(57)【要約】本発明は、概して、クロンの医薬組成物及び調製物並びにその使用に関する。一部の実施形態では、クロンは、タンパク質性外層に包膜された遺伝子エレメントを含む粒子を含み、これは、遺伝子エレメントを細胞（例えば、ヒト細胞）内に導入することができる。一部の事例では、遺伝子エレメントは、ペイロードを含み、例えば、それは、細胞内で発現される外性エフェクター（例えば、ノンコーディングＲＮＡなどの核酸エフェクター、又はポリペプチドエフェクター、例えば、タンパク質）をコード化する。
2020524993.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下：
（ｉ）プロモータエレメントと、外性エフェクターをコード化する核酸配列と、タンパク質結合配列と、を含む遺伝子エレメントであって、前記遺伝子エレメントが、以下：
（ａ）表１１の核酸配列のヌクレオチド３２３〜３９３のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）５’ＵＴＲ保存ドメインヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する配列、又は
（ｂ）表１１の核酸配列のヌクレオチド２８６８〜２９２９のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＧＣリッチ領域に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する配列
の一方又は両方を含む遺伝子エレメント；及び
（ｉｉ）タンパク質性外層
を含む合成クロンにおいて；前記遺伝子エレメントが前記タンパク質外層内に閉じ込められており；且つ
前記合成クロンが、前記遺伝子エレメントを真核細胞内に送達することができる、合成クロン。
【請求項２】
前記遺伝子エレメントが、一本鎖である、請求項１に記載の合成クロン。
【請求項３】
前記遺伝子エレメントが、ＤＮＡである、請求項１〜２のいずれか１項に記載の合成クロン。
【請求項４】
前記遺伝子エレメントが、マイナス鎖ＤＮＡである、請求項３に記載の合成クロン。
【請求項５】
前記遺伝子エレメントが、前記細胞に進入する前記クロンの１０％、８％、６％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．２％、０．１％未満の頻度で組み込まれ、例えば、前記合成クロンは非統合性である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の合成クロン。
【請求項６】
前記遺伝子エレメントが、表１６−１に示すコンセンサス５’ＵＴＲ核酸配列の配列を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の合成クロン。
【請求項７】
前記遺伝子エレメントが、表１６−２に示すコンセンサスＧＣリッチ領域の配列を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の合成クロン。
【請求項８】
前記遺伝子エレメントが、少なくとも１００ヌクレオチド長の配列を含み、これは、少なくとも７０％（例えば、約７０〜１００％、７５〜９５％、８０〜９５％、８５〜９５％、若しくは８５〜９０％）の位置のＧ又はＣから構成される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の合成クロン。
【請求項９】
前記遺伝子エレメントが、表１１の核酸配列のヌクレオチド１〜３９３のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）５’ＵＴＲ保存ドメインヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する配列と、表１１の核酸配列のヌクレオチド２８６８〜２９２９のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＧＣリッチ領域に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の合成クロン。
【請求項１０】
前記遺伝子エレメントが、表１１のヌクレオチド配列に対して少なくとも７５％の同一性を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の合成クロン。
【請求項１１】
前記プロモータエレメントが、野生型アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）に対して外性である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の合成クロン。
【請求項１２】
前記プロモータエレメントが、野生型アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）に対して内在性である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の合成クロン。
【請求項１３】
前記外性エフェクターが、治療薬、例えば、治療用ペプチド若しくはポリペプチド又は治療用核酸をコード化する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の合成クロン。
【請求項１４】
前記外性エフェクターが、調節核酸、例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｇＲＮＡ；蛍光タグ若しくはマーカ、抗原、ペプチド、天然の生物活性ペプチド由来の合成若しくはアナログペプチド、アゴニスト若しくはアンタゴニストペプチド、抗微生物ペプチド、孔形成ペプチド、二環式ペプチド、ターゲティング若しくは細胞傷害性ペプチド、分解若しくは自滅ペプチド、小分子、免疫エフェクター（例えば、免疫応答／シグナルに対する感受性に影響を与える）、細胞死誘導タンパク質（アポトーシス若しくは壊死の誘導物質）、腫瘍の非溶解性阻害剤（例えば、癌タンパク質の阻害剤）、後成的修飾剤、後成的酵素、転写因子、ＤＮＡ若しくはタンパク質修飾酵素、ＤＮＡ挿入剤、排出ポンプ阻害剤、核受容体アクチベータ若しくは阻害剤、プロテアソーム阻害剤、１酵素の競合阻害剤、タンパク質合成エフェクター若しくは阻害剤、ヌクレアーゼ、タンパク質断片若しくはドメイン、リガンド、抗体、受容体、又はＣＲＩＳＰＲ系若しくは成分を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の合成クロン。
【請求項１５】
前記外性エフェクターが、ｍｉＲＮＡを含み、宿主遺伝子の発現を低減する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の合成クロン。
【請求項１６】
前記外性エフェクターが、約２０〜２００、３０〜１８０、４０〜１６０、５０〜１４０、又は６０〜１２０ヌクレオチド長の核酸配列を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の合成クロン。
【請求項１７】
前記外性エフェクターをコード化する前記核酸配列が、約２０〜２００、３０〜１８０、４０〜１６０、５０〜１４０、又は６０〜１２０ヌクレオチド長である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の合成クロン。
【請求項１８】
前記外性エフェクターをコード化する前記核酸配列が、以下：ＯＲＦ１遺伝子座、例えば、前記ＯＲＦ１遺伝子座のＣ末端、又はポリ−Ａ領域下流の３’ノンコーディング領域の１つ若しくは複数に、その内部、又はそれに隣接して（例えば、５’若しくは３’側で）位置する、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の合成クロン。
【請求項１９】
前記外性エフェクターをコード化する前記核酸配列が、前記遺伝子エレメントの前記ポリ−Ａ領域と前記ＧＣリッチ領域の間に位置する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の合成クロン。
【請求項２０】
表１２のＯＲＦ２、ＯＲＦ２／２、ＯＲＦ２／３、ＯＲＦ１、ＯＲＦ１／１、若しくはＯＲＦ１／２から選択されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列の１つ又は複数を（例えば、前記タンパク質性外層内に）含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の合成クロン。
【請求項２１】
前記エフェクターを除く前記遺伝子エレメントの部分が、約２．５〜５ｋｂ（例えば、約２．８〜４ｋｂ、約２．８〜３．２ｋｂ、約３．６〜３．９ｋｂ、又は約２．８〜２．９ｋｂ）、約５ｋｂ未満（例えば、約２．９ｋｂ、３．２ｋｂ、３．６ｋｂ、３．９ｋｂ、若しくは４ｋｂ）、又は少なくとも１００ヌクレオチド（例えば、少なくとも１ｋｂ）の合計サイズを有する、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の合成クロン。
【請求項２２】
前記合成クロンが、脂質二重層を含まない、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の合成クロン。
【請求項２３】
前記合成クロンが、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞、例えば、免疫細胞、肝細胞、又は肺上皮細胞に感染することができる、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の合成クロン。
【請求項２４】
前記遺伝子エレメントが、例えば、定量ＰＣＲアッセイにより測定される場合、細胞当たり少なくとも１０２、２×１０２、５×１０２、１０３、２×１０３、５×１０３、又は１０４ゲノム当量の遺伝子エレメントを複製、例えば、産生することができる、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の合成クロン。
【請求項２５】
実質的に非病原性であり、例えば、被験者の検出可能な有害な症状（例えば、クロンに曝露されていない被験者と比較して、例えば、細胞死又は毒性の増大）を誘導しない、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の合成クロン。
【請求項２６】
実質的に非免疫原性であり、例えば、実施例４に記載の方法に従って検出される場合、例えば、検出可能な及び／又は不要な免疫応答を誘導しない、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の合成クロン。
【請求項２７】
前記実質的に非免疫原性のクロンが、被験者において、免疫応答が欠損する対照被験者における効力の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％である効力を有する、請求項２６に記載の合成クロン。
【請求項２８】
前記免疫応答が、以下：前記クロンに対して特異的な抗体；前記クロン若しくは前記クロンを含む細胞に対する細胞応答（例えば、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞若しくはＮＫ細胞）応答）；前記クロン若しくは前記クロンを含む細胞に対する細胞のマクロファージ貪食のうち１つ又は複数を含む、請求項２６又は２７に記載の合成クロン。
【請求項２９】
少なくとも１０００の前記合成クロンの集団が、少なくとも１００コピーの前記遺伝子エレメントを１つ又は複数の真核細胞内に送達することができる、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の合成クロン。
【請求項３０】
以下：
（ｉ）プロモータエレメントと、外性エフェクターをコード化する核酸配列と、タンパク質結合配列と、を含む遺伝子エレメントであって、前記遺伝子エレメントが、以下：
（ａ）表１、３、５、７、９、若しくは１３の核酸配列のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）５’ＵＴＲ保存ドメインに対して少なくとも８５％の配列同一性を有する配列；又は
（ｂ）表１、３、５、７、９、若しくは１３の核酸配列のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＧＣリッチ領域に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する配列
の一方又は両方を含む遺伝子エレメント；及び
（ｉｉ）タンパク質性外層
を含む合成クロンにおいて；前記遺伝子エレメントが、タンパク質性外層内に閉じ込められており；且つ
前記合成クロンが、前記遺伝子エレメントを真核細胞内に送達することができる、合成クロン。
【請求項３１】
表２、４、６、８、１０、若しくは１４のいずれかのＯＲＦ２、ＯＲＦ２／２、ＯＲＦ２／３、ＯＲＦ１、ＯＲＦ１／１、若しくはＯＲＦ１／２から選択されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列の１つ又は複数を（例えば、前記タンパク質性外層内に）含む、請求項３０に記載の合成クロン。
【請求項３２】
プロモータエレメントと、外性エフェクターをコード化する核酸配列と、タンパク質結合配列と、を含む核酸分子であって、遺伝子エレメントが、以下：
（ａ）表１１の核酸配列のヌクレオチド３２３〜３９３のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）５’ＵＴＲ保存ドメインヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する配列、又は
（ｂ）表１１の核酸配列のヌクレオチド２８６８〜２９２９のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＧＣリッチ領域に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する配列
の一方又は両方を含む、核酸分子。
【請求項３３】
プロモータエレメントと、外性エフェクターをコード化する核酸配列と、タンパク質結合配列と、を含む核酸分子において、前記遺伝子エレメントが、以下：
（ａ）表１、３、５、７、若しくは１３の核酸配列のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）５’ＵＴＲ保存ドメインに対して少なくとも８５％の配列同一性を有する配列、又は
（ｂ）表１、３、５、７、若しくは１３の核酸配列のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＧＣリッチ領域に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する配列
の一方又は両方を含む、核酸分子。
【請求項３４】
請求項１〜３１のいずれか１項に記載の合成クロン及び薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項３５】
少なくとも１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、又は１０９個の合成クロンを含む、請求項３４に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
請求項１〜３１のいずれか１項に記載の合成クロンと、表１２のＯＲＦ２、ＯＲＦ２／２、ＯＲＦ２／３、ＯＲＦ１、ＯＲＦ１／１、若しくはＯＲＦ１／２から選択されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも８５％配列同一性を有するアミノ酸配列の１つ又は複数をコード化する第２の核酸配列とを含む反応混合物。
【請求項３７】
請求項１〜３１のいずれか１項に記載の合成クロンと、表２、４、６、８、１０、若しくは１４のいずれかのＯＲＦ２、ＯＲＦ２／２、ＯＲＦ２／３ＯＲＦ２ｔ／３、ＯＲＦ１、ＯＲＦ１／１、若しくはＯＲＦ１／２から選択されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列の１つ又は複数をコード化する第２の核酸配列とを含む反応混合物。
【請求項３８】
前記第２の核酸配列が、遺伝子エレメントの一部である、請求項３６又は３７に記載の反応混合物。
【請求項３９】
前記第２の核酸配列が、遺伝子エレメントの一部ではなく、例えば、第２の核酸配列は、ヘルパー又はヘルパーウイルスに含まれる、請求項３６又は３７に記載の反応混合物。
【請求項４０】
前記遺伝子エレメントを宿主遺伝子に送達することを目的とする、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の合成クロン又は請求項３４〜３５のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項４１】
被験者の疾患又は障害を治療することを目的とする、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の合成クロン又は請求項３４〜３５のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項４２】
前記疾患又は障害が、免疫障害、インターフェロン症（例えば、Ｉ型インターフェロン症）、感染症、免疫障害、自己免疫疾患、癌（例えば、固形腫瘍、例えば肺癌）、及び胃腸障害から選択される、請求項４１に記載の使用。
【請求項４３】
被験者の疾患又は障害を治療することを目的とする、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の合成クロン又は請求項３４〜３５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項４４】
被験者の疾患又は障害を治療する方法であって、前記方法は、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の合成クロン又は請求項３４〜３５のいずれか１項に記載の医薬組成物を前記被験者に投与するステップを含み、ここで、前記疾患又は障害が、免疫障害、インターフェロン症（例えば、Ｉ型インターフェロン症）、感染症、免疫障害、自己免疫疾患、癌（例えば、固形腫瘍、例えば肺癌）、及び胃腸障害から選択される、方法。
【請求項４５】
合成クロン組成物を製造する方法であって、以下：
ａ）請求項１〜３１のいずれか１項に記載の複数の合成クロン又は請求項３４〜３５のいずれか１項に記載の医薬組成物を提供するステップ；
ｂ）任意選択で、以下：本明細書に記載される混入物、光学密度測定（例えば、ＯＤ２６０）、粒子数（例えば、ＨＰＬＣにより）、感染力（例えば、粒子：感染単位比）のうち１つ又は複数について複数の合成クロンを評価するステップ；並びに
ｃ）例えば、（ｂ）のパラメータの１つ又は複数が、指定される閾値を満たしていれば、複数の合成クロンを、例えば、被験者への投与に好適な医薬組成物として製剤化するステップ
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１７年６月１３日に出願された米国特許出願第６２／５１８，８９８号明細書、２０１７年１２月１１日に出願された米国特許出願第６２／５９７，３８７号明細書、及び２０１８年５月２５日に出願された米国特許出願第６２／６７６，７３０号明細書に対する優先権を主張し、これらの各々は全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本願は、ＡＳＣＩＩフォーマットに電子データとして提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１８年６月１３日に作成され、Ｖ２０５７−７０００ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔと題し、そのサイズは、１，０６６，２９２バイトである。
【背景技術】
【０００３】
治療薬を送達するための既存のウイルス系は、疾患又は障害に関連し得るウイルスを使用するため、極めて免疫原性となる可能性がある。実質的に非免疫原性且つ非病原性である改善された送達ビヒクルのニーズが存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、送達ビヒクルとして、例えば、真菌細胞に治療薬を送達するために用いることができるクロン、例えば、合成クロンを提供する。一部の実施形態では、クロンは、タンパク質性外層に包膜された遺伝子エレメントを含む粒子を含み、これは、遺伝子エレメントを細胞（例えば、ヒト細胞）内に導入することができる。一部の事例では、遺伝子エレメントは、ペイロードを含み、例えば、それは、細胞内で発現される外性エフェクター（例えば、ノンコーディングＲＮＡなどの核酸エフェクター、又はポリペプチドエフェクター、例えば、タンパク質）をコード化する。例えば、クロンは、細胞と接触して、外性エフェクターをコードする遺伝子エレメントを細胞内に導入することによって、細胞により外性エフェクターが生成又は発現されるように外性エフェクターを細胞内に送達することができる。外性エフェクターは、一部の事例では、細胞の機能を調節するか、又は細胞中の標的分子の活性又はレベルを調節することができる。例えば、外性エフェクターは、癌細胞の生存能を低減する（例えば、実施例２２に記載の通り）か、又は細胞中の標的タンパク質、例えば、インターフェロンのレベルを低下させる（例えば、実施例３及び４に記載の通り）ことができる。別の例では、外性エフェクターは、細胞により発現されるタンパク質であってもよい（例えば、実施例９に記載の通り）。
【０００５】
合成クロンは、野生型ウイルスと比較して、少なくとも１つの構造的相違、例えば、欠失、挿入、置換、酵素的修飾を有する。概して、合成クロンは、タンパク質性外層内に閉じ込められた外性遺伝子エレメントを含み、これは、遺伝子エレメント、又はそこでコード化されたエフェクター（例えば、外性エフェクター又は内在性エフェクター）（例えば、ポリペプチド又は核酸エフェクター）を真核細胞内に送達するための実質的に非免疫原性のビヒクルとして使用することができる。クロンは、例えば、治療薬を所望の細胞又は組織に送達することにより、疾患及び障害の治療のために使用することができる。本開示の合成クロンの遺伝子エレメントは、環状一本鎖ＤＮＡ分子であってよく、一般に、タンパク質結合配列を含み、これは、タンパク質性外層、又はそこに結合したポリペプチドに結合し、これによって、タンパク質性外層内への遺伝子エレメントの閉じ込め及び／又はタンパク質性外層内で、他の核酸と比較して、遺伝子エレメントの濃縮を促進し得る。
【０００６】
一態様では、本発明は、（ｉ）プロモータエレメントと、外性エフェクター（例えば、ペイロード）をコード化する配列と、タンパク質結合配列（例えば、外部タンパク質結合配列、例えば、パッケージングシグナル）と、を含む遺伝子エレメントを含む、合成クロンを特徴とする。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、一本鎖ＤＮＡである。これに代わり、又は組み合わせて、遺伝子エレメントは、以下の特性：環状である、且つ／又は細胞に進入する遺伝子エレメントの約０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、又は２％未満の頻度で、真核細胞のゲノム中に組み込まれる、のうちの一方又は両方を有する；並びに（ｉｉ）タンパク質性外層。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、タンパク質性外層内に閉じ込められる。一部の実施形態では、合成クロンは、遺伝子エレメントを真核細胞内に送達することができる。
【０００７】
一態様では、本発明は、以下：（ｉ）プロモータエレメントと、外性エフェクター（例えば、ペイロード）をコード化する配列と、タンパク質結合配列（例えば、外部タンパク質結合配列）と、を含む遺伝子エレメント；及び（ｉｉ）タンパク質性外層を含む合成クロンを特徴とし、ここで、遺伝子エレメントは、タンパク質性外層内に閉じ込められており；且つ合成クロンは、遺伝子エレメントを真核細胞内に送達することができる。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、野生型アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）の配列（例えば、野生型トルク・テノウイルス（Ｔｏｒｑｕｅ  Ｔｅｎｏ  ｖｉｒｕｓ）（ＴＴＶ）、トルク・テノミニウイルス（Ｔｏｒｑｕｅ  Ｔｅｎｏ  ｍｉｎｉ  ｖｉｒｕｓ）（ＴＴＭＶ）、又はＴＴＭＤＶ配列、例えば、表１、３、５、７、９、１１、若しくは１３のいずれかに挙げる野生型アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）配列）に対して少なくとも７５％（例えば、少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００％）の配列同一性を有する核酸配列（例えば、３００〜４０００ヌクレオチド、例えば、３００〜３５００ヌクレオチド、３００〜３０００ヌクレオチド、３００〜２５００ヌクレオチド、３００〜２０００ヌクレオチド、３００〜１５００ヌクレオチドの核酸配列）を含む。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、野生型アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）の配列（例えば、野生型トルク・テノウイルス（Ｔｏｒｑｕｅ  Ｔｅｎｏ  ｖｉｒｕｓ）（ＴＴＶ）、トルク・テノミニウイルス（Ｔｏｒｑｕｅ  Ｔｅｎｏ  ｍｉｎｉ  ｖｉｒｕｓ）（ＴＴＭＶ）、又はＴＴＭＤＶ配列、例えば、表１、３、５、７、９、１１、若しくは１３のいずれかに挙げる野生型アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）配列）に対して少なくとも７５％（例えば、少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００％）の配列同一性を有する核酸配列（例えば、少なくとも３００ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、１０００ヌクレオチド、１５００ヌクレオチド、２０００ヌクレオチド、２５００ヌクレオチド、３０００ヌクレオチド以上の核酸配列）を含む。
【０００８】
一態様では、本発明は、被験者の疾患又は障害を治療する方法を特徴とし、本方法は、クロン、例えば、本明細書に記載の通り、例えば、合成クロンを被験者に投与するステップを含む。一部の実施形態では、クロンは、以下：（ｉ）プロモータエレメントと、エフェクター（例えば、ペイロード）をコード化する配列と、外部タンパク質結合配列と、を含む遺伝子エレメントを含む。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、一本鎖ＤＮＡであり、ここで、遺伝子エレメントは、環状である、且つ／又は細胞に進入する遺伝子エレメントの約０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、又は２％未満の頻度で組み込まれる；並びに（ｉｉ）タンパク質性外層；ここで、遺伝子エレメントは、タンパク質性外層内に閉じ込められ；且つ、クロンは、遺伝子エレメントを真核細胞内に送達することができる。
【０００９】
一態様では、本発明は、細胞、組織又は被験者にペイロードを送達する方法を特徴とし、本方法は、クロン、例えば、本明細書に記載の通り、例えば、合成クロンを被験者に投与するステップを含み、ここで、クロンは、ペイロードをコード化する核酸配列を含む。一部の実施形態では、クロンは、以下：（ｉ）プロモータエレメントと、エフェクター（例えば、ペイロード）をコード化する配列と、外部タンパク質結合配列と、を含む遺伝子エレメントを含む。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、一本鎖ＤＮＡであり、ここで、遺伝子エレメントは、環状である、且つ／又は細胞に進入する遺伝子エレメントの約０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、又は２％未満の頻度で組み込まれる；並びに（ｉｉ）タンパク質性外層；ここで、遺伝子エレメントは、タンパク質性外層内に閉じ込められ；且つ、クロンは、遺伝子エレメントを真核細胞内に送達することができる。複数の実施形態では、ペイロードは、核酸である。複数の実施形態では、ペイロードは、タンパク質である。
【００１０】
一態様では、本発明は、合成クロンを細胞に送達する方法を特徴とし、これは、例えば、本明細書に記載の態様（例えば、前述の態様）のいずれかの、合成クロンを細胞、例えば、真核細胞、例えば、哺乳動物細胞と接触させるステップを含む。
【００１１】
一態様では、本発明は、本明細書に記載されるクロン（例えば、合成クロン）を含む医薬組成物を含む。複数の実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体又は賦形剤をさらに含む。複数の実施形態では、医薬組成物は、キログラム当たり約１０５〜１０１４ゲノム当量のクロンを含有する用量を含む。
【００１２】
一態様では、本発明は、プロモータエレメントと、エフェクター（例えば、ペイロード）をコード化する配列と、外部タンパク質結合配列と、を含む遺伝子エレメントを含む核酸分子を特徴とする。複数の実施形態では、遺伝子エレメントは、一本鎖ＤＮＡであり、ここで、遺伝子エレメントは、環状である、且つ／又は細胞に進入する遺伝子エレメントの約０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、又は２％の頻度で組み込まれる。複数の実施形態では、エフェクターは、ＴＴＶ由来ではなく、ＳＶ４０−ｍｉＲ−Ｓ１ではない。複数の実施形態では、核酸分子は、ＴＴＭＶ−ＬＹのポリヌクレオチド配列を含まない。複数の実施形態では、プロモータエレメントは、真核細胞におけるエフェクターの発現を指令することができる。
【００１３】
一態様では、本発明は、以下の１つ、２つ、若しくは３つを含む遺伝子エレメントを特徴とする：（ｉ）プロモータエレメントと、エフェクター（例えば、ペイロード）をコード化する配列；ここで、エフェクターは、野生型アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）配列に対して外性であり；（ｉｉ）野生型アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）の配列に対して少なくとも７５％（例えば、少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００％）の配列同一性を有する、少なくとも７２個の連続した核酸（例えば、少なくとも７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、９０、１００、若しくは１５０ヌクレオチド）；又は野生型アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）の配列に対して少なくとも７２％（例えば、少なくとも７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００％）の配列同一性を有する、少なくとも１００個（例えば、少なくとも３００個、５００個、１０００個、１５００個）の連続した核酸；並びに（ｉｉｉ）タンパク質結合配列、例えば、外部タンパク質結合配列、ここで、核酸構築物は、一本鎖ＤＮＡであると共に；核酸構築物は、環状である、且つ／又は細胞に進入する遺伝子エレメントの約０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、又は２％の頻度で組み込まれる。
【００１４】
一態様では、本発明は、合成クロン組成物を製造する方法を特徴とし、これは、以下：
ａ）クロン、例えば、本明細書に記載の通り、合成クロンの１つ又は複数の構成体（例えば、構成体の全部）を含む、例えば、発現する宿主細胞を提供するステップ；
ｂ）宿主細胞からクロンの調製物（調製物の合成クロンは、タンパク質性外層、及びプロモータエレメントと、外性エフェクター（例えば、ペイロード）をコード化する配列と、タンパク質結合配列（例えば、外部タンパク質結合配列、例えば、パッケージングシグナル）とを含む遺伝子エレメントを含む）を産生させ、これによって、合成クロンの調製物を作製するステップ；並びに
ｃ）合成クロンの調製物を、例えば、被験者への投与に好適な医薬組成物として製剤化するステップ
を含む。
【００１５】
一態様では、本発明は、合成クロン組成物を製造する方法を特徴とし、これは、以下：
ａ）本明細書に記載される複数の合成クロン、又は本明細書に記載される医薬組成物を提供するステップ；並びにｂ）合成クロンを、例えば、被験者への投与に好適な医薬組成物として製剤化するステップを含む。
【００１６】
一態様では、本発明は、合成クロンを含む宿主細胞、例えば、第１宿主細胞又はプロデューサ細胞（例えば、図１２に示すものなど）、例えば、第１宿主細胞の集団を作製する方法を特徴とし、本方法は、例えば、本明細書に記載の通り、遺伝子エレメントを宿主細胞に導入するステップと、合成クロンの産生に好適な条件下で宿主細胞を培養するステップと、を含む。複数の実施形態では、本方法は、ヘルパー、例えば、ヘルパーウイルスを宿主細胞に導入するステップをさらに含む。複数の実施形態では、導入ステップは、合成クロンを用いたトランスフェクション（例えば、化学的トランスフェクション）又はエレクトロポレーションを含む。
【００１７】
一態様では、本発明は、合成クロンを作製する方法を特徴とし、本方法は、例えば、本明細書に記載の通り、合成クロンを含む宿主細胞、例えば、第１宿主細胞又はプロデューサ細胞（例えば、図１２に示す通り）を提供するステップと、宿主細胞からクロンを精製するステップと、を含む。一部の実施形態では、本方法は、提供ステップの前に、宿主細胞を、例えば、本明細書に記載される合成クロンと接触させるステップと、合成クロンの産生に好適な条件下で宿主細胞をインキュベートするステップをさらに含む。複数の実施形態では、宿主細胞は、前述した宿主細胞の作製方法に記載される第１宿主細胞又はプロデューサ細胞である。複数の実施形態では、宿主細胞からクロンを精製するステップは、宿主細胞を溶解させるステップを含む。
【００１８】
一部の実施形態では、本方法は、第１宿主細胞又はプロデューサ細胞により産生された合成クロンを第２宿主細胞、例えば、許容細胞（例えば、図１２に示す通り）、例えば、第２宿主細胞の集団と接触させる第２ステップをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、合成クロンの産生に好適な条件下で第２宿主細胞をインキュベートするステップをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、さらに、第２宿主細胞から合成クロンを精製して、例えば、これによりクロンシード集団を生産するステップを含む。複数の実施形態では、第１宿主細胞の集団からのものと比較して、第２宿主細胞の集団から少なくとも約２〜１００倍多い合成クロンが産生される。複数の実施形態では、第２宿主細胞からクロンを精製するステップは、第２宿主細胞を溶解させるステップを含む。
【００１９】
一部の実施形態では、本方法は、第２宿主細胞により産生された合成クロンを第３宿主細胞、例えば、許容細胞（例えば、図１２に示す通り）、例えば、第３宿主細胞の集団と接触させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、合成クロンの産生に好適な条件下で第３宿主細胞をインキュベートするステップをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、第３宿主細胞からの合成クロンを精製して、例えば、これによりクロンストック集団を生産するステップを含む。複数の実施形態では、第３宿主細胞からのクロンの精製は、第３宿主細胞を溶解させるステップを含む。複数の実施形態では、第２宿主細胞の集団からのものと比較して、第３宿主細胞の集団から少なくとも約２〜１００倍多い合成クロンが生成される。
【００２０】
一部の実施形態では、本方法は、１つ若しくは複数の特性制御パラメータ、例えば、純度、力価、効力（例えば、クロン粒子当たりのゲノム当量）、及び／又は核酸配列（例えば、合成クロンに含まれる遺伝子エレメント由来）について、クロンシード集団又はクロンストック集団からの１つ又は複数の合成クロンを評価するステップを含むさらに含む。一部の実施形態では、評価される核酸配列は、外性エフェクターをコード化する核酸配列を含む。
【００２１】
一態様では、本発明は、１つ若しくは複数の特性制御パラメータ、例えば、純度、力価、効力、及び／又は核酸配列（例えば、合成クロンに含まれる遺伝子エレメント由来）について、クロンシード集団又はクロンストック集団からの１つ又は複数の合成クロンを評価するステップを含む。一部の実施形態では、評価される核酸配列は、外性エフェクターをコード化する核酸配列を含む。
【００２２】
一態様では、本発明は、本明細書に記載される合成クロン及びヘルパーウイルスを含む反応混合物を特徴とし、ここで、ヘルパーウイルスは、ポリヌクレオチド、例えば、外部タンパク質（例えば、外部タンパク質結合配列に結合することができる外部タンパク質、及び任意選択で、脂質エンベロープ）をコード化するポリヌクレオチド、複製タンパク質（例えば、ポリメラーゼ）をコード化するポリヌクレオチド、又はこれらの任意の組合せを含む。
【００２３】
一部の実施形態では、クロン（例えば、合成クロン）を単離する、例えば、宿主細胞から単離する、及び／又は溶液（例えば、上清）中の他の構成要素から単離する。一部の実施形態では、クロン（例えば、合成クロン）を、例えば、溶液（例えば、上清）から精製する。一部の実施形態では、溶液中の他の構成要素に対してクロンを溶液中で濃縮する。
【００２４】
前述したクロン、組成物又は方法のいずれかの一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、例えば、実施例９に記載の方法に従って同定される通り、最小クロンゲノムを含む。一部の実施形態では、最小クロンゲノムは、クロンの複製（例えば、宿主細胞における）に十分な最小アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ゲノムを含む。複数の実施形態では、最小クロンゲノムは、ＴＴＶ−ｔｔｈ８核酸配列のヌクレオチド３４３６〜３７０７の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％の欠失を有する、ＴＴＶ−ｔｔｈ８核酸配列、例えば、表５に示すＴＴＶ−ｔｔｈ８核酸配列を含む。複数の実施形態では、最小クロンゲノムは、ＴＴＭＶ−ＬＹ２核酸配列のヌクレオチド５７４〜１３７１、１４３２〜２２１０、５７４〜２２１０、及び／又は２６１０〜２８０９の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％の欠失を有する、ＴＴＭＶ−ＬＹ２核酸配列、例えば、表１１に示すＴＴＭＶ−ＬＹ２核酸配列を含む。複数の実施形態では、最小クロンゲノムは、自己複製及び／又は自己増幅が可能な最小クロンゲノムである。複数の実施形態では、最小クロンゲノムは、ヘルパー、例えば、ヘルパーウイルスの存在下で複製又は増幅が可能な最小クロンゲノムである。
【００２５】
前述したクロン、組成物又は方法のいずれかのさらに別の特徴は、以下に列挙する実施形態の１つ又は複数を含む。
【００２６】
当業者は、本明細書に記載される本発明の具体的な実施形態に対する様々な同等物を認識する、又は常用的な実験を用いて確認することができるであろう。こうした同等物は、以下に列挙する実施形態に含まれることが意図される。
【００２７】
実施形態の列挙
１．以下：
（ｉ）プロモータエレメントと、外性エフェクター（例えば、ペイロード）をコード化する核酸配列（例えば、ＤＮＡ配列）と、タンパク質結合配列（例えば、外部タンパク質結合配列、例えば、パッケージングシグナル）と、を含む遺伝子エレメントであって、遺伝子エレメントが、一本鎖ＤＮＡであり、さらに、以下の特性：環状である、且つ／又は細胞に進入する遺伝子エレメントの約０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、若しくは２％未満の頻度で、真核細胞のゲノム中に組み込まれる、の一方又は両方を有する、遺伝子エレメント；並びに
（ｉｉ）タンパク質性外層
を含む合成クロンにおいて、
遺伝子エレメントが、タンパク質性外層内に閉じ込められ；且つ
合成クロンが、遺伝子エレメントを真核細胞内に送達することができる、合成クロン。
【００２８】
２．以下：
（ｉ）プロモータエレメントと、外性エフェクター（例えば、ペイロード）をコード化する核酸配列（例えば、ＤＮＡ配列）と、タンパク質結合配列（例えば、外部タンパク質結合配列）と、を含む遺伝子エレメントであって、
遺伝子エレメントが、野生型アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）配列（例えば、野生型トルク・テノウイルス（Ｔｏｒｑｕｅ  Ｔｅｎｏ  ｖｉｒｕｓ）（ＴＴＶ）、トルク・テノミニウイルス（Ｔｏｒｑｕｅ  Ｔｅｎｏ  ｍｉｎｉ  ｖｉｒｕｓ）（ＴＴＭＶ）、又はＴＴＭＤＶ配列、例えば、表１、３、５、７、９、１１、若しくは１３のいずれかに挙げる野生型アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）配列）に対して少なくとも７５％（例えば、少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００％）の配列同一性を有する遺伝子エレメント；並びに
（ｉｉ）タンパク質性外層
を含む合成クロンにおいて、
遺伝子エレメントが、タンパク質性外層内に閉じ込められ；且つ
合成クロンが、遺伝子エレメントを真核細胞内に送達することができる、合成クロン。
【００２９】
３．以下：
（ｉ）プロモータエレメントと、エフェクター（例えば、外性エフェクター若しくは内在性エフェクター、例えば、内在性ｍｉＲＮＡ）をコード化する核酸配列（例えば、ＤＮＡ配列）と、タンパク質結合配列（例えば、外部タンパク質結合配列）と、を含む遺伝子エレメントであって、
遺伝子エレメントが、野生型アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）配列（例えば、野生型トルク・テノウイルス（Ｔｏｒｑｕｅ  Ｔｅｎｏ  ｖｉｒｕｓ）（ＴＴＶ）、トルク・テノミニウイルス（Ｔｏｒｑｕｅ  Ｔｅｎｏ  ｍｉｎｉ  ｖｉｒｕｓ）（ＴＴＭＶ）、又はＴＴＭＤＶ配列、例えば、表１、３、５、７、９、１１、若しくは１３のいずれかに挙げる野生型アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）配列）に対して少なくとも７５％（例えば、少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００％）の配列同一性を有し；且つ
遺伝子エレメントが、天然に存在する配列ではない（例えば、野生型アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）配列（例えば、野生型トルク・テノウイルス（Ｔｏｒｑｕｅ  Ｔｅｎｏ  ｖｉｒｕｓ）（ＴＴＶ）、トルク・テノミニウイルス（Ｔｏｒｑｕｅ  Ｔｅｎｏ  ｍｉｎｉ  ｖｉｒｕｓ）（ＴＴＭＶ）、又はＴＴＭＤＶ配列、例えば、表１、３、５、７、９、１１、若しくは１３のいずれかに挙げる野生型アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）配列に対して欠失、置換、又は挿入を含む）遺伝子エレメント；
（ｉｉ）タンパク質性外層
を含む合成クロンにおいて、
遺伝子エレメントが、タンパク質性外層内に閉じ込められ；且つ
合成クロンが、遺伝子エレメントを真核細胞内に送達することができる、合成クロン。
【００３０】
４．以下：
（ｉ）プロモータエレメントと、外性エフェクター（例えば、ペイロード）をコード化する核酸配列（例えば、ＤＮＡ配列）と、タンパク質結合配列（例えば、外部タンパク質結合配列）と、を含む遺伝子エレメントであって、
タンパク質結合配列が、表１６−１に示すコンセンサス５’ＵＴＲ配列、若しくは表１６−２に示すコンセンサスＧＣリッチ配列、又は表１６−１に示すコンセンサス５’ＵＴＲ配列と表１６−２に示すコンセンサスＧＣリッチ配列の両方に対して少なくとも７５％（例えば、少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００％）の配列同一性を有する、遺伝子エレメント；並びに
（ｉｉ）タンパク質性外層
を含む合成クロンにおいて、
遺伝子エレメントが、タンパク質性外層内に閉じ込められ；且つ
合成クロンが、遺伝子エレメントを真核細胞内に送達することができる、合成クロン。
【００３１】
５．以下：
（ｉ）プロモータエレメントと、外性エフェクターをコード化する核酸配列と、タンパク質結合配列と、を含む遺伝子エレメントであって、遺伝子エレメントが、以下：
（ａ）表１１の核酸配列のヌクレオチド３２３〜３９３のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）５’ＵＴＲ保存ドメインヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する配列、又は
（ｂ）表１１の核酸配列のヌクレオチド２８６８〜２９２９のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＧＣリッチ領域に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する配列
の一方又は両方を含む遺伝子エレメント；並びに
（ｉｉ）タンパク質性外層
を含む合成クロンにおいて；遺伝子エレメントがタンパク質外層内に閉じ込められており；且つ
合成クロンが、遺伝子エレメントを真核細胞内に送達することができる、合成クロン。
【００３２】
６．以下：
（ｉ）プロモータエレメントと、外性エフェクターをコード化する核酸配列と、タンパク質結合配列と、を含む遺伝子エレメントであって、遺伝子エレメントが、以下：
（ａ）表１、３、５、７、９、若しくは１３の核酸配列のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）５’ＵＴＲ保存ドメインに対して少なくとも８５％の配列同一性を有する配列；又は
（ｂ）表１、３、５、７、９、若しくは１３の核酸配列のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＧＣリッチ領域に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する配列
の一方又は両方を含む遺伝子エレメント；並びに
（ｉｉ）タンパク質性外層を含む合成クロンにおいて、遺伝子エレメントが、タンパク質性外層内に閉じ込められており；且つ
合成クロンが、遺伝子エレメントを真核細胞内に送達することができる、合成クロン。
【００３３】
７．プロモータエレメントが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ依存性プロモータ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ依存性プロモータ、ＰＧＫプロモータ、ＣＭＶプロモータ、ＥＦ−１αプロモータ、ＳＶ４０プロモータ、ＣＡＧＧプロモータ、又はＵＢＣプロモータ、ＴＴＶウイルスプロモータ、アクチベータタンパク質（ＴｅｔＲ−ＶＰ１６、Ｇａｌ４−ＶＰ１６，ｄＣａｓ９−ＶＰ１６など）の上流ＤＮＡ結合部位を有する組織特異的、Ｕ６（ｐｏｌｌＩＩＩ）、最小ＣＭＶプロモータを含む、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【００３４】
８．プロモータエレメントが、ＴＡＴＡボックスを含む、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【００３５】
９．プロモータエレメントが、野生型アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）、例えば、表１、３、５、６、９、１１、若しくは１３のいずれかに挙げる野生型アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）に対して内在性である、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【００３６】
１０．プロモータエレメントが、野生型アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）に対して外性である、実施形態１〜８のいずれかに記載の合成クロン。
【００３７】
１１．外性エフェクターが、治療薬、例えば、治療用ペプチド若しくはポリペプチド又は治療用核酸をコード化する、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【００３８】
１２．外性エフェクターが、調節核酸、例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｇＲＮＡ；蛍光タグ若しくはマーカ、抗原、ペプチド、天然の生物活性ペプチド由来の合成若しくはアナログペプチド、アゴニスト若しくはアンタゴニストペプチド、抗微生物ペプチド、孔形成ペプチド、二環式ペプチド、ターゲティング若しくは細胞傷害性ペプチド、分解若しくは自滅ペプチド、小分子、免疫エフェクター（例えば、免疫応答／シグナルに対する感受性に影響を与える）、細胞死誘導タンパク質（アポトーシス若しくは壊死の誘導物質）、腫瘍の非溶解性阻害剤（例えば、癌タンパク質の阻害剤）、後成的修飾剤、後成的酵素、転写因子、ＤＮＡ若しくはタンパク質修飾酵素、ＤＮＡ挿入剤、排出ポンプ阻害剤、核受容体アクチベータ若しくは阻害剤、プロテアソーム阻害剤、１酵素の競合阻害剤、タンパク質合成エフェクター若しくは阻害剤、ヌクレアーゼ、タンパク質断片若しくはドメイン、リガンド、抗体、受容体、又はＣＲＩＳＰＲ系若しくは成分を含む、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【００３９】
１３．外性エフェクターが、ｍｉＲＮＡを含む、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【００４０】
１４．エフェクター、例えば、ｍｉＲＮＡが、宿主遺伝子をターゲティングする、例えば、遺伝子の発現を調節する、例えば、遺伝子の発現を増大又は低減する、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【００４１】
１５．外性エフェクターが、ｍｉＲＮＡを含み、宿主遺伝子の発現を低減する、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【００４２】
１６．外性エフェクターが、約２０〜２００、３０〜１８０、４０〜１６０、５０〜１４０、又は６０〜１２０ヌクレオチド長の核酸配列を含む、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【００４３】
１７．外性エフェクターをコード化する核酸配列が、約２０〜２００、３０〜１８０、４０〜１６０、５０〜１４０、又は６０〜１２０ヌクレオチド長である、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【００４４】
１８．外性エフェクターをコード化する配列が、少なくとも約１００ヌクレオチドのサイズを有する、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【００４５】
１９．外性エフェクターをコード化する配列が、少なくとも約１００〜約５０００ヌクレオチドのサイズを有する、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【００４６】
２０．外性エフェクターをコード化する配列が、約１００〜２００、２００〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜６００、６００〜７００、７００〜８００、８００〜９００、９００〜１０００、１０００〜１５００、又は１５００〜２０００ヌクレオチドのサイズを有する、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【００４７】
２１．外性エフェクターをコード化する配列が、以下：遺伝子エレメントのＯＲＦ１遺伝子座（例えば、ＯＲＦ１遺伝子座のＣ末端）、ｍｉＲＮＡ遺伝子座、ＴＡＴＡボックス上流の５’ノンコーディング領域、５’ＵＴＲ、ポリ−Ａ領域下流の３’ノンコーディング領域、若しくはＧＣリッチ領域上流のノンコーディング領域の１つ若しくは複数に、その内部、又はそれに隣接して（例えば、５’若しくは３’側で）位置する、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【００４８】
２２．外性エフェクターをコード化する配列が、遺伝子エレメントのポリ−Ａ領域とＧＣリッチ領域の間に位置する、実施形態２１に記載の合成クロン。
【００４９】
２３．表１２のＯＲＦ２、ＯＲＦ２／２、ＯＲＦ２／３、ＯＲＦ１、ＯＲＦ１／１、若しくはＯＲＦ１／２から選択されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列の１つ又は複数を（例えば、タンパク質性外層内に）含む、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【００５０】
２４．表２、４、６、８、１０、若しくは１４のいずれかのＯＲＦ２、ＯＲＦ２／２、ＯＲＦ２／３、ＯＲＦ２ｔ／３、ＯＲＦ１、ＯＲＦ１／１、若しくはＯＲＦ１／２から選択されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも８５％配列同一性を有するアミノ酸配列の１つ又は複数を（例えば、タンパク質性外層内に）含む、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【００５１】
２５．タンパク質結合配列が、野生型アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）、例えば、表１、３、５、６、９、１１、１３、Ａ、若しくはＢのいずれかに挙げる野生型アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）配列の５’ＵＴＲ保存ドメイン又はＧＣリッチドメインに対して、少なくとも７５％（例えば、少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００％）の配列同一性を有する核酸配列を含む、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【００５２】
２６．遺伝子エレメント、例えば、遺伝子エレメントのタンパク質結合配列が、表１６−１に示すコンセンサス５’ＵＴＲ核酸配列に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％）の同一性を含む、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【００５３】
２７．遺伝子エレメント、例えば、遺伝子エレメントのタンパク質結合配列が、表１６−１に示す例示的なＴＴＶ５’ＵＴＲ核酸配列に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％）の同一性を含む、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【００５４】
２８．遺伝子エレメント、例えば、遺伝子エレメントのタンパク質結合配列が、表１６−１に示すＴＴＶ−ＣＴ３０Ｆ５’ＵＴＲ核酸配列に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％）の同一性を含む、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【００５５】
２９．遺伝子エレメント、例えば、遺伝子エレメントのタンパク質結合配列が、表１６−１に示すＴＴＶ−ＨＤ２３ａ５’ＵＴＲ核酸配列に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％）の同一性を含む、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【００５６】
３０．遺伝子エレメント、例えば、遺伝子エレメントのタンパク質結合配列が、表１６−１に示すＴＴＶ−ＪＡ２０  ５’ＵＴＲ核酸配列に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％）の同一性を含む、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【００５７】
３１．遺伝子エレメント、例えば、遺伝子エレメントのタンパク質結合配列が、表１６−１に示すＴＴＶ−ＴＪＮ０２  ５’ＵＴＲ核酸配列に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％）の同一性を含む、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【００５８】
３２．遺伝子エレメント、例えば、遺伝子エレメントのタンパク質結合配列が、表１６−１に示すＴＴＶ−ｔｔｈ８  ５’ＵＴＲ核酸配列に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％）の同一性を含む、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【００５９】
３３．遺伝子エレメント、例えば、遺伝子エレメントのタンパク質結合配列が、表１６−２に示すコンセンサスＧＣリッチ領域に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％）の同一性を含む、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【００６０】
３４．遺伝子エレメント、例えば、遺伝子エレメントのタンパク質結合配列が、表１６−２に示す例示的なＴＴＶ  ＧＣリッチ領域に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％）の同一性を含む、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【００６１】
３５．遺伝子エレメント、例えば、遺伝子エレメントのタンパク質結合配列が、表１６−２に示すＴＴＶ−ＣＴ３０Ｆ  ＧＣリッチ領域に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％）の同一性を含む、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【００６２】
３６．遺伝子エレメント、例えば、遺伝子エレメントのタンパク質結合配列が、表１６−２に示すＴＴＶ−ＨＤ２３ａ  ＧＣリッチ領域に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％）の同一性を含む、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【００６３】
３７．遺伝子エレメント、例えば、遺伝子エレメントのタンパク質結合配列が、表１６−２に示すＴＴＶ−ＪＡ２０  ＧＣリッチ領域に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％）の同一性を含む、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【００６４】
３８．遺伝子エレメント、例えば、遺伝子エレメントのタンパク質結合配列が、表１６−２に示すＴＴＶ−ＴＪＮ０２  ＧＣリッチ領域に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％）の同一性を含む、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【００６５】
３９．遺伝子エレメント、例えば、遺伝子エレメントのタンパク質結合配列が、表１６−２に示すＴＴＶ−ｔｔｈ８  ＧＣリッチ領域に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％）の同一性を含む、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【００６６】
４０．タンパク質結合配列の少なくとも６０％（例えば、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％）が、Ｇ又はＣから構成される、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【００６７】
４１．遺伝子エレメントが、少なくとも８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、又は１４０ヌクレオチド長の配列を含み、これが、少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％）又は約７０〜１００％、７５〜９５％、８０〜９５％、８５〜９５％、若しくは８５〜９０％の位置のＧ又はＣから構成される、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【００６８】
４２．遺伝子エレメントが、表１１の核酸配列のヌクレオチド１〜３９３のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）５’ＵＴＲ保存ドメインヌクレオチド配列に対して、少なくとも８５％の配列同一性を有する配列と、表１１の核酸配列のヌクレオチド２８６８〜２９２９のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＧＣリッチ領域に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する配列を含む、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【００６９】
４３．タンパク質結合配列が、外部タンパク質、例えば、キャプシドタンパク質、例えば、アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）キャプシドタンパク質、例えば、表１〜１４、１６、又は１８に挙げる配列のいずれかに対して、少なくとも７５％（例えば、少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質に結合することができる、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【００７０】
４４．遺伝子エレメントが、表１１の核酸配列に対して少なくとも７５％同一性を有する、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【００７１】
４５．タンパク質結合配列が、タンパク質性外層のアルギニンリッチ領域に結合する、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【００７２】
４６．タンパク質性外層が、タンパク質結合配列と特異的に結合することができる外部タンパク質を含む、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【００７３】
４７．外部タンパク質が、キャプシドタンパク質、例えば、アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）キャプシドタンパク質、例えば、表１〜１４、１６、又は１８に挙げる配列のいずれかに対して、少なくとも７５％（例えば、少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は表１〜１４、１５、１７、若しくは１９に挙げる配列のいずれか又はその断片によりコード化されたアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質を含む、実施形態４６に記載の合成クロン。
【００７４】
４８．タンパク質性外層が、以下：１つ若しくは複数のグリコシル化タンパク質、親水性ＤＮＡ−結合領域、アルギニンリッチ領域、トレオニンリッチ領域、グルタミンリッチ領域、Ｎ−末端ポリアルギニン配列、可変領域、Ｃ−末端ポリグルタミン／グルタミン酸配列、及び１つ若しくは複数のジスルフィド架橋のうち１つ又は複数を含む、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【００７５】
４９．タンパク質性外層が、以下の特徴：正二十面体対称、１つ若しくは複数の宿主細胞と相互作用して、宿主細胞内への進入を媒介する分子の認識及び／若しくはそれとの結合、脂質分子の欠失、炭水化物の欠失、ｐＨ及び温度安定性、界面活性剤抵抗性、及び宿主細胞において実質的に非免疫原性若しくは実質的に非病原性であることのうち１つ又は複数を含む、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【００７６】
５０．タンパク質性外層が、以下：１つ若しくは複数の機能、例えば、種及び／若しくは組織及び／若しくは細胞指向性、遺伝子エレメント結合及び／若しくはパッケージング、免疫回避（実質的な非免疫原性及び／若しくは寛容性）、薬物動態、エンドサイトーシス及び／若しくは細胞接着、核内進入、細胞内調節及び局在化、エキソサイトーシス調節、増殖、並びに核酸保護を提供する少なくとも１つの機能性ドメインを含む、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【００７７】
５１．エフェクターを除く遺伝子エレメントの部分が、約２．５〜５ｋｂ（例えば、約２．８〜４ｋｂ、約２．８〜３．２ｋｂ、約３．６〜３．９ｋｂ、又は約２．８〜２．９ｋｂ）、約５ｋｂ未満（例えば、約２．９ｋｂ、３．２ｋｂ、３．６ｋｂ、３．９ｋｂ、若しくは４ｋｂ）、又は少なくとも１００ヌクレオチド（例えば、少なくとも１ｋｂ）の合計サイズを有する、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【００７８】
５２．遺伝子エレメントが、一本鎖である、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【００７９】
５３．遺伝子エレメントが、環状である、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【００８０】
５４．遺伝子エレメントが、ＤＮＡである、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【００８１】
５５．遺伝子エレメントが、マイナス鎖ＤＮＡである、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【００８２】
５６．遺伝子エレメントが、エピソームを含む、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【００８３】
５７．合成クロンが、１０％、５％、２％、若しくは１重量％未満の脂質含有率を有し、例えば、脂質二重層を含まない、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【００８４】
５８．合成クロンが、外側脂質二重層を含むウイルス粒子、例えば、レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）と比較して、界面活性剤（例えば、中性洗剤、例えば、胆汁酸塩、例えば、デオキシコール酸ナトリウム）による分解に対して抵抗性である、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【００８５】
５９．界面活性剤（例えば、０．５重量％の界面活性剤）と３７℃で３０分間のインキュベーション後に、合成クロンの少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、若しくは９９．９％）が分解されない、実施形態５８に記載の合成クロン。
【００８６】
６０．遺伝子エレメントが、野生型サーコウイルス科（Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ）配列又は野生型アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）配列、例えば、野生型トルク・テノウイルス（Ｔｏｒｑｕｅ  Ｔｅｎｏ  ｖｉｒｕｓ）（ＴＴＶ）、トルク・テノミニウイルス（Ｔｏｒｑｕｅ  Ｔｅｎｏ  ｍｉｎｉ  ｖｉｒｕｓ）（ＴＴＭＶ）、又はＴＴＭＤＶ配列、例えば、表１、３、５、７、９、１１、若しくは１３のいずれかに挙げる１配列に対して、少なくとも７５％（例えば、少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００％）の配列同一性を有する、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【００８７】
６１．遺伝子エレメントが、野生型アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）配列、例えば、野生型ＴＴＶ配列又は野生型ＴＴＭＶ配列に対して、少なくとも１つのエレメント、例えば、表１、３、５、７、９、１１、若しくは１３のいずれかに挙げる１エレメントの欠失を含む、実施形態６０に記載の合成クロン。
【００８８】
６２．遺伝子エレメントが、ＴＴＶ−ｔｔｈ８配列のヌクレオチド３４３６〜３６０７に対応する核酸配列、例えば、表５に示す核酸配列を含む欠失を含む、実施形態６１に記載の合成クロン。
【００８９】
６３．遺伝子エレメントが、ＴＴＭＶ−ＬＹ２配列のヌクレオチド５７４〜１３７１及び／又はヌクレオチド１４３２〜２２１０に対応する核酸配列、例えば、表１１に示す核酸配列を含む欠失を含む、実施形態６１に記載の合成クロン。
【００９０】
６４．遺伝子エレメントが、ＴＴＭＶ−ＬＹ２配列のヌクレオチド１３７２〜１４３１に対応する核酸配列、例えば、表１１に示す核酸配列を含む欠失を含む、実施形態６１又は６２に記載の合成クロン。
【００９１】
６５．遺伝子エレメントが、ＴＴＭＶ−ＬＹ２配列のヌクレオチド２６１０〜２８０９に対応する核酸配列、例えば、表１１に示す核酸配列を含む欠失を含む、実施形態６１、６３、又は６４に記載の合成クロン。
【００９２】
６６．遺伝子エレメントが、野生型アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）配列、例えば、野生型トルク・テノウイルス（Ｔｏｒｑｕｅ  Ｔｅｎｏ  ｖｉｒｕｓ）（ＴＴＶ）、トルク・テノミニウイルス（Ｔｏｒｑｕｅ  Ｔｅｎｏ  ｍｉｎｉ  ｖｉｒｕｓ）（ＴＴＭＶ）、又はＴＴＭＤＶ配列、例えば、表１、３、５、７、９、１１、若しくは１３のいずれかに挙げる１配列の少なくとも７２ヌクレオチド（例えば、少なくとも７３、７４、７５ｎｔなど、任意選択で、ゲノムの完全長未満）を含む、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【００９３】
６７．遺伝子エレメントが、さらに、以下の配列：１つ若しくは複数のｍｉＲＮＡをコード化する配列、１つ若しくは複数の複製タンパク質をコード化する配列、外性遺伝子をコード化する配列、治療薬をコード化する配列、調節配列（例えば、プロモータ、エンハンサー）、内在性遺伝子（ｓｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）をターゲティングする１つ若しくは複数の調節配列をコード化する配列、治療用ｍＲＮＡ若しくはタンパク質をコード化する配列、細胞溶解性／細胞傷害性ＲＮＡ若しくはタンパク質をコード化する配列のうち１つ又は複数を含む、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【００９４】
６８．合成クロンが、さらに、第２の遺伝子エレメント、例えば、タンパク質性外層内に閉じ込められた第２の遺伝子エレメントを含む、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【００９５】
６９．遺伝子エレメントが、タンパク質結合配列、例えば、外部タンパク質結合配列、例えば、パッケージングシグナル、例えば、本明細書に記載の通り、例えば５’ＵＴＲ保存ドメイン又はＧＣリッチ領域を含む、実施形態６８に記載の合成クロン。
【００９６】
７０．合成クロンが、検出可能な程度で細菌細胞に感染せず、例えば、細菌細胞の１％、０．５％、０．１％、又は０．０１％未満に感染する、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【００９７】
７１．合成クロンが、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞、例えば、免疫細胞、肝細胞、上皮細胞に、例えば、インビトロで感染することができる、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【００９８】
７２．遺伝子エレメントが、細胞に進入するクロンの１０％、８％、６％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．２％、０．１％未満の頻度で組み込まれ、例えば、合成クロンは非統合性である、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【００９９】
７３．遺伝子エレメントが、例えば、定量ＰＣＲアッセイにより測定される場合、細胞当たり少なくとも１０２、２×１０２、５×１０２、１０３、２×１０３、５×１０３、又は１０４ゲノム当量の遺伝子エレメントを複製、例えば、産生することができる、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【０１００】
７４．遺伝子エレメントが、例えば、定量ＰＣＲアッセイにより測定される場合、細胞内への遺伝子エレメントの送達前に合成クロン中に存在したものと比較して、細胞当たり少なくとも１０２、２×１０２、５×１０２、１０３、２×１０３、５×１０３、又は１０４多いゲノム当量の遺伝子エレメントを複製することができる、例えば、産生することができる、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【０１０１】
７５．遺伝子エレメントが複製不可能であり、例えば、遺伝子エレメントが、複製起点で改変されているか、又は複製起点がない、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【０１０２】
７６．遺伝子エレメントが、自己複製不可能であり、例えば、宿主細胞ゲノムに組み込まれることなく、複製されることが可能である、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【０１０３】
７７．合成クロンが、実質的に非病原性であり、例えば、被験者の検出可能な有害な症状（例えば、クロンに曝露されていない被験者と比較して、例えば、細胞死又は毒性の増大）を誘導しない、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【０１０４】
７８．合成クロンが、実質的に非免疫原性であり、例えば、実施例４に記載の方法に従って検出される場合、例えば、検出可能な及び／又は不要な免疫応答を誘導しない、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【０１０５】
７９．実質的に非免疫原性のクロンが、被験者において、免疫応答が欠損する対照被験者における効力の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％である効力を有する、実施形態７８に記載の合成クロン。
【０１０６】
８０．免疫応答が、以下：クロンに対して特異的な抗体；クロン若しくはクロンを含む細胞に対する細胞応答（免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞若しくはＮＫ細胞）応答）；クロン若しくはクロンを含む細胞に対する細胞のマクロファージ貪食のうち１つ又は複数を含む、実施形態７８又は７９に記載の合成クロン。
【０１０７】
８１．合成クロンが、ＡＡＶより免疫原性が低く、例えば、本明細書に記載のアッセイにより測定した場合、同等量のＡＡＶについて検出されるものを下回る免疫応答を誘発し、本明細書に記載のアッセイにより測定した場合、７０％未満の抗体陽性率（例えば、約６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、若しくは１０％未満の抗体陽性率）を誘導するか、又は実質的に非免疫原性である、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【０１０８】
８２．少なくとも１０００の合成クロンの集団が、少なくとも１００コピーの遺伝子エレメントを１つ又は複数の真核細胞内に送達することができる、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【０１０９】
８３．合成クロンの集団が、真核細胞の集団の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、若しくはそれ以上に遺伝子エレメントを送達することができる、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【０１１０】
８４．合成クロンの集団が、真核細胞の集団に、細胞当たり少なくとも１、２、５、１０、２０、５０、１００、２００、５００、１０００、２０００、５０００、８，０００、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７以上の遺伝子エレメントのコピーを送達することができる、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【０１１１】
８５．合成クロンの集団が、真核細胞の集団に、細胞当たり１×１０４〜１×１０５、１×１０４〜１×１０６、１×１０４〜１×１０７、１×１０５〜１×１０６、１×１０５〜１×１０７、又は１×１０６〜１×１０７の遺伝子エレメントのコピーを送達することができる、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【０１１２】
８６．合成クロンが、少なくとも２つの継代後に存在する、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【０１１３】
８７．合成クロンが、少なくとも２つの継代を含むプロセスにより生成される、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【０１１４】
８８．合成クロンが、所望の細胞型、組織、又は器官（例えば、網膜の光受容体、上皮内層、若しくは膵臓）に外性エフェクターを選択的に送達する、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【０１１５】
８９．合成クロンが、胎児腎細胞株（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ）に対して、肺上皮癌細胞株（例えば、Ａ５４９）より高い選択性をインビトロで示す、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【０１１６】
９０．合成クロンが、他の器官又は組織と比較して、所望の器官又は組織において高レベルで存在する（例えば、優先的に蓄積する）、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【０１１７】
９１．所望の器官又は組織が、骨髄、血液、心臓、胃腸、又は皮膚である、実施形態９０に記載の合成クロン。
【０１１８】
９２．真核細胞が、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞である、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【０１１９】
９３．合成クロン、又はそのコピーが、細胞内への送達から２４時間（例えば、１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間、４週間、３０日、又は１ヵ月）後に検出可能である、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【０１２０】
９４．合成クロンが、例えば、感染力アッセイ、例えば、実施例７に記載のアッセイを用いた場合、感染から３〜４日後に、例えば、細胞に感染させるために用いられる合成クロンの量に対して、少なくとも約１０８倍（例えば、約１０５倍、１０６倍、１０７倍、１０８倍、１０９倍、若しくは１０１０倍）のゲノム当量／ｍＬで、細胞ペレット及び上清中に産生される、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン。
【０１２１】
９５．先行実施形態のいずれかに記載の合成クロンを含む組成物。
【０１２２】
９６．先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン、及び薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む医薬組成物。
【０１２３】
９７．少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくはそれ以上のクロン、例えば、合成クロンを含む、実施形態９５又は９６に記載の組成物又は医薬組成物。
【０１２４】
９８．少なくとも１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、又は１０９個の合成クロンを含む、実施形態９５〜９７のいずれかに記載の組成物又は医薬組成物。
【０１２５】
９９．以下：
ａ）（ｉ）本明細書に記載の遺伝子エレメント、例えば、プロモータエレメントと、外性エフェクター（例えば、ペイロード）をコード化する核酸配列（例えば、ＤＮＡ配列）と、タンパク質結合配列（例えば、外部タンパク質結合配列、例えば、パッケージングシグナル）と、を含む遺伝子エレメントであって、遺伝子エレメントが、一本鎖ＤＮＡであり、さらには、以下の特性：環状である、且つ／又は細胞に進入する遺伝子エレメントの約０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、若しくは２％未満の頻度で、真核細胞のゲノム中に組み込まれる、の一方又は両方を有する、遺伝子エレメント；及び
（ｉｉ）タンパク質性外層
を含む、少なくとも１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、又は１０９個のクロン（例えば、本明細書に記載の合成クロン）
（遺伝子エレメントは、タンパク質性外層内に閉じ込められ；且つ
合成クロンは、遺伝子エレメントを真核細胞内に送達することができる）；
ｂ）製剤用賦形剤、並びに任意選択で、
ｃ）予定量に満たないマイコプラズマ、外毒素、宿主細胞核酸（例えば、宿主細胞ＤＮＡ及び／又は宿主細胞ＲＮＡ）、動物由来のプロセス不純物（例えば、血清アルブミン若しくはトリプシン）、複製可能生物（ＲＣＡ）、例えば、複製可能ウイルス又は不要なクロン、遊離ウイルスキャプシドタンパク質、外来性汚染生物、及び／又は凝集体
を含む医薬組成物。
【０１２６】
１００．ａ）（ｉ）本明細書に記載の遺伝子エレメント、例えば、プロモータエレメントと、外性エフェクター（例えば、ペイロード）をコード化する核酸配列（例えば、ＤＮＡ配列）と、タンパク質結合配列（例えば、外部タンパク質結合配列）と、を含む遺伝子エレメントであって、
遺伝子エレメントが、野生型アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）配列（例えば、野生型トルク・テノウイルス（Ｔｏｒｑｕｅ  Ｔｅｎｏ  ｖｉｒｕｓ）（ＴＴＶ）、トルク・テノミニウイルス（Ｔｏｒｑｕｅ  Ｔｅｎｏ  ｍｉｎｉ  ｖｉｒｕｓ）（ＴＴＭＶ）、又はＴＴＭＤＶ配列、例えば、表１、３、５、７、９、１１、若しくは１３のいずれかに挙げる野生型アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）配列）に対して少なくとも７５％（例えば、少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００％）の配列同一性を有する遺伝子エレメント；及び
（ｉｉ）タンパク質性外層
を含む、少なくとも１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、又は１０９個のクロン（例えば、本明細書に記載の合成クロン）
（遺伝子エレメントは、タンパク質性外層内に閉じ込められており；且つ
合成クロンは、遺伝子エレメントを真核細胞内に送達することができる）；
ｂ）製剤用賦形剤、並びに任意選択で、
ｃ）予定量に満たないマイコプラズマ、外毒素、宿主細胞核酸（例えば、宿主細胞ＤＮＡ及び／又は宿主細胞ＲＮＡ）、動物由来のプロセス不純物（例えば、血清アルブミン若しくはトリプシン）、複製可能生物（ＲＣＡ）、例えば、複製可能ウイルス若しくは不要なクロン、遊離ウイルスキャプシドタンパク質、外来性汚染生物、及び／又は凝集体
を含む医薬組成物。
【０１２７】
１０１．以下の特徴：
ａ）医薬組成物が、医薬又は適正製造基準（ＧＭＰ）を満たすこと；
ｂ）医薬組成物が、適正製造基準（ＧＭＰ）に従って製造されていること；
ｃ）医薬組成物が、予め定めた基準値を下回る病原体レベルを有する、例えば、病原体を実質的に含まないこと；
ｄ）医薬組成物が、予め定めた基準値を下回る混入物レベルを有する、例えば、混入物を実質的に含まないこと；
ｅ）医薬組成物が、予め定めたレベルの非感染性粒子、又は予め定めた粒子：感染性単位の比（例えば、＜３００：１、≦２００：１、≦１００：１、若しくは＜５０：１）を有すること、或いは
ｆ）医薬組成物が、例えば、本明細書に記載の通り、低免疫原性を有する、又は実質的に非免疫原性であること
の１つ又は複数を有する、実施形態９５〜１００のいずれかに記載の組成物又は医薬組成物。
【０１２８】
１０２．医薬組成物が、予め定めた基準値を下回る混入物レベルを有する、例えば、混入物を実質的に含まない、実施形態９５〜１０１のいずれかに記載の組成物又は医薬組成物。
【０１２９】
１０３．混入物が、マイコプラズマ、外毒素、宿主細胞核酸（例えば、宿主細胞ＤＮＡ及び／又は宿主細胞ＲＮＡ）、動物由来のプロセス不純物（例えば、血清アルブミン若しくはトリプシン）、複製可能生物（ＲＣＡ）、例えば、複製可能ウイルス若しくは不要なクロン（所望のクロン、例えば、本明細書に記載するような合成クロン以外のクロン）、遊離ウイルスキャプシドタンパク質、外来性汚染生物、及び凝集体からなる群から選択される、実施形態１０２に記載の組成物又は医薬組成物。
【０１３０】
１０４．混入物が、宿主細胞ＤＮＡであり、閾値量が、医薬組成物の用量当たり約５００ｎｇの宿主細胞ＤＮＡである、実施形態１０３に記載の組成物又は医薬組成物。
【０１３１】
１０５．医薬組成物が、１０重量％未満（例えば、約１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、若しくは０．１％未満）の混入物を含む、実施形態９５〜１０４のいずれかに記載の組成物又は医薬組成物。
【０１３２】
１０６．被験者の疾患又は障害を治療することを目的とする、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン、組成物、又は医薬組成物の使用。
【０１３３】
１０７．疾患又は障害が、免疫障害、インターフェロン症（例えば、Ｉ型インターフェロン症）、感染症、炎症性障害、自己免疫疾患、癌（例えば、固形腫瘍、例えば肺癌）、及び胃腸障害から選択される、実施形態１０６に記載の使用。
【０１３４】
１０８．被験者の疾患又は障害の治療に使用するための先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン、組成物、又は医薬組成物。
【０１３５】
１０９．被験者の疾患又は障害を治療する方法であって、本方法が、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン又は実施形態９５〜１０５のいずれかに記載の医薬組成物を被験者に投与するステップを含む方法。
【０１３６】
１１０．疾患又は障害が、免疫障害、インターフェロン症（例えば、Ｉ型インターフェロン症）、感染症、炎症性障害、自己免疫疾患、癌（例えば、固形腫瘍、例えば肺癌）、及び胃腸障害から選択される、実施形態１０９に記載の方法。
【０１３７】
１１１．被験者の生物学的機能を調節する、例えば、増強する方法であって、本方法が、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロン又は実施形態９５〜１０５のいずれかに記載の医薬組成物を被験者に投与するステップを含む方法。
【０１３８】
１１２．被験者の疾患又は障害を治療する方法であって、本方法が、被験者に、以下：
（ｉ）プロモータエレメントと、エフェクター（例えば、ペイロード）をコード化する配列と、外部タンパク質結合配列と、を含む遺伝子エレメントであって；
遺伝子エレメントが、一本鎖ＤＮＡであり、ここで遺伝子エレメントは環状である、且つ／又は細胞に進入する遺伝子エレメントの約０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、若しくは２％未満の頻度で組み込まれる遺伝子エレメント；並びに
（ｉｉ）タンパク質性外層
を含む、クロン、例えば、合成クロンを投与するステップを含み、
ここで、遺伝子エレメントは、タンパク質性外層内に閉じ込められており；且つ
クロン、例えば、合成クロンは、遺伝子エレメントを真核細胞内に送達することができる、方法。
【０１３９】
１１３．疾患又は障害が、免疫障害、インターフェロン症（例えば、Ｉ型インターフェロン症）、感染症、免疫障害、自己免疫疾患、癌（例えば、固形腫瘍、例えば肺癌）、及び胃腸障害から選択される、実施形態１１２に記載の方法。
【０１４０】
１１４．エフェクターが、ＳＶ４０−ｍｉＲ−Ｓ１ではなく、例えば、エフェクターは、タンパク質コード化ペイロードである、実施形態１０９〜１１３のいずれかに記載の方法。
【０１４１】
１１５．クロンが、外性エフェクターを含まない、実施形態１０９〜１１４のいずれかに記載の方法。
【０１４２】
１１６．クロンが、野生型サーコウイルス（Ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ）又は野生型アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）、例えば、ＴＴＶ若しくはＴＴＭＶを含む、実施形態１０９〜１１５のいずれかに記載の方法。
【０１４３】
１１７．クロン、例えば、合成クロンの投与により、被験者の標的細胞の集団の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、若しくはそれ以上への遺伝子エレメントの送達が達成される、実施形態１０９〜１１６のいずれかに記載の方法。
【０１４４】
１１８．クロン、例えば、合成クロンの投与により、被験者の標的細胞の集団の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、若しくはそれ以上への外性エフェクターの送達が達成される、実施形態１０９〜１１７のいずれかに記載の方法。
【０１４５】
１１９．標的細胞が、例えば、インビトロで、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞、例えば、免疫細胞、肝細胞、肺上皮細胞を含む、実施形態１１７又は１１８に記載の方法。
【０１４６】
１２０．標的細胞が、肝臓又は肺に存在する、実施形態１１７〜１１９のいずれかに記載の方法。
【０１４７】
１２１．遺伝子エレメントが送達される標的細胞が各々、少なくとも１０、５０、１００、５００、１０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００、又はそれ以上の遺伝子エレメントのコピーを受ける、実施形態１１７〜１２０のいずれかに記載の方法。
【０１４８】
１２２．エフェクターが、ｍｉＲＮＡを含み、且つｍｉＲＮＡが、例えば、クロンが送達される細胞又は細胞の集団中の標的タンパク質又はＲＮＡのレベルを、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、若しくは５０％低下させる、実施形態１０９〜１２１のいずれかに記載の方法。
【０１４９】
１２３．合成クロンを細胞に送達する方法であって、先行実施形態のいずれかに記載の合成クロンを細胞、例えば、真核細胞、例えば、哺乳動物細胞と接触させるステップを含む、方法。
【０１５０】
１２４．ヘルパーウイルスを細胞と接触させるステップをさらに含み、ここで、ヘルパーウイルスが、ポリヌクレオチド、例えば、外部タンパク質をコード化するポリヌクレオチド、例えば、外部タンパク質結合配列に結合することができる外部タンパク質、並びに任意選択で、脂質エンベロープを含む、実施形態１２３に記載の方法。
【０１５１】
１２５．合成クロンを細胞と接触させるステップの前、それと同時、又はその後に、ヘルパーウイルスを細胞と接触させる、実施形態１２４に記載の方法。
【０１５２】
１２６．ヘルパーポリヌクレオチドを細胞と接触させるステップをさらに含む、実施形態１２３に記載の方法。
【０１５３】
１２７．ヘルパーポリヌクレオチドが、外部タンパク質をコード化する配列ポリヌクレオチド、例えば、外部タンパク質結合配列に結合することができる外部タンパク質と、脂質エンベロープとを含む、実施形態１２６に記載の方法。
【０１５４】
１２８．ヘルパーポリヌクレオチドが、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ、プラスミド、ウイルスポリヌクレオチド、又はこれらの任意の組合せである、実施形態１２６に記載の方法。
【０１５５】
１２９．合成クロンを細胞と接触させるステップの前、それと同時、又はその後に、ヘルパーポリヌクレオチドを細胞と接触させる、実施形態１２６〜１２８のいずれかに記載の方法。
【０１５６】
１３０．ヘルパータンパク質を細胞と接触させるステップをさらに含む、実施形態１２３〜１２９のいずれかに記載の方法。
【０１５７】
１３１．ヘルパータンパク質が、ウイルス複製タンパク質又はキャプシドタンパク質を含む、実施形態１３０に記載の方法。
【０１５８】
１３２．先行実施形態のいずれかに記載の合成クロンを含む宿主細胞。
【０１５９】
１３３．プロモータエレメント、エフェクター（例えば、ペイロード）をコード化する配列、及び外部タンパク質結合配列を含む核酸分子であって、
核酸分子が、一本鎖ＤＮＡであり、また、核酸分子は、環状である、且つ／又は細胞に進入する核酸分子の約０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、若しくは２％未満の頻度で組み込まれ；
エフェクターは、ＴＴＶ由来ではなく、しかもＳＶ４０−ｍｉＲ−Ｓ１ではなく；
核酸分子は、ＴＴＭＶ−ＬＹのポリヌクレオチド配列を含まず；
プロモータエレメントは、真核細胞におけるエフェクターの発現を指令することができる、核酸分子。
【０１６０】
１３４．プロモータエレメントと、外性エフェクターをコード化する核酸配列と、タンパク質結合配列と、を含む核酸分子であって、遺伝子エレメントが、以下：
（ａ）表１１の核酸配列のヌクレオチド３２３〜３９３のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）５’ＵＴＲ保存ドメインヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する配列、又は
（ｂ）表１１の核酸配列のヌクレオチド２８６８〜２９２９のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＧＣリッチ領域に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する配列
の一方又は両方を含む、核酸分子。
【０１６１】
１３５．プロモータエレメントと、外性エフェクターをコード化する核酸配列と、タンパク質結合配列と、を含む核酸分子であって、遺伝子エレメントが、以下：
（ａ）表１、３、５、７、９、若しくは１３の核酸配列のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）５’ＵＴＲ保存ドメインに対して少なくとも８５％の配列同一性を有する配列、又は
（ｂ）表１、３、５、７、９、若しくは１３の核酸配列のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＧＣリッチ領域に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する配列
の一方又は両方を含む、核酸分子。
【０１６２】
１３６．以下：
（ｉ）プロモータエレメント、及びエフェクター（例えば、ペイロード）をコード化する配列（エフェクターは、野生型アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）配列に対して外性である）と、
（ｉｉ）野生型アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）配列に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する少なくとも７２個の連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、９０、１００、若しくは１５０ヌクレオチド）；又は野生型アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）配列に対して少なくとも７２％（例えば、少なくとも７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００％）の配列同一性を有する少なくとも１００の連続したヌクレオチドと：
（ｉｉｉ）タンパク質結合配列、例えば、外部タンパク質結合配列と、
を含む遺伝子エレメントにおいて、
核酸構築物が、一本鎖ＤＮＡであり；
核酸構築物が、環状である、且つ／又は細胞に進入する遺伝子エレメントの約０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、若しくは２％未満の頻度で組み込まれる、遺伝子エレメント。
【０１６３】
１３７．合成クロン組成物を製造する方法であって、以下：
ａ）合成クロン、例えば、本明細書に記載の合成クロンの構成体をコード化する１つ若しくは複数の核酸分子を含む宿主細胞を提供するステップにおいて、合成クロンが、タンパク質性外層、及び遺伝子エレメント、例えば、プロモータエレメントと、外性エフェクター（例えば、ペイロード）をコード化する配列と、タンパク質結合配列（例えば、外部タンパク質結合配列、例えば、パッケージングシグナル）とを含む遺伝子エレメントを含む、ステップ；
ｂ）宿主細胞から合成クロンを産生させ、これによって、合成クロンを作製するステップ；並びに
ｃ）合成クロンを、例えば、被験者への投与に好適な医薬組成物として製剤化するステップ
を含む、方法。
【０１６４】
１３８．合成クロン組成物を製造する方法であって、以下：
ａ）先行実施形態のいずれかに記載の複数の合成クロン、又は実施形態９５〜１０５のいずれかに記載の組成物若しくは医薬組成物を提供するステップ；
ｂ）任意選択で、以下：本明細書に記載される混入物、光学密度測定（例えば、ＯＤ２６０）、粒子数（例えば、ＨＰＬＣにより）、感染力（例えば、粒子：感染単位比）のうち１つ又は複数について複数の合成クロンを評価するステップ；並びに
ｃ）例えば、（ｂ）のパラメータの１つ又は複数が、指定される閾値を満たしていれば、複数の合成クロンを、例えば、被験者への投与に好適な医薬組成物として製剤化するステップ
を含む、方法。
【０１６５】
１３９．合成クロン組成物が、少なくとも１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、又は１０１５個の合成クロンを含む、実施形態１３８に記載の方法。
【０１６６】
１４０．合成クロン組成物が、少なくとも１０ｍｌ、２０ｍｌ、５０ｍｌ、１００ｍｌ、２００ｍｌ、５００ｍｌ、１Ｌ、２Ｌ、５Ｌ、１０Ｌ、２０Ｌ、若しくは５０Ｌを含む、実施形態１３８又は１３９に記載の方法。
【０１６７】
１４１．先行実施形態のいずれかに記載の合成クロンとヘルパーウイルスとを含む反応混合物であって、ヘルパーウイルスが、ポリヌクレオチド、例えば、外部タンパク質（例えば、外部タンパク質配列に結合することができる外部タンパク質）をコード化するポリヌクレオチドと、任意選択で、脂質エンベロープとを含む、反応混合物。
【０１６８】
１４２．先行実施形態のいずれかに記載の合成クロンと、表１２のＯＲＦ２、ＯＲＦ２／２、ＯＲＦ２／３、ＯＲＦ１、ＯＲＦ１／１、若しくはＯＲＦ１／２から選択されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも８５％配列同一性を有するアミノ酸配列の１つ又は複数をコード化する第２の核酸配列とを含む、反応混合物。
【０１６９】
１４３．先行実施形態のいずれかに記載の合成クロンと、表２、４、６、８、１０、若しくは１４のいずれかのＯＲＦ２、ＯＲＦ２／２、ＯＲＦ２／３、ＯＲＦ２ｔ／３、ＯＲＦ１、ＯＲＦ１／１、若しくはＯＲＦ１／２から選択されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列の１つ又は複数をコード化する第２の核酸配列とを含む、反応混合物。
【０１７０】
１４４．第２の核酸配列が、遺伝子エレメントの一部である、実施形態１４２又は１４３に記載の反応混合物。
【０１７１】
１４５．第２の核酸配列が、遺伝子エレメントの一部ではなく、例えば、第２の核酸配列は、ヘルパー細胞又はヘルパーウイルスに含まれる、実施形態１４４に記載の反応混合物。
【０１７２】
１４６．以下：
（ｉ）非病原性外部タンパク質をコード化する配列と、（ｉｉ）遺伝子エレメントを非病原性外部タンパク質に結合させる外部タンパク質結合配列と、（ｉｉｉ）エフェクター、例えば、調節核酸をコード化する配列と、を含む遺伝子エレメント；及び
遺伝子エレメントと結合される、例えば、これを包膜又は閉じ込めるタンパク質性外層
を含む、合成クロン。
【０１７３】
１４７．以下：
ａ）（ｉ）非病原性外部タンパク質をコード化する配列と、（ｉｉ）遺伝子エレメントを非病原性外部タンパク質に結合させる外部タンパク質結合配列と、（ｉｉｉ）エフェクター、例えば、調節核酸をコード化する配列と、を含む遺伝子エレメント；及び
遺伝子エレメントと結合される、例えば、これを包膜又は閉じ込めるタンパク質性外層とを含む、合成クロン；並びに
ｂ）製剤用賦形剤
を含む、医薬組成物。
【０１７４】
１４８．以下：
ａ）（ｉ）非病原性外部タンパク質をコード化する配列と、（ｉｉ）遺伝子エレメントを非病原性外部タンパク質に結合させる外部タンパク質結合配列と、（ｉｉｉ）エフェクター、例えば、調節核酸をコード化する配列と、を含む遺伝子エレメント；及び
遺伝子エレメントと結合される、例えば、これを包膜又は閉じ込めるタンパク質性外層
を含む、少なくとも１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、又は１０９個のクロン（例えば、本明細書に記載の合成クロン）
ｂ）製剤用賦形剤、並びに任意選択で、
ｃ）予定量に満たないマイコプラズマ、外毒素、宿主細胞核酸（例えば、宿主細胞ＤＮＡ及び／又は宿主細胞ＲＮＡ）、動物由来のプロセス不純物（例えば、血清アルブミン若しくはトリプシン）、複製可能生物（ＲＣＡ）、例えば、複製可能ウイルス若しくは不要なクロン、遊離ウイルスキャプシドタンパク質、外来性汚染生物、及び／又は凝集体
を含む医薬組成物。
【０１７５】
１４９．以下の特徴：遺伝子エレメントが、一本鎖ＤＮＡであること；遺伝子エレメントが、環状であること；クロンが、非統合性であること；クロンが、アネロウイルス（ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）又は他の非病原性ウイルスに基づく配列、構造及び／又は機能を有すること、並びにクロンが、非病原性であること、の少なくとも１つをさらに含む、先行実施形態のいずれか１つに記載のクロン又は組成物。
【０１７６】
１５０．タンパク質性外層が、非病原性外部タンパク質を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載のクロン又は組成物。
【０１７７】
１５１．タンパク質性外層が、以下：１つ若しくは複数のグリコシル化タンパク質、親水性ＤＮＡ−結合領域、アルギニンリッチ領域、トレオニンリッチ領域、グルタミンリッチ領域、Ｎ−末端ポリアルギニン配列、可変領域、Ｃ−末端ポリグルタミン／グルタミン酸配列、及び１つ若しくは複数のジスルフィド架橋のうち１つ又は複数を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載のクロン又は組成物。
【０１７８】
１５２．タンパク質性外層が、以下の特徴：正二十面体対称、１つ若しくは複数の宿主細胞分子と相互作用して、宿主細胞内への進入を媒介する分子の認識及び／若しくはそれとの結合、脂質分子の欠失、炭水化物の欠失、ｐＨ及び温度安定性、界面活性剤抵抗性、及び宿主細胞における非免疫原性若しくは非病原性のうち１つ又は複数を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載のクロン又は組成物。
【０１７９】
１５３．非病原性外部タンパク質をコード化する配列が、表１５に挙げる１つ若しくは複数の配列又はその断片に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一の配列を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載のクロン又は組成物。
【０１８０】
１５４．非病原性外部タンパク質が、表１６又は表１７に挙げる１つ若しくは複数の配列又はその断片に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一の配列を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載のクロン又は組成物。
【０１８１】
１５５．非病原性外部タンパク質が、１つ若しくは複数の機能、例えば、種及び／若しくは組織及び／若しくは細胞指向性、ウイルスゲノム結合及び／若しくはパッケージング、免疫回避（非免疫原性及び／若しくは寛容性）、薬物動態、エンドサイトーシス及び／若しくは細胞接着、核内進入、細胞内調節及び局在化、エキソサイトーシス調節、増殖、並びに核酸保護を提供する少なくとも１つの機能性ドメインを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載のクロン又は組成物。
【０１８２】
１５６．エフェクターが、調節核酸、例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＩｎｃＲＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｇＲＮＡ；治療薬、例えば、蛍光タグ若しくはマーカ、抗原、ペプチド治療薬、天然の生物活性ペプチド由来の合成若しくはアナログペプチド、アゴニスト若しくはアンタゴニストペプチド、抗微生物ペプチド、孔形成ペプチド、二環式ペプチド、ターゲティング若しくは細胞傷害性ペプチド、分解若しくは自滅ペプチド、及び複数の分解若しくは自滅ペプチド、小分子、免疫エフェクター（例えば、免疫応答／シグナルに対する感受性に影響を与える）、細胞死誘導タンパク質（例えば、アポトーシス若しくは壊死の誘導物質）、腫瘍の非溶解性阻害剤（例えば、癌タンパク質の阻害剤）、後成的修飾剤、後成的酵素、転写因子、ＤＮＡ若しくはタンパク質修飾酵素、ＤＮＡ挿入剤、排出ポンプ阻害剤、核受容体アクチベータ若しくは阻害剤、プロテアソーム阻害剤、１酵素の競合阻害剤、タンパク質合成エフェクター若しくは阻害剤、ヌクレアーゼ、タンパク質断片若しくはドメイン、リガンド若しくは受容体、並びにＣＲＩＳＰＲ系若しくは構成体を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載のクロン又は組成物。
【０１８３】
１５７．エフェクターが、表１８に挙げる１つ若しくは複数のｍｉＲＮＡ配列に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一の配列を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載のクロン又は組成物。
【０１８４】
１５８．エフェクター、例えば、ｍｉＲＮＡが、宿主遺伝子をターゲティングし、例えば、遺伝子の発現を調節する、先行実施形態に記載のクロン又は組成物。
【０１８５】
１５９．ｍｉＲＮＡが、例えば、表１６に挙げる１つ若しくは複数の配列に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する、先行実施形態に記載のクロン又は組成物。
【０１８６】
１６０．遺伝子エレメントが、さらに、以下の配列：１つ若しくは複数のｍｉＲＮＡをコード化する配列、１つ若しくは複数の複製タンパク質をコード化する配列、外性遺伝子をコード化する配列、治療薬をコード化する配列、調節配列（例えば、プロモータ、エンハンサー）、内在性遺伝子（ｓｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）をターゲティングする１つ若しくは複数の調節配列をコード化する配列、治療用ｍＲＮＡ若しくはタンパク質をコード化する配列、細胞溶解性及び／若しくは細胞傷害性ＲＮＡ若しくはタンパク質のうち１つ又は複数を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載のクロン又は組成物。
【０１８７】
１６１．遺伝子エレメントが、以下の特徴：宿主細胞のゲノムと非統合性であること、エピソーム核酸であること、一本鎖ＤＮＡであること、約１〜１０ｋｂであること、細胞の核内に存在すること、内在性タンパク質と結合することができること、及び宿主遺伝子をターゲティングするｍｉｃｒｏＲＮＡを産生することのうち１つ又は複数を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載のクロン又は組成物。
【０１８８】
１６２．遺伝子エレメントが、表１９又は表２０に挙げる１つ若しくは複数の配列に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載のクロン又は組成物。
【０１８９】
１６３．ウイルス配列が、一本鎖ＤＮＡウイルス（例えば、アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）、ビドナウイルス（Ｂｉｄｎａｖｉｒｕｓ）、サーコウイルス（Ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ）、ジェミニウイルス（Ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｕｓ）、ゲノモウイルス（Ｇｅｎｏｍｏｖｉｒｕｓ）、イノウイルス（Ｉｎｏｖｉｒｕｓ）、ミクロウイルス（Ｍｉｃｒｏｖｉｒｕｓ）、ナノウイルス（Ｎａｎｏｖｉｒｕｓ）、パルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、及びスピラウイルス（Ｓｐｉｒａｖｉｒｕｓ））、二本鎖ＤＮＡウイルス（例えば、アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、アンプラウイルス（Ａｍｐｕｌｌａｖｉｒｕｓ）、アスコウイルス（Ａｓｃｏｖｉｒｕｓ）、アスファウイルス（Ａｓｆａｒｖｉｒｕｓ）、バキュロウイルス（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）、フセロウイルス（Ｆｕｓｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）、グロブロウイルス（Ｇｌｏｂｕｌｏｖｉｒｕｓ）、グッタウイルス（Ｇｕｔｔａｖｉｒｕｓ）、ヒトロサウイルス（Ｈｙｔｒｏｓａｖｉｒｕｓ）、ヘルペスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）、イリドウイルス（Ｉｒｉｄｏｖｉｒｕｓ）、リポスリックスウイルス（Ｌｉｐｏｔｈｒｉｘｖｉｒｕｓ）、ニマウイルス（Ｎｉｍａｖｉｒｕｓ）、及びポックスウイルス（Ｐｏｘｖｉｒｕｓ））、ＲＮＡウイルス（例えば、アルファウイルス（Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ）、フロウイルス（Ｆｕｒｏｖｉｒｕｓ）、肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、ホルデイウイルス（Ｈｏｒｄｅｉｖｉｒｕｓ）、トバモウイルス（Ｔｏｂａｍｏｖｉｒｕｓ）、トブラウイルス（Ｔｏｂｒａｖｉｒｕｓ）、トリコルナウイルス（Ｔｒｉｃｏｒｎａｖｉｒｕｓ）、ルビウイルス（Ｒｕｂｉｖｉｒｕｓ）、ビルナウイルス（Ｂｉｒｎａｖｉｒｕｓ）、シストウイルス（Ｃｙｓｔｏｖｉｒｕｓ）、パルティティウイルス（Ｐａｒｔｉｔｉｖｉｒｕｓ）、及びレオウイルス（Ｒｅｏｖｉｒｕｓ））の少なくとも１つに由来する、先行実施形態に記載のクロン又は組成物。
【０１９０】
１６４．ウイルス配列が、１つ又は複数の非アネロウイルス、例えば、アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、ヘルペスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）、ポックスウイルス（Ｐｏｘｖｉｒｕｓ）、ワクシニアウイルス（Ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ）、ＳＶ４０、パピローマウイルス（ｐａｐｉｌｌｏｍａ  ｖｉｒｕｓ）、レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）、例えば、レンチウイルス（ｌｅｎｔｉ  ｖｉｒｕｓ）などのＲＮＡウイルス、一本鎖ＲＮＡウイルス、例えば、肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、又は二本鎖ＤＮＡウイルス、例えば、ロタウイルス（ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）に由来する、先行実施形態に記載のクロン又は組成物。
【０１９１】
１６５．タンパク質結合配列が、タンパク質性外層のアルギニンリッチ領域と相互作用する、先行実施形態のいずれか１つに記載のクロン又は組成物。
【０１９２】
１６６．クロンが、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞において複製可能である、先行実施形態のいずれか１つに記載のクロン又は組成物。
【０１９３】
１６７．クロンが、宿主細胞において非病原性且つ／又は非統合性である、先行実施形態に記載のクロン又は組成物。
【０１９４】
１６８．クロンが、宿主において非免疫原性である、先行実施形態に記載のクロン又は組成物。
【０１９５】
１６９．クロンが、宿主又は宿主細胞において１つ又は複数のウイルス特性、例えば、選択性、例えば、感染力、例えば、免疫抑制／活性化を阻害／増強する、先行実施形態のいずれか１つに記載のクロン又は組成物。
【０１９６】
１７０．クロンが、（例えば、表現型、ウイルスレベル、遺伝子発現、他のウイルス、病態との競合などを少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、若しくはそれ以上）調節するのに十分な量で存在する、先行実施形態に記載のクロン又は組成物。
【０１９７】
１７１．ウイルス、例えば、クロンの変異体、例えば、片利共生／ネイティブウイルスのゲノムを含む少なくとも１つのウイルス又はベクターをさらに含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物。
【０１９８】
１７２．異種部分、少なくとも１つの小分子、抗体、ポリペプチド、核酸、ターゲティング剤、イメージング剤、ナノ粒子、及びこれらの組合せをさらに含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物。
【０１９９】
１７３．（ｉ）非病原性外部タンパク質をコード化する配列と、（ｉｉ）遺伝子エレメントを非病原性外部タンパク質と結合させる外部タンパク質結合配列と、（ｉｉｉ）エフェクター、例えば、調節核酸をコード化する配列とを含む、遺伝子エレメントを含むベクター。
【０２００】
１７４．遺伝子エレメントが、宿主細胞のゲノムと統合することができない、先行実施形態に記載のベクター。
【０２０１】
１７５．遺伝子エレメントが、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞において複製可能である、先行実施形態のいずれか１つに記載のベクター。
【０２０２】
１７６．例えば、遺伝子、例えば、ヒト遺伝子の発現を調節するように選択された、外性核酸配列をさらに含む、先行実施形態のいずれか１つに記載のベクター。
【０２０３】
１７７．先行実施形態のいずれか１つに記載のベクターと製剤用賦形剤を含む、医薬組成物。
【０２０４】
１７８．ベクターが、宿主細胞において非病原性且つ／又は非統合性である、先行実施形態に記載の組成物。
【０２０５】
１７９．ベクターが、宿主において非免疫原性である、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物。
【０２０６】
１８０．ベクターが、（表現型、ウイルスレベル、遺伝子発現、他のウイルス、病態との競合などを、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、若しくはそれ以上）調節するのに十分な量で存在する、先行実施形態に記載の組成物。
【０２０７】
１８１．ウイルス、例えば、クロンの変異体、片利共生／ネイティブウイルス、ヘルパーウイルス、非アネロウイルスのゲノムを含む少なくとも１つのウイルス又はベクターをさらに含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物。
【０２０８】
１８２．異種部分、少なくとも１つの小分子、抗体、ポリペプチド、核酸、ターゲティング剤、イメージング剤、ナノ粒子、及びこれらの組合せをさらに含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物。
【０２０９】
１８３．先行実施形態のいずれか１つに記載のクロンを生産、増殖、及び回収する方法。
【０２１０】
１８４．先行実施形態のいずれか１つに記載のベクターを設計し、作製する方法。
【０２１１】
１８５．先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物を有効量で被験者に投与するステップを含む方法。
【０２１２】
１８６．被験者のディスビロシス（ｄｙｓｖｉｒｏｓｉｓ）を識別する方法であって、以下：
それを必要とする被験者から得られたサンプルから遺伝子情報を分析するステップにおいて、ウイルス遺伝子情報が、被験者の遺伝子情報及び他の微生物から分離されるステップと；
ウイルス遺伝子情報を参照標準、例えば、対照、健常な被験者と比較するステップと；
ウイルス遺伝子情報の比較により、被験者のウイルス遺伝子情報の不均衡又は異常な比が得られる場合、被験者のディスビロシス（ｄｙｓｖｉｒｏｓｉｓ）を識別するステップと、
を含む方法。
【０２１３】
１８７．標的細胞、組織又は被験者に、核酸若しくはタンパク質ペイロードを送達する方法であって、本方法は、（ａ）ウイルス由来の第１ＤＮＡ（第１ＤＮＡは、標的細胞、組織又は被験者に感染することができる粒子の産生を可能にするのに十分である）及び（ａ）核酸若しくはタンパク質ペイロードをコード化する第２ＤＮＡ配列を含む核酸組成物と、標的細胞、組織又は被験者を接触させるステップを含み、改善が、以下：
第１ＤＮＡ配列が、表１、３、５、７、９、１１、若しくは１３のいずれかに挙げる対応する配列に対して少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、１００％）の配列同一性を有する少なくとも５００（少なくとも６００、７００、８００、９００、１０００、１２００、１４００、１５００、１６００、１８００、２０００）ヌクレオチドを含むか、又は
第１ＤＮＡ配列が、表２、４、６、８、１０、１２、若しくは１４に挙げるＯＲＦに対して少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、１００％）の配列同一性を有する配列をコード化するか、或いは
第１ＤＮＡ配列が、表１４−１に挙げるコンセンサス配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、９７％、９９％、１００％）の配列同一性を有する配列を含む、方法。
【０２１４】
本発明の他の特徴、目的、及び利点は、説明及び図面、並びに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【０２１５】
別に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に挙げる全ての刊行物、特許出願、特許、及びその他の参照文献は、その全体を参照により本明細書に組み込むものとする。加えて、材料、方法、及び例は、例示的に過ぎず、限定を意図するものではない。
【０２１６】
本発明の実施形態についての以下の詳細な説明は、添付の図面と一緒に読めば、より明瞭に理解されるであろう。本発明を説明する目的のために、図面には、本明細書で例示される実施形態を示す。しかしながら、本発明が、図面に示す実施形態の正確な配置及び有用性に限定されないことは理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【０２１７】
【図１】図１Ａは、キャプシドタンパク質配列のアミノ酸領域の配列類似性（％）を示す図である。図１Ｂは、キャプシドタンパク質配列の配列類似性（％）を示す図である。
【図２】クロンの一実施形態を示す図である。
【図３】ＴＴＭｉｎｉＶのＬＹ１株をコード化するカナマイシンベクター（「クロン１」）の概略図を描く。
【図４】ＴＴＭｉｎｉＶのＬＹ２株をコード化するカナマイシンベクター（「クロン２」）の概略図を描く。
【図５】２９３Ｔ及びＡ５４９細胞における合成クロンのトランスフェクション効率を描く。
【図６Ａ】合成クロンによる２９３Ｔ細胞の感染達成を示す定量ＰＣＲ結果を描く。
【図６Ｂ】合成クロンによる２９３Ｔ細胞の感染達成を示す定量ＰＣＲ結果を描く。
【図７Ａ】合成クロンによるＡ５４９細胞の感染達成を示す定量ＰＣＲ結果を描く。
【図７Ｂ】合成クロンによるＡ５４９細胞の感染達成を示す定量ＰＣＲ結果を描く。
【図８Ａ】合成クロンによるＲａｊｉ細胞の感染達成を示す定量ＰＣＲ結果を描く。
【図８Ｂ】合成クロンによるＲａｊｉ細胞の感染達成を示す定量ＰＣＲ結果を描く。
【図９Ａ】合成クロンによるＪｕｒｋａｔ細胞の感染達成を示す定量ＰＣＲ結果を描く。
【図９Ｂ】合成クロンによるＪｕｒｋａｔ細胞の感染達成を示す定量ＰＣＲ結果を描く。
【図１０Ａ】合成クロンによるＣｈａｎｇ細胞の感染達成を示す定量ＰＣＲ結果を描く。
【図１０Ｂ】合成クロンによるＣｈａｎｇ細胞の感染達成を示す定量ＰＣＲ結果を描く。
【図１１Ａ−１１Ｂ】ＴＴＭＶ−ＬＹ２Δ５７４−１３７１、Δ１４３２−２２１０，２６１０：：ｎＬｕｃでトランスフェクトした又は感染させた細胞からのルシフェラーゼ発現を示す一連のグラフである。感染した細胞にルミネセンスが観察され、これは、複製及びパッケージングの達成を示している。
【図１１Ｃ】アルファトルクウイルス（ａｌｐｈａｔｏｒｑｕｅｖｉｒｕｓ）（トルク・テノウイルス（Ｔｏｒｑｕｅ  Ｔｅｎｏ  Ｖｉｒｕｓ；ＴＴＶ）の系統樹を描く図であり、クレードをハイライトした。少なくとも１００のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）株が表示され、５つのクレードに区分される。５つのクレードの各々からの例示的な配列を例えば、本明細書の表１〜１４に提供する。上ボックス＝クレード１；中央上ボックス＝クレード２；中央ボックス＝クレード３、中央下ボックス＝クレード４；下ボックス＝クレード５
【図１２】クロン（例えば、本明細書に記載の複製可能又は複製欠損クロン）生産のための例示的なワークフローを示す概略図である。
【図１３】ＴＴＶ及びＴＴＭＶゲノム当量の定量のために設計されるプライマーセットに対してプライマー特異性を示すグラフである。ＳＹＢＲグリーンケミストリーに基づく定量ＰＣＲは、それぞれのゲノムをコード化するプラスミドに対し、表示の通り、ＴＴＭＶ若しくはＴＴＶ特異的プライマーを用いる増幅産物各々について１つの明瞭なピークを示す。
【図１４】ｑＰＣＲによるＴＴＶゲノム当量の定量におけるＰＣＲ効率を示す一連のグラフである。プライマーの漸増濃度及び加水分解プローブの定濃度（２５０ｎＭ）を２つの異なる市販のｑＰＣＲマスターミックスと一緒に使用した。９０〜１１０％の効率によって定量工程中に生じた誤差伝搬は、最小であった。
【図１５】ゲノム当量濃度の７ｌｏｇ１０にわたるＴＴＭＶ（標的１）又はＴＴＶ（標的２）の線形増幅の例示的な増幅プロットを示すグラフである。ゲノム当量は、高いＰＣＲ効率及び線形性で、７  １０倍希釈物について定量した（Ｒ２ＴＴＭＶ：０．９９６；Ｒ２ＴＴＶ：０．９９７）。
【図１６Ａ】クロンストック中のＴＴＭＶゲノム当量の定量を示す一連のグラフである。（Ａ）各々１：１０で希釈し、２回反復で実施した２つのストックの増幅プロットである。（Ｂ）パネルＡに示すものと同じ２つのサンプルであり、ここでは、線形範囲に関して示す。２つの代表的なサンプルでの上限及び下限を示す。ＰＣＲ効率：９９．５８％、Ｒ２：０９８８。
【図１６Ｂ】クロンストック中のＴＴＭＶゲノム当量の定量を示す一連のグラフである。（Ａ）各々１：１０で希釈し、２回反復で実施した２つのストックの増幅プロットである。（Ｂ）パネルＡに示すものと同じ２つのサンプルであり、ここでは、線形範囲に関して示す。２つの代表的なサンプルでの上限及び下限を示す。ＰＣＲ効率：９９．５８％、Ｒ２：０９８８。
【図１７Ａ】外性ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲ−６２５を含む合成クロンの機能効果を示す一連のグラフである。（Ａ）３つの異なるＮＳＣＬＣ細胞株（Ａ５４９細胞、ＮＣＩ−Ｈ４０細胞、及びＳＷ９００細胞）においてｍｉＲ−６２５を発現するクロンに感染させたときの非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞の細胞生存能に対する影響。（Ｂ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞によるＹＦＰリポータの発現に対する、ｍｉＲ−６２５を発現するクロンの影響。
【図１７Ｂ】外性ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲ−６２５を含む合成クロンの機能効果を示す一連のグラフである。（Ａ）３つの異なるＮＳＣＬＣ細胞株（Ａ５４９細胞、ＮＣＩ−Ｈ４０細胞、及びＳＷ９００細胞）においてｍｉＲ−６２５を発現するクロンに感染させたときの非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞の細胞生存能に対する影響。（Ｂ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞によるＹＦＰリポータの発現に対する、ｍｉＲ−６２５を発現するクロンの影響。
【図１７Ｃ】表示のクロンと接触させるか、又は未処理のままのいずれかのＳＷ９００細胞の全タンパク質に対して正規化したｐ６５イムノブロット分析の定量を示すグラフである。
【図１８】５つのアルファトルクウイルスクレード内のウイルスＤＮＡ配列のアラインメントについてのペアワイズ同一性を示す図である。各ＴＴＶクレードからのウイルスのＤＮＡ配列をアラインメントした。５０ｂｐスライディングウィンドウにわたるペアワイズ同一性（％）を各クレードのアラインメントの長さに沿って示す。平均ペアワイズ同一性を表示する。
【図１９】各アルファトルクウイルスクレードからの代表的な配列のアラインメントについてのペアワイズ同一性を示す図である。ＴＴＶ−ＣＴ３０Ｆ、ＴＴＶ−ＴＪＮ０２、ＴＴＶ−ｔｔｈ８、ＴＴＶ−ＪＡ２０、及びＴＴＶ−ＨＤ２３ａのＤＮＡ配列をアラインメントした。５０ｂｐスライディングウィンドウにわたるペアワイズ同一性（％）をアラインメントの長さに沿って示す。上のブラケットは、表示のペアワイズ同一性を有するノンコーディング及びコーディング領域を示す。下のブラケットは、高度配列保存の領域を示す。
【図２０】５つのアルファトルクウイルスクレードの間の推定タンパク質についてのアミノ酸アラインメントのペアワイズ同一性を示す図である。ＴＴＶ−ＣＴ３０Ｆ、ＴＴＶ−ＴＪＮ０２、ＴＴＶ−ｔｔｈ８、ＴＴＶ−ＪＡ２０、及びＴＴＶ−ＨＤ２３ａ由来の推定タンパク質のアミノ酸配列をアラインメントした。５０ａａスライディングウィンドウにわたるペアワイズ同一性（％）を各アラインメントの長さに沿って示す。オープンリーディングフレームＤＮＡ配列及びタンパク質アミノ酸配列の両方のペアワイズ同一性を示す。
【図２１】５’ＵＴＲ内のドメインが、５つのアルファトルクウイルスクレードにわたって高度に保存されていることを示す図である。各代表的アルファトルクウイルスの７１ｂｐ５’ＵＴＲ保存ドメイン配列をアラインメントした。配列は、５つのクレード間で９６．６％のペアワイズ同一性を有する。図２１に示す配列（それぞれ、配列番号７０３〜７０８、出現順）はまた、例えば、本明細書の表１６−１にも列挙する。
【図２２】５つのアルファトルクウイルスクレード由来のＧＣリッチドメインのアラインメントを示す図である。各アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）は、ＯＲＦの下流に７０％超のＧＣ含有率を有する領域を有する。ＴＴＶ−ＣＴ３０Ｆ、ＴＴＶ−ＴＪＮ０２、ＴＴＶ−ｔｔｈ８、ＴＴＶ−ＪＡ２０、及びＴＴＶ−ＨＤ２３ａ由来のＧＣリッチ領域のアラインメントを示す。これらの領域は長さがまちまちであるが、それらがアラインメントすると、８１．８％のペアワイズ同一性を示す。図２２に示す配列（それぞれ、配列番号７０９〜７１４、出現順）はまた、例えば、本明細書の表１６−２にも列挙する。
【発明を実施するための形態】
【０２１８】
定義
「治療、調節などを目的とする化合物、組成物、生成物など」という表現は、それ自体で、治療、調節など、明示される目的に好適な化合物、組成物、生成物などを指すと理解すべきである。「治療、調節などを目的とする化合物、組成物、生成物など」の表現は、さらに、実施形態として、こうした化合物、組成物、生成物などが、治療、調節などに使用されることも開示される。
【０２１９】
「・・・に使用するための化合物、組成物、生成物など」又は「・・・のための薬剤、医薬組成物、獣医学組成物、診断用組成物などの製造における化合物、組成物、生成物などの使用」という表現は、こうした化合物、組成物、生成物などが、ヒト又は動物身体に対して実施され得る治療方法で使用されることが意図されることを示す。それらは、治療方法などに関する実施形態及び請求項の同等の開示物として考えられる。実施形態又は請求項は、従って、「疾患への罹患が疑われるヒト又は動物の治療に使用するための化合物」を指す場合、これはまた、「疾患への罹患が疑われるヒト又は動物の治療を目的とする薬剤の製造における化合物の使用」又は「疾患への罹患が疑われるヒト又は動物に化合物を投与することによる治療方法」の開示であるともみなされる。「治療、調節などを目的とする化合物、組成物、生成物など」という表現は、それ自体で、治療、調節などの明示される目的に好適な化合物、組成物、生成物などを指すと理解すべきである。
【０２２０】
以後、用語、値、数などの例が括弧内に付与される場合、これは、括弧内に記載される例が、実施形態を構成し得ることを示すものとして理解すべきである。例えば、「複数の実施形態では、核酸分子は、表１のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１ヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列（例えば、表１の核酸配列のヌクレオチド５７１〜２６１３）を含む」と記載されている場合、一部の実施形態は、表１の核酸配列のヌクレオチド５７１〜２６１３に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む核酸分子に関する。
【０２２１】
本明細書で使用される場合、用語「クロン」は、タンパク質性外層内に閉じ込められた遺伝子エレメント、例えば、エピソーム、例えば、環状ＤＮＡを含むビヒクルを指す。「合成クロン」は、本明細書で使用される場合、概して、天然に存在しない、例えば、野生型ウイルス（例えば、本明細書に記載の野生型アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ））に対して修飾された配列を有するクロンを指す。一部の実施形態では、合成クロンは、操作されているか、又は組換え体であり、例えば、野生型ウイルスゲノム（例えば、本明細書に記載の野生型アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ゲノム）に対して修飾を含む遺伝子エレメントを含む。一部の実施形態では、タンパク質性外層内に閉じ込められたとは、タンパク質性外層による１００％の被覆、並びに１００％未満の被覆、例えば、９５％、９０％、８５％、８０％、７０％、６０％、５０％以下の被覆を包含する。例えば、遺伝子エレメントが、例えば、宿主細胞内への進入前に、タンパク質性外層内に保持されている限り、間隙又は不連続（例えば、タンパク質性外層を水、イオン、ペプチド、又は小分子に対して透過性にするもの）が、タンパク質性外層中に存在してもよい。一部の実施形態では、クロンは精製され、例えば、これは、元の供給源から分離される、且つ／又は他の構成体を実質的に含まない（＞５０％、＞６０％、＞７０％、＞８０％、＞９０％）。
【０２２２】
本明細書で使用される場合、「コード化する」核酸は、アミノ酸配列又は機能性ポリヌクレオチド（例えば、ノンコーディングＲＮＡ、例えば、ｓｉＲＮＡ若しくはｍｉＲＮＡ）をコード化する核酸配列を指す。
【０２２３】
本明細書で使用される場合、「ディスビロシス（ｄｙｓｖｉｒｏｓｉｓ）」は、被験者のウイルス集団の調節異常を指す。
【０２２４】
本明細書で使用される場合、「外性」物質（例えば、エフェクター、核酸（例えば、ＲＮＡ）、遺伝子、ペイロード、タンパク質）は、対応する野生型ウイルス、例えば、本明細書に記載のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）に含まれないか、又はそれによってコード化されない物質を指す。一部の実施形態では、外性物質は、天然に存在するタンパク質又は核酸に対して改変された（例えば、挿入、欠失、若しくは置換により）配列を有するタンパク質又は核酸のように、天然に存在しない。一部の実施形態では、外生物質は、宿主細胞中に天然に存在しない。一部の実施形態では、外性物質は、宿主細胞中に天然に存在するが、ウイルスに対しては外性である。一部の実施形態では、外性物質は、宿主細胞中に天然に存在するが、所望のレベルで、又は所望の時点に存在しない。
【０２２５】
本明細書で使用される場合、「遺伝子エレメント」という用語は、一般に、クロン内の核酸配列を指す。遺伝子エレメントをネイキッドＤＮＡとして生産し、任意選択で、さらにタンパク質性外層へとアセンブルすることができることは理解される。また、クロンはその遺伝子エレメントを細胞内に挿入することができ、それにより、遺伝子エレメントは細胞内に存在するため、タンパク質性外層が必ずしも細胞に進入するわけではないことも理解される。
【０２２６】
本明細書で使用される場合、「実質的に非病原性の」生物、粒子、又は構成体は、例えば、宿主生物、例えば、哺乳動物、例えば、ヒトに検出可能な疾患又は病的状態を誘発若しくは誘導しない生物、粒子（例えば、本明細書に記載の例えばウイルス若しくはクロン）、又はそれらの構成体を指す。一部の実施形態では、被験者に対するクロンの投与によって、標準治療の一部として許容可能な若干の反応又は副作用が起こり得る。
【０２２７】
本明細書で使用される場合、「非病原性」は、例えば、宿主生物、例えば、哺乳動物、例えば、ヒトにおいて検出可能な疾患又は病的状態を誘発若しくは誘導しない生物又はその構成体を指す。
【０２２８】
本明細書で使用される場合、「実質的に非統合性の」遺伝子エレメントは、宿主細胞（例えば、真核細胞）又は生物（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）に進入する遺伝子エレメントの約０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、若しくは１％未満が、ゲノムに組み込まれる遺伝子エレメント、例えば、ウイルス又はクロン（例えば、本明細書に記載されるもの）内の遺伝子エレメントを指す。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、例えば、宿主細胞のゲノムに検出可能な程度で組み込まれない。一部の実施形態では、ゲノム内への遺伝子エレメントの組込みは、本明細書に記載の技術、例えば、核酸シークエンシング、ＰＣＲ検出及び／又は核酸ハイブリダイゼーションを用いて検出することができる。
【０２２９】
本明細書で使用される場合、「実質的に非免疫原性の」生物、粒子、又は構成体は、宿主組織又は生物（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）に不要の若しくは非標的免疫応答を誘発若しくは誘導しない生物、粒子（例えば、本明細書に記載の例えばウイルス若しくはクロン）、又はそれらの構成体を指す。複数の実施形態では、実質的に非免疫原性の生物、粒子、又は構成体は、検出可能な免疫応答を生成しない。複数の実施形態では、実質的に非免疫原性のクロンは、表１〜１４のいずれかに示す核酸配列によりコード化されるアミノ酸配列を含むタンパク質に対して検出可能な免疫応答を生成しない。複数の実施形態では、免疫応答（例えば、不要の若しくは非標的免疫応答）は、例えば、Ｔｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ７７：１９９−２０６；参照により本明細書に組み込まれる）に記載される抗ＴＴＶ抗体検出方法及び／又はＫａｋｋｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．（２００８；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３８２：１８２−１８９；参照により本明細書に組み込まれる）に記載される抗ＴＴＶ  ＩｇＧレベルの測定方法に従って、被験者の抗体の存在又はレベル（例えば、抗クロン抗体の存在又はレベル、例えば、本明細書に記載の合成クロンに対する抗体の存在又はレベル）を検定することにより、決定される。アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）又はそれに基づくクロンに対する抗体もまた、抗ウイルス抗体を検出するための当技術分野の方法、例えば、Ｃａｌｃｅｄｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３；Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４（３４１）：１−７；参照により本明細書に組み込まれる）に記載される抗ＡＡＶ抗体を検出する方法によっても検出することができる。
【０２３０】
本明細書で使用される場合、「タンパク質性外層」という用語は、主としてタンパク質である外部構成体を指す。
【０２３１】
本明細書で使用される場合、「調節核酸」という用語は、発現産物をコード化するＤＮＡ配列の発現、例えば、転写及び／又は翻訳を修飾する核酸配列を指す。複数の実施形態では、発現産物は、ＲＮＡ又はタンパク質を含む。
【０２３２】
本明細書で使用される場合、「調節配列」という用語は、標的遺伝子産物の転写を修飾する核酸配列を指す。一部の実施形態では、調節配列は、プロモータ又はエンハンサーである。
【０２３３】
本明細書で使用される場合、「複製タンパク質」という用語は、感染、ウイルスゲノム複製／発現、ウイルスタンパク質合成、及び／又はウイルス構成体のアセンブリ中に使用されるタンパク質、例えば、ウイルスタンパク質を指す。
【０２３４】
本明細書で使用される場合、「治療（療法）」、「治療する（こと）」及びそれらの同等物は、疾患、病的状態、若しくは障害の改善、緩和、安定化、予防又は治癒を意図する、被験者の医学的管理を指す。この用語は、積極的治療（疾患、病的状態、若しくは障害の改善に向けた治療）、原因療法（関連疾患、病的状態、若しくは障害の原因に向けた治療）、緩和療法（症状の緩和のために設計される治療）、予防療法（関連疾患、病的状態、若しくは障害の発生の予防、最小化又は部分的若しくは完全な阻害に向けた治療）；並びに支持療法（別の療法を補助するために使用される治療）を含む。
【０２３５】
本明細書で使用される場合、「ウイルス集団（ビローム）」は、特定の環境、例えば、身体の一部、例えば、生物、例えば、細胞、例えば、組織中のウイルスを指す。
【０２３６】
本発明は、概して、クロン、例えば、合成クロン、及びその使用に関する。本開示は、合成クロン、合成クロンを含む組成物、及び合成クロンの製造又は使用方法を提供する。合成クロンは、一般に、例えば、真核細胞に治療薬を送達するための、送達ビヒクルとして有用である。概して、合成クロンは、タンパク質性外層内に閉じ込められた外性核酸配列（例えば、外性エフェクターをコード化する）を含む遺伝子エレメントを含む。合成クロンは、例えば、遺伝子エレメント、又はそこでコード化されるエフェクター（例えば、本明細書に記載される、例えばポリペプチド若しくは核酸エフェクター）を真核細胞に送達して、細胞を含む被験者の疾患又は障害を治療するための実質的に非免疫原性のビヒクルとして使用することができる。
【０２３７】
クロン
一部の態様では、本明細書に記載される本発明は、組成物並びに合成クロンの使用及び製造方法を含む。一部の実施形態では、クロンは、遺伝子エレメント（例えば、環状ＤＮＡ、例えば、一本鎖ＤＮＡ）を含み、これは、残りの遺伝子エレメント及び／又はタンパク質性外層に対して少なくとも１つの外性エレメント（例えば、本明細書に記載の通り、例えば、エフェクターをコード化する外性エレメント）を含む。クロンは、宿主、例えば、ヒトへのペイロードの送達ビヒクル（例えば、実質的に非免疫原性送達ビヒクル）であってもよい。一部の実施形態では、クロンは、真核細胞、例えば、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞において複製が可能である。一部の実施形態では、クロンは、哺乳動物（例えば、ヒト）細胞において、実質的に非病原性及び／又は実質的に非統合性である。一部の実施形態では、クロンは、哺乳動物、例えば、ヒトにおいて、実質的に非免疫原性である。一部の実施形態では、クロンは、アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）（例えば、本明細書に記載のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）、例えば、表１〜１４のいずれかに示す配列を含む核酸又はポリペプチドを含むアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ））又は他の実質的に非病原性のウイルス、例えば、共生ウイルス、片利共生ウイルス、ネイティブウイルスに基づく配列、構造、及び／又は機能を有する。一般に、アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ベースのクロンは、アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）に対して外性の少なくとも１つのエレメント、例えば、外性エフェクター又はクロンの遺伝子エレメント内に配置される外性エフェクターをコード化する核酸配列を含む。一部の実施形態では、クロンは、複製欠損である。一部の実施形態では、クロンは、複製可能である。
【０２３８】
一態様では、本発明は、以下：（ｉ）プロモータエレメントと、外性エフェクター（例えば、ペイロード）をコード化する配列と、タンパク質結合配列（例えば、外部タンパク質結合配列、例えば、パッケージングシグナル）と、を含む遺伝子エレメントであって、遺伝子エレメントが、一本鎖ＤＮＡであり、さらには、以下の特性：環状である、且つ／又は細胞に進入する遺伝子エレメントの約０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、若しくは２％未満の頻度で、真核細胞のゲノム中に組み込まれる、の一方又は両方を有する、遺伝子エレメント；並びに（ｉｉ）タンパク質性外層を含む合成クロンを含み、ここで、遺伝子エレメントは、タンパク質性外層内に閉じ込められており；且つ合成クロンは、遺伝子エレメントを真核細胞内に送達することができる。
【０２３９】
本明細書に記載される合成クロンの一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、細胞に進入する遺伝子エレメントの約０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、若しくは２％未満の頻度で組み込まれる。一部の実施形態では、被験者に投与される複数の合成クロンからの約０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、若しくは５％未満の遺伝子エレメントが、被験者の１つ又は複数の宿主細胞のゲノムに組み込まれる。一部の実施形態では、例えば、本明細書に記載の通り、合成クロンの集団の遺伝子エレメントは、ＡＡＶウイルスの同等集団の頻度よりも低い頻度で、例えば、ＡＡＶウイルスの同等集団の頻度より約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、若しくはそれ以上低い頻度で、宿主細胞のゲノムに組み込まれる。
【０２４０】
一態様では、本発明は、以下：（ｉ）プロモータエレメントと、外性エフェクター（例えば、ペイロード）をコード化する配列と、タンパク質結合配列（例えば、外部タンパク質結合配列）と、を含む遺伝子エレメントであって、遺伝子エレメントが、野生型アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）配列（例えば、野生型トルク・テノウイルス（Ｔｏｒｑｕｅ  Ｔｅｎｏ  ｖｉｒｕｓ）（ＴＴＶ）、トルク・テノミニウイルス（Ｔｏｒｑｕｅ  Ｔｅｎｏ  ｍｉｎｉ  ｖｉｒｕｓ）（ＴＴＭＶ）、又はＴＴＭＤＶ配列、例えば、表１、３、５、７、９、１１、若しくは１３のいずれかに挙げる野生型アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）配列）に対して少なくとも７５％（例えば、少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００％）の配列同一性を有する遺伝子エレメント：及び（ｉｉ）タンパク質性外層を含む合成クロンを含み、ここで、遺伝子エレメントは、タンパク質性外層内に閉じ込められており；且つ合成クロンは、遺伝子エレメントを真核細胞内に送達することができる。
【０２４１】
一態様では、本発明は、以下：
ａ）（ｉ）非病原性外部タンパク質をコード化する配列と、（ｉｉ）非病原性外部タンパク質に遺伝子エレメントを結合させる外部タンパク質結合配列と、（ｉｉｉ）調節核酸をコード化する配列と、を含む遺伝子エレメント；及び
ｂ）遺伝子エレメントと結合される、例えば、これを包膜又は閉じ込めるタンパク質性外層
を含む合成クロンを含む。
【０２４２】
一部の実施形態では、クロンは、非包膜、環状、一本鎖ＤＮＡウイルス由来の（又はそれに対して＞７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％の相同性を有する）配列若しくは発現産物を含む。動物環状一本鎖ＤＮＡウイルスは、一般に、真核非植物宿主に感染し、環状ゲノムを有する一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）の亜群を指す。従って、動物環状ｓｓＤＮＡウイルスは、原核生物に感染するｓｓＤＮＡウイルス（すなわち、ミクロウイルス科（Ｍｉｃｒｏｖｉｒｉｄａｅ）及びイノウイルス科（Ｉｎｏｖｉｒｉｄａｅ））、並びに植物に感染するｓｓＤＮＡウイルス（すなわち、ジェミニウイルス科（Ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｉｄａｅ）及びナノウイルス科（Ｎａｎｏｖｉｒｉｄａｅ））から識別可能である。これらはまた、非植物真核細胞に感染する線状ｓｓＤＮＡウイルス（すなわち、パルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ））からも識別可能である。
【０２４３】
一部の実施形態では、クロンは、宿主細胞の機能を例えば、一過性又は長期に調節する。いくつかの実施形態では、細胞の機能は安定に改変され、例えば、調節は少なくとも約１時間〜約３０日、又は少なくとも約２時間、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、６０日、若しくはそれ以上又はこれらの間の任意の時間にわたって持続する。
【０２４４】
いくつかの実施形態では、細胞の機能は、一過性改変され、例えば、調節は、約３０分〜約７日以下、又は約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、４日、５日、６日、７日以下、又はこれらの間の任意の時間にわたって持続する。
【０２４５】
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、プロモータエレメントを含む。複数の実施形態では、プロモータエレメントは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ依存性プロモータ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ依存性プロモータ、ＰＧＫプロモータ、ＣＭＶプロモータ、ＥＦ−１αプロモータ、ＳＶ４０プロモータ、ＣＡＧＧプロモータ、又はＵＢＣプロモータ、ＴＴＶウイルスプロモータ、アクチベータタンパク質（ＴｅｔＲ−ＶＰ１６、Ｇａｌ４−ＶＰ１６、ｄＣａｓ９−ＶＰ１６など）の上流ＤＮＡ結合部位を有する組織特異的、Ｕ６（ｐｏｌｌＩＩＩ）、最小ＣＭＶプロモータから選択される。複数の実施形態では、プロモータエレメントは、ＴＡＴＡボックスを含む。複数の実施形態では、プロモータエレメントは、例えば、本明細書に記載される野生型アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）に対して内在性である。
【０２４６】
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、以下の特徴：一本鎖、環状、マイナス鎖、及び／又はＤＮＡのうち１つ又は複数を含む。複数の実施形態では、遺伝子エレメントは、エピソームを含む。一部の実施形態では、エフェクターを除く遺伝子エレメントの部分は、約２．５〜５ｋｂ（例えば、約２．８〜４ｋｂ、約２．８〜３．２ｋｂ、約３．６〜３．９ｋｂ、又は約２．８〜２．９ｋｂ）、約５ｋｂ未満（例えば、約２．９ｋｂ、３．２ｋｂ、３．６ｋｂ、３．９ｋｂ、若しくは４ｋｂ未満）、又は少なくとも１００ヌクレオチド（例えば、少なくとも１ｋｂ）の合計サイズを有する。
【０２４７】
本明細書に記載されるクロン、クロンを含む組成物、こうしたクロンを使用する方法などは、一部の事例において、異なるエフェクター、例えば、ｍｉＲＮＡ（例えば、ＩＦＮ若しくはｍｉＲ−６２５に対する）、ｓｈＲＮＡなどと、タンパク質結合配列、例えば、Ｑ９９１５３などのキャプシドタンパク質に結合するＤＮＡ配列を、タンパク質性外層、例えば、Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ（２００７）１５２：１９６１−１９７５に開示されるキャプシドと組み合わせて、クロンを産生させる（次に、これは、外性エフェクターを細胞（例えば、動物細胞、例えば、ヒト細胞又はブタ若しくはマウス細胞などのヒト以外の細胞）に送達するために使用することができる）方法を説明する実施例に部分的に基づく。複数の実施形態では、外性エフェクターは、インターフェロンなどの因子の発現を抑制することができる。実施例はさらに、いかにして、例えば、アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）由来の配列に外性エフェクターを挿入することにより、クロンを製造することができるかも説明する。これらの実施例に基づいて、以下の説明は、特定の知見の様々な変形及び実施例で検討される組合せを考慮する。例えば、当業者は、実施例から、特定のｍｉＲＮＡが外性エフェクターのほんの１例として使用されること、及びその他の外性エフェクターが、例えば、他の調節核酸又は治療用ペプチドであってもよいことを理解されるであろう。同様に、本実施例で使用される特定のキャプシドの代わりに、本明細書に後述する実質的に非病原性のタンパク質を使用してもよい。また、本実施例に記載する特定のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）配列の代わりに、本明細書に後述するアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）配列を使用してもよい。これらの検討事項は、タンパク質結合配列、プロモータなどの調節配列などにも同様に適用される。それらから独立に、当業者は、本実施例に密接に関連するこうした実施形態を特に考慮するであろう。
【０２４８】
一部の実施形態では、クロン、又はクロンに含まれる遺伝子エレメントを細胞（例えば、ヒト細胞）に導入する。一部の実施形態では、例えば、実施例１９に記載する通り、例えば、クロン又は遺伝子エレメントが細胞に一旦導入されると、例えば、クロンの遺伝子エレメントによりコード化された外性エフェクター（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍｉＲＮＡ）は、細胞（例えば、ヒト細胞）において発現される。一部の実施形態では、クロン、又はそこに含まれる遺伝子エレメントの細胞への導入は、例えば、細胞による標的分子の発現レベルを改変することによって（例えば、実施例２２に記載する通り）、細胞中の標的分子（例えば、標的核酸、例えば、ＲＮＡ、若しくは標的ポリペプチド）のレベルを調節（例えば、増大若しくは低減）する。複数の実施形態では、クロン、又はそこに含まれる遺伝子エレメントの導入は、実施例３及び４に記載する通り、細胞により産生されたインターフェロンのレベルを低減する。一部の実施形態では、クロン、又はそこに含まれる遺伝子エレメントの細胞への導入は、細胞の機能を調節（例えば、増大若しくは低減）する。複数の実施形態では、クロン、又はそこに含まれる遺伝子エレメントの細胞への導入は、細胞の生存能を調節（例えば、増大若しくは低減）する。複数の実施形態では、クロン、又はそこに含まれる遺伝子エレメントの細胞への導入は、例えば、実施例２２に記載する通り、細胞（例えば、癌細胞）の生存能を低減する。
【０２４９】
一部の実施形態では、本明細書に記載のクロン（例えば、合成クロン）は、７０％未満の抗体陽性率（例えば、約６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、若しくは１０％未満の抗体陽性率）を誘導する。複数の実施形態では、抗体陽性率は、当技術分野で公知の方法に従って測定される。複数の実施形態では、抗体陽性率は、例えば、Ｔｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ７７：１９９−２０６；参照により本明細書に組み込まれる）に記載される抗ＴＴＶ抗体検出法及び／又はＫａｋｋｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．（２００８；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３８２：１８２−１８９；参照により本明細書に組み込まれる）に記載される抗ＴＴＶ  ＩｇＧ血清陽性率を決定する方法に従って、生体サンプル中のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）（例えば、本明細書に記載の通り）又はそれに基づくクロンに対する抗体を検出することにより測定される。さらに、アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）又はそれに基づくクロンに対する抗体は、抗ウイルス抗体を検出するための当技術分野の方法、例えば、Ｃａｌｃｅｄｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３；Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４（３４１）：１−７；参照により本明細書に組み込まれる）に記載される抗ＡＡＶ抗体を検出する方法により検出することもできる。
【０２５０】
アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）
一部の実施形態では、例えば、本明細書に記載の合成クロンは、アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）由来の配列又は発現産物を含む。概して、合成クロンは、アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）に対して外性の１つ若しくは複数の配列又は発現産物を含む。アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）属は、かつてサーコウイルス（Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ）科の１クレードとして分類されていたが、近年個別の科として分類されている。アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）は一般に、負極性を有する一本鎖環状ＤＮＡゲノムを有する。アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）は、ヒト疾患と関連付けられていない。しかし、アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）感染をヒト疾患と関連付ける試みは、対照コホート集団における無症候性アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ウイルス血症の高い発生率、アネロウイルス（ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ウイルス科の著しいゲノム多様性、このウイルスをインビトロでの増殖がこれまで不可能であったこと、並びにアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）疾患の動物モデルがないことによって妨げられている（Ｙｚｅｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐａｎｍｉｎｅｒｖａ  Ｍｅｄ．（２００２）４４：１６７−１７７；Ｂｉａｇｉｎｉ，Ｐ．，Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００４）９８：９５−１０１）。
【０２５１】
アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）は、口鼻若しくは糞口感染、母子及び／又は子宮感染により伝播されると思われる（Ｇｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｄ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｊ．（２０００）１９：１０７４−１０７７）。感染した人は、長期（数ヵ月〜数年）にわたるアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ウイルス血症の特徴を有する。ヒトは、２つ以上の遺伝子群又は系統に同時感染する可能性がある（Ｓａｂａｃｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃａｄ．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．（２００１）３３：１２１−１２５）。これらの遺伝子群は、感染したヒトにおいて再結合し得ることが示唆されている（Ｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．（２００３）３１：２２６−２３３）。二本鎖イソ型（複製）中間体が、肝臓、末梢血単核細胞及び骨髄などのいくつかの組織で見出されている（Ｋｉｋｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．（２０００）６１：１６５−１７０；Ｏｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（２００２）２７０：６５７−６６２；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−ｌｎｉｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．（２０００）１５６：１２２７−１２３４）。
【０２５２】
一部の実施形態では、本明細書に記載のクロンは、例えば、本明細書に記載されるアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）配列、又はその断片に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列を含む１つ又は複数の核酸分子（例えば、本明細書に記載の遺伝子エレメント）を含む。複数の実施形態では、アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）配列は、表１、３、５、７、９、１１、若しくは１３のいずれかに示す配列から選択される。一部の実施形態では、本明細書に記載のクロンは、本明細書に記載されるアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）のいずれか（例えば、表１〜１６若しくは１９のいずれかにアノテートした、又はそこに挙げた１配列によりコード化されるアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）配列）のＴＡＴＡボックス、キャップ部位、転写開始部位、５’ＵＴＲ保存ドメイン、ＯＲＦ１、ＯＲＦ１／１、ＯＲＦ１／２、ＯＲＦ２、ＯＲＦ２／２、ＯＲＦ２／３、ＯＲＦ２ｔ／３、３オープンリーディングフレーム領域、ポリ（Ａ）シグナル、ＧＣリッチ領域、又はこれらの任意の組合せに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列を含む１つ又は複数の核酸分子（例えば、本明細書に記載の遺伝子エレメント）を含む。一部の実施形態では、核酸分子は、キャプシドタンパク質をコード化する配列、例えば、本明細書に記載されるアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）のいずれか（例えば、表１〜１６若しくは１９のいずれかにアノテートした、又はそこに挙げた１配列によりコード化されるアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）配列）のＯＲＦ１、ＯＲＦ１／１、ＯＲＦ１／２、ＯＲＦ２、ＯＲＦ２／２、ＯＲＦ２／３、ＯＲＦ２ｔ／３配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１又はＯＲＦ２タンパク質に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列（例えば、表２、４、６、８、１０、１２、１４、若しくは１６のいずれかに示すＯＲＦ１若しくはＯＲＦ２アミノ酸配列、又は表１、３、５、７、９、１１、１３、１５、若しくは１９のいずれかに示す核酸配列によりコード化されるＯＲＦ１若しくはＯＲＦ２アミノ酸配列）を含むキャプシドタンパク質をコード化する配列を含む。
【０２５３】
複数の実施形態では、核酸分子は、表１のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１ヌクレオチド配列（例えば、表１の核酸配列のヌクレオチド５７１〜２６１３）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表１のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１／１ヌクレオチド配列（例えば、表１の核酸配列のヌクレオチド５７１〜５８７及び／又は２１３７〜２６１３）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表１のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１／２ヌクレオチド配列（例えば、表１の核酸配列のヌクレオチド５７１〜６８７及び／又は２３３９〜２６５９）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表１のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２ヌクレオチド配列（例えば、表１の核酸配列のヌクレオチド２９９〜６９１）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表１のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２／２ヌクレオチド配列（例えば、表１の核酸配列のヌクレオチド２９９〜６８７及び／又は２１３７〜２６５９）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表１のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２／３ヌクレオチド配列（例えば、表１の核酸配列のヌクレオチド２９９〜６８７及び／又は２３３９〜２８３１）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表１のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２ｔ／３ヌクレオチド配列（例えば、表１の核酸配列のヌクレオチド２９９〜３４８及び／又は２３３９〜２８３１）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表１のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＴＡＴＡボックスヌクレオチド配列（例えば、表１の核酸配列のヌクレオチド８４〜９０）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表１のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）Ｃａｐ部位ヌクレオチド配列（例えば、表１の核酸配列のヌクレオチド１０７〜１１４）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表１のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）転写開始部位ヌクレオチド配列（例えば、表１の核酸配列のヌクレオチド１１４）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表１のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）５’ＵＴＲ保存ドメインヌクレオチド配列（例えば、表１の核酸配列のヌクレオチド１７７〜２４７）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表１のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）３オープンリーディングフレーム領域ヌクレオチド配列（例えば、表１の核酸配列のヌクレオチド２３２５〜２６１０）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表１のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ポリ（Ａ）シグナルヌクレオチド配列（例えば、表１の核酸配列のヌクレオチド２８１３〜２８１８）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表１のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＧＣリッチヌクレオチド配列（例えば、表１の核酸配列のヌクレオチド３４１５〜３５７０）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０２５４】
複数の実施形態では、核酸分子は、表３のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１ヌクレオチド配列（例えば、表３の核酸配列のヌクレオチド５９９〜２８３９）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表３のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１／１ヌクレオチド配列（例えば、表３の核酸配列のヌクレオチド５９９〜７２７及び／又は２３８１〜２８３９）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表３のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１／２ヌクレオチド配列（例えば、表３の核酸配列のヌクレオチド５９９〜７２７及び／又は２６１９〜２８１３）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表３のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２ヌクレオチド配列（例えば、表３の核酸配列のヌクレオチド３５７〜７３１）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表３のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２／２ヌクレオチド配列（例えば、表３の核酸配列のヌクレオチド３５７〜７２７及び／又は２３８１〜２８１３）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表３のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２／３ヌクレオチド配列（例えば、表３の核酸配列のヌクレオチド３５７〜７２７及び／又は２６１９〜３０２１）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表３のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２ｔ／３ヌクレオチド配列（例えば、表３の核酸配列のヌクレオチド３５７〜４０６及び／又は２６１９〜３０２１）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表３のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＴＡＴＡボックスヌクレオチド配列（例えば、表３の核酸配列のヌクレオチド８９〜９０）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表３のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）Ｃａｐ部位ヌクレオチド配列（例えば、表３の核酸配列のヌクレオチド１０７〜１１４）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表３のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）転写開始部位ヌクレオチド配列（例えば、表３の核酸配列のヌクレオチド１１４）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表３のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）５’ＵＴＲ保存ドメインヌクレオチド配列（例えば、表３の核酸配列のヌクレオチド１７４〜２４４）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表３のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）３オープンリーディングフレーム領域ヌクレオチド配列（例えば、表３の核酸配列のヌクレオチド２５９６〜２８１０）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表３のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ポリ（Ａ）シグナルヌクレオチド配列（例えば、表３の核酸配列のヌクレオチド３０１７〜３０２２）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表３のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＧＣリッチヌクレオチド配列（例えば、表３の核酸配列のヌクレオチド３６９１〜３７９４）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０２５５】
複数の実施形態では、核酸分子は、表５のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１ヌクレオチド配列（例えば、表５の核酸配列のヌクレオチド５９９〜２８３０）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表５のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１／１ヌクレオチド配列（例えば、表５の核酸配列のヌクレオチド５９９〜７１５及び／又は２３６３〜２８３０）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表５のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１／２ヌクレオチド配列（例えば、表５の核酸配列のヌクレオチド５９９〜７１５及び／又は２５６５〜２７８９）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表５のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２ヌクレオチド配列（例えば、表５の核酸配列のヌクレオチド３３６〜７１９）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表５のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２／２ヌクレオチド配列（例えば、表５の核酸配列のヌクレオチド３３６〜７１５及び／又は２３６３〜２７８９）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表５のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２／３ヌクレオチド配列（例えば、表５の核酸配列のヌクレオチド３３６〜７１５及び／又は２５６５〜３０１５）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表５のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２ｔ／３ヌクレオチド配列（例えば、表５の核酸配列のヌクレオチド３３６〜３８８及び／又は２５６５〜３０１５）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表５のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＴＡＴＡボックスヌクレオチド配列（例えば、表５の核酸配列のヌクレオチド８３〜８８）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表５のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）Ｃａｐ部位ヌクレオチド配列（例えば、表５の核酸配列のヌクレオチド１０４〜１１１）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表５のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）転写開始部位ヌクレオチド配列（例えば、表５の核酸配列のヌクレオチド１１１）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表５のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）５’ＵＴＲ保存ドメインヌクレオチド配列（例えば、表５の核酸配列のヌクレオチド１７０〜２４０）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表５のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）３オープンリーディングフレーム領域ヌクレオチド配列（例えば、表５の核酸配列のヌクレオチド２５５１〜２７８６）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表５のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ポリ（Ａ）シグナルヌクレオチド配列（例えば、表５の核酸配列のヌクレオチド３０１１〜３０１６）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表５のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＧＣリッチヌクレオチド配列（例えば、表５の核酸配列のヌクレオチド３６３２〜３７５３）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０２５６】
複数の実施形態では、核酸分子は、表７のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１ヌクレオチド配列（例えば、表７の核酸配列のヌクレオチド５９０〜２８９９）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表７のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１／１ヌクレオチド配列（例えば、表７の核酸配列のヌクレオチド５９０〜７１２及び／又は２３７２〜２８９９）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表７のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１／２ヌクレオチド配列（例えば、表７の核酸配列のヌクレオチド５９０〜７１２及び／又は２５６５〜２８７３）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表７のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２ヌクレオチド配列（例えば、表７の核酸配列のヌクレオチド３５４〜７１６）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表７のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２／２ヌクレオチド配列（例えば、表７の核酸配列のヌクレオチド３５４〜７１２及び／又は２３７２〜２８７３）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表７のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２／３ヌクレオチド配列（例えば、表７の核酸配列のヌクレオチド３５４〜７１２及び／又は２５６５〜３０７５）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表７のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２ｔ／３ヌクレオチド配列（例えば、表７の核酸配列のヌクレオチド３５４〜４００及び／又は２５６５〜３０７５）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表７のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＴＡＴＡボックスヌクレオチド配列（例えば、表７の核酸配列のヌクレオチド８６〜９０）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表７のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）Ｃａｐ部位ヌクレオチド配列（例えば、表７の核酸配列のヌクレオチド１０７〜１１４）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表７のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）転写開始部位ヌクレオチド配列（例えば、表７の核酸配列のヌクレオチド１１４）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表７のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）５’ＵＴＲ保存ドメインヌクレオチド配列（例えば、表７の核酸配列のヌクレオチド１７４〜２４４）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表７のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）３オープンリーディングフレーム領域ヌクレオチド配列（例えば、表７の核酸配列のヌクレオチド２５５１〜２８７０）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表７のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ポリ（Ａ）シグナルヌクレオチド配列（例えば、表７の核酸配列のヌクレオチド３０７１〜３０７６）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表７のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＧＣリッチヌクレオチド配列（例えば、表７の核酸配列のヌクレオチド３７３３〜３８５３）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０２５７】
複数の実施形態では、核酸分子は、表９のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１ヌクレオチド配列（例えば、表９の核酸配列のヌクレオチド５７７〜２７８７）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表９のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１／１ヌクレオチド配列（例えば、表９の核酸配列のヌクレオチド５７７〜６９９及び／又は２３１１〜２７８７）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表９のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１／２ヌクレオチド配列（例えば、表９の核酸配列のヌクレオチド５７７〜６９９及び／又は２５０４〜２８０６）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表９のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２ヌクレオチド配列（例えば、表９の核酸配列のヌクレオチド３４１〜７０３）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表９のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２／２ヌクレオチド配列（例えば、表９の核酸配列のヌクレオチド３４１〜６９９及び／又は２３１１〜２８０６）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表９のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２／３ヌクレオチド配列（例えば、表９の核酸配列のヌクレオチド３４１〜６９９及び／又は２５０４〜２９７８）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表９のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２ｔ／３ヌクレオチド配列（例えば、表９の核酸配列のヌクレオチド３４１〜３８７及び／又は２５０４〜２９７８）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表９のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＴＡＴＡボックスヌクレオチド配列（例えば、表９の核酸配列のヌクレオチド８３〜８７）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表９のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）Ｃａｐ部位ヌクレオチド配列（例えば、表９の核酸配列のヌクレオチド１０４〜１１１）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表９のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）転写開始部位ヌクレオチド配列（例えば、表９の核酸配列のヌクレオチド１１１）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表９のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）５’ＵＴＲ保存ドメインヌクレオチド配列（例えば、表９の核酸配列のヌクレオチド１７１〜２４１）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表９のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）３オープンリーディングフレーム領域ヌクレオチド配列（例えば、表９の核酸配列のヌクレオチド２４６３〜２７８４）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表９のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ポリ（Ａ）シグナルヌクレオチド配列（例えば、表９の核酸配列のヌクレオチド２９７４〜２９７９）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表９のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＧＣリッチヌクレオチド配列（例えば、表９の核酸配列のヌクレオチド３６４４〜３７５８）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０２５８】
複数の実施形態では、核酸分子は、表１１のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１ヌクレオチド配列（例えば、表１１の核酸配列のヌクレオチド６１２〜２６１２）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表１１のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１／１ヌクレオチド配列（例えば、表１１の核酸配列のヌクレオチド６１２〜７１９及び／又は２２７４〜２６１２）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表１１のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１／２ヌクレオチド配列（例えば、表１１の核酸配列のヌクレオチド６１２〜７１９及び／又は２４４９〜２５８９）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表１１のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２ヌクレオチド配列（例えば、表１１の核酸配列のヌクレオチド４２４〜７２３）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表１１のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２／２ヌクレオチド配列（例えば、表１１の核酸配列のヌクレオチド４２４〜７１９及び／又は２２７４〜２５８９）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表１１のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２／３ヌクレオチド配列（例えば、表１１の核酸配列のヌクレオチド４２４〜７１９及び／又は２４４９〜２８１２）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表１１のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＴＡＴＡボックスヌクレオチド配列（例えば、表１１の核酸配列のヌクレオチド２３７〜２４３）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表１１のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）Ｃａｐ部位ヌクレオチド配列（例えば、表１１の核酸配列のヌクレオチド２６０〜２６７）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表１１のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）転写開始部位ヌクレオチド配列（例えば、表１１の核酸配列のヌクレオチド２６７）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表１１のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）５’ＵＴＲ保存ドメインヌクレオチド配列（例えば、表１１の核酸配列のヌクレオチド３２３〜３９３）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表１１のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）３オープンリーディングフレーム領域ヌクレオチド配列（例えば、表１１の核酸配列のヌクレオチド２４４１〜２５８６）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表１１のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ポリ（Ａ）シグナルヌクレオチド配列（例えば、表１１の核酸配列のヌクレオチド２８０８〜２８１３）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表１１のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＧＣリッチヌクレオチド配列（例えば、表１１の核酸配列のヌクレオチド２８６８〜２９２９）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０２５９】
複数の実施形態では、核酸分子は、表１３のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１ヌクレオチド配列（例えば、表１３の核酸配列のヌクレオチド４３２〜２４５３）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表１３のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１／１ヌクレオチド配列（例えば、表１３の核酸配列のヌクレオチド４３２〜５８４及び／又は１９７７〜２４５３）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表１３のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１／２ヌクレオチド配列（例えば、表１３の核酸配列のヌクレオチド４３２〜５８４及び／又は２１９７〜２３８８）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表１３のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２ヌクレオチド配列（例えば、表１３の核酸配列のヌクレオチド２８３〜５８８）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表１３のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２／２ヌクレオチド配列（例えば、表１３の核酸配列のヌクレオチド２８３〜５８４及び／又は１９７７〜２３８８）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表１３のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２／３ヌクレオチド配列（例えば、表１３の核酸配列のヌクレオチド２８３〜５８４及び／又は２１９７〜２６１４）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表１３のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＴＡＴＡボックスヌクレオチド配列（例えば、表１３の核酸配列のヌクレオチド２１〜２５）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表１３のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）Ｃａｐ部位ヌクレオチド配列（例えば、表１３の核酸配列のヌクレオチド４２〜４９）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表１３のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）転写開始部位ヌクレオチド配列（例えば、表１３の核酸配列のヌクレオチド４９）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表１３のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）５’ＵＴＲ保存ドメインヌクレオチド配列（例えば、表１３の核酸配列のヌクレオチド１１７〜１８７）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表１３のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）３オープンリーディングフレーム領域ヌクレオチド配列（例えば、表１３の核酸配列のヌクレオチド２１８６〜２３８５）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表１３のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ポリ（Ａ）シグナルヌクレオチド配列（例えば、表１３の核酸配列のヌクレオチド２６７６〜２６８１）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表１３のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＧＣリッチヌクレオチド配列（例えば、表１３の核酸配列のヌクレオチド３０５４〜３１７２）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０２６０】
複数の実施形態では、核酸分子は、表２のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコード化する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表２のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１／１アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコード化する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表２のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１／２アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコード化する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表２のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコード化する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表２のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２／２アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコード化する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表２のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２／３アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコード化する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表２のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２ｔ／３アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコード化する核酸配列を含む。
【０２６１】
複数の実施形態では、核酸分子は、表４のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコード化する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表４のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１／１アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコード化する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表４のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１／２アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコード化する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表４のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコード化する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表４のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２／２アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコード化する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表４のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２／３アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコード化する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表４のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２ｔ／３アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコード化する核酸配列を含む。
【０２６２】
複数の実施形態では、核酸分子は、表６のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコード化する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表６のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１／１アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコード化する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表６のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１／２アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコード化する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表６のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコード化する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表６のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２／２アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコード化する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表６のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２／３アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコード化する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表６のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２ｔ／３アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコード化する核酸配列を含む。
【０２６３】
複数の実施形態では、核酸分子は、表８のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコード化する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表８のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１／１アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコード化する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表８のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１／２アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコード化する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表８のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコード化する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表８のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２／２アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコード化する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表８のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２／３アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコード化する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表８のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２ｔ／３アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコード化する核酸配列を含む。
【０２６４】
複数の実施形態では、核酸分子は、表１０のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコード化する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表１０のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１／１アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコード化する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表１０のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１／２アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコード化する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表１０のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコード化する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表１０のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２／２アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコード化する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表１０のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２／３アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコード化する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表１０のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２ｔ／３アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコード化する核酸配列を含む。
【０２６５】
複数の実施形態では、核酸分子は、表１２のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコード化する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表１２のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１／１アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコード化する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表１２のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１／２アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコード化する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表１２のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコード化する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表１２のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２／２アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコード化する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表１２のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２／３アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコード化する核酸配列を含む。
【０２６６】
複数の実施形態では、核酸分子は、表１４のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコード化する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表１４のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１／１アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコード化する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表１４のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１／２アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコード化する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表１４のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコード化する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表１４のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２／２アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコード化する核酸配列を含む。複数の実施形態では、核酸分子は、表１４のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２／３アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコード化する核酸配列を含む。
【０２６７】
複数の実施形態では、本明細書に記載のクロンは、表２のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。複数の実施形態では、本明細書に記載のクロンは、表２のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１／１アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。複数の実施形態では、本明細書に記載のクロンは、表２のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１／２アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。複数の実施形態では、本明細書に記載のクロンは、表２のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。複数の実施形態では、本明細書に記載のクロンは、表２のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２／２アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。複数の実施形態では、本明細書に記載のクロンは、表２のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２／３アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。複数の実施形態では、本明細書に記載のクロンは、表２のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２ｔ／３アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。
【０２６８】
複数の実施形態では、本明細書に記載のクロンは、表４のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。複数の実施形態では、本明細書に記載のクロンは、表４のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１／１アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。複数の実施形態では、本明細書に記載のクロンは、表４のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１／２アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。複数の実施形態では、本明細書に記載のクロンは、表４のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。複数の実施形態では、本明細書に記載のクロンは、表４のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２／２アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。複数の実施形態では、本明細書に記載のクロンは、表４のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２／３アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。複数の実施形態では、本明細書に記載のクロンは、表４のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２ｔ／３アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。
【０２６９】
複数の実施形態では、本明細書に記載のクロンは、表６のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。複数の実施形態では、本明細書に記載のクロンは、表６のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１／１アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。複数の実施形態では、本明細書に記載のクロンは、表６のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１／２アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。複数の実施形態では、本明細書に記載のクロンは、表６のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。複数の実施形態では、本明細書に記載のクロンは、表６のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２／２アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。複数の実施形態では、本明細書に記載のクロンは、表６のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２／３アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。複数の実施形態では、本明細書に記載のクロンは、表６のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２ｔ／３アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。
【０２７０】
複数の実施形態では、本明細書に記載のクロンは、表８のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。複数の実施形態では、本明細書に記載のクロンは、表８のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１／１アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。複数の実施形態では、本明細書に記載のクロンは、表８のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１／２アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。複数の実施形態では、本明細書に記載のクロンは、表８のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。複数の実施形態では、本明細書に記載のクロンは、表８のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２／２アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。複数の実施形態では、本明細書に記載のクロンは、表８のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２／３アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。複数の実施形態では、本明細書に記載のクロンは、表８のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２ｔ／３アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。
【０２７１】
複数の実施形態では、本明細書に記載のクロンは、表１０のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。複数の実施形態では、本明細書に記載のクロンは、表１０のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１／１アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。複数の実施形態では、本明細書に記載のクロンは、表１０のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１／２アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。複数の実施形態では、本明細書に記載のクロンは、表１０のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。複数の実施形態では、本明細書に記載のクロンは、表１０のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２／２アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。複数の実施形態では、本明細書に記載のクロンは、表１０のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２／３アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。複数の実施形態では、本明細書に記載のクロンは、表１０のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２ｔ／３アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。
【０２７２】
複数の実施形態では、本明細書に記載のクロンは、表１２のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。複数の実施形態では、本明細書に記載のクロンは、表１２のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１／１アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。複数の実施形態では、本明細書に記載のクロンは、表１２のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１／２アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。複数の実施形態では、本明細書に記載のクロンは、表１２のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。複数の実施形態では、本明細書に記載のクロンは、表１２のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２／２アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。複数の実施形態では、本明細書に記載のクロンは、表１２のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２／３アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。
【０２７３】
複数の実施形態では、本明細書に記載のクロンは、表１４のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。複数の実施形態では、本明細書に記載のクロンは、表１４のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１／１アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。複数の実施形態では、本明細書に記載のクロンは、表１４のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１／２アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。複数の実施形態では、本明細書に記載のクロンは、表１４のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。複数の実施形態では、本明細書に記載のクロンは、表１４のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２／２アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。複数の実施形態では、本明細書に記載のクロンは、表１４のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２／３アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。
【０２７４】
【表１−１】
2020524993.tif 000003
【０２７５】
【表１−２】
2020524993.tif 000004
【０２７６】
【表１−３】
2020524993.tif 000005
【０２７７】
【表２−１】
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【０２７８】
【表３−１】
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【０２７９】
【表３−２】
2020524993.tif 000008
【０２８０】
【表３−３】
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【０２８１】
【表４−１】
2020524993.tif 000010
【０２８２】
【表４−２】
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【０２８３】
【表５−１】
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【０２８４】
【表５−２】
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【０２８５】
【表５−３】
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【０２８６】
【表６−１】
2020524993.tif 000015
【０２８７】
【表６−２】
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【０２８８】
【表７−１】
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【０２８９】
【表７−２】
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【０２９０】
【表７−３】
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【０２９１】
【表８−１】
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【０２９２】
【表８−２】
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【０２９３】
【表９−１】
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【０２９４】
【表９−２】
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【０２９５】
【表９−３】
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【０２９６】
【表１０−１】
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【０２９７】
【表１０−２】
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【０２９８】
【表１１−１】
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【０２９９】
【表１１−２】
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【０３００】
【表１１−３】
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【０３０１】
【表１２−１】
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【０３０２】
【表１２−２】
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【０３０３】
【表１３−１】
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【０３０４】
【表１３−２】
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【０３０５】
【表１３−４】
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【０３０６】
【表１４−１】
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【０３０７】
【表１４−２】
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【０３０８】
一部の実施形態では、合成クロンは、例えば、実施例９に記載する方法に従って同定される通り、最小アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ゲノムを含む。一部の実施形態では、合成クロンは、実施例１３に記載の通り、アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）配列、又はその一部を含む。
【０３０９】
一部の実施形態では、合成クロンは、例えば、表１４−１に示す通り、コンセンサスアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）モチーフを含む遺伝子エレメントを含む。一部の実施形態では、合成クロンは、例えば、表１４−１に示す通り、コンセンサスアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１モチーフを含む遺伝子エレメントを含む。一部の実施形態では、合成クロンは、例えば、表１４−１に示す通り、コンセンサスアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１／１モチーフを含む遺伝子エレメントを含む。一部の実施形態では、合成クロンは、例えば、表１４−１に示す通り、コンセンサスアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ１／２モチーフを含む遺伝子エレメントを含む。一部の実施形態では、合成クロンは、例えば、表１４−１に示す通り、コンセンサスアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２／２モチーフを含む遺伝子エレメントを含む。一部の実施形態では、合成クロンは、例えば、表１４−１に示す通り、コンセンサスアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＯＲＦ２／３モチーフを含む遺伝子エレメントを含む。一部の実施形態では、表１４−１に示されるＸは、任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、表１４−１に示されるＺは、グルタミン酸又はグルタミンを示す。一部の実施形態では、表１４−１に示されるＢは、アスパラギン酸又はアスパラギンを示す。一部の実施形態では、表１４−１に示されるＪは、ロイシン又はイソロイシンを示す。
【０３１０】
【表１４−３】
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【０３１１】
【表１４−４】
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【０３１２】
遺伝子エレメント
一部の実施形態では、クロンは、遺伝子エレメントを含む。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、以下の特徴の１つ又は複数を有する：宿主細胞のゲノムと実質的に非統合性であること、エピソーム核酸、一本鎖ＤＮＡ、環状であること、約１〜１０ｋｂであること、細胞の核内に存在すること、内在性タンパク質に結合することができること、並びに宿主遺伝子をターゲティングするｍｉｃｒｏＲＮＡを産生すること。一実施形態では、遺伝子エレメントは、実質的に非統合性ＤＮＡである。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、例えば、本明細書に記載される（例えば、表１〜１４のいずれかに記載の）アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）配列、又はその断片に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する。複数の実施形態では、遺伝子エレメントは、外性エフェクター（例えば、ペイロード）、例えば、ポリペプチドエフェクター（例えば、タンパク質）又は核酸エフェクター（例えば、非コーディングＲＮＡ、例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｇＲＮＡ）をコード化する配列を含む。
【０３１３】
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、２０ｋｂ未満（例えば、約１９ｋｂ、１８ｋｂ、１７ｋｂ、１６ｋｂ、１５ｋｂ、１４ｋｂ、１３ｋｂ、１２ｋｂ、１１ｋｂ、１０ｋｂ、９ｋｂ、８ｋｂ、７ｋｂ、６ｋｂ、５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ未満）の長さを有する。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、独立に、又は加えて、１０００ｂ超（例えば、少なくとも約１．１ｋｂ、１．２ｋｂ、１．３ｋｂ、１．４ｋｂ、１．５ｋｂ、１．６ｋｂ、１．７ｋｂ、１．８ｋｂ、１．９ｋｂ、２ｋｂ、２．１ｋｂ、２．２ｋｂ、２．３ｋｂ、２．４ｋｂ、２．５ｋｂ、２．６ｋｂ、２．７ｋｂ、２．８ｋｂ、２．９ｋｂ、３ｋｂ、３．１ｋｂ、３．２ｋｂ、３．３ｋｂ、３．４ｋｂ、３．５ｋｂ、３．６ｋｂ、３．７ｋｂ、３．８ｋｂ、３．９ｋｂ、４ｋｂ、４．１ｋｂ、４．２ｋｂ、４．３ｋｂ、４．４ｋｂ、４．５ｋｂ、４．６ｋｂ、４．７ｋｂ、４．８ｋｂ、４．９ｋｂ、５ｋｂ以上）の長さを有する。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、約２．５〜４．６、２．８〜４．０、３．０〜３．８、又は３．２〜３．７ｋｂの長さを有する。
【０３１４】
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、本明細書に記載される特徴、例えば、実質的に非病原性のタンパク質をコード化する配列、タンパク質結合配列、調節配列をコード化する１つ若しくは複数の配列、１つ若しくは複数の調節配列、複製タンパク質をコード化する１つ若しくは複数の配列、及びその他の配列のうち１つ又は複数を含む。
【０３１５】
一実施形態では、本発明は、（ｉ）実質的に非病原性の外部タンパク質と、（ｉｉ）実質的に非病原性の外部タンパク質と遺伝子エレメントを結合させる外部タンパク質結合配列と、（ｉｉｉ）調節核酸と、をコード化する核酸配列（例えば、ＤＮＡ配列）を含む遺伝子エレメントを含む。こうした実施形態では、遺伝子エレメントは、ネイティブウイルス配列と比較して、ヌクレオチド配列のいずれか１つに対し少なくとも約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、及び９９％のヌクレオチド配列同一性を有する１つ若しくは複数の配列を含み得る。
【０３１６】
タンパク質、例えば、実質的に非病原性のタンパク質
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、タンパク質、例えば、実質的に非病原性のタンパク質をコード化する配列を含む。複数の実施形態では、実質的に非病原性のタンパク質は、クロンのタンパク質性外層の主要構成体である。複数の実質的に非病原性のタンパク質分子は正二十面体構造に自己アセンブルすることができ、これが、タンパク質性外層を構成する。複数の実施形態では、タンパク質は、タンパク質性外層に存在する。
【０３１７】
一部の実施形態では、タンパク質、例えば、実質的に非病原性のタンパク質及び／又はタンパク質性外層タンパク質は、１つ又は複数、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、若しくはそれ以上のグリコシル化アミノ酸を含む。
【０３１８】
一部の実施形態では、タンパク質、例えば、実質的に非病原性のタンパク質及び／又はタンパク質性外層は、少なくとも１つの親水性ＤＮＡ−結合領域、アルギニンリッチ領域、トレオニンリッチ領域、グルタミンリッチ領域、Ｎ−末端ポリアルギニン配列、可変領域、Ｃ−末端ポリグルタミン／グルタミン酸配列、及び１つ若しくは複数のジスルフィド架橋を含む。
【０３１９】
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、キャプシドタンパク質若しくはキャプシドタンパク質の断片をコード化するヌクレオチド配列、又は本明細書に記載の、例えば表１〜１６若しくは１９のいずれかに挙げる、キャプシドタンパク質をコード化するヌクレオチド配列のいずれか１つに対して、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％のヌクレオチド配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、キャプシドタンパク質若しくはキャプシドタンパク質の機能性断片をコード化するヌクレオチド配列、又は本明細書に記載の、例えば、表１〜１６若しくは１９のいずれかに挙げる、キャプシドタンパク質をコード化するヌクレオチド配列のいずれか１つに対して、少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、実質的に非病原性のタンパク質は、キャプシドヌクレオチド配列、又は本明細書に記載の、例えば、表１、３、５、７、９、１１、１３、若しくは１５のいずれかに挙げるヌクレオチド配列のいずれか１つに対して、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％のヌクレオチド配列同一性を有する配列によってコード化される、キャプシドタンパク質若しくはキャプシドタンパク質の機能性断片を含む。
【０３２０】
【表１５−１】
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【０３２１】
【表１５−２】
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【０３２２】
【表１５−３】
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【０３２３】
【表１５−４】
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【０３２４】
【表１５−５】
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【０３２５】
【表１５−６】
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【０３２６】
【表１５−７】
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【０３２７】
【表１５−８】
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【０３２８】
【表１５−９】
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【０３２９】
【表１５−１０】
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【０３３０】
【表１５−１１】
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【０３３１】
【表１５−１２】
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【０３３２】
【表１５−１３】
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【０３３３】
【表１５−１４】
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【０３３４】
【表１５−１５】
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【０３３５】
【表１５−１６】
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【０３３６】
【表１５−１７】
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【０３３７】
【表１５−１８】
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【０３３９】
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【０３４０】
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【０３４２】
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【０３４３】
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【０３４４】
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【０３４７】
【表１５−２８】
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【０３４９】
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【０３５０】
【表１５−３１】
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【０３５１】
【表１５−３２】
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【０３５２】
【表１５−３３】
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【０３５３】
【表１５−３４】
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【０３５５】
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【０３６１】
【表１５−４２】
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【０３６２】
【表１５−４３】
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【０３６３】
【表１５−４４】
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【０３６４】
【表１５−４５】
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【０３６５】
【表１５−４６】
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【０３６６】
【表１５−４７】
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【０３６７】
【表１５−４８】
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【０３６８】
【表１５−４９】
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【０３６９】
【表１５−５０】
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【０３７０】
【表１５−５１】
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【０３７１】
【表１５−５２】
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【０３７２】
【表１５−５３】
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【０３７３】
【表１５−５４】
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【０３７４】
【表１５−５５】
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【０３７５】
【表１５−５６】
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【０３７６】
【表１５−５７】
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【表１５−５８】
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【０３７８】
【表１５−５９】
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【０３７９】
【表１５−６０】
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【０３８０】
【表１５−６１】
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【０３８１】
【表１５−６２】
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【０３８２】
【表１５−６３】
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【０３８３】
【表１５−６４】
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【０３８４】
【表１５−６５】
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【０３８５】
【表１５−６６】
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【０３８６】
【表１５−６７】
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【０３８７】
【表１５−６８】
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【０３８８】
【表１５−６９】
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【０３８９】
【表１５−７０】
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【０３９０】
【表１５−７１】
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【０３９１】
【表１５−７２】
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【０３９２】
【表１５−７３】
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【０３９３】
【表１５−７４】
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【０３９４】
【表１５−７５】
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【０３９５】
【表１５−７６】
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【０３９６】
【表１５−７７】
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【０３９７】
【表１５−７８】
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【０３９８】
【表１５−７９】
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【０３９９】
【表１５−８０】
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【０４００】
【表１５−８１】
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【０４０１】
【表１５−８２】
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【０４０２】
【表１５−８３】
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【０４０３】
【表１５−８４】
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【０４０４】
【表１５−８５】
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【０４０５】
【表１５−８６】
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【０４０６】
【表１５−８７】
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【０４０７】
【表１５−８８】
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【０４０８】
【表１５−８９】
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【０４０９】
【表１５−９０】
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【０４１０】
【表１５−９１】
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【０４１１】
【表１５−９２】
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【０４１２】
【表１５−９３】
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【０４１３】
【表１５−９４】
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【０４１４】
【表１５−９５】
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【０４１５】
【表１５−９６】
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【０４１６】
【表１５−９７】
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【０４１７】
【表１５−９８】
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【０４１８】
【表１５−９９】
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【０４１９】
【表１５−１００】
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【０４２０】
【表１５−１０１】
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【０４２１】
【表１５−１０２】
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【０４２２】
【表１５−１０３】
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【０４２３】
【表１５−１０４】
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【０４２４】
【表１５−１０５】
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【０４２５】
【表１５−１０６】
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【０４２６】
【表１５−１０７】
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【０４２７】
【表１５−１０８】
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【０４２８】
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、キャプシドタンパク質若しくはキャプシドタンパク質の機能性断片をコード化するヌクレオチド配列、又は本明細書において、例えば、表２、４、６、８、１０、１２、１４、若しくは１６のいずれかに記載するアミノ酸配列のいずれか１つ対して少なくとも約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、実質的に非病原性のタンパク質は、キャプシドタンパク質若しくはキャプシドタンパク質の機能性断片、又は本明細書において、例えば、表２、４、６、８、１０、１２、１４、若しくは１６のいずれかに記載するアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列を含む。
【０４２９】
【表１６−１】
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【０４３０】
【表１６−２】
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【０４３１】
【表１６−３】
2020524993.tif 000149
【０４３２】
【表１６−４】
2020524993.tif 000150
【０４３３】
【表１６−５】
2020524993.tif 000151
【０４３４】
【表１６−６】
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【０４３５】
【表１６−７】
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【０４３６】
【表１６−８】
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【０４３７】
【表１６−９】
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【０４３８】
【表１６−１０】
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【０４３９】
【表１６−１１】
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【０４４０】
【表１６−１２】
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【０４４１】
【表１６−１３】
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【０４４２】
【表１６−１４】
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【０４４３】
【表１６−１５】
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【０４４４】
【表１６−１６】
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【０４４５】
【表１６−１７】
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【０４４６】
【表１６−１８】
2020524993.tif 000164
【０４４７】
【表１６−１９】
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【０４４８】
【表１６−２０】
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【０４４９】
【表１６−２１】
2020524993.tif 000167
【０４５０】
【表１６−２２】
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【０４５１】
【表１６−２３】
2020524993.tif 000169
【０４５２】
【表１６−２４】
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【０４５３】
【表１６−２５】
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【０４５４】
【表１６−２６】
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【０４５５】
【表１６−２７】
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【０４５６】
【表１６−２８】
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【０４５７】
【表１６−２９】
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【０４５８】
【表１６−３０】
2020524993.tif 000176
【０４５９】
【表１６−３１】
2020524993.tif 000177
【０４６０】
【表１６−３２】
2020524993.tif 000178
【０４６１】
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、アミノ酸配列若しくはその機能断片、又は本明細書において、例えば、表１７に記載するアミノ酸配列のいずれか１つ対して少なくとも約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列をコード化するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、実質的に非病原性のタンパク質は、アミノ酸配列若しくはその機能断片、又は本明細書に記載の、例えば、表２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、若しくは１７に挙げるアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列を含む。
【０４６２】
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、本明細書に記載の、例えば、表２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、若しくは１７に挙げる、若しくは図１に示すアミノ酸配列、又はそれらの機能性断片の約１位〜約１５０位（例えば、約２０位〜約３５位、約２５位〜約３０位、約２６位〜約３０位、又は例えば、各範囲内の任意のサブセットのアミノ酸）、約１５０位〜約３９０位（例えば、約２００位〜約３８０位、約２０５位〜約３７５位、約２０５位〜約３７１位、又は例えば、各範囲内の任意のサブセットのアミノ酸）、約３９０位〜約５２５位、約５２５位〜約８５０位（例えば、約５３０位〜約８４０位、約５４５位〜約８３０位、約５５０位〜約８２０位、又は例えば、各範囲内の任意のサブセットのアミノ酸）、約８５０位〜約９５０位（例えば、約８６０位〜約９４０位、約８７０位〜約９３０位、約８８０位〜約９２３位、又は例えば、各範囲内の任意のサブセットのアミノ酸）を有するアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、実質的に非病原性のタンパク質は、アミノ酸配列若しくはその機能性断片、又は本明細書に記載の、例えば表２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、若しくは１７に挙げる、若しくは図１に示すアミノ酸配列の約１位〜約１５０位（例えば、又は本明細書に記載の各範囲内のアミノ酸の任意のサブセット）、約１５０位〜約３９０位、約３９０位〜約５２５位、約５２５位〜約８５０位、約８５０位〜約９５０位に対して少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列を含む。
【０４６３】
一部の実施形態では、実質的に非病原性のタンパク質は、アミノ酸配列若しくはその機能性断片、又は本明細書に記載の、例えば表２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、若しくは１７に挙げる、若しくは図１に示すアミノ酸配列又はアミノ酸の範囲のいずれか１つに対して、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列を含み、ここで、配列は、機能性ドメインであるか、又は例えば、種及び／若しくは組織及び／若しくは細胞指向性、ウイルスゲノム結合及び／若しくはパッケージング、免疫回避（実質的な非免疫原性及び／若しくは寛容性）、薬物動態、エンドサイトーシス及び／若しくは細胞接着、核内進入、細胞内調節及び局在化、エキソサイトーシス調節、増殖、核酸保護、並びにこれらの組合せなどの機能を提供する。一部の実施形態では、配列同一性が低い多様なアミノ酸は、本明細書に記載の特性、並びに細胞／組織／種特異性（例えば、指向性）の相違の１つ又は複数を提供し得る。
【０４６４】
タンパク質結合配列
多くのウイルスによって使用される戦略は、ウイルスキャプシドタンパク質が、そのゲノム内の特定のタンパク結合配列を認識することである。例えば、酵母のＬ−Ａウイルスなどの非分節型ゲノムを有するウイルスの場合、ゲノムの５’末端に二次構造（ステムループ）と特定の配列があり、その両方がウイルスキャプシドタンパク質との結合に使用される。しかし、レオウイルス科（Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）、オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）（インフルエンザ）、ブンヤウイルス科（Ｂｕｎｙａｖｉｒｕｓｅ）及びアレナウイルス科（Ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）など、分節型ゲノムを有するウイルスは、ゲノムセグメントの各々をパッケージングする必要がある。一部のウイルスは、ウイルスがそれぞれゲノム分子の１つを含有するのを促進するために、セグメントの相補性領域を使用する。他のウイルスは、様々なセグメントの各々に対して特定の結合部位を有する。例えば、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ．２０１０  Ｆｅｂ；２０（１）：１１４−１２０；Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００３），７７（２４），１３０３６−１３０４１を参照されたい。
【０４６５】
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、実質的に非病原性のタンパク質に結合するタンパク結合配列をコード化する。一部の実施形態では、タンパク結合配列は、遺伝子エレメントのタンパク質性外層内へのパッケージングを促進する。一部の実施形態では、タンパク結合配列は、実質的に非病原性のタンパク質のアルギニンリッチ領域に特異的に結合する。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、実施例８に記載のタンパク結合配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）配列（例えば、表１、３、５、７、９、１１、若しくは１３のいずれかに示す通り）の５’ＵＴＲ保存ドメイン又はＧＣリッチ領域に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するタンパク結合配列を含む。一部の実施形態では、タンパク結合配列は、表１のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）５’ＵＴＲ保存ドメインヌクレオチド配列（例えば、表１の核酸配列のヌクレオチド１７７〜２４７）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、タンパク結合配列は、表１のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＧＣリッチヌクレオチド配列（例えば、表１の核酸配列のヌクレオチド３４１５〜３５７０）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、タンパク結合配列は、表３のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）５’ＵＴＲ保存ドメインヌクレオチド配列（例えば、表３の核酸配列のヌクレオチド１７４〜２４４）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、タンパク結合配列は、表３のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＧＣリッチヌクレオチド配列（例えば、表３の核酸配列のヌクレオチド３６９１〜３７９４）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、タンパク結合配列は、表５のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）５’ＵＴＲ保存ドメインヌクレオチド配列（例えば、表５の核酸配列のヌクレオチド１７０〜２４０）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、タンパク結合配列は、表５のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＧＣリッチヌクレオチド配列（例えば、表５の核酸配列のヌクレオチド３６３２〜３７５３）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、タンパク結合配列は、表７のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）５’ＵＴＲ保存ドメインヌクレオチド配列（例えば、表７の核酸配列のヌクレオチド１７４〜２４４）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、タンパク結合配列は、表７のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＧＣリッチヌクレオチド配列（例えば、表７の核酸配列のヌクレオチド３７３３〜３８５３）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、タンパク結合配列は、表９のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）５’ＵＴＲ保存ドメインヌクレオチド配列（例えば、表９の核酸配列のヌクレオチド１７１〜２４１）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、タンパク結合配列は、表９のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＧＣリッチヌクレオチド配列（例えば、表９の核酸配列のヌクレオチド３６４４〜３７５８）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、タンパク結合配列は、表１１のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）５’ＵＴＲ保存ドメインヌクレオチド配列（例えば、表１１の核酸配列のヌクレオチド３２３〜３９３）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、タンパク結合配列は、表１１のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＧＣリッチヌクレオチド配列（例えば、表１１の核酸配列のヌクレオチド２８６８〜２９２９）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、タンパク結合配列は、表１３のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）５’ＵＴＲ保存ドメインヌクレオチド配列（例えば、表１３の核酸配列のヌクレオチド１１７〜１８７）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、タンパク結合配列は、表１３のアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ＧＣリッチヌクレオチド配列（例えば、表１３の核酸配列のヌクレオチド３０５４〜３１７２）に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する。
【０４６６】
一部の実施形態では、遺伝子エレメント（例えば、遺伝子エレメントのタンパク結合配列）は、図１６−１及び／又は図２１に示す核酸配列に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％）の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子エレメント（例えば、遺伝子エレメントのタンパク結合配列）は、図１６−１に示すコンセンサス５’ＵＴＲ配列の核酸配列を含み、ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、及びＸ５は、各々独立に任意のヌクレオチドであり、例えば、Ｘ１＝Ｇ又はＴ、Ｘ２＝Ｃ又はＡ、Ｘ３＝Ｇ又はＡ、Ｘ４＝Ｔ又はＣ、及びＸ５＝Ａ、Ｃ、又はＴである）。一部の実施形態では、遺伝子エレメント（例えば、遺伝子エレメントのタンパク結合配列）は、図１６−１に示すコンセンサス５’ＵＴＲ配列に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％）の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子エレメント（例えば、遺伝子エレメントのタンパク結合配列）は、図１６−１に示す例示的なＴＴＶ  ５’ＵＴＲ配列に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％）の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子エレメント（例えば、遺伝子エレメントのタンパク結合配列）は、図１６−１に示すＴＴＶ−ＣＴ３０Ｆ  ５’ＵＴＲ配列に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％）の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子エレメント（例えば、遺伝子エレメントのタンパク結合配列）は、図１６−１に示すＴＴＶ−ＨＤ２３ａ  ５’ＵＴＲ配列に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％）の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子エレメント（例えば、遺伝子エレメントのタンパク結合配列）は、図１６−１に示すＴＴＶ−ＪＡ２０  ５’ＵＴＲ配列に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％）の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子エレメント（例えば、遺伝子エレメントのタンパク結合配列）は、図１６−１に示すＴＴＶ−ＴＪＮ０２  ５’ＵＴＲ配列に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％）の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子エレメント（例えば、遺伝子エレメントのタンパク結合配列）は、図１６−１に示すＴＴＶ−ｔｔｈ８  ５’ＵＴＲ配列に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％）の同一性を有する核酸配列を含む。
【０４６７】
【表１６−３３】
2020524993.tif 000179
【０４６８】
一部の実施形態では、遺伝子エレメント（例えば、遺伝子エレメントのタンパク結合配列）は、図１６−２及び／又は図２２に示す核酸配列に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％）の同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、遺伝子エレメント（例えば、遺伝子エレメントのタンパク結合配列）は、図１６−１に示すコンセンサスＧＣリッチ配列の核酸配列を含み、ここで、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ１２、Ｘ１３、Ｘ１４、Ｘ１５、Ｘ２０、Ｘ２１、Ｘ２２、Ｘ２６、Ｘ２９、Ｘ３０、及びＸ３３は、各々独立に任意のヌクレオチドであり、また、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１６、Ｘ１７、Ｘ１８、Ｘ１９、Ｘ２３、Ｘ２４、Ｘ２５、Ｘ２７、Ｘ２８、Ｘ３１、Ｘ３２、及びＸ３４は、各々独立に存在しないか、又は任意のヌクレオチドである。複数の実施形態では、Ｘ１〜Ｘ３４の１つ若しくは複数（例えば、全部）は、各々独立に図１６−２に記載のヌクレオチド（又は非存在）である。複数の実施形態では、遺伝子エレメント（例えば、遺伝子エレメントのタンパク結合配列）は、図１６−１に示すコンセンサスＧＣリッチ配列に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％）の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子エレメント（例えば、遺伝子エレメントのタンパク結合配列）は、図１６−１に示す例示的なＴＴＶ  ＧＣリッチ配列（例えば、全配列、断片１、断片２、断片３、又はそれらの任意の組合せ、例えば、順に断片１〜３）に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％）の同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、遺伝子エレメント（例えば、遺伝子エレメントのタンパク結合配列）は、図１６−１に示すＴＴＶ−ＣＴ３０Ｆ  ＧＣリッチ配列（例えば、全配列、断片１、断片２、断片３、断片４、断片５、断片６、断片７、断片８、又はそれらの任意の組合せ、例えば、順に断片１〜７）に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％）の同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、遺伝子エレメント（例えば、遺伝子エレメントのタンパク結合配列）は、図１６−１に示すＴＴＶ−ＨＤ２３ａ  ＧＣリッチ配列（例えば、全配列、断片１、断片２、断片３、断片４、断片５、断片６、又はそれらの任意の組合せ、例えば、順に断片１〜６）に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％）の同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、遺伝子エレメント（例えば、遺伝子エレメントのタンパク結合配列）は、図１６−１に示すＴＴＶ−ＪＡ２０  ＧＣリッチ配列（例えば、全配列、断片１、断片２、又はそれらの任意の組合せ、例えば、順に断片１及び２）に対して少なくとも約７５％（例え���、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％）の同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、遺伝子エレメント（例えば、遺伝子エレメントのタンパク結合配列）は、図１６−１に示すＴＴＶ−ＴＪＮ０２  ＧＣリッチ配列（例えば、全配列、断片１、断片２、断片３、断片４、断片５、断片６、断片７、断片８、又はそれらの任意の組合せ、例えば、順に断片１〜８）に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％）の同一性を有する核酸配列を含む。複数の実施形態では、遺伝子エレメント（例えば、遺伝子エレメントのタンパク結合配列）は、図１６−１に示すＴＴＶ−ｔｔｈ８  ＧＣリッチ配列（例えば、全配列、断片１、断片２、断片３、断片４、断片５、断片６、又はそれらの任意の組合せ、例えば、順に断片１〜６）に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％）の同一性を有する核酸配列を含む。
【０４６９】
【表１６−３４】
2020524993.tif 000180
【０４７０】
【表１６−３５】
2020524993.tif 000181
【０４７１】
【表１６−３６】
2020524993.tif 000182
【０４７２】
【表１６−３７】
2020524993.tif 000183
【０４７３】
エフェクター
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、機能性核酸、例えば、外性エフェクター、例えば、治療薬、例えば、調節核酸、例えば、細胞傷害性若しくは細胞溶解性ＲＮＡ又はタンパク質をコード化する１つ若しくは複数の配列を含んでもよい。一部の実施形態では、機能性核酸は、ノンコーディングＲＮＡである。
【０４７４】
一部の実施形態では、外性エフェクターをコード化する配列は、遺伝子エレメント内の、例えば、実施例１０、１２、又は２２に記載する挿入部位に挿入される。複数の実施形態では、外性エフェクターをコード化する配列は、遺伝子エレメント内のノンコーディング領域、例えば、オープンリーディングフレームの３’側及び遺伝子エレメントのＧＣリッチ領域の５’側に位置するノンコーディング領域、ＴＡＴＡボックス上流の５’ノンコーディング領域、５’ＵＴＲ、ポリ−Ａシグナル３’ノンコーディング領域下流、又はＧＣリッチ領域上流の３’ノンコーディング領域に挿入される。複数の実施形態では、外性エフェクターをコード化する配列は、遺伝子エレメント内の、例えば、本明細書に記載される通り、ＴＴＶ−ｔｔｈ８プラスミドのヌクレオチド３５８８付近に、又は例えば、本明細書に記載される通り、ＴＴＭＶ−ＬＹ２プラスミドのヌクレオチド２８４３付近に挿入される。複数の実施形態では、外性エフェクターをコード化する配列は、遺伝子エレメント内の、例えば、本明細書に記載されるように、ＴＴＶ−ｔｔｈ８プラスミドのヌクレオチド３３６〜３０１５若しくはその範囲内に、又は例えば、本明細書に記載されるように、ＴＴＶ−ＬＹ２プラスミドのヌクレオチド２４２〜２８１２若しくはその範囲内に挿入される。一部の実施形態では、外性エフェクターをコード化する配列は、オープンリーディングフレームの一部又は全部（例えば、本明細書に記載のＯＲＦ、例えば、表１〜１４のいずれかに示すＯＲＦ１、ＯＲＦ１／１、ＯＲＦ１／２、ＯＲＦ２、ＯＲＦ２／２、ＯＲＦ２／３、及び／若しくはＯＲＦ２ｔ／３）を置換する。
【０４７５】
一部の実施形態では、外性エフェクターをコード化する配列は、１００〜２０００、１００〜１０００、１００〜５００、１００〜２００、２００〜２０００、２００〜１０００、２００〜５００、５００〜１０００、５００〜２０００、又は１０００〜２０００ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、外性エフェクターは、例えば、実施例１１に記載するように、核酸又はタンパク質ペイロードである。
【０４７６】
調節核酸
一部の実施形態では、調節核酸は、内在性遺伝子及び／又は外性遺伝子の発現を修飾する。一実施形態では、調節核酸は、宿主遺伝子をターゲティングする。調節核酸として、限定はされないが、外性遺伝子とハイブリダイズする核酸（例えば、本明細書の他所に記載するｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｇＲＮＡ）、ウイルスＤＮＡ若しくはＲＮＡなどの外性核酸とハイブリダイズする核酸、ＲＮＡとハイブリダイズする核酸、遺伝子転写を妨害する核酸、ＲＮＡ翻訳を妨害する核酸、分解のターゲティングなどによってＲＮＡを安定化する、若しくは不安定化する核酸、並びにＤＮＡ若しくはＲＮＡ結合因子を調節する核酸が挙げられる。複数の実施形態では、調節核酸は、ｍｉＲＮＡをコード化する。
【０４７７】
一部の実施形態では、調節核酸は、典型的に５〜５００塩基対（具体的なＲＮＡ構造に応じて、例えば、ｍｉＲＮＡ５〜３０ｂｐ、ｌｎｃＲＮＡ２００〜５００ｂｐ）を含有するＲＮＡ又はＲＮＡ様構造を含み、細胞内の発現された標的遺伝子中のコード配列と同一（若しくは相補的な）又はほぼ同一の（若しくは実質的に相補的な）核酸塩基配列、或いは細胞内の発現された標的遺伝子をコード化する配列を有し得る。
【０４７８】
一部の実施形態では、調節核酸は、核酸配列、例えば、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、ＤＮＡターゲティング部分は、ガイドＲＮＡ又はガイドＲＮＡをコード化する核酸を含む。ｇＲＮＡの短い合成ＲＮＡは、不完全なエフェクター部分に結合するために必要な「スカフォールド」配列と、ゲノム標的に対するユーザ設定の約２０ヌクレオチドのターゲティング配列から構成され得る。実際に、ガイドＲＮＡ配列は、一般に、１７〜２４ヌクレオチド（例えば、１９、２０、若しくは２１ヌクレオチド）の長さを有するように設計され、標的化核酸配列に対して相補的である。カスタムｇＲＮＡ生成装置及びアルゴリズムが、効果的なガイドＲＮＡの設計で使用するために市販されている。また、遺伝子編集は、キメラ「シングルガイドＲＮＡ」（「ｓｇＲＮＡ」）を用いて達成されており、これは、天然に存在するｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を模倣し、且つ、ｔｒａｃｒＲＮＡ（ヌクレアーゼに結合する）と少なくとも１つのｃｒＲＮＡ（編集のためにターゲティングされる配列にヌクレアーゼを誘導する）の両方を含有する操作（合成）シングルＲＮＡ分子である。また、化学的に修飾されたｓｇＲＮＡも、ゲノム編集に効果的であることが実証されている；例えば、Ｈｅｎｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，９８５−９９１を参照されたい。
【０４７９】
調節核酸は、特定のＤＮＡ配列（例えば、遺伝子のプロモータ、エンハンサー、サイレンサー、又はリプレッサーに隣接する、若しくはその内部の配列）を認識するｇＲＮＡを含む。
【０４８０】
いくつかの調節核酸は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の生物学的プロセスによって遺伝子発現を阻害することができる。ＲＮＡｉ分子は、典型的に、１５〜５０塩基対（例えば、約１８〜２５塩基対）を含有し、且つ細胞内の発現された標的遺伝子中のコード配列と同一の（相補的な）又はほぼ同一の（実質的に相補的な）核酸塩基配列を有する、ＲＮＡ又はＲＮＡ様構造を含む。ＲＮＡｉ分子として、限定はされないが、以下：低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、メロデュプレックス、及びダイサー基質が挙げられる（米国特許第８，０８４，５９９号明細書、同第８，３４９，８０９号明細書及び同第８，５１３，２０７号明細書）。
【０４８１】
長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）は、１００ヌクレオチド超の非タンパク質コード転写物として定義される。この幾分任意の制限によって、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、及び他の低分子ＲＮＡなどの小さい調節ＲＮＡからｌｎｃＲＮＡを区別する。一般に、ｌｎｃＲＮＡの大部分（約７８％）は、組織特異的として特徴付けられる。隣接するタンパク質コード遺伝子に対して反対方向に転写される分岐ｌｎｃＲＮＡ（哺乳動物ゲノムの全ｌｎｃＲＮＡの相当の割合、約２０％を占める）は、恐らく隣接遺伝子の転写を調節すると考えられる。
【０４８２】
遺伝子エレメントは、内在性遺伝子又は遺伝子産物（例えば、ｍＲＮＡ）の全部若しくは断片に対して実質的に相補的、若しくは完全に相補的な配列を有する調節核酸をコード化する。調節核酸は、特定の遺伝子の新生核ＲＮＡ転写物が転写のためのｍＲＮＡへと成熟するのを阻止するために、イントロンとエキソンの間の境界で配列を補完することができる。特定の遺伝子に相補的な調節核酸は、その遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズして、その翻訳を阻止する。アンチセンス調節核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はその誘導体若しくはハイブリッドであってよい。
【０４８３】
目的の転写物とハイブリダイズする調節核酸の長さは、５〜３０ヌクレオチド、約１０〜３０ヌクレオチド、又は約１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０以上のヌクレオチドであってよい。標的転写物に対する調節核酸の同一性の割合は、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％であるべきである。
【０４８４】
遺伝子エレメントは、調節核酸、例えば、標的遺伝子の約５〜約２５の連続ヌクレオチドと同一のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）分子をコード化し得る。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ配列は、ｍＲＮＡをターゲティングし、ジヌクレオチドＡＡで開始し、約３０〜７０％（約３０〜６０％、約４０〜６０％、又は約４５％〜５５％）のＧＣ含有率を含み、例えば、標準ＢＬＡＳＴ検索により決定される場合、それを導入しようとする哺乳動物のゲノム内の標的以外のいずれのヌクレオチド配列に対しても高い同一性（％）を持たない。
【０４８５】
一部の実施形態では、調節核酸は、少なくとも１つ、例えば、２、３、４、５、６、若しくはそれ以上のｍｉＲＮＡである。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、ヌクレオチド配列のいずれかに対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％のヌクレオチド同一性を有するｍｉＲＮＡをコード化する配列又は本明細書、例えば、表１８に記載する１配列と相補的な配列を含む。
【０４８６】
【表１８−１】
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【０４８７】
【表１８−２】
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【０４８８】
【表１８−３】
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【０４８９】
【表１８−４】
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【０４９０】
【表１８−５】
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【０４９１】
【表１８−６】
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【０４９２】
【表１８−７】
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【０４９３】
【表１８−８】
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【０４９４】
【表１８−９】
2020524993.tif 000192
【０４９５】
ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡは、内在性マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）遺伝子（Ｂａｒｔｅｌ，Ｃｅｌｌ  １１６：２８１−２９７，２００４）のプロセシング経路中の中間体と類似する。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡとして機能することができ、その逆も同様である（Ｚｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ９：１３２７−１３３３，２００２；Ｄｏｅｎｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １７：４３８−４４２，２００３）。ｓｉＲＮＡのようなマイクロＲＮＡは、ＲＩＳＣを用いて標的遺伝子を下方制御するが、ｓｉＲＮＡとは異なり、ほとんどの動物ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡを切断しない。その代わり、ｍｉＲＮＡは、翻訳抑制又はポリＡ除去及びｍＲＮＡ分解によりタンパク質産生を低減する（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０３：４０３４−４０３９，２００６）。既知のｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍＲＮＡ  ３’ＵＴＲ内にあり；ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡの５’末端からのヌクレオチド２〜８に対してほぼ完全な相補性を有する部位をターゲティングすると思われる（Ｒａｊｅｗｓｋｙ，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ３８  Ｓｕｐｐｌ：Ｓ８−１３，２００６；Ｌｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４３３：７６９−７７３，２００５）。この領域は、シード領域として知られる。ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡは、置き換え可能であるため、外性ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡに対してシード相補性を有するｍＲＮＡを下方制御する（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３：１９９−２０４，２００６。３’ＵＴＲ内の複数の標的部位は、より強度の下方制御を付与する（Ｄｏｅｎｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １７：４３８−４４２，２００３）。
【０４９６】
既知のｍｉＲＮＡ配列表は、中でも、ウェルカム・トラスト・サンガー・インスティチュート（Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ  Ｓａｎｇｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ペン・センター・フォア・バイオインフォマティクス（Ｐｅｎｎ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）、メモリアル・スローン。ケタリング・癌センター（Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｎ  Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ）、及び欧州分子生物学研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）などの研究機関により維持されているデータベースに見出すことができる。既知の有効なｓｉＲＮＡ配列及びコグネイト結合部位も関連文献に十分に記載されている。ＲＮＡｉ分子は、当技術分野で公知の技術によって容易に設計及び作製される。加えて、有効且つ特異的な配列モチーフを見出す可能性を高める計算ツールもある（Ｌａｇａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，２０１５，１２６９：３９３−４１２）。
【０４９７】
調節核酸は、遺伝子によりコード化されるＲＮＡの発現を調節することができる。一部の実施形態では、複数の遺伝子が、互いにある程度の配列相同性を共有しているため、調節核酸は、十分な配列相同性を有する遺伝子のクラスをターゲティングするように設計することができる。一部の実施形態では、調節核酸は、様々な遺伝子標的の間で共有されるか、又は特定の遺伝子標的についてユニークな配列に対して相補性を有する配列を含むことができる。一部の実施形態では、調節核酸は、いくつかの遺伝子の間で相同性を有するＲＮＡ配列の保存領域をターゲティングして、これにより、遺伝子ファミリー内のいくつかの遺伝子（例えば、異なる遺伝子イソ型、スプライス変異体、突然変異型遺伝子など）をターゲティングするように設計することができる。一部の実施形態では、調節核酸は、単一の遺伝子の特定のＲＮＡ配列に対してユニークな配列をターゲティングするように設計することができる。
【０４９８】
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、１つ又は複数の遺伝子の発現を調節する調節核酸をコード化する１つ又は複数の配列を含んでもよい。
【０４９９】
一部の実施形態では、本明細書の他の箇所に記載するｇＲＮＡを、遺伝子編集のためのＣＲＩＳＰＲ系の一環として使用する。遺伝子編集の目的で、所望の標的ＤＮＡ配列に対応する１つ又は複数のガイドＲＮＡ配列を含有するようにクロンを設計してもよい；例えば、Ｃｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３９：８１９−８２３；Ｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，８：２２８１−２３０８を参照されたい。一般に、ｇＲＮＡの少なくとも約１６又は１７ヌクレオチドが、Ｃａｓ９媒介ＤＮＡ切断を可能にし；Ｃｐｆ１の場合、検出可能なＤＮＡ切断を達成するために、ｇＲＮＡ配列の少なくとも約１６ヌクレオチドが必要である。
【０５００】
治療用ペプチド又はポリペプチド
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、治療用ペプチド又はポリペプチドをコード化する配列を含む。こうした治療薬として、限定はされないが、低分子ペプチド、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド）、アミノ酸、及びアミノ酸類似体が挙げられる。こうした治療薬は、概して、モル当たり約５，０００グラム未満の分子量、モル当たり約２，０００グラム未満の分子量、モル当たり約１，０００グラム未満の分子量、モル当たり約５００グラム未満の分子量、並びにこうした化合物の塩、エステル、及び他の薬学的に許容される形態を有する。こうした治療薬として、限定はされないが、神経伝達物質、ホルモン、薬物、毒素、ウイルス若しくは微生物粒子、合成粒子、及びそれらのアゴニスト又はアンタゴニストが挙げられる。
【０５０１】
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、ペプチド、例えば、治療用ペプチドを含む。ペプチドは、直鎖状又は分岐状であってよい。ペプチドは、約５〜約５００アミノ酸、約１５〜約４００アミノ酸、約２０〜約３２５アミノ酸、約２５〜約２５０アミノ酸、約５０〜約１５０アミノ酸、又はそれらの間の範囲の長さを有する。
【０５０２】
ペプチドの一部の例として、限定はされないが、蛍光タグ若しくはマーカ、抗原、ペプチド治療薬、天然の生物活性ペプチド由来の合成若しくはアナログペプチド、アゴニスト若しくはアンタゴニストペプチド、抗微生物ペプチド、ターゲティング若しくは細胞傷害性ペプチド、分解若しくは自滅ペプチド及び分解若しくは自滅ペプチドが挙げられる。また、本明細書に記載される本発明で有用なペプチドとして、抗原結合ペプチド、例えば、抗原結合抗体又は抗体様断片、例えば、一本鎖抗体、ナノボディも挙げられる（例えば、Ｓｔｅｅｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．２０１６．Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ  ａｓ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：ｂｉｇ  ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ  ｆｏｒ  ｓｍａｌｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ：２１（７）：１０７６−１１３を参照）。こうした抗原結合ペプチドは、サイトゾル抗原、核抗原、又はオルガネラ内抗原に結合し得る。
【０５０３】
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、タンパク質、例えば、治療用タンパク質をコード化する配列を含む。治療用タンパク質のいくつかの例として、限定はされないが、ホルモン、サイトカイン、酵素、抗体、転写因子、受容体（例えば、膜受容体）、リガンド、膜輸送体、分泌タンパク質、ペプチド、担体タンパク質、構造タンパク質、ヌクレアーゼ、又はそれらの構成体が挙げられる。
【０５０４】
一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物又はクロンは、特定の位置、組織、又は細胞をターゲティングすることができるリガンドに結合するポリペプチドを含む。
【０５０５】
調節配列
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、調節配列、例えば、プロモータ又はエンハンサーを含む。
【０５０６】
一部の実施形態では、プロモータは、発現産物をコード化するＤＮＡに隣接して位置するＤＮＡ配列を含む。プロモータは、隣接するＤＮＡ配列と作動可能に連結してもよい。プロモータは、典型的に、プロモータが存在しないときに発現された産物の量と比較して、ＤＮＡ配列から発現される産物の量を増加させる。１つの生物由来のプロモータを使用して、別の生物に由来するＤＮＡ配列からの産物の発現を増大することができる。例えば、脊椎動物プロモータは、脊椎動物においてクラゲＧＦＰの発現のために用いることができる。加えて、１つのプロモータエレメントが、タンデムで結合された複数のＤＮＡ配列について発現された産物の量を増加させることができる。従って、１プロモータエレメントは、１つ又は複数の産物の発現を増大することができる。当業者には、複数のプロモータエレメントが周知である。
【０５０７】
一実施形態では、高レベルの構成性発現が要望される。こうしたプロモータの例として、限定はしないが、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕｓ  ｓａｒｃｏｍａ  ｖｉｒｕｓ）（ＲＶＳ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモータ／エンハンサー、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）中間体初期プロモータ／エンハンサー（例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ，４１：５２１−５３０（１９８５）を参照）、ＳＶ４０プロモータ、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモータ、細胞質βアクチンプロモータ及びホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモータが挙げられる。
【０５０８】
別の実施形態では、誘導性プロモータが要望される場合もある。誘導性プロモータは、シス又はトランスのいずれかで、外部から供給される化合物により調節されるものであり、限定はしないが、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオニン（ＭＴ）プロモータ；デキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導性マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモータ；Ｔ７ポリメラーゼプロモータシステム（国際公開第９８／１００８８号パンフレット）；テトラサイクリン抑制性システム（Ｇｏｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５４７−５５５１（１９９２））；テトラサイクリン誘導性システム（Ｇｏｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８：１７６６−１７６９（１９９５）；また、Ｈａｒｖｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２：５１２−５１８（１９９８））も参照）；ＲＵ４８６誘導性システム（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１５：２３９−２４３（１９９７）及びＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，４：４３２−４４１（１９９７）］；並びにラパマイシン誘導性システム（Ｍａｇａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１００：２８６５−２８７２（１９９７）；Ｒｉｖｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２：１０２８−１０３２（１９９６））が挙げられる。本発明に関して有用となり得る他のタイプの誘導性プロモータは、特定の生理的状態、例えば、温度、急性相によって、又は複製細胞においてのみ調節されるものである。
【０５０９】
一部の実施形態では、目的の遺伝子又は核酸配列のネイティブプロモータを使用する。ネイティブプロモータは、遺伝子又は核酸配列の発現が、ネイティブ発現を模倣すべきであることが要望される場合に使用することができる。ネイティブプロモータは、遺伝子又は他の核酸配列の発現を一過性若しくは発展的に、又は組織特異的に、又は特定の転写刺激に応答して調節しなければならない場合に使用することができる。別の実施形態では、ネイティブ発現を模倣するために、他のネイティブ発現制御エレメント、例えば、エンハンサーエレメント、ポリアデニル化部位又はコザック（Ｋｏｚａｋ）コンセンサス配列を用いてもよい。
【０５１０】
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、組織特異的プロモータに作動可能に連結された遺伝子を含む。例えば、骨格筋での発現が要望される場合、筋肉において活性のプロモータを用いることができる。こうしたものとして、骨格αアクチン、ミオシン軽鎖２Ａ、ジストロフィン、筋クレアチンキナーゼをコード化する遺伝子由来のプロモータ、並びに天然のプロモータより高い活性を有する合成筋肉プロモータが挙げられる。Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１７：２４１−２４５（１９９９）を参照されたい。組織特異的であるプロモータの例は、中でも、以下のものについて知られている：肝臓アルブミン、Ｍｉｙａｔａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：５１２４−３２（１９９７）；Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモータ、Ｓａｎｄｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．３：１００２−９（１９９６）；αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ａｒｂｕｔｈｎｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，７：１５０３−１４（１９９６）］、骨（オステオカルシン、Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．，２４：１８５−９６（１９９７）；骨シアロタンパク質、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．１１：６５４−６４（１９９６））、リンパ球（ＣＤ２、Ｈａｎｓａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６１：１０６３−８（１９９８）；免疫グロブリン重鎖；Ｔ細胞受容体ａ鎖）、神経（ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモータ、Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１３：５０３−１５（１９９３）；ニューロフィラメント軽鎖遺伝子、Ｐｉｃｃｉｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：５６１１−５（１９９１）；ニューロン特異的ｖｇｆ遺伝子、Ｐｉｃｃｉｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，１５：３７３−８４（１９９５）］。
【０５１１】
遺伝子エレメントは、エンハンサー、例えば、遺伝子をコード化するＤＮＡ配列に隣接して位置するＤＮＡ配列を含んでもよい。エンハンサーエレメントは、典型的に、プロモータエレメントの上流に位置するか、又はコーディングＤＮＡ配列（例えば、１つ若しくは複数の産物に転写若しくは翻訳されたＤＮＡ配列）の下流、又はその内部に位置してもよい。従って、エンハンサーエレメントは、産物をコード化するＤＮＡ配列上流又は下流の１００塩基対、２００塩基対、若しくは３００塩基対若しくはそれ以上に位置することができる。エンハンサーエレメントは、プロモータエレメントによってもたらされる発現増大を上回って、ＤＮＡ配列から発現される組換え産物の量を増大することができる。複数のエンハンサーエレメントが当業者には容易に入手可能である。
【０５１２】
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、本明細書に記載の発現産物をコード化する配列にフランキングする１つ又は複数の逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、本明細書に記載の発現産物をコード化する配列にフランキングする１つ又は複数の長末端反復（ＬＴＲ）を含む。用いることができるプロモータ配列の例として、限定はされないが、サルウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモータ、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモータ、ＭｏＭｕＬＶプロモータ、トリ白血病ウイルスプロモータ、エプスタイン・バーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）前初期プロモータ、及びラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕｓ  ｓａｒｃｏｍａ  ｖｉｒｕｓ）プロモータが挙げられる。
【０５１３】
複製タンパク質
一部の実施形態では、クロン、例えば、合成クロンの遺伝子エレメントは、１つ又は複数の複製タンパク質をコード化する配列を含んでもよい。一部の実施形態では、クロンは、ローリングサークル複製法、例えば、リーディング鎖の合成により複製することができ、ラギング鎖は結合されない。こうした実施形態では、クロンは、３つの追加エレメント：ｉ）イニシエータタンパク質をコード化する遺伝子、ｉｉ）二本鎖起点、及びｉｉｉ）一本鎖起点を含む。複製タンパク質を含むローリングサークル複製（ＲＣＲ）タンパク質複合体は、リーディング鎖に結合して、複製起点を不安定化する。ＲＣＲ複合体は、ゲノムを切断して、自由３’ＯＨ末端を生成する。細胞ＤＮＡポリメラーゼは、自由３’ＯＨ末端からウイルスＤＮＡ複製を開始する。ゲノムが複製された後、ＲＣＲ複合体は、ループを共有結合により閉鎖する。これにより、環状プラス一本鎖親ＤＮＡ分子、及び親マイナス鎖と新しく合成されたプラス鎖とから構成される環状二本鎖ＤＮＡ分子の放出が起こる。一本鎖ＤＮＡ分子は、包膜されるか、又は第２ラウンドの複製に参加することができる。例えば、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２００９，６：６０  ｄｏｉ：１０．１１８６／１７４３−４２２Ｘ−６−６０を参照されたい。
【０５１４】
遺伝子エレメントは、ポリメラーゼ、例えば、ＲＮＡポリメラーゼ又はＤＮＡポリメラーゼをコード化する配列を含んでもよい。
【０５１５】
その他の配列
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、産物をコード化する核酸（例えば、リボザイム、タンパク質をコード化する治療用ｍＲＮＡ、外性遺伝子）をさらに含む。
【０５１６】
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、宿主又は宿主細胞中のクロンの種及び／若しくは組織及び／若しくは細胞指向性（例えば、キャプシドタンパク質配列）、感染力（例えば、キャプシドタンパク質配列）、免疫抑制／活性化（例えば、調節核酸）、ウイルスゲノム結合及び／又はパッケージング、免疫回避（非免疫原性及び／又は寛容性）、薬物動態、エンドサイトーシス及び／又は細胞接着、核内進入、細胞内調節及び局在化、エキソサイトーシス調節、増殖、並びに核酸保護に影響を及ぼす１つ又は複数の配列を含む。
【０５１７】
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は人工核酸を含む他の配列を含んでもよい。他の配列として、限定はされないが、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又はｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、若しくはその他のＲＮＡｉ分子をコード化する配列を挙げることができる。一実施形態では、遺伝子エレメントは、調節核酸と同じ遺伝子発現産物の異なる遺伝子座をターゲティングするために、ｓｉＲＮＡをコード化する配列を含む。一実施形態では、遺伝子エレメントは、調節核酸とは異なる遺伝子発現産物をターゲティングするために、ｓｉＲＮＡをコード化する配列を含む。
【０５１８】
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、以下：１つ若しくは複数のｍｉＲＮＡをコード化する配列、１つ若しくは複数の複製タンパク質をコード化する配列、外性遺伝子をコード化する配列、治療薬をコード化する配列、調節配列（例えば、プロモータ、エンハンサー）、内在性遺伝子（ｓｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）をターゲティングする１つ若しくは複数の調節配列をコード化する配列、並びに治療用ｍＲＮＡ若しくはタンパク質をコード化する配列のうち１つ又は複数を含む。
【０５１９】
他の配列は、約２〜約５０００ｎｔ、約１０〜約１００ｎｔ、約５０〜約１５０ｎｔ、約１００〜約２００ｎｔ、約１５０〜約２５０ｎｔ、約２００〜約３００ｎｔ、約２５０〜約３５０ｎｔ、約３００〜約５００ｎｔ、約１０〜約１０００ｎｔ、約５０〜約１０００ｎｔ、約１００〜約１０００ｎｔ、約１０００〜約２０００ｎｔ、約２０００〜約３０００ｎｔ、約３０００〜約４０００ｎｔ、約４０００〜約５０００ｎｔ、又はこれらの間の任意の範囲の長さを有し得る。
【０５２０】
外性遺伝子
例えば、遺伝子エレメントは、シグナル伝達生化学経路に関連する遺伝子、例えば、シグナル伝達生化学経路関連遺伝子又はポリヌクレオチドを含んでもよい。例として、疾患関連遺伝子又はポリヌクレオチドがある。「疾患関連」遺伝子又はポリヌクレオチドは、非疾患対照の組織若しくは細胞と比較して、疾患に罹患した組織由来の細胞において異常なレベル又は異常な形態で転写若しくは翻訳産物をもたらしているあらゆる遺伝子又はポリヌクレオチドを指す。これは、異常に高いレベルで発現される遺伝子であってもよいし；異常に低いレベルで発現される遺伝子であってもよく、その際、改変された発現は、疾患の発生及び／又は進行と相関する。疾患関連遺伝子はまた、遺伝子プロセシング突然変異又は遺伝子変異とも呼ばれ、これは、疾患の直接の原因であるか、又は病因となる遺伝子との連関不均衡状態にある。
【０５２１】
疾患関連遺伝子及びポリヌクレオチドは、ＭｃＫｕｓｉｃｋ−Ｎａｔｈａｎｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．）及びＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）から入手可能である。疾患関連遺伝子又はポリヌクレオチドの例は、米国特許第８，６９７，３５９号明細書の表Ａ及びＢに列挙されており、これらは、その全体を参照により本明細書に組み込むものとする。疾患別の情報は、ＭｃＫｕｓｉｃｋ−Ｎａｔｈａｎｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．）及びＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）から入手可能である。シグナル伝達生化学経路関連遺伝子及びポリヌクレオチドの例は、米国特許第８，６９７，３５９号明細書の表Ａ〜Ｃに列挙されており、これらは、その全体を参照により本明細書に組み込むものとする。
【０５２２】
さらに、遺伝子エレメントは、本明細書の他所に記載する通り、ターゲティング部分をコード化することができる。これは、例えば、糖、糖脂質、又は抗体などのタンパク質をコード化するポリヌクレオチドを挿入することによって達成することができる。当業者は、ターゲティング部分の更なる作製方法について周知している。
【０５２３】
ウイルス配列
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、少なくとも１つのウイルス配列を含む。一部の実施形態では、これらの配列は、一本鎖ＤＮＡウイルス、例えば、アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）、ビドナウイルス（Ｂｉｄｎａｖｉｒｕｓ）、サーコウイルス（Ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ）、ジェミニウイルス（Ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｕｓ）、ゲノモウイルス（Ｇｅｎｏｍｏｖｉｒｕｓ）、イノウイルス（Ｉｎｏｖｉｒｕｓ）、ミクロウイルス（Ｍｉｃｒｏｖｉｒｕｓ）、ナノウイルス（Ｎａｎｏｖｉｒｕｓ）、パルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、及びスピラウイルス（Ｓｐｉｒａｖｉｒｕｓ）由来の１つ若しくは複数の配列に対して相同性又は同一性を有する。一部の実施形態では、配列は、二本鎖ＤＮＡウイルス、例えば、アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、アンプラウイルス（Ａｍｐｕｌｌａｖｉｒｕｓ）、アスコウイルス（Ａｓｃｏｖｉｒｕｓ）、アスファウイルス（Ａｓｆａｒｖｉｒｕｓ）、バキュロウイルス（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）、フセロウイルス（Ｆｕｓｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）、グロブロウイルス（Ｇｌｏｂｕｌｏｖｉｒｕｓ）、グッタウイルス（Ｇｕｔｔａｖｉｒｕｓ）、ヒトロサウイルス（Ｈｙｔｒｏｓａｖｉｒｕｓ）、ヘルペスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）、イリドウイルス（Ｉｒｉｄｏｖｉｒｕｓ）、リポスリックスウイルス（Ｌｉｐｏｔｈｒｉｘｖｉｒｕｓ）、ニマウイルス（Ｎｉｍａｖｉｒｕｓ））、及びポックスウイルス（Ｐｏｘｖｉｒｕｓ）由来の１つ若しくは複数の配列に対して相同性又は同一性を有する。一部の実施形態では、配列は、ＲＮＡウイルス、例えば、アルファウイルス（Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ）、フロウイルス（Ｆｕｒｏｖｉｒｕｓ）、肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、ホルデイウイルス（Ｈｏｒｄｅｉｖｉｒｕｓ）、トバモウイルス（Ｔｏｂａｍｏｖｉｒｕｓ）、トブラウイルス（Ｔｏｂｒａｖｉｒｕｓ）、トリコルナウイルス（Ｔｒｉｃｏｒｎａｖｉｒｕｓ）、ルビウイルス（Ｒｕｂｉｖｉｒｕｓ）、ビルナウイルス（Ｂｉｒｎａｖｉｒｕｓ）、シストウイルス（Ｃｙｓｔｏｖｉｒｕｓ）、パルティティウイルス（Ｐａｒｔｉｔｉｖｉｒｕｓ）、及びレオウイルス（Ｒｅｏｖｉｒｕｓ）由来の１つ若しくは複数の配列に対して相同性又は同一性を有する。
【０５２４】
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、非病原性ウイルス、例えば、共生ウイルス、例えば、片利共生ウイルス、例えば、ネイティブウイルス、例えば、アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）由来の１つ又は複数の配列を含んでもよい。近年命名に変更がなされ、ヒト細胞に感染することができる３つのアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）は、アネロウイルス科（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｉｄａｅ）ウイルスのアルファトルクウイルス属（Ａｌｐｈａｔｏｒｑｕｅｖｉｒｕｓ）（ＴＴ）、ベータトルクウイルス属（Ｂｅｔａｔｏｒｑｕｅｖｉｒｕｓ）（ＴＴＭ）、及びガンマトルクウイルス属（Ｇａｍｍａｔｏｒｑｕｅｖｉｒｕｓ）（ＴＴＭＤ）に分類された。現在まで、アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）は、ヒト疾患に関連付けられていない。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、環状マイナス−センスゲノムを有する非包膜一本鎖ＤＮＡウイルスであるトルク・テノウイルス（Ｔｏｒｑｕｅ  Ｔｅｎｏ  Ｖｉｒｕｓ）（ＴＴ）に対して相同性又は同一性を有する配列を含み得る。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、ＳＥＮウイルス、センチネルウイルス（Ｓｅｎｔｉｎｅｌ  ｖｉｒｕｓ）、ＴＴＶ様ミニウイルス、及びＴＴウイルスに対して相同性又は同一性を有する配列を含み得る。ＴＴウイルス遺伝子型６、ＴＴウイルス群、ＴＴＶ様ウイルスＤＸＬ１、及びＴＴＶ様ウイルスＤＸＬ２をはじめとする様々なタイプのＴＴウイルスが記載されている。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、より小さなウイルス、トルク・テノ様ミニウイルス（Ｔｏｒｑｕｅ  Ｔｅｎｏ−ｌｉｋｅ  Ｍｉｎｉ  Ｖｉｒｕｓ）（ＴＴＭ）、又はトルク・テノ様ミディウイルス（Ｔｏｒｑｕｅ  Ｔｅｎｏ−ｌｉｋｅ  Ｍｉｄｉ  Ｖｉｒｕｓ）（ＴＴＭＤ）と呼ばれる、ＴＴＶとＴＴＭＶの中間のゲノムサイズを有する第３のウイルスに対して相同性又は同一性を有する配列を含み得る。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、本明細書において、例えば、表１９に記載のヌクレオチド配列のいずれか１つに対して少なくとも約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％及び９９％のヌクレオチド配列同一性を有する非病原性ウイルス由来の１つ若しくは複数の配列又は１配列の断片を含んでもよい。
【０５２５】
【表１９−１】
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【０５２６】
【表１９−２】
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【０５２７】
【表１９−３】
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【０５２８】
【表１９−４】
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【０５２９】
【表１９−５】
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【０５３０】
【表１９−６】
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【０５３１】
【表１９−７】
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【０５３２】
【表１９−８】
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【０５３３】
【表１９−９】
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【０５３４】
【表１９−１０】
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【０５３５】
【表１９−１１】
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【０５３６】
【表１９−１２】
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【０５３７】
【表１９−１３】
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【０５３８】
【表１９−１４】
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【０５３９】
【表１９−１５】
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【０５４０】
【表１９−１６】
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【０５４１】
【表１９−１７】
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【０５４２】
【表１９−１８】
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【０５４３】
【表１９−１９】
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【０５４４】
【表１９−２０】
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【０５４５】
【表１９−２１】
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【０５４６】
【表１９−２２】
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【０５４７】
【表１９−２３】
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【０５４８】
【表１９−２４】
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【０５４９】
【表１９−２５】
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【０５５０】
【表１９−２６】
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【０５５１】
【表１９−２７】
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【０５５２】
【表１９−２８】
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【０５５３】
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、本明細書において、例えば、表２０に記載のヌクレオチド配列のいずれか１つに対して少なくとも約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％及び９９％のヌクレオチド配列同一性を有する実質的に非病原性のウイルス由来の１つ若しくは複数の配列又は１配列の断片を含んでもよい。
【０５５４】
【表２０−１】
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【０５５５】
【表２０−２】
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【０５５６】
【表２０−３】
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【０５５７】
【表２０−４】
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【０５５８】
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、１つ又は複数の非アネロウイルス、例えば、アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、ヘルペスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）、ポックスウイルス（Ｐｏｘｖｉｒｕｓ）、ワクシニアウイルス（Ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ）、ＳＶ４０、パピローマウイルス（ｐａｐｉｌｌｏｍａ  ｖｉｒｕｓ）、レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）などのＲＮＡウイルス、例えば、レンチウイルス（ｌｅｎｔｉ  ｖｉｒｕｓ）、一本鎖ＲＮＡウイルス、例えば、肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、又は二本鎖ＤＮＡウイルス、例えば、ロタウイルス（ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）由来の１つ若しくは複数の配列に対して相同性又は同一性を有する１つ又は複数の配列を含む。一部の実施形態では、組換えレトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）は、欠損していることから、感染性粒子を産生するために補助を提供することができる。こうした補助は、例えば、ＬＴＲ内で調節配列の制御下、レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）の構造遺伝子全てをコード化するプラスミドを含むヘルパー細胞を用いることによって提供することができる。本明細書に記載のクロンを複製するために好適な細胞株としては、当技術分野で公知の細胞株、例えば、Ａ５４９があり、これは、本明細書に記載されるように修飾することができる。前記遺伝子エレメントは、さらに、所望の遺伝子エレメントを同定することができるように、選択マーカをコード化する遺伝子も含み得る。
【０５５９】
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、配列が、最初のヌクレオチド配列によりコード化されたポリペプチドに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一であるか、又はそうでなければ、本発明を実施する上で有用である限り、非サイレント突然変異、例えば、コード化されたポリペプチドにアミノ酸変化をもたらす塩基置換、欠失、又は付加を含む。これに関して、いくつかの保存的アミノ酸置換を実施することができ、これらは一般に、タンパク質機能全体を、例えば、陽荷電アミノ酸（及びその逆）、すなわち、リシン、アルギニン及びヒスチジンに関して；陰荷電アミノ酸（及びその逆）、すなわち、アスパラギン酸及びグルタミン酸に関して；並びにいくつかの中性荷電アミノ酸群（及びあらゆるケース、またその逆）、すなわち（１）アラニン及びセリン、（２）アスパラギン、グルタミン、及びヒスチジン、（３）システイン及びセリン、（４）グリシン及びプロリン、（５）イソロイシン、ロイシン及びバリン、（６）メチオニン、ロイシン及びイソロイシン、（７）フェニルアラニン、メチオニン、ロイシン、及びチロシン、（８）セリン及びトレオニン、（９）トリプトファン及びチロシン、（１０）並びに例えば、チロシン、トリプトファン及びフェニルアラニンに関して、不活性化しないことが認められている。アミノ酸は、物理的特性並びに二次及び三次タンパク質構造への寄与に従って分類することができる。保存的置換は、類似の特性を有する別のアミノ酸による１アミノ酸の置換として、当技術分野では認識されている。
【０５６０】
同一の若しくは指定パーセンテージのヌクレオチド、又は同一の（比較ウインドウ又は指定領域にわたる最大一致について比較し、アラインメントした場合、指定領域にわたって約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくはそれ以上の同一性）アミノ酸残基を有する２つ以上の核酸又はポリペプチド配列の同一性は、以下に記載するデフォルトパラメータを有するＢＬＡＳＴ若しくはＢＬＡＳＴ  ２．０配列比較アルゴリズムを用いて、又は手動アラインメント及び視覚検査によって測定することができる（例えば、ＮＣＢＩウェブサイト  ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／などを参照）。同一性はまた、試験配列の補体を指すこともあり、或いは補体に適用され得る。同一性はまた、欠失及び／又は付加を有する配列、並びに置換を有する配列も含む。本明細書に記載するように、アルゴリズムはギャップなどを考慮する。同一性は、少なくとも約１０アミノ酸又はヌクレオチド長、約１５アミノ酸又はヌクレオチド長、約２０アミノ酸又はヌクレオチド長、約２５アミノ酸又はヌクレオチド長、約３０アミノ酸又はヌクレオチド長、約３５アミノ酸又はヌクレオチド長、約４０アミノ酸又はヌクレオチド長、約４５アミノ酸又はヌクレオチド長、約５０アミノ酸又はヌクレオチド長、若しくはそれ以上の領域にわたって存在し得る。
【０５６１】
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、本明細書において、例えば、表１９又は表２０に記載のヌクレオチド配列のいずれか１つに対して、少なくとも約７５％のヌクレオチド配列同一性、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。遺伝子コードは、縮重であることから、相同性ヌクレオチド配列は、任意の数の「サイレント」塩基変更、すなわち、やはり同じアミノ酸をコード化するヌクレオチド置換を含むことができる。
【０５６２】
遺伝子編集構成体
合成クロンの遺伝子エレメントは、遺伝子編集システムの１構成体をコード化する１つ又は複数の遺伝子を含んでもよい。例示的な遺伝子編集システムとして、クラスター化規則間隔短回文反復（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔ）（ＣＲＩＳＰＲ）システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、及び転写アクチベータ様エフェクターベースヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）がある。ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、及びＣＲＩＳＰＲに基づく方法は、例えば、Ｇａｊ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１．７（２０１３）：３９７−４０５に記載されており；遺伝子編集のＣＲＩＳＰＲ法は、例えば、以下：Ｇｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ：Ｐｒｅ−ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌ．ＤＮＡ  Ｒｅｐａｉｒ  ２０１６  Ｏｃｔ；４６：１−８．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｄｎａｒｅｐ．２０１６．０７．００４；Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｅｃｉｓｅ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｖｏｌ．５７，Ｎｏ．３，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２０１４，ｐｐ．１１５−１２４に記載されている。
【０５６３】
ＣＲＩＳＰＲシステムは、初め細菌及び古細菌で発見された適応防御システムである。ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＣＲＩＳＰＲ関連又は「Ｃａｓ」エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９若しくはＣｐｆ１）と呼ばれるＲＮＡ誘導ヌクレアーゼを用いて、外来ＤＮＡを切断する。典型的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて、エンドヌクレアーゼは、一本鎖若しくは二本鎖ＤＮＡ配列をターゲティングする配列特異的なノンコーディング「ガイドＲＮＡ」により、標的ヌクレオチド配列（例えば、ゲノム内で配列編集しようとする部位）に向けられる。３つのクラス（Ｉ〜ＩＩＩ）のＣＲＩＳＰＲシステムが同定されている。クラスＩＩ  ＣＲＩＳＰＲシステムは、単一のＣａｓエンドヌクレアーゼ（複数のＣａｓタンパク質ではなく）を使用する。或るクラスＩＩ  ＣＲＩＳＰＲシステムは、Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（「ｃｒＲＮＡ」）、及びトランス活性化ｃｒＲＮＡ（「ｔｒａｃｒＲＮＡ」）などのＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼを含む。ｃｒＲＮＡは、「ガイドＲＮＡ」、典型的には、標的ＤＮＡ配列に対応する約２０ヌクレオチドＲＮＡ配列を含む。ｃｒＲＮＡはまた、ｔｒａｃｒＲＮＡに結合して部分的に二本鎖の構造を形成する領域も含有し、これは、ＲＮａｓｅＩＩＩにより切断されて、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドが形成される。次に、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを指令して、標的ＤＮＡ配列を認識させ、切断させる。標的ＤＮＡ配列は、概して、所与のＣａｓエンドヌクレアーゼに特異的な「プロトスペーサ隣接モチーフ」（「ＰＡＭ」）に隣接していなければならない；しかし、ＰＡＭ配列は、所与のゲノム全体に出現する。
【０５６４】
一部の実施形態では、クロンは、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼの遺伝子を含む。例えば、様々な原核生物種から同定されるいくつかのＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、ユニークなＰＡＭ配列要件を有し；ＰＡＭ配列の例として、５’−ＮＧＧ（化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、５’−ＮＮＡＧＡＡ（ストレプコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ１）、５’−ＮＧＧＮＧ（ストレプコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ３）、及び５’−ＮＮＮＧＡＴＴ（髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｄｉｔｉｓ））が挙げられる。いくつかのエンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ＧリッチＰＡＭ部位、例えば、５’−ＮＧＧに結合しており、ＰＡＭ部位（その５’側）から上流の３ヌクレオチド位置で標的ＤＮＡの平滑末端切断を実施する。別のクラスＩＩ  ＣＲＩＳＰＲシステムは、Ｃａｓ９より小さいＶ型エンドヌクレアーゼＣｐｆ１を含み；例として、ＡｓＣｐｆ１（アシダミノコッカス種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）由来）及びＬｂＣｐｆ１（ラクノスピラ科種（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｓｐ．）由来）が挙げられる。Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、ＴリッチＰＡＭ部位、例えば、５’−ＴＴＮと結合している。Ｃｐｆ１はまた、５’−ＣＴＡ  ＰＡＭモチーフを認識することができる。Ｃｐｆ１は、４−又は５−ヌクレオチド５’オーバーハングを伴うオフセット又はスタッガー二本鎖切断を導入し、例えば、コード鎖のＰＡＭ部位（その３’側）から下流の１８ヌクレオチドで、且つ相補鎖のＰＡＭ部位から下流の２３ヌクレオチドに位置する５−ヌクレオチドオフセット又はスタッガーカットで標的ＤＮＡを切断することにより、標的ＤＮＡを切断し；こうしたオフセット切断によって生じた５−ヌクレオチドオーバーハングは、平滑末端切断されたＤＮＡでの挿入と比較して、相同組換えによるＤＮＡ挿入による正確なゲノム編集を可能にする。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｃｅｌｌ，１６３：７５９−７７１を参照されたい。
【０５６５】
様々なＣＲＩＳＰＲ結合（Ｃａｓ）遺伝子をクロンに含有させてもよい。遺伝子の具体的な例は、クラスＩＩシステムからのＣａｓタンパク質をコード化するものであり、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃｐｆ１、Ｃ２Ｃ１、又はＣ２Ｃ３が挙げられる。一部の実施形態では、クロンは、Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９タンパク質をコード化する遺伝子を含み、これは、多様な原核生物種のいずれに由来するものでもよい。一部の実施形態では、クロンは、特定のＣａｓタンパク質、例えば、特定のＣａｓ９タンパク質をコード化する遺伝子を含み、これは、特定のプロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を認識するように選択される。一部の実施形態では、クロンは、２つ以上の異なるＣａｓタンパク質をコード化する核酸、又は２つ以上のＣａｓタンパク質を含み、例えば、同じ、類似する若しくは異なるＰＡＭモチーフを含む部位の認識及び修飾を可能にするために、クロンを細胞、接合子、胚、又は動物に導入してもよい。一部の実施形態では、クロンは、不活性化ヌクレアーゼ、例えば、ヌクレアーゼ欠失Ｃａｓ９を含む修飾Ｃａｓタンパク質をコード化する遺伝子を含む。
【０５６６】
野生型Ｃａｓ９タンパク質は、ｇＲＮＡによりターゲティングされた特定のＤＮＡ配列に二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成するが、修飾された機能性を有するいくつかのＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼが知られており、例えば、Ｃａｓ９の「ニッカーゼ」バージョンは、一本鎖切断しか生成せず；触媒能のないＣａｓ９（「ｄＣａｓ９」）は、標的ＤＮＡを切断しない。ｄＣａｓ９をコード化する遺伝子を、エフェクタードメインをコード化する遺伝子と融合させて、標的遺伝子の発現を抑制（ＣＲＩＳＰＲｉ）又は活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）することができる。例えば、遺伝子は、転写サイレンサー（例えば、ＫＲＡＢドメイン）又は転写アクチベータ（例えば、ｄＣａｓ９−ＶＰ６４融合物）をコード化し得る。ＦｏｋＩヌクレアーゼに融合した触媒能のないＣａｓ９（ｄＣａｓ９）をコード化する遺伝子（「ｄＣａｓ９−ＦｏｋＩ」）を含有させて、２つのｇＲＮＡに対して相同的な標的配列にＤＳＢを生成することができる。例えば、Ａｄｄｇｅｎｅリポジトリ（Ａｄｄｇｅｎｅ，７５  Ｓｉｄｎｅｙ  Ｓｔ．，Ｓｕｉｔｅ  ５５０Ａ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ  ０２１３９；ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｃｒｉｓｐｒ／）に開示され、そこから一般に入手可能な多数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラスミドを参照されたい。各々が個別のガイドＲＮＡにより指令される２つの個別の二本鎖切断を導入する「ダブルニッカーゼ」Ｃａｓ９は、Ｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ，１５４：１３８０−１３８９によって、より正確なゲノム編集を達成するものとして記載されている。
【０５６７】
真核細胞の遺伝子を編集するためのＣＲＩＳＰＲ技術は、以下：米国特許出願公開第２０１６／０１３８００８Ａ１号明細書及び同第２０１５／０３４４９１２Ａ１号明細書、並びに米国特許第８，６９７，３５９号明細書、同第８，７７１，９４５号明細書、同第８，９４５，８３９号明細書、同第８，９９９，６４１号明細書、同第８，９９３，２３３号明細書、同第８，８９５，３０８号明細書、同第８，８６５，４０６号明細書、同第８，８８９，４１８号明細書、同第８，８７１，４４５号明細書、同第８，８８９，３５６号明細書、同第８，９３２，８１４号明細書、同第８，７９５，９６５号明細書、及び同第８，９０６，６１６号明細書に開示されている。Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼ並びに対応するガイドＲＮＡ及びＰＡＭ部位は、米国特許出願公開第２０１６／０２０８２４３Ａ１号明細書に開示されている。
【０５６８】
一部の実施形態では、クロンは、本明細書に記載のポリペプチド、例えば、標的化ヌクレアーゼをコード化する遺伝子、例えば、Ｃａｓ９、例えば、野生型Ｃａｓ９、ニッカーゼＣａｓ９（例えば、Ｃａｓ９  Ｄ１０Ａ）、不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）、ｅＳｐＣａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２Ｃ１、又はＣ２Ｃ３、及びｇＲＮＡを含む。ヌクレアーゼをコード化する遺伝子、及びｇＲＮＡの選択は、標的化突然変異がヌクレオチドの欠失、置換、又は付加、例えば、標的化配列に対するヌクレオチドの欠失、置換、又は付加であるか否かによって決定される。（１つ又は複数の）エフェクタードメイン（例えば、ＶＰ６４）の全部又は一部（例えば、その生物活性部分）と係留された触媒能のないエンドヌクレアーゼ、例えば、不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９、例えば、Ｄ１０Ａ；Ｈ８４０Ａ）をコード化する遺伝子は、１つ又は複数の標的核酸配列の活性及び／又は発現を調節することができるキメラタンパク質を産生する。
【０５６９】
本明細書で使用される場合、「エフェクタードメインの生物活性部分」は、エフェクタードメイン（例えば、「最小」又は「コア」ドメイン）の機能を（例えば、完全に、部分的に、又は最小限）維持するタンパク質である。一部の実施形態では、クロンは、本明細書に記載の方法に有用なキメラタンパク質を作製するために、１つ又は複数のエフェクタードメインの全部又は一部とｄＣａｓ９の融合物をコード化する遺伝子を含む。従って、一部の実施形態では、クロンは、ｄＣａｓ９−メチラーゼ融合物をコード化する遺伝子を含む。他の一部の実施形態では、クロンは、内在性遺伝子をターゲティングする部位特異的ｇＲＮＡを含むｄＣａｓ９−酵素融合物をコード化する遺伝子を含む。
【０５７０】
他の態様では、クロンは、ｄＣａｓ９と融合した１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又はそれ以上のエフェクタードメイン（全部又は生物活性部分）をコード化する遺伝子を含む。
【０５７１】
タンパク質性外層
一部の実施形態では、クロン、例えば、合成クロンは、遺伝子エレメントを閉じ込めるタンパク性外層を含む。タンパク性外層は、哺乳動物において免疫応答を誘発することができない実質的に非病原性の外部タンパク質を含むことができる。一部の実施形態では、合成クロンは、タンパク性外層中に脂質が存在しない。一部の実施形態では、合成クロンには、脂質二重層、例えば、ウイルスエンベロープが存在しない。一部の実施形態では、合成クロンの内部は、タンパク性外層によって完全に（例えば、１００％）覆われている。一部の実施形態では、合成クロンの内部は、外部タンパク質によって１００％未満、例えば、９５％、９０％、８５％、８０％、７０％、６０％、５０％以下の被覆率で覆われている。一部の実施形態では、タンパク性外層は、遺伝子エレメントが、クロン内に保持されている限り、間隙又は不連続（例えば、水、イオン、ペプチド、又は小分子に対する透過性を可能にするもの）を含む。
【０５７２】
一部の実施形態では、タンパク性外層は、宿主細胞内への遺伝子エレメントの進入を媒介するために、宿主細胞を特異的に認識及び／又はそれに結合する１つ若しくは複数のタンパク質又はポリペプチド、例えば、相補的タンパク質又はポリペプチドを含む。
【０５７３】
一部の実施形態では、タンパク性外層は、以下：１つ若しくは複数のグリコシル化タンパク質、親水性ＤＮＡ−結合領域、アルギニンリッチ領域、トレオニンリッチ領域、グルタミンリッチ領域、Ｎ−末端ポリアルギニン配列、可変領域、Ｃ−末端ポリグルタミン／グルタミン酸配列、及び１つ若しくは複数のジスルフィド架橋のうち１つ又は複数を含む。
【０５７４】
一部の実施形態では、タンパク性外層は、以下の特徴：正二十面体対称、１つ若しくは複数の宿主細胞と相互作用して、宿主細胞内への進入を媒介する分子の認識及び／若しくはそれとの結合、脂質分子の欠失、炭水化物の欠失、ｐＨ及び温度不安定性、界面活性剤抵抗性、及び宿主細胞において実質的に非免疫原性若しくは実質的に非病原性であることのうち１つ又は複数を含む。
【０５７５】
ベクター
本明細書に記載の遺伝子エレメントは、ベクター内に含有させてもよい。好適なベクター並びにそれらの製造及びそれらの使用方法は、従来技術分野で公知である。
【０５７６】
一態様では、本発明は、（ｉ）非病原性外部タンパク質をコード化する配列と、（ｉｉ）遺伝子エレメントを非病原性外部タンパク質と結合させる外部タンパク質結合配列と、（ｉｉｉ）調節核酸をコード化する配列と、を含む遺伝子エレメントを含むベクターを包含する。
【０５７７】
遺伝子エレメント又は遺伝子エレメント内の配列のいずれかは、任意の好適な方法を用いて取得することができる。例えば、標準的技法を用いて、ウイルス配列を含む細胞からのライブラリーのスクリーニング、当該配列を含むことがわかっているベクターからの配列の誘導、又は細胞及びそれを含有する組織からの直接の単離など、様々な組換え方法が当技術分野で公知である。これに代わり、又はこれと組み合わせて、遺伝子エレメントの一部又は全部は、クローニングではなく、合成により生産することができる。
【０５７８】
一部の実施形態では、ベクターは、調節エレメントと、標的遺伝子と相同性の核酸配列と、生存細胞内において且つ／又は細胞内分子が標的細胞内に存在するときにリポータ分子の発現を誘発するための様々なリポータ構築物と、を含む。
【０５７９】
リポータ遺伝子は、トランスフェクトされた可能性がある細胞を同定する、及び調節配列の機能性を評価するために使用される。一般に、リポータ遺伝子は、レシピエント生物又は組織に存在しないか、又は発現されない遺伝子であり、その発現が何らかの容易に検出可能な特性、例えば、酵素活性によって現れるポリペプチドをコード化する遺伝子である。リポータ遺伝子の発現は、ＤＮＡがレシピエント細胞内に導入されてから適切な時間後に検定する。好適なリポータ遺伝子としては、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌アルカリホスファターゼをコード化する遺伝子、又は緑色蛍光タンパク質遺伝子を挙げることができる（例えば、Ｕｉ−Ｔｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４７９：７９−８２）。好適な発現系は周知であり、公知の技法を用いて調製してもよいし、又は市販のものを取得することもできる。一般に、最も高レベルのリポータ遺伝子発現を示す最小５’フランキング領域を有する構築物がプロモータとして同定される。こうしたプロモータ領域をリポータ遺伝子に結合させて、プロモータ駆動転写を調節する能力について物質を評価するために使用することができる。
【０５８０】
一部の実施形態では、ベクターは、宿主細胞において実質的に非病原性及び／又は実質的に非統合性であるか、或いは宿主細胞において実質的に非免疫原性である。
【０５８１】
一部の実施形態では、ベクターは、表現型、ウイルスレベル、遺伝子発現、他のウイルス、病態との競合などのうち１つ又は複数を少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、若しくはそれ以上調節するのに十分な量で存在する。
【０５８２】
組成物
本明細書に記載の合成クロン又はベクターはまた、例えば、本明細書に記載する通り、製剤用賦形剤と一緒に医薬組成物に含有させてもよい。一部の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、又は１０１５個の合成クロンを含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、１０５〜１０１５、１０５〜１０１０、又は１０１０〜１０１５個の合成クロンを含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、約１０８（例えば、約１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、又は１０１０）ゲノム当量／ｍＬの合成クロンを含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、例えば、実施例１８の方法に従って決定される場合、１０５〜１０１０、１０６〜１０１０、１０７〜１０１０、１０８〜１０１０、１０９〜１０１０、１０５〜１０６、１０５〜１０７、１０５〜１０８、又は１０５〜１０９ゲノム当量／ｍＬの合成クロンを含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、細胞当たりクロン中に含まれる少なくとも１、２、５、若しくは１０、１００、５００、１０００、２０００、５０００、８，０００、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、又はそれ以上の遺伝子エレメントのコピーを真核細胞の集団に送達する上で十分な合成クロンを含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、細胞当たりクロン中に含まれる少なくとも約１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、又は約１×１０４〜１×１０５、１×１０４〜１×１０６、１×１０４〜１×１０７、１×１０５〜１×１０６、１×１０５〜１×１０７、又は１×１０６〜１×１０７の遺伝子エレメントのコピーを真核細胞の集団に送達する上で十分な合成クロンを含む。
【０５８３】
一部の実施形態では、医薬組成物は、以下の特徴：医薬組成物が、医薬又は適正製造基準（ＧＭＰ）を満たすこと；医薬組成物が、適正製造基準（ＧＭＰ）に従って製造されること；医薬組成物が、予め定めた基準値を下回る病原体レベルを有する、例えば、病原体を実質的に含まないこと；医薬組成物が、予め定めた基準値を下回る混入物レベルを有する、例えば、混入物を実質的に含まないこと；医薬組成物が、低免疫原性を有する、又は例えば、本明細書に記載する通り、実質的に非免疫原性であることのうち１つ又は複数を有する。
【０５８４】
一部の実施形態では、医薬組成物は、閾値量を下回る１又は複数種の混入物を含む。医薬組成物において排除するか、又は最小限に抑えることが望ましい例示的な混入物として、限定はしないが、宿主細胞核酸（例えば、宿主細胞ＤＮＡ及び／又は宿主細胞ＲＮＡ）、動物由来成分（例えば、血清アルブミン若しくはトリプシン）、複製可能ウイルス、非感染性粒子、遊離ウイルスキャプシドタンパク質、外来性汚染生物、及び凝集体が挙げられる。複数の実施形態では、混入物は、宿主細胞ＤＮＡである。複数の実施形態では、組成物は、用量当たり約５００ｎｇ未満の宿主細胞ＤＮＡを含む。複数の実施形態では、医薬組成物は、１０重量％未満（例えば、約１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、若しくは０．１％未満）の混入物からなる。
【０５８５】
一態様では本明細書に記載する本発明は、以下：
ａ）（ｉ）非病原性外部タンパク質をコード化する配列と、（ｉｉ）非病原性外部タンパク質に遺伝子エレメントを結合させる外部タンパク質結合配列と、（ｉｉｉ）調節核酸をコード化する配列；及び
遺伝子エレメントと結合される、例えば、これを包膜する又は閉じ込めるタンパク質性外層を含む遺伝子エレメントを含む合成クロン；並びに
ｂ）製剤用賦形剤
を含む医薬組成物を含む。
【０５８６】
小胞
一部の実施形態では、組成物は、さらに、担体構成体、例えば、マイクロ粒子、リポソーム、小胞、又はエキソソームを含む。一部の実施形態では、リポソームは、内部の水性コンパートメントを取り囲む単一若しくは多重膜脂質二重層と、比較的非透過性の外側親油性リン脂質二重層から構成される球体小胞構造を含む。リポソームは、アニオン性、中性又はカチオン性であってよい。リポソームは、一般に、生体適合性、非毒性であり、親水性及び親油性薬物分子の両方を送達し、それらの積荷を血漿酵素による分解から保護し、生体膜を介してそれらの積荷を輸送することができる（例えば、論文については、Ｓｐｕｃｈ  ａｎｄ  Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ４６９６７９，１２  ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照）。
【０５８７】
小胞は、数種の異なる脂質から製造することができるが；薬物担体としてのリポソームの作製にはリン脂質が最も一般的に使用されている。小胞として、限定はしないが、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＩＭ、ＤＤＡＢ（単独、又はＤＯＴＭＡを得るためにコレステロールと一緒に）、並びにコレステロール、ＤＯＴＡＰとコレステロール、ＤＯＴＩＭとコレステロール、及びＤＤＡＢとコレステロールが挙げられる。多重膜小胞脂質の調製方法は、当技術分野では公知である（例えば、米国特許第６，６９３，０８６号明細書を参照、多重膜小胞脂質調製に関するその教示内容は、参照により本明細書に組み込む）。脂質膜を水溶液と混合すれば、小胞形成は自然に起こり得るが、ホモジナイザー、超音波発生装置、又は押出機を用いて、振盪の形態で力を加えることにより、小胞形成を促進することもできる（例えば、論文については、Ｓｐｕｃｈ  ａｎｄ  Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ４６９６７９，１２  ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照）。押出脂質は、Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，１５：６４７−６５２，１９９７（押出脂質調製に関するその教示内容は、参照により本明細書に組み込む）に記載されている通り、サイズが漸減するフィルターを介した押出により製造することができる。
【０５８８】
本明細書に記載する通り、その構造及び／又は特性を修飾するために、添加物を小胞に添加してもよい。例えば、構造の安定化を助け、内部積荷の漏れを防ぐために、コレステロール又はスフィンゴミエリンのいずれかを混合物に添加することができる。さらに、小胞は、水添卵ホスファチジルコリン若しくは卵ホスファチジルコリン、コレステロール、及びリン酸ジセチルから製造することもできる（例えば、論文については、Ｓｐｕｃｈ  ａｎｄ  Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ４６９６７９，１２  ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照）。また、小胞を合成中又は合成後に表面修飾して、レシピエント細胞上の反応基に相補的な反応基を含有させてもよい。こうした反応基としては、限定しないが、マレイミド基がある。一例として、例えば、限定はしないが、ＤＳＰＥ−ＭａＬ−ＰＥＧ２０００などのマレイミド共役リン脂質を含有するように、小胞を合成してもよい。
【０５８９】
小胞製剤は、主として、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、スフィンゴミエリン、卵ホスファチジルコリン及びモノシアロガングリオシドなどの天然のリン脂質及び脂質から構成され得る。リン脂質のみから構成される製剤は、血漿中で安定性が低い。しかし、コレステロールを用いた脂質膜の操作で、包膜された積荷の急速な放出を抑制するか、又は１，２−ジオレイオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）により安定性を高める（例えば、論文については、Ｓｐｕｃｈ  ａｎｄ  Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ４６９６７９，１２  ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照）。
【０５９０】
複数の実施形態では、脂質を用いて、脂質マイクロ粒子を形成することができる。脂質として、限定はされないが、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ４、Ｃ１２−２００及びコリピドジステロイルホスファチジルコリン、コレステロール、及びＰＥＧ−ＤＭＧが挙げられ、自発的小胞形成手順を用いて製剤化することができる（例えば、Ｎｏｖｏｂｒａｎｔｓｅｖａ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ（２０１２）１，ｅ４；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｎａ．２０１１．３を参照）。構成体モル比は、約５０／１０／３８．５／１．５（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ又はＣ１２−２００／ジステロイルホスファチジルコリン／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ）であってよい。Ｔｅｋｍｉｒａは、米国及び海外で約９５のパテントファミリーのポートフォリオを有し、これらは、多様な態様の脂質マイクロ粒子及び脂質マイクロ粒子製剤に関し（例えば、米国特許第７，９８２，０２７号明細書；同第７，７９９，５６５号明細書；同第８，０５８，０６９号明細書；同第８，２８３，３３３号明細書；同第７，９０１，７０８号明細書；同第７，７４５，６５１号明細書；同第７，８０３，３９７号明細書；同第８，１０１，７４１号明細書；同第８，１８８，２６３号明細書；同第７，９１５，３９９号明細書；同第８，２３６，９４３号明細書及び同第７，８３８，６５８号明細書並びに欧州特許第１７６６０３５号明細書；同第１５１９７１４号明細書；同第１７８１５９３号明細書及び同第１６６４３１６号明細書を参照）、これらは全て、本発明に使用及び／又は適用することができる。
【０５９１】
一部の実施形態では、マイクロ粒子は、ランダムな様式で配置される１つ又は複数の固体ポリマーを含む。マイクロ粒子は生分解性であり得る。生分解性マイクロ粒子は、例えば、限定はされないが、溶媒蒸発、ホットメルトマイクロカプセル化、溶媒除去、及び噴霧乾燥をはじめとする当技術分野で公知の方法を用いて、合成することができる。マイクロカプセルを合成する例示的な方法は、Ｂｅｒｓｈｔｅｙｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｏｆｔ  Ｍａｔｔｅｒ  ４：１７８７−１７８７，２００８及び米国特許出願公開第２００８／００１４１４４  Ａ１号明細書に記載されており、マイクロカプセル合成に関する具体的な教示内容は、参照により本明細書に組み込む。
【０５９２】
生分解性マイクロ粒子を形成するために使用することができる例示的な合成ポリマーとして、限定はしないが、以下のものが挙げられる：脂肪族ポリエステル、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、乳酸及びグリコール酸のコポリマー（ＰＬＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリウレタン、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、及びポリ（ラクチド−コ−カプロラクトン）、並びにアルブミンなどの天然ポリマー、アルギン酸塩、並びにデキストラン及びセルロースなどの他の多糖類、コラーゲン、例えば、アルキル、アルキレンなどの化学基の置換、付加、ヒドロキシル化、酸化、並びに当業者により常用的に実施されるその他の修飾を含むそれらの化学誘導体）、アルブミン及びその他の親水性タンパク質、ゼイン及びその他のプロラミン並びに疎水性タンパク質、それらのコポリマー及び混合物。一般に、これらの材料は、酵素加水分解又は水への曝露、表面又はバルク浸食のいずれかにより分解する。
【０５９３】
マイクロ粒子の直径は、０．１〜１０００マイクロメートル（μｍ）の範囲である。一部の実施形態では、それらの直径は、１〜７５０μｍ、又は５０〜５００μｍ、又は１００〜２５０μｍの範囲のサイズである。一部の実施形態では、それらの直径は、５０〜１０００μｍ、５０〜７５０μｍ、５０〜５００μｍ、又は５０〜２５０μｍの範囲のサイズである。一部の実施形態では、それらの直径は、．０５〜１０００μｍ、１０〜１０００μｍ、１００〜１０００μｍ、又は５００〜１０００μｍの範囲のサイズである。一部の実施形態では、それらの直径は、約０．５μｍ、約１０μｍ、約５０μｍ、約１００μｍ、約２００μｍ、約３００μｍ、約３５０μｍ、約４００μｍ、約４５０μｍ、約５００μｍ、約５５０μｍ、約６００μｍ、約６５０μｍ、約７００μｍ、約７５０μｍ、約８００μｍ、約８５０μｍ、約９００μｍ、約９５０μｍ、又は約１０００μｍである。マイクロ粒子に関して使用される場合、「約」という用語は、記載される絶対値の＋／−５％を意味する。
【０５９４】
一部の実施形態では、リガンドは、粒子の表面に存在する、及び結合させようとするリガンド上に存在する官能化学基（カルボン酸、アルデヒド、アミン、スルフヒドリル及びヒドロキシル）を介してマイクロ粒子の表面に共役させる。例えば、マイクロ粒子のエマルジョン調製工程中に、官能化学基と一緒に安定剤を組み込むことにより、官能基をマイクロ粒子内に導入することが可能である。
【０５９５】
マイクロ粒子に官能基を導入する別の例は、粒子製造後の工程中に、ホモ又はヘテロ官能性架橋剤を用いて、粒子とリガンドを直接架橋することによるものである。この手順では、好適なケミストリー及び１クラスの架橋剤（以下にさらに詳細に述べる通り、ＣＤＩ、ＥＤＡＣ、グルタルアルデヒドなど）又は製造後の粒子の化学修飾によって粒子表面にリガンドを結合させる任意の他の架橋剤を使用してよい。これはまた、脂肪酸、脂質又は官能性安定化剤などの両親媒性分子を粒子表面に受動的に吸着及び付着させ、これにより、リガンドに係留させるための官能性末端基を導入し得るプロセスも含む。
【０５９６】
一部の実施形態では、マイクロ粒子は、特定の細胞又は組織タイプ（例えば、心筋細胞）をターゲティングさせるために、その外側表面に１つ又は複数のターゲティング基を含むように合成してもよい。これらのターゲティング基として、限定はしないが、受容体、リガンド、抗体などが挙げられる。これらのターゲティング基は、細胞表面上のそのパートナーに結合する。一部の実施形態では、細胞表面を含む脂質二重層内にマイクロ粒子を組み込み、ミトコンドリアを細胞に送達する。
【０５９７】
マイクロ粒子はまた、その最も外側表面に脂質二重層を含んでもよい。この二重層は、同じ又は異なるタイプの１つ又は複数の脂質から構成されてもよい。例として、限定はしないが、ホスホコリン及びホスホイノシトールなどのリン脂質が挙げられる。具体的な例として、限定はしないが、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＳＰＣ、並びにリポソーム用に本明細書に記載するものなど、様々な他の脂質が挙げられる。
【０５９８】
一部の実施形態では、担体は、例えば、本明細書に記載の通り、ナノ粒子を含む。
【０５９９】
一部の実施形態では、本明細書に記載する小胞又はマイクロ粒子を診断薬で官能化する。診断薬の例として、限定はされないが、ポジトロン断層法（ＰＥＴ）、コンピュータ断層法（ＣＡＴ）、単光子放射断層撮影、Ｘ線、蛍光分析、及び磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）に使用される市販のイメージング剤；並びに造影剤が挙げられる。ＭＲＩでの造影剤として使用するのに好適な材料の例としては、ガドリニウムキレート、並びに鉄、マグネシウム、マンガン、銅及びクロミウムが挙げられる。
【０６００】
膜貫通ポリペプチド
一部の実施形態では、組成物は、細胞内に、又は膜、例えば、細胞若しくは核膜を通して、構成体を運搬するための膜貫通ポリペプチド（ＭＰＰ）をさらに含む。膜を通した物質の輸送を促進することができる膜貫通ポリペプチドとして、限定はされないが、細胞貫通ペプチド（ＣＰＰ）（例えば、米国特許第８，６，０３，９６６号明細書を参照）、植物細胞内送達のための融合ペプチド（例えば、Ｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２０１６，１１：ｅ０１５４０８１を参照）、タンパク質形質導入ドメイン、Ｔｒｏｊａｎペプチド、及び膜転位シグナル（ＭＴＳ）（例えば、Ｔｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５５：２８１−２９４（２００３）を参照）が挙げられる。いくつかのＭＰＰは、アルギニンなどのアミノ酸が豊富で、陽荷電側鎖を有する。
【０６０１】
膜貫通ポリペプチドは、構成体の膜貫通を誘導する能力を有し、全身投与時に、インビボで複数の組織の細胞内での高分子転位を可能にする。また、膜貫通ポリペプチドは、ペプチドと呼ばれることもあり、これは、適切な条件下で細胞と接触させたとき、外部環境から、細胞質、ミトコンドリアなどのオルガネル、若しくは細胞の核をはじめとする細胞内環境内に、受動拡散で到達する場合よりも有意に高い量で通過する。
【０６０２】
膜を通して輸送される構成体は、膜貫通ポリペプチドと可逆的又は不可逆的に連結し得る。リンカーは、化学結合、例えば、１つ若しくは複数の共有結合又は非共有結合であってよい。一部の実施形態では、リンカーは、ペプチドリンカーである。こうしたリンカーは、２〜３０アミノ酸であるか、又はそれ以上長くてもよい。リンカーとしては、柔軟、硬質又は切断可能リンカーが挙げられる。
【０６０３】
組合せ
一態様では、本明細書に記載する合成クロン又は合成クロンを含む組成物は、さらに１つ又は複数の異種部分を含んでもよい。一態様では、本明細書に記載の合成クロン又は合成クロンを含む組成物はまた、融合物中に１つ又は複数の異種部分を含み得る。一部の実施形態では、異種部分は、遺伝子エレメントと連結されていてもよい。一部の実施形態では、異種部分は、クロンの一部としてタンパク性外層内に閉じ込めてもよい。一部の実施形態では、合成クロンと一緒に異種部分を投与してもよい。
【０６０４】
一態様では、本発明は、合成クロンのいずれか１つと本明細書に記載の異種部分を含む細胞又は組織を含む。
【０６０５】
別の態様では、本発明は、合成クロンと本明細書に記載の異種部分を含む医薬組成物を含む。
【０６０６】
一部の実施形態では、異種部分は、ウイルス（例えば、エフェクター（例えば、薬物、小分子）、ターゲティング剤（例えば、ＤＮＡターゲティング剤、抗体、受容体リガンド）、タグ（例えば、蛍光団、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄなどの感光剤）、又は本明細書に記載の編集若しくはターゲティング部分であってもよい。一部の実施形態では、本発明に記載の膜転位ポリペプチドは、１つ又は複数の異種部分に連結される。一実施形態では、異種部分は、小分子（例えば、ペプチド模倣物又は分子量２０００ダルトン未満の有機小分子）、ペプチド若しくはポリペプチド（例えば、抗体若しくはその抗原結合断片）、ナノ粒子、アプタマー、又は薬物（ｐｈａｒｍａｃｏａｇｅｎｔ）である。
【０６０７】
ウイルス
一部の実施形態では、組成物は、さらに、異種部分としてウイルス、例えば、一本鎖ＤＮＡウイルス、例えば、アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）、ビドナウイルス（Ｂｉｄｎａｖｉｒｕｓ）、サーコウイルス（Ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ）、ジェミニウイルス（Ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｕｓ）、ゲノモウイルス（Ｇｅｎｏｍｏｖｉｒｕｓ）、イノウイルス（Ｉｎｏｖｉｒｕｓ）、ミクロウイルス（Ｍｉｃｒｏｖｉｒｕｓ）、ナノウイルス（Ｎａｎｏｖｉｒｕｓ）、パルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、及びスピラウイルス（Ｓｐｉｒａｖｉｒｕｓ）を含み得る。一部の実施形態では、組成物は、さらに、二本鎖ＤＮＡウイルス、例えば、アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、アンプラウイルス（Ａｍｐｕｌｌａｖｉｒｕｓ）、アスコウイルス（Ａｓｃｏｖｉｒｕｓ）、アスファウイルス（Ａｓｆａｒｖｉｒｕｓ）、バキュロウイルス（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）、フセロウイルス（Ｆｕｓｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）、グロブロウイルス（Ｇｌｏｂｕｌｏｖｉｒｕｓ）、グッタウイルス（Ｇｕｔｔａｖｉｒｕｓ）、ヒトロサウイルス（Ｈｙｔｒｏｓａｖｉｒｕｓ）、ヘルペスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）、イリドウイルス（Ｉｒｉｄｏｖｉｒｕｓ）、リポスリックスウイルス（Ｌｉｐｏｔｈｒｉｘｖｉｒｕｓ）、ニマウイルス（Ｎｉｍａｖｉｒｕｓ）、及びポックスウイルス（Ｐｏｘｖｉｒｕｓ）を含み得る。一部の実施形態では、組成物は、さらに、ＲＮＡウイルス、例えば、アルファウイルス（Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ）、フロウイルス（Ｆｕｒｏｖｉｒｕｓ）、肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、ホルデイウイルス（Ｈｏｒｄｅｉｖｉｒｕｓ）、トバモウイルス（Ｔｏｂａｍｏｖｉｒｕｓ）、トブラウイルス（Ｔｏｂｒａｖｉｒｕｓ）、トリコルナウイルス（Ｔｒｉｃｏｒｎａｖｉｒｕｓ）、ルビウイルス（Ｒｕｂｉｖｉｒｕｓ）、ビルナウイルス（Ｂｉｒｎａｖｉｒｕｓ）、シストウイルス（Ｃｙｓｔｏｖｉｒｕｓ）、パルティティウイルス（Ｐａｒｔｉｔｉｖｉｒｕｓ）、及びレオウイルス（Ｒｅｏｖｉｒｕｓ）を含み得る。一部の実施形態では、クロンは、異種部分としてのウイルスと一緒に投与される。
【０６０８】
一部の実施形態では、異種部分は、非病原性、例えば、共生ウイルス、片利共生ウイルス、ネイティブウイルスを含み得る。一部の実施形態では、非病原性ウイルスは、１若しくは複数種のアネロウイルス、例えば、アルファトルクウイルス属（Ａｌｐｈａｔｏｒｑｕｅｖｉｒｕｓ）（ＴＴ）、ベータトルクウイルス属（Ｂｅｔａｔｏｒｑｕｅｖｉｒｕｓ）（ＴＴＭ）、及びガンマトルクウイルス属（Ｇａｍｍａｔｏｒｑｕｅｖｉｒｕｓ）（ＴＴＭＤ）である。一部の実施形態では、アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）は、トルク・テノウイルス（Ｔｏｒｑｕｅ  Ｔｅｎｏ  Ｖｉｒｕｓ）（ＴＴ）、ＳＥＮウイルス、センチネルウイルス（Ｓｅｎｔｉｎｅｌ  ｖｉｒｕｓ）、ＴＴＶ様ミニウイルス、ＴＴウイルス、ＴＴウイルス遺伝子型６、ＴＴウイルス群、ＴＴＶ様ウイルスＤＸＬ１、ＴＴＶ様ウイルスＤＸＬ２、トルク・テノ様ミニウイルス（Ｔｏｒｑｕｅ  Ｔｅｎｏ−ｌｉｋｅ  Ｍｉｎｉ  Ｖｉｒｕｓ）（ＴＴＭ）、又はトルク・テノ様ミディウイルス（Ｔｏｒｑｕｅ  Ｔｅｎｏ−ｌｉｋｅ  Ｍｉｄｉ  Ｖｉｒｕｓ）（ＴＴＭＤ）を含み得る。一部の実施形態では、非病原性ウイルスは、本明細書において、例えば、表１９又は表２０に記載のヌクレオチド配列のいずれか１つに対して少なくとも少なくとも約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％及び９９％のヌクレオチド配列同一性を有する１つ若しくは複数の配列を含む。
【０６０９】
一部の実施形態では、異種部分は、被験者に欠失するものとして同定される１又は複数種のウイルスを含んでもよい。例えば、ディビロシス（ｄｙｖｉｒｏｓｉｓ）を有するとして識別された被験者に、クロンを含む組成物と、被験者において不均衡であるか、又は基準値、例えば健常な被験者とは異なる比率を有する１又は複数種のウイルス組成物若しくはウイルスとを投与することができる。
【０６１０】
一部の実施形態では、異種部分は、１又は複数種の非アネロウイルス、例えば、アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、ヘルペスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）、ポックスウイルス（Ｐｏｘｖｉｒｕｓ）、ワクシニアウイルス（Ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ）、ＳＶ４０、パピローマウイルス（ｐａｐｉｌｌｏｍａ  ｖｉｒｕｓ）、レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）、例えば、レンチウイルス（ｌｅｎｔｉ  ｖｉｒｕｓ）などのＲＮＡウイルス、一本鎖ＲＮＡウイルス、例えば、肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、又は二本鎖ＤＮＡウイルス、例えば、ロタウイルス（ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）を含み得る。一部の実施形態では、クロン又はウイルスは、欠損しているか、又は感染性粒子を産生するために補助を必要とする。こうした補助は、例えば、ＬＴＲ内で調節配列の制御下、複製欠損クロン若しくはウイルスの構造遺伝子の１つ又は複数（例えば、全て）をコード化する核酸、例えば、ゲノムに組み込まれたプラスミド若しくはＤＮＡを含むヘルパー細胞を用いることによって提供することができる。本明細書に記載のクロンを複製するために好適な細胞株としては、当技術分野で公知の細胞株、例えば、Ａ５４９細胞があり、これは、本明細書に記載されるように修飾することができる。
【０６１１】
エフェクター
一部の実施形態では、組成物又は合成クロンは、エフェクター活性を有するエフェクターをさらに含んでもよい。エフェクターは、生物活性を調節する、例えば、酵素活性、遺伝子発現、細胞シグナル伝達、及び細胞若しくは器官機能を増大又は低減することができる。エフェクター活性はまた、転写又は翻訳などの調節因子の活性を調節するために結合調節タンパク質を含んでもよい。エフェクター活性はさらに、アクチベータ又は阻害剤機能も含み得る。例えば、エフェクターは、酵素の基質親和性増大をトリガーすることにより、酵素活性を誘導することができ、例えば、フルクトース２，６−ビスリン酸は、ホスホフルクトキナーゼ１を活性化して、インスリンに応答して解糖速度を高める。別の例では、エフェクターは、受容体に対する基質の結合を阻害して、その活性化を阻害することができ、例えば、ナルトレキソン及びナロキソンは、オピオイド受容体に、それらを活性化することなく結合して、これらの受容体がオピオイドに結合する能力を阻止する。エフェクター活性はまた、タンパク質安定性／分解及び／又は転写物安定性／分解の調節も含み得る。例えば、タンパク質は、分解の目的でそれらをマーキングするタンパク質上の、ポリペプチド補因子、ユビキチンにより、分解の目的でターゲティングされ得る。別の例では、エフェクターは、酵素の活性部位を遮断することにより、酵素活性を阻害し、例えば、メトトレキサートは、テトラヒドロ葉酸の構造類似体、すなわち、天然基質の１０００倍超強度にジヒドロ葉酸レダクターゼに結合して、ヌクレオチド塩基合成を阻害する酵素ジヒドロ葉酸レダクターゼの補酵素である。
【０６１２】
ターゲティング部分
一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物又は合成クロンは、さらに、ターゲティング部分、例えば、標的細胞上に存在する目的の分子に特異的に結合するターゲティング部分を含み得る。ターゲティング部分は、目的の分子又は細胞の特定の機能を調節し、特定の分子（例えば、酵素、タンパク質若しくは核酸）、例えば、経路内の目的の分子の下流の特定の分子を調節する、又は標的に特異的に結合して、クロン若しくは遺伝子エレメントを局在化することができる。例えば、ターゲティング部分は、目的の特定の分子と相互作用して、その機能を増大、低減、又はそうでなければ調節する治療薬を含み得る。
【０６１３】
タグ付け又はモニタリング部分
一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物又は合成クロンは、さらに、本明細書に記載の組成物又は合成クロンを標識若しくはモニターするためのタグを含み得る。タグ付け又はモニタリング部分は、化学物質又は酵素切断、例えば、タンパク質分解若しくはインテインスプライシングにより除去可能であってもよい。アフィニティタグは、アフィニティ技術を用いてタグ付けされたポリペプチドを精製するのに有用となり得る。いくつかの例として、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、及びポリ（Ｈｉｓ）タグが挙げられる。可溶化タグは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などのシャペロン欠失種に発現される組換えタンパク質が、タンパク質の適正な折り畳みを補助し、それらが沈殿するのを防ぐのを助ける上で有用となり得る。いくつかの例として、チオレドキシン（ＴＲＸ）及びポリ（ＮＡＮＰ）が挙げられる。タグ付け又はモニタリング部分は、感光性タグ、例えば、蛍光を含んでもよい。蛍光タグは、視覚化に有用である。ＧＦＰ及びその変異体が、蛍光タグとして一般に用いられるいくつかの例である。タンパク質タグは、特定の酵素修飾（ビオチンリガーゼによるビオチン化など）又は化学修飾（蛍光イメージングのためのＦｌＡｓＨ−ＥＤＴ２との反応など）を起こすことが可能である。タグ付け又はモニタリング部分は、タンパク質を複数の他の構成体とつなげるために、結合させることが多い。タグ付け又はモニタリング部分は、また、特定のタンパク質分解又は酵素切断（例えば、ＴＥＶプロテアーゼ、トロンビン、Ｘａ因子又はエンテロペプチダーゼによる）によって除去することもできる。
【０６１４】
ナノ粒子
一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物又は合成クロンは、さらに、ナノ粒子を含み得る。ナノ粒子としては、約１〜約１０００ナノメートル、約１〜約５００ナノメートル、約１〜約１００ｎｍ、約５０〜約３００ｎｍ、約７５〜約２００ｎｍ、及び約１００〜約２００ｎｍ、並びにこれらの間の任意の範囲のサイズを有する無機材料が挙げられる。ナノ粒子は、一般に、ナノ単位の寸法の複合構造を有する。一部の実施形態では、ナノ粒子は、典型的に球体であるが、ナノ粒子組成物に応じて様々な形態が可能である。ナノ粒子に対して外部の環境と接触するナノ粒子の部分は、一般に、ナノ粒子の表面として識別される。本明細書に記載するナノ粒子の場合、サイズ制限を２つの寸法に限定することができ、そのため、ナノ粒子は、約１〜約１０００ｎｍの直径を有する複合構造を含み、ここで、具体的な直径は、ナノ粒子組成物及び実験設計に従うナノ粒子の意図される使用に応じて変わる。例えば、治療用途に使用されるナノ粒子は、典型的に、約２００ｎｍ以下のサイズを有する。
【０６１５】
表面電荷及び立体安定化といったナノ粒子の追加的な望ましい特性も、意図される具体的な用途を考慮して変わり得る。臨床用途に望ましいと考えられる例示的な特性は、Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ２００８  ｖｏｌ．７，ｐａｇｅｓ７７１−７８２；Ｄｕｎｃａｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２００６  ｖｏｌ．６，ｐａｇｅｓ  ６８８−７０１；及びＡｌｌｅｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２００２  ｖｏｌ．２  ｐａｇｅｓ７５０−７６３に記載されており、これらの各々は、全体を参照により本明細書に組み込む。追加特性は、当業者が、本開示を読んで確認することができる。ナノ粒子の寸法及び特性を検出するための例示的な技術として、限定はされないが、動的光散乱法（ＤＬＳ）並びに透過型電子顕微鏡検査（ＴＥＭ）及び原子間力顕微鏡検査（ＡＦＭ）などの種々の顕微鏡検査が挙げられる。粒子形態を検出するための例示的な技術として、限定はされないが、ＴＥＭ及びＡＦＭが挙げられる。ナノ粒子の表面電荷を検出するための例示的な技術として、限定はされないが、ゼータ電位法がある。他の化学的特性を検出するための別の技術は、１Ｈ、１１Ｂ、及び１３Ｃ及び１９ＦＮＭＲによるもの、ＵＶ／Ｖｉｓ及び赤外／ラマン分光法及び蛍光分光法（ナノ粒子を蛍光標識と組み合わせて使用する場合）、並びに当業者により確認可能なそれ以外の技術を含む。
【０６１６】
小分子
一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物又は合成クロンは、さらに、小分子を含み得る。小分子として、限定はされないが、概して、モル当たり約５，０００グラム未満の分子量を有する、低分子ペプチド、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド）、アミノ酸、アミノ酸類似体、合成ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、有機及び無機化合物（ヘテロ有機及び有機金属化合物を含む）、例えば、モル当たり約２，０００グラム未満の分子量を有する有機又は無機化合物、例えば、モル当たり約１，０００グラム未満の分子量を有する有機又は無機化合物、例えば、モル当たり約５００グラム未満の分子量を有する有機又は無機化合物、並びにこうした化合物の塩、エステル、及び他の薬学的に許容される形態が挙げられる。小分子は、限定はされないが、神経伝達物質、ホルモン、薬物、毒素、ウイルス若しくは微生物粒子、合成分子、及びアゴニスト又はアンタゴニストを含み得る。
【０６１７】
好適な分子の例は、以下：“Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，”  Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，（１９９６），Ｎｉｎｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  ｓｅｃｔｉｏｎｓ：Ｄｒｕｇｓ  Ａｃｔｉｎｇ  ａｔ  Ｓｙｎａｐｔｉｃ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｓｉｔｅｓ；Ｄｒｕｇｓ  Ａｃｔｉｎｇ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｎｅｒｖｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ；Ａｕｔａｃｏｉｄｓ：Ｄｒｕｇ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ；Ｗａｔｅｒ，Ｓａｌｔｓ  ａｎｄ  Ｉｏｎｓ；Ｄｒｕｇｓ  Ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  Ｒｅｎａｌ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ；Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｄｒｕｇｓ；Ｄｒｕｇｓ  Ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ；Ｄｒｕｇｓ  Ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  Ｕｔｅｒｉｎｅ  Ｍｏｔｉｌｉｔｙ；Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｐａｒａｓｉｔｉｃ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ；Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ；Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ；Ｄｒｕｇｓ  Ｕｓｅｄ  ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ；Ｄｒｕｇｓ  Ａｃｔｉｎｇ  ｏｎ  Ｂｌｏｏｄ−Ｆｏｒｍｉｎｇ  ｏｒｇａｎｓ；Ｈｏｒｍｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ；Ｖｉｔａｍｉｎｓ，Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ；及びＴｏｘｉｃｏｌｏｇｙ（全て、参照により本明細書に組み込む）に記載されるものが挙げられる。小分子のいくつかの例として、限定はされないが、タクロリムスなどのプリオン薬、ユビキチンリガーゼ又はヘクリンなどのＨＥＣＴリガーゼ阻害剤、酪酸ナトリウムなどのヒストン修飾薬、５−アザ−シチジンなどの酵素阻害剤、ドキソルビシンなどのアントラサイクリン、ペニシリンなどのβラクタム、抗菌剤、化学療法薬、抗ウイルス剤、ＶＰ６４などの他の生物からのモジュレータ、並びに薬物動態欠損を有する化学療法薬など、バイオアベイラビリティが不十分な薬物が挙げられる。
【０６１８】
一部の実施形態では、小分子は、エピジェネティック修飾剤、例えば、ｄｅ  Ｇｒｏｏｔｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（２０１２）：１−１８に記載されるものなどである。例示的な小分子エピジェネティック修飾剤は、Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  １７．５（２０１２）：５５５−７１、例えば、表１又は２に記載されており、これは、参照により本明細書に組み込む。一部の実施形態では、エピジェネティック修飾剤は、ボリノスタット又はロミデプシンを含む。一部の実施形態では、エピジェネティック修飾剤は、クラスＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、及び／又はＩＶヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）の阻害剤を含む。一部の実施形態では、エピジェネティック修飾剤は、ＳｉｒＴＩのアクチベータを含む。一部の実施形態では、エピジェネティック修飾剤は、ガルシノール、Ｌｙｓ−ＣｏＡ、Ｃ６４６、（＋）−ＪＱＩ、Ｉ−ＢＥＴ、ＢＩＣＩ、ＭＳ１２０、ＤＺＮｅｐ、ＵＮＣ０３２１、ＥＰＺ００４７７７、ＡＺ５０５、ＡＭＩ−Ｉ、ピラゾールアミド７ｂ、ベンゾ［ｄ］イミダゾール１７ｂ、アシル化ダプソン誘導体（例えば、ＰＲＭＴＩ）、メチルスタット、４，４’−ジカルボキシ−２，２’−ビピリジン、ＳＩＤ８５７３６３３１、ヒドロキサム酸塩類似体８、トラニルシプロミン（ｔａｎｙｌｃｙｐｒｏｍｉｅ）、ビスグアニジン及びビグアニドポリアミン類似体、ＵＮＣ６６９、ビダザ、デシタビン、フェニル酪酸ナトリウム（ＳＤＢ）、リポ酸（ＬＡ）、ケルセチン、バルプロ酸、ヒドラジン、バクトリム、緑茶エキス（例えば、没食子酸エピガロカテキン（ＥＧＣＧ））、クルクミン、スルホルファン及び／又はアリシン／ジアリルジスルフィドを含む。一部の実施形態では、エピジェネティック修飾剤は、ＤＮＡメチル化を阻害し、例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの阻害剤（例えば、５−アザシチジン及び／又はデシタビン）である。一部の実施形態では、エピジェネティック修飾剤は、ヒストン修飾、例えば、ヒストンアセチル化、ヒストンメチル化、ヒストンスモイル化、及び／又はヒストンリン酸化を修飾する。一部の実施形態では、エピジェネティック修飾剤は、ヒストンデアセチラーゼの阻害剤である（例えば、ボリノスタット及び／又はトリコスタチンＡである）。
【０６１９】
一部の実施形態では、小分子は、薬学的に有効な薬剤である。一実施形態では、小分子は、代謝活性又は成分の阻害剤である。有用なクラスの薬学的に有効な薬剤として、限定はされないが、抗生物質、抗炎症薬、血管新生又は血管作用剤、成長因子及び化学療法（抗腫瘍）薬（例えば、腫瘍抑制剤）が挙げられる。本明細書に記載のカテゴリー及び例から、又は（Ｏｒｍｅ−Ｊｏｈｎｓｏｎ  ２００７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００７；８０：８１３−２６）からの分子の１つ又は組合せを使用することができる。一実施形態では、本発明は、抗生物質、抗炎症薬、血管新生又は血管作用剤、成長因子又は化学療法薬を含む組成物を含む。
【０６２０】
ペプチド又はタンパク質
一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物又は合成クロンは、さらに、ペプチド又はタンパク質を含み得る。ペプチド部分として、限定はされないが、ペプチドリガンド又は抗体フラグメント（例えば、細胞外受容体などの受容体に結合する抗体フラグメント）、神経ペプチド、ホルモンペプチド、ペプチド薬、有毒ペプチド、ウイルス若しくは微生物ペプチド、合成ペプチド、及びアゴニスト若しくはアンタゴニストペプチドを挙げることができる。
【０６２１】
ペプチド部分は、直鎖状又は分岐状であってよい。ペプチドは、約５〜約２００アミノ酸、約１５〜約１５０アミノ酸、約２０〜約１２５アミノ酸、約２５〜約１００アミノ酸、又はこれらの間の任意の範囲の長さを有する。
【０６２２】
ペプチドのいくつかの例として、限定はされないが、蛍光タグ若しくはマーカ、抗原、単一ドメイン抗体などの抗体フラグメント、リガンド及び受容体、例えば、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、ＧＬＰ−２受容体２、コレシストキニンＢ（ＣＣＫＢ）及びソマトスタチン受容体など、ペプチド治療薬、例えば、Ｇタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）若しくはイオンチャネルなどの特定の細胞表面受容体に結合するものなど、天然の生物活性ペプチドからの合成若しくはアナログペプチド、抗微生物ペプチド、孔形成ペプチド、腫瘍ターゲティング若しくは細胞傷害性ペプチド、分解若しくは自滅ペプチド、例えば、アポトーシス誘導ペプチドシグナル又は光増感剤ペプチドが挙げられる。
【０６２３】
本明細書に記載の本発明に有用なペプチドはまた、小分子結合ペプチド、例えば、抗原結合抗体又は抗体様フラグメント、例えば、一本鎖抗体、ナノボディなども含む（例えば、Ｓｔｅｅｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．２０１６．Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ  ａｓ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：ｂｉｇ  ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ  ｆｏｒ  ｓｍａｌｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ：２１（７）：１０７６−１１３を参照）。こうした低分子抗原結合ペプチドは、サイトゾル抗原、核抗原、オルガネラ内抗原に結合することができる。
【０６２４】
一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物又はクロンは、特定の位置、組織、又は細胞をターゲティングすることができるリガンドに連結したポリペプチドを含む。
【０６２５】
オリゴヌクレオチドアプタマー
一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物又は合成クロンは、さらに、オリゴヌクレオチドアプタマーを含み得る。アプタマー部分は、オリゴヌクレオチド又はペプチドアプタマーである。オリゴヌクレオチドアプタマーは、一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ（ｓｓＤＮＡ又はｓｓＲＮＡ）分子であり、これらは、タンパク質及びペプチドをはじめとする予め選択した標的に、高い親和性及び特異性で結合することができる。
【０６２６】
オリゴヌクレオチドアプタマーは、核酸種であり、これらは、小分子、タンパク質、核酸などの種々の分子標的に、さらには細胞、組織及び生物にも結合するように、反復ラウンドのインビトロ選択又は同様に、ＳＥＬＥＸ（指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化）により操作することができる。アプタマーは、明確な分子認識を提供し、化学合成により生成することができる。加えて、アプタマーは、望ましい保存特性を有し、治療用途では免疫原性をほとんど、又は全く誘発しないであろう。
【０６２７】
ＤＮＡ及びＲＮＡアプタマーはいずれも、様々な標的に対して頑健な結合親和性を示すことができる。例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡアプタマーは、ｔリゾチーム、トロンビン、ヒト免疫不全ウイルストランス作用応答性エレメント（ＨＩＶ  ＴＡＲ）（ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ａｐｔａｍｅｒ  −  ｃｉｔｅ＿ｎｏｔｅ−１０を参照）、ヘミン、インターフェロンγ、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ドーパミン、及び非古典的オンコジーン、熱ショック因子１（ＨＳＦ１）について選択されている。
【０６２８】
ペプチドアプタマー
一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物又は合成クロンは、さらに、ペプチドアプタマーを含み得る。ペプチドアプタマーは、低分子量、１２〜１４ｋＤａのペプチドを含め、１つ（又は複数の）短い可変ペプチドドメインを有する。ペプチドアプタマーは、細胞内のタンパク質−タンパク質相互作用に特異的に結合し、それを阻害するように、設計することができる。
【０６２９】
ペプチドアプタマーは、特定の標的分子に結合するように、選択又は操作された人工タンパク質である。これらのタンパク質は、可変配列の１つ又は複数のペプチドループを含む。これらは、典型的に、コンビナトリアルライブラリから単離された後、往々にして、指定突然変異又は複数ラウンドの可変領域突然変異誘発及び選択によって改善される。インビボで、ペプチドアプタマーは、細胞タンパク質標的に結合して、生物学的作用を及ぼすことができ、こうしたものとして、その標的分子と他のタンパク質との正常なタンパク質相互作用の妨害がある。具体的には、転写因子結合ドメインに結合した可変ペプチドアプタマーループを、転写因子活性化ドメインに結合した標的タンパク質に対してスクリーニングする。この選択戦略によるペプチドアプタマーとその標的とのインビボ結合は、下流の酵母マーカ遺伝子の発現として検出される。こうした実験によって、アプタマーにより結合される特定のタンパク質、並びにアプタマーが破壊するタンパク質相互作用を見出して、表現型を生じさせる。加えて、適切な官能部分で誘導体化したペプチドアプタマーは、それらの標的タンパク質の特定の翻訳後修飾を引き起こすか、又は標的の細胞内局在化を変化させることができる。
【０６３０】
ペプチドアプタマーは、インビトロで標的を認識することもできる。これらは、バイオセンサー中の抗体に代わって有用であることが見出され、不活性及び活性タンパク質形態の両方を含有する集団からタンパク質の活性イソ型を検出するために使用されている。タッドポールとして知られる誘導体は、ペプチドアプタマーの「頭部」が、ユニーク配列二本鎖ＤＮＡ「テール」に共有結合されており、それらのＤＮＡテールのＰＣＲ（例えば、定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を用いて）によって混合物中の乏しい標的分子の定量を可能にする。
【０６３１】
ペプチドアプタマー選択は、様々なシステムを用いて行うことができるが、現在最も使用されているのは、酵母２−ハイブリッドシステムである。ペプチドアプタマーはまた、ファージディスプレイ並びにｍＲＮＡディスプレイ、リボソームディスプレイ、細菌ディスプレイ及び酵母ディスプレイなどの他の表面ディスプレイ技術により構築されたコンビナトリアルペプチドライブラリーから選択することもできる。これらの実験手順はまた、バイオパニングとしても知られる。バイオパニングから得られるペプチドの中でも、ミモトープは、１種のペプチドアプタマーとみなすことができる。コンビナトリアルペプチドライブラリーからパニングされた全てのペプチドは、ＭｉｍｏＤＢという名称の特定のデータベースに保存されている。
【０６３２】
宿主
本発明はさらに、本明細書に記載の合成クロンを含む宿主又は宿主細胞に関する。一部の実施形態では、宿主又は宿主細胞は、植物、昆虫、細菌、真菌、脊椎動物、哺乳動物（例えば、ヒト）、又はその他の生物若しくは細胞である。いくつかの実施形態では、本明細書で確認される通り、提供されるクロンは、多種多様な宿主細胞に感染する。標的宿主細胞は、中胚葉、内胚葉、又は外胚葉由来の細胞を含む。標的宿主細胞として、例えば、上皮細胞、筋肉細胞、白血球（例えば、リンパ球）、腎組織細胞、肺組織細胞が挙げられる。
【０６３３】
一部の実施形態では、クロンは、宿主において実質的に非免疫原性である。クロン又は遺伝子エレメントは、宿主の免疫系による不要の実質的な応答を生成することができない。いくつかの免疫応答として、限定はされないが、体液性免疫応答（例えば、抗原特異的抗体の産生）及び細胞性免疫応答（例えば、リンパ球増殖）が挙げられる。
【０６３４】
一部の実施形態では、宿主又は宿主細胞を合成クロンと接触（例えば、合成クロンに感染）させる。一部の実施形態では、宿主は、哺乳動物、例えば、ヒトである。宿主におけるクロンの量は、投与後の任意の時点で測定することができる。いくつかの実施形態では、培養物中のクロン増殖の経過時間を測定する。
【０６３５】
一部の実施形態では、クロン、例えば、本明細書に記載のクロンは、遺伝性である。一部の実施形態では、クロンは、体液及び／又は細胞中で母から子に線形伝達される。一部の実施形態では、元の宿主細胞由来の娘細胞は、クロンを含む。一部の実施形態において、母は子に、少なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の効率で、又は宿主細胞から娘細胞に、少なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の伝達効率で、クロンを伝達する。一部の実施形態では、宿主細胞中のクロンは、減数分裂中に、２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の伝達効率を有する。一部の実施形態では、宿主細胞中のクロンは、有糸分裂中に、２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の伝達効率を有する。一部の実施形態では、細胞中のクロンは、約１０％〜２０％、２０％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、又はこれらの間の任意のパーセンテージの伝達効率を有する。
【０６３６】
一部の実施形態では、クロン、例えば、合成クロンは、宿主細胞内で複製する。一実施形態では、合成クロンは、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞において複製することができる。
【０６３７】
一部の実施形態では、合成クロンは、宿主細胞において複製するが、合成クロンは、宿主のゲノム中に、例えば、宿主の染色体と統合しない。一部の実施形態では、合成クロンは、例えば、宿主の染色体と、無視できる程度の組換え頻度を有する。一部の実施形態では、クロンは、例えば、宿主の染色体と、例えば、約１．０ｃＭ／Ｍｂ、０．９ｃＭ／Ｍｂ、０．８ｃＭ／Ｍｂ、０．７ｃＭ／Ｍｂ、０．６ｃＭ／Ｍｂ、０．５ｃＭ／Ｍｂ、０．４ｃＭ／Ｍｂ、０．３ｃＭ／Ｍｂ、０．２ｃＭ／Ｍｂ、０．１ｃＭ／Ｍ未満、又はそれ以下の組換え頻度を有する。
【０６３８】
使用方法
本明細書に記載の合成クロン及び合成クロンを含む組成物は、例えば、それを必要とする被験者（例えば、哺乳動物被験者、例えば、ヒト被験者）の疾患、障害、又は状態を治療する方法に用いることができる。本明細書に記載の医薬組成物の投与は、例えば、非経口（静脈内、腫瘍内、腹腔内、筋肉内、体腔内、及び皮下を含む）投与により実施してよい。合成クロンは、単独で投与してもよいし、又は医薬組成物として製剤化してもよい。
【０６３９】
合成クロンは、単位用量非経口組成物などの単位用量組成物の形態で投与してもよい。こうした組成物は、一般に、混合により調製した後、非経口投与のために好適に適合させることができる。こうした組成物は、例えば、注射液及び注入液若しくは懸濁液又は座薬又はエアゾールの形態であってもよい。
【０６４０】
一部の実施形態では、合成クロン又は例えば、本明細書に記載する通り、これを含む組成物の投与により、例えば、被験者の標的細胞に対して、合成クロンに含まれる遺伝子エレメントの送達を達成することができる。
【０６４１】
例えば、外性エフェクター若しくはペイロードを含む、本明細書に記載の合成クロン又はその組成物は、細胞、組織、又は被験者に外性エフェクター若しくはペイロードを送達するために使用することができる。一部の実施形態では、合成クロン又はその組成物を用いて、骨髄、血液、心臓、胃腸又は皮膚に外性エフェクター若しくはペイロードを送達する。本明細書に記載の合成クロン組成物の投与による外性エフェクター若しくはペイロードの送達によって、細胞、組織、又は被験者におけるノンコーディングＲＮＡ又はポリペプチドの発現レベルを調節（例えば、増大若しくは低減）することができる。この様式での発現レベルの調節は、外性エフェクター又はペイロードが送達される細胞の機能活性の改変をもたらし得る。一部の実施形態では、調節される機能活性は、天然の酵素、構造、又は調節活性であってよい。
【０６４２】
一部の実施形態では、合成クロン、又はそのコピーは、細胞内への送達から２４時間（例えば、１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間、４週間、３０日、又は１ヵ月）後に細胞内で検出可能である。複数の実施形態では、合成クロン又はその組成物は、標的細胞に対する作用を媒介し、その作用は、少なくとも１、２、３、４、５、６、若しくは７日、２、３、若しくは４週間、又は１、２、３、６、若しくは１２ヵ月間持続する。一部の実施形態（例えば、合成クロン又はその組成物が、外性タンパク質をコード化する遺伝子エレメントを含む）では、作用は、１、２、３、４、５、６、若しくは７日、２、３、若しくは４週間、又は１、２、３、６、若しくは１２ヵ月間未満持続する。
【０６４３】
本明細書に記載の合成クロン、又は合成クロンを含む組成物を用いて治療することができる疾患、障害、及び状態の例として、限定はしないが、以下：免疫障害、インターフェロン症（例えば、Ｉ型インターフェロン症）、感染症、炎症性障害、自己免疫疾患、癌（例えば、固形腫瘍、例えば肺癌、非小細胞肺癌、例えば、ｍＩＲ−６２５、例えば、カスパーゼ−３に対して応答性の遺伝子を発現する腫瘍）、及び胃腸障害が挙げられる。一部の実施形態では、合成クロンは、クロンを接触させた細胞の活性又は機能を調節（例えば、増大若しくは低減）する。一部の実施形態では、合成クロンは、クロンを接触させた細胞中の分子（例えば、核酸若しくはタンパク質）のレベル又は活性を調節（例えば、増大若しくは低減）する。一部の実施形態では、合成クロンは、クロンを接触させた細胞、例えば、癌細胞の生存能を例えば、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又はそれ以上低減する。一部の実施形態では、合成クロンは、エフェクター、例えば、ｍｉＲＮＡ、例えば、ｍｉＲ−６２５を含み、これは、クロンを接触させた細胞、例えば、癌細胞の生存能を例えば、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又はそれ以上低減する。一部の実施形態では、合成クロンは、クロンを接触させた細胞、例えば、癌細胞のアポトーシスを、例えば、カスパーゼ−３活性を増大することにより、例えば、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又はそれ以上増大する。一部の実施形態では、合成クロンは、エフェクター、例えば、ｍｉＲＮＡ、例えば、ｍｉＲ−６２５を含み、これは、クロンを接触させた細胞、例えば、癌細胞のアポトーシスを例えば、カスパーゼ−３活性を増大することにより、例えば、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又はそれ以上増大する。
【０６４４】
さらなるクロン実施形態
一態様では、本発明は、以下：（ｉ）非病原性外部タンパク質をコード化する配列と、（ｉｉ）遺伝子エレメントを非病原性外部タンパク質に結合させる外部タンパク質結合配列と、（ｉｉｉ）エフェクター、例えば、調節核酸をコード化する配列と、を含む遺伝子エレメント；及び遺伝子エレメントと結合している、例えば、これを包膜する、又は閉じ込めるタンパク性外層を含む合成クロンを包含する。
【０６４５】
一態様では、本発明は、以下：ａ）（ｉ）非病原性外部タンパク質をコード化する配列と、（ｉｉ）遺伝子エレメントを非病原性外部タンパク質に結合させる外部タンパク質結合配列と、（ｉｉｉ）エフェクター、例えば、調節核酸をコード化する配列と、を含む遺伝子エレメント；及び遺伝子エレメントと結合している、例えば、これを包膜する、又は閉じ込めるタンパク性外層を含むクロン；並びにｂ）製剤用賦形剤を含む医薬組成物を包含する。
【０６４６】
本明細書に描く本発明の様々な態様において、本明細書に記載する様々な実施形態の１つ又は複数を組み合わせてもよい。
【０６４７】
一部の実施形態では、本明細書に記載するクロン又は組成物は、以下の特徴：遺伝子エレメントが、一本鎖ＤＮＡであること；遺伝子エレメントが、環状であること；クロンが、非統合性であること；クロンが、アネロウイルス又は他の非病原性ウイルスに基づく配列、構造及び／又は機能を有すること、並びにクロンが、非病原性であることのうち少なくとも１つをさらに含む。
【０６４８】
一部の実施形態では、タンパク性外層は、非病原性外部タンパク質を含む。一態様では、タンパク性外層は、以下：１つ若しくは複数のグリコシル化タンパク質、親水性ＤＮＡ−結合領域、アルギニンリッチ領域、トレオニンリッチ領域、グルタミンリッチ領域、Ｎ−末端ポリアルギニン配列、可変領域、Ｃ−末端ポリグルタミン／グルタミン酸配列、及び１つ若しくは複数のジスルフィド架橋のうち１つ又は複数を含む。一態様では、タンパク性外層は、以下の特徴：正二十面体対称、１つ若しくは複数の宿主細胞と相互作用して、宿主細胞内への進入を媒介する分子の認識及び／若しくはそれとの結合、脂質分子の欠失、炭水化物の欠失、ｐＨ及び温度安定性、界面活性剤抵抗性、及び宿主細胞における非免疫原性若しくは非病原性のうち１つ又は複数を含む。例えば、本明細書に提供するデータによって、提供されるクロンが感染性であることが確認される。
【０６４９】
一部の実施形態では、非病原性外部タンパク質をコード化する配列は、表１５に挙げる１つ若しくは複数の配列又はその断片に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一の配列を含む。一部の実施形態では、非病原性外部タンパク質は、表１６又は表１７に挙げる１つ若しくは複数の配列又はその断片に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一の配列を含む。一部の実施形態では、非病原性外部タンパク質は、１つ若しくは複数の機能、例えば、種及び／若しくは組織及び／若しくは細胞指向性、ウイルスゲノム結合及び／若しくはパッケージング、免疫回避（非免疫原性及び／若しくは寛容性）、薬物動態、エンドサイトーシス及び／若しくは細胞接着、核内進入、細胞内調節及び局在化、エキソサイトーシス調節、増殖、並びに核酸保護を提供する少なくとも１つの機能性ドメインを含む。
【０６５０】
一部の実施形態では、エフェクターは、調節核酸、例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｇＲＮＡ；治療薬、例えば、蛍光タグ若しくはマーカ、抗原、ペプチド治療薬、天然の生物活性ペプチド由来の合成若しくはアナログペプチド、アゴニスト若しくはアンタゴニストペプチド、抗微生物ペプチド、孔形成ペプチド、二環式ペプチド、ターゲティング若しくは細胞傷害性ペプチド、分解若しくは自滅ペプチド、及び複数の分解若しくは自滅ペプチド、小分子、免疫エフェクター（例えば、免疫応答／シグナルに対する感受性に影響を与える）、細胞死誘導タンパク質（例えば、アポトーシス若しくは壊死の誘導物質）、腫瘍の非溶解性阻害剤（例えば、癌タンパク質の阻害剤）、後成的修飾因子、後成的酵素、転写因子、ＤＮＡ若しくはタンパク質修飾酵素、ＤＮＡ挿入剤、排出ポンプ阻害剤、核受容体アクチベータ若しくは阻害剤、プロテアソーム阻害剤、酵素の競合阻害剤、タンパク質合成エフェクター若しくは阻害剤、ヌクレアーゼ、タンパク質断片若しくはドメイン、リガンド若しくは受容体、並びにＣＲＩＳＰＲ系若しくは構成体を含む。一部の実施形態では、エフェクターは、表１８に挙げる１つ若しくは複数のｍｉＲＮＡ配列に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一の配列を含む。一部の実施形態では、エフェクター、例えば、ｍｉＲＮＡは、宿主遺伝子をターゲティングし、例えば、遺伝子の発現を調節する。
【０６５１】
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、以下の配列：１つ若しくは複数のｍｉＲＮＡをコード化する配列、１つ若しくは複数の複製タンパク質をコード化する配列、外性遺伝子をコード化する配列、治療薬をコード化する配列、調節配列（例えば、プロモータ、エンハンサー）、内在性遺伝子（ｓｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）をターゲティングする１つ若しくは複数の調節配列をコード化する配列、治療用ｍＲＮＡ若しくはタンパク質をコード化する配列、並びに細胞溶解性及び／若しくは細胞傷害性ＲＮＡ若しくはタンパク質をコード化する配列のうち１つ又は複数を含む。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、以下の特徴：宿主細胞のゲノムと非統合性であること、エピソーム核酸であること、一本鎖ＤＮＡであること、約１〜１０ｋｂであること、細胞の核内に存在すること、内在性タンパク質と結合することができること、及び宿主遺伝子をターゲティングするｍｉｃｒｏＲＮＡを産生すること、のうち１つ又は複数を含む。
【０６５２】
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、少なくとも１つのウイルス配列又は、表１９又は表２０に挙げる１つ若しくは複数の配列若しくはその断片に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する。１つのこうした実施形態では、ウイルス配列は、一本鎖ＤＮＡウイルス（例えば、アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）、ビドナウイルス（Ｂｉｄｎａｖｉｒｕｓ）、サーコウイルス（Ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ）、ジェミニウイルス（Ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｕｓ）、ゲノモウイルス（Ｇｅｎｏｍｏｖｉｒｕｓ）、イノウイルス（Ｉｎｏｖｉｒｕｓ）、ミクロウイルス（Ｍｉｃｒｏｖｉｒｕｓ）、ナノウイルス（Ｎａｎｏｖｉｒｕｓ）、パルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、及びスピラウイルス（Ｓｐｉｒａｖｉｒｕｓ））、二本鎖ＤＮＡウイルス（例えば、アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、アンプラウイルス（Ａｍｐｕｌｌａｖｉｒｕｓ）、アスコウイルス（Ａｓｃｏｖｉｒｕｓ）、アスファウイルス（Ａｓｆａｒｖｉｒｕｓ）、バキュロウイルス（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）、フセロウイルス（Ｆｕｓｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）、グロブロウイルス（Ｇｌｏｂｕｌｏｖｉｒｕｓ）、グッタウイルス（Ｇｕｔｔａｖｉｒｕｓ）、ヒトロサウイルス（Ｈｙｔｒｏｓａｖｉｒｕｓ）、ヘルペスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）、イリドウイルス（Ｉｒｉｄｏｖｉｒｕｓ）、リポスリックスウイルス（Ｌｉｐｏｔｈｒｉｘｖｉｒｕｓ）、ニマウイルス（Ｎｉｍａｖｉｒｕｓ）、及びポックスウイルス（Ｐｏｘｖｉｒｕｓ））、ＲＮＡウイルス（例えば、アルファウイルス（Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ）、フロウイルス（Ｆｕｒｏｖｉｒｕｓ）、肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、ホルデイウイルス（Ｈｏｒｄｅｉｖｉｒｕｓ）、トバモウイルス（Ｔｏｂａｍｏｖｉｒｕｓ）、トブラウイルス（Ｔｏｂｒａｖｉｒｕｓ）、トリコルナウイルス（Ｔｒｉｃｏｒｎａｖｉｒｕｓ）、ルビウイルス（Ｒｕｂｉｖｉｒｕｓ）、ビルナウイルス（Ｂｉｒｎａｖｉｒｕｓ）、シストウイルス（Ｃｙｓｔｏｖｉｒｕｓ）、パルティティウイルス（Ｐａｒｔｉｔｉｖｉｒｕｓ）、及びレオウイルス（Ｒｅｏｖｉｒｕｓ））の少なくとも１つに由来する。別の実施形態では、ウイルス配列は、１又は複数種の非アネロウイルス、例えば、アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、ヘルペスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）、ポックスウイルス（Ｐｏｘｖｉｒｕｓ）、ワクシニアウイルス（Ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ）、ＳＶ４０、パピローマウイルス（ｐａｐｉｌｌｏｍａ  ｖｉｒｕｓ）、レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）、例えば、レンチウイルス（ｌｅｎｔｉ  ｖｉｒｕｓ）などのＲＮＡウイルス、一本鎖ＲＮＡウイルス、例えば、肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、又は二本鎖ＤＮＡウイルス、例えば、ロタウイルス（ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）に由来する。
【０６５３】
一部の実施形態では、タンパク質結合配列は、タンパク質性外層のアルギニンリッチ領域と相互作用する。
【０６５４】
一部の実施形態では、クロンは、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞において複製可能である。一部の実施形態では、クロンは、宿主細胞において非病原性で、且つ／又は非統合性である。一部の実施形態では、クロンは、宿主において、実質的に非免疫原性である。一部の実施形態では、クロンは、宿主又は宿主細胞において１つ又は複数のウイルス特性、例えば、指向性、例えば、感染力、例えば、免疫抑制／活性化を阻害／増強する。一部の実施形態では、クロンは、（表現型、ウイルスレベル、遺伝子発現、他のウイルス、病態との競合などを例えば、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、若しくはそれ以上）調節するのに十分な量で存在する。
【０６５５】
一部の実施形態では、組成物は、ウイルス、例えば、クロンの変異体、例えば、片利共生／ネイティブウイルスのゲノムを含む少なくとも１つのウイルス又はベクターをさらに含む。一部の実施形態では、組成物は、異種部分、例えば、少なくとも１つの小分子、抗体、ポリペプチド、核酸、ターゲティング剤、イメージング剤、ナノ粒子、及びこれらの組合せをさらに含む。
【０６５６】
一態様では、本発明は、（ｉ）非病原性外部タンパク質をコード化する配列と、（ｉｉ）遺伝子エレメントを非病原性外部タンパク質に結合させる外部タンパク質結合配列と、（ｉｉｉ）エフェクター、例えば、調節核酸をコード化する配列とを含む、遺伝子エレメントを含むベクターを包含する。
【０６５７】
本明細書に描く本発明の様々な態様において、本明細書に記載する様々な実施形態の１つ又は複数を組み合わせてもよい。
【０６５８】
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、宿主細胞のゲノムと統合することができない。一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞において複製可能である。
【０６５９】
一部の実施形態では、ベクターは、例えば、遺伝子、例えば、ヒト遺伝子の発現を調節するように選択された外性核酸配列をさらに含む。
【０６６０】
一態様では、本発明は、本明細書に記載のベクターと製剤用賦形剤を含む、医薬組成物を包含する。
【０６６１】
本明細書に描く本発明の様々な態様において、本明細書に記載する様々な実施形態の１つ又は複数を組み合わせてもよい。
【０６６２】
一部の実施形態では、ベクターは、宿主細胞において実質的に非病原性で、且つ／又は非統合性である。一部の実施形態では、ベクターは、宿主において実質的に非免疫原性である。
【０６６３】
一部の実施形態では、ベクターは、（表現型、ウイルスレベル、遺伝子発現、他のウイルス、病態との競合などを例えば、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、若しくはそれ以上）調節するのに十分な量で存在する。
【０６６４】
一部の実施形態では、組成物は、ウイルス、例えば、クロンの変異体、片利共生／ネイティブウイルス、ヘルパーウイルス、非アネロウイルスのゲノムを含む少なくとも１つのウイルス又はベクターをさらに含む。一部の実施形態では、組成物は、異種部分、少なくとも１つの小分子、抗体、ポリペプチド、核酸、ターゲティング剤、イメージング剤、ナノ粒子、及びこれらの組合せをさらに含む。
【０６６５】
一態様では、本発明は、本明細書に記載のクロンを生産、増殖、及び回収する方法を包含する。
【０６６６】
一態様では、本発明は、本明細書に記載のベクターを設計し、作製する方法を包含する。
【０６６７】
一態様では、本発明は、被験者のディスビロシス（ｄｙｓｖｉｒｏｓｉｓ）を識別する方法であって、以下：それを必要とする被験者から得られたサンプルから遺伝子情報を分析するステップにおいて、ウイルス遺伝子情報が、被験者の遺伝子情報及び他の微生物から分離されるステップと；ウイルス遺伝子情報を参照標準、例えば、対照、健常な被験者と比較するステップと；ウイルス遺伝子情報の比較により、被験者のウイルス遺伝子情報の不均衡又は異常な比率が得られる場合、被験者のディスビロシス（ｄｙｓｖｉｒｏｓｉｓ）を識別するステップと、を含む方法を包含する。
【０６６８】
本明細書に描く本発明の様々な態様において、本明細書に記載する様々な実施形態の１つ又は複数を組み合わせてもよい。
【０６６９】
一部の実施形態では、ウイルス遺伝子情報に示されない１つ又は複数のウイルス株をさらに含む医薬組成物が被験者に投与される。一部の実施形態では、被験者は、炎症性病態若しくは障害、自己免疫病態若しくは疾患、慢性／急性病態若しくは障害、癌、胃腸病態若しくは障害、又はこれらのいずれかの組合せを有する。
【０６７０】
複数の実施形態では、合成クロンは、インターフェロン発現を阻害する。
【０６７１】
生産方法
遺伝子エレメントの生産
クロンの遺伝子エレメントを製造する方法は、例えば、Ｋｈｕｄｙａｋｏｖ  ＆  Ｆｉｅｌｄｓ，Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ＤＮＡ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（２００２）；ｉｎ  Ｚｈａｏ，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｏｏｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，（Ｆｉｒｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（２０１３）；及びＥｇｌｉ  ＆  Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，（Ｆｉｒｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ（２０１２）に記載されている。
【０６７２】
一部の実施形態では、遺伝子エレメントは、コンピュータ支援設計ツールを用いて設計することができる。クロンは、より小さい重複断片（例えば、約１００ｂｐ〜約１０ｋｂセグメント又は個別のＯＲＦの範囲内）に分割してもよく、これらは、合成するのがさらに容易である。これらのＤＮＡセグメントは、１セットの重複一本鎖オリゴヌクレオチドから合成される。次に、得られた重複シントンをより大きなＤＮＡ断片、例えば、クロンにアセンブルする。ＯＲＦのセグメントを、クロン、例えば、連結を可能にするために５’及び３’末端のインビトロ組換え又はユニークな制限部位にアセンブルしてもよい。
【０６７３】
或いは、クロンをオリゴ長断片に構文解析して、配列間隔の複雑さを考慮に入れる合成のための最適設計条件を生み出す設計アルゴリズムを用いて、遺伝子エレメントを合成することもできる。次に、半導体ベースの高密度チップでオリゴを化学的に合成するが、この場合、チップ当たり２００，０００超の個別のオリゴが合成される。オリゴは、ＢｉｏＦａｂ（登録商標）などのアセンブリ技術を用いてアセンブリすることにより、小さなオリゴからより長いＤＮＡセグメントを構築する。これは、並行して実施されるため、１度に数百〜数千の合成ＤＮＡセグメントが構築される。
【０６７４】
各遺伝子エレメント又は遺伝子エレメントのセグメントを配列確認することもできる。一部の実施形態では、ＡｎｙＤｏｔ．チップ（Ｇｅｎｏｖｏｘｘ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、ＲＮＡ又はＤＮＡのハイスループットシーケンシングを実施することができ、これは、生物学的プロセスのモニタリング（例えば、ｍｉＲＮＡ発現又は対立遺伝子可変性（ＳＮＰ検出）を可能にする。特に、ＡｎｙＤｏｔ−チップは、ヌクレオチド蛍光シグナル検出の１０×〜５０×の増強を可能にする。ＡｎｙＤｏｔ．チップ及びこれらを使用する方法は、一部が、以下：国際公開第０２０８８３８２号パンフレット、同第０３０２０９６８号パンフレット、同第０３０３  １９４７号パンフレット、同第２００５０４４８３６号パンフレット、ＰＣＴＥＰ第０５１０５６５７号明細書、ＰＣＭＥＰ第０５１０５６５５号明細書；並びに独国特許出願第１０１  ４９  ７８６号明細書、同第１０２  １４  ３９５号明細書、同第１０３  ５６  ８３７号明細書、同第１０  ２００４  ００９  ７０４号明細書、同第１０  ２００４  ０２５  ６９６号明細書、同第１０  ２００４  ０２５  ７４６号明細書、同第１０  ２００４  ０２５  ６９４号明細書、同第１０  ２００４  ０２５  ６９５号明細書、同第１０  ２００４  ０２５  ７４４号明細書、同第１０  ２００４  ０２５  ７４５号明細書、及び同第１０  ２００５  ０１２  ３０１号明細書に記載されている。
【０６７５】
他のハイスループットシーケンシングシステムとして、以下の文献に開示されるものが挙げられる：Ｖｅｎｔｅｒ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １６  Ｆｅｂ．２００１；Ａｄａｍｓ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４  Ｍａｒ．２０００；及びＭ．Ｊ，Ｌｅｖｅｎｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９９：６８２−６８６，Ｊａｎｕａｒｙ  ２００３；並びに米国特許出願公開第２００３００４４７８１号明細書及び同第２００６／００７８９３７号明細書。こうしたシステム全体は、１核酸分子について測定される重合反応を介した塩基の一時的な付加により複数の塩基を有する標的核酸分子をシーケンシングするステップを含む。すなわち、シーケンシングしようとする鋳型核酸分子に対する核酸重合酵素の活性をリアルタイムで追跡する。次に、連続した塩基付加での各ステップで、核酸重合酵素の触媒活性により標的核酸の成長相補鎖にどの塩基が組み込まれているかを同定することによって、配列を推定することができる。標的核酸分子複合体上のポリメラーゼは、標的核酸分子に沿って運動して、活性部位でのオリゴヌクレオチドプライマーを伸長するのに好適な位置に提供される。複数の標識されたタイプのヌクレオチド類似体が活性部位に隣接して提供され、識別可能なタイプのヌクレオチド類似体は各々、標的核酸配列中の異なるヌクレオチドと相補的である。核酸鎖の活性部位にヌクレオチド類似体を付加するポリメラーゼを用いることにより、成長核酸鎖を伸長するが、その際、付加されるヌクレオチド類似体は、活性部位で標的核酸のヌクレオチドと相補的である。重合ステップの結果としてオリゴヌクレオチドプライマーに付加されたヌクレオチド類似体を同定する。標識ヌクレオチド類似体を提供するステップ、成長核酸鎖を重合するステップ、及び付加されたヌクレオチド類似体を同定するステップを反復して、核酸鎖をさらに伸長して、標的核酸の配列を決定する。
【０６７６】
一部の実施形態では、ショットガンシーケンシングを実施する。ショットガンシーケンシングでは、ＤＮＡをランダムに多数の小さいセグメントに分解し、これらを、連鎖停止法を用いてシーケンシングすることにより、リードを取得する。数ラウンドの断片化及びシーケンシングを実施することによって標的ＤＮＡの複数の重複リードが得られる。次に、コンピュータプログラムは、様々なリードの重複末端を用いて、これらを連続した配列にアセンブルする。
【０６７７】
合成クロンの生成
遺伝子エレメント及び本明細書に記載のように作製した遺伝子エレメントを含むベクターは、合成クロンを適切な宿主細胞に発現させるための様々な方法で使用することができる。一部の実施形態では、遺伝子エレメント及び遺伝子エレメントを含むベクターを適切な宿主細胞にトランスフェクトすると、得られたＲＮＡが、クロン遺伝子産物、例えば、高レベルの非病原性タンパク質及びタンパク質結合配列の発現を指令し得る。高レベルの発現をもたらす宿主細胞系は、ウイルス機能を供給する連続細胞株、例えば、ＡＰＶ又はＭＰＶにそれぞれ重感染した細胞株、ＡＰＶ又はＭＰＶ機能を補完するように操作された細胞株が挙げられる。
【０６７８】
一部の実施形態では、合成クロンは、実施例１、２、５、６、又は１５〜１７のいずれかに記載の通り生成する。
【０６７９】
一部の実施形態では、合成クロンは、連続動物細胞株においてインビトロで培養する。本発明の一実施形態によれば、細胞株は、ブタ細胞株を含んでもよい。本発明に関連して考慮される細胞株として、不死化ブタ細胞株、例えば、限定はされないが、ブタ腎臓上皮細胞株ＰＫ−１５及びＳＫ、モノ骨髄細胞株３Ｄ４／３１及び精巣細胞株ＳＴが挙げられる。また、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣）、ＭＡＲＣ−１４５、ＭＤＢＫ、ＲＫ−１３、ＥＥＬといった他の哺乳動物細胞なども含まれる。これに加えて又は代わって、本発明の方法の特定の実施形態は、上皮細胞株、すなわち、上皮細胞系統の細胞の細胞株である動物細胞株を利用する。クロンによる感染に対して感受性の細胞株として、限定はされないが、ヒト又は霊長類由来の細胞株、例えば、ヒト又は霊長類腎臓癌細胞株が挙げられる。
【０６８０】
一部の実施形態では、遺伝子エレメント及び遺伝子エレメントを含むベクターは、クロンの発現を達成するために、ウイルスポリメラーゼタンパク質を発現する細胞株にトランスフェクトする。このために、クロンポリメラーゼタンパク質を発現する形質転換細胞株が、適切な宿主細胞として使用され得る。同様に、宿主細胞は、他のウイルス機能又は追加機能を提供するように操作してもよい。
【０６８１】
本明細書に開示する合成クロンを調製するために、本明細書に開示する遺伝子エレメントを含む遺伝子エレメント又はベクターを用いて、複製及び産生に必要なクロンタンパク質及び機能を提供する細胞をトランスフェクトしてもよい。或いは、本明細書に開示する遺伝子エレメント又はその遺伝子エレメントを含むベクターによるトランスフェクションの前、その最中、若しくはその後に、細胞をヘルパーウイルスでトランスフェクトしてもよい。一部の実施形態では、ヘルパーウイルスは、不完全なウイルス粒子の産生を補完するのに有用となり得る。ヘルパーウイルスは、宿主域制限又は温度感受性といった条件付き増殖障害を有し得るが、これによって、後のトランスフェクタントウイルスの選択が可能になる。一部の実施形態では、ヘルパーウイルスは、クロンの発現を達成するために、宿主細胞により使用される１つ又は複数の複製タンパク質を提供することができる。一部の実施形態では、宿主細胞は、１つ又は複数の複製タンパク質などのウイルスタンパク質をコード化するベクターでトランスフェクトしてもよい。
【０６８２】
本明細書に開示する遺伝子エレメント又は遺伝子エレメントを含むベクターは、例えば、以下：米国特許第４，６５０，７６４号；同第５，１６６，０５７号；同第５，８５４，０３７号明細書；欧州特許公開第０７０２０８５Ａ１号明細書；米国特許出願公開第０９／１５２，８４５号明細書；国際公開第９７／１２０３２号；同第９６／３４６２５号パンフレット；欧州特許出願公開第Ａ７８０４７５号明細書；国際公開第９９／０２６５７号；同第９８／５３０７８号；同第９８／０２５３０号；同第９９／１５６７２号；同第９８／１３５０１号；同第９７／０６２７０号パンフレット；並びにＥＰＯ７８０  ４７ＳＡ１（これらの各々は、その全体を参照により本明細書に組み込む）に記載される、当技術分野で公知である任意の数の技術によってクロン粒子内で複製及び産生させることができる。
【０６８３】
本発明に従うクロン含有細胞培養物の生成は、フラスコ、ローラボトル又はバイオリアクターなど、様々な規模で実施することができる。感染させようとする細胞の培養に用いられる培地は、当業者には周知であり、細胞生存に必要な標準的栄養素を含むが、細胞型に応じて別の栄養素を含んでもよい。任意選択で、培地はタンパク質を含まない場合もある。細胞型に応じて、細胞を懸濁液中又は基質上で培養することができる。
【０６８４】
合成クロンの精製及び単離は、ウイルス産生に関して当業者が周知の方法に従い実施することができ、例えば、Ｒｉｎａｌｄｉ，ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），３ｒｄ  ｅｄ．２０１４，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓにより記載されている。
【０６８５】
一態様では、本発明は、本明細書に記載のクロンのインビトロ複製及び増殖のための方法を含み、これは、以下のステップ：（ａ）線形化遺伝子エレメントを、クロン感染に対して感受性の細胞株にトランスフェクトするステップ；（ｂ）細胞を収集して、遺伝子エレメントの存在を示す細胞を単離するステップ；（ｃ）実験条件及び遺伝子発現に応じて、少なくとも３日、例えば、少なくとも１週間若しくはそれ以上にわたって、ステップ（ｂ）で得られた細胞を培養するステップ；並びに（ｄ）ステップ（ｃ）の細胞を収集するステップを含み得る。
【０６８６】
投与／送達
組成物（例えば、本明細書に記載の合成クロンを含む医薬組成物）は、薬学的に許容される賦形剤を含むように、製剤化してもよい。医薬組成物は、任意選択で、１つ又は複数の追加活性物質、例えば、治療及び／又は予防に有効な物質を含んでもよい。本発明の医薬組成物は、滅菌及び／又はパイロジェンフリーであってもよい。医薬剤の製剤化及び／又は製造に関する一般指針は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２１ｓｔ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５（参照により本明細書に組み込む）に見出すことができる。
【０６８７】
本明細書に提供される医薬組成物の説明は、主として、ヒトへの投与に好適な医薬組成物に関するが、当業者には、こうした組成物が、一般に、任意の他の動物、例えば、ヒト以外の動物、例えば、ヒト以外の哺乳動物への投与に好適であることは理解されよう。組成物を様々な動物への投与に好適にする目的での、ヒトへの投与に好適な医薬組成物の修飾は十分に理解されており、通常の技能を有する獣医薬理学者は、あったとしても通常の実験を行うだけで、こうした修飾を設計及び／又は実施することができる。医薬組成物の投与が考慮される被験者として、限定はされないが、ヒト及び／又は他の霊長類；商業関連の哺乳動物、例えば、畜牛、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス、及び／若しくはラットを含む哺乳動物；並びに／又は商業関連のトリ、例えば、家禽、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、及び／若しくはシチメンチョウを含むトリが挙げられる。
【０６８８】
本明細書に記載の医薬組成物は、薬理学の分野で公知の、又は以後開発される任意の方法によって調製することができる。一般に、こうした調製方法は、活性成分を賦形剤及び／又は１つ若しくは複数の他の補助成分と結合させるステップ、並びに必要な場合及び／又は望ましい場合、次に、生成物を分割、造形及び／又は包装するステップを含む。
【０６８９】
一態様では、本発明は、クロンを被験者に送達する方法を特徴とする。この方法は、本明細書に記載のクロンを含む医薬組成物を、被験者に送達するステップを含む。一部の実施形態では、投与されたクロンは、被験者において複製する（例えば、被験者のウイルス集団の一部となる）。
【０６９０】
一態様では、本発明は、ディスビロシス（ｄｙｓｖｉｒｏｓｉｓ）を有する被験者に、クロンを送達する方法を特徴とする。この方法は、本明細書に記載するディスビロシス（ｄｙｓｖｉｒｏｓｉｓ）を有する被験者を選択するステップと、本明細書に記載するクロンを含む医薬組成物を、被験者に送達するステップとを含む。一部の実施形態では、投与されたクロンは、被験者において複製する（例えば、被験者のウイルス集団の一部となる）。
【０６９１】
医薬組成物は、野生型若しくはネイティブウイルスエレメント及び／又は修飾ウイルスエレメントを含み得る。クロンは、表１〜２０のいずれかに示す配列（例えば、核酸配列若しくはそのアミノ酸配列をコード化する核酸配列）、又はヌクレオチド配列のいずれか１つに対して少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、及び９９％のヌクレオチド配列同一性を有する配列、又は表１〜２０のいずれかに示す配列と相補的な配列のうちの１つ又は複数を含み得る。クロンは、表１〜２０のいずれかに示す配列、又は表２、４、６、８、１０、１２、１４、若しくは１６のいずれかに示すアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、及び９９％の配列同一性を有する配列のうちの１つ又は複数をコード化し得る。クロンは、表１９若しくは２０に示す配列、又はヌクレオチド配列のいずれか１つに対して少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、及び９９％のヌクレオチド配列同一性を有する配列、又は表１９若しくは２０に示す配列と相補的な配列のうちの１つ又は複数を含み得る。
【０６９２】
一部の実施形態では、合成クロンは、内在性遺伝子及びタンパク質発現を、参照標準、例えば、健常な対照と比較して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、若しくはそれ以上増大する（刺激する）上で十分である。いくつかの実施形態では、合成クロンは、内在性遺伝子及びタンパク質発現を、参照標準、例えば、健常な対照と比較して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、若しくはそれ以上低減する（阻害する）上で十分である。
【０６９３】
一部の実施形態では、合成クロンは、宿主若しくは宿主細胞において１つ又は複数のウイルス特性、例えば、指向性、感染力、免疫抑制／活性化を、参照標準、例えば、健常な対照と比較して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、若しくはそれ以上阻害／増強する。
【０６９４】
一態様では、本発明は、被験者のディスビロシス（ｄｙｓｖｉｒｏｓｉｓ）、例えば、宿主内に存在するウイルス集団の調節不全を識別する方法を含み、これは、以下：それを必要とする被験者から得られたサンプルから遺伝子情報を分析するステップにおいて、ウイルス遺伝子情報が、被験者の遺伝子情報及び他の微生物から分離されるステップと；ウイルス遺伝子情報を参照標準、例えば、対照、健常な被験者と比較するステップと；ウイルス遺伝子情報の比較により、被験者のウイルス遺伝子情報の不均衡又は異常な比率が得られた場合、被験者のディスビロシス（ｄｙｓｖｉｒｏｓｉｓ）を識別するステップと、を含む。
【０６９５】
一態様では、本発明は、罹患した被験者のディスビロシス（ｄｙｓｖｉｒｏｓｉｓ）を識別するための遺伝子情報のデータベースを作成する方法も含み、これは、以下：（ｉ）健常な被験者からのサンプル中の宿主細胞ゲノムのヌクレオチド配列を決定するステップと；（ｉｉ）宿主細胞ゲノム中に存在する及び／又はエピソーム形態中に存在するウイルス核酸配列を決定するステップと；（ｉｉｉ）特定のウイルス株に関連するステップ（ｉｉ）で決定したウイルス核酸配列のデータベースを編集するステップと；（ｉｖ）複数の被験者についてステップ（ｉ）〜（ｉｉｉ）を反復して、データベースを収集するステップと、を含み得る。
【０６９６】
一態様では、本発明は、ディスビロシス（ｄｙｓｖｉｒｏｓｉｓ）を有する被験者に本明細書に記載の医薬組成物を投与する方法を含み、これは、本明細書に記載するようにウイルス遺伝子情報を取得するステップと、被験者におけるウイルス集団を、参照標準、例えば、健常な対照と比較して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、若しくはそれ以上改変するのに十分な量で本明細書に記載のクロンを含む医薬組成物を投与するステップと、を含む。
【０６９７】
一部の実施形態では、ウイルス遺伝子情報に示されていない１つ又は複数のウイルス株をさらに含む医薬組成物を被験者に投与する。
【０６９８】
一部の実施形態では、本明細書に記載のクロンを含む医薬組成物は、ウイルス感染を調節する上で十分な用量及び時間で投与される。ウイルス感染のいくつかの非限定的な例を以下に挙げる；アデノ関連ウイルス、アイチウイルス（Ａｉｃｈｉ  ｖｉｒｕｓ）、オーストラリアコウモリ・リッサウイルス（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  ｂａｔ  ｌｙｓｓａｖｉｒｕｓ）、ＢＫポリオーマウイルス（ＢＫ  ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ）、バンナウイルス（Ｂａｎｎａ  ｖｉｒｕｓ）、バーマ森林ウイルス（Ｂａｒｍａｈ  ｆｏｒｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ）、ブンヤムウェラウイルス（Ｂｕｎｙａｍｗｅｒａ  ｖｉｒｕｓ）、ブンヤウイルス・ラ・クロス（Ｂｕｎｙａｖｉｒｕｓ  Ｌａ  Ｃｒｏｓｓｅ）、カンジキウサギブンヤウイルス（Ｂｕｎｙａｖｉｒｕｓ  ｓｎｏｗｓｈｏｅ  ｈａｒｅ）、オナガザルヘルペスウイルス（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｉｎｅ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）、チャンディプラウイルス（Ｃｈａｎｄｉｐｕｒａ  ｖｉｒｕｓ）、チクングニアウイルス（Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ  ｖｉｒｕｓ）、コーサウイルスＡ（Ｃｏｓａｖｉｒｕｓ  Ａ）、牛痘ウイルス（Ｃｏｗｐｏｘ  ｖｉｒｕｓ）、コサッキーウイルス（Ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓ）、クリミア−コンゴ出血熱ウイルス（Ｃｒｉｍｅａｎ−Ｃｏｎｇｏ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ），デング熱ウイルス（Ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ）、ドーリウイルス（Ｄｈｏｒｉ  ｖｉｒｕｓ）、デュグベウイルス（Ｄｕｇｂｅ  ｖｉｒｕｓ）、デュベンヘイジウイルス（Ｄｕｖｅｎｈａｇｅ  ｖｉｒｕｓ）、東部ウマ脳炎ウイルス（Ｅａｓｔｅｒｎ  ｅｑｕｉｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、エボラウイルス（Ｅｂｏｌａｖｉｒｕｓ）、エコーウイルス（Ｅｃｈｏｖｉｒｕｓ）、脳心筋炎ウイルス（Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、エプスタイン・バーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）、ヨーロッパコウモリ・リッサウイルス（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｂａｔ  ｌｙｓｓａｖｉｒｕｓ）、ＧＢウイルスＣ／Ｇ型肝炎ウイルス（ＧＢ  ｖｉｒｕｓ  Ｃ／Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｇ  ｖｉｒｕｓ）、ハンターンウイルス（Ｈａｎｔａａｎ  ｖｉｒｕｓ）、ヘンドラウイルス（Ｈｅｎｄｒａ  ｖｉｒｕｓ）、Ａ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ａ  ｖｉｒｕｓ）、Ｂ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ）、Ｃ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ）、Ｅ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｅ  ｖｉｒｕｓ）、Ｄ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｄｅｌｔａ  ｖｉｒｕｓ）、ウマポックスウイルス（Ｈｏｒｓｅｐｏｘ  ｖｉｒｕｓ）、ヒトアデノウイルス（Ｈｕｍａｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、ヒトアストロウイルス（Ｈｕｍａｎ  ａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ）、ヒトコロナウイルス（Ｈｕｍａｎ  ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）、ヒトサイトメガロウイルス（Ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）、ヒトエンテロウイルス６８（Ｈｕｍａｎ  ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ  ６８）、ヒトエンテロウイルス７０（Ｈｕｍａｎ  ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ  ７０）、ヒトヘルペスウイルス１型（Ｈｕｍａｎ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  １）、ヒトヘルペスウイルス２型（Ｈｕｍａｎ  ｈ��ｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  ２）、ヒトヘルペスウイルス６型（Ｈｕｍａｎ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  ６）、ヒトヘルペスウイルス７型（Ｈｕｍａｎ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  ７）、ヒトヘルペスウイルス８型（Ｈｕｍａｎ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  ８）、ヒト免疫不全ウイルス（Ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ）、ヒトパピローマウイルス１型（Ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  １）、ヒトパピローマウイルス２型（Ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ２）、ヒトパピローマウイルス１６型（Ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  １６）、ヒトパピローマウイルス１８型（Ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  １８）、ヒトパラインフルエンザウイルス（Ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、ヒトパルボウイルスＢ１９（Ｈｕｍａｎ  ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ  Ｂ１９）、ヒト呼吸器合胞体ウイルス（Ｈｕｍａｎ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ）、ヒトライノウイルス（Ｈｕｍａｎ  ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ）、ヒトＳＡＲＳコロナウイルス（Ｈｕｍａｎ  ＳＡＲｓ  ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）、ヒトスプマレトロウイルス（Ｈｕｍａｎ  ｓｐｕｍａｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）、ヒトＴ−リンパ好性ウイルス（Ｈｕｍａｎ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ  ｖｉｒｕｓ）、ヒトトロウイルス（Ｈｕｍａｎ  ｔｏｒｏｖｉｒｕｓ）、Ａ型インフルエンザウイルス（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓ）、Ｂ型インフルエンザウイルス（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ）、Ｃ型インフルエンザウイルス（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ）、イスファンウイルス（Ｉｓｆａｈａｎ  ｖｉｒｕｓ）、ＪＣポリオーマウイルス（ＪＣ  ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ）、日本脳炎ウイルス（Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、フニンアレナウイルス（Ｊｕｎｉｎ  ａｒｅｎａｖｉｒｕｓ）、ＫＩポリオーマウイルス（ＫＩ  Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ）、クンジンウイルス（Ｋｕｎｊｉｎ  ｖｉｒｕｓ）、ラゴスコウモリウイルス（Ｌａｇｏｓ  ｂａｔ  ｖｉｒｕｓ）、レイク・ビクトリア・マーブルグウイルス（Ｌａｋｅ  Ｖｉｃｔｏｒｉａ  ｍａｒｂｕｒｇｖｉｒｕｓ）、ランガトウイルス（Ｌａｎｇａｔ  ｖｉｒｕｓ）、ラッサウイルス（Ｌａｓｓａ  ｖｉｒｕｓ）、ローズデールウイルス（Ｌｏｒｄｓｄａｌｅ  ｖｉｒｕｓ）、跳躍病ウイルス（Ｌｏｕｐｉｎｇ  ｉｌｌ  ｖｉｒｕｓ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｃｈｏｒｉｏｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、マチュポウイルス（Ｍａｃｈｕｐｏ  ｖｉｒｕｓ）、マヤロウイルス（Ｍａｙａｒｏ  ｖｉｒｕｓ）、ＭＥＲＳコロナウイルス（ＭＥＲＳ  ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）、麻疹ウイルス（Ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ）、メンゴ脳心筋炎ウイルス（Ｍｅｎｇｏ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、メルケル細胞ポリオーマウイルス（Ｍｅｒｋｅｌ  ｃｅｌｌ  ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ）、モコラウイルス（Ｍｏｋｏｌａ  ｖｉｒｕｓ）、伝染性軟属腫ウイルス（Ｍｏｌｌｕｓｃｕｍ  ｃｏｎｔａｇｉｏｓｕｍ  ｖｉｒｕｓ）、サル痘ウイルス（Ｍｏｎｋｅｙｐｏｘ  ｖｉｒｕｓ）、ムンプスウイルス（Ｍｕｍ��ｓ  ｖｉｒｕｓ）、マレー渓谷脳炎ウイルス（Ｍｕｒｒａｙ  ｖａｌｌｅｙ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、ニューヨークウイルス（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ｖｉｒｕｓ）、ニパウイルス（Ｎｉｐａｈ  ｖｉｒｕｓ）、ノーウォークウイルス（Ｎｏｒｗａｌｋ  ｖｉｒｕｓ）、オニョン−ニョンウイルス（Ｏ’ｎｙｏｎｇ−ｎｙｏｎｇ  ｖｉｒｕｓ）、オルフウイルス（Ｏｒｆ  ｖｉｒｕｓ）、オロポーシャウイルス（Ｏｒｏｐｏｕｃｈｅ  ｖｉｒｕｓ）、ピチンデウイルス（Ｐｉｃｈｉｎｄｅ  ｖｉｒｕｓ）、ポリオウイルス（Ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ）、プンタ・トロ・フレボウイルス（Ｐｕｎｔａ  ｔｏｒｏ  ｐｈｌｅｂｏｖｉｒｕｓ）、プーマラウイルス（Ｐｕｕｍａｌａ  ｖｉｒｕｓ）、狂犬病ウイルス（Ｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓ）、リフトバレー熱ウイルス（Ｒｉｆｔ  ｖａｌｌｅｙ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、ロサウイルスＡ（Ｒｏｓａｖｉｒｕｓ  Ａ）、ロスリバーウイルス（Ｒｏｓｓ  ｒｉｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、ロタウイルスＡ（Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ  Ａ）、ロタウイルスＢ（Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ  Ｂ）、ロタウイルスＣ（Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ  Ｃ）、ルベラウイルス（Ｒｕｂｅｌｌａ  ｖｉｒｕｓ）、サギヤマウイルス（Ｓａｇｉｙａｍａ  ｖｉｒｕｓ）、サリウイルスＡ（Ｓａｌｉｖｉｒｕｓ  Ａ）、砂バエ熱シチリアウイルス（Ｓａｎｄｆｌｙ  ｆｅｖｅｒ  ｓｉｃｉｌｉａｎ  ｖｉｒｕｓ）、サッポロウイルス（Ｓａｐｐｏｒｏ  ｖｉｒｕｓ）、セムリキ森林ウイルス（Ｓｅｍｌｉｋｉ  ｆｏｒｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ）、ソウルウイルス（Ｓｅｏｕｌ  ｖｉｒｕｓ）、サル泡沫状ウイルス（Ｓｉｍｉａｎ  ｆｏａｍｙ  ｖｉｒｕｓ）、サルウイルス５型（Ｓｉｍｉａｎ  ｖｉｒｕｓ  ５）、シンドビスウイルス（Ｓｉｎｄｂｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、サウサンプトンウイルス（Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ  ｖｉｒｕｓ）、セントルイス脳炎ウイルス（Ｓｔ．ｌｏｕｉｓ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、ダニ媒介ポワッサンウイルス（Ｔｉｃｋ−ｂｏｒｎｅ  ｐｏｗａｓｓａｎ  ｖｉｒｕｓ）、トルク・テノウイルス（Ｔｏｒｑｕｅ  ｔｅｎｏ  ｖｉｒｕｓ）、トスカーナウイルス（Ｔｏｓｃａｎａ  ｖｉｒｕｓ）、ウークニエミウイルス（Ｕｕｋｕｎｉｅｍｉ  ｖｉｒｕｓ）、ワクシニアウイルス（Ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ）、水痘帯状疱疹ウイルス（Ｖａｒｉｃｅｌｌａ−ｚｏｓｔｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、天然痘ウイルス（Ｖａｒｉｏｌａ  ｖｉｒｕｓ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ  ｅｑｕｉｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、水痘性口炎（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、西部ウマ脳炎ウイルス（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｅｑｕｉｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、ＷＵポリオーマウイルス（ＷＵ  ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ）、西ナイルウイルス（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ  ｖｉｒｕｓ）、ヤバサル腫瘍ウイルス（Ｙａｂａ  ｍｏｎｋｅｙ  ｔｕｍｏｒ  ｖｉｒｕｓ）、ヤバ様疾患ウイルス（Ｙａｂａ−ｌｉｋｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ）、黄熱病ウイルス（Ｙｅｌｌｏｗ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、及びジカウイルス（Ｚｉｋａ  Ｖｉｒｕｓ）。いくつかの実施形態では、クロンは、被験者に既に存在するウイルスを、参照標準と比較して���例えば、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、若しくはそれ以上駆逐及び／又は移動させる上で十分である。いくつかの実施形態では、クロンは、慢性又は急性ウイルス感染と競合する上で十分である。いくつかの実施形態では、クロンは、ウイルス感染（例えば、プロウイルス感染）から防御するために予防的に投与してもよい。一部の実施形態では、クロンは、（例えば、表現型、ウイルスレベル、遺伝子発現、他のウイルス、病態との競合などを少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、若しくはそれ以上）調節するのに十分な量で存在する。
【０６９９】
本明細書で引用する全ての参照文献及び刊行物は参照により本明細書に組み込むものとする。
【０７００】
本発明のいくつかの実施形態をさらに詳しく説明するために、以下の実施例を提供するが、これらは、本発明の範囲を何ら制限することは意図されず；それらの例示的な性質から、当業者には周知の他の手順、方法、技術が代替的に使用され得ることは理解されよう。
【実施例】
【０７０１】
実施例１：クロンの製造
この実施例では、インターフェロン（ＩＦＮ）発現を阻害する合成クロンの設計及び合成を説明する。
【０７０２】
クロン（クロンＡ）は、１）非病原性パッケージングエンクロージャ（Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ（２００７）１５２：１９６１−１９７５）、アクセッション番号：Ａ７ＸＣＥ８．１（ＯＲＦ１１＿ＴＴＷ３）；２）宿主遺伝子（例えば、ＩＦＮ）をターゲティングするマイクロＲＮＡをコードするＤＮＡ配列（ＰＬＯＳ  Ｐａｔｈｏｇｅｎ（２０１３），９（１２），ｅ１００３８１８），アクセッション番号：ＡＪ６２０２３１．１；及び３）キャプシドタンパク質内の特定の領域（例えば、アクセッション番号：Ｑ９９１５３．１を有するキャプシドの特定の領域）に結合するＤＮＡ配列（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００３），７７（２４），１３０３６−１３０４１）から出発して設計する。
【０７０３】
この配列に、１ｋｂのノンコーディングＤＮＡ配列を付加する（クロンＢ）。設計したクロン（図２）を３ｋｂ（合計サイズ）に化学的に合成し、これを配列確認する。
【０７０４】
ＪｅｔＰＥＩ試薬（ＰｏｌｙＰｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，Ｉｌｌｋｉｒｃｈ，Ｆｒａｎｃｅ）と一緒に、製造者の推奨に従って、クロン配列をヒト胎児腎２９３Ｔ細胞（１２ウェルプレート上で１０５細胞当たり１ｍｇ）にトランスフェクトする。対照トランスフェクションは、ベクターのみを含むか、又はＪｅｔＰＥＩ単独でトランスフェクトした細胞を含み、トランスフェクション効率を、ＧＦＰコード化リポータプラスミドで最適化する。対照トランスフェクションの蛍光を測定して、適正にトランスフェクトされた細胞を確実にする。トランスフェクトした培養物を３７℃及び５％二酸化炭素で一晩インキュベートする。
【０７０５】
１８時間後、細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、新鮮な培地を添加する。上清を収集し、下記の通り超遠心分離及びクロンの採取を行う。４，０００×ｇで３０分、次に、８，０００×ｇで１５分の遠心分離により、培地を清澄化して、細胞及び細胞残屑を除去する。次に、上清を０．４５μｍ孔径フィルターでろ過する。５％ショ糖クッション（５ｍｌ）により、クロンを２７，０００ｒｐｍで１時間ペレット化し、１×リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）及び原体積の１／１００中の０．１％バシトラシンに再懸濁させる。濃縮したクロンを２４，０００ｒｐｍで２時間の２０〜３５％のショ糖段階勾配により遠心分離する。勾配ジャンクションのクロンバンドを収集する。次に、クロンを１×ＰＢＳで希釈した後、２７，０００ｒｐｍで１時間ペレット化する。クロンペレットを１×ＰＢＳに再懸濁し、２０から３５％までの連続ショ糖段階勾配によりさらに精製する。
【０７０６】
実施例２：クロン（クロンＡ及び／又はＢ）のラージスケール生産
この実施例では、クロンの生産及び増殖を説明する。
【０７０７】
実施例１に記載の精製クロンを懸濁液中に増殖させたプロデューサＡ５４９細胞を含むスピナーフラスコ内でラージスケール増幅のために調製する。Ａ５４９細胞は、Ｆ１２Ｋ培地、１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭグルタミン及び抗生物質中に維持する。１０６クロンのクロン負荷でＡ５４９細胞をクロンに感染させて、３７℃及び５％二酸化炭素で２４時間のインキュベーション後に約１×１０７個のクロン粒子を生産する。次に、細胞をＰＢＳで３回洗浄してから、新鮮な培地で６時間インキュベートする。
【０７０８】
クロン精製のために、塩化セシウム勾配に基づく２回の超遠心分離ステップを実施した後、下記の通り透析を行う（Ｂｉｏ−Ｐｒｏｔｏｃｏｌ（２０１２）Ｂｉｏ１０１：ｅ２０１）。遠心分離（１０分の６０００×ｇ）により細胞を除去し、上清を０．８μｍ、続いて０．２μｍフィルターでろ過する。ろ過物をろ過膜（１００，０００ｍｗ）の通過により濃縮して、８ｍｌの体積にする。リテンテートを硫酸セシウム溶液中にロードし、２４７，０００×ｇで２０時間遠心分離する。クロンバンドを取り出し、１４，０００ｍｗカットオフ透析チューブに導入して、透析する。必要に応じて、さらに濃縮を実施してもよい。
【０７０９】
実施例３：インビトロでのクロン（クロンＡ）の作用
この実施例は、細胞感染後のクロンの発現及びエフェクター機能、例えば、ｍｉＲＮＡの発現のインビトロ評価を説明する。
【０７１０】
実施例１に記載の精製クロンの作用を、内在性遺伝子調節（例えば、ＩＦＮシグナル伝達）によりインビトロで評価する。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をデュアルルシフェラーゼプラスミド（インターフェロン刺激応答エレメント（ＩＳＲＥ）ベースのプロモータを含むホタルルシフェラーゼ及び構成性プロモータを含むトランスフェクション対照ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ）：ルシフェラーゼリポータミックス（１：４比のｐｃＤＮＡ３．１ｄｓＲｌｕｃ：ｐＩＳＲＥ−Ｌｕｃ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ））（Ｊ  Ｖｉｒｏｌ（２００８），８２：９８２３−９８２８）で同時トランスフェクトする。
【０７１１】
６ウェルプレート（２セットの３回反復−３つの対照ウェルとクロンＡを含む３つの実験ウェル）に接種したＨＥＫ２９３Ｔ細胞に１０７の感染多重度でクロンを投与する。
【０７１２】
４８時間後、培地を、１００ｕ／ｍｌのユニバーサルＩ型インターフェロン（ＰＢＬ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を含む、又は含まない新しい培地に取り換える。ＩＦＮ処理から１６時間後、デュアルルシフェラーゼアッセイ（Ｊ  Ｖｉｒｏｌ（２００８），８２：９８２３−９８２８）を実施して、ＩＦＮシグナル伝達を決定する。ホタルルシフェラーゼをウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ発現に対して正規化して、トランスフェクションの差を調製する。同等の実験ウェルを対照ウェルで割ることにより、ＩＳＲＥ  ｆｆＬｕｃリポータの倍率誘導を計算し、各条件での誘導を陰性対照と比較する。
【０７１３】
一実施形態では、対照と比較して、クロン処理群のルシフェラーゼシグナルが減少していれば、クロンが細胞中のＩＦＮ産生を低減することを示すことになる。
【０７１４】
実施例４：クロン（クロンＡ）の免疫作用
この実施例は、投与後のクロンのインビボエフェクター機能、例えば、ｍｉＲＮＡの発現を説明する。
【０７１５】
キログラム当たり１０４ゲノム当量から出発してキログラム当たり０ゲノム当量までの百倍希釈物を用い、実施例１及び２に記載の通りに調製した精製済クロンを様々な用量で健常なブタに静脈内投与する。免疫寛容に対する作用を評価するために、上に示す用量のクロン又はビヒクル対照ＰＢＳをブタに３日間毎日注射し、３日後に犠牲にする。
【０７１６】
脾臓、骨髄及びリンパ節を採取する。単一細胞懸濁液を組織の各々から調製して、ＭＨＣ−ＩＩ、ＣＤ１１ｃ、及び細胞内ＩＦＮについて細胞外マーカで染色する。ＭＨＣ＋、ＣＤ１１ｃ＋、ＩＦＮ＋抗原提示細胞を各組織からフローサイトメトリーにより分析する。その際、例えば、前述のマーカの所与の１つについて陽性である細胞は、マーカの発現のない陰性対照群の細胞の９９％より高い蛍光を示すが、それ以外は、同じ条件下で、アッセイ細胞集団と類似している細胞である。
【０７１７】
一実施形態では、対照と比較して、クロン処理群のＩＦＮ＋細胞の数が減少していれば、クロンが投与後の細胞中のＩＦＮ産生を低減することを示すことになる。
【０７１８】
実施例５：合成クロンの調製
この実施例は、合成クロンのインビトロ産生を実証する。
【０７１９】
ＥｃｏＲＶ制限酵素部位同士のＴＴＭｉｎｉＶ（Ｅｕｒ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｊ．２０１３  Ａｕｇ；４２（２）：４７０−９）のＬＹ１及びＬＹ２株由来のＤＮＡ配列をカナマイシンベクター（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にクローニングした。ＴＴＭｉｎｉＶのＬＹ１及びＬＹ２株由来のＤＮＡ配列を含むクロンは、実施例６及び７、並びに図６Ａ〜１０Ｂにおいて、それぞれクロン１及び２と呼ばれる。クローニングした構築物を１０−βコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換した（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．）後、プラスミド精製（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者のプロトコルに従って実施する。
【０７２０】
ＤＮＡ構築物（図３及び図４）をＥｃｏＲＶ制限消化（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．）により３７℃で６時間線形化した後、アガロースゲル電気泳動、正しいサイズのＤＮＡバンド（２．９キロ塩基対）の切除に続いて、ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、製造者のプロトコルに従って、切除したアガロースバンドからのＤＮＡのゲル精製を実施した。
【０７２１】
実施例６：クロンのアセンブリ及び感染
この実施例は、実施例５に記載する通り、合成ＤＮＡ配列を用いた感染性クロンのインビトロ産生の達成を実証する。
【０７２２】
クロンＤＮＡ（実施例５で取得）を、脂質トランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ヒト胎児腎細胞株）又はＡ５４９細胞（ヒト肺癌細胞株）のいずれかに、インタクトプラスミド又は線形化形態のいずれかでトランスフェクトした。６ｕｇのプラスミド又は１．５ｕｇの線形化ＤＮＡをＴ２５フラスコ内での７０％密集細胞のトランスフェクションのために使用した。クロンに含まれるウイルス配列が欠失した空ベクター骨格を陰性対照として用いた。トランスフェクションから６時間後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、３７℃及び５％二酸化炭素の新鮮な増殖培地中で増殖させた。ヒトＥｆ１αプロモータ、続いてＹＦＰ遺伝子をコード化するＤＮＡ配列をＩＤＴから合成した。このＤＮＡ配列をクローニングベクター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に平滑末端連結した。得られたベクターを対照として用いて、トランスフェクション効率を評価した。トランスフェクションから７２時間後に、細胞イメージングシステム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ＹＦＰを検出した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及びＡ５４９細胞のトランスフェクション効率は、それぞれ８５％及び４０％として算出された（図５）。
【０７２３】
クロンでトランスフェクトした２９３Ｔ及びＡ５４９細胞の上清をトランスフェクションから９６時間後に採取した。採取した上清を４℃にて１０分間２０００ｒｐｍでスピンすることにより、細胞残屑を全て除去した。採取した上清の各々を用いて、２４ウェルプレートのウェル内で７０％密集であった新しい２９３Ｔ及びＡ５４９細胞にそれぞれ感染させた。３７℃及び５％二酸化炭素で２４時間のインキュベーション後に上清を洗い流してから、ＰＢＳで２回洗浄し、新鮮な増殖培地に取り替えた。３７℃及び５％二酸化炭素でさらに４８時間これらの細胞をインキュベートした後、ゲノムＤＮＡ抽出のために細胞を個別に採取した。ゲノムＤＮＡ抽出キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、製造者のプロトコルに従い、サンプルの各々からゲノムＤＮＡを採取した。
【０７２４】
インビトロで産生されたクロンによる２９３Ｔ及びＡ５４９細胞の感染の達成を確認するために、本明細書に記載の通りに採取した１００ｎｇのゲノムＤＮＡを使用して、ベータトルクウイルスに特異的なプライマー又はＬＹ２特異的配列を用いた定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を実施した。ＳＹＢＲグリーン試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、製造者のプロトコルに従い、ｑＰＣＲを実施した。ＧＡＰＤＨのゲノムＤＮＡ配列に特異的なプライマーのｑＰＣＲを正規化に使用した。使用した全てのプライマーの配列を表２１に挙げる。
【０７２５】
【表２１】
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【０７２６】
図６Ａ、６Ｂ、７Ａ、及び７Ｂに描くｑＰＣＲ結果に示すように、インビトロで、且つこの実施例に説明する通りに生産されたクロンは、感染性であった。
【０７２７】
実施例７：クロンの選択性
この実施例は、インビトロで生産された合成クロンが、様々な組織に由来する細胞株に感染する能力を実証する。
【０７２８】
感染性ＴＴＭｉｎｉＶクロン（実施例５に記載する）を含む上清を、２４ウェルプレートのウェル内の７０％密集２９３Ｔ、Ａ５４９、Ｊｕｒｋａｔ（急性Ｔ細胞性白血病細胞株）、Ｒａｊｉ（バーキットリンパ腫Ｂ細胞株）、及びＣｈａｎｇ（肝臓癌細胞株）細胞株と一緒に、３７℃及び５％二酸化炭素でインキュベートした。感染から２４時間後に細胞をＰＢＳで２回洗浄してから、新鮮な増殖培地に取り替えた。次に、３７℃及び５％二酸化炭素でさらに４８時間細胞を再度インキュベートした後、ゲノムＤＮＡ抽出のために採取した。ゲノムＤＮＡ抽出キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、製造者のプロトコルに従い、サンプルの各々からのゲノムＤＮＡを採取した。
【０７２９】
先の実施例で産生されたクロンによるこれらの細胞株の感染の達成を確認するために、本明細書に記載の通りに採取した１００ｎｇのゲノムＤＮＡを使用して、ベータトルクウイルスに特異的なプライマー又はＬＹ２特異的配列を用いた定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を実施した。ＳＹＢＲグリーン試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、製造者のプロトコルに従い、ｑＰＣＲを実施した。ＧＡＰＤＨのゲノムＤＮＡ配列に特異的なプライマーのｑＰＣＲを正規化に使用した。使用した全てのプライマーの配列を表２１に挙げる。
【０７３０】
図６Ａ〜１０Ｂに描くように、インビトロで産生されたクロンは、感染性であるだけでなく、上皮細胞、肺組織細胞、肝細胞、癌細胞、リンパ球、リンパ芽球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、及び腎細胞の例を含め、多様な細胞株に感染することができた。また、合成クロンは、ＨｅｐＧ２細胞に感染することができ、それにより、対照に比して１００倍超の増加が起こったことも観察された。
【０７３１】
実施例８：タンパク質結合配列の同定及び使用
この実施例は、例えば、本明細書に記載のクロンにおいて、エフェクターを増幅及びパッケージングするために用いることができるアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ゲノム内の推定タンパク質結合部位を説明する。一部の事例では、タンパク質結合部位は、キャプシドタンパク質などの外部タンパク質と結合することができると考えられる。
【０７３２】
アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ゲノム内の２つの保存ドメインは、推定複製起点である：５’ＵＴＲ保存ドメイン（５ＣＤ）及びＧＣリッチドメイン（ＧＣＤ）（ｄｅ  Ｖｉｌｌｉｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０１１；Ｏｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９９９）。一例では、これらの配列が、ＤＮＡ複製部位又はキャプシドパッケージングシグナルとして作用するか否かを確認するために、ＴＴＭＶ−ＬＹ２を有するプラスミドに各領域の欠失を作製する。Ａ５３９細胞をｐＴＴＭＶ−ＬＹ２Δ５ＣＤ又はｐＴＴＭＶ−ＬＹ２ΔＧＣＲでトランスフェクトする。トランスフェクトした細胞を４日間インキュベートした後、上清及び細胞ペレットからウイルスを単離する。Ａ５４９細胞をウイルスに感染させ、その４日後、上清及び感染細胞ペレットからウイルスを単離する。ｑＰＣＲを実施して、サンプルからのウイルスゲノムを定量する。複製起点の破壊により、ウイルスのレプリカーゼがウイルスＤＮＡを増幅するのが阻止され、その結果、野生型ウイルスと比較して、トランスフェクト細胞ペレットから単離されたウイルスゲノムが減少する。少量のウイルスが依然としてパッケージされており、それをトランスフェクトされた上清及び感染細胞ペレット中に認めることができる。一部の実施形態では、パッケージングシグナルの破壊により、ウイルスＤＮＡがキャプシドタンパク質により包膜されるのが阻止されるであろう。従って、複数の実施形態では、トランスフェクトした細胞にはウイルスゲノムの増幅がまだあるが、上清及び感染細胞ペレットにウイルスゲノムは存在しない。
【０７３３】
別の実施例では、ＤＮＡ中の他の複製及びパッケージングシグナルを特性決定するために、ＴＴＭＶ−ＬＹ２ゲノム全体に及ぶ一連の欠失を使用する。１００ｂｐの欠失を配列の長さにわたって段階的に作製する。ＴＴＭＶ−ＬＹ２欠失を含むプラスミドをＡ５４９にトランスフェクトして、前述のように試験する。一部の実施形態では、ウイルス増幅又はパッケージングを破壊する欠失は、潜在的なシス−調節ドメインを含有するであろう。
【０７３４】
増幅及び包膜を誘導するために、複製及びパッケージングシグナルをエフェクターコード化ＤＮＡ配列（例えば、クロン内の遺伝子エレメント中の）に組み込むことができる。これは、クロンゲノムのより大きな領域に関して（すなわち、ゲノム内の特定部位へのエフェクターの挿入、若しくはエフェクターによるウイルスＯＲＦの置換など）、又はエフェクターＤＮＡへの最小シスシグナルの組込みによる、いずれでも実施される。クロンが、トランス複製又はパッケージング因子（例えば、レプリカーゼ及びキャプシドタンパク質など）を欠失している場合には、トランス因子がヘルパー遺伝子により供給される。ヘルパー遺伝子は、増幅及びパッケージングを誘導する上で十分なタンパク質及びＲＮＡの全てを発現するが、それ自身のパッケージングシグナルは欠失している。クロンＤＮＡをヘルパー遺伝子で同時トランスフェクトすると、エフェクターの増幅及びパッケージングが起こるが、ヘルパー遺伝子のそれは起こらない。
【０７３５】
実施例９：最小アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ゲノム
この実施例は、ウイルスの複製に十分な最小ゲノムの特性決定を助けること、及びエフェクターペイロードを挿入することの両方を目的とする、アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ゲノムにおける欠失を説明する。
【０７３６】
ＯＲＦ下流で、且つＧＣリッチ領域（ｎｔ３４３６〜３６０７）上流のＴＴＶ−ｔｔｈ８のノンコーディング領域（ＮＣＲ）に１７２−ヌクレオチド（ｎｔ）欠失を作製した。ランダム５６−ｎｔ配列（ＴＴＴＧＴＧＡＣＡＣＡＡＧＡＴＧＧＣＣＧＡＣＴＴＣＣＴＴＣＣＴＣＴＴＴＡＧＴＣＴＴＣＣＣＣＡＡＡＧＡＡＧＡＣＡＡ（配列番号６９６））をこの欠失に挿入した。２μｇの環状又は線状化（ＳｍａＩ）ｐＴＴＶ−ｔｔｈ８（３４３６〜３７０７：：５６ｎｔ）、すなわち、改変ＴＴＶ−ｔｔｈ８を含むＤＮＡプラスミドを、リポフェクタミン２０００を用いて、６ｃｍプレート内で６０％密集のＨＥＫ２９３又はＡ５４９細胞に、２回反復で、トランスフェクトした。トランスフェクションから９６時間後に、液体窒素と３７℃水浴の間で凍結融解を３回交互に繰り返すことにより、ウイルスを細胞ペレット及び上清から単離した。上清からのウイルスを用いて、細胞を再感染させた（ＨＥＫ２９３細胞はＨＥＫ２９３から単離したウイルスにより感染させ、Ａ５４９細胞は、Ａ５４９から単離したウイルスにより感染させた）。感染から７２時間後、凍結融解により、ウイルスを細胞ペレット及び上清から単離した。全てのサンプルに対してｑＰＣＲを実施した。以下の表２２に示すように、ＴＴＶ−ｔｔｈ８は、感染細胞の細胞ペレット及び上清の両方に観察され、これはｐＴＴＶ−ｔｔｈ８（３４３６〜３７０７：：５６ｎｔ）によるウイルス産生の達成を示している。従って、ＴＴＶ−ｔｔｈ８は、ｎｔ３４３６〜３７０７の欠失を許容することができる。
【０７３７】
【表２２】
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【０７３８】
ヌクレオチド５７４〜１３７１及び１４３２〜２２１０が欠失し（１５７７ｂｐ欠失）、且つＯＲＦ１のＣ末端（野生型ＴＴＭＶ−ＬＹ２におけるｎｔ２６０９後）に５１３ｂｐＮａｎｏＬｕｃ（ｎＬｕｃ）リポータＯＲＦを挿入した、ＴＴＭＶ−ＬＹ２の操作バージョンをアセンブルした。操作ＴＴＭＶ−ＬＹ２のＤＮＡ配列を含むプラスミド（ｐＶＬ４６−０１５Ｂ）をＡ５４９細胞にトランスフェクトした後、実施例１７に記載の通り、ウイルスを単離し、新しいＡ５４９細胞を感染させるのに用いた。感染細胞の細胞ペレット及び上清中でｎＬｕｃルミネセンスが検出されたが、これは、ウイルス複製を示している（図１１Ａ〜１１Ｂ）。これは、ＴＴＭＶ−ＬＹ２が、ＯＲＦ領域内の少なくとも１５７７ｂｐ欠失を許容し得ることを実証する。
【０７３９】
複製に十分な最小ウイルスゲノムをさらに特性決定するために、ＴＴＭＶ−ＬＹ２ＤＮＡに一連の欠失を作製する。ｎｔ５７４〜１３７１及びｎｔ１４３２〜２２１０の欠失を有するが、ｎＬｕｃ挿入はないＴＴＭＶ−ＬＹ２を作製し、前述した通りにウイルス複製について試験する。ＴＴＭＶ−ＬＹ２Δ５７４−１３７１、Δ１４３２−２２１０に対してさらなる欠失を作製する。ｎｔ１３７２〜１４３１を欠失させて、ＴＴＭＶ−ＬＹ２Δ５７４−２２１０を作出する。さらに、ＯＲＦ１下流のＯＲＦ３配列を欠失させる（Δ２６１０−２８０９）。最後に、ノンコーディング領域内の欠失を試験するために、ＮＣＲ全域にわたって連続的に一連の１００ｂｐ欠失を作製する。全ての欠失突然変異体を、前述の通り、ウイルス複製について試験する。ウイルス産生の達成をもたらす欠失（欠失した領域が、ウイルス複製に必須ではないことを示す）を組み合わせて、さらに多くのヌクレオチドが欠失したＴＴＭＶ−ＬＹ２の変異体を作製する。この戦略によって、自己増幅に十分な最小ウイルスが得られることになる。ヘルパーで増幅することができる最小ウイルスを同定するために、ウイルス複製を崩壊させた欠失突然変異体の各々を、トランス複製及びパッケージングエレメントを含むヘルパー遺伝子と並行して試験する。複製エレメントのトランス発現によりレスキューされる欠失は、別の供給源からヘルパー遺伝子が付与されると、欠失させて最小ウイルスを形成することができるウイルスゲノムの領域を示している。
【０７４０】
実施例１０：アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ゲノムへの様々な長さのヌクレオチド挿入
この実施例は、アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ゲノムへの様々な長さのＤＮＡ配列の付加を説明し、これは、一部の事例において、本明細書に記載のクロンを作製するために用いることができる。
【０７４１】
ＴＴＶ−ｔｔｈ８（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＪ６２０２３１．１）及びＴＴＭＶ−ＬＹ２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＪＸ１３４０４５．１）を含むプラスミドにＤＮＡ配列をクローニングする。オープンリーディングフレームの３’側及びＧＣリッチ領域の５’側のノンコーディング領域（ＮＣＲ）：ＴＴＶ−ｔｔｈ８のヌクレオチド３５８８、又はＴＴＭＶ−ＬＹ２のヌクレオチド２８４３後に、挿入を作製する。
【０７４２】
下記長さのランダム化ＤＮＡ配列をＴＴＶ−ｔｔｈ８及びＴＴＭＶ−ＬＹ２のＮＣＲに挿入する：１００塩基対（ｂｐ）、２００ｂｐ、５００ｂｐ、１０００ｂｐ、及び２０００ｂｐ。これらの配列は、各ウイルスゲノムの相対ＧＣ含有率と一致するように設計する：ＴＴＶ−ｔｔｈ８への挿入については約５０％ＧＣ、及びＴＴＭＶ−ＬＹ２については約３８％ＧＣ。加えて、いくつかのトランス遺伝子をＮＣＲに挿入する。これらは、Ｕ６プロモータ（３５１ｂｐ）に駆動されるｍｉＲＮＡ及び構成性ｈＥＦ１ａプロモータ（２５０９ｂｐ）に駆動されるＥＧＦＰを含む。
【０７４３】
様々なサイズのＤＮＡ挿入片を含むＴＴＶ−ｔｔｈ８及びＴＴＭＶ−ＬＹ２を、前述の通りに、ＨＥＫ２９３及びＡ５４９などの哺乳動物細胞株にトランスフェクトする。ウイルスを上清又は細胞ペレットから単離する。単離したウイルスを用いて、別の細胞に感染させる。感染細胞からのウイルスの産生を定量ＰＣＲによりモニターする。一部の実施形態では、ウイルス産生の達成は、挿入の許容を示す。
【０７４４】
実施例１１：送達しようとする例示的な積荷
この実施例は、例えば、本明細書に記載するクロン、例えば、アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）に基づくクロンを用いて送達することができる例示的なクラスの核酸及びタンパク質ペイロードを説明する。
【０７４５】
ペイロードの一例は、タンパク質発現のためのｍＲＮＡである。目的のコード配列は、ウイルス源（例えば、アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）に対してネイティブのウイルスプロモータ、又はトランス遺伝子の一部としてペイロードと一緒に導入されたプロモータのいずれかから転写する。或いは、ｍＲＮＡをウイルスｍＲＮＡのオープンリーディングフレーム内でコード化することにより、ウイルスタンパク質と目的のタンパク質との融合物を取得する。必要に応じて、切断ドメイン、例えば、２Ａペプチド又はプロテイナーゼ標的部位を用いて、ウイルスタンパク質から目的のタンパク質を分離してもよい。
【０７４６】
ノンコーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）は、ペイロードの別の例である。これらのＲＮＡは、一般に、Ｕ６又はＶＡなどのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータを用いて転写される。或いは、ｎｃＲＮＡは、ネイティブウイルスプロモータ又は調節可能な合成プロモータなどのＲＮＡポリメラーゼＩＩを用いて転写される。ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモータから発現される場合、ｎｃＲＮＡは、ｍＲＮＡエキソン、イントロンの一部として、又はポリ−Ａシグナル下流で転写されるエキストラＲＮＡとしてコード化される。ｎｃＲＮＡは、多くの場合、より大きなＲＮＡ分子としてコード化されるか、又はリボザイム又はエンドリボヌクレアーゼを用いて切断される。クロンのゲノム内の積荷としてコード化することができるｎｃＲＮＡとしては、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、ｍｉＲＮＡスポンジ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が挙げられる。
【０７４７】
ＤＮＡは、ＲＮＡ転写を必要とせずに、機能性エレメントとして使用することができる。例えば、ＤＮＡは、相同組換えのための鋳型として用いることができる。別の例では、タンパク質結合ＤＮＡ配列を用いて、キャプシド内（例えば、クロンのタンパク質性外層内）への目的のタンパク質のパッケージングを駆動することができる。相同組換えのために、ヒトゲノムＤＮＡに対する相同性領域を、相同性アームとして作動するようにベクターＤＮＡにコード化する。組換えは、標的化エンドヌクレアーゼ（ｇＲＮＡを有するＣａｓ９、又はジンクフィンガーヌクレアーゼなど）により駆動することができ、これは、ベクター又は別の供給源のいずれかから発現させることができる。細胞内部で、一本鎖ＤＮＡゲノムを二本鎖ＤＮＡに変換すると、これは、ゲノムＤＮＡ切断部位での相同組換え用の鋳型の役割を果たす。目的のタンパク質を動員するために、タンパク質結合配列をクロンＤＮＡにコード化することができる。目的のＤＮＡ結合タンパク質、又はＤＮＡ結合タンパク質（Ｇａｌ４など）と融合した目的のタンパク質は、クロンＤＮＡに結合する。クロンＤＮＡがキャプシドタンパク質により包膜されると、ＤＮＡ結合タンパク質も包膜されるため、クロンと一緒に細胞に送達することができる。
【０７４８】
実施例１２：例示的なペイロード組込み遺伝子座
この実施例は、核酸ペイロードを挿入することができるＴＴＶ−ｔｔｈ８（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＪ６２０２３１．１）及びＴＴＭＶ−ＬＹ２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＪＸ１３４０４５）のゲノム内の例示的な遺伝子座を説明する。
【０７４９】
ＴＴＶ−ｔｔｈ８（ヌクレオチド３３６〜３０１５）及びＴＴＭＶ−ＬＹ２（ヌクレオチド４２４〜２８１２）のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内への挿入のために、いくつかの戦略を使用することができる。一例では、ウイルスタンパク質にタグ付けするか、又は融合タンパク質を作出するために、目的の特定のＯＲＦ内のフレーム中にペイロードを挿入する。或いは、ＯＲＦ領域の一部又は全部を欠失させるが、これにより、ウイルスタンパク質機能が破壊するか、又は破壊しない場合もある。次に、ペイロードを欠失領域に挿入する。加えて、ＴＴＶ−ｔｔｈ８（ヌクレオチド７１６〜２３６２の間）又はＴＴＭＶ−ＬＹ２（ヌクレオチド７２４〜２２７３の間）のＯＲＦ１内の超可変ドメイン（ＨＶＤ）を挿入部位として用いることもできる。
【０７５０】
或いは、ペイロード挿入を、ＴＴＶ−ｔｔｈ８又はＴＴＭＶ−ＬＹ２のノンコーディング領域（ＮＣＲ）と同等のベクターの領域に作製する。特に、ＴＡＴＡボックスの５’ＮＣＲ上流、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、ポリ−Ａシグナルの３’ＮＣＲ下流、及びＧＣリッチ領域の上流に挿入を作製する。さらに、ＴＴＶ−ｔｔｈ８（ヌクレオチド３４２９〜３５０６）のｍｉＲＮＡ領域にも挿入を作製する。５’ＮＣＲ領域の場合、挿入は、ＴＡＴＡボックスの上流（ＴＴＶ−ｔｔｈ８のヌクレオチド１〜８２の間、及びＴＴＭＶ−ＬＹ２のヌクレオチド１〜２３６の間）に作製する。一部の実施形態では、プロモータ干渉を低減するために、トランス遺伝子を逆方向に挿入する。５’ＵＴＲの場合、挿入は、転写開始部位の下流（ＴＴＶ−ｔｔｈ８のヌクレオチド１１１、及びＴＴＭＶ−ＬＹ２のヌクレオチド２６７）で、且つＯＲＦ２開始コドンの上流（ＴＴＶ−ｔｔｈ８のヌクレオチド３３６、及びＴＴＭＶ−ＬＹ２のヌクレオチド４２１）に作製する。５’ＵＴＲ挿入は、５’ＵＴＲ内にヌクレオチドを付加又は置換する。３’ＮＣＲ挿入は、ＧＣリッチ領域の上流、特に、実施例１０に記載の通り、ＴＴＶ−ｔｔｈ８のヌクレオチド３５８８又はＴＴＭＶ−ＬＹ２のヌクレオチド２８４３後に作製する。ＴＴＶ−ｔｔｈ８のｍｉＲＮＡは、代替の天然又は合成ｍｉＲＮＡヘアピンにより置換される。
【０７５１】
実施例１３：アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）の規定カテゴリー及びその保存領域
ヒトに存在する３つのアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）属がある：アルファトルクウイルス属（ａｌｐｈａｔｏｒｑｕｅｖｉｒｕｓ）（トルク・テノウイルス（Ｔｏｒｑｕｅ  Ｔｅｎｏ  Ｖｉｒｕｓ）、ＴＴＶ）、ベータトルクウイルス属（ｂｅｔａｔｏｒｑｕｅｖｉｒｕｓ）（トルク・テノミディウイルス（Ｔｏｒｑｕｅ  Ｔｅｎｏ  Ｍｉｄｉ  Ｖｉｒｕｓ）、ＴＴＭＤＶ）、及びガンマトルクウイルス属（ｇａｍｍａｔｏｒｑｕｅｖｉｒｕｓ）（トルク・テノミニウイルス（Ｔｏｒｑｕｅ  Ｔｅｎｏ  Ｍｉｎｉ  Ｖｉｒｕｓ）、ＴＴＭＶ）。アルファトルクウイルス属（ａｌｐｈａｔｏｒｑｕｅｖｉｒｕｓ）には、５つの十分に支持される系統発生クレードがある（図１１Ｃ）。本明細書に記載のクロンを生産するために、アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）のいずれかをウイルス源（例えば、ウイルスＤＮＡ配列の供給源）として用いることができると考えられる。
【０７５２】
これらの配列の中でも、最も高い保存は、５’ＵＴＲドメイン（約７５％保存）及びＧＣリッチドメイン（１００超の塩基対、７０％超のＧＣ含有率、約７０％保存）に見出される。さらに、配列内の超可変ドメイン（ＨＶＤ）は、非常に低い保存（約３０％保存）を有する。全てのアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）はまた、３つのリーディングフレーム全てがオープンである領域も含む。
【０７５３】
本明細書にはまた、ＴＴＶクレード、並びにＴＴＭＤＶ及びＴＴＭＶの各々由来の代表的なウイルスの例示的な配列も提供し、これらは、保存領域と共にアノテートする（例えば、表１〜１４を参照）。
【０７５４】
実施例１４：複製欠損クロン及びヘルパーウイルス
クロンの複製及びパッケージングのために、いくつかのエレメントをトランスで提供することができる。これらは、ＤＮＡ複製又はパッケージングを指令若しくは支持するタンパク質又はノンコーディングＲＮＡを含む。トランスエレメントは、一部の事例において、ヘルパーウイルス、プラスミドなどのクロンに代わる供給源、又は細胞ゲノムから供給することができる。
【０７５５】
他のエレメントは、典型的に、シスで提供される。これらのエレメントは、例えば、複製起点として作用するクロンＤＮＡ（例えば、クロンＤＮＡの増幅を可能にするために）又はパッケージングシグナル（例えば、タンパク質を結合して、ゲノムをキャプシドにロードするために）内の配列又は構造であってよい。一般に、複製欠損ウイルス又はクロンは、これらのエレメントの１つ又は複数が欠失しているため、他のエレメントがトランスで提供されても、ＤＮＡは、感染性ビリオン又はクロンにパッケージされることが不可能である。
【０７５６】
複製欠損ウイルスは、例えば、同じ細胞内でのクロン（例えば、複製欠損クロン又はパッケージング欠損クロン）の複製を制御するために、ヘルパーウイルスとして有用となり得る。一部の事例では、ヘルパーウイルスは、シス複製又はパッケージングエレメントを欠失しているが、タンパク質及びノンコーディングＲＮＡなどのトランスエレメントは発現する。一般に、治療用クロンは、これらのトランスエレメントの一部又は全部を欠失しているため、それ自体で複製することはできないが、シスエレメントは保持する。細胞に同時トランスフェクト／感染すると、複製欠損ヘルパーウイルスは、クロンの増幅及びパッケージングを駆動する。そのため、収集されるパッケージ粒子は、治療用クロンだけから構成され、ヘルパーウイルス混入を含まない。
【０７５７】
複製欠損クロンを作製するために、アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）のノンコーディング領域内の保存エレメントを除去する。特に、保存５’ＵＴＲ及びＧＣリッチドメインの欠失を個別に、及び一緒に試験する。両エレメントは、ウイルス複製又はパッケージングに重要であると考えられる。加えて、これまで不明であった目的の領域を同定するために、ノンコーディング領域全体にわたって一連の欠失を実施する。
【０７５８】
複製エレメントの欠失が達成されると、例えば、ｑＰＣＲにより測定した場合、細胞内のクロンＤＮＡ増幅の低減が起こるが、例えば、感染細胞に対するアッセイ（ｑＰＣＲ、ウエスタンブロット、蛍光アッセイ、又はルミネセンスアッセイのいずれか若しくは全てを含み得る）によりモニターした場合、一部の感染性クロン産生を支持するであろう。パッケージングエレメントの欠失の達成は、クロンＤＮＡ増幅を崩壊させないため、ｑＰＣＲによって、トランスフェクト細胞にクロンＤＮＡの増加が観察されるであろう。しかし、クロンゲノムは包膜されないため、感染性クロンの産生は観察されないであろう。
【０７５９】
実施例１５：複製可能クロンの製造方法
この実施例は、複製可能クロンの回収及びその生産のスケール拡大方法を説明する。クロンは、細胞内で複製するのに必要な全ての遺伝子エレメント及びＯＲＦをそのゲノムにコード化するとき、複製可能である。これらのクロンは、その複製に欠損がないため、トランで提供される補完活性を必要としない。しかしながら、これらは、転写のエンハンサー（例えば、酪酸ナトリウム）又はウイルス転写因子（例えば、アデノウイルスＥ１、Ｅ２、Ｅ４、ＶＡ；ＨＳＶ  Ｖｐ１６及び前初期タンパク質）などのヘルパー活性を必要とし得る。
【０７６０】
この実施例では、線状又は環状いずれかの形態の合成クロンの完全長配列をコード化する二本鎖ＤＮＡを、Ｔ７５フラスコ内の５Ｅ＋０５接着哺乳動物細胞に化学トランスフェクションにより、又は懸濁液中の５Ｅ＋０５細胞にエレクトロポレーションにより導入する。最適時間後（例えば、トランスフェクションから３〜７日後）に、細胞を上清培地中に掻き入れることにより、細胞及び上清を収集する。胆汁酸塩などの中性洗剤を最終濃度０．５％まで添加した後、３７℃で３０分間インキュベートする。塩化カルシウム及びマグネシウムをそれぞれ最終濃度０．５ｍＭ及び２．５ｍＭまで添加する。エンドヌクレアーゼ（例えば、ＤＮＡｓｅ  Ｉ、ベンゾナーゼ）を添加し、２５〜３７℃で０．５〜４時間インキュベートする。クロン懸濁液を１０００×ｇで、４℃にて１０分間遠心分離する。清澄化した上清を新しいチューブに移し、凍結防止バッファー（安定化バッファーとしても知られる）で１：１希釈した後、必要に応じて−８０℃で保存する。これは、継代０のクロン（Ｐ０）を産生する。洗剤の濃度を培養細胞に用いられる安全限界未満にするために、この接種材料をクロン力価に応じて、無血清培地（ＳＦＭ）中で少なくとも１００倍以上に希釈する。
【０７６１】
Ｔ２２５フラスコ内の新鮮な単層の哺乳動物細胞を、培養物表面を被覆するのに十分な最少量で覆い、穏やかに揺らしながら、３７℃及び５％二酸化炭素で９０分間インキュベートする。このステップに用いる哺乳動物細胞は、Ｐ０回収に用いたものと同じ細胞型であってもよいし、そうでなくてもよい。このインキュベーション後、接種材料を４０ｍｌの無血清、非動物由来培地に取り替えた。細胞を３７℃及び５％二酸化炭素で３〜７日間インキュベートする。先に使用したのと同じ中性洗剤の４ｍｌの１０×溶液を添加して、最終洗剤濃度０．５％を達成してから、混合物を穏やかに攪拌しながら、３７℃で３０分間インキュベートする。エンドヌクレアーゼを添加し、２５〜３７℃で０．５〜４時間インキュベートする。次に、培地を収集し、１０００×ｇで、４℃にて１０分間遠心分離する。清澄化した上清を４０ｍｌの安定化バッファーと混合した後、−８０℃で保存する。これは、シードストック、又は継代１のクロン（Ｐ１）を産生する。
【０７６２】
ストックの力価に応じて、これをＳＦＭ中で１００倍以下に希釈してから、必要なサイズの多層フラスコで増殖させた細胞に添加する。感染多重度（ＭＯＩ）及びインキュベーション時間を、より小さなスケールで最適化して、最大クロン産生を確実にする。採取した後、必要に応じて、クロンを精製及び濃縮してもよい。例えば、本実施例に記載するようなワークフローを示す概略図を図１２に提供する。
【０７６３】
実施例１６：複製欠損クロンの製造方法
この実施例は、複製欠損クロンの回収及び生産スケール拡大方法を説明する。
【０７６４】
複製に関与する１つ又は複数のＯＲＦ（例えば、ＯＲＦ１、ＯＲＦ１／１、ＯＲＦ１／２、ＯＲＦ２、ＯＲＦ２／２、ＯＲＦ２／３、及び／又はＯＲＦ２ｔ／３）の欠失により、クロンを複製欠損にすることができる。複製欠損クロンは、補完細胞株において増殖させることができる。このような細胞株は、クロン増殖を促進するが、クロンのゲノム内では存在しないか、又は非機能性である構成体を構成的に発現する。
【０７６５】
一例では、クロン増殖に関与する任意のＯＲＦの配列を、選択マーカをコード化する安定した細胞株の作製に好適なレンチウイルス（ｌｅｎｔｉ  ｖｉｒｕｓ）発現系にクローニングすると、本明細書に記載のようにレンチウイルス（ｌｅｎｔｉ  ｖｉｒｕｓ）ベクターが産生される。クロン増殖を支持することができる哺乳動物細胞株をこのレンチウイルス（ｌｅｎｔｉ  ｖｉｒｕｓ）ベクターで感染させて、選択マーカ（例えば、プロマイシン又は他の抗生物質）による選択圧に付すことによって、クローニングされたＯＲＦを安定に組み込んだ細胞集団を選択する。この細胞株を特性決定して、この細胞株が操作クロンの欠損を補完し、従って、こうしたクロンの成長及び増殖を支持することが証明されたら、これを拡大し、凍結保存で保管する。これらの細胞の拡大及び維持の間、選択圧を維持するために、選択抗生物質を培地に添加する。クロンがこれらの細胞に導入されたら、選択抗生物質の添加を停止してもよい。
【０７６６】
この細胞株が樹立されたら、例えば、実施例１５に記載のように、複製欠損クロンの増殖及び産生を実施する。
【０７６７】
実施例１７：懸濁細胞を用いたクロンの生産
この実施例は、懸濁液中の細胞におけるクロンの生産を説明する。
【０７６８】
この実施例では、懸濁液条件下で増殖するように改変されたＡ５４９又は２９３Ｔプロデューサ細胞を、３７℃及び５％二酸化炭素のＷＡＶＥバイオリアクターバッグ内の動物性成分及び抗生物質無添加の懸濁培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で増殖させる。これらの細胞は、１×１０６生存細胞／ｍＬで接種され、クロン配列を含むプラスミド、さらには、クロンをパッケージするのに好適又は必要な任意の補完プラスミドと一緒に（例えば、実施例１６に記載の通り、複製欠損クロンの場合）、現在の適正製造基準（ｃＧＭＰ）に従い、リポフェクタミン２０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてトランスフェクトする。補完プラスミドは、一部の事例において、クロンゲノム（例えば、ウイルスゲノム、例えば、本明細書に記載のように、アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ゲノムに基づくクロンゲノム）から欠失されているが、クロンの複製及びパッケージングに有用又は必要なウイルスタンパク質をコード化することができる。トランスフェクト細胞をＷＡＶＥバイオリアクターバッグ内で増殖させた後、上清を下記の時点：トランスフェクションから４８、７２、及び９６時間後に採取する。遠心分離を用いて、各サンプルの細胞ペレットから上清を分離する。次に、採取した上清及び溶解細胞ペレットから、イオン交換クロマトグラフィーを用いて、パッケージクロン粒子を精製する。
【０７６９】
例えば、精製調製物の少量アリコートを用いて、ウイルスゲノム抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）によりクロンゲノムを採取した後、例えば、実施例１８に記載の通り、クロンＤＮＡ配列に対してターゲティングさせるプライマー及びプローブを用いたｑＰＣＲを実施することにより、クロンの精製調製物中のゲノム当量を決定することができる。
【０７７０】
精製調製物中のクロンの感染力は、新しいＡ５４９細胞に感染する精製調製物の階段希釈物を調製することにより、定量することができる。トランスフェクションから７２時間後にこれらの細胞を採取し、クロンＤＮＡ配列に特異的なプライマー及びプローブを用いて、ゲノムＤＮＡに関するｑＰＣＲアッセイを実施する。
【０７７１】
実施例１８：ｑＰＣＲによるクロンゲノム当量の定量
この実施例は、クロンを定量するための加水分解プローブベースの定量ＰＣＲアッセイの開発を明らかにする。最終ユーザ最適化を含むソフトウェアＧｅｎｅｉｏｕｓを用いて、ＴＴＶ（アクセッション番号：ＡＪ６２０２３１．１）及びＴＴＭＶ（アクセッション番号：ＪＸ１３４０４５．１）の選択ゲノム配列に基づいて複数セットのプライマー及びプローブを設計した。プライマー配列を以下の表２３に示す。
【０７７２】
【表２３】
2020524993.tif 000227
【０７７３】
開発プロセスの第１ステップとして、プライマー特異性を確認するために、ＳＹＢＲグリーンケミストリーと共にＴＴＶ及びＴＴＭＶプライマーを用いて、ｑＰＣＲを実行する。図１３は、各プライマーペアの１つの明瞭な増幅ピークを示す。
【０７７４】
５’末端の蛍光団６ＦＡＭ、及び３’末端のマイナーグルーブ結合非蛍光クエンチャー（ＭＧＢＮＦＱ）で標識した加水分解プローブを注文した。次に、標準曲線の成分として精製プラスミドＤＮＡと漸増濃度のプライマーを用いた２つの異なる市販のマスターミックスを使用して、新しいプライマー及びプローブのＰＣＲ効率を評価した。異なるセットのプライマー−プローブに対する標的配列を含む精製プラスミドを用いて、標準曲線を作成した。７ｌｏｇにわたる線形範囲と、２０ｕｌ反応物当たり１５コピーの定量下限を達成するために、７回の１０倍階段希釈を実施した。マスターミックス＃２は、９０〜１１０％のＰＣＲ効率、すなわち、定量ＰＣＲに許容可能な値を生み出すことができた（図１４）。ｑＰＣＲ用のプライマーは全て、ＩＤＴから注文した。蛍光団６ＦＡＭ及びマイナーグルーブ結合非蛍光クエンチャー（ＭＧＢＮＦＱ）に共役した加水分解プローブ並びに全てのｑＰＣＲマスターミックスは、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒから入手した。例示的な増幅プロットを図１５に示す。
【０７７５】
これらのプライマー−プローブセット及び試薬を用いて、クロンストック中のゲノム当量（ＧＥｑ）／ｍｌを定量した。線形範囲は、２０ｕｌ反応物当たり１．５Ｅ＋０７〜１５ＧＥｑであったが、次にこれを用いて、図１６Ａ〜１６Ｂに示すように、ＧＥｑ／ｍｌを計算した。線形範囲より高い濃度を有するサンプルは、必要に応じて希釈することができる。
【０７７６】
実施例１９：マウスにおいて外性タンパク質を発現させるためのクロンの使用
この実施例は、マウスにおいてホタルルシフェラーゼタンパク質を発現するように、トルク・テノミニウイルス（Ｔｏｒｑｕｅ  Ｔｅｎｏ  Ｍｉｎｉ  Ｖｉｒｕｓ）（ＴＴＭＶ）が操作されているクロンの使用を説明する。
【０７７７】
ホタルルシフェラーゼ遺伝子をコード化する操作ＴＴＭＶのＤＮＡ配列をコード化するプラスミドを化学トランスフェクションによりＡ５４９細胞（ヒト肺癌細胞株）に導入する。１８ｕｇのプラスミドＤＮＡを１０ｃｍ組織培養プレート内の７０％密集細胞のトランスフェクションに使用する。ＴＴＭＶ配列が欠失した空ベクター骨格を陰性対照として用いた。トランスフェクションから５時間後、細胞をＰＢＳで２回洗浄してから、３７℃及び５％二酸化炭素の新鮮な増殖培地中で増殖させた。
【０７７８】
トランスフェクションから９６時間後、トランスフェクトＡ５４９細胞をその上清と一緒に採取する。採取した材料を０．５％デオキシコール酸塩（重量／体積）で３７℃にて１時間処理した後、エンドヌクレアーゼ処理を実施する。イオン交換クロマトグラフィーを用いて、この溶解物からクロン粒子を精製する。クロン濃度を決定するために、クロンストックのサンプルをウイルスＤＮＡ精製キットに通過させ、クロンＤＮＡ配列に向けてターゲティングされたプライマー及びプローブを用いて、ｍｌ当たりのゲノム当量をｑＰＣＲにより測定する。
【０７７９】
１×リン酸緩衝食塩水中のクロンのゲノム当量の用量範囲を８〜１０週齢のマウスに様々な注射経路で（例えば、静脈内、腹腔内、皮内、筋肉内）実施する。注射から３、７、１０及び１５日後、各動物について背側及び腹側バイオルミネセンスイメージングを実施する。イメージングは、製造者のプロトコルに従って、指示時点に各動物にルシフェラーゼ基質（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を腹腔内添加した後、生体内イメージングすることにより実施する。
【０７８０】
実施例２０：クロンＤＮＡが宿主ゲノムに組み込まれたか否かを決定するためのゲノムアラインメント
この実施例は、トルク・テノウイルス（Ｔｏｒｑｕｅ  Ｔｅｎｏ  Ｖｉｒｕｓ）（ＴＴＶ）がヒトゲノムに組み込まれたか否かを調べることによって、クロンＤＮＡが宿主ゲノムに組み込まれ得るか否かを決定するために実施されるコンピュータ分析を説明する。
【０７８１】
配列間の局所類似性の領域を見出すＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）を用いて、クレード１〜５の各々から１つの代表的なＴＴＶ配列の完全なゲノムをヒトゲノム配列に対してアラインメントした。表２４に示す代表的なＴＴＶ配列を分析した：
【０７８２】
【表２４】
2020524993.tif 000228
【０７８３】
アラインメントしたＴＴＶのいずれに由来する配列も、ヒトゲノムに対して有意な類似性がないことが判明し、これは、ＴＴＶが、ヒトゲノムに組み込まれていないことを示している。
【０７８４】
実施例２１：宿主ゲノムへのクロン組込みの評価
この実施例では、Ａ５４９細胞（ヒト肺癌細胞株）及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ヒト胎児腎細胞株）をクロン粒子又はＡＡＶ粒子のいずれかに、５、１０、３０若しくは５０のＭＯＩで感染させる。感染から５時間後、細胞をＰＢＳで洗浄してから、新鮮な増殖培地に取り換える。次に、細胞を３７℃及び５％二酸化炭素で増殖する。感染から５日後、細胞を採取し、ゲノムＤＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、これらを処理することにより、ゲノムＤＮＡを採取する。また、非感染細胞（陰性対照）からもゲノムＤＮＡを採取する。Ｎｅｘｔｅｒａ  ＤＮＡライブラリー調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて、製造者のプロトコルに従い、これらの採取したＤＮＡについて全ゲノムシーケンシングライブラリーを調製する。ＮｅｘｔＳｅｑ  ５５０システム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて、製造者のプロトコルに従い、ＤＮＡライブラリーをシーケンシングする。シーケンシングデータを参照ゲノムに対してアセンブルし、分析して、クロン又はＡＡＶゲノムと宿主ゲノム同士のジャンクションを探す。ジャンクションが検出される場合、これらを、ＰＣＲによるシーケンシングライブラリー調製前の元のゲノムＤＮＡサンプル中で確認する。ジャンクションを含み、それを取り囲む領域を増幅するように、プライマーを設計する。ｑＰＣＲによりジャンクションの数（組込み事象を表す）及びサンプル中のクロンコピーの総数を定量することによって、宿主ゲノムへのクロンの組込みの頻度を決定する。この比率をＡＡＶのものと比較することができる。
【０７８５】
実施例２２：外性マイクロＲＮＡ配列を発現するクロンの機能効果
この実施例には、外性マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）配列を発現するクロンの機能の実証の達成を記載する。
【０７８６】
３’ノンコーディング領域（ＮＣＲ）に下記の外性マイクロＲＮＡ配列の１つを含むクロンＤＮＡ配列を作製した：
１）ｍｉＲ−１２４
２）ｍｉＲ−５１８
３）ｍｉＲ−６２５
４）非ターゲティングスクランブルｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−ｓｃｒ）
【０７８７】
これは、ＴＴＶ−ｔｔｈ８のｔｔｈ８−Ｔ１  ｍｉＲＮＡのｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列を、前述したｍｉＲＮＡのｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列で置換することにより実施した。次に、クロンＤＮＡをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に個別にトランスフェクトした。トランスフェクションから９６時間後、トランスフェクト２９３Ｔ細胞を上清と一緒に採取した。採取した材料を３７℃にて０．５％デオキシコール酸塩（重量／体積）で処理した後、エンドヌクレアーゼ処理を実施した。パッケージされたクロン（クロンのＰ０ストック）を含むこの溶解物を用いて、新しい２９３Ｔ細胞を感染させた。感染から９６時間後、これらの細胞を採取した。次に、採取した材料を３７℃にて０．５％デオキシコール酸塩（重量／体積）で処理した後、エンドヌクレアーゼ処理を実施した。次に、この溶解物を４℃のＰＢＣ中の１０Ｋ分子量カットオフ透析カセットで一晩透析して、デオキシコール酸塩を全て除去した。ｑＰＣＲを用いて、これらの透析済溶解物（クロンのＰ１ストック）中でクロンの力価を定量した。次に、クロンのＰ１ストックをいくつかのＫＲＡＳ突然変異非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞株（ＳＷ９００、ＮＣＩ−Ｈ４６０、及びＡ５４９）と一緒に、細胞当たり２７４ゲノム当量の力価で、３日間インキュベートした。Ａｌａｍａｒブルーアッセイにより細胞生存能を測定した。図１７Ａに示すように、外性ｍｉＲ−６２５を発現するクロンは、スクランブルされた非標的化ｍｉＲＮＡを発現する対照クロンに感染させた細胞及び非感染細胞と比較して、３つのＮＳＣＬＣ細胞株全てにおいて癌細胞株の生存能を有意に阻害した。
【０７８８】
加えて、ＹＦＰ−リポータアッセイを用いて、クロンｍｉＲＮＡによる、その標的部位に対する部位特異的結合による標的の下方制御を決定した。ｍｉＲ−６２５に対する特異的結合配列を有するＹＦＰリポータを作製して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションから２４時間後、これらのＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ｍｉＲ−６２５又は非特異的ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−１２４）のいずれかを発現するクロンに、細胞当たり２．４ゲノム当量の力価で感染させた後、フローサイトメトリーを用いてＹＦＰ蛍光を測定した。図１７Ｂに示すように、ｍｉＲ−６２５を発現するクロンは、ＹＦＰ発現を有意に下方制御したが、非特異的ｍｉＲＮＡ  ｍｉＲ−１２４を発現するクロンは、ＹＦＰ発現に影響を与えなかった。これらの結果は、ｍｉＲ−６２５を有するクロンが、ＹＦＰタンパク質標的のオンターゲット下方制御を誘導したことを示している。
【０７８９】
外性ｍｉＲＮＡを発現するクロンが、宿主遺伝子発現を調節する能力も試験した。ＳＷ−９００ＮＳＣＬＣ細胞を、ｍｉＲ−５１８又はｍｉＲ−６２５又はｍｉＲ−ｓｃｒのいずれかを発現するクロンに、細胞当たり１０ゲノム当量の用量で感染させた。感染から７２時間後、感染細胞を採取し、全タンパク質溶解物を調製した。これらのタンパク質溶解物についてイムノブロット分析を実施して、ｐ６５タンパク質のレベルを決定した。ｐ６５タンパク質シグナルの強度を、各サンプルについて膜上のタンパク質の総量に対して正規化した（図１７Ｃ）。ｐ６５レベルの低下が観察されたが、これは、クロンが宿主遺伝子の発現を調節することができることを示している。
【０７９０】
実施例２３：外性ノンコーディングＲＮＡを発現するためのクロンの調製及び生産
この実施例は、外性低分子ノンコーディングＲＮＡを発現するためのクロンの合成及び生産を説明する。
【０７９１】
ＴＴＶのｔｔｈ８株からのＤＮＡ配列（Ｊｅｌｃｉｃ  ｅｔ  ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００４）を合成し、細菌の複製起点と細菌の抗生物質耐性遺伝子を含むベクターにクローニングする。このベクターでは、ＴＴＶ  ｍｉＲＮＡヘアピンをコード化するＤＮＡ配列は、ｍｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡなどの外性低分子ノンコーディングＲＮＡをコード化するＤＮＡ配列により置換される。次に、操作構築物をエレクトロコンピテント細菌に形質転換した後、製造者のプロトコルに従い、プラスミド精製キットを用いてプラスミド単離を実施する。
【０７９２】
外性低分子ノンコーディングＲＮＡをコード化するクロンＤＮＡを真核プロデューサ細胞株にトランスフェクトして、クロン粒子を産生させる。トランスフェクション後の様々な時点で、クロン粒子を含有するトランスフェクト細胞の上清を採取する。ろ過した上清からのクロン粒子又は精製後のクロン粒子のいずれかを、例えば、本明細書に記載のように下流適用のために使用する。
【０７９３】
実施例２４：アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）クレードにおける保存
この実施例は、アルファトルクウイルス（ａｌｐｈａｔｏｒｑｕｅｖｉｒｕｓ）属の５つのクレードの同定を説明する。各クレード内の平均ペアワイズ同一性は、一般に、６６〜９０％の範囲である（図１８）。これらのクレード間の代表的な配列は、配列全域で５７．２％のペアワイズ同一性を示した（図１９）。ペアワイズ同一性は、オープンリーディングフレーム間で最も低く（約５１．４％）、ノンコーディング領域でより高い（５’ＮＣＲで６９．５％、３’ＮＣＲで７２．６％）（図１９）。これは、ノンコーディング領域内のＤＮＡ配列又は構造が、ウイルス複製に重要な役割を果たすことを示唆している。
【０７９４】
アルファトルクウイルス（ａｌｐｈａｔｏｒｑｕｅｖｉｒｕｓ）中の推定タンパク質のアミノ酸配列も比較した。ＤＮＡ配列は、約４９〜５４％のペアワイズ同一性を示したのに対し、アミノ酸配列は、約２９〜３６％のペアワイズ同一性を示した（図２０）。興味深いことには、アルファトルクウイルス（ａｌｐｈａｔｏｒｑｕｅｖｉｒｕｓ）クレードからの代表的な配列は、インビボで複製を達成することができ、また、ヒト集団に認められる。これは、アネロウイルスタンパク質のアミノ酸配列が、複製及びパッケージングなどの機能性を保持しながら、大きく変動し得ることを示唆している。
【０７９５】
アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）は、ノンコーディング領域内に局所的に高い保存の領域を有することが判明した。プロモータ下流の領域には、７１−ｂｐ  ５’ＵＴＲ保存ドメインがあり、これは、５つのアルファトルクウイルス（ａｌｐｈａｔｏｒｑｕｅｖｉｒｕｓ）クレード間で９６．６％のペアワイズ同一性を有する（図２１）。アルファトルクウイルス（ａｌｐｈａｔｏｒｑｕｅｖｉｒｕｓ）の３’ノンコーディング領域内のオープンリーディングフレームの下流には、代表的な配列間で８５．２％のペアワイズ同一性を有する３０７ｂｐ領域がある（図１９）。この３’保存ノンコーディング領域の３’末端付近には、９６．５％のペアワイズ同一性を有する高度に保存された５１ｂｐ配列がある。この分析で試験された各アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）は、７０％を超えるＧＣ含有率を有するＧＣリッチ領域も含む（図２２）。
【０７９６】
実施例２５：クロンからの外性ｍｉＲＮＡの発現及び外性ｍｉＲＮＡの欠失
１実施例では、ＴＴＶ−ｔｔｈ８株に基づくクロンを用いて、培養中のＲａｊｉ  Ｂ細胞を感染させた。これらのクロンは、ＴＴＶ−ｔｔｈ８アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）の内在性ペイロードをコード化する配列を含み、それは、ｎ−ｍｙｃ相互作用タンパク質（ＮＭＩ）をコード化するｍＲＮＡをターゲティングするｍｉＲＮＡである。ＮＭＩは、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の下流で作動して、インターフェロン刺激遺伝子、増殖及び成長遺伝子、並びに炎症反応の媒介物質をはじめとする多様な細胞内シグナルの転写を調節する。図２３Ａに示すように、クロンは、Ｒａｊｉ  Ｂ細胞への感染を達成することができた。ＮＭＩに対するｍｉＲＮＡを含むクロンを有する細胞の感染によって、ＮＭＩに対するｍｉＲＮＡを含まないクロンに感染させた対照細胞と比較して、ＮＭＩのノックダウンが達成された（図２３Ｂ）。ＮＭＩに対するｍｉＲＮＡを含むクロンに感染させた細胞は、対照細胞と比較して、ＮＭＩタンパク質レベルの７５％超の低下を示した。この実施例は、ネイティブアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）ｍｉＲＮＡを含むクロンが、宿主細胞中の標的分子をノックダウンすることができることを実証する。
【０７９７】
別の実施例では、アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）に基づくクロンの内在性ｍｉＲＮＡを欠失させた。次に、得られたクロン（ΔｍｉＲ）を用いて、宿主細胞を感染させた。内在性ｍｉＲＮＡが保持された対応するクロンと、感染率を比較した。図２４に示すように、内在性ｍｉＲＮＡが欠失したクロンは、内在性ｍｉＲＮＡが依然として存在するクロンに認められるものと同等のレベルで細胞に依然として感染することができた。この実施例は、アネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）に基づくクロンの内在性ｍｉＲＮＡを突然変異させる、又は完全に欠失させても、依然として感染性粒子を産生することができることを実証する。
【図１】
2020524993.tif 000229
【図２】
2020524993.tif 000230
【図３】
2020524993.tif 000231
【図４】
2020524993.tif 000232
【図５】
2020524993.tif 000233
【図６Ａ】
2020524993.tif 000234
【図６Ｂ】
2020524993.tif 000235
【図７Ａ】
2020524993.tif 000236
【図７Ｂ】
2020524993.tif 000237
【図８Ａ】
2020524993.tif 000238
【図８Ｂ】
2020524993.tif 000239
【図９Ａ】
2020524993.tif 000240
【図９Ｂ】
2020524993.tif 000241
【図１０Ａ】
2020524993.tif 000242
【図１０Ｂ】
2020524993.tif 000243
【図１１Ａ−１１Ｂ】
2020524993.tif 000244
【図１１Ｃ】
2020524993.tif 000245
【図１２】
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【図１３】
2020524993.tif 000247
【図１４】
2020524993.tif 000248
【図１５】
2020524993.tif 000249
【図１６Ａ】
2020524993.tif 000250
【図１６Ｂ】
2020524993.tif 000251
【図１７Ａ】
2020524993.tif 000252
【図１７Ｂ】
2020524993.tif 000253
【図１７Ｃ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
2020524993.tif 000257
【図２１】
2020524993.tif 000258
【図２２】
2020524993.tif 000259
【配列表】
2020524993000001.app
【国際調査報告】
2020524993.tif 000260
2020524993.tif 000261
2020524993.tif 000262