(57)【要約】  細胞内沈着物の蓄積に関連する疾患、および／または不完全なオートファジーおよび／または不完全なプロテアソーム活性に関連する疾患の処置において使用するための、一般式（Ｉ）の化合物および少なくとも１つの金属イオンを含む金属錯体が開示される。細胞内沈着物の蓄積に関連する疾患、および／または不完全なオートファジーおよび／または不完全なプロテアソーム活性に関連する疾患の処置において使用するための、一般式（Ｉ）の化合物および少なくとも１つの金属イオンを含む金属錯体を含む組成物も開示される。【化１】2020527536.tif 000009【選択図】図６
2020527536.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内沈着物の蓄積に関連する疾患、および／または不完全なオートファジーおよび／または不完全なプロテアソーム活性に関連する疾患の処置における使用のための、一般式（Ｉ）の化合物および少なくとも１つの金属イオンを含む金属錯体であって、
【化１】
2020527536.tif 000007
前記疾患は、ハンチントン病、プリオン病、アミロイドーシス病、限局性糸球体硬化症、α−１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）欠乏症、スフィンゴリピドース、ニーマン−ピックＣ型疾患（ＮＰＣ）、ウォルマン病およびコレステリルエステル蓄積症（ＣＥＳＤ）、グリコーゲン貯蔵病、ガラクトース血症、遺伝性フルクトース不耐性、ムコ多糖症、ピルビン酸代謝障害、ホスホグリセリン酸キナーゼ欠損症、ラフォラ病、副腎白質ジストロフィー、オートファジー液胞ミオパチー、ダノン病、大脳海綿状奇形（ＣＣＭ）、顆粒状角膜ジストロフィー２型（ＧＣＤ２）、慢性腎疾患(ＣＫＤ)、ベツレムミオパシー、ウールリッヒ型先天性筋ジストロフィー、筋硬化症、封入体筋炎、ＨＩＶ、アデノウイルス、Ｂ型肝炎、シェーグレン症候群、敗血症または代謝性アシドーシスに関連する疾患から独立して選択される、金属錯体。
【請求項２】
前記金属イオンは二価金属イオンである、請求項１に記載の使用のための金属錯体。
【請求項３】
前記二価金属イオンは、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｚｎ（ＩＩ）またはＭｎ（ＩＩ）から選択される、請求項２に記載の使用のための金属錯体。
【請求項４】
前記二価金属イオンは、Ｍｎ（ＩＩ）である、請求項３に記載の使用のための金属錯体。
【請求項５】
前記疾患は、ラフォラ病、副腎白質ジストロフィーまたはハンチントン病から選択される、請求項１〜４のいずれかに記載の使用のための金属錯体。
【請求項６】
細胞内沈着物の蓄積に関連する疾患および／または不完全なオートファジーおよび／または不完全なプロテアソーム活性に関連する疾患の処置において使用するための、少なくとも１つの賦形剤または担体と一緒に、一般式（Ｉ）の化合物および少なくとも１つの金属イオンを含む有効量の金属錯体を含む組成物であって、
【化２】
2020527536.tif 000008
前記疾患は、ハンチントン病、プリオン病、アミロイドーシス病、限局性糸球体硬化症、α−１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）欠乏症、スフィンゴリピドース、ニーマン−ピックＣ型疾患（ＮＰＣ）、ウォルマン病およびコレステリルエステル蓄積症（ＣＥＳＤ）、グリコーゲン貯蔵病、ガラクトース血症、遺伝性フルクトース不耐性、ムコ多糖症、ピルビン酸代謝障害、ホスホグリセリン酸キナーゼ欠損症、ラフォラ病、副腎白質ジストロフィー、オートファジー液胞ミオパチー、ダノン病、大脳海綿状奇形（ＣＣＭ）、顆粒状角膜ジストロフィー２型（ＧＣＤ２）、慢性腎疾患(ＣＫＤ)、ベツレムミオパシー、ウールリッヒ型先天性筋ジストロフィー、筋硬化症、封入体筋炎、ＨＩＶ、アデノウイルス、Ｂ型肝炎、シェーグレン症候群、敗血症または代謝性アシドーシスに関連する疾患から独立して選択される、組成物。
【請求項７】
前記組成物は、第２の活性成分をさらに含む、請求項６に記載の使用のための組成物。
【請求項８】
前記第２の活性成分は、メトホルミン、核酸、抗体、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、抗酸化剤、ポリフェノール化合物、ドーパミン作動性阻害剤、コリンエステラーゼ阻害剤、リルゾールまたはクルクミンから独立して選択される、請求項７に記載の使用のための組成物。
【請求項９】
前記金属イオンは二価金属イオンである、請求項６〜８のいずれかに記載の使用のための組成物。
【請求項１０】
前記二価金属イオンは、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｚｎ（ＩＩ）またはＭｎ（ＩＩ）から選択される、請求項９に記載の使用のための組成物。
【請求項１１】
前記疾患は、ラフォラ病、副腎白質ジストロフィーまたはハンチントン病から選択される、請求項６〜１０のいずれかに記載の使用のための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内沈着物の蓄積に関連する疾患および／または不完全なオートファジーおよび／または不完全なプロテアソーム活性に関連する疾患の処置および予防における使用のためのマクロアザピリジノファンの金属錯体、およびその組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
リソソームおよびプロテアソームは細胞内沈着物の蓄積を排除するための２つの主要な細胞経路である。リソソームは、エンドサイトーシスを介して、細胞内でタンパク質、核酸または脂質を分解するのに重要であるが、オートファジーとして知られるプロセスにおいて、プロテアソームが、真核生物における細胞内タンパク質の主な原因である。
【０００３】
オートファジーは、古くなった細胞成分をリサイクルし、損傷された細胞小器官およびタンパク質凝集体を排除するために使用されるリソソーム分解プロセスである。オートファジーのプロセスは複数のステップを含む：オートファジーの誘導後、細胞質の一部は、器官全体を含むことができ、二重膜によって捕捉され、オートファゴソームを形成する。その後、オートファゴソームはエンドソームおよびリソソームと融合し、オートリソソームを形成する。その後、器官および高分子の完全な消化が行われる。オートファゴソーム膜の伸長は、主にタンパク質結合の２つの系によって制御されている。一方の系は、Ａｔｇ１２およびＡｔｇ５の共役を意味し、他方の系は、ＬＣ３−Ｉとして知られるＬＣ３のサイトゾル型を、オートファゴソーム膜に関連するＬＣ３−ＩＩとして知られる脂質型に変換することを意味する。ＬＣ３−ＩＩタンパク質のレベルは現在、オートファジー活性の最も容認されて使用されるバイオマーカーである。
【０００４】
他方では、いくつかの研究によって、老化の際にタンパク質恒常性が崩壊すると、折り畳まれていない、誤って折り畳まれた、または凝集されたタンパク質が蓄積され、多くの加齢性疾患を引き起こすことが実証された。プロテオームを維持するための主要なメカニズムの１つは、プロテアソーム系であり、損傷されたまたは誤って折り畳まれたタンパク質の排除を確保するため、老化を遅らせる上で中心的な役割を果たす。
【０００５】
最終的に、いくつかの疾患は、オートファジーおよびプロテアソーム活性における欠陥を示し、細胞にタンパク質、脂質または他の分子を蓄積させる。実際、ニューロンは、損なわれたオートファジーまたはプロテアソーム活性に対して特に脆弱な細胞である。例えば、ハンチントン病の原因となるタンパク質である、変異ハンチンチンは、哺乳類において遍在的に発現される。しかしながら、この分子が凝集体に崩壊し、ニューロンの核内および周囲に蓄積した後、神経系のみが実質的な障害を被る。他のすべての組織および細胞のタイプは明らかに影響を受けないままである。したがって、タンパク質の沈着または蓄積を示す疾患には、オートファジーまたはプロテアソーム活性のいずれかを介して、それらの内部沈着物を排除する細胞の問題が明らかにある。
【０００６】
したがって、細胞内沈着物の蓄積を示す疾患であって、蓄積がこれらの沈着物の異常な蓄積をもたらす代謝欠損に起因し、正常な細胞オートファジーまたはプロテアソーム活性がそれらを排除できない疾患、または蓄積が、不完全なオートファジーまたはプロテアソーム活性に起因する疾患を処置する必要がある。
【０００７】
付与された特許ＥＰ２４９２２７０および米国特許第９１４５３８６号は、以下にＡまたはＢとして説明される化合物を含む金属錯体に言及している。前記化合物は、大環状のポリアザピリジノファン中心構造にキノロン複素環が結合した中心構造を含み、該キノロン複素環は、４位によってメチレン基（または橋）に結合し、メチレン基（または橋）は、（以下のＡとして示される）トリアザピリジノファン中心構造に連結されたエチルアミン鎖の−ＮＨ基に順に結合されるか、あるいは、前記キノロン複素環は、（以下のＢとして示される）トリアザピリジノファン中心構造に連結されたエチルアミン鎖の−ＮＨ基に順に結合されるメチレン基に２位によって結合される。
【０００８】
【化１】
2020527536.tif 000003
【０００９】
上記のＡまたはＢとして示される化合物を含む前記金属錯体のファミリーは、引用された特許によれば、その病因が内因性ＳＯＤの活性の障害または内因性ＳＯＤにおける欠乏に起因する治療的疾患を処置するのに有用である（ＥＰ  ２４９２２７０［０００１］を参照のこと）。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、細胞内沈着物の蓄積に関連する疾患、および／または不完全なオートファジーおよび／または不完全なプロテアソーム活性に関連する疾患の処置における使用のための、一般式（Ｉ）の化合物および少なくとも１つの金属イオンを含む金属錯体に関する。
【００１１】
【化２】
2020527536.tif 000004
【００１２】
したがって、本明細書に開示される金属錯体は、キノロン部分の４位によって連結されたトリアザピリジノファン中心を特徴としている。
【００１３】
本明細書において開示される実験データは、金属錯体のファミリーの選択にのみ関連し、金属錯体のファミリーに特徴的なキノロン複素環は、４位によって（Ａとして示される）トリアザピリジノファン中心構造に結合される。
【００１４】
開示される一実施形態は、細胞内沈着物の蓄積に関連する疾患および／または不完全なオートファジーおよび／または不完全なプロテアソーム活性に関連する疾患の処置における使用のための本明細書の上述の金属錯体を指し、金属イオンは二価金属イオンである。
【００１５】
開示される別の実施形態は、細胞内沈着物の蓄積に関連する疾患および／または不完全なオートファジーおよび／または不完全なプロテアソーム活性に関連する疾患の処置における使用のための本明細書に上述の金属錯体を指し、二価金属イオンは、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｚｎ（ＩＩ）またはＭｎ（ＩＩ）から独立して選択され得る。
【００１６】
細胞内沈着物の蓄積に関連する疾患および／または不完全なオートファジーおよび／または不完全なプロテアソーム活性に関連する疾患の処置において使用する上記の金属錯体の別の実施形態は、式（Ｉ）の化合物およびＭｎ（ＩＩ）を含む金属錯体（ＩＩ）である。
【００１７】
開示される実験データは、オートファジーおよび／またはプロテアソーム活性の活性化が、上述の特許文書（ＥＰ２４９２２７０、米国特許第９１４５３８６号およびＷＯ  ２０１５１２４８２４）に開示されるトリアザピリジノファン金属錯体のファミリーの特定の選択に対してのみ存在することを示している。
【００１８】
実際、本発明は、細胞内沈着物の蓄積に関連する疾患および／または不完全なオートファジーおよび／または不完全なプロテアソーム活性に関連する疾患の処置における使用のための、キノロン部分が４位によってトリアザピリジノファン中心構造に結合される、金属錯体の特定の選択に関する 。
【００１９】
さらに、本発明の一実施形態は、細胞内沈着物の蓄積に関連する疾患および／または不完全なオートファジーおよび／または不完全なプロテアソーム活性に関連する疾患の処置における使用のための、少なくとも１つの賦形剤または担体と一緒に、上述の一般式（Ｉ）の化合物、および少なくとも１つの金属イオンを含む有効量の金属錯体を含む組成物に関する。
【００２０】
好ましくは、前記金属イオンは二価金属イオンであり、より好ましくは、前記二価金属イオンは、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｚｎ（ＩＩ）またはＭｎ（ＩＩ）から独立して選択され得、さらにより好ましくはＭｎ（ＩＩ）である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】金属錯体（ＩＩ）の存在下または非存在下におけるヒト線維芽細胞上のＬＣ３−ＩＩのレベルであって、完全および絶食培地（Kｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ）の対照細胞株（Ｃ１およびＣ２）ならびにラフォラ患者の細胞株（Ｌ１、Ｌ２およびＭ１）上のＬＣ３−ＩＩレベルにおける金属錯体（ＩＩ）の効果を示す。
【図１Ｂ】金属錯体（ＩＩ）の存在下または非存在下におけるヒト線維芽細胞のＬＣ３−ＩＩのレベルであって、完全および絶食培地の対照細胞株（C１およびC２）およびＬ３ならびにＭ１ラフォラ患者の細胞株（Ｌ１、Ｌ２およびＭ１）のＬＣ３−ＩＩレベルにおける金属錯体（ＩＩ）の効果を示す。
【図１Ｃ】６時間の間に５μＭでの金属錯体（ＩＩ）の非存在下または存在下で試験された、蛍光ＧＦＰ−ＬＣ３でトランスフェクトした、ラフォラ患者からのヒト線維芽細胞（Ｌ−３として示される）および健康なヒト線維芽細胞（Ｃ−１して示される）を示す。目に見える点は、オートファジーの液胞を示す。図面の下部にある白線は、参照用に使用されており、１０μｍを表す。
【図２】１μＭ、５μＭおよび１０μＭ濃度（それぞれ、２、３および４として標識された）金属錯体（ＩＩ）の非存在下（１として標識された）または存在下で試験された健康な、またはラフォリン（３３４９Ｂのラフォリン突然変異ではＬ１および３３４８Ｄのラフォリン突然変異ではＬ２）およびマリン（３３４９Ｂのマリン突然変異ではＭ１）において突然変異を有するヒト線維芽細胞（細胞株３３４９Ｂおよび３３４８Ｄ）のＬＣ３−ＩＩレベルを示す。ラパマイシンを陽性対照（５として標識された）として使用した。ラベル５＊はローディングのエラーである。
【図３Ａ】ヒト皮膚線維芽細胞における金属錯体（ＩＩ）によるプロテアソームのキモトリプシン様活性化を示すインビトロ研究を示し、結果は、対照に正規化された相対発光単位（ＲＬＵ）で測定される。図３Ａは、未処理細胞の対照に対しても５μＭのピトレン  ２Ｑで実施した試験を示す。ピトレン  ２Ｑは、金属錯体（ＩＩ）として、トリアザピリジノファン中心構造を含むＭｎ（ＩＩ）錯体でもあるが、キノロン複素環は、２位によって前記トリアザピリジノファン中心構造に結合される。したがって、ピトレン  ２Ｑにおけるキノロン複素環は、本明細書に開示される金属錯体におけるように４位ではなく、２位によってトリアザピリジノファン中心構造に結合される。
【図３Ｂ】ヒト皮膚線維芽細胞における金属錯体（ＩＩ）によるプロテアソームのキモトリプシン様活性化を示すインビトロ研究を示し、結果は、対照に正規化された相対発光単位（ＲＬＵ）で測定される。図３Ｂは、未処理細胞の対照に対して５μMの金属錯体（ＩＩ）で実施した試験を示す。
【図４】モデルワーム線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）のグラフィカルな表現および穏やかなタッチ感度（爪楊枝の端に接着された眉毛）をテストするための器具を示す。
【図５】図５Ａは、トランスジェニックワーム（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）の頭部の共焦点画像を示し、ＦＬＰ機械感覚ニューロンにおける１１０Ｑ：：ＴｄＴｏｍａｔｏの発現（丸で囲んだ部分）を示す。ライトグレーの組織は、導入遺伝子のマーカー（すなわち、咽頭で発現される緑色蛍光タンパク質（GFP））である。図５Ｂは、１１０Ｑ：：ＴｄＴｏｍａｔｏの凝集体（丸で囲んだ部分）を発現するＦＬＰニューロンを示す共焦点画像を示す。図５Ｃは、神経障害（野生型動物よりも低い機械感覚）を示す１１０Ｑ：：ＴｄＴｏｍａｔｏを発現する３つの独立した株のタッチアッセイを示す。図５Ｄは、金属錯体（ＩＩ）が用量依存的に１１０Ｑ：：ＴｄＴｏｍａｔｏ発現による神経障害を救助する方法を示す。その試験は、対照Ｃとして（神経障害を示す１１０Ｑ：：ＴｄＴｏｍａｔｏを発現する）未処理動物を使用して実施された。図５Ｃおよび図５Ｄの結果は、タッチ応答を示す個体の％として表された。メトホルミン（ＭＥＴＦ）を陽性対照として使用した。
【図６】金属錯体（ＩＩ）を線虫のハンチントン病モデルにおける異なる濃度で穏やかなタッチ感度で試験した、図５Ｄによって表される３回の反復試験の結果を示す。その試験は、対照Ｃとして（神経障害を示す１１０Ｑ：：ＴｄＴｏｍａｔｏを発現する）未処理動物を使用して実施された。結果は、タッチ応答を示す個体の％として表された。メトホルミン（ＭＥＴＦ）を陽性対照として使用した。
【図７】金属錯体（ＩＩ）が、試験された用量に有意な変化をもたらさない化合物２Ｑに対して、用量依存的に１１０Ｑ：：ＴｄＴｏｍａｔｏ発現による神経障害を救助する方法を示す。その試験は、対照Ｃとして（神経障害を示す１１０Ｑ：：ＴｄＴｏｍａｔｏを発現する）未処理動物を使用して実施された。メトホルミンを陽性対照として使用した。結果は、タッチ応答動作を示す個体の％として表された。
【図８】対照（左から１列目）として（神経障害を示す１１０Ｑ：：ＴｄＴｏｍａｔｏを発現する）未処理動物と比較して、金属錯体（ＩＩ）が１１０Ｑ：：ＴｄＴｏｍａｔｏ発現による神経障害を救助する方法（左から３列目）を示す。結果は、タッチ応答を示す個体の％として表された。しかしながら、クロロキンのようなオートファジーの特定の阻害剤が金属錯体（ＩＩ）と組み合わせて使用された場合、救助は検出されなかった（左から４列目）。クロロキンは、１１０Ｑ：：ＴｄＴｏｍａｔｏ発現によるタッチ応答障害（左から１列目）に追加のタッチ応答障害（左から２列目）を引き起こさない。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
したがって、本発明は、細胞内沈着物の蓄積に関連する疾患、および／または不完全なオートファジーおよび／または不完全なプロテアソーム活性に関連する疾患の処置における使用のための、一般式（Ｉ）の化合物および少なくとも１つの金属イオンを含む金属錯体に関する。
【００２３】
【化３】
2020527536.tif 000005
【００２４】
本明細書に記載されるように、金属錯体は、化合物と少なくとも１つの金属イオンとの分子会合、特に一般式（Ｉ）の化合物と少なくとも１つの金属イオンとの分子会合を指す。
【００２５】
本発明の一実施形態は、細胞内沈着物の蓄積に関連する疾患および／または不完全なオートファジーおよび／または不完全なプロテアソーム活性に関連する疾患の処置における使用のための、式（Ｉ）の化合物および少なくとも１つの金属イオンを含む金属錯体に関し、前記金属イオンは二価金属イオンである。
【００２６】
本発明の別の実施形態は、細胞内沈着物の蓄積に関連する疾患および／または不完全なオートファジーおよび／または不完全なプロテアソーム活性に関連する疾患の処置における使用のための、式（Ｉ）の化合物および少なくとも１つの金属イオンを含む金属錯体に関し、前記二価金属イオンは、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｚｎ（ＩＩ）またはＭｎ（ＩＩ）から独立して選択される。
【００２７】
本発明の別の実施形態において、金属錯体は、式（Ｉ）の化合物およびＭｎ（ＩＩ）を含む金属錯体（ＩＩ）である。
【００２８】
本発明の文脈において、細胞内沈着物の蓄積に関連する疾患および／または不完全なオートファジーおよび／または不完全なプロテアソーム活性に関連する疾患は、ハンチントン病、プリオン病、限局性糸球体硬化症、ＡＡＴ欠乏症（α−１−アンチトリプシン欠乏症）、スフィンゴリピドース、ニーマン−ピックＣ型疾患（ＮＰＣ）、ウォルマン病およびコレステリルエステル蓄積症（ＣＥＳＤ）、グリコーゲン貯蔵病、ガラクトース血症、遺伝性フルクトース不耐性、ムコ多糖症、ピルビン酸代謝障害、ホスホグリセリン酸キナーゼ欠損症、ラフォラ病、副腎白質ジストロフィー、オートファジー液胞ミオパチー、ダノン病、大脳海綿状奇形（ＣＣＭ）、顆粒状角膜ジストロフィー２型（ＧＣＤ２）、慢性腎疾患(ＣＫＤ)、ベツレムミオパシーとしての遺伝性筋疾患、Ｕｌｌｒｉｃｈ先天性筋ジストロフィーおよび筋硬化症、封入体筋炎に関連する疾患、ＨＩＶ、アデノウイルス、Ｂ型肝炎またはＨＴＬＶとしてのウイルス感染、シェーグレン症候群、敗血症または代謝性アシドーシスを指すが、これらに限定されない。
【００２９】
特に、本発明の一実施形態は、本発明によれば、細胞内沈着物の蓄積および／または不完全なオートファジーおよび／または不完全なプロテアソーム活性に関連する疾患の処置における使用のための、式（Ｉ）の化合物および少なくとも１つの金属イオンを含む金属錯体に関し、疾患は、ハンチントン病、プリオン病、白内障、限局性糸球体硬化症、ＡＡＴ欠乏症、スフィンゴリピドース、ニーマン−ピックＣ型疾患（ＮＰＣ）、ウォルマン病およびコレステリルエステル蓄積症（ＣＥＳＤ）、グリコーゲン貯蔵病、ガラクトース血症、遺伝性フルクトース不耐性、ムコ多糖症、ピルビン酸代謝障害、ホスホグリセリン酸キナーゼ欠損症、ラフォラ病、副腎白質ジストロフィー、オートファジー液胞ミオパチー、ダノン病、大脳海綿状奇形（ＣＣＭ）、顆粒状角膜ジストロフィー２型（ＧＣＤ２）、慢性腎疾患(ＣＫＤ)、ベツレムミオパシー、ウールリッヒ型先天性筋ジストロフィー、筋硬化症、封入体筋炎、ＨＩＶ、アデノウイルス、Ｂ型肝炎、ＨＴＬＶ、シェーグレン症候群、敗血症または代謝性アシドーシスから独立して選択される。好ましくは、疾患は、ラフォラ病、副腎白質ジストロフィーまたはハンチントン病から独立して選択される。より好ましくは、前記疾患はラフォラ病またはハンチントン病である。
【００３０】
本明細書に開示される式（Ｉ）の化合物および少なくとも１つの金属イオンを含む金属錯体は、不完全なオートファジーおよび／またはプロテアソーム活性を示す細胞において、オートファジーおよびプロテアソーム活性を刺激または活性化する。本明細書に開示される金属錯体は、また、不完全なオートファジーおよび／または不完全なプロテアソーム活性を示す疾患の症状を軽減させることができる。
【００３１】
本発明の一実施形態は、細胞内沈着物の蓄積に関連する疾患および／または不完全なオートファジーおよび／または不完全なプロテアソーム活性に関連する疾患の処置における使用のために本明細書で上述した、式（Ｉ）の化合物および少なくとも１つの金属イオンを含む金属錯体に関し、前記疾患は加齢性疾患である。
【００３２】
本明細書の目的のために、加齢性疾患は、細胞老化および細胞損傷の蓄積、特に脂質、炭水化物またはタンパク質沈着物である細胞内沈着物の蓄積に順に関連する老化の増加に関連する疾患である。
【００３３】
本開示の文脈において、脂質、炭水化物またはタンパク質沈着物の蓄積に順に関連する前記加齢性疾患は、ＡＡＴ欠乏症（α−１−アンチトリプシン欠乏症）、ハンチントン病、プリオン病、限局性糸球体硬化症、スフィンゴリピドーシス、ニーマン−ピックＣ型疾患（ＮＰＣ）、ウォルマン病およびコレステリルエステル蓄積症（ＣＥＳＤ）、グリコーゲン貯蔵病、ガラクトース血症、遺伝性フルクトース不耐性、ムコ多糖症、ピルビン酸代謝障害またはホスホグリセリン酸キナーゼ欠損症に関連する疾患を指すが、これらに限定されない。
【００３４】
本発明の別の実施形態は、細胞内沈着物の蓄積に関連する疾患および／または不完全なオートファジーおよび／または不完全なプロテアソーム活性に関連する疾患の処置における使用のための、本明細書で上述した、式（Ｉ）の化合物および少なくとも１つの金属イオンを含む金属錯体に関し、前記疾患はラフォラ病またはハンチントン病から独立して選択される。
【００３５】
本発明の一実施形態は、細胞内沈着物の蓄積を示す疾患の処置における使用のための、本明細書で上述した、式（Ｉ）の化合物および少なくとも１つの金属イオンを含む金属錯体に関する。
【００３６】
好ましい実施形態において、前記疾患は、ラフォラ病、副腎白質ジストロフィーまたはハンチントン病から選択され、より好ましくは、ラフォラ病またはハンチントン病から選択される。
【００３７】
ラフォラ病は、ラフォラ進行性ミオクローヌスてんかんまたはＭＥＬＦとも呼ばれ、心臓、肝臓、筋肉および皮膚の細胞の細胞質内の封入体（ラフォラ体）の存在によって特徴付けられる常染色体劣性遺伝障害である。ラフォラ患者は、ラフォリンまたはマリンタンパク質において変異を示す。
【００３８】
本明細書に開示される式（Ｉ）の化合物および少なくとも１つの金属イオンを含む金属錯体は、実施例１（図１および２）に示されるように、不完全なオートファジーを示すラフォリンおよびマリンタンパク質における変異を有するラフォラ病患者の細胞内のオートファジーを活性化する。実際、実施例１では、健康な人からの線維芽細胞およびラフォラ病患者からの線維芽細胞がテストされた。結果は、すべての線維芽細胞が、金属錯体（ＩＩ）を用いた処理後にＬＣ３−ＩＩタンパク質のより高いレベルを有することを示し、ＬＣ３−ＩＩの量はオートファジー活性化のレベルを示す（図１および２）。
【００３９】
最初のテストは、完全培地を用いておよび絶食培地を用いて実行された。培地から栄養分を部分的に除去すると、細胞の絶食状態（絶食培地）を模倣し、細胞を刺激してオートファジーを活性化し、内部構造の分解からエネルギーを獲得する。
【００４０】
ラフォラ患者に存在する不完全なオートファジーを、図１Ａ、図１Ｂに示す。ラフォリンおよびマリンに変異を有する未処理細胞株（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３またはＭ１）は、完全培地および絶食培地の両方で、未処理対照細胞株（Ｃ１およびＣ２）よりも低いＬＣ３−ＩＩレベルを示す。
【００４１】
対照線維芽細胞およびラフォラ患者からの線維芽細胞（図１Ａおよび１Ｂ）は、６時間の間５μＭの濃度で金属錯体（ＩＩ）を用いて処理した後、ＬＣ３−ＩＩタンパク質のより高いレベルを有する。
【００４２】
絶食培地においておよび金属錯体（ＩＩ）の非存在下において、完全培地中の同じ細胞で行われた試験と比較すると、タンパク質ＬＣ３−ＩＩのレベルの増加が見られ、栄養素の非存在下でオートファジーが増加することが確認される。金属錯体（ＩＩ）で処理すると、未処理細胞に照らし合わせると、ＬＣ３−ＩＩのレベルがさらに増加し、金属錯体（ＩＩ）で処理された細胞におけるオートファジーレベルの増加が確認される。
【００４３】
別の研究が、１、５および１０μＭの濃度で金属錯体（ＩＩ）をテストするために実施された。健康なヒト線維芽細胞またはラフォリンおよびマリンに変異を有するヒト線維芽細胞のＬＣ３−ＩＩのレベルを、金属錯体（ＩＩ）の非存在下（１として標識される）または存在下で、１μＭ、５μＭおよび１０μＭの濃度（それぞれ２、３および４として標識される）で試験した。ラパマイシンを陽性対照（５として標識される）として使用した。再び、ラフォラ患者に存在する不完全なオートファジーは、健康な未処理細胞と未処理のラフォラ細胞のＬＣ３−ＩＩのレベルを比較して、図２のこの研究でも見られる。研究の結果を図２に示し、そこでは、金属錯体（ＩＩ）は、培地に添加されるとオートファジーを増加させ、正常なヒト線維芽細胞およびラフォリンまたはマリンを欠く線維芽細胞におけるより高いレベルのＬＣ３−ＩＩタンパク質を示す。
【００４４】
ＬＣ３−ＩＩの量がオートファジー活性化のレベルを示すことを考慮すると、前記データは、金属錯体（ＩＩ）が健康な細胞およびオートファジー欠損細胞でオートファジーを刺激または活性化することを示す。
【００４５】
本明細書に開示された金属錯体のオートファジーに対する効果を研究するための異なる実験を使用して、ＧＦＰ−ＬＣ３でトランスフェクトされた細胞を用いた蛍光試験が行われた（図１Ｃ）。この実験では、健康なヒト線維芽細胞（対照Ｃ−１）およびラフォラ患者からの線維芽細胞（Ｌ−３）を、金属錯体（ＩＩ）の非存在下または存在下でテストした。図１Ｃに示す結果は、オートファジーが金属錯体（ＩＩ）の存在下で増加される（オートファジー液胞の増加により測定される）ことを示し、このことは、金属錯体（ＩＩ）がオートファジーを刺激または活性化することを再び示す。
【００４６】
ハンチントン病は、ハンチンチン（Ｈｔｔ）と呼ばれる遺伝子の個体の２つのコピーのいずれか１つにおける常染色体優性突然変異によって引き起こされる。ヒトにおけるＨｔｔの機能は不明である。ハンチンチンタンパク質をコードする遺伝子におけるＣＡＧ（シトシン−アデニン−グアニン）トリプレットリピートの拡大は、グルタミンの長い軌跡をコードする異常なタンパク質をもたらし、それ自体および他のタンパク質と凝集する傾向がある。変異ハンチンチン（ｍＨｔｔ）のこの「粘着性」の状態は、多くの重要なニューロンの事象（例えば、シナプス伝達、軸索輸送、転写）を妨げ、完全に理解されていないメカニズムを通じて脳内の細胞を徐々に損傷する。したがって、この疾患はニューロン内のｍＨｔｔタンパク質の蓄積によって引き起こされる。本明細書に開示された金属錯体を用いたプロテアソームおよび／またはオートファジー活性化を介したこれらの沈着物の分解は、実施例３における線虫のハンチントン病モデルで示される症状の後退をもたらす。
【００４７】
線虫は、神経回路を使用して多様な機械的刺激を検出し、これに応答する。これらの刺激は、身体に送達される優しいタッチ刺激、中間体への厳しいタッチ、頭または尾への厳しいタッチ、鼻のタッチ、およびテクスチャを含む。穏やかなタッチ感度をテストするために最初にかつ最も一般的に使用される方法は、爪楊枝の端に接着された眉毛で動物を撫でることである（図４）。
【００４８】
実施例３で使用された線虫動物は、図５Ａおよび５Ｂに示すように、機械感覚ニューロン中の赤色蛍光タンパク質ＴｄＴｏｍａｔｏのための遺伝子（１１０Ｑ：：ＴｄＴｏｍａｔｏ）とインフレームで融合される１１０ＣＡＧを発現した。１１０Ｑ：：ＴｄＴｏｍａｔｏを発現する動物は、図５Ｃに示すように、野生型動物（ＷＴ）に対して神経障害を示し、１１０Ｑ：：ＴｄＴｏｍａｔｏを発現する神経障害動物（３つの異なる系統）で実施された試験で得られたタッチ応答を示す動物の％は、ＷＴ動物で得られたものよりも有意に低い。
【００４９】
図５Ｄ（および図６に示される上記試験の３回の繰り返し）は、用量依存的に、未処理動物と比較する場合金属錯体（ＩＩ）で処理された動物におけるタッチ応答を示す個体の％の有意な改善を示す。したがって、結果は、金属錯体（ＩＩ）によって例示される本発明の金属錯体が、用量依存的に、１１０Ｑ：：ＴｄＴｏｍａｔｏを発現する線虫のハンチントン病モデルにおいて示される症状を著しく改善できることを示す。
【００５０】
この活性とは対照的に、図７は、未処理動物と比較した場合、２Ｑで処理した動物における％タッチ応答の有意な改善を示さず、したがって、２Ｑは、試験した用量のいずれかでの線虫ハンチントン病モデルにおけるタッチ応答を有意に改善しなかった。
【００５１】
２Ｑと金属錯体（ＩＩ）との間の構造的な違いは、本明細書に開示された金属錯体の特定のファミリーにより提供されるプロテアソームおよび／またはオートファジー活性化に驚くほど関与している。上述のように、本明細書に開示される式（Ｉ）の化合物および少なくとも１つの金属イオンを含む金属錯体は、分子のトリアザピリドファン中心構造に４位によって結合されたキノロン部分を特徴とするが、トリアザピリドファン中心構造を特徴とする化合物である２Ｑは、代わりに２位によって結合されたキノロン部分を特徴とする。
【００５２】
上記のすべての結果は、金属錯体（ＩＩ）がニューロンの１１０Ｑ：：ＴｄＴｏｍａｔｏによって生じる毒性効果を救うことができ、タッチ反応を示す動物の％を有意に増加させることを強く支持する。
【００５３】
また、このニューロンの救済効果がオートファジーによって特異的に生成されるかどうかも試験された。これは、実施例３で説明されるように行われ、線虫のワームは、金属錯体（ＩＩ）およびオートファジーの周知の阻害剤であるクロロキンの存在下でインキュベートされた。図８が示すように、両方の化合物の存在下で培養された動物はもはや救済されず、このことは、金属錯体（ＩＩ）の有益な効果はオートファジーによるものであることを示唆している。
【００５４】
本発明の別の実施形態は、不完全なプロテアソーム活性に関連する疾患の処置において使用するための、本明細書で上述した式（Ｉ）の化合物および少なくとも１つの金属イオンを含む金属錯体に関する。
【００５５】
実施例２は、金属錯体（ＩＩ）によって例示される本発明の化合物が、プロテアソーム活性を刺激する方法を示す（図３Ｂ）。２Ｑも同じ試験条件で試験された。図３Ａは、金属錯体（ＩＩ）によって示される活性とは対照的に、化合物２Ｑがプロテアソーム活性を刺激しないことを示す。
【００５６】
再び、それらの結果は、２Ｑと金属錯体（ＩＩ）との間の構造的な違いを示し、キノロン複素環は、それぞれ、４位ではなく２位によってトリアザピリドファン中心構造に結合し、驚くべきことに、プロテアソームおよび／またはオートファジー活性化を有する本明細書に開示される金属錯体の選択を提供する。
【００５７】
本発明の一実施形態は、細胞内沈着物の蓄積に関連する疾患および／または不完全なオートファジーおよび／または不完全なプロテアソーム活性に関連する疾患の処置における使用のための、少なくとも１つの賦形剤または担体と一緒に、本明細書で上述したような一般式（Ｉ）の化合物および少なくとも１つの金属イオンを含む金属錯体を含む、組成物または医薬組成物に関する。
【００５８】
本開示の目的のために、許容可能な賦形剤または担体は、水、生理食塩水、アルコール、ポリエチレングリコール、ポリヒドロキシエトキシ化ヒマシ油、落花生油、オリーブ油、乳糖、白土、ブドウ糖、果糖、マンニトール、シクロデキストリン、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、 タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、デンプン、アカシア、ステアリン酸またはセルロースの低級アルキルエーテル、ケイ酸、脂肪酸、脂肪酸アミン、脂肪酸モノグリセリドおよびジグリセリド、ペンタエリスリトール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン、ヒドロキシメチルセルロース、またはポリビニルピロリドンなどである。
【００５９】
別の実施形態は、細胞内沈着物の蓄積に関連する疾患および／または不完全なオートファジーおよび／または不完全なプロテアソーム活性に関連する疾患の処置における使用のための、少なくとも１つの賦形剤または担体と一緒に、本明細書で上述した一般式（Ｉ）の化合物および少なくとも１つの金属イオンを含む有効量の金属錯体を含む組成物を開示する。
【００６０】
一般に、有効量の対象化合物が、処置において使用される。本発明に従って使用される化合物の用量は、化合物および処置される状態、例えばレシピエント患者の年齢、体重、および臨床状態に応じて変化する。その他の要因には、投与経路、患者、患者の病歴、疾患進行の重症度、および特定の化合物の効力が含まれる。投与量は、患者に容認できない毒性を生じることなく、処置される疾患の症状または徴候を改善するのに十分であるべきである。一般的に、化合物の有効量は、臨床医または他の資格のある観察者が指摘するように、症状の主観的な軽減または客観的に特定可能な改善のいずれかを提供する量である。
【００６１】
本発明の別の実施形態は、細胞内沈着物の蓄積に関連する疾患および／または不完全なオートファジーおよび／または不完全なプロテアソーム活性に関連する疾患の処置における使用のための少なくとも１つの賦形剤または担体とともに、本明細書に記載の一般式（Ｉ）の化合物および少なくとも１つの金属イオンを含む有効量の金属錯体を含む、本明細書に記載の使用のための組成物に関し、前記組成物は、必要に応じて、少なくとも第２の活性化合物をさらに含む。
【００６２】
前記第２の活性化合物は、細胞内沈着物の蓄積に関連する疾患、および／または不完全なオートファジーおよび／または不完全なプロテアソーム活性に関連する疾患の処置において使用される化合物に対応し、メトホルミン、核酸、抗体、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、抗酸化剤、ポリフェノール化合物、ドーパミン作動性阻害剤、コリンエステラーゼ阻害剤、リルゾール、クルクミン、および細胞治療薬を含むが、これらに限定されない。
【００６３】
したがって、本発明の実施形態は、本明細書で上述のような使用のための組成物を指し、ここで、第２の活性成分は、メトホルミン、核酸、抗体、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、抗酸化剤、ポリフェノール化合物、ドーパミン作動性阻害剤、コリンエステラーゼ阻害剤、リルゾールまたはクルクミンから独立して選択される。
【００６４】
本発明の一実施形態において、前記組成物は、少なくとも１つの賦形剤または担体とともに、本明細書で上述した一般式（Ｉ）の化合物および少なくとも１つの金属イオンを含む有効量の金属錯体を含み、前記金属イオンは二価イオンである。より好ましくは、前記二価金属イオンは、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｚｎ（ＩＩ）またはＭｎ（ＩＩ）から選択される。
【００６５】
本発明の別の実施形態は、本明細書で上述のような使用のために、本明細書で上述したような一般式（Ｉ）の化合物および少なくとも１つの金属イオンを含む有効量の金属錯体、ならびに少なくとも１つの賦形剤または担体を含む組成物を開示し、ここで、前記金属錯体は金属錯体（ＩＩ）である。
【００６６】
本発明の別の実施形態は、細胞内沈着物の蓄積に関連する疾患および／または不完全なオートファジーおよび／または不完全なプロテアソーム活性に関連する疾患の処置において使用するための、本明細書に上記の組成物を開示し、前記疾患は加齢性疾患である。
【００６７】
本発明の一実施形態は、細胞内沈着物の蓄積を示す疾患の処置において使用するための、本明細書で上述したような組成物を開示する。好ましい実施形態において、前記疾患は、ラフォラ病、副腎白質ジストロフィーまたはハンチントン病から選択され、より好ましくは、ラフォラ病またはハンチントン病から選択される。
【００６８】
本発明の別の実施形態は、細胞内沈着物の蓄積に関連する疾患、および／または不完全なオートファジーおよび／または不完全なプロテアソーム活性に関連する疾患の処置における使用のための、少なくとも１つの賦形剤または担体とともに、本明細書で上述した一般式（Ｉ）の化合物および少なくとも１つの金属イオンを含む有効量の金属錯体を含む組成物を開示し、前記疾患は、ラフォラ病またはハンチントン病から独立して選択される。
【００６９】
一実施形態は、細胞内沈着物の蓄積に関連する疾患および／または不完全なあるオートファジーおよび／または不完全なプロテアソーム活性に関連する疾患の処置のための薬剤の製造における、本明細書で上述した一般式（Ｉ）の化合物および少なくとも１つの金属イオンを含む金属錯体の使用を開示する。好ましくは、前記金属イオンは、二価イオンであり、より好ましくは、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｚｎ（ＩＩ）またはＭｎ（ＩＩ）から独立して選択される。
【００７０】
別の実施形態は、細胞内沈着物の蓄積に関連する疾患、および／または不完全なオートファジーおよび／または不完全なプロテアソーム活性に関連する疾患の処置のための薬剤の製造において、本明細書で上述した一般式（Ｉ）の化合物および少なくとも１つの金属イオンを含む金属錯体の使用を開示し、前記金属錯体は金属錯体（ＩＩ）である。
【００７１】
開示される本発明の一実施形態は、本明細書で上述した一般式（Ｉ）の化合物および少なくとも１つの金属イオンを含む有効量の金属錯体を、細胞内沈着物の蓄積を示す疾患および／または不完全なオートファジーおよび／または不完全なプロテアソーム活性に関連する疾患に罹患している個体に投与する工程を含む、処置の方法を提供する。好ましくは、前記金属イオンは二価イオンであり、より好ましくは、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｚｎ（ＩＩ）またはＭｎ（ＩＩ）から独立して選択される。
【００７２】
開示される一実施形態は、本明細書で上述した一般式（Ｉ）の化合物および少なくとも１つの金属イオンを含む有効量の金属錯体を、細胞内沈着物の蓄積に関連する疾患および／または不完全なオートファジーおよび／または不完全なプロテアソーム活性に関連する疾患に罹患している個体に投与する工程を含む処置の方法を提供し、前記金属錯体は金属錯体（ＩＩ）である。
【実施例】
【００７３】
（実施例１：ラフォラ病におけるオートファジー活性化の研究）
健康な個体からの２系統の線維芽細胞（対照Ｃ１およびＣ２）およびラフォラ病患者からの３系統の線維芽細胞（Ｌ１およびＬ２ラフォリン欠損、Ｍ１マリン欠損）をテストした。
【００７４】
すべての細胞株を、Ｃｅｎｔｒｏ  ｄｅ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｃｉｏｎ  Ｐｒｉｎｃｉｐｅ  Ｆｅｌｉｐｅ（ＣＩＰ  Ｆ））コレクションから入手した。ラフォリンを欠くラフォラ患者から使用されたすべての細胞株［Ａｇｕａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０、Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９，２８６７−２８７６；Ｋｎｅｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０、Ａｕｔｏｐｈａｇｙ，９９１−９９３］ｏｒ  ｍａｌｉｎ［Ｃｒｉａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｈｕｍ。Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２１，１５２１−１５３３；Ｋｎｅｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ８，７０１−７０３］には、オートファジーに欠陥がある。
【００７５】
１．１．ＬＣ３−ＩＩレベルの研究
前述のように、ＬＣ３−ＩＩタンパク質のレベルは、今日ではオートファジー活性の最良のバイオマーカーである。
【００７６】
以前に記載されているように［Ｍｏｒｕｎｏ−Ｍａｎｃｈｏｎ  ａｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．４４９，４９７−５０６］、完全培地および絶食培地（すなわち、培地から栄養素を部分的に除去する）中ですべてインキュベートされた上述の細胞株（Ｃ１、Ｃ２、Ｌ１、Ｌ２、Ｍ１、Ａ１、Ａ２およびＡ３）におけるＬＣ３−ＩＩタンパク質のレベルは、ウェスタンブロット分析によって評価された。オートファジーの流れを決定するために、リソソームの分解が、［Ｆｕｅｒｔｅｓ  ａｔ  ａｌ．，２００３ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３７５，７５−８６]に記載のように、（０．２ｍＭのロイペプチンおよび２０ｍＭのＮＨ４Ｃｌを使用して）阻害され、これにより、ＬＣ３−ＩＩタンパク質の蓄積が可能になる。ＬＣ３に対するおよび（電荷対象として使用された）アクチンに対する抗体を使用した。
【００７７】
（結果研究１）
研究１を、細胞株Ｃ１およびＣ２（健康な個体）、Ｌ１、Ｌ２およびＭ１（ラフォラ患者）において、５μＭの金属錯体（ＩＩ）での処理によりおよび処理を行うことなく実施した。
【００７８】
研究を、完全培地および絶食培地を使用して、それぞれのケースで実施した。培地から栄養分を部分的に除去すると、細胞の絶食状態（絶食培地）を模倣し、細胞を刺激してオートファジーを活性化し、内部構造の分解からエネルギーを獲得する。図１に示すように、対照線維芽細胞（細胞株Ｃ１、Ｃ２）、ラフォラ患者からの線維芽細胞（図１Ａの細胞株Ｌ１、Ｌ２およびＭ１、ならびに図１Ｂの細胞株Ｌ３およびＭ１）は、６時間の間に５μＭの濃度で、金属錯体（ＩＩ）で処理した後により高いＬＣ３−ＩＩタンパク質のレベルを有する。したがって、結果は、金属錯体（ＩＩ）で処理した健康な細胞株およびラフォラ患者細胞株の両方でオートファジーの増加を示す。
【００７９】
（結果研究２）
健康なヒト線維芽細胞、またはラフォリン（Ｌ１およびＬ２）およびマリン（Ｍ１）に変異を有するヒト線維芽細胞（３３４９Ｂおよび３３４８Ｄ）におけるＬＣ３−ＩＩのレベルを、１μＭ、５μＭおよび１０μＭ濃度（それぞれ、２、３および４として標識された）金属錯体（ＩＩ）の非存在下（１として標識された）または存在下で試験した。ラパマイシンを陽性対照（５として標識された）として使用した。
【００８０】
図２に示すように、１μＭ、５μＭおよび１０μＭ濃度の金属錯体（ＩＩ）は、ラフォリンおよびマリンを欠くヒト線維芽細胞上の培地に添加された場合、オートファジーの欠陥を改善した。ＬＣ３−ＩＩの量はオートファジー活性化のレベルを示す。
【００８１】
１．２．オートファジー空胞の数の研究
この試験は、金属錯体（ＩＩ）で処理された細胞におけるオートファジーのレベルを決定するために、ＧＦＰ−ＬＣ３蛍光トランスフェクト細胞の研究とともに実施された。健康なヒト線維芽細胞およびラフォラ患者からの線維芽細胞を、６時間の間に０．５μｇのｐＥＧＦＰ−ＬＣ３に一時的にトランスフェクトした。トランスフェクションの約２４時間後、細胞の一部を６時間の間に５μＭの金属錯体（ＩＩ）で処理した。処置の最後の９０分の間に、リソソーム阻害剤（０．２Ｍのロイペプチン＋２０ｍＭのＮＨ４ＣＬ）を添加した。
【００８２】
図１Ｃに示すように、金属錯体（ＩＩ）は、ヒト線維芽細胞（健康なヒト線維芽細胞またはラフォラ病を示すヒト線維芽細胞の両方）において、オートファジー液胞の数を増加させ、それによってオートファジーを増加させた。
【００８３】
（実施例２：プロテアソームのキモトリプシン様活性化）
ヒト皮膚線維芽細胞における金属錯体（ＩＩ）を用いたプロテアソームのキモトリプシン様活性化を示すためのインビトロ研究。結果は、対照に正規化された相対発光単位（ＲＬＵ）で測定される。図３Ｂは、５μＭの濃度での金属錯体（ＩＩ）を用いた処理が、対照の未処理の初代ヒト皮膚線維芽細胞と比較した場合、プロテアソームのキモトリプシン様活性化を、６４．０e１６．０％（Ｐ値＝０．０１０３）刺激することを示す。この研究は、また、トリアザピリジノファン中心構造を含むＭｎ（ＩＩ）錯体である、２Ｑでも行われたが、２Ｑにおけるキノロン複素環は、本明細書に開示される金属錯体におけるように４位によってではなく２位によって、トリアザピリジノファン中心構造に結合されている。図３Ａに示されるように、前記化合物はプロテアソーム活性に対して有意な効果を示さなかった。
【００８４】
以下の表は、金属錯体（ＩＩ）を使用して実施した試験の結果も要約している。
【００８５】
【表１】
2020527536.tif 000006
【００８６】
これは、キノロン部分が４位によってトリアザピリジノファン中心構造に結合される本明細書に開示される金属錯体のみが、細胞内沈着物の蓄積に関連する疾患および／または不完全なオートファジーおよび／または不完全なプロテアソーム活性に関連する疾患の処置において有用であることを確認する。
【００８７】
（実施例３：線虫のハンチントン病モデルにおける応答活性化）
この研究は、金属錯体（ＩＩ）の投与が、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ（線虫）ハンチントン病モデルにおける神経感度（穏やかなタッチ感度）を改善するかどうかを評価するために実施された。
【００８８】
線虫は、神経回路を使用して多様な機械的刺激を検出し、これに応答する。これらの刺激は、身体に送達される優しいタッチ刺激、中間体への厳しいタッチ、頭または尾への厳しいタッチ、鼻のタッチ、およびテクスチャを含む。
【００８９】
穏やかなタッチ感度をテストするために最初にかつ最も一般的に使用される方法は、爪楊枝の端に接着された眉毛で動物を撫でることである（図４）。
【００９０】
機械感覚ニューロン凝集体内で、インフレームで融合され、神経障害を誘発される１１０ＣＡＧを発現している線虫を、使用した。図５Ａは、ＦＬＰ機械感覚ニューロン（丸で囲まれた部分）において１１０Ｑ：：ＴｄＴｏｍａｔｏの発現を示す線虫トランスジェニックワームの頭部の共焦点画像を示す。ライトグレーの組織は、導入遺伝子のマーカー（すなわち、咽頭で発現される緑色蛍光タンパク質（GFP））である。図５Ｂは、１１０Ｑ：：ＴｄＴｏｍａｔｏの凝集体（丸で囲まれた部分）を発現するＦＬＰニューロンを示す共焦点画像を示す。
【００９１】
線虫の神経障害を図５Ｃに示し、ここでは、図４で説明したように、１１０Ｑ：：ＴｄＴｏｍａｔｏを発現する３つの独立した株を、タッチアッセイを使用してテストした。１１０Ｑ：：ＴｄＴｏｍａｔｏを発現するテストされた３つの株はすべて、野生型動物の結果（ＷＴと標識される）と比較する場合、図５Ｃで見られるように、神経障害（タッチ応答を示す個体の％として示されるより低い機械感覚）を示した。
【００９２】
図５Ｄは、金属錯体（ＩＩ）が用量依存的に１１０Ｑ：：ＴｄＴｏｍａｔｏ発現による神経障害を救助する方法を示す。試験を、対照Ｃとして（１１０Ｑ：：ＴｄＴｏｍａｔｏを発現し、したがって神経障害を示す）未処理動物を使用して実行し、２ｍＭのメトホルミンで処理された動物を陽性対照として使用した。結果は、図６に示す３つの実験の繰り返しに基づいている。各試験は、対照として未処理動物を使用して、陽性対照として２ｍＭの濃度で、メトホルミンで処理された動物を使用して、５、１０および２０μＭ濃度の金属錯体（ＩＩ）を用いて（神経障害を示す１１０Ｑ：：ＴｄＴｏｍａｔｏを発現する）動物を処理して行われた。
【００９３】
図７は、金属錯体（ＩＩ）が試験された用量において有意な変化をもたらさない化合物２Ｑに対して、用量依存的に１１０Ｑ：：ＴｄＴｏｍａｔｏ発現による神経障害をどのように救済できるかを示す。試験を、対照Ｃとして（神経障害を示す１１０Ｑ：：ＴｄＴｏｍａｔｏを発現する）未処理動物を使用して実行した。メトホルミンを再び陽性対照として使用した。再び、これらのデータは、キノロン部分が４位によってトリアザピリジノファン）中心構造に結合されている本明細書に開示される金属錯体の選択のみが、細胞内沈着物の蓄積に関連する疾患および／または不完全なオートファジーおよび／または不完全なプロテアソーム活性の処置において有用であることを示す。
【００９４】
最後に、金属錯体（ＩＩ）の処理で示される１１０Ｑ：：ＴｄＴｏｍａｔｏ発現による神経障害の救済が、オートファジーの活性化によって生じるかどうかを試験した。この目的のために、（神経障害を示す１１０Ｑ：：ＴｄＴｏｍａｔｏを発現する）ワーム線虫を、金属錯体（ＩＩ）の存在下で、オートファジーの周知の阻害剤であるクロロキンの存在下および非存在下でインキュベートした。対照として、（神経障害を示す１１０Ｑ：：ＴｄＴｏｍａｔｏを発現する）動物も、クロロキンの存在下および非存在下で、金属錯体（ＩＩ）を用いた処理なしでインキュベートした。図８が示すように、両方の化合物の存在下で培養された動物はもはや救済されず、金属錯体（ＩＩ）の有益な効果はオートファジーによるものであり、他の可能なメカニズムによるものではないことを示唆している。
【００９５】
（実施例４：式（Ｉ）の金属錯体のインビボでの急性毒性）
急性毒性を評価するために、３匹のマウスの４つの群に分けられた合計１２匹のマウスに、インビボで金属錯体（ＩＩ）を投与した。オスおよびメスマウスの体重は、それぞれ２４〜３０ｇおよび１７〜２２ｇであった。金属錯体（ＩＩ）を、リン酸生理食塩水緩衝液（ＰＢＳ）またはＮａＣｌＯ．９％とともに、マウスに経口投与した。
【００９６】
急性毒性実験は、ＰＢＳまたは０．９％の０．９％のＮａＣｌのいずれかにおいて、最大２００ｍｇ／ｋｇの用量で経口投与した試験マウス（オスおよびメス）において死亡も運動活性の低下も示さなかった。
【図１Ａ】
2020527536.tif 000010
【図１Ｂ】
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2020527536.tif 000012
【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
2020527536.tif 000022
2020527536.tif 000023
2020527536.tif 000024