(57)【要約】本発明は、ＧＫＮ１タンパク（Ｇａｓｔｒｏｋｉｎｅ  １  Ｐｒｏｔｅｉｎ）水準を測定する製剤を含む胃癌診断用組成物または前記組成物を含む胃癌診断用キットに関するものであり、また、ＧＫＮ１タンパク（Ｇａｓｔｒｏｋｉｎｅ  １  Ｐｒｏｔｅｉｎ）を有効成分として含む胃癌の予防または治療用組成物に関するものである。
2020531811.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＫＮ１タンパク（Ｇａｓｔｒｏｋｉｎｅ  １  Ｐｒｏｔｅｉｎ）水準を測定する製剤を含む胃癌の診断用組成物。
【請求項２】
前記ＧＫＮ１タンパク水準を測定する製剤は、前記タンパクに特異的に結合する抗体であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＧＫＮ１タンパクは、血液、血漿または血清のエクソソーム内に存在することを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
請求項１による組成物を含む胃癌診断用キット。
【請求項５】
前記キットは、ＥＬＩＳＡキットまたはタンパクチップキットであることを特徴とする請求項４に記載のキット。
【請求項６】
（ａ）患者から分離した生物学的試料からＧＫＮ１タンパク水準を測定する段階と、
（ｂ）前記ＧＫＮ１タンパク水準を対照群試料から得た基準値と比べる段階とを含む胃癌の診断または予後予測のための情報提供方法。
【請求項７】
前記ＧＫＮ１タンパクは、６０〜８０℃で５〜１５分間熱処理する段階をさらに含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＧＫＮ１タンパク水準が基準値に比べて低い場合に胃癌であると判断する段階をさらに含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記ＧＫＮ１タンパク水準が基準値に比べて低い場合に胃癌の発病可能性が高いか予後が良くない可能性が高いと判断する段階をさらに含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記生物学的試料は、血液、血漿または血清であることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記測定は、酵素免疫分析法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫分析法（ｒａｄｉｏｉｍｍｎｏａｓｓａｙ、ＲＩＡ）、サンドイッチ測定法（ｓａｎｄｗｉｃｈ  ａｓｓａｙ）、ウェスタンブロッティング、免疫沈降法、免疫組織化学染色法（ｉｍｍｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）、フローサイトメトリー、蛍光活性化細胞分類法（ＦＡＣＳ）、酵素基質発色法及び抗原−抗体凝集法からなるグループより選択されるいずれか一つ以上の方法を利用して行われることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
ＧＫＮ１タンパク（Ｇａｓｔｒｏｋｉｎｅ  １  Ｐｒｏｔｅｉｎ）を有効成分として含む胃癌の予防または治療用薬学組成物。
【請求項１３】
前記ＧＫＮ１タンパクは、ＧＫＮ１タンパクを発現する細胞のエクソソームに由来することを特徴とする請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ＧＫＮ１タンパクは、ＧＫＮ１タンパクを発現する細胞の培養上層液から分離することを特徴とする請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ＧＫＮ１タンパクは、組換えＧＫＮ１（ｒＧＫＮ１：ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＧＫＮ１）タンパクが導入された細胞の培養上層液から分離することを特徴とする請求項１２に記載の組成物。
【請求項１６】
前記組換えＧＫＮ１タンパクは、１〜１０ｎｇ／ｍｌの濃度で処理されることを特徴とする請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ＧＫＮ１タンパクは、１〜２０ｎｇ／ｍｌの濃度で処理されることを特徴とする請求項１２に記載の組成物。
【請求項１８】
前記ＧＫＮ１タンパクは、クラスリン（Ｃｌａｔｈｒｉｎ）によって癌細胞で内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）されることを特徴とする請求項１２に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ＧＫＮ１タンパクは、癌細胞の細胞増殖を抑制し、癌細胞の細胞死滅を誘導することを特徴とする請求項１２に記載の組成物。
【請求項２０】
ＧＫＮ１タンパク（Ｇａｓｔｒｏｋｉｎｅ  １  Ｐｒｏｔｅｉｎ）を投与する段階を含む胃癌の予防または治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＧＫＮ１タンパク（Ｇａｓｔｒｏｋｉｎｅ  １  Ｐｒｏｔｅｉｎ）を有効成分として含む胃癌の診断、予防または治療用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
胃癌は、全世界的に韓国、中国、日本などで多く発生する癌であって、米国、ヨーロッパなどの西欧では発生率が低いが、韓国の場合、癌発生率の１位が胃癌であり、死亡率は肺癌に続き２位を占めている。胃癌の分類をみると、全体の９５％が胃壁粘膜の腺細胞で生じる腺癌であり、その他にリンパ系で発生するリンパ腫、間質組織で発生する胃腸管間質性腫瘍がある。
【０００３】
現在、癌を治療する方法の中で３つの主要な治療法としては、外科的治療法、薬物療法、放射線療法があるが、薬物療法は治療に伴う苦痛が少なく、外科的治療や放射線治療に比べて治療後も癌の再発が相対的に少ないので、これに対する期待が集まっている。従って、これに応えるような数多くの抗癌剤が開発されて使用されているが、これらの大部分の抗癌剤は、癌の異常増殖を念頭において活発に分裂する細胞を選択的に死なせることで坑癌効果を表すものである。このような抗癌剤は、一般的に人体内で活発に分裂する細胞である兔疫細胞、毛根細胞のような正常細胞も共に殺すという深刻な副作用を伴うので、長期間使用が不可能な問題点を抱えている。また、胃癌治療のための方法としては、リンパ節郭清、内視鏡的粘膜切除術、腹腔鏡胃切除術などの方法が使用されているが、内視鏡的粘膜切除術は、粘膜内に早期胃癌に対して癌病変のある胃粘膜周りに生理食塩水を注入して病変部位を膨らませた後、病変のある粘膜を切除する方法として、簡単な内視鏡手術で胃切除手術の苦痛が避けられるという長所があるが、粘膜に限った早期胃癌の中でリンパ節転移可能性の低い場合に限って使用可能であるという限界がある。
【０００４】
最近、全世界的に癌の生成及び治療と関連した遺伝子の機能研究を通じて治療用標的を掘り出し、これらを診断及び治療剤の開発に利用するための研究を進行している。ゲノム研究の活性化と共にヒト遺伝子ＤＮＡチップまたはプロテオーム分析研究が活発に行われ、癌と関連した遺伝子が大量発掘されることにより、多くの遺伝子のリストと関連したデータベースは構築されているが、多くがこれらの遺伝子に対する細胞内における具体的な生物学的機能及び癌の関連性は未だ研究されていないか不確実であり、実際、癌の関連性または診断及び標的遺伝子としての活用と共に、さらに癌を効果的に治療することができる遺伝子の発掘に相当な困難がある。従って、これまで明らかになった癌関連の遺伝子以外にも新しい遺伝子の発掘が必要な実情である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、ＧＫＮ１タンパク（Ｇａｓｔｒｏｋｉｎｅ  １  Ｐｒｏｔｅｉｎ）水準を測定する製剤を含む胃癌の診断用組成物を提供することにある。
【０００６】
本発明のまた他の目的は、前記胃癌の診断用組成物を含む胃癌診断用キットを提供することにある。
【０００７】
本発明のまた他の目的は、（ａ）患者から分離した生物学的試料からＧＫＮ１タンパク水準を測定する段階と、（ｂ）ＧＫＮ１タンパク水準を対照群試料から得た基準値と比べる段階とを含むことを特徴とする胃癌の診断または予後予測のための情報提供方法を提供することにある。
【０００８】
本発明のさらに他の目的は、ＧＫＮ１タンパク（Ｇａｓｔｒｏｋｉｎｅ  １  Ｐｒｏｔｅｉｎ）を有効成分として含む胃癌の予防または治療用薬学組成物を提供することにある。
【０００９】
本発明のさらに他の目的は、ＧＫＮ１タンパク（Ｇａｓｔｒｏｋｉｎｅ  １  Ｐｒｏｔｅｉｎ）を投与する段階を含む胃癌の予防または治療方法に関するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成するために、本発明は、ＧＫＮ１タンパク（Ｇａｓｔｒｏｋｉｎｅ  １  Ｐｒｏｔｅｉｎ）水準を測定する製剤を含む胃癌の診断用組成物を提供する。
【００１１】
本発明の一実施例において、前記ＧＫＮ１タンパク水準を測定する製剤は、前記タンパクに特異的に結合する抗体であることができる。
【００１２】
本発明の一実施例において、前記ＧＫＮ１タンパクは、血液、血漿または血清のエクソソーム内に存在することができる。
【００１３】
また、本発明は、胃癌の診断用組成物を含む胃癌診断用キットを提供する。
【００１４】
本発明の一実施例において、前記キットは、ＥＬＩＳＡキットまたはタンパクチップキットであることができる。
【００１５】
また、本発明は、（ａ）患者から分離した生物学的試料からＧＫＮ１タンパク水準を測定する段階と、（ｂ）前記ＧＫＮ１タンパク水準を対照群試料から得た基準値と比べる段階とを含むことを特徴とする胃癌の診断または予後予測のための情報提供方法を提供する。
【００１６】
本発明の一実施例において、前記ＧＫＮ１タンパクは、６０〜８０℃で５〜１５分間熱処理する段階をさらに含むことができ、好ましくは、７５〜８５℃で８〜１２分間熱処理することができ、さらに好ましくは、７０℃で１０分間熱処理することができる。
【００１７】
本発明の一実施例において、前記ＧＫＮ１タンパク水準が基準値に比べて低い場合に胃癌であると判断される段階をさらに含むことができる。
【００１８】
本発明の一実施例において、前記ＧＫＮ１タンパク水準が基準値に比べて低い場合に胃癌の発病可能性が高いか予後が良くない可能性が高いと判断する段階をさらに含むことができる。
【００１９】
本発明の一実施例において、前記生物学的試料は、血液、血漿または血清であることができ、好ましくは血清であることができる。
【００２０】
本発明の一実施例において、前記測定は、酵素免疫分析法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫分析法（ｒａｄｉｏｉｍｍｎｏａｓｓａｙ、ＲＩＡ）、サンドイッチ測定法（ｓａｎｄｗｉｃｈ  ａｓｓａｙ）、ウェスタンブロッティング、免疫沈降法、免疫組織化学染色法（ｉｍｍｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）、フローサイトメトリー、蛍光活性化細胞分類法（ＦＡＣＳ）、酵素基質発色法及び抗原−抗体凝集法からなるグループより選択されるいずれか一つ以上の方法を利用して行われることができる。
【００２１】
また、本発明は、ＧＫＮ１タンパク（Ｇａｓｔｒｏｋｉｎｅ  １  Ｐｒｏｔｅｉｎ）を有効成分として含む胃癌の予防または治療用薬学組成物を提供する。
【００２２】
本発明の一実施例において、前記ＧＫＮ１タンパクは、ＧＫＮ１タンパクを発現する細胞から分泌されるエクソソームであることができる。
【００２３】
本発明の一実施例において、前記ＧＫＮ１タンパクは、ＧＫＮ１タンパクを発現する細胞の培養上層液から分離することができる。
【００２４】
本発明の一実施例において、前記ＧＫＮ１タンパクは、組換えＧＫＮ１（ｒＧＫＮ１：ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＧＫＮ１）タンパクが導入された細胞の培養上層液から分離することができる。
【００２５】
本発明の一実施例において、前記組換えＧＫＮ１タンパクは、１〜１０ｎｇ／ｍｌの濃度で処理されることができ、好ましくは、３〜７ｎｇ／ｍｌの濃度で処理されることができ、さらに好ましくは、５ｎｇ／ｍｌの濃度で処理されることができるが、これに制限されるものではない。
【００２６】
本発明の一実施例において、前記ＧＫＮ１タンパクは、１〜２０ｎｇ／ｍｌの濃度で処理されることができ、好ましくは、５〜１５ｎｇ／ｍｌの濃度で処理されることができ、さらに好ましくは、１０ｎｇ／ｍｌの濃度で処理されることができるが、これに制限されるものではない。
【００２７】
本発明の一実施例において、前記ＧＫＮ１タンパクは、クラスリン（Ｃｌａｔｈｒｉｎ）によって癌細胞で内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）されることができる。
【００２８】
本発明の一実施例において、前記ＧＫＮ１タンパクは、癌細胞の細胞増殖を抑制し、癌細胞の細胞死滅を誘導することができる。
【００２９】
また、本発明は、ＧＫＮ１タンパク（Ｇａｓｔｒｏｋｉｎｅ  １  Ｐｒｏｔｅｉｎ）を投与する段階を含む胃癌の予防または治療方法を提供する。
【００３０】
本発明の癌の治療方法は、ＧＫＮ１タンパクを治療的有効量で個体に投与することを含む。特定個体に対する具体的な治療的有効量は、達成しようとする反応の種類と程度、場合によって他の製剤が使用されるか否かを含み、具体的組成物、個体の年齢、体重、一般健康状態、性別及び食餌、投与時間、投与経路及び組成物の分泌率、治療期間、具体的組成物と共に使用されるか同時使用される薬物を含む多様な因子と医薬分野によく知られた類似因子によって異なって適用することが好ましい。従って、本発明の目的に適宜な組成物の有効量は、前述した事項を考慮して決定することが好ましい。
【００３１】
上記個体は、任意の哺乳動物に適用可能であり、上記哺乳動物は、ヒト及び霊長類だけでなく、牛、豚、羊、馬、犬、及び猫などの家畜を含む。
【発明の効果】
【００３２】
本発明によるＧＫＮ１タンパク（Ｇａｓｔｒｏｋｉｎｅ  １  Ｐｒｏｔｅｉｎ）は、胃癌の予測または診断に有用なバイオマーカーとして、前記エクソソームのＧＫＮ１タンパクを含み、試料内の総ＧＫＮ１タンパク水準が正常人に比べて低い場合は胃癌であると、早期且つ便利に胃癌の診断または予後予測が可能である。
【００３３】
また、本発明によるＧＫＮ１タンパク（Ｇａｓｔｒｏｋｉｎｅ  １  Ｐｒｏｔｅｉｎ）は、ＧＫＮ１タンパクを発現する細胞でエクソソームとして分泌され、ＧＫＮ１タンパクを発現する細胞の培養上層液から分離され、クラスリン（Ｃｌａｔｈｒｉｎ）によって癌細胞に内在化されて癌細胞の細胞増殖を抑制し、癌細胞の細胞死滅を誘導することで、胃癌の予防または治療に有用に使用されることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】ＧＫＮ１結合タンパクを同定した結果として、（ａ）はタンパクマイクロアレイで組換えＧＫＮ１タンパクに結合を示すエクソソームタンパクのリストに関するものであり、（ｂ）はＧＫＮ１がＣＯＭＴ及びＹＷＨＡＺタンパクに対する結合力を免疫沈殿法及びウェスタンブロッティングで確認した結果を示すものである。
【図２ａ】ＨＦＥ−１４５細胞、組換えＧＫＮ１（ｒＧＫＮ１）タンパクを処理／非処理したＡＧＳ及びＭＫＮ１細胞から分離したエクソソーム（Ｅｘｏｓｏｍｅ）、エクソソームが除去された培地（ｓｏｌｕｂｌｅ）及び全体細胞溶解物（ＷＣＬ）におけるＧＫＮ１、ＴＳＧ−１０１及びＣＤ８１に対するウェスタンブロッティングの結果を示すものである。
【図２ｂ】ＨＦＥ−１４５細胞における全体培養液（Ｔｏｔａｌ  ｍｅｄｉａ）、エクソソーム分画（Ｅｘｏｓｏｍｅ）及びエクソソームが除去された培地（Ｓｏｌｕｂｌｅ）をＧＫＮ１タンパクの濃度測定用ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ  内の希釈緩衝溶液を処置した後、ＧＫＮ１濃度を測定した結果を示すものである。
【図２ｃ】ＨＦＥ−１４５細胞由来のエクソソームにトリプシン及びＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の処理／非処理による酵素分解アッセイ（Ｔｒｙｐｓｉｎ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）をした結果を示すものである。
【図３ａ】組換えＧＫＮ１タンパクをＡＧＳ細胞に処理した後、分離されたエクソソームを確認した結果を示すものである。
【図３ｂ】ｓｉＣｌａｔｈｒｉｎを処理したＡＧＳ及びＭＫＮ１細胞でＣｌａｔｈｒｉｎタンパクの発現が抑制されることをウェスタンブロッティングで確認した結果を示すものである。
【図３ｃ】ｓｉＣｌａｔｈｒｉｎが処理されたＡＧＳ及びＭＫＮ１細胞でＧＫＮ１タンパクを含むエクソソームの位置化（ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）を調査した結果を示すものである。
【図３ｄ】ｓｉＣｌａｔｈｒｉｎが処理されたＡＧＳ及びＭＫＮ１細胞でＧＫＮ１及びＣＤ８１の発現量をウェスタンブロッティングで確認した結果を示すものである。
【図４ａ】ＨＦＥ−１４５細胞で熱処理をしないか（Ｎｏｎ−ｈｅａｔｉｎｇ）熱処理をした場合（Ｈｅａｔｉｎｇ）の全体培地（Ｍｅｄｉａ）、エクソソーム（Ｅｘｏｓｏｍｅ）及びエクソソームが除去された培地（ｅｘｏｓｏｍｅ  ｄｅｐｌｅｔｅｄ  ｍｅｄｉａ）におけるＧＫＮ１タンパクの濃度を分析した結果を示すものである。
【図４ｂ】１０人の健康な被験者（Ｎｏｒｍａｌ  ｓｅｒｕｍ）及び１０人の胃癌患者（ｃａｎｃｅｒ  ｓｅｒｕｍ）の血清で熱処理をしないか（Ｎｏｎ−ｈｅａｔｉｎｇ）熱処理をした場合（Ｈｅａｔｉｎｇ）の全体血清（Ｗｈｏｌｅ  Ｓｅｒｕｍ）、エクソソーム（Ｅｘｏｓｏｍｅ）及びエクソソームが除去された血清（Ｗ／Ｏ  Ｅｓｏｓｏｍｅ）におけるＧＫＮ１タンパクの濃度を分析した結果を示すものである。
【図４ｃ】１００人の健康な被験者から血清ＧＫＮ１タンパク濃度による年齢及び性別の関連度を分析した結果を示すものである。
【図４ｄ】健康な被験者、萎縮性胃炎（ａｔｒｏｐｈｉｃＧａｓｔｒｉｔｉｓ：Ａｔｒｏｐｈｙ）のある者、腸上皮化生（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｍｅｔａｐｌａｓｉａ：ＩＭ）が伴った萎縮性胃炎のある者及び胃癌患者におけるＧＫＮ１タンパクの濃度を分析した結果を示すものである（Ｐ＜０．０００１）。
【図４ｅ】１００人の健康な被験者（Ｎｏｒｍａｌ  ｓｅｒｕｍ）、１５０人の胃癌患者（ＧＣ  ｓｅｒｕｍ）、４５人の肝癌患者（ＬＣ  ｓｅｒｕｍ）及び５０人の大膓癌患者（ＣＣ  ｓｅｒｕｍ）で血清ＧＫＮ１濃度を分析した結果を示すものである。
【図４ｆ】正常胃粘膜（ｎｏｒｍａｌ）を持った者、萎縮性胃炎（ａｔｒｏｐｈｉｃＧａｓｔｒｉｔｉｓ：Ａｔｒｏｐｈｙ）のある者及び腸上皮化生（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｍｅｔａｐｌａｓｉａ：ＩＭ）が伴った萎縮性胃炎のある者に対する胃癌患者における血清ＧＫＮ１水準によるＲＯＣ曲線分析結果を示すものである。
【図４ｇ】血清ＧＫＮ１濃度で胃癌患者を肝癌及び大膓癌患者と区分することができるかに対するＲＯＣ曲線分析結果を示すものである。
【図４ｈ】健康な被験者、萎縮性胃炎（ａｔｒｏｐｈｉｃＧａｓｔｒｉｔｉｓ：Ａｔｒｏｐｈｙ）のある者、腸上皮化生（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｍｅｔａｐｌａｓｉａ：ＩＭ）が伴った萎縮性胃炎のある者及び胃癌患者の中で早期胃癌と進行性胃癌患者におけるＧＫＮ１タンパクの濃度を分析した結果を示すものである（Ｐ＜０．０００１）。
【図４ｉ】健康な被験者、萎縮性胃炎（ａｔｒｏｐｈｉｃＧａｓｔｒｉｔｉｓ：Ａｔｒｏｐｈｙ）のある者、腸上皮化生（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｍｅｔａｐｌａｓｉａ：ＩＭ）が伴った萎縮性胃炎のある者及び胃癌患者の中で早期胃癌患者におけるＧＫＮ１水準に対するＲＯＣ曲線分析結果を示すものである。
【図５ａ】ＨＦＥ−１４５細胞由来のエクソソームがＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞、ＴＨＰ−１タンパク球、Ｕ９３７大食細胞の細胞膜に付いたか否かを確認するための免疫蛍光アッセイ結果を示すものである。
【図５ｂ】ＨＦＥ−１４５細胞由来のエクソソームＧＫＮ１及びＣＤ８１タンパクがＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞、ＴＨＰ−１タンパク球、Ｕ９３７大食細胞の細胞膜または細胞質や核に存在するか否かを分析した結果を示すものである。
【図５ｃ】ＨＦＥ−１４５細胞由来のエクソソームＧＫＮ１がＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞、ＴＨＰ−１タンパク球、Ｕ９３７大食細胞の細胞生存率に影響を及ぼすか否かを分析した結果を示すものである。
【図５ｄ】ＨＦＥ−１４５細胞由来のエクソソームＧＫＮ１がＴＨＰ−１タンパク球、Ｕ９３７大食細胞の機能に影響を及ぼすか否かを分析した結果を示すものである。
【図６ａ】ＭＫＮ１（組換えＧＫＮ１処理／非処理）、ＡＧＳ（組換えＧＫＮ１処理／非処理）及びＨＦＥ−１４５細胞由来のエクソソームをＨＦＥ−１４５、ＡＧＳ及びＭＫＮ１細胞にそれぞれ処理した後、ＭＴＴ  ａｓｓａｙを通じて細胞生存率を確認した結果を示すものである。
【図６ｂ】ＭＫＮ１（組換えＧＫＮ１処理／非処理）、ＡＧＳ（組換えＧＫＮ１処理／非処理）及びＨＦＥ−１４５細胞由来のエクソソームをＨＦＥ−１４５、ＡＧＳ及びＭＫＮ１細胞に処理した後、ＢｒｄＵ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙを通じて細胞増殖能を確認した結果を示すものである。
【図６ｃ】組換えＧＫＮ１（ｒＧＫＮ１）またはＧＫＮ１タンパクを含むエクソソーム（Ｅｘｏｓｏｍｅ  ｃａｒｒｙｉｎｇ  ｇａｓｔｒｏｋｉｎｅ  １  Ｐｒｏｔｅｉｎ）を処理した後、ＭＴＴとＢｒｄＵ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙを通じて時間による細胞生存率と細胞増殖能を確認した結果を示すものである。
【図６ｄ】組換えＧＫＮ１をＡＧＳ及びＭＫＮ１細胞に処理（ｒＧＫＮ１＿ｅｘｏｓｏｍｅ）／非処理（ｗ／ｏＧＫＮ１＿ｅｘｏｓｏｍｅ）した後、細胞周期を分析した結果を示すものである。
【図６ｅ】ＨＦＥ−１４５、ＡＧＳ（組換えＧＫＮ１処理／非処理）及びＭＫＮ１（組換えＧＫＮ１処理／非処理）細胞でｐ５３、ｐ２１、ＣＤＫ４、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ、Ｃｄｃ２５ｃ、ｐ−Ｃｄｃ２、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｂ、ＢＡＸ、ＢＣＬ２、Ｃａｓｐａｓｅ−３（ｃｌｅａｖｅｄ含む）及びＣａｓｐａｓｅ−８（ｃｌｅａｖｅｄ含む）の発現変化をウェスタンブロッティングで確認した結果を示すものである。
【図６ｆ】組換えＧＫＮ１が処理／非処理された細胞に由来したＧＫＮ１タンパクを含むエクソソームをＡＧＳ及びＭＫＮ１細胞に処理した後、細胞死滅アッセイを通じて細胞死滅程度を確認した結果を示すものである。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明における用語「診断」とは、病理状態を確認することを意味するもので、本発明の目的上、上記診断はエクソソームのＧＫＮ１タンパク発現水準を確認して胃癌の進行有無を確認することを意味する。
【００３６】
本発明における用語「抗体」とは、当該分野で公知された用語として、抗原性部位に対して指示される特異的なタンパク質分子を意味する。本発明の目的上、抗体は本発明のマーカーであるＧＫＮ１タンパクに特異的に結合する抗体を意味する。これには上記タンパクで作られることができる部分ペプチドも含まれ、本発明の部分ペプチドとしては、最小限７個のアミノ酸、好ましくは９個のアミノ酸、さらに好ましくは１２個以上のアミノ酸を含む。本発明の抗体の形態は特に制限されず、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体または抗原結合性を有するものであればその一部も本発明の抗体に含まれ、全ての免疫グロブリン抗体が含まれる。さらに、本発明の抗体にはヒト化抗体などの特殊抗体も含まれる。このような本発明のＧＫＮ１タンパク質に対する抗体は、当業界の公知された方法で製造可能な全ての抗体を含む。
【００３７】
本発明の胃癌診断キットは、エクソソームのＧＫＮ１タンパクに特異的に結合する抗体を含むことができ、タンパク水準を測定するキットは「タンパク質発現水準の測定」のために使用されるＥＬＩＳＡキットまたはタンパク質チップキットであることができる。
【００３８】
上記抗体を利用したタンパク発現有無の測定は、ＧＫＮ１タンパク及びその抗体間の抗原−抗体複合体を形成することで測定され、多様な方法によって上記複合体の形成量を測定することで定量的に検出することができる。
【００３９】
上記抗原−抗体複合体による測定は、酵素免疫分析法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫分析法（ｒａｄｉｏｉｍｍｎｏａｓｓａｙ、ＲＩＡ）、サンドイッチ測定法（ｓａｎｄｗｉｃｈ  ａｓｓａｙ）、ウェスタンブロッティング、免疫沈降法、免疫組織化学染色法（ｉｍｍｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）、フローサイトメトリー、蛍光活性化細胞分類法（ＦＡＣＳ）、酵素基質発色法及び抗原−抗体凝集法からなるグループより選択されるいずれか一つ以上の方法を利用して行われるものであるが、これに制限されるものではない。
【００４０】
本発明における用語「生物学的試料」とは、具体的にエクソソーム内のＧＫＮ１タンパクを含み、総ＧＫＮ１タンパク発現水準を検出することができる試料を意味し、例として血液、血漿または血清などを含むが、好ましくは血清を意味する。
【００４１】
本発明は、患者から分離した生物学的試料を獲得した後、６０〜８０℃で５〜１５分間熱処理する段階を含むことができる。上記熱処理後、総試料内あるいはエクソソーム内のＧＫＮ１タンパクの発現水準を測定して対照群試料から得た基準値と比べてエクソソームのＧＫＮ１タンパク水準が基準値に比べて低い場合に胃癌であると判断することで胃癌の予測または診断が可能である。
【００４２】
本発明は、ＧＫＮ１タンパク（Ｇａｓｔｒｏｋｉｎｅ  １  Ｐｒｏｔｅｉｎ）を有効成分として含む胃癌の予防または治療用薬学組成物に関するものである。
【００４３】
本発明の用語「予防」とは、本発明による薬学的組成物の投与によって胃癌を抑制させるか発病を遅延させる全ての行為を意味する。
【００４４】
本発明の用語「治療」とは、本発明による薬学組成物の投与によって胃癌による病症が好転するか良く変更する全ての行為を意味する。
【００４５】
本発明による薬学組成物は、薬学的に許容可能な担体を含むことができる。上記薬学的に許容可能な担体は、製剤時に通常利用されるもので、食塩水、滅菌液、リンゲル液、緩衝食塩水、シクロデキストリン、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール、リポソームなどを含むが、これに限定されず、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液などの他の通常の添加剤をさらに含むことができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤、潤滑剤などを付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤として製剤化することができる。適合した薬学的に許容される担体及び製剤化については、レミントンの文献（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ）に開示されている方法を利用して各成分によって好ましく製剤化することができる。本発明の薬学組成物は、剤形に特に制限はないが、注射剤、吸入剤、皮膚外用剤などとして製剤化することができる。
【００４６】
本発明の薬学組成物は、目的の方法によって経口投与するか非経口投与（例えば、静脈内、皮下、皮膚、鼻腔、気道に適用）することができ、投与量は患者の状態及び体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路及び時間によって異なるが、当業者によって適切に選択することができる。
【００４７】
本発明による組成物は、薬学的に有効な量で投与する。本発明において「薬学的に有効な量」は、医学的治療に適用可能な合理的な受益／危険の割合で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効用量水準は、患者の疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出の割合、治療期間、同時に使用される薬物を含む要素及びその他の医学分野によく知られた要素によって決められることができる。本発明による組成物は、個別治療剤で投与するか他の治療剤と併用して投与することができ、従来の治療剤とは順次または同時に投与することができ、単一または多重投与することができる。上記の要素を全て考慮して副作用なく最小限の量で最大の効果が得られる量を投与することが重要であり、これは当業者によって容易に決められることができる。
【００４８】
具体的に、本発明による組成物の有効量は、患者の年齢、性別、体重によって変えることができ、一般的には体重１ｋｇ当たり０．００１〜１５０ｍｇ、好ましくは０．０１〜１００ｍｇを毎日または隔日投与するか、１日１〜３回に分けて投与することができる。しかし、投与経路、肥満の重症度、性別、体重、年齢などによって増減することができるので、上記投与量が如何なる方法でも本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００４９】
以下、本発明を実施例を通じてさらに詳しく説明する。これらの実施例は、本発明をより具体的に説明するためのもので、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５０】
実施例１．実験方法
【００５１】
１．１．ＧＫＮ１が導入された組換えベクターの製造
組換えＧＫＮ１タンパクを製造するために次のように組換えベクターを製造した。先ず、人体ＧＫＮ１  ｃＤＮＡをＰＣＲ方法を利用して増幅させ、ｐＣＭＶ６−ＡＮ−ＦＣ（Ｏｒｉｇｅｎｅ  ＩＤ  ＰＳ１０００５５）ベクターに制限酵素サイトを利用してｐＣＭＶ６−ＡＮ−ＦＣ−ｈＧＫＮ１組換えベクターを製造した。より具体的に、ｐＣＭＶ６−ＡＮ−ＦＣベクターとＧＫＮ１  ｃＤＮＡをＳｇｆＩとＭｌｕＩの制限酵素で処理した後、ｐＣＭＶ６−ＡＮ−ＦＣとｈＧＫＮ１  ｃＤＮＡを連結させて前記ベクターにＧＫＮ１遺伝子を導入させた。以後、大膓菌に形質転換してアガープレート上で生じたコロニーを取った後、これを培養してＤＮＡを抽出した後、シーケンスを行ってＧＫＮＩ遺伝子が正しく導入されたのかを確認した。その後、ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ａｆｆｉｎｉｔｙクロマトグラフィーを利用して組換えＧＫＮ１タンパクを精製した後、これをウェスタンブロット法を利用してＧＫＮ１組換えタンパクを確認した。以後、前記ＧＫＮＩ遺伝子の配列を配列番号１と、これにコーディングされたＧＫＮ１タンパクのアミノ酸配列を配列番号２と示した。
【００５２】
１．２．細胞培養
ＧＫＮ１（Ｇａｓｔｒｏｋｉｎｅ  １）タンパクを発現しないＡＧＳ及びＭＫＮ１胃癌細胞株（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ）とＧＫＮ１を発現するＨＦＥ−１４５不滅化胃上皮細胞株（ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）は、１０％熱−不活性化されたＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地で３７℃、５％ＣＯ2で培養された。また、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞、ＴＨＰ−１単核球及びＵ９３７大食細胞も上記のような条件で培養された。
【００５３】
１．３．ＨｕＰｒｏｔＴＭマイクロアレイ（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）を通じたＧＫＮ１結合タンパクの同定
ＧＫＮ１結合タンパクを同定するために、１９，０００個以上の全−長さ組換えヒトタンパクを含むＨｕｍａｎ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ（ＣＤＩ  Ｌａｂｓ，ＵＳＡ）が使用された。簡単には、タンパクマイクロアレイは、２時間の間Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（５％  ＢＳＡ  ｉｎ  ＰＢＳ  ｗｉｔｈ  ０．０５％  ｔｗｅｅｎ−２０）が処理された後、１μｇのｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  ＧＫＮ１が４℃で８時間の間処理された。以後、マイクロアレイに１μｇのｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ  ６３５ｎｍ）が処理された。結果はＧｅｎｅＰｉｘ  ４１００Ａ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｌａｓｅｒ  Ｓｃａｎｎｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＵＳＡ）で確認した。
【００５４】
１．４．エクソソームの分離（Ｅｘｏｓｏｍｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ）
ＧＫＮ１タンパクがエクソソームに存在するか否かを調査するために、ＡＧＳ及びＭＫＮ１細胞は、組換えＧＫＮ１タンパク（ｒＧＫＮ１，ＡＮＲＴ，Ｄａｅｊｅｏｎ，Ｋｏｒｅａ）で処理された。エクソソームは、ＨＦＥ−１４５、ＡＧＳ及びＭＫＮ１細胞の上層液から分離された。簡単には、ｐａｓｓａｇｅ  ３〜８の細胞がｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ培地で培養され、培地を集める前に４８時間の間１０％ＦＢＳと１％ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを添加して３７℃、５％ＣＯ2で培養された。条件化された培地は、細胞残骸（ｃｅｌｌ  ｄｅｂｒｉｓ）を除去するために４℃で１０分間２０００ｇで遠心分離され、以後０．２２μｍフィルターを通過させた。フィルターされた上層液は、新しいＧｌａｓｓ  ｔｕｂｅに移して氷に置いておいた。以後、新しいＧｌａｓｓ  ｔｕｂｅに２ｍｌの上層液を０．７５ｍｌのＡ／Ｂ／Ｃ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１０１Ｂｉｏ  ｃｏｍｐａｎｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）と混合させ、３０秒間強くボルテックスし、４℃で３０分間引き置いた。混合物は２個の層に分離され、上層は除去され、下層はｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ｔｕｂｅに移して３分間５，０００ｇで遠心分離され、また中間層は新しいｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ｔｕｂｅに移して３分間５，０００ｇで遠心分離した後、蓋を開けて常温で１０分間エアードライさせた。総４倍の体積の１Ｘ  ＰＢＳをｔｕｂｅに加え、強くピペットした。Ｔｕｂｅは、ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ  ｓｈａｋｅｒで高速で１５分間処理した後、５分間５，０００ｇで遠心分離した。上層液はＰｕｒｅＥｘｏ  Ｃｏｌｕｍｎ（１０１Ｂｉｏ  ｃｏｍｐａｎｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）に用心深く移した後、５分間１，０００ｇで遠心分離した。通過液は、ＰＢＳに浮遊された分離したエクソソーム分画を含んでいる。
【００５５】
１．５．エクソソーム標識（Ｅｘｏｓｏｍｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ）
エクソソームは、製造社のプロトコル（若干変形）によってＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）で標識された。簡単には、エクソソームペレットは１ｍｌのＤｉｌｕｅｎｔ  Ｃで浮遊され、別途に１ｍｌのＤｉｌｕｅｎｔ  Ｃは４μｌのＰＫＨ２６で混合させてＳｔａｉｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを作った。エクソソーム懸濁液は、前記ｓｔａｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎを混合して４分間反応させ、標識反応は、同量の１％ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）が加わりながら止まった。標識されたエクソソームは、Ｔｏｔａｌ  Ｅｘｏｓｏｍｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して製造社のプロトコルによって分離された。簡単には、０．５ｖｏｌｕｍｅのＩｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔが標識されたエクソソームに加わって混合された。標識されたエクソソームは一晩中４℃に引き置き、順次に４℃で１時間の間１０，０００ｇで遠心分離された。以後、上層液は捨て、各ペレットは１００μｌのＰＢＳで浮遊された。
【００５６】
１．６．エクソソームでＧＫＮ１タンパクの発現
ＨＦＥ−１４５、ＡＧＳ及びＭＫＮ１細胞の細胞溶解物（ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅ）及びエクソソームにおけるＧＫＮ１の発現は、ウェスタンブロッティングで分析された。同量の細胞溶解物及びエクソソームは、１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥから分離され、Ｈｙｂｏｎｄ−ＰＶＤＦ（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ  ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ）ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移された。０．５％のｓｋｉｍ  ｍｉｌｋでブロッキングした後、メンブレンはａｎｔｉ−ＧＫＮ１（Ａｂｃａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ａｎｔｉ−ＴＳＧ１０１及びａｎｔｉ−ＣＤ８１  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＴＸ，ＵＳＡ）である１次抗体で反応させ、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓで反応させた。タンパクバンドはＷｅｓｔｅｒｎｓｕｒｅ  ＥＣＬ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＥ，ＵＳＡ）で検出され、バンドはＬＡＳ  ４０００（Ｆｕｊｉ  Ｆｉｌｍ，Ｊａｐａｎ）で可視化された。
【００５７】
１．７．共同−免疫沈殿（ｃｏ−ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）
組換えＧＫＮ１（ｒＧＫＮ１）で処理されたＡＧＳ及びＭＫＮ１細胞由来のエクソソームはＰＢＳで洗浄され、上述したように１％のＮＰ−４０、０．５％のｓｏｄｉｕｍ  ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ、０．１％のＳＤＳ、１０ｍＭのＮａＦ、１．０ｍＭのＮａＶＯ４及び１％のｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を含むＰＢＳ（ｐＨ７．２）で４℃で溶解された（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１０；２８５：２０５４７−５７）。上述したように、同量のタンパクアリコート（１．０ｍｇ）は、２．０μｇのＧＫＮ１（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）、ＣＯＭＴ及びＹＷＨＡＺ（Ｇｅｎｅｔｅｘ，ＣＡ，ＵＳＡ）に対する抗体が結合されたＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ／Ｇ−ａｇａｒｏｓｅ（ＳａｎｔａＣｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で免疫沈殿された（ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ．２０１６； ９：９７−１０９）。
【００５８】
１．８．Ｔｒｙｐｓｉｎ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ
ＧＫＮ１タンパクのエクソソーム内の存在有無を確認するために、上述したように、ＨＦＥ−１４５細胞（７μｌのＰＢＳに３５μｇのタンパク質）から分離されたエクソソームは、４℃で３０分間１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００によって脂質膜が分解された（Ｂｌｏｏｄ．２００９；１１３：１９５７−６６）。エクソソームはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００のない同一条件下で培養された。エクソソーム懸濁液は、２つの酵素濃度（１５及び０．０１μｇ／ｍＬ）で３７℃でトリプシンで分解された。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００処置は、トリプシン活性にほとんど影響を与えなかった（ｄａｔａ  ｎｏｔ  ｓｈｏｗｎ）。トリプシンの処理後、サンプルは同量のＬａｅｍｍｌｉ  ｂｕｆｆｅｒで直ちに混合され、３分間沸かした後、ゲルローディングが行われた。
【００５９】
１．９．細胞の生存及び死滅の測定
細胞生存率の分析の場合、ＨＦＥ−１４５細胞と５ｎｇの組換えＧＫＮ１（ｒＧＫＮ１）で処理／非処理されたＡＧＳ及びＭＫＮ１細胞に由来したエクソソームを各細胞に処理した後、２４、４８及び７２時間にＨＦＥ−１４５、ＡＧＳ及びＭＫＮ１細胞でＭＴＴアッセイが行われた。吸光度は５４０ｎｍでｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒを使用して測定され、細胞生存率は非処理された細胞に相対的に表現された。
【００６０】
細胞増殖アッセイの場合、５ｎｇ組換えＧＫＮ１（ｒＧＫＮ１）で処理されたＨＦＥ−１４５、ＡＧＳ及びＭＫＮ１細胞に由来したエクソソームを各細胞に処理した後、ＢｒｄＵ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して２４、４８及び７２時間にＢｒｄＵ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙが製造社のプロトコルによって行われた。吸光度は４５０ｎｍでｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒを使用して測定され、細胞増殖率は非処理された細胞に相対的に表現された。エクソソームのＧＫＮ１タンパクと組換えＧＫＮ１（ｒＧＫＮ１）タンパクの細胞生存率及び細胞増殖に及ぼす効果を比べるために、ＧＫＮ１タンパク（１０ｎｇ／ｍｌ）を含むエクソソームまたは組換えＧＫＮ１（ｒＧＫＮ１）タンパク（１０ｎｇ／ｍｌ）を処理した後、ＡＧＳ及びＭＫＮ１細胞の細胞生存率と細胞増殖能を分析した。
【００６１】
細胞死滅アッセイの場合、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ｂｉｎｄｉｎｇ  Ａｓｓａｙが製造社の指示に従って行われた。Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖは、細胞膜にホスファチジルセリンを持つ細胞に結合し、ＰＩ（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ）は弱化した細胞膜を持つ細胞のＤＮＡを染色する。ＡＧＳ及びＭＫＮ１細胞は、ＧＫＮ１タンパクを含むエクソソームで処理され、冷たいＰＢＳで二回洗浄され、１００μｌの結合バッファで浮遊された。各場合に１００μｌの上層液は４００μｌのブロッキング溶液と混合し、５μｌのＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＦＩＴＣ（１μｇ／ｍｌ）及び５μｌのＰＩ（２μｇ／ｍｌ）が混合液に加わり１５分間程度暗室で反応され、細胞はＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｅｒ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）で分析された。ＰＩ染色されなかった蛍光−陽性細胞だけが死滅された細胞として見なされた。
【００６２】
１．１０．細胞周期の測定
細胞周期の分析の場合、５ｎｇ組換えＧＫＮ１（ｒＧＫＮ１）で処理／非処理されたＡＧＳ細胞から分離したエクソソームをＡＧＳ及びＭＫＮ１細胞に処理した後、前記細胞を集め、分析前に暗室で４５分間ＰＩ（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ）で染色された。細胞周期中に各ｐｈａｓｅにある細胞のパーセントはＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ  ｗｉｔｈ  ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ  ３．０  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して決められた。実験は二回繰り返して行われた。
【００６３】
１．１１．細胞周期調節因子の発現
エクソソームのＧＫＮ１タンパクが細胞周期及び細胞死滅の調節に関与するか否かを決めるために、ＨＦＥ−１４５細胞と組換えＧＫＮ１（ｒＧＫＮ１）が処理されたＡＧＳ及びＭＫＮ１細胞に由来したエクソソームを処理した後、４８時間にＨＦＥ−１４５、ＡＧＳ及びＭＫＮ１細胞でｐ５３、ｐ２１、ＣＤＫ４、ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１、Ｃｄｃ２５、ｐ−Ｃｄｃ２、ＢＡＸ、ＢＣＬ２、Ｃａｓｐａｓｅ−３及び８タンパクの発現変化が分析された。細胞溶解物は、１０％ポリアクリルアミドゲルから分離され、Ｈｙｂｏｎｄ  ＰＶＤＦ  ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）に移された。ブロッキング後、メンブレンは順次にＧ０／Ｇ１ｐｈａｓｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓに対する抗体で標識された。タンパク質バンドは、ＥＣＬ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅａｇｅｎｔｓ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）溶液を使用して確認した。
【００６４】
１．１２．免疫蛍光の研究
Ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ＦＩＴＣ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ＧＫＮ１（Ｇｅｎｅｔｅｘ）、ａｎｔｉ−ｃｌａｔｈｒｉｎ（Ａｂｃａｍ）及びＴｅｘａｓ−ｒｅｄ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙが免疫反応のために使用された。反応の特異性は、Ｎｏｎ−ｉｍｍｕｎｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｓｅｒｕｍ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でテストされた。
【００６５】
１．１３．血清サンプル
胃切除術をする予定である胃癌患者１５０人と健康な志願者１００人で構成された集団で研究が行われた。また、４５人の肝癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）患者と５０人の大膓癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ）患者がそれぞれ対照群として使用された。手術前の癌患者２４５人と、１００人の健康な志願者から全血が採取され、サンプリングした後、血清を分離して即時に−８０℃で保管した。凍結された血清は氷で溶かした後、個々人の血清内の総タンパク濃度差を正規化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）するためにリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で血清内の総タンパクの濃度を１５μｇ／ｍｌで希釈して使用した。ＧＫＮ１タンパクがＨＦＥ−１４５細胞の培養液及びヒトの血清にあるエクソソームタンパクとして存在するか否かを調査するために、サンプルは７０℃で処理されるか処理されなかった。全体培養液、全血清、エクソソームが除去されたサンプル及びエクソソーム分画にあるＧＫＮ１タンパクの濃度は、製造社の指示に従ってＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（ＵＳＣＮ，Ｗｕｈａｎ，Ｃｈｉｎａ）を使用して計算された。告知された同意書がヘルシンキ宣言によって提供され、全ての被験者から書面同意書を受けた。本発明は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｃａｔｈｏｌｉｃ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｋｏｒｅａ，Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＭＣ１６ＳＩＳＩ０１３２）によって承認された。癌患者の誰にも遺伝性癌の証拠はなかった。
【００６６】
１．１４．統計分析
二枝分類法に基づいたマーカーの診断学的有用性を評価するために、ＲＯＣ（ｒｅｃｅｉｖｅｒ  ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）曲線分析が使用された。ＲＯＣ曲線は全ての可能な限界値に評価されるｔｒｕｅ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｆｒａｃｔｉｏｎ対ｆａｌｓｅ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｆｒａｃｔｉｏｎのプロット（ｐｌｏｔ）である。また、細胞生存率及び細胞増殖でＧＫＮ１の効果を分析するためにＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔが使用された。全ての実験は、再現性を証明するために２回以上繰り返して実験した。データは２個の独立した実験から平均±Ｓ．Ｄ．（ｓｔａｎｄａｒｄ  ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）で表現し、Ｐ値が０．０５未満であれば統計的に有意であるとみなした。
【００６７】
実施例２．ＧＫＮ１結合タンパクの同定
【００６８】
本発明者らは、ＧＫＮ１に結合するタンパクを同定するために、タンパクマイクロアレイアッセイを行った。その結果、組換えＧＫＮ１（ｒＧＫＮ１）に普通または強い結合力を持った２７個のエクソソームタンパクが発見された（図１ａ）。エクソソームタンパクに対するＧＫＮ１の結合力を確認するために、本発明者らはＨＦＥ−１４５細胞と組換えＧＫＮ１（ｒＧＫＮ１）を処理したＡＧＳ及びＭＫＮ１細胞でエクソソームタンパクを抽出し、共同−免疫沈殿分析によってエクソソームタンパク中のＧＫＮ１とＣＯＭＴ間の相互作用及びＧＫＮ１とＹＷＨＡＺ間の相互作用を証明した（図１ｂ）。
【００６９】
実施例３．胃細胞株由来のエクソソームでＧＫＮ１タンパクの検出
【００７０】
前記組換えＧＫＮ１（ｒＧＫＮ１）タンパクがエクソソームタンパクに対する結合力があるという事実から、本発明者らは、ＧＫＮ１がエクソソームタンパクで自然的に分泌して内在化されるのかを調査するために、ＨＦＥ−１４５、ＡＧＳ及びＭＫＮ１細胞の培養上層液からエクソソームを分離してＧＫＮ１の存在有無を確認する実験を行った。その結果、ＨＦＥ−１４５細胞由来のエクソソームではＧＫＮ１タンパクが含まれていたが、ＡＧＳ及びＭＫＮ１胃癌細胞株由来のエクソソームではＧＫＮ１タンパクが発現されていないことを確認した（図２ａ）。エクソソームマーカーであるＴＳＧ１０１は、分離されたエクソソーム及び細胞溶解物で確認されたが、ＣＤ８１は、単にエクソソームのみで存在することを確認して、ＣＤ８１を以後実験でエクソソームマーカーとして使用した（図２ａ）。また、組換えＧＫＮ１（ｒＧＫＮ１）タンパクをＡＧＳ及びＭＫＮ１細胞に処理する場合、ＧＫＮ１タンパクの大部分がエクソソームに存在することを確認した（図２ａ）。これと一致するように、ＨＦＥ−１４５細胞における全体培養液、エクソソーム分画及びエクソソームが除去された培地におけるＧＫＮ１タンパクの濃度は、それぞれ１．１３±０．０４、１．０８±０．０７、０．０５±０．０３ｎｇ／ｍｌであった（図２ｂ）。
【００７１】
次に、エクソソーム内のＧＫＮ１タンパクの存在部位を確認するために、トリプシン及びＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の処理／非処理によるＴｒｙｐｓｉｎ  Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙが行われ、以後ウェスタンブロッティングが行われた（Ｂｌｏｏｄ．２００９；１１３：１９５７−６６）。エクソソームにＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００が非処理され、トリプシンのみが処理された場合、ＧＫＮ１はトリプシン依存の酵素分解が起こらなかった。しかし、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及びトリプシンが全て処理された場合、ＧＫＮ１は完全に分解された（図２ｃ）。上記結果からＧＫＮ１タンパクがエクソソーム内部に存在することを確認した。
【００７２】
実施例４．ＧＫＮ１タンパクを含むエクソソームのＣｌａｔｈｒｉｎ依存的内在化
【００７３】
本発明者らは、エクソソームのＧＫＮ１タンパクの内在化にＣｌａｔｈｒｉｎが関連したか否かを確認する実験を行った。ＣａｔｈｒｉｎをノックダウンさせるためにｓｉＲＮＡであるｓｉＣｌａｔｈｒｉｎを使用し、ｓｉＣｌａｔｈｒｉｎ及びＧＫＮ１タンパクを含むエクソソームをＡＧＳ及びＭＫＮ１細胞に処理した後、上記細胞でＧＫＮ１タンパクの発現有無を確認するために免疫蛍光アッセイ及びウェスタンブロッティングを行った。
【００７４】
先ず、ＧＫＮ１タンパクを含むＰＫＨ２６陽性エクソソームをＡＧＳ及びＭＫＮ１細胞に処理した場合、前記エクソソームはＡＧＳ及びＭＫＮ１の細胞質で明確に内在化されていた（図３ａ及び３ｃ）。しかし、ＡＧＳ及びＭＫＮ１細胞でＣｌａｔｈｒｉｎがノックダウンされた場合は、細胞膜と細胞質におけるＰＫＨ２６−陽性エクソソームの存在が確実に抑制された（図３ｂ及び３ｃ）。また、ｓｉＣｌａｔｈｒｉｎによるＣｌａｔｈｒｉｎのサイレンシングは、細胞膜と細胞質でＧＫＮ１タンパク発現を顕著に抑制させたことを確認した（図３ｄ）。
【００７５】
従って、Ｃｌａｔｈｒｉｎは、ＧＫＮ１タンパクを含むエクソソームを上記粘膜上皮細胞に付着させて内在化させるのに重要な役割をしていることを確認した。
【００７６】
実施例５．血清ＧＫＮ１タンパク濃度による胃癌の診断
【００７７】
ＧＫＮ１タンパクがエクソソームタンパクとして培地及びヒト血清に存在するか否かを確認するために、ＨＦＥ−１４５細胞の培養液及びヒト血清を７０℃で１０分間処理した後、ＥＬＩＳＡ  ａｓｓａｙでＧＫＮ１タンパクの濃度を測定した。その結果、ＨＦＥ−１４５細胞で熱処理されていない場合（Ｎｏｎ−ｈｅａｔｉｎｇ）、ＧＫＮ１タンパクが全体培地、エクソソーム及びエクソソームが除去された培地で確認されず、一方、７０℃で１０分間熱処理した場合（ｈｅａｔｉｎｇ）は、全体培地、エクソソーム及びエクソソームが除去された培地（ｓｏｌｕｂｌｅ）でＧＫＮ１タンパクの濃度がそれぞれ１．１３±０．０６、１．０８±０．１及び０．０５±０．０４ｎｇ／ｍｌと確認された（図４ａ）。これと一致して、ＧＫＮ１タンパクは熱処理されていない全体血清、エクソソーム及びエクソソームが除去された血清で確認されなかった（図４ｂ）。１０人の健康な被験者の中で、熱処理された全体血清及びエクソソームにおけるＧＫＮ１タンパクの発現濃度は、それぞれ６．５３±０．５８ｎｇ／ｍｌ及び６．２４±０．５５ｎｇ／ｍｌであった（図４ｂ）。また、１０人の胃癌患者において、全体血清及びエクソソームにおけるＧＫＮ１タンパクの発現濃度は、それぞれ３．５８±０．５４ｎｇ／ｍｌ及び３．２８±０．８２ｎｇ／ｍｌであったが（図４ｂ）、これは、血清ＧＫＮ１タンパクの大部分がエクソソーム内に存在することを意味する。上記結果によって、本発明者らは、１００人の健康な被験者及び２４５人の胃癌、大膓癌及び肝癌患者における全体血清を得た後、７０℃で１０分間熱処理した後、ＧＫＮ１濃度を分析した。
【００７８】
図４ｃに示すように、正常健康人で血清ＧＫＮ１タンパクの水準は年齢と関連がある傾向を示したが、統計的有意性はなかった（Ｐ＝０．３３８）。また、血清ＧＫＮ１水準において男女間の差異は見えなかった（Ｐ＝０．０７４）。興味深いことに、萎縮性胃炎のある者と腸上皮化生（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｍｅｔａｐｌａｓｉａ、ＩＭ）が伴った萎縮性胃炎のある者は、胃炎のない被験者より低い血清ＧＫＮ１濃度を示したが、胃癌を持った患者よりは顕著に高かった（図４ｄ）。
【００７９】
１００人の健康な被験者及び１５０人の胃癌患者の全体血清にあるＧＫＮ１濃度は、それぞれ６．３５±０．８２ｎｇ／ｍｌ及び３．５０±０．５７ｎｇ／ｍｌであり（図４ｅ）、これにより、胃癌患者における血清ＧＫＮ１タンパク水準が健康な被験者の水準に比べて顕著に低いことを確認した（Ｐ＜０．０００１）。さらに、肝癌及び大膓癌患者における血清ＧＫＮ１濃度は、それぞれ６．０７±０．９２及び６．２６±０．９５ｎｇ／ｍｌであり、これは健康な被験者の水準と類似し、胃癌患者に比べて顕著に高い水準であった（図４ｅ）。特に、ＲＯＣ曲線のａｒｅａ値がそれぞれ１．０、１．０及び０．９９６４と確認されることで、血清ＧＫＮ１タンパクの濃度によって健康な被験者、萎縮性胃炎のある者、腸上皮化生（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｍｅｔａｐｌａｓｉａ、ＩＭ）が伴った萎縮性胃炎のある者と胃癌患者を区別することができることを確認した（図４ｆ）。また、本発明者らが血清ＧＫＮ１水準によって胃癌患者と肝癌及び大膓癌患者を区別できることを確認するために、ＲＯＣ曲線値を測定し、ＲＯＣ曲線でａｒｅａはそれぞれ０．９９３８及び０．９９８７であり、全体血清におけるＧＫＮ１タンパク濃度によって胃癌を予測及び診断できることを確認した（図４ｇ）。
【００８０】
胃癌は、癌細胞の胃壁浸潤程度によって早期胃癌と進行性胃癌に区分される。本研究で早期胃癌患者血清におけるＧＫＮ１濃度は３．７５±０．４７ｎｇ／ｍｌであり、進行性胃癌患者の血清ＧＫＮ１濃度である３．３８±０．５８ｎｇ／ｍｌより高かったが（Ｐ＜０．００１）（図４ｈ）、腸上皮化生（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｍｅｔａｐｌａｓｉａ、ＩＭ）が伴った萎縮性胃炎のある者の血清ＧＫＮ１濃度よりは低かった（Ｐ＜０．００１）（図４ｈ）。ＲＯＣ曲線のａｒｅａ値がいずれも１．０と確認されることで、血清ＧＫＮ１タンパクの濃度によって健康な被験者、萎縮性胃炎のある者、腸上皮化生（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｍｅｔａｐｌａｓｉａ、ＩＭ）が伴った萎縮性胃炎のある者と早期胃癌患者を区別できることを確認した（図４ｉ）。
【００８１】
上記結果から、本発明者らは、ヒト血清にあるエクソソームＧＫＮ１タンパクが胃癌の診断のための有用なバイオマーカーとして使用可能なことを確認した。
【００８２】
実施例６．エクソソーム内のＧＫＮ１タンパクの血球細胞に対する細胞毒性
【００８３】
胃上皮細胞で生産分泌されて腫瘍形成抑制機能を持ったＧＫＮ１タンパクが血清で確認されたという証拠に基づいて、本発明者らは、ＧＫＮ１タンパクを含むエクソソームが血液内のリンパ球、単核球及び大食細胞の細胞生存率と機能に影響を及ぼすか否かを調査した。興味深いことに、免疫蛍光アッセイ結果でＨＦＥ−１４５細胞由来のＧＫＮ１タンパクを含むエクソソームは、ＴＨＰ−１タンパク球及びＵ９３７大食細胞の細胞膜に付いたが、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞には付かず（図５ａ）、ウェスタンブロッティングでエクソソームＧＫＮ１タンパクは、ＴＨＰ−１タンパク球及びＵ９３７大食細胞の細胞膜部分のみに存在することを確認した（図５ｂ）。また、エクソソームＧＫＮ１タンパクは、ＴＨＰ−１タンパク球及びＵ９３７大食細胞の細胞生存率及びＩＬ−６を含むサイトカインの分泌に何らの影響も及ぼさなかった（図５ｃ及び５ｄ）。上記結果から、本発明者らは、エクソソームＧＫＮ１タンパクはリンパ球、単核球及び大食細胞に対して細胞毒性がないことを確認した。
【００８４】
実施例７．細胞増殖及び細胞死滅の測定
【００８５】
本発明者らは、エクソソームのＧＫＮ１タンパクによる細胞生存率及び増殖に対する効果を確認するために、ＭＴＴ  ａｓｓａｙ及びＢｒｄＵ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙを行った。ＨＦＥ−１４５、ＡＧＳ（組換えＧＫＮ１処理／非処理）及びＭＫＮ１（組換えＧＫＮ１処理／非処理）細胞に由来したエクソソームをそれぞれＨＦＥ−１４５、ＡＧＳ及びＭＫＮ１細胞に処理し、細胞生存率及び細胞増殖能を実験した。
【００８６】
その結果、ＡＧＳ及びＭＫＮ１細胞に由来したＧＫＮ１陰性エクソソーム（組換えＧＫＮ１が非処理された群）を処理した場合は細胞生存率が確実に増加したが、ＨＦＥ−１４５、ＡＧＳ及びＭＫＮ１細胞に由来したＧＫＮ１タンパクを含むエクソソーム（組換えＧＫＮ１が処理された群）がＡＧＳ及びＭＫＮ１細胞で細胞生存率及び細胞増殖能を顕著に抑制することを確認した（図６ａ及び６ｂ）。
【００８７】
次に、本発明者らは、エクソソームのＧＫＮ１タンパク及び組換えＧＫＮ１（ｒＧＫＮ１）タンパクを処理した後、時間によるＡＧＳ及びＭＫＮ１細胞の細胞生存率を比べる実験を行った。その結果、上記細胞でエクソソームのＧＫＮ１タンパクと組換えＧＫＮ１（ｒＧＫＮ１）タンパクを処理すると、時間依存的に細胞生存率と細胞増殖能が抑制されることを確認し、特に、エクソソームのＧＫＮ１タンパクを処理した場合、組換えＧＫＮ１（ｒＧＫＮ１）タンパクを処理した細胞でより細胞生存率と細胞増殖能が急激に減少することを確認した（図６ｃ）。
【００８８】
また、本発明者らは、組換えＧＫＮ１（ｒＧＫＮ１）タンパクをＡＧＳ及びＭＫＮ１細胞に処理（ｒＧＫＮ１＿ｅｘｏｓｏｍｅ）／非処理（ｗ／ｏＧＫＮ１＿ｅｘｏｓｏｍｅ）した後、細胞周期を分析する実験を行った。その結果、ＡＧＳ及びＭＫＮ１細胞に組換えＧＫＮ１（ｒＧＫＮ１）を処置後、分離したＧＫＮ１タンパクを含むエクソソーム（ＧＫＮ−陽性エクソソーム）を処理した場合、ＡＧＳ及びＭＫＮ１細胞のいずれもＳ  ｐｈａｓｅにある細胞群は顕著に減少し、Ｇ１及びＧ２／Ｍ  ｐｈａｓｅの細胞群は増加したことを確認した（図６ｄ）。
【００８９】
また、本発明者らは、エクソソームのＧＫＮ１タンパクによるＧ１またはＧ２／Ｍ  ｐｈａｓｅ  ａｒｒｅｓｔに影響を与える細胞周期調節因子の発現有無を確認する実験を行った。その結果、エクソソームのＧＫＮ１タンパクは、Ｇ１  ｐｈａｓｅ  ａｒｒｅｓｔのためにｐ５３及びｐ２１のような陽性細胞周期調節因子の発現を増加させ、ｃｄｋ４及びｃｙｃｌｉｎ  Ｄのような陽性細胞周期調節因子の発現を減少させたことを確認した（図６ｅ）。また、Ｇ２／Ｍ  ｐｈａｓｅ  ａｒｒｅｓｔのために、エクソソームのＧＫＮ１タンパクはＨＦＥ−１４５、ＡＧＳ及びＭＫＮ１細胞でｐ−ｃｄｃ２、ｃｄｃ２５ｃ及びｃｙｃｌｉｎ  Ｂタンパクの発現を下向調節したことを確認した（図６ｅ）。
【００９０】
次に、本発明者らは、組換えＧＫＮ１が処理／非処理された細胞に由来したＧＫＮ１タンパクを含むエクソソームをＡＧＳ及びＭＫＮ１細胞に処理した後、細胞死滅アッセイを行った。細胞死滅は、ＦＩＴＣ−ｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖによって染色された細胞によって測定されたが、組換えＧＫＮ１（ｒＧＫＮ１）が処理されたＡＧＳ細胞に由来したＧＫＮ１タンパクを含むエクソソームの投与によりＡＧＳ及びＭＫＮ１細胞で細胞死滅が顕著に増加したことを確認した（図６ｆ）。ウェスタンブロッティングの結果ではｃｌｅａｖｅｄ  ｃａｓｐａｓｅ−３及び−８の発現量が確実に増加した一方、ＢＡＸ及びＢＣＬ２発現には変化がなかったことを確認した（図６ｅ）。
【００９１】
従って、エクソソームのＧＫＮ１タンパクは胃癌細胞で内在化され、細胞質タンパクと相互作用して細胞の増殖を抑制し、細胞死滅を誘導して胃癌を治療することができ、血球細胞には細胞毒性がないことを確認した。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図４ｅ】
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【図４ｆ】
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【図４ｇ】
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【図４ｈ】
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【図４ｉ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図５ｄ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図６ｄ】
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【図６ｅ】
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【図６ｆ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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