(57)【要約】  本発明は、抗菌性接着タンパク質、抗菌性ナノ粒子、それを含む抗菌組成物及びその製造方法に関し、より詳細には、ムール貝の接着タンパク質に抗生ペプチドが連結される抗菌性接着タンパク質、上記抗菌性接着タンパク質内のチロシン残基がカテコール誘導体に修正された（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）ムール貝の接着タンパク質の誘導体、及び上記ムール貝の接着タンパク質の誘導体と配位結合可能な金属を含み、内在した抗菌性を有する、抗菌性ナノ粒子、それを含む抗菌組成物及びその製造方法に関する。
2020526570.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ムール貝の接着タンパク質に抗生ペプチドが連結されている、抗菌性接着タンパク質。
【請求項２】
前記ムール貝の接着タンパク質は、Ｍｅｆｐ（Ｍｙｔｉｌｕｓ  ｅｄｕｌｉｓ  ｆｏｏｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）−１、Ｍｅｆｐ−２、Ｍｅｆｐ−３、Ｍｅｆｐ−４、Ｍｅｆｐ−５、Ｍｇｆｐ（Ｍｙｔｉｌｕｓ  ｇａｌｌｏｐｒｏｖｉｎｃｉａｌｉｓ  ｆｏｏｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）−１、Ｍｇｆｐ−２、Ｍｇｆｐ−３、Ｍｇｆｐ−４、Ｍｇｆｐ−５、Ｍｃｆｐ（Ｍｙｔｉｌｕｓ  ｃｏｒｕｓｃｕｓ  ｆｏｏｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）−１、Ｍｃｆｐ−２、Ｍｃｆｐ−３、Ｍｃｆｐ−４、Ｍｃｆｐ−５、ｆｐ（ｆｏｏｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）−１、ｆｐ−２、ｆｐ−３、ｆｐ−４、ｆｐ−５、及びｆｐ−６からなる群より選択されたタンパク質、前記タンパク質の変異体、または前記群より選択された１種以上のタンパク質が連結されている融合タンパク質である、請求項１に記載の抗菌性接着タンパク質。
【請求項３】
前記抗生ペプチドは、Ａ７ペプチド、Ｔｅｔ−２０ペプチド、ｍｉｎＴＢＰペプチド、及びＭＰ１９６ペプチドからなる群より選択される少なくとも一つのペプチドである、請求項１に記載の抗菌性接着タンパク質。
【請求項４】
請求項１の抗菌性接着タンパク質内のチロシン残基がカテコール誘導体で修正された（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）ムール貝の接着タンパク質の誘導体、及び前記ムール貝の接着タンパク質の誘導体と配位結合可能な金属を含み、内在した抗菌性を有する、抗菌性ナノ粒子。
【請求項５】
前記カテコール誘導体は、ドーパ（３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ、ＤＯＰＡ）、ドーパキノン（Ｄｏｐａ  ｏ−ｑｕｉｎｏｎｅ）、ドーパミン（ｄｏｐａｍｉｎｅ）、ノレピネプリン（ｎｏｒｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ）、エピネフリン（ｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎ）、エピガロカテキン（ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ）、及びこれらの誘導体からなる群より選択された１種以上である、請求項４に記載の抗菌性ナノ粒子。
【請求項６】
前記配位結合可能な金属は、チタン（ｔｉｔａｎｉｕｍ）、バナジウム（ｖａｎａｄｉｕｍ）、クロム（ｃｈｒｏｍｅ）、マンガン（ｍａｎｇａｎｅｓｅ）、鉄、コバルト（ｃｏｂａｌｔ）、ニッケル（ｎｉｃｋｅｌ）、ジルコニウム（ｚｉｒｃｏｎｉｕｍ）、ニオブ（ｎｉｏｂｉｕｍ）、モリブデン（ｍｏｌｙｂｄｅｎｕｍ）、テクネチウム（ｔｅｃｈｎｅｔｉｕｍ）、ルテニウム（ｒｕｔｈｅｎｉｕｍ）、ロジウム、パラジウム（ｐａｌｌａｄｉｕｍ）、銀、ハフニウム（ｈａｆｎｉｕｍ）、タンタル（ｔａｎｔａｌｕｍ）、タングステン（ｔｕｎｇｓｔｅｎ）、レニウム（ｒｈｅｎｉｕｍ）、オスミウム（ｏｓｍｉｕｍ）、イリジウム（ｉｒｉｄｉｕｍ）、白金、及び金からなる群より選択された１種以上である、請求項４に記載の抗菌性ナノ粒子。
【請求項７】
抗菌剤がさらに積載されている、請求項４に記載の抗菌性ナノ粒子。
【請求項８】
前記抗菌剤は、ペニシリン系（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎｓ）、セファロスポリン系（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎｓ）、ベータラクタム系（β−ｌａｃｔａｍｓ）、マクロライド系（ｍａｃｒｏｌｉｄｅｓ）、グリコペプチド系（ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅｓ）、リンコサミド系（ｌｉｎｃｏｓａｍｉｄｅｓ）、キノロン系（ｑｕｉｎｏｌｏｎｅｓ）、リファマイシン、クロラムフェニコール、ポリマイシン、トリメトロプリム、ストレプトグラミン、オキサゾリジノン、ゲンタマイシン、及びバシトラシンからなる群より選択された１種以上である、請求項７に記載の抗菌性ナノ粒子。
【請求項９】
細菌の感染環境であるｐＨ０．１〜ｐＨ６．５の条件下で抗菌効果を発現する、請求項４に記載の抗菌性ナノ粒子。
【請求項１０】
請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の抗菌性接着タンパク質内のチロシン残基がカテコール誘導体で修正された（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）ムール貝の接着タンパク質の誘導体を水とエタノールの混合溶媒に溶解する段階と、
前記ムール貝の接着タンパク質の誘導体と配位結合可能な金属の塩を追加して放射溶液を製造する段階と、
前記放射溶液を電気放射する段階と、
を含む、内在した抗菌性を有する、抗菌性ナノ粒子の製造方法。
【請求項１１】
前記混合溶媒は、水とエタノールが２０：８０〜４０：６０の重量比で混合される、請求項１０に記載の抗菌性ナノ粒子の製造方法。
【請求項１２】
前記金属の塩は、金属イオンとカテコール誘導体のモル比が１：３〜１：４になるように追加される、請求項１０に記載の抗菌性ナノ粒子の製造方法。
【請求項１３】
前記金属は、チタン（ｔｉｔａｎｉｕｍ）、バナジウム（ｖａｎａｄｉｕｍ）、クロム（ｃｈｒｏｍｅ）、マンガン（ｍａｎｇａｎｅｓｅ）、鉄、コバルト（ｃｏｂａｌｔ）、ニッケル（ｎｉｃｋｅｌ）、ジルコニウム（ｚｉｒｃｏｎｉｕｍ）、ニオブ（ｎｉｏｂｉｕｍ）、モリブデン（ｍｏｌｙｂｄｅｎｕｍ）、テクネチウム（ｔｅｃｈｎｅｔｉｕｍ）、ルテニウム（ｒｕｔｈｅｎｉｕｍ）、ロジウム、パラジウム（ｐａｌｌａｄｉｕｍ）、銀、ハフニウム（ｈａｆｎｉｕｍ）、タンタル（ｔａｎｔａｌｕｍ）、タングステン（ｔｕｎｇｓｔｅｎ）、レニウム（ｒｈｅｎｉｕｍ）、オスミウム（ｏｓｍｉｕｍ）、イリジウム（ｉｒｉｄｉｕｍ）、白金、及び金からなる群より選択された１種以上である、請求項１０に記載の抗菌性ナノ粒子の製造方法。
【請求項１４】
請求項４から請求項９のいずれか一項に記載の抗菌性ナノ粒子を含む、抗菌組成物。
【請求項１５】
前記抗菌性ナノ粒子は１．０μｇ／ｍｌ〜２μｇ／ｍｌで含まれる、請求項１４に記載の抗菌組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗菌性接着タンパク質、それを用いた抗菌性ナノ粒子、それを含む抗菌組成物及びその製造方法に関し、より詳細には、タンパク質自体が接着性及び抗菌性をともに示すタンパク質、それを含む抗菌組成物、ならびにそれを用いた抗菌性ナノ粒子及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌は、外科手術機材や体内植込み型医療機器などの表面に付着してバイオフィルム（ｂｉｏｆｉｌｍ）を形成し、この過程で宿主に対する免疫反応や抗菌物質に対する抵抗性を獲得するようになる。この場合、患者の治療の失敗、治療期間の延長、合併症誘発などという様々な問題を引き起こすことがある。そこで、外科的手術中の感染を介したバイオフィルムの形成を防止するために、様々な抗菌剤及び抗菌戦略が開発されてきたが、抗菌剤に対する耐性の増加、周囲の組織への毒性、抗菌剤の限時性などという様々な問題点が浮上している。
【０００３】
人体に感染する病原菌のうち特定の菌株は、宿主細胞内に寄生して宿主の代謝活動を支配しながら継続的に増殖する。結核菌、腸チフス菌、クラミジア菌、リステリア菌などが代表的な細胞内生菌（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｂａｃｔｅｒｉａ）であり、一般的に細胞外生菌（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｂａｃｔｅｒｉａ）として知られている大腸菌やブドウ球菌なども宿主細胞に侵入し、宿主細胞内に寄生する能力を有することが明らかになっている。かかる細胞内生菌の感染を阻害するために、細胞の内部まで抗菌剤が拡散または内包作用によって到達するようにする必要があるが、現存する抗菌剤のうち３分の２以上は、細胞内生菌に効果を奏することができないという限界がある。
【０００４】
抗生ペプチド（または抗菌ペプチド、ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ、ＡＭＰ）とは、自然に存在する生命体が有する先天的免疫システムの一部として生成されるアミノ酸の鎖のことであり、一般に、細菌、ウイルス、真菌類に対する抗生活性を示す。特に、抗生ペプチドは、細菌の細胞膜を崩壊したり、または孔を形成して細胞内の物質が失われるようにして、細菌細胞内の物質と反応し、細菌の核酸またはタンパク質合成を阻害するなどという様々な機作で幅広い細菌に対する抗菌活性を有することから、次世代の抗菌剤として脚光を浴びている。
【０００５】
一方、海洋生命体であるムール貝（ｍｕｓｓｅｌ）は、接着タンパク質（ａｄｈｅｓｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）を生産及び分泌することにより、ムール貝自体を海の中の岩のような濡れた固体表面にしっかりと付着させることができ、波の衝撃や海水の浮力効果による影響を受けない。ムール貝の接着タンパク質は、強力な自然の接着剤として知られており、化学合成接着剤と比較したとき、大部分のエポキシ樹脂よりも約２倍程度の高い引張強度を示しながらも、曲がることができる柔軟性を有する。また、ムール貝の接着タンパク質は、プラスチック、ガラス、金属、テフロン（登録商標）や生体物質などという様々な表面に接着することができる能力を有しているため、これまで化学接着剤の開発において未完の課題として残っている濡れた表面での接着も数分内で可能である。
【０００６】
しかし、ムール貝から自然抽出した接着物質１グラムを得るためには、約一万匹のムール貝を必要とするため、ムール貝の接着タンパク質の物性が非常に優れているにもかかわらず、自然抽出したムール貝の接着タンパク質を産業的に利用するには多くの制約を伴う。１つの代替案として、遺伝子組換え技術を用いたムール貝の接着タンパク質の大量生産に関する研究がＭｅｆｐ（Ｍｙｔｉｌｕｓ  ｅｄｕｌｉｓ  ｆｏｏｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）−１、Ｍｇｆｐ（Ｍｙｔｉｌｕｓ  ｇａｌｌｏｐｒｏｖｉｎｃｉａｌｉｓ  ｆｏｏｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）−１、Ｍｃｆｐ（Ｍｙｔｉｌｕｓ  ｃｏｒｕｓｃｕｓ  ｆｏｏｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）−１、Ｍｅｆｐ−２、Ｍｅｆｐ−３、Ｍｇｆｐ−３、及びＭｇｆｐ−５などで行われている。
【０００７】
一方、ナノ粒子は、食細胞作用（ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）または飲細胞作用（ｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）経路を介して動物細胞内に侵入することができる特性を有することから、細胞内感染を阻害するための戦略として注目されてきた。よって、温度やｐＨなどのような外部刺激感応型素材をベースに、ナノ粒子に抗菌剤を担持し、抗菌剤の安定性向上及び選択的な抗菌放出についての研究が報告されてきた。しかし、かかる大部分の研究では、ナノ粒子に担持された抗菌剤によって抗菌効果が示され、ナノ粒子自体が抗菌性を有する物質についての報告はされたことがない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＫＲ１０−２０１４−０００２２４４
【特許文献２】ＷＯ０６１０７１８３  Ａ
【特許文献３】ＷＯ０５０９２９２０  Ａ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の一目的は、自体が抗菌性を有する抗菌性接着タンパク質を提供することである。
【００１０】
本発明の他の目的は、内在した抗菌性を有する抗菌性ナノ粒子を提供することである。
【００１１】
本発明のさらに他の目的は、内在した抗菌性を有する、抗菌性ナノ粒子の製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の一側面によると、ムール貝の接着タンパク質に抗生ペプチドが連結された抗菌性接着タンパク質が提供される。
【００１３】
上記ムール貝の接着タンパク質は、Ｍｅｆｐ（Ｍｙｔｉｌｕｓ  ｅｄｕｌｉｓ  ｆｏｏｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）−１、Ｍｅｆｐ−２、Ｍｅｆｐ−３、Ｍｅｆｐ−４、Ｍｅｆｐ−５、Ｍｇｆｐ（Ｍｙｔｉｌｕｓ  ｇａｌｌｏｐｒｏｖｉｎｃｉａｌｉｓ  ｆｏｏｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）−１、Ｍｇｆｐ−２、Ｍｇｆｐ−３、Ｍｇｆｐ−４、Ｍｇｆｐ−５、Ｍｃｆｐ（Ｍｙｔｉｌｕｓ  ｃｏｒｕｓｃｕｓ  ｆｏｏｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）−１、Ｍｃｆｐ−２、Ｍｃｆｐ−３、Ｍｃｆｐ−４、Ｍｃｆｐ−５、ｆｐ（ｆｏｏｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）−１、ｆｐ−２、ｆｐ−３、ｆｐ−４、ｆｐ−５、及びｆｐ−６からなる群より選択されたタンパク質、上記タンパク質の変異体、または上記群より選択された１種以上のタンパク質が連結される融合タンパク質であることが好ましい。
【００１４】
上記抗生ペプチドは、Ａ７ペプチド、Ｔｅｔ−２０ペプチド、ｍｉｎＴＢＰペプチド、及びＭＰ１９６ペプチドからなる群より選択される少なくとも一つのペプチドであることが好ましい。
【００１５】
本発明の他の側面によると、上記本発明の抗菌性接着タンパク質内のチロシン残基がカテコール誘導体で修正された（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）ムール貝の接着タンパク質の誘導体、及び上記ムール貝の接着タンパク質の誘導体と配位結合可能な金属を含み、内在した抗菌性を有する抗菌性ナノ粒子が提供される。
【００１６】
上記カテコール誘導体は、ドーパ（３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ、ＤＯＰＡ）、ドーパキノン（Ｄｏｐａ  ｏ−ｑｕｉｎｏｎｅ）、ドーパミン（ｄｏｐａｍｉｎｅ）、ノルエピネフリン（ｎｏｒｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ）、エピネフリン（ｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎ）、エピガロカテキン（ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ）、及びこれらの誘導体からなる群より選択された１種以上であることが好ましい。
【００１７】
上記配位結合可能な金属は、チタン（ｔｉｔａｎｉｕｍ）、バナジウム（ｖａｎａｄｉｕｍ）、クロム（ｃｈｒｏｍｅ）、マンガン（ｍａｎｇａｎｅｓｅ）、鉄、コバルト（ｃｏｂａｌｔ）、ニッケル（ｎｉｃｋｅｌ）、ジルコニウム（ｚｉｒｃｏｎｉｕｍ）、ニオブ（ｎｉｏｂｉｕｍ）、モリブデン（ｍｏｌｙｂｄｅｎｕｍ）、テクネチウム（ｔｅｃｈｎｅｔｉｕｍ）、ルテニウム（ｒｕｔｈｅｎｉｕｍ）、ロジウム、パラジウム（ｐａｌｌａｄｉｕｍ）、銀、ハフニウム（ｈａｆｎｉｕｍ）、タンタル（ｔａｎｔａｌｕｍ）、タングステン（ｔｕｎｇｓｔｅｎ）、レニウム（ｒｈｅｎｉｕｍ）、オスミウム（ｏｓｍｉｕｍ）、イリジウム（ｉｒｉｄｉｕｍ）、白金、及び金からなる群より選択された１種以上であることが好ましい。
【００１８】
上記抗菌性ナノ粒子は、抗菌剤がさらに積載されたものであることが好ましい。
【００１９】
上記抗菌剤は、ペニシリン系（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎｓ）、セファロスポリン系（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎｓ）、ベータラクタム系（β−ｌａｃｔａｍｓ）、マクロライド系（ｍａｃｒｏｌｉｄｅｓ）、グリコペプチド系（ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅｓ）、リンコサミド系（ｌｉｎｃｏｓａｍｉｄｅｓ）、キノロン系（ｑｕｉｎｏｌｏｎｅｓ）、リファマイシン、クロラムフェニコール、ポリマイシン、トリメトロプリム、ストレプトグラミン、オキサゾリジノン、ゲンタマイシン、及びバシトラシンからなる群より選択された１種以上であることが好ましい。
【００２０】
細菌の感染環境であるｐＨ０．１〜ｐＨ６．５の条件下で抗菌効果を発現することができる。
【００２１】
本発明のさらに他の側面によると、上記本発明の抗菌性接着タンパク質内のチロシン残基がカテコール誘導体で修正された（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）ムール貝の接着タンパク質の誘導体を水とエタノールの混合溶媒に溶解する段階と、上記ムール貝の接着タンパク質の誘導体と配位結合可能な金属の塩を追加して放射溶液を製造する段階と、上記放射溶液を電気放射する段階と、を含む、内在した抗菌性を有する、抗菌性ナノ粒子の製造方法が提供される。
【００２２】
上記混合溶媒は、水とエタノールが２０：８０〜４０：６０の重量比で混合されることが好ましい。
【００２３】
上記金属の塩は、金属イオンとカテコール誘導体のモル比が１：３〜１：４になるように追加されることが好ましい。
【００２４】
上記金属は、チタン（ｔｉｔａｎｉｕｍ）、バナジウム（ｖａｎａｄｉｕｍ）、クロム（ｃｈｒｏｍｅ）、マンガン（ｍａｎｇａｎｅｓｅ）、鉄、コバルト（ｃｏｂａｌｔ）、ニッケル（ｎｉｃｋｅｌ）、ジルコニウム（ｚｉｒｃｏｎｉｕｍ）、ニオブ（ｎｉｏｂｉｕｍ）、モリブデン（ｍｏｌｙｂｄｅｎｕｍ）、テクネチウム（ｔｅｃｈｎｅｔｉｕｍ）、ルテニウム（ｒｕｔｈｅｎｉｕｍ）、ロジウム、パラジウム（ｐａｌｌａｄｉｕｍ）、銀、ハフニウム（ｈａｆｎｉｕｍ）、タンタル（ｔａｎｔａｌｕｍ）、タングステン（ｔｕｎｇｓｔｅｎ）、レニウム（ｒｈｅｎｉｕｍ）、オスミウム（ｏｓｍｉｕｍ）、イリジウム（ｉｒｉｄｉｕｍ）、白金、及び金からなる群より選択された１種以上であることが好ましい。
【００２５】
本発明のさらに他の側面によると、上記本発明の抗菌性ナノ粒子を含む抗菌組成物が提供される。
【００２６】
上記抗菌性ナノ粒子は１．０μｇ／ｍｌ〜２μｇ／ｍｌの濃度で含まれることが好ましい。
【発明の効果】
【００２７】
本発明は、抗生ペプチドがムール貝の接着タンパク質に内在するようにすることにより、抗菌効果を示す生体接着材料として用いることができ、ムール貝の接着タンパク質の優れた接着力を用いることで、表面材質に関係なく様々な表面にコーティングすることができるとともに、ナノ粒子の形で製造することにより細胞内感染を効率的に防止することができる。特に、本発明による抗菌性ナノ粒子は、細胞内感染に活用される際に、感染した動物細胞には非活性状態として影響を与えず、細菌、すなわち、動物細胞内の感染した内生菌を死滅させる内在的抗菌性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明の抗菌性接着タンパク質ＭＡＰ−ｃＡＭＰがコーティングされた表面において、抗生ペプチドの作用により細菌細胞膜を崩壊して抗菌効果を発現する様相を示す模式図である。
【図２】ＭＡＰ−ｃＡＭＰ融合タンパク質の発現を確認したＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示すものである。
【図３】ＭＡＰ−ｃＡＭＰ融合タンパク質の溶液内の電荷を確認した結果を示すグラフである。ここで、対照群として、ペプチドを融合しないＭＡＰを適用した。
【図４】ＭＡＰ−ｃＡＭＰ融合タンパク質のコーティング濃度による抗菌効果を分析するためのディスク拡散試験（ｄｉｓｋ  ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ｔｅｓｔ）の結果を示すものである。
【図５】上記図４の抗菌活性分析の結果から阻害面積を図式化したグラフである。
【図６】コーティング濃度を異ならせたＭＡＰ−ｃＡＭＰ融合タンパク質のコーティング表面を大腸菌が培養される液体培地に適用した後、２４時間後の光学密度（ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ）の値を示すグラフである。
【図７】抗菌性接着タンパク質ＭＡＰ−ｃＡＭＰを用いて製造したナノ粒子の感染環境における抗菌効果の活性化に関する模式図である。
【図８】ＭＡＰ−ｃＡＭＰ融合タンパク質と対照群ＭＡＰタンパク質のナノ粒子相及びタンパク質溶液相の電荷を確認した結果を示すものである。
【図９】抗菌性ナノ粒子ＭＡＰ−ｃＡＭＰ−ＮＰｓのＳＥＭ観察結果及び粒子サイズ分布についての結果を示すグラフである。
【図１０】ゲンタマイシンを搭載した抗菌性ナノ粒子（ＭＡＰ−ｃＡＭＰ＠ＧＥＮＴ）−ＮＰｓのＳＥＭ観察結果及び粒子サイズ分布についての結果を示すグラフである。
【図１１】抗菌性ナノ粒子ＭＡＰ−ｃＡＭＰ−ＮＰｓの中性環境（ｐＨ７．４）及び酸性環境（ｐＨ４．０）における溶液内の電荷を確認した結果を示すグラフである。
【図１２】抗菌性ナノ粒子ＭＡＰ−ｃＡＭＰ−ＮＰｓの中性環境（ｐＨ７．４）及び酸性環境（ｐＨ４．０）におけるＳＥＭ観察結果を示すグラフである。
【図１３】濃度を異ならせた抗菌性ナノ粒子ＭＡＰ−ｃＡＭＰ−ＮＰｓを大腸菌が培養される液体培地に適用した後、１２時間及び２４時間後の光学密度（ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ）の値を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下、添付の図面を参照して、本発明の好ましい実施形態を説明する。しかし、本発明の実施形態は、いくつかの他の形態に変形することができ、本発明の範囲が以下説明する実施形態に限定されるものではない。
【００３０】
本発明によると、抗菌性接着タンパク質、抗菌性ナノ粒子、及びその製造方法が提供される。
【００３１】
本発明によって提供される抗菌性接着タンパク質は、タンパク質自体が抗菌性を有し、ムール貝の接着タンパク質に抗生ペプチドが連結されたものである。
【００３２】
本発明において、ムール貝の接着タンパク質は、ＫＲ１０−２０１４−０００２２４４、ＷＯ２００６／１０７１８３  Ａ、及びＷＯ２００５／０９２９２０  Ａなどに開示されたものを用いることができ、具体的な製造過程は、国際特許公開ＷＯ２００６／１０７１８３及びＷＯ２００５／０９２９２０に示すように行われることができる。
【００３３】
このとき、適用されることができるムール貝の接着タンパク質は、ムール貝から由来した接着タンパク質であって、好ましくは、ヨーロッパイガイ（Ｍｙｔｉｌｕｓ  ｅｄｕｌｉｓ）、ムラサキイガイ（Ｍｙｔｉｌｕｓ  ｇａｌｌｏｐｒｏｖｉｎｃｉａｌｉｓ）、イガイ（Ｍｙｔｉｌｕｓ  ｃｏｒｕｓｃｕｓ  ）に由来したムール貝の接着タンパク質またはその変異体を含むが、これに制限されない。
【００３４】
上記ムール貝の接着タンパク質は、上記ムール貝種からそれぞれ由来したＭｅｆｐ（Ｍｙｔｉｌｕｓ  ｅｄｕｌｉｓ  ｆｏｏｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）−１、Ｍｅｆｐ−２、Ｍｅｆｐ−３、Ｍｅｆｐ−４、Ｍｅｆｐ−５、Ｍｇｆｐ（Ｍｙｔｉｌｕｓ  ｇａｌｌｏｐｒｏｖｉｎｃｉａｌｉｓ  ｆｏｏｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）−１、Ｍｇｆｐ−２、Ｍｇｆｐ−３、Ｍｇｆｐ−４、Ｍｇｆｐ−５、Ｍｃｆｐ（Ｍｙｔｉｌｕｓ  ｃｏｒｕｓｃｕｓ  ｆｏｏｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）−１、Ｍｃｆｐ−２、Ｍｃｆｐ−３、Ｍｃｆｐ−４、及びＭｃｆｐ−５、またはその変異体を含むことができ、好ましくは、ｆｐ（ｆｏｏｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）−１、ｆｐ−２、ｆｐ−３、ｆｐ−４、ｆｐ−５、及びｆｐ−６からなる群より選択されたタンパク質、または上記群から選択された１種以上のタンパク質が連結される融合タンパク質、または上記タンパク質の変異体を含むが、これに制限されない。
【００３５】
また、本発明のムール貝の接着タンパク質は、上記ＷＯ２００６／１０７１８３及びＷＯ２００５／０９２９２０に記載されたすべてのムール貝の接着タンパク質を含む。好ましくは、上記ムール貝の接着タンパク質は、ｆｐ−１５１やｆｐ−１３１、ｆｐ−３５３、ｆｐ−１５３、ｆｐ−３５１などの融合タンパク質を含むことができるが、これらに制限されない。また、本発明のムール貝の接着タンパク質は、ｆｐ−１において８０回程度繰り返されるデカペプチドが１〜１２回、またはそれ以上連結されたポリペプチドを含むことができる。好ましくは、上記序列番号２のデカペプチドが１２回連続して連結されたｆｐ−１変異（ｖａｒｉａｎｔ）ポリペプチドであってもよいが、これに制限されない。
【００３６】
本発明者らは、前回の研究で、ｆｐ−１において１０個の繰り返しアミノ酸が６回繰り返された構造を、ｆｐ−５におけるＮ−末端及びＣ−末端に遺伝子レベルで連結させた新しい形のムール貝の接着タンパク質ｆｐ−１５１を開発し、上記組換えムール貝の接着タンパク質を大腸菌で発現させることに成功し、大量生産が可能で、単純な分離精製過程を経て産業利用の可能性が非常に高いことを確認した（ＷＯ２００６／１０７１８３及びＷＯ２００５／０９２９２０）。
【００３７】
例えば、上記ムール貝の接着タンパク質は、Ｍｅｆｐ（Ｍｙｔｉｌｕｓ  ｅｄｕｌｉｓ  ｆｏｏｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）−１、Ｍｅｆｐ−２、Ｍｅｆｐ−３、Ｍｅｆｐ−４、Ｍｅｆｐ−５、Ｍｇｆｐ（Ｍｙｔｉｌｕｓ  ｇａｌｌｏｐｒｏｖｉｎｃｉａｌｉｓ  ｆｏｏｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）−１、Ｍｇｆｐ−２、Ｍｇｆｐ−３、Ｍｇｆｐ−４、Ｍｇｆｐ−５、Ｍｃｆｐ（Ｍｙｔｉｌｕｓ  ｃｏｒｕｓｃｕｓ  ｆｏｏｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）−１、Ｍｃｆｐ−２、Ｍｃｆｐ−３、Ｍｃｆｐ−４、Ｍｃｆｐ−５、ｆｐ（ｆｏｏｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）−１、ｆｐ−２、ｆｐ−３、ｆｐ−４、ｆｐ−５、及びｆｐ−６からなる群より選択されたタンパク質、上記タンパク質の変異体、または上記群より選択された１種以上のタンパク質が連結される融合タンパク質であることができる。
【００３８】
一方、本発明に用いられることができる上記抗生ペプチドは、下記表１に開示されているように、Ａ７ペプチド、Ｔｅｔ−２０ペプチド、ｍｉｎＴＢＰペプチド、ＭＰ１９６ペプチド、ＰＴＰ７ペプチド、テンポリン（Ｔｅｍｐｏｒｉｎ）１ＣＥａからなる群より選択される少なくとも一つのペプチドであることができるが、これらに制限されるものではない。
【００３９】
例えば、上記抗生ペプチドは、序列番号１６のアミノ酸序列からなるものであってもよい。
【００４０】
【表１】
2020526570.tif 000003
【００４１】
本発明によると、内在した抗菌性を有する、抗菌性ナノ粒子が提供される。このとき、上記抗菌性ナノ粒子は、抗菌性接着タンパク質内のチロシン残基がカテコール誘導体で修正された（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）ムール貝の接着タンパク質の誘導体、及び上記ムール貝の接着タンパク質の誘導体と配位結合可能な金属を含む。
【００４２】
本発明において、抗菌活性とは、微生物または菌株の生長を抑制する抗生効果、及び存在する微生物または菌株を除去する除菌効果を示すものすべてを含むことができる。
【００４３】
一方、本発明において、ムール貝の接着タンパク質内のチロシン残基がカテコール誘導体で修正された（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）ムール貝の接着タンパク質を「修正ムール貝の接着タンパク質」または「ムール貝の接着タンパク質の誘導体」と呼ぶ。ここで、その修正方法は特に制限されない。
【００４４】
上記カテコール誘導体は、ジヒドロキシ基を含む化合物であって、金属との配位結合が可能である。具体的には、上記カテコール誘導体は、ドーパ（３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ、ＤＯＰＡ）、ドーパキノン（Ｄｏｐａ  ｏ−ｑｕｉｎｏｎｅ）、ドーパミン（ｄｏｐａｍｉｎｅ）、ノレピネプリン（ｎｏｒｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ）、エピネフリン（ｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎ）、エピガロカテキン（ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ）、及びこれらの誘導体からなる群より選択された１種以上であることが好ましい。
【００４５】
例えば、上記カテコール誘導体は、全チロシン残基の１０〜１００％がカテコール誘導体、特にＤＯＰＡで修正されたものであってもよい。
【００４６】
上記配位結合可能な金属は、カテコール誘導体と配位結合が可能な任意の金属であって、典型金属または遷移金属であることができる。例えば、上記金属は、チタン（ｔｉｔａｎｉｕｍ）、バナジウム（ｖａｎａｄｉｕｍ）、クロム（ｃｈｒｏｍｅ）、マンガン（ｍａｎｇａｎｅｓｅ）、鉄、コバルト（ｃｏｂａｌｔ）、ニッケル（ｎｉｃｋｅｌ）、ジルコニウム（ｚｉｒｃｏｎｉｕｍ）、ニオブ（ｎｉｏｂｉｕｍ）、モリブデン（ｍｏｌｙｂｄｅｎｕｍ）、テクネチウム（ｔｅｃｈｎｅｔｉｕｍ）、ルテニウム（ｒｕｔｈｅｎｉｕｍ）、ロジウム、パラジウム（ｐａｌｌａｄｉｕｍ）、銀、ハフニウム（ｈａｆｎｉｕｍ）、タンタル（ｔａｎｔａｌｕｍ）、タングステン（ｔｕｎｇｓｔｅｎ）、レニウム（ｒｈｅｎｉｕｍ）、オスミウム（ｏｓｍｉｕｍ）、イリジウム（ｉｒｉｄｉｕｍ）、白金、及び金からなる群より選択された１種以上であることができ、鉄（ＩＩＩ）であることが好ましい。
【００４７】
このとき、用いられることができる金属の塩は、例えば、塩化鉄（ＩＩ）（ＦｅＣｌ２）、塩化鉄（ＩＩＩ）（ＦｅＣｌ３）、四塩化チタン（ＴｉＣｌ４）、塩化チタン（ＩＩＩ）（ＴｉＣｌ３）、塩化コバルト（ＩＩＩ）（ＣｏＣｌ３）、塩化コバルト（ＩＩ）（ＣｏＣｌ２）、塩化ニッケル（ＮｉＣｌ２）、塩化銀（ＡｇＣｌ）などであってもよいが、これらに制限されるものではない。
【００４８】
上記カテコール誘導体及び金属は、配位結合して金属−カテコール誘導体の複合体を形成することができる。好ましくは、上記金属−カテコール誘導体の複合体は、Ｆｅ（ＩＩＩ）−ドーパ複合体であることができる。本発明の一実施例によると、ドーパ及びＦｅ（ＩＩＩ）は、配位結合を介して架橋を形成する。ここで、ドーパ及びＦｅ（ＩＩＩ）は、体内に既に存在している物質であるため、生体適合性に優れるという長所がある。
【００４９】
上記ドーパは、Ｆｅ（ＩＩＩ）金属と反応してｐＨに応じてモノ−、ビス−、トリス−結合すると知られている。また、それぞれの結合様相に応じて、Ｆｅ（ＩＩＩ）−ドーパ結合の固有の色を示すと知られている。本発明の一実施例によると、Ｆｅ（ＩＩＩ）金属を提供するために、Ｆｅ（ＩＩＩ）を含む試薬、すなわち、ＦｅＣｌ３を用いることができ、好ましくは、Ｆｅ（ＩＩＩ）：ドーパの分子比が１：３のモル（ｍｏｌａｒ）比、またはＦｅ（ＩＩＩ）の割合がこれよりも少なくなるようにＦｅＣｌ３溶液を添加することができる。
【００５０】
さらに、本発明の抗菌性ナノ粒子は、抗菌剤がさらに積載されたものであってもよく、例えば、抗菌剤薬物を担持し、多重薬剤（ｍｕｌｔｉ−ｄｒｕｇ）の形でも応用することができる。上記抗菌剤薬物は、ペニシリン、メチシリン、オキサシリン、ナフシリン、アンピシリン、カルボキシペニシリン、アモキシシリン、ピペラシリンなどのペニシリン系（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎｓ）；セファロスポリン、セファゾリン、セフタジジム、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフタジジムなどのセファロスポリン系（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎｓ）；カルバペネム、メロペネム、スルバクタム、クラブラン酸、タゾバクタムなどのその他のベータラクタム系（β−ｌａｃｔａｍｓ）；ストレプトマイシン、ネオマイシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、アミカシン、シソマイシン、アストロマイシン、イセパマイシン、アルベカシンなどのアミノグリコシド系（ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ）；エリスロマイシン、クラリスロマイシンなどのマクロライド系（ｍａｃｒｏｌｉｄｅｓ）；テトラサイクリン、メタサイクリン、ミノサイクリン、チゲサイクリン、ドキシサイクリンなどのテトラサイクリン系（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅｓ）；バンコマイシン、テイコプラニンなどのグリコペプチド系（ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅｓ）；リンコマイシン、クリンダマイシンなどのリンコサミド系（ｌｉｎｃｏｓａｍｉｄｅｓ）；ナリジクス酸、オキソリニン酸、フルオロキノロン、シプロフロキサシン、ノルフロキサシン、レボフロキサシンなどのキノロン系（ｑｕｉｎｏｌｏｎｅｓ）；リファマイシン、クロラムフェニコール、ポリマイシン、トリメトロプリム、ストレプトグラミン、オキサゾリジノン、バシトラシン、及びこれらの混合物であることができるが、これらに制限されない。
【００５１】
例えば、上記抗菌剤は、ペニシリン系（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎｓ）、セファロスポリン系（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎｓ）、ベータラクタム系（β−ｌａｃｔａｍｓ）、マクロライド系（ｍａｃｒｏｌｉｄｅｓ）、グリコペプチド系（ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅｓ）、リンコサミド系（ｌｉｎｃｏｓａｍｉｄｅｓ）、キノロン系（ｑｕｉｎｏｌｏｎｅｓ）、リファマイシン、クロラムフェニコール、ポリマイシン、トリメトロプリム、ストレプトグラミン、オキサゾリジノン、ゲンタマイシン、及びバシトラシンからなる群より選択された１種以上であることが好ましい。
【００５２】
本発明の抗菌性ナノ粒子は、内在的抗菌性を有するものであって、特に酸性条件、すなわち、ｐＨ０．１〜ｐＨ６．５、好ましくはｐＨ０．１〜ｐＨ５、例えば、ｐＨ４．０〜５．０の条件下では、ナノ粒子の形が溶解しながら（ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ）抗菌性を発現することができる。
【００５３】
すなわち、上記ナノ粒子は、ｐＨ７．４の体液内ではナノ粒子の形を十分に維持して安定性を示すのに対し、細菌に感染し、結果として、代謝産物である酢酸及び乳酸を生成することで造成された酸性環境（ｐＨ＝〜６．５）では、ナノ粒子の形が溶解し、本来抗菌性接着タンパク質が本来有する正電荷を誘導することができる。
【００５４】
したがって、本発明による抗菌性接着タンパク質ＭＡＰ−ｃＡＭＰベースのナノ粒子は、非活性化した形で適用されて存在し、抗菌活性が要求される時点で分解（ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ）されて抗菌性を発現することができる技術を確立することができる。これにより、特に細胞内感染で感染した宿主動物細胞には影響を与えることなく、細胞内部の感染菌を死滅させるために活用されることができる。
【００５５】
上記ナノ粒子のサイズは、平均直径８０〜１３０ｎｍの範囲であることができ、好ましくは１１０ｎｍであることができる。かかるサイズは、上記ナノ粒子の標的細胞への移動に適する。尚、人体に投入される際には、注射、経口、皮膚などの様々な方法を介して伝達されることができる。積載された薬物は、治療に効果的な疾患状態または症状のある人、またはその他の哺乳動物に好適に注射または他の方法で伝達されることができるが、特に非経口の方法で伝達されることが好ましい。
【００５６】
非経口とは、筋肉内、腹膜内、腹部内、皮下、静脈、及び動脈内を意味する。そのため、本発明のナノ粒子は、代表的に注射剤形で製剤されることができる。
【００５７】
本発明の注射可能なナノ粒子は、任意の適切な方法、好ましくは、皮下針を介して注射によって人や他の哺乳動物の体内に注射または挿入することができる。例えば、注射またはその他の方法で動脈内、静脈内、尿生殖、皮下筋肉内、皮下、頭蓋内、心臓膜内、胸膜内、またはその他の体腔、または可能な空間内に投与されることができる。または、カテーテルまたはシリンジを介して、例えば、関節鏡手術中に、関節内、尿生殖管内、脈管内、口蓋内、胸膜内、または身体内の任意の体腔または可能な空間内に、手術、外科、診断、またはインターベンション中に導入することができる。
【００５８】
上記ナノ粒子は、結核、肝炎、腸チフス、食中毒、コレラ、赤痢などの感染症疾患に用いられることができるが、これらに制限されるものではない。
【００５９】
さらに、本発明によると、上述のような内在した抗菌性を有する、抗菌性ナノ粒子の製造方法が提供される。
【００６０】
本発明の抗菌性ナノ粒子の製造方法は、本発明の抗菌性接着タンパク質内のチロシン残基がカテコール誘導体で修正された（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）ムール貝の接着タンパク質の誘導体を水とエタノールの混合溶媒に溶解する段階と、上記ムール貝の接着タンパク質の誘導体と配位結合可能な金属の塩を追加して放射溶液を製造する段階と、上記放射溶液を電気放射する段階と、を含む。
【００６１】
電気放射工程は、高分子溶液または溶融した高分子を所定の電圧に荷電させる際に発生する電気的引力及び斥力を用いてナノ粒子を形成させる技術である。電気放射工程により、数ｎｍ〜数千ｎｍのサイズの様々な直径を有するナノ粒子を製造することができ、装備の構造が簡単であり、且つ幅広い材料への適用が可能である。
【００６２】
有機溶媒の代わりに水ベースの溶媒を用いることにより、電気放射中に残っている溶媒の毒性効果を排除することができる。上記水ベースの溶媒は、蒸発性を向上させるために、有機溶媒をさらに混合することができ、好ましくは、蒸留水に対して６０〜８０％（ｖ／ｖ）のエタノールをさらに混合することができる。
【００６３】
このとき、上記溶媒は、有機溶媒の代わりに水ベースの溶媒を用いることにより、電気放射中に残っている溶媒の毒性効果を排除することができる。上記水ベースの溶媒には、蒸発性を向上させるために、有機溶媒をさらに混合することができ、好ましくは、蒸留水に対して６０〜８０％（ｖ／ｖ）のエタノールをさらに混合することができる。すなわち、上記混合溶媒は、水とエタノールが２０：８０〜４０：６０の重量比で混合されることが好ましく、３０：７０の重量比で混合されることがより好ましい。
【００６４】
一方、上記金属の塩は、金属イオンとカテコール誘導体のモル比が１：３〜１：４になるように追加されることが好ましい。上記金属は、チタン（ｔｉｔａｎｉｕｍ）、バナジウム（ｖａｎａｄｉｕｍ）、クロム（ｃｈｒｏｍｅ）、マンガン（ｍａｎｇａｎｅｓｅ）、鉄、コバルト（ｃｏｂａｌｔ）、ニッケル（ｎｉｃｋｅｌ）、ジルコニウム（ｚｉｒｃｏｎｉｕｍ）、ニオブ（ｎｉｏｂｉｕｍ）、モリブデン（ｍｏｌｙｂｄｅｎｕｍ）、テクネチウム（ｔｅｃｈｎｅｔｉｕｍ）、ルテニウム（ｒｕｔｈｅｎｉｕｍ）、ロジウム（ｒｈｏｄｉｕｍ）、パラジウム（ｐａｌｌａｄｉｕｍ）、銀、ハフニウム（ｈａｆｎｉｕｍ）、タンタル（ｔａｎｔａｌｕｍ）、タングステン（ｔｕｎｇｓｔｅｎ）、レニウム（ｒｈｅｎｉｕｍ）、オスミウム（ｏｓｍｉｕｍ）、イリジウム（ｉｒｉｄｉｕｍ）、白金、及び金からなる群より選択された１種以上であることができる。
【００６５】
このように製造された放射溶液を電気放射する段階は、特に制限されるものではないが、例えば、上記放射溶液をシリンジポンプを用いて０．５〜２ｍｌ／ｈの速度で送り出しながら０．１〜０．８ｍｍの直径を有する針を通過させる際に、６〜１４ｋＶの高電圧をかけながらナノ粒子を生成させる方法で行うことができる。このように生成されたナノ粒子は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．４）などを含む攪拌水槽またはアルミホイル上に回収することができる。
【００６６】
さらに、本発明によると、上述のような内在した抗菌性を有する抗菌性ナノ粒子を含む抗菌組成物が提供される。
【００６７】
上記抗菌性ナノ粒子は、１．０μｇ／ｍｌ〜２μｇ／ｍｌの濃度、好ましくは１．０〜１．５μｇ／ｍｌの濃度で含まれることが好ましい。上記抗菌性ナノ粒子の濃度が１．０μｇ／ｍｌの未満の場合には、抗菌活性が不十分な問題があり、２μｇ／ｍｌを超えると、濃度増加に対する効果の差が大きくなく、工程上経済の面から好ましくない。
【００６８】
本発明の抗菌性ナノ粒子及び抗菌組成物が微生物または菌株の生長を抑制する抗生効果、及び存在する微生物または菌株を除去する除菌効果を示すことができる菌株は、特に制限されるものではないが、例えば、大腸菌などを含むものであってもよい。
【実施例】
【００６９】
以下、具体的な実施例を介して本発明をより具体的に説明する。下記実施例は、本発明の理解を助けるための例示に過ぎず、本発明の範囲がこれに限定されるものではない。
【００７０】
実施例
１．抗菌性接着タンパク質ＭＡＰ−ｃＡＭＰの製造
先ず、１２回繰り返し連結されたデカペプチド（ＡＫＰＳＹＰＰＴＹＫ）で構成されたムール貝の接着タンパク質ｆｐ−１（Ｍｙｔｉｌｕｓ  ｍｕｓｓｅｌ  ｆｏｏｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｙｐｅ  １）変異体を公知の手順に従って準備した（参照：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２０１０年，１０７，１２８５０−３）。
【００７１】
上記のように製造されたムール貝の接着タンパク質ｆｐ−１に抗菌ペプチドインドリシジン（Ｉｎｄｏｌｉｃｉｄｉｎ）から由来した類似ペプチドＡ７ペプチド（Ｎａｎ，ＹＨ，Ｂａｎｇ，Ｊ−Ｋ，Ｓｈｉｎ，ＳＹ，２００９．Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ３０：８３２−８３８）に対する序列のプライマー（下記表２）を製作し、重合酵素連鎖反応を用いて連結した。
【００７２】
【表２】
2020526570.tif 000004
【００７３】
その結果物であるＭＡＰ−ｃＡＭＰ遺伝子を、Ｔ７プロモーターが含まれるｐＥＴ−２２ｂ（＋）ベクターをプラスミド運搬体として用いて、大腸菌ＴＯＰ１０菌株に形質転換した。また、融合タンパク質の発現のために、クローニングされた組換えベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株に再び形質転換した。
【００７４】
ＭＡＰ−ｃＡＭＰ遺伝子に形質転換された大腸菌菌株を（ＢＬ２１）５０μｇ／ｍｌのアンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）を含むＬＢ液体培地で３７℃、３００ｒｐｍの条件で培養し、６００ｎｍに対する光学密度（ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ；ＯＤ６００）が０．４〜０．６のレベルに達したとき、１ｍＭのイソプロピル-β-Ｄ−チオガラクトピラノシド（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ））を添加して同一の条件で８時間培養した。このように培養された細胞は、４℃、１８，０００＞ｇの条件で１０分間遠心分離し、溶出バッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、及び１００ｍＭのｓｏｄｉｕｍｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ｐＨ８）に再浮遊させて２００Ｋｐｓｉの条件で細胞破砕を行った。
【００７５】
これにより得られた細胞溶解物（ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅ）から細胞破壊物（ｃｅｌｌ  ｄｅｂｒｉｓ）を得るために、４℃、１８，０００＞ｇの条件で２０分間遠心分離し、２５％（ｖ／ｖ）の酢酸を用いて目的融合タンパク質を抽出し、最終的に精製された融合タンパク質は、凍結乾燥を経た後、−８０℃で保管した。
【００７６】
タンパク質に対する生産及び精製は、１２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析し、融合タンパク質が正常に発現されることを確認した（図２参照）。タンパク質の濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ  ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて測定した。生産された融合タンパク質ＭＡＰ−ｃＡＭＰは、対照群タンパク質であるＭＡＰに比べてｐＨ７．４溶液相で高い正電荷を示した（図３参照）。
【００７７】
２．抗菌表面コーティング剤でコーティングされた表面の抗菌効果を確認
上記１．で製造した抗菌性接着タンパク質ＭＡＰ−ｃＡＭＰの抗菌活性を確認するために、上記タンパク質をそれぞれ０、５、１０、２０ｍｇ／ｍｌの濃度で蒸留水に溶解した後、ポリスチレン製のカバースリップが覆われるように、一定量適用し、１時間３７℃で乾燥してコーティングした。このように準備されたＭＡＰ−ｃＡＭＰコーティング表面を細菌が接種された固体及び液体培地にそれぞれ適用し、抗菌効果を確認した。このとき、コーティングされていない物質を陰性対照群として用いた。
【００７８】
（１）固体培地での抗菌効果を確認
遅延期（ｌｏｇ  ｐｈａｓｅ）のグラム陰性菌である大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）が塗抹されている寒天平板培地（ａｇａｒ  ｐｌａｔｅ  ｍｅｄｉｕｍ）上に、上述のように、ＭＡＰ−ｃＡＭＰがそれぞれ０、５、１０、２０ｍｇ／ｍｌでコーティングされた表面を３７℃で１日間培養した。
【００７９】
抗菌効果は、グラフィックプログラム（ＩｍａｇｅＪ）を用いて阻害面積（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ａｒｅａ）を測定して分析した。その結果、ＭＡＰ−ｃＡＭＰがコーティングされたすべての表面では細菌成長阻害を示し、コーティング濃度が高くなるほど、広い阻害面積を示すことを確認した（図４及び図５参照）。
【００８０】
（２）液体培地での抗菌効果を確認
上記（１）で用いた各ポリスチレン製のカバースリップを遅延期状態のグラム陰性菌である大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）５μｌが接種された５００μｌのＬＢ液体培地に適用した後、２４時間培養して、６００ｎｍに対する光学密度（ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ；ＯＤ６００）を測定した。細菌菌株の培養は、４８ウェルカルチャープレート（４８−ｗｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｐｌａｔｅ）を用いて、３７℃、３００ｒｐｍの条件で行った。
【００８１】
その結果、大腸菌の生長を９０％阻害するためのＭＡＰ−ｃＡＭＰの最小コーティング濃度（ｍｉｎｉｍｕｍ  ｃｏａｔｉｎｇ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）は２０ｍｇ／ｍｌであり、５０％阻害のための最小コーティング濃度は５ｍｇ／ｍｌであることが分かった（図６参照）。
【００８２】
３．融合タンパク質ＭＡＰ−ｃＡＭＰを用いた抗菌性ナノ粒子の製造
（１）ドーパ（ＤＯＰＡ）変換された融合タンパク質ｍＭＡＰ−ｃＡＭＰの準備
上記１．で準備された融合タンパク質ＭＡＰ−ｃＡＭＰに対してチロシナーゼ（ｍｕｓｈｒｏｏｍ  ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）酵素を用いた試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）酵素反応を行い、上記ＭＡＰ−ｃＡＭＰのチロシン残基をＤＯＰＡ（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）に変換した。具体的には、１．５０ｍｇ／ｍｌのＭＡＰ−ｃＡＭＰ溶液及び１００μｇ／ｍＬのチロシナーゼをバッファ溶液（１００ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのホウ酸、２５ｍＭのアスコルビン酸、ｐＨ６．８）で１時間反応させた後、１％の酢酸溶液を用いて透析した。
【００８３】
（２）抗菌性ナノ粒子の製造
上記（１）で製造されたｍＭＡＰ−ｃＡＭＰを用いてナノ粒子を製造するために、電気放射技術を用いた。具体的には、蒸留水：エタノール（３０：７０）溶媒に１．５〜３ｗｔ％のｍＭＡＰ−ｃＡＭＰを溶解し、ＦｅＣｌ３溶液を加えてＦｅ３＋：ＤＯＰＡが１：３のモル（ｍｏｌａｒ）比になるように製作した後、上記混合溶液を電気放射した。電気放射は、上記溶液をシリンジポンプを用いて１ｍｌ／ｈの速度で送り出しながら、０．４ｍｍの直径を有する針を通過させる際に、６〜１４ｋＶの高電圧をかけてナノ粒子を生成させる方法で行った。その後、生成されたナノ粒子をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．４）を含む攪拌水槽またはアルミホイル上に回収した。ＭＡＰ−ｃＡＭＰは、従来溶液相に比べてナノ粒子になって正電荷が減少し、対照群であるＭＡＰのナノ粒子が示す電荷様相と同様のレベルの表面電位を示した（図８参照）。
【００８４】
したがって、本発明による抗菌性接着タンパク質ＭＡＰ−ｃＡＭＰベースのナノ粒子は、非活性化した形で適用されて存在し、抗菌活性が要求される時点で分解（ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ）されて抗菌性を発現することができる技術を確立することができる。これにより、特に細胞内感染で感染した宿主動物細胞には影響を与えることなく、細胞内部の感染菌を死滅させるために活用されることができる。
【００８５】
（３）ゲンタマイシン積載の抗菌性ナノ粒子の製造
ゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ、ＧＥＮＴ）積載のＦｅ（ＩＩＩ）−ドーパ（ＤＯＰＡ）ナノ粒子を製造するために、上記混合溶液にＧＥＮＴ溶液を加えた後、上記混合溶液をＰＢＳに直接電気放射した。その後、ＭＷＣＯ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｃｕｔ  ｏｆｆ）３５００膜を用いてＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対する透析を３回行うことで、積載されていないＧＥＮＴを除去することにより、紫の純粋なＧＥＮＴ積載のＦｅ（ＩＩＩ）−ドーパ（ＤＯＰＡ）複合体ナノ粒子を得た。
【００８６】
ＤＬＳ分析の結果、ＭＡＰ−ｃＡＭＰ−ＮＰは〜９０ｎｍ、（ＭＡＰ−ｃＡＭＰ＠ＧＥＮＴ）−ＮＰは〜１３５ｎｍの平均直径を有することが分かった（図９及び図１０参照）。
【００８７】
４．抗菌性ナノ粒子の抗菌効果を確認
（１）抗菌性ナノ粒子のｐＨ条件に応じた抗菌効果を確認
上記３．（２）で得られた抗菌性ナノ粒子（ＭＡＰ−ｃＡＭＰ−ＮＰ）のｐＨに応じた抗菌性の発現有無を確認するために、グラム陰性菌である大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）５μｌが接種された５００μｌのＬＢ液体培地に適用した後、２４時間培養して、６００ｎｍに対する光学密度（ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ；ＯＤ６００）を測定した。細菌菌株の培養は、４８ウェルカルチャープレート（４８−ｗｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｐｌａｔｅ）を用いて、３７℃、３００ｒｐｍの条件で行った。
【００８８】
その結果、上記抗菌性ナノ粒子ＭＡＰ−ｃＡＭＰ−ＮＰは、中性環境であるｐＨ７．４溶液に比べて酸性環境であるｐＨ４．０溶液相で高い正電荷を示すことが確認できた（図１１参照）。これは、ナノ粒子となって減少したナノ粒子の正電荷が細菌感染環境などのような酸性環境で溶解され、従来の正電荷を回復するものと解釈することができる。さらに、ＳＥＭ観察の結果、上記抗菌性ナノ粒子ＭＡＰ−ｃＡＭＰ−ＮＰは、酸性環境で従来のナノ粒子の形を奪われて瓦解される様相を示すことが確認できた（図１２参照）。
【００８９】
（２）抗菌性ナノ粒子の細菌感染環境における抗菌効果を確認
上記３．（２）で得られた抗菌性ナノ粒子（ＭＡＰ−ｃＡＭＰ−ＮＰ）の抗菌活性を確認するために、上記ナノ粒子をそれぞれ０、０．２５、０．５、１、１．５、２μｇ／ｍｌの濃度で、細菌が接種された液体培地にそれぞれ適用して抗菌効果を確認した。
【００９０】
具体的には、本実験では、遅延期状態のグラム陰性菌である大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）５μｌ（約５×１０５ＣＦＵ）が接種された５００μｌのＬＢ液体培地に、上記各濃度のナノ粒子を適用した後、１２時間及び２４時間の間培養し、６００ｎｍの光学密度（ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ；ＯＤ６００）を測定した。細菌菌株の培養は、４８ウェルカルチャープレートを用いて、３７℃、３００ｒｐｍの条件で行った。
【００９１】
その結果、大腸菌の生長を９０％阻害するための抗菌性ナノ粒子（ＭＡＰ−ｃＡＭＰ−ＮＰ）の最小阻害濃度（ｍｉｎｉｍｕｍ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ、ＭＩＣ９０）は１．５μｇ／ｍｌであり、５０％阻害のための最小阻害濃度（ＭＩＣ５０）は１．０μｇ／ｍｌであることを確認した（図１３参照）。
【００９２】
以上、本発明の実施例について詳細に説明したが、本発明の範囲はこれに限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載された本発明の技術的思想を外れない範囲内で様々な修正及び変形が可能であることは、当技術分野における通常の知識を有する者には自明である。
【図１】
2020526570.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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