(57)【要約】  生物学的材料の凍結保存のための温度に冷却する前に、生物学的材料を、少なくとも1つの凍結保護剤に富むガラス化溶液に90秒未満の間、曝露することからなる一段階工程を含む、生物学的材料の凍結保存のための方法。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的材料の凍結保存のための温度に冷却する前に、生物学的材料を、少なくとも1つの凍結保護剤に富む高浸透圧ガラス化溶液に90秒未満の期間、曝露する一段階工程を含む、生物学的材料の凍結保存のための方法。
【請求項２】
支持体上の生物学的材料を冷却媒体に浸漬することによってガラス化する工程を更に含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
生物学的材料が胚であることを特徴とする、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
生物学的材料が胚細胞又は他の関連若しくは誘導細胞を含むことを特徴とする、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項５】
高浸透圧ガラス化溶液が、サッカロースの存在下での多糖誘導体を含むことを特徴とする、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
凍結保護剤がジメチルスルホキシド(DMSO)とエチレングリコールとの混合物であることを特徴とする、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
DMSO/エチレングリコール比が50:50であることを特徴とする、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
ガラス化溶液が、凍結保護剤として動物又はヒトの血清も含むことを特徴とする、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
とりわけ、
a)生物学的材料を高浸透圧ガラス化溶液と90秒未満の期間、接触させる工程;
b)工程a)から得られる生物学的材料を支持体上に堆積させる工程;
c)支持体上に堆積した生物学的材料を冷却媒体中でガラス化する工程、
を含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
支持体上に堆積した生物学的材料を冷却媒体に浸漬する前に、一端が封止されたストロー中に導入することを特徴とする、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
冷却媒体が液体窒素であることを特徴とする、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ガラス化溶液を生物学的材料と接触させる前に、5〜1℃、好ましくは4℃の温度に予備冷却することを特徴とする、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ガラス化から得られる生物学的材料を、正常圧溶液中で室温に急激に再加熱する一段階工程を更に含む、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
急激な再加熱を毎分20000℃の速度で行うことを特徴とする、請求項13に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的材料の凍結保存方法、より詳細には生物学的材料のガラス化のための一段階方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
凍結保存方法は、生物学的材料を非常に低い温度、典型的には77K又は-196℃、すなわち液体窒素の沸点で保存するための方法である。緩慢凍結法とガラス化方法は区別されている。
【０００３】
ガラス化方法は、結晶化することなく液体を非晶質固体に変換する方法である。その方法は、細胞内又は細胞外の氷晶のいずれも出現させることなく、生物学的材料及びその培地を-196℃の温度に冷却することを可能にする。ガラス化方法は、予備調整した生物学的材料を液体窒素に急激に浸漬することを含み、それにより、材料自体及びその容器に関連する熱慣性に応じて、毎分900〜20000℃の範囲の冷却速度が得られる(Vanderzwalmenら、2010年、gynecol. Obstet. Fertil.、38、541〜546頁)。逆に、毎分約0.5〜4℃の徐冷速度を含む凍結保存方法のいずれも、細胞外水の結晶化を伴う緩慢凍結技法の一部である。
【０００４】
凍結保存方法、特にガラス化方法は、一般に、ヒト、動物又は植物の細胞型の生物学的材料、より詳細には、胚細胞、生殖細胞、幹細胞のような高い個別価値を有する細胞、人工多能性細胞、遺伝子組み換え細胞、スクリーニング、診断、毒物学的研究、ワクチン等の治療的研究、又は同様の用途等の用途に使用されるツールである細胞だけでなく、組織、臓器、胚、配偶子及びそれらの前駆体又は他の任意の種類の生物学的材料に適用される。高い個別価値を有する細胞の使用は、再生療法、遺伝子療法、医学的補助による生殖、診断、製薬研究及びワクチン製造の分野において著しく拡大している。これらの細胞の凍結保存は、研究分野及びバイオバンク分野の両方におけるそれらの貯蔵、それらの輸送、それらのスクリーニング及びそれらの増殖のために不可欠であり、産業界の参加者又は治療的又は医学的補助生殖分野の使用者を対象としている。
【０００５】
有効であるためには、凍結保存方法は、高い回収率、液体窒素(LN2)のような冷却媒体中での貯蔵時間に関係なく、生物学的特徴の安定性を可能にしなければならず、化学的及び(ミクロ)生物学的に安全で、実施が容易でかつ自動化が可能でなければならず、最適な健康上の安全性が保証されなければならない。実際に、それらの使用前の貯蔵、輸送、スクリーニング及び増殖の努力はそれに依存している。治療目的のための細胞の凍結保存に適用可能な品質及び安全の制約は、更に、欧州指針に述べられている(2004/03/EC;2006/17/EC;2006/86/EC)。
【０００６】
全ての凍結保存方法、したがって生物学的材料のガラス化方法の目的は、冷却及び再加熱工程中のガラス状非晶質状態を得るのに適合する細胞内条件を定めて維持することである。
【０００７】
より詳細には生物学的材料のガラス化に関し、今日まで、成功への鍵は、凍結保護剤(CP)の増加する濃度を有するいくつかの高張ガラス化溶液への生物学的材料の連続的な曝露中の、(i)冷却速度及び再加熱速度、(ii)細胞脱水、及び(iii)凍結保護剤(CP)の細胞や胚等の生物学的材料中への浸透の間の最適なバランスに依存していた。
【０００８】
ガラス化溶液は様々な種類の溶質からなる。それは、例えば、プロピレングリコール、エチレングリコール、Ficoll、ジメチルスルホキシド(DMSO)、グリセリン、糖類(サッカロース又はジオース、トレハロース、グルコース、フルクトース、スクロース、マンノース、サッカロース等又はそれらの誘導体)等の1種又は複数の異なる凍結保護剤、又はそれらの混合物を含み得る。
【０００９】
ガラス化溶液はまた、例えば、KCl、NaCl又は他の塩の存在下でのK2PO4又はK2HPO4のようなリン酸緩衝液のような生物学的材料の完全性を維持するために要求される溶質だけでなく、グルコース、サッカロース、デキストロース、トレハロース又はそれらの誘導体等の上記の糖類もまた含み得る。
【００１０】
最後に、ガラス化溶液はまた、タンパク質の提供及び凍結保護効果のために使用されるヒト又はウシ胎児血清(FBS)、又はウシ胎児血清(FCS)又はウシ血清アルブミン(BSA)等の動物血清等の溶質を含み得る。
【００１１】
これらの溶質は全て、等張浸透圧に向かう平衡のメカニズムにおいても役割を果たす。
【００１２】
ガラス化溶液は、低張又は低浸透圧である細胞内培地の別の溶液に関して高張又は高浸透圧として説明され、生体又は半透膜によってガラス化溶液から、高張ガラス化溶液の溶質濃度が、細胞内培地の溶液によってこの膜に加えられる圧力(低張)よりも低い圧力を及ぼすようなものである場合に、分離される。これは、圧力の平衡を再確立し、したがって2つの溶液の等張性又は等浸透圧に向かわせるために、細胞内膜からガラス化溶液への水の誘引及び/又は膜を通る溶質の交換という結果をもたらす。生理学的条件下で細胞内培地に関して等張である溶液は正常圧(normotonic)であると説明できる。
【００１３】
The Asian Journal of Animal and Veterinary Advances 11(10)、2016年は、従来技術による通常の実施に従う二段階ガラス化プロセスを記載している。生物学的材料を、適切な卵母細胞又は胚の場合、最初に浸透性の凍結保護剤を含む非ガラス化溶液に供し、次に高濃度の浸透性凍結保護剤及び非浸透性凍結保護剤を含む第2のガラス化溶液に曝露する。第一の工程において、卵母細胞を、例えば、18%ウシ胎児血清(FBS)を含有するリン酸緩衝液中の10%(v/v)エチレングリコール及び10%DMSO(v/v)の溶液に浸漬し、次に、18%ウシ胎児血清(FBS)を含有するリン酸緩衝液中に20%(v/v)のエチレングリコール、20%(v/v)のDMSO及び0.3Mのトレハロースを含む第2のガラス化溶液に浸漬する。2つの工程は、細胞壁を通して平衡化する、細胞内及び細胞外溶液の種々の溶質間のゆっくりした平衡化を可能にする。この平衡化は約10分のゆっくりした反応である(第611頁最終段落左欄参照)。
【００１４】
従来技術によれば、ガラス化方法の実施中、冷却工程に供されることになる最終溶液又はガラス化溶液は、高張ガラス化溶液(VS)、つまり、浸透性及び/又は非浸透性CPの混合物を含有する溶液でなければならない。VSの役割は、細胞外の氷晶の出現を阻害するガラス化鞘において、細胞、胚等の生物学的材料を被覆することである。実際には、ほとんどのガラス化方法は、細胞又は胚のような生物学的材料のいくつかの段階の曝露を含み、VS溶液中の最終曝露の前の、次第に濃厚化し浸透するCPの溶液からなる。それ故、Vanderzwalmenらは、Human Reproductionの2013年4月の記事において、卵母細胞及び胚について、浸透性CPの濃度が増加する(約3〜4M)非ガラス化溶液(nVSi)への最初の一連の曝露を記載している。卵母細胞及び胚は次に、高濃度の浸透性CP(約5〜6.5M)及び非浸透性CP(約0.5〜1M)を含むガラス化溶液(VS)としても知られるガラス化溶液(VS)に、液体窒素に浸される前に曝される。細胞内ガラス化状態を調製するためには、nVSi曝露工程中に次第に濃厚化する凍結保護剤(CP)が必要であることは当業者に知られており受け入れられている。他方、VS中の浸透性CPと非浸透性CPとの混合物は、塩、タンパク質、オルガネラ、多糖類、及び前の工程の間に細胞中にすでに浸透しているはずの任意のCPを含む細胞内成分を濃厚化する最終的な細胞脱水の原因である。
【００１５】
非浸透性の凍結保護剤(CP)(又はそれらに対する膜浸透性が非常に低いことを考慮すると、非浸透性と考えられるもの)には、例えば、Ficoll(登録商標)、サッカロース、トレハロース、ラクトース、マンニトール、マルトース、マンノース及び二糖類及び三糖類のファミリーに属する任意の分子、又は多糖類、又は多価アルコール、又は他の誘導若しくは類似の分子がある。
【００１６】
浸透性の凍結保護剤の中では、例えば、ジメチルスルホキシド(DMSO)、エチレングリコール(EG)、プロピレングリコール(PG)、ポリエチレングリコール、トリエチレングリコール、グリセリン及び他の誘導又は類似の分子が挙げられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Vanderzwalmenら、2010年、gynecol. Obstet. Fertil.、38、541〜546頁
【非特許文献２】The Asian Journal of Animal and Veterinary Advances 11(10)、2016年
【非特許文献３】Quinn、J.Reprod.Fert.、1982年9月:66(1):161〜8頁
【非特許文献４】Whittingham、J.Reprod.Fertil Suppl.、1971年、14:7〜21頁
【非特許文献５】Vanderzwalmenら、Human Reproduction、第28巻、2101〜2110、1〜10頁、2013年
【非特許文献６】Nagyら、PNAS、第90巻、8424〜8428頁、1993年
【非特許文献７】「Manipulating the mouse embryo, a laboratory manual」、第4版、2013年、Behringerら、CSH Press
【非特許文献８】Yavinら、Hum Reprod.、2009年4月;24(4):797〜804頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
凍結保護剤(CP)の存在は必要ではあるが、その一方で、全てのCPが潜在的に有毒であり、特に浸透性のCPであることを受け入れなければならない。それらの毒性は、使用される濃度、曝露の温度及び期間、培地の張度、細胞の生成物との接触様式、最後に、細胞の種類に依存する。例えば、ジメチルスルホキシド(DMSO)、グリセリン、より詳細にはプロピレングリコール(PROH)は、非酵素反応によって潜在的に毒性のホルムアルデヒドを形成し得る。更に、DMSOは、膜タンパク質を不安定化し、それに結合している結合水を置換することによって毒性作用を有すると考えられている。全てのCPは有毒であり、細胞内濃度を下げることが有益であると誰もが同意しているが、現在、細胞や胚を使用せずに凍結保存する方法については一致する意見がない。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
既知のガラス化方法に特有の非ガラス化溶液(nVSi)への一連の曝露工程を避ける、新規なガラス化方法が今や見出され、それにより、細胞や胚が次第に濃厚化する浸透性で有毒なCPに徐々に曝されるのを回避できる。
【００２０】
本発明は、実際に、凍結保存のための一段階方法、より詳細には、生物学的材料を、浸透性CP及び非浸透性CPを含む1種のガラス化溶液(VS)だけに、冷却前の限定された期間、曝露してガラス化するための一段階方法に関する。曝露の時間は、好ましくは90秒未満、優先的には30秒〜90秒である。冷却は、生物学的材料の凍結保存のための温度で行われる。凍結保存温度は、例えば液体窒素の温度であり得る。非浸透性凍結保護剤(CP)は、ガラス化溶液(VS)中に10%(v/v)〜60%(v/v)の範囲、好ましくは60%の濃度で存在する。
【００２１】
浸透性凍結保護剤CPは、ガラス化溶液(VS)中に5%〜50%(v/v)、好ましくは20%(v/v)の範囲の濃度で存在する。
【００２２】
アルブミンのような動物又はヒトの血清もまた、ガラス化溶液(VS)中の0.1%〜1%(v/v)の範囲、好ましくは0.6%の低濃度で凍結保護剤として使用される。
【００２３】
驚くべきことに、この一段階ガラス化方法は、nVSis及びVSへの連続曝露を組み合わせた従来技術によるガラス化方法で得られる結果と同等又はそれ以上の結果を得ることを可能にする。
【００２４】
この方法は、CPへの長期曝露に関連する毒性の影響を排除するという利点も有する。
【００２５】
本発明による生物学的材料は、例えば、任意の種類の細胞若しくは組織若しくは器官、又は単細胞生物若しくは多細胞生物であり得る。本発明の好ましい一実施態様では、生物学的材料は、胚、胚細胞、又は他の関連若しくは誘導された細胞、及び人工多能性細胞及び成体腱間葉系幹細胞でもある。
【００２６】
好ましい生物学的材料は、胚又は正常である(例えば、間葉系幹細胞)又は遺伝的に修飾されている(例えば、人工多能性細胞)、残りの細胞である。
【００２７】
本発明による生物学的材料は、胚に関してはそれらの接合子、桑実胚又は胚盤胞胚;胚から誘導した細胞に関しては、胚性幹細胞、栄養膜細胞;成体幹細胞又は異なる起源からの分化細胞に関しては、臍帯血細胞、様々な組織に由来する細胞、例えば、血液-末梢血単球-、筋肉-筋細胞又は筋芽細胞、衛星細胞-、靭帯及び腱-腱細胞、間葉系幹細胞-、骨-骨芽細胞、骨細胞、破骨細胞-、軟骨-軟骨芽細胞及び軟骨細胞-、心臓-心筋細胞、心筋芽細胞-、肺及び呼吸器系の経路-肺細胞、繊毛細胞-、肝臓-肝細胞-、膵臓-α及びβ細胞、膵臓外分泌細胞-、脾臓-脾細胞-、樹状細胞-、リンパ器官、腎臓、神経組織-神経芽細胞及び神経細胞、マイクログリオサイト、シュワン細胞、介在ニューロン-、血管-内皮細胞、平滑筋細胞-、感覚器官-角膜細胞、網膜の神経感覚細胞、内耳の細胞-、胃-胃上皮細胞-、腸-腸細胞、平滑筋細胞、神経細胞-、生殖系-卵胞細胞、セルトリ細胞、ライディッヒ細胞、始原生殖細胞、幹細胞及び性腺細胞-、腔壁-中皮細胞-、結合組織-間葉系幹細胞、線維芽細胞-、胸腺、甲状腺、副甲状腺、副腎、及びこれらの細胞の遺伝的に修飾又は再プログラムされた変異体も含む。
【００２８】
従来のプロトコールを単純化することに加えて、本発明による方法は、凍結保存のための冷却の前に、胚や細胞等の生物学的材料を、短期間、好ましくは90秒未満、優先的には30秒〜90秒、慣用的なガラス化技術で通常使用される中間溶液(nVSi)を含まずに最適な脱水を誘導するように、単一のガラス化溶液(VS)に暴露することを可能にする。本発明によるガラス化方法において、この急速な脱水の原因となる高張溶液は、高浸透圧溶液とも呼ばれ、冷却によって誘導されたガラス化後に細胞内の遊離水を消失させて生物学的材料を生存させる。本発明による方法では、細胞内空間に侵入する凍結保護剤(CP)に頼る必要はもはやなく、これは、細胞内培地のCPへの長期曝露に関連する、遺伝毒性を含む、既知又は未知の短期、中期、又は長期の毒性効果を排除するという利点を有する。本発明による方法では、冷却速度は、従来技術による慣用的な方法におけるよりもはるかに重要ではないように思われる。
【００２９】
本発明の一実施態様において、本発明による方法はまた、支持体上の生物学的材料を冷却媒体に浸漬することによってガラス化する工程を含む。冷却媒体は、例えば液体窒素であり得る。
【００３０】
本発明による凍結保存方法は、
a)生物学的材料を高張又は高浸透圧ガラス化溶液(VS)と、制限された時間、好ましくは90秒未満の期間、接触させる工程;
b)工程a)から得られる生物学的材料を支持体上に堆積させる工程;
c)工程b)から得られる支持体上の生物学的材料を、好ましくは液体窒素である冷却媒体中でガラス化する工程
を優先的には含む。
【００３１】
したがって、生物学的材料は、例えば、無菌又は非無菌条件下で、冷却媒体としての液体窒素中に制限された期間、保存することができる。
【００３２】
非無菌ガラス化の場合、生物学的材料を、好ましくは溝の形態の支持体上に堆積させ、次いで、ガラス化溶液(VS)内に短い期間曝露した後、好ましくは液体窒素である冷却媒体中に直接浸漬する。
【００３３】
無菌ガラス化の場合、生物学的材料を、ガラス化溶液(VS)に暴露した後に支持体上に堆積させ、一端を封止した容器又は保護用ストロー中に導入する。保護ストローは、好ましくは液体窒素である冷却媒体に浸漬される場合はその他端も封止される。
【００３４】
保護用ストローは、無菌であって低温保存に耐性がなければならない。それは合成材料で作られるのが好ましく、ポリプロピレンのようなポリマーをベースとしたプラスチック又はアイオノマー樹脂のような樹脂をベースとしたプラスチックからなり得る。ストローの体積は250μl〜500μlの範囲であり得る。好ましくは250μlである。
【００３５】
本発明の好ましい一実施態様では、ガラス化溶液(VS)は、生物学的材料と接触させる前に、好ましくは5〜1℃、好ましくは4℃の温度に冷却する。
【００３６】
液体窒素のような冷却媒体中で費やすその時間後、生物学的材料は次に室温まで再加熱することによって回収される。
【００３７】
高張性を低減する溶液のいくつかの連続した浴を必要とする従来技術によるガラス化方法とは対照的に、本発明による方法は、ガラス化工程を経た生物学的材料を急激に再加熱する工程を1つだけ含む。液体窒素の温度のような冷却温度から開始する、約18〜25℃の室温までのこの急激な再加熱は、毎分10000〜30000度、好ましくは、毎分20000℃の範囲の速度で行われる。
【００３８】
再加熱は、生物学的材料を、M2胚をすすぐための溶液(Quinn、J.Reprod.Fert.、1982年9月:66(1):161〜8頁による洗浄培地)等の正常圧溶液に浸漬することによって行われる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】本発明による一段階でガラス化したR1 mESCをC57BL/6胚盤胞に注射した結果得られた9匹のキメラ新生児マウスの同腹子の写真である。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本発明は、特許請求の範囲に記載される本発明の限定として解釈されるべきではないいくつかの実施例によって以下に説明される。
【００４１】
材料及び方法
1.胚の製造
5週齢の雌性FVB/N又はC57Bl/6J近交系マウス(Janvier Labs、フランス)に、5国際単位(i.u.)の妊馬血清ゴナドトロピン(PMSG)の腹腔内(i.p.)注射により、続いて46時間後に、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)の5i.u.のip注射により過剰排卵させた。hCG注射の直後に、処置した雌を同一系統の雄と交配させた。交配の翌日、膣栓を示すマウスを頸椎脱臼により安楽死させ、それらの接合子を集めた。2つの前核及び正常な細胞質を有する胚のみをこの研究に含んだ。胚盤胞期までの接合子のインビトロでの発達(インビトロでの発達の5日目)は、オイル下のM16胚のための培地(Whittingham、J.Reprod.Fertil Suppl.、1971年、14:7〜21頁)50μlの液滴中で、水分で飽和した5%CO2の制御された雰囲気中において38℃で行った。
【００４２】
2.胚の使用
概して、胚を様々な群にランダムに分散させた。インビトロで発達させた胚を、1細胞期(接合子;1期)、2細胞期(2期)及び桑実胚期で使用した。再加熱後、全ての胚(移植に使用したものを除く)をインビトロで胞胚期まで培養した。各実験の検証のために、各操作は、試験群に加えて、非凍結保存対照群及びVanderzwalmenらによってHuman Reproduction(第28巻、2101〜2110、1〜10頁、2013年)に記載された従来技術によるプロトコールとも呼ばれる「慣用的な」プロトコールに従ってガラス化した群も含んでいた。簡単に言うと、従来のプロトコールによるガラス化は、それらを4℃に予備冷却したガラス化溶液(VS)中で洗浄してそれらをそれぞれの支持体上に堆積させる前に、胚を非ガラス化溶液1及び2(nVS1及びnVS2)に2回、3分間及び室温で曝露することからなる。後者の工程は1分を超えない。試験群を、以下に記載されるように(実施例1〜4において)ガラス化及び/又は再加熱される前に予備冷却したVSに直接暴露した。胚の生存を、再加熱の1時間後に評価し、一方で、発達率を、得られた胚盤胞を数えることによってインビトロ培養の5日目に評価する。
【００４３】
3.マウス胚性幹細胞(mESC)の培養
R1系のマウス胚性幹細胞(mESC)(Nagyら、PNAS、第90巻、8424〜8428頁、1993年)を、フィーダー細胞を含まないゼラチン化培養皿で、培地中で、それらの多能性及びそれらの増殖能力を維持する条件下で培養した。使用した培地は以下のTable 1(表1)に記載の通りである。
【００４４】
【表１】
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【００４５】
培養開始後3日目から、培地を毎日交換する。成長に必要な場合(70%コンフルエント)、細胞を、新しい培養皿中で実験の必要性に応じた密度で分配する。これを行うために、培養物をカルシウム又はマグネシウムを含まないPBSですすぎ、次いでトリプシン-EDTAを用いて採取し、均質な細胞懸濁液を得るために3〜5分間インキュベートする。以下のTable 2(表2)に記載するように、トリプシン活性を6〜8容量の洗浄溶液を用いて停止させる。
【００４６】
【表２】
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【００４７】
洗浄した細胞の懸濁液を遠心し、ペレットを培地に再懸濁する。細胞を実験の必要性に応じた密度で新しい培養皿に分配する。
【００４８】
4.本発明による実施例を用いた凍結保護溶液
実施例で使用される全てのnVSi凍結保護溶液は、商業的供給源(例えばGibco(登録商標)のウシ胎児血清)由来の細胞培養のために、10%ウシ胎児血清(FCS)を補充したD-PBS(Sigma D-4031)の緩衝溶液から調製する。対照群に使用するnVS1及びnVS2溶液を、従来技術に従って慣習的に調製し、Vanderzwalmenら、Human Reproduction(第28巻、2101〜2110、1〜10頁、2013年)に記載されている。nVS1溶液は5%(v/v)のジメチルスルホキシド(DMSO)及び5%(v/v)のエチレングリコール(EG)を含み、一方nVS2溶液は10%(v/v)のDMSO及び10%(v/v)のEGを含む。
【００４９】
従来技術の慣用的な方法に従ってnVSi溶液に続いて使用されるVS高浸透圧溶液は、又は本発明による方法においてそれ自体において、20%(v/v)のDMSO、20%(v/v)のEG、0.5Mのサッカロース(Sigma S-1888)及び25μMのFicoll(Sigma F-8636)からなる。使用したサッカロース溶液(S-1888)は、10%のウシ胎児血清を補充したD-PBS緩衝液(Sigma D-4031)から調製する。
【００５０】
5.再加熱後の細胞の計数
mESCを、再加熱直後、並びに24時間後及び48時間後にNeubauerセルを用いて計数する。死亡率は、トリパンブルー排除試験により推定した。
【００５１】
6.本発明による一段階ガラス化方法
胚のガラス化:
一段階ガラス化のために、4〜6の群の胚をそれらの培地から取り出し、4℃に予備冷却した0.5ml液滴のVS中に移す。VSにおける様々な持続時間の曝露後(実験1では30;90;120;150及び180秒;実験2、3及び4bでは30対150秒;実験3及び4bでは50秒)、胚をガラス化の支持体:非無菌ガラス化の場合のVitriPlug(オーストリア、Vitrimed)(実施例1、2、3、4a及び対照群)、及び無菌ガラス化用のVitriSafe(オーストリア、Vitrimed)(実施例3及び4b)の溝上に配置する。「無菌ガラス化」という語は、培地及び胚が液体窒素と直接接触しないガラス化を意味することを意図している。無菌ガラス化の間、このVitriSafe支持体は、事前に確認され、バラストをかけられ、一端を封止した0.3mlの保護ストロー(CryoBioSystem)中に導入する(0.3mlのストローには2つのコンパートメントがある)。これら2つのコンパートメントはコットンウールプランジャーで区切られている。0.3mlの大きなコンパートメントはVitriSafe(登録商標)を収容し、もう一方は、識別ラベルに包まれたバラスト(着色プラスチックフィルムで被覆されたステンレス鋼の棒)を収容することを意図する。液体窒素に浸漬させている間、保護ストローの第2の端部も封止される。無菌ガラス化及び非無菌ガラス化の両方の間、ストローの周囲に断熱ガス層を形成することによって冷却速度を低下させる「ライデンフロスト」効果を防ぐために液体窒素中で円運動を行うことによって冷却を加速する。
【００５２】
2つの対照群、すなわち非凍結保存胚の群及びVanderzwalmenら(Human Reproduction、2013年)に記載された従来技術の慣用的な方法に従ってガラス化した群を並行して処理する。
【００５３】
胚性幹細胞のガラス化:
ガラス化を、従来技術によるガラス化及び本発明による一段階ガラス化のために無菌的に行う。培養中の細胞を上記のように採取し、次いで細胞懸濁液のアリコートを細胞計数のために使用し、任意にそれらの計数の関数として画分に分配する。次いで細胞懸濁液を遠心分離し、ペレットを4℃に予備冷却したVS溶液250μl中に50秒間再懸濁する。この培養の間、細胞懸濁液を、胚について上で説明した通りの方法で液体窒素に浸漬する前に両端を封止した250μlのストロー中に吸引する。
【００５４】
7.本発明によるガラス化に続く再加熱工程
無菌ガラス化後の再加熱中、及び保護ストローを依然として部分的に液体窒素に浸漬している間、VitriSafe(登録商標)を含むコンパートメントに対応する封止端をハサミで切断し、そこからVitriSafeを抽出する。胚を支持するその溝を、0.5mlの0.5Mサッカロース(対照群)又は0.25Mサッカロース(例1及び4aの群)又はM2培地(室温(実施例2及び4b))の液滴に直接かつ直ちに浸漬する。浸漬による再加熱手順の後者の工程は室温で行い、VitriPlugs(登録商標)を使用する場合に同一である。それはVSの再加熱及び即時希釈にも起因する。
【００５５】
8.統計分析
胚に関する全ての実施例において、統計分析はSASソフトウェアを用いて線形モデル(分散分析)に従って行った。pの値が0.05未満である差異のみが有意とみなされる。
【実施例】
【００５６】
実施例及び結果
(実施例1)
I期及びII期並びに桑実胚期における胚の本発明による一段階ガラス化工程:VSへの曝露期間の影響
「Manipulating the mouse embryo, a laboratory manual」、第4版、2013年、Behringerら、CSH Pressに記載の製造方法に従って、胚を1細胞期(接合子;1期)で採取する。これらの胚のいくつかは、非凍結保存対照群に割り当てられ、実験のための参照として役立つことになる。この参照群が90%未満の胚盤胞のパーセンテージを示した全ての実験は無効にした。ガラス化した胚の群のうち、1つの群は、Vanderzwalmenら(Human Reproduction、2013年)に記載された従来技術の慣用的な方法に従って処理し、冷却の前に、他の5つの群の胚を、ポイント3に記載のガラス化溶液(VS)にそれぞれ30秒間、90秒間、120秒間、150秒間及び180秒間、直接曝露する。
【００５７】
その後、胚を非無菌支持体(Vitrimed(登録商標)製)上に5つ(+又は-1)の群に置き、概して1日〜1週間の範囲で液体窒素中で長期間保存するためにその中に直接浸漬する。
【００５８】
再加熱中、VanderzwalmenらによってHuman Reproduction(第28巻、2101〜2110、1〜10頁、2013年)に記載された慣用的な方法に従ってガラス化した対照群を含むが、非凍結保存対照群を除く全ての群を、0.25Mの濃度でPBS(Sigma D4031)中に希釈したサッカロース(Sigma S-1888)溶液にそれらを浸漬させながら、毎分20000℃の速度で急激に室温にする。1〜3分の範囲の様々な期間、胚の群をこの溶液中に滞留させる。
【００５９】
次いで、胚をM16培地(Whittingham、J. Reprod.Fertil Suppl.、1971年、14:7〜21)中に配置する前に、M2培地(J.Reprod.Fert.1982年、9月:66(1):161〜8のQuinnによる洗浄培地)で洗浄する。回収した胚のみを考慮する。実験的生存率を1時間の培養後に計算する。一方、発達率は発生の5日目に評価する。これは、再加熱後に回収された胚の数に対する、得られて発現した胚盤胞のパーセンテージである。
【００６０】
その後、接合子期で採取し、培養24時間後に2細胞期までインビトロで発達させた胚を用いて同じ実験を行った。
【００６１】
接合子段階で採取し、培養36時間後に桑実胚段階(+/-16細胞)までインビトロで発達させた胚を用いて同じ実験を行った。
【００６２】
結果をTable 1(表3)に再現する。Table 1(表3)は、再加熱の1時間後に観察された生存率及び接合子、II期及び桑実胚期の一段階ガラス化後の、発達5日目に観察された胚盤胞のパーセンテージを示す。
【００６３】
実施例1の間に、46匹の過排卵雌から合計681個の接合子を採取した。
【００６４】
【表３】
2020503065.tif 000005
【００６５】
この実施例1を分析すると、接合子について、1時間後の生存率はVSへの曝露の期間による影響を受けないことが観察された。胚盤胞への発達の最高速度は、最低曝露期間、したがって最低細胞内濃度のCP(ICCP)で得られる:30秒群及び90秒群。
【００６６】
II期に関しては、1時間後の生存率は180秒の曝露で低下する。培養5日目に得られた胚盤胞の量は、接合子について得られたものとほぼ同じであり、最適曝露は約90秒の曝露を中心とし、150及び特に180秒の曝露で非常に少なくなる。
【００６７】
桑実胚については、II期と同様に、1時間後の生存率は最大150秒まで優れているが、その後劇的に低下する。同様のことが5日目の胚盤胞のパーセンテージにも当てはまり、その最適値は短時間の曝露を中心としている。したがって、驚くべきことに、研究された各段階について、発達速度はVSへの曝露の最短期間に対して最高であり、従来技術による慣用的なガラス化後の対照群で得られたものと同様である。これは、本発明による短時間の急激な一段階脱水が細胞内ガラス化を誘導し、毎回CPとそれに続く水の浸入が続く段階的脱水よりも有害ではないことを示している。したがって、マウス胚の生存は、30秒という短い期間のVSへの曝露後で可能である。これはまた、非常に低い、又はゼロの細胞内濃度のCPにもかかわらず、胚がガラス化を生き残ることを意味する。確かに、VSへの曝露の最短期間(30秒)は、CP又は水の侵入を許さずに細胞の脱水を引き起こし、この例では、最長の曝露と比較してガラス化の有効性(生存と発達)が大きくなり、これはCPに続いて水を侵入させる(Vanderzwalmenら、Human Reproduction、第28巻、2101〜2110、1〜10頁、2013年)。
【００６８】
(実施例2)
I期とII期及び桑実胚期の一段階ガラス化:再加熱中の、瞬間的な細胞質内再水和を誘導する、サッカロース不含培地(M2培地単独)でVSを一段階で希釈した場合の効果
従来技術による慣用的なガラス化プロセス(Vanderzwalmenら、Human Reproduction、第28巻、2101〜2110、1〜10頁、2013年)の間、CPは、VSへの曝露及び冷却に先行するnVSi溶液への様々な曝露中に細胞に入る。再加熱中、細胞を、nVSi曝露工程の間に細胞に侵入する浸透性CPを含む脱水細胞質中への急激で過剰な水の侵入を妨げるために使用する浸透圧活性剤であるサッカロースに曝露した。従来技術による慣用的なガラス化に続く再加熱プロセスの間、このサッカロース含有溶液の不在は、過度に急激で大量の水の侵入の後に細胞の破裂をもたらす。この過剰な水の侵入は、細胞内に浸透し浸透圧的に活性なCPが存在することにのみ関連している(Vanderzwalmenら、Human Reproduction、第28巻、2101〜2110、1〜10頁、2013年)。
【００６９】
本発明によるガラス化の場合、胚をnVSiに曝露しない。したがって、特にVSへの曝露に関連する脱水段階が短い場合は、細胞質中へのCPの侵入があってはならない。この仮説が正しいとすれば、細胞内CPの不在において、サッカロースは、再加熱中に水が過剰に侵入するのを防ぐのに必要ではなくなる。この仮説を検証するために、実施例2の間、サッカロース不含M2培地中での直接再加熱を行った。
【００７０】
実施例1と同様に、マウス胚を、接合子、2細胞期及び桑実胚期にガラス化する。凍結保存されていない対照群は実験の参照として役立ち、対照群はVanderzwalmenら(第28巻、2101〜2110、1〜10頁、2013年)に記載されている従来技術の方法によってガラス化し、再加熱する。他の2つの胚の群(接合子、2期及び桑実胚)は、本発明に従って、ガラス化溶液(VS)に30秒間又は150秒間直接曝露することによってガラス化する。
【００７１】
この後、胚を非無菌支持体(VitriPlug、Vitrimed(登録商標)製)上に5つ(+又は-1)の群に置き、概して1日〜1週間の範囲で液体窒素中で長期間保存するためにその中に直接浸漬する。
【００７２】
再加熱中、従来技術(Vanderzwalmenら、Human Reproduction、2013年)に従ってガラス化した対照群を、0.5Mの濃度でPBS(Sigma D4031)中に希釈したサッカロース(Sigma S-1888)溶液にそれを浸漬させながら、毎分20000℃の速度で急激に室温にする。この群の胚を、M2培地(Quinnによる洗浄培地、1982年)中で洗浄する前に、1〜3分の範囲の様々な期間、この溶液中に滞留させ、その後、M16培地(Whittingham、J.Reprod.Fertil Suppl.、1971年、14:7〜21)中で培養する。本発明に従ってガラス化した他の群もまた、毎分20000℃の速度で急激に室温にするが、今度はそれらをM2培地(Quinn、1982年)に直接浸漬しながら行い、その後、M16培地(Whittingham、J.Reprod.Fertil Suppl.、1971年、6月:14:7〜21)中で培養する。
【００７３】
Table 2(表4)は、接合子、II期及び桑実胚について、再加熱の1時間後に観察された生存率、並びにサッカロース不含培地における一段階ガラス化及び一段階再加熱後の発達5日目に観察された胚盤胞のパーセンテージを示す。
【００７４】
25匹のマウスから合計526個の接合子を採取し、実施例2の間に使用した。
【００７５】
【表４】
2020503065.tif 000006
【００７６】
この実施例2を分析すると、ガラス化中の胚の段階に関係なく、T0での生存率及び5日後の胚盤胞への発達率も、慣用的なガラス化と比較して、本発明による方法(糖類無しの一段階ガラス化及び一段階再加熱)と同等又はそれ以上でさえある(VSへの30秒間の曝露)。したがって、本発明による一段階ガラス化後の再加熱中のサッカロースの浸透圧活性は、特にVSへの短い曝露(30秒)のためには必要ではないと思われる。それ故、正常圧溶液(M2)中の急激な浸漬は、それが膨潤した後に細胞死を引き起こすことはい。これは、サッカロース不含培地中で直接再加熱すると、胚の過剰な膨潤に続いて、その生存能力が劇的に低下するという従来技術による方法(Vanderzwalmenら、Human Reproduction、第28巻、2101〜2110、1〜10頁、2013年)中の場合には当てはまらない。
【００７７】
従来技術によるガラス化とは対照的に、本発明による一段階ガラス化が細胞内への凍結保護剤(CP)の侵入を劇的に制限するか又は排除さえするという本発明者らの仮説はこのように検証される。
【００７８】
更に、実施例1と関連して、この実験は、本発明による一段階ガラス化のプロセスとそれに続く一段階再加熱が、従来技術によるガラス化と少なくとも同程度の細胞の生存能力及び発達に関して効果的であると同時に、潜在的に有害な凍結保護剤(CP)の含有量を確実に減らす又は排除さえすることを保証することを示している。
【００７９】
(実施例3)
一段階ガラス化及び再加熱:支持体の性質の影響:無菌又は非無菌
先の実施例(1及び2)は、本発明による一段階ガラス化が、非常に低いか又はゼロでさえある凍結保護剤(ICCP)の細胞内濃度をもたらすことを実証した。
【００８０】
従来技術による細胞内ガラス化の教義の1つは、水性培地のガラス化の特性から推測される。つまり、細胞中のCPの濃度が低ければ低いほど、ガラス状態を発生させ維持するために冷却速度及び加熱速度をより一層高くしなければならない(Yavinら、Hum Reprod.、2009年4月;24(4):797〜804頁)。
【００８１】
それ故、本発明による一段階ガラス化の間、冷却及び再加熱速度の低下は、ガラス状態を得るか又は保持することのいずれも可能にせず、細胞に有害な氷晶の出現を引き起こすであろうと予測される。
【００８２】
実施例1及び2においてこれまで使用してきた非無菌支持体は、生物学的試料を液体窒素と直接接触させることを可能にする。これにより、毎分約+/-20000℃の冷却速度が得られる。逆に、無菌支持体は、胚を担持する支持体が保護ストロー内に配置されるので、生物学的試料を液体窒素と直接接触させない。このストローの存在の結果として、冷却速度は遅くなり、その後毎分+/-1000℃である。
【００８３】
本発明による一段階ガラス化に対する冷却速度の効果を評価するために、後者を無菌及び非無菌の2種類の支持体を用いて行った。単一の再加熱方法を使用した:一段階及び直接M2培地中で。
【００８４】
実施例1及び2に関しては、マウス接合子を採取し、この段階で直接ガラス化する。非凍結保存対照群は参照として役立ち、対照群をVanderzwalmenら(Human Reproduction、第28巻、2101〜2110、1〜10頁、2013年)によって記載された従来技術の慣用的な方法によってガラス化する。他の群の胚は、50秒間又は150秒間VSに直接曝露する。
【００８５】
その後、胚を非無菌支持体(Vitrimed(登録商標)からのVitriPlug(登録商標))又は無菌支持体(Vitrimed(登録商標)からのVitrisafe(登録商標))のいずれか上に5つ(+又は-1)の群中に配置し、概して1日〜1週間の範囲で液体窒素中で長期間保存するためにその中に直接浸漬する。
【００８６】
再加熱中、従来技術による慣用的な方法(Vanderzwalmenら、Human Reproduction、第28巻、2101〜2110、1〜10頁、2013年)に従ってガラス化した対照群を、0.5Mの濃度でPBS(Sigma D4031)中に希釈したサッカロース(Sigma S-1888)溶液にそれらを浸漬しながら、毎分20000℃の速度で急激に室温にする。M2培地(Quinnによる洗浄培地、J.Reprod. Fert.、1982年9月:66(1):161-8)中で洗浄し、その後M16培地(Whittingham、J.Reprod.Fertil Suppl.、1971年、14:7〜21頁)での培養に配置する前に、この群の胚を、1〜3分の範囲の様々な期間この溶液中に滞留させる。他の群もまた、M16培地(Whittingham、1971年)での培養に配置する前に、毎分20000℃の速度で急激に室温にするが、それらは直接M2培地(Quinn、1982年)に浸漬しながらである。
【００８７】
Table 3(表5)は、再加熱の1時間後に観察された生存率及び発達の5日目に観察された胚盤胞のパーセンテージを示す。
【００８８】
実施例3の間に合計405個の接合子を採取して使用した。それらは17匹のマウスから採取した。そのより大きな複雑さのために、無菌条件下でのガラス化は50秒未満では実施できない。このため、この比較を、2つの「無菌」及び「非無菌」の群でこの期間にわたって実行する。
【００８９】
【表５】
2020503065.tif 000007
【００９０】
非無菌群と無菌群の間に有意差は見られない。VSへの短い曝露(50秒)の間、2種の容器は従来技術によるガラス化に匹敵する非常に類似した結果を与える。2つの包装形態に関して、より長い曝露(150秒)は胚盤胞の発達を減少させる傾向があり、無菌支持体については更にそうである。
【００９１】
この実施例は更に、本発明によるガラス化の間、細胞内ガラス化に関連しているのはCPの細胞内存在ではないことを示す。確かに、VSへの曝露の最短期間(50秒)は、CP又は水を侵入させずに細胞の脱水を引き起こし(Vanderzwalmenら、2013年)、これは、先の実施例(1及び2)では、CP及び水の侵入を可能にするより長い曝露(Vanderzwalmenら、2013年)と比較して、より大きな有効性(生存と発達)が得られた。
【００９２】
冷却速度を低下させること(例えば、無菌支持体の使用に関連する)は、より高い細胞内濃度の凍結保護剤(ICCP)の必要性を伴うことが、従来技術によるガラス化の間に共通して認められている。この原則によれば、本発明によるガラス化によって誘導されるICCPは低いか又はゼロであると仮定すると、無菌支持体では胚の生存率の減少が観察されるはずである(これは冷却速度をかなり減少させる)。しかしながら、ICCPが実質的にゼロ(50秒曝露)である本発明の条件下で、本発明者らの結果は、無菌支持体による生存率のこの減少を示さない。
【００９３】
結論として、本発明によるガラス化の間、及びVSへの短い曝露(30〜50秒)の間、細胞によって達成される脱水状態は、冷却速度が従来技術によるガラス化の間よりもガラス状態を達成し維持するために重要ではないようなものである。最初の脱水プロセスの後にCP及び水を細胞に侵入させることを可能にするVSへのより長い曝露(150秒)の場合(Vanderzwalmenら、Human Reproduction、第28巻、2101〜2110、1〜10頁、2013年)、無菌支持体を使用すると減少する傾向がある有効性によって示唆されるように、ICCPと、ガラス状態を達成するための冷却速度との間の関係が再確立される。
【００９４】
(実施例4)
本発明による一段階ガラス化後に胚が新生児マウスになる能力を確認するための、偽妊娠レシピエントマウスへの接合子の移植の使用
(実施例4a)
非無菌ガラス化:移植後の出生%に対するVSへの曝露期間の影響
一段階でガラス化した胚の移植後の若いマウスの出生は、この方法の毒性がないことの最終的な証明である。
【００９５】
(i)これに関連して、「Manipulating the mouse embryo, a laboratory manual」第4版、2013年、Behringerら、CSHL Pressに記載されているプロトコールに従って、VSに30及び150秒間曝露した後にこの段階で採取し、ガラス化した接合子を偽妊娠レシピエントマウスの卵管に移植した。
【００９６】
Table 4(表6)は、得られた出生パーセンテージを表す。154個及び103個の接合子の群を、一段階非無菌ガラス化のプロトコール及び30及び150秒それぞれのVSへの曝露に従ってガラス化し、0.25Mのサッカロース中で再加熱した後、それらのうち142個及び53個を偽妊娠レシピエントマウスに同日に移植した。
【００９７】
【表６】
2020503065.tif 000008
【００９８】
2つのVS曝露期間の間に出生率の有意差は検出できなかった。これは、プロセス全体の複雑さ及び移植のランダム効率を考慮すると驚くことではない。それにもかかわらず、出生パーセンテージは、従来技術に従ってガラス化した胚の再移植の間に同様の条件下で日常的に得られたものに完全に匹敵する(20.9%; 138個出生/658個移植;F. Ectors、データ示さず)。したがって、本発明によるガラス化は細胞の生物学的特性を保存し、出生までの通常の発達と完全に適合する。
【００９９】
(実施例4b)
一段階無菌ガラス化(VSへの50秒間の曝露)を経た接合子の移植後の出生パーセンテージ及びM2における瞬間的な再水和。
Table 5(表7)は、得られた出生パーセンテージを表す。52個の接合子の群を、50秒間のVSへの曝露による一段階無菌ガラス化のプロトコールに従ってガラス化した。再加熱は、M2中(Quinn、J.Reprod.Fert.、1982年9月:66(1):161〜8頁による洗浄培地)で直接行われた。全ての胚を同日に2匹の偽妊娠レシピエントに移植した。
【０１００】
【表７】
2020503065.tif 000009
【０１０１】
この場合、出生パーセンテージはまた、従来技術に従ってガラス化した胚の再移植中に日常的に得られたもの(20.9%; F.Ectors、データ示さず)に匹敵する。
【０１０２】
まとめると、実施例4a及び4b(Table 4及び5(表6及び7))は、本発明による一段階ガラス化、任意にその後のM2培地(Quinn、J.Reprod.Fert.1982年9月:66(1):161〜8頁による洗浄培地)中での直接再加熱は、無菌又は非無菌条件下で、レシピエント中への移植後に接合子が正常な妊娠を確実にする能力を損なわないことを確認する。
【０１０３】
(実施例5)
マウス胚性幹細胞(mESC)の本発明による一段階ガラス化及び再加熱
本発明による予備的な一段階ガラス化実験を、mESCで行った。条件は、細胞生存率の信頼できる定量化を実行することを可能にするようにではなかったが、従来技術による慣用的なガラス化の間に得られたものに匹敵するようなものであった。更に、本発明による一段階でガラス化したmESC(NagyのR1、アグーチカラー、129SV系)を、C57BL/6jマウスの胚盤胞の芽球中に微量注入し、生まれた9匹の新生児マウスでは、キメラ現象の非常に高いパーセンテージ(100%に近いか又は同等)を、それらの体表面全体にわたって均一なアグーチカラーを示すキメラのコートを与えた(図1)。
【０１０４】
ガラス化した系統から誘導した細胞の生殖細胞系伝達を交配によって確認した。したがって、この実験の予備的な性質にもかかわらず、極めて複雑な生物学を有する細胞は、本発明による一段階ガラス化による前記生物学の障害を経験しないと思われる。
【０１０５】
議論及び結論
着床前胚発達の間、胚が分裂すればするほど、細胞はますます小さくなり、その表面/体積比がより一層高くなることでより速い膜貫通交換が可能となる。更に、膜透過性は新しいアクアポリンの出現により増加する。桑実胚期に存在する細胞(+/-16個の細胞)は、他の哺乳動物細胞の大部分に完全に匹敵する表面/体積比及び一般的な生物学的特性(生理学)を有することに留意すべきである。分割球の本発明によるガラス化溶液(VS)への一段階曝露の間、より小さい細胞はその最大脱水レベルにより急速に達する。それから凍結保護溶液中に存在する浸透性の凍結保護剤(CP)を侵入させ、その後水を侵入させることができる。Table 1(表3)は、150及び180秒のVSへの曝露についてのD5での、より詳細には、小さな細胞(桑実胚)により進行した期での発達の減少を示す。細胞質中にCPが非常に少ない(又は全くない)にもかかわらず、細胞がVSへの短い曝露後に、本発明によるガラス化を生存する場合(Table 1及び3(表3及び5)参照)、これは、それらの生存率(したがってガラス化の質)が、CPの侵入によって全く条件付けられていないか、又はほとんど条件付けられていないことを裏付けている。VSへの短い曝露の高い効率を示す本発明者らの結果は、本発明によるこれらのガラス化条件下において結晶化の不在が優勢であることを示唆している。ガラス化状態は、ICCPが低いか又はゼロであるにもかかわらず、冷却中及び再加熱中の両方において得られ、維持される可能性が非常に高い。30秒間のVSへの曝露後、細胞内凍結保護剤(ICCP)の濃度は実際には非常に低いか又はゼロにさえなり得る。確かに、VS(30秒)への曝露の最短期間は、CP又は水を侵入させずに細胞の脱水を引き起こし、この例では、CPの侵入とそれに続く水の侵入を可能にするより長い曝露(Vanderzwalmenら、Human Reproduction、第28巻、2101〜2110、1〜10頁、2013年)と比較して、より高いガラス化効率(生存及び発生)をもたらした。CPのこの非常に低い膜貫通浸透は、胚の曝露前にVSを4℃に予備冷却することによって更に減少する。
【０１０６】
実施例2(瞬間的な再水和をもたらすM2での一段階ガラス化及び直接再加熱;Table 2(表4))の間、本発明者らは、正常圧溶液中での直接再加熱にもかかわらず観察される良好な生存率の観点から、細胞内CPが(仮想的に)存在しないという仮説を強化した(M2培地 - Quinn、J.Reprod.、1982年9月:66(1):161〜8-サッカロースなし)。実際、本発明による一段階ガラス化後の再加熱中のサッカロースのさらなる浸透活性は、特にVSへの短い曝露(30秒)のためには必要ではないと思われる。したがって、細胞を正常圧溶液(M2、Quinn、J.Reprod.Fert.1982年9月、66(1):161〜8頁による洗浄培地)に急激に浸漬しても、細胞の浸透圧膨潤に続く細胞死には至ることはなく、それ故にそれらの体積の異常な増加をもたらさない。これは、サッカロース不含M2培地中で直接再加熱すると、過剰に膨潤した後に胚の生存能力が劇的に低下する従来技術による方法(Vanderzwalmenら、Human Reproduction、第28巻、2101〜2110、1〜10頁、2013年)の間には当てはまらない。
【０１０７】
それ故、本発明者らの仮説は、従来技術によるガラス化とは反対に、本発明による一段階ガラス化は、細胞内へのCPの侵入を劇的に制限するか、更には排除することさえ実証される。
【０１０８】
更に、実験1と関連して、この実験2は、本発明による一段階ガラス化/一段階再加熱のプロセスが、細胞の生存能力及び発達に関する従来技術によるガラス化と少なくとも同じ程度に効率的であると同時に、短期、中期、又は長期的に潜在的に有害なCPの含有量の減少又は排除さえ確実にすることを示している。
【０１０９】
無菌及び非無菌支持体を使用した実施例3は、本発明によるガラス化中の冷却速度の効果を評価することを可能にする。得られた結果は、冷却速度が結晶化を回避するのに重要である従来技術によるガラス化中に観察されるものに対応しないという点で予想外である。冷却速度を低下させること(例えば無菌支持体の使用に関連する)がより高いICCPの必要性を伴うことは、従来技術によるガラス化の間に実際に一般に認められていることである。一方、実施例3では、非無菌群と無菌群との間に有意差は見られず、これは非常に異なる冷却速度を可能にする(無菌の場合の毎分+/-1000℃に比較して、非無菌支持体の場合、毎分+/-20000℃)。実際には、VSへの短い曝露(50秒)の間、2種の容器は、従来技術によるガラス化に匹敵する非常に類似した結果を与える。2つの形態の包装については、より長い曝露(150秒)は胚盤胞への発生を減少させる傾向があるが、無菌支持体については更にそうである。一般的に認められている原理によれば、本発明によるガラス化によって誘導される細胞内濃度が低いか、又はゼロでさえある凍結保護剤(ICCP)を考えると、無菌支持体では胚の生存率の低下が観察されるはずである(これは冷却速度をかなり低下させる)。しかしながら、ICCPが実質的にゼロ(50秒曝露)である本発明の条件下では、本発明者らの結果は、無菌支持体による生存率のこの減少を示さない。この第3の実施例は、本発明によるガラス化の間、及びVSへの短い曝露(30〜50秒)の間、細胞によって達成される脱水状態が、冷却速度が従来技術によるガラス化の間よりもガラス状態に到達し維持するために重要ではないようなものであることを明らかにする。初期脱水プロセス(Vanderzwalmenら、Human Reproduction、第28巻、2101〜2110、1〜10頁、2013年)後、CPの細胞中への侵入とそれに続く水の侵入を可能にする、VSへのより長い曝露(150秒)の場合、無菌支持体を使用すると効率が低下する傾向があることから示唆されるように、ICCPとガラス状態を達成するための冷却速度との間の関係が再確立される。
【０１１０】
冷却前のVSへの短い曝露及びM2洗浄培地中での直接希釈を伴う本発明によるガラス化の効率及び無害性に関する本発明者らの結論は、移植後に得られた出生率によって更に補強される(Table 4及び5(表6及び7))。従来技術に従って非凍結保存及びガラス化した接合子の移植後に日常的に得られた新生児マウスの平均パーセンテージは、それぞれ20.2%及び20.9%である(F. Ectors、結果は示さない)。合わせて、実施例4a及び4bは、レシピエントへの移植後に接合子が正常な妊娠を確実にする能力を損なわない、本発明によるガラス化の同程度の効率を示す。
【０１１１】
これは、本発明による一段階ガラス化中の冷却及び再加熱前後の瞬間的な脱水及び瞬間的な再水和のそれぞれが、発達の様々な段階に有害ではないことを実証している。
【０１１２】
インビトロであり、また胚移植の後に得られた本発明者らの結果を考慮すると、胚をVSに30秒間曝露した後、すなわち最大細胞脱水(Vanderzwalmenら、Human Reproduction、第28巻、2101〜2110、1〜10頁、2013年)に対応する時点で、ガラス化(したがって生存能力)は細胞内のCPの存在とは関連していないが、実際には遊離又は隣接水としても知られる浸透活性水の欠如によるものであることを確認できると考えられる。
【０１１３】
したがって、4℃で30秒という短い期間のVSへの曝露に関連する細胞脱水は、CPを侵入させないが、細胞を脱水し、ガラス化の様々な工程の間に細胞をその生存に適合する条件にするのに十分である。細胞内のタンパク質、塩、高分子、オルガネラ及び多糖類の存在は、前記細胞が十分に脱水された時に、冷却中に細胞内粘度を無限に増加させることによってガラス状の固体状態を形成することを可能にする。それ故、本発明者らの実験には2種類のガラス状態が関与しているように思われる:(i)冷却中の細胞質ゲルのガラス状固体への変換に関連する近接水の不在に関連する細胞内ガラス状状態、及び(ii)より低い濃度の高分子及び多糖類を有し、水の無定形固化が高濃度のCPの存在を必要とする細胞外培地のガラス状態。これは、細胞外ガラス化の条件が満たされ、細胞脱水が十分である限り、細胞内CPの存在はガラス化プロセス全体の間の細胞生存に必須ではないことを実証する。
【０１１４】
本発明によるガラス化の実施例及び検証は、接合子期及び桑実胚期における胚に対して行った。桑実胚期に存在する細胞(+/-16個の細胞)は、ほとんどの他の哺乳動物細胞に完全に匹敵する表面/体積比及び一般的な生物学的特性(生理学)を有し、これは結果をこれらの他の細胞型に外挿することを可能にすることを想起されたい。更に、これらの細胞(mESC R1)についての実験は、本発明による一段階ガラス化が、その生物学を損なうことなく他の細胞に対して有効であることを確認する。
【０１１５】
結論として、本発明によるガラス化は、CPの浸透なしに遊離水を除去する細胞脱水を含む前例のないアプローチに基づいている。従来技術による慣用的なプロトコールと比較して効率を損なうことなく方法論的に単純化することに加えて、細胞内培地のCPへの長期曝露に関連する遺伝毒性を含む、既知又は未知の短期、中期、又は長期の毒性効果を排除するという利点をそれは有する。
【図１】
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【国際調査報告】
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