(57)【要約】  βアミロイド蓄積および／またはタウ凝集の阻害および／または低減を必要とする対象に対し、それを実施する方法であって、ＬＡＲファミリーのホスファターゼの触媒活性、シグナル伝達、および機能の１つまたは複数を阻害する治療薬を対象に投与することを含む、方法。【選択図】図１Ｇ
2020524132.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
βアミロイド蓄積および／またはタウ凝集の阻害および／または低減を必要としている対象に対しそれを実施する方法であって、
ＬＡＲファミリーのホスファターゼの触媒活性、シグナル伝達、および機能の１つまたは複数を阻害する治療薬を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記ＬＡＲファミリーホスファターゼが、受容体タンパク質チロシンホスファターゼシグマ（ＰＴＰσ）であり、前記治療薬が治療用ペプチドを含み、前記治療用ペプチドが、ＰＴＰσのくさび形ドメインの約１０〜約２０個の連続するアミノ酸に対して少なくとも約８５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＬＡＲファミリーホスファターゼが、受容体タンパク質チロシンホスファターゼシグマ（ＰＴＰσ）であり、前記治療薬が治療用ペプチドを含み、前記治療用ペプチドが、ＰＴＰσのくさび形ドメインの約１０〜約２０個の連続するアミノ酸に対して少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記治療薬が、配列番号９〜１３および１６からなる群より選択される治療用ペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記治療薬が、配列番号１６からなる治療用ペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記治療薬が、配列番号１６に対して少なくとも約６５％同一であり、配列番号１６の残基４、５、６、７、９、１０、１２または１３の内の少なくとも１つのアミノ酸の保存的置換を含む治療用ペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記治療薬が、治療用ペプチドに連結されている輸送部分を含み、治療される神経細胞による前記治療用ペプチドの取り込みを容易にする、請求項２〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記輸送部分が、ＨＩＶ  Ｔａｔ輸送部分である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記治療薬が、治療される前記対象に全身投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記治療薬が、前記細胞中で発現される、請求項２〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記対象がアルツハイマー病である、請求項１〜１０のいずれかに１項に記載の方法。
【請求項１２】
治療を必要としている対象のアルツハイマー病を治療する方法であって、
前記ＬＡＲファミリーのホスファターゼの触媒活性、シグナル伝達、および機能の１つまたは複数を阻害する治療薬を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項１３】
前記ＬＡＲファミリーホスファターゼが、受容体タンパク質チロシンホスファターゼシグマ（ＰＴＰσ）であり、前記治療薬が治療用ペプチドを含み、前記治療用ペプチドが、ＰＴＰσのくさび形ドメインの約１０〜約２０個の連続するアミノ酸に対して少なくとも約８５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＬＡＲファミリーホスファターゼが、受容体タンパク質チロシンホスファターゼシグマ（ＰＴＰσ）であり、前記治療薬が治療用ペプチドを含み、前記治療用ペプチドが、ＰＴＰσのくさび形ドメインの約１０〜約２０個の連続するアミノ酸に対して少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記治療薬が、配列番号９〜１３および１６からなる群より選択される治療用ペプチドを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記治療薬が、配列番号１６からなる治療用ペプチドを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記治療薬が、配列番号１６に対して少なくとも約６５％同一であり、配列番号１６の残基４、５、６、７、９、１０、１２または１３の内の少なくとも１つのアミノ酸の保存的置換を含む治療用ペプチドを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記治療薬が、治療用ペプチドに連結されている輸送部分を含み、治療される神経細胞による前記治療用ペプチドの取り込みを容易にする、請求項３〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記輸送部分が、ＨＩＶ  Ｔａｔ輸送部分である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記治療薬が、治療される前記対象に全身投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
前記治療薬が、前記細胞中で発現される、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記治療薬が、分泌酵素阻害剤と組み合わせて投与される、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記分泌酵素阻害剤が、ＢＡＣＥ１阻害剤またはγ−分泌酵素阻害剤の内の少なくとも１つを含む、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１７年６月５日に出願された米国仮特許出願第６２／５１５，２７２号からの優先権を主張する。この仮出願の主題は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本出願は、白血球共通抗原関連（ＬＡＲ）ファミリーのホスファターゼの活性、シグナル伝達および／または機能を阻害または低減する組成物および方法、ならびにβアミロイドーシスを阻害し、アルツハイマー病を治療するための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
アルツハイマー病（ＡＤ）の確定的病理学的特徴は、βアミロイドーシスとしても知られる過程である、脳内でのβアミロイド（Ａβ）ペプチドの徐々に進行する凝集であり、多くの場合、神経炎症および微小管結合タンパク質のタウを含有した神経原線維濃縮体の形成が付随して起こる。
【０００４】
ＡＤの病因学的機序については、議論が続けられているところであるが、ヒトの遺伝的調査からの具体的証拠は、遺伝子変異によるＡβの過剰産生が細胞傷害性イベントのカスケードを不可避的にもたらし、最終的に神経変性および脳機能の崩壊に繋がることを示した。従って、Ａβペプチドの、特にそれらの可溶型での蓄積は、ＡＤ発症の重要な犯人として認識されている。脳では、Ａβペプチドは主に、神経アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のβ−およびγ−分泌酵素による逐次切断から生ずる。しかし、数十年に及ぶ研究にもかかわらず、アミロイド形成性分泌酵素活性の分子調節は、理解が進んでおらず、ＡＰＰアミロイド形成経路を特異的に標的とする治療薬の設計を妨げている。
【０００５】
β−およびγ−分泌酵素活性の薬理学的阻害は、Ａβ産生の抑制では効果的であるが、分泌酵素の他の基質に対する生理学的機能を妨害する。従って、このような介入戦略は、不都合な副作用に本質的に関連する場合が多く、このことが、過去における臨床試験のいくつかの失敗に繋がった。現在まで、ＡＤの発症を防ぐ、または進行を抑制するために利用可能な治療法は存在しない。
【発明の概要】
【０００６】
本明細書で記載の実施形態は、βアミロイド蓄積および／またはタウ凝集の阻害および／または低減を必要としている対象に対しそれを実施する方法に関する。方法は、ＬＡＲファミリーのホスファターゼ触媒活性、シグナル伝達および機能の１つまたは複数を阻害する治療薬を対象に投与することを含む。
【０００７】
いくつかの実施形態では、ＬＡＲファミリーのホスファターゼは、受容体タンパク質チロシンホスファターゼシグマ（ＰＴＰσ）であり、治療薬には、ＰＴＰσのくさび形ドメインの約１０〜約２０個の連続するアミノ酸に対して少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％同一のアミノ酸配列を有する治療用ペプチドが含まれる。例えば、治療薬は配列番号９〜１３および１６からなる群より選択される治療用ペプチドを含むことができる。
【０００８】
他の実施形態では、ＬＡＲファミリーのホスファターゼは、受容体タンパク質チロシンホスファターゼシグマ（ＰＴＰσ）であり、治療薬は、配列番号１６のアミノ酸配列に対して少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％同一の治療用ペプチドを含むことができる。治療用ペプチドは、例えば、配列番号１６の残基４、５、６、７、９、１０、１２または１３個の内の少なくとも１、２、３または４個のアミノ酸の保存的置換を含むことができる。
【０００９】
いくつかの実施形態では、治療薬は、対象に、または神経細胞、グリア細胞、グリア前駆細胞または神経前駆細胞に全身投与または局所投与される。
【００１０】
他の実施形態では、治療薬は、治療用ペプチドと連結され、細胞による治療用ペプチドの取り込みを容易にする輸送部分を含む。例えば、輸送部分はＨＩＶのＴａｔ輸送部分であり得る。
【００１１】
さらに他の実施形態では、細胞は治療される対象中にあり、治療薬は治療される対象に局所投与または全身投与される。
【００１２】
さらに他の実施形態では、治療用ペプチドは対象の細胞により発現される。
【００１３】
本明細書で記載の実施形態は、治療を必要としている対象のβアミロイド蓄積および／またはタウ凝集に関連する疾患、障害、および／または状態を治療する方法にも関する。方法は、ＬＡＲファミリーのホスファターゼの触媒活性、シグナル伝達および機能の１つまたは複数を阻害する治療薬を対象に投与することを含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、疾患、障害および／または状態には、神経系の疾患、障害および／または状態の少なくとも１つが含まれる。
【００１５】
他の実施形態では、神経系の疾患、障害および／または状態には、神経障害、神経精神障害、神経損傷、神経毒性障害、神経障害性疼痛、および神経変性障害の少なくとも１つが含まれる。
【００１６】
例えば、神経障害には、アルツハイマー病またはアルツハイマー病関連認知症の内の少なくとも１つを含み得る。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】（Ａ〜Ｉ）。ＰＴＰσは、脳中でＡＰＰの結合相手であることを示す画像および免疫ブロットである。Ａ〜Ｆ：成体ラットの海馬ＣＡ１ニューロン中のＰＴＰσ（Ａ）およびＡＰＰ（Ｂ）の共局在化が共焦点画像化により示される。ＣＡ１ニューロンの核がＤＡＰＩで染色されている（Ｃ）。Ｄ：３つのチャネルをマージしたもの。スケールバーは５０μｍ。Ｅ：Ｄの神経細胞体層の拡大像。矢印は、頂端部樹状突起の初期セグメント中のＰＴＰσとＡＰＰの強い共局在化を示す；矢頭は、核周辺領域中の共局在化点状物を示す。スケールバーは２０μｍ。Ｆ：Ｄの軸索コンパートメント中の極微粒子状の点状物の拡大像。矢印は、焦点面に垂直に突き出た軸索中のＰＴＰσとＡＰＰの共局在化を示す。スケールバーは１０μｍ。Ｇ：２つのサブユニット複合体として細胞表面上で発現したＰＴＰσの概略図。ＰＴＰσは、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）および膜貫通型細胞内ドメイン（ＩＣＤ）へと翻訳後プロセッシングされる。これらの２つのサブユニットは、非共有結合を介して相互に結合する。Ｉｇ様：免疫グロブリン様ドメイン；ＦＮＩＩＩ様：フィブロネクチンＩＩＩ様ドメイン；Ｄ１およびＤ２：２つのホスファターゼドメイン。Ｈ、Ｉ：マウス前脳溶解物由来のＰＴＰσおよびＡＰＰの共免疫沈降（ｃｏ−ＩＰ）。左パネル：マウス前脳中のＰＴＰσおよびＡＰＰの発現。右パネル：ＡＰＰのＣ末端（Ｃ−ｔｅｒｍ）に対し特異的な抗体を用いたＩＰ。抗ＡＰＰ  Ｃ−ｔｅｒｍ抗体により、完全長ＡＰＰ（ＡＰＰ  ＦＬ）が検出される。Ｈ：ＰＴＰσ−ＥＣＤに対する抗体により検出して、ＰＴＰσは、野生型の前脳溶解物由来のＡＰＰと共免疫沈降するが、ＰＴＰσ欠損マウス（Ｂａｌｂ／ｃ背景）の場合には、そうではない。Ｉ：ＰＴＰσ−ＩＣＤに対する抗体により検出して、ＰＴＰσは、野生型の前脳溶解物由来のＡＰＰと共免疫沈降するが、ＡＰＰノックアウトマウス（Ｂ６背景）の場合には、そうではない。Ｉの点線は、相互に隣接するように移動した同じウェスタンブロット曝露時のレーンを示す。示した画像は、少なくとも３回の独立した実験の代表例である。
【図２】（Ａ〜Ｉ）。ＰＴＰσの遺伝子欠乏が、ＡＰＰのβアミロイド形成性生成物を低減させることを示す模式図、免疫ブロット、およびグラフである。Ａ：β−およびγ−分泌酵素によるＡＰＰのアミロイド形成プロセッシングを示す模式図である。完全長ＡＰＰ（ＡＰＰ  ＦＬ）は、β−分泌酵素により可溶性Ｎ末端（ｓＡＰＰβ）およびＣ末端（ＣＴＦβ）フラグメントに切断される。ＡＰＰ  ＣＴＦβは、γ−分泌酵素により、Ｃ末端細胞内ドメイン（ＡＩＣＤ）およびＡβペプチドにさらにプロセッシングされ得る。Ａβの凝集は、ＡＤの確定的病理学的特徴である。Ｂ：ＰＴＰσ欠損は、ＡＰＰ  ＦＬの発現に影響を与えることなく、マウス前脳溶解物中の約１５ＫＤのＡＰＰ  ＣＴＦのレベルを低減する。ＡＰＰのＣ末端に対する抗体は、マウスおよびヒト両方の起源のＡＰＰ  ＦＬおよびＣＴＦを認識する。ＣおよびＤ：１５ＫＤ  ＡＰＰ  ＣＴＦは、ダイアグラム（Ａ）でマークされた抗体対を用いて、ウェスタンブロット分析の後の免疫沈殿（ＩＰ）によりＣＴＦβと特定される。Ａβのアミノ酸１〜１６に対する抗体（抗Ａβ１−１６）は、ＣＴＦβを検出するが、ＣＴＦα中にはエピトープが存在しないので、ＣＴＦαを検出しない。Ｃ：マウス内在性ＣＴＦβレベルは、ＰＴＰσ欠損マウス脳中で低減されている。４回実施した反復実験をデンシトメトリーにより定量化した。Ｄ：ヒト遺伝子導入ＣＴＦβレベルは、ヒトＡＰＰ−ＳｗＤＩ導入遺伝子を含むＰＴＰσ欠損マウス脳中で低減されている。６回行った反復実験をデンシトメトリーにより定量化した。ＣおよびＤ両方の各実験内で、ＰＴＰσ欠損試料由来の値は、野生型ＰＴＰσの試料由来の値に正規化された。ＥおよびＦ：ＰＴＰσ欠損は、ＥＬＩＳＡアッセイで測定して、ＴｇＡＰＰ−ＳｗＤＩマウス中のＡβ４０（Ｅ）およびＡβ４２（Ｆ）のレベルを低減する。各群ｎ＝１２。ＰＴＰσ欠損試料からの平均値は、野生型ＰＴＰσの試料由来の値に正規化された。ＧおよびＨ：１０月齢のＴｇＡＰＰ−ＳｗＤＩマウスの海馬中でのＡβの沈着。Ａβ（緑）は、抗Ａβ抗体クローン６Ｅ１０（Ｇ）およびクローン４Ｇ８（Ｈ）を用いて免疫蛍光染色により検出される。ＤＡＰＩ染色を示す。ＰＴＰσ欠損は、ＴｇＡＰＰ−ＳｗＤＩマウスの脳中のＡβ量を有意に低減させる。Ｈ：上段パネル：背側海馬台（ＤＳ）とＣＡ１との間の多形細胞層（Ｇの矢印でも示されている）；中段パネル：ＣＡ１とＣＡ２との間の多形細胞層；下段パネル：歯状回の門部（ＤＧ；Ｇの矢頭でも示される）。左列：一次抗体を用いない対照染色（１次Ａｂなし）。Ａβシグナルは非遺伝子導入マウスでは検出されない（データは示さず）。スケールバー  Ｇ：５００μｍ、ｈ：１００μｍ。示した画像は、９〜１１月齢の同年、同性のマウス５対中の代表的な対を示す。Ｉ：ＰＴＰσの遺伝子欠乏は、ＴｇＡＰＰ−ＳｗＤＩマウスのＡβの病状進行を抑制する。９および１６月齢ＴｇＡＰＰ−ＳｗＤＩマウス由来のＤＧ門部のＡβ免疫蛍光染色（６Ｅ１０による）のＩｍａｇｅＪ定量化。各群ｎ＝３。ＤＧ門部中のＡβの総密度を門部の面積サイズに正規化し、平均強度を得て、棒グラフとして示した。各群の平均値を、野生型ＰＴＰσを発現している１６月齢ＴｇＡＰＰ−ＳｗＤＩマウスの値��正規化した。全ｐ値：スチューデントの両側ｔ検定。エラーバー：ＳＥＭ。
【図３】（Ａ〜Ｃ）。ＰＴＰσ欠損脳中のＢＡＣＥ１とＡＰＰとの間の低親和性を示す免疫ブロット、グラフ、およびプロットである。Ａ：共免疫沈降実験は、緩やかな洗浄剤条件（１％ＮＰ４０）下で、野生型およびＰＴＰσ欠損マウス脳中でほぼ同じＢＡＣＥ１−ＡＰＰ結合を示す。しかし、ＰＴＰσ欠損脳では、共免疫沈降により検出されたＢＡＣＥ１−ＡＰＰ結合は、野生型脳の場合に比べて、洗浄剤の過酷さの増大に対し影響をより受けやすい。ブロットのパネルは、マウス前脳溶解物由来の抗ＢＡＣＥ１抗体でプルダウンした完全長ＡＰＰ（ＡＰＰ  ＦＬ）を示す。ＮＰ４０：Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、非イオン洗浄剤。ＳＤＳ：ナトリウムドデシルスルフェート、イオン性洗浄剤。Ｂ：Ａの中段パネルに示す、１％ＮＰ４０および０．３％ＳＤＳを用いた緩衝液条件下で共免疫沈降を３回反復した。各実験をデンシトメトリーにより定量化し、ＰＴＰσ欠損試料由来の値を野生型試料の値のパーセンテージとして計算した（Ｃのオレンジ色の点としても示される）。エラーバー：ＳＥＭ。ｐ値：スチューデントの両側ｔ検定。Ｃ：各洗浄剤条件下で共免疫沈降実験を反復した。ドットで示すパーセンテージ値は、Ｂの場合と同じ方法を用いて誘導される。バーは平均を表す。次第に増加する過酷な緩衝液条件により、ＰＴＰσ欠損脳中のより低いＢＡＣＥ１−ＡＰＰ親和性が顕在化する。ｐ値およびＲ２：線形回帰。
【図４】（Ａ〜Ｆ）。ＰＴＰσは、総じてβおよびγ分泌酵素を調節しないことを示す免疫ブロットの図である。分泌酵素の発現レベルも、他の大部分の基質に対するそれらの活性も、ＰＴＰσ欠乏により影響を受けない。ＰＴＰσを含むまたは含まないマウス前脳溶解物をウェスタンブロットにより分析した。ＡおよびＢ：ＰＴＰσ欠損は、ＢＡＣＥ１（Ａ）またはγ−分泌酵素サブユニット（Ｂ）の発現レベルを変えない。プレセニリン１および２（ＰＳ１／２）は、γ−分泌酵素の触媒サブユニットであり、これは、それらの成熟型のＮ末端およびＣ末端フラグメント（ＮＴＦおよびＣＴＦ）にプロセッシングされる。ニカストリン、プレセニリンエンハンサー２（ＰＥＮ２）、およびＡＰＨ１は、γ−分泌酵素の他の不可欠なサブユニットである。Ｃ：ＰＴＰσ欠損は、ニューレグリン１（ＮＧＲ１）ＣＴＦβ（ＢＡＣＥ１によるＣ末端切断産物）のレベルを変えない。ＮＲＧ１  ＦＬ：完全長ニューレグリン１。Ｄ：γ−分泌酵素によるノッチ切断産物のレベルは、ＰＴＰσ欠損により影響を受けない。ＴＭＩＣ：ノッチ膜貫通／細胞内フラグメント、これは、γ−分泌酵素によりＣ末端細胞内ドメインＮＩＣＤ（上段パネルのノッチＣ末端に対する抗体、および下段パネルのγ−分泌酵素切断ＮＩＣＤに対する特異的抗体により、検出される）に切断できる。Ｅ：ＡおよびＣに対するアクチン負荷対照。Ｆ：ＢおよびＤに対するアクチン負荷対照。示した全ての画像は、少なくとも３回の独立した実験の代表例である。示した全ての画像は、少なくとも３回の独立した実験の代表例である。
【図５】（Ａ〜Ｉ）。ＰＴＰσ欠損がＡＰＰ遺伝子導入マウス中の反応性アストログリオーシスを弱めることを示す画像およびグラフである。ＧＦＡＰ（反応性星状膠細胞のマーカー）の発現レベルは、ＰＴＰσ欠乏により、ＴｇＡＰＰ−ＳｗＤＩマウスの脳中で抑制される。代表的画像は、９ヶ月齢ＴｇＡＰＰ−ＳｗＤＩマウスの脳の核のＧＡＦＰおよびＤＡＰＩ染色を示す。Ａ〜Ｄ：海馬の歯状回（ＤＧ）；スケールバー  １００μｍ。Ｅ〜Ｈ：一次体性感覚皮質；スケールバー  ２００μｍ。Ｉ：９〜１１ヶ月齢のＴｇＡＰＰ−ＳｗＤＩマウス由来のＤＧ門部中のＧＦＡＰレベルのＩｍａｇｅＪ定量化。ＡＰＰ−ＳｗＤＩ（−）ＰＴＰσ（＋／＋）：非遺伝子導入野生型同腹仔（ＰＴＰσを発現しているが、ヒトＡＰＰ導入遺伝子は発現していない）。ＤＧ門部中のＧＦＡＰの総密度を門部の面積サイズに正規化し、平均強度を得て、棒グラフとして示した。各群の平均値を、ＡＰＰ−ＳｗＤＩ（−）ＰＴＰσ（＋／＋）マウスの値に正規化した（画像は示さず）。ＡＰＰ−ＳｗＤＩ（−）ＰＴＰσ（＋／＋）、ｎ＝４；ＡＰＰＳｗＤＩ（＋）ＰＴＰσ（＋／＋）、ｎ＝４；ＡＰＰ−ＳｗＤＩ（＋）ＰＴＰσ（−／−）、ｎ＝６。全ｐ値：スチューデントの両側ｔ検定。エラーバー：ＳＥＭ。
【図６】（Ａ〜Ｇ）。ＰＴＰσ欠損がシナプスの減少からＡＰＰ遺伝子導入マウスを保護することを示す画像およびグラフである。代表的画像は、ＣＡ３領域の苔状線維終末域におけるシナプス前のマーカーのシナプトフィジンの免疫蛍光染色を示す。Ａ〜Ｆ：シナプトフィジン：赤；ＤＡＰＩ：青。スケールバー：１００μｍ。Ｇ：９〜１１ヶ月齢のマウス由来のＣＡ３苔状線維終末域中のシナプトフィジン発現レベルのＩｍａｇｅＪ定量化。ＣＡ３苔状線維終末域中のシナプトフィジンの総密度を面積サイズに正規化し、平均強度を得て、棒グラフとして示した。各群の平均値を、野生型ＡＰＰ−ＳｗＤＩ（−）ＰＴＰσ（＋／＋）マウスの値に正規化した。ＡＰＰ−ＳｗＤＩ（−）ＰＴＰσ（＋／＋）：ｎ＝４；ＡＰＰ−ＳｗＤＩ（＋）ＰＴＰσ（＋／＋）：ｎ＝６、ＡＰＰ−ＳｗＤＩ（＋）ＰＴＰσ（−／−）：ｎ＝６。全ｐ値：スチューデントの両側ｔ検定。エラーバー：ＳＥＭ。
【図７】（Ａ〜Ｈ）。ＰＴＰσ欠損が、ＴｇＡＰＰ−ＳｗＤＩマウスのタウ病状を軽減することを示す模式図、画像、およびグラフである。Ａ：９〜１１ヶ月齢のＴｇＡＰＰ−ＳｗＤＩ遺伝子導入マウスの脳で、抗タウ抗体を用いて免疫蛍光染色により検出されたタウ凝集の分布パターンを示す模式図。凝集したタウは、ＡＰＰＳｗＤＩ（＋）ＰＴＰσ（＋／＋）マウスの梨状葉皮質および嗅内皮質の分子層中に最も顕著に認められ、また、海馬領域中で、たまに認められる。Ｂ：ＰＴＰσ欠損は、タウ凝集を減少させる。棒グラフは、４対の同年、同性の９〜１１ヶ月齢のＡＰＰ−ＳｗＤＩ（＋）ＰＴＰσ（＋／＋）およびＡＰＰ−ＳｗＤＩ（＋）ＰＴＰσ（−／−）マウス由来の冠状脳切片中のタウ凝集の定量化を示す。各対に対し、ＡＰＰ−ＳｗＤＩ（＋）ＰＴＰσ（−／−）試料由来の値をＡＰＰ−ＳｗＤＩ（＋）ＰＴＰσ（＋／＋）試料由来の値に正規化する。ｐ値：スチューデントの両側ｔ検定。エラーバー：ＳＥＭ。Ｃ、Ｄ：ＡＰＰ−ＳｗＤＩ（＋）ＰＴＰσ（＋／＋）脳中のタウ凝集を有する多くの領域の代表的画像。Ｆ、Ｇ：同年のＡＰＰ−ＳｗＤＩ（＋）ＰＴＰσ（−／−）脳中のタウ凝集を有するいくつかの領域の代表的画像。ＣおよびＦ：海馬領域。Ｄ〜Ｈ：梨状葉皮質。Ｅ：ｄに隣接する部分の染色であるが、一次抗体は用いていない（１次Ａｂなし）。Ｈ：同年の非遺伝子導入野生型同腹仔（ＰＴＰσを発現しているが、ヒトＡＰＰ導入遺伝子は発現していない）では、タウ凝集体が検出されない。矢印は、タウ凝集体を示す。スケールバー：５０μｍ。
【図８】（Ａ〜Ｃ）。ＰＴＰσ欠損が、ＴｇＡＰＰ−ＳｗＤＩマウスの行動欠陥を救済することを示すグラフである。Ａ：Ｙ−迷路アッセイでは、空間ナビゲーションの能力が、総アーム進入の内の自発的交替行動のパーセンテージによりスコア化される。値は、コロニー内の非遺伝子導入野生型ＡＰＰ−ＳｗＤＩ（−）ＰＴＰσ（＋／＋）マウスの値に正規化される。非遺伝子導入野生型マウスと比較して、ＡＰＰ−ＳｗＤＩ（＋）ＰＴＰσ（＋／＋）マウスは、短期空間記憶の障害を示し、これは、ＡＰＰ−ＳｗＤＩ（＋）ＰＴＰσ（−／−）マウスのＰＴＰσの遺伝子欠乏により救済される。ＡＰＰ−ＳｗＤＩ（−）ＰＴＰσ（＋／＋）：ｎ＝２３（１８匹の雌および５匹の雄）；ＡＰＰ−ＳｗＤＩ（＋）ＰＴＰσ（＋／＋）：ｎ＝５２（３０匹の雌および２２匹の雄）；ＡＰＰ−ＳｗＤＩ（＋）ＰＴＰσ（−／−）：ｎ＝３５（２２匹の雌および１３匹の雄）。全ての遺伝子型群の年齢は、４ヶ月齢および１１ヶ月齢の間で類似になるように分配される。Ｂ、Ｃ：新奇物体試験。ＮＯ：新奇物体。ＦＯ：馴染物体。探索時間（Ｂ）および進入回数（Ｃ）の観点から、ＮＯに対する注意力がＮＯ探索の総物体探索（ＮＯ＋ＦＯ）に対する比率により測定される。値は、非遺伝子導入野生型マウスの値に正規化される。ＡＰＰ−ＳｗＤＩ（＋）ＰＴＰσ（＋／＋）マウスは、野生型ＡＰＰ−ＳｗＤＩ（−）ＰＴＰσ（＋／＋）マウスに比べて、ＮＯへの関心の低減を示した。障害は、ＡＰＰ−ＳｗＤＩ（＋）ＰＴＰσ（−／−）マウスのＰＴＰσ欠乏により回復される。ＡＰＰ−ＳｗＤＩ（−）ＰＴＰσ（＋／＋）：ｎ＝２８（１９匹の雌および９匹の雄）；ＡＰＰ−ＳｗＤＩ（＋）ＰＴＰσ（＋／＋）：ｎ＝４６（３２匹の雌および１４匹の雄）；ＡＰＰ−ＳｗＤＩ（＋）ＰＴＰσ（−／−）：ｎ＝２９（２１匹の雌および８匹の雄）。全ての群の年齢は、４ヶ月齢および１１ヶ月齢の間で類似になるように分配される。全ｐ値：スチューデントの両側ｔ検定。エラーバー：ＳＥＭ。
【図９】ＰＴＰσ欠損が、ＴｇＡＰＰ−ＳｗＤＩマウスの短期空間記憶を回復することを示すグラフである。Ｙ−迷路アッセイでは、空間ナビゲーションの能力が、総アーム進入の内の自発的交替行動のパーセンテージによりスコア化される。ここで示される生の値は、図６Ａの正規化前のものである。非遺伝子導入野生型ＡＰＰ−ＳｗＤＩ（−）ＰＴＰσ（＋／＋）マウスと比較して、ＡＰＰ−ＳｗＤＩ（＋）ＰＴＰσ（＋／＋）マウスは、短期空間記憶の障害を示し、これは、ＰＴＰσの遺伝子欠乏により救済される。ＡＰＰ−ＳｗＤＩ（−）ＰＴＰσ（＋／＋）：ｎ＝２３（１８匹の雌および５匹の雄）；ＡＰＰ−ＳｗＤＩ（＋）ＰＴＰσ（＋／＋）：ｎ＝５２（３０匹の雌および２２匹の雄）；ＡＰＰ−ＳｗＤＩ（＋）ＰＴＰσ（−／−）：ｎ＝３５（２２匹の雌および１３匹の雄）。全ての遺伝子型群の年齢は、４ヶ月齢および１１ヶ月齢の間で類似になるように分配される。全ｐ値：スチューデントの両側ｔ検定。エラーバー：ＳＥＭ。
【図１０】（Ａ〜Ｄ）。ＰＴＰσ欠損がＴｇＡＰＰ−ＳｗＤＩマウスによる新奇物体探索を高めることを示すグラフである。ＮＯ：新奇物体。ＦＯ：馴染物体。ＡおよびＢ：新奇物体試験では、ＮＯの嗜好性が、ＮＯおよびＦＯ探索の間の比率により測定され、ＮＯ／ＦＯ＞１は、ＮＯに対する嗜好性を示す。ＣおよびＤ：さらに、ＮＯに対する注意力が、識別指数：ＮＯ／（ＮＯ＋ＦＯ）、ＮＯ探索の総物体探索（ＮＯ＋ＦＯ）に対する比率、により測定される。ここで示したｃおよびｄの生の値は、図６ＢおよびＣの正規化前のものである。このコロニーのマウスは、それらの親Ｂａｌｂ／ｃ株からの遺伝であると思われる、低いベースラインのＮＯ／（ＮＯ＋ＦＯ）識別指数を示す。非遺伝子導入野生型ＡＰＰ−ＳｗＤＩ（−）ＰＴＰσ（＋／＋）マウスに対しては、識別指数は僅かに０．５（確率値）より高く、以前にＢａｌｂ／ｃ野生型マウス２７に関し報告されたものと類似である。従って、識別指数の測定値だけでは、ＮＯ／ＦＯ比のようには、ＮＯに対する嗜好性を示さないかもしれない。物体の嗜好性の測定では高感度ではないが、ＮＯ／（ＮＯ＋ＦＯ）指数は、総物体探索活動に対するＮＯ探索の正規化を与えるので、最もよく使われる。それぞれは、それ自体の利点と欠点を有するが、ＮＯ／ＦＯおよびＮＯ／（ＮＯ＋ＦＯ）測定値は、ＴｇＡＰＰ−ＳｗＤＩ遺伝子の発現がＮＯに対する注意力の障害に繋がり、一方で、ＰＴＰσの遺伝子欠乏が、新奇物体の探索を非遺伝子導入野生型マウスに近いレベルまで回復させることを一貫して示す。ＡおよびＣ：探索時間の観点での測定値。ＢおよびＤ：進入回数の観点での測定値。ＡＰＰ−ＳｗＤＩ（−）ＰＴＰσ（＋／＋）：ｎ＝２８（１９匹の雌および９匹の雄）；ＡＰＰ−ＳｗＤＩ（＋）ＰＴＰσ（＋／＋）：ｎ＝４６（３２匹の雌および１４匹の雄）；ＡＰＰ−ＳｗＤＩ（＋）ＰＴＰσ（−／−）：ｎ＝２９（２１匹の雌および８匹の雄）。全ての群の年齢は、４ヶ月齢および１１ヶ月齢の間で類似になるように分配される。全ｐ値：スチューデントの両側ｔ検定。エラーバー：ＳＥＭ。
【図１１】（Ａ〜Ｃ）。ＰＴＰσ欠損がＴｇＡＰＰ−ＳｗＩｎｄマウスの行動成績を改善することを示す。Ａ：Ｙ−迷路アッセイでは、空間ナビゲーションの能力が、総アーム進入の内の自発的交替行動のパーセンテージによりスコア化される。ＡＰＰ−ＳｗＩｎｄ（＋）ＰＴＰσ（＋／＋）マウスに比べて、ＡＰＰ−ＳｗＩｎｄ（＋）ＰＴＰσ（−／−）マウスは、短期空間記憶の改善を示した。ＡＰＰ−ＳｗＩｎｄ（＋）ＰＴＰσ（＋／＋）：ｎ＝４０（２０匹の雌および２０匹の雄）；ＡＰＰ−ＳｗＩｎｄ（＋）ＰＴＰσ（−／−）：ｎ＝１８（９匹の雌および９匹の雄）。両方の遺伝子型群の年齢は、４ヶ月齢および１１ヶ月齢の間で類似になるように分配される。Ｂ、Ｃ：新奇物体試験。ＮＯ：新奇物体。ＦＯ：馴染物体。ＮＯ嗜好性がＮＯ探索時間の総物体探索時間に対する比率（Ｂ）およびＮＯ探索時間のＦＯ探索時間に対する比率（Ｃ）により測定される。ＰＴＰσ欠乏は、これらの遺伝子導入マウスにおける新奇物体嗜好性を改善する。ＡＰＰ−ＳｗＤＩ（＋）ＰＴＰσ（＋／＋）：ｎ＝４３（２１匹の雌および２２匹の雄）；ＡＰＰ−ＳｗＩｎｄ（＋）ＰＴＰσ（−／−）：ｎ＝２４（１０匹の雌および１４匹の雄）。両方の群の年齢は、５ヶ月齢および１５ヶ月齢の間で類似になるように分配される。全ｐ値：スチューデントの両側ｔ検定。エラーバー：ＳＥＭ。
【図１２】単独で投与されたγ−分泌酵素阻害剤またはγ−分泌酵素阻害剤と組み合わせて投与されたＢＡＣＥ１阻害剤と比較して、ＡＰＰプロセッシングに対するγ−分泌酵素阻害剤と組み合わせたＩＳＰの効果を示す免疫ブロットである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本明細書に記載される実施形態は、特定の方法論、プロトコールおよび試薬等に限定されず、従って、変わり得る。本明細書で用いられる用語は特定の実施形態を記載するためのみのものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、本発明の範囲は、特許請求の範囲によってのみ定義される。操作例における場合以外または別義が指示される場合以外、本明細書で使用される成分または反応条件の量を表す全ての数は、全ての場合において、用語の「約」によって修飾されているものとして理解されるべきである。
【００１９】
特定される特許および他の出版物はすべて、例えば、本発明との関連で使用され得るこのような出版物で記載された方法論を記載し、開示する目的で、参照により明示的に本明細書に組み込まれる。これらの出版物は本出願の出願日に先立つそれらの開示のためにのみ提供される。これに関しては、先行発明を理由にしてまたは何らかの他の理由で本発明者らがそのような開示に先行する権利を与えられないことを承認するものと解釈されるべきではない。これらの文書の内容に関する日付または表現に関する記載はすべて出願者に利用可能な情報に基づくものであり、これらの文書の日付または内容の正確さに関する承認を構成するものではない。
【００２０】
別に定めのない限り、本明細書で使用される科学技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈により別義が要求されない限り、単数用語は複数を含むものとし、複数用語は単数を含むものとする。一般に、本明細書で記載される細胞および組織の培養、分子生物学、およびタンパク質およびオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの化学およびハイブリッド形成と関連して利用される命名法、ならびにそれらの技法は、当該技術で周知であり、一般に使用されるものである。
【００２１】
本明細書で使用される場合、「ａ、ｂおよびｃの１つまたは複数」はａ、ｂ、ｃ、ａｂ、ａｃ、ｂｃまたはａｂｃを意味する。本明細書における「または」の使用は、包含的なまたはである。
【００２２】
本明細書で使用される場合、患者に「投与する」という用語には、脳脊髄液へのまたは脳血管関門を横切る投与、非経口または経口の経路による送達、筋肉内注射、皮下または皮内注射、静脈内注射、頬内投与、経皮送達、および直腸、結腸、膣、鼻腔内のまたは気道経路による投与を含む、対象の所望の位置に活性化合物を送達するために（例えば、それにより、所望のニューロンなどの所望の細胞に接触させるために）好適な経路により、対象への医薬製剤中の活性化合物の分配、送達または適用が含まれる。薬剤は、例えば、静脈内注射を介して昏睡状態、麻酔下のもしくは麻痺した対象に投与され得、または妊娠した対象の静脈内に投与して胎児の軸索成長を刺激し得る。投与の特定の経路には、局所投与（例えば、まぶたの下に投入される点眼薬、クリームまたは浸食性の製剤）、水性体液または硝子体液への眼内注射、結膜下注射またはテノン嚢下注射を介するなどの眼の外層への注射、非経口投与または経口経路を介した投与が挙げられ得る。
【００２３】
本明細書で使用される場合、用語「抗体」には、ヒトおよび動物のｍＡｂ、およびポリクローナル抗体、組換え抗体（抗血清）、ヒト化抗体、抗イディオタイプ抗体およびその誘導体などのキメラ抗体を含む合成抗体の調製が挙げられる。抗体の一部またはフラグメントは、特定のエピトープに結合する能力（結合の特異性および親和性）の少なくとも一部を保持する抗体の領域を意味する。用語「エピトープ」または「抗原決定基」は抗体のパラトープが結合する抗原上の部位を意味する。連続アミノ酸により形成されるエピトープは通常、変性溶媒への暴露の際、保持されるが、三次折り畳みにより形成されるエピトープは通常、変性溶媒による処理の際に失われる。エピトープは通常、特有の空間配置中に少なくとも３個、少なくとも５個または８〜１０個、または約１３〜１５個のアミノ酸を含む。エピトープの空間配置を決定する方法には、例えば、Ｘ線結晶学および二次元核磁気共鳴が挙げられる。例えば、６６  ＥＰＩＴＯＰＥ  ＭＡＰＰＩＮＧ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＥＴＳ．ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯ．（Ｍｏｒｒｉｓ，ｅｄ．，１９９６）；Ｂｕｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，１７０  Ｊ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．１１１０−１９（１９９４）；Ｔｉｇｇｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１５６  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３９０１−１０を参照されたい。
【００２４】
本明細書で使用される場合、「中枢神経系（ＣＮＳ）のニューロン」には脳、脳神経および脊髄のニューロンが含まれる。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、ポリペプチドをコードする第１のアミノ酸配列と、第１のポリペプチドのドメインに対して外来性であり、実質的に相同ではないドメイン（例えば、ポリペプチドの一部）を規定する第２のアミノ酸配列との融合体である。キメラタンパク質は、第１のタンパク質も発現する生物で見出される外来性のドメイン（異なるタンパク質中ではあるが）であってもよく、またはキメラタンパク質は、異なる種類の生物により発現されるタンパク質構造体の「種間」、「遺伝子間」等の融合体であってもよい。
【００２６】
本明細書で使用される場合、用語「ニューロンに接触すること」または「ニューロンを治療すること」は、薬剤がニューロン中でその医薬効果を示すことが可能である細胞または全生物への薬剤の送達または「投与」の任意の様式を意味する。「ニューロンに接触すること」には、本発明の薬剤をインビボおよびインビトロの両方でニューロンの近傍に運ぶ方法が含まれる。好適な投与方法は、当業者により決定することができ、このような投与方法は、薬剤の間で変化し得る。
【００２７】
本明細書で使用される場合、薬剤または治療用ペプチドの「有効量」は、所望の治療効果または医薬効果を達成するのに十分な量、例えば、βアミロイド蓄積またはタウ凝集を阻害できる量である。本明細書で定義される薬剤の有効量は、例えば、対象の疾患の状態、年齢および体重、ならびに対象において、所望の応答を誘発する薬剤の能力などの因子により変化し得る。投与計画を調節して最適な治療応答をもたらし得る。有効量はまた、治療上の有益な効果が活性化合物の毒性効果または有害効果に勝るものでもある。
【００２８】
本明細書で使用される場合、用語の「治療有効量」は、必要な用量と期間で、所望の治療結果を達成するために有効な量を意味する。治療結果は、例えば、症状の減少、生存の延長、運動の改善などであり得る。治療結果は「治癒」である必要はない。
【００２９】
本明細書で使用される場合、用語「発現」は、核酸がペプチドに翻訳されるまたは、例えば、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質に翻訳できるＲＮＡに転写される過程を意味する。核酸がゲノムＤＮＡに由来するのであれば、発現は、適当な真核宿主細胞または生物が選択される場合、ｍＲＮＡのスプライシングを含む。宿主細胞中で発現される異種核酸については、それは先ず細胞に送達され、その後、いったん細胞に入って、最終的に核に存在しなければならない。
【００３０】
本明細書で使用される場合、用語の「遺伝子治療」には、治療または診断が求められる障害または状態にある哺乳動物、特にヒトの細胞への異種のＤＮＡの移入が含まれる。選択された標的細胞にＤＮＡが導入され、それにより、異種のＤＮＡが発現され、それにより、コードされた治療用産物が産生される。あるいは、異種のＤＮＡは、治療用産物をコードするＤＮＡの発現を何らかの形で媒介し、治療用産物の発現を何らかの形で直接的にまたは間接的に媒介するペプチドまたはＲＮＡなどの産物をコードし得る。遺伝子治療を用いて遺伝子産物をコードする核酸を送達して欠陥のある遺伝子を置き換えてもよく、またはそれが導入された哺乳動物または細胞により産生される遺伝子産物を補完してもよい。導入された核酸は、通常は哺乳動物宿主では産生されないまたは治療上有効な量でもしくは治療上有用な時間で産生されない、治療用化合物をコードし得る。治療用産物をコードする異種のＤＮＡは、その産物または発現を増大するかまたは別の方法で変えるために、罹患している宿主の細胞に導入する前に修飾され得る。
【００３１】
本明細書で使用される場合、用語の「遺伝子」または「組換え遺伝子」はエクソンおよび（任意に）イントロンの配列の両方を含むポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸を意味する。
【００３２】
本明細書で使用される場合、用語の「異種核酸配列」は通常、それが発現される細胞によって、インビボでは通常産生されないＲＮＡおよびタンパク質をコードするＤＮＡ、または転写、翻訳若しくは他の調節性の生物過程に影響を及ぼすことにより、内在性のＤＮＡの発現を変更するメディエーターを媒介するもしくはそれをコードするＤＮＡである。異種核酸配列はまた外来性のＤＮＡとも呼ばれる。それが発現される細胞に対して異種または外来性であると当業者が認識するまたは見なすＤＮＡは本明細書では異種ＤＮＡにより包含される。異種ＤＮＡの例には、限定されないが、薬剤耐性を付与するタンパク質などの追跡可能なマーカータンパク質をコードするＤＮＡ、治療上有効な物質をコードするＤＮＡ、ならびに抗体などの他の種類のタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。異種のＤＮＡによって、コードされる抗体は、異種のＤＮＡが導入されている細胞の表面で分泌され得るかまたは発現され得る。
【００３３】
本明細書で使用される場合、用語の「相同性」および「同一性」は、全体を通して同義に使用され、２つのペプチド間のまたは２つの核酸分子間の配列類似性を意味する。相同性は、比較の目的で並べられ得る各配列における位置を比較することによって、決定できる。比較した配列における位置が同一の塩基またはアミノ酸で占められれば、その位置で分子は相同または同一である。配列間の相同性または同一性の程度は配列により共有される一致するまたは相同性の位置の数の関数である。
【００３４】
本明細書で使用される場合、用語の「神経障害」には、対象の神経系の正常な機能または解剖学的構造に直接または間接的に影響する疾患、障害または状態が含まれる。
【００３５】
本明細書で使用される場合、語句の「非経口投与」および「非経口で投与される」は本明細書で使用される場合、腸内投与および局所投与以外の、通常は注射による投与方法を意味し、これには、限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、脳室内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節腔内、嚢下、クモ膜下、脊髄内および胸骨内の注射および注入が挙げられる。
【００３６】
本明細書で使用される場合、語句の「全身投与」、「全身に投与される」、「末梢投与」および「末梢に投与される」は、本明細書で使用される場合、標的組織（例えば、中枢神経系）への直接投与以外の化合物、薬物またはその他の物質の投与を意味し、それにより、動物の体系に入り、従って、代謝および他の類似の過程、例えば、皮下投与を受ける。
【００３７】
本明細書で使用される場合、用語の「患者」または「対象」または「動物」または「宿主」は任意の哺乳動物を意味する。対象はヒトであり得るが、獣医治療を必要とする哺乳動物、例えば、愛玩動物（例えば、イヌ、ネコ等）、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ニワトリ、ブタ、ウマ等）および実験動物（例えば、ラット、マウス、モルモット等）でもあり得る。
【００３８】
本明細書で使用される場合、用語の「末梢神経系（ＰＮＳ）のニューロン」には、ＣＮＳの外側に存在するまたは伸びるニューロンが含まれる。ＰＮＳは、感覚ニューロンおよび運動ニューロンを含む末梢神経系に分類されるとして一般的に理解されるニューロンを含むことが意図されている。
【００３９】
本明細書で使用される場合、用語の「ポリヌクレオチド配列」および「ヌクレオチド配列」は本明細書では同じ意味で用いられる。
【００４０】
本明細書で使用される場合、用語の「ペプチド」および「ポリペプチド」は、本明細書では同じ意味に用いられ、約２〜約９０個（包括的）のアミノ酸残基からなる化合物を意味し、１つのアミノ酸のアミノ基がペプチド結合により、別のアミノ酸のカルボキシル基に連結される。ペプチドは例えば、酵素切断または化学切断によって、ネイティブのタンパク質から導き出すまたは取り出すことができ、または従来のペプチド合成法（例えば、固相合成）または分子生物学的な技法により、調製できる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：ＬＡＢ．ＭＡＮＵＡＬ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）を参照）。「ペプチド」は、好適なＬ−および／またはＤ−アミノ酸、例えば、一般的なα−アミノ酸（例えば、アラニン、グリシン、バリン）、非α−アミノ酸（例えば、Ｐ−アラニン、４−アミノ酪酸、６−アミノカプロン酸、サルコシン、スタチン）および異常アミノ酸（例えば、シトルリン、ホモシトルリン、ホモセリン、ノルロイシン、ノルバリン、オルニチン）を含むことができる。ペプチド上のアミノ基、カルボキシル基および／または他の官能基は遊離状態（例えば、非修飾）、または好適な保護基で保護され得る。アミノ基およびカルボキシル基の好適な保護基、および保護基を付加するまたは取り外す手段は当該技術で既知である。例えば、Ｇｒｅｅｎ  ＆ａｍｐ；Ｗｕｔｓ，ＰＲＯＴＥＣＴＩＮＧ  ＧＲＯＵＰＳ  ＩＮ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆ａｍｐ；Ｓｏｎｓ，１９９１）を参照されたい。ペプチドの官能基も既知の方法を用いて誘導体化（例えば、アルキル化）することができる。
【００４１】
ペプチドは合成することができ、また、多数の別々の分子種を含むライブラリを構築することができる。このようなライブラリはコンビナトリアル化学の周知の方法を用いて調製することができ、本明細書で記載されるように、またはライブラリが、ＣＳＰＧ／ＰＴＰσの相互作用に拮抗できるペプチドを含むかどうかを判定する好適な他の方法を用いて、スクリーニングすることができる。次いで好適な手段により、このようなペプチドのアンタゴニストを単離できる。
【００４２】
本明細書で使用される場合、用語の「ペプチド模倣体」は、ペプチドを模倣するように設計されたタンパク質様分子を意味する。ペプチド模倣体は通常、既存のペプチドの修飾から、またはペプトイドおよびβ−ペプチドなどのペプチドを模倣する類似の系を設計することによって、生じる。手法に関わりなく、化学構造を変えた設計を行うことにより、安定性または生物活性などの分子特性が有利に調節される。これらの修飾には、天然に存在しないペプチドに対する変更（例えば、変化した骨格および非天然のアミノ酸の取り込み）を含む。
【００４３】
本明細書で使用される場合、用語の「前駆細胞」は、その高分化型の子孫の特徴の全部ではない一部を有する幹細胞の分化の間に生成される細胞である。例えば、「神経前駆細胞」などの明確な前駆細胞は、系列に関係付けられているが、特定のまたは高分化細胞型には関係付けられない。
【００４４】
本明細書で使用される場合、用語「幹細胞」は、自己複製を受けることができ（すなわち、同じ分化能を持つ子孫）、分化能においてさらに拘束されている子孫細胞を生じることができる細胞を意味する。本発明の文脈の範囲内では、幹細胞は、例えば、核移入により、さらに原始的な幹細胞との融合により、特定の転写因子の導入により、または特定の条件下での培養により、脱分化しているさらに分化した細胞も包含する。例えば、Ｗｉｌｍｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３８５：８１０−８１３（１９９７）；Ｙｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４１６：５４５−５４８（２００２）；Ｇｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４４０：１１９９−１２０３（２００６）；Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１２６：６６３−６７６（２００６）；Ｏｋｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４４８：３１３−３１７（２００７）；ａｎｄ  Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１３１：８６１−８７２（２００７）を参照されたい。
【００４５】
ポリヌクレオチド配列（ＤＮＡ、ＲＮＡ）は、発現制御配列がそのポリヌクレオチド配列の転写および翻訳を制御し、調節する場合、発現制御配列に「動作可能に連結される」。用語の「動作可能に連結される」には、発現されるポリヌクレオチド配列の前で適切な開始シグナル（例えば、ＡＴＧ）を有すること、および正しいリーディングフレームを維持して発現制御配列の制御下でポリヌクレオチド配列の発現を可能にし、ポリヌクレオチド配列によりコードされる所望のポリペプチドの産生を可能にすることが含まれる。
【００４６】
本明細書で使用される場合、本明細書で使用される用語の「組換え」は、タンパク質が原核生物発現系または真核生物発現系に由来することを意味する。
【００４７】
本明細書で使用される場合、用語「組織特異的なプロモーター」は、プロモーターとして役立つ、すなわち、プロモーターに動作可能に連結された選択された核酸配列の発現を調節し、上皮細胞の細胞などの組織の特定の細胞の選択された核酸配列の発現に影響を与える核酸配列を意味する。この用語はまた１つの組織で主として選択された核酸の発現を調節するが、同様に他の組織でも発現を生ずるいわゆる「漏出性」プロモーターも網羅する。用語「遺伝子導入」は細胞による外来性ＤＮＡの取り込みを意味するのに使用される。外因性ＤＮＡが細胞膜の内側に導入されている場合、細胞は「遺伝子導入」されている。多数の遺伝子導入方法が当該技術で一般に知られている。例えば、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６（１９７３）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８９）；Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６）；Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １３：１９７（１９８１）を参照されたい。このような技法を用いて、例えば、ヌクレオチド組込み型ベクターおよび他の核酸分子などの１つまたは複数の外来性ＤＮＡ部分を好適な宿主細胞に導入できる。この用語は化学的、電気的、およびウイルス媒介遺伝子導入の手順を含む。
【００４８】
本明細書で使用される場合、用語の「転写調節配列」は、それらが動作可能に連結されるタンパク質コード配列の転写を誘導するまたは制御する開始シグナル、エンハンサーおよびプロモーターなどの核酸配列を意味するのに明細書全体を通して使用される一般的な用語である。いくつかの実施例では、組換え遺伝子の転写は、プロモーター配列（または他の転写調節配列）の制御下にあり、それは、発現が意図される細胞型の組換え遺伝子の発現を制御する。組換え遺伝子は、これらの配列と同一であるまたは異なる、タンパク質の天然に存在する形態の転写を制御する転写調節配列の制御下にあり得ることも理解されよう。
【００４９】
本明細書で使用される場合、用語の「ベクター」はそれが連結されている別の核酸を輸送することが可能である核酸分子を意味する。好ましいベクターは、それらが結合する核酸の自律複製および発現の１つまたは複数が可能であるものである。それらが動作可能に連結された遺伝子の発現を指示することが可能であるベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。
【００５０】
本明細書で使用される場合、用語の「野生型」は、インビボでそれが正常に存在するような、それぞれ、タンパク質、またはその一部、またはタンパク質配列、またはその一部をコードする天然のポリヌクレオチドを意味する。本明細書で使用される場合、用語の「核酸」はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、および該当する場合には、リボ核酸（ＲＮＡ）などのポリヌクレオチドを意味する。この用語は、ヌクレオチド類似体から作られ、記載の実施形態に適用可能なＲＮＡまたはＤＮＡの等価物、類似体として、一本鎖（センスまたはアンチセンス）および二本鎖のポリヌクレオチドを含むことは理解されるべきである。
【００５１】
本明細書で記載される方法で使用される薬剤、化合物、組成物、抗体等は、使用前に精製および／または単離することが検討される。精製された物質は通常、「実質的に純粋」であり、核酸、ポリペプチド、またはそのフラグメント、または他の分子が天然ではそれに付随する成分から分離されていることを意味する。通常、それが天然で結合するタンパク質および他の有機分子を、重量で少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはさらに９９％含まない場合、ポリペプチドは実質的に純粋である。例えば、実質的に純粋なポリペプチドは、天然源からの抽出により、正常ではそのタンパク質を発現しない細胞における組換え核酸の発現により、または化学合成により、得られ得る。「単離された物質」はその天然の位置および環境から取り出されている。単離されたまたは精製されたドメインまたはタンパク質フラグメントの場合、ドメインまたはフラグメントは、天然配列のタンパク質に隣接するアミノ酸配列を実質的に含まない。用語の「単離されたＤＮＡ」は、ＤＮＡが天然のゲノム中で所与のＤＮＡに隣接する遺伝子を実質的に含んでいないことを意味する。従って、用語の「単離されたＤＮＡ」は、例えば、ｃＤＮＡ、クローニングされたゲノムＤＮＡおよび合成ＤＮＡを包含する。
【００５２】
本明細書で使用される場合、用語の「一部」、「フラグメント」、「バリアント」、「誘導体」および「類似体」は、本発明のポリペプチドを意味する場合、本明細書で言及される少なくとも一部の生物活性（例えば、結合などの相互作用の阻害）を保持するいずれかのポリペプチドを含む。本明細書で記載されるポリペプチドには、ポリペプチドが依然としてその機能を果たす限り、限定されないが、一部、フラグメント、バリアント、または誘導体分子が含まれ得る。本発明のポリペプチドまたはその一部には、タンパク分解フラグメント、欠失フラグメント、および特に、または動物に送達された際、作用部位にさらに容易に到達するフラグメントが含まれ得る。
【００５３】
本明細書で記載の実施形態は、βアミロイド蓄積および／またはタウ凝集の阻害および／または低減を必要としている対象に対しそれを実施する方法に関する。βアミロイド蓄積およびタウ凝集は、アルツハイマー病の特徴であるが、それらの根底にある分子機序は不明瞭なままである。我々は、２つのマウスモデルで、神経受容体ＰＴＰσが、βアミロイドおよびタウ病変形成の両方を媒介することを見出した。脳では、ＰＴＰσは、βアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）に結合する。ＰＴＰσの欠乏は、ＡＰＰとβ−分泌酵素の間の親和性を、分泌酵素の他の主要な基質に影響を与えることなく低下させ、β−およびγ−切断によりＡＰＰタンパク分解性産物を漸減させ、これは、βアミロイド形成性調節の特異性を示唆する。ヒトＡＰＰ遺伝子導入加齢マウスでは、βアミロイドーシス、タウ凝集、神経炎症、シナプスの減少、ならびに行動欠陥の進行は、全て、ＰＴＰσの発現に対する明確な依存性を示す。さらに、内在性タウの凝集体は、アルツハイマー脳の初期段階神経原線維濃縮体に類似の分布パターンで見つかる。
【００５４】
ＰＴＰσの細胞内触媒ドメイン（例えば、配列番号９を有するＩＳＰ）のくさび形状ドメイン（すなわち、くさび形ドメイン）の小型ペプチド模倣体を用いたＰＴＰσ活性または機能の遮断は、ＢＡＣＥ１によるＡＰＰアミロイド形成プロセッシングを、ＰＴＰσ欠乏と類似の程度まで抑制できる。好都合にも、ＰＴＰσのくさび形ドメインのペプチド模倣体は、それを必要としている対象に送達されると、βアミロイドおよびタウ病変形成の両方を阻害し、受動的アミロイド免疫療法に比べて、βアミロイドを活発に抑制し、分泌酵素の他の基質に影響を与えることなく、ＡＰＰプロセッシングを調節し、従って、分泌酵素阻害剤よりもより安全な治療法を提供できる。
【００５５】
したがって、本明細書で記載のいくつかの実施形態では、触媒活性、シグナル伝達およびＰＴＰσなどのＬＡＲファミリーのホスファターゼの機能の内の１つまたは複数を阻害する治療薬を、それを必要としている対象に投与して、それを必要としている対象のβアミロイド蓄積および／またはタウ凝集を阻害および／または低減でき、および／またはアルツハイマー病および／またはアルツハイマー病に関連する認知症を治療できる。
【００５６】
ＰＴＰσなどのＬＡＲファミリーのホスファターゼの活性、シグナル伝達、および／または機能は、次記を含むいくつかの方法で抑制、阻害、および／または遮断できる：ＬＡＲファミリーのホスファターゼの細胞内ドメインの活性の直接阻害（例えば、小分子、ペプチド模倣体またはドミナントネガティブポリペプチドの使用により）；ＬＡＲファミリーのホスファターゼの細胞内ドメインの活性、シグナル伝達、および／または機能の１つまたは複数を阻害する遺伝子および／またはタンパク質の活性化（例えば、遺伝子および／またはタンパク質の発現または活性を高めることにより）；ＬＡＲファミリーのホスファターゼの下流メディエーターである遺伝子および／またはタンパク質の阻害（例えば、メディエーター遺伝子および／またはタンパク質の発現および／または活性を遮断することにより）；ＬＡＲファミリーのホスファターゼの活性、シグナル伝達、および／または機能の１つまたは複数を負に制御する遺伝子および／またはタンパク質の導入（例えば、組換え遺伝子発現ベクター、組換えウイルスベクターまたは組換えポリペプチドを用いることにより）；または例えば、ＬＡＲファミリーのホスファターゼの発現低下変異体による遺伝子の置換（例えば、組み換え遺伝子発現またはウイルスベクター、または変異誘発を用いた相同組換え、過剰発現により）。
【００５７】
ＰＴＰσなどのＬＡＲファミリーのホスファターゼの活性、シグナル伝達および／または機能の１つまたは複数を阻害するまたは低減する治療薬には、ＣＳＰＧなどのプロテオグリカンによるＬＡＲファミリーのホスファターゼの結合または活性化を阻害することなく、ＬＡＲファミリーのホスファターゼの活性、シグナル伝達および／または機能を低下させるおよび／または抑制する薬剤を挙げることができる。このような薬剤は、細胞内にまたは細胞外に投与でき、送達されると、神経に有益な（ｎｅｕｒｏｓａｌｕｔａｒｙ）効果を生成する。
【００５８】
神経に有益な効果には、ニューロン、神経系の一部、または神経系全般の健康または機能に好ましい応答または結果を挙げることができる。そのような効果の例には、ニューロンまたは神経系の一部の損傷に耐える、再生する、所望の機能を維持する、増殖するまたは生存する能力における改善が挙げられる。神経に有益な効果には、神経系の構成成分の中での機能または回復力におけるこのような応答または改善を生成することまたは生じさせることを挙げることができる。神経に有益な効果の生成の例には、ニューロンに対する損傷後の軸索の成長を刺激すること；ニューロンをアポトーシスに対し抵抗性にすること；ニューロンをβアミロイド、アンモニア、またはその他の神経毒などの毒性化合物に対し抵抗性にすること；加齢性神経萎縮または機能の低下を元に戻すこと；加齢性コリン作動性神経支配の低下を元に戻すこと；変性退縮を元に戻すおよび／または低減すること、および／または神経新芽形成を促進すること、が挙げられる。
【００５９】
ＬＡＲファミリーのホスファターゼの調節、調整、および／または阻害に対して可能性のあるメカニズムの１つには、ＬＡＲファミリーのホスファターゼの細胞内部分の二量体化が含まれる。二量体として活性があり、単量体としては不活性である受容体チロシンキナーゼとは対照的に、いくつかのタンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）は二量体化した状態で不活性であり、単量体として活性がある。これらには、ＰＴＰα、ＰＴＰ１ＢおよびＣＤ４５が含まれる。これらの分子のそれぞれは、活性な単量体形態および不活性の二量体形態の両方に結晶化できる。さらに、ＬＡＲおよびＣＤ４５は、特定の酸化条件下で同種親和性結合を示す一方で、ＰＴＰσはリガンド結合に応答して二量体化できる。このことは、ＬＡＲファミリーのホスファターゼに対するリガンドが、ＬＡＲおよびＰＴＰσなどのＬＡＲファミリーのホスファターゼの活性化状態を誘導できることを示唆している。従って、細胞内標的療法を用いて、二量体化を模倣することにより、細胞外マトリックスまたは他のリガンドを変更することなく、ＬＡＲファミリーのホスファターゼを直接不活化できる。
【００６０】
一実施形態では、ＰＴＰσなどのＬＡＲファミリーのホスファターゼの活性、シグナル伝達および／または機能の１つまたは複数を阻害するまたは低減する治療薬には、少なくとも１つのＬＡＲファミリーのホスファターゼの細胞内ドメインに結合し、および／またはそれと複合体形成してＬＡＲファミリーのホスファターゼの活性、シグナル伝達および／または機能を阻害する治療用ペプチドまたは小分子を挙げることができる。従って、神経細胞の少なくとも１つのＬＡＲファミリーのホスファターゼの細胞内ドメインに結合する、および／またはそれと複合体形成する治療用ペプチドまたは小分子を用いて、βアミロイド蓄積またはタウ凝集を阻害できる。
【００６１】
いくつかの実施形態では、治療薬は、ＬＡＲファミリーのホスファターゼの細胞内触媒ドメインのくさび形形状のドメイン（すなわち、くさび形ドメイン）のペプチド模倣体であり得る。構造および配列の解析により、ＬＡＲファミリーの全メンバーが、同種／異種親和性受容体の相互作用を媒介する可能性を有する第１の細胞内触媒ドメイン中に保存された２４アミノ酸のくさび形形状のヘリックス・ループ・ヘリックスモチーフを含有することが明らかになった。表１は、くさび形ドメインを含有するＬＡＲファミリーのホスファターゼのメンバーの細胞内部分のアミノ酸配列を示す。ＬＡＲファミリーのホスファターゼのこれらの細胞内部分の２４アミノ酸のくさび形ドメインは下線で特定されている。くさび形ドメインの特定の構造がＬＡＲファミリーのくさび形ドメインのほとんどで保存されている一方で、くさび形ドメインを構成する正確なアミノ酸は個々のタンパク質およびサブファミリーの間で変化する。
【表１】
2020524132.tif 000003
【００６２】
特定のＬＡＲファミリーのメンバーのくさび形ドメインはその特定のＬＡＲファミリーのメンバーとの同種親和性相互作用または結合に関与することが明らかになった。例えば、プルダウンアッセイでは、ＬＡＲのくさび形ドメインは完全長ＬＡＲと特異的に相互作用することができたが、ＰＴＰσなどの他のファミリーメンバーは相互作用できなかった。さらに、インビトロ結合アッセイは、ＰＴＰｍｕおよびＬＡＲのくさび形ドメインペプチド（くさび形ドメイン＋ＨＩＶ−ＴＡＴ）は、無差別に相互に結合するのではなく、同種親和性的に特異的に凝集した。特に興味深いのは、ＬＡＲのくさび形ドメインがシグマに結合することができず、これは、類似のファミリーのメンバー間でさえ特異性があることを示している。
【００６３】
いくつかの実施形態では、治療薬は、例えば、国際公開第２０１３／１５５１０３Ａ１（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載ものなどのＰＴＰσの細胞内触媒ドメインのくさび形形状のドメイン（すなわち、くさび形ドメイン）のペプチド模倣体であり得る。細胞（例えば、神経細胞）で発現される場合または細胞内輸送部分に結合される場合の、ＰＴＰσのくさび形ドメインのペプチド模倣体を用いて、神経細胞におけるＰＴＰσシグナル伝達を消滅させることができ、βアミロイド蓄積およびタウ凝集を阻害できる。これらの治療用ペプチドのＰＴＰσの無傷のくさび形ドメインへの結合は、可能性として、（ｉ）ＰＴＰσがホスファターゼ標的などの標的タンパク質を相互作用する能力を妨害する；（ｉｉ）ＰＴＰσと、触媒的不活性な第２のホスファターゼドメインＤ２などのＰＴＰσ中に含まれる別のドメインとの分子間相互作用促進活性を妨害する；タンパク質の活性ホスファターゼ部位へのアクセスを妨害する；（ｉｉｉ）くさび形ドメインの正常な相互作用を排除する；および／または（ｉｖ）ホスファターゼ活性を立体的に阻害する。
【００６４】
いくつかの実施形態では、ペプチド模倣体（すなわち、治療用ペプチド）は、約１０〜約２０個のアミノ酸を含み、それから本質的に成り、および／またはそれからなることができ、ＰＴＰσなどのＬＡＲファミリーのホスファターゼのくさび形ドメインのアミノ酸配列の約１０〜約２０個の連続するアミノ酸部分に対して少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を有する。
【００６５】
他の実施形態では、治療用ペプチドは約１０〜約２０個のアミノ酸を含み、から本質的に成り、および／またはからなることができ、ＰＴＰσのくさび形ドメインの約１０〜約２０個の連続するアミノ酸部分に対して少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または１００％同一であるアミノ酸配列を有する。
【００６６】
特定のＬＡＲファミリーメンバーのくさび形ドメイン配列を表２に示す。
【表２】
2020524132.tif 000004
【００６７】
ＰＴＰσのくさび形ドメインの第１のαヘリックスは、アミノ酸１〜１０を含み、ターン領域はアミノ酸１１〜１４を含み、第２のαヘリックスはアミノ酸１５〜２４を含む。例えば、ヒトＰＴＰσのくさび形ドメインの第１のαヘリックスは、ＤＭＡＥＨＴＥＲＬＫ（配列番号１３）のアミノ酸配列を有し、ターンはＡＮＤＳ（配列番号１４）のアミノ酸配列を有し、第２のαヘリックスはＬＫＬＳＱＥＹＥＳＩ（配列番号１５）を有する。
【００６８】
くさび形ドメインはまた、ＬＡＲファミリーの他のメンバー、ＬＡＲおよびＰＴＰδと配列相同性を共有する。これらのアミノ酸はくさび形ドメインの全体構造に必要であると思われる。保存されたアミノ酸には１３位のアラニンが含まれ、それは第１のαヘリックスの末端およびターンの開始にマークし、一般的なくさび形のサイズおよび構造に必要になる可能性が高い。
【００６９】
くさび形ドメインの大略の二次構造および三次構造がほとんどの受容体ＰＴＰで変わらないままなので、ＰＴＰσのくさび形ドメインを標的とする治療用ペプチドに対していくつかの保存的置換を行って類似の結果を得ることができる。保存的置換の例には、例えば、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンなどの１つの非極性（疎水性）残基の別の残基への置換、アルギニンとリシンの間、グルタミンとアスパラギンの間、グリシンとセリンの間などの１つの極性（親水性）残基の別の残基への置換、リシン、アルギニンまたはヒスチジンなどの１つの塩基性残基の別の残基への置換、および／またはアスパラギン酸またはグルタミン酸などの１つの酸性残基の別の残基への置換が挙げられる。
【００７０】
これらの保存的置換は、αヘリックスまたはターンにおける独特ではないドメイン、特に第１のαヘリックスにおける１〜３位および７〜１０位、ターンにおける１２および１３位、ならびに第２のαヘリックスにおける１５、１６、１８〜２４位で行なうことができる。これらのアミノ酸はくさび形ドメインの全体構造に対して必要であり得るが、ＰＴＰσへのくさび形の結合の特異性には必要ではない。
【００７１】
ＰＴＰσに対する独特のアミノ酸、特にＰＴＰσとＬＡＲで差次的に発現されるアミノ酸は、くさび形ドメインの結合の特異性に必要であることが見出された。これらには、第１のαヘリックスの４位および５位、それに続く６位のスレオニンまたはメチオニン（ラットとマウスでの置換）におけるＥＨドメインが挙げられる。ターンでは、高等哺乳動物すべてにおいて、１４位の独特のセリンがある。最後に、第２のαヘリックスでは１７位に独特のロイシンがある。これらの独特のアミノ酸の可能な役割は以下で考察する。
【００７２】
１４位でのターンにおけるセリン残基はくさび形ドメインのその位置のために特に興味深い。αヘリックス間のターンに位置するこのアミノ酸は、ＰＴＰσの一般的な二次構造および三次構造からやや伸びて、結合の相互作用にそれを利用できるようにしている。加えて、セリンは、そのヒドロキシル基およびそれが有する極性のために、例えば、隣接するセリン間の水素結合などのいくつかの同種親和性および異種親和性の結合事象を促進することが知られている。セリンはまたリン酸化のような種々の修飾を受けることも知られ、特異性のためのその必要性の可能性を高くしている。くさび形ドメインのターンに焦点を置き、保存されたセリンを含む小さなペプチドが類似の機能と共にさらに大きな安定性を提供し得ることは可能である。そのようなペプチドは、システインのいずれかの末端と共にループとして合成されてジスルフィド結合を生成することができる。
【００７３】
第１のαヘリックスにおける独特のアミノ酸には、４位のグルタミン酸、５位のヒスチジンおよび６位のスレオニンまたはメチオニンが挙げられる。ヒスチジンはコンセンサスくさび形ドメインに関与するが、それはＬＡＲ、ＰＴＰδ、ＰＴＰｍｕまたはＣＤ４５には見つからない。これらの３個のアミノ酸はすべて帯電しているかまたは極性なので、この配列またはその成分の１つがＰＴＰσのくさび形の特異性に必要であると思われる。
【００７４】
さらに、第２のαヘリックスは１７位で独特のロイシンを含む。ロイシンは、ロイシンジッパーの三次元構造にとって重要な接着性分子に関係があるとされている。くさび形ドメインに構造的に類似するこれらの分子では、ほぼ７間隔で配置されている、対向するαヘリックスのロイシンは、対向するαヘリックスの疎水性領域と相互作用する。第１のαヘリックスには９位に位置するロイシンもあるので、この独特のロイシンはＰＴＰσのくさび形の全体三次構造の構造的健全性に必要であると考えられる。
【００７５】
従って、他の実施形態では、治療用ペプチドは、約１４〜約２０個のアミノ酸を含む、それから本質的になる、またはそれからなることができ、アミノ酸配列ＥＨＸ１ＥＲＬＫＡＮＤＳＬＫＬ（配列番号１６）を含み、配列中、Ｘ１はＴまたはＭである。配列番号１６を含む治療用ペプチドは、治療用ペプチドが配列番号１６に対して少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％相同であるアミノ酸配列を有するように少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、または少なくとも５個の保存的置換を含むことができる。
【００７６】
いくつかの実施形態では、保存的置換は、配列番号１６のアミノ酸残基４Ｅ、５Ｒ、６Ｌ、７Ｋ、９Ｎ、１０Ｄ、１２Ｌ、または１３Ｋのものであり得る。一例を挙げると、アミノ酸残基４ＥをＤまたはＱで置換することができ、アミノ酸残基５ＲをＨ，ＬまたはＫで置換することができ、アミノ酸残基６ＬをＩ、ＶまたはＭで置換することができ、アミノ酸残基７ＫをＲまたはＨで置換することができ、アミノ酸残基９ＮをＥまたはＤで置換することができ、アミノ酸残基１０ＤをＥまたはＮで置換することができ、アミノ酸残基１２ＬをＩ、ＶまたはＭで置換することができ、および／またはアミノ酸残基１３ＫをＲまたはＨで置換できる。
【００７７】
本明細書で記載される治療用ペプチドは、他の種々の変更、置換、挿入、および欠失を受けることができ、このような変更は、その使用時に、特定の利点をもたらす。この点で、ＬＡＲファミリーのホスファターゼのくさび形ドメインに結合および／またはそれと複合体形成する治療用ペプチドは、１つまたは複数の変更が行われ、それがＬＡＲファミリーのホスファターゼ機能の活性、シグナル伝達および／または機能の１つまたは複数を阻害するまたは低減する能力を保持する記述されたポリペプチドの配列に一致するのではなく、むしろ、それに相当し得る、または実質的に相同であり得る。
【００７８】
治療用ペプチドは、アミド、タンパク質との複合体、環化ポリペプチド、重合ポリペプチド、類似体、フラグメント、化学修飾ポリペプチド、などの誘導体を含む種々の形態のポリペプチド誘導体のいずれかであり得る。
【００７９】
保存的置換は、そのようなペプチドが必要な結合活性を示すという条件で非誘導体化残基の代わりに化学的に誘導体化した残基を使用することも含むことができることが十分に理解されよう。
【００８０】
「化学的誘導体」は、官能側基の反応によって、化学的に誘導体化された１つまたは複数の残基を有する当該ポリペプチドを意味する。そのような誘導体化された分子には、例えば、遊離のアミノ基が誘導体化されてアミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブトキシカルボニル基、クロロアセチル基、またはホルミル基を形成する分子が挙げられる。遊離のカルボキシル基は誘導体化されて塩、メチルエステルおよびエチルエステル、または他の種類のエステルまたはヒドラジドを形成し得る。遊離のヒドロキシル基は誘導体化されてＯ−アシルまたはＯ−アルキル誘導体を形成し得る。ヒスチジンのイミダゾール窒素は誘導体化されてＮ−イン−ベンジルヒスチジンを形成し得る。また、化学的な誘導体として包含されるのは、２０個の標準アミノ酸の１個または複数の天然に存在するアミノ酸誘導体を含有するポリペプチドである。例えば、４−ヒドロキシプロリンは、プロリンを置換してもよく、５−ヒドロキシリシンはリシンを置換してもよく、３−メチルヒスチジンはヒスチジンを置換してもよく、ホモセリンはセリンを置換してもよく、オルニチンはリシンを置換してもよい。本明細書で記載されるポリペプチドはまた、必要な活性が維持される限り、その配列が本明細書で示されるポリペプチドの配列に対する１つまたは複数の残基の付加および／または欠失を有する任意のポリペプチドも含む。
【００８１】
本明細書で記載される治療用ペプチドの１種または複数のペプチドを、例えば、当該技術で既知である、翻訳後プロセッシングなどの天然の過程、および／または化学修飾法により修飾できる。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、およびアミノ末端またはカルボキシ末端を含むペプチドで行われ得る。同じ種類の修飾が所与のペプチドのいくつかの部位で、同じまたは異なる程度で存在し得ることは理解されよう。修飾は、例えば、限定されないが、アセチル化、アシル化、アセトアミドメチル（Ａｃｍ）基の付加、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンへの共有結合、ヘム部分への共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化およびユビキチン化などの転移ＲＮＡが介在するタンパク質へのアミノ酸の付加を含む（参考のために、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ−ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ−Ｙｏｒｋ，１９９３を参照されたい）。
【００８２】
本明細書で記載のペプチドおよび／またはタンパク質は、例えば、生物学的に活性のある変異体、バリアント、フラグメント、キメラおよび類似体も含み得る；フラグメントは、１個または複数のアミノ酸の短縮化を有するアミノ酸配列を包含し、短縮化は、アミノ末端（Ｎ末端）、カルボキシ末端（Ｃ末端）、またはタンパク質の内部を起源とし得る。
本発明の類似体には１個または複数のアミノ酸の挿入または置換を含む。バリアント、変異体、フラグメント、キメラおよび類似体は、ＬＡＲファミリーのホスファターゼの阻害剤として機能し得る（本発明の実施例に限定されることなく）。
【００８３】
本明細書で記載の治療用ポリペプチドは、当業者に既知の方法で調製され得る。ペプチドおよび／またはタンパク質は組換えＤＮＡを用いて調製され得る。例えば、調製の１つには、細胞の中でペプチドおよび／またはタンパク質の発現を提供する条件下で宿主細胞（細菌または真核細胞）を培養することが含まれ得る。
【００８４】
ポリペプチドの精製は、アフィニティ法、イオン交換クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、疎水性、またはタンパク質精製に通常使用される他の精製法により行われ得る。精製ステップは非変性条件下で実施できる。一方、変性ステップが必要である場合には、当該技術で既知の技法を用いてタンパク質が復元され得る。
【００８５】
いくつかの実施形態では、本明細書で記載される治療用ペプチドは、ポリペプチドが他のポリペプチド、タンパク質、検出可能な部分、標識、固体マトリクスまたはキャリアに好都合に連結され、および／または取り付けられ得るリンカーを提供することを目的として、ポリペプチドのいずれかの末端に付加され得る追加の残基を含むことができる。
【００８６】
アミノ酸残基のリンカーは普通、少なくとも残基１個であり、４０個以上の残基であることができ、１〜１０個の残基であることがさらに多い。連結に使用される典型的なアミノ酸残基は、グリシン、チロシン、システイン、リシン、グルタミン酸およびアスパラギン酸等である。加えて、当該ポリペプチドは、末端−ＮＨ２アシル化、例えば、アセチル化により、または末端カルボキシルアミド化、例えば、アンモニア、メチルアミン等の末端修飾によるチオグリコール酸のアミド化により修飾されている配列によって、異なり得る。末端修飾は、周知のように、プロテイナーゼ消化による感受性を低減するのに有用であるので、プロテアーゼが存在し得る溶液、特に生体液中のポリペプチドの半減期を延ばすように役立つ。この点で、ポリペプチドの環化も有用な末端修飾であり、環化により形成される安定な構造のために、および本明細書で記載のこのような環状ペプチドで認められる生物活性の観点で特に好ましい。
【００８７】
いくつかの実施形態では、リンカーは、治療用ペプチドを他のポリペプチド、タンパク質および／または検出可能な部分などの分子、標識、固体マトリクスまたはキャリアに連結する柔軟性のペプチドリンカーであり得る。柔軟性のペプチドリンカーは長さ約２０個以下のアミノ酸であり得る。例えば、ペプチドリンカーは約１２個以下のアミノ酸残基、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１および１２個を含み得る。いくつかの事例では、ペプチドリンカーは２個以上の次記のアミノ酸：グリシン、セリン、アラニンおよびスレオニンを含む。
【００８８】
いくつかの実施形態では、本明細書で記載される治療用ペプチドを含む治療薬は、治療用ペプチドに連結される少なくとも輸送用のサブドメインまたは部分（すなわち、輸送部分）を含む複合体タンパク質または薬剤送達構築物の形態で提供される。輸送部分は、治療用ポリペプチドの哺乳動物（すなわち、ヒトまたは動物）の組織または細胞（例えば、神経細胞）への取り込みを容易にできる。輸送部分は治療用ペプチドに共有結合できる。共有結合にはペプチド結合および不安定結合（例えば、容易に切断可能なまたは内部の標的細胞環境で化学変化にさらされる結合）が挙げられ得る。さらに、輸送部分は治療用ポリペプチドに架橋（例えば、化学架橋、ＵＶ架橋）することができる。輸送部分は本明細書で記載の連結ポリペプチドで治療用ポリペプチドに連結することもできる。
【００８９】
輸送部分は治療薬中で２回以上反復できる。輸送部分の反復は所望の細胞によるペプチドおよび／またはタンパク質の取り込みに影響し得る（例えば、取り込みを増やす）。輸送部分はまた、治療用ペプチドのアミノ末端またはそのカルボキシ末端の領域のいずれか、または両方の領域に位置し得る。
【００９０】
一実施形態では、輸送部分は、いったん輸送部分に連結されると治療用ペプチドが受容体に独立した機序によって、細胞に侵入することを可能にする少なくとも１つの輸送用ペプチドを含むことができる。一例では、輸送用ペプチドは、Ｔａｔ媒介タンパク質送達配列と、配列番号９〜１３および１６の少なくとも１つを含有する合成ペプチドである。これらのペプチドはそれぞれ、配列番号１７〜２２のアミノ酸配列を有し得る。
【００９１】
既知の輸送用の部分、サブドメイン等の他の例は、例えば、カナダ特許第２，３０１，１５７号（アンテナペディアのホメオドメインを含有する複合体）、ならびに米国特許第５，６５２，１２２号、同第５，６７０，６１７号、同第５，６７４，９８０号、同第５，７４７，６４１号、および同第５，８０４，６０４号（Ｔａｔ  ＨＩＶタンパク質のアミノ酸含有複合体；単純性ヘルペスウイルス−１  ＤＮＡ結合タンパク質ＶＰ２２、４〜３０のヒスチジン反復長さの範囲のヒスチジンタグ、または受容体とは独立した方法によって、活性カーゴ部分の取り込みを容易にすることが可能であるその変異誘導体またはホモログ）に記載されている。前述の全ての特許は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００９２】
アンテナペディアのホメオドメインの第３αヘリックスの１６アミノ酸領域は、タンパク質（融合タンパク質として作られた）が細胞膜の通過を可能にすることが示されている（国際公開第９９／１１８０９号およびカナダ特許出願第２，３０１，１５７号）。同様に、ＨＩＶのＴａｔタンパク質も細胞膜を通過することができることが示された。
【００９３】
加えて、輸送部分は、活性薬剤部分（例えば、細胞内ドメイン含有フラグメント阻害物質ペプチド）に共有結合された塩基性アミノ酸リッチ領域を有するポリペプチドを含むことができる。本明細書で使用される場合、用語の「塩基性アミノ酸リッチ領域」は、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン、グルタミン、リシンなどの塩基性アミノ酸の含量が高いタンパク質の領域に関する。「塩基性アミノ酸リッチ領域」は、例えば、１５％以上の塩基性アミノ酸を有し得る。いくつかの事例では、「塩基性アミノ酸リッチ領域」は、１５％未満の塩基性アミノ酸を有し得るが、依然として輸送剤領域として機能する。他の例では、塩基性アミノ酸領域は３０％以上の塩基性アミノ酸を有する。
【００９４】
輸送部分は、プロリンリッチ領域をさらに含み得る。本明細書で使用される場合、用語のプロリンリッチ領域は、その配列に５％以上（１００％までの）プロリンを有するポリペプチドの領域を意味する。いくつかの事例では、プロリンリッチ領域は、５％〜１５％のプロリンを有し得る。さらに、プロリンリッチ領域は、天然タンパク質（例えば、ヒトゲノムによりコードされるタンパク質）で通常観察されるものより多いプロリンを含有するポリペプチドの領域を意味する。本出願のプロリンリッチ領域は輸送剤領域として機能できる。
【００９５】
一実施形態では、本明細書で記載の治療用ペプチドは形質導入剤に非共有結合できる。非共有結合ポリペプチド形質導入剤の例は、Ｃｈａｒｉｏｔタンパク質送達システム（米国特許第６，８４１，５３５号；Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４（３５）：２４９４１−２４９４６；およびＮａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃ．１９：１１７３−１１７６を参照されたい（これらの文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる））である。
【００９６】
他の実施形態では、遺伝子治療を用いて治療される細胞中で治療用ペプチドを発現させて、ＬＡＲファミリーのシグナル伝達を阻害できる。遺伝子治療は、治療用ペプチドをコードするヌクレオチドを含むベクターを使用できる。「ベクター」（遺伝子送達または遺伝子導入「ビークル」とも呼ばれることがある）は、細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む高分子または分子の複合体を意味する。送達されるポリヌクレオチドは遺伝子治療の対象にしているコード配列を含み得る。ベクターには、例えば、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス（Ａｄ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）およびレトロウイルス）、リポソームおよび他の脂質含有複合体、および標的細胞へのポリヌクレオチドの送達を媒介することが可能である他の高分子複合体が挙げられる。
【００９７】
ベクターはまた、遺伝子送達および／または遺伝子発現をさらに調節する、または他の方法で標的細胞に有益な特性を提供する他の成分または官能基を含むことができる。このような他の成分には、例えば、細胞への結合またはターゲティングに影響を与える成分（細胞型または組織に特異的な結合を媒介する成分を含む）、細胞によるベクター核酸の取り込みに影響を与える成分、取り込み後、細胞内でのポリヌクレオチドの局在化に影響を与える成分（例えば、核での局在化を媒介する薬剤）、およびポリヌクレオチドの発現に影響を与える成分が挙げられる。このような成分はまた、ベクターにより送達された核酸を取り込み、発現している細胞を選択し、検出するのに使用できる検出可能なおよび／または選択可能なマーカーなどのマーカーも含み得る。このような成分は、ベクターの固有の特徴として提供することができ（例えば、結合および取り込みを媒介する成分または官能基を有する特定のウイルスベクターの使用）、またはベクターは修飾されてこのような官能基を提供できる。
【００９８】
選択可能なマーカーは、ポジティブ、ネガティブ、または二官能性であり得る。ポジティブ選択マーカーマーカーはマーカーを運ぶ細胞の選択を可能にするが、ネガティブ選択マーカーは、マーカーを運ぶ細胞が選択的に除去されるのを可能にする。二官能性（すなわち、ポジティブ／ネガティブ）のマーカーを含む種々のこのようなマーカー遺伝子が記載されている（例えば、１９９２年５月２９日に公開されたＬｕｐｔｏｎ，Ｓ．の国際公開第９２／０８７９６号、および１９９４年１２月８日に公開されたＬｕｐｔｏｎ，Ｓ．の国際公開第９４／２８１４３号を参照されたい）。このようなマーカー遺伝子は、遺伝子治療の状況で有利であり得る制御の追加の尺度を提供できる。多種多様なこのようなベクターが当該技術で既知であり、一般に利用可能である。
【００９９】
本明細書で使用するためのベクターには、本明細書で記載される治療用ペプチドをコードするヌクレオチドを標的細胞に送達することが可能であるウイルスベクター、脂質系ベクターおよび他の非ウイルスベクターが挙げられる。ベクターは、標的化ベクター、特にニューロンに選択的に結合する標的化ベクターであり得る。本出願で使用するためのベクターには、標的細胞に対して低い毒性を示し、治療上有用な量の治療用ペプチドの細胞特異的な産生を誘導するものが挙げられる。
【０１００】
ウイルスベクターの例は、アデノウイルス（Ａｄ）またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来するものである。ヒトおよび非ヒトのウイルスベクター両方を使用することができ、組換えウイルスベクターはヒトでは複製欠損であり得る。ベクターがアデノウイルスである場合、ベクターは治療用ペプチドをコードする遺伝子に動作可能に連結されたプロモーターを有するポリヌクレオチドを含むことができ、ヒトでは複製欠損である。
【０１０１】
本明細書で使用できる他のウイルスベクターには単純性ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）系のベクターが挙げられる。１つまたは複数の前初期遺伝子（ＩＥ）を欠失させたＨＳＶベクターは、通常、非毒性であり、標的細胞において潜伏に似た状態で生き残り、効率的な標的細胞への形質導入を提供するので有利である。組換えＨＳＶベクターはおよそ３０ｋｂの異種の核酸を組み入れることができる。
【０１０２】
Ｃ型レトロウイルスおよびレンチウイルスなどのレトロウイルスも本出願で使用され得る。例えば、レトロウイルスベクトルは、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）をベースにし得る。例えば、Ｈｕ  ａｎｄ  Ｐａｔｈａｋ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．５２：４９３−５１１，２０００  ａｎｄ  Ｆｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．１７：１−６０，２０００を参照されたい。ＭＬＶ系ベクターは、ウイルス遺伝子の代わりに８ｋｂまでの異種（治療用）のＤＮＡを含有し得る。異種のＤＮＡは組織特異的なプロモーターおよび治療用ペプチドをコードする核酸を含み得る。神経細胞への送達方法では、それは組織特異的な受容体に対するリガンドもコードし得る。
【０１０３】
使用され得る追加のレトロウイルスベクターはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）系ベクターを含む複製欠損のレンチウイルス系ベクターである。例えば、Ｖｉｇｎａ  ａｎｄ  Ｎａｌｄｉｎｉ，Ｊ．Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．５：３０８−３１６，２０００  ａｎｄ  Ｍｉｙｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８１５０−８１５７，１９９８を参照されたい。レンチウイルスベクターは、活発に分裂している細胞および分裂しない細胞の両方に感染させることが可能であるという点で有利である。
【０１０４】
本出願で使用するためのレンチウイルスはヒトおよび非ヒト（ＳＩＶを含む）のレンチウイルスに由来し得る。レンチウイルスベクターの例には、ベクターの感染に必要とされる核酸配列ならびに治療用ペプチドをコードする核酸に動作可能に連結される組織特異的なプロモーターを含む。これら前者はウイルスＬＴＲ、プライマー結合部位、ポリプリン配列、ａｔｔ部位およびカプシド形成部位を含み得る。
【０１０５】
一部の態様では、レンチウイルスベクターを採用できる。レンチウイルスは、異なる種類のＣＮＳニューロンに形質導入するのが可能であることが判明しており（Ａｚｚｏｕｚ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２：１０３０２−１２）、その大きなクローニング能力のためにいくつかの実施形態で使用され得る。
【０１０６】
レンチウイルスベクターは任意のレンチウイルスカプシドにパッケージされ得る。１つの粒子タンパク質を異なるウイルスに由来する別の粒子タンパク質で置き換えることを「シュードタイピング」と呼ぶ。ベクターカプシドは、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）または水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を含む他のウイルスに由来するウイルスエンベロープタンパク質を含有し得る。ＶＳＶのＧタンパク質の使用は高いベクター力価を生じ、ベクターウイルス粒子の高い安定性をもたらす。
【０１０７】
セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）およびシンドビスウイルス（ＳＩＮ）から作製されるものなどのアルファウイルス系ベクターも本出願で使用され得る。アルファウイルスの使用は、Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ，Ｋ．，Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４３：２４７−２５７，２０００  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７４：９８０２−９８０７，２０００に記載されている。
【０１０８】
組換え複製欠損のアルファウイルスベクターは、高レベルの異種（治療用）遺伝子の発現が可能であり、広い範囲の標的細胞に感染することができるので有利である。同族の結合相手を発現している標的細胞への選択的な結合を可能にする機能的な異種のリガンドまたは結合ドメインをそのビリオン表面に表示させることにより、アルファウイルスのレプリコンは特定の細胞型を標的化し得る。アルファウイルスのレプリコンは潜伏を成立させ得るので、標的細胞における長期の異種の核酸の発現を樹立し得る。レプリコンはまた標的細胞中で一時的な異種の核酸の発現も示し得る。
【０１０９】
本出願の方法に適合する多数のウイルスベクターの内で、２つ以上のプロモーターをベクターに導入して、２つ以上の異種の遺伝子がベクターにより発現させるのを可能にすることができる。さらに、ベクターは、標的細胞からの治療用ペプチドの発現を促進するシグナルペプチドまたは他の部分をコードする配列を含むことができる。
【０１１０】
２つのウイルスベクターの系の有利な特性を組み合わせるために、ハイブリッドウイルスベクターを使用して治療用ペプチドをコードする核酸を標的のニューロン、細胞または組織に送達し得る。ハイブリッドベクターの構築の標準的な技法は当業者に周知である。このような技法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．または組換えＤＮＡ技法について考察するいくつかの実験マニュアル中に見出すことができる。ＡＡＶとアデノウイルスＩＴＲの組み合わせを含有するアデノウイルスのカプシド中の二本鎖ＡＡＶゲノムを用いて細胞に形質導入し得る。別の変異では、ＡＡＶベクターが「パワー不足の」、「ヘルパー依存性の」または「高い許容量」のアデノウイルスベクター中に配置され得る。アデノウイルス／ＡＡＶのハイブリッドベクターは、Ｌｉｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：９３１４−９３２４，１９９９で考察されている。レトロウイルス／アデノウイルスのハイブリッドベクターは、Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：１７６−１８６，２０００で考察されている。アデノウイルスの中に含有されるレトロウイルスのゲノムを、標的細胞のゲノムに統合し、安定な遺伝子発現を行い得る。
【０１１１】
治療用ペプチドの発現およびベクターのクローニングを容易にする他のヌクレオチド配列要素がさらに意図されている。例えば、プロモーターの上流のエンハンサーまたはコーディング領域の下流のターミネーターの存在は、例えば、発現を容易にできる。
【０１１２】
別の実施形態では、本明細書で記載される治療用ペプチドをコードするヌクレオチドに組織特異的プロモーターを融合できる。アデノウイルス構築物内でこのような組織特異的なプロモーターを融合することにより、導入遺伝子の発現は特定の組織に限定される。本出願の組換えアデノウイルスの系を用いて、組織特異的なプロモーターにより提供される遺伝子発現の有効性および特異性の程度を決定できる。例えば、血小板由来増殖因子β鎖（ＰＤＧＦ−β）のプロモーターなどのニューロン特異的なプロモーターおよびベクターは当該技術で既知である。
【０１１３】
ウイルスベクター系の方法に加えて、非ウイルス系の方法を用いて治療用ペプチドをコードする核酸を標的細胞に同様に導入し得る。遺伝子送達の非ウイルス性の方法の概説は、Ｎｉｓｈｉｋａｗａ  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１２：８６１−８７０，２００１で提供されている。本出願による非ウイルス性の遺伝子送達法の例は、プラスミドＤＮＡを採用して治療用ペプチドをコードする核酸を標的細胞に導入する。プラスミド系遺伝子送達法は当該技術で一般に知られている。
【０１１４】
合成の遺伝子導入分子を設計してプラスミドＤＮＡとの多分子凝集体を形成できる。これらの凝集体を標的細胞に結合するように設計できる。リポポリアミンおよびカチオン性脂質を含むカチオン性両親媒性物質を用いて受容体とは独立した標的細胞への核酸導入を提供できる。
【０１１５】
加えて、事前に形成されたカチオン性リポソームまたはカチオン性脂質を、プラスミドＤＮＡと混合して細胞−遺伝子導入複合体を生成し得る。カチオン性脂質配合物を含む方法は、Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７２：１２６−１３９，１９９５およびＬａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．２０：２２１−２６６，１９９６で概説されている。遺伝子送達のために、ＤＮＡはまた、両親媒性のカチオン性ペプチドにも結合され得る（Ｆｏｍｉｎａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．２：４５５−４６４，２０００）。
【０１１６】
ウイルス系および非ウイルス系成分の両方を含む方法を本出願に従って使用し得る。例えば、治療用の遺伝子送達のためのエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）系プラスミドについては、Ｃｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ８：１５０８−１５１３，２００１に記載されている。さらに、アデノウイルスに結合させたＤＮＡ／リガンド／ポリカチオン性の付加物を含む方法は、Ｃｕｒｉｅｌ，Ｄ．Ｔ．，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎ．１３：１４１−１６４，１９９４に記載されている。
【０１１７】
さらに、電気穿孔法を用いて標的細胞に遺伝子導入することにより、治療用ペプチドをコードする核酸を標的細胞に導入できる。電気穿孔法は周知であり、プラスミドＤＮＡ用いた細胞の遺伝子導入を容易にするために使用できる。
【０１１８】
必要に応じて、例えば、生理食塩水などの薬学的に許容可能なキャリアを含有する注射可能な製剤の形態で、治療用ペプチドの発現をコードするベクターをインビボで標的細胞に送達できる。本出願に従って、他の医薬キャリア、製剤および調剤を使用することもできる。
【０１１９】
標的細胞が、静止ニューロンまたは休眠ニューロンなどの治療されるニューロンを含む場合、高効果的療法を可能にする程度に治療用ペプチドが発現されるのに十分な量での直接注入によって、ベクターを送達するこができる。ニューロンに直接にまたはその周辺部近傍にベクターを注入することによって、ベクターの遺伝子導入を予想以上に効果的に標的とすることができ、組換えベクターの損失を最小限にすることができる。この種の注入は、特にＣＮＳ損傷の部位での所望の数の細胞の局所的遺伝子導入を可能にし、それにより、遺伝子導入の治療効力を最大化し、ウイルスタンパク質に対する炎症反応の可能性を最少化する。標的細胞にベクターを投与する他の方法を用いることができ、それは採用される特定のベクターに左右されるであろう。
【０１２０】
一時的な発現および安定した長期的な発現を含めて、標的細胞の中で所望の長さの時間、治療用ペプチドを発現させることができる。本出願の一態様では、治療用ペプチドをコードする核酸は、遺伝子導入された細胞の活性および増殖を誘導するのに効果的な一定の時間長さにわたり、治療量で発現される。本出願の別の態様では、治療用ペプチドをコードする核酸は、それを必要としている対象のβアミロイド蓄積および／またはタウ凝集を阻害および／または低減するのに効果的な一定の時間長さにわたり治療量で発現される。
【０１２１】
治療量は、治療される動物またはヒトにおいて、医学的に望ましい結果をもたらすことができる量である。医療技術で周知のように、動物またはヒトのいずれかの対象に対する投与量は、対象の大きさ、体表面積、年齢、投与される特定の組成物、性別、投与の時間および経路、総体的な健康、および同時に投与される他の薬物を含む多くの因子に依存する。タンパク質および核酸の特定の投与量は、以下に記載される実験方法を用いて当業者が容易に決定できる。
【０１２２】
本明細書で記載される治療薬はさらに修飾され得る（例えば、化学的に修飾される）。このような修飾は、分子の取り扱いまたは精製を容易にする、分子の溶解度を高める、投与を容易にする、所望の位置を標的とする、半減期を増減するように設計し得る。多くのこのような修飾が当該技術で既知であり、技量のある開業医により適用できる。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、本明細書で記載される治療薬および治療薬を含む医薬組成物が、ＣＮＳおよび／またはＰＮＳのニューロンに送達され得る。このようなニューロンは、損傷されたニューロン、または罹患したニューロンであり得る。あるいは、このようなニューロンは健常で、損傷されていないニューロンであり得る。このようなニューロンは損傷の部位または損傷に付随する部位に位置し得る。本明細書で記載される薬剤および組成物の治療投与、送達／接触の標的とされるニューロンは、ニューロンの伸長が対象にとって有益であると分かると考えられるニューロンである。このような決定は、わずかな日常的実験を通して行われ、技量のある開業医の能力の範囲内である。
【０１２４】
本明細書で記載される治療薬および治療用の医薬組成物はまた、ＣＮＳおよび／またはＰＮＳの、例えば、神経細胞を支持する非ニューロン細胞などの非ニューロン細胞にも送達され得る。このような細胞には、限定されないが、グリア細胞（例えば、ＣＮＳでは、星状細胞、オリゴ樹状細胞、上衣細胞、放射状グリア、およびＰＮＳでは、シュワン細胞、サテライトグリア細胞、腸管グリア細胞）が挙げられる。
【０１２５】
一実施形態では、投与は対象の神経系の範囲内で１つまたは複数の特定の位置に特異的である。好ましい投与方法は選択される特定の薬剤および特定の標的に応じて変化し得る。
【０１２６】
治療薬が対象に送達される場合、例えば、経口で（例えば、カプセル、懸濁剤または錠剤で）、全身性に、または非経口での投与を含む任意の好適な経路により投与できる。非経口投与には、例えば、筋肉内、静脈内、関節内、動脈内、くも膜下腔内、皮下または腹腔内の投与を挙げ得る。薬剤はまた、経口で、経皮で、局所に、吸入によって、（例えば、気管支内、鼻腔内、経口吸入、または点鼻剤）、または直腸内に投与することもできる。投与は適応があれば、局所性または全身性とすることができる。
【０１２７】
局所投与および全身性投与の両方が本明細書で意図されている。局所投与の望ましい特徴には、治療薬の有効な局所濃度を達成すること、ならびに治療薬の全身性投与に由来する有害な副作用を回避することが挙げられる。一実施形態では、対象の脳脊髄液への導入により治療薬を投与できる。特定の態様では、治療薬は、脳室、腰部または大槽に導入できる。別の態様では、治療薬は、神経または脊髄の損傷の部位に、疼痛または神経変性の部位に、または神経網膜細胞に接触する眼内に導入できる。
【０１２８】
薬学的に許容可能な製剤を水性ビークルに懸濁し、従来の皮下注射針を介してまたは注入ポンプを用いて導入できる。
【０１２９】
別の実施形態では、対象のくも膜下腔内に治療薬を投与できる。本明細書で使用される場合、用語の「くも膜下腔内投与」は、穿頭孔または大槽または腰椎穿刺を介した側脳室への注入などを含む技法により、対象の脳脊髄液に直接治療薬を送達することを含むように意図される（Ｌａｚｏｒｔｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，ａｎｄ  Ｏｍｍａｙａ，１９８４に記載されている；この文献の内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。用語の「腰部」は、第３腰椎から第４腰椎（腰部）の間の領域を含むように意図される。用語の「大槽」は、後頭部で、頭蓋骨が終わり、脊髄が開始する領域を含むように意図される。用語の「脳室」は脊髄中心管に続く脳中の空洞を含むように意図される。上述の部位のいずれかへの治療薬の投与は、治療薬の直接注入または注入ポンプの使用により達成できる。埋め込み可能なまたは外部のポンプおよびカテーテルが使用され得る。
【０１３０】
注射用として、治療薬は、液体溶液、通常、例えば、ハンクス液またはリンゲル液などの生理的に適合性の緩衝液中で処方できる。加えて、治療薬は固形形態で処方され、使用の直前に再溶解または懸濁され得る。凍結乾燥された形態も含まれる。注入は、例えば、治療薬のボーラス注入の形態または連続点滴（例えば、注入ポンプを用いて）の形態であり得る。
【０１３１】
一実施形態では、対象の脳への側脳室注入により治療薬を投与できる。注入は、例えば、対象の頭蓋骨に作られた頭蓋穿孔を介して行うことができる。別の実施形態では、治療薬は、対象の脳室に外科的に挿入されたシャントを介して投与できる。例えば、第３および第４のより小さい脳室への注入も行うことができるとしても、注入はさらに大きな側脳室に対して行うことができる。さらに別の実施形態では、治療薬は、対象の大槽または腰部への注入により投与できる。
【０１３２】
頭蓋内組織への投与の追加の手段には、嗅上皮への適用と、その後の嗅球への伝播および脳のさらに近傍部分への輸送が含まれる。このような投与は、噴霧化またはエアロゾル化製剤により実施し得る。
【０１３３】
別の実施形態では、対象の損傷部位に、または対象の全身に治療薬を投与できる。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、治療薬を対象に長期間投与できる。例えば、１週間、数週間、１ヵ月以上などの期間にわたる活性化合物の反復投与により、活性化合物との持続的接触を達成できる。治療薬の投与に使用される薬学的に許容可能な製剤を処方して、活性化合物の対象への持続送達を提供することもできる。例えば、対象への最初の投与に続いて、少なくとも１、２、３または４週間（包括的）にわたり製剤は活性化合物を送達し得る。例えば、本発明に従って治療される対象は、少なくとも３０日間活性化合物により治療される（反復投与または持続送達系の使用のいずれかまたは両方によって）。
【０１３５】
治療薬の持続送達は、例えば、長時間にわたる治療薬の連続治療効果によって、実証することができる。あるいは、治療薬の持続送達は、長時間にわたってインビボでの治療薬の存在を検出することによって、実証され得る。
【０１３６】
持続送達への手法には、高分子カプセル、製剤を送達するためのミニポンプ、生分解性インプラントまたは移植遺伝子導入自己細胞の使用が挙げられる（米国特許第６，２１４，６２２号を参照されたい）。埋め込み可能な注入ポンプシステム（例えば、ＩＮＦＵＳＡＩＤポンプ（Ｔｏｗａｎｄａ，ＰＡ）；Ｚｉｅｒｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８；Ｋａｎｏｆｆ，１９９４を参照されたい）および浸透圧ポンプ（Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより販売）が市販されており、また、他の方法は、当該技術で既知である。別の投与方法は、埋め込み可能で外部からプログラム可能な注入ポンプを経由するものである。注入ポンプシステムおよびリザーバシステムはまた、例えば、米国特許第５，３６８，５６２号および同第４，７３１，０５８号にも記載されている。
【０１３７】
治療用ペプチドをコードするベクターは、多くの場合、他の型の治療薬に比べてあまり頻繁に投与されない。例えば、このようなベクターの有効量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５または１０ｍｇ／ｋｇ（包括的）の範囲であり、毎日、毎週、二週に１回、毎月またはさらに少ない頻度で投与される。
【０１３８】
治療用ペプチドを送達するまたは発現させる能力は、多数の異なる細胞型での細胞の活性調節を可能にする。治療用ペプチドは、例えば、アルツハイマー病などの変性疾患に冒された神経細胞または脳領域で発現させることができる。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、治療薬を使用して、それを必要としている対象のβアミロイド蓄積および／またはタウ凝集に関連する疾患、障害、または状態を治療することができる。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、疾患、障害および／または状態には、神経系の疾患、障害および／または状態の少なくとも１つが含まれる。
【０１４１】
他の実施形態では、神経系の疾患、障害および／または状態には、神経障害、神経精神障害、神経損傷、神経毒性障害、神経障害性疼痛、および神経変性障害の少なくとも１つが含まれる。
【０１４２】
例えば、神経障害には、アルツハイマー病またはアルツハイマー病関連認知症の内の少なくとも１つを含み得る。
【０１４３】
他の実施形態では、本明細書で記載の治療薬は、抗アルツハイマー病薬と組み合わせて投与できる。本明細書で用いられる用語の「抗アルツハイマー病薬」または「抗アルツハイマー薬」は、限定されないが、アルツハイマー病およびその他の認知症の治療に使用できる、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体（ＮＭＤＡ）受容体アンタゴニスト、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、アセチルコリン合成モジュレーター、アセチルコリン貯蔵モジュレーター、アセチルコリン放出モジュレーター、Ａβ阻害剤、Ａβプラーク除去剤、Ａβプラーク形成阻害剤、アミロイド前駆体タンパク質プロセッシング酵素阻害剤、βアミロイド変換酵素阻害剤、β−分泌酵素阻害剤、γ−分泌酵素モジュレーター、神経成長因子アゴニスト、ホルモン受容体遮断薬、神経伝達モジュレーター、およびこれらの組み合わせ、などの化合物を意味する。一実施形態では、抗アルツハイマー病薬は、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストである。一実施形態では、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストには、限定されないが、メマンチン、アマンタジン、ネラメキサン（１，３，３，５，５−ペンタメチルシクロヘキサン−１−アミン）、ケタミン、リマンチジン、エリプロディル、イフェンプロジル、ジゾシルピン、レマセミド、リルゾール、アプチガネル、フェンシクリジン、フルピルチン、セルフォテル、フェルバメート、スペルミン、スペルミジン、レベモパミル、および／またはこれらの組み合わせが挙げられる。別の実施形態では、本発明で用いられるＮＭＤＡ受容体アンタゴニストは、抗アルツハイマー薬である。一実施形態では、抗アルツハイマー病薬は、コリンエステラーゼ阻害剤である。一実施形態では、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤には、限定されないが、ドネペジル、タクリン、リバスチグミン、ガランタミン、フィゾスチグミン、ネオスチグミン、フペルジンＡ、イコペジル（ＣＰ−１１８９５４、５，７−ジヒドロ−３−［２−［１−（フェニルメチル）−４−ピペリジニル］エチル］−６Ｈ−ピロロ−［４，５−ｆ−］−１，２−ベンゾイソオキサゾール−６−オン  マレエート）、ＥＲ−１２７５２８（４−［（５，６−ジメトキシ−２−フルオロ−１−インダノン）−２−イル］メチル−１−（３−フルオロベンジル）ピペリジン塩酸塩）、ザナペジル（ＴＡＫ−１４７；３−［１−（フェニルメチル）ピペリジン−４−イル］−１−（２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−１−ベンゾアゼピン−８−イル）−１−プロパン  フマレート）、メトリホネート（Ｔ−５８８；−）（−Ｒ−α−［［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］メチル］ベンゾ［ｂ］チオフェン−５−メタノール  塩酸塩）、ＦＫ−９６０（Ｎ−（４−アセチル−１−ピペラジニル）−ｐ−フルオロベンズアミド−水和物）、ＴＣＨ−３４６（Ｎ−メチル−Ｎ−２−ピロピニルジベンゾ［ｂ，ｆ］オキセピン−１０−メタンアミン）、ＳＤＺ−２２０−５８１（（Ｓ）−α−アミノ−５−（ホスホノメチル）−［１，１’−ビフェニル］−３−プロピオン酸）、およびこれらの組み合わせが挙げられる。
【０１４４】
別の実施形態では、抗アルツハイマー病薬は、Ａβ阻害剤、Ａβプラーク除去剤、Ａβプラーク形成阻害剤、アミロイド前駆体タンパク質プロセッシング酵素阻害剤、βアミロイド変換酵素阻害剤、β−分泌酵素阻害剤、γ−分泌酵素モジュレーターである。
【０１４５】
別の実施形態では、Ａβ阻害剤には、限定されないが、タレンフルルビル、トラミプロサート、クリオキノール、ＰＢＴ−２およびその他の８−ヒドロキシキノリン誘導体、Ａβプラーク除去剤、Ａβプラーク形成阻害剤、アミロイド前駆体タンパク質プロセッシング酵素阻害剤、βアミロイド変換酵素阻害剤、β−分泌酵素阻害剤、α−分泌酵素モジュレーター（ＬＹ４５０１３９；Ｎ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェナセチル）−Ｌ−アラニル）−Ｓ−フェニルグリシン  ｔ−ブチルエステル）、およびこれらの組み合わせが挙げられる。
【０１４６】
別の実施形態では、抗アルツハイマー病薬は、神経成長因子アゴニストである。神経成長因子アゴニストは、限定されないが、キサリプロデンまたは脳由来神経栄養因子または神経成長因子である。
【０１４７】
別の実施形態では、抗アルツハイマー病薬は、ホルモン受容体遮断薬である。ホルモン受容体遮断薬剤は、限定されないが、ロイプロリドまたはその誘導体である。
【０１４８】
別の実施形態では、抗アルツハイマー病薬は、神経伝達モジュレーターである。神経伝達モジュレーターは、限定されないが、イスプロニクリンである。
【０１４９】
以下の実施例により、本発明をさらに例示する。この実施例は、特許請求の範囲を限定することを意図するものではない。
【０１５０】
実施例１
ホスファターゼの白血球共通抗原関連（ＬＡＲ）ファミリーは３つのメンバー：ＬＡＲ自体、受容体タンパク質チロシンホスファターゼシグマ（ＲＰＴＰσ）および受容体タンパク質チロシンホスファターゼデルタ（ＲＰＴＰδ）からなる。構造解析および配列解析により、ＬＡＲファミリーの全てのメンバーが、同種／異種親和性の受容体相互作用を媒介する第１の細胞内触媒ドメイン中にくさび形のヘリックス・ループ・ヘリックスモチーフを含有することが明らかになった。細胞質に局在するＴＡＴ配列にタグとして付けられたこのくさび形ドメインのペプチド模倣体を用いて、ニューロトロフィンシグナル伝達のパラダイムにおけるＬＡＲ活性を上手く消滅させた。我々は、ＮＩＨのＢＬＡＳＴを利用して、ＲＰＴＰσおよびＲＰＴＰδのオーソロガス配列を特定し、各標的に対するくさび形ドメインのペプチドを設計した。ペプチドは、新造語による名称の細胞内ＬＡＲ遮断ペプチド（ＩＬＰ）、細胞内シグマ遮断ペプチド（ＩＳＰ）および細胞内デルタ遮断ペプチド（ＩＤＰ）であった。興味深いことに、このドメインが高等脊椎動物で高度に保存されており、これは、機能的に重要な領域であることを示している。ペプチドはタグとしてＨＩＶ−ＴＡＴに結合されて、次の機能遮断ペプチドを生成する：
【化１】
2020524132.tif 000005
【０１５１】
実施例２
この実施例は、神経受容体ＰＴＰσ（タンパク質チロシンホスファターゼシグマ）がβアミロイド（Ａβ）病変形成およびタウの凝集を抑制することを示す。ＰＴＰσの遺伝子欠乏は、β−分泌酵素のＡＰＰに対する親和性を低下させ、β−およびγ−分泌酵素活性を包括的には阻害しない特異的な方法でＡβ蓄積を抑制する。ＰＴＰσの遺伝子欠乏はタウの凝集も阻害する。
【０１５２】
本明細書で記載の２つのマウスモデルで、一連のＡＤ神経病理学および行動欠陥は、全て、明確なＰＴＰσ依存性を実証し、このニューロン受容体がＡＤ病変形成における上流の重要な主因であることを示す。
【０１５３】
データは、ＰＴＰσの標的化は、このような主要な遺伝的駆動力に打ち勝って、ＡＤ進行を抑制することができる可能性を有する治療手法であることを示唆する。この標的化戦略の利点は、β−およびγ−分泌酵素の他の主要な基質に広く影響を与えることなくＡβ蓄積を抑制し、それにより、分泌酵素を総括的に阻害する臨床試験中のものに比べて、より有望な技術移転の可能性が予測される。
【０１５４】
材料および方法
マウス株：
マウスは、実験動物委員会により承認された標準条件下で維持された。Ｂａｌｂ／ｃ背景の野生型およびＰＴＰσ欠損マウスは、Ｍｉｃｈｅｌ  Ｌ．Ｔｒｅｍｂｌａｙ博士から提供された。ホモ接合のＴｇＡＰＰ−ＳｗＤＩマウス、Ｃ５７ＢＬ／６−Ｔｇ（Ｔｈｙ１−ＡＰＰＳｗＤｕｔＩｏｗａ）ＢＷｅｖｎ／Ｍｍｊａｘ、ストック番号００７０２７、をＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した。これらのマウスは、Ｓｗｅｄｉｓｈ、ＤｕｔｃｈおよびＩｏｗａ変異を含むヒトＡＰＰ導入遺伝子を発現し、ＰＴＰσ遺伝子とヘテロ接合のＢａｌｂ／ｃマウスと交配させて、ＴｇＡＰＰ−ＳｗＤＩおよびＰＴＰσ遺伝子の両方にヘテロ接合のバイジェニックマウスを生成した。このマウスは、５０％のＣ５７ＢＬ／６Ｊおよび５０％のＢａｌｂ／ｃ遺伝的背景のハイブリッドである。これらのマウスをＰＴＰσ遺伝子に対しヘテロ接合のＢａｌｂ／ｃマウスとさらに交配した。この交配由来の出生児を実験で使用し、これには、次の遺伝子型の同腹仔を含む：ＴｇＡＰＰ−ＳｗＤＩ（＋／−）ＰＴＰσ（＋／＋）：野生型ＰＴＰσを有するＴｇＡＰＰ−ＳｗＤＩ導入遺伝子に対しヘテロ接合のマウス；ＴｇＡＰＰ−ＳｗＤＩ（＋／−）ＰＴＰσ（−／−）：ＰＴＰσ遺伝子欠乏のＴｇＡＰＰ−ＳｗＤＩ導入遺伝子に対しヘテロ接合のマウス；ＴｇＡＰＰ−ＳｗＤＩ（−／−）ＰＴＰσ（＋／＋）：野生型ＰＴＰσを有し、ＴｇＡＰＰ−ＳｗＤＩ導入遺伝子不含のマウス。ＴｇＡＰＰ−ＳｗＤＩ（−／−）ＰＴＰσ（＋／＋）およびＢａｌｂ／ｃ  ＰＴＰσ（＋／＋）の両マウスは、野生型マウスであるが、異なる遺伝的背景を有する。ヘテロ接合のＴｇＡＰＰ−ＳｗＩｎｄ（Ｊ２０）マウス、６．Ｃｇ−Ｔｇ（ＰＤＧＦＢ−ＡＰＰＳｗＩｎｄ）２０Ｌｍｓ／２ＭｍｊａｘをＬｅｎｎａｒｔ  Ｍｕｃｋｅ博士から提供された。これらのマウスは、ＳｗｅｄｉｓｈおよびＩｎｄｉａｎａ変異を含むヒトＡＰＰ導入遺伝子を発現し、上記と同じ戦略で交配させて、ＴｇＡＰＰ−ＳｗＩｎｄ（＋／−）ＰＴＰσ（＋／＋）およびＴｇＡＰＰ−ＳｗＩｎｄ（＋／−）ＰＴＰσ（−／−）の遺伝子型を有するマウスを得た。
【０１５５】
免疫組織化学的検査
成体ラットおよびマウスを新しく作製した低温のリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の４％パラホルムアルデヒドで心臓内潅流した。脳を収集し、４℃で２日間、後固定した。１０μｍ厚さのパラフィン包埋切片を免疫染色法用に収集した。切片を脱パラフィンし、順次再水和した。抗原回収をトリス−ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ９．０）中、１００℃で５０分間実施した。その後、切片を蒸留水およびＰＢＳで洗浄し、ブロッキング緩衝液（５％正常ロバ血清、５％正常ヤギ血清、および０．２％トリトンＸ−１００含有ＰＢＳ）中、室温で１時間インキュベートした。一次抗体インキュベーションを加湿チャンバー中、４℃で一晩実施した。０．２％トリトンＸ−１００含有ＰＢＳで３回の洗浄後、切片を二次および三次抗体混合物と共に、室温で２時間インキュベートした。ブロッキング緩衝液を用いて、全抗体を製造者による推奨濃度に希釈した。マウス一次抗体は、ロバ抗ヤギＡｌｅｘａ４８８抗体と一緒に、ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ４８８で検出し；ウサギ一次抗体はニワトリ抗ウサギＣＦ５６８およびロバ抗ニワトリＣｙ３抗体で検出し；ニワトリ抗体は、ロバ抗ニワトリＣｙ３抗体で検出した。二次および三次抗体のみ（一次抗体なし）で染色した切片を陰性対照として使用した。最後に、ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、３００ｎＭ）を核染色のために切片に適用した。取り付ける前に、切片をＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）で５回洗浄した。
【０１５６】
広視野および共焦点画像を、それぞれ、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏ  Ｉｍａｇｅｒ  Ｍ２およびＬＳＭ７８０を用いて取得した。Ｚｅｎ２ＰｒｏソフトウェアおよびＩｍａｇｅＪを用いて画像を定量化する。
【０１５７】
タンパク質抽出、免疫沈殿、およびウェスタンブロット分析
ＡＰＰおよびＰＴＰσの共免疫沈降のために、ＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％ＮＰ４０、０．１％ＳＤＳ、０．５％デオキシコール酸ナトリウム）を用いた。ＡＰＰおよびＢＡＣＥ１の共免疫沈降のために、０．１％、０．３％、および０．４％の濃度におけるＳＤＳを含む場合と含まない場合のＮＰ４０緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％ＮＰ４０）を用いた。ＣＴＦβの総タンパク質抽出および免疫精製のために、ＲＩＰＡ緩衝液中のＳＤＳの濃度を１％に調節し、脂質ラフトからのタンパク質抽出を確実にした。マウスまたはラット前脳を、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）含有ホモジナイゼーション緩衝液（上述）中、氷上で完全にホモジナイズした。それぞれ半分の前脳に対し、マウスに対しては少なくとも５ｍｌの緩衝液体積およびラットに対しては８ｍｌを使用して、十分な洗浄剤／組織比率を確保した。ホモジネートを４℃の緩やかな混合および１時間インキュベートを行い、氷上で超音波ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃモデル１２０、５０％パルス出力、１秒オン２秒オフ）で２分間超音波処理し、続けて、さらに１時間、４℃で緩やかに混合した。全て、凍結および解凍を行わない、新しい試料を用いた。
【０１５８】
次に、共免疫沈降および免疫精製のために、ホモジネートを８５，０００ｘｇ、４℃で１時間、遠心分離し、上清を収集した。ＢＣＡプロテインアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、タンパク質濃度を測定した。０．５ｍｇの総タンパク質の脳ホモジネートを、５μｇの指定抗体および３０μｌのタンパク質−Ａセファロースビーズ（５０％スラリー、Ｒｏｃｈｅ）を加えて、ＲＩＰＡ緩衝液で総体積を１ｍｌに調節して、これらと共にインキュベートした。試料を４℃で緩やかに一晩混合した。その後、ビーズを低温の免疫沈殿緩衝液で５回洗浄した。その後、試料を１００ｍＭのＤＴＴ含有レムリ緩衝液中、７５℃で２０分間インキュベートし、ウェスタンブロット分析に供した。
【０１５９】
タンパク質発現レベルの分析のために、ホモジネートを２３，０００ｘｇ、４℃で３０分間、遠心分離し、上清を収集した。ＢＣＡプロテインアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、タンパク質濃度を測定した。３０μｇの総タンパク質をウェスタンブロット分析に供した。
【０１６０】
ＭＯＰＳまたはＭＥＳ緩衝液およびＮｏｖｅｘ  Ｓｈａｒｐ  Ｐｒｅ−ｓｔａｉｎｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄを含む、４〜１２％ビス−トリスＢｏｌｔ  Ｐｌｕｓゲルを用いて、タンパク質試料の電気泳動を実施した（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手）。タンパク質をニトロセルロース膜（０．２μｍ細孔径、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に転写し、製造者により提案された濃度の選択抗体（上表参照）でブロットした。一次抗体をＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋ  ＴＢＳブロッキング緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に希釈し、ニトロセルロース膜と共に４℃で一晩インキュベートし；二次抗体を５％脱脂乳および０．２％ツイーン２０含有ＰＢＳで希釈し、室温で２時間インキュベートした。一次抗体と二次抗体の間で、およびＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、化学発光検出の前に膜を０．２％ツイーン２０含有ＰＢＳで４回洗浄した。
【０１６１】
ウェスタンブロットのバンド強度をデンシトメトリーで定量化した。
【０１６２】
ＡβのＥＬＩＳＡアッセイ
プロテアーゼ阻害剤反応混液（Ｒｏｃｈｅ）含有組織ホモジナイゼーション緩衝液（２ｍＭトリスｐＨ７．４、２５０ｍＭスクロース、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ  ＥＧＴＡ）中で、マウス前脳を完全にホモジナイズし、続けて、１３５，０００ｘｇ（ＳＷ５０．１ローターで３３，５００ＲＰＭ）下、４℃で１時間、遠心分離した。ペレット状態のタンパク質をギ酸（ＦＡ）で抽出し、１０９，０００ｘｇ（ＳＷ５０．１ローターで３０，１００ＲＰＭ）下、４℃で１時間、遠心分離した。上清を収集し、中和緩衝液（１Ｍトリス塩基、０．５Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４、０．０５％ＮａＮ３）で１：２０に希釈し、その後、ＥＬＩＳＡ緩衝液（０．０５％ツイーン２０、１％ＢＳＡ、および１ｍＭ  ＡＥＢＳＦ含有ＰＢＳ）で１：３に希釈した。希釈試料を６Ｅ１０抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）でプレコートしたＥＬＩＳＡプレートにロードし、Ａβペプチドを捕捉した。合成ヒトＡβ１−４０または１−４２（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ）の段階希釈試料をロードし、検量線を決定した。Ａβ１−４０または１−４２に対して、ＨＲＰ標識抗体を用いてＡβを検出した（上表を参照）。ＥＬＩＳＡを、ＴＭＢ基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて発色させ、１ＮのＨＣｌで反応を停止した。プレートを４５０ｎｍで読み取り、検量線を用いて試料中のＡβ濃度を決定した。
【０１６３】
行動アッセイ
Ｙ−迷路アッセイ
マウスをＹ−迷路の中心に置き、各アームを通って自由に移動させた。マウスの探索活動を５分間記録した。アーム進入は、４本全ての肢がアーム内にあるときとして定義される。各マウスに対し、トライアドの数を「自発的交替行動」として数え、その後、これを総アーム進入数で除算して、パーセンテージスコアを得る。新奇物体試験：１日目：マウスを、黒色化壁を備えた空のケージ（４５ｃｍ  ｘ  ２４ｃｍ  ｘ  ２２ｃｍ）に曝露し、活動領域への探索および馴化を行わせた。２日目〜４日目：マウスを同じケージに戻し、２つの同じ物体を等距離の位置に置いた。毎日、マウスを１日のほぼ同じ時間にケージに戻し、１０分間探索させた。それぞれの動物の間で、ケージと物体を７０％のエタノールで清浄化した。その後、４日目の習熟期間の２時間後、マウスを同じケージに戻し、馴染物体の１つ（無作為に選択）を新奇物体と共に置き、５分間探索させた。Ｏｂｓｅｒｖｅｒソフトウェア（Ｎｏｌｄｕｓ）を用いてどちらかの物体の探索のための持続時間および進入回数に関しマウスをスコア化した。物体探索を、物体に向かって、積極的に物体を嗅ぐ動作または物体に触ることとして定義し、よじのぼる行動はスコア化しなかった。新奇物体への関心を反映した識別指数は、新奇物体探索の総物体探索に対する比率（ＮＯ／ＮＯ＋ＦＯ）、または新奇物体探索の馴染物体探索に対する比率（ＮＯ／ＦＯ）として表記される。全ての試験およびデータ解析を二重盲検方式で行った。
【０１６４】
２つの群の比較には、両側スチューデントのｔ検定を用いた。２つの変数の間の関係（図３に示すような、ＳＤＳ濃度とＡＰＰ−ＢＡＣＥ１結合）は、線形回帰を用いて解析した。全てのエラーバーは、平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を示す。
【０１６５】
ＰＴＰσは、脳中ではＡＰＰの結合相手である
細胞外のプロテオグリカンのニューロン受容体として既に特定されている、ＰＴＰσは、成体神経系全体にわたり発現されるが、大多数は、ＡＤで最も早期に罹患する能の領域の１つである海馬中で発現される。免疫組織化学的検査および共焦点画像化を用いて、我々はＰＴＰσおよびＡＰＰ（Ａβの前駆物質）が、成体ラット脳の海馬錐体ニューロン中の、尖端樹状突起の初節中、ならびに核周辺領域および軸索領域中で最も集中的に、点状物パターンで共存していることを見出した（図１Ａ〜Ｆ）。この共存がこれらの２つの分子間の結合相互作用を反映しているかどうかを評価するために、我々は、脳ホモジネートからのそれらの共免疫沈降を試験した。異なる遺伝的背景を有するラットおよびマウスの脳では、ＡＰＰおよびＰＴＰσの種々の抗体を用いて、我々は、常に、ＡＰＰと共免疫沈降する一部のＰＴＰσを検出し、これらの２つの膜貫通タンパク質間の分子複合体の証拠を得た（図１Ｈ、Ｉ）。
【０１６６】
ＰＴＰσの遺伝子欠乏は、ＡＰＰのβアミロイド形成性産物を低減する
ＰＴＰσとＡＰＰとの間の分子相互作用は、我々に、ＰＴＰσがＡＰＰのアミロイド形成プロセッシングにおいて何らかの役割を果たしているのかどうかを調査するように促す。ニューロンでは、ＡＰＰは主に、α−またはβ−分泌酵素による代替切断によりプロセッシングされる。これらの分泌酵素は、ＡＰＰのＮ末端部をその膜係留Ｃ末端フラグメント（それぞれ、ＣＴＦαまたはＣＴＦβ）から放出し、これは、γ−分泌酵素によりさらにプロセッシングされ得る。β−およびγ−分泌酵素によるＡＰＰの逐次切断は、それがＡβペプチドを生成するので、アミロイド形成プロセッシングと見なされる。過剰産生されると、Ａβペプチドは、細胞傷害性カスケードの分岐の引き金を引く可溶性オリゴマーを形成でき、一方、Ａβの進行性凝集は、最終的にＡＤ患者の脳中に老人斑を形成する（図２ａ）。このアミロイド形成プロセッシングにおけるＰＴＰσの効果を試験するために、我々は、ＰＴＰσ含有または非含有マウス脳におけるＡＰＰ  β−およびγ切断産物のレベルを分析した。
【０１６７】
マウス脳由来のタンパク質抽出物のウェスタンブロット分析は、ＰＴＰσの遺伝子欠乏は、完全長ＡＰＰの発現レベルに影響を与えないことを示した（２Ｂ）。しかし、Ｃ末端のＡＰＰに対する抗体は、ＣＴＦβに一致する分子量の位置にバンドを検出し、これは、それらの同年、同性の野生型同腹仔に比べて、ＰＴＰσ欠損マウスでは低下する（図２Ｂ）。さらに、アミロイド形成変異を有する２匹のヒトＡＰＰ遺伝子を発現しているＡＤマウスモデルでは、我々は、ＰＴＰσ欠乏の場合に、同様のＡＰＰ  ＣＴＦの低減を認めた（図２Ｂ）。β−切断部位近くにＳｗｅｄｉｓｈ変異を含むＡＰＰ導入遺伝子をそれぞれ発現しているＴｇＡＰＰ−ＳｗＤＩおよびＴｇＡＰＰ−ＳｗＩｎｄマウスを、ＰＴＰσ株と交雑させて、それらのそれぞれのＡＰＰ導入遺伝子に対しヘテロ接合である、ＰＴＰσ含有または非含有の出生児を生成した。これらのＡＰＰ導入遺伝子により保持されるＳｗｅｄｉｓｈ変異は、β−切断の傾向があるため、これらの遺伝子導入マウスのＡＰＰ  ＣＴＦの優勢型は、ＣＴＦβであると予測される。従って、ＰＴＰσ欠損ＡＰＰ遺伝子導入マウスにおけるＡＰＰ  ＣＴＦの減少は、ＣＴＦβレベルに対するＰＴＰσの調節の役割を示す可能性がある。しかし、これらの実験で使用されたＡＰＰ  Ｃ末端抗体は、ＣＴＦσおよびＣＴＦβの両方、ならびにこれらのＣＴＦのリン酸化種（ウェスタンブロットのより長期曝露は、複数のＣＴＦバンドを示した）を認識できるので、低減したＣＴＦの素性をその分子量で単純に判断するのは、不適切であるかもしれない。従って、我々は、ＣＴＦβを認識するがＣＴＦαを認識しない抗体を用いて、ＣＴＦβ免疫精製とそれに続くウェスタンブロット検出を行った（図２Ｃ、Ｄ）。この絶対的標準法を用いて、我々は、ＰＴＰσ欠乏が、マウス内在性およびヒト遺伝子導入ＡＰＰの両起源のＣＴＦβのレベルを低減することを確認した。
【０１６８】
ＣＴＦβは、β−切断とγ−切断との間の中間タンパク分解性産物であるので、その低い定常状態レベルは、β−切断による低減した産生またはそれに続くγ−分泌酵素切断による増大した分解から生じ得る（図２Ａ）。これらの２つの可能性を区別するために、我々は、γ−切断によるＣＴＦβ分解の下流生成物であるＡβペプチドのレベルを測定した。ＴｇＡＰＰ−ＳｗＤＩマウス由来の脳ホモジネートのＥＬＩＳＡアッセイを用いて、我々は、ＰＴＰσ欠乏が、ＡβペプチドのレベルをＣＴＦβのレベルと類似の程度まで低減することを見出した（図２Ｅ、Ｆ）。遺伝子導入マウスの加齢の間に、常に、Ａβペプチドがプラークに徐々に凝集するので、我々は、野生型ＰＴＰσを発現している同年のＡＰＰ遺伝子導入同腹仔に比べて、ＰＴＰσ欠損マウスにおける脳Ａβ沈着の実質的低減を認めた（図２Ｇ、Ｈ）。従って、β−およびγ−切断産物の同時低減は、増大したγ−分泌酵素活性とは反対の主張をするが、その代わりに、ＡＰＰの低減したβ−分泌酵素切断を示唆し、これは、ＣＴＦβのレベルを抑制するのみでなく、下流のＰＴＰσ欠損脳中のＡβ産生も抑制する。
【０１６９】
ＰＴＰσの非存在下におるβアミロイドーシスの進行の抑制
進行性脳Ａβ凝集（βアミロイドーシス）は、ＡＤ進行の指標と見なされる。ＰＴＰσのこの病理学的発生に対する効果を調査するために、我々は、９月齢（中年）および１６月齢（老年）ＴｇＡＰＰ−ＳｗＤＩマウスの脳中のＡβ沈着物を監視した。９〜１１月齢では、Ａβ沈着物は、主に海馬中、特に歯状回（ＤＧ）の門部中で認められる（図２Ｇ、Ｈ）。１６月齢までに、病状は全体脳を通して広範囲に広がる。しかし、Ａβ沈着の伝播は、代表的領域としてＤＧ門部を用いて定量化されたように、ＰＴＰσの遺伝子欠乏により抑制される（図２Ｉ）。９〜１６月齢の間では、Ａβ量は、野生型ＰＴＰσ［ＡＰＰ−ＳｗＤＩ（＋）ＰＴＰσ（＋／＋）］を発現しているＴｇＡＰＰ−ＳｗＤＩマウスの２倍を超えるが、機能的ＰＴＰσ［ＡＰＰ−ＳｗＤＩ（＋）ＰＴＰσ（−／−）］を欠く遺伝子導入マウスでは、ほんの僅かな増大を示すだけである。一方、９月齢のＡＰＰ−ＳｗＤＩ（＋）ＰＴＰσ（＋／＋）マウスで測定されたＡβ量は、１６月齢ＡＰＰ−ＳｗＤＩ（＋）ＰＴＰσ（−／−）マウスと類似であり（ｐ＝０．９５）、ＰＴＰσ欠乏による疾患進行の抑制を示す（図２Ｉ）。
【０１７０】
ＰＴＰσ欠損脳におけるＢＡＣＥ１−ＡＰＰ親和性の低減
ＡＰＰ  β−切断でＰＴＰσの役割の促進を示唆するこれらの観察と一致して、我々のデータは、ＰＴＰσ欠乏が脳中でＡＰＰとＢＡＣＥ１、β−分泌酵素との相互作用を弱めることをさらに明らかにする。ＢＡＣＥ１とＡＰＰとの間のインビボ親和性を試験するために、我々は、順次に過酷さの増大する洗浄剤を含む緩衝液中で、マウス脳ホモジネート由来の酵素および基質の共免疫沈降を実施した。ＢＡＣＥ１−ＡＰＰ結合は、過酷でない緩衝液状態下では、野生型とＰＴＰσ欠損脳ではほぼ等しいが、緩衝液中の洗浄剤の過酷さの漸増により、ＰＴＰσがなければ、分子複合体が脳中で解離をより受けやすいことが明らかになる（図３）。従って、ＰＴＰσ欠損脳におけるより低いＢＡＣＥ１−ＡＰＰ親和性は、低減されたレベルのＣＴＦβおよびその誘導体Ａβに対する根底にある機序の可能性がある。
【０１７１】
いくつかの別の特徴づけられていない経路が、ＰＴＰσ欠損ＰＴＰσ欠損脳中のＣＴＦβおよびＡβの同時低減の一因となり得ることを排除できないが、これらのデータは、おそらく、Ａβ産生の初期過程であるＡＰＰに対するＢＡＣＥ１活性の促進を介して、ＰＴＰσがＡＰＰアミロイド形成プロセッシングを調節するという考えを一貫して裏付ける。
【０１７２】
ＰＴＰσによるβアミロイド形成性調節の特異性
ＰＴＰσのＡＰＰアミロイド形成産物に対する抑制効果は、我々に、この考えが、ＡＰＰ代謝の特異的調節を反映しているのか、あるいは、β−およびγ−分泌酵素に対する包括的調節を反映しているのかに関するさらなる問題をもたらした。我々は、最初に、ＰＴＰσ含有または非含有のマウス脳中でのこれらの分泌酵素の発現レベルを評価し、ＢＡＣＥ１またはγ−分泌酵素の不可欠なサブユニットに関し変化がないことを見出した（図４Ａ、Ｂ）。さらに、我々は、それらの他の基質のタンパク分解性プロセッシングを試験することにより、ＰＴＰσが、β−およびγ−分泌酵素活性を広範に調節するかどうかを試験した。ＡＰＰの他に、ニューレグリン１（ＮＲＧ１）およびノッチは、それぞれ、ＢＡＣＥ１およびγ−分泌酵素の主要なインビボ基質である。ＮＲＧ１のＢＡＣＥ１切断も、ノッチのγ−分泌酵素切断も、ＰＴＰσ欠損により影響を受けない（図４Ｃ、Ｄ）。まとめると、これらのデータは、β−およびγ−分泌酵素の包括的調節を排除しないが、むしろ、ＰＴＰσによるＡＰＰアミロイド形成調節の特異性を示唆している。
【０１７３】
ＰＴＰσ欠乏は、ＡＰＰ遺伝子導入マウスにおいて神経炎症およびシナプス障害を軽減する
以前の研究からの十分な証拠は、脳中のＡβの過剰産生は、持続性アストログリオーシスなどのグリアの慢性炎症反応を含む多様な下流の病理学的イベントを誘発することを確定した。反応性（炎症性）グリアは、ニューロンとクロストークし、疾患進行中に神経変性を増幅する不完全なフィードバックループを引き起こす。
【０１７４】
ＴｇＡＰＰ−ＳｗＤＩモデルは、既存の多くのＡＤマウスモデル中で、最も早く神経変性病態および行動欠陥を発症するモデルの１つである。従って、我々は、神経毒性Ａβの下流のＡＤ病態におけるＰＴＰσの役割のさらなる試験のために、これらのマウスを選択する。
【０１７５】
ＴｇＡＰＰ−ＳｗＤＩ導入遺伝子および野生型ＰＴＰσを発現するＡＰＰ−ＳｗＤＩ（＋）ＰＴＰσ（＋／＋）マウスは、アストログリオーシスのマーカーであるＧＦＡＰ（グリア線維酸性タンパク質）のレベルで測定して、９月齢までに、脳中に重度神経炎症を発症した（図５）。ＤＧ門部では、例えば、ＡＰＰ−ＳｗＤＩ（＋）ＰＴＰσ（＋／＋）マウス中のＧＦＡＰ発現レベルは、同年の非遺伝子導入同腹仔［ＡＰＰ−ＳｗＤＩ（−）ＰＴＰσ（＋／＋）］のレベルと比較して、１０倍超である。しかし、ＰＴＰσ欠損は、アミロイド形成導入遺伝子により誘導されたアストログリオーシスを効果的に弱める。ＡＰＰ−ＳｗＤＩ（＋）ＰＴＰσ（−／−）脳中では、ＰＴＰσの欠乏は、ＤＧ門部中のＧＦＡＰ発現を非遺伝子導入野生型同腹仔のレベル近くまで回復する（図５ｋ）。
【０１７６】
全ての脳領域中で、ＴｇＡＰＰ−ＳｗＤＩ導入遺伝子の発現により最も影響を受けるのは、Ａβ沈着およびアストログリオーシスの両方が最も激しいことが明らかになったＤＧの門部であるように見える（図２Ｇ、Ｈ；図５）。従って、我々は、この領域の病態が、門部を通って、それらがＣＡ３樹状突起と共にシナプスを形成するＣＡ３領域中に突き出たＤＧ錐体ニューロンの苔状線維軸索に対し影響を与えるかどうかについて疑問視した。ＣＡ３苔状線維終末域中のシナプス前のマーカーの試験時に、我々は、ＡＰＰ−ＳｗＤＩ（＋）ＰＴＰσ（＋／＋）マウスにおいて、それらの同年非遺伝子導入同腹仔に比較して、シナプトフィジンおよびシナプシン−１のレベルが低減しているのを見出した（図６、シナプシン−１のデータは示していない）。明らかに、ＡＰＰ導入遺伝子の発現およびおそらくＡβの過剰産生から生じたものであるこのようなシナプス障害は、ＡＰＰ−ＳｗＤＩ（＋）ＰＴＰσ（−／−）マウスにおけるＰＴＰσの遺伝子欠乏により回復される（図６）。
【０１７７】
興味深いことに、我々は、ＡＰＰ−ＳｗＤＩ（＋）ＰＴＰσ（−／−）マウスは、ＣＡ３終末域中で、それらの同年の非遺伝子導入野生型同腹仔より高いレベルのシナプス前のマーカーを発現することがあることを認めた（図６ｇ）。この観察は、以前の研究で観察されたように、我々の定量分析では統計的に有意ではないが、ＡＰＰ導入遺伝子とは無関係のＰＴＰσの追加のシナプス効果を示唆している可能性がある。
【０１７８】
加齢ＡＤマウス脳のタウ病態はＰＴＰσに依存する
高リン酸化され、凝集したタウから構成される神経原線維濃縮体は通常、ＡＤ脳で見出される。これらの濃縮体は、階層型パターンで発生する傾向があり、最初に、嗅内皮質中に出現し、その後、その他の脳領域に広がる。しかし、濃縮体形成の正確な機序は十分に理解されていない。タウ濃縮体およびＡβ沈着物は、死後脳中の別々の位置で見つけることができるという事実は、ＡＤにおけるタウ病状はＡβ蓄積とは無関係なのかどうかという疑問をもたらした。さらに、多くのＡＰＰ遺伝子導入マウスモデルにおいて、重篤な脳βアミロイドーシスにもかかわらず、タウ濃縮体は報告されておらず、インビボでのＡβとタウ病態との間の関連性についてさらに疑問が生じている。
【０１７９】
それにもかかわらず、いくつかの研究は、ＡＰＰ遺伝子導入マウス株のＡβプラーク周辺のジストロフィーの神経突起中でタウの非濃縮体様構築物を示し、タウ病態の正確な性質は、ヒトとマウスとの間で異なり得るにも関わらず、Ａβは、タウ調節不全の原因因子であり得ることを主張している。タウのプロリンリッチドメインに対する抗体を用いた我々の組織学的分析で、我々は、加齢過程中のＴｇＡＰＰ−ＳｗＤＩおよびＴｇＡＰＰ−ＳｗＩｎｄの両方のマウス（ＡＰＰ−ＳｗＤＩ（＋）ＰＴＰσ（＋／＋）マウスは約９月齢、およびＡＰＰ−ＳｗＩｎｄ（＋）ＰＴＰσ（＋／＋）マウスは１５月齢）の脳中にタウ凝集を認めた（図７）。このような凝集は、同年非遺伝子導入同腹仔で認められず（図７ｈ）、これが、アミロイド形成ＡＰＰ導入遺伝子の発現の下流の病理学的イベント、おそらくＡβ細胞傷害性の結果、であることを示唆している。Ａβレベルを低下させるＰＴＰσの遺伝子欠乏は、ＴｇＡＰＰ−ＳｗＤＩおよびＴｇＡＰＰ−ＳｗＩｎｄ両マウスのタウ凝集を抑制する（図７）。
【０１８０】
ＴｇＡＰＰ−ＳｗＤＩおよびＴｇＡＰＰ−ＳｗＩｎｄ両マウスでは、タウ凝集体は、主に、梨状葉皮質および嗅内皮質の分子層中に、場合により、海馬領域中に認められ（図７）、ＡＤ脳中の初期段階濃縮体部位が想起される。より細密な調査では、タウ凝集体は、変質した細胞体および神経突起由来のデブリのような点状物形状で、核染色のない領域中でばらばらに見つかる場合が多い。希に、いくつかが、原繊維構造中（おそらく、分解前の変質細胞中の）に存在する。これらの知見を確認するために、我々は、タウのＣ末端を認識する追加の抗体を使用し、同じ形態ならびに分布パターンを検出した（図７Ａ）。
【０１８１】
死後ＡＤ脳の調査結果と一致して、ＴｇＡＰＰ−ＳｗＤＩ脳中のタウ凝集体の分布パターンは、Ａβ沈着のパターンと相関せず、これは、９月齢では、海馬中で顕著で、しかも、梨状葉皮質または嗅内皮質中ではまばらに存在するにすぎない（図２Ｇ、Ｈ）。これらのマウスにおけるタウ病状の因果関係は、おそらく、過剰産生Ａβに関連することを考慮すると、Ａβおよびタウ沈着の主要な領域の分離は、細胞傷害性は堆積したアミロイドではなく、可溶性Ａβが起源であることを示す可能性がある。異なる脳領域におけるニューロンが、タウ病状を等しく発症しやすい訳ではないことも明らかである。
【０１８２】
我々は、次に、ＡＰＰ導入遺伝子の発現またはＰＴＰσの遺伝子欠乏がタウ凝集を調節するかどうかを、その発現レベルおよび／またはリン酸化状態を変えることにより調査した。脳ホモジネートのウェスタンブロット分析は、タウタンパク質発現がＡＰＰ導入遺伝子またはＰＴＰσにより影響を受けないことを示し、凝集が、このタンパク質の過剰発現ではなく、タウの局所的ミスフォールディングに起因し得ることを示唆する。脳ホモジネートを用いたこれらの実験はまた、明らかにタウ凝集の原因である、ＴｇＡＰＰ−ＳｗＤＩまたはＴｇＡＰＰ−ＳｗＩｎｄ導入遺伝子は、セリン１９１、トレオニン１９４、およびトレオニン２２０を含むタウ残基のリン酸化を強化しない（データは示さず）ことを明らかにした。ヒトタウ中のこれらの残基の同族体（セリン２０２、トレオニン２３１）は通常、神経原線維濃縮体中で高リン酸化されている。これらの知見は、野生型およびＴｇＡＰＰ−ＳｗＩｎｄマウス中のタウの類似の翻訳後修飾を示す最近の定量的調査と一致する。さらに、以前の報告とは異なり、我々は、タウ凝集体中でこれらのリン酸化残基を検出できず、エピトープがない（残基がリン酸化されていないかまたは切断されている）か、またはミスフォールディングの内側に包埋されているかを示唆する。タウの翻訳後修飾の複雑さを考慮すると、凝集がいくつかのタウの未知の改質により媒介されている可能性があることを排除できない。その他の因子、例えば、タウに結合する分子が、凝集物を沈降させ得るという可能性もある。
【０１８３】
根底にある機序はまだ明確ではないが、我々のこれらのマウスにおけるタウ病状の知見は、アミロイド形成ＡＰＰ導入遺伝子の発現とタウ構築の調節不全との間の因果関係を確立する。我々のデータはまた、ＰＴＰσ欠乏が、ＡＰＰのアミロイド形成産物を低減させることにより、タウ凝集を抑制するという可能性を示唆する。
【０１８４】
タウの機能不全は、微小管の劣化を示すので、神経変性マーカーとして広く認識されている。従って、ＰＴＰσの遺伝子欠乏によるタウ凝集に対する抑制効果は、神経完全性の重要な調節因子としてのこの受容体の役割に対する追加の証拠を提供する。
【０１８５】
ＰＴＰσ欠損がＡＤマウスモデルの行動欠陥を救済する
次に、我々は、ＰＴＰσ欠乏による神経病理学の軽減が、ＡＤ関連行動欠陥からの救済を伴うかどうかを評価した。ＡＤの最もよくある症状には、最初期段階中の短期記憶喪失およびアパシー、続けて、認知症進行に伴う多くの認知機能の障害の内の空間的見当識障害が挙げられる。Ｙ−迷路および新奇物体アッセイを代用モデルとして用いて、我々は、ＴｇＡＰＰ−ＳｗＤＩおよびＴｇＡＰＰ−ＳｗＩｎｄマウスにおけるこれらの認知および精神的特徴を評価した。
【０１８６】
３つの同一のアームをマウスに自由に探索させるＹ−迷路アッセイは、マウスの短期空間記憶を測定する。これは、繰り返ししないでアーム探索を交替するマウスの天然の傾向に基づいている。能力は、総アーム進入中の自発的交替行動のパーセンテージによりスコア化され、より高いスコアは、より良好な空間ナビゲーションを示す。コロニー内の非遺伝子導入野生型マウスと比較して、ＡＰＰ−ＳｗＤＩ（＋）ＰＴＰσ（＋／＋）マウスは、それらの能力の明確な障害を示す。しかし、ＡＰＰ−ＳｗＤＩ（＋）ＰＴＰσ（−／−）マウスのＰＴＰσ遺伝子欠乏は、認知機能を非遺伝子導入野生型マウスのレベルまで回復する（図８Ａ、図９）。
【０１８７】
ＡＤの個体中で報告されている最もよくある精神神経症状であるアパシーは、意欲喪失および新奇物体に対する注意力の低下を特徴とし、次第に、前臨床および初期症候前認知症期の早期診断を下されるようになる。初期段階ＡＤの多くの患者は、彼らの新規刺激を特定する能力に関係なく、新規状況に対する注意力を失い、新規情報のさらなる処理に関与する回路における根底にある障害を示唆する。アパシーの重要な特徴として、このような新奇物体に対する注意力の障害は、患者の「キュリオシティーフィギュアーズ（ｃｕｒｉｏｓｉｔｙ  ｆｉｇｕｒｅｓ）課題」または「オドボール課題」により知ることができる。これらの視覚ベース新奇物体の神経信号を脳に受容可能な形にする課題は、げっ歯類に対する新奇物体アッセイに極めて類似しており、新奇物体アッセイは、げっ歯類が事前馴染物体（ＦＯ）に対し新奇物体（ＮＯ）と同時に曝露された場合に、新奇物体に対する動物の関心を測定する。従って、我々は、このアッセイを、ＡＰＰ遺伝子導入マウスの新奇物体に対する注意力を試験するために使用した。マウスが、ＦＯを認識するように予備訓練されている場合、新奇物体に対するマウスの注意力は、ＮＯ探索の総物体探索（ＮＯ＋ＦＯ）に対する比率として識別指数により、あるいは、ＮＯ探索のＦＯ探索に対する比率により測定される。両方の比率がよく使われるが、これらの評価の組み合わせは、動物行動のより包括的な評価を提供する。本試験では、両方の測定値により示されるように、ＡＰＰ−ＳｗＤＩ（＋）ＰＴＰσ（＋／＋）マウス中のＡＰＰ−ＳｗＤＩ導入遺伝子の発現は、非遺伝子導入野生型マウスに比べて、ＮＯ探索の実質的な低減に繋がる（図８Ｂ、Ｃ；図１０）。ＮＯ／ＦＯ比率で判定して、遺伝子導入および非遺伝子導入群の両方は、２つの物体を認識し、これらの間を識別できることは明らかである（図１０Ａ、Ｂ）。従って、ＡＰＰ−ＳｗＤＩ（＋）ＰＴＰσ（＋／＋）マウスによる低減したＮＯ探索は、ＮＯへの注意力の欠如またはＮＯに対する注意に切り替えることができないことを表している。再度、この行動欠陥は、ＡＰＰ−ＳｗＤＩ（＋）ＰＴＰσ（−／−）マウスのＰＴＰσの欠損により大きく回復され（図８Ｂ、Ｃ；図１０）、以前のＰＴＰσの非存在下でのＮＯ嗜好性の増加の観察と一致する。
【０１８８】
これらの行動状況に対するＰＴＰσの効果をさらに検証するために、我々は、両アッセイでＴｇＡＰＰ−ＳｗＩｎｄマウスを追加で試験して、類似の結果観察し、ＰＴＰσの遺伝子欠乏の場合に、両方の短期空間記憶および新奇物体に対する注意力の改善を確認した（図１１）。
【０１８９】
図１２は、γ−分泌酵素阻害剤単独でまたはγ−分泌酵素阻害剤と組み合わせて投与されたＢＡＣＥ１阻害剤と比較して、ＡＰＰプロセッシングに対するγ−分泌酵素阻害剤と組み合わせたＩＳＰの効果を示す免疫ブロットである。この図で示すように、γ−分泌酵素阻害剤単独でまたはγ−分泌酵素阻害剤と組み合わせて投与されたＢＡＣＥ１阻害剤と比較して、γ−分泌酵素阻害剤と組み合わせたＩＳＰは、ＡＰＰプロセッシングを実質的に阻害した。
【０１９０】
本発明を、その好ましい実施形態に関連して、詳細に提示し、説明してきたが、添付した特許請求の範囲に包含される本発明の範囲から逸脱することなく、その形態や詳細を様々に変更し得ることを当業者なら理解するであろう。前述の明細書で引用された特許、出版物および参考文献はすべてその全体が参照によって、本明細書に組み込まれる。
【図１Ａ】
2020524132.tif 000006
【図１Ｂ】
2020524132.tif 000007
【図１Ｃ】
2020524132.tif 000008
【図１Ｄ】
2020524132.tif 000009
【図１Ｅ】
2020524132.tif 000010
【図１Ｆ】
2020524132.tif 000011
【図１Ｇ】
2020524132.tif 000012
【図１Ｈ】
2020524132.tif 000013
【図１Ｉ】
2020524132.tif 000014
【図２−１】
2020524132.tif 000015
【図２−２】
2020524132.tif 000016
【図２−３】
2020524132.tif 000017
【図２−４】
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【図２−５】
2020524132.tif 000019
【図２−６】
2020524132.tif 000020
【図２−７】
2020524132.tif 000021
【図３−１】
2020524132.tif 000022
【図３−２】
2020524132.tif 000023
【図４Ａ】
2020524132.tif 000024
【図４−１】
2020524132.tif 000025
【図４−２】
2020524132.tif 000026
【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
2020524132.tif 000028
【図５Ｃ】
2020524132.tif 000029
【図５Ｄ】
2020524132.tif 000030
【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図５Ｉ】
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【図６−１】
2020524132.tif 000036
【図６−２】
2020524132.tif 000037
【図６−３】
2020524132.tif 000038
【図６−４】
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【図７−１】
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【図７−２】
2020524132.tif 000041
【図７−３】
2020524132.tif 000042
【図７−４】
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【図８−１】
2020524132.tif 000044
【図８−２】
2020524132.tif 000045
【図９】
2020524132.tif 000046
【図１０−１】
2020524132.tif 000047
【図１０−２】
2020524132.tif 000048
【図１１−１】
2020524132.tif 000049
【図１１−２】
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【図１２】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年2月14日(2020.2.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2020524132000001.app
【国際調査報告】
2020524132.tif 000052
2020524132.tif 000053
2020524132.tif 000054
2020524132.tif 000055