(57)【要約】  遺伝子改変された（ＧＭ）ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびＧＭ  ＮＫ細胞の集団を産生する方法が、本明細書において提供される。例えば、腫瘍細胞の増殖を抑制するため、または病原体感染、例えば、ウイルス感染を阻害するために、本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫ細胞を使用する方法が、さらに本明細書において提供される。ある特定の代替法では、本明細書において提供されるＧＭ  ＮＫ細胞は、ＣＢＬＢ、ＮＫＧ２Ａおよび／もしくはＴＧＦＢＲ２の発現および／もしくは機能を欠き、またはＣＢＬＢ、ＮＫＧ２Ａおよび／もしくはＴＧＦＢＲ２の発現および／もしくは機能の低減を示す。ある特定の代替法では、本明細書において提供されるＧＭ  ＮＫ細胞は、改変されたＣＤ１６を含む。
2020503043.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナチュラルキラー細胞の集団であって、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が、ＮＫ阻害性分子の発現を欠く、またはＮＫ阻害性分子の発現の低減を示すように遺伝子改変されているナチュラルキラー細胞の集団。
【請求項２】
ＮＫ阻害性分子が、ＣＢＬＢ、ＮＫＧ２ＡおよびＴＧＦＢＲ２からなる群から選択される１種または複数のＮＫ阻害性分子である、請求項１に記載の集団。
【請求項３】
遺伝子改変されたＮＫ細胞が、ＮＫ阻害性分子の発現がノックアウトまたは低減されていないＮＫ細胞よりも、腫瘍細胞に対して高い細胞毒性を有する、請求項１または２に記載の集団。
【請求項４】
腫瘍細胞が、多発性骨髄腫細胞、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞、乳癌細胞、頭頸部癌細胞、肉腫細胞、腺管癌細胞、白血病細胞、急性Ｔ細胞白血病細胞、慢性骨髄性リンパ腫細胞、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞、多発性骨髄腫（ＭＭ）、肺癌腫細胞、結腸腺癌細胞、組織球性リンパ腫細胞、結腸直腸癌腫細胞、結腸直腸腺癌細胞および網膜芽細胞腫細胞からなる群から選択される、請求項３に記載の集団。
【請求項５】
腫瘍細胞が、固形腫瘍細胞である、請求項４に記載の集団。
【請求項６】
固形腫瘍細胞が、肝臓腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、膵臓腫瘍細胞、腎腫瘍細胞および多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）細胞からなる群から選択される、請求項５に記載の集団。
【請求項７】
ＮＫ阻害性分子の発現が、ノックアウトされている、請求項１に記載の集団。
【請求項８】
ＮＫ阻害性分子の発現が、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはＴＡＬＥＮヌクレアーゼによってノックアウトされている、請求項７に記載の集団。
【請求項９】
ＮＫ阻害性分子の発現が、ＣＲＩＳＰＲ関連技術によってノックアウトされている、請求項７に記載の集団。
【請求項１０】
ＮＫ阻害性分子がＣＢＬＢである、請求項１または２に記載の集団。
【請求項１１】
ＣＢＬＢ発現のノックアウトが、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも、ＩＣＡＭ−１およびＭＩＣＡを用いて刺激された場合に、高いＩＦＮγ分泌を有するＮＫ細胞の集団を生成する、請求項７から１０のいずれか一項に記載の集団。
【請求項１２】
ＣＢＬＢ発現のノックアウトが、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも、ＩＣＡＭ−１およびＭＩＣＡを用いて刺激された場合に、高い脱顆粒を有するＮＫ細胞の集団を生成する、請求項７から１０のいずれか一項に記載の集団。
【請求項１３】
脱顆粒が、ＣＤ１０７ａの増大によって測定される、請求項１２に記載の集団。
【請求項１４】
ＣＢＬＢ発現のノックアウトが、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞と比較して、多発性骨髄腫細胞と同時培養された場合に、ＧＭ−ＣＳＦ、可溶性ＣＤ１３７（ｓＣＤ１３７）、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＴＮＦαおよびパーフォリンのうち１種または複数の分泌の変化を有するＮＫ細胞の集団を生成する、請求項７から１０のいずれか一項に記載の集団。
【請求項１５】
ＮＫ阻害性分子がＮＫＧ２Ａである、請求項１または２に記載の集団。
【請求項１６】
ＮＫＧ２Ａ発現のノックアウトが、ＮＫＧ２ＡがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも、ＮＫＧ２Ａアゴニスト抗体の存在下で、ＩＣＡＭ−１およびＭＩＣＡを用いて刺激された場合に、高い脱顆粒を有するＮＫ細胞の集団を生成する、請求項１５から１９のいずれか一項に記載の集団。
【請求項１７】
脱顆粒が、ＣＤ１０７ａの増大によって測定される、請求項１６に記載の集団。
【請求項１８】
ＮＫＧ２Ａ発現のノックアウトが、ＮＫＧ２ＡがノックアウトされていないＮＫ細胞と比較して、ＧＭ−ＣＳＦ、可溶性ＣＤ１３７（ｓＣＤ１３７）、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＴＮＦαおよび／またはパーフォリンのうち１種または複数の分泌の変化を有するＮＫ細胞の集団を生成する、請求項１６または１７に記載の集団。
【請求項１９】
ＮＫ阻害性分子がＴＧＦＢＲ２である、請求項１または２に記載の集団。
【請求項２０】
ＴＧＦＢＲ２発現のノックアウトが、ＴＧＦＢＲ２がノックアウトされていないＮＫ細胞と比較して、腫瘍細胞に対するＮＫ細胞の細胞毒性のＴＧＦβ媒介性阻害に対する耐性を有するＮＫ細胞の集団を生成する、請求項１９に記載の集団。
【請求項２１】
ナチュラルキラー細胞の集団であって、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が、改変されたＣＤ１６を含むように遺伝子改変されているナチュラルキラー細胞の集団。
【請求項２２】
改変されたＣＤ１６が、野生型ＣＤ１６よりもＩｇＧに対して高い親和性を有する、請求項２１に記載の集団。
【請求項２３】
改変されたＣＤ１６が、ＣＤ１６ａの位置１５８にバリンを有する、請求項２２に記載の集団。
【請求項２４】
改変されたＣＤ１６が、ＡＤＡＭ１７切断に対して耐性である、請求項２１に記載の集団。
【請求項２５】
改変されたＣＤ１６が、ＣＤ１６ａの位置１９７にプロリンを有する、請求項２４に記載の集団。
【請求項２６】
改変されたＣＤ１６が、ＩｇＫシグナルペプチドを含有する、請求項２１から２５のいずれか一項に記載の集団。
【請求項２７】
改変されたＣＤ１６が、ＣＤ１６シグナルペプチドを含有する、請求項２１から２６のいずれか一項に記載の集団。
【請求項２８】
改変されたＣＤ１６が、ウイルス感染を介してＮＫ細胞に導入される、請求項２１から２７のいずれか一項に記載の集団。
【請求項２９】
改変されたＣＤ１６が、ウイルス感染を介して造血細胞に導入され、次いで造血細胞がＮＫ細胞に分化する、請求項２８に記載の集団。
【請求項３０】
改変されたＣＤ１６が、レンチウイルスベクターを介して導入される、請求項２８から２９に記載の集団。
【請求項３１】
レンチウイルスベクターが、ＣＭＶまたはＥＦ１αプロモーターのいずれかを有する、請求項３０に記載の集団。
【請求項３２】
レンチウイルスベクターが、１種または複数の薬物選択マーカーを含む、請求項３０または３１に記載の集団。
【請求項３３】
改変されたＣＤ１６が、レトロウイルスベクターを介して導入される、請求項２８または２９に記載の集団。
【請求項３４】
レトロウイルスベクターが、１種または複数の薬物選択マーカーを含む、請求項３３に記載の集団。
【請求項３５】
ＮＫ細胞が、胎盤由来（ＰＮＫ細胞）である、請求項１から３４のいずれか一項に記載の集団。
【請求項３６】
腫瘍細胞の増殖を抑制する方法であって、腫瘍細胞を、請求項１から３５または５５から５９のいずれか一項に記載の集団に由来するナチュラルキラー細胞と接触させることを含む方法。
【請求項３７】
前記接触が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで起こる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記接触が、ｉｎ  ｖｉｖｏで起こる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記接触が、ヒト個体、好ましくは、抗癌療法を受けるように選択された個体において起こる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ナチュラルキラー細胞を前記個体に投与することを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記腫瘍細胞が、多発性骨髄腫細胞である、請求項３６から４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
前記腫瘍細胞が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞である、請求項３６から４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
前記個体が、再発性／難治性ＡＭＬを有する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記個体が、ＡＭＬに対する少なくとも１種の非自然リンパ球系細胞（ＩＬＣ）治療が失敗しているＡＭＬを有する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記個体が、６５歳以上であり、最初の寛解中である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
前記個体が、前記ナチュラルキラー細胞を投与する前にフルダラビン、シタラビンまたは両方を用いてコンディショニングされている、請求項４０から４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
腫瘍細胞が、多発性骨髄腫細胞、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞、乳癌細胞、頭頸部癌細胞、肉腫細胞、腺管癌細胞、白血病細胞、急性Ｔ細胞白血病細胞、慢性骨髄性リンパ腫細胞、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞、多発性骨髄腫（ＭＭ）、肺癌腫細胞、結腸腺癌細胞、組織球性リンパ腫細胞、結腸直腸癌腫細胞、結腸直腸腺癌細胞および網膜芽細胞腫細胞からなる群から選択される、請求項４０から４６のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
腫瘍細胞が、固形腫瘍細胞である、請求項４０から４７のいずれかに記載の集団。
【請求項４９】
固形腫瘍細胞が、肝臓腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、膵臓腫瘍細胞、腎腫瘍細胞および多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）細胞からなる群から選択される、請求項４８に記載の集団。前記ナチュラルキラー細胞が、抗ＣＤ３３抗体とともに投与される、請求項４０から４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記ナチュラルキラー細胞が、抗ＣＤ２０抗体とともに投与される、請求項４０から４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記ナチュラルキラー細胞が、抗ＣＤ１３８抗体とともに投与される、請求項４０から４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記ナチュラルキラー細胞が、抗ＣＤ３８抗体とともに投与される、請求項４０から４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記ナチュラルキラー細胞が、前記接触または前記投与に先立って凍結保存されている、請求項３６から５３のいずれかに記載の方法。
【請求項５４】
前記ナチュラルキラー細胞が、前記接触または前記投与に先立って凍結保存されていない、請求項３６から５３のいずれかに記載の方法。
【請求項５５】
ナチュラルキラー細胞が、ＣＤ５６＋ＣＤ３−ＣＤ１１７＋ＣＤ１１ａ＋であり、パーフォリンおよび／またはＥＯＭＥＳを発現し、ＲＯＲγｔ、アリール炭化水素受容体およびＩＬ１Ｒ１のうち１種または複数を発現しない、請求項１から５４のいずれか一項に記載の集団。
【請求項５６】
前記ナチュラルキラー細胞が、パーフォリンおよびＥＯＭＥＳを発現し、ＲＯＲγｔ、アリール炭化水素受容体またはＩＬ１Ｒ１のいずれも発現しない、請求項５５に記載の集団。
【請求項５７】
前記ナチュラルキラー細胞が、Ｔ−ｂｅｔ、ＧＺＭＢ、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０および／またはＮＫＧ２Ｄをさらに発現する、請求項５５または５６に記載の集団。
【請求項５８】
前記ナチュラルキラー細胞が、ＣＤ９４を発現する、請求項５５から５７のいずれか一項に記載の集団。
【請求項５９】
前記ナチュラルキラー細胞が、ＣＤ９４を発現しない、請求項５５から５７のいずれか一項に記載の集団。
【請求項６０】
胎盤またはその一部に由来し、それによって胎盤由来ＮＫ細胞（ｐＮＫ細胞）を含むナチュラルキラー細胞の集団であって、ｐＮＫ細胞が、ＮＫ阻害性分子の発現を欠く、またはＮＫ阻害性分子の発現の低減を示すように遺伝子改変されているナチュラルキラー細胞の集団。
【請求項６１】
ＮＫ阻害性分子が、ＣＢＬＢ、ＮＫＧ２ＡおよびＴＧＦＢＲ２からなる群から選択される１種または複数のＮＫ阻害性分子である、請求項６０に記載の集団。
【請求項６２】
遺伝子改変されたＮＫ細胞が、ＮＫ阻害性分子の発現がノックアウトまたは低減されていないＮＫ細胞よりも、腫瘍細胞に対して高い細胞毒性を有する、請求項６０または６１に記載の集団。
【請求項６３】
腫瘍細胞が、多発性骨髄腫細胞、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞、乳癌細胞、頭頸部癌細胞、肉腫細胞、腺管癌細胞、白血病細胞、急性Ｔ細胞白血病細胞、慢性骨髄性リンパ腫細胞、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞、多発性骨髄腫（ＭＭ）、肺癌腫細胞、結腸腺癌細胞、組織球性リンパ腫細胞、結腸直腸癌腫細胞、結腸直腸腺癌細胞および網膜芽細胞腫細胞からなる群から選択される、請求項６２に記載の集団。
【請求項６４】
腫瘍細胞が、固形腫瘍細胞である、請求項６２に記載の集団。
【請求項６５】
固形腫瘍細胞が、肝臓腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、膵臓腫瘍細胞、腎腫瘍細胞および多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）細胞からなる群から選択される、請求項６４に記載の集団。
【請求項６６】
ＮＫ阻害性分子の発現が、ノックアウトされている、請求項６０に記載の集団。
【請求項６７】
ＮＫ阻害性分子の発現が、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはＴＡＬＥＮヌクレアーゼによってノックアウトされている、請求項６６に記載の集団。
【請求項６８】
ＮＫ阻害性分子の発現が、ＣＲＩＳＰＲ関連技術によってノックアウトされている、請求項６６に記載の集団。
【請求項６９】
ＮＫ阻害性分子が、ＣＢＬＢである、請求項６０または６１に記載の集団。
【請求項７０】
ＣＢＬＢ発現のノックアウトが、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも、ＩＣＡＭ−１およびＭＩＣＡを用いて刺激された場合に、高いＩＦＮγ分泌を有するＮＫ細胞の集団を生成する、請求項６９に記載の集団。
【請求項７１】
ＣＢＬＢ発現のノックアウトが、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも、ＩＣＡＭ−１およびＭＩＣＡを用いて刺激された場合に、高い脱顆粒を有するＮＫ細胞の集団を生成する、請求項６９に記載の集団。
【請求項７２】
脱顆粒が、ＣＤ１０７ａの増大によって測定される、請求項７１に記載の集団。
【請求項７３】
ＣＢＬＢ発現のノックアウトが、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞と比較して、多発性骨髄腫細胞と同時培養された場合に、ＧＭ−ＣＳＦ、可溶性ＣＤ１３７（ｓＣＤ１３７）、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＴＮＦαおよび／またはパーフォリンのうち１種または複数の分泌の変化を有するＮＫ細胞の集団を生成する、請求項６９から７２のいずれか一項に記載の集団。
【請求項７４】
ＮＫ阻害性分子が、ＮＫＧ２Ａである、請求項６０または６１に記載の集団。
【請求項７５】
ＮＫＧ２Ａ発現のノックアウトが、ＮＫＧ２ＡがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも、ＮＫＧ２Ａアゴニスト抗体の存在下で、ＩＣＡＭ−１およびＭＩＣＡを用いて刺激された場合に、高い脱顆粒を有するＮＫ細胞の集団を生成する、請求項７４に記載の集団。
【請求項７６】
脱顆粒が、ＣＤ１０７ａの増大によって測定される、請求項７５に記載の集団。
【請求項７７】
ＣＤ１０７ａの増大が、ＦＡＣｓによって測定される、請求項７６に記載の集団。
【請求項７８】
ＮＫＧ２Ａ発現のノックアウトが、ＮＫＧ２ＡがノックアウトされていないＮＫ細胞、例えば、天然に存在するＮＫ細胞と比較して、ＧＭ−ＣＳＦ、可溶性ＣＤ１３７（ｓＣＤ１３７）、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＴＮＦαおよび／またはパーフォリンのうち１種または複数の分泌の変化を有するＮＫ細胞の集団を生成する、請求項７４から７７のいずれか一項に記載の集団。
【請求項７９】
胎盤由来ナチュラルキラー細胞（ｐＮＫ）の集団であって、ｐＮＫ細胞が、改変されたＣＤ１６を含むように遺伝子改変されている胎盤由来ナチュラルキラー細胞（ｐＮＫ）の集団。
【請求項８０】
改変されたＣＤ１６が、野生型ＣＤ１６よりもＩｇＧに対して高い親和性を有する、請求項７９に記載の集団。
【請求項８１】
改変されたＣＤ１６が、ＣＤ１６ａの位置１５８にバリンを有する、請求項８０に記載の集団。
【請求項８２】
改変されたＣＤ１６が、ＡＤＡＭ１７切断に対して耐性である、請求項７９に記載の集団。
【請求項８３】
ＣＤ１６が、ＣＤ１６ａの位置１９７にプロリンを有する、請求項８２に記載の集団。
【請求項８４】
改変されたＣＤ１６が、ＩｇＫシグナルペプチドまたはＣＤ１６シグナルペプチドを含有する、請求項７９から８３のいずれか一項に記載の集団。
【請求項８５】
改変されたＣＤ１６が、ウイルス感染を介してＮＫ細胞に導入される、請求項７９から８４のいずれか一項に記載の集団。
【請求項８６】
改変されたＣＤ１６が、ウイルス感染を介して造血細胞に導入され、次いで造血細胞がＮＫ細胞に分化する、請求項８５に記載の集団。
【請求項８７】
改変されたＣＤ１６が、レンチウイルスベクターを介して導入される、請求項８５または８６に記載の集団。
【請求項８８】
レンチウイルスベクターが、ＣＭＶまたはＥＦ１αプロモーターのいずれかを有する、請求項８７に記載の集団。
【請求項８９】
レンチウイルスベクターが、１種または複数の薬物選択マーカーを含む、請求項８５または８６に記載の集団。
【請求項９０】
選択マーカーが、ＰｕｒｏＲ遺伝子、ＺｅｏＲ遺伝子、ＨｙｇｒｏＲ遺伝子、ｎｅｏＲ遺伝子および／またはブラストサイジン耐性遺伝子などの選択剤に対する耐性を付与するタンパク質をコードする遺伝子を含む、請求項８９に記載の集団。
【請求項９１】
改変されたＣＤ１６が、レトロウイルスベクターを介して導入される、請求項８５または８６に記載の集団。
【請求項９２】
レトロウイルスベクターが、１種または複数の薬物選択マーカーを含む、請求項９１に記載の集団。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
任意の優先出願の参照による組込み
本願は、２０１６年１２月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／４４０，９０９号の優先権の利益を主張する。前記の出願の全開示内容は、その全文が参照により本明細書に明確に組み込まれる。
【０００２】
Ｉ．分野
遺伝子改変（遺伝子組み換え）された（ＧＭ）ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびＧＭ  ＮＫ細胞を含む細胞集団を産生する方法が、本明細書に記載される。また、例えば、腫瘍細胞の増殖を抑制するため、病原体感染、例えば、細菌感染もしくはウイルス感染を調節するため、または病原体感染、例えば、細菌感染もしくはウイルス感染を阻害するために、ＧＭ  ＮＫ細胞を含むこれらの細胞集団を使用する方法も開示される。ある特定の代替法では、ＧＭ  ＮＫ細胞を含む細胞の集団は、ＣＢＬＢ、ＮＫＧ２Ａおよび／もしくはＴＧＦＢＲ２の発現を欠き、ならびに／またはＣＢＬＢ、ＮＫＧ２Ａおよび／もしくはＴＧＦＢＲ２の発現および／もしくは機能の低減を示す。ある特定の代替法では、細胞集団は、改変されたＣＤ１６を含むＧＭ  ＮＫ細胞を含む。
【背景技術】
【０００３】
ＩＩ．背景
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、自然免疫系の主構成成分を構成する細胞傷害性リンパ球である。
【０００４】
ＮＫ細胞は、インターフェロンまたはマクロファージ由来サイトカインに応答して活性化される。ＮＫ細胞の細胞傷害性活性は、「活性化受容体」または「阻害性受容体」と考えられ得る２種類の表面受容体によって高度に調節されるが、いくつかの受容体、例えば、ＣＤ９４および２Ｂ４（ＣＤ２４４）は、リガンド相互作用に応じていずれかの方法で働く。
【０００５】
ＮＫ細胞は、その他の活性の中でも、腫瘍の宿主拒絶において役割を果たし、ウイルス感染細胞を死滅させることができるとわかっている。ナチュラルキラー細胞は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）タンパク質を欠く、またはその低減したレベルを示す細胞によって活性化され得る。自己クラスＩ  ＭＨＣ発現のレベルが変更されたまたは低減した癌細胞は、ＮＫ細胞感受性の誘導をもたらし得る。末梢血由来の活性化および増殖されたＮＫ細胞、いくつかの場合には、ＬＡＫ細胞は、進行癌を有する患者のｅｘ  ｖｉｖｏ療法およびｉｎ  ｖｉｖｏ治療の両方において使用されており、骨髄関連疾患、例えば、白血病、乳癌および特定の種類のリンパ腫に対して一部成功している。改変ＮＫ細胞を開発するためのさらなるアプローチが必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際特許出願公開ＷＯ２０１６／１０９６６１
【特許文献２】米国特許第８，２６３，０６５号
【特許文献３】米国特許出願公開第２０１１／０２８０８４９号
【特許文献４】米国特許出願公開第２０１５／０３６６９１０号
【特許文献５】米国特許第８，９２６，９６４号
【特許文献６】米国特許出願公開第２０１５／０２２５６９７号
【特許文献７】国際特許公開ＷＯ２０１６／１０９６６８
【特許文献８】米国特許第７，９４８，１７１号
【特許文献９】米国特許第７，４６８，２７６号
【特許文献１０】米国特許第８，０５７，７８８号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）ら、２００５、Ｂｌｏｏｄ  １０５：３０５１−３０５７
【非特許文献２】ルブニッツ（Ｒｕｂｎｉｔｚ）ら、２０１０、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２８：９５５−９５９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ＩＩＩ．概要
遺伝子改変された（ＧＭ）ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、例えば、ヒトＮＫ細胞、ＧＭ  ＮＫ細胞を含む細胞の集団を産生する方法ならびに例えば、腫瘍細胞の増殖を抑制するため、病原体感染（例えば、細菌感染もしくはウイルス感染）を調節するため、または病原体感染、例えば、細菌感染もしくはウイルス感染を阻害するために本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫ細胞またはＧＭ  ＮＫ細胞を含む細胞の集団を使用する方法が、本明細書に記載される。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子の発現を欠く、またはＮＫ阻害性分子の発現の低減を示すように遺伝子改変されているＮＫ細胞の集団が提供される。いくつかの代替法では、ＮＫ細胞は、ＮＫ阻害性分子の発現を調節する、またはＮＫ阻害性分子の発現を阻害するように遺伝子改変されている。例えば、いくつかの代替法では、本明細書において提供される改変されたＮＫ細胞は、ＮＫ阻害性分子の発現レベルに関して改変されていないＮＫ細胞（このような細胞は、ＮＫ阻害性分子の発現以外の点で天然に存在する細胞から改変されていてもよいが、「非改変細胞」と本明細書において呼ばれる）よりも低いレベルで、１種または複数のＮＫ阻害性分子を発現するように遺伝子改変されているＮＫ細胞を含む細胞の集団を含む。ＮＫ阻害性分子のレベルが比較される非改変細胞は、例えば、天然に存在するＮＫ細胞または本明細書に記載されるものなどの方法を使用して得られ、天然に存在しないＮＫ細胞であり得る。ある特定の代替法では、調節された、低減されたまたはヌルレベルで発現されるＮＫ阻害性分子は、ＣＢＬＢ、ＮＫＧ２Ａおよび／またはＴＧＦＢＲ２である。
【００１０】
ある特定の代替法では、ＮＫ細胞において調節された、低減されたまたはヌルレベルで発現されるＮＫ阻害性分子は、ＣＢＬＢである。ある特定の代替法では、ＮＫ細胞におけるＣＢＬＢ発現は、ノックアウトされている。ある特定の代替法では、ＮＫ細胞におけるＣＢＬＢ発現は、ゲノム編集（遺伝子編集）技術によって、例えば、ＣＲＩＳＰＲまたはＣＲＩＳＰＲ関連技術を使用することなどによってノックアウトされている。ある特定の代替法では、ＮＫ細胞におけるＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢの発現を低減もしくは排除するように遺伝子改変されていない天然に存在するＮＫ細胞または天然に存在しないＮＫ細胞であり得る、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも腫瘍細胞に対して高い細胞毒性を有するＮＫ細胞の集団またはＮＫ細胞を含む細胞の集団を生成する。特定の代替法では、腫瘍細胞は、多発性骨髄腫細胞である。特定の代替法では、腫瘍細胞は、ＲＰＭＩ８２２６細胞である。特定の代替法では、腫瘍細胞は、Ｕ２６６細胞である。特定の代替法では、腫瘍細胞は、ＡＲＨ７７細胞である。特定の代替法では、腫瘍細胞は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞である。特定の代替法では、腫瘍細胞は、ＨＬ６０細胞である。特定の代替法では、腫瘍細胞は、ＫＧ１細胞である。ある特定の代替法では、ＮＫ細胞におけるＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢがノックアウトされていない非改変ＮＫ細胞、例えば、天然に存在するＮＫ細胞よりも高いＩＦＮγ分泌を有するＮＫ細胞の集団を生成する。ある特定の代替法では、ＮＫ細胞におけるＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも高い脱顆粒を有するＮＫ細胞の集団を生成する。特定の代替法では、脱顆粒は、ＣＤ１０７ａの増加によって測定される。ある特定の代替法では、ＮＫ細胞におけるＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞と比較して、ＧＭ−ＣＳＦ、可溶性ＣＤ１３７（ｓＣＤ１３７）、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＴＮＦαまたはパーフォリンのうち１種または複数の分泌の変化を有するＮＫ細胞の集団を生成する。ある特定の代替法では、ＮＫ細胞におけるＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞、例えば、天然に存在するＮＫ細胞と比較して、ＧＭ−ＣＳＦ、可溶性ＣＤ１３７（ｓＣＤ１３７）、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＴＮＦαまたはパーフォリンのうち１種または複数の分泌の変化を有するＮＫ細胞の集団を生成する。
【００１１】
ある特定の代替法では、ＮＫ細胞を含む細胞の集団において発現が調節または低減されるＮＫ阻害性分子は、ＮＫＧ２Ａである。ある特定の代替法では、ＮＫＧ２Ａ発現は、ノックアウトされている。ある特定の代替法では、ＮＫＧ２Ａ発現は、ＣＲＩＳＰＲまたはＣＲＩＳＰＲ関連技術によってノックアウトされている。ある特定の代替法では、ＮＫ細胞におけるＮＫＧ２Ａ発現のノックアウトは、ＮＫＧ２ＡがノックアウトされていないＮＫ細胞、例えば、天然に存在するＮＫ細胞よりも腫瘍細胞に対して高い細胞毒性を有するＮＫ細胞を含む細胞の集団を生成する。特定の代替法では、腫瘍細胞は、多発性骨髄腫細胞である。特定の代替法では、腫瘍細胞は、ＲＰＭＩ８２２６細胞である。特定の代替法では、腫瘍細胞は、Ｕ２６６細胞である。特定の代替法では、腫瘍細胞は、ＡＲＨ７７細胞である。ある特定の代替法では、ＮＫ細胞におけるＮＫＧ２Ａ発現のノックアウトは、ＮＫＧ２ＡがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも高いＩＦＮγ分泌を有するＮＫ細胞の集団を生成する。ある特定の代替法では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでアゴニストＮＫＧ２Ａ抗体の存在下でＩＣＡＭ−１およびＭＩＣＡを用いて刺激されたＮＫ細胞から分泌されたＩＦＮγを測定する。ある特定の代替法では、ＮＫ細胞におけるＮＫＧ２Ａ発現のノックアウトは、ＮＫＧ２ＡがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも高い脱顆粒を有するＮＫ細胞の集団を生成する。特定の代替法では、脱顆粒は、ＣＤ１０７ａの増加によって測定される。ある特定の代替法では、ＮＫ細胞におけるＮＫＧ２Ａ発現のノックアウトは、ＮＫＧ２ＡがノックアウトされていないＮＫ細胞と比較して、ＧＭ−ＣＳＦ、可溶性ＣＤ１３７（ｓＣＤ１３７）、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＴＮＦαまたはパーフォリンのうち１種または複数の分泌の変化を有するＮＫ細胞の集団を生成する。本明細書におけるいくつかの代替法では、ＮＫＧ２ＡノックアウトＮＫ細胞は、ＮＫＧ２Ａノックアウトを有さない未処理細胞、例えば、天然に存在するＮＫ細胞と比較して、細胞毒性の最大３倍またはそれより多い増大を有する。
【００１２】
ある特定の代替法では、ＮＫ細胞を含む細胞の集団において発現が調節または低減されるＮＫ阻害性分子は、ＴＧＦＢＲ２である。ある特定の代替法では、ＮＫ細胞を含む細胞の集団においてＴＧＦＢＲ２発現がノックアウトされている。ある特定の代替法では、ＴＧＦＢＲ２発現は、ＣＲＩＳＰＲまたはＣＲＩＳＰＲ関連技術によってノックアウトされている。ある特定の代替法では、ＮＫ細胞におけるＴＧＦＢＲ２発現のノックアウトは、ＴＧＦＢＲ２がノックアウトされていないＮＫ細胞と比較して、腫瘍細胞に対するＮＫ細胞の細胞毒性のＴＧＦβ媒介性阻害に対して耐性である細胞の集団を生成する。特定の代替法では、腫瘍細胞は、多発性骨髄腫細胞である。特定の代替法では、腫瘍細胞は、ＲＰＭＩ８２２６細胞である。特定の代替法では、腫瘍細胞は、Ｋ５６２細胞である。特定の代替法では、腫瘍細胞は、ＨＬ−６０細胞である。
【００１３】
ある特定の代替法では、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が、改変されたＣＤ１６、例えば、改変されたＣＤ１６ａを含むように遺伝子改変されているナチュラルキラー細胞の集団が提供される。ある特定の代替法では、改変されたＣＤ１６は、野生型ＣＤ１６よりもＩｇＧに対して高い親和性を有する、例えば、改変されたＣＤ１６ａは、野生型ＣＤ１６ａよりもＩｇＧに対して高い親和性を有する。ある特定の代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＣＤ１６ａの位置１５８にバリンを有する。ある特定の代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＡＤＡＭ１７切断に対して耐性である。ある特定の代替法では、ＣＤ１６は、ＣＤ１６ａの位置１９７にプロリンを有する。ある特定の代替法では、改変されたＣＤ１６は、配列番号１に示されるアミノ酸配列（ＭＷＱＬＬＬＰＴＡＬＬＬＬＶＳＡＧＭＲＴＥＤＬＰＫＡＶＶＦＬＥＰＱＷＹＲＶＬＥＫＤＳＶＴＬＫＣＱＧＡＹＳＰＥＤＮＳＴＱＷＦＨＮＥＳＬＩＳＳＱＡＳＳＹＦＩＤＡＡＴＶＤＤＳＧＥＹＲＣＱＴＮＬＳＴＬＳＤＰＶＱＬＥＶＨＩＧＷＬＬＬＱＡＰＲＷＶＦＫＥＥＤＰＩＨＬＲＣＨＳＷＫＮＴＡＬＨＫＶＴＹＬＱＮＧＫＧＲＫＹＦＨＨＮＳＤＦＹＩＰＫＡＴＬＫＤＳＧＳＹＦＣＲＧＬＶＧＳＫＮＶＳＳＥＴＶＮＩＴＩＴＱＧＬＡＶＰＴＩＳＳＦＦＰＰＧＹＱＶＳＦＣＬＶＭＶＬＬＦＡＶＤＴＧＬＹＦＳＶＫＴＮＩＲＳＳＴＲＤＷＫＤＨＫＦＫＷＲＫＤＰＱＤＫ；配列番号１）を有する。ある特定の代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＩｇＫシグナルペプチドを含有する。ある特定の代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＣＤ１６シグナルペプチドを含む。ある特定の代替法では、改変されたＣＤ１６は、ウイルス感染を介してＮＫ細胞に導入される。ある特定の代替法では、改変されたＣＤ１６は、ウイルス感染を介して造血細胞に導入され、次いで造血細胞はＮＫ細胞に分化する。ある特定の代替法では、改変されたＣＤ１６は、レンチウイルスベクターを介して導入される。ある特定の代替法では、レンチウイルスベクターは、ＣＭＶまたはＥＦ１αプロモーターのいずれかを有する。ある特定の代替法では、レンチウイルスベクターは、１種または複数の薬物選択マーカーを含む。ある特定の代替法では、改変されたＣＤ１６は、レトロウイルスベクターを介して導入される。ある特定の代替法では、レトロウイルスベクターは、１種または複数の薬物選択マーカーを含む。
【００１４】
腫瘍細胞を、本明細書に記載されるように調製された、遺伝子改変されたナチュラルキラー細胞の１種または複数の集団と接触させることを含む、腫瘍細胞の増殖を抑制する方法が本明細書に記載される。ある特定の代替法では、前記接触は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで起こる。ある特定の代替法では、前記接触は、ｉｎ  ｖｉｖｏで起こる。ある特定の代替法では、前記接触は、ヒト個体において起こる。ある特定の代替法では、ヒト個体は、癌療法を必要とするものとして選択または同定される。ある特定の代替法では、前記方法は、前記ナチュラルキラー細胞を前記の選択または同定された個体に投与することを含む。ある特定の代替法では、前記腫瘍細胞は、多発性骨髄腫細胞である。ある特定の代替法では、前記腫瘍細胞は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞である。ある特定の代替法では、前記個体は、再発性／難治性ＡＭＬを有する。ある特定の代替法では、前記個体は、ＡＭＬに対する少なくとも１種の非自然リンパ球系細胞（ＩＬＣ）治療が失敗しているＡＭＬを有する。ある特定の代替法では、前記個体は、６５歳以上であり、最初の寛解中である。ある特定の代替法では、前記個体は、前記ナチュラルキラー細胞を投与する前にフルダラビン、シタラビンまたは両方を用いてコンディショニングされている。ある特定の代替法では、前記腫瘍細胞は、乳癌細胞、頭頸部癌細胞または肉腫細胞である。ある特定の代替法では、前記腫瘍細胞は、原発性腺管癌細胞、白血病細胞、急性Ｔ細胞白血病細胞、慢性骨髄性リンパ腫（ＣＭＬ）細胞、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞、多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞、肺癌腫細胞、結腸腺癌細胞、組織球性リンパ腫細胞、結腸直腸癌腫細胞、結腸直腸腺癌細胞および／または網膜芽細胞腫細胞である。ある特定の代替法では、前記腫瘍細胞は、固形腫瘍細胞である。ある特定の代替法では、前記腫瘍細胞は、肝臓腫瘍細胞である。ある特定の代替法では、前記腫瘍細胞は、肺腫瘍細胞である。ある特定の代替法では、前記腫瘍細胞は、膵臓腫瘍細胞である。ある特定の代替法では、前記腫瘍細胞は、腎腫瘍細胞である。ある特定の代替法では、前記腫瘍細胞は、多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）細胞である。
【００１５】
ある特定の代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、抗ＣＤ３３抗体と併せて投与される。ある特定の代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、抗ＣＤ２０抗体と併せて投与される。ある特定の代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、抗ＣＤ１３８抗体と併せて投与される。ある特定の代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、抗ＣＤ３８抗体と併せて投与される。ある特定の代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、抗ＣＤ３２抗体と併せて投与される。
【００１６】
ある特定の代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、前記接触または前記投与に先立って凍結保存されている。ある特定の代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、前記接触または前記投与に先立って凍結保存されていない。
【００１７】
ある特定の代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、ＣＤ５６＋ＣＤ３−ＣＤ１１７＋ＣＤ１１ａ＋であり、パーフォリンおよび／またはＥＯＭＥＳを発現し、ＲＯＲγｔ、アリール炭化水素受容体および／またはＩＬ１Ｒ１のうち１種または複数を発現しない。ある特定の代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、パーフォリンおよび／またはＥＯＭＥＳを発現し、ＲＯＲγｔ、アリール炭化水素受容体および／またはＩＬ１Ｒ１のいずれも発現しない。ある特定の代替法では、前記ナチュラルキラー細胞はさらに、Ｔ−ｂｅｔ、ＧＺＭＢ、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０および／またはＮＫＧ２Ｄを発現する。ある特定の代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、ＣＤ９４を発現する。ある特定の代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、ＣＤ９４を発現しない。
【００１８】
第１の態様において、ナチュラルキラー細胞の集団であって、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が、ＮＫ阻害性分子の発現を欠く、またはＮＫ阻害性分子の発現の低減を示すように遺伝子改変されているナチュラルキラー細胞の集団が提供される。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子は、ＣＢＬＢ、ＮＫＧ２ＡおよびＴＧＦＢＲ２からなる群から選択される１種または複数のＮＫ阻害性分子である。いくつかの代替法では、遺伝子改変されたＮＫ細胞は、ＮＫ阻害性分子の発現がノックアウトされていないまたは低減されていないＮＫ細胞よりも、腫瘍細胞に対して高い細胞毒性を有する。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、多発性骨髄腫細胞、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞、乳癌細胞、頭頸部癌細胞、肉腫細胞、腺管癌細胞、白血病細胞、急性Ｔ細胞白血病細胞、慢性骨髄性リンパ腫細胞、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞、多発性骨髄腫（ＭＭ）、肺癌腫細胞、結腸腺癌細胞、組織球性リンパ腫細胞、結腸直腸癌腫細胞、結腸直腸腺癌細胞および網膜芽細胞腫細胞からなる群から選択される。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、固形腫瘍細胞である。いくつかの代替法では、固形腫瘍細胞は、肝臓腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、膵臓腫瘍細胞、腎腫瘍細胞および多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）細胞からなる群から選択される。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子の発現は、ノックアウトされている。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子の発現は、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはＴＡＬＥＮヌクレアーゼによってノックアウトされている。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子の発現は、ＣＲＩＳＰＲ関連技術によってノックアウトされている。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子は、ＣＢＬＢである。いくつかの代替法では、ＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも、ＩＣＡＭ−１およびＭＩＣＡを用いて刺激された場合に、高いＩＦＮγ分泌を有するＮＫ細胞の集団を生成する。いくつかの代替法では、ＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも、ＩＣＡＭ−１およびＭＩＣＡを用いて刺激された場合に、高い脱顆粒を有するＮＫ細胞の集団を生成する。いくつかの代替法では、脱顆粒は、ＣＤ１０７ａの増大によって測定される。いくつかの代替法では、ＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞と比較して、多発性骨髄腫細胞と同時培養された場合に、ＧＭ−ＣＳＦ、可溶性ＣＤ１３７（ｓＣＤ１３７）、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＴＮＦαおよびパーフォリンのうち１種または複数の分泌の変化を有するＮＫ細胞の集団を生成する。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子は、ＮＫＧ２Ａである。いくつかの代替法では、ＮＫＧ２Ａ発現のノックアウトは、ＮＫＧ２ＡがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも、ＮＫＧ２Ａアゴニスト抗体の存在下で、ＩＣＡＭ−１およびＭＩＣＡを用いて刺激された場合に、高い脱顆粒を有するＮＫ細胞の集団を生成する。いくつかの代替法では、脱顆粒は、ＣＤ１０７ａの増大によって測定される。いくつかの代替法では、ＮＫＧ２Ａ発現のノックアウトは、ＮＫＧ２Ａがノックアウト��れていないＮＫ細胞と比較して、ＧＭ−ＣＳＦ、可溶性ＣＤ１３７（ｓＣＤ１３７）、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＴＮＦαおよび／またはパーフォリンのうち１種または複数の分泌の変化を有するＮＫ細胞の集団を生成する。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子は、ＴＧＦＢＲ２である。いくつかの代替法では、ＴＧＦＢＲ２発現のノックアウトは、ＴＧＦＢＲ２がノックアウトされていないＮＫ細胞と比較して、腫瘍細胞に対するＮＫ細胞の細胞毒性のＴＧＦβ媒介性阻害に対する耐性を有するＮＫ細胞の集団を生成する。いくつかの代替法では、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、改変されたＣＤ１６を含むように遺伝子改変されている。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、野生型ＣＤ１６よりもＩｇＧに対して高い親和性を有する。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＣＤ１６ａの位置１５８にバリンを有する。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＡＤＡＭ１７切断に対して耐性である。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＣＤ１６ａの位置１９７にプロリンを有する。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＩｇＫシグナルペプチドを含有する。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＣＤ１６シグナルペプチドを含有する。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ウイルス感染を介してＮＫ細胞中に導入される。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ウイルス感染を介して造血細胞中に導入され、造血細胞は、次いで、ＮＫ細胞に分化する。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、レンチウイルスベクターを介して導入される。いくつかの代替法では、レンチウイルスベクターは、ＣＭＶまたはＥＦ１ａプロモーターのいずれかを有する。いくつかの代替法では、レンチウイルスベクターは、１種または複数の薬物選択マーカーを含む。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、レトロウイルスベクターを介して導入される。いくつかの代替法では、レトロウイルスベクターは、１種または複数の薬物選択マーカーを含む。いくつかの代替法では、ＮＫ細胞は、胎盤由来（ＰＮＫ細胞）である。いくつかの代替法では、ナチュラルキラー細胞は、ＣＤ５６＋ＣＤ３−ＣＤ１１７＋ＣＤ１１ａ＋であり、パーフォリンおよび／またはＥＯＭＥＳを発現し、ＲＯＲγｔ、アリール炭化水素受容体およびＩＬ１Ｒ１のうち１種または複数を発現しない。いくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、パーフォリンおよびＥＯＭＥＳを発現し、ＲＯＲγｔ、アリール炭化水素受容体またはＩＬ１Ｒ１のいずれも発現しない。いくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、Ｔ−ｂｅｔ、ＧＺＭＢ、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０および／またはＮＫＧ２Ｄをさらに発現する。いくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、ＣＤ９４を発現する。いくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、ＣＤ９４を発現しない。
【００１９】
第２の態様において、腫瘍細胞の増殖を抑制する方法であって、腫瘍細胞を、本明細書におけるナチュラルキラー細胞の代替集団のいずれか１つの集団に由来するナチュラルキラー細胞と接触させることを含む方法が提供される。いくつかの代替法では、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が、ＮＫ阻害性分子の発現を欠く、またはＮＫ阻害性分子の発現の低減を示すように遺伝子改変されているナチュラルキラー細胞の集団が提供される。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子は、ＣＢＬＢ、ＮＫＧ２ＡおよびＴＧＦＢＲ２からなる群から選択される１種または複数のＮＫ阻害性分子である。いくつかの代替法では、遺伝子改変されたＮＫ細胞は、ＮＫ阻害性分子の発現がノックアウトまたは低減されていないＮＫ細胞よりも、腫瘍細胞に対して高い細胞毒性を有する。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、多発性骨髄腫細胞、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞、乳癌細胞、頭頸部癌細胞、肉腫細胞、腺管癌細胞、白血病細胞、急性Ｔ細胞白血病細胞、慢性骨髄性リンパ腫細胞、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞、多発性骨髄腫（ＭＭ）、肺癌腫細胞、結腸腺癌細胞、組織球性リンパ腫細胞、結腸直腸癌腫細胞、結腸直腸腺癌細胞および網膜芽細胞腫細胞からなる群から選択される。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、固形腫瘍細胞である。いくつかの代替法では、固形腫瘍細胞は、肝臓腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、膵臓腫瘍細胞、腎腫瘍細胞および多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）細胞からなる群から選択される。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子の発現は、ノックアウトされている。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子の発現は、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはＴＡＬＥＮヌクレアーゼによってノックアウトされている。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子の発現は、ＣＲＩＳＰＲ関連技術によってノックアウトされている。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子は、ＣＢＬＢである。いくつかの代替法では、ＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも、ＩＣＡＭ−１およびＭＩＣＡを用いて刺激された場合に、高いＩＦＮγ分泌を有するＮＫ細胞の集団を生成する。いくつかの代替法では、ＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも、ＩＣＡＭ−１およびＭＩＣＡを用いて刺激された場合に、高い脱顆粒を有するＮＫ細胞の集団を生成する。いくつかの代替法では、脱顆粒は、ＣＤ１０７ａの増大によって測定される。いくつかの代替法では、ＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞と比較して、多発性骨髄腫細胞と同時培養された場合に、ＧＭ−ＣＳＦ、可溶性ＣＤ１３７（ｓＣＤ１３７）、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＴＮＦαおよびパーフォリンのうち１種または複数の分泌の変化を有するＮＫ細胞の集団を生成する。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子は、ＮＫＧ２Ａである。いくつかの代替法では、ＮＫＧ２Ａ発現のノックアウトは、ＮＫＧ２ＡがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも、ＮＫＧ２Ａアゴニスト抗体の存在下でＩＣＡＭ−１およびＭＩＣＡを用いて刺激された場合に、高い脱顆粒を有するＮＫ細胞の集団を��成する。いくつかの代替法では、脱顆粒は、ＣＤ１０７ａの増大によって測定される。いくつかの代替法では、ＮＫＧ２Ａ発現のノックアウトは、ＮＫＧ２ＡがノックアウトされていないＮＫ細胞と比較して、ＧＭ−ＣＳＦ、可溶性ＣＤ１３７（ｓＣＤ１３７）、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＴＮＦαおよび／またはパーフォリンのうち１種または複数の分泌の変化を有するＮＫ細胞の集団を生成する。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子は、ＴＧＦＢＲ２である。いくつかの代替法では、ＴＧＦＢＲ２発現のノックアウトは、ＴＧＦＢＲ２がノックアウトされていないＮＫ細胞と比較して、腫瘍細胞に対するＮＫ細胞の細胞毒性のＴＧＦβ媒介性阻害に対する耐性を有するＮＫ細胞の集団を生成する。いくつかの代替法では、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、改変されたＣＤ１６を含むように遺伝子改変されている。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、野生型ＣＤ１６よりもＩｇＧに対して高い親和性を有する。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＣＤ１６ａの位置１５８にバリンを有する。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＡＤＡＭ１７切断に対して耐性である。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＣＤ１６ａの位置１９７にプロリンを有する。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＩｇＫシグナルペプチドを含有する。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＣＤ１６シグナルペプチドを含有する。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ウイルス感染を介してＮＫ細胞に導入される。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ウイルス感染を介して造血細胞に導入され、次いで造血細胞はＮＫ細胞に分化する。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、レンチウイルスベクターを介して導入される。いくつかの代替法では、レンチウイルスベクターは、ＣＭＶまたはＥＦ１αプロモーターのいずれかを有する。いくつかの代替法では、レンチウイルスベクターは、１種または複数の薬物選択マーカーを含む。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、レトロウイルスベクターを介して導入される。いくつかの代替法では、レトロウイルスベクターは、１種または複数の薬物選択マーカーを含む。いくつかの代替法では、ＮＫ細胞は、胎盤由来（ＰＮＫ細胞）である。いくつかの代替法では、ナチュラルキラー細胞は、ＣＤ５６＋ＣＤ３−ＣＤ１１７＋ＣＤ１１ａ＋であり、パーフォリンおよび／またはＥＯＭＥＳを発現し、ＲＯＲγｔ、アリール炭化水素受容体およびＩＬ１Ｒ１のうち１種または複数を発現しない。いくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、パーフォリンおよびＥＯＭＥＳを発現し、ＲＯＲγｔ、アリール炭化水素受容体またはＩＬ１Ｒ１のいずれも発現しない。いくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、Ｔ−ｂｅｔ、ＧＺＭＢ、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０および／またはＮＫＧ２Ｄをさらに発現する。いくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、ＣＤ９４を発現する。いくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、ＣＤ９４を発現しない。方法のいくつかの代替法では、前記接触は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで起こる。方法のいくつかの代替法では、前��接触は、ｉｎ  ｖｉｖｏで起こる。方法のいくつかの代替法では、前記接触は、ヒト個体、好ましくは、抗癌療法を受けるように選択された個体において起こる。方法のいくつかの代替法では、前記方法は、前記ナチュラルキラー細胞を前記個体に投与することを含む。方法のいくつかの代替法では、前記腫瘍細胞は、多発性骨髄腫細胞である。方法のいくつかの代替法では、前記腫瘍細胞は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞である。方法のいくつかの代替法では、前記個体は、再発性／難治性ＡＭＬを有する。方法のいくつかの代替法では、前記個体は、ＡＭＬに対する少なくとも１種の非自然リンパ球系細胞（ＩＬＣ）治療が失敗しているＡＭＬを有する。方法のいくつかの代替法では、前記個体は、６５歳以上であり、最初の寛解中である。方法のいくつかの代替法では、前記個体は、前記ナチュラルキラー細胞を投与する前にフルダラビン、シタラビンまたは両方を用いてコンディショニングされている。方法のいくつかの代替法では、腫瘍細胞は、多発性骨髄腫細胞、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞、乳癌細胞、頭頸部癌細胞、肉腫細胞、腺管癌細胞、白血病細胞、急性Ｔ細胞白血病細胞、慢性骨髄性リンパ腫細胞、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞、多発性骨髄腫（ＭＭ）、肺癌腫細胞、結腸腺癌細胞、組織球性リンパ腫細胞、結腸直腸癌腫細胞、結腸直腸腺癌細胞および網膜芽細胞腫細胞からなる群から選択される。方法のいくつかの代替法では、腫瘍細胞は、固形腫瘍細胞である。方法のいくつかの代替法では、固形腫瘍細胞は、肝臓腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、膵臓腫瘍細胞、腎腫瘍細胞および多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）細胞からなる群から選択される。方法のいくつかの代替法では、ナチュラルキラー細胞は、抗ＣＤ３３抗体とともに投与される。方法のいくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、抗ＣＤ２０抗体とともに投与される。方法のいくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、抗ＣＤ１３８抗体とともに投与される。方法のいくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、抗ＣＤ３８抗体とともに投与される。方法のいくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、前記接触または前記投与に先立って凍結保存されている。方法のいくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、前記接触または前記投与に先立って凍結保存されていない。
【００２０】
第３の態様では、胎盤またはその一部に由来し、それによって胎盤由来ＮＫ細胞（ｐＮＫ細胞）を含むナチュラルキラー細胞の集団であって、ｐＮＫ細胞が、ＮＫ阻害性分子の発現を欠く、またはＮＫ阻害性分子の発現の低減を示すように遺伝子改変されているナチュラルキラー細胞の集団が提供される。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子は、ＣＢＬＢ、ＮＫＧ２ＡおよびＴＧＦＢＲ２からなる群から選択される１種または複数のＮＫ阻害性分子である。いくつかの代替法では、遺伝子改変されたＮＫ細胞は、ＮＫ阻害性分子の発現がノックアウトまたは低減されていないＮＫ細胞よりも、腫瘍細胞に対して高い細胞毒性を有する。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、多発性骨髄腫細胞、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞、乳癌細胞、頭頸部癌細胞、肉腫細胞、腺管癌細胞、白血病細胞、急性Ｔ細胞白血病細胞、慢性骨髄性リンパ腫細胞、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞、多発性骨髄腫（ＭＭ）、肺癌腫細胞、結腸腺癌細胞、組織球性リンパ腫細胞、結腸直腸癌腫細胞、結腸直腸腺癌細胞および網膜芽細胞腫細胞からなる群から選択される。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、固形腫瘍細胞である。いくつかの代替法では、固形腫瘍細胞は、肝臓腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、膵臓腫瘍細胞、腎腫瘍細胞および多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）細胞からなる群から選択される。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子の発現は、ノックアウトされている。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子の発現は、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはＴＡＬＥＮヌクレアーゼによってノックアウトされている。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子の発現は、ＣＲＩＳＰＲ関連技術によってノックアウトされている。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子は、ＣＢＬＢである。いくつかの代替法では、ＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも、ＩＣＡＭ−１およびＭＩＣＡを用いて刺激された場合に、高いＩＦＮγ分泌を有するＮＫ細胞の集団を生成する。いくつかの代替法では、ＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも、ＩＣＡＭ−１およびＭＩＣＡを用いて刺激された場合に、高い脱顆粒を有するＮＫ細胞の集団を生成する。いくつかの代替法では、脱顆粒は、ＣＤ１０７ａの増大によって測定される。いくつかの代替法では、ＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞と比較して、多発性骨髄腫細胞と同時培養された場合に、ＧＭ−ＣＳＦ、可溶性ＣＤ１３７（ｓＣＤ１３７）、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＴＮＦαおよび／またはパーフォリンのうち１種または複数の分泌の変化を有するＮＫ細胞の集団を生成する。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子は、ＮＫＧ２Ａである。いくつかの代替法では、ＮＫＧ２Ａ発現のノックアウトは、ＮＫＧ２ＡがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも、ＮＫＧ２Ａアゴニスト抗体の存在下で、ＩＣＡＭ−１およびＭＩＣＡを用いて刺激された場合に、高い脱顆粒を有するＮＫ細胞の集団を生成する。いくつかの代替法では、脱顆粒は、ＣＤ１０７ａの増大によって測定される。いくつかの代替法では、ＣＤ１��７ａの増大は、ＦＡＣｓによって測定される。いくつかの代替法では、ＮＫＧ２Ａ発現のノックアウトは、ＮＫＧ２ＡがノックアウトされていないＮＫ細胞、例えば、天然に存在するＮＫ細胞と比較して、ＧＭ−ＣＳＦ、可溶性ＣＤ１３７（ｓＣＤ１３７）、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＴＮＦαおよび／またはパーフォリンのうち１種または複数の分泌の変化を有するＮＫ細胞の集団を生成する。
【００２１】
第４の態様では、胎盤由来ナチュラルキラー細胞（ｐＮＫ）の集団であって、ｐＮＫ細胞は、改変されたＣＤ１６を含むように遺伝子改変されている。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、野生型ＣＤ１６よりもＩｇＧに対して高い親和性を有する。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＣＤ１６ａの位置１５８にバリンを有する。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＡＤＡＭ１７切断に対して耐性である。いくつかの代替法では、ＣＤ１６は、ＣＤ１６ａの位置１９７にプロリンを有する。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＩｇＫシグナルペプチドまたはＣＤ１６シグナルペプチドを含有する。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ウイルス感染を介してＮＫ細胞に導入される。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ウイルス感染を介して造血細胞に導入され、次いで造血細胞はＮＫ細胞に分化する。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、レンチウイルスベクターを介して導入される。いくつかの代替法では、レンチウイルスベクターは、ＣＭＶまたはＥＦ１αプロモーターのいずれかを有する。いくつかの代替法では、レンチウイルスベクターは、１種または複数の薬物選択マーカーを含む。いくつかの代替法では、選択マーカーは、ＰｕｒｏＲ遺伝子、ＺｅｏＲ遺伝子、ＨｙｇｒｏＲ遺伝子、ｎｅｏＲ遺伝子および／またはブラストサイジン耐性遺伝子などの選択剤に対する耐性を付与するタンパク質をコードする遺伝子を含む。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、レトロウイルスベクターを介して導入される。いくつかの代替法では、レトロウイルスベクターは、１種または複数の薬物選択マーカーを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
ＩＶ．図面の簡単な説明
【図１Ａ】ＧＭ  ＮＫ細胞におけるＣＢＬＢノックアウト効率を示す図である。
【図１Ｂ】ＧＭ  ＮＫ細胞におけるノックアウト後の増殖倍数を示す図である。
【図２Ａ】２０：１、１０：１および５：１のエフェクター：ターゲット（Ｅ：Ｔ）比における、３４／３５日目のＲＰＭＩ８２２６ならびにＣＢＬＢ−ノックアウト（四角）のＮＫ細胞の細胞毒性（死滅パーセントによって測定されるような）を示す図である。
【図２Ｂ】２０：１、１０：１および５：１のエフェクター：ターゲット（Ｅ：Ｔ）比における、３４／３５日目のＵ２６６ならびにＣＢＬＢ−ノックアウト（四角）のＮＫ細胞の細胞毒性（死滅パーセントによって測定されるような）を示す図である。
【図２Ｃ】２０：１、１０：１および５：１のエフェクター：ターゲット（Ｅ：Ｔ）比における、３４／３５日目のＡＲＨ７７細胞に対する未処理（菱形）ならびにＣＢＬＢ−ノックアウト（四角）のＮＫ細胞の細胞毒性（死滅パーセントによって測定されるような）を示す図である。
【図３Ａ】２０：１、１０：１および５：１のエフェクター：ターゲット（Ｅ：Ｔ）比における、３段階プロセスの３４／３５日目の（３Ａ）ＲＰＭＩ８２２６ならびにＣＢＬＢ−ノックアウト（四角）３段階ＮＫ細胞の相対細胞毒性を示す図である。
【図３Ｂ】２０：１、１０：１および５：１のエフェクター：ターゲット（Ｅ：Ｔ）比における、３段階プロセスの３４／３５日目のＵ２６６ならびにＣＢＬＢ−ノックアウト（四角）３段階ＮＫ細胞の相対細胞毒性を示す図である。
【図３Ｃ】２０：１、１０：１および５：１のエフェクター：ターゲット（Ｅ：Ｔ）比における、３段階プロセスの３４／３５日目のＡＲＨ７７細胞に対する未処理（菱形）ならびにＣＢＬＢ−ノックアウト（四角）３段階ＮＫ細胞の相対細胞毒性を示す図である。
【図４Ａ】ＨＬ−６０細胞に対する未処理（ＮＴ）ならびにＣＢＬＢ−ノックアウト（ＣＢＬＢ  ＫＯ）３段階ＮＫ細胞の相対細胞毒性を示す図である。
【図４Ｂ】ＫＧ１細胞に対する未処理（ＮＴ）ならびにＣＢＬＢ−ノックアウト（ＣＢＬＢ  ＫＯ）３段階ＮＫ細胞の相対細胞毒性を示す図である。
【図５Ａ】１．２５μｇ／ｍｌのＩＣＡＭ−１の存在下で種々の量における主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ関連鎖Ａ（ＭＩＣＡ）刺激の際の、未処理（右）およびＣＢＬＢ−ノックアウト（左）３段階ＮＫ細胞のＩＦＮ−γ分泌アッセイを示す図である。
【図５Ｂ】１．２５μｇ／ｍｌのＩＣＡＭ−１の存在下で種々の量における主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ関連鎖Ａ（ＭＩＣＡ）刺激の際の、未処理（右）およびＣＢＬＢ−ノックアウト（左）３段階ＮＫ細胞のＣＤ１０７ａ／脱顆粒アッセイを示す図である。
【図６Ａ】ＣＢＬＢノックアウト３段階ＮＫ細胞の、ＲＰＭＩ８２２６との同時インキュベーションの間に分泌されたサイトカインのレベルを、未処理３段階ＮＫ細胞によるサイトカイン分泌のパーセンテージとして表す図である。
【図６Ｂ】ＣＢＬＢノックアウト３段階ＮＫ細胞の、Ｕ２６６との同時インキュベーションの間に分泌されたサイトカインのレベルを、未処理３段階ＮＫ細胞によるサイトカイン分泌のパーセンテージとして表す図である。
【図６Ｃ】ＣＢＬＢノックアウト３段階ＮＫ細胞の、ＡＲＨ７７細胞との同時インキュベーションの間に分泌されたサイトカインのレベルを、未処理３段階ＮＫ細胞によるサイトカイン分泌のパーセンテージとして表す図である。
【図７】ＣＢＬＢノックアウト３段階ＮＫプロセスの模式図である。
【図８】−１日または−５日にブスルファンを用いた、３段階ＣＢＬＢノックアウトＮＫ細胞または未処理ＮＫ細胞の投与後７日のＮＯＤ  ＳＣＩＤガンマ（ＮＳＧ）マウスの脾臓、骨髄（ＢＭ）、血液、肝臓、肺における、および合計のヒトＣＤ４５＋細胞の数を示す図である。
【図９】−１日または−５日にブスルファンを用いた、ＣＢＬＢノックアウト３段階ＮＫ細胞または未処理ＮＫ細胞の投与後１４日のＮＳＧマウスの脾臓、ＢＭ、血液、肝臓、肺における、および合計のヒトＣＤ４５＋細胞の数を示す図である。
【図１０】−１日または−５日にブスルファンを用いた、ＣＢＬＢノックアウト３段階ＮＫ細胞または未処理ＮＫ細胞の投与後２１日のＮＳＧマウスの脾臓、ＢＭ、血液、肝臓、肺における、および合計のヒトＣＤ４５＋細胞の数を示す図である。
【図１１Ａ】−１日または−５日にブスルファンを用いた、ＣＢＬＢノックアウトまたは未処理を用いる投与後７、１４および２１日の脾臓におけるＣＤ５６＋ＣＤ１１ａ＋３段階ＮＫ細胞パーセントを示す図である。
【図１１Ｂ】−１日または−５日にブスルファンを用いた、ＣＢＬＢノックアウトまたは未処理を用いる投与後７、１４および２１日の肝臓におけるＣＤ５６＋ＣＤ１１ａ＋３段階ＮＫ細胞パーセントを示す図である。
【図１１Ｃ】−１日または−５日にブスルファンを用いた、ＣＢＬＢノックアウトまたは未処理を用いる投与後７、１４および２１日の骨髄におけるＣＤ５６＋ＣＤ１１ａ＋３段階ＮＫ細胞パーセントを示す図である。
【図１１Ｄ】−１日または−５日にブスルファンを用いた、ＣＢＬＢノックアウトまたは未処理を用いる投与後７、１４および２１日の肺におけるＣＤ５６＋ＣＤ１１ａ＋３段階ＮＫ細胞パーセントを示す図である。
【図１２Ａ】−１日または−５日にブスルファンを用いた、ＣＢＬＢノックアウトまたは未処理を用いる投与後７、１４および２１日のＮＳＧマウスの脾臓におけるＣＤ５６＋ＣＤ１６＋３段階ＮＫ細胞パーセントを示す図である。
【図１２Ｂ】−１日または−５日にブスルファンを用いた、ＣＢＬＢノックアウトまたは未処理を用いる投与後７、１４および２１日のＮＳＧマウスの肝臓におけるＣＤ５６＋ＣＤ１６＋３段階ＮＫ細胞パーセントを示す図である。
【図１２Ｃ】−１日または−５日にブスルファンを用いた、ＣＢＬＢノックアウトまたは未処理を用いる投与後７、１４および２１日のＮＳＧマウスの骨髄におけるＣＤ５６＋ＣＤ１６＋３段階ＮＫ細胞パーセントを示す図である。
【図１２Ｄ】−１日または−５日にブスルファンを用いた、ＣＢＬＢノックアウトまたは未処理を用いる投与後７、１４および２１日のＮＳＧマウスの肺におけるＣＤ５６＋ＣＤ１６＋３段階ＮＫ細胞パーセントを示す図である。
【図１３Ａ】−１日または−５日にブスルファンを用いた、ＣＢＬＢノックアウトまたは未処理を用いる投与後７、１４および２１日のＮＳＧマウスの脾臓におけるＣＤ５６＋ＣＤ１５８ｂ１、ｂ２、ｊ＋３段階ＮＫ細胞パーセントを示す図である。
【図１３Ｂ】−１日または−５日にブスルファンを用いた、ＣＢＬＢノックアウトまたは未処理を用いる投与後７、１４および２１日のＮＳＧマウスの肝臓におけるＣＤ５６＋ＣＤ１５８ｂ１、ｂ２、ｊ＋３段階ＮＫ細胞パーセントを示す図である。
【図１３Ｃ】−１日または−５日にブスルファンを用いた、ＣＢＬＢノックアウトまたは未処理を用いる投与後７、１４および２１日のＮＳＧマウスの骨髄におけるＣＤ５６＋ＣＤ１５８ｂ１、ｂ２、ｊ＋３段階ＮＫ細胞パーセントを示す図である。
【図１３Ｄ】−１日または−５日にブスルファンを用いた、ＣＢＬＢノックアウトまたは未処理を用いる投与後７、１４および２１日のＮＳＧマウスの肺におけるＣＤ５６＋ＣＤ１５８ｂ１、ｂ２、ｊ＋３段階ＮＫ細胞パーセントを示す図である。
【図１４Ａ】Ｋ５６２に対する、ＮＳＧマウス由来の投与後１４日の、単離され、精製された３段階ＮＫ細胞、ＣＢＬＢノックアウトまたは対照の細胞毒性を示す図である。対照は低パーセントキラーとして示される。
【図１４Ｂ】ＨＬ６０細胞に対する、ＮＳＧマウス由来の投与後１４日の、単離され、精製された３段階ＮＫ細胞、ＣＢＬＢノックアウトまたは対照の細胞毒性を示す図である。対照は低パーセントキラーとして示される。
【図１５Ａ】Ｋ５６２細胞、ＨＬ６０細胞と同時インキュベートされた、または細胞を伴わないＮＳＧマウス由来の投与後１４日の、単離され、精製された３段階ＮＫ細胞、ＣＢＬＢノックアウト（右）または対照（左）のＧＭ−ＣＳＦ分泌を示す図である。
【図１５Ｂ】Ｋ５６２細胞、ＨＬ６０細胞と同時インキュベートされた、または細胞を伴わないＮＳＧマウス由来の投与後１４日の、単離され、精製された３段階ＮＫ細胞、ＣＢＬＢノックアウト（右）または対照（左）のＩＦＮ−γ分泌を示す図である。
【図１５Ｃ】Ｋ５６２細胞、ＨＬ６０細胞と同時インキュベートされた、または細胞を伴わないＮＳＧマウス由来の投与後１４日の、単離され、精製された３段階ＮＫ細胞、ＣＢＬＢノックアウト（右）または対照（左）のｓＣＤ１３７分泌を示す図である。
【図１５Ｄ】Ｋ５６２細胞、ＨＬ６０細胞と同時インキュベートされた、または細胞を伴わないＮＳＧマウス由来の投与後１４日の、単離され、精製された３段階ＮＫ細胞、ＣＢＬＢノックアウト（右）または対照（左）のＴＮＦα分泌を示す図である。
【図１６Ａ】２種のＡＭＬ患者異種移植片（ＰＤＸ）腫瘍細胞とともに同時培養されたＮＳＧマウス由来の投与後１４日の、３段階ＮＫ細胞、ＣＢＬＢノックアウト（右）または対照（左）のＧＭ−ＣＳＦ分泌を示す図である。
【図１６Ｂ】２種のＡＭＬ患者異種移植片（ＰＤＸ）腫瘍細胞とともに同時培養されたＮＳＧマウス由来の投与後１４日の、３段階ＮＫ細胞、ＣＢＬＢノックアウト（右）または対照（左）のＩＦＮ−γ分泌を示す図である。
【図１６Ｃ】２種のＡＭＬ患者異種移植片（ＰＤＸ）腫瘍細胞とともに同時培養されたＮＳＧマウス由来の投与後１４日の、３段階ＮＫ細胞、ＣＢＬＢノックアウト（右）または対照（左）のｓＣＤ１３７分泌を示す図である。
【図１６Ｄ】２種のＡＭＬ患者異種移植片（ＰＤＸ）腫瘍細胞とともに同時培養されたＮＳＧマウス由来の投与後１４日の、３段階ＮＫ細胞、ＣＢＬＢノックアウト（右）または対照（左）のＴＮＦα分泌を示す図である。
【図１７Ａ】ＮＫＧ２ＡノックアウトＧＭ  ＮＫ効率を示す図である。
【図１７Ｂ】ノックアウト後の増殖倍数を示す図である。
【図１８Ａ】種々のＥ：Ｔ比における、３段階プロセスの３４／３５日目のＫ５６２細胞に対する、未処理（菱形）およびＮＫＧ２Ａ−ノックアウト（四角）３段階ＮＫ細胞の細胞毒性（死滅パーセントによって測定されるような）を示す図である。
【図１８Ｂ】種々のＥ：Ｔ比における、３段階プロセスの３４／３５日目のＲＰＭＩ８２２６細胞に対する、未処理（菱形）およびＮＫＧ２Ａ−ノックアウト（四角）３段階ＮＫ細胞の細胞毒性（死滅パーセントによって測定されるような）を示す図である。
【図１８Ｃ】種々のＥ：Ｔ比における、３段階プロセスの３４／３５日目のＵ２６６細胞に対する、未処理（菱形）およびＮＫＧ２Ａ−ノックアウト（四角）３段階ＮＫ細胞の細胞毒性（死滅パーセントによって測定されるような）を示す図である。
【図１８Ｄ】種々のＥ：Ｔ比における、３段階プロセスの３４／３５日目のＡＲＨ７７細胞に対する、未処理（菱形）およびＮＫＧ２Ａ−ノックアウト（四角）３段階ＮＫ細胞の細胞毒性（死滅パーセントによって測定されるような）を示す図である。
【図１９Ａ】２０：１、１０：１および５：１のエフェクター：ターゲット（Ｅ：Ｔ）比における、３段階プロセスの３４／３５日目のＲＰＭＩ８２２６細胞に対する未処理（菱形）およびＮＫＧ２Ａ−ノックアウト（四角）３段階ＮＫ細胞の相対細胞毒性を示す図である。
【図１９Ｂ】２０：１、１０：１および５：１のエフェクター：ターゲット（Ｅ：Ｔ）比における、３段階プロセスの３４／３５日目のＵ２６６細胞に対する未処理（菱形）およびＮＫＧ２Ａ−ノックアウト（四角）３段階ＮＫ細胞の相対細胞毒性を示す図である。
【図１９Ｃ】２０：１、１０：１および５：１のエフェクター：ターゲット（Ｅ：Ｔ）比における、３段階プロセスの３４／３５日目のＡＲＨ７７細胞に対する未処理（菱形）およびＮＫＧ２Ａ−ノックアウト（四角）３段階ＮＫ細胞の相対細胞毒性を示す図である。
【図２０】１．２５μｇ／ｍｌのＩＣＡＭ−１および５μｇ／ｍｌのＭＩＣＡのすべて存在下での、ＮＫＧ２Ａ抗体を用いる野生型３段階ＮＫ細胞（四角）、ＮＫＧ２Ａ抗体を用いるＮＫＧ２Ａノックアウト３段階ＮＫ細胞（三角）、ＩｇＧを用いる野生型３段階ＮＫ細胞（丸）およびＩｇＧを用いるＮＫＧ２Ａノックアウト３段階ＮＫ細胞（菱形）のＣＤ１０７ａ（プレートに結合された）アッセイ結果を示す図である。
【図２１Ａ】未処理３段階ＮＫ細胞によるサイトカイン分泌のパーセンテージとして表される、ＮＫＧ２Ａノックアウト３段階ＮＫ細胞のＲＰＭＩ８２２６細胞との同時インキュベーションの間に分泌されたサイトカインのレベルを示す図である。
【図２１Ｂ】未処理３段階ＮＫ細胞によるサイトカイン分泌のパーセンテージとして表される、ＮＫＧ２Ａノックアウト３段階ＮＫ細胞のＵ２６６細胞との同時インキュベーションの間に分泌されたサイトカインのレベルを示す図である。
【図２１Ｃ】未処理３段階ＮＫ細胞によるサイトカイン分泌のパーセンテージとして表される、ＮＫＧ２Ａノックアウト３段階ＮＫ細胞のＡＲＨ７７細胞との同時インキュベーションの間に分泌されたサイトカインのレベルを示す図である。
【図２２】５日目（四角）対１０日目（×ｓ）での、トランスフェクションの際の３５日の３段階ＮＫプロセスの間のＴＧＦＢＲ２ノックアウトのノックアウト効率を示す図である。
【図２３Ａ】アッセイの４８時間前の２０ｎｇ／ｍＬ（四角）または４０ｎｇ／ｍＬ（三角）のＴＧＦ−β１を用いる処置の際の、または未処理のままの（菱形）、種々のＥ：Ｔ比における、３段階ＮＫ細胞対腫瘍細胞株、対照ＮＫ対Ｋ５６２の細胞毒性（死滅パーセントによって測定されるような）を示す図である。
【図２３Ｂ】アッセイの４８時間前の２０ｎｇ／ｍＬ（四角）または４０ｎｇ／ｍＬ（三角）のＴＧＦ−β１を用いる処置の際の、または未処理のままの（菱形）、種々のＥ：Ｔ比における、３段階ＮＫ細胞対腫瘍細胞株、ＴＧＦＢＲ２ノックアウト対Ｋ５６２の細胞毒性（死滅パーセントによって測定されるような）を示す図である。
【図２３Ｃ】アッセイの４８時間前の２０ｎｇ／ｍＬ（四角）または４０ｎｇ／ｍＬ（三角）のＴＧＦ−β１を用いる処置の際の、または未処理のままの（菱形）、種々のＥ：Ｔ比における、３段階ＮＫ細胞対腫瘍細胞株、対照ＮＫ対ＲＰＭＩ８２２６の細胞毒性（死滅パーセントによって測定されるような）を示す図である。
【図２３Ｄ】アッセイの４８時間前の２０ｎｇ／ｍＬ（四角）または４０ｎｇ／ｍＬ（三角）のＴＧＦ−β１を用いる処置の際の、または未処理のままの（菱形）、種々のＥ：Ｔ比における、３段階ＮＫ細胞対腫瘍細胞株、ＴＧＦＢＲ２ノックアウト対ＲＰＭＩ８２２６の細胞毒性（死滅パーセントによって測定されるような）を示す図である。
【図２４Ａ】対照細胞対ＨＬ６０細胞の、ＴＧＦ−β１の不在下（上側の線）または存在下（下側の線）での４時間細胞毒性アッセイを示す図である。
【図２４Ｂ】ＴＧＦＢＲ２ノックアウト細胞対ＨＬ６０細胞の、ＴＧＦ−β１の不在下（上側の線）または存在下（下側の線）での４時間細胞毒性アッセイを示す図である。
【図２４Ｃ】対照細胞対Ｋ５６２細胞の、ＴＧＦ−β１の不在下（上側の線）または存在下（下側の線）での４時間細胞毒性アッセイを示す図である。
【図２４Ｄ】ＴＧＦＢＲ２ノックアウト細胞対Ｋ５６２細胞の、ＴＧＦ−β１の不在下（上側の線）または存在下（下側の線）での４時間細胞毒性アッセイを示す図である。
【図２５】未処理またはＣＤ１６ＶＰが形質導入された細胞の培養の間の３段階ＮＫ細胞におけるＣＤ１６発現の持続を示す図である。
【図２６Ａ】未処理のまま（上側の線）またはＣＤ１６ＶＰを用いて形質導入された（下側の線）３段階ＮＫ細胞の増殖倍数を示す図である。
【図２６Ｂ】未処理（左）またはＣＤ１６ＶＰが形質導入された（右）細胞の、３５日のうちの３３日目の３段階ＮＫ培養のマーカー発現を示す図である。
【図２７Ａ】Ｄａｕｄｉ細胞に対する４時間ＡＤＣＣアッセイにおける抗ＣＤ２０抗体の存在下でのＣＤ１６ＶＰが形質導入された細胞のＡＤＣＣ平均特異的死滅を示す図である。
【図２７Ｂ】Ｄａｕｄｉ細胞に対する４時間ＡＤＣＣアッセイにおける抗ＣＤ３８抗体の存在下でのＣＤ１６ＶＰが形質導入された細胞のＡＤＣＣ平均特異的死滅を示す図である。
【図２８Ａ】種々の条件下での４時間ＡＤＣＣアッセイにおけるＣＤ１６ＶＰが形質導入された細胞のＩＦＮ−γ分泌を示す図である。
【図２８Ｂ】種々の条件下での４時間ＡＤＣＣアッセイにおけるＣＤ１６ＶＰが形質導入された細胞のＧＭ−ＣＳＦ分泌を示す図である。
【図２８Ｃ】種々の条件下での４時間ＡＤＣＣアッセイにおけるＣＤ１６ＶＰが形質導入された細胞のＴＮＦ−α分泌を示す図である。
【図２９】偽トランスフェクション（菱形、９５５．８９）、ＴＧＦＢＲ２単一ノックアウト（四角、３８０）、ＣＢＬＢ単一ノックアウト（三角、５００．１７５）およびＴＧＦＢＲ２／ＣＢＬＢ二重ノックアウト（×ｓ、３２２．６９）を示す、二重ノックアウト３段階ＧＭ  ＮＫの増殖倍数を示す図である。
【図３０Ａ】ＴＧＦβ処置の存在下におけるＨＬ６０に対する二重ノックアウト３段階ＧＭ  ＮＫのエフェクター機能を示す図である。
【図３０Ｂ】ＴＧＦβ処置の不在下におけるＨＬ６０に対する二重ノックアウト３段階ＧＭ  ＮＫのエフェクター機能を示す図である。
【図３１Ａ】ＴＧＦβ処置の存在下でのＫ５６２に対する二重ノックアウト３段階ＧＭ  ＮＫのエフェクター機能を示す図である。
【図３１Ｂ】ＴＧＦβ処置の不在下でのＫ５６２に対する二重ノックアウト３段階ＧＭ  ＮＫのエフェクター機能を示す図である。
【図３２Ａ】ＴＧＦβ処置の存在または不在下、およびＫ５６２、ＨＬ６０、ＲＰＭＩまたはＫＧ１細胞の存在下で、ＮＫ細胞のＧＭ−ＣＳＦ分泌を示す図である。棒は、左から右に、偽トランスフェクトされたもの、ＴＧＦＢＲ２ノックアウト、ＣＢＬＢノックアウトおよびＴＧＦＢＲ２／ＣＢＬＢ二重ノックアウトの分泌を示す。
【図３２Ｂ】ＴＧＦβ処置の存在または不在下、およびＫ５６２、ＨＬ６０、ＲＰＭＩまたはＫＧ１細胞の存在下で、ＮＫ細胞のｓＣＤ１３７分泌を示す図である。棒は、左から右に、偽トランスフェクトされたもの、ＴＧＦＢＲ２ノックアウト、ＣＢＬＢノックアウトおよびＴＧＦＢＲ２／ＣＢＬＢ二重ノックアウトの分泌を示す。
【図３２Ｃ】ＴＧＦβ処置の存在または不在下、およびＫ５６２、ＨＬ６０、ＲＰＭＩまたはＫＧ１細胞の存在下で、ＮＫ細胞のＩＦＮ−γ分泌を示す図である。棒は、左から右に、偽トランスフェクトされたもの、ＴＧＦＢＲ２ノックアウト、ＣＢＬＢノックアウトおよびＴＧＦＢＲ２／ＣＢＬＢ二重ノックアウトの分泌を示す。
【図３２Ｄ】ＴＧＦβ処置の存在または不在下、およびＫ５６２、ＨＬ６０、ＲＰＭＩまたはＫＧ１細胞の存在下で、ＮＫ細胞のＴＮＦ−α分泌を示す図である。棒は、左から右に、偽トランスフェクトされたもの、ＴＧＦＢＲ２ノックアウト、ＣＢＬＢノックアウトおよびＴＧＦＢＲ２／ＣＢＬＢ二重ノックアウトの分泌を示す。
【図３２Ｅ】ＴＧＦβ処置の存在または不在下、およびＫ５６２、ＨＬ６０、ＲＰＭＩまたはＫＧ１細胞の存在下で、ＮＫ細胞のパーフォリン分泌を示す図である。棒は、左から右に、偽トランスフェクトされたもの、ＴＧＦＢＲ２ノックアウト、ＣＢＬＢノックアウトおよびＴＧＦＢＲ２／ＣＢＬＢ二重ノックアウトの分泌を示す。
【図３３】ＣＤ１６形質導入効率を示す図である。ＣＤ３４細胞の形質導入は、種々の条件を試験して最適化した。レンチウイルス形質導入は、７０％を超える（８人の異なるドナー（９２番〜９９番）から得られた細胞について４３〜８１％）中央値形質導入効率を達成するように、６００ｇで５日目に１００ＭＯＩで１×形質導入で最適化した。
【図３４】８人の異なるドナー（９２番〜９９番）から得られた細胞のＰＮＫ−ＣＤ１６ＶＰ増殖結果を示す図である。
【図３５】８人の異なるドナー（９２番〜９９番）から得られた細胞の増殖後ＰＮＫ−ＣＤ１６ＣＰ表現型データを示す図である。
【図３５Ｃｏｎｔ．１】８人の異なるドナー（９２番〜９９番）から得られた細胞の増殖後ＰＮＫ−ＣＤ１６ＣＰ表現型データを示す図である。
【図３５Ｃｏｎｔ．２】８人の異なるドナー（９２番〜９９番）から得られた細胞の増殖後ＰＮＫ−ＣＤ１６ＣＰ表現型データを示す図である。
【図３６】８人の異なるドナー（９２番〜９９番）から得られた細胞のＰＮＫ−ＣＤ１６ＶＰ構築物検証データを示す図である。左のパネルに示されるように、上側の線は、ＣＤ１６ＶＰのデータであり、下側の線は、ＰＮＫ−ＮＴのものである。右パネルの棒グラフでは、ＰＭＡによる活性化の６つの棒の順序は、以下の通りである：未処理、ＰＭＡ処理、ＰＭＡ＋ａ−ＴＡＣＥ  Ｄ１（Ａ１２）未処理、ＰＭＡ処理およびＰＭＡ＋ａ−ＴＡＣＥ  Ｄ１（Ａ１２）。ＡＤＣＣによる活性化のデータを示す棒グラフでは、６つの棒の順序は、Ｄａｕｄｉコーティングされていない、Ｄａｕｄｉ＋ＩｇＧ、Ｄａｕｄｉ＋ａ−ＣＤ３８、Ｄａｕｄｉコーティングされていない、Ｄａｕｄｉ＋ＩｇＧおよびＤａｕｄｉ＋ａ−ＣＤ３８である。
【図３６Ｃｏｎｔ．】８人の異なるドナー（９２番〜９９番）から得られた細胞のＰＮＫ−ＣＤ１６ＶＰ構築物検証データを示す図である。左のパネルに示されるように、上側の線は、ＣＤ１６ＶＰのデータであり、下側の線は、ＰＮＫ−ＮＴのものである。右パネルの棒グラフでは、ＰＭＡによる活性化の６つの棒の順序は、以下の通りである：未処理、ＰＭＡ処理、ＰＭＡ＋ａ−ＴＡＣＥ  Ｄ１（Ａ１２）未処理、ＰＭＡ処理およびＰＭＡ＋ａ−ＴＡＣＥ  Ｄ１（Ａ１２）。ＡＤＣＣによる活性化のデータを示す棒グラフでは、６つの棒の順序は、Ｄａｕｄｉコーティングされていない、Ｄａｕｄｉ＋ＩｇＧ、Ｄａｕｄｉ＋ａ−ＣＤ３８、Ｄａｕｄｉコーティングされていない、Ｄａｕｄｉ＋ＩｇＧおよびＤａｕｄｉ＋ａ−ＣＤ３８である。
【図３７】８人の異なるドナー（９２番〜９９番）から得られた細胞のＰＮＫ−ＣＤ１６ＶＰ  ＡＤＣＣ機能を示すデータを示す図である。示されるように、ＰＮＫ−ＣＤ１６ＶＰは、ＣＤ２０、ＣＤ３８およびＣＤ３１９を用いた場合の、Ｄａｕｄｉに対するＡＤＣＣの改善を示した。
【図３７Ｃｏｎｔ．】８人の異なるドナー（９２番〜９９番）から得られた細胞のＰＮＫ−ＣＤ１６ＶＰ  ＡＤＣＣ機能を示すデータを示す図である。示されるように、ＰＮＫ−ＣＤ１６ＶＰは、ＣＤ２０、ＣＤ３８およびＣＤ３１９を用いた場合の、Ｄａｕｄｉに対するＡＤＣＣの改善を示した。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
Ｖ．技術用語
以下の説明では、用語は、明細書に照らして読まれる場合にその平易で普通の意味を与えられるべきである。当業者ならば、明細書全体を考慮して使用されるように用語を理解するであろう。
【００２４】
本明細書において使用されるように、用語「免疫調節性化合物」および「ＩＭｉＤ（商標）」は、サリドマイドを包含しない。
【００２５】
「遺伝子改変する」は、明細書に照らして読まれる場合にその平易で普通の意味を有し、それだけには限らないが、例えば、遺伝子工学技術を使用して変更されている核酸などの遺伝物質を用いて、細菌などの生物または細胞、Ｔ細胞またはＮＫ細胞などのリンパ球、細菌細胞、真核細胞、昆虫、植物または哺乳動物を改変するプロセスを含み得る。例えば、分子クローニング方法を使用して対象の遺伝物質をまず単離およびコピーしてＤＮＡ配列を生成することによって、またはＤＮＡを合成することによって、次いで、この構築物を宿主生物中に挿入することによってＤＮＡなどの核酸を宿主ゲノム中に挿入できる。遺伝子および遺伝子発現はまた、ゲノム編集を使用して除去または「ノックアウト」できる。当業者ならば、遺伝子をノックアウトする多数の技術を理解できる。制限されるものではないが、遺伝子および／または遺伝子発現は、例えば、ＲＮＡ干渉、ＣＲＩＳＰＲまたはＴＡＬＥＮを使用する技術を用いてノックアウトできる。遺伝子ターゲティングは、相同組換えを使用して内因性遺伝子を変化させる異なる技術であり、遺伝子を欠失させ、エキソンを除去し、遺伝子を付加し、または点突然変異を導入するために使用できる。
【００２６】
形質導入によって実施された遺伝子改変が本明細書に記載されている。「形質導入」は、明細書に照らして読まれる場合に、その平易で普通の意味を有し、それだけには限らないが、例えば、ベクターによって、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの遺伝物質を細胞に導入する方法を含み得る。一般的な技術は、ウイルスベクター、エレクトロポレーションおよび細胞透過性を増大するための化学試薬を使用する。ＤＮＡは、ウイルスによって、またはウイルスベクターを介して導入することができる。本明細書に記載されるように、免疫細胞、例えば、ナチュラルキラー細胞を改変する方法が提供される。ウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルスおよびレンチウイルスに由来し得る。
【００２７】
送達のために組換え感染性ウイルス粒子を利用する種々の形質導入技術が開発されている。これは、細胞の形質導入への現在好ましいアプローチに相当する。形質導入ために使用してもよいウイルスベクターとして、サルウイルス４０、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルスベクターおよびレトロウイルスに由来するウイルスベクターを挙げることができる。したがって、遺伝子導入および発現方法は多数あるが、本質的に、哺乳動物細胞において遺伝物質を導入し発現するように機能する。リン酸カルシウムトランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、および組換えアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルスまたはレトロウイルスベクターによる感染を含む、上記の技術のうちいくつかを、細胞を形質導入するために使用できる。リンパ球は、エレクトロポレーションによって、およびレトロウイルスまたはレンチウイルス感染によって成功裏に形質導入されている。そのようなものとして、レトロウイルスおよびレンチウイルスベクターは、真核細胞における遺伝子導入のための高度に効率的な方法を提供し得る。レトロウイルスおよびレンチウイルスベクターは、Ｔ細胞およびＮＫ細胞などのリンパ球への遺伝子導入のための高度に効率的な方法を提供する。さらに、レトロウイルスまたはレンチウイルス組み込みは、制御された様式で起こり、細胞あたり新規遺伝情報の１つまたは２、３コピーの安定な組み込みをもたらす。
【００２８】
「ゲノム編集」は、明細書に照らして読まれる場合にその平易で普通の意味を有し、それだけには限らないが、例えば、ヌクレアーゼまたは操作されたヌクレアーゼ（単数または複数）を使用して生物のゲノムにおいてＤＮＡが挿入、欠失または置き換えられる遺伝子工学の種類を含み得る。制限されるものではないが、ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９システムのもの、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはＴＡＬＥＮヌクレアーゼであり得る。ヌクレアーゼは、遺伝子座または核酸配列上の標的化された遺伝子座を標的とするために使用できる。
【００２９】
「ＴＡＬＥＮ」または「転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ」は、明細書に照らして読まれる場合にその平易で普通の意味を有し、それだけには限らないが、例えば、ＤＮＡの特定の配列を切断するように操作され得る制限酵素を含み得る。それらは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインを、ＤＮＡ切断ドメイン（ＤＮＡ鎖を切断するヌクレアーゼ）と融合することによって作製される。転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）は、任意の所望のＤＮＡ配列と実際に結合するように操作することができ、そのため、ヌクレアーゼと組み合わされた場合に、ＤＮＡを特定の位置で切断できる。制限酵素は、ゲノム編集において使用するために、またはｉｎ  ｓｉｔｕでのゲノム編集、操作されたヌクレアーゼを用いるゲノム編集として知られる技術のために細胞中に導入することができる。ジンクフィンガーヌクレアーゼおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９と並んで、ＴＡＬＥＮは、ゲノム編集の分野において卓越したツールである。これらのヌクレアーゼは、遺伝子を「ノックアウト」するために使用してもよい。
【００３０】
「ＣＲＩＳＰＲ」（クラスター化規則的間隔短鎖回文配列リピート（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ））は、明細書に照らして読まれる場合に、その平易で普通の意味を有し、それだけには限らないが、例えば、塩基配列の短い反復を含有する原核生物ＤＮＡのセグメントを含み得る。各反復に、細菌ウイルスまたはプラスミドに対する先の曝露に由来する「スペーサーＤＮＡ」の短いセグメントが続く。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、プラスミドおよびファージなどの外来遺伝要素に対する耐性を付与する原核生物の免疫系であり、獲得免疫性の一形態を提供する。ＣＲＩＳＰＲスペーサーは、真核生物におけるＲＮＡｉと同様の方法でこれらの外因性遺伝要素を認識し、切断する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、生命の樹を通して種においてゲノム編集（特定の遺伝子の配列の付加、破壊または変更）および遺伝子調節のために使用されている。Ｃａｓ９タンパク質および適当なガイドＲＮＡを細胞中に送達することによって、生物のゲノムを任意の所望の位置で切断できる。当業者ならば、集団全体のゲノムを変更可能な、ＲＮＡによってガイドされるゲノム編集ツールを構築するためのＣＲＩＳＰＲの使用を理解し得る。
【００３１】
「レナリドミド」は、明細書に照らして読まれる場合に、その平易で普通の意味を有し、それだけには限らないが、例えば、３−（４’アミノイソインドリン−１’−オン）−１−ピペリジン−２，６−ジオン（ケミカル・アブストラクツ・サービス（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  Ｓｅｒｖｉｃｅ）名）または２，６−ピペリジンジオン，３−（４−アミノ−１，３−ジヒドロ−１−オキソ−２Ｈ−イソインドール−２−イル）−（国際純粋・応用化学連合（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｕｒｅ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）（ＩＵＰＡＣ）名）を含み得る。本明細書において使用されるように、「ポマリドミド」は、４−アミノ−２−（２，６−ジオキソピペリジン−３−イル）イソインドール−１，３−ジオンを意味する。
【００３２】
「複能性」とは、明細書に照らして読まれる場合に、その平易で普通の意味を有し、それだけには限らないが、例えば、細胞に言及する場合には、別の細胞種の細胞に分化する能力を有する細胞を挙げることができ、意味する。ある特定の代替法では、「複能性細胞」は、哺乳動物の身体のおよそ２６０細胞種のサブセットに成長する能力を有する細胞である。多能性細胞とは異なり、複能性細胞は、すべての細胞種を形成する能力は有さない。
【００３３】
「フィーダー細胞」は、明細書に照らして読まれる場合に、その平易で普通の意味を有し、それだけには限らないが、例えば、第２の種類の細胞が維持され、おそらくは増殖することができる環境を提供するために、第２の種類の細胞と同時培養されるある種の細胞を含み得る。いずれかの理論に捉われようとは思わないが、フィーダー細胞は、標的細胞に、例えば、ペプチド、ポリペプチド、電気的シグナル、有機分子（例えば、ステロイド）、核酸分子、成長因子（例えば、ｂＦＧＦ）、その他の因子（例えば、サイトカイン）および代謝的栄養素を提供し得る。ある特定の代替法では、フィーダー細胞は、単層で成長する。
【００３４】
「ナチュラルキラー細胞」または「ＮＫ細胞」は、明細書に照らして読まれる場合に、その平易で普通の意味を有し、それだけには限らないが、例えば、任意の組織供給源に由来するナチュラルキラー細胞を挙げることができ、本明細書に記載されるものなどの方法を使用して産生されるナチュラルキラー細胞を含む。
【００３５】
「胎盤灌流液」は、明細書に照らして読まれる場合に、その平易で普通の意味を有し、それだけには限らないが、例えば、胎盤、例えば、ヒト胎盤の少なくとも一部を通って、例えば、胎盤脈管構造を通って通過した灌流溶液を挙げることができ、胎盤を通る通過の際に灌流溶液によって集められる複数の細胞を含む。
【００３６】
「胎盤灌流液細胞」は、明細書に照らして読まれる場合に、その平易で普通の意味を有し、それだけには限らないが、例えば、有核細胞、例えば、胎盤灌流液から単離された、またはそれから単離可能な総有核細胞を含み得る。
【００３７】
「腫瘍細胞抑制」、「腫瘍細胞増殖の抑制」などは、明細書に照らして読まれる場合に、その平易で普通の意味を有し、それだけには限らないが、例えば、本明細書に記載される３段階法を使用して産生されたＮＫ細胞またはＮＫ細胞集団を、腫瘍細胞の集団と接触させることまたは近接させること、例えば、腫瘍細胞の集団を、本明細書に記載される３段階法を使用して産生されたＮＫ細胞またはＮＫ細胞集団と接触させることによって、例えば、腫瘍細胞の前記集団中の１種または複数の腫瘍細胞を死滅させることによる、例えば、腫瘍細胞の集団の成長の減速を含み得る。ある特定の代替法では、前記接触は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで起こる。その他の代替法では、前記接触は、ｉｎ  ｖｉｖｏで起こる。
【００３８】
「造血細胞」は、明細書に照らして読まれる場合に、その平易で普通の意味を有し、それだけには限らないが、例えば、造血幹細胞および造血前駆体細胞を含み得る。
【００３９】
「ＣＢＬＢ」、Ｅ３ユビキチンリガーゼ（ｃａｓｉｔａｓ  Ｂリンパ系リンパ腫ｂ）は、Ｔ細胞活性化の負のレギュレーターである。本明細書に記載されるいくつかの代替法では、ナチュラルキラー細胞を含む細胞の集団が提供され、これでは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、ＮＫ阻害性分子の発現を欠く、またはＮＫ阻害性分子の発現の低減を示すように遺伝子改変されている。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子は、Ｔ細胞活性化の負のレギュレーターである。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子は、ＣＢＬＢである。
【００４０】
「ＮＫＧ２Ａ」は、ＮＫ細胞およびＣＤ８＋Ｔリンパ球のサブセットの表面で主に発現されるＣ型レクチン受容体の一形態である。これらの受容体は、ＮＫ細胞の細胞傷害性活性を刺激または阻害し、したがって、それらはその機能に従って活性化および阻害性受容体にわけられる。本明細書に記載されるいくつかの代替法では、ナチュラルキラー細胞を含む細胞の集団が提供される、これでは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、ＮＫ阻害性分子の発現を欠く、またはＮＫ阻害性分子の発現の低減を示すように遺伝子改変されている。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子は、Ｃ型レクチン受容体の一形態である。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子は、ＮＫＧ２Ａである。本明細書におけるいくつかの代替法では、ＮＫＧ２ＡノックアウトＮＫ細胞は、天然に存在するＮＫ細胞などのＮＫＧ２Ａノックアウトを有さない未処理細胞との比較において細胞毒性において最大３倍またはそれより多い増大を有する。
【００４１】
「ＴＧＦＢＲ２」は、ＴＧＦベータ受容体である。本明細書に記載されるいくつかの代替法では、ナチュラルキラー細胞を含む細胞の集団が提供され、ここでナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、ＮＫ阻害性分子の発現を欠く、またはＮＫ阻害性分子の発現の低減を示すように遺伝子改変されている。いくつかの代替法では、このＮＫ阻害性分子は、ＴＧＦＢＲ２である。
【００４２】
「ＣＤ１６」は、免疫細胞、例えば、ナチュラルキラー細胞、好中球多形核白血球、単球およびマクロファージの表面で見られる低い親和性Ｆｃ受容体である。
【００４３】
「ＡＤＡＭメタロペプチダーゼドメイン１７」（ＡＤＡＭ１７）は、ＴＡＣＥとしても知られ、ディスインテグリンおよびメタロプロテアーゼのＡＤＡＭタンパク質ファミリーに属する酵素である。ＡＤＡＭは、ＴＮＦ−αのプロセシングに関与し得る。本明細書におけるいくつかの代替法では、ナチュラルキラー細胞を含む細胞の集団が提供され、ここで、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、改変されたまたは突然変異体ＣＤ１６を含むように遺伝子改変されている。いくつかの代替法では、改変されたまたは突然変異体ＣＤ１６は、ＡＤＡＭ１７切断に対して耐性である。
【００４４】
「薬物選択マーカー」は、明細書に照らして読まれる場合に、その平易で普通の意味を有し、ベクターを受け取っている、選択マーカーを有する宿主細胞の同定または選択を促進するために選択マーカーを含み得る。制限するものではないが、選択マーカーは、選択剤、例えば、ＰｕｒｏＲ遺伝子、ＺｅｏＲ遺伝子、ＨｙｇｒｏＲ遺伝子、ｎｅｏＲ遺伝子および／またはブラストサイジン耐性遺伝子に対する耐性を付与するタンパク質をコードする遺伝子を含み得る。
【００４５】
「未定義の構成成分」は、明細書に照らして読まれる場合に、その平易で普通の意味を有し、それだけには限らないが、例えば、成分が一般に提供されていない、または定量化されていない構成成分を含み得る。「未定義の構成成分」の例として、制限するものではないが、血清、例えば、ヒト血清（例えば、ヒト血清ＡＢ）および胎児血清（例えば、ウシ胎児血清またはウシ胎児血清）が挙げられる。
【００４６】
本明細書において、「＋」とは、特定の細胞性マーカーの存在を示すために使用される場合には、細胞性マーカーがアイソタイプ対照を上回って蛍光活性化セルソーターにおいて検出可能に存在し、定量的または半定量的ＲＴ−ＰＣＲにおいてバックグラウンドを上回って検出可能であることを意味する。
【００４７】
本明細書において、「−」とは、特定の細胞性マーカーの存在を示すために使用される場合には、細胞性マーカーがアイソタイプ対照を上回って蛍光活性化セルソーターにおいて検出可能に存在せず、定量的または半定量的ＲＴ−ＰＣＲにおいてバックグラウンドを上回って検出可能ではないことを意味する。
【００４８】
「胎盤由来ＮＫ細胞」またはｐＮＫ細胞は、明細書に照らして読まれる場合に、その平易で普通の意味を有し、分娩後胎盤および臍帯由来のＮＫ細胞を含み得る。ｐＮＫ細胞のプロセシングに先立って、ドナー適格性は、血清学、細菌学およびＨＬＡタイピングなどの一連の試験によって行われる。単離は、当業者によって滅菌条件下で実施される。
【００４９】
「発現される」は、明細書に照らして読まれる場合に、その平易で普通の意味を有し、それだけには限らないが、例えば、特定の細胞性マーカーの存在を示すためを含むことができ、細胞性マーカーが、当業者に公知のタンパク質または核酸の存在を検出する技術を使用して、検出可能に存在する、またはバックグラウンドを上回って検出可能に存在することを意味する。本明細書において、「発現されない」、または「発現を欠く」、などは、特定の細胞性マーカーの存在を示すために使用される場合には、細胞性マーカーが、当業者に公知のタンパク質または核酸の存在を検出する技術を使用して、検出可能に存在しない、またはバックグラウンドを上回って検出可能ではないことを意味する。
【００５０】
本明細書において、「機能を欠く」、「機能しない」、などは、特定の機能の存在を示すために使用される場合には、機能が、当技術分野で公知の前記機能を検出するための標準アッセイを使用して、検出可能に存在しない、またはバックグラウンドを上回って検出可能ではないことを意味する。
【００５１】
ＶＩ．詳細な説明
腫瘍細胞およびウイルス感染細胞を死滅させるＮＫ細胞の有利な特性にもかかわらず、殺腫瘍性機能を保持するナチュラルキラー細胞を産生および増殖させる効率的な方法を開発する必要性が当技術分野において依然としてある。
【００５２】
ＮＫ細胞は、自然リンパ系細胞（ＩＬＣ）である。自然リンパ系細胞は、発達のために転写因子ＩＤ２に対するその依存性によって関連している。
【００５３】
遺伝子改変された（ＧＭ）ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の集団、ＧＭ  ＮＫ細胞の集団を産生する方法およびＧＭ  ＮＫ細胞を使用する方法が、本明細書において提供される。
【００５４】
１．ＮＫ阻害性分子の発現が変更されたＧＭ  ＮＫ細胞
ある特定の代替法では、本明細書において提供されるＧＭ  ＮＫ細胞は、ＣＢＬＢ、ＮＫＧ２Ａおよび／もしくはＴＧＦＢＲ２の発現および／もしくは機能を欠く、または天然に存在するＮＫ細胞もしくは非改変ＮＫ細胞対照と比較して、ＣＢＬＢ、ＮＫＧ２Ａおよび／もしくはＴＧＦＢＲ２の発現および／もしくは機能の低減を示す。ＣＢＬＢ、ＮＫＧ２ＡおよびＴＧＦＢＲ２の遺伝子配列は当業者に公知であり、例示的配列が本明細書に記載されている。当業者に公知の標準技術を使用して、本明細書に記載される配列を改変できる。
【００５５】
ＣＢＬＢ（Ｃａｓｉｔａｓ  Ｂリンパ系リンパ腫原癌遺伝子Ｂ）は、ＲＴＫ、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４およびＴＧＦｂシグナル伝達経路の下流に作用し、免疫性および耐性の間のバランスを維持する細胞内タンパク質である。ＧｅｎＢａｎｋ（商標）受託番号Ｑ１３１９１．２は、例示的ヒトＣＢＬＢアミノ酸配列を提供する。ＧｅｎＢａｎｋ（商標）受託番号ＮＭ＿００１３２１７８８．１は、例示的ヒトＣＢＬＢヌクレオチド配列を提供する。任意の特定の機序または理論に捉われようとは思わないが、ＮＫ細胞においてＣＢＬＢをノックアウトすることは、ＮＫ細胞活性化閾値を低下させ、ＮＫ細胞を活動亢進にすると仮定される。ある特定の代替法では、ＣＢＬＢの発現を欠くＧＭ  ＮＫ細胞の集団が本明細書において提供される。ある特定の代替法では、ＣＢＬＢの発現が低減されたＧＭ  ＮＫ細胞の集団が本明細書において提供される。ある特定の代替法では、ＧＭ  ＮＫ細胞は、ヒトＧＭ  ＮＫ細胞である。ある特定の代替法では、ＧＭ  ＮＫ細胞の集団が本明細書において提供され、ここで、ＣＢＬＢ発現がノックアウトされている。遺伝子は、ＲＮＡ干渉、ＣＲＩＳＰＲまたはＴＡＬＥＮを使用する技術を用いてノックアウトされてもよい。特定の代替法では、ＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＲＩＳＰＲ関連技術によって実施される。ある特定の代替法では、ＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢノックアウトを有さないＮＫ細胞、例えば、非改変ＮＫ細胞または天然に存在するＮＫ細胞よりも、腫瘍細胞に対して高い細胞毒性を有するＮＫ細胞の集団を生成する。特定の代替法では、腫瘍細胞は、多発性骨髄腫細胞である。特定の代替法では、腫瘍細胞は、ＲＰＭＩ８２２６細胞である。特定の代替法では、腫瘍細胞は、Ｕ２６６細胞である。特定の代替法では、腫瘍細胞は、ＡＲＨ７７細胞である。ある特定の代替法では、ＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢノックアウトを有さないＮＫ細胞、例えば、天然に存在するまたは非改変ＮＫ細胞よりも高いＩＦＮγ分泌を有するＮＫ細胞の集団を生成する。ある特定の代替法では、ＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢノックアウトを有さないＮＫ細胞、例えば、天然に存在するＮＫ細胞または非改変ＮＫ細胞よりも高い脱顆粒を有するＮＫ細胞の集団を生成する。特定の代替法では、より高い脱顆粒は、ＣＤ１０７ａの増大によって測定される。免疫応答のマーカーの測定技術は、当業者に公知である。ＣＤ１０７ａは、例えば、抗ＣＤ１０７ａ抗体を使用するフローサイトメトリーベースの方法によって測定されてもよい。ある特定の代替法では、ＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢノックアウトを有さないＮＫ細胞、例えば、天然に存在するまたは非改変ＮＫ細胞と比較して、ＮＫ細胞におけるＧＭ−ＣＳＦ、可溶性ＣＤ１３７（ｓＣＤ１３７）、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＴＮＦαまたはパーフォリンのうち１種または複数の分泌の変化をもたらす。ある特定の代替法では、ＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢノックアウトを有さないＮＫ細胞、例えば、天然に存在するまたは非改変ＮＫ細胞と比較して、ＮＫ細胞におけるＧＭ−ＣＳＦ、可溶性ＣＤ１３７（ｓＣＤ１３７）、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＴＮＦαまたはパーフォリンのうち１種または複数の分泌濃度の変化をもたらす。
【００５６】
ＮＫＧ２Ａは、ＮＫ細胞においてＣＤ９４と結合し、ＮＫ活性を阻害するタンパク質である。ＧｅｎＢａｎｋ（商標）受託番号ＡＡＬ６５２３４．１は、例示的ヒトＮＫＧ２Ａアミノ酸配列を提供する。ＧｅｎＢａｎｋ（商標）受託番号ＡＦ４６１８１２．１は、例示的ヒトＮＫＧ２Ａヌクレオチド配列を提供する。任意の特定の機序または理論に捉われようとは思わないが、ＮＫＧ２Ａが欠損した、機能的に成熟したＮＫ細胞生成物の生成は、治療活性の増強を提供すると仮定される。ある特定の代替法では、ＮＫＧ２Ａの発現を欠くＧＭ  ＮＫ細胞の集団が本明細書において提供される。ある特定の代替法では、ＧＭ  ＮＫ細胞は、ヒトＧＭ  ＮＫ細胞である。ある特定の代替法では、ＧＭ  ＮＫ細胞の集団は、ＮＫＧ２Ａの発現が低減している。本明細書において提供される特定の代替法は、ＧＭ  ＮＫ細胞の集団に関し、これでは、ＮＫＧ２Ａ発現は、ノックアウトされている。遺伝子は、ＲＮＡ干渉、ＣＲＩＳＰＲまたはＴＡＬＥＮを使用する技術を用いてノックアウトできる。特定の代替法では、ＮＫＧ２Ａ発現のノックアウトは、ＣＲＩＳＰＲ関連技術によって実施される。ある特定の代替法では、ＮＫＧ２Ａ発現のノックアウトは、ＮＫＧ２Ａノックアウトを有さないＮＫ細胞、例えば、非改変ＮＫ細胞または天然に存在するＮＫ細胞よりも、腫瘍細胞に対して高い細胞毒性を有するＮＫ細胞の集団を生成する。特定の代替法では、腫瘍細胞は、多発性骨髄腫細胞である。特定の代替法では、腫瘍細胞は、ＲＰＭＩ８２２６細胞である。特定の代替法では、腫瘍細胞は、Ｕ２６６細胞である。特定の代替法では、腫瘍細胞は、ＡＲＨ７７細胞である。ある特定の代替法では、ＮＫＧ２Ａ発現のノックアウトは、ＮＫＧ２Ａノックアウトを有さないＮＫ細胞、例えば、非改変ＮＫ細胞または天然に存在するＮＫ細胞よりも高いＩＦＮγ分泌を有するＮＫ細胞の集団を生成する。ある特定の代替法では、ＮＫＧ２Ａ発現のノックアウトは、ＮＫＧ２Ａノックアウトを有さないＮＫ細胞、例えば、非改変ＮＫ細胞または天然に存在するＮＫ細胞よりも高い脱顆粒を有するＮＫ細胞の集団を生成する。特定の代替法では、より高い脱顆粒は、ＣＤ１０７ａ検出の増大によって測定される。ある特定の代替法では、ＮＫＧ２Ａ発現のノックアウトは、ＮＫＧ２Ａノックアウトを有さないＮＫ細胞、例えば、非改変ＮＫ細胞または天然に存在するＮＫ細胞と比較して、ＮＫ細胞におけるＧＭ−ＣＳＦ、ｓＣＤ１３７、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＴＮＦαおよび／またはパーフォリンのうち１種または複数の分泌の変化をもたらす。ある特定の代替法では、ＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢノックアウトを有さないＮＫ細胞、例えば、非改変ＮＫ細胞または天然に存在するＮＫ細胞と比較して、ＮＫ細胞におけるＧＭ−ＣＳＦ、可溶性ＣＤ１３７（ｓＣＤ１３７）、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＴＮＦαおよび／またはパーフォリンのうち１種または複数の分泌濃度の変化をもたらす。本明細書におけるいくつかの代替法では、ＮＫＧ２ＡノックアウトＮＫ細胞は、ＮＫＧ２Ａノックアウトを有さない未処理細胞と比較して、細胞毒性の最大３倍またはそれより多い増大を有する。
【００５７】
ＴＧＦ−β１は、ＮＫ細胞抗腫瘍免疫からの回避を促進する強力な免疫抑制剤である。ＴＧＦβシグナル伝達は、ＴＧＦβ２型受容体２（ＴＧＦＢＲ２またはＴβＲＩＩ）を通して作用し、下流の数百種の遺伝子の発現を制御する。下流の事象は、Ｓｍａｄ２／３リン酸化およびＮＫ活性化受容体の下流制御を含む。ＧｅｎＢａｎｋ（商標）受託番号ＡＢＧ６５６３２．１は、例示的ヒトＴＧＦＢＲ２アミノ酸配列を提供する。ＧｅｎＢａｎｋ（商標）受託番号ＫＵ１７８３６０．１は、例示的ヒトＴＧＦＢＲ２ヌクレオチド配列を提供する。したがって、任意の特定の機序または理論に捉われようとは思わないが、ＮＫ細胞におけるＴＧＦＢＲ２ノックアウトの生成は、より大きなエフェクター機能および活性化受容体のより高い発現を有するＮＫ細胞の集団を提供すると仮定される。本明細書において提供される、ある特定の代替法は、ＴＧＦＢＲ２の発現を欠くＧＭ  ＮＫ細胞の集団を含む。ある特定の代替法では、本明細書において提供されるＧＭ  ＮＫ細胞の集団は、ＴＧＦＢＲ２の低減された発現を有する。ある特定の代替法では、ＧＭ  ＮＫ細胞の集団が本明細書において提供され、これでは、ＴＧＦＢＲ２発現がノックアウトされている。遺伝子は、ＲＮＡ干渉、ＣＲＩＳＰＲまたはＴＡＬＥＮを使用する技術を用いてノックアウトできる。ある特定の代替法では、ＧＭ  ＮＫ細胞は、ヒトＧＭ  ＮＫ細胞である。特定の代替法では、ＴＧＦＢＲ２発現のノックアウトは、ＣＲＩＳＰＲ関連技術によって実施される。ある特定の代替法では、ＴＧＦＢＲ２発現のノックアウトは、ＴＧＦＢＲ２ノックアウトを有さないＮＫ細胞、例えば、非改変ＮＫ細胞または天然に存在するＮＫ細胞よりも、腫瘍細胞に対して高い細胞毒性を有するＮＫ細胞を有するＮＫ細胞の集団を生成する。特定の代替法では、腫瘍細胞は、多発性骨髄腫細胞である。特定の代替法では、腫瘍細胞は、慢性骨髄性白血病細胞である。特定の代替法では、腫瘍細胞は、急性骨髄性白血病細胞である。特定の代替法では、腫瘍細胞は、ＲＰＭＩ８２２６細胞である。特定の代替法では、腫瘍細胞は、Ｕ２６６細胞である。特定の代替法では、腫瘍細胞は、Ｋ５６２細胞である。特定の代替法では、腫瘍細胞は、ＨＬ−６０細胞である。特定の代替法では、腫瘍細胞は、ＡＲＨ７７細胞である。ある特定の代替法では、ＴＧＦＢＲ２発現のノックアウトは、ＴＧＦＢＲ２ノックアウトを有さないＮＫ細胞よりも高いＩＦＮγ分泌を有するＮＫ細胞をもたらす。ある特定の代替法では、ＴＧＦＢＲ２発現のノックアウトは、ＴＧＦＢＲ２ノックアウトを有さないＮＫ細胞、例えば、非改変ＮＫ細胞または天然に存在するＮＫ細胞よりも高い脱顆粒を有するＮＫ細胞の集団を生成する。特定の代替法では、より高い脱顆粒は、ＣＤ１０７ａ検出の増大によって測定される。免疫応答のマーカーの測定技術は、当業者に公知である。ＣＤ１０７ａは、例えば、抗ＣＤ１０７ａ抗体を使用するフローサイトメトリーベースの方法によって測定され得る。ある特定の代替法では、ＴＧＦＢＲ２発現のノックアウトは、ＴＧＦＢＲ２ノックアウトを有さないＮＫ細胞、例えば、非改変ＮＫ細胞または天然に存在するＮＫ細胞と比較して、ＮＫ細胞におけるＧＭ−ＣＳＦ、ｓ���Ｄ１３７、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＴＮＦαおよび／またはパーフォリンのうち１種または複数の分泌の変化をもたらす。ある特定の代替法では、ＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢノックアウトを有さないＮＫ細胞、例えば、非改変ＮＫ細胞または天然に存在するＮＫ細胞と比較して、ＮＫ細胞におけるＧＭ−ＣＳＦ、可溶性ＣＤ１３７（ｓＣＤ１３７）、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＴＮＦαおよび／またはパーフォリンのうち１種または複数の分泌濃度の変化をもたらす。ある特定の代替法では、ＴＧＦＢＲ２発現のノックアウトは、ＴＧＦＢＲ２ノックアウトを有さないＮＫ細胞、例えば、非改変ＮＫ細胞または天然に存在するＮＫ細胞と比較して、Ｓｍａｄ２／３リン酸化のレベルの低減をもたらす。ある特定の代替法では、ＴＧＦＢＲ２発現のノックアウトは、ＴＧＦＢＲ２ノックアウトを有さないＮＫ細胞、例えば、非改変ＮＫ細胞または天然に存在するＮＫ細胞と比較して、Ｓｍａｄ２／３リン酸化のレベルの増大をもたらす。ある特定の代替法では、ＴＧＦＢＲ２発現のノックアウトは、ＤＮＡＭ−１、ＮＫＧ２Ｄおよび／またはＮＫｐ３０のうち１種または複数の発現の増大をもたらす。
【００５８】
２．改変されたＣＤ１６を含むＧＭ  ＮＫ細胞
ＣＤ１６の遺伝子配列は、当業者に公知であり、例示的配列が本明細書に記載されている。当業者に公知の標準技術を使用して、本明細書に記載される配列を改変できる。
【００５９】
ＣＤ１６（分化のクラスター１６）は、それぞれＣＤ１６ａおよびＣＤ１６ｂとしても知られる、２つのアイソフォーム、Ｆｃ受容体、ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩｂからなる。ＣＤ１６ａは、ナチュラルキラー細胞で見られる。ＣＤ１６は、ＩｇＧ抗体のＦｃ部分と結合し、これが、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）のためにナチュラルキラー細胞を活性化する。ＣＤ１６ａおよびＣＤ１６ｂは両方ともＡＤＡＭ１７により標的とされる切断部位を含有する。ＡＤＡＭ１７によるＣＤ１６ａのタンパク質分解による切断は、ＮＫ細胞活性化で起こり、血漿中への可溶性ＣＤ１６放出につながる。ＧｅｎＢａｎｋ（商標）受託番号ＮＰ＿０００５６０．６は、例示的ヒト野生型ＣＤ１６ａアミノ酸配列を提供する。ＧｅｎＢａｎｋ（商標）受託番号ＢＣ０３６７２３．１は、例示的ヒト野生型ＣＤ１６ａヌクレオチド配列を提供する。
【００６０】
ある特定の代替法では、改変されたＣＤ１６を含むＧＭ  ＮＫ細胞が本明細書において提供される。ある特定の代替法では、ＧＭ  ＮＫ細胞は、ヒトＧＭ  ＮＫ細胞である。ある特定の代替法では、改変されたＣＤ１６は、改変されたヒトＣＤ１６である。特定の代替法では、改変されたＣＤ１６は、野生型ＣＤ１６よりもＩｇＧに対して高い親和性を有する。より特定の代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＣＤ１６ａの位置１５８にバリン（ＶａｌまたはＶ）を有する。特定の代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＡＤＡＭ１７切断に対して耐性である。より特定の代替法では、ＣＤ１６は、ＣＤ１６ａ中の位置１９７にプロリン（ＰｒｏまたはＰ）を有する（Ｓ１９７Ｐ突然変異）。ある特定の代替法では、改変されたＣＤ１６は、野生型ＣＤ１６よりもＩｇＧに対して高い親和性を有し、ＡＤＡＭ１７切断に対して耐性である。ある特定の代替法では、改変されたＣＤ１６は、配列番号１に示されるアミノ酸配列（ＭＷＱＬＬＬＰＴＡＬＬＬＬＶＳＡＧＭＲＴＥＤＬＰＫＡＶＶＦＬＥＰＱＷＹＲＶＬＥＫＤＳＶＴＬＫＣＱＧＡＹＳＰＥＤＮＳＴＱＷＦＨＮＥＳＬＩＳＳＱＡＳＳＹＦＩＤＡＡＴＶＤＤＳＧＥＹＲＣＱＴＮＬＳＴＬＳＤＰＶＱＬＥＶＨＩＧＷＬＬＬＱＡＰＲＷＶＦＫＥＥＤＰＩＨＬＲＣＨＳＷＫＮＴＡＬＨＫＶＴＹＬＱＮＧＫＧＲＫＹＦＨＨＮＳＤＦＹＩＰＫＡＴＬＫＤＳＧＳＹＦＣＲＧＬＶＧＳＫＮＶＳＳＥＴＶＮＩＴＩＴＱＧＬＡＶＰＴＩＳＳＦＦＰＰＧＹＱＶＳＦＣＬＶＭＶＬＬＦＡＶＤＴＧＬＹＦＳＶＫＴＮＩＲＳＳＴＲＤＷＫＤＨＫＦＫＷＲＫＤＰＱＤＫ；配列番号１）を有する。ある特定の代替法では、ＣＤ１６は、ＣＤ１６ａの位置１５８にバリンを有し、ＣＤ１６ａの位置１９７にプロリンを有する。ある特定の代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＩｇＫシグナルペプチドを含有する。ある特定の代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＣＤ１６シグナルペプチドを含有する。ある特定の代替法では、改変されたＣＤ１６は、ウイルス感染を介してＮＫ細胞に導入される。ある特定の代替法では、改変されたＣＤ１６は、ウイルス感染を介して造血細胞に導入され、次いで造血細胞はＮＫ細胞に分化する。ある特定の代替法では、改変されたＣＤ１６は、レンチウイルスベクターを介して導入される。ある特定の代替法では、レンチウイルスベクターは、ＣＭＶまたはＥＦ１αプロモーターのいずれかを有する。ある特定の代替法では、レンチウイルスベクターは、１種または複数の薬物選択マーカーを含む。ある特定の代替法では、改変されたＣＤ１６は、レトロウイルスベクターを介して導入される。ある特定の代替法では、レトロウイルスベクターは、１種または複数の薬物選択マーカーを含む。
【００６１】
ある特定の代替法では、本明細書において開示される改変されたＣＤ１６を有するＧＭ−ＮＫ細胞は、野生型ＣＤ１６を有するＮＫ細胞、例えば、天然に存在するＮＫ細胞よりも改善された抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を示す。
【００６２】
３．遺伝子改変を含むＧＭ  ＮＫ細胞
ある特定の代替法では、本明細書において提供されるＧＭ  ＮＫ細胞は、（１）ＣＢＬＢ、ＮＫＧ２Ａおよび／もしくはＴＧＦＢＲ２の発現および／または機能を欠き、またはＣＢＬＢ、ＮＫＧ２Ａおよび／もしくはＴＧＦＢＲ２の発現および／または機能の低減を示し、ならびに／または（２）本明細書に記載される改変されたＣＤ１６を含む。特定の代替法では、本明細書において提供されるＧＭ  ＮＫ細胞は、ＣＢＬＢおよびＴＧＦＢＲ２の発現および／または機能を欠く。
【００６３】
４．ＧＭ  ＮＫ細胞およびＧＭ  ＮＫ細胞集団の産生
ある特定の代替法では、本方法によるＧＭ  ＮＫ細胞および／またはＧＭ  ＮＫ細胞集団の産生は、造血細胞の集団を増殖させることを含む。ある特定の代替法では、ＮＫ細胞は、本明細書において、および参照によりその全文が本明細書に組み込まれる（特許文献１）に記載されるような、ＮＫ細胞を産生するための３５日の、３段階プロセスの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１日目に遺伝子改変される。ある特定の代替法では、ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞を産生するための３５日の、３段階プロセスの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０もしくは２１日目、または前記の日数のうちいずれか２つによって規定される範囲の間の任意の日数に遺伝子改変される。ある特定の代替法では、ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞を産生するための３５日の、３段階プロセスの３、５、７または９日目に遺伝子改変される。ある特定の代替法では、ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞を産生するための３５日の、３段階プロセスの３、５、７もしくは９日目、または任意の２つの前記の日数によって規定される範囲の間の任意の日数に遺伝子改変される。ある特定の代替法では、ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞を産生するための３５日の、３段階プロセスの５日目に遺伝子改変される。ある特定の代替法では、ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞を産生するための３５日の、３段階プロセスの３日目に遺伝子改変される。ある特定の代替法では、ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞を産生するための３５日の、３段階プロセスの７日目に遺伝子改変される。ある特定の代替法では、ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞を産生するための３５日の、３段階プロセスの９日目に遺伝子改変される。ある特定の代替法では、遺伝子改変は、本明細書に記載されるようなＣＢＬＢ、ＮＫＧ２Ａおよび／またはＴＧＦＢＲ２のノックアウトを含む。ある特定の代替法では、遺伝子改変は、本明細書に記載されるようなＣＢＬＢ、ＮＫＧ２Ａおよび／またはＴＧＦＢＲ２のノックアウトを含む。ある特定の代替法では、遺伝子改変は、本明細書に記載されるような改変されたＣＤ１６の導入を含む。
【００６４】
本明細書に記載されるようなノックアウトによる遺伝子改変は、当業者に公知の任意の方法によって行うことができる。例えば、ノックアウトは、ゲノム編集技術によって行うことができる。遺伝子は、ＲＮＡ干渉、ＣＲＩＳＰＲまたはＴＡＬＥＮを使用する技術を用いてノックアウトできる。ある特定の代替法では、ゲノム編集技術は、ＣＲＩＳＰＲ関連技術である。ある特定の代替法では、ゲノム編集技術は、メガヌクレアーゼ関連技術である。ある特定の代替法では、ゲノム編集技術は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）関連技術である。ある特定の代替法では、ゲノム編集技術は、転写アクチベーター様エフェクターベースのヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）関連技術である。
【００６５】
特定の代替法では、ＣＲＩＳＰＲ関連技術は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを含む。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用してノックアウトを産生するために、ＣｒｉｓｐｒガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を化学的に修飾し、単一ガイド（ｓｇＲＮＡ）形式で合成することができる。次いで、Ｃａｓ９をプソイドウリジン（Ψ）修飾を有するｍＲＮＡとして送達してもよい。次いで、ヌクレオフェクター（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ）を利用して、ｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９  ｍＲＮＡを細胞に送達することができる。
【００６６】
本明細書に記載される改変された遺伝子の導入は、当業者に公知の任意の方法によって行うことができる。例えば、遺伝子改変された遺伝子を、レトロウイルスベクターを介して導入してもよい。いくつかの代替法では、遺伝子改変された遺伝子は、レンチウイルスベクターを介して導入される。
【００６７】
例えば、ＮＫ細胞を産生するための３段階法における細胞増殖の際に、造血細胞集団内の複数の造血細胞がＮＫ細胞に分化する。このプロセスの際に、前記ＮＫ細胞は、得られたＮＫ細胞がＧＭ  ＮＫ細胞であるように遺伝子改変される。ある特定の代替法では、遺伝子改変は、細胞がＮＫ細胞に分化する前に実施される。ある特定の代替法では、遺伝子改変は、細胞がＮＫ細胞に分化した後に実施される。ある特定の代替法では、遺伝子改変は、ＮＫ前駆体細胞で実施される。一態様では、造血幹細胞または前駆体細胞、例えば、ＣＤ３４＋幹細胞または前駆体細胞を、幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１の培地中で培養して、第１の細胞の集団を産生すること、続いて、前記の第１の細胞の集団を、幹細胞動員剤およびインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠く第２の培地中で培養して、第２の細胞の集団を産生すること、続いて、前記の第２の細胞の集団を、ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、幹細胞動員剤およびＬＭＷＨを欠く第３の培地中で培養して、第３の細胞の集団を産生することを含む方法によってＮＫ細胞を産生することを含むＧＭ  ＮＫ細胞を産生する方法であって、第３の細胞の集団は、ＣＤ５６＋、ＣＤ３−であるナチュラルキラー細胞を含み、ナチュラルキラー細胞の少なくとも７０％、例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または前記のパーセンテージのいずれか２つによって規定される範囲内に入るパーセンテージが生存可能である方法が、本明細書において提供される。ある特定の代替法では、このようなナチュラルキラー細胞は、ＣＤ１６−であるナチュラルキラー細胞を含む。ある特定の代替法では、このようなナチュラルキラー細胞は、ＣＤ９４＋であるナチュラルキラー細胞を含む。ある特定の代替法では、このようなナチュラルキラー細胞は、ＣＤ９４＋またはＣＤ１６＋であるナチュラルキラー細胞を含む。ある特定の代替法では、このようなナチュラルキラー細胞は、ＣＤ９４−またはＣＤ１６−であるナチュラルキラー細胞を含む。ある特定の代替法では、このようなナチュラルキラー細胞は、ＣＤ９４＋およびＣＤ１６＋であるナチュラルキラー細胞を含む。ある特定の代替法では、このようなナチュラルキラー細胞は、ＣＤ９４−およびＣＤ１６−であるナチュラルキラー細胞を含む。ある特定の代替法では、前記の第１の培地および／または前記の第２の培地は、白血病阻害因子（ＬＩＦ）および／またはマクロファージ炎症性タンパク質−１アルファ（ＭＩＰ−Ια）を欠く。ある特定の代替法では、前記の第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよび／またはＦＭＳ様チロシンキナーゼ−３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）を欠く。特定の代替法では、前記の第１の培地および前記の第２の培地は、ＬＩＦおよび／またはＭＩＰ−１αを欠き、前記の第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよび／またはＦｌｔ３Ｌを欠く。ある特定の代替法では、第１の培地、第２の培地または第３の培地のいずれも、ヘパリン、例えば、低分子量ヘパリンを含まない。
【００６８】
一態様では、（ａ）造血幹細胞または前駆体細胞を、幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１の培地中で培養して、第１の細胞の集団を産生することと、（ｂ）第１の細胞の集団を、幹細胞動員剤およびインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠く第２の培地中で培養して、第２の細胞の集団を産生することと、（ｃ）第２の細胞の集団を、ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、ＬＭＷＨを欠く第３の培地中で培養して、第３の細胞の集団を産生することとを含む方法によってＮＫ細胞を産生することを含むＧＭ  ＮＫ細胞を産生する方法であって、第３の細胞の集団が、ＣＤ５６＋、ＣＤ３−およびＣＤ１１ａ＋であるナチュラルキラー細胞を含む方法が、本明細書において提供される。ある特定の代替法では、前記の第１の培地および／または前記の第２の培地は、白血病阻害因子（ＬＩＦ）および／またはマクロファージ炎症性タンパク質−１アルファ（ＭＩＰ−１α）を欠く。ある特定の代替法では、前記の第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよび／またはＦＭＳ様チロシンキナーゼ−３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）を欠く。特定の代替法では、前記の第１の培地および前記の第２の培地は、ＬＩＦおよび／またはＭＩＰ−１αを欠き、前記の第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよび／またはＦｌｔ３Ｌを欠く。ある特定の代替法では、第１の培地、第２の培地または第３の培地のいずれも、ヘパリン、例えば、低分子量ヘパリンを含まない。
【００６９】
一態様では、（ａ）造血幹細胞または前駆体細胞を、幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１の培地中で培養して、第１の細胞の集団を産生することと、（ｂ）第１の細胞の集団を、幹細胞動員剤およびインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠く第２の培地中で培養して、第２の細胞の集団を産生することと、（ｃ）第２の細胞の集団を、ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、幹細胞因子（ＳＣＦ）およびＬＭＷＨの各々を欠く第３の培地中で培養して、第３の細胞の集団を産生することとを含む方法によってＮＫ細胞を産生することを含むＧＭ  ＮＫ細胞を産生する方法であって、第３の細胞の集団が、ＣＤ５６＋、ＣＤ３−およびＣＤ１１ａ＋であるナチュラルキラー細胞を含む方法が本明細書において提供される。ある特定の代替法では、前記の第１の培地および／または前記の第２の培地は、白血病阻害性因子（ＬＩＦ）および／またはマクロファージ炎症性タンパク質−１アルファ（ＭＩＰ−１α）を欠く。ある特定の代替法では、前記の第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよび／またはＦＭＳ様チロシンキナーゼ−３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）を欠く。特定の代替法では、前記の第１の培地および前記の第２の培地は、ＬＩＦおよび／またはＭＩＰ−１αを欠き、前記の第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよび／またはＦｌｔ３Ｌを欠く。ある特定の代替法では、第１の培地、第２の培地または第３の培地のいずれも、ヘパリン、例えば、低分子量ヘパリンを含まない。
【００７０】
一態様では、（ａ）造血幹細胞または前駆体細胞を、幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１の培地中で培養して、第１の細胞の集団を産生することと、（ｂ）第１の細胞の集団を、幹細胞動員剤およびインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠く第２の培地中で培養して、第２の細胞の集団を産生することと、（ｃ）第２の細胞の集団を、ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、ＳＣＦ、幹細胞動員剤およびＬＭＷＨの各々を欠く第３の培地中で培養して、第３の細胞の集団を産生することとを含む方法によってＮＫ細胞を産生することを含むＧＭ  ＮＫ細胞を産生する方法であって、第３の細胞の集団が、ＣＤ５６＋、ＣＤ３−およびＣＤ１１ａ＋であるナチュラルキラー細胞を含む方法が本明細書において提供される。ある特定の代替法では、前記の第１の培地および／または前記の第２の培地は、白血病阻害因子（ＬＩＦ）および／またはマクロファージ炎症性タンパク質−１アルファ（ＭＩＰ−１α）を欠く。ある特定の代替法では、前記の第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよび／またはＦＭＳ様チロシンキナーゼ−３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）を欠く。特定の代替法では、前記の第１の培地および前記第２の培地は、ＬＩＦおよび／またはＭＩＰ−１αを欠き、前記の第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよび／またはＦｌｔ３Ｌを欠く。ある特定の代替法では、第１の培地、第２の培地または第３の培地のいずれも、ヘパリン、例えば、低分子量ヘパリンを含まない。
【００７１】
一態様では、（ａ）造血幹細胞または前駆体細胞を、幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１の培地中で培養して、第１の細胞の集団を産生することと、（ｂ）第１の細胞の集団を、幹細胞動員剤およびインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠く第２の培地中で培養して、第２の細胞の集団を産生することと、（ｃ）第２の細胞の集団を、ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、幹細胞動員剤およびＬＭＷＨの各々を欠く第３の培地中で培養して、第３の細胞の集団を産生することと、（ｄ）第３の細胞の集団からＣＤ１１ａ＋細胞を単離して、第４の細胞の集団を産生することとを含む方法によってＮＫ細胞を産生することを含むＧＭ  ＮＫ細胞を産生する方法であって、第４の細胞の集団が、ＣＤ５６＋、ＣＤ３−およびＣＤ１１ａ＋であるナチュラルキラー細胞を含む方法が、本明細書において提供される。ある特定の代替法では、前記の第１の培地および／または前記の第２の培地は、白血病阻害因子（ＬＩＦ）および／またはマクロファージ炎症性タンパク質−１アルファ（ＭＩＰ−１α）を欠く。ある特定の代替法では、前記の第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよび／またはＦＭＳ様チロシンキナーゼ−３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）を欠く。特定の代替法では、前記の第１の培地および前記の第２の培地は、ＬＩＦおよび／またはＭＩＰ−１αを欠き、前記の第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよび／またはＦｌｔ３Ｌを欠く。ある特定の代替法では、第１の培地、第２の培地または第３の培地のいずれも、ヘパリン、例えば、低分子量ヘパリンを含まない。
【００７２】
上記の代替法のいずれかのある特定の代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、パーフォリンおよび／またはＥＯＭＥＳを発現する。ある特定の代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、ＲＯＲγｔおよび／またはＩＬ１Ｒ１のいずれかを発現しない。
【００７３】
本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫ細胞は、任意の種類のＮＫ細胞から、またはＮＫ細胞を産生する任意の産生方法によって産生できる。本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫ細胞は、本明細書に記載される方法を使用して単離または産生できる。ある特定の代替法では、本明細書における方法を使用して産生されたＮＫ細胞が、産生後にＧＭ  ＮＫ細胞を産生するために改変される。ある特定の代替法では、本明細書における方法を使用して産生されたＮＫ細胞が、産生の際にＧＭ  ＮＫ細胞を産生するために改変される。ある特定の代替法では、本明細書における方法を使用して産生されたＮＫ細胞は、産生前にＧＭ  ＮＫ細胞を産生するために改変される。本明細書においてＧＭ  ＮＫ細胞は、遺伝子改変が直接行われた細胞および遺伝子改変を含むこのような細胞の任意の後代を指す。ある特定の代替法では、本明細書において提供されるＧＭ  ＮＫ細胞は、３段階法、例えば、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる（特許文献１）に記載されるような３段階法によって産生される。ある特定の代替法では、本明細書において提供されるＧＭ  ＮＫ細胞は、胎盤ＮＫ細胞、例えば、各々参照によりその全文が本明細書に組み込まれる（特許文献２）、（特許文献３）および／または（特許文献４）に記載されるような胎盤ＮＫ細胞から産生される。ある特定の代替法では、本明細書において提供されるＧＭ  ＮＫ細胞は、各々参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、（特許文献５）および／または（特許文献６）に記載されるような２ステップまたは３ステップ法によって産生される。ある特定の代替法では、本明細書において提供されるＧＭ  ＮＫ細胞は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる（特許文献７）に記載される方法のいずれかによって産生される。
【００７４】
ａ．６．４．１  ３段階法を使用するＧＭ  ＮＫ細胞集団の産生
１つの代替法では、本明細書において提供されるＧＭ  ＮＫ細胞は、３段階法、例えば、その全文が参照により本明細書に組み込まれる（特許文献１）に記載されるような３段階法によって産生される。ある特定の代替法では、遺伝子改変は、第１、第２および／または第３段階の間にＮＫ細胞中に導入される。ある特定の代替法では、遺伝子改変は、第１および第２の段階の間にＮＫ細胞中に導入される。ある特定の代替法では、遺伝子改変は、第１および第３段階の間にＮＫ細胞中に導入される。ある特定の代替法では、遺伝子改変は、第２および第３段階の間にＮＫ細胞中に導入される。ある特定の代替法では、遺伝子改変は、第１段階の間にＮＫ細胞中に導入される。ある特定の代替法では、遺伝子改変は、第２段階の間にＮＫ細胞中に導入される。ある特定の代替法では、遺伝子改変は、第３段階の間にＮＫ細胞中に導入される。
【００７５】
特定の代替法では、３段階法は、造血幹細胞または前駆体細胞、例えば、ＣＤ３４＋幹細胞または前駆体細胞を、第１の細胞の集団を産生するために、本明細書に記載されるように第１の培地中で指定の期間培養することを含む第１段階（「段階１」）を含む。ある特定の代替法では、第１の培地は、幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む。ある特定の代替法では、第１の培地は、幹細胞動員剤およびＴｐｏに加えて、ＬＭＷＨ、Ｆｌｔ−３Ｌ、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよび／またはＧＭ−ＣＳＦのうち１種または複数を含む。特定の代替法では、第１の培地は、幹細胞動員剤およびＴｐｏに加えて、ＬＭＷＨ、Ｆｌｔ−３Ｌ、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよび／またはＧＭ−ＣＳＦの各々を含む第１の培地の各々を含む。特定の代替法では、第１の培地は、添加されるＬＭＷＨを欠く。特定の代替法では、第１の培地は、添加される脱硫酸化グリコサミノグリカンを欠く。特定の代替法では、第１の培地は、ＬＭＷＨを欠く。特定の代替法では、第１の培地は、脱硫酸化グリコサミノグリカンを欠く。特定の代替法では、第１の培地は、幹細胞動員剤およびＴｐｏに加えて、Ｆｌｔ−３Ｌ、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよび／またはＧＭ−ＣＳＦのうち各々を含む第１の培地の各々を含む。特定の代替法では、第１の培地は、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、マクロファージ阻害性タンパク質−１アルファ（ＭＩＰ１α）または両方を欠く。
【００７６】
ある特定の代替法では、続いて、「段階２」において、前記細胞は、第２の細胞の集団を産生するために、本明細書に記載されるように第２の培地中で指定の期間培養される。ある特定の代替法では、第２の培地は、幹細胞動員剤およびインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠く。ある特定の代替法では、第２の培地は、幹細胞動員剤およびＩＬ−１５に加えて、ＬＭＷＨ、Ｆｌｔ−３、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよび／またはＧＭ−ＣＳＦのうち１種または複数を含む。ある特定の代替法では、第２の培地は、幹細胞動員剤およびＩＬ−１５に加えて、ＬＭＷＨ、Ｆｌｔ−３、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよび／またはＧＭ−ＣＳＦの各々を含む。特定の代替法では、第２の培地は、添加されるＬＭＷＨを欠く。特定の代替法では、第２の培地は、添加される脱硫酸化グリコサミノグリカンを欠く。特定の代替法では、第２の培地は、ヘパリン、例えば、ＬＭＷＨを欠く。特定の代替法では、第２の培地は、脱硫酸化グリコサミノグリカンを欠く。ある特定の代替法では、第２の培地は、幹細胞動員剤およびＩＬ−１５に加えて、Ｆｌｔ−３、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよび／またはＧＭ−ＣＳＦの各々を含む。特定の代替法では、第２の培地は、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、マクロファージ阻害性タンパク質−１アルファ（ＭＩＰ−１α）または両方を欠く。
【００７７】
ある特定の代替法では、続いて、「段階３」において、前記細胞は、第３の細胞の集団、例えば、ナチュラルキラー細胞を産生するために、本明細書に記載されるように第３の培地中で指定の期間培養される。ある特定の代替法では、第３の培地は、ＩＬ−２および／またはＩＬ−１５を含み、幹細胞動員剤および／またはＬＭＷＨを欠く。ある特定の代替法では、第３の培地は、ＩＬ−２および／またはＩＬ−１５に加えて、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよび／またはＧＭ−ＣＳＦのうち１種または複数を含む。ある特定の代替法では、第３の培地は、ＩＬ−２および／またはＩＬ−１５に加えて、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよび／またはＧＭ−ＣＳＦの各々を含む。特定の代替法では、第１の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよび／またはＦｌｔ３Ｌのうち１種、２種または３種すべてを欠く。特定の代替法では、第３の培地は、添加される脱硫酸化グリコサミノグリカンを欠く。特定の代替法では、第３の培地は、脱硫酸化グリコサミノグリカンを欠く。特定の代替法では、第３の培地は、ヘパリン、例えば、ＬＭＷＨを欠く。
【００７８】
特定の代替法では、ＮＫ細胞集団を産生するために３段階法が使用される。ある特定の代替法では、３段階法は、間質フィーダー細胞支持体の不在下で実施される。ある特定の代替法では、３段階法は、外因的に添加されるステロイド（例えば、コルチゾン、ヒドロコルチゾンまたはそれらの誘導体）の不在下で実施される。
【００７９】
ある特定の態様では、３段階法は、少なくとも２０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ナチュラルキラー細胞を含むナチュラルキラー細胞を産生する。ある特定の態様では、３段階法は、少なくとも４０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ナチュラルキラー細胞を含むナチュラルキラー細胞を産生する。ある特定の態様では、３段階法は、少なくとも６０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ナチュラルキラー細胞を含むナチュラルキラー細胞を産生する。ある特定の態様では、段階法は、少なくとも７０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ナチュラルキラー細胞を含むナチュラルキラー細胞を産生する。ある特定の態様では、３段階法は、少なくとも８０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ナチュラルキラー細胞を含むナチュラルキラー細胞を産生する。ある特定の態様では、３段階法は、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％もしくは８０％または前記のパーセンテージのいずれか２つによって規定される範囲の間のパーセントのＣＤ５６＋ＣＤ３−ナチュラルキラー細胞を含むナチュラルキラー細胞を産生する。
【００８０】
ある特定の態様では、本明細書に記載される３段階法は、少なくとも２０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ＣＤ１１ａ＋ナチュラルキラー細胞を含むナチュラルキラー細胞を産生する。ある特定の態様では、本明細書に記載される３段階法は、少なくとも４０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ＣＤ１１ａ＋ナチュラルキラー細胞を含むナチュラルキラー細胞を産生する。ある特定の態様では、本明細書に記載される３段階法は、少なくとも６０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ＣＤ１１ａ＋ナチュラルキラー細胞を含むナチュラルキラー細胞を産生する。ある特定の態様では、本明細書に記載される３段階法は、少なくとも８０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ＣＤ１１ａ＋ナチュラルキラー細胞を含むナチュラルキラー細胞を産生する。ある特定の態様では、本明細書に記載される３段階法は、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％もしくは８０％または前記のパーセンテージのいずれか２つによって規定される範囲の間のパーセントのＣＤ５６＋ＣＤ３−ＣＤ１１ａ＋ナチュラルキラー細胞を含むナチュラルキラー細胞を産生する。
【００８１】
ある特定の態様では、３段階法は、前記ナチュラルキラー細胞および前記Ｋ５６２細胞が、１０：１の比でｉｎ  ｖｉｔｒｏで同時培養される場合に、Ｋ５６２細胞に対して少なくとも２０％の細胞毒性を示すナチュラルキラー細胞を産生する。ある特定の態様では、３段階法は、前記ナチュラルキラー細胞および前記Ｋ５６２細胞が、１０：１の比でｉｎ  ｖｉｔｒｏで同時培養される場合に、Ｋ５６２細胞に対して少なくとも３５％の細胞毒性を示すナチュラルキラー細胞を産生する。ある特定の態様では、３段階法は、前記ナチュラルキラー細胞および前記Ｋ５６２細胞が、１０：１の比でｉｎ  ｖｉｔｒｏで同時培養される場合に、Ｋ５６２細胞に対して少なくとも４５％の細胞毒性を示すナチュラルキラー細胞を産生する。ある特定の態様では、３段階法は、前記ナチュラルキラー細胞および前記Ｋ５６２細胞が、１０：１の比でｉｎ  ｖｉｔｒｏで同時培養される場合に、Ｋ５６２細胞に対して少なくとも６０％の細胞毒性を示すナチュラルキラー細胞を産生する。ある特定の態様では、３段階法は、前記ナチュラルキラー細胞および前記Ｋ５６２細胞が、１０：１の比でｉｎ  ｖｉｔｒｏで同時培養される場合に、Ｋ５６２細胞に対して少なくとも７５％の細胞毒性を示すナチュラルキラー細胞を産生する。ある特定の態様では、３段階法は、前記ナチュラルキラー細胞および前記Ｋ５６２細胞が、１０：１の比でｉｎ  ｖｉｔｒｏで同時培養される場合に、Ｋ５６２細胞に対して少なくとも３５％、４５％、５５％、６５％もしくは７５％または前記のパーセンテージのいずれか２つによって規定される範囲の間のパーセントの細胞毒性を示すナチュラルキラー細胞を産生する。
【００８２】
ある特定の態様では、前記の第３の培養ステップ後、前記の第３の細胞の集団、例えば、前記のＧＭ  ＮＫ細胞の集団は、凍結保存される。ある特定の態様では、前記の第４のステップ後、前記の第４の細胞の集団、例えば、前記のＧＭ  ＮＫ細胞の集団は、凍結保存される。
【００８３】
ある特定の態様では、ナチュラルキラー細胞、すなわち、本明細書に記載される３段階法によって産生されたナチュラルキラー細胞を含む細胞の集団が、本明細書において提供される。したがって、本明細書に記載される３段階法によって産生された単離されたナチュラルキラー細胞集団が、本明細書において提供される。特定の代替法では、前記ナチュラルキラー細胞集団は、少なくとも２０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ナチュラルキラー細胞を含む。特定の代替法では、前記ナチュラルキラー細胞集団は、少なくとも４０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ナチュラルキラー細胞を含む。特定の代替法では、前記ナチュラルキラー細胞集団は、少なくとも６０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ナチュラルキラー細胞を含む。特定の代替法では、前記ナチュラルキラー細胞集団は、少なくとも８０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ナチュラルキラー細胞を含む。特定の代替法では、前記ナチュラルキラー細胞集団は、少なくとも６０％のＣＤ１６−細胞を含む。特定の代替法では、前記ナチュラルキラー細胞集団は、少なくとも８０％のＣＤ１６−細胞を含む。特定の代替法では、前記ナチュラルキラー細胞集団は、少なくとも２０％、４０％、６０％もしくは８０％または前記のパーセンテージのいずれか２つによって規定される範囲の間のパーセントのＣＤ５６＋ＣＤ３−ナチュラルキラー細胞を含む。特定の代替法では、前記ナチュラルキラー細胞集団は、少なくとも２０％のＣＤ９４＋細胞を含む。特定の代替法では、前記ナチュラルキラー細胞集団は、少なくとも４０％のＣＤ９４＋細胞を含む。
【００８４】
ある特定の態様では、ＣＤ５６＋ＣＤ３−ＣＤ１１７＋ＣＤ１１ａ＋ナチュラルキラー細胞の集団が本明細書において提供され、前記ナチュラルキラー細胞は、パーフォリンおよび／またはＥＯＭＥＳを発現し、ＲＯＲγｔ、アリール炭化水素受容体（ＡＨＲ）および／またはＩＬ１Ｒ１のうち１種または複数を発現しない。ある特定の態様では、前記ナチュラルキラー細胞は、パーフォリンおよびＥＯＭＥＳを発現し、ＲＯＲγｔ、アリール炭化水素受容体および／またはＩＬ１Ｒ１のいずれも発現しない。ある特定の態様では、前記ナチュラルキラー細胞は、Ｔ−ｂｅｔ、ＧＺＭＢ、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０および／またはＮＫＧ２Ｄをさらに発現する。ある特定の態様では、前記ナチュラルキラー細胞は、ＣＤ９４を発現する。ある特定の態様では、前記ナチュラルキラー細胞は、ＣＤ９４を発現しない。
【００８５】
ある特定の態様では、（ａ）造血幹細胞または前駆体細胞を、幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１の培地中で培養して、第１の細胞の集団を産生することと、（ｂ）第１の細胞の集団を、幹細胞動員剤およびインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠く第２の培地中で培養して、第２の細胞の集団を産生することと、（ｃ）第２の細胞の集団を、ＩＬ−２および／またはＩＬ−１５を含み、幹細胞動員剤および／またはＬＭＷＨの各々を欠く第３の培地中で培養して、第３の細胞の集団を産生することと、（ｄ）第３の細胞の集団からＣＤ１１ａ＋細胞およびＣＤ１１ａ−細胞を分離することと、（ｅ）ＣＤ１１ａ＋細胞を、ＣＤ１１ａ−細胞を、５０：１、４０：１、３０：１、２０：１、１０：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：１０、１：２０、１：３０、１：４０または１：５０の比で、または前記の比のいずれか２つによって規定される範囲の間の比で組み合わせて、第４の細胞の集団を産生することとを含むＧＭ  ＮＫ細胞を含む細胞集団を産生する方法が、本明細書において提供される。ある特定の代替法では、前記の第１の培地および／または前記の第２の培地は、白血病阻害因子（ＬＩＦ）および／またはマクロファージ炎症性タンパク質−１アルファ（ＭＩＰ−１α）を欠く。ある特定の代替法では、前記の第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよび／またはＦＭＳ様チロシンキナーゼ−３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）を欠く。特定の代替法では、前記の第１の培地および前記の第２の培地は、ＬＩＦおよび／またはＭＩＰ−１αを欠き、前記の第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよび／またはＦｌｔ３Ｌを欠く。ある特定の代替法では、第１の培地、第２の培地または第３の培地のいずれも、ヘパリン、例えば、低分子量ヘパリンを含まない。ある特定の態様では、第４の細胞の集団では、ＣＤ１１ａ＋細胞およびＣＤ１１ａ−細胞は、５０：１、２０：１、１０：１、５：１もしくは１：１または上記の比のいずれか２つによって規定される範囲の間の任意の比で組み合わされる。ある特定の態様では、第４の細胞の集団では、ＣＤ１１ａ＋細胞およびＣＤ１１ａ−細胞は、５０：１の比で組み合わされる。ある特定の態様では、第４の細胞の集団では、ＣＤ１１ａ＋細胞およびＣＤ１１ａ−細胞は、２０：１の比で組み合わされる。ある特定の態様では、第４の細胞の集団では、ＣＤ１１ａ＋細胞およびＣＤ１１ａ−細胞は、１０：１の比で組み合わされる。ある特定の態様では、第４の細胞の集団では、ＣＤ１１ａ＋細胞およびＣＤ１１ａ−細胞は、５：１の比で組み合わされる。ある特定の態様では、第４の細胞の集団では、ＣＤ１１ａ＋細胞およびＣＤ１１ａ−細胞は、１：１の比で組み合わされる。ある特定の態様では、第４の細胞の集団では、ＣＤ１１ａ＋細胞およびＣＤ１１ａ−細胞は、１：５の比で組み合わされる。ある特定の態様では、第４の細胞の集団では、ＣＤ１１ａ＋細胞およびＣＤ１１ａ−細胞は、１：１０の比で組み合わされる。ある特定の態様では、第４の細胞の集団では、ＣＤ１１ａ＋細胞およびＣＤ１１ａ−細胞は、１：２０の比で組み合わされる。ある特定の態様では、��４の細胞の集団では、ＣＤ１１ａ＋細胞およびＣＤ１１ａ−細胞は、１：５０の比で組み合わされる。
【００８６】
５．ＮＫ細胞の単離
ナチュラルキラー細胞を単離する方法は、当技術分野で公知であり、ＮＫ細胞、例えば、ＧＭ  ＮＫ細胞を単離するために使用できる。例えば、ＮＫ細胞を、例えば、細胞を、１つの代替法では、ＣＤ５６およびＣＤ３に対する抗体を用いて染色することおよびＣＤ５６＋ＣＤ３−細胞を選択することによって単離または濃縮できる。ある特定の代替法では、ＮＫ細胞は、本明細書に記載される３段階法を使用して産生された総細胞との比較において、ＣＤ５６＋ＣＤ３−細胞について濃縮される。ＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載される３段階法を使用して産生された細胞を、市販のキット、例えば、ＮＫ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して単離できる。ＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載される３段階法を使用して産生された細胞はまた、ＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載される３段階法を使用して産生された細胞を含む細胞の集団におけるＮＫ細胞以外の細胞の除去によって単離または濃縮できる。例えば、ＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載される３段階法を使用して産生された細胞を、例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３６、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ１２３、ＨＬＡ  ＤＲおよび／またはＣＤ２３５ａ（グリコホリンＡ）のうち１種または複数に対する抗体を使用する、非ＮＫ細胞マーカーを示す細胞の枯渇によって単離または濃縮してもよい。陰性単離は、市販のキット、例えば、ＮＫ細胞陰性単離キット（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して実施できる。これらの方法によって単離された細胞を、ＣＤ１１ａ＋およびＣＤ１１ａ−細胞ならびに／またはＣＤ１１７＋およびＣＤ１１７−細胞および／またはＣＤ１６＋およびＣＤ１６−細胞および／またはＣＤ９４＋およびＣＤ９４−を分離するためにさらに選別してもよい。ある特定の代替法では、細胞、例えば、本明細書に記載される３ステップ法によって産生された細胞が、ＣＤ１１ａ＋およびＣＤ１１ａ−細胞を分離するために選別される。特定の代替法では、ＣＤ１１ａ＋細胞は単離される。ある特定の代替法では、細胞は、本明細書に記載される３段階法を使用して産生された総細胞との比較において、ＣＤ１１ａ＋細胞について濃縮される。特定の代替法では、ＣＤ１１ａ−細胞が単離される。ある特定の代替法では、細胞は、本明細書に記載される３段階法を使用して産生された総細胞との比較において、ＣＤ１１ａ−細胞について濃縮される。ある特定の代替法では、細胞は、ＣＤ１１７＋およびＣＤ１１７−細胞を分離するために選別される。特定の代替法では、ＣＤ１１７＋細胞が単離される。ある特定の代替法では、細胞は、本明細書に記載される３段階法を使用して産生された総細胞との比較において、ＣＤ１１７＋細胞について濃縮される。特定の代替法では、ＣＤ１１７−細胞が単離される。ある特定の代替法では、細胞は、本明細書に記載される３段階法を使用して産生された総細胞との比較において、ＣＤ１１７−細胞について濃縮される。細胞を選択および濃縮する方法は、当業者に公知であり、細胞を、例えば、細胞表面タンパク質を標的化することによって選択してもよい。ある特定の代替法では、細胞は、ＣＤ１６＋およびＣＤ１６−細胞を分離するために選別���れる。特定の代替法では、ＣＤ１６＋細胞が単離される。ある特定の代替法では、細胞は、本明細書に記載される３段階法を使用して産生された総細胞との比較において、ＣＤ１６＋細胞について濃縮される。特定の代替法では、ＣＤ１６−細胞が単離される。ある特定の代替法では、細胞は、本明細書に記載される３段階法を使用して産生された総細胞との比較において、ＣＤ１６−細胞について濃縮される。ある特定の代替法では、細胞は、ＣＤ９４＋およびＣＤ９４−細胞を分離するために選別される。特定の代替法では、ＣＤ９４＋細胞が単離される。ある特定の代替法では、細胞は、本明細書に記載される３段階法を使用して産生された総細胞との比較において、ＣＤ９４＋細胞について濃縮される。特定の代替法では、ＣＤ９４−細胞が単離される。ある特定の代替法では、細胞は、本明細書に記載される３段階法を使用して産生された総細胞との比較において、ＣＤ９４−細胞について濃縮される。ある特定の代替法では、単離は、磁性分離を使用して実施される。ある特定の代替法では、単離は、フローサイトメトリーを使用して実施される。
【００８７】
１つの代替法では、ＮＫ細胞、例えば、ＧＭ  ＮＫ細胞は、ＣＤ５６＋ＣＤ３−ＣＤ９４＋ＣＤ１１ａ＋細胞について選択することによって単離または濃縮される。ある特定の代替法では、ＮＫ細胞は、本明細書に記載される３段階法を使用して産生された総細胞との比較において、ＣＤ５６＋ＣＤ３−ＣＤ９４＋ＣＤ１１ａ＋細胞について濃縮される。１つの代替法では、ＮＫ細胞は、ＣＤ５６＋ＣＤ３−ＣＤ９４＋ＣＤ１１ａ＋ＣＤ１１７−細胞について選択することによって単離または濃縮される。ある特定の代替法では、ＮＫ細胞は、本明細書に記載される３段階法を使用して産生された総細胞との比較において、ＣＤ５６＋ＣＤ３−ＣＤ９４＋ＣＤ１１ａ＋ＣＤ１１７−細胞について濃縮される。
【００８８】
細胞分離は、例えば、フローサイトメトリー、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によって、または１つの代替法では、特異的抗体とコンジュゲートしているミクロビーズを使用する磁性セルソーティングによって達成できる。細胞は、例えば、磁性活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）技術、１種または複数の特異的抗体、例えば、抗ＣＤ５６抗体を含む磁性ビーズ（例えば、０．５〜１００μｍ径）と結合するその能力に基づいて粒子を分離する方法を使用して単離できる。磁性細胞分離は、例えば、ＡＵＴＯＭＡＣＳ（商標）Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して実施および自動化できる。種々の有用な改変は、特定の細胞表面分子またはハプテンを特異的に認識する抗体の共有結合付加を含む磁性ミクロスフェアで実施できる。次いで、ビーズを細胞と混合し、結合させる。次いで、細胞を磁場に通して、特異的細胞表面マーカーを有する細胞を分離除去する。１つの代替法では、次いで、これらの細胞を、単離し、さらなる細胞表面マーカーに対する抗体にカップリングされた磁性ビーズと再度混合してもよい。細胞を磁場に再度通し、両抗体に結合された細胞を単離する。次いで、このような細胞を希釈し、クローン単離のためにマイクロタイターディッシュなどの別個のディッシュに分離してもよい。
【００８９】
６．ＧＭ  ＮＫ細胞
本明細書において提供されるＧＭ  ＮＫ細胞は、本明細書に記載される方法のいずれかによって産生されるＮＫ細胞の集団ならびに任意の組織供給源、例えば、ヒト組織供給源から単離されたＮＫ細胞を含む。
【００９０】
ａ．６．６．１  ３段階法によって産生されたＧＭ  ＮＫ細胞
別の代替法では、単離されたＧＭ  ＮＫ細胞集団が本明細書において提供され、これでは、ＮＫ細胞は、上記の３段階法に従って産生され、遺伝子改変は、ＧＭ  ＮＫ細胞集団を産生するための３段階のうちの１つまたは複数の間に導入される。
【００９１】
１つの代替法では、単離されたＧＭ  ＮＫ細胞集団が本明細書において提供され、これでは、ＮＫ細胞集団は、本明細書に記載される３段階法によって産生され、前記ＮＫ細胞集団は、ＧＭ  ＮＫ細胞集団を産生するために遺伝子改変され、前記ＮＫ細胞集団は、５０％またはそれより多いＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞を含む。ある特定の代替法では、前記ＮＫ細胞集団中のＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞は、さらにＮＫｐ４６＋であるＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞を含む。ある特定の代替法では、前記ＮＫ細胞集団中の前記ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞は、さらにＣＤ１６−であるＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞を含む。ある特定の代替法では、前記ＮＫ細胞集団中の前記ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞は、さらにＣＤ１６＋であるＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞を含む。ある特定の代替法では、前記ＮＫ細胞集団中の前記ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞は、さらにＣＤ９４−であるＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞を含む。ある特定の代替法では、前記ＮＫ細胞集団中の前記ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞は、さらにＣＤ９４＋であるＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞を含む。ある特定の代替法では、前記ＮＫ細胞集団中の前記ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞は、さらにＣＤ１１ａ＋であるＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞を含む。ある特定の代替法では、前記ＮＫ細胞集団中の前記ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞は、さらにＮＫｐ３０＋であるＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞を含む。ある特定の代替法では、前記ＮＫ細胞集団中の前記ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞は、さらにＣＤ１６１＋であるＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞を含む。ある特定の代替法では、前記ＮＫ細胞集団中の前記ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞は、さらにＤＮＡＭ−１＋であるＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞を含む。ある特定の代替法では、前記ＮＫ細胞集団中の前記ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞は、さらにＴ−ｂｅｔ＋であるＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞を含む。
【００９２】
１つの代替法では、本明細書に記載される３段階法によって産生されるＮＫ細胞集団は、ＣＤ１１７＋である細胞を含む。１つの代替法では、本明細書に記載される３段階法によって産生されるＮＫ細胞集団は、ＮＫＧ２Ｄ＋である細胞を含む。１つの代替法では、本明細書に記載される３段階法によって産生されるＮＫ細胞集団は、ＮＫｐ４４＋である細胞を含む。１つの代替法では、本明細書に記載される３段階法によって産生されるＮＫ細胞集団は、ＣＤ２４４＋である細胞を含む。１つの代替法では、本明細書に記載される３段階法によって産生されるＮＫ細胞集団は、パーフォリンを発現する細胞を含む。１つの代替法では、本明細書に記載される３段階法によって産生されるＮＫ細胞集団は、ＥＯＭＥＳを発現する細胞を含む。１つの代替法では、本明細書に記載される３段階法によって産生されるＮＫ細胞集団は、グランザイムＢを発現する細胞を含む。１つの代替法では、本明細書に記載される３段階法によって産生されるＮＫ細胞集団は、ＩＦＮγ、ＧＭ−ＣＳＦおよび／またはＴＮＦαを分泌する細胞を含む。
【００９３】
７．細胞の保存
細胞、例えば、本明細書において提供される、または本明細書に記載される方法を使用して産生されるＧＭ  ＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載される３段階法を使用して産生されるＧＭ  ＮＫ細胞集団は、保存できる、すなわち、長期貯蔵を可能にする条件下または例えば、アポトーシスもしくは壊死による細胞死を阻害する条件下に置くことができる。
【００９４】
適した凍結保存培地として、それだけには限らないが、生理食塩水、例えば、成長培地を含む培養培地または細胞凍結培地、例えば、市販の細胞凍結培地、例えば、Ｃ２６９５、Ｃ２６３９またはＣ６０３９（Ｓｉｇｍａ）、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ２、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ５またはＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０（ＢｉｏＬｉｆｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）が挙げられる。１つの代替法では、凍結保存培地は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０％（ｖ／ｖ）または上記のパーセンテージのうち任意の２つによって規定される範囲の間の任意のパーセントｖ／ｖの濃度のＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を含む。凍結保存培地は、さらなる薬剤、例えば、メチルセルロース、デキストラン、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）、トレハロースおよび／またはグリセロールを含み得る。ある特定の代替法では、凍結保存培地は、約１％〜１０％のＤＭＳＯ、約２５％〜７５％デキストランおよび／または約２０〜６０％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む。ある特定の代替法では、凍結保存培地は、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％または１０％のＤＭＳＯまたは上記のパーセンテージのうち任意の２つによって規定される範囲の間の任意のパーセンテージのＤＭＳＯを含む。ある特定の代替法では、凍結保存培地は、２５％、３５％、４５％、５５％、６５％、７０％、７５％のデキストランまたは上記のパーセンテージのうち任意の２つによって規定される範囲の間の任意のパーセンテージのデキストランを含む。ある特定の代替法では、凍結保存培地は、２０％、３０％、４０％、５０％または６０％のＨＳＡまたは上記のパーセンテージのうち任意の２つによって規定される範囲の間の任意のパーセンテージのＨＳＡを含む。ある特定の代替法では、凍結保存培地は、１％〜１０％のＤＭＳＯ、２５％〜７５％のトレハロースおよび／または２０〜６０％のヒトＨＳＡを含む。ある特定の代替法では、凍結保存培地は、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％または１０％のＤＭＳＯまたは上記のパーセンテージのうち任意の２つによって規定される範囲の間の任意のパーセンテージのＤＭＳＯを含む。ある特定の代替法では、凍結保存培地は、２５％、３５％、４５％、５５％、６５％、７０％、７５％のトレハロースまたは上記のパーセンテージのうち任意の２つによって規定される範囲の間の任意のパーセンテージのトレハロースを含む。ある特定の代替法では、凍結保存培地は、２０％、３０％、４０％、５０％または６０％のＨＳＡまたは上記のパーセンテージのうち任意の２つによって規定される範囲の間の任意のパーセンテージのＨＳＡを含む。特定の代替法では、凍結保存培地は、５％のＤＭＳＯ、５５％のデキストランおよび４０％のＨＳＡを含む。より特定の代替法では、凍結保存培地は、５％のＤＭＳＯ、５５％のデキストラン（生理食塩水中１０％  ｗ／ｖ）および４０％のＨＳＡを含む。別の特定の代替法では、凍結保存培地は、５％のＤＭＳＯ、５５％のトレハロースおよび４０％のＨＳＡを含む。より特定の代替法では、凍結保存培地は、５％のＤＭＳＯ、５５％のトレハロー��（生理食塩水中１０％  ｗ／ｖ）および４０％のＨＳＡを含む。別の特定の代替法では、凍結保存培地は、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ５を含む。別の特定の代替法では、凍結保存培地は、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０を含む。
【００９５】
本明細書において提供される細胞は、種々の方法のいずれかよって、細胞培養、増殖または分化のいずれかの段階で凍結保存してもよい。例えば、本明細書において提供される細胞は、起源組織または臓器、例えば、胎盤灌流液または臍帯血からの単離直後に、または上記で概説される方法の第１、第２または第３のステップのいずれかの間、もしくはその後に凍結保存してもよい。ある特定の代替法では、造血細胞、例えば、造血幹細胞または前駆体細胞を、起源組織または臓器からの単離後１、５、１０、１５、２０、３０、４５分以内または１、２、４、６、１０、１２、１８、２０もしくは２４時間以内または上記の時点のうち任意の２つによって規定される範囲内である時間の間以内に凍結保存する。ある特定の代替法では、造血細胞、例えば、造血幹細胞または前駆体細胞を、起源組織または臓器からの単離後、１、５、１０、１５、２０、３０、４５分もしくは上記の分数のうち任意の２つによって規定される範囲内の任意の分数以内または１、２、４、６、１０、１２、１８、２０もしくは２４時間以内もしくは上記の時点のうち任意の２つによって規定される範囲内で凍結保存する。ある特定の代替法では、前記細胞を、起源組織または臓器からの単離後１、２または３日以内で凍結保存する。ある特定の代替法では、前記細胞を、上記のように第１の培地中で培養した後、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７もしくは２８日または上記の日数のうち任意の２つによって規定される範囲の間の任意の日数の間で凍結保存する。いくつかの代替法では、前記細胞を、上記のように第１の培地中で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７もしくは２８日または上記の日数のうち任意の２つによって規定される範囲の間の任意の日数の間培養した後、および上記のように、第２の培地中で、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７もしくは２８日または上記の日数のうち任意の２つによって規定される範囲の間の任意の日数の間培養した後凍結保存する。いくつかの代替法では、ＮＫ細胞を、本明細書に記載される３段階法を使用して作製する場合に、前記細胞を、第１の培地中で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４もしくは２５日または上記の日数のうち任意の２つによって規定される範囲の間の任意の日数培養した後、および／または第２の培地中で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４もしくは２５日または上記の日数のうち任意の２つによって規定される範囲の間の任意の日数培養した後、および／または第３の培地中で約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４もしくは２５日または上記の日数のうち任意の２つによって規定される範囲の間の任意の日数培養した後、凍結保存する。特定の代替法では、ＮＫ細胞、例えば、ＧＭ  ＮＫ細胞を、本明細書に記載される３段階法を使用して作製し、前記細胞を、第１の培地中で１０日間培養した後、第２の培地中で４日間培養した後、および第３の培地中で２１日間培養した後凍結保存する。
【００９６】
一態様では、ＮＫ細胞の集団、例えば、ＧＭ  ＮＫ細胞を凍結保存する方法が本明細書において提供される。１つの代替法では、前記方法は、造血幹細胞または前駆体細胞、例えば、ＣＤ３４＋幹細胞または前駆体細胞を、幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１の培地中で培養して、第１の細胞の集団を産生することと、続いて、前記の第１の細胞の集団を、幹細胞動員剤およびインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠く第２の培地中で培養して、第２の細胞の集団を産生することと、続いて、前記の第２の細胞の集団を、ＩＬ−２および／またはＩＬ−１５を含み、幹細胞動員剤および／またはＬＭＷＨを欠く第３の培地中で培養して、第３の細胞の集団を産生することであって、第３の細胞の集団は、ＣＤ５６＋、ＣＤ３−、ＣＤ１６−またはＣＤ１６＋およびＣＤ９４＋またはＣＤ９４−であるナチュラルキラー細胞を含み、少なくとも７０％もしくは少なくとも８０％、８５％、９０％もしくは９５％または上記のパーセンテージのうち任意の２つによって規定される範囲内のパーセンテージのナチュラルキラー細胞が生存可能であることと、次に、ＮＫ細胞を凍結保存培地中で凍結保存することとを含む。ある特定の代替法では、前記の第１の培地および／または前記の第２の培地は、白血病阻害因子（ＬＩＦ）および／またはマクロファージ炎症性タンパク質−１アルファ（ＭＩＰ−１α）を欠く。ある特定の代替法では、前記の第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＴＰ−１αおよび／またはＦＭＳ様チロシンキナーゼ−３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）を欠く。特定の代替法では、前記の第１の培地および前記の第２の培地は、ＬＩＦおよび／またはＭＩＰ−１αを欠き、前記の第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよび／またはＦｌｔ３Ｌを欠く。ある特定の代替法では、第１の培地、第２の培地または第３の培地のいずれも、ヘパリン、例えば、低分子量ヘパリンを含まない。特定の代替法では、前記凍結保存ステップは、（１）細胞懸濁液溶液を調製するステップと、（２）ステップ（１）からの細胞懸濁液溶液に凍結保存培地を添加して、凍結保存細胞懸濁液を得るステップと、（３）ステップ（２）からの凍結保存細胞懸濁液を冷却して凍結保存サンプルを得るステップと、（４）−８０℃未満で凍結保存サンプルを保存するステップとをさらに含む。ある特定の代替法では、方法は、中間ステップを含まない。
【００９７】
１つの代替法では、前記方法は、（ａ）造血幹細胞または前駆体細胞を、幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１の培地中で培養して、第１の細胞の集団を産生することと、（ｂ）第１の細胞の集団を、幹細胞動員剤およびインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠く第２の培地中で培養して、第２の細胞の集団を産生することと、（ｃ）第２の細胞の集団を、ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、ＬＭＷＨを欠く第３の培地中で培養して、第３の細胞の集団を産生することであって、第３の細胞の集団が、ＣＤ５６＋、ＣＤ３−およびＣＤ１１ａ＋であるナチュラルキラー細胞を含むことと、次に、ＮＫ細胞を凍結保存培地中で凍結保存することとを含む。細胞動員剤は、当業者に公知であり、例えば、プレリキサホルなどのＣＸＣＲ４アンタゴニストを含み得る。ある特定の代替法では、前記の第１の培地および／または前記の第２の培地は、白血病阻害因子（ＬＩＦ）および／またはマクロファージ炎症性タンパク質−１アルファ（ＭＩＰ−１α）を欠く。ある特定の代替法では、前記の第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよび／またはＦＭＳ様チロシンキナーゼ−３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）を欠く。特定の代替法では、前記の第１の培地および前記の第２の培地は、ＬＩＦおよび／またはＭＩＰ−１αを欠き、前記の第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよび／またはＦｌｔ３Ｌを欠く。ある特定の代替法では、第１の培地、第２の培地または第３の培地のいずれも、ヘパリン、例えば、低分子量ヘパリンを含まない。特定の代替法では、前記凍結保存ステップは、（１）細胞懸濁液溶液を調製するステップと、（２）ステップ（１）からの細胞懸濁液溶液に凍結保存培地を添加して、凍結保存細胞懸濁液を得るステップと、（３）ステップ（２）からの凍結保存細胞懸濁液を冷却して凍結保存サンプルを得るステップと、（４）−８０℃未満で凍結保存サンプルを保存するステップとをさらに含む。ある特定の代替法では、方法は、中間ステップを含まない。
【００９８】
１つの代替法では、前記方法は、（ａ）造血幹細胞または前駆体細胞を、幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１の培地中で培養して、第１の細胞の集団を産生することと、（ｂ）第１の細胞の集団を、幹細胞動員剤およびインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠く第２の培地中で培養して、第２の細胞の集団を産生することと、（ｃ）第２の細胞の集団を、ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、幹細胞因子（ＳＣＦ）および／またはＬＭＷＨの各々を欠く第３の培地中で培養して、第３の細胞の集団を産生することであって、第３の細胞の集団が、ＣＤ５６＋、ＣＤ３−およびＣＤ１１ａ＋であるナチュラルキラー細胞を含むことと、次に、ＮＫ細胞を凍結保存培地中で凍結保存することとを含む。ある特定の代替法では、前記の第１の培地および／または前記の第２の培地は、白血病阻害因子（ＬＩＦ）および／またはマクロファージ炎症性タンパク質−１アルファ（ＭＩＰ−１α）を欠く。ある特定の代替法では、前記の第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよび／またはＦＭＳ様チロシンキナーゼ−３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）を欠く。特定の代替法では、前記の第１の培地および前記の第２の培地は、ＬＩＦおよびＭＩＰ−１αを欠き、前記の第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよび／またはＦｌｔ３Ｌを欠く。ある特定の代替法では、第１の培地、第２の培地または第３の培地のいずれも、ヘパリン、例えば、低分子量ヘパリンを含まない。特定の代替法では、前記凍結保存ステップは、（１）細胞懸濁液溶液を調製するステップと、（２）ステップ（１）からの細胞懸濁液溶液に凍結保存培地を添加して、凍結保存細胞懸濁液を得るステップと、（３）ステップ（３）からの凍結保存細胞懸濁液を冷却して凍結保存サンプルを得るステップと、（４）−８０℃未満で凍結保存サンプルを保存するステップとをさらに含む。ある特定の代替法では、方法は、中間ステップを含まない。
【００９９】
１つの代替法では、前記方法は、（ａ）造血幹細胞または前駆体細胞を、幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１の培地中で培養して、第１の細胞の集団を産生することと、（ｂ）第１の細胞の集団を、幹細胞動員剤およびインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠く第２の培地中で培養して、第２の細胞の集団を産生することと、（ｃ）第２の細胞の集団を、ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、ＳＣＦ、幹細胞動員剤および／またはＬＭＷＨの各々を欠く第３の培地中で培養して、第３の細胞の集団を産生することであって、第３の細胞の集団が、ＣＤ５６＋、ＣＤ３−およびＣＤ１１ａ＋であるナチュラルキラー細胞を含むことと、次に、ＮＫ細胞を凍結保存培地中で凍結保存することとを含む。ある特定の代替法では、前記の第１の培地および／または前記の第２の培地は、白血病阻害因子（ＬＩＦ）および／またはマクロファージ炎症性タンパク質−１アルファ（ＭＩＰ−１α）を欠く。ある特定の代替法では、前記の第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよび／またはＦＭＳ様チロシンキナーゼ−３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）を欠く。特定の代替法では、前記の第１の培地および前記第２の培地は、ＬＩＦおよび／またはＭＩＰ−１αを欠き、前記の第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよび／またはＦｌｔ３Ｌを欠く。ある特定の代替法では、第１の培地、第２の培地または第３の培地のいずれも、ヘパリン、例えば、低分子量ヘパリンを含まない。特定の代替法では、前記凍結保存ステップは、（１）細胞懸濁液溶液を調製するステップと、（２）ステップ（１）からの細胞懸濁液溶液に凍結保存培地を添加して、凍結保存細胞懸濁液を得るステップと、（３）ステップ（３）からの凍結保存細胞懸濁液を冷却して凍結保存サンプルを得るステップと、（４）−８０℃未満で凍結保存サンプルを保存するステップとをさらに含む。ある特定の代替法では、方法は、中間ステップを含まない。
【０１００】
１つの代替法では、前記方法は、（ａ）造血幹細胞または前駆体細胞を、幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１の培地中で培養して、第１の細胞の集団を産生することと、（ｂ）第１の細胞の集団を、幹細胞動員剤およびインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠く第２の培地中で培養して、第２の細胞の集団を産生することと、（ｃ）第２の細胞の集団を、ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、幹細胞動員剤および／またはＬＭＷＨの各々を欠く第３の培地中で培養して、第３の細胞の集団を産生することと、第３の細胞の集団からＣＤ１１ａ＋細胞を単離して、第４の細胞の集団を産生することであって、第４の細胞の集団が、ＣＤ５６＋、ＣＤ３−およびＣＤ１１ａ＋であるナチュラルキラー細胞を含むことと、次に、ＮＫ細胞を凍結保存培地中で凍結保存することとを含む。ある特定の代替法では、前記の第１の培地および／または前記の第２の培地は、白血病阻害因子（ＬＩＦ）および／またはマクロファージ炎症性タンパク質−１アルファ（ＭＩＰ−１α）を欠く。ある特定の代替法では、前記の第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよび／またはＦＭＳ様チロシンキナーゼ−３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）を欠く。特定の代替法では、前記の第１の培地および前記の第２の培地は、ＬＩＦおよび／またはＭＩＰ−１αを欠き、前記の第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよび／またはＦｌｔ３Ｌを欠く。ある特定の代替法では、第１の培地、第２の培地または第３の培地のいずれも、ヘパリン、例えば、低分子量ヘパリンを含まない。特定の代替法では、前記凍結保存ステップは、（１）細胞懸濁液溶液を調製するステップと、（２）ステップ（１）からの細胞懸濁液溶液に凍結保存培地を添加して、凍結保存細胞懸濁液を得るステップと、（３）ステップ（３）からの凍結保存細胞懸濁液を冷却して凍結保存サンプルを得るステップと、（４）−８０℃未満で凍結保存サンプルを保存するステップとをさらに含む。ある特定の代替法では、方法は、中間ステップを含まない。
【０１０１】
本明細書において提供される細胞は、凍結保存の際に、制御速度フリーザー中で、例えば、０．１、０．３、０．５、１または２℃／分または上記の温度のうち任意の２つによって規定される範囲の間の任意の温度で冷却することができる。１つの代替法では、凍結保存温度は、−８０℃〜−１８０℃または−１２５℃〜−１４０℃である。凍結保存細胞を液体窒素に移し、その後、使用するために解凍してもよい。いくつかの代替法では、例えば、アンプルが、−９０℃に到達すると、それらを液体窒素貯蔵領域に移す。凍結保存細胞は、２５℃〜４０℃の温度で解凍してもよい、より詳しくは、３７℃の温度に解凍してもよい。凍結保存細胞を、２５℃、３５℃、４０℃または４０℃または任意の２つの上記の温度によって規定される範囲の間の任意の温度で解凍してもよい。ある特定の代替法では、１、２、４、６、１０、１２、１８、２０もしくは２４時間もしくは上記の値のうち任意の２つによって規定される範囲の間の任意の時間数の間または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７もしくは２８日もしくは上記の値のうち任意の２つによって規定される範囲の間の任意の日数の間、凍結保存された後、凍結保存細胞を解凍する。ある特定の代替法では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７もしくは２８ヶ月もしくは上記の値のうち任意の２つによって規定される範囲の間の任意の月数の間、凍結保存された後、凍結保存細胞を解凍する。ある特定の代替法では、１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０年もしくは上記の値のうち任意の２つによって規定される範囲の間の任意の年数の間、凍結保存された後、凍結保存細胞を解凍する。
【０１０２】
適した解凍培地として、それだけには限らないが、生理食塩水、例えば、成長培地、例えば、ＲＰＭＩ培地を含むプラズマライト（ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ）培養培地が挙げられる。ある特定の代替法では、解凍培地は、１種または複数の培地上清（例えば、栄養素、サイトカインおよび／または因子）を含む。本明細書において提供される細胞を解凍するのに適した培地上清として、例えば、制限するものではないが、ヒト血清ＡＢ、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）またはウシ胎児血清（ＦＣＳ）などの血清、ビタミン、ヒト血清アルブミン（ｈａｓ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、アミノ酸（例えば、Ｌ−グルタミン）、脂肪酸（例えば、オレイン酸、リノール酸またはパルミチン酸）、インスリン（例えば、組換えヒトインスリン）、トランスフェリン（鉄飽和ヒトトランスフェリン）、β−メルカプトエタノール、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ−３リガンド（Ｆｌｔ３−Ｌ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）などのサイトカイン、トロンボポエチン（Ｔｐｏ）またはヘパリンが挙げられる。特定の代替法では、本明細書において提供される方法において有用な解凍培地は、ＲＰＭＩを含む。別の特定の代替法では、前記解凍培地は、プラズマライトを含む。別の特定の代替法では、前記解凍培地は、０．５〜２０％  ＦＢＳを含む。別の特定の代替法では、前記解凍培地は、０．５、１、５、１５、１５または２０％のＦＢＳまたは上記のパーセンテージの任意の２つによって規定される範囲の間の任意のパーセンテージのＦＢＳを含む。別の特定の代替法では、前記解凍培地は、１、２、５、１０、１５または２０％のＦＢＳを含む。別の特定の代替法では、前記解凍培地は、０．５％〜２０％のＨＳＡを含む。別の特定の代替法では、前記解凍培地は、０．５、１、５、１５、１５または２０％のＨＳＡまたは上記のパーセンテージの任意の２つによって規定される範囲の間の任意のパーセンテージのＨＳＡを含む。別の特定の代替法では、前記解凍培地は、１、２．５、５、１０、１５または２０％のＨＳＡを含む。より特定の代替法では、前記解凍培地は、ＲＰＭＩおよび１０％のＦＢＳを含む。別のより特定の代替法では、前記解凍培地は、プラズマライトおよび５％のＨＳＡを含む。
【０１０３】
本明細書において提供される凍結保存方法は、長期貯蔵、またはアポトーシスもしくは壊死による細胞死を阻害する条件下を可能にするように最適化することができる。１つの代替法では、解凍後細胞は、例えば、自動細胞カウンタまたはトリパンブルー法によって決定されるような、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％より多い生存可能である細胞を含む。１つの代替法では、解凍後細胞は、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％より多い生存可能である細胞または上記のパーセンテージの任意の２つによって規定される範囲の間の任意のパーセンテージ含む。別の代替法では、解凍後細胞は、０．５、１、５、１０、１５、２０または２５％の死滅細胞を含む。別の代替法では、解凍後細胞は、０．５、１、５、１０、１５、２０または２５％の死滅細胞または上記のパーセンテージの任意の２つによって規定される範囲の間の任意のパーセンテージの死滅細胞を含む。別の代替法では、解凍後細胞は、０．５、１、５、１０、１５、２０または２５％の早期アポトーシス細胞を含む。別の代替法では、解凍後細胞は、０．５、１、５、１０、１５、２０または２５％の早期アポトーシス細胞または上記のパーセンテージの任意の２つによって規定される範囲の間の任意のパーセンテージの早期アポトーシス細胞を含む。別の代替法では、０．５、１、５、１０、１５または２０％の解凍後細胞は、例えば、アポトーシスアッセイ（例えば、ＴＯ−ＰＲＯ３またはＡｎｎＶ／ＰＩアポトーシスアッセイキット）によって決定されるように、解凍された後、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８日後に、アポトーシスを起こす。ある特定の代替法では、解凍後細胞を、本明細書において提供される方法を使用して培養、増殖または分化させた後、再度凍結保存する。
【０１０４】
８．ＧＭ  ＮＫ細胞を含む組成物
本明細書において提供されるＧＭ  ＮＫ細胞を含む組成物、例えば、医薬組成物は、本明細書に記載される方法のいずれかによって産生されたＮＫ細胞の集団を含む組成物ならびに任意の組織供給源、例えば、ヒト組織供給源から単離されたＮＫ細胞を含む組成物を含む。
【０１０５】
ａ．６．８．１  ３段階法を使用して産生されたＧＭ  ＮＫ細胞
いくつかの代替法では、単離されたＮＫ細胞集団、例えば、ＧＭ  ＮＫ細胞集団を含む組成物、例えば、医薬組成物が、本明細書において提供される。特定の代替法では、前記の単離されたＮＫ細胞集団は、胎盤灌流液、臍帯血および／または末梢血から単離された造血細胞、例えば、造血幹細胞または前駆体細胞から産生される。別の特定の代替法では、前記の単離されたＮＫ細胞集団は、組成物中に少なくとも５０％の細胞を含む。別の特定の代替法では、前記の単離されたＮＫ細胞集団、例えば、ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞は、組成物中の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の細胞を含む。ある特定の代替法では、前記の単離されたＮＫ細胞集団中の５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％または４０％以下の細胞が、ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞である。ある特定の代替法では、前記ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞は、ＣＤ１６−である。
【０１０６】
ＮＫ細胞集団、例えば、ＧＭ  ＮＫ細胞集団は、ｉｎ  ｖｉｖｏで使用するために医薬組成物に製剤化することができる。このような医薬組成物は、薬学的に許容される担体、例えば、生理食塩水溶液またはｉｎ  ｖｉｖｏ投与のためのその他の許容される生理学的に許容される溶液中にＮＫ細胞の集団を含む。本発明の医薬組成物は、本明細書において別の場所に記載されるＮＫ細胞集団のいずれかを含み得る。
【０１０７】
本明細書に記載される医薬組成物は、５０％の生存可能である細胞またはそれ以上を含む（すなわち、例えば、集団中の細胞の少なくとも５０％が機能的であるまたは生存している）ＮＫ細胞の集団を含む。好ましくは、集団中の細胞の少なくとも６０％が、生存可能である。より好ましくは、医薬組成物中の集団中の細胞の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％または上記のパーセンテージの任意の２つによって規定される範囲内の任意のパーセンテージが生存可能である。
【０１０８】
本明細書に記載される医薬組成物は、例えば、移植を容易にする１種または複数の化合物、アルブミン、デキストラン４０、ゼラチンおよび／またはヒドロキシエチルデンプンなどの安定化剤を含み得る。
【０１０９】
注射用溶液として製剤化される場合には、１つの代替法において、医薬組成物は、１．２５％のＨＳＡおよび２．５％のデキストランを含み得る。細胞生成物の投与に適したその他の注射用製剤を使用してもよい。
【０１１０】
１つの代替法では、本明細書において提供される組成物、例えば、医薬組成物は、全身または局所投与に適している。特定の代替法では、本明細書において提供される組成物、例えば、医薬組成物は、非経口投与に適している。特定の代替法では、本明細書において提供される組成物、例えば、医薬組成物は、注射、注入、静脈内（ＩＶ）投与、大腿内投与または腫瘍内投与に適している。特定の代替法では、本明細書において提供される組成物、例えば、医薬組成物は、デバイス、マトリックスまたはスキャフォールドによる投与に適している。特定の代替法では、本明細書において提供される組成物、例えば、医薬組成物は、注射に適している。特定の代替法では、本明細書において提供される組成物、例えば、医薬組成物は、カテーテルによる投与に適している。特定の代替法では、本明細書において提供される組成物、例えば、医薬組成物は、局所注射に適している。より特定の代替法では、本明細書において提供される組成物、例えば、医薬組成物は、固形腫瘍（例えば、肉腫）への直接的な局所注射に適している。特定の代替法では、本明細書において提供される組成物、例えば、医薬組成物は、シリンジによる注射に適している。特定の代替法では、本明細書において提供される組成物、例えば、医薬組成物は、ガイドされた送達による投与に適している。特定の代替法では、本明細書において提供される組成物、例えば、医薬組成物は、腹腔鏡検査、内視鏡、超音波、コンピューター断層撮影法、磁気共鳴または放射線医学によって補助される注射に適している。
【０１１１】
ある特定の代替法では、ＮＫ細胞、例えば、ＧＭ  ＮＫ細胞を含む本明細書において提供される組成物、例えば、医薬組成物は、医薬等級の投与可能な単位として提供される。このような単位は、別個の容量、例えば、１５ｍＬ、２０ｍＬ、２５ｍＬ、３０ｍＬ、３５ｍＬ、４０ｍＬ、４５ｍＬ、５０ｍＬ、５５ｍＬ、６０ｍＬ、６５ｍＬ、７０ｍＬ、７５ｍＬ、８０ｍＬ、８５ｍＬ、９０ｍＬ、９５ｍＬ、１００ｍＬ、１５０ｍＬ、２００ｍＬ、２５０ｍＬ、３００ｍＬ、３５０ｍＬ、４００ｍＬ、４５０ｍＬ、５００ｍＬなどまたは上記の容量量の任意の２つによって規定される範囲の間の任意の容量で提供できる。このような単位は、指定の細胞数、例えば、ＧＭ  ＮＫ細胞、例えば、１ミリリットルあたり１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８個の、もしくはそれより多い細胞、または単位当たり１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０、１×１０１１個の、もしくはそれより多い細胞または上記の値の任意の２つによって規定される範囲の間の、単位あたりの任意の細胞数を含有するように提供できる。特定の代替法では、単位は、１ミリリットルあたり約、少なくとも約、または多くて約１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６個の、もしくはそれより多いＧＭ  ＮＫ細胞、または単位あたり１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５ｘ１０８、１×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０、１×１０１１個の、もしくはそれより多い細胞または上記の値の任意の２つによって規定される範囲内のミリリットルまたは単位あたりの任意の細胞数を含み得る。このような単位は、指定の数のＮＫ細胞またはＮＫ細胞集団および／または任意のその他の細胞を含有するように提供できる。特定の代替法では、ＮＫ細胞は本明細書において提供されるような比で存在する。
【０１１２】
別の特定の代替法では、前記組成物中の前記の単離されたＮＫ細胞、例えば、ＧＭ  ＮＫ細胞は、単一個体に由来する。より特定の代替法では、前記の単離されたＮＫ細胞は、少なくとも２つの異なる個体に由来するＮＫ細胞を含む。別の特定の代替法では、前記組成物中の前記の単離されたＮＫ細胞は、ＮＫ細胞を用いる処置が意図される個体とは異なる個体に由来する。別の特定の代替法では、前記ＮＫ細胞は、前記ＮＫ細胞が、同等数のナチュラルキラー細胞、すなわち、前記免疫調節性化合物またはサリドマイドと接触されていない、または近接されていないＮＫ細胞よりも多くグランザイムＢおよび／またはパーフォリンを検出可能に発現するのに十分な量および時間、免疫調節性化合物またはサリドマイドと接触されている、または近接されている。別の特定の代替法では、前記組成物は、免疫調節性化合物もしくはサリドマイドをさらに含む、または免疫調節性化合物もしくはサリドマイドとの製剤組合せで、もしくはそれとともに（例えば、その前、その間またはその後であるが、別個に）提供される。ある特定の代替法では、免疫調節性化合物は、以下に記載される化合物である。例えば、その開示内容が参照により全文で本明細書に組み込まれる（特許文献８）を参照のこと。ある特定の代替法では、免疫調節性化合物は、アミノ置換イソインドリンである。１つの代替法では、免疫調節性化合物は、３−（４−アミノ−１−オキソ−１，３−ジヒドロイソインドール−２−イル）−ピペリジン−２，６−ジオン、３−（４’アミノイソインドリン（ａｍｉｎｏｉｓｏｌｉｎｄｏｌｉｎｅ）−１’−オン）−１−ピペリジン−２，６−ジオン、４−（アミノ）−２−（２，６−ジオキソ（３−ピペリジル））−イソインドリン−１，３−ジオンまたは４−アミノ−２−（２，６−ジオキソピペリジン−３−イル）イソインドール−１，３−ジオンである。別の代替法では、免疫調節性化合物は、ポマリドミドまたはレナリドミドである。別の代替法では、前記免疫調節性化合物は、以下の構造：
【０１１３】
【化１】
2020503043.tif 000003
［式中、ＸおよびＹのうち一方は、Ｃ＝Ｏであり、ＸおよびＹのうちもう一方は、Ｃ＝ＯまたはＣＨ２であり、Ｒ２は、水素または低級アルキルである］
を有する化合物またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、包接体、エナンチオマー、ジアステレオマー、ラセミ体または立体異性体の混合物である。別の代替法では、前記免疫調節性化合物は、以下の構造：
【０１１４】
【化２】
2020503043.tif 000004
［式中、ＸおよびＹのうち一方は、Ｃ＝Ｏであり、もう一方は、ＣＨ２またはＣ＝Ｏであり、
Ｒ１は、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ７）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルキニル、ベンジル、アリール、（Ｃ０〜Ｃ４）アルキル−（Ｃ１〜Ｃ６）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ０〜Ｃ４）アルキル−（Ｃ２〜Ｃ５）ヘテロアリール、Ｃ（Ｏ）Ｒ３、Ｃ（Ｓ）Ｒ３、Ｃ（Ｏ）ＯＲ４、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル−Ｎ（Ｒ６）２、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル−ＯＲ５、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル−Ｃ（Ｏ）ＯＲ５、Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ３、Ｃ（Ｓ）ＮＨＲ３、Ｃ（Ｏ）ＮＲ３Ｒ３’、Ｃ（Ｓ）ＮＲ３Ｒ３’または（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル−Ｏ（ＣＯ）Ｒ５であり、
Ｒ２は、Ｈ、Ｆ、ベンジル、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルケニルまたは（Ｃ２〜Ｃ８）アルキニルであり、
Ｒ３およびＲ３’は独立に、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ７）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルキニル、ベンジル、アリール、（Ｃ０〜Ｃ４）アルキル−（Ｃ１〜Ｃ６）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ０〜Ｃ４）アルキル−（Ｃ２〜Ｃ５）ヘテロアリール、（Ｃ０〜Ｃ８）アルキル−Ｎ（Ｒ６）２、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル−ＯＲ５、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル−Ｃ（０）ＯＲ５、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル−Ｏ（ＣＯ）Ｒ５またはＣ（Ｏ）ＯＲ５であり、
Ｒ４は、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルキニル、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル−ＯＲ５、ベンジル、アリール、（Ｃ０〜Ｃ４）アルキル−（Ｃ１〜Ｃ６）ヘテロシクロアルキルまたは（Ｃ０〜Ｃ４）アルキル−（Ｃ２〜Ｃ５）ヘテロアリールであり、
Ｒ５は、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルキニル、ベンジル、アリールまたは（Ｃ２〜Ｃ５）ヘテロアリールであり、
Ｒ６の各出現は独立に、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルキニル、ベンジル、アリール、（Ｃ２〜Ｃ５）ヘテロアリールまたは（Ｃ０〜Ｃ８）アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｒ５であるか、またはＲ６基を接続して、ヘテロシクロアルキル基を形成してもよく、
ｎは、０または１であり、
＊は、キラル炭素中心を表す］
を有する化合物またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、包接体、エナンチオマー、ジアステレオマー、ラセミ体または立体異性体の混合物である。別の代替法では、前記免疫調節性化合物は、以下の構造：
【０１１５】
【化３】
2020503043.tif 000005
［式中、
ＸおよびＹのうち一方は、Ｃ＝Ｏであり、もう一方は、ＣＨ２またはＣ＝Ｏであり、
Ｒは、ＨまたはＣＨ２ＯＣＯＲ’であり、
（ｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３もしくはＲ４は各々、他とは独立に、ハロ、１〜４個の炭素原子のアルキルもしくは１〜４個の炭素原子のアルコキシであるか、または（ｉｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３もしくはＲ４のうち１つは、ニトロもしくは−ＮＨＲ５であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３もしくはＲ４の内の残りは水素であり、
Ｒ５は、水素または１〜８個の炭素のアルキルであり、
Ｒ６は、水素、１〜８個の炭素原子のアルキル、ベンゾ、クロロまたはフルオロであり、
Ｒ’は、Ｒ７−ＣＨＲ１０−Ｎ（Ｒ８Ｒ９）であり、
Ｒ７は、ｍ−フェニレンまたはｐ−フェニレンまたは−（ＣｎＨ２ｎ）−（式中、ｎは、０〜４の値を有する）であり、
Ｒ８およびＲ９は各々独立して、水素もしくは１〜８個の炭素原子のアルキルであるか、またはＲ８およびＲ９は一緒になって、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレンまたは−ＣＨ２ＣＨ２Ｘ１ＣＨ２ＣＨ２−（式中、Ｘ１は、−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＨ−である）であり、
Ｒ１０は、水素もしくは１〜８個の炭素原子のアルキルまたはフェニルであり、
＊は、キラル炭素中心を表す］
を有する化合物またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、包接体、エナンチオマー、ジアステレオマー、ラセミ体または立体異性体の混合物である。
【０１１６】
別の特定の代替法では、本明細書に記載される組成物は、１種または複数の抗癌化合物、例えば、１種または複数の以下に記載される抗癌化合物をさらに含む、またはそれとの生成物組合せで、もしくはそれとともに投与される。
【０１１７】
より特定の代替法では、組成物は、遺伝子改変されているか否かに関わらず、別の供給源に由来する、または別の方法によって作製されたＮＫ細胞を含む。特定の代替法では、前記のその他の供給源は、胎盤血液および／または臍帯血である。別の特定の代替法では、前記のその他の供給源は、末梢血である。より特定の代替法では、前記組成物中のＮＫ細胞集団は、別の供給源に由来する、または別の方法で作製されたＮＫ細胞と、約１００：１、９５：５、９０：１０、８５：１５、８０：２０、７５：２５、７０：３０、６５：３５、６０：４０、５５：４５：５０：５０、４５：５５、４０：６０、３５：６５、３０：７０、２５：７５、２０：８０、１５：８５、１０：９０、５：９５、１００：１、９５：１、９０：１、８５：１、８０：１、７５：１，７０：１、６５：１、６０：１、５５：１、５０：１，４５：１，４０：１、３５：１，３０：１，２５：１，２０：１、１５：１、１０：１、５：１、１：１、１：５、１：１０、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５０、１：５５、１：６０、１：６５、１：７０、１：７５、１：８０、１：８５、１：９０、１：９５、１：１００などの比、または任意の２つの上記の比によって規定される範囲の間の任意の比で組み合わされる。
【０１１８】
別の特定の代替法では、組成物は、本明細書に記載される３段階法を使用して産生されたＮＫ細胞集団および単離された胎盤灌流液または単離された胎盤灌流液細胞のいずれかを含む。より特定の代替法では、前記胎盤灌流液は、前記ＮＫ細胞集団と同一個体に由来する。別のより特定の代替法では、前記胎盤灌流液は、前記ＮＫ細胞集団とは異なる個体に由来する胎盤灌流液を含む。別の特定の代替法では、前記胎盤灌流液中のすべてまたは実質的にすべて（例えば、９０％、９５％、９８％または９９％より多く）の細胞は、胎児細胞である。別の特定の代替法では、胎盤灌流液または胎盤灌流液細胞は、胎児および母体細胞を含む。より特定の代替法では、前記胎盤灌流液中の胎児細胞は、前記灌流液中の９０％、８０％、７０％、６０％または５０％未満の（ただしゼロではない）細胞または上記のパーセンテージの任意の２つによって規定される範囲の間の任意のパーセンテージの細胞を含む。別の特定の代替法では、前記灌流液は、胎盤脈管構造を通る０．９％のＮａＣｌ溶液の通過によって得られる。別の特定の代替法では、前記灌流液は、培養培地を含む。別の特定の代替法では、前記灌流液は、赤血球を除去するように処置されている。別の特定の代替法では、前記組成物は、免疫調節性化合物、例えば、以下に記載される免疫調節性化合物、例えば、アミノ置換イソインドリン化合物を含む。別の特定の代替法では、組成物は、１種または複数の抗癌化合物、例えば、１種または複数の以下に記載される抗癌化合物をさらに含む。
【０１１９】
別の特定の代替法では、組成物は、ＮＫ細胞集団および胎盤灌流液細胞を含む。より特定の代替法では、前記胎盤灌流液細胞は、前記ＮＫ細胞集団と同一個体に由来する。別のより特定の代替法では、前記胎盤灌流液細胞は、前記ＮＫ細胞集団とは異なる個体に由来する。別の特定の代替法では、組成物は、単離された胎盤灌流液および単離された胎盤灌流液細胞を含み、前記の単離された灌流液および前記の単離された胎盤灌流液細胞は、異なる個体に由来する。胎盤灌流液を含む上記の代替法のいずれかの別のより特定の代替法では、前記胎盤灌流液は、少なくとも２つの個体に由来する胎盤灌流液を含む。胎盤灌流液細胞を含む上記の代替法のいずれかの別のより特定の代替法では、前記の単離された胎盤灌流液細胞は、少なくとも２人の個体に由来する。別の特定の代替法では、前記組成物は、免疫調節性化合物を含む。別の特定の代替法では、組成物は、１種または複数の抗癌化合物、例えば、１種または複数の以下に記載される抗癌化合物をさらに含む。
【０１２０】
９．ＧＭ  ＮＫ細胞の使用
本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載される３段階法によって産生されるＧＭ  ＮＫ細胞は、癌を有する個体、例えば、固形腫瘍細胞および／もしくは血液癌細胞を有する個体またはウイルス感染を有する人に、療法を提供する方法において使用できる。いくつかのこのような代替法では、ＮＫ細胞の有効投与量は、１×１０４〜５×１０４、５×１０４〜１×１０５、１×１０５〜５×１０５、５×１０５〜１×１０６、１×１０６〜５×１０６、５×１０６〜１×１０７個の範囲またはそれより多い細胞／体重１キログラムである。いくつかのこのような代替法では、ＮＫ細胞の有効投与量は、１×１０４〜５×１０４、５×１０４〜１×１０５、１×１０５〜５×１０５、５×１０５〜１×１０６、１×１０６〜５×１０６、５×１０６〜１×１０７個の範囲またはそれより多い細胞／体重１キログラムまたは上記の値の任意の２つによって規定される範囲の間の任意の細胞数／体重１キログラムである。ＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫ細胞はまた、腫瘍細胞の増殖を抑制する方法において使用できる。
【０１２１】
ａ．６．９．１癌を有する個体の治療
１つの代替法では、癌、例えば、血液癌または固形腫瘍を有する個体に療法を提供する方法が本明細書において提供され、前記個体、好ましくは、抗癌療法を受けるように選択または同定されているものに、治療上有効な量の本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫ細胞集団を投与することを含む。ある特定の代替法では、個体は、ナチュラルキラー細胞の欠乏、例えば、個体の癌に対して活性のＮＫ細胞の欠乏を有し、前記個体は、療法を受け取る前にそのようなものとして同定または選択されている。特定の代替法では、方法は、前記個体に、単離された胎盤灌流液または単離された胎盤灌流液細胞、例えば、治療上有効な量の胎盤灌流液または単離された胎盤灌流液細胞を投与することをさらに含む。いくつかの代替法では、個体は、単離された胎盤灌流液または単離された胎盤灌流液細胞を受けるように選択されている。別の特定の代替法では、方法は、前記個体に、有効量の免疫調節性化合物、例えば、上記の免疫調節性化合物またはサリドマイドを投与することをさらに含む。いくつかの代替法では、個体は、免疫調節性化合物を受けるように選択されている。本明細書において、「有効量」とは、例えば、個体が患っている癌の１つまたは複数の症状の、検出可能な改善、進行の減少、排除をもたらす量である。
【０１２２】
単離されたＧＭ  ＮＫ細胞の集団またはその医薬組成物の投与は、全身である場合も局所である場合もある。特定の代替法では、投与は、非経口である。特定の代替法では、対象への単離されたＧＭ  ＮＫ細胞の集団またはその医薬組成物の投与は、注射、注入、静脈内（ＩＶ）投与、大腿内投与または腫瘍内投与による。特定の代替法では、対象への単離されたＧＭ  ＮＫ細胞の集団またはその医薬組成物の投与は、デバイス、マトリックスまたはスキャフォールドを用いて実施される。特定の代替法では、対象への単離されたＧＭ  ＮＫ細胞の集団またはその医薬組成物の投与は、注射による。特定の代替法では、対象への単離されたＧＭ  ＮＫ細胞の集団またはその医薬組成物の投与は、カテーテルによる。特定の代替法では、ＧＭ  ＮＫ細胞の注射は、局所注射である。より特定の代替法では、局所注射は、固形腫瘍（例えば、肉腫）へ直接的である。特定の代替法では、対象への単離されたＧＭ  ＮＫ細胞の集団またはその医薬組成物の投与は、シリンジによる注射による。特定の代替法では、対象への単離されたＧＭ  ＮＫ細胞の集団またはその医薬組成物の投与は、ガイドされた送達による。特定の代替法では、注射による対象への単離されたＧＭ  ＮＫ細胞の集団またはその医薬組成物の投与は、腹腔鏡検査、内視鏡、超音波、コンピューター断層撮影法、磁気共鳴または放射線医学によって補助される。
【０１２３】
特定の代替法では、癌は、血液癌、例えば、白血病またはリンパ腫である。より特定の代替法では、癌は、急性白血病、例えば、急性Ｔ細胞白血病、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性巨核芽球性白血病、前駆Ｂ急性リンパ性白血病、前駆Ｔ急性リンパ性白血病、バーキット白血病（バーキットリンパ腫）または急性混合型（ｂｉｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ）白血病、慢性白血病、例えば、慢性骨髄性リンパ腫、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性単球性白血病、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ性リンパ腫またはＢ細胞前リンパ性白血病、ヘアリー細胞リンパ腫、Ｔ細胞前リンパ性白血病またはリンパ腫、例えば、組織球性リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫（例えば、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症）、脾臓周辺帯リンパ腫、形質細胞新生物（例えば、形質細胞骨髄腫、形質細胞腫、モノクローナル免疫グロブリン沈着症または重鎖病）、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（ＭＡＬＴリンパ腫）、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（ＮＭＺＬ）、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出液リンパ腫、Ｔ細胞大型顆粒リンパ性白血病、侵攻性ＮＫ細胞白血病、成体Ｔ細胞白血病／リンパ腫、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、鼻腔型、腸症型Ｔ細胞リンパ腫、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、芽細胞性ＮＫ細胞リンパ腫、菌状息肉症（セザリー症候群）、原発性皮膚ＣＤ３０陽性Ｔ細胞リンパ増殖性障害（例えば、原発性皮膚未分化大細胞リンパ腫またはリンパ腫様丘疹症）、血管免疫芽細胞性Ｔ細胞リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫、不特定の未分化大細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫または結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫である。別の特定の代替法では、癌は、多発性骨髄腫または骨髄異形成症候群である。
【０１２４】
ある特定の他の特定の代替法では、癌は、固形腫瘍、例えば、癌腫、例えば、腺癌、副腎皮質癌腫、結腸腺癌、結腸直腸腺癌、結腸直腸癌腫、腺管細胞癌腫、肺癌腫、甲状腺癌腫、鼻咽頭癌腫、黒色腫（例えば、悪性黒色腫）、非黒色腫皮膚癌腫または不特定癌腫、類腱腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、内分泌腫瘍、ユーイング肉腫、生殖細胞腫瘍（例えば、精巣癌、卵巣癌、絨毛癌、卵黄嚢腫瘍、胚細胞腫など）、肝芽腫（ｈｅｐａｔｏｓｂｌａｓｔｏｍａ）、肝細胞癌腫、神経芽細胞腫、非横紋筋肉腫軟組織肉腫、骨肉腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫またはウィルムス腫瘍である。別の代替法では、固形腫瘍は、膵臓癌または乳癌である。その他の代替法では、固形腫瘍は、聴神経腫瘍、星状細胞腫（例えば、グレードＩ毛様細胞性星状細胞腫、グレードＩＩ低悪性度星状細胞腫、グレードＩＩＩ未分化星状細胞腫またはグレードＩＶ多形神経膠芽腫）、脊索腫、頭蓋咽頭腫、神経膠腫（例えば、脳幹神経膠腫、上衣腫、混合膠腫、視神経神経膠腫または上衣下腫）、神経膠芽腫、髄芽腫、髄膜腫、転移性脳腫瘍、乏突起神経膠腫、松果体芽腫、下垂体腫瘍、原始神経外胚葉性腫瘍またはシュワン腫である。別の代替法では、癌は、前立腺癌である。別の代替法では、癌は、肝臓癌である。別の代替法では、癌は、肺癌である。別の代替法では、癌は、腎癌である。
【０１２５】
ある特定の代替法では、癌、例えば、血液癌または固形腫瘍を有する個体、例えば、ナチュラルキラー細胞の欠乏を有する個体は、前記投与の前に骨髄移植を受けている個体である。ある特定の代替法では、骨髄移植は、前記癌の治療においてであった。ある特定のその他の代替法では、骨髄移植は、前記癌以外の状態の治療においてであった。ある特定の代替法では、個体は、前記骨髄移植に加えて免疫抑制剤を受け取った。ある特定の代替法では、骨髄移植を受けていた個体は、前記投与の時間に移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の１つまたは複数の症状を示す。ある特定のその他の代替法では、骨髄移植を受けていた個体に、ＧＶＨＤの症状が示される前に前記細胞が投与される。
【０１２６】
ある特定の代替法では、癌、例えば、血液癌を有する個体は、前記投与の前に、少なくとも１用量のＴＮＦα阻害剤、例えば、エタネルセプト（登録商標）（エンブレル）を受け取っている。特定の代替法では、前記個体は、前記癌の診断の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２ヶ月以内に、または上記の期間のうち任意の２つによって規定される範囲内にＴＮＦα阻害剤の前記用量を受け取った。特定の代替法では、一定用量のＴＮＦα阻害剤を受け取っている個体は、急性骨髄性白血病を示す。より特定の代替法では、一定用量のＴＮＦα阻害剤を受け取っている個体は、急性骨髄性白血病を示し、血液細胞において染色体５の長腕の欠失をさらに示す。別の代替法では、癌、例えば、血液癌を有する個体は、フィラデルフィア染色体を示す。
【０１２７】
ある特定のその他の代替法では、前記個体における癌、例えば、血液癌または固形腫瘍は、１種または複数の抗癌薬に対して抵抗性である。特定の代替法では、癌は、グリベック（登録商標）（メシル酸イマチニブ）に対して抵抗性である。
【０１２８】
ある特定の代替法では、前記個体における癌、例えば、血液癌は、少なくとも１種の抗癌薬に対して応答し、この代替法では、本明細書に記載される胎盤灌流液、単離された胎盤灌流液細胞、単離されたナチュラルキラー細胞、例えば、胎盤ナチュラルキラー細胞、例えば、胎盤由来中間体ナチュラルキラー細胞、単離された混合ナチュラルキラー細胞またはＮＫ細胞および／またはそれらの組合せならびに任意選択で、免疫調節性化合物を、補助療法として、または前記抗癌薬との併用療法として添加する。ある特定のその他の代替法では、癌、例えば、血液癌を有する個体は、少なくとも１種の抗癌薬を受け取っており、前記投与の前に再発していた。ある特定の代替法では、療法を受ける個体は、抵抗性癌を有している。１つの代替法では、本明細書に記載される細胞を用いる癌治療法は、癌の再発に対して保護する（例えば、予防または遅延する）。１つの代替法では、本明細書に記載される癌治療法は、１ヶ月もしくはそれより多い、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２ヶ月もしくはそれより多い、１年もしくはそれより多い、２年もしくはそれより多い、３年もしくはそれより多い、または４年もしくはそれより多い間、癌の寛解をもたらす。
【０１２９】
１つの代替法では、多発性骨髄腫を有する個体に療法を提供する方法であって、個体に（１）レナリドミド、（２）メルファランおよび（３）ＧＭ  ＮＫ細胞を投与することを含む方法が、本明細書において提供され、これでは、前記ＧＭ  ＮＫ細胞は、前記個体において多発性骨髄腫を治療するのに有効である。特定の代替法では、前記ＧＭ  ＮＫ細胞は、臍帯血ＮＫ細胞または臍帯血造血細胞、例えば、造血幹細胞から産生されたＮＫ細胞に由来する。別の代替法では、前記ＧＭ  ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞を産生するために本明細書に記載される３段階法によって産生されている。別の代替法では、前記レナリドミド、メルファランおよび／またはＧＭ  ＮＫ細胞は、互いに別個に投与される。多発性骨髄腫を有する個体を治療する方法のある特定の代替法では、前記ＧＭ  ＮＫ細胞は、造血幹細胞または前駆体細胞、例えば、ＣＤ３４＋幹細胞または前駆体細胞を、幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１の培地中で培養して、第１の細胞の集団を産生することと、続いて、前記の第１の細胞の集団を、幹細胞動員剤およびインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠く第２の培地中で培養して、第２の細胞の集団を産生することと、続いて、前記の第２の細胞の集団を、ＩＬ−２および／またはＩＬ−１５を含み、幹細胞動員剤および／またはＬＭＷＨを欠く第３の培地中で培養して、第３の細胞の集団を産生することであって、第３の細胞の集団が、ＣＤ５６＋、ＣＤ３−、ＣＤ１６−またはＣＤ１６＋およびＣＤ９４＋またはＣＤ９４−であるナチュラルキラー細胞を含み、ナチュラルキラー細胞の少なくとも７０％または少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％が生存可能であることを含む方法によってＮＫ細胞を産生することを含む方法によって産生される。ある特定の代替法では、前記の第１の培地および／または前記の第２の培地は、白血病阻害因子（ＬＩＦ）および／またはマクロファージ炎症性タンパク質−１アルファ（ＭＩＰ−１α）を欠く。ある特定の代替法では、前記の第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよび／またはＦＭＳ様チロシンキナーゼ−３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）を欠く。特定の代替法では、前記の第１の培地および前記の第２の培地は、ＬＩＦおよび／またはＭＩＰ１αを欠き、前記の第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよび／またはＦｌｔ３Ｌを欠く。ある特定の代替法では。第１の培地、第２の培地または第３の培地のいずれも、ヘパリン、例えば、低分子量ヘパリンを含まない。
【０１３０】
別の代替法では、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を有する個体を治療する方法であって、個体にＮＫ細胞（任意選択で、ＩＬ２単独またはＩＬ−１５単独、ＩＬ２およびＩＬ１２およびＩＬ１８、ＩＬ１２およびＩＬ１５、ＩＬ１２およびＩＬ１８、ＩＬ２およびＩＬ１２およびＩＬ１５およびＩＬ１８またはＩＬ２およびＩＬ１５およびＩＬ１８を用いる前処理によって活性化された）を投与することを含む方法が本明細書において提供され、これでは、前記ＮＫ細胞は、前記個体においてＡＭＬを治療するのに有効である。特定の代替法では、単離された、本明細書に記載される３段階法を使用して産生されたＮＫ細胞集団は、前記投与に先立って、ＩＬ２、ＩＬ１２、ＩＬ１８またはＩＬ１５のうち１種または複数を用いて前処理されている。特定の代替法では、前記ＧＭ  ＮＫ細胞は、臍帯血ＮＫ細胞または臍帯血造血細胞、例えば、造血幹細胞から産生されたＮＫ細胞に由来する。別の代替法では、前記ＧＭ  ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞を産生するための本明細書に記載される３段階法によって産生されていた。ＡＭＬを有する個体を治療する方法のある特定の代替法では、前記ＮＫ細胞は、本明細書に記載されるような３段階法によって産生される。特定の代替法では、前記の方法によって治療されるべきＡＭＬは、難治性ＡＭＬ、予後不良ＡＭＬまたは小児ＡＭＬを含む。難治性ＡＭＬ、予後不良ＡＭＬまたは小児ＡＭＬの治療のためにＮＫ細胞を投与するための当技術分野で公知の方法は、この目的のために適応され得る、例えば、各々参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、（非特許文献１）；（非特許文献２）を参照のこと。ある特定の代替法では、前記個体は、ＡＭＬに対する少なくとも１種の非ナチュラルキラー細胞治療薬が失敗しているＡＭＬを有する。特定の代替法では、前記個体は、６５歳以上であり、最初の寛解中である。特定の代替法では、前記個体は、前記ナチュラルキラー細胞を投与する前に、フルダラビン、シタラビンまたは両方を用いてコンディショニングされている。
【０１３１】
ＡＭＬを有する個体を治療する方法のその他の特定の代替法では、前記ＧＭ  ＮＫ細胞は、造血幹細胞または前駆体細胞、例えば、ＣＤ３４＋幹細胞または前駆体細胞を、幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１の培地中で培養して、第１の細胞の集団を産生することと、続いて、前記の第１の細胞の集団を、幹細胞動員剤およびインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠く第２の培地中で培養して、第２の細胞の集団を産生することと、続いて、前記の第２の細胞の集団を、ＩＬ−２および／またはＩＬ−１５を含み、幹細胞動員剤および／またはＬＭＷＨを欠く第３の培地中で培養して、第３の細胞の集団を産生することであって、第３の細胞の集団が、ＣＤ５６＋、ＣＤ３−、ＣＤ１６−またはＣＤ１６＋およびＣＤ９４＋またはＣＤ９４−であるナチュラルキラー細胞を含み、ナチュラルキラー細胞の少なくとも７０％または少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％が生存可能であることを含む方法によってＮＫ細胞を産生することを含む方法によって産生される。ある特定の代替法では、前記の第１の培地および／または前記の第２の培地は、白血病阻害因子（ＬＩＦ）および／またはマクロファージ炎症性タンパク質−１アルファ（ＭＩＰ−１α）を欠く。ある特定の代替法では、前記の第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよび／またはＦＭＳ様チロシンキナーゼ−３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）を欠く。特定の代替法では、前記の第１の培地および前記の第２の培地は、ＬＩＦおよび／またはＭＩＰ−１αを欠き、前記の第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよび／またはＦｌｔ３Ｌを欠く。ある特定の代替法では、第１の培地、第２の培地または第３の培地のいずれも、ヘパリン、例えば、低分子量ヘパリンを含まない。
【０１３２】
別の代替法では、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を有する個体を治療する方法であって、個体に、（１）レナリドミド、（２）メルファラン、（３）フルダラビンおよび（４）ＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫ細胞の治療上有効用量を投与することを含む方法が、本明細書において提供され、これでは、前記ＧＭ  ＮＫ細胞は、前記個体において前記ＣＬＬを治療する、または寛解させる、または阻害するのに有効である。特定の代替法では、前記ＧＭ  ＮＫ細胞は、臍帯血ＮＫ細胞または臍帯血造血幹細胞から産生されたＮＫ細胞に由来する。別の代替法では、前記ＧＭ  ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞を産生するために本明細書に記載される３段階法によって産生されている。上記の方法のいずれかの特定の代替法では、前記レナリドミド、メルファラン、フルダラビンおよびＧＭ  ＮＫ細胞は、前記個体に別個に投与される。ＣＬＬを有する個体に療法を提供する方法のある特定の代替法では、前記ＧＭ  ＮＫ細胞は、造血幹細胞または前駆体細胞、例えば、ＣＤ３４＋幹細胞または前駆体細胞を、幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１の培地中で培養して、第１の細胞の集団を産生することと、続いて、前記の第１の細胞の集団を、幹細胞動員剤およびインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠く第２の培地中で培養して、第２の細胞の集団を産生することと、続いて、前記の第２の細胞の集団を、ＩＬ−２および／またはＩＬ−１５を含み、幹細胞動員剤およびＬＭＷＨを欠く第３の培地中で培養して、第３の細胞の集団を産生することであって、第３の細胞の集団が、ＣＤ５６＋、ＣＤ３−、ＣＤ１６−またはＣＤ１６＋およびＣＤ９４＋またはＣＤ９４−であるナチュラルキラー細胞を含み、ナチュラルキラー細胞の少なくとも７０％または少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％が生存可能であることを含む方法によってＮＫ細胞を産生することを含む方法によって産生される。ある特定の代替法では、前記の第１の培地および／または前記の第２の培地は、白血病阻害因子（ＬＩＦ）および／またはマクロファージ炎症性タンパク質−１アルファ（ＭＩＰ−１α）を欠く。ある特定の代替法では、前記の第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよび／またはＦＭＳ様チロシンキナーゼ−３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）を欠く。特定の代替法では、前記の第１の培地および前記の第２の培地は、ＬＩＦおよび／またはＭＩＰ−１αを欠き、前記の第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよび／またはＦｌｔ３Ｌを欠く。ある特定の代替法では、第１の培地、第２の培地または第３の培地のいずれも、ヘパリン、例えば、低分子量ヘパリンを含まない。
【０１３３】
ｂ．６．９．２腫瘍細胞増殖の抑制
腫瘍細胞の増殖を抑制する方法であって、本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫ細胞を、腫瘍細胞と近接させること、例えば、腫瘍細胞を、本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫ細胞と接触させることを含む方法が、本明細書においてさらに提供される。任意選択で、単離された胎盤灌流液または単離された胎盤灌流液細胞は、腫瘍細胞および／または本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫ細胞と近接される。別の特定の代替法では、免疫調節性化合物、例えば、上記の免疫調節性化合物またはサリドマイドが、腫瘍細胞および／または本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫ細胞とさらに近接され、その結果、腫瘍細胞の増殖が、本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫ細胞と近接されない同種の腫瘍細胞と比較して検出可能に低減される。任意選択で、単離された胎盤灌流液または単離された胎盤灌流液細胞は、免疫調節性化合物と接触されている、またはそれと近接されている、腫瘍細胞および／または本明細書に記載されたＧＭ  ＮＫ細胞と近接される。
【０１３４】
本明細書において、ある特定の代替法では、細胞に関して、「接触させること」または「近接させること」とは、１つの代替法において、ナチュラルキラー細胞、例えば、本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫ細胞集団と腫瘍細胞の間の直接の物理的な、例えば、細胞−細胞接触を包含する。別の代替法では、「接触させること」は、同一物理的空間における存在を包含する、例えば、ナチュラルキラー細胞、例えば、本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫ細胞および／または単離された組み合わされたナチュラルキラー細胞が、腫瘍細胞と同一容器（例えば、培養ディッシュ、マルチウェルプレート）中に入れられる。別の代替法では、ナチュラルキラー細胞、例えば、本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫ細胞および腫瘍細胞を「接触させること」は、例えば、ナチュラルキラー細胞、例えば、ＧＭ  ＮＫ細胞を、個体、例えば、腫瘍細胞を含むヒト、例えば、癌患者に注射または注入することによって達成される。免疫調節性化合物および／またはサリドマイドに関連して「接触させること」とは、例えば、細胞と、免疫調節性化合物および／またはサリドマイドが、互いに直接的に物理的に接触されること、または同一物理的容量（例えば、細胞培養容器または個体）内に入れられることを意味する。
【０１３５】
特定の代替法では、腫瘍細胞は、血液癌細胞、例えば、白血病細胞またはリンパ腫細胞である。より特定の代替法では、癌は、急性白血病、例えば、急性Ｔ細胞白血病細胞、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞、急性前骨髄球性白血病細胞、急性骨髄芽球性白血病細胞、急性巨核芽球性白血病細胞、前駆体Ｂ急性リンパ性白血病細胞、前駆体Ｔ急性リンパ性白血病細胞、バーキット白血病（バーキットリンパ腫）細胞または急性混合型（ｂｉｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ）白血病細胞、慢性白血病細胞、例えば、慢性骨髄性リンパ腫細胞、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞、慢性単球性白血病細胞、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ性リンパ腫細胞またはＢ細胞前リンパ性白血病細胞、ヘアリー細胞リンパ腫細胞、Ｔ細胞前リンパ性白血病細胞またはリンパ腫細胞、例えば、組織球性リンパ腫細胞、リンパ形質細胞性リンパ腫細胞（例えば、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症細胞）、脾臓周辺帯リンパ腫細胞、形質細胞新生物細胞（例えば、形質細胞骨髄腫細胞、形質細胞腫細胞、モノクローナル免疫グロブリン沈着症または重鎖病）、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（ＭＡＬＴリンパ腫）細胞、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（ＮＭＺＬ）細胞、濾胞性リンパ腫細胞、マントル細胞リンパ腫細胞、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫細胞、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫細胞、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫細胞、原発性滲出液リンパ腫細胞、Ｔ細胞大型顆粒リンパ性白血病細胞、侵攻性ＮＫ細胞白血病細胞、成体Ｔ細胞白血病／リンパ腫細胞、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫−鼻腔型細胞、腸症型Ｔ細胞リンパ腫細胞、肝脾Ｔ細胞リンパ腫細胞、芽細胞性ＮＫ細胞リンパ腫細胞、菌状息肉症（セザリー症候群）、原発性皮膚ＣＤ３０陽性Ｔ細胞リンパ増殖性障害（例えば、原発性皮膚未分化大細胞リンパ腫またはリンパ腫様丘疹症）細胞、血管免疫芽細胞性Ｔ細胞リンパ腫細胞、末梢Ｔ細胞リンパ腫−不特定細胞、未分化大細胞リンパ腫細胞、ホジキンリンパ腫細胞または結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫細胞である。別の特定の代替法では、腫瘍細胞は、多発性骨髄腫細胞または骨髄異形成症候群細胞である。
【０１３６】
特定の代替法では、腫瘍細胞は、固形腫瘍細胞、例えば、癌腫細胞、例えば、腺癌細胞、副腎皮質癌腫細胞、結腸腺癌細胞、結腸直腸腺癌細胞、結腸直腸癌腫細胞、腺管細胞癌腫細胞、肺癌腫細胞、甲状腺癌腫細胞、鼻咽頭癌腫細胞、黒色腫細胞（例えば、悪性黒色腫細胞）、非黒色腫皮膚癌腫細胞または不特定癌腫細胞、類腱腫細胞、線維形成性小円形細胞腫瘍細胞、内分泌腫瘍細胞、ユーイング肉腫細胞、生殖細胞腫瘍細胞（例えば、精巣癌細胞、卵巣癌細胞、絨毛癌細胞、卵黄嚢腫瘍細胞、胚細胞腫細胞など）、肝芽腫（ｈｅｐａｔｏｓｂｌａｓｔｏｍａ）細胞、肝細胞癌腫細胞、神経芽細胞腫細胞、非横紋筋肉腫軟組織肉腫細胞、骨肉腫細胞、網膜芽細胞腫細胞、横紋筋肉腫細胞またはウィルムス腫瘍細胞である。別の代替法では、腫瘍細胞は、膵臓癌細胞または乳癌細胞である。その他の代替法では、固形腫瘍細胞は、聴神経腫瘍細胞、星状細胞腫細胞（例えば、グレードＩ毛様細胞性星状細胞腫細胞、グレードＩＩ低悪性度星状細胞腫細胞、グレードＩＩＩ未分化星状細胞腫細胞またはグレードＩＶ多形神経膠芽腫細胞）、脊索腫細胞、頭蓋咽頭腫細胞、神経膠腫細胞（例えば、脳幹神経膠腫細胞、上衣腫細胞、混合膠腫細胞、視神経神経膠腫細胞または上衣下腫細胞）、神経膠芽腫細胞、髄芽腫細胞、髄膜腫細胞、転移性脳腫瘍細胞、乏突起神経膠腫細胞、松果体芽腫細胞、下垂体腫瘍細胞、原始神経外胚葉性腫瘍細胞またはシュワン腫細胞である。別の代替法では、腫瘍細胞は、前立腺癌細胞である。
【０１３７】
本明細書において、「治療上有益な」および「治療的利益」として、それだけには限らないが、例えば、腫瘍の大きさの低減、腫瘍の増殖の減少または停止、転移性疾患を低減することまたは予防すること、単位容量あたりの組織サンプル、例えば、血液サンプル中の癌細胞数の低減、前記個体が有する特定の癌または腫瘍の任意の症状における臨床的改善、個体が有する特定の癌の任意の症状の悪化の減少または停止などが挙げられる。
【０１３８】
ｃ．６．９．３．ＧＭ  ＮＫ細胞およびその他の抗癌剤を使用する癌の治療
本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫ細胞を使用して癌を有する個体に療法を提供することは、１種または複数のさらなる抗癌剤を含む抗癌療法レジメンの一部であり得る。さらにまたはあるいは、本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫ細胞を使用して癌を有する個体に療法を提供することを使用して、１種または複数のその他の抗癌剤を含む抗癌療法を補うことができる。このような抗癌剤は、当技術分野で周知であり、抗炎症剤、免疫調節剤、細胞傷害性薬剤、癌ワクチン、化学療法薬、ＨＤＡＣ阻害剤（例えば、ＨＤＡＣ６ｉ（ＡＣＹ−２４１））およびｓｉＲＮＡを含む。本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫ細胞に加えて、癌を有する個体、例えば、腫瘍細胞を有する個体に投与してもよい特定の抗癌剤として、それだけには限らないが、アシビシン、アクラルビシン、塩酸アコダゾール、アクロニン、アドゼレシン、アドリアマイシン、アドルシル、アルデスロイキン、アルトレタミン、アンボマイシン、酢酸アメタントロン、アムサクリン、アナストロゾール、アントラマイシン、アスパラギナーゼ（例えば、エルウィニア・クリサン（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎ）由来；エルウィナーゼ（Ｅｒｗｉｎａｚｅ））、アスペルリン、アバスチン（ベバシズマブ）、アザシチジン、アゼテパ、アゾトマイシン、バチマスタット、ベンゾデパ、ビカルタミド、塩酸ビサントレン、ビスナフィドジメシレート（ｂｉｓｎａｆｉｄｅ  ｄｉｍｅｓｙｌａｔｅ）、ビゼレシン、硫酸ブレオマイシン、ブレキナルナトリウム、ブロピリミン、ブスルファン、カクチノマイシン、カルステロン、カラセミド、カルベチマー、カルボプラチン、カルムスチン、塩酸カルビシン、カルゼレシン、セデフィンゴール、セレコキシブ（ＣＯＸ−２阻害剤）、セルビジン、クロラムブシル、シロレマイシン、シスプラチン、クラドリビン、メシル酸クリスナトール、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、塩酸ダウノルビシン、デシタビン、デキソルマプラチン、デザグアニン、メシル酸デザグアニン、ジアジクオン、ドセタキセル、ドキソルビシン、塩酸ドキソルビシン、ドロロキシフェン、クエン酸ドロロキシフェン、プロピオン酸ドロモスタノロン、ズアゾマイシン、エダトレキサート、塩酸エフロミチン、エルサミトルシン、エルスパー（Ｅｌｓｐａｒ）、エンロプラチン、エンプロメート、エピプロピジン、塩酸エピルビシン、エルブロゾール、塩酸エソルビシン、エストラムスチン、リン酸エストラムスチンナトリウム、エタニダゾール、エトポシド、リン酸エトポシド、エトポフォス（Ｅｔｏｐｏｐｈｏｓ）、エトプリン、塩酸ファドロゾール、ファザラビン、フェンレチニド、フロクスウリジン、リン酸フルダラビン、フルオロウラシル、フルロシタビン、ホスキドンフォストリエシンナトリウム、ゲムシタビン、塩酸ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダマイシン、塩酸イダルビシン、イホスファミド、イルモホシン、イプロプラチン、イリノテカン、塩酸イリノテカン、酢酸ランレオチド、レトロゾール、酢酸リュープロリド、塩酸リアロゾール、ロメトレキソールナトリウム、ロムスチン、塩酸ロソキサントロン、マソプロコール、マイタンシン、塩酸メクロレタミン、酢酸メゲストロール、酢酸メレ��ゲストロール、メルファラン、メノガリル、メルカププリン、メトトレキサート、メトトレキサートナトリウム、メトプリン、メツレデパ、ミチンドミド、マイトカルシン、マイトクロミン、マイトギリン、マイトマルシン、マイトマイシン、マイトスペル、ミトタン、塩酸ミトキサントロン、ミコフェノール酸、ノコダゾール、ノガラマイシン、オルマプラチン、オキシスラン、パクリタキセル、ペグアスパルガーゼ、ペリオマイシン、ペンタムスチン、硫酸ペプロマイシン、ペルホスファミド、ピポブロマン、ピポスルファン、塩酸ピロキサントロン、プリカマイシン、プロメスタン、ポルフィマーナトリウム、ポルフィロマイシン、プレドニムスチン、塩酸プロカルバジン、プロロイキン（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）、プリネトール（Ｐｕｒｉｎｅｔｈｏｌ）、ピューロマイシン、塩酸ピューロマイシン、ピラゾフリン、レウマトレックス、リボプリン、サフィンゴール、塩酸サフィンゴール、セムスチン、シムトラゼン、スパルホセートナトリウム、スパルソマイシン、塩酸スピロゲルマニウム、スピロムスチン、スピロプラチン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、スロフェヌル、タブロイド（Ｔａｂｌｏｉｄ）、タリソマイシン、テコガランナトリウム、タキソテール、テガフール、塩酸テロキサントロン、テモポルフィン、テニポシド、テロキシロン、テストラクトン、チアミプリン、チオグアニン、チオテパ、チアゾフリン、チラパザミン、トポサル（Ｔｏｐｏｓａｒ）、クエン酸トレミフェン、酢酸トレストロン、トレキサル（Ｔｒｅｘａｌｌ）、リン酸トリシリビン、トリメトレキサート、グルクロン酸トリメトレキサート、トリプトレリン、塩酸ツブロゾール、ウラシルマスタード、ウレデパ、バプレオチド、ベルテポルフィン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、ビンデシン、硫酸ビンデシン、硫酸ビネピジン、硫酸ビングリシネート、硫酸ビンロイロシン、酒石酸ビノレルビン、硫酸ビンロシジン、硫酸ビンゾリジン、ボロゾール、ゼニプラチン、ジノスタチンおよび／または塩酸ゾルビシンが挙げられる。
【０１３９】
ＧＭ  ＮＫ細胞が絡むいくつかの考慮される方法において提供してもよいさらなる抗癌薬として、それだけには限らないが、２０−エピ−１，２５ジヒドロキシビタミンＤ３、５−アザシチジン、５−エチニルウラシル、アビラテロン、アクラルビシン、アシルフルベン、アデシペノール、アドゼレシン、アルデスロイキン、ＡＬＬ−ＴＫアンタゴニスト、アルトレタミン、アンバムスチン、アミドックス、アミホスチン、アミノレブリン酸、アムルビシン、アムサクリン、アナグレリド、アナストロゾール、アンドログラフォリド、脈管形成阻害剤、アンタゴニストＤ、アンタゴニストＧ、アンタレリクス、抗背方化形態形成タンパク質−１、抗アンドロゲン、前立腺癌腫、抗エストロゲン剤、アンチネオプラストン、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アフィジコリングリシネート、アポトーシス遺伝子モジュレーター、アポトーシスレギュレーター、アプリン酸、ａｒａ−ＣＤＰ−ＤＬ−ＰＴＢＡ、アルギニンデアミナーゼ、アスラクリン、アタメスタン、アトリムスチン、アキシナスタチン１、アキシナスタチン２、アキシナスタチン３、アザセトロン、アザトキシン、アザチロシン、バッカチンＩＩＩ誘導体、バラノール、バチマスタット、ＢＣＲ／ＡＢＬアンタゴニスト、ベンゾクロリン、ベンゾイルスタウロスポリン、ベータラクタム誘導体、ベータ−アレチン、ベタクラマイシンＢ、ベツリン酸、ｂＦＧＦ阻害剤、ビカルタミド、ビサントレン、ビスアジリジニルスペルミン、ビスナフィド、ビストラテンＡ、ビゼレシン、ブレフレート、ブロピリミン、ブドチタン、ブチオニンスルホキシミン、カルシポトリオール、カルスチンＣ、カンプトサール（カンプトとも呼ばれる、イリノテカン）カンプトテシン誘導体、カペシタビン、カルボキサミド−アミノ−トリアゾール、カルボキシアミドトリアゾール、ＣａＲｅｓｔ  Ｍ３、ＣＡＲＮ  ７００、軟骨由来阻害剤、カルゼレシン、カゼインキナーゼ阻害剤（ＩＣＯＳ）、カスタノスペルミン、ＣＣ−１２２、ＣＣ−２２０、ＣＣ−４８６、セクロピンＢ、セトロレリクス、クロリン（ｃｈｌｏｒｌｎ）、クロロキノキサリンスルホンアミド、シカプロスト、シス−ポルフィリン、クラドリビン、クロミフェン類似体、クロトリマゾール、コリスマイシンＡ、コリスマイシンＢ、コンブレタスタチンＡ４、コンブレタスタチン類似体、コナゲニン、クラムベスシジン８１６、クリスナトール、クリプトフィシン８、クリプトフィシンＡ誘導体、クラシンＡ、シクロペンタントラキノン、シクロプラタム、シペマイシン、シタラビン億ホスフェート、細胞溶解因子、サイトスタチン、ダクリキシマブ、デシタビン、デヒドロジデンミンＢ、デスロレリン、デキサメタゾン、デキシホスファミド、デクスラゾキサン、デクスベラパミル、ジアジクオン、ジデムニンＢ、ジドックス、ジエチルノルスペルミン、ジヒドロ−５−アザシチジン、ジヒドロタキソール、９−；ジオキサマイシン、ジフェニルスピロムスチン、ドセタキセル、ドコサノール、ドラセトロン、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、ドロロキシフェン、ドロナビノール、デュオカルマイシンＳＡ、エブセレン、エコムスチン、エデルホシン、エドレコロマブ、エフロールニチン、エレメン、エミテフール、エピルビシン、エプリステリド、エストラムスチン類似体、エストロゲンアゴニスト、エストロゲンアンタゴニスト、エタニダゾール、リン酸エトポシド、エキセメスタン、ファドロゾール、ファザラビン、フェンレチニド、フィルグラスチム、フィナステリド、フラボピリドール、フレゼラスチン、フルアステロン、フルダラビン（例えば、フルダラ）、塩酸フルオロダウノルニシン、フォルフェニメックス、フォルメスタン、フォストリエシン、ホテムスチン、ガドリニウムテキサフィリン、硝酸ガリウム、ガロシタビン、ガニレリクス、ゼラチナーゼ阻害剤、ゲムシタビン、グルタチオン阻害剤、ヘプスルファム、ヘレグリン、ヘキサメチレンビスアセトアミド、ヒペリシン、イバンドロン酸、イダルビシン、イドキシフェン、イドラマントン、イルモホシン、イロマスタット、イマチニブ（例えば、グリベック（登録商標））、イミキモド、免疫賦活薬ペプチド、インスリン様成長因子−１受容体阻害剤、インターフェロンアゴニスト、インターフェロン、インターロイキン、イオベングアン、ヨードドキソルビシン、イポメアノール、４−；イロプラクト、イルソグラジン、イソベンガゾール、イソホモハリコンドリンＢ、イタセトロン、ジャスプラキノリド、カハラリドＦ、ラメラリン−Ｎトリアセテート、ランレオチド、レイナマイシン、レノグラスチム、硫酸レンチナン、レプトルスタチン、レトロゾール、白血病阻害因子、白血球アルファインターフェロン、リュープロリド＋エストロゲン＋プロゲステロン、リュープロレリン、レバミソール、リアロゾール、直鎖ポリアミン類似体、親油性二糖ペプチド、親油性白金化合物、リッソクリナミド７、ロバプラチン、ロンブリシン、ロメトレキソール、ロニダミン、ロソキサントロン、ロキソリビン、ルルトテカン、ルテチウムテキサフィリン、リソフィリン、溶解性ペプチド、マイタンシン、マンノスタチンＡ、マリマスタット、マソプロコール、マスピン、マトリライシン阻害剤、マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤、メノガリル、メルバロン、メテレリン、メチオニナーゼ、メトクロプラミド、ＭＩＦ阻害剤、ミフェプリストン、ミルテホシン、ミリモスチム、ミトグアゾン、ミトラクトール、マイトマイシン類似体、ミトナフィド、マイトトキシン線維芽細胞成長因子−サポリン、ミトキサントロン、モファロテン、モルグラモスチム、抗ＥＧＦＲ抗体（例えば、アービタックス（セツキシマブ））、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）、抗ＣＳ−１抗体（例えば、エロツズマブ（ＢＭＳ／ＡｂｂＶｉｅ））、抗ＣＤ３８抗体（例えば、ダラツムマブ（Ｇｅｎｍａｂ／Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、抗ＣＤ１３８抗体（例えば、インダツキシマブ（ｉｎｄａｔｕｘｉｍａｂ）（Ｂｉｏｔｅｓｔ  ＡＧ  Ｄｒｅｉｅｉｃｈ））、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（例えば、デュルバルマブ（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ））、抗ＮＫＧ２Ａ抗体（例えば、モナリズマブ（ｍｏｎａｌｉｚｕｍａｂ）（ＩＰＨ２２０１；Ｉｍｍａｔｅ  Ｐｈａｒｍａ））、抗ＤＬＬ４抗体（例えば、デミシズマブ（Ｏｎｃｏｍｅｄ／Ｃｅｌｇｅｎｅ））、抗ＤＬＬ４および抗ＶＥＧＦ二重特異性抗体、抗ＲＳＰＯ３抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、Ｉ���ＯＳアゴニスト抗体、抗ジシアロガングリオシド（ＧＤ２）抗体（例えば、モノクローナル抗体３Ｆ８またはｃｈ１４．１８），抗ＥｒｂＢ２抗体（例えば、ヘルセプチン）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、モノホスホリル脂質Ａ＋ミオバクテリウム細胞壁ｓｋ、モピダモール、マスタード抗癌剤、ミカペルオキシドＢ、マイコバクテリア細胞壁抽出物、ミリアポロン、Ｎ−アセチルジナリン、Ｎ−置換ベンズアミド、ナファレリン、ナグレスチップ、ナロキソン＋ペンタゾシン、ナパビン、ナフテルピン、ナルトグラスチム、ネダプラチン、ネモルビシン、ネリドロン酸、ニルタミド、ニサマイシン、一酸化窒素モジュレーター、窒素酸化物酸化防止剤、ニトルリン、オブリメルセン（ＧＥＮＡＳＥＮＳＥ（登録商標））、Ｏ６−ベンジルグアニン、オクトレオチド、オキセノン、オリゴヌクレオチド、オナプリストン、オンダンセトロン、オンダンセトロン、オラシン、経口サイトカインインデューサー、オルマプラチン、オサテロン、オキサリプラチン（例えば、フロキサチン（Ｆｌｏｘａｔｉｎ））、オキサウノマイシン、パクリタキセル、パクリタキセル類似体、パクリタキセル誘導体、パラウアミン、パルミトイルリゾキシン、パミドロン酸、パナキシトリオール、パノミフェン、パラバクチン、パゼリプチン、ペグアスパルガーゼ、ペルデシン、ペントサンポリスルフェートナトリウム、ペントスタチン、ペントロゾール、ペルフルブロン、ペルホスファミド、ペリリルアルコール、フェナジノマイシン、酢酸フェニル、ホスファターゼ阻害剤、ピシバニール、塩酸ピロカルピン、ピラルビシン、ピリトレキシム、プラセチンＡ、プラセチンＢ、プラスミノゲンアクチベーター阻害剤、白金複合体、白金加賀応物、白金−トリアミン複合体、ポルフィマーナトリウム、ポルフィロマイシン、プレドニゾン、プロピルビス−アクリドン、プロスタグランジンＪ２、プロテアソーム阻害剤、プロテインＡベースの免疫モジュレーター、タンパク質キナーゼＣ阻害剤、タンパク質キナーゼＣ阻害剤、微細藻類、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤、プルプリン、ピラゾロアクリジン、ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレンコンジュゲート、ｒａｆアンタゴニスト、ラルチトレキセド、ラモセトロン、ｒａｓファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、ｒａｓ阻害剤、ｒａｓ−ＧＡＰ阻害剤、脱メチル化レテリプチン、レニウムＲｅ  １８６エチドロネート、リゾキシン、リボザイム、ＲＩＩレチナミド、ロヒツキン、ロムルチド、ロキニメックス、ルビギノンＢ１、ルボキシル、サフィンゴール、サイントピン、ＳａｒＣＮＵ、サルコフィトールＡ、サルグラモスチム、Ｓｄｉ  １ミメティクス、セムスチン、老化由来阻害剤１、センスオリゴヌクレオチド、シグナル伝達阻害剤、シゾフィラン、ソブゾキサン、ナトリウムボロカプテート、酢酸フェニルナトリウム、ソルベロール、ソマトメジン結合タンパク質、ソネルミン、スパルフォシン酸、スピカマイシンＤ、スピロムスチン、スプレノペンチン、スポンジスタチン１、スクアラミン、スチピアミド、ストロメライシン阻害剤、スルフィノシン、超活性血管作用性小腸ペプチドアンタゴニスト、スラジスタ、スラミン、スウェインソニン、タリムスチン、タモキシフェンメチオジド、タウロムスチン、タザロテン、テコガランナトリウム、テガフール、テルラピリリウム、テロメラーゼ阻害剤、テモポルフィン、テニポシド、テトラクロロデカオキシド、テトラゾミン、タリブラスチン、チオコラリン、トロンボポエチン、トロンボポエチンミメティック、チマルファシン、サイモポエチン受容体アゴニスト、チモトリナン、甲状腺刺激ホルモン、；エチルエチオプルプリンスズ、チラパザミン、二塩化チタノセン、トプセンチン、トレミフェン、翻訳阻害剤、トレチノイン、トリアセチルウリジン、トリシリビン、トリメトレキサート、トリプトレリン、トロピセトロン、ツロステリド、チロシンキナーゼ阻害剤、チルホスチン、ＵＢＣ阻害剤、ウベニメクス、尿生殖洞由来成長阻害因子、ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト、バプレオチド、バリオリンＢ、ベクティビックス（パニツムマブ）ベラレゾール、ベラミン、ベルジン、ベルテポルフィン、ビノレルビン、ビンキサルチン、ビタキシン、ボロゾール、ウェルコボリン（Ｗｅｌｃｏｖｏｒｉｎ）（ロイコボリン）、ゼローダ（カペシタビン）、ザノテロン、ゼニプラチン、ジラスコルブおよび／またはジノスタチンスチマラマーが挙げられる。
【０１４０】
本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫ細胞を使用する癌を有する個体に提供される療法は、１種または複数の免疫チェックポイントモジュレーターを含む抗癌療法レジメンの一部であり得る。ある特定の代替法では、免疫チックポイントモジュレーターは、ＣＤ２８、ＯＸ４０、グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体関連タンパク質（ＧＩＴＲ）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２７、ヘルペスウイルス侵入メディエーター（ＨＶＥＭ）、Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン含有−３（ＴＩＭ−３）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ−３）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原−４（ＣＴＬＡ−４）、Ｔ細胞活性化のＶドメイン免疫グロブリンサプレッサー（ＶＩＳＴＡ）、ＢおよびＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１などの免疫チェックポイント分子を調節する。ある特定の代替法では、免疫チェックポイント分子は、抗体またはその抗原結合断片である。ある特定の代替法では、免疫チェックポイントモジュレーターは、免疫チェックポイント分子のアゴニストである。ある特定の代替法では、免疫チェックポイント分子は、ＣＤ２８、ＯＸ４０、グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体関連タンパク質（ＧＩＴＲ）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２７、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、誘導可能Ｔ細胞共刺激分子）および／またはヘルペスウイルス侵入メディエーター（ＨＶＥＭ）である。ある特定の代替法では、免疫チェックポイントモジュレーターは、抗体またはその抗原結合断片である。ある特定の代替法では、免疫チェックポイントモジュレーターは、免疫チェックポイント分子のアンタゴニストである。ある特定の代替法では、免疫チェックポイント分子は、Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン含有−３（ＴＩＭ−３）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ−３）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原−４（ＣＴＬＡ−４）、Ｔ細胞活性化のＶドメイン免疫グロブリンサプレッサー（ＶＩＳＴＡ）、ＢおよびＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１である。ある特定の代替法では、免疫チェックポイントモジュレーターは、抗体またはその抗原結合断片である。ある特定の代替法では、免疫チェックポイントモジュレーターは、抗体またはその抗原結合断片である。ある特定の代替法では、抗体またはその抗原結合断片は、ＰＤ−１と結合する。ある特定の代替法では、ＰＤ−１と結合する抗体またはその抗原結合断片は、ニボルマブ（オプジーボ（登録商標）、ＢＭＳ−９３６５５８、ＭＤＸ−１１０６、ＯＮＯ−４５３８；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ、Ｏｎｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．）、ペムブロリズマブ（キイトルーダ（登録商標）、ランブロリズマブ、ＭＫ−３４７５；Ｍｅｒｃｋ）、ピディリズマブ（ＣＴ−０１１；Ｃｕｒｅｔｅｃｈ、Ｍｅｄｉｖａｔｉｏｎ）、ＭＥＤＩ０６８０（ＡＭＰ−５１４；Ｍｅｄｌｍｍｕｎｅ、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＰＤＲ−００１（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＳＨＲ１２１０またはＩＮＣＳＨＲ１２１０；Ｉｎｃｙｔｅ、Ｊｉａｎｇｓｕ  Ｈｅｎｇｒｕｉ）である。ある特定の代替法では、抗体またはその抗原結合断片は、ＰＤ−���１と結合する。ある特定の代替法では、ＰＤ−Ｌ１と結合する抗体またはその抗原結合断片は、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６；Ｍｅｄｌｍｍｕｎｅ、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＢＭＳ−９３６５５９（ＭＤＸ−１１０５；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、アベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ；Ｍｅｒｃｋ  Ｓｅｒｏｎｏ、Ｐｆｉｚｅｒ）またはアテゾリズマブ（ＭＰＤＬ−３２８０Ａ；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｒｏｃｈｅ）である。ある特定の代替法では、抗体またはその抗原結合断片は、ＬＡＧ−３と結合する。ある特定の代替法では、ＬＡＧ−３と結合する抗体またはその抗原結合断片は、ＢＭＳ−９８６０１６（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、ＧＳＫ２８３１７８１（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）またはＬＡＧ５２５（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）である。ある特定の代替法では、抗体またはその抗原結合断片は、ＣＴＬＡ−４と結合する。ある特定の代替法では、ＣＴＬＡ−４と結合する抗体またはその抗原結合断片は、イピリムマブ（ＹＥＲＶＯＹ（商標）、ＢＭＳ−７３４０１６、ＭＤＸ０１０、ＭＤＸ−１０１；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）またはトレメリムマブ（ＣＰ−６７５，２０６；ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）である。ある特定の代替法では、抗体またはその抗原結合断片は、ＯＸ４０と結合する。ある特定の代替法では、ＯＸ４０と結合する抗体またはその抗原結合断片は、ＭＥＤＩ６４６９（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＭＥＤＩ０５６２（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）またはＫＨＫ４０８３（Ｋｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏ  Ｋｉｒｉｎ）である。ある特定の代替法では、抗体またはその抗原結合断片は、ＧＩＴＲと結合する。ある特定の代替法では、ＧＩＴＲと結合する抗体またはその抗原結合断片は、ＴＲＸ５１８（Ｌｅａｐ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）またはＭＥＤＩ１８７３（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）である。ある特定の代替法では、抗体またはその抗原結合断片は、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）と結合する。ある特定の代替法では、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）と結合する抗体またはその抗原結合断片は、ＰＦ−２５６６（ＰＦ−０５０８２５６６；Ｐｆｉｚｅｒ）またはウレルマブ（ＢＭＳ−６６３５１３；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）である。ある特定の代替法では、抗体またはその抗原結合断片は、ＣＤ２７と結合する。ある特定の代替法では、ＣＤ２７と結合する抗体またはその抗原結合断片は、バリルマブ（ｖａｒｉｌｕｍａｂ）（ＣＤＸ−１１２７；Ｃｅｌｌｄｅｘ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ）である。
【０１４１】
ある特定の代替法では、本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫ細胞を使用する、癌を有する個体のための療法は、レナリドミドまたはポマリドミドを含む抗癌療法レジメンの一部である。ある特定の代替法では、本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫ細胞を使用する、癌を有する個体のための療法は、ＨＤＡＣ阻害剤を含む抗癌療法レジメンの一部である。ある特定の代替法では、本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫを使用する、癌を有する個体のための療法は、抗ＣＳ−１抗体を含む抗癌療法レジメンの一部である。ある特定の代替法では、本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫ細胞を使用する、癌を有する個体のための療法は、抗ＣＤ３８抗体を含む抗癌療法レジメンの一部である。ある特定の代替法では、本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫ細胞を使用する、癌を有する個体のための療法は、抗ＣＤ１３８抗体を含む抗癌療法レジメンの一部である。ある特定の代替法では、本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫ細胞を使用する、癌を有する個体のための療法は、抗ＰＤ−１抗体を含む抗癌療法レジメンの一部である。ある特定の代替法では、本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫを使用する、癌を有する個体のための療法は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む抗癌療法レジメンの一部である。ある特定の代替法では、本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫ細胞を使用する、癌を有する個体のための療法は、抗ＮＫＧ２Ａ抗体を含む抗癌療法レジメンの一部である。ある特定の代替法では、本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫ細胞を使用する、癌を有する個体のための療法は、抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ、リツキサン（登録商標））を含む抗癌療法レジメンの一部である。ある特定の代替法では、本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫ細胞を使用する、癌を有する個体のための療法は、ＣＣ−１２２を含む抗癌療法レジメンの一部である。ある特定の代替法では、本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫ細胞を使用する、癌を有する個体のための療法は、ＣＣ−２２０を含む抗癌療法レジメンの一部である。ある特定の代替法では、本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫ細胞を使用する、癌を有する個体のための療法は、抗ＤＬＬ４抗体（例えば、デミシズマブ）を含む抗癌療法レジメンの一部である。ある特定の代替法では、本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫ細胞を使用する、癌を有する個体のための療法は、抗ＤＬＬ４および抗ＶＥＧＦ二重特異性抗体を含む抗癌療法レジメンの一部である。ある特定の代替法では、本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫ細胞を使用する、癌を有する個体のための療法は、抗ＲＳＰＯ３抗体を含む抗癌療法レジメンの一部である。ある特定の代替法では、本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫ細胞を使用する、癌を有する個体のための療法は、抗ＴＩＧＩＴ抗体を含む抗癌療法レジメンの一部である。ある特定の代替法では、本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫ細胞を使用する、癌を有する個体のための療法は、ＩＣＯＳアゴニスト抗体を含む抗癌療法レジメンの一部である。
【０１４２】
いくつかの代替法では、本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫ細胞を使用する、癌を有する個体のための療法は、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）のための抗癌療法レジメンの一部である。１つの代替法では、ＡＤＣＣレジメンは、本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫ細胞と組み合わせた１種または複数の抗体（例えば、前記の段落に記載される抗体）の投与を含む。それだけには限らないが、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）またはその他のＢ細胞悪性腫瘍（リンパ腫および  白血病）、神経芽細胞腫、黒色腫、乳癌および頭頸部癌を含むいくつかの種類の癌は、このようなＡＤＣＣ法を使用して阻害または治療することができる。特定の代替法では、ＡＤＣＣ療法は、本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫ細胞と組み合わせた、以下の抗体抗ＥＧＦＲ抗体（例えば、アービタックス（セツキシマブ））、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）、抗ジシアロガングリオシド（ＧＤ２）抗体（例えば、モノクローナル抗体３Ｆ８またはｃｈ１４．１８）または抗ＥｒｂＢ２抗体（例えば、ヘルセプチン）のうち１種または複数の投与を含む。１つの代替法では、ＡＤＣＣレジメンは、本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫ細胞と組み合わせた、抗ＣＤ３３  抗体の投与を含む。１つの代替法では、ＡＤＣＣレジメンは、本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫ細胞と組み合わせた、抗ＣＤ２０抗体の投与を含む。１つの代替法では、ＡＤＣＣレジメンは、本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫ細胞と組み合わせた、抗ＣＤ１３８抗体の投与を含む。１つの代替法では、ＡＤＣＣレジメンは、本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫ細胞と組み合わせた、抗ＣＤ３２抗体の投与を含む。
【０１４３】
ｄ．  ６．９．４．ウイルス感染の治療
別の代替法では、ウイルス感染を有する個体の療法を提供する方法であって、前記個体に、治療上有効な量の、本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫ細胞を投与することを含む方法が、本明細書において提供される。ある特定の代替法では、個体は、ナチュラルキラー細胞の欠乏、例えば、ＮＫ細胞または個体のウイルス感染に対して活性なその他の自然リンパ系細胞の欠乏を有する。ある特定の代替法では、本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫ細胞は、前記投与に先立って、免疫調節性化合物、例えば、上記の免疫調節性化合物またはサリドマイドと接触される、または近接される。ある特定の他の特定の代替法では、前記の投与することは、前記の本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫ細胞に加えて、前記個体に、免疫調節性化合物、例えば、上記の免疫調節性化合物またはサリドマイドを投与することを含み、ここで、前記量は、前記ウイルス感染の１つまたは複数の症状の、検出可能な改善、進行の減少、排除をもたらす量である。特定の代替法では、ウイルス感染は、アデノウイルス科（Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ）、ピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）、ヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）、ヘパドナウイルス科（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）、フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、パピローマウイルス科（Ｐａｐｉｌｏｍｍａｖｉｒｉｄａｅ）、ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）またはトガウイルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）のウイルスによる感染である。より特定の代替法では、前記ウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、コクサッキーウイルス、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、ポリオウイルス、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、単純ヘルペス１型（ＨＳＶ１）、単純ヘルペス２型（ＨＳＶ２）、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトヘルペスウイルス８型（ＨＨＶ８）、帯状疱疹（ｈｅｒｐｅｓ  ｚｏｓｔｅｒ）ウイルス（水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）または帯状疱疹（ｓｈｉｎｇｌｅｓ）ウイルス）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）、インフルエンザウイルス（例えば、インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス、インフルエンザＣウイルスまたはトゴトウイルス）、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、パラインフルエンザウイルス、パピローマウイルス、狂犬病ウイルスまたは風疹ウイルスである。
【０１４４】
その他のより特定の代替法では、前記ウイルスは、アデノウイルス種Ａ、血清型１２、１８または３１；アデノウイルス種Ｂ、血清型３、７、１１、１４、１６、３４、３５または５０；アデノウイルス種Ｃ、血清型１、２、５または６；種Ｄ、血清型８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３２、３３、３６、３７、３８、３９、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５１；種Ｅ、血清型４；または種Ｆ、血清型４０または４１である。
【０１４５】
ある特定のその他のより特定の代替法では、ウイルスは、アポイウイルス（ＡＰＯＩＶ）、アロアウイルス（ＡＲＯＡＶ）、バガザ（ｂａｇａｚａ）ウイルス（ＢＡＧＶ）、ベンジ（Ｂａｎｚｉ）ウイルス（ＢＡＮＶ）、ブブイ（Ｂｏｕｂｏｕｉ）ウイルス（ＢＯＵＶ）、カシパコア（Ｃａｃｉｐａｃｏｒｅ）ウイルス（ＣＰＣＶ）、カレー島（Ｃａｒｅｙ  Ｉｓｌａｎｄ）ウイルス（ＣＩＶ）、カウボーンリッジ（Ｃｏｗｂｏｎｅ  Ｒｉｄｇｅ）ウイルス（ＣＲＶ）、デングウイルス（ＤＥＮＶ）、エッジヒル（Ｅｄｇｅ  Ｈｉｌｌ）ウイルス（ＥＨＶ）、ガシェッツガリー（Ｇａｄｇｅｔｓ  Ｇｕｌｌｙ）ウイルス（ＧＧＹＶ）、イルへウス（Ｉｌｈｅｕｓ）ウイルス（ＩＬＨＶ）、イスラエルシチメンチョウ髄膜脳脊髄炎ウイルス（ＩＴＶ）、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）、ジュグラ（Ｊｕｇｒａ）ウイルス（ＪＵＧＶ）、ジュチアパ（Ｊｕｔｉａｐａ）ウイルス（ＪＵＴＶ）、カダム（ｋａｄａｍ）ウイルス（ＫＡＤＶ）、ケドゥグ（Ｋｅｄｏｕｇｏｕ）ウイルス（ＫＥＤＶ）、ココベラウイルス（ＫＯＫＶ）、コウタンゴ（Ｋｏｕｔａｎｇｏ）ウイルス（ＫＯＵＶ）、キャサヌール森林病ウイルス（ＫＦＤＶ）、ランガットウイルス（ＬＧＴＶ）、メアバン（Ｍｅａｂａｎ）ウイルス（ＭＥＡＶ）、モドック（Ｍｏｄｏｃ）ウイルス（ＭＯＤＶ）、モンタナミオチス白質脳炎（Ｍｏｎｔａｎａ  ｍｙｏｔｉｓ  ｌｅｕｋｏｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）ウイルス（ＭＭＬＶ）、マレー渓谷脳炎ウイルス（ＭＶＥＶ）、ンタヤ（Ｎｔａｙａ）ウイルス（ＮＴＡＶ）、オムスク出血熱ウイルス（ＯＨＦＶ）、ポワッサンウイルス（ＰＯＷＶ）、リオブラボーウイルス（ＲＢＶ）、ロイヤルファーム（Ｒｏｙａｌ  Ｆａｒｍ）ウイルス（ＲＦＶ）、サボヤ（Ｓａｂｏｙａ）ウイルス（ＳＡＢＶ）、セントルイス脳炎ウイルス（ＳＬＥＶ）、サルビエジャ（Ｓａｌ  Ｖｉｅｊａ）ウイルス（ＳＶＶ）、サンペルリタ（Ｓａｎ  Ｐｅｒｌｉｔａ）ウイルス（ＳＰＶ）、ソーマレズリーフ（Ｓａｕｍａｒｅｚ  Ｒｅｅｆ）ウイルス（ＳＲＥＶ）、セピック（Ｓｅｐｉｋ）ウイルス（ＳＥＰＶ）、テンブス（Ｔｅｍｂｕｓｕ）ウイルス（ＴＭＵＶ）、ダニ媒介脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）、チュレーニー（Ｔｙｕｌｅｎｉｙ）ウイルス（ＴＹＵＶ）、ウガンダ（Ｕｇａｎｄａ）Ｓウイルス（ＵＧＳＶ）、ウスツ（Ｕｓｕｔｕ）ウイルス（ＵＳＵＶ）、ヴェッセルスブロン（Ｗｅｓｓｅｌｓｂｒｏｎ）ウイルス（ＷＥＳＳＶ）、ウエストナイルウイルス（ＷＮＶ）、ヤウンデ（Ｙａｏｕｎｄｅ）ウイルス（ＹＡＯＶ）、黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）、ヨコセ（Ｙｏｋｏｓｅ）ウイルス（ＹＯＫＶ）またはジカウイルス（ＺＩＫＶ）である。
【０１４６】
その他の代替法では、本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫ細胞を、１種または複数のその他の抗ウイルス剤を含む抗ウイルス療法レジメンの一部としてウイルス感染を有する個体に投与する。いくつかの代替法では、個体は、遺伝子改変されたＮＫ細胞、抗ウイルス剤を受けるように選択されている。ウイルス感染を有する個体に投与してもよい具体的な抗ウイルス剤として、それだけには限らないが、イミキモド、ポドフィロックス、ポドフィリン、インターフェロンアルファ（ＩＦＮα）、レチコロス（ｒｅｔｉｃｏｌｏｓ）、ノノキシノール−９、アシクロビル、ファムシクロビル、バラシクロビル、ガンシクロビル、シドホビル、アマンタジン、リマンタジン、リバビリン、ザナマビル（ｚａｎａｍａｖｉｒ）およびオセルタマビル（ｏｓｅｌｔａｕｍａｖｉｒ）；インジナビル、ネルフィナビル、リトナビルまたはサキナビルなどのプロテアーゼ阻害剤；ジダノシン、ラミブジン、スタブジン、ザルシタビンまたはジドブジンなどのヌクレオシド逆転写酵素阻害剤；およびネビラピンまたはエファビレンツなどの非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤が挙げられる。
【０１４７】
ｅ．６．９．５．投与
単離されたＧＭ  ＮＫ細胞の集団またはその医薬組成物の投与は、全身である場合も局所である場合もある。特定の代替法では、投与は、非経口である。特定の代替法では、対象への単離されたＧＭ  ＮＫ細胞の集団またはその医薬組成物の投与は、注射、注入、静脈内（ＩＶ）投与、大腿内投与または腫瘍内投与による。特定の代替法では、対象への単離されたＧＭ  ＮＫ細胞の集団またはその医薬組成物の投与は、デバイス、マトリックスまたはスキャフォールドを用いて実施される。特定の代替法では、対象への単離されたＧＭ  ＮＫ細胞の集団またはその医薬組成物の投与は、注射による。特定の代替法では、対象への単離されたＧＭ  ＮＫ細胞の集団またはその医薬組成物の投与は、カテーテルによる。特定の代替法では、ＧＭ  ＮＫ細胞の注射は、局所注射である。より特定の代替法では、局所注射は、固形腫瘍（例えば、肉腫）へ直接的である。特定の代替法では、対象への単離されたＧＭ  ＮＫ細胞の集団またはその医薬組成物の投与は、シリンジによる注射による。特定の代替法では、対象への単離されたＧＭ  ＮＫ細胞の集団またはその医薬組成物の投与は、ガイドされた送達による。特定の代替法では、注射による対象への単離されたＧＭ  ＮＫ細胞の集団またはその医薬組成物の投与は、腹腔鏡検査、内視鏡、超音波、コンピューター断層撮影法、磁気共鳴または放射線医学によって補助される。
【０１４８】
ｉ．６．９．５．１．細胞の投与
ある特定の代替法では、本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫ細胞は、ウイルス感染、癌または腫瘍細胞を有する個体、例えば、腫瘍細胞、固形腫瘍または血液癌を有する個体、例えば、癌患者に検出可能な治療上の利益をもたらす任意の量または数、例えば、有効量で使用される、例えば、個体に投与される。このような細胞は、細胞の絶対数によって個体に投与することができる、例えば、前記個体に、少なくともまたは多くて１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０または１×１０１１個の本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫ細胞または上記の値の任意の２つによって規定される範囲の間の任意の数の細胞を投与することができる。その他の代替法では、本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫ細胞を、細胞の相対数によってこのような個体に投与することができる、例えば、前記個体に、少なくともまたは多くて、個体の１キログラムあたり１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０または１×１０１１個の本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫ細胞または上記の値の任意の２つによって規定される範囲の間の個体の１キログラムあたりの任意の細胞数を投与することができる。その他の代替法では、本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫ細胞を、細胞の相対数によって、このような個体に投与することができる、例えば、前記個体に、少なくともまたは多くて、個体の１キログラムあたり１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８または５×１０８個の本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫ細胞または上記の値の任意の２つによって規定される範囲の間の個体の１キログラムあたりの任意の細胞数を投与することができる。本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫ細胞を、ＧＭ  ＮＫ細胞数と前記個体における腫瘍細胞数（例えば、推定数）の間の適当な比に従ってこのような個体に投与することができる。例えば、本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫ細胞を、個体における腫瘍細胞数に対する、少なくともまたは多くて１：１、１：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１、５５：１、６０：１、６５：１、７０：１、７５：１、８０：１、８５：１、９０：１、９５：１または１００：１の比または上記の比のいずれか２つによって規定される範囲の間にある、個体における腫瘍細胞数に対するＧＭ  ＮＫ細胞の比で投与することができる。このような個体における腫瘍細胞数は、例えば、個体から得た組織のサンプル、例えば、血液サンプル、生検などにおける腫瘍細胞数をカウントすることによって推定することができる。特定の代替法では、例えば、固形腫瘍について、前記カウントは、腫瘍（単数または複数）のイメージングと組み合わせて実施されて、およその腫瘍容量が得られる。特定の代替法では、免疫調節性化合物またはサリドマイド、例えば、本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫ細胞に加えて、有効量の免疫調節性化合物またはサリドマイドを、個体に投与する。
【０１４９】
ある特定の代替法では、例えば、個体において腫瘍細胞の増殖を抑制する方法、個体のナチュラルキラー細胞の欠乏を有する個体の療法または療法またはウイルス感染を有する個体のための療法または癌を有する個体、例えば、腫瘍細胞、血液癌もしくは固形腫瘍を有する個体の療法は、腫瘍細胞を、ＧＭ  ＮＫ細胞ならびに１種または複数の胎盤灌流液および／または胎盤灌流液細胞の組合せと近接させること、または前記個体に、それを投与することを含む。特定の代替法では、方法は、腫瘍細胞を、免疫調節性化合物またはサリドマイドと近接させること、または個体にそれを投与することをさらに含む。
【０１５０】
特定の代替法では、例えば、個体のナチュラルキラー細胞の欠乏（例えば、ＮＫ細胞数の、またはＮＫ細胞の癌、腫瘍もしくはウイルス感染した細胞に対する反応性の欠乏）を有する個体の療法または癌もしくはウイルス感染を有する個体の療法または腫瘍細胞増殖の抑制は、前記腫瘍細胞を、単離された胎盤灌流液細胞または胎盤灌流液が補給された本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫ細胞と近接させること、または前記個体にそれを投与することを含む。特定の代替法では、１ミリリットルあたり１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８個もしくはそれより多いＮＫ細胞が本明細書に記載される方法を使用して産生され、もしくは上記の値の任意の２つによって規定される範囲の間の、ミリリットルあたりの任意の細胞数が産生されるか、または１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０、１×１０１１個もしくはそれより多いＧＭ  ＮＫ細胞もしくは上記の値の任意の２つによって規定される範囲の間のＧＭ  ＮＫ細胞の任意の数が、本明細書に記載される方法を使用して産生され、少なくとも、１ミリリットルあたり１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８個もしくはそれより多い単離された胎盤灌流液細胞もしくは１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０、１×１０１１個もしくはそれより多い単離された胎盤灌流液細胞を用いて補給される。その他のより特定の代替法では、約１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８個もしくはそれより多いＧＭ  ＮＫ細胞もしくは上記の値の任意の２つによって規定される範囲の間のＧＭ  ＮＫ細胞の任意の数が、本明細書に記載される方法を使用して産生され、または１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０、１×１０１１個もしくはそれより多いＧＭ  ＮＫ細胞もしくは上記の値の任意の２つによって規定される範囲の間のＧＭ  ＮＫ細胞の任意の数が、本明細書に記載される方法を使用して産生され、少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０もしくは１０００ｍＬの灌流液、または１単位の灌流液を用いて補給される。
【０１５１】
別の特定の代替法では、個体のナチュラルキラー細胞の欠乏を有する個体の療法、癌療法を有する個体の、ウイルス感染を有する個体の療法または腫瘍細胞増殖の抑制は、腫瘍細胞を本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫ細胞と近接させることまたは個体にそれを投与することを含み、これでは、前記細胞は、接着性胎盤細胞、例えば、接着性胎盤幹細胞または複能性細胞、例えば、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋組織培養プラスチック接着性胎盤細胞が補給される。特定の代替法では、本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫ細胞は、１ミリリットルあたり１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８個もしくはそれより多い接着性胎盤幹細胞もしくは上記の値の任意の２つによって規定される範囲の間の、１ミリリットルあたりの接着性胎盤幹細胞の任意の数、または１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０、１×１０１１個もしくはそれより多い接着性胎盤細胞もしくは上記の値の任意の２つによって規定される範囲の間の、１ミリリットルあたりの接着性胎盤幹細胞の任意の数、例えば、接着性胎盤幹細胞もしくは複能性細胞が補給される。
【０１５２】
別の特定の代替法では、個体のナチュラルキラー細胞の欠乏を有する個体の療法、癌療法を有する個体の療法、ウイルス感染を有する個体の療法または腫瘍細胞増殖の抑制は、本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫ細胞と組み合わせた免疫調節性化合物またはサリドマイドを使用して実施され、これでは、前記細胞は、コンディショニングされた培地、例えば、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋組織培養プラスチック接着性胎盤細胞によってコンディショニングされた培地、例えば、灌流液の単位あたり、または１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０または１０１１個の、本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫ細胞もしくは上記の値の任意の２つによって規定される範囲の間の任意の数のＧＭ  ＮＫ細胞あたり、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．１、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ｍＬの、もしくは上記の値の任意の２つによって規定される範囲の間の任意の容量の幹細胞によってコンディショニングされた培養培地が補給される。ある特定の代替法では、組織培養プラスチック接着性胎盤細胞は、開示内容が参照によりその全文で本明細書に組み込まれる（特許文献９）および（特許文献１０）において記載される複能性接着性胎盤細胞である。別の特定の代替法では、方法は、腫瘍細胞を免疫調節性化合物またはサリドマイドと近接させること、または個体にそれを投与することをさらに含む。
【０１５３】
別の特定の代替法では、前記の本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫ細胞に、胎盤灌流液細胞が補給される、個体のナチュラルキラー細胞の欠乏を有する個体の療法、癌を有する個体の療法、ウイルス感染を有する個体の療法または腫瘍細胞増殖の抑制、灌流液細胞を、前記の近接させることに先立つ一定期間、インターロイキン−２（ＩＬ−２）と近接させる。ある特定の代替法では、前記期間は、少なくともまたは多くて、前記の近接させることに先立って１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６もしくは４８時間または上記の値の任意の２つによって規定される範囲の間の任意の時間数である。
【０１５４】
抗癌療法の過程の間に、ウイルス感染を有する個体、癌を有する個体または腫瘍細胞を有する個体に、本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫ細胞および任意選択で灌流液または灌流液細胞を１回投与してもよい、または複数回、例えば、療法の間、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２もしくは２３時間ごとに１回、もしくは１、２、３、４、５、６もしくは７日ごとに１回、もしくは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２４、３６もしくはそれより多い週ごとに１回投与してもよい。いくつかの代替法では、抗癌療法の過程の間に、ウイルス感染を有する個体、癌を有する個体または腫瘍細胞を有する個体に、ＧＭ  ＮＫ細胞を、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２もしくは２３時間または上記の値の任意の２つによって規定される範囲の間の任意の時間量ごとに１回投与する。いくつかの代替法では、抗癌療法の過程の間に、ウイルス感染を有する個体、癌を有する個体または腫瘍細胞を有する個体に、ＧＭ  ＮＫ細胞を、１、２、３、４、５、６もしくは７日または上記の値の任意の２つによって規定される範囲の間の任意の時間量ごとに１回投与する。いくつかの代替法では、抗癌療法の過程の間に、ウイルス感染を有する個体、癌を有する個体または腫瘍細胞を有する個体に、ＧＭ  ＮＫ細胞を１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２４、３６もしくはそれより多い週または上記の値の任意の２つによって規定される範囲の間の任意の時間量ごとに１回投与する。細胞および免疫調節性化合物またはサリドマイドが使用される代替法では、免疫調節性化合物またはサリドマイドおよび細胞または灌流液を、一緒に、例えば、同一製剤中で、別個に、例えば、別個の製剤中で、およそ同時に個体に投与する、または別個に、例えば、異なる投薬スケジュールで、もしくは１日の異なる時間に投与してもよい。同様に、細胞および抗ウイルス化合物または抗癌化合物が使用される代替法では、抗ウイルス化合物または抗癌化合物および細胞または灌流液を、一緒に、例えば、同一製剤中で、別個に、例えば、別個の製剤中で、およそ同時に個体に投与してもよい、または別個に、例えば、異なる投薬スケジュールで、もしくは１日の異なる時間に投与してもよい。本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫ細胞、灌流液または灌流液細胞が、過去に個体に投与されたか否かに関わらず、本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫ細胞および灌流液または灌流液細胞を投与してもよい。
【０１５５】
１０．キット
本明細書に記載される組成物、例えば、１種もしくは複数のＧＭ  ＮＫ細胞の集団を含む組成物のうち１種もしくは複数が詰められた医薬パックまたは１種もしくは複数の容器を含むキットが、本明細書において提供される。任意選択で、このような容器（複数可）を、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形式の通知と関連づけてもよく、この通知は、ヒト投与のための製造、使用または販売の機関による承認を反映する。
【０１５６】
本明細書に記載される方法、例えば、腫瘍細胞の成長を抑制する方法および／または癌、例えば、血液学的癌を治療する方法および／またはウイルス感染を治療する方法に従って、本明細書において包含されるキットを使用してもよい。１つの代替法では、キットは、本明細書に記載されるＧＭ  ＮＫ細胞またはその組成物を、１つまたは複数の容器中に含む。特定の代替法では、１種もしくは複数の本明細書に記載されるＮＫ細胞集団またはその組成物を含むキットが本明細書において提供される。
【０１５７】
１１．さらなる代替法
いくつかの代替法では、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が、ＮＫ阻害性分子の発現を欠くまたはＮＫ阻害性分子の発現の低減を示すように遺伝子改変されているナチュラルキラー細胞の集団が提供される。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子は、ＣＢＬＢ、ＮＫＧ２Ａおよび／またはＴＧＦＢＲ２である。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子は、ＣＢＬＢである。いくつかの代替法では、ＣＢＬＢ発現は、ノックアウトされている。いくつかの代替法では、ＣＢＬＢ発現は、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはＴＡＬＥＮヌクレアーゼによってノックアウトされている。いくつかの代替法では、ＣＢＬＢ発現は、ＣＲＩＳＰＲ関連技術によってノックアウトされている。いくつかの代替法では、ＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも、腫瘍細胞に対して高い細胞毒性を有するＮＫ細胞をもたらす。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、多発性骨髄腫細胞である。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、ＲＰＭＩ８２２６細胞である。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、Ｕ２６６細胞である。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、ＡＲＨ７７細胞である。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、急性骨髄性白血病細胞である。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、ＨＬ６０細胞である。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、ＫＧ１細胞である。いくつかの代替法では、ＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも、ＩＣＡＭ−１およびＭＩＣＡを用いて刺激された場合に、高いＩＦＮγ分泌を有するＮＫ細胞をもたらす。いくつかの代替法では、ＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも、ＩＣＡＭ−１およびＭＩＣＡを用いて刺激された場合に、高い脱顆粒を有するＮＫ細胞もたらす。いくつかの代替法では、脱顆粒は、ＣＤ１０７ａの増大によって測定される。いくつかの代替法では、ＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞と比較して、多発性骨髄腫細胞と同時培養された場合に、ＧＭ−ＣＳＦ、可溶性ＣＤ１３７（ｓＣＤ１３７）、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＴＮＦαまたはパーフォリンのうち１種または複数の分泌の変化を有するＮＫ細胞をもたらす。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子は、ＮＫＧ２Ａである。いくつかの代替法では、ＮＫＧ２Ａ発現はノックアウトされている。いくつかの代替法では、ＮＫＧ２Ａ発現は、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳｓ９システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはＴＡＬＥＮヌクレアーゼによってノックアウトされている。いくつかの代替法では、ＮＫＧ２Ａ発現は、ＣＲＩＳＰＲ関連技術によってノックアウトされている。いくつかの代替法では、ＮＫＧ２Ａ発現のノックアウトは、ＮＫＧ２ＡがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも、腫瘍細胞に対して高い細胞毒性を有するＮＫ細胞をもたらす。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、多発性骨髄腫細胞である。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、ＲＰＭＩ８２２６細胞である。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、Ｕ２６６細胞である。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、ＡＲＨ７７細胞で��る。いくつかの代替法では、ＫＧ２Ａ発現のノックアウトは、ＮＫＧ２ＡがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも、ＮＫＧ２Ａアゴニスト抗体の存在下で、ＩＣＡＭ−１およびＭＩＣＡを用いて刺激された場合に、高い脱顆粒を有するＮＫ細胞をもたらす。いくつかの代替法では、脱顆粒は、ＣＤ１０７ａの増大によって測定される。いくつかの代替法では、ＮＫＧ２Ａ発現のノックアウトは、ＮＫＧ２ＡがノックアウトされていないＮＫ細胞と比較して、ＧＭ−ＣＳＦ、可溶性ＣＤ１３７（ｓＣＤ１３７）、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＴＮＦαまたはパーフォリンのうち１種または複数の分泌の変化を有するＮＫ細胞をもたらす。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子は、ＴＧＦＢＲ２である。いくつかの代替法では、ＴＧＦＢＲ２発現は、ノックアウトされている。いくつかの代替法では、ＴＧＦＢＲ２発現は、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはＴＡＬＥＮヌクレアーゼによってノックアウトされている。いくつかの代替法では、ＴＧＦＢＲ２発現は、ＣＲＩＳＰＲ関連技術によってノックアウトされている。いくつかの代替法では、ＴＧＦＢＲ２発現のノックアウトは、ＴＧＦＢＲ２がノックアウトされていないＮＫ細胞と比較して、腫瘍細胞に対するＮＫ細胞の細胞毒性のＴＧＦβ媒介性阻害に対する耐性をもたらす。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、多発性骨髄腫細胞である。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、ＲＰＭＩ８２２６細胞である。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、急性骨髄性白血病細胞である。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、Ｋ５６２細胞である。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、慢性骨髄性白血病細胞である。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、ＨＬ−６０細胞である。いくつかの代替法では、ＮＫ細胞は、胎盤由来（ＰＮＫ細胞）である。いくつかの代替法では、ナチュラルキラー細胞は、ＣＤ５６＋ＣＤ３−ＣＤ１１７＋ＣＤ１１ａ＋であり、パーフォリンおよび／またはＥＯＭＥＳを発現し、ＲＯＲγｔ、アリール炭化水素受容体およびＩＬ１Ｒ１のうち１種または複数を発現しない。いくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、パーフォリンおよびＥＯＭＥＳを発現し、ＲＯＲγｔ、アリール炭化水素受容体またはＩＬ１Ｒ１のいずれも発現しない。方法のいくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、Ｔ−ｂｅｔ、ＧＺＭＢ、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０およびＮＫＧ２Ｄをさらに発現する。いくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、ＣＤ９４を発現する。いくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、ＣＤ９４を発現しない。
【０１５８】
いくつかの代替法では、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が、改変されたＣＤ１６を含むように遺伝子改変されているナチュラルキラー細胞の集団が提供される。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、野生型ＣＤ１６よりもＩｇＧに対して高い親和性を有する。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＣＤ１６ａの位置１５８にバリンを有する。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＡＤＡＭ１７切断に対して耐性である。いくつかの代替法では、ＣＤ１６は、ＣＤ１６ａの位置１９７にプロリンを有する。ある特定の代替法では、改変されたＣＤ１６は、配列番号１に示されるアミノ酸配列（ＭＷＱＬＬＬＰＴＡＬＬＬＬＶＳＡＧＭＲＴＥＤＬＰＫＡＶＶＦＬＥＰＱＷＹＲＶＬＥＫＤＳＶＴＬＫＣＱＧＡＹＳＰＥＤＮＳＴＱＷＦＨＮＥＳＬＩＳＳＱＡＳＳＹＦＩＤＡＡＴＶＤＤＳＧＥＹＲＣＱＴＮＬＳＴＬＳＤＰＶＱＬＥＶＨＩＧＷＬＬＬＱＡＰＲＷＶＦＫＥＥＤＰＩＨＬＲＣＨＳＷＫＮＴＡＬＨＫＶＴＹＬＱＮＧＫＧＲＫＹＦＨＨＮＳＤＦＹＩＰＫＡＴＬＫＤＳＧＳＹＦＣＲＧＬＶＧＳＫＮＶＳＳＥＴＶＮＩＴＩＴＱＧＬＡＶＰＴＩＳＳＦＦＰＰＧＹＱＶＳＦＣＬＶＭＶＬＬＦＡＶＤＴＧＬＹＦＳＶＫＴＮＩＲＳＳＴＲＤＷＫＤＨＫＦＫＷＲＫＤＰＱＤＫ；配列番号１）を有する。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＩｇＫシグナルペプチドを含有する。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＣＤ１６シグナルペプチドを含有する。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ウイルス感染を介してＮＫ細胞に導入される。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ウイルス感染を介して造血細胞に導入され、次いで造血細胞はＮＫ細胞に分化する。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、レンチウイルスベクターを介して導入される。いくつかの代替法では、レンチウイルスベクターは、ＣＭＶまたはＥＦ１αプロモーターのいずれかを有する。いくつかの代替法では、レンチウイルスベクターは、１種または複数の薬物選択マーカーを含む。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、レトロウイルスベクターを介して導入される。いくつかの代替法では、レトロウイルスベクターは、１種または複数の薬物選択マーカーを含む。いくつかの代替法では、ＮＫ細胞は、胎盤由来（ＰＮＫ細胞）である。いくつかの代替法では、ナチュラルキラー細胞は、ＣＤ５６＋ＣＤ３−ＣＤ１１７＋ＣＤ１１ａ＋であり、パーフォリンおよび／またはＥＯＭＥＳを発現し、ＲＯＲγｔ、アリール炭化水素受容体およびＩＬ１Ｒ１のうち１種または複数を発現しない。いくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、パーフォリンおよびＥＯＭＥＳを発現し、ＲＯＲγｔ、アリール炭化水素受容体またはＩＬ１Ｒ１のいずれも発現しない。方法のいくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、Ｔ−ｂｅｔ、ＧＺＭＢ、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０およびＮＫＧ２Ｄをさらに発現する。いくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、ＣＤ９４を発現する。いくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、ＣＤ９４を発現しない。
【０１５９】
いくつかの代替法では、腫瘍細胞の増殖を抑制する方法は、腫瘍細胞を、本明細書における代替法のいずれか１つの集団に由来するナチュラルキラー細胞を接触させることを含む。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子の発現を欠く、またはＮＫ阻害性分子の発現の低減を示すように遺伝子改変されているナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が提供される。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子は、ＣＢＬＢ、ＮＫＧ２Ａおよび／またはＴＧＦＢＲ２である。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子は、ＣＢＬＢである。いくつかの代替法では、ＣＢＬＢ発現は、ノックアウトされている。いくつかの代替法では、ＣＢＬＢ発現は、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはＴＡＬＥＮヌクレアーゼによってノックアウトされている。いくつかの代替法では、ＣＢＬＢ発現は、ＣＲＩＳＰＲ関連技術によってノックアウトされている。いくつかの代替法では、ＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも腫瘍細胞に対して高い細胞毒性を有するＮＫ細胞をもたらす。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、多発性骨髄腫細胞である。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、ＲＰＭＩ８２２６細胞である。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、Ｕ２６６細胞である。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、ＡＲＨ７７細胞である。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、急性骨髄性白血病細胞である。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、ＨＬ６０細胞である。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、ＫＧ１細胞である。いくつかの代替法では、ＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも、ＩＣＡＭ−１およびＭＩＣＡを用いて刺激された場合に、高いＩＦＮγ分泌を有するＮＫ細胞をもたらす。いくつかの代替法では、ＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも、ＩＣＡＭ−１およびＭＩＣＡを用いて刺激された場合に、高い脱顆粒を有するＮＫ細胞をもたらす。いくつかの代替法では、脱顆粒は、ＣＤ１０７ａの増大によって測定される。いくつかの代替法では、ＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞と比較して、多発性骨髄腫細胞と同時培養された場合に、ＧＭ−ＣＳＦ、可溶性ＣＤ１３７（ｓＣＤ１３７）、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＴＮＦαまたはパーフォリンのうち１種または複数の分泌の変化を有するＮＫ細胞をもたらす。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子は、ＮＫＧ２Ａである。いくつかの代替法では、ＮＫＧ２Ａ発現は、ノックアウトされている。いくつかの代替法では、ＮＫＧ２Ａ発現は、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはＴＡＬＥＮヌクレアーゼによってノックアウトされている。いくつかの代替法では、ＮＫＧ２Ａ発現は、ＣＲＩＳＰＲ関連技術によってノックアウトされている。いくつかの代替法では、ＮＫＧ２Ａ発現のノックアウトは、ＮＫＧ２ＡがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも、腫瘍細胞に対して高い細胞毒性を有するＮＫ細胞をもたらす。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、多発性骨髄腫細胞である。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は��ＲＰＭＩ８２２６細胞である。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、Ｕ２６６細胞である。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、ＡＲＨ７７細胞である。いくつかの代替法では、ＮＫＧ２Ａ発現のノックアウトは、ＮＫＧ２ＡがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも、ＮＫＧ２Ａアゴニスト抗体の存在下で、ＩＣＡＭ−１およびＭＩＣＡを用いて刺激された場合に、高い脱顆粒を有するＮＫ細胞をもたらす。いくつかの代替法では、脱顆粒は、ＣＤ１０７ａの増大によって測定される。いくつかの代替法では、ＮＫＧ２Ａ発現のノックアウトは、ＮＫＧ２ＡがノックアウトされていないＮＫ細胞と比較して、ＧＭ−ＣＳＦ、可溶性ＣＤ１３７（ｓＣＤ１３７）、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＴＮＦαまたはパーフォリンのうち１種または複数の分泌の変化を有するＮＫ細胞をもたらす。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子は、ＴＧＦＢＲ２である。いくつかの代替法では、ＴＧＦＢＲ２発現は、ノックアウトされている。いくつかの代替法では、ＴＧＦＢＲ２発現は、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはＴＡＬＥＮヌクレアーゼによってノックアウトされている。いくつかの代替法では、ＴＧＦＢＲ２発現は、ＣＲＩＳＰＲ関連技術によってノックアウトされている。いくつかの代替法では、ＴＧＦＢＲ２発現のノックアウトは、ＴＧＦＢＲ２がノックアウトされていないＮＫ細胞と比較して、腫瘍細胞に対するＮＫ細胞の細胞毒性のＴＧＦβ媒介性阻害に対する耐性をもたらす。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、多発性骨髄腫細胞である。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、ＲＰＭＩ８２２６細胞である。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、急性骨髄性白血病細胞である。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、Ｋ５６２細胞である。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、慢性骨髄性白血病細胞である。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、ＨＬ−６０細胞である。いくつかの代替法では、ＮＫ細胞は、胎盤由来（ＰＮＫ細胞）である。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６を含むように遺伝子改変されているナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が提供される。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、野生型ＣＤ１６よりもＩｇＧに対して高い親和性を有する。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＣＤ１６ａの位置１５８にバリンを有する。ある特定の代替法では、改変されたＣＤ１６は、配列番号１に示されるアミノ酸配列（ＭＷＱＬＬＬＰＴＡＬＬＬＬＶＳＡＧＭＲＴＥＤＬＰＫＡＶＶＦＬＥＰＱＷＹＲＶＬＥＫＤＳＶＴＬＫＣＱＧＡＹＳＰＥＤＮＳＴＱＷＦＨＮＥＳＬＩＳＳＱＡＳＳＹＦＩＤＡＡＴＶＤＤＳＧＥＹＲＣＱＴＮＬＳＴＬＳＤＰＶＱＬＥＶＨＩＧＷＬＬＬＱＡＰＲＷＶＦＫＥＥＤＰＩＨＬＲＣＨＳＷＫＮＴＡＬＨＫＶＴＹＬＱＮＧＫＧＲＫＹＦＨＨＮＳＤＦＹＩＰＫＡＴＬＫＤＳＧＳＹＦＣＲＧＬＶＧＳＫＮＶＳＳＥＴＶＮＩＴＩＴＱＧＬＡＶＰＴＩＳＳＦＦＰＰＧＹＱＶＳＦＣＬＶＭＶＬＬＦＡＶＤＴＧＬＹＦＳＶＫＴＮＩＲＳＳＴＲＤＷＫＤＨＫＦＫＷＲＫＤＰＱＤＫ；配列番号１）を有する。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＡＤＡＭ１７切断に対して耐性である。いくつかの代替法では、ＣＤ１６は、Ｃ���１６ａの位置１９７にプロリンを有する。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＩｇＫシグナルペプチドを含有する。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＣＤ１６シグナルペプチドを含有する。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ウイルス感染を介してＮＫ細胞に導入される。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ウイルス感染を介して造血細胞に導入され、次いで造血細胞はＮＫ細胞に分化する。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、レンチウイルスベクターを介して導入される。いくつかの代替法では、レンチウイルスベクターは、ＣＭＶまたはＥＦ１αプロモーターのいずれかを有する。いくつかの代替法では、レンチウイルスベクターは、１種または複数の薬物選択マーカーを含む。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、レトロウイルスベクターを介して導入される。いくつかの代替法では、レトロウイルスベクターは、１種または複数の薬物選択マーカーを含む。いくつかの代替法では、ナチュラルキラー細胞は、ＣＤ５６＋ＣＤ３−ＣＤ１１７＋ＣＤ１１ａ＋であり、パーフォリンおよび／またはＥＯＭＥＳを発現し、ＲＯＲγｔ、アリール炭化水素受容体およびＩＬ１Ｒ１のうち１種または複数を発現しない。いくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、パーフォリンおよびＥＯＭＥＳを発現し、ＲＯＲγｔ、アリール炭化水素受容体またはＩＬ１Ｒ１のいずれも発現しない。方法のいくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、Ｔ−ｂｅｔ、ＧＺＭＢ、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０およびＮＫＧ２Ｄをさらに発現する。いくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、ＣＤ９４を発現する。いくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、ＣＤ９４を発現しない。いくつかの代替法では、ＮＫ細胞は、胎盤由来（ＰＮＫ細胞）である。方法のいくつかの代替法では、接触は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで起こる。方法のいくつかの代替法では、前記接触は、ｉｎ  ｖｉｖｏで起こる。方法のいくつかの代替法では、前記接触は、ヒト個体において起こる。方法のいくつかの代替法では、前記方法は、前記ナチュラルキラー細胞を前記個体に投与することを含む。方法のいくつかの代替法では、前記腫瘍細胞は、多発性骨髄腫細胞である。方法のいくつかの代替法では、前記腫瘍細胞は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞である。方法のいくつかの代替法では、前記個体は、再発性／難治性ＡＭＬを有する。方法のいくつかの代替法では、前記個体は、ＡＭＬに対する少なくとも１種の非自然リンパ球系細胞（ＩＬＣ）治療が失敗しているＡＭＬを有する。方法のいくつかの代替法では、前記個体は、６５歳以上であり、最初の寛解中である。方法のいくつかの代替法では、前記個体は、前記ナチュラルキラー細胞を投与する前にフルダラビン、シタラビンまたは両方を用いてコンディショニングされている。方法のいくつかの代替法では、前記腫瘍細胞は、乳癌細胞、頭頸部癌細胞または肉腫細胞である。方法のいくつかの代替法では、前記腫瘍細胞は、原発性腺管癌細胞、白血病細胞、急性Ｔ細胞白血病細胞、慢性骨髄性リンパ腫（ＣＭＬ）細胞、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞、多発性骨髄腫（ＭＭ）、肺癌腫細胞、結腸腺癌細胞、組織球性リンパ腫細胞、結腸直腸癌腫細胞、結腸直腸腺癌細胞または網膜芽細胞腫細胞である。方法のいくつかの代替法では、前記腫瘍細胞は、固形腫瘍細胞である。方法のいくつかの代替法では、前記腫瘍細胞は、肝臓腫瘍細胞である。方法のいくつかの代替法では、前記腫瘍細胞は、肺腫瘍細胞である。方法のいくつかの代替法では、前記腫瘍細胞は、膵臓腫瘍細胞である。方法のいくつかの代替法では、前記腫瘍細胞は、腎腫瘍細胞である。方法のいくつかの代替法では、前記腫瘍細胞は、多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）細胞である。方法のいくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、抗ＣＤ３３抗体とともに投与される。いくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、抗ＣＤ２０抗体とともに投与される。いくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、抗ＣＤ１３８抗体とともに投与される。いくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、抗ＣＤＦ３８抗体とともに投与される。方法のいくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、前記接触または前記投与に先立って凍結保存されている。いくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、前記接触または前記投与に先立って凍結保存されていない。いくつかの代替法では、ナチュラルキラー細胞は、ＣＤ５６＋ＣＤ３−ＣＤ１１７＋ＣＤ１１ａ＋であり、パーフォリンおよび／またはＥＯＭＥＳを発現し、ＲＯＲγｔ、アリール炭化水素受容体およびＩＬ１Ｒ１のうち１種または複数を発現しない。いくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、パーフォリンおよびＥＯＭＥＳを発現し、ＲＯＲγｔ、アリール炭化水素受容体またはＩＬ１Ｒ１のいずれも発現しない。方法のいくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、Ｔ−ｂｅｔ、ＧＺＭＢ、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０およびＮＫＧ２Ｄをさらに発現する。いくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、ＣＤ９４を発現する。いくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、ＣＤ９４を発現しない。
【０１６０】
いくつかの代替法では、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が、ＮＫ阻害性分子の発現を欠く、またはＮＫ阻害性分子の発現の低減を示すように遺伝子改変されているナチュラルキラー細胞の集団が提供される。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子は、ＣＢＬＢ、ＮＫＧ２ＡおよびＴＧＦＢＲ２からなる群から選択される１種または複数のＮＫ阻害性分子である。いくつかの代替法では、遺伝子改変されたＮＫ細胞は、ＮＫ阻害性分子の発現がノックアウトまたは低減されていないＮＫ細胞よりも、腫瘍細胞に対して高い細胞毒性を有する。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、多発性骨髄腫細胞、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞、乳癌細胞、頭頸部癌細胞、肉腫細胞、腺管癌細胞、白血病細胞、急性Ｔ細胞白血病細胞、慢性骨髄性リンパ腫細胞、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞、多発性骨髄腫（ＭＭ）、肺癌腫細胞、結腸腺癌細胞、組織球性リンパ腫細胞、結腸直腸癌腫細胞、結腸直腸腺癌細胞および網膜芽細胞腫細胞からなる群から選択される。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、固形腫瘍細胞である。いくつかの代替法では、固形腫瘍細胞は、肝臓腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、膵臓腫瘍細胞、腎腫瘍細胞および多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）細胞からなる群から選択される。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子の発現は、ノックアウトされている。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子の発現は、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはＴＡＬＥＮヌクレアーゼによってノックアウトされている。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子の発現は、ＣＲＩＳＰＲ関連技術によってノックアウトされている。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子は、ＣＢＬＢである。いくつかの代替法では、ＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも、ＩＣＡＭ−１およびＭＩＣＡを用いて刺激された場合に、高いＩＦＮγ分泌を有するＮＫ細胞の集団を生成する。いくつかの代替法では、ＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも、ＩＣＡＭ−１およびＭＩＣＡを用いて刺激された場合に、高い脱顆粒を有するＮＫ細胞の集団を生成する。いくつかの代替法では、脱顆粒は、ＣＤ１０７ａの増大によって測定される。いくつかの代替法では、ＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞と比較して、多発性骨髄腫細胞と同時培養された場合に、ＧＭ−ＣＳＦ、可溶性ＣＤ１３７（ｓＣＤ１３７）、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＴＮＦαおよびパーフォリンのうち１種または複数の分泌の変化を有するＮＫ細胞の集団を生成する。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子は、ＮＫＧ２Ａである。いくつかの代替法では、ＮＫＧ２Ａ発現のノックアウトは、ＮＫＧ２ＡがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも、ＮＫＧ２Ａアゴニスト抗体の存在下で、ＩＣＡＭ−１およびＭＩＣＡを用いて刺激された場合に、高い脱顆粒を有するＮＫ細胞の集団を生成する。いくつかの代替法では、脱顆粒は、ＣＤ１０７ａの増大によって測定される。いくつかの代替法では、ＮＫＧ２Ａ発現のノックアウトは、ＮＫＧ２ＡがノックアウトされていないＮＫ細胞と比較して、ＧＭ−ＣＳＦ、��溶性ＣＤ１３７（ｓＣＤ１３７）、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＴＮＦαおよび／またはパーフォリンのうち１種または複数の分泌の変化を有するＮＫ細胞の集団を生成する。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子は、ＴＧＦＢＲ２である。いくつかの代替法では、ＴＧＦＢＲ２発現のノックアウトは、ＴＧＦＢＲ２がノックアウトされていないＮＫ細胞と比較して、腫瘍細胞に対するＮＫ細胞の細胞毒性のＴＧＦβ媒介性阻害に対する耐性を有するＮＫ細胞の集団を生成する。いくつかの代替法では、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、改変されたＣＤ１６を含むように遺伝子改変されている。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、野生型ＣＤ１６よりもＩｇＧに対して高い親和性を有する。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＣＤ１６ａの位置１５８にバリンを有する。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＡＤＡＭ１７切断に対して耐性である。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＣＤ１６ａの位置１９７にプロリンを有する。ある特定の代替法では、改変されたＣＤ１６は、配列番号１に示されるアミノ酸配列（ＭＷＱＬＬＬＰＴＡＬＬＬＬＶＳＡＧＭＲＴＥＤＬＰＫＡＶＶＦＬＥＰＱＷＹＲＶＬＥＫＤＳＶＴＬＫＣＱＧＡＹＳＰＥＤＮＳＴＱＷＦＨＮＥＳＬＩＳＳＱＡＳＳＹＦＩＤＡＡＴＶＤＤＳＧＥＹＲＣＱＴＮＬＳＴＬＳＤＰＶＱＬＥＶＨＩＧＷＬＬＬＱＡＰＲＷＶＦＫＥＥＤＰＩＨＬＲＣＨＳＷＫＮＴＡＬＨＫＶＴＹＬＱＮＧＫＧＲＫＹＦＨＨＮＳＤＦＹＩＰＫＡＴＬＫＤＳＧＳＹＦＣＲＧＬＶＧＳＫＮＶＳＳＥＴＶＮＩＴＩＴＱＧＬＡＶＰＴＩＳＳＦＦＰＰＧＹＱＶＳＦＣＬＶＭＶＬＬＦＡＶＤＴＧＬＹＦＳＶＫＴＮＩＲＳＳＴＲＤＷＫＤＨＫＦＫＷＲＫＤＰＱＤＫ；配列番号１）を有する。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＩｇＫシグナルペプチドを含有する。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＣＤ１６シグナルペプチドを含有する。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ウイルス感染を介してＮＫ細胞に導入される。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ウイルス感染を介して造血細胞に導入され、次いで造血細胞はＮＫ細胞に分化する。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、レンチウイルスベクターを介して導入される。いくつかの代替法では、レンチウイルスベクターは、ＣＭＶまたはＥＦ１αプロモーターのいずれかを有する。いくつかの代替法では、レンチウイルスベクターは、１種または複数の薬物選択マーカーを含む。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、レトロウイルスベクターを介して導入される。いくつかの代替法では、レトロウイルスベクターは、１種または複数の薬物選択マーカーを含む。いくつかの代替法では、ＮＫ細胞は、胎盤由来（ＰＮＫ細胞）である。いくつかの代替法では、ナチュラルキラー細胞は、ＣＤ５６＋ＣＤ３−ＣＤ１１７＋ＣＤ１１ａ＋であり、パーフォリンおよび／またはＥＯＭＥＳを発現し、ＲＯＲγｔ、アリール炭化水素受容体およびＩＬ１Ｒ１のうち１種または複数を発現しない。いくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、パーフォリンおよびＥＯＭＥＳを発現し、ＲＯＲγｔ、アリール炭化水素受容体または���Ｌ１Ｒ１のいずれも発現しない。いくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、Ｔ−ｂｅｔ、ＧＺＭＢ、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０および／またはＮＫＧ２Ｄをさらに発現する。いくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、ＣＤ９４を発現する。いくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、ＣＤ９４を発現しない。
【０１６１】
いくつかの代替法では、腫瘍細胞の増殖を抑制する方法であって、腫瘍細胞を、本明細書における代替ナチュラルキラー細胞の集団のいずれか１つの集団に由来するナチュラルキラー細胞と接触させることを含む方法が提供される。いくつかの代替法では、ナチュラルキラー細胞の集団が提供され、これでは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、ＮＫ阻害性分子の発現を欠く、またはＮＫ阻害性分子の発現の低減を示すように遺伝子改変されている。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子は、ＣＢＬＢ、ＮＫＧ２ＡおよびＴＧＦＢＲ２からなる群から選択される１種または複数のＮＫ阻害性分子である。いくつかの代替法では、遺伝子改変されたＮＫ細胞は、ＮＫ阻害性分子の発現がノックアウトまたは低減されていないＮＫ細胞よりも、腫瘍細胞に対して高い細胞毒性を有する。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、多発性骨髄腫細胞、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞、乳癌細胞、頭頸部癌細胞、肉腫細胞、腺管癌細胞、白血病細胞、急性Ｔ細胞白血病細胞、慢性骨髄性リンパ腫細胞、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞、多発性骨髄腫（ＭＭ）、肺癌腫細胞、結腸腺癌細胞、組織球性リンパ腫細胞、結腸直腸癌腫細胞、結腸直腸腺癌細胞および網膜芽細胞腫細胞からなる群から選択される。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、固形腫瘍細胞である。いくつかの代替法では、固形腫瘍細胞は、肝臓腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、膵臓腫瘍細胞、腎腫瘍細胞および多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）細胞からなる群から選択される。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子の発現は、ノックアウトされている。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子の発現は、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはＴＡＬＥＮヌクレアーゼによってノックアウトされている。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子の発現は、ＣＲＩＳＰＲ関連技術によってノックアウトされている。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子は、ＣＢＬＢである。いくつかの代替法では、ＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも、ＩＣＡＭ−１およびＭＩＣＡを用いて刺激された場合に、高いＩＦＮγ分泌を有するＮＫ細胞の集団を生成する。いくつかの代替法では、ＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも、ＩＣＡＭ−１およびＭＩＣＡを用いて刺激された場合に、高い脱顆粒を有するＮＫ細胞の集団を生成する。いくつかの代替法では、脱顆粒は、ＣＤ１０７ａの増大によって測定される。いくつかの代替法では、ＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞と比較して、多発性骨髄腫細胞と同時培養された場合に、ＧＭ−ＣＳＦ、可溶性ＣＤ１３７（ｓＣＤ１３７）、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＴＮＦαおよびパーフォリンのうち１種または複数の分泌の変化を有するＮＫ細胞の集団を生成する。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子は、ＮＫＧ２Ａである。いくつかの代替法では、ＮＫＧ２Ａ発現のノックアウトは、ＮＫＧ２ＡがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも、ＮＫＧ２Ａアゴニスト抗体の存在下で、ＩＣＡＭ−１およびＭＩＣＡを用いて刺激された場合に、高い脱顆粒を有するＮ��細胞の集団を生成する。いくつかの代替法では、脱顆粒は、ＣＤ１０７ａの増大によって測定される。いくつかの代替法では、ＮＫＧ２Ａ発現のノックアウトは、ＮＫＧ２ＡがノックアウトされていないＮＫ細胞と比較して、ＧＭ−ＣＳＦ、可溶性ＣＤ１３７（ｓＣＤ１３７）、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＴＮＦαおよび／またはパーフォリンのうち１種または複数の分泌の変化を有するＮＫ細胞の集団を生成する。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子は、ＴＧＦＢＲ２である。いくつかの代替法では、ＴＧＦＢＲ２発現のノックアウトは、ＴＧＦＢＲ２がノックアウトされていないＮＫ細胞と比較して、腫瘍細胞に対するＮＫ細胞の細胞毒性のＴＧＦβ媒介性阻害に対する耐性を有するＮＫ細胞の集団を生成する。いくつかの代替法では、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、改変されたＣＤ１６を含むように遺伝子改変されている。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、野生型ＣＤ１６よりもＩｇＧに対して高い親和性を有する。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＣＤ１６ａの位置１５８にバリンを有する。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＡＤＡＭ１７切断に対して耐性である。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＣＤ１６ａの位置１９７にプロリンを有する。ある特定の代替法では、改変されたＣＤ１６は、配列番号１に示されるアミノ酸配列（ＭＷＱＬＬＬＰＴＡＬＬＬＬＶＳＡＧＭＲＴＥＤＬＰＫＡＶＶＦＬＥＰＱＷＹＲＶＬＥＫＤＳＶＴＬＫＣＱＧＡＹＳＰＥＤＮＳＴＱＷＦＨＮＥＳＬＩＳＳＱＡＳＳＹＦＩＤＡＡＴＶＤＤＳＧＥＹＲＣＱＴＮＬＳＴＬＳＤＰＶＱＬＥＶＨＩＧＷＬＬＬＱＡＰＲＷＶＦＫＥＥＤＰＩＨＬＲＣＨＳＷＫＮＴＡＬＨＫＶＴＹＬＱＮＧＫＧＲＫＹＦＨＨＮＳＤＦＹＩＰＫＡＴＬＫＤＳＧＳＹＦＣＲＧＬＶＧＳＫＮＶＳＳＥＴＶＮＩＴＩＴＱＧＬＡＶＰＴＩＳＳＦＦＰＰＧＹＱＶＳＦＣＬＶＭＶＬＬＦＡＶＤＴＧＬＹＦＳＶＫＴＮＩＲＳＳＴＲＤＷＫＤＨＫＦＫＷＲＫＤＰＱＤＫ；配列番号１）を有する。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＩｇＫシグナルペプチドを含有する。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＣＤ１６シグナルペプチドを含有する。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ウイルス感染を介してＮＫ細胞に導入される。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ウイルス感染を介して造血細胞に導入され、次いで造血細胞はＮＫ細胞に分化する。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、レンチウイルスベクターを介して導入される。いくつかの代替法では、レンチウイルスベクターは、ＣＭＶまたはＥＦ１αプロモーターのいずれかを有する。いくつかの代替法では、レンチウイルスベクターは、１種または複数の薬物選択マーカーを含む。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、レトロウイルスベクターを介して導入される。いくつかの代替法では、レトロウイルスベクターは、１種または複数の薬物選択マーカーを含む。いくつかの代替法では、ＮＫ細胞は、胎盤由来（ＰＮＫ細胞）である。いくつかの代替法では、ナチュラルキラー細胞は、ＣＤ５６＋ＣＤ３−ＣＤ１１７＋ＣＤ１１ａ＋であり、パーフォリンおよび／またはＥＯＭＥＳを��現し、ＲＯＲγｔ、アリール炭化水素受容体およびＩＬ１Ｒ１のうち１種または複数を発現しない。いくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、パーフォリンおよびＥＯＭＥＳを発現し、ＲＯＲγｔ、アリール炭化水素受容体またはＩＬ１Ｒ１のいずれも発現しない。いくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、Ｔ−ｂｅｔ、ＧＺＭＢ、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０および／またはＮＫＧ２Ｄをさらに発現する。いくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、ＣＤ９４を発現する。いくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、ＣＤ９４を発現しない。いくつかの代替法では、胎盤またはその一部に由来し、それによって胎盤由来ＮＫ細胞（ｐＮＫ細胞）を含むナチュラルキラー細胞の集団であって、ｐＮＫ細胞が、ＮＫ阻害性分子の発現を欠く、またはＮＫ阻害性分子の発現の低減を示すように遺伝子改変されているナチュラルキラー細胞の集団が提供される。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子は、ＣＢＬＢ、ＮＫＧ２ＡおよびＴＧＦＢＲ２からなる群から選択される１種または複数のＮＫ阻害性分子である。いくつかの代替法では、遺伝子改変されたＮＫ細胞は、ＮＫ阻害性分子の発現がノックアウトまたは低減されていないＮＫ細胞よりも、腫瘍細胞に対して高い細胞毒性を有する。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、多発性骨髄腫細胞、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞、乳癌細胞、頭頸部癌細胞、肉腫細胞、腺管癌細胞、白血病細胞、急性Ｔ細胞白血病細胞、慢性骨髄性リンパ腫細胞、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞、多発性骨髄腫（ＭＭ）、肺癌腫細胞、結腸腺癌細胞、組織球性リンパ腫細胞、結腸直腸癌腫細胞、結腸直腸腺癌細胞および網膜芽細胞腫細胞からなる群から選択される。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、固形腫瘍細胞である。いくつかの代替法では、固形腫瘍細胞は、肝臓腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、膵臓腫瘍細胞、腎腫瘍細胞および多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）細胞からなる群から選択される。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子の発現は、ノックアウトされている。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子の発現は、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはＴＡＬＥＮヌクレアーゼによってノックアウトされている。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子の発現は、ＣＲＩＳＰＲ関連技術によってノックアウトされている。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子は、ＣＢＬＢである。いくつかの代替法では、ＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも、ＩＣＡＭ−１およびＭＩＣＡを用いて刺激された場合に、高いＩＦＮγ分泌を有するＮＫ細胞の集団を生成する。いくつかの代替法では、ＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも、ＩＣＡＭ−１およびＭＩＣＡを用いて刺激された場合に、高い脱顆粒を有するＮＫ細胞の集団を生成する。いくつかの代替法では、脱顆粒は、ＣＤ１０７ａの増大によって測定される。いくつかの代替法では、ＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞と比較して、多発性骨髄腫細胞と同時培養された場合に、ＧＭ−ＣＳＦ、可溶性ＣＤ１３７（ｓＣＤ１��７）、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＴＮＦαおよび／またはパーフォリンのうち１種または複数の分泌の変化を有するＮＫ細胞の集団を生成する。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子は、ＮＫＧ２Ａである。いくつかの代替法では、ＮＫＧ２Ａ発現のノックアウトは、ＮＫＧ２ＡがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも、ＮＫＧ２Ａアゴニスト抗体の存在下で、ＩＣＡＭ−１およびＭＩＣＡを用いて刺激された場合に、高い脱顆粒を有するＮＫ細胞の集団を生成する。いくつかの代替法では、脱顆粒は、ＣＤ１０７ａの増大によって測定される。いくつかの代替法では、ＣＤ１０７ａの増大は、ＦＡＣｓによって測定される。いくつかの代替法では、ＮＫＧ２Ａ発現のノックアウトは、ＮＫＧ２ＡがノックアウトされていないＮＫ細胞、例えば、天然に存在するＮＫ細胞と比較して、ＧＭ−ＣＳＦ、可溶性ＣＤ１３７（ｓＣＤ１３７）、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＴＮＦαおよび／またはパーフォリンのうち１種または複数の分泌の変化を有するＮＫ細胞の集団を生成する。いくつかの代替法では、細胞の集団は、胎盤由来ナチュラルキラー細胞（ｐＮＫ）のものであって、ｐＮＫ細胞は、改変されたＣＤ１６を含むように遺伝子改変されている。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、野生型ＣＤ１６よりもＩｇＧに対して高い親和性を有する。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＣＤ１６ａの位置１５８にバリンを有する。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＡＤＡＭ１７切断に対して耐性である。
いくつかの代替法では、ＣＤ１６は、ＣＤ１６ａの位置１９７にプロリンを有する。ある特定の代替法では、改変されたＣＤ１６は、配列番号１に示されるアミノ酸配列（ＭＷＱＬＬＬＰＴＡＬＬＬＬＶＳＡＧＭＲＴＥＤＬＰＫＡＶＶＦＬＥＰＱＷＹＲＶＬＥＫＤＳＶＴＬＫＣＱＧＡＹＳＰＥＤＮＳＴＱＷＦＨＮＥＳＬＩＳＳＱＡＳＳＹＦＩＤＡＡＴＶＤＤＳＧＥＹＲＣＱＴＮＬＳＴＬＳＤＰＶＱＬＥＶＨＩＧＷＬＬＬＱＡＰＲＷＶＦＫＥＥＤＰＩＨＬＲＣＨＳＷＫＮＴＡＬＨＫＶＴＹＬＱＮＧＫＧＲＫＹＦＨＨＮＳＤＦＹＩＰＫＡＴＬＫＤＳＧＳＹＦＣＲＧＬＶＧＳＫＮＶＳＳＥＴＶＮＩＴＩＴＱＧＬＡＶＰＴＩＳＳＦＦＰＰＧＹＱＶＳＦＣＬＶＭＶＬＬＦＡＶＤＴＧＬＹＦＳＶＫＴＮＩＲＳＳＴＲＤＷＫＤＨＫＦＫＷＲＫＤＰＱＤＫ；配列番号１）を有する。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＩｇＫシグナルペプチドまたはＣＤ１６シグナルペプチドを含有する。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ウイルス感染を介してＮＫ細胞に導入される。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ウイルス感染を介して造血細胞に導入され、次いで造血細胞はＮＫ細胞に分化する。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、レンチウイルスベクターを介して導入される。いくつかの代替法では、レンチウイルスベクターは、ＣＭＶまたはＥＦ１αプロモーターのいずれかを有する。いくつかの代替法では、レンチウイルスベクターは、１種または複数の薬物選択マーカーを含む。いくつかの代替法では、選択マーカーは、ＰｕｒｏＲ遺伝子、ＺｅｏＲ遺伝子、ＨｙｇｒｏＲ遺伝子、ｎｅｏＲ遺伝子および／またはブラストサイジン耐性遺伝子などの選択剤に対する耐性を付与するタンパク質をコードする遺伝子を含む。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、レトロウイルスベクターを介して導入される。いくつかの代替法では、レトロウイルスベクターは、１種または複数の薬物選択マーカーを含む。方法のいくつかの代替法では、前記接触は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで起こる。方法のいくつかの代替法では、前記接触は、ｉｎ  ｖｉｖｏで起こる。方法のいくつかの代替法では、前記接触は、ヒト個体、好ましくは、抗癌療法を受け取るよう選択された個体において起こる。方法のいくつかの代替法では、前記方法は、前記ナチュラルキラー細胞を前記個体に投与することを含む。方法のいくつかの代替法では、前記腫瘍細胞は、多発性骨髄腫細胞である。方法のいくつかの代替法では、前記腫瘍細胞は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞である。方法のいくつかの代替法では、前記個体は、再発性／難治性ＡＭＬを有する。方法のいくつかの代替法では、前記個体はＡＭＬに対する少なくとも１種の非自然リンパ球系細胞（ＩＬＣ）治療が失敗しているＡＭＬを有する。方法のいくつかの代替法では、前記個体は、６５歳以上であり、最初の寛解中である。方法のいくつかの代替法では、前記個体は、前記ナチュラルキラー細胞を投与する前にフルダラビン、シタラビンまたは両方を用いてコンディショニングされている。方法のいくつかの代替法では、腫瘍細胞は、多発性骨髄腫細胞、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞、乳癌細胞、頭頸部癌細胞、肉腫細胞、腺管癌細胞、白血病細胞、急性Ｔ細胞白血病細胞、慢性骨髄性リンパ腫細胞、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞、多発性骨髄腫（ＭＭ）、肺癌腫細胞、結腸腺癌細胞、組織球性リンパ腫細胞、結腸直腸癌腫細胞、結腸直腸腺癌細胞および網膜芽細胞腫細胞からなる群から選択される。方法のいくつかの代替法では、腫瘍細胞は、固形腫瘍細胞である。方法のいくつかの代替法では、固形腫瘍細胞は、肝臓腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、膵臓腫瘍細胞、腎腫瘍細胞および多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）細胞からなる群から選択される。方法のいくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、抗ＣＤ３３抗体とともに投与される。方法のいくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、抗ＣＤ２０抗体とともに投与される。方法のいくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、抗ＣＤ１３８抗体とともに投与される。方法のいくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、抗ＣＤ３８抗体とともに投与される。方法のいくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、前記接触または前記投与に先立って凍結保存されている。方法のいくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、前記接触または前記投与に先立って凍結保存されていない。
【０１６２】
第３の態様では、胎盤またはその一部に由来し、それによって胎盤由来ＮＫ細胞（ｐＮＫ細胞）を含むナチュラルキラー細胞の集団であって、ｐＮＫ細胞が、ＮＫ阻害性分子の発現を欠く、またはＮＫ阻害性分子の発現の低減を示すように遺伝子改変されているナチュラルキラー細胞の集団が提供される。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子は、ＣＢＬＢ、ＮＫＧ２ＡおよびＴＧＦＢＲ２からなる群から選択される１種または複数のＮＫ阻害性分子である。いくつかの代替法では、遺伝子改変されたＮＫ細胞は、ＮＫ阻害性分子の発現がノックアウトまたは低減されていないＮＫ細胞よりも、腫瘍細胞に対して高い細胞毒性を有する。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、多発性骨髄腫細胞、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞、乳癌細胞、頭頸部癌細胞、肉腫細胞、腺管癌細胞、白血病細胞、急性Ｔ細胞白血病細胞、慢性骨髄性リンパ腫細胞、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞、多発性骨髄腫（ＭＭ）、肺癌腫細胞、結腸腺癌細胞、組織球性リンパ腫細胞、結腸直腸癌腫細胞、結腸直腸腺癌細胞および網膜芽細胞腫細胞からなる群から選択される。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、固形腫瘍細胞である。いくつかの代替法では、固形腫瘍細胞は、肝臓腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、膵臓腫瘍細胞、腎腫瘍細胞および多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）細胞からなる群から選択される。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子の発現は、ノックアウトされている。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子の発現は、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはＴＡＬＥＮヌクレアーゼによってノックアウトされている。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子の発現は、ＣＲＩＳＰＲ関連技術によってノックアウトされている。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子は、ＣＢＬＢである。いくつかの代替法では、ＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも、ＩＣＡＭ−１およびＭＩＣＡを用いて刺激された場合に、高いＩＦＮγ分泌を有するＮＫ細胞の集団を生成する。いくつかの代替法では、ＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも、ＩＣＡＭ−１およびＭＩＣＡを用いて刺激された場合に、高い脱顆粒を有するＮＫ細胞の集団を生成する。いくつかの代替法では、脱顆粒は、ＣＤ１０７ａの増大によって測定される。いくつかの代替法では、ＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞と比較して、多発性骨髄腫細胞と同時培養された場合に、ＧＭ−ＣＳＦ、可溶性ＣＤ１３７（ｓＣＤ１３７）、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＴＮＦαおよび／またはパーフォリンのうち１種または複数の分泌の変化を有するＮＫ細胞の集団を生成する。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子は、ＮＫＧ２Ａである。いくつかの代替法では、ＮＫＧ２Ａ発現のノックアウトは、ＮＫＧ２ＡがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも、ＮＫＧ２Ａアゴニスト抗体の存在下で、ＩＣＡＭ−１およびＭＩＣＡを用いて刺激された場合に、高い脱顆粒を有するＮＫ細胞の集団を生成する。いくつかの代替法では、脱顆粒は、ＣＤ１０７ａの増大によって測定される。いくつかの代替法では、ＣＤ１��７ａの増大は、ＦＡＣｓによって測定される。いくつかの代替法では、ＮＫＧ２Ａ発現のノックアウトは、ＮＫＧ２ＡがノックアウトされていないＮＫ細胞、例えば、天然に存在するＮＫ細胞と比較して、ＧＭ−ＣＳＦ、可溶性ＣＤ１３７（ｓＣＤ１３７）、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＴＮＦαおよび／またはパーフォリンのうち１種または複数の分泌の変化を有するＮＫ細胞の集団を生成する。
【０１６３】
第４の態様では、胎盤由来ナチュラルキラー細胞（ｐＮＫ）の集団であって、ｐＮＫ細胞は、改変されたＣＤ１６を含むように遺伝子改変されている。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、野生型ＣＤ１６よりもＩｇＧに対して高い親和性を有する。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＣＤ１６ａの位置１５８にバリンを有する。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＡＤＡＭ１７切断に対して耐性である。いくつかの代替法では、ＣＤ１６は、ＣＤ１６ａの位置１９７にプロリンを有する。ある特定の代替法では、改変されたＣＤ１６は、配列番号１に示されるアミノ酸配列（ＭＷＱＬＬＬＰＴＡＬＬＬＬＶＳＡＧＭＲＴＥＤＬＰＫＡＶＶＦＬＥＰＱＷＹＲＶＬＥＫＤＳＶＴＬＫＣＱＧＡＹＳＰＥＤＮＳＴＱＷＦＨＮＥＳＬＩＳＳＱＡＳＳＹＦＩＤＡＡＴＶＤＤＳＧＥＹＲＣＱＴＮＬＳＴＬＳＤＰＶＱＬＥＶＨＩＧＷＬＬＬＱＡＰＲＷＶＦＫＥＥＤＰＩＨＬＲＣＨＳＷＫＮＴＡＬＨＫＶＴＹＬＱＮＧＫＧＲＫＹＦＨＨＮＳＤＦＹＩＰＫＡＴＬＫＤＳＧＳＹＦＣＲＧＬＶＧＳＫＮＶＳＳＥＴＶＮＩＴＩＴＱＧＬＡＶＰＴＩＳＳＦＦＰＰＧＹＱＶＳＦＣＬＶＭＶＬＬＦＡＶＤＴＧＬＹＦＳＶＫＴＮＩＲＳＳＴＲＤＷＫＤＨＫＦＫＷＲＫＤＰＱＤＫ；配列番号１）を有する。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＩｇＫシグナルペプチドまたはＣＤ１６シグナルペプチドを含有する。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ウイルス感染を介してＮＫ細胞に導入される。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ウイルス感染を介して造血細胞に導入され、次いで造血細胞はＮＫ細胞に分化する。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、レンチウイルスベクターを介して導入される。いくつかの代替法では、レンチウイルスベクターは、ＣＭＶまたはＥＦ１αプロモーターのいずれかを有する。いくつかの代替法では、レンチウイルスベクターは、１種または複数の薬物選択マーカーを含む。いくつかの代替法では、選択マーカーは、ＰｕｒｏＲ遺伝子、ＺｅｏＲ遺伝子、ＨｙｇｒｏＲ遺伝子、ｎｅｏＲ遺伝子および／またはブラストサイジン耐性遺伝子などの選択剤に対する耐性を付与するタンパク質をコードする遺伝子を含む。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、レトロウイルスベクターを介して導入される。いくつかの代替法では、レトロウイルスベクターは、１種または複数の薬物選択マーカーを含む。
【０１６４】
ａ．  ７．１代替法１：ＣＢＬＢノックアウト３段階ＮＫ細胞
ｉ．  ７．１．１  ＣＢＬＢノックアウト特性決定
本明細書およびその全文が参照により本明細書に組み込まれる（特許文献１）に記載されるような、ＮＫ細胞を産生するための３５日の、３段階プロセスの３、５または７日目の間にＮＫ細胞においてＣＢＬＢ遺伝子のＣＲＩＳＰＲノックアウトを実施することによって、ＣＢＬＢノックアウトＮＫ細胞を生成した。
【０１６５】
ＣＢＬＢノックアウトの平均効率は、ＴＩＤＥ（分解によるインデルの追跡）アッセイによって測定されるように、３５日のプロセスの３５日目に８０％を上回る（図１Ａ）。
【０１６６】
ノックアウト後のＮＫ細胞の増殖倍数を測定し、生存細胞およびＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞のパーセンテージを決定した。増殖倍数は、未処理細胞と比較して低減したが（図１Ｂ）、ＣＢＬＢノックアウトＮＫ細胞における生存細胞およびＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞の割合は、未処理細胞と同等であった。
【０１６７】
３段階プロセスの３４または３５日目に、種々の多発性骨髄腫細胞株（ＲＰＭＩ８２２６、Ｕ２６６、ＡＲＨ２７７）に対する細胞毒性を、２０：１、１０：１および５：１のエフェクター：ターゲット（Ｅ：Ｔ）比で決定した（図２Ａ〜Ｃ）。ＣＢＬＢノックアウトＮＫ細胞は、試験した各細胞株について、すべての比で、未処理細胞と比較して増大した細胞毒性を有するとわかった（図３Ａ〜Ｃ）。次いで、細胞毒性データを正規し、ＣＢＬＢノックアウトＮＫ細胞は、未処理細胞との比較において細胞毒性の最大４倍の増大を有するとわかった。図４Ａ〜Ｂに示されるように、ＨＬ６０およびＫＧ１細胞に対するＣＢＬＢノックアウトＮＫ細胞の細胞毒性も決定した。
【０１６８】
細胞毒性データに加えて、ＭＨＣクラスＩポリペプチド関連配列Ａ（ＭＩＣＡ）およびＩＣＡＭ−１を用いる刺激の際のＩＦＮγ分泌およびＣＤ１０７ａのレベル、脱顆粒の尺度を測定した。一貫したレベルのＩＣＡＭ−１の存在下で、変動するレベルのＭＩＣＡ刺激を用いた場合のＣＢＬＢノックアウトおよび未処理ＮＫ細胞のＩＦＮγ分泌レベルは、図５Ａに示されている。一貫したレベルのＩＣＡＭ−１の存在下で、変動するレベルのＭＩＣＡ刺激を用いた場合のＣＢＬＢノックアウトおよび未処理ＮＫ細胞両方におけるＣＤ１０７ａアッセイの結果は、図５Ｂに示されている。５Ａおよび５Ｂに示されるように、未処理は、図８における棒グラフの対中の右側の棒グラフであり、処理は、左側の棒グラフである。
【０１６９】
ＧＭ−ＣＳＦ、ｓＣＤ１３７、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＴＮＦαおよびパーフォリンのサイトカイン分泌はまた、ＭＩＣＡ刺激を用いずに、多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ、Ｕ２６６またはＡＲＨ７７の存在下で測定した。サイトカイン分泌アッセイの結果は、図６Ａ〜Ｃに示されている。
【０１７０】
ｉｉ．  ７．１．２．  ＣＢＬＢノックアウト前臨床データ
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける、実施例７．１．１において産生されたような、ＣＢＬＢノックアウトＮＫ細胞の体内分布および残留性を決定するために、図７に示されるように研究を設計した。２群、−１日目にブスルファン（抗新生物剤）プレコンディションを用いる１群、および−５日目にブスルファンプレコンディショニングを用いる１群を研究した。ＮＯＤ  ＳＣＩＤガンマ（ＮＳＧ）マウス組織への細胞注入の７、１４および２１日後に、脾臓、骨髄（ＢＭ）、血液、肝臓および肺においてヒトＣＤ４５＋カウントをとり、総カウントも集計した（図８〜１０）。体内分布および残留性は、７日後に未処理およびＣＢＬＢノックアウトＮＫ細胞において同様であるとわかった（図８）。１４日後、体内分布および残留性の類似性は、群間で維持されたが、ヒトＣＤ４５＋カウントの絶対数が高かった（図８〜９）。２１日後、残留性および体内分布は、同様であり続けたが、ヒトＣＤ４５＋カウントの絶対数は低下し、これは、残留性は、ＩＬ−１５補給と関連していることを示唆した（図１０）。ＩＬ−１５は、ＮＫ細胞の細胞増殖を誘導するサイトカインである。
【０１７１】
７、１４および２１日目に、ＣＤ５６＋ＣＤ１１ａ＋細胞の存在も、脾臓、肝臓、骨髄および肺において測定した（図１１）。未処理およびＣＢＬＢノックアウト条件について同様の頻度のＣＤ５６＋ＣＤ１１ａ＋細胞が見られ、その他の組織と比較して骨髄において低い頻度のＣＤ５６＋ＣＤ１１ａ＋細胞が見られた（図１１）。脾臓、肝臓、骨髄および肺におけるＣＤ１６およびＫＩＲ発現も測定し、未処理およびＣＢＬＢノックアウト条件について同様の頻度が見られた（図１２および１３）。ＣＤ１６およびＫＩＲ発現が両方とも、注入前プロフィールとの比較においてｉｎ  ｖｉｖｏで増大したことが留意された。
【０１７２】
ＮＳＧマウスにおけるＮＫ細胞の増殖を測定し、ＣＢＬＢノックアウトＮＫ細胞は、ＮＫ細胞投与の１４日目までに、対照処理細胞よりも迅速に増殖するとわかった。
【０１７３】
投与の１４日後にＮＳＧマウス組織から単離されたＮＫ細胞を精製し、Ｋ５６２およびＨＬ６０細胞株に対する細胞毒性を決定した（図１４Ａ〜Ｂ）。ＣＢＬＢノックアウトＮＫ細胞は、対照処理細胞との比較において、ｅｘ  ｖｉｖｏでの両細胞に対する細胞毒性の増強を有するとわかった（図１４Ａ〜Ｂ）。図１４Ａ〜１４Ｂでは、対照は、両グラフにおいて低パーセントキラーとして示されている。ｅｘ  ｖｉｖｏで、単離されたＣＢＬＢノックアウト細胞はまた、対照処理細胞との比較において、腫瘍細胞同時培養において増大したレベルのＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮγ、ｓＣＤ１３７およびＴＮＦαサイトカインを放出するとわかった（図１５Ａ〜Ｄ）。したがって、ＣＢＬＢノックアウトＮＫ細胞は、ＮＳＧマウスにおいて１４日後にその増強された機能活性を保持する。
【０１７４】
最後に、ＣＢＬＢノックアウトＮＫ細胞の機能活性を、新たに単離された患者由来ＡＭＬ異種移植片（ＰＤＸ）に対して試験した（図１６Ａ〜Ｄ）。ＣＢＬＢノックアウトＮＫ細胞は、対照と比較して、分泌されたＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮγ、ｓＣＤ１３７およびＴＮＦαの増大を示した（図１６Ａ〜Ｄ）。
【０１７５】
ｂ．  ７．２  代替法２：ＮＫＧ２Ａノックアウト３段階ＮＫ細胞
本明細書およびその全文が参照により本明細書に組み込まれる（特許文献１）に記載されるような、ＮＫ細胞を産生するための３５日の、３段階プロセスの３、５または７日目の間に、ＮＫ細胞においてＮＫＧ２Ａ遺伝子のＣＲＩＳＰＲノックアウトを実施することによって、ＮＫＧ２ＡノックアウトＮＫ細胞を作製した。
【０１７６】
ＮＫＧ２Ａノックアウトの平均効率は、ＴＩＤＥ（分解によるインデルの追跡）アッセイによって測定されるように、３５日のプロセスの３５日目に約６０％である（図１７Ａ）。
【０１７７】
ノックアウト後のＮＫ細胞の増殖倍数を測定し、生存細胞およびＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞のパーセンテージを決定した。増殖倍数は、未処理細胞と比較して低減したが（図１７Ｂ）、ＮＫＧ２ＡノックアウトＮＫ細胞における生存細胞およびＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞の割合は、未処理細胞と同等であった。
【０１７８】
３段階プロセスの３４または３５日目に、種々の多発性骨髄腫細胞株（ＲＰＭＩ８２２６、Ｕ２６６、ＡＲＨ２７７）に対する細胞毒性を、２０：１、１０：１および５：１のＥ：Ｔ比で決定した（図１８Ａ〜Ｄ）。Ｋ５６２細胞に対する細胞毒性は、１０：１、５：１および２．５：１のＥ：Ｔ比で決定した。ＮＫＧ２ＡノックアウトＮＫ細胞は、ＲＰＭＩ８２２６、Ｕ２６６およびＡＲＨ２７７細胞株の各々について、すべての比で、未処理細胞との比較において増大した細胞毒性を有するとわかった（図１９Ａ〜Ｃ）が、Ｋ５６２細胞に対して未処理細胞を用いる場合に同等の細胞毒性を有していた。Ｋ５６２細胞に対する細胞毒性は、最大レベルに到達したということが仮定される。次いで、多発性骨髄腫細胞株に対する細胞毒性データを正規化し、ＮＫＧ２ＡノックアウトＮＫ細胞は、未処理細胞との比較において細胞毒性の最大３倍の増大を有するとわかった。本明細書におけるいくつかの代替法では、ＮＫＧ２ＡノックアウトＮＫ細胞は、未処理細胞との比較において細胞毒性の最大３倍の増大を有するとわかった。
【０１７９】
プレートに結合された脱顆粒アッセイを実施して、ＭＩＣＡおよびＩＣＡＭ−１刺激の存在下でのＮＫＧ２Ａアゴニスト抗体に対するＮＫＧ２ＡノックアウトＮＫ細胞の応答を試験した（図２０）。対照ＩｇＧ抗体の存在下で、ＮＫＧ２Ａノックアウト細胞は、野生型ＮＫＧ２Ａを有する対照ＮＫ細胞と同様に、高活性を示した（ＣＤ１０７ａパーセント）。対照（非ノックアウト）ＮＫ細胞は、ＮＫＧ２Ａアゴニスト抗体の存在下で、予測されたように低活性を示した。ＮＫＧ２ＡノックアウトＮＫ細胞は、ＮＫＧ２Ａアゴニスト抗体の存在下で、中間の活性を示した。したがって、ＮＫＧ２Ａアゴニスト抗体は、対照ＮＫ細胞活性を低減するとわかったが、ＮＫＧ２Ａノックアウト細胞においてはあまり有効ではなく、これは、これらの細胞が、ＮＫＧ２Ａ媒介性阻害性シグナルに対してより耐性であることを示す。
【０１８０】
ＧＭ−ＣＳＦ、ｓＣＤ１３７、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＴＮＦαおよびパーフォリンのサイトカイン分泌はまた、多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ、Ｕ２６６およびＡＲＨ７７の存在下で、ＭＩＣＡ刺激を用いず測定した。サイトカイン分泌アッセイの結果は、図２１Ａ〜Ｃに示されている。
【０１８１】
ｃ．  ７．３  代替法３：ＴＧＦ−βノックアウト３段階ＮＫ細胞
ＣＲＩＳＰＲ関連技術を使用して、ＮＫ−９２細胞においてＴＧＦ−β受容体ＩＩ（ＴＧＦＢＲ２）をノックアウトし、その結果、ＴＧＦＢＲ２発現が有意に減少した。ＴＧＦ−βシグナル伝達経路の遮断を示す、リン酸化Ｓｍａｄ２／３（ｐＳｍａｄ２／３）が低減されたことを示すことによって、結果をＮＫ−９２細胞においてさらに検証した。これらの細胞では、ＴＧＦ−β誘発活性化マーカー（ＮＫｐ３０）下方制御も消失した。
【０１８２】
次いで、本明細書およびその全文が参照により本明細書に組み込まれる（特許文献１）に記載されるような、ＮＫ細胞を産生するための３５日の、３段階プロセスの０、５、１０または１４日目の間にＮＫ細胞においてＴＧＦＢＲ２遺伝子のＣＲＩＳＰＲノックアウトを実施することによって、ＴＧＦＢＲ２ノックアウトＮＫ細胞を作製した。５日目ノックアウトの特性決定を以下に記載する。
【０１８３】
ＴＧＦＢＲ２ノックアウトの効率は、５日目の７０％から８０％を上回るまで急速に高まり、３５日のプロセスを通じて安定したままであった（図２２）。同様に、突然変異スペクトルは、プロセスを通じて不変のままであった。ＮＫ−９２細胞と同様に、５日目ＴＧＦ−βノックアウトＧＭ  ＮＫ細胞は、ＴＧＦ−βシグナル伝達の遮断を示し、これは、ｐＳｍａｄ２−３の低減をもたらした。ＤＮＡＭ−１、ＮＫＧ２ＤおよびＮＫｐ３０などの受容体について、ＴＧＦＢＲ２ノックアウト細胞において、活性化受容体下方制御もまた抑制された。表１に示されるように、ＴＧＦＢＲ２ノックアウトＮＫ細胞の分化は、対照、未処理群と同様であるとわかった。
【０１８４】
【表１】
2020503043.tif 000006
【０１８５】
３４または３５日目に、Ｋ５６２およびＲＰＭＩ８２２細胞株に対する細胞毒性を一定範囲のＥ：Ｔ比で決定した。細胞毒性は、ＴＧＦ−β１処理を用いない対照における細胞毒性に対して、ＴＧＦＢＲ２ノックアウトＮＫ細胞において同様であり（図２３Ａ〜Ｄ）、ＴＧＦＢＲ２ノックアウトＮＫ細胞は、細胞毒性アッセイの間にＴＧＦ−β１阻害に対する耐性を付与するとわかった。
【０１８６】
トランスフェクションの種々の日数での、および種々の細胞バッチにおけるＴＧＦＢＲ２ノックアウトの結果の遺伝子および表現型解析が、表２に示されている。種々の時点での複数のドナーにわたってＧＭ  ＮＫについて高レベルのＴＧＦＢＲ２欠失（８８．１％平均）が達成された。これらの結果は、表現型変化、例えば、シグナル伝達遮断およびＮＫマーカー下方制御の変化を対応させることによって確認された。
【０１８７】
【表２】
2020503043.tif 000007
【０１８８】
４時間細胞毒性アッセイにおいてＨＬ６０細胞およびＫ５６２細胞に対してＴＧＦＢＲ２ノックアウト細胞のエフェクター機能も試験した（図２４Ａ〜Ｄ）。ＴＧＦＢＲ２ノックアウト細胞は、ＨＬ６０およびＫ５６２細胞の両方における抗腫瘍細胞毒性に対するＴＧＦ−β１誘発阻害に対する耐性を実証した（図２４Ａ〜Ｄ）。
【０１８９】
ｄ．  ７．４  代替法４：改変されたＣＤ１６を有するＮＫ細胞
表３に示されるように、遺伝子改変されたＣＤ１６を含むレンチウイルスベクターを開発した。
【０１９０】
【表３】
2020503043.tif 000008
【０１９１】
所望の突然変異−高ＩｇＧ結合親和性突然変異体Ｆ１５８ＶおよびＡＤＡＭ１７耐性突然変異体Ｓ１９７Ｐとともに、２種の異なるシグナルペプチド、ＩｇＫおよびＣＤ１６を使用し、２種の異なるプロモーター、ＥＦ１αおよびＣＭＶを使用した。レンチウイルスベクターはまた、形質導入後濃縮のためのピューロマイシン選択のために設計した。
【０１９２】
５日目に形質導入されたＮＫ細胞について、本明細書および（特許文献１）（その全文が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるような、ＮＫ細胞を産生するための３５日の、３段階プロセスにおけるＣＤ１６発現の残留性を試験した。ＣＤ１６発現を、抗ＣＤ１６ＦＩＴＣ抗体（ＢＤカタログ番号５５５４０６、クローン３Ｇ８）を使用してＦＡＣＳによって決定した。野生型と比較してＣＤ１６ＶＰ形質導入細胞において、安定な高いレベルのＣＤ１６が明白であった（図２５）（図２５中の棒グラフの対中の右の棒グラフ）。したがって、３５日の、３段階プロセスＮＫ細胞に遺伝子改変されたＣＤ１６を送達するためにレンチウイルスベクターを使用することの実現可能性が確認された。
【０１９３】
ＣＤ１６切断に起因するＣＤ１６シェディングの量を調べるために、ＮＫ細胞が、５０μＭのプロテイナーゼ阻害剤ＴＡＰＩを用いて３０分間、次いで、ＰＭＡ（１μｇ／ｍＬ）を用いて、または用いずに４時間処理されるアッセイを開発した。ＰＭＡ活性化は、ＣＤ１６を、末梢血ＮＫ細胞において９７％、３５日の、３段階プロセスＮＫ細胞において８９％低減するとわかった。ＴＡＰＩ処理は、末梢血および３段階ＮＫ細胞の両方においてＣＤ１６シェディングを阻害できた。ＣＤ１６ＶＰを用いて形質導入されたＮＫ細胞は、ＰＭＡによって誘導されるＣＤ１６シェディングに対して耐性を示した。未処理細胞では、ＣＤ１６の９４％がシェディングしたのに対し、ＣＤ１６ＶＰが形質導入された細胞では、ＣＤ１６の１７％しかシェディングしなかった。
【０１９４】
ＣＤ１６ＶＰを用いて形質導入された、３５日の、３段階プロセスＮＫ細胞の増殖および表現型を、未処理細胞と比較した。形質導入された細胞と未処理細胞の間に、増殖において、またはＮＫ成熟マーカーにおいて有意差は見られなかった（図２６Ａ〜Ｂ）。（図２６Ｂでは、棒グラフの対の左の棒グラフは、未処理を表す。図２６Ｂ中の棒グラフの対の右の棒グラフは、ＣＤ１６ＶＰが形質導入された細胞を表す。
【０１９５】
抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を研究して、ＣＤ１６ＶＰを用いる形質導入の効果を評価した。標的癌細胞（ＤａｕｄｉまたはＵ２６６）を、ｍＡｂ（抗ＣＤ２０または抗ＣＤ３８）とともに３０分間インキュベートし、ｍＡｂなしおよびＩｇＧを対照として使用した。エフェクター細胞および癌細胞を、１．２５：１のＥ：Ｔ比で一緒に添加し、エフェクター細胞を用いない対照を実施した。生存細胞について染色するためにＴｏｐｏ５を添加した。ＦＡＣＳ解析によって、エフェクター細胞による特異的死滅のパーセンテージを決定した。ＣＤ１６ＶＰが形質導入された細胞は、抗ＣＤ２０および抗ＣＤ３８抗体の両方を用いて、未処理ＮＫ細胞と比較して、Ｄａｕｄｉ細胞に対する改善されたＡＤＣＣを有するとわかった（図２７Ａ〜Ｂ）。１：１のＥ：Ｔで２４時間のＡＤＣＣの間に、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦ−αの分泌も試験し、ＣＤ１６ＶＰが形質導入されたＮＫ細胞は、未処理ＮＫ細胞と比較して、増大されたサイトカイン分泌を示した（図２８Ａ〜Ｃ）。
【０１９６】
ｅ．  ７．５  代替法５：ＴＧＦＢＲ２／ＣＢＬＢ二重ノックアウト３段階ＮＫ細胞
ＣＲＩＳＰＲ関連技術を使用して、５日目のＧＭ  ＮＫ細胞でＴＧＦＢＲ２およびＣＢＬＢ遺伝子のノックアウトを実施して、以下の集団を作製した：偽トランスフェクション、ＴＧＦＢＲ２ノックアウトＧＭ  ＮＫ、ＣＢＬＢノックアウトＧＭ  ＮＫおよびＴＧＦＢＲ２／ＣＢＬＢ二重ノックアウトＧＭ  ＮＫ。ＴＩＤＥ（分解によるインデルの追跡）解析と組み合わせた標的化アンプリコンシーケンシングによって、ゲノム編集効率を評価した。ＧＭ  ＮＫ細胞および対照の免疫表現型決定は、通例の免疫表現型決定プロトコールに従って実施した。エフェクター機能および分泌された分析物評価に先立って、ＴＧＦβ１を用いて、または用いずに４８時間細胞を処理した。血液学的癌細胞株、すなわち、Ｋ５６２、ＨＬ６０、ＫＧ−１およびＲＰＭＩ８２６６においてエフェクター機能を調べるために、４時間、フローベースの細胞毒性アッセイを利用した。分泌された分析物評価のために、ＧＭ  ＮＫおよび対照を、血液学的癌細胞株と、１：１  Ｅ：Ｔ比で２４時間同時培養した。上清を回収し、Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘイムノアッセイによって解析されるまで−２０℃で保存した。
【０１９７】
二重ノックアウトＧＭ  ＮＫの遺伝子ノックアウト効率。ノックアウト効率は、二重ノックアウト中のＴＧＦＢＲ２およびＣＢＬＢ遺伝子座各々について、単一ノックアウト対照に対して同等であった、表４を参照のこと。
【０１９８】
【表４】
2020503043.tif 000009
【０１９９】
二重ノックアウトＧＭ  ＮＫの免疫表現型決定。免疫表現型決定解析は、二重ノックアウトＧＭ  ＮＫは、対照と同様の表現型を有していたことを示した（表５）。
【０２００】
【表５】
2020503043.tif 000010
【０２０１】
二重ノックアウトＧＭ  ＮＫの増殖倍数。全体的な増殖倍数は、単一ノックアウトが偽トランスフェクション対照よりも少なく増殖したこと、および二重ノックアウトが単一ノックアウトよりも増殖がさらに減少したことを示した（図２９）。
【０２０２】
細胞毒性アッセイ。二重ノックアウトＧＭ  ＮＫは、両方の単一ノックアウトからの組み合わされた利点を実証した。二重ノックアウトは、ＣＢＬＢ−ＧＭ  ＮＫの増強された特異的死滅およびＴＧＦＢＲ２−ＧＭ  ＮＫ  のＴＧＦβ誘発阻害に対する非感受性の両方を示した。したがって、図３０および３１に示されるように、ＴＧＦβの存在下で、二重ノックアウトＧＭ  ＮＫ細胞は、標的腫瘍細胞株に対して最も多い死滅を示した。
【０２０３】
同時培養上清中の分泌された分析物。ＣＢＬＢ−ＧＭ  ＮＫ由来の分泌された分析物は、その増強されたエフェクター機能を反映した。ＣＢＬＢ−ＧＭ  ＮＫにおいて、対照群と比較した場合に、ｓＣＤ１３７の大きな増大ならびにＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびパーフォリンの中程度の増大が観察された。これらの分析物の分泌は、ＣＢＬＢ−ＧＭ  ＮＫおよびＧＭ  ＮＫ対照の両方においてＴＧＦβ処置によって有意に低減された（図３２Ａ〜Ｅ）。
【０２０４】
ＧＭ  ＮＫ対照と比較して、ＴＧＦＢＲ２−ＧＭ  ＮＫは、同様のレベルのＧＭ−ＣＳＦ、ｓＣＤ１３７、ＴＮＦαおよびパーフォリンだけでなく、より大きく増大された、ある特定の標的細胞に対するＩＦＮγも分泌した。これらの分析物の分泌は、ＴＧＦβ処理によって阻害されなかった（図３２Ａ〜Ｅ）。
【０２０５】
二重ノックアウトＧＭ  ＮＫは、両方の単一ノックアウトからの組み合わされた利点を実証した。ＧＭ−ＣＳＦ、ｓＣＤ１３７、ＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびパーフォリンなどの分泌された分析物は、増大されただけでなく、ＴＧＦβ誘発低減に対して耐性であった。ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮγおよびＴＮＦαについて相互作用も観察された。それらの場合には、二重ノックアウトＧＭＮＫは、組み合わされた両方の単一ノックアウトと同等またはより多い分析物を分泌した（図３２Ａ〜Ｅ）。
【０２０６】
ｆ．  ７．６．  代替法６：ＰＮＫ−ＣＤ１６ＶＰ
ｉ．ＣＤ１６ＶＰ構築物および実験設定の背景
ＣＤ１６構築物を、ＰＮＫ（胎盤由来ＮＫ細胞）細胞における過剰発現のために作出し、増強されたＡＤＣＣ機能を有する遺伝子改変ＰＮＫ細胞を作製した。ＣＤ１６を、２つの点突然変異、高親和性バリン変異体（１５８Ｖ／Ｖ）を作出するための１つおよびＣＤ１６をＡｄａｍ１７（Ｓ１９７Ｐ）によって切断できなくするための第２のものを用いて作出した。ＣＤ１６変異体は、ＣＤ１６ＶＰと名付けられた。レンチウイルスベクターを作製し、増殖プロセスの５日目にＣＤ３４細胞に形質導入した。培養の間にＣＤ１６の発現をモニタリングし、培養期間の最後に機能を評価した。ＣＤ１６ＶＰを有する、または有さないＰＮＫ細胞を、ＩｇＧ１ｋ抗体に対する親和性の改善ならびに活性化誘導性シェディングに対する耐性について試験した。
【０２０７】
ｉｉ．形質導入効率、ＰＮＫ増殖および表現型
目的１：レンチウイルスベクターを使用してＰＮＫ細胞でのＣＤ１６ＶＰの高い発現効率を達成するため。
方法論：ＰＮＫ細胞でのＣＤ１６ＶＰの高い発現を達成するために、ＣＤ３４細胞を、以下に列挙される種々の条件によって形質導入した：
・５および１０日目または培養
・１〜２ラウンドの感染
・５ＭＯＩ〜２００ＭＯＩの範囲の感染多重度（ＭＯＩ）
・６００ｇおよび１２００ｇのスピノキュレーション（Ｓｐｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）遠心分離速度
【０２０８】
結果：５および１０日目での形質導入は、同様の形質導入効率をもたらし、したがって、レンチウイルス形質導入の標準時間枠として５日目を選択した。形質導入のラウンド数（１対２）は、低い方のＭＯＩ（５０ＭＯＩ）でわずかな改善を示したが、高い方のＭＯＩ（１００ＭＯＩ）では、効率は異ならなかった。形質導入効率は、５０から１００ＭＯＩで増大したが、２００ＭＯＩではさらなる改善は示さなかった。６００ｇの遠心分離速度は、１２００ｇと同様の形質導入効率をもたらした。したがって、最適化されたプロトコールは、５日目での１００ＭＯＩで１ラウンド感染を用いる６００ｇ／１時間のスピノキュレーションプロトコールであると決定した。１０〜２０μｇ／ｃｍ２レトロネクチンを用いてコーティングされた非組織培養物処理４８ウェルプレートを使用して形質導入を実施した（図３３）。
【０２０９】
最適化された形質導入プロトコールを、ＣＤ３４ドナー（ｎ＝７）を用いて評価し、７０％を上回る中央値形質導入効率が達成された。
【０２１０】
目的２：ＰＮＫ細胞の増殖能に対する遺伝子改変および形質導入プロセスの影響を評価するため。
方法論：最適化された形質導入プロセスにしたがって、細胞をこれまでに報告されたように培養した。
【０２１１】
結果：一部のドナーが、非形質導入対照と比較してＰＮＫ−ＣＤ１６ＶＰによる増殖倍率の低下を示したものの、最適化された形質導入プロセスは、細胞の中央値増殖能に影響を与えなかった（ｎ＝６）（図３４）。ＰＮＫ−ＮＴの増殖の範囲は、８１〜５８６３であり、ＰＮＫ−ＣＤ１６ＶＰは、１３４〜７８１８倍であった。
【０２１２】
目的３：ＰＮＫ細胞表現型に対するレンチウイルス遺伝子改変の影響を評価するため。
方法論：以前に報告されたように、フローサイトメトリーによってＰＮＫ細胞をＣＤ３、ＣＤ５６、ＣＤ１１ａおよびＣＤ１６の発現について評価した。
【０２１３】
結果：レンチウイルス遺伝子改変は、製品定義基準（３５日目までに８５％のＣＤ３−ＣＤ５６＋の）により、ＣＤ５６陽性細胞の出現にわずかな遅延を引き起こした。３５から３８日への３日間の培養期間の増大は、８５％閾値を上回る改善されたＣＤ３−ＣＤ５６＋表現型パーセントをもたらした。ＣＤ１６発現は、非形質導入細胞よりも高く持続し、ＰＮＫ細胞の約５５％において中央値ＣＤ１６発現を有した。ＰＮＫ−ＮＴと比較して、ＣＤ１６ＶＰにおいてＣＤ１１ａ陽性集団のわずかな増大も観察された（図３５）。遺伝子改変は、ＣＤ５６分化の遅延を引き起こし、これは、培養スケジュールを３日延長すること（３８日）によって克服された。増殖後の遺伝子改変された群における中央値ＣＤ１６発現は、５５を上回ると示された。ＣＤ１６ＶＰを用いて改変された細胞におけるＣＤ１１ａの中央値発現は、非形質導入対照よりも高いと思われる。
【０２１４】
遺伝子改変によって引き起こされたＣＤ５６＋ＰＮＫ細胞の分化の遅延は、培養期間を３日間延長することによって克服された。
【０２１５】
ｉｉｉ．ＰＮＫ  ＣＤ１６ＶＰ構築物検証：ＣＤ１６誘導性脱顆粒および活性化誘導性切断に対する耐性
目的１：ＩｇＧ１カッパ治療用抗体に向けたＣＤ１６ＶＰ構築物の機能的応答を評価するため。
方法論：ＣＤ１６ＶＰ発現に由来するＰＮＫ細胞を、４時間脱顆粒アッセイにおいてプレートに結合されたユニツキシン（Ｕｎｉｔｕｘｉｎ）抗体に対する応答性について試験した。変動する濃度のユニツキシン（０μｇ／ｍｌ、０．０１μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌ）を、高結合平底９６ウェルプレート上に４℃で一晩コーティングした。洗浄後、ＣＤ１０７ａ−ＰＥ抗体およびモネンシン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の存在下で、プレートにＰＢＳ、ＰＮＫ−ＮＴまたはＰＮＫ−ＣＤ１６ＶＰ細胞を用いて播種した。ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で４時間の刺激後、ＣＤ５６−ＡＰＣ、ＣＤ１６−ＢＶ４２１、ＣＤ１１ａ−ＦＩＴＣおよびＣＤ１０７ａ−ＰＥ（すべて、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製の抗体）を用いて細胞を染色し、ＰＮＫ細胞による脱顆粒を評価した。細胞を洗浄し、固定し、Ｕ底９６ウェルプレートに移し、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  Ｉフローサイトメーターを使用して読み取った。
【０２１６】
結果：プレートに結合されたＧＤ２抗体（ユニツキシン）を用いる活性化後、ＰＮＫ−ＮＴおよびＰＮＫ−ＣＤ１６ＶＰの両方とも、コーティングされていないウェルと比較した１μｇ／ｍｌのユニツキシンコーティングでのＰＮＫ細胞でのＣＤ１０７ａの発現によって実証される脱顆粒応答を示した。遺伝子改変（ＣＤ１６ＶＰ）によるＣＤ１６の発現の増大は、ＰＮＫ−ＮＴと比較したＰＮＫ−ＣＤ１６ＶＰによる脱顆粒応答の増大につながり、これによって、操作されたＣＤ１６ＶＰタンパク質の機能が損なわれていないという驚くべき結果が確認された（図３６）。
【０２１７】
目的２：ＣＤ１６ＶＰ構築物を活性化誘導性シェディングに対する耐性について評価するため。
方法論：ＣＤ１６ＶＰ発現に由来するＰＮＫ細胞を活性化誘導性切断に対する耐性について試験した。ＡＤＡＭ−１７阻害性抗体（抗ＴＡＣＥ、クローンＤ１（Ａ１２））の存在下または不在下で免疫細胞アクチベーターであるホルボール（ｐｈｏｒｂａｌ）１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）を用いてＰＮＫ細胞を４時間処理した。抗ＣＤ１６抗体を使用してＣＤ１６の発現を評価した。
【０２１８】
結果：ＰＭＡ媒介性活性化後、非形質導入ＰＮＫ（ＰＮＫ−ＮＴ）細胞は、ＣＤ１６発現の約９０％までの著しい喪失を示し、これは、ＡＤＡＭ−１７阻害剤抗ｔａｃｅ抗体の存在下で防がれた。ＰＭＡを用いる刺激時にＰＮＫ−ＣＤ１６ＶＰ細胞からのＣＤ１６の発現の有意な喪失はなかった（発現の約６％の喪失）。ここでもまた、ＡＤＡＭ−１７阻害剤の存在が、ＣＤ１６発現の観察された６％の喪失を防いだ。データは、ＣＤ１６ＶＰ構築物は、ＰＮＫ細胞の活性化の際にシェディングに対して耐性であることを示す。ＰＮＫ−ＮＴにおける野生型ＣＤ１６のＰＭＡ媒介性シェディングの作用機序は、野生型ＣＤ１６発現の喪失の防止におけるＡＤＡＭ−１７阻害剤の能力によって証明される（文献において実証されるような）ＡＤＡＭ−１７の作用に起因し得る。
【０２１９】
操作されたタンパク質ＣＤ１６ＶＰは、機能的に無傷であった−−ＰＮＫ−ＣＤ１６ＶＰによって脱顆粒応答を誘発でき、予測されるように、活性化媒介性受容体切断に対して耐性であった。
【０２２０】
ｉｖ．抗体依存性細胞性細胞同性（ＡＤＣＣ）
目的：ＰＮＫ−ＣＤ１６ＶＰの改善されたＡＤＣＣ能を評価するため。
方法論：ＡＤＣＣアッセイを、これまでに記載されたように設定し、腫瘍標的を、ＰＫＨ−２６色素を用いて予備染色し、次いで、２０μｇ／ｍｌの治療用抗体（ＣＤ２０、ＣＤ３８およびＣＤ３１９）を用いて、アッセイバッファー中、３７℃で３０分間染色し、過剰の結合していない抗体を除去するために洗浄した。アッセイは、Ｕ底９６ウェルプレートにおいて１０：１および２．５：１のＥ：Ｔ比で設定した。
【０２２１】
結果：試験した３種の抗体は、ＰＮＫ−ＮＴと比較して、ＰＮＫ−ＣＤ１６ＶＰによる腫瘍標的Ｄａｕｄｉの溶解において改善を示した。（図３７）
【０２２２】
示されるように、ｐＮＫ細胞を使用する試験から、これらの細胞は増殖され、特徴付けられてもよく、癌などの疾患の処置に使用され得る生成物を生じ得る。
【０２２３】
最適化されたレンチウイルス形質導入プロセスを開発し、７０％の中央値（４３〜８１％）の形質導入効率を達成し、増殖の最後に５０％を上回る中央値発現を維持した。実験はまた、形質導入プロセスが、ＰＮＫ−ＮＴと比較してＰＮＫ−ＣＤ１６ＶＰ細胞の中央値増殖能に対して負に影響を及ぼさなかったこと（８１〜７８１８の範囲）を示す。
【０２２４】
ＣＤ５６陽性ＰＮＫ細胞の分化は、わずかに遅延し、これは、培養期間を３日間延長することによって克服された。
【０２２５】
しかし、ＰＮＫ−ＣＤ１６ＶＰでのＣＤ１６のさらなる発現は、プレートに結合された治療用ＩｇＧ１カッパ抗体ユニツキシンに応じたＰＮＫ−ＣＤ１６ＶＰによるより高い脱顆粒につながった−これは、操作されたタンパク質の機能が損なわれていないことを示した。
【０２２６】
ＣＤ１６ＶＰは、活性化誘導性シェディング／切断に対して耐性であると確認された。
【０２２７】
驚くべきことに、ＰＮＫ−ＣＤ１６ＶＰ細胞は、ＣＤ２０、ＣＤ３８およびＣＤ３１９抗体に対してＤａｕｄｉ腫瘍株に対してより高い細胞毒性を示した。
【０２２８】
本発明は、本明細書に記載される特定の代替法による範囲に制限されるべきではない。実際、記載されたものに加えて、本発明の種々の改変が、上記の説明および添付の図面から当業者には明らかになろう。このような改変は、添付の特許請求の範囲内に入るよう意図される。
【０２２９】
本明細書において引用されたすべての参考文献は、各個々の刊行物、特許または特許出願が全ての目的のためにその全体が参照により組み込まれるように具体的に、個々に示されるのと同程度に、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。いかなる刊行物の引用も、出願日前のその開示のためであり、本発明が先行発明のためにそのような刊行物に先行する権利がないことの承認として解釈されてはならない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１７Ａ】
2020503043.tif 000052
【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
2020503043.tif 000054
【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
2020503043.tif 000057
【図１９Ａ】
2020503043.tif 000058
【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２４Ｄ】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
2020503043.tif 000076
【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２８Ｃ】
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【図２９】
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【図３０Ａ】
2020503043.tif 000083
【図３０Ｂ】
2020503043.tif 000084
【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３２Ｃ】
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【図３２Ｄ】
2020503043.tif 000090
【図３２Ｅ】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３５Ｃｏｎｔ．１】
2020503043.tif 000095
【図３５Ｃｏｎｔ．２】
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【図３６】
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【図３６Ｃｏｎｔ．】
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【図３７】
2020503043.tif 000099
【図３７Ｃｏｎｔ．】
2020503043.tif 000100
【国際調査報告】
2020503043.tif 000101
2020503043.tif 000102
2020503043.tif 000103
2020503043.tif 000104