(57)【要約】  オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）の移動、分化、増殖および／または成熟を必要としている対象でそれを高める方法は、ＰＴＰσの触媒活性、シグナル伝達、および機能の１つまたは複数を阻害する治療薬を対象に投与することを含む。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）の移動、分化、増殖および／または成熟を必要としている対象でそれを高める方法であって、ＰＴＰσの触媒活性、シグナル伝達、および機能の１つまたは複数を阻害する治療有効量の治療薬を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記治療薬が、治療用ペプチドを含み、前記治療用ペプチドが、ＰＴＰσのくさび形ドメインの約１０〜約２０個の連続するアミノ酸に対して少なくとも約８５％相同であるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記治療薬が、配列番号１〜２５、３２、３３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する治療用ペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記治療薬が、配列番号３２および配列番号３３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する治療用ペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記治療薬が、配列番号３２または配列番号３３に対して少なくとも約８５％相同であるアミノ酸配列を有する治療用ペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記治療用ペプチドが、配列番号３２の残基４、５、６、７、９、１０、１２もしくは１３または配列番号３３の残基７、８、９、１０、１２、もしくは１３の少なくとも１個の保存的置換を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記治療薬が、前記治療用ペプチドに連結され、前記ＯＰＣによる前記治療用ペプチドの取り込みを容易にする輸送部分を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記輸送部分がＨＩＶ  Ｔａｔ輸送部分である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記治療薬が、治療される前記対象に全身投与される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記対象が、ミエリン関連障害であるかまたはミエリン関連障害の危険がある、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ミエリン関連障害が、髄鞘破壊性障害、白質萎縮性障害または末梢神経系の脱髄性疾患の内の少なくとも１つを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ミエリン関連障害が、多発性硬化症である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記治療有効量が、前記対象の認知を高めるための有効量である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
治療を必要としている対象のミエリン関連疾患または障害を治療する方法であって、ＰＴＰσの触媒活性、シグナル伝達、および機能の１つまたは複数を阻害する治療有効量の治療薬を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項１５】
前記治療薬が、治療用ペプチドを含み、前記治療用ペプチドが、ＰＴＰσのくさび形ドメインの約１０〜約２０個の連続するアミノ酸に対して少なくとも約８５％相同であるアミノ酸配列を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記治療薬が、配列番号１〜２５、３２、３３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する治療用ペプチドを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記治療薬が、配列番号３２および配列番号３３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する治療用ペプチドを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記治療薬が、配列番号３２または配列番号３３に対して少なくとも約８５％相同であるアミノ酸配列を有する治療用ペプチドを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記治療用ペプチドが、配列番号３２の残基４、５、６、７、９、１０、１２もしくは１３または配列番号３３の残基７、８、９、１０、１２、もしくは１３の少なくとも１個の保存的置換を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記治療薬が、前記治療用ペプチドに連結され、オリゴデンドロサイト前駆細胞またはオリゴデンドロサイトによる前記治療用ペプチドの取り込みを容易にする輸送部分を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記輸送部分がＨＩＶ  Ｔａｔ輸送部分である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記治療薬が、治療される前記対象に全身投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
前記ミエリン関連障害が、髄鞘破壊性障害、白質萎縮性障害または末梢神経系の脱髄性疾患の内の少なくとも１つを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２４】
前記ミエリン関連障害が、多発性硬化症である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２５】
前記薬剤が、オリゴデンドロサイト前駆細胞の移動、分化、増殖および／または成熟を誘導、促進、および／または調節する、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１７年７月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／５３１，２５１号からの優先権を主張する。この仮出願の主題は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府の支援
本発明は、米国国立衛生研究所により授与された認可番号第ＮＳ０７７９４２号に基づく政府の支援によりなされた。米国政府は本発明に対し一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
多発性硬化症（ＭＳ）は、乏突起膠細胞（ＯＬ）のクラスターの劇的な減少に繋がる激しい炎症、脱髄、および不可逆的神経障害を特徴とする自己免疫媒介中枢神経系（ＣＮＳ）の慢性脱髄性疾患である。ＭＳの初期段階中に再ミエリン化が自然発生的に起こるが、これは、瘢痕様のプロテオグリカン含有プラークを発生している領域では、最終的に失敗する。しかし、失敗したオリゴデンドロサイト分化、成熟、および再ミエリン化の根底にある機序は、まだよく理解されていない。最近の研究では、ＯＰＣ成熟および機能におけるコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＣＳＰＧ）の調節作用が特定された。
【０００４】
ＣＳＰＧは、コアタンパク質に結合した硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の鎖から成る構造的細胞外マトリックス（ＥＣＭ）分子である。ＣＳＰＧの劇的な発現上昇は、脊髄損傷（ＳＣＩ）、てんかん、アルツハイマー病、ストロークおよびＭＳなどのＣＮＳ侵襲の顕著な特徴である。ＣＳＰＧの軸索再生に対する阻害的影響および脊髄損傷（ＳＣＩ）後の軸索終末の再生を封じ込めることによるジストロフィーエンドボール形成におけるそれらの役割に対する阻害的影響は、十分に実証されている。
【０００５】
ＭＳでは、アグリカンおよびバーシカンなどの反応性アストログリア産生ＣＳＰＧが、活性脱髄病変内で大量に検出された。許容的ラミニンは、ＯＬの拡散、生存、および成熟を促進するが、最近の研究は、阻害性ＣＳＰＧが、成長を支援するＥＣＭタンパク質を排除でき、移動、形態学的過程の延長、および成熟能力の低減を引き起こすことにより、マウスまたはヒトＯＰＣ／ＯＬを強力に減らすことができることを示している。しかし、ＣＳＰＧ阻害は、コンドロイチナーゼＡＢＣを介した酵素分解を行ってインビトロでＯＬ成熟を強化することにより軽減され得る。インビボでは、ＣＳＰＧは、一時的に、リゾレシチン（ＬＰＣ）誘導病変中で増大し、また、改善された再ミエリン化も同様に、プロテオグリカン合成阻害剤のベータ−ｄ−キシロシドまたはフルオロサミンなどによるＣＳＰＧ標的化治療後に起こり得る。
【発明の概要】
【０００６】
本明細書で記載の実施形態は、一般に、オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）の移動、分化、増殖および／または成熟を調節する薬剤、化合物、および方法、ミエリン形成を促進する方法、ならびにミエリン形成または再ミエリン化が対象にとって有益である対象の疾患または障害の治療方法に関する。
【０００７】
方法は、髄鞘破壊性障害、白質萎縮性障害または末梢神経系の脱髄性疾患などのミエリン関連障害を有するかまたはその危険のある対象に、ＰＴＰσの触媒活性、シグナル伝達、または機能の１つまたは複数を阻害する治療薬を投与することを含むことができる。
【０００８】
いくつかの実施形態では、治療薬には、治療用ペプチドを挙げることができる。治療用ペプチドは、ＰＴＰσのくさび形ドメインの約１０〜約２０個の連続するアミノ酸に対して少なくとも約６５％、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、少なくとも約９５％相同であるアミノ酸配列を有することができる。例えば、治療薬は、配列番号１〜２５、３２、および３３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する治療用ペプチドを含むことができる。
【０００９】
さらに他の実施形態では、治療薬は、配列番号３２のアミノ酸配列に対して少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％相同である配列同一性を有する治療用ペプチドを含むことができる。治療用ペプチドは、例えば、配列番号３２の残基４、５、６、７、９、１０、１２または１３個の内の少なくとも１、２、３または４個のアミノ酸の保存的置換を含むことができる。
【００１０】
他の実施形態では、治療薬は、配列番号３３のアミノ酸配列に対して少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％相同である配列同一性を有する治療用ペプチドを含むことができる。治療用ペプチドは、例えば、配列番号３３の残基７、８、９、１０、１２または１３個の内の少なくとも１、２、３または４個のアミノ酸の保存的置換を含むことができる。
【００１１】
他の実施形態では、治療薬は治療用ペプチドと連結され、オリゴデンドロサイト（ＯＬ）またはＯＰＣによる治療用ペプチドの取り込みを容易にする輸送部分を含む。例えば、輸送部分はＨＩＶのＴａｔ輸送部分または（ＰＲＲ５）輸送部分であり得る。
【００１２】
さらにその他の実施形態では、治療薬は、オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）の移動、分化、増殖および／または成熟を誘導または促進するための有効量で投与できる。いくつかの実施形態では、治療有効量は、対象の認知を高めるための有効量である。いくつかの実施形態では、治療薬は、全身投与できる。
【００１３】
いくつかの実施形態では、対象は、髄鞘破壊性障害、白質萎縮性障害または末梢神経系の脱髄性疾患などのミエリン関連障害を有するかまたはその危険がある。いくつかの実施形態では、ミエリン関連障害は、多発性硬化症である。
【００１４】
本開示はまた、インビボでのタンパク質チロシンホスファターゼσ（ＰＴＰσ）とのコンドロイチン硫酸プロテオグリカンベース相互作用および／またはタンパク質チロシンホスファターゼσ（ＰＴＰσ）のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンベース阻害を、防止または低減する方法、およびインビボでのＭＭＰ２活性および／または発現を高める方法を提供する。方法の実施形態は、本明細書で開示の治療薬を、それを必要としている対象に投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１Ａ−図１Ｊ。ＩＳＰがＥＡＥマウスモデルの機能および組織回復を促進することを示す。図１Ａ：臨床スコアにより決定された病気の開始時またはピーク時でのＥＡＥマウスへのＩＳＰ投与の図。図１Ｂ：疾患の発症時またはピーク時から開始して、ＩＳＰまたはビークルで毎日治療されたＭＯＧ３５−５５誘導ＥＡＥマウスにおける疾患重症度の臨床スコア。図１Ｃ：コホートＢのＥＡＥの動物毎の疾患スコアの平均改善。（ｎ＝９匹（ＥＡＥビークル群）、１５匹（ＥＡＥ  ＩＳＰ発症群）および１２匹（ＥＡＥ  ＩＳＰピーク群）、分散分析  Ｆ（２，３３）＝２０．９６；チューキーの多重比較検定、ＰＥＡＥ＋Ｖｅｈ  対  ＥＡＥ  ＩＳＰ発症＜０．０００１、ＰＥＡＥ＋Ｖｅｈ  対  ＥＡＥ  ＩＳＰピーク＝０．０００４）。１Ｄおよび１Ｅ：それぞれ、ミエリンのルクソール・ファスト・ブルー（ＬＦＢ）染色を示す免疫染色およびグラフで、誘導の４８日後に、ＩＳＰ治療ＥＡＥマウスの正常なミエリン完全性を示し、ビークル治療対照の脊髄中に存在するミエリンの顕著な減少とは対照的である。破線は、病変領域を区別する。スケールバー＝１００μｍ。（ｎ＝５匹のマウス／群、Ｐ＝０．０００２、ｔ＝６．６４７、ｄｆ＝８；対応のないスチューデントの両側ｔ検定。図１Ｆ：誘導の４８日後のビークル治療およびＩＳＰ治療ＥＡＥマウスの胸部脊髄中のＭＢＰおよび神経フィラメント−２００（ＮＦ２００）のダブル免疫染色。破線は、病変領域を区別する。スケールバー１００μｍ。図１Ｇ：ビークルまたはＩＳＰ治療対照マウスならびにＥＡＥマウスの脊髄組織中のＭＢＰ発現のウェスタンブロット分析。データは、β−アクチンタンパク質発現に正規化される。（ｎ＝４匹のマウス／群、分散分析  Ｆ（３，１２）＝２６．６８；チューキーの多重比較検定、Ｐｃｏｎ  対  ＥＡＥ＋Ｖｅｈ＝０．０００１、ＰＥＡＥ＋Ｖｅｈ  対  ＥＡＥ＋ＩＳＰ＝０．００３７）。図１Ｈ：誘導の４８日後のビークルおよびＩＳＰ１０７０治療ＥＡＥマウスの腹側腰髄由来の電子顕微鏡写真。スケールバー  ２μｍ。図１Ｉ：ビークルおよびＩＳＰ１０７２治療ＥＡＥマウスの脊髄病変のミエリン化軸索の数。（ｎ＝３匹のマウス／群、Ｐ＝０．００１４、ｔ＝７．８１５、ｄｆ＝４；対応のないスチューデントの両側ｔ検定）。図１Ｊ：ビークルおよびＩＳＰ治療ＥＡＥマウスの腹側腰髄中のミエリン化繊維のｇ比（軸索直径／繊維直径）の定量化。（ＥＡＥ＋Ｖｅｈ群、ｇ比＝０．８８７４±０．００１９０１；ＥＡＥ＋ＩＳＰ群、ｇ１０７７比＝０．８４２３ＩＳＰ群；３匹のマウス／群由来のｎ＝１３４再ミエリン化軸索；Ｐ＜０．０００１、１０７８ｔ＝１４．３１、ｄｆ＝２６６；対応のないスチューデントの両側ｔ検定）。データは、平均±ｓ．ｅ．ｍとして表される。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図２】図２Ａ−図２Ｇ。ＩＳＰは、脊髄中のリゾレシチン（ＬＰＣ）−脱髄マウスの再ミエリン化を促進することを示す。図２Ａ：ビークルまたはＩＳＰ治療マウスの脊髄由来のＬＰＣ病変の代表的ＬＦＢ染色切片。破線は、病変領域を区別する。スケールバー１００μｍ。図２Ｂ：ビークルまたはＩＳＰ治療マウスの多量の損傷を受けた脊髄の３、７、１４および２１ｄｐｌでの定量分析。（ｎ＝４匹のマウス／群、分散分析  Ｆ（３，１２）＝１６．４１；シダックの多重比較検定、１４ｄｐｌ：ＰＬＰＣ＋Ｖｅｈ  対  ＬＰＣ＋ＩＳＰ＝０．０００３；２１ｄｐｌ：ＰＬＰＣ＋Ｖｅｈ  対  ＬＰＣ＋ＩＳＰ＜０．０００１）。図２Ｃ：１４および２１ｄｐｌでのビークルおよびＩＳＰ治療マウスの脊髄中のＭＢＰおよびＤＡＰＩのダブル免疫染色。破線は、病変領域を区別する。スケールバー＝１００μｍ。図２Ｄ：１４ｄｐｌでのビークルまたはＩＳＰ治療マウスの脊髄組織中のＭＢＰ発現のウェスタンブロット分析。データは、β−アクチンタンパク質発現に正規化される。（ｎ＝４匹のマウス／群、分散分析  Ｆ（３，１２）＝２４．２１；チューキーの多重比較検定、Ｐｃｏｎ  対  ＬＰＣ＋Ｖｅｈ＜０．０００１、ＰＬＰＣ＋Ｖｅｈ  対  ＬＰＣ＋ＩＳＰ＝０．０２７６）。図２Ｅ：１４ｄｐｌでのビークルまたはＩＳＰ治療マウスの脊髄由来のＬＰＣ病変の代表的電子顕微鏡観察像。スケールバー＝５μｍ。図２Ｅ：１４ｄｐｌでのビークルまたはＩＳＰ１１００治療マウス由来のＬＰＣ誘導病変中のミエリン化軸索の数。（ｎ＝３匹のマウス／群、Ｐ＝０．０００１、ｔ＝１４．２６、ｄｆ＝４；対応のないスチューデントの両側ｔ検定）。図２Ｇ：１４ｄｐｌでのビークルまたはＩＳＰ治療マウスのＬＰＣ病変中のミエリンｇ比。（ＬＰＣ＋ｖｅｈ群、ｇ比＝０．９１０３±０．００３５８５；ＬＰＣ＋ＩＳＰ群、ｇ比＝０．８７４１±７４１０３５９９；３匹のマウス／群由来のｎ＝１３９再ミエリン化軸索；Ｐ＜０．０００１、ｔ＝７．１４２、ｄｆ＝２７６；対応のないスチューデントの両側ｔ検定）。データは、平均±ｓ．ｅ．ｍとして表される。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図３】図３Ａ−図３Ｃ。ＩＳＰが、治療器官型小脳培養物における再ミエリン化を加速することを示す。図３Ａ：ＭＢＰおよび神経フィラメント−２００（ＮＦ２００）の代表的免疫組織化学的検査像は、インビトロ１日目（ｄｉｖ）のＬＰＣ誘導脱髄の未処理（Ｃｏｎ）の切片において正常なミエリン形成を示し、また、８ｄｉｖおよび４ｄｉｖでのＬＰＣ脱髄小脳切片でＩＳＰ処理後に再ミエリン化増大を示す。スケールバー１００μｍ。図３Ｂ：非治療（対照として１００％とする）と比較した小脳切片における相対的ＭＢＰ免疫反応性（すなわち、ＭＢＰおよびＮＦ２００の共局在化）。（群当たり３回の独立した反復実験由来のｎ＝９切片、分散分析  Ｆ（５，４８）＝２３０．４、チューキーの多重比較検定、８ｄｐｌ：ＰＬＰＣ＋Ｖｅｈ  対  ＬＰＣ＋ＩＳＰ＜０．０００１、１４ｄｐｌ：ＰＬＰＣ＋Ｖｅｈ  対  ＬＰＣ＋ＩＳＰ＜０．０００１）。図３Ｃ：８ｄｉｖおよび１４ｄｉｖでのビークルまたはＩＳＰ処理小脳切片におけるＭＢＰ発現のウェスタンブロット分析。データは、β−アクチンタンパク質発現に正規化される。（ｎ＝群当たり３回の独立した反復実験。８ｄｉｖ：分散分析  Ｆ（３，８）＝５８．８９、チューキーの多重比較検定、ＰＶｅｈ  対  ＬＰＣ＋Ｖｅｈ＜０．０００１、ＰＬＰＣ＋Ｖｅｈ  対  ＬＰＣ＋ＩＳＰ＝０．０１８７；１４ｄｉｖ：分散分析  Ｆ（３，８）＝６．２８１、チューキーの多重比較検定、ＰＶｅｈ  対  ＬＰＣ＋Ｖｅｈ＜０．０４８、ＰＬＰＣ＋Ｖｅｈ  対  ＬＰＣ＋ＩＳＰ＝０．０２５）。データは、平均±ｓ．ｅ．ｍとして表される。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図４】図４Ａ−図４Ｄ。ＥＡＥおよびＬＰＣモードの両方で、ＩＳＰがコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＣＳＰＧ）量を低減することを示す。図４Ａ：Ｉｂａ１およびＣａｔ３０１（アグリカン特異的抗体）の代表的免疫組織化学的検査像は、誘導後４１日目のＩＳＰ治療ＥＡＥマウスの胸部脊髄中のＣＳＰＧおよびミクログリア／マクロファージの蓄積が、ビークル治療マウスに比べて、低減することを示す。スケールバー１００μｍ。図４Ｂ：１４ｄｐｌでのＬＰＣ脱髄マウスのＩＳＰ治療後にＣＳＰＧの蓄積の低減を示すＭＢＰ、Ｃａｔ３０１およびＣＳ５６（グリコサミノグリカン特異的抗体）の代表的免疫組織化学的検査像。スケールバー１００μｍ。図４Ｃ：７ｄｐｌでのＬＰＣ脱髄マウスのＩＳＰ治療後のＣＳＰＧの蓄積の低減を示すＩｂａ１、ＧＦＡＰ、ＭＢＰ、Ｃａｔ３０１およびＣＳ５６の代表的免疫組織化学的検査像。スケールバー１００μｍ。図４Ｄ：７ｄｐｌでのビークルまたはＩＳＰ治療ＬＰＣマウスの脊髄中のＩｂａ１、ＧＦＡＰ、ＭＢＰ、Ｃａｔ３０１およびＣＳ５６の免疫蛍光強度の相対的定量化。（ｎ＝３匹のマウス／群、Ｉｂａ１：Ｐ＝０．１８４８、ｔ＝１．６、ｄｆ＝４；Ｃａｔ３０１：Ｐ＝０．００９２、ｔ＝４．７１９、ｄｆ＝４；ＧＦＡＰ：Ｐ＝０．１１１１、ｔ＝２．０３９、ｄｆ＝４；ＣＳ５６：Ｐ＝０．００２８、ｔ＝６．５５、ｄｆ＝４；ＭＢＰ：Ｐ＞０．９９９９、ｔ＝０、ｄｆ＝４；バーシカン：Ｐ＝０．００９５、ｔ＝４．６６９、ｄｆ＝４；対応のないスチューデントの両側ｔ検定）。データは、平均±ｓ．ｅ．ｍとして表される。＊＊Ｐ＜０．０１。
【図５】図５Ａ−図５Ｉ。ＩＳＰがＣＳＰＧ分解プロテアーゼ活性を高めることを示す。図５Ａおよび５Ｂ：ＣＳＰＧ勾配交差アッセイ（ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｃｒｏｓｓｉｎｇ  ａｓｓａｙ）は、ＩＳＰ治療がＣＳＰＧの勾配を介してＰＤＧＦＲα＋またはＯ４＋ＯＰＣの交差を促進することを示す。スケールバー１００μｍ。図５Ｃ：ビークルまたはＩＳＰ治療後の、ＣＳＰＧ境界と交差するＰＤＧＦＲα＋またはＯ４＋ＯＰＣの量の免疫染色法定量化。（３回の独立した反復実験からのｎ＝９スポット。ＰＤＧＦＲα：Ｐ＜０．０００１、ｔ＝７．９９、ｄｆ＝１６：Ｏ４：Ｐ＜０．０００１、ｔ＝９．４１９、ｄｆ＝１６、対応のないスチューデントの両側ｔ検定）。データは、平均±ｓ．ｅ．ｍとして表される。図５Ｄ：ＩＳＰ治療後に、境界と交差し、ＣＳ５６の「影」（挿入図および矢印）を残すことからわかるように、ＣＳＰＧ分解を示すＣＳＰＧ境界上のＣＳ５６およびＰＤＧＦＲα＋ＯＰＣの代表的免疫染色像。図５Ｅ：プロテアーゼ活性を調べるために、ＯＰＣ培養上清（ＣＭ）をビークル対照または２．５ｕＭのＩＳＰまたはスクランブルＩＳＰ（ＳＩＳＰ）で治療し、アグリカン（２０ｕｇ／ｍＬ）またはラミニン（１０ｕｇ／ｍＬ）と共にインキュベートした後、ウェスタンブロットで分析した。図５Ｆ：ＣＳ５６イムノブロッティングによるグリコサミノグリカン部分の定量化は、ＩＳＰ治療後の有意なＣＳ５６分解を明らかにする。（１元配置分散分析、ダネットのポストホック検定、Ｐ＝０．０４３２、Ｆ（２，１２）＝４．１３１、Ｎ＝５ウェスタンブロット）。図５Ｇ：ラミニンイムノブロッティングの定量化は、有意な変化がないことを示す。（１元配置分散分析、チューキーのポストホック検定、Ｐ＝０．９０２４、Ｆ（２，１５）＝０．１０３４，Ｎ＝６ウェスタンブロット）。図５Ｈ：ＥｎｚＣｈｅｋプロテアーゼ活性アッセイでの急冷カゼインは、切断されると、蛍光を発する。図５Ｉ：ＥｎｚＣｈｅｋプロテアーゼアッセイの定量化は、対照と比較して、２．５μＭのＩＳＰで治療したＯＰＣ  ＣＭにおいて、有意なプロテアーゼ活性を示す（１元配置分散分析  ダネットのポストホック検定、Ｐ＝０．００１５、Ｆ（２，１８）＝９．５３４、７回の反復実験からのＮ＝２６）。グラフは、ウェスタンブロットの散布図表現または各反復実験の平均と標準誤差を示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。ｎ．ｓ．＝有意でない。
【図６】図６Ａ−図６Ｉ。ＩＳＰがＭＭＰ−２分泌および活性を高め、プロテアーゼ活性をさらに特徴付けることを示す。図６Ａ：培養したＯＰＣをビークル対照または２．５μＭのＩＳＰまたはＳＩＳＰで処理し、濃縮後、ゼラチンＳＤＳ／ＰＡＧＥゲルにロードし、ザイモグラフィー分析を行った。２５ｎｇの組換えＭＭＰ−９またはＭＭＰ−２は陽性対照としての役割を果たした。図６Ｂ：ゼラチンザイモグラフィーの活性ＭＭＰ−２レーンの定量化は、ＩＳＰ処理後、対照に比較して、有意なＭＭＰ−２活性を示す（１元配置分散分析、ダネットのポストホック検定、Ｐ＝０．０１６１、Ｆ（２，１２）＝５．９３７、Ｎ＝５ザイモグラム）。図６Ｃ：濃縮ＯＰＣ培養上清（ＣＭ）のウェスタンブロットで、ＩＳＰ治療後に向上したＭＭＰ−２発現が確認された。図６Ｄ：ＭＭＰ−２イムノブロッティングの定量化は、ＩＳＰ処理後、対照に比較して、有意に向上したことを示した（１元配置分散分析、ダネットのポストホック検定、Ｐ＝０．０１５０、Ｆ（２，１５）＝５．６３、Ｎ＝６ウェスタンブロット）。対照的に、図６Ｅで、ＭＭＰ−１０イムノブロッティングは処理間で有意ではなかった（１元配置分散分析、チューキーのポストホック検定、Ｐ＝０．９６１９、Ｆ（２，１５）＝０．０３８９９、Ｎ＝６ウェスタンブロット）。図６Ｉ：ＩＳＰがプロテアーゼの分泌を誘導し、ＣＳＰＧを分解するかどうかを調査するために、培養したＯＰＣを、２．５ｕＭのＩＳＰを含有または非含有の次の薬物で処理した：エキソサイトーシス阻害剤Ｅｘｏ１  １０ｕｇ／ｍＬ、一般メタロプロテアーゼ阻害剤ＧＭ６００１（２５ｕＭ）、または特異的ＭＭＰ−２阻害剤（ＯＡ−Ｈｙ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、１００ｎＭ）。収集したＣＭをアグリカン（２０ｕｇ／ｍＬ）とインキュベートし、ＣＳ５６で免疫ブロットした。図６Ｊ：ＣＳ５６の定量化は、対照、Ｅｘｏ１＋ＩＳＰ、ＧＭ６００１＋ＩＳＰ、およびＯＡ−Ｈｙ＋ＩＳＰに比べて、有意なＣＳＰＧのＩＳＰ誘導分解を示す（１元配置分散分析、チューキーのポストホック検定、Ｐ＝０．００１０、Ｆ（７，３２）＝４．７４９、Ｎ＝５ウェスタンブロット）。図６Ｈ：Ｏ４＋（赤色）ＯＰＣの免疫染色は、ＭＭＰ−２がＯＰＣの細胞体および突起中で濃縮されていることを示す。グラフは、ウェスタンブロットの散布図表現または各反復実験の平均と標準誤差を示す。＊Ｐ＜０．０５、ｎ．ｓ．＝有意でない。
【図７】図７Ａ−図７Ｆ。ＩＳＰ誘導ＭＭＰ−２活性は、ＯＰＣ移動およびＣＳＰＧ抑制解除による再ミエリン化を増大させることを示す。ＩＳＰ誘導プロテアーゼ活性がＯＰＣ移動および再ミエリン化に関与するかどうかを確認するために、図７Ａで、培養したＯＰＣを、ＣＳＰＧスポット勾配を有するカバーガラス上に播種し、ビークル対照、２．５μＭのＩＳＰ、２５ｕＭのＧＭ６００１プラス／マイナスＩＳＰまたはＳＩＳＰ、または１００ｎＭのＭＭＰ−２阻害剤（ＯＡ−Ｈｙ）プラス／マイナスＩＳＰまたはＳＩＳＰで処理した。ＣＳＰＧ境界と交差するＯ４＋ＯＰＣの量を計数し、図７Ｂで、定量化し、グラフ表示した。ＩＳＰ処理（Ｎ＝３７スポット、５回の反復実験）は、対照（１元配置分散分析、チューキーのポストホック検定、Ｐ＝０．０００２、Ｆ（１１，４８）＝５．０１３）、ＧＭ６００１＋ＩＰＳ（Ｎ＝２０スポット）、またはＯＡ−Ｈｙ＋ＩＳＰ（Ｎ＝２０スポット）処理に比べて、ＣＳＰＧ境界を通過するより多くのＯ４＋ＯＰＣ移動を有意に誘導した。Ｎ（スポット）：対照＝３１、ＳＩＳＰ＝２６、ＧＭ６００１＝１８、ＧＭ６００１＋ＳＩＳＰ＝２０、ＯＡ−Ｈｙ＝１８、ＯＡ−Ｈｙ＋ＳＩＳＰ＝１９。図７Ｃ：再ミエリン化がプロテアーゼ阻害により影響を受けているかどうかを試験するために、Ｐ７−９小脳切片を全て、ＬＰＣで１８時間処理した後、対照ビークル、２．５μＭのＩＳＰまたはＳＩＳＰ、２５ｕＭのＧＭ６００１プラス／マイナスＩＳＰ、または１００ｎＭのＯＡ−Ｈｙプラス／マイナスＩＳＰで９日間処理し、その後、神経フィラメント（ＮＦ２００）またはＭＢＰの染色を行った。図７Ｄ：再ミエリン化は、ＭＢＰおよび神経フィラメント共存により定量化された。ＩＳＰ処理（４回の反復実験からの合計１３個までの切片を有するＮ＝３５画像）は、対照（１元配置分散分析、チューキーのポストホック検定、Ｐ＝０．０００１、Ｆ（８，８８）＝１３．６１）、ＧＭ６００１＋ＩＳＰ（Ｎ＝２８）、およびＯＡ−Ｈｙ＋ＩＳＰ（Ｎ＝２３）群に比べて、ＭＢＰ−神経フィラメント共存を有意に増大させた。Ｎ（画像）：対照＝１７、ＳＩＳＰ＝２２、ＧＭ６００１＝４８、ＧＭ６００１＋ＳＩＳＰ＝２０、ＯＡ−Ｈｙ＝２２、ＯＡ−Ｈｙ＋ＳＩＳＰ＝２２。グラフは、各反復実験の平均の散布図表現と標準誤差を示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。図７Ｅおよび７Ｆ：小脳切片培養物をレンチウイルス構築物で４８時間処理した後、ＬＰＣ処理した。続けて、ビークルまたはＩＳＰ（２．５ｕＭ）処理をインビトロで６日間行った。次に、ＭＢＰ免疫蛍光（緑）を、ＮＦ２００（赤）を用いて定量した。（１元配置分散分析、チューキーのポストホック検定、Ｐ＝０．０００５、Ｆ（３，１１６）＝６．３９５，Ｎ＝１０切片からの約３０画像）。グラフは、各反復実験の平均の散布図表現と標準誤差を示す。
【図８】図８Ａ−図８Ｆ。ＬＰＣ誘導脱髄マウスモデルにおいて、ＩＳＰが、ＭＭＰ−２発現を増大させることにより、ミエリン修復を促進することを示す。図８Ａ：ＭＭＰ−２およびＤＡＰＩの免疫組織化学的検査からの代表的画像は、未処理またはＬＰＣビークル対照脊髄に比べて、ＬＰＣ注入の７日目後（７ｄｐｌ）でのＩＳＰ治療マウスの脊髄中のＭＭＰ−２のレベルの増大を示す。破線は、病変領域を区別する。スケールバー＝１００μｍ。図８Ｂ：７ｄｐｌでのＩＳＰ治療マウスの脊髄中のＭＭＰ−２の免疫蛍光強度の相対的定量化（ｎ＝３匹のマウス／群、分散分析  Ｆ（２，６）＝４８．１２、チューキーの多重比較検定、Ｐｃｏｎ  対  ＬＰＣ＝０．００７５、ＰＬＰＣ  対  ＬＰＣ＋ＩＳＰ＝０．００５６）。図８Ｃ：７ｄｐｌでの未処置、ビークル、またはＩＳＰ治療マウスの脊髄組織中のＭＭＰ−２発現のウェスタンブロット分析。データは、β−アクチンタンパク質発現に正規化される。（ｎ＝３匹のマウス／群、分散分析  Ｆ（２，６）＝３３．１４、チューキーの多重比較検定、Ｐｃｏｎ  対  ＬＰＣ＝０．０１６８、ＰＬＰＣ  対  ＬＰＣ＋ＩＳＰ＝０．０１４３）。図８Ｄ：代表的免疫組織化学的検査像は、１４ｄｐｌでのＩＳＰ治療マウスの脊髄中でＯｌｉｇ２＋ＯＰＣがＭＭＰ−２を発現させることを示す。白色矢印は、ＭＭＰ−２とＯｌｉｇ２の共存を示す。図８Ｅ：代表的免疫組織化学的検査像は、１４ｄｐｌでのＩＳＰ治療マウスの脊髄中でＩｂａ１＋細胞（ミクログリア／マクロファージ）がＭＭＰ−２を発現させることを示す。白色矢印は、ＭＭＰ−２とＩｂａ１の共存を示す。スケールバー＝１００μｍ。図８Ｆ：未処理、ビークル、ＩＳＰ、ＭＭＰ−２阻害剤（ＯＡ−Ｈｙ）、またはＭＭＰ−２  ｓｈＲＮＡ治療マウスの脊髄由来ＬＰＣ病変の代表的エリオクロムシアニン（ミエリン）染色。破線は、病変領域を区別する。スケールバー１００μｍ。図８Ｇ：１８ｄｐｌでのビークル、ＩＳＰ、ＭＭＰ−２阻害剤（ＯＡ−Ｈｙ）、またはＭＭＰ−２  ｓｈＲＮＡ治療マウス中の大量の損傷を受けた脊髄の定量的分析。（ｎ＝４匹のマウス／群、分散分析  Ｆ（５，１８）＝１６９．７；チューキーの多重比較検定、ＰＬＰＣ  対  ＬＰＣ＋ＩＳＰ＜０．０００１；ＰＬＰＣ＋ＩＳＰ  対  ＬＰＣ＋ＩＳＰ＋ＯＡ−Ｈｙ＜０．０００１；ＰＬＰＣ＋ＩＳＰ  対  ＬＰＣ＋ＩＳＰ＋ＭＭＰ−２  ｓｈＲＮＡ＜０．０００１；ＰＬＰＣ  対  ＬＰ｛＋ＯＡ−Ｈｙ＝０．０２７９）。データは、平均±ｓ．ｅ．ｍとして表される。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図９】図９Ａ−図９Ｄ。ＭＳのマウスモデル中の増大したＣＳＰＧ量を示す。図９Ａおよび９Ｂ：Ｃａｔ３０１およびＣＳ５６の代表的ＬＦＢ染色切片および免疫組織化学的検査像は、誘導の２８および４８日後のＥＡＥマウスの胸部脊髄中のＣＳＰＧ蓄積を示す。スケールバー１００μｍ。Ｃａｔ３０１（アグリカンＣＳＰＧ）およびＣＳ５６（ＣＳＰＧのグリコサミノグリカン部分）のピクセル強度の定量化を示す。（Ｃａｔ３０１：ｎ＝３マウス／群、分散分析  Ｆ（２，６）＝１６３．９、チューキーの多重比較検定、Ｐｃｏｎ  対  ＥＡＥ  Ｄ２８＝０．０００７、ＰＥＡＥ  Ｄ２８  対  ＥＡＥ  Ｄ４１＝０．０００１；ＣＳ５６：ｎ＝３匹のマウス／群、分散分析  Ｆ（２，６）＝１６８．７、チューキーの多重比較検定、Ｐｃｏｎ  対  ＥＡＥ  Ｄ２８＝０．００５２、ＰＥＡＥ  Ｄ２８  対  ＥＡＥ  Ｄ４１＜０．０００１）。図９Ｃおよび９Ｄ：Ｃａｔ３０１およびＣＳ５６の代表的ＬＦＢ−染色した切片および免疫組織化学的検査像は、７ｄｐｌおよび１４ｄｐｌのＬＰＣ脱髄後の病変部位中のＣＳＰＧ蓄積を示す。スケールバー１００μｍ。Ｃａｔ３０１およびＣＳ５６のピクセル強度の定量化を示す（Ｃａｔ３０１：ｎ＝３匹のマウス／群、分散分析  Ｆ（２，６）＝２６９．７、チューキーの多重比較検定、Ｐｃｏｎ  対  ７ｄｐｌ＜０．０００１、Ｐ７ｄｐｌ  対  １４ｄｐｌ＜０．０００１；ＣＳ５６：ｎ＝３匹のマウス／群、分散分析  Ｆ（２，６）＝１０５、チューキーの多重比較検定、Ｐｃｏｎ  対  ７ｄｐｌ＜０．０００１、Ｐ７ｄｐｌ  対  １４ｄｐｌ＝０．００１１）。
【図１０】図１０Ａ−図１０Ｅ。ＥＡＥおよびＬＰＣ後、ＰＴＰσ発現が高まることを示す。図１０Ａ：ＰＴＰσおよびＯｌｉｇ２の代表的免疫細胞化学像は、インビトロで成長したオリゴデンドロサイト前駆細胞上でＰＴＰσ発現を示す。図１０Ｂ：公的に入手可能なＲＮＡ配列解析トランスクリプトームデータベース（ｗｅｂ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｇｒｏｕｐ／ｂａｒｒｅｓ＿ｌａｂ／）から取得した細胞特異的ＰＴＰＲＤ（ＰＴＰδ）、ＰＴＰＲＳ（ＰＴＰσ）、ＰＴＰＲＦ（ＬＡＲ）およびＲＴＮ４Ｒ（Ｎｏｇｏ）ｍＲＮＡレベルのグラフ表示。ＦＰＫＭは、マッピングされた百万フラグメント当たりの転写物配列のキロベース当たりのフラグメントを表す。図１０Ｃ：ＰＴＰσ、ＣＣ１、およびＭＢＰの代表的免疫組織化学的検査像は、インビトロでのＯＰＣ培養物のＣＣ１＋またはＭＢＰ＋細胞中のＰＴＰσ発現を示す。図１０Ｄ：ＥＡＥまたはＬＰＣ誘導脱髄マウスの胸部脊髄中のＰＴＰσ発現のウェスタンブロット分析。データは、β−アクチンタンパク質発現に正規化される（ｎ＝４マウス／群、Ｐｃｏｎ  対  ＥＡＥ＝０．０１２、ｔ＝３．５５８、ｄｆ＝６；Ｐｃｏｎ  対  ＬＰＣ＝０．００１２、ｔ＝５．７７５、ｄｆ＝６；対応のないスチューデントの両側ｔ検定）。図１０Ｅ：ＰＴＰσおよびＯｌｉｇ２の代表的免疫組織化学的検査像は、誘導の２８日後のＥＡＥマウスの脊髄のＯｌｉｇ２＋細胞中のＰＴＰσ発現の増大を示す。スケールバー＝５０μｍ。データは、平均±ｓ．ｅ．ｍとして表される。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図１１】図１１Ａ−図１１Ｂ。再ミエリン化が生じるに伴いＩＳＰがＣＳＰＧ除去を増大することを示す。図１１Ａ：ＭＢＰおよびＣａｔ３０１の代表的免疫組織化学的検査像は、ＩＳＰ治療後に、８ｄｐｌおよび１４ｄｐｌでのＬＰＣ脱髄小脳切片中のＣＳＰＧの存在量の低減を示す。スケールバー１００μｍ。図１１Ｂ：ビークルまたはＩＳＰ治療後の、４ｄｐｌ、８ｄｐｌおよび１４ｄｐｌでのＬＰＣ脱髄小脳切片中のＣａｔ３０１の免疫蛍光強度の相対的定量化（群あたり３回の独立した反復実験由来のｎ＝９切片、２元配置分散分析  Ｆ（２，６）＝３０．７８、シダックの多重比較検定、８ｄｐｌ：ＰＬＰＣ＋Ｖｅｈ  対  ＬＰＣ＋ＩＳＰ＜０．０００１、１４ｄｐｌ：ＰＬＰＣ＋Ｖｅｈ  対  ＬＰＣ＋ＩＳＰ＜０．０３２５）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎ．ｓ．：有意でない。
【図１２】図１２Ａ−図１２Ｆ。ＩＳＰがＥＡＥマウスモデルの炎症を調節することを示す。図１２Ａ：Ｉｂａ１およびＧＦＡＰの代表的免疫組織化学的検査像は、ＥＡＥ誘導の４１日後のＩＳＰ治療マウスの脊髄中のそれぞれミクログリアおよび星状膠細胞の活性化の低減を示す。スケールバー＝１００μｍ。図１２Ｂ：４１日目のＩＳＰ治療マウスの脊髄中のＩｂａ１およびＧＦＡＰの免疫蛍光強度の相対的定量化（ｎ＝３匹のマウス／群、Ｉｂａ１：Ｐ＝０．００１６、ｔ＝７．６０８、ｄｆ＝４；ＧＦＡＰ：Ｐ＝０．０１１３、ｔ＝４．４４８、ｄｆ＝４。対応のないスチューデントの両側ｔ検定）。図１２Ｃ：ｉＮＯＳ（Ｍ１ミクログリアマーカー）およびアルギナーゼ−１（Ｍ２ミクログリアマーカー）の代表的免疫組織化学的検査像は、２８日目のＩＳＰ治療マウスの脊髄中で、増大したＭ２ミクログリアおよび低減したＭ１ミクログリアを示す。スケールバー＝１００μｍ。図１２Ｄ：４１日目のＩＳＰ治療マウスの脊髄中のｉＮＯＳおよびアルギナーゼ−１の相対的免疫蛍光の定量化（ｎ＝３匹のマウス／群、ＮＯＳ：Ｐ＝０．０００８、ｔ＝９．１１４、ｄｆ＝４；アルギナーゼ−１：Ｐ＝０．００１４、ｔ＝７．８２４、ｄｆ＝４。対応のないスチューデントの両側ｔ検定）。図１２Ｅ：代表的ルクソール・ファスト・ブルー染色像は、１８日目のビークルまたはＩＳＰ治療マウスの脱髄領域における差異はないことを示す。図１２Ｆ：１８日目のビークルまたはＩＳＰ治療マウスの脊髄中の脱髄領域の定量化は、ＥＡＥモデルで類似のレベルの脱髄を示す（ｎ＝３匹のマウス／群、Ｐ＝０．８５５９、ｔ＝０．１９３６、ｄｆ＝４、対応のないスチューデントの両側ｔ検定）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎ．ｓ．：優位でない。
【図１３】図１３Ａ−図１３Ｆ。ＩＳＰがＯＰＣ動員およびＣＳＰＧの存在下で生存を促進することを示す。図１３Ａ：７ｄｐｌでのビークルおよびＩＳＰ治療マウスの脊髄中の増殖性ＯＰＣ（Ｏｌｉｇ２＋）を示す代表的Ｋｉ６７免疫染色像。白色矢印は、Ｏｌｉｇ２＋／Ｋｉ６７＋細胞を示す。スケールバー１００μｍ。図１３Ｂ：７ｄｐｌでのビークルおよびＩＳＰ治療マウスの脊髄中でＯｌｉｇ２＋細胞／ｍｍ２、Ｋｉ６７＋細胞／ｍｍ２およびＯｌｉｇ２＋／Ｋｉ６７＋細胞／ｍｍ２を示す免疫染色の定量化。（ｎ＝３匹のマウス／群、Ｏｌｉｇ２：Ｐ＝０．００１２、ｔ＝１．６、ｄｆ＝４；Ｋｉ６７：Ｐ＝０．０４４９、ｔ＝２．８８３、ｄｆ＝４；Ｏｌｉｇ２＋／Ｋｉ６７＋：Ｐ＝０．０５６、ｔ＝２．６６６、ｄｆ＝４。対応のないスチューデントの両側ｔ検定）。データは、平均±ｓ．ｅ．ｍとして表される。図１３Ｃ：脊髄ＬＰＣ注入後、７ｄｉｖにわたり動物をビークルまたはＩＳＰで処理した。切片をＯｌｉｇ２、Ｋｉ６７、およびＤＡＰＩで染色した。Ｂ）ＬＰＣ切片中のＯｌｉｇ２、Ｋｉ６７、および共存Ｏｌｉｇ２およびＫｉ６７の定量化。Ｃ）ＯＰＣを、アグリカン／ラミニンプレコートカバーガラス上で培養し、ビークル対照、２．５μＭのＩＳＰまたはＳＩＳＰで治療し、Ｏ４およびＫｉ６７で染色した。図１３Ｄ：Ｋｉ６７は、群内で有意に変化しなかった（１元配置分散分析、チューキーのポストホック検定、Ｐ＝０．８９９８、Ｆ（２，９）＝０．１０６８、４回の実験で、それぞれ３回ずつで合計Ｎ＝１２画像）。図１３Ｅ：ＯＰＣをアグリカン／ラミニン上で培養し、対照または２．５μＭのＩＳＰで２ｄｉｖにわたり処理し、その後、ビークルまたはＬＰＣ（１μｇ／ｍＬ）と共に２時間インキュベーションした後、ＤＡＰＩおよびＴＵＮＥＬ染色を実施した。図１３Ｆ：ＤＡＰＩ＋細胞に比較したＴＵＮＥＬ＋細胞の定量化は、対照に比較したＩＳＰ処理（Ｎ＝４０画像、４回反復実験）ＯＰＣの有意な生存を示す（１元配置分散分析、チューキーのポストホック検定、Ｐ＝０．００２１、Ｆ（３，３６）＝５．９６）。ＩＳＰ治療は、ＬＰＣ処理細胞の生存を増大させる。（Ｎ（画像）：対照＝３６、各ＬＰＣ処理群＝２８）。グラフは、各反復実験の平均の散布図表現と標準誤差を示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１４】図１４Ａ−図１４Ｇ。ＩＳＰがＯＰＣ突起成長および成熟を強化する。図１４Ａ：誘導の４１日後のビークルまたはＩＳＰ治療ＥＡＥマウスの胸部脊髄中のＯｌｉｇ２およびＣＣ１の代表的免疫組織化学的検査像。スケールバー＝５０μｍ。図１４Ｂ：誘導の４１日後のビークルまたはＩＳＰ治療ＥＡＥマウスの胸部脊髄中のＯｌｉｇ２＋細胞／ｍｍ２およびＣＣ１＋細胞／ｍｍ２に対する免疫染色定量化。（ｎ＝３匹のマウス／群、Ｏｌｉｇ２：Ｐ＝０．００１８９、ｔ＝３．８１１、ｄｆ＝４；ＣＣ１：Ｐ＝０．００１９、ｔ＝７．２５９、ｄｆ＝４。対応のないスチューデントの両側ｔ検定）。図１４Ｃ：１４ｄｐｌでのビークルまたはＩＳＰ治療ＬＰＣマウスの脊髄中のＤＡＰＩおよびＣＣ１の代表的免疫組織化学的像。破線は、病変領域を区別する。スケールバー１００μｍ。図１４Ｄ：１４ｄｐｌでの正規化したＣＣ１＋乏突起膠細胞密度に対する免疫染色定量化。（ｎ＝３匹のマウス／群、Ｐ＝０．００４４、ｔ＝５．７８９、ｄｆ＝４。対応のないスチューデントの両側ｔ検定）。図１４Ｅ：ＩＳＰまたはビークルの存在下でポリ−Ｌ−リシンまたはＣＳＰＧ上に播種後の、ＯＰＣの成熟の代表的免疫組織化学的像。スケールバー１００μｍ。図１４Ｆ：ＩＳＰまたはビークルの存在下でポリ−Ｌ−リシン（対照）またはＣＳＰＧ上にＯＰＣ播種後のＯＬ成熟の相対的比率の定量化。（ｎ＝３回の独立した反復実験、Ｏ４：分散分析  Ｆ（２，６）＝１．３２１、Ｐ＝０．３３４７；ＭＢＰ：分散分析  Ｆ（２，６）＝３０．９９、チューキーの多重比較検定、ＰＣｏｎ  対  ＣＳＰＧ＋Ｖｅｈ＝０．０００５、ＰＣＳＰＧ＋Ｖｅｈ  対  ＣＰＳＧ＋ＩＳＰ＝０．０１７５）。図１４Ｇ：６日目に、ＩＳＰまたはビークルの存在下でポリ−Ｌ−リシン（対照）またはＣＳＰＧ上のＯＰＣ播種後のＭＢＰ＋フットプリントのサイズの比較。ｎ＝３の独立した反復実験、分散分析  Ｆ（２，６）＝４０．９６、チューキーの多重比較検定、ＰＣｏｎ  対  ＣＳＰＧ＋Ｖｅｈ＝０．０００３、ＰＣＳＰＧ＋Ｖｅｈ  対  ＣＰＳＧ＋ＩＳＰ＝０．００５２）。データは、平均±ｓ．ｅ．ｍとして表される。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。ｎ．ｓ．：有意でない。
【図１５】プロテアーゼアッセイの結果をグラフで示す。ＩＳＰ治療によりプロテアーゼが発現上昇され得るスクリーニングを開始するために、培養したＯＰＣをビークル対照または２．５μＭのＩＳＰで４日間インビトロ処理した。その後、培養上清を定性的プロテアーゼアレイ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）と共にインキュベートし、展開した。次に、ＩＳＰ処理  対  対照ＯＰＣ  ＣＭのピクセル強度の％変化を計算した。
【図１６】図１６Ａ−図１６Ｈ。ＩＳＰがＣＳ５６分解を用量依存的に高めることを示す。ＩＳＰ処理ＯＰＣ  ＣＭは、ＣＳ５６スポットを分解できる。図１６Ａ：ビークル対照、２．５μＭのＩＳＰまたはＳＩＳＰで処理したＯＰＣをインビトロで２日間インキュベートし、その後、ＣＭを集め、アグリカン／ラミニンスポットと共にインキュベートした。追加のサブセットのスポットを培地のみで同じ時間にわたりインキュベートした。スポットをＣＳ５６またはラミニンで免疫染色し、スポット外周部のピクセル強度を記録した。図１６Ｂ：スポットの測定部分を示す、黄色関心領域を含むＣＳ５６染色スポットの代表的画像。図１６Ｃ：ＣＳ５６免疫染色されスポットの定量化は、対照に比較して、ＩＳＰ処理ＯＰＣ  ＣＭは、有意にＣＳＰＧを分解することを示す（１元配置分散分析、ダネットのポストホック検定、Ｐ＝０．０００１、Ｆ（５，７２）＝４５．１９）。Ｎ（画像、５回の反復実験）：対照＝６９、ＩＳＰ＝１０４、ＩＳＰ＝９５、培地のみ＝３１）。図１６Ｄ：ラミニン染色したスポットの代表的像。図１６Ｅ：ラミニン染色したスポットの定量化は、群間で有意な変化は示さない（１元配置分散分析、チューキーのポストホック検定、Ｐ＝０．０８１８、Ｆ（３，８５）＝２．３１２、Ｎ（画像、５回の反復実験）：対照＝１３３、ＩＳＰ＝１３４、ＳＩＳＰ＝１１４、培地のみ＝３４）。図１６Ｆ：ＣＳ５６分解を確認するために、ＯＰＣを種々の投与量のＩＳＰまたはビークル対照で処理し、固定濃度のアグリカン（２０μｇ／ｍＬ）と共に２時間インキュベートし、その後、ウェスタンブロット分析を行った。図１６Ｇ：ＣＳ５６のウェスタンブロット分析およびその後のＣＳ５６バンドの定量化（図１６Ｈ）は、２．５および５μＭ投与量の対照に比較して、有意なＩＳＰ処理ＣＳ５６分解を示す（１元配置分散分析、チューキーのポストホック検定、Ｐ＝０．００４９、Ｆ（５，１２）＝６．１１２、Ｎ＝３ウェスタンブロット）。グラフは、ウェスタンブロットの散布図表現または各反復実験の平均と標準誤差を示す。
【図１７】図１７Ａ−図１７Ｇ。プロテアーゼ阻害剤がＩＳＰ誘導ＣＳＰＧ分解およびその後のＣＳＰＧ−ＯＰＣ抑制解除を弱めることを示す。プロテアーゼ阻害剤のＯＰＣに対する機能的効果を評価するために、図１７Ａおよび１７Ｂは、ＣＳ５６免疫染色スポットがビークル対照、２，５μＭのＩＳＰ、または２５μＭのＧＭ６００１プラス／マイナスＩＳＰ処理ＯＰＣ  ＣＭと共にインキュベートされた、アッセイの結果を示す。定量化ＣＳ５６免疫反応性は、対照およびＧＭ６００１＋ＩＳＰに比べて、有意なＩＳＰ誘導ＣＳ５６分解を示す（１元配置分散分析、チューキーのポストホック検定、Ｐ＝０．０００１、Ｆ（３，３７）＝２１．４３）、Ｎ（画像、３回の反復実験）：対照＝２４、ＩＳＰ＝１７、ＧＭ６００１＝１９、ＧＭ６００１＋ＩＳＰ＝２０。同様に、図１７Ｃおよび１７Ｄは、ビークル対照、２．５μＭのＩＳＰ、または１００ｎＭのＭＭＰ−２阻害剤（ＯＡ−Ｈｙ）プラス／マイナスＩＳＰにより処理したアグリカンスポットが、ビークル対照およびＭＭＰ−２阻害剤（ＯＡ−Ｈｙ）＋ＩＳＰに比べて、ＩＳＰ誘導分解を示した（１元配置分散分析、チューキーのポストホック検定、Ｐ＝０．００１、Ｆ（３，４４）＝３１．５０。各Ｎ＝２４画像）。図１７Ｅ：ＭＭＰ−２阻害剤がアポトーシスに影響を与えるかどうかを評価するために、アグリカン／ラミニンプレコートカバーガラス上で培養したＯＰＣを、ＩＳＰ、１００ｎＭのＭＭＰ−２阻害剤（ＯＡ−Ｈｙ）プラス／マイナスＩＳＰで２日間インビトロ処理した。処理ＯＰＣのサブセットを、追加で、ＬＰＣ  １ｕｇ／ｍＬとのインキュベーションで２時間誘発し、その後、ＴＵＮＥＬ／ＤＡＰＩ染色を行った。ＭＭＰ−２阻害剤（ＯＡ−Ｈｙ）は、ＴＵＮＥＬ＋細胞／総細胞を有意に増加させなかった。しかし、ＭＭＰ−２阻害剤（ＯＡ−Ｈｙ）は、ＩＳＰ処理を含む場合でも、ＬＰＣ処理後、ＬＰＣ−ＩＳＰ処理に比べて、アポトーシスを増加させた（１元配置分散分析、チューキーのポストホック検定、Ｐ＝０．０００１、Ｆ（７，２１）＝２９．６６。Ｎ＝２反復実験、各２ウェル）。図１７Ｆ：アグリカン／ラミニン上で培養したＯＰＣの１００ｎＭのＭＭＰ−２阻害剤（ＯＡ−Ｈｙ）処理は、ＩＳＰ処理単独に比べて、さらにＭＢＰフットプリントを有意に低減した（１元配置分散分析、Ｐ＝０．０００１、Ｆ（３，１１２）＝２２８．３。Ｎ（細胞、５回の反復実験）：対照＝１２８、ＩＳＰ＝１２６、ＯＡ−Ｈｙ＝１９１、ＯＡ−Ｈｙ＋ＩＳＰ＝２２２）。グラフは、各反復実験の平均の散布図表現と標準誤差を示す。
【図１８】図１８Ａ−図１８Ｅ。ＭＭＰ−２のｓｈＲＮＡノックダウンは、ＯＰＣ成熟およびＣＳＰＧに対する移動を低減し、小脳切片における再ミエリン化を制限する。図１８Ａ：ＯＰＣ培養物に対照レンチウイルススクランブルｓｈＲＮＡまたはＭＭＰ−２を標的とするｓｈＲＮＡ構築物を発現しているレンチウイルス粒子を４８時間感染させた後、ウェスタンブロッティングを行い、ＭＭＰ−２ノックダウンをＧＡＰＤＨと比較して評価した。図１８Ｂおよび１８Ｃ：ラミニンおよび低濃度のアグリカン（１μｇ／ｍＬ）上で培養したＭＭＰ−２レンチウイルス感染ＯＰＣを標的とするスクランブルまたはｓｈＲＮＡを、ビークルまたはＩＳＰ（２．５μＭ）で４８時間の処理後、ＭＢＰで免疫染色した。ＭＢＰ面積を定量した。（１元配置分散分析、チューキーのポストホック検定、Ｐ＝０．０１３、Ｆ（３，１５８）＝６．６７７、２回の反復実験由来のＮ＝１００細胞）。図１８Ｄおよび１８Ｅ：ＯＰＣ（Ｏ４、赤）をレンチウイルス構築物で４８時間感染させ、その後、スポットアッセイ用に播種し、ＩＳＰ（２．５μＭ）を含有または非含有アグリカン（緑）と交差する移動を評価した。アグリカンスポットを横切るＯＰＣの数を計数した（１元配置分散分析、チューキーのポストホック検定。Ｐ＝０．００１５，Ｆ（３，４４）＝６．０５６。２回の反復実験由来のＮ＝４０スポット）。
【図１９】図１９Ａ−図１９Ｄ。ＬＰＣ脱髄マウスモデル中で、ＭＭＰ−２がＩＳＰ誘導再ミエリン化を媒介することを示す。図１９Ａ：ＬＰＣ注入の１４日後の、ビークル、ＩＳＰまたはＭＭＰ−２阻害剤（ＯＡ−Ｈｙ）治療マウスの脊髄由来のＣＳ５６およびＤＡＰＩの免疫組織化学的検査からの代表的画像は、ＭＭＰ−２媒介ＣＳ５６分解を示す。破線は背側の脊髄白質を区別する。スケールバー＝１００μｍ。図１９Ｂ：１４ｄｐｌでの、ビークル、ＩＳＰまたはＭＭＰ−２阻害剤（ＯＡ−Ｈｙ）治療マウスの脊髄中のＣＳ５６の免疫蛍光強度の相対的定量化（ｎ＝３匹のマウス／群、分散分析  Ｆ（３，８）＝７６．０８、チューキーの多重比較検定、ＰＬＰＣ  対  ＬＰＣ＋ＩＳＰ＜０．０００１、ＰＬＰＣ＋ＩＳＰ  対  ＬＰＣＮＩＳＰ＋ＯＡ−Ｈｙ＝０．００７９、ＰＬＰＣ  対  ＬＰＣ＋ＯＡ−Ｈｙ＝０．００２６）。図１９Ｃ：ＬＰＣ注入の１４日後の、ビークル、ＩＳＰまたはＭＭＰ−２阻害剤（ＯＡ−Ｈｙ）治療マウスの脊髄由来Ｏｌｉｇ２およびＤＡＰＩの免疫組織化学的検査からの代表的画像は、ＭＭＰ−２媒介ＯＰＣ移動を示す。破線は、病変領域を区別する。スケールバー＝１００μｍ。図１９Ｄ：１４ｄｐｌでの、ビークル、ＩＳＰまたはＭＭＰ−２阻害剤（ＯＡ−Ｈｙ）治療マウスの脊髄中のＯｌｉｇ２＋細胞の数の定量化（ｎ＝３匹のマウス／群、分散分析  Ｆ（３，８）＝２１．５８、チューキーの多重比較検定、ＰＬＰＣ  対  ＬＰＣ＋ＩＳＰ＝０．００７４、ＰＬＰＣ＋ＩＳＰ  対  ＬＰＣ＋ＩＳＰ＋ＯＡ−Ｈｙ＝０．００８８、ＰＬＰＣ  対  ＬＰＣ＋ＯＡ−Ｈｙ＝０．０３８５）。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
別に定めのない限り、本明細書で使用される科学技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈により別義が要求されない限り、単数用語は複数を含むものとし、複数用語は単数を含むものとする。一般に、本明細書で記載される細胞および組織の培養、分子生物学、およびタンパク質およびオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの化学およびハイブリッド形成と関連して利用される命名法、ならびにそれらの技法は、当該技術で周知であり、一般に使用されるものである。
【００１７】
便宜上、明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲で採用される特定の用語をここにまとめる。特に断らなければ、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、本出願が属する当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【００１８】
冠詞の「ａ」および「ａｎ」は、１つの、または１つを超える（すなわち、少なくとも１つの）、その冠詞の文法的対象を意味するものとして本明細書で使用される。例えば、「ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ」は、１つの要素または２つ以上の要素を意味する。
【００１９】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」「含有する（ｉｎｃｌｕｄｅ）」「含有する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」「有する（ｈａｖｅ）」および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語は、追加の要素が含まれ得ることを意味する包括的な、非限定的な意味で使用される。本明細書で使用される場合、「など（ｓｕｃｈ  ａｓ）」、「例えば（ｅ．ｇ．）」という用語は非限定的であり、例示を目的としているにすぎない。「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「含むが、それらに限定はされない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」は同じ意味で使用される。
【００２０】
「または（ｏｒ）」という用語は、本明細書では、文脈により明確に別義が示されない限り、「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」を意味すると理解されるべきである。
【００２１】
本明細書で使用される場合、「約（ａｂｏｕｔ）」または「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という用語は、基準の量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量（ａｍｏｕｎｔ）、重量または長さに対する１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％程度変動する量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量（ａｍｏｕｎｔ）、重量または長さを意味する。一実施形態では、「約（ａｂｏｕｔ）」または「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という用語は、基準の量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量（ａｍｏｕｎｔ）、重量または長さ±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％、または±１％の範囲の量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量（ａｍｏｕｎｔ）、重量または長さを意味する。
【００２２】
本明細書で使用される場合、「ａ、ｂおよびｃの１つまたは複数」はａ、ｂ、ｃ、ａｂ、ａｃ、ｂｃまたはａｂｃを意味する。本明細書における「または」の使用は、包含的なまたはである。
【００２３】
患者に「投与すること」という用語には、脳脊髄液へのまたは脳血管関門を横切る投与、非経口または経口の経路による送達、筋肉内注射、皮下または皮内注射、静脈内注射、頬内投与、経皮送達、および直腸、結腸、膣、鼻腔内のまたは気道経路による投与を含む、対象の所望の位置に活性化合物を送達するために（例えば、それにより、所望のニューロンなどの所望の細胞に接触させるために）好適な経路により、対象に医薬製剤中の活性化合物の分配、送達または適用が含まれる。薬剤は、例えば、静脈内注射を介して昏睡状態、麻酔下のもしくは麻痺した対象に投与され得、または妊娠した対象の静脈内に投与して胎児の軸索成長を誘発し得る。投与の特定の経路には、局所投与（例えば、まぶたの下に投入される点眼薬、クリームまたは浸食性の製剤）、水性体液または硝子体液への眼内注射、結膜下注射またはテノン嚢下注射を介するなどの眼の外層への注射、非経口投与または経口経路を介した投与が挙げられ得る。
【００２４】
用語の「抗体」には、ヒトおよび動物のｍＡｂ、およびポリクローナル抗体、組換え抗体（抗血清）、ヒト化抗体、抗イディオタイプ抗体およびその誘導体などのキメラ抗体を含む合成抗体が挙げられる。抗体の一部またはフラグメントは、特定のエピトープに結合する能力（結合の特異性および親和性）の少なくとも一部を保持する抗体の領域を意味する。用語「エピトープ」または「抗原決定基」は抗体のパラトープが結合する抗原上の部位を意味する。連続アミノ酸により形成されるエピトープは通常、変性溶媒への暴露の際、保持されるが、三次折り畳みにより形成されるエピトープは通常、変性溶媒による処理の際に失われる。エピトープは通常、特有の空間配置中に少なくとも３個、少なくとも５個または８〜１０個、または約１３〜１５個のアミノ酸を含む。エピトープの空間配置を決定する方法には、例えば、Ｘ線結晶学および二次元核磁気共鳴が挙げられる。
【００２５】
「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」という用語は、ポリペプチドをコードする第１のアミノ酸配列と、第１のポリペプチドのドメインに対して外来性であり、実質的に相同ではないドメイン（例えば、ポリペプチドの一部）を規定する第２のアミノ酸配列との融合体を意味する。キメラタンパク質は、第１のタンパク質も発現する生物で見出される外来性のドメイン（異なるタンパク質中ではあるが）であってもよく、またはキメラタンパク質は、異なる種類の生物により発現されるタンパク質構造体の「種間」、「遺伝子間」等の融合体であってもよい。
【００２６】
薬剤または治療用ペプチドの「有効量」は、所望の治療効果または医薬効果を達成するのに十分な量、例えば、ニューロンの成長を活性化することが可能である量である。本明細書で定義される薬剤の有効量は、例えば、対象の疾患の状態、年齢および体重、ならびに対象において、所望の応答を誘発する薬剤の能力などの因子により変化し得る。投与計画を調節して最適な治療応答をもたらし得る。有効量はまた、治療上の有益な効果が活性化合物の毒性効果または有害効果に勝るものでもある。
【００２７】
用語の「発現」は、核酸がペプチドに翻訳されるまたはペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質に翻訳できるＲＮＡに転写される過程を意味する。核酸がゲノムＤＮＡに由来するのであり、適当な真核宿主細胞または生物が選択される場合、発現はｍＲＮＡのスプライシングを含む。宿主細胞中で発現される異種核酸については、それは先ず細胞に送達され、その後、いったん細胞に入って、最終的に核に存在しなければならない。
【００２８】
用語の「遺伝子治療（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｔｈｅｒａｐｙ）」およびその文法的変形体（例えば、「遺伝子治療（ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ）」）には、治療または診断が求められる障害または状態にある哺乳動物、特にヒトの細胞への異種のＤＮＡの移入が含まれる。選択された標的細胞にＤＮＡが導入され、それにより、異種のＤＮＡが発現され、それにより、コードされた治療用産物が産生される。あるいは、異種のＤＮＡは、治療用産物をコードするＤＮＡの発現を何らかの形で媒介し、治療用産物の発現を何らかの形で直接的にまたは間接的に媒介するペプチドまたはＲＮＡなどの産物をコードし得る。遺伝子治療を用いて遺伝子産物をコードする核酸を送達して欠陥のある遺伝子を置き換えてもよく、またはそれが導入された哺乳動物または細胞により産生される遺伝子産物を補完してもよい。治療用産物をコードする異種のＤＮＡは、その産物または発現を増大するかまたは別の方法で変えるために、罹患している宿主の細胞に導入する前に修飾され得る。
【００２９】
用語の「遺伝子」または「組換え遺伝子」はエクソンおよび（任意に）イントロンの配列の両方を含むポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸を意味する。
【００３０】
用語の「異種核酸配列」は通常、それが発現される細胞によって、インビボでは通常産生されないＲＮＡおよびタンパク質をコードするＤＮＡ、または転写、翻訳若しくは他の調節性の生物過程に影響を及ぼすことにより、内在性のＤＮＡの発現を変更するメディエーターを媒介するもしくはそれをコードするＤＮＡである。異種核酸配列はまた外来性のＤＮＡとも呼ばれる。それが発現される細胞に対して異種または外来性であると当業者が認識するまたは見なすＤＮＡは本明細書では異種ＤＮＡにより包含される。異種ＤＮＡの例には、例えば、薬剤耐性を付与するタンパク質などの追跡可能なマーカータンパク質をコードするＤＮＡ、例えば、抗癌剤、酵素およびホルモンなどの治療上有効な物質をコードするＤＮＡ、ならびに抗体などの他の種類のタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。異種のＤＮＡによって、コードされる抗体は、異種のＤＮＡが導入されている細胞の表面で分泌され得るかまたは発現され得る。
【００３１】
用語の「相同性」および「同一性」は、全体を通して同義に使用され、２つのペプチド間のまたは２つの核酸分子間の配列類似性を意味する。相同性は、比較の目的で並べられ得る各配列における位置を比較することによって、決定できる。比較した配列における位置が同一の塩基またはアミノ酸で占められれば、その位置で分子は相同または同一である。配列間の相同性または同一性の程度は配列により共有される一致するまたは相同性の位置の数の関数である。
【００３２】
本明細書で使用される場合、用語の「オリゴデンドロサイト前駆細胞」または「ＯＰＣ」は、新しいオリゴデンドロサイト細胞を生成できる神経前駆細胞を意味する。ＯＰＣは、多くの表面抗原の発現により特定できる。例えば、血小板由来成長因子受容体サブユニット（ＰＤＧＦＲα）、ＮＧ２コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、およびガングリオシドＧＤ３として既知の表面抗原がＯＰＣの特定によく使用される。
【００３３】
未成熟ＯＰＣは、共通のグリア前駆細胞から発生中の脳の腹側領域で生成される。未成熟細胞は、積極的に移動、増殖し、中枢神経系（ＣＮＳ）に存在し、最終的にミエリン形成前オリゴデンドロサイト（Ｏ４＋）に分化する。ＯＰＣ分化および成熟は、複数突起の伸張、細胞体サイズの増大およびミエリンの形成を特徴とする。
【００３４】
語句の「非経口投与」および「非経口で投与される」は本明細書で使用される場合、腸内投与および局所投与以外の、通常は注射による投与方法を意味し、これには、限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、脳室内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節腔内、嚢下、クモ膜下、脊髄内および胸骨内の注射および注入が挙げられる。
【００３５】
語句の「全身投与」、「全身に投与される」、「末梢投与」および「末梢に投与される」は、本明細書で使用される場合、標的組織への直接投与以外の化合物、薬物またはその他の物質の投与を意味し、それにより、動物の体系に入り、従って、代謝および他の類似の過程、例えば、皮下投与を受ける。
【００３６】
用語の「患者」または「対象」または「動物」または「宿主」は任意の哺乳動物を意味する。対象はヒトであり得るが、獣医治療を必要とする哺乳動物、例えば、愛玩動物（例えば、イヌ、ネコ等）、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ニワトリ、ブタ、ウマ等）および実験動物（例えば、ラット、マウス、モルモット等）でもあり得る。
【００３７】
用語の「末梢神経系（ＰＮＳ）のニューロン」には、ＣＮＳの外側に存在するまたは伸びるニューロンが含まれる。ＰＮＳは、感覚ニューロンおよび運動ニューロンを含む末梢神経系に分類されるとして一般的に理解されるニューロンを含むことが意図されている。
【００３８】
用語の「ポリヌクレオチド配列」および「ヌクレオチド配列」は本明細書では同じ意味で用いられる。
【００３９】
用語の「ペプチド」および「ポリペプチド」は、本明細書では同じ意味に用いられ、約２〜約９０個（包括的）のアミノ酸残基からなる化合物を意味し、１つのアミノ酸のアミノ基がペプチド結合により、別のアミノ酸のカルボキシル基に連結される。ペプチドは例えば、酵素切断または化学切断によって、ネイティブのタンパク質から導き出すまたは取り出すことができ、または従来のペプチド合成法（例えば、固相合成）または分子生物学的な技法により、調製できる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：ＬＡＢ．ＭＡＮＵＡＬ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）を参照）。「ペプチド」は、好適なＬ−および／またはＤ−アミノ酸、例えば、一般的なα−アミノ酸（例えば、アラニン、グリシン、バリン）、非α−アミノ酸（例えば、Ｐ−アラニン、４−アミノ酪酸、６−アミノカプロン酸、サルコシン、スタチン）および異常アミノ酸（例えば、シトルリン、ホモシトルリン、ホモセリン、ノルロイシン、ノルバリン、オルニチン）を含むことができる。ペプチド上のアミノ基、カルボキシル基および／または他の官能基は遊離状態（例えば、非修飾）、または好適な保護基で保護され得る。アミノ基およびカルボキシル基の好適な保護基、および保護基を付加するまたは取り外す手段は当該技術で既知である。例えば、Ｇｒｅｅｎ  ＆ａｍｐ；Ｗｕｔｓ，ＰＲＯＴＥＣＴＩＮＧ  ＧＲＯＵＰＳ  ＩＮ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆ａｍｐ；Ｓｏｎｓ，１９９１）を参照されたい。ペプチドの官能基も既知の方法を用いて誘導体化（例えば、アルキル化）することができる。
【００４０】
ペプチドは合成することができ、また、多数の別々の分子種を含むライブラリを構築することができる。このようなライブラリはコンビナトリアル化学の周知の方法を用いて調製することができ、本明細書で記載のように、またはライブラリが、ＣＳＰＧ／ＰＴＰσの相互作用に拮抗できるペプチドを含むかどうかを判定する好適な他の方法を用いて、スクリーニングすることができる。次いで好適な手段により、このようなペプチドのアンタゴニストを単離できる。
【００４１】
用語の「ペプチド模倣体」は、ペプチドを模倣するように設計されたタンパク質様分子を意味する。ペプチド模倣体は通常、既存のペプチドの修飾から、またはペプトイドおよびβ−ペプチドなどのペプチドを模倣する類似の系を設計することによって、生じる。手法に関わりなく、化学構造を変えた設計を行うことにより、安定性または生物活性などの分子特性が有利に調節される。これらの修飾には、天然に存在しないペプチドに対する変更（例えば、変化した骨格および非天然のアミノ酸の取り込み）を含む。
【００４２】
用語の「防止する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」または「防止すること（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」は、疾患または状態の頻度または重症度を低減することを意味する。この用語は、疾患または状態の絶対的な排除を必要としない。むしろ、この用語は、疾患の発生の機会を減らすことを含む。例えば、開示されるのは、対象の神経根引抜き損傷の発生および／または重症度を低減する方法であり、該方法は、対象の神経根引抜き損傷に対し、治療有効量の治療薬を含む組成物を投与することを含む。
【００４３】
ポリヌクレオチド配列（ＤＮＡ、ＲＮＡ）は、発現制御配列がそのポリヌクレオチド配列の転写および翻訳を制御し、調節する場合、発現制御配列に「動作可能に連結される」。用語の「動作可能に連結される」には、発現されるポリヌクレオチド配列の前で適切な開始シグナル（例えば、ＡＴＧ）を有すること、および正しいリーディングフレームを維持して発現制御配列の制御下でポリヌクレオチド配列の発現を可能にし、ポリヌクレオチド配列によりコードされる所望のポリペプチドの産生を可能にすることが含まれる。
【００４４】
本明細書で使用される用語の「組換え」は、タンパク質が原核生物発現系または真核生物発現系に由来することを意味する。
【００４５】
用語の「治療に効果的な」は、使用される組成物の量が、疾患または障害の原因、症状、または後遺症の１つまたは複数を回復するのに十分な量であることを意味する。このような回復は、疾患または障害の原因、症状、または後遺症を減らすまたは変えることのみ必要とし、必ずしも除去が必要とは限らない。
【００４６】
用語「組織特異的なプロモーター」は、プロモーターとして役立つ、すなわち、プロモーターに動作可能に連結された選択された核酸配列の発現を調節し、上皮細胞の細胞などの組織の特定の細胞の選択された核酸配列の発現に影響を与える核酸配列を意味する。この用語はまた１つの組織で主として選択された核酸の発現を調節するが、同様に他の組織でも発現を生ずるいわゆる「漏出性」プロモーターも網羅する。用語「遺伝子導入」は細胞による外来性ＤＮＡの取り込みを意味するのに使用される。外因性ＤＮＡが細胞膜の内側に導入されている場合、細胞は「遺伝子導入」されている。多数の遺伝子導入方法が当該技術で一般に知られている。例えば、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６（１９７３）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８９）；Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６）；Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １３：１９７（１９８１）を参照されたい。このような技法を用いて、例えば、ヌクレオチド組込み型ベクターおよび他の核酸分子などの１つまたは複数の外来性ＤＮＡ部分を好適な宿主細胞に導入できる。この用語は化学的、電気的、およびウイルス媒介遺伝子導入の手順を含む。
【００４７】
用語の「転写調節配列」は、それらが動作可能に連結されるタンパク質コード配列の転写を誘導するまたは制御する開始シグナル、エンハンサーおよびプロモーターなどの核酸配列を意味するように明細書で使用される一般的な用語である。いくつかの実施例では、組換え遺伝子の転写は、プロモーター配列（または他の転写調節配列）の制御下にあり、それは、発現が意図される細胞型の組換え遺伝子の発現を制御する。組換え遺伝子は、これらの配列と同一であるまたは異なる、タンパク質の天然に存在する形態の転写を制御する転写調節配列の制御下にあり得ることも理解されよう。
【００４８】
用語の「治療」は、疾患、病的状態、または障害を治癒、回復、安定化、または予防することを目的とした患者の医学的管理を意味する。この用語は、積極療法、すなわち、疾患、病的状態、または障害を改善する方向に具体的に向けられた治療を含み、また、原因療法、すなわち、関連する疾患、病的状態、または障害の原因の除去に向けた治療も含む。さらに、この用語は、対症療法、すなわち、疾患、病的状態、または障害の治癒ではなく、症状の軽減のために設計された治療；この用語は、予防治療、すなわち、関連疾患、病的状態、または障害の発症を最小化する、または部分的にもしくは完全にそれを抑制する方向に向けられた治療；支持療法、すなわち、関連疾患、病的状態、または障害の改善に向けられた別の特異療法を補充するために採用される治療を含む。
【００４９】
用語の「ベクター」はそれが連結されている別の核酸を輸送することが可能である核酸分子を意味する。好ましいベクターは、それらが結合する核酸の自律複製および発現の１つまたは複数が可能であるものである。それらが動作可能に連結された遺伝子の発現を指示することが可能であるベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。
【００５０】
用語の「野生型」（または「ＷＴ」）は、インビボでそれが正常に存在するような、それぞれ、タンパク質、またはその一部、またはタンパク質配列、またはその一部をコードする天然のポリヌクレオチドを意味する。本明細書で使用される場合、用語の「核酸」はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、および該当する場合には、リボ核酸（ＲＮＡ）などのポリヌクレオチドを意味する。この用語は、ヌクレオチド類似体から作られ、記載の実施形態に適用可能なＲＮＡまたはＤＮＡの等価物、類似体として、一本鎖（センスまたはアンチセンス）および二本鎖のポリヌクレオチドを含むことは理解されるべきである。
【００５１】
本明細書で記載の方法で使用される薬剤、化合物、組成物、抗体等は、使用前に精製および／または単離することが検討される。精製された物質は通常、「実質的に純粋」であり、核酸、ポリペプチド、またはそのフラグメント、または他の分子が天然ではそれに付随する成分から分離されていることを意味する。通常、それが天然で結合するタンパク質および他の有機分子を、重量で少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはさらに９９％含まない場合、ポリペプチドは実質的に純粋である。例えば、実質的に純粋なポリペプチドは、天然源からの抽出により、正常ではそのタンパク質を発現しない細胞における組換え核酸の発現により、または化学合成により、得られ得る。「単離された物質」はその天然の位置および環境から取り出されている。単離されたまたは精製されたドメインまたはタンパク質フラグメントの場合、ドメインまたはフラグメントは、天然配列のタンパク質に隣接するアミノ酸配列を実質的に含まない。用語の「単離されたＤＮＡ」は、ＤＮＡが天然のゲノム中で所与のＤＮＡに隣接する遺伝子を実質的に含んでいないことを意味する。従って、用語の「単離されたＤＮＡ」は、例えば、ｃＤＮＡ、クローニングされたゲノムＤＮＡおよび合成ＤＮＡを包含する。
【００５２】
ポリペプチドを意味する場合、用語の「一部」、「フラグメント」、「バリアント」、「誘導体」および「類似体」は、本明細書で言及される少なくとも一部の生物活性（例えば、結合などの相互作用の阻害）を保持するいずれかのポリペプチドを含む。本明細書で記載のポリペプチドには、ポリペプチドが依然としてその機能を果たす限り、限定されないが、一部、フラグメント、バリアント、または誘導体分子が含まれ得る。本発明のポリペプチドまたはその一部には、タンパク分解フラグメント、欠失フラグメント、および特に、または動物に送達された際、作用部位にさらに容易に到達するフラグメントが含まれ得る。
【００５３】
本明細書で記載の実施形態は、一般に、オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）の移動、分化、増殖および／または成熟を誘導、促進、および／または調節する薬剤、化合物、および方法、ミエリン形成を促進する方法、ならびにミエリン形成または再ミエリン化が対象にとって有益である対象の疾患または障害の治療方法に関する。
【００５４】
我々は、中枢神経系（ＣＮＳ）損傷に応答してグリア性瘢痕の形成中に細胞外マトリックス中に放出された特定のタイプのコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＣＳＰＧ）が、ＯＰＣ上の同族レセプタータンパク質チロシンホスファターゼσ（ＰＴＰσ）との結合を介して、ミエリンの生成を低減できることを見出した。種々のインビトロ、インサイツおよびインビボ多発性硬化症（ＭＳ）のモデルでは、瘢痕形成に関連する病変中のプロテオグリカン沈着がＯＰＣ移動、分化およびミエリンの再形成を強力に阻害した。我々は、ＰＴＰσ触媒活性、シグナル伝達、および／または機能を阻害する全身性ペプチド治療がＬＰＳ誘導病変中で再ミエリン化の速度を顕著に高め、慢性脱髄後の強力なミエリン再生および機能回復を誘発することを見出した。さらに、ＰＴＰσ触媒活性、シグナル伝達、および／または機能の阻害が、ＯＰＣにより分泌されるプロテアーゼＭＭＰ−２の発現上昇を高めることができ、これが、次に、ＭＳの進行を停止または遅延させ得るＣＳＰＧの強力な消化を可能とする。
【００５５】
したがって、本明細書で記載のいくつかの実施形態では、ＰＴＰσの触媒活性、シグナル伝達、および／または機能の１つまたは複数を、抑制、阻害、および／または遮断する治療薬を、ＯＰＣの移動、分化、増殖および／または成熟を誘導、促進、および／または調節するために、ならびにミエリン形成または再ミエリン化が対象にとって有益である対象の疾患または障害を治療するために、対象に投与できる。
【００５６】
ＰＴＰσのシグナル伝達、および／または機能は、次記を含むいくつかの方法で抑制、阻害、および／または遮断できる：ＰＴＰσの細胞内ドメインの活性の直接阻害（例えば、小分子、ペプチド模倣体、抗体、細胞内抗体、またはドミナントネガティブポリペプチドの使用により）；ＰＴＰσの細胞内ドメインの活性、シグナル伝達、および／または機能の１つまたは複数を阻害する遺伝子および／またはタンパク質の活性化（例えば、遺伝子および／またはタンパク質の発現または活性を高めることにより）；ＰＴＰσの下流メディエーターである遺伝子および／またはタンパク質の阻害（例えば、メディエーター遺伝子および／またはタンパク質の発現および／または活性を遮断することにより）；ＰＴＰσの活性、シグナル伝達、および／または機能の１つまたは複数を負に制御する遺伝子および／またはタンパク質の導入（例えば、組換え遺伝子発現ベクター、組換えウイルスベクターまたは組換えポリペプチドを用いることにより）；または例えば、ＰＴＰσの発現低下変異体による遺伝子の置換（例えば、組み換え遺伝子発現またはウイルスベクター、または変異誘発を用いた相同組換え、過剰発現により）。
【００５７】
ＰＴＰσの活性、シグナル伝達および／または機能の１つまたは複数を阻害するまたは低減する治療薬には、ＰＴＰσの活性、シグナル伝達および／または機能を低下させるおよび／または抑制する薬剤を挙げることができる。このような薬剤は、細胞内に送達でき、細胞内に送達されると、ＯＰＣ移動、分化、増殖および／または成熟を促進し、ミエリン形成または再ミエリン化を増強できる。
【００５８】
いくつかの実施形態では、ＰＴＰσの活性、シグナル伝達および／または機能の１つまたは複数を阻害するまたは低減する治療薬には、ＰＴＰσの細胞内ドメイン、特に、細胞内くさび形状ドメインに結合および／またはそれと複合体形成してＰＴＰσの活性、シグナル伝達および／または機能を阻害する治療用ペプチドまたは小分子を挙げることができる。従って、ＯＬおよび／またはＯＰＣ（ＯＬ／ＯＰＣ）のＰＴＰσの細胞内ドメインに結合する、および／またはそれと複合体形成する治療用ペプチドまたは小分子を用いてこれらの細胞の細胞増殖、運動、生存および可塑性を促進できる。
【００５９】
治療薬は、例えば、国際公開第２０１３／１５５１０３Ａ１（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載ものなどのＰＴＰσの細胞内触媒ドメインのくさび形形状のドメイン（すなわち、くさび形ドメイン）のペプチド模倣体であり得る。細胞（例えば、ＯＬ／ＯＰＣ）で発現される場合または細胞内輸送部分に結合される場合の、ＰＴＰσのくさび形ドメインのペプチド模倣体は、くさび形ドメインに結合することができ、また、これを用いて、ＣＳＰＧで活性化されたＯＬ／ＯＰＣのＰＴＰσシグナル伝達を消滅させて、細胞増殖、運動、および生存を促進できる。これらの治療用ペプチドのＰＴＰσの無傷のくさび形ドメインへの結合は、可能性として、（ｉ）ＰＴＰσがホスファターゼ標的などの標的タンパク質を相互作用する能力を妨害する；（ｉｉ）ＰＴＰσと、触媒的不活性な第２のホスファターゼドメインＤ２などのＰＴＰσ中に含まれる別のドメインとの分子間相互作用促進活性を妨害する；（ｉｉｉ）タンパク質の活性ホスファターゼ部位へのアクセスを妨害する；（ｉｖ）くさび形ドメインの正常な相互作用を排除する；および／または（ｖ）ホスファターゼ活性を立体的に阻害する。
【００６０】
いくつかの実施形態では、ペプチド模倣体（すなわち、治療用ペプチド）は、約１０〜約２０個アミノ酸を含み、から本質的に成り、および／またはから成ることができ、ＰＴＰσのくさび形ドメインのアミノ酸配列の約１０〜約２０個の連続するアミノ酸部分に対して少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または約１００％相同または同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、約１０個〜約２０個の連続するアミノ酸部分は、Ｎ末端αヘリックスおよび４個のアミノ酸ターンのくさび形ドメインの連続するアミノ酸を含む。
【００６１】
細胞質ゾル−キャリアを有するＰＴＰσのくさび形ドメインに相当するまたは実質的に相同であるペプチド（例えば、治療用ペプチド）は、ＣＳＰＧ媒介阻害を除去することができ、ＬＰＳ誘導病変中の再ミエリン化の速度を高め、強力な慢性脱髄後のミエリン再生および機能回復を誘発し、ＯＰＣにより分泌されるプロテアーゼＭＭＰ−２の発現上昇を強化でき、これが、次に、ＣＳＰＧの強力な消化を可能とする。このペプチドは、対象に全身性に投与され、ミエリン形成または再ミエリン化を促進できる。
【００６２】
表１に示すように、ＰＴＰσのくさび形ドメインの配列は高等哺乳動物の間では高度に保存されており、ヒトからマウスとラットへは、たった１つのアミノ酸の変化があり（６位におけるスレオニンからメチオニンへ）、１００％相同を妨げている。
【表１】
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【００６３】
表１に示すように、ＰＴＰσのくさび形ドメインの第１のαヘリックスは、アミノ酸１〜１０を含み、ターン領域はアミノ酸１１〜１４を含み、第２のαヘリックスはアミノ酸１５〜２４を含む。例えば、ヒトＰＴＰσのくさび形ドメインの第１のαヘリックスは、ＤＭＡＥＨＴＥＲＬＫ（配列番号２９）のアミノ酸配列を有し、ターンはＡＮＤＳ（配列番号３０）のアミノ酸配列を有し、第２のαヘリックスはＬＫＬＳＱＥＹＥＳＩ（配列番号３１）を有する。
【００６４】
くさび形ドメインはまた、ＬＡＲファミリーの他のメンバー、ＬＡＲおよびＰＴＰσと配列相同性を共有する。これらのアミノ酸はくさび形ドメインの全体構造に必要であると思われる。保存されたアミノ酸には１３位のアラニンが含まれ、それは第１のαヘリックスの末端およびターンの開始にマークし、一般的なくさび形のサイズおよび構造に必要になる可能性が高い。
【００６５】
くさび形ドメインの大略の二次構造および三次構造がほとんどの受容体ＰＴＰで変わらないままなので、ＰＴＰσを標的とする治療用ペプチドに対していくつかの保存的置換を行って類似の結果を得ることができる。保存的置換の例には、例えば、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンなどの１つの非極性（疎水性）残基の別の残基への置換、アルギニンとリシンの間、グルタミンとアスパラギンの間、グリシンとセリンの間などの１つの極性（親水性）残基の別の残基への置換、リシン、アルギニンまたはヒスチジンなどの１つの塩基性残基の別の残基への置換、および／またはアスパラギン酸またはグルタミン酸などの１つの酸性残基の別の残基への置換が挙げられる。
【００６６】
これらの保存的置換は、αヘリックスまたはターンにおける独特ではないドメイン、特に第１のαヘリックスにおける１〜３位および７〜１０位、ターンにおける１２および１３位、ならびに第２のαヘリックスにおける１５、１６、１８〜２４位で行なうことができる。これらのアミノ酸はくさび形ドメインの全体構造に対して必要であり得るが、ＰＴＰσへのくさび形の結合の特異性には必要ではない。
【００６７】
ＰＴＰσに対する独特のアミノ酸、特にＰＴＰσとＬＡＲで差次的に発現されるアミノ酸は、くさび形ドメインの結合の特異性に必要であることが見出された。これらには、第１のαヘリックスの４位および５位、それに続く６位のスレオニンまたはメチオニン（ラットとマウスでの置換）におけるＥＨドメインが挙げられる。ターンでは、高等哺乳動物すべてにおいて、１４位の独特のセリンがある。最後に、第２のαヘリックスでは１７位に独特のロイシンがある。これらの独特のアミノ酸の可能な役割は以下で考察する。
【００６８】
１４位でのターンにおけるセリン残基はくさび形ドメインのその位置のために特に興味深い。αヘリックス間のターンに位置するこのアミノ酸は、ＰＴＰσの一般的な二次構造および三次構造からやや伸びて、結合の相互作用にそれを利用できるようにしている。加えて、セリンは、そのヒドロキシル基およびそれが有する極性のために、例えば、隣接するセリン間の水素結合などのいくつかの同種親和性および異種親和性の結合事象を促進することが知られている。セリンはまたリン酸化のような種々の修飾を受けることも知られ、特異性のためのその必要性の可能性を高くしている。くさび形ドメインのターンに焦点を置き、保存されたセリンを含む小さなペプチドが類似の機能と共にさらに大きな安定性を提供し得ることは可能である。そのようなペプチドは、システインのいずれかの末端と共にループとして合成されてジスルフィド結合を生成することができる。
【００６９】
第１のαヘリックスにおける独特のアミノ酸には、４位のグルタミン酸、５位のヒスチジンおよび６位のスレオニンまたはメチオニンが挙げられる。ヒスチジンはコンセンサスくさび形ドメインに関与するが、それはＬＡＲ、ＰＴＰσ、ＰＴＰμまたはＣＤ４５には見つからない。これらの３個のアミノ酸はすべて帯電しているかまたは極性なので、この配列またはその成分の１つがＰＴＰσのくさび形の特異性に必要であると思われる。
【００７０】
さらに、第２のαヘリックスは１７位で独特のロイシンを含む。ロイシンは、ロイシンジッパーの三次元構造にとって重要な接着性分子に関係があるとされている。くさび形ドメインに構造的に類似するこれらの分子では、ほぼ７間隔で配置されている、対向するαヘリックスのロイシンは、対向するαヘリックスの疎水性領域と相互作用する。第１のαヘリックスには９位に位置するロイシンもあるので、この独特のロイシンはＰＴＰσのくさび形の全体三次構造の構造的健全性に必要であると考えられる。
【００７１】
従って、他の実施形態では、治療用ペプチドは、約１４〜約２０個のアミノ酸を含む、それから本質的になる、またはそれからなることができ、アミノ酸配列ＥＨＸ１ＥＲＬＫＡＮＤＳＬＫＬ（配列番号３２）を含み、配列中、Ｘ１はＴまたはＭである。配列番号３２を含む治療用ペプチドは、治療用ペプチドが配列番号３２に対して少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％相同であるアミノ酸配列を有するように少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、または少なくとも５個の保存的置換を含むことができる。
【００７２】
いくつかの実施形態では、保存的置換は、配列番号３２のアミノ酸残基４Ｅ、５Ｒ、６Ｌ、７Ｋ、９Ｎ、１０Ｄ、１２Ｌ、または１３Ｋのものである。一例を挙げると、アミノ酸残基４ＥをＤまたはＱで置換することができ、アミノ酸残基５ＲをＨ，ＬまたはＫで置換することができ、アミノ酸残基６ＬをＩ、ＶまたはＭで置換することができ、アミノ酸残基７ＫをＲまたはＨで置換することができ、アミノ酸残基９ＮをＥまたはＤで置換することができ、アミノ酸残基１０ＤをＥまたはＮで置換することができ、アミノ酸残基１２ＬをＩ、ＶまたはＭで置換することができ、および／またはアミノ酸残基１３ＫをＲまたはＨで置換できる。
【００７３】
他の実施形態では、治療用ペプチドは、約１４〜約２０個のアミノ酸を含む、それから本質的になる、またはそれからなることができ、アミノ酸配列ＤＭＡＥＨＸ１ＥＲＬＫＡＮＤＳ（配列番号３３）を含み、配列中、Ｘ１はＴまたはＭである。配列番号３３を含む治療用ペプチドは、治療用ペプチドが配列番号３３に対して少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％相同であるアミノ酸配列を有するように少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、または少なくとも５個の保存的置換を含むことができる。
【００７４】
いくつかの実施形態では、保存的置換は、配列番号３３のアミノ酸残基７Ｅ、８Ｒ、９Ｌ、１０Ｋ、１２Ｎ、または１３Ｄのものである。一例を挙げると、アミノ酸残基７ＥをＤまたはＱで置換することができ、アミノ酸残基８ＲをＨ、ＬまたはＫで置換することができ、アミノ酸残基９ＬをＩ、ＶまたはＭで置換することができ、アミノ酸残基１０ＫをＲまたはＨで置換することができ、アミノ酸残基１２ＮをＥまたはＤで置換することができ、およびアミノ酸残基１３ＤをＥまたはＮで置換することができる。
【００７５】
本明細書で記載の治療用ペプチドは、他の種々の変更、置換、挿入、および欠失を受けることができ、このような変更は、その使用時に、特定の利点をもたらす。この点で、ＰＴＰσのくさび形ドメインに結合および／またはそれと複合体形成する治療用ペプチドは、１つまたは複数の変更が行われ、それがＰＴＰσの活性、シグナル伝達および／または機能の１つまたは複数を阻害するまたは低減する能力を保持する記述されたポリペプチドの配列に一致するのではなく、むしろ、それに相当し得る、または実質的に相同であり得る。
【００７６】
治療用ポリペプチドは、アミド、タンパク質との複合体、環化ポリペプチド、重合ポリペプチド、類似体、フラグメント、化学修飾ポリペプチド、などの誘導体を含む種々の形態のポリペプチド誘導体のいずれかであり得る。
【００７７】
保存的置換は、そのようなペプチドが必要な結合活性を示すという条件で非誘導体化残基の代わりに化学的に誘導体化した残基を使用することも含むことができることが十分に理解されよう。
【００７８】
「化学的誘導体」は、官能側基の反応によって、化学的に誘導体化された１つまたは複数の残基を有する当該ポリペプチドを意味する。そのような誘導体化された分子には、例えば、遊離のアミノ基が誘導体化されてアミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブトキシカルボニル基、クロロアセチル基、またはホルミル基を形成する分子が挙げられる。遊離のカルボキシル基は誘導体化されて塩、メチルエステルおよびエチルエステル、または他の種類のエステルまたはヒドラジドを形成し得る。遊離のヒドロキシル基は誘導体化されてＯ−アシルまたはＯ−アルキル誘導体を形成し得る。ヒスチジンのイミダゾール窒素は誘導体化されてＮ−イン−ベンジルヒスチジンを形成し得る。また、化学的な誘導体として包含されるのは、２０個の標準アミノ酸の１個または複数の天然に存在するアミノ酸誘導体を含有するポリペプチドである。例えば、４−ヒドロキシプロリンは、プロリンを置換してもよく、５−ヒドロキシリシンはリシンを置換してもよく、３−メチルヒスチジンはヒスチジンを置換してもよく、ホモセリンはセリンを置換してもよく、オルニチンはリシンを置換してもよい。本明細書で記載のポリペプチドはまた、必要な活性が維持される限り、その配列が本明細書で示されるポリペプチドの配列に対する１つまたは複数の残基の付加および／または欠失を有する任意のポリペプチドも含み得る。
【００７９】
本明細書で記載される治療用ペプチドの１種または複数のペプチドを、例えば、当該技術で既知である、翻訳後プロセッシングなどの天然の過程、および／または化学修飾法により修飾できる。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、およびアミノ末端またはカルボキシ末端を含むペプチドで行われ得る。同じ種類の修飾が所与のペプチドのいくつかの部位で、同じまたは異なる程度で存在し得ることは理解されよう。修飾は、例えば、限定されないが、アセチル化、アシル化、アセトアミドメチル（Ａｃｍ）基の付加、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンへの共有結合、ヘム部分への共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化およびユビキチン化などの転移ＲＮＡが介在するタンパク質へのアミノ酸の付加を含む（参考のために、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ−ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ−Ｙｏｒｋ，１９９３を参照されたい）。
【００８０】
本明細書で記載のペプチドおよび／またはタンパク質は、例えば、生物学的に活性のある変異体、バリアント、フラグメント、キメラおよび類似体も含み得る；フラグメントは、１個または複数のアミノ酸の短縮化を有するアミノ酸配列を包含し、短縮化は、アミノ末端（Ｎ末端）、カルボキシ末端（Ｃ末端）、またはタンパク質の内部を起源とし得る。本発明の類似体には１個または複数のアミノ酸の挿入または置換を含む。バリアント、変異体、フラグメント、キメラおよび類似体は、ＬＡＲファミリーのホスファターゼの阻害剤として機能し得る（本発明の実施例に限定されることなく）。
【００８１】
本明細書で記載の治療用ポリペプチドは、当業者に既知の方法で調製され得る。ペプチドおよび／またはタンパク質は組換えＤＮＡを用いて調製され得る。例えば、調製の１つには、細胞の中でペプチドおよび／またはタンパク質の発現を提供する条件下で宿主（細菌または真核細胞）を培養することが含まれ得る。
【００８２】
ポリペプチドの精製は、アフィニティ法、イオン交換クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、疎水性、またはタンパク質精製に通常使用される他の精製法により行われ得る。精製ステップは非変性条件下で実施できる。一方、変性ステップが必要である場合には、当該技術で既知の技法を用いてタンパク質が復元され得る。
【００８３】
いくつかの実施形態では、本明細書で記載の治療用ペプチドは、ポリペプチドが他のポリペプチド、タンパク質、検出可能な部分、標識、固体マトリクスまたはキャリアに好都合に連結され、および／または取り付けられ得るリンカーを提供することを目的として、ポリペプチドのいずれかの末端に付加され得る追加の残基を含むことができる。
【００８４】
アミノ酸残基のリンカーは普通、少なくとも残基１個であり、４０個以上の残基であることができ、１〜１０個の残基であることがさらに多い。連結に使用される典型的なアミノ酸残基は、グリシン、チロシン、システイン、リシン、グルタミン酸およびアスパラギン酸等である。加えて、当該ポリペプチドは、末端−ＮＨ２アシル化、例えば、アセチル化により、または末端カルボキシルアミド化、例えば、アンモニア、メチルアミン等の末端修飾によるチオグリコール酸のアミド化により修飾されている配列によって、異なり得る。末端修飾は、周知のように、プロテイナーゼ消化による感受性を低減するのに有用であるので、プロテアーゼが存在し得る溶液、特に生体液中のポリペプチドの半減期を延ばすように役立つ。この点で、ポリペプチドの環化も有用な末端修飾であり、環化により形成される安定な構造のために、および本明細書で記載のこのような環状ペプチドで認められる生物活性の観点で特に好ましい。
【００８５】
いくつかの実施形態では、リンカーは、治療用ペプチドを他のポリペプチド、タンパク質および／または検出可能な部分などの分子、標識、固体マトリクスまたはキャリアに連結する柔軟性のペプチドリンカーであり得る。柔軟性のペプチドリンカーは長さ約２０個以下のアミノ酸であり得る。例えば、ペプチドリンカーは約１２個以下のアミノ酸残基、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１および１２個を含み得る。いくつかの事例では、ペプチドリンカーは２個以上の次記のアミノ酸：グリシン、セリン、アラニンおよびスレオニンを含む。
【００８６】
いくつかの実施形態では、本明細書で記載される治療用ペプチドを含む治療薬は、治療用ペプチドに連結される少なくとも輸送用のサブドメインまたは部分（すなわち、輸送部分）を含む抱合タンパク質または薬剤送達構築物の形態で提供され得る。輸送部分は、治療用ポリペプチドの哺乳動物（すなわち、ヒトまたは動物）の組織または細胞（例えば、神経細胞）への取り込みを容易にできる。輸送部分は治療用ポリペプチドに共有結合できる。共有結合にはペプチド結合および不安定結合（例えば、容易に切断可能なまたは内部の標的細胞環境で化学変化にさらされる結合）が挙げられ得る。さらに、輸送部分は治療用ポリペプチドに架橋（例えば、化学架橋、ＵＶ架橋）することができる。輸送部分は本明細書で記載される連結ポリペプチドと共に治療用ポリペプチドに連結することもできる。
【００８７】
輸送部分は治療剤中で２回以上反復できる。輸送部分の反復は所望の細胞によるペプチドおよび／またはタンパク質の取り込みに影響し得る（例えば、取り込みを増やす）。輸送部分はまた、治療用ペプチドのアミノ末端またはそのカルボキシ末端の領域のいずれか、または両方の領域に位置し得る。
【００８８】
一実施形態では、輸送部分は、いったん輸送部分に連結されると治療用ポリペプチドが受容体に無関係なメカニズムによって、細胞に侵入することを可能にする少なくとも１つの輸送用ペプチドを含むことができる。一例では、輸送用ペプチドは、Ｔａｔ媒介タンパク質送達配列と、配列番号１〜２５、３２、および３３の少なくとも１つを含有する合成ペプチドである。これらのペプチドはそれぞれ、配列番号３４〜６０のアミノ酸配列を有し得る。
【００８９】
既知の輸送用の部分、サブドメイン等の他の例は、例えば、カナダ特許第２，３０１，１５７号（アンテナペディアのホメオドメインを含有する複合体）、ならびに米国特許第５，６５２，１２２号、同第５，６７０，６１７号、同第５，６７４，９８０号、同第５，７４７，６４１号、および同第５，８０４，６０４号（Ｔａｔ  ＨＩＶタンパク質タンパク質のアミノ酸含有複合体；単純性ヘルペスウイルス−１  ＤＮＡ結合タンパク質ＶＰ２２、４〜３０のヒスチジン反復長さの範囲のヒスチジンタグ、または受容体とは独立した方法によって、活性カーゴ部分の取り込みを容易にすることが可能であるその変異誘導体またはホモログ）に記載されている。前述の全ての特許は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００９０】
アンテナペディアのホメオドメインの第３αヘリックスの１６アミノ酸領域は、タンパク質（融合タンパク質として作られた）が細胞膜の通過を可能にすることが示されている（国際公開第９９／１１８０９号およびカナダ特許出願第２，３０１，１５７号）。同様に、ＨＩＶのＴａｔタンパク質も細胞膜を通過することができることが示された。
【００９１】
加えて、輸送部分は、活性薬剤部分（例えば、細胞内ドメイン含有フラグメント阻害物質ペプチド）に共有結合された塩基性アミノ酸リッチ領域を有するポリペプチドを含むことができる。本明細書で使用される場合、用語の「塩基性アミノ酸リッチ領域」は、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン、グルタミン、リシンなどの塩基性アミノ酸の含量が高いタンパク質の領域に関する。「塩基性アミノ酸リッチ領域」は、例えば、１５％以上の塩基性アミノ酸を有し得る。いくつかの事例では、「塩基性アミノ酸リッチ領域」は、１５％未満の塩基性アミノ酸を有し得るが、依然として輸送剤領域として機能する。他の例では、塩基性アミノ酸領域は３０％以上の塩基性アミノ酸を有する。
【００９２】
輸送部分は、プロリンリッチ領域をさらに含み得る。本明細書で使用される場合、用語のプロリンリッチ領域は、その配列に５％以上（１００％までの）プロリンを有するポリペプチドの領域を意味する。いくつかの事例では、プロリンリッチ領域は、５％〜１５％のプロリンを有し得る。さらに、プロリンリッチ領域は、天然タンパク質（例えば、ヒトゲノムによりコードされるタンパク質）で通常観察されるものより多いプロリンを含有するポリペプチドの領域を意味する。本出願のプロリンリッチ領域は輸送剤領域として機能できる。
【００９３】
一実施形態では、本明細書で記載の治療用ペプチドは形質導入剤に非共有結合できる。非共有結合ポリペプチド形質導入剤の例は、Ｃｈａｒｉｏｔタンパク質送達システム（米国特許第６，８４１，５３５号；Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４（３５）：２４９４１−２４９４６；およびＮａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃ．１９：１１７３−１１７６を参照されたい（これらの文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる））である。
【００９４】
他の実施形態では、遺伝子治療を用いて治療される細胞中で治療用ペプチドを発現させて、ＬＡＲファミリーのシグナル伝達またはＰＴＰσのシグナル伝達を阻害できる。遺伝子治療は、治療用ペプチドをコードするヌクレオチドを含むベクターを使用できる。「ベクター」（遺伝子送達または遺伝子導入「ビークル」とも呼ばれることがある）は、細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む高分子または分子の複合体を意味する。送達されるポリヌクレオチドは遺伝子治療の対象にしているコード配列を含み得る。ベクターには、例えば、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス（Ａｄ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）およびレトロウイルス）、リポソームおよび他の脂質含有複合体、および標的細胞へのポリヌクレオチドの送達を媒介することが可能である他の高分子複合体が挙げられる。
【００９５】
ベクターはまた、遺伝子送達および／または遺伝子発現をさらに調節する、または他の方法で標的細胞に有益な特性を提供する他の成分または官能基を含むことができる。このような他の成分には、例えば、細胞への結合またはターゲティングに影響を与える成分（細胞型または組織に特異的な結合を媒介する成分を含む）、細胞によるベクター核酸の取り込みに影響を与える成分、取り込み後、細胞内でのポリヌクレオチドの局在化に影響を与える成分（例えば、核での局在化を媒介する薬剤）、およびポリヌクレオチドの発現に影響を与える成分（例えば、１つまたは複数の転写制御配列）が挙げられる。このような成分はまた、ベクターにより送達された核酸を取り込み、発現している細胞を選択し、検出するのに使用できる検出可能なおよび／または選択可能なマーカーなどのマーカーも含み得る。このような成分は、ベクターの固有の特徴として提供することができ（例えば、結合および取り込みを媒介する成分または官能基を有する特定のウイルスベクターの使用）、またはベクターは修飾されてこのような官能基を提供できる。
【００９６】
選択可能なマーカーは、ポジティブ、ネガティブ、または二官能性であり得る。ポジティブ選択マーカーマーカーはマーカーを運ぶ細胞の選択を可能にするが、ネガティブ選択マーカーは、マーカーを運ぶ細胞が選択的に除去されるのを可能にする。二官能性（すなわち、ポジティブ／ネガティブ）のマーカーを含む種々のこのようなマーカー遺伝子が記載されている（例えば、１９９２年５月２９日に公開されたＬｕｐｔｏｎ，Ｓ．の国際公開第９２／０８７９６号、および１９９４年１２月８日に公開されたＬｕｐｔｏｎ，Ｓ．の国際公開第９４／２８１４３号を参照されたい）。このようなマーカー遺伝子は、遺伝子治療の状況で有利であり得る制御の追加の尺度を提供できる。多種多様なこのようなベクターが当該技術で既知であり、一般に利用可能である。
【００９７】
本明細書で使用するためのベクターには、本明細書で記載される治療用ペプチドをコードするヌクレオチドを標的細胞に送達することが可能であるウイルスベクター、脂質系ベクターおよび他の非ウイルスベクターが挙げられる。ベクターは、標的化ベクター、特にニューロンに選択的に結合する標的化ベクターであり得る。本出願で使用するためのベクターには、標的細胞に対して低い毒性を示し、治療上有用な量の治療用ペプチドの細胞特異的な産生を誘導するものが挙げられる。
【００９８】
ウイルスベクターの例は、アデノウイルス（Ａｄ）またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来するものである。ヒトおよび非ヒトのウイルスベクター両方を使用することができ、組換えウイルスベクターはヒトでは複製欠損であり得る。ベクターがアデノウイルスである場合、ベクターは治療用ペプチドをコードする遺伝子に動作可能に連結されたプロモーターを有するポリヌクレオチドを含むことができ、ヒトでは複製欠損である。
【００９９】
本明細書で使用できる他のウイルスベクターには単純性ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）系のベクターが挙げられる。１つまたは複数の前初期遺伝子（ＩＥ）を欠失させたＨＳＶベクターは、通常、非毒性であり、潜伏に似た状態で生き残り、効率的な標的細胞への形質導入を提供するので有利である。組換えＨＳＶベクターはおよそ３０ｋｂの異種の核酸を組み入れることができる。
【０１００】
Ｃ型レトロウイルスおよびレンチウイルスなどのレトロウイルスも本出願で使用され得る。例えば、レトロウイルスベクトルは、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）をベースにし得る。例えば、Ｈｕ  ａｎｄ  Ｐａｔｈａｋ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．５２：４９３−５１１，２０００  ａｎｄ  Ｆｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．１７：１−６０，２０００を参照されたい。ＭＬＶ系ベクターは、ウイルス遺伝子の代わりに８ｋｂまでの異種（治療用）のＤＮＡを含有し得る。異種のＤＮＡは組織特異的なプロモーターおよび治療用ペプチドをコードする核酸を含み得る。神経細胞への送達方法では、それは組織特異的な受容体に対するリガンドもコードし得る。
【０１０１】
使用され得る追加のレトロウイルスベクターはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）系ベクターを含む複製欠損のレンチウイルス系ベクターである。例えば、Ｖｉｇｎａ  ａｎｄ  Ｎａｌｄｉｎｉ，Ｊ．Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．５：３０８−３１６，２０００  ａｎｄ  Ｍｉｙｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８１５０−８１５７，１９９８を参照されたい。レンチウイルスベクターは、活発に分裂している細胞および分裂しない細胞の両方に感染させることが可能であるという点で有利である。
【０１０２】
本出願で使用するためのレンチウイルスはヒトおよび非ヒト（ＳＩＶを含む）のレンチウイルスに由来し得る。レンチウイルスベクターの例には、ベクターの感染に必要とされる核酸配列ならびに治療用ペプチドをコードする核酸に動作可能に連結される組織特異的なプロモーターを含む。これら前者はウイルスＬＴＲ、プライマー結合部位、ポリプリン配列、ａｔｔ部位およびカプシド形成部位を含み得る。
【０１０３】
一部の態様では、レンチウイルスベクターを採用できる。レンチウイルスは、異なる種類のＣＮＳニューロンに形質導入するのが可能であることが判明しており（Ａｚｚｏｕｚ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２：１０３０２−１２）、その大きなクローニング能力のためにいくつかの実施形態で使用され得る。
【０１０４】
レンチウイルスベクターは任意のレンチウイルスカプシドにパッケージされ得る。１つの粒子タンパク質を異なるウイルスに由来する別の粒子タンパク質で置き換えることを「シュードタイピング」と呼ぶ。ベクターカプシドは、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）または水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を含む他のウイルスに由来するウイルスエンベロープを含有し得る。ＶＳＶのＧタンパク質の使用は高いベクター力価を生じ、ベクターウイルス粒子の高い安定性をもたらす。
【０１０５】
セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）およびシンドビスウイルス（ＳＩＮ）から作製されるものなどのアルファウイルス系ベクターも本出願で使用され得る。アルファウイルスの使用は、Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ，Ｋ．，Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４３：２４７−２５７，２０００  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７４：９８０２−９８０７，２０００に記載されている。
【０１０６】
組換え複製欠損のアルファウイルスベクターは、高レベルの異種（治療用）遺伝子の発現が可能であり、広い範囲の標的細胞に感染することができるので有利である。同族の結合相手を発現している標的細胞への選択的な結合を可能にする機能的な異種のリガンドまたは結合ドメインをそのビリオン表面に表示させることにより、アルファウイルスのレプリコンは特定の細胞型を標的化し得る。アルファウイルスのレプリコンは潜伏を成立させ得るので、標的細胞における長期の異種の核酸の発現を樹立し得る。レプリコンはまた標的細胞中で一時的な異種の核酸の発現も示し得る。
【０１０７】
本出願の方法に適合する多数のウイルスベクターの内で、２つ以上のプロモーターをベクターに導入して、２つ以上の異種の遺伝子がベクターにより発現させるのを可能にすることができる。さらに、ベクターは、標的細胞からの治療用ペプチドの発現を促進するシグナルペプチドまたは他の部分をコードする配列を含むことができる。
【０１０８】
２つのウイルスベクターの系の有利な特性を組み合わせるために、ハイブリッドウイルスベクターを使用して治療用ペプチドをコードする核酸を標的のニューロン、細胞または組織に送達し得る。ハイブリッドベクターの構築の標準的な技法は当業者に周知である。このような技法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．または組換えＤＮＡ技法について考察するいくつかの実験マニュアル中に見出すことができる。ＡＡＶとアデノウイルスＩＴＲの組み合わせを含有するアデノウイルスのカプシド中の二本鎖ＡＡＶゲノムを用いて細胞に形質導入し得る。別の変異では、ＡＡＶベクターが「パワー不足の」、「ヘルパー依存性の」または「高い許容量」のアデノウイルスベクターに入れられ得る。アデノウイルス／ＡＡＶのハイブリッドベクターは、Ｌｉｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：９３１４−９３２４，１９９９で考察されている。レトロウイルス／アデノウイルスのハイブリッドベクターは、Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：１７６−１８６，２０００で考察されている。 アデノウイルスの中に含有されるレトロウイルスのゲノムを、標的細胞のゲノムに統合し、安定な遺伝子発現を行い得る。
【０１０９】
治療用ペプチドの発現およびベクターのクローニングを容易にする他のヌクレオチド配列要素がさらに意図されている。例えば、プロモーターの上流のエンハンサーまたはコーディング領域の下流のターミネーターの存在は、例えば、発現を容易にできる。
【０１１０】
別の実施形態では、本明細書で記載される治療用ペプチドをコードするヌクレオチドに組織特異的プロモーターを融合できる。アデノウイルス構築物内でこのような組織特異的なプロモーターを融合することにより、導入遺伝子の発現は特定の組織に限定される。本出願の組換えアデノウイルスの系を用いて、組織特異的なプロモーターにより提供される遺伝子発現の有効性および特異性の程度を決定できる。例えば、血小板由来増殖因子β鎖（ＰＤＧＦ−β）のプロモーターなどのニューロン特異的なプロモーターおよびベクターは当該技術で既知である。
【０１１１】
ウイルスベクター系の方法に加えて、非ウイルス系の方法を用いて治療用ペプチドをコードする核酸を標的細胞に同様に導入し得る。遺伝子送達の非ウイルス性の方法の概説は、Ｎｉｓｈｉｋａｗａ  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１２：８６１−８７０，２００１で提供されている。本出願による非ウイルス性の遺伝子送達法の例は、プラスミドＤＮＡを採用して治療用ペプチドをコードする核酸を標的細胞に導入する。プラスミド系遺伝子送達法は当該技術で一般に知られている。
【０１１２】
合成の遺伝子導入分子を設計してプラスミドＤＮＡとの多分子凝集体を形成できる。これらの凝集体を標的細胞に結合するように設計できる。リポポリアミンおよびカチオン性脂質を含むカチオン性両親媒性物質を用いて受容体とは独立した標的細胞への核酸導入を提供できる。
【０１１３】
加えて、事前に形成されたカチオン性リポソームまたはカチオン性脂質を、プラスミドＤＮＡと混合して細胞−遺伝子導入複合体を生成し得る。カチオン性脂質配合物を含む方法は、Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７２：１２６−１３９，１９９５およびＬａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．２０：２２１−２６６，１９９６で概説されている。    遺伝子送達のために、ＤＮＡはまた、両親媒性のカチオン性ペプチドにも結合され得る（Ｆｏｍｉｎａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．２：４５５−４６４，２０００）。
【０１１４】
ウイルス系および非ウイルス系成分の両方を含む方法を本出願に従って使用し得る。たとえば、治療用の遺伝子送達のためのエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）系プラスミドについては、Ｃｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ８：１５０８−１５１３，２００１に記載されている。さらに、アデノウイルスに結合させたＤＮＡ／リガンド／ポリカチオン性の付加物を含む方法は、Ｃｕｒｉｅｌ，Ｄ．Ｔ．，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎ．１３：１４１−１６４，１９９４に記載されている。
【０１１５】
さらに、電気穿孔法を用いて標的細胞に遺伝子導入することにより、治療用ペプチドをコードする核酸を標的細胞に導入できる。電気穿孔法は周知であり、プラスミドＤＮＡ用いた細胞の遺伝子導入を容易にするために使用できる。
【０１１６】
必要に応じて、例えば、生理食塩水などの薬学的に許容可能なキャリアを含有する注射可能な製剤の形態で、治療用ペプチドの発現をコードするベクターをインビボで標的細胞に送達できる。本出願に従って、他の医薬キャリア、製剤および調剤を使用することもできる。
【０１１７】
標的細胞が、処理されるＯＬ／ＯＰＣを含む場合、ベクターは、高効果的療法を可能にする程度に治療用ペプチドが発現されるのに十分な量で、ＯＬ／ＯＰＣに直接またはＯＬ／ＯＰＣの周辺部近くに注入することにより送達できる。ＯＬ／ＯＰＣに直接にまたはその周辺部近傍にベクターを注入することによって、ベクターの遺伝子導入を予想以上に効果的に標的とすることができ、組換えベクターの損失を最小限にすることができる。この種の注入は、特に損傷の部位での所望の数の細胞の局所的遺伝子導入を可能にし、それにより、遺伝子導入の治療効力を最大化し、ウイルスタンパク質に対する炎症反応の可能性を最少化する。標的細胞にベクターを投与する他の方法を用いることができ、それは採用される特定のベクターに左右されるであろう。
【０１１８】
一時的な発現および安定した長期的な発現を含めて、標的細胞の中で所望の長さの時間、治療用ペプチドを発現させることができる。本出願の一態様では、治療用ペプチドをコードする核酸は、遺伝子導入された細胞の活性および増殖を誘導するのに効果的な一定の時間長さにわたり、治療量で発現される。本出願の別の態様では、治療用ペプチドをコードする核酸は、ＯＬ／ＯＰＣの生存率を上げるのに効果的な一定の時間長さにわたり治療量で発現されて、ＯＰＣ移動、分化、増殖および／または成熟を高め、および／またはミエリン形成または再ミエリン化を高める。
【０１１９】
本明細書で記載される治療薬は修飾され得る（例えば、化学的に修飾される）。このような修飾は、分子の取り扱いまたは精製を容易にする、分子の溶解度を高める、投与を容易にする、所望の位置を標的とする、半減期を増減させるように設計し得る。多くのこのような修飾が当該技術で既知であり、技量のある開業医により適用できる。
【０１２０】
本明細書で開示される治療方法では、治療有効量の治療薬が対象に投与され、ミエリン関連または脱髄関連疾患または障害（例えば、ＭＳ）が治療される。一実施形態では、治療薬を含む製剤を、例えば、ミエリン関連または脱髄関連疾患または障害（例えば、ＭＳ）の検出または発症の時間から、ミエリン関連または脱髄関連疾患または障害（例えば、ＭＳ）の検出または発症の数日、数週、数カ月、および／または数年後までの期間、対象に投与できる。
【０１２１】
治療薬は、例えば、局所および／または全身投与を含む任意の好適な経路により対象に送達できる。全身投与には、例えば、筋肉内、静脈内、関節内、動脈内、くも膜下腔内、皮下または腹腔内の投与などの、非経口的投与を含むことができる。薬剤はまた、経口で、経皮で、局所に、吸入によって、（例えば、気管支内、鼻腔内、経口吸入、または点鼻剤）、または直腸内に投与することもできる。いくつかの実施形態では、治療薬は、注入ポンプを用いて、毎日、毎週、または複数服用量の治療薬を送達する静脈内投与により対象に投与できる。
【０１２２】
局所投与の望ましい特徴には、治療薬の有効な局所濃度を達成すること、ならびに治療薬の全身性投与に由来する有害な副作用を回避することが挙げられる。一実施形態では、対象の脳中に治療薬を直接導入できる。
【０１２３】
薬学的に許容可能な治療薬の製剤を水性ビークルに懸濁し、従来の皮下注射針を介してまたは注入ポンプを用いて導入できる。
【０１２４】
注射用として、治療薬は、液体溶液、通常、例えば、ハンクス液またはリンゲル液などの生理的に適合性の緩衝液中で処方できる。加えて、治療薬は固形形態で処方され、使用の直前に再溶解または懸濁され得る。凍結乾燥された形態も含まれる。注入は、例えば、治療薬のボーラス注入の形態または連続点滴（例えば、注入ポンプを用いて）の形態であり得る。
【０１２５】
動物またはヒトのいずれかに対する治療薬の量、体積、濃度、および／または投与量は、対象の大きさ、体表面積、年齢、投与される特定の組成物、性別、投与の時間および経路、総体的な健康、および同時に投与される他の薬物を含む多くの因子に依存することは理解されよう。上述の治療薬の量、体積、濃度、および／または投与量の具体的変化量は、以下に記載される実験方法を用いて当業者が容易に決定できる。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、本明細書で記載の治療用ペプチドなどの治療薬は、それを必要としている対象に、約０．１μｍｏｌ、約１μｍｏｌ、約５μｍｏｌ、約１０μｍｏｌ、もしくはそれ超；または約０．０００１ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇの治療される対象の体重、の用量または量で、局所的におよび／または全身性に投与できる。治療薬は、毎日１回、週１回、２週に１回、月１回、またはそれ未満の頻度で、ＣＳＰＧ領域の最大再ミエリン化があるまで、投与できる。
【０１２７】
別の実施形態では、治療薬は、損傷が生じたときの、通常、約２４時間以内、約４８時間以内、約１００時間以内、または約２００時間もしくはそれ超の時間以内（例えば、損傷の時間から約６、約１２、または２４時間以内（包括的））に、対象に静脈内注射により全身性にまたは損傷部位に局所的に投与できる。
【０１２８】
他の実施形態では、治療薬の投与に使用される薬学的に許容可能な製剤はまた、活性化合物の対象への持続送達を提供するように処方することもできる。例えば、対象への最初の投与に続いて、少なくとも１、２、３または４週間（包括的）にわたり製剤は活性化合物を送達し得る。例えば、本明細書で記載の方法により治療される対象は、少なくとも３０日間治療薬で治療できる（反復投与または持続送達系の使用、または両方の使用により）。
【０１２９】
持続送達への手法には、高分子カプセル、製剤を送達するためのミニポンプ、生分解性インプラントまたは移植遺伝子導入自己細胞の使用が挙げられる（米国特許第６，２１４，６２２号を参照されたい）。埋め込み可能な注入ポンプシステム（例えば、ＩＮＦＵＳＡＩＤポンプ（Ｔｏｗａｎｄａ，ＰＡ）；Ｚｉｅｒｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８；Ｋａｎｏｆｆ，１９９４を参照されたい）および浸透圧ポンプ（Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより販売）が市販されており、また、他の方法は、当該技術で既知である。別の投与方法は、埋め込み可能で外部からプログラム可能な注入ポンプを経由するものである。注入ポンプシステムおよびリザーバシステムはまた、例えば、米国特許第５，３６８，５６２号および同第４，７３１，０５８号にも記載されている。
【０１３０】
治療用ペプチドをコードするベクターは、多くの場合、他の型の治療薬に比べてあまり頻繁に投与されない。例えば、このようなベクターの有効量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５または１０ｍｇ／ｋｇ（包括的）の範囲であり、毎日、毎週、二週に１回、毎月またはさらに少ない頻度で投与される。
【０１３１】
治療用ペプチドを送達するまたは発現させる能力は、多数の異なる細胞型での細胞の活性調節を可能にする。治療用ペプチドは、例えば、特異的プロモーターを介してＯＬ／ＯＰＣ中で発現させることができる。
【０１３２】
医薬組成物は、ＯＰＣ移動、分化、増殖および／または成熟の有益な効果を経験できる任意の対象に投与できる。この動物中で最も重要なのはヒトであるが、本発明はそのように限定されることを意図していない。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、治療薬は、対象におけるＯＰＣ移動、分化、増殖および／または成熟により対象を治療する方法で使用できる。方法は、治療有効量の本明細書で記載の治療薬を、それを必要としている対象に投与することを含み得る。治療有効量は、例えば、神経変性疾患（例えば、多発性硬化症）の対象を治療するのに効果的である量（投与量）を含み得る。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、本明細書で記載の治療薬を、未治療ＯＬ／ＯＰＣまたは対象中に生き残っているＯＬ／ＯＰＣの数に比べて、少なくとも、５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、５５０％、６００％、６５０％、７００％、７５０％、８００％、８５０％、９００％、９５０％、または１０００％の生き残っているＯＬ／ＯＰＣの数の増加により、対象のＯＬ／ＯＰＣの生存を促進するのに効果的な量で投与し得る。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、本明細書で記載の治療薬を、未治療ＯＰＣまたは対象中のＯＬ生成の量に比べて、少なくとも、５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、５５０％、６００％、６５０％、７００％、７５０％、８００％、８５０％、９００％、９５０％、または１０００％のＯＬ生成量の増加により、対象の中枢神経系中のＯＬの生成を高めるのに効果的な量で投与し得る。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、本明細書で記載の治療薬を、未治療ＯＰＣまたは対象中のＯＰＣ分化の量に比べて、少なくとも、５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、５５０％、６００％、６５０％、７００％、７５０％、８００％、８５０％、９００％、９５０％、または１０００％のＯＬ分化の増加により、対象の中枢神経系中のＯＬの分化を誘導するのに効果的な量で投与し得る。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、治療薬を対象に投与して、神経変性疾患および障害を治療することができる。本明細書で記載の方法による治療で意図されている神経変性疾患には、ミエリン関連障害を含むことができる。ミエリン関連障害には、対象の脱髄、不十分なミエリン形成および再ミエリン化、または髄鞘形成異常に関連する任意の疾患、状態、または障害を含むことができる。ミエリン関連障害は、種々の神経毒性侵襲から生じたミエリン形成関連障害または脱髄に起因する。本明細書で使用される場合、「脱髄」は、脱髄性の作用、または神経を絶縁しているミエリン鞘の減少を意味し、多発性硬化症、横断性脊髄炎、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、白質ジストロフィー、およびギラン・バレー症候群を含むいくつかの神経変性自己免疫疾患の顕著な特徴である。白質ジストロフィーは、遺伝性酵素欠損に起因し、これは、異常な形成、破壊、および／またはＣＮＳ白質内の異常なミエリン鞘の代謝回転を引き起こす。後天性および遺伝性両方のミエリン障害は、重度の障害に繋がる予後不良を共有する。従って、いくつかの実施形態は、対象の神経変性自己免疫疾患を治療する方法を含むことができる。
【０１３８】
本明細書記載の方法により治療または回復させ得るミエリン関連疾患または障害には、対象のＣＮＳまたは末梢神経系の髄鞘形成異常または脱髄に関連する疾患、障害または損傷を含むことができる。このような疾患には、限定されないが、ニューロンの周りのミエリンが存在しない、不完全な、正しく形成されていない、または劣化している疾患および障害が含まれる。このような疾患には、限定されないが、多発性硬化症（ＭＳ）、デビック病および炎症性の脱髄性疾患などの髄鞘破壊性障害；白質脳症、白質ジストロフィー、例えば、副腎脊髄ニューロパチー、脳腱黄色腫症、クラッベ病、アレキサンダー病、およびペリツェウス・メルツバッハ病（ＰＭＤ）などの白質萎縮性障害；ならびにギラン・バレー症候群およびシャルコー・マリー・トゥース病などの末梢神経系の脱髄性疾患が挙げられる。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、本明細書記載の方法により治療または回復させ得るミエリン関連疾患または障害には、白質ジストロフィーが含まれる。白質ジストロフィーは、脳、脊髄および頻繁に末梢神経に影響を与える一群の進行性で代謝性の遺伝性疾患である。各タイプの白質ジストロフィーは、脳のミエリン鞘の異常な発生または破壊に繋がる特定の遺伝子異常に起因する。各タイプの白質ジストロフィーは、ミエリン鞘の種々の部分に影響を与え、一連の神経学的障害をもたらす。本明細書記載の方法により治療または回復され得る白質ジストロフィーの例には、成人発症常染色体優性白質ジストロフィー（ＡＤＬＤ）、アイカルディ・グティエール症候群、アレキサンダー病、ＣＡＤＡＳＩＬ、カナバン病、ＣＡＲＡＳＩＬ、脳腱黄色腫症、小児期運動失調および大脳白質形成不全症（ＣＡＣＨ）／白質消失病（ＶＷＭＤ）、ファブリー病、フコシドーシス、ＧＭ１ガングリオシドーシス、クラッベ病、Ｌ−２−ヒドロキシグルタル酸尿症、概要皮質下嚢胞をもつ大頭型白質ジストロフィー、異染性白質ジストロフィー、多種スルファターゼ欠損症、ペリツェウス・メルツバッハ病（ＰＭＤ）、Ｐｏｌ  ＩＩＩ関連白質ジストロフィー、Ｘ連鎖副腎白質ジストロフィー、およびツェルウェーガー症候群スペクトル障害が挙げられる。
【０１４０】
本明細書記載の方法により治療または回復させ得るミエリン関連疾患または障害には、ミエリン欠損を特徴とする疾患または障害を上げることができる。中枢神経系における不十分なミエリン形成は、多様な神経障害に結びつけられてきた。これらには、脳室周囲白質軟化症の小児の前脳ミエリン形成の先天性の障害が神経学的病的状態の一因となっている種々の種類の脳性麻痺がある（Ｇｏｌｄｍａｎら、２００８）。Ｇｏｌｄｍａｎ，Ｓ．Ａ．，Ｓｃｈａｎｚ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｗｉｎｄｒｅｍ，Ｍ．Ｓ．（２００８）．Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｉｎｇ  ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｏｆ  ｍｙｅｌｉｎ．Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．１７，Ｒ７６−８３。年代スペクトルの他端では、ミエリン減少および効果的でない修復が老化関連認知機能の低下の一因となり得る（Ｋｏｈａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。Ｋｏｈａｍａ，Ｓ．Ｇ．，Ｒｏｓｅｎｅ，Ｄ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｌ．Ｓ．（２０１１）Ａｇｅ（Ｄｏｒｄｒ）．Ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｎｏｎ−ｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅ  ｗｈｉｔｅ  ｍａｔｔｅｒ：ｆｒｏｍ  ｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ  ｄｉｓｔｕｒｂａｎｃｅｓ  ｔｏ  ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  ｄｅｃｌｉｎｅ． 従って、ミエリン形成および／または再ミエリン化を強化する効果的薬剤および方法は、疾患進行の停止、およびＭＳおよび多様な神経障害における機能の復元に、実質的治療効果を有すると考えられる
【０１４１】
１つの特定の態様は、対象の多発性硬化症の治療を意図している。方法は、治療有効量の本明細書で記載の治療薬を対象に投与することを含む。多発性硬化症（ＭＳ）は、最もよくある脱髄性疾患である。多発性硬化症では、身体でミエリン修復ができないことが、神経損傷に繋がり、多発性硬化症関連症状を引き起こし、身体障害を増大させると考えられる。ＭＳで観察される脱髄は、必ずしも永久的とは限らず、疾患の初期段階では再ミエリン化が実証されている。本明細書で記載の方法は、対象中でＯＰＣ分化を促進でき、それにより、内在性再ミエリン化に繋がると考えられる。
【０１４２】
別の特定の態様は、対象の遺伝的ミエリンの減少（脱髄）による遺伝的ミエリン障害の治療を意図している。方法は、治療有効量の本明細書で記載の治療薬を対象に投与することを含む。特定の実施形態では、遺伝的ミエリン障害は、限定されないが、ペリツェウス・メルツバッハ病（ＰＭＤ）などの白質ジストロフィーである。
【０１４３】
神経変性疾患または障害を罹患している対象を治療する別の戦略は、治療有効量の本明細書で記載の治療薬を、治療有効量の追加のオリゴデンドロサイト分化および／または増殖誘発剤および／または抗神経変性疾患剤と共に投与することである。抗神経変性疾患剤の例には、Ｌ−ドーパ、コリンエステラーゼ阻害剤、抗コリン作用薬、ドーパミンアゴニスト、ステロイド、およびインターフェロン、モノクローナル抗体、および酢酸グラチラマーを含む免疫調節物質が挙げられる。
【０１４４】
従って、いくつかの実施形態では、本明細書で記載の治療薬は、神経変性およびミエリン関連障害を治療するための補助的療法剤を用いた併用療法の一部として投与できる。
【０１４５】
「併用療法」という語句は、ＰＴＰσの活性、シグナル伝達、および／または機能の１つまたは複数を阻害または低減する治療薬、および追加の治療薬を、これらの治療薬の共作用から有益な効果を得ることを意図した、特定の治療計画の一部として投与することを含む。組み合わせとして投与する場合、ＰＴＰσの活性、シグナル伝達、および／または機能を阻害または低減する治療薬、および追加の治療薬は、別々の組成物として処方できる。組み合わせたこれらの治療薬の投与は、通常、一定の期間（通常は、選択した組み合わせに応じて、数分、数時間、数日、数週）にわたって実施される。
【０１４６】
「併用療法」はこれらの治療薬の連続方式での投与を含むこと、すなわち、各治療薬は異なる時間に投与され、ならびにこれらの治療薬、または治療薬の少なくとも２つは、実質的に同時に投与することが意図されている。実質的同時投与は、例えば、一定比率の各治療薬を含む単一カプセル、または治療薬の各々に対する複数の単一カプセルとして対象に投与することにより達成することができる。各治療薬の逐次または実質的同時投与は、任意の適切な経路、例えば、限定はされないが、経口経路、静脈内経路、筋肉内経路、および粘膜組織を介する直接吸収により行うことができる。複数治療薬を同じ経路または異なる経路により投与することができる。例えば、選択された組み合わせの第１の治療薬は、静脈内注射により投与され、一方、組み合わせの他の治療薬は経口投与され得る。あるいは、例えば、全ての治療薬が経口投与され得るか、または全ての治療薬が静脈内注射により投与され得る。治療薬が投与される順序は、厳密に重要であるというわけではない。「併用療法」はまた、他の生物学的有効成分（例えば、限定されないが、第２の異なる治療薬）および非薬物療法（例えば、手術）をさらに組み合わせて上記の治療薬を投与することも含み得る。
【０１４７】
別の実施形態では、ＰＴＰσの活性、シグナル伝達、および／または機能の１つまたは複数を阻害または低減する治療薬との併用療法で投与される追加の治療薬は、限定されないが、免疫療法薬などの少なくとも１種の抗神経変性剤を含み得る。
【０１４８】
本方法で使用するための免疫療法薬には、寛解−再発性多発性硬化症の急性攻撃中に明らかになった疾患および／または急性炎症反応の免疫成分を標的とする治療薬を含み得る。例としては、限定されないが、インターフェロンベータ−１ａおよびベータ−１ｂ（それぞれ、ＡｖｏｎｅｘおよびＢｅｔａｓｅｒｏｎ）、ナタリズマブ（Ｃｏｐａｘｏｎｅ）、ナタリズマブ（Ｔｙｓａｂｒｉ）、酢酸グラチラマー（Ｃｏｐａｘｏｎｅ）またはミトキサントロンなどの免疫調節物質が挙げられる。他の実施形態では、治療薬は、ミエリン依存性プロセスを強化するまたは促進するために、ミエリン関連障害ではない、および／またはミエリン関連障害と疑われていない対象に投与できる。いくつかの実施形態では、ミエリン依存性プロセスであることが知られている認知を高めるために、認知的に健康な対象に、本明細書で記載の治療薬を対象に投与してＣＮＳニューロンのミエリン形成を促進できる。特定の実施形態では、本明細書で記載の治療薬は、認識促進（向知性）薬と組み合わせて投与できる。薬剤の例には、任意の薬物、栄養補助剤、または健常者において、認知機能、特に実行機能、記憶装置、創造性、または動機づけを改善するその他の物質が挙げられる。非限定的例には、ラセタム（例えば、ピラセタム、オキシラセタム、およびアニラセタム）、栄養補助食品（例えば、オトメアゼナ、オタネニンジン、イチョウ、およびＧＡＢＡ）、刺激薬（例えば、アンフェタミン医薬品、メチルフェニデート、ユーゲロックス、キサンチン、およびニコチン）、Ｌ−テアニン、トルカポン、レボドパ、アトモキセチン、およびデシプラミンが挙げられる。
【０１４９】
以下は、本開示の特定の例示的実施形態の考察である。この考察では、我々は、細胞内シグマペプチド（ＩＳＰ）治療が種々の脱髄性モデルにおいて機能回復を促進することを示す。ＩＳＰ治療は、ＣＳＰＧ障壁を乗り越えて、再ミエリン化および機能回復を促進し、多発性硬化症（ＭＳ）の病理生物学におけるレセプタータンパク質チロシンホスファターゼ（ＲＰＴＰ）の重要な役割を示す。我々はまた、ＰＴＰσのＩＳＰ調節がＯＰＣそれ自体中でプロテアーゼ活性を劇的に高める新規機序を示す。次に、高められた酵素放出がＣＳＰＧを選択的に分解し、これが、以前に瘢痕形成された領域内への移動およびその中での分化を強化するのにさらに役立つ。
【０１５０】
実施例
材料および方法
動物
すべての動物飼育および動物処置方法は、Ｃａｓｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅの実験動物委員会によって承認された。野性型Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ストック番号０００６６４）から購入し、Ｃａｓｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＡｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒで収容し、マウスを１２時間明／暗サイクルで維持した。雄および雌の両方のマウスをこの試験に含めた。
【０１５１】
実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデル
ＥＡＥの誘導のために、製造業者の説明書に従い、１０週齡のＣ５７Ｂｌ６／Ｊ雌マウスをフロイント完全アジュバントエマルジョン（Ｈｏｏｋｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＭＯＧ３５−５５  ＥＡＥ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ，ＥＫ−２１１０）と一緒にＭＯＧ３５−５５で免役した。ＥＡＥ誘導キットを用いて、疾患誘導に９８％成功した。全てのＥＡＥ動物を毎日監視し、０〜５（０：異常なし；１：尾挙上不全；２：尾挙上不全および後肢脱力；３：尾挙上不全および後肢の完全運動麻痺；４：後肢および部分前肢運動麻痺；５：瀕死）の臨床スケールを用いてスコア化した。ＥＡＥマウスが１〜３にスコア化されると、マウスを無作為に治療群およびビークル群に配分した。治療群では、５〜７匹のマウスに、ＩＳＰ（２０μｇ／日）、またはビークル群に対し生理食塩水中の５％ＤＭＳＯ（１００μｌ）の腹腔内注射を毎日投与した。実験は盲検とし、動物を毎日スコア化した。ＩＳＰ発症：ＩＳＰ治療を、臨床スケールによりスコア化して病気の発症時に投与した。ＩＳＰピーク：ＩＳＰ治療を、臨床スケールでスコア化して病気のピーク時に投与した。
【０１５２】
マウスにおけるリゾレシチン（ＬＰＣ）誘導限局性脱髄
１２週齡のＣ５７ＢＬ／６雄マウスを、イソフルランを用いて麻酔し、椎弓切除術を実施した。１．５μｌの１％ＬＰＣをＴ１１とＴ１２脊髄の間の脊髄後柱中に、１．２５μｌ／分の速度で輸注した。逆流を最小限にするために５分の遅延後に針を除去し、病変を閉じた。術後２４時間に開始して、ＩＳＰ（２０μｇ／日）またはビークル（生理食塩水中の５％ＤＭＳＯ、１００μｌ）を、損傷部位近傍に皮下注射することにより毎日マウスを治療した。椎弓切除術後、７日目、１４日目、および２１日目に、マウスを別々に安楽死させた。さらなるウェスタンブロット、組織学および微細構造解析のために、脊髄を切開した。対照動物に、等価量のサリンの注射を投与し、組織をおなじパラダイムに従って収集した。ＭＭＰ−２阻害剤ＯＡ−Ｈｙ（１０μｇ／１．５μｌ、４４４２４４、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、マウスＭＭＰ−２標的化ｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルス粒子（１μｌ、ＬＰＰ−ＭＳＨ０２７６５７−ＬＶＲＵ６ＧＰ、ＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ）または０．９％生理食塩水の第２の注射のために、動物をＬＰＣ病変１日目に（レンチウイルス粒子用）または４日目に（ＯＡ−Ｈｙ用）麻酔し、ＯＡ−Ｈｙまたはレンチウイルス粒子を、上記パラダイムを用いて同じ領域に送達した。動物を覚醒させ、病変後１４日目（１４ｄｐｌ）または１８ｄｐｌで屠殺した。病変サイズを、エリオクロムシアニン染色を用いて連続切片の染色により測定した。
【０１５３】
マウス小脳切片培養物中のＬＰＣ誘導脱髄
我々は、以前に記載の小脳切片培養法を実施した（Ｚｈａｎｇ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｒｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ−Ａ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ２３０，１３８−１４８（２０１１））。手短に説明すると、Ｌｅｉｃａ振動ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ，ＶＴ１０００Ｓ）を用いて、３００μｍ厚さの小脳切片をＰ１０〜１２マウス小脳から切り出し、５０％の基本培地イーグル培地、２５％の加熱不活性化ウマ血清、２５％ハンクス溶液、２．５％グルコース、１％グルタミンおよびペニシリン−ストレプトマイシンを含む培地中で培養した。インビトロで４日（４ＤＩＶ）後、０．５ｇｍ／ｍｌのＬＰＣを１７〜１８時間加えて、脱髄を誘導した。その後、切片を２．５μＭのＩＳＰと共に８日間インキュベートした。ＧＭ６００１の実験に対しては、２５μＭのＧＭ６００１（Ｔｏｃｒｉｓ）および／または２．５μＭのＩＳＰまたはＳＩＳＰを９日間インキュベートした。ＭＢＰの半定量的ウェスタンブロットおよびＭＢＰおよびＮｅｕＦ２００の免疫蛍光染色により再ミエリン化を調査した。
【０１５４】
培養切片の免疫染色法
切片を４％ＰＦＡで固定し、脱脂し、ＰＢＳ中で３回洗浄し、０．１％トリトンＸ−１００および５％正常ヤギ血清含有ＰＢＳ中でブロッキングし、抗ＭＢＰ（ＳＭＩ−９９Ｐ、Ｃｏｖａｎｃｅ、１：３００）および抗ＮｅｕＦ２００（Ｎ４１４２、Ｓｉｇｍａ、１：２５０）抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。その後、切片をＰＢＳ中で洗浄し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ標識二次抗体（１：５００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で２時間インキュベートした。切片をＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）含有Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入剤で取付け、Ｌｅｉｃａ  ＤＦＣ５００蛍光顕微鏡で分析した。
【０１５５】
精製マウスオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）培養物
以前に記載のように（Ｌｕｏ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｃｙｃｌｉｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｋｉｎａｓｅ  ５  ｐ３５  ａｎｄ  ｐ３９  Ａｒｅ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ  Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３６，３０２４−３０３７（２０１６））、新生児Ｃ５７ＢＬ／６マウスからＯＰＣを調製した。培養皿を５０ｍＭのトリス塩酸中のＩｇＭ（１０μｇ／ｍｌ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でプリコートし、一次マウス抗体Ａ２Ｂ５を追跡した。解離細胞をプリコート培養皿中、３７℃で３０分間インキュベートした後、付着細胞をゆっくり取り外した。ＤＭＥＭ中の０．０５％トリプシンにより、約９６％の純度でＡ２Ｂ５＋ＯＰＣを放出させた。精製ＯＰＣ細胞を、Ｎ２、２０ｎｇ／ｍｌの（「ＰＤＧＦ」）、２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ、５ｎｇ／ｍｌのＮＴ−３、１０ｎｇ／ｍｌのＣＮＴＦ、グルタミン（２００ｍＭ）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で増殖させた。
【０１５６】
培養上清（ＣＭ）プロテアーゼ活性アッセイ
ウェル当たり約１ｘ１０６ＯＰＣを、ＰＬＬ、１μｇ／ｍＬのラミニン、および２μｇ／ｍＬのアグリカンコート６ウェルプレート上に播種し、ビークル、２．５μＭのＩＳＰまたはＳＩＳＰを用いて、３７℃で２日間処理した。ＣＭを収集し、細胞染色し、アッセイまで氷上に置いた。ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒプロテアーゼアッセイキット（Ｅ６６３８３、ＥｎｚＣｈｅｋ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いてプロテアーゼ活性をアッセイした。１ｘのＥｎｚＣｈｅｋ混合物を各群由来のＣＭと１：１で混合し、緩やかに浸透しながら室温で一晩インキュベートした。各サンプルに対し、３回の反復実験を行った。試料を、分光光度計を用いて、５０２／５２８ｎｍの励起および放射で分析し、切断およびフルオレセインカゼインを評価した。報告された蛍光単位は、ＥｎｚＣｈｅｋおよび細胞培養培地混合物でブランクを取ってある。
【０１５７】
ＣＳＰＧ勾配交差アッセイおよび勾配定量化
ＣＳＰＧ勾配を以前に記載のように調製した（Ｔｏｍ，Ｖ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｃｏｎｅ，ｔｈｅ  Ｈａｌｌｍａｒｋ  ｏｆ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｆａｉｌｕｒｅ，ｉｎ  ａｎ  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｌｉａｌ  Ｓｃａｒ  ａｎｄ  ａｆｔｅｒ  Ｓｐｉｎａｌ  Ｃｏｒｄ  Ｉｎｊｕｒｙ）。２４ウェルカバーガラスをポリ−Ｌ−リシンおよびニトロセルロースでコートし、７００μｇ／ｍＬのアグリカン（Ａ１９６０  Ｓｉｇｍａ）および１０μｇ／ｍＬのラミニン（１１２４３２１７００１  Ｓｉｇｍａ）の混合物をコーティングしたカバーガラス上にスポットした。乾燥後、コーティングしたカバーガラスを３７℃で３時間インキュベートした。精製ＯＰＣを１０，０００／カバーガラスの濃度で播種し、Ｎ２、ＰＤＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ、ＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＮＴ−３（５ｎｇ／ｍｌ）、ＣＮＴＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、グルタミン（２００ｍＭ）含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で培養した。カバーガラスをＣＳ−５６（Ｃ８０３５、Ｓｉｇｍａ、１：５００）およびＯ４抗体（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｃｏｒｅ  Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃ、１：１０）で染色した。アグリカン境界と交差するＯ４−陽性細胞をスポット毎に計数した。ＣＳＰＧ勾配定量化に対しては、ウェル当たり約１ｘ１０６ＯＰＣを、ＰＬＬ、１μｇ／ｍＬのラミニン、および２μｇ／ｍＬのアグリカンコート６ウェルプレート上に播種した。ＯＰＣを、ビークル、２．５μＭのＩＳＰ、または２．５μＭのＳＩＳＰを用いて、３７℃で２日間処理した。ＣＭを採取し、新たに作製したスポットと共にインキュベートした。スポットをＣＭと共に３７℃で２日間インキュベートした後、ＣＳ−５６およびラミニン（Ｌ９３９３、Ｓｉｇｍａ、１：１０００）で染色した。ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）を用いて、ＣＳ−５６またはラミニンスポット外周部のピクセル強度を同じＲＯＩを使って定量化した。培養した脊髄外植片については、P1マウスの子の頸部および胸部の脊髄を１〜２ｍｍの組織片に切断し、カバーガラスに移した。１５％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ（Ｓｉｇｍａ）およびＮ２補充剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で外植片を培養した。ＩＳＰ処理に関しては、２．５μＭのＩＳＰを播種時に培地に加えた。２５μＭのＧＭ６００１（２９８３、Ｔｏｃｒｉｓ）、１００ｎＭのＭＭＰ−２阻害剤（４４４２４４、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、および／または２．５μＭのＩＳＰまたはＳＩＳＰを使用した。
【０１５８】
ペプチド配列
ペプチドをＧｅｎＳｃｒｉｐｔまたはＣＳ−Ｂｉｏから、１ｍｇの凍結乾燥量で購入し、これを、ｄＨ２Ｏ中で２．５ｍＭに希釈し、以前記載したように、使用する準備ができている場合には、−２０℃で分注した（Ｌａｎｇ，Ｂ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＰＴＰｓｉｇｍａ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ａｆｔｅｒ  ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄ  ｉｎｊｕｒｙ．Ｎａｔｕｒｅ  ５１８，４０４−４０８（２０１５））。
細胞内Ｓｉｇｍａペプチド（ＩＳＰ）：ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＣＤＭＡＥＨＭＥＲＬＫＡＮＤＳＬＫＬＳＱＥＹＥＳＩ（配列番号６１）
スクランブルＩＳＰ（ＳＩＳＰ）：ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＣＩＲＥＤＤＳＬＭＬＹＡＬＡＱＥＫＫＥＳＮＭＨＥＳ（配列番号６２）
【０１５９】
アグリカンおよびラミニンのウェスタンブロット分析
ＰＬＬ、１μｇ／ｍＬのラミニン、および２μｇ／ｍＬのアグリカンコート６ウェルプレート上でインキュベートした１ｘ１０６ＯＰＣからＣＭを採取した。ＯＰＣを、１０μｇ／ｍＬのＥｘｏ１（ａｂ１２０２９２、Ａｂｃａｍ）、または２５μＭのＧＭ６００１（３６４２０５、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）と共に、ビークル、２．５μＭのＩＳＰ、または２．５μＭのＳＩＳＰを用いて、３７℃で２日間処理した各細胞染色群の１００μＬのＣＭを、２０μｇ／ｍＬのアグリカンおよび／または１０μｇ／ｍＬのラミニンと共に、１ｍＬのエッペンドルフチューブ中、３７℃で２時間インキュベートした。陽性対照として、ＯＰＣ培地を、アグリカンと共に、同様にしてインキュベートした。その後、ＣＳ−５６および／またはラミニン抗体に対するインキュベーションで後述のように、ウェスタンブロットを実施した。
【０１６０】
ＯＰＣ溶解物またはＣＭのウェスタンブロット分析
ＭＭＰ−２または１０をＯＰＣ  ＣＭまたは溶解物中で評価するために、ＯＰＣを、上述のようにプレコートしたＰＬＬ、アグリカン、およびラミニン上でインキュベートした。ＯＰＣを、ビークル、２．５μＭのＩＳＰまたはＳＩＳＰを用いて、３７℃で２日間処理した。その後、ＣＭが採取され、Ｍｉｌｉｐｏｒｅ  Ｕｌｔｒａｃｅｌ  ＹＭ−Ｃ遠心濾過機ユニット（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ５４１５Ｄ）を最大速度で、４℃で３０分間用いて、濃縮した。５０μｇの濃縮ＣＭを各レーンにロードした。下記のウェスタンブロット技術を用いて、各群からロードした２０μｇのタンパク質を使用して、ＯＰＣ溶解物を評価した。
【０１６１】
ウェスタンブロット分析
組織試料または小脳切片または精製ＯＰＣ細胞をＲＩＰＡリシスバッファーでホモジナイズし、タンパク質濃度を、ＰｉｅｒｃｅＢＣＡタンパク質アッセイキットを用いて製造業者の説明書に従い測定した。その後、等量のタンパク質を１５％ＰＡＧＥ−ＳＤＳゲルにロードし、ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に電気泳動的に転写した。膜を５％の脱脂ミルクを含む０．１％のＴＰＢＳ中、室温で１時間ブロッキングし、示した一次抗体を使って４℃で一晩検出し、続けて、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識二次抗体で検出した。以下の一次抗体を使用した：ＭＢＰ（ＳＭＩ−９９Ｐ、Ｃｏｖａｎｃｅ、１：１０００）、ＣＳ−５６（Ｃ８０３５、Ｓｉｇｍａ、１：１０００）、ラミニン（Ｌ９３９３、Ｓｉｇｍａ、１：１０００）、ＧＡＰＤＨ（ＡＦ５７１８、Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、１：１０００）、ＭＭＰ−２（ＡＦ１４８８、Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、１：１０００）、ＭＭＰ−１０（ＭＡＢ９１０、Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、１：１０００）、およびβ−アクチン（ｓｃ−４７７７８、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、１：１０００）。Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて増強化学発光を実施し、ＦｌｕｏｒＣｈｅｍ  Ｅ  ｓｙｓｔｅｍ（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ，ＵＳＡ）により検出した。バンドの密度を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）を使って定量化した。
【０１６２】
酵素電気泳動ゼラチンザイモグラフィー
ＰＬＬ、１μｇ／ｍＬのラミニン、および２μｇ／ｍＬのアグリカンコート６ウェルプレート上でインキュベートした１ｘ１０６ＯＰＣからＣＭを収集した。ＯＰＣを、ビークル、２．５μＭのＩＳＰまたはＳＩＳＰを用いて、３７℃で２日間処理した。ＣＭをＭｉｌｉｐｏｒｅ  Ｕｌｔｒａｃｅｌ  ＹＭ−３遠心濾過機ユニットを使用して以前記載したように濃縮した。濃縮ＣＭ由来の４０μｇの非変性タンパク質または２５ｎｇの組換えＭＭＰ−２（ＰＦ０２３、Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）およびＭＭＰ−９（ＰＦ１４０、Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）を１ｘレムリ緩衝液（１６１０７４７、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）と共に１０％ゼラチンザイモグラム（１６１１１６７、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上にロードし、１００ｍＶ、氷上で１．５時間実施した。その後、ザイモグラムを１ｘ再生緩衝液（１６１０７６５、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）と共に３０分間室温で緩やかに振盪した後１ｘ展開緩衝液（１６１０７６６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）と共に３７℃で一晩インキュベートした。次に、展開したザイモグラムをｄＨ２Ｏで緩やかに洗浄し、０．１％クーマシーブルー色素（２７８１６、Ｓｉｇｍａ）と共に一晩インキュベートした。脱染緩衝液（４０％ＭｅＯＨ、１０％酢酸）で洗浄後、ザイモグラムを画像化し、ウェスタンブロットセクションで記載の方法でゼラチン分解の量を、ＩｍａｇｅＪを使って評価した。
【０１６３】
プロテアーゼアレイスクリーニング
ＯＰＣを６ウェルプレート上でビークル対照または２．５μＭのＩＳＰと共に、４ｄｉｖにわたり培養した。培養上清を各群から集め、細胞染色した後、Ｒ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍｓＰｒｏｔｅａｓｅ  Ａｒｒａｙ  Ｋｉｔ（ＡＲＹ０２５）で提供されたブロットアレイと共にインキュベートした。キットの説明書に従い、収集した培地を４℃で一晩インキュベーションした。対照およびＩＳＰブロットを同じ暴露時間で一緒に展開し、アレイのピクセル強度を、ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）を用いて評価した。
【０１６４】
ルクソール・ファスト・ブルー（ＬＦＢ）ミエリン染色および定量化
ＬＦＢ染色を、製造業者の説明書（＃２６６８１、Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に従って実施した。脊髄切片については、２０μｍの冠状切片をＬＦＢ溶液中、５６℃で一晩インキュベートした後、９５％アルコールおよび蒸留水で順次濯いだ。次に、切片を０．１％炭酸リチウム溶液中に入れ、一連の段階的に変えたエタノールで脱水し、Ｈｉｓｔｏｃｌｅａｒで清浄化し、取り付けた。一連の順次整合切片を画像化し、分析した。画像（５〜６切片／動物）を光学顕微鏡下で取得した。脱髄領域（ＬＦＢ染色の欠如）を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて定量化した。ＥＡＥ切片については、脱髄領域を測定し、脊髄の全領域のパーセンテージとして表した。ＬＰＣモデルの切片については、病変体積を全体病変にわたる連続切片から病変面積により、シリンダ−の体積の式（Ｖ＝病変面積ｘ病変の長さ）に基づいて計算した。
【０１６５】
免疫細胞化学
ＭＭＰ−２／Ｏ４染色については、ＰＬＬ、１μｇ／ｍＬのラミニン、および２μｇ／ｍＬのアグリカンでプレコートした２４ウェルカバーガラス上にＯＰＣを播種し、ビークルまたは２．５μＭのＩＳＰと共に３７℃で２日間インキュベートした。培養したＯＰＣまたはＯＬ細胞を４％ＰＦＡで固定し、続けて、ＰＢＳＴ溶液（１０％の正常ヤギ血清およびＰＢＳ中の０．２％トリトンＸ１００）中でブロッキングした。希釈した一次抗体を試料と４℃で一晩インキュベートし、続けて、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８または５９４で標識した（１：５００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）適切な二次抗体ヤギ抗マウスまたは抗ウサギＩｇＭまたはＩｇＧとインキュベートした。以下の一次抗体を使用した：ＰＤＧＦＲα（ＸＸ）、Ｏ４（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｃｏｒｅ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃ）、ＭＢＰ（ＳＭＩ−９９Ｐ、Ｃｏｖａｎｃｅ、１：３００）、ＭＭＰ−２（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、１：５００）、およびＣＳ−５６（Ｃ８０３５、Ｓｉｇｍａ、１：２５０）。細胞をＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含むＶｅｃｔａ  Ｓｈｉｅｌｄ封入剤を用いて取り付けた。
【０１６６】
ＴＵＮＥＬ、Ｋｉ−６７免疫細胞化学および定量化
増殖を評価するために、ＰＬＬ、１μｇ／ｍＬのラミニン、および２μｇ／ｍＬのアグリカンでプレコートした２４ウェルカバーガラス上にＯＰＣを播種した。ＯＰＣを、ビークル、２．５μＭのＩＳＰまたはＳＩＳＰを用いて、３７℃で２日間の播種時に直ぐに処理した。カバーガラスを固定し、免疫細胞化学セクションで記載と同じ方法を用いてＫｉ−６７（５５０６０９、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、１：５００）およびＯ４（１：１０）で染色した。カバーガラスを画像化し、計数した。アポトーシスを評価するために、ＯＰＣを同じ方式で培養し、ビークル、２．５μＭのＩＳＰまたはＳＩＳＰとのインキュベーションの２日後に、ビークルまたは１μｇ／ｍＬのＬＰＣと共に、２時間インキュベートした。その後、カバーガラスをＰＦＡおよびメタノールで固定した後、ＡＰＯ−ＢｒｄＵ  ＴＵＮＥＬアッセイキット（Ａ２３２１０、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）および一次抗体の室温での一晩のインキュベーションを含むガイドラインを用いて、染色した。カバーガラスをさらにＤＡＰＩ（Ｄ９５４２、Ｓｉｇｍａ、１：１０，０００）と共染色した後、画像化し、計数した。
【０１６７】
免疫組織化学的検査
マウスをアベルチンで麻酔し、ＰＢＳおよび４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で灌流した。脳または脊髄を切開し、４％ＰＦＡ中、４℃で一晩、後固定し、２０％スクロース中で平衡化した。抗原回収のために、製造業者の説明書に従い、２０μ厚切片をＲｅｖｅａｌ  Ｄｅｃｌｏａｋｅｒ溶液（ＲＶ１０００Ｍ、Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ）で前処理した。ブロッキング後、切片を一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートし、続けて、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８または５９４で標識した適切な二次抗体とインキュベートした。以下の一次抗体を使用した：ＭＢＰ（ＳＭＩ−９９Ｐ、Ｃｏｖａｎｃｅ、１：３００）、ＮｅｕＦ２００（Ｎ４１４２、Ｓｉｇｍａ、１：２５０）、ＣＳ−５６（Ｃ８０３５、Ｓｉｇｍａ、１：２５０）、ＣＡＴ３０１（ＭＡＢ５２８４、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、１：２５０）、バーシカン（ＡＢ１０３２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、１：２５０）、Ｉｂａ１（０１９−１９７４１、ＷＡＫＯ、１：２５０）、ＧＦＡＰ（ＭＡＢ３６０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、１：２５０）、Ｏｌｉｇ２（ＡＢ９６１０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、１：２５０）、ＣＣ１（ＯＰ８０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、１：２５０）。各染色に対し、少なくとも３匹の個別の動物／群を調査し、画像をＬｅｉｃａ  ＤＦＣ５００蛍光顕微鏡で取得した。ＩｍａｇｅＪソフトウェア（アメリカ国立衛生研究所、ＵＳＡ）を用いて染色を定量化した。蛍光強度を、未処置対照の平均値のパーセンテージとして、計算した。
【０１６８】
電子顕微鏡観察（ＥＭ）分析用組織作製
ミエリン形成の超微細構造解析のために、麻酔した動物を、０．１Ｍのカコジル酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）中の２％グルタルアルデヒド／４％パラホルムアルデヒドで灌流した。ＩＳＰ治療または対照動物由来のＬＰＣまたはＥＡＥ誘導脊髄の損傷を受けた領域を切開し、１％ＯｓＯ４中で２時間、後固定した。脳梁含有脊髄または脳の冠状切片（５００μｍ）を調製し（Ｌｅｉｃａ、ビブラトーム）、脱水し、飽和酢酸ウラニルで染色し、Ｐｏｌｙ／Ｂｅｄ８１２樹脂（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）中に埋め込んだ。１μ厚切片を切り出し、トルイジンブルーで染色し、整合領域をＥＭ解析用に選択した。超微細構造解析のために、極薄切片（０．１μｍ）を切り出し、電子顕微鏡（ＪＥＯＬ１００ＣＸ）を８０ｋＶで用いて可視化した。少なくとも５０〜１００個の無作為に選択したミエリン化軸索から、ミエリン鞘の内径および外径のミエリン厚さを測定することによりＧ比を計算した。
【０１６９】
ＭＭＰ−２のｓｈＲＮＡノックダウン
ＭＭＰ−２ノックダウンを、Ｕ６プロモーター（ＬＰＰ−ＭＳＨ０２７６５７−ＬＶＲＵ６ＧＰ、ＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ）により駆動されるマウスＭＭＰ２標的化ｓｈＲＮＡを発現しているレンチウイルス粒子により媒介させた。ｓｈＲＮＡスクランブル構築物のためのレンチウイルス粒子（ＬＰＰ−ＣＳＨＣＴＲ００１−ＬＶＲＵ６ＧＰ−１００−Ｃ、ＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ）を、対応する対照として使用した。実験の前に、ＯＰＣ培養物に、１の感染多重度（ＭＯＩ）で、少なくとも４８時間感染させた。感染ＯＰＣ培養物のウェスタンブロット分析を用いて、ＭＭＰ−２（ＡＢ１９１６７７、Ｓｉｇｍａ、１：５００）に対して、構築物を確認した。
【０１７０】
統計分析
全てのデータ分析をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ６．００を用いて行った。データは平均±ＳＥＭとして示されている。ｐ＜０．０５を統計的に有意と見なす。統計分析は、対応のないスチューデントの両側ｔ検定、チューキーの多重比較検定、ダネットの多重比較検定、またはシダックの多重比較検定による事後分析を用いた１元配置または２元配置分散分析により実施した。盲検方式で定量化を実施した。統計的検定を用いて標本数を予め設定することはしなかったが、我々の標本数は、この分野で一般的に採用される標本数と類似である。データ分布は、正規であることを想定したが、これは正式には試験しなかった。全ての実験は、独立に、少なくとも３回実施した。
【０１７１】
結果
ＥＡＥおよびＬＰＣ脱髄性ＭＳマウスモデルの病変において増大したＣＳＰＧおよび受容体ＰＴＰσの発現
我々は、ＭＯＧ３５−５５誘導慢性進行性ＥＡＥおよびＬＰＣ誘導急性限局性脱髄の脱髄病変におけるＣＳＰＧ発現の特徴付けを行った。脊髄の白質中の脱髄ＥＡＥおよびＬＰＣ病変をルクソール・ファスト・ブルー（ＬＢＦ）ミエリン染色で可視化した（図９Ａ〜９Ｄ）。予測通り、ＬＦＢ染色は、両モデルの病変中で低減した。脊髄組織の免疫染色切片は、ビークル対照に比較して、ＥＡＥおよびＬＰＣ罹患動物の脱髄病変中でＣＳＰＧ発現の上昇を示した（図９Ａ〜９Ｄ）。さらに、ＣＳＰＧの発現上昇は、ＥＡＥ損傷脊髄中で免疫後の２８日から４１日にわたり漸進的に増大した（図９Ａ）。背側脊髄中へのＬＰＣ注入の７〜１４日後に動物から採取した組織切片（図９Ｃおよび９Ｄ）も同様に、脱髄病変中のＣＳＰＧ産生の増大を示した。限局性脱髄領域中の増大したＣＳＰＧにより、我々は、ＣＳＰＧは、病変部位でＰＴＰσシグナル伝達を介してＯＰＣにネガティブな影響を与え、これが、脊髄を再ミエリン化するそれらの能力に影響を及ぼし得るという仮説を立てるに至った。
【０１７２】
ＣＳＰＧは、受容体ＰＴＰσ、ＬＡＲ、およびＮｏｇｏ受容体１および３を介してシグナル伝達することが知られている。我々は、以前に発表した、ＯＰＣ発生中にＰＴＰＲＳ（ＰＴＰσ）、ＰＴＰＲＦ（ＬＡＲ）、ＰＴＰＲＤ（ＰＴＰδ）、およびＲＴＮ４Ｒ（Ｎｏｇｏ受容体）の遺伝子発現を検索するためのマウス大脳皮質のＲＮＡ配列解析トランスクリプトームデータベースを使用した。ＰＴＰＲＳ遺伝子転写物（ＦＰＫＭ）は、発生中のＯＰＣにおける最も豊富なタイプのＣＳＰＧ受容体であった（図１０Ｂ）。野生型マウス子（生後１〜２日目）の脳由来の免疫染色ＯＰＣ／ＯＬ細胞は、ＰＴＰσが未成熟Ｏｌｉｇ２＋および成熟ＣＣ１＋またはミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）＋細胞の細胞体および突起で発現することを示した（図１０Ａおよび１０Ｃ）。ウェスタンブロット分析はまた、ＥＡＥまたはＬＰＣ誘導脱髄性モデルの損傷を受けた脊髄中で、注入後２８日目（ＥＡＥ）および７日目（ＬＰＣ）に、ＰＴＰσの発現上昇を示した（図１０Ｄ）。ＥＡＥ誘導動物では、ＰＴＰσおよびＯＰＣマーカー、Ｏｌｉｇ２に対する抗体を用いてダブル免疫染色法も実施し、脱髄病変中でＯｌｉｇ２＋ＯＰＣで共標識したＰＴＰσの増大を示した（図１０Ｅ）。これらの知見は、ＰＴＰσが、ＥＡＥまたはＬＰＣ誘導疾患後、オリゴデンドロサイト系統の細胞中で発現し、発現上昇していること、およびこの受容体が、ＭＳモデルにおけるＣＳＰＧの効果および／または受容体の操作を研究するための扱いやすい標的を提供することを示唆する。
【０１７３】
ＩＳＰによるＰＴＰσの調節はＥＡＥ動物モデルの機能回復および再ミエリン化を促進する
我々は次に、慢性進行性脱髄疾病過程を再現する、ＥＡＥマウスモデルを用いて細胞内シグマペプチド（ＩＳＰ）を試験した。ＭＯＧ３５−５５免疫化後、動物は、腹腔内ＩＳＰ注射（２０μｇ／マウス、毎日）を、臨床スコアリングにより決定した病気の開始時（ＥＡＥ  ＩＳＰ発症）または病気のピーク時（ＥＡＥ  ＩＳＰピーク）から、４１日間にわたり受けた（図１Ａ）。対照群は、同時に、５％ＤＭＳＯビークルを注射された。機能回復は、最初は、発症群でＩＳＰ投与の約１０〜１２日後（すなわち、免疫後２３日）に観察された。ＩＳＰは、臨床スコアを３．５〜４（重度運動麻痺）から２〜１．５（尾挙上不全および後肢脱力）に改善した。ＩＳＰ治療の２０〜２２日後（免疫後約３３日）、発症群の数匹の動物が回復し、臨床スコアが０．５〜１（尾挙上不全）に改善した（図１Ｂおよび１Ｃ）。対照的に、対照動物は、重度麻痺が持続し、スコアは約３．５〜４のままであった。ＥＡＥ  ＩＳＰピーク動物はまた、ＩＳＰ治療で有意に改善したが、しかし、疾患の発症時に投与されたＩＳＰは、より良好な後肢回復を可能とした（図１Ｂおよび１Ｃ）。これらの改善はまた、組織の改善と密接に相関していた。ＬＦＢミエリン染色で示されるように、病変サイズは発症治療動物で特に低減された（図１Ｄおよび１Ｅ）。逆に、ＭＢＰ免疫染色法は、対照ＥＡＥ動物に比べて、ＩＳＰで４１日間治療した動物でより濃い（図１Ｆ）。ＭＢＰタンパク質アイソフォームのウェスタンブロッティングも同様に、ＩＳＰ治療マウスでＭＢＰ発現の回復を示した（図１Ｇ）。超微細構造解析は、対照と比較して、ＩＳＰ治療マウスのＥＡＥ損傷を受けた脊髄中でミエリン化／再ミエリン化軸索の増大を示した（図１Ｈ）。定量分析により、ＩＳＰ治療群でミエリン化／再ミエリン化軸索の増大が確認され（図１Ｉ）、また、ミエリン形成の直径を軸索直径により正規化することによるミエリン形成厚さを示す、Ｇ比は、ビークル治療群に比べて、ＩＳＰ治療群でより低かった（図１Ｊ）。重要なのは、我々の結果は、ＥＡＥ誘導の１８日後の脱髄ベースライン（ＬＦＢ）が、この疾患進行の初期段階で２つの群間で有意に異ならなかったことから（図１２Ｅおよび１２Ｆ）、ＩＳＰは、脱髄を防止することではなく、ミエリン再生を高めるように作用することを示唆することである。
【０１７４】
ＩＳＰ治療は、経時的脱髄病変中の低減したＣＳＰＧ発現ならびにＥＡＥにおいて変化した炎症反応に関連する
ＥＡＥ誘導動物のＩＳＰ治療後にＣＳＰＧが顕著に低減した（図４Ａ、Ｃａｔ３０１）という観察に加えて、我々はまた、同じ動物において、変化したマクロファージ動力学を見出した。最初に、マクロファージ（Ｉｂａ１）は、アグリカン（Ｃａｔ３０１）と、特に白質中で共局在化するように見え（図４Ａ）、これは、活性化マクロファージの沈着、またはより可能性が高いのは、アグリカンの貪食に起因し得るが、これらは発生することが知られていない。我々は、さらに、対照と比較して、ＩＳＰ治療ＥＡＥ動物中で低減したＩｂａ１免疫染色法ならびにＩｂａ１＋マクロファージ内のアグリカンの低減した量を観察した（図４Ａ）。我々は、ＥＡＥ誘導後４１日でのＩｂａ１およびＧＦＡＰのさらなる定量化を実施し、ミクログリア／マクロファージの両方および反応性星状膠細胞のそれぞれＩＳＰ治療後の有意な減少を認めた（図４Ａおよび４Ｂ）。ＩＳＰを含む合成ペプチドによるＬＡＲファミリー受容体ホスファターゼの調節が、脊髄損傷後にミクログリア／マクロファージをＭ２分極化の方向に偏らせることが報告された。実際に、Ｍ１（ｉＮＯＳ）およびＭ２（アルギナーゼ−１）マクロファージ分極化を特定するマーカーの免疫染色法は、ＩＳＰ治療がＥＡＥ動物の炎症性環境を調節するという補強証拠を明らかにした（図４Ｃおよび４Ｄ）。注目すべきことに、ミクログリア／マクロファージは、損傷後にＰＴＰσを産生するように見えるが、反応性星状膠細胞はそうではない。
【０１７５】
ＩＳＰは、ＬＰＣ誘導脱髄におけるミエリン修復速度を高める
我々は、次に、ＰＴＰσ−ＣＳＰＧ相互作用のＩＳＰ調節が、ＬＰＣ注入１日後に開始のＩＳＰ（２０μｇ／日、皮下投与）または対照ビークルで治療した若年成体Ｃ５７Ｂｌ６／Ｊマウスの脊髄後柱白質中へのＬＰＣ注入により誘導された急性限局性脱髄において類似の効果を有するかどうかを問うた。ＩＳＰ治療後、ＬＰＣ誘導病変体積は、ＬＦＢミエリン染色により示すように、ビークル治療動物に比べて、病変後（ｄｐｌ）１４および２１日目に有意に低減した（図２Ａおよび２Ｂ）。図２Ａ〜２Ｇに示すように、ビークル治療動物は、平均病変体積が、７、１４または２１ｄｐｌにそれぞれ、１．５０８±０．０６９ｍｍ３、１．０３５±０．０６ｍｍ３および０．７３８±０．０２７ｍｍ３であった。対照的に、ＩＳＰ治療動物は、病変体積が７ｄｐｌの平均１．５３５±０．０５８ｍｍ３から、１４ｄｐｌの０．６１３±０．０４３ｍｍ３に低減した（図２Ｂ）。２１ｄｐｌまでに、我々は、ＩＳＰ治療マウスで完璧な病変修復および低減した病変体積（１．５３５±０．０５８ｍｍ３から０．２±０．０４１ｍｍ３に）を認めた（図２Ｂ）。免疫染色法は、１４および２１ｄｐｌに、ビークル治療マウスに比べて、ＩＳＰ治療マウスのＬＰＣ病変中の増大したＭＢＰ発現を一貫して示した（図２Ｃ）。定量的ウェスタンブロット分析により、ＩＳＰ治療後、１４ｄｐｌにＬＰＣ損傷を受けた動物中のＭＢＰの増大した発現を確認した（図２Ｄ）。最後に、微細構造解析により、対照と比較して、１４ｄｐｌのＩＳＰ治療マウスの再ミエリン化軸索の数を確認した（図２Ｅおよび２Ｆ）。これらの結果と一致して、ＩＳＰ治療マウスのＩＳＰおよびビークル治療マウスの間のＧ比の定量的解析は、１４ｄｐｌのＩＳＰ治療マウスのミエリン鞘の増大した厚さを示した（図２Ｇ）。これらの実験は、ＩＳＰ治療がインビボでのミエリン修復速度を加速することを示した。
【０１７６】
ＯＰＣおよびその後の再ミエリン化に影響を与えるＩＳＰの能力をより良好に可視化するために、我々は、脱髄を誘導するために０．１％ＬＰＣで１７〜１８時間処理した、生後８〜１０日の子由来のマウス小脳切片培養物の有髄化の十分に確立されたエクスビボモデルを利用した。我々は、未処理切片培養物が、ＭＢＰおよび神経フィラメント（ＮＦ２００）共存で示されるように、大量のミエリン化軸索を発生することを見出した（図３Ａ、Ｃｏｎ）。しかし、ＬＰＣ処理は、大量の脱髄を引き起こし、点状物および無秩序なミエリンを生成した（図３Ａ、インビトロで１日（ｄｉｖ））。８ｄｉｖ後、脱髄表現型はまだ顕著で、再ミエリン化は、ビークル処理と比べて、ＬＰＣ処理切片では遅れた（図３Ａ、ＬＰＣ＋Ｖｅｈ、８ｄｉｖ）。対照的に、ＩＳＰで８ｄｉｖにわたり処理したＬＰＣ脱髄切片は、ビークル処理に比べて、増大した再ミエリン化を示した（図３Ａ、ＬＰＣ＋ＩＳＰ、８ｄｉｖ）。ビークル処理切片では、ＬＰＣ処理後１４ｄｉｖまでＭＢＰ発現の増大が認められたが、ＭＢＰの発現は、その時点でも無秩序で、軸索と十分に共存できない（図３Ａ、ＬＰＣ＋Ｖｅｈ、１４ｄｉｖ）。しかし、１４ｄｉｖにわたるＩＳＰ処理は、多くの再ミエリン化軸索を生じ（図３Ａおよび３Ｂ、ＬＰＣ＋ＩＳＰ、１４ｄｉｖ）、これは、ウェスタンブロット分析および定量化で確認された（図３Ｃ）。これらの切片培養物実験は、ＬＰＣ処理後、おそらく、ＯＰＣに直接影響を与えることにより、または場合により、加えてミクログリア／マクロファージにも影響を与えることにより、ＩＳＰが再ミエリン化速度を高めることを確証する。
【０１７７】
興味深いことに、このＩＳＰが再ミエリン化の速度を高めることは、我々の小脳切片培養物中の８ｄｉｖまでのアグリカン存在（Ｃａｔ３０１）の低減と相関する（図１１Ａおよび１１Ｂ）が、アグリカン発現は、４ｄｉｖでは、ＩＳＰ群とビークル群との間では類似であった（図１１Ａおよび１１Ｂ）。１４ｄｉｖまでは、我々は、両群で、ＭＢＰ染色により同時再ミエリン化および低減したＣＳＰＧ発現を観察したが、ＩＳＰ処理切片は、増大したＭＢＰ発現およびより大きいＣＳＰＧ減少を有した。
【０１７８】
ＣＳＰＧがＩＳＰ処理により影響を受けるかどうかをさらに調べるために、我々は、ＬＰＣ注入動物でＭＢＰおよびＣＳＰＧのダブル免疫染色を行った。対照ＬＰＣ損傷を受けた動物は、１４ｄｐｌでのＭＢＰの低減した発現とは逆相関の上昇したレベルのＧＡＧ−ＣＳＰＧ（ＣＳ５６）およびアグリカン（Ｃａｔ３０１）を示した（図４Ｂ）。対照的に、ＩＳＰ治療動物は、ＣＳＰＧ（ＣＳ５６およびＣａｔ３０１）のより迅速な低減および増大したミエリン発現を示した（図４Ｂおよび４Ｄ）。ミエリン修復は通常、ＬＰＣ損傷を受けた動物では発生しないが、ＣＳＰＧ分解は、ペプチド治療後に発生する分解より遙かに遅い（追補図３Ａおよび３Ｂ）ことに留意することは重要である。従って、我々は、ＩＳＰ処理がミエリン修復速度を高めるのみならず、ＣＳＰＧ発現のより急速な低減にも関連することを見出した。
【０１７９】
ＬＰＣ注入動物では、バーシカン免疫染色法は、反応性星状膠細胞（ＧＦＡＰ＋）が認められる病変のペナンブラ中では最強であった（図４Ｃ）。このＣＳＰＧ沈着パターンは、反応性星状膠細胞による増大したバーシカン分泌の最近報告された知見を確証する。我々はまた、我々のＩＳＰ処理後の低減したＣＳＰＧ発現の根底にある機序の調査を開始するために、局所的に脱髄されたＬＰＣ病変中の炎症細胞および星状膠細胞および変化したＩＳＰ処理タイミングについて調査した。ＬＰＣ注射時、直ちに（１日の遅延ではなく）、マウスは、ＩＳＰ（２０μｇ／日／マウス）を７日間受けた。この初期段階では、病変の中心の染色は、ＩＳＰ治療動物と対照群との間で、活性化ミクログリア（Ｉｂａ１）、反応性星状膠細胞（ＧＦＡＰ）、またはＭＢＰミエリンタンパク質発現の量の変化を示さなかった（図４Ｃおよび４Ｄ）。このことは、ＬＰＣ誘導損傷は、初期には、ＩＳＰと対照群との間で類似であることを示唆している。この場合も、アグリカン染色は、Ｉｂａ１＋マクロファージと共存した（図４Ｃ）。しかし、ＣＳＰＧ発現（ＣＳ５６、Ｃａｔ３０１）は、ＩＳＰ治療後有意に低減し、ＩＳＰが脱髄病変中でＣＳＰＧの増大した分解に関与し得ることを示唆する。
【０１８０】
ＩＳＰによるＣＳＰＧ減少はＯＰＣ生存、分化、および移動を高める
ＩＳＰ誘導ＣＳＰＧ抑制解除は、ＯＰＣ増殖、生存、分化、または移動を調節することにより、増大した再ミエリン化を生じ得る。これらの可能性間で区別するために、我々は、７ｄｐｌのＬＰＣ病変中で、Ｏｌｉｇ２およびＫｉ６７抗体で免疫染色することにより、増殖性ＯＰＣの定量化を開始した。我々は、Ｏｌｉｇ２＋ＯＰＣのパーセンテージが、ビークル治療マウスに比べて、ＩＳＰ治療マウスの病変中で有意に増大した（図１３Ａおよび１３Ｂ）が、群間のＯｌｉｇ２＋／Ｋｉ６７＋細胞に差異は認められない（図１３Ｂ）ことを見出した。ＯＰＣ増殖に対するＩＳＰによる効果をさらに調べるために、我々は、低濃度のラミニン（１μｇ／ｍＬ）およびアグリカン（２μｇ／ｍＬ）上で２ｄｉｖにわたり培養したＯＰＣをペプチド処理し、処理および対照群間で増殖速度の有意な差異がないことを見出した（図１３Ｃおよび１３Ｄ）。ＯＰＣのアポトーシスがＣＳＰＧにより影響を受けたかどうかを調べるために、我々は、低濃度のラミニンおよびアグリカン上で同様に培養されたＯＰＣのＴＵＮＥＬ染色を実施し、ＩＳＰ処理がアポトーシス細胞のパーセンテージを低減することを見出した（図１３Ｅおよび１３Ｆ）。ＩＳＰはまた、同様に培養したＯＰＣがＬＰＣ（１μｇ／ｍＬ、２時間）で誘発された場合に、ＯＰＣ死亡を低減した（図１３Ｅおよび１３Ｆ）。
【０１８１】
ＩＳＰ処理のＯＰＣ分化に対する影響を調べるために、我々は、ＩＳＰで治療したＥＡＥ動物（４１ｄｐｌ）（およびＬＰＣ注入動物１４ｄｐｌ）の両方中の分化したＣＣ１＋乏突起膠細胞の数を定量化した。ＣＣ１＋乏突起膠細胞のパーセンテージは、対照と比較して、ＩＳＰ治療マウスの病変中で有意に高かった（図１４Ａ〜１４Ｄ）。ＩＳＰ強化ＯＰＣ成熟はまた、アグリカンおよびラミニンプリコートカバーガラス上で培養された免疫精製ＯＰＣ（Ｐ１〜２のＷＴマウス）を用いて、インビトロで確認された。初期ＯＰＣ（Ｏ４＋）および成熟ＯＬ（ＭＢＰ＋）の免疫染色法は、非ＣＳＰＧ対照基質上で成長したＯＰＣに比べて、ＣＳＰＧ上で成長したＯ４およびＭＢＰ発現細胞の短くなった突起長さからわかるように、ＣＳＰＧがＯＰＣの漸進的成熟を低減させることを示した（図１４Ｅおよび１４Ｆ）。ＣＳＰＧ上で成長したＯＰＣの突起成長および成熟は、ＩＳＰ治療により大部分救済された（ＩＳＰ治療有りまたは無しのＣＳＰＧ上で成長した細胞のＭＢＰ＋フットプリントを分析することにより定量化して）（図１４Ｅおよび１４Ｇ）。これらの知見は、ＩＳＰが、脱髄病変中のＯＰＣの増殖ではなく、生存および分化を強化し得ることを示す。
【０１８２】
ＩＳＰはまた、ＯＰＣが生存し、その後、それらの有髄化型へ分化できる病変部位へのＯＰＣの移動を促進し得る。ＯＰＣ移動に対するＣＳＰＧ／受容体効果を調査するために、我々は、以前に、グリア性瘢痕中で見つかったＣＳＰＧの阻害性勾配分布の強力なインビトロモデルとして使用した、我々のＣＳＰＧ勾配スポットアッセイ上で成長したＰ２のＷＴ子由来の脊髄外植片を利用した。外植片由来の、ＩＳＰ処理初期（ＰＤＧＦＲα＋）および成熟前（Ｏ４＋）ＯＰＣは、勾配スポットのＣＳＰＧ濃縮外周部と交差させることが可能であった。対照外植片では、ほとんどの細胞がこの阻害性領域を交差して移動できなかった（図５Ａ〜５Ｃ）。従って、ＣＳＰＧ関連アポトーシスおよび成熟障害の緩和に加えて、ＩＳＰはまた、ＯＰＣが生存し、その後、それらの成熟有髄化型へ分化できる病変部位へのＯＰＣの移動を促進し得る。ＩＳＰ処理後の両切片培養物中（図１１Ａおよび１１Ｂ）およびＭＳインビボモデル（図４Ａ〜４Ｄ）におけるＣＳＰＧの低減と共に、これらの観察により、我々は、ＩＳＰを介したＰＴＰσの標的化が、内在性プロテアーゼの分泌または活性化の増大を誘導するという仮説を立てるに至った。
【０１８３】
ＩＳＰ処理はＣＳＰＧのプロテアーゼ依存性酵素消化を高める
ＩＳＰ処理エクスビボおよびインビボモデルにおける低減したＣＳＰＧ発現の観察に加えて、我々は、ＩＳＰ処理ＰＤＧＦＲα＋ＯＰＣが、おそらく消化されたＧＡＧ−ＣＳＰＧ領域の、我々のスポットアッセイのアグリカン外周部にそれらが浸潤した、「影」を残すことに気づいた（図５Ｄ、矢印）。全外側プロテオグリカン外周部はまた、ＩＳＰの存在下で直径が減少した（図５Ｄ、外周部幅を比較）。プロテアーゼ活性が発生していたかどうかの調査を開始するために、我々は、我々のスポットアッセイに戻り、推定アグリカン分解をより良好に特徴付けた。培養上清（ＣＭ）を、ビークル、ＩＳＰ、またはＳＩＳＰ（スクランブルＩＳＰ）で処理した免疫精製ＯＰＣから収集し、新たに作製したスポット上に播種した。ＩＳＰ処理ＯＰＣ  ＣＭは、ビークルまたはスクランブルペプチド対照ならびに無細胞対照に比較して、ＣＳ５６発現を有意に低減した（図１６Ａ〜１６Ｃ）。興味深いことに、スポットのラミニン部分は、免疫染色法により可視化されているように、完全に温存されたことである（図１６Ｄおよび１６Ｅ）。我々はまた、これらの結果を、ビークル、ＩＳＰ、またはＳＩＳＰで処理したＯＰＣから収集したアグリカン（２０μｇ／ｍＬ）およびラミニン）１０μｇ／ｍＬ）と共にインキュベートしたＯＰＣ  ＣＭのウェスタンブロット分析で確認した（図５Ｅ〜５Ｇ）。
【０１８４】
ＯＰＣプロテアーゼ活性のＩＳＰ誘導を独立に特徴付けるために、我々は、消光されたカゼイン蛍光をベースにした一般酵素活性アッセイ（ＥｎｚＣｈｅｋキット）を実施し、ビークルおよびＳＩＳＰ対照に比較して、ＯＰＣのＩＳＰ処理が実際に、プロテアーゼ活性（蛍光Ａ．Ｕ．）を増大させたことを認めた（図５Ｈおよび５Ｉ）。さらに、ＩＳＰは、アグリカンとインキュベートしたＯＰＣ  ＣＭのＩＳＰ処理のウェスタンブロットにより可視化されているように、アグリカン消化を用量依存性的に増大させた（図１６Ｇおよび１６Ｈ）。
【０１８５】
ＩＳＰはプロテアーゼ活性、特にＭＭＰ−２分泌を増大させてＯＰＣ移動および再ミエリン化を増大する
どの重要なプロテアーゼＩＳＰが調節し得るかの特定を始めるために、我々は、ビークルまたはＩＳＰ処理ＯＰＣ  ＣＭをプロテアーゼアレイブロットと共にインキュベートした。我々は、潜在的に（十分な量で産生された場合）ＣＳＰＧを消化できる、ＩＳＰ処理群中のいくつかの種類のプロテアーゼ（例えば、ＡＤＡＭＴＳ、カリクレイン、カテプシン、ＭＭＰ）に属する種々の酵素に対し増大したシグナル伝達を見つけた（図１５）。興味深いことに、カテプシンＬおよびＶおよびＭＭＰ−１０などの３種のラミニン分解プロテアーゼは減少し、ＰＴＰσ調節に関連する酵素カスケードの調節において、ある程度の特異性を示唆する。この結果は、なぜ我々が、我々のＩＳＰ処理インビトロアッセイで、不変のラミニン発現を観察したのかを説明する助けになる可能性がある（図５Ｅ、５Ｇ、１６Ｄ、および１６Ｅ）。我々のプロテアーゼアレイからの結果を確認するために、我々は、ＩＳＰまたは対照で処理したＯＰＣ  ＣＭ中のＭＭＰ−２、９、およびカテプシンＢを含む複数の発現上昇プロテアーゼのウェスタンブロット分析を実施し、ＭＭＰ−２は容易に検出可能であり、ＩＳＰ処理後、明確に増大したことを見出した（図６Ｃおよび６Ｄ）。培養ＯＰＣの染色は、ＭＭＰ−２がＯ４＋ＯＰＣ中のそれらの突起内で発現し、ペプチド処理後に強化されている用に見えることを示した（図６Ｈ）。
【０１８６】
ＯＰＣ  ＣＭ由来ＭＭＰ−２活性がＩＳＰ処理により強化されることを確認するために、我々は、ゼラチンザイモグラフィーを実施し、ＭＭＰ−２のゼラチン分解する活性が、対照に比較して、ＩＳＰ処理時に有意に増大したことを認めた（図６Ａおよび６Ｂ）。ＭＭＰ−９活性は、ゼラチンザイモグラフィーによりわずかに目視可能であり（図６Ａ）、ウェスタンブロット分析により非検出であった（データは示さず）。我々はまた、フィブロネクチン、ラミニン、およびエラスチンを分解するプロテアーゼである、ＭＭＰ−１０をブロットし、ＭＭＰ−２より遙かに少ない量で分泌されることを見出した（図６Ｃ）。ビークル、ＩＳＰ、およびＳＩＳＰ処理ＯＰＣ培養物は、ＭＭＰ−１０を同様に少ない量で分泌するように見え（図６Ｃおよび６Ｅ）、ＩＳＰによる向上したＭＭＰ−２分泌は、ＰＴＰσ調節に特異的である可能性がある。ＩＳＰ処理ＯＰＣ  ＣＭに加えて、ＯＰＣ溶解物もまた、ウェスタンブロットで分析し、ＧＡＰＤＨ負荷対照に対し正規化したＭＭＰ−２発現の増大を示し、ＭＭＰ−２分泌がＩＳＰにより強化され得ることを示唆する（図６Ｆ）。これを試験するために、我々は、アグリカンを、ＩＳＰと併せて、エキソサイトーシス阻害剤のＥｘｏ１（１０μｇ／ｍＬ）で処理したＯＰＣ  ＣＭと共にインキュベートした。十分な濃度で、Ｅｘｏ１は、エキソサイトーシスをＡｒｆ  ＧＴＰアーゼの阻害を介して可逆的に阻害することが観察された。我々は、Ｅｘｏ１が部分的にアグリカンＧＡＧ消化を救済したことを見出した（図６Ｉおよび６Ｊ）。我々はまた、ＩＳＰを含む、広範なＭＭＰ阻害剤のＧＭ６００１（２５μＭ）、および特異的ＭＭＰ−２阻害剤（ＯＡ−Ｈｙ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、１００ｎＭ）を用いて、同じ実験を実施し、両ケースでＧＡＧ消化が部分的に救済されることを見出し、ＩＳＰ誘導ＣＳＰＧ分解が主にメタロプロテアーゼファミリーおよびＭＭＰ−２により確実に行われ得ることを示唆する（図６Ｉおよび６Ｊ）。ＧＭ６００１およびＭＭＰ−２阻害剤は、ＣＳ５６スポット分解をさらに救済する（図１７Ａ〜１７Ｄ）。
【０１８７】
我々は、ＭＭＰ阻害がＣＳＰＧ外周部と交差するＯＰＣ移動を低減するかどうかを試験するためにスポットアッセイに戻った。ＧＭ６００１（２５μＭ）および特異的ＭＭＰ−２阻害剤（ＯＡ−Ｈｙ、１００ｎＭ）によるＯＰＣの処理が、ＩＳＰの存在下であっても、ＣＳＰＧリッチ領域へのＯＰＣの進入を効果的に停止させた（図７Ａおよび７Ｂ）。このことは、ＩＳＰ誘導による増大したＯＰＣ移動は、ＭＭＰ依存性であり得ることを示唆している。最後に、再ミエリン化に対するＭＭＰの機能的必要性を試験するために、我々は、ＬＰＣ脱髄小脳切片を、ＩＳＰと併用して、ＧＭ６００１または特異的ＭＭＰ−２阻害剤で処理した。ＭＢＰおよび神経フィラメント＋軸索の共存は、実際に、ＩＳＰの存在にも関わらず、ＧＭ６００１およびＭＭＰ−２阻害剤処理で低減した（図７Ｃおよび７Ｄ）。さらに、低濃度のアグリカンおよびラミニン上で培養した、ＬＰＣ誘発（１μｇ／ｍＬ、２時間）ＯＰＣ中のＭＭＰ−２の２ｄｉｖ阻害は、ＴＵＮＥＬ染色により評価したように、ＩＳＰの生存促進効果を除去した（図１７Ｅ）。しかし、ビークル対照に比較して、ＭＭＰ−２阻害剤は、アグリカン／ラミニン単独上で、アポトーシスを増大させるようには見えなかった（図１７Ｅ）。ＭＭＰ−２の特異的阻害は、さらに、低濃度のアグリカン／ラミニン上で成長した成熟乏突起膠細胞のＭＢＰフットプリントの増大を打ち消した（図１７Ｆおよび１７Ｇ）。
【０１８８】
再ミエリン化の増大におけるＩＳＰ処理後のＭＭＰ−２活性の必要性をさらに明らかにするために、我々は、レンチウイルス粒子送達ｓｈＲＮＡ構築物を利用した。我々は、最初に、４８時間感染させたＯＰＣ培養物中のＭＭＰ−２をノックダウンするために、レンチウイルス送達ならびにウエスタン分析を用いたこのｓｈＲＮＡ手法の妥当性を確認した（図１８Ａ）。ｓｈＲＮＡによるＭＭＰ−２ノックダウンは、アグリカン上でインビトロ培養されたＯＬの伸張したＭＢＰ＋突起の領域（図１８Ｂおよび１８Ｃ）、および高いアグリカン障壁を通過して移動するＯＰＣの能力（図１８Ｄおよび１８Ｅ）を、ＩＳＰ処理にかかわらず、減らすことができる。予想通り、ｓｈＲＮＡによるＭＭＰ−２ノックダウンはまた、小脳切片培養物中のＩＳＰ誘導再ミエリン化を減弱させた（図７Ｅおよび７Ｆ）。
【０１８９】
我々は、次に、免疫組織化学的検査を用いてＭＭＰ−２インビボ発現を特徴付け、未処理脊髄の脊髄後柱はベースラインの少しのＭＭＰ−２タンパク質を発現しているが、ＬＰＣの同じ領域への注入が、１４ｄｐｌに、ＭＭＰ−２発現を幾分増大させることを見出した（図８Ａおよび８Ｂ）。しかし、ＩＳＰ処理は、ＬＰＣ注入部位でのＭＭＰ−２発現を顕著に増大させ、これはまた、影響を受けた脊髄領域のウェスタンブロット分析でも確認された（図８Ｃ）。ＩＳＰ処理ＬＰＣ脱髄脊髄の免疫染色は、ＭＭＰ−２のＯｌｉｇ２特定ＯＰＣとの共存を示した（図８Ｄ）が、Ｉｂａ１標識免疫細胞とも共存した（図８Ｅ）。ＩＳＰによる再ミエリン化の増大におけるＭＭＰ−２活性の必要性をさらに調査するために、我々は、ＬＰＣモデルに戻り、ＭＭＰ−２阻害剤（ＯＡ−Ｈｙ）またはレンチウイルス粒子で送達されるＭＭＰ−２標的化ｓｈＲＮＡ構築物を含むＬＰＣモデルで、１８ｄｐｌのミエリン染色後病変体積を分析した（図８Ｆおよび８Ｇ）。興味深いことに、ビークル対照に比較して、ＭＭＰ−２の薬理学的阻害が、病変体積を増大させ、ベースラインレベルのＭＭＰ−２がこのモデルにおける遅い再ミエリン化を促進し得ることを示唆する。ＭＭＰ−２薬理学的阻害またはＭＭＰ−２のｓｈＲＮＡ媒介ノックダウンの付加は、ＩＳＰの向上した再有髄化効果を減弱化させ、これは、ＣＳ５６免疫反応性の付随する増加と相関し（図１９Ａおよび１９Ｂ）、病変中心のＯｌｉｇ２＋ＯＰＣの蓄積を低減した（図１９Ｃおよび１９Ｄ）。まとめると、これらの結果は、ＯＰＣによるＰＴＰσ調節ＭＭＰ−２分泌の重要性を示すが、また、場合により、ミクログリアもそれらの移動を助けるために、および高いＣＳＰＧ沈着に関わらず限局性脱髄性損傷後に再ミエリン化する能力も重要である。
【０１９０】
考察
我々は、病変関連瘢痕形成中のプロテオグリカン沈着がＯＰＣ移動、分化、および再ミエリン化を強力に阻害する、種々のＭＳモードでのＯＰＣ恒常性の回復における調節後のＣＳＰＧ受容体ＰＴＰσの重要な役割を明らかにした。本明細書に記載のように、全身的に送達ペプチドによるＰＴＰσの標的化は、ＬＰＣ誘導病変中のミエリン修復の速度を高め、強力なミエリン再生および慢性脱髄性ＥＡＥ後の機能回復を誘発する。これらのデータは、変化した免疫分極化を有するＰＴＰσ調節と、向上したプロテアーゼ活性との間の新規の関連性を示す。これは、ＣＳＰＧがＣＮＳ脱髄性疾患後に果たす、および脳脊髄幹全体を通してＭＳ病変を広範に標的化し、ＣＳＰＧ媒介阻害を軽減できる戦略を特定する重要な役割を明確に示す。
【０１９１】
細胞がＣＳＰＧ阻害を克服するのを可能とする受容体ＰＴＰσのペプチド調節後の下流の機序はほとんど知られていない。プロテアーゼ活性は、起こり得る有害な活性の足かせをはずすのを防ぐために、転写、翻訳、分泌、局在化、活性化、および阻害を含むいくつかのレベルで大きく調節されている。無制御で残されているプロテアーゼは、種々のＣＮＳ損傷後の「プロテアーゼストーム」でみられるような、潜在的に被害甚大な結果を有する多様なタンパク質を分解できるＭＳの再発期では、激しい炎症と関連する非特異的プロテアーゼ発現上昇およびミエリン変性は、明確に特徴づけられている。しかし、損傷後の細かく調節されたプロテアーゼ分泌の組織修復を促進する有益な効果は、より正しく認識されつつある。ここで、我々は、ＯＰＣにより高められたＭＭＰ−２プロテアーゼ活性によるＰＴＰσ調節に関連する新規知見を提供し、これは、ＭＳ様病変を包むＣＳＰＧ含有脱髄プラークを介したそれらの消化に役立つ。インビトロ、エクスビボおよびインビボアッセイにより、我々は、ＯＰＣ移動のためのみでなく、改善されたＯＰＣ生存、成熟、および再ミエリン化のためでもある、ＰＴＰσ調節を介したＭＭＰ−２活性の必要性を（一部は）特定した。ＭＭＰ−２発現上昇が、幹細胞のグリア性瘢痕のＣＳＰＧ含有領域への進入を可能とし、培養物中のシュワン細胞による周辺軸索の再ミエリン化を改善することを以前に特定した。我々は、ＩＳＰ処理によるラミニン不足および付随するＣＳＰＧ分解を観察し、これは、ＯＰＣが高密度ＣＳＰＧ脱髄病変中に浸潤でき、そうしない場合は高密度ＣＳＰＧ脱髄病変を生存させる１つの機序であり得る。これは、ＰＴＰσを介して制御されたＣＳＰＧ分解を促進するためのＯＰＣ、および、おそらく免疫細胞によるプロテアーゼの精密調節を明確に示す。
【０１９２】
さらに、我々の調査は、ペプチド処理ＭＳのＥＡＥモデルにおけるマクロファージのこの調節を確証し、我々は、ＣＳＰＧ量ならびに有害なＭ１マクロファージ表現型マーカーｉＮＯＳの減少およびＭ２関連アルギナーゼ−１の増加を観察した。
【０１９３】
我々の調査は、ＩＳＰがミクログリア食細胞能力を顕著に高め得ることを示唆する。ＣＳＰＧの同族受容体を調節することにより、ＯＰＣおよびミクログリアは、一緒に機能して、阻害性ＣＳＰＧおよびその他の細胞の残り物をより急速に除去し得る。従って、炎症促進性の環境をＭ２状態の方向に変更し、選択的細胞により限局性プロテアーゼ活性を誘導することで、ＩＳＰは追加のＣＳＰＧ抑制解除を提供し、結果的にミエリン再生になり得る。
【０１９４】
本開示は、以下の実施例により、さらに例示される。この実施例は、特許請求の範囲を限定することを意図するものではない。
【０１９５】
本発明を、その好ましい実施形態に関連して、詳細に提示し、説明してきたが、添付した特許請求の範囲に包含される本発明の範囲から逸脱することなく、その形態や詳細を様々に変更し得ることを当業者なら理解するであろう。前述の明細書で引用された特許、出版物および参考文献はすべてその全体が参照によって、本明細書に組み込まれる。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【国際調査報告】
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