(57)【要約】  癌患者、特に胃癌患者が、ＦＯＬＦＩＲＩレジメン（イリノテカン／５−フルオロウラシル／フォリン酸）の初回投与に次いで、化学療法剤ドセタキセルおよびシスプラチンの組合せ（ＦＯＬＦＩＲＩ＋ドセタキセル／シスプラチン）の別々の逐次投与を含んでなる逐次治療戦略による治療に反応を示すかどうかを明らかにするための方法が提供される。癌患者がＦＯＬＦＩＲＩ＋ドセタキセル／シスプラチンの逐次併用療法に積極的に反応するかどうかを判定するために、癌患者から得られた腫瘍組織から回収される腫瘍細胞、特に胃癌腫瘍細胞において直接、特定のＴＵＢＢ３およびＴＹＭＰ断片ペプチドをＳＲＭ質量分析により正確に検出および定量化し、参照レベルと比較する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌に罹患している患者の治療方法であって、
（ａ）  特定のＴＵＢＢ３断片ペプチドのレベルを定量すること、ならびに患者から得られた腫瘍組織サンプルから調製されたタンパク質消化物中の特定のＴＹＭＰ断片ペプチドのレベルを定量すること、ならびに質量分析を用いた選択的反応モニタリングにより、前記サンプル中のＴＵＢＢ３およびＴＹＭＰペプチドのレベルを算出すること；
（ｂ）  前記ＴＵＢＢ３断片ペプチドのレベルをＴＵＢＢ３参照レベルと比較すること、および前記ＴＹＭＰ断片ペプチドをＴＹＭＰ参照レベルと比較すること、ならびに
（ｃ）  ＴＵＢＢ３断片ペプチドのレベルが前記ＴＵＢＢ３参照レベルより低い場合に、ＦＯＬＦＩＲＩレジメン（イリノテカン／５−フルオロウラシル／フォリン酸）の初回投与に次いで、化学療法剤ドセタキセルおよびシスプラチンの組合せ（ＦＯＬＦＩＲＩ＋ドセタキセル／シスプラチン）の別々の逐次投与を含んでなる治療レジメンで患者を治療すること、または
（ｄ）  ＴＵＢＢ３断片ペプチドのレベルが前記ＴＵＢＢ３参照レベルより高い場合に、ＦＯＬＦＩＲＩレジメン（イリノテカン／５−フルオロウラシル／フォリン酸）の初回投与に次いで、化学療法剤ドセタキセルおよびシスプラチンの組合せ（ＦＯＬＦＩＲＩ＋ドセタキセル／シスプラチン）の別々の逐次投与を含んでなる治療戦略以外の異なる治療薬を含んでなる異なる治療レジメンで患者を治療すること、または
（ｅ）  ＴＹＭＰ断片ペプチドのレベルが前記ＴＹＭＰ参照レベルより高い場合に、ＦＯＬＦＩＲＩレジメン（イリノテカン／５−フルオロウラシル／フォリン酸）の初回投与に次いで、化学療法剤ドセタキセルおよびシスプラチンの組合せ（ＦＯＬＦＩＲＩ＋ドセタキセル／シスプラチン）の別々の逐次投与を含んでなる治療レジメンで患者を治療すること、または
（ｆ）  ＴＵＢＢ３断片ペプチドのレベルが前記ＴＹＭＰ参照レベルより低い場合に、ＦＯＬＦＩＲＩレジメン（イリノテカン／５−フルオロウラシル／フォリン酸）の初回投与に次いで、化学療法剤ドセタキセルおよびシスプラチンの組合せ（ＦＯＬＦＩＲＩ＋ドセタキセル／シスプラチン）の別々の逐次投与以外の異なる治療薬を含んでなる異なる治療レジメンで患者を治療すること、
を含んでなる、方法。
【請求項２】
前記癌が胃癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記タンパク質消化物が、プロテアーゼ消化物を含んでなる、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記タンパク質消化物が、トリプシン消化物を含んでなる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
質量分析が、タンデム質量分析、イオントラップ質量分析、三連四重極質量分析、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析、ＭＡＬＤＩ質量分析、ハイブリッドイオントラップ／四重極質量分析および／または飛行時間型質量分析を含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
使用する質量分析のモードが、選択的反応モニタリング（ＳＲＭ）、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）、並列反応モニタリング（ＰＲＭ）、インテリジェント選択的反応モニタリング（ｉＳＲＭ）、および／または多重選択的反応モニタリング（ｍＳＲＭ）である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
特定のＴＵＢＢ３ペプチドが、配列番号１として示されるアミノ酸配列を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
特定のＴＹＭＰペプチドが、配列番号２として示されるアミノ酸配列を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
腫瘍サンプルが、細胞、細胞の集合、または固形組織である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
腫瘍サンプルがホルマリン固定固形組織である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
組織がパラフィン包埋組織である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
特定のＴＵＢＢ３断片ペプチドを定量することが、既知量の添加内部標準ペプチドと比較することにより、前記サンプル中のＴＵＢＢ３ペプチドの量を決定することを含んでなり、ここで、生体サンプル中の天然ペプチドおよび内部標準ペプチドの両方が、配列番号１に示されるＴＵＢＢ３断片ペプチドの同じアミノ酸配列に対応する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
特定のＴＹＭＰ断片ペプチドを定量することが、既知量の添加内部標準ペプチドと比較することにより、前記サンプル中のＴＹＭＰペプチドの量を決定することを含んでなり、ここで、生体サンプル中の天然ペプチドおよび内部標準ペプチドの両方が、配列番号２に示されるＴＹＭＰ断片ペプチドの同じアミノ酸配列に対応する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
内部標準ペプチドが同位体標識ペプチドである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
同位体標識内部標準ペプチドが、１８Ｏ、１７Ｏ、１５Ｎ、１３Ｃ、２Ｈまたはその組合せから選択される１以上の重安定同位体を含んでなる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
ＴＵＢＢ３ペプチド断片の特定のレベルが、分析されるタンパク質の約７５０ａｍｏｌ／μｇである、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
ＴＹＭＰペプチド断片の特定のレベルが、分析されるタンパク質の約２８００ａｍｏｌ／μｇである、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
どの薬剤を治療に使用するかに関する治療の決定が、その生体サンプル中の他のペプチド／タンパク質と組み合わせた特定のＴＵＢＢ３断片ペプチドの特定のレベルに基づくように、特定のＴＵＢＢ３断片ペプチドの検出および定量化を、他のタンパク質からの他のペプチドの検出および定量化と多重形式で組み合わせる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
どの薬剤を治療に使用するかに関する治療の決定が、その生体サンプル中の他のペプチド／タンパク質と組み合わせた特定のＴＹＭＰ断片ペプチドの特定のレベルに基づくように、特定のＴＹＭＰ断片ペプチドの検出および定量化を、他のタンパク質からの他のペプチドの検出および定量化と多重的に組み合わせる、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
序文
患者から外科的に切除された腫瘍組織をアッセイすること、ならびに、５−フルオロウラシル／フォリン酸（ＤｅＧｒａｍｏｎｔ）の投与を含んでなる標準化学療法戦略（治療１）と、これに対する、ＦＯＬＦＩＲＩレジメン（イリノテカン／５−フルオロウラシル／フォリン酸）の初回投与に次いでドセタキセル／シスプラチンの組合せの逐次投与を含んでなるレジメン（治療２）による治療に最も反応を示す可能性が高い患者を同定することにより、癌患者、特に胃癌（ＧＩ）患者を治療するための改善された方法が提供される。治療１は５ＦＵ／ＬＶを含んでなり、一方、治療２はＦＯＬＦＩＲＩ＋ドセタキセル／シスプラチンを含んでなる。
【０００２】
より具体的には、ＳＲＭ質量分析を用いて、患者の腫瘍組織に由来する腫瘍細胞中のＴＵＢＢ３およびＴＹＭＰタンパク質を測定し、次に、これらの測定値を用いて、ＦＯＬＦＩＲＩの逐次投与に次いでドセタキセル／シスプラチンの化学療法剤の組合せによる治療に最も反応を示す可能性が高い癌患者、特に胃癌患者を同定する。
【０００３】
クラスＩＩＩ  β−チューブリンとしても知られるＴＵＢＢ３は、細胞微小管重合体の重要な成分であり、リガンド結合の調節にも積極的に関与する。プロテオミクス解析により、これらのシステイン残基に結合する多くの因子が、酸化ストレスおよび脱グルコース反応に関与することが明らかとなっている。ＴＵＢＢ３は、予後バイオマーカーならびにドセタキセルおよび他の類似のタキサン化合物に対する抵抗性の指標の両方として調べられており、報告では、転帰不良のバイオマーカーとしての高定量レベルのＴＵＢＢ３を示している。従って、患者の癌細胞中のＴＵＢＢ３タンパク質の定量的発現レベルの決定は、癌細胞がドセタキセルによる治療にどのように反応を示すかを決定する助けとなり得る。
【０００４】
チミジンホスホリラーゼとしても知られるＴＹＭＰは、チミンからｄＴＭＰを合成するタンパク質であり、それ自体がピリミジン代謝の一部であるｄＴＭＰ生合成サルベージ経路の一部である。ＴＹＭＰは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの血管新生を促進し、種々の内皮細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの成長を刺激する血管新生因子として知られる。ＴＹＭＰは通常、非常に制限された標的細胞特異性を有し、内皮細胞に対してのみ作用する。しかしながら、場合によっては、ＴＹＭＰは、腫瘍細胞において高レベルで異常に発現し得る。ＴＹＭＰは、５−ｄＦＵＲから５ＦＵおよび５ＦＵからＦｄＵＭ,Ｐ(5FU to FdUM,P)へ変換するように機能し、これは、ＴＳタンパク質を阻害する５ＦＵの機能性を促進し、それにより、ＤＮＡの産生が遮断され、腫瘍細胞のアポトーシスが誘発される。
【０００５】
ＴＵＢＢ３およびＴＹＭＰは、癌患者における治療成績の予後予測因子であり、そのようなものとして、癌の化学療法治療戦略に関する情報を提供し得る。患者の腫瘍細胞から得られたＴＵＢＢ３およびＴＹＭＰタンパク質発現の存在および／または定量レベルは、ＳＲＭ質量分析の方法を用いて、ＴＵＢＢ３およびＴＹＭＰ全長タンパク質の各々の部分配列に由来する特定のペプチドを定量することにより決定される。癌患者内に存在する癌細胞においてＳＲＭ質量分析により検出されたＴＵＢＢ３タンパク質の特定の定量レベルは、患者がドセタキセルを含有する化学療法レジメンに対して積極的に反応を示す可能性が高いまたは低いのいずれかであることを示す。ＳＲＭ質量分析により癌患者内の癌細胞において検出されたＴＹＭＰタンパク質の特定の定量レベルは、患者が５ＦＵを含む化学療法レジメンに対して積極的に反応を示す可能性が高いまたは低いのいずれかであることを示す。
【０００６】
カンプトサーとしても知られるイリノテカンは、インターカレーションによりＤＮＡと相互作用し、それにより、転写のためにＤＮＡ中のスーパーコイルを弛緩させる酵素トポイソメラーゼＩ（ＴＯＰＯ１）の進行を阻害する、癌化学療法剤である。ドキソルビシンは、複製のためにＤＮＡ鎖を切断した後、ＴＯＰＯ１複合体を安定化し、ＤＮＡ二重らせんが再度封鎖されるのを防止し、複製の過程を停止する。これは、癌細胞がＤＮＡを合成するのを防止し、癌細胞分裂および腫瘍成長を停止する。しかしながら、癌細胞中のＴＯＰＯ１酵素の高発現レベルは、イリノテカンの効果を克服し得、癌細胞におけるイリノテカンの効果に対する抵抗性を生じさせ、癌細胞がＤＮＡを合成するのを許し、細胞分裂および腫瘍成長を促進し得る。
【０００７】
アドルシルとしても知られるフルオロウラシル（５−ＦＵ）は、ＤＮＡを遮断することにより機能し、それにより、細胞分裂を阻害し、腫瘍細胞が分裂および成長するのを防止する、化学療法剤である。５−ＦＵは様々な様式で作用するが、主にチミジル酸シンターゼ（ＴＳ）阻害剤として作用する）。ＴＳ活性の妨害は、ＤＮＡ複製に必要なヌクレオシドであるピリミジンチミジンの合成を遮断する。チミジル酸シンターゼは、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）をメチル化して、チミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）を形成する。５−ＦＵの投与はｄＴＭＰの欠乏を引き起こし、このチミンの欠乏が原因で、急速に分裂する癌細胞が細胞死を受ける。高レベルのチミジル酸シンターゼは、５−ＦＵの効果を克服し得、一方、高レベルのチミジンホスホリラーゼ（ＴＹＭＰ）タンパク質は、５−ＦＵの活性を促進する。
【０００８】
タキソテールとしても知られるドセタキセルは、パクリタキセル（タキソール）の半合成類似体である。これは、タキサンの薬剤クラスに入る。ドセタキセルは、高い親和性で微小管に可逆的に結合し、微小管を安定化し、解重合を防止することにより、分裂細胞を死滅させる。この細胞性微小管重合体の安定化は、微小管形成に必要な遊離チューブリン（ＴＵＢＢ３）の有意な減少をもたらし、その結果、中期と後期の間の有糸分裂が阻害され、さらに癌細胞分裂および腫瘍成長が防止される。癌細胞中のＴＵＢＢ３タンパク質の高発現レベルは、ドセタキセルの効果を克服し得、よって、細胞におけるドセタキセルの効果に対する抵抗性をもたらし、細胞が微小管重合体を解重合するのを許し、よって、細胞分裂および腫瘍成長を促進する。
【０００９】
プラチノールとしても知られるシスプラチンは、ＤＮＡ複製に干渉することで、細胞を分裂するのを防止し、アポトーシスを介した腫瘍細胞死をもたらす、癌化学療法剤である。シスプラチンは、いくつかの異なる様式でＤＮＡを不可逆的に架橋し、有糸分裂に干渉する。損傷したＤＮＡは、ＤＮＡ修復機序を誘発し、これが次に、修復が不可能と判明した場合にアポトーシスを活性化することにより、腫瘍細胞を死滅させる。
【００１０】
フォリン酸としても知られるロイコボリンカルシウム（ＬＶ）は、抗癌特性を有さないが、化学療法剤の中毒性副作用を低減するために用いられる薬剤である。ＬＶは、５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸（ＣＨ２ＴＨＦ）の細胞内プールを増加させることにより、フルオロデオキシウリジン一リン酸（ＦｄＵＭＰ）のチミジル酸シンターゼへの結合を安定化し、よって、チミジル酸シンターゼ（ＴＳ）の阻害を亢進する。ロイコボリンは、それ自体の副作用はほぼないが、フルオロウラシルと併用した場合は、その薬剤の副作用の重症度を増加させることがある。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、５ＦＵ／ＬＶを含んでなる治療１レジメンで治療されたこの胃癌コホートに対するＴＵＢＢ３  ７５０ａｍｏｌ／μｇ以下およびＴＵＢＢ３  ７５０ａｍｏｌ／μｇ超のカットオフを用いた、カプラン・マイヤー全生存（ＯＳ）曲線を示す。結果は、統計的有意性を算出するための２つの異なる方法を用いた、これらのＴＵＢＢ３タンパク質レベルに基づき、胃癌患者（ｎ＝１２２）の全生存に対する統計的に有意でない予測値を示す（マンテル・コックス検定  ｐ＝０．４７４４；ゲーハン・ブレスロウ・ウィルコクソン検定  ｐ＝０．２１７９）。
【図２】図２は、５ＦＵ／ＬＶを含んでなる治療１レジメンで治療されたこの胃癌コホートに対するＴＹＭＰ  １３３５ａｍｏｌ／μｇ以下およびＴＹＭＰ  １３３５ａｍｏｌ／μｇ超のカットオフを用いた、カプラン・マイヤー全生存（ＯＳ）曲線を示す。結果は、統計的有意性を算出するための２つの異なる方法を用いた、ＴＹＭＰタンパク質カットオフレベル１３３５ａｍｏｌ／μｇに基づき、胃癌患者（ｎ＝１２２）の全生存に対する小さいがそれでも統計的に有意な予測値を示す（マンテル・コックス検定  ｐ＝０．０１８５；ゲーハン・ブレスロウ・ウィルコクソン検定  ｐ＝０．０３７８）。
【図３】図３は、ＦＯＬＦＩＲＩに次いでドセタキセル／シスプラチンの組合せの投与を含んでなる治療２レジメンで治療されたこの胃癌コホートに対するＴＵＢＢ３  ７５０ａｍｏｌ／μｇ以下およびＴＵＢＢ３  ７５０ａｍｏｌ／μｇ超のカットオフを用いた、カプラン・マイヤー全生存（ＯＳ）曲線を示す。結果は、統計的有意性を算出するための２つの異なる方法を用いた、これらのＴＵＢＢ３タンパク質レベルに基づき、胃癌患者（ｎ＝１２５）の全生存に対する小さいがそれでも統計的に有意な予測値を示す（マンテル・コックス検定  ｐ＝０．０３８２；ゲーハン・ブレスロウ・ウィルコクソン検定  ｐ＝０．０３２９）。
【図４】図４は、ＦＯＬＦＩＲＩに次いでドセタキセル／シスプラチンの組合せの投与を含んでなる治療２レジメンで治療されたこの胃癌コホートに対するＴＹＭＰ  １３３５ａｍｏｌ／μｇ以下およびＴＹＭＰ  １３３５ａｍｏｌ／μｇ超のカットオフを用いた、カプラン・マイヤー全生存（ＯＳ）曲線を示す。結果は、統計的有意性を算出するための２つの異なる方法を用いた、ＴＹＭＰタンパク質カットオフレベル１３３５ａｍｏｌ／μｇに基づき、胃癌患者（ｎ＝１２５）の全生存に対する統計的に有意でない予測値を示す（マンテル・コックス検定  ｐ＝０．４２００；ゲーハン・ブレスロウ・ウィルコクソン検定  ｐ＝０．３４４８）。
【図５】図５は、ＦＯＬＦＩＲＩに次いでドセタキセル／シスプラチンの組合せの投与を含んでなる治療２レジメンで治療されたこの胃癌コホートに対するＴＹＭＰ  ２８００ａｍｏｌ／μｇ以下およびＴＹＭＰ  ２８００ａｍｏｌ／μｇ超のカットオフを用いた、カプラン・マイヤー全生存（ＯＳ）曲線を示す。結果は、統計的有意性を算出するための２つの異なる方法を用いた、ＴＹＭＰタンパク質カットオフレベル２８００ａｍｏｌ／μｇに基づき、胃癌患者（ｎ＝１２５）の全生存に対する小さいがそれでも統計的に有意な予測値を示す（マンテル・コックス検定  ｐ＝０．０３４４；ゲーハン・ブレスロウ・ウィルコクソン検定  ｐ＝０．０２１１）。
【図６】図６は、ＦＯＬＦＩＲＩに次いでドセタキセル／シスプラチンの組合せの投与を含んでなる治療２レジメンで治療されたこの胃癌コホートに対するＴＵＢＢ３カットオフ７５０ａｍｏｌ／μｇ＋ＴＹＭＰカットオフ１３００ａｍｏｌ／μｇの組合せを用いた、カプラン・マイヤー全生存（ＯＳ）曲線を示す。結果は、統計的有意性を算出するための２つの異なる方法を用いた、胃癌患者（ｎ＝５８）の全生存に対するわずかだが統計的に有意でない予測値を示す（マンテル・コックス検定  ｐ＝０．０５３９；ゲーハン・ブレスロウ・ウィルコクソン検定  ｐ＝０．０５６１）。
【図７】図７は、ＦＯＬＦＩＲＩに次いでドセタキセル／シスプラチンの組合せの投与を含んでなる治療２レジメンで治療されたこの胃癌コホートに対するＴＵＢＢ３カットオフ７５０ａｍｏｌ／μｇ＋ＴＹＭＰカットオフ２８００ａｍｏｌ／μｇの組合せを用いた、カプラン・マイヤー全生存（ＯＳ）曲線を示す。結果は、統計的有意性を算出するための２つの異なる方法を用いた、胃癌患者（ｎ＝３２）の全生存に対する高度に統計的に有意な予測値を示す（マンテル・コックス検定  ｐ＝０．０００２；ゲーハン・ブレスロウ・ウィルコクソン検定  ｐ＝０．０００１）。
【発明の具体的説明】
【００１２】
癌患者、具体的には胃患者(a gastric patient)が、ＦＯＬＦＩＲＩレジメン（イリノテカン／５−フルオロウラシル／フォリン酸）の初回投与に次いで、化学療法剤ドセタキセルおよびシスプラチンの組合せ（ＦＯＬＦＩＲＩ＋ドセタキセル／シスプラチン）の別々の逐次投与を含んでなる治療戦略に対して好ましい様式で臨床的に反応を示すかどうかを判定するための方法が提供される。具体的には、腫瘍サンプルまたは患者から得られたサンプル中のＴＵＢＢ３およびＴＹＭＰタンパク質を測定するための診断方法が提供される。サンプルは、有利には、ホルマリン固定である。特定のＴＵＢＢ３ペプチド断片および特定のＴＹＭＰペプチド断片を同時に測定するＳＲＭ／ＭＲＭアッセイ、ならびにペプチド断片に関する特定の特徴を用いて、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織に由来する細胞中のＴＵＢＢ３およびＴＹＭＰタンパク質の量を決定する。ペプチド断片は、全長ＴＵＢＢ３およびＴＹＭＰタンパク質に由来し、ここで、ＴＵＢＢ３タンパク質に対するペプチド配列は配列番号１（ＩＳＶＹＹＮＥＡＳＳＨＫ）であり、一方、ＴＹＭＰタンパク質に対するペプチド配列は配列番号２（ＤＧＰＡＬＳＧＰＱＳＲ）である。意外にも、これらのペプチドは、腫瘍組織のＦＦＰＥサンプルから調製された消化物において確実に検出され、かつ同時に定量化され得ることが見出されている。米国特許出願第１３，９９３，０４５号を参照。その全内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。
【００１３】
より具体的には、このＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、ホルマリン固定癌患者組織などの患者組織サンプルから得られた細胞から調製された複雑なタンパク質ライセートサンプルにおいて、直接これらのペプチドを測定することができる。ホルマリン固定組織からのタンパク質サンプルの調製方法は、米国特許第７，４７３，５３２号に記載されており、その全内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。米国特許第７，４７３，５３２号に記載の方法は、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．（ロックビル、メリーランド州）から入手可能な液体組織試薬およびプロトコールを用いて、好都合に実施され得る。
【００１４】
癌患者からの組織、および癌組織の最も広くかつ有利に入手可能な形態は、ホルマリン固定パラフィン包埋組織である。外科的に切除された組織のホルムアルデヒド／ホルマリン固定は、世界中ではるかに最も一般的な癌組織サンプルの保存方法であり、標準的な病理学の実践において認められている慣習である。ホルムアルデヒドの水溶液は、ホルマリンと呼ばれる。「１００％」ホルマリンは、水中ホルムアルデヒド（これは約４０容量％または３７質量％である）の飽和溶液からなり、酸化および重合度を制限するために、少量の安定剤、通常メタノールが含まれる。組織を保存する最も一般的な方法は、全組織を長時間（８時間〜４８時間）、通常１０％中性緩衝ホルマリンと呼ばれる含水ホルムアルデヒドに浸漬した後、固定全組織をパラフィンろうに室温にて長時間保存で包埋することである。よって、ホルマリン固定癌組織を分析するための分子分析方法が、癌患者組織の分析のための最も受け入れられ、頻繁に利用されている方法であろう。 
【００１５】
ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイの結果は、胃癌組織を含む、組織が回収および保存された患者の特定の癌内でのＴＵＢＢ３およびＴＹＭＰタンパク質の正確かつ精密な定量レベルを相関させるために用いられ得る。これは、癌に関する診断／予後情報を提供するだけでなく、医師または他の医療従事者が患者に対する適当な療法を決定することも可能にする。この場合は、これらのアッセイを利用すれば、癌組織中のＴＵＢＢ３およびＴＹＭＰタンパク質発現の特定のレベルに関する情報を同時に提供でき、また、癌組織を得た患者が、ＦＯＬＦＩＲＩレジメン（イリノテカン／５−フルオロウラシル／フォリン酸）の投与に次いで、化学療法剤ドセタキセルおよびシスプラチンの組合せ（ＦＯＬＦＩＲＩ＋ドセタキセル／シスプラチン）の別々の逐次投与を含んでなる治療戦略に対して好ましい様式で反応を示すかどうかに関する情報を提供できる。
【００１６】
ＦＯＬＦＩＲＩレジメンによる癌患者の治療は、癌患者、特に胃癌患者の生命を延長することが示されている一般的かつ有効な戦略である。併用療法ＦＯＬＦＩＲＩレジメンにおける剤の１つは、複数の様式で機能する５−フルオロウラシル（５ＦＵ）であり、その様式には、チミジル酸シンターゼの作用を遮断することにより、ＤＮＡの産生を停止すること、およびＲＮＡの産生を遮断することにより、アポトーシスを生じさせることが含まれる。ＴＹＭＰタンパク質は、５−ｄＦＵＲの活性５ＦＵへの変換、および５ＦＵのＦＵＤＲへの変換に関与する。これらの変換の両方とも、外因的に投与された５ＦＵの活性を促進することにより、５ＦＵによる腫瘍細胞死滅を亢進し、５ＦＵを含むレジメンで癌患者を治療する場合、より高いレベルのＴＹＭＰタンパク質が望ましい。
【００１７】
ドセタキセルによる癌患者の治療も、患者の生命を延長するための一般的かつ有効な戦略である。ＴＵＢＢ３タンパク質は、細胞微小管重合体の重要な成分として機能し、リガンド結合の調節にも積極的に関与する。両機能とも、細胞が成長および分裂する助けに関与する。ドセタキセルは、正常な微小管過程およびリガンド結合を阻害することにより、腫瘍細胞が成長および分裂するのを防止する。従って、患者の癌細胞におけるドセタキセルの治療効果は、単にＴＵＢＢ３タンパク質の過剰発現により克服され得るため、ドセタキセルは、臨床医が患者の癌細胞中のＴＵＢＢ３タンパク質の定量レベルを知るのに有用である。臨床医が、癌患者の腫瘍細胞が非常に高レベルのＴＵＢＢ３タンパク質を発現していることを知っている場合、該患者は好ましく反応を示す可能性が低いため、該患者にドセタキセルを処方しない可能性が高い。同様に、患者の腫瘍細胞が非常に少量のＴＵＢＢ３タンパク質を発現している場合、臨床医は、併用療法戦略における化学療法剤の１つとしてドセタキセルを処方する可能性が高いが、その理由は、該薬剤は、癌細胞における正常な微小管機能およびリガンド結合を阻害することにより、腫瘍の成長を停止する助けとなることができる可能性が高いからである。
【００１８】
現在、癌患者組織、特にＦＦＰＥ組織中のタンパク質の存在を判定するための最も広く使用され、適用されている方法は、免疫組織化学（ＩＨＣ）である。ＩＨＣ法は、目的のタンパク質を検出するために抗体を利用する。ＩＨＣ検査の結果は、病理学者または組織技師によって解釈されることが最も多い。この解釈は、主観的なものであり、ＴＵＢＢ３およびＴＹＭＰ陽性腫瘍細胞集団における５ＦＵおよびドセタキセルの感受性などの、標的特異性の腫瘍性タンパク質が標的とする治療薬に対する感受性を予測する定量的データを提供しない。
【００１９】
Ｈｅｒ２  ＩＨＣ検査などの他のＩＨＣアッセイからの研究では、このような検査から得られた結果は誤っている可能性があることを示唆している。これはおそらく、異なる検査室が、陽性および陰性のＩＨＣの状態を分類するための異なるルールを使用していることが原因である。検査を実施する各病理学者も、結果が陽性または陰性であるかどうかを決定するために異なる基準を使用する場合がある。ほとんどの場合、これは、検査結果がボーダーラインにある場合、すなわち、結果が強陽性または強陰性のいずれでもない場合に生じる。他の場合では、癌組織のある領域からの組織は、検査が陽性となり得、一方、癌の異なる領域からの組織は、検査が陰性となる。不正確なＩＨＣ検査結果は、癌と診断された患者が考え得る最良のケアを受けないことを意味し得る。癌の全部または一部が特定の標的腫瘍性タンパク質に陽性であるが、検査結果がそれを陰性と分類する場合、医師は正確な治療を推奨する可能性は低いが、患者はそれらの薬剤から利益を得られる可能性がある。癌が腫瘍性タンパク質標的陰性であるが、検査結果がそれを陽性と分類する場合、医師は特定の治療を推奨し得るが、患者は、何らかの利益を得る可能性は低く、薬剤の二次的なリスクに曝露する。
【００２０】
よって、患者が最適な治療を受ける最大の機会を得るように、腫瘍、特に胃腫瘍中のＴＵＢＢ３およびＴＹＭＰタンパク質の定量レベルを正確に評価できる能力には、大きな臨床的価値がある。
【００２１】
ペプチドの検出および特定のＴＵＢＢ３およびＴＹＭＰ断片ペプチドの定量レベルの決定は、ＳＲＭ／ＭＲＭ法により質量分析計において決定され、それにより、液体組織ライセートに存在する複雑なペプチド混合物内で、各ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャークロマトグラフィーピーク面積が決定される（上記の米国特許第７，４７３，５３２号参照）。次に、ＴＵＢＢ３およびＴＹＭＰタンパク質の定量レベルは、ＳＲＭ／ＭＲＭ法により決定され、それにより、１つの生体サンプル中のＴＵＢＢ３およびＴＹＭＰタンパク質の各々からの個々の特定のペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャークロマトグラフィーピーク面積が、個々の特定のＴＵＢＢ３およびＴＹＭＰ断片ペプチドの各々に対する既知量の「添加(spiked)」内部標準のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャークロマトグラフィーピーク面積と比較される。一実施態様では、内部標準は、合成ペプチドが１以上の重同位体で標識された１以上のアミノ酸残基を含有する、同一の正確なＴＵＢＢ３およびＴＹＭＰ断片ペプチドの合成バージョンである。このような同位体標識内部標準は、質量分析が、天然ＴＵＢＢ３およびＴＹＭＰ断片ペプチドクロマトグラフィーシグネチャーピークとは異なり、かつ、比較ピーク(comparator peaks)として使用され得る、予測可能な一貫したＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャークロマトグラフィーピークを生じさせるように合成される。よって、内部標準が、生体サンプルからのタンパク質またはペプチド調製物に既知量で添加され、質量分析により分析される場合、天然ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャークロマトグラフィーピーク面積は、内部標準ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャークロマトグラフィーピーク面積と比較され、この数値比較は、生体サンプルからの最初のタンパク質調製物に存在する天然ペプチドの絶対モル濃度および／または絶対重量のいずれかを示す。断片ペプチドに関する定量的データは、１サンプルあたりに分析されたタンパク質の量に従って示される。
【００２２】
ＴＵＢＢ３およびＴＹＭＰ断片ペプチドに対するＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを開発するために、ペプチド配列を単に超えた追加の情報が、質量分析計により利用され得る。その追加の情報は、質量分析計（例えば、三連四重極質量分析計）に対して、特定のＴＵＢＢ３およびＴＹＭＰ断片ペプチドの正確かつ集中した分析を実施するように指示および命令するのに重要である。ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを実施する場合の重要な考慮は、このようなアッセイは三連四重極質量分析計で効率的に実施され得ることである。その種類の質量分析計は、１細胞内に含まれる全タンパク質からの数十万〜数百万の個々のペプチドからなり得る非常に複雑なタンパク質ライセート内の単一の単離された標的ペプチドを分析するための最も好適な機器であると考えられ得る。追加の情報は、三連四重極質量分析計に対して、１細胞内に含まれる全タンパク質からの数十万〜数百万の個々のペプチドからなり得る非常に複雑なタンパク質ライセート内の単一の単離された標的ペプチドの分析を可能とするための正確な指示を提供する。
【００２３】
ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、ＭＡＬＤＩ、イオントラップ、イオントラップ／四重極ハイブリッド、または三連四重極を含むいずれの種類の質量分析計で開発および実施され得るが、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイのための現在最も有利な機器プラットフォームは、三連四重極機器プラットフォームであるとみなされることが多い。一般に標的ペプチド、特に、特定のＴＵＢＢ３およびＴＹＭＰ断片ペプチドに関する追加の情報は、各ペプチドのモノアイソトピック質量、その前駆体の荷電状態、前駆体のｍ／ｚ値、ｍ／ｚ遷移イオン、および各遷移イオンのイオン型の１以上を含み得る。特定のＴＵＢＢ３およびＴＹＭＰ断片ペプチドのペプチド配列を表１に示す。 
【００２４】
【表１】
2020522500.tif 000002
【００２５】
ＴＵＢＢ３およびＴＹＭＰの定量化のための適当な参照レベルを決定するため、癌、例えば胃癌に罹患している患者のコホートから腫瘍サンプルを得る。腫瘍サンプルは、標準的な方法を用いてホルマリン固定され、サンプル中のＴＵＢＢ３およびＴＹＭＰのレベルは、上記の方法を用いて測定される。組織サンプルは、当技術分野で周知の方法を用いて、ＩＨＣおよびＦＩＳＨを用いて調べてもよい。コホート内の患者は、１）５−フルオロウラシル／フォリン酸（ＤｅＧｒａｍｏｎｔ）の投与を含んでなる化学療法戦略（治療１）；または２）ＦＯＬＦＩＲＩレジメン（イリノテカン／５−フルオロウラシル／フォリン酸）の初回投与に次いでドセタキセル／シスプラチンの組合せの逐次投与を含んでなる化学療法治療戦略（治療２）のいずれかの組合せで治療される。治療１は５ＦＵ／ＬＶを含んでなり、一方、治療２はＦＯＬＦＩＲＩ＋ドセタキセル／シスプラチンを含んでなる。
【００２６】
患者の反応は、当技術分野で周知の方法を用いて、例えば、治療後の時間間隔での患者の全生存を記録することにより、測定される。好適な参照レベルは、当技術分野で周知の統計的方法を用いて、例えば、ログランク検定の最低ｐ値を決定することにより、決定され得る。参照レベルが決定されたら、それを用いて、患者が治療レジメン１または治療レジメン２の組合せから利益を得られる可能性が高いことを示すＴＵＢＢ３およびＴＹＭＰタンパク質発現レベルを有する患者を同定することができる。当業者ならば、イリノテカン＋５−フルオロウラシル＋フォリン酸を含んでなるＦＯＬＦＩＲＩレジメンが、胃癌患者にとって一般的な治療レジメンであることを認識するであろう。患者の腫瘍サンプル中のＴＵＢＢ３およびＴＹＭＰタンパク質のレベルは、一般にａｍｏｌ／μｇで表されるが、他の単位も使用することができる。当業者ならば、参照レベルは、およそ中心値の範囲、例えば、＋／−２５０、１５０、１００、５０または２５ａｍｏｌ／μｇとして表され得ることを認識するであろう。
【００２７】
核酸およびタンパク質の両方が、同じ液体組織生体分子調製物から分析され得るため、タンパク質が分析された同じサンプル中の核酸から、疾患の診断および薬物治療の決定に関する追加の情報を生成することが可能である。例えば、ＴＵＢＢ３およびＴＹＭＰタンパク質が高レベルで特定の細胞により発現している場合、ＳＲＭによりアッセイされる際、データは、細胞の状態およびそれらの制御されない成長の可能性、最適な療法の選択、ならびに潜在的な薬剤耐性に関する情報を提供し得る。同時に、遺伝子ならびに／またはそれらがコードする核酸およびタンパク質（例えば、ｍＲＮＡ分子およびそれらの発現レベルまたはスプライス変異）の状態に関する情報を、同じ液体組織生体分子調製物に存在する核酸から得ることができる。核酸は、ＴＵＢＢ３およびＴＹＭＰタンパク質を含むタンパク質のＳＲＭ分析と同時に評価され得る。一実施態様では、ＴＵＢＢ３およびＴＹＭＰタンパク質および／または１、２、３、４以上の追加のタンパク質に関する情報は、それらのタンパク質をコードする核酸を調べることにより、評価してもよい。それらの核酸は、例えば、シークエンシング法、ポリメラーゼ連鎖反応法、制限断片多型分析、欠失、挿入の同定、および／もしくは限定されるものではないが、一塩基対多型、トランジション、トランスバージョンを含む変異の存在の判定のうち１以上、２以上、もしくは３以上、またはその組合せにより調べられ得る。
【実施例】
【００２８】
５ＦＵ／ＬＶを含んでなる治療１レジメンに対する単変量コックスモデルにおいて、ＴＵＢＢ３のタンパク質レベルとＯＳとの間の関連性を判定することにより、ＴＵＢＢ３を評価した。連続ＴＵＢＢ３データを用いた分析に加えて、コックス比例モデリングおよびゲーハン・ブレスロウ・ウィルコクソン有意性検定を用いて、ＴＵＢＢ３レベルにより患者を二分するために、カットオフ閾値を導出した。患者の半分を無作為に選択し、ＯＳイベントの数および学習用セットとしてのコホート（第１対第２）に対してバランスを取った。２５〜７５パーセンタイルの間の総ての潜在的値を、学習用セットを「高」群対「低」群に二分するための潜在的閾値として評価し、ＯＳの一連の単変量コックスモデルを２値ＴＵＢＢ３変数に対して当てはめた。次に、学習用セットにおいて最良のコックスモデルの当てはめを示した閾値を検証用セットに適用し、コックスモデルの当てはめを二分されたテストケースにおいて評価した。手順を１０００回繰り返し、１０００の検証用セットにわたる尤度比検定（ＬＲ）のｐ値をロジット法を用いて組み合わせた。閾値を少なくとも１０回選択し、最低の組み合わせたｐ値を選択した。２つのＴＵＢＢ３群で層別化された併合データセットのカプラン・マイヤー曲線を、可視化のために作成した。上記の手順を用いて、閾値７５０ａｍｏｌ／μｇを選択し、患者集団の分離の可能性を検定した。連続変数として、２つの患者集団のわずかな分離がみられたが、基本的にＴＵＢＢ３とＯＳとの間の関連性に関する傾向はなく、治療成績に関する予測値も認められず、ここで、より低いＴＵＢＢ３レベルは、より良いまたはより悪いＯＳと関連していなかった。９３例が７５０ａｍｏｌ／μｇ以下のＴＵＢＢ３レベルを示し、２９例が７５０ａｍｏｌ／μｇ超のＴＵＢＢ３レベルを示している。この胃癌コホートに対するＴＵＢＢ３  ７５０ａｍｏｌ／μｇ以下およびＴＵＢＢ３  ７５０ａｍｏｌ／μｇ超のカットオフを用いたカプラン・マイヤー全生存（ＯＳ）曲線は、統計的有意性を算出するための２つの異なる方法を用いた、これらのＴＵＢＢ３タンパク質レベルに基づき、胃癌患者（ｎ＝１２２）の全生存に対する統計的に有意でない予測値を示す（マンテル・コックス検定  ｐ＝０．４７４４；ゲーハン・ブレスロウ・ウィルコクソン検定  ｐ＝０．２１７９）。ＴＵＢＢ３  ７５０ａｍｏｌ／μｇ未満群のＯＳの中央値は１３２５日であり、一方、ＴＵＢＢ３  ７５０ａｍｏｌ／μｇ超群のＯＳの中央値は１９９１日である。結果を図１に示す。
【００２９】
ＴＵＢＢ３に対する上記と同じ分析アプローチを用いて、５ＦＵ／ＬＶを含んでなる治療レジメン１で治療された同じ患者集団におけるＴＹＭＰとＯＳとの間の関連性を評価した。上記の手順の後、閾値１３３５ａｍｏｌ／μｇを選択した。連続変数として、ＴＹＭＰはＯＳとわずかに有意に関連していたため（コックス検定  ｐ＝０．０１８５；ゲーハン・ブレスロウ・ウィルコクソン検定  ｐ＝０．０３７８）、治療成績に対するいくつかの予測値が得られた。５７例が１３３５ａｍｏｌ／μｇ以下のＴＹＭＰレベルを有し、６５例が１３３５ａｍｏｌ／μｇ超のＴＹＭＰレベルを有していた。１３３５ａｍｏｌ／μｇ超のＴＹＭＰレベルを有する患者は、１３３５ａｍｏｌ／μｇ以下のＴＹＭＰレベルを有する患者よりも有意に優れたＯＳを有していた。ＴＹＭＰレベル１３３５ａｍｏｌ／μｇで二分された併合コホートのカプラン・マイヤーＯＳ曲線を示す。ＴＹＭＰ  １３３５ａｍｏｌ／μｇ以下のＯＳの中央値は１０６２日であり、一方、ＴＹＭＰ  １３３５ａｍｏｌ／μｇ超群のＯＳの中央値は２３６２日であった。これらの結果を図２に示す。
【００３０】
上記と同じ分析アプローチを用いて、ＦＯＬＦＩＲＩ（イリノテカン／５−フルオロウラシル／フォリン酸）に次いでドセタキセル／シスプラチンの組合せの投与を含んでなる治療レジメン２で治療された胃癌患者集団におけるＴＵＢＢ３とＯＳとの間の関連性を評価した。上記の手順の後、閾値７５０ａｍｏｌ／μｇを選択した。連続変数として、ＴＵＢＢ３はＯＳと有意に関連していた（コックス検定  ｐ＝０．０３８２；ゲーハン・ブレスロウ・ウィルコクソン検定  ｐ＝０．０３２９）。１００例が７５０ａｍｏｌ／μｇ以下のＴＵＢＢ３レベルを有し、２５例が７５０ａｍｏｌ／μｇ超のＴＵＢＢ３レベルを有している。７５０ａｍｏｌ／μｇ未満のＴＵＢＢ３レベルを有する患者は、７５０ａｍｏｌ／μｇ超のＴＵＢＢ３レベルを有する患者よりも有意に優れたＯＳを有していた。ＴＵＢＢ３レベル７５０ａｍｏｌ／μｇで二分された併合コホートのカプラン・マイヤーＯＳ曲線を示した。ＴＵＢＢ３  ７５０ａｍｏｌ／μｇ以下のＯＳの中央値は１５６３日であり、一方、ＴＵＢＢ３  ７５０ａｍｏｌ／μｇ超群のＯＳの中央値は８８６日であった。これらの結果を図３に示す。
【００３１】
図４は、ＦＯＬＦＩＲＩ（イリノテカン／５−フルオロウラシル／フォリン酸）に次いでドセタキセル／シスプラチンの組合せの投与を含んでなる治療レジメン２で治療された胃癌患者集団におけるＴＹＭＰとＯＳとの間の関連性を示す。初期の分析との比較には、先に導出したカットオフ１３３５ａｍｏｌ／μｇを選択した。連続変数として、ＴＵＢＢ３はＯＳと有意に関連していなかった（コックス検定  ｐ＝０．４２０；ゲーハン・ブレスロウ・ウィルコクソン検定  ｐ＝０．３４４８）。６９例が１３３５ａｍｏｌ／μｇ以下のＴＹＭＰレベルを有し、５６例が１３３５ａｍｏｌ／μｇ超のＴＹＭＰレベルを有していた。１３３５ａｍｏｌ／μｇ超のＴＹＭＰレベルを有する患者は、１３３５ａｍｏｌ／μｇ未満のＴＹＭＰレベルを有する患者よりも大きいＯＳを有していなかった。ＴＹＭＰレベル１３３５ａｍｏｌ／μｇで二分された併合コホートのカプラン・マイヤーＯＳ曲線を示す。ＴＹＭＰ  １３３５ａｍｏｌ／μｇ以下のＯＳの中央値は１３７９日であり、一方、ＴＹＭＰ  １３３５ａｍｏｌ／μｇ超群のＯＳの中央値は１１４６日であった。
【００３２】
ＴＹＭＰの発現とＯＳとの間の不偏の関連性を導出するため、上記と同じ分析アプローチを用いて、ＦＯＬＦＩＲＩ（イリノテカン／５−フルオロウラシル／フォリン酸）に次いでドセタキセル／シスプラチンの組合せの投与を含んでなる治療レジメン２で治療された胃癌患者集団におけるＴＹＭＰとＯＳとの間の関連性を評価した。上記の手順の後、閾値２８００ａｍｏｌ／μｇを選択した。連続変数として、ＴＹＭＰはＯＳと有意に関連していた（コックス検定  ｐ＝０．０３４４；ゲーハン・ブレスロウ・ウィルコクソン検定  ｐ＝０．０２１１）。９４例が２８００ａｍｏｌ／μｇ以下のＴＹＭＰレベルを有し、３１例が２８００ａｍｏｌ／μｇ超のＴＹＭＰレベルを有していた。２８００ａｍｏｌ／μｇ超のＴＹＭＰレベルを有する患者は、２８００ａｍｏｌ／μｇ未満のＴＹＭＰレベルを有する患者よりも有意に優れたＯＳを有していた。ＴＹＭＰレベル２８００ａｍｏｌ／μｇで二分された併合コホートのカプラン・マイヤーＯＳ曲線を示す。ＴＹＭＰ  ２８００ａｍｏｌ／μｇ以下のＯＳの中央値は１１４６日であった。一方、ＴＹＭＰ  ２８００ａｍｏｌ／μｇ超群のＯＳの中央値は、このＯＳの中央値はこの患者群により達成されていなかったため（２８００日超）、割り当てることができなかった。これらの結果を図５に示す。
【００３３】
併合コホートを、選択された閾値（ＴＵＢＢ３  ７５０ａｍｏｌ／μｇ未満；ＴＹＭＰ  １３３５ａｍｏｌ／μｇ超）でのＴＵＢＢ３およびＴＹＭＰの組合せを用いて層別化した場合、ＴＵＢＢ３  ７５０ａｍｏｌ／μｇ未満およびＴＹＭＰ  １３３５ａｍｏｌ／μｇ超の患者は５１例、ＴＵＢＢ３  ７５０ａｍｏｌ／μｇ超およびＴＯＰＯ２Ａ  １３３５ａｍｏｌ／μｇ未満の患者は７例であった。カプラン・マイヤーＯＳ曲線を、２つの別々のＴＵＢＢ３／ＴＹＭＰ群に層別化した。連続変数として、ＴＵＢＢ３  ７５０ａｍｏｌ／μｇ未満およびＴＹＭＰ  １３３５ａｍｏｌ／μｇ超を有する患者は、より大きなＯＳを有していたが、統計的に有意であるとはみなされなかった（コックス検定  ｐ＝０．０５３９；ゲーハン・ブレスロウ・ウィルコクソン検定  ｐ＝０．０５６１）。ＴＵＢＢ３  ７５０ａｍｏｌ／μｇ未満およびＴＹＭＰ  １３３５ａｍｏｌ／μｇ超の患者群のＯＳの中央値は１５６６日であり、一方、ＴＵＢＢ３  ７５０ａｍｏｌ／μｇ超およびＴＹＭＰ  １３３５ａｍｏｌ／μｇ未満の患者群のＯＳの中央値は４６４日であった。これらの結果を図６に示す。
【００３４】
併合コホートを、異なる選択された閾値（ＴＵＢＢ３  ７５０ａｍｏｌ／μｇ未満；ＴＹＭＰ  ２８００ａｍｏｌ／μｇ超）でのＴＵＢＢ３およびＴＹＭＰの組合せを用いて層別化した場合、ＴＵＢＢ３  ７５０ａｍｏｌ／μｇ未満およびＴＹＭＰ  ２８００ａｍｏｌ／μｇ超の患者は１９例、ＴＵＢＢ３  ７５０ａｍｏｌ／μｇ超およびＴＹＭＰ  ２８００ａｍｏｌ／μｇ未満の患者は１３例であった。カプラン・マイヤーＯＳ曲線を、２つの別々のＴＵＢＢ３／ＴＹＭＰ群に層別化した。連続変数として、ＴＵＢＢ３  ７５０ａｍｏｌ／μｇ未満およびＴＹＭＰ  ２８００ａｍｏｌ／μｇ超を有する患者は、非常に統計的に有意なかなり大きいＯＳを有していた（コックス検定  ｐ＝０．０００２；ゲーハン・ブレスロウ・ウィルコクソン検定  ｐ＝０．０００１）。ＴＵＢＢ３  ７５０ａｍｏｌ／μｇ未満およびＴＹＭＰ  ２８００ａｍｏｌ／μｇ超の患者群のＯＳの中央値は、このＯＳの中央値はこの患者群により達成されていなかったため（２８００日超）、割り当てることができなかった。一方、ＴＵＢＢ３  ７５０ａｍｏｌ／μｇ超およびＴＹＭＰ  ２８００ａｍｏｌ／μｇ未満の患者群のＯＳの中央値は４０８日であった。これらの結果を図７に示す。
【図１】
2020522500.tif 000003
【図２】
2020522500.tif 000004
【図３】
2020522500.tif 000005
【図４】
2020522500.tif 000006
【図５】
2020522500.tif 000007
【図６】
2020522500.tif 000008
【図７】
2020522500.tif 000009
【配列表】
2020522500000001.app
【国際調査報告】
2020522500.tif 000010
2020522500.tif 000011