(57)【要約】  本発明は、多重特異的抗体を調製するための突然変異ポリペプチドリンカー、該多重特異的抗体、及び該多重特異的抗体を生成するための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
異なるＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインを有する少なくとも２つのＦａｂ断片を含む多重特異的抗原結合断片であって、各Ｆａｂ断片は、関心対象の異なるエピトープを認識し、該Ｆａｂ断片は任意の順序で直列に整列し、第一のＦａｂ断片のＣＨ１ドメインのＣ末端は、ポリペプチドリンカーを通して後続のＦａｂ断片のＶＨドメインのＮ末端に連結され、該ポリペプチドリンカー配列は、アミノ酸配列EPKX1CDKX2HX3X4PPX5PAPELLGGPX6X7PPX8PX9PX10GG（配列番号１）を含むか又はそれからなることを特徴とし、ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０は、同一又は異なり、任意のアミノ酸であり；ただし、該リンカー配列は、EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSTPPTPSPSGG（配列番号５）又はEPKSCDKTHTSPPSPAPELLGGPSTPPTPSPSGG（配列番号６）の配列を含むこともそれからなることもない、該多重特異的抗原結合断片。
【請求項２】
各々が請求項１の多重特異的抗原結合断片からなる、２つの同一な抗原結合アームを有する多重特異的抗体。
【請求項３】
−各々が請求項１に定義されているような多重特異的抗原結合断片からなる、２つの同一な抗原結合アーム；
−免疫グロブリンの二量体化したＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン；
−抗原結合アームのＣＨ１ドメインのＣ末端をＣＨ２ドメインのＮ末端に連結している、ＩｇＡ、ＩｇＧ、又はＩｇＤのヒンジ領域
を含む、免疫グロブリン様構造を有する、請求項２の多重特異的抗体。
【請求項４】
２本の重鎖と４本の軽鎖とを含む、多重特異的抗体、好ましくは二重特異的抗体であって、ここでの各々の重鎖は、
ａ．ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインを含む、免疫グロブリンのＦｃ領域
を含み、
ｂ．該Ｆｃ領域は、該ヒンジドメインによって抗体１（Ａｂ１）のＦａｂの重鎖ＣＨ１−ＶＨに連結され、
ｃ．これは次いで、ポリペプチドリンカー配列によって抗体２（Ａｂ２）のＦａｂの重鎖ＣＨ１−ＶＨに連結され、ここでのポリペプチドリンカー配列は、Ａｂ１の該Ｆａｂの重鎖ＶＨドメインのＮ末端を、Ａｂ２の該ＣＨ１ドメインのＣ末端に連結し、
ここでの４本の軽鎖は、その同族重鎖ドメインと会合したＡｂ１の軽鎖とＡｂ２の軽鎖を含み；
該ポリペプチドリンカー配列は、アミノ酸配列EPKX1CDKX2HX3X4PPX5PAPELLGGPX6X7PPX8PX9PX10GG（配列番号１）を含むか又はそれからなり、
ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０は、同一又は異なり、任意のアミノ酸であり；ただし、該リンカー配列は、EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSTPPTPSPSGG（配列番号５）又はEPKSCDKTHTSPPSPAPELLGGPSTPPTPSPSGG（配列番号６）の配列を含むこともそれからなることもない、該多重特異的抗体。
【請求項５】
Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３が、同一又は異なり、トレオニン（Ｔ）又はセリン（Ｓ）である、請求項１〜４のいずれかの多重特異的抗原結合断片又は多重特異的抗体。
【請求項６】
Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３が、同一又は異なり、トレオニン（Ｔ）又はセリン（Ｓ）以外の任意のアミノ酸であり、好ましくはＸ１、Ｘ２、及びＸ３が、同一又は異なり、Ａｌａ（Ａ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ａｓｐ（Ｄ）、及びＩｌｅ（Ｉ）からなる群より選択される、請求項１〜４のいずれかの多重特異的抗原結合断片又は多重特異的抗体。
【請求項７】
Ｘ４及びＸ５が、同一又は異なり、セリン（Ｓ）、システイン（Ｃ）、アラニン（Ａ）、及びグリシン（Ｇ）からなる群より選択される任意のアミノ酸である、請求項１〜６のいずれかの多重特異的抗原結合断片又は多重特異的抗体。
【請求項８】
Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０が、同一又は異なり、トレオニン（Ｔ）又はセリン（Ｓ）以外の任意のアミノ酸である、請求項１〜７のいずれかの多重特異的抗原結合断片又は多重特異的抗体。
【請求項９】
Ｘ４が、セリン（Ｓ）又はシステイン（Ｃ）である、請求項１〜８のいずれかの多重特異的抗原結合断片又は多重特異的抗体。
【請求項１０】
Ｘ５が、アラニン（Ａ）又はシステイン（Ｃ）である、請求項１〜９のいずれかの多重特異的抗原結合断片又は多重特異的抗体。
【請求項１１】
Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０が、同一又は異なり、Ａｌａ（Ａ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ａｓｐ（Ｄ）、及びＩｌｅ（Ｉ）からなる群より選択される、請求項１〜９のいずれかの多重特異的抗原結合断片又は多重特異的抗体。
【請求項１２】
Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０が、同一又は異なり、Ａｌａ（Ａ）及びＧｌｙ（Ｇ）からなる群より選択される、請求項１１の多重特異的抗原結合断片又は多重特異的抗体。
【請求項１３】
Ｘ６及びＸ７が同一であり、好ましくはＡｌａ（Ａ）及びＧｌｙ（Ｇ）からなる群より選択される、請求項１２の多重特異的抗原結合断片又は多重特異的抗体。
【請求項１４】
ポリペプチドリンカー配列が、
EPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPAAPPAPAPAGG（配列番号３）；
EPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPGGPPGPGPGGG（配列番号２）；及び
EPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPAAPPGPAPGGG（配列番号４）からなる群より選択される配列を含むか又はそれからなる、請求項１２の多重特異的抗原結合断片又は多重特異的抗体。
【請求項１５】
ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２/ｎｅｕの両方を認識する、請求項１〜１４のいずれかの多重特異的抗原結合断片又は多重特異的抗体。
【請求項１６】
Ａｂ１及びＡｂ２が異なり、一方ではセツキシマブ又はその突然変異誘導体、他方ではトラスツズマブ又はその突然変異誘導体からなる群より独立して選択される、請求項４の多重特異的抗体。
【請求項１７】
ＣＤ３８及びＰＤ−Ｌ１の両方を認識する、請求項１〜１４のいずれかの多重特異的抗原結合断片又は多重特異的抗体。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれかに定義されているような抗原結合断片の重鎖又は多重特異的抗体の重鎖を含む、好ましくはそれからなる、ポリペプチド。
【請求項１９】
請求項１８のポリペプチドをコードしている配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項２０】
請求項１９のポリヌクレオチドを含む発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項２１】
２本の異なる軽鎖（第一の軽鎖は、該重鎖の第一のＶＨ／ＣＨ１領域と特異的に対を形成している；第二の軽鎖は、該重鎖の第二のＶＨ／ＣＨ１領域と特異的に対を形成している）をコードしている少なくとも２つのポリヌクレオチドでさらに形質転換されている、請求項２０の宿主細胞。
【請求項２２】
第一の軽鎖及び第二の軽鎖とは異なり、該重鎖の第三のＶＨ／ＣＨ１領域と特異的に対を形成している、第三の軽鎖をコードしている第三のポリヌクレオチドでさらに形質転換されている、請求項２１の宿主細胞。
【請求項２３】
請求項１〜１７のいずれかに定義されているような抗原結合断片又は多重特異的抗体を調製するための方法であって、請求項２０〜２２のいずれかの宿主細胞を培養し、該培養液から該抗原結合断片又は抗体を回収する工程を含む、該方法。
【請求項２４】
医薬品として使用するための、請求項１〜１７のいずれかに定義されているような多重特異的抗原結合断片又は多重特異的抗体。
【請求項２５】
がんの処置に使用するための、請求項１５〜１７のいずれかに定義されているような多重特異的抗原結合断片又は多重特異的抗体。
【請求項２６】
アミノ酸配列EPKX1CDKX2HX3X4PPX5PAPELLGGPX6X7PPX8PX9PX10GG（配列番号１）を含むか又はからなるポリペプチドであって、ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０は、同一又は異なり、請求項１〜１０のいずれかに定義されているような任意のアミノ酸であり；ただし、EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSTPPTPSPSGG（配列番号５）又はEPKSCDKTHTSPPSPAPELLGGPSTPPTPSPSGG（配列番号６）の配列を含むこともそれからなることもない、該ポリペプチド。
【請求項２７】
配列が、EPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPAAPPAPAPAGG（配列番号３）；
EPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPGGPPGPGPGGG（配列番号２）；及び
EPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPAAPPGPAPGGG（配列番号４）からなる群より選択される配列を含むか又はそれからなる、請求項２６のポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学分野において有用である、改善された特性を有する多重特異的抗体に関する。
【０００２】
発明の背景
治療用融合タンパク質は、薬品開発において重要な手法となっている。異なる機能的タンパク質モジュールから多重ドメインタンパク質を構築するために、ペプチドリンカーが頻繁に使用されている。結果として得られた多重ドメインタンパク質を、個々のモジュールに同族である標的に結合する（又は、個々のモジュールの生物学的機能を同時に発揮する）ように設計することで、孤立した単一ドメインに伴う生物学的効果を増強するか、又は、孤立した単一ドメインによって到達不可能な新規な生物学的活性をもたらすかのいずれかである。ペプチドリンカーを使用する数多くの分子の例が存在する：抗体の一本鎖可変ドメイン（ｓｃＦｖ）、免疫サイトカイン（サイトカイン−抗体の融合物）、二重特異的抗体（ＢｓＡｂ）など。特定の融合タンパク質に対するリンカー（群）の選択は、１）様々なドメインが特定の３次構造（例えばｓｃＦｖに基づいた抗体）へと折り畳まれるためにリンカー（群）が可動性を必要とするかどうか、２）タンパク質ドメイン間に必要な隔離をもたらすためにリンカー（群）が強剛性を必要とするかどうか、又は３）インビボにおいて所望の活性を生じるためのドメインの隔離を可能とするためにリンカー（群）は切断可能でなければならないかどうか、などの考慮によって指示される（Xiaoying Chen, et al, Adv Drug Deliv Rev. 2013. 65(10): 1357-1369）。不適切なリンカーは、融合タンパク質の所望の活性を減少又は消失させる可能性があるからリンカーの選択は重大であり得る。（Yumi Maeda, et al, Anal. Biochem. 1997. 249(2): 147-152）。
【０００３】
融合タンパク質の構築に使用するための様々なリンカー配列が同定されている（Richard George and Jaap Heringa, Protein Engineering. 2003. 15(11): 871-879; Xiaoying Chen et al, Adv Drug Deliv Rev. 2013. 65(10): 1357-1369）。融合タンパク質の構築に使用されるリンカー配列を編集した様々な入手可能なデータベースも存在する：１）シンガポール国立大学によって編集されたＳｙｎＬｉｎｋｅｒ（http://synlinker.syncti.org）、及び２）合成生物学国際大会（http://parts.igem.org/Protein_domains/Linker）；アムステルダム自由大学の統合的バイオインフォマティクスセンター（Centre for Integrative Bioinformatics）（http://www.ibi.vu.nl/programs/linkerdbwww）。国際特許出願の国際公開公報第２０１３／００５１９４号は、ＩｇＧ１ヒンジ配列、続いてＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン配列のＮ末端、続いてＩｇＡ１ヒンジの中央部分に由来する８アミノ酸の半剛性リンカー配列から設計されたリンカーを用いて構築された多重特異的抗体を開示している。ＩｇＡ１ヒンジの中央部分を含む、この半剛性リンカーは、抗体の両方のＦａｂドメインを十分に離して、内側のＦｃに近いＦａｂ２の抗原結合パラトープに対して影響を及ぼす外側のＦａｂ１のＣ末端に由来する立体障害を回避するのに重要である。
【０００４】
しかしながら、本発明者らは、多数のグリコフォームの存在により、治療薬の開発に必要とされるこのような多重特異的抗体の一貫した調製物の生成がそれほど容易にはならないことを明らかとした。さらに、このような調製物の特徴付けはまた極めて複雑であり、これにより異なる方法で製造されたバッチの比較は労力のかかるものとなるだろう。
【０００５】
発明の概要
その後、本発明者らは、これは、リンカーを再設計することによって、特にリンカーからグルコシル化部位を排除することによって改善され得ると気付いた。
【０００６】
したがって、本発明は、アミノ酸配列EPKX1CDKX2HX3X4PPX5PAPELLGGPX6X7PPX8PX9PX10GG（配列番号１）を含むか又はそれからなるリンカーポリペプチドを提供し、ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０は、同一又は異なり、本明細書において定義されているような任意のアミノ酸であり；ただし、該ポリペプチドは、EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSTPPTPSPSGG（配列番号５）又はEPKSCDKTHTSPPSPAPELLGGPSTPPTPSPSGG（配列番号６）の配列を含むこともそれからなることもない。
【０００７】
このようなポリペプチドは、融合タンパク質、より特定すると多重特異的抗体、特に二重特異的抗体におけるリンカーとして有用である。
【０００８】
したがって、本発明の主題は、異なるＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインを有する少なくとも２つのＦａｂ断片を含む多重特異的抗原結合断片であり、ここでの各Ｆａｂ断片は、関心対象の異なるエピトープを認識し、該Ｆａｂ断片は任意の順序で直列に整列し、第一のＦａｂ断片のＣＨ１ドメインのＣ末端は、ポリペプチドリンカーを通して後続のＦａｂ断片のＶＨドメインのＮ末端に連結され、該ポリペプチドリンカー配列は、アミノ酸配列EPKX1CDKX2HX3X4PPX5PAPELLGGPX6X7PPX8PX9PX10GG（配列番号１）を含むか又はそれからなることを特徴とし、ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０は、同一又は異なり、任意のアミノ酸であり；ただし、該リンカー配列は、EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSTPPTPSPSGG（配列番号５）又はEPKSCDKTHTSPPSPAPELLGGPSTPPTPSPSGG（配列番号６）の配列を含むこともそれからなることもない。
【０００９】
さらに、２つの同一な抗原結合アーム（各々が、本明細書において定義されているような多重特異的抗原結合断片からなる）を有する多重特異的抗体が提供される。
【００１０】
好ましい実施態様では、
−各々が本明細書に定義されているような多重特異的抗原結合断片からなる、２つの同一な抗原結合アーム；
−免疫グロブリンの二量体化したＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン；
−抗原結合アームのＣＨ１ドメインのＣ末端をＣＨ２ドメインのＮ末端に連結している、ＩｇＡ、ＩｇＧ、又はＩｇＤのヒンジ領域
を含む、免疫グロブリン様構造を有する多重特異的抗体が提供される。
【００１１】
したがって、本発明はより特定すると、２本の重鎖と４本の軽鎖とを含む、多重特異的抗体、好ましくは二重特異的抗体を提供し、
ここでの各々の重鎖は、
ａ．ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインを含む、免疫グロブリンのＦｃ領域
を含み、
ｂ．該Ｆｃ領域は、該ヒンジドメインによって抗体１（Ａｂ１）のＦａｂの重鎖ＣＨ１−ＶＨに連結され、
ｃ．これは次いで、ポリペプチドリンカー配列によって抗体２（Ａｂ２）のＦａｂの重鎖ＣＨ１−ＶＨに連結され、ここでのポリペプチドリンカー配列は、Ａｂ１の該Ｆａｂの重鎖ＶＨドメインのＮ末端を、Ａｂ２の該ＣＨ１ドメインのＣ末端に連結し、
ここでの４本の軽鎖は、その同族重鎖ドメインと会合したＡｂ１の軽鎖とＡｂ２の軽鎖を含み；
該ポリペプチドリンカー配列は、アミノ酸配列EPKX1CDKX2HX3X4PPX5PAPELLGGPX6X7PPX8PX9PX10GG（配列番号１）を含むか又はそれからなることを特徴とし、
ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０は、同一又は異なり、任意のアミノ酸であり；ただし、該リンカー配列は、EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSTPPTPSPSGG（配列番号５）又はEPKSCDKTHTSPPSPAPELLGGPSTPPTPSPSGG（配列番号６）の配列を含むこともそれからなることもない。
【００１２】
特定の実施態様では、ポリペプチドリンカー配列は、
EPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPGGPPGPGPGGG（配列番号２）；
EPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPAAPPAPAPAGG（配列番号３）；及び
EPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPAAPPGPAPGGG（配列番号４）
からなる群より選択される配列を含むか又はそれからなる。
【００１３】
本発明のさらなる主題は、本明細書において定義されているような多重特異的抗原結合断片、又は多重特異的抗体、好ましくは二重特異的抗体の重鎖を含む、好ましくはからなる、ポリペプチドである。
【００１４】
本発明はさらに、このようなポリペプチドをコードしている配列を含むポリヌクレオチドを提供する。
【００１５】
前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを用いてトランスフェクトされた宿主細胞も本発明の一部である。
【００１６】
本発明のさらなる主題は、本明細書に記載されているような、多重特異的抗体、好ましくは二重特異的抗体を生成するための方法であり、該方法は、以下の工程：ａ）適切な培地及び培養条件において、本明細書において定義されているような抗体の重鎖及び本明細書において定義されているような抗体の軽鎖を発現している宿主細胞を培養する工程；並びにｂ）培養培地から又は該培養細胞から前記の生成された抗体を回収する工程を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、本発明の完全長のＢｉＸＡｂ二重特異的抗体の図である。
【図２】図２は、Ｆｃドメインを含まない、リンカーによって接続されたたった２つのＦａｂドメイン（Ｆａｂ−Ｆａｂ）しか含有していない二重特異的構築物の図である。
【図３Ａ】図３Ａは、ＢｉＸＡｂ２ｂのサイズ排除クロマトグラフィー分析を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＢｉＸＡｂ３ｂのサイズ排除クロマトグラフィー分析を示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、Ｆａｂ−Ｆａｂ３ｂのサイズ排除クロマトグラフィー分析を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、Ｆａｂ−Ｆａｂ３ａのＬＣ−ＭＳ分析のＭＳスペクトルを示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、Ｆａｂ−Ｆａｂ３ｂのＬＣ−ＭＳ分析のＭＳスペクトルを示す。
【図５Ａ】図５Ａは、ＢｉＸＡｂ３ａのＬＣ−ＭＳ分析のＭＳスペクトルを示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＢｉＸＡｂ３ｂのＬＣ−ＭＳ分析のＭＳスペクトルを示す。
【００１８】
発明の詳細な説明
定義
天然に存在する抗体分子の基本構造は、非共有結合による相互作用によって及び鎖間ジスルフィド結合によって互いに保持された、２本の同一な重鎖と２本の同一な軽鎖からなる、Ｙ字形の四量体四次構造である。
【００１９】
哺乳動物種では、５種類の重鎖（α、δ、ε、γ、及びμ）が存在し：これは、それぞれ、免疫グロブリンのクラス（アイソタイプ）（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ）を決定する。γ、α、及びδの重鎖では、重鎖のＮ末端可変ドメイン（ＶＨ）の後に、３つのドメイン（Ｎ末端からＣ末端に向かってＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３と番号付けされている）を含有している定常領域があるが、μ及びεの重鎖の定常領域は４つのドメイン（Ｎ末端からＣ末端に向かってＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４と番号付けされている）から構成されている。ＩｇＡ、ＩｇＧ、及びＩｇＤのＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメインは、異なるクラスの間で、ＩｇＡ及びＩｇＧの場合には、異なるサブタイプの間で長さの異なる可動性ヒンジによって隔離され（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４）それぞれ、１５、１２、６２（又は７７）、及び１２アミノ酸のヒンジを有し、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２はそれぞれ２０アミノ酸及び７アミノ酸のヒンジを有する。
【００２０】
λ及びκという２種類の軽鎖が存在し：これらは重鎖アイソタイプのいずれかと会合することができるが、所与の抗体分子内においては両方共に同じ種類である。両方の軽鎖は、機能的に同一であるようである。それらのＮ末端可変ドメイン（ＶＬ）の後には、ＣＬと呼ばれる単一ドメインからなる定常領域がある。
【００２１】
重鎖及び軽鎖は、ＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの間、及びＶＨドメインとＶＬドメインとの間で、タンパク質／タンパク質相互作用によって対を形成し、２本の重鎖は、それらのＣＨ３ドメイン間のタンパク質／タンパク質相互作用によって会合している。
【００２２】
抗原結合領域は、Ｙ字形構造のアームに相当し、これは、重鎖のＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインと対を形成した完全な各軽鎖からなり、これらはＦａｂ断片と呼ばれる（抗原結合断片（Fragment antigen binding）のために）。Ｆａｂ断片はまず、パパインによる消化によって天然免疫グロブリン分子から生成されるが、このパパインによる消化により、抗体分子がヒンジ領域内の鎖間ジスルフィド結合のアミノ末端側上で切断され、これにより２つの同一な抗原結合アームが遊離する。ペプシンなどの他のプロテアーゼもまた、抗体分子をヒンジ領域において切断するが、鎖間ジスルフィド結合のカルボキシ末端側上であり、これにより２つの同一なＦａｂ断片からなる断片が遊離され、これはジスルフィド結合を通して連結されたままであり；Ｆ（ａｂ'）２断片におけるジスルフィド結合の還元によりＦａｂ’断片が生成される。
【００２３】
ＶＨドメイン及びＶＬドメインに相当する抗原結合領域の部分は、Ｆｖ断片と呼ばれ（可変断片（Fragment variable）のために）；それは、抗原結合部位（パラトープとも呼ばれる）を形成している、ＣＤＲ（相補性決定領域）を含有している。
【００２４】
免疫細胞上のエフェクター分子へのその結合に関与している抗体のエフェクター領域は、Ｙ字形構造の幹に相当し、これは対を形成した重鎖のＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン（又は、抗体のクラスに応じて、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、及びＣＨ４ドメイン）を含有し、これはＦｃ（結晶性断片（Fragment crystallisable）のために）領域と呼ばれる。
【００２５】
２本の重鎖と２本の軽鎖が同一であることから、天然に存在する抗体分子は２つの同一な抗原結合部位を有し、したがって、２つの同一なエピトープに同時に結合する。
【００２６】
本発明の脈絡において、「多重特異的抗原結合断片」は本明細書において、各々が異なるエピトープを認識する、２つ以上の抗原結合領域を有する分子として定義されている。異なるエピトープは、同じ抗原性分子によって生じていても、又は異なる抗原性分子によって生じていてもよい。「認識している」又は「認識する」という用語は、該断片が標的抗原に特異的に結合することを意味する。
【００２７】
抗体が他の物質と結合するよりも高い親和性、結合力で、より容易に、及び／又はより長い期間におよび結合する場合に、該抗体は標的抗原に「特異的に結合」する。「特異的に結合している」又は「優先的に結合している」は、必ずしも排他的な結合を要求するものではない（排他的な結合を含んでいてもよいが）。一般的であって必ずしもではないが、結合への言及は、優先的な結合を意味する。
【００２８】
「被験体」、「個体」及び「患者」という用語は本明細書において互換的に使用され、処置のために評価される及び／又は処置される哺乳動物を指す。被験体はヒトであってもよいが、他の哺乳動物、特にヒト疾患のための実験モデルとして有用な哺乳動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌなども含む。
【００２９】
「処置」又は「処置する」という用語は、措置、適用、又は療法を指し、ここでのヒトをはじめとする被験体は、被験体の容態を直接的に又は間接的に改善する目的で医療を受ける。特に、該用語は、発症率を低減すること、又は症状を軽減すること、再発をなくすこと、再発を予防すること、発症を予防すること、症状を改善すること、予後を改善すること、又はその組合せをいくつかの実施態様において指す。当業者は、処置により、必ずしも症状が完全になくなるものでも除去されるものでもないことを理解しているだろう。例えば、がんに関しては、「処置」又は「処置している」は、腫瘍性細胞若しくは悪性細胞の成長、増殖、若しくは転移を緩徐化すること、腫瘍性細胞若しくは悪性細胞の成長、増殖、若しくは転移の発生を予防若しくは遅延させること、又はそのいくつかの組合せを指し得る。
【００３０】
多重特異的抗体の設計
本明細書において、多重特異的抗原結合断片（群）、及び該断片を含む多重特異的抗体構築物が提供され、各々の多重特異的抗原結合断片は、本発明のリンカーによって隔てられた直列に整列したＦａｂ断片から本質的になる。
【００３１】
このような断片及び構築物は好ましくは、ヒト免疫グロブリン、好ましくはＩｇＧ、さらに好ましくはＩｇＧ１由来の鎖を含む。
【００３２】
２つを超える異なるＦａｂ断片を含む多重特異的抗原結合断片の場合、Ｆａｂ断片を隔てているポリペプチドリンカーは、同一であっても異なっていてもよい。
【００３３】
本発明の多重特異的抗体の好ましい実施態様によると、それは、各々が上記に定義されているような多重特異的抗原結合断片からなる、２つの同一な抗原結合アームを有する。抗原結合アームは、抗体の目的とする用途に応じて、様々な方法で互いに連結させることができる。
【００３４】
Ｆｃにより媒介される効果を有さない抗体を得ることを所望する場合、抗体はＦｃ領域を全く含まないだろう。この場合、２つの抗原結合アームを、例えば：
−Ｆａｂ断片を隔離するポリペプチドリンカー（群）によってもたらされる鎖間ジスルフィド結合を通した抗原結合アームのホモ二量体化によって；及び／又は
−鎖間ジスルフィド結合の形成を可能とする、システイン残基を含有しているポリペプチド伸長物を、各抗原結合アームのＣ末端に付加すること、及び該ポリペプチド伸長物のホモ二量体化によりヒンジ様構造をもたらすことを通して；非限定的な例として、該ポリペプチド伸長物は、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ３のヒンジ配列であり得る；
−２つの抗原結合アームの重鎖のＣ末端を接続して、単一ポリペプチド鎖を形成し、該抗原結合アームを互いに十分な距離で維持している、半剛性リンカーを通して、
互いに連結させることができる。
【００３５】
あるいは、ＣＤＣ障害、ＡＤＣＣ障害、又はＡＤＰなどのエフェクター機能が所望である場合、本発明の多重特異的抗体はさらに、これらのエフェクター機能を与えるＦｃドメインを含んでいてもよい。Ｆｃドメインの選択は、所望のエフェクター機能の種類に依存するだろう。
【００３６】
この場合、本発明の多重特異的抗体は、以下を含む免疫グロブリン様構造を有する：
−上記に定義されているような２つの同一な多重特異的抗原結合アーム；
−二量体化した免疫グロブリンのＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン；
−抗原結合アームのＣＨ１ドメインのＣ末端をＣＨ２ドメインのＮ末端に連結している、ＩｇＡ、ＩｇＧ、又はＩｇＤのいずれかのヒンジ領域、あるいは、代替的には、ＣＨ３ドメインの後にあるＣＨ４ドメインがＩｇＭ又はＩｇＥに由来する場合、抗原結合アームのＣＨ１ドメインのＣ末端はこの場合、ＣＨ２ドメインのＮ末端に直接連結されていてもよい。
【００３７】
好ましくは、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン、ヒンジ領域、並びに／又はＣＨ４ドメインは、同じ免疫グロブリンに由来しているか、あるいは、抗原結合アームのＣＨ１ドメインと同じアイソタイプ及び同じサブクラスの免疫グロブリンに由来している。
【００３８】
天然免疫グロブリンに由来するＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、及び場合によりＣＨ４ドメイン、並びにヒンジ領域を使用してもよい。また、所望であれば、例えば、抗体のエフェクター機能を調節するために、それらを突然変異させることも可能である。場合によっては、ＣＨ２ドメイン又はＣＨ３ドメインの全部又は一部を省略してもよい。
【００３９】
本発明はより特定すると、それらの各々の標的に対する２つの結合部位と、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）及び食作用などのエフェクター機能の活性化を可能とする機能的なＦｃドメインとを含む、二重特異的で四価の抗体を提供する。
【００４０】
本発明のこのような好ましい抗体は、完全長抗体である。それらは好ましくは、ヒト免疫グロブリン、好ましくはＩｇＧ、さらに好ましくはＩｇＧ１に由来する重鎖及び軽鎖を含む。
【００４１】
軽鎖はλ軽鎖であってもκ軽鎖であってもよく；それらは好ましくはκ軽鎖である。
【００４２】
好ましい実施態様では、本発明のリンカーは、四価Ｆａｂ二重特異的抗体フォーマットにおいてＩｇＧ Ｆａｂドメインを連結し、そのアミノ酸配列は、適切なＩｇＧ軽鎖配列と同時発現させた、該ポリペプチドリンカーによって接続された少なくとも２つのＦａｂの重鎖配列、続いて天然ヒンジ配列、続いてＩｇＧ Ｆｃ配列を含む。
【００４３】
ＩｇＧ様構造を有する、ＢｉＸＡｂ抗体と命名された、本発明の抗体の一例を図１に例示する。以下に記載のＢｉＸＡｂ２ａ、ＢｉＸＡｂ２ｂ、ＢｉＸＡｂ２ｃ、及びＢｉＸＡｂ３ｂと呼称される抗体は具体例である。
【００４４】
本発明の二重特異的抗体は典型的には、
−Ｆｃの構築された連続重鎖（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）、
−続いて、抗体１のＦａｂの重鎖（ＣＨ１−ＶＨ）、及び連続した抗体２のＦａｂの重鎖（ＣＨ１−ＶＨ）（後者は、本発明のポリペプチドリンカー配列によって接続されている）
を含み、
−タンパク質の発現中に、結果として得られた重鎖は会合して二量体となり、一方、同時発現された抗体１及び抗体２の軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）はその同族重鎖と会合して、最終的な直列型Ｆ（ａｂ）’２−Ｆｃ分子を形成し、
抗体１（Ａｂ１）及び抗体２（Ａｂ２）は異なる。
【００４５】
好ましい実施態様では、
ａ）ヒトＩｇＧ１/κ由来のＣＨ１ドメイン及びＣ−κドメインと、Ａｂ１のＶＨドメイン及びＶＬドメインとを有する、Ｆａｂ断片、
ｂ）ヒトＩｇＧ１/κ由来のＣＨ１ドメイン及びＣ−κドメインと、Ａｂ２のＶＨドメイン及びＶＬドメインとを有する、Ｆａｂ断片、
ｃ）ヒトκ定常ドメインに由来する突然変異した軽鎖ＣＬ定常ドメイン、
ｄ）突然変異した重鎖ＣＨ１定常ドメイン
からなる、異なるＣＨ１ドメインとＣＬドメインとを有する２つのＦａｂ断片
を含む、二重特異的抗体が記載され、該Ｆａｂ断片は、以下の順で直列に並んでいる：
−ポリペプチドリンカーを通して、Ａｂ２のＦａｂ断片のＶＨドメインのＮ末端に連結されている、Ａｂ１のＦａｂ断片のＣＨ１ドメインのＣ末端、
−Ａｂ２の断片のＣＨ１ドメインのＣ末端をＣＨ２ドメインのＮ末端に連結している、ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域、
−ヒトＩｇＧ１の二量体化したＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン。
【００４６】
Ａｂ１及びＡｂ２は、関心対象の任意の抗体であり得、特に治療的に関心のある任意の抗体であり得る。特定の実施態様では、Ａｂ１及びＡｂ２は、異なり、抗ＥＧＦＲ抗体及び抗ＨＥＲ２/ｎｅｕ抗体からなる群より独立して選択される。好ましい実施態様では、Ａｂ１及びＡｂ２は、異なり、一方ではセツキシマブ又はその突然変異誘導体、他方ではトラスツズマブ又はその突然変異誘導体からなる群より独立して選択される。
【００４７】
別の特定の実施態様では、Ａｂ１及びＡｂ２は、異なり、抗ＣＤ３８抗体及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体からなる群より独立して選択される。
【００４８】
このような抗体は、医薬品として、より特定するとがんの処置において有用である。
【００４９】
本明細書全体を通して、アミノ酸配列は、Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.（1991）に従って定義される。
【００５０】
Ｆｃドメインを含有していない、多重特異的抗原結合断片Ｆａｂ−Ｆａｂである、本発明の構築物の別の例を図２に例示する。Ｆａｂ−Ｆａｂ３ａと称される具体例が以下に記載されている。
【００５１】
このようなＦａｂ−Ｆａｂ構築物は典型的には、２つの異なるＦａｂドメインを含む。このような抗体は、抗原１及び抗原２にそれぞれ結合するたった１つのＦａｂドメインしか有さない。それらは、対応するＢｉＸＡｂ抗体と同じ軽鎖を有するが、しかしながら、Ｆａｂ−Ｆａｂの重鎖は、その最もＣ末端にある残基がシステイン−２２０（ＥＵによる番号付け）であるように短縮されている。
【００５２】
リンカーの設計
本発明によるポリペプチドリンカー配列は、アミノ酸配列EPKX1CDKX2HX3X4PPX5PAPELLGGPX6X7PPX8PX9PX10GG（配列番号１）を含むか又はそれからなり、ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０は、同一又は異なり、任意のアミノ酸であり；ただし、該リンカー配列は、EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSTPPTPSPSGG（配列番号５）又はEPKSCDKTHTSPPSPAPELLGGPSTPPTPSPSGG（配列番号６）の配列を含むこともそれからなることもない。
【００５３】
ポリペプチドリンカー配列は、８０未満のアミノ酸、好ましくは６０未満のアミノ酸、さらに好ましくは４０未満のアミノ酸からなる。
【００５４】
特定の実施態様では、Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３は、同一又は異なり、トレオニン（Ｔ）又はセリン（Ｓ）である。
【００５５】
別の特定の実施態様では、Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３は、同一又は異なり、トレオニン（Ｔ）又はセリン（Ｓ）以外の任意のアミノ酸であり、好ましくはＸ１、Ｘ２、及びＸ３は、同一又は異なり、Ａｌａ（Ａ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ａｓｐ（Ｄ）、及びＩｌｅ（Ｉ）からなる群より選択され、さらに好ましくはＸ１、Ｘ２、及びＸ３は、同一又は異なり、Ａｌａ（Ａ）又はＧｌｙ（Ｇ）であり得る。
【００５６】
あるいは、Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３は、同一又は異なり、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｙｒ（Ｔ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、好ましくはＬｅｕ（Ｌ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、又はＧｌｎ（Ｑ）であり得る。
【００５７】
特定の実施態様では、Ｘ４及びＸ５は、同一又は異なり、セリン（Ｓ）、システイン（Ｃ）、アラニン（Ａ）、及びグリシン（Ｇ）からなる群より選択される任意のアミノ酸である。
【００５８】
好ましい実施態様では、Ｘ４は、セリン（Ｓ）又はシステイン（Ｃ）である。
【００５９】
好ましい態様では、Ｘ５は、アラニン（Ａ）又はシステイン（Ｃ）である。
【００６０】
特定の実施態様では、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０は、同一又は異なり、トレオニン（Ｔ）又はセリン（Ｓ）以外の任意のアミノ酸である。好ましくは、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０は、同一又は異なり、Ａｌａ（Ａ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ａｓｐ（Ｄ）、及びＩｌｅ（Ｉ）からなる群より選択される。
【００６１】
あるいは、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０は、同一又は異なり、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｙｒ（Ｔ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、好ましくはＬｅｕ（Ｌ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、又はＧｌｎ（Ｑ）であり得る。
【００６２】
好ましい実施態様では、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０は、同一又は異なり、Ａｌａ（Ａ）及びＧｌｙ（Ｇ）からなる群より選択される。
【００６３】
さらに好ましい実施態様では、Ｘ６及びＸ７は同一であり、好ましくはＡｌａ（Ａ）及びＧｌｙ（Ｇ）からなる群より選択される。
【００６４】
好ましい実施態様では、ポリペプチドリンカー配列は、配列番号１の配列を含むか又はそれからなり、ここで
Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３は、同一又は異なり、トレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）であり；
Ｘ４は、セリン（Ｓ）又はシステイン（Ｃ）であり；
Ｘ５は、アラニン（Ａ）又はシステイン（Ｃ）であり；
Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０は、同一又は異なり、Ａｌａ（Ａ）及びＧｌｙ（Ｇ）からなる群より選択される。
【００６５】
特定の実施態様では、ポリペプチドリンカー配列は、
EPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPGGPPGPGPGGG（配列番号２）；
EPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPAAPPAPAPAGG（配列番号３）；及び
EPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPAAPPGPAPGGG（配列番号４）
からなる群より選択される配列を含むか又はそれからなる。
【００６６】
別の好ましい実施態様では、ポリペプチドリンカー配列は、配列番号１の配列を含むか又はそれからなり、ここで
Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３は、同一又は異なり、Ａｌａ（Ａ）又はＧｌｙ（Ｇ）であり：
Ｘ４は、セリン（Ｓ）又はシステイン（Ｃ）であり；
Ｘ５は、アラニン（Ａ）又はシステイン（Ｃ）であり；
Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０は、同一又は異なり、Ａｌａ（Ａ）及びＧｌｙ（Ｇ）からなる群より選択される。
【００６７】
抗体の生成
本発明の抗体の重鎖及び軽鎖をコードしている核酸を発現ベクターに挿入する。軽鎖及び重鎖を同じ又は異なる発現ベクターにクローニングすることができる。免疫グロブリン鎖をコードしているＤＮＡセグメントは、免疫グロブリンポリペプチドの発現を確実にする発現ベクター（群）内の制御配列に作動可能に連結されている。このような制御配列は、シグナル配列、プロモーター、エンハンサー、及び転写終結配列を含む。発現ベクターは典型的には、エピソームとして、又は宿主染色体ＤＮＡの組込み部分としてのいずれかとして宿主生物において複製可能である。一般的には、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列を用いて形質転換された細胞の検出を可能とするための、選択マーカー、例えばテトラサイクリン又はネオマイシンを含有しているだろう。
【００６８】
一例では、重鎖コード配列及び軽鎖コード配列の両方（例えば、ＶＨ及びＶＬ、ＶＨ−ＣＨ１、又はＶＬ−ＣＬをコードしている配列）が１つの発現ベクターに含まれる。別の例では、抗体の重鎖及び軽鎖の各々が、個々のベクターにクローニングされる。後者の場合、重鎖及び軽鎖をコードしている発現ベクターを、両方の鎖の発現のために１つの宿主細胞に同時トランスフェクトしてもよく、この両鎖を会合することにより、インビボ又はインビトロのいずれかにおいてインタクトな抗体を形成することができる。
【００６９】
特定の実施態様では、宿主細胞を、プラスミドなどの３つの独立した発現ベクターを用いて同時トランスフェクトし、これにより、３本の全ての鎖（すなわち、それぞれ重鎖ＨＣ、並びに２本の軽鎖ＬＣ１及びＬＣ２）が同時に生成され、多重特異的抗体が分泌される。
【００７０】
より具体的には、３つのベクターは有利には、以下の分子比３：２：２（ＨＣ：ＬＣ１：ＬＣ２）で使用され得る。
【００７１】
本明細書に記載の抗体の発現のための組換えベクターは典型的には、構成性又は誘導性のいずれかであるプロモーターに作動可能に連結された抗体のアミノ酸配列をコードしている核酸を含有している。該ベクターは、原核細胞、真核細胞、又はその両方における複製及び組込みに適切であり得る。典型的なベクターは、転写終結因子及び翻訳終結因子、開始配列、並びに抗体をコードしている核酸の発現の調節に有用なプロモーターを含有している。該ベクターは場合により、少なくとも１つの独立した終結配列、真核生物及び原核生物の両方においてカセットの複製を可能とする配列、すなわちシャトルベクター、並びに原核生物系及び真核生物系の両方のための選択マーカーを含有している、遺伝子発現カセットを含有している。
【００７２】
本明細書に記載のような多重特異的抗体は、細菌、酵母、糸状菌、昆虫、及び哺乳動物細胞などの、原核生物発現系又は真核生物発現系において生成され得る。本発明の組換え抗体が、グリコシル化されているか又は真核細胞において発現される必要はないが、しかしながら、哺乳動物細胞における発現が一般的に好ましい。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ヒト胚腎臓（２９３細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ細胞）、チャイニーズハムスター卵巣細胞/−又は＋ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−ＤＧ４４、Ｆｌｐ−ｉｎ ＣＨＯ細胞）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ細胞）、及びヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２細胞）である。
【００７３】
ポリペプチドを発現及び生成するのには哺乳動物組織細胞培養が好ましい。なぜなら、インタクトな免疫グロブリンを分泌することのできる多くの適切な宿主細胞株が当技術分野において開発され、これには、ＣＨＯ細胞株、様々なＣｏｓ細胞株、ＨｅＬａ細胞、好ましくは骨髄腫細胞株、又は形質転換されたＢ細胞若しくはハイブリドーマが挙げられる。
【００７４】
最も好ましい実施態様では、本発明の多重特異的抗体、好ましくは二重特異的抗体は、ＣＨＯ細胞株、最も有利にはＣＨＯ−Ｓ細胞株を使用することによって生成される。
【００７５】
これらの細胞のための発現ベクターは、複製起点、プロモーター、及びエンハンサーなどの発現制御配列、並びに必要なプロセシング情報部位、例えばリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写終結配列を含み得る。好ましい発現制御配列は、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、サイトメガロウイルスなどに由来するプロモーターである。
【００７６】
関心対象のポリヌクレオチド配列（例えば、重鎖及び軽鎖をコードしている配列、並びに発現制御配列）を含有しているベクターを周知の方法によって宿主細胞に導入することができ、この方法は、細胞宿主の種類に応じて変化する。例えば、リン酸カルシウムによる処理又は電気穿孔法を、他の細胞宿主のために使用し得る（一般的にはSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 2nd ed., 1989参照)。重鎖及び軽鎖が、別々の発現ベクター上にクローニングされる場合、ベクターを同時にトランスフェクトすることにより、インタクトな免疫グロブリンの発現及びアセンブリが得られる。
【００７７】
宿主細胞を、ベクターを用いて形質転換又はトランスフェクトし（例えば、化学的トランスフェクション又は電気穿孔法によって）、プロモーターを誘導するか、形質転換体を選択するか、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅させるために、慣用的な栄養培地（又は適宜、改変されている）中で培養する。
【００７８】
一旦発現すると、本発明の完全な抗体、その二量体、個々の軽鎖及び重鎖、又は他の免疫グロブリン形態を、さらに単離又は精製することにより、さらなるアッセイ及び適用のために実質的に均一である調製物を得ることができる。当技術分野において公知である標準的なタンパク質精製法を使用することができる。例えば、適切な精製手順としては、イムノアフィニティカラム又はイオン交換カラムでの分画、エタノールによる沈降、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、硫酸アンモニウムによる沈降、及びゲルろ過（一般的にはScopes, Protein Purification（Springer-Verlag, N.Y., 1982）参照）が挙げられ得る。少なくとも約９０〜９５％の均一性の実質的に純粋な免疫グロブリンが好ましく、９８〜９９％又はそれ以上の均一性が最も好ましい。
【００７９】
インビトロでの生成は、大量の所望の本発明の多重特異的抗体、好ましくは二重特異的抗体を得るためのスケールアップを可能とする。このような方法は、例えばエアリフト反応器若しくは連続撹拌反応器中の均一な懸濁培養、又は、例えば中空繊維、マイクロカプセル、アガロースマイクロビーズ若しくはセラミックカートリッジ中に固定された若しくは封入された細胞培養を使用し得る。
【００８０】
治療適用
本発明のさらなる態様は、本発明に記載の抗体を含む医薬組成物である。本発明の別の態様は、医薬組成物の製造のための本発明に記載の抗体の使用である。本発明のさらなる態様は、本発明に記載の抗体を含む医薬組成物の製造法である。
【００８１】
別の態様では、本発明は、薬学的担体と一緒に製剤化された、本明細書に定義されているような抗体を含有している、組成物、例えば医薬組成物を提供する。
【００８２】
本発明の組成物は、当技術分野において公知である様々な方法によって投与され得る。
【００８３】
したがって一般的に上記されている本発明は、以下の実施例を参照することによってより容易に理解され、この実施例は説明のために提供され、本発明を限定するためのものではない。
【００８４】
実施例
設計
本発明の第一の二重特異的抗体は、以下の構造を有するＢｉＸＡｂ２ａと称される抗体である：
ｉ）以下を含む連続的な重鎖：
・配列番号７に対応するトラスツズマブの重鎖可変領域（ＶＨ）、
・配列番号８に対応するヒトＩｇＧ１に由来する野生型ＣＨ１定常ドメイン（Ｋａｂａｔの１９２位の残基はトレオニンである）
EPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPGGPPGPGPGGG（配列番号２）からなる２つのＦａｂ重鎖を接続しているポリペプチドリンカー；
・配列番号９に対応するセツキシマブの重鎖可変領域（ＶＨ）、
・配列番号１０に対応するヒトＩｇＧ１に由来する突然変異したＣＨ１定常ドメイン（Ｋａｂａｔの１９２位の残基は、トレオニンからグルタミン酸へと突然変異している）、
・配列番号１１に対応するヒトＩｇＧ１に由来する野生型ヒンジ領域、
・配列番号１２に対応するヒトＩｇＧ１の野生型ＣＨ２ドメイン、
・配列番号１３に対応するヒトＩｇＧ１の野生型ＣＨ３ドメイン。
よって、本発明の二重特異的抗体は、配列番号１４の連続的な重鎖（７０１残基）を有する。
ｉｉ）配列番号１５からなる野生型トラスツズマブ軽鎖、
ｉｉｉ）配列番号１６に対応するヒトκに由来する突然変異した定常ドメイン（ＫａｂａｔのＳｅｒ１１４位及びＡｓｎ１３７位の残基は、それぞれＡｌａ及びＬｙｓに突然変異している）を有するセツキシマブ軽鎖。
【００８５】
本発明の第二の二重特異的抗体は、リンカーを除いて同じ配列から構成される、ＢｉＸＡｂ２ｂと称される抗体であり、このリンカーはEPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPAAPPAPAPAGG（配列番号３）である。
【００８６】
本発明の第三の二重特異的抗体は、リンカーを除いて同じ配列から構成される、ＢｉＸＡｂ２ｃと称される抗体であり、このリンカーはEPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPAAPPGPAPGGG（配列番号４）である。
【００８７】
本発明の第四の二重特異的抗体は、以下の構造を有するＢｉＸＡｂ３ｂと称される抗体である：
ｉ）以下を含む連続的な重鎖
・配列番号２３（EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS）に対応するアテゾリズマブの重鎖可変領域（ＶＨ）、
・配列番号１０に対応するヒトＩｇＧ１に由来する突然変異したＣＨ１定常ドメイン（Ｋａｂａｔの１９２位の残基は、トレオニンからグルタミン酸へと突然変異している）、
配列番号３からなる、２つのＦａｂ重鎖を接続しているポリペプチドリンカー；
配列番号１７（EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTFNSFAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGGTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAKDKILWFGEPVFDYWGQGTLVTVSS）に対応するダラツムマブの重鎖可変領域（ＶＨ）、
・配列番号８に対応するヒトＩｇＧ１に由来する野生型ＣＨ１定常ドメイン（Ｋａｂａｔの１９２位の残基は、トレオニンである）、
・配列番号１１に対応するヒトＩｇＧ１に由来する野生型ヒンジ領域、
・配列番号１２に対応するヒトＩｇＧ１の野生型ＣＨ２ドメイン、
・配列番号１３に対応するヒトＩｇＧ１の野生型ＣＨ３ドメイン、
［よって、本発明の重鎖は、配列番号１８
【化１】
2020503873.tif 000002
の連続的な重鎖を有する］
ｉｉ）配列番号１９
【化２】
2020503873.tif 000003
に対応するヒトκに由来する突然変異した定常ドメイン（ＫａｂａｔのＳｅｒ１１４位及びＡｓｎ１３７位の残基は、それぞれＡｌａ及びＬｙｓへと突然変異している）を有するアテゾリズマブ軽鎖、
ｉｉｉ）配列番号２０
【化３】
2020503873.tif 000004
からなる野生型ダラツムマブ軽鎖。
【００８８】
比較するために、EPKSCDKTHTSPPSPAPELLGGPSTPPTPSPSGG（配列番号６）からなるリンカーによって、ＢｉＸＡｂ３ｂ抗体とは異なる、ＢｉＸＡｂ３ａと称される抗体も生成された。
【００８９】
本発明の別の構築物は、Ｆａｂ−Ｆａｂ３ｂと称され；それはヒンジ、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインが重鎖において欠失していることを除いて、ＢｉＸＡｂ３ｂと同じ配列を含む。よって、Ｆａｂ−Ｆａｂ３ｂは、配列番号２１
【化４】
2020503873.tif 000005
の連続的な重鎖を有する。
【００９０】
比較のために、ヒンジを除いてＢｉＸＡｂ３ａと同じ配列から構成される、Ｆａｂ−Ｆａｂ３ａと称される構築物も生成され、重鎖においてＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインが欠失している。
【００９１】
配列番号７〜１６は以下に示されている。
・配列番号７
【化５】
2020503873.tif 000006
・配列番号８
【化６】
2020503873.tif 000007
・配列番号９
【化７】
2020503873.tif 000008
・配列番号１０
【化８】
2020503873.tif 000009
・配列番号１１
【化９】
2020503873.tif 000010
・配列番号１２
【化１０】
2020503873.tif 000011
・配列番号１３
【化１１】
2020503873.tif 000012
・配列番号１４
【化１２】
2020503873.tif 000013
・配列番号１５
【化１３】
2020503873.tif 000014
・配列番号１６
【化１４】
2020503873.tif 000015
【００９２】
遺伝子の合成
抗ＨＥＲ２抗体（トラスツズマブ、クローンｈｕｍＡｂ４Ｄ５−８）及び抗ＥＧＦＲ抗体（セツキシマブ）のアミノ酸配列を使用して、ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔプログラムを使用した哺乳動物における発現のためのコドン最適化後に、ＤＮＡ配列を設計した。重鎖については、Ｆａｂ１のシグナルペプチド、可変領域、及びＣＨ１定常ドメインに続いて偽ヒンジリンカー、並びにＦａｂ２の可変領域及びＣＨ１定常ドメインをコードしている制限酵素による消化のためのフランキング配列を有するＤＮＡは、ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔによって合成された。軽鎖については、シグナルペプチド並びに可変領域及び定常κ領域をコードしているＤＮＡは、ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔによって合成された。
【００９３】
Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔを使用したＰＣＲ反応を実施してインサートを増幅し、これを次いで、それぞれ重鎖及び軽鎖についてＮｏｔＩ＋ＡｐａＩ及びＮｏｔＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩによって消化した。二重消化された重鎖断片を、ＮｏｔＩ＋ＡｐａＩで処理されたｐｃＤＮＡ３．１発現ベクター（インビトロジェン社）を用いてライゲートし、このベクターにはヒトＩｇＧ１ ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ＣＨ３ドメインがすでに挿入されていた。二重消化された軽鎖断片を、ＮｏｔＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩで処理されたｐｃＤＮＡ３．１発現ベクター（インビトロジェン社）を用いてライゲートした。プラスミドＤＮＡは、二本鎖ＤＮＡシークエンスによって確認された。
【００９４】
発現及び精製
本発明の二重特異的抗体は、２：３：３＝ＨＣ：ＬＣ１：ＬＣ２のモル比（１本の連続的な重鎖（ＨＣ）及び２本の軽鎖（ＬＣ））で別々のベクター上にコードされた３つの遺伝子を、無血清懸濁培地（ライフテクノロジーズ社製のＣＨＯ ＳＦＭ−ＩＩ培地（商標））に適応させたＣＨＯ−Ｓ細胞中で同時トランスフェクションすることよる、一過性遺伝子発現を用いて作製された。典型的には、５０mLの培地の規模の発現試験では、合計で５０μgのプラスミドＤＮＡ（２５μgの重鎖１、１２．５μgのトラツズマブ軽鎖、及び１２．５μgのセツキシマブ軽鎖）を１．５mLのエッペンドルフチューブ中で混合し、２５μLの３mg/mLのＰＥＩトランスフェクション試薬（ポリプラス社）ｐＨ７．０を含有している１mLのＣＨＯ ＳＦＭ培地を加え、室温で２０分間インキュベートした。ＤＮＡ−ＰＥＩの混合物を、１２５mLの振盪フラスコ中の、４９mLのライフテクノロジーズ社のインビトロジェンフリースタイル（商標）ＣＨＯ−Ｓ細胞に１〜２×１０６/mLでローディングした。細胞をさらに６日間振盪した。細胞を３，０００rpmで１５分間遠心分離にかけることによって上清を収集した。上清中のＢｉＸＡｂの発現力価は、フォルテバイオ社のプロテインＡバイオセンサー（オクテット（登録商標）システム）を使用して決定された。次いで、二重特異的モノクローナル抗体（ＢｉＸＡｂ）をプロテインＡアフィニティ培地でＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（ＧＥヘルスケアライフサイエンシーズ社）を使用して精製した。抗体は、プロテインＡから０．１ＭグリシンｐＨ３．５を使用して溶出した。ダルベッコＰＢＳ（Ｌｏｎｚａ ＢＥ１７−５１２Ｑ）中の精製された抗体を滅菌ろ過し（テクノプラスチックプロダクツＡＧ社製の０．２μMの滅菌フィルター）、最終濃度を、エッペンドルフバイオスペクトロメーター（登録商標）を使用して２８０nmでの吸光度の解読によって決定した。
【００９５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析
電気泳動を、還元条件下及び非還元条件下で、バイオラッド社のゲルのステインフリー４〜１５％ゲル及び対応する泳動緩衝液を使用して実施した。精製されたＢｉＸＡｂ又はＦａｂ−Ｆａｂ抗体を２×ＳＤＳ試料緩衝液と合わせ、９５℃で５分間加熱することによって試料を調製した。還元試料の調製は、加熱前のＮｕＰＡＧＥ還元剤の添加を含んでいた。見かけの分子量は、ラダープレシジョンＰｌｕｓプロテイン未着色スタンダード（バイオラッド社）を使用して決定された。
【００９６】
サイズ排除クロマトグラフィー分析
タンパク質の凝集は、工学操作されたタンパク質分子において頻繁に観察されている。本発明者らは、本発明者らの抗体の高分子量種の含量をアッセイするために分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を実施した。本発明者らは、ＳＥＣ−ｓ３０００（３００×７．８mm）カラム（バイオセップ社）及びAktapurifier 10システム（ＧＥヘルスケア社）を使用し；アッセイは、ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液を使用して１mL/分の流速で実施された。
【００９７】
ＢｉＸＡｂ２ｂ（図３Ａ）、ＢｉＸＡｂ３ａ、ＢｉＸＡｂ３ｂ（図３Ｂ）、Ｆａｂ−Ｆａｂ３ａ、及びＦａｂ−Ｆａｂ３ｂ（図３Ｃ）のＳＥＣクロマトグラムにより、メインピークが、単量体のＢｉＸＡｂ及びＦａｂ−Ｆａｂ抗体の予想されれるサイズに相当することが実証され；これらのピークは、全試料の９９．９〜１００．０％を占めた。したがって、本発明者らは、新規リンカーを含有している抗体が、高分子量種を全く有していないと結論付けた。単量体ピークの狭くかつ対称的な形状は、全てのＢｉＸＡｂ及びＦａｂ−Ｆａｂが正しく会合し、単一の種によって示されたことを示唆した。
【００９８】
示差走査熱量測定によるＢｉＸＡｂの特徴付け
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を使用して、ＢｉＸＡｂ２ｂの熱的安定性を試験した。Microcal（商標）VP-Capillary DSCシステム（Malvern Instruments）を使用して、示差走査熱量測定実験を実施した。
【００９９】
試料を遠心分離にかけ（２０，０００×ｇ、５分間、４℃）、そのタンパク質含量を、示差走査熱量測定分析前にＮａｎｏｄｒｏｐ ＮＤ−１０００分光光度計（サーモサイエンティフィック社）を使用してＩｇＧ分析プログラムを使用して定量した。アッセイのために、試料をＰＢＳで最終濃度１mg/mLとなるまで希釈した。
【０１００】
前平衡時間は３分間であり、得られたサーモグラムは６０℃/ｈの走査速度で２０〜１１０℃で、２５秒間のフィルタリング期間、及び培地のフィードバックで、取得された。試料を分析する前に、５つの緩衝液／緩衝液スキャンを測定して機器を安定化させ、緩衝液／緩衝液スキャンを、各タンパク質／緩衝液スキャンの間に実施した。データを、２状態ではないアンフォールディングモデルにあてはめ基線を差し引くことにより遷移前及び遷移後を調整した。
【０１０１】
ＤＳＣの結果は、ＢｉＸＡｂ２ｂのＤＳＣプロファイルが、２つの遷移を示したことを実証した。小さい方のピークは、９６Ｋｃａｌ/モル/℃のＣｐｍａｘ及び７１．５℃のＴｍ１を有し、これはＣＨ２ドメイン及びＦａｂドメインの両方のアンフォールディングに相当し、大きい方のピークは、１９０Ｋｃａｌ/モル/℃のＣｐｍａｘ及び８０．５℃のＴｍ２を有し、これはＣＨ３ドメインのアンフォールディングに相当する。
【０１０２】
液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ−ＭＳ）による分析
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳデータを、Q-Exactive質量分析計（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、ブレーメン、ドイツ）及びProswift RP-4H逆相カラム（２５０mm×１mm；サーモフィッシャー社）に連結させたDionex Ultimate 3000システムを使用して取得した。カラムオーブン温度を６５℃に設定した。１０μlを、ＬＣによる分離のために注入した。０．１％ギ酸を含むＬＣ−ＭＳ等級の水（移動相Ａ）及び０．１％ギ酸を含むアセトニトリル（移動相Ｂ）からなる移動相の勾配を、０．２mL/分の流速で送達した（全操作時間は２０分間）。溶出された抗体種は、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）によってQ-Exactive機器に導入され、これはフルスキャン１５，０００分解能を使用したポジティブイオンモードで作動した。Xcalibur 2.2ソフトウェア（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、ブレーメン、ドイツ）を、機器の制御及びデータファイルの処理のために使用した。
【０１０３】
図４Ａ及び４Ｂは、それぞれ、Ｆａｂ−Ｆａｂ３ａ（配列番号６を有するリンカーを含有している）及びＦａｂ−Ｆａｂ３ａ（配列番号３を有するリンカーを含有している）のＬＣ−ＭＳ分析を示す。図４Ａは、配列番号６に対応するリンカーを有するＦａｂ−Ｆａｂ３ａのＬＣ−ＭＳスペクトルが、リンカー（配列番号３）の組成だけが異なる関連したＦａｂ−Ｆａｂ３ｂ抗体よりも有意により不均一であることを実証する。Ｆａｂ−Ｆａｂ３ａ抗体におけるリンカー配列は、PSTPPTPSPS（配列番号２２）配列を含有し、これはヒトＩｇＡ１ヒンジに見られ、２つのトレオニン残基及び２つのセリン残基においてＯ結合グリコシル化を受けることが知られている。これらの部位のグリコシル化は不均一であるので、生成物は通常、複数のグリコフォームを有し、その集団は、組換えタンパク質の発現条件によって強く影響を受ける。Ｆａｂ−Ｆａｂ３ａにおけるＮ結合グルコシル化部位及びＯ結合グルコシル化部位の総数は少なくとも４つであり、これは図４Ａで観察された複雑なＭＳスペクトルを説明する。均一ではないＯ結合グリコシル化に起因する不均一性を低減させるために、配列番号３に対応するリンカー配列が設計された。したがって、リンカー（その配列は、Ｏ結合グリコシル化を受けることが知られているヒトＩｇＡ１のヒンジ配列に一致している）の部分におけるいくつかのセリン残基及びトレオニン残基をグリシン残基で置換し；さらに、リンカー内のいくつかの他のセリン残基及びトレオニン残基も、グリシンで置換した。図４Ｂは、配列番号３のリンカーを含有しているＦａｂ−Ｆａｂ３ｂのＭＳスペクトルが実質的に単純化していることを示し；これは、Ｆａｂ−Ｆａｂ３ｂ分析物が、そのスペクトルが図４Ａに示されているＦａｂ−Ｆａｂ３ａ分析物よりも複雑ではないためである。したがって、本発明者らは、配列番号６のリンカーを配列番号３のリンカーで置換することによって、Ｆａｂ−Ｆａｂ３ｂ抗体から４つのＯ結合グリコシル化部位を排除することにより、実質的により均一なＢｉＸＡｂ調製物が得られたと結論付けた。
【０１０４】
配列番号６及び配列番号３のリンカーを含有している二重特異的抗体の均一性の相違は、２つのリンカー配列を有し、したがってＢｉＸＡｂ調製物内に増加した数のグリコフォームを有する、対称分子である、完全長ＢｉＸＡｂ抗体の分析から特に明らかであった。さらに、ＢｉＸＡｂは、２つのＮ結合グルコシル化部位を有し、Ｆｃドメインのそれぞれの重鎖上に１つずつである。ＢｉＸＡｂ３ａのＬＣ−ＭＳスペクトル（配列番号６のリンカーを用いて構築される）及びＢｉＸＡｂ３ｂ（配列番号３のリンカーを用いて構築される）のＬＣ−ＭＳスペクトルをそれぞれ図５Ａ及び５Ｂに提示する。ＢｉＸＡｂ３ａは、リンカー配列の差異に基づいて、ＢｉＸＡｂ３ｂと比較して８つの追加のＯ結合グルコシル化部位を含有していることが予想される。ＢｉＸＡｂ３ａにおける多数のＯ結合グリコシル化部位は、図５Ａにおける高度に複雑なＭＳスペクトルを説明する。どちらのＢｉＸＡｂ抗体も、Ｆｃドメインに２つのＮ−グリコシル化部位を有し、その結果、両方のＢｉＸＡｂの不均一性に寄与する追加のグリコフォームが得られ、これは、図５Ｂで観察されたＢｉＸＡｂ３ｂの不均一性の残留量を説明する。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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