(57)【要約】  本発明は、タイプＩＩＩポリケチド合成酵素をコードする遺伝子がゲノムに挿入されているか、それを含む組換えベクターが導入されている、マロニル−ＣｏＡ検出用の組換え微生物；前記組換え微生物を用いたマロニル−ＣｏＡ生産誘導物質のスクリーニング方法、マロニル−ＣｏＡ生産能の増加に関与する遺伝子のスクリーニング方法；および前記方法により選別された遺伝子を微生物でノックダウン（Ｋｎｏｃｋ−ｄｏｗｎ）して微生物のマロニル−ＣｏＡ生産量を増加させ、それに基づいてマロニル−ＣｏＡを前駆体とし前記微生物内の有用物質を生産する方法に関する。本発明によるバイオセンサーを活用する場合、単一ステップのシグナル発生、種々の微生物における活用性、自体蛍光を呈する微生物における活用性、および簡単な構築方法を提供するとともに、簡単なスクリーニング方法を提供する。また、本発明を高速スクリーニングと組み合わせると、増産されたマロニル−ＣｏＡ生産能を有する菌株を非常に容易に且つ迅速に（〜３日）選別することができ、これを、直ちにマロニル−ＣｏＡベースの有用化合物生産菌株に適用可能であるという利点がある。
2020530757.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タイプＩＩＩポリケチド合成酵素をコードする遺伝子がゲノムに挿入されているか；または、タイプＩＩＩポリケチド合成酵素をコードする遺伝子を含む組換えベクターが導入されている、マロニル−ＣｏＡ検出用の組換え微生物。
【請求項２】
前記タイプＩＩＩポリケチド合成酵素は、
ストレプトミセス・グリゼウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトミセス・  コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトミセス・エバミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、サッカロポリスポラ・エリスラエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ）、ストレプトミセス・ペウセティウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ）、およびストレプトミセス・アクレオラタス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｃｕｌｅｏｌａｔｕｓ）で構成された群から選択される微生物由来のＲｐｐＡ；
シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）由来のＰｈｌＤ（ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）；
アミコラトプシス・メディテラネイ（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ）  由来のＤｐｇＡ（ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）；
ショウヨウダイオウ（Ｒｈｅｕｍ  ｐａｌｍａｔｕｍ）由来のＡＬＳ（ａｌｏｅｓｏｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）；または  
アロエアルボレスケンス（Ａｌｏｅ  ａｒｂｏｒｅｓｃｅｎｓ）由来のＰＣＳ（５，７−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｍｅｔｈｙｌｃｈｒｏｍｏｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ＯＫＳ（ｏｃｔａｋｅｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ＰＫＳ３（ａｌｏｅｓｏｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ＰＫＳ４（ｏｃｔａｋｅｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ２）またはＰＫＳ５（ｏｃｔａｋｅｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ３）
であることを特徴とする請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項３】
前記タイプＩＩＩポリケチド合成酵素をコードする遺伝子が、ｔａｃ、ｔｒｃ、Ｔ７、ＢＡＤ、λＰＲ、およびアンダーソン合成プロモーターで構成された群から選択されるプロモーターに作動可能であるように連結されていることを特徴とする請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項４】
前記組換え微生物は、大腸菌、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ），ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ），ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ），カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ），エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ），エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ），パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ），マンヘミア（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ），アクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ），アグリゲイティバクター（Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ），キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ），ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ），シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ），アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ），アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ），ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ），アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ），ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ），ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ），バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ），スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ），ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ），ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ），ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ），クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ），コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ），ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ），ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ），シアノバクテリウム（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）  および  サイクロバクテリウム（Ｃｙｃｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）で構成された菌株群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項５】
下記ステップを含むマロニル−ＣｏＡ生産誘導物質のスクリーニング方法：
（ａ）請求項１に記載の組換え微生物を培養するステップと、
（ｂ）前記組換え微生物に候補物質を添加するステップと、
（ｃ）前記候補物質添加後の組換え微生物の培養上清の色と、前記候補物質を添加していない組換え微生物の培養上清の色とを比較するステップと、
（ｄ）前記候補物質添加後の組換え微生物の培養上清が、前記候補物質を添加していない組換え微生物の培養上清に比べてより濃い赤色を呈する場合、前記候補物質をマロニル−ＣｏＡ生産誘導物質として選択するステップ。
【請求項６】
前記ステップ（ｃ）の色の比較は、目視で行うことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ステップ（ｃ）の色の比較は、吸光度を測定して行い、前記ステップ（ｄ）において、前記候補物質添加後に測定された吸光度が、前記候補物質を添加せずに測定された吸光度に比べてより増加する場合、前記候補物質をマロニル−ＣｏＡ生産誘導物質として選択することを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項８】
下記ステップを含む、マロニル−ＣｏＡ生産能の増加に関与する遺伝子のスクリーニング方法：
（ａ）請求項１に記載の組換え微生物に、前記組換え微生物中の遺伝子の発現を変化させる遺伝子調節ライブラリを導入することで、組換え微生物中の遺伝子の発現が変化された組換え微生物ライブラリを作製するステップと、
（ｂ）前記作製された組換え微生物ライブラリを培養して組換え微生物ライブラリの培養上清の吸光度を測定し、遺伝子調節ライブラリを導入する前の組換え微生物を培養して、組換え微生物ライブラリの培養上清の色と、遺伝子調節ライブラリを導入する前の組換え微生物の培養上清の色を比較するステップと、
（ｃ）前期組換え微生物ライブラリの培養上清が、前記遺伝子調節ライブラリを導入する前の組換え微生物の培養上清の色に比べて濃い赤色を呈する場合、組換え微生物ライブラリに導入した遺伝子を、マロニル−ＣｏＡ生産能の増加に関与する遺伝子として選択するステップ。
【請求項９】
前記ステップ（ｂ）の色の比較は、目視で行われることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ステップ（ｂ）の色の比較は、吸光度を測定して行われ、前記ステップ（ｃ）は、前記組換え微生物ライブラリの培養上清の吸光度が、前記遺伝子調節ライブラリを導入する前の組換え微生物の培養上清の吸光度に比べて増加する場合に、前記組換え微生物ライブラリに導入した遺伝子を選択することを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記遺伝子調節ライブラリは、ｓＲＮＡライブラリ、ゲノムライブラリ、ｃＤＮＡライブラリ、ｇＲＮＡライブラリおよびノックアウトまたは突然変異作製用のオリゴヌクレオチドライブラリで構成された群から選択されるライブラリであることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
マロニル−ＣｏＡ生産能を有している微生物で、請求項８〜１１のいずれかに記載の方法により選別された遺伝子の発現を調節することを特徴とする、マロニル−ＣｏＡ生産能が増加された組換え微生物の製造方法。
【請求項１３】
前記選別された遺伝子は、
ｆａｂＦ（３−オキソアシル−［アシル−キャリア−プロテイン］合成酵素ＩＩ（３−ｏｘｏａｃｙｌ−［ａｃｙｌ−ｃａｒｒｉｅｒ−ｐｒｏｔｅｉｎ］  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ＩＩ））；
ｙｆｃＹ（β‐ケトアシルＣｏＡチオラーゼ（ｂｅｔａ−ｋｅｔｏａｃｙｌ−ＣｏＡ  ｔｈｉｏｌａｓｅ））；
ｘａｐＲ（ｘａｐＡＢの転写活性化因子）；
ｃｙｔＲ（ｄｅｏオペロンｕｄｐ，ｃｄｄ，ｔｓｘ，ｎｕｐＣおよびｎｕｐＧに対する転写抑制因子）；
ｆａｂＨ（３−オキソアシル−［アシル−キャリア−プロテイン］合成酵素ＩＩＩ（３−ｏｘｏａｃｙｌ−［ａｃｙｌ−ｃａｒｒｉｅｒ−ｐｒｏｔｅｉｎ］  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ＩＩＩ））；
ｍｑｏ（リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｍａｌａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ））；
ｙｆｉＤ（ピルビン酸ギ酸リアーゼサブユニット（ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｆｏｒｍａｔｅ  ｌｙａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ））；
ｆｍｔ（１０−ホルミルテトラヒドロ葉酸：Ｌ−メチオニル−ｔＲＮＡ（ｆＭｅｔ）Ｎ−ホルミルトランスフェラーゼ（１０−ｆｏｒｍｙｌｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ：Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｙｌ−ｔＲＮＡ（ｆＭｅｔ）Ｎ−ｆｏｒｍｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ））；
ｐｙｒＦ（オロチジン５’−リン酸脱炭酸酵素（ｏｒｏｔｉｄｉｎｅ−５’−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ））；
ａｒａＡ（Ｌ−アラビノースイソメラーゼ（Ｌ−ａｒａｂｉｎｏｓｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ））；
ｆａｄＲ（ｆａｄレギュロンに対するネガティブレギュレーターであり、ｆａｂＡレギュロンに対するポジティブレギュレーター）；
ｐａｂＡ（アミノデオキシコリスマート合成酵素、サブユニットＩＩ（ａｍｉｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｒｉｓｍａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ，ｓｕｂｕｎｉｔ  ＩＩ））；
ｐｕｒＢ（アデニロコハク酸リアーゼ（ａｄｅｎｙｌｏｓｕｃｃｉｎａｔｅ  ｌｙａｓｅ））；および  
ｈｙｃＩ（ＨｙｃＥのＣ末端処理に関係するプロテアーゼ）で構成された群から選択される一つ以上の遺伝子であり、
前記遺伝子の発現を減少させることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記組換え微生物は、大腸菌、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ），ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ），ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ），カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ），エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ），エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ），パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ），マンヘミア（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ），アクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ），アグリゲイティバクター（Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ），キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ），ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ），シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ），アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ），アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ），ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ），アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ），ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ），ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ），バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ），スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ），ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ），ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ），ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ），クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ），コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ），ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ），ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ），シアノバクテリウム（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）  および  サイクロバクテリウム（Ｃｙｃｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）で構成された菌株群から選択される微生物であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
マロニル−ＣｏＡ生産能を有している微生物で、
ｆａｂＦ（３−オキソアシル−［アシル−キャリア−プロテイン］合成酵素ＩＩ（３−ｏｘｏａｃｙｌ−［ａｃｙｌ−ｃａｒｒｉｅｒ−ｐｒｏｔｅｉｎ］  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ＩＩ））；
ｙｆｃＹ（β‐ケトアシルＣｏＡチオラーゼ（ｂｅｔａ−ｋｅｔｏａｃｙｌ−ＣｏＡ  ｔｈｉｏｌａｓｅ））；
ｘａｐＲ（ｘａｐＡＢの転写活性化因子）；
ｃｙｔＲ（ｄｅｏオペロンｕｄｐ，ｃｄｄ，ｔｓｘ，ｎｕｐＣおよびｎｕｐＧに対する転写抑制因子）；
ｆａｂＨ（３−オキソアシル−［アシル−キャリア−プロテイン］合成酵素ＩＩＩ（３−ｏｘｏａｃｙｌ−［ａｃｙｌ−ｃａｒｒｉｅｒ−ｐｒｏｔｅｉｎ］  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ＩＩＩ））；
ｍｑｏ（リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｍａｌａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ））；
ｙｆｉＤ（ピルビン酸ギ酸リアーゼサブユニット（ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｆｏｒｍａｔｅ  ｌｙａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ））；
ｆｍｔ（１０−ホルミルテトラヒドロ葉酸：Ｌ−メチオニル−ｔＲＮＡ（ｆＭｅｔ）Ｎ−ホルミルトランスフェラーゼ（１０−ｆｏｒｍｙｌｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ：Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｙｌ−ｔＲＮＡ（ｆＭｅｔ）Ｎ−ｆｏｒｍｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ））；
ｐｙｒＦ（オロチジン５’−リン酸脱炭酸酵素（ｏｒｏｔｉｄｉｎｅ−５’−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ））；
ａｒａＡ（Ｌ−アラビノースイソメラーゼ（Ｌ−ａｒａｂｉｎｏｓｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ））；
ｆａｄＲ（ｆａｄレギュロンに対するネガティブレギュレーターであり、ｆａｂＡレギュロンに対するポジティブレギュレーター）；
ｐａｂＡ（アミノデオキシコリスマート合成酵素、サブユニットＩＩ（ａｍｉｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｒｉｓｍａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ，ｓｕｂｕｎｉｔ  ＩＩ））；
ｐｕｒＢ（アデニロコハク酸リアーゼ（ａｄｅｎｙｌｏｓｕｃｃｉｎａｔｅ  ｌｙａｓｅ））；および  
ｈｙｃＩ（ＨｙｃＥのＣ末端処理に関係するプロテアーゼ）で構成された群から選択された１つ以上の遺伝子の発現が野生型遺伝子に比べて減少されている、マロニル−ＣｏＡ生産能が増加された組換え微生物。
【請求項１６】
下記ステップを含む、マロニル−ＣｏＡを基質または中間物質とする有用物質の生産方法：
（ａ）請求項１５に記載の組換え微生物に、有用物質の生産に関与する遺伝子をさらに導入し、もしくは当該遺伝子の発現を増加させ、または、有用物質の生産に関与する遺伝子をさらに欠損させ、もしくは当該遺伝子の発現を抑制させた組換え微生物を作製するステップと、
（ｂ）前記作製された微生物を培養するステップと、
（ｃ）前記培養された微生物から有用物質を回収するステップ。
【請求項１７】
前記有用物質は、
アクチノロージン（ａｃｔｉｎｏｒｈｏｄｉｎ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、オキシテトラサイクリン（ｏｘｙｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）、ラパマイシン（ｒａｐａｍｙｃｉｎ）、ロバスタチン（ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ）、ＳＥＫ４、ＳＥＫ４ｂ、ＳＥＫ３４、ＳＥＫ１５、ＳＥＫ２６、ＦＫ５０６、ＤＭＡＣ、アクラビノン（ａｋｌａｖｉｎｏｎｅ）、アクラノン酸（ａｋｌａｎｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、エプシロンロドマイシノン（ｅｐｓｉｌｏｎ−ｒｈｏｄｏｍｙｃｉｎｏｎｅ）、アロエシン（ａｌｏｅｓｉｎ）、アロエニン（ａｌｏｅｎｉｎ）、バルバロイン（ｂａｒｂａｌｏｉｎ）、５，７−ジヒドロキシ−２−メチルクロモン（５，７−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｍｅｔｈｙｌｃｈｒｏｍｏｎｅ）、エリスロマイシン（ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）、リファマイシン（ｒｉｆａｍｙｃｉｎ）、エバーメクチン（ａｖｅｒｍｅｃｔｉｎ）、ゲルダナマイシン（ｇｅｌｄａｎａｍｙｃｉｎ）、イベルメクチン（ｉｖｅｒｍｅｃｔｉｎ）、ドキシサイクリン（ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ）、アントラマイシン（ａｎｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、ペニシリン酸（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｃ  ａｃｉｄ）、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、エポチロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）、テトラセノマイシン（ｔｅｔｒａｃｅｎｏｍｙｃｉｎ）、フレノリシン（ｆｒｅｎｏｌｉｃｉｎ）、トリ酢酸ラクトン（ｔｒｉａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｌａｃｔｏｎｅ）、６−メチルサリチル酸（６−ｍｅｔｈｙｌｓａｌｉｃｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）、およびアロエソン（ａｌｏｅｓｏｎｅ）からなるポリケチド系化合物；
ピノセムブリン（ｐｉｎｏｃｅｍｂｒｉｎ）、ジヒドロケンペロール（ｄｉｈｙｄｒｏｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ）、エリオジクチオール（ｅｒｉｏｄｉｃｔｙｏｌ）、ジヒドロケルセチン（ｄｉｈｙｄｒｏｑｕｅｒｃｅｔｉｎ）、ダイゼイン（ｄａｉｄｚｅｉｎ）、ゲニステイン（ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）、アピゲニン（ａｐｉｇｅｎｉｎ）、ルテオリン（ｌｕｔｅｏｌｉｎ）、ケンペロール（ｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ）、ケルセチン（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ）、カテキン（ｃａｔｅｃｈｉｎ）、ペラルゴニジン（ｐｅｌａｒｇｏｎｉｄｉｎ）、シアニジン（ｃｙａｎｉｄｉｎ）、アフゼレキン（ａｆｚｅｌｅｃｈｉｎ）、ミリセチン（ｍｙｒｉｃｅｔｉｎ）、フィセチン（ｆｉｓｅｔｉｎ）、ガランギン（ｇａｌａｎｇｉｎ）、ヘスペレチン（ｈｅｓｐｅｒｅｔｉｎ）、タンゲリチン（ｔａｎｇｅｒｉｔｉｎ）、デルフィニジン（ｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ）、エピカテキン（ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ）、クリシン（ｃｈｒｙｓｉｎ）、レスベラトロール（ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）、およびナリンゲニン（ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ）からなるフェニルプロパノイド系化合物；
ペンタン（ｐｅｎｔａｎｅ）、ヘキサン（ｈｅｘａｎｅ）、ヘプタン（ｈｅｐｔａｎｅ）、オクタン（ｏｃｔａｎｅ）、ノナン（ｎｏｎａｎｅ）、デカン（ｄｅｃａｎｅ）、ウンデカン（ｕｎｄｅｃａｎｅ）、ドデカン（ｄｏｄｅｃａｎｅ）、トリデカン（ｔｒｉｄｅｃａｎｅ）、テトラデカン（ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｅ）、ペンタデカン（ｐｅｎｔａｄｅｃａｎｅ）、ヘキサデカン（ｈｅｘａｄｅｃａｎｅ）、ヘプタデカン（ｈｅｐｔａｄｅｃａｎｅ）、オクタデカン（ｏｃｔａｄｅｃａｎｅ）、ノナデカン（ｎｏｎａｄｅｃａｎｅ）、イコサン（ｉｃｏｓａｎｅ）、ペンタノール（ｐｅｎｔａｎｏｌ）、ヘキサノール（ｈｅｘａｎｏｌ）、ヘプタノール（ｈｅｐｔａｎｏｌ）、オクタノール（ｏｃｔａｎｏｌ）、ノナノール（ｎｏｎａｎｏｌ）、デカノール（ｄｅｃａｎｏｌ）、ウンデカノール（ｕｎｄｅｃａｎｏｌ）、ドデカノール（ｄｏｄｅｃａｎｏｌ）、トリデカノール（ｔｒｉｄｅｃａｎｏｌ）、テトラデカノール（ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｌ）、ペンタデカノール（ｐｅｎｔａｄｅｃａｎｏｌ）、ヘキサデカノール（ｈｅｘａｄｅｃａｎｏｌ）、ヘプタデカノール（ｈｅｐｔａｄｅｃａｎｏｌ）、オクタデカノール（ｏｃｔａｄｅｃａｎｏｌ）、ノナデカノール（ｎｏｎａｄｅｃａｎｏｌ）、イコサノール（ｉｃｏｓａｎｏｌ）、メチルカプレート（ｍｅｔｈｙｌ  ｃａｐｒａｔｅ）、メチルラウレート（ｍｅｔｈｙｌ  ｌａｕｒａｔｅ）、メチルミリステート（ｍｅｔｈｙｌ  ｍｙｒｉｓｔａｔｅ）、メチルパルミテート（ｍｅｔｈｙｌ  ｐａｌｍｉｔａｔｅ）、メチルパルミトレート（ｍｅｔｈｙｌ  ｐａｌｍｉｔｏｌｅａｔｅ）、メチルステアレート（ｍｅｔｈｙｌ  ｓｔｅａｒａｔｅ）、メチルオレート（ｍｅｔｈｙｌ  ｏｌｅａｔｅ）、メチルリノレート（ｍｅｔｈｙｌ  ｌｉｎｏｌｅａｔｅ）、メチルリノレネート（ｍｅｔｈｙｌ  ｌｉｎｏｌｅｎａｔｅ）、メチルアラキデート（ｍｅｔｈｙｌ  ａｒａｃｈｉｄａｔｅ）、メチルパウリネート（ｍｅｔｈｙｌ  ｐａｕｌｌｉｎａｔｅ）、メチルエルケート（ｍｅｔｈｙｌ  ｅｒｕｃａｔｅ）、エチルカプレート（ｅｔｈｙｌ  ｃａｐｒａｔｅ）、エチルラウレート（ｅｔｈｙｌ  ｌａｕｒａｔｅ）、エチルミリステート（ｅｔｈｙｌ  ｍｙｒｉｓｔａｔｅ）、エチルパルミテート（ｅｔｈｙｌ  ｐａｌｍｉｔａｔｅ）、エチルパルミトレート（ｅｔｈｙｌ  ｐａｌｍｉｔｏｌｅａｔｅ）、エチルステアレート（ｅｔｈｙｌ  ｓｔｅａｒａｔｅ）、エチルオレート（ｅｔｈｙｌ  ｏｌｅａｔｅ）、エチルリノレート（ｅｔｈｙｌ  ｌｉｎｏｌｅａｔｅ）、エチルリノレネート（ｅｔｈｙｌ  ｌｉｎｏｌｅｎａｔｅ）、エチルアラキデート（ｅｔｈｙｌ  ａｒａｃｈｉｄａｔｅ）、エチルパウリネート（ｅｔｈｙｌ  ｐａｕｌｌｉｎａｔｅ）、およびエチルエルケート（ｍｅｔｈｙｌ  ｅｒｕｃａｔｅ）からなるバイオ燃料群；
セラミド（ｃｅｒａｍｉｄｅ）、パルミテート（ｐａｌｍｉｔａｔｅ）、およびスフィンゴシン（ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ）からなる脂質系化合物；ならびに
３−ヒドロキシプロピオン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）
から選択される何れか１つ以上の有用物質であることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１５に記載の組換え微生物に、６−メチルサリチル酸合成酵素（６−ｍｅｔｈｙｌｓａｌｉｃｙｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｙｎｔｈａｓｅ、６ＭＳＡＳ）および４´−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（４´−ｐｈｏｓｐｈｏｐａｎｔｅｔｈｅｉｎｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、Ｓｆｐ）をコードする遺伝子がさらに導入されるか、その発現が増加されている、６−メチルサリチル酸生産用組換え微生物。
【請求項１９】
前記ノックダウンされる遺伝子は、ｐａｂＡ，ｆａｂＦ，ｘａｐＲおよびｙｔｃＹで構成された群から選択された一つ以上であることを特徴とする請求項１８に記載の６−メチルサリチル酸生産用組換え微生物。
【請求項２０】
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（Ｍｄｈ）、ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（ＳｅｒＡ）、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡｃｃＢＣおよびＡｃｃＤ１）、グリセルアルデヒド  ３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧａｐＡ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｐｇｋ）、アセチル−ＣｏＡシンテターゼ（Ａｃｓ）、およびピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ：ＡｃｅＥＦおよびＬｐｄ）で構成された群から選択される１つ以上の酵素をコードする遺伝子がさらに導入されるか、その発現が増加されていることを特徴とする請求項１８に記載の６−メチルサリチル酸生産用組換え微生物。
【請求項２１】
下記ステップを含む、６−メチルサリチル酸の製造方法：
（ａ）請求項１８に記載の組換え微生物を培養するステップと、
（ｂ）前記培養された微生物から６−メチルサリチル酸を回収するステップ。
【請求項２２】
請求項１５に記載の組換え微生物に、アロエソン合成酵素（アロエソン  ｓｙｎｔｈａｓｅ）をコードする遺伝子がさらに導入されるか、その発現が増加されている、アロエソン生産用組換え微生物。
【請求項２３】
前記ノックダウンされる遺伝子は、ｐａｂＡであることを特徴とする請求項２２に記載のアロエソン生産用組換え微生物。
【請求項２４】
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（Ｍｄｈ）、ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（ＳｅｒＡ）、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡｃｃＢＣおよびＡｃｃＤ１）、グリセルアルデヒド  ３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧａｐＡ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｐｇｋ）、アセチル−ＣｏＡシンテターゼ（Ａｃｓ）、およびピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ：ＡｃｅＥＦおよびＬｐｄ）で構成された群から選択される１つ以上の酵素をコードする遺伝子がさらに導入されるか、その発現が増加されていることを特徴とする請求項２２に記載のアロエソン生産用組換え微生物。
【請求項２５】
下記ステップを含む、アロエソンの製造方法：
（ａ）請求項２２に記載の組換え微生物を培養するステップと、
（ｂ）前記培養された微生物からアロエソンを回収するステップ。
【請求項２６】
請求項１５に記載の組換え微生物に、チロシンアンモニア−リアーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ａｍｍｏｎｉａ−ｌｙａｓｅ、ＴＡＬ）、４−クマレート：ＣｏＡリガーゼ（４−ｃｏｕｍａｒａｔｅ：ＣｏＡ  ｌｉｇａｓｅ、４ＣＬ）およびスチルベン合成酵素（ｓｔｉｌｂｅｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ、ＳＴＳ）をコードする遺伝子がさらに導入されるか、その発現が増加されている、レスベラトロール生産用組換え微生物。
【請求項２７】
前記４−クマレート：ＣｏＡリガーゼは、配列番号１２８で表されるアミノ酸配列においてＩ２５０Ｌ／Ｎ４０４Ｋ／Ｉ４６１Ｖにアミノ酸が変異された変異酵素、または配列番号１３１で表されるアミノ酸配列においてＡ２９４Ｇ／Ａ３１８Ｇにアミノ酸が変異された変異酵素であることを特徴とする請求項２６に記載のレスベラトロール生産用組換え微生物。
【請求項２８】
前記ノックダウンされる遺伝子は、ｐａｂＡ，ｙｆｉＤ，ｍｑｏ，ｘａｐＲ，ｐｕｒＢ，ｆａｂＨ，ｆａｂＦ，ｙｔｃＹ，ａｒａＡ，ｆａｄＲ，ｃｙｔＲ，ｆｍｔおよびｐｙｒＦで構成された群から選択された一つ以上であることを特徴とする請求項２６に記載のレスベラトロール生産用組換え微生物。
【請求項２９】
下記ステップを含む、レスベラトロールの製造方法：
（ａ）請求項２６に記載の組換え微生物を培養するステップと、
（ｂ）前記培養された微生物からレスベラトロールを回収するステップ。
【請求項３０】
請求項１５に記載の組換え微生物に、チロシンアンモニア−リアーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ａｍｍｏｎｉａ−ｌｙａｓｅ、ＴＡＬ）、４−クマレート：ＣｏＡリガーゼ（４−ｃｏｕｍａｒａｔｅ：ＣｏＡ  ｌｉｇａｓｅ、４ＣＬ）、カルコン合成酵素（ｃｈａｌｃｏｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ、ＣＨＳ）およびカルコンイソメラーゼ（ｃｈａｌｃｏｎｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ、ＣＨＩ）をコードする遺伝子がさらに導入されるか、その発現が増加されている、ナリンゲニン生産用組換え微生物。
【請求項３１】
前記４−クマレート：ＣｏＡリガーゼは、配列番号１２８で表されるアミノ酸配列においてＩ２５０Ｌ／Ｎ４０４Ｋ／Ｉ４６１Ｖにアミノ酸が変異された変異酵素であることを特徴とする請求項３０に記載のナリンゲニン生産用組換え微生物。
【請求項３２】
前記ノックダウンされる遺伝子は、ｆａｄＲ，ｈｙｃＩおよびｘａｐＲで構成された群から選択された一つ以上であることを特徴とする請求項３０に記載のナリンゲニン生産用組換え微生物。
【請求項３３】
下記ステップを含む、ナリンゲニンの製造方法：
（ａ）請求項３０に記載の組換え微生物を培養するステップと、
（ｂ）前記培養された微生物からナリンゲニンを回収するステップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タイプＩＩＩポリケチド合成酵素ベースの新規マロニル−ＣｏＡバイオセンサーおよびその用途に関し、より詳細には、タイプＩＩＩポリケチド合成酵素をコードする遺伝子を含む組換えベクターが導入された、マロニル−ＣｏＡ検出用の組換え微生物；前記組換え微生物を用いたマロニル−ＣｏＡ生産誘導物質のスクリーニング方法、マロニル−ＣｏＡ生産能の増加に関与する遺伝子のスクリーニング方法；および前記方法により選別された遺伝子を微生物でノックダウン（Ｋｎｏｃｋ−ｄｏｗｎ）して微生物のマロニル−ＣｏＡ生産量を増加させ、それに基づいてマロニル−ＣｏＡを前駆体とし前記微生物内の有用物質を生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
全世界的な環境問題、限定された資源の枯渇、環境にやさしいエネルギー源の需要の増加に伴い、再生産可能な生物体ベースの細胞工場の構築に関する関心が高まっている。かかる細胞工場は、細胞内の代謝回路（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｎｅｔｗｏｒｋ）を目的代謝産物（バイオエネルギー、環境にやさしい化学物質、新薬製剤など）の生産に最適化して製造することができるが、この技術過程において、様々な分子生物学技術が求められている。
【０００３】
微生物細胞工場で作製可能な種々の物質の中でも、マロニル−ＣｏＡは、ポリケチド、フェニルプロパノイド、バイオ燃料などの非常に有用な産物の主要前駆体であるため、特に重要である。しかし、マロニル−ＣｏＡは、脂肪酸の生合成など、細胞内で様々な必須代謝反応を引き起こすため、代謝工学的に活用可能な量が非常に少ない。さらに、細胞内のマロニル−ＣｏＡ濃度を測定するためには、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳなどの高性能機器が必要であり、細胞内で速く生成されてから消え、周辺環境条件に敏感なマロニル−ＣｏＡを測定するためには、長時間がかかるだけでなく、非常に注意を要するサンプリング方法が求められる。したがって、細胞内のマロニル−ＣｏＡ濃度をより速く且つ容易に測定するために、従来の研究から、転写因子に基づくマロニル−ＣｏＡバイオセンサーが開発されている（Ｘｕ  Ｐ，Ｌｉ  Ｌ，Ｚｈａｎｇ  Ｆ，Ｓｔｅｐｈａｎｏｐｏｕｌｏｓ  Ｇ，Ｋｏｆｆａｓ  Ｍ（２０１４），Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １１１：１１２９９−１１３０４；Ｌｉ  Ｓ，Ｓｉ  Ｔ，Ｗａｎｇ  Ｍ，Ｚｈａｏ  Ｈ（２０１５），ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈ  Ｂｉｏｌ  ４：１３０８−１３１５）。しかしながら、上記のような転写因子に基づく蛍光タンパク質ベースのセンサーは、多くのシグナル伝達ステップを経なければならず、シュードモナスのように自体蛍光を呈する微生物では、活用が不可能であるという欠点がある。
【０００４】
そこで、本発明者らは、上記の問題を解決するために、タイプＩＩＩポリケチド合成酵素ベースの新規なマロニル−ＣｏＡバイオセンサーを開発したが、これは、ＲｐｐＡを始めとするタイプＩＩＩポリケチド合成酵素が、マロニル−ＣｏＡを単一ステップ反応により色を呈する物質に変換させる性質を活用したものであって、前記バイオセンサーを用いる場合、マロニル−ＣｏＡを容易に検出できるだけでなく、マロニル−ＣｏＡ生産菌株、マロニル−ＣｏＡ生産誘導物質、マロニル−ＣｏＡ生産能増加に関与する遺伝子のスクリーニングが可能であり、マロニル−ＣｏＡを基質や前駆体とする種々の有用物質の生産方法を容易に構築できることを確認し、本発明を成すに至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、マロニル−ＣｏＡ検出のための新規なバイオセンサー、および前記バイオセンサーの様々な活用方法を提供し、さらには、前記方法によりマロニル−ＣｏＡの生産量を増加させ、それに基づき、マロニル−ＣｏＡを基質または前駆体とし前記微生物内の有用物質を生産する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記目的を達成するために、本発明は、タイプＩＩＩポリケチド合成酵素をコードする遺伝子がゲノムに挿入されているか；または、タイプＩＩＩポリケチド合成酵素をコードする遺伝子を含む組換えベクターが導入されている、マロニル−ＣｏＡ検出用の組換え微生物を提供する。
【０００７】
本発明はまた、
（ａ）前記組換え微生物を培養するステップと、
（ｂ）前記組換え微生物に候補物質を添加するステップと、
（ｃ）前記候補物質添加後の組換え微生物の培養上清の色と、前記候補物質添加前の組換え微生物の培養上清の色とを比較するステップと、
（ｄ）前記候補物質添加後の組換え微生物の培養上清が、前記候補物質添加前の組換え微生物の培養上清に比べてより赤色を呈する場合、前記候補物質をマロニル−ＣｏＡ生産誘導物質として選択するステップと、含むマロニル−ＣｏＡ生産誘導物質のスクリーニング方法を提供する。
【０００８】
本発明はまた、
（ａ）前記組換え微生物に、前記組換え微生物中の遺伝子の発現を変化させる遺伝子調節ライブラリを導入することで、組換え微生物中の遺伝子の発現が変化された組換え微生物ライブラリを作製するステップと、
（ｂ）前記作製された組換え微生物ライブラリを培養して培養上清の吸光度を測定し、遺伝子調節ライブラリを導入する前の組換え微生物を培養して前記組換え微生物ライブラリの培養上清の色と、前記遺伝子調節ライブラリを導入する前の組換え微生物の培養上清の色を比較するステップと、
（ｃ）前記組換え微生物ライブラリの培養上清の色が前記遺伝子調節ライブラリを導入する前の組換え微生物の培養上清の色に比べて赤色が増加する場合、組換え微生物ライブラリに導入した遺伝子を選択するステップと、を含むマロニル−ＣｏＡ生産能の増加に関与する遺伝子のスクリーニング方法を提供する。
【０００９】
本発明はまた、マロニル−ＣｏＡ生産能を内在的に有しているか、マロニル−ＣｏＡ生産能が外部から導入された微生物で、前記方法により選別された遺伝子の発現を調節することを特徴とする、マロニル−ＣｏＡ生産能が増加された組換え微生物の製造方法を提供する。
【００１０】
本発明はまた、マロニル−ＣｏＡ生産能を有している微生物で、
ｆａｂＦ（３−オキソアシル−［アシル−キャリア−プロテイン］合成酵素ＩＩ（３−ｏｘｏａｃｙｌ−［ａｃｙｌ−ｃａｒｒｉｅｒ−ｐｒｏｔｅｉｎ］  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ＩＩ））；
ｙｆｃＹ（β‐ケトアシルＣｏＡチオラーゼ（ｂｅｔａ−ｋｅｔｏａｃｙｌ−ＣｏＡ  ｔｈｉｏｌａｓｅ））；
ｘａｐＲ（ｘａｐＡＢの転写活性化因子）；
ｃｙｔＲ（ｄｅｏオペロンｕｄｐ，ｃｄｄ，ｔｓｘ，ｎｕｐＣおよびｎｕｐＧに対する転写抑制因子）；
ｆａｂＨ（３−オキソアシル−［アシル−キャリア−プロテイン］合成酵素ＩＩＩ（３−ｏｘｏａｃｙｌ−［ａｃｙｌ−ｃａｒｒｉｅｒ−ｐｒｏｔｅｉｎ］  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ＩＩＩ））；
ｍｑｏ（リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｍａｌａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ））；
ｙｆｉＤ（ピルビン酸ギ酸リアーゼサブユニット（ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｆｏｒｍａｔｅ  ｌｙａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ））；
ｆｍｔ（１０−ホルミルテトラヒドロ葉酸：Ｌ−メチオニル−ｔＲＮＡ（ｆＭｅｔ）Ｎ−ホルミルトランスフェラーゼ（１０−ｆｏｒｍｙｌｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ：Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｙｌ−ｔＲＮＡ（ｆＭｅｔ）Ｎ−ｆｏｒｍｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ））；
ｐｙｒＦ（オロチジン５’−リン酸脱炭酸酵素（ｏｒｏｔｉｄｉｎｅ−５’−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ））；
ａｒａＡ（Ｌ−アラビノースイソメラーゼ（Ｌ−ａｒａｂｉｎｏｓｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ））；
ｆａｄＲ（ｆａｄレギュロンに対するネガティブレギュレーターであり、ｆａｂＡレギュロンに対するポジティブレギュレーター）；
ｐａｂＡ（アミノデオキシコリスマート合成酵素、サブユニットＩＩ（ａｍｉｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｒｉｓｍａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ，ｓｕｂｕｎｉｔ  ＩＩ））；
ｐｕｒＢ（アデニロコハク酸リアーゼ（ａｄｅｎｙｌｏｓｕｃｃｉｎａｔｅ  ｌｙａｓｅ））；および  
ｈｙｃＩ（ＨｙｃＥのＣ末端処理に関係するプロテアーゼ）で構成された群から選択された１つ以上の遺伝子の発現が野生型遺伝子に比べて減少されている、マロニル−ＣｏＡ生産能が増加された組換え微生物を提供する。
【００１１】
本発明はまた、
（ａ）前記組換え微生物に、有用物質の生産に関与する遺伝子をさらに導入もしくは遺伝子の発現を増加させるか、有用物質の生産に関与する遺伝子をさらに欠損もしくは遺伝子の発現を抑制させた組換え微生物を作製するステップと、
（ｂ）前記作製された微生物を培養するステップと、
（ｃ）前記培養された微生物から有用物質を回収するステップと、を含む、マロニル−ＣｏＡを基質または中間物質とする有用物質の生産方法を提供する。
【００１２】
本発明はまた、前記組換え微生物に、６−メチルサリチル酸合成酵素（６−ｍｅｔｈｙｌｓａｌｉｃｙｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｙｎｔｈａｓｅ、６ＭＳＡＳ）および４´−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（４´−ｐｈｏｓｐｈｏｐａｎｔｅｔｈｅｉｎｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、Ｓｆｐ）をコードする遺伝子がさらに導入されるか、その発現が増加されている、６−メチルサリチル酸生産用組換え微生物を提供する。
【００１３】
本発明はまた、
（ａ）前記組換え微生物を培養するステップと、
（ｂ）前記培養された微生物から６−メチルサリチル酸を回収するステップと、を含む、６−メチルサリチル酸の製造方法を提供する。
【００１４】
本発明はまた、前記組換え微生物に、アロエソン合成酵素（アロエソン  ｓｙｎｔｈａｓｅ）をコードする遺伝子がさらに導入されるか、その発現が増加されている、アロエソン生産用組換え微生物を提供する。
【００１５】
本発明はまた、
（ａ）前記組換え微生物を培養するステップと、
（ｂ）前記培養された微生物からアロエソンを収回するステップ
を含む、アロエソンの製造方法を提供する。
【００１６】
本発明はまた、前記組換え微生物に、チロシンアンモニア−リアーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ａｍｍｏｎｉａ−ｌｙａｓｅ、ＴＡＬ）、４−クマレート：ＣｏＡリガーゼ（４−ｃｏｕｍａｒａｔｅ：ＣｏＡ  ｌｉｇａｓｅ、４ＣＬ）およびスチルベン合成酵素（ｓｔｉｌｂｅｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ、ＳＴＳ）をコードする遺伝子がさらに導入されるか、その発現が増加されている、レスベラトロール生産用組換え微生物を提供する。
【００１７】
本発明はまた、
（ａ）前記組換え微生物を培養するステップと、
（ｂ）前記培養された微生物からレスベラトロールを回収するステップと、を含む、レスベラトロールの製造方法を提供する。
【００１８】
本発明はまた、前記組換え微生物に、チロシンアンモニア−リアーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ａｍｍｏｎｉａ−ｌｙａｓｅ、ＴＡＬ）、４−クマレート：ＣｏＡリガーゼ（４−ｃｏｕｍａｒａｔｅ：ＣｏＡ  ｌｉｇａｓｅ、４ＣＬ）、カルコン合成酵素（ｃｈａｌｃｏｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ、ＣＨＳ）およびカルコンイソメラーゼ（ｃｈａｌｃｏｎｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ、ＣＨＩ）をコードする遺伝子がさらに導入されるか、その発現が増加されている、ナリンゲニン生産用組換え微生物を提供する。
【００１９】
本発明はまた、
（ａ）前記組換え微生物を培養するステップと、 
（ｂ）前記培養された微生物からナリンゲニンを回収するステップと、
を含むナリンゲニンの製造方法。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】タイプＩＩＩポリケチド合成酵素（ＲｐｐＡ）を用いたマロニル−ＣｏＡバイオセンサーの作動機序を示す。（Ａ）ＲｐｐＡは、５分子のマロニル−ＣｏＡを１分子の赤色フラビオリンに転換することができる。この際、先ず１，３，６，８−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ（ＴＨＮ）に転換された後、これが、自発的な酸化反応によりフラビオリンに転換される。（Ｂ）ＲｐｐＡバイオセンサーにより、赤色が濃いほど、細胞内のマロニル−ＣｏＡ濃度が高い。
【図２】フラビオリンの生合成について説明している。（Ａ）互いに異なる５種の菌株からのｒｐｐＡによるフラビオリン生産量。（Ｂ）ＬＣ−ＭＳ、ＭＳ／ＭＳ分析により立証されたフラビオリンの生産。（Ｃ）フラビオリン生産量の最適化。５´ＵＴＲの最適化により、フラビオリン生産量が増加された。（Ｄ）ＲｐｐＡバイオセンサーの効用性の究明。セルレニンを用いた間接的な細胞内のマロニル−ＣｏＡ変動によるシグナルの変化。ＲｐｐＡ＋は、ＲｐｐＡが発現された菌株、ＲｐｐＡ−はＲｐｐＡを発現しない菌株を示す。
【図３】ＲｐｐＡバイオセンサーの効用性および拡張性を示す。（Ａ）フラビオリンの生産は、添加されたセルレニンの量が多くなるほど増加し、（Ｂ）これは、目視でも確認可能である。（Ｃ）１６種の大腸菌株から、何れもフラビオリンの生産が可能である。（Ｄ）ＲｐｐＡ発現菌株（ＲｐｐＡ＋）とＲｐｐＡを発現しない対照群菌株（ＲｐｐＡ−）の場合、３４０ｎｍで（矢印で示す）、対照群におけるノイズが最も少なく、ＲｐｐＡ＋菌株でシグナルが強かったため、３４０ｎｍでの吸光度をＲｐｐＡバイオセンサーのシグナルとして活用した。
【図４】ＡａＯＫＳ、ＡａＰＫＳ４、ＡａＰＫＳ５の３種のタイプＩＩＩポリケチド合成酵素のマロニル−ＣｏＡバイオセンサーとしての性質の究明を示す。（Ａ）ＡａＯＫＳ、ＡａＰＫＳ４、ＡａＰＫＳ５を発現させる大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の培養上清のＬＣ−ＭＳ（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｃａｎ  ｍｏｄｅ）による抽出イオンクロマトグラム（ｅｘｔｒａｃｔｅｄ  ｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ）。各クロマトグラムで予測される生産物は、次のとおりである：５，７−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｍｅｔｈｙｌｃｈｒｏｍｏｎｅ（ｍ／ｚ１９１）；ａｌｏｅｓｏｎｅ（ｍ／ｚ２３１）；ＳＥＫ４  ａｎｄ  ＳＥＫ４ｂ（ｍ／ｚ３１７）。（Ｂ）ＡａＯＫＳ、ＡａＰＫＳ４、ＡａＰＫＳ５を発現する大腸菌株の、互いに異なるセルレニン濃度下での培養液の色と、（Ｃ）互いに異なる波長での培養液の吸光度を示す。ＣＴ、対照群菌株（ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ−３０ａ（＋））。この際、３００ｎｍで、対照群に比べてマロニル−ＣｏＡバイオセンサー菌株のシグナルが最も強かったため、ＡａＯＫＳ、ＡａＰＫＳ４、ＡａＰＫＳ５の場合、３００ｎｍでの吸光度をシグナルとして活用した。各データは、３回の実験による平均値を示す。
【図５】ＡａＯＫＳ、ＡａＰＫＳ４、ＡａＰＫＳ５の３種のタイプＩＩＩポリケチド合成酵素のマロニル−ＣｏＡバイオセンサーとしての活用が可能であることを示す。（Ａ）ＡａＯＫＳ、（Ｂ）ＡａＰＫＳ４、（Ｃ）ＡａＰＫＳ５は、（セルレニンの添加によって調節される）マロニル−ＣｏＡ濃度の増加につれて増加された、標準化されたシグナルを示す。各シグナルは、ＰＫＳを含んでいるか、含んでいない、それぞれの場合を示す。
【図６】シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ロドコッカス・オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ）でのＲｐｐＡバイオセンサーテスト結果を示す。（Ａ）Ｐ．ｐｕｔｉｄａ菌株に、表記したプラスミドを形質転換した時におけるフラビオリンの生産量を示す。（Ｂ）Ｐ．ｐｕｔｉｄａ  ｐＢＢＲ１−ｒｐｐＡセンサー菌株のセルレニン濃度毎のシグナルの強度を示し、（Ｃ）この際の相対的なフラビオリン生産量を示す。（Ｄ）Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株に、表記したプラスミドを形質転換した時におけるフラビオリンの生産量を示す。（Ｅ）Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ｐＣＥＳ−Ｈｉｓ−ｒｐｐＡセンサー菌株のセルレニン濃度毎のシグナルの強度を示し、（Ｆ）この際の相対的なフラビオリン生産量を示す。（Ｇ）Ｒ．ｏｐａｃｕｓ菌株に、表記したプラスミドを形質転換した時における培養液の色を示す。
【図７】ＲｐｐＡバイオセンサーを活用し、増加されたマロニル−ＣｏＡ生産量を示す菌株を高速スクリーニングにより選別する過程を示す。
【図８】大腸菌ゲノムスケールの合成調節ｓＲＮＡライブラリを導入し、ＲｐｐＡバイオセンサーを活用した高速スクリーニングを行った時に、増加されたマロニル−ＣｏＡ濃度を示す菌株をスクリーニングした初期結果である。
【図９】初期に選別された、増加されたマロニル−ＣｏＡ生産能を付与する２６種の合成調節ｓＲＮＡを大腸菌センサー菌株に形質転換した時に発生するシグナルを示す。この際、対照群に比べて７０％以上のシグナル増加に成功した１４種の合成調節ｓＲＮＡを最終ターゲットとして選別した。
【図１０】ＦＶＳＥＯＦシミュレーションによるマロニル−ＣｏＡの増産を示す。（Ａ）は、マロニル−ＣｏＡ生合成に関連する生合成経路を示し、太字となっている文字は反応を示し、一般字となっている文字は代謝体を示す。灰色の矢印は、代謝フラックスを、赤色の矢印は、過発現ターゲットとして現れた代謝フラックスを示す。（Ｂ）ＦＶＳＥＯＦで確認された遺伝子ターゲットを過発現させた時に現れるバイオセンサーシグナル。（Ｃ）ＦＶＳＥＯＦで確認された遺伝子ターゲットのリスト。
【図１１】６−メチルサリチル酸の生合成経路を示す。この際、赤色のＸは、ノックアウトされた遺伝子を示し、青色のＸは、ノックダウンされた遺伝子を示す。ｂｌａ，ｂｅｔａ−ｌａｃｔａｍａｓｅ  ｇｅｎｅ；ｋａｎＲ，ｋａｎａｍｙｃｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｇｅｎｅ；ｐ１５Ａ，ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｒｉｇｉｎ；ＣｏｌＥ１，ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｒｉｇｉｎ；Ｐｔａｃ，ｔａｃ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ；ＰＢＡＤ，ａｒａｂｉｎｏｓｅ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ；ＰＲ，ＰＲ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ；ｒｒｎＢ，ｒｒｎＢＴ１Ｔ２  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ；Ｔ１／ＴＥ，ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ．Ｇｌｙ，ｇｌｙｃｅｒｏｌ；Ｇｌｙ−３Ｐ，ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ＤＨＡ，ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｎｅ；ＤＨＡＰ，ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ；Ｇ３Ｐ，ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ  ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ；１，３ＢＰＧ，１，３−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ；３ＰＧ，３−ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ；２ＰＧ，２−ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ；ＰＥＰ，ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ；ＰＹＲ，ｐｙｒｕｖａｔｅ；ＯＡＡ，ｏｘａｌｏａｃｅｔａｔｅ；Ｅ４Ｐ，Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏｓｅ４−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ＤＡＨＰ，３−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ａｒａｂｉｎｏｈｅｐｔｕｌｏｓｏｎａｔｅ  ７−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ＣＨＯＲ，ｃｈｏｒｉｓｍａｔｅ；ＡｃＣｏＡ，ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ；ＭａｌＣｏＡ，ｍａｌｏｎｙｌ−ＣｏＡ；６ＭＳＡＳ，６ＭＳＡ  ｓｙｎｔｈａｓｅ；ＫＳ，ｋｅｔｏｓｙｎｔｈａｓｅ；ＡＴ，ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＤＨ，ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ；ＫＲ，ｋｅｔｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ；ＡＣＰ，ａｃｙｌ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ．
【図１２】６−メチルサリチル酸の生産のための、互いに異なる遺伝子発現カセットを示す。（Ａ）は、プラスミドｐＴａｃ−Ｐｇ６ＭＳＡＳ−ｓｆｐを、（Ｂ）は、プラスミドｐＴａｃ−Ｐｇ６ＭＳＡＳと大腸菌ＢＡＰ１菌株のゲノム上で発現されるｓｆｐを示す。（Ｃ）６−メチルサリチル酸合成酵素（Ｐｇ６ＭＳＡＳ）と４´−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（Ｓｆｐ）の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した結果である。Ｐｇ６ＭＳＡＳ（１８８ｋＤａ），Ｓｆｐ（２６．１ｋＤａ）．
【図１３】改良された大腸菌株からの６−メチルサリチル酸の生産を示す。（Ａ）は、様々な濃度のブドウ糖／グリセロールで、ＢＬ２１ベースの菌株とＢＡＰ１ベースの菌株からの６−メチルサリチル酸の生産を示す。（Ｂ）大腸菌から生産された６−メチルサリチル酸のＬＣ−ＭＳ分析結果を示し、（Ｃ）実際に市販されている６−メチルサリチル酸化合物のＬＣ−ＭＳ分析結果を示す。（Ｄ）１６種の大腸菌からの試験管スケールにおける６−メチルサリチル酸の生産を示す。青色部分は、１ｍｇ／Ｌ以上の生産能を示す。（Ｅ）大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＴａｃ−Ｐｇ６ＭＳＡＳ−ｓｆｐ  ｐＷＡＳ−ａｎｔｉ−ｐａｂＡ（ｐａｂＡノックダウン用ｓＲＮＡプラスミド）菌株の時間毎の６−メチルサリチル酸の生産様相。（Ｆ）ＢＡＰ１  ｐＴａｃ−Ｐｇ６ＭＳＡＳ  ｐＷＡＳ−ａｎｔｉ−ｐａｂＡ菌株の時間毎の６−メチルサリチル酸の生産様相。（Ｇ）同一菌株の流加型醗酵の様相。赤色の矢印は、ＩＰＴＧ誘導時点を示す。（Ｅ）、（Ｆ）、（Ｇ）において、青色線および点は細胞生長（ＯＤ６００）を示し、赤色線および点は６−メチルサリチル酸の濃度を示す。
【図１４】選別された６種の大腸菌株に、実施例２．１で選別された１４種の合成調節ｓＲＮＡをそれぞれ導入した後、このように生成された菌株を試験管スケールで培養した時の６−メチルサリチル酸の生産を示す。
【図１５】左側グラフは、図１２で６−メチルサリチル酸の生産能が最も高かった菌株であるＥ．ｃｏｌｉ  ＢＡＰ１  ｐＴａｃ−Ｐｇ６ＭＳＡＳ  ｐＷＡＳ−ａｎｔｉ−ｐａｂＡに、左側グラフ下端の遺伝子を過発現した時に、フラスコ培養上で現れた６−メチルサリチル酸の濃度を示す。右側グラフは、左側グラフで生産能が最も高かった菌株であるＥ．ｃｏｌｉ  ＢＡＰ１  ｐＴａｃ−Ｐｇ６ＭＳＡＳ  ｐＷＡＳ−ａｎｔｉ−ｐａｂＡ  ｐＢＢＲ１−ａｃｃＢＣＤ１菌株の流加型醗酵の結果を示す。
【図１６】アロエソンの生合成経路を示す。この際、赤色のＸは、ノックアウトされた遺伝子を示し、青色のＸは、ノックダウンされた遺伝子を示す。Ｇｌｃ，ｇｌｕｃｏｓｅ；Ｇ６Ｐ，ｇｌｕｃｏｓｅ  ６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ；Ｆ６Ｐ，ｆｒｕｃｔｏｓｅ  ６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ；Ｆ１，６ＢＰ，ｆｒｕｃｔｏｓｅ  １，６−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ＤＨＡＰ，ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ；Ｇ３Ｐ，ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ  ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ；１，３ＢＰＧ，１，３−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ；３ＰＧ，３−ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ；２ＰＧ，２−ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ；ＰＥＰ，ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ；ＰＹＲ，ｐｙｒｕｖａｔｅ；ＯＡＡ，ｏｘａｌｏａｃｅｔａｔｅ；Ｅ４Ｐ，Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏｓｅ  ４−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ＤＡＨＰ，３−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ａｒａｂｉｎｏｈｅｐｔｕｌｏｓｏｎａｔｅ  ７−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ＣＨＯＲ，ｃｈｏｒｉｓｍａｔｅ；ＡｃＣｏＡ，ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ；ＭａｌＣｏＡ，ｍａｌｏｎｙｌ−ＣｏＡ；ＡＬＳ，ａｌｅｏｓｏｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ．  ｂｌａ，ｂｅｔａ−ｌａｃｔａｍａｓｅ  ｇｅｎｅ；ｓｐｃＲ，ｓｐｅｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｇｅｎｅ；ＣＤＦ，ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｒｉｇｉｎ；ＣｏｌＥ１，ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｒｉｇｉｎ；ＰＴ７，Ｔ７  ｐｒｏｍｏｔｅｒ；ＰＢＡＤ，ａｒａｂｉｎｏｓｅ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ；ＰＲ，ＰＲ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ；ｒｒｎＢ，ｒｒｎＢＴ１Ｔ２  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ；Ｔ１／ＴＥ，ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ．
【図１７】改良された大腸菌株からのアロエソンの生産を示す。（Ａ）は、アロエソン合成酵素（ＲｐＡＬＳ、４３ｋＤａ）とアロエソン合成酵素（ＡａＰＫＳ３、４４ｋＤａ）の発現を確認するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果である。（Ｂ）は、ブドウ糖／グリセロールが炭素源として用いられた時に、ＲｐＡＬＳ／ＡａＰＫＳ３が発現された時のアロエソンの生産を示す。（Ｃ）は、大腸菌から生産されたアロエソンのＬＣ−ＭＳ、ＭＳ／ＭＳスペクトルである。（Ｄ）は、ＢＬ２１（ＤＥ３）  ｐＣＤＦ−ＲｐＡＬＳ菌株の時間毎のアロエソンの生産様相であり、（Ｅ）は、ＢＬ２１（ＤＥ３）  ｐＣＤＦ−ＲｐＡＬＳ  ｐＷＡＳ−ａｎｔｉ−ｐａｂＡ菌株の時間毎のアロエソンの生産様相である。（Ｄ）、（Ｅ）において、青色線および点は細胞生長（ＯＤ６００）を示し、赤色線および点はアロエソンの濃度を示す。（Ｆ）は、２種の大腸菌ＤＥ３菌株に、実施例２．１で選別された１４種の合成調節ｓＲＮＡをそれぞれ導入した後に生成された菌株の試験管スケール培養の結果である。
【図１８】図１７（Ｅ）でアロエソンの生産能が最も高かった菌株であるＢＬ２１（ＤＥ３）  ｐＣＤＦ−ＲｐＡＬＳ  ｐＷＡＳ−ａｎｔｉ−ｐａｂＡに、グラフ下端の遺伝子を過発現した時に、フラスコ培養上で現れたアロエソンの濃度を示す。
【図１９】レスベラトロールの生合成経路を示す。この際、赤色のＸは、ノックアウトされた遺伝子を示し、青色のＸは、ノックダウンされた遺伝子を示す。太字で表記された遺伝子と太い黒色矢印は、過発現された代謝フラックスを示す。赤色点線（円内の−符号とともに）は、転写抑制過程を示す。黒色点線（円内の＋符号とともに）は、転写活性過程を示す。Ｇｌｙ，ｇｌｙｃｅｒｏｌ；Ｇｌｙ−３Ｐ，ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ＤＨＡ，ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｎｅ；ＤＨＡＰ，ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ；Ｇ３Ｐ，ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ  ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ；１，３ＢＰＧ，１，３−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ；３ＰＧ，３−ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ；２ＰＧ，２−ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ；ＰＥＰ，ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ；ＰＹＲ，ｐｙｒｕｖａｔｅ；ＯＡＡ，ｏｘａｌｏａｃｅｔａｔｅ；Ｅ４Ｐ，Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏｓｅ  ４−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ＤＡＨＰ，３−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ａｒａｂｉｎｏｈｅｐｔｕｌｏｓｏｎａｔｅ  ７−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ＳＨＩＫ，ｓｈｉｋｉｍａｔｅ；ＣＨＯＲ，ｃｈｏｒｉｓｍａｔｅ；ＰＰＨＮ，ｐｒｅｐｈｅｎａｔｅ；ＨＰＰ，４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌｐｙｒｕｖａｔｅ；ＦＯＲ，ｆｏｒｍａｔｅ；ＡｃＣｏＡ，ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ；ＭａｌＣｏＡ，ｍａｌｏｎｙｌ−ＣｏＡ．  ｂｌａ，ｂｅｔａ−ｌａｃｔａｍａｓｅ  ｇｅｎｅ；ｋａｎＲ，ｋａｎａｍｙｃｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｇｅｎｅ；ｓｐｃＲ，ｓｐｅｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｇｅｎｅ；ｐ１５Ａ，ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｒｉｇｉｎ；ＣｏｌＥ１，ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｒｉｇｉｎ；ＣＤＦ，ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｒｉｇｉｎ；Ｐｔａｃ，ｔａｃ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ；ＰＢＡＤ，ａｒａｂｉｎｏｓｅ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ；ＰＲ，ＰＲ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ；Ｐｔｒｃ，ｔｒｃ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ；ｒｒｎＢ，ｒｒｎＢＴ１Ｔ２  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ；Ｔ１／ＴＥ，ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ．
【図２０】改良された大腸菌を用いたｐ−クマル酸（ｐ−ｃｏｕｍａｒｉｃ  ａｃｉｄ）およびレスベラトロールの生産を示す。（Ａ）は、Ｎ−末端のタンパク質タグの効果を調べるために構築された種々のプラスミドによるｐ−クマル酸の生産を示す。この際、ｐＴＹ１３−ＨｉｓＴＡＬを除き、何れもＢＴＹ５．１３菌株に形質転換されており、ｐＴＹ１３−ＨｉｓＴＡＬは、ＢＴＹ５菌株に形質転換された。（Ｂ）各タンパク質の発現を調べるためのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。Ａｔ４ＣＬ１ｍ（６１．１ｋＤａ），Ａｔ４ＣＬ３（６１．３ｋＤａ），Ａｔ４ＣＬ４（６２．６ｋＤａ），Ｓｃ４ＣＬｍ（５５．３ｋＤａ），ＳＴＳ（４２．８ｋＤａ）．ＣＴは対照群を示す。Ｍは、タンパク質サイズマーカーを示す。（Ｃ）互いに異なる４ＣＬとＳＴＳの組み合わせによるレスベラトロールの生産テスト結果。（Ｄ）他のプラスミド構築戦略によるレスベラトロールの生産。この際、１−５はプラスミドを示し、各プラスミドは次のとおりである。１、ｐＴａｃ−ＶｖＳＴＳ−Ａｔ４ＣＬ１ｍ；２、ｐＴａｃ−Ａｔ４ＣＬ１ｍ−ｏｐｒ−ＶｖＳＴＳ（２つの遺伝子を１つのオペロンとして発現）；３、ｐＴａｃ−Ａｔ４ＣＬ１ｍ−ｆｕｓ−ＶｖＳＴＳ（Ａｔ４ＣＬ１ｍとＳＴＳのフュージョンタンパク質を発現）；４と５、ｐＴａｃＣＤＦ−ＶｖＳＴＳ−Ａｔ４ＣＬ１ｍ。この際、１−４に該当するプラスミドは、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換され、２ｍＭのｐ−クマル酸と２０ｇ／Ｌのグリセロールの添加下で培養された。５に該当するプラスミドは、ＢＴＹ５  ｐＴＹ１３−ＨｉｓＴＡＬ菌株に形質転換され、２０ｇ／Ｌのグリセロールの添加下で培養された。５に該当する菌株が基本レスベラトロール生産菌株として使用され、濃い青色の棒グラフで示した。（Ｅ）実施例２．１で選別された１４種の合成調節ｓＲＮＡを基本レスベラトロール菌株（ＢＴＹ５  ｐＴＹ１３−ＨｉｓＴＡＬ  ｐＴａｃＣＤＦ−ＶｖＳＴＳ−Ａｔ４ＣＬ１ｍ）に形質転換した後、フラスコ培養して得られたレスベラトロールの生産量。より濃い赤色グラフで示した６種の菌株に該当するｓＲＮＡは、対照群に比べてレスベラトロール生産能が２．５倍以上増産されたため、二重同時ノックダウンテストに用いられた。（Ｆ）上記の選別された６種のｓＲＮＡを組み合わせ、二重同時ノックダウンテストを行った結果。
【図２１】改良された大腸菌から生産されたレスベラトロールの真偽を判断するために行ったＬＣ−ＭＳ結果を示す。（Ａ）は、改良された大腸菌から生産されたレスベラトロール、（Ｂ）は市販されているレスベラトロール化合物のＬＣ−ＭＳスペクトルを示す。
【図２２】ナリンゲニンの生合成経路を示す。この際、赤色のＸは、ノックアウトされた遺伝子を示し、青色のＸは、ノックダウンされた遺伝子を示す。太字で表記された遺伝子と太い黒色矢印は、過発現された代謝フラックスを示す。赤色点線（円内の−符号とともに）は、転写抑制過程を示す。黒色点線（円内の＋符号とともに）は、転写活性過程を示す。ｂｌａ，ｂｅｔａ−ｌａｃｔａｍａｓｅ  ｇｅｎｅ；ｋａｎＲ，ｋａｎａｍｙｃｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｇｅｎｅ；ｓｐｃＲ，ｓｐｅｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｇｅｎｅ；ｐ１５Ａ，ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｒｉｇｉｎ；ＣｏｌＥ１，ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｒｉｇｉｎ；ＣＤＦ，ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｒｉｇｉｎ；Ｐｔａｃ，ｔａｃ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ；ＰＢＡＤ，ａｒａｂｉｎｏｓｅ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ；ＰＲ，ＰＲ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ；Ｐｔｒｃ，ｔｒｃ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ；ｒｒｎＢ，ｒｒｎＢＴ１Ｔ２  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ；Ｔ１／ＴＥ，ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ．  Ｇｌｙ，ｇｌｙｃｅｒｏｌ；Ｇｌｙ−３Ｐ，ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ＤＨＡ，ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｎｅ；ＤＨＡＰ，ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ；Ｇ３Ｐ，ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ  ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ；１，３ＢＰＧ，１，３−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ；３ＰＧ，３−ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ；２ＰＧ，２−ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ；ＰＥＰ，ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ；ＰＹＲ，ｐｙｒｕｖａｔｅ；ＯＡＡ，ｏｘａｌｏａｃｅｔａｔｅ；Ｅ４Ｐ，Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏｓｅ  ４−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ＤＡＨＰ，３−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ａｒａｂｉｎｏｈｅｐｔｕｌｏｓｏｎａｔｅ  ７−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ＳＨＩＫ，ｓｈｉｋｉｍａｔｅ；ＣＨＯＲ，ｃｈｏｒｉｓｍａｔｅ；ＰＰＨＮ，ｐｒｅｐｈｅｎａｔｅ；ＨＰＰ，４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌｐｙｒｕｖａｔｅ；ＦＯＲ，ｆｏｒｍａｔｅ；ＡｃＣｏＡ，ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ；ＭａｌＣｏＡ，ｍａｌｏｎｙｌ−ＣｏＡ；ＴＹＲ，Ｌ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ；ＣＯＵ，ｐ−ｃｏｕｍａｒｉｃ  ａｃｉｄ；ＣｏｕＣｏＡ，ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ−ＣｏＡ．
【図２３】改良された大腸菌からのナリンゲニンの生産を示す。（Ａ）は、ｐＴｒｃＣＤＦ−Ａｔ４ＣＬ１ｍ−ＡｔＣＨＩ−ＰｈＣＨＳプラスミドを有している菌株からのナリンゲニンの生産を示すが、この際、ｐ−クマル酸の経路を有している菌株の場合はＢＴＹ５  ｐＴＹ１３−ＨｉｓＴＡＬ菌株に形質転換され、そうではない場合はＢＬ２１（ＤＥ３）菌株に形質転換された後、２ｍＭのｐ−クマル酸が培地に添加された。それぞれ２０ｇ／Ｌのブドウ糖またはグリセロールが添加された。（Ｂ）は、外来酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。Ａｔ４ＣＬ１ｍ，ＰｈＣＨＳ（４２．６  ｋＤａ），ＡｔＣＨＩ（２６．６  ｋＤａ）。
【図２４】改良された大腸菌から生産されたナリンゲニンの真偽を判断するために行ったＬＣ−ＭＳ結果である。（Ａ）は、改良された大腸菌から生産されたナリンゲニン、（Ｂ）は、市販されているナリンゲニン化合物のＬＣ−ＭＳスペクトルを示す。
【図２５】改良された大腸菌からのナリンゲニンの生産を示す。（Ａ）実施例２．１で選別された１４種の合成調節ｓＲＮＡを、基本ナリンゲニン菌株（ＢＴＹ５  ｐＴＹ１３−ＨｉｓＴＡＬ  ｐＴｒｃＣＤＦ−Ａｔ４ＣＬ１ｍ−ＡｔＣＨＩ−ＰｈＣＨＳ）に形質転換した後、フラスコ培養して生産されたナリンゲニンの生産量。より濃い赤色グラフで示された３種の菌株に該当するｓＲＮＡは、対照群に比べてナリンゲニン生産能が１５％以上増産されたため、二重同時ノックダウンテストに用いられた。（Ｂ）上記で選別された３種のｓＲＮＡを組み合わせ、二重同時ノックダウンテストを行った結果。＊Ｐ  ＜  ０．０５，＊＊Ｐ  ＜  ０．０１（ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
他の方式で定義されない限り、本明細書において使用されたあらゆる技術的・科学的用語は、本発明が属する技術分野に熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。通常、本明細書において使用された命名法及び以下で詳述する實驗方法は、本技術分野において周知であり、しかも汎用されるものである。
【００２２】
本発明では、タイプＩＩＩポリケチド合成酵素が導入された組換え微生物を活用する場合、従来のマロニル−ＣｏＡ濃度を測定する方法に比べて、時間、コスト、便利性などが著しく改善されたマロニル−ＣｏＡ濃度の測定が可能であることを確認した。
【００２３】
したがって、本発明は、一観点において、タイプＩＩＩポリケチド合成酵素をコードする遺伝子がゲノムに挿入されているか；または、タイプＩＩＩポリケチド合成酵素をコードする遺伝子を含む組換えベクターが導入されている、マロニル−ＣｏＡ検出用の組換え微生物に関する。
【００２４】
本発明において、前記タイプＩＩＩポリケチド合成酵素は、ストレプトミセス・グリゼウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトミセス・  コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトミセス・エバミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、サッカロポリスポラ・エリスラエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ）、ストレプトミセス・ペウセティウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ）、およびストレプトミセス・アクレオラタス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｃｕｌｅｏｌａｔｕｓ）で構成された群から選択される微生物由来のＲｐｐＡ；
シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）由来のＰｈｌＤ（ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）；
アミコラトプシス・メディテラネイ（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ）  由来のＤｐｇＡ（ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）；
ショウヨウダイオウ（Ｒｈｅｕｍ  ｐａｌｍａｔｕｍ）由来のＡＬＳ（ａｌｏｅｓｏｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）；または  
アロエアルボレスケンス（Ａｌｏｅ  ａｒｂｏｒｅｓｃｅｎｓ）由来のＰＣＳ（５，７−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｍｅｔｈｙｌｃｈｒｏｍｏｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ＯＫＳ（ｏｃｔａｋｅｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ＰＫＳ３（ａｌｏｅｓｏｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ＰＫＳ４（ｏｃｔａｋｅｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ２）  または  ＰＫＳ５（ｏｃｔａｋｅｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ３）であってもよいがこれに限定されない。
【００２５】
上述の６種の放線菌から由来したタイプＩＩＩポリケチド合成酵素ＲｐｐＡは、何れもマロニル−ＣｏＡを基質としフラビオリンを産物として生産する。また、他のタイプＩＩＩポリケチド合成酵素も何れもマロニル−ＣｏＡを基質として使用するがＰｈｌＤはフロログルシノールを産物として、ＤｐｇＡは  ジヒドロキシフェニル酢酸（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｃｅｔａｔｅ）を産物として、ＰＣＳは５，７−ジヒドロキシ−２−メチルクロモン（５，７−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｍｅｔｈｙｌｃｈｒｏｍｏｎｅ）を産物として、そしてＯＫＳ，ＰＫＳ４およびＰＫＳ５はＳＥＫ４とＳＥＫ４ｂを産物として生産する。ＡＬＳとＰＫＳ３はアロエソンを産物として生産する。
【００２６】
本発明で使用された各ＲｐｐＡ酵素のミノ酸配列は次のとおりである：  
ストレプトミセス・グリゼウスＲｐｐＡ[配列番号９３]: matlcrpaia vpehvitmqq tldlaretha ghpqrdlvlr liqntgvqtr hlvqpiektl ahpgfevrnq vyeaeaktrv pevvrralan aetepseidl ivyvsctgfm mpsltawiin smgfrpetrq lpiaqlgcaa ggaainrahd fcvaypdsnv livscefcsl cyqptdigvg sllsnglfgd alsaavvrgq ggtgmrlern gshlvpdted wisyavrdtg fhfqldkrvp gtmemlapvl ldlvdlhgws vpnmdffivh aggprilddl chfldlppem frysratlte rgniassvvf dalarlfddg gaaesaqgli agfgpgitae vavgswakeg lgadvgrdld eleltagval sg
ストレプトミセス・セリカラーＲｐｐＡ[配列番号９４]: matlcrpsvs vpehvitmee tlelarrrht dhpqlplalr lientgvrtr hivqpiedtl ehpgfedrnk vyereaksrv paviqraldd aellatdidv iiyvsctgfm mpsltawlin emgfdsttrq ipiaqlgcaa ggaainrahd fctaypeana livacefcsl cyqptdlgvg sllcnglfgd giaaavvrgr ggtgvrlern gsylipkted wimydvkatg fhflldkrvp atmeplapal kelagehgwd asdldfyivh aggprilddl stflevdpha frfsratlte ygniasavvl dalrrlfdeg gveegargll agfgpgitae mslgcwqtad vrrgirqdvt rtaargvsrr vrqa
ストレプトミセス・エバミティリスＲｐｐＡ[配列番号９５]: matlckpavs vpehvitmee tlelarsrhp dhpqlplalr lientgvhtr hivqpieetl khpgfeernh vyeaeakarv pavvqralde aellttdidv iiyvsctgfm mpsltaylin smdfssdtrq ipiaqlgcaa ggsainrahd fctaypqana livacefcsl cyqptdlgvg sllsnglfgd giaaaavrgk ggtgitlern asylipktde wisydvratg fhflldkrvp gtmeplapal qelasqhgwd asdldfyiih aggprilddl skflrvppea frfsratlte ygniasavvl dalrrlfdeg gaehaargml agfgpgitae mslgrwhrtd ea
サッカロポリスポラ・エリスラエＲｐｐＡ［配列番号９６]: mavlctpava vpehvitvee tldlarrvha dhpqlplvlr lisntgvrer hlirpiedtl ehpgfevrnr iyeeqakqrv pavvrealds aelgpedidl ivyvsctgfm mpsltawlin smgfrmstrq lpiaqlgcaa ggaainrahd fctaypdana livscefcsl cyqptdddig sllsnglfgd avgaavvrgh ggtgvrlern assmipeted wisyavkatg fhfqldkrvp ktmeplapal ralaedhrwd vagldfyvih aggprilddl tkflgvpsea frhsratlaq ygniasavvl dalrriieeg rlesgargmi agfgpgitae msvgtwvphd vllhgehstt sapggnr
ストレプトミセス・ペウセティウスＲｐｐＡ[配列番号９７]: mrvpvavddl vapstmgerh tvidrgtsva avhtalpphr yaqsdlteli adlclepgad rallrrlhts agvrtrhlal pieqyaglgd fgqanaawlt vglalaeeal sgaldaaglt aadidllvct sitgvaapsl darlavrmgm radvkrvpvf glgcvggaag lgrlhdyllg hpddtavlls velcsltlqr dgslanlvag alfgdgaaav varggdagrr gagwpmvaat rghlypdteh llgwrigasg frvvvdagip dvvrthlggd lrnflathgl vpddigtwic hpggpkvlaa vgdalelpdg aldsswrsla gvgnlssasv lrvledvatr crpdpgtwgv llamgpgfca efvllrw
ストレプトミセス・アクレオラタスＲｐｐＡ[配列番号９８]: mprlckpavs apeytitmee tlefakqaha gkpqlplalr lirntgvlkr hivqpiektl ghpglternl iyeaeskkmc ppvieealqn admtardida iiyvsctgfl mpsltawlin kmgfrsdtrq ipiaqlgcaa ggaavnrahd fclahpgsnv livacelcsl cyqptaddig sllsdglfgd avaaavvrgn ggvgievern asylipntee wisysvrdtg fhfqldrrvp gtmeplapvl refakdhswd agkldfyivh aggprilddl arfldvdrqv frhswstlte ygniasavvf daarrlfeeg sakpdatgmi agfgpgitae malgtwgtdg tgtsn
【００２７】
本発明で使用された他のタイプＩＩＩポリケチド合成酵素のミノ酸配列は次のとおりである: 
シュードモナス・フルオレッセンスタイプＩＩＩポリケチド合成酵素（ＰｈｌＤ）［配列番号９９］：  
MSTLCKPSLL FPHYKITQQQ MIDHLEQLHD DHPRMALAKR MIQNTQVNER YLVLPIDELA VHTGFTHRSI VYEREARRMS SIAARQAIEN AGLTTDDIRM VAVTSCTGFM MPSLTAHLIN DLGLRTSTVQ LPIAQLGCVA GAAAINRAND FASLSPDNHA LIVSLEFSSL CYQPQDTKLH AFISAALFGD AVSACVMRAD DKAPGFKIAK TGSYFLPDSE HYIKYDVKDS GFHFTLDKAV MNSIKDVAPM MEELNFETFN QHCAQNDFFI FHTGGRKILD ELVLQLDLEP GRVAQSRDSL SEAGNIASVV VFDVLKRQFD SGPANGATGM LAAFGPGFTA EMAVGKWVA
アミコラトプシス・  オリエンタリスタイプＩＩＩポリケチド合成酵素（ＤｐｇＡ）［配列番号１００］：  
MDVSMTTGIE LTEELSVLNG LTEITRFAGV GTAVSETSYS QTELLDILDV EDPKIRSVFL NSAIDRRFLT LPPENPGGGR LAEPQGDLLD KHKKIAVDMG CRALEACLKS AGATLSDLRH LCCVTSTGFL TPGLSALIIR EMGIDPHCSR SDIVGMGCNA GLNALNVVSG WSAAHPGELG VVLCSEACSA AYALDGTMRT AVVNSLFGDG SAALAVISGD GRVAGPRVLK FASYIITDAV DAMRYDWDRD QDRFSFFLDP QIPYVVGAHA EIVVDRLLSG TGLRRSDIGH WLVHSGGKKV VDAVVVNLGL SRHDVRHTTG VLRDYGNLSS GSFLFSYERL SEEDVTRPGD YGVLMTMGPG STIEMALIQW
ショウヨウダイオウタイプＩＩＩポリケチド合成酵素（ａｌｏｅｓｏｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＡＬＳ）［配列番号１０１］：
madvlqeirn sqkasgpatv laigtahppt cypqadypdf yfrvcksehm tklkkkmqfi cdrsgirqrf mfhteenlgk npgmctfdgp slnarqdmli mevpklgaea aekaikewgq dksrithlif ctttsndmpg adyqfatlfg lnpgvsrtmv yqqgcfaggt vlrlvkdiae nnkgarvlvv cseivafafr gphedhidsl igqllfgdga aalvvgtdid esverpifqi msatqatipn slhtmalhlt eagltfhlsk evpkvvsdnm eelmleafkp lgitdwnsif wqvhpggrai ldkieeklel tkdkmrdsry ilseygnlts acvlfvmdem rkrsfregkq ttgdgyewgv aiglgpgltv etvvlrsvpip
アロエアルボレスケンスタイプＩＩＩポリケチド合成酵素（５，７−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｍｅｔｈｙｌｃｈｒｏｍｏｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＰＣＳ）［配列番号１０２]:
MSSLSNSLPL MEDVQGIRKA QKADGTATVM AIGTAHPPHI FPQDTYADVY FRATNSEHKV ELKKKFDHIC KKTMIGKRYF NYDEEFLKKY PNITSYDEPS LNDRQDICVP GVPALGTEAA VKAIEEWGRP KSEITHLVFC TSCGVDMPSA DFQCAKLLGL HANVNKYCIY MQGCYAGGTV MRYAKDLAEN NRGARVLVVC AELTIMMLRA PNETHLDNAI GISLFGDGAA ALIIGSDPII GVEKPMFEIV CTKQTVIPNT EDVIHLHLRE TGMMFYLSKG SPMTISNNVE ACLIDVFKSV GITPPEDWNS LFWIPHPGGR AILDQVEAKL KLRPEKFRAA RTVLWDYGNM VSASVGYILD EMRRKSAAKG LETYGEGLEW GVLLGFGPGI TVETILLHSL PLM
アロエアルボレスケンスタイプＩＩＩポリケチド合成酵素（ｏｃｔａｋｅｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＯＫＳ）［配列番号１０３］：
MSSLSNASHL MEDVQGIRKA QRADGTATVM AIGTAHPPHI FPQDTYADFY FRATNSEHKV ELKKKFDRIC KKTMIGKRYF NYDEEFLKKY PNITSFDEPS LNDRQDICVP GVPALGAEAA VKAIAEWGRP KSEITHLVFC TSCGVDMPSA DFQCAKLLGL RTNVNKYCVY MQGCYAGGTV MRYAKDLAEN NRGARVLVVC AELTIIGLRG PNESHLDNAI GNSLFGDGAA ALIVGSDPII GVEKPMFEIV CAKQTVIPNS EDVIHLHMRE AGLMFYMSKD SPETISNNVE ACLVDVFKSV GMTPPEDWNS LFWIPHPGGR AILDQVEAKL KLRPEKFRAT RTVLWDCGNM VSACVLYILD EMRRKSADEG LETYGEGLEW GVLLGFGPGM TVETILLHSL PLM
アロエアルボレスケンスタイプＩＩＩポリケチド合成酵素（ａｌｏｅｓｏｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＰＫＳ３）［配列番号１０４］：
mgslsdstpl mkdvqgirka qkadgtatvm aigtahpphi isqdsyadfy frvtnsehkv elkkkfdric kktmigkryf nfdeeflkky pnitsfdkps lndrhdicip gvpalgaeaa vkaieewgrp kseithlvfc tsggvdmpsa dfqcakllgl rtnvnkyciy mqgcyaggtv mryakdlaen nrgarvlmvc aeltiialrg pndshidnai gnslfgdgaa alivgsdpii gvekpmfeiv cakqtvipns eevihlhlre sglmfymtkd saatisnnie aclvdvfksv gmtppedwns lfwiphpggr aildqveakl klrpekfsat rtvlwdygnm isacvlyild emrrksaaeg letygeglew gvllgfgpgm tietillhsl ppv
アロエアルボレスケンスタイプＩＩＩポリケチド合成酵素（ｏｃｔａｋｅｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ２，ＰＫＳ４）［配列番号１０５］：
MGSLSNYSPV MEDVQAIRKA QKADGTATVM AIGTAHPPHI FPQDTYADFY FRATNSEHKV ELKKKFDRIC KKTMIGKRYF NYDEEFLKKY PNITSFDEPS LNDRQDICVP GVPALGAEAA VKAIAEWGRP KSEITHLVFC TSCGVDMPSA DFQCAKLLGL RTNVNKYCVY MQGCYAGGTV MRYAKDLAEN NRGARVLVVC AELTIIGLRG PNESHLDNAI GNSLFGDGAA ALIVGSDPII GVERPMFEIV CAKQTVIPNS EDVIHLHMRE AGLMFYMSKD SPETISNNVE ACLVDVFKSV GMTPPEDWNS LFWIPHPGGR AILDQVEARL KLRPEKFGAT RTVLWDCGNM VSACVLYILD EMRRKSVADG LATYGEGLEW GVLLGFGPGM TVETILLHSL PPV
アロエアルボレスケンスタイプＩＩＩポリケチド合成酵素（ｏｃｔａｋｅｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ３，ＰＫＳ５）［配列番号１０６］：
MGSIAESSPL MSRENVEGIR KAQRAEGTAT VMAIGTAHPP HIFPQDTYAD FYFRATNSEH KVELKKKFDR ICKKTMIGKR YFNYDEEFLK KYPNITSFDE PSLNDRQDIC VPGVPALGKE AALKAIEEWG QPLSKITHLV FCTSCGVDMP SADFQLAKLL GLNTNVNKYC VYMQGCYAGG TVLRYAKDLA ENNRGSRVLV VCAELTIIGL RGPNESHLDN AIGNSLFGDG AAALIVGADP IVGIEKPIFE IVCAKQTVIP DSEDVIHLHL REAGLMFYMS KDSPETISNN VEGCLVDIFK SVGMTPPADW NSLFWIPHPG GRAILDEVEA RLKLRPEKFR ATRHVLWEYG NMVSACVLYI LDEMRNKSAA DGLGTYGEGL EWGVLLGFGP GMTVETILLH SLPPV
【００２８】
前記記載されたタイプＩＩＩポリケチド合成酵素のアミノ酸配列は、本発明のマロニル−ＣｏＡ検出用の組換え微生物を作製するための、一部の実施可能な酵素を例示したものであって、本発明は、タイプＩＩＩポリケチド合成酵素の導入によってマロニル−ＣｏＡ検出が可能であるという点に技術的特徴がある。したがって、前記記載された配列のタイプＩＩＩポリケチド合成酵素以外の他の種類のタイプＩＩＩポリケチド合成酵素が導入された組換え微生物の作製が可能であるということは、当業者にとって自明である。
【００２９】
本発明において、前記タイプＩＩＩポリケチド合成酵素をコードする遺伝子は、ｔａｃ、ｔｒｃ、Ｔ７、ＢＡＤ、λＰＲ、およびアンダーソン合成プロモーターで構成された群から選択されるプロモーターに作動可能であるように連結されていることを特徴とするが、これに限定されない
【００３０】
本発明において、前記組換え微生物は、大腸菌、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ），ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ），ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ），カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ），エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ），エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ），パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ），マンヘミア（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ），アクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ），アグリゲイティバクター（Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ），キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ），ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ），シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ），アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ），アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ），ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ），アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ），ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ），ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ），バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ），スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ），ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ），ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ），ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ），クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ），コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ），ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ），ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ），シアノバクテリウム（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）  および  サイクロバクテリウム（Ｃｙｃｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）で構成された菌株群から選択して適用可能であるが、本発明が適用可能な微生物がこれに限定されるものではない。好ましくは、本発明の組換え微生物は、大腸菌、シュードモナス種、コリネバクテリウム種、およびロドコッカス種からなる群から選択される微生物に、組換えベクターが導入されて作製可能であるが、これに限定されない。また、大腸菌としては、下記表２に記載の大腸菌株のうち１種を選択して使用することが好ましいが、当業者が類似の効果が発揮すると予想可能な範囲内で、他の大腸菌株を用いても良い。シュードモナス菌株としてはシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、コリネバクテリウム菌株としてはコリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ロドコッカス菌株としてはロドコッカス・オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ）を用いて組換え微生物を作製可能であるが、これは代表的な微生物を例示したものであって、本発明が適用可能な微生物がこれに限定されるものではない。
【００３１】
一方、本発明では、タイプＩＩＩポリケチド合成酵素をコードする遺伝子がゲノムに挿入されているか；または、タイプＩＩＩポリケチド合成酵素をコードする遺伝子を含む組換えベクターが導入されている、マロニル−ＣｏＡ検出用の組換え微生物を用いる場合、マロニル−ＣｏＡの濃度依存的な発色現象から、マロニル−ＣｏＡの生産量の多少を容易に確認することができ、マロニル−ＣｏＡ生産誘導物質を容易にスクリーニングすることもできる。
【００３２】
したがって、本発明は、他の観点において、下記ステップを含むマロニル−ＣｏＡ生産誘導物質のスクリーニング方法に関する。
（ａ）前記組換え微生物を培養するステップと、
（ｂ）前記組換え微生物に候補物質を添加するステップと、
（ｃ）前記候補物質添加後の組換え微生物の培養上清の色と、前記候補物質を添加していない組換え微生物の培養上清の色とを比較するステップと、
（ｄ）前記候補物質添加後の組換え微生物の培養上清が、前記候補物質を添加していない組換え微生物の培養上清に比べてより濃い赤色を呈する場合、前記候補物質をマロニル−ＣｏＡ生産誘導物質として選択するステップ。
【００３３】
本発明において、ステップ（ｃ）の色の変化は、目視で明確に観察可能であり、吸光度を測定して、その変化を定量的に表現してもよい。
【００３４】
したがって、前記ステップ（ｃ）の色の変化は、目視で行ってもよい。
【００３５】
また、前記ステップ（ｃ）の色の比較は、吸光度を測定して行い、前記ステップ（ｄ）において、前記候補物質添加後に測定された吸光度が、前記候補物質を添加せずに測定された吸光度に比べてより増加する場合、前記候補物質をマロニル−ＣｏＡ生産誘導物質として選択してもよい。
【００３６】
本発明において、吸光度は、２８０〜４５０ｎｍ、好ましくは３００〜３４０ｎｍ付近でのＯＤ値を比較してもよく、マロニル−ＣｏＡ濃度が高いと、ＯＤ値が高く現れる。
【００３７】
前記マロニル−ＣｏＡ生産誘導物質は、マロニル−ＣｏＡ生産能増加に関与する遺伝子の発現を調節する機序によりマロニル−ＣｏＡの生産を誘導することができる。
【００３８】
したがって、本発明は、さらに他の観点において、下記ステップを含む、マロニル−ＣｏＡ生産能の増加に関与する遺伝子のスクリーニング方法に関する：
（ａ）前記組換え微生物に、前記組換え微生物中の遺伝子の発現を変化させる遺伝子調節ライブラリを導入することで、組換え微生物中の遺伝子の発現が変化された組換え微生物ライブラリを作製するステップと、
（ｂ）前記作製された組換え微生物ライブラリを培養して組換え微生物ライブラリの培養上清の吸光度を測定し、遺伝子調節ライブラリを導入する前の組換え微生物を培養して前記組換え微生物ライブラリの培養上清の色と、前記遺伝子調節ライブラリを導入する前の組換え微生物の培養上清の色を比較するステップと、
（ｃ）前記組換え微生物ライブラリの培養上清の色が前記遺伝子調節ライブラリを導入する前の組換え微生物の培養上清の色に比べて濃い赤色を呈する場合、組換え微生物ライブラリに導入した遺伝子を、マロニル−ＣｏＡ生産能の増加に関与する遺伝子として選択するステップ。
【００３９】
本発明において、ステップ（ｃ）の色の変化は、目視で明確に観察可能であり、吸光度を測定して、その変化を定量的に表現してもよい。
【００４０】
したがって、前記ステップ（ｃ）の色の比較は、目視で行ってもよい。
【００４１】
また、前記ステップ（ｂ）の色は、吸光度を測定して比較し、前記ステップ（ｃ）では、前記組換え微生物ライブラリの培養上清の吸光度が前記遺伝子調節ライブラリを導入する前の組換え微生物の培養上清の吸光度に比べて増加する場合、組換え微生物ライブラリに導入した遺伝子を、マロニル−ＣｏＡ生産能の増加に関与する遺伝子として選択してもよい。
【００４２】
本発明において、吸光度は、２８０〜４５０ｎｍ、好ましくは３００〜３４０ｎｍ付近でのＯＤ値を比較してもよく、マロニル−ＣｏＡ濃度が高いと、ＯＤ値が高く現れる。
【００４３】
本発明において、前記遺伝子調節ライブラリは、ｓＲＮＡライブラリ、ゲノムライブラリ、ｃＤＮＡライブラリ、ｇＲＮＡライブラリおよびノックアウトまたは突然変異菌株作製用のオリゴヌクレオチドライブラリで構成された群から選択されるライブラリであってもよいが、これに限定されない。
【００４４】
具体的に、本発明の目的達成のために、前記遺伝子調節ライブラリは、組換え微生物の内在的遺伝子の発現を抑制するためのｓＲＮＡライブラリ、または、ノックアウトまたは突然変異菌株作製用のオリゴヌクレオチドライブラリ；
内在的または外来遺伝子の過発現のためのライブラリであるゲノムライブラリ（ｇｅｎｏｍｉｃ  ｌｉｂｒａｒｙ）、またはｃＤＮＡライブラリ；または
遺伝子の発現の抑制または過発現の両方が可能なライブラリであるｇＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ）−Ｃａｓ９技術で用いられるガイドＲＮＡ）ライブラリから適宜選択されてもよい。
【００４５】
すなわち、下記実施例２で説明する合成調節ｓＲＮＡライブラリの添加は、本発明を詳細に説明するための一つの例示としてその利用方法を提示したものであり、類似の機能を発揮すると報告された他の如何なるライブラリの導入も可能であろう。
【００４６】
一方、前記方法により選別された遺伝子を微生物でノックダウンすると、微生物中のマロニル−ＣｏＡ生産量を増加させることができる。したがって、本発明は、さらに他の観点において、マロニル−ＣｏＡ生産能を有している微生物で、前記方法により選別された遺伝子の発現を調節することを特徴とする、マロニル−ＣｏＡ生産能が増加された組換え微生物の製造方法に関する。
【００４７】
「マロニル−ＣｏＡ生産能を有している微生物」とは、マロニル−ＣｏＡ生産能を内在的に有しているか、マロニル−ＣｏＡ生産能が外部から導入された微生物を意味する。
【００４８】
本発明において、前記選別された遺伝子は、
ｆａｂＦ（３−オキソアシル−［アシル−キャリア−プロテイン］合成酵素ＩＩ（３−ｏｘｏａｃｙｌ−［ａｃｙｌ−ｃａｒｒｉｅｒ−ｐｒｏｔｅｉｎ］  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ＩＩ））；
ｙｆｃＹ（β‐ケトアシルＣｏＡチオラーゼ（ｂｅｔａ−ｋｅｔｏａｃｙｌ−ＣｏＡ  ｔｈｉｏｌａｓｅ））；
ｘａｐＲ（ｘａｐＡＢの転写活性化因子）；
ｃｙｔＲ（ｄｅｏオペロンｕｄｐ，ｃｄｄ，ｔｓｘ，ｎｕｐＣおよびｎｕｐＧに対する転写抑制因子）；
ｆａｂＨ（３−オキソアシル−［アシル−キャリア−プロテイン］合成酵素ＩＩＩ（３−ｏｘｏａｃｙｌ−［ａｃｙｌ−ｃａｒｒｉｅｒ−ｐｒｏｔｅｉｎ］  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ＩＩＩ））；
ｍｑｏ（リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｍａｌａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ））；
ｙｆｉＤ（ピルビン酸ギ酸リアーゼサブユニット（ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｆｏｒｍａｔｅ  ｌｙａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ））；
ｆｍｔ（１０−ホルミルテトラヒドロ葉酸：Ｌ−メチオニル−ｔＲＮＡ（ｆＭｅｔ）Ｎ−ホルミルトランスフェラーゼ（１０−ｆｏｒｍｙｌｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ：Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｙｌ−ｔＲＮＡ（ｆＭｅｔ）Ｎ−ｆｏｒｍｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ））；
ｐｙｒＦ（オロチジン５’−リン酸脱炭酸酵素（ｏｒｏｔｉｄｉｎｅ−５’−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ））；
ａｒａＡ（Ｌ−アラビノースイソメラーゼ（Ｌ−ａｒａｂｉｎｏｓｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ））；
ｆａｄＲ（ｆａｄレギュロンに対するネガティブレギュレーターであり、ｆａｂＡレギュロンに対するポジティブレギュレーター）；
ｐａｂＡ（アミノデオキシコリスマート合成酵素、サブユニットＩＩ（ａｍｉｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｒｉｓｍａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ，ｓｕｂｕｎｉｔ  ＩＩ））；
ｐｕｒＢ（アデニロコハク酸リアーゼ（ａｄｅｎｙｌｏｓｕｃｃｉｎａｔｅ  ｌｙａｓｅ））；および  
ｈｙｃＩ（ＨｙｃＥのＣ末端処理に関係するプロテアーゼ）で構成された群から選択される一つ以上の遺伝子であり、
前記遺伝子の発現を調節する減少させてもよいが、これに限定されない。
【００４９】
本発明において、ｆａｂＦは３−オキソアシル−［アシル−キャリア−プロテイン］合成酵素ＩＩ（３−ｏｘｏａｃｙｌ−［ａｃｙｌ−ｃａｒｒｉｅｒ−ｐｒｏｔｅｉｎ］ｓｙｎｔｈａｓｅ  ＩＩ）を、ｙｆｃＹはβ−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ（ｂｅｔａ−ｋｅｔｏａｃｙｌ−ＣｏＡ  ｔｈｉｏｌａｓｅ）を、ｘａｐＲはｘａｐＡＢの転写活性因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｘａｐＡＢ）を、ｃｙｔＲはｄｅｏ、ｕｄｐ、ｃｄｄ、ｔｓｘ、ｎｕｐＣ、ｎｕｐＧに対する転写抑制因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ  ｆｏｒ  ｄｅｏ  ｏｐｅｒｏｎ、ｕｄｐ、ｃｄｄ、ｔｓｘ、ｎｕｐＣ、ｎｕｐＧ）を、ｆａｂＨは３−オキソアシル−［アシル−キャリア−プロテイン］合成酵素ＩＩＩ（３−ｏｘｏａｃｙｌ−［ａｃｙｌ−ｃａｒｒｉｅｒ−ｐｒｏｔｅｉｎ］ｓｙｎｔｈａｓｅ  ＩＩＩ）を、ｍｑｏはリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｍａｌａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を、ｙｆｉＤはピルビン酸ギ酸リアーゼ（ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｆｏｒｍａｔｅ  ｌｙａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ）を、ｆｍｔは１０−ホルミルテトラヒドロ葉酸：Ｌ−メチオニル−ｔＲＮＡ（ｆＭｅｔ）Ｎ−ホルミルトランスフェラーゼ（１０−ｆｏｒｍｙｌｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ：Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｙｌ−ｔＲＮＡ（ｆＭｅｔ）Ｎ−ｆｏｒｍｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）を、ｐｙｒＦはオロチジン−５´リン酸デカルボキシラーゼ（ｏｒｏｔｉｄｉｎｅ−５´−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）を、ａｒａＡはＬ−アラビノースイソメラーゼ（Ｌ−ａｒａｂｉｎｏｓｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）を、ｆａｄＲはｆａｄの負調節因子およびｆａｂＡの正調節因子（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｆｏｒ  ｆａｄ  ｒｅｇｕｌｏｎ  ａｎｄ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｆａｂＡ）を、ｐａｂＡはアミノデオキシコリスミ酸合成酵素、サブユニットＩＩ（ａｍｉｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｒｉｓｍａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ、ｓｕｂｕｎｉｔ  ＩＩ）を、ｐｕｒＢはアデニロスクシネートリアーゼ（ａｄｅｎｙｌｏｓｕｃｃｉｎａｔｅ  ｌｙａｓｅ）を、そして、ｈｙｃＩはＨｙｃＥのＣ−末端に作用するタンパク質分解酵素（ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｅｎｄ  ｏｆ  ＨｙｃＥ）をそれぞれコードする。
【００５０】
本発明で選別されて用いられる各酵素のアミノ酸配列は下記のとおりであるが、これらのアミノ酸配列において、１つ以上のアミノ酸配列が置換、欠失、付加されても、最終変異アミノ酸配列は、本発明と同等もしくはそれ以上の機能を発揮してもよい。例えば、変異アミノ酸配列の構造的形態が野生型アミノ酸配列と同一もしくは類似し、基質に対して同等もしくはそれ以上の効果を発揮する場合であれば、該当変異アミノ配列も本発明の権利範囲に含まれるということは、自明であろう。同じ文脈で、本発明で用いられた酵素以外にも、同一もしくは類似の機能を有する他の微生物由来の酵素を本発明に適宜応用可能であり、当業者が容易に応用可能な範囲内で、該酵素の適用が本発明の権利範囲に含まれるということは、自明であろう。
【００５１】
ＦａｂＦ［配列番号１０７］：
MSKRRVVVTGLGMLSPVGNTVESTWKALLAGQSGISLIDHFDTSAYATKFAGLVKDFNCEDIISRKEQRKMDAFIQYGIVAGVQAMQDSGLEITEENATRIGAAIGSGIGGLGLIEENHTSLMNGGPRKISPFFVPSTIVNMVAGHLTIMYGLRGPSISIATACTSGVHNIGHAARIIAYGDADVMVAGGAEKASTPLGVGGFGAARALSTRNDNPQAASRPWDKERDGFVLGDGAGMLVLEEYEHAKKRGAKIYAELVGFGMSSDAYHMTSPPENGAGAALAMANALRDAGIEASQIGYVNAHGTSTPAGDKAEAQAVKTIFGEAASRVLVSSTKSMTGHLLGAAGAVESIYSILALRDQAVPPTINLDNPDEGCDLDFVPHEARQVSGMEYTLCNSFGFGGTNGSLIFKKI
ＹｆｃＹ［配列番号１０８］：
MGQVLPLVTRQGDRIAIVSGLRTPFARQATAFHGIPAVDLGKMVVGELLARSEIPAEVIEQLVFGQVVQMPEAPNIAREIVLGTGMNVHTDAYSVSRACATSFQAVANVAESLMAGTIRAGIAGGADSSSVLPIGVSKKLARVLVDVNKARTMSQRLKLFSRLRLRDLMPVPPAVAEYSTGLRMGDTAEQMAKTYGITREQQDALAHRSHQRAAQAWSDGKLKEEVMTAFIPPYKQPLVEDNNIRGNSSLADYAKLRPAFDRKHGTVTAANSTPLTDGAAAVILMTESRAKELGLVPLGYLRSYAFTAIDVWQDMLLGPAWSTPLALERAGLTMSDLTLIDMHEAFAAQTLANIQLLGSERFAREALGRAHATGEVDDSKFNVLGGSIAYGHPFAATGARMITQTLHELRRRGGGFGLVTACAAGGLGAAMVLEAE
ＸａｐＲ［配列番号１０９］：
MERVYRTDLKLLRYFLAVAEELHFGRAAARLNMSQPPLSIHIKELENQLGTQLFIRHSRSVVLTHAGKILMEESRRLLVNANNVLARIEQIGRGEAGRIELGVVGTAMWGRMRPVMRRFLRENPNVDVLFREKMPAMQMALLERRELDAGIWRMATEPPTGFTSLRLHESAFLVAMPEEHHLSSFSTVPLEALRDEYFVTMPPVYTDWDFLQRVCQQVGFSPVVIREVNEPQTVLAMVSMGIGITLIADSYAQMNWPGVIFRPLKQRIPADLYIVYETQQVTPAMVKLLAALTQ
ＣｙｔＲ［配列番号１１０］：
MKAKKQETAATMKDVALKAKVSTATVSRALMNPDKVSQATRNRVEKAAREVGYLPQPMGRNVKRNESRTILVIVPDICDPFFSEIIRGIEVTAANHGYLVLIGDCAHQNQQEKTFIDLIITKQIDGMLLLGSRLPFDASIEEQRNLPPMVMANEFAPELELPTVHIDNLTAAFDAVNYLYEQGHKRIGCIAGPEEMPLCHYRLQGYVQALRRCGIMVDPQYIARGDFTFEAGSKAMQQLLDLPQPPTAVFCHSDVMALGALSQAKRQGLKVPEDLSIIGFDNIDLTQFCDPPLTTIAQPRYEIGREAMLLLLDQMQGQHVGSGSRLMDCELIIRGSTRALP
ＦａｂＨ［配列番号１１１］：
MYTKIIGTGSYLPEQVRTNADLEKMVDTSDEWIVTRTGIRERHIAAPNETVSTMGFEAATRAIEMAGIEKDQIGLIVVATTSATHAFPSAACQIQSMLGIKGCPAFDVAAACAGFTYALSVADQYVKSGAVKYALVVGSDVLARTCDPTDRGTIIIFGDGAGAAVLAASEEPGIISTHLHADGSYGELLTLPNADRVNPENSIHLTMAGNEVFKVAVTELAHIVDETLAANNLDRSQLDWLVPHQANLRIISATAKKLGMSMDNVVVTLDRHGNTSAASVPCALDEAVRDGRIKPGQLVLLEAFGGGFTWGSALVRF
Ｍｑｏ［配列番号１１２］：
MKKVTAMLFSMAVGLNAVSMAAKAKASEEQETDVLLIGGGIMSATLGTYLRELEPEWSMTMVERLEGVAQESSNGWNNAGTGHSALMELNYTPQNADGSISIEKAVAINEAFQISRQFWAHQVERGVLRTPRSFINTVPHMSFVWGEDNVNFLRARYAALQQSSLFRGMRYSEDHAQIKEWAPLVMEGRDPQQKVAATRTEIGTDVNYGEITRQLIASLQKKSNFSLQLSSEVRALKRNDDNTWTVTVADLKNGTAQNIRAKFVFIGAGGAALKLLQESGIPEAKDYAGFPVGGQFLVSENPDVVNHHLAKVYGKASVGAPPMSVPHIDTRVLDGKRVVLFGPFATFSTKFLKNGSLWDLMSSTTTSNVMPMMHVGLDNFDLVKYLVSQVMLSEEDRFEALKEYYPQAKKEDWRLWQAGQRVQIIKRDAEKGGVLRLGTEVVSDQQGTIAALLGASPGASTAAPIMLNLLEKVFGDRVSSPQWQATLKAIVPSYGRKLNGDVAATERELQYTSEVLGLNYDKPQAADSTPKPQLKPQPVQKEVADIAL
ＹｆｉＤ［配列番号１１３］：
MITGIQITKAANDDLLNSFWLLDSEKGEARCIVAKAGYAEDEVVAVSKLGDIEYREVPVEVKPEVRVEGGQHLNVNVLRRETLEDAVKHPEKYPQLTIRVSGYAVRFNSLTPEQQRDVIARTFTESL
Ｆｍｔ［配列番号１１４］：
MSESLRIIFAGTPDFAARHLDALLSSGHNVVGVFTQPDRPAGRGKKLMPSPVKVLAEEKGLPVFQPVSLRPQENQQLVAELQADVMVVVAYGLILPKAVLEMPRLGCINVHGSLLPRWRGAAPIQRSLWAGDAETGVTIMQMDVGLDTGDMLYKLSCPITAEDTSGTLYDKLAELGPQGLITTLKQLADGTAKPEVQDETLVTYAEKLSKEEARIDWSLSAAQLERCIRAFNPWPMSWLEIEGQPVKVWKASVIDTATNAAPGTILEANKQGIQVATGDGILNLLSLQPAGKKAMSAQDLLNSRREWFVPGNRLV
ＰｙｒＦ［配列番号１１５］：
MTLTASSSSRAVTNSPVVVALDYHNRDDALAFVDKIDPRDCRLKVGKEMFTLFGPQFVRELQQRGFDIFLDLKFHDIPNTAAHAVAAAADLGVWMVNVHASGGARMMTAAREALVPFGKDAPLLIAVTVLTSMEASDLVDLGMTLSPADYAERLAALTQKCGLDGVVCSAQEAVRFKQVFGQEFKLVTPGIRPQGSEAGDQRRIMTPEQALSAGVDYMVIGRPVTQSVDPAQTLKAINASLQRSA
ＡｒａＡ［配列番号１１６］：
MTIFDNYEVWFVIGSQHLYGPETLRQVTQHAEHVVNALNTEAKLPCKLVLKPLGTTPDEITAICRDANYDDRCAGLVVWLHTFSPAKMWINGLTMLNKPLLQFHTQFNAALPWDSIDMDFMNLNQTAHGGREFGFIGARMRQQHAVVTGHWQDKQAHERIGSWMRQAVSKQDTRHLKVCRFGDNMREVAVTDGDKVAAQIKFGFSVNTWAVGDLVQVVNSISDGDVNALVDEYESCYTMTPATQIHGKKRQNVLEAARIELGMKRFLEQGGFHAFTTTFEDLHGLKQLPGLAVQRLMQQGYGFAGEGDWKTAALLRIMKVMSTGLQGGTSFMEDYTYHFEKGNDLVLGSHMLEVCPSIAAEEKPILDVQHLGIGGKDDPARLIFNTQTGPAIVASLIDLGDRYRLLVNCIDTVKTPHSLPKLPVANALWKAQPDLPTASEAWILAGGAHHTVFSHALNLNDMRQFAEMHDIEITVIDNDTRLPAFKDALRWNEVYYGFRR
ＡｒｇＣ［配列番号１１７］：
MLNTLIVGASGYAGAELVTYVNRHPHMNITALTVSAQSNDAGKLISDLHPQLKGIVDLPLQPMSDISEFSPGVDVVFLATAHEVSHDLAPQFLEAGCVVFDLSGAFRVNDATFYEKYYGFTHQYPELLEQAAYGLAEWCGNKLKEANLIAVPGCYPTAAQLALKPLIDADLLDLNQWPVINATSGVSGAGRKAAISNSFCEVSLQPYGVFTHRHQPEIATHLGADVIFTPHLGNFPRGILETITCRLKSGVTQAQVAQVLQQAYAHKPLVRLYDKGVPALKNVVGLPFCDIGFAVQGEHLIIVATEDNLLKGAAAQAVQCANIRFGYAETQSLI
ＦａｄＲ［配列番号１１８］：
MVIKAQSPAGFAEEYIIESIWNNRFPPGTILPAERELSELIGVTRTTLREVLQRLARDGWLTIQHGKPTKVNNFWETSGLNILETLARLDHESVPQLIDNLLSVRTNISTIFIRTAFRQHPDKAQEVLATANEVADHADAFAELDYNIFRGLAFASGNPIYGLILNGMKGLYTRIGRHYFANPEARSLALGFYHKLSALCSEGAHDQVYETVRRYGHESGEIWHRMQKNLPGDLAIQGR
ＮｕｄＤ［配列番号１１９］：
MFLRQEDFATVVRSTPLVSLDFIVENSRGEFLLGKRTNRPAQGYWFVPGGRVQKDETLEAAFERLTMAELGLRLPITAGQFYGVWQHFYDDNFSGTDFTTHYVVLGFRFRVSEEELLLPDEQHDDYRWLTSDALLASDNVHANSRAYFLAEKRTGVPGL
ＰａｂＡ［配列番号１２０］：
MILLIDNYDSFTWNLYQYFCELGADVLVKRNDALTLADIDALKPQKIVISPGPCTPDEAGISLDVIRHYAGRLPILGVCLGHQAMAQAFGGKVVRAAKVMHGKTSPITHNGEGVFRGLANPLTVTRYHSLVVEPDSLPACFDVTAWSETREIMGIRHRQWDLEGVQFHPESILSEQGHQLLANFLHR
ＰｕｒＢ［配列番号１２１］：
MELSSLTAVSPVDGRYGDKVSALRGIFSEYGLLKFRVQVEVRWLQKLAAHAAIKEVPAFAADAIGYLDAIVASFSEEDAARIKTIERTTNHDVKAVEYFLKEKVAEIPELHAVSEFIHFACTSEDINNLSHALMLKTARDEVILPYWRQLIDGIKDLAVQYRDIPLLSRTHGQPATPSTIGKEMANVAYRMERQYRQLNQVEILGKINGAVGNYNAHIAAYPEVDWHQFSEEFVTSLGIQWNPYTTQIEPHDYIAELFDCVARFNTILIDFDRDVWGYIALNHFKQKTIAGEIGSSTMPHKVNPIDFENSEGNLGLSNAVLQHLASKLPVSRWQRDLTDSTVLRNLGVGIGYALIAYQSTLKGVSKLEVNRDHLLDELDHNWEVLAEPIQTVMRRYGIEKPYEKLKELTRGKRVDAEGMKQFIDGLALPEEEKARLKAMTPANYIGRAITMVDELK
ＨｙｃＩ［配列番号１２２］：
MTDVLLCVGNSMMGDDGAGPLLAEKCAAAPKGNWVVIDGGSAPENDIVAIRELRPTRLLIVDATDMGLNPGEIRIIDPDDIAEMFMMTTHNMPLNYLIDQLKEDIGEVIFLGIQPDIVGFYYPMTQPIKDAVETVYQRLEGWEGNGGFAQLAVEEE
【００５２】
本発明において、前記組換え微生物は、大腸菌、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ），ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ），ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ），カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ），エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ），エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ），パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ），マンヘミア（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ），アクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ），アグリゲイティバクター（Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ），キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ），ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ），シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ），アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ），アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ），ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ），アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ），ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ），ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ），バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ），スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ），ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ），ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ），ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ），クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ），コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ），ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ），ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ），シアノバクテリウム（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）  および  サイクロバクテリウム（Ｃｙｃｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）で構成された菌株群から選択して適用可能であるが、本発明が適用可能な微生物がこれに限定されるものではない。好ましくは、本発明の微生物は、大腸菌、シュードモナス種、コリネバクテリウム種、およびロドコッカス種からなる群から選択される微生物に、組換えベクターが導入されて作製可能であるが、これに限定されない。また、大腸菌としては、下記表２に記載の大腸菌株のうち１種を選択して使用することが好ましいが、当業者が類似の効果が発揮すると予想可能な範囲内で、他の大腸菌株を用いても良い。シュードモナス菌株としてはシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、コリネバクテリウム菌株としてはコリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ロドコッカス菌株としてはロドコッカス・オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ）を用いて組換え微生物を作製可能であるが、これは代表的な微生物を例示したものであって、本発明が適用可能な微生物がこれに限定されるものではない。
【００５３】
また、前記スクリーニングされた遺伝子を用いると、本発明では、マロニル−ＣｏＡを基質または中間物質とする有用物質を、非常に単純な遺伝子操作のみにより高収率で生産することができる。
【００５４】
したがって、本発明は、さらに他の観点において、マロニル−ＣｏＡ生産能を有している微生物で、
ｆａｂＦ（３−オキソアシル−［アシル−キャリア−プロテイン］合成酵素ＩＩ（３−ｏｘｏａｃｙｌ−［ａｃｙｌ−ｃａｒｒｉｅｒ−ｐｒｏｔｅｉｎ］  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ＩＩ））；
ｙｆｃＹ（β‐ケトアシルＣｏＡチオラーゼ（ｂｅｔａ−ｋｅｔｏａｃｙｌ−ＣｏＡ  ｔｈｉｏｌａｓｅ））；
ｘａｐＲ（ｘａｐＡＢの転写活性化因子）；
ｃｙｔＲ（ｄｅｏオペロンｕｄｐ，ｃｄｄ，ｔｓｘ，ｎｕｐＣおよびｎｕｐＧに対する転写抑制因子）；
ｆａｂＨ（３−オキソアシル−［アシル−キャリア−プロテイン］合成酵素ＩＩＩ（３−ｏｘｏａｃｙｌ−［ａｃｙｌ−ｃａｒｒｉｅｒ−ｐｒｏｔｅｉｎ］  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ＩＩＩ））；
ｍｑｏ（リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｍａｌａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ））；
ｙｆｉＤ（ピルビン酸ギ酸リアーゼサブユニット（ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｆｏｒｍａｔｅ  ｌｙａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ））；
ｆｍｔ（１０−ホルミルテトラヒドロ葉酸：Ｌ−メチオニル−ｔＲＮＡ（ｆＭｅｔ）Ｎ−ホルミルトランスフェラーゼ（１０−ｆｏｒｍｙｌｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ：Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｙｌ−ｔＲＮＡ（ｆＭｅｔ）Ｎ−ｆｏｒｍｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ））；
ｐｙｒＦ（オロチジン５’−リン酸脱炭酸酵素（ｏｒｏｔｉｄｉｎｅ−５’−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ））；
ａｒａＡ（Ｌ−アラビノースイソメラーゼ（Ｌ−ａｒａｂｉｎｏｓｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ））；
ｆａｄＲ（ｆａｄレギュロンに対するネガティブレギュレーターであり、ｆａｂＡレギュロンに対するポジティブレギュレーター）；
ｐａｂＡ（アミノデオキシコリスマート合成酵素、サブユニットＩＩ（ａｍｉｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｒｉｓｍａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ，ｓｕｂｕｎｉｔ  ＩＩ））；
ｐｕｒＢ（アデニロコハク酸リアーゼ（ａｄｅｎｙｌｏｓｕｃｃｉｎａｔｅ  ｌｙａｓｅ））；および  
ｈｙｃＩ（ＨｙｃＥのＣ末端処理に関係するプロテアーゼ）で構成された群から選択された１つ以上の遺伝子の発現が野生型遺伝子に比べて減少されている、マロニル−ＣｏＡ生産能が増加された組換え微生物に関する。
【００５５】
「マロニル−ＣｏＡ生産能を有している微生物」とは、マロニル−ＣｏＡ生産能を内在的に有しているか、マロニル−ＣｏＡ生産能が外部から導入された微生物を意味する。
【００５６】
本発明は、また、下記ステップを含む、マロニル−ＣｏＡを基質または中間物質とする有用物質の生産方法に関する。
（ａ）前記組換え微生物に、有用物質の生産に関与する遺伝子をさらに導入し、もしくは当該遺伝子の発現を増加させ、または、有用物質の生産に関与する遺伝子をさらに欠損させ、もしくは当該遺伝子の発現を抑制させた組換え微生物を作製するステップと、
（ｂ）前記作製された微生物を培養するステップと、
（ｃ）前記培養された微生物から有用物質を回収するステップ。
【００５７】
本発明において、前記有用物質は、
アクチノロージン（ａｃｔｉｎｏｒｈｏｄｉｎ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、オキシテトラサイクリン（ｏｘｙｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）、ラパマイシン（ｒａｐａｍｙｃｉｎ）、ロバスタチン（ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ）、ＳＥＫ４、ＳＥＫ４ｂ、ＳＥＫ３４、ＳＥＫ１５、ＳＥＫ２６、ＦＫ５０６、ＤＭＡＣ、アクラビノン（ａｋｌａｖｉｎｏｎｅ）、アクラノン酸（ａｋｌａｎｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、エプシロンロドマイシノン（ｅｐｓｉｌｏｎ−ｒｈｏｄｏｍｙｃｉｎｏｎｅ）、アロエシン（ａｌｏｅｓｉｎ）、アロエニン（ａｌｏｅｎｉｎ）、バルバロイン（ｂａｒｂａｌｏｉｎ）、５，７−ジヒドロキシ−２−メチルクロモン（５，７−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｍｅｔｈｙｌｃｈｒｏｍｏｎｅ）、エリスロマイシン（ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）、リファマイシン（ｒｉｆａｍｙｃｉｎ）、エバーメクチン（ａｖｅｒｍｅｃｔｉｎ）、ゲルダナマイシン（ｇｅｌｄａｎａｍｙｃｉｎ）、イベルメクチン（ｉｖｅｒｍｅｃｔｉｎ）、ドキシサイクリン（ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ）、アントラマイシン（ａｎｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、ペニシリン酸（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｃ  ａｃｉｄ）、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、エポチロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）、テトラセノマイシン（ｔｅｔｒａｃｅｎｏｍｙｃｉｎ）、フレノリシン（ｆｒｅｎｏｌｉｃｉｎ）、トリ酢酸ラクトン（ｔｒｉａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｌａｃｔｏｎｅ）、６−メチルサリチル酸（６−ｍｅｔｈｙｌｓａｌｉｃｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）、およびアロエソン（ａｌｏｅｓｏｎｅ）からなるポリケチド系化合物；
ピノセムブリン（ｐｉｎｏｃｅｍｂｒｉｎ）、ジヒドロケンペロール（ｄｉｈｙｄｒｏｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ）、エリオジクチオール（ｅｒｉｏｄｉｃｔｙｏｌ）、ジヒドロケルセチン（ｄｉｈｙｄｒｏｑｕｅｒｃｅｔｉｎ）、ダイゼイン（ｄａｉｄｚｅｉｎ）、ゲニステイン（ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）、アピゲニン（ａｐｉｇｅｎｉｎ）、ルテオリン（ｌｕｔｅｏｌｉｎ）、ケンペロール（ｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ）、ケルセチン（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ）、カテキン（ｃａｔｅｃｈｉｎ）、ペラルゴニジン（ｐｅｌａｒｇｏｎｉｄｉｎ）、シアニジン（ｃｙａｎｉｄｉｎ）、アフゼレキン（ａｆｚｅｌｅｃｈｉｎ）、ミリセチン（ｍｙｒｉｃｅｔｉｎ）、フィセチン（ｆｉｓｅｔｉｎ）、ガランギン（ｇａｌａｎｇｉｎ）、ヘスペレチン（ｈｅｓｐｅｒｅｔｉｎ）、タンゲリチン（ｔａｎｇｅｒｉｔｉｎ）、デルフィニジン（ｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ）、エピカテキン（ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ）、クリシン（ｃｈｒｙｓｉｎ）、レスベラトロール（ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）、およびナリンゲニン（ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ）からなるフェニルプロパノイド系化合物；および
ペンタン（ｐｅｎｔａｎｅ）、ヘキサン（ｈｅｘａｎｅ）、ヘプタン（ｈｅｐｔａｎｅ）、オクタン（ｏｃｔａｎｅ）、ノナン（ｎｏｎａｎｅ）、デカン（ｄｅｃａｎｅ）、ウンデカン（ｕｎｄｅｃａｎｅ）、ドデカン（ｄｏｄｅｃａｎｅ）、トリデカン（ｔｒｉｄｅｃａｎｅ）、テトラデカン（ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｅ）、ペンタデカン（ｐｅｎｔａｄｅｃａｎｅ）、ヘキサデカン（ｈｅｘａｄｅｃａｎｅ）、ヘプタデカン（ｈｅｐｔａｄｅｃａｎｅ）、オクタデカン（ｏｃｔａｄｅｃａｎｅ）、ノナデカン（ｎｏｎａｄｅｃａｎｅ）、イコサン（ｉｃｏｓａｎｅ）、ペンタノール（ｐｅｎｔａｎｏｌ）、ヘキサノール（ｈｅｘａｎｏｌ）、ヘプタノール（ｈｅｐｔａｎｏｌ）、オクタノール（ｏｃｔａｎｏｌ）、ノナノール（ｎｏｎａｎｏｌ）、デカノール（ｄｅｃａｎｏｌ）、ウンデカノール（ｕｎｄｅｃａｎｏｌ）、ドデカノール（ｄｏｄｅｃａｎｏｌ）、トリデカノール（ｔｒｉｄｅｃａｎｏｌ）、テトラデカノール（ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｌ）、ペンタデカノール（ｐｅｎｔａｄｅｃａｎｏｌ）、ヘキサデカノール（ｈｅｘａｄｅｃａｎｏｌ）、ヘプタデカノール（ｈｅｐｔａｄｅｃａｎｏｌ）、オクタデカノール（ｏｃｔａｄｅｃａｎｏｌ）、ノナデカノール（ｎｏｎａｄｅｃａｎｏｌ）、イコサノール（ｉｃｏｓａｎｏｌ）、メチルカプレート（ｍｅｔｈｙｌ  ｃａｐｒａｔｅ）、メチルラウレート（ｍｅｔｈｙｌ  ｌａｕｒａｔｅ）、メチルミリステート（ｍｅｔｈｙｌ  ｍｙｒｉｓｔａｔｅ）、メチルパルミテート（ｍｅｔｈｙｌ  ｐａｌｍｉｔａｔｅ）、メチルパルミトレート（ｍｅｔｈｙｌ  ｐａｌｍｉｔｏｌｅａｔｅ）、メチルステアレート（ｍｅｔｈｙｌ  ｓｔｅａｒａｔｅ）、メチルオレート（ｍｅｔｈｙｌ  ｏｌｅａｔｅ）、メチルリノレート（ｍｅｔｈｙｌ  ｌｉｎｏｌｅａｔｅ）、メチルリノレネート（ｍｅｔｈｙｌ  ｌｉｎｏｌｅｎａｔｅ）、メチルアラキデート（ｍｅｔｈｙｌ  ａｒａｃｈｉｄａｔｅ）、メチルパウリネート（ｍｅｔｈｙｌ  ｐａｕｌｌｉｎａｔｅ）、メチルエルケート（ｍｅｔｈｙｌ  ｅｒｕｃａｔｅ）、エチルカプレート（ｅｔｈｙｌ  ｃａｐｒａｔｅ）、エチルラウレート（ｅｔｈｙｌ  ｌａｕｒａｔｅ）、エチルミリステート（ｅｔｈｙｌ  ｍｙｒｉｓｔａｔｅ）、エチルパルミテート（ｅｔｈｙｌ  ｐａｌｍｉｔａｔｅ）、エチルパルミトレート（ｅｔｈｙｌ  ｐａｌｍｉｔｏｌｅａｔｅ）、エチルステアレート（ｅｔｈｙｌ  ｓｔｅａｒａｔｅ）、エチルオレート（ｅｔｈｙｌ  ｏｌｅａｔｅ）、エチルリノレート（ｅｔｈｙｌ  ｌｉｎｏｌｅａｔｅ）、エチルリノレネート（ｅｔｈｙｌ  ｌｉｎｏｌｅｎａｔｅ）、エチルアラキデート（ｅｔｈｙｌ  ａｒａｃｈｉｄａｔｅ）、エチルパウリネート（ｅｔｈｙｌ  ｐａｕｌｌｉｎａｔｅ）、およびエチルエルケート（ｍｅｔｈｙｌ  ｅｒｕｃａｔｅ）からなるバイオ燃料群；
セラミド（ｃｅｒａｍｉｄｅ）、パルミテート（ｐａｌｍｉｔａｔｅ）、およびスフィンゴシン（ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ）からなる脂質系化合物；および
３−ヒドロキシプロピオン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）から選択される何れか１つ以上の有用物質であることを特徴とするが、これに限定されない。すなわち、上記に記載の有用物質だけでなく、他のマロニル−ＣｏＡ由来の天産物、化合物、バイオ燃料などの付加価値産物が、何れも本発明のバイオセンサー（すなわち、組換え微生物）に適用可能であると言える。
【００５８】
さらに、本発明は、前記組換え微生物に、６−メチルサリチル酸合成酵素（６−ｍｅｔｈｙｌｓａｌｉｃｙｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｙｎｔｈａｓｅ、６ＭＳＡＳ）および４´−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（４´−ｐｈｏｓｐｈｏｐａｎｔｅｔｈｅｉｎｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、Ｓｆｐ）をコードする遺伝子がさらに導入されるか、その発現が増加されている、６−メチルサリチル酸生産用組換え微生物に関する。
【００５９】
前記６ＭＳＡＳは、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐａｔｕｌｕｍ（またはＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｇｒｉｓｅｏｆｕｌｖｕｍ），Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｗｅｓｔｅｒｄｉｊｋｉａｅ，Ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｓ  ｎｉｖｅａ，Ｇｌａｒｅａ  ｌｏｚｏｙｅｎｓｉｓ，Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｅｘｐａｎｓｕｍ，または  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓから由来されてもよいが、これに限定されない。
前記Ｓｆｐは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ，Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ，Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ，Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ，Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａ，Ｓｔｉｇｍａｔｅｌｌａ  ａｕｒａｎｔｉａｃａ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｓ  またはＶｉｂｒｉｏ  ｈａｒｖｅｙｉから由来されてもよいが、これに限定されない。
【００６０】
前記発現が野生型遺伝子に比べて減少されている遺伝子は、ｐａｂＡ，ｆａｂＦ，ｘａｐＲおよびｙｔｃＹで構成された群から選択された一つ以上であってもよいが、これに限定されない。
【００６１】
前記６−メチルサリチル酸生産用組換え微生物は、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（Ｍｄｈ）、ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（ＳｅｒＡ）、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡｃｃＢＣおよびＡｃｃＤ１）、グリセルアルデヒド  ３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧａｐＡ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｐｇｋ）、アセチル−ＣｏＡシンテターゼ（Ａｃｓ）、およびピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ：ＡｃｅＥＦおよびＬｐｄ）で構成された群から選択される１つ以上の酵素をコードする遺伝子がさらに導入されるか、その発現が増加されていることを特徴とする。
【００６２】
前記Ｚｗｆ、Ｍｄｈ、ＳｅｒＡ、ＧａｐＡ、Ｐｇｋ、Ａｃｓ、ＡｃｅＥ、ＡｃｅＦ、およびＬｐｄは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉから由来されてもよいが、これに限定されない。ＡｃｃＢＣおよびＡｃｃＤ１は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍに由来してもよいが、これに限定されず、他の微生物由来のアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼに該当する酵素に拡張可能である。
【００６３】
本発明で選別されて用いられる各酵素のアミノ酸配列は下記のとおりであるが、これらのアミノ酸配列において、１つ以上のアミノ酸配列が置換、欠失、付加されても、最終変異アミノ酸配列は、本発明と同等もしくはそれ以上の機能を発揮してもよい。例えば、変異アミノ酸配列の構造的形態が野生型アミノ酸配列と同一もしくは類似し、基質に対して同等もしくはそれ以上の効果を発揮する場合であれば、該当変異アミノ配列も本発明の権利範囲に含まれるということは、自明であろう。同じ文脈で、本発明で用いられた酵素以外にも、同一もしくは類似の機能を有する他の微生物由来の酵素を本発明に適宜応用可能であり、当業者が容易に応用可能な範囲内で、該酵素の適用が本発明の権利範囲に含まれるということは、自明であろう。
【００６４】
Ｚｗｆ［配列番号１７１］：
MAVTQTAQACDLVIFGAKGDLARRKLLPSLYQLEKAGQLNPDTRIIGVGRADWDKAAYTKVVREALETFMKETIDEGLWDTLSARLDFCNLDVNDTAAFSRLGAMLDQKNRITINYFAMP
PSTFGAICKGLGEAKLNAKPARVVMEKPLGTSLATSQEINDQVGEYFEECQVYRIDHYLGKETVLNLLALRFANSLFVNNWDNRTIDHVEITVAEEVGIEGRWGYFDKAGQMRDMIQNHLLQILCMIAMSPPSDLSADSIRDEKVKVLKSLRRIDRSNVREKTVRGQYTAGFAQGKKVPGYLEEEGANKSSNTETFVAIRVDIDNWRWAGVPFYLRTGKRLPTKCSEVVVYFKTPELNLFKESWQDLPQNKLTIRLQPDEGVDIQVLNKVPGLDHKHNLQITKLDLSYSETFNQTHLADAYERLLLETMRGIQALFVRRDEVEEAWKWVDSITEAWAMDNDAPKPYQAGTWGPVASVAMITRDGRSWNEFE
Ｍｄｈ［配列番号１７２］：
MKVAVLGAAGGIGQALALLLKTQLPSGSELSLYDIAPVTPGVAVDLSHIPTAVKIKGFSGEDATPALEGADVVLISAGVARKPGMDRSDLFNVNAGIVKNLVQQVAKTCPKACIGIITNPVNTTVAIAAEVLKKAGVYDKNKLFGVTTLDIIRSNTFVAELKGKQPGEVEVPVIGGHSGVTILPLLSQVPGVSFTEQEVADLTKRIQNAGTEVVEAKAGGGSATLSMGQAAARFGLSLVRALQGEQGVVECAYVEGDGQYARFFSQPLLLGKNGVEERKSIGTLSAFEQNALEGMLDTLKKDIALGEEFVNK
ＳｅｒＡ［配列番号１７３］：
MAKVSLEKDKIKFLLVEGVHQKALESLRAAGYTNIEFHKGALDDEQLKESIRDAHFIGLRSRTHLTEDVINAAEKLVAIGCFCIGTNQVDLDAAAKRGIPVFNAPFSNTRSVAELVIGELLLLLRGVPEANAKAHRGVWNKLAAGSFEARGKKLGIIGYGHIGTQLGILAESLGMYVYFYDIENKLPLGNATQVQHLSDLLNMSDVVSLHVPENPSTKNMMGAKEISLMKPGSLLINASRGTVVDIPALCDALASKHLAGAAIDVFPTEPATNSDPFTSPLCEFDNVLLTPHIGGSTQEAQENIGLEVAGKLIKYSDNGSTLSAVNFPEVSLPLHGGRRLMHIHENRPGVLTALNKIFAEQGVNIAAQYLQTSAQMGYVVIDIEADEDVAEKALQAMKAIPGTIRARLLY
ＧａｐＡ［配列番号１７４］：
MTIKVGINGFGRIGRIVFRAAQKRSDIEIVAINDLLDADYMAYMLKYDSTHGRFDGTVEVKDGHLIVNGKKIRVTAERDPANLKWDEVGVDVVAEATGLFLTDETARKHITAGAKKVVMTGPSKDNTPMFVKGANFDKYAGQDIVSNASCTTNCLAPLAKVINDNFGIIEGLMTTVHATTATQKTVDGPSHKDWRGGRGASQNIIPSSTGAAKAVGKVLPELNGKLTGMAFRVPTPNVSVVDLTVRLEKAATYEQIKAAVKAAAEGEMKGVLGYTEDDVVSTDFNGEVCTSVFDAKAGIALNDNFVKLVSWYDNETGYSNKVLDLIAHISK
Ｐｇｋ［配列番号１７５］：
MSVIKMTDLDLAGKRVFIRADLNVPVKDGKVTSDARIRASLPTIELALKQGAKVMVTSHLGRPTEGEYNEEFSLLPVVNYLKDKLSNPVRLVKDYLDGVDVAEGELVVLENVRFNKGEKKDDETLSKKYAALCDVFVMDAFGTAHRAQASTHGIGKFADVACAGPLLAAELDALGKALKEPARPMVAIVGGSKVSTKLTVLDSLSKIADQLIVGGGIANTFIAAQGHDVGKSLYEADLVDEAKRLLTTCNIPVPSDVRVATEFSETAPATLKSVNDVKADEQILDIGDASAQELAEILKNAKTILWNGPVGVFEFPNFRKGTEIVANAIADSEAFSIAGGGDTLAAIDLFGIADKISYISTGGGAFLEFVEGKVLPAVAMLEERAKK
Ａｃｓ［配列番号１７６］：
MSQIHKHTIPANIADRCLINPQQYEAMYQQSINVPDTFWGEQGKILDWIKPYQKVKNTSFAPGNVSIKWYEDGTLNLAANCLDRHLQENGDRTAIIWEGDDASQSKHISYKELHRDVCRFANTLLELGIKKGDVVAIYMPMVPEAAVAMLACARIGAVHSVIFGGFSPEAVAGRIIDSNSRLVITSDEGVRAGRSIPLKKNVDDALKNPNVTSVEHVVVLKRTGGKIDWQEGRDLWWHDLVEQASDQHQAEEMNAEDPLFILYTSGSTGKPKGVLHTTGGYLVYAALTFKYVFDYHPGDIYWCTADVGWVTGHSYLLYGPLACGATTLMFEGVPNWPTPARMAQVVDKHQVNILYTAPTAIRALMAEGDKAIEGTDRSSLRILGSVGEPINPEAWEWYWKKIGNEKCPVVDTWWQTETGGFMITPLPGATELKAGSATRPFFGVQPALVDNEGNPLEGATEGSLVITDSWPGQARTLFGDHERFEQTYFSTFKNMYFSGDGARRDEDGYYWITGRVDDVLNVSGHRLGTAEIESALVAHPKIAEAAVVGIPHNIKGQAIYAYVTLNHGEEPSPELYAEVRNWVRKEIGPLATPDVLHWTDSLPKTRSGKIMRRILRKIAAGDTSNLGDTSTLADPGVVEKLLEEKQAIAMPS
ＡｃｅＥ［配列番号１７７］：
MSERFPNDVDPIETRDWLQAIESVIREEGVERAQYLIDQLLAEARKGGVNVAAGTGISNYINTIPVEEQPEYPGNLELERRIRSAIRWNAIMTVLRASKKDLELGGHMASFQSSATIYDVCFNHFFRARNEQDGGDLVYFQGHISPGVYARAFLEGRLTQEQLDNFRQEVHGNGLSSYPHPKLMPEFWQFPTVSMGLGPIGAIYQAKFLKYLEHRGLKDTSKQTVYAFLGDGEMDEPESKGAITIATREKLDNLVFVINCNLQRLDGPVTGNGKIINELEGIFEGAGWNVIKVMWGSRWDELLRKDTSGKLIQLMNETVDGDYQTFKSKDGAYVREHFFGKYPETAALVADWTDEQIWALNRGGHDPKKIYAAFKKAQETKGKATVILAHTIKGYGMGDAAEGKNIAHQVKKMNMDGVRHIRDRFNVPVSDADIEKLPYITFPEGSEEHTYLHAQRQKLHGYLPSRQPNFTEKLELPSLQDFGALLEEQSKEISTTIAFVRALNVMLKNKSIKDRLVPIIADEARTFGMEGLFRQIGIYSPNGQQYTPQDREQVAYYKEDEKGQILQEGINELGAGCSWLAAATSYSTNNLPMIPFYIYYSMFGFQRIGDLCWAAGDQQARGFLIGGTSGRTTLNGEGLQHEDGHSHIQSLTIPNCISYDPAYAYEVAVIMHDGLERMYGEKQENVYYYITTLNENYHMPAMPEGAEEGIRKGIYKLETIEGSKGKVQLLGSGSILRHVREAAEILAKDYGVGSDVYSVTSFTELARDGQDCERWNMLHPLETPRVPYIAQVMNDAPAVASTDYMKLFAEQVRTYVPADDYRVLGTDGFGRSDSRENLRHHFEVDASYVVVAALGELAKRGEIDKKVVADAIAKFNIDADKVNPRLA
ＡｃｅＦ［配列番号１７８］：
MAIEIKVPDIGADEVEITEILVKVGDKVEAEQSLITVEGDKASMEVPSPQAGIVKEIKVSVGDKTQTGALIMIFDSADGAADAAPAQAEEKKEAAPAAAPAAAAAKDVNVPDIGSDEVEVTEILVKVGDKVEAEQSLITVEGDKASMEVPAPFAGTVKEIKVNVGDKVSTGSLIMVFEVAGEAGAAAPAAKQEAAPAAAPAPAAGVKEVNVPDIGGDEVEVTEVMVKVGDKVAAEQSLITVEGDKASMEVPAPFAGVVKELKVNVGDKVKTGSLIMIFEVEGAAPAAAPAKQEAAAPAPAAKAEAPAAAPAAKAEGKSEFAENDAYVHATPLIRRLAREFGVNLAKVKGTGRKGRILREDVQAYVKEAIKRAEAAPAATGGGIPGMLPWPKVDFSKFGEIEEVELGRIQKISGANLSRNWVMIPHVTHFDKTDITELEAFRKQQNEEAAKRKLDVKITPVVFIMKAVAAALEQMPRFNSSLSEDGQRLTLKKYINIGVAVDTPNGLVVPVFKDVNKKGIIELSRELMTISKKARDGKLTAGEMQGGCFTISSIGGLGTTHFAPIVNAPEVAILGVSKSAMEPVWNGKEFVPRLMLPISLSFDHRVIDGADGARFITIINNTLSDIRRLVM
Ｌｐｄ［配列番号１７９］：
MSTEIKTQVVVLGAGPAGYSAAFRCADLGLETVIVERYNTLGGVCLNVGCIPSKALLHVAKVIEEAKALAEHGIVFGEPKTDIDKIRTWKEKVINQLTGGLAGMAKGRKVKVVNGLGKFTGANTLEVEGENGKTVINFDNAIIAAGSRPIQLPFIPHEDPRIWDSTDALELKEVPERLLVMGGGIIGLEMGTVYHALGSQIDVVEMFDQVIPAADKDIVKVFTKRISKKFNLMLETKVTAVEAKEDGIYVTMEGKKAPAEPQRYDAVLVAIGRVPNGKNLDAGKAGVEVDDRGFIRVDKQLRTNVPHIFAIGDIVGQPMLAHKGVHEGHVAAEVIAGKKHYFDPKVIPSIAYTEPEVAWVGLTEKEAKEKGISYETATFPWAASGRAIASDCADGMTKLIFDKESHRVIGGAIVGTNGGELLGEIGLAIEMGCDAEDIALTIHAHPTLHESVGLAAEVFEGSITDLPNPKAKKK
ＡｃｃＢＣ［配列番号１８０］：
VSVETRKITKVLVANRGEIAIRVFRAARDEGIGSVAVYAEPDADAPFVSYADEAFALGGQTSAESYLVIDKIIDAARKSGADAIHPGYGFLAENADFAEAVINEGLIWIGPSPESIRSLGDKVTARHIADTAKAPMAPGTKEPVKDAAEVVAFAEEFGLPIAIKAAFGGGGRGMKVAYKMEEVADLFESATREATAAFGRGECFVERYLDKARHVEAQVIADKHGNVVVAGTRDCSLQRRFQKLVEEAPAPFLTDDQRERLHSSAKAICKEAGYYGAGTVEYLVGSDGLISFLEVNTRLQVEHPVTEETTGIDLVREMFRIAEGHELSIKEDPAPRGHAFEFRINGEDAGSNFMPAPGKITSYREPQGPGVRMDSGVVEGSEISGQFDSMLAKLIVWGDTREQALQRSRRALAEYVVEGMPTVIPFHQHIVENPAFVGNDEGFEIYTKWIEEVWDNPIAPYVDASELDEDEDKTPAQKVVVEINGRRVEVALPGDLALGGTAGPKKKAKKRRAGGAKAGVSGDAVAAPMQGTVIKVNVEEGAEVNEGDTVVVLEAMKMENPVKAHKSGTVTGLTVAAGEGVNKGVVLLEIK
ＡｃｃＤ１［配列番号１８１］：
MTISSPLIDVANLPDINTTAGKIADLKARRAEAHFPMGEKAVEKVHAAGRLTARERLDYLLDEGSFIETDQLARHRTTAFGLGAKRPATDGIVTGWGTIDGREVCIFSQDGTVFGGALGEVYGEKMIKIMELAIDTGRPLIGLYEGAGARIQDGAVSLDFISQTFYQNIQASGVIPQISVIMGACAGGNAYGPALTDFVVMVDKTSKMFVTGPDVIKTVTGEEITQEELGGATTHMVTAGNSHYTAATDEEALDWVQDLVSFLPSNNRSYTPLEDFDEEEGGVEENITADDLKLDEIIPDSATVPYDVRDVIECLTDDGEYLEIQADRAENVVIAFGRIEGQSVGFVANQPTQFAGCLDIDSSEKAARFVRTCDAFNIPIVMLVDVPGFLPGAGQEYGGILRRGAKLLYAYGEATVPKITVTMRKAYGGAYCVMGSKGLGSDINLAWPTAQIAVMGAAGAVGFIYRKELMAADAKGLDTVALAKSFEREYEDHMLNPYHAAERGLIDAVILPSETRGQISRNLRLLKHKNVTRPARKHGNMPL
【００６５】
本発明はまた、下記ステップを含む、６−メチルサリチル酸の製造方法に関する:
（ａ）前記組換え微生物を培養するステップと、
（ｂ）前記培養された微生物から６−メチルサリチル酸を回収するステップ。
【００６６】
本発明の６−メチルサリチル酸の製造方法では、炭素源として、１〜５０ｇ／Ｌのブドウ糖または１〜１００ｇ／Ｌのグリセロールを添加して組換え微生物を培養することを特徴とする。
【００６７】
本発明はまた、前記組換え微生物に、アロエソン合成酵素（アロエソン  ｓｙｎｔｈａｓｅ）をコードする遺伝子がさらに導入されるか、その発現が増加されている、アロエソン生産用組換え微生物に関し、本発明で前記アロエソン合成酵素は、ＡＬＳまたはＰＫＳ３であってもよく、前記ＡＬＳは、Ｒｈｅｕｍ  ｐａｌｍａｔｕｍ由来であってもよく、前記ＰＫＳ３は、Ａｌｏｅ  ａｒｂｏｒｅｓｃｅｎｓ由来であってもよいが、前記アロエソン合成酵素以外のアロエソン合成酵素を本発明に適用することも可能である。
【００６８】
前記発現が野生型遺伝子に比べて減少されている遺伝子は、ｐａｂＡであってもよいが、これに限定されない。
【００６９】
前記６−メチルサリチル酸生産用組換え微生物は、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（Ｍｄｈ）、ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（ＳｅｒＡ）、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡｃｃＢＣおよびＡｃｃＤ１）、グリセルアルデヒド  ３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧａｐＡ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｐｇｋ）、アセチル−ＣｏＡシンテターゼ（Ａｃｓ）、およびピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ：ＡｃｅＥＦおよびＬｐｄ）で構成された群から選択される１つ以上の酵素をコードする遺伝子がさらに導入されるか、その発現が増加されていることを特徴とする。
【００７０】
前記Ｚｗｆ、Ｍｄｈ、ＳｅｒＡ、ＧａｐＡ、Ｐｇｋ、Ａｃｓ、ＡｃｅＥ、ＡｃｅＦ、およびＬｐｄは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉから由来されてもよいが、これに限定されない。ＡｃｃＢＣおよびＡｃｃＤ１は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍに由来してもよいが、これに限定されず、他の微生物由来のアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼに該当する酵素に拡張可能である。
【００７１】
本発明はまた、下記ステップを含む、アロエソンの製造方法に関する：
（ａ）前記組換え微生物を培養するステップと、
（ｂ）前記培養された微生物からアロエソンを回収するステップ。
【００７２】
本発明のアロエソンの製造方法では、炭素源として、１〜５０ｇ／Ｌのブドウ糖または１〜１００ｇ／Ｌのグリセロールを添加して組換え微生物を培養することを特徴とする。
【００７３】
本発明はまた、前記組換え微生物に、チロシンアンモニア−リアーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ａｍｍｏｎｉａ−ｌｙａｓｅ、ＴＡＬ）、４−クマレート：ＣｏＡリガーゼ（４−ｃｏｕｍａｒａｔｅ：ＣｏＡ  ｌｉｇａｓｅ、４ＣＬ）およびスチルベン合成酵素（ｓｔｉｌｂｅｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ、ＳＴＳ）をコードする遺伝子がさらに導入されるか、その発現が増加されている、レスベラトロール生産用組換え微生物に関する。
【００７４】
前記ＴＡＬは、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ，Ｃｌｉｔｏｒｉａ  ｔｅｒｎａｔｅａ，Ｆｒａｇａｒｉａ  ｘ  ａｎａｎａｓｓａ，Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ，Ｚｅａ  ｍａｙｓまたはＳａｃｃｈａｒｏｔｈｒｉｘ  ｅｓｐａｎａｅｎｓｉｓ  由来であってもよく、
前記４ＣＬは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ，Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｗｏｏｄｉｉ，Ａｇａｓｔａｃｈｅ  ｒｕｇｏｓｅ，Ａｖｅｎａ  ｓａｔｉｖａ，Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ，Ｃｅｎｔａｕｒｉｕｍ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ，Ｃｅｐｈａｌｏｃｅｒｅｕｓ  ｓｅｎｉｌｉｓ，Ｃｏｃｏｓ  ｎｕｃｉｆｅｒａ，Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ  ｊａｐｏｎｉｃａ，Ｅｒｙｔｈｒｉｎａ  ｃｒｉｓｔａｇａｌｌｉ，Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ  ｓｐ．，Ｆｒａｇａｒｉａ  ｘ  ａｎａｎａｓｓａ，Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ，Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ，Ｈｉｂｉｓｃｕｓ  ｃａｎｎａｂｉｎｕｓ，Ｌａｒｉｘ  ｃａｊａｎｄｅｒｉ，Ｌａｒｉｘ  ｇｍｅｌｉｎｉｉ，Ｌａｒｉｘ  ｋａｅｍｐｆｅｒｉ，Ｌａｒｉｘ  ｋａｍｔｓｃｈａｔｉｃａ，Ｌａｒｉｘ  ｓｉｂｉｒｉｃａ，Ｌａｒｉｘ  ｓｕｋａｃｚｅｗｉｉ，Ｌｉｔｈｏｓｐｅｒｍｕｍ  ｅｒｙｔｈｒｏｒｈｉｚｏｎ，Ｌｏｌｉｕｍ  ｐｅｒｅｎｎｅ，Ｌｏｎｉｃｅｒａ  ｊａｐｏｎｉｃａ，Ｍｅｔａｓｅｑｕｏｉａ  ｇｌｙｐｔｏｓｔｒｏｂｏｉｄｅｓ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ，Ｏｃｉｍｕｍ  ｂａｓｉｌｉｃｕｍ，Ｏｃｉｍｕｍ  ｔｅｎｕｉｆｌｏｒｕｍ，Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ，Ｐａｕｌｏｗｎｉａ  ｔｏｍｅｎｔｏｓａ，Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ  ｃｒｉｓｐｕｍ，Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ  ｂａｍｂｕｓｏｉｄｅｓ，Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ，Ｐｉｃｅａ  ａｂｉｅｓ，Ｐｉｎｕｓ  ｒａｄｉａｔｅ，Ｐｉｎｕｓ  ｔａｅｄａ，Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ，Ｐｌａｔｙｃｌａｄｕｓ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ，Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ  ｈｉｓｐｉｄｕｓ，Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｏｍｅｎｔｏｓａ，Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ，Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｘ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ，Ｐｒｕｎｕｓ  ａｖｉｕｍ，Ｐｕｅｒａｒｉａ  ｍｏｎｔａｎａ，Ｒｏｂｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏａｃａｃｉａ，Ｒｕｔａ  ｇｒａｖｅｏｌｅｎｓ，Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，Ｓａｌｉｘ  ｂａｂｙｌｏｎｉｃａ，Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ，Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ，Ｓｏｒｂｕｓ  ａｕｃｕｐａｒｉａ，Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  またはＶｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ由来であってもよく、前記ＳＴＳは、Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａ，Ｐｉｎｕｓ  ｄｅｎｓｉｆｌｏｒａ，Ｐｉｎｕｓ  ｍａｓｓｏｎｉａｎａ，Ｐｉｎｕｓ  ｓｔｒｏｂｕｓ，Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ  ｃｕｓｐｉｄａｔｕｍ，Ｐｓｉｌｏｔｕｍ  ｎｕｄｕｍ  またはＶｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ由来であってもよいが、これに限定されない。
【００７５】
前記４−クマレート：ＣｏＡリガーゼは、配列番号１２８で表されるアミノ酸配列においてＩ２５０Ｌ／Ｎ４０４Ｋ／Ｉ４６１Ｖにアミノ酸が変異された変異酵素、または配列番号１３１で表されるアミノ酸配列においてＡ２９４Ｇ／Ａ３１８Ｇにアミノ酸が変異された変異酵素であってもよいが、これに限定されない。
【００７６】
前記発現が野生型遺伝子に比べて減少されている遺伝子は、ｐａｂＡ，ｙｆｉＤ，ｍｑｏ，ｘａｐＲ，ｐｕｒＢ，ｆａｂＨ，ｆａｂＦ，ｙｔｃＹ，ａｒｇＣ，ｎｕｄＤ，ａｒａＡ，ｆａｄＲ，ｃｙｔＲ，ｆｍｔ  および  ｐｙｒＦで構成された群から選択された一つ以上であってもよいが、これに限定されない。  
【００７７】
本発明はまた、下記ステップを含む、レスベラトロールの製造方法に関する：
（ａ）前記組換え微生物を培養するステップと、
（ｂ）前記培養された微生物からレスベラトロールを回収するステップ。
【００７８】
本発明のレスベラトロールの製造方法では、炭素源として、１〜５０ｇ／Ｌのブドウ糖または１〜１００ｇ／Ｌのグリセロールを添加して組換え微生物を培養することを特徴とする。
【００７９】
本発明はまた、前記組換え微生物に、チロシンアンモニア−リアーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ａｍｍｏｎｉａ−ｌｙａｓｅ、ＴＡＬ）、４−クマレート：ＣｏＡリガーゼ（４−ｃｏｕｍａｒａｔｅ：ＣｏＡ  ｌｉｇａｓｅ、４ＣＬ）、カルコン合成酵素（ｃｈａｌｃｏｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ、ＣＨＳ）およびカルコンイソメラーゼ（ｃｈａｌｃｏｎｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ、ＣＨＩ）をコードする遺伝子がさらに導入されるか、その発現が増加されている、ナリンゲニン生産用組換え微生物に関する。
【００８０】
前記ＴＡＬは、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ，Ｃｌｉｔｏｒｉａ  ｔｅｒｎａｔｅａ，Ｆｒａｇａｒｉａ  ｘ  ａｎａｎａｓｓａ，Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ，Ｚｅａ  ｍａｙｓまたはＳａｃｃｈａｒｏｔｈｒｉｘ  ｅｓｐａｎａｅｎｓｉｓ  由来であってもよく、
前記４ＣＬは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ，Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｗｏｏｄｉｉ，Ａｇａｓｔａｃｈｅ  ｒｕｇｏｓｅ，Ａｖｅｎａ  ｓａｔｉｖａ，Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ，Ｃｅｎｔａｕｒｉｕｍ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ，Ｃｅｐｈａｌｏｃｅｒｅｕｓ  ｓｅｎｉｌｉｓ，Ｃｏｃｏｓ  ｎｕｃｉｆｅｒａ，Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ  ｊａｐｏｎｉｃａ，Ｅｒｙｔｈｒｉｎａ  ｃｒｉｓｔａｇａｌｌｉ，Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ  ｓｐ．，Ｆｒａｇａｒｉａ  ｘ  ａｎａｎａｓｓａ，Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ，Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ，Ｈｉｂｉｓｃｕｓ  ｃａｎｎａｂｉｎｕｓ，Ｌａｒｉｘ  ｃａｊａｎｄｅｒｉ，Ｌａｒｉｘ  ｇｍｅｌｉｎｉｉ，Ｌａｒｉｘ  ｋａｅｍｐｆｅｒｉ，Ｌａｒｉｘ  ｋａｍｔｓｃｈａｔｉｃａ，Ｌａｒｉｘ  ｓｉｂｉｒｉｃａ，Ｌａｒｉｘ  ｓｕｋａｃｚｅｗｉｉ，Ｌｉｔｈｏｓｐｅｒｍｕｍ  ｅｒｙｔｈｒｏｒｈｉｚｏｎ，Ｌｏｌｉｕｍ  ｐｅｒｅｎｎｅ，Ｌｏｎｉｃｅｒａ  ｊａｐｏｎｉｃａ，Ｍｅｔａｓｅｑｕｏｉａ  ｇｌｙｐｔｏｓｔｒｏｂｏｉｄｅｓ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ，Ｏｃｉｍｕｍ  ｂａｓｉｌｉｃｕｍ，Ｏｃｉｍｕｍ  ｔｅｎｕｉｆｌｏｒｕｍ，Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ，Ｐａｕｌｏｗｎｉａ  ｔｏｍｅｎｔｏｓａ，Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ  ｃｒｉｓｐｕｍ，Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ  ｂａｍｂｕｓｏｉｄｅｓ，Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ，Ｐｉｃｅａ  ａｂｉｅｓ，Ｐｉｎｕｓ  ｒａｄｉａｔｅ，Ｐｉｎｕｓ  ｔａｅｄａ，Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ，Ｐｌａｔｙｃｌａｄｕｓ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ，Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ  ｈｉｓｐｉｄｕｓ，Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｏｍｅｎｔｏｓａ，Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ，Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｘ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ，Ｐｒｕｎｕｓ  ａｖｉｕｍ，Ｐｕｅｒａｒｉａ  ｍｏｎｔａｎａ，Ｒｏｂｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏａｃａｃｉａ，Ｒｕｔａ  ｇｒａｖｅｏｌｅｎｓ，Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，Ｓａｌｉｘ  ｂａｂｙｌｏｎｉｃａ，Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ，Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ，Ｓｏｒｂｕｓ  ａｕｃｕｐａｒｉａ，Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  またはＶｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ由来であってもよく、
前記ＣＨＳは、Ｆｒｅｅｓｉａ  ｈｙｂｒｉｄ  ｃｕｌｔｉｖａｒ，Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ，Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ，Ｐｌａｇｉｏｃｈａｓｍａ  ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｍ，Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ，Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ，Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ，Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ，Ａｖｅｎａ  ｓａｔｉｖａ，Ｄａｕｃｕｓ  ｃａｒｏｔａ，Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ，Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ，Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ  ｅｃｈｉｎａｔａ，Ｈｕｍｕｌｕｓ  ｌｕｐｕｌｕｓ，Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ  ａｎｄｒｏｓａｅｍｕｍ，Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ  ｃｒｉｓｐｕｍ，Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ，Ｒｕｂｕｓ  ｉｄａｅｕｓ，Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ  ｂａｉｃａｌｅｎｓｉｓ，Ｘａｎｔｈｉｓｍａ  ｇｒａｃｉｌｅ，Ｃｏｓｍｏｓ  ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｓ，Ｇｅｒｂｅｒａ  ｈｙｂｒｉｄ  ｃｕｌｔｉｖａｒ，Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ，Ｊｕｇｌａｎｓ  ｓｐ．，Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ，Ｐｕｅｒａｒｉａ  ｍｏｎｔａｎａ，Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌ，Ｓｉｌｅｎｅ  ｓｐ．，Ｓｉｎａｐｉｓ  ａｌｂａ，Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａ，Ｓｔｅｌｌａｒｉａ  ｌｏｎｇｉｐｅｓ，Ｔｕｌｉｐａ  ｈｙｂｒｉｄ  ｃｕｌｔｉｖａｒ，Ｖｅｒｂｅｎａ  ｓｐ．，またはＰｅｔｕｎｉａ  ｘ  ｈｙｂｒｉｄａ由来であってもよく、
前記ＣＨＩは、Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ，Ｇｉｎｋｇｏ  ｂｉｌｏｂａ，Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ  ｆｏｅｎｕｍｇｒａｅｃｕｍ，Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ，Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ  ｂａｉｃａｌｅｎｓｉｓ，Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ，Ｃｅｐｈａｌｏｃｅｒｅｕｓ  ｓｅｎｉｌｉｓ，Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ，Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ  ｅｃｈｉｎａｔａ，Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ  ｕｒａｌｅｎｓｉｓ，Ｌｉｌｉｕｍ  ｃａｎｄｉｄｕｍ，Ｍｏｒｅｌｌａ  ｒｕｂｒａ，Ｐｅｔｕｎｉａ  ｘ  ｈｙｂｒｉｄ，Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ，Ｓｏｊａ  ｈｉｓｐｉｄａ，Ｔｕｌｉｐａ  ｈｙｂｒｉｄ  ｃｕｌｔｉｖａｒ，Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａまたはＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ由来であってもよいが、これに限定されない。  
【００８１】
前記４−クマレート：ＣｏＡリガーゼは、配列番号１２８で表されるアミノ酸配列においてＩ２５０Ｌ／Ｎ４０４Ｋ／Ｉ４６１Ｖにアミノ酸が変異された変異酵素であってもよいが、これに限定されない。
【００８２】
前記発現が野生型遺伝子に比べて減少されている遺伝子は、ｆａｄＲ，ｈｙｃＩおよびｘａｐＲで構成された群から選択された一つ以上であってもよいが、これに限定されない。  
【００８３】
本発明はまた、下記ステップを含む、ナリンゲニンの製造方法に関する：  
（ａ）前記組換え微生物を培養するステップと、
（ｂ）前記培養された微生物からナリンゲニンを回収するステップ。
【００８４】
本発明のナリンゲニンの製造方法では、炭素源として、１〜５０ｇ／Ｌのブドウ糖または１〜１００ｇ／Ｌのグリセロールを添加して組換え微生物を培養することを特徴とする。
【００８５】
本発明において、遺伝子の「調節」は、遺伝子の欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）、発現抑制、発現増進、ノックダウン（ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ）、プロモーター交替、調節機作の導入などの技法により、遺伝子の発現を誘発することも全て含み、生合成経路に存在する酵素のうち１つ以上を進化（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）または変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）させることを包括する概念である。
【００８６】
本発明において、「ノックダウン」は、遺伝子の発現を完全に遮断させる「ノックアウト」とは異なって、遺伝子の発現量の相当量減らして遺伝子の機能が減少されるようにすることを意味する。これは、遺伝子の転写体レベルで調節されてもよく、タンパク質レベルで調節されてもよい。しかし、本発明は、該当経路に関与する酵素をコードする遺伝子の発現を抑制または減少させるのに意義があるため、「ノックダウン」および「ノックアウト」の何れを用いても、所期の目的を果たすことができるであろう。
【００８７】
本願において、「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」とは、適切な宿主内でＤＮＡを発現させることができる適切な調節配列に作動可能に連結されたＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ製造物を意味する。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子または単に潜在的ゲノム挿入物であってもよい。適当な宿主で形質転換されると、ベクターは、宿主ゲノムと関係がなく複製して機能できるか、または、一部の場合にはゲノムそれ自体に統合され得る。プラスミドが現在のベクターの最も通常的に用いられる形態であるため、本発明の明細書で「プラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）」及び「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」は、時には互いに交換的に用いられる。本発明の目的上、プラスミドベクターを利用することが好ましい。このような目的に使用されることができる典型的なプラスミドベクターは、（ａ）宿主細胞当たり数個〜数百個のプラスミドベクターを含むように複製が効率的に行われるようにする複製開始点、（ｂ）プラスミドベクターで形質転換された宿主細胞が選抜できるようにする抗生剤耐性遺伝子及び（ｃ）外来ＤＮＡ切片が挿入できるようにする制限酵素切断部位を含む構造を持っている。適切な制限酵素切断部位が存在しなくても、通常の方法による合成オリゴヌクレオチドアダプター（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｄａｐｔｏｒ）または、リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を使えば、ベクターと外来ＤＮＡを容易にライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）することができる。ライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）後に、ベクターは適切な宿主細胞に形質転換されなければならない。形質転換は、塩化カルシウム法または電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）（Ｎｅｕｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１：８４１，１９８２）などにより容易に達成されることができる。
【００８８】
前記ベクターのプロモーターは、構成的であっても誘導性であってもよく、本発明の効果のためにさらに変形されてもよい。また、発現ベクターは、ベクターを含有する宿主細胞を選択するための選択マーカーを含み、複製可能な発現ベクターである場合、複製原点（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｒｉｇｉｎ）を含む。ベクターは、自己複製するか宿主ゲノムＤＮＡに統合され得る。好ましくは、ベクター中に挿入されて伝達された遺伝子が、宿主細胞のゲノム中に不可逆的に融合され、細胞内で遺伝子の発現が長期間にわたって安定して持続されるようにすることが好ましい。
【００８９】
核酸配列は、他の核酸配列と機能的関係で配置される時、「作動可能に連結（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」される。これは、適切な分子（例えば、転写活性化タンパク質）が調節配列（等）に結合する時遺伝子発現を可能にする方式で連結された遺伝子および調節配列（等）であってもよい。例えば、プレ配列（ｐｒｅ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）または分泌リーダー（ｌｅａｄｅｒ）に対するＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参加するプレタンパク質として発現する場合、ポリペプチドに対するＤＮＡに作動可能に連結されて；プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結されたり；またはリボソーム結合部位は、配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結されたり；またはリボソーム結合部位は、翻訳を容易にするように配置される場合、コード配列に作動可能に連結される。一般に、「作動可能に連結された」とは、連結されたＤＮＡ配列が接触して、また、分泌リーダーの場合、接触してリーディングフレーム内に存在することを意味する。しかし、エンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）は、接触する必要がない。これらの配列の連結は、便利な制限酵素部位でライゲーション（連結）により行われる。そのような部位が存在しない場合、通常の方法による合成オリゴヌクレオチドアダプター（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｄａｐｔｏｒ）またはリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を使用する
【００９０】
当業界に周知された通り、宿主細胞で形質感染遺伝子の発現水準を高めるためには、該当遺伝子が、選択された発現宿主内で機能を発揮する転写および解読発現調節配列に作動可能に連結されなければならない。好ましくは発現調節配列および該当遺伝子は、細菌選択マーカーおよび複製開始点（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｒｉｇｉｎ）を一緒に含んでいる一つの組換えベクター内に含まれるようになる。宿主細胞が真核細胞である場合には、組換えベクターは、真核発現宿主内で有用な発現マーカーをさらに含まなければならない。
【００９１】
上述した組換えベクターによって形質転換された宿主細胞は、本発明のさらに他の側面を構成する。本願明細書に使用される用語「形質転換」とは、ＤＮＡを宿主に導入してＤＮＡが染色体外因子としてまたは染色体統合完成によって複製可能になることを意味する。
【００９２】
もちろん、すべてのベクターが、本発明のＤＮＡ配列を発現するが、すべてが同等に機能を発揮するとは限らないことを理解しなければならない。同様にすべての宿主が同じ発現システムに対して同じ機能を発揮することはない。しかし、当業者なら、過度な実験的負担なしに本発明の範囲を逸脱しないまま種々のベクター、発現調節配列および宿主の中から適切な選択を行うことができる。例えば、ベクターを選択するには宿主を考慮しなければならないが、これはベクターがその中で複製されなければならないためである。ベクターの複製数、複製数を調節できる能力および当該ベクターによってコードされる他のタンパク質、例えば抗生剤マーカーの発現もさらに考慮されなければならない。
【００９３】
尚、本発明において導入された遺伝子は、宿主細胞のゲノムに導入され、染色体上に因子として存在することを特徴とする。本発明が属する技術分野における当業者にとって、前記遺伝子を宿主細胞のゲノム染色体に挿入しても、上記のように組換えベクターを宿主細胞に導入した場合と同様の効果を奏するということは、自明であるといえる。
【００９４】
［実施例］
以下、本発明を、実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者において通常の知識を有する者にとって自明である。
実施例１．タイプＩＩＩポリケチド合成酵素ベースのマロニル−ＣｏＡバイオセンサーの構築
１．１．種々のタイプＩＩＩポリケチド合成酵素の性能テスト
本実施例および下記実施例で使用した制限酵素はＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｌａｂｓ（米国）またはＥｎｚｙｎｏｍｉｃｓ（大韓民国）、ＰＣＲ重合酵素はＢｉｏｆａｃｔ（大韓民国）から購入した。それ以外のものについては、別に表記した。また、本実施例および下記実施例で導入された外来遺伝子は、表１に、その情報および配列が収録されているデータベースの通し番号をまとめた。また、特に記載していない場合、クローニングに用いられた大腸菌株はＤＨ５α菌株であり、これは、ＬＢ培地（ｐｅｒ  ｌｉｔｅｒ：１０ｇ  ｔｒｙｐｔｏｎｅ、５ｇ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、および１０ｇ  ＮａＣｌ）またはＬＢ寒天平板（１／５％、ｖ／ｖ）上で培養した。また、必要に応じて、適切な濃度の抗生剤（５０μｇ／ｍＬ  ｋａｎａｍｙｃｉｎ，１００μｇ／ｍＬ  ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎおよび／または１００μｇ／ｍＬ  ｓｐｅｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）を添加した。
【００９５】
本発明では、タイプＩＩＩポリケチド合成酵素ＲｐｐＡを活用して、５個のマロニル−ＣｏＡ分子から赤色を呈するフラビオリン（ｆｌａｖｉｏｌｉｎ）を生産し、それを、細胞内のマロニル−ＣｏＡ濃度の指示物質として使用しようとした（図１）。そのために、先ず、種々のタイプＩＩＩポリケチド合成酵素の性能を比較し、テストしようとした。総５種の放線菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ，Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｃｕｌｅｏｌａｔｕｓ）から、タイプＩＩＩポリケチド合成酵素をコードするｒｐｐＡ遺伝子をクローニングした。それぞれの遺伝子を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株に形質転換させた後、作製された菌株を、１０ｇ／Ｌのブドウ糖が添加されたＭ９最少培地を含むフラスコに接種した後、初期対数期（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｐｈａｓｅ）で０．５ｍＭのＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−１−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を処理してから、４８時間培養してフラビオリンの生産を観察した。この際、Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓベースの酵素Ｓｇｒ＿ＲｐｐＡを発現させた菌株から、最も高いフラビオリンの生産が観察された（２５．７ｍｇ／Ｌ；図２Ａ）。それぞれ生成されたプラスミドは、ｐＥＴ−３０ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）をベースとしており、ｐＥＴ−Ｓｇｒ＿ｒｐｐＡ、ｐＥＴ−Ｓｃｏ＿ｒｐｐＡ、ｐＥＴ−Ｓｍａ＿ｒｐｐＡ、ｐＥＴ−Ｓｅｎ＿ｒｐｐＡ、ｐＥＴ−Ｓａｃ＿ｒｐｐＡと命名した。ｐＥＴ−Ｓｇｒ＿ｒｐｐＡの構築のために、Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓのゲノムＤＮＡをテンプレートとし、［配列番号１／配列番号２］のプライマー対を活用してｒｐｐＡ遺伝子をＰＣＲ増幅した（Ｇｉｂｓｏｎ  ＤＧ，ｅｔ  ａｌ．（２００９），Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６：３４３−３４５）。これは、ｐＥＴ−３０ａ（＋）プラスミドのＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩサイトを介してギブソン・アセンブリ（Ｇｉｂｓｏｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙ）によりクローニングした。他のプラスミドも同様の方法により作製した。Ｍ９最少培地は、１Ｌ当たり、次のような成分を含んでいる：１２．８ｇ  Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、３ｇ  ＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ  ＮａＣｌ、１ｇ  ＮＨ４Ｃｌ、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２。
[配列番号1]5'-CTTTAAGAAGGAGATATACATATGGCGACCCTGTGCCGACC-3'
[配列番号2]5'-CTTGTCGACGGAGCTCGAATTCATTAGCCGGACAGCGCAACGC-3'
【００９６】
【表１】
2020530757.tif 000003
【００９７】
図１Ａにおいて、マロニル−ＣｏＡは、ＲｐｐＡ酵素によってＴＨＮに転換され、それが、引き続いて自発的な酸化反応によってフラビオリンに転換される。この際、ＷｈｉＥ＿ＯＲＦＩＩＩが、この最後のステップに関与するという報告があったため（Ａｕｓｔｉｎ  ＭＢ，ｅｔ  ａｌ．（２００４），Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９：４５１６２−４５１７４．）、本発明では、該遺伝子をｐＥＴ−３０ａ（＋）にさらにクローニングした。しかし、これは却ってフラビオリン生産能の減少を引き起こしたため、ｒｐｐＡ単一遺伝子が、フラビオリンの生産に十分であるという事実を証明した。生産されたフラビオリンは、ＬＣ−ＭＳ、ＭＳ／ＭＳにより確認した（図２のＢ）。その後、Ｔ７プロモーターベースの既存のシステムから脱して、全ての大腸菌株への適用が可能であるように、ｔａｃプロモーターベースのプラスミドにプラットホームを移そうとした。そのために、先ず、ｐＣＤＦＤｕｅｔ−１（Ｎｏｖａｇｅｎ）プラスミドベースのｐＴａｃＣＤＦＳプラスミドが構築されたが、これは、ＣＤＦ複製起点を有し、スペクチノマイシン（ｓｐｅｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）抗生剤耐性を有し、ｔａｃプロモーターベース遺伝子の発現カセットを有するプラスミドである。そのために、ｐＴａｃ１５Ｋプラスミド（Ｌｅｅ  ＳＹ，ｅｔ  ａｌ．（２００８），ＵＳ  ｐａｔｅｎｔ  ２０１１０２６９１８３）をテンプレートとし、［配列番号３／配列番号４］プライマーを活用してｔａｃプロモーターを含むＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅した。また、ｐＣＤＦＤｕｅｔ−１プラスミドをテンプレートとし、［配列番号５／配列番号６］プライマーを活用して該プラスミドを線形化した。このように生産された２つのＤＮＡ断片をギブソン・アセンブリ（Ｇｉｂｓｏｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙ）により繋げ、ｐＴａｃＣＤＦＳプラスミドが完成された。後で活用するために、ｐＴｒｃＣＤＦＳプラスミドも作製したが、これは、ｔｒｃプロモーターを含むことを除いてはｐＴａｃＣＤＦＳプラスミドと同一のものであり、その作製過程も、ｐＴｒｃ９９Ａプラスミド（Ｌｅｅ  ＳＹ，ｅｔ  ａｌ．（２００８），ＵＳ  ｐａｔｅｎｔ  ２０１１０２６９１８３）をテンプレートとしｔｒｃプロモーターを含むＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅したことを除き、他の方法は同様であった。その後、ｐＴａｃＣＤＦＳプラスミドベースのｒｐｐＡ発現プラスミドｐＴａｃ−Ｓｇｒ＿ｒｐｐＡを作製するために、次のような方法が用いられた。先ず、Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓゲノムＤＮＡから、ｒｐｐＡ遺伝子を［配列番号７／配列番号８］プライマーを活用してＰＣＲ増幅し、ｐＴａｃＣＤＦＳプラスミドは、［配列番号９／配列番号１０］プライマーを活用して線形化した。このように生成された２つのＤＮＡ断片をギブソン・アセンブリにより繋げ、ｐＴａｃ−Ｓｇｒ＿ｒｐｐＡプラスミドが作製された。さらに、ｒｐｐＡの最適化された発現のために、５´ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ（５´ＵＴＲ）の最適化を行った。５´ＵＴＲ  ＤＮＡ配列は、従来に報告されているＵＴＲ  ｄｅｓｉｇｎｅｒ（ｕｒｌ：ｈｔｔｐｓ：／／ｓｂｉ．ｐｏｓｔｅｃｈ．ａｃ．ｋｒ／ｕｔｒ＿ｄｅｓｉｇｎｅｒ／）を活用して設計した（Ｓｅｏ  ＳＷ，ｅｔ  ａ���．（２０１３），Ｍｅｔａｂ  Ｅｎｇ  １５：６７−７４）。該プラスミドであるｐＴａｃ−５´ＵＴＲ−Ｓｇｒ＿ｒｐｐＡの作製のために、ｐＴａｃ−Ｓｇｒ＿ｒｐｐＡをテンプレートとし、［配列番号９／配列番号１１］プライマーを活用して逆ＰＣＲ（ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ）を行った。このように生成された、線形化されたプラスミドは、ＤｐｎＩによりテンプレートを除去し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｋｉｎａｓｅ、ＰＮＫ）（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ、大韓民国）とＴ４リガーゼ（ｌｉｇａｓｅ）（Ｅｌｐｉｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、大韓民国）処理によりライゲーションした。このように生成されたプラスミドは、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株に導入し、Ｍ９最少培地でフラスコ培養して、１７．８ｍｇ／Ｌのフラビオリンが生産された（図２のＣ）。
[配列番号3] 5'-CGACTCCTGCATTAGGAAATGACTGCACGGTGCACCAATG-3'
[配列番号4] 5'-GCGTTTCACTTCTGAGTTCG-3'
[配列番号5] 5'-CGAACTCAGAAGTGAAACGCCTGAAACCTCAGGCATTTGAG-3'
[配列番号6] 5'-ATTTCCTAATGCAGGAGTCG-3'
[配列番号7] 5'-CAATTTCACACAGGAAACAGAATGGCGACCCTGTGCCGACC-3'
[配列番号8] 5'-CTCTAGAGGATCCCCGGGTACCATTAGCCGGACAGCGCAACGC-3'
[配列番号9] 5'-GGTACCCGGGGATCCTCTAGAG-3'
[配列番号10] 5'-TCTGTTTCCTGTGTGAAATTG-3'
[配列番号11] 5'-GATGCTCCTTTCTTGTTATTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTC-3'
【００９８】
１．２．タイプＩＩＩポリケチド合成酵素ベースのマロニル−ＣｏＡバイオセンサーの活用性の究明
Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ  ＲｐｐＡベースのマロニル−ＣｏＡバイオセンサーを構築した後、その活用性を究明するために、次のような実験を行った。先ず、ＲｐｐＡマロニル−ＣｏＡバイオセンサーのシグナルは、細胞培養上清の３４０ｎｍでの吸光度と定義された（図３のＤ）。バイオセンサーの性質を究明する時にターゲットとなる化合物を濃度毎に添加した時に、増加されたシグナルが発生するかを調べることとなるが、マロニル−ＣｏＡの場合、細胞膜を通過できない物質であるため、培地に添加することが無意味となることから、脂肪酸の生合成経路を阻止すると報告されているセルレニン（Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ，米国）を活用して、それを間接的に究明しようとした（Ｏｍｕｒａ  Ｓ（１９７６），Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  Ｒｅｖ  ４０：６８１−６９７．）。セルレニンは脂肪酸の生合成経路を阻止するため、これは、脂肪酸の前駆体であるマロニル−ＣｏＡの蓄積に繋がる。したがって、従来の研究により、セルレニンの濃度毎の添加による大腸菌内のマロニル−ＣｏＡの濃度を測定した（Ｘｕ  Ｐ，Ｌｉ  Ｌ，Ｚｈａｎｇ  Ｆ，Ｓｔｅｐｈａｎｏｐｏｕｌｏｓ  Ｇ，Ｋｏｆｆａｓ  Ｍ（２０１４），Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １１１：１１２９９−１１３０４）。プラスミドｐＴａｃ−５´ＵＴＲ−Ｓｇｒ＿ｒｐｐＡを有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株は、１４ｍＬ  ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ  Ｆａｌｃｏｎ  ｒｏｕｎｄ−ｂｏｔｔｏｍ  ｔｕｂｅに入った３ｍＬのＬＢ培地に接種した。その後、摂氏３０度、２２０ｒ．ｐ．ｍの培養器で１６時間培養した後、他の１４ｍＬ  ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ  Ｆａｌｃｏｎ  ｒｏｕｎｄ−ｂｏｔｔｏｍ  ｔｕｂｅに入った３ｍＬの修正されたＲ／２培地（ｐＨ６．８）に接種した。修正されたＲ／２培地は、１Ｌ当たり、次の成分を含むように作製された：３ｇ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ，６．７５ｇ  ＫＨ２ＰＯ４，２ｇ  （ＮＨ４）２ＨＰＯ４，０．８ｇ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，３ｇ  （ＮＨ４）２ＳＯ４，０．８５ｇ  ｃｉｔｒｉｃ  ａｃｉｄ，５ｍＬ  ｔｒａｃｅ  ｍｅｔａｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ［１  Ｌの  ０．１Ｍ  ＨＣｌ当たり：  １０ｇ  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，２．２５ｇ  ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，０．５８ｇ  ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ，１ｇ  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ，０．１ｇ（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ，０．０２ｇ  Ｎａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ，２ｇ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ］。これに、２０ｇ／Ｌのブドウ糖、１００μｇ／ｍＬのスペクチノマイシン、０．２ｍＭのＩＰＴＧ、適切な濃度のセルレニンが添加した。添加したセルレニンの濃度は、次のとおりである：０、５、１０、１５、２０、２５、５０、１００μＭ。接種した細胞は、摂氏３０度、２２０ｒ．ｐ．ｍ．の培養器で１６時間培養した。その後、細胞の成長（ＯＤ６００）と培養上清の３４０ｎｍでの吸光度を測定し、図２のＤのような結果を得た。この際、ＲｐｐＡを発現する菌株は、発現しない菌株に比べて、セルレニンの濃度が増加するにつれて明らかに増加する、標準化されたシグナルを発生させるという事実が分かった。図３のＡから確認されるように、セルレニンの濃度が増加するにつれて、ラビオリンの標準化された生産量も増加する事実を確認��ることができ、これは目視でも観察することができた（図３のＢ）。また、ｐＴａｃ−５´ＵＴＲ−Ｓｇｒ＿ｒｐｐＡプラスミドを、互いに異なる１６種の大腸菌株（表２）に導入した時に、何れの菌株からもフラビオリンが生産されるという事実が立証され、本発明で提示するマロニル−ＣｏＡバイオセンサーが、何れの大腸菌株にも適用可能であるという事実が証明された（図３のＣ）。
【００９９】
【表２】
2020530757.tif 000004
【０１００】
また、Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ  ＲｐｐＡベースのマロニル−ＣｏＡバイオセンサー以外に、他のタイプＩＩＩポリケチドもマロニル−ＣｏＡバイオセンサーとして活用可能であるということを証明するために、３個のタイプＩＩＩポリケチド合成酵素をテストしようとした。そのために、アロエアルボレセンス（ａｌｏｅ  ａｒｂｏｒｅｓｃｅｎｓ）タイプＩＩＩポリケチド合成酵素（ｏｃｔａｋｅｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＯＫＳ）［配列番号  １０３］，アロエアルボレセンスタイプＩＩＩポリケチド合成酵素（ｏｃｔａｋｅｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ２，ＰＫＳ４）［配列番号  １０５］，アロエアルボレセンスタイプＩＩＩポリケチド合成酵素（ｏｃｔａｋｅｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ３，ＰＫＳ５）［配列番号１０６をテストした。各酵素をコードする遺伝子を有するプラスミドであるｐＥＴ−ＡａＯＫＳ、ｐＥＴ−ＡａＰＫＳ４、およびｐＥＴ−ＡａＰＫＳ５を下記のように構築した。先ず、ＡａＯＫＳの場合、合成されたＡａＯＫＳ遺伝子（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．  米国）をテンプレートとし、［配列番号１３７／配列番号１３８］ライマーを活用してＰＣＲ増幅した後、ｐＥＴ−３０ａ（＋）プラスミドにＮｄｅＩとＥｃｏＲＩサイトを介して挿入した。他のプラスミドの場合も同様の方法により作製したが、この際、ＡａＰＫＳ４の場合は［配列番号１４１／配列番号１４２］ライマー、ＡａＰＫＳ５の場合は［配列番号１４３／配列番号１４４］ライマーを用いて増幅した。
[配列番号135] 5'-CTTTAAGAAGGAGATATACATATGAGTTCACTCTCCAACTCTC-3'
[配列番号136] 5'-CTTGTCGACGGAGCTCGAATTCATTACATGAGAGGCAGGCTGTG-3'
[配列番号137] 5'-CTTTAAGAAGGAGATATACATATGAGTTCACTCTCCAACGCTTC-3'
[配列番号138] 5'-CTTGTCGACGGAGCTCGAATTCATTACATGAGAGGCAGGCTGTG-3'
[配列番号139] 5'-CTTTAAGAAGGAGATATACATATGGGTTCACTCTCCGACTCTAC-3'
[配列番号140] 5'-CTTGTCGACGGAGCTCGAATTCATTACACAGGAGGCAGGCTATG-3'
[配列番号141] 5'-CTTTAAGAAGGAGATATACATATGGGTTCACTCTCCAACTAC-3'
[配列番号142] 5'-CTTGTCGACGGAGCTCGAATTCATTACACAGGGGGCAGGCTG-3'
[配列番号143] 5'-CTTTAAGAAGGAGATATACATATGGGTTCGATCGCCGAG-3'
[配列番号144] 5'-CTTGTCGACGGAGCTCGAATTCATTAGACAGGAGGCAGGCTG-3'
[配列番号145] 5'-GCTCACCATCATTGGGCTCCGTGGCCCCAATG-3'
[配列番号146] 5'-CATTGGGGCCACGGAGCCCAATGATGGTGAGC-3'
【０１０１】
上記の構築されたプラスミドをそれぞれ含んでいる大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株を培養した時に、ＡａＯＫＳ、ＡａＰＫＳ４、ＡａＰＫＳ５を発現させる菌株の培養液の色変化を観察することができた。したがって、色変化に寄与したポリケチドをＬＣ−ＭＳ分析により分析し（図４のＡ）、前記明示されたように、セルレニンを用いたマロニル−ＣｏＡ実験を行い、細胞内の増加されたマロニル−ＣｏＡの濃度につれて、各菌株が示すシグナルが増加するということを証明した（図４、図５）。この際、シグナルとは、培養上清の３００ｎｍでの吸光度を示す（図４Ｃ）。したがって、本発明では、ＲｐｐＡ酵素だけでなく、マロニル−ＣｏＡから色を呈するポリケチド系化合物を生産することができる、他の全てのタイプＩＩＩポリケチド合成酵素も、マロニル−ＣｏＡバイオセンサーとして活用可能であるということを証明した。
【０１０２】
下記実施例では、前記タイプＩＩＩポリケチド合成酵素のうちＲｐｐＡを用いて追加実験を行った。
【０１０３】
１．３．産業的に有用な他の菌株への拡張性の究明
上記の実施例より大腸菌での活用性を証明した後、本ＲｐｐＡマロニル−ＣｏＡバイオセンサーの他の産業的に有用な菌株への拡張性を究明した。そのために例示する菌株は、大腸菌に引き続き、代表的なグラム陰性菌であるシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）と、代表的なグラム陽性菌であるコリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）とロドコッカス・オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ）である。先ず、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ菌株からフラビオリンを生産するためのプラスミドを構築したが、この際、ベースとなるプラスミドとしては、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２を活用した（Ｋｏｖａｃｈ  ＭＥ，ｅｔ  ａｌ．（１９９５），Ｇｅｎｅ  １６６：１７５−１７６）。先ず、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２プラスミドは、［配列番号１２／配列番号１３］プライマーを用いて線形化した。その後、ｐＴａｃ−Ｓｇｒ＿ｒｐｐＡプラスミドをテンプレートとし、［配列番号１４／配列番号１５］プライマーを活用してｔａｃプロモーターを含むｒｐｐＡ発現カセットをＰＣＲ増幅した。このように得られた２つのＤＮＡ断片を、ギブソン・アセンブリによりｐＢＢＲ１−ｒｐｐＡプラスミドとして作製した。さらに、Ｎ−末端にｐｏｌｙ  Ｈｉｓ−ｔａｇを付けることが、酵素発現において、さらにはフラビオリンの生産においてどのような影響を与えるかを観察するために、先ず、ｐＴａｃ−Ｈｉｓ−Ｓｇｒ＿ｒｐｐＡを構築した。この際、［配列番号９／配列番号１０］プライマーとＰＣＲを用いて線形化したｐＴａｃＣＤＦＳプラスミドと、Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓゲノムＤＮＡから［配列番号１６／配列番号８］を用いてＰＣＲ増幅したＨｉｓ−ｔａｇ付きのｒｐｐＡ遺伝子を、ギブソン・アセンブリにより１つのプラスミド（ｐＴａｃ−Ｈｉｓ−Ｓｇｒ＿ｒｐｐＡ）として繋げた。このように作製されたプラスミドは、再び［配列番号１４／配列番号１５］を活用してＰＣＲ増幅し、前記線形化したｐＢＢＲ１ＭＣＳ２プラスミドとギブソン・アセンブリにより繋げ、ｐＢＢＲ１−Ｈｉｓ−ｒｐｐＡプラスミドが構築された。この際、ｐＢＢＲ１−ｒｐｐＡとｐＢＢＲ１−Ｈｉｓ−ｒｐｐＡプラスミドをそれぞれＰ．ｐｕｔｉｄａ菌株に形質転換し後、該菌株を、５ｍＬのＬＢ培地が入った試験管に接種した後、摂氏３０度、２２０ｒ．ｐ．ｍ．で１８時間培養した。その後、５ｍＬのＬＢに、０．８ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１０ｇ／Ｌのブドウ糖、および抗生剤を添加した後、継代培養し、同一の条件で２４時間培養してからサンプリングを行った。その結果、ｐＢＢＲ１−ｒｐｐＡプラスミドを有する菌株で、より多量のフラビオリンが生産された（４４．７ｍｇ／Ｌ；図６のＡ）。したがって、このように選別されたＰ．ｐｕｔｉｄａ  ｐＢＢＲ１−ｒｐｐＡ菌株を用いて、前記実施例１．２と同様に、セルレニンを活用したマロニル−ＣｏＡバイオセンサーとして性質を究明した結果、該菌株でも、セルレニンの濃度が増加するに従い、標準化されたシグナルと標準化されたフラビオリン生産量が増加することを観察することができた（図６のＢ、図６のＣ）。この際、継代培養は、２ｍＬのＭＲ−ＭＯＰＳ培地に、２０ｇ／Ｌの��ドウ糖、２５μｇ／ｍＬのカナマイシン、０．５ｍＭのＩＰＴＧ、適切な濃度のセルレニンが添加された状態で行い、ＭＲ−ＭＯＰＳ培地（ｐＨ７．０）の組成は、１Ｌ当たり、次のような成分を含んでいる：６．６７ｇ  ＫＨ２ＰＯ４，４ｇ（ＮＨ４）２ＨＰＯ４，０．８ｇ  ｃｉｔｒｉｃ  ａｃｉｄ，５ｍＬ  ｔｒａｃｅ  ｍｅｔａｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ，２０．０９ｇ  ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ），０．８ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ。したがって、ＲｐｐＡマロニル−ＣｏＡバイオセンサーが、Ｐ．ｐｕｔｉｄａで成功的に作動することが証明された。
[配列番号12] 5'-CGAACTCAGAAGTGAAACGCTGCCTAATGAGTGAGCTAAC-3'
[配列番号13] 5'-CATTGGTGCACCGTGCAGTCAAAATTCGCGTTAAATTTTTG-3'
[配列番号14] 5'-GACTGCACGGTGCACCAATG-3'
[配列番号15] 5'-GCGTTTCACTTCTGAGTTCG-3'
[配列番号16] 5'-CAATTTCACACAGGAAACAGAATGCACCATCACCATCACCATGCGACCCTGTGCCGACC-3'
【０１０４】
また、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株に本バイオセンサーを適用するために、ｒｐｐＡ発現プラスミドを作製しようとしたが、この際、ｐＣＥＳ−Ｈ３６をベースプラスミドとして活用した（Ｙｉｍ  ＳＳ，Ａｎ  ＳＪ，Ｋａｎｇ  Ｍ，Ｌｅｅ  Ｊ，Ｊｅｏｎｇ  ＫＪ（２０１３），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  １１０：２９５９−２９６９）。この際、ｐＣＥＳ−Ｈ３６−ＧＦＰプラスミドをテンプレートとし、［配列番号１７／配列番号１８］プライマーを活用して該プラスミドを線形化した。ｔａｃプロモーターベースのｒｐｐＡ発現カセットは、ｐＴａｃ−Ｓｇｒ＿ｒｐｐＡをテンプレートとし、［配列番号１９／配列番号２０］プライマーを活用してＰＣＲ増幅し、ｔａｃプロモーターベースのＮ−末端Ｈｉｓ−ｔａｇ付きのｒｐｐＡ発現カセットは、ｐＴａｃ−Ｈｉｓ−Ｓｇｒ＿ｒｐｐＡをテンプレートとし、［配列番号２１／配列番号２０］プライマーを活用してＰＣＲ増幅した。この２つのｒｐｐＡ発現カセットを、上記で線形化したｐＣＥＳ−Ｈ３６プラスミドとギブソン・アセンブリにより繋げることで、ｐＣＥＳ−ｒｐｐＡとｐＣＥＳ−Ｈｉｓ−ｒｐｐＡプラスミドが構築された。このように構築されたプラスミドをＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株に形質転換した後、５ｍＬのＬＢ培地に接種した。摂氏３０℃、２２０ｒ．ｐ．ｍ．の培養器にて１８時間培養した後、５ｍＬのＬＢ培地で４８時間継代培養してからサンプリングを行った。この際、Ｎ末端のＨｉｓ−ｔａｇが加えられたｒｐｐＡ発現プラスミド（ｐＣＥＳ−Ｈｉｓ−ｒｐｐＡ）を有する菌株のみから、３．９ｍｇ／Ｌのフラビオリンが生産された（図６のＤ）。したがって、このように選別されたＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ｐＣＥＳ−Ｈｉｓ−ｒｐｐＡ菌株を用いて、前記実施例１．２と同様に、セルレニンを活用したマロニル−ＣｏＡバイオセンサーとしての性質を究明した結果、該菌株も、セルレニンの濃度が増加するにつれて、標準化されたシグナルと標準化されたフラビオリン生産量が増加することを観察することができた（図６のＥ、図６のＦ）。
[配列番号17] 5'-CCATTATAATTAGGCCTCGG-3'
[配列番号18] 5'-CCATGCTACTCCTACCAACC-3'
[配列番号19] 5'-GGTTGGTAGGAGTAGCATGGGATCCATGGCGACCCTGTGCCGACC-3'
[配列番号20] 5'-CCGAGGCCTAATTATAATGGATTAGCCGGACAGCGCAACGC-3'
[配列番号21] 5'-GGTTGGTAGGAGTAGCATGGGATCCATGCACCATCACCATCACCATGC-3'
【０１０５】
さらに他の例示として、Ｒ．ｏｐａｃｕｓ菌株に本バイオセンサーを適用するために、ｒｐｐＡ発現プラスミドを作製しようとしたが、この際、ｐＣＨをベースプラスミドとして活用した。Ａｃｅｔａｍｉｄｅ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅプロモーター（Ｇ．  Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｌｅｔｔ．  ２２２：１３１−１３６，２００３）を活用したが、これは、［配列番号２２／配列番号２３］プライマーを用いてＰＣＲ増幅した。また、Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓのゲノムＤＮＡから、ｒｐｐＡ発現カセットを［配列番号２４／配列番号２５］プライマーを用いてＰＣＲ増幅し、Ｎ−末端Ｈｉｓ−ｔａｇの追加発現のためのｒｐｐＡ発現カセットを［配列番号２６／配列番号２５］プライマーを用いてＰＣＲ増幅した。それぞれのｒｐｐＡ発現カセット、ａｃｅｔａｍｉｄｅ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅプロモーターＤＮＡ断片、およびＰｓｔＩで線形化したｐＣＨプラスミドの全てをギブソン・アセンブリにより繋げ、これにより、２つのベクターｐＣＨ−ｒｐｐＡとｐＣＨ−Ｈｉｓ−ｒｐｐＡが作製された。このように構築されたプラスミドをＲ．ｏｐａｃｕｓ菌株に形質転換した後、５ｍＬのＬＢ培地に接種した。摂氏３０℃、２２０ｒ．ｐ．ｍ．の培養器で１８時間培養した後、５ｍＬのＬＢ培地で４８時間継代培養してからサンプリングを行った。この際、ｐＣＨ−ｒｐｐＡを有する菌株でのみ、フラビオリンの赤色が現れることが分かった（図６のＧ）。
[配列番号22] 5'-CTTGATCAGCTTGCATGCCTGCAGAAGCTTTCTAGCAGAAATAATTC-3'
[配列番号23] 5'-GTGCATGTGGACTCCCTTTCTCTTATC-3'
[配列番号24] 5'-GATAAGAGAAAGGGAGTCCACATGGCGACCCTGTGCCGACC-3'
[配列番号25] 5'-GGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGATTAGCCGGACAGCGCAACGC-3'
[配列番号26] 5'-GATAAGAGAAAGGGAGTCCACATGCACCATCACCATCACCATGC-3'
【０１０６】
実施例２．ＲｐｐＡバイオセンサーを活用した、増加されたマロニル−ＣｏＡ生産能を有する菌株の高速スクリーニング
２．１．大腸菌ゲノムスケールの合成調節ｓＲＮＡライブラリの導入による、増加されたマロニル−ＣｏＡ生産能を有する菌株の高速スクリーニング
ＲｐｐＡマロニル−ＣｏＡバイオセンサーの構築、成功的な作動究明、および本バイオセンサーの応用性および拡張性を立証した後、それを活用して、増加されたマロニル−ＣｏＡ生産能を有する菌株を選別するために、本発明者らが従来に開発した合成調節ｓＲＮＡ技術を導入しようとした（ＫＲ  １０−１５７５５８７，ＵＳ  ９３８８４１７，ＥＰ  １３７３５９４２．８，ＣＮ  ２０１３８００１２７６７．Ｘ，ＫＲ  １０−１６９０７８０，ＫＲ  １０−１７５０８５５，ＵＳ  １５３１７９３９，ＣＮ  ２０１４８００８１１３２．Ｘ；  Ｎａ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３），Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３１：１７０−１７４；  Ｙｏｏ  ＳＭ，Ｎａ  Ｄ，Ｌｅｅ  ＳＹ（２０１３），Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  ８：１６９４−１７０７）。また、大腸菌内の全ての主要遺伝子を含ませるために、既存に構築された大腸菌ゲノムスケールの合成調節ｓＲＮＡライブラリ（Ｅ．  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  Ｗ３１１０菌株内１，８５８遺伝子を含む）を導入し、ゲノムレベルでノックダウンした時に、マロニル−ＣｏＡの増産に効果的な発現抑制遺伝子ターゲットを捜そうとした。したがって、ｐＴａｃ−５´ＵＴＲ＿Ｓｇｒ＿ｒｐｐＡプラスミドを有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株に、大腸菌ゲノムスケールの合成調節ｓＲＮＡライブラリを導入した後、高速スクリーニングを行った（図７）。このように得られたコロニーのうち、１，８５８個のｓＲＮＡを全て含むように十分に選択するために、ライブラリの大きさの６倍以上である１１，４８８個のコロニーを選択した後、ロボティック自動化高速スクリーニングシステムを用いた。そのために、Ｋ３コロニーピッカー（ｃｏｌｏｎｙ  ｐｉｃｋｅｒ）（ＫＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂａｓｉｌｄｏｎ，ＵＫ）を活用し、ロボットにより、各コロニーを９６ウェルマイクロプレート中のＬＢ培地（抗生剤と０．２ｍＭのＩＰＴＧ添加）に接種した（韓国生命工学研究院、井邑分院、韓国）。Ｋ３コロニーピッカーは、ＬＢ寒天平板を照らして画像を得て、内蔵プログラムを用いてコロニーを認識し、多数のピンが取り付けられたロボットアームを用いてコロニーを取って接種する役割をする。このように接種された細胞は、ＨＴ−ＭｅｇａＧｒｏｗインキュベーター（バイオニア、韓国）で摂氏３０度、５００ｒ．ｐ．ｍ．で２４時間培養した。培養後、２３１個の相対的に強いシグナルを示す菌株を選別した。このように選別された菌株は、抗生剤と０．２ｍＭのＩＰＴＧが添加された３ｍＬのＬＢ培地が入っている１４ｍＬ  ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ  Ｆａｌｃｏｎ  ｒｏｕｎｄ−ｂｏｔｔｏｍ  ｔｕｂｅで、摂氏３０度、２５０ｒ．ｐ．ｍ．、２４時間培養した。これらのうち７０個の菌株が、対照群（ｓＲＮＡを含んでいないバイオセンサー菌株）に比べて高いシグナルを示し、これらの菌株に含まれているｓＲＮＡのシーケンス分析を行った（図８）。この際、３つのｓＲＮＡが重複観察された（ａｒｇＢ，ｆａｂＦ，ｎｕｄＤ）．。また、これらのうち２６個の菌株が、対照群に比べて４５％以上増加されたシグナルを示した。したがって、２６個の菌株に該当するｓＲＮＡベクターを、さらに本来のバイオセンサー菌株にそれぞれ形質転換し（図９）、さらに上記のよ���に３ｍＬのＬＢで培養した。その結果、これらのうち、対照菌株に比べてシグナルが７０％以上増加された１４個のｓＲＮＡを最終的に選別した。このように選別された、増加されたマロニル−ＣｏＡ生産のための１４種のノックダウン遺伝子ターゲットは、下記表３に挙げられている。
【０１０７】
【表３】
2020530757.tif 000005
【０１０８】
２．２．ＦＶＳＥＯＦアルゴリズムを用いて選別された、増加されたマロニル−ＣｏＡ生産のための過発現遺伝子ターゲットのＲｐｐＡバイオセンサーによる立証
ノックダウン遺伝子ターゲットだけでなく、過発現遺伝子ターゲットもＲｐｐＡバイオセンサーによって証明しようとした。この際、ＦＶＳＥＯＦアルゴリズムを活用して選別された遺伝子ターゲットが使用された（Ｐａｒｋ  ＪＭ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２），ＢＭＣ  Ｓｙｓｔ  Ｂｉｏｌ  ６：１０６）。インシリコ分析では、大腸菌ゲノムレベルの代謝モデルｉＪＯ１３６６が使用された（Ｏｒｔｈ  ＪＤ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１），Ｍｏｌ  Ｓｙｓｔ  Ｂｉｏｌ  ７：５３５）．  このように選別された９個の遺伝子ターゲットは、次のとおりである：  ｚｗｆ，ｍｄｈ，ｆｕｍＡ，ｆｕｍＢ，ｆｕｍＣ，ｓｅｒＡ，ｓｅｒＢ，ｓｅｒＣ，ｔｐｉＡ（図１０のＡ、Ｃ）。各遺伝子ターゲットは、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）で増幅し、ｐＴｒｃ９９Ａプラスミドにｔｒｃプロモーター下で挿入し、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＴａｃ−５´ＵＴＲ−Ｓｇｒ＿ｒｐｐＡ菌株に形質転換した。このように構築されたセンサー菌株を、前記実施例２．１と同様に試験管で培養した。この際、シグナルを測定した結果、９個の遺伝子ターゲットのうち８個の遺伝子ターゲット（ｓｅｒＡ，ｍｄｈ，ｚｗｆ，ｔｐｉＡ，ｓｅｒＢ，ｆｕｍＢ，ｓｅｒＣ，ｆｕｍＣ）で、対照群に比べて増加されたシグナルが観察された（図１０のＢ）。
【０１０９】
実施例３．ＲｐｐＡバイオセンサーを活用して選別されたノックダウン遺伝子ターゲットを活用した有用産物の増産
本実施例および下記実施例で活用されたフラスコ培養の条件は、特に明示していない場合、次のとおりである。コロニーは、１０ｍＬのＬＢ培地を含む試験管に接種し、摂氏３７度、２００ｒ．ｐ．ｍ．のインキュベーターで培養し、１ｍＬの細胞培養液は、５０ｍＬの改良されたＲ／２培地を含んでいるバッフルフラスコに接種した。摂氏３７度、２００ｒ．ｐ．ｍ．で培養されていた菌株は、ＯＤ６００値が０．８に達した時に、０．５ｍＭのＩＰＴＧを用いて生産を誘導し、摂氏３０℃、２００ｒ．ｐ．ｍ．で４８時間培養した。炭素源としては、グリセロールまたはブドウ糖を添加した。
【０１１０】
３．１．選別されたノックダウン遺伝子ターゲットを活用した６−メチルサリチル酸の増産
次のステップとして、前記実施例により選別された、増加されたマロニル−ＣｏＡ生産能を可能とするノックダウン遺伝子ターゲットを実際の有用産物の生産に適用しようとした。これにより、本バイオセンサーが、効果的なノックダウン遺伝子ターゲットを成功的に選別することができたという点を証明しようとした。したがって、その第一の産物として、ペニシリウム・グリセオフルバム（Ｐｅｎｉｃｉｌｉｕｍ  ｇｒｉｓｅｏｆｕｌｖｕｍ（またはＰｅｎｉｃｉｌｉｕｍ  ｐａｔｕｌｕｍ）菌株から生産されると報告されている６−メチルサリチル酸（６−ｍｅｔｈｙｌｓａｌｉｃｙｌｉｃ  ａｃｉｄ、６ＭＳＡ）を、遺伝子操作された大腸菌から生産しようとした。６−メチルサリチル酸は、抗生剤および抗真菌剤としての効果を有しており（Ｄｉｍｒｏｔｈ  Ｐ，Ｒｉｎｇｅｌｍａｎｎ  Ｅ，Ｌｙｎｅｎ  Ｆ（１９７６），Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ６８：５９１−５９６）、真菌類から発見されるタイプＩ繰り返し性ポリケチド合成酵素６−メチルサリチル酸合成酵素（６−ｍｅｔｈｙｌｓａｌｉｃｙｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｙｎｔｈａｓｅ、６ＭＳＡＳ）によって、１分子のアセチル−ＣｏＡと３分子のマロニル−ＣｏＡから生産される（図１１）。
本発明で使用した，６−メチルサリチル酸合成酵素（６ＭＳＡＳ）の配列は、次の通りである：
６−メチルサリチル酸合成酵素（６ＭＳＡＳ）［配列番号１２３］：
mhsaatstyp sgktspapvg tpgteyseye fsndvavvgm acrvaggnhn pellwqslls qksamgeipp mrwepyyrrd arnekflknt tsrgyfldrl edfdcqffgi spkeaeqmdp qqrvslevas ealedagipa kslsgsdtav fwgvnsddys klvledlpnv eawmgigtay cgvpnrisyh lnlmgpstav daacasslva ihhgvqairl geskvaivgg vnalcgpglt rvldkagais sdgscksfdd dahgyargeg agalvlkslh ralldhdnvl avikgsavcq dgktngimap nsvaqqlaan nalsaanidp htvryveaha tstplgdpte isaiasvyga drpaddpcyi gsikpnighl eagagvmgfi kavlaiqkgv lppqanltkl nsridwktag vkvvqeatpw pesdpirrag vcsygyggtv shavieefsp ilqpdplgng avsgpgllll sgpqekrlal qaktlrdwmt aegkdhnlsd ilttlatrrd hhdyraalvv ddyrdaeqvl qslangvdht fttqsrvlgs diskdvvwvf sghgaqwpdm gkqlihnpvf faaiqpldel iqaeiglspi ellrtgdfes sdrvqiltyv mqiglsallq sngitpqavi ghsvgeiaas vvagalspae galivtrral lyrqvmgkgg milvnlpsae teeilgsrsd lvvaidssps scvvagdkel vaetaealka rgvktftvks diafhsptln glvdplrdvl aetlspvspn vklystalad prgqdlrdve ywagnmvnrv rltsavkaav edgyrlflev sthpvvshsi netlmdagme dfaviptllr kkptekhilh siaqlhcrga evnwaaqmpg rwatgvpttt wmhkpiwrki etaplhtglt hdvekhtllg qripvpgtdt yvyttrldnd tkpfpgshpl hgteivpaag lintflkgtg gqmlqnvvlr vpvainaprs vqvvvqqdqv kvvsrlipse psqldddasw vthttaywdr kvagsedrid faavksrlvt kladnfsidy ldkvgvsamg fpwavtehyr ndkemlarvd vnpaisgdap lpwdssswap vldaatsvgs tifptpalrm paqiervevf tsqdppkisw lyvqeasdsv ptshvsvvse agevlakfta mrfseiegtp gvsgsmeslv hqiawppatp aeeplsietv ilvspdattr alyaaslptr vnsfqfsstq effsnasslp lekgtvvtyi pgevaslaev paasesftwn llelikftvn gslpikvftl tanigegqtp talaqsplyg larviasehp dlgtlidvee pviplstmry iqgadiirin dgiartsrfr slprnkllpa segprllprp egtylitggl gvlglevadf lvekgarrll lisrralppr rtwdqvsedl qptiakirll esrgasvhvl plditkpdav eqlttaldrl slpsvqgvvh aagvldnelv mqttrdafnr vlapkiagal alhevfppks vdffvmfssc gnlvgftgqa sygsgnafld tlathrarlg daavsfqwts wrglgmgast dfinaelesk gitdvtrdea faawqhlaky dmdhgvvlrs rafedgepip vsilndiavr rvgtvsntsp aaagssdavp tsgpelkayl dekirgcvak vlqmtaedvd skaaladlgv dsvmtvtlrr qlqltlkiav pptltwshpt vshlavwfae klak
【０１１１】
６−メチルサリチル酸を生産可能な大腸菌株を構築するために、先ず、ｐＴａｃ１５Ｋプラスミドを［配列番号２７／配列番号２８］プライマーを用いて逆ＰＣＲにより線形化させた後、Ｐ．ｇｒｉｓｅｏｆｕｌｖｕｍゲノムＤＮＡをテンプレートとし、［配列番号２９／配列番号３０］、配列番号３１／配列番号３０］プライマーを順に用いて６−メチルサリチル酸合成酵素をコードするＰｇ６ＭＳＡＳ遺伝子を増幅した。この２つのＤＮＡ断片を、ギブソン・アセンブリにより繋げることで、ｐＴａｃ−Ｐｇ６ＭＳＡＳプラスミドが構築された（図１２のＢ）。６ＭＳＡＳ酵素の末端にはａｃｙｌ−ｃａｒｒｉｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎドメインが存在するが、この部分が活性化されるためには、４´−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（４´−ｐｈｏｓｐｈｏｐａｎｔｅｔｈｅｉｎｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、Ｓｆｐ）が必要である。
【０１１２】
本発明で使用した，４´−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（Ｓｆｐ）の配列は、次の通りである：
４´−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（Ｓｆｐ）[配列番号１２４]:
mkiygiymdr plsqeenerf msfispekre kcrrfyhked ahrtllgdvl vrsvisrqyq ldksdirfst qeygkpcipd lpdahfnish sgrwvicafd sqpigidiek tkpisleiak rffskteysd llakdkdeqt dyfyhlwsmk esfikqegkg lslpldsfsv rlhqdgqvsi elpdshspcy iktyevdpgy kmavcavhpd fpeditmvsy eell
【０１１３】
したがって、先ず、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓのゲノムＤＮＡから、［配列番号３２／配列番号３３］プライマーを用いて４´−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼをコードするｓｆｐ遺伝子断片をＰＣＲ増幅し、ＥｃｏＲＩサイトを介してｐＴａｃ１５Ｋプラスミドに挿入した。このように完成されたプラスミドは、［配列番号３４／配列番号３５］プライマーを用いてさらにＰＣＲ増幅した後、ｐＴａｃ−Ｐｇ６ＭＳＡＳプラスミドにＳｐｈＩサイトを介して挿入することで、ｐＴａｃ−Ｐｇ６ＭＳＡＳ−ｓｆｐプラスミドが完成された（図１２のＡ）。完成されたプラスミドは、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株に形質転換し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって酵素発現をチェックした後（図１２のＣ）、様々な濃度のブドウ糖またはグリセロールの存在下で、改造されたＲ／２培地でフラスコ培養を行った。その結果、１００ｇ／Ｌのグリセロールの添加時に、４．７ｍｇ／Ｌの６−メチルサリチル酸が生産されたことが分かった（図１３のＡ）。生産された６−メチルサリチル酸の真偽は、ＬＣ−ＭＳにより検証した（図１３のＢ、図１３のＣ）。前記実施例で選別されたｓＲＮＡを導入する前に、互いに異なる大腸菌株における６−メチルサリチル酸の生産能を調べるために、表１の１６種の大腸菌株にｐＴａｃ−Ｐｇ６ＭＳＡＳ−ｓｆｐプラスミドを導入した後、試験管スケールで培養（３ｍＬの改良されたＲ／２培地）を行い、これらのうち、１ｍｇ／Ｌ以上の６ＭＳＡを生産する６種の菌株（ＮＭ５２２，ＢＬ２１，Ｓ１７−１，ＪＭ１１０，ＨＢ１０１，ＸＬ１−Ｂｌｕｅ）を選別した（図１３のＤ）。そして、選別された菌株のそれぞれに１４個の選別されたｓＲＮＡを導入して構築された総８４種の菌株に対して、試験管スケールで培養を行った。その結果、ｐａｂＡがノックダウンされたＢＬ２１（ＤＥ３）菌株から最も多い６−メチルサリチル酸が生産されたが（６．１  ｍｇ／Ｌ；  図１４）、この菌株からは、後に同一培地条件でフラスコ培養した（５０ｍＬ）結果、８．０ｍｇ／Ｌの６−メチルサリチル酸が生産された（図１３のＥ）。
[配列番号27] 5'-GCTGAGAAGCTTGCCAAATAATGGATCCTCTAGAGTCGACCTG-3'
[配列番号28] 5'-CTGGGGATGTTTTCCCAGAGGGGTATGTAGAAGTTGCAGCGGAATGCATGAATTCTGTTTCCTGTGTGAAATTG-3'
[配列番号29] 5'-ACAGTGAATATGAATTCTCCAACG-3'
[配列番号30] 5'-ATTATTTGGCAAGCTTCTCAGC-3'
[配列番号31] 5'-CTCTGGGAAAACATCCCCAGCACCAGTCGGAACCCCTGGGACTGAGTACAGTGAATATGAATTCTCCAACG-3'
[配列番号32] 5'-TAATAAGAATTCATGAAGATTTACGGAATTTATATG-3'
[配列番号33] 5'-TTATTAGAATTCTTATAAAAGCTCTTCGTACGAG-3'
[配列番号34] 5'-CTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCCACTCCCGTTCTGGATAATG-3'
[配列番号35] 5'- CAAAACAGCCAAGCTTGCATGC-3'
【０１１４】
６−メチルサリチル酸の生産菌株をさらに最適化するために、長さの長い（５．３ｋｂ）Ｐｇ６ＭＳＡＳ遺伝子のみをプラスミドで発現させ（ｐＴａｃ−Ｐｇ６ＭＳＡＳ）  、ｓｆｐは、ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株のゲノム上に挿入された菌株ＢＡＰ１（Ｐｆｅｉｆｅｒ  ＢＡ，Ａｄｍｉｒａａｌ  ＳＪ，Ｇｒａｍａｊｏ  Ｈ，Ｃａｎｅ  ＤＥ，Ｋｈｏｓｌａ  Ｃ（２００１），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９１：１７９０−１７９２）を活用して発現させようとした。フラスコ培養結果、１７．６ｍｇ／Ｌの増加された６−メチルサリチル酸の生産量を示したが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果、これは、改善された４´−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの発現と、減少された不活性化６−メチルサリチル酸合成酵素の割合であると考えられた（図１２のＣ）。したがって、大腸菌ＢＡＰ１  ｐＴａｃ−Ｐｇ６ＭＳＡＳ菌株にｐａｂＡノックダウンｓＲＮＡを導入した時に、約３５．８％増加された、２３．９ｍｇ／Ｌの６−メチルサリチル酸の生産量が得られた（図１３のＦ）。この菌株を利用して流加型醗酵を行ったところ、２７時間後に、９７．８ｍｇ／Ｌの増加された６−メチルサリチル酸濃度が得られた（図１３のＧ）。流加型醗酵は、６．６Ｌの発酵器（ＢｉｏＦｌｏ３２０，Ｅｐｐｅｎｄｏｆｒ，ドイツ）にて、１．９Ｌの改良されたＲ／２培地で行い、初期炭素源としては５０ｇ／Ｌのグリセロールを添加した。コロニーを１０ｍＬのＬＢ培地を含んでいる試験管に接種した後、摂氏３７度、２００ｒ．ｐ．ｍ．で一日間培養した。その後、それぞれ５０ｍＬの改良されたＲ／２培地を含んでいるバッフルフラスコ２つに接種したが、この際、炭素源としては、５０ｇ／Ｌのグリセロールを活用した。フラスコ培養は、ＯＤ６００値が約２となるまで、９時間程度行い、その後、発酵器に接種した。培養のｐＨは、２８％（ｖ／ｖ）のアンモニア水を用いて６．８に維持し、溶存酸素度（ＤＯ）値は、２Ｌ／ｍｉｎの空気、１，０００ｒ．ｐ．ｍ．まで自動調節可能な撹拌速度、および増加する酸素流量により、４０％に維持した。栄養供給はｐＨ−ｓｔａｔ  ｓｔｒａｔｅｇｙにより行ったが、ｐＨ値が６．８３を超えた時に自動でフィードが流入されるように設定した。フィード溶液は、１Ｌ当たり、次の成分を有している：  ８００  ｇ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ，６  ｍＬ  ｔｒａｃｅ  ｍｅｔａｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎおよび１２  ｇ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  。接種後、ＯＤ６００値が２〜３に達した時に、０．５ｍＭのＩＰＴＧを用いて外来タンパク質の発現を誘導した。
【０１１５】
６−メチルサリチル酸の生産量をさらに増加させるために、上記で選別された３つのＦＶＳＥＯＦ遺伝子ターゲット（Ｐ  ＜  ０．０５；  ｚｗｆ，ｍｄｈ，ｓｅｒＡ；  図１０）と下記のような５個の酵素の発現を増加させようとした：  Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ、ＡｃｃＢＣおよびＡｃｃＤ１）、Ｅ．  ｃｏｌｉ  グリセルアルデヒド  ３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ  ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＧａｐＡ）、  Ｅ．  ｃｏｌｉ  ホスホグリセリン酸キナーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ、Ｐｇｋ）、Ｅ．  ｃｏｌｉ  アセチル−ＣｏＡシンテターゼ（ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、Ａｃｓ）、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＰＤＨ：ＡｃｅＥＦおよびＬｐｄ）。この際、該各遺伝子断片は、ｐＢＢＲ１ＴａＣプラスミドに挿入してクローニングしたが、ｐＢＢＲ１ＴａＣプラスミドは、ｐＢＢＲ１ＭＣＳから構築されたｔａｃプロモーターベースの発現プラスミドである。ｐＢＢＲ１ＴａＣの構築のために、先ず、ｐＢＢＲ１ＭＣＳを［配列番号１４７／配列番号１４８］プライマーを用いて逆ＰＣＲにより増幅し、これに、［配列番号１４９／配列番号１５０］プライマーを用いてｐＴａｃ１５Ｋをテンプレートとして増幅したｔａｃプロモーター、ＭＣＳ、ｒｒｎＢＴ１Ｔ２ターミネーター断片をギブソン・アセンブリによりクローニングした。その後、前記実施例２．２で構築されたｐＴｒｃ９９Ａ−ｚｗｆ、ｐＴｒｃ９９Ａ−ｍｄｈ、ｐＴｒｃ９９Ａ−ｓｅｒＡプラスミドから遺伝子らをｐＢＢＲ１ＴａＣに移すために、下記のような実験を行った。先ず、ｚｗｆ、ｍｄｈ、ｓｅｒＡ遺伝子は、それぞれ［配列番号１５１/配列番号１５２］プライマーを用いて増幅し、ｐＢＢＲ１ＴａＣプラスミドを［配列番号７５/配列番号７６］プライマーを用いて増幅した後、ギブソン・アセンブリにより、ｐＢＢＲ１−ｚｗｆ、ｐＢＢＲ１−ｍｄｈ、ｐＢＢＲ１−ｓｅｒＡプラスミドの作製を完成した。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼは、αサブユニットであるＡｃｃＢＣとβサブユニットであるＡｃｃＤ１で構成されているが、該遺伝子は、先ずそれぞれｐＢＢＲ１ＴａＣにクローニングし、ｐＢＢＲ１−ａｃｃＢＣ、ｐＢＢＲ１−ａｃｃＤ１を構築した。この際、ａｃｃＢＣ遺伝子は、［配列番号１５３／配列番号１５４］プライマーを用いて増幅し、ａｃｃＤ１遺伝子は、［配列番号１５５／配列番号１５６］プライマーを用いて増幅した。この２つの遺伝子断片を、［配列番号９／配列番号１０］プライマーを用いて増幅したｐＢＢＲ１ＴａＣプラスミドに、それぞれギブソン・アセンブリにより挿入した。このように構築された２つのプラスミドのうちｐＢＢＲ１−ａｃｃＤ１をテンプレートとし、［配列番号１５７／配列番号１５８］プライマーを用いてｔａｃプロモーターとａｃｃＤ１が含まれた遺伝子断片を増幅し、これを、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素によって切断されたｐＢＢＲ１−ａｃｃＢＣプラスミドに、ギブソン・アセンブリ���より挿入することで、ｐＢＢＲ１−ａｃｃＢＣＤ１プラスミドの構築が完成された。大腸菌ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）は、ｓｕｂｕｎｉｔ  Ｅ１（ＡｃｅＥ）、Ｅ２（ＡｃｅＦ）、およびＥ３（Ｌｐｄ）で構成されているが、先ず、ａｃｅＥＦ遺伝子断片およびｌｐｄ遺伝子断片をｐＢＢＲ１ＴａＣプラスミドにクローニングし、ｐＢＢＲ１−ａｃｅＥＦとｐＢＢＲ１−ｌｐｄプラスミドを構築しようとした。遺伝子断片ａｃｅＥＦは、［配列番号１５９／配列番号１６０］プライマーを用いて増幅し、ｌｐｄは、［配列番号１６１／配列番号１６２］プライマーを用いて増幅した。この２つの遺伝子断片は、前記ｐＢＢＲ１−ａｃｃＢＣ、ｐＢＢＲ１−ａｃｃＤ１の構築時に活用した線形化されたｐＢＢＲ１ＴａＣプラスミドに、ギブソン・アセンブリにより挿入した。このように構築された２つのプラスミドのうち、ｐＢＢＲ１−ｌｐｄをテンプレートとし、［配列番号１６３／配列番号１６４］プライマーを用いて増幅したｔａｃプロモーターとｌｐｄを含む遺伝子断片を、ＳａｌＩ制限酵素によって切断されたｐＢＢＲ１−ａｃｅＥＦプラスミドに挿入することで、ｐＢＢＲ１−ａｃｅＥＦ−ｌｐｄプラスミドを完成した。Ｅ．ｃｏｌｉグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ  ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＧａｐＡ）、Ｅ．ｃｏｌｉホスホグリセリン酸キナーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ、Ｐｇｋ）、Ｅ．ｃｏｌｉアセチル−ＣｏＡシンテターゼ（ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、Ａｃｓ）をそれぞれ含むプラスミドであるｐＢＢＲ１−ｇａｐＡ、ｐＢＢＲ１−ｐｇｋ、ｐＢＢＲ１−ａｃｓの構築のために、［配列番号１６５／配列番号１６６］プライマー、［配列番号１６７／配列番号１６８］プライマー、［配列番号１６９／配列番号１７０］プライマーを用いてｇａｐＡ、ｐｇｋ、ａｃｓ遺伝子断片をＰＣＲ増幅した後、それぞれ前記線形化されたｐＢＢＲ１ＴａＣプラスミドに、ギブソン・アセンブリにより挿入した。
[配列番号147] 5'-GACGGATGGCCTTTTACTAGTGCCTGGGGTGCCTAATGAG-3'
[配列番号148] 5'-CGATGATTAATTGTCAACTGCTACGCCTGAATAAGTGATAATAAG-3'
[配列番号149] 5'-GTTGACAATTAATCATCGGCTC-3'
[配列番号150] 5'-ACTAGTAAAAGGCCATCCGTCAGGATG-3'
[配列番号151] 5'-GTTGACAATTAATCATCGGC-3'
[配列番号152] 5'-CGTTTCACTTCTGAGTTCGG-3'
[配列番号153] 5'-CAATTTCACACAGGAAACAGAATTCGTGTCAGTCGAGACTAGGAAG-3'
[配列番号154] 5'-CTCTAGAGGATCCCCGGGTACCATTACTTGATCTCGAGGAGAAC-3'
[配列番号155] 5'-CAATTTCACACAGGAAACAGAATTCATGACCATTTCCTCACCTTTG-3'
[配列番号156] 5'-CTCTAGAGGATCCCCGGGTACCATTACAGTGGCATGTTGCCGTG-3'
[配列番号157] 5'-GAGTCGACCTGCAGGCATGCATTGACAATTAATCATCGGCTCG-3'
[配列番号158] 5'-CTCATCCGCCAAAACAGCCAAGCTT-3'
[配列番号159] 5'-CAATTTCACACAGGAAACAGAATTCATGTCAGAACGTTTCCCAAATG-3'
[配列番号160] 5'-CTCTAGAGGATCCCCGGGTACCATTACATCACCAGACGGCGAATG-3'
[配列番号161] 5'-CAATTTCACACAGGAAACAGAATTCATGAGTACTGAAATCAAAACTC-3'
[配列番号162] 5'-CTCTAGAGGATCCCCGGGTACCATTACTTCTTCTTCGCTTTCGG-3'
[配列番号163] 5'-GTACCCGGGGATCCTCTAGAGTTGACAATTAATCATCGGCTCG-3'
[配列番号164] 5'-CAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGAC-3'
[配列番号165] 5'-CAATTTCACACAGGAAACAGAATTCATGACTATCAAAGTAGGTATCAAC-3'
[配列番号166] 5'-CTCTAGAGGATCCCCGGGTACCATTATTTGGAGATGTGAGCGATC-3'
[配列番号167] 5'-CAATTTCACACAGGAAACAGAATTCATGTCTGTAATTAAGATGACCGATC-3'
[配列番号168] 5'-CTCTAGAGGATCCCCGGGTACCATTACTTCTTAGCGCGCTCTTCG-3'
[配列番号169] 5'-CAATTTCACACAGGAAACAGAATTCATGAGCCAAATTCACAAACAC-3'
[配列番号170] 5'-CTCTAGAGGATCCCCGGGTACCATTACGATGGCATCGCGATAG-3'
【０１１６】
このように構築された８種のプラスミドを、既存の最大生産量を示す菌株であるＥ．ｃｏｌｉ  ＢＡＰ１  ｐＴａｃ−Ｐｇ６ＭＳＡＳ  ｐＷＡＳ−ａｎｔｉ−ｐａｂＡにそれぞれ形質転換した後、フラスコ培養を行った結果は、図１５のＡのとおりである。この際、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼが過発現された時に、６−メチルサリチル酸が６３．６ｍｇ／Ｌまで増産された。該菌株を用いて流加型醗酵を行ったところ、図１５のＢに示されたように、グリセロールから４４０．３ｍｇ／Ｌ±３０．２ｍｇ／Ｌまで６−メチルサリチル酸が増加された。
【０１１７】
３．２．選別されたノックダウン遺伝子ターゲットを活用したアロエソンの増産
第二の産物として、Ｒｈｅｕｍ  ｐａｌｍａｔｕｍ（Ａｂｅ  Ｉ，Ｕｔｓｕｍｉ  Ｙ，Ｏｇｕｒｏ  Ｓ，Ｎｏｇｕｃｈｉ  Ｈ（２００４），ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ５６２：１７１−１７６）またはＡｌｏｅ  ａｒｂｏｒｅｓｃｅｎｓ（Ｍｉｚｕｕｃｈｉ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．（２００９），ＦＥＢＳ  Ｊ  ２７６：２３９１−２４０１）のタイプＩＩＩポリケチド合成酵素から生産されるアロエソン（ａｌｏｅｓｏｎｅ）をテストしようとした。アロエソンは、美白効果を示すため化粧品業界で広く用いられているアロエシン（ａｌｏｅｓｉｎ）の前駆体である。しかし、アロエソンからアロエシンが生産される生合成経路はまだ報告されていない。アロエソンは、１分子のアセチル−ＣｏＡと６分子のマロニル−ＣｏＡによって生産され（図１６）、Ｒ．ｐａｌｍａｔｕｍアロエソン合成酵素（ａｌｏｅｓｏｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ、ＡＬＳ）またはＡ．ａｒｂｏｒｅｓｃｅｎｓアロエソン合成酵素（ａｌｏｅｓｏｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ、ＰＫＳ３）から生産されることが報告されている。
【０１１８】
Ｒ．ｐａｌｍａｔｕｍ由来のアロエソン合成酵素（ａｌｏｅｓｏｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ、ＡＬＳ）の配列は、次の通りである：
Ｒ．ｐａｌｍａｔｕｍ  由来のアロエソン合成酵素（ａｌｏｅｓｏｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ、ＡＬＳ）[配列番号１２５]:
madvlqeirn sqkasgpatv laigtahppt cypqadypdf yfrvcksehm tklkkkmqfi cdrsgirqrf mfhteenlgk npgmctfdgp slnarqdmli mevpklgaea aekaikewgq dksrithlif ctttsndmpg adyqfatlfg lnpgvsrtmv yqqgcfaggt vlrlvkdiae nnkgarvlvv cseivafafr gphedhidsl igqllfgdga aalvvgtdid esverpifqi msatqatipn slhtmalhlt eagltfhlsk evpkvvsdnm eelmleafkp lgitdwnsif wqvhpggrai ldkieeklel tkdkmrdsry ilseygnlts acvlfvmdem rkrsfregkq ttgdgyewgv aiglgpgltv etvvlrsvpi p
【０１１９】
また、Ａ．ａｒｂｏｒｅｓｃｅｎｓ由来のアロエソン合成酵素（ａｌｏｅｓｏｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ、ＰＫＳ３）の配列は、次の通りである:
Ａ．ａｒｂｏｒｅｓｃｅｎｓ由来のアロエソン合成酵素（ａｌｏｅｓｏｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ、ＰＫＳ３）[配列番号１２６]:
mgslsdstpl mkdvqgirka qkadgtatvm aigtahpphi isqdsyadfy frvtnsehkv elkkkfdric kktmigkryf nfdeeflkky pnitsfdkps lndrhdicip gvpalgaeaa vkaieewgrp kseithlvfc tsggvdmpsa dfqcakllgl rtnvnkyciy mqgcyaggtv mryakdlaen nrgarvlmvc aeltiialrg pndshidnai gnslfgdgaa alivgsdpii gvekpmfeiv cakqtvipns eevihlhlre sglmfymtkd saatisnnie aclvdvfksv gmtppedwns lfwiphpggr aildqveakl klrpekfsat rtvlwdygnm isacvlyild emrrksaaeg letygeglew gvllgfgpgm tietillhsl ppv
【０１２０】
この２つの酵素に該当する遺伝子は、それぞれＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ（米国）。から合成された後、ｐＣＤＦＤｕｅｔ−１（Ｎｏｖａｇｅｎ）プラスミドのＮｃｏＩサイトにギブソン・アセンブリにより挿入した。このように構築された２つのプラスミドｐＣＤＦ−ＲｐＡＬＳとｐＣＤＦ−ＡａＰＫＳ３を、それぞれ大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株に形質転換した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、外来酵素の発現を確認し（図１７のＡ）、フラスコ培養を行った結果、２０ｇ／Ｌのブドウ糖から２０．５ｍｇ／Ｌと４．７ｍｇ／Ｌのアロエソンが生産された（図１７のＢ）。したがって、以後の実験では、プラスミドｐＣＤＦ−ＲｐＡＬＳを使用した。生産されたアロエソンの真偽は、ＬＣ−ＭＳとＭＳ／ＭＳ分析により検証された（図１７のＣ）。その後、前記実施例で選別された１４種のｓＲＮＡを導入しようとした。前記実施例３．１と同様に、種々の大腸菌株に同時多発的に導入して結果を確認するために、ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株とＷ３１１０（ＤＥ３）菌株に各ｓＲＮＡを導入し、２８種の菌株を作製した。このように作製された菌株を試験管スケールで培養した結果は、図１７のＦのとおりである。この際、ｐａｂＡがノックダウンされたＢＬ２１（ＤＥ３）菌株が、最も高いアロエソン生産量を示したが（１８．５ｍｇ／Ｌ）、フラスコでの生産量は２７．１ｍｇ／Ｌであって、これは、対照群（ｓＲＮＡを含んでいない）菌株に比べて３２．２％向上した結果である（図１７のＤ、図１７のＥ）。
【０１２１】
アロエソンの生産量をさらに増加させるために、上記で６−メチルサリチル酸の増産のために活用した３つのＦＶＳＥＯＦ遺伝子ターゲット（ｚｗｆ、ｍｄｈ、ｓｅｒＡ；図１０）と、下記のような５個の酵素の発現を増加させようとした:Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ、ＡｃｃＢＣおよびＡｃｃＤ１）、E. coli グリセルアルデヒド  ３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ  ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＧａｐＡ）、E. coli ホスホグリセリン酸キナーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ、Ｐｇｋ）、E. coli アセチル−ＣｏＡシンテターゼ（ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、Ａｃｓ）、E. coli ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＰＤＨ：ＡｃｅＥＦおよびＬｐｄ）。該遺伝子を含んでいるプラスミド８種であるｐＢＢＲ１−ｚｗｆ，ｐＢＢＲ１−ｍｄｈ，ｐＢＢＲ１−ｓｅｒＡ，ｐＢＢＲ１−ａｃｃＢＣＤ１，ｐＢＢＲ１−ｇａｐＡ，ｐＢＢＲ１−ｐｇｋ，ｐＢＢＲ１−ａｃｓ，およびｐＢＢＲ１−ａｃｅＥＦ−ｌｐｄ  を、既存の最大生産量を示す菌株であるＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）  ｐＣＤＦ−ＲｐＡＬＳ  ｐＷＡＳ−ａｎｔｉ−ｐａｂＡにそれぞれ形質転換した後、フラスコ培養を行った結果は、図１８のとおりである。この際、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼが過発現された時に、アロエソンが３０．９ｍｇ／Ｌまで増産された。この際、炭素源としては、２０ｇ／Ｌのブドウ糖が使用された。
【０１２２】
３．３．選別されたノックダウン遺伝子ターゲットを活用したレスベラトロールの増産
第三の産物として、植物から生産されるレスベラトロール（ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）を決定した。レスベラトロールは、フェニルプロパノイド系天然物の中でも、スチルベノイドに属する物質であって、抗酸化、抗老化、坑癌効果などを有している非常に有用な天然物である。レスベラトロールは、１分子のｐ−クマロイル（ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−ＣｏＡと３分子のマロニル−ＣｏＡから生産される（図１９）。したがって、先ず、ｐ−クマル酸を簡単な炭素源から生産する菌株を構築することとし、そのために、既存に構築されたチロシン過生産菌株を使用した（Ｋｉｍ  Ｂ，Ｂｉｎｋｌｅｙ  Ｒ，Ｋｉｍ  ＨＵ，Ｌｅｅ  ＳＹ（２０１８），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ）。この菌株（ＢＴＹ５．１３）は、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ベースのｔｙｒＲ、ｔｙｒＰがノックアウトされた菌株（ＢＴＹ５）に、ｐＴａｃ１５ＫプラスミドベースのＺｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ  ｔｙｒＣ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ａｒｏＧｆｂｒ、ａｒｏＬを過発現させるプラスミド（ｐＴＹ１３）を含んでいる。チロシンをｐ−クマル酸に転換させるためには、チロシンアンモニア−リアーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ａｍｍｏｎｉａ−ｌｙａｓｅ、ＴＡＬ）を発現させなければならないため、サッカロスリクス・エスパナエンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｔｈｒｉｘ  ｅｓｐａｎａｅｎｓｉｓ）のゲノムＤＮＡから、［配列番号３６／配列番号３７］プライマーを用いてチロシンアンモニア−リアーゼをコードする遺伝子ＳｅＴＡＬを増幅した後、ｐＴｒｃ９９Ａプラスミドを、［配列番号３８／配列番号３９］プライマーを用いたＰＣＲにより線形化した。その後、この２つのＤＮＡ断片をギブソン・アセンブリにより繋げることで、プラスミドｐＴｒｃ−ＳｅＴＡＬが構築された。
【０１２３】
本発明で使用した、チロシンアンモニア−リアーゼの配列は、次の通りである：
チロシンアンモニア−リアーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ａｍｍｏｎｉａ−ｌｙａｓｅ、ＴＡＬ）［配列番号１２７］：
mtqvverqad rlssreylar vvrsagwdag ltsctdeeiv rmgasartie eylksdkpiy gltqgfgplv lfdadseleq ggslishlgt gqgaplapev srlilwlriq nmrkgysavs pvfwqkladl wnkgftpaip rhgtvsasgd lqplahaala ftgvgeawtr dadgrwstvp avdalaalga epfdwpvrea lafvngtgas lavavlnhrs alrlvracav lsarlatllg anpehydvgh gvargqvgql taaewirqgl prgmvrdgsr plqepyslrc apqvlgavld qldgagdvla revdgcqdnp ityegellhg gnfhampvgf asdqiglamh maaylaerql gllvspvtng dlppmltpra grgaglagvq isatsfvsri rqlvfpaslt tlptngwnqd hvpmalngan svfealelgw ltvgslavgv aqlaamtgha aegvwaelag icppldadrp lgaevraard llsahadqll vdeadgkdfg
【０１２４】
この際、チロシンアンモニア−リアーゼの発現を最適化するために、Ｎ末端に、それぞれＨｉｓ−ｔａｇとｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ  ｔａｇ（ＴｒｘＡ）を付着したが、先ず、Ｈｉｓ−ｔａｇの付着のために、Ｓ．ｅｓｐａｎａｅｎｓｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとし、［配列番号４０／配列番号３７］プライマーを用いてＨｉｓ−ＳｅＴＡＬをＰＣＲ増幅し、ｐＴｒｃ−ＳｅＴＡＬをテンプレートとし、［配列番号３８／配列番号４１］プライマーを用いて逆ＰＣＲにより線形化した。この２つのＤＮＡ断片をギブソン・アセンブリにより繋げることで、ｐＴｒｃ−ＨｉｓＴＡＬが構築された。その後、大腸菌Ｗ３１１０のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、［配列番号４２／配列番号４３］プライマーを用いてｔｒｘＡ遺伝子をＰＣＲ増幅し、Ｓ．ｅｓｐａｎａｅｎｓｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとし、［配列番号４４／配列番号４５］プライマーを用いてＴｒｘＡ−ＴＡＬをＰＣＲ増幅した。この２つのＤＮＡ断片を、［配列番号４６／配列番号３７］プライマーを用いたエクステンションＰＣＲを行って、１つのＤＮＡ断片として作製した。このように繋げられたＤＮＡ断片は、前記ｐＴｒｃ−ＨｉｓＴＡＬを作製する時に使用した線形化されたｐＴｒｃ−ＳｅＴＡＬ  ＤＮＡ断片とギブソン・アセンブリにより繋げることで、ｐＴｒｃ−ＴｒｘＴＡＬが作製された。このように作製された３種のプラスミドであるｐＴｒｃ−ＳｅＴＡＬ、ｐＴｒｃ−ＨｉｓＴＡＬ、ｐＴｒｃ−ＴｒｘＴＡＬは、それぞれＢＴＹ５．１３プラスミドに形質転換した後、２０ｇ／Ｌのブドウ糖が添加された５０ｍＬの改良されたＭＲ培地を含んでいるフラスコに接種し、摂氏３０度、２００ｒ．ｐ．ｍ．で培養した。細胞のＯＤ６００値が約０．８になった時に、１ｍＭのＩＰＴＧを処理し、その後、３６時間培養した。改良されたＭＲ培地は、１Ｌ当たり、次の成分を含んでいる：６．６７ｇ  ＫＨ２ＰＯ４，４ｇ  （ＮＨ４）２ＨＰＯ４，０．８ｇ  ｃｉｔｒｉｃ  ａｃｉｄ，０．８ｇ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，５  ｍＬ  ｔｒａｃｅ  ｍｅｔａｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ，２ｇ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔおよび１５ｇ  （ＮＨ４）２ＳＯ４。この際、Ｈｉｓ−ＴＡＬを発現させた時に、最も高いレベルのｐ−クマル酸の生産量（０．４１ｇ／Ｌ）が得られたため（図２０Ａ）、ｐＴｒｃ−ＨｉｓＴＡＬをｐＴＹ１３プラスミドと繋げて単一のプラスミドとして作製するために、ＨｉｓＴＡＬ部分を［配列番号４７／配列番号４８］プライマーを用いて増幅した後、ｐＴＹ１３プラスミドのＮｈｅＩにギブソン・アセンブリにより挿入した。これにより、ｐＴＹ１３−ＨｉｓＴＡＬプラスミドが作製された。構築されたプラスミドは、ＢＴＹ５菌株に形質転換した後、上記のようにフラスコ培養を行ったが、２０ｇ／Ｌのグリセロールから０．３５ｇ／Ｌのｐ−クマル酸が生産された（図２０のＡ）。
[配列番号36] 5'-GAATTGTGAGCGGATAACAAAGACCGAGGAAAAGGAGCATCGCAAATGACGCAGGTCGTGGAACGTC-3'
[配列番号37] 5'-TAGAGGATCCCCGGGTACTCATCCGAAATCCTTCCCGTC-3'
[配列番号38] 5'-GTACCCGGGGATCCTCTAG-3'
[配列番号39] 5'-TTGTTATCCGCTCACAATTC-3'
[配列番号40] 5'-GAGGAAAAGGAGCATCGCAAATGCACCATCATCATCATCATACGCAGGTCGTGGAACGTC-3'
[配列番号41] 5'-TTGCGATGCTCCTTTTCCTC-3'
[配列番号42] 5'-ATGAGCGATAAAATTATTCACCTG-3'
[配列番号43] 5'-CGCCAGGTTAGCGTCGAGG-3'
[配列番号44] 5'-CCTCGACGCTAACCTGGCGACGCAGGTCGTGGAACGTC-3'
[配列番号45] 5'-TCATCCGAAATCCTTCCCGTC-3'
[配列番号46] 5'-AGACCGAGGAAAAGGAGCATCGCAAATGAGCGATAAAATTATTCACCTG-3'
[配列番号47] 5'-GTAAGCCAGTATACACTCCGGACTGCACGGTGCACCAATG-3'
[配列番号48] 5'-CTGTTGGGCGCCATCTCCTTGTGTAGAAACGCAAAAAGGCCATC-3'
【０１２５】
上記のようにｐ−クマル酸生産菌株を成功的に構築した後、これから始まる下端生合成経路から構築したが、これは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａの４−クマレート：ＣｏＡリガーゼ（４−ｃｏｕｍａｒａｔｅ：ＣｏＡ  ｌｉｇａｓｅ、４ＣＬ）１の変異体（Ａｔ４ＣＬ１ｍ）と、Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａのスチルベン合成酵素（ｓｔｉｌｂｅｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ、ＳＴＳ）で構成される。先ず、Ａｔ４ＣＬ１遺伝子を、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａのｃＤＮＡから［配列番号４９／配列番号５０］プライマーを用いて増幅した後、ｐＴａｃ１５ＫプラスミドにＥｃｏＲＩとＫｐｎＩサイトを介してギブソン・アセンブリにより挿入することで、ｐＴａｃ−Ａｔ４ＣＬ１プラスミドが生成された。その後、３つのステップの繰り返される点突然変異誘発作業によりｐＴａｃ−Ａｔ４ＣＬ１ｍ（Ａｔ４ＣＬ１ｍ；Ｉ２５０Ｌ／Ｎ４０４Ｋ／Ｉ４６１Ｖ）を作製したが、これは、ｐ−クマロイル−ＣｏＡへの基質特異性を強化させるためであった（Ｘｉｏｎｇ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．（２０１７），Ｍｅｔａｂ  Ｅｎｇ  ４０：１１５−１２３）。この際、各ステップで、点突然変異誘発作業のために［配列番号５１／配列番号５２］、［配列番号５３／配列番号５４］、［配列番号５５／配列番号５６］プライマー対が用いられた。その後、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａから４−クマレート：ＣｏＡリガーゼ３，４−クマレート：ＣｏＡリガーゼ４をそれぞれコードするＡｔ４ＣＬ３、Ａｔ４ＣＬ４遺伝子、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒから４−クマレート：ＣｏＡリガーゼをコードするＳｃ４ＣＬ遺伝子を、それぞれ［配列番号５７／配列番号５８］、［配列番号５９／配列番号６０］、［配列番号６１／配列番号６２］プライマー対を用いてＰＣＲ増幅した後、上記と同様にクローニングすることで、ｐＴａｃ−Ａｔ４ＣＬ３、ｐＴａｃ−Ａｔ４ＣＬ４、ｐＴａｃ−Ｓｃ４ＣＬが構築された。この際、ｐＴａｃ−Ｓｃ４ＣＬに対しては、ｐ−クマロイル−ＣｏＡへの基質特異性を強化させるために（Ｋａｎｅｋｏ  Ｍ，Ｏｈｎｉｓｈｉ  Ｙ，Ｈｏｒｉｎｏｕｃｈｉ  Ｓ（２００３），Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８５：２０−２７）、１回の点突然変異誘発作業を［配列番号６３／配列番号６４］プライマー対を用いて行うことで、ｐＴａｃ−Ｓｃ４ＣＬｍ（Ｓｃ４ＣＬｍ；  Ａ２９４Ｇ／Ａ３１８Ｇ）  プラスミドが作製された。Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａスチルベン合成酵素をコードするＳＴＳ遺伝子は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．から合成し、これを、［配列番号６５／配列番号６６］プライマー対を用いてＰＣＲ増幅した後、また同様に、ｐＴａｃ１５Ｋプラスミドに、ＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩサイトにギブソン・アセンブリにより挿入することで、ｐＴａｃ−ＶｖＳＴＳプラスミドを作製した。
【０１２６】
本発明で使用されたＡ．ｔｈａｌｉａｎａ  ４−クマレート：ＣｏＡリガーゼ１の配列は、次の通りである：
Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ ４−クマレート：ＣｏＡリガーゼ１[配列番号１２８]:
mapqeqavsq vmekqsnnnn sdvifrsklp diyipnhlsl hdyifqnise fatkpcling ptghvytysd vhvisrqiaa nfhklgvnqn dvvmlllpnc pefvlsflaa sfrgatataa npfftpaeia kqakasntkl iitearyvdk ikplqnddgv vivciddnes vpipegclrf teltqsttea sevidsveis pddvvalpys sgttglpkgv mlthkglvts vaqqvdgenp nlyfhsddvi lcvlpmfhiy alnsimlcgl rvgaailimp kfeinlllel iqrckvtvap mvppivlaia kssetekydl ssirvvksga aplgkeleda vnakfpnakl gqgygmteag pvlamslgfa kepfpvksga cgtvvrnaem kivdpdtgds lsrnqpgeic irghqimkgy lnnpaataet idkdgwlhtg diglidddde lfivdrlkel ikykgfqvap aelealligh pditdvavva mkeeaagevp vafvvkskds elseddvkqf vskqvvfykr inkvfftesi pkapsgkilr kdlraklang l
【０１２７】
本発明で使用されたＡ．ｔｈａｌｉａｎａ４−クマレート：ＣｏＡリガーゼ３の配列は、次の通りである:
Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ４−クマレート：ＣｏＡリガーゼ３[配列番号１２９]:
mitaalhepq ihkptdtsvv sddvlphspp tprifrsklp didipnhlpl htycfeklss vsdkpclivg stgksytyge thlicrrvas glyklgirkg dvimillqns aefvfsfmga smigavstta npfytsqely kqlkssgakl iithsqyvdk lknlgenltl ittdeptpen clpfstlitd detnpfqetv diggddaaal pfssgttglp kgvvlthksl itsvaqqvdg dnpnlylksn dvilcvlplf hiyslnsvll nslrsgatvl lmhkfeigal ldliqrhrvt iaalvpplvi alaknptvns ydlssvrfvl sgaaplgkel qdslrrrlpq ailgqgygmt eagpvlsmsl gfakepiptk sgscgtvvrn aelkvvhlet rlslgynqpg eicirgqqim keylndpeat satideegwl htgdigyvde ddeifivdrl kevikfkgfq vppaelesll inhhsiadaa vvpqndevag evpvafvvrs ngnditeedv keyvakqvvf ykrlhkvffv asipkspsgk ilrkdlkakl c
【０１２８】
本発明で使用されたＡ．ｔｈａｌｉａｎａ４−クマレート：ＣｏＡリガーゼ４の配列は、次の通りである:
Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ４−クマレート：ＣｏＡリガーゼ４[配列番号１３０]:
mvlqqqthfl tkkidqedee eepshdfifr sklpdifipn hlpltdyvfq rfsgdgdgds sttciidgat griltyadvq tnmrriaagi hrlgirhgdv vmlllpnspe falsflavay lgavsttanp fytqpeiakq akasaakmii tkkclvdklt nlkndgvliv cldddgdngv vsssddgcvs fteltqadet ellkpkispe dtvampyssg ttglpkgvmi thkglvtsia qkvdgenpnl nftandvilc flpmfhiyal dalmlsamrt gaallivprf elnlvmeliq rykvtvvpva ppvvlafiks peterydlss vrimlsgaat lkkeledavr lkfpnaifgq gygmtesgtv akslafaknp fktksgacgt virnaemkvv dtetgislpr nksgeicvrg hqlmkgylnd peatartidk dgwlhtgdig fvddddeifi vdrlkelikf kgyqvapael eallishpsi ddaavvamkd evadevpvaf varsqgsqlt eddvksyvnk qvvhykrikm vffievipka vsgkilrkdl rakletmcsk
【０１２９】
本発明で使用されたＳ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ４−クマレート：ＣｏＡリガーゼの配列は、次の通りである:
Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ４−クマレート：ＣｏＡリガーゼ[配列番号１３１]:
mfrseyadvp pvdlpihdav lggaaafgst palidgtdgt tltyeqvdrf hrrvaaalae tgvrkgdvla lhspntvafp lafyaatrag asvttvhpla taeefakqlk dsaarwivtv spllstarra aelaggvqei lvcdsapghr slvdmlasta pepsvaidpa edvaalpyss gttgtpkgvm lthrqiatnl aqlepsmpsa pgdrvlavlp ffhiygltal mnaplrlgat vvvlprfdle qflaaiqnhr itslyvappi vlalakhplv adydlsslry ivsaaaplda rlaaacsqrl glppvgqayg mtelspgthv vpldamadap pgtvgrliag temrivsltd pgtdlpages geilirgpqi mkgylgrpda taamideegw lhtgdvghvd adgwlfvvdr vkelikykgf qvapaeleah llthpgvada avvgaydddg nevphafvvr qpaapglaes eimmyvaerv apykrvrrvt fvdavpraas gkilrrqlre pr
【０１３０】
本発明で使用されたスチルベン合成酵素の配列は、次の通りである:
スチルベン合成酵素[配列番号１３２]:
masveefrna qrakgpatil aigtatpdhc vyqsdyadfy frvtksehmt alkkkfnric dksmikkryi hlteemleeh pnigaymaps lnirqeiita evpklgkeaa lkalkewgqp kskithlvfc ttsgvempga dyklanllgl epsvrrvmly hqgcyaggtv lrtakdlaen nagarvlvvc seitvvtfrg psedaldslv gqalfgdgsa avivgsdpdi sierplfqlv saaqtfipns agaiagnlre vgltfhlwpn vptlisenie kcltqafdpl gisdwnslfw iahpggpail daveaklnld kkkleatrhv lseygnmssa cvlfildemr kkslkgerat tgegldwgvl fgfgpgltie tvvlhsipmv tn
【０１３１】
前記各プラスミドは、ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株に形質転換した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより外来酵素の発現を検証した。そして、４ＣＬ遺伝子とＳＴＳ遺伝子を１つのプラスミドとして繋げるために、次のような作業を行った。先ず、スチルベン合成酵素発現用のＤＮＡ断片（ｔａｃプロモーターを含む）をＰＣＲ増幅するために、［配列番号４７／配列番号４８］プライマーを活用してｐＴａｃ−ＶｖＳＴＳから増幅し、これを、ｐＴａｃ−Ａｔ４ＣＬ３、ｐＴａｃ−Ａｔ４ＣＬ４、ｐＴａｃ−Ｓｃ４ＣＬｍプラスミドに、ＮｈｅＩサイトを介してギブソン・アセンブリにより挿入することで、ｐＴａｃ−ＶｖＳＴＳ、Ａｔ４ＣＬ３、ｐＴａｃ−ＶｖＳＴＳ−Ａｔ４ＣＬ４、ｐＴａｃ−ＶｖＳＴＳ−Ｓｃ４ＣＬｍプラスミドが作製された。Ａｔ４ＣＬ１ｍの場合は逆に、ｐＴａｃ−Ａｔ４ＣＬ１ｍから、［配列番号６７／配列番号６８］プライマーを活用して４−クマレート：ＣｏＡリガーゼ発現用のＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅し、ｐＴａｃ−ＶｖＳＴＳプラスミドのＰｖｕＩＩサイトに挿入することで、ｐＴａｃ−ＶｖＳＴＳ−Ａｔ４ＣＬ１ｍプラスミドが作製された。作製されたプラスミドｐＴａｃ−ＶｖＳＴＳ−Ａｔ４ＣＬ１ｍ、ｐＴａｃ−ＶｖＳＴＳ、Ａｔ４ＣＬ３、ｐＴａｃ−ＶｖＳＴＳ−Ａｔ４ＣＬ４、ｐＴａｃ−ＶｖＳＴＳ−Ｓｃ４ＣＬｍは、それぞれＢＬ２１（ＤＥ３）菌株に形質転換し、フラスコ培養を行い（２ｍＭのｐ−クマル酸培地に添加）、その結果は図２０のＣのとおりである。この際、最も高いレスベラトロール生産能を示した菌株は、ＢＬ２１（ＤＥ３）  ｐＴａｃ−ＶｖＳＴＳ−Ａｔ４ＣＬ１ｍ菌株であった（１８．０ｍｇ／Ｌ）。この際、ｐ−クマル酸を２ｍＭ（３２８．１ｍｇ／Ｌ）の濃度で添加したにもかかわらずこの程度のレスベラトロールが生産されたということは、マロニル−ＣｏＡがボトルネックとなったという間接的な証拠であった。本発明では、マロニル−ＣｏＡの濃度を増加させてこの仮定による問題を解決する前に、レスベラトロールの生産のための外来遺伝子の発現を様々な方法で調節して解決してから、マロニル−ＣｏＡについて検討することとした。したがって、先ず、Ａｔ４ＣＬ１ｍ遺伝子とＳＴＳ遺伝子を１つのオペロンとして発現させるために、［配列番号６９／配列番号７０］プライマーを用いてＳＴＳ遺伝子をＰＣＲ増幅した後、これを、ｐＴａｃ−Ａｔ４ＣＬ１ｍプラスミドのＳｐｈＩサイトに挿入することで、ｐＴａｃ−Ａｔ４ＣＬ１ｍ−ｏｐｒ−ＶｖＳＴＳプラスミドを作製した。また、２つの酵素を１つの融合された酵素として発現させ、基質の伝達を容易にするために、［配列番号７１／配列番号７２］プライマー対を用いてＡｔ４ＣＬ１ｍ遺伝子をＰＣＲ増幅した後、これを、ｐＴａｃ−ＶｖＳＴＳプラスミドのＮｄｅＩサイトに挿入することで、ｐＴａｃ−Ａｔ４ＣＬ１ｍ−ｆｕｓ−ＶｖＳＴＳプラスミドを作製した。この際、融合タンパク質の発現のために、グリシン−セリンリンカー（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）を活用した。しかし、この２つの戦略は、両方とも高いレスベラトロールを生産することができなかった（図２０のＤ）。したがって、最終プラスミドとしてはｐＴａｃ−ＶｖＳＴＳ−Ａｔ４ＣＬ１ｍが決定されたが���このプラスミドは、ｐＴＹ１３−ＨｉｓＴＡＬと互換可能ではなかったため（２つのプラスミドが両方ともｐ１５Ａ複製起点を有する）、上述のｐＴａｃＣＤＦＳプラスミドに移動させることとした。この過程で、先ず、ＳＴＳ発現カセットを［配列番号７３／配列番号７４］プライマーを用いてＰＣＲ増幅させた後、［配列番号７５／配列番号７６］プライマーを用いて線形化されたｐＴａｃＣＤＦＳプラスミドとギブソン・アセンブリにより繋げた。このように構築されたプラスミドにＰｓｔＩ制限酵素を処理した後、［配列番号７５／配列番号７６］プライマーを用いてＰＣＲ増幅されたＡｔ４ＣＬ１ｍ発現カセットをギブソン・アセンブリまたはＴ４ライゲーションにより１つのプラスミド（ｐＴａｃＣＤＦ−ＶｖＳＴＳ−Ａｔ４ＣＬ１ｍ）として繋げた。このように構築されたプラスミドはＢＬ２１（ＤＥ３）菌株に形質転換した後、フラスコ培養により、２１．２ｍｇ／Ｌのレスベラトロールを生産した（図２０のＤ）。しかし、これは、２ｍＭのｐ−クマル酸を供給した結果であるため、グリセロールから直ちにレスベラトロールを生産するために、ＢＴＹ５  ｐＴＹ１３−ＨｉｓＴＡＬ菌株にｐＴａｃＣＤＦ−ＶｖＳＴＳ−Ａｔ４ＣＬ１ｍプラスミドを形質転換し、フラスコ培養を行った結果、２０ｇ／Ｌのグリセロールから１２．４ｍｇ／Ｌのレスベラトロールが生産された。生産されたレスベラトロールの真偽は、ＬＣ−ＭＳにより判別された（図２１）。
[配列番号49] 5'-CAATTTCACACAGGAAACAGACATATGGCGCCACAAGAACAAGC-3'
[配列番号50] 5'-CTCTAGAGGATCCCCGGGTACCATTACAATCCATTTGCTAGTTTTG-3'
[配列番号51] 5'-CACAGCGATGACGTCCTACTCTGTGTTTTG-3'
[配列番号52] 5'-CAAAACACAGAGTAGGACGTCATCGCTGTG-3'
[配列番号53] 5'-CTCTTTCGAGGAAACAACCCGGTGAG-3'
[配列番号54] 5'-CTCACCGGGTTGTTTCCTCGAAAGAG-3'
[配列番号55] 5'-GATTGAAAGAACTTGTCAAGTATAAAGG-3'
[配列番号56] 5'-CCTTTATACTTGACAAGTTCTTTCAATC-3'
[配列番号57] 5'-CAATTTCACACAGGAAACAGACATATGATCACTGCAGCTCTACAC-3'
[配列番号58] 5'-CTCTAGAGGATCCCCGGGTACCATTAACAAAGCTTAGCTTTGAGG-3'
[配列番号59] 5'-CAATTTCACACAGGAAACAGACATATGGTGCTCCAACAACAAACG-3'
[配列番号60] 5'-CTCTAGAGGATCCCCGGGTACCATTATTTAGAGCACATGGTTTCC-3'
[配列番号61] 5'-CAATTTCACACAGGAAACAGACATATGTTCCGCAGCGAGTACGC-3'
[配列番号62] 5'-CTCTAGAGGATCCCCGGGTACCATTATCGCGGCTCCCTGAGCTGTC-3'
[配列番号63] 5'-GTACATCGTCAGCGGCGCCGCCCCGCTCGACG-3'
[配列番号64] 5'-CGTCGAGCGGGGCGGCGCCGCTGACGATGTAC-3'
[配列番号65] 5'-CAATTTCACACAGGAAACAGACATATGGCAAGTGTCGAGGAATTC-3'
[配列番号66] 5'-CTCTAGAGGATCCCCGGGTACCATTAATTGGTAACCATCGGAATGG-3'
[配列番号67] 5'-GTAAGCCAGTATACACTCCGGACTGCACGGTGCACCAATG-3'
[配列番号68] 5'-CTGTTGGGCGCCATCTCCTTGTGTAGAAACGCAAAAAGGCCATC-3'
[配列番号69] 5'-GAGTCGACCTGCAGGCATGCAATTTCACACAGGAAACAGA-3'
[配列番号70] 5'-CAAAACAGCCAAGCTTGCATG-3'
[配列番号71] 5'-TTTCACACAGGAAACAGACATATG-3'
[配列番号72] 5'-GAATTCCTCGACACTTGCCATACTACCACCACCCAATCCATTTGCTAGTTTTG-3'
[配列番号73] 5'-GTTGACAATTAATCATCGGC-3'
[配列番号74] 5'-CGTTTCACTTCTGAGTTCGG-3'
[配列番号75] 5'-CCGAACTCAGAAGTGAAACG-3'
[配列番号76] 5'-GCCGATGATTAATTGTCAAC-3'
【０１３２】
このように構築された最終レスベラトロール生産菌株に、上記実施例２．１で選別された１４種のｓＲＮＡを導入した後、フラスコ培養を行った結果は、図２０のＥのとおりである。その結果、ｐａｂＡをノックダウンした時に、グリセロールから５１．８ｍｇ／Ｌのレスベラトロールが生産された。これは、対照菌株（ｓＲＮＡを有していない菌株）に比べて４．２倍増加された生産量であった。また、ｐａｂＡは、上述の６−メチルサリチル酸とアロエソンの両方で最も大きい生産量増加を示したノックダウンターゲットであった点で、注目すべきである。ここで、２．５倍以上の増加を可能としたノックダウンターゲット６種を選別し、これらを２つずつ組み合わせてｓＲＮＡプラスミドを構築した後、レスベラトロール生産菌株に形質転換してからフラスコ培養を行うことで、図２０のような結果を得た。しかし、ここでは、最も高いレスベラトロール生産量が、ｙｆｉＤとｐｕｒＢを同時ノックダウンした時の５０．０ｍｇ／Ｌであったため、上述の結果に比べてさらなる増産はなされなかった。
【０１３３】
この際、二重同時ノックダウンのためのｓＲＮＡプラスミドは、次のように構築された。挿入すべき合成調節ｓＲＮＡをコードするＤＮＡ断片は、元となるプラスミドから［配列番号７７／配列番号７８］プライマーを用いて増幅した後、［配列番号７９／配列番号８０］プライマーを用いたＰＣＲにより線形化された、母体となる合成調節ｓＲＮＡを含むプラスミドに、ギブソン・アセンブリにより繋げた。
[配列番号77] 5'-GAATTTTAACAAAATATTAACGAATTCTAACACCGTGCGTG-3'
[配列番号78] 5'-GTGCCACCTAAATTGTAAGCGGCGAATTGGGTACCTATAAAC-3'
[配列番号79] 5'-GCTTACAATTTAGGTGGCAC-3'
[配列番号80] 5'-GTTAATATTTTGTTAAAATTCGCG-3'
【０１３４】
３．４．選別されたノックダウン遺伝子ターゲットを活用したナリンゲニンの増産
第四の産物として、植物から生産されるナリンゲニン（ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ）を決定した。ナリンゲニンは、フェニルプロパノイド系天然物の中でも、フラボノイドに属する数多くの薬理学的に有用な産物の共通された前駆体である。また、ナリンゲニンは、坑アルツハイマー病、坑癌、抗酸化、および抗菌効能を有していると報告されている。ナリンゲニンは、レスベラトロールと同様に、１分子のｐ−クマロイル−ＣｏＡと３分子のマロニル−ＣｏＡの縮合反応により生産される（図２１）。上記実施例３．３でｐ−クマル酸生産菌株が作製されたため、本発明では、下端ナリンゲニン生合成経路を構築しようとした。この際、ｐ−クマル酸からｐ−クマロイル−ＣｏＡへの転換は、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ  ４−クマレート：ＣｏＡリガーゼ１の変異体（Ａｔ４ＣＬ１ｍ）、ｐ−クマロイル−ＣｏＡとマロニル−ＣｏＡからナリンゲニンカルコン（ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ  ｃｈａｌｃｏｎｅ）への転換は、Ｐｅｔｕｎｉａ  ｘ  ｈｙｂｒｉａカルコン合成酵素（ｃｈａｌｃｏｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ、ＣＨＳ）、そしてナリンゲニンカルコン（ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ  ｃｈａｌｃｏｎｅ）からナリンゲニンへの転換は、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａカルコンイソメラーゼ（ｃｈａｌｃｏｎｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ、ＣＨＩ）をそれぞれ用いて行った。
【０１３５】
本発明で使用されたカルコン合成酵素（ｃｈａｌｃｏｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ、ＣＨＳ）の配列は、次の通りである:
カルコン合成酵素（ｃｈａｌｃｏｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ、ＣＨＳ）[配列番号１３３]:
mvtveeyrka qraegpatvm aigtatptnc vdqstypdyy fritnsehkt dlkekfkrmc eksmikkrym hlteeilken psmceymaps ldarqdivvv evpklgkeaa qkaikewgqp kskithlvfc ttsgvdmpgc dyqltkllgl rpsvkrlmmy qqgcfaggtv lrlakdlaen nkgarvlvvc seitavtfrg pndthldslv gqalfgdgag aiiigsdpip gverplfelv saaqtllpds hgaidghlre vgltfhllkd vpglisknie ksleeafrpl sisdwnslfw iahpggpail dqveiklglk peklkatrnv lsnygnmssa cvlfildemr kasakeglgt tgeglewgvl fgfgpgltve tvvlhsvat
【０１３６】
本発明で使用されたカルコンイソメラーゼ（ｃｈａｌｃｏｎｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ、ＣＨＩ）の配列は、次の通りである:
カルコンイソメラーゼ（ｃｈａｌｃｏｎｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ、ＣＨＩ）[配列番号１３４]:
msssnacasp spfpavtklh vdsvtfvpsv kspassnplf lggagvrgld iqgkfviftv igvylegnav pslsvkwkgk tteeltesip ffreivtgaf ekfikvtmkl pltgqqysek vtencvaiwk qlglytdcea kavekfleif keetfppgss ilfalsptgs ltvafskdds ipetgiavie nkllaeavle siigkngvsp gtrlsvaerl sqlmmknkde kevsdhsvee klaken
【０１３７】
４−クマレート：ＣｏＡリガーゼ１の変異体をコードするＡｔ４ＣＬ１ｍ遺伝子は、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ  ｃＤＮＡをテンプレートとし、［配列番号８１／配列番号８２］プライマーを活用してＰＣＲ増幅し、カルコンイソメラーゼをコードするＡｔＣＨＩ遺伝子は、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ  ｃＤＮＡをテンプレートとし、［配列番号８３／配列番号８４］プライマーを活用してＰＣＲ増幅した。そして、この２つのＤＮＡ断片を、［配列番号８１／配列番号８４］プライマーを用いたエクステンションＰＣＲにより、１つのＤＮＡ断片として繋げ、ｐＴｒｃ９９ＡプラスミドのＫｐｎＩ、ＢａｍＨＩサイトを介して挿入した。そして、カルコン合成酵素をコードするＰｈＣＨＳ遺伝子は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．から合成されたＤＮＡ断片をテンプレートとし、［配列番号８５／配列番号８６］プライマーを用いてＰＣＲ増幅した後、前記作製されたプラスミドのＢａｍＨＩ、ＸｂａＩサイトに挿入することで、ｐＴｒｃ−Ａｔ４ＣＬ１ｍ−ＡｔＣＨＩ−ＰｓＣＨＳプラスミドが作製された。しかし、前記実施例３．３と同様の理由から、ｐ−クマル酸生産菌株内のプラスミドと互換可能とするために、プラスミドｐＴｒｃ−Ａｔ４ＣＬ１ｍ−ＡｔＣＨＩ−ＰｓＣＨＳをＮｃｏＩ、ＰｓｔＩ制限酵素を用いて切断した後、このように生成されたＤＮＡ断片を、［配列番号８７／配列番号８８］プライマーを用いて逆ＰＣＲにより線形化されたｐＴｒｃＣＤＦＳプラスミドとギブソン・アセンブリにより繋げることで、ｐＴｒｃＣＤＦ−Ａｔ４ＣＬ１ｍ−ＡｔＣＨＩ−ＰｈＣＨＳプラスミドが作製された。
[配列番号81] 5'-AGACAGGGTACCATGGCGCCACAAGAACAAG-3'
[配列番号82] 5'-ATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAATTACAATCCATTTGCTAGTTTTGCCC-3'
[配列番号83] 5'-TTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGTCTTCATCCAACGCCTGC-3'
[配列番号84] 5'-AGACAGGGATCCTCAGTTCTCTTTGGCTAGTTTTTCC-3'
[配列番号85] 5'-AGAGAGGATCCATAACAATTCCCCATCTTAG-3'
[配列番号86] 5'-AGAGATCTAGATTAGGTAGCCACACTATGCAGAACC-3'
[配列番号87] 5'-GAAACTGCTTGTTCTTGTGGCGCCATGGTCTGTTTCCTGTGTG-3'
[配列番号88] 5'-CTAATCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTG-3'
【０１３８】
上記のように作製されたプラスミドｐＴｒｃＣＤＦ−Ａｔ４ＣＬ１ｍ−ＡｔＣＨＩ−ＰｈＣＨＳをＢＴＹ５  ｐＴＹ１３−ＨｉｓＴＡＬ菌株に導入した後、フラスコ培養を行った結果、ブドウ糖またはグリセロールからそれぞれ３７．２ｍｇ／Ｌと６４．５ｍｇ／Ｌのナリンゲニンが生産された（図２３のＡ）。したがって、下記のナリンゲニン生産に係わる実験は、何れもグリセロールを用いて行った。外来酵素はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより発現が確認され（図２３のＢ）、生産されたナリンゲニンの真偽はＬＣ−ＭＳにより判別された（図２４）。このように構築されたナリンゲニン生産菌株に、前記実施例２．１で選別された１４種のｓＲＮＡを導入した後、フラスコ培養を行った結果は、図２５のＡのとおりである。この際、ｆａｄＲがノックダウンされた菌株が、最も高いナリンゲニン生産量を示したが（９２．３ｍｇ／Ｌ）、これは、対照群（ｓＲＮＡのないナリンゲニン生産菌株）に比べて４３％も増産された結果であった。また、対照群に比べてナリンゲニン生産量が１５％以上増加されたノックダウンターゲットを組み合わせて二重同時ノックダウン実験を行ったが、その結果は、図２５のＢのとおりである。この際、ｆａｄＲとｘａｐＲが同時ノックダウンされた菌株で、グリセロールから１０３．８ｍｇ／Ｌのナリンゲニンが生産されたが、これは、対照群に比べて６１％増産された結果である。
【０１３９】
この際、二重同時ノックダウンのためのｓＲＮＡプラスミドは、次のように構築された。挿入すべき合成調節ｓＲＮＡをコードするＤＮＡ断片は、元となるプラスミドから［配列番号８９／配列番号９０］プライマーを用いて増幅した後、［配列番号９１／配列番号９２］プライマーを用いたＰＣＲにより線形化された、母体となる合成調節ｓＲＮＡを含むプラスミドに、ギブソン・アセンブリにより繋げた。
[配列番号89] 5'-CACTAGATCTCAAATGTGCTGGAATTCTAACACCGTGCGTG-3'
[配列番号90] 5'-CCTTATAAATCAAACATGTGCGGCGAATTGGGTACCTATAAAC-3'
[配列番号91] 5'-GCACATGTTTGATTTATAAGGG-3'
[配列番号92] 5'-CAGCACATTTGAGATCTAGTGG-3'
【０１４０】
前記実施例３で検討したように、ＲｐｐＡマロニル−ＣｏＡバイオセンサーにより、容易に且つ迅速に選別されたマロニル−ＣｏＡの増産のためのノックダウンターゲットは、何れもマロニル−ＣｏＡベースの有用化合物の生産に大きく寄与した。上記の実施例で検討した４種の有用産物生産菌株は、何れも既存の研究で報告されたような多くのシステム代謝工学的戦略により構築されたものではない、基本的な生産経路の構築および簡単なｓＲＮＡの形質転換により、短い期間に構築された菌株である。このように簡単に構築された菌株が、目覚しい生産能を示すことは、当業界でまさに注目すべきことである。また、ＲｐｐＡバイオセンサーの効用性および活用性が、前記実施例のみに限定されないということは、当業界における者にとっては自明なことである。
【０１４１】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。
【産業上の利用可能性】
【０１４２】
従来のマロニル−ＣｏＡ濃度測定法は、長時間がかかり、労働集約的であり、熟練した技術が必要であるだけでなく、データの信頼性が低く、大容量実験が困難であって、高性能機器を必要とするなど、様々な欠点および限界点を有していた。しかし、本発明によるバイオセンサーを活用する場合、単一ステップのシグナル発生、種々の微生物における活用性、自体蛍光を呈する微生物における活用性、および簡単な構築方法を提供するとともに、簡単なスクリーニング方法を提供する。また、本発明を高速スクリーニングと組み合わせると、増産されたマロニル−ＣｏＡ生産能を有する菌株を非常に容易に且つ迅速に（〜３日）選別することができ、これを、直ちにマロニル−ＣｏＡベースの有用化合物生産菌株に適用可能であるという利点がある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年7月29日(2019.7.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タイプＩＩＩポリケチド合成酵素をコードする遺伝子がゲノムに挿入されているか；または、タイプＩＩＩポリケチド合成酵素をコードする遺伝子を含む組換えベクターが導入されている、細胞内マロニル−ＣｏＡレベルを示すための組換え微生物。
【請求項２】
前記タイプＩＩＩポリケチド合成酵素は、
ストレプトミセス・グリゼウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトミセス・  コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトミセス・エバミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、サッカロポリスポラ・エリスラエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ）、ストレプトミセス・ペウセティウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ）、およびストレプトミセス・アクレオラタス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｃｕｌｅｏｌａｔｕｓ）で構成された群から選択される微生物由来のＲｐｐＡ；
シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）由来のＰｈｌＤ（ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）；
アミコラトプシス・メディテラネイ（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ）  由来のＤｐｇＡ（ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）；
ショウヨウダイオウ（Ｒｈｅｕｍ  ｐａｌｍａｔｕｍ）由来のＡＬＳ（ａｌｏｅｓｏｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）；または  
アロエアルボレスケンス（Ａｌｏｅ  ａｒｂｏｒｅｓｃｅｎｓ）由来のＰＣＳ（５，７−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｍｅｔｈｙｌｃｈｒｏｍｏｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ＯＫＳ（ｏｃｔａｋｅｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ＰＫＳ３（ａｌｏｅｓｏｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ＰＫＳ４（ｏｃｔａｋｅｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ２）またはＰＫＳ５（ｏｃｔａｋｅｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ３）
であることを特徴とする請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項３】
前記タイプＩＩＩポリケチド合成酵素をコードする遺伝子が、ｔａｃ、ｔｒｃ、Ｔ７、ＢＡＤ、λＰＲ、およびアンダーソン合成プロモーターで構成された群から選択されるプロモーターに作動可能であるように連結されていることを特徴とする請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項４】
前記組換え微生物は、大腸菌、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ），ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ），ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ），カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ），エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ），エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ），パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ），マンヘミア（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ），アクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ），アグリゲイティバクター（Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ），キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ），ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ），シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ），アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ），アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ），ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ），アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ），ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ），ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ），バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ），スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ），ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ），ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ），ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ），クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ），コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ），ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ），ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ），シアノバクテリウム（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）  および  サイクロバクテリウム（Ｃｙｃｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）で構成された菌株群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項５】
下記ステップを含むマロニル−ＣｏＡ生産誘導物質のスクリーニング方法：
（ａ）請求項１に記載の組換え微生物を培養するステップと、
（ｂ）前記組換え微生物に候補物質を添加するステップと、
（ｃ）前記候補物質添加後の組換え微生物の培養上清の色と、前記候補物質を添加していない組換え微生物の培養上清の色とを比較するステップと、
（ｄ）前記候補物質添加後の組換え微生物の培養上清が、前記候補物質を添加していない組換え微生物の培養上清に比べてより濃い赤色を呈する場合、前記候補物質をマロニル−ＣｏＡ生産誘導物質として選択するステップ。
【請求項６】
前記ステップ（ｃ）の色の比較は、目視で行うことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ステップ（ｃ）の色の比較は、吸光度を測定して行い、前記ステップ（ｄ）において、前記候補物質添加後に測定された吸光度が、前記候補物質を添加せずに測定された吸光度に比べてより増加する場合、前記候補物質をマロニル−ＣｏＡ生産誘導物質として選択することを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項８】
下記ステップを含む、マロニル−ＣｏＡ生産能の増加に関与する遺伝子のスクリーニング方法：
（ａ）請求項１に記載の組換え微生物に、前記組換え微生物中の遺伝子の発現を変化させる遺伝子調節ライブラリを導入することで、組換え微生物中の遺伝子の発現が変化された組換え微生物ライブラリを作製するステップと、
（ｂ）前記作製された組換え微生物ライブラリおよび遺伝子調節ライブラリを導入する前の組換え微生物を培養し、組換え微生物ライブラリの培養上清の色と、遺伝子調節ライブラリを導入する前の組換え微生物の培養上清の色を比較するステップと、
（ｃ）前期組換え微生物ライブラリの培養上清が、前記遺伝子調節ライブラリを導入する前の組換え微生物の培養上清の色に比べて濃い赤色を呈する場合、組換え微生物ライブラリに導入した遺伝子を、マロニル−ＣｏＡ生産能の増加に関与する遺伝子として選択するステップ。
【請求項９】
前記ステップ（ｂ）の色の比較は、目視で行われることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ステップ（ｂ）の色の比較は、吸光度を測定して行われ、前記ステップ（ｃ）は、前記組換え微生物ライブラリの培養上清の吸光度が、前記遺伝子調節ライブラリを導入する前の組換え微生物の培養上清の吸光度に比べて増加する場合に、前記組換え微生物ライブラリに導入した遺伝子を選択することを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記遺伝子調節ライブラリは、ｓＲＮＡライブラリ、ゲノムライブラリ、ｃＤＮＡライブラリ、ｇＲＮＡライブラリおよびノックアウトまたは突然変異作製用のオリゴヌクレオチドライブラリで構成された群から選択されるライブラリであることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
マロニル−ＣｏＡ生産能を有している微生物で、請求項８〜１１のいずれかに記載の方法により選別された遺伝子の発現を調節することを特徴とする、マロニル−ＣｏＡ生産能が増加された組換え微生物の製造方法。
【請求項１３】
前記選別された遺伝子は、
ｆａｂＦ（３−オキソアシル−［アシル−キャリア−プロテイン］合成酵素ＩＩ（３−ｏｘｏａｃｙｌ−［ａｃｙｌ−ｃａｒｒｉｅｒ−ｐｒｏｔｅｉｎ］  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ＩＩ））；
ｙｆｃＹ（β‐ケトアシルＣｏＡチオラーゼ（ｂｅｔａ−ｋｅｔｏａｃｙｌ−ＣｏＡ  ｔｈｉｏｌａｓｅ））；
ｘａｐＲ（ｘａｐＡＢの転写活性化因子）；
ｃｙｔＲ（ｄｅｏオペロンｕｄｐ，ｃｄｄ，ｔｓｘ，ｎｕｐＣおよびｎｕｐＧに対する転写抑制因子）；
ｆａｂＨ（３−オキソアシル−［アシル−キャリア−プロテイン］合成酵素ＩＩＩ（３−ｏｘｏａｃｙｌ−［ａｃｙｌ−ｃａｒｒｉｅｒ−ｐｒｏｔｅｉｎ］  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ＩＩＩ））；
ｍｑｏ（リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｍａｌａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ））；
ｙｆｉＤ（ピルビン酸ギ酸リアーゼサブユニット（ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｆｏｒｍａｔｅ  ｌｙａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ））；
ｆｍｔ（１０−ホルミルテトラヒドロ葉酸：Ｌ−メチオニル−ｔＲＮＡ（ｆＭｅｔ）Ｎ−ホルミルトランスフェラーゼ（１０−ｆｏｒｍｙｌｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ：Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｙｌ−ｔＲＮＡ（ｆＭｅｔ）Ｎ−ｆｏｒｍｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ））；
ｐｙｒＦ（オロチジン５’−リン酸脱炭酸酵素（ｏｒｏｔｉｄｉｎｅ−５’−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ））；
ａｒａＡ（Ｌ−アラビノースイソメラーゼ（Ｌ−ａｒａｂｉｎｏｓｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ））；
ｆａｄＲ（ｆａｄレギュロンに対するネガティブレギュレーターであり、ｆａｂＡレギュロンに対するポジティブレギュレーター）；
ｐａｂＡ（アミノデオキシコリスマート合成酵素、サブユニットＩＩ（ａｍｉｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｒｉｓｍａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ，ｓｕｂｕｎｉｔ  ＩＩ））；
ｐｕｒＢ（アデニロコハク酸リアーゼ（ａｄｅｎｙｌｏｓｕｃｃｉｎａｔｅ  ｌｙａｓｅ））；および  
ｈｙｃＩ（ＨｙｃＥのＣ末端処理に関係するプロテアーゼ）で構成された群から選択される一つ以上の遺伝子であり、
前記遺伝子の発現を減少させることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記組換え微生物は、大腸菌、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ），ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ），ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ），カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ），エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ），エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ），パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ），マンヘミア（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ），アクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ），アグリゲイティバクター（Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ），キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ），ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ），シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ），アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ），アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ），ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ），アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ），ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ），ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ），バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ），スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ），ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ），ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ），ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ），クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ），コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ），ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ），シアノバクテリウム（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）  および  サイクロバクテリウム（Ｃｙｃｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）で構成された菌株群から選択される微生物であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
マロニル−ＣｏＡ生産能を有している微生物で、
ｆａｂＦ（３−オキソアシル−［アシル−キャリア−プロテイン］合成酵素ＩＩ（３−ｏｘｏａｃｙｌ−［ａｃｙｌ−ｃａｒｒｉｅｒ−ｐｒｏｔｅｉｎ］  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ＩＩ））；
ｙｆｃＹ（β‐ケトアシルＣｏＡチオラーゼ（ｂｅｔａ−ｋｅｔｏａｃｙｌ−ＣｏＡ  ｔｈｉｏｌａｓｅ））；
ｘａｐＲ（ｘａｐＡＢの転写活性化因子）；
ｃｙｔＲ（ｄｅｏオペロンｕｄｐ，ｃｄｄ，ｔｓｘ，ｎｕｐＣおよびｎｕｐＧに対する転写抑制因子）；
ｆａｂＨ（３−オキソアシル−［アシル−キャリア−プロテイン］合成酵素ＩＩＩ（３−ｏｘｏａｃｙｌ−［ａｃｙｌ−ｃａｒｒｉｅｒ−ｐｒｏｔｅｉｎ］  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ＩＩＩ））；
ｍｑｏ（リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｍａｌａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ））；
ｙｆｉＤ（ピルビン酸ギ酸リアーゼサブユニット（ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｆｏｒｍａｔｅ  ｌｙａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ））；
ｆｍｔ（１０−ホルミルテトラヒドロ葉酸：Ｌ−メチオニル−ｔＲＮＡ（ｆＭｅｔ）Ｎ−ホルミルトランスフェラーゼ（１０−ｆｏｒｍｙｌｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ：Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｙｌ−ｔＲＮＡ（ｆＭｅｔ）Ｎ−ｆｏｒｍｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ））；
ｐｙｒＦ（オロチジン５’−リン酸脱炭酸酵素（ｏｒｏｔｉｄｉｎｅ−５’−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ））；
ａｒａＡ（Ｌ−アラビノースイソメラーゼ（Ｌ−ａｒａｂｉｎｏｓｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ））；
ｆａｄＲ（ｆａｄレギュロンに対するネガティブレギュレーターであり、ｆａｂＡレギュロンに対するポジティブレギュレーター）；
ｐａｂＡ（アミノデオキシコリスマート合成酵素、サブユニットＩＩ（ａｍｉｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｒｉｓｍａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ，ｓｕｂｕｎｉｔ  ＩＩ））；
ｐｕｒＢ（アデニロコハク酸リアーゼ（ａｄｅｎｙｌｏｓｕｃｃｉｎａｔｅ  ｌｙａｓｅ））；および  
ｈｙｃＩ（ＨｙｃＥのＣ末端処理に関係するプロテアーゼ）で構成された群から選択された１つ以上の遺伝子の発現が野生型遺伝子に比べて減少されている、マロニル−ＣｏＡ生産能が増加された組換え微生物。
【請求項１６】
下記ステップを含む、マロニル−ＣｏＡを基質または中間物質とする有用物質の生産方法：
（ａ）請求項１５に記載の組換え微生物に、有用物質の生産に関与する遺伝子をさらに導入し、もしくは当該遺伝子の発現を増加させ、または、有用物質の生産に関与する遺伝子をさらに欠損させ、もしくは当該遺伝子の発現を抑制させた組換え微生物を作製するステップと、
（ｂ）前記作製された微生物を培養するステップと、
（ｃ）前記培養された微生物から有用物質を回収するステップ。
【請求項１７】
前記有用物質は、
アクチノロージン（ａｃｔｉｎｏｒｈｏｄｉｎ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、オキシテトラサイクリン（ｏｘｙｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）、ラパマイシン（ｒａｐａｍｙｃｉｎ）、ロバスタチン（ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ）、ＳＥＫ４、ＳＥＫ４ｂ、ＳＥＫ３４、ＳＥＫ１５、ＳＥＫ２６、ＦＫ５０６、ＤＭＡＣ、アクラビノン（ａｋｌａｖｉｎｏｎｅ）、アクラノン酸（ａｋｌａｎｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、エプシロンロドマイシノン（ｅｐｓｉｌｏｎ−ｒｈｏｄｏｍｙｃｉｎｏｎｅ）、アロエシン（ａｌｏｅｓｉｎ）、アロエニン（ａｌｏｅｎｉｎ）、バルバロイン（ｂａｒｂａｌｏｉｎ）、５，７−ジヒドロキシ−２−メチルクロモン（５，７−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｍｅｔｈｙｌｃｈｒｏｍｏｎｅ）、エリスロマイシン（ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）、リファマイシン（ｒｉｆａｍｙｃｉｎ）、エバーメクチン（ａｖｅｒｍｅｃｔｉｎ）、ゲルダナマイシン（ｇｅｌｄａｎａｍｙｃｉｎ）、イベルメクチン（ｉｖｅｒｍｅｃｔｉｎ）、ドキシサイクリン（ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ）、アントラマイシン（ａｎｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、ペニシリン酸（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｃ  ａｃｉｄ）、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、エポチロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）、テトラセノマイシン（ｔｅｔｒａｃｅｎｏｍｙｃｉｎ）、フレノリシン（ｆｒｅｎｏｌｉｃｉｎ）、トリ酢酸ラクトン（ｔｒｉａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｌａｃｔｏｎｅ）、６−メチルサリチル酸（６−ｍｅｔｈｙｌｓａｌｉｃｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）、およびアロエソン（ａｌｏｅｓｏｎｅ）からなるポリケチド系化合物；
ピノセムブリン（ｐｉｎｏｃｅｍｂｒｉｎ）、ジヒドロケンペロール（ｄｉｈｙｄｒｏｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ）、エリオジクチオール（ｅｒｉｏｄｉｃｔｙｏｌ）、ジヒドロケルセチン（ｄｉｈｙｄｒｏｑｕｅｒｃｅｔｉｎ）、ダイゼイン（ｄａｉｄｚｅｉｎ）、ゲニステイン（ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）、アピゲニン（ａｐｉｇｅｎｉｎ）、ルテオリン（ｌｕｔｅｏｌｉｎ）、ケンペロール（ｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ）、ケルセチン（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ）、カテキン（ｃａｔｅｃｈｉｎ）、ペラルゴニジン（ｐｅｌａｒｇｏｎｉｄｉｎ）、シアニジン（ｃｙａｎｉｄｉｎ）、アフゼレキン（ａｆｚｅｌｅｃｈｉｎ）、ミリセチン（ｍｙｒｉｃｅｔｉｎ）、フィセチン（ｆｉｓｅｔｉｎ）、ガランギン（ｇａｌａｎｇｉｎ）、ヘスペレチン（ｈｅｓｐｅｒｅｔｉｎ）、タンゲリチン（ｔａｎｇｅｒｉｔｉｎ）、デルフィニジン（ｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ）、エピカテキン（ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ）、クリシン（ｃｈｒｙｓｉｎ）、レスベラトロール（ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）、およびナリンゲニン（ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ）からなるフェニルプロパノイド系化合物；
ペンタン（ｐｅｎｔａｎｅ）、ヘキサン（ｈｅｘａｎｅ）、ヘプタン（ｈｅｐｔａｎｅ）、オクタン（ｏｃｔａｎｅ）、ノナン（ｎｏｎａｎｅ）、デカン（ｄｅｃａｎｅ）、ウンデカン（ｕｎｄｅｃａｎｅ）、ドデカン（ｄｏｄｅｃａｎｅ）、トリデカン（ｔｒｉｄｅｃａｎｅ）、テトラデカン（ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｅ）、ペンタデカン（ｐｅｎｔａｄｅｃａｎｅ）、ヘキサデカン（ｈｅｘａｄｅｃａｎｅ）、ヘプタデカン（ｈｅｐｔａｄｅｃａｎｅ）、オクタデカン（ｏｃｔａｄｅｃａｎｅ）、ノナデカン（ｎｏｎａｄｅｃａｎｅ）、イコサン（ｉｃｏｓａｎｅ）、ペンタノール（ｐｅｎｔａｎｏｌ）、ヘキサノール（ｈｅｘａｎｏｌ）、ヘプタノール（ｈｅｐｔａｎｏｌ）、オクタノール（ｏｃｔａｎｏｌ）、ノナノール（ｎｏｎａｎｏｌ）、デカノール（ｄｅｃａｎｏｌ）、ウンデカノール（ｕｎｄｅｃａｎｏｌ）、ドデカノール（ｄｏｄｅｃａｎｏｌ）、トリデカノール（ｔｒｉｄｅｃａｎｏｌ）、テトラデカノール（ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｌ）、ペンタデカノール（ｐｅｎｔａｄｅｃａｎｏｌ）、ヘキサデカノール（ｈｅｘａｄｅｃａｎｏｌ）、ヘプタデカノール（ｈｅｐｔａｄｅｃａｎｏｌ）、オクタデカノール（ｏｃｔａｄｅｃａｎｏｌ）、ノナデカノール（ｎｏｎａｄｅｃａｎｏｌ）、イコサノール（ｉｃｏｓａｎｏｌ）、メチルカプレート（ｍｅｔｈｙｌ  ｃａｐｒａｔｅ）、メチルラウレート（ｍｅｔｈｙｌ  ｌａｕｒａｔｅ）、メチルミリステート（ｍｅｔｈｙｌ  ｍｙｒｉｓｔａｔｅ）、メチルパルミテート（ｍｅｔｈｙｌ  ｐａｌｍｉｔａｔｅ）、メチルパルミトレート（ｍｅｔｈｙｌ  ｐａｌｍｉｔｏｌｅａｔｅ）、メチルステアレート（ｍｅｔｈｙｌ  ｓｔｅａｒａｔｅ）、メチルオレート（ｍｅｔｈｙｌ  ｏｌｅａｔｅ）、メチルリノレート（ｍｅｔｈｙｌ  ｌｉｎｏｌｅａｔｅ）、メチルリノレネート（ｍｅｔｈｙｌ  ｌｉｎｏｌｅｎａｔｅ）、メチルアラキデート（ｍｅｔｈｙｌ  ａｒａｃｈｉｄａｔｅ）、メチルパウリネート（ｍｅｔｈｙｌ  ｐａｕｌｌｉｎａｔｅ）、メチルエルケート（ｍｅｔｈｙｌ  ｅｒｕｃａｔｅ）、エチルカプレート（ｅｔｈｙｌ  ｃａｐｒａｔｅ）、エチルラウレート（ｅｔｈｙｌ  ｌａｕｒａｔｅ）、エチルミリステート（ｅｔｈｙｌ  ｍｙｒｉｓｔａｔｅ）、エチルパルミテート（ｅｔｈｙｌ  ｐａｌｍｉｔａｔｅ）、エチルパルミトレート（ｅｔｈｙｌ  ｐａｌｍｉｔｏｌｅａｔｅ）、エチルステアレート（ｅｔｈｙｌ  ｓｔｅａｒａｔｅ）、エチルオレート（ｅｔｈｙｌ  ｏｌｅａｔｅ）、エチルリノレート（ｅｔｈｙｌ  ｌｉｎｏｌｅａｔｅ）、エチルリノレネート（ｅｔｈｙｌ  ｌｉｎｏｌｅｎａｔｅ）、エチルアラキデート（ｅｔｈｙｌ  ａｒａｃｈｉｄａｔｅ）、エチルパウリネート（ｅｔｈｙｌ  ｐａｕｌｌｉｎａｔｅ）、およびエチルエルケート（ｍｅｔｈｙｌ  ｅｒｕｃａｔｅ）からなるバイオ燃料群；
セラミド（ｃｅｒａｍｉｄｅ）、パルミテート（ｐａｌｍｉｔａｔｅ）、およびスフィンゴシン（ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ）からなる脂質系化合物；ならびに
３−ヒドロキシプロピオン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）
から選択される何れか１つ以上の有用物質であることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１５に記載の組換え微生物に、６−メチルサリチル酸合成酵素（６−ｍｅｔｈｙｌｓａｌｉｃｙｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｙｎｔｈａｓｅ、６ＭＳＡＳ）および４´−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（４´−ｐｈｏｓｐｈｏｐａｎｔｅｔｈｅｉｎｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、Ｓｆｐ）をコードする遺伝子がさらに導入されるか、その発現が増加されている、６−メチルサリチル酸生産用組換え微生物。
【請求項１９】
前記発現の減少した遺伝子は、ｐａｂＡ，ｆａｂＦ，ｘａｐＲおよびｙｔｃＹで構成された群から選択された一つ以上であることを特徴とする請求項１８に記載の６−メチルサリチル酸生産用組換え微生物。
【請求項２０】
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（Ｍｄｈ）、ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（ＳｅｒＡ）、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡｃｃＢＣおよびＡｃｃＤ１）、グリセルアルデヒド  ３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧａｐＡ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｐｇｋ）、アセチル−ＣｏＡシンテターゼ（Ａｃｓ）、およびピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ：ＡｃｅＥＦおよびＬｐｄ）で構成された群から選択される１つ以上の酵素をコードする遺伝子がさらに導入されるか、その発現が増加されていることを特徴とする請求項１８に記載の６−メチルサリチル酸生産用組換え微生物。
【請求項２１】
下記ステップを含む、６−メチルサリチル酸の製造方法：
（ａ）請求項１８に記載の組換え微生物を培養するステップと、
（ｂ）前記培養された微生物から６−メチルサリチル酸を回収するステップ。
【請求項２２】
請求項１５に記載の組換え微生物に、アロエソン合成酵素（アロエソン  ｓｙｎｔｈａｓｅ）をコードする遺伝子がさらに導入されるか、その発現が増加されている、アロエソン生産用組換え微生物。
【請求項２３】
前記発現の減少した遺伝子は、ｐａｂＡであることを特徴とする請求項２２に記載のアロエソン生産用組換え微生物。
【請求項２４】
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（Ｍｄｈ）、ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（ＳｅｒＡ）、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡｃｃＢＣおよびＡｃｃＤ１）、グリセルアルデヒド  ３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧａｐＡ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｐｇｋ）、アセチル−ＣｏＡシンテターゼ（Ａｃｓ）、およびピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ：ＡｃｅＥＦおよびＬｐｄ）で構成された群から選択される１つ以上の酵素をコードする遺伝子がさらに導入されるか、その発現が増加されていることを特徴とする請求項２２に記載のアロエソン生産用組換え微生物。
【請求項２５】
下記ステップを含む、アロエソンの製造方法：
（ａ）請求項２２に記載の組換え微生物を培養するステップと、
（ｂ）前記培養された微生物からアロエソンを回収するステップ。
【請求項２６】
請求項１５に記載の組換え微生物に、チロシンアンモニア−リアーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ａｍｍｏｎｉａ−ｌｙａｓｅ、ＴＡＬ）、４−クマレート：ＣｏＡリガーゼ（４−ｃｏｕｍａｒａｔｅ：ＣｏＡ  ｌｉｇａｓｅ、４ＣＬ）およびスチルベン合成酵素（ｓｔｉｌｂｅｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ、ＳＴＳ）をコードする遺伝子がさらに導入されるか、その発現が増加されている、レスベラトロール生産用組換え微生物。
【請求項２７】
前記４−クマレート：ＣｏＡリガーゼは、配列番号１２８で表されるアミノ酸配列においてＩ２５０Ｌ／Ｎ４０４Ｋ／Ｉ４６１Ｖにアミノ酸が変異された変異酵素、または配列番号１３１で表されるアミノ酸配列においてＡ２９４Ｇ／Ａ３１８Ｇにアミノ酸が変異された変異酵素であることを特徴とする請求項２６に記載のレスベラトロール生産用組換え微生物。
【請求項２８】
前記発現の減少した遺伝子は、ｐａｂＡ，ｙｆｉＤ，ｍｑｏ，ｘａｐＲ，ｐｕｒＢ，ｆａｂＨ，ｆａｂＦ，ｙｔｃＹ，ａｒａＡ，ｆａｄＲ，ｃｙｔＲ，ｆｍｔおよびｐｙｒＦで構成された群から選択された一つ以上であることを特徴とする請求項２６に記載のレスベラトロール生産用組換え微生物。
【請求項２９】
下記ステップを含む、レスベラトロールの製造方法：
（ａ）請求項２６に記載の組換え微生物を培養するステップと、
（ｂ）前記培養された微生物からレスベラトロールを回収するステップ。
【請求項３０】
請求項１５に記載の組換え微生物に、チロシンアンモニア−リアーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ａｍｍｏｎｉａ−ｌｙａｓｅ、ＴＡＬ）、４−クマレート：ＣｏＡリガーゼ（４−ｃｏｕｍａｒａｔｅ：ＣｏＡ  ｌｉｇａｓｅ、４ＣＬ）、カルコン合成酵素（ｃｈａｌｃｏｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ、ＣＨＳ）およびカルコンイソメラーゼ（ｃｈａｌｃｏｎｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ、ＣＨＩ）をコードする遺伝子がさらに導入されるか、その発現が増加されている、ナリンゲニン生産用組換え微生物。
【請求項３１】
前記４−クマレート：ＣｏＡリガーゼは、配列番号１２８で表されるアミノ酸配列においてＩ２５０Ｌ／Ｎ４０４Ｋ／Ｉ４６１Ｖにアミノ酸が変異された変異酵素であることを特徴とする請求項３０に記載のナリンゲニン生産用組換え微生物。
【請求項３２】
前記発現の減少した遺伝子は、ｆａｄＲ，ｈｙｃＩおよびｘａｐＲで構成された群から選択された一つ以上であることを特徴とする請求項３０に記載のナリンゲニン生産用組換え微生物。
【請求項３３】
下記ステップを含む、ナリンゲニンの製造方法：
（ａ）請求項３０に記載の組換え微生物を培養するステップと、
（ｂ）前記培養された微生物からナリンゲニンを回収するステップ。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
したがって、本発明は、さらに他の観点において、下記ステップを含む、マロニル−ＣｏＡ生産能の増加に関与する遺伝子のスクリーニング方法に関する：
（ａ）前記組換え微生物に、前記組換え微生物中の遺伝子の発現を変化させる遺伝子調節ライブラリを導入することで、組換え微生物中の遺伝子の発現が変化された組換え微生物ライブラリを作製するステップと、
（ｂ）前記作製された組換え微生物ライブラリおよび遺伝子調節ライブラリを導入する前の組換え微生物を培養し、前記組換え微生物ライブラリの培養上清の色と、前記遺伝子調節ライブラリを導入する前の組換え微生物の培養上清の色を比較するステップと、
（ｃ）前記組換え微生物ライブラリの培養上清の色が前記遺伝子調節ライブラリを導入する前の組換え微生物の培養上清の色に比べて濃い赤色を呈する場合、組換え微生物ライブラリに導入した遺伝子を、マロニル−ＣｏＡ生産能の増加に関与する遺伝子として選択するステップ。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４２】
従来のマロニル−ＣｏＡ濃度測定法は、長時間がかかり、労働集約的であり、熟練した技術が必要であるだけでなく、データの信頼性が低く、大容量実験が困難であって、高性能機器を必要とするなど、様々な欠点および限界点を有していた。しかし、本発明によるバイオセンサーを活用する場合、単一ステップのシグナル発生、種々の微生物における活用性、自体蛍光を呈する微生物における活用性、および簡単な構築方法を提供するとともに、簡単なスクリーニング方法を提供する。また、本発明を高速スクリーニングと組み合わせると、増産されたマロニル−ＣｏＡ生産能を有する菌株を非常に容易に且つ迅速に（〜３日）選別することができ、これを、直ちにマロニル−ＣｏＡベースの有用化合物生産菌株に適用可能であるという利点がある。
本発明は一態様において、以下を提供する。
[項目１]
タイプＩＩＩポリケチド合成酵素をコードする遺伝子がゲノムに挿入されているか；または、タイプＩＩＩポリケチド合成酵素をコードする遺伝子を含む組換えベクターが導入されている、マロニル−ＣｏＡ検出用の組換え微生物。
[項目２]
前記タイプＩＩＩポリケチド合成酵素は、
ストレプトミセス・グリゼウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトミセス・  コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトミセス・エバミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、サッカロポリスポラ・エリスラエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ）、ストレプトミセス・ペウセティウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ）、およびストレプトミセス・アクレオラタス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｃｕｌｅｏｌａｔｕｓ）で構成された群から選択される微生物由来のＲｐｐＡ；
シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）由来のＰｈｌＤ（ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）；
アミコラトプシス・メディテラネイ（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ）  由来のＤｐｇＡ（ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）；
ショウヨウダイオウ（Ｒｈｅｕｍ  ｐａｌｍａｔｕｍ）由来のＡＬＳ（ａｌｏｅｓｏｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）；または  
アロエアルボレスケンス（Ａｌｏｅ  ａｒｂｏｒｅｓｃｅｎｓ）由来のＰＣＳ（５，７−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｍｅｔｈｙｌｃｈｒｏｍｏｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ＯＫＳ（ｏｃｔａｋｅｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ＰＫＳ３（ａｌｏｅｓｏｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ＰＫＳ４（ｏｃｔａｋｅｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ２）またはＰＫＳ５（ｏｃｔａｋｅｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ３）
であることを特徴とする項目１に記載の組換え微生物。
[項目３] 
前記タイプＩＩＩポリケチド合成酵素をコードする遺伝子が、ｔａｃ、ｔｒｃ、Ｔ７、ＢＡＤ、λＰＲ、およびアンダーソン合成プロモーターで構成された群から選択されるプロモーターに作動可能であるように連結されていることを特徴とする項目１に記載の組換え微生物。
[項目４]
前記組換え微生物は、大腸菌、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ），ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ），ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ），カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ），エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ），エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ），パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ），マンヘミア（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ），アクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ），アグリゲイティバクター（Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ），キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ），ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ），シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ），アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ），アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ），ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ），アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ），ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ），ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ），バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ），スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ），ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ），ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ），ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ），クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ），コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ），ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ），ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ），シアノバクテリウム（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）  および  サイクロバクテリウム（Ｃｙｃｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）で構成された菌株群から選択されることを特徴とする項目１に記載の組換え微生物。
[項目５]  
下記ステップを含むマロニル−ＣｏＡ生産誘導物質のスクリーニング方法：
（ａ）項目１に記載の組換え微生物を培養するステップと、
（ｂ）前記組換え微生物に候補物質を添加するステップと、
（ｃ）前記候補物質添加後の組換え微生物の培養上清の色と、前記候補物質を添加していない組換え微生物の培養上清の色とを比較するステップと、
（ｄ）前記候補物質添加後の組換え微生物の培養上清が、前記候補物質を添加していない組換え微生物の培養上清に比べてより濃い赤色を呈する場合、前記候補物質をマロニル−ＣｏＡ生産誘導物質として選択するステップ。
[項目６]
前記ステップ（ｃ）の色の比較は、目視で行うことを特徴とする項目５に記載の方法。
[項目７]
前記ステップ（ｃ）の色の比較は、吸光度を測定して行い、前記ステップ（ｄ）において、前記候補物質添加後に測定された吸光度が、前記候補物質を添加せずに測定された吸光度に比べてより増加する場合、前記候補物質をマロニル−ＣｏＡ生産誘導物質として選択することを特徴とする項目５に記載の方法。
[項目８]
下記ステップを含む、マロニル−ＣｏＡ生産能の増加に関与する遺伝子のスクリーニング方法：
（ａ）項目１に記載の組換え微生物に、前記組換え微生物中の遺伝子の発現を変化させる遺伝子調節ライブラリを導入することで、組換え微生物中の遺伝子の発現が変化された組換え微生物ライブラリを作製するステップと、
（ｂ）前記作製された組換え微生物ライブラリを培養して組換え微生物ライブラリの培養上清の吸光度を測定し、遺伝子調節ライブラリを導入する前の組換え微生物を培養して、組換え微生物ライブラリの培養上清の色と、遺伝子調節ライブラリを導入する前の組換え微生物の培養上清の色を比較するステップと、
（ｃ）前期組換え微生物ライブラリの培養上清が、前記遺伝子調節ライブラリを導入する前の組換え微生物の培養上清の色に比べて濃い赤色を呈する場合、組換え微生物ライブラリに導入した遺伝子を、マロニル−ＣｏＡ生産能の増加に関与する遺伝子として選択するステップ。
[項目９]
前記ステップ（ｂ）の色の比較は、目視で行われることを特徴とする項目８に記載の方法。
[項目１０]
前記ステップ（ｂ）の色の比較は、吸光度を測定して行われ、前記ステップ（ｃ）は、前記組換え微生物ライブラリの培養上清の吸光度が、前記遺伝子調節ライブラリを導入する前の組換え微生物の培養上清の吸光度に比べて増加する場合に、前記組換え微生物ライブラリに導入した遺伝子を選択することを含む、項目８に記載の方法。
[項目１１]
前記遺伝子調節ライブラリは、ｓＲＮＡライブラリ、ゲノムライブラリ、ｃＤＮＡライブラリ、ｇＲＮＡライブラリおよびノックアウトまたは突然変異作製用のオリゴヌクレオチドライブラリで構成された群から選択されるライブラリであることを特徴とする項目８に記載の方法。
[項目１２]
マロニル−ＣｏＡ生産能を有している微生物で、項目８〜１１のいずれかに記載の方法により選別された遺伝子の発現を調節することを特徴とする、マロニル−ＣｏＡ生産能が増加された組換え微生物の製造方法。
[項目１３]
前記選別された遺伝子は、
ｆａｂＦ（３−オキソアシル−［アシル−キャリア−プロテイン］合成酵素ＩＩ（３−ｏｘｏａｃｙｌ−［ａｃｙｌ−ｃａｒｒｉｅｒ−ｐｒｏｔｅｉｎ］  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ＩＩ））；
ｙｆｃＹ（β‐ケトアシルＣｏＡチオラーゼ（ｂｅｔａ−ｋｅｔｏａｃｙｌ−ＣｏＡ  ｔｈｉｏｌａｓｅ））；
ｘａｐＲ（ｘａｐＡＢの転写活性化因子）；
ｃｙｔＲ（ｄｅｏオペロンｕｄｐ，ｃｄｄ，ｔｓｘ，ｎｕｐＣおよびｎｕｐＧに対する転写抑制因子）；
ｆａｂＨ（３−オキソアシル−［アシル−キャリア−プロテイン］合成酵素ＩＩＩ（３−ｏｘｏａｃｙｌ−［ａｃｙｌ−ｃａｒｒｉｅｒ−ｐｒｏｔｅｉｎ］  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ＩＩＩ））；
ｍｑｏ（リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｍａｌａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ））；
ｙｆｉＤ（ピルビン酸ギ酸リアーゼサブユニット（ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｆｏｒｍａｔｅ  ｌｙａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ））；
ｆｍｔ（１０−ホルミルテトラヒドロ葉酸：Ｌ−メチオニル−ｔＲＮＡ（ｆＭｅｔ）Ｎ−ホルミルトランスフェラーゼ（１０−ｆｏｒｍｙｌｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ：Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｙｌ−ｔＲＮＡ（ｆＭｅｔ）Ｎ−ｆｏｒｍｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ））；
ｐｙｒＦ（オロチジン５’−リン酸脱炭酸酵素（ｏｒｏｔｉｄｉｎｅ−５’−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ））；
ａｒａＡ（Ｌ−アラビノースイソメラーゼ（Ｌ−ａｒａｂｉｎｏｓｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ））；
ｆａｄＲ（ｆａｄレギュロンに対するネガティブレギュレーターであり、ｆａｂＡレギュロンに対するポジティブレギュレーター）；
ｐａｂＡ（アミノデオキシコリスマート合成酵素、サブユニットＩＩ（ａｍｉｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｒｉｓｍａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ，ｓｕｂｕｎｉｔ  ＩＩ））；
ｐｕｒＢ（アデニロコハク酸リアーゼ（ａｄｅｎｙｌｏｓｕｃｃｉｎａｔｅ  ｌｙａｓｅ））；および  
ｈｙｃＩ（ＨｙｃＥのＣ末端処理に関係するプロテアーゼ）で構成された群から選択される一つ以上の遺伝子であり、
前記遺伝子の発現を減少させることを特徴とする項目１２に記載の方法。
[項目１４]
前記組換え微生物は、大腸菌、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ），ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ），ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ），カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ），エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ），エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ），パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ），マンヘミア（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ），アクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ），アグリゲイティバクター（Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ），キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ），ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ），シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ），アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ），アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ），ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ），アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ），ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ），ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ），バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ），スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ），ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ），ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ），ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ），クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ），コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ），ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ），ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ），シアノバクテリウム（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）  および  サイクロバクテリウム（Ｃｙｃｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）で構成された菌株群から選択される微生物であることを特徴とする項目１２に記載の方法。
[項目１５]
マロニル−ＣｏＡ生産能を有している微生物で、
ｆａｂＦ（３−オキソアシル−［アシル−キャリア−プロテイン］合成酵素ＩＩ（３−ｏｘｏａｃｙｌ−［ａｃｙｌ−ｃａｒｒｉｅｒ−ｐｒｏｔｅｉｎ］  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ＩＩ））；
ｙｆｃＹ（β‐ケトアシルＣｏＡチオラーゼ（ｂｅｔａ−ｋｅｔｏａｃｙｌ−ＣｏＡ  ｔｈｉｏｌａｓｅ））；
ｘａｐＲ（ｘａｐＡＢの転写活性化因子）；
ｃｙｔＲ（ｄｅｏオペロンｕｄｐ，ｃｄｄ，ｔｓｘ，ｎｕｐＣおよびｎｕｐＧに対する転写抑制因子）；
ｆａｂＨ（３−オキソアシル−［アシル−キャリア−プロテイン］合成酵素ＩＩＩ（３−ｏｘｏａｃｙｌ−［ａｃｙｌ−ｃａｒｒｉｅｒ−ｐｒｏｔｅｉｎ］  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ＩＩＩ））；
ｍｑｏ（リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｍａｌａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ））；
ｙｆｉＤ（ピルビン酸ギ酸リアーゼサブユニット（ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｆｏｒｍａｔｅ  ｌｙａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ））；
ｆｍｔ（１０−ホルミルテトラヒドロ葉酸：Ｌ−メチオニル−ｔＲＮＡ（ｆＭｅｔ）Ｎ−ホルミルトランスフェラーゼ（１０−ｆｏｒｍｙｌｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ：Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｙｌ−ｔＲＮＡ（ｆＭｅｔ）Ｎ−ｆｏｒｍｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ））；
ｐｙｒＦ（オロチジン５’−リン酸脱炭酸酵素（ｏｒｏｔｉｄｉｎｅ−５’−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ））；
ａｒａＡ（Ｌ−アラビノースイソメラーゼ（Ｌ−ａｒａｂｉｎｏｓｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ））；
ｆａｄＲ（ｆａｄレギュロンに対するネガティブレギュレーターであり、ｆａｂＡレギュロンに対するポジティブレギュレーター）；
ｐａｂＡ（アミノデオキシコリスマート合成酵素、サブユニットＩＩ（ａｍｉｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｒｉｓｍａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ，ｓｕｂｕｎｉｔ  ＩＩ））；
ｐｕｒＢ（アデニロコハク酸リアーゼ（ａｄｅｎｙｌｏｓｕｃｃｉｎａｔｅ  ｌｙａｓｅ））；および  
ｈｙｃＩ（ＨｙｃＥのＣ末端処理に関係するプロテアーゼ）で構成された群から選択された１つ以上の遺伝子の発現が野生型遺伝子に比べて減少されている、マロニル−ＣｏＡ生産能が増加された組換え微生物。
[項目１６]
下記ステップを含む、マロニル−ＣｏＡを基質または中間物質とする有用物質の生産方法：
（ａ）項目１５に記載の組換え微生物に、有用物質の生産に関与する遺伝子をさらに導入し、もしくは当該遺伝子の発現を増加させ、または、有用物質の生産に関与する遺伝子をさらに欠損させ、もしくは当該遺伝子の発現を抑制させた組換え微生物を作製するステップと、
（ｂ）前記作製された微生物を培養するステップと、
（ｃ）前記培養された微生物から有用物質を回収するステップ。
[項目１７]
前記有用物質は、
アクチノロージン（ａｃｔｉｎｏｒｈｏｄｉｎ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、オキシテトラサイクリン（ｏｘｙｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）、ラパマイシン（ｒａｐａｍｙｃｉｎ）、ロバスタチン（ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ）、ＳＥＫ４、ＳＥＫ４ｂ、ＳＥＫ３４、ＳＥＫ１５、ＳＥＫ２６、ＦＫ５０６、ＤＭＡＣ、アクラビノン（ａｋｌａｖｉｎｏｎｅ）、アクラノン酸（ａｋｌａｎｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、エプシロンロドマイシノン（ｅｐｓｉｌｏｎ−ｒｈｏｄｏｍｙｃｉｎｏｎｅ）、アロエシン（ａｌｏｅｓｉｎ）、アロエニン（ａｌｏｅｎｉｎ）、バルバロイン（ｂａｒｂａｌｏｉｎ）、５，７−ジヒドロキシ−２−メチルクロモン（５，７−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｍｅｔｈｙｌｃｈｒｏｍｏｎｅ）、エリスロマイシン（ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）、リファマイシン（ｒｉｆａｍｙｃｉｎ）、エバーメクチン（ａｖｅｒｍｅｃｔｉｎ）、ゲルダナマイシン（ｇｅｌｄａｎａｍｙｃｉｎ）、イベルメクチン（ｉｖｅｒｍｅｃｔｉｎ）、ドキシサイクリン（ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ）、アントラマイシン（ａｎｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、ペニシリン酸（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｃ  ａｃｉｄ）、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、エポチロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）、テトラセノマイシン（ｔｅｔｒａｃｅｎｏｍｙｃｉｎ）、フレノリシン（ｆｒｅｎｏｌｉｃｉｎ）、トリ酢酸ラクトン（ｔｒｉａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｌａｃｔｏｎｅ）、６−メチルサリチル酸（６−ｍｅｔｈｙｌｓａｌｉｃｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）、およびアロエソン（ａｌｏｅｓｏｎｅ）からなるポリケチド系化合物；
ピノセムブリン（ｐｉｎｏｃｅｍｂｒｉｎ）、ジヒドロケンペロール（ｄｉｈｙｄｒｏｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ）、エリオジクチオール（ｅｒｉｏｄｉｃｔｙｏｌ）、ジヒドロケルセチン（ｄｉｈｙｄｒｏｑｕｅｒｃｅｔｉｎ）、ダイゼイン（ｄａｉｄｚｅｉｎ）、ゲニステイン（ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）、アピゲニン（ａｐｉｇｅｎｉｎ）、ルテオリン（ｌｕｔｅｏｌｉｎ）、ケンペロール（ｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ）、ケルセチン（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ）、カテキン（ｃａｔｅｃｈｉｎ）、ペラルゴニジン（ｐｅｌａｒｇｏｎｉｄｉｎ）、シアニジン（ｃｙａｎｉｄｉｎ）、アフゼレキン（ａｆｚｅｌｅｃｈｉｎ）、ミリセチン（ｍｙｒｉｃｅｔｉｎ）、フィセチン（ｆｉｓｅｔｉｎ）、ガランギン（ｇａｌａｎｇｉｎ）、ヘスペレチン（ｈｅｓｐｅｒｅｔｉｎ）、タンゲリチン（ｔａｎｇｅｒｉｔｉｎ）、デルフィニジン（ｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ）、エピカテキン（ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ）、クリシン（ｃｈｒｙｓｉｎ）、レスベラトロール（ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）、およびナリンゲニン（ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ）からなるフェニルプロパノイド系化合物；
ペンタン（ｐｅｎｔａｎｅ）、ヘキサン（ｈｅｘａｎｅ）、ヘプタン（ｈｅｐｔａｎｅ）、オクタン（ｏｃｔａｎｅ）、ノナン（ｎｏｎａｎｅ）、デカン（ｄｅｃａｎｅ）、ウンデカン（ｕｎｄｅｃａｎｅ）、ドデカン（ｄｏｄｅｃａｎｅ）、トリデカン（ｔｒｉｄｅｃａｎｅ）、テトラデカン（ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｅ）、ペンタデカン（ｐｅｎｔａｄｅｃａｎｅ）、ヘキサデカン（ｈｅｘａｄｅｃａｎｅ）、ヘプタデカン（ｈｅｐｔａｄｅｃａｎｅ）、オクタデカン（ｏｃｔａｄｅｃａｎｅ）、ノナデカン（ｎｏｎａｄｅｃａｎｅ）、イコサン（ｉｃｏｓａｎｅ）、ペンタノール（ｐｅｎｔａｎｏｌ）、ヘキサノール（ｈｅｘａｎｏｌ）、ヘプタノール（ｈｅｐｔａｎｏｌ）、オクタノール（ｏｃｔａｎｏｌ）、ノナノール（ｎｏｎａｎｏｌ）、デカノール（ｄｅｃａｎｏｌ）、ウンデカノール（ｕｎｄｅｃａｎｏｌ）、ドデカノール（ｄｏｄｅｃａｎｏｌ）、トリデカノール（ｔｒｉｄｅｃａｎｏｌ）、テトラデカノール（ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｌ）、ペンタデカノール（ｐｅｎｔａｄｅｃａｎｏｌ）、ヘキサデカノール（ｈｅｘａｄｅｃａｎｏｌ）、ヘプタデカノール（ｈｅｐｔａｄｅｃａｎｏｌ）、オクタデカノール（ｏｃｔａｄｅｃａｎｏｌ）、ノナデカノール（ｎｏｎａｄｅｃａｎｏｌ）、イコサノール（ｉｃｏｓａｎｏｌ）、メチルカプレート（ｍｅｔｈｙｌ  ｃａｐｒａｔｅ）、メチルラウレート（ｍｅｔｈｙｌ  ｌａｕｒａｔｅ）、メチルミリステート（ｍｅｔｈｙｌ  ｍｙｒｉｓｔａｔｅ）、メチルパルミテート（ｍｅｔｈｙｌ  ｐａｌｍｉｔａｔｅ）、メチルパルミトレート（ｍｅｔｈｙｌ  ｐａｌｍｉｔｏｌｅａｔｅ）、メチルステアレート（ｍｅｔｈｙｌ  ｓｔｅａｒａｔｅ）、メチルオレート（ｍｅｔｈｙｌ  ｏｌｅａｔｅ）、メチルリノレート（ｍｅｔｈｙｌ  ｌｉｎｏｌｅａｔｅ）、メチルリノレネート（ｍｅｔｈｙｌ  ｌｉｎｏｌｅｎａｔｅ）、メチルアラキデート（ｍｅｔｈｙｌ  ａｒａｃｈｉｄａｔｅ）、メチルパウリネート（ｍｅｔｈｙｌ  ｐａｕｌｌｉｎａｔｅ）、メチルエルケート（ｍｅｔｈｙｌ  ｅｒｕｃａｔｅ）、エチルカプレート（ｅｔｈｙｌ  ｃａｐｒａｔｅ）、エチルラウレート（ｅｔｈｙｌ  ｌａｕｒａｔｅ）、エチルミリステート（ｅｔｈｙｌ  ｍｙｒｉｓｔａｔｅ）、エチルパルミテート（ｅｔｈｙｌ  ｐａｌｍｉｔａｔｅ）、エチルパルミトレート（ｅｔｈｙｌ  ｐａｌｍｉｔｏｌｅａｔｅ）、エチルステアレート（ｅｔｈｙｌ  ｓｔｅａｒａｔｅ）、エチルオレート（ｅｔｈｙｌ  ｏｌｅａｔｅ）、エチルリノレート（ｅｔｈｙｌ  ｌｉｎｏｌｅａｔｅ）、エチルリノレネート（ｅｔｈｙｌ  ｌｉｎｏｌｅｎａｔｅ）、エチルアラキデート（ｅｔｈｙｌ  ａｒａｃｈｉｄａｔｅ）、エチルパウリネート（ｅｔｈｙｌ  ｐａｕｌｌｉｎａｔｅ）、およびエチルエルケート（ｍｅｔｈｙｌ  ｅｒｕｃａｔｅ）からなるバイオ燃料群；
セラミド（ｃｅｒａｍｉｄｅ）、パルミテート（ｐａｌｍｉｔａｔｅ）、およびスフィンゴシン（ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ）からなる脂質系化合物；ならびに
３−ヒドロキシプロピオン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）
から選択される何れか１つ以上の有用物質であることを特徴とする項目１６に記載の方法。
[項目１８]
項目１５に記載の組換え微生物に、６−メチルサリチル酸合成酵素（６−ｍｅｔｈｙｌｓａｌｉｃｙｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｙｎｔｈａｓｅ、６ＭＳＡＳ）および４´−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（４´−ｐｈｏｓｐｈｏｐａｎｔｅｔｈｅｉｎｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、Ｓｆｐ）をコードする遺伝子がさらに導入されるか、その発現が増加されている、６−メチルサリチル酸生産用組換え微生物。
[項目１９]
前記ノックダウンされる遺伝子は、ｐａｂＡ，ｆａｂＦ，ｘａｐＲおよびｙｔｃＹで構成された群から選択された一つ以上であることを特徴とする項目１８に記載の６−メチルサリチル酸生産用組換え微生物。
[項目２０]
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（Ｍｄｈ）、ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（ＳｅｒＡ）、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡｃｃＢＣおよびＡｃｃＤ１）、グリセルアルデヒド  ３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧａｐＡ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｐｇｋ）、アセチル−ＣｏＡシンテターゼ（Ａｃｓ）、およびピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ：ＡｃｅＥＦおよびＬｐｄ）で構成された群から選択される１つ以上の酵素をコードする遺伝子がさらに導入されるか、その発現が増加されていることを特徴とする項目１８に記載の６−メチルサリチル酸生産用組換え微生物。
[項目２１]
下記ステップを含む、６−メチルサリチル酸の製造方法：
（ａ）項目１８に記載の組換え微生物を培養するステップと、
（ｂ）前記培養された微生物から６−メチルサリチル酸を回収するステップ。
[項目２２]
項目１５に記載の組換え微生物に、アロエソン合成酵素（アロエソン  ｓｙｎｔｈａｓｅ）をコードする遺伝子がさらに導入されるか、その発現が増加されている、アロエソン生産用組換え微生物。
[項目２３]
前記ノックダウンされる遺伝子は、ｐａｂＡであることを特徴とする項目２２に記載のアロエソン生産用組換え微生物。
[項目２４]
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（Ｍｄｈ）、ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（ＳｅｒＡ）、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡｃｃＢＣおよびＡｃｃＤ１）、グリセルアルデヒド  ３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧａｐＡ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｐｇｋ）、アセチル−ＣｏＡシンテターゼ（Ａｃｓ）、およびピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ：ＡｃｅＥＦおよびＬｐｄ）で構成された群から選択される１つ以上の酵素をコードする遺伝子がさらに導入されるか、その発現が増加されていることを特徴とする項目２２に記載のアロエソン生産用組換え微生物。
[項目２５]
下記ステップを含む、アロエソンの製造方法：
（ａ）項目２２に記載の組換え微生物を培養するステップと、
（ｂ）前記培養された微生物からアロエソンを回収するステップ。
[項目２６]
項目１５に記載の組換え微生物に、チロシンアンモニア−リアーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ａｍｍｏｎｉａ−ｌｙａｓｅ、ＴＡＬ）、４−クマレート：ＣｏＡリガーゼ（４−ｃｏｕｍａｒａｔｅ：ＣｏＡ  ｌｉｇａｓｅ、４ＣＬ）およびスチルベン合成酵素（ｓｔｉｌｂｅｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ、ＳＴＳ）をコードする遺伝子がさらに導入されるか、その発現が増加されている、レスベラトロール生産用組換え微生物。
[項目２７]
前記４−クマレート：ＣｏＡリガーゼは、配列番号１２８で表されるアミノ酸配列においてＩ２５０Ｌ／Ｎ４０４Ｋ／Ｉ４６１Ｖにアミノ酸が変異された変異酵素、または配列番号１３１で表されるアミノ酸配列においてＡ２９４Ｇ／Ａ３１８Ｇにアミノ酸が変異された変異酵素であることを特徴とする項目２６に記載のレスベラトロール生産用組換え微生物。
[項目２８]
前記ノックダウンされる遺伝子は、ｐａｂＡ，ｙｆｉＤ，ｍｑｏ，ｘａｐＲ，ｐｕｒＢ，ｆａｂＨ，ｆａｂＦ，ｙｔｃＹ，ａｒａＡ，ｆａｄＲ，ｃｙｔＲ，ｆｍｔおよびｐｙｒＦで構成された群から選択された一つ以上であることを特徴とする項目２６に記載のレスベラトロール生産用組換え微生物。
[項目２９]
下記ステップを含む、レスベラトロールの製造方法：
（ａ）項目２６に記載の組換え微生物を培養するステップと、
（ｂ）前記培養された微生物からレスベラトロールを回収するステップ。
[項目３０]
項目１５に記載の組換え微生物に、チロシンアンモニア−リアーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ａｍｍｏｎｉａ−ｌｙａｓｅ、ＴＡＬ）、４−クマレート：ＣｏＡリガーゼ（４−ｃｏｕｍａｒａｔｅ：ＣｏＡ  ｌｉｇａｓｅ、４ＣＬ）、カルコン合成酵素（ｃｈａｌｃｏｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ、ＣＨＳ）およびカルコンイソメラーゼ（ｃｈａｌｃｏｎｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ、ＣＨＩ）をコードする遺伝子がさらに導入されるか、その発現が増加されている、ナリンゲニン生産用組換え微生物。
[項目３１]
前記４−クマレート：ＣｏＡリガーゼは、配列番号１２８で表されるアミノ酸配列においてＩ２５０Ｌ／Ｎ４０４Ｋ／Ｉ４６１Ｖにアミノ酸が変異された変異酵素であることを特徴とする項目３０に記載のナリンゲニン生産用組換え微生物。
[項目３２]
前記ノックダウンされる遺伝子は、ｆａｄＲ，ｈｙｃＩおよびｘａｐＲで構成された群から選択された一つ以上であることを特徴とする項目３０に記載のナリンゲニン生産用組換え微生物。
[項目３３]
下記ステップを含む、ナリンゲニンの製造方法：
（ａ）項目３０に記載の組換え微生物を培養するステップと、
（ｂ）前記培養された微生物からナリンゲニンを回収するステップ。
【国際調査報告】
2020530757.tif 000031
2020530757.tif 000032
2020530757.tif 000033
2020530757.tif 000034
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