(57)【要約】  自己免疫疾患及び糖尿病を治療するウイルスベクター、その構築方法及び応用を提供し、該ウイルスベクターは、ｍｆａｔ−１遺伝子がクローニングされたレンチウイルス発現プラスミド又はアデノ随伴ウイルス発現プラスミドであり、前記ｍｆａｔ−１遺伝子は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：１に示される。  【選択図】図４
2020512010.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスベクターであって、
ｍｆａｔ−１遺伝子がクローニングされたレンチウイルス発現プラスミド又はｍｆａｔ−１遺伝子がクローニングされたアデノ随伴ウイルス発現プラスミドであり、
前記ｍｆａｔ−１遺伝子は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：１に示されることを特徴とするウイルスベクター。
【請求項２】
前記レンチウイルス発現プラスミドは、ｐＬＪＭ１−ＣＭＶ−ｈＰＧＫ−ＥＧＦＰプラスミド、ｐＬＪＭ１−ＣＭＶ−ｈＰＧＫ−ｍｋａｔｅ２プラスミド、ｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＧＦＰ−ＳＶ−ｐｕｒｏプラスミド、ＦＵＧＷ、ｐＬｅｎｔｉ−ｐｕｒｏ、ｐＬｅｎｔｉ−ＭＰ２又はｐＬｅｎｔｉプラスミドであり、前記アデノ随伴ウイルス発現プラスミドは、ｐＥＭＢＬ−ＡＡＶ−Ｄ（＋）−ＣＭＶ−ｅＧＦＰ−ＳＶ４０プラスミド、ＡＡＶ  ＧＦＰプラスミド、ＡＡＶ１プラスミド、ＡＡＶ２プラスミド、ｒＡＡＶ２プラスミド、ＡＡＶ５プラスミド、ＡＡＶ８プラスミド、ＡＡＶ９プラスミド又はｐＡＶ−ＦＨ  ＡＡＶプラスミドであることを特徴とする請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のウイルスベクターの構築方法であって、
前記ｍｆａｔ−１遺伝子をレンチウイルス発現プラスミド又はアデノ随伴ウイルス発現プラスミドにクローニングして、ウイルスベクターを得ることを特徴とする構築方法。
【請求項４】
前記ｍｆａｔ−１遺伝子配列をテンプレートとして、プライマーｍｆａｔ−１−Ｆ：５´−ＴＡＴＴＡＡＧＣＴＡＧＣＡＴＧＧＴＣＧＣＣＣＡＣＡＧＣＡ−３´と、ｍｆａ
ｔ−１−Ｒ：５´−ＣＡＡＣＣＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＣＡＣＴＴＧＧＣＣＴ−３´を
設計してＰＣＲ増幅を行い、得られた前記ｍｆａｔ−１遺伝子配列の両端にＮｈｅＩ及びＥｃｏＲＩ酵素消化部位を持たせるステップ（１）と、
ステップ（１）で得られたＰＣＲ増幅産物を電気泳動し、次に、ゲルを切り出して回収して精製し、得られたＰＣＲ増幅産物を制限エンドヌクレアーゼＮｈｅＩ及びＥｃｏＲで酵素消化して使用時まで保存し、空の前記レンチウイルス発現プラスミド又はアデノ随伴ウイルス発現プラスミドを制限エンドヌクレアーゼＮｈｅＩ及びＥｃｏＲで酵素消化して、使用時まで保存するステップ（２）と、
ステップ（２）で得られたＤＮＡ断片を酵素消化後の前記空のシャトルプラスミドに連結して、ウイルスベクターを得るステップ（３）とを含むことを特徴とする請求項３に記載のウイルスベクターの構築方法。
【請求項５】
前記ステップ（１）におけるＰＣＲ増幅反応系は、
５×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）Ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｇ２＋ｐｌｕｓ）  １０μｌと、
ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（各ｄＮＴＰ  ２．５ｍＭ）  ４μｌと、
テンプレートＤＮＡ  ２０−２００ｎｇと、
上流プライマーｍｆａｔ−１−Ｆ（１０μＭ）１μｌと、
下流プライマーｍｆａｔ−１−Ｒ（１０μＭ）１μｌと、
ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（２．５Ｕ／μｌ）０．５μｌと、
５０μＬまで補充する滅菌超純水とを含むことを特徴とする請求項３又は４に記載のウイルスベクターの構築方法。
【請求項６】
前記ステップ（１）におけるＰＣＲ増幅反応の過程において、９８℃で５分変性し、９８℃で１０秒保持して、６０℃で１５秒保持し、７２℃で２分保持することを合計３０回サイクルし、最後に、７２℃で１０分伸長することを特徴とする請求項３又は４に記載のウイルスベクターの構築方法。
【請求項７】
組換えウイルスベクターであって、
請求項１又は２に記載のウイルスベクターを用いて構築されることを特徴とする組換えウイルスベクター。
【請求項８】
ウイルス粒子であって、
請求項１又は２に記載の前記ウイルスベクターを細胞に形質転換して得るウイルス粒子であることを特徴とするウイルス粒子。
【請求項９】
前記ウイルス粒子の投与方式は、静脈注射であることを特徴とする請求項８に記載のウイルス粒子。
【請求項１０】
請求項１又は２に記載のウイルスベクター、又は請求項７に記載の組換えウイルスベクター、又は請求項８に記載のウイルス粒子の、糖尿病治療薬又は自己免疫関連疾患治療薬の調製における応用
【請求項１１】
前記糖尿病は、自己免疫性１型糖尿病であることを特徴とする請求項１０に記載の応用。
【請求項１２】
前記自己免疫関連疾患は、Ｔｈ細胞分化のアンバランス及びその分泌サイトカインのアンバランスによる自己免疫疾患であることを特徴とする請求項１０に記載の応用。
【請求項１３】
前記自己免疫疾患は、１型糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ及び全身性エリテマトーデスであることを特徴とする請求項１２に記載の応用。
【請求項１４】
医薬品であって、
請求項１又は２に記載のウイルスベクター、又は請求項７に記載の組換えウイルスベクター、又は請求項８に記載のウイルス粒子と、その薬学的に許容可能な担体とを含むことを特徴とする医薬品。
【請求項１５】
一般的なプロセスに従って、請求項１又は２に記載のウイルスベクター、又は請求項７に記載の組換えウイルスベクター、又は請求項８に記載のウイルス粒子に一般的な佐剤を添加して、臨床的に許容可能な剤形に調製することを特徴とする請求項１４に記載の医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖尿病及び免疫のアンバランスにより誘発された自己免疫疾患の治療薬に関し、具体的には、自己免疫疾患及び糖尿病を治療するウイルスベクター、その構築方法及び応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔリンパ球を介した細胞性免疫は、人体の免疫応答の主要な一環である。その中でも、ＣＤ４+Ｔ細胞分化のアンバランスによって引き起こされる免疫障害及び炎症と、さまざまな自己免疫疾患や神経変性疾患との相関性は、長期間にわたって科学者から注目されており、そのメカニズムが部分的に解明されている。ＣＤ４+Ｔ細胞は、異なる転写因子の制御下でＴｈ１、Ｔｈ２、Ｔｒｅｇ及びＴｈ１７に分化し、それらから分泌されるサイトカインを介して互いに制限されて、動的平衡状態を保持することができる。研究から明らかなように、細胞亜集団であるＴｈ１／Ｔｈ２細胞とＴｈ１７／Ｔｒｅｇとのアンバランスは、複数の自己免疫疾患、特に１型糖尿病（Ｔｙｐｅ１  ｄｉａｂｅｔｅｓ、Ｔ１Ｄ）、関節リウマチ（Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ、ＲＡ）、多発性硬化症（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、ＭＳ）、全身性エリテマトーデス（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ、ＳＬＥ）などと密接に関連している。
【０００３】
１型糖尿病は、インスリン依存型糖尿病（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ、ＩＤＤＭ）と呼ばれ、一般的な器官特異的自己免疫疾患であり、児童や青年の健康を深刻な危険にさらす慢性疾患の１つである。アメリカ糖尿病協会により、糖尿病患者の約５％が１型糖尿病であり、そのほとんどが児童期又は青年期に発症することが確認された。児童及び青年の患者では、Ｔ１ＤＭの割合は、約８０〜９０％である。さらに、遅発性の成人潜在性自己免疫性糖尿病（Ｌａｔｅｎｔ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｉｎ  Ａｄｕｌｔｓ、ＬＡＤＡ）があり、その病因が自己免疫性Ｔ１ＤＭに属するが、患者の発症年齢や臨床症状が２型糖尿病と類似している原因で誤診されやすい。中国の１型糖尿病患者の絶対数は１００万人を超えている。１型糖尿病の発症過程に亘って一連の炎症及び免疫障害が伴い、その症状として、主に自己反応性Ｔ細胞による膵島β細胞の攻撃及び自己抗体の産生により膵島β細胞の機能不全及び壊死を引き起こし、インスリン分泌の絶対的不足を招いてしまい、適切な治療を受けないと、失明、腎不全、心臓病、切断などの深刻な合併症を引き起こすことがある。
【０００４】
２型糖尿病は、インスリン非依存型糖尿病（ｎｏｎｉｎｓｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ、ＮＩＤＤＭ）と呼ばれ、糖尿病の大部分を占めている。さまざまな程度のインスリン欠乏と組織のインスリン抵抗性の共同作用が、２型糖尿病の主な発症メカニズムである。２型糖尿病が診断されると、膵島β細胞の機能の進行性が低下し、肝臓のグルコースの産生量及び放出量が増加し、血糖値が上がる。
【０００５】
１型糖尿病か２型糖尿病かにかかわらず、疾患の自然コースには、以下の３つの段階が含まれる。１、最大１０年も続く初期高血糖期。この期間において、１型糖尿病の場合は、β細胞性免疫が既に破壊され、ＧＡＤ又はＩＣＡなどの自己抗体の発生がその主なマーカーである。２型糖尿病の場合は、特定の血清学的マーカーがないが、高インスリン血症や腹部肥満などのインスリン抵抗性症候群を伴う場合が多く、膵島機能には、耐糖能異常（ｉｍｐａｉｒｅｄ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ、ＩＧＴ）及び／又は空腹時血糖異常（Ｉｍｐａｉｒｅｄ  ｆａｓｔｉｎｇ  ｇｌｕｃｏｓｅ、ＩＦＧ）が見られる。２．空腹時血糖及び食後血糖が糖尿病の診断基準を満たす高血糖期。３．慢性合併症期。
【０００６】
近年、免疫調節及び炎症と糖尿病との相関性は、科学者から持続的に注目されており、そのメカニズムが部分的に解明されている。膵島抗原に対する自己免疫応答は、１型糖尿病の発症と進行を支配している。研究から明らかなように、Ｔｈ１細胞過分極化が１型糖尿病を引き起こす要因の１つである。長い間、ＣＤ４+エフェクターリンパ球は、Ｔｈ１とＴｈ２の２つのカテゴリーに分類されており、両方がそれぞれから分泌されたサイトカインによって互いに制限されて、動的平衡状態を保持する。所定のβ細胞の自己抗原がマクロファージ又は他の抗原提示細胞によって処理されると、ＭＨＣ  ＩＩ分子とともに抗原提示細胞の表面に提示されて、自己免疫シグナルの放出を引き起こし、それによりＴｈ１細胞を活性化させて、Ｔｈ２細胞とそのサイトカインの放出を阻害し、Ｔｈ細胞においてＴｈ１細胞の表現型が支配的になり、Ｔｈ１細胞は、さらに細胞傷害性マクロファージ、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８+Ｔ細胞）及びナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）を活性化させ、膵島β細胞を損傷して、膵島の炎症を引き起こし、インスリン分泌の減少又は欠乏を招き、最終的に、１型糖尿病になる。
【０００７】
同様に、２型糖尿病患者のほとんどは、慢性炎症に罹患するとともにインスリン抵抗性を示しており、そのため、２型糖尿病は、炎症性疾患でもある。たとえば、炎症性メディエーターＴＮＦ−αは、インスリンシグナル伝達経路を阻害するいくつかのタンパク質の発現を活性化させて、体のインスリンに対する応答能力を弱め、さらにインスリン抵抗性を誘発させる。デンマークの科学者は、マウスでは、疾患の初期段階でマクロファージが糖尿病に関する膵臓組織に侵入し、次に、これら炎症細胞は、膵臓のインスリン産生用のβ細胞に直接作用して損傷を与える炎症性タンパク質（サイトカイン）を大量に産生し、２型糖尿病を引き起こすことを見出した、この発見は、２０１４年１月にＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙに発表された。さらに研究した結果、後天性免疫におけるＴｈ１細胞とＣＤ８Ｔ細胞は、インスリン抵抗性の発生を促進する一方、Ｔｈ２細胞及びＴｒｅｇ細胞は、このような作用に拮抗できることを見出した。したがって、炎症の制御及びＴ細胞機能の制御も、２型糖尿病の制御及び治療のための重要な標的である。
【０００８】
臨床的には、インスリンなどの従来の医薬品は、２型糖尿病患者の膵臓β細胞機能低下の傾向を効果的に抑制又は逆転させることができず、また、１型糖尿病に対しても、予防及び治療に有効な手段はなかった。臨床研究では、インスリン及び抗拒絶反応薬を注射することにより、Ｔ細胞及び／又は炎症性サイトカインが膵島β細胞を攻撃することを防止するものの、現在の研究結果から、この手段の有効性がサポートできず、それは、免疫抑制剤が一般的に、体の腫瘍や感染のリスクを高めるなど、多くの全身的な副作用をもたらすとともに、その自体もインスリン抵抗性やβ細胞機能の低下につながるためである。さらに、膵島移植による１型糖尿病の治療も楽観的と言えない。２０１１年までに、世界中の５０個以上の医療機関では、５０例以上の膵島細胞移植術が実施されているが、膵島移植の長期的な効果が好適ではなかったり、膵臓ドナーが不足したり、免疫抑制剤の長期使用が必要であったりするため、過去数年間実施されている臨床膵島移植術の数は減少している。モノクローナル抗体Ａｎｔｉ−ＣＤ３は、インスリン分泌機能の低下を軽減し、新規発症１型糖尿病の２年以内のインスリン需要量の増加を減少することができ、１型糖尿病の初期では役割を果たし、若い患者又はより多くのβ細胞機能が残っている２型糖尿病患者にとって有利であるが、免疫力低下、発熱、発疹や貧血などの副作用を有するために、その臨床応用については、まだ評価中である。したがって、糖尿病の炎症及び自己免疫関連の発症メカニズムを正しく理解し、免疫抑制剤を使用せずに済む新方法を開発し、炎症及び自己免疫攻撃に抵抗する新しい細胞内サイトカインを見つけることは、疾患の治療及び管理をより効果的に行うことを可能にし、患者の体にも生活にも大切なことである。
【０００９】
関節リウマチ（Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ、ＲＡ）は、慢性自己免疫疾患である。最近の疫学調査によると、中国人の発症率は、約０．４％であり、白人の１％よりもわずかに低いことが分かった。これに基づいて、中国では、毎年約４００万−５００万人のＲＡ患者があり、且つ、中高齢女性の罹患率は高く、男性と女性の比率は１：３である。ＲＡ患者の免疫系は、周囲の関節の滑膜を誤って攻撃し、炎症、痛みや関節損傷を引き起こす。ＲＡを引き起こす病因は、未だ明らかではないが、近年の研究では、Ｔ細胞機能障害、特にヘルパーＣＤ４+Ｔ細胞の異常な活性化がＲＡの発症の要因であることが幅広く認められている。健常人の体内では、炎症性サイトカインと抗炎症性サイトカインが平衡状態にあり、一方、ＲＡ患者の場合、ある要素が免疫応答を開始させると、Ｔｈ１及びＴｈ１７細胞が活性化されて、炎症性サイトカインを放出し、炎症を引き起こしてその進行を悪化させるとともに、Ｔｈ２及びＴｒｅｇ細胞を阻害し、炎症性及び抗炎症性のバランスがＴｈ１及びＴｈ１７細胞に移行すると、ＲＡの発症を引き起こす可能性がある。ＲＡ患者の血清及び関節の滑液におけるＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、ＩＬ−１、ＩＬ−１７などのサイトカインは、炎症の発生を引き起こし、それを悪化させ続ける。ＩＬ−１７は、滑膜炎症においてＴＮＦ−α及びＩＬ−１と相乗作用し、一連のサイトカイン及びケモカインを誘発し、滑膜炎症を悪化させる。Ｔｈ１及びＴｈ１７細胞とは異なり、Ｔｈ２及びＴｒｅｇ細胞は、サイトカインＩＬ−４、ＩＬ−１０などを分泌することにより抗炎症効果に関与している。Ｔｈ２細胞によって分泌されたＩＬ−４は、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６及びＩＬ−８の活性を阻害し、抗炎症作用を発揮し得る。Ｔｒｅｇ細胞は、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−βなどを含むサイトカインを産生することにより、ＲＡ疾患モデルにおいて免疫抑制作用を発揮できる。Ｔｈ細胞分化のアンバランスは、軟骨破壊にも関与している[22]。軟骨は、軟骨細胞、基質及びコラーゲン線維から構成される軟骨組織と、その周囲の軟骨膜とから構成されている。正常な生理学的プロセスにおいて、骨形成と骨吸収の間にはバランスが形成され、炎症と骨侵食は、密接に関連している。近年の研究から、核因子κＢ受容体活性化因子（ＲＡＮＫ）がその受容体ＲＡＮＫＬに結合して、破骨細胞の分化及び成熟を仲介し、一方、ＯＰＧがＲＡＮＫに結合して、ＲＡＮＫＬとＲＡＮＫとの結合を阻止して、破骨細胞の分化、活性化を阻害するとともに、成熟破骨細胞のアポトーシスを誘発させることが分かった。ＩＬ−１７は、ＲＡＮＫＬとその受容体の発現をアップレギュレートすることで、滑液におけるＲＡＮＫＬ／ＯＰＧのバランスを崩して、骨破壊を悪化させる。Ｔｈ２細胞により産生されるＩＬ−４、ＩＬ−１０は、破骨細胞の分化を阻害し、Ｔｈ１７に対して拮抗効果を有するＴｒｅｇ細胞は、破骨細胞形成を直接阻害でき、且つＴｒｅｇ細胞は、自己が分泌したＩＬ−１０を利用してＯＰＧ発現をアップレギュレートし、ＲＡＮＫＬをダウンレギュレートすることにより、骨破壊を抑制することができる。
【００１０】
現在、ＲＡを治癒できる方法がなく、一般的に、使用されている薬物及び物理的方法は、ＲＡ患者の症状を治療し、炎症や痛みを軽減させ、ＲＡの進行を遅らせるに過ぎない。現在、臨床的にＲＡの治療に使用されている第一選択の化学医薬品は、金化合物、Ｄ−ペニシラミン、抗マラリア薬、スルファサラジン、メトトレキサートなどの非ステロイド性抗炎症薬（Ｎｏｎｓｔｅｒｏｉｄａｌ  Ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｄｒｕｇ、ＮＳＡＩＤ）であり、主に免疫系を抑制することで関節の破壊を減少させる。ＲＡの治療に使用されるバイオ医薬品であるインフリキシマブ、エタネルセプト及びアナキンラは、主にＴＮＦ−α及びＩＬ−１を標的とし、ＴＮＦα及びＩＬ−１による炎症誘発作用に拮抗する。これらの遺伝子工学バイオ医薬品は、急性炎症反応を軽減させて、患者の腫れや痛みを軽減できるものの、患者の３０％〜４０％は、ＴＮＦ−α拮抗薬に対して有効反応を示さず、さらに一部の患者には、このキメラ抗体に対する抗体が発生し、それは、徐々に作用できなくなる。さらに、ＴＮＦ−αは、正常な免疫系における重要なサイトカインであり、ブロックされると深刻な副作用を引き起こし、感染のリスクを高める。したがって、現在の抗リウマチ薬については、短期及び長期の耐性と安全性の懸念が指摘されており、このため、疾患を徹底的に治療でき、自己免疫をブロックし、免疫調節のバランスを取り直すための新規医薬品の研究が求められる。
【００１１】
多発性硬化症（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、ＭＳ）は、最も一般的な中枢神経系の脱髄疾患である。この疾患の急性活動期には、中枢神経白質に多発性炎症性脱髄プラークが見られ、古い病変の場合、グリア繊維の増殖により石灰化プラークが形成され、複数の病変、寛解と再発の繰り返しが特徴であり、視神経、脊髄及び脳幹に多発し、主に若年及び中年で発症し、女性の方が男性より大きい。ヒトのＭＳ病理学研究では、ヒトＭＳは、マウスの実験的アレルギー性脳脊髄炎（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｌｌｅｒｇｉｃａｌ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ、ＥＡＥ）に類似しており、その発症メカニズムは、ＭＢＰに特異的なＴｈ細胞が血液脳関門を通過して中枢神経系に入り、ＭＢＰに接触して免疫応答を発生させて、炎症反応を誘発させ、炎症性サイトカイン及びケモカインの浸潤を引き起こし、脊髄鞘を破壊し、患者には視覚障害や筋無力などの症状を引き起こす[25]。ＭＳは、主にＴｈ１、Ｔｈ１７反応であり、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−１７は病変部で有意に増加し、回復期には、ＩＬ−４、ＩＬ−１０及びＴＧＦ−βが増加し、Ｔｈ１型サイトカインの産生がその分低下する。特異的なＴｈ２細胞を再注入すると、ＥＡＥの進行を防ぐことができる[27]。ＭＳの臨床研究でも、類似した状況が確認された。したがって、Ｔｈ細胞分化のアンバランスをブロックすることは、ＭＳの治療にも重要な役割を果たすことが期待できる。
【００１２】
ＭＳは、治癒する方法がなく、治療には免疫によって引き起こされる炎症反応の抑制を重点とする。現在、ＦＤＡは、ＭＳの治療のために合計６種類の薬剤を承認しており、免疫調節剤（インターフェロン−β１ａ（皮下及び筋肉内注射の２種の剤形）、インターフェロン−β１ｂ（皮下注射）、酢酸グラチラマー）、免疫抑制剤（ミトキサントロン）及びモノクローナル抗体（ナタリズマブ）に分類される。インターフェロン−βは、高安全性の利点を有するが、再発回数を３０％しか減らすことができず、高価であり、普及に適していない。ミトキサントロンは、主に白血病、乳がん、リンパ腫及び肝臓がんの治療に使用される抗がん剤である。ミトキサントロンは、Ｔ細胞、Ｂ細胞及びマクロファージの増殖を阻害し、免疫抑制作用を発揮できる。ミトキサントロンの最大の副作用は、心筋毒性であり、その累積投与量が１４０ｍｇ／ｍ2を超えると、心筋毒性を発生させやすい。ミトキサントロンは、３ヵ月ごとに１２ｍｇ／ｍ2投与すると最大３年間しか使用できず、ＭＳの平均３０年のコースに対して使用期間が短すぎる[30]。ミトキサントロンに加えて、アザチオプリン、シクロホスファミド、メトトレキサート、ミコフェノール酸モフェチル及びタクロリムスなどの他の免疫抑制剤は、いずれも短期的な免疫抑制効果を有するが、顕著な副作用を有し、たとえば、シクロホスファミドは、出血性膀胱炎を引き起こし、メトトレキサートは、低用量でも肝臓毒性を引き起こし、ミコフェノール酸モフェチル、モフェチル、タクロリムス及びアザチオプリンは、骨髄抑制作用を有する。ナタリズマブは、リンパ球の表面の接着分子α−４インテグリンを中和し、接着分子の血管内皮細胞及び基質細胞におけるリガンド（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１、ＶＣＡＭ−１）への結合を防ぎ、リンパ球が血管内皮を貫通して組織に到達することを防ぎ、それにより、脳組織における自己免疫炎症を減少させ、また、必然的に全体的な免疫応答に影響を与え、ＪＣウイルスに感染して進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）に罹患するリスクを高める。ナタリズマブは、重度の肝臓毒性も有する。ＭＳは、長期にわたって再発を繰り返した難治性の慢性自己免疫疾患であり、したがって、治療薬の開発には、治療効果に加えて、長期使用の安全性と利便性を考慮する必要があり、免疫障害によって引き起こされる自己免疫攻撃を効果的に変えることは、間違いなくこれらの問題を解決する最良の方法である。
【００１３】
ＳＬＥは、慢性自己免疫疾患である。不明な発症の原因のため、患者の免疫系は、自体の細胞や組織を攻撃する自己抗体を発生させて、炎症や組織損傷を引き起こす。一般的な症状には、関節炎、発熱、胸痛、脱毛、口腔潰瘍、リンパ腺の腫れ、疲労、顔面発疹などが含まれる。ＳＬＥの発症メカニズムは明らかではないが、研究によれば、Ｔ細胞の異常がその病理学的な進行に重要な役割を果たすと考えられる。遺伝的要素、環境要素、エストロゲンレベルなどの各種要素の相互作用下で、ＳＬＥでは、自己反応性Ｔｈ細胞は、自己抗原により活性化されると、クローン増殖して、サイトカインを産生する。ＭＲＬＰ  ｌｐｒループスマウスでは、ＩＦＮ−γの分泌が増加し、Ｔｈ１／Ｔｈ２細胞の割合が高まり、ＩＶ型であるびまん性増殖性ループス腎炎（ＤＰＬＮ）患者では、末梢血及び腎臓におけるＴｈ１／Ｔｈ２細胞が有意に上昇し、且つ腎障害の程度と正の相関を示し、それから、Ｔｈ１細胞もＳＬＥの発症に重要な役割を果たすことが示されている。また、ＳＬＥ患者では、Ｔｒｅｇ細胞の数が減少し、機能が低下し、Ｂ細胞が過剰増殖し、自己抗体が大量発生して体内の対応する自己抗原と結合して対応する免疫複合体を形成し、皮膚、関節、小血管、糸球体などの部位に蓄積する。補体の関与により、急性慢性の炎症及び組織壊死（ループス腎炎など）を引き起こし、又は、抗体が組織細胞抗原と直接作用して細胞破壊を引き起こし、体の複数のシステムの損傷を引き起こす。
【００１４】
現在まで、ＳＬＥを根治する方法はなく、現在使用されている治療薬には、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、コルチコステロイド、免疫抑制剤、ヒドロキシクロロキン及びメトトレキサートが含まれる。非ステロイド系抗炎症薬の一般的な副作用には、胃腸の不快感、胃焼け、下痢及び体内の水貯留が含まれ、コルチコステロイドは、炎症を迅速に抑制することができ、効果が強いため、一般的に、最低用量だけで最大の効果を達成することができる。コルチコステロイドの短期的な副作用には、浮腫、食欲増進及び体重増加が含まれ、長期的な副作用には、骨質低下（骨粗鬆）、高血圧、高コレステロール、高血糖（糖尿病）、動脈損傷、感染や白内障が含まれる。免疫抑制剤の共通副作用には、吐き気、嘔吐、脱毛、膀胱障害、妊娠困難、癌のリスク増加及び感染が含まれる。上記全身性エリテマトーデス治療法によれば、患者が薬を止めた後に病気が再発する可能性があり、治療期間が長くなるほど、副作用のリスクが大きくなる。したがって、ＳＬＥにおけるＴｈ細胞分化のアンバランスを改善して、自己免疫攻撃を緩和及び逆転させることは、ＳＬＥを完全に治すための研究の方向となっている。
【００１５】
多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡｓ）は、１８〜２２の炭素原子を有し、２〜３個の水素結合を含む直鎖脂肪酸であり、一般的に、カルボキシル基からの最も遠位の二重結合が最後からの３番目の炭素原子にあるω−３と、カルボキシル基からの最も遠位の二重結合が最後からの６番目の炭素原子にあるω−６とに分類される。ω−６及びω−３ＰＵＦＡｓは、いずれも異なるデサチュラーゼの作用下で飽和脂肪酸前駆体から合成されるものであり、脊椎類動物及び哺乳動物では特異的なデサチュラーゼを欠いているため、ｉｎ  ｖｉｖｏでω−６及びω−を合成することはできず、このため、食事からこれらの不飽和脂肪酸を摂取するしかない。
【００１６】
ω−３  ＰＵＦＡｓは、正常な生理機能を維持するために非常に重要なものであり、細胞脂質膜の構造を構成する重要な成分である。多数の研究から、ω−６／ω−３  ＰＵＦＡｓのバランスを維持することが健康にとって重要であることが示されている。最近発表された２つの大規模な臨床研究の結果から明らかなように、ω−３  ＰＵＦＡｓの長期摂取は、１型糖尿病の発症率に反比例し、２，０００人のノルウェーの子供に基づく症例対照研究から明らかなように、出生後１年目からω−３  ＰＵＦＡｓが豊富なタラ肝油を摂取すると、小児の１型糖尿病の発症リスクを低下させることができ、アメリカ青年期自己免疫性糖尿病研究プログラム（ＤＡＩＳＹ）による追跡調査は、１型糖尿病の遺伝的リスクのある子供が食事からω−３  ＰＵＦＡｓを摂取すると、膵島の自己免疫炎症のリスクを減少できることが示されている。さらに、ω−３  ＰＵＦＡｓは、パルミチン酸などの遊離脂肪酸がｉｎ  ｖｉｔｒｏでインスリン分泌を阻害するという現象を逆転させることができる。グルコースで刺激されたインスリン分泌は、ω−３  ＰＵＦＡｓを食事で補充することによって強化できる。さらに、近年、多くの臨床研究により、ω−３  ＰＵＦＡｓは、炎症を抑制し、自己免疫を予防及び緩和する作用を有し、ＲＡ、ＭＳ及びＳＬＥの発症及び病理学的進行に対して保護作用を有することが示されている。しかし、臨床的には、ω−３  ＰＵＦＡｓを含む魚油カプセルによる糖尿病治療、体重制御の試みは、ほとんど失敗しており、その原因は、摂取された食物におけるω−６  ＰＵＦＡｓの含有量が多すぎて、魚油カプセルだけを補充すると両方の割合のバランスを取りにくいことにある。したがって、本発明は、ウイルスベクターを提案しており、前記ウイルスベクターに含まれるｆａｔ−１遺伝子によってコードされるω−３不飽和脂肪酸デサチュラーゼ（ω−３  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ）がｉｎ  ｖｉｖｏでω−６からω−３へ変換することを促進し、２つの割合のバランスを取る。
【００１７】
カエノラブディティス・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）由来のｆａｔ−１遺伝子のタンパク質産物がω−３不飽和脂肪酸デサチュラーゼであり、ω−６  ＰＵＦＡｓを基質として不飽和化反応を行って、対応したω−３  ＰＵＦＡｓを生成し、それによって、動物体内の内因性ω−３  ＰＵＦＡｓの含有量を大幅に増やすとともに、ω−６  ＰＵＦＡｓの含有量を減らし、ω−６／ω−３ＰＵＦＡｓの割合を変える。ｆａｔ−１を哺乳類においてよりよく発現させるために、ｆａｔ−１をコードするｃＤＮＡを哺乳動物化（Ｍａｍｍａｌｉａｎｉｚｅｄ）し、得られたものをｍｆａｔ−１と命名する。ｍｆａｔ−１遺伝子導入マウスの膵島β細胞は、サイトカインにより誘発された抗アポトーシス作用に有意に抵抗することができ、且つω−３  ＰＵＦＡｓは、インスリン分泌を促進することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明が解決しようとする第１技術的課題は、安全で、毒性がなく、また治療活性を有し、臨床的ニーズを満たすウイルスベクターを提供することである。
【００１９】
本発明が解決しようとする第２技術的課題は、上記ウイルスベクターの構築方法を提供することである。
【００２０】
本発明が解決しようとする最後の第３技術的課題は、上記ウイルスベクターの、糖尿病治療薬又は自己免疫関連疾患治療薬の調製における応用を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
上記技術的課題を解決するために、本発明は、ウイルスベクターを提供し、前記ウイルスベクターは、ｍｆａｔ−１遺伝子がクローニングされたレンチウイルス発現プラスミド又はｍｆａｔ−１遺伝子がクローニングされたアデノ随伴ウイルス発現プラスミドであり、前記ｍｆａｔ−１遺伝子は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：１に示される。
【００２２】
前記ウイルスベクターにおいて、前記レンチウイルス発現プラスミドは、ｐＬＪＭ１−ＣＭＶ−ｈＰＧＫ−ＥＧＦＰプラスミド、ｐＬＪＭ１−ＣＭＶ−ｈＰＧＫ−ｍｋａｔｅ２プラスミド、ｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＧＦＰ−ＳＶ−ｐｕｒｏプラスミド、ＦＵＧＷ、ｐＬｅｎｔｉ−ｐｕｒｏ、ｐＬｅｎｔｉ−ＭＰ２又はｐＬｅｎｔｉプラスミドであり、前記アデノ随伴ウイルス発現プラスミドは、ｐＥＭＢＬ−ＡＡＶ−Ｄ（＋）−ＣＭＶ−ｅＧＦＰ−ＳＶ４０プラスミド、ＡＡＶ  ＧＦＰプラスミド、ＡＡＶ１プラスミド、ＡＡＶ２プラスミド、ｒＡＡＶ２プラスミド、ＡＡＶ５プラスミド、ＡＡＶ８プラスミド又はｐＡＶ−ＦＨ  ＡＡＶプラスミドである。
【００２３】
本発明は、前記ｍｆａｔ−１遺伝子をレンチウイルス発現プラスミド又はアデノ随伴ウイルス発現プラスミドにクローニングして、ウイルスベクターを得る前記ウイルスベクターの構築方法を提供する。
【００２４】
前記ウイルスベクターの構築方法は、
【００２５】
前記ｍｆａｔ−１遺伝子配列をテンプレートとして、プライマーｍｆａｔ−１−Ｆ：５´−ＴＡＴＴＡＡＧＣＴＡＧＣＡＴＧＧＴＣＧＣＣＣＡＣＡＧＣＡ−３´と、ｍｆａ
ｔ−１−Ｒ：５´−ＣＡＡＣＣＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＣＡＣＴＴＧＧＣＣＴ−３´を
設計してＰＣＲ増幅を行い、得られた前記ｍｆａｔ−１遺伝子配列の両端にＮｈｅＩ及びＥｃｏＲＩ酵素消化部位を持たせるステップ（１）と、
ステップ（１）で得られたＰＣＲ増幅産物を電気泳動し、次に、ゲルを切り出して回収して精製し、得られたＰＣＲ増幅産物を制限エンドヌクレアーゼＮｈｅＩ及びＥｃｏＲで酵素消化して使用時まで保存し、空の前記レンチウイルス発現プラスミド又はアデノ随伴ウイルス発現プラスミドを制限エンドヌクレアーゼＮｈｅＩ及びＥｃｏＲで酵素消化して、使用時まで保存するステップ（２）と、
ステップ（２）で得られたＤＮＡ断片を酵素消化後の前記空のシャトルプラスミドに連結して、ウイルスベクターを得るステップ（３）とを含む。
【００２６】
前記ウイルスベクターの構築方法において、前記ステップ（１）におけるＰＣＲ増幅反応系は、
５×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）Ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｇ２＋ｐｌｕｓ）  １０μｌと、
ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（各ｄＮＴＰ  ２．５ｍＭ）  ４μｌと、
テンプレートＤＮＡ  ２０−２００ｎｇと、
上流プライマーｍｆａｔ−１−Ｆ（１０μＭ）  １μｌと、
下流プライマーｍｆａｔ−１−Ｒ（１０μＭ）  １μｌと、
ＰｒｉｍｅＳＴＡ（登録商標）ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（２．５Ｕ／μｌ）  ０．５μｌと、
５０μＬまで補充する滅菌超純水とを含む。
【００２７】
好ましくは、前記テンプレートＤＮＡは、１００ｎｇである。
【００２８】
前記ウイルスベクターの構築方法において、前記ステップ（１）におけるＰＣＲ増幅反応の過程において、９８℃で５ｍｉｎ変性し、９８℃で１０ｓ保持して、６０℃で１５ｓ保持し、７２℃で２ｍｉｎ保持することを合計３０回サイクルし、最後に、７２℃で１０ｍｉｎ伸長する。
【００２９】
本発明は、前記ウイルスベクターを用いて構築される組換えウイルスベクターを提供する。
【００３０】
本発明は、前記ウイルスベクターを細胞に形質転換して得るウイルス粒子であるウイルス粒子を提供する。
【００３１】
好ましくは、前記ウイルス粒子は、前記ウイルスベクターをリポソームによって２９３ＦＴ細胞にトランスフェクションして、パッケージングして増幅して得る。
【００３２】
好ましくは、前記ウイルス粒子の投与方式は、静脈注射である。
【００３３】
本発明は、前記ウイルスベクター、又は前記組換えウイルスベクター、又は前記ウイルス粒子の、糖尿病治療薬又は自己免疫関連疾患治療薬の調製における応用を提供する。
【００３４】
前記応用において、前記自己免疫関連疾患は、Ｔｈ細胞分化のアンバランス及びその分泌サイトカインのアンバランスによる自己免疫疾患である。
【００３５】
前記応用において、前記糖尿病は、自己免疫性１型糖尿病である。
【００３６】
前記応用において、前記自己免疫疾患は、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）、多発性硬化症（ＭＳ）、関節リウマチ（ＲＡ）又は全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）である。
【００３７】
本発明は、前記ウイルスベクター、又は前記組換えウイルスベクター、又は前記ウイルス粒子と、上記ウイルスベクター、組換えウイルスベクター又はウイルス粒子の薬学的に許容可能な担体とを含む医薬品を提供する。
【００３８】
好ましくは、前記医薬品は、一般的なプロセスに従って、前記ウイルスベクター又は前記組換えウイルスベクター又は前記ウイルス粒子に一般的な佐剤を添加して、臨床的に許容可能な剤形に調製することを含む。
【００３９】
前記レンチウイルス発現プラスミドは、ｐＬＪＭ１−ＣＭＶ−ｈＰＧＫ−ＥＧＦＰプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ（Ｐｌａｓｍｉｄ＃１９３１９）から購入）、及びｐＬＪＭ１−ＣＭＶ−ｈＰＧＫ−ｍｋａｔｅ２プラスミド（ａｄｄｇｅｎｅから購入）である。
【００４０】
前記アデノ随伴ウイルス発現プラスミドは、ｐＥＭＢＬ−ＡＡＶ−Ｄ（＋）−ＣＭＶ−ｅＧＦＰ−ＳＶ４０プラスミド（ａｄｄｇｅｎｅから購入）である。
【００４１】
本発明では、遺伝子治療法が使用されており、本発明の前記ウイルス粒子を利用してｍｆａｔ−１遺伝子を自然発症非肥満性糖尿病モデルマウス（ＮＯＤマウス）の体内に導入し、対照群マウスと比べて、ｍｆａｔ−１レンチウイルス粒子は、発症ＮＯＤマウスの血糖レベルを有意に低下させるとともに、その血清インスリンレベルを向上させ、顕著な治療作用を有する。ｍｆａｔ−１遺伝子治療法による糖尿病及び自己免疫の治療についてのメカニズムとしては、ｍｆａｔ−１は、体内の過量なω−６  ＰＵＦＡｓを基質として形質転換してω−３  ＰＵＦＡｓとすることで、両方の割合のバランスを取り、ω−６／ω−３の比の値を１：１に近くすることが挙げられる。これらω−６  ＰＵＦＡｓから形質転換された内因性ω−３  ＰＵＦＡｓは、Ｔｈ細胞のＴｈ２への分化を促進し、ω−６  ＰＵＦＡｓによるＴｈ１細胞活性化の促進効果に拮抗し、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１７などの炎症性サイトカインの分泌レベルを低下させて、Ｔｈ１細胞を介した炎症反応を緩和させ、ＣＤ８+ＣＴＬ細胞、マクロファージの膵島への浸潤を抑制して、膵島炎症及び膵臓周囲炎の発生を緩和させる。哺乳動物の体内に不飽和脂肪酸デヒドロゲナーゼを欠いているため、レンチウイルベクター又はアデノ随伴ウイルスベクターでｍｆａｔ−１を体内に導入する必要がある。
【００４２】
上記ウイルスベクターの投与方式は、静脈注射である。
【発明の効果】
【００４３】
有益な効果は、以下のとおりである。従来技術に比べて、本発明に係るウイルスベクターは、１型糖尿病及び自己免疫関連疾患を治療するバイオ医薬品の調製に適用でき、たとえば、ウイルスベクターを利用して細胞にトランスフェクションされたウイルス粒子は、安全で毒性がなく、抗炎症活性を有する新規バイオ医薬品であり、レンチウイルスをベクターとして、遺伝子組換え技術を用いて多価不飽和脂肪酸デヒドロゲナーゼを高発現させ、抗自己反応性炎症活性が高く、使用ニーズを満たすことができ、調製方法がシンプルであり、操作しやすく、応用の将来性が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】ｐＬＪＭ１−ｍｆａｔ−１−ＥＧＦＰプラスミドをＮｈｅＩ及びＥｃｏＲＩで酵素消化して同定した１％アガロースゲル電気泳動図である。
【図２】本発明の実施例２においてレンチウイルス粒子で健常人（図２Ａ−Ｅ）及び１型糖尿病患者（図２Ｆ−Ｊ）の末梢血単球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで２４時間処理した後、ヒト末梢血のＣＤ４  Ｔ細胞分化及びそのサイトカインの変化の結果図である。
【図３】本発明の実施例２において１型糖尿病患者の末梢血単球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで２４時間処理した後、末梢血のＣＤ４  Ｔ細胞の転写因子の変化の結果図である。
【図４】本発明の実施例３においてレンチウイルスを投与して９週間治療した後のＮＯＤマウスの糖尿病の発症率変化の結果図である。
【図５】本発明の実施例３においてレンチウイルスを投与して治療したＮＯＤマウスの血糖変化の結果図である。
【図６】本発明の実施例３においてレンチウイルスを投与して９週間治療した後のＮＯＤマウスのインスリン分泌の結果図である。
【図７】本発明の実施例３においてレンチウイルスを投与して９週間治療した後のＮＯＤマウスの膵島炎症浸潤の進行の変化の結果図である。
【図８】本発明の実施例３においてレンチウイルスを投与して９週間治療した後のＮＯＤマウスのＣＤ４細胞分化の結果図である。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
下記実施例によれば、本発明をよく理解できる。ただし、当業者であれば、実施例において説明される内容は、本発明を説明するために過ぎず、特許請求の範囲に詳しく説明する本発明を制限するものではないことが理解できる。下記実施例では、ＤＨ５α大腸菌は、ＴＡＫＡＲＡ製であり、ＬＢ培地は、Ｓｉｇｍａ製であり、２９３ＦＴ細胞株は、ＡＴＣＣ製であり、成長培地は、ＧＩＢＣＯ製のＤＭＥＭであり、ＦＢＳウシ胎児血清は、ＧＩＢＣＯ製であり、ＯＰＴＩ−ＭＥＭは、ＧＩＢＣＯ製であり、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００トランスフェクション試薬は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製であり、ＮＯＤマウスは、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ製である。遠心分離機は、米国Ｔｈｅｒｍｏ製の型番ＦＲＥＳＣＯ１７の高速凍結遠心分離機であり、電気泳動装置は、米国ＢＩＯ−ＲＡＤ製の型番ＰｏｗｅｒＰａｃ  ＴＭａｎｄ  Ｍｉｎｉ−Ｓｕｂ  ｃｅｌｌ  ＧＴであり、ゲルイメージャーは、米国ＢＩＯ−ＲＡＤ製の型番ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＴＭＸＲＳ＋Ｓｙｓｔｅｍであった。
【００４６】
実施例１：ｍｆａｔ−１レンチウイルス発現プラスミドがクローニングされたウイルスベクターの構築
【００４７】
まず、ｍｆａｔ−１（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：１に示される）遺伝子（金斯瑞社製）を合成し、次に、ＮｈｅＩ及びＥｃｏＲＩ酵素消化部位を介してｐＬＪＭ１−ＣＭＶ−ｈＰＧＫ−ＥＧＦＰプラスミド（ａｄｄｇｅｎｅ、Ｐｌａｓｍｉｄ＃１９３１９）にサブクローニングし、ｐＬＪＭ１−ＣＭＶ−ｈＰＧＫ−ＥＧＦＰ−ｍｆａｔ−１（ＰＬＪＭ１−ｍｆａｔ−１）発現プラスミドを得た。構築過程は、具体的には、以下のとおりである。
【００４８】
１）ｍｆａｔ−１領域のＰＣＲ増幅
【００４９】
合成されたｍｆａｔ−１遺伝子配列をテンプレートとして、上流プライマーｍｆａｔ−１−Ｆ：５´−ＴＡＴＴＡＡＧＣＴＡＧＣＡＴＧＧＴＣＧＣＣＣＡＣＡＧＣＡ−３´
と、下流プライマーｍｆａｔ−１−Ｒ：５´−ＣＡＡＣＣＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＣＡ
ＣＴＴＧＧＣＣＴ−３´を設計し、ｍｆａｔ−１領域をＰＣＲ増幅して、その配列の両
端にＮｈｅＩ及びＥｃｏＲＩ酵素消化部位を持たせた。
【００５０】
ＰＣＲ増幅系を表１に示した。
【００５１】
【表１】
2020512010.tif 000003
【００５２】
前記ＰＣＲ増幅の過程において、９８℃、５ｍｉｎ；９８℃、１０ｓ；６０℃、１５ｓ、７２℃、２ｍｉｎ変性して、合計３０サイクルし、最後に、７２℃で１０ｍｉｎ伸長する。
【００５３】
２）酵素消化
【００５４】
上記ステップで得られたＰＣＲ増幅産物について、１．５％アガロースゲル電気泳動でターゲットＤＮＡ断片を回収し、Ａｇａｒｏｓｅ  Ｇｅｌ  ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製したターゲットＤＮＡ断片を得て、上記精製したｍｆａｔ−１のＤＮＡ断片を制限エンドヌクレアーゼＮｈｅＩ及びＥｃｏＲで酵素消化し、使用時まで保存した。対応した制限エンドヌクレアーゼＮｈｅＩ及びＥｃｏＲ酵素を用いて、ｐＬＪＭ１−ＥＧＦＰ空のシャトルプラスミドを酵素消化した。前記酵素消化反応系を表２に示した。
【００５５】
【表２】
2020512010.tif 000004
【００５６】
酵素消化反応条件：３７℃、２ｈ水浴。上記酵素消化産物について１％アガロースゲル電気泳動でターゲット断片を分離して、Ａｇａｒｏｓｅ  Ｇｅｌ  ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製したプラスミド又はターゲットＤＮＡ断片を得た。
【００５７】
３）連結
【００５８】
ターゲットＤＮＡ断片をｐＬＪＭ１ベクターに連結した。
【００５９】
【表３】
2020512010.tif 000005
【００６０】
反応条件：室温（１６℃）で一晩、すなわち１２時間連結して、前記ＰＬＪＭ１−ｍｆａｔ−１ベクターを得た。
【００６１】
本実施例は、上記調製されたウイルスベクターを細胞に形質転換して調製されたウイルス粒子をさらに提供し、ステップは、具体的には、以下のとおりである。
【００６２】
１  使用されるコンピテント細菌を形質転換してＤＨ５α大腸菌とし、ＣａＣｌ2法で調製し、調製方法及び後続の形質転換操作については、《分子クローニング》第二版を参照すればよく、具体的には、以下のとおりである。
【００６３】
Ａ  コンピテント細菌の調製
【００６４】
ｉ  飽和菌液１ｍｌをＬＢ  １００ｍｌに加えて、細菌密度を示す光密度ＯＤ６００が０．４−０．６となるまで、３７℃、２８０ｒｐｍで２−３ｈ振とう培養した。
【００６５】
ｉｉ  氷で予冷されたポリプロピレン管５０ｍｌに移して、氷浴に入れて１０ｍｉｎ放置した。
【００６６】
ｉｉｉ  ４℃、１０００ｇで、１０ｍｉｎ遠心分離した。
【００６７】
ｉｖ  上澄みを捨てて、管を逆にして１ｍｉｎ保持し、液体をすべて流出させ、氷で予冷された０．１ｍｏｌ／ｌ  ＣａＣｌ2  １０ｍｌを加えて再懸濁させて沈殿させ、氷浴に入れて３０ｍｉｎ放置した。
【００６８】
ｖ  ４℃、１０００ｇで１０ｍｉｎ遠心分離した。
【００６９】
ｖｉ  上澄みを捨てて、氷で予冷された０．１ｍｏｌ／ｌ  ＣａＣｌ2  ２ｍｌを加えて再懸濁させて沈殿させ、７５％滅菌グリセロール（０．１ｍｏｌ／ｌ  ＣａＣｌ2を用いて調製した）０．５ｍｌを加えて均一に混合し、１００μｌ／管で１．５ｍｌ遠心分離管に分注し、−８０℃の氷箱で半年間保存した。
【００７０】
ｖｉｉ  形質転換効率の同定
【００７１】
Ｂ  連結産物の形質転換
【００７２】
ｉ  １本の管分のコンピテント細胞を、氷に置いて溶融し、連結産物３μｌを加えて、均一に混合し、３０ｍｉｎ氷浴処理した。
【００７３】
ｉｉ  ４２℃で水浴処理して、９０ｓｅｃ静置した。素早く氷に移して、１−２ｍｉｎ氷浴処理した。
【００７４】
ｉｉｉ  ＬＢ培地９００μｌを加えて、３７℃で１０ｍｉｎ水浴処理した。
【００７５】
ｉｖ  細菌を３７℃、２１０ｒｐｍで、４５ｍｉｎ増幅した。
【００７６】
ｖ  フレートに塗布し、すなわち、上記形質転換済みの細菌１００μｌを１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む寒天プレートに塗布した。
【００７７】
ｖｉ  プレートを逆にして、３７℃で１６−２０ｈ培養した。
【００７８】
Ｃ  陽性クローンをスクリーニングし（酵素消化同定、シーケンシング同定）、１％アガロースゲル電気泳動によって同定し、結果は、図１に示すように、前記ウイルスベクターＰＬＪＭ１−ｍｆａｔ−１の構築に成功したことを示した。
【００７９】
２．ｌｅｎｔｉ−ｍｆａｔ−１レンチウイルス粒子のパッケージング、増幅及び精製
【００８０】
レンチウイルスのパッケージング細胞は、２９３ＦＴ細胞株であり、成長培地は、ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ含有）であった。付着細胞を培養して成長して増殖し、単層細胞を形成した。
【００８１】
（１）ウイルス増幅
【００８２】
１）トランスフェクションの２４ｈ前に、トリプシンで対数増殖期の２９３ＦＴ細胞を消化し、１０％ＦＢＳウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ製）を含むＤＭＥＭ高グルコース培地（ＧＩＢＣＯ製）で細胞密度を１ｘ１０5細胞／ｍｌに調整して、６ウェルプレートに接種し、３７℃、５％ＣＯ2インキュベータにおいて培養した。２４ｈ後、細胞密度が０．８×１０6細胞／ｍｌになると、トランスフェクションに供した。細胞状態がウイルスパッケージングにとって重要なことであるため、良好な細胞状態及び少ない継代回数が必要であった。
【００８３】
２）トランスフェクションの１ｈ前に、細胞培地を新しい完全培地に変更した。
【００８４】
３）１．５ｍｌ  ＥＰ管に、プラスミド試薬としてＰＬＪＭ１−ｍｆａｔ−１ベクター１．５μｇ、ｐｓＰＡＸ２ベクターＡｄｄｇｅｎｅ（Ｐｌａｓｍｉｄ＃１２２６０）１．１２５μｇ、ｐＭＤ２．ＧベクターＡｄｄｇｅｎｅ（Ｐｌａｓｍｉｄ＃１２２５９）０．３７５μｇ）、及びＯＰＴＩ−ＭＥＭ  １００μｌを加えて均一に混合し、室温（２０℃−３０℃）で５分間インキュベートした。
【００８５】
４）別の１．５ｍｌ  ＥＰ管に、まず、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ  １００μｌを加え、次にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００トランスフェクション試薬３μｌを加え、軽く弾いて均一に混合し、室温（２０℃−３０℃）で５分間インキュベートした。
【００８６】
５）ステップ３）においてインキュベートしたプラスミド試薬（ＰＬＪＭ１−ｍｆａｔ−１、ｐｓＰＡＸ２、及びｐＭＤ２．Ｇの３つのプラスミドの混合物）を、ステップ４）において希釈されたＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００トランスフェクション試薬と混合し、軽く均一に混合し、室温（２０℃−３０℃）で１５分間インキュベーションして、前記プラスミド試薬とＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００トランスフェクション試薬とのトランスフェクション複合体を形成した。
【００８７】
６）ステップ５）で得られた試薬（ステップ５）で最終的に得られたＰＬＪＭ１−ｍｆａｔ−１、ｐｓＰＡＸ２及びｐＭＤ２．ＧとＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００トランスフェクション試薬とのトランスフェクション複合体）２００μｌを、ステップ１）における２９３ＦＴ含有細胞培地に滴下して、軽く均一に振とうさせ、３７℃、５％ＣＯ2の細胞インキュベータにおいて培養した。
【００８８】
（２）ウイルス精製
【００８９】
１）上記ステップにおいて２９３ＦＴ含有細胞培地で２４ｈ培養した後、トランスフェクション複合体を含有する培地を捨てて、新しい完全培地を２ｍｌ加えて、培養し続けた。
【００９０】
２）それぞれ４８ｈ及び７２ｈに細胞の上澄みを収集し、収集した２回の上澄みを混合し、１２５０ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離して、できるだけ２９３ＦＴ細胞を除去し、次に０．４５μｍフィルターで濾過し、Ｌｅｎｔｉ−ｍｆａｔ−１レンチウイルス粒子、すなわち前記ウイルス粒子を得た。前記ウイルス粒子は、使用時まで短期間（＜３ｄ）の場合は、４℃で保存し、長期間の場合は、−８０℃で保存し、また、繰り返した凍結融解を避けるように分注した。
【００９１】
（２）ウイルス力価の測定
【００９２】
ＴＣＩＤ５０法によってウイルス力価を測定した。対照となる裸のウイルスの増幅、精製及び力価測定は、上記と同様であった。
【００９３】
実施例２  ω−３  ＰＵＦＡｓによる１型糖尿病患者の末梢血ＣＤ４  Ｔ細胞への制御作用
【００９４】
（１）患者及び健常人の末梢血をそれぞれ５ｍｌ採取し、ｐＨ７．２のＰＢＳで１倍希釈した後、リンパ球分離液Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ、Ｎｏｒｗａｙ）と混合し、３５００ｒｐｍで２０ｍｉｎ遠心分離した後、リンパ球を取り、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏから購入）で培養し、次に、それぞれ最終濃度１００μＭのＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸）、最終濃度１００μＭのＥＰＡ（エイコサペンタエン酸）及び最終濃度１００μＭのＡＡ（アラキドン酸）を用いて、上記細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで２４時間処理した後、上記細胞におけるＣＤ４  Ｔ細胞の細胞内サイトカインの変化を検出した（上記ＤＨＡ、ＥＰＡ及びＡＡは、すべてＳｉｇｍａから購入される）。
【００９５】
（２）ＣＤ４Ｔ細胞の細胞内サイトカインの標識：上記ステップにおける患者と健常人のリンパ球（数量１×１０5個）をそれぞれ異なる標識管に取り、各標識管に蛍光標識モノクローナル抗体ＣＤ３（０．１μｇ）、ＣＤ８（０．１μｇ）を加え、次に、管ごとに濃度４質量％のパラホルムアルデヒド１ｍｌを加えて均一に混合し、室温（２０℃−３０℃）で２０ｍｉｎインキュベートした後、膜透過化剤０．５％ｓａｐｏｎｉｎ  １ｍｌを加えて、室温（２０℃−３０℃）で３０ｍｉｎインキュベートし、次に、４℃で、３００ｇを５ｍｉｎ遠心分離し、上澄みを捨てて、次に、０．５％のｓａｐｏｎｉｎ  ８０μｌを加えて再懸濁させ、得られた懸濁液について、それぞれＩＦＮ−γ蛍光モノクローナル抗体（０．１μｇ）、ＩＬ−１７蛍光モノクローナル抗体（０．１μｇ）、ＩＬ−４蛍光モノクローナル抗体（０．１μｇ）及びＦｏｘｐ３蛍光モノクローナル抗体（０．１μｇ）で細胞を標識し、４℃で、遮光下で１時間（Ｆｏｘｐ３蛍光モノクローナル抗体で標識される場合、８時間インキュベートして膜透過化する）インキュベートし、次に、０．５％ｓａｐｏｎｉｎで３回洗浄し、４℃で、３００ｇを５ｍｉｎ遠心分離し、上澄みを捨てて、濃度１質量％のパラホルムアルデヒドで固定して、２４時間後、それぞれフローサイトメーターＡｃｃｕｒｉ−Ｃ６を用いて検出して、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７及びＴｒｅｇ細胞の割合を分析した（上記ステップに使用されている抗体及び器具は、すべてＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製である）。
【００９６】
（３）ＣＤ４Ｔ細胞の細胞内転写因子の標識：上記ステップ１）における患者と健常人のリンパ球（数量１×１０5個）をそれぞれ標識管に取り、各標識管に蛍光標識モノクローナル抗体ＣＤ３（０．１μｇ）、ＣＤ８（０．１μｇ）を加えた。次に、管ごとに４％パラホルムアルデヒド１ｍｌを加えて均一に混合し、室温で２０ｍｉｎインキュベートした後、膜透過化剤０．５％ｓａｐｏｎｉｎ  １ｍｌを加えて、室温で３０ｍｉｎインキュベートし、４℃で、３００ｇを５ｍｉｎ遠心分離し、上澄みを捨てて、０．５％ｓａｐｏｎｉｎ  ８０μｌで再懸濁させ、得られた懸濁液について、それぞれＴ−ｂｅｔ蛍光モノクローナル抗体（０．１μｇ）、ＧＡＴＡ３蛍光モノクローナル抗体  （０．１μｇ）、ＲＯＲγＴ蛍光モノクローナル抗体（０．１μｇ）及びＦｏｘｐ３蛍光モノクローナル抗体（０．１μｇ）で標識を細胞し、４℃、遮光下で１時間（Ｆｏｘｐ３の場合、８時間膜透過化する）インキュベートし、０．５％ｓａｐｏｎｉｎで３回洗浄し、４℃で、３００ｇを５ｍｉｎ遠心分離し、上澄みを捨てて、１％パラホルムアルデヒドで固定して、２４時間後にフローサイトメーターＡｃｃｕｒｉ−Ｃ６を用いて検出して、上記転写因子の割合を分析した（ステップに使用されたすべての抗体及び器具は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製である）。
【００９７】
（４）結果の説明：検出結果は、図２及び図３に示されており、その中でも、図２におけるＣＯＮは、空白対照群としてＤＨＡ、ＥＰＡ及びＡＡのいずれによっても処理されていない健常人の末梢血のリンパ球であり、図３におけるＣＯＮは、空白対照群としてＤＨＡ、ＥＰＡ及びＡＡのいずれかによっても処理されていない患者の末梢血のリンパ球であり、図２には、Ａ図、Ｂ図、Ｃ図、Ｄ図及びＥ図は、それぞれ健常人の末梢血ＣＤ４  Ｔ細胞におけるＴｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１／Ｔｈ２、Ｔｈ１７及びＴｒｅｇ細胞の百分率であり、Ｆ図、Ｇ図、Ｈ図、Ｉ図及びＪ図は、それぞれ患者の末梢血ＣＤ４  Ｔ細胞におけるＴｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１／Ｔｈ２、Ｔｈ１７及びＴｒｅｇ細胞の百分率であり、図３には、Ａ図、Ｂ図、Ｃ図、Ｄ図は、それぞれ患者の末梢血ＣＤ４  Ｔ細胞における転写因子Ｔ−ｂｅｔ、ＧＡＴＡ３、ＲＯＲγＴ及びＦｏｘｐ３の百分率であり、図２−３に示すように、それぞれＤＨＡ、ＥＰＡ及びＡＡで処理された１型糖尿病患者の末梢血ＣＤ４Ｔ細胞では、Ｔｈ１、Ｔｈ１７細胞の百分率は低下し、Ｔｈ２、Ｔｒｅｇ細胞の百分率は上昇し、Ｔｈ１／Ｔｈ２の割合とＴ１７／Ｔｒｅｇの割合のバランスが取り戻されており、また、Ｔｈ１サイトカインの発現を制御する転写因子Ｔ−ｂｅｔ及びＴｈ１７サイトカインの発現を制御する転写因子ＲＯＲγＴは、ω−３ＰＵＦＡｓによって有意に阻害され、一方、Ｔｈ２及びＴｒｅｇサイトカインの発現を制御する転写因子ＧＡＴＡ３及びＦｏｘｐ３の発現は、ω−３ＰＵＦＡｓの作用で上昇した。これら結果から、ω−３ＰＵＦＡｓは、Ｔｈ細胞分化のバランスを取り戻し、Ｔｈ１／Ｔｈ２及びＴ１７／Ｔｒｅｇのアンバランスによる炎症を有意に抑制できることが示されており、さらに、本発明の前記ウイルス粒子に含まれるｍｆａｔ−１遺伝子は、体内で過剰なω−６  ＰＵＦＡｓを基質として、ω−３  ＰＵＦＡｓとして形質転換することにより、両方の割合のバランスを取り、ω−６／ω−３の比の値を１：１に近くし、さらにＴｈ１／Ｔｈ２とＴ１７／Ｔｒｅｇの割合のアンバランスによる自己免疫疾患、たとえば１型糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ及び全身性エリテマトーデスを抑制できることが示されている。
【００９８】
実施例３：Ｌｅｎｔｉ−ｍｆａｔ−１レンチウイルス粒子による１型糖尿病の治療効果
【００９９】
（１）１型糖尿病マウスモデルの構築
【０１００】
体重２５ｇのＮＯＤマウスを複数匹準備して、毎日、所定の時刻に採血してＮＯＤマウスのランダム血糖値を検出し、数値が２週間持続的に１１．１ｍｍｏｌ／Ｌを超えたマウスを選別して実験に用い、上記血糖値が２週間持続的に１１．１ｍｍｏｌ／Ｌを超えたＮＯＤマウスを、１群５匹で、対照群（Ｌｅｎｔｉ−Ｃｏｎ）とレンチウイルス治療群（Ｌｅｎｔｉ−ｍｆａｔ−１）の２群にランダムに分けた。
【０１０１】
（２）投与方法
【０１０２】
治療群では、ウイルス力価１０8ＴＵ／ｍＬの濃縮液基準でマウス体重に対して１０9ＴＵ／ＫｇでＬｅｎｔｉ−ｍｆａｔ−１レンチウイルス粒子を尾静脈注射した後、対照群では、同じ条件でｍｆａｔ−１遺伝子を含まないｐＬＪＭ１−ＣＭＶ−ｈＰＧＫ−ＥＧＦＰプラスミドを投与し、マウスのランダム血糖値の変化を検出した。
【０１０３】
（３）結果及び検討
【０１０４】
１）Ｌｅｎｔｉ−ｍｆａｔ−１レンチウイルス粒子治療後のＮＯＤマウスの一般的な生理状態
【０１０５】
治療群のマウスにＬｅｎｔｉ−ｍｆａｔ−１レンチウイルス粒子を尾静脈注射したところ、対照群に比べて、マウスの摂食及び飲水の状況が正常であり、２週間治療後、治療群の体重率が対照群より高いが、統計的に有意ではなかった。
【０１０６】
２）本発明の実施施１におけるウイルス粒子を投与して９週間治療後、マウスの末梢血の多価不飽和脂肪酸の変化のレベルを検出し、具体的には、ステップは、以下のとおりであった。一般的な有機化学法を用いて２群のマウスの末梢血から脂肪酸を抽出した後、上記抽出したサンプル（抽出した脂肪酸）をヘプタンに溶解して、バイアルに滴下し、ロードして検出した。前記サンプルをオートサンプラーで注入して、アジレント７８９０Ａを用いて検出し、１回の注入運行時間を約１時間とした。ガスクロマトグラフィー条件：コラム型番：ＳＰ２３８０、１０５ｍ×０．５３ｍｍ×０．２０μｍ（アジレント）；運行過程：開始温度１４０℃で、３ｍｉｎ保持し、次に８℃／ｍｉｎの速度で２２０℃に昇温して、１２ｍｉｎ保持する。サンプラー、検出器の温度：２６０℃；キャリアガス：ヘリウムガス；速度：１２ｐｓｉ。最後に、サンプルのピーク出現時間を標準品（米国Ｓｉｇｍａ社から購入）と比較して、脂肪酸のタイプを特定し、各脂肪酸の含有量百分率として最終結果を得た。標準品とピーク出現時間、ピーク形状、ピーク面積百分率を比較することでターゲットピークを特定し、すべてのω−３及びω−６多価不飽和脂肪酸の面積百分率の和を算出し、ω−６／ω−３比の値を算出した。コラム型番：ＳＰ２３８０、１０５ｍ×０．５３ｍｍ×０．２０μｍ。その結果、Ｌｅｎｔｉ−ｍｆａｔ−１レンチウイルス粒子を投与したマウスでは、ＥＰＡの割合が高まり、それは、投与されたｍｆａｔ−１含有レンチウイルス粒子は作用したことを示している（表４）。
【０１０７】
表５  ウイルス粒子を投与して治療した後のマウスの血液における多価不飽和脂肪酸の変化
【０１０８】
【表４】
2020512010.tif 000006
【０１０９】
ω−３及びω−６多価不飽和脂肪酸は、それぞれ相対百分率で表され、ガスクロマトグラフィーで検出されたすべての脂肪酸のピーク面積は、１００％であり、ターゲット脂肪酸の含有量は、そのピーク出現面積をピーク面積の和で割って算出した。各組のデータごとに３回繰り返し、ｏｎｅｗａｙ−ＡＮＯＶＡを用いて統計し、対照群に比べて、*Ｐ＜０．０５であり、ＮＰは、未検出を示した。
【０１１０】
３）２群のＮＯＤマウスのランダム血糖値のレベル、インスリンのレベル及び膵島炎症のモニタリング
【０１１１】
ランダム血糖値が２週間持続的に１１．１ｍｍｏｌ／Ｌより低いマウスを、血糖が正常に回復したものとした。Ｌｅｎｔｉ−ｍｆａｔ−１治療群及び対照群ＮＯＤマウスのまぶたから採血した後、米国Ｒｏｃｈｅ社のＡｃｃｕ−Ｃｈｅｋ血糖計を用いて血糖レベルを検出し、結果を図４−５に示し、治療群と対照群を比較すると、治療群ＮＯＤマウスでは、ランダム血糖値は、２週目から明らかに低下し、６週目までに、血糖レベルは、６．３ｍｍｏｌ／Ｌという正常なレベルに低下して保持した。このことから、Ｌｅｎｔｉ−ｍｆａｔ−１レンチウイルス粒子は、ＮＯＤマウスに対して有意な治療作用を有することが示されている。９週間治療後、２群のマウスの眼球から２ｍｌ採血して、５ｍｉｎ静置後、３５００ｒｐｍで１５ｍｉｎ遠心分離し、上層の血清を２００μｌ取り、ｐＨ７．４のＰＢＳで１００倍希釈した後、Ｍｅｒｃｏｄｉａ社のキットを用いて血清インスリン濃度を検出し、結果を図６に示した。９週間治療後、実体顕微鏡下で２組のマウスの膵臓を摘出して、一般的なパラフィン包埋、切片を行い、さらにＨＥ染色をして、マウスの膵島のリンパ球浸潤の状況を観察して、結果を図７に示した。
【０１１２】
４）Ｌｅｎｔｉ−ｍｆａｔ−１レンチウイルス粒子治療後のＮＯＤマウスＣＤ４  Ｔリンパ球分化の変化
【０１１３】
治療群及び対照群のＮＯＤマウスの脾臓のリンパ球（数量１×１０5個）をそれぞれ異なる標識管に取り、各標識管に蛍光標識モノクローナル抗体ＣＤ３（０．１μｇ）、ＣＤ８（０．１μｇ）を加え、次に、管ごとに濃度４質量％のパラホルムアルデヒド１ｍｌを加えて均一に混合し、室温（２０℃−３０℃）で２０ｍｉｎインキュベートした後、膜透過化剤０．５％ｓａｐｏｎｉｎ  １ｍｌを加えて、室温（２０℃−３０℃）で３０ｍｉｎインキュベートし、次に、４℃で、３００ｇを５ｍｉｎ遠心分離し、上澄みを捨てて、次に、０．５％のｓａｐｏｎｉｎ  ８０μｌを加えて再懸濁させ、得られた懸濁液について、それぞれＩＦＮ−γ蛍光モノクローナル抗体（０．１μｇ）、ＩＬ−１７蛍光モノクローナル抗体（０．１μｇ）、ＩＬ−４蛍光モノクローナル抗体（０．１μｇ）及びＦｏｘｐ３蛍光モノクローナル抗体（０．１μｇ）で細胞を標識し、４℃、遮光下で１時間（Ｆｏｘｐ３蛍光モノクローナル抗体で標識される場合、８時間インキュベートして膜透過化する）インキュベートし、次に、０．５％ｓａｐｏｎｉｎで３回洗浄し、４℃で、３００ｇを５ｍｉｎ遠心分離し、上澄みを捨てて、濃度１質量％のパラホルムアルデヒドで固定して、２４時間後、それぞれフローサイトメーターＡｃｃｕｒｉ−Ｃ６を用いて検出して、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７及びＴｒｅｇ細胞の割合を分析した（上記ステップに使用されている抗体及び器具は、すべてＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製である）。結果を図８に示し、Ｌｅｎｔｉ−ｍｆａｔ−１レンチウイルス粒子治療後のＮＯＤマウスでは、ＣＤ４  Ｔ細胞におけるＴｈ１、Ｔｈ１７細胞の百分率は低下し、Ｔｈ２、Ｔｒｅｇ細胞の百分率は上昇し、Ｔｈ１／Ｔｈ２の割合とＴ１７／Ｔｒｅｇの割合のバランスが取り戻されており、Ｔｈ１／Ｔｈ２及びＴ１７／Ｔｒｅｇ割合のアンバランスによる炎症環状が改善された。
【０１１４】
実施例４  ｍｆａｔ−１遺伝子導入マウスの誘発剤によるＭＳの発生誘発に対する完全な抵抗。
【０１１５】
（１）モデル作成：Ｗｉｄｅ  ｔｙｐｅマウス（南京大学模式動物研究所から購入）３匹（６−８週齢、雌２匹、雄１匹）と、ｍａｆｔ−１遺伝子導入マウス（南京大学模式動物研究所から提供、前記ｍａｆｔ−１遺伝子導入マウスのｆａｔ−１遺伝子についてｐＳＴ１８１原核発現ベクターを用いて発現させ、ｆａｔ−１遺伝子のプロモーターＣＭＶ−β−ａｃｔｉｎの上流にｍｕｓｃｌｅ  ｃｒｅａｔｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ（ＭＣＫ）エンハンサーを設計することで、ｆａｔ−１遺伝子の哺乳動物での発現効率（ｍａｍｍａｌｉａｎｉｚｅｄ）を向上させ、このため、それをｍｆａｔ−１遺伝子導入マウスと命名した）３只（６週齢、雌２匹、雄１匹）。すべてのマウスをＭＯＧで免疫し、具体的には、ＭＯＧ３５−５５（Ｓｉｇｍａから購入）を３００μｇ／体重（ｋｇ）で背部の皮下４点から注射して動物を免疫した。一回目の免疫６日間後、同じ用量で二回目の免疫を行った。動物は、２４日間生存した。
【０１１６】
（２）モデル観察指標：臨床神経病変の行動観察：モデルを作成した後１２日目から、毎日動物の行動学的変化（Ｋｅｒｌｅｒｏスコア法）を１回観察して記録した。１点、尾が無力である。２点、尾が不随になる。２．５点、片側後肢が軽度で無力である。３点、片側後肢が顕著に無力である。４点、片側後肢が不随になる。４．５点、片側後肢が不随になるとともに、対側後肢が無力であるか又は同側前肢が軽度で無力である；５点、両側後肢が不随になる；６点、両側後肢が不随になるとともに、片側前肢が不随になる。
【０１１７】
（３）結果の説明：結果を表６に示し、正常野生型ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅマウスでは、モデルを作成した後１４日目から、尾が無力である軽度症状が見られ、２３日目までに、すべて片側後肢がほぼ不随になる病症が観察され、同じ誘発条件において、ｍｆａｔ−１遺伝子導入マウスでは、過程全体にわたって明らかな発症の症状が認められなかった。このことから、ｍｆａｔ−１遺伝子は、体内で明らかなＭＳへの抵抗又は治療作用を果たすことが示されている。
【０１１８】
表５  ｍｆａｔ−１遺伝子導入マウス及び正常ｗｉｌｄｔｙｐｅマウスについてのＭＳ発症行動関連のスコア
【０１１９】
【表５】
2020512010.tif 000007
【０１２０】
配列表
＜１１０＞広州華真生物医薬科技有限公司
＜１２０＞自己免疫疾患及び糖尿病を治療するウイルスベクター、その構築方法及び応用
＜１３０＞  ＳＧ１5１０１６００１
＜１６０＞  １
＜１７０＞  Ｐａｔｅｎｔｌｎ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．３
＜２１０＞  １
＜２１１＞  １２４８
＜２１２＞  ＤＮＡ
＜２１３＞  ｍｆａｔ−１
＜４００＞  １
ｃｔａｇａａｔｃｇｔ  ｃｇａｃｃｔｇｃａｇ  ｇｃａｔｇｇｔｃｇｃ  ｃｃａｃａｇｃａｇｃ  ｇａｇｇｇｃｃｔｇａ  ｇｃｇｃｃａｃｃｇｃ  ６０
ｃｃｃｔｇｔｇａｃａ  ｇｇｃｇｇｃｇａｃｇ  ｔｇｃｔｇｇｔｃｇａ  ｃｇｃｃａｇａｇｃｃ  ａｇｃｃｔｇｇａｇｇ  ａｇａａｇｇａｇｇｃ  １２０
ｃｃｃｃａｇｇｇａｃ  ｇｔｃａａｃｇｃｃａ  ａｃａｃｃａａｇｃａ  ｇｇｃｃａｃｃａｃｃ  ｇａｇｇａｇｃｃｃａ  ｇａａｔｃｃａｇｃｔ  １８０
ｇｃｃｃａｃｃｇｔｇ  ｇａｃｇｃｃｔｔｃｃ  ｇｇａｇａｇｃｃａｔ  ｃｃｃｃｇｃｃｃａｃ  ｔｇｃｔｔｃｇａｇｃ  ｇｇｇａｃｃｔｇｇｔ  ２４０
ｇａａｇａｇｃａｔｃ  ｃｇｃｔａｃｃｔｇｇ  ｔｇｃａｇｇａｃｔｔ  ｃｇｃｃｇｃｃｃｔｇ  ａｃｃａｔｃｃｔｇｔ  ａｃｔｔｃｇｃｃｃｔ  ３００
ｃｃｃｇｃｃｔｔｃ  ｇａｇｔａｃｔｔｃｇ  ｇｃｃｔｇｔｔｃｇｇ  ｃｔａｔｃｔｇｇｔｇ  ｔｇｇａａｃａｔｃｔ  ｔｃａｔｇｇｇｃｇｔ  ３６０
ｇｔｔｃｇｇｃｔｔｃ  ｇｃｃｃｔｇｔｔｃｇ  ｔｇｇｔｇｇｇｃｃａ  ｃｇａｃｔｇｃｃｔｇ  ｃａｃｇｇｃａｇｃｔ  ｔｃａｇｃｇａｃａａ  ４２０
ｃｃａｇａａｃｃｔｇ  ａａｃｇａｃｔｔｃａ  ｔｃｇｇｃｃａｃａｔ  ｃｇｃｃｔｔｃａｇｃ  ｃｃｃｃｔｇｔｔｃａ  ｇｃｃｃｃｔａｃｔｔ  ４８０
ｃｃｃｃｔｇｇｃａｇ  ａａｇａｇｃｃａｃａ  ａｇｃｔｇｃａｃｃａ  ｃｇｃｃｔｔｃａｃｃ  ａａｃｃａｃａｔｃｇ  ａｃａａｇｇａｃｃａ  ５４０
ｃｇｇｃｃａｔｇｔｇ  ｔｇｇａｔｔｃａｇｇ  ａｃａａｇｇａｃｔｇ  ｇｇａｇｇｃｃａｔｇ  ｃｃｃａｇｃｔｇｇａ  ａｇｃｇｇｔｇｇｔｔ  ６００
ｃａａｃｃｃｃａｔｃ  ｃｃｃｔｔｃａｇｃｇ  ｇｃｔｇｇｃｔｇａａ  ｇｔｇｇｔｔｃｃｃｃ  ｇｔｇｔａｔａｃｃｃ  ｔｇｔｔｔｇｇｃｔｔ  ６６０
ｃｔｇｃｇａｃｇｇｃ  ａｇｃｃａｃｔｔｃｔ  ｇｇｃｃｔｔａｃａｇ  ｃａｇｃｃｔｇｔｔｔ  ｇｔｇｃｇｇａａｃａ  ｇｃｇａａａｇａｇｔ  ７２０
ｇｃａｇｔｇｃｇｔｃ  ａｔｃａｇｃｇｇｃａ  ｔｃｔｇｃｔｇｃｔｇ  ｔｇｔｇｔｇｃｇｃｃ  ｔａｃａｔｃｇｃｃｃ  ｔｇａｃａａｔｃｇｃ  ７８０
ｃｇｇｃａｇｃｔａｃ  ａｇｃａａｃｔｇｇｔ  ｔｃｔｇｇｔａｃｔａ  ｃｔｇｇｇｔｇｃｃｃ  ｃｔｇａｇｃｔｔｃｔ  ｔｃｇｇｃｃｔｇａｔ  ８４０
ｇｃｔｇｇｔｇａｔｃ  ｇｔｇａｃｃｔａｃｃ  ｔｇｃａｇｃａｃｇｔ  ｇｇａｃｇａｃｇｔｇ  ｇｃｃｇａａｇｔｇｔ  ａｃｇａｇｇｃｃｇａ  ９００
ｃｇａｇｔｇｇａｇｃ  ｔｔｔｇｔｇｃｇｇｇ  ｇｃｃａｇａｃｃｃａ  ｇａｃｃａｔｃｇａｃ  ｃｇｇｔａｃｔａｃｇ  ｇｃｃｔｇｇｇｃｃｔ  ９６０
ｇｇａｃａｃｃａｃｃ  ａｔｇｃａｃｃａｃａ  ｔｃａｃｃｇａｃｇｇ  ａｃａｃｇｔｇｇｃｃ  ｃａｔｃａｃｔｔｔｔ  ｔｃａａｃａａｇａｔ  １０２０
ｃｃｃｃｃａｃｔａｃ  ｃａｃｃｔｇａｔｃｇ  ａｇｇｃｃａｃｃｇａ  ｇｇｇｃｇｔｇａａｇ  ａａａｇｔｇｃｔｇｇ  ａｇｃｃｃｃｔｇａｇ  １０８０
ｃｇａｃａｃｃｃａｇ  ｔａｃｇｇｃｔａｃａ  ａｇａｇｃｃａｇｇｔ  ｇａａｃｔａｃｇａｃ  ｔｔｃｔｔｃｇｃｃｃ  ｇｇｔｔｃｃｔｇｔｇ  １１４０
ｇｔｔｃａａｃｔａｃ  ａａｇｃｔｇｇａｃｔ  ａｔｃｔｇｇｔｇｃａ  ｃａａｇａｃｃｇｃｃ  ｇｇｃａｔｃａｔｇｃ  ａｇｔｔｃｃｇｇａｃ  １２００
ｃａｃｃｃｔｇｇａｇ  ｇａａａａｇｇｃｃａ  ａｇｇｃｃａａｇｔｇ  ａｔｇａａｔｇｃａａ  ｇｃｔｇｇｃｇｔ  １２４８
【図１】
2020512010.tif 000008
【図２】
2020512010.tif 000009
【図３】
2020512010.tif 000010
【図４】
2020512010.tif 000011
【図５】
2020512010.tif 000012
【図６】
2020512010.tif 000013
【図７】
2020512010.tif 000014
【図８】
2020512010.tif 000015
【配列表】
2020512010000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年9月26日(2019.9.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスベクターであって、
ｍｆａｔ−１遺伝子がクローニングされたレンチウイルス発現プラスミド又はｍｆａｔ−１遺伝子がクローニングされたアデノ随伴ウイルス発現プラスミドであり、
前記ｍｆａｔ−１遺伝子は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：１に示されることを特徴とするウイルスベクター。
【請求項２】
前記レンチウイルス発現プラスミドは、ｐＬＪＭ１−ＣＭＶ−ｈＰＧＫ−ＥＧＦＰプラスミド、ｐＬＪＭ１−ＣＭＶ−ｈＰＧＫ−ｍｋａｔｅ２プラスミド、ｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＧＦＰ−ＳＶ−ｐｕｒｏプラスミド、ＦＵＧＷ、ｐＬｅｎｔｉ−ｐｕｒｏ、ｐＬｅｎｔｉ−ＭＰ２又はｐＬｅｎｔｉプラスミドであり、前記アデノ随伴ウイルス発現プラスミドは、ｐＥＭＢＬ−ＡＡＶ−Ｄ（＋）−ＣＭＶ−ｅＧＦＰ−ＳＶ４０プラスミド、ＡＡＶ  ＧＦＰプラスミド、ＡＡＶ１プラスミド、ＡＡＶ２プラスミド、ｒＡＡＶ２プラスミド、ＡＡＶ５プラスミド、ＡＡＶ８プラスミド、ＡＡＶ９プラスミド又はｐＡＶ−ＦＨ  ＡＡＶプラスミドであることを特徴とする請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のウイルスベクターの構築方法であって、
前記ｍｆａｔ−１遺伝子をレンチウイルス発現プラスミド又はアデノ随伴ウイルス発現プラスミドにクローニングして、ウイルスベクターを得ることを特徴とする構築方法。
【請求項４】
前記ｍｆａｔ−１遺伝子配列をテンプレートとして、プライマーｍｆａｔ−１−Ｆ：５´−ＴＡＴＴＡＡＧＣＴＡＧＣＡＴＧＧＴＣＧＣＣＣＡＣＡＧＣＡ−３´と、ｍｆａ
ｔ−１−Ｒ：５´−ＣＡＡＣＣＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＣＡＣＴＴＧＧＣＣＴ−３´を
設計してＰＣＲ増幅を行い、得られた前記ｍｆａｔ−１遺伝子配列の両端にＮｈｅＩ及びＥｃｏＲＩ酵素消化部位を持たせるステップ（１）と、
ステップ（１）で得られたＰＣＲ増幅産物を電気泳動し、次に、ゲルを切り出して回収して精製し、得られたＰＣＲ増幅産物を制限エンドヌクレアーゼＮｈｅＩ及びＥｃｏＲで酵素消化して使用時まで保存し、空の前記レンチウイルス発現プラスミド又はアデノ随伴ウイルス発現プラスミドを制限エンドヌクレアーゼＮｈｅＩ及びＥｃｏＲで酵素消化して、使用時まで保存するステップ（２）と、
ステップ（２）で得られたＤＮＡ断片を酵素消化後の前記空のシャトルプラスミドに連結して、ウイルスベクターを得るステップ（３）とを含むことを特徴とする請求項３に記載のウイルスベクターの構築方法。
【請求項５】
前記ステップ（１）におけるＰＣＲ増幅反応系は、
５×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）Ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｇ２＋ｐｌｕｓ）  １０μｌと、
ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（各ｄＮＴＰ  ２．５ｍＭ）  ４μｌと、
テンプレートＤＮＡ  ２０−２００ｎｇと、
上流プライマーｍｆａｔ−１−Ｆ（１０μＭ）１μｌと、
下流プライマーｍｆａｔ−１−Ｒ（１０μＭ）１μｌと、
ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（２．５Ｕ／μｌ）０．５μｌと、
５０μＬまで補充する滅菌超純水とを含むことを特徴とする請求項４に記載のウイルスベクターの構築方法。
【請求項６】
前記ステップ（１）におけるＰＣＲ増幅反応の過程において、９８℃で５分変性し、９８℃で１０秒保持して、６０℃で１５秒保持し、７２℃で２分保持することを合計３０回サイクルし、最後に、７２℃で１０分伸長することを特徴とする請求項４に記載のウイルスベクターの構築方法。
【請求項７】
組換えウイルスベクターであって、
請求項１又は２に記載のウイルスベクターを用いて構築されることを特徴とする組換えウイルスベクター。
【請求項８】
ウイルス粒子であって、
請求項１又は２に記載の前記ウイルスベクターを細胞に形質転換して得るウイルス粒子であることを特徴とするウイルス粒子。
【請求項９】
前記ウイルス粒子の投与方式は、静脈注射であることを特徴とする請求項８に記載のウイルス粒子。
【請求項１０】
請求項１又は２に記載のウイルスベクター、又は請求項７に記載の組換えウイルスベクター、又は請求項８に記載のウイルス粒子の、糖尿病治療薬又は自己免疫関連疾患治療薬の調製における応用
【請求項１１】
前記糖尿病は、自己免疫性１型糖尿病であることを特徴とする請求項１０に記載の応用。
【請求項１２】
前記自己免疫関連疾患は、Ｔｈ細胞分化のアンバランス及びその分泌サイトカインのアンバランスによる自己免疫疾患であることを特徴とする請求項１０に記載の応用。
【請求項１３】
前記自己免疫疾患は、１型糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ及び全身性エリテマトーデスであることを特徴とする請求項１２に記載の応用。
【請求項１４】
医薬品であって、
請求項１又は２に記載のウイルスベクター、又は請求項７に記載の組換えウイルスベクター、又は請求項８に記載のウイルス粒子と、その薬学的に許容可能な担体とを含むことを特徴とする医薬品。
【請求項１５】
一般的なプロセスに従って、請求項１又は２に記載のウイルスベクター、又は請求項７に記載の組換えウイルスベクター、又は請求項８に記載のウイルス粒子に一般的な佐剤を添加して、臨床的に許容可能な剤形に調製することを特徴とする請求項１４に記載の医薬品。
【国際調査報告】
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