、それらはヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同等でなければならず、すなわち少なくとも約85〜90％、好ましくは約95％以上同一でなければならない。よって、CDRと重鎖定常領域中の可能な数残基を除いた、ヒト化免疫グロブリンの全ての部分が、エフェクター機能の活性調節（モジュレーション）が必要ならば、天然のヒト免疫グロブリン配列の対応部分と実質的に同一である。抗体をヒト化することを通して、生物学的半減期が増加され、ヒトへの投与によって不利な免疫反応を起こす可能性が低減され得る。
【００１２】
用語「完全にヒトの」免疫グロブリン（または「完全ヒト」抗体）は、ヒトフレームワーク領域とヒトCDRの両方を含む免疫グロブリンを指す。定常領域は完全体で存在する必要はないが、もしそうならば、それらはヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同等でなければならず、すなわち少なくとも約85〜90％、好ましくは約95％以上同一でなければならない。よって、重鎖定常領域中の可能な数残基を除いた、完全ヒト免疫グロブリンの全ての部分が、エフェクター機能または薬物動態的性質の活性調節（モジュレーション）が必要ならば、天然のヒト免疫グロブリン配列の対応部分と実質的に同一である。ある場合には、抗体の結合親和性を改善するためおよび／または免疫原性を減らすためおよび／または生化学的／生物物理学的性質を改善するために、CDR、フレームワーク領域または定常領域中にアミノ酸変異を導入することが可能である。
【００１３】
用語「組換え抗体」（または「組換え免疫グロブリン」）は、組換え技術により産生された抗体を意味する。抗体の創製における組換えDNA技術の適用可能性のため、天然抗体に見られるアミノ酸配列に限定する必要はない；抗体は所望の特性を得るために再設計することができる。可能な変異は多数あり、ただ１つまたは数個のアミノ酸の変更から、例えば可変ドメインもしくは定常領域の完全な再設計にまで及ぶことができる。定常領域中の変異は、一般に、補体の固定化のような性質（例えば補体依存性細胞傷害、CDC）、Fc受容体との相互作用、および他のエフェクター機能（例えば抗体依存性細胞傷害、ADCC）、薬物動態的特性（例えば新生児Fc受容体FcRnへの結合）を改善、低減または変更するために作製されるだろう。可変ドメイン中の変異は、抗原結合特性を改善するために作製されるだろう。抗体に加えて、免疫グロブリンは多数の他の形態、例えばダイアボディ、直鎖状抗体、多価または多特異性ハイブリッド抗体の形で存在してもよい。
【００１４】
用語「単量体形」、「凝集形」および「断片化された形」は、普通の一般的知識の通りに解釈されるだろう。従って、用語「単量体形」は、Fc融合タンパク質または第二の類似分子を伴わない抗体を指し、用語「凝集形」（高分子量種；HMWとも称する）は、第二の類似分子と共有結合的にまたは非共有結合的に会合している抗体またはFc融合タンパク質を指し、そして用語「断片化された形」（低分子量種；LMWとも称する）は、Fc融合タンパク質または抗体の単一部分（例えば軽鎖および／または重鎖）を指す。「単量体形」は、該タンパク質（例えばFc融合タンパク質または抗体）が100％単量体形であることを意味するわけではなく、単に本質的に単量体形であること、すなわち少なくとも95％が単量体形、または好ましくは97％が単量体形、または更により好ましくは少なくとも98％が単量体形であることを意味する。単量体形、凝集形および断片化された形の間にはバランスがある（３つの種の総量＝100％）ため、凝集体と断片化形が減ると、単量体形が増加する。
【００１５】
「全精製率（total purification factor）」は、目的のタンパク質（例えば単量体形の）のより高度な精製をもたらす、分析される種についての「全減少率（total reduction factor）」を指す。全精製率が高くなればなるほどよい。
【００１６】
用語「Fc融合タンパク質」は、Fc部分または抗体部分のいずれかを含む、単一のタンパク質を与える少なくとも2つのタンパク質または少なくとも2つのタンパク質フラグメントの組合せ(融合とも称す)を包含する。
【００１７】
用語「緩衝液（バッファー）」は、当該技術に従って用いられる。「平衡化バッファー」は、精製すべきサンプルを受け入れるクロマトグラフィー材料を調製するために用いられるバッファーである。「ローディングバッファー」は、サンプルをクロマトグラフィー材料上またはフィルター上にロード（負荷）するために用いられるバッファーを指す。「洗浄バッファー」は、樹脂を洗浄するために用いられるバッファーである。クロマトグラフィーの形式に依存して、不純物の除去（結合／溶出モード(in bind/elute mode)）または精製サンプルの収集（フロースルーモード（in flowthrough mode））を可能にするだろう。「溶出バッファー」は、サンプルをクロマトグラフィー材料から解離させるために用いられるバッファーである。これは、ロード／洗浄バッファーと溶出バッファーとの間のイオン強度の変化によるものである。このようにして抗体を含む精製サンプルが溶出液として回収される。
【００１８】
「樹脂」または「膜」などの「クロマトグラフィー材料」（クロマトグラフィー支持体とも呼称される）という用語は、精製すべき分子を不純物から分離できるようにする任意の固相／膜を指す。前記樹脂、膜またはクロマトグラフィー材料は、アフィニティー、アニオン、カチオン、疎水性または混合モードの樹脂／クロマトグラフィー材料であることができる。
【００１９】
本発明に従って生産できる既知抗体の例としては、限定されないが、アダリムマブ、アレムツズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、ベリムマブ、ベバシズマブ、カナキヌマブ、セルトリズマブペゴール、セツキシマブ、デノスマブ、エクリズマブ、ゴリムマブ、インフリキシマブ、ナタリズマブ、ニボルマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、ペムブロリズマブ、ペルツズマブ、ピジリズマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、シルツキシマブ、トシリズマブ、トラスツズマブ、ウステキヌマブ、またはベドリゾマブが挙げられる。
【００２０】
単位、接頭辞および記号は、標準（国際単位規格（SI)）に従って使用される。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
Ａ．総論
本発明者らは、「プロテインＡクロマトグラフィー」に続くフロースルーモードでの第一の「混合モードクロマトグラフィー」に続くフロースルーモードでの第二の「混合モードクロマトグラフィー」のシーケンス（順序）の使用が、HCPを許容範囲に維持しながら、特にタンパク質サンプル中の、凝集体や低分子量種のような不純物の量を減らすことができることを発見した。本発明の方法に従って精製しようとするタンパク質（例えば抗体またはFc融合タンパク質）のサンプルは、好ましくは、採集と同時にまたは採集後に得られ、精製前の一定の時間の間維持されるだろう。
【００２２】
従って、第一の態様では、本発明は、タンパク質と不純物を含むサンプルからタンパク質を精製する方法であって、該方法は次の工程：（a)タンパク質と不純物を含むサンプルを、アフィニティークロマトグラフィー材料（樹脂または膜のいずれか）と、該タンパク質が該クロマトグラフィー材料に結合し、かつ前記不純物の少なくとも一部分が該クロマトグラフィー材料に結合しないような条件下で、接触させ；(b)前記アフィニティークロマトグラフィー材料から前記タンパク質を溶出させて溶出液を取得し；(c)第一の混合モードのクロマトグラフィー材料（樹脂または膜のいずれか）上に、前記タンパク質が該クロマトグラフィー材料に結合せず、かつ残りの不純物の少なくとも一部分が該クロマトグラフィー材料に結合するような条件下で、工程(b)の溶出液をロードし；(d)回収される素通り液が工程(b)の溶出液よりも低レベルの不純物を含むような条件下で、前記タンパク質を含む素通り液を回収し；(e)工程(d)のタンパク質を含む回収された素通り液を、第二の混合モードのクロマトグラフィー材料（樹脂または膜のいずれか）上に、該タンパク質が該クロマトグラフィー材料に結合せず、かつ残りの不純物の少なくとも一部分が該クロマトグラフィー材料に結合するような条件下で、ロードし；そして(f)回収される素通り液が、工程(d)の回収された素通り液よりも低レベルの不純物を含むような条件下で、前記タンパク質を含む素通り液を回収することを含む方法が提供される。
【００２３】
第二の態様では、本発明は、単量体形のタンパク質を取得する方法であって、次の工程(a)単量体形、凝集形または断片化形のタンパク質を含有するサンプルを、アフィニティークロマトグラフィー材料（樹脂または膜のいずれか）と、単量体形の該タンパク質が該クロマトグラフィー材料に結合し、かつ該凝集形と断片化形の少なくとも一部分が該クロマトグラフィー材料に結合しないような条件下で、接触させ；(b)前記アフィニティークロマトグラフィー材料から単量体形の前記タンパク質を溶出させて溶出液を取得し；(c)第一の混合モードクロマトグラフィー材料（樹脂または膜のいずれか）上に、単量体形の前記タンパク質が該クロマトグラフィー材料に結合せず、かつ残りの凝集形と断片化形の少なくとも一部分が該クロマトグラフィー材料に結合するような条件下で、工程(b)の溶出液をロードし；(d)回収される素通り液が工程(b)の溶出液よりも低レベルの凝集形と断片化形を含むような条件下で、単量体形の前記タンパク質を含む素通り液を回収し；(e)工程(d)の単量体形のタンパク質を含む回収された素通り液を、第二の混合モードのクロマトグラフィー材料（樹脂または膜のいずれか）上に、単量体形の該タンパク質が該クロマトグラフィー材料に結合せず、かつ残りの凝集形と断片化形の少なくとも一部分が該クロマトグラフィー材料に結合するような条件下で、ロードし；そして(f)回収される素通り液が工程(d)の回収された素通り液より低レベルの凝集形と断片化形を含むような条件下で、単量体形の前記タンパク質を含む素通り液を回収することを含む方法を記載する。
【００２４】
全体としての本発明の状況では、除去すべき不純物は、好ましくは、目的のタンパク質もしくは前記目的のタンパク質の断片またはそれらの混合物、１以上の宿主タンパク質、エンドトキシン、ウイルス、核酸分子、脂質、多糖、およびそれらの任意組み合わせを含むまたはから成る群より選択される。
【００２５】
本発明に従って精製すべきタンパク質は、任意の種類の抗体、例えばモノクローナル抗体、またはFc融合タンパク質であることができる。目的のタンパク質がFc融合タンパク質である時、それはFc部分を含むか、または抗体成分からもしくは抗体フラグメントから誘導され、そして前記抗体成分またはフラグメントの少なくともCH2／CH3ドメインを含む。目的のタンパク質がモノクローナル抗体である時、それはキメラ抗体、ヒト化抗体または完全ヒト抗体またはそれの任意フラグメントであることができる。精製すべき目的のタンパク質は、原核または真核細胞、例えば細菌、酵母細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞において最初に生産させることができる。好ましくは、目的のタンパク質は組換え哺乳動物細胞において生産された。前記哺乳動物宿主細胞（本明細書中では哺乳動物細胞とも称する）としては、限定されないが、HeLa、Cos、3T3、骨髄腫細胞系（例えばNS0、SP2/0）およびチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞が挙げられる。好ましい実施形態では、宿主細胞はチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、例えばCHO-S細胞およびCHO-k1細胞である。本発明において使用される細胞系（「組換え細胞」または「宿主細胞」とも称される）は、目的のタンパク質を発現するように遺伝子操作されている。目的のポリペプチドを発現させるための細胞および／または細胞系の遺伝子操作のための方法およびベクターは、当業者に周知である；例えば、様々な技術がSambrook他（[3]）またはAusbel他（[4]）中に例示されている。前記方法に従って生産された目的のタンパク質は組換えタンパク質と呼ばれる。組換えタンパク質は一般に培地中に分泌され、該培地からそれらを回収することができる。回収されたタンパク質は次いで、既知の方法と商業的供給業者より入手可能な製品を使って、精製または部分精製することができる。精製されたタンパク質は、医薬組成物として製剤化することができる。医薬組成物のための適当な処方は、Remington's Pharmaceutical Sciences (1995および改訂版；[5]）中に記載されたものを含む。
【００２６】
典型的には、精製すべきタンパク質を含むサンプルが、標準手順の通りに採集した後で通常は冷蔵条件（典型的には２℃〜８℃）下で保存されるので、２〜８℃で実施／開始されるローディング工程（a）を除いて、本発明による方法は室温（15℃〜25℃の間）で実施される。
【００２７】
精製抗体を含む工程(f)の回収サンプルは、好ましくは、工程(a)のサンプル中の凝集体レベルよりも少なくとも50％低いレベルで、好ましくは工程(a)のサンプル中の凝集体レベルよりも少なくとも60％低いレベルで、更に好ましくは工程(a)のサンプル中の凝集体レベルよりも少なくとも70％低いレベルで、更に好ましくは工程(a)のサンプル中の凝集体レベルよりも少なくとも80％低いレベルで、凝集体を含む。同様に、前記回収されたサンプルは、好ましくは工程(a)のサンプル中のフラグメントのレベルよりも少なくとも10％低いレベルで、または更に好ましくは工程(a)のサンプル中のフラグメントのレベルよりも少なくとも20％低いレベルで、フラグメントを含む。HCPは、好ましくは100 ppmの典型的許容限界より低いレベルで含まれる。
【００２８】
好ましくは、本明細書に記載の精製方法は３以上のクロマトグラフィー工程を含まない。より好ましくは、本明細書に記載の精製方法は、３つのクロマトグラフィー工程（すなわちアフィニティークロマトグラフィー工程と２つの混合モードのクロマトグラフィー工程）のみから成り、所望によりろ過工程および／または別のウイルス不活性化工程を含む。更により好ましくは、本明細書に記載の精製方法は、特定モード、すなわち結合／溶出モードでのアフィニティークロマトグラフィー、フロースルーモードでの２つの混合モードクロマトグライー工程および場合によりろ過工程および／または別のウイルス不活性化工程に従って実施される。
【００２９】
本明細書に記載の精製方法は、工程の一部または全部が「逐次的」または連続モードで実施することができる。
Ｂ．アフィニティークロマトグラフィー工程（工程(a)と(b)）
B.1. 総論
【００３０】
用語「プロテインＡクロマトグラフィー」とは、プロテインＡを使ったアフィニティークロマトグラフィー技術を言い、その場合、プロテインＡは通常、固相上に固定化される。プロテインＡは、細菌の黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）の細胞壁中に最初に見つかった表面タンパク質である。現在は天然由来のまたは恐らく幾つかの突然変異を含む組換え生産された様々な種のプロテインＡが存在する。このタンパク質はIgG抗体や任意のFc融合タンパク質などの免疫グロブリンのFc部分に特異的に結合する能力を有する。
【００３１】
プロテインＡクロマトグラフィーは、抗体およびFc融合タンパク質を精製するために用いられる最も汎用型のアフィニティークロマトグラフィーの１つである。典型的には、精製すべき溶液からの抗体（またはFc融合タンパク質）は、それらのFc部分を介してプロテインＡに可逆的に結合する。それに対して、不純物はカラムを素通りし、洗浄工程によって除去される。よって、抗体（またはFc融合タンパク質）は、カラムからまたはアフィニティー樹脂から溶出させて、次の精製工程のために回収する必要がある。
【００３２】
本発明との関連での工程(a)のプロテインＡクロマトグラフィー材料は、概して、例えばMABSELECTTM、MABSELECTTM SuRe、MABSELECTTM SuRe LX、AMSPHERETM A3、TOYOPEARL（登録商標）AF-rProtein A-650F、TOYOPEARL（登録商標）AF-HC、PROSEP（登録商標）-vA、PROSEP（登録商標）-vA Ultra、PROSEP（登録商標）Ultra PlusまたはESHMUNO-A（登録商標）およびそれらの任意組み合わせから成る群より選択されるが、それに限定されない。幾つかの実施形態では、プロテインＡリガンドは、デキストランベースの母材、アガロースベースの母材、ポリスチレンベースの母材、親水性ポリビニルエチルベースの母材、硬質ポリメタクリレートベースの母材、多孔質ポリマーベースの母材、粒孔制御ガラスベースの母材、およびそれらの任意組み合わせから成る群より選択された樹脂上に固定化される。あるいは、プロテインＡリガンドは、膜上に固定化することができる。
【００３３】
この工程の目的は、清澄化した（clarified）収集物中に存在する目的のタンパク質を捕捉し、それらを濃縮し、プロセス関連不純物（例えばHCP、DNA、細胞培養ブロスの成分）の大部分を除去することである。
【００３４】
B.2. 平衡化およびローディング
本発明との関連では概して、工程(a)でのアフィニティークロマトグラフィー材料と接触させるための目的のタンパク質を含むサンプルは、水溶液の状態にある。それは粗製の収集物、清澄化した収集物または更に水性緩衝液中に予め平衡化したサンプルであることもできる。
【００３５】
サンプルの精製前に、プロテインＡ材料は平衡化しなければならない。この平衡化は水性緩衝液を用いて実施される。適当な水性緩衝液（またはバッファー）としては、限定されないが、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液、および／またはクエン酸緩衝液である。この工程での水性緩衝液は、好ましくは、酢酸ナトリウムまたはリン酸ナトリウムに基づく。好ましくは、緩衝液は、（約）10 mMから（約）40 mMまでの範囲の濃度、および（約）6.5から（約）8.0までの範囲のpHを有する。更に好ましくは、緩衝液は、（約）15 mMから（約）30 mMまでの範囲の濃度、および（約）6.8から（約）7.5までの範囲のpHを有する。更に好ましくは、緩衝液の濃度は（約）15.0、16.0、17.0、17.0、18.0、19.0、20.0、21.0、22.0、23.0、24.0または25.0 mMであり、そのpHは（約）6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4および7.5である。
【００３６】
本発明の方法の１つにおいて使用できる水性緩衝液は、更に（約）100 mMから（約）200 mMの範囲の濃度、好ましくは（約）125から（約）180 mMまでの範囲の濃度、例えば（約）130、135、140、145、150、155、160、165または170 mMの濃度の塩を含む。適当な塩としては、限定されないが、塩化ナトリウムである。
【００３７】
当業者は、精製すべきタンパク質がアフィニティークロマトグラフィー材料に結合しないように、適切な平衡化とローディング条件を選択することができる。それに対して、不純物の少なくとも一部分は、クロマトグラフィー材料を素通りするはずである。例えば、平衡化のための水性緩衝液は、（約）25 mMの濃度でかつ（約）7.0±0.2のpHのリン酸ナトリウムおよび（約）150 mMの濃度の塩化ナトリウムを含む。
【００３８】
B.3. 洗浄
ローディング（工程(a)）の後、アフィニティークロマトグラフィー材料は、多量の平衡化バッファーと同じ溶液もしくは異なる溶液またはその両方の組み合わせで、１回または２回洗浄される。平衡化とローディング工程に関しては、適当な水性緩衝液（またはバッファー）としては、限定されないが、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液、および／またはクエン酸緩衝液が挙げられる。洗浄工程は未結合の不純物を除去するために必要である。
【００３９】
好ましくは、洗浄は一工程（１ステップ）で、すなわち単一の緩衝液を用いて実施される。好ましくは、洗浄緩衝液は、（約）40 mMから（約）70 mMまでの範囲の濃度および（約）5.0から約6.0までの範囲のpHの酢酸緩衝液（例えば酢酸ナトリウム緩衝液）である。更に好ましくは、緩衝溶液は（約）45 mMから（約）65 mMまでの範囲の濃度および（約）5.2から（約）5.8までの範囲内のpHを有する。更に好ましくは、緩衝溶液の濃度は（約）50、51、52、53、54、55、56、57、58、59または60 mM であり、そのpHは、（約）5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7 および 5.8である。
【００４０】
代わりに、洗浄は２種類の異なる緩衝液を使って二工程（２ステップ）で実施される。好ましくは、第一の洗浄緩衝液が（約）40 mMから（約）70 mMまでの範囲の濃度および（約）5.0から（約）6.0までの範囲のpHの酢酸緩衝液である。更に好ましくは、緩衝液は（約）45 mMから（約）65 mMまでの範囲の濃度および（約）5.2から（約）5.8までの範囲のpHのものである。更に好ましくは、緩衝液の濃度が（約）50、51、52、53、54、55、56、57、58、59または60 mMであり、そのpHが（約）5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7および5.8である。好ましくは、第二の洗浄緩衝液が平衡化／ローディング緩衝液と同様のものである。
【００４１】
本発明の方法の１つで使用される水性緩衝液は、更に塩を含むことができる。好ましくは、塩が存在しそして該方法が２洗浄工程を含む場合には、前記塩は、２番目の洗浄緩衝液中のものよりも最初（１番目）の洗浄緩衝液中の方が高濃度であろう。好ましくは、洗浄緩衝液（一工程のみの場合）または最初の洗浄緩衝液（二工程の場合）中の塩濃度は、存在する場合には、（約）1.0 Mから（約）2.0 M、好ましくは（約）1.25 Mから（約）1.80 Mまでの範囲の濃度、例えば約1.3、1.35、1.4、1.45、1.5、1.55、1.6、1.65または1.70 Mの濃度である。好ましくは、２番目の洗浄緩衝液中の塩濃度は、もしある場合には、（約）100 mMから（約）200 mMまでの範囲内の濃度、好ましくは（約）125 mMから（約）180 mMまでの範囲内、例えば（約）130、135、140、145、150、155、160、165または170 mMの濃度である。適当な塩としては、限定されないが、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、カルシウム塩および／またはマグネシウム塩が挙げられる。
【００４２】
当業者は、精製すべきタンパク質がアフィニティークロマトグラフィー材料に結合したままにするように、洗浄工程に適切な条件を選択するだろう。それに対して、不純物の少なくとも一部分は、洗浄緩衝液の力によってアフィニティークロマトグラフィー材料を素通りし続けるだろう。非限定例として、２工程洗浄では、平衡化緩衝液は（約）25 mMのリン酸ナトリウム、（約）150 mMの濃度の塩を含み、かつ7.0±0.2のpHを有し、最初の洗浄は、（約）55 mMのリン酸塩、（約）1.5 Mの濃度の塩および5.5±0.2のpHを含む洗浄緩衝液を使って実施され、そして２番目の洗浄は、平衡化緩衝液と同一の洗浄緩衝液を使って実施することができる。
【００４３】
B.4. 溶出
目的のタンパク質は続いて、精製すべきタンパク質のFc成分／定常ドメインへのアフィニティークロマトグラフィー材料の結合を妨害する溶液（溶出バッファーと称する）を使って溶出させることができる（工程(b)）。この溶出バッファーは、酢酸、グリシン、クエン酸塩またはクエン酸を含み得る。好ましくは、緩衝液は（約）40 mMから（約）70 mMの範囲の濃度の酢酸緩衝液である。更に好ましくは、緩衝液（約）45 mMから（約）65 mMの範囲の濃度である。更に好ましくは、緩衝液の濃度は（約）50、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59 または60 mMである。溶出は、クロマトグラフィー材料およびそれに結合したタンパク質のpHを下げることにより実行される。例えば、溶出バッファーのpHは（約）4.5以下、または（約）4.0以下であることができる。好ましくは（約）2.8から（約）3.7、例えば2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5または3.6である。溶出バッファーは場合によりカオトロピック剤を含む。
【００４４】
当業者は、精製すべきタンパク質がアフィニティークロマトグラフィー材料から放出されるように、溶出工程に適切な条件を選択するだろう。非限定例として、溶出（すなわち工程(b)の溶出）は、（約）55 mMの酢酸および3.2±0.2のpHを含む溶出バッファーを用いて実施することができる。
【００４５】
Ｃ．混合モードクロマトグラフィー工程
C.1. 総論
【００４６】
本発明による混合モードクロマトグラフィー材料（混合モードクロマトグラフィー支持体とも称する）は、次の機能（それに限定されない）のうちの２以上の組み合わせを含むクロマトグラフ用材料を指す：カチオン交換、アニオン交換、疎水性相互作用、親水性相互作用、水素結合または金属親和性。よって、それは２種類のタイプのリガンドを含む。固相は樹脂、多孔質粒子、非孔質粒子、膜、またはモノリスのような母材（マトリックス）であることができる。
C.2. 第一の混合モードクロマトグラフィー（工程(c)および(d)）
【００４７】
概して本発明に関しては、工程(c)の好ましい混合モードクロマトグラフィー支持体は、Capto（登録商標）-MMC、Capto（登録商標）-adhere、Capto（登録商標） adhere ImPes、MEP HyperCelTMおよびESHMUNO（登録商標）HCXから成る群より選択される。それは好ましくはCapto（登録商標）-adhereのようなアニオン交換特性を有する支持体である。あるいは、混合モードクロマトグラフィー材料はNatrix（登録商標）HD-SBのような膜であることができる。
【００４８】
好ましくは、アフィニティークロマトグラフィー後に回収された溶出液（すなわち工程(b)の溶出液）をロードする前に、6.5〜8.5のpH、例えば6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1または8.2のpHに調整される。pH調整は、例えばTRIS（トリス）および／またはNaOHの濃縮溶液を用いて行うことができる。その目的は、工程(b)の溶出液を、工程(c)が実施される時のものと同様なpHおよび電気伝導度にすることである。よって前記溶出液は調整された溶出液であろう。例えば工程(c)が8.0±0.2のpHで実施される予定である場合、工程(b)の溶出液は8.0±0.2のpHに調整されなければならない。同様に、工程(c)が塩を用いて実施される予定であるならば、その調整に同じ塩条件が用いられるだろう。
【００４９】
調整された溶出液を用いてロードする前に、第一の混合モードクロマトグラフィー材料が水性緩衝液（平衡化バッファー）を用いて平衡化される。適当な水性緩衝液（またはバッファー）としては、限定されないが、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液、および／またはクエン酸緩衝液が挙げられる。好ましくは、緩衝液、例えばリン酸ナトリウム緩衝液は、（約）20 mMから（約）60 mMの範囲の濃度および（約）6.5から（約）8.5までの範囲のpHである。更に好ましくは、緩衝液は（約）30 mMから（約）50 mMまでの範囲の濃度および（約）6.5から（約）8.5までの範囲のpHである。更に好ましくは、緩衝液の濃度は（約）35、36、37、38、39、40、41、42、43、44または45 mMであり、そのpHは（約）6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1または8.2である。
【００５０】
本発明による方法の１つで使用される水性緩衝液は、（約）50 mMから（約）1 Mの範囲の濃度、好ましくは（約）85〜500 mMの範囲内の濃度、例えば（約）100、150、200、250、300、350、400、450または500 mMの濃度の塩を更に含むことができる。適当な塩としては、限定されないが、塩化ナトリウムおよび／または塩化カリウムが挙げられる。
【００５１】
平衡化緩衝液は、前記精製された抗体／タンパク質を回収するために（工程(d)）、目的の未結合タンパク質を素通り液中に「押し出す」ためにも用いられるだろう。前記素通り液は、カラムの底から回収される。それに対して、不純物の少なくとも一部分はクロマトグラフィー材料に結合する。
【００５２】
混合モードクロマトグラフィー材料が平衡化されると、工程(b)の溶出液（または調整された溶出液）をロードすることができる。未結合の着目タンパク質は、平衡化バッファーの添加によって押し出され、カラムの底から回収されるだろう。
【００５３】
本発明との関連では、当業者は、精製すべきタンパク質が第一の混合モードクロマトグラフィー材料に結合しないように、すなわちそれがクロマトグラフィー材料を素通りするように、第一の混合モードクロマトグラフィー工程にとって適切な条件を選択するだろう。当業者は、緩衝液のpHおよび／または塩条件を、精製すべきタンパク質のpI（等電点）を考慮していかに適合させるかを知っているだろう。非限定例として、9.0より上のpIを有する着目タンパク質の場合、第一の混合モードクロマトグラフィー工程の平衡化緩衝液は、（約）40 mMのリン酸ナトリウム、（約）95 mMの濃度の塩化ナトリウム、および8.0±0.2のpHを含みうる。ローディングは同一条件下で実施される。更なる非限定例として、例えば約8.5〜約9.5のpIを有する着目タンパク質の場合、第一の混合モードクロマトグラフィー工程の平衡化バッファーは、（約）40 mMのリン酸ナトリウム、（約）470 mMの濃度の塩化ナトリウムおよび（約）7.3±0.2のpHを含むことができる。ローディングは同一条件で実施される。
【００５４】
C.3. 第二の混合モードクロマトグラフィー（工程(e)および(f)）
概して本発明との関連では、第二の混合モードクロマトグラフィー工程（工程(e)）のための好ましい混合モードクロマトグラフィー支持体は、ヒドロキシベースのリガンドおよび／またはフルオロアパタイトベースのリガンドから成る群より選択された（１または複数の）リガンドを含む。そのようなリガンドは樹脂または膜のようなクロマトグラフィー材料において使用できる。
【００５５】
ヒドロキシアパタイトベースのリガンドは、構造式(Ca5(PO4)3OH)2を有するリン酸カルシウムのミネラルを含む。それの相互作用の基本モードは、ホスホリルカチオン交換とカルシウム金属親和性である。前記ヒドロキシアパタイトベースのリガンドを含む混合モードクロマトグラフィー支持体は、様々な形で市販されており、限定されないが、例えばセラミック形を含む。セラミックヒドロキシアパタイトの商品例としては、限定されないが、CHTTM タイプIおよびCHTTM タイプIIが挙げられる。セラミックヒドロキシアパタイトは、多孔質粒子であり、例えば約20、40および80ミクロンのような様々な直径を有することができる。
【００５６】
フルオロアパタイトベースのリガンドは、構造式Ca5(PO4)3F またはCa10(PO4)6F2を有するリン酸カルシウムの不溶性フッ素化ミネラルを含む。それの相互作用の基本モードはホスホリルカチオン交換とカルシウム金属親和性である。前記フルオロアパタイトベースのリガンドを含む混合モードクロマトグラフィー支持体は、様々な形で市販されており、限定されないが、例えばセラミック形を含む。セラミックフルオロアパタイトの商品例としては、限定されないが、CFTTM タイプIおよびCFTTM タイプIIが挙げられる。セラミックフルオロアパタイトは球状多孔質粒子であり、例えば約10、20、40および80ミクロンのような様々な直径を有することができる。
【００５７】
ヒドロキシフルオロアパタイトベースのリガンドは、構造式 Ca10(P04)6(OH)x(F)y を有するリン酸カルシウムの不溶性ヒドロキシル化ミネラルと不溶性フッ素化ミネラルを含む。それの相互作用の基本モードはホスホリルカチオン交換とカルシウム金属親和性である。前記ヒドロキシフルオロアパタイトリガンドを含む混合モードクロマトグラフィー支持体は、様々な形で市販されており、例えば限定されないが、セラミック、結晶質および複合材料（コンポジット）形を含む。コンポジット形は、アガロースの細孔中に封入されたヒドロキシフルオロアパタイト微結晶または他のビーズを含む。セラミックヒドロキシフルオロアパタイト樹脂の一例は、構造式(Ca10(PO4)6(OH)1.5(F)0.5)を有するMPCTM（商標）セラミックヒドロキシフルオロアパタイト樹脂である。それはセラミックアパタイトタイプＩ（40μm）混合モード樹脂をベースにしたものである。
【００５８】
好ましくは、ロードする前に、第一の混合モードクロマトグラフィー後に回収された素通り液（すなわち工程(d)の溶出液）が7.0〜8.5のpH、例えば7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1または8.2のpHに調整される。調整は、例えばトリス（Tris）および／またはNaOHの濃縮溶液を用いて行うことができる。よって前記溶出液は調整された溶出液である。その目的は、工程(d)の素通り液を、第二の混合モードクロマトグラフィー上へのロードに適した条件に合わせることである。例えば工程(e)を7.5±0.2のpHで実施しようとするならば、工程(d)の素通り液は7.5±0.2のpHに調整されなければならない。この調整工程は、濃縮工程と一緒に実施することができる。そのような場合、第二の混合モードクロマトグラフィーの前にろ過工程を追加することができる。必要とされうる別の調整は塩とNaPO4に関する調整である。
【００５９】
目的のタンパク質を含む調整済の素通り液をロードする前に、第一の混合モードクロマトグラフィー材料を水性緩衝液（平衡化バッファー）で平衡化する。好ましくは、第一の混合モードクロマトグラフィー工程の後に（工程(d)）回収された素通り液は、第二の混合モードクロマトグラフィー工程（工程(e)）上へのロード前に、水性緩衝液で平衡化される。適当な水性緩衝液（またはバッファー）としては、限定されないが、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液、および／またはクエン酸緩衝液が挙げられる。好ましくは、緩衝液、例えばリン酸ナトリウム緩衝液は（約）1 mMから（約）20 mMまでの範囲の濃度および（約）7.0から（約）8.5までの範囲のpHである。更に好ましくは、緩衝液は（約）2 mMから（約）15 mMまでの範囲の濃度および（約）7.2から（約）7.8までの範囲のpHである。更に好ましくは、緩衝液の濃度は（約）2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0、9.0、10.0 mMであり、そしてそのpHは（約）7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7および7.8である。
【００６０】
本発明の方法の１つに用いられる水性緩衝液は、（約）50 mMから（約）1 Mまでの範囲の濃度、好ましくは（約）85〜500 mM、例えば（約）100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450または500 mMの範囲の濃度の塩を更に含むことができる。適当な塩としては、限定されないが、塩化ナトリウムおよび／または塩化カリウムが挙げられる。
【００６１】
平衡化バッファーは、前記精製タンパク質を回収するために（工程(f)）、素通り液中の目的の未結合タンパク質（例えば抗体またはFc融合タンパク質）を「押し出す（push）」ためにも用いられるだろう。前記素通り液は、カラムの底から回収される。反対に、不純物の少なくとも一部分はクロマトグラフィー材料に結合する。
【００６２】
混合モードクロマトグラフィー材料が平衡化されたら、工程(d)の溶出液（または調整された溶出液）をロードすることができる。目的の未結合タンパク質は、平衡化バッファーの添加によって押し出され、カラムの底から回収されるだろう。
【００６３】
本発明に関しては、当業者は、この第二の混合モードクロマトグラフィー工程に適当な条件（精製すべきタンパク質のpHを考慮して）を、精製すべきタンパク質が第一の混合モードクロマトグラフィー材料に結合しないように、すなわちそれがクロマトグラフィー材料を素通りするように選択するだろう。非限定例として、例えば9.0超のpIを有する目的のタンパク質の場合、第二の混合モードクロマトグラフィー工程は、5 mMリン酸ナトリウム、170 mM塩化ナトリウムを含むpH 7.5±0.2の水性緩衝液を用いて実施することができる。更なる非限定例として、例えば約8.5〜約9.5のpIを有する目的のタンパク質の場合、第二の混合モードクロマトグラフィー工程は、3 mM リン酸ナトリウム、470 mM塩化ナトリウムを含むpH 7.5±0.2の水性緩衝液を用いて実施することができる。ローディングは同じ条件で行われる。
【００６４】
C.4. 代替手段
当業者は、本開示に基づいて、第一の混合モード工程（工程(c)〜(d)）としてヒドロキシベースのリガンドおよび／またはフルオロアパタイトベースのリガンドから成る群より選択された混合モードクロマトグラフィー支持体を使用でき、そして第二の混合モード工程（工程(e)〜(f)）としてCapto（登録商標）-MMC、Capto（登録商標）-adhere、Capto（登録商標） adhere ImPres、MEP HyperCelTMおよびESHMUNO（登録商標）HCXから成る群より選択された混合モード支持体を使用できることを理解するだろう。
【００６５】
Ｄ．可能な追加の工程
D.1. ウイルス不活性化
所望により、本発明の方法はウイルス不活性化工程を含む。この工程は、好ましくはアフィニティークロマトグラフィー工程と第一の混合モードクロマトグラフィー工程の間に実施される。それは工程(b')と呼ばれる。ウイルスを不活性化するために、アフィニティークロマトグラフィー工程の後に回収された溶出液（すなわち工程(b)の溶出液）が濃酸性水溶液でpH調整される。調整の間に達成すべきpHは、好ましくは（約）3.0から（約）4.5の範囲、更に好ましくは（約）3.2から（約）4.0の範囲、例えば3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9または4.0である。好ましくは、酸性水溶液中の塩濃度は、（約）1.5から（約）2.5までである。好ましくは、酸性水溶液中の塩濃度は（約）1.7から（約）2.3まで、例えば1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2または2.3 Mである。好ましい酸性水溶液は酢酸である。得られた調整済の溶出液は典型的には約60±15分間インキュベートされる。
【００６６】
インキュベーションの終了時、材料は次いで濃い中性水溶液で中和される。中和の間に達成すべきpHは、好ましくは（約）4.5から（約）6.5の範囲内であり、その中和されたサンプルは工程(c)の前に（約）4.8〜5.6の範囲内、例えば4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5 または5.6に維持すべきである。中和されたサンプルは工程(c)に直接使用され、中和の間に達成すべきpHは、工程(c)に使われるものと同じpH、すなわち6.5〜8.5であろう。中和に用いる水溶液中の塩濃度は（約）1.0から（約）2.5である。好ましくは、中性水溶液中の塩濃度は（約）1.0〜（約）2.0、例えば1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0 Mである。好ましい中性水溶液はトリス塩基である。
【００６７】
D.2. 任意のろ過工程
精製プロセスには様々なろ過工程を追加することができる。そのような工程は、更に不純物を除去するために必要とされるが、次のクロマトグラフィー工程の前に精製すべきサンプルを濃縮するため、または次のクロマトグラフィー工程の前に緩衝液を交換するためにも使用することができる。
【００６８】
例えば、工程(b)または(b')の後の溶出液（または調整された溶出液）の不純物を更に減らすために、ろ過工程は、第一の混合モードクロマトグラフィーの直前に実施することができる。このろ過工程は、深層ろ過用（デプス）フィルターを用いて実施される。前記工程は第一の混合モードクロマトグラフィーに則して実施することができる。
【００６９】
深層ろ過のようなろ過工程は、プロセスの中に含めることができる。この工程は例えば、実施例２に記載したように、アフィニティークロマトグラフィーの直前にまたは第一の混合モードクロマトグラフィーの直前に実施することができる。
【００７０】
タンジェント流ろ過（TFF）も精製プロセスの間に実施することができる。例えば、第二の混合モードクロマトグラフィー上にロードする前に工程(d)からの素通り液を濃縮しようと所望するならば、TFFを工程(e)の直前に実施することができる。そのような工程は、存在する場合には、工程(d')と称される。斯かるろ過工程は、第二の混合モードクロマトグラフィーに用いられる平衡化バッファーを使って実施することができる。これにより、素通り液が濃縮されるだけでなく、次のクロマトグラフィー工程の準備ができた状態を可能にする。
【実施例】
【００７１】
Ｉ．細胞、細胞繁殖（cell expansion）および細胞増殖
「mAb1」は細胞膜上に見られる受容体に対して向けられたヒト化モノクローナル抗体である。それの等電点（pI）は約9.20〜9.40である。mAb1はCHO-K1細胞中で産生された。「mAb2」は、可溶性免疫タンパク質を標的とする第二の部分に連結された、膜タンパク質に対して向けられた第一の部分（Fcドメインを含むIgG部分）を含む、IgG1融合タンパク質である。それの等電点（pI）は約6.6〜8.0である。それはCHO-S細胞中で発現された。
「mAb3」は、細胞膜上に見られる受容体に対して向けられたヒト化モノクローナル抗体である。それの等電点（pI）は約8.5〜9.5である。mAb3はCHO-S細胞中で生産された。
【００７２】
細胞は流加培養（fed-batch culture）において培養した。それらは36.5℃、5％CO2、90％湿度でインキュベートし、320 rpmで振盪した。各々の流加培養は14日間維持した。
【００７３】
II．分析方法
HCPの含有量（ppm）：ppmでのHCPレベルは、ng/mLで求めたHCPレベルを、UV吸収により決定したmAb濃度（mg/mL）により割った値を使って算出される。
凝集体（HMW）の含有量（タンパク質濃度の％で表す）：評価は標準プロトコルを用いてSE-HPLCによって行った。
断片化された形（LMW）の含有量（タンパク質濃度の％で表す）：評価は標準プロトコルを用いてCE-SDSにより行った。
【００７４】
実施例１：標準方法に従って調製したmAb1
全ての精製プロセスは、精製前に清澄化収集物を通常２〜８℃で保存するため、プロテインＡ工程のロード工程を除いて室温（15〜25℃）で実施した。
【００７５】
mAb1は、「プロテインＡクロマトグラフィー」に続いて結合溶出モードでの第一の「イオン交換クロマトグラフィー（IEX）」の後に、フロースルーモードでの第二のIEX（ポリッシング工程とも呼ばれる）を含む、標準的な精製方法に従って精製した。
前記標準方法を使って次の結果が得られた：
【００７６】
【表１】
2020531557.tif 000002
【００７７】
実施例２：本発明の方法に従って精製されたmAb1
清澄化収集物を精製前に２〜８℃で保存したので、プロテインＡ工程のロード工程を除き、全ての精製プロセスは室温（15℃〜25℃）で実施した。本発明による新規精製方法を、mAb1の精製スキームを改善するために使用した。
【００７８】
この新規方法の主な工程は次のものであった：
・プロテインＡクロマトグラフィー（PUP）
・混合モードクロマトグラフィー１（MM1）
・混合モードクロマトグラフィー２（MM2）。
【００７９】
プロテインＡ工程
プロテインＡ工程は、20±2 cmの目標カラム床高さ（bed height）を有するProsep Ultra Plus（登録商標）樹脂（Merck Millipore製）上で実施した。この工程は次の条件下で実施した：
【００８０】
１．平衡化：少なくとも（≧）５カラム床体積（BV）の25 mM NaPI（リン酸ナトリウム）＋150 mM NaCl, pH 7.0を含む水溶液。平衡化の終わりに、流出液のpHと電気伝導度をチェックした。それらは、ローディングを開始する前に、それぞれ7.0±0.2および18±1 mS/cmのpHと電気伝導度の要件を満たさなければならない。
２．ロード：約35〜40 g mAb1/L 充填床体積の最大容量の清澄化収集物、２〜25℃の温度。
３．洗浄Ｉ：≧5 BVの55 mM酢酸ナトリウム, 1.5 M NaCl, pH 5.5を含む溶液。
４．洗浄II：≧3 BVの25 mM NaPI＋150 mM NaCl, pH 7.0を含む溶液。
５．溶出：55 mM酢酸 pH 3.2。溶出ピークは、280 nmでの吸光度が25 mAU/mm UVセル光路長に達した時点で収集を開始し、そして280 nmでの吸光度が25 mAU/mm UVセル光路長に戻った時点ですぐに収集を停止した。溶出液の体積は４BV未満でなければならない。
【００８１】
低pHでのウイルス不活性化
プロテインＡ溶出液を攪拌下で2M酢酸溶液の添加によりpH 3.5±0.2に調整した。目標pHに達したら、攪拌を停止し、酸性化した溶出液を60±15分間インキュベートした。インキュベーション終了後、それを攪拌下で2Mトリス塩基溶液の添加によりpH 5.2±0.2に中和した。得られた溶出液（中和した溶出液）は２〜８℃で少なくとも３か月間保存することができる。
【００８２】
混合モードクロマトグラフィー１
中和した溶出液を2MトリスでpH 8.0±0.2に調整し、その電気伝導度を3M NaClにより15.0±0.5 mS/cmに増加させた。次いでこの調整した溶出液を、次の通りにCapto adhere（登録商標）（GE Healthcare）上での混合モードクロマトグラフィーのラインに沿った深層ろ過に供した：
【００８３】
１．深層ろ過用フィルター（Merck Millipore製のMillistack Pod）をクロマトグラフィーカラムの直前の精製システムに接続した。
２．樹脂の予備平衡化：≧3 BVの500 mM NaPI, pH 7.5。
３．樹脂の平衡化：≧6 BVの40 mM NaPI, 93 mM NaCl, pH 8.0。
４．調整済の溶出液を100 g/LのmAb1／L充填樹脂の容量でロードした。280 nmでの吸光度が12.5 mAU/mm UVセル光路長に達したらすぐに素通り液の収集を開始した。
５．洗浄（＝押出）：4 BVの40 mM NaPI, 93 mM NaCl, pH 8.0。次いで精製したmAb1を含む素通り液の収集を停止した。
【００８４】
混合モードクロマトグラフィー２
混合モードクロマトグラフィー２において更に精製を行う前に、混合モードクロマトグラフィー１からの素通り液を、Pellicon 3 Ultracel（登録商標）30 kDaメンブレン（Merck Millipore製）上でのTFFを介して濃縮した。この工程は、バッファーを、CFT Ceramic Fluorapatite（登録商標）II型（40μm）（Bio-Rad製）上でのフルオロアパタイトクロマトグラフィー工程のロードに適当な条件に交換できるようにした。TFF工程は次のように実施した：
【００８５】
１．フィルターの平衡化（濃縮保持液（retentate）と透過液ラインの両方を含む）：5 mM NaPO4, 170 mM NaCl, pH 7.5バッファー。
２．混合モードクロマトグラフィー１からの素通り液を≦500 g mAb1/m2でロードした。
３．≧9 BVの平衡化と同じバッファーを用いて限外ろ過した。
４．精製されたmAb1を含む濃縮保持液を回収した。
【００８６】
混合モードクロマトグラフィー２工程は次の通り実施した：
１．予備平衡化：≧3 BVの0.5 M NaPI, pH 7.50。
２．平衡化：≧5 BVの5 mM NaPI, 170 mM NaCl, pH 7.5。
３．TFF保持液を≦60 g mAb1／L充填樹脂の容量でロードした。280 nmでの吸光度が12.5 mAU/mmのUVセル光路長に達したらすぐに素通り液の回収を開始した。
４．洗浄（＝押出）：≧6 BVの5 mM NaPI, 170 mM NaCl, pH 7.5を用いて洗浄。次いで精製されたmAb1を含む素通り液の収集を停止した。
【００８７】
前記新規方法を用いて、次の結果が得られた。
【表２】
2020531557.tif 000003
【００８８】
実施例３：標準方法に従って精製されたmAb2
清澄化収集物は通常は低温（すなわち２〜８℃）で貯蔵されるので、プロテインＡ工程のロード工程を除き、全ての精製プロセスは室温（15〜25℃）で実施した。
mAb2は、「プロテインＡクロマトグラフィー」に続きフロースルーモードでの第一のIEXに続く結合溶出モードでの第二のIEXを含む標準的な精製プロセスに従って精製した。前記標準プロセスを用いて、次の結果が得られた：
【００８９】
【表３】
2020531557.tif 000004
【００９０】
実施例４：本発明の方法に従って精製されたmAb2
全ての精製プロセスは、清澄化収集物が通常低温（すなわち２〜８℃）で保存されるので、プロテインＡ工程のロード工程を除いて、20〜23℃の温度で実施した。この新規プロセスの主な工程は実施例２と同様であった。mAb2のpIに合うようにいくつかの補正を行った：
【００９１】
混合モードクロマトグラフィー１レベルで
中和した溶出液をpH 7.1±0.2および33±0.5 mS/cmの電気電導度に達するように透析した。この調整した溶出液を、次いで実施例２と同様なCapto adhere（登録商標）（GE Healthcare製）上での混合モードクロマトグラフィーに供した。
１．樹脂の平衡化：≧6 BVの40 mM NaPI, 340 mM NaCl, pH 7.1。
２．100 g/LのmAb2/L充填樹脂の容量での透析溶液のロード。ロード工程の開始後すぐに素通り液の収集を開始した。
３．洗浄（＝押出）：≧4 BVの40 mM NaPI, 340 mM NaCl, pH 7.1。280 nmでの吸光度が100 mAU/mm UVセル光路長より下に減少した時に精製mAb2を含む素通り液の収集を停止した。
【００９２】
混合モードクロマトグラフィー２レベルで
混合モードクロマトグラフィー２で更に精製する前に、フロースルーバッファーを、CFT Ceramic Fluoroapatite（登録商標）II型（40μm）（Bio-Rad製）上でのフルオロアパタイトクロマトグラフィー工程のロードに適当な条件に置換した。混合モードクロマトグラフィー２工程は次の通りに実施した：
１．予備平衡化：≧5 BVの0.5 M NaPI, pH 7.50。
２．平衡化：≧15 BVの3 mM NaPI, 420 mM NaCl, pH 7.5。
３．≦60 gのmAb2/L充填樹脂の容量での透析済溶液のローディング。ローディング工程の開始後すぐに素通り液の収集を開始した。
４．洗浄（＝押出）：≧6 BVの3 mM NaPI, 420 mM NaCl, pH 7.5。280 nmでの吸光度が100 mAU/mm UVセル光路より下に減少した時に精製mAb2を含む素通り液の収集を停止した。
前記新規方法を用いて、次の結果が得られた：
【表４】
2020531557.tif 000005
【００９３】
実施例５：標準方法に従って精製されたmAb3
全ての精製プロセスは、清澄化収集物が通常は低温（すなわち２〜８℃）で保存されるので、プロテインＡ工程のロード工程を除いて、室温（15〜25℃）で実施した。mAb3は実施例３に従って精製した。
前記標準方法を用いて、次の結果が得られた：
【００９４】
【表５】
2020531557.tif 000006
【００９５】
実施例６：本発明の方法に従って精製したmAb3
全ての精製プロセスは、清澄化収集物が通常低温（すなわち２〜８℃）で保存されるので、プロテインＡ工程のロード工程を除いて、20〜23℃の温度で実施した。この新規プロセスの主な工程は実施例４と同様であった。mAb3のpIに合うようにいくつかの補正を行った：
【００９６】
混合モードクロマトグラフィー１レベルで
中和した溶出液をpH 7.3±0.2および46±0.5 mS/cmの電気電導度に達するように透析した。この調整した溶出液を、次いで実施例４と同様なCapto Adhere（登録商標）（GE Healthcare製）上での混合モードクロマトグラフィーに供した。
１．樹脂の平衡化：≧6 BVの40 mM NaPI, 470 mM NaCl, pH 7.3。
２．洗浄（＝押出）：≧4 BVの40 mM NaPI, 470 mM NaCl, pH 7.3。
【００９７】
混合モードクロマトグラフィー２レベルで
混合モードクロマトグラフィー２で更に精製する前に、フロースルーバッファーを、CFT Ceramic Fluoroapatite（登録商標）II型（40μm）（Bio-Rad製）上でのフルオロアパタイトクロマトグラフィー工程のロードに適当な条件に置換した。混合モードクロマトグラフィー２工程は実施例４と同様に実施した。
前記新規方法を用いて、次の結果が得られた：
【００９８】
【表６】
2020531557.tif 000007
【００９９】
結論
本発明者らは、本発明の方法（例えば実施例２、４または６に記載のような）を使って、様々な抗体およびFc融合タンパク質の精製が標準法（例えば実施例１、３または５に記載のような）に比較して改善されたことを見出した。特に、HCPを許容可能な範囲に維持しながら（データは示していない）、凝集体（HMW含有量）および断片（LMW含有量）のような不純物の量を更に一層減少させることが可能であった。
【０１００】
〔参考文献〕
[1] Davis他, 2010, Protein Eng Des Sel 23: 195-202
[2] 米国特許US8871912
[3] Sambrook他, 1989 & 改訂版, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press.
[4] Ausubel他, 1988 & 改訂版, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Wiley & Sons, New York.
[5] Remington's Pharmaceutical Sciences, 1995, 18th版, Mack Publishing Company, Easton, PA.
[6] Horenstein他, 2003, Journal of Immunological Methods 275:99-112.
【国際調査報告】
2020531557.tif 000008
2020531557.tif 000009
2020531557.tif 000010