(57)【要約】  本出願は、ヒト内在性レトロウイルスタンパク質に関する。このヒト内在性レトロウイルスタンパク質は本明細書中ではHEMOと称される。本出願は、より具体的にはHEMOタンパク質の脱離形態に、より具体的には循環血液に放出されるHEMOの脱離形態に関する。本出願はまた、抗体、核酸ベクター及び組換え細胞などのHEMOの脱離形態に由来する物質、並びに、これら脱離形態又は由来物質の医学的又はバイオテクノロジー応用、とりわけ胎盤発生、胎児保護、癌治療及び幹細胞産生の分野における応用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
内在性北方真獣類レトロウイルスEnvタンパク質のエクトドメインのＮ末端フラグメントからなるポリペプチドであって
ａ．前記レトロウイルスEnvタンパク質は
・  配列番号１のアミノ酸配列、又は
・  配列番号１に対して少なくとも59％同一、より具体的には配列番号１に対して少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％若しくは99％同一であるアミノ酸配列、又は
・  配列番号129〜143の配列から選択される配列
であり、
ｂ．前記レトロウイルスEnvタンパク質のエクトドメインは、シグナルペプチドもそのフラグメントも有さない状態では、
・  前記配列の443〜468又は443〜467アミノ酸、より具体的にはＮ末端→Ｃ末端方向に
i. CWLCアミノ酸配列
ii. CTQG配列、CTQR配列、CIQR配列、RTQR配列及びRTKR配列から選択されるアミノ酸配列、及び
iv. 配列番号149のアミノ酸配列
を含む前記配列の443〜468又は443〜467アミノ酸からなり、より具体的には、配列番号178、912及び547〜561の配列と、配列番号172、911及び457〜471の配列の少なくとも１つのフラグメントであり且つ配列番号178、912及び547〜561の配列の少なくとも１つの長さと最大７又は８アミノ酸異なる配列とから選択される配列からなり、
ここで、前記Ｎ端末フラグメントの配列は：
・  前記エクトドメインの数より少ない数のアミノ酸からなり、前記少ない数が344〜457又は374〜446から選択され、
・  前記エクトドメインのＮ末端先端から始まり
・  b.i.の配列及びb.ii.の配列を含む、
ポリペプチド。
【請求項２】
ａ．前記レトロウイルスEnvタンパク質は
・  配列番号１のアミノ酸配列、又は
・  配列番号１に対して少なくとも59％同一、より具体的には配列番号１に対して少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％若しくは99％同一であるアミノ酸配列、又は
・  配列番号129〜143の配列から選択される配列
であり、
ｂ．前記レトロウイルスEnvタンパク質のエクトドメインは、シグナルペプチドもそのフラグメントも有さない状態では、
・  前記配列の443〜468又は443〜467アミノ酸、より具体的にはＮ末端→Ｃ末端方向に
i. CWLCアミノ酸配列
ii. CTQG配列、CTQR配列、CIQR配列及びRTKR配列から選択されるアミノ酸配列
iii. 配列番号148のアミノ酸配列、及び
iv. 配列番号149のアミノ酸配列
を含む前記配列の443〜468又は443〜467アミノ酸からなり、より具体的には、配列番号178、912及び547〜560の配列と、配列番号172、911及び457〜470の配列の少なくとも１つのフラグメントであり且つ配列番号178、912及び547〜560の配列の少なくとも１つの長さと最大７又は８アミノ酸異なる配列とから選択される配列からなり、
ここで、前記Ｎ端末フラグメントの配列は：
・  前記エクトドメインの数より少ない数のアミノ酸からなり、前記少ない数が344〜457又は374〜446から選択され、
・  前記エクトドメインのＮ末端先端から始まり
・  b.i.の配列及びb.ii.の配列を含む、
請求項１に記載の内在性北方真獣類レトロウイルスEnvタンパク質のエクトドメインのＮ末端フラグメントからなるポリペプチド。
【請求項３】
ａ．前記レトロウイルスEnvタンパク質は
・  配列番号143のアミノ酸配列、又は
・  配列番号143に対して少なくとも80％同一、より具体的には配列番号143に対して少なくとも81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％若しくは99％同一であるアミノ酸配列
であり、
ｂ．前記レトロウイルスEnvタンパク質のエクトドメインは、シグナルペプチドもそのフラグメントも有さない状態では、前記配列の443〜468又は443〜467アミノ酸、より具体的にはＮ末端→Ｃ末端方向に
i. CWLCアミノ酸配列
ii. RTQR配列、及び
iv. 配列番号149のアミノ酸配列
を含む前記配列の443〜468又は443〜467アミノ酸からなり、より具体的には、配列番号561及び951の配列と、配列番号471及び949の配列のフラグメントであり且つ配列番号561及び951の配列の少なくとも１つの長さと最大７又は８アミノ酸異なる配列とから選択される配列からなり、
きこで、前記Ｎ端末フラグメントの配列は：
・  前記エクトドメインの数より少ない数のアミノ酸からなり、前記少ない数が352〜457又は374〜446から選択され、
・  前記エクトドメインのＮ末端先端から始まり、
・  b.i.の配列及びb.ii.の配列を含む、
請求項１に記載の内在性ネコレトロウイルスタンパク質のエクトドメインのＮ末端フラグメントからなるポリペプチド。
【請求項４】
前記Ｎ末端フラグメントの配列が前記エクトドメインより少ない数のアミノ酸からなり、前記少ない数が354〜456又は374〜446から選択される、請求項２に記載の内在性北方真獣類レトロウイルスEnvタンパク質のエクトドメインのＮ末端フラグメントからなるポリペプチド。
【請求項５】
ａ．前記Ｎ末端フラグメントのＣ末端先端は、配列番号１、129〜134及び136〜137の配列の380位アミノ酸から480位アミノ酸までに位置し、且つ配列番号１、129〜134及び136〜137の配列の膜貫通ドメインのＮ末端先端の前であって、配列番号１、129〜134及び136〜137の配列の膜貫通ドメインのＮ末端先端の６〜112アミノ酸上流に位置するか、又は
ｂ．前記Ｎ末端フラグメントのＣ末端先端は、配列番号135の配列の379位アミノ酸から479位アミノ酸までに位置し、且つ配列番号135の配列の膜貫通ドメインのＮ末端先端の前であって、配列番号135の配列の膜貫通ドメインのＮ末端先端の６〜112アミノ酸上流に位置するか、又は
ｃ．前記Ｎ末端フラグメントのＣ末端先端は、配列番号138の配列の380位アミノ酸から479位アミノ酸までに位置し、且つ配列番号138の配列の膜貫通ドメインのＮ末端先端の前であって、配列番号138の配列の膜貫通ドメインのＮ末端先端の６〜111アミノ酸上流に位置するか、又は
ｄ．前記Ｎ末端フラグメントのＣ末端先端は、配列番号139〜140及び142の配列の380位アミノ酸から476位アミノ酸までに位置し、且つ配列番号139〜140及び142の配列の膜貫通ドメインのＮ末端先端の前であって、配列番号139〜140及び142の配列の膜貫通ドメインのＮ末端先端の３〜105アミノ酸上流に位置するか、又は
ｅ．前記Ｎ末端フラグメントのＣ末端先端は、配列番号141の配列の370位アミノ酸から466位アミノ酸までに位置し、且つ配列番号141の配列の膜貫通ドメインのＮ末端先端の前であって、配列番号141の配列の膜貫通ドメインのＮ末端先端の３〜105アミノ酸上流に位置する、
請求項２又は４に記載の内在性北方真獣類レトロウイルスEnvタンパク質のエクトドメインのＮ末端フラグメントからなるポリペプチド。
【請求項６】
ａ．前記レトロウイルスEnvタンパク質は
・  配列番号１のアミノ酸配列、又は
・  配列番号１に対して少なくとも80％同一、より具体的には配列番号１に対して少なくとも81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％若しくは99％同一であるアミノ酸配列
であり、
ｂ．前記エクトドメインは、シグナルペプチドもそのフラグメントも有さない状態では、
・  前記配列の443〜468又は443〜467アミノ酸、より具体的にはＮ末端→Ｃ末端方向に
i. CWLCアミノ酸配列
ii. CTQG配列、CTQR配列、CIQR配列及びRTKR配列から選択されるアミノ酸配列
iii. 配列番号148のアミノ酸配列、及び
iv. 配列番号149のアミノ酸配列
を含む前記配列の443〜468又は443〜467アミノ酸からなり、より具体的には、
・  配列番号178及び912の配列と、配列番号172及び911の配列の少なくとも１つのフラグメントであり且つ配列番号178及び912の配列の少なくとも１つの長さと最大７又は８アミノ酸異なる配列とから選択される配列からなり、
ここで、前記Ｎ端末フラグメントの配列は：
・  前記エクトドメインの数より少ない数のアミノ酸からなり、前記少ない数が354〜456又は374〜446から選択され、
・  前記エクトドメインのＮ末端先端から始まり
・  b.i.の配列及びb.ii.の配列を含み
・  前記Ｎ末端フラグメントのＣ末端先端は、配列番号１の配列の380位アミノ酸から480位アミノ酸までに位置し、且つ配列番号１の配列の膜貫通ドメインのＮ末端先端の前であって、配列番号１の配列の膜貫通ドメインのＮ末端先端の６〜112アミノ酸上流に位置する、
請求項２及び４〜５のいずれか一項に記載の内在性ヒトレトロウイルスEnvタンパク質のエクトドメインのＮ末端フラグメントからなるポリペプチド。
【請求項７】
ａ．前記エクトドメインのＮ末端フラグメントの配列は、請求項２のb.iiiの全長配列を含まないが請求項２のb.iiiの全長配列のフラグメントを含み
ｂ．より具体的には前記エクトドメインのＮ末端フラグメントの配列は、配列番号９〜10、183〜184及び185〜186の配列から選択される配列を含んでなるか又は該配列からなる、
請求項２及び４〜６いずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
ａ．前記エクトドメインのＮ末端フラグメントの配列は、請求項２のb.iiiの全長配列も、請求項２のb.iiiの全長配列のフラグメントも含まず
より具体的には、前記エクトドメインのＮ末端フラグメントの配列は、配列番号13〜33、670〜689、195〜215、690〜709、216〜236及び710〜729の配列から選択される配列を含んでなるか又は該配列からなり
又は
ｂ．前記エクトドメインのＮ末端フラグメントの配列は、請求項２のb.iiiに記載の全長配列を含み、
より具体的には、前記エクトドメインのＮ末端フラグメントの配列は、配列番号55〜75、830〜839、300〜320、840〜849、321〜341及び850〜859の配列から選択される配列を含んでなるか又は該配列からなる、
請求項２及び４〜６いずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記エクトドメインのＮ末端フラグメントの配列は、配列番号９〜10、184〜186、991〜1071の配列から選択される配列を含んでなるか又は該配列からなる、
請求項２及び４〜６いずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
内在性北方真獣類レトロウイルスEnvタンパク質のエクトドメインのフラグメントからなるポリペプチドであって、前記フラグメントが前記レトロウイルスEnvタンパク質のエクトドメインのＣ末端フラグメントを含み、
ａ．前記レトロウイルスEnvタンパク質及び前記エクトドメインは請求項１〜９のいずれか一項に記載の通りであり、
ｂ．前記Ｃ末端フラグメントが前記エクトドメインのＮ末端部を含まずに前記エクトドメインのＣ末端フラグメントを含み
ｃ．前記Ｃ末端フラグメントは、前記エクトドメインからの請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチドの切断後に残るＣ末端フラグメント、より具体的には前記Ｃ末端フラグメントの配列は、配列番号11〜12及び189〜194から選択される配列又は配列番号34〜54、237〜299及び730〜809から選択される配列又は配列番号76〜96、342〜404及び860〜899から選択される配列からなる、
ポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のポリペプチドと少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％若しくは99％の同一性を有する請求項１〜１０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
請求項１０に記載のポリペプチドを発現する単離された細胞又は該細胞の部分であって、
請求項１０に記載のポリペプチドの一部が前記細胞の表面又は該細胞の前記部分に発現され、前記表面に発現される部分は、請求項１０に記載のポリペプチドに含まれるエクトドメインのＣ末端フラグメントを含み、より具体的には、前記細胞又は該細胞の前記部分が胎盤細胞若しくは胎盤細胞の部分、幹細胞若しくは幹細胞の部分、腫瘍細胞若しくは腫瘍細胞の部分又は腫瘍幹細胞若しくは腫瘍幹細胞の部分である、細胞又は該細胞の部分。
【請求項１３】
治療に使用するための、より具体的には北方真獣類の胎盤形成不全の治療、又は北方真獣類が有する胎仔の微生物感染、より具体的にはウイルス感染に対する保護の欠損の治療に使用するための、請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
ａ．抗体、又は
ｂ．モノクローナル抗体、より具体的には受託番号I-5211にてCNCMに寄託されたハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体、又は
ｃ．Fab、Fab'若しくはF(ab)2フラグメント、又は
ｄ．scFv、又は
ｅ．sdAb、又は
ｆ．sdAbの可変ドメイン
であり、少なくとも１つの薬物に連結されていてもいなくてもよく、請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチドに特異的に結合する物質。
【請求項１５】
ａ．抗体、又は
ｂ．Fab、Fab'若しくはF(ab)2フラグメント、又は
ｃ．scFv、又は
ｄ．sdAb、又は
ｅ．sdAbの可変ドメイン
であり、少なくとも１つの薬物に連結されていてもいなくてもよく、請求項１０に記載のポリペプチドに特異的に結合する物質。
【請求項１６】
キメラ抗原受容体がTCRシグナル伝達ドメインに連結されたscFvを含み、前記scFvが請求項１４又は１５に記載のscFvであるキメラ抗原受容体Ｔ細胞(CAR-Ｔ細胞)。
【請求項１７】
治療に使用するため、より具体的には抗癌治療に使用するための請求項１４若しくは１５に記載の物質又は請求項１６に記載のCAR-Ｔ細胞であって、前記物質又はCAR-Ｔ細胞が腫瘍細胞又は腫瘍幹細胞に結合し、前記癌がより具体的には卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、妊娠性癌、乳癌、肺癌、胃癌、結腸癌、肝臓癌、腎臓癌、前立腺癌、尿路上皮癌、胚細胞癌、脳腫瘍、頭部頸部癌、膵臓癌、甲状腺癌、胸腺癌、皮膚癌、骨肉腫又は骨髄癌である、物質又はCAR-Ｔ細胞。
【請求項１８】
次の２つのステップａ及びｂ：
ａ．試料中の可溶形態に含まれるポリペプチドであって、請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチドの検出
及び/又は
ｂ．試料中の細胞であって、請求項１２の細胞であるか又は該細胞を含む細胞の検出
の少なくとも１つを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチド又は請求項１２の細胞を検出するインビトロ方法。
【請求項１９】
被験体における腫瘍の出現を検出し又は腫瘍の進展を追跡するための請求項１８に記載のインビトロ方法であって、前記被験体が北方真獣類であり、前記インビトロ方法が次の２つのステップａ及びｂ：
ａ．試料中に可溶形態で含まれるポリペプチドであって、請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチドの検出ステップ、ここで、前記試料が
・  前記被験体の血液若しくは尿若しくは腹水試料、又は
・  前記腫瘍の生検試料、又は
・  前記血液若しくは尿若しくは腹水若しくは腫瘍生検試料の可溶性タンパク質抽出物
であり、ここで、前記試料中の可溶形態の前記ポリペプチドの検出は、腫瘍細胞又は腫瘍幹細胞が前記被験体に存在することを示す、ステップ
及び/又は
ｂ．試料中の細胞であって、請求項１２の細胞であるか又は該細胞を含む細胞の検出ステップ、ここで、前記試料が
・  前記被験体の血液若しくは尿若しくは腹水試料、又は
・  前記腫瘍の生検試料、又は
・  前記血液若しくは尿若しくは腹水若しくは生検試料の細胞画分
であり、ここで、前記試料中の前記細胞の検出は、腫瘍細胞又は腫瘍幹細胞が前記被験体に存在することを示す、ステップ
の少なくとも１つを含む、方法。
【請求項２０】
対照被験体の試料中で測定される平均濃度より高い濃度で請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチドを分泌する腫瘍の出現を検出するための、請求項１９に記載のインビトロ方法。
【請求項２１】
治療後の腫瘍の再出現を検出するための請求項１９に記載のインビトロ方法。
【請求項２２】
被験体の腫瘍の組織型、悪性度又はステージを決定するための請求項１８に記載のインビトロ方法であって、前記被験体が北方真獣類であり、前記インビトロ方法が次の２つのステップａ及びｂ：
ａ．試料中に可溶形態で含まれるポリペプチドであって、請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチドの検出ステップ、ここで、前記試料が
・  前記被験体の血液若しくは尿若しくは腹水試料、又は
・  前記腫瘍の生検試料、又は
・  前記血液若しくは尿若しくは腹水若しくは腫瘍生検試料の可溶性タンパク質抽出物
であり、ここで、前記試料中の可溶形態の前記ポリペプチドの検出は、前記腫瘍の組織型、悪性度又はステージを決定する、ステップ
及び/又は
ｂ．試料中の細胞であって、請求項１２の細胞であるか又は該細胞を含む細胞の検出ステップ、ここで、前記試料が
・  前記被験体の血液若しくは尿若しくは腹水試料、又は
・  前記腫瘍の生検試料、又は
・  前記血液若しくは尿若しくは腹水若しくは生検試料の細胞画分
であり、ここで、前記試料中の前記細胞の検出は、前記腫瘍の組織型、悪性度又はステージを決定する、ステップ。
の少なくとも１つを含む方法。
【請求項２３】
妊娠被験体の胎盤形成不全、より具体的には前記妊娠被験体を胎盤剥離、子癇前症又は子癇のリスクに曝す胎盤形成不全を検出するための請求項１８に記載のインビトロ方法であって、前記被験体が北方真獣類であり、前記インビトロ方法が次の２つのステップａ及びｂ：
ａ．試料中の可溶形態のポリペプチドであって、請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチドの量又は濃度を測定するステップ、ここで、前記試料が
・  前記被験体の血液若しくは尿若しくは羊水試料、又は
・  前記血液若しくは尿若しくは羊水試料の可溶性タンパク質抽出物
であり、ここで、前記試料中の前記量又は濃度が前記被験体の胎盤形成不全を示す、ステップ
及び/又は
ｂ．試料中の細胞であって、請求項１２の細胞である細胞の量又は濃度を測定するステップ、ここで、前記試料が
・  前記北方真獣類の血液若しくは尿若しくは羊水試料、又は
・  前記北方真獣類の胎盤試料、又は
・  前記血液若しくは尿若しくは羊水若しくは胎盤試料の細胞抽出物
であり、ここで、前記試料中の前記量又は濃度が前記被験体の胎盤形成不全を示す、ステップ
の少なくとも１つを含む方法。
【請求項２４】
北方真獣類の循環血液試料又は該試料の細胞画分から細胞を精製又は単離することを含んでなり、前記細胞を精製又は単離することが、請求項１４又は１５に記載の物質であるリガンドに結合する細胞をポジティブ選択することを含む、北方真獣類の循環性細胞を精製又は単離するため、より具体的には腫瘍細胞又は腫瘍幹細胞又は胎盤細胞である北方真獣類循環性細胞を精製又は単離するためのインビトロ方法。
【請求項２５】
北方真獣類の新鮮な腫瘍又は生検試料中の非循環性細胞を精製又は単離して該非循環性細胞を特徴決定するインビトロ方法であって、前記非循環性細胞を精製又は単離することが請求項１４又は１５に記載の物質であるリガンドに結合する細胞をポジティブ選択することを含む、方法。
【請求項２６】
多能性関連遺伝子を体細胞へ導入すること、及び導入された多能性関連遺伝子を発現する体細胞を選択することを含み、前記多能性関連遺伝子が請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチド及び/又は請求項１０に記載のポリペプチドからなるポリペプチドをコードする遺伝子を含む、体細胞からの多能性幹細胞を誘導するためのインビトロ方法。
【請求項２７】
次の５つの用途：
ａ．北方真獣類である被験体における腫瘍出現の検出又は腫瘍の進展の追跡
及び/又は
ｂ．卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、妊娠性癌、乳癌、肺癌、胃癌、結腸癌、肝臓癌、腎臓癌、前立腺癌、尿路上皮癌、胚細胞癌、脳腫瘍、頭部頸部癌、膵臓癌、甲状腺癌、胸腺癌、皮膚癌、骨肉腫又は骨髄癌である腫瘍の組織型、悪性度又はステージの決定
及び/又は
ｃ．妊娠被験体の胎盤形成不全、より具体的には前記妊娠被験体を胎盤剥離、子癇前症又は子癇のリスクに曝す胎盤形成不全の検出
及び/又は
ｄ．北方真獣類の循環性細胞の精製又は単離、より具体的には腫瘍細胞又は腫瘍幹細胞又は胎盤細胞である北方真獣類循環性細胞の精製又は単離
及び/又は
ｅ．北方真獣類の非循環性細胞の精製又は単離、より具体的には北方真獣類の新鮮な腫瘍又は生検試料中の非循環性細胞の精製又は単離
の少なくとも１つに使用される物質を含み、ここで、該物質は請求項１４又は１５に記載の物質であり、前記物質は検出標識に連結又は結合されていてもいなくてもよい、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
分野
本出願は、ヒト内在性レトロウイルスタンパク質に、特に遺伝子ERVMER34-1(ORF LP9056)にコードされたヒト内在性レトロウイルスタンパク質に関する。本明細書中では、このヒト内在性レトロウイルスタンパク質はヒト内在性MER34 ORF(Human Endogenous MER34 ORF)、いわゆるHEMOタンパク質と称する。このHEMOタンパク質は北方真獣類(Boreoeutheria)間、特に真主齧上目(Euarchontoglires)及びローラシア獣上目(Laurasiatheria)間、より詳細には霊長類間で保存される。
本出願は、より具体的にはHEMOタンパク質の脱離形態(shed form)に、より具体的には循環血液に放出されるHEMOの脱離形態に関する。本出願はまた、抗体、核酸ベクター及び組換え細胞などのHEMOの脱離形態に由来する物質、並びに、これら脱離形態又は由来物質の医学的又はバイオテクノロジー応用、とりわけ胎盤発生、胎児保護、癌診断、癌治療及び幹細胞産生における応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
内在性レトロウイルス配列はヒトゲノムの約８％を占める。この配列(ヒト内在性レトロウイルスではHERVと呼ぶ)は今日のレトロウイルスと強い類似性を示し、活性なレトロウイルスによる祖先の生殖細胞系列感染の(その後、メンデル則に従って伝達されてきた)プロウイルス残渣である。ヒトゲノムに認められる30,000以上のプロウイルスコピーは約80の異なるファミリーに分類でき、これらエレメントの多くは、変異、挿入、欠失及び/又は短縮の蓄積のため、タンパク質をコードしていない。しかしながら、一部のレトロウイルス遺伝子はコーディング能力を保持しており、その幾つかは生理学的役割について遠い霊長類祖先から分岐している。これは、いわゆる「シンシチン」、すなわちヒトにおけるシンシチン-1及びシンシチン-2(それぞれが25及び40Myaに捕捉されたレトロウイルスエンベロープ(env)であり、全長タンパク質コード配列、融合活性及び強力な胎盤発現を有する)についてまさにそうである(Mi et al. 2000；Blond et al. 2000；Blaise et al. 2003；Lavialle et al. 2013)。これら遺伝子は、胎盤形成に関与することが示されており、その融合活性は、下層の単核細胞栄養芽層のシンシチン媒介細胞-細胞融合の結果として、母児界面での合胞体栄養細胞層の形成に寄与する。その後、シンシチンは、調べられた全ての有胎盤哺乳動物で同定され、その胎盤形成における明白な役割がノックアウトマウスの作製及び特徴決定により示された。シンシチンは有袋動物にも存在し、有袋動物では、外袋にて胚が発達する前の非常に一過性に(数日間)形成される短命の胎盤に発現される。
【０００３】
ヒトゲノム内の内在性レトロウイルスEnvタンパク質をコードする遺伝子の以前の系統的探索により、全長コード配列を有する18遺伝子(とりわけ、シンシチン-1及びシンシチン-2)が同定された(de Parseval et al. 2003；Villesen et al. 2004)。これら分析は、とりわけ、Ｎ末端→Ｃ末端に
シグナルペプチド
表面サブユニット(SU)と、ほとんどのオンコレトロウイルスに見出される免疫制御ドメイン(ISD、17aaモチーフ)を含む付加シグネチャを有する膜貫通(TM)サブユニットとの間の(正準)フリン切断部位(R-X-R/K-R))
特徴的なC-(X)6-7-Cモチーフ
細胞膜又はビリオン膜にEnvタンパク質を係留する膜貫通疎水性ドメイン
を含む、レトロウイルスEnvにより保有される特徴的モチーフの探索に基づく方法を使用して実施されてきた(de Parseval et al. 2005；Henzy et al. 2013)。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本出願は、従来のヒト内在性レトロウイルスEnvタンパク質の構造的特徴の全てではなく、幾つかを有し、前例のない特性、より具体的には前例のない脱離(shedding)特性を示すヒト内在性レトロウイルスEnvタンパク質に関する。
【０００５】
要旨
本出願は、ヒト遺伝子ERVMER34-1(ORF LP9056)にコードされたヒト内在性レトロウイルスタンパク質に関する。このタンパク質は、本明細書中において一般には、ヒト内在性MER34 ORF(Human Endogenous MER34 ORF)の略称であるHEMOと呼ばれる。
本発明者らは、HEMOタンパク質をコードする遺伝子が100Myaを超える哺乳動物祖先のゲノムに侵入したこと、及び、HEMOタンパク質が北方真獣類(Boreoeutheria)の間、より具体的には真主齧上目(Euarchontoglires)及びローラシア獣上目(Laurasiatheria)の間、より具体的には真主齧上目の間、より具体的には霊長類間で保存されていることを示した(図10Bを参照)。
従来のヒト内在性レトロウイルスEnvタンパク質に比べると、ヒトHEMOタンパク質は、正準フリン切断部位を欠いており(正準R-X-R/K-R部位を欠いているが、(図1Cの352位〜355位に)非通常CTQG部位を示す)、隣接する疎水性融合ペプチドを欠いている(図1A、1B、1Cを参照)。
【０００６】
HEMOは前例のない特性、より具体的には前例のない脱離特性を示す。実際、HEMOタンパク質のエクトドメインは、脱離(shedding)により切断されて、HEMOエクトドメインフラグメントが循環血液に放出される(図13を参照)。ヒトHEMOの脱離により生成される主要な可溶性フラグメントは、シグナルペプチド後の最初のアミノ酸から432位又は433位アミノ酸(含む)まで伸びる(図1Cを参照：25位アミノ酸、26位アミノ酸又は27位アミノ酸Lから432位アミノ酸Q若しくは433位アミノ酸Rまで、図13を参照：切断部位１)。副次の可溶性フラグメントは、シグナルペプチド後の最初のアミノ酸から450〜480位及び380〜420位(図13を参照、切断部位２及び３)及び421〜449位から選択される位置のアミノ酸(含む)まで伸びるヒトHEMOフラグメントを含む。
HEMOタンパク質は幹細胞により、また胎盤により高度に発現され、妊婦血液中の濃度が増加する。HEMOタンパク質はまた、幾つかの(ヒト)腫瘍で発現され、よって病状のマーカー、場合により免疫療法の標的を提供する。
HEMOタンパク質は、正常細胞の「幹細胞性(stemness)」マーカーとして、及びがん免疫療法の「標的」として認識することができる。
【０００７】
本出願は、より具体的にはHEMOタンパク質の脱離形態(shed form)、より具体的には循環血液に放出されるHEMOの脱離形態に関する。
本出願はまた、抗体、核酸ベクター及び組換え細胞などの、HEMOの脱離形態由来の物質に関する。
本出願はまた、脱離形態又は由来物質の医学的又はバイオテクノロジー応用に関し、とりわけ胎盤発生、胎児保護、癌診断、癌治療及び幹細胞産生の分野における応用に関する。
特に、本出願は、
-  癌診断
-  腫瘍タイプ決定
-  癌免疫療法
-  治療薬のスクリーニング、例えば、(癌の緩和又は予防を含む)癌治療に有用であり得る薬剤のスクリーニング、又は胎盤発生の欠損(例えば、胎盤剥離、子癇前症、子癇)の治療に有用であり得る薬剤のスクリーニング、又は胎児保護(例えば、ウイルス又は微生物感染に対する防御)に有用であり得る薬剤のスクリーニング
-  循環性細胞の精製(例えば、腫瘍循環性細胞の精製又は循環栄養芽細胞の精製)
-  (体細胞からの)人工多能性幹細胞の産生
に有用である手段に関する。
【０００８】
図面の簡単な説明
本出願が言及する図の一部はカラーである。出願当初の出願は、図のカラープリントを含んでおり、したがって出願当初の出願ファイルを閲覧することによりアクセス可能である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１−１】図1A、1B、1C、1D：正準レトロウイルスEnvタンパク質の構造及びヒトHEMO Envの特徴決定。(A) SU及びTMサブユニットを示す、レトロウイルスEnvタンパク質の模式図。２つのユニット間のフリン切断部位(コンセンサス：R-X-R/K-R)、SU-TM相互作用に関与するC-X-X-Cモチーフ、疎水性のシグナルペプチド(紫色)、融合ペプチド(緑色)、膜貫通ドメイン(赤色)及び推定の免疫抑制ドメイン(ISD)(青色)を、保存されたC-X5/6/7-CCモチーフと併せて示す。(B) HEMO Envの疎水性プロフィール。Aにおいて強調された正準構造的特徴が位置しており、Aにおいて用いられたカラーコードで示される。変異フリン部位(CTQG)を点線で示す。(C) 同じカラーコードを有するHEMO Envタンパク質のアミノ酸配列。
【図１−２】図1A、1B、1C、1D：正準レトロウイルスEnvタンパク質の構造及びヒトHEMO Envの特徴決定。(D) 同定されたHEMO Envタンパク質を有するレトロウイルスEnvタンパク質ベースの系統樹。最尤樹は、HERV Env(HERV-Kコンセンサスを含む)の全長SU-TMアミノ酸配列、以前に同定された全てのシンシチン並びに一連の内在性及び感染性レトロウイルスを使用して構成した。水平枝の長さは部位あたりのアミノ酸置換の平均数に比例し(左下のスケールバーを参照)、1,000の複製物から得られたパーセントブートストラップ値はノードに示す。ALV(トリ白血病ウイルス)、BaEV(ヒヒ内在性ウイルス)、BLV(ウシ白血病ウイルス)、Env-Cav1(シンシチン様モルモット(Cavia porcellus)Env1タンパク質)、FeLV(ネコ白血病ウイルス)、FIV(ネコ免疫不全ウイルス)、GaLV(テナガザル白血病ウイルス)、HERV(ヒト内在性レトロウイルス)、HIV1(HIV１型)、HTLV-2(ヒトＴリンパ向性ウイルス２型)、mlAPE(env遺伝子を有するハツカネズミ嚢内Ａタイプ粒子)、JSRV(ヤーグジークヒツジレトロウイルス)、KoRV(コアラレトロウイルス)、MMTV(マウス乳癌ウイルス)、MoMLV(モロニーマウス白血病ウイルス)、MPMV(Mason-Pfizerモンキーウイルス)、PERV-A(ブタ内在性レトロウイルス)、RD114(ネコ内在性Ｃ型レトロウイルス)、Rev-A(細網内皮症ウイルスＡ型)、BIV(ウシ免疫不全ウイルス)、Env-panMars(保存有袋動物Env-2)。
【図２−１】図2A、2B、2C、2D、2E、2F：HEMO Env遺伝子の特徴決定(A) 染色体４(4q12、ゲノムリファレンスコンソーシアムのGRCh38アセンブリ座標)でのHEMO遺伝子座の模式図。上：コンセンサスアミノ酸配列に従って表示された、MER34-intコンセンサス(Repbase)並びに推定gag、pro及びpolレトロウイルスORF。点線は、HEMO座に見出されるMER34配列の部分を表す。中：HEMO遺伝子座(11kb)は、RASL11B遺伝子(〜120 kb 5')とUSP46遺伝子(〜120 kb 3')の間に位置する。HEMO env ORFをオレンジ色のボックスとして示し、Dfam.orgウェブサイトで同定された反復配列は異なる色のボックスで示し、センス配列を線の上に、アンチセンス配列を線の下に示す。注目すべきことに、この遺伝子は、短縮型の推定3'LTR(MER34-A)であり5'LTRのない縮重pol配列(大部分が反対に配向)のみを維持するMEr34プロウイルスの部分である。この遺伝子と100kb離れて別のMER34配列は見られない。EMBOSS-newcpgreportソフトウェアで検出されたCpGアイランド(染色体4:52750911-52751703)は緑色のボックスとして示す。下：NCBI及びRNA転写物から予測されたイントロン-エクソン構造：5'及び3'RACE実験で決定された胎盤RNAに見られるエクソンを示し、その下に、主要なE1-E2-E4スプライスされたenvサブゲノム転写物を示す。HEMO env ORFの開始部位ヌクレオチド配列(ACTTC...)及びアクセプタースプライス部位を示す。矢印はqRT-PCRプライマーを指している(表４を参照)。
【図２−２】図2A、2B、2C、2D、2E、2F：HEMO Env遺伝子の特徴決定(B) 20のヒト組織のパネル及び16のヒト細胞株のパネルにおけるHEMO転写物のリアルタイムqRT-PCR分析。転写物レベルは、最大値のパーセンテージで示し、ハウスキーピング遺伝子の量に対して規格化されている(「方法」を参照)。胎盤の値は妊娠第一期からの12試料の平均値であり、その他の組織は市販のパネル(Zyagen)のものである。
【図２−３】図2A、2B、2C、2D、2E、2F：HEMO Env遺伝子の特徴決定(C) 転写開始部位(赤色で示すACTTC  +1)付近のCpGアイランドプロモーター(CGジヌクレオチドを緑色で強調する)。エクソン１及びエクソン２は枠で囲まれている。灰色のヌクレオチド配列は亜硫酸水素塩処理後に分析された２つのフラグメント(I及びII；左側に縦線で示す)の増幅に使用されたプライマー配列を表す(パネルＥ)。
【図２−４】図2A、2B、2C、2D、2E、2F：HEMO Env遺伝子の特徴決定(D) CpGアイランドプロモーターのルシフェラーゼアッセイ上：プロモーター-ルシフェラーゼ構築物並びにエクソンE1及びE2を含むCpGアイランド(緑色)の模式図。E2は、スプライシングをルシフェラーゼ遺伝子の外に限定するために、3'末端がドナースプライス部位の28bp上流で短縮されている。下：各pGL3構築物のプロモーター配列を白色ボックスで示す(座標は、本遺伝子の＋１転写開始部位からの相対位置である)。対照(「なし」)は、挿入配列の無い基本pGL3ベクターに対応する。発光単位(LU)で表示されるプロモーター活性は、pGL3ベクターをトランスフェクトした293T細胞の溶解物中で、ルシフェラーゼリポーターアッセイを用いて測定された。プロットされたデータは、３つの独立実験の平均値である。
【図２−５】図2A、2B、2C、2D、2E、2F：HEMO Env遺伝子の特徴決定(E) HEMO遺伝子を発現しない細胞株(293TとBeWo細胞)又は発現する細胞株(iPSCとCaCo-2)のゲノムDNAの亜硫酸水素塩処理と、パネルＣに示したフラグメントI(26CpG)及びII(33CpG)のPCR増幅により明らかにされるHEMOプロモーター領域のメチル化状態。このグラフは、各PCR増幅フラグメントについて10クローンの配列決定を表し、メチル化CpG(黒丸)及び非メチル化CpG(白丸)を示す。
【図２−６】図2A、2B、2C、2D、2E、2F：HEMO Env遺伝子の特徴決定(F) DNA脱メチル化のHEMO遺伝子の発現への影響。HEMO遺伝子転写レベルは、0.1〜５μMの5-アザ-2'-デオキシシチジン(Aza-dC)で３日間処理したか又は未処理(DMSOのみ)の細胞株(293T、BeWo)において、RT-qPCRにより検出され、ハウスキーピング遺伝子RPLPOに対して規格化された。データは平均±SEMで示す。アスタリスク(*)は未処理細胞で得られた値から有意に異なる値を示す(対応のない両側ｔ検定；*, P<0.05；***, P<0.001)。
【図３】図３：トランスフェクトHeLa細胞におけるHEMOタンパク質発現の免疫蛍光分析。細胞(HeLa)にphCMV-HEMO発現ベクター(又は陰性対照としての空ベクター)をトランスフェクションし、固定し、透過処理(上パネル)された後又はされることなく(下パネル)、特異的抗HEMOポリクローナル抗体を用いてHEMOタンパク質発現について染色した(「方法」を参照)。上パネル：空ベクタートランスフェクト細胞と対比させたphCMV-HEMOトランスフェクト細胞の特異的染色。下パネル：連続共焦点画像は、本タンパク質の細胞表面局在を示す。
【図４−１】図4A、4B、4C：脱離HEMOタンパク質の特徴決定。(A) ウエスタンブロット分析による脱離HEMO Envタンパク質の検出。(左側)phCMV-Env-Wトランスフェクト293T細胞の細胞溶解物中の抗Env-Wポリクローナル抗体を有するシンシチン-1タンパク質の検出。(中央及び右)phCMV-HEMOトランスフェクト293T細胞(中央)及び妊娠第１期の胎盤組織と胎盤血液(右：同一個人からの一致した代表的試料)の細胞溶解物及び上清における、抗HEMOポリクローナル抗体を用いるHEMOタンパク質の２つの形態(全長SU-TM及び脱離Env)の検出；試料はPNGase F処理(+)又は未処理(-)された。
【図４−２】図4A、4B、4C：脱離HEMOタンパク質の特徴決定。(B) 脱離HEMOタンパク質のＮ末端とＣ末端の質量分析測定。phCMV-HEMOトランスフェクト293T細胞の上清より精製された脱離Env形態のタンパク質範囲(coverage)は、トリプシンタンパク質分解及び得られたペプチドの質量分析特徴決定の後に緑色文字で示し、キモトリプシンタンパク質分解についてはアンダーライン付きの文字で示す(「方法」を参照)。HEMOのＮ末端とＣ末端は大文字で示し、(*)はＣで生成され分析された変異体における終止コドンの位置を示す。
【図４−３】図4A、4B、4C：脱離HEMOタンパク質の特徴決定。(C) Ａにおいて分析された変異体HEMO形態の移動パターン。左：HEMOタンパク質の模式図を、生成された変異体の終止コドン及び再構成されたフリン部位(H-fur+、RTKRフリン部位)を有する変異体の終止コドンと併せて示す。右：Ａと同様にPNGase F処理、SDSゲル電気泳動及びウエスタンブロットの後で分析された、野生型(WT)及び変異体HEMOプラスミドの発現ベクターをトランスフェクトした293T細胞の上清。
【図５】図５：トランスフェクト細胞の上清におけるHEMO放出の阻害ポリクローナル抗HEMOポリクローナル抗体を使用する、phCMV-HEMO発現ベクターをトランスフェクトされた293T細胞の細胞溶解物及び上清のウエスタンブロット分析(「方法」を参照)。細胞は、示された用量のADAM及びMMP化学阻害剤Batismastat、Marismastat及びGM6001又はDMSO単独で３日間処理された。抗γ-チューブリン抗体を細胞溶解物タンパク質負荷の対照として用いた。全長HEMOタンパク質(SU-TM)及び分泌形態(脱離Env)を矢頭で示す。
【図６】図６：妊娠中の末梢血液におけるHEMOタンパク質の放出ポリクローナル抗HEMO抗体(上パネル)及び抗hCG-ベータ抗体(下パネル)を用いた精製血液試料のウエスタンブロット分析。脱離HEMOタンパク質は、妊娠第一期(T1)の胎盤血液、男性(M)、非妊娠女性(F)、妊娠第一期(T1)、妊娠第二期(T2)及び妊娠第三期(T3)の妊娠女性の末梢血液において検出された。低分子量及び高分子量の両方で観察されたバンドは、HEMOタンパク質のマイナーな択一的に処理された/脱離形態に対応する可能性がある。
【図７−１】図7A、7B、７C：妊娠第１期ヒト胎盤のホルマリン固定組織におけるHEMOタンパク質の免疫組織化学的検出。(A) 母性血液に浴し拡大・固着した絨毛を有する胎児-胎盤ユニットの模式図であり、合胞体栄養細胞層(ST)、下層の単核細胞栄養芽層(CT)及び浸潤性の絨毛外細胞栄養芽層(EVT)を示す。
【図７−２】図7A、7B、７C：妊娠第１期ヒト胎盤のホルマリン固定組織におけるHEMOタンパク質の免疫組織化学的検出。(B) 対照IgG2aマウスアイソタイプ(左)又は抗HEMOモノクローナル抗体2F7(右、CNCM 1-5211)で染色された複数の胎盤絨毛及び絨毛膜の連続切片。倍率４倍。
【図７−３】図7A、7B、７C：妊娠第１期ヒト胎盤のホルマリン固定組織におけるHEMOタンパク質の免疫組織化学的検出。(C) Ｂに示される４つの領域の拡大図：胎盤絨毛はCT(1-2)及びEVT(3)が優先的に染色され、絨毛膜はCT(4)が染色された。倍率60倍。
【図８−１】図8A、8B、8C、8D：インシリコ分析によるRNA-Seq分析による、発生の間のHEMO遺伝子の発現。A〜C：HEMO、シンシチン-1(env-W)とシンシチン-2(env-FRD)、GCM１(特異的な胎盤発現遺伝子であるGlial Cells Missing homolog 1)及びOCT４(幹細胞において高度に発現する)に関するRNA-seqデータの３つのパネルのインシリコ分析。RNA-seq生データは各遺伝子のコーディング部分を用いてスクリーニングされ、ヒットがスクリーニングされた配列のキロベース当たりのlogスケールで、２つのハウスキーピング遺伝子RPLPOとRPS6を用いた規格化後に報告された。(A) ヒト着床前胚及び胚性幹細胞のパネルの124の単一細胞RNA seqのパネル(参考文献(30)において、類似パターンが卵母細胞から桑実期までをカバーするデータから得られている)
【図８−２】図8A、8B、8C、8D：インシリコ分析によるRNA-Seq分析による、発生の間のHEMO遺伝子の発現。A〜C：HEMO、シンシチン-1(env-W)とシンシチン-2(env-FRD)、GCM１(特異的な胎盤発現遺伝子であるGlial Cells Missing homolog 1)及びOCT４(幹細胞において高度に発現する)に関するRNA-seqデータの３つのパネルのインシリコ分析。RNA-seq生データは各遺伝子のコーディング部分を用いてスクリーニングされ、ヒットがスクリーニングされた配列のキロベース当たりのlogスケールで、２つのハウスキーピング遺伝子RPLPOとRPS6を用いた規格化後に報告された。(B) 正常胎盤組織の７試料のパネル(C) ヒトCD34+細胞(NT)のiPS細胞への再プログラミング及びヒトES細胞株からの28のRNA-seq試料のパネル(D) WGA精製胎盤血液(妊娠第１期)及びコンフルーエントなiPSC-クローンN(血清なしで更に36時間増殖させ、20倍濃縮)のWGA精製上清のウエスタンブロット分析。試料はPNGase F処理された。脱離HEMO形態はポリクローナル抗HEMO抗体を用いて検出される。
【図９−１】図9A、9B、9C、9D：正常組織及び腫瘍試料内でのHEMO発現のマイクロアレイ分析。(A、B) E-MTAB62データセットから抽出された、HEMO遺伝子発現について得られた規格化値のボックスプロット図(対数スケール)。元の組織カテゴリーは、著者が記載した主要な群を維持しながら、同じ生物学的供給源からの試料を併せてグループ化するように調整された：正常組織(A)と腫瘍試料(B)。
【図９−２】図9A、9B、9C、9D：正常組織及び腫瘍試料内でのHEMO発現のマイクロアレイ分析。(A、B) E-MTAB62データセットから抽出された、HEMO遺伝子発現について得られた規格化値のボックスプロット図(対数スケール)。元の組織カテゴリーは、著者が記載した主要な群を維持しながら、同じ生物学的供給源からの試料を併せてグループ化するように調整された：正常組織(A)と腫瘍試料(B)。
【図９−３】図9A、9B、9C、9D：正常組織及び腫瘍試料内でのHEMO発現のマイクロアレイ分析。(C) 種々のAE及びGEO研究(「方法」を参照)からのraw.CELファイルとして抽出された、拡大卵巣腫瘍試料から得られた規格化値のボックスプロット図。正常卵巣組織の値を対照として規格化プロセスに含ませた。卵巣腫瘍組織型は60の明細胞癌、96の子宮内膜性腫瘍、34の粘液性腫瘍、289の漿液性腫瘍試料に対応する(ウィルコクソンの順位和検定、**, P<0.01)。
【図９−４】図9A、9B、9C、9D：正常組織及び腫瘍試料内でのHEMO発現のマイクロアレイ分析。(D) ホルマリン固定正常卵巣組織(左)と卵巣明細胞癌(右、２倍率)の、HEMOタンパク質に特異的な2F7モノクローナル抗体(CNCM1-5211)(又は対照アイソタイプ)を用いた免疫組織化学分析。
【図１０−１】図10A、10B、10C：類人猿におけるHEMO遺伝子の配列保存性及び純化選択。(A) 哺乳動物におけるHEMO遺伝子座のシンテニー(syntenic)保存。ヒト染色体４におけるHEMO遺伝子とその周囲のRASL11B及びUSP46遺伝子(275kb離れた)の遺伝子座は、チンパンジー、マクワザル、マーモセット、メガネザル、ネズミキツネザル、ヒヨケザル、マウス、モルモット、ラビット、ハリネズミ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ゾウ、テンレック、アルマジロ及びフクロネズミのゲノムのシンテニー配座(syntenic loci)と併せて、UCSCゲノムブラウザから回収された；RASL11BとUSP46遺伝子のエクソン、及び転写のセンス(矢印)を示す。HEMO遺伝子のエクソン(E1〜E4)はシンテニー配座の相同性(MultiPipMakerアライメント構築ツールを使用して分析)と併せて、15kbのHEMO座の拡大図に示す。相同領域は緑色のボックスとして示し、高度保存領域(少なくとも70％の同一性を示すギャップのない100 bp以上)は赤色のボックスとして示す。全長HEMO ORFを有する(+)又は有しない(-)配列は右側に示す(nr：無関係)。
【図１０−２】図10A、10B、10C：類人猿におけるHEMO遺伝子の配列保存性及び純化選択。(B) HEMOベースの最尤系統樹は、HEMO遺伝子のヌクレオチドアライメントを用いて決定され、RAxMLプログラムで推測された。水平方向の枝の長さとスケールはヌクレオチド置換のパーセンテージを示す。1,000の複製物から得られたパーセントブートストラップ値はノードに表示する。左側の系統樹に列挙された種々の類人猿種のHEMO遺伝子と、上に略号にて同じ順序で列挙された種との間のアミノ酸配列同一性の２つ組(pairwise)パーセンテージ(下側三角)及びdN/dSの２つ組の値(上側三角)の複式表。カラーコードは、両方シリーズの値について設けられている。(OWM：旧世界ザル、NWM：新世界ザル、AGM：アフリカミドリザル、ｍ：モンキー)
【図１０−３】図10A、10B、10C：類人猿におけるHEMO遺伝子の配列保存性及び純化選択。(C) 示された類人猿HEMO遺伝子又はコンセンサスフリン部位を有するヒトHEMO変異体(H-fur+)の発現ベクターをトランスフェクトされた293T細胞のウエスタンブロット分析により表された類人猿におけるHEMO脱離の保存。細胞溶解物及び上清は採集され、PNGase F処理された後に、ポリクローナル抗HEMO抗体を用いてウエスタンブロット分析された。全SU-TM HEMOタンパク質は、細胞溶解物に観察される主要な形態である一方、(フリン部位を有するNWM遺伝子及びH-fur+変異体について)脱離及び遊離形態のSUは主に上清で観察される。
【図１１−１】図11A、11B：類人猿HEMOタンパク質の整列されたアミノ酸配列。特徴的なドメイン、SUサブユニットとTMサブユニットの間の推定タンパク質分解性フリン切断部位(RXKR、黒色)、SUサブユニット中のシグナルペプチド(紫色)とCWLCモチーフ(CXXC、黒色)、TMサブユニット中の免疫抑制ドメイン(ISD、青色)、C6XCC配列(黒色)及び膜貫通ドメイン(赤色)を示す。点はアミノ酸同一性を示し、ハイフンはコドン欠失を示す。HUM(ヒト)、CPZ(チンパンジー)、GOR(ゴリラ)、ORA(オラウータン)、GIB(テナガザル)、MAC(マクワザル)、BAB(ヒヒ)、AGM(アフリカミドリザル)、COL(コロブス)、LAN(ラングール)、RHI(キンシコウ)、MAR(マーモセット)、SQM(リスザル)、SPI(クモザル)、SAK(サキザル)。
【図１１−２】図11A、11B：類人猿HEMOタンパク質の整列されたアミノ酸配列。特徴的なドメイン、SUサブユニットとTMサブユニットの間の推定タンパク質分解性フリン切断部位(RXKR、黒色)、SUサブユニット中のシグナルペプチド(紫色)とCWLCモチーフ(CXXC、黒色)、TMサブユニット中の免疫抑制ドメイン(ISD、青色)、C6XCC配列(黒色)及び膜貫通ドメイン(赤色)を示す。点はアミノ酸同一性を示し、ハイフンはコドン欠失を示す。HUM(ヒト)、CPZ(チンパンジー)、GOR(ゴリラ)、ORA(オラウータン)、GIB(テナガザル)、MAC(マクワザル)、BAB(ヒヒ)、AGM(アフリカミドリザル)、COL(コロブス)、LAN(ラングール)、RHI(キンシコウ)、MAR(マーモセット)、SQM(リスザル)、SPI(クモザル)、SAK(サキザル)。
【図１２−１】図12A、12B、12C、12D、12E：有袋動物env-panMars遺伝子及びタンパク質の特徴決定。(A、B及びC) 代表的な類人猿種の有袋動物env-panMars及びHEMOタンパク質とイエネコのものとの間でのアミノ酸配列相同性。類人猿又はネコ配列において同じ位置で見出される有袋動物配列の全てのアミノ酸は黄色で強調している。アスタリスク(*)：終止コドン。HUM(ヒト)、GIB(テナガザル)、MAC(マクワザル)、MAR(マーモセット)、CAT(ネコ)、OPO(フクロネズミ)、WAL(ワラビー)及びTAS(タスマニアデビル)。図1Cと同様に特徴的envドメインには同じカラーコード。
【図１２−２】図12A、12B、12C、12D、12E：有袋動物env-panMars遺伝子及びタンパク質の特徴決定。(A、B及びC) 代表的な類人猿種の有袋動物env-panMars及びHEMOタンパク質とイエネコのものとの間でのアミノ酸配列相同性。類人猿又はネコ配列において同じ位置で見出される有袋動物配列の全てのアミノ酸は黄色で強調している。アスタリスク(*)：終止コドン。HUM(ヒト)、GIB(テナガザル)、MAC(マクワザル)、MAR(マーモセット)、CAT(ネコ)、OPO(フクロネズミ)、WAL(ワラビー)及びTAS(タスマニアデビル)。図1Cと同様に特徴的envドメインには同じカラーコード。
【図１２−３】図12A、12B、12C、12D、12E：有袋動物env-panMars遺伝子及びタンパク質の特徴決定。(A、B及びC) 代表的な類人猿種の有袋動物env-panMars及びHEMOタンパク質とイエネコのものとの間でのアミノ酸配列相同性。類人猿又はネコ配列において同じ位置で見出される有袋動物配列の全てのアミノ酸は黄色で強調している。アスタリスク(*)：終止コドン。HUM(ヒト)、GIB(テナガザル)、MAC(マクワザル)、MAR(マーモセット)、CAT(ネコ)、OPO(フクロネズミ)、WAL(ワラビー)及びTAS(タスマニアデビル)。図1Cと同様に特徴的envドメインには同じカラーコード。
【図１２−４】図12A、12B、12C、12D、12E：有袋動物env-panMars遺伝子及びタンパク質の特徴決定。(D) HAタグ付きフクロネズミとワラビーのenv-panMarsタンパク質の検出。phCMV-空、phCMV-フクロネズミ-env又はphCMV-ワラビー-env発現ベクターをトランスフェクトされた293T細胞の細胞溶解物(L)及び上清(S)のウエスタンブロット分析。抗HA抗体(上)及び抗γ-チューブリン抗体(下)を用いて検出。
【図１２−５】図12A、12B、12C、12D、12E：有袋動物env-panMars遺伝子及びタンパク質の特徴決定。(E) フクロネズミ(上)とワラビー(下)のenv-panMars遺伝子座及び転写物の構造。env-panMars遺伝子座の模式図(env ORFをオレンジ色で、CpGアイランドを緑色で表す)。Nは特徴決定されていない配列を表す。黒色の矢頭は、AATAAAポリアデニル化シグナル配列の位置を示す。イントロン-エクソン構造は、フクロネズミについてはUCSCから入手したものであり、ワラビー(卵巣のRNA)についてはRACE-PCR実験で特徴決定されている；開始部位(CTTTCTA...)とenv ORFアクセプタースプライス部位のヌクレオチド配列を示す；E2-E3イントロンの点は、ワラビー転写物の一部における(HEMO遺伝子について観察されたような)E3スキッピングを示す。
【図１３】図13：HEMOタンパク質の脱離の模式図。「1」は主要切断部位である(脱離フラグメントのＣ末端＝432位又は433位のaa)。「2」及び「3」は副次切断部位である(「2」：脱離フラグメントのＣ末端は450〜480位である；「3」：脱離フラグメントのＣ末端は380〜420である)。
【図１４】図14：腫瘍試料内でのHEMO発現のマイクロアレイ分析。GSE2109データベースから抽出されたHEMO遺伝子発現について得られた規格化値のボックスプロット図(対数スケール)。
【図１５−１】図15A及び15B：腫瘍試料内でのHEMO発現のTGCA RNA-seq分析(A) HEMO遺伝子発現について得られた規格化値のボックスプロット図(FPKMスケール)。この図は、完全Mer34-cDNA配列(5'及び3'非翻訳配列を含む約3000bp)を用いた17の異なる腫瘍のパネルに関するインターネットTCGAデータ分析のコピーである。
【図１５−２】図15A及び15B：腫瘍試料内でのHEMO発現のTGCA RNA-seq分析(B) 一連のTCGA腫瘍(頭部及び頸部扁平上皮癌(HNSC)、肺腺癌(LUAD)、子宮体内膜癌(UCEC))及びTCGA反対側正常組織(対照)のRNAseqデータセットにおけるHEMO発現。
【図１６−１】図16A及び16B：Gustave Roussyの腫瘍試料におけるHEMO発現。(A) 卵巣癌(E=子宮内膜様卵巣癌、C=明細胞癌)の凍結試料及び対照(N=正常卵巣、PL=胎盤)におけるウエスタンブロット分析。
【図１６−２】図16A及び16B：Gustave Roussyの腫瘍試料におけるHEMO発現。(B) 倍率が異なる、二人の患者(I及びII)の子宮内膜様卵巣癌のFFPE試料に関するHES染色及びHEMO免疫化学分析。正常卵巣対照は図9Dに示す。
【図１７】図17：Gustave Roussyの腫瘍試料におけるHEMO発現。倍率が異なる、二人の患者(I及びII)の子宮内膜様卵巣癌のFFPE試料に関するHES染色及びHEMO免疫化学分析。
【図１８】図18：Gustave Roussyの腫瘍試料におけるHEMO発現。倍率が異なる、二人の患者(HER2+及びトリプルネガティブ)の乳癌のFFPE試料及び正常組織対照に関するHES染色及びHEMO免疫化学分析。
【図１９】図19A及び19B：循環性HEMO脱離タンパク質を検出するための血液-ELISAアッセイの開発。(A) サンドイッチELISAの模式図。(B) 女性血清中の循環性HEMO脱離タンパク質のELISA分析。
【図２０−１】図20A及び20B：HEMO-エクトドメインのＣ末端部分に対する抗体。(A) HTM5-ポリクローナル抗体を用いる、トランスフェクト293T(1=全長HEMO-pHCMVベクター、2=SU-HEMO-pHCMVベクター、3=TM-HEMO-pHCMVベクター、4=ポストSHED-HEMO-pHCMVベクター)の細胞溶解物のウエスタンブロット分析。
【図２０−２】図20A及び20B：HEMO-エクトドメインのＣ末端部分に対する抗体。(B) HTM5-ポリクローナル抗体を用いる、トランスフェクト293T細胞(左=空ベクター、中央=全長HEMOベクター、右=ポストSHED HEMOベクター)のフローサイトメトリー分析。HTM5抗体は、全長HEMOの天然型とエクトドメインのＣ末端部分を検出することができる。
【図２１】図21A、21B、21C：CrispR-Cas9によるHEMOのKO(ノックアウト)細胞クローン(A及びB) 2F7モノクローナル抗体(CNCMI-5211)を用いる、WT(野生型)及びKO-HEMO CaCo-2細胞又は上清の免疫化学及びウエスタンブロット分析。HEMOは、FFPE細胞ペレット試料(A)に対するIHCでも濃縮(20倍)上清(B)中でもCaCo-2 KO HEMO細胞内に検出されない。(C) 2F7モノクローナル抗体(CNCMI-5211)を用いた、WT iPSC上清、CrispR-KO iPSC上清(細胞クローン1、2、3に由来)、non-KO(対照CrispR-処理)iPSC上清(T)のウエスタンブロット分析。HEMOは、CrispR-KO iPSCの上清中に検出されない。
【図２２】図22A及び22B：ScFvフラグメントとしてのmABのクローニング。(A) ScFV-2F7-Fc及び2F7モノクローナル抗体(CNCMI-5211)を用いる、トランスフェクト293T細胞(空ベクター又は全長HEMOベクター)上清のELISA分析。HEMOは、ScFV-2F7-Fc及び2F7モノクローナル抗体(CNCMI-5211)の両方で、HEMOを発現する293T細胞でのみ検出される。(B) ScFV-2F7-Fc、ScFv-2F7-His及び2F7モノクローナル抗体(CNCMI-5211)を用いる、トランスフェクト293T細胞(空ベクター又は全長HEMOベクター)のフローサイトメトリー分析。HEMOは、ScFVフラグメント(FcとHisタグを有する)と2F7モノクローナル抗体(CNCMI-5211)の両方で、HEMOを発現する293T細胞でのみ検出される。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
発明の詳細な説明
本発明は、出願時の特許請求の範囲に規定される主題及び本明細書に記載される主題に関する。
本出願においては、別段の定めがない限り又は文脈上そうでないとする明確な指示がない限り、全ての用語は関連分野での通常の意味を有する。
本出願は、北方真獣類哺乳動物クレードに対して内在性であるレトロウイルスEnvタンパク質、より具体的にはヒトに対して内在性であるレトロウイルスEnvタンパク質(換言すれば、ヒト内在性レトロウイルス(HERV))に関する。
このレトロウイルスEnvタンパク質は、本発明者らによりHEMOと命名される。HEMOはヒト内在性MER34 ORFの略号であるが、HEMOタンパク質はヒトに限定されない：HEMOタンパク質は例えば、ヒトと同様に、非ヒト霊長類などの非ヒト北方真獣類(Boreoeutheria)において発現される(図10A及び10Bを参照)。
【００１１】
ヒトHEMOのRNA転写物は、例えば、UNIPROTKBにおける番号Q9H9K5 (MER34_HUMAN) [Name：ERVMER34-1；ORF Name：LP9056]などの先行技術にて記載されている。推定タンパク質の配列は、先行技術のRNA配列から推論されたがこのタンパク質が実際に存在するかは仮説にすぎなかった。
本発明者らは、このタンパク質が北方真獣類で、より具体的にはヒトで実際に発現されることを実証する。また本発明者らは、このタンパク質の新たな機能(特性)を記述する。
HEMOは、シグナルペプチド(切り離されて成熟タンパク質を形成する)、エクトドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインからなる膜貫通タンパク質である。
HEMOタンパク質の例示的な配列は、
−  配列番号１のヒトHEMOアミノ酸配列(図1C、図1Bを参照、図11A〜11B、図12A〜12Cの配列HUMを参照)
−  チンパンジー(CPZ)、ゴリラ(GOR)、オラウータン(ORA)、テナガザル(GIB)、マクワザル(MAC)、ヒヒ(BAB)、アフリカミドリザル(AGM)、コロブス(アンゴラコロブス)(COL)、ラングール(LAN)、マーモセット(MAR)、キンシコウ(ゴールデンモンキー)(RHI)、リスザル(SQM)、クモザル(SPI)、サキザル(SAK)及びネコ(CAT)のHEMOタンパク質配列である配列番号129〜143の非ヒトHEMOタンパク質(図11A〜11B及び図12A〜12Cを参照)
を含む。
【００１２】
本出願において、HEMO参照アミノ酸配列、特にアミノ酸位置の計算のためのHEMO参照アミノ酸配列は、Ｎ末端シグナルペプチドを含むヒトHEMOタンパク質配列、すなわち配列番号１の配列(563アミノ酸)である。
図11A〜11B及び図12A〜12Cに示す配列アライメントは、非ヒト北方真獣類における対応位置の同定を可能にする。
本発明者らは、特に、北方真獣類において、より具体的にはヒトにおいて、HEMOタンパク質が胎盤細胞、幹細胞及び幾つかの腫瘍細胞により高度に発現されることを示す。
本出願は、一般に、HEMOタンパク質、HEMOエクトドメイン、HEMO膜貫通ドメイン及びHEMO細胞内ドメイン並びにこれらドメインのフラグメントに関する。
本発明者らは、更に、HEMOタンパク質が脱離により切断されることを示す。このことから、HEMOタンパク質の可溶性フラグメントは、北方真獣類の血中に、よい具体的には循環血中に見出すことができる。
本発明者らは、より具体的には、HEMOタンパク質がそのエクトドメインで脱離することを示す。
HEMOエクトドメインの脱離は、HEMOエクトドメインのＮ末端フラグメントである可溶性フラグメントの放出をもたらす。(可溶性)Ｎ末端フラグメントの切断から生じるＣ末端フラグメントは、細胞表面に保持される。
【００１３】
このことから、本出願は、一般には、HEMOタンパク質のフラグメント、より具体的にはHEMOエクトドメインのフラグメントに関する。本出願は、より具体的には、
−  HEMOエクトドメインの可溶性フラグメント、より具体的にはHEMOエクトドメインのＮ末端可溶性フラグメント、及び
−  HEMOエクトドメインの可溶性フラグメントの脱離から生じるHEMOエクトドメイン又はHEMOタンパク質のフラグメント、より具体的にはHEMOエクトドメインのＮ末端可溶性フラグメントの脱離から生じるHEMOエクトドメイン又はタンパク質のＣ末端フラグメント
に関する。
本発明者らは、HEMOエクトドメインに少なくとも３つの異なる切断部位を同定した。主要な切断部位は、HEMOエクトドメインの免疫抑制ドメインに位置する。他の切断部位は、免疫抑制ドメインの上流又は下流に位置し得る(Ｎ→Ｃ方向)。
したがって、北方真獣類、より具体的にはヒトの血液、より具体的には循環血液は、
-  HEMOエクトドメインの１又は数個の可溶性(脱離)Ｎ末端フラグメント、及び
-  その表面で、(可溶性(脱離)Ｎ末端フラグメントの１つの切断から生じる)HEMOエクトドメインのＣ末端フラグメントを発現する１又は数個の細胞(又は細胞の一部、例えば、エクソソーム)
を含み得る。
【００１４】
このことから、北方真獣類の、より具体的にはヒトの胎盤細胞、幹細胞及び腫瘍細胞は、その表面で、(HEMOエクトドメインのＮ末端フラグメントの脱離から生じる)HEMOエクトドメインのＣ末端フラグメントを発現する細胞(又は細胞の一部、例えば、エクソソーム)を含み得る。これら細胞は、細胞組織の一部(例えば、胎盤の胎盤細胞、腫瘍組織の腫瘍細胞、骨髄又は正常組織又は腫瘍組織に含まれる幹細胞)であってもよいし、循環性細胞(例えば、循環性胎盤細胞、循環性幹細胞又は循環性腫瘍細胞)であってもよい。
本出願は、特に、
−  HEMOエクトドメインのＮ末端可溶性(脱離)フラグメントの１つであるポリペプチド、及び
−  HEMOエクトドメインのＣ末端フラグメントの１つであるポリペプチド、及び
その表面でＣ末端フラグメントを発現する細胞(又は細胞の一部、例えば、エクソソーム)
に関する。
本出願はまた、前記ポリペプチドの(サブ)フラグメント、より具体的にはHEMOエクトドメインの前記Ｎ末端可溶性(脱離)フラグメントの(サブ)フラグメントに関し、ここで、前記(サブ)フラグメントは抗体産生、より具体的にはモノクローナル抗体産生に有用である。
本出願全体を通して、また文脈上そうでないとする指示がない限り、ポリペプチド(又はポリペプチド(サブ)フラグメント)は、可溶形態(すなわち、非膜性形態)のポリペプチド(又はポリペプチド(サブ)フラグメント)であり得る。
本出願全体を通して、また文脈上そうでないとする指示がない限り、ポリペプチド(又はポリペプチド(サブ)フラグメント、核酸、核酸ベクター)は、単離形態(又は精製形態)のポリペプチド(又は、それぞれ、ポリペプチド(サブ)フラグメント、核酸、核酸ベクター)であり得る。
【００１５】
本出願はまた、前記のポリペプチド、細胞又はポリペプチド(サブ)フラグメントに由来する物質に関する。本出願は、より具体的には、
−  本出願の少なくとも１つのポリペプチド、細胞又はポリペプチド(サブ)フラグメントを含む組成物、より具体的には医薬組成物
−  本出願の少なくとも１つのポリペプチド、細胞又はポリペプチド(サブ)フラグメントに特異的に結合する抗体、モノクローナル抗体、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、F(ab)2フラグメント、scFv、sdAb又はsdAbの可変ドメイン
−  本出願のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
−  遺伝子操作Ｔ細胞、より具体的にはキメラ抗原受容体Ｔ細胞(CAR-Ｔ細胞)、ここで、前記キメラ抗原受容体(CAR)のエクトドメインは、本出願のsdFvを含むか又は本出願のsdFvである
−  本出願のポリペプチド又はポリペプチド(サブ)フラグメントをコードする核酸、より具体的にはRNA 
−  本出願の少なくとも１つの核酸を組換えにより含む核酸ベクター
−  本出願の少なくとも１つの核酸又は核酸ベクターを組換えにより含む宿主細胞、より具体的には遺伝子操作細胞
−  本出願の核酸に特異的に結合する核酸プローブ又は本出願の核酸に特異的に結合するプライマー対(又はプライマー対及びプローブ)を含むオリゴヌクレオチドのセット
−  前記物質の少なくとも１つ、例えば、本出願の少なくとも１つの抗体、モノクローナル抗体、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、F(ab)2フラグメント、scFv、sdAb、sdAb可変ドメイン又はCAR-Ｔ細胞を含むキット
−  本出願の少なくとも１つのポリペプチド、細胞又はポリペプチド(サブ)フラグメントが連結された固体支持体、例えば、合成膜又は核酸チップ、又は本出願の少なくとも１つの抗体、モノクローナル抗体、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、F(ab)2フラグメント、scFv、sdAb、sdAb可変ドメイン又はCAR-Ｔ細胞が連結又はグラフトされた少なくとも１つの前記物質、例えば、(合成)、又は本出願の少なくとも１つのプローブが連結又はグラフトされた核酸チップ
に関する。
本出願は、本出願の少なくとも１つのポリペプチド、ポリペプチド(サブ)フラグメント、細胞又は物質の使用又は応用、並びに本出願の少なくとも１つのポリペプチド又は物質を包含する方法に関する。
【００１６】
HEMOタンパク質
HEMOタンパク質は、北方真獣類、より具体的にはヒトに発現する。
HEMOタンパク質、より具体的にはヒトHEMOタンパク質は、胎盤細胞、幹細胞及び幾つかの腫瘍細胞により高度に発現される
本出願全体を通して、哺乳動物又は有胎盤哺乳動物には、特に、北方真獣類、より具体的には真主齧上目又はローラシア獣上目、より具体的には真主齧上目、より具体的には霊長類、より具体的にはヒト又は類人猿が含まれる。
本出願全体を通して、北方真獣類には真主齧上目又はローラシア獣上目、より具体的には真主齧上目、より具体的には霊長類、より具体的にはヒト又は類人猿が含まれる。
例えば、有胎盤哺乳動物又は北方真獣類は、Homo sapiens(ヒト)、Pan troglodytes(チンパンジー)、Gorilla(ゴリラ)、Pongo(オラウータン)、Hylobates(テナガザル)、Macaca(マクワザル)、Papio anubis(ヒヒ)、Chlorocebus sabeus(アフリカミドリザル、又はAGM)、Colobus angolensis palliatus(コロブス)、Semnopithecus entellus(ラングール)、Rhinopithecus roxellana(キンシコウ)、Marmoset(マーモセット)、Saimiri(リスザル)、Ateles(クモザル)又はPithecia(サキザル)であり得る。
例えば、有胎盤哺乳動物又は北方真獣類は、Homo sapiens(ヒト)、Pan troglodytes(チンパンジー)、Gorilla(ゴリラ)、Pongo(オラウータン)、Hylobates(テナガザル)、Macaca(マクワザル)、Papio anubis(ヒヒ)、Chlorocebus sabeus(アフリカミドリザル、又はAGM)、アンゴラクロシロコロブス(コロブス)、Semnopithecus entellus(ラングール)又はRhinopithecus roxellana(キンシコウ)であり得る。
例えば、有胎盤哺乳動物又は北方真獣類は、Homo sapiens(ヒト)、Pan troglodytes(チンパンジー)、Gorilla(ゴリラ)、Pongo(オラウータン)又はHylobates(テナガザル)であり得る。
より具体的には、有胎盤哺乳動物又は北方真獣類は、ホモサピエンス(ヒト)である。
【００１７】
HEMOタンパク質は、北方真獣類、より具体的にはヒトの細胞に対して内在性であるレトロウイルスEnvタンパク質と見なすことができる。
細胞は、例えば、胎盤細胞(例えば、栄養芽細胞)、幹細胞、腫瘍細胞又は腫瘍幹細胞であり得る。
栄養芽細胞は、例えば、絨毛栄養膜細胞、絨毛外細胞栄養芽細胞又は絨毛膜栄養芽細胞である。
腫瘍細胞は、例えば、卵巣癌、子宮癌(より具体的には、子宮内膜癌、子宮頸癌、妊娠性癌(胎盤の癌、例えば、絨毛腫を含む))、乳癌、肺癌、胃癌、結腸癌、肝臓癌、腎臓癌、前立腺癌、尿路上皮癌、胚細胞癌、脳腫瘍、頭部頸部癌、膵臓癌、甲状腺癌、胸腺癌、皮膚癌、骨肉腫又は骨髄癌であり得る。尿路上皮癌は膀胱、尿管及び腎盂の癌腫を包含するので、前記癌は、膀胱癌、尿管癌又は腎盂癌を含む尿路上皮癌であり得る。
【００１８】
アミノ酸又は核酸配列は、下記表８並びに図及び実施例に記載される。ST25に準拠した配列表も提示している。
HEMO参照配列は、配列番号１のヒトHEMOタンパク質の配列である(図1C又は11A〜11Bを参照)。配列番号１のHEMOタンパク質は、
−  シグナルペプチド(配列番号１のアミノ酸１〜26位又は１〜24位又は１〜25位、すなわち、それぞれ配列番号２、168、169である)
−  エクトドメイン(配列番号１のアミノ酸27〜489位若しくは25〜489位若しくは26〜489位若しくは27〜488位若しくは25〜488位若しくは26〜488位若しくは27〜491位若しくは25〜491位若しくは26〜491位若しくは27〜486位若しくは25〜486位若しくは26〜486位、すなわち、それぞれ配列番号４、172〜182であるか、又はアミノ酸25〜487位若しくは25〜490位若しくは25〜492位若しくは26〜487位若しくは26〜490位若しくは26〜492位若しくは27〜487位若しくは27〜490位若しくは27〜492位、すなわち、それぞれ配列番号910〜918である)
−  膜貫通ドメイン(例えば、配列番号１のアミノ酸490〜512位又は489〜512位又は492〜512位又は487〜512位又は490〜509位又は489〜509位又は492〜509位又は487〜509位又は490〜513位又は489〜513位又は492〜513位又は487〜513位、すなわち、それぞれ配列番号５、427〜437である)
−  細胞内ドメイン(配列番号１のアミノ酸513〜563位又は510〜563位又は514〜563位、すなわち、それぞれ配列番号６、417、418である)
を含む。
【００１９】
ヒト以外の北方真獣類のHEMOタンパク質の配列は、517〜578アミノ酸(より具体的には536、562、527、517又は578アミノ酸、より具体的には563又は562アミノ酸、より具体的には563アミノ酸)からなり、配列番号１に対して(配列番号１の全長にわたって)少なくとも59％の同一である配列と定義できる。
表現「少なくとも59％の同一」とは、配列番号１に対して配列番号１の全長にわたって少なくとも60％、少なくとも61％、少なくとも62％、少なくとも63％、少なくとも64％、少なくとも65％、少なくとも66％、少なくとも67％、少なくとも68％、少なくとも69％、少なくとも70％、少なくとも71％、少なくとも72％、少なくとも73％、少なくとも74％、少なくとも75％、少なくとも76％、少なくとも少なくとも77％、少なくとも78％、少なくとも79％、より具体的には少なくとも80％の同一、より具体的には少なくとも81％の同一、より具体的には少なくとも82％の同一、より具体的には少なくとも83％の同一、より具体的には少なくとも84％の同一、より具体的には少なくとも85％の同一、より具体的には少なくとも86％の同一、より具体的には少なくとも87％の同一、より具体的には少なくとも88％の同一、より具体的には少なくとも89％の同一、より具体的には少なくとも90％の同一、より具体的には少なくとも91％の同一、より具体的には少なくとも92％の同一、より具体的には少なくとも93％の同一、より具体的には少なくとも94％の同一、より具体的には少なくとも95％の同一、より具体的には少なくとも96％の同一、より具体的には少なくとも97％の同一、より具体的には少なくとも98％の同一、より具体的には少なくとも99％の同一を包含する。
非ヒトHEMOタンパク質の例は、それぞれチンパンジー(CPZ)、ゴリラ(GOR)、オラウータン(ORA)、テナガザル(GIB)、マクワザル(MAC)、ヒヒ(BAB、アフリカミドリザル(AGM)、コロブス(アンゴラコロブス)(COL)、ラングール(LAN)、マーモセット(MAR)、キンシコウ(ゴールデンモンキー)(RHI)、リスザル(SQM)、クモザル(SPI)、サキザル(SAK)及びネコ(CAT)のHEMOタンパク質配列である配列番号129〜143の配列を含む(図11A〜11B及び12A〜12Cを参照)。
非ヒトHEMOタンパク質の例は、より具体的には、配列番号129〜142(すなわち、CPZからSAKまで)の配列、より具体的には配列番号129〜138(すなわち、CPZからRHIまで)の配列、より具体的には配列番号129〜132(すなわち、CPZからGIB)の配列である。
【００２０】
HEMOシグナルペプチド
HEMOタンパク質のシグナルペプチドは、24、25、又は26アミノ酸からなり、配列番号405の配列を含む。
例えば、HEMOタンパク質のシグナルペプチドは、配列番号147(26アミノ酸)、配列番号405(24アミノ酸)又は配列番号406(25アミノ酸)の配列からなり得る。
例えば、(ヒト)HEMOタンパク質のシグナルペプチドは、配列番号２(26アミノ酸)、配列番号168(24アミノ酸)又は配列番号169(25アミノ酸)の配列からなり得る。
HEMOタンパク質の成熟形態は、(切り離された)シグナルペプチドを含まない。このことから、シグナルペプチドの切断後に成熟するヒトHEMOタンパク質は、配列番号３、170又は171(開始位置はそれぞれ27、25又は26)であり得る。
【００２１】
HEMOエクトドメイン
HEMOタンパク質のエクトドメインは、Ｎ末端→Ｃ末端方向に、レトロウイルスEnvタンパク質に特徴的である下記の配列：
i. CWLCアミノ酸配列
ii. CTQG配列、CTQR配列、CIQR配列、RTQR配列及びRTKR配列から選択されるアミノ酸配列
iii. 任意に、配列番号148のアミノ酸配列(HEMOタンパク質の免疫抑制ドメイン［又はISD］を特徴付ける)
iv. 配列番号149のアミノ酸配列
を含む。
例えば、図1C又は4Bに示すヒトHEMOタンパク質を参照。
HEMOタンパク質のエクトドメインのアミノ酸配列は、443〜468アミノ酸又は443〜467アミノ酸、より具体的には460〜467アミノ酸又は459〜466アミノ酸、又は453〜460アミノ酸、又は443〜450アミノ酸、例えば、463若しくは456若しくは446アミノ酸からなり得る。
HEMOエクトドメインは、シグナルペプチドの後(Ｎ→Ｃ方向)の最初のアミノ酸から開始し得る。HEMOエクトドメインは、膜貫通ドメインの最初のアミノ酸の前(Ｎ→Ｃ方向)に終了する。
【００２２】
iiのアミノ酸配列は、より具体的には、CTQG配列、CTQR配列及びCIQR配列から選択される。より具体的には、iiのアミノ酸配列はCTQG配列である。
iiiの任意選択のアミノ酸配列、すなわち配列番号148のアミノ酸配列は、HEMOタンパク質の免疫抑制ドメイン［又はISD］を特徴付けるものであり、北方真獣類には一般的である。ヒトHEMOタンパク質において、配列番号148の配列(ISD)は配列番号７の配列からなり得る。
ivのアミノ酸配列、すなわち配列番号149のアミノ酸配列は、CX6CCモチーフを特徴付けるものであり、北方真獣類には一般的である。ヒトHEMOタンパク質において、配列番号149の配列は、配列番号410の配列からなり得る。
【００２３】
例えば、HEMOエクトドメインは、
a/ 配列番号４及び172〜182[ヒトHEMOエクトドメイン；開始位置27、25又は26；停止位置489、488、491又は486］
b/ 配列番号910〜918[ヒトHEMOエクトドメイン；開始位置25、26又は27；停止位置487、490、491又は492]
c/ 443〜468又は443〜467アミノ酸からなり、配列番号４及び172〜182の少なくとも１つに対して(配列番号４及び172〜182及び910〜918の少なくとも１つの全長にわったって)少なくとも76％同一である配列
から選択される配列からなり得る。
少なくとも76％の同一という表現は、少なくとも77％、少なくとも78％、少なくとも79％、少なくとも80％、少なくとも81％、少なくとも82％、少なくとも83％、少なくとも84％、少なくとも85％、少なくとも86％、少なくとも87％、少なくとも88％、又は少なくとも89％、又は少なくとも90％、又は少なくとも、又は少なくとも91％、又は少なくとも92％、又は少なくとも93％、又は少なくとも94％、又は少なくとも95％、又は少なくとも96％、又は少なくとも97％、又は少なくとも98％、又は少なくとも99％同一を含む。
【００２４】
b/の配列は、非ヒト北方真獣類のHEMOエクトドメインを含む。これらは、例えば、
−  配列番号547〜561の配列、及び
−  配列番号547〜561の配列の少なくとも１つのフラグメントであり、かつ配列番号547〜561の配列の少なくとも１つとは最大７又は８アミノ酸だけ異なる配列
から選択され得る。b/の配列は、例えば、配列番号442〜621の配列から選択され得る。
例えば、(ヒト)HEMOエクトドメインは、
d/ 配列番号178、912及び547〜561の配列、及び
e/ 配列番号172、911及び457〜471の配列の少なくとも１つのフラグメントであり、かつ配列番号178、912及び547〜561の配列の少なくとも１つとは最大７アミノ酸だけ異なる配列
から選択される配列からなり得る。d/及びe/の配列は、例えば、配列番号４、172〜182及び442〜621の配列から選択され得る。
(ヒト)HEMOタンパク質のシグナルペプチドの最初のアミノ酸からエクトドメインの最後のアミノ酸まで(Ｎ→Ｃ方向に)伸びる配列は、例えば、配列番号438〜441の配列(開始位置=１；停止位置=489、488、491又は486)から選択される配列であり得る。
【００２５】
HEMO膜貫通ドメイン
HEMOタンパク質の膜貫通ドメインは、エクトドメインの最後のアミノ酸の直後のアミノ酸から、細胞内ドメインの最初のアミノ酸を直前のアミノ酸まで(Ｎ→Ｃ方向に)伸びる。
HEMOタンパク質の膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、17又は18〜27アミノ酸からなり得る。これは配列番号421の配列を含んでもよい。
より具体的には、膜貫通のアミノ酸配列は、17又は18〜27アミノ酸からなり得、配列番号151、407〜409及び429〜426の配列から選択される配列を含み得るか又は該配列からなり得る。
より具体的には、(ヒト)HEMOタンパク質の膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、17又は18〜27アミノ酸からなり得、配列番号432の配列を含み得る。
より具体的には、(ヒト)HEMOタンパク質の膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、17又は18〜27アミノ酸からなり得、配列番号５及び427〜437の配列から選択される配列を含み得るか又は該配列からなり得る。
より具体的には、(ヒト)HEMOタンパク質の膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、配列番号５及び427〜437の配列から選択される配列からなる。
【００２６】
HEMO細胞内ドメイン
HEMOタンパク質の細胞内ドメインは、膜貫通の最後のアミノ酸の直後のアミノ酸からHEMOタンパク質の最後のアミノ酸まで(Ｎ→Ｃ方向に)伸びる。
HEMOタンパク質の細胞内ドメインのアミノ酸配列は、20〜54アミノ酸、例えば、30〜54アミノ酸、40〜54アミノ酸又は50〜54アミノ酸からなり得る。これは、配列番号413の配列を含み得る。より具体的には、HEMOタンパク質の細胞内ドメインのアミノ酸配列は、配列番号411〜413の配列から選択される配列からなり得る。
例えば、HEMOタンパク質の細胞内ドメインのアミノ酸配列は、50〜54アミノ酸からなり得、配列番号416の配列を含み得る。より具体的には、HEMOタンパク質の細胞内ドメインのアミノ酸配列は、配列番号414〜416の配列から選択される配列からなり得る。
例えば、(ヒト)HEMOタンパク質の細胞内ドメインのアミノ酸配列は、50〜54アミノ酸からなり得、配列番号418の配列を含み得る。より具体的には、(ヒト)HEMOタンパク質の細胞内ドメインのアミノ酸配列は、配列番号６、417及び418の配列から選択される配列からなり得る。
【００２７】
HEMO脱離
本発明者らは、HEMOタンパク質がそのエクトドメインで脱離することを示す。
本発明者らは、HEMOエクトドメインにおける脱離(又は切断)部位、より具体的にはHEMOエクトドメインにおける少なくとも３つの異なる脱離を同定した。
これら脱離部位は、配列番号１のヒトHEMOタンパク質においてアミノ酸380位からアミノ酸480位まで伸びる領域に、すなわち配列番号150のHEMOポリペプチド中に位置し得る。
より具体的には、脱離部位の少なくとも１つは、アミノ酸380位からアミノ酸420位まで、又はアミノ酸421位からアミノ酸449位まで、又はアミノ酸450位からアミノ酸480位までに及んでいる配列番号１のヒトHEMOタンパク質の領域に位置する。
より具体的には、脱離部位の少なくとも１つは、配列番号１のヒトHEMOタンパク質において、アミノ酸421位からアミノ酸449位まで伸びる領域に位置し得、ここで、脱離部位は、アミノ酸421及び422位、又は422及び423位、又は423及び424位、又は424及び425位、又は425及び426位、又は426及び427位、又は427及び428位、又は428及び429位、又は429及び430位、又は430及び431位、又は431及び432位、又は432及び433位、又は433及び434位、又は434及び435位、又は435及び4364位、又は436及び4374位、又は437及び4384位、又は438及び439位、又は439及び440位、又は440及び441位、又は441及び442位、又は442及び443位、又は443及び444位、又は444及び445位、又は445及び446位、又は446及び447位、又は447及び448位、又は448及び449位の間に位置し得る。
【００２８】
より具体的には、脱離部位の少なくとも１つは、配列番号１のヒトHEMOタンパク質において、アミノ酸428位からアミノ酸438位まで伸びる領域に、すなわち配列番号623のHEMOポリペプチド中に位置し得る。これは、HEMOタンパク質の主要な脱離部位であり、HEMOエクトドメインの免疫抑制ドメインに位置する。
例えば、脱離部位の少なくとも１つは、アミノ酸432及び433位、又は433及び434位の間に位置する(配列番号１のヒトHEMOタンパク質を参照して計算される；非ヒトHEMOタンパク質における対応位置の同定については図11A〜11B又は12A〜12Cを参照)。
別の脱離部位は免疫抑制ドメインの上流又は下流(Ｎ→Ｃ方向)に位置する。
配列番号１のヒトHEMOタンパク質を参照して、下流の脱離部位は、アミノ酸450〜480位から選択される２つの(異なる)アミノ酸位置の間(すなわち、配列番号624中)に位置し得、例えば、アミノ酸472と473位の間に位置し得る。
配列番号１のヒトHEMOタンパク質を参照して、上流の脱離部位は、アミノ酸380〜420位から選択される２つの(異なる)アミノ酸位置の間(すなわち、配列番号622中)に位置し得、例えば、アミノ酸406と407位の間に位置し得る。
【００２９】
HEMOエクトドメインの脱離は、HEMOエクトドメインのＮ末端フラグメントである可溶性フラグメントの放出につながる。
(可溶性)Ｎ末端フラグメントの切断から生じるＣ末端フラグメントは、細胞(又は細胞の部分、例えばエクソソーム)の表面、より具体的には胎盤細胞(又は胎盤細胞の部分)、幹細胞(又は幹細胞の部分)又は(幾つかの)腫瘍細胞(又は(幾つかの)腫瘍細胞の部分)の表面に保持される。
本発明者らは、特に、HEMOタンパク質の脱離が多能性及び/又は腫瘍原性を示し得ること(それらのマーカーであり得ること)を示す。
【００３０】
(HEMOタンパク質の脱離により生じる)HEMOエクトドメインの可溶性Ｎ末端フラグメント
表現「可溶形態のポリペプチド」(又は類似の表現)は、当業分野における通常の意味に一致すると意図される。この表現は、一般には、非細胞又は無細胞のポリペプチド、すなわち細胞に含まれも連結もされていないポリペプチドを指す。この表現は、より具体的には、膜ポリペプチドでも、膜貫通ポリペプチドでも、細胞質ポリペプチドでもないポリペプチドを指す。
このことから、本出願は、そのアミノ酸配列が、レトロウイルスEnvタンパク質(上記のとおりのHEMOタンパク質である)のエクトドメインのフラグメントの配列、より具体的にはＮ末端フラグメントの配列であるポリペプチドに関する。
HEMOタンパク質は、例えば、北方真獣類に対して内在性であるレトロウイルスEnvタンパク質と定義でき、ここで、HEMOタンパク質のアミノ酸配列は、例えば、
ａ．配列番号１の配列、若しくは配列番号１に対して少なくとも59％同一、より具体的には、配列番号１に対して少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％若しくは99％同一であるアミノ酸配列、又は
ｂ．517〜578アミノ酸からなり、配列番号１に対して配列番号１の全長にわたって少なくとも78％同一である配列
である。
【００３１】
レトロウイルスEnvタンパク質のエクトドメインのアミノ酸配列は、上記のとおりであり、例えば、Ｎ末端→Ｃ末端方向に
i. CWLCアミノ酸配列
ii. CTQG配列、CTQR配列、CIQR配列、RTQR配列及びRTKR配列から選択されるアミノ酸配列
iii. 任意選択的に、配列番号148のアミノ酸配列(HEMOタンパク質のISDを特徴づける)
iv. 配列番号149のアミノ酸配列
を含み得る、443〜467アミノ酸の配列からなり得る。
エクトドメインのフラグメントの配列は、該エクトドメインの数より少ない数のアミノ酸からなり、該少ない数は、より具体的には、344〜457、又は352〜457、又は354〜456、又は374〜446から、より具体的には344〜373、又は354〜373、又は406〜409、又は374〜396、又は424〜446、又は447〜456、又は447〜457から選択される。
エクトドメインのフラグメントの配列は、前記iの配列及び前記iiの配列を含み得る。
【００３２】
本出願は、参照としてヒトのHEMOタンパク質配列を使用し、チンパンジー(CPZ)、ゴリラ(GOR)、オラウータン(ORA)、テナガザル(GIB)、マクワザル(MAC)、ヒヒ(BAB)、アフリカミドリザル(AGM)、コロブス(アンゴラコロブス)(COL)、ラングール(LAN)、マーモセット(MAR)、キンシコウ(ゴールデンモンキー)(RHI)、リスザル(SQM)、クモザル(SPI)、サキザル(SAK)及びネコ(CAT)のHEMOタンパク質を含み、ここで、本明細書に記載のエクトドメインの異なるモチーフ及び位置の対応関係は次のとおりである：
【表１】
2020530438.tif 000002
【００３３】
このことから、本発明の一般的な態様は、内在性北方真獣類レトロウイルスEnvタンパク質のエクトドメインのＮ末端フラグメントからなるポリペプチドであって
ａ．前記レトロウイルスEnvタンパク質は
・  配列番号１のアミノ酸配列、又は
・  配列番号１に対して少なくとも59％同一、より具体的には配列番号１に対して少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％若しくは99％同一であるアミノ酸配列、又は
・  配列番号129〜143の配列から選択される配列
であり、
ｂ．前記レトロウイルスEnvタンパク質のエクトドメインは、シグナルペプチドもそのフラグメントも有さない状態では、
・  前記配列の443〜468又は443〜467アミノ酸、より具体的にはＮ末端→Ｃ末端方向に
i. CWLCアミノ酸配列
ii. CTQG配列、CTQR配列、CIQR配列、RTQR配列及びRTKR配列から選択されるアミノ酸配列、及び
iv. 配列番号149のアミノ酸配列
を含む前記配列の443〜468又は443〜467アミノ酸からなり、より具体的には、配列番号178、912及び547〜561の配列と、配列番号172、911及び457〜471の配列の少なくとも１つのフラグメントであり且つ配列番号178、912及び547〜561の配列の少なくとも１つの長さと最大７又は８アミノ酸異なる配列とから選択される配列からなり、
ここで、前記Ｎ端末フラグメントの配列は：
・  前記エクトドメインの数より少ない数のアミノ酸からなり、前記少ない数が344〜457又は374〜446から選択され、
・  前記エクトドメインのＮ末端先端から始まり
・  b.i.の配列及びb.ii.の配列を含む、
ポリペプチドに関する。
【００３４】
特別な実施態様によれば、本発明は、
ａ．前記レトロウイルスEnvタンパク質は
・  配列番号１のアミノ酸配列、又は
・  配列番号１に対して少なくとも59％同一、より具体的には配列番号１に対して少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％若しくは99％同一であるアミノ酸配列、又は
・  配列番号129〜143の配列から選択される配列
であり、
ｂ．前記レトロウイルスEnvタンパク質のエクトドメインは、シグナルペプチドもそのフラグメントも有さない状態では、
・  前記配列の443〜468又は443〜467アミノ酸、より具体的にはＮ末端→Ｃ末端方向に
i. CWLCアミノ酸配列
ii. CTQG配列、CTQR配列、CIQR配列及びRTKR配列から選択されるアミノ酸配列
iii. 配列番号148のアミノ酸配列、及び
iv. 配列番号149のアミノ酸配列
を含む前記配列の443〜468又は443〜467アミノ酸からなり、より具体的には、配列番号178、912及び547〜560の配列と、配列番号172、911及び457〜470の配列の少なくとも１つのフラグメントであり且つ配列番号178、912及び547〜560の配列の少なくとも１つの長さと最大７又は８アミノ酸異なる配列とから選択される配列からなり、
ここで、前記Ｎ端末フラグメントの配列は：
・  前記エクトドメインの数より少ない数のアミノ酸からなり、前記少ない数が344〜457又は374〜446から選択され、
・  前記エクトドメインのＮ末端先端から始まり
・  b.i.の配列及びb.ii.の配列を含む、
上記のとおりの内在性北方真獣類(例えば、ヒト、CPZ、GOR、ORA、GIB、MAC、BAB、AGM、COL、LAN、MAR、RHI、SQM、SPI、SAK)レトロウイルスEnvタンパク質のエクトドメインのＮ末端フラグメントからなるポリペプチドに関する。
【００３５】
より具体的には、上記のペプチドは、前記Ｎ末端フラグメントの配列が前記エクトドメインより少ない数のアミノ酸からなり、前記少ない数が354〜456又は374〜446から選択される、上記のとおりの内在性北方真獣類レトロウイルスEnvタンパク質のエクトドメインのＮ末端フラグメントである。
【００３６】
別の特別な実施態様によれば、本発明は、
ａ．前記Ｎ末端フラグメントのＣ末端先端は、配列番号１、129〜134及び136〜137の配列の380位アミノ酸から480位アミノ酸までに位置し、且つ配列番号１、129〜134及び136〜137の配列の膜貫通ドメインのＮ末端先端の前であって、配列番号１、129〜134及び136〜137の配列の膜貫通ドメインのＮ末端先端の６〜112アミノ酸上流に位置するか、又は
ｂ．前記Ｎ末端フラグメントのＣ末端先端は、配列番号135の配列の379位アミノ酸から479位アミノ酸までに位置し、且つ配列番号135の配列の膜貫通ドメインのＮ末端先端の前であって、配列番号135の配列の膜貫通ドメインのＮ末端先端の６〜112アミノ酸上流に位置するか、又は
ｃ．前記Ｎ末端フラグメントのＣ末端先端は、配列番号138の配列の380位アミノ酸から479位アミノ酸までに位置し、且つ配列番号138の配列の膜貫通ドメインのＮ末端先端の前であって、配列番号138の配列の膜貫通ドメインのＮ末端先端の６〜111アミノ酸上流に位置するか、又は
ｄ．前記Ｎ末端フラグメントのＣ末端先端は、配列番号139〜140及び142の配列の380位アミノ酸から476位アミノ酸までに位置し、且つ配列番号139〜140及び142の配列の膜貫通ドメインのＮ末端先端の前であって、配列番号139〜140及び142の配列の膜貫通ドメインのＮ末端先端の３〜105アミノ酸上流に位置するか、又は
ｅ．前記Ｎ末端フラグメントのＣ末端先端は、配列番号141の配列の370位アミノ酸から466位アミノ酸までに位置し、且つ配列番号141の配列の膜貫通ドメインのＮ末端先端の前であって、配列番号141の配列の膜貫通ドメインのＮ末端先端の３〜105アミノ酸上流に位置する、
上記のとおりの内在性北方真獣類(例えば、ヒト、CPZ、GOR、ORA、GIB、MAC、BAB、AGM、COL、LAN、MAR、RHI、SQM、SPI、SAK)レトロウイルスEnvタンパク質のエクトドメインのＮ末端フラグメントからなるポリペプチドに関する。
【００３７】
表現「配列番号１、129〜134及び136〜137の配列の膜貫通ドメインのＮ末端先端の前であって、配列番号１、129〜134及び136〜137の配列の膜貫通ドメインのＮ末端先端の６〜112アミノ酸上流」とは、例えば、次：
ヒトHEMOエクトドメインが配列番号１の配列の27〜492位に対応する場合、膜貫通ドメインのＮ末端先端は配列番号１の配列のアミノ酸493であり、
その結果、ヒトHEMOエクトドメインのＮ末端フラグメントが354アミノ酸のサイズを有する場合、ヒトHEMOエクトドメインのＮ末端フラグメントは配列番号１の配列のアミノ酸27からアミノ酸380までであり、380位アミノ酸は配列番号１の配列の膜貫通ドメインのＮ末端先端である493位アミノ酸から112アミノ酸上流の位置にあり、
ヒトHEMOエクトドメインが配列番号１の配列の25〜486位に対応する場合、膜貫通ドメインのＮ末端先端は配列番号１のアミノ酸487であり、
その結果、ヒトHEMOエクトドメインのＮ末端フラグメントが456アミノ酸のサイズを有する場合、ヒトHEMOエクトドメインのＮ末端フラグメントは配列番号１の配列のアミノ酸25からアミノ酸480までである、480位アミノ酸は配列番号１の配列の膜貫通ドメインのＮ末端先端である487位アミノ酸から６アミノ酸上流の位置にある
という事実に対応する。
【００３８】
別の特別な実施態様によれば、本発明は、
ａ．前記レトロウイルスEnvタンパク質は
・  配列番号１のアミノ酸配列、又は
・  配列番号１に対して少なくとも80％同一、より具体的には配列番号１に対して少なくとも81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％若しくは99％同一であるアミノ酸配列
であり、
ｂ．前記エクトドメインは、シグナルペプチドもそのフラグメントも有さない状態では、
・  前記配列の443〜468又は443〜467アミノ酸、より具体的にはＮ末端→Ｃ末端方向に
i. CWLCアミノ酸配列
ii. CTQG配列、CTQR配列、CIQR配列及びRTKR配列から選択されるアミノ酸配列
iii. 配列番号148のアミノ酸配列、及び
iv. 配列番号149のアミノ酸配列
を含む前記配列の443〜468又は443〜467アミノ酸からなり、より具体的には、
・  配列番号178及び912の配列と、配列番号172及び911の配列の少なくとも１つのフラグメントであり且つ配列番号178及び912の配列の少なくとも１つの長さと最大７又は８アミノ酸異なる配列とから選択される配列からなり、
ここで、前記Ｎ端末フラグメントの配列は：
・  前記エクトドメインの数より少ない数のアミノ酸からなり、前記少ない数が354〜456又は374〜446から選択され、
・  前記エクトドメインのＮ末端先端から始まり
・  b.i.の配列及びb.ii.の配列を含み
・  前記Ｎ末端フラグメントのＣ末端先端は、配列番号１の配列の380位アミノ酸から480位アミノ酸までに位置し、且つ配列番号１の配列の膜貫通ドメインのＮ末端先端の前であって、配列番号１の配列の膜貫通ドメインのＮ末端先端の６〜112アミノ酸上流に位置する、
上記のとおりの内在性ヒトレトロウイルスEnvタンパク質のエクトドメインのＮ末端フラグメントからなるポリペプチドに関する。
【００３９】
(可溶性)エクトドメインフラグメントの配列は、iiiの全長配列を含まなくてよいが、iiiの配列のフラグメントを含み得る。このことは、脱離部位が上記の主要な脱離部位である場合に特に該当する。例えば、(可溶性)エクトドメインフラグメントの配列は、配列番号９〜10、183〜184及び185〜186の配列から選択される配列を含み得るか又は該配列からなり得る。
(可溶性)エクトドメインフラグメントの配列は、iiiの配列を含まなくてよく、iiiの配列のフラグメントも含まなくてよい。このことは、脱離部位が上記の副次(上流)の脱離部位である場合に特に該当する。例えば、(可溶性)エクトドメインフラグメントの配列は、配列番号13〜33、670〜689、195〜215、690〜709、216〜236及び710〜729の配列から選択される配列を含み得るか又は該配列からなり得る。
(可溶性)エクトドメインフラグメントの配列はiiiの配列を含む。このことは脱離部位が上記の二次的な(下流の)脱離部位である場合に顕著である。例えば、(可溶性)エクトドメインフラグメントの配列は配列番号55〜75、830〜839、300〜320、840〜849、321〜341、850〜859の配列から選択される配列を含み得るか又は該配列からなり得る。
【００４０】
より具体的には、本発明は、
ａ．前記エクトドメインのＮ末端フラグメントの配列は、b.iiiの全長配列を含まないが、b.iiiの配列のフラグメントを含み、
ｂ．より具体的には、前記エクトドメインのＮ末端フラグメントの配列は、配列番号９〜10、183〜184及び185〜186の配列から選択される配列を含んでなるか又は該配列からなる、
上記のポリペプチドに関する。
より具体的には、本発明は、
ａ．前記エクトドメインのＮ末端フラグメントの配列は、b.iiiの全長配列も、b.iiiの配列のフラグメントも含まず
より具体的には、前記エクトドメインのＮ末端フラグメントの配列は、配列番号13〜33、670〜689、195〜215、690〜709、216〜236及び710〜729の配列から選択される配列を含んでなるか又は該配列からなり
又は
ｂ．前記エクトドメインのＮ末端フラグメントの配列は、b.iiiに記載の配列を含み、
より具体的には、前記エクトドメインのＮ末端フラグメントの配列は、配列番号55〜75、830〜839、300〜320、840〜849、321〜341及び850〜859の配列から選択される配列を含んでなるか又は該配列からなる、
上記のポリペプチドに関する。
【００４１】
より具体的には、本発明は、
ａ．前記エクトドメインのＮ末端フラグメントの配列は該エクトドメインのＮ末端先端から開始し、前記エクトドメインの該Ｎ末端先端は配列番号１の配列の25位アミノ酸に対応し、ここで、
前記Ｎ末端フラグメントのＣ末端先端は配列番号１の配列の421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、445、446、447、448又は449位アミノ酸に対応し、又は
ｂ．前記エクトドメインのＮ末端フラグメントの配列は該エクトドメインのＮ末端先端から開始し、前記エクトドメインの該Ｎ末端先端は配列番号１の配列の26位アミノ酸に対応し、ここで、
前記Ｎ末端フラグメントのＣ末端先端は配列番号１の配列の421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、445、446、447、448又は449位アミノ酸に対応し、又は
ｃ．前記エクトドメインのＮ末端フラグメントの配列は該エクトドメインのＮ末端先端から開始し、前記エクトドメインの該Ｎ末端先端は配列番号１の配列の27位アミノ酸に対応し、ここで、
前記Ｎ末端フラグメントのＣ末端先端は配列番号１の配列の421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、445、446、447、448又は449位アミノ酸に対応する、
上記のポリペプチドに関する。
より具体的には、本発明は、前記エクトドメインのＮ末端フラグメントの配列は、配列番号９〜10、184〜186、991〜1071の配列から選択される配列を含んでなるか又は該配列からなる、上記のポリペプチドに関する。
【００４２】
特別な実施態様によれば、本発明は、
ａ．前記レトロウイルスEnvタンパク質は
・  配列番号143のアミノ酸配列、又は
・  配列番号143に対して少なくとも80％同一、より具体的には配列番号143に対して少なくとも81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％若しくは99％同一であるアミノ酸配列
であり、
ｂ．前記レトロウイルスEnvタンパク質のエクトドメインは、シグナルペプチドもそのフラグメントも有さない状態では、前記配列の443〜468又は443〜467アミノ酸、より具体的にはＮ末端→Ｃ末端方向に
i. CWLCアミノ酸配列
ii. RTQR配列、及び
iv. 配列番号149のアミノ酸配列
を含む前記配列の443〜468又は443〜467アミノ酸からなり、より具体的には、配列番号561及び951の配列と、配列番号471及び949の配列のフラグメントであり且つ配列番号561及び951の配列の少なくとも１つの長さと最大７又は８アミノ酸異なる配列とから選択される配列からなり、
きこで、前記Ｎ端末フラグメントの配列は：
・  前記エクトドメインの数より少ない数のアミノ酸からなり、前記少ない数が352〜457又は374〜446から選択され、
・  前記エクトドメインのＮ末端先端から始まり、
・  b.i.の配列及びb.ii.の配列を含む、
上記のとおりの内在性ネコレトロウイルスタンパク質のエクトドメインのＮ末端フラグメントからなるポリペプチドに関する。
【００４３】
より具体的には、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドと少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％又は99％の同一性を有する上記のとおりのポリペプチドに関する。
具体的には、本発明の上記ポリペプチドは、任意の生理学的に許容可能なキャリア中で、凍結乾燥形態又は濃縮形態(例えば、0.001から10,000nMまで、0.01から10,000nMまで、0.001から1,000nMまで、0.01から1,000nMまで、0.1から1,000nMまで、0.1から100nMまで、0.1から10nMまで、10から100nMまで、10から1,000nMまで、100から1,000nMまで、1,000から10,000nMまで、5,000から10,000nMまで)である。
(可溶性)エクトドメインフラグメントは、HEMOエクトドメインの第１のアミノ酸(Ｎ末端→Ｃ末端方向)を含み得る。
(可溶性)エクトドメインフラグメントは、本明細書において、可溶性ポリペプチド、又はＮ末端フラグメント、又は可溶性Ｎ末端エクトドメインフラグメントとも呼ぶ。
【００４４】
抗体産生などに有用であり得る可溶性Ｎ末端エクトドメインフラグメントの(サブ)フラグメント
本出願はまた、上記の(可溶性)エクトドメインフラグメントの(サブ)フラグメントに関する。これら(サブ)フラグメントは、特に、抗体産生に、より具体的には、モノクローナル抗体産生に有用な(サブ)フラグメントを包含する(下記の実施例２を参照)。
このことから、本出願は、
−  少なくとも10アミノ酸、より具体的には少なくとも50アミノ酸、より具体的には少なくとも150アミノ酸、より具体的には少なくとも160アミノ酸、より具体的には164アミノ酸、及び/又は
−  400アミノ酸未満、より具体的には300アミノ酸未満、より具体的には250アミノ酸未満、より具体的には200アミノ酸未満
を含む、HEMOエクトドメインの(可溶性)Ｎ末端フラグメント(HEMOタンパク質の脱離により生じる可溶性Ｎ末端フラグメント)の(サブ)フラグメントに関する。
例えば、(サブ)フラグメントは、少なくとも100アミノ酸で200アミノ酸未満、例えば164〜199アミノ酸、例えば164アミノ酸を含み得る。
例えば、(サブ)フラグメントは配列番号８の配列を含み得る。
この(サブ)フラグメントは、有利には、少なくとも１つの抗原又はエピトープを含む。(サブ)フラグメントは、例えばマウスに投与する(例えば全身投与により)と、免疫原性であり得る。
【００４５】
HEMOエクトドメインのＣ末端フラグメント(前記Ｎ末端エクトドメインフラグメントの１つの脱離から生じる)及び表面にＣ末端フラグメントを発現する細胞
本出願はまた、前記可溶性Ｎ末端エクトドメインフラグメントの１つの脱離から生じる、HEMOエクトドメイン又はHEMOタンパク質の(Ｃ末端)フラグメントに関する。
本出願はまた、HEMOエクトドメイン又はHEMOタンパク質の(Ｃ末端)フラグメントを発現する(又は保持する)細胞(又は細胞の部分、例えばエクソソーム)に関する。
このことから、本出願は、そのアミノ酸配列が(上記のとおりの)HEMOタンパク質のフラグメントの配列であるポリペプチドであって、前記フラグメントはHEMOタンパク質のエクトドメインのＣ末端フラグメントを含み、ここで、
レトロウイルスEnvタンパク質の前記フラグメントは、前記エクトドメインの全長アミノ酸配列を含まず、より具体的には、前記Ｃ末端フラグメントが前記エクトドメインのＮ末端部を有しない該エクトドメインのＣ末端部を含み、
ここで、エクトドメインの前記Ｃ末端フラグメントは、前記可溶性Ｎ末端エクトドメインフラグメントの１つの脱離(又は切断)後に保持されるＣ末端フラグメントである、
ポリペプチドに関する。
【００４６】
このポリペプチドの配列は、
配列番号11〜12、189〜190、191〜192及び193〜194から選択される配列、又は
配列番号34〜54、730〜749、237〜257、750〜769、258〜278、770〜789、279〜299及び790〜809から選択される配列、又は
配列番号76〜96、860〜869、342〜362、870〜879、363〜383、880〜889、384〜404及び890〜899から選択される配列
を含み得る(エクトドメインのＣ末端フラグメントの配列は、前記配列からなり得る)。
例えば、前記ポリペプチドの配列は、配列番号625〜626、627〜647、810〜829、648〜668及び900〜909の配列から選択され得る。
このポリペプチドは、本明細書おいて、Ｃ末端タンパク質フラグメントとも呼ぶ。
本出願はまた、前記Ｃ末端タンパク質フラグメントを発現する(単離された)細胞、より具体的には天然に存在するかまたは遺伝子操作された細胞に関し、ここで、Ｃ末端タンパク質フラグメントの一部は前記細胞の表面で発現され、前記表面で発現される部分は、前記Ｃ末端タンパク質フラグメントに含まれるエクトドメインのＣ末端フラグメントを含む。
【００４７】
本出願はまた、そのアミノ酸配列がHEMOタンパク質のエクトドメインのＣ末端フラグメントの配列であるポリペプチドに関し、ここで、前記HEMOタンパク質及び前記エクトドメインは本明細書に記載の通りであり、前記Ｃ末端フラグメントは、前記エクトドメインから前記可溶性Ｎ末端エクトドメインフラグメントの１つが脱離(又は切断)した後に保持される、前記エクトドメインのＣ末端フラグメントである。
前記ポリペプチドは、
配列番号11〜12、189〜190、191〜192及び193〜194から選択される配列、又は
配列番号34〜54、730〜749、237〜257、750〜769、258〜278、770〜289、279〜299及び790〜809から選択される配列、又は
配列番号76〜96、860〜869、342〜362、870〜879、363〜383、880〜889、384〜404及び890〜899から選択される配列
からなり得る。
このポリペプチドは、本明細書において、Ｃ末端エクトドメインフラグメントとも呼ぶ。
【００４８】
本出願はまた、その配列が、Ｎ末端→Ｃ末端方向に、(上記のとおりの)Ｃ末端エクトドメインフラグメントの配列で開始するポリペプチドに関すし、ここで、Ｃ末端エクトドメインフラグメントの配列のＣ末端部は、HEMOタンパク質の膜貫通ドメインに、又はHEMOタンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインに(直接)連結され、HEMOタンパク質は本明細書に記載のとおりである。
本出願はまた、前記Ｃ末端エクトドメインフラグメントをその表面で発現する(単離された)細胞、より具体的には天然に存在する又は遺伝子操作された細胞に関する。
この細胞は、天然に存在する(しかし、単離された)細胞又は遺伝子操作された細胞であり得る。
この細胞は、北方真獣類の細胞、より具体的にはヒト細胞であり得る。
この細胞は、胎盤細胞(例えば、細胞栄養芽細胞)、幹細胞、腫瘍細胞又は腫瘍幹細胞であり得る。胎盤細胞は、例えば栄養芽細胞、より具体的には絨毛細胞栄養芽細胞、絨毛外細胞栄養芽細胞又は絨毛膜栄養芽細胞である。
腫瘍細胞は、例えば、卵巣腫瘍、子宮腫瘍(より具体的には、子宮内膜腫瘍、子宮頸腫瘍、妊娠性腫瘍(胎盤の腫瘍、例えば、絨毛腫を含む))、乳腫瘍、肺腫瘍、胃腫瘍、結腸腫瘍、肝臓腫瘍、腎臓腫瘍、前立腺腫瘍、尿路上皮腫瘍、胚細胞腫瘍、脳腫瘍、頭部頸部腫瘍、膵臓腫瘍、甲状腺腫瘍、胸腺腫瘍、皮膚腫瘍、骨肉腫又は骨髄腫瘍であり得る。尿路上皮腫瘍は、膀胱、尿管、腎盂の癌腫を包含するので、前記腫瘍は膀胱腫瘍、尿管腫瘍又は腎盂腫瘍を含む尿路上皮腫瘍であり得る。
【００４９】
特別な実施態様によれば、本発明は、内在性北方真獣類レトロウイルスEnvタンパク質のエクトドメインのフラグメントからなるポリペプチドであって、前記フラグメントが前記レトロウイルスEnvタンパク質のエクトドメインのＣ末端フラグメントを含み、
ａ．前記レトロウイルスEnvタンパク質及び前記エクトドメインは本明細書に記載の通りであり、
ｂ．前記Ｃ末端フラグメントが前記エクトドメインのＮ末端部を含まずに前記エクトドメインのＣ末端フラグメントを含み
ｃ．前記Ｃ末端フラグメントは、前記エクトドメインからの前記ポリペプチドの切断後に残るＣ末端フラグメント、より具体的にはエクトドメインの前記Ｃ末端フラグメントの配列は、配列番号11〜12及び189〜194から選択される配列又は配列番号34〜54、237〜299及び730〜809から選択される配列又は配列番号76〜96、342〜404及び860〜899から選択される配列からなる、
ポリペプチドに関する。
より具体的には、本発明は、本明細書に記載の前記ポリペプチドと少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％又は99％の同一性を有する上記ポリペプチドに関する。
【００５０】
抗体産生などに有用であり得る、HEMOエクトドメインの(前記Ｎ末端エクトドメインフラグメントの１つの脱離から生じる)Ｃ末端フラグメントの(サブ)フラグメント
本出願はまた、上記のHEMOエクトドメインの(可溶性Ｎ末端フラグメントに脱離後に細胞表面に保持される)上記Ｃ末端フラグメントの(サブ)フラグメントに関する。これら(サブ)フラグメントは、特に、抗体産生に、より具体的にはモノクローナル抗体産生に有用な(サブ)フラグメントを包含する(下記の実施例３を参照)。
このことから、本出願は、
−  少なくとも10アミノ酸、より具体的には少なくとも15、16又は17アミノ酸、及び/又は
−  少なくとも200アミノ酸未満、より具体的には30アミノ酸未満
を含む、HEMOエクトドメインのＣ末端フラグメントの(サブ)フラグメントに関する。
この(サブ)フラグメントは、有利には、少なくとも１つの抗原又はエピトープを含む。(サブ)フラグメントは、例えばマウスに投与する(例えば全身投与により)と、免疫原性であり得る。
【００５１】
本出願のポリペプチド、ポリペプチド(サブ)フラグメント又は細胞を含むか又はこれらに由来する物質又はその使用
本出願はまた、前記可溶性Ｎ末端エクトドメインフラグメント、(可溶性)エクトドメインフラグメントの前記(サブ)フラグメント、前記Ｃ末端タンパク質フラグメント、前記Ｃ末端エクトドメインフラグメント及び前記細胞を含むか若しくは直接由来する物質又は前記のものを含む使用に関する。
より具体的には、本出願は、診断に、例えば腫瘍の診断、胎盤形成不全の診断若しくは妊娠中の北方真獣類における微生物(より具体的にはウイルス)感染に対する胎児保護の欠陥の診断、又は治療法に、例えば、腫瘍の治療、胎盤形成不全の治療若しくは妊娠中の北方真獣類における微生物(より具体的には、ウイルス)感染に対する胎児保護の欠陥の治療に用いるための前記可溶性Ｎ末端エクトドメインフラグメント、前記Ｃ末端タンパク質フラグメント、前記Ｃ末端エクトドメインフラグメント及び前記細胞に関する。
より具体的には、本出願は、非ヒト哺乳動物における免疫による抗体の産生、より具体的にはモノクローナル抗体の産生に用いられる(可溶性)エクトドメインフラグメントの前記(サブ)フラグメントに関する。
【００５２】
本出願はまた、本出願の少なくとも１つのポリペプチド又は細胞、より具体的には、前記可溶性Ｎ末端エクトドメインフラグメント、前記Ｃ末端タンパク質フラグメント、前記Ｃ末端エクトドメインフラグメント及び前記細胞の少なくとも１つを含む任意の組成物、より具体的には任意の医薬組成物に関する。この組成物(又は医薬組成物)は、必要に応じて、少なくとも１つの(医薬的に許容される)ビヒクル及び/又は北方真獣類の血液又は組織細胞及び/又は少なくとも１つの免疫アジュバント及び/又は少なくとも１つの緩衝液を更に含み得る。
より具体的には、本出願は、前記可溶性Ｎ末端エクトドメインフラグメントの少なくとも１つ及び/又は前記細胞の１つを含み、必要に応じて、北方真獣類の血液を更に含む組成物に関する。
より具体的には、本出願は、前記可溶性Ｎ末端エクトドメインフラグメントの少なくとも１つを含み、必要に応じて、少なくとも１つの医薬的に許容されるビヒクルを更に含む組成物又は医薬組成物又は薬物に関する。この医薬組成物又は薬物は、例えば、胎盤形成不全の治療又は妊娠中の北方真獣類における微生物(より具体的には、ウイルス)感染に対する胎児保護の欠陥の治療に有用であり得る。
【００５３】
より具体的には、本出願は、(可溶性)エクトドメインフラグメントの前記(サブ)フラグメントの少なくとも１つを含み、必要に応じて、少なくとも１つのワクチンアジュバントを更に含む組成物又は医薬組成物に関する。この組成物は、本出願のポリペプチドに結合する、より具体的には特異的に結合する抗体、より具体的にはモノクローナル抗体を産生するために非ヒト哺乳動物への投与に有用であり得る。
より具体的には、本出願は、前記Ｃ末端タンパク質フラグメント及び前記Ｃ末端エクトドメインフラグメントの少なくとも１つを含み、必要に応じて、少なくとも１つの緩衝液を更に含む組成物又は医薬組成物に関する。
より具体的には、本出願は、(前記Ｃ末端タンパク質フラグメント及び前記Ｃ末端エクトドメインフラグメントの少なくとも１つを発現する)前記細胞の少なくとも１つを含み、必要に応じて、北方真獣類の血液又は細胞組織を更に含む組成物又は医薬組成物に関する。
より具体的には、本出願は、(前記Ｃ末端タンパク質フラグメント及び前記Ｃ末端エクトドメインフラグメントの少なくとも１つを発現する)前記細胞又は該細胞の部分(例えば、エクソソーム)の少なくとも１つを含み、必要に応じて、少なくとも１つの医薬的に許容されるビヒクルを更に含む組成物又は医薬組成物又は薬物に関する。この医薬組成物又は薬物は、例えば、胎盤形成不全の治療に有用であり得る。
表現「細胞」は、細胞又は細胞の一部(例えば、エクソソーム)を包含し、より具体的には表現「細胞」は細胞及びエクソソームを包含する。
【００５４】
本出願はまた、物質、より具体的にはタンパク質又はタンパク質性物質に関し、ここで、前記物質は、
−  抗体、又は
−  モノクローナル抗体、より具体的にはブダペスト条約の下で受託番号I-5211にて2017年6月20日付でCNCMに寄託されたハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体、又は
−  前記(モノクローナル)抗体の抗原結合特異性を保持する(モノクローナル)抗体のフラグメント、例えばFab、Fab'又はF(ab)2フラグメント、又は
−  前記(モノクローナル)抗体の抗原結合特異性を保持する融合タンパク質、例えばscFv、又は
−  単一ドメイン抗体(sdAb)、又は
−  sdAbの可変ドメイン
であり、ここで、前記物質は、
−  前記可溶性Ｎ末端エクトドメインフラグメント及び前記(可溶性)エクトドメインフラグメントの(サブ)フラグメントの１つ、又は
−  前記Ｃ末端タンパク質フラグメント及び前記Ｃ末端エクトドメインフラグメントの１つ
に特異的にに結合する。
CNCMとは、Collection Nationale de Culture de Microorganismes (Institut Pasteur ；28, rue du Docteur Roux ；75724 Paris CEDEX 15、フランス)である。
より具体的には、本出願はまた、前記Ｃ末端タンパク質フラグメント及び前記Ｃ末端エクトドメインフラグメントの１つと結合せず、前記可溶性Ｎ末端エクトドメインフラグメント及び(可溶性)エクトドメインフラグメントの(サブ)フラグメントの１つに特異的に結合する(タンパク質性)物質に関する。
【００５５】
より具体的には、本出願はまた、前記可溶性Ｎ末端エクトドメインフラグメント及び(可溶性)エクトドメインフラグメントの(サブ)フラグメントの１つに結合せず、前記Ｃ末端タンパク質フラグメント及びＣ末端エクトドメインフラグメントの１つに特異的に結合する物質、より具体的にはタンパク質又は(タンパク質性)物質に関する。
句「抗体」又は「モノクローナル抗体」は、(重鎖及び軽鎖を含む)従来型抗体及び単一ドメイン抗体(sdAB；従来型抗体とは対照的に軽鎖がなく、単一の単量体可変抗体ドメインからなる)、例えば重鎖抗体(hcAb)を包含する。
句「抗体」又は「モノクローナル抗体」は、単一特異性、二重特異性又は三重特異性抗体を含む。
表現「抗原結合特異性を保持する(モノクローナル)抗体のフラグメント」は、(従来型Ab又はmAbの)Fab、Fab'及びF(ab)2フラグメント並びにsdAb又はhcAbの可変ドメイン(VHH又はナノボディ)を包含する。
表現「(モノクローナル)抗体の抗原結合特異性を保持する融合タンパク質」は、scFvを含む。
この抗体、抗体フラグメント又は融合タンパク質のCDR(又はCDR1、CDR2及びCDR3の少なくとも１つ)は、ブダペスト条約の下で受託番号I-5211にて2017年6月20日付でCNCMに寄託されたハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体のCDR(又はそれぞれCDR1、CDR2及びCDR3の少なくとも１つ)であり得る。
この抗体、抗体フラグメント又は融合タンパク質は、必要に応じて、少なくとも１つの検出標識又はマーカー又はタグ又は薬物に連結又は結合されていてもよい。
【００５６】
本出願はまた、抗体が本明細書に記載の抗体の１つであるHEMO腫瘍細胞を標的にする薬物接合抗体に関する。
HEMO腫瘍細胞は、本出願の前記Ｎ末端(可溶性)エクトドメインフラグメントの１つ又は前記Ｃ末端タンパク質フラグメントの１つであるポリペプチドをその表面で発現する。
本出願はまた、物質、より具体的にはタンパク質又はタンパク質性物質に関し、ここで、前記物質は
-  抗体、又は
-  モノクローナル抗体、又は
−  前記(モノクローナル)抗体の抗原結合特異性を保持する(モノクローナル)抗体のフラグメント、例えばFab、Fab'又はF(ab)2フラグメント、又は
−  前記(モノクローナル)抗体の抗原結合特異性を保持する融合タンパク質、例えばscFv、又は
-  単一ドメイン抗体(sdAb)、又は
-  sdAbの可変ドメイン
であり、ここで、前記物質は、必要に応じて、少なくとも１つの検出標識又はマーカー又はタグ又は薬物に連結され、前記物質は配列番号８、919、924〜939、981〜988及び990の配列から選択される(ヒト)HEMO抗原に特異的に結合する。
【００５７】
本出願はまた、本出願のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマに関する。より具体的には、本出願は、(ヒトHEMOエクトドメインのフラグメント、すなわち本出願のＮ末端可溶性ポリペプチドのサブフラグメント、すなわち配列番号１のフラグメント123〜286(配列番号８のフラグメント)を指向する)受託番号I-5211にて2017年6月20日付でCNCMに寄託されたハイブリドーマ(2F7-E8)に関する。より具体的には、本出願は、少なくとも１つの検出標識又はマーカー又はタグ又は薬物に連結又は結合され、場合によりヒト化された、受託番号I-5211にて2017年6月20日付でCNCMに寄託されたハイブリドーマ(2F7-E8)により産生されるモノクローナル抗体に関する。このハイブリドーマ(2F7-E8)又は受託番号I-5211にて2017年6月20日付でCNCMに寄託されたハイブリドーマ(2F7-E8)により産生されるモノクローナル抗体は、本出願のＮ末端可溶性ポリペプチドのサブフラグメント、及びHEMOタンパク質が脱離していないときの本出願のＮ末端可溶性ポリペプチドの前記サブフラグメントの非可溶形態を認識可能である。
本出願はまた、キメラ抗原受容体が細胞内Ｔ細胞受容体(TCR)シグナル伝達ドメインに連結された細胞外単鎖可変フラグメント(scFv)を含み、該scFvが本出願のscFvであるキメラ抗原受容体Ｔ細胞(すなわちCAR-Ｔ細胞)に関する。
細胞内TCRシグナル伝達ドメインは、例えば、CD3zetaであり得る。
scFvは、例えばヒンジ/スペーサペプチド及び/又は膜貫通ドメインを介して、TCRシグナル伝達ドメインに間接的に連結されていてもよい。CARの細胞内部分は、TCRシグナル伝達ドメインに加えて、少なくとも１つの共刺激ドメイン(例えば、CD28又は4-1BB)を含み得る。
【００５８】
本出願はまた、治療で用いるため、例えば抗癌治療で用いるため、より具体的には固形腫瘍の治療で用いるための、本出願の抗体若しくはモノクローナル抗体又は本出願のCAR-Ｔ細胞に関する。
この抗体、モノクローナル抗体、CAR-Ｔ細胞は、腫瘍細胞又は腫瘍幹細胞に(特異的に)結合し得る。
癌は、例えば、卵巣癌、子宮癌(より具体的には、子宮内膜癌、子宮頸癌、妊娠性癌(胎盤の癌、例えば、絨毛腫を含む))、乳癌、肺癌、胃癌、結腸癌、肝臓癌、腎臓癌、前立腺癌、尿路上皮癌、胚細胞胞癌、脳腫瘍、頭部頸部癌、膵臓癌、甲状腺癌、胸腺癌、皮膚癌、骨肉腫又は骨髄の癌であり得る。尿路上皮癌は膀胱、尿管及び腎盂の癌腫を包含するので、前記癌は膀胱癌、尿管癌又は腎盂癌を含む尿路上皮癌であり得る。
本出願はまた、診断、より具体的には(インビトロ)癌診断、より具体的には被験体の腫瘍の組織型(historype)、悪性度(grade)若しくはステージ(stage)を決定する(インビトロ)方法、又は妊娠被験体の胎盤形成不全、より具体的には妊娠被験体を胎盤剥離、子癇前症若しくは子癇のリスクに曝す胎盤形成不全を検出する(インビトロ)方法に用いるための、本出願の抗体若しくはモノクローナル抗体又は本出願のCAR-Ｔ細胞に関する。
本出願はまた、北方真獣類の循環性細胞、より具体的には腫瘍細胞若しくは腫瘍幹細胞若しくは胎盤細胞である循環性細胞を精製又は単離する(インビトロ)方法又は体細胞から多能性幹細胞を誘導する(インビトロ)方法に用いるための、本出願の抗体若しくはモノクローナル抗体又は本出願のCAR-Ｔ細胞に関する。
【００５９】
本出願はまた、治療、より具体的には腫瘍を患う北方真獣類における腫瘍細胞の標的化に用いるための、本出願の薬物接合(モノクローナル)抗体又は本出願のCAR-Ｔ細胞に関し、ここで、前記腫瘍細胞は、その表面に、本出願の前記Ｎ末端(可溶性)エクトドメインフラグメントの１つ又は前記Ｃ末端タンパク質フラグメントの１つであるを発現する。
腫瘍細胞は、例えば、卵巣腫瘍、子宮腫瘍(より具体的には、子宮内膜腫瘍、子宮頸腫瘍、妊娠性腫瘍(胎盤の腫瘍、例えば、絨毛腫を含む))、乳腫瘍、肺腫瘍、胃腫瘍、結腸腫瘍、肝臓腫瘍、腎臓腫瘍、前立腺腫瘍、尿路上皮腫瘍、胚細胞腫瘍、脳腫瘍、頭部頸部腫瘍、膵臓腫瘍、甲状腺腫瘍、胸腺腫瘍、皮膚腫瘍、骨肉腫又は骨髄腫瘍であり得る。尿路上皮腫瘍は、膀胱、尿管、腎盂の癌腫を包含するので、前記癌は膀胱腫瘍、尿管腫瘍又は腎盂腫瘍を含む尿路上皮腫瘍であり得る。
【００６０】
本出願はまた、物質、より具体的にはタンパク質又はタンパク質性物質を含み、下記の５つの使用：
−  北方真獣類である被験体における腫瘍出現の検出又は腫瘍の進展の追跡
−  腫瘍の組織型、悪性度又はステージの決定、ここで、前記癌は、より具体的には、卵巣癌、子宮癌(より具体的には、子宮内膜癌、子宮頸癌、妊娠性癌(胎盤の癌、例えば、絨毛腫を含む))、乳癌、肺癌、胃癌、結腸癌、肝臓癌、腎臓癌、前立腺癌、尿路上皮癌(膀胱癌、尿管癌又は腎盂癌を含む)、胚細胞癌、脳腫瘍、頭部頸部癌、膵臓癌、甲状腺癌、胸腺癌、皮膚癌、骨肉腫又は骨髄癌である
−  妊娠被験体の胎盤形成不全、より具体的には前記妊娠被験体を胎盤剥離、子癇前症又は子癇のリスクに曝す胎盤形成不全の検出
−  北方真獣類の循環性細胞の精製又は単離、より具体的には、腫瘍細胞又は腫瘍幹細胞又は胎盤細胞である循環性細胞の精製又は単離
−  北方真獣類の非循環性細胞の精製又は単離、より具体的には北方真獣類の新鮮な腫瘍又は生検試料中の非循環性細胞の精製又は単離
の少なくとも１つにおいて前記物質を使用するように指示する指示書を更に含み、
ここで、前記(タンパク質性)物質は本出願の(タンパク質性)物質であり、前記(タンパク質性)物質は、必要に応じて、検出標識に連結又は結合されている、
キットに関する。
【００６１】
本出願はまた、前記可溶性Ｎ末端エクトドメインフラグメント、(可溶性)エクトドメインフラグメントの前記(サブ)フラグメント、前記Ｃ末端タンパク質フラグメント及び前記Ｃ末端エクトドメインフラグメントの少なくとも１つからなるポリペプチドをコードする核酸に関する。この核酸はDNA、RNA又はcDNAであり得る。
ヒトHEMOをコードする核酸は配列番号152の配列である。非ヒトHEMOをコードする核酸は配列番号153〜167の配列から選択され得る。
本発明は、より具体的には、
前記可溶性Ｎ末端エクトドメインフラグメント、(可溶性)エクトドメインフラグメントの前記(サブ)フラグメント、前記Ｃ末端タンパク質フラグメント及び前記Ｃ末端エクトドメインフラグメントの少なくとも１つからなるポリペプチドをコードする配列番号152及び153〜167の配列のフラグメントに関する。
本出願はまた、本出願の少なくとも１つの核酸を(組換えにより)含む核酸ベクター、より具体的には核酸発現ベクターに関する。
本出願はまた、本出願の少なくとも１つの核酸又はベクターを(組換えにより)含む操作された宿主細胞に関する。
本出願はまた、本出願の核酸に特異的にハイブリダイズする核酸プローブに関する。
本出願はまた、本出願の核酸の少なくとも１つを特異的に増幅するプライマー対に関する。
【００６２】
本出願はまた、HEMOプロモーター、より具体的にはヒトHEMOプロモーター、より具体的には配列番号669のヒトHEMOプロモーターに関する。
本出願はまた、本出願の少なくとも１つの(タンパク質性)物質又は本出願の少なくともプローブ、プライマー対又はオリゴヌクレオチドセットを含むキットに関し、ここで、前記キットは、必要に応じて、HEMOタンパク質の脱離形態の検出及び/又は腫瘍細胞、幹細胞若しくは腫瘍幹細胞の検出に当該キットを用いるための指示書を更に含む。
本出願はまた、本出願の少なくとも１つの(タンパク質性)物質又は本出願の少なくともプローブ、プライマー対若しくはオリゴヌクレオチドセットが結合、連結又は付着された固相支持体、例えば膜又はチップに関する。
【００６３】
本出願はまた、本出願の少なくとも１つの物質を含み、必要に応じて、少なくとも１つの緩衝液又は医薬的に許容されるビヒクル(又は希釈剤若しくはアジュバント)を更に含む任意の組成物、医薬組成物又は薬物に関する。
本出願は、より具体的には、本出願の少なくとも１つの物質が本出願の少なくとも１つの抗体、モノクローナル抗体又はCAR-Ｔ細胞である医薬組成物又は薬物に関する。この医薬組成物又は薬物は、例えば、癌、より具体的には卵巣癌、子宮癌(より具体的には、子宮内膜癌、子宮頸癌、妊娠性癌(胎盤の癌、例えば、絨毛腫を含む))、乳癌、肺癌、胃癌、結腸癌、肝臓癌、腎臓癌、前立腺癌、尿路上皮癌、胚細胞癌、脳腫瘍、頭部頸部癌、膵臓癌、甲状腺癌、胸腺癌、皮膚癌、骨肉腫又は骨髄癌の治療治療に有用であり得る。尿路上皮癌は膀胱、尿管及び腎盂の癌腫を包含するので、前記癌は、膀胱癌、尿管癌又は腎盂癌を含む尿路上皮癌であり得る。
特別な実施態様によれば、本発明は、本明細書に記載のＣ末端タンパク質フラグメント及びＣ末端エクトドメインフラグメントを発現する単離された細胞又は細胞の部分(例えば、エクソソーム)に関し、ここで、本明細書に記載のＣ末端タンパク質フラグメント及びＣ末端エクトドメインフラグメントの一部が前記細胞の表面又は前記細胞の部分に発現され、前記表面に発現される部分は、本明細書に記載の前記Ｃ末端タンパク質フラグメント及びＣ末端エクトドメインフラグメントに含まれるエクトドメインのＣ末端フラグメントを含み、より具体的には、前記細胞又は前記細胞の部分は胎盤細胞若しくは胎盤細胞の部分、幹細胞若しくは幹細胞の部分、腫瘍細胞若しくは腫瘍細胞の部分又は腫瘍幹細胞若しくは腫瘍幹細胞の部分である。
【００６４】
特別な実施態様によれば、本発明は、本明細書に記載のＣ末端タンパク質フラグメント及びＣ末端エクトドメインフラグメントを発現する単離された細胞に関し、ここで、本明細書に記載のＣ末端タンパク質フラグメント及びＣ末端エクトドメインフラグメントの一部が前記細胞の表面で発現され、前記表面に発現される部分は、本明細書に記載の前記Ｃ末端タンパク質フラグメント及びＣ末端エクトドメインフラグメントに含まれるエクトドメインのＣ末端フラグメントを含み、より具体的には、前記細胞は胎盤細胞、幹細胞、腫瘍細胞又は腫瘍幹細胞である。
別の特別な実施態様によれば、本発明は、治療に用いるため、より具体的には北方真獣類の胎盤形成不全の治療に用いるため、又は北方真獣類が有する胎児の微生物感染、より具体的にはウイルス感染に対する保護の欠陥の治療に用いるための、本明細書に記載の可溶性Ｎ末端エクトドメインフラグメント及び(可溶性)エクトドメインフラグメントの(サブ)フラグメントに関する。
【００６５】
別の特別な実施態様によれば、本発明はまた、
ａ．抗体、又は
ｂ．モノクローナル抗体、より具体的には受託番号I-5211にてCNCMに寄託されたハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体、又は
ｃ．Fab、Fab'若しくはF(ab)2フラグメント、又は
ｄ．scFv、又は
ｅ．sdAb、又は
ｆ．sdAbの可変ドメイン
であり、少なくとも１つの薬物に必要に応じて連結されていてもよく、本明細書に記載の可溶性Ｎ末端エクトドメインフラグメント及び(可溶性)エクトドメインフラグメントの(サブ)フラグメントに特異的に結合する物質に関する。
別の特別な実施態様によれば、本発明はまた、
ａ．抗体、又は
ｂ．Fab、Fab'若しくはF(ab)2フラグメント、又は
ｃ．scFv、又は
ｄ．sdAb、又は
ｅ．sdAbの可変ドメイン
であり、少なくとも１つの薬物に必要に応じて連結されていてもよく、本明細書に記載の前記Ｃ末端タンパク質フラグメント及びＣ末端エクトドメインフラグメントに特異的に結合する物質に関する。
【００６６】
別の特別な実施態様によれば、本発明は、キメラ抗原受容体がTCRシグナル伝達ドメインに連結されたscFvを含み、該scFvが本明細書に記載の前記物質のscFvであるキメラ抗原受容体Ｔ細胞(CAR-Ｔ細胞)に関する。
より具体的には、本発明は、治療、より具体的には抗癌治療に用いるための、本明細書に記載の物質又は本明細書に記載のCAR-Ｔ細胞に関し、ここで、前記物質又はCAR-Ｔ細胞は、腫瘍細胞又は腫瘍幹細胞に結合し、前記癌は、より具体的には、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、妊娠性癌、乳癌、肺癌、胃癌、結腸癌、肝臓癌、腎臓癌、前立腺癌、尿路上皮癌(膀胱癌、尿管癌又は腎盂癌を含む)、胚細胞癌、脳腫瘍、頭部頸部癌、膵臓癌、甲状腺癌、胸腺癌、皮膚癌、骨肉腫又は骨髄癌である。
より具体的には、本発明はまた、下記の５つの使用：
ａ．北方真獣類である被験体における腫瘍出現の検出又は腫瘍の進展の追跡
及び/又は
ｂ．腫瘍の組織型、悪性度又はステージの決定、ここで、前記癌は、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、妊娠性癌、乳癌、肺癌、胃癌、結腸癌、肝臓癌、腎臓癌、前立腺癌、尿路上皮癌(膀胱癌、尿管癌又は腎盂癌を含む)、胚細胞癌、脳腫瘍、頭部頸部癌、膵臓癌、甲状腺癌、胸腺癌、皮膚癌、骨肉腫又は骨髄癌である
及び/又は
ｃ．妊娠被験体の胎盤形成不全、より具体的には前記妊娠被験体を胎盤剥離、子癇前症又は子癇のリスクに曝す胎盤形成不全の検出
及び/又は
ｄ．北方真獣類の循環性細胞の精製又は単離、より具体的には、腫瘍細胞又は腫瘍幹細胞又は胎盤細胞である循環性細胞の精製又は単離
及び/又は
ｅ．北方真獣類の非循環性細胞の精製又は単離、より具体的には北方真獣類の新鮮な腫瘍又は生検試料中の非循環性細胞の精製又は単離
の少なくとも１つにおいて用いる物質であって、本出願の(タンパク質性)物質であり、必要に応じて、検出標識に連結又は結合されている(タンパク質性)物質を含むキットに関する。
【００６７】
方法
本出願は、本出願の少なくとも１つの物質、より具体的には前記可溶性Ｎ末端エクトドメインフラグメント、(可溶性)エクトドメインフラグメントの前記(サブ)フラグメント、前記Ｃ末端タンパク質フラグメント、前記Ｃ末端エクトドメインフラグメント、前記細胞、前記(タンパク質性)物質、前記プローブ及び/又はプライマーの少なくとも１つを含むか又は実施するか又は用いた方法に関する。
本出願の方法は、特に、
−  腫瘍タイピング
−  癌の診断
−  癌の免疫療法
−  治療薬のスクリーニング、例えば、(癌の緩和又は予防を含む)癌の治療に有用であり得る薬剤又は胎盤発生の欠陥(例えば、胎盤剥離、子癇前症、子癇)の治療に有用であり得る薬剤又は胎児保護(例えば、ウイルス又は微生物感染の防御)に有用であり得る薬剤のスクリーニング
-  循環性細胞の精製(例えば、腫瘍循環性細胞又は循環性栄養芽細胞の精製)
−(体細胞からの)人工多能性幹細胞の産生
の方法を含む。
【００６８】
より具体的には、本出願は、被験体に存在する腫瘍細胞又は腫瘍幹細胞を検出するための(インビトロ)方法に関し、ここで、前記被験体は北方真獣類であり、前記インビトロ方法は次の２つのステップi及びii：
i．試料中に可溶形態で含まれるポリペプチドであって、本出願の可溶性Ｎ末端エクトドメインフラグメントの１つである可溶形態のポリペプチドを検出するステップ、ここで、前記試料は、前記被験体の血液試料若しくは尿試料若しくは腹水試料、又は、前記被験体の組織の生検試料、又は前記血液試料若しくは尿試料若しくは腹水試料若しくは生検試料のタンパク質抽出物(より詳細には、前記血液試料若しくは尿試料若しくは生検試料の可溶性タンパク質抽出物)であり、ここで、前記試料中の可溶形態の前記ポリペプチドの検出は、腫瘍細胞又は腫瘍幹細胞が前記被験体に存在することを示す、ステップ
及び
ii．試料中の細胞であって、(その表面で前記Ｃ末端エクトドメインフラグメントの少なくとも１つを発現する)本出願の細胞であるか又は該細胞を含む細胞を検出するステップ、ここで、前記試料は、前記被験体の血液試料若しくは尿試料若しくは腹水試料、前記被験体の組織の生検試料又は前記血液若しくは尿若しくは腹水若しくは生検試料の細胞画分であり、ここで、前記試料中の前記細胞の検出は、腫瘍細胞又は腫瘍幹細胞が前記被験体に存在することを示す、ステップ
の少なくとも１つを含む。
【００６９】
本出願はまた、被験体における腫瘍の出現を検出し又は腫瘍の進展を追跡するための(インビトロ)方法に関し、ここで、前記被験体は北方真獣類であり、前記インビトロ方法は次の２つのステップi及びii：
i．試料中に可溶形態で含まれるポリペプチドであって、本出願の可溶性Ｎ末端エクトドメインフラグメントの１つである可溶形態のポリペプチドを検出するステップ、ここで、前記試料は、前記被験体の血液試料若しくは尿試料若しくは腹水試料、又は、前記被験体の組織の生検試料、又は前記血液試料若しくは尿試料若しくは腹水試料若しくは生検試料のタンパク質抽出物(より詳細には、前記血液試料若しくは尿試料若しくは生検試料の可溶性タンパク質抽出物)であり、ここで、前記試料中の可溶形態の前記ポリペプチドの検出は、腫瘍細胞又は腫瘍幹細胞が前記被験体に存在することを示す、ステップ
及び
ii．試料中の細胞であって、(その表面で前記Ｃ末端エクトドメインフラグメントの少なくとも１つを発現する)本出願の細胞であるか又は該細胞を含む細胞を検出するステップ、ここで、前記試料は、前記被験体の血液試料若しくは尿試料若しくは腹水試料、前記被験体の組織の生検試料又は前記血液若しくは尿若しくは腹水若しくは生検試料の細胞画分であり、ここで、前記試料中の前記細胞の検出は、腫瘍細胞又は腫瘍幹細胞が前記被験体に存在することを示す、ステップ
の少なくとも１つを含む。
【００７０】
表現「被験体における腫瘍の進展を追跡(する)」は、前記腫瘍の出現の検出又は治療後の前記腫瘍の再出現の検出及び治療前及び治療中の前記腫瘍の組織型、悪性度又はステージの決定を含む。
より具体的には、本出願は、対照被験体の試料中で測定される平均濃度より高い濃度で、本出願の可溶性Ｎ末端エクトドメインフラグメントの１つを分泌する腫瘍の出現を検出する本明細書に記載の(インビトロ)方法に関する。
より具体的には、本出願は、治療後における腫瘍の再出現を検出する本明細書に記載の(インビトロ)方法に関する。
腫瘍細胞は、例えば、卵巣腫瘍、子宮腫瘍(より具体的には、子宮内膜腫瘍、子宮頸腫瘍、妊娠性腫瘍(胎盤の腫瘍、例えば、絨毛腫を含む))、乳腫瘍、肺腫瘍、胃腫瘍、結腸腫瘍、肝臓腫瘍、腎臓腫瘍、前立腺腫瘍、尿路上皮腫瘍、胚細胞腫瘍、脳腫瘍、頭部頸部腫瘍、膵臓腫瘍、甲状腺腫瘍、胸腺腫瘍、皮膚腫瘍、骨肉腫又は骨髄腫瘍であり得る。尿路上皮腫瘍は、膀胱、尿管、腎盂の癌腫を包含するので、前記癌は膀胱腫瘍、尿管腫瘍又は腎盂腫瘍を含む尿路上皮腫瘍であり得る。
【００７１】
本出願は、被験体の腫瘍の組織型、悪性度又はステージを決定するための(インビトロ)方法に関し、ここで、前記被験体が北方真獣類であり、前記インビトロ方法が次の２つのステップi及びii：
i．試料中に可溶形態で含まれるポリペプチドであって、本出願の可溶性Ｎ末端エクトドメインフラグメントの１つである可溶形態のポリペプチドを検出するステップ、ここで、前記試料は、前記被験体の血液試料若しくは尿試料若しくは腹水試料、又は前記腫瘍の生検試料、又は前記血液試料若しくは尿試料若しくは腹水試料若しくは腫瘍生検試料のタンパク質抽出物(より具体的には、前記血液試料若しくは尿試料若しくは腫瘍生検試料の可溶性タンパク質抽出物)であり、ここで、前記試料中の可溶形態の前記ポリペプチドの検出は、前記腫瘍の組織型、悪性度又はステージを決定する、ステップ
及び
ii．試料中の細胞であって、(その表面で前記Ｃ末端エクトドメインフラグメントの少なくとも１つを発現する)本出願の細胞であるか又は該細胞を含む細胞を検出するステップ、ここで、前記試料は、前記被験体の血液試料若しくは尿試料若しくは腹水試料、前記腫瘍の生検試料又は前記血液試料若しくは尿試料若しくは腹水試料若しくは生検試料の細胞画分であり、ここで、前記試料中の前記細胞の検出は、前記腫瘍の組織型、悪性度又はステージを決定する、ステップ。
の少なくとも１つを含む。
【００７２】
より具体的には、本出願は、被験体の腫瘍の組織型、悪性度又はステージを決定するための(インビトロ)方法に関し、ここで、前記被験体が北方真獣類であり、前記インビトロ方法が、試料中の細胞であって、(その表面で前記Ｃ末端エクトドメインフラグメントの少なくとも１つを発現する)本出願の細胞であるか又は該細胞を含む細胞を検出することを含み、ここで、前記試料は、前記腫瘍の生検試料又は該生検試料の細胞画分であり、ここで、前記試料中の前記細胞の検出は、前記腫瘍の組織型、悪性度又はステージを決定する。
可溶形態の前記ポリペプチドの検出又は前記細胞の検出は、それぞれ前記ポリペプチド又は細胞の量又は濃度を測定することと、必要に応じて、測定した量又は濃度を参照の量又は濃度(例えば、対照の量又は濃度)と比較することを含み得る。
腫瘍は、例えば、卵巣腫瘍、子宮腫瘍(より具体的には、子宮内膜腫瘍、子宮頸腫瘍、妊娠性腫瘍(胎盤の腫瘍、例えば、絨毛腫を含む))、乳腫瘍、肺腫瘍、胃腫瘍、結腸腫瘍、肝臓腫瘍、腎臓腫瘍、前立腺腫瘍、尿路上皮腫瘍、胚細胞腫瘍、脳腫瘍、頭部頸部腫瘍、膵臓腫瘍、甲状腺腫瘍、胸腺腫瘍、皮膚腫瘍、骨肉腫又は骨髄腫瘍であり得る。尿路上皮腫瘍は、膀胱、尿管、腎盂の癌腫を包含するので、前記腫瘍は膀胱腫瘍、尿管腫瘍又は腎盂腫瘍を含む尿路上皮腫瘍であり得る。
【００７３】
下記：
−  対照被験体(癌も腫瘍も有さない対照被験体)の血液中で測定される平均濃度、又は
−  被験体の血液中で日常的に測定される平均濃度
より(有意に)高い濃度は、前記被験体における腫瘍の存在を示し得る。(癌も腫瘍も有さない)対照被験体の血液中で測定される平均濃度は、例えば、１fM〜１mM、又は１fM〜１μM、又は１fM〜１nM、又は１fM〜１pM、又は１pM〜１mM、又は１pM〜１μM、又は１pM〜１nM、又は１nM〜１mM、又は１nM〜１μM、又は１μM〜１mM、又は１fM〜100pM、又は１fM〜10pM、又は１pM〜100nM、又は１pM〜10nM、又は１nM〜100μM、又は１nM〜10μM、又は１μM〜100mM、又は１μM〜10mM、又は１pM〜10nM、又は１pM〜10pM、又は１pM〜100pM、又は100pM〜10nM、又は１nM〜100nM、又は１nM〜10nM、又は10nM〜100nM、又は５nM〜100nM、又は１nM〜５nMであり得る。これら正常範囲外であり、前記範囲の上限より高い濃度、例えば、１mM、又は１μM、又は１nM、又は１pM、又は100nM、又は100pM、又は10nM、又は10pM、又は５nMは、前記被験体における腫瘍の存在を示し得る。
このように決定された腫瘍の組織型、悪性度又はステージは、抗腫瘍治療の選択及び/又は抗腫瘍治療の調整に際して医師に指針を提供し得る。このことから、本出願は、抗癌治療を必要とする被験体のために抗癌治療の選択する方法に関し、該方法は、本出願の組織型決定/悪性度決定/ステージ決定方法を使用して前記腫瘍の組織型、悪性度又はステージを決定すること、及び、外科手術による抗癌治療、化学療法、放射線治療及びホルモン療法から、前記腫瘍組織型、悪性度又はステージに適合する治療を選択することを含む。
【００７４】
本出願はまた、妊娠被験体の胎盤形成不全、より具体的には前記妊娠被験体を胎盤剥離、子癇前症又は子癇のリスクに曝す胎盤形成不全を検出するための(インビトロ)方法に関し、ここで、前記被験体が北方真獣類であり、前記インビトロ方法が次の２つのステップi及びii：
i．試料中の可溶形態のポリペプチドであって、本出願の可溶性Ｎ末端エクトドメインフラグメントの１つであるポリペプチドの量又は濃度を測定するステップ、ここで、前記試料は、前記被験体の血液試料若しくは尿試料若しくは羊水試料、又は前記血液若しくは尿若しくは羊水試料の(可溶性)タンパク質抽出物であり、ここで、前記試料中の前記量又は濃度(の測定)は前記被験体の胎盤形成不全を示す、ステップ；及び
ii．試料中の細胞であって、(その表面で前記Ｃ末端エクトドメインフラグメントの少なくとも１つを発現する)本出願の細胞の量又は濃度を測定するステップ、ここで、前記試料は、前記北方真獣類の血液試料若しくは尿試料若しくは羊水試料、又は前記北方真獣類の胎盤試料、又は前記血液試料若しくは尿試料若しくは羊水試料若しくは胎盤試料の細胞抽出物であり、ここで、前記試料中の前記量又は濃度(の測定)は前記被験体の胎盤形成不全を示す、ステップ
の少なくとも１つを含む。
【００７５】
より具体的には、本出願はまた、妊娠被験体の胎盤形成不全(例えば、胎盤剥離、子癇前症、子癇)を検出するインビトロ方法に関し、ここで、前記被験体は北方真獣類であり、前記インビトロ方法が試料中の可溶形態のポリペプチの量又は濃度を測定することを含み、可溶形態の前記ポリペプチドは、本出願の可溶性Ｎ末端エクトドメインフラグメントの１つであり、前記試料は、前記北方真獣類の血液試料又は該血液試料の(可溶性)タンパク質抽出物であり、ここで、前記試料中の前記量又は濃度(の測定)は前記被験体の胎盤形成不全を示す。
対照被験体(胎盤形成が正常な妊娠対照被験体)の血液中で測定される平均濃度より(有意に)高い又は低い濃度は、前記被験体の胎盤形成の不全を示し得る。
対照被験体(胎盤形成が正常な妊娠対照被験体)の血液中で測定される平均濃度は、例えば、１fM〜１mM、又は１fM〜１μM、又は１fM〜１nM、又は１fM〜１pM、又は１pM〜１mM、又は１pM〜１μM、又は１pM〜１nM、又は１nM〜１mM、又は１nM〜１μM、又は１μM〜１mM、又は１fM〜100pM、又は１fM〜10pM、又は１pM〜100nM、又は１pM〜10nM、又は１nM〜100μM、又は１nM〜10μM、又は１μM〜100mM、又は１μM〜10mM、又は１pM〜10nM、又は１pM〜10pM、又は１pM〜100pM、又は100pM〜10nM、又は１nM〜100nM、又は１nM〜10nM、又は10nM〜100nM、又は５nM〜100nM、又は１nM〜５nMであり得、具体的には、(例えば、妊娠第三期には)１nM〜10nMであり得る。これら正常範囲外の濃度(例えば、妊娠第三期に前記正常範囲を下回る濃度)は前記被験体の胎盤形成の不全を示し得る。
【００７６】
本出願はまた、北方真獣類を妊娠について検査する(インビトロ)方法であって、
i．前記被験体の血液試料中の可溶形態のポリペプチドの量又は濃度を測定すること、ここで、前記可溶形態のポリペプチドは本出願の可溶性Ｎ末端エクトドメインフラグメントの１つであり、前記試料中の前記量又は濃度の測定は前記北方真獣類の妊娠又は非妊娠を示す、
及び
ii．前記被験体の血液試料中の細胞であって、(その表面で前記Ｃ末端エクトドメインフラグメントの少なくとも１つを発現する)本出願の細胞の量又は濃度を測定すること、ここで、前記試料中の前記量又は濃度の測定は前記北方真獣類の妊娠又は非妊娠を示す
を含む。
対照被験体(非妊娠対照被験体)の血液中で測定された平均量又は濃度より(有意に)高い又は低い量又は濃度は、前記北方真獣類が妊娠している又は妊娠していないことを示し得る。
【００７７】
本出願はまた、妊娠北方真獣類における微生物(より具体的には、ウイルス)感染に対する胎児保護の欠陥を検出する(インビトロ)方法に関し、ここで、該インビトロ方法は、下記の２つのステップi及びii：
i．前記妊娠北方真獣類の血液試料中の可溶形態のポリペプチドの量又は濃度を測定するステップ、ここで、前記可溶形態のポリペプチドは本出願の可溶性Ｎ末端エクトドメインフラグメントの１つであり、前記試料中の前記量又は濃度の測定は、微生物(より具体的には、ウイルス)感染に対する前記胎児の保護における欠陥を示す、ステップ
ii．試料中の細胞又は細胞の部分(例えば、エキソソーム)の量又は濃度を測定するステップ、ここで、前記細胞は、(その表面で前記Ｃ末端エクトドメインフラグメントの少なくとも１つを発現する)本出願の細胞であり、［必要に応じて、前記細部が母性細胞又は胎児性細胞であるかを遺伝子分析により決定し］、前記試料中の前記量又は濃度の測定は、微生物(より具体的には、ウイルス)感染に対する前記胎児の保護における欠陥を示す、ステップ
の少なくとも１つのを含む。
対照被験体(胎盤形成が正常な妊娠対照被験体)の血液中で測定される平均濃度より(有意に)高い又は低い量又は濃度は、前記被験体の胎盤形成の不全を示し得る。
【００７８】
本出願はまた、化合物が北方真獣類における治療の活性成分の候補であるかどうかを決定する(インビトロ)方法に関し、ここで、前記治療は、前記北方真獣類の胎盤形成不全の治療、又は前記北方真獣類が有する胎児の微生物(より具体的には、ウイルス)感染に対する保護の欠陥の治療であり、前記(インビトロ)方法は、前記化合物を、本出願の可溶性Ｎ末端エクトドメインフラグメントの１つのリガンドと接触させてリガンド結合アッセイを実行すること、及び、前記化合物が前記リガンドに結合するかどうかを検出することを含み、前記結合の検出は、前記化合物が前記治療の活性成分の候補であることを示す。
本出願の可溶性Ｎ末端エクトドメインフラグメントの１つのリガンドと接触させることに加え、前記化合物を、本出願の可溶性Ｎ末端エクトドメインフラグメントの１つと接触させて競合結合アッセイを実行することもできる。前記リガンドへの結合に関する前記化合物と前記ポリペプチドとの間の競合の検出は、前記化合物が前記治療の活性成分の候補であることを示し得る。
リガンドは、例えば、本出願のモノクローナル抗体又はscFvであり得る。
【００７９】
本出願はまた、化合物が北方真獣類における治療の活性成分の候補であるかどうかを決定する(インビトロ)方法に関し、ここで、前記治療は、前記北方真獣類における癌の治療であり、前記方法は、前記化合物を、本出願の可溶性Ｎ末端エクトドメインフラグメントの１つと接触させてポリペプチド結合アッセイを実行すること、及び、前記化合物が前記ポリペプチドに結合するかどうかを検出することを含み、前記結合の検出は、前記化合物が前記治療の活性成分の候補であることを示す。
本出願の可溶性Ｎ末端エクトドメインフラグメントの１つと接触させることに加え、前記化合物を、前記ポリペプチドのリガンドと接触させて競合結合アッセイを実行することもできる。前記ポリペプチドへの結合に関する前記化合物と前記リガンドとの間の競合の検出は、前記化合物が前記治療の活性成分の候補であることを示し得る。
リガンドは、例えば、本出願のモノクローナル抗体又はscFvであり得る。
【００８０】
本出願はまた、北方真獣類の循環血液試料又は該試料の細胞画分から細胞を精製又は単離することを含んでなり、前記細胞の精製又は単離は、その表面で細胞マーカーを発現する細胞をポジティブ選別することを含み、前記細胞は、(その表面で前記Ｃ末端エクトドメインフラグメントの少なくとも１つを発現する)本出願の細胞である、北方真獣類の循環性細胞を精製又は単離するための(インビトロ)方法に関する。
より具体的には、本出願はまた、
北方真獣類の循環血液試料又は該試料の細胞画分から細胞を精製又は単離することを含んでなり、前記細胞の精製又は単離は、リガンドに結合する細胞をポジティブ選別することを含み、前記リガンドは、本出願の(タンパク質性の)物質である、北方真獣類の循環性細胞を精製又は単離するため、より具体的には腫瘍細胞又は腫瘍幹細胞又は胎盤細胞である北方真獣類循環性細胞を精製又は単離するための(インビトロ)方法に関する。
ポジティブ選別は、例えば、前記循環性細胞の表面に発現されるポリペプチドに特異的に結合するリガンドを用いて実行することができ、ここで、前記ポリペプチドは、前記Ｎ末端(可溶性)エクトドメインフラグメントの１つ又は前記Ｃ末端エクトドメインフラグメント及びＣ末端エクトドメインフラグメントの１つ、より具体的には、前記Ｃ末端エクトドメインフラグメント及びＣ末端エクトドメインフラグメントの１つである。
循環性細胞は、例えば、腫瘍細胞又は腫瘍幹細胞又は胎盤細胞であり得る。
【００８１】
本出願はまた、北方真獣類の新鮮な腫瘍又は生検試料において非循環性(腫瘍)細胞を精製又は単離して該非循環性(腫瘍)細胞を(例えば、RNAseq又はDNAseq又はPDXmice法で)特徴付けるための(インビトロ)方法に関し、ここで、前記非循環性(腫瘍)細胞の精製又は単離はリガンドに結合する細胞をポジティブ選別することを含み、前記リガンドは本出願の(タンパク質性の)物質である。
【００８２】
本出願はまた、多能性関連遺伝子を体細胞(例えば、線維芽細胞)へ導入すること、及び導入された多能性関連遺伝子を発現する体細胞を選択することを含み、前記多能性関連遺伝子が本出願の可溶性Ｎ末端エクトドメインフラグメントの１つからなるポリペプチドをコードする遺伝子を含む、体細胞からの多能性幹細胞を誘導するための(インビトロ)方法に関する。
多能性関連遺伝子は、転写因子をコードする１又は数個の遺伝子、例えばOct4(Pou5f1)、Sox、Klf、Myc、Nanog、LIN28及びGlis1転写遺伝子をコードする遺伝子から選択される１又は数個の遺伝子、例えばOct4(Pou5f1)、Sox2、cMyc及びKlf4転写因子をコードする遺伝子から選択される１又は数個の遺伝子を更に含み得る。この多能性関連遺伝子は、１又は数個のウイルスベクター、より具体的には１又は数個のレトロウイルスが有し得る。
前記方法は、細胞培養培地において、選択された細胞を増殖させることを更に含み得る。この細胞培養培地は、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、サイトカイン(例えば、腫瘍増殖因子(TGF)又はWnt3a)、ウシ胎仔血清(FBS)、ヒト血清、コラーゲン、アルブミン、コレステロール及びインスリンから選択される１又は数個の成分を含み得る。
【００８３】
本出願はまた、被験体の試料において本明細書に記載の可溶性Ｎ末端エクトドメインフラグメント及び(可溶性)エクトドメインフラグメントの(サブ)フラグメントを検出するための(インビトロ)方法に関すし、該方法は、少なくとも下記：
−  可溶性Ｎ末端エクトドメインフラグメント又は(可溶性)エクトドメインフラグメントの(サブ)フラグメントの第１のエピトープを指向する第１のモノクローナル又はポリクローナル抗体、及び
−  可溶性Ｎ末端エクトドメインフラグメント又は(可溶性)エクトドメインフラグメントの(サブ)フラグメントの第２のエピトープを指向する第２のモノクローナル又はポリクローナル抗体
を用いるELISAサンドイッチアッセイを含んでなるか又は該アッセイからなり、ここで、第１及び第２のエピトープは異なり、前記試料は前記被験体の血液若しくは尿若しくは羊水若しくは腹水試料又は前記血液若しくは尿若しくは羊水若しくは腹水試料の(可溶性)タンパク質抽出物である。
例えば、このELISAアッセイは、正常状態及び病的状態におけるHEMO血清レベルの変動の検出及び/又は病的状態における進展の追跡に使用することができる。
【００８４】
用語「含む」は、「含んでなる」、「包含する」又は「含有する」と同義であり、非限定的表現であって、追加の、記載されていない要素、成分又は方法ステップを排除するものではない一方、用語「からなる」は明示的に記載されていない如何なる追加の要素もステップも成分も排除する限定的用語である。
用語「から本質的になる」とは、本発明の基本的で新規な特性に実質的に影響しない限り、追加の、記載されていない要素もステップも成分も排除しないという部分的に非制限的な表現である。
このことから、用語「含む」は用語「からなる」及び「から本質的になる」を含む。したがって、用語「含む」は、本発明において、より具体的には、用語「からなる」及び「から本質的になる」を包含するものとして意図される。
読み手の手助けになるように本出願は、パラグラフ又はセクションに区分されて記述されている。この区分はパラグラフ又はセクションの内容を別のパラグラフ又はセクションからの切り離しと考えてはならない。逆に本明細書は考えられる数々のセクション、パラグラフ、センテンスのあらゆる組み合わせを含む。
本明細書に引用した全ての参考文献の関連のある開示は参照することにより本発明に明確に援用される。下記の実施例は例として示しており、これに限定されるものではない。
【００８５】
特別な実施態様によれば、本発明は、下記の２つのステップａ及びｂ：
ａ．試料中の可溶形態で含まれるポリペプチドを検出するステップであって、前記ポリペプチドが本明細書に記載の可溶性Ｎ末端エクトドメインフラグメント及び(可溶性)エクトドメインフラグメントの(サブ)フラグメントである、ステップ；
及び/又は
ｂ．試料中の細胞を検出するステップであって、前記細胞がＣ末端タンパク質フラグメント及びＣ末端エクトドメインフラグメントを発現する本明細書に記載の細胞であるか若しくは該細胞を含む、ステップ
の少なくとも１つを含む、本明細書に記載の可溶性Ｎ末端エクトドメインフラグメント及び(可溶性)エクトドメインフラグメントの(サブ)フラグメントを検出するか、又はＣ末端タンパク質フラグメント及びＣ末端エクトドメインフラグメントを発現する本明細書に記載の細胞を検出するインビトロ方法に関する。
【００８６】
別の特別な実施態様によれば、本発明は、被験体の腫瘍の組織型、悪性度又はステージを決定するためのインビトロ方法であって、前記被験体が北方真獣類であり、前記インビトロ方法が次の２つのステップａ及びｂ：
ａ．試料中に可溶形態で含まれるポリペプチドを検出するステップであって、ここで、
前記ポリペプチドは本明細書に記載の可溶性Ｎ末端エクトドメインフラグメント及び(可溶性)エクトドメインフラグメントの(サブ)フラグメントであり、前記試料は
・  前記被験体の血液若しくは尿若しくは腹水試料、又は
・  前記腫瘍の生検試料、又は
・  前記血液若しくは尿若しくは腹水若しくは腫瘍生検試料の可溶性タンパク質抽出物
であり、前記試料中の可溶形態の前記ポリペプチドの検出は、前記腫瘍の組織型、悪性度又はステージを決定する、ステップ
及び/又は
ｂ．試料中の細胞を検出するステップであって、ここで、前記細胞はＣ末端タンパク質フラグメント及びＣ末端エクトドメインフラグメントを発現する本明細書に記載の細胞であるか又は該細胞を含み、前記試料は
・  前記被験体の血液若しくは尿若しくは腹水試料、又は
・  前記腫瘍の生検試料、又は
・  前記血液若しくは尿若しくは腹水若しくは生検試料の細胞画分
であり、前記試料中の前記細胞の検出は、前記腫瘍の組織型、悪性度又はステージを決定する、ステップ
の少なくとも１つを含む方法に関する。
【００８７】
別の特別な実施態様によれば、本発明は、妊娠被験体の胎盤形成不全、より具体的には前記妊娠被験体を胎盤剥離、子癇前症又は子癇のリスクに曝す胎盤形成不全を検出するためのインビトロ方法であって、前記被験体が北方真獣類であり、前記インビトロ方法が次の２つのステップａ及びｂ：
ａ．試料中の可溶形態のポリペプチドの量又は濃度を測定するステップであって、ここで、前記ポリペプチドは、本明細書に記載の可溶性Ｎ末端エクトドメインフラグメント及び(可溶性)エクトドメインフラグメントの(サブ)フラグメントであり、前記試料は
・  前記被験体の血液若しくは尿若しくは羊水試料、又は
・  前記血液若しくは尿若しくは羊水試料の可溶性タンパク質抽出物
であり、前記試料中の前記量又は濃度が前記被験体の胎盤形成不全を示す、ステップ
及び/又は
ｂ．試料中の細胞の量又は濃度を測定するステップであって、ここで、前記細胞は、Ｃ末端タンパク質フラグメント及びＣ末端エクトドメインフラグメントを発現する本明細書に記載の細胞であり、前記試料は
・  前記北方真獣類の血液若しくは尿若しくは羊水試料、又は
・  前記北方真獣類の胎盤試料、又は
・  前記血液若しくは尿若しくは羊水若しくは胎盤試料の細胞抽出物
であり、前記試料中の前記量又は濃度が前記被験体の胎盤形成不全を示す、ステップ
の少なくとも１つを含む方法に関する。
【００８８】
別の特別な実施態様によれば、本発明は、北方真獣類の循環血液試料又は該試料の細胞画分から細胞を精製又は単離することを含んでなり、前記細胞を精製又は単離することが、本明細書に記載の物質であるリガンドに結合する細胞をポジティブ選択することを含む、北方真獣類の循環性細胞を精製又は単離するため、より具体的には腫瘍細胞又は腫瘍幹細胞又は胎盤細胞である北方真獣類循環性細胞を精製又は単離するためのインビトロ方法に関する。
【００８９】
別の特別な実施態様によれば、本発明は、北方真獣類の新鮮な腫瘍又は生検試料中の非循環性細胞を精製又は単離して該非循環性細胞を特徴決定するインビトロ方法であって、前記非循環性細胞を精製又は単離することが本出願の(タンパク質性)物質であるリガンドに結合する細胞をポジティブ選択することを含む、方法に関する。
【００９０】
別の特別な実施態様によれば、本発明はまた、多能性関連遺伝子を体細胞へ導入すること、及び導入された多能性関連遺伝子を発現する体細胞を選択することを含み、前記多能性関連遺伝子が本明細書に記載の可溶性Ｎ末端エクトドメインフラグメント及び(可溶性)エクトドメインフラグメントの(サブ)フラグメント並びに/又は本明細書に記載のＣ末端タンパク質フラグメント及びＣ末端エクトドメインフラグメントからなるポリペプチドをコードする遺伝子を含む、体細胞からの多能性幹細胞を誘導するためのインビトロ方法に関する。
【実施例】
【００９１】
実施例
実施例１：
レトロウイルスエンベロープ遺伝子の捕捉は哺乳動物において生じる多重で、反復し、依存しない捕捉イベントの証拠を有する有胎盤哺乳動物の出現には不可欠であり、今日の胎盤構造の多様性の原因である。本明細書において本発明者らは膜貫通ドメインの上流での前駆体エンベロープタンパク質の特異的な切断によって、ヒトの血液循環において活発に脱離する前例のない特徴を有する全長の内在性レトロウイルスエンベロープタンパク質明らかにする。以前に同定されたレトロウイルスエンベロープ遺伝子と相違して、コードする遺伝子は胎盤と共に別の組織を含めて、またどちらかと言うと予測外にタンパク質も検出される幹細胞と、再プログラム化されたiPS細胞とを含めて発現の部位において、レトロウイルスLTRに関連しない特異的なCpGに富むプロモーターからの転写と認められる。本発明者らは純化淘汰の下にあり、また類似した脱離能力を有した全ての類人猿における全長タンパク質をコードする同定されたレトロウイルスエンベロープ遺伝子により、ローラシア獣上目と真主齧上目との分裂以前に関連レトロウイルス捕捉イベントが＞100Myaでほぼ確実に生じている証拠を提出する。最後に遺伝子の発現に関する包括的スクリーンは胚細胞腫瘍、乳癌、卵巣腫瘍などの複数の腫瘍組織において高い転写レベルであることを明らかにしており、また後者を例にすると明細胞癌における組織型依存性と特異的なタンパク質発現の証拠がある。最終的に同定されたタンパク質は正常細胞の「幹細胞性マーカー」を構成し、また明白な腫瘍における免疫療法的アプローチ用の「標的」を構成する可能性が高い。
【００９２】
有意性
レトロウイルスの内在化は有袋動物を含む哺乳動物の胎盤形成において主要な役割を担っている捕捉レトロウイルスエンベロープシンシチンに関連し、脊椎動物では希であるがよく起こるイベントである。本明細書において本発明者らはヒト血液循環において細胞外部分の脱離をもたらす特異的な切断プロセスを含む、前例のない特性を有する内在性レトロウイルスエンベロープタンパク質を同定する。このタンパク質は有袋動物に見られる相同タンパク質を伴い、また胚及び再プログラム化された幹細胞において、さらに胎盤ならびに一部のヒト腫瘍、特に卵巣腫瘍において「幹細胞性」発現を伴って全ての類人猿に保存されている。このタンパク質は特異的な細胞状態の多用途のマーカー(場合によりエフェクタ)を構成する可能性が高く、また脱離すれば血液中で免疫検出される。
【００９３】
方法
生物試料
妊娠初期のヒト胎盤組織は書面によるインフォームドコンセント付きでDepartment of Obstetrics and Gynecology at the COCHIN Hospital, Paris 75014、フランスから、法的効力を持つ妊娠の終端(在胎期間は8週から12週)から取得された。
全ての血液試料には書面によるインフォームドコンセントが添付されている。妊娠(無月経の11〜18週)及び非妊娠(排卵誘発ホルモン治療法の前の)女性からの試料はMTAプロトコールMTA2015-45によりLaboratoire EYLAU (34, avenue du Roule；92200 Neuilly sur Seine、フランス)からのものである。男性の血液試料は研究契約15EFS018項の合意にてETABLISSEMENT FRANCAIS DU SANG (20 Avenue du Stade de France；93218 Saint-Denis、フランス)からのものである。
卵巣組織試料は研究契約RT09916の合意にてBiological Resource Centre and the Department of Laboratory Medicine and Pathology of the GUSTAVE ROUSSY INSTITUTE (114, rue Edouard Vaillant；94800 Villejuif、フランス)からのものである。
hESC(H1、H7、H9)からのRNAはGUSTAVE ROUSSY INSTITUTEのU1170-INSERMからのものである。
iPSC (再プログラム化CD34+ヒト細胞、継代24代目で)及び、それらの上清は GUSTAVE ROUSSY INSTITUTEのiPSC プラットフォームからである。
非ヒト霊長類ゲノムDNAの源はEsnault et al. 2013  に記載され、またWallaby RNAの源はCornelis et al. 2015にある。
【００９４】
倫理規定
動物実験は GUSTAVE ROUSSY INSTITUTEの倫理委員会により承認されている。この研究は動物実験(実験及び別の科学的目的のために使用される動物保護に関する指令書86/609/EEC)に関するフランス及び欧州の法令を遵守して行われた。
【００９５】
ポリクローナル及びモノクローナル抗HEMO抗体
HEMO SUエンベロープサブユニット(aa123〜286、配列番号8)の163アミノ酸をコードするDNAフラグメントはpET28b(NOVAGEN)原核生物発現ベクターに挿入されてBL21(DE3)細菌で発現した。組替えＣ末端Hisタグ付きタンパク質はニッケルアフィニティークロマトグラフィーにより細菌溶解産物から精製された。マウス免疫は標準的な手順により実施された。ポリクローナル抗体を含む血清は10匹のマウスから独立して回収され、HEMO Env発現ベクターで一過性にトランスフェクトされた293Tの溶解産物を用いてウエスタンブロット分析により検査された。一匹のマウスはAGRO-BIO (2 allee de la Chavannerie；45240 La Ferte Saint-Aubin、フランス)によるモノクローナル抗体産生のために選択され、また１個のハイブリドーマクローンがIgG産生のために単離された(2F7、IgG2aアイソタイプ)。
【００９６】
データベーススクリーニング及び配列分析
レトロウイルスの内在性env遺伝子配列はヒトゲノム上のBLAST(登録商標)により探索された(GRCh38/hg38 Genome Reference Consortium Human Reference 38 (GCA_000001405.15), Dec 2013)。初めに400 aa以上のORF(開始から終止コドンまで)を含む全てのゲノム配列はEMBOSSパッケージのGETORFプログラム(http://emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/getorf.html)を使用してhg38ヒトデータベースから抽出されてアミノ酸配列に翻訳された。次にアミノ酸配列はNational Center for Biotechnology Information (NCBI(登録商標)；www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)のBLASTPプログラムを使用して(周知のシンシチン、及び感染レトロウイルスの中の代表的なERVから)42個のレトロウイルスエンベロープ糖タンパク質のSU-TMアミノ酸配列に対してブラストされた。陽性エンベロープ含有ORFはClustalWプロトコール(www.ebi.ac.uk)を使用してアミノ酸配列の多重アライメントにより分類された。高度反復配列を構成するORFは廃棄された。
最尤の系統樹は高速のブートストラッピングアルゴリズム用のGAMMA + GTRモデルを使用して1,000の複製後に計算されたブーストラップ値にて、RaxML 7.3.2により構成された。
【００９７】
配列は複数のプラットフォームとソフトウェアを使用して分析された：カリフォルニア大学サンタクルーズUCSCブラウザー(https://genome.ucsc.edu/)、REPBASE (http://www.girinst.org/repbase/)、REPEATMASKER (http://www.repeatmasker.org)、モンタナ大学DFAM (http://www.dfam.org/)；CBiB-Bordeaux、フランスのEMBOSS(登録商標)ソフトウェア (http://services.cbib.u-bordeaux.fr/galaxy/), prediction servers at (http://www.cbs.dtu.dk/services/) and (http://www.expasy.org/) and NEWCPGREPORT for CpG island characterization at (http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/)の予測サーバ。
dN/dS率はPAMLXグラフィックユーザインターフェイス(バージョン1.2)においてPAML プログラムパッケージを用いて取得された。選択されたHEMO ORF配列の座標は下記の表2に示す。テナガザル、ヒヒ、クモザル、サキザルのヌクレオチドHEMO ORFは以下のとおりPCR増幅され、配列はGENBANK(登録商標)に寄託される。
シンテニック座はRASL11BとUSP46のHEMO座に対する5'及び3'の全ての種に保存される２つの遺伝子の間に配置された250kbゲノム領域において、UCSCブラウザーからの種の代表番号のために回収された。これらは参照としてヒトゲノム配列を用いてMULTIPIPMAKERアライメントツール(http://pipmaker.bx.psu.edu/pipmaker/)を使用して分析された。選択された配列の座標は下記の表3に示す。
【００９８】
【表２】
2020530438.tif 000003
【００９９】
【表３】
2020530438.tif 000004
【０１００】
細胞培養、5-アザ-2'-デオキシシチジン処理、及びメタロプロテアーゼ阻害剤
細胞は293T(胎児肝臓)、HeLa(頸部腺癌)、CaCo-2(結腸腺癌)、TE671(横紋筋肉腫)、SH-SY5Y(神経芽細胞腫)、HeH7(幹細胞癌)ヒト細胞を対象にしたダルベッコ変法イーグル培地にて、またJAR(絨毛腫)、2102Ep(奇形癌)、NCCIT(奇形癌)ヒト細胞を対象にしたRPMI培地1640にて、またBeWo(絨毛腫)、JEG-3(絨毛腫)、Ntera2D1(奇形癌)ヒト細胞を対象にしたF-12K培地にて37℃、5％ CO2に維持された。全ての培地には10％熱不活性化ウシ胎児血清(FCS)、100 U/mlペニシリン、100 U/mlストレプトマイシン(試薬は全てLIFE TECHNOLOGY製)が添加された。iPSCはGUSTAVE ROUSSYのiPSCプラットフォームにて照射MEFs上に培養された。コンフルエンスに到達した時に細胞は血清欠乏され、上清は収穫され、濾過(0.22 μm Milliporeフィルター)されてAMICON Ultra 0.5mL(MILLIPORE、10K)により20倍に濃縮される。
5-アザ-2'-デオキシシチジン(5-Aza-dC；SIGMA-ALDRICH)の処理では、2 x 105 BeWo及び293T細胞は6ウエルディッシュにプレートされた。次に5-Aza-dCの0.1〜5μM用量を3日間の毎日、新鮮にした培地に添加された。１日後にRNA抽出のために細胞は収穫された。
メタロプロテアーゼ阻害剤の処理では5 x 105 293T細胞は2ｍL/ウエルの培養培地により6ウエルディッシュにて播種された。播種の１日後に細胞はウエル当たり1.5μgのphCMV-HEMOプラスミド及び4.5μLのリポフェクタミンLTX(THERMOFISHER)を使用して、一過性にトランスフェクトされた。トランスフェクションの１日後にメタロプロテアーゼ阻害剤(CALBIOCHEM)：BATIMASTAT (0.1〜10 μM)、MARIMASTAT (0.1〜10 μM)又はGM6001(１〜50μM)の指示濃度が添加された培養培地にてインキュベートされた。阻害剤入りの培地はさらに2日間補給され、１日後に上清は採集されてMILLIPOREフィルターで濾過された。細胞はタンパク質分析のために同日に収穫された。
【０１０１】
ルシフェラーゼプロモータアッセイ
HEMOプロモーター活性アッセイにおいて、TSS(+1)を含む異なるサイズのフラグメントは、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の上流でのPGL3基本ベクター(PROMEGA))のHindIII-NheI部位に対してPCR増幅され、ヒトゲノムDNAからセンスとアンチセンス配向でクローン化された(757 bpフラグメント:-290〜+472から、467 bpフラグメント：+1 (TSS)〜+472から、408 bpフラグメント：+57〜+472から、使用されたプライマーは下記の表4に表示しており、(NNN)はHindIII及びNheI部位を表す)。
293T細胞はウエル当たり2ｘ104で96ウエルディッシュに播種された。播種の１日後に細胞は100ngのプラスミドと0.2μLのJETPRIME(登録商標) (POLYPLUS TRANSFECTION；850 boulevard Sebastien Brant；67400 Illkirch、フランス)でトランスフェクションされた。トランスフェクションの2日後に培養培地は廃棄されてルシフェラーゼの活性は、製造メーカの指示書に従ってPIERCE(登録商標) RENILLA-Firefly Luciferase Dual Assay Kit及びGLOMAX(登録商標)-Multi+ Luminescence Apparatus (PROMEGA)を使用して検出された。
【０１０２】
【表４−１】
2020530438.tif 000005
【表４−２】
2020530438.tif 000006
【０１０３】
亜硫酸水素塩ゲノム配列分析
293T、iPSC-NP24、CaCo-2細胞からのゲノムDNAにはEpiTect Plus DNA Bisulfite Kit (QIAGEN)を用いて亜硫酸水素塩処理を施した。プロモーター領域の２つのDNAフラグメントは上記の特異的なプライマーを使用する50〜150ngの亜硫酸水素塩処理DNAにてACCUPRIMETM High Fidelity polymerase(INVITROGEN, @THERMO-FISCHER)を用いて、ネスト化(nested)PCR(35周期を2ラウンド)を介して増幅された。次にPCR産物はpGEMT-Easy vector(PROMEGA)にクローン化されて最低10個のクローンが配列決定のために選択された。
【０１０４】
ヒト及び類人猿からのHEMO ORFのための発現ベクター、及びEx Vivoのアッセイ
ヒト及び選択された類人猿(図11A及び11B)からのHEMO ORFは高保存5'によるユニークな順方向(forward)プライマーを有するPHUSION DNA Polymerase (THERMO SCIENTIFIC)を使用して対応するゲノムDNAからATGコドン(hemoGe-F-Xho)に、また２つの逆方向プライマー(hemoGe-R-Mlu、又は特異的なNWMモンキー  hemoNWM-R-Mluプライマー)の１つにPCR増幅された(上記の表4を参照)。PCR産物は直接配列決定された(BIGDYE TERMINATOR v3.1、THERMOFISCHER)。次に増幅されたHEMO遺伝子フラグメントはトランスフェクション実験を目的としてphCMV-G発現ベクター(GENBANK(登録商標)、寄託番号AJ318514)のXho及びMlu部位にクローン化された。未成熟終止コドンHEMO変異体(図4)は、phCMV-HEMOからの指示されたフラグメントのPCR増幅に使用された逆方向プライマーでのTGA終止コドンの挿入と、上記の再クローン化で構成される。コンセンサスフリン部位RTKRによるCTQG配列の置換(NWM HEMO遺伝子のように)は、多重PCR反応を伴う部位特異的変異誘発により実施された。
HEMOタンパク質産生及び放出は6ウエルディッシュにおいて1.5μgのphCMV-HEMOプラスミド及び7.5μlのFugene 6(PROMEGA)でトランスフェクトされた5 x 105 293T細胞を使用して測定された。細胞培地は無血清培地を用いてトランスフェクションの１日後に置き換えられた。トランスフェクションの48時間後に上清と細胞は採集された。上清は濾過(0.45μmのMILLIPOREフィルター)されて-80℃で保存された。胞溶解物について試料は１X-プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤カクテル(１X-Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail)(THERMO SCIENTIFIC)を用いて、緩衝液中で可溶化(150mM NaCl、25 mM Tris HCl pH 7.6、0.1％ SDS、１％ デオキシコール酸ナトリウム、THERMO SCIENTIFIC)され、遠心分離(微粒子を除去するのに20分間、14,000gで)されて試験開始前に-80℃で保存された。
【０１０５】
免疫蛍光及び免疫組織化学アッセイ
HEMO免疫蛍光アッセイにつてHela細胞はガラスカバースリップ上に培養され、またphCMV-HEMO発現ベクター又は対照空ベクター(500ng)と、12ウエルディッシュのウエル当たり1.5μLのリポフェクタミンLTX(THERMOFISHER)とで一過性にトランスフェクションされた。トランスフェクションの48時間後に細胞は4％パラホルムアルデヒドに固定され、0.2％のトリトンX100有りと無しで透過処理され、マウス抗HEMOポリクローナル抗体(上記参照)と、ALEXA Fluor488-共役抗マウス二次抗体(MOLECULAR PROBES)とで染色された。核はDAPI(SIGMA-ALDRICH)を用いて青に染色された。観察はLEICA TCS SP8 MP共焦点顕微鏡にて実施された。
免疫組織化学アッセイにつて新鮮に採集された胎盤組織は4％パラホルムアルデヒドに固定されてパラフィンに封埋した。切片(4μm)はヘマトキシリン・エオシン及びサフランで染色された。パラフィン切片は熱誘導抗原検索(Tris EDTA pH 9、ABCAM)のために処理され、一晩かけてモノクローナルマウス抗HEMO(2F7)抗体(1/10に希釈)又は対照IgG2aアイソタイプを用いてインキュベートされた。染色はペルオキシダーゼ/アミノベンジジンMouse PowerVisionキット(IMMUNOVISION TECHNOLOGIES)を使用して可視化された。
【０１０６】
ウエスタンブロット分析、小麦胚芽アグルチニン精製、N-グルコシダーゼF処理
試料、細胞上清又は細胞溶解物は勾配プレキャストゲル(NuPAGE NOVEX 4〜12％ Bis-Trisゲル、LIFE TECHNOLOGIES)上でSDS/PAGEにより分析され、半乾燥式移動システムを使用してニトロセルロース膜へ移動させた。0.1％ Tween-20及び5％の脱脂粉乳を含むPBS中でのブロッキング後に膜を一晩4℃でインキュベートして、一次抗体(抗HEMOマウスポリクローナル抗体1/5000、抗CGB/hCG-betaラビットポリクローナル抗体(ABGENT) 1/100000、抗γチューブリンマウスモノクローナル抗体(SIGMA-ALDRICH) 1/1000)を用いて3回洗浄され、続けて種に適した西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)共役二次抗体を用いてRTにて45分間インキュベートした。タンパク質は増強化学ルミネセンスシステム(ECL、PIERCE)を使用して検出された。
指定された時に糖タンパク質はレクチン小麦胚芽アグルチニン(WGA)キット(THERMO SCIENTIFIC))を使用して、最初は胎盤組織又は血清から抽出された。600μlの全タンパク質抽出物は製造メーカの指示書に従って調製されて200μｌの溶出緩衝液中に溶出された。指定された時に試料はSDS/PAGEの前にN-グルコシダーゼF(PNGase F、NEB BIOLAB)を用いて処理された。
【０１０７】
HEMOタンパク質のＮ末端とＣ末端の質量分析特徴決定
特徴決定に充分な量のHEMOタンパク質を得るために293T細胞(3 x 106 セル/ディッシュである4 10-cmディッシュにて)は、DMEM-FCS培地(プレート当たり10μg)にphCMV-HEMO発現ベクターでトランスフェクションされた。培地は2日後に無血清DMEM培地で置き換えられて上清は更に2日後に回収された。全ての分泌タンパク質はVIVASPIN20(SARTORIUS、30,000 MWCO PES)を使用して約60倍に濃縮された。高濃度抽出物からの糖タンパク質はWGAキットを使用して回収され、200μｌ中に溶出されて4〜12％NuPAGEゲルに負荷された。アクリルアミドゲルの80kDa部分は切除され、タンパク質は透析袋の中で電気泳動的に溶出された。いま一度、タンパク質は付加的な精製ステップのためにAMICON Ultra Centrifugal Filters (ULTRACEL-50K)を使用して濃縮され、PNGase F処理されて4〜12％ NuPAGEゲルに再負荷された。主バンド(クーマシーブルー染色において見られ、また脱離48kDa HEMOタンパク質に対応する)は切除され、独立して異なる酵素消化を受けた(トリプシン、キモトリプシン)。フラグメントに関連する脱離HEMOタンパク質はGif-sur-Yvette(フランス)のIMAGIFプラットフォームにより、またTriple-TOF 4600質量分析計(AB Sciex、Framingham、MA、USA)を用いたnanoLC-MS/MS分析により特徴決定されてタンパク質のＮ末端とＣ末端の決定を可能にした。
【０１０８】
RNA、リアルタイムRT-PCR、RACE実験
ヒト組織及び細胞からの総RNAはZYAGEN(San Diego)から購入したものか、若しくは製造メーカの指示書に従ってRNAeasy Isolationキット(QIAGEN)を使用して単離されてDnase I(AMBION)で処理された。逆転写はMLV reverse-transcriptase(APPLIED BIOSYSTEMS)使用して１μgのRNAを用いて実施された。リアルタイム定量PCRはSYBR green PCR master mix (QIAGEN)を使用して25μlの最終液量において5μlの希釈(1：20)ｃDNAを用いて実施された。qPCRは上記の表4のプライマーを使用してABI Prism 7000 Sequence Detection Systemを用いて実施された。転写レベルはハウスキーピング遺伝子(RPLPO又はG6PD)mRNAの量を基準に正規化された。試料は2回測定した。
5'RACE及び3'RACEはSMARter RACE cDNA Amplification Kit (CLONTECH)を使用して100ngのPNGase処理RNAにて実施され、またプライマーは上記の表4に示す。
【０１０９】
NA-seqデータマイニング
RNA-seq生データは寄託番号がSRP011546(GSE36552)、ERP003613(PRJEB4337)、SRP042153(GSE57866)であってNCBI(登録商標) Sequence Read Archive (SRA)からダウンロードされた。RNA-seq生データは「--read-mismatches 0 -g 1 --no-coverage-search」のパラメータでTOPHAT2(v2.0.14)を用いて、いくつかのレトロウイルス及びハウスキーピング遺伝子を含めた興味のあるカスタム遺伝子データベースに合わせた。一意にマッピングされた読み取りは、詳細分析のためにSAMtools(v0.1.19)を使用して選択された。別の相同ERV遺伝子の検出をさけるために完全な一致のヒット(hits)のみを数える。読み数は(キロ塩基での併合後に)遺伝子の長さで、また２つのハウスキーピング遺伝子(RPLPO及びRPS6)の読み数及び対数変換で正規化された。遺伝子の特異的な転写物(イントロンとフランキング配列における読み数の不存在と、特異的なスプライス接合に対応するスプリットRNA-seq読み数の存在)はNCBI(登録商標)-Trace Archive Nucleotide BLAST(登録商標)プラットフォームにてブラストにより検証された。興味のある遺伝子において読み数はIntegrative Genomics Viewer visualizationツール(http://software.broadinstitute.org/software/igv)上でコードする配列全体に均等に分布されていることが検証された。
【０１１０】
マイクロアレイデータマイニング
ヒトの正常及び腫瘍細胞でのHEMO遺伝子の発現プロフィールについての洞察を得るためにマイクロアレイデータのインシリコ分析は、2010年にLukkらにより詳しく述べられたE-MTAB-62データセット(https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/experiments/E-MTAB-62/files/)を使用して実施されたが、これらには数々のAE及び遺伝子発現オムニバス(GEO)研究で得られた正常組織からの1033個の試料と2315個の腫瘍組織(neoplasm)試料が含まれる。データセットE-MTAB-62は処理された発現データとしてダウンロードされた。統計的有意性はウィルコクソンの順位和検定を使用して評価された。より大きなパネル分析での追加的な卵巣癌のデータセット(https://www.ebi.ac.uk/arrayexpressからのAE E-GEOD-63885、E-GEOD-30311、E-GEOD-54809、E-GEOD-6008、E-GEOD-14764)はバックグラウンド補正のためのRobust Multiarray Average法(RMA)、完全一致(PM)プローブ(”pmonly”)のみの維持、またクオンタイル正規化などのパラメータを用いてパッケージ(v1.48.0)(Gautier et al. 2004)の「expresso」機能を使用して前処理された。ログ2の変換値とプローブセット強度ログ2の変換値との両方で規格値を得るために「medianpolish」と「avgdiff」との両方は要約手法として適用された。データ処理後にHEMO遺伝子の発現値は抽出されてR 3.2.3(www.r-project.org)でプロットされた。卵巣癌のデータセットはバッチ効果の補正方法としてCOMBATを適用し、inSilicoMerging Rパッケージ(Taminau et al. 2012)(version 1.14)を使用して統合された。
【０１１１】
結果
全長タンパク質をコードするHERV env遺伝子、HEMOの同定
最新のヒトゲノム配列放出は全て以前に同定されたシンシチンを含む、感染レトロウイルスとERVファミリーとの両方を代表する選択された一連の42個のEnv配列を使用して、ORFsのBLAST探索(Met開始コドンから終止コドンまで)> 400 aaにより全長ERV Envタンパク質をコードする遺伝子の存在のスクリーニングを受けた(方法を参照)。これにより１個以外の全てで既知のHERV EnvファミリーへのclustaIWアライメントによりグループ化することができ、45個のEnvをコードするORFが出された(この中は24個のEnvをコードするORFsと、以前に記載の一連の12個のHERV Envsに属する20個のEnvをコードするORFsであった(下記の表5を参照))。
【０１１２】
【表５−１】
2020530438.tif 000007
【表５−２】
2020530438.tif 000008
【０１１３】
しかしながら無関連env遺伝子(ヒト内在性MER34 ORFを表すHEMO)は真性レトロウイルスEnvタンパク質の特徴の全てではないが一部を示す全長の563アミノ酸ORFを用いて、すなわちシグナルペプチド、推定上のSUサブユニットにおけるCWLCモチーフ及び推定上のTMサブユニットにおけるC-X6-CCモチーフ、TM膜貫通ドメインに配置される23 aa疎水性ドメイン、ISDドメインを用いて同定することもできる(図１を参照)。特筆すべきは推定上のHEMOタンパク質は明白に識別されるフリン切断部位(正準R/K-X-R/K-Rの代わりにCTQG)と、隣接する疎水性融合ペプチドとを欠いている(図1Bを参照)。HEMO配列はゲノムスクリーニングに使用された42個のレトロウイルスエンベロープaa配列を含む図1Dに示されるEnv系統樹に組み込まれた。図はHEMOタンパク質に最も密接に関連した配列が全ての有袋動物に認められる保存されて先祖的に捕捉されたレトロウイルスEnv遺伝子によりコードされ、膜貫通ドメインの上流での未成熟終止コドンを有するenv-panMarsであることを示す(図12A〜Eを参照)。
最後にヒトゲノムのBLAST分析はMER34(こらは中程度反復頻度ファミリー34であり最初は1994年のToth及びJurkaにて記載)として知られているHEMO遺伝子が非常に古い縮重多重遺伝子ファミリーの一部であることを示す。このファミリーにおいてはGag-Pro-Pol-Envレトロウイルス構造とLTR-MER配列を有するMER34-intコンセンサス配列は、RepBase(Jurka et al. 2005)にて記載と報告がある。MER34-intコンセンサス配列を用いるゲノムBLASTはGag又はPol遺伝子について、全長の推定上のORsを検出することができなかった。ヒトゲノム中に散乱されたMER34ファミリーのenv配列(ブラストにより同定された>200bp相同性を有する20コピー、下記の表6を参照)の中において、HEMOは明白に異常値(1692bp/563aa)であって、他の全ての配列では数多くの終止コドン、Alu又はLINE挿入を含み、かつORFは147 aaよりも長くない。
【０１１４】
【表６】
2020530438.tif 000009
【０１１５】
HEMO遺伝子座及び転写プロフィール
HEMO遺伝子は遺伝子間の距離が約120kbであるRASL11BとUSP46遺伝子との間の染色体4q12に配置される(図10をも参照)。RepBaseのMER34-intコンセンサス(Jurka et al. 2005)とのBLAST比較によるHEMO Env遺伝子座(10kb)の詳細な検査から、一部が逆配向になり、さらに数多くのAlu(SINE)挿入により妨げられている複雑なスクランブル構造(図2Aを参照)の中のレトロウイルスPol遺伝子の痕跡が明らかにされる。遺伝子座構成は捕捉されたenvsを抱いている以前に特徴決定された座にしばしば観察されるプロウイルス非env遺伝子における低い選択圧力を示す。
ヒト組織及び細胞株のパネ(図2B)から同定されたORF及びRNA内のプライマーを使用する定量RT-PCR(RT-qPCR)は胎盤において高レベルで発現されたことを示す。低レベルであるが腎臓においても有意に発現する。細胞株においてHEMO遺伝子の発現は幹細胞(ESC及びiPSC)で、この系統的発現を除けば不均一と見られる。全く思いがけないことには複数の胎盤性絨毛癌の細胞株(BEWo、JAR、JEG-3)と、一連の胎性期癌(NT2D1、2102Ep、NCCIT)及び腫瘍細胞株(しかしCaCo-2結腸腺癌を参照)とには検出可能な転写物は存在しない。
HEMO Env転写物の構造は胎盤からのEnvをコードする転写物のRACE-PCR分析により決定された。これによりゲノム配列から予測されたドナー/受容体スプライス部位に対応するイントロン境界が有る多重スプライス転写物と、レトロウイルスEnv遺伝子について古典的に観察されるenv ATG開始部位の近くに配置される機能的受容体部位の同定が可能になった。興味深いことにはレトロウイルス転写物に予測されるように転写物3'末端部は同定可能なMER34LTRの範囲に入る。しかしながらEnv遺伝子に対して約5kb5'に配置される転写開始部位は同定可能なLTR構造に対応しない。どちらかと言えば転写開始部位はに関連する配列はCpGに富むドメインに配置(図2A及び2Cを参照)されて、ほぼ確実にレトロウイルス要素に無関連の細胞プロモーターに対応する。tc|ACTTCの転写物5'末端部は正準RNAポリマラーゼIIコアプロモーターイニシエータモチーフ(Core Promoter Initiator Motif)(yy|ANWYY)の範囲に入る。
【０１１６】
CpGに富む開始部位を含む領域(CpGアイランド、Deaton and Bird 2011にて論評)は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を使用してEx Vivoのトランスフェクションアッセイによりプロモーター活性について研究がなされた。図2Dに示すように、このアッセイにおいて同定された開始部位は強力プロモーターとして作用する(無い場合と比べて>500倍)。より低い発現(無い場合と比べて10〜50倍)は部分的な欠失変異体において、またCpGプロモーターに予測されるようにアンチセンス配向に配置されると観察される。
同定されたCpGアイランド内の転写開始部位の周囲の配列のDNAメチル化パターンは亜硫酸水素塩処理により分析された。図2Eに示すようにHEMO陰性細胞株(293T、BeWo)において大多数のCpGはメチル化される一方、これらはHEMO発現細胞株において非メチル化される(iPSC及びCaCo-2)。CpGアイランドメチル化パターンにおけるプロモーター活性の依存性の洞察を得るために5-アザ-2'-デオキシシチジン(5-Aza-dC)処理はBeWo及び293T細胞に対して用量0.1〜５μMの範囲で実施された(図2Fを参照)。転写物はBeWo細胞では低用量(0.1μM)で、また293T細胞ではより高い用量(５μM)で3日処理後にqRT-PCRにより検出可能であった。注目すべきはCaCo-2細胞におけるHEMO遺伝子の高転写レベルは同様の5-Aza-dC処理によって更に増幅されない。結果を総合するとHEMO発現はCpGプロモーターのメチル化状態に敏感であることを示す。
【０１１７】
HEMOタンパク質合成及び構造：特異的脱離
エンベロープタンパク質を産生する同定された遺伝子の能力は特異的プロモーター駆動の発現ベクターへのenv ORF導入と、ex vivoの一過性トランスフェクションアッセイにより検査された。ポリクローナル及びモノクローナル抗体は、タンパク質の推定上のSU部分の163 aaフラグメントに対応する組換タンパク質のマウスの免疫により誘発された(方法を参照)。図３の上パネルの免疫蛍光アッセイに示されるように強いラベリングが(対照細胞ではなく、空ベクターでトランスフェクションされる)トランスフェクト細胞の透過性において観察される。さらにHEMOタンパク質は図３の下パネルに示す連続的な共焦点画像において、HEMOがレトロウイルスEnv遺伝子であるのと一致して、透過処理無しのトランスフェクトHeLa細胞の細胞膜の特異的な免疫蛍光ラベリングによって証明され、細胞表面で検出される。
【０１１８】
全ての細胞溶解物のウエスタンブロット分析に示すように(図4Aのレーン3を参照)、上記のHEMO発現ベクターでトランスフェクションはHEMO全長SU-TMタンパク質(理論的にMW 61 kDa)に予測されるよりも遥かに大きく、しかしレトロウイルスタンパク質に予測されるようにグリコシル化と一致している、見かけの分子量>80kDaを有する強い結合を出した。実際、(タンパク質を脱グリコシル化する)ペプチドN-グルコシダーゼF(PNGase F)での細胞抽出物の処理は、より低い分子量(レーン4)の>80kDaのバンドを２つのバンドに、すなわち約58kDaの主要なバンドと48kDaの微弱なバンドとに分割する。主要なバンドは、ほぼ確実に全長SU-TMタンパク質(予測サイズ61kDa)に対応する一方、より低いバンドはフリン部位におけるSU-TM切断により潜在的に生成される(ヒトHEMOでは正準でないが)単一SUサブユニット(予測サイズ37kDa)のバンドとは不一致なサイズを有する(RXKRの代わりにCTQG)(下記参照)。
48kDaタンパク質の起源について細胞上清の分析は意外な回答を提供した。実際、この48kDaタンパク質は細胞上清において主要な形(図4Aのレーン6を参照、上清のPNGase F処理)であると判明した一方、全ての細胞抽出物に観察されたより大きい58kDaバンド(図4Aのレーン4を参照、同様のPNGase F処理)は細胞膜付着の全長Envタンパク質に予測されるように、ほぼ検出可能ではない(図4Aのレーン6を参照)。NGase F処理されていない細胞上清中の、より高い分子量で観察されるように、この分泌48kDaタンパク質はグリコシル化されている(図4Aのレーン5を参照)。結果を総合すると、これらのデータによりHEMOタンパク質はMWが前述にかかわらずSU単体よりも大きいタンパク質の形態で、上清中に定量的に放出(脱離)していることが強く示唆される。実際のところ、レトロウイルスEnvタンパク質には予測されていなかった、この特性は同じプロトコールの使用と、陰性対照として使用されたシンシチン-1(HERV env-W)の発現ベクターとの使用でも観察されていない(図4Aのレーン1及び2を参照)。
【０１１９】
さらに脱離し、可溶性タンパク質の特徴決定を進めるためにトランスフェクト293T細胞の上清(方法を参照)から、このタンパク質を精製して質量分析(MS)を使用してＮ末端とＣ末端の両方の決定の配列を特徴決定した。トリプシン又はキモトリプシン生成ペプチドのMS分析によりHEMOタンパク質配列決定範囲提供する図4Bに示すように、脱離タンパク質はＣ末端で、すなわち異なる豊度で(すなわち、4対1でのQ432及びR433)同定された２つのＣ末端のあり、主にISDドメインに配置された位置で切断されると判明した。Ｎ末端でHEMOタンパク質は27位で、すなわち予測されたシグナルペプチド切断部位の後の2 aaで開始する(SignalP 4.1 Serverソフトウェアを使用。http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)。脱離HEMOタンパク質のMSサイズ決定をさらに特定するために複数の変異体は指示された位置(図4Bと4Cのアスタリスク(*)で示す：433R終止、472P終止、489S終止)で終止コドンを挿入するか、又は予測位置でコンセンサスフリン部位RTKR(ヒトのフリン+構築物、H-fur+)を導入して構成された。  HEMO変異体トランスフェクト細胞の上清に関するウエスタンブロット分析は、野生型の脱グリコシル化脱離HEMOタンパク質がR433停止変異体として移動することを明白に示した。加えて、また予測されるようにH-fur+変異体は脱グリコシル化SUサブユニットに予測されるサイズに一致して、より小さな37kDaバンドを示す。注目すべきは脱離部位配列(aa 432/433)を含むが膜貫通ドメイン(aa 490〜512)を含まないが、472及び489停止変異体は分かり易く(野生型のHEMOタンパク質として更なる処理の無い)分泌することから、細胞表面でのenvタンパク質の固定(anchoring)は脱離過程の必要性を示唆している。
【０１２０】
HEMOタンパク質の脱離形態がインビボ条件下で観察されるかを決定するために、胎盤血液(HEMO遺伝子に対して高い転写レベルを示す。図2Bを参照)は局所の胎盤血液(胎盤絨毛を浴びさせていて、かつ平行して分析できる)と併せて妊娠初期の合法中絶から回収され、またタンパク質はウエスタンブロット分析用に抽出と脱グリコシル化がなされた。図4Aのレーン7に示すように小さな48kDaバンド(及び微弱なSU-TM 58kDaバンド)は胎盤組織抽出物中に検出される。48kDaバンドも胎盤血液に検出され、ほぼ確実に胎盤により分泌されたタンパク質に対応する。対応するゲルバンドにおける48kDaタンパク質の質量分析(上記の)は免疫学的検出の関連性を裏付ける。
処理されたHEMOタンパク質の放出は切断が細胞関連ADAMタンパク質により仲介されることが示されている完璧に無関連なウイルスのウイルスエンベロープタンパク質、言い換えればエボラフィロウイルスについての観察を想起させる(Dolnik et al. 2004)。このことから本発明者らはメタロプロテイナーゼの化学阻害剤(ADAM/MMP化学阻害剤(Dolnik et al. 2004、Okazaki et al. 2012、Weber 及びSaftig 2012))が293Tトランスフェクト細胞におけるHEMO脱離に影響を及ぼすのかを検査した。図５に示すように広範囲ADAM/MMP化学阻害剤のBATIMASTATとMARIMASTAT、MMP阻害剤のGM6001は種々の程度で用量依存的に、細胞溶解物中の非分泌型の可視的な蓄積で、上清中において明白にHEMO放出を阻害した。これらの実験からインビボではHEMO脱離は、特に胎盤細胞に存在が知れらている単数又は複数のメタロプロテイナーゼにより動かされることを示唆する。
【０１２１】
インビボでのHEMO発現：妊婦の血液循環におけるHEMO放出
図2Bに示すヒト組織のパネル上のRT-PCRと、図4に示すタンパク質の脱離との併用結果からHEMOが血液循環中に、特に妊婦において検出されると考えられる。このことから血清は採集されてウエスタンブロット分析により脱離HEMOの存在について測定された。血清はグリコシル化タンパク質を単離するのに小麦胚芽アグルチニン(WGA)で処理され、続けて脱グリコシル化された。図６の下パネルに示すように妊娠についての早期バイオマーカー(Cole 2009)として既知であるhCG-betaタンパク質は、男性と非妊娠女性の末梢血液中の検出不能レベル(レーン2及び3を参照)を示す一方、妊娠初期の女性について後の段階では低下(レーン7〜12を参照)するが、非常に高いレベル(20kDaバンド、レーン4〜6を参照)が観察される。意外なことに、脱グリコシル化脱離形態HEMO(48kDa、胎盤血液にて以前に同定されている、図4Aのレーン6を参照、及び図６の上パネル、レーン１を参照)は妊婦の末梢血液中に最初は妊娠初期には微弱なレベルで検出される(図６の上パネル、レーン4〜12を参照)。妊娠経過に伴い、妊娠中の胎盤腫瘤の大きな増加と一致してHEMOタンパク質レベルが非常に有意に増加する。ーク時点のHEMO濃度は(精製組替え脱離HEMOタンパク質の段階希釈のウエスタンブロット比較分析により)１〜10nMと推定され、これはピーク(T1)ではhCGには満たない約１〜2ログであり、また更なる比較のためにピーク(T2)では妊婦の血中のアルファフェトタンパク質とほぼ同じである。注目すべきは脱離HEMOタンパク質の微弱なレベルは腎臓などの別の器官における無視できない発現と一致して(図2BのRT-qPCRを参照)、男性と非妊娠女性の血液中に観察される(図６の上パネル、レーン2及び3を参照)。
図６に示すように、高低次及び高次MWで観察されたバンドはHEMOタンパク質のマイナーな交互的処理/脱離形態に相当する(すなわち、27〜432/433フラグメント以外であり、aa位置、配列番号９、配列番号10の計算のために図1Cを参照)。この交互的処理/脱離形態はaa位置27(シグナルペプチドの後の最初のaa)から450〜480及び380 〜420(配列番号35〜55及び13〜23)位置から選択されるaa位置までを含めて広がるフラグメントを含む。この別のHEMO可溶性フラグメントは図13の切断部位n°2及びn°3に対応する(切断部位n°１：aa位置27から432〜433まで(主要な切断部位)、切断部位n°2 ：aa位置27から450〜480まで、切断部位n°3：aa位置27から380〜42まで)。
【０１２２】
胎盤でのHEMO産生細胞の同定
ヒト胎盤は血絨毛性タイプであり、母親の胎盤血液に直接接触して浴びさせられている胎児絨毛の存在により特徴決定される(図7Aを参照)。この絨毛は(胎児起源の)絨毛膜由来であり、表面の合胞体層の基礎となる内部の単核細胞栄養芽層(CT)、合胞体栄養細胞層(ST)を有する(Bischof et al. 2005；Maltepe and Fisher 2015にて論評)。胎盤は侵入する絨毛外細胞栄養芽層(EVT)により特徴決定される固定している絨毛を伴い、母親の子宮部に侵入する。
次に胎盤にHEMO発現を正確に局在化するために、中絶された妊娠初期の胎盤組織の切片に免疫組織化学実験が実施された。図7B及び7Cに示すように特異的な染色はパネルBに示す対照アイソタイプではなく、モノクローナル抗HEMO抗体で得られた(4倍率)。パネルBの枠で囲まれている胎盤絨毛及び絨毛膜に対応するパネルCに示す4つの拡大(60倍率)では濃い染色が細胞栄養芽層(CT)、絨毛外細胞栄養芽層(EVT)、絨毛膜栄養膜を含めて栄養膜細胞において観察されることから、HEMOがこれらの細胞により産生されていることを確実に示唆している。より拡散した染色がCT融合により生成され、胎児と母親の間の血液交換に関連する合胞体栄養細胞層(ST)において観察される。
結果を総合すると、上記の抗HEMO抗体で実施された胎盤の免疫組織化学的分析は本質的に栄養膜レベルで強いラベリングを示しており、母親の血中のHEMOの観察された脱離と一致する(図６を参照)。
【０１２３】
発生中のHEMO発現のプロフィール
胚発生におけるHEMOのについて可能性のある関連性の洞察を得るためにSRA-NCBIプラットフォームに寄託された一連のヒトRNA-seq実験に関して、発生の異なる段階に対応してデータマイニングにより更なる分析をした(Yan et al. 2013；Xue et al. 2013；Friedli et al. 2014；Uhlen et al. 2015)。一連のヒト遺伝子の発現プロフィールの抽出は実行され、その結果はHEMO、シンシチン-1(env-W)とシンシチン-2(env-FRD)env遺伝子、さらに胎盤(GCM1)又は幹細胞(OCT4/POU5F1)のいずれかに発現された特異的な遺伝子について図8A〜Cに示す。興味のある遺伝子において読み数はコードする配列全体に均等に分布されていることが検証された(方法を参照)。図8Aは胚発生において早い時期に発現し、8細胞段階から開始して遅い時期の胚盤胞段階まで、また由来の胚幹細胞で恒久的に発現して継代ゼロ代目から継代10代目までとするHEMOの幅の広い発現プロフィールを明白に示した。幹細胞に見られるHEMO遺伝子RNA-seq発現プロフィールは図2Bに示すRT-qPCRの結果を確認するもであり、２つのヒトシンシチン遺伝子において観察された事実とは明白に異なる：すなわち発生の極めて早い時期に発現したenv-Wはヒト幹細胞にてダウンレギュレーションされ、env-FRDはほぼ検出が不可能として残る。３つのenv遺伝子の全て(胎盤GCM1特異的遺伝子と一緒に)は予測されるように、胎盤組織の試料に見られる(図8B)。最終的にHEMOのRNA-seq発現はiPSCへの分化した体細胞の再プログラミング実験(Friedli et al. 2014に記載)にて分析され、図8Cに報告されたヒットはOCT4/POU5F1転写因子の発現の期待されるプロフィールに平行するHEMO遺伝子(env-W及びenv-FRでは観察されない)の特異的な再プログラミングを強調している。注目すべきはタンパク質レベルでの図8Dに示すように培養中のiPSCのウエスタンブロット分析で、iPSC上清において検出された48kDaバンドを用いて上の記載で明らかにされたHEMO遺伝子発現はHEMOタンパク質の脱離に帰着することの検証ができる。
最終的にHEMO遺伝子は少なくとも栄養膜及び幹細胞からの可溶性タンパク質の形態でのHEMOの正真正銘の産生を伴った発現(ES細胞を含めて)の特異的なパターンを、すなわち非LTR起源の特異的なCpGに富むプロモーターの「捕捉」に関連されると思われる特徴を示す。
【０１２４】
腫瘍におけるHEMO発現
ヒト腫瘍におけるHEMO遺伝子の発現の可能性についての洞察を得るために本発明者らは、2010年にLukkらにより詳しく述べられたE-MTAB-62データセットを使用してマイクロアレイデータのインシリコ分析を実施したが、これらには数々のArrayExpress(AE)及び遺伝子発現オムニバス(GEO)研究で得られた正常組織からの1033個の試料と2315個の腫瘍組織(neoplasm)試料が含まれる。図2BのRT-qPCR分析から予測されるように正常組織では有意なレベルの発現が原則的には胎盤組織で、また限定した範囲で腎臓に観察された(図9Aを参照)。図9Bに示すように複数の腫瘍においては不均一性(黒い色のドットで描かれた異常値)が同一の器官からの試料中で検出されたが、いくつかのケースでは例えば、生殖細胞系列、肝臓、肺、又は乳癌において有意なレベルの発現の証拠をともなっており、また最も顕著な不均一性が卵巣腫瘍で観察された。後者のケースでは卵巣癌の種々の組織型に関連した注釈(annotation)データの更なる探索(Cho and Shih 2009；Kurman and Shih 2016)により、最高値は特異的な腫瘍の組織型、主として明細胞癌との相関関係をもつ。
このデータセットを拡張するために別の5つのGEOデータベースからの卵巣腫瘍の試料は採集され、E-MTAB-62と併せて、さらに正規化された(方法を参照)ことから合計で479個の腫瘍試料を得た。図9Cに示すように遺伝子の高発現値は明細胞癌(60個の試料)で観察され、比較的規模は小さいが、類内膜癌の試料(96個の試料)で観察される。HEMO遺伝子の明確なアップレギュレーションは漿液性腺癌組織型(289個の試料、いくつかの不均一性があるが)及び粘液性組織型(34の試料)において観察されない。
これらの転写データに一致して正常な組織に対する明細胞癌の卵巣組織の免疫組織化学分析は、抗HEMOモノクローナル抗体を使用して、対照アイソタイプ染色との比較において腫瘍透明細胞の高度に特異的な染色を明らかにした(図9Dを参照)。
【０１２５】
HEMO挿入日及び哺乳動物ゲノムにわたる保存
捕捉された遺伝子の生理学的役割についての極めて確かなヒントは進化におけるその保存であり、それが受ける選択の性質にある。このことから本発明者らはインシリコスクリーニングにより、またPCRクローニング及び配列により、真獣類哺乳動物のHEMO遺伝子を対象とした広範囲な検索を実施し、さらに延長して有袋動物にも実施した(図１の系統樹はHEMOのenv-panMarsとの相同性を示す)(下記参照)。またこれらの分析は哺乳動物の祖先のゲノムへのHEMO挿入日の決定、種々の種の同定された遺伝子のコード能力の決定、さらに一部のケースでは発現ベクターへのクローン化遺伝子の導入と、293T細胞のトランスフェクション後の脱離HEMOタンパク質の存在の決定を目的とする。全体のデータは図10に要約されている。本発明者らはMultiPipMakerシンテニービルディングツールを使用して、全ての哺乳動物ゲノム(及びヒトHEMO遺伝子からの約120kbで見られるもの)に保存されたRASL11BとUSP46遺伝子の間にあるシンテニック座のインシリコ分析を実施した。分析を15kbのHEMO領域(図10Aを参照)に集中することでHEMO遺伝子が、100〜120 Mya(37)の間の領域でローラシア獣上目と真主齧上目との分裂以前であり、アフリカ獣上目(象、テンレック)と異節上目(アルマジロ)とのいずれにも見出せない哺乳動物ゲノムに侵入したことを示した。これは霊長類(及び齧歯動物における非常に縮重配列として)と、一連の反すう動物及び肉食性動物におけるローラシア獣上目とにおいてオーソロガスHEMO遺伝子の同定をも可能にした。より詳細な分析はHEMO遺伝子が全ての類人猿において(図11A及び11Bを参照)、また意外にもネコにおいて全長タンパク質コード配列として保存されることを明らかにする(図12A〜Eを参照)。同定された全長HEMO ORFは変異の数が有意なdN/dS値を出すのは十分に高くない非常に近い種(例えば、ヒト/チンパンジー)を除いて、84〜99％のアミノ酸同一性(図10Bの下の三角形を参照)の高い類似性を示し、またユニティーより低い種(平均値0.46)の全ての対の間における非同義に対する同義の比率(dN/dS)にて純化淘汰の兆候を示す。例えば、0.29〜0.42のdN/dS値は真性細胞遺伝子に予測されるように類人猿と旧世界ザル(OWM、図10Bの上の三角形を参照)との間に観察される。
【０１２６】
ヒトに観察される特異的な脱離特性の保存を検査するために一連の類人猿HEMO遺伝子はクローン化され、phCMV発現ベクターに導入され、293T細胞のトランスフェクションにより検査された。図10Cに示すように検査された種の全てからのHEMO遺伝子は、全てのケースにおいて細胞上清にタンパク質脱離の証拠を伴ってヒトHEMO抗体を用いてタンパク質をコードする(ただし離れた新世界ザル(NWM)では低い強度である)。HEMOタンパク質は機能的フリン部位を保持(図11A及び11Bを参照)しているNWMの部門でさえもタンパク質の脱離形態はより小さなSU型と併せて上清に放出される。クモザルのタンパク質に観察される小さなサイズは遺伝子の5'部分における10  aa欠失と一致する(アミノ酸182〜191、図11A及び11Bを参照)。このことからHEMOタンパク質の脱離が類人猿に良く保存される特性は、この遺伝子に適応する純化淘汰と併せて、特に妊婦において、この分泌タンパク質の可能な役割のヒントである。注目すべきは脱離タンパク質型に対するドメイン3'は、ほぼ確実に細胞膜でのHEMOタンパク質の脱離に必要とされる膜貫通を固定しているドメインを除き、類人猿の配列レベルでかなり低く保存される(図11A及び11Bを参照)。
【０１２７】
有袋動物における関連するHEMO遺伝子
HEMO様配列がオーソロガス遺伝子の同定がない一部の種で存在可能であるかの決定のために、有袋動物におけるヒット(hits)を与えるが、アフリカ獣上目と異節上目では与えない厳格さが弱いBLAST検索が実施された。注目すべきは同定された最も近いenv遺伝子は本発明者らが以前に同定した保存された有袋動物env遺伝子(Cornelis et al. 2015)であり、すわなちenv-panMarsである(図1Dの系統樹を参照)。
この保存された有袋動物エンベロープタンパク質とHEMOとのアミノ酸配列比較により僅か20〜30％の類似性が示されるが、類人猿、ネコ、(フクロネズミ、ワラビー、タスマニアデビルからの)有袋動物の配列のアライメント(図12A〜Eを参照)は全て細胞外ドメインに沿っている有意な同一性の領域を示す。env-panMars配列は膜貫通ドメインの上流の終止コドンにより切断型envに対応する。このことからコードされるタンパク質は可溶性タンパク質であることが予測される。図12Dに示すようにHAタグ付きenv-panMarsタンパク質、フクロネズミ及びワラビーenvタンパク質は対応する発現ベクターでトランスフェクションされた細胞の上清に実際に放出される。ワラビーのトランスフェクト細胞からの上清に、縮重フリン部位(FHKR)での部分的な切断の後で産生されたHAタグ付きTMサブユニットにほぼ対応する15kDaの微弱なバンドも観察される。フクロネズミについては類似するバンドは観察されない(フリン部位での配列、VHKP)。
さらに卵巣からのワラビーRNA転写物に対して実施されたRACE‐PCｒ実験(図12Eを参照)はHEMO遺伝子で見られるように、プロモーター領域での多重スプライスRNAを伴ってCpGに富む領域内に転写開始部位の位置決めをする。フクロネズミのケースではUCSCにコンパイルされたRNA-seqデータ(図12Eを参照)は相似構成を示す(転写開始部位を伴って、相同CpGアイランドに配置され、また同じE3エクソンの使用)。結果を総合するとデータは類人猿と有袋動物のenv遺伝子の両方が共通のレトロウイルスの祖先を有しており、これらは関連する感染レトロウイルスの依存しない捕捉にほぼ対応することを示す。
【０１２８】
議論
本明細書において本発明者らは全長タンパク質コード配列としてヒトを含む類人猿で保存され、細胞外培地に脱離して放出されるレトロウイルスエンベロープの前例のない特徴を有し、妊婦の血中に高いレベルで見出せる内在性レトロウイルスエンベロープ遺伝子のHEMOを同定した。複数のレトロウイルスエンベロープ遺伝子の「捕捉」はほとんどの哺乳動物において報告されているが、多くのケースでは遺伝子は胎盤での役割を演じる遺伝子としての「シンシチン」であり、宿主に利益になる生理学的機能に関わる祖先のレトロウイルス前駆細胞から受け継がれた正準の免疫抑制及び融合特性とともに実証されている(Mangeney et al. 2007；Lavialle et al. 2013；Denner 2016にて論評)。本出願で同定されたHEMO遺伝子はシンシチンの特性の一部を共有するが、融合活性の証拠の無い細胞外環境に脱離されるのであるから、異なっている。加えて本出願の発現のパターンは胎盤に厳密に限定されないが、この器官において発現が最も高い。しかしながら真性遺伝子の特徴を有する進化におけるその保存、すなわち純化淘汰の証拠はHEMO CpGに富むプロモーター及び細胞外培地に放出されるタンパク質産物の能力(これはTMサブユニットの膜貫通ドメインの上流の終止コドンにより(Cornelis et al. 2015))を共有する離れた有袋動物クレード(Marsupial clade)(150Myaを超える真獣類哺乳動物から分岐された)において捕捉及び保存された近縁レトロウイルスEnv遺伝子の同定と併せて、類人猿における潜在的な生理学的役割についての極めて確かなヒントを構成する(下記参照)。
【０１２９】
同定されたレトロウイルスEnv遺伝子は非常に変性した要素を伴って不十分に特徴決定され中程度に反復されるERVファミリーに、すなわちMER34ファミリーに属する(Vargiu et al. 2016；Toth and Jurka 1994；Jurka et al. 2005)。HEMOが同定できる遺伝子座の構造分析は高度に再編成された遺伝子構成を伴って、祖先のプロウイルスの痕跡を明らかにする。注目すべきは、LTR構造はHEMOの3'側にかろうじて検出可能であり5'LTRはもはや存在しない。実際にHEMO転写物のRACE-PCR分析はLTRには関連しないが、しかし培養細胞中のリポータープラスミド(両方の配向でのプロモーターを介して)のトランスフェクションにより示されるプロモーター活性を明確に持つCpGに富むドメイン内に転写開始部位を明らかにする。この通常ではないプロモーターは、ほぼ確実に発育中の胚における非常に初期にex vivoとインビボでの一連の幹細胞において活性であるHEMO遺伝子の発現の特異的パターンの原因である。コードされるタンパク質はフリン切断部位がすでに無いので(依然として機能的なものは新世界ザルゲノム内に損じするHEMOオルソログについて示すことができるが)、さらに重要なことには新世界ザルを含む全ての類人猿に観察される細胞外培地へのエクトドメインの脱離に帰着するメタロプロテイナーゼ仲介プロセシングを介して細胞膜で特異的に切断されているので、それ自身で通常でない特徴を有する。一連の細胞遺伝子(例えば、Notch、TNF-alphaなど)のための細胞性機構(例えば、シグナル伝達、細胞移動度、移動に関わる)により使用される過程であっても、脱離の過程はレトロウイルスエンベロープについて従来は報告されてこなかった。注目すべきは密接に関連した分子事象はまた、膜貫通ドメインの上流の特異的ADAM仲介切断により細胞培地に脱離されるエボラフィロウイルスエンベロープタンパク質にても起こる。この場合におても脱離タンパク質は血中に検出され、また抗env抗体に対してデコイ(decoy)効果を及ぼすか、又は直接免疫活性化と感染者における増加した血管透析性でも、関連病理学において重要な役割を果たすと見られる。今回観察された事実上のHEMOレトロウイルスエンベロープタンパク質の脱離は、無関係ウイルス(例えば、フィロウイルス及びレトロウイルス)間を関連付ける。進化レベルでは、この事実はウイルス要素の異なるクラス間の遺伝子捕捉の、及び/又は脱離過程を介した全身効果の引き金(triggering)における収束進化のヒントになり得る。
【０１３０】
更に問題となるのはヒトの生理学及び/又は病理学におけるHEMOが果たす可能な役割についてである。HEMOが役割をほぼ確実に妊娠中にはたすと予想される理由として、i)類人猿における遺伝子に作用する純化淘汰が高レベル、ii)類似するプロモーターからの転写された遺伝子の有袋動物における保存に加え、配列と成熟タンパク質構造の両方における密接に関連したタンパク質のコード化、iii)発達中の発現のかなり珍しいプロフィール、iv)胎盤による該タンパク質の血中への大量の脱離などがある。ウイルス及び/又はレトロウイルスによる感染に対する保護効果も関連している。この保護効果は血液循環中へのHEMOタンパク質の放出、お及び受容体の直接な標的化によりさらに増強される効果の、侵入ウイルスにおける受容体の隔離を介する古典的な「干渉」による仲介の可能性が有る。代わりとしてHEMOは妊娠中に可能な役割を伴ってサイトカイン様、又はホルモン様活性を有する。発現が早ければ8細胞段階にも観察され、また続く全ての胚期で継続することを考えて発達中のHEMOの効果も考慮すべきである。注目すべきは別のERV(HERV-H及びHERV-K含めて)が発現の関連するプロフィールを有しており、また豊富なHERV-H RNAは最近になりヒトにおける細胞の「幹細胞性」マーカーであり、更にヒト幹細胞において多能性の維持における役割(転写効果及び/又は特異的ERV駆動転写物を介して)を果たす可能性があることが示された。検出可能なレトロウイルスエンベロープタンパク質を明白にコードするHEMOの場合、その発現は高度に反復されるERVについて「幹細胞性」マーカーのみならず、コードされるタンパク質はまた多能性自体の分子エフェクターを構成する。最後に本発明者らは一連のヒト腫瘍においてHEMO遺伝子発現を明らかにして、また卵巣腫瘍におけるHEMOタンパク質発現を示す。卵巣腫瘍に発現される別のレトロウイルスEnvについてHEMOタンパク質発現を特異的な腫瘍の組織型に決定的に関連をもたせるために、またタンパク質が所与の腫瘍状態について信頼性のあるマーカーといえるか、暫定的には免疫療法的アプローチ用の可能な標的といえるかを評価するために数多くの腫瘍及び対照組織を基に、さらなる免疫学的分析の実施が必要である。
現在、病理学的過程の正常な発達と発症との両方でHEMO機能をさらに特徴決定するためにインビボでのHEMOタンパク質の細胞相互作用パートナーを同定する実験が進行中である。
【０１３１】
実施例２：mAb産生
抗体は上の記載の実施例１にあるHEMO SUエンベロープサブユニット(aa123〜286、配列番号8)の163アミノ酸をコードするDNAフラグメントでのマウスの免疫化により産生された。
上の記載の実施例１のハイブリドーマ2F7(IgG2aアイソタイプ)と別のハイブリドーマは標準的な細胞融合を使用して産生された。
ハイブリドーマはブダペスト条約の下でCNCMに寄託された。CNCMとはCollection Nationale de Culture de Microorganismes (Institut Pasteur ；28, rue du Docteur Roux ；75724 Paris CEDEX 15、フランス)である。
【０１３２】
【表７】
2020530438.tif 000010
【０１３３】
配列番号１の280〜400位からの121アミノ酸HEMOエクトドメインフラグメント(HST5と名付けられ)は抗原として使用される：
280-TWWLTGSNLTLSVNNSGLFFLCGNGVYKGFPPKWSGRCGLGYLVPSLTRYLTLNASQITNLRSFIHKVTPH
RCTQGDTDNPPLYCNPKDNSTIRALFPSLGTYDLEKAILNISKAMEQEFS-400(配列番号988)
これはＮ末端STREPタグ(StrepTaglinker(GGGS)x3) STREPタグ)HEMOフラグメントとして真核生物発現ベクターでクローン化され、ショウジョウバエ細胞S2で発現される。抗原-StrepTagタンパク質フラグメントは上清から二段階法により精製され、第一段はStrep Tactinカラムで、第二段はHiLoad 16/60 Superdex75カラムで実施される。分画は統合されて1mg/mlに調整されて初日、15日目、45日目、60日目に4回注射するマウス及びラットの免疫に使用される。ポリクローナル抗体産生は25日目及び55日目にELISAにより検査される。血清ポリクローナル抗体はStreptag-HST5の注射後に回収される。ポリクローナル抗体はウエスタンブロット分析、ELISA分析、フローサイトメトリー分析により検査される。モノクローナル抗体クローン化も実施される。
【０１３４】
【化１】
2020530438.tif 000011
【０１３５】
実施例３：HEMOエクトドメイン(可溶性フラグメントの脱離後に細胞表面に保持された)の細胞膜付着の部分に(特異的に)結合する抗体の産生
ポストSHEDフラグメントに対応するHEMOタンパク質(aa  433〜489、配列番号990)のエクトドメイン部分の57アミノ酸をコードするDNAフラグメントはpET28bに挿入でき、また実施例１に記載のBL21バクテリアにおいて発現されて組替タンパク質フラグメントはマウスの免疫に使用する。
細胞膜付着のエクトドメインタンパク質(aa 433〜489、配列番号990)に対応する合成ペプチド(10〜20アミノ酸)は合成でき、またKLH(キーホールリンペットヘモシアニン)などのキャリアタンパク質に結合できる。ペプチドは免疫のためにマウスに投与される。
産生された抗体は採集される。ハイブリドーマは標準的な細胞融合を使用して産生される。
【０１３６】
実施例４：腫瘍の大規模パネルのスクリーニング/組織型(histotyping)
HEMOタンパク質は潜在的な癌のバイオマーカーおよぼ見込みのある治療標的として考慮される可能性が有る。腫瘍細胞の試料は実施例１に記載のプロトコールを基づき免疫組織化学により、HEMOタンパク質の存在について、特にHEMOエクトドメインの(Ｎ末端)可溶性フラグメントの存在及び/又はHEMOエクトドメインドメイン若しくはHEMOタンパク質の膜固定(Ｃ末端)フラグメント(可溶性フラグメントの脱離後に細胞表面に保持されるフラグメント)の存在のスクリーングを受ける。実施例2及び/又は3の抗体、特にモノクローナル抗体は検出に使用できる。対照(非腫瘍)組織は並行してスクリーニングされる。
腫瘍組織は限界を設けずに下記の器官を含む：
- 卵巣
- 子宮：子宮内膜、子宮頸、妊娠性(絨毛腫)
- 乳房
- 肺
- 結腸
- 胚細胞
- 頭頸部
- 骨髄
HEMOを発現する細胞は実施例2及び3に記載の抗体を用いたFACS分析を使用して新鮮な腫瘍試料(特に生検の)から単離でき、さらに細胞マーカー同定のために、特に幹細胞マーカーの同定のために分析される。対照(非腫瘍)組織は並行して分析される。
【０１３７】
実施例５：血液検出検査の最適化(診断、予後、進化のための)
ELISAアッセイは正常及び病的状態でのHEMO血清レベルでの変動の検出及び/又は病的状態の進展経過観察に使用できる。このアッセイは実施例2に記載の抗体を含む。
【０１３８】
実施例６：腫瘍におけるHEMOタンパク質発現
１ - マイクロアレイデータ
方法
マイクロアレイデータのインシリコ分析は実施例１に記載のように腫瘍学(expO)データセット(GEO寄託番号、GSE2109)のための発現プロジェクトからの追加データに関して実施(マイクロアレイデータマイニング)され、ボックスプロット図は腫瘍の原発部位に沿ってプロットされた。
【０１３９】
結果
マイクロアレイデータセット分析(図9A〜9B及び図14)は多くの腫瘍の型で不均一な発現を示す。このことはNIH-GDCデータポータルのTCGA RNAseqデータセットにても観察された(図15を参照、https://portal.gdc.cancer.gov/projects)。
以上をまとめると、高HEMO発現の腫瘍は婦人科癌である：
o 卵巣：組織学的サブタイプ「明細胞癌」及び「類内膜」
o 子宮：子宮内膜及び子宮頸癌
o 乳癌
o 肺癌
o 消化器癌：結腸直腸腺、胃、肝臓
o 頭部頸部癌
o 胚細胞癌
o 尿路上皮癌(膀胱を含む)
o 骨髄の癌
また小規模での腎臓、前立腺、脳である。
不均一性は試料中の癌細胞の量と腫瘍の段階に依存する。
【０１４０】
2 - TACA RNA-seq
方法
TCGA RNAseq 腫瘍からのFastQファイルは、TCGAサイト(portal.gdc.cancer.gov/projects)からダウンロードされ、ハウスキーピング遺伝子のセットはR-DESeq2パッケージを使用して定量化され、正規化された。HEMO発現はR ggplot2パッケージを使用してボックスプロット図として示す。
【０１４１】
結果
図15BのI：対照及び腫瘍組織のケースを示す。各点はケースを表す。
図15BのII：ボックスプロットの拡大を示すが、最高値は除く。
HNSC及びUCEDにおける反対側の正常組織と比べてボックスプロットは、腫瘍における高くて不均一なHEMO発現を示す。UCECデータセットにおける最高値を有する第3のデータセットにおけるHEMO発現について不均一性が観察される(図15Bを参照)。
【０１４２】
3 - GUSTAVE ROUSSYからの腫瘍試料におけるHEMO発現
方法
分析は下記のように代表的なパネルにて実施された(各腫瘍の型について20〜30の試料：卵巣、子宮、頭頸部)：
- 腫瘍組織及び正常な対照組織の凍結試料は記載のように処理された：
o ウエスタンブロット(実施例１を参照)：タンパク質抽出は50μmの20個の冷凍切片にて実施され、モノクローナル抗体2F7(CNCM I-5211)が使用された
o 組織染色(Hematoxylin Eosin Saffron)は5μmの冷凍切片にて実施され、また
- 免疫化学(IHC)は次のように対応するホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)試料に対してモノクローナル抗体2F7(CNCM I-5211)を用いて実施された：パラフィン切片は熱誘導抗原検索(Tris EDTA pH 9、ABCAM)のために処理され、一晩かけてモノクローナルマウス抗HEMO(2F7、CNCM I-5211)抗体(1/10に希釈)又は対照IgG2aアイソタイプを用いてインキュベートされた。染色はペルオキシダーゼ/アミノベンジジンMouse PowerVision(登録商標)キット(IMMUNOVISION TECHNOLOGIES(登録商標))を使用して可視化された。
- 
【０１４３】
結果
卵巣癌(図16A及び16Bを参照)
抽出タンパク質のウエスタンブロット分析(2F7 mABを使用して)は胎盤試料、卵巣類内膜(E)、明細胞癌(C1〜C5)試料におけるHEMO発現を示す。正常卵巣細胞におては発現は検出されない。膜は抗γ-チューブリンAbで再ハイブリダイズされて試料中のタンパク質負荷を定量した。
2人の患者からのホルマリン固定の卵巣類内膜の(2F7 mAbを使用した)免疫組織化学的分析は、特異的な腫瘍細胞において高HEMO発現を示す。詳細患者IIのHES切片に見ると腫瘍細胞における不均一性がある。
子宮癌(図17を参照)
倍率を変えたHES及びIHC(2F7 mAbを使用)は2人の患者からの子宮内膜癌のHEMOタンパク質の特異的発現を示す。同じ切片における正常組織におてはHEMO発現は検出されない。
乳癌(図18を参照)
倍率を変えたHES及びIHC(2F7 mAbを使用)は反対側の胸部組織ではHEMO発現を示さないが、異なる分子署名の乳癌の2人の患者では種々のレベルにおいてHEMO発現を示す：HER2+乳癌の腫瘍細胞において高い染色性が観察され、またTriple Neg Breast Carcinomaにて、より拡散した染色が観察される。
【０１４４】
4 - HEMO陽性腫瘍細胞の特徴決定
HEMOが幹細胞(ESi及びPSC)及び胎盤の栄養膜細胞に発現して両方とも高度増殖性であり、HEMO陽性細胞は腫瘍から単離されて潜在的な増殖特性を特徴決定する。HES及びIHC(実施例6の第3項を参照)は腫瘍試料においてHEMO陽性細胞の特異的なモルフォロジーを示し、この細胞は特異的な抗体により標的化される(薬物共役、一重(mono)又は二重特異的(Bispecific))。
HEMO陽性細胞の潜在力及び有用性を調査するために、この細胞は実施例2及び3に記載の抗HEMO抗体を用いてフローサイトメーターにより単離され選別され、HEMO陰性細胞と比較して、その増殖状態を分析した。RNAseq分析は異なる腫瘍の型においてHEMO陽性細胞とHEMO陰性細胞とに実施され、特異的な分子経路の探索と幹細胞マーカーの発現との比較をした。増殖特性はex vivoモデルとPDXマウスとにおいて調査された。
【０１４５】
実施例７：循環HEMO脱離タンパク質を検出するためのblood-ELISA法の開発
生理学的条件下でタンパク質はヒト血清の脱グリコシル化試料に対してウエスタンブロット分析により検出され、レベルは妊娠中に上昇する(図６を参照)。HEMO陽性腫瘍の患者の、又は病理妊娠の女性の血清レベルにおける変化を検出する鋭敏なアッセイ開発を目的とした。
捕捉されたHEMOを検出するタンパク質のエピトープに対して血清HEMO脱離タンパク質と、二次ポリクローナル又はモノクローナル抗体とを捕捉するために高濃度で被覆(Maxisorp(登録商標)プレートの各ウエルに200ngの捕捉用抗体)された、少なくとも１つの精製されたモノクローナル抗体からなるサンドイッチELISA試験(図19Aを参照)が開発された。
【０１４６】
方法
試薬：
- PBST：PBS １X + 0,1％ Tween 20
- BSA(ウシ血清アルブミン)
- 捕捉用抗体(ウサギHEMO-TM捕捉ポリクローナル抗体、SIGMA-ALDRICH(登録商標)、製品名Anti-ERVMER34-1)
- 一次抗体(実施例１を参照、マウス抗HEMOポリクローナル抗体)、又は精製された2F7 mAb、又はハイブリドーマの上清、又はScFv HIS-tag若しくはrabbit-Fc mAbs
- 二次抗体(抗マウスHRP)、若しくは抗HIS HEP若しくは抗ラビットHRP
- revelation液TMB 
- リン酸 1M 
材料：
- Maxisorp(登録商標)プレート(Nunc、ThermoFischer(登録商標))
- ピペット
- Biotek(登録商標)レートリーダー
- シール性フィルム
ステップ：
D-1：
- Maxisorpプレートの各ウエルにて200ngの捕捉用抗体を被覆
- プレートをシーリングして4℃で一晩インキュベートする
DO：
- コーティング剤を保つ
- 100μLのPBST(PBS １X + 0,1％ Tween 20)+5％ BSAでプレートを飽和して室温で１時間インキュベートする
- 50μLの抗原液を添加する(一般的にSVFに希釈されたHH1トランスフェクト細胞の上清、比率は1：50)又は各ウエル内の試料若しくは血清試料
- 300μLのPBSTで各ウエル内のプレートを3回洗浄する
- PBST + １％ BSA(1/1000)中の一次抗体溶液を調製する
- 各ウエル内の50μLの一次抗体溶液を添加して少なくとも１時間、室温でインキュベートする
- 300μLのPBSTで各ウエル内のプレートを3回洗浄する
- PBST + １％ BSA(1/1000)中の二次抗体溶液を調製する
- 各ウエル内の50μLの二次抗体溶液を添加して少なくとも45分間室温でインキュベートする
- 300μLのPBSTで各ウエル内のプレートを3回洗浄する
- 溶液Aを溶液Bに混合(比率は1：1)後に50μLのrevelation液を添加する
- 50μLのリン酸(1M)を添加して反応を停止させる
- レートリーダーを用いて4450nmでプレートを読む
【０１４７】
結果
ELISAアッセイで得られた曲線(図19Bを参照)は妊婦の末梢血液に対するウエスタンブロット分析によるHEMOの検出(図６を参照)と同じ結果を示す：すなわち妊娠期間が長いほど、多くのHEMOが検出される。
【０１４８】
実施例８：HEMOドメインのＣ末端部分に対する抗体
脱離後でも主要な脱離部位(配列番号１の432〜433)と膜貫通ドメインの開始(配列番号１の492位の周り)との間のエクトドメインのＣ末端部分は、HEMOの下流の膜貫通領域によって固定された細胞膜の細胞外側に変わらずに存在する。ポストSHED-HEMOのこのＮ末端部分は特異的な抗体に接近する。
高効率でHEMO腫瘍産生細胞を標的化するために抗体は、さらなる薬物複合体Ab標的について開発された。
【０１４９】
方法
HST5と名付けられた配列番号１の387〜471位の、すなわち脱離部位QRの両側に85アミノ酸HEMOエクトドメインフラグメントは抗原として使用される：
387-AILNISKAMEQEFSATKQTLEAHQSKVSSLASASRKDHVLDIPTTQRQTACGTVGKQCCLYINYSEEIKSNIQRLHEASENLKNV-471(配列番号919)
Ｎ末端STREPタグ(StrepTaglinker(GGGS)x3) STREPタグ)HEMOフラグメントとして真核生物発現ベクターでクローン化されて、ショウジョウバエ細胞S2で発現される。分画は統合されて１mg/mlに調整されて初日、15日目、45日目、60日目に4回注射するマウス及びラットの免疫に使用される。ポリクローナル抗体は25日目と55日目にELISAにより検査された。血清ポリクローナル抗体はStreptag-HTM5の注射後に回収される。ポリクローナル抗体はウエスタンブロット分析、ELISA分析、フローサイトメトリー分析により検査される。treptag-HTM5ペプチド単独に対してのモノクローナル抗体を含む一匹のマウスの血清が実験に使用される(図20A及び20Bを参照)。モノクローナル抗体クローン化も実施される。
【０１５０】
【化２】
2020530438.tif 000012
【０１５１】
マウスpAb-antiHTM5がタンパク質の天然型と、脱離部位の両側、すなわち脱離HEMOのＣ末端及び細胞膜付着のHEMOのＮ末端とを検出できるかを検査するために種々のHEMO産生ベクターは構成され293T細胞にトランスフェクトされた：
１. 全長HEMO-pHCMVベクター
2. SU-HEMO-pHCMVベクター(配列番号１＝配列番号921のaa １〜351)
3. TM-HEMO-pHCMVベクター(aa 34〜352からの内部欠失＝配列番号１からの１〜33 + 353〜563)：
MGSLSNYALLQLTLTAFLTILVQPQHLLAPVFRTQGDTDNPPLYCNPKDNSTIRALFPSLGTYDLEKAILNISKAMEQEFSATKQTLEAHQSKVSSLASASRKDHVLDIPTTQRQTACGTVGKQCCLYINYSEEIKSNIQRLHEASENLKNVPLLDWQGIFAKVGDWFRSWGYVLLIVLFCLFIFVLIYVRVFRKSRRSLNSQPLNLALSPQQSAQLLVSETSCQVSNRAMKGLTTHQYDTSLL(配列番号922)
4. ポストSHED-HEMO-pHCMVベクター(aa 34〜432からの内部欠失=配列番号１からの１〜33 + 433〜563)：
MGSLSNYALLQLTLTAFLTILVQPQHLLAPVFRRQTACGTVGKQCCLYINYSEEIKSNIQRLHEASENLKNVPLLDWQGIFAKVGDWFRSWGYVLLIVLFCLFIFVLIYVRVFRKSRRSLNSQPLNLALSPQQSAQLLVSETSCQVSNRAMKGLTTHQYDTSLL(配列番号923)
【０１５２】
トランスフェクション後の細胞溶解物はHTM5-pABを用いてウエスタンブロットで分析(図20Aを参照)されたか、細胞はマウスpAB-HTM5を用いたフローサイトメトリーで分析(図20Bを参照)された。
ヒトHEMOエクトドメインフラグメントのＣ末端先端において、マウスとラットの免疫はシステインアミノ酸のおかげでKLH(キーホールリンペットヘモシアニン)タンパク質キャリアに関連される別のヒトHEMOエクトドメインフラグメント(下記参照)を用いて実施された：
【０１５３】
【表８】
2020530438.tif 000013
【０１５４】
結果
HTM5抗体(配列番号１のマウスモノクローナル抗aa 387〜471=配列番号919)は下記の天然型を検出できる(図20A〜20Bを参照)：
- 全長HEMO
- HEMOのTM部分でありSUではない
- エクトドメインのＣ末端部分(aa 433〜471)。
【０１５５】
実施例９：CrispR-Cas9技術によるHEMOのためのKO(ノックアウト)細胞クローン
CaC0-2細胞株
CaC0-2細胞株、ヒト結腸腺癌、強力に発現するHEMOについてのCrispR-Cas9技術の発達(図2Bを参照)：
１. 遺伝子HEMOの標的化のためのCas9遺伝子と種々のRNAガイド(guide)を含むプラスミドのトランスフェクション(4カ所の異なる領域を選択)
2. 制限希釈法によるHEMOタンパク質をもはや発現しない２つの対立遺伝子上のKOクローンの取得
3. クローンDNAの配列決定による検証：ORF(フレームシフト及び未成熟終止コドンを有するヌクレオチドIndel)の変異
4. FFPE block細胞上のIHCモノクローナル抗体2F7(CNCM I-5211)による、また培養中のWT(野生型)及びKO細胞の濃縮上清に対するウエスタンブロットによる検証。
5.
人工多能性幹細胞(iPSC)
複数のステップでの２つの対立遺伝子上の複数のiPSC KOクローンの取得：
１. ２つの最良のガイド(CaCo-2で検査された4つから)を用いたCas9ガイドプラスミドのエレクトロポレーション
2. HEMO遺伝子の配列決定による変異の検証
3. iPSC-KOクローンの濃縮培養上清中のタンパク質不存在の検証
4. 下記の能力により得られたKOクローンの多能性の検証：
- 培養中の胚様体と次に記載を発達させる
- 及び、MSG(NOD Scidガンマ)マウスの奇形腫。
- 
【０１５６】
結果
IHCとウエスタンブロット分析により確認されたようにCaCo-2(図21A及び21Bを参照)とiPSC(図21Cを参照)の両方により、KO HEMO細胞の発達が可能になる。このKOクローン(CaCo-2又はiPSC)は試験するためのツールを表すことが指摘されている：
- HEMOの役割(WT及びKO細胞のRNAseqのトランスクリプトーム分析:発現がHEMOにより調節される遺伝子の探索)
- 培養細胞系又はマウス異種移植片(PDX)におけるタンパク質に対する特異的な薬物の効果。
【０１５７】
実施例10：胎盤形成不全の検出方法
妊婦の血中のHEMOタンパク質の発現の変化は病理妊娠との相関があるかを調べるために評価された(子宮内増殖遅延、子癇前症など)。
コホートは妊婦からの200試料を含む。
妊娠第2期のサンプリング(第6月の)中の、第28週のWA(無月経の週)程度である妊婦からの血液試料を得た：
- 血清を回収するためのゲルに対して１つのドライチューブ(ウエスタンブロット分析及び/又はELISA試験による、胎盤により産生されたHEMOタンパク質の血清レベルの分析)
- 任意：細胞リンパ球から母親のDNAを回収するための１つのEDTAチューブ(HEMO遺伝子配列の検証)。
下記のものも可能である：
- 関連病理について医療ファイルを調べる
- HEMOの血清レベルを調べるために第2の血液試料(妊娠第3期の、又は分娩前の)を得る
- 異常がある場合にはHEMO遺伝子配列を検査するために、分娩時に胎盤組織のフラグメント及び胎児臍帯のフラグメントを得る(胎児起源の、胎盤により産生されたタンパク質)。
妊婦は血液試料について研究のために同意書にサインをしており、下記の所望の情報を提供している：
- 双胎妊娠であるかないか、及びモノ(mono-)又はバイ(bi-)絨毛性妊娠の有無
- 妊娠中に知られている病理及び現在の感染の有無(特にHIV)
- 子供の数
- 別の病理(腫瘍など)について。
【０１５８】
実施例11：ScFVフラグメントとしてのmABｍのクローン化
方法
マウスIgG2a抗体であるSUドメインに対する１つのmAbsは取得されている(2F7、CNCM I-5211、実施例2を参照)。将来使うために(ELISA血液試験、結晶学実験、推定上の癌標的化)、このmAbsは組み替えられ、ScFVフラグメントとしてクローン化された：
１. ハイブリドーマAbのRNAからのVH-(linker[GGGGS]x4)-VkappaフラグメントとしてのScFvのクローン化
2. 従来のRACE方法による細胞株の産生
3. 配列決定
4. ウエスタンブロット分析、ELISA分析、フローサイトメトリー分析、又はIHC検査によるHEMOタンパク質に結合するScFvの産生及び検証。
結果
293Tトランスフェクト細胞の上清に産生された脱離HEMOタンパク質へのScFv-2F7-FcとScFv-2F7-HisのELISA結合(図22Aを参照)及びフローサイトメトリー結合(図22Bを参照)はScFVフラグメントが完全2F7抗体(CNCM I-5211)として作動することを示す。
【０１５９】
配列
配列は図及び実施例を参考にして表される。ST25配列表も添付している。
【表９−１】
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【表９−２】
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【表９−３】
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【表９−４】
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【表９−５】
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【表９−６】
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【表９−７】
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【表９−８】
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【表９−９】
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【表９−１０】
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【表９−１１】
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【表９−１２】
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【表９−１３】
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【表９−１４】
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【表９−１５】
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【表９−１６】
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【表９−１７】
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【表９−１８】
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【表９−１９】
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【表９−２０】
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【表９−２１】
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【表９−２２】
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【表９−２３】
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【表９−２４】
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【表９−２５】
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【０１６０】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
2020530438.tif 000041
【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図２−６】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５】
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【図６】
2020530438.tif 000052
【図７−１】
2020530438.tif 000053
【図７−２】
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【図７−３】
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【図８−１】
2020530438.tif 000056
【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１２−５】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
2020530438000001.app
【国際調査報告】
2020530438.tif 000085
2020530438.tif 000086
2020530438.tif 000087