(57)【要約】本発明は、生物医学の分野に関する。特に、本発明は、ヒト腫瘍幹細胞に対する単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片、並びに腫瘍の治療及び診断における前記抗体又は断片の使用に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍幹細胞に対する単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片であって、前記モノクローナル抗体が、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、
前記軽鎖可変領域が：
配列番号２に示されるアミノ酸配列又は配列番号２と比較して１又は２個のアミノ酸残基の置換、欠失又は付加を有するアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、
配列番号３に示されるアミノ酸配列又は配列番号３と比較して１又は２個のアミノ酸残基の置換、欠失又は付加を有するアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、及び
配列番号４に示されるアミノ酸配列又は配列番号４と比較して１又は２個のアミノ酸残基の置換、欠失又は付加を有するアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３
を含み；
前記重鎖可変領域が：
配列番号６に示されるアミノ酸配列又は配列番号６と比較して１又は２個のアミノ酸残基の置換、欠失又は付加を有するアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、
配列番号７に示されるアミノ酸配列又は配列番号７と比較して１又は２個のアミノ酸残基の置換、欠失又は付加を有するアミノ酸配列、例として、配列番号１３に示される配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、及び
配列番号８に示されるアミノ酸配列又は配列番号８と比較して１又は２個のアミノ酸残基の置換、欠失又は付加を有するアミノ酸配列、例として、配列番号１４に示される配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３
を含む、単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項２】
前記モノクローナル抗体が、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、
前記軽鎖可変領域が：
配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、
配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、及び
配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３
を含み；
前記重鎖可変領域が：
配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、
配列番号７に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、及び
配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３
を含む、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項３】
前記軽鎖可変領域が、配列番号１に示されるアミノ酸配列又は配列番号１と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項４】
前記重鎖可変領域が、配列番号５に示されるアミノ酸配列又は配列番号５と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項５】
前記重鎖可変領域が、配列番号１５〜１９のうちの１つに示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項６】
前記軽鎖可変領域が、配列番号２０〜３１のうちの１つに示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項７】
前記重鎖可変領域が、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号３０に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項８】
前記モノクローナル抗体が、ヒト重鎖定常領域、例えば、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むヒト重鎖定常領域を含む、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項９】
前記モノクローナル抗体が、ヒト軽鎖定常領域、例えば、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含むヒト軽鎖定常領域を含む、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項１０】
前記モノクローナル抗体が、配列番号９に示されるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項１１】
前記モノクローナル抗体が、配列番号３２〜３６のうちの１つに示されるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号３７〜４８のうちの１つに示されるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項１２】
前記モノクローナル抗体が、配列番号３６に示される重鎖及び配列番号４７に示される軽鎖を含む、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項１３】
前記モノクローナル抗体が、配列番号３６に示される重鎖及び配列番号４２に示される軽鎖を含む、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項１４】
２０１６年３月１６日にＣＧＭＣＣ（Ｃｈｉｎａ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ）にＣＧＭＣＣ番号１２２５１の受託番号で寄託されたマウスハイブリドーマにより生成されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項１５】
２０１６年３月１６日にＣＧＭＣＣにＣＧＭＣＣ番号１２２５１の受託番号で寄託されたハイブリドーマ細胞。
【請求項１６】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片及び薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物。
【請求項１７】
前記モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片が、細胞毒、放射性同位体又は生物活性タンパク質からなる群から選択される治療用部分にコンジュゲートされている、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
患者において悪性腫瘍を治療する、悪性腫瘍の転移又は再発を予防及び／又は治療するための方法であって、有効量の請求項１〜１４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体若しくはその抗原結合性断片又は請求項１６若しくは１７に記載の医薬組成物を前記患者に投与するステップを含む方法。
【請求項１９】
前記悪性腫瘍が、乳がん、結腸直腸がん、膵がん、前立腺がん、肝がん、肺がん及び胃がんからなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
他の抗腫瘍治療手段を前記患者に投与するステップ、例として、化学療法剤、他の腫瘍特異的抗原をターゲティングする抗体又は放射線療法を投与するステップをさらに含む、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
悪性腫瘍を治療する、悪性腫瘍の転移又は再発を予防及び／又は治療するための医薬の調製における、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体若しくはその抗原結合性断片又は請求項１６若しくは１７に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２２】
前記悪性腫瘍が、乳がん、結腸直腸がん、膵がん、前立腺がん、肝がん、肺がん及び胃がんからなる群から選択される、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
生体試料において腫瘍幹細胞の存在を検出するための方法であって：
ａ）前記生体試料を請求項１〜１４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片と接触させるステップと、
ｂ）前記モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片の、前記生体試料中の標的抗原への結合を検出するステップであって、
検出される前記結合が、前記生体試料中の腫瘍幹細胞の存在を示す、検出するステップと
を含む方法。
【請求項２４】
腫瘍幹細胞を単離するための方法であって：
（ａ）腫瘍幹細胞を含有する疑いのある細胞集団を用意するステップと、
（ｂ）請求項１〜１４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片に結合する前記細胞のサブ集団を特定するステップと、
（ｃ）前記サブ集団を単離するステップと
を含む方法。
【請求項２５】
前記腫瘍幹細胞が、乳がん幹細胞、結腸直腸がん幹細胞、膵がん幹細胞、前立腺がん幹細胞、肝がん幹細胞、肺がん幹細胞及び胃がん幹細胞からなる群から選択される、請求項２３又は２４に記載の方法。
【請求項２６】
患者において悪性腫瘍の存在を検出するための方法であって：
ａ）前記患者からの生体試料を請求項１〜１４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片と接触させるステップと、
ｂ）前記モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片の、前記生体試料中の標的抗原への結合を検出するステップであって、検出される前記結合が、前記患者における前記悪性腫瘍の存在を示す、検出するステップと
を含む方法。
【請求項２７】
患者における悪性腫瘍の再発又は進行の予後予測のための方法であって：
（ａ）前記患者から循環細胞を含む生体試料を単離するステップと、
（ｂ）循環細胞を含む前記生体試料を請求項１〜１４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片と接触させるステップと、
（ｃ）前記モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片に結合する循環細胞の存在を特定するステップと
を含み、
それによって、前記患者における前記悪性腫瘍の前記再発又は進行の予後を予測する、方法。
【請求項２８】
前記悪性腫瘍の前記進行が、前記患者における前記悪性腫瘍の転移を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記生体試料が、血液試料、リンパ試料又はその成分を含む、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記悪性腫瘍が、乳がん、結腸直腸がん、膵がん、前立腺がん、肝がん、肺がん及び胃がんからなる群から選択される、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片をコードする単離された核酸分子。
【請求項３２】
発現調節配列に作動可能に連結されている、請求項３１に記載の単離された核酸分子。
【請求項３３】
請求項３１又は３２に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項３４】
請求項３１若しくは３２に記載の核酸分子又は請求項３１に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項３５】
ヒト腫瘍幹細胞に対するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を生成する方法であって：
（ｉ）請求項３４に記載の宿主細胞を、前記核酸分子又は発現ベクターの発現に好適な条件で培養するステップと、
（ｉｉ）前記核酸分子又は発現ベクターによって発現された抗体又はその抗原結合性断片を単離及び精製するステップと
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物医学の分野に関する。特に、本発明は、ヒト腫瘍幹細胞に対する単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片、並びに腫瘍の治療及び診断における前記抗体又は断片の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
悪性腫瘍（がん）は、世界中で人々の生命及び健康を脅かす「第１位の死亡原因」になっている。世界で年間１４００万症例を超える新しいがんが存在しており、一方、中国では毎年３００万人を超える新しいがん患者が存在している。
【０００３】
がんの高い死亡率の主因は、がん細胞の転移、及びほとんどの患者が治療後に再発及び薬物抵抗性を起こしやすいことである。現在臨床的に使用可能な治療、手術、放射線療法及び化学療法は、がん細胞の転移、再発及び薬物抵抗性に対してほとんど効果を有しないか、又は短期的効果しか有さず、このため、患者の長期生存を達成することができない。現在、外科的切除は、初期患者の約１０〜２０％について有効であるが、外科的切除は、転移を経験した患者についてはほとんど無効である。放射線療法は、局所性病変を治療し得るのみであるので、放射線療法は多くの場合、数種類のがんの手術及び根治療法前後の付属的療法として使用される。化学療法は、転移を経験した患者について使用され得るが、その強い毒性効果及び副作用並びにその短期又は長期薬物抵抗性を生成する傾向のために、化学療法は、患者の約２０〜３０％について顕著な短期治療効果を有し得るのみである。手術、放射線療法及び化学療法を統合する包括的治療手段でさえも、長期治療効果である５年生存率は、何年もの間２０〜３０％で変動しており、患者の約７０〜８０％が、転移、再発及び薬物抵抗性のために治療後５年以内に死亡している。初めに転移を示さなかった初期がん患者でさえも、彼らのうちの一部は、治療後に転移及び再発のために死亡した。ポリペプチド、小分子、タンパク質因子、遺伝子療法及び抗体薬物を含む、近年開発された腫瘍の新しいターゲティング薬物は、それらが化学療法薬との組合せで使用された場合でさえも、患者の生存期間を３〜９か月延長することができるのみであり、患者の長期５年生存率について顕著な改善を有しない。ここ２年間で出現した腫瘍免疫療法、例として、免疫チェックポイントに対するＰＤ−１モノクローナル抗体薬物及びＣＡＲ−Ｔ細胞療法は、長期治療有効性についてのいくつかの励みとなるような徴候を示したが、がん患者に対する腫瘍免疫療法の全体的な有効率は、約２０〜３０％に達し得るのみであり、未だに真に有効な薬物による治療を受けることができない多数のがん患者がいる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
それゆえ、長期治療有効性を改善し、がん患者の生存期間を延長するための、腫瘍転移、再発及び薬物抵抗性を阻害する新しい薬物を開発することが所望される。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一態様においては、本発明は、腫瘍幹細胞に対する単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片であって、モノクローナル抗体が、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、
軽鎖可変領域が：
配列番号２に示されるアミノ酸配列又は配列番号２と比較して１又は２個のアミノ酸残基の置換、欠失又は付加を有するアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、
配列番号３に示されるアミノ酸配列又は配列番号３と比較して１又は２個のアミノ酸残基の置換、欠失又は付加を有するアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、及び
配列番号４に示されるアミノ酸配列又は配列番号４と比較して１又は２個のアミノ酸残基の置換、欠失又は付加を有するアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３
を含み；
重鎖可変領域が：
配列番号６に示されるアミノ酸配列又は配列番号６と比較して１又は２個のアミノ酸残基の置換、欠失又は付加を有するアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、
配列番号７に示されるアミノ酸配列又は配列番号７と比較して１又は２個のアミノ酸残基の置換、欠失又は付加を有するアミノ酸配列、例として、配列番号１３に示される配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、及び
配列番号８に示されるアミノ酸配列又は配列番号８と比較して１又は２個のアミノ酸残基の置換、欠失又は付加を有するアミノ酸配列、例として、配列番号１４に示される配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３
を含む、単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を提供する。
【０００６】
モノクローナル抗体が、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む一部の実施形態においては、
軽鎖可変領域は：
配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、
配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、及び
配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３
を含み；
重鎖可変領域は：
配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、
配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、及び
配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３
を含む。
【０００７】
モノクローナル抗体が、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む一部の実施形態においては、
軽鎖可変領域は：
配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、
配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、及び
配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３
を含み；
重鎖可変領域は：
配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、
配列番号７に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、及び
配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３
を含む。
【０００８】
一部の実施形態においては、軽鎖可変領域は、配列番号１に示されるアミノ酸配列又は配列番号１と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０００９】
一部の実施形態においては、重鎖可変領域は、配列番号５に示されるアミノ酸配列又は配列番号５と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００１０】
一部の実施形態においては、重鎖可変領域は、（ヒト化重鎖変形型Ｈ１〜Ｈ５の可変領域にそれぞれ対応する）配列番号１５〜１９のうちの１つに示されるアミノ酸配列を含む。
【００１１】
一部の実施形態においては、軽鎖可変領域は、（ヒト化軽鎖変形型Ｌ１〜Ｌ１２の可変領域にそれぞれ対応する）配列番号２０〜３１のうちの１つに示されるアミノ酸配列を含む。
【００１２】
一部の実施形態においては、重鎖可変領域は、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含む。
【００１３】
一部の実施形態においては、重鎖可変領域は、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号３０に示されるアミノ酸配列を含む。
【００１４】
一部の実施形態においては、モノクローナル抗体は、ヒト重鎖定常領域、例として、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むヒト重鎖定常領域を含む。
【００１５】
一部の実施形態においては、モノクローナル抗体は、ヒト軽鎖定常領域、例として、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含むヒト軽鎖定常領域を含む。
【００１６】
一部の実施形態においては、モノクローナル抗体は、配列番号９に示されるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。
【００１７】
一部の実施形態においては、モノクローナル抗体は、（ヒト化重鎖変形型Ｈ１〜Ｈ５にそれぞれ対応する）配列番号３２〜３６のうちの１つに示されるアミノ酸配列を有する重鎖及び（ヒト化軽鎖変形型Ｌ１〜Ｌ１２にそれぞれ対応する）配列番号３７〜４８のうちの１つに示されるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。
【００１８】
一部の実施形態においては、モノクローナル抗体は、配列番号３６に示される重鎖及び（ヒト化抗体Ｈ５Ｌ１１に対応する）配列番号４７に示される軽鎖を含む。
【００１９】
一部の実施形態においては、モノクローナル抗体は、配列番号３６に示される重鎖及び（ヒト化抗体Ｈ５Ｌ６に対応する）配列番号４２に示される軽鎖を含む。
【００２０】
別の態様においては、本発明は、２０１６年３月１６日にＣｈｉｎａ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ＣｅｎｔｅｒにＣＧＭＣＣ番号１２２５１の受託番号で寄託されたマウスハイブリドーマによって生成されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を提供する。
【００２１】
別の態様においては、本発明は、２０１６年３月１６日にＣＧＭＣＣにＣＧＭＣＣ番号１２２５１の受託番号で寄託されたハイブリドーマを提供する。
【００２２】
別の態様においては、本発明は、本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片及び薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物を提供する。
【００２３】
一部の実施形態においては、モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、細胞毒、放射性同位体又は生物活性タンパク質からなる群から選択される治療用部分にコンジュゲートされている。
【００２４】
別の態様においては、本発明は、患者において悪性腫瘍を治療する、悪性腫瘍の転移又は再発を予防及び／又は治療するための方法であって、有効量の本発明のモノクローナル抗体若しくはその抗原結合性断片又は本発明の医薬組成物を患者に投与するステップを含む方法を提供する。
【００２５】
一部の実施形態においては、悪性腫瘍は、乳がん、結腸直腸がん、膵がん、前立腺がん、肝がん、肺がん及び胃がんからなる群から選択される。
【００２６】
一部の実施形態においては、本方法は、他の抗腫瘍治療手段を患者に投与するステップ、例として、化学療法剤、他の腫瘍特異的抗原をターゲティングする抗体又は放射線療法を投与するステップをさらに含む。
【００２７】
別の態様においては、本発明は、悪性腫瘍を治療する、悪性腫瘍の転移又は再発を予防及び／又は治療するための医薬の調製における、本発明のモノクローナル抗体若しくはその抗原結合性断片又は本発明の医薬組成物の使用を提供する。
【００２８】
一部の実施形態においては、悪性腫瘍は、乳がん、結腸直腸がん、膵がん、前立腺がん、肝がん、肺がん及び胃がんからなる群から選択される。
【００２９】
別の態様においては、本発明は、生体試料において腫瘍幹細胞の存在を検出するための方法であって：
ａ）生体試料を本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片と接触させるステップと、
ｂ）本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片の、前記生体試料中の標的抗原への結合を検出するステップであって、検出される結合が、生体試料中の腫瘍幹細胞の存在を示す、検出するステップと
を含む方法を提供する。
【００３０】
別の態様においては、本発明は、腫瘍幹細胞を単離するための方法であって：
（ａ）腫瘍幹細胞を含有する疑いのある細胞集団を用意するステップと、
（ｂ）本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片に結合する前記細胞のサブ集団を特定するステップと、
（ｃ）サブ集団を単離するステップと
を含む方法をさらに提供する。
【００３１】
上記様々な態様の一部の実施形態においては、腫瘍幹細胞は、乳がん幹細胞、結腸直腸がん幹細胞、膵がん幹細胞、前立腺がん幹細胞、肝がん幹細胞、肺がん幹細胞及び胃がん幹細胞からなる群から選択される。
【００３２】
別の態様においては、本発明は、患者において悪性腫瘍の存在を検出するための方法であって：
ａ）前記患者から得た生体試料を本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片と接触させるステップと、
ｂ）本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片の、前記生体試料中の標的抗原への結合を検出するステップであって、検出される結合が、前記患者における悪性腫瘍の存在を示す、検出するステップと
を含む方法をさらに提供する。
【００３３】
別の態様においては、本発明は、患者における悪性腫瘍の再発又は進行の予後予測のための方法であって：
（ａ）患者から循環細胞を含む生体試料を単離するステップと、
（ｂ）循環細胞を含む前記生体試料を本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片と接触させるステップと、
（ｃ）本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片に結合する循環細胞の存在を特定するステップと
を含み、
それによって、患者における悪性腫瘍の再発又は進行の予後を予測する、方法をさらに提供する。
【００３４】
一部の実施形態においては、悪性腫瘍の進行は、患者における悪性腫瘍の転移を含む。
【００３５】
上記様々な態様の一部の実施形態においては、生体試料は、血液試料、リンパ試料又はその任意の成分を含む。一部の実施形態においては、悪性腫瘍は、乳がん、結腸直腸がん、膵がん、前立腺がん、肝がん、肺がん及び胃がんからなる群から選択される。
【００３６】
別の態様においては、本発明は、本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片をコードする単離された核酸分子をさらに提供する。
【００３７】
一部の実施形態においては、核酸分子は、発現調節配列に作動可能に連結されている。
【００３８】
別の態様においては、本発明は、本発明の核酸分子を含む発現ベクターをさらに提供する。
【００３９】
別の態様においては、本発明は、本発明の核酸分子又は本発明の発現ベクターで形質転換された宿主細胞をさらに提供する。
【００４０】
別の態様においては、本発明は、ヒト腫瘍幹細胞に対するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を生成する方法であって：
（ｉ）本発明の宿主細胞を、本発明の核酸分子又は発現ベクターの発現に好適な条件で培養するステップと、
（ｉｉ）核酸分子又は発現ベクターによって発現された抗体又はその抗原結合性断片を単離及び精製するステップと
を含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】生細胞免疫蛍光手法による様々な腫瘍細胞の生存細胞の表面のモノクローナル抗体ヘツモマブ（Ｈｅｔｕｍｏｍａｂ）標的抗原の発現の検出（いくつかの典型的な陽性の結果）を示す図である。
【図２】ヒトの肝がん、肺がん、及び胃がんの組織におけるヘツモマブ標的抗原の特異的な高発現の免疫組織化学的検出（いくつかの典型的な陽性の結果）を示す図である。
【図３】様々なヒト腫瘍細胞株のスフェア培養細胞においてヘツモマブによって認識されるがん細胞の実質的な濃縮の免疫学的フロー蛍光検出（いくつかの典型的なフロー蛍光アトラス）を示す図である。
【図４】ヘツモマブによって認識される様々なヒト腫瘍細胞（例えば肝がん、肺がん、及び胃がんなど）におけるヘツモマブ＋細胞の薬剤耐性のＣＣＫ８検出（ＩＣ５０）を示す図である。
【図５】ヘツモマブが様々な腫瘍（例えば肝がん、肺がん、及び胃がんなど）において腫瘍幹細胞の自己再生能（スフェア形成）を有意に阻害することを示す図である。
【図６】ヘツモマブが様々な腫瘍（例えば肝がん、肺がん、及び胃がんなど）において腫瘍幹細胞の浸潤能を有意に阻害することを示す図である。
【図７】ヘツモマブが多発性腫瘍由来の腫瘍幹細胞の浸潤能を有意に阻害することを示す図である。
【図８】ヘツモマブと、ヘツモマブ及び化学療法薬の組合せとを用いて治療されたヒト肝がん移植腫瘍Ｂｅｌ７４０２−Ｖ１３のｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍増殖曲線を示す図である。
【図９】ヘツモマブと、ヘツモマブ及び化学療法薬の組合せとを用いて治療されたヒト肝がん移植腫瘍Ｂｅｌ７４０２−Ｖ１３のｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍体積阻害率（薬剤中止時）を示す図である。
【図１０】ヘツモマブと、ヘツモマブ及び化学療法薬の組合せとを用いて治療されたヒト肝がん移植腫瘍Ｂｅｌ７４０２−Ｖ１３のｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍体積阻害率（薬剤中止の１か月後）を示す図である。
【図１１】ヘツモマブと、ヘツモマブ及び化学療法薬の組合せとを用いて治療されたヒト肝がん移植腫瘍Ｂｅｌ７４０２−Ｖ１３を有するマウスの生存曲線を示す図である。
【図１２】ヘツモマブを用いて治療されたヒト肺がん移植腫瘍ＳＰＣＡ−１のｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍増殖曲線を示す図である。
【図１３】ヘツモマブと、ヘツモマブ及び化学療法薬の組合せとを用いて治療されたヒト胃がん移植腫瘍ＳＮＵ−５のｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍増殖曲線を示す図である。
【図１４】キメラ抗体ヘツキシマブ（Ｈｅｔｕｘｉｍａｂ）が親抗体ヘツモマブと同じ腫瘍幹細胞上の抗原性タンパク質に結合することを示す図である。
【図１５】キメラ抗体ヘツキシマブが抗原への結合について親抗体ヘツモマブと競合することを示す図である。
【図１６】ヘツモマブを略称Ｅ２１に対応させて、ヘツモマブのヒト化重鎖の各バージョンのアミノ酸配列の（部分的な）アラインメントを示す図である。
【図１７】ヘツモマブを略称Ｅ２１に対応させて、ヘツモマブのヒト化軽鎖の各バージョンのアミノ酸配列の（部分的な）アラインメントを示す図である。
【図１８】電気泳動分析によって明らかになった、Ｈ１重鎖シリーズに存在するグリコシル化の不均一性を示す図である。
【図１９】ＡはＨ５のグリコシル化異性が消失することを示す図であり、Ｂは電気泳動分析により、Ｈ５をＬ１１、Ｌ６に組み合わせた際にグリコシル化異性の組合せが消失することを示す図である。
【図２０】ＡはＣＨＯ細胞から発現及び精製によって得られた、９５％超の純度を有するヒト化抗体Ｈ５Ｌ１１を示す図である。還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動分析は、精製抗体の純度が９５％超であることを示す。ＢはＣＨＯ細胞から発現及び精製によって得られた、９５％超の純度を有するヒト化抗体Ｈ５Ｌ１１を示す図である。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動分析は、精製抗体の純度が９５％超であることを示す。ＣはＣＨＯ細胞から発現及び精製によって得られた、９５％超の純度を有するヒト化抗体Ｈ５Ｌ１１を示す図である。ＨＰＬＣ分析は、精製抗体の純度が９５％超であることを示す。
【図２１】Ａはマウスモノクローナル親抗体ヘツモマブ、キメラ抗体ヘツキシマブ、及びヒト化モノクローナル抗体ヘツズマブ（Ｈｅｔｕｚｕｍａｂ）が、抗原との結合について競合することを示す図である。各種濃度のマウスモノクローナル親抗体ヘツモマブは、ヘツズマブの３つのバリアント（Ｈ５Ｌ６、Ｈ５Ｌ１１、Ｈ５Ｌ１２）及びキメラ抗体ヘツキシマブの抗原との結合について競合的に阻害する。Ｂはマウスモノクローナル親抗体ヘツモマブ、キメラ抗体ヘツキシマブ、及びヒト化モノクローナル抗体ヘツズマブが、抗原との結合について競合することを示す図である。各種濃度のヘツズマブの３つのバリアント（Ｈ５Ｌ６、Ｈ５Ｌ１１、Ｈ５Ｌ１２）、及びキメラ抗体ヘツキシマブは、マウスモノクローナル親抗体ヘツモマブの抗原との結合について競合的に阻害する。
【図２２】モノクローナル抗体ヘツズマブＨ５Ｌ１１と、ヘツズマブＨ５Ｌ１１及び化学療法薬の組合せとを用いて治療された、ヒト肝がん移植腫瘍を有するマウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍増殖曲線を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
Ｉ．定義
別に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明（複数可）が属する分野の当業者によって通常理解されているのと同じ意味を有する。加えて、タンパク質及び核酸化学、分子生物学、細胞及び組織培養、微生物学並びに免疫学に関する用語及び実験手技は、本分野において広く使用されている用語及び通常の手技である。一方で、本発明のより良い理解のために、関連用語の定義及び説明を以下に示す。
【００４３】
本明細書で使用されるとき、「抗体」とは、天然であるか、部分的又は全体的に合成生成、例として、組換え生成されたかにかかわらず、免疫グロブリン及び免疫グロブリン断片を指し、全長免疫グロブリンの結合特異性能を保持する免疫グロブリン分子の可変領域の少なくとも一部を含有するその任意の断片を含む。それゆえ、抗体とは、免疫グロブリン抗原結合性ドメイン（抗体結合部位）に相同又は実質的に相同な結合ドメインを有する任意のタンパク質を含む。抗体は、抗体断片、例として、腫瘍幹細胞に対する抗体断片を含む。したがって、本明細書で使用されるとき、抗体という用語は、合成抗体、組換え生成抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ヒト抗体、非ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、イントラボディ及び、例として、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、Ｆｄ断片、Ｆｄ’断片、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）、ディアボディ、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体又は上記のいずれかの抗原結合性断片を含むが、これらに限定されない抗体断片を含む。本明細書で示される抗体は、任意の免疫グロブリン型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラス（例えば、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂ）のメンバーを含む。
【００４４】
本明細書で使用されるとき、抗体の「抗体断片」又は「抗原結合性断片」とは、全長より短いが、抗原に結合する抗体の可変領域の少なくとも一部（例えば、１つ若しくは複数のＣＤＲ及び／又は１つ若しくは複数の抗体結合部位）を含有し、したがって全長抗体の結合特異性、及び特異的結合能の少なくとも一部を保持する、全長抗体の任意の一部を指す。それゆえ、抗原結合性断片とは、抗体断片が由来する抗体と同じ抗原に結合する抗原結合部分を含有する抗体断片を指す。抗体断片は、全長抗体の酵素処理によって生成した抗体誘導体、及び合成生成、例えば組換え生成された誘導体を含む。抗体断片は、抗体に含まれる。抗体断片の例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ディアボディ、Ｆｄ及びＦｄ’断片並びに修飾断片を含む他の断片が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２０７巻：Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（２００３）；１章；３〜２５ページ、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖを参照のこと）。断片は、例として、ジスルフィド架橋及び／又はペプチドリンカーによって、共に連結された多数の鎖を含み得る。抗体断片は一般的に、少なくとも５０個又は約５０個のアミノ酸、典型的に、少なくとも２００個又は約２００個のアミノ酸を含有する。抗原結合性断片は、（例として、対応する領域を置換することによって）抗体フレームワークに挿入された場合、抗原に免疫特異的に結合する（すなわち、少なくとも１０７〜１０８Ｍ−１又は少なくとも約１０７〜１０８Ｍ−１のＫａを示す）抗体をもたらす任意の抗体断片を含む。
【００４５】
本明細書で使用されるとき、「モノクローナル抗体」とは、同一の抗体の集団を指し、モノクローナル抗体の集団中の各個々の抗体分子がその他と同一であることを意味する。この特性は、複数の様々な配列を有する抗体を含有する、抗体のポリクローナル集団の特性とは対照的である。モノクローナル抗体は、いくつかの周知の方法（Ｓｍｉｔｈら（２００４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．５７、９１２〜９１７ページ；及びＮｅｌｓｏｎら、Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ（２０００）、５３、１１１〜１１７ページ）によって生成され得る。例えば、モノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ細胞株を産生するための骨髄腫細胞との融合を通したＢ細胞の不死化によって、又はＢ細胞のウイルス、例として、ＥＢＶ感染によって生成され得る。また、組換え技術を使用して、宿主細胞を、抗体をコードする人工ヌクレオチド配列を有するプラスミドで形質転換することによって、宿主細胞のクローン集団からｉｎ  ｖｉｔｒｏで抗体を生成することができる。
【００４６】
本明細書で使用されるとき、「ハイブリドーマ」又は「ハイブリドーマ細胞」という用語は、抗体生成リンパ球と非抗体生成がん細胞との融合によって生成した、細胞又は細胞株（典型的に、骨髄腫又はリンパ腫細胞）を指す。当業者に知られている通り、ハイブリドーマは、分裂増殖し、特異的モノクローナル抗体を生成し続けることができる。ハイブリドーマを生成するための方法は、本分野で公知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ、１９８８を参照のこと）。「ハイブリドーマ」又は「ハイブリドーマ細胞」という用語について言及する場合、この用語は、ハイブリドーマのサブクローニングされた細胞及び子孫細胞も含む。
【００４７】
本明細書で使用されるとき、「従来型抗体」とは、（Ｈ及びＨ’と呼ばれ得る）２つの重鎖及び（Ｌ及びＬ’と呼ばれ得る）２つの軽鎖並びに２つの抗体結合部位を含有し、各重鎖が、全長免疫グロブリン重鎖又は抗原結合性能を保持するその任意の機能領域であることがあり（例えば、重鎖は、ＶＨ鎖、ＶＨ−ＣＨ１鎖及びＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３鎖を含むが、これらに限定されない）、各軽鎖が、全長軽鎖又はその任意の機能領域であることがある（例えば、軽鎖は、ＶＬ鎖及びＶＬ−ＣＬ鎖を含むが、これらに限定されない）、抗体を指す。各重鎖（Ｈ及びＨ’）は、１つの軽鎖（それぞれ、Ｌ及びＬ’）と対を形成する。
【００４８】
本明細書で使用されるとき、全長抗体は、２つの全長重鎖（例えば、ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３又はＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ４）及び２つの全長軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）並びにヒンジ領域を有する抗体、例として、抗体分泌Ｂ細胞によって天然に生成されたヒト抗体、及び合成生成された同じドメインを有する抗体である。
【００４９】
本明細書で使用されるとき、ｄｓＦｖとは、ＶＨ−ＶＬ対を安定化する操作された分子間ジスルフィド結合を有するＦｖを指す。
【００５０】
本明細書で使用されるとき、Ｆａｂ断片は、パパインによる全長免疫グロブリンの消化から生ずる抗体断片、又は例えば、組換え法によって、合成生成された同じ構造を有する断片である。Ｆａｂ断片は、（ＶＬ及びＣＬを含有する）軽鎖、並びに重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）及び重鎖の１つの定常領域ドメイン（ＣＨ１）を含有する別の鎖を含有する。
【００５１】
本明細書で使用されるとき、Ｆ（ａｂ’）２断片は、ｐＨ４．０〜４．５におけるペプシンによる免疫グロブリンの消化から生ずる抗体断片、又は例えば、組換え法によって、合成生成された同じ構造を有する断片である。Ｆ（ａｂ’）２断片は本質的に、各重鎖部分が、２つの断片を接合するジスルフィド結合を形成するシステイン残基を含む追加の数個のアミノ酸を含有する、２つのＦａｂ断片を含有する。
【００５２】
本明細書で使用されるとき、Ｆａｂ’断片は、Ｆ（ａｂ’）２断片のうちの１つの半分（１つの重鎖及び１つの軽鎖）を含有する断片である。
【００５３】
本明細書で使用されるとき、ｓｃＦｖ断片とは、任意の順序でポリペプチドリンカーによって共有結合された可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）を含有する抗体断片を指す。リンカーは、２つの可変ドメインが、実質的な妨害なく架橋されるような長さのリンカーである。リンカーの例は、可溶性を増大させるためにいくつかのＧｌｕ又はＬｙｓ残基が全体に分散されている（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎ残基である。
【００５４】
「キメラ抗体」という用語は、可変領域配列が１つの種に由来し、定常領域配列が別の種に由来する抗体、例として、可変領域配列がラット抗体に由来し、定常領域配列がヒト抗体に由来する抗体を指すと意図される。
【００５５】
「ヒト化」抗体とは、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はその断片（例として、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又は抗体の他の抗原結合性サブ配列）である非ヒト（例えば、ラット）抗体の形態を指す。ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）からの残基が、所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種、例として、マウス、ラット又はウサギのＣＤＲ（ドナー抗体）からの残基によって置換されている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であることが好ましい。
【００５６】
さらに、ヒト化中に、ＶＨ及び／又はＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３領域内のアミノ酸残基を変異誘発し、それによって、抗体の１つ又は複数の結合特性（例えば、親和性）を改善することも可能である。変異、例として、変異の抗体結合又は他の機能特性に対する効果が、本明細書で説明するｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ試験を使用して査定され得るＰＣＲ媒介変異を行ってもよい。保存的変異が導入されることが典型的である。そのような変異は、アミノ酸置換、付加又は欠失であり得る。加えて、ＣＤＲ内の変異数は１つ又は２つを超えないことが典型的である。したがって、また、本発明のヒト化抗体は、ＣＤＲ内の１つ又は２つのアミノ酸変異を含む抗体を包含する。
【００５７】
本明細書で使用されるとき、「エピトープ」という用語は、抗体のパラトープが結合する抗原上の任意の抗原決定基を指す。エピトープ決定基は、分子、例として、アミノ酸又は糖側鎖の化学活性表面群を含有することが典型的であり、特異的３次元構造特徴及び特異的電荷特徴を有することが典型的である。
【００５８】
本明細書で使用されるとき、可変ドメイン又は可変領域は、異なる抗体間で変動するアミノ酸配列を含有する抗体重鎖又は軽鎖の特異的Ｉｇドメインである。各軽鎖及び各重鎖は、それぞれ、１つの可変領域ドメイン、ＶＬ及びＶＨを有する。可変ドメインは、抗原特異性を与え、したがって、抗原認識の要因である。各可変領域は、抗原結合性部位ドメインの部分であるＣＤＲ及びフレームワーク領域（ＦＲ：ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ）を含有する。
【００５９】
本明細書で使用されるとき、「抗原結合性ドメイン」、「抗原結合性部位（ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ）」、「抗原結合部位（ａｎｔｉｇｅｎ  ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｓｉｔｅ）」及び「抗体結合部位」は、同族の抗原を認識し、同族の抗原と物理的に相互作用する抗体内のドメインについて言及するために同義的に使用される。ネイティブの従来型全長抗体分子は、２つの従来型抗原結合性部位を有し、各々は、重鎖可変領域の部分及び軽鎖可変領域の部分を含有する。従来型抗原結合性部位は、可変領域ドメイン内の逆平行ベータ鎖を接続するループを含有する。抗原結合部位は、可変領域ドメインの他の部分を含有し得る。各従来型抗原結合性部位は、重鎖からの３つの超可変領域、及び軽鎖からの３つの超可変領域を含有する。超可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれる。
【００６０】
本明細書で使用されるとき、「超可変領域」、「ＨＶ」、「相補性決定領域」並びに「ＣＤＲ」及び「抗体ＣＤＲ」は、抗体の抗原結合性部位を共に形成する、各可変領域内の複数の部分のうちの１つについて言及するために互換的に使用される。各可変領域ドメインは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３という３つのＣＤＲを含有する。３つのＣＤＲは、直鎖アミノ酸配列に沿って非連続であるが、折り畳まれたポリペプチドにおいて近接している。ＣＤＲは、可変ドメインのベータシートの平行鎖を接続するループ内に位置する。本明細書で説明する通り、当業者は、Ｋａｂａｔ又はＣｈｏｔｈｉａ番号付けに基づいてＣＤＲが分かり、ＣＤＲを特定することができる（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、米国保健福祉省、ＮＩＨ出版物番号９１〜３２４２、及びＣｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ら（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７ページを参照のこと）。
【００６１】
本明細書で使用されるとき、フレームワーク領域（ＦＲ）は、ベータシート内に位置する抗体可変領域ドメイン内のドメインであり；ＦＲ領域は、それらのアミノ酸配列の点で超可変領域より比較的保存されている。
【００６２】
本明細書で使用されるとき、「定常領域」ドメインは、可変領域ドメインのアミノ酸配列より比較的保存されているアミノ酸配列を含有する、抗体重鎖又は軽鎖のドメインである。従来型全長抗体分子において、各軽鎖は、単一の軽鎖定常領域（ＣＬ）ドメインを有し、各重鎖は、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４を含む１つ又は複数の重鎖定常領域（ＣＨ）ドメインを含有する。全長ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＧアイソタイプは、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びヒンジ領域を含有し、一方、ＩｇＥ及びＩｇＭは、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４を含有する。ＣＨ１及びＣＬドメインは、抗体分子のＦａｂアームを延長し、したがって、抗原との相互作用及び抗体アームの回転に寄与する。抗体定常領域は、例えば、様々な細胞、生体分子及び組織との相互作用を通して、エフェクター機能、例として、非限定的に、抗体が特異的に結合する抗原、病原体及び毒素のクリアランスを与え得る。
【００６３】
本明細書で使用されるとき、抗体の機能領域は、抗体の少なくともＶＨ、ＶＬ、ＣＨ（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２又はＣＨ３）、ＣＬ又はヒンジ領域ドメインを含有する抗体の一部、又は少なくともその機能領域である。
【００６４】
本明細書で使用されるとき、ＶＨドメインの機能領域は、ＶＨドメインの機能領域が単独又は別の抗体ドメイン（例えば、ＶＬドメイン）若しくはその領域との組合せのいずれかで、抗原に結合するように、（例えば、全ＶＨドメインの１つ又は複数のＣＤＲを保持することによって）全ＶＨドメインの結合特異性の少なくとも一部を保持する全ＶＨドメインの少なくとも一部である。ＶＨドメインの機能領域の例は、ＶＨドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３を含有する領域である。
【００６５】
本明細書で使用されるとき、ＶＬドメインの機能領域は、ＶＬドメインの機能領域が単独又は別の抗体ドメイン（例えば、ＶＨドメイン）若しくはその領域との組合せのいずれかで、抗原に結合するように、（例えば、全ＶＬドメインの１つ又は複数のＣＤＲを保持することによって）全ＶＬドメインの結合特異性の少なくとも一部を保持する全ＶＬドメインの少なくとも一部である。ＶＬドメインの機能領域の例は、ＶＬドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３を含有する領域である。
【００６６】
本明細書で使用されるとき、抗体又はその抗原結合性断片についての「特異的に結合する」又は「免疫特異的に結合する」は、本明細書で互換的に使用され、抗体又は抗原結合性断片の、抗体及び抗原の抗体結合部位（複数可）間の非共有結合相互作用による同族の抗原と１つ又は複数の非共有結合を形成する能力を指す。抗原は、単離された抗原であってもよく、腫瘍細胞に存在してもよい。抗原に免疫特異的に結合する（又は特異的に結合する）抗体は、約１×１０７Ｍ−１若しくは１×１０８Ｍ−１又はそれよりも高い親和定数Ｋａ（又は１×１０−７Ｍ若しくは１×１０−８Ｍ若しくはそれよりも低い解離定数（Ｋｄ））で抗原に結合する抗体であることが典型的である。親和定数は、抗体反応についての標準の速度論法、例えば、免疫測定法、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ：ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）（Ｒｉｃｈ及びＭｙｓｚｋａ（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １１：５４；Ｅｎｇｌｅｂｉｅｎｎｅ（１９９８）Ａｎａｌｙｓｔ．１２３：１５９９）、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ：ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ｔｉｔｒａｔｉｏｎ  ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ）又は本分野で公知の他の速度論相互作用アッセイ（例えば、Ｐａｕｌ編、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第２版、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、３３２〜３３６ページ（１９８９）を参照のこと；また、抗体の結合親和性を計算するためのＳＰＲ及びＩＴＣ法の例の説明については、米国特許第７，２２９，６１９号を参照のこと）によって決定することができる。結合速度の実時間検出及びモニタリングのための器具使用及び方法は公知であり、市販されている（例えば、ＢｉａＣｏｒｅ  ２０００、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ及びＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｍａｌｍｑｖｉｓｔ（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２７：３３５）。
【００６７】
「競合する（ｃｏｍｐｅｔｅ）」又は「競合する（ｃｏｍｐｅｔｅｓ）」という用語は、抗体について本明細書で使用されるとき、第１の抗体のその同族のエピトープとの結合の結果が、第２の抗体の非存在下での第１の抗体の結合と比較して第２の抗体の存在下で検出可能に減少されるほど十分に、第１の抗体又はその抗原結合性断片が、第２の抗体又はその抗原結合性断片の結合と同様の様式でエピトープに結合することを意味する。或いは、また、第２の抗体のそのエピトープへの結合が第１の抗体の存在下で検出可能に減少される場合は、競合する場合であり得るが、必ずしもそうではない。すなわち、第２の抗体が、第１の抗体のその各々のエピトープへの結合を阻害することなく、第１の抗体は、その第２の抗体のそのエピトープへの結合を阻害し得る。しかしながら、各抗体が、他の抗体のその同族のエピトープ又はリガンドとの結合を、同じ程度でも、より大きな程度でも、より小さい程度でも検出可能に阻害する場合、抗体は、それらの各々のエピトープ（複数可）の結合について互いに「交差競合する」と言われる。競合及び交差競合する抗体の両方は、本発明に包含される。そのような競合又は交差競合が起こる機構（例えば、立体障害、コンフォメーション変化又は通常のエピトープ若しくはその断片への結合）にかかわらず、当業者は、本明細書で示される教示に基づいて、そのような競合及び／又は交差競合抗体が包含され、本明細書で開示される方法のために有用であり得ることを理解し得る。
【００６８】
本明細書で使用されるとき、「ポリペプチド」とは、共有結合した２つ以上のアミノ酸を指す。「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本明細書で互換的に使用される。
【００６９】
「単離されたタンパク質」、「単離されたポリペプチド」又は「単離された抗体」は、誘導のその起源又は供給源のために、（１）そのネイティブ状態においてそれに付随する天然関連成分を伴わないか、（２）同じ種からの他のタンパク質を含有しないか、（３）異なる種からの細胞によって発現されるか、又は（４）天然に存在しない、タンパク質、ポリペプチド又は抗体である。したがって、化学合成されたか、又はポリペプチドが天然に起源をもつ細胞とは異なる細胞系において合成されたポリペプチドは、その天然関連成分から「単離され」る。また、タンパク質は、本分野で周知のタンパク質精製技術を使用する単離によって、天然関連成分を実質的に含まないようにしてもよい。
【００７０】
ペプチド又はタンパク質においては、好適なアミノ酸の保存的置換は、当業者に公知であり、一般的に、得られる分子の生物活性を変更することなく行われ得る。当業者は、一般的に、ポリペプチドの非必須領域における単一アミノ酸置換は、生物活性を実質的に変更しないことを認識する（例えば、Ｗａｔｓｏｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ、第４版、１９８７、Ｔｈｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂ．ｃｏ．、２２４ページを参照のこと）。
【００７１】
本明細書で使用されるとき、「ポリヌクレオチド」及び「核酸分子」という用語は、典型的にホスホジエステル結合によって、共に接合された、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）を含む、少なくとも２つの連結したヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体を含有するオリゴマー又はポリマーを指す。
【００７２】
本明細書で使用されるとき、単離された核酸分子は、核酸分子の天然供給源において存在する他の核酸分子から分離された核酸分子である。「単離された」核酸分子、例として、ｃＤＮＡ分子は、他の細胞物質、又は組換え技術によって生成された場合培養培地を実質的に含まないか、又は化学合成された場合化学前駆体又は他の化学物質を実質的に含まないことがある。本明細書で示される単離された核酸分子の例として、示される抗体又は抗原結合性断片をコードする単離された核酸分子が挙げられる。
【００７３】
配列「同一性」は、技術分野で認識されている意味を有し、２つの核酸又はポリペプチド分子又は領域間の配列同一性の割合は、公開されている技術を使用して計算することができる。配列同一性は、ポリヌクレオチド又はポリペプチドの全長に沿って、又は分子の領域に沿って測定され得る。（例えば：Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ、第Ｉ部、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．及びＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８７；及びＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，  Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１を参照のこと）。２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド間の同一性を測定するためのいくつかの方法が存在するが、「同一性」という用語は、当業者に周知である（Ｃａｒｒｉｌｌｏ，Ｈ．＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．、ＳＩＡＭ  Ｊ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ  ４８：１０７３（１９８８））。
【００７４】
本明細書で使用されるとき、核酸配列、領域、エレメント又はドメインについての「作動可能に連結されている」は、核酸領域が互いに機能的に関連していることを意味する。例えば、プロモーターは、ポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されることがあり、それによって、プロモーターは、核酸の転写を調節又は媒介する。
【００７５】
本明細書で使用されるとき、「発現」とは、ポリペプチドがポリヌクレオチドの転写及び翻訳によって生成されるプロセスを指す。ポリペプチドの発現レベルは、例えば、宿主細胞から生成されたポリペプチドの量を決定する方法を含む、本分野で公知の任意の方法を使用して査定され得る。そのような方法として、ＥＬＩＳＡによる細胞溶解物中のポリペプチドの定量、ゲル電気泳動法後のクーマシーブルー染色、ローリータンパク質アッセイ及びブラッドフォードタンパク質アッセイを挙げることができるが、これらに限定されない。
【００７６】
本明細書で使用されるとき、「宿主細胞」は、ベクターを受容、維持、再生及び増幅するために使用される細胞である。また、宿主細胞は、ベクターによってコードされるポリペプチドを発現するために使用することができる。ベクターに含有される核酸は、宿主細胞が分裂するときに複製され、それによって、核酸を増幅する。宿主細胞は、真核細胞であっても、原核細胞であってもよい。好適な宿主細胞として、ＣＨＯ細胞、様々なＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ細胞、例として、ＨＥＫ２９３細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７７】
コドン最適化とは、目的の宿主細胞における発現を向上させるためにネイティブアミノ酸配列を維持しながら核酸配列を改変する、ネイティブ配列の少なくとも１つのコドン（例えば、約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０個若しくはそれよりも多い、又は約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０個よりも多いか、若しくはそれよりも多いコドン）の、宿主細胞の遺伝子においてより頻繁に、又は最も頻繁に使用されるコドンによる置換を指す。異なる種は、特定のアミノ酸のある特定のコドンについて特異的な優先を示す。コドン優先（生物間のコドン利用の差）は多くの場合、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率と関連付けられており、翻訳されるコドンの性質及び特異的なトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられている。細胞内で選択されるｔＲＮＡの利点は一般的に、ペプチド合成に最も頻繁に使用されるコドンを反映する。それゆえ、遺伝子は、コドン最適化に基づいて所与の生物において最も良く遺伝子発現するようにカスタマイズすることができる。コドン利用表は、例えば、ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒｊｐ／ｃｏｄｏｎ／で利用可能なコドン利用データベースにおいて容易に得ることができ、これらの表は、様々な方法で調整することができる。Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｙ．ら「Ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ  ｔａｂｕｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａｂａｓｅｓ：ｓｔａｔｕｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｙｅａｒ２０００  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２８：２９２（２０００）を参照されたい。
【００７８】
本明細書で使用されるとき、「ベクター」とは、ベクターを適切な宿主細胞に形質転換した場合に、１つ又は複数の異種のタンパク質が発現され得る複製可能な核酸である。ベクターについての言及は、ポリペプチド又はその断片をコードする核酸が、典型的に制限消化及びライゲーションによって、導入され得るベクターを含む。また、ベクターについての言及は、ポリペプチドをコードする核酸を含有するベクターを含む。ベクターは、核酸の増幅のために、又は核酸によってコードされるポリペプチドの発現／提示のために、ポリペプチドをコードする核酸を宿主細胞に導入するために使用される。ベクターはエピソームのままであることが典型的であるが、遺伝子又はその部分の、ゲノム染色体への統合を引き起こすように設計してもよい。また、人工染色体、例として、酵母人工染色体及び哺乳動物人工染色体であるベクターが企図される。そのような媒体の選択及び使用は、当業者に周知である。
【００７９】
本明細書で使用されるとき、また、ベクターとは、「ウイルスベクター（ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ）」又は「ウイルスベクター（ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ）」を含む。ウイルスベクターは、外因性遺伝子を細胞に（媒体又はシャトルとして）移行するように外因性遺伝子に作動可能に連結された、操作されたウイルスである。
【００８０】
本明細書で使用されるとき、「発現ベクター」とは、ＤＮＡ断片の発現を引き起こすことができる調節配列、例として、プロモーター領域と作動可能に連結された、ＤＮＡを発現することができるベクターを含む。そのような追加のセグメントは、プロモーター及びターミネーター配列を含むことがあり、任意選択で、１つ又は複数の複製起点、１つ又は複数の選択可能マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル等を含み得る。発現ベクターは一般的に、プラスミド又はウイルスＤＮＡに由来するか、又は両方のエレメントを含有し得る。したがって、発現ベクターとは、組換えＤＮＡ又はＲＮＡ構築物、例として、プラスミド、ファージ、組換えウイルス、又は適切な宿主細胞への導入に際してクローニングされたＤＮＡの発現をもたらす他のベクターを指す。適切な発現ベクターは、当業者に周知であり、真核細胞及び／又は原核細胞において複製可能な発現ベクター、及びエピソームのままである発現ベクター又は宿主細胞ゲノムに統合する発現ベクターを含む。
【００８１】
本明細書で使用されるとき、疾患又は状態を有する対象を「治療すること」は、治療後に対象の症状が、部分的又は全体的に緩和されるか、又は静止したままであることを意味する。それゆえ、治療は、予防、療法及び／又は治癒を包含する。予防とは、潜在的な疾患の予防及び／又は疾患の症状若しくは進行の悪化の予防を指す。また、治療は、本明細書で示される任意の抗体若しくはその抗原結合性断片又は示される組成物の任意の薬学的使用を包含する。
【００８２】
本明細書で使用されるとき、「治療効果」とは、疾患又は状態の症状を変更、典型的には改善又は寛解させるか、又は疾患又は状態を治癒させる、対象の治療から得られる効果を意味する。
【００８３】
本明細書で使用されるとき、「治療有効量」又は「治療有効用量」とは、対象への投与後に治療効果を生成するのに少なくとも十分な、剤、化合物、物質又は化合物を含有する組成物の量を指す。それゆえ、「治療有効量」又は「治療有効用量」は、疾患又は障害の症状を予防、治癒、寛解、阻止又は部分的に阻止するために必要な量である。
【００８４】
本明細書で使用されるとき、「予防有効量」又は「予防有効用量」とは、対象に投与された場合、意図される予防効果、例えば、疾患又は症状の開始又は再発を予防又は遅延すること、疾患又は症状の開始又は再発の可能性を低減させること、又はウイルス感染の発生を低減させることを有する、剤、化合物、物質又は化合物を含有する組成物の量を指す。完全な予防効果は、１つの用量の投与によって必ずしも起こらず、一連の用量の投与後にのみ起こることがある。したがって、予防有効量は、１回又は複数の投与で投与され得る。
【００８５】
本明細書で使用されるとき、「患者」という用語は、哺乳動物、例として、ヒトを指す。
【００８６】
「腫瘍幹細胞」とは、普通のがん細胞と比較して自己再生能、強い浸潤能、化学療法、薬物に耐性を有する能力及び強い腫瘍原性能を有する、腫瘍組織に存在する幹細胞性を有するがん細胞の小群を指す。
【００８７】
ＩＩ．腫瘍幹細胞に対するモノクローナル抗体
本発明においては、ヒト腫瘍多能性幹細胞株を、マウスを免疫化するための免疫原として使用し、モノクローナル抗体ヘツモマブを古典的ハイブリドーマ融合技術によって得た。ヘツモマブを生成するマウスハイブリドーマ細胞株ヘツモマブを、２０１６年３月１６日にＣＧＭＣＣにＣＧＭＣＣ番号１２２５１の受託番号で寄託した。（実施例１）
【００８８】
このようにして、本発明は、２０１６年３月１６日にＣＧＭＣＣにＣＧＭＣＣ番号１２２５１の受託番号で寄託されたマウスハイブリドーマによって生成されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を提供する。
【００８９】
本発明者らは、本発明のヘツモマブの標的抗原が、様々なヒト腫瘍細胞の生細胞の表面上で発現し、様々な腫瘍組織において（７９％〜９４％の陽性率で）特異的に高度に発現していることを発見した。本発明のヘツモマブモノクローナル抗体は、様々な腫瘍のスフェア培養細胞から腫瘍幹細胞マーカー、例として、ＥＳＡ及びＣＤ９０を有する腫瘍細胞を富化することができ、このことは、ヘツモマブが腫瘍幹細胞に特異的なモノクローナル抗体であることを示唆する（実施例２）。
【００９０】
ヘツモマブ標的抗原陽性腫瘍細胞に基づくさらなる研究は、ヘツモマブ標的抗原陽性腫瘍細胞が、親腫瘍細胞及びヘツモマブ標的抗原陰性腫瘍細胞と比較してより強い自己再生能、浸潤能、薬物抵抗性及びｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍形成能を有することを示し、このことは、ヘツモマブモノクローナル抗体が腫瘍幹細胞を特異的にターゲティングすることをさらに証明する（実施例３）。本発明者らは、ヘツモマブモノクローナル抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の配列並びに対応するＣＤＲ配列をさらに特定した（実施例６）。可変領域配列をそれぞれ、ヒト軽鎖及び重鎖定常領域と組み合わせることによって、ヒト−マウスキメラ抗体ヘツキシマブを構築した（実施例７）。実験は、キメラ抗体ヘツキシマブ及びマウス抗体ヘツモマブが、腫瘍幹細胞上の同じ抗原エピトープに結合し、腫瘍幹細胞を阻害する同様の薬力学的効果を有することを示した（実施例８〜９）。
【００９１】
本発明者らは、ヘツモマブモノクローナル抗体をさらにヒト化して、ヒト化抗体ヘツズマブの様々なバリアントを得た（実施例１０）。実験は、ヘツズマブのヒト化抗体及びマウス抗体ヘツモマブ並びにキメラ抗体ヘツキシマブは、腫瘍幹細胞上の同じ抗原エピトープに結合し、腫瘍幹細胞を阻害する同様の薬力学的効果を有することを示した（実施例１１〜１２）。
【００９２】
このようにして、本発明は、腫瘍幹細胞に対する単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片であって、モノクローナル抗体が、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、
軽鎖可変領域が：
配列番号２に示されるアミノ酸配列又は配列番号２と比較して１又は２個のアミノ酸残基の置換、欠失又は付加を有するアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、
配列番号３に示されるアミノ酸配列又は配列番号３と比較して１又は２個のアミノ酸残基の置換、欠失又は付加を有するアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、及び
配列番号４に示されるアミノ酸配列又は配列番号４と比較して１又は２個のアミノ酸残基の置換、欠失又は付加を有するアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３
を含み；
重鎖可変領域が：
配列番号６に示されるアミノ酸配列又は配列番号６と比較して１又は２個のアミノ酸残基の置換、欠失又は付加を有するアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、
配列番号７に示されるアミノ酸配列又は配列番号７と比較して１又は２個のアミノ酸残基の置換、欠失又は付加を有するアミノ酸配列、例として、配列番号１３に示される配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、及び
配列番号８に示されるアミノ酸配列又は配列番号８と比較して１又は２個のアミノ酸残基の置換、欠失又は付加を有するアミノ酸配列、例として、配列番号１４に示される配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３
を含む、単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を提供する。
【００９３】
一部の実施形態においては、モノクローナル抗体は、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、
軽鎖可変領域は：
配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、
配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、及び
配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３
を含み；
重鎖可変領域は：
配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、
配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、及び
配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３
を含む。
【００９４】
一部の実施形態においては、モノクローナル抗体は、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、
軽鎖可変領域は：
配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、
配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、及び
配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３
を含み；
重鎖可変領域は：
配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、
配列番号７に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、及び
配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３
を含む。
【００９５】
一部の実施形態においては、モノクローナル抗体は、ヒト化抗体である。
【００９６】
一部の実施形態においては、軽鎖可変領域は、配列番号１に示されるアミノ酸配列又は配列番号１と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態においては、軽鎖可変領域は、配列番号１と約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００９７】
一部の実施形態においては、重鎖可変領域は、配列番号５に示されるアミノ酸配列又は配列番号５と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態においては、重鎖可変領域は、配列番号５と約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００９８】
一部の実施形態においては、重鎖可変領域は、（ヒト化重鎖変形型Ｈ１〜Ｈ５の可変領域にそれぞれ対応する）配列番号１５〜１９のうちの１つに示されるアミノ酸配列を含む。
【００９９】
一部の実施形態においては、軽鎖可変領域は、（ヒト化軽鎖変形型Ｌ１〜Ｌ１２の可変領域にそれぞれ対応する）配列番号２０〜３１のうちの１つに示されるアミノ酸配列を含む。
【０１００】
一部の実施形態においては、重鎖可変領域は、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含む。
【０１０１】
一部の実施形態においては、重鎖可変領域は、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号３０に示されるアミノ酸配列を含む。
【０１０２】
一部の実施形態においては、モノクローナル抗体は、ヒト重鎖定常領域、例として、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むヒト重鎖定常領域を含む。
【０１０３】
一部の実施形態においては、モノクローナル抗体は、ヒト軽鎖定常領域、例として、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含むヒト軽鎖定常領域を含む。
【０１０４】
一部の実施形態においては、モノクローナル抗体は、（ヒト化重鎖変形型Ｈ１〜Ｈ５にそれぞれ対応する）配列番号３２〜３６のうちの１つに示されるアミノ酸配列を有する重鎖及び（ヒト化軽鎖変形型Ｌ１〜Ｌ１２にそれぞれ対応する）配列番号３７〜４８のうちの１つに示されるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。
【０１０５】
一部の実施形態においては、モノクローナル抗体は、配列番号３６に示される重鎖及び（ヒト化抗体Ｈ５Ｌ１１に対応する）配列番号４７に示される軽鎖を含む。
【０１０６】
一部の実施形態においては、モノクローナル抗体は、配列番号３６に示される重鎖及び（ヒト化抗体Ｈ５Ｌ６に対応する）配列番号４２に示される軽鎖を含む。
【０１０７】
可変領域がグリコシル化部位を有する場合、抗体分子の異なるグリコシル化形態（グリコシル化アイソマー）に対応して、電気泳動において重鎖又は軽鎖の２つの隣接するタンパク質バンドが現れることが本分野で公知である。抗体分子の異なるグリコシル化形態は、ヒトにおいて異なる薬物動態効果及び薬力学的効果を示し得る。それゆえ、異なるグリコシル化形態を有する抗体は、薬物認可当局による市販認可を得ることが困難である。過剰の可変領域グリコシル化部位の除去は、ヒト薬物の調製におけるモノクローナル抗体の使用を大いに促進する。したがって、一部の好ましい実施形態においては、本発明の単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、グリコシル化部位を含まないか、又は抗体のグリコシル化部位は、変異によって除去される。例えば、配列番号１９に示される重鎖可変領域におけるグリコシル化部位及び配列番号３６に示される重鎖におけるグリコシル化部位は、変異によって除去されており、したがって、配列番号１９に示される重鎖可変領域及び配列番号３６に示される重鎖は、本発明において好ましい。
【０１０８】
一部の実施形態においては、本発明の単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、ヘツモマブに由来する。一部の実施形態においては、本発明の単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、ヘツモマブと同じ腫瘍幹細胞上の抗原に結合する。一部の実施形態においては、本発明の単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、ヘツモマブと同じ腫瘍幹細胞上のエピトープに結合する。一部の実施形態においては、本発明の単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、腫瘍幹細胞への結合についてヘツモマブと競合する。
【０１０９】
一部の実施形態においては、本発明の単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、腫瘍幹細胞を特異的にターゲティングする。本発明の単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片によって特異的にターゲティングされる腫瘍幹細胞として、乳がん幹細胞、結腸直腸がん幹細胞、膵がん幹細胞、前立腺がん幹細胞、肝がん幹細胞、肺がん幹細胞及び胃がん幹細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１０】
本発明は、ヘツモマブと同じ腫瘍幹細胞上の抗原に結合する単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片をさらに包含する。本発明は、ヘツモマブと同じ腫瘍幹細胞上のエピトープに結合する単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片をさらに包含する。本発明は、腫瘍幹細胞への結合についてヘツモマブと競合する単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片をさらに包含する。腫瘍幹細胞として、乳がん幹細胞、結腸直腸がん幹細胞、膵がん幹細胞、前立腺がん幹細胞、肝がん幹細胞、肺がん幹細胞及び胃がん幹細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１１】
ＩＩＩ．抗体を生成するための核酸、ベクター及び方法
別の態様においては、本発明は、上記に説明する本発明の抗体又はその抗原結合性断片をコードする単離された核酸分子を提供する。一部の実施形態においては、核酸分子のヌクレオチド配列は、発現のために宿主細胞についてコドン最適化されている。一部の実施形態においては、本発明の核酸分子は、発現調節配列に作動可能に連結されている。
【０１１２】
本発明は、上記に説明する少なくとも１つの本発明の核酸分子を含む発現ベクターをさらに提供する。
【０１１３】
本発明は、上記に説明する少なくとも１つの本発明の核酸分子又は発現ベクターで形質転換された宿主細胞をさらに提供する。
【０１１４】
別の態様においては、本発明は、本発明の抗体又はその抗原結合性断片を生成するための方法であって：
（ｉ）本発明の宿主細胞を、核酸分子又は発現ベクターの発現に好適な条件で培養するステップと、
（ｉｉ）宿主細胞によって発現された抗体又はその抗原結合性断片を単離及び精製するステップと
を含む方法を提供する。
【０１１５】
また、本発明は、腫瘍幹細胞を特異的にターゲティングすることができる、上記に説明する本発明の方法によって得た、単離された抗体又はその抗原結合性断片に関する。
【０１１６】
ＩＶ．疾患治療及び／又は疾患予防
腫瘍幹細胞は、腫瘍組織に存在する幹細胞性を有するがん細胞の小群であり、以下の生物学的特徴：自己再生及び複製能、無指向性分化、高腫瘍形成能、高浸潤及び転移能、並びに放射線療法又は化学療法のいずれかに対する非感受性を有する。腫瘍幹細胞の存在のために、腫瘍は、増殖、転移及び再発を続ける。より重要なことに、腫瘍幹細胞は、近年市販されているほとんど全ての伝統的な化学療法薬、放射線療法及びターゲティング薬物（抗体ターゲティング薬物を含む）に対して抵抗性である。腫瘍幹細胞は、細胞周期のＧ０期にあり、増殖又は分裂増殖しない。放射線療法及び化学療法は、高分裂増殖中のがん細胞にのみ影響を及ぼすが、Ｇ０期の腫瘍幹細胞は殺滅することができない。さらに、多数の迅速に増殖するがん細胞が放射線療法及び化学療法によって殺滅された場合、放射線療法及び化学療法に抵抗性の腫瘍幹細胞は、選択及び富化され、その割合が大いに増大する。腫瘍幹細胞は、強い自己複製及び転移能を有するので、これらの腫瘍幹細胞は、迅速に分化及び分裂増殖し、増殖し、身体の様々な器官へ転移して新しい転移病変を形成し、この転移病変のがん細胞は、放射線療法及び化学療法に抵抗性である。腫瘍幹細胞は、様々な悪性腫瘍、例として、乳がん、結腸直腸がん、膵がん、前立腺がん、肝がん、肺がん及び胃がんに存在することが示されている。より高い悪性度を有するがんは、より多くの腫瘍幹細胞を有し得るが、一方で、より高い割合の腫瘍幹細胞を有する患者は、転移及び再発のより高いリスク、及びしたがって、より短い生存期間を有することがある。
【０１１７】
本発明者らは、腫瘍幹細胞を特異的に認識する本発明のモノクローナル抗体は、様々な腫瘍幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの自己再生能、浸潤能及び薬物抵抗性能を顕著に阻害し得ることを発見した（実施例４）。さらなる実験は、腫瘍幹細胞を特異的に認識する本発明のモノクローナル抗体は、動物モデルにおいて様々な腫瘍移植腫瘍の増殖、転移及び薬物抵抗性を阻害することができることを示した（実施例５）。それゆえ、本発明のモノクローナル抗体は、腫瘍幹細胞をターゲティングすることによって、悪性腫瘍を治療する、悪性腫瘍の転移又は再発を予防及び／又は治療するために使用され得る。
【０１１８】
このようにして、本発明は、患者において悪性腫瘍を治療する、悪性腫瘍の転移又は再発を予防及び／又は治療するための方法であって、有効量の腫瘍幹細胞に対する本発明の抗体又はその抗原結合性断片を患者に投与するステップを含む方法を提供する。本発明の方法によって治療及び／又は予防され得る悪性腫瘍として、乳がん、結腸直腸がん、膵がん、前立腺がん、肝がん、肺がん及び胃がんが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１９】
Ｖ．医薬組成物
本発明は、本発明の腫瘍幹細胞に対するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片及び薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物をさらに提供する。医薬組成物は、患者において悪性腫瘍を治療する、悪性腫瘍の転移又は再発を予防及び／又は治療するために使用される。
【０１２０】
本明細書で使用されるとき、「薬学的に許容できる担体」には、生理的に適合性の任意及び全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤等が含まれる。担体は、（例えば、注射又は点滴による）静脈内、筋内、皮下、非経口、脊髄又は上皮投与に好適であることが好ましい。投与経路によって、活性化合物、すなわち、抗体、又はコンジュゲートは、化合物を不活性化し得る酸及び他の天然条件の作用から化合物を保護する物質でコーティングされ得る。
【０１２１】
また、本発明の医薬組成物は、薬学的に許容できる抗酸化剤を含み得る。薬学的に許容できる抗酸化剤の例として：（１）水溶性抗酸化剤、例として、アスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等；（２）油溶性抗酸化剤、例として、パルミチン酸アスコルビル、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ：ｂｕｔｙｌａｔｅｄ  ｈｙｄｒｏｘｙａｎｉｓｏｌｅ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ：ｂｕｔｙｌａｔｅｄ  ｈｙｄｒｏｘｙｔｏｌｕｅｎｅ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ−トコフェロール等；及び（３）金属キレート剤、例として、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ：ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ  ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸等が挙げられる。
【０１２２】
また、これらの組成物は、補助剤、例として、保存剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤を含有し得る。
【０１２３】
微生物の存在の予防は、上記滅菌手技、並びに様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸等を含めることの両方によって確実にされ得る。また、等張剤、例として、糖、塩化ナトリウム等を組成物に含めることは、望ましいことがある。加えて、注射用医薬形態の吸収の延長は、吸収を遅延させる剤、例として、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含めることによってもたらされ得る。
【０１２４】
薬学的に許容できる担体として、滅菌水溶液又は分散液、及び滅菌注射用溶液又は分散液の即時の調製のための滅菌粉末が挙げられる。薬理活性物質のためのそのような媒体及び剤の使用は、本分野において公知である。任意の従来型媒体又は剤が活性化合物と非適合性でない限り、本発明の医薬組成物における任意の従来型媒体又は剤の使用が企図される。また、補助的な活性化合物が組成物に組み込まれ得る。
【０１２５】
治療組成物は、製造及び保存の条件下で無菌及び安定でなければならないことが典型的である。組成物は、溶液、マイクロエマルション、リポソーム、又は高薬物濃度に好適な他の規則的構造として製剤化され得る。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール等）及びその好適な混合物を含有する溶媒又は分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、コーティング、例として、レシチンの使用によって、分散液の場合必要な粒子サイズの維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。
【０１２６】
滅菌注射用溶液は、必要量の活性化合物を、必要に応じて上記に列挙する成分のうちの１つ又は組合せを含む適切な溶媒に組み込み、続いて滅菌精密濾過を行うことによって調製され得る。一般的に、分散液は、活性化合物を、基礎分散媒体及び上記に列挙する成分からの必要な他の成分を含有する滅菌媒体に組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分及び任意の追加の所望の成分の事前に滅菌濾過した溶液から、その粉末を産出する真空乾燥及び冷凍乾燥（凍結乾燥）である。
【０１２７】
単一の投与形態を生成するために担体物質と混合され得る活性成分の量は、治療される対象及び特定の投与様式によって変動する。単一の投与形態を生成するために担体物質と混合され得る活性成分の量は一般的に、治療効果を生成する組成物の量である。一般的に、この量は、薬学的に許容できる担体との組合せで、約０．０１％〜約９９％の活性成分に及び、約０．１％〜約７０％の活性成分に及ぶことは好ましく、約１％〜約３０％の活性成分に及ぶことは最も好ましい。
【０１２８】
投与量レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療応答）をもたらすように調節される。例えば、単一のボーラスを投与してもよく、いくつかに分けた用量を経時的に投与してもよく、治療状況の危急によって指示される通りに用量を比例して低減又は増大してもよい。投与の容易さ及び投与量の均一性のために、非経口組成物を投与単位形態に製剤化することはとりわけ有益である。本明細書で使用される投与単位形態とは、治療される対象のための単一の投与量として適合された物理的に別々の単位を指し；各単位は、必要な医薬担体を伴う、所望の治療効果を生成するように計算された所定量の活性化合物を含有する。本発明の投与単位形態の明細は、（ａ）活性化合物のユニークな特徴及び達成されるべき特定の治療効果、及び（ｂ）個体における感受性の治療についてのそのような活性化合物を化合する分野において固有の限定によって規定され、これに直接依存する。
【０１２９】
抗体分子の投与について、投与量は、対象の体重の約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、より通常には０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇに及ぶ。例えば、投与量は、０．３ｍｇ／体重ｋｇ、１ｍｇ／体重ｋｇ、３ｍｇ／体重ｋｇ、５ｍｇ／体重ｋｇ、１０ｍｇ／体重ｋｇ若しくは２０ｍｇ／体重ｋｇ、又は１〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲内であり得る。治療レジメンの例は、１週間に１回、２週毎に１回、３週毎に１回、４週毎に１回、１か月に１回、３か月毎に１回若しくは３〜６か月毎に１回、又は開始時の短い投与間隔（例として、１週間に１回から３週毎に１回）及びその後の延長された間隔（例として、１か月に１回から３〜６か月毎に１回）での投与を必要とする。
【０１３０】
或いは、腫瘍幹細胞に対する抗体は、維持放出製剤として投与してもよく、この場合、より少ない頻度の投与しか必要とされない。投与量及び頻度は、患者における抗体の半減期に依存して変動する。一般的に、ヒト抗体は最も長い半減期を示し、次にヒト化抗体、キメラ抗体及び非ヒト抗体である。投与の投与量及び頻度は、治療が予防であるか、治療であるかによって変動し得る。予防適用においては、比較的低投与量が、長期間にわたり比較的頻繁でない間隔で投与される。一部の患者は、残りの生涯、治療を受容し続ける。治療適用においては、比較的短い間隔での比較的高投与量が、疾患の進行が低減又は停止されるまで、必要とされる場合があり、患者が疾患の症状の部分的又は完全な寛解を示すまで、比較的高投与量が必要とされることが好ましい。その後、患者は、予防レジメンを投与され得る。
【０１３１】
本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、患者にとって毒性であることなく、特定の患者、組成物及び投与様式について所望の治療応答を達成するのに有効な活性成分の量を得るように変動し得る。選択された投与量レベルは、使用される本発明の特定の組成物又はそのエステル、塩若しくはアミドの活性、投与経路、投与時間、使用される特定の化合物の排出速度、処置期間、使用される特定の組成物との組合せで使用される他の薬物、化合物及び／又は物質、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、健康状態及び以前の病歴、並びに医療分野において周知の同様の因子を含む、様々な薬物動態因子に依存する。
【０１３２】
「治療有効量」の本発明の抗体又はその抗原結合性断片が、疾患症状の重症度の減少、疾患症状を有しない期間の頻度及び持続期間の増大、又は疾患苦のための機能障害若しくは能力障害の予防をもたらすことは好ましい。例えば、腫瘍の治療のために、「治療有効量」が、細胞増殖又は腫瘍増殖を、治療していない対象と比較して少なくとも約１０％、少なくとも約２０％阻害することは好ましく、少なくとも約４０％阻害することはより好ましく、少なくとも約６０％阻害することはさらにより好ましく、少なくとも約８０％阻害することはさらにより好ましい。腫瘍増殖を阻害する能力は、ヒト腫瘍における有効性を予測する動物モデル系において評価することができる。或いは、組成物のこの特性は、化合物の細胞増殖を阻害する能力を調査することによって評価することができ；そのような阻害は、熟練した実施者に公知のアッセイによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで決定することができる。治療有効量の治療化合物は、対象において腫瘍サイズを減少するか、又は別の方法で症状を寛解させることができる。当業者は、対象のサイズ、対象の症状の重症度、及び選択される特定の組成物又は投与経路等の因子に基づいて治療有効量を決定することができる。
【０１３３】
本発明の抗体若しくはその抗原結合性断片又は本発明の医薬組成物は、本分野で公知の様々な方法のうちの１つ又は複数を使用して１つ又は複数の投与経路を介して投与することができる。当業者によって理解される通り、投与経路及び／又は投与様式は、所望の結果によって変動する。本発明のＰＤＬ１結合分子についての好ましい投与経路として、例えば、注射又は点滴による、静脈内、筋内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄又は他の非経口投与経路が挙げられる。「非経口投与」という句は、本明細書で使用されるとき、通常、注射による、経腸投与及び局所投与以外の投与様式を意味し、静脈内、筋内、動脈内、クモ膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外及び胸骨内注射及び点滴が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３４】
或いは、本発明の腫瘍幹細胞に対する抗体若しくはその抗原結合性断片又は本発明の医薬組成物は、非経口経路、例として、局所、上皮又は粘膜投与経路を介して、例えば、鼻内に、経口で、膣に、直腸に、舌下に、又は局所に投与することができる。
【０１３５】
活性化合物は、迅速な放出に対して化合物を保護する担体を伴って調製してもよく、例として、インプラント、経皮パッチ及びマイクロカプセル化送達系を含む、制御放出製剤がある。生分解性、生体適合性ポリマー、例として、エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物類、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル類及びポリ乳酸を使用してもよい。そのような製剤の調製のための多くの方法は、特許取得されているか、又は当業者に一般的に公知である。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｊ．Ｒ．  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７８を参照されたい。
【０１３６】
治療組成物は、本分野で公知の医療デバイスにより投与され得る。例えば、好ましい実施形態においては、本発明の治療組成物は、無針皮下注射デバイス、例として、米国特許第５，３９９，１６３号、同第５，３８３，８５１号、同第５，３１２，３３５号、同第５，０６４，４１３号、同第４，９４１，８８０号、同第４，７９０，８２４号又は同第４，５９６，５５６号において開示されているデバイスにより投与され得る。本発明において有用な周知のインプラント及びモジュールの例として：制御された速度で薬剤を分配するための埋め込み式微小注入ポンプを開示している米国特許第４，４８７，６０３号；皮膚を通して医薬を投与するための治療デバイスを開示している米国特許第４，４８６，１９４号；正確な注入速度で薬剤を送達するための薬剤注入ポンプを開示している米国特許第４，４４７，２３３号；連続薬物送達のための変動流速埋め込み式注入装置を開示している米国特許第４，４４７，２２４号；多チャンバー区画を有する浸透圧薬物送達系を開示している米国特許第４，４３９，１９６号；及び浸透圧薬物送達系を開示している米国特許第４，４７５，１９６号が挙げられる。これらの特許は、参照により本明細書に組み込む。多くの他のそのようなインプラント、送達系及びモジュールは、当業者に公知である。
【０１３７】
ある特定の実施形態においては、腫瘍幹細胞に対する本発明の抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの適切な分布を確実にするように製剤化され得る。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は、多くの高親水性化合物を除外する。本発明の治療化合物が（所望の場合）ＢＢＢを通ることを確実にするために、本発明の治療化合物は、例えば、リポソームに製剤化され得る。リポソームを製造する方法については、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号、同第５，３７４，５４８号及び同第５，３９９，３３１号を参照されたい。リポソームは、特異的な細胞又は器官に選択的に輸送される１つ又は複数の部分を含み、したがって、ターゲティングされた薬物送達を向上し得る（例えば、Ｖ．Ｖ．  Ｒａｎａｄｅ（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：６８５を参照のこと）。ターゲティング部分の例として、葉酸塩又はビオチン（例えば、Ｌｏｗらの米国特許第５，４１６，０１６号を参照のこと）；マンノシド（Ｕｍｅｚａｗａら、（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５３：１０３８）：抗体（Ｐ．Ｇ．Ｂｌｏｅｍａｎら（１９９５）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３５７：１４０；Ｍ．Ｏｗａｉｓら（１９９５）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３９：１８０）；界面活性タンパク質Ａ受容体（Ｂｒｉｓｃｏｅら（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２３３：１３４）；ｐｌ２０（Ｓｃｈｒｅｉｅｒら（１９９４）Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９０９０）が挙げられ：また、Ｋ．Ｋｅｉｎａｎｅｎ；Ｍ．Ｌ．Ｌａｕｋｋａｎｅｎ（１９９４）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３４６：１２３；ＪＪ．Ｋｉｌｌｉｏｎ；ＬＪ．Ｆｉｄｌｅｒ（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２７３を参照されたい。
【０１３８】
また、医薬組成物中の腫瘍幹細胞に対する本発明の抗体又はその抗原結合性断片は、治療用部分、例として、細胞毒、放射性同位体又は生物活性タンパク質にコンジュゲートされ得る。
【０１３９】
細胞毒は、細胞にとって有害な（例えば、細胞を殺滅する）任意の剤を含む。例として、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラセンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール及びピューロマイシン並びにそれらのアナログ又はホモログが挙げられる。
【０１４０】
また、コンジュゲートされ得る治療剤として、例えば、代謝拮抗薬（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルダカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ並びにシス−ジアンミンジクロロプラチナ（ＤＤＰ：ｃｉｓ−ｄｉｃｈｌｏｒｏｄｉａｍｉｎｅ  ｐｌａｔｉｎｕｍ（ＩＩ））シスプラチン）、アントラサイクリン類（例えば、ダウノルビシン（以前のダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前のアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン及びアントラマイシン（ＡＭＣ：ａｎｔｈｒａｍｙｃｉｎ））及び有糸分裂阻害剤（例えば、ビンクリスチン及びビンブラスチン）が挙げられる。
【０１４１】
本発明の腫瘍幹細胞に対する抗体にコンジュゲートされ得る治療用細胞毒の他の好ましい例として、デュオカルマイシン、カリケアマイシン、マイタンシン及びオーリスタチン並びにそれらの誘導体が挙げられる。
【０１４２】
細胞毒は、本分野で使用可能なリンカー技術を使用して本発明の腫瘍幹細胞に対する抗体にコンジュゲートされ得る。細胞毒を本発明の腫瘍幹細胞に対する抗体にコンジュゲートするために使用されているリンカータイプの例として、ヒドラゾン、チオエーテル、エステル、ジスルフィド及びペプチド含有リンカーが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、リソソーム区画内の低ｐＨによって切断されやすいか、又はプロテアーゼ、例として、腫瘍組織において優先的に発現するプロテアーゼ、例として、カテプシン（例えば、カテプシンＢ、Ｃ、Ｄ）によって切断されやすいリンカーが選択され得る。
【０１４３】
細胞毒の種類、治療剤を抗体にコンジュゲートするためのリンカー及び方法のさらなる説明については、Ｓａｉｔｏ，Ｇ．ら（２００３）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５５：１９９〜２１５ページ；Ｔｒａｉｌ，ＰＡら（２００３）Ｃａｎｃｅｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５２：３２８〜３３７ページ；Ｐａｙｎｅ，Ｇ．（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ３：２０７〜２１２ページ；Ａｌｌｅｎ，Ｔ．Ｍ．（２００２）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ２：７５０〜７６３ページ；Ｐａｓｔａｎ，Ｉ．及びＫｒｅｉｔｍａｎ，Ｒ．Ｊ．（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ  ３：１０８９〜１０９１ページ；Ｓｅｎｔｅｒ，Ｐ．Ｄ．及びＳｐｒｉｎｇｅｒ，Ｃ．Ｊ．（２００１）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５３：２４７〜２６４ページを参照されたい。
【０１４４】
また、本発明の腫瘍幹細胞に対する抗体は、放射性同位体にコンジュゲートされて、放射性抗体コンジュゲートとしても公知の、細胞毒性放射性医薬品を生成し得る。診断又は治療的使用のために抗体にコンジュゲートされ得る放射性同位体の例として、ヨウ素１３１、インジウム１１１、イットリウム９０及びルテチウム１７７が挙げられるが、これらに限定されない。放射性抗体コンジュゲートを調製するための方法は、本分野において確立されている。
【０１４５】
また、本発明の腫瘍幹細胞に対する抗体は、所望の生物活性を有するタンパク質にコンジュゲートされて、所与の生物学的応答を変更し得る。そのようなタンパク質として、例えば、酵素活性毒素若しくはその活性断片、例として、アブリン、ヒマ毒Ａ、緑膿菌外毒素若しくはジフテリア毒素；タンパク質、例として、腫瘍壊死因子若しくはインターフェロン−γ；又は生物学的応答変更剤、例として、例えば、リンホカイン、インターロイキン−１（「ＩＬ（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ）−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）」）若しくは他の免疫因子、例として、ＩＦＮを挙げることができる。
【０１４６】
そのような治療用部分を抗体分子にコンジュゲートするための技術は、周知であり、例えば、Ａｒｎｏｎら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編）、２４３〜５６ページ（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（第２版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編）、６２３〜５３ページ（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ’  ８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編）、４７５〜５０６ページ（１９８５）；「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂａｌｄｗｉｎら（編）、３０３〜１６ページ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５）及びＴｈｏｒｐｅら、「Ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．、６２：１１９〜５８ページ（１９８２）を参照されたい。
【０１４７】
ＶＩ．組合せ療法
腫瘍幹細胞に対する本発明の抗体又は医薬組成物は、化学療法剤又は他の腫瘍抗原をターゲティングする抗体との組合せで投与され得る。本出願の実施例５は、化学療法剤との組合せの本発明のモノクローナル抗体が腫瘍治療において相乗効果を有することを示す。いかなる理論にも束縛されるものではないが、本発明の腫瘍幹細胞に対する抗体は、化学療法剤又は他の腫瘍抗原をターゲティングする抗体との組合せで投与された場合、腫瘍の薬物抵抗性を阻害することができ、それによって、相乗効果を可能にすると考えられる。
【０１４８】
本発明の抗体又は本発明の医薬組成物との組合せで使用され得る化学療法剤又は他の腫瘍抗原をターゲティングする抗体は、特に限定されない。そのような化学療法剤又は他の腫瘍抗原をターゲティングする抗体の例として、イホスファミド、シクロホスファミド、ダカルバジン、テモゾロミド、ニムスチン、ブスルファン、メルファラン、エノシタビン、カペシタビン、カルモフール、クラドリビン、ゲムシタビン、シタラビン、テガフール、テガフール−ウラシル、ＴＳ−１、ドキシフルリジン、ネララビン、ヒドロキシ尿素、フルオロウラシル、フルダラビン、ペメトレキセド、ペントスタチン、メルカプトプリン、メトトレキサート、イリノテカン、エトポシド、エリブリン、ソブゾキサン、ドセタキセル、パクリタキセル、ビノレルビン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビンブラスチン、アクチノマイシンＤ、アクラルビシン、アムルビシン、イダルビシン、エピルビシン、ジノスタチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ピラルビシン、ブレオマイシン、ペプロマイシン、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、オキサリプラチン、カルボプラチン、シスプラチン、ネダプラチン、アナストロゾール、エキセメスタン、エチニルエストラジオール、クロルマジノン、ゴセレリン、タモキシフェン、デキサメタゾン、ビカルタミド、トレミフェン、フルタミド、プレドニゾロン、ホスフェストロール、ミトタン、メチルテストステロン、リュープロレリン、レトロゾール、メチルメドロキシプロゲステロン、イブリツモマブ・チウキセタン、イマチニブ、エベロリムス、エルロチニブ、ゲフィチニブ、スニチニブ、セツキシマブ、ソラフェニブ、ダサチニブ、タミバロテン、トラスツズマブ、レチノイン酸、キイトルーダ、ベバシズマブ、ボルテゾミブ及びラパチニブが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態においては、化学療法剤は、プラチナ含有化学療法剤、例として、シスプラチンである。
【０１４９】
本発明の抗体及び化学療法剤又は他の腫瘍抗原をターゲティングする抗体は、１回の投与で投与してもよく、別々に投与してもよい。別々に（各々の異なる投与レジメンで）投与される場合、本発明の抗体及び化学療法剤又は他の腫瘍抗原をターゲティングする抗体は、間隔なしで連続して投与してもよく、所定の間隔で投与してもよい。
【０１５０】
本発明の医薬組成物中の、本発明の抗体及び化学療法剤又は他の腫瘍抗原をターゲティングする抗体の用量は、特に限定されない。上記に説明する通り、本発明の抗体の用量は、抗体が単独で使用される場合の用量を参照することによって決定することができる。化学療法剤及び他の腫瘍抗原をターゲティングする抗体は、各々の薬物によって指示される用量に従って使用してもよく、又は用量は、（本発明の抗体と組み合わせた効果を考慮して）低減してもよい。
【０１５１】
また、本発明の抗体又は本発明の医薬組成物は、放射線療法、例えば、本発明の抗体又は医薬組成物の投与前、投与中及び／又は投与後に電離放射線を患者に投与することと組み合わせてもよい。
【０１５２】
ＶＩＩ．腫瘍幹細胞の検出及び精製
本明細書で説明する通り、本発明のモノクローナル抗体は、腫瘍幹細胞を特異的に認識する。そのため、本発明は、生体試料において腫瘍幹細胞の存在を検出するための方法であって：
ａ）生体試料を本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片と接触させるステップと、
ｂ）本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片の、前記生体試料中の標的抗原への結合を検出するステップであって、検出される結合が、生体試料中の腫瘍幹細胞の存在を示す、検出するステップと
を含む方法をさらに提供する。
【０１５３】
一部の実施形態においては、腫瘍幹細胞は、乳がん幹細胞、結腸直腸がん幹細胞、膵がん幹細胞、前立腺がん幹細胞、肝がん幹細胞、肺がん幹細胞及び胃がん幹細胞からなる群から選択される。
【０１５４】
本発明の上記検出方法の一部の実施形態においては、本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、検出に使用される蛍光染料、化学物質、ポリペプチド、酵素、同位体、タグ等とさらにコンジュゲートされるか、又は他の試薬によって検出され得る。
【０１５５】
抗体−抗原結合を検出するための方法、例として、ＥＬＩＳＡ等は、本分野において公知である。
【０１５６】
本発明は、腫瘍幹細胞を単離するための方法であって：
（ａ）腫瘍幹細胞を含有する疑いのある細胞集団を用意するステップと、
（ｂ）本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片に結合する前記細胞のサブ集団を特定するステップと、
（ｃ）サブ集団を単離するステップと
を含む方法をさらに提供する。
【０１５７】
例えば、腫瘍幹細胞は、フローサイトメトリーによって単離され得る。
【０１５８】
ＶＩＩＩ．診断及び予後予測
本開示において言及する通り、本発明のモノクローナル抗体の標的抗原は、様々なヒト腫瘍生細胞の表面上で発現され、様々な腫瘍組織において特異的に高度に発現している（陽性率：７９％〜９４％）。
【０１５９】
そのため、本発明は、患者において悪性腫瘍の存在を検出するための方法であって：
ａ）前記患者から得た生体試料を本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片と接触させるステップと、
ｂ）本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片の、前記生体試料中の標的抗原への結合を検出するステップであって、検出される結合が、前記患者における悪性腫瘍の存在を示す、検出するステップと
を含む方法をさらに提供する。
【０１６０】
本発明は、患者における悪性腫瘍の再発又は進行の予後予測のための方法であって：
（ａ）患者から循環細胞を含む生体試料を単離するステップと、
（ｂ）循環細胞を含む前記生体試料を本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片と接触させるステップと、
（ｃ）本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片に結合する循環細胞の存在を特定するステップと
を含み、
それによって、患者における悪性腫瘍の再発又は進行の予後を予測する、方法をさらに提供する。
【０１６１】
一部の実施形態においては、悪性腫瘍の進行は、患者における悪性腫瘍の転移を含む。
【０１６２】
本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片に結合する特定された循環細胞の存在は、患者における悪性腫瘍の再発又は進行の高リスクを示唆する。
【０１６３】
一部の実施形態においては、生体試料は、血液試料、リンパ試料又はその成分を含む。
【０１６４】
一部の実施形態においては、悪性腫瘍は、乳がん、結腸直腸がん、膵がん、前立腺がん、肝がん、肺がん及び胃がんからなる群から選択される。
【０１６５】
本発明の上記方法の一部の実施形態においては、本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、検出に使用される蛍光染料、化学物質、ポリペプチド、酵素、同位体、タグ等とさらにコンジュゲートされるか、又は他の試薬によって検出され得る。
【０１６６】
抗体−抗原結合を検出するための方法、例として、ＥＬＩＳＡ等は、本分野において公知である。
【０１６７】
ＩＸ．キット
また、本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片及び使用のための教示を含む、本発明の方法における使用のためのキットは、本発明の範囲内に含まれる。キットは、本発明のモノクローナル抗体の存在を検出するための少なくとも１つの追加の検出試薬をさらに含み得る。キットは一般的に、キットの意図される使用及び／又は内容物の使用方法を示す標識を含む。標識という用語は、キット上に、又はキットと共に供給されるか、又は別の方法でキットに付随する任意の文書又は記録材料を含む。
【実施例】
【０１６８】
本明細書に定められた具体的な例を参照することによって、本願発明のさらに進んだ理解が得られることがあるが、それらの例は、本発明を説明することのみを意図されており、本発明の範囲を限定することを意図されていない。様々な改変及び変形が、本発明の趣旨を逸脱することなく本願発明に行われ得ることが明らかであり、それゆえそのような改変及び変形もまた、本願発明の趣旨内にある。
【０１６９】
実施例１  マウスモノクローナル抗体ヘツモマブの調製
１．ヒト腫瘍多能性幹細胞に対するマウスモノクローナル抗体ライブラリーの調製
この実施例は、ヒト腫瘍多能性幹細胞株Ｔ３Ａ−Ａ３を免疫原として利用する（Ｌｉｕ  Ｈら、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ．２０１３年、４：ｅ８５７）。このヒト腫瘍幹細胞株は、原発性肝がん患者から外科的に切除された肝がん組織から単離され、長期間にわたってｉｎ  ｖｉｔｒｏで継代培養することができるものである。この細胞株は１００回より多く継代されており、細胞は依然として速やかに成長しており、幹細胞の性質を保持している。この細胞株は、様々な幹細胞のマーカーを発現しており、幹細胞の自己再生の能力と、異なる腫瘍細胞に直接的に分化する潜在能とを有し、腫瘍の性質をも有し、腫瘍発生及び転移の能力を有する。この細胞株は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで長期間にわたって同じ性質を維持しながら培養されており、免疫不全マウスにおいて強力な腫瘍形成能及び転移性の能力を有する。
【０１７０】
拡大培養によって得られた肝がん幹細胞（ヒト腫瘍多能性幹細胞）株Ｔ３Ａ−Ａ３をパラホルムアルデヒドで固定し、正常なＢａｌｂ／ｃマウスを２〜４週間毎に１回、各回約１×１０７個の細胞で免疫した。免疫されたマウスのヒト肝がん幹細胞（ヒト腫瘍多能性幹細胞）株Ｔ３Ａ−Ａ３に対する、従来の細胞免疫化学により決定された血清価が、１：５００００超を達成するまで、長期間の免疫を実施した。マウス脾臓細胞とマウスミエローマ細胞ＳＰ２／０とを、従来のＰＥＧ媒介性融合により融合して、マウスモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを形成した。ハイブリドーマのモノクローンを従来のメチルセルロースプレート法により調製し、その成長後、各モノクローンを９６ウェルプレートに拾って培養することによって、ヒト肝がん幹細胞（ヒト腫瘍多能性幹細胞）株Ｔ３Ａ−Ａ３に対する大量のモノクローナル抗体を含有するハイブリドーマクローンライブラリーを得た。９６ウェルプレートの各ハイブリドーマクローンの培養上清を、次の判定及びスクリーニングの工程に使用するために採集した。
【０１７１】
２．ヒト腫瘍多能性幹細胞に対するマウスモノクローナル抗体ヘツモマブのスクリーニング
血清不含の懸濁培地は、２０ｎｇ／ｍＬ  ＥＧＦ、２０ｎｇ／ｍＬ  ｂＦＧＦ、比１：５０で添加されたＢ２７、１０ｎｇ／ｍＬ  ＬＩＦ、２ｍｍｏｌ／ｍＬグルタミン、１μ／ｍＬヘパリンを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）培養培地とした。細胞を１回洗浄した後、血清不含培地で培養した。血清不含の懸濁培地で培養したヒト肝がん幹細胞（ヒト腫瘍多能性幹細胞）株Ｔ３Ａ−Ａ３のスフェア細胞を、穏やかに吐出して単細胞とし、９６ウェルプレートに細胞２０００個／ウェルで播種した。血清不含培地中で２４時間培養した後、細胞を１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで洗浄し、各ウェルに１つのハイブリドーマクローンの培養上清１００μＬを添加した後、室温で２時間インキュベートした。１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで５回洗浄した後、ビオチン標識抗マウス二次抗体を添加し、室温で３０分間反応した。再度１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで５回洗浄した後、Ｃｙ３標識アビジンを添加し、室温で３０分間反応した。１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで５回洗浄した後、蛍光顕微鏡下で蛍光顕微鏡観察を実施して、モノクローナル抗体ライブラリー中の各モノクローナル抗体ハイブリドーマ上清とヒト肝がん幹細胞（ヒト腫瘍多能性幹細胞）株Ｔ３Ａ−Ａ３との反応を判定した。いくつかの細胞が蛍光染色を有していたことを観察することができ、この染色によりそれらは陽性であるものと判定され、ヒト肝がん幹細胞（ヒト腫瘍多能性幹細胞）株Ｔ３Ａ−Ａ３の膜表面抗原に結合できるマウスモノクローナル抗体が初めに選別された。
【０１７２】
さらに、上記の工程を再度繰り返すため、血清不含の懸濁培地中で培養したヒト肝がん細胞株（Ｙａｎ  Ｌｉ、Ｚｈａｏ−Ｙｏｕ  Ｔａｎｇ、Ｓｈｅｎｇ−Ｌｏｎｇ  Ｙｅ、Ｙｉｎ−Ｋｕｎ  Ｌｉｕ、Ｊｉｅ  ＣＨＥＮ、Ｑｉｏｎｇ  Ｘｕｅ、Ｊｕｎ  Ｃｈｅｎ、Ｄｏｎｇ−Ｍｅｉ  Ｇａｏ、Ｗｅｉ−Ｈｕａ  Ｂａｏ、Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｃｌｏｎｅｓ  ｗｉｔｈ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ＭＨＣＣ９７、Ｗｏｒｌｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ（英語版）、２００１年、７巻（０５）：６３０〜６３６ページ）のスフェア細胞を選択した。肝がん幹細胞の膜表面抗原に結合できるマウスモノクローナル抗体を得るため、顕微鏡検査を用いて、モノクローナル抗体ライブラリー中のハイブリドーマモノクローナル抗体上清とヒト肝がん幹細胞（ＭＨＣＣ９７Ｌスフェア細胞は肝がん幹細胞に富んでいる）との反応を判定した。
【０１７３】
１つのマウスモノクローナル抗体ヘツモマブが、ヒト腫瘍多能性幹細胞に対するマウスモノクローナル抗体ライブラリーから選別されたが、この抗体は、ヒト腫瘍多能性幹細胞株Ｔ３Ａ−Ａ３の膜表面抗原に結合しただけでなく、ヒト肝がんＭＨＣＣ９７Ｌ細胞株（ＭＨＣＣ９７Ｌスフェア細胞）の幹細胞の膜表面抗原にも結合し、このことは、マウスモノクローナル抗体ヘツモマブが、各種供給源由来のヒト肝がん幹細胞を認識できたこと示す。マウスモノクローナル抗体ヘツモマブを、さらなる特徴解析及び薬学的効能研究のために選択した。
【０１７４】
ヘツモマブモノクローナル抗体を分泌するマウスハイブリドーマ細胞を、Ｃｈｉｎａ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＣＧＭＣＣ）（中国科学院微生物研究所、第３棟、北辰西路１号、朝陽区、北京）に２０１６年３月１６日にＣＧＭＣＣ番号１２２５１の受託番号で寄託した。
【０１７５】
ヘツモマブハイブリドーマ細胞を拡大して、抗体含有上清を採集した。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈのモノクローナル抗体サブクラス検出キットを使用して、モノクローナル抗体のタイプ及びサブクラスを同定し、ＳｉｇｍａのＥＬＩＳＡ二次抗体を使用して、上清の抗体産生を検出した。実験結果は、ヘツモマブがＩｇＧ１の重鎖とκタイプの軽鎖とを有する抗体であることを示した。
【０１７６】
ヘツモマブを分泌するハイブリドーマ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで拡大し、細胞を８０％に成長させた後、血清不含培地に一新して４〜５日間培養を継続し、次いで、分泌された抗体を含む血清不含の上清を採集した。抗プロテインＧ精製カラムを使用して、ヘツモマブを精製した。単離及び精製したヘツモマブモノクローナル抗体の純度を、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりクーマシーブルー染色後に決定した。結果は、ヘツモマブが分子量約４７ｋＤａの重鎖及び分子量約２６ｋＤａの軽鎖を有していたことを示し、それらは一般的なＩｇＧ抗体の重鎖及び軽鎖の理論分子量に一致するものであった。スキャン及び分析により、電気泳動の標的バンドの純度が９５％超であり、精製されたヘツモマブモノクローナル抗体の純度が以降の実験の要求を満たしていたことが判定された。
【０１７７】
実施例２  様々な腫瘍細胞及び組織中のヘツモマブ標的抗原の特異的発現
１．ヘツモマブの標的抗原は、ヒトの肝がん、肺がん、胃がんの種々のがん細胞株に発現され、生存細胞の表面に発現される。
様々なヒト腫瘍細胞株、例えば肝がん、肺がん、及び胃がんの細胞株などの生存細胞の表面のモノクローナル抗体ヘツモマブ標的抗原の発現が、従来の生細胞免疫蛍光染色によって検出された。具体的な技術的方法は以下の通りである：細胞をスライド上に成長させるか、又は９６ウェル培養プレートに接種して（細胞４×１０３個／ウェル）プレート全体の６０％から７０％成長させ、次いで、血清不含の培養流体で２回洗浄し、ＰＢＳで１回洗浄した。一次抗体（ハイブリドーマ上清又は精製抗体）を添加し（細胞透過性の対照としてマウス抗α−チューブリン抗体（希釈：１：１０００）、陰性対照として正常マウスＩｇＧ、ＳＰ２／０上清、ＰＢＳを共存）、次いで室温で１時間インキュベートして；生細胞洗浄液（１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ）で５回、各回５分間洗浄し、次いで４％パラホルムアルデヒドを用いて室温で１５分間固定し；固定細胞洗浄液（０．１％ＢＳＡ、０．０５％ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ）で５回、各回５分間洗浄した。二次抗体１００μＬを添加して、室温遮光で３０分間インキュベートして；固定細胞洗浄液で５回、各回４分間洗浄し、１０μｇ／ｍＬ  ＤＡＰＩ、５０％グリセロールを含有するＰＢＳ  ５０μＬでブロッキングし；次いで顕微鏡下で観察した。いくつかの細胞で観察された膜の蛍光染色を陽性であるものとした。
【０１７８】
ヘツモマブの標的抗原が、以下のヒト肝がん、肺がん、及び胃がんの細胞株（Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから購入）の生きた細胞の表面上で発現され得ることが見出された：
ヒト肝がん細胞株：ＭＨＣＣ９７Ｌ、Ｂｅｌ７４０２−Ｖ１３；
ヒト肺がん細胞株：Ａ５４９、ＳＰＣＡ−１；
ヒト胃がん細胞株：ＳＮＵ−５、ＢＧＣ−８２３。
【０１７９】
いくつかの典型的な陽性の結果を図１に示す。
【０１８０】
上記の結果は、ヘツモマブの標的抗原が様々なヒト腫瘍、例えば肝がん、肺がん、及び胃がんの細胞株などで発現され、生きたがん細胞の膜表面に発現されていることを指し示している。
【０１８１】
２．ヘツモマブの標的抗原は、ヒトの肝がん、肺がん、及び胃がんの組織で特異的に高度に発現している。
従来の免疫組織化学的手法を用いることによって、数多くのヒトの肝がん、肺がん、胃がん患者及び他の関連組織におけるヘツモマブの標的抗原の発現を、一次抗体としてヘツモマブ、二次抗体として抗マウス抗体を採用することにより検出した。
【０１８２】
具体的な技術的方法を簡単に以下のように記載する：一般的な脱パラフィンを組織切片スライドに実施する；クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を抗原復活ボックス内に注ぎ、スライドをボックス内に置き、次いで、復活ボックスを沸騰水中に置き、それを水浴で３０分間加熱して、室温で２時間、自然冷却する；ＰＢＳで３分間×３回洗浄し、スライド上の水を旋回乾燥し、次いで、直ちに組織に沿って組織化学ペンで円を描く；各組織に内在性ペルオキシダーゼブロッキング溶液を１滴添加して、室温で２０分間インキュベートし、ＰＢＳで３分×３回洗浄して、洗浄液を振って除き、ブロッキングのために正常動物血清（ヒツジ血清）１滴を添加して、室温で２０分間インキュベートする；ブロッキングした血清を振って除き、一次抗体を各組織ポイントに添加し、スライドを湿潤ボックス内に置き、４℃で一晩インキュベートする；一次抗体を振って除き、ＰＢＳで３分間×３回洗浄して、洗浄液を振って除き、二次抗体であるビオチン−抗マウス抗体を添加し、室温で２０分間インキュベートする；ＰＢＳで３分間×５回洗浄して、洗浄液を振って除き、アビジン−ＨＲＰ  １滴を添加して、室温で１０分間インキュベートする；ＰＢＳで３分間×３回洗浄し、洗浄液を振って除き、新たに調製したＤＡＢ  １滴を添加し、次いで、厳密に時間管理しつつ、発色を展開し水でリンスすることにより反応を停止した後に、顕微鏡下で観察する；ヘマトキシリン対比染色を５分間実施し、１％塩酸−７５％アルコールで２秒間処理し、水でリンスする；脱水後に切片をＮｅｕｔｒａｌ  ｂａｌｓａｍでマウントし、顕微鏡下で観察する。
【０１８３】
ヘツモマブを一次抗体として使用することによって、ヘツモマブの標的抗原の発現が、１２０症例のヒト肝がん組織、２０症例の癌腫隣接組織、１０症例の正常肝臓組織、１０症例の肝炎組織、及び４０症例の肝硬変組織に検出された。実験結果（表１）は、ヘツモマブの標的抗原がヒト肝がん組織の７９．１７％（９５／１２０）に特異的に発現されていたが、癌腫隣接組織、正常肝臓組織、肝炎組織、及び肝硬変組織には発現されていなかったことを示し、このことは、ヘツモマブの標的抗原がヒト肝がん組織に特異的に高度に発現していることを指し示している。
【表１】
2020524527.tif 000002
【０１８４】
ヘツモマブを一次抗体として使用することによって、ヘツモマブの標的抗原の発現が、１６０症例のヒト肺がん組織、３２症例の癌腫隣接組織、及び３症例の正常肺組織に検出された。実験結果（表２）は、ヘツモマブの標的抗原がヒト肺がん組織の８２．５％（１３２／１６０）に特異的に発現されていたが、癌腫隣接組織の６．２５％に発現されていたに過ぎず、正常肺組織には発現されていなかったことを示し、このことは、ヘツモマブの標的抗原がヒト肺がん組織に特異的に高度に発現していることを指し示している。
【表２】
2020524527.tif 000003
【０１８５】
ヘツモマブを一次抗体として使用することによって、ヘツモマブの標的抗原の発現が、１１０症例のヒト胃がん組織、２０症例の癌腫隣接組織、及び３症例の正常胃組織に検出された。実験結果（表３）は、ヘツモマブの標的抗原がヒト胃がん組織の９３．６４％（１０３／１１０）に特異的に発現されていたが、癌腫隣接組織及び正常胃組織には発現されなかったことを示し、このことは、ヘツモマブの標的抗原がヒト胃がん組織に特異的に高度に発現していることを指し示している。
【表３】
2020524527.tif 000004
【０１８６】
上記の免疫組織化学検査の結果のうちいくつかの典型的な陽性の結果の写真を図２に示す。
【０１８７】
上記の結果は、ほとんどのがん患者の様々ながん組織、例えば肝がん、肺がん、及び胃がんなどで、ヘツモマブの標的抗原が特異的な高発現を有することを指し示している。
【０１８８】
実施例３  モノクローナル抗体ヘツモマブによる腫瘍幹細胞の認識
１．ヘツモマブによって認識されるがん細胞は、がん細胞のスフェア形成培養に濃縮される。
多数の文献報告によれば、血清不含懸濁培養、すなわちスフェア（スフェア形成）培養は、腫瘍幹細胞を濃縮することができる（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｂ．Ａ．及びＳ．Ｗｅｉｓｓ、「Ｃｌｏｎａｌ  ａｎｄ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｅｓ  ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅ  ｔｈａｔ  ａｎ  ＥＧＦ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ＣＮＳ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｉｓ  ａ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ．」、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ、１９９６年、１７５巻（１）、１〜１３ページ；Ｆａｎｇ，Ｎ．ら、「ｐＨ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  ｖｅｓｉｃｌｅ  ｏｎ  ｐｏｌｙ（ａｃｒｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）  ｃｕｓｈｉｏｎ  ｇｒａｆｔｅｄ  ｔｏ  ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｔｅｒｅｐｈｔｈａｌａｔｅ）  ｓｕｒｆａｃｅ．」、Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  Ｓｕｒｆ  Ｂ  Ｂｉｏｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ、２００５年、４２巻（３−４）、２４５〜５２ページ；及びＴｉｒｉｎｏ，Ｖ．ら、「Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＣＤ１３３  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｕｒ−ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ．」、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ、２００９年、３６巻（３）、４４６〜５３ページ）。そのため、ヘツモマブによって認識されるがん細胞がスフェア培養に濃縮されるか否かを利用して、ヘツモマブによって認識される細胞が腫瘍幹細胞に関連するか否かを決定し得る可能性がある。
【０１８９】
ヒト肝がん細胞株Ｂｅｌ７４０２−Ｖ１３及びＭＨＣＣ９７Ｌ細胞を、血清不含の方式で５日間培養し、親細胞及びスフェア培養由来細胞中のヘツモマブ＋細胞を、生細胞蛍光フローサイトメトリーによって検出した。実験結果（表４）は、Ｂｅｌ７４０２−Ｖ１３スフェア細胞中のヘツモマブ＋細胞の比が８．９２％であり、親細胞中の比２．２５％に比べて３．９６倍濃縮されたこと；及びＭＨＣＣ９７Ｌスフェア細胞中のヘツモマブ＋細胞の比が７．５１％であり、親細胞中の比３．４５％に比べて２．１８倍濃縮されたことを示す。言い換えれば、血清不含培養後、肝がん細胞株のヘツモマブ＋細胞が濃縮された。
【表４】
2020524527.tif 000005
【０１９０】
ヒト肺がん細胞株ＳＰＣＡ−１及びＡ５４９細胞を、血清不含の方式で５日間培養し、親細胞及びスフェア培養由来細胞中のヘツモマブ＋細胞を、生細胞蛍光フローサイトメトリーによって検出した。実験結果（表５）は、ＳＰＣＡ−１スフェア細胞中のヘツモマブ＋細胞の比が７．３４％であり、親細胞中の比１．７４％に比べて４．２２倍濃縮されたこと；及びＡ５４９スフェア細胞中のヘツモマブ＋細胞の比が１３．３０％であり、親細胞中の比７．２３％に比べて１．８４倍濃縮されたことを示す。言い換えれば、血清不含培養後、肺がん細胞株のヘツモマブ＋細胞が濃縮された。
【表５】
2020524527.tif 000006
【０１９１】
ヒト胃がん細胞株ＳＮＵ−５及びＢＧＣ−８２３細胞を、血清不含の方式で５日間培養し、親細胞及びスフェア培養由来細胞中のヘツモマブ＋細胞を、生細胞蛍光フローサイトメトリーによって検出した。実験結果（表６）は、ＳＮＵ−５スフェア細胞中のヘツモマブ＋細胞の比が７．１９％であり、親細胞中の比３．３８％に比べて２．１３倍濃縮されたこと；及びＢＧＣ−８２３スフェア細胞中のヘツモマブ＋細胞の比が７．４５％であり、親細胞中の比２．９５％に比べて２．５３倍濃縮されたことを示す。言い換えれば、血清不含培養後、胃がん細胞株のヘツモマブ＋細胞が濃縮された。
【表６】
2020524527.tif 000007
【０１９２】
上記のフロー免疫蛍光の結果のうちいくつかの典型的な図を図３に示す。
【０１９３】
これらの結果は、ヘツモマブによって認識されるがん細胞が、種々のヒト腫瘍細胞株、例えば肝がん、肺がん、及び胃がん細胞株などのスフェア培養に有意に濃縮されることを指し示している。
【０１９４】
２．ヘツモマブは、ＥＳＡ陽性及びＣＤ９０陽性のがん幹細胞を認識する。
現在、数多くの論説（Ｙａｍａｓｈｉｔａ  Ｔら、ＥｐＣＡＭ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ａｒｅ  ｔｕｍｏｒ−ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｓｔｅｍ／ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ  ｆｅａｔｕｒｅｓ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．２００９年、１３６巻（３）、１０１２〜１０２４ページ；及びＹａｎｇ  ＺＦ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｏｃａｌ  ａｎｄ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｌｉｖｅｒ  ｃａｎｃｅｒ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２００８年、４７巻（３）、９１９〜９２８ページ）は、ＥＳＡ及びＣＤ９０がいくつかの肝がん細胞の腫瘍幹細胞の表面マーカーであることを実証している。モノクローナル抗体ヘツモマブによって認識され、ＥＳＡ及びＣＤ９０マーカー陽性でもある、ヒト肝がん細胞株Ｂｅｌ７４０２−Ｖ１３細胞中の肝がん幹細胞を検出するために、我々は、２色フロー蛍光測定を使用して、血清不含培地中での５日間の培養後のヒト肝がん細胞株Ｂｅｌ７４０２−Ｖ１３細胞を染色した。
【０１９５】
結果（表７）は、ヘツモマブによって認識された細胞の比が８．５２％であり、ＥＳＡ＋幹細胞の発現比が９．０２％であり、２つの共染色比が３．６３％であったことを示した。言い換えれば、ヘツモマブは、ＥＳＡ＋幹細胞の４０．２％を認識した。血清不含培地中で５日間培養したヒト肝がんＭＨＣＣ９７Ｌ細胞を染色した。結果（表７）は、ヘツモマブによって認識された細胞の比が２．３８％であり、ＣＤ９０＋幹細胞の発現比が４．５４％であり、２つの共染色比が２．０１％であったことを示す。言い換えれば、ヘツモマブは、ＣＤ９０＋幹細胞の４４．３％を認識した。
【表７】
2020524527.tif 000008
【０１９６】
これらの結果は、ＥＳＡ又はＣＤ９０などのマーカーに陽性であるヒト腫瘍幹細胞をヘツモマブが認識することを指し示している。
【０１９７】
３．モノクローナル抗体ヘツモマブによって認識されるがん細胞はさらに強力な自己再生能を有する。
自己再生能、強い浸潤能、化学療法薬に耐える能力、及び強力な腫瘍形成能は、通常の腫瘍細胞から区別する腫瘍幹細胞の重要な基本的特性である。そのため、ヘツモマブによって認識される細胞が腫瘍幹細胞の特徴を有するか否かをさらに検証するため、様々なヒト腫瘍細胞中のヘツモマブ＋細胞をソートして、自己再生能、浸潤能、薬剤耐性、及びｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍形成能を検出した。
【０１９８】
腫瘍幹細胞の自己再生能の主要な徴候は、血清不含培地中でスフェア細胞を形成する能力であるが、その能力は非対称分裂と呼ばれ、言い換えれば、１つの細胞が２つの娘細胞に分裂する際に、娘細胞のうち一方は親細胞と同じ特性を維持するのに対して、他方の娘細胞は分裂を続けて正常な娘細胞を形成し得る。ゆえに、自己再生能は、ヘツモマブ＋細胞の血清不含培地中でスフェアを形成する能力を検出することによって決定され得る。
【０１９９】
５日間培養したヒト肝がんＢｅｌ７４０２−Ｖ１３スフェア細胞から、ヘツモマブ＋細胞、親細胞、及びヘツモマブ−細胞を、フローソーティングによって単離した。ソートした細胞を、０．８％メチルセルロースを含有する半固形スフェア培地［０．８％メチルセルロース、２０ｎｇ／ｍＬ  ＥＧＦ、２０ｎｇ／ｍＬ  ｂＦＧＦ、比１：５０で添加されたＢ２７、１０ｎｇ／ｍＬ  ＬＩＦ、２ｍｍｏｌ／ｍＬグルタミン、１ｕ／ｍＬヘパリンを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）培養溶液］に細胞５００個／ウェルで播種し、超低接着性２４ウェルプレートで培養して、各細胞群から形成されたスフェアの数を観察した。結果（表８）は、血清不含培地中でヘツモマブ＋細胞、親細胞、及びヘツモマブ−細胞から形成されたスフェアの数が、それぞれ２６２±８．５個、１６８±５．６個、及び９８±５．６個であったこと、言い換えれば、ヘツモマブ＋細胞のスフェア形成率は、他の２つの細胞よりも有意に高かった（ｐ＜０．０５）ことを示した。ゆえに、ヘツモマブ＋細胞は、親細胞及びヘツモマブ−細胞よりも強力な自己再生能を有する。
【表８】
2020524527.tif 000009
【０２００】
ヒト肺がんＳＰＣＡ−１スフェア細胞から、ヘツモマブ＋細胞、親細胞、及びヘツモマブ−細胞を、フローソーティングによって単離した。ソートした細胞を、０．８％メチルセルロースを含有する半固形スフェア培地に細胞５００個／ウェルで播種し、超低接着性２４ウェルプレートで培養して、各細胞群から形成されたスフェアの数を観察した。結果（表９）は、血清不含培地中でヘツモマブ＋細胞、親細胞、及びヘツモマブ−細胞から形成されたスフェアの数が、それぞれ１６５．７±６．０個、１２７±５．６個、及び８３．７±４．７個であったこと、言い換えれば、ヘツモマブ＋細胞のスフェア形成率は、他の２つの細胞よりも有意に高かった（ｐ＜０．０５）ことを示した。ゆえに、ヘツモマブ＋細胞は、親細胞及びヘツモマブ−細胞よりも強力な自己再生能を有する。
【表９】
2020524527.tif 000010
【０２０１】
ヒト胃がんＳＮＵ−５スフェア細胞から、ヘツモマブ＋細胞、親細胞、及びヘツモマブ−細胞を、フローソーティングによって単離した。ソートした細胞を、０．８％メチルセルロースを含有する半固形スフェア培地に細胞５００個／ウェルで播種し、超低接着性２４ウェルプレートで培養して、各細胞群から形成されたスフェアの数を観察した。結果（表１０）は、血清不含培地中でヘツモマブ＋細胞、親細胞、及びヘツモマブ−細胞から形成されたスフェアの数が、それぞれ２４±１．４個、１５．５±０．７個、及び１１．５±０．７個であったこと、言い換えれば、ヘツモマブ＋細胞のスフェア形成率は、他の２つの細胞よりも有意に高かった（ｐ＜０．０５）ことを示した。ゆえに、ヘツモマブ＋細胞は、親細胞及びヘツモマブ−細胞よりも強力な自己再生能を有する。
【表１０】
2020524527.tif 000011
【０２０２】
これらの結果は、ヘツモマブによって認識される種々のがん細胞（肝がん、肺がん、胃がん）がさらに強力な自己再生能を有すること、言い換えれば、腫瘍幹細胞の主要な特徴のうちの１つ：高い自己再生能を有することを指し示している。
【０２０３】
４．モノクローナル抗体ヘツモマブによって認識されるがん細胞は、さらに強い浸潤能を有する。
自己再生能、強い浸潤能、化学療法薬に耐える能力、及び強力な腫瘍形成能は、通常の腫瘍細胞から区別する腫瘍幹細胞の重要な基本的特性である。そのため、ヘツモマブによって認識される細胞が腫瘍幹細胞の特徴を有するか否かをさらに検証するため、様々なヒト腫瘍細胞中のヘツモマブ＋細胞をソートして、自己再生能、浸潤能、薬剤耐性、及びｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍形成能を検出した。
【０２０４】
５日間培養したヒト肝がんＢｅｌ７４０２−Ｖ１３スフェア細胞から、ヘツモマブ＋細胞、親細胞、及びヘツモマブ−細胞を、フローソーティングによって単離した。ソートされた細胞を、Ｍａｔｒｉｇｅｌゲルで予め被覆されたトランスウェルチャンバーに同じ量で播種し、２４時間後に固定して、膜を通して浸潤する細胞の数を顕微鏡下で観察した。結果（表１１）は、ヘツモマブ＋細胞、親細胞、及びヘツモマブ−細胞において上記膜を通して浸潤する細胞の数が、視野当たりそれぞれ３０８±９．５個、２１０±１０．７個、及び１３２±１４．７個であったこと、言い換えれば、膜を通して浸潤するヘツモマブ＋細胞の数が、他の２つの細胞よりも有意に高かった（ｐ＜０．０５）ことを示した。ゆえに、ヘツモマブ＋細胞は、親細胞及びヘツモマブ−細胞よりも強い浸潤能を有する。
【表１１】
2020524527.tif 000012
【０２０５】
培養したヒト肺がんＳＰＣＡ−１スフェア細胞から、ヘツモマブ＋細胞、親細胞、及びヘツモマブ−細胞を、フローソーティングによって単離した。ソートされた細胞を、Ｍａｔｒｉｇｅｌゲルで予め被覆されたトランスウェルチャンバーに同じ量で播種し、２４時間後に固定して、膜を通して浸潤する細胞の数を顕微鏡下で観察した。結果（表１２）は、ヘツモマブ＋細胞、親細胞、及びヘツモマブ−細胞において上記膜を通して浸潤する細胞の数が、視野当たりそれぞれ２２２±１１．５個、１９３．７±５．７個、及び１５４．３±１２．１個であったこと、言い換えれば、膜を通して浸潤するヘツモマブ＋細胞の数が、他の２つの細胞よりも有意に高かった（ｐ＜０．０５）ことを示した。ゆえに、ヘツモマブ＋細胞は、親細胞及びヘツモマブ−細胞よりも強い浸潤能を有する。
【表１２】
2020524527.tif 000013
【０２０６】
培養したヒト胃がんＳＮＵ−５スフェア細胞から、ヘツモマブ＋細胞、親細胞、及びヘツモマブ−細胞を、フローソーティングによって単離した。ソートされた細胞を、Ｍａｔｒｉｇｅｌゲルで予め被覆されたトランスウェルチャンバーに同じ量で播種し、２４時間後に固定して、膜を通して浸潤する細胞の数を顕微鏡下で観察した。結果（表１３）は、ヘツモマブ＋細胞、親細胞、及びヘツモマブ−細胞において上記膜を通して浸潤する細胞の数が、視野当たりそれぞれ２４７．５±１９．１個、１４２．５±９．２個、及び１４５．０±１１．３個であること、言い換えれば、膜を通して浸潤するヘツモマブ＋細胞の数が、他の２つの細胞よりも有意に高かった（ｐ＜０．０５）ことを示した。ゆえに、ヘツモマブ＋細胞は、親細胞及びヘツモマブ−細胞よりも強い浸潤能を有する。
【表１３】
2020524527.tif 000014
【０２０７】
これらの結果は、ヘツモマブによって認識される種々のがん細胞（肝がん、肺がん、胃がん）がさらに強い浸潤能を有すること、言い換えれば、腫瘍幹細胞の主要な特徴のうちの１つ：高い浸潤能を有することを指し示している。
【０２０８】
５．モノクローナル抗体ヘツモマブによって認識されるがん細胞は、化学療法薬に耐えるさらに強力な能力を有する。
自己再生能、強い浸潤能、化学療法薬に耐える能力、及び強力な腫瘍形成能は、通常の腫瘍細胞から区別する腫瘍幹細胞の重要な基本的特性である。そのため、ヘツモマブによって認識される細胞が腫瘍幹細胞の特徴を有するか否かをさらに検証するため、様々なヒト腫瘍細胞中のヘツモマブ＋細胞をソートして、自己再生能、浸潤能、薬剤耐性、及びｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍形成能を検出した。
【０２０９】
ヘツモマブ＋肝がん細胞の薬剤耐性を検出するために、ヒト肝がん細胞Ｂｅｌ７４０２−Ｖ１３のスフェア細胞をフローソーティングすることによって得られたヘツモマブ＋細胞、親細胞、及びヘツモマブ−細胞を、９６ウェルプレートに細胞５０００個／ウェルで播種した。各細胞群を、８つの異なる濃度、すなわち０μｇ／ｍＬ、０．０６２５μｇ／ｍＬ、０．１２５μｇ／ｍＬ、０．２５μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、及び４μｇ／ｍＬのシスプラチンを含有する完全培地で培養した。培地を３日に１回交換し、７日後にＯＤ値をＣＣＫ８法によって測定して、薬剤耐性を反映するＩＣ５０を決定した。実験結果（表１４、図４）は、ヘツモマブ＋細胞、親細胞、及びヘツモマブ−細胞のＩＣ５０がそれぞれ０．７３９μｇ／ｍＬ、０．５０２μｇ／ｍＬ、及び０．３１３μｇ／ｍＬであったこと、言い換えれば、ヘツモマブ＋細胞の薬剤耐性が親細胞及びヘツモマブ−細胞よりも有意に高く、その差が統計学的に有意であった（ｐ＜０．０５）ことを示す。ゆえに、ヘツモマブ＋肝がん細胞は、親細胞及びヘツモマブ−細胞よりも強力な化学療法薬耐性を有する。
【表１４】
2020524527.tif 000015
【０２１０】
ヘツモマブ＋肺がん細胞の薬剤耐性を検出するために、ヒト肺がん細胞ＳＰＣＡ−１のスフェア細胞をフローソーティングすることによって得られたヘツモマブ＋細胞、親細胞、及びヘツモマブ−細胞を、９６ウェルプレートに細胞５０００個／ウェルで播種した。各細胞群を、７つの異なる濃度、すなわち０μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、０．４μｇ／ｍＬ、０．６μｇ／ｍＬ、０．８μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、及び２μｇ／ｍＬのシスプラチンを含有する完全培地で培養し、次いで、ＯＤ値をＣＣＫ８法によって測定して、薬剤耐性を反映するＩＣ５０を決定した。実験結果（表１５、図４）は、ヘツモマブ＋細胞、親細胞、及びヘツモマブ−細胞のＩＣ５０がそれぞれ０．７０７μｇ／ｍＬ、０．５１３μｇ／ｍＬ、及び０．１８０μｇ／ｍＬであったこと、言い換えれば、ヘツモマブ＋細胞の薬剤耐性が親細胞及びヘツモマブ−細胞よりも有意に高く、その差が統計学的に有意であった（ｐ＜０．０５）ことを示す。ゆえに、ヘツモマブ＋肺がん細胞は、親細胞及びヘツモマブ−細胞よりも強力な化学療法薬耐性を有する。
【表１５】
2020524527.tif 000016
【０２１１】
ヘツモマブ＋胃がん細胞の薬剤耐性を検出するために、ヒト胃がん細胞ＳＮＵ−５のスフェア細胞をフローソーティングすることによって得られたヘツモマブ＋細胞、親細胞、及びヘツモマブ−細胞を、９６ウェルプレートに細胞５０００個／ウェルで播種した。各細胞群を、８つの異なる濃度、すなわち０μｇ／ｍＬ、０．０１２５μｇ／ｍＬ、０．０２５μｇ／ｍＬ、０．０５μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、０．４μｇ／ｍＬ、及び０．８μｇ／ｍＬのシスプラチンを含有する完全培地で培養し、次いで、ＯＤ値をＣＣＫ８法によって測定して、薬剤耐性を反映するＩＣ５０を決定した。実験結果（表１６、図４）は、ヘツモマブ＋細胞、親細胞、及びヘツモマブ−細胞のＩＣ５０がそれぞれ０．２８５μｍｏｌ／Ｌ、０．１５５μｍｏｌ／Ｌ、及び０．０９４μｍｏｌ／Ｌであったこと、言い換えれば、ヘツモマブ＋細胞の薬剤耐性が親細胞及びヘツモマブ−細胞よりも有意に高く、その差が統計学的に有意であった（ｐ＜０．０５）ことを示す。ゆえに、ヘツモマブ＋胃がん細胞は、親細胞及びヘツモマブ−細胞よりも強力な化学療法薬耐性を有する。
【表１６】
2020524527.tif 000017
【０２１２】
これらの結果は、ヘツモマブによって認識される種々のがん細胞（肝がん、肺がん、胃がん）がさらに強い化学療法薬耐性を有し、言い換えれば、腫瘍幹細胞の主要な特徴の１つ：高い薬剤耐性を有することを指し示している。
６．モノクローナル抗体ヘツモマブによって認識されるがん細胞は、さらに強力なｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍形成能を有する。
【０２１３】
自己再生能、強い浸潤能、化学療法薬に耐える能力、及び強力な腫瘍形成能は、通常の腫瘍細胞から区別する腫瘍幹細胞の重要な基本的特性である。そのため、ヘツモマブによって認識される細胞が腫瘍幹細胞の特徴を有するか否かをさらに検証するため、様々なヒト腫瘍細胞中のヘツモマブ＋細胞をソートして、自己再生能、浸潤能、薬剤耐性、及びｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍形成能を検出した。
【０２１４】
細胞ががん幹細胞であるか否かを試験するための「ゴールドスタンダード」は、その強力なｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍形成能である。そのため、ヒト肝がん細胞Ｂｅｌ７４０２−Ｖ１３のスフェア細胞をフローソーティングすることによって得られたヘツモマブ＋細胞、親細胞、及びヘツモマブ−細胞を、４週齢のヌードマウスにそれぞれ皮下接種して、ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍形成能を長期にわたって観察した。結果として、表１７に示すように、ヘツモマブ＋細胞１×１０４個は接種３週間目でマウスに腫瘍発生をもたらしたのに対し、親細胞１×１０５個が接種後３週間で腫瘍発生をもたらすのに必要であり、また、ヘツモマブ−細胞は、全観察期間の間に腫瘍発生を引き起こすことができなかった。この古典的な実験の結果は、ヘツモマブ＋細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍形成能が親細胞及びヘツモマブ−細胞よりも有意に強力であることを指し示している。ヘツモマブ＋細胞は、腫瘍幹細胞を同定するための「ゴールドスタンダード」に合致する腫瘍幹細胞の特徴である、高腫瘍形成能を有することが示唆される。ゆえに、ヘツモマブによって認識される細胞は、肝がんの腫瘍幹細胞である。
【表１７】
2020524527.tif 000018
【０２１５】
ヒト胃細胞ＳＮＵ−５のスフェア細胞をフローソーティングすることによって得られたヘツモマブ＋細胞、親細胞、及びヘツモマブ−細胞を、４週齢のヌードマウスにそれぞれ皮下接種して、ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍形成能を長期にわたって観察した。結果として、表１８に示すように、ヘツモマブ＋細胞２×１０３個が接種３か月目でマウスにｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍発生をもたらしたのに対し、親細胞２×１０３個は接種の４か月後に腫瘍発生を誘発できず、また、ヘツモマブ−細胞は、全観察期間の間に腫瘍発生を引き起こすことができなかった。この古典的な実験の結果は、ヘツモマブ＋細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍形成能が親細胞及びヘツモマブ−細胞よりも有意に強力であることを指し示している。ヘツモマブ＋細胞は、腫瘍幹細胞を同定するための「ゴールドスタンダード」に合致する腫瘍幹細胞の特徴である、高腫瘍形成能を有することが示唆される。ゆえに、ヘツモマブによって認識される細胞は、胃がんの腫瘍幹細胞である。
【表１８】
2020524527.tif 000019
【０２１６】
これらの結果は、ヘツモマブによって認識される種々のがん細胞（肝がん、肺がん、胃がん）が、さらに強力なｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍形成能を有すること、言い換えれば、腫瘍幹細胞の主要な特徴の１つ：高いｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍形成能を有することを指し示している。
【０２１７】
実施例４  モノクローナル抗体ヘツモマブは、腫瘍幹細胞の自己再生、浸潤、及び薬剤耐性を阻害することができる
１．ヘツモマブは、様々な腫瘍（肝がん、肺がん、及び胃がん）において腫瘍幹細胞の自己再生能（腫瘍幹細胞の主要な特徴の１つ）を有意に阻害する。
腫瘍幹細胞の自己再生能の主要な徴候は、血清不含培地中でスフェア細胞を形成する能力であるが、その能力は非対称分裂と呼ばれ、言い換えれば、１つの細胞が２つの娘細胞に分裂する際に、娘細胞のうち一方は親細胞と同じ特性を維持するのに対して、他方の娘細胞は分裂を続けて正常な娘細胞を形成し得る。ヘツモマブが肝がん幹細胞を直接的に阻害できる機能的なモノクローナル抗体であるか否かを立証するために、血清不含培地中で５日間培養することによって得られたヒト肝がん細胞株Ｂｅｌ７４０２−Ｖ１３のスフェアから、単細胞懸濁液を調製した。そして、次いで、ヘツモマブ（２５０μｇ／ｍＬ）を実験群として使用し、ＰＢＳを陰性対照群として使用して、細胞と共に３７℃で２時間インキュベートし、その間、細胞を３０分毎に１回、抗体又は陰性対照と混合した。各群５００個の細胞を、０．８％メチルセルロースを含有する半固形スフェア培地（ＥＧＦ、ＬＩＦ、ｂＦＧＦなどを含有）中に接種し、超低接着性２４ウェルプレートで培養した。液体培地１〜１．５ｍＬを隔日に添加し、上記２群由来の形成されたスフェアの数を１４日後に観察した。実験結果（図５）は、実験群で形成されたスフェアの数が２１２±２．８個であるのに対して、陰性対照群で形成されたスフェアの数は２７８．５±０．７個と実験群よりも有意に高かったことを示した。Ｂｅｌ７４０２−Ｖ１３細胞のスフェア形成に対するヘツモマブの阻害比は、統計学的差異を伴って２３．９％、ｐ＜０．０５であった。この結果は、ヘツモマブが肝がん幹細胞に直接的に作用してその自己再生能を阻害できることを示していた。
【０２１８】
ヘツモマブが肺がん幹細胞を直接的に阻害できる機能的なモノクローナル抗体であるか否かを立証するために、同じ方法を使用して、ヒト肺がん細胞株ＳＰＣＡ−１のスフェア形成に及ぼすヘツモマブの阻害効果を検出した。結果（表１９及び図５に示されるように）は、実験群で最も高い濃度の抗体由来の形成スフェアの数が８８．３±７．２個であったのに対し、陰性対照群由来では１５１．３±９．１個と実験群よりも有意に高く、ＳＰＣＡ−１細胞のスフェア形成に対するヘツモマブの阻害比が統計学的差異を伴って４１．６％、ｐ＜０．０１であったことを示した。この結果は、ヘツモマブが肺がん幹細胞に直接的に作用しその自己再生能を阻害することができることを示していた。
【表１９】
2020524527.tif 000020
【０２１９】
ヘツモマブが胃がん幹細胞を直接的に阻害できる機能的なモノクローナル抗体であるか否かを立証するために、同じ方法を使用して、ヒト胃がん細胞株ＳＮＵ−５のＣＤ４４陽性細胞の腫瘍幹細胞サブ群のスフェア形成に及ぼされるヘツモマブの阻害効果を検出した。結果（表２０及び図５に示されるように）は、実験群で最も高い濃度の抗体由来の形成スフェアの数が１８±２．０個であったのに対し、陰性対照群由来では１２８±４．０個と実験群よりも有意に高く、ＳＮＵ−５  ＣＤ４４＋細胞のスフェア形成に対するヘツモマブの阻害比が統計学的差異を伴って８５．９％、ｐ＜０．０１であったことを示した。この結果は、ヘツモマブが胃がん幹細胞に直接的に作用しその自己再生能を阻害できることを示していた。
【表２０】
2020524527.tif 000021
【０２２０】
これらの結果は、ヘツモマブが様々ながん細胞（肝がん、肺がん、胃がん）の自己再生能を直接的に阻害することができること、及びヘツモマブが標的腫瘍幹細胞を認識することができるだけでなく、腫瘍幹細胞を直接的に阻害できる機能的な（治療的な）モノクローナル抗体でもあることを指し示している。
【０２２１】
２．ヘツモマブは、様々な腫瘍（肝がん、肺がん、及び胃がん）において腫瘍幹細胞の浸潤能（腫瘍幹細胞の第２の主要な特徴）を有意に阻害する。
高い浸潤性は、がん幹細胞の別の重要な生物学的特性である。ヘツモマブが肝がん幹細胞を直接的に阻害できる機能的なモノクローナル抗体であるか否かを立証するために、トランスウェル浸潤実験を使用して、モノクローナル抗体ヘツモマブが肝がん細胞の浸潤を阻害する能力を分析した。実験結果（図６）は、ＰＢＳ陰性対照群の浸潤性細胞の数が（３０１．０±１６．３個）／視野であり、ヘツモマブ（０．５ｍｇ／ｍｌ）群の浸潤性細胞の数が（１４８±１６．４個）／視野であったことを示した。この結果は、細胞の浸潤能がヘツモマブの直接的な作用によって有意に弱化し、Ｂｅｌ７４０２−Ｖ１３スフェア細胞の浸潤に対するヘツモマブの阻害率が統計学的差異を伴って５０．８％、ｐ＜０．０５であったことを示していた。この結果は、ヘツモマブが肝がん幹細胞に直接的に作用しその浸潤能を阻害することができることを示していた。
【０２２２】
ヘツモマブが肺がん幹細胞を直接的に阻害できる機能的なモノクローナル抗体であるか否かを立証するために、同じ方法を使用して、ヒト肺がん細胞株ＳＰＣＡ−１の浸潤に及ぼされるヘツモマブの阻害効果を検出した。実験結果（表２１、図６）は、ＰＢＳ陰性対照群の浸潤性細胞の数が（２３２．３±３．１個）／視野であり、ヘツモマブ群の浸潤性細胞の数が（１５３．０±６．１個）／視野であったことを示した。この結果は、細胞の浸潤能がヘツモマブの直接的な作用によって有意に弱化し、ＳＰＣＡ−１スフェア細胞の浸潤に対するヘツモマブの阻害率が統計学的差異を伴って３４．１％、ｐ＜０．０５であったことを示していた。この結果は、ヘツモマブが肺がん幹細胞に直接的に作用しその浸潤能を阻害できることを示していた。
【表２１】
2020524527.tif 000022
【０２２３】
ヘツモマブが胃がん幹細胞を直接的に阻害できる機能的なモノクローナル抗体であるか否かを立証するために、同じ方法を使用して、ヒト胃がん細胞株ＳＮＵ−５のＣＤ４４陽性細胞の腫瘍幹細胞サブ群の浸潤に及ぼされるヘツモマブの阻害効果を検出した。実験結果（表２２、図６）は、ＰＢＳ陰性対照群の浸潤性細胞の数が（２３１±７．０個）／視野であり、ヘツモマブ群の浸潤性細胞の数が（５６±４．０個）／視野であったことを示した。この結果は、細胞の浸潤能がヘツモマブの直接的な作用によって有意に弱化し、ＳＮＵ−５  ＣＤ４４＋細胞の浸潤に対するヘツモマブの阻害率が統計学的差異を伴って７５．８％、ｐ＜０．０５であったことを示していた。この結果は、ヘツモマブが胃がん幹細胞に直接的に作用しその浸潤能を阻害できることを示していた。
【表２２】
2020524527.tif 000023
【０２２４】
これらの結果は、ヘツモマブが様々ながん細胞（肝がん、肺がん、胃がん）の浸潤能を直接的に阻害することができること、及びヘツモマブが標的腫瘍幹細胞を認識することができるだけでなく、腫瘍幹細胞を直接的に阻害できる機能的な（治療的な）モノクローナル抗体でもあることを指し示している。
【０２２５】
３．ヘツモマブは、様々な腫瘍（肝がん、肺がん、及び胃がん）において腫瘍幹細胞の化学療法薬耐性（腫瘍幹細胞の第３の主要な特徴）を有意に阻害する。
薬剤耐性は、腫瘍幹細胞の生物学的特性の１つである。ヘツモマブが肝がん幹細胞を直接的に阻害できる機能的なモノクローナル抗体であるか否かを実証するために、５日間培養したＢｅｌ７４０２−Ｖ１３スフェア細胞を９６ウェルプレートに細胞５０００個／ウェルで播種し、精製モノクローナル抗体ヘツモマブ（０．５ｍｇ／ｍＬ）及びＰＢＳをウェルにそれぞれ添加して、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで２４時間インキュベートした後、抗体含有培地を除去した。９つの各種濃度、すなわち０、０．０６２５、０．１２５、０．２５、０．５、１、２、４、及び８μｇ／ｍＬのシスプラチンを含有する培地を用いて各細胞群を培養した。シスプラチンを含有する完全培地を４８時間毎に１回置き換えた。５日後、ＣＣＫ−８試薬をＣＣＫ−８キットの指示書に従って添加した。ＯＤ４５０吸光度値を測定し、各群についてＩＣ５０値を算出した。実験結果（図７）は、ヘツモマブを用いて直接的に処置された細胞の薬剤耐性がＩＣ５０値０．３３４μｇ／ｍＬで有意に減少したのに対し、対照群のＩＣ５０値が０．９μｇ／ｍＬであり、ヘツモマブが直接的に作用する細胞の薬剤耐性が対照群よりも有意に低かったことを示した。この結果は、ヘツモマブが肝がん幹細胞に直接的に作用しその薬剤耐性を阻害できることを示していた。
【０２２６】
ヘツモマブが肺がん幹細胞を直接的に阻害できる機能的なモノクローナル抗体であるか否かを立証するために、同じ方法を使用して、ヒト肺がん細胞株ＳＰＣＡ−１の薬剤耐性に及ぼされるヘツモマブの阻害効果を検出した。実験結果（図７）は、ヘツモマブを用いて直接的に処置された細胞の薬剤耐性が有意に減少し、最も低いＩＣ５０値が０．１３６μｇ／ｍＬであるのに対し、対照群のＩＣ５０値が０．３５１μｇ／ｍＬであり、ヘツモマブが直接的に作用する細胞の薬剤耐性は対照群よりも有意に低かったことを示す。この結果は、ヘツモマブが肺がん幹細胞に直接的に作用しその薬剤耐性能を阻害することができることを示していた。
【０２２７】
これらの結果は、ヘツモマブが様々ながん細胞（肝がん、肺がん）の化学療法薬耐性を直接的に阻害することができること、及びヘツモマブが標的腫瘍幹細胞を認識することができるだけでなく、腫瘍幹細胞を直接的に阻害できる腫瘍幹細胞に対する機能的な（治療的な）モノクローナル抗体でもあることを指し示している。
【０２２８】
実施例５  ヘツモマブは、動物において移植腫瘍の成長を阻害する薬学的効果と、化学療法との相乗効果とを有する
上記の実験結果は、ヘツモマブが種々の腫瘍幹細胞をターゲティングするモノクローナル抗体であることを実証した。そして、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ薬学的研究の結果は、ヘツモマブが様々な腫瘍幹細胞の自己再生、浸潤能、及び薬剤耐性を有意に阻害することができることを示している。様々な腫瘍の成長、転移、及び薬剤耐性に及ぼされるヘツモマブのｉｎ  ｖｉｖｏ効果をさらに明確にするために、種々のヒト腫瘍動物モデルを使用して、様々な腫瘍の成長、転移、及び薬剤耐性に及ぼされるヘツモマブのｉｎ  ｖｉｖｏ薬学的効果を評価した。
【０２２９】
１．ヘツモマブは、ヒト肝がん移植腫瘍のｉｎ  ｖｉｖｏ成長を有意に阻害し、有意な抗腫瘍薬学的効果により、化学療法の治療効能を相乗的に亢進し、且つ生存期間を有意に延長することができる。
ヘツモマブによるヌードマウスにおける肝がんの治療に関する実験研究を実施して、肝がんを治療する際のモノクローナル抗体単独、化学療法薬単独、及びモノクローナル抗体と化学療法薬との組合せの治療効能を観察及び比較し、肝がんの成長及び薬剤耐性に及ぼされるヘツモマブのｉｎ  ｖｉｖｏ効果を決定すると共に、肝がん幹細胞をターゲティングすることによって肝がんの最適な治療を探った。
【０２３０】
Ｂｅｌ７４０２−Ｖ１３スフェア細胞を、細胞３０，０００個／マウスでヌードマウスに皮下接種した。このヌードマウスを以下のように無作為に６群に分けた（１群当たり６匹）：化学療法群（０．３ｍｇ／ｋｇシスプラチン、マウス６匹）；高用量抗体群（１０ｍｇ／ｋｇ、マウス６匹）；高用量抗体＋化学療法群（マウス６匹）；低用量抗体群（２．５ｍｇ／ｋｇ、マウス６匹）；低用量抗体＋化学療法群（マウス６匹）；及びＰＢＳ群（マウス６匹）。細胞を接種した翌日に治療を開始し、１週間に２回行い、５週間後に終了した。皮下移植された腫瘍の大径及び小径を１週間に２回測定した。式Ｖ＝（π／６）×（大径×小径×小径）を用いて腫瘍体積を算出し、各群の腫瘍体積及び成長速度の変化を観察した。薬剤中止後、移植腫瘍の成長を再度観察し、腫瘍サイズを記録した。腫瘍増殖率＝（Ｖｔ−Ｖ０）／日数、上式でＶｔは各測定での腫瘍体積であり、Ｖ０は投与前の腫瘍体積である（Ｖ０は投与を停止した際の腫瘍体積である）。
【０２３１】
マウスにおける移植腫瘍の成長曲線を図８に示すが、ここでは、ヌードマウスにおいてヘツモマブが移植腫瘍の成長を有意に阻害できることが示されている。そして、抗体の用量を増加させると、移植腫瘍の阻害率が次第に増加したが、それは用量依存的な関係を示すものであった。実験結果を図９に示す。５週間の治療後に薬剤を中断すると、高用量及び低用量のヘツモマブ群の移植腫瘍への阻害率はそれぞれ７１．５％及び５４．４％であったのに対して、化学療法群の阻害率は８３．５％であり、化学療法薬に組み合わされた高用量の抗体、低用量の抗体の群の阻害率は同様であり約９７％であった。この結果は、化学療法薬に組み合わされたモノクローナル抗体が、移植腫瘍の治療において、モノクローナル抗体単独及び化学療法薬単独に比べてさらに良好な治療効果を示したことを示唆していた。
【０２３２】
薬剤中止の１か月後、何匹かのマウスが死亡した。この時点での各群の阻害率を図１０に示す。高用量及び低用量のモノクローナル抗体群の移植腫瘍への阻害率はそれぞれ４９．１％及び３４．４％であったのに対して、化学療法薬に組み合わされた高用量及び低用量のモノクローナル抗体の群の阻害率は同様であり、約８４．５％であったが、化学療法群の阻害率は４８．６％であった。この結果は、化学療法薬に組み合わされたモノクローナル抗体の群のマウスにおける移植腫瘍への阻害率が、他の治療群よりも統計学的有意差を伴ってＰ＜０．０５で高かったことを示唆するものであった。薬剤中止後１か月での移植腫瘍の体積を薬剤中止時と比較した。化学療法薬に組み合わされたモノクローナル抗体の群の腫瘍増殖速度は０．０５１ｃｍ３／日であり、ＰＢＳ対照群（０．２３９ｃｍ３／日）よりも４．７倍低かった。この組合せ群の腫瘍増殖速度は、高用量及び低用量のモノクローナル抗体群並びに化学療法群（０．１４８ｃｍ３／日、０．１８５ｃｍ３／日、及び０．１５４ｃｍ３／日）よりも、それぞれ２．９倍、３．６倍、及び３．１倍低かった。この結果は、モノクローナル抗体と化学療法薬との組合せを投与するための方法が腫瘍の成長及び再発を効果的に阻害し得ることを示していた。
【０２３３】
治療及び観察全体は６か月続いた。マウスの６か月の生存曲線（図１１）は、６群のマウスの生存曲線にＰ＜０．０５で統計学的有意差があったことを示した。このことは、化学療法に組み合わされたモノクローナル抗体の群のマウスの生存状態がＰＢＳ対照群、モノクローナル抗体群、及び化学療法群よりも有意に良好であったことを示す。化学療法に組み合わされたモノクローナル抗体はマウスの生存を延長し得ることが示されている。
【０２３４】
上記の結果は、ヘツモマブ単独がヒト肝がん移植腫瘍の成長を有意に阻害し得ること、及び肝がんを阻害する有意な薬学的効果を有することを示している。ヘツモマブと化学療法薬との組合せは全て、抗体単独群及び化学療法薬単独よりも良好な治療効果を伴って、移植腫瘍に対する高い阻害率を示し、この阻害率により腫瘍増殖を有意に阻害することができたが、このことは、化学療法薬に組み合わされたモノクローナル抗体が効果的に腫瘍増殖を阻害し、化学療法薬耐性を低減し得ることを指し示している。組合せ療法群のマウスの生存期間は、抗体群及び化学療法薬群よりも有意に長く、このことは、化学療法薬に組み合わされたヘツモマブが、腫瘍増殖を治療し得るだけでなく、マウスの生存期間をも延長し得ることを指し示している。腫瘍のｉｎ  ｖｉｖｏ転移に起因するマウスの死が有意に阻害された可能性がある。
【０２３５】
２．ヘツモマブは、ｉｎ  ｖｉｖｏでヒト肺がん移植腫瘍の成長を有意に阻害し、有意な抗腫瘍薬学的効果を有する。
ヘツモマブによるヌードマウスにおける肺がんのｉｎ  ｖｉｖｏ治療に関する実験研究を実施し、モノクローナル抗体単独及び化学療法薬単独による肺がんの治療の治療効能を観察した。
【０２３６】
具体的には、ヒト肺がん細胞株ＳＰＣＡ−１のスフェア細胞を採取し、ヌードマウスに細胞２．５×１０５個／マウスで接種した。マウスを以下の５群に、各群５匹のマウスとして分けた：ＰＢＳ対照群；化学療法群（シスプラチン０．３ｍｇ／ｋｇ）；高用量抗体ヘツモマブ群（４０ｍｇ／ｋｇ）；中用量抗体ヘツモマブ群（１０ｍｇ／ｋｇ）；及び低用量ヘツモマブ群（２．５ｍｇ／ｋｇ）。肺がん細胞の接種後２日目に抗体治療を開始した。実験群及び対照群を腹腔内注射によって治療した。治療を接種後２８日間実施した。化学療法薬群を週に２回治療した。皮下移植腫瘍の大径及び小径を週に２回測定した。式Ｖ＝（π／６）×（大径×小径×小径）を用いて、腫瘍体積を算出した。各群の腫瘍体積の変化を観察した。
【０２３７】
接種の２８日後に治療を停止した際に、マウスの腫瘍体積の成長を観察及び測定して、阻害率を算出した。マウスにおける移植腫瘍の成長曲線を図１２に示し、腫瘍体積阻害率を表２２に示す。ヘツモマブは、ヌードマウスにおいて移植腫瘍の成長を有意に阻害し得るが、その阻害率は抗体の用量の増加に伴って増加した。薬剤中止時に、高用量、中用量、及び低用量のモノクローナル抗体ヘツモマブの群の移植腫瘍への阻害率は、それぞれ５５．９７％、４３．５６％、及び３５．５８％であったのに対して、化学療法薬群の阻害率は２４．９１％に過ぎなかった。
【０２３８】
上記の結果は、ヘツモマブ単独がヒト肺がん移植腫瘍の成長を有意に阻害し得ること、及び肺がんへの有意な薬学的効果を有することを示している。
【表２３】
2020524527.tif 000024
【０２３９】
３．ヘツモマブは、ヒト胃がん移植腫瘍のｉｎ  ｖｉｖｏ成長を有意に阻害し、有意な抗腫瘍薬学的効果を伴って、化学療法の治療効能を相乗的に亢進することができ、生存期間を有意に延長することができる。
ヘツモマブによる、ヌードマウスにおける胃がんの治療に関する実験研究を実施した。肺がんを治療する際のモノクローナル抗体単独、化学療法薬単独、及びモノクローナル抗体と化学療法薬との組合せの治療効能を観察して比較した。ヘツモマブがｉｎ  ｖｉｖｏで胃腫瘍の成長を阻害し、化学療法の治療効果を相乗的に亢進することができるか否かを分析した。
【０２４０】
具体的には、ヒト胃がん細胞株ＳＮＵ−５−Ｖ１３のスフェア細胞を採取し、ヌードマウスに細胞２．５×１０５個／マウスで接種した。マウスを以下の７群に、各群８匹のマウスとして分けた：ＰＢＳ対照群；マウスＩｇＧ対照群；化学療法群（シスプラチン０．３ｍｇ／ｋｇ）；高用量抗体ヘツモマブ群（２０ｍｇ／ｋｇ）；低用量ヘツモマブ群（１．２５ｍｇ／ｋｇ）；高用量ヘツモマブ＋化学療法薬群；及び低用量ヘツモマブ＋化学療法薬群。胃がん細胞の接種後２日目に抗体治療を開始した。実験群及び対照群を腹腔内注射によって治療した。治療を１か月間実施した。化学療法薬群を週に２回、４週間治療した。皮下移植腫瘍の大径及び小径を週に２回測定した。式Ｖ＝（π／６）×（大径×小径×小径）を用いて、腫瘍体積を算出した。各群の腫瘍体積の変化を観察した。
【０２４１】
接種の１か月後に治療を停止した際に、マウスの腫瘍体積の成長を観察及び測定して、阻害率を算出した。マウスにおける移植腫瘍の成長曲線を図１３に示し、腫瘍体積阻害率を表２３に示す。ヘツモマブは、ヌードマウスにおいて移植腫瘍の成長を有意に阻害できるが、移植腫瘍へのその阻害率は抗体の用量の増加に伴って増加した。薬剤中止時に、高用量及び低用量のモノクローナル抗体ヘツモマブの群の移植腫瘍への阻害率は、それぞれ５７．６２％及び３０．６８％であったのに対して、化学療法薬群の阻害率は３３．１６％に過ぎなかった。高用量＋化学療法薬及び低用量＋化学療法薬の群の阻害率は、それぞれ７０．６８％及び４７．９３％であった。この結果は、マウスにおいてモノクローナル抗体と化学療法薬との組合せが移植腫瘍に及ぼす阻害性率が、ｐ＜０．０５で化学療法薬群及び抗体群よりも高かったこと、並びにモノクローナル抗体と化学療法薬との組合せが、移植腫瘍の治療においてさらに良好な治療効果を示したことを示唆していた。
【０２４２】
上記の結果は、ヘツモマブ単独がヒト胃がん移植腫瘍の成長を有意に阻害し得ること、及び胃がんを阻害する有意な薬学的効果を有することを示している。ヘツモマブと化学療法薬との組合せは全て、移植腫瘍に対する高い阻害率を示し、腫瘍増殖を有意に阻害することができ、それゆえに抗体単独群及び化学療法薬単独群よりも良好な治療効果を呈したが、このことは、化学療法薬に組み合わされたモノクローナル抗体が効果的に腫瘍増殖を阻害し、化学療法薬耐性を低減し得ることを指し示している。
【表２４】
2020524527.tif 000025
【０２４３】
腫瘍を阻害することに関する上記の一連の動物実験の結果は、ヘツモマブがｉｎ  ｖｉｖｏで種々のヒト腫瘍（例えば肝がん、肺がん、及び胃がんなど）の成長及び薬剤耐性に有意な阻害効果（薬力学的効果）を有し、数多くの腫瘍の成長、転移、及び薬剤耐性に対処するための重要な適用価値を有することを実証するものであった。
【０２４４】
実施例６  マウスモノクローナル抗体ヘツモマブの可変領域配列のクローニング及びその相補性決定領域の配列解析
この実施例では、サブタイプＩｇＧ１及びカッパ軽鎖を有するマウスモノクローナル抗体ヘツモマブのハイブリドーマ細胞を使用した。細胞をＴｒｉｚｏｌ試薬で溶解して、総ＲＮＡを抽出した。イソプロピルアルコールで沈殿しエタノールで洗浄した後、ＲＮＡ電気泳動及びＵＶ分光光度測定を使用して、ＲＮＡの濃度、純度、及び完全性を決定した。その結果、ヘツモマブハイブリドーマ細胞由来の総ＲＮＡを濃度２．５μｇ／μＬ及びＯＤ２６０／ＯＤ２８０＝１．８で得た。それらを従来法によって第１鎖ｃＤＮＡに逆転写し、２倍希釈してＰＣＲ増幅用の鋳型として使用した。
【０２４５】
以降のルーチンのＰＣＲ反応のために、適切な可変領域のプライマーの組合せを設計して、抗体の可変領域遺伝子配列を増幅し、ＺＴ４−Ｂｌｕｎｔベクターにクローニングし、大腸菌ＤＨ５αコンピテントセル内へ形質転換した。陽性クローンをシークエンシング用に選択した。ヘツモマブの軽鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号１に示し、重鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号５に示す。
【０２４６】
ヘツモマブの軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１）は：
DIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYLYWFLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELYTFGGGTKLEIK
であり、式中、ＶＬ−ＣＤＲ１（配列番号２：ＲＳＳＫＳＬＬＨＳＮＧＩＴＹＬＹ）、ＶＬ−ＣＤＲ２（配列番号３：ＱＭＳＮＬＡＳ）、及びＶＬ−ＣＤＲ３（配列番号４：ＡＱＮＬＥＬＹＴ）はそれぞれ下線を付されている。
【０２４７】
ヘツモマブの重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号５）は：
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTISKDSSNNQVFLKITSVDTADTATYYCARSFYYYANNSFAYWGQGTLVTVSS
であり、式中、ＶＨ−ＣＤＲ１（配列番号６：ＴＳＧＭＧＶＳ）、ＶＨ−ＣＤＲ２（配列番号７：ＨＩＹＷＤＤＤＫＲＹＮＰＳＬＫＳ）、ＶＨ−ＣＤＲ３（配列番号８：ＳＦＹＹＹＡＮＮＳＦＡＹ）はそれぞれ下線を付されている。
【０２４８】
実施例７  マウスモノクローナル抗体ヘツモマブに由来するヒト−マウスキメラ抗体ヘツキシマブの構築、発現、及び精製
この実施例では、マウスモノクローナル抗体ヘツモマブの軽鎖及び重鎖の可変領域遺伝子断片を、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ（重鎖定常領域遺伝子）及びヒトＩｇＧ  ＣＫ（軽鎖定常領域遺伝子）を含有する一過的発現ベクターにクローニングし、次いで、真核細胞にトランスフェクトした。トランスフェクト細胞の培養上清から、ヘツモマブのヒト−マウスキメラ抗体バリアントを、従来のプロテインＡ親和性クロマトグラフィーによって精製し、ヘツキシマブと命名した。
【０２４９】
ヘツモマブの重鎖及び軽鎖の抗体可変領域遺伝子断片を、大規模にＰＣＲにより増幅し、一過的発現ベクターｐＫＮ００９（ヒトＩｇＧ１  ＣＨコード配列を含有）及びｐＫＮ０１９（ヒトＩｇＧ  ＣＫコード配列を含有）の対応する制限部位にクローニングし、大腸菌内へ形質転換し、陽性クローンを選択した。陽性クローンを、同定のためにさらにシークエンシングした。その結果、ヘツモマブに由来するヒト−マウスキメラ抗体ヘツキシマブ及びその発現ベクターを得た。キメラ抗体の特異的なタンパク質配列は以下の通りである：
【０２５０】
キメラ抗体ヘツキシマブの重鎖のアミノ酸配列（配列番号９）は：
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTISKDSSNNQVFLKITSVDTADTATYYCARSFYYYANNSFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
であり、式中、ＶＨ−ＣＤＲ１（配列番号６）、ＶＨ−ＣＤＲ２（配列番号７）、ＶＨ−ＣＤ３（配列番号８）、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ（配列番号１１）はそれぞれ下線を付されている。
【０２５１】
キメラ抗体ヘツキシマブの軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１０）は：
DIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYLYWFLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
であり、式中、ＶＬ−ＣＤＲ１（配列番号２）、ＶＬ−ＣＤＲ２（配列番号３）、ＶＬ−ＣＤＲ３（配列番号４）、ヒトＩｇＧ  Ｃ（配列番号１２）はそれぞれ下線を付されている。
【０２５２】
検証された軽鎖及び重鎖のキメラ抗体遺伝子発現ベクターを、リポソームトランスフェクションを用いて真核性ＨＥＫ−２９３細胞に従来のようにトランスフェクトして、キメラ抗体を一過的に発現した。上清を採集して、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーカラムを用いて予備精製し、次いで、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて不純物を除去した。精製生成物の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって検証した。その結果、純度＞９５％及び２ｍｇ／ｍＬのヘツモマブ由来のヒト−マウスキメラ抗体ヘツキシマブを得た。
【０２５３】
実施例８  キメラ抗体ヘツキシマブは、マウスモノクローナル親抗体と同じ抗原性タンパク質の同じエピトープを認識して結合し、同じ特異性及び同等の親和性を有する。
１．ウェスタンブロッティングを使用して、キメラ抗体ヘツキシマブ及びマウスモノクローナル親抗体ヘツモマブが同じ抗原タンパク質を認識して結合し、同じ特異性を有することを実証した。
４種類のヘツモマブ標的抗原陽性のヒト腫瘍細胞ＳＮＵ−５、ＢＧＣ−８２３、ＭＨＣＣ−９７Ｌ、ＢＥＬ７４０２  Ｖ１３の総タンパク質を従来法により抽出し、タンパク質濃度をＢＣＡキットにより定量した。適切な量のタンパク質試料（２０μｇ）をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、セミドライ式エレクトロポレーターを用いてＰＶＤＦ膜に転写した。次いで、ＰＶＤＦ膜をブロッキング溶液（ＴＢＳＴ／５％スキムミルク粉）に配し、水平式攪拌器にて室温で１時間インキュベートした。次いで、一次抗体（キメラ抗体ヘツキシマブ及びマウスモノクローナル親抗体ヘツモマブ、各２ｕｇ／ｍＬ、ブロッキング溶液で希釈）、４℃で一晩インキュベートした。次いで、膜を５回、各回ＴＢＳＴで５分間リンスした。次いで、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ−ＨＲＰに対する又はマウスＩｇＧ  Ｆｃ−ＨＲＰに対する二次抗体（１：２０００から１：５０００希釈）を適宜添加し、室温で１時間インキュベートした。次いで、膜を３回、各回ＴＢＳＴで５分間リンスし、次いでＰＢＳで３回リンスした。可視化を実施した。結果を図１４に示す。
【０２５４】
この結果は、キメラ抗体ヘツキシマブ及びマウスモノクローナル親抗体ヘツモマブが同じタンパク質分子を認識することを示していた。それらはどちらも、抗原タンパク質に特異的に結合し、ヒト真核細胞の他のタンパク質に対し何らバンドを生成しなかったことから、キメラ抗体ヘツキシマブ及びマウスモノクローナル親抗体ヘツモマブは同じ特異性を有する。
【０２５５】
２．免疫組織化学検査を使用して、キメラ抗体ヘツキシマブ及びマウスモノクローナル親抗体ヘツモマブが同じ抗原タンパク質を認識して結合し、同じ特異性を有することを実証した。
前述の従来の免疫組織化学的手法を用いて、ヘツモマブを一次抗体として使用し且つ抗マウス抗体を二次抗体として使用して、並びにキメラ抗体ヘツキシマブを一次抗体として使用し且つ抗ヒト抗体を二次抗体として使用して、ヒトの肝がん、肺がん、及び胃がん患者由来の３つのヘツモマブ標的抗原陽性組織の切片、並びにヒトの肝がん、肺がん、及び胃がん患者由来の３つの陰性組織の切片を検出に供した。
【０２５６】
実験結果は、キメラ抗体ヘツキシマブ及びマウスモノクローナル親抗体ヘツモマブがどちらも、ヒトの肝がん、肺がん、及び胃がん患者由来の３つのヘツモマブ標的抗原陽性組織の切片を陽性に染色できたが、ヒトの肝がん、肺がん、及び胃がん患者由来の３つの陰性組織の切片を染色できなかったことを示し、このことは、キメラ抗体ヘツキシマブ及びマウスモノクローナル親抗体ヘツモマブが、同じ抗原タンパク質を認識して結合すること、ヒト組織の他のタンパク質を認識しなかったこと、ゆえに同じ特異性を有することを指し示している。
【０２５７】
３．競合阻害細胞ＥＬＩＳＡを実施して、キメラ抗体ヘツキシマブ及びマウスモノクローナル親抗体ヘツモマブが同じ抗原タンパク質の同じエピトープを認識して結合し、同等の親和性を有することを実証した。
ＭＨＣＣ−９７Ｌ細胞を９６ウェル培養プレートに播種し（細胞４×１０３個／ウェル）、細胞が９０％〜１００％に成長した時に実験を実施した。ウェル中の培養培地を捨てた後、プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ、３００μＬ／ウェル、１分間×５回で洗浄した。次いで、以下の設計に基づき、２連、１００μＬ／ウェルで試料を添加し、３７℃で１．５時間インキュベートした。ウェルから液体を捨てた後、プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ、３００μＬ／ウェル、１分間×５回で洗浄した。ヒトＩｇＧ  Ｆｃ−ＨＲＰに対する（マウスＩｇＧ  Ｆｃに反応性がない）又はマウスＩｇＧ  Ｆｃ−ＨＲＰに対する（ヒトＩｇＧ  Ｆｃに反応性がない）１：５０００希釈の対応の二次抗体を、次いで１００μＬ／ウェルで添加し、３７℃で１時間インキュベートした。ウェル中の液体を捨てた後、プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ、３００μＬ／ウェル、１分間×３回で洗浄し、次いで、純水で２回、再び洗浄した。純水を振って除いた後、次いでＴＭＢを１００μＬ／ウェルで添加し、次いで可視化のために３７℃で３０分間インキュベートし；次いで２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を５０μＬ／ウェルで添加した。その後、ＯＤ４５０をマイクロプレートリーダーによって測定した。
【０２５８】
抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ−ＨＲＰ（マウスＩｇＧ  Ｆｃに反応性がない）を二次抗体として使用した際の、結果を以下の表に示す：
【表２５】
2020524527.tif 000026
【０２５９】
抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ−ＨＲＰ（ヒトＩｇＧ  Ｆｃに反応性がない）を二次抗体として使用した際の、結果を以下の表に示す：
【表２６】
2020524527.tif 000027
【０２６０】
表２４及び表２５の元となった結果をプロットし、図１５に示す。図１５から、キメラ抗体ヘツキシマブ及びマウスモノクローナル親抗体ヘツモマブが互いに有意に競合して、標的細胞であるＭＨＣＣ−９７Ｌ細胞の表面の標的抗原への他方の結合を阻害することを見ることができるが、このことは、キメラ抗体ヘツキシマブ及びマウスモノクローナル親抗体ヘツモマブが同じ抗原タンパク質の同じエピトープを認識して結合すること、並びにそれらが同様の競合阻害効率を示すことを指し示しており、キメラ抗体ヘツキシマブ及びマウスモノクローナル親抗体ヘツモマブが同等の親和性を有することを示唆している。
【０２６１】
実施例９  キメラ抗体ヘツキシマブ及びマウスモノクローナル親抗体は、同じ腫瘍幹細胞を認識し、腫瘍幹細胞を阻害することについて同じ薬学的効果を有する。
１．キメラ抗体ヘツキシマブ及びマウスモノクローナル親抗体ヘツモマブは、同じ腫瘍幹細胞群を認識する。
上記に記載されるように、４つの細胞株ＳＮＵ−５、ＢＧＣ−８２３、ＭＨＣＣ−９７Ｌ、及びＢＥＬ７４０２  Ｖ１３を使用して、親細胞と腫瘍幹細胞に富んだスフェア細胞との両方を採取した。ヘツキシマブ（抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃを二次抗体として使用）及びヘツモマブ（抗マウスＩｇＧ  Ｆｃを二次抗体として使用）をそれぞれフロー免疫蛍光実験に用いて、上記の４つの細胞株の親細胞及び腫瘍幹細胞に富んだスフェア細胞における陽性細胞の割合と、スフェア細胞におけるそれらの濃縮倍率とを検出した。結果は以下の通りである：
【表２７】
2020524527.tif 000028
【０２６２】
上記の結果から、４種類の腫瘍細胞及び腫瘍幹細胞に富んだスフェア細胞で、２つの抗体が極めて一貫した陽性率及び濃縮を有することを見ることができる。よって、キメラ抗体ヘツキシマブ及びマウスモノクローナル親抗体ヘツモマブは、同じ腫瘍幹細胞群を認識する。
【０２６３】
２．キメラ抗体ヘツキシマブ及びマウスモノクローナル親抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで腫瘍幹細胞を阻害することについて同じ薬学的効果を有する。
上記に記載された同じ工程を用いて、４つの細胞株、すなわちＳＮＵ−５細胞株、ＢＧＣ−８２３細胞株、ＭＨＣＣ−９７Ｌ細胞株、ＢＥＬ７４０２  Ｖ１３細胞株の腫瘍幹細胞に富んだスフェア細胞を用いることによって、並びにヘツキシマブ及びヘツモマブを用いて従来のスフェア形成阻害実験を実施することによって、上記の４つの細胞株の腫瘍幹細胞に富んだスフェア細胞においてヘツキシマブ及びヘツモマブが腫瘍幹細胞を阻害する薬学的効果を検出した。結果を下記の表に示す：
【表２８】
2020524527.tif 000029
2020524527.tif 000030
【０２６４】
上記の結果から、４種類の腫瘍細胞株の腫瘍幹細胞のスフェア形成の阻害に際して、それぞれの個別の濃度勾配にある２つの抗体が極めて一貫した効率を有することを見ることができる。よって、キメラ抗体ヘツキシマブ及びマウスモノクローナル親抗体ヘツモマブは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで腫瘍幹細胞を阻害することについて同じ薬学的効果を有する。
【０２６５】
実施例１０  マウスモノクローナル抗体ヘツモマブの可変領域配列のヒト化及びグリコシル化部位の改変
この実施例では、マウスモノクローナル抗体ヘツモマブの可変領域タンパク質配列に基づき、ヘツモマブのグリコシル化部位改変及びヒト化を、配列設計、遺伝子合成、クローニング、及び真核細胞のトランスフェクションによって実施した。
【０２６６】
ヒト抗体生殖系列遺伝子の配列ライブラリー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ２．ｍｒｃ−ｌｍｂ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅ／ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ２．ｐｈｐ＃ＶＨＥＸ）において、相同性比較の結果に基づいて、最も類似したヒト抗体の鋳型を見出した。最終的に、ＣＤＲ移植に用いる基本的な鋳型としてＶＨ２（３−１）を選択し、ヘツモマブのＶＨ  ＣＤＲ−１、ＶＨ  ＣＤＲ−２、及びＶＨ  ＣＤＲ−３をそのＦＲフレームワークに移植した。ヘツモマブのＶＨ  ＣＤＲ−３の配列に従って、ヒト生殖系列のＪＨ４（ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）をＪ領域の配列として選択した。次いで、完全ヒト化重鎖可変領域ＦＲを有する重鎖可変領域タンパク質配列を設計し、ヘツズマブＨ１と命名した。Ｈ１バージョンは、フレームワーク領域において完全ヒト化を達成していた。
【０２６７】
Ｈ１重鎖配列に基づき、２つの他の重鎖変異体を初発のヒト化：Ｈ２及びＨ３として設計した。これらのバージョンのヒト化の程度は降順とした。特異的な配列を図１６に示す。キメラ抗体ヘツキシマブの軽鎖と組み合わせると、３つの全ての重鎖変異体（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）がキメラ抗体ヘツキシマブの親和性を保持していたことが、細胞ＥＬＩＳＡによって見出された。Ｈ１はフレームワーク領域が全てヒト化された最もヒト化されたバージョンであったことから、最終的にＨ１を好適なヒト化分子の鋳型として決定した。
【０２６８】
また、３つの変異体を軽鎖の初発のヒト化として設計した。相同性比較の結果に基づいて、最も類似したヒト抗体の鋳型をヒト抗体生殖系列ライブラリー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ２．ｍｒｃ−ｌｍｂ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅ／ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ２．ｐｈｐ＃ＶＨＥＸ）に見出した。基本的な鋳型としてＶＫＩＩ（Ｏ１１）及びＪＫ１を選択し、ヘツモマブのＶＬ  ＣＤＲ−１、ＶＬ  ＣＤＲ−２、及びＶＬ  ＣＤＲ−３をそれらのＦＲフレームワークに移植した。完全にヒト化された軽鎖可変領域ＦＲを有する軽鎖可変領域タンパク質配列を設計し、ヘツズマブＬ１と命名した。Ｌ１バージョンは、フレームワーク領域において完全ヒト化を達成していた。
【０２６９】
完全ヒト化ＦＲ領域を有するＬ１に基づき、Ｌ２及びＬ３を設計し、この３つのバージョンのヒト化の程度も降順とした。しかし、キメラ抗体ヘツキシマブの重鎖と組み合わせることによって、３つの軽鎖変異体の親和性が大きく低減したことが、細胞性ＥＬＩＳＡ法を用いて見出された。ヒト化の間にどの鍵アミノ酸が変異されたのかを見出すために、戻し変異を実施し、９つの異なる変異体（Ｌ４〜Ｌ１２）を調製した。特異的な配列を図１７に示す。
【０２７０】
細胞性ＥＬＩＳＡ法を用いて親和性を分析することによって、軽鎖の９位及び４２位のフェニルアラニン（Ｆ９及びＦ４２）を戻し変異しなければならないことが見出され、これらの２つのマウス由来アミノ酸残基を保持する６番目の変異体（Ｌ６）の親和性は回復した。Ｌ６に基づくさらに高度にヒト化されたバージョンＬ１１の親和性は、Ｌ６に近いものであり、ヒト化された軽鎖の１１番目のＡｓｎを有するＬ１２の親和性もまた、Ｌ１１と同様であったが、他の変異体バージョンは異なっていた。そのため、Ｌ６、Ｌ１１、及びＬ１２が、最も良い軽鎖ヒト化バージョンの最適化スクリーニングのために最終的に選択された。
【０２７１】
一方、ヘツズマブＨ１重鎖のグリコシル化異性体を、抗体配列解析及び還元電気泳動分析によって確認した。電気泳動によるＨ１重鎖発現生成物の分析では、Ｈ１Ｌ６、Ｈ１Ｌ１１、及びＨ１Ｌ１２は全て、重鎖の主要バンドの下に見えた弱いサブバンドと共に示された。この分析は、グリコシル化異性体を生じる不均一なグリコシル化を重鎖が有する可能性があることを指し示していた（図１８）。このことは、均一性に関する深刻な品質の問題を引き起こす可能性があり、薬剤の開発には望ましくない。配列解析は、Ｎ６２（ＣＤＲ２に配置）及びＮ１０７（ＣＤＲ３に配置）が潜在的な２つのグリコシル化部位であることを示した。アラニン変異をこれら２つの部位で実施し、得られたような重鎖の新しい２つのヒト化バージョン：Ｈ４としてＮ６２Ａ（そのＣＤＲ２配列を配列番号１３に示す）、及びＨ５としてＮ１０７Ａ（そのＣＤＲ３配列を配列番号１４に示す）を設計した。Ｈ４及びＨ５をＬ１１にそれぞれ組み合わせて、発現後に電気泳動によって分析した。Ｈ５のグリコシル化異性（Ｈ１Ｎ１０７Ａ）が消失したことが見出され、細胞ＥＬＩＳＡによって、Ｈ５Ｌ１１がほぼ同等の親和性を維持していたこと；及びＨ４のグリコシル化異性（Ｈ１Ｎ６２Ａ）が依然として存在し、親和性が減少したこと（図１９Ａ）が見出された。さらに、Ｈ５とＬ１１及びＬ６とを組み合わせることによって、グリコシル化異性は消失し、重鎖は均一なバンドを示すことが確認された（図１９Ｂ）。よって、Ｈ５（Ｈ１  Ｎ１０７Ａ）が、最終的に選択された可変領域配列である。
【０２７２】
最も良いヒト化バージョンを決定するために、３つのヒト化の組合せの候補（Ｈ５Ｌ６、Ｈ５Ｌ１１、Ｈ５Ｌ１２）を選択し、精製抗体を調製した。Ｈ５Ｌ６、Ｈ５Ｌ１１、及びＨ５Ｌ１２の軽鎖及び重鎖のコード配列を真核生物用高発現ベクターにクローニングし、懸濁培養で維持されたＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６４）細胞にエレクトロトランスフェクトした。安定発現株をＭＳＸスクリーニングによって得て、血清不含タンパク質不含ＣＤ−ＣＨＯ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてフェドバッチ培養した。培養によって得られた上清をプロテインＡ（ＧＥ、Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ  ｓｕｒｅカラム）親和性クロマトグラフィーカラムによって精製し、不純物を陽イオン交換カラムによってさらに除去した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＨＰＬＣ分析により、生成物の純度は９５％超であり（例としてＨ５Ｌ１１を用いて結果を図２０に示す）、エンドトキシンのレベルは＜３ＥＵ／ｍｇであった。それは様々な薬学的実験及びサル薬物動態解析に使用できるものである。
【０２７３】
実施例１１  ヘツズマブの３つのヒト化バリアント（Ｈ５Ｌ６、Ｈ５Ｌ１１、Ｈ５Ｌ１２）は全て、マウスモノクローナル親抗体と同じ抗原タンパク質の同じエピトープを認識して結合する。
１．免疫組織化学検査を使用して、ヘツズマブの３つのヒト化バリアント（Ｈ５Ｌ６、Ｈ５Ｌ１１、Ｈ５Ｌ１２）が、キメラ抗体ヘツキシマブ及びマウスモノクローナル親抗体ヘツモマブと同じ抗原タンパク質を認識して結合すること、並びに同じ特異性を有することを実証した。
【０２７４】
前述の従来の免疫組織化学的手法を用いて、ヘツモマブを一次抗体として使用し且つ抗マウス抗体を二次抗体として使用して；キメラ抗体ヘツキシマブを一次抗体として使用し且つ抗ヒト抗体を二次抗体として使用して；並びにヘツズマブの３つのヒト化バリアントを一次抗体として使用し且つ抗ヒト抗体を二次抗体として使用して、ヒトの肝がん、肺がん、及び胃がん患者由来の１０種のヘツモマブ標的抗原陽性組織の切片、並びにヒトの肝がん、肺がん、及び胃がん患者由来の１０種の陰性組織の切片を検出に供した。
【０２７５】
実験結果は、ヘツズマブの３つのヒト化バリアント（Ｈ５Ｌ６、Ｈ５Ｌ１１、Ｈ５Ｌ１２）、キメラ抗体ヘツキシマブ、及びマウスモノクローナル親抗体ヘツモマブが、ヒトの肝がん、肺がん、及び胃がん患者由来の１０種のヘツモマブ標的抗原陽性組織の切片を陽性に染色できたが、ヒトの肝がん、肺がん、及び胃がん患者由来の１０種の陰性組織の切片を染色しなかったことを示し、このことは、ヘツズマブの３つのヒト化バリアント（Ｈ５Ｌ６、Ｈ５Ｌ１１、Ｈ５Ｌ１２）、キメラ抗体ヘツキシマブ、及びマウスモノクローナル親抗体ヘツモマブが、同じ抗原タンパク質を認識して結合すること、ヒト組織の他のタンパク質を認識しなかったこと、ゆえに同じ特異性を有することを指し示している。
【０２７６】
２．競合阻害細胞ＥＬＩＳＡ実験を実施して、ヘツズマブの３つのヒト化バリアント（Ｈ５Ｌ６、Ｈ５Ｌ１１、Ｈ５Ｌ１２）及びマウスモノクローナル親抗体ヘツモマブが同じ抗原タンパク質の同じエピトープを認識して結合し、その際にＨ５Ｌ６、Ｈ５Ｌ１１がマウスモノクローナル抗体ヘツモマブと同等の親和性も有することを実証した。
【０２７７】
ＭＨＣＣ−９７Ｌ細胞を９６ウェル培養プレートに播種し（細胞４×１０３個／ウェル）、細胞が９０％〜１００％に成長した時に実験を実施した。ウェル中の培養培地を捨てた後、プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ、３００μＬ／ウェル、１分間×５回で洗浄した。次いで、２連、１００μＬ／ウェルで試料を添加し、３７℃で１．５時間インキュベートした。ウェルから液体を捨てた後、プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ、３００μＬ／ウェル、１分間×５回で洗浄した。ヒトＩｇＧ  Ｆｃ−ＨＲＰに対する（マウスＩｇＧ  Ｆｃに反応性がない）又はマウスＩｇＧ  Ｆｃ−ＨＲＰに対する（ヒトＩｇＧ  Ｆｃに反応性がない）１：５０００希釈の対応の二次抗体を、次いで１００μＬ／ウェルで添加し、３７℃で１時間インキュベートした。ウェル中の液体を捨てた後、プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ、３００μＬ／ウェル、１分間×３回で洗浄し、次いで、純水で２回、再び洗浄した。純水を振って除いた後、次いでＴＭＢを１００μＬ／ウェルで添加し、次いで可視化のために３７℃で３０分間インキュベートし；次いで２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を５０μＬ／ウェルで添加した。ＯＤ４５０をマイクロプレートリーダーによって測定した。
【０２７８】
結果を下記の表２８、表２９及び図２１に示す：
【表２９】
2020524527.tif 000031
【表３０】
2020524527.tif 000032
【０２７９】
各ヒト化モノクローナル抗体の濃度を０．２５ｕｇ／ｍＬとし、マウスモノクローナル抗体の濃度勾配を用いて、各ヒト化モノクローナル抗体の抗原への結合を競合的に阻害した際に、マウスモノクローナル抗体に対し算出されたＩＣ５０の結果を下記の表３０に示す。
【表３１】
2020524527.tif 000033
【０２８０】
上記の結果から、マウスモノクローナル親抗体ヘツモマブが、ヘツズマブの３つのバリアント（Ｈ５Ｌ６、Ｈ５Ｌ１１、Ｈ５Ｌ１２）、キメラ抗体ヘツキシマブのＭＨＣＣ−９７Ｌ細胞の表面の標的抗原への結合を有意に阻害できることを見ることができ、このことは、ヘツズマブの３つのバリアント（Ｈ５Ｌ６、Ｈ５Ｌ１１、Ｈ５Ｌ１２）、キメラ抗体ヘツキシマブ、及びマウスモノクローナル親抗体ヘツモマブが同じ抗原タンパク質の同じエピトープを認識して結合することを指し示している。ヘツズマブの２つのバリアント（Ｈ５Ｌ６、Ｈ５Ｌ１１）は、同様の程度の競合阻害を示し、それは僅かにキメラ抗体ヘツキシマブよりも高かったのに対し、ヘツズマブの１つのバリアント（Ｈ５Ｌ１２）は、有意にさらに高い程度の競合阻害を示した。このことは、キメラ抗体ヘツキシマブ及びマウスモノクローナル親抗体ヘツモマブの親和性が同等であったことを示唆していた。ヘツズマブの２つのヒト化バリアント（Ｈ５Ｌ６、Ｈ５Ｌ１１）の親和性が僅かに低減したとはいえ、それらは概ね同等の親和性を有するのに対し；ヘツズマブのヒト化バリアントＨ５Ｌ１２の親和性は減少している。
【０２８１】
マウスモノクローナル抗体の濃度を０．２５ｕｇ／ｍＬとし、各ヒト化モノクローナル抗体の濃度勾配を用いて、抗原へのマウスモノクローナル抗体の結合を競合的に阻害した。各ヒト化モノクローナル抗体について算出したＩＣ５０の結果を下記の表３１に示す。
【表３２】
2020524527.tif 000034
【０２８２】
上記の結果から、ヘツズマブの３つのバリアント（Ｈ５Ｌ６、Ｈ５Ｌ１１、Ｈ５Ｌ１２）及びキメラ抗体ヘツキシマブがＭＨＣＣ−９７Ｌ細胞の表面の標的抗原へのマウスモノクローナル親抗体ヘツモマブの結合を有意に競合的に阻害できることを見ることができ、このことは、ヘツズマブの３つのバリアント（Ｈ５Ｌ６、Ｈ５Ｌ１１、Ｈ５Ｌ１２）、キメラ抗体ヘツキシマブ、及びマウスモノクローナル親抗体ヘツモマブが同じ抗原タンパク質の同じエピトープを認識して結合することを指し示している。尚、ヘツズマブの２つのバリアント（Ｈ５Ｌ６、Ｈ５Ｌ１１）がキメラ抗体ヘツキシマブよりも僅かに低く、同様の競合阻害効率を示したのに対し、ヘツズマブの１つのバリアント（Ｈ５Ｌ１２）はさらに低い競合阻害効率を示した。このことは、キメラ抗体ヘツキシマブ及びマウスモノクローナル親抗体ヘツモマブの親和性が同等であることを示唆していた。ヒト化抗体ヘツズマブの２つのバリアント（Ｈ５Ｌ６、Ｈ５Ｌ１１）の親和性は僅かに低減されたものの、それらは概ね同等の親和性を有する。ヘツズマブのヒト化バリアントＨ５Ｌ１２の親和性は減少している。
【０２８３】
これらの結果から、ヘツズマブの３つのヒト化バリアント（Ｈ５Ｌ６、Ｈ５Ｌ１１、Ｈ５Ｌ１２）、キメラ抗体ヘツキシマブ、及びマウスモノクローナル親抗体ヘツモマブは全て、標的細胞であるＭＨＣＣ−９７Ｌ細胞の表面の標的抗原へ結合することについて互いに対し有意に競合することを見ることができ、このことは、ヘツズマブの３つのヒト化バリアント（Ｈ５Ｌ６、Ｈ５Ｌ１１、Ｈ５Ｌ１２）、キメラ抗体ヘツキシマブ、及びマウスモノクローナル親抗体ヘツモマブが同じ抗原タンパク質の同じエピトープを認識し結合することを指し示している。Ｈ５Ｌ６、Ｈ５Ｌ１１、ヘツキシマブ、及びヘツモマブは、互いに同様の競合阻害を示したが、このことは、Ｈ５Ｌ６、Ｈ５Ｌ１１、及びマウスモノクローナル抗体ヘツモマブが同等の親和性を有することを示唆する。
【０２８４】
実施例１２  ヘツズマブのヒト化バリアントは全て、その親モノクローナル抗体と同じ腫瘍幹細胞を認識し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍幹細胞を阻害することについて同じ薬学的効果を有する。
１．フロー免疫蛍光実験を用いて、３つのヒト化バリアント（Ｈ５Ｌ６、Ｈ５Ｌ１１、Ｈ５Ｌ１２）がマウスモノクローナル親抗体ヘツモマブと同じ腫瘍幹細胞群を認識することを実証した。
【０２８５】
前述の方法に従って、４つの細胞株ＳＮＵ−５、ＢＧＣ−８２３、ＭＨＣＣ−９７Ｌ、及びＢＥＬ７４０２  Ｖ１３を使用して、親細胞と腫瘍幹細胞に富んだスフェア細胞との両方を収集した。ヘツズマブの３つのヒト化バリアント（Ｈ５Ｌ６、Ｈ５Ｌ１１、Ｈ５Ｌ１２）、ヘツキシマブ（抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃを二次抗体として使用）、及びヘツモマブ（抗マウスＩｇＧ  Ｆｃを二次抗体として使用）をフロー免疫蛍光実験にそれぞれ使用し、上記の４つの細胞株の親細胞及び腫瘍幹細胞に富んだスフェア細胞における陽性細胞の割合、並びにスフェア細胞におけるそれらの濃縮倍率を検出した。結果は以下の通りである：
【表３３】
2020524527.tif 000035
【０２８６】
上記の結果から、ヘツズマブの３つのヒト化バリアント（Ｈ５Ｌ６、Ｈ５Ｌ１１、Ｈ５Ｌ１２）、キメラ抗体ヘツキシマブ、及びマウスモノクローナル親抗体ヘツモマブが、４種の腫瘍細胞及び腫瘍幹細胞に富んだスフェア細胞において極めて一貫した陽性率及び濃縮を有することを見ることができ、特にヘツズマブＨ５Ｌ６及びヘツズマブＨ５Ｌ１１に見ることができる。そのため、ヘツズマブの３つのバリアント（Ｈ５Ｌ６、Ｈ５Ｌ１１、Ｈ５Ｌ１２）、キメラ抗体ヘツキシマブ、及びマウスモノクローナル親抗体ヘツモマブは、同じ腫瘍幹細胞群を認識する。
【０２８７】
２．スフェア形成阻害実験を用いて、ヘツズマブのヒト化バリアント、キメラ抗体ヘツキシマブ、及びマウスモノクローナル親抗体ヘツズマブが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで腫瘍幹細胞を阻害することについて同じ薬学的効果を有することを実証した。
上記に記載された同じ工程に従って、４つの細胞株、すなわちＳＮＵ−５細胞株、ＢＧＣ−８２３細胞株、ＭＨＣＣ−９７Ｌ細胞株、ＢＥＬ７４０２  Ｖ１３細胞株の腫瘍幹細胞に富んだスフェア細胞を用いることによって、並びにヘツズマブの各種バリアント、ヘツキシマブ、及びヘツモマブを用いて従来のスフェア形成阻害実験を実施することによって、抗体の腫瘍幹細胞を阻害する薬学的効果を検出した。４つの細胞株の結果は以下の通りである：
【表３４】
2020524527.tif 000036
2020524527.tif 000037
2020524527.tif 000038
【０２８８】
上記の結果から、様々な濃度のヘツズマブの２つのヒト化バリアント（Ｈ５Ｌ６、Ｈ５Ｌ１１）、キメラ抗体ヘツキシマブ、及びマウスモノクローナル親抗体ヘツモマブが、４つの腫瘍細胞株の腫瘍幹細胞に富んだスフェア細胞のスフェア形成を阻害する際に極めて一貫した効率を有することを見ることができる。ゆえに、ヘツズマブの２つのヒト化バリアント（Ｈ５Ｌ６、Ｈ５Ｌ１１）、及びマウスモノクローナル親抗体ヘツモマブは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで腫瘍幹細胞を阻害することについて同じ薬学的効果を有する。
【０２８９】
３．ヘツズマブのヒト化バリアントは、ヒト肝がん移植腫瘍のｉｎ  ｖｉｖｏでの成長を有意に阻害し、化学療法の治療効能を相乗的に亢進することができ、有意な抗腫瘍薬学的効果を有し得る。
ヒト化ヘツモマブによるヌードマウスにおけるヒト肝がんの治療について実験を実施した。肝がんを治療するためのモノクローナル抗体単独、化学療法薬単独、及びモノクローナル抗体と化学療法薬との組合せの治療効能を観察して比較した。さらに、ヘツモマブがｉｎ  ｖｉｖｏで肝臓腫瘍の成長を阻害し、化学療法の治療効果を相乗的に亢進できるか否かを比較し分析した。
【０２９０】
具体的には、ヒト肝がん細胞株Ｂｅｌ７４０２−Ｖ１３のスフェア細胞を採取して、ヌードマウスに細胞３００００個／マウスで皮下接種した。マウスを以下の７群に、各群８匹のマウスとして分けた：ＰＢＳ対照群；マウスＩｇＧ対照群；化学療法群（シスプラチン０．３ｍｇ／ｋｇ）；高用量ヘツズマブＨ５Ｌ１１群（２０ｍｇ／ｋｇ）；低用量ヘツズマブＨ５Ｌ１１群（１．２５ｍｇ／ｋｇ）；高用量ヘツズマブＨ５Ｌ１１＋化学療法薬群；及び低用量ヘツズマブＨ５Ｌ１１＋化学療法薬群。がん細胞の接種後２日目に抗体治療を開始した。実験群及び対照群を腹腔内注射によって治療した。抗体治療を３６日間実施した。化学療法薬群を４週間、週に２回治療した。皮下移植腫瘍の大径及び小径を、週に２回測定した。腫瘍体積を式Ｖ＝（π／６）×（大径×小径×小径）を用いて算出した。各群の腫瘍体積の変化を観察した。
【０２９１】
接種の３６日後に治療を停止した際に、マウスの腫瘍体積の成長を観察及び測定して、阻害率を算出した。マウスにおける移植腫瘍の成長曲線を図２２に示し、腫瘍体積阻害率を表３４に示す。ヒト化モノクローナル抗体ヘツズマブＨ５Ｌ１１は、ヌードマウスにおいてヒト肝がん移植腫瘍の成長を有意に阻害できるが、移植腫瘍に対するその阻害率は抗体の用量の増加に伴って増加した。薬剤中止時に、高用量及び低用量のヒト化モノクローナル抗体ヘツズマブＨ５Ｌ１１が移植腫瘍に及ぼす阻害率は、それぞれ４７．４７％及び３６．８０％であった。化学療法群の阻害率は１４．５２％に過ぎず、これはその療法がほぼ効果のないものであったことを意味する。しかし、化学療法薬に組み合わされた高用量及び低用量のヒト化モノクローナル抗体ヘツズマブＨ５Ｌ１１の群の阻害率は、それぞれ６５．０８％及び３２．６６％に達した。この結果は、化学療法薬に組み合わされたヒト化モノクローナル抗体ヘツズマブＨ５Ｌ１１がマウスにおいて移植腫瘍に及ぼす阻害性率が、ｐ＜０．０５で化学療法単独及び抗体単独よりも高かったことを示唆する。化学療法薬との組合せのヒト化モノクローナル抗体ヘツズマブＨ５Ｌ１１の群は、移植腫瘍の治療においてさらに高い治療効果を示した。
【０２９２】
上記の結果は、単独で適用された際のヒト化モノクローナル抗体ヘツズマブＨ５Ｌ１１がヒト悪性腫瘍の移植腫瘍の成長を有意に阻害し得ること、及びヒト悪性腫瘍を阻害する有意な薬学的効果を有することを示している。ヒト化モノクローナル抗体ヘツズマブＨ５Ｌ１１と化学療法薬との組合せは全て、移植腫瘍に対する高い阻害率を示し、それゆえに腫瘍増殖を有意に阻害し、且つ抗体単独群及び化学療法薬単独よりも良好な治療効果をもたらすことができたが、このことは、ヒト化モノクローナル抗体ヘツズマブＨ５Ｌ１１と化学療法薬との組合せが効果的に腫瘍増殖を阻害し、化学療法薬耐性を低減し得ることを指し示している。
【表３５】
2020524527.tif 000039
【０２９３】
腫瘍の阻害に関する上記動物実験の結果は、ヒト化モノクローナル抗体ヘツズマブＨ５Ｌ１１がｉｎ  ｖｉｖｏでヒト腫瘍の成長及び薬剤耐性への有意な阻害効果（薬学的効果）を有し、ヒト腫瘍の成長、転移、及び薬剤耐性に対処するための重要な適用価値を有することを実証した。
【０２９４】
〔配列表〕
>配列番号1    ヘツモマブ軽鎖可変領域
DIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYLYWFLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELYTFGGGTKLEIK
>配列番号2    ヘツモマブVL-CDR1
RSSKSLLHSNGITYLY
>配列番号3    ヘツモマブVL-CDR2
QMSNLAS
>配列番号4    ヘツモマブVL-CDR3
AQNLELYT
>配列番号5    ヘツモマブ重鎖可変領域
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTISKDSSNNQVFLKITSVDTADTATYYCARSFYYYANNSFAYWGQGTLVTVSS
>配列番号6    ヘツモマブVH-CDR1
TSGMGVS
>配列番号7    ヘツモマブVH-CDR2
HIYWDDDKRYNPSLKS
>配列番号8    ヘツモマブVH-CDR3
SFYYYANNSFAY
>配列番号9    ヘツキシマブキメラ抗体重鎖アミノ酸配列
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTISKDSSNNQVFLKITSVDTADTATYYCARSFYYYANNSFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
>配列番号10    ヘツキシマブキメラ抗体軽鎖アミノ酸配列
DIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYLYWFLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
>配列番号11    ヒトIgG1 CH
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
>配列番号12    ヒトIgG CK
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
>配列番号13    変異型VH CDR2
HIYWDDDKRYAPSLKS
>配列番号14    変異型VH CDR3
SFYYYAANSFAY
>配列番号15    ヒト化重鎖可変領域H1
QVTLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKALEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARSFYYYANNSFAYWGQGTLVTVSS
>配列番号16    ヒト化重鎖可変領域H2
QVTLKESGPGILQPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKALEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARSFYYYANNSFAYWGQGTLVTVSS
>配列番号17    ヒト化重鎖可変領域H3
QVTLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKALEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTISKDTSKNQVFLKITSVDPVDTATYYCARSFYYYANNSFAYWGQGTLVTVSS
>配列番号18    ヒト化重鎖可変領域H4
QVTLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKALEWLAHIYWDDDKRYAPSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARSFYYYANNSFAYWGQGTLVTVSS
>配列番号19    ヒト化重鎖可変領域H5
QVTLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKALEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARSFYYYAANSFAYWGQGTLVTVSS
>配列番号20    ヒト化軽鎖可変領域L1
DIVMTQTPLSLPVTLGQPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELYTFGQGTKVEIK
>配列番号21    ヒト化軽鎖可変領域L2
DIVMTQAAFSLPVTLGQPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELYTFGQGTKVEIK
>配列番号22    ヒト化軽鎖可変領域L3
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>配列番号23    ヒト化軽鎖可変領域L4
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>配列番号24    ヒト化軽鎖可変領域L5
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>配列番号25    ヒト化軽鎖可変領域L6
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>配列番号26    ヒト化軽鎖可変領域L7
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>配列番号27    ヒト化軽鎖可変領域L8
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>配列番号28    ヒト化軽鎖可変領域L9
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>配列番号29    ヒト化軽鎖可変領域L10
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>配列番号30    ヒト化軽鎖可変領域L11
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>配列番号31    ヒト化軽鎖可変領域L12
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>配列番号32    ヒト化重鎖H1
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>配列番号33    ヒト化重鎖H2
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>配列番号34    ヒト化重鎖H3
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>配列番号35    ヒト化重鎖H4
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>配列番号36    ヒト化重鎖H5
QVTLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKALEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARSFYYYAANSFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
>配列番号37    ヒト化軽鎖L1
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>配列番号38    ヒト化軽鎖L2
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>配列番号39    ヒト化軽鎖L3
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>配列番号40    ヒト化軽鎖L4
DIVMTQTPLSLPVTLGQPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWFLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
>配列番号41    ヒト化軽鎖L5
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>配列番号42    ヒト化軽鎖L6
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>配列番号43    ヒト化軽鎖L7
DIVMTQTPFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
>配列番号44    ヒト化軽鎖L8
DIVMTQSPFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYLYWFLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
>配列番号45    ヒト化軽鎖L9
DIVMTQSAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYLYWFLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
>配列番号46    ヒト化軽鎖領域L10
DIVMTQTPFSLPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYLYWFLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
>配列番号47    ヒト化軽鎖L11
DIVMTQTPFSNPVTLGQPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWFLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
>配列番号48    ヒト化軽鎖L12
DIVMTQTPFSLPVTLGQPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWFLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【図１】
2020524527.tif 000040
【図２】
2020524527.tif 000041
【図３】
2020524527.tif 000042
【図４】
2020524527.tif 000043
【図５】
2020524527.tif 000044
【図６】
2020524527.tif 000045
【図７】
2020524527.tif 000046
【図８】
2020524527.tif 000047
【図９】
2020524527.tif 000048
【図１０】
2020524527.tif 000049
【図１１】
2020524527.tif 000050
【図１２】
2020524527.tif 000051
【図１３】
2020524527.tif 000052
【図１４】
2020524527.tif 000053
【図１５】
2020524527.tif 000054
【図１６】
2020524527.tif 000055
【図１７】
2020524527.tif 000056
【図１８】
2020524527.tif 000057
【図１９】
2020524527.tif 000058
【図２０】
2020524527.tif 000059
【図２１】
2020524527.tif 000060
【図２２】
2020524527.tif 000061
【配列表】
2020524527000001.app
【国際調査報告】
2020524527.tif 000062
2020524527.tif 000063
2020524527.tif 000064
2020524527.tif 000065
2020524527.tif 000066
2020524527.tif 000067
2020524527.tif 000068
2020524527.tif 000069