(57)【要約】先端オリフィスと、処理液を含む内部キャビティとを有するキャピラリー、前記キャピラリーの先端オリフィスを位置決め可能な位置決め要素、前記キャピラリーから処理液を吐出するとともに、前記キャピラリーへ処理液を吸引することができる吐出／吸引要素、を少なくとも備えた装置を用いて、粒子状ターゲットを単離及び処理する方法であって、前記方法は、以下の工程を含む：ａ．単離及び処理すべき粒子状ターゲットを配置する工程、ｂ．前記位置決め要素を用いて、前記キャピラリーの先端オリフィスが前記粒子状ターゲットに近接するように、前記キャピラリーの先端オリフィスを位置決めする工程、ｃ．前記粒子状ターゲットを処理液中に封入するように、ある量の処理液を吐出する工程、ｄ．前記処理液中に封入された前記粒子状ターゲットを、前記キャピラリーの内部キャビティに吸引する工程、ｅ．前記処理液を含む前記キャピラリーの内部キャビティ内で前記粒子状ターゲットを処理する工程。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
先端オリフィスと、処理液を含む内部キャビティとを有するキャピラリー、
前記キャピラリーの先端オリフィスを位置決め可能な位置決め要素、
前記キャピラリーから処理液を吐出し、前記キャピラリーへ処理液を吸引することができる吐出／吸引要素、
を少なくとも備えた装置を用いて、粒子状ターゲットを単離及び処理する方法であって、
ａ．単離及び処理すべき粒子状ターゲットを配置する工程、
ｂ．前記位置決め要素を用いて、前記キャピラリーの先端オリフィスが前記粒子状ターゲットに近接するように、前記キャピラリーの先端オリフィスを位置決めする工程、
ｃ．前記粒子状ターゲットを処理液中に封入するように、前記処理液を吐出する工程、
ｄ．前記処理液中に封入された前記粒子状ターゲットを、前記キャピラリーの内部キャビティに吸引する工程、
ｅ．  前記処理液を含む前記キャピラリーの内部キャビティ内で、前記粒子状ターゲットを処理する工程
を含み、
前記粒子状ターゲットが、単一細胞又はその凝集体であることを特徴とする方法。
【請求項２】
細胞を単離及び処理する方法であって、前記処理液が増殖培養液でない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
粒子状ターゲットを単離及び処理する方法であって、前記処理液が、細胞溶解緩衝液、又はタンパク質分解処理緩衝液である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
粒子状ターゲットを単離及び処理する方法であって、前記キャピラリーのオリフィスは、前記キャピラリーのオリフィスが前記粒子状ターゲットの少なくとも２０μｍ以内、好ましくは１０μｍ以内の位置にくるように位置決めされ、及び／又は、前記粒子状ターゲットの大きさは、１００ｎｍ〜１００μｍ、好ましくは５００ｎｍ〜５０μｍであり、及び／又は、前記先端オリフィスの直径が、１μｍ〜１０００μｍの範囲、好ましくは１０μｍ〜１００μｍの範囲である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
粒子状ターゲットを単離及び処理する方法であって、前記粒子状ターゲットは、顕微鏡スライド、ＣＴＣフィルター等のろ過膜、又は、好ましくは細胞培養培地を含む細胞培養容器の底板上に配置される、請求項１〜４のいずれかに記載の粒子状ターゲットを単離及び処理する方法。
【請求項６】
先端オリフィスと、細胞溶解緩衝液を含む内部キャビティとを有するキャピラリー、
前記キャピラリーの先端オリフィスを位置決め可能な位置決め要素、
前記キャピラリーから液を吐出するとともに、前記キャピラリーへ液を吸引することができる吐出／吸引要素、
を少なくとも備えた装置を用いて、ターゲット細胞を単離及び溶解させる方法であって、
ａ．単離及び溶解すべきターゲット細胞を配置する工程、
ｂ．前記位置決め要素を用いて、前記キャピラリーの先端オリフィスが前記ターゲット細胞に近接するように、前記キャピラリーの先端オリフィスを位置決めする工程、
ｃ．前記吐出／吸引要素を用いて、前記ターゲット細胞を前記細胞溶解緩衝液中に封入するように、前記細胞溶解緩衝液を吐出する工程、
ｄ．前記吐出／吸引要素を用いて、前記細胞溶解緩衝液中に封入された前記ターゲット細胞を、前記キャピラリーの内部キャビティに吸引する工程、
ｅ．前記細胞溶解緩衝液を含む前記キャピラリーの内部キャビティ内で、前記ターゲット細胞を溶解させる工程、及び、任意で
ｆ．前記細胞溶解緩衝液を中和するように、前記キャピラリーの内部キャビティに中和液を導入するか、又は、前記細胞溶解緩衝液を中和するように、好ましくは中和液を含むレシピエントに前記ターゲット細胞溶解物を吐出する工程を含み、
前記ターゲット細胞が、単一細胞又はその凝集体であることを特徴とする方法。
【請求項７】
先端オリフィスと、タンパク質分解緩衝液を含む内部キャビティとを有するキャピラリー、
前記キャピラリーの先端オリフィスを位置決め可能な位置決め要素、
前記キャピラリーから前記タンパク質分解緩衝液を吐出するとともに、前記キャピラリーへ前記タンパク質分解緩衝液を吸引することができる吐出／吸引要素、
を少なくとも備えた装置を用いて、ターゲット細胞を単離及びタンパク質分解処理する方法であって、
ａ．単離及びタンパク質分解処理すべきターゲット細胞を配置する工程、
ｂ．前記位置決め要素を用いて、前記キャピラリーの先端オリフィスが前記ターゲット細胞に近接するように、前記キャピラリーの先端オリフィスを位置決めする工程、
ｃ．前記吐出／吸引要素を用いて、前記ターゲット細胞を前記タンパク質分解緩衝液中に実質的に封入するように、前記タンパク質分解緩衝液を吐出する工程、
ｄ．前記吐出／吸引要素を用いて、前記タンパク質分解緩衝液中に封入された前記ターゲット細胞を、前記キャピラリーの内部キャビティに吸引する工程、
ｅ．前記タンパク質分解緩衝液を含む前記キャピラリーの内部キャビティ内で、前記ターゲット細胞をタンパク質分解処理する工程、及び、任意で
ｆ．前記タンパク質分解緩衝液を中和するように、前記キャピラリーの内部キャビティに中和液を導入するか、又は、前記タンパク質分解緩衝液を中和するように、好ましくは中和液を含むレシピエントに前記タンパク質分解処理したターゲット細胞を吐出する工程を含み、
前記ターゲット細胞が、単一細胞又はその凝集体であることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の方法であって粒子状ターゲットを単離及び処理する方法に用いられる装置であって、
ａ．先端オリフィスと、処理液が入るように構成された内部キャビティとを有するキャピラリー、
ｂ．前記キャピラリーの先端オリフィスを、前記粒子状ターゲットに近接させて位置決め可能に構成された位置決め要素、
ｃ．前記キャピラリーから処理液を吐出するとともに、前記キャピラリーへ処理液を吸引するように構成された吐出／吸引要素、
を少なくとも備え、
前記粒子状ターゲットが、単一細胞又はその凝集体であることを特徴とする装置。
【請求項９】
前記キャピラリーは、前記キャピラリーの内部キャビティ内での粒子状ターゲットの処理のモニタリングを可能にするための統合モニタリングエリアをさらに備え、及び／又は、前記装置は、好ましくは前記統合モニタリングエリアを介して、前記キャピラリーの内部キャビティ内での粒子状ターゲットの処理をモニタリングするように構成されたモニタリング要素をさらに備える、請求項８に記載の装置。
【請求項１０】
ｉ）前記モニタリング要素から、前記キャピラリーの内部キャビティ内での前記粒子状ターゲットの処理の進行を示す情報を受けとるように、及び、
ｉｉ）前記モニタリング要素から前記処理の完了を示す情報を受け取ると、前記吐出／吸引要素を制御することによって、前記キャピラリーから前記粒子状ターゲットを吐出するように構成された制御要素をさらに備える、請求項９に記載の装置。
【請求項１１】
例えば超音波パルス又はレーザーパルス又は機械的作用により、基板から前記粒子状ターゲットを放出するように構成された放出要素をさらに備える、請求項８〜１０のいずれかに記載の装置。
【請求項１２】
少なくとも、前記キャピラリーの先端オリフィスは、さらに、ポリシロキサン層等の疎水性層、及び／又は親水性層で被覆される、請求項８〜１１のいずれかに記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キャピラリーセルソーティング装置を用いて、基板上に配置された粒子状ターゲットを単離及び処理する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍、内皮組織、組織球、幹細胞、及び他の物質から単離された細胞は、医療診断の用途や生命科学の研究における分析及び患者のプロファイリングにとって、欠くことのできないものである。しかしながら、細胞等の単一粒子状ターゲットの現時点での単離方法は、本来の意味通りの単一細胞の単離というよりは、濃縮法に相当する場合が多い。
【０００３】
例えば、血液等の体液から、サイズによって、循環腫瘍細胞（ＣＴＣｓ）等の上皮性腫瘍細胞を単離するように設計されたフィルターが、Ｒａｒｅｃｅｌｌｓ  ＳＡＳによって商品化されており、実際には、どちらかと言えば、こうした細胞を濃縮する。これは、フィルター内に捕捉される複数の細胞が、細胞型に関して同一でもなければ、遺伝子的にも似ていないことを意味する。従って、収集された細胞をまとめて分析することは不可能であり、よって個々の細胞は、それらの遺伝子型を決定するために、個々に単離されなければならない。
【０００４】
さらに、レーザーマイクロダイセクション法によって、組織サンプルから個々の細胞又は細胞クラスターを単離することが可能であり、これには複数のバリエーションが存在する。例えば、特許文献１は、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションと呼ばれる、特定のレーザーをベースにした技術を使用することを記載しており、この場合、熱可塑性メンブレンを利用したＩＲ−レーザー誘起転写によって、生体組織サンプルから小さな細胞エリアを抽出することができる。特許文献２に記載されている他の変形は、レーザカタパルト技術と呼ばれる手法にある。まず、レーザーを用いて、組織サンプル中の細胞等の関心のあるエリアの周りをカットし、次に、このエリアを、レーザーパルスを用いて回収容器に射出する。特許文献３は、第１の工程で、膜スライド上の組織サンプルから細胞を切除するためにレーザーを使用し、第２の工程で、この切断エリアを付着キャップ上に付着させることによって細胞を単離し、続いて、溶解緩衝液を用いて、さらなる遺伝子分析のために、ＤＮＡ又はＲＮＡのような細胞成分を抽出する、レーザーマイクロダイセクション技術を開示する。
【０００５】
上記方法の全ては、２つの不連続な工程を必要とする：つまり、ターゲット細胞を、その環境及び／又は基材から選択して単離するという第１工程と、ターゲット細胞を別個の容器に移して、そこで、例えば、溶解緩衝液等の処理液を、先に単離したターゲット細胞に加えるという続く第２工程である。こうした方法は労働集約型であるし、たとえ自動化されていても、転写箔や試験管等の付加的な容器や材料の使用を必要とする。
【０００６】
組織サンプルからの細胞の切除は、レーザーマイクロダイセクションを使用して克服したものの、このような方法は、細胞培養容器の底から、付着性の細胞、特に培養細胞を単離するには不向きである。
【０００７】
従って、例えば、細胞等の単一粒子状ターゲットの取り扱いを能率化するように、そのような単一粒子状ターゲットを、より効果的且つ簡単な方法で単離して処理することができる方法及び適切な装置を提供することが望ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＷＯ  ２００６０３１５７４  Ａ１
【特許文献２】ＥＰ  ０  ８７９  ４０８  Ｂ１
【特許文献３】ＤＥ  １０００３５８８  Ｃ１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の方法及び装置は、実質的に、処理液で満たされたキャピラリーに粒子状ターゲットを吸引して、粒子状ターゲットを処理のための別個の容器に移さないで、キャピラリー内部で処理を行うことによって、細胞等のターゲット粒子の単離及び処理を同時に行う方法及び装置を提供することによって、上記の問題を克服する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
従って、本発明の目的は、
先端オリフィスと、処理液を含む内部キャビティとを有するキャピラリー、
前記キャピラリーの先端オリフィスを位置決め可能な位置決め要素、
前記キャピラリーから液を吐出するとともに、前記キャピラリーへ液を吸引することができる吐出／吸引要素、
を少なくとも備える装置を用いて、好ましくは基板上に配置された、粒子状ターゲットを単離及び処理する方法を提供することであって、
前記方法は、以下の工程を含む：
ａ．前記基板上に、単離及び処理すべき粒子状ターゲットを配置する工程；
ｂ．前記位置決め要素を用いて、前記キャピラリーの先端オリフィスが前記粒子状ターゲットに近接するように、前記キャピラリーの先端オリフィスを位置決めする工程；
ｃ．前記吐出／吸引要素を用いて、前記粒子状ターゲットを前記処理液中に実質的に封入するように、好ましくは前記キャピラリーの内部キャビティから、十分な量の処理液を吐出する工程；
ｄ．前記処理液に封入された粒子状ターゲットを、前記キャピラリーの内部キャビティに吸引する工程；
ｅ．前記処理液を含む前記キャピラリーの内部キャビティ内で、前記粒子状ターゲットを処理する工程。
【００１１】
本発明のさらなる目的は、
先端オリフィスと、細胞溶解緩衝液を含む内部キャビティとを有するキャピラリー、
前記キャピラリーの先端オリフィスを位置決め可能な位置決め要素、
前記キャピラリーから液を吐出するとともに、前記キャピラリーへ液を吸引することができる吐出／吸引要素、
を少なくとも備える装置を用いて、好ましくは基板上に配置された、ターゲット細胞を単離及び溶解させる方法を提供することであって、
前記方法は、以下の工程を含む：
ａ．基板上に、単離及び溶解すべきターゲット細胞を配置する工程；
ｂ．前記位置決め要素を用いて、前記キャピラリーの先端オリフィスが前記ターゲット細胞に近接するように、前記キャピラリーの先端オリフィスを位置決めする工程；
ｃ．前記吐出／吸引要素を用いて、ターゲット細胞を前記細胞溶解緩衝液中に実質的に封入するように、好ましくは前記キャピラリーの内部キャビティから、十分な量の細胞溶解緩衝液を吐出する工程；
ｄ．前記吐出／吸引要素を用いて、前記細胞溶解緩衝液中に封入されたターゲット細胞を、前記キャピラリーの内部キャビティに吸引する工程；
ｅ．前記細胞溶解緩衝液を含む前記キャピラリーの内部キャビティ内で、前記ターゲット細胞を溶解させる工程、及び、任意で
ｆ．前記細胞溶解緩衝液を中和するように、前記キャピラリーの内部キャビティに中和液を導入するか、又は、前記細胞溶解緩衝液を中和するように、好ましくは中和液を含むレシピエントに前記ターゲット細胞溶解物を吐出する工程。
【００１２】
さらに、本発明の目的は、
先端オリフィスと、タンパク質分解緩衝液（proteolytic buffer）を含む内部キャビティとを有するキャピラリー、
前記キャピラリーの先端オリフィスを位置決め可能な位置決め要素、
前記キャピラリーから前記タンパク質分解緩衝液を吐出するとともに、前記キャピラリーへ前記タンパク質分解緩衝液を吸引することができる吐出／吸引要素、
を少なくとも備える装置を用いて、好ましくは基板上に配置された、ターゲット細胞を単離及びタンパク質分解処理する（proteolytically treating）方法を提供することであって、
前記方法は、以下の工程を含む：
ａ．基板上に、単離及びタンパク質分解処理すべきターゲット細胞を配置する工程；
ｂ．前記位置決め要素を用いて、前記キャピラリーの先端オリフィスが前記ターゲット細胞に近接するように、前記キャピラリーの先端オリフィスを位置決めする工程；
ｃ．前記吐出／吸引要素を用いて、前記ターゲット細胞を前記タンパク質分解緩衝液中に実質的に封入するように、好ましくは前記キャピラリーの内部キャビティから、十分な量のタンパク質分解緩衝液を吐出する工程；
ｄ．前記吐出／吸引要素を用いて、前記タンパク質分解緩衝液中に封入されたターゲット細胞を、前記キャピラリーの内部キャビティに吸引する工程；
ｅ．前記タンパク質分解緩衝液を含む前記キャピラリーの内部キャビティ内で、前記ターゲット細胞をタンパク質分解処理する工程、及び、任意で
ｆ．前記タンパク質分解緩衝液を中和するように、前記キャピラリーの内部キャビティに中和液を導入するか、又は、前記タンパク質分解緩衝液を中和するように、好ましくは中和液を含むレシピエントに前記タンパク質分解処理したターゲット細胞を吐出する工程。
【００１３】
さらに、本発明の目的は、好ましくは基板上に配置された、粒子状ターゲットを単離及び処理する方法において使用するための装置を提供することであって、上述したように、前記装置は、少なくとも以下を備える：
ａ．先端オリフィスと、処理液を含むように構成された内部キャビティとを有するキャピラリー、
ｂ．前記キャピラリーの先端オリフィスを、前記粒子状ターゲットに近接させて位置決め可能に構成された位置決め要素、
ｃ．前記キャピラリーから処理液を吐出するとともに、前記キャピラリーへ処理液を吸引するように構成された吐出／吸引要素。
【００１４】
さらに、本発明の目的は、好ましくは基板上に配置された細胞を単離及び溶解させる方法において使用するための装置を提供することであって、前記装置は、少なくとも以下を備える：
ａ．先端オリフィスと、細胞溶解緩衝液を含むように構成された内部キャビティとを有するキャピラリー、
ｂ．前記キャピラリーの先端オリフィスを、前記細胞に近接させて位置決め可能に構成された位置決め要素、
ｃ．前記キャピラリーから前記細胞溶解緩衝液を吐出するとともに、前記キャピラリーへ前記細胞溶解緩衝液を吸引するように構成された吐出／吸引要素。
【００１５】
さらに、本発明の目的は、好ましくは基板上に配置された細胞を単離及びタンパク質分解処理する方法において使用するための装置を提供することであって、前記装置は、少なくとも以下を備える：
ａ．先端オリフィスと、タンパク質分解緩衝液を含むように構成された内部キャビティとを有するキャピラリー、
ｂ．前記キャピラリーの先端オリフィスを、前記細胞に近接させて位置決め可能に構成された位置決め要素、
ｃ．  前記キャピラリーから前記タンパク質分解緩衝液を吐出するとともに、前記キャピラリーへ前記タンパク質分解緩衝液を吸引するように構成された吐出／吸引要素。
【００１６】
さらなる実施形態は、特許請求の範囲及び以下の本発明の詳細な説明に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、内部キャビティ（４）を有するキャピラリー（３）を示し、その先端オリフィスは、基板（１）上に配置された粒子状ターゲット（２）に近接させて位置決めされる。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の好ましい実施形態を、図に基づいて以下に説明するが、これらは、本発明の好ましい実施形態を説明するためのものであって、本発明を限定するためのものではない。
【００１９】
よって、本発明の目的は、
先端オリフィスと、処理液を含む内部キャビティとを有するキャピラリー、
前記キャピラリーの先端オリフィスを位置決め可能な位置決め要素、
前記キャピラリーから液を吐出するとともに、前記キャピラリーへ液を吸引することができる吐出／吸引要素、
を少なくとも備える装置を用いて、配置された粒子状ターゲット、特に単一粒子状ターゲットを単離及び処理する方法を提供することであって、
前記方法は、以下の工程を含む：
ａ．単離及び処理すべき粒子状ターゲットを配置する工程；
ｂ．前記位置決め要素を用いて、前記キャピラリーの先端オリフィスが前記粒子状ターゲットに近接するように、前記キャピラリーの先端オリフィスを位置決めする工程；
ｃ．前記吐出／吸引要素を用いて、前記粒子状ターゲットを前記処理液中に封入するように、ある量の処理液を吐出する工程；
ｄ．前記処理液に封入された粒子状ターゲットを、前記キャピラリーの内部キャビティに吸引する工程；
ｅ．前記処理液を含む前記キャピラリーの内部キャビティ内で、前記粒子状ターゲットを処理する工程、及び、任意で
ｆ．前記処理液を中和するように、前記キャピラリーの内部キャビティに中和液を導入するか、又は、前記処理液を中和するように、好ましくは中和液を含むレシピエントに前記粒子状ターゲットを吐出する工程。
【００２０】
本発明による方法及び装置の好ましい実施形態では、粒子状ターゲットは、例えば法医学検査又は地質調査において単離及び処理すべき、例えば無機粒子状ターゲット又は有機粒子状ターゲット等の無生物粒子状ターゲット粒子、特に、単一無生物粒子状ターゲット粒子であってよい。そのような無生物粒子状ターゲットの例としては、塵埃粒子、結晶粒子、ダイヤモンド粒子、塩粒子、硫化物粒子、酸化物粒子、及び金属粒子がある。特に、無生物粒子状ターゲットは、天然または人工の材料に包埋されてよい。そのような包埋の例としては、天然岩に包埋された地質学的に関心のあるターゲット粒子、又は保存目的のためにパラフィンマトリックスに包埋された法医学的に関心のあるターゲット粒子がある。
【００２１】
本発明による方法及び装置の好ましい実施形態では、粒子状ターゲットは、さらに、細胞、特に、単一細胞、又はその凝集体、すなわち、真核又は原核いずれかの単一細胞、又はその凝集体であってよい。原核細胞の凝集体の例は、細菌細胞又は真菌細胞のコロニーであり、原核細胞の凝集体は、組織標本又は細胞培養から凝集した細胞であり得る。特に、粒子状ターゲットは、白血球、血小板又は赤血球のような循環細胞等の単一動物細胞もしくはその凝集体、又は、非接着性細胞及び接着性細胞等の培養された単一動物細胞であってもよい。診断で特に着目される単一動物細胞は、循環腫瘍細胞（ＣＴＣｓ）であり、これは、例えば、血液サンプル試料からろ過によって得ることのできる、単一ＣＴＣ又はＣＴＣクラスターであってよい。細胞の単離を容易にするために、当該技術分野で知られているように、例えば蛍光標識又は蛍光色素を用いて細胞を標識することができる。
【００２２】
本発明による方法及び装置の好ましい実施形態では、粒子状ターゲットは、真核細胞もしくは原核細胞等の細胞、又はその凝集体であり、好ましくは単一動物細胞又はその集合体である。
【００２３】
本発明による方法及び装置の好ましい実施形態では、処理液は、増殖培養液ではない。処理液は、培養動物細胞の凝集体又は単一培養動物細胞を、それらが培養されている基材から解離させるために使用することができるタンパク質分解処理のための酵素緩衝液であってよい。そのような酵素緩衝液の例としては、トリプシン緩衝液がある。
【００２４】
本発明による方法及び装置の好ましい実施形態では、処理液は、増殖培養液ではない。処理液は、例えば、粒子状ターゲットが遺伝子学的に分析されるべき細胞である場合、細胞溶解緩衝液又は細胞解離緩衝液である。そのような細胞溶解緩衝液の例としては、リン酸二水素ナトリウム／リン酸水素二ナトリウム緩衝液、トリス塩酸緩衝液、及びＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液がある。一般に、粒子状ターゲット、すなわち細胞の処理は、処理液中、すなわち溶解緩衝液中で、１秒〜１０分、好ましくは５秒〜５分、継続して行う。
【００２５】
本発明による方法及び装置の好ましい実施形態では、好ましくは、例えば無機粒子状ターゲット又は有機粒子状ターゲット等の無生物粒子状ターゲットである粒子状ターゲットは、固体物中に包埋され、この固体物は、好ましくは、処理液に可溶である。固形物は、天然又は人工物であってよい。例えば、処理液は、有機溶媒又は有機もしくは無機酸のいずれかであってよい。
【００２６】
本発明による方法及び装置の好ましい実施形態では、基板は、例えばスライドガラス、高分子膜、ろ過板もしくはろ過膜、又は細胞培養容器の底板等の、粒子状ターゲットを担持することができる任意の適切な物体であってよい。粒子状ターゲットが動物細胞である場合、そして特に動物細胞が循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）である場合、基板は、ろ過板又はろ過膜であり得る。
【００２７】
本発明による方法及び装置の好ましい実施形態では、キャピラリーの先端オリフィスは、キャピラリーのオリフィスが、粒子状ターゲットから、少なくとも２０μｍ以内、好ましくは１０μｍ以内の位置にくるように位置決めされ、及び／又は、粒子状ターゲットの大きさは、１００ｎｍ〜１００μｍ、好ましくは５００ｎｍ〜５０μｍ、より好ましくは１μｍ〜５０μｍである。
【００２８】
本発明による粒子状ターゲットを単離及び処理する方法において用いられる装置は、先端オリフィスと処理液を含む内部キャビティとを有するキャピラリー、キャピラリーの先端オリフィスを位置決め可能な位置決め要素、キャピラリーから処理液を吐出し、キャピラリーへ処理液を吸引することができる吐出／吸引要素を少なくとも備える。
【００２９】
先端オリフィスと内部キャビティとを有するキャピラリーは、市場で購入することができる。先端オリフィスの直径は、粒子状ターゲットが、キャピラリーに入ることができるように選択されなければならないので、特に限定されないが、大抵の場合、先端オリフィスの直径は、１μｍ〜１０００μｍの範囲、より好ましくは１０μｍ〜１００μｍの範囲、さらに好ましくは１０μｍ〜５０μｍの範囲となるであろう。内部キャビティの直径は、内部キャビティの直径が先端オリフィスの直径と少なくとも同じか、又はそれより大きい限りは、特に限定されない。一例として、適切な直径は、１００μｍ〜５０００μｍの範囲、好ましくは１００μｍ〜１０００μｍの範囲であろう。キャピラリーは、ガラス、ポリマー又は石英等の任意の適切な材料から形成されてよい。
【００３０】
本発明による方法及び装置の好ましい実施形態では、キャピラリーは、さらに、モニタリング手段、例えば、分光計等の光学的手段によって、キャピラリーの内部キャビティ内での粒子状ターゲットの処理をモニタリングできるように構成された、１以上の統合モニタリングエリアを備えることができる。統合モニタリングエリアは、キャピラリー上のエリアに対応する。かかるエリアは、例えば、ＵＶ、ＩＲ又はＶＩＳ放射等の、所定の波長又は波長範囲を有する電磁放射が透過し、統合モニタリングエリアと交差して、内部キャビティ内に入って戻ることを可能にするように構成される。好ましくは、統合モニタリングエリアは、放射線の好ましくは少なくとも７５％又は少なくとも８０％の透過を可能にするように構成される。統合モニタリングエリアは、使用される電磁放射線の必要な波長に応じて、異なる材料から作られてもよい。例えば、適切な材料としては、光学波長透過範囲が３４０〜２，５００ｎｍのガラス、波長透過範囲が３８０〜７８０ｎｍ（ＶＩＳ）のポリマー、及び、波長透過範囲が３８０ｎｍ以下（ＵＶ）の石英がある。１以上の統合モニタリングエリアは、例えば直径方向に対向する２つの統合モニタリングエリアとして、又は、キャピラリーを取り囲む１つの連続的な統合モニタリングエリア（従って、リング状の統合モニタリングエリアを形成する）として形成することができる。
【００３１】
本発明による方法及び装置の好ましい実施形態では、キャピラリーの内部キャビティへの、処理液内に封入された粒子状ターゲットの吸引は、実質的にキャピラリーの内部キャビティ内で処理が実施されるように、実質的に粒子状ターゲットを処理液に封入した直後に行われる。特に、粒子状ターゲットが単一細胞又はその凝集体の場合は、処理液中に封入された粒子状ターゲットの、キャピラリーの内部キャビティへの吸引は、好ましくは、粒子状ターゲットが処理液中に封入された後、数秒以内に行われ、より好ましくは１分以内に行われる。
【００３２】
本発明による方法及び装置の好ましい実施形態では、装置は、好ましくは統合モニタリングエリアを介して、キャピラリーの内部キャビティ内での粒子状ターゲットの処理をモニタリングするように構成されたモニタリング要素をさらに備えることができる。モニタリング要素は、好ましくは、放射線源と放射線検出器を備える。放射線源は、一定の波長範囲内のＵＶ、ＩＲ又はＶＩＳ光を放射することができる光源であってよく、放射線検出器は、同じ一定の波長範囲内の光を検出することができるか、又は、例えば、キャピラリーの内部キャビティ内の粒子状ターゲットの処理が、蛍光発光を測定することによってモニタリングされる場合のように、放射波長の対応する範囲の光を検出することができる。本発明による方法及び装置の好ましい実施形態では、放射線源、統合モニタリングエリア及び放射線検出器は、共通の軸に沿って配置される。
【００３３】
従って、本発明のさらなる目的は、
先端オリフィスと、処理液を含む内部キャビティと、統合モニタリングエリアとを有するキャピラリー、
キャピラリーの先端オリフィスを位置決め可能な位置決め要素、
キャピラリーから液体を吐出するとともに、キャピラリーへ液体を吸引することができる吐出／吸引要素、
キャピラリーの統合モニタリングエリアを介して、キャピラリーの内部キャビティ内での粒子状ターゲットの処理をモニタリングすることができるモニタリング要素、
を少なくとも備える装置を用いて、粒子状ターゲット、特に、細胞等の単一粒子状ターゲットを単離及び処理する方法を提供することであって、前記方法は、以下の工程を含む：
ａ．単離及び処理すべき粒子状ターゲットを配置する工程；
ｂ．前記位置決め要素を用いて、前記キャピラリーの先端オリフィスが前記粒子状ターゲットに近接するように、前記キャピラリーの先端オリフィスを位置決めする工程；
ｃ．前記吐出／吸引要素を用いて、前記粒子状ターゲットを前記処理液中に封入するように、ある量の処理液を吐出する工程；
ｄ．前記処理液に封入された前記粒子状ターゲットを、前記キャピラリーの内部キャビティに吸引する工程；
ｅ．前記処理液を含む前記キャピラリーの内部キャビティ内で、前記粒子状ターゲットを処理する工程、
ｆ．前記モニタリング要素を用いて、前記キャピラリーの内部キャビティ内での前記粒子状ターゲットの処理が完了したかどうかを決定する工程、及び、そうであれば、任意で、
ｆ．前記処理液を中和するように、前記キャピラリーの内部キャビティに中和液を導入するか、又は、前記処理液を中和するように、好ましくは中和液を含むレシピエントに前記粒子状ターゲットを吐出する工程。
【００３４】
本発明による方法及び装置の好ましい実施形態では、前記装置は、手動又は自動で操作することが可能であり、キャピラリーの先端オリフィスを位置決め可能な位置決め要素をさらに備えることができる。前記キャピラリーは、一般に、キャピラリーの固定部分の周りを締め付ける締結要素によって位置決め要素に固定される。一実施形態では、位置決め要素は、キャピラリーの先端オリフィスを三次元空間で位置決めするように構成された高精度ロボットアームである。
【００３５】
本発明による方法及び装置の好ましい実施形態では、さらに、装置は、キャピラリーから処理液を吐出するとともに、キャピラリー内に処理液を吸引することができる吐出／吸引要素を備えることができる。かかる吐出／吸引要素は、処理が施される動物細胞のような単一粒子状ターゲットを取り扱うために、ナノリットル範囲の少量の処理溶液を吐出又は吸引することが可能な高精度ポンプとすることができることができる。一般に、吐出及び／又は吸引される体積は、１〜１０００ｎｌの範囲、好ましくは１０〜５００ｎｌの範囲で選択することができる。吐出／吸引要素は、手動又は自動で操作することができる。好ましい実施形態では、ある量の処理液に封入された粒子状ターゲットは、好ましくは、粒子状ターゲットを封入するために先に吐出された処理液と同じ量、又は、好ましくはより少ない量を吸引することによって、キャピラリーの内部キャビティに吸引される。
【００３６】
本発明による方法及び装置の好ましい実施形態において、キャピラリーが、光学的手段によってキャピラリーの内部キャビティ内での粒子状ターゲットの処理のモニタリングを可能にするように構成された統合モニタリングエリアをさらに備える場合、前記装置は、ｉ）モニタリング要素から、キャピラリーの内部キャビティ内での粒子状ターゲットの処理の進行を示す情報を受けとるように、及び、ｉｉ）モニタリング要素から処理の完了を示す情報を受け取ると、吐出／吸引要素を制御することによって、キャピラリーから粒子状ターゲットを吐出するように構成される制御要素をさらに備える。
【００３７】
本発明による方法及び装置の好ましい実施形態において、例えば、モニタリング要素が、放射線源と放射線検出器を備える場合、制御ユニットは、ｉ）キャピラリーの内部キャビティ内での細胞等の粒子状ターゲットの処理の進行を示す情報を、放射線源及び放射線検出器の両方から、電気信号又は光信号の形で受け取るように、及びｉｉ）モニタリング要素から処置の完了を示す情報を受け取ると、吐出／吸引要素を制御することによって、キャピラリーから細胞等の粒子状ターゲットを吐出するように構成される。
【００３８】
本発明による方法及び装置の好ましい実施形態では、装置は、例えば、超音波パルス又はレーザーパルスによって、基板から粒子状ターゲットを放出するように構成された放出要素をさらに備える。放出要素が、超音波パルスによって粒子状ターゲットの放出を促進する場合、放出要素は、例えば第２の位置決め要素を介して粒子状ターゲットに近接させて位置決め可能に構成された、超音波トランスデューサ針又はスパチュラであってもよい。放出要素が、レーザーパルスによって粒子状ターゲットの放出を促進する場合、放出要素は、例えば第２の位置決め要素を介して粒子状ターゲットに近接させて焦点を合わせることができ、０．１〜１０００μＪ、好ましくは１〜１００μＪ、及び／又は約１〜１０００００ｐｓｅｃ、好ましくは約１〜１００００ｐｓｅｃの連続パルスを送達することができるレーザー放出要素であってよい。この波長は、粒子状ターゲットの保全性に影響を及ぼさないように、すなわち細胞の場合には死滅しないように、選択されるのが好ましい。本発明の一実施形態では、放出要素は、ポリマー又は金属等の適切な材料から形成された、超音波又はレーザーを用いない、針又はスパチュラであってよい。
【００３９】
本発明による方法及び装置の好ましい実施形態では、少なくとも、キャピラリーの先端オリフィス及び／又は内部キャビティ及び／又は放出要素は、さらに、例えばポリシロキサン層又はフッ素重合体層等の疎水性層により、又はキャピラリーの先端オリフィス及び／又は内部キャビティ及び／又は放出要素の浸潤を高めるための親水性層により裏打ちされる。
【００４０】
本発明による方法及び装置の好ましい実施形態では、キャピラリーの先端部及び／又は長手方向軸は、基板によって画定される平面に対して法線方向に配向されるか、又は、キャピラリーの先端部及び／又は長手方向軸は、基板によって画定される平面に対して非法線方向に配向され、好ましくは、基板によって画定される平面に対して３０〜６０度の方向に配向される。
【符号の説明】
【００４１】
１      基板
２      粒子状ターゲット
３      キャピラリー
４      内部キャビティ
【図１】
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【国際調査報告】
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