(57)【要約】  無細胞ＤＮＡを分析することによって特定の臓器の疾患（例えば癌）を検出することができる。いくつかの実施形態は、例えば、尿、唾液、血液、および便サンプル中に生じ得るように、特定の臓器由来または特定の臓器を通過する臓器関連サンプルを使用することができる。いくつかの実施形態では、無細胞ＤＮＡのメチル化レベルはサンプル中で測定することができる。組織特異的メチル化パターンを使用して、異なる組織型からの寄与度を決定することができる。他の実施形態では、臓器関連の無細胞ＤＮＡのサイズを測定することができる。サイズプロファイルの統計的尺度は、無細胞ＤＮＡ断片が健康でない組織と比較して健康な組織を有する対象について予想より集合的に長いことを示し得る。他の実施形態では、２つの異なるサンプルを分析して、特定の臓器に癌があるかどうかを決定することができる。血液サンプルおよび臓器関連サンプルの両方の無細胞ＤＮＡを分析して、コピー数異常を示す染色体領域を同定することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物の生物学的サンプルを分析する方法であって、前記生物学的サンプルが第１の組織型を含む複数の組織型からの無細胞ＤＮＡ分子の混合物を含み、前記方法が、
Ｎが１０以上の整数である、Ｎ個のゲノム部位を同定することと、
Ｍ個の組織型のそれぞれについて、
前記Ｎ個のゲノム部位でＮ個の組織特異的メチル化レベルを得ることであって、ＮがＭ以上であり、前記組織特異的メチル化レベルがＮ×Ｍの寸法のマトリックスＡを形成し、前記Ｍ個の組織型のうちの１つが第１の臓器の第１の疾患に対応する第１の罹患組織型に対応する、得ることと、
コンピュータシステムによって、前記生物学的サンプルからの複数の無細胞ＤＮＡ分子を分析することであって、前記複数の無細胞ＤＮＡ分子が少なくとも１，０００個の無細胞ＤＮＡ分子であり、前記無細胞ＤＮＡ分子を分析することが、
前記生物に対応する参照ゲノム中の前記無細胞ＤＮＡ分子の位置を同定することを含む、分析することと、
前記Ｎ個のゲノム部位のうちのいずれか１つにそれぞれ位置する前記複数の無細胞ＤＮＡ分子のセットを同定することと、
前記複数の無細胞ＤＮＡ分子の前記セットを用いて、前記Ｎ個のゲノム部位のＮ個の混合物メチル化レベルを測定することと、
前記Ｍ個の組織型それぞれの前記Ｎ個の混合物メチル化レベルおよび前記Ｎ個の組織特異的メチル化レベルを使用して、前記コンピュータシステムによって、前記混合物中の前記第１の罹患組織型の第１の寄与度を決定することと、
前記生物内の前記第１の臓器の前記第１の疾患のレベルを決定するために、前記第１の罹患組織型の前記第１の寄与度を使用することと、を含む、方法。
【請求項２】
前記Ｍ個の組織型のうちの第２の組織型が、第１の臓器の第２の疾患に対応する第２の罹患組織型に対応し、前記方法が、
前記Ｍ個の組織型それぞれの前記Ｎ個の混合物メチル化レベルおよび前記Ｎ個の組織特異的メチル化レベルを使用して、前記コンピュータシステムによって、前記混合物中の前記第２の罹患組織型の第２の寄与度を決定することと、
前記生物内の前記第１の臓器についての前記第２の疾患のレベルを決定するために、前記第２の罹患組織型の前記第２の寄与度を使用することと、をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｍ個の組織型のうちの第２の型が、第２の臓器の第２の疾患に対応する第２の罹患組織型に対応し、前記方法が、
前記Ｍ個の組織型それぞれの前記Ｎ個の混合物メチル化レベルおよび前記Ｎ個の組織特異的メチル化レベルを使用して、前記コンピュータシステムによって、前記混合物中の前記第２の罹患組織型の第２の寄与度を決定することと、
前記生物内の前記第２の臓器についての前記第２の疾患のレベルを決定するために、前記第２の罹患組織型の前記第２の寄与度を使用することと、をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｍ個の組織型のうちの第２の組織型が、前記第１の臓器の健康な組織に対応する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記生物学的サンプルが、第１の臓器由来である、または前記生物学的サンプルが前記生物から出るときに前記第１の臓器を通過する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記生物学的サンプルが尿であり、前記第１の臓器が膀胱である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記生物学的サンプルが尿であり、前記第１の臓器が腎臓である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第１の疾患が、糸球体腎炎またはネフローゼ症候群である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記生物学的サンプルが唾液であり、前記第１の臓器が唾液腺である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１の疾患が癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記生物学的サンプルが尿サンプルであり、前記方法が、
エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を添加することによって前記尿サンプルを調製すること、をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記生物学的サンプル中の無細胞ＤＮＡおよび細胞ＤＮＡの寄与比率を決定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｎ個のゲノム部位が閾値量未満の個体間変動を有する部位を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｍ個の組織型が、腎臓、尿路上皮、好中球、Ｂ細胞、およびＴ細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｎ個のゲノム部位が、正常尿路上皮のメチローム中の部位を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記Ｎ個のゲノム部位が、正常尿路上皮のメチロームおよび腫瘍メチロームに共通する部位を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
生物の尿サンプルを分析する方法であって、前記尿サンプルが正常細胞および潜在的に癌に関連する細胞に由来するＤＮＡを含み、前記ＤＮＡの少なくとも一部が前記尿サンプル中で無細胞であり、前記方法が、
複数のサイズの各サイズについて、
前記サイズに対応する前記尿サンプルからのＤＮＡ断片の量を測定することと、
複数のサイズにおける前記ＤＮＡ断片の量に基づいて、第１のパラメータの第１の値を計算することであって、前記第１のパラメータが前記尿サンプル中のＤＮＡ断片のサイズプロファイルの統計的尺度を提供し、前記ＤＮＡ断片のサイズの増加と共に前記第１のパラメータが増加する、計算することと、
前記第１の値を基準値と比較することと、
前記比較することに基づいて膀胱癌のレベルの分類を決定することと、を含む、方法。
【請求項１８】
前記基準値が、膀胱癌を有することおよび／または膀胱癌を有さないことがそれぞれ分かっているサンプルから決定される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１のパラメータが周期性指標を含み、前記周期性指標が、前記サイズプロファイルの複数のピークにおけるＤＮＡ断片の量と前記サイズプロファイルの複数のトラフにおけるＤＮＡ断片の量との差を用いて計算され、
前記複数のピークが一定のサイズ間隔で存在し、
前記複数のトラフが、前記複数のピークからオフセットされた一定のサイズ間隔で存在する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
膀胱癌のレベルの分類を決定することが、前記第１の値が前記基準値よりも大きい場合に、前記生物が膀胱癌を有すると決定することを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記膀胱癌のレベルが、膀胱癌のステージを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記基準値が、前記生物の膀胱から腫瘍を除去する手術前に前記生物から決定される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
生物の腎臓の腎盂からの尿サンプルを分析する方法であって、前記尿サンプルがＤＮＡを含み、前記ＤＮＡの少なくとも一部が無細胞であり、前記方法が、
複数のサイズの各サイズについて、
前記サイズに対応する前記尿サンプルからのＤＮＡ断片の量を測定することと、
複数のサイズの前記ＤＮＡ断片の量に基づいて第１のパラメータの第１の値を計算することであって、前記第１のパラメータが前記尿サンプル中のＤＮＡ断片のサイズプロファイルの統計的尺度を提供する、計算することと、
前記第１の値を基準値と比較することと、
前記比較に基づいて前記腎臓の炎症レベルの分類を決定することと、を含む、方法。
【請求項２４】
前記ＤＮＡ断片のサイズの増加と共に前記第１のパラメータが増加する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記第１の値が前記基準値よりも大きい場合に、前記腎臓が炎症していると決定すること、をさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記腎臓の前記腎盂からの前記尿サンプルを得ること、をさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記第１のパラメータが周期性指標を含み、前記第１のパラメータが周期性指標を含み、前記周期性指標が、前記サイズプロファイルの複数のピークにおけるＤＮＡ断片の量と前記サイズプロファイルの複数のトラフにおけるＤＮＡ断片の量との差を用いて計算され、
前記複数のピークが一定のサイズ間隔で存在し、
前記複数のトラフが、前記複数のピークからオフセットされた一定のサイズ間隔で存在する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記第１のパラメータが、中央値または閾値サイズを有するＤＮＡ断片の割合を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記生物が健康であると分かっていた場合に、前記基準値が前記生物から決定される、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
生物の第１のサンプルおよび血液サンプルを分析することによって、前記生物の第１の臓器における癌を同定する方法であって、前記第１のサンプルおよび前記血液サンプルが、両方とも正常細胞および潜在的に癌に関連する細胞に由来するＤＮＡを含み、前記第１のサンプルが第１の臓器由来であり、または前記第１のサンプルが前記生物から出るときに前記第１の臓器を通過し、かつ前記血液サンプルとは異なり、前記ＤＮＡの少なくとも一部が、前記第１のサンプルおよび前記血液サンプルの両方において無細胞であり、前記方法が、
前記第１のサンプルおよび前記血液サンプルからの複数のＤＮＡ分子を分析することであって、前記ＤＮＡ分子を分析することが、
前記生物のゲノム中の前記ＤＮＡ分子の位置を同定することと、前記ＤＮＡ分子が１つ以上の部位でメチル化されているかどうかを任意選択に決定することと、を含むＤＮＡ分子を分析することと、
前記生物の複数の染色体領域の各染色体領域について、
前記染色体領域が、前記第１のサンプルおよび前記血液サンプルのそれぞれについてコピー数異常またはメチル化異常のうちの少なくとも一方の異常を示すかどうかの分類を、
前記同定された位置に基づいて各サンプルからのＤＮＡ分子の各群を前記染色体領域からのものとして同定することであって、前記各群が前記染色体領域の複数の遺伝子座のそれぞれに位置する少なくとも１つのＤＮＡ分子を含む、同定することと、
コンピュータシステムを用いてＤＮＡ分子の前記各群の各値を計算することであって、前記各値が前記各群の前記ＤＮＡ分子の特性を定義し、前記特性がコピー数またはメチル化レベルのうちの少なくとも１つである、計算することと、
前記各値を基準値と比較することと、によって決定することと、
前記第１のサンプルについて異常を示すと分類された染色体領域の第１の量が第１の閾値を超えるかどうかに基づいて第１の癌のレベルを決定することと、
前記血液サンプルについて異常を示すと分類された第２の量の染色体領域が第２の閾値を超えるかどうかに基づいて第２の癌のレベルを決定することと、
前記第１の癌のレベルは前記生物が癌を有することを示し、前記第２の癌のレベルは前記生物が癌を有しないことを示す場合に、前記生物が前記第１の臓器の癌を有すると決定することと、を含む、方法。
【請求項３１】
前記メチル化異常が、低メチル化または高メチル化を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記第１のサンプルが、尿、唾液、または便である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記複数の染色体領域が非重複である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記血液サンプルが血漿または血清である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＤＮＡ分子を分析することが、前記ＤＮＡ分子が１つ以上の部位でメチル化されているかどうかを決定することをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
前記基準値が正常サンプルについて決定される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３７】
各染色体領域の前記基準値が、隣接する染色体領域についての前記各値と前記基準値との比較に依存する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＤＮＡ分子が１つ以上の部位でメチル化されているかどうかを決定することをさらに含み、
前記異常が低メチル化であり、かつ
前記特性が前記メチル化レベルである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３９】
前記異常がコピー数異常であり、
前記特性が前記コピー数である、請求項３０に記載の方法。
【請求項４０】
前記各値が、前記コピー数および前記メチル化レベルの両方を使用して計算される、請求項３０に記載の方法。
【請求項４１】
生物の尿サンプルを分析する方法であって、前記尿サンプルが正常細胞および潜在的に癌に関連する細胞に由来するＤＮＡを含み、前記ＤＮＡの少なくとも一部が前記尿サンプル中で無細胞であり、前記方法が、
前記尿サンプルから複数のＤＮＡ分子を分析することであって、ＤＮＡ分子を分析することが、
前記生物のゲノム中の前記ＤＮＡ分子の位置を同定することを含む、ＤＮＡ分子を分析することと、
前記生物の複数の染色体領域の各染色体領域について、
前記染色体領域が、コピー数異常またはメチル化異常のうちの少なくとも一方の異常を示すかどうかの分類を、
前記同定された位置に基づいて前記染色体領域に由来するものとして前記尿サンプルからのＤＮＡ分子の群を同定することであって、前記群が前記染色体領域の複数の遺伝子座のそれぞれに位置する少なくとも１つのＤＮＡ分子を含む、同定することと、
コンピュータシステムを用いて前記ＤＮＡ分子の群の値を計算することであって、前記値が前記群の前記ＤＮＡ分子の特性を定義し、前記特性がコピー数またはメチル化レベルのうちの少なくとも１つである、計算することと、
前記値を基準値と比較することと、によって決定することと、
前記尿サンプルについてコピー数異常を示すと分類された染色体領域の第１の量が第１の閾値を超えるかどうかに基づいて第１の癌のレベルを決定することと、
前記尿サンプルについて前記メチル化異常を示すと分類された染色体領域の第２の量が第２の閾値を超えるかどうかに基づいて第２の癌のレベルを決定することと、
腫瘍組織の寄与度が第３の閾値を超えるかどうかに基づいて第３の癌のレベルを決定することと、
前記第１の癌のレベル、前記第２の癌のレベル、または前記第３の癌のレベルのうちの少なくとも１つが、前記生物が癌を有することを示す場合に、前記生物が癌を有することを決定することと、を含む、方法。
【請求項４２】
前記メチル化異常が低メチル化または高メチル化を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記腫瘍組織の前記寄与度を決定することをさらに含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記腫瘍組織の前記寄与度を決定することが、腫瘍特異的体細胞変異、腫瘍特異的メチル化シグネチャ、腫瘍特異的断片のエンドパターン、または断片のサイズ分析を使用することによるものである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記腫瘍組織の前記寄与度を決定することが、得られた組織特異的メチル化レベルおよびゲノム部位で測定されたメチル化レベルからの前記腫瘍組織の前記寄与度を推定することによるものである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記腫瘍組織の前記寄与度を決定することが、
Ｎが１０以上の整数である、Ｎ個のゲノム部位を同定することと、
Ｍ個の組織型のそれぞれについて、
前記Ｎ個のゲノム部位でＮ個の組織特異的メチル化レベルを得ることであって、ＮがＭ以上であり、前記組織特異的メチル化レベルがＮ×Ｍの寸法のマトリックスＡを形成し、前記Ｍ個の組織型のうちの１つが膀胱の癌に対応する腫瘍組織に対応する、Ｎ個の組織特異的メチル化レベルを得ることと、
コンピュータシステムによって前記尿サンプルからの複数の無細胞ＤＮＡ分子を分析することであって、前記複数の無細胞ＤＮＡ分子が少なくとも１，０００個の無細胞ＤＮＡ分子であり、前記無細胞ＤＮＡ分子を分析することが、
前記生物に対応する参照ゲノム中の前記無細胞ＤＮＡ分子の位置を同定することを含む、無細胞ＤＮＡ分子を分析することと、
前記Ｎ個のゲノム部位のうちのいずれか１つにそれぞれ位置する前記複数の無細胞ＤＮＡ分子のセットを同定することと、
前記複数の無細胞ＤＮＡ分子の前記セットを用いてＮ個のゲノム部位のＮ個の混合物メチル化レベルを測定することと、
前記Ｍ個の組織型それぞれの前記Ｎ個の混合物メチル化レベルおよび前記Ｎ個の組織特異的メチル化レベルを使用して、前記コンピュータシステムによって、前記混合物中の前記腫瘍組織の前記寄与度を決定することと、によるものである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記第１の癌のレベル、前記第２の癌のレベル、もしくは前記第３の癌のレベルのうちの少なくとも２つが、前記生物が癌を有することを示す場合に、または前記第１の癌のレベル、前記第２の癌のレベル、もしくは前記第３の癌のレベルが、前記生物が癌を有することを示す場合に、前記生物が癌を有することを決定する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４８】
生物の生物学的サンプルを分析する方法であって、前記生物学的サンプルは正常細胞および潜在的に癌に関連する細胞に由来し、前記ＤＮＡの少なくとも一部は、前記生物学的サンプル中で無細胞であり、前記方法が、
前記生物学的サンプルのＤＮＡ分子に対応する複数のシークエンスリードを受けることと、
前記シークエンスリードのゲノム位置を決定することと、
前記参照ゲノムに対して１つのミスマッチを有する前記シークエンスリードの数に基づいてパラメータを決定する、前記参照ゲノムに対して１つのミスマッチを有する前記シークエンスリードを決定するために、前記シークエンスリードと参照ゲノムとを比較することと、
前記パラメータを閾値と比較することと、
パラメータと前記閾値との前記比較を使用して癌のレベルの分類を決定することと、を含む、方法。
【請求項４９】
複数のミスマッチが、体細胞変異およびシークエンシングエラーに起因する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記シークエンスリードの前記数が、正確に１つのミスマッチを有するシークエンスリードのものである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
癌のレベルの分類を決定することが、コピー数異常、低メチル化、高メチル化、または腫瘍寄与のうちの少なくとも１つを使用することを含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
ヒトの尿サンプルを分析する方法であって、前記尿サンプルが正常細胞および潜在的に癌に関連する細胞に由来するＤＮＡを含み、前記ＤＮＡの少なくとも一部は前記尿サンプル中で無細胞であり、前記方法が、
前記尿サンプルのＤＮＡ分子に対応する複数のシークエンスリードを得ることと、
前記複数のシークエンスリードのうちの各シークエンスリードについて、
コンピュータシステムによって、前記シークエンスリードがヒト参照ゲノムに整列する場合に、前記シークエンスリードをヒトリードとして分類すること、または
前記シークエンスリードが第１の病原体の種または属に対応する第１の病原体参照ゲノムに整列する場合に、前記シークエンスリードを第１の病原体リードとして分類することと、
第１の病原体リードの量に基づいてパラメータを決定することと、
前記パラメータとカットオフ値とを比較することであって、前記カットオフ値が、膀胱癌を有する参照サンプルの第１のセットおよび膀胱癌を有さない対照サンプルの第２のセットから決定される、比較することと、
前記比較を用いて膀胱癌のレベルの分類を決定することと、を含む、方法。
【請求項５３】
前記シークエンスリードを第１の病原体リードとして分類することが、１つ以上の細菌の参照ゲノムに前記シークエンスリードを整列させることを含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記第１の病原体が細菌である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記細菌が、Ｈａｌｏｎｏｔｉｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｐｕｍｉｌｕｓ、またはＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓを含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記パラメータが第１のパラメータであり、
前記カットオフ値が第１のカットオフ値であり、
前記複数のシークエンスリードのうちの各シークエンスリードについて、
前記シークエンスリードを第２の病原体の種または属に対応する第２の病原体参照ゲノムに整列させる場合に、前記シークエンスリードを第２の病原体リードとして分類することと、
第２の病原体リードの第２の量に基づいて第２のパラメータを決定することと、
前記第２のパラメータを第２のカットオフ値と比較することと、
前記第１のパラメータと前記第１のカットオフ値との比較、および前記第２のパラメータと前記第２のカットオフ値との比較を使用して、前記膀胱癌のレベルの分類を決定することと、をさらに含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５７】
前記第１の病原体が、ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ、ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、またはｃａｎｄｉｄａｔｕｓを含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５８】
上記の前記方法のいずれかの動作を実行するコンピュータシステムを制御するための複数の命令を保存するコンピュータ可読媒体を含むコンピュータ製品。
【請求項５９】
請求項５８に記載の前記コンピュータ製品と、
前記コンピュータ可読媒体上に保存された命令を実行するための１つ以上の処理装置と、を備えたシステム。
【請求項６０】
上記の前記方法のいずれかを実行するための手段を含むシステム。
【請求項６１】
上記の方法のいずれかを実行するように構成されたシステム。
【請求項６２】
上記の方法のいずれかのステップをそれぞれ実行するモジュールを備えるシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年１１月３０日に出願された「尿および他のサンプルにおける無細胞ＤＮＡの分析」と題する米国仮特許出願第６２／４２７，９９９号からの優先権を主張し、全ての目的のために、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの体液に見出される細胞外ＤＮＡの短い断片は、アポトーシスおよび壊死中に死細胞から放出される（１）。胎児由来の循環血漿中の無細胞（ｃｆ）ＤＮＡ（２）、腫瘍細胞（３）および移植同種移植（４）の分析は、非侵襲的出生前検査（５）、腫瘍を評価するための「液体生検」（６、７）、および移植臓器の臨床状態のモニタリング（８）の開発を可能にしてきた。
【０００３】
尿分析は全く非侵襲的であり、尿中ｃｆＤＮＡの由来を理解することは、「液体生検」の形態としてのその臨床使用を導くのに有用である。尿の無細胞上清から単離されたＤＮＡは、腎前性、腎性、または腎後性の系から生じるものとして大別され得る。輸血（９）、妊娠（９−１１）、造血幹細胞移植（１２）、非泌尿器悪性腫瘍（１３、１４）、腎移植（１５）、および膀胱癌（１６、１７）をモデル系として用いて、いくつかの群では尿中ｃｆＤＮＡの割合が全身循環、腎臓、および腎後性尿路上皮に由来していることを実証してきた。
【０００４】
以前の研究では、目的の単一ソースから一度にｃｆＤＮＡ検出することを重視し、特定のソースに由来する尿中ｃｆＤＮＡの量には大きな変動がある。総尿中ｃｆＤＮＡに対する各組織ソースの寄与比率は不明であり、いくつかの研究では、目的のソースからのｃｆＤＮＡ濃度は極端に低く、または検出不能である（１５、１６、１８）。したがって、癌または他の疾患を検出するために、尿（または血液以外の非侵襲的生検、例えば唾液もしくは便サンプル）を使用することは困難であった。
【０００５】
他の技術は、以前に癌と診断された患者をモニターするための点変異を分析する。しかしながら、そのような技術は、癌を診断するための無症候性患者の広く適用可能なスクリーニング技術に容易には修正できない。癌を検出し得る前に特定の点変異は同定されなければならない。したがって、周知の点変異についてのスクリーニングのみがスクリーニングに可能であり、または患者についての特定の点変異は、以前に検出された腫瘍についての従来の侵襲性生検を通して同定されなければならない。
【発明の概要】
【０００６】
実施形態は、特定の臓器での疾患の検出（例えば、癌）のために無細胞ＤＮＡを分析できる。いくつかの実施形態は、例えば、尿、唾液、血液、および便サンプル中に生じ得るように、特定の臓器由来または特定の臓器を通過する臓器関連サンプルを使用することができる。分析は様々な方法で実行することができる。
【０００７】
いくつかの実施形態では、無細胞ＤＮＡのメチル化レベルをサンプル中で測定することができる。組織特異的メチル化パターンを使用して、異なる組織型からの寄与度を決定することができる。１つの組織型は、特定の臓器での特定の疾患の罹患組織型であり得る。罹患組織型の寄与度を使用して、サンプル中の特定疾患のレベル（分類）を決定することができる。一例として、メチル化パターンを使用して癌性膀胱内膜細胞の割合を決定することができ、その割合を使用して癌のレベルを決定することができる。
【０００８】
他の実施形態では、臓器関連無細胞ＤＮＡのサイズを測定することができる。膀胱から排泄された尿サンプルを使用する例では、サイズプロファイルは、尿中に天然に存在する無細胞ＤＮＡ断片を測定することができる。サイズプロファイルの統計的尺度は、無細胞ＤＮＡ断片が健康な膀胱組織を有する対象について予想されるよりも集合的に長いことを示し得る。より長い断片の徴候を使用することで、対象における膀胱癌を同定することができる。尿サンプルを使用する別の例では、尿サンプルを腎盂から回収することができる。腎臓が炎症を起こしているかどうかについての判定は、無細胞ＤＮＡ断片が、非炎症腎臓を有する対象について予想されるよりも集合的に長いことを示す統計的尺度に基づいて行うことができる。
【０００９】
他の実施形態では、２つの異なるサンプルを分析して、特定の臓器が癌を有するかどうかを決定することができる。血液サンプルおよび臓器関連サンプル（例えば、尿、唾液、または便サンプル）両方の無細胞ＤＮＡを分析して、コピー数異常を示す染色体領域を同定することができる。血液サンプルが癌を示さず、臓器関連サンプルが癌を示す場合、対象はサンプルに関連した臓器に癌を有すると同定することができる。例えば、尿サンプルについては、対象は膀胱癌を有すると同定することができる。尿路の癌、尿路上皮から生じる移行上皮癌、および腎臓癌などの他の癌も検出することができる。
【００１０】
他の実施形態は、本明細書に記載の方法と関係したシステムおよびコンピュータ可読媒体に関する。
【００１１】
本発明の実施形態の性質および利点に関するより良好な理解は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照して得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の実施形態による、腎臓、尿路上皮、Ｂ細胞、Ｔ細胞、および好中球から同定された１９，４１８個のメチル化可変領域におけるメチル化密度を示す。各垂直線は、メチル化密度に基づいて色分けされた単一のメチル化可変領域を表す。高いメチル化密度を有するメチル化可変領域（ＤＭＲ）を濃い灰色で表し、低いメチル化密度を有する遺伝子座を薄い灰色で表す。
【図２】本発明の実施形態による、膀胱腫瘍、Ｂ細胞、尿路上皮、腎臓、好中球、およびＴ細胞における２７，３７１個のメチル化可変領域（ＤＭＲ）のメチル化密度を示すヒートマップである。
【図３】本発明の実施形態による、造血幹細胞移植患者（ＨＳＣＴ）（三角）および腎移植患者（丸いドット）からの３１の尿サンプル中の血球および腎臓に由来するｃｆＤＮＡの寄与比率を示す。
【図４Ａ】本発明の実施形態による、正常尿路上皮細胞（図４Ａ）、単一の組織特異的メチル化パターンとしての尿路上皮および膀胱癌細胞（図４Ｂ）、および別々の組織特異的メチル化パターンとしての尿路上皮および膀胱癌細胞（図４Ｃ）を含む異なる組織特異的メチル化パターンを使用して定義された割合に対する、膀胱癌症例および無癌対照のメチル化デコンボリューションをグラフ化したものを示す。
【図４Ｂ】本発明の実施形態による、正常尿路上皮細胞（図４Ａ）、単一の組織特異的メチル化パターンとしての尿路上皮および膀胱癌細胞（図４Ｂ）、および別々の組織特異的メチル化パターンとしての尿路上皮および膀胱癌細胞（図４Ｃ）を含む異なる組織特異的メチル化パターンを使用して定義された割合に対する、膀胱癌症例および無癌対照のメチル化デコンボリューションをグラフ化したものを示す。
【図４Ｃ】本発明の実施形態による、正常尿路上皮細胞（図４Ａ）、単一の組織特異的メチル化パターンとしての尿路上皮および膀胱癌細胞（図４Ｂ）、および別々の組織特異的メチル化パターンとしての尿路上皮および膀胱癌細胞（図４Ｃ）を含む異なる組織特異的メチル化パターンを使用して定義された割合に対する、膀胱癌症例および無癌対照のメチル化デコンボリューションをグラフ化したものを示す。
【図５】本発明の実施形態による、罹患組織型の組織特異的メチル化パターンを用いて、生物の生体サンプルを分析する方法５００を示すフローチャートである。
【図６Ａ】本発明の実施形態による、６人の膀胱癌症例および６人の対照についてのミリリットル尿あたりのゲノム当量（ＧＥ）の総ｃｆＤＮＡ濃度を示す。
【図６Ｂ】本発明の実施形態による、６人の膀胱癌症例および６人の対照についての膀胱腫瘍ＧＥ指数値を示す。
【図７Ａ】本発明の実施形態による、代表的なＨＳＣＴ患者（図７Ａ）および腎移植患者（図７Ｂ）のレシピエントならびにドナーＤＮＡについての尿中ｃｆＤＮＡのサイズプロファイルを示す。
【図７Ｂ】本発明の実施形態による、代表的なＨＳＣＴ患者（図７Ａ）および腎移植患者（図７Ｂ）のレシピエントならびにドナーＤＮＡについての尿中ｃｆＤＮＡのサイズプロファイルを示す。
【図８Ａ】本発明の実施形態による、石が原因でブロックされた右腎の腎盂、および左腎からの排泄尿のｃｆＤＮＡのサイズプロファイルを示す。
【図８Ｂ】本発明の実施形態による、石が原因でブロックされた右腎の腎盂、および左腎からの排泄尿のｃｆＤＮＡのサイズプロファイルを示す。
【図９Ａ】本発明の実施形態による、３７℃で０時間、３時間、６時間インビトロ培養した腎盂からの尿のｃｆＤＮＡのサイズプロファイルである。
【図９Ｂ】本発明の実施形態による、３７℃で０時間、３時間、６時間インビトロ培養した腎盂からの尿のｃｆＤＮＡのサイズプロファイルである。
【図１０Ａ】本発明の実施形態による、（ａ）３時間および（ｂ）６時間培養した腎盂尿のサイズプロファイルと比較した排泄尿のサイズプロファイルを示す。
【図１０Ｂ】本発明の実施形態による、（ａ）３時間および（ｂ）６時間培養した腎盂尿のサイズプロファイルと比較した排泄尿のサイズプロファイルを示す。
【図１１Ａ】本発明の実施形態による、３１のＨＳＣＴおよび腎移植尿サンプルについてのｃｆＤＮＡ断片のサイズパラメータ間の関係を表示するグラフである。
【図１１Ｂ】本発明の実施形態による、３１のＨＳＣＴおよび腎移植尿サンプルについてのｃｆＤＮＡ断片のサイズパラメータ間の関係を表示するグラフである。
【図１２Ａ】本発明の実施形態による、腎盂からの尿（図１２Ａ）および排泄尿（図１２Ｂ）に対する３７℃インビトロ培養実験中の尿中ｃｆＤＮＡの濃度を示す。
【図１２Ｂ】本発明の実施形態による、腎盂からの尿（図１２Ａ）および排泄尿（図１２Ｂ）に対する３７℃インビトロ培養実験中の尿中ｃｆＤＮＡの濃度を示す。
【図１３Ａ】本発明の実施形態による、３７℃で０〜１２時間インビトロ培養した排泄尿ｃｆＤＮＡのサイズプロファイル。
【図１３Ｂ】本発明の実施形態による、３７℃で０〜１２時間インビトロ培養した排泄尿ｃｆＤＮＡのサイズプロファイル。
【図１３Ｃ】本発明の実施形態による、３７℃で０〜１２時間インビトロ培養した排泄尿ｃｆＤＮＡのサイズプロファイル。
【図１３Ｄ】本発明の実施形態による、３７℃で０〜１２時間インビトロ培養した排泄尿ｃｆＤＮＡのサイズプロファイル。
【図１４】本発明の実施形態による、生物の腎臓の腎盂からの尿サンプルを分析して、臓器損傷の程度（例えば、炎症レベル）を決定する方法１４００のフローチャートである。
【図１５Ａ】本発明の実施形態による、筋肉浸潤性膀胱癌２症例の術前および術後の尿サンプルのサイズプロファイルを示す。
【図１５Ｂ】本発明の実施形態による、筋肉浸潤性膀胱癌２症例の術前および術後の尿サンプルのサイズプロファイルを示す。
【図１６Ａ】本発明の実施形態による、膀胱癌患者からの３つの排泄尿サンプルのサイズプロファイルを示す。
【図１６Ｂ】本発明の実施形態による、膀胱癌患者からの３つの排泄尿サンプルのサイズプロファイルを示す。
【図１６Ｃ】本発明の実施形態による、膀胱癌患者からの３つの排泄尿サンプルのサイズプロファイルを示す。
【図１７Ａ】本発明の実施形態による、ＴＵＲＢＴを受ける非筋肉浸潤性膀胱癌を有する３患者からの３つの術前尿サンプルのサイズプロファイルを示す。
【図１７Ｂ】本発明の実施形態による、ＴＵＲＢＴを受ける非筋肉浸潤性膀胱癌を有する３患者からの３つの術前尿サンプルのサイズプロファイルを示す。
【図１７Ｃ】本発明の実施形態による、ＴＵＲＢＴを受ける非筋肉浸潤性膀胱癌を有する３患者からの３つの術前尿サンプルのサイズプロファイルを示す。
【図１８】本発明の実施形態による、尿中ｃｆＤＮＡのサイズを使用して膀胱癌を検出するために生物の尿サンプルを分析する方法１８００のフローチャートを示す。
【図１９Ａ】本発明の実施形態による、対照、Ｔａ−Ｔ１疾患を有する膀胱癌患者、およびＴ２−Ｔ４疾患を有する膀胱癌患者における７０ｂｐ（Ｐ＞７０ｂｐ）よりも長い尿中ｃｆＤＮＡ断片の割合の箱ひげ図を示す。
【図１９Ｂ】本発明の実施形態による、対照、Ｔａ−Ｔ１疾患を有する膀胱癌患者、およびＴ２−Ｔ４疾患を有する膀胱癌患者における７０ｂｐ（Ｐ＞７０ｂｐ）よりも長い尿中ｃｆＤＮＡ断片の割合の箱ひげ図を示す。
【図２０】本発明の実施形態による、全体的なメチル化における一致、および尿中ｃｆＤＮＡおよび膀胱癌組織間のコピー数異常を表示するＣｉｒｃｏｓプロットを示す。
【図２１Ａ】本発明の実施形態による、５人の膀胱癌患者（Ａ〜Ｅ）の全体的なメチル化および尿中ｃｆＤＮＡのコピー数異常についてのＣｉｒｃｏｓプロットを示す。
【図２１Ｂ】本発明の実施形態による、５人の膀胱癌患者（Ａ〜Ｅ）の全体的なメチル化および尿中ｃｆＤＮＡのコピー数異常についてのＣｉｒｃｏｓプロットを示す。
【図２１Ｃ】本発明の実施形態による、５人の膀胱癌患者（Ａ〜Ｅ）の全体的なメチル化および尿中ｃｆＤＮＡのコピー数異常についてのＣｉｒｃｏｓプロットを示す。
【図２１Ｄ】本発明の実施形態による、５人の膀胱癌患者（Ａ〜Ｅ）の全体的なメチル化および尿中ｃｆＤＮＡのコピー数異常についてのＣｉｒｃｏｓプロットを示す。
【図２１Ｅ】本発明の実施形態による、５人の膀胱癌患者（Ａ〜Ｅ）の全体的なメチル化および尿中ｃｆＤＮＡのコピー数異常についてのＣｉｒｃｏｓプロットを示す。
【図２２Ａ】本発明の実施形態による、Ｔ２２の膀胱癌腫瘍（１９Ａ）およびｃｆ尿（１９Ｂ）についてのＣｉｒｃｏｓプロットを示す。
【図２２Ｂ】本発明の実施形態による、Ｔ２２の膀胱癌腫瘍（１９Ａ）およびｃｆ尿（１９Ｂ）についてのＣｉｒｃｏｓプロットを示す。
【図２３Ａ】本発明の実施形態による、膀胱癌症例および対照における全体的な高メチル化密度の箱ひげ図を示す。
【図２３Ｂ】本発明の実施形態による、癌を検出するために、高メチル化密度を使用するための受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す。
【図２４Ａ】本発明の実施形態による、根治的膀胱摘出術（Ｔ２２およびＴ２３）を受ける２人の膀胱癌患者の術前（図２４Ａおよび図２４Ｃ）および術後（図２４Ｂおよび図２４Ｄ）のｃｆ尿を示す。
【図２４Ｂ】本発明の実施形態による、根治的膀胱摘出術（Ｔ２２およびＴ２３）を受ける２人の膀胱癌患者の術前（図２４Ａおよび図２４Ｃ）および術後（図２４Ｂおよび図２４Ｄ）のｃｆ尿を示す。
【図２４Ｃ】本発明の実施形態による、根治的膀胱摘出術（Ｔ２２およびＴ２３）を受ける２人の膀胱癌患者の術前（図２４Ａおよび図２４Ｃ）および術後（図２４Ｂおよび図２４Ｄ）のｃｆ尿を示す。
【図２４Ｄ】本発明の実施形態による、根治的膀胱摘出術（Ｔ２２およびＴ２３）を受ける２人の膀胱癌患者の術前（図２４Ａおよび図２４Ｃ）および術後（図２４Ｂおよび図２４Ｄ）のｃｆ尿を示す。
【図２５Ａ】本発明の実施形態による、２人の患者の全体的なメチル化およびＣＮＡの術前および術後のＣｉｒｃｏｓプロットを示す。
【図２５Ｂ】本発明の実施形態による、２人の患者の全体的なメチル化およびＣＮＡの術前および術後のＣｉｒｃｏｓプロットを示す。
【図２５Ｃ】本発明の実施形態による、２人の患者の全体的なメチル化およびＣＮＡの術前および術後のＣｉｒｃｏｓプロットを示す。
【図２５Ｄ】本発明の実施形態による、２人の患者の全体的なメチル化およびＣＮＡの術前および術後のＣｉｒｃｏｓプロットを示す。
【図２６】本発明の実施形態による、非侵襲的（Ｔａ）の低悪性度乳頭状尿路上皮腫瘍（ＰＵＮＬＭＰ）を有する膀胱癌患者におけるメチル化およびコピー数異常を示すＣｉｒｃｏｓプロットである。
【図２７Ａ】本発明の実施形態による、同一排泄尿から得られた膀胱癌患者（Ｔ２３）のｃｆ尿（図２７Ａ）および尿沈渣（図２７Ｂ）についてのＣｉｒｃｏｓプロットを示す。
【図２７Ｂ】本発明の実施形態による、同一排泄尿から得られた膀胱癌患者（Ｔ２３）のｃｆ尿（図２７Ａ）および尿沈渣（図２７Ｂ）についてのＣｉｒｃｏｓプロットを示す。
【図２８Ａ】本発明の実施形態による、２人の膀胱癌患者（Ｔ２２とＴ２３）からのｃｆ尿（図２８Ａおよび図２８Ｃ）および血漿（図２８Ｂおよび図２８Ｄ）についてのＣｉｒｃｏｓプロットを示す。
【図２８Ｂ】本発明の実施形態による、２人の膀胱癌患者（Ｔ２２とＴ２３）からのｃｆ尿（図２８Ａおよび図２８Ｃ）および血漿（図２８Ｂおよび図２８Ｄ）についてのＣｉｒｃｏｓプロットを示す。
【図２８Ｃ】本発明の実施形態による、２人の膀胱癌患者（Ｔ２２とＴ２３）からのｃｆ尿（図２８Ａおよび図２８Ｃ）および血漿（図２８Ｂおよび図２８Ｄ）についてのＣｉｒｃｏｓプロットを示す。
【図２８Ｄ】本発明の実施形態による、２人の膀胱癌患者（Ｔ２２とＴ２３）からのｃｆ尿（図２８Ａおよび図２８Ｃ）および血漿（図２８Ｂおよび図２８Ｄ）についてのＣｉｒｃｏｓプロットを示す。
【図２９Ａ】本発明の実施形態による、Ｔ２２およびＴ２３の膀胱癌２症例のＣＮＡまたは低メチル化の証拠を示しているゲノム全体の１ＭＢビンの割合を示す。
【図２９Ｂ】本発明の実施形態による、Ｔ２２およびＴ２３の膀胱癌２症例のＣＮＡまたは低メチル化の証拠を示しているゲノム全体の１ＭＢビンの割合を示す。
【図３０】本発明の実施形態による、対象における血液サンプルおよび尿サンプルを分析することによって、対象における膀胱癌を同定する方法を示すフローチャートである。
【図３１Ａ】本発明の実施形態による、低メチル化を有する１ｍｂビンの割合、コピー数異常を有する１ｍｂビンの割合、ならびに４６人の膀胱癌患者および３９人の対照のメチル化デコンボリューションからの膀胱腫瘍寄与についての箱ひげ図を示す。
【図３１Ｂ】本発明の実施形態による、低メチル化を有する１ｍｂビンの割合、コピー数異常を有する１ｍｂビンの割合、ならびに４６人の膀胱癌患者および３９人の対照のメチル化デコンボリューションからの膀胱腫瘍寄与についての箱ひげ図を示す。
【図３１Ｃ】本発明の実施形態による、低メチル化を有する１ｍｂビンの割合、コピー数異常を有する１ｍｂビンの割合、ならびに４６人の膀胱癌患者および３９人の対照のメチル化デコンボリューションからの膀胱腫瘍寄与についての箱ひげ図を示す。
【図３１Ｄ】本発明の実施形態による、低メチル化、ＣＮＡ、および膀胱腫瘍寄与についての受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す。
【図３１Ｅ】本発明の実施形態による、低メチル化、ＣＮＡ、および膀胱腫瘍寄与についての受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す。
【図３１Ｆ】本発明の実施形態による、低メチル化、ＣＮＡ、および膀胱腫瘍寄与についての受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す。
【図３２Ａ】本発明の実施形態による、低メチル化を有する１ｍｂビンの割合、コピー数異常を有する１ｍｂビンの割合、ならびに非侵襲性（Ｔａ）低悪性度疾患を有する１７人の膀胱癌患者および３９人の対照のメチル化デコンボリューションからの膀胱腫瘍寄与についての箱ひげ図を示す。
【図３２Ｂ】本発明の実施形態による、低メチル化を有する１ｍｂビンの割合、コピー数異常を有する１ｍｂビンの割合、ならびに非侵襲性（Ｔａ）低悪性度疾患を有する１７人の膀胱癌患者および３９人の対照のメチル化デコンボリューションからの膀胱腫瘍寄与についての箱ひげ図を示す。
【図３２Ｃ】本発明の実施形態による、低メチル化を有する１ｍｂビンの割合、コピー数異常を有する１ｍｂビンの割合、ならびに非侵襲性（Ｔａ）低悪性度疾患を有する１７人の膀胱癌患者および３９人の対照のメチル化デコンボリューションからの膀胱腫瘍寄与についての箱ひげ図を示す。
【図３２Ｄ】本発明の実施形態による、低メチル化、ＣＮＡ、および膀胱腫瘍寄与の受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す。
【図３２Ｅ】本発明の実施形態による、低メチル化、ＣＮＡ、および膀胱腫瘍寄与の受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す。
【図３２Ｆ】本発明の実施形態による、低メチル化、ＣＮＡ、および膀胱腫瘍寄与の受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す。
【図３３】本発明の実施形態による、生体の尿サンプルを分析する方法を示す。
【図３４Ａ】本発明の実施形態による、４９人の膀胱癌症例および３９人の対照において１つのミスマッチを有するリード割合の箱ひげ図である。
【図３４Ｂ】本発明の実施形態による、図３４Ａに対応するＲＯＣ曲線分析である。
【図３５】本発明の実施形態による、生物の生体サンプルを分析する方法を示す。
【図３６】本発明の実施形態による、３人の膀胱癌症例および５人の対照についての異なる微生物種の相対存在量を表示するヒートマップである。
【図３７】本発明の実施形態による、ヒトの尿サンプルを分析する方法を示す。
【図３８】本発明の一実施形態によるシステム３８００を示す。
【図３９】本発明の実施形態による、システムおよび方法と共に使用可能な、例となるコンピュータシステムのブロック図を示す。
【００１３】
用語
「生物学的サンプル」は、対象（例えば、妊婦、癌に罹患している人もしくは癌に罹患していると疑われる人、臓器移植レシピエント、または臓器（例えば、心筋梗塞における心臓、卒中における脳、または貧血における造血系など）が関与する疾患プロセスを有すると疑われる対象）から得られ、目的の１つ以上の核酸分子（複数可）を含有する任意のサンプルを指す。生物学的サンプルは、血液、血漿、血清、尿、膣液、水腫（例えば精巣の）からの液、膣洗浄流体、胸水、腹水、脳脊髄液、唾液、汗、涙、痰、気管支肺胞洗浄液、乳首からの吸引液、体の異なる部分からの吸引液などの体液であり得る。便サンプルも使用することができる。種々の実施形態では、無細胞ＤＮＡのために濃縮された生物学的サンプル（例えば、遠心分離プロトコルを介して得られた血漿サンプル）におけるＤＮＡの大部分は無細胞であり得、例えば、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、９５％超、または９９％超のＤＮＡは無細胞であり得る。遠心分離プロトコルは、例えば、３，０００ｇ×１０分で流体部分を得ることと、残留細胞を除去するために３０，０００ｇでさらに１０分間再遠心分離することを含み得る。
【００１４】
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子座（ｌｏｃｕｓ）」またはその複数形「遺伝子座（ｌｏｃｉ）」は、ゲノム全体において変動を有するヌクレオチド（または塩基対）の任意の長さの位置またはアドレスである。「シークエンスリード」は、核酸分子の任意の部分または全部から配列決定されたヌクレオチドの鎖を指す。例えば、シークエンスリードは、核酸断片から配列決定された短鎖ヌクレオチド（例えば、約２０〜１５０個）、核酸断片の片端もしくは両端の短鎖ヌクレオチド、または生物学的サンプルに存在する核酸断片全体の配列決定であり得る。シークエンスリードは、例えば、シークエンシング技術を用いた、またはプローブを用いた種々の方法で、例えば、ハイブリッド形成アレイもしくは捕捉プローブで、または単一プライマーもしくは等温増幅を用いた、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）もしくは線形増幅などの増幅技術で、得ることができる。
【００１５】
用語「サイズプロファイル」は、一般に、生物学的サンプル中のＤＮＡ断片のサイズを指す。サイズプロファイルは、様々なサイズの量のＤＮＡ断片の分布を提供するヒストグラムであってもよい。様々な統計パラメータ（サイズパラメータまたは単にパラメータとも呼ばれる）を使用して、あるサイズプロファイルを別のサイズプロファイルと区別することができる。１つのパラメータは、全てのＤＮＡ断片に対する、または他のサイズもしくは範囲のＤＮＡ断片に対する、特定のサイズもしくはサイズ範囲のＤＮＡ断片の割合である。
【００１６】
本明細書で使用される場合、用語「分類」は、サンプルの特定の特性と関係した任意の数（複数可）または他の特徴（複数可）を指す。例えば、「＋」記号（または「陽性」という語）は、サンプルが欠失または増幅を有するものとして分類されることを意味し得る。分類は、二元性（例えば、陽性または陰性）であり得、またはより多レベルの分類（例えば、１〜１０または０〜１の尺度）を有し得る。
【００１７】
用語「カットオフ」および「閾値」は、ある操作において使用される所定の数を指す。例えば、カットオフサイズは、それを超えると断片が除外されるサイズを指すことができる。閾値は、特定の分類が当てはまるものを上回るまたは下回る値であってよい。これらの用語のいずれかは、これらの文脈のいずれかで使用することができる。
【００１８】
哺乳類ゲノムにおける「ＤＮＡメチル化」は、典型的には、ＣｐＧジヌクレオチドにおけるシトシン残基の５’炭素へのメチル基の付加（すなわち、５−メチルシトシン）を指す。ＤＮＡメチル化は、他の文脈、例えばＣＨＧおよびＣＨＨ、においてはシトシンにおいて生じ得、式中、Ｈはアデニン、シトシンまたはチミンである。シトシンのメチル化は、５−ヒドロキシメチルシトシンの形態でもあり得る。Ｎ６−メチルアデニンなどの非シトシンのメチル化も報告されている。
【００１９】
「部位」は、単一の塩基位置または相関する塩基位置の群、例えば、ＣｐＧ部位であり得る単一の部位に対応する。「遺伝子座」は、複数の部位を含む領域に対応し得る。遺伝子座は、遺伝子座をその脈絡における部位と等価にするであろうただ１つの部位を含むことができる。
【００２０】
「メチローム」は、ゲノムにおける複数の部位または遺伝子座のＤＮＡメチル化の量の尺度を提供する。メチロームは、ゲノムの全部、ゲノムの実質的な部分、またはゲノムの比較的わずかな部分（複数可）に対応し得る。「腫瘍メチローム」は、生物（例えば、ヒト）の腫瘍のメチロームに対応する。腫瘍メチロームは、母体血漿中の腫瘍組織または無細胞腫瘍ＤＮＡを用いて決定することができる。目的の組織特異的メチロームの他の例は、臓器のメチローム（例えば、脳細胞、骨、肺、心臓、筋肉、および腎臓などのメチローム）であり、それはＤＮＡを体液（例えば、血漿、血清、汗、唾液、尿、生殖分泌物、精液、便液、下痢液、脳脊髄液、消化管分泌物、腹水、胸水、眼内液、水腫（例えば精巣の）からの液、嚢胞液、膵臓分泌物、腸分泌物、痰、涙、乳房および甲状腺からの吸引液など）に寄与することができる。臓器は移植臓器であってもよい。
【００２１】
「組織」は、同じタイプの細胞の群に対応する。異なるタイプの組織は、異なるタイプの細胞（例えば、肝細胞、肺胞細胞または血球細胞）からなり得るが、異なる生物（母親対胎児）由来の組織または健常細胞対腫瘍細胞にも対応し得る。「参照組織」は、組織特異的メチル化レベルを決定するために使用される組織に対応する。異なる個体由来の同じ組織型の複数のサンプルを使用して、その組織型の組織特異的メチル化レベルを決定することができる。
【００２２】
各ゲノム部位（例えば、ＣｐＧ部位）についての「メチル化指数」は、部位におけるメチル化を、その部位を網羅するリード総数と比較して示す、シークエンスリードの比率を指す。ある領域の「メチル化密度」は、その領域における部位を網羅するリード総数で分割されたメチル化を示す、領域内の部位のリード数である。この部位は、特定の特徴を有し得、例えば、ＣｐＧ部位であり得る。したがって、ある領域の「ＣｐＧメチル化密度」は、その領域におけるＣｐＧ部位（例えば、特定のＣｐＧ部位、ＣｐＧアイランド内のＣｐＧ部位、またはそれより大きな領域）を網羅するリード総数で分割されたＣｐＧメチル化を示すリード数である。例えば、ヒトゲノム中の各１００ｋｂビンのメチル化密度は、１００ｋｂ領域へマッピングされたシークエンスリードによって覆われたＣｐＧ部位全部の比率として、ＣｐＧ部位の（メチル化されたシトシンに対応する）バイサルファイト処理後に覆われていないシトシンの総数から決定することができる。この分析は、５０ｋｂまたは１Ｍｂなどの他のビンサイズでも実施できる。領域は、全ゲノムまたは染色体または染色体の一部（例えば、染色体腕）であり得る。ＣｐＧ部位のメチル化指数は、領域がそのＣｐＧ部位のみを含む場合、その領域のメチル化密度と同じである。「メチル化シトシンの比率」は、その領域における解析されたシトシン残基の総数、すなわちＣｐＧの脈絡外のシトシンなどについて、メチル化されている（例えば、二亜硫酸塩変換後に覆われていない）ことが示されているシトシン部位「Ｃ」の数を指す。メチル化指数、メチル化密度、およびメチル化シトシンの比率は、「メチル化レベル」の例である。
【００２３】
用語「疾患のレベル」または「病態のレベル」は、疾患（例えば、癌）が存在するかどうか、疾患が癌である場合、疾患のステージ、腫瘍のサイズ、転移があるかどうか、身体の総腫瘍量、および／または疾患の重症度の他の尺度を指すことができる。疾患のレベルは、記号、アルファベット、および色などの数または他のしるしであり得る。レベルは、ゼロであり得る。癌のレベルはまた、変異または変異の数に関連付けられる前悪性または前癌性の病態（状態）を含む。疾患のレベルは、種々の方法で使用することができる。例えば、スクリーニングは、疾患を有することが今まで分かっていない人において、疾患が存在するかどうかを確認することができる。評価は、疾患と診断された人を調べて疾患の進行を経時的にモニターし、療法の有効性を研究し、または予後を判断することができる。一実施形態では、予後は、患者が疾患で死亡する可能性、または特定の持続時間または特定の時間の後に疾患が進行する可能性として表すことができる。検出は、「スクリーニング」を意味することができ、または疾患の示唆的な特徴（例えば、症状または他の陽性試験）を有する人が疾患を有するかどうかを確認することを意味することができる。
【００２４】
ゲノム遺伝子座（マーカー）についての「型」は、組織型全体の遺伝子座について特定の属性に対応する。所与の型の遺伝子座は、組織型全体にわたるメチル化レベルに特定の統計的変動を有することができる。ゲノム遺伝子座（マーカー）についての「カテゴリー」は、同じ組織型についての異なる個体にわたる遺伝子座についてのメチル化レベルの特定の変動に対応する。１セットのゲノム遺伝子座（マーカー）は、様々な型および／またはカテゴリーの任意の数の遺伝子座から構成することができる。したがって、遺伝子座のセットは特定の測定のために選択された遺伝子座に対応し、そのセットにおける遺伝子座の任意の特定の特性を暗示するものではない。本明細書は主にＩ型遺伝子座およびＩＩ型遺伝子座に関する。ゲノム部位のセットは、特定の組織型についての特定のメチル化シグネチャを有さなくてもよく、例えば、特定の組織型において唯一または優勢にメチル化されなくてもよい。このようなセットはＩＩ型部位と呼ばれる。これらのゲノム部位は、特定の徴候を有するゲノム部位と組み合わせて使用することができ、Ｉ型部位と呼ばれる。
【００２５】
「臓器関連サンプル」は、例えば、尿、唾液、胸水、血液、および便サンプル中に生じ得るような、特定の臓器によって生成され（例えば、腎臓によって生成された尿）、または特定の臓器を通過する（例えば、膀胱を通過する尿）サンプルを指すことができる。サンプルは無細胞ＤＮＡを含み、無細胞ＤＮＡと細胞ＤＮＡの混合物であり得る。
【００２６】
尿路上皮（または尿上皮）は、「移行上皮」の一例である。腎盂、尿管、膀胱、尿道の一部など、尿路の大部分を覆う上皮型である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
尿無細胞（ｃｆ）ＤＮＡ、ならびに他の臓器関連サンプルは、便サンプルのように、液体生検の完全に非侵襲的な形態、または他の非侵襲的な生検として大きな可能性を持つ。原発組織によるｃｆＤＮＡの組成の知見は、その臨床用途を導くのに有用である。しかしながら、そのようなサンプルの組成は非常に変わりやすく、それによって生検として使用するための広い適用性を制限する。例えば、任意の特定の臓器からの経腎臓ＤＮＡの量は、サンプルごとに大きく異なり、それによって腎臓からの無細胞ＤＮＡの割合も同様に変動させる。
【００２８】
ＣｐＧ部位のメチル化はエピジェネティック調節およびメチル化シグネチャの重要な形態であり、異なる組織（１９、２０）および細胞型（２１）について同定することができる。異なる組織からの血漿ｃｆＤＮＡの寄与比率は、全ゲノムバイサルファイトシークエンシングおよびシークエンシングデータのデコンボリューション解析を用いて、確認できることを近年実証した（２２）。
【００２９】
本開示は、異なる組織からの尿中ｃｆＤＮＡの寄与比率を推定するために、メチル化デコンボリューションを使用することによって尿中ｃｆＤＮＡの組成を分析し、それは組織特異的メチル化パターン（参照パターンとも呼ばれる）を使用する。そのような分析は、罹患組織型、例えば癌性尿路上皮細胞のメチル化パターンの使用を含み得る。そのようなデコンボリューションを使用した技術は、関連する疾患のレベルを決定することができる。結果は、メチル化デコンボリューションを使用した膀胱癌患者からの尿中ｃｆＤＮＡの分析が、膀胱腫瘍に由来するｃｆＤＮＡ割合の増加を同定することを示す。
【００３０】
断片サイズ、腫瘍関連コピー数、およびメチル化レベルの他の変化もまた分析される。例えば、排泄尿のサイズプロファイルを使用して、対象が膀胱癌を有するかどうかを同定する。さらに、腎盂からの尿のサイズプロファイルは、腎臓が炎症を起こしているかどうかを同定するために使用される。
【００３１】
さらに、例えば、その全体が参照として組み込まれる米国特許第８，７４１，８１１号に記載されているように、コピー数異常は血液を使用して癌を検出するために使用することができる。しかしながら、血液は多くの臓器由来の組織を含み、それによって多くの臓器に関連しているので、どの臓器に腫瘍があるのかが分からない場合がある。尿、またはより少ない臓器由来の組織を通常は有する他のサンプルを分析できるが、コピー数異常を有する経腎臓ＤＮＡは依然として様々な臓器由来であり得る。したがって、腫瘍を有する特定の臓器を同定することは困難であり得る。これに対処する１つの方法は、臓器関連サンプル（例えば、唾液、胸水、尿、または便サンプル）および血液サンプルからの無細胞ＤＮＡのコピー数分析が癌のレベルの別個の判定を得る、本明細書に記載の技術と関連する。血液サンプルが癌を示さず、排尿サンプルが示すのであれば、癌は、排尿サンプルに関連する臓器に由来するもの、例えば尿に対する膀胱癌と同定することができる。
【００３２】
Ｉ．病変組織参照パターンを用いたデコンボリューション
サンプル（例えば、血液および尿）は複数の組織型を含むことができ、各サンプルは無細胞ＤＮＡの異なる割合に寄与する。異なるタイプの組織のＤＮＡは典型的には異なるメチル化パターンを有するので、特定のサンプルにおいて測定されたメチル化レベルを使用して、サンプル中の複数の組織型それぞれの寄与度を決定することができる。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１６／００１７４１９号に記載されているように、デコンボリューションのプロセスは、組織特異的メチル化パターンを使用して寄与度を決定することができる。
【００３３】
寄与度の変化を使用して異常を検出することができる。しかしながら、特定のサンプルが、例えば尿中の寄与度において高い変動性を有する場合、問題が起こり得る。いくつかの実施形態は、臓器の健康な組織から決定されるメチル化パターンを使用するのとは対照的に、病変組織と特異的に対応する組織特異的メチル化パターンを使用することによってこの問題に対処することができる。最初に、サンプルとしての尿に関する問題、およびデコンボリューションに関する詳細について説明する。
【００３４】
Ａ．サンプルとしての尿
造血細胞は、一貫して、比較的安定した濃度で存在する血漿ｃｆＤＮＡに対する優勢な寄与体であるが（２２、２７）、尿中ｃｆＤＮＡの量と組成は非常に変動しやすい。例えば、ｃｆＤＮＡに対する腎臓の寄与は、臨床的に安定している腎移植患者において、４．２〜９４％、または１０４〜３，９７０ＧＥ／ｍｌ尿の範囲で変動し得る。この組成変動の度合によって、尿中の総ｃｆＤＮＡ濃度の変動（移植患者からの２２５〜２５，７１０ＧＥ／ｍｌ尿）が悪化し、単一の供給源からのｃｆＤＮＡを高感度検出することのみを目的とするアッセイが、なぜ検出できないレベルのサンプルに遭遇することがあるのか、を説明し得る。これは、恒常性平衡に維持されている血漿の内容物間の違いを際立たせるが、排泄尿の内容物は、泌尿器系を一回一方向に通過した後の恒常性要件の排出性副産物である。様々な水和状態は総ｃｆＤＮＡ濃度に影響を及ぼし得ると考えられるが、希釈効果は各組織からの寄与比率の変動を説明することができない。
【００３５】
尿中ｃｆＤＮＡの調査は、尿中ｃｆＤＮＡ断片の大部分が短く（＜１００ｂｐ）、主要な分泌性ＤＮＡ加水分解酵素であるＤＮａｓｅＩが、腎臓および膀胱で高発現され（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎａｔｌａｓ．ｏｒｇ／）、尿中に存在し（Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．１９８４）、高活性（Ｎａｄａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９３）である、という事実によってさらに複雑になる。各組織供給源からの検出可能なｃｆＤＮＡ量の変動は、由来組織による尿中ｃｆＤＮＡの組成、および尿路を下るにつれｃｆＤＮＡが受け得る変化も深く理解することを必要とする。
【００３６】
したがって、尿中のｃｆＤＮＡの組成を決定する際の課題は、尿中ｃｆＤＮＡは、血漿中のそれ（尿中では約５０塩基および血漿中では１５０塩基）よりも短いという事実にあり、それが尿路を通過するように尿ＤＮＡは絶えず分解されている。さらに、尿からの無細胞ＤＮＡの抽出は、ＤＮａｓｅＩの存在により血漿からの抽出よりも困難である。したがって、メチル化デコンボリューションがそのようなかなり短い断片に有効であることは明らかではない。
【００３７】
血球、腎臓、および尿路上皮は、尿中へのｃｆＤＮＡの腎前性、腎性、および腎後性放出について、それぞれ主要原因として関与しているという仮説を立てた。血漿中ｃｆＤＮＡの８０％前後は造血細胞（２７）に由来し、相当量の血漿ｃｆＤＮＡを尿中に腎臓を介して濾過することができる場合、これらのＤＮＡ断片は、造血細胞の特徴を持つ可能性が高い。しかしながら、様々な組織からの経腎臓ＤＮＡの組成は尿中で変動する。
【００３８】
全ゲノムバイサルファイトシークエンシングを用いて尿中ｃｆＤＮＡ組成について全体的な調査を行った。ＤＮＡ断片をワトソン鎖とクリック鎖にマッピングした。サンプルあたり１レーンを使用して、ゲノム全体のＣｐＧ部位において平均シークエンシング深度２．４２で、中央値８０００万の一意的にマッピング可能な非重複リードを得た。組織特異的メチル化シグネチャおよびメチル化デコンボリューションを使用して、各組織からの寄与比率を推定した。
【００３９】
尿中の無細胞ＤＮＡおよび細胞ＤＮＡの寄与比率を決定することが可能であることを実証している。メチル化デコンボリューションから導き出された寄与比率は、造血幹細胞および腎移植レシピエントの尿中の同種移植片由来ドナー特異的遺伝的マーカーを用いて計算されたものと高度に相関している。異なる組織からの寄与比率に大きな変動を見出した。腎盂から得られた尿からのｃｆＤＮＡは、排泄尿と比較してより高い割合の長い断片を有する。インビボ分解を模倣するための３７°Ｃでの尿中ｃｆＤＮＡのインビトロ培養は、尿中ｃｆＤＮＡの絶対濃度が３．５〜４．９時間の半減期で減少することを明らかにした。インビボ分解にもかかわらず、腎移植患者および骨髄移植患者の排泄尿を用いた検証は、メチル化デコンボリューションとドナー特異的ＳＮＰとの間の寄与比率において高い相関を示した。
【００４０】
無細胞尿および尿沈渣からのＤＮＡメチル化は、尿路を構成する組織を含む異なる正常組織および病理学的組織からの参照メチロームと比較される。膀胱癌患者からの尿中ｃｆＤＮＡのメチル化デコンボリューションは、癌からの寄与比率の増加を同定した。そのような尿中ｃｆＤＮＡはまた、サイズプロファイル、コピー数、ならびに全体的な低メチル化および／または高メチル化において異常を示した。
【００４１】
尿中ｃｆＤＮＡのこの全体的な調査によって、組成、分解、および尿路におけるｃｆＤＮＡの変動に関する理解が深まり、分子診断ツールとしての全ゲノム尿中ｃｆＤＮＡシークエンシングの使用のための基礎を築いた。
【００４２】
Ｂ．メチル化デコンボリューション
メチル化デコンボリューションの原理は、生物からのＤＮＡ混合物の組成を決定するための単一のメチル化ゲノム部位（メチル化マーカー）を用いて説明することができる。生物は、哺乳動物またはヒトを含む動物であり得る。組織Ａがゲノム部位に対して完全にメチル化されている、すなわち１００％のメチル化密度（ＭＤ）であり、組織Ｂが完全にメチル化されていない、すなわち０％のＭＤであると仮定する。この例では、メチル化密度は、ＣｐＧジヌクレオチドが目的の領域でメチル化されているという状況で、シトシン残基の割合を指す。
【００４３】
ＤＮＡ混合物Ｃが組織Ａおよび組織Ｂで構成され、ＤＮＡ混合物Ｃの全体的なメチル化密度が６０％である場合、以下の式に従ってＤＮＡ混合物Ｃに対する組織Ａおよび組織Ｂの寄与比率を推定することができる。
ＭＤＣ＝ＭＤＡ×ａ＋ＭＤＢ×ｂ、
式中、ＭＤＡ、ＭＤＢ、ＭＤＣはそれぞれ組織Ａ、組織ＢおよびＤＮＡ混合物ＣのＭＤを表し、ａおよびｂは、ＤＮＡ混合物Ｃに対する組織ＡおよびＢの寄与比率である。この特定の例では、組織ＡおよびＢがＤＮＡ混合物の唯一の２つの構成要素であると仮定されている。したがって、ａ＋ｂ＝１００％である。したがって、組織Ａおよび組織ＢはそれぞれＤＮＡ混合物に６０％および４０％寄与すると計算される。
【００４４】
組織Ａおよび組織Ｂにおけるメチル化の密度は、生物のサンプルから、または同一タイプ（潜在的な同一亜集団、例えば、他のヒト）の他の生物由来のサンプルから得ることができる。他の生物由来のサンプルを使用する場合、組織Ａのサンプルのメチル化密度の統計分析（例えば平均、中央値、幾何平均）を使用してメチル化密度ＭＤＡを得ることができ、ＭＤＢについても同様である。
【００４５】
ゲノム部位は、最小の個体間変動、例えば、変動の特定の絶対量未満を有するように、または試験したゲノム部位の最も低い部分内にあるように選択することができる。例えば、最も低い部分については、実施形態は、試験したゲノム部位群の中で最も低い１０％の変動を有するゲノム部位のみを選択することができる。他の生物は、健康な人、特定の生理的状態を有する人（妊娠中の女性、年齢の違う人、特定の性別の人など）から得ることができ、現在試験中の生物を含む特定の亜集団に対応し得る。
【００４６】
亜集団の他の生物はまた、他の病態（例えば、肝炎や糖尿病患者など）を有してもよい。そのような亜集団は、様々な組織について組織特異的メチル化パターンを変えた可能性がある。そのような病状下の組織のメチル化パターンは、正常組織のメチル化パターンを使用することに加えて、デコンボリューション分析に使用することができる。このデコンボリューション分析は、そのような亜集団からの生物をそれらの条件で試験する場合に、より正確であり得る。例えば、硬変性肝臓または線維性腎臓は、それぞれ正常な肝臓および正常な腎臓と比較して異なるメチル化パターンを有し得る。したがって、肝硬変の患者が他の疾患についてスクリーニングされた場合、血漿ＤＮＡにＤＮＡを寄与する候補の１つとして、他の組織型の健康な組織と共に硬変性肝臓を含めることがより正確であり得る。
【００４７】
より多くのゲノム部位（例えば、１０以上）を使用して、より潜在的な候補組織がある場合に、ＤＮＡ混合物の構成を決定することができる。ＤＮＡ混合物の組成比率の推定の正確さは、ゲノム部位の数、特定の組織に対するゲノム部位（「部位」とも呼ばれる）の特異性、および参照組織特異的レベルを決定するために使用される、異なる候補組織にわたる部位および異なる個体にわたる部位の多様性を含む多くの要因に依存する。組織に対する部位の特異性は、特定の組織型と他の組織型との間のゲノム部位のメチル化密度の差を指す。
【００４８】
それらのメチル化密度間で差が大きくなるほど、特定の組織への特定の部位はより多くなる。例えば、ある部位が肝臓内で完全にメチル化され（メチル化密度＝１００％）、他の全ての組織内で完全に非メチル化される（メチル化密度＝０％）場合、この部位は肝臓に対して非常に特異的である。一方、異なる組織にわたる部位の変動性は、例えば、異なるタイプの組織における部位のメチル化密度の範囲または標準偏差に反映され得るが、これらに限定されるものではない。より広い範囲またはより高い標準偏差は、数学的に、ＤＮＡ混合物に対する異なる臓器の相対寄与をより正確かつ精密に判定することを可能にする。ＤＮＡ混合物に対する候補組織の寄与比率を推定する精度に関するこれらの要因の影響は、本出願の後節で説明される。
【００４９】
ここでは、数学の方程式を使用してＤＮＡ混合物への異なる臓器の寄与比率の演繹を説明する。ＤＮＡ混合物中の異なる部位のメチル化密度と、異なる組織中の対応する部位のメチル化密度との間の数学的関係を以下のように表すことができる。
【数１】
2020503003.tif 000002
式中、
【数２】
2020503003.tif 000003
は、ＤＮＡ混合物中の部位ｉのメチル化密度を表し，ｐｋは、ＤＮＡ混合物に対する組織ｋの寄与比率を表し、ＭＤｉｋは、組織ｋ内の部位ｉのメチル化密度を表す。部位の数が臓器の数と同じかそれより多い場合、個々のｐｋ値を決定することができる。組織特異的メチル化密度は他の個体から得ることができ、部位は上述のように最小の個体間変動を有するように選択することができる。
【００５０】
追加の基準は、精度を向上させるためのアルゴリズムに含めることができる。例えば、全ての組織の集合した寄与は１００％になるように制限され得る。すなわち、
Σｋｐｋ＝１００％
さらに、全ての臓器の寄与は非負である必要があり得る。
【数３】
2020503003.tif 000004
【００５１】
生物学的変化により、観察された全体的なメチル化パターンは、組織のメチル化から推定されるメチル化パターンと完全に同一でなくてもよい。そのような状況では、個々の組織の最も可能性の高い寄与比率を決定するために数学的分析が必要とされる。これに関して、ＤＮＡにおいて観察されたメチル化パターンと組織から推定されたメチル化パターンとの間の差は、Ｗで示される。
【数４】
2020503003.tif 000005
式中、ＯはＤＮＡ混合物について観察されたメチル化パターンであり、Ｍｋは個々の組織ｋのメチル化パターンであり、ｐｋはＤＮＡ混合物に対する組織ｋの寄与比率である。各ｐｋの最もありそうな値は、観察されたメチル化パターンと推定されたメチル化パターンとの間の差であるＷを最小化することによって決定することができる。この方程式は、数学的アルゴリズムを用いて、例えば、二次計画法、線形／非線形回帰、期待値最大化（ＥＭ）アルゴリズム、最尤推定アルゴリズム、最大事後確率推定、および最小二乗法を用いて解くことができるが、これらに限定されるものではない。
【００５２】
Ｃ．尿中ｃｆＤＮＡ組織マッピングのためのメチル化可変領域の同定
公に利用可能なメチロームおよびに異なる組織から得られた正常サンプルおよび病理学的サンプルの全ゲノムのバイサルファイトシークエンシングに基づいて、参照メチロームを組み立てることができる。サンプル組織は、腎皮質、腎髄質、尿管、膀胱尿路上皮、膀胱筋、前立腺（内腔、中枢、および末梢）、ならびに精嚢を含むがこれらに限定されない組織に由来し得る。サンプルの組織および細胞組成は手術中に得られ、肉眼的解剖によって確認され得る。
【００５３】
これらの組織を区別できるメチル化シグネチャを同定するために、血球（好中球、Ｔ細胞、およびＢ細胞）、腎臓、ならびに尿路上皮のメチロームを特徴付けることを目的とした。血液細胞に関する公的に入手可能な全ゲノムバイサルファイトシークエンシングデータ（Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ、ｗｗｗ．ｇｅｎｂｏｒｅｅ．ｏｒｇ／ｅｐｉｇｅｎｏｍｅａｔｌａｓ／ｉｎｄｅｘ．ｒｈｔｍｌ、（２８））を利用して、腎移植または泌尿器科手術を受けた患者からの腎臓または尿路上皮組織を得て、３５〜４０倍のカバレッジで全ゲノムバイサルファイトシークエンシングを実行した。
【００５４】
多数のＣｐＧ部位にわたって類似のメチル化密度を有する組織を一緒にグループ化することができ、有益なメチル化可変領域（ＤＭＲ）を同定することができる。腎臓、尿路上皮、好中球、Ｂ細胞、およびＴ細胞を用いて、１９４１８個のＤＭＲがメチル化マーカーとしての使用のために同定された。これは、１つの組織においてＤＭＲにおけるメチル化密度が他の４つの組織と比較して有意に異なる（Ｚスコア＞３）３５４９のＩ型マーカー、およびメチル化密度が異なる組織にわたって変動を示す１５，８６９のＩＩ型マーカーを含む。
【００５５】
図１は、好中球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、腎臓および尿路上皮における１９，４１８個のメチル化可変領域（ＤＭＲ）でのメチル化密度を示すヒートマップである。各垂直線はＤＭＲを表し、高メチル化密度から低メチル化密度は赤（例えば区画１０２）から黄色（例えば区画１０４）で表される。階層的クラスタリングは、血球中のこれらのＤＭＲにおけるメチル化パターンが腎臓および尿路上皮のそれらとは大きく異なることを示す。
【００５６】
前述のようにメチル化デコンボリューションアルゴリズムを使用して、尿中ｃｆＤＮＡをバイサルファイト処理後に配列決定し、ＤＭＲのｃｆＤＮＡ断片中で観察されたメチル化パターンを、５つの参照組織におけるメチル化シグネチャと比較した。（２２）。次に、好中球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、腎臓、および尿路上皮の寄与比率を推測した。図１は、血球、腎臓、および尿路上皮が正常な尿中ｃｆＤＮＡの組成中にあることを示す。
【００５７】
４１×２ペアエンドバイサルファイトシークエンシングを使用して、一意的にマッピング可能なリード２９．９Ｍの中央値に、合計４６膀胱癌症例および３９の対照を配列決定した。膀胱癌症例は、非侵襲性超低悪性度（Ｔａ  ＰＵＮＬＭＰ）からＴ４高悪性度の疾患まで多岐にわたった。全ての対照はｕｒｉｓｔｉｘに血液または肉眼的血尿のいずれかを有していた。８人の対照は日常的な臨床ケアの一環として、ｕｒｉｓｔｉｘに持続する血液または肉眼的血尿に対して柔軟な膀胱鏡検査を受け、悪性腫瘍について陰性であることが確認された。１５人の対照を使用して、ベースラインレベルのメチル化およびコピー数を確立した。残りの２４人の対照を試験群で使用した。
【００５８】
図２は、膀胱腫瘍、Ｂ細胞、尿路上皮、腎臓、好中球、およびＴ細胞における２７，３７１個のメチル化可変領域（ＤＭＲ）のメチル化密度を示すヒートマップである。各垂直線は、メチル化密度に基づくＤＭＲカラーコードを表す。図２のＤＭＲは、図１のＤＭＲとはわずかに異なる。垂直線はメチル化レベルによって順序付けられている。常染色体のＤＭＲのみが含まれる。低メチル化は赤色に着色され（例えばセクション２０２）、高メチル化は黄色に着色されている（例えばセクション２０４）。これらのＤＭＲはメチル化デコンボリューションに使用され、各尿サンプル中の膀胱腫瘍に起因する尿中ｃｆＤＮＡの比率を同定する。膀胱腫瘍組織を一倍体ゲノムの８．５倍カバレッジに配列決定して、メチル化デコンボリューションのためのＤＭＲを同定した。図２は、膀胱腫瘍ＤＮＡが検出され得ることを示す。異常なメチロームを有する任意の組織は、他の生理学的病態または病理学的病態において検出され得る。
【００５９】
手術前後の尿サンプルによって証明されるように、全ゲノムバイサルファイトシークエンシングを使用して膀胱癌患者を長期的にモニターすることができる。
【００６０】
Ｄ．造血幹細胞および腎移植患者におけるメチル化デコンボリューションならびにドナー特異的遺伝子型を用いた検証
腎移植患者およびＨＳＣＴ患者からのそれぞれ２６および５尿サンプルについて、全ゲノムバイサルファイトシークエンシングを行った。ゲノム全体にわたる１９，４１８個のＤＭＲのメチル化密度により、腎臓、尿路上皮、Ｂ細胞、Ｔ細胞、および好中球に由来するＤＮＡの割合を決定することができた。ドナー特異的ＳＮＰにより、各尿サンプル中の腎臓および血球由来のＤＮＡ断片の割合を同定することができ、メチル化デコンボリューションの精度をドナー特異的ＳＮＰにより決定されたゴールドスタンダードと比較した。メチル化デコンボリューションからの血球の寄与比率は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、および好中球の合計であった。
【００６１】
ＨＳＣＴおよび腎移植患者のためのＩｌｌｕｍｉｎａ  ＯＭＮＩ  ２Ｍ  ＳＮＰアレイを使用して、ドナーおよびレシピエントの生殖細胞系列遺伝子型情報を確認した。バイサルファイトシークエンシングのために３１個の尿サンプルを採取した。各サンプルについて平均８０００万の一意的にマッピングされたリードを得て、ドナーおよびレシピエント特異的ＳＮＰを有する断片の同定が、ドナー組織からのｃｆＤＮＡ断片の割合の正確な計算を可能にした。
【００６２】
図３は、本発明の実施形態による、ＨＳＣＴ（三角）および腎移植（丸点）患者からの３１個の尿サンプル中の血球および腎臓由来のｃｆＤＮＡの寄与比率を示す。ｘ軸はドナー特異的ＳＮＰから計算されたドナー臓器からの寄与度を示し、ｙ軸はメチル化デコンボリューションによって推定されたものとしてのドナー臓器の寄与度を表示する。メチル化デコンボリューションによって決定されたドナー組織の寄与比率ならびにドナーおよびレシピエント特異的遺伝子型を使用して決定された比率は、高度に相関していた（Ｒ２＝０．９７）。
【００６３】
これらの結果は、メチル化デコンボリューションの能力を実証し、良好なダイナミックレンジにわたって尿中ｃｆＤＮＡに異なる組織の寄与比率を決定した。ドナー特異的ＳＮＰを用いて、尿中ｃｆＤＮＡに対するドナー造血細胞の寄与の割合は６〜７８％の範囲で変動し、ドナー腎臓の寄与の割合は１〜９４％の範囲で変動した。３１個の移植尿サンプルについての全尿中ｃｆＤＮＡメチル化デコンボリューションの結果を表１に列挙する。
【表１】
2020503003.tif 000006
【００６４】
これらの結果は、血液細胞、腎臓、および尿路上皮の寄与が異なるサンプル間で非常に変動しやすいことを示した。いくつかのサンプルでは、異なる日に得られれた同じ個体からの尿サンプル中の特定の組織からの寄与比率に大きな変動があった（例えばＴ４５およびＴ８６）。これらの組織のそれぞれの寄与比率は０％程度に低くすることができ、血球、腎臓、および尿路上皮についてそれぞれ９３％、１００％、および６４％まで上昇できる。３１個の尿サンプルにわたって、血球、腎臓、および尿路上皮についてのメチル化デコンボリューションを使用して測定された寄与比率の中央値および四分位範囲は、それぞれ５２％（０〜８４％）、３２％（７〜１００％）、および５％（０〜１２％）であった。
【００６５】
Ｅ．メチル化デコンボリューションを用いた癌の判定
このセクションでは、尿路上皮および膀胱腫瘍ＤＮＡのメチロームを用いて、尿中ｃｆＤＮＡのメチルデコンボリューションを説明する。デコンボリューションは、異なる組織からのＤＮＡの絶対量のばらつきを説明することができる。しかし、上記のように、尿中の異なる組織の寄与には高い変動性がある。したがって、１つのソースからの寄与が低いまたは高い場合、それは必ずしも異常ではない。
【００６６】
図４Ａ〜４Ｃは、正常尿路上皮細胞（図４Ａ）、単一の組織特異的メチル化パターンとしての尿路上皮細胞および膀胱癌細胞（図４Ｂ）、および別々の組織特異的メチル化パターンとしての尿路上皮細胞および膀胱癌細胞（図４Ｃ）を含む、異なる組織特異的メチル化パターン（参照パターンとも呼ばれる）を使用して定義された割合についての、膀胱癌症例および無癌対照に対するメチル化デコンボリューションのプロットを示す。メチル化デコンボリューションから導き出された寄与比率は、ｙ軸上に表示される。
【００６７】
１．参照としての正常尿路上皮の使用
膀胱癌の大部分は、尿路上皮細胞から生じる移行上皮癌である。しかしながら、膀胱腫瘍由来のＤＮＡのメチル化は、正常な尿路上皮に類似しているか、または大きく異なりかつ明瞭なメチル化パターンを示し得る。膀胱腫瘍が細胞回転を増加させ、正常尿路上皮に似たｃｆＤＮＡ断片を放出する可能性があるという理由で、膀胱癌患者からの尿中ｃｆＤＮＡへの尿路上皮の寄与比率を、無癌対照と比較して調べた。
【００６８】
図４Ａは、組織特異的メチル化パターンが、メチル化デコンボリューションにおける腎臓、正常尿路上皮、Ｂ細胞、Ｔ細胞、および好中球を含む場合の正常尿路上皮の寄与度を示す。非癌症例および膀胱癌症例における正常尿路上皮の寄与度は変動し、大きく重複しており、２つの群間に有意差はない（マン・ホイットニーＵ検定ｐ＝０．１５）。したがって、メチル化デコンボリューションは、膀胱癌患者と無腫瘍対照との間で尿路上皮の寄与に有意差がないことを見出した。これは、膀胱癌患者の尿中の正常尿路上皮に似たｃｆＤＮＡの顕著な増加がないことを示唆している。
【００６９】
２．正常と癌の間で共通のメチル化を持つ部位の使用
膀胱癌は、悪性の変化を受けた尿路上皮細胞から発生すると考えられているので、膀胱腫瘍のメチロームと正常尿路上皮との間の類似点と相違点を同定するために、膀胱腫瘍サンプルを８．５倍カバレッジに配列決定した。膀胱腫瘍と正常尿路上皮との間でメチル化密度が類似している（＜１０％の差）７２０１のＤＭＲを同定した。その後、腎臓、Ｂ細胞、Ｔ細胞、および好中球と共に、尿路上皮に関するこの定義を用いてメチル化デコンボリューションを行った。
【００７０】
図４Ｂは、本発明の実施形態による、組織特異的メチル化パターンが、膀胱癌において保存された、腎臓、Ｂ細胞、Ｔ細胞、好中球、および尿路上皮マーカーを含む場合の尿路上皮の寄与度を示す。正常尿路上皮および膀胱癌において保存されていたＤＭＲによって定義される尿路上皮の寄与は、非癌（０〜６７％）および膀胱癌患者（１３〜８６％）において非常に変動しやすい。正常尿路上皮および膀胱癌において保存されていたメチル化マーカーを用いて、対照と比較して膀胱癌対象からの尿路上皮の寄与が増加した（マン・ホイットニーＵ検定Ｐ＝０．００３）。対照と比較して、膀胱癌対象からの尿路上皮寄与の中央値は４．５倍増加した。対照の中央値は１０．３４であり、膀胱癌患者の中央値は４８．９であった。
【００７１】
３．別の参照としての腫瘍尿路上皮の使用
最後に、好中球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、腎臓、および正常尿路上皮と共に、別個の参照パターンとして膀胱腫瘍メチロームを含んだ。したがって、正常および腫瘍尿路上皮は別々の組織として扱われる。腫瘍尿路上皮は生検腫瘍に基づいて決定された。腫瘍参照パターンは、１つまたは複数のそのような生検腫瘍に基づいて決定することができる。複数の生検を使用する場合、腫瘍参照パターンは、生検の全部または特定の割合（例えば、５０％超）で発生するＤＭＲに限定され得る。異なる腫瘍生検もまた、異なる参照パターンを有する別個の組織とみなすことができ、それによって腫瘍細胞の特定の群の分類が可能になる。６つの細胞／組織にわたってＤＭＲを同定し、同定されたＤＭＲをメチル化デコンボリューションにおいて使用した。
【００７２】
図４Ｃは、本発明の実施形態による、組織特異的メチル化パターンが、腎臓、尿路上皮、Ｂ細胞、Ｔ細胞、好中球、および膀胱癌を含む場合の膀胱腫瘍細胞の寄与度を示す。本発明者らは、膀胱癌を有する症例では膀胱腫瘍寄与の中央値が１４倍増加したが、非癌対照では膀胱腫瘍寄与が非常に低レベルであることを見出した。非癌症例は非常に低い膀胱腫瘍寄与（０〜１１％）を有するが、膀胱癌症例は最大８４％の高い膀胱腫瘍寄与を有する。マン・ホイットニーＵ検定は、２つの群の間に有意差があることを示した（ｐ＝０．０００２）。対照についての寄与の中央値は４．１３であり、膀胱癌対象についての寄与の中央値は５７．４５である。
【００７３】
したがって、約２０のカットオフ値は、癌のレベルの正確な分類を提供する。２０に近い他の値でも同様の感度と特異性が得られる。他の疾患または癌については、特定のカットオフ値は異なってもよい。
【００７４】
正常な対照に対比した膀胱癌患者の尿中の膀胱腫瘍の寄与度の間の有意差は、膀胱腫瘍寄与を使用して非癌対照から膀胱癌患者を区別できることを示唆する。膀胱癌メチロームは１つの膀胱腫瘍からのＤＮＡに基づいて決定されたので、これは異なる患者からの膀胱癌ＤＮＡにおいて共有されるメチル化パターンがあることを示唆する。
【００７５】
根治的膀胱切除術を受ける筋肉侵襲性膀胱癌２症例について、小腸の一部を使用して、膀胱の代わりに導尿および貯蔵のための回腸導管または新生膀胱を形成した。小腸が尿と直接接触しているので、膀胱腫瘍寄与の減少および小腸寄与の増加を検出することができるかどうかを確かめるために、術前および術後の尿サンプルにおいて膀胱腫瘍および小腸でメチル化デコンボリューションを行った。両方の術後膀胱癌サンプルは、正常対照によって観察されたレベルに対して膀胱腫瘍寄与の著しい減少を示した（表２）。術後のサンプルでは、好中球ならびに小腸からの寄与も有意に増加した。
【表２】
2020503003.tif 000007
【００７６】
手術前後の結果を比較すると、膀胱腫瘍からの寄与が減少し、小腸および好中球からの寄与が上昇する。好中球の増加は手術直後に予想される。したがって、５人の膀胱癌患者からの術前サンプルにおいて、実施形態では、膀胱腫瘍細胞から尿中へのｃｆＤＮＡ寄与の有意な増加を検出するためにメチル化デコンボリューションを使用することができたが、癌症例と正常対照との間の正常尿路上皮寄与に有意差はなかった。これは、膀胱腫瘍メチロームが正常尿路上皮細胞のそれとは大きく異なること、および実施形態が単一の膀胱腫瘍参照メチロームを使用して異なる膀胱癌患者からの尿中ｃｆＤＮＡにおける腫瘍寄与の増大を同定できることを示唆する。今回の結果は、代表的な膀胱癌メチロームを参照として使用して、寄与の増加を検出できることを示す。
【００７７】
疾患の検出およびモニタリングのための「液体生検」として使用される尿中ｃｆＤＮＡについて、尿中ｃｆＤＮＡの起源、およびそれが尿路内で受ける変化を理解することは有用である。ここでは、尿中ｃｆＤＮＡの全ゲノムバイサルファイトシークエンシングが、異なる組織に特徴的なメチル化シグネチャの認識を可能にし、すなわち組織型による尿中ｃｆＤＮＡの組成の全体的な調査を可能にすることを実証する。以前の研究は一般に単一供給源からの尿中ｃｆＤＮＡの同定に集中していたが、尿サンプル中のｃｆＤＮＡの全体的な調査が各組織型の寄与比率を示し、異なる尿サンプル中の異なる組織寄与の同時比較を可能にする。ｃｆＤＮＡの由来を検出するためのメチル化シグネチャの使用は、遺伝的変異に基づく方法に関して利点を有し、それはドナー特異的対立遺伝子、または各患者に特有であり得る腫瘍特異的体細胞変異について予備知識を必要とする。
【００７８】
Ｆ．病変組織を参照として用いて疾患を判定する方法
図５は、本発明の実施形態による、罹患組織型の組織特異的メチル化パターンを使用して生物の生物学的サンプルを分析する方法５００を示すフローチャートである。生物学的サンプルは、第１の組織型を含む、複数の組織型由来の無細胞ＤＮＡ分子の混合物を含む。方法５００を使用して、特定の臓器における疾患のレベルを決定でき、例えば、その臓器の病変細胞に対応する組織特異的メチル化パターンがデコンボリューションに使用される。方法５００は、コンピュータシステムを使用して実行することができる。
【００７９】
ブロック５１０において、Ｎが整数である、Ｎ個のゲノム部位は分析のために同定される。Ｎ個のゲノム部位は、例えば、Ｉ型およびＩＩ型のゲノム部位を説明するセクションＩＩに詳細に記載されるように、種々の属性を有し得る。例として、Ｎ個のゲノム部位は、Ｉ型もしくはＩＩ型部位のみ、または両方の組み合わせを含むことができる。ゲノム部位は、１つ以上の他のサンプルの分析に基づいて、例えば、様々な個体において測定されたメチル化レベルについてのデータベースから得られたデータに基づいて、同定され得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１０個のＮ個のゲノム部位がＩＩ型である。Ｎ個のゲノム部位はまた、Ｉ型部位（例えば、少なくとも１０個）を含み得る。
【００８０】
ゲノム遺伝子座のこれらのメチル化特性は、１つのサンプルまたはサンプルのセットについて測定することができる。サンプルのセットは、試験される本生物を含む生物の亜集団、例えば本生物と共有される特定の形質を有する亜集団のためのものであり得る。これらの他のサンプルは参照組織と呼ぶことができ、異なる参照組織は異なるサンプルから使用することができる。
【００８１】
ブロック５２０において、Ｎ個の組織特異的メチル化レベルは、Ｍ個の組織型のそれぞれに対するＮ個のゲノム部位で得られる。ＮはＭ以上であるので、デコンボリューションにおいて組織特異的メチル化レベルを使用して、分数百分率を決定することができる。組織特異的メチル化レベルは、Ｎ×Ｍ寸法のマトリックスＡを形成することができる。マトリックスＡの各列は、特定の組織型についてのメチル化パターンに対応することができ、パターンはＮ個のゲノム部位におけるメチル化レベルである。
【００８２】
臓器の特定の疾患の検出のために、Ｍ個の組織型の１つは、第１の臓器の第１の疾患に対応する第１の罹患組織型に対応することができる。Ｍ個の組織型のうちの第２の組織型は、第１の臓器の健康な組織に対応し得る。様々な実施形態において、組織特異的メチル化パターンは、公開データベース（複数可）または以前の研究から検索することができる。これらの組織特異的メチル化パターンを使用して、デコンボリューション分析で使用されるＮ個のゲノム部位を同定することができる。
【００８３】
ブロック５３０において、Ｍ個の組織型からの無細胞ＤＮＡ分子の混合物を含む生物学的サンプルを受ける。生物学的サンプルは、様々な方法で患者の生物から得ることができる。そのようなサンプルを得る様式は、非侵襲的または侵襲的であり得る。非侵襲的に得られたサンプルの例は、ある種の体液（例えば、血漿または血清または尿）または便を含む。例えば、血漿および尿は、複数の臓器組織由来の無細胞ＤＮＡ分子を含み、したがって１つのサンプルを介して複数の臓器を分析するのに有用である。
【００８４】
いくつかの例では、生物学的サンプルは、細胞ＤＮＡを含んでもよい。例えば、尿サンプルでは、生物学的サンプルは尿沈渣由来の細胞ＤＮＡを含んでもよい。細胞ＤＮＡは一般に無細胞ＤＮＡよりも長く、超音波処理などの断片化プロセスを使用して、ショートリードシークエンシングのためのより短い断片を産生することができる。
【００８５】
ブロック５４０において、生物学的サンプルからの無細胞ＤＮＡ分子を分析して生物に対応する参照ゲノムにおけるそれらの位置を同定する。例えば、無細胞ＤＮＡ分子を配列決定してシークエンスリードを得ることができ、シークエンスリードを参照ゲノムにマッピング（整列）させることができる。生物がヒトの場合、参照ゲノムは、潜在的には特定の亜集団からの参照ヒトゲノムである。別の例として、無細胞ＤＮＡ分子は、（例えば、ＰＣＲまたは他の増幅後に）異なるプローブを用いて分析することができ、各プローブは異なるゲノム部位に対応する。いくつかの実施形態では、無細胞ＤＮＡ分子の分析は、無細胞ＤＮＡ分子に対応するシークエンスリードまたは他の実験データを受け取り、次いで実験データを分析することによって実施され得る。
【００８６】
Ｍ個の組織型からの寄与度を決定するための正確なデコンボリューションを提供するように、無細胞ＤＮＡ分子の統計的に有意な数を分析することができる。いくつかの実施形態において、少なくとも１，０００個の無細胞ＤＮＡ分子が分析される。他の実施形態では、少なくとも１０，０００または５０，０００または１００，０００または５００，０００または１，０００，０００または５，０００，０００以上の無細胞ＤＮＡ分子を分析することができる。分析する分子の総数は、ＭおよびＮ、ならびに目的の精度（正確さ）に依存し得る。
【００８７】
ブロック５５０において、Ｎ個の混合物メチル化レベルは、各参照ゲノムのＮ個のゲノム部位のいずれかに位置する無細胞ＤＮＡ分子の第一の群（セット）を使用してＮ個のゲノム部位で測定される。Ｎ個の混合物メチル化レベルは、生物学的サンプルの混合物中のメチル化レベルを指す。例として、混合物からの無細胞ＤＮＡ分子がＮ個のゲノム部位の１つに位置する場合、その部位におけるその分子のメチル化指数はその部位の全体的なメチル化密度に含まれ得る。Ｎ個の混合物メチル化レベルは、Ｎ個の長さのメチル化ベクトルｂを形成することができ、ｂは観察された値に対応し、そこから組織型の寄与度が決定され得る。
【００８８】
一実施形態では、ＤＮＡ混合物中のゲノム部位についてのメチル化レベルは、全ゲノムバイサルファイトシークエンシングを用いて決定することができる。他の実施形態において、ゲノム部位のメチル化レベルは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０システムなどのメチル化マイクロアレイ分析を用いて、またはメチル化免疫沈降を用いること（例えば、抗メチルシトシン抗体を用いること）もしくはメチル化結合タンパク質による処理に続いてマイクロアレイ分析もしくはＤＮＡシークエンシングによって、またはメチル化感受性制限酵素処理に続いてマイクロアレイ分析もしくはＤＮＡシークエンシングによって、またはメチル化認識シークエンシングを用いること、例えば、単一分子シークエンシング法を用いることによって（例えば、ナノポアシークエンシング（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ２０１３；１１０：１８９１０−１８９１５）によって、またはＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ単一分子リアルタイム分析（Ｆｌｕｓｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ２０１０；７：４６１−４６５）によって）、決定することができる。組織特異的メチル化レベルは、同じ方法で測定することができる。他の例として、標的化バイサルファイトシークエンシング、メチル化特異的ＰＣＲ、非バイサルファイトベースのメチル化認識シークエンシング（例えば、単一分子シークエンシングプラットフォームによる（Ｐｏｗｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｎｄ  ａｃｃｕｒａｔｅ  ｗｈｏｌｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｙｌｏｍｅ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｅ．ｃｏｌｉ，ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０１３；１４：６７５）は、血漿ＤＮＡメチル化デコンボリューション分析のための血漿ＤＮＡのメチル化レベルの分析に使用することができる。したがって、メチル化認識シークエンシングの結果は、種々の方法で得ることができる。
【００８９】
ブロック５６０において、混合物中の第１の罹患組織型の寄与度は、Ｍ個の組織型それぞれのＮ個の第１のメチル化レベルおよびＮ個の組織特異的メチル化レベルを使用して決定される。いくつかの実施形態では、組成ベクトルのＭ値を決定することができる。各Ｍ値は、ＤＮＡ混合物に対するＭ個の組織型のうちの特定の組織型の寄与度に対応する。Ｎ×Ｍの組織特異的メチル化レベルを考えると、組成ベクトルのＭ値を解いてＮ個の混合物メチル化レベル（例えば、メチル化ベクトルｂ）を得ることができる。当業者によって理解されるように、Ｍ個の寄与度は、様々な方法（例えば、行列因数分解および／または行列反転、または最適化プロセスによる）で解くことができる、Ａｘ＝ｂを解くことによって決定されるベクトルｘに対応し得る。ＮがＭよりも大きいとき、解決策は、例えば最小二乗法を使用して、エラーの最小化を伴うことができる。
【００９０】
組成ベクトルを使用して、混合物中のＭ個の組織型のそれぞれの量を決定することができる。組成ベクトルのＭ値は、Ｍ個の組織型の寄与度として直接とらえてもよい。いくつかの実装形態では、Ｍ値はパーセントに変換することができる。誤差項を使用して、Ｍ値をより高い値またはより低い値にシフトできる。組成ベクトルの値はそれぞれ成分とみなすことができ、特定の成分は特定の組織型に対応し得る。
【００９１】
ブロック５７０において、第１の罹患組織型の寄与度を使用して、生物における第１の臓器についての第１の疾患のレベルを決定する。寄与度はカットオフ値（閾値）と比較することができる。例えば、図４Ｃでは、カットオフ値は２０であり得る。カットオフ値は、その組織型について健康である生物、およびその組織型について罹患している生物からのサンプルを用いて決定することができる。サンプルは、第１の疾患を有するか否かに加えて、様々なレベルの第１の疾患を有することができる。当業者は、既知のレベルの第１の疾患を有するサンプルから測定されたデータに基づいて所望のカットオフ値を決定する方法を理解するであろう。
【００９２】
第１の臓器の例としては、腎臓（例えば、尿がサンプルである場合）、膀胱（例えば、尿がサンプルである場合）、肝臓（例えば、血漿または血清がサンプルである場合）、または唾液腺（例えば、唾液がサンプルである場合）であり得る。第１の疾患の例は、癌、第１の臓器が腎臓である場合の糸球体腎炎、または第１の臓器が腎臓である場合のネフローゼ症候群であり得る。
【００９３】
いくつかの実施形態では、参照パターンは、潜在的に同じ臓器または異なる臓器から、複数の病変組織のために使用することができる。このようにして、複数の疾患タイプを同時に測定することができる。
【００９４】
いくつかの実施形態では、寄与度を使用して、カットオフ値と比較することができる指数値を決定することができる。寄与度は特定の範囲に制限され、寄与の合計は１００％になる。したがって、寄与が増加すると、他が犠牲になる。指標値はより広い範囲を有することができ、他の組織型の寄与に依存しない。指数値は、膀胱腫瘍ＧＥ指数と呼ばれる、尿１ミリリットル当たりの総ｃｆＤＮＡゲノム当量（ＧＥ）を乗じた寄与度であってもよい。
【００９５】
図６Ａに示すように、６人の症例および６人の対照は、ＧＥ／ｍｌで測定した場合に尿中の全無細胞ＤＮＡ濃度に統計的差異を示さなかった。図６Ｂに示すように、膀胱腫瘍組織の決定寄与度に総ＧＥ／ｍｌ（膀胱腫瘍ＧＥ指数）を乗じて指数値を計算すると、指数値は対照と比較して膀胱癌症例において有意に高かった。
【００９６】
いくつかの実施形態では、寄与度を使用して、新しい指数値を計算するためのＣＮＡおよび／または尿中で同定された低メチル化の数および振幅を調整することができる。
【００９７】
ＩＩ．尿中ＣＦＤＮＡのサイズ
ｃｆＤＮＡ断片の長さは、全ゲノム配列解析を使用して、単一塩基対の分解能に確認することができる。具体的には、尿中ｃｆＤＮＡの長さは、ペアエンド超並列シークエンシングを用いて一塩基対の分解能で決定し、異なる断片長での頻度のサイズプロファイルプロットで可視化することができる。尿中ｃｆＤＮＡ断片の大部分は比較的短い。正常対照の排泄尿において、中央値のｃｆＤＮＡ断片長は６５〜８０ｂｐである。サイズプロファイル分析における異なる長さでのｃｆＤＮＡ断片の頻度の可視化は、＜１００ｂｐのｃｆＤＮＡ断片において明確な１０ｂｐの周期性を明らかにし、ピークの頻度はトラフの頻度の最大３倍である。
【００９８】
以下に説明するように、腎盂からの対をなすサンプルからのデータおよび排泄尿は、上部尿路において長いｃｆＤＮＡ断片の割合が大きいことを示す。インビトロ培養実験は、ｃｆＤＮＡが一次速度論の下で尿路において分解されることを示唆する。これは、長い断片の割合の減少および５０〜８０ｂｐの範囲における１０ｂｐの周期性の強調によってサイズプロファイルに反映されている。尿中ｃｆＤＮＡで観察された１０ｂｐの周期性は、血漿と比較して尿中のより大きな振幅ではあるが（３６、３７）、血漿中で見られるものを連想させる。この分解プロセスは全体的なメチル化密度に影響を及ぼし、メチル化デコンボリューションの結果にも変動を引き起こすが、移植患者の排泄尿中に観察される高度の相関は、メチル化デコンボリューションプロセスがインビボ分解にもかかわらずロバストであることを示唆する。
【００９９】
Ａ．ＨＳＣＴおよび腎移植患者における尿中ｃｆＤＮＡのサイズ
以前の研究では、胎児由来の尿中ｃｆＤＮＡ断片は、母性由来の断片（Ｔｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏｓ  Ｏｎｅ２０１２）よりも短いことを示した。ここでは、特に同種移植片由来のｃｆＤＮＡがレシピエント由来の断片と比較して異なるサイズプロファイルになる場合、移植尿中ｃｆＤＮＡ断片のサイズを調べる。
【０１００】
図７Ａおよび７Ｂは、本発明の実施形態による、代表的なＨＳＣＴ患者（図７Ａ）および腎移植患者（図７Ｂ）からのレシピエントおよびドナーＤＮＡの尿中ｃｆＤＮＡサイズプロファイルを示す。Ｘ軸は一塩基対の分解能でサイズを表示し、軸線は各長さでの頻度を示す。ドナーおよびレシピエントのサイズプロファイルは、それぞれ青と赤で表示される。
【０１０１】
３１人のＨＳＣＴおよび腎移植患者からの尿サンプルは、特に５０〜８０ｂｐの範囲で、８１ｂｐの長さの中央値および１０の倍数である長さで異なる１０ｂｐの周期で、同様のパターンを示す。ＨＳＣＴ患者（図７Ａ）および腎移植患者（図７Ｂ）からのドナーおよびレシピエント特異的サイズプロファイルの分離後、レシピエント組織と比較してドナーの造血および腎臓組織由来の尿中ｃｆＤＮＡのサイズ間に観察可能な差はなかった。したがって、同種造血細胞および腎臓由来のドナー特異的ｃｆＤＮＡのサイズプロファイルは、レシピエント由来のｃｆＤＮＡのサイズプロファイルとほぼ同一である。
【０１０２】
これは、造血組織および腎臓組織から放出されたｃｆＤＮＡがレシピエント組織と同程度のサイズのものであり、または尿路の分解環境が一定期間後に異なる組織から放出されたｃｆＤＮＡに共通のサイズプロファイルを担わせることを示す。造血系由来および胎児由来の両方のｃｆＤＮＡは血漿の腎臓濾過を介して尿に寄与するが、尿路中の造血細胞はｃｆＤＮＡを直接尿中に寄与することがあり、したがってそれらサイズプロファイル間の差を説明することができる。
【０１０３】
Ｂ．腎盂と排泄尿中の尿中ｃｆＤＮＡのサイズと組成
血漿ｃｆＤＮＡのサイズと組成は、循環中に均衡を達成するように見え、末梢血の繰り返しサンプリングとほぼ一貫したままである。これとは対照的に、尿は腎臓で産生され、尿管を通って一方向に膀胱へと下降し、そこで排尿される前に蓄えられる。
【０１０４】
ＤＮａｓｅＩが腎臓および膀胱（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎａｔｌａｓ．ｏｒｇ／）で高発現して存在し、（２９）尿中で高活性するため（３０）、ｃｆＤＮＡ断片が排泄尿と比較して腎盂でのサイズが異なるものか調べた。右側尿路系の完全な閉塞を引き起こし、腎盂から直接尿を排出させる経皮的腎瘻造設術（尿が形成される腎盂への管）の挿入を必要とする、２ｃｍの尿管結石に罹患した患者から尿サンプルを得た。左側腎臓は、尿路を介して排泄された正常な尿を産生した。石は右側の完全な閉塞を引き起こした。右腎臓の腎盂と排泄尿から同時に２つの機会で尿を採取したところ、腎盂からの尿には長い断片の割合が多いことが分かった。２番目の機会は炎症が腎盂で減少した後だった。
【０１０５】
図８Ａおよび８Ｂは、本発明の実施形態による、石のために遮断された右腎の腎盂からのｃｆＤＮＡ、および左腎からの排泄尿のサイズプロファイルを示す。尿中ｃｆＤＮＡのサイズプロファイルは、３７日違いの２機会に腎盂および排泄尿からの対をなすサンプルからのものである。図８Ａは、経皮的腎結石摘出術（ＰＣＮ）挿入の５日後に採取された腎盂尿および排泄尿を表す。図８Ｂは、患者が回復した後、ＰＣＮ挿入の４２日後に採取された尿サンプルを表す。Ｘ軸は一塩基対の解像度でサイズを表示し、Ｙ軸は特定の長さで一意にマッピング可能な断片の頻度を示す。線８０２および８０６は、左腎によって産生された排泄尿を表す。線８０４および８０８は、同時に採取された右腎盂からの尿を表す。
【０１０６】
両方の機会に、排泄尿と比べて腎盂尿中の長い尿中ｃｆＤＮＡ断片の割合がより大きく、５０〜８０ｂｐの範囲で周期性の振幅の減少がある。さらに、最初のサンプル（図８Ａ）の尿中ｃｆＤＮＡ断片の平均長は、後のサンプル（図８Ｂ）の尿中ｃｆＤＮＡ断片の平均長よりも長く、これは右腎において炎症が減少した後に生じた。
【０１０７】
腎盂尿および排泄尿についてのメチル化デコンボリューションの結果は、排泄尿と比較して腎盂尿中で寄与比率がより高く、４つ全ての尿サンプル中で好中球由来の有意な寄与があることを示す。好中球のメチル化シグネチャを有するｃｆＤＮＡ断片は、血漿由来の腎前性由来のものか、または腎盂内の白血球凝集由来のもののいずれかであり得る。排泄尿と比較して腎盂尿中のＣｐＧ部位にわたってより高い全体的なメチル化密度も存在する。
【表３】
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【０１０８】
表３には、腎盂尿および排泄尿のｃｆＤＮＡについて、ＣｐＧ部位でのメチル化デコンボリューションおよび全体的なメチル化密度による各組織からの寄与比率を示す。ＡおよびＢは、図８Ａおよび図８Ｂに表示されている対をなす右腎盂尿サンプルおよび排泄尿サンプルに対応する。
【０１０９】
Ｃ．腎盂からの尿中ｃｆＤＮＡのサイズプロファイルの経時変化
尿路の異なる部分から尿をサンプリングすることによって、腎盂で長いｃｆＤＮＡ断片の割合が大きいことが分かった。尿が尿路を下降するにつれて、ｃｆＤＮＡの絶対濃度が減少し、５０〜８０ｂｐの間で最も顕著である特徴的な１０塩基対（ｂｐ）周期性を有するより短い断片の割合が増加する。
【０１１０】
１．経時的に培養した腎盂尿
腎盂尿および排泄尿間で観察された差異の一部は、ｃｆＤＮＡのインビボ分解に起因し得る。第１の機会（図８Ａ）で腎盂尿および排泄尿の差を観察した後、第２の採取（図８Ｂ）のために、より多くの量の腎盂尿を採取し、追加の尿を密封容器に入れ、３７℃で培養した。腎盂尿のインビトロ培養は、尿路における尿のインビボ通過および膀胱における貯蔵を模倣する。尿を容器から取り出し、３時間、６時間、および２４時間培養で処理した。
【０１１１】
図９Ａおよび９Ｂは、３７℃で０、３、および６時間のインビトロ培養した腎盂からの尿由来のｃｆＤＮＡのサイズプロファイルである。図９Ａは、各塩基対長における周波数を表示し、図９Ｂは、累積頻度を表示する。線９０２および９０８は採取時のｃｆＤＮＡのサイズプロファイルを表す。線９０４および９１０は、３時間の培養後のサイズプロファイルを表す。線９０６および９１２は、６時間の培養後のサイズプロファイルを表す。これらのグラフは、１０ｂｐ周期性の振幅の増加およびインビトロ培養による長いｃｆＤＮＡ断片の割合の減少を示す。見て分かるように、３時間および６時間の培養後、これらのサンプルのサイズプロファイルは、長い断片の割合の漸進的な減少および５０〜８０ｂｐの領域における１０ｂｐ周期性の振幅の増加を示した。腎盂由来の尿からのｃｆＤＮＡのこのインビトロ培養は、尿路との接触がない場合でさえ、３７℃での培養がｃｆＤＮＡの濃度の減少、短いｃｆＤＮＡのより大きい割合、および１０ｂｐ周期性の増加を引き起こすことを示す。腎盂尿のサイズプロファイルは、３７℃で３〜６時間培養した後の排泄尿のサイズプロファイルに似ている。
【０１１２】
図１０Ａおよび１０Ｂは、（ａ）３時間および（ｂ）６時間培養した腎盂尿のサイズプロファイルと比較した、排泄尿のサイズプロファイルを示す。線１００２は、３時間培養した腎盂尿を表す。線１００４および１００８は排泄尿を表す。線１００６は、６時間培養した腎盂尿を表す。見られるように、排泄尿のサイズプロファイルは、３時間および６時間培養した腎盂のサイズプロファイルと非常に類似している。これらのデータは、尿が腎盂から尿路へとインビボ通過の間に、ｃｆＤＮＡの濃度を減少させてｃｆＤＮＡ断片の長さを短くする分解プロセスがある可能性を示す。
【０１１３】
２．異なるサイズパラメータの相互関係
単一尿サンプル由来の尿中ｃｆＤＮＡ断片の長さ、すなわち尿中ｃｆＤＮＡの分解の程度は、中央値長、７０ｂｐより長い断片の割合（Ｐ＞７０と標識）、および断片化（周期性）指標などのいくつかの定量的尺度を用いて、特徴付けることができる。７０ｂｐより長い断片の割合（Ｐ＞７０ｂｐ）は、７０ｂｐより長い断片の数を断片の総数で割ってパーセントとして表すことで決定することができる。
【０１１４】
１０ｂｐの周期性が最大で５０〜８０ｂｐとの間に顕著であり、周期性の振幅は、５０、６０、および７０ｂｐのピーク長と、５５、６５、７５ｂｐのトラフ長との間の周波数の差で表すことができる。これは周期性指数（ＰＩ）として表すことができる。周期性指数は、サイズプロファイル中の複数のトラフ長でのＤＮＡ断片の頻度からの、サイズプロファイル中の複数のピーク長でのＤＮＡ断片の頻度の差を表し得る。複数のピーク長は、一定のサイズ間隔で存在してもよい。複数のトラフ長は、複数のピーク長からオフセットされた一定のサイズ間隔で存在してもよい。例えば、一定のサイズ間隔は１０ｂｐであってもよいが、トラフ長はピーク長と５ｂｐだけずれて（または位相のずれ）いてもよい。周期性指数の一例は、以下のように計算することができる。
ＰＩ＝（Ｆ（５０）＋Ｆ（６０）＋Ｆ（７０））−（Ｆ（５５）＋Ｆ（６５）＋Ｆ（７５））
式中、Ｆ５０、Ｆ６０、Ｆ７０、Ｆ５５、Ｆ６５、およびＦ７５は、その特定の長さにおけるｃｆＤＮＡ断片の頻度を表す。高い周期性指数は、トラフと比較したピークにおけるｃｆＤＮＡ断片間の頻度の大きな差、つまりより大きい周期性の振幅を表す。図１０Ａおよび図１０Ｂに示すように、１０ｂｐの周期性が５０〜８０ｂｐの間で最も顕著であり、周期性の振幅は、５０、６０、および７０ｂｐのピーク長の頻度の合計と、５５、６５、および７５ｂｐのトラフ長の合計との差によって表すことができる。
【０１１５】
図１１Ａおよび１１Ｂは、３１個のＨＳＣＴ尿サンプルおよび腎移植尿サンプルについてのｃｆＤＮＡ断片のサイズパラメータ間の関係を示すグラフである。パラメータは、中央値（ｂｐ）、比率＞７０ｂｐ（Ｐ＞７０）、および周期性指数（ＰＩ）である。図１１Ａは、中央値長とＰ＞７０との間に強い正の相関があることを示している。図１１Ｂは、中央値とＰＩとの間に、したがってＰ＞７０ｂｐの場合にも負の（逆）相関があることを示している。この後者の観察は、ｃｆＤＮＡ断片の長さおよび周期性が関連しており、各サンプルの分解の程度を表すという概念を補強する。
【０１１６】
サイズプロファイルで見られる培養した腎盂尿中に見られる変化は、中央値の減少、Ｐ＞７０ｂｐの減少、およびＰＩ（表４）の増加によって反映される。腎盂尿の中央値、Ｐ＞７０ｂｐおよびＰＩは、３〜６時間の培養後に対をなす排泄尿のそれと非常に同等になる。
【表４】
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【０１１７】
表４は、３７℃でインビトロ培養中の腎盂由来の尿中ｃｆＤＮＡおよび対をなす排泄尿について、塩基対（ｂｐ）の中央値、７０ｂｐ超の断片割合（Ｐ＞７０）、および周期性指数（ＰＩ）の形態における要約サイズ統計を示す。腎盂尿、排泄尿、および３７℃で３時間および６時間インビトロで培養した腎盂尿の比較は、腎盂尿が排泄尿と比較して高い中央値、Ｐ＞７０、および低いＦＩを有することを示す。腎盂尿は、より短い断片の割合が増加するように３７℃に保たれ、より顕著な周期性が５０〜７５ｂｐのピークとトラフ間により大きな差として見られる場合に、分解される。腎盂由来の尿がインビトロ培養中に断片化されたので、中央値、Ｐ＞７０において漸進的な減少、およびＰＩの増加があった。
【０１１８】
インビトロ培養の結果は、一般的に、排泄尿中に観察されるサイズプロファイルを説明し、ｃｆＤＮＡ断片の断片化が尿路で発生したという証拠を提供する。これは、尿中ｃｆＤＮＡのサイズおよび濃度が、ｉ）採尿部位、およびｉｉ）尿が体内にあった期間の影響を受け得ることを知らせる。
【０１１９】
３．メチル化および経時的組成
興味深いことに、全体的なＣｐＧ部位のメチル化密度は排泄尿と比べて腎盂尿でより高く、腎盂は３７℃で培養されるので、全体的なＣｐＧ部位のメチル化密度の漸進的な減少がある。インビトロ培養中の尿中ｃｆＤＮＡの絶対濃度、断片サイズ、および全体的なＣｐＧ部位メチル化密度の変化を考慮して、これらの因子がメチル化デコンボリューションに影響を与えるかどうかを評価した。腎盂における尿中ｃｆＤＮＡのメチル化デコンボリューションによる全体的なメチル化密度および異なる組織による寄与比率は、３７℃でのインビトロ培養中に変動するが、血球、腎臓、および尿路上皮由来の寄与比率はランク付けに関して一定のままである。（表５）
【表５】
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【０１２０】
表５は、３７℃でインビトロ培養中のｃｆＤＮＡについて、ＣｐＧ部位でのメチル化デコンボリューションおよび全体的なメチル化密度による各組織からの寄与比率を示す。全体的なメチル化密度は、６時間で７４．１％〜６８．９％に減少し、メチル化デコンボリューション寄与に変動があった。しかしながら、血球（好中球、Ｔ細胞、およびＢ細胞）、腎臓、および尿路上皮からの寄与比率は、ランク付けに関して一定のままである。
【０１２１】
インビトロ培養中の腎盂尿についてのメチル化デコンボリューションの結果は、血球（好中球）が、異なる組織由来の寄与度のわずかな変動を伴う、０時間、３時間、６時間時点で優勢な寄与体であることを示した。対をなす排泄尿のメチル化デコンボリューション結果はまた、腎盂尿サンプルと比較して、尿路上皮由来のわずかに高い寄与を伴う優勢な好中球寄与を示した。より高い尿路上皮の寄与は、尿が尿路のより長い範囲から尿路上皮ｃｆＤＮＡを獲得することを反映し得る。
【０１２２】
Ｄ．尿中ｃｆＤＮＡ濃度の経時変化
腎盂内の尿中ｃｆＤＮＡ断片のサイズプロファイルが高割合の長い断片を有していたので、３７℃での腎盂尿のインビトロ培養の効果を調べた。腎盂尿を、ＰＣＮを介して採取し、ｑＰＣＲによる絶対ｃｆＤＮＡ濃度、および各時点からのサイズプロファイルを確かめるために異なる時点で一定分量を得ながら、３７℃に保った。
【０１２３】
腎盂尿ｃｆＤＮＡの濃度を６２ｂｐのＬＥＰ遺伝子領域についてｑＰＣＲを用いて定量化し、定量化は時間ゼロ、およびそれぞれの培養時点で行われた。経時的に総ＤＮＡ濃度の減少があり、初期期間中により大きな減少を伴う（図１２Ａ）。指数関数的減衰曲線が当てはまる場合、尿中ｃｆＤＮＡは４．９時間の半減期および７．０時間の平均寿命を有すると推定される。
【０１２４】
次いで、３７℃に維持された場合に、腎盂尿において観察された分解および断片化パターンも、対照の排泄尿中に見出すことができるかどうかを評価した。その日の２回目の排泄尿から約２００ｍｌの尿を採取し、その尿をインビトロで、３７℃で１２時間まで培養した。正常対照におけるｃｆＤＮＡの濃度は変動しやすい。ここでは、最も高いｃｆＤＮＡ濃度を持つ対照の尿サンプルの尿培養の結果を示す。排泄尿中のｃｆＤＮＡの濃度は腎盂尿と同様に経時的に減少し、指数関数的な減衰曲線は０．９２のＲ２に当てはめることができ、３．５時間の推定半減期および５．１時間の平均寿命を伴う（図１２Ｂ）。
【０１２５】
したがって、インビトロ培養中のｃｆＤＮＡ断片の短縮はまた、ｑＰＣＲによって定量化した場合のｃｆＤＮＡ濃度の低下に経時的に反映される。（図１２Ａ）正常な対象の排泄尿のインビトロ培養で同様の指数関数的減少のパターンが観察され（図１２Ｂ）、これはｃｆＤＮＡが３．５〜４．９時間の半減期で時間依存的に断片化されることを示唆する。
【０１２６】
図１２Ａおよび１２Ｂは、腎盂からの尿（図１２Ａ）および排泄尿（図１２Ｂ）について３７℃でインビトロ培養実験中の尿中ｃｆＤＮＡの濃度を示す。ｘ軸は、対数スケールで表示された尿中のｃｆＤＮＡの濃度ＧＥ／ｍｌであり、ｙ軸は、時間での培養時間である。ｃｆＤＮＡは、腎盂尿および排泄尿の両方において一次反応速度下で３．５〜４．９時間の半減期で分解されるようである。分解速度は個体によって異なってもよい。
【０１２７】
Ｅ．排泄尿中ｃｆＤＮＡの経時的なサイズ変化
排泄尿のサイズ変化を経時的に調べた。非バイサルファイトシークエンシングのために適切なＤＮＡを３時間間隔で収集した。驚くべきことに、０〜１２時間のｃｆＤＮＡの連続的なサイズプロファイルは静的なままであり、排泄尿のサイズプロファイルの典型的なものである。対照対象からの排泄ｃｆＤＮＡのサイズプロファイルが、３７℃で最長１２時間までの培養中一定のままであるという事実は、安定したサイズプロファイルが一定の時点以降維持されることを示す。この安定したサイズプロファイルは、排泄尿サンプルに最も一般的に見られるパターンである。
【０１２８】
図１３Ａ〜１３Ｄ。０〜１２時間、３７℃でのインビトロ培養による排泄尿ｃｆＤＮＡのサイズプロファイル。尿を培養容器から等分し、３時間間隔で処理した。図１３Ａ〜図１３Ｄは、ｑＰＣＲによって測定した場合のｃｆＤＮＡ濃度の同時低下を示す。図１３Ａは、０時間および３時間でのサイズプロファイルを示す。図１３Ｂは、３時間および６時間でのサイズプロファイルを示す。図１３Ｃは、６時間および９時間でのサイズプロファイルを示す。図１３Ｄは、９時間および１２時間でのサイズプロファイルを示す。図１２ＢのｃｆＤＮＡ濃度に見られる指数関数的減衰にもかかわらず、これらの尿サンプルのサイズプロファイルは、１２時間の培養にわたって一定のままである。
【０１２９】
したがって、腎盂尿の培養における並列サイズプロファイルは、長い断片の割合および１０ｂｐ周期の強調の減少を示す。（図９Ａ）しかしながら、排泄尿の培養の並列サイズプロファイルは、典型的な排泄尿サイズプロファイル（図１３Ａ〜１３Ｄ）が安定した終点を表すように見えることを示す。この時点以降、異なる長さのｃｆＤＮＡ断片は同様の速度で分解され、総ｃｆＤＮＡの継続的な減少にもかかわらずサイズプロファイルは一定のままである。
【０１３０】
Ｆ．長い断片から炎症を決定する方法
イメージングは腎臓結石を同定できることもあるが、例えば、ＭＲＩまたはＣＴスキャンなどのイメージングから腎臓の炎症レベルを決定することは困難である。
【０１３１】
図１４は、本発明の実施形態による、生物の腎臓の腎盂からの尿サンプルを分析して臓器損傷の程度（例えば炎症レベル）を決定する方法１４００のフローチャートである。尿サンプル中の少なくとも一部のＤＮＡは無細胞である。方法１４００は、本明細書に記載の他の特定の方法と同様に、全体または部分的にコンピュータシステムを用いて実行することができる。
【０１３２】
方法１４００は、サイズ分布を使用して炎症のレベル（病態のレベルの一例）を決定することができる。血漿ＤＮＡのサイズ分布は、例えば、リアルタイムＰＣＲ、電気泳動、および質量分析を使用して決定され得るが、これらに限定されない。様々な実施形態において、測定サイズは、長さ、分子量、または電気泳動図における移動度および電気泳動もしくは質量分析計において一定距離を移動するのに必要な時間などの長さもしくは質量に比例する測定パラメータである。別の例では、結合した染料の量がＤＮＡ分子の長さに比例するであろう挿入蛍光染料、例えば臭化エチジウムまたはＳＹＢＲグリーンでＤＮＡを染色することができる。サンプルに紫外線が照射されたときに放出される蛍光の強度によって結合した染料の量を決定することができる。
【０１３３】
ブロック１４１０において、様々なサイズに対応するＤＮＡ断片の量を測定する。複数のサイズの各サイズについて、そのサイズに対応する尿サンプルから複数のＤＮＡ断片の量を測定することができる。例えば、１４０塩基の長さを有するＤＮＡ断片の数を測定することができる。量はヒストグラムとして保存されてもよい。一実施形態では、生物学的サンプルからの複数の核酸の各サイズが測定され、それは個々の基準で（例えば、単一分子シークエンシングまたはペアエンドシークエンシングおよび参照に対するアライメントによって）、または群ベース（例：電気泳動によって）で行われ得る。サイズは範囲に対応し得る。したがって、ある量は、特定の範囲内のサイズを有するＤＮＡ断片についてのものであり得る。
【０１３４】
複数のＤＮＡ断片は、ランダムに選択することができる。例えば、ＤＮＡ断片はランダムに配列決定されてもよい。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ断片から生じる一対のシークエンスリードを対象に対応するゲノム（例えば、参照ヒトゲノム）に整列させて、ＤＮＡ断片の長さを決定することができる。様々な実施形態において、サイズは、質量、長さ、または他の適切なサイズの尺度であり得る。本明細書に記載するように、測定は様々な方法で実施することができる。例えば、ＤＮＡ断片のペアエンドシークエンシングおよびアラインメントを実施してもよく、または電気泳動を使用してもよい。統計的に有意な数のＤＮＡ断片を測定して、生物学的サンプルの正確なサイズプロファイルを得ることができる。統計的に有意な数のＤＮＡ断片の例には、１０万、１００万、２００万、または他の適切な値を超えるものが含まれ、それは必要な精度に依存し得る。
【０１３５】
一実施形態では、そのようなペアエンドシークエンシングまたは電気泳動などの物理的測定から得られたデータをコンピュータで受信し分析して、ＤＮＡ断片のサイズの測定を達成することができる。例えば、ペアエンドシークエンシングからのシークエンスリードを分析して（例えば、アライメントにより）サイズを決定することができる。別の例として、電気泳動から生じる電気泳動図を分析してサイズを決定することができる。一実施態様では、ＤＮＡ断片の分析は、ＤＮＡ断片を配列決定する、または電気泳動に供する実際のプロセスを含む一方、他の実施態様は、得られたデータの分析を単に実行することができる。
【０１３６】
ブロック１４２０において、第１のパラメータの第１の値は、複数のサイズでのＤＮＡ断片の量に基づいて計算される。一態様では、第１のパラメータは、生物学的サンプル中のＤＮＡ断片のサイズプロファイル（例えばヒストグラム）の統計的尺度を提供する。パラメータは、複数のＤＮＡ断片のサイズから決定されるので、サイズパラメータと呼ぶことができる。一実施形態では、第１のパラメータはＤＮＡ断片サイズの増加と共に増加する。
【０１３７】
第１のパラメータは、様々な形態のものであることができる。そのようなパラメータは、ヒストグラム（特定サイズの断片の絶対数または相対数を提供する任意のデータ構造）から得ることができる、断片の総数で割った特定サイズのＤＮＡ断片の数である。別の例として、パラメータは、特定のサイズまたは特定の範囲内の断片数を別のサイズまたは範囲の断片数で割ったものであり得る。分割は、異なるサンプルについて分析されている異なる数のＤＮＡ断片を説明するための正規化として作用することができる。正規化は、各サンプルについて同数のＤＮＡ断片を分析することによって達成することができ、それは分析された断片の総数で割ることと同じ結果を効果的に提供する。パラメータの他の例は、参照によりその全体が組み込まれる米国特許出願公開第２０１３／０２３７４３１号に記載されている。
【０１３８】
ブロック１４３０において、第１の値を基準値と比較する。基準値の例には、正常値、および正常値からの特定の距離であるカットオフ値（例えば、標準偏差の単位で）が含まれる。基準値は、同じ生物からの異なるサンプルから決定されてもよい（例えば、その生物が健康であると分かった場合）。したがって、生物が炎症を有していないと推定される場合に、基準値はサンプルから決定された第１のパラメータの値に対応してもよい。一実施形態では、生物学的サンプルは治療後に生物から得られ、基準値は治療前に得られたサンプルから決定された第１のパラメータの値に対応する。基準値はまた、他の健康な生物のサンプルから決定されてもよい。
【０１３９】
ブロック１４４０において、腎臓における炎症のレベルの分類は、その比較に基づいて決定される。様々な実施形態において、分類は、数値的、テキスト的、または他の任意の指標であり得る。分類は、炎症、確率、または他のスコアに関して、イエスまたはノーの二元的結果を提供することができ、それは、例えば以前に生物の過去の分類に対する絶対値または相対値であり得る。一実施態様では、分類は、腎臓に炎症がないこと、または炎症レベルが低下したことである。他の実施形態では、分類は、腎臓が炎症を起こしていること、または炎症のレベルが上がっていることである。一実施形態では、第１の値が基準値を超える場合に、第１の腎臓が炎症を起こしていると判定することができる。
【０１４０】
本明細書に記載されるように、炎症のレベルは炎症の存在を含むことができる。例えば、第１の値が超えているかどうか（例えば、第１のパラメータが定義される方法に応じて大きいか小さいか）、または炎症が存在するかどうか、または少なくとも尤度（例えば尤度率）を決定することができる。閾値を超える範囲は、可能性の増加をもたらし、複数の閾値の使用をもたらすことができる。さらに、上記の程度は炎症の異なるレベルに対応できる。したがって、実施形態は、腎臓における炎症のレベルの進行を診断、病期分類、予測、またはモニターすることができる。
【０１４１】
腎臓における炎症のレベルに基づいて、治療計画を立ててもよい。炎症は、薬物、食事療法、療法、または手術によって治療することができる。場合によっては、炎症の存在が早期に検出され得るので、本明細書に記載の方法を用いない場合よりも炎症は早く治療され得る。検出方法の結果として、死亡を含む合併症の危険性が低減され得る。
【０１４２】
ＩＩＩ．尿中ｃｆＤＮＡサイズを用いた膀胱癌の検出
癌から放出されたｃｆＤＮＡは、非癌細胞から放出されたｃｆＤＮＡと比較して異なる長さであることが実証された（３１、３２）。下部尿路腫瘍からの大量のｃｆＤＮＡの放出が、排泄尿の全体的なサイズプロファイルを乱すのに十分な異なるサイズのｃｆＤＮＡ断片に寄与する可能性があるという理由で、２症例の筋肉浸潤性膀胱癌を選択した。これらのサンプルのサイズおよびメチル化パターンを評価する全ゲノムのバイサルファイトシークエンシングのために根治的膀胱摘出術を受けているこれらの２人の患者についての手術前後の尿サンプルを採取した。結果は、膀胱癌症例が、長い断片のより大きい割合を有する尿中ｃｆＤＮＡを有することを示す。
【０１４３】
Ａ．分析
図１５Ａおよび１５Ｂは、２例の筋肉浸潤性膀胱癌からの術前および術後の尿サンプルのサイズプロファイルを示す。術前サンプルは線１５０２および１５０６で表される。術後サンプルは線１５０４および１５０８で表される。両方の術前サンプルは、より大きな割合の長い断片を有する異常なサイズプロファイルを示し、サイズプロファイルは術後サンプルにおいて正常である。これは、図１５Ａの術前サンプル：中央値１３１ｂｐ、Ｐ＞７０  ９０．１％、ＰＩ０．１０、図１５Ｂの術前サンプル：中央値１４３ｂｐ、Ｐ＞７０  ９６．２％、ＰＩ０．０４、図１５Ａの術後サンプル：中央値８０ｂｐ、Ｐ＞７０  ６０．０％、ＰＩ１．６、および図１５Ｂの術後サンプル：中央値９３ｂｐ、Ｐ＞７０  ７２．７％、ＰＩ１．６１で、要約サイズ統計にも反映されている。
【０１４４】
Ｐ＞７０の他に、長いｃｆＤＮＡ断片＞１００ｂｐまたは他の長さの割合を使用することができる。図１５Ａおよび１５Ｂは、サイズパラメータを用いて、癌を有するサンプル（術前）と癌を有さないサンプル（術後）とを識別し得ることを示す。
【０１４５】
術後尿中のサイズプロファイルの正規化は、術前に観察された長い断片の大部分が切除された腫瘍に由来していたことを示した。これは、手術前のサンプルで見られるより大きな断片が膀胱癌サンプルからのものであることを示唆している。メチル化デコンボリューションからさらなる示唆を得て、術前サンプル中の５６．２％および７８．８％のｃｆＤＮＡ断片が膀胱腫瘍に由来することが示す。したがって、長いＤＮＡ断片の割合を使用して、膀胱癌についてスクリーニングし、かつ再発についてモニターすることができる。術後膀胱腫瘍寄与は、図１５Ａおよび１５Ｂそれぞれについて４．９％および３．１％であり、これにより、長いＤＮＡ断片と腫瘍寄与との間の関係が確認される。
【０１４６】
図１６Ａ〜図１６Ｃは、膀胱癌患者からの３つの排泄尿サンプルのサイズプロファイルを示す。３人の患者全員が筋肉浸潤性膀胱癌を患っていた。３つ全てのサンプルについて長い断片の割合が増加しており、これは、サイズ要約統計（図１６Ａ）中央値１３１、Ｐ＞７０  ９０．１％、ＦＩ０．１０、（図１６Ｂ）中央値１４３、Ｐ＞７０  ９６．２％、ＦＩ０．０４、（図１６Ｃ）中央値１１４、Ｐ＞７０  ８３．７％、ＦＩ０．１６にも反映される。膀胱癌患者の尿サイズプロファイルは、１１４〜１４３ｂｐの中央値、８３〜９６％のＦ＞７０、および０．２未満のＦＩを有する。これは、膀胱癌患者からの尿で長いｃｆＤＮＡ断片の割合が大きく、そのサイズプロファイルが通常５０〜７５ｂｐの範囲で見られる周期性を欠くことを反映する。
【０１４７】
また、膀胱腫瘍（ＴＵＲＢＴ）の経尿道的切除術を受けた非筋肉侵襲性疾患の治療を受けた、膀胱癌さらなる３症例の術前尿を配列決定した。１つの症例はより長い断片を伴う著しく異常なサイズプロファイルを示したが、他の２つは正常なサイズプロファイルを示した。
【０１４８】
図１７Ａ〜１７Ｃは、ＴＵＲＢＴを受けている非筋肉浸潤性膀胱癌を有する３人の患者からの３個の術前尿サンプルのサイズプロファイルを示す。ＴＢＲ４１３では長い断片の割合が増加する。要約サイズ統計は、中央値１１４ｂｐ、Ｐ＞７０  ８３．７％、ＰＩ０．１６である。他の２つの尿サイズプロファイル（ＴＢＲ４０６およびＴＢＲ４１９）は、排泄尿に典型的なサイズプロファイルを表示する。ＴＢＲ４１３は術前には非筋肉侵襲性であると考えられていたが、ＴＵＲＢＴ後に筋肉侵襲性疾患を有することが判明し、その後根治的膀胱摘出術が必要となった。したがって、癌のタイプを識別することができ、異常なサイズプロファイル（例えば、長い断片の統計値が閾値を上回る）は、より進行した疾患を示し得る。図１７Ａは、図１６Ｃと同じサンプルに対応する。
【０１４９】
異常なサイズプロファイル（ＴＢＲ４１３）の症例は、筋肉浸潤を有する高悪性度であったサイズが１４ｃｍの広範な膀胱腫瘍を有することが見出され、その後、根治的膀胱摘出術を必要とした。他の２つの症例（ＴＢＲ４０６および４０９）は、ＴＵＲＢＴ後に疾患再発を伴わずに非筋肉侵襲性疾患を有することが組織学的に確認された。これらの結果は、大きな腫瘍量を有する筋肉浸潤性膀胱癌が、異常な尿サイズプロファイルを生じさせるのに十分な腫瘍ＤＮＡを放出する可能性が高いことを示した。
【０１５０】
Ｂ．長い尿中ｃｆＤＮＡを用いた膀胱癌の検出方法
図１８は、本発明の実施形態による、あるサイズの尿中ｃｆＤＮＡを用いて膀胱癌を検出するために生物の尿サンプルを分析する方法１８００のフローチャートを示す。尿サンプルは、正常細胞および潜在的に癌に関連する細胞に由来するＤＮＡを含む。尿サンプル中の少なくとも一部のＤＮＡは無細胞である。
【０１５１】
ブロック１８１０において、様々なサイズに対応するＤＮＡ断片の量を測定する。複数のサイズの各サイズについて、そのサイズに対応する尿サンプルから複数のＤＮＡ断片の量を測定することができる。ブロック１８１０は、図１４のブロック１４１０と類似の様式で実施してもよい。
【０１５２】
ブロック１８２０において、第１のパラメータの第１の値は、複数のサイズでのＤＮＡ断片の量に基づいて計算される。一態様では、第１のパラメータは、生物学的サンプル中のＤＮＡ断片のサイズプロファイル（例えばヒストグラム）の統計的尺度を提供する。一実施形態では、第１のパラメータはＤＮＡ断片サイズの増加と共に増加する。サイズは、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、または１２０ｂｐより大きい断片を含んでもよい。ブロック１８２０は、図１４のブロック１４２０と類似の様式で実施してもよい。
【０１５３】
ブロック１８３０において、第１の値を基準値と比較する。ブロック１８３０は、図１４のブロック１４３０と類似の様式で実施してもよい。
【０１５４】
ブロック１８４０において、膀胱癌のレベルの分類は、その比較に基づいて決定される。例えば、第１の値が基準値を超える場合、生物は膀胱癌を有すると判断してもよい。判定は、癌の特定のレベル、例えば癌が筋肉侵襲性であるかどうかについてのものであり得る。
【０１５５】
上記の結果に示されるように、尿中ｃｆＤＮＡのサイズプロファイル分析は、長い断片が予想外に大きな割合を占める尿サンプルを同定することができ、メチルデコンボリューションはｃｆＤＮＡ断片の由来を同定することができる。尿路上皮癌の場合、大きなｃｆＤＮＡ断片を同定することができ、メチル化デコンボリューションを使用して、尿路上皮癌のそのような症例について尿路上皮腫瘍由来の断片の増加があることを確かめた。
【０１５６】
癌のレベルに基づいて、治療計画を立ててもよい。癌は化学療法、薬物、食事療法、療法、および／または手術によって治療することができる。場合によっては、癌の存在は早期に検出され得るので、本明細書に記載の方法を用いない場合よりも癌は早く治療され得る。検出方法の結果として、死亡を含む合併症の危険性が低減され得る。膀胱癌は、原発腫瘍の外科的切除後に最大７０％の再発率を有する。非侵襲性尿検査が定期的に行われる場合、検査はより早期に再発を検出することができ、また、膀胱鏡検査の必要性または頻度を減らし得る。
【０１５７】
Ｃ．進行性浸潤性腫瘍を同定するためのｃｆＤＮＡ断片サイズの使用
膀胱癌を検出することに加えて、ｃｆＤＮＡ断片のサイズを分析して、腫瘍のステージを示すことができる。浸潤性高悪性度の尿路上皮癌は、長い断片の割合がより大きいことと関連している。
【０１５８】
図１９Ａは、対照、および非筋肉侵襲性Ｔａ−Ｔ１疾患を有する膀胱癌患者、および筋肉侵襲性Ｔ２−Ｔ４疾患を有する膀胱癌患者における、７０ｂｐより長い尿中ｃｆＤＮＡ断片の比率（Ｐ＞７０ｂｐ）を示す箱ひげ図である。対照およびＴａ−Ｔ１疾患を有する膀胱癌患者におけるＰ＞７０ｂｐの間に有意差はなかった。Ｔ２−Ｔ４疾患を有する膀胱癌患者は、長い尿中ｃｆＤＮＡ断片の割合がより大きいことを示した（マン・ホイットニーＵ検定Ｐ＝０．０３）。それゆえ、７０ｂｐより長い断片の割合を使用して、Ｔ２−Ｔ４疾患を有するものとその疾患を有さないものとを区別してもよい。
【０１５９】
図１９Ｂは、対照、およびＴａ−Ｔ１疾患を有する膀胱癌患者、およびＴ２−Ｔ４疾患を有する膀胱癌患者における、１０５ｂｐより長い尿中ｃｆＤＮＡ断片の比率（Ｐ＞１０５ｂｐ）を示す箱ひげ図である。対照と非筋肉侵襲性（Ｔａ−Ｔ１）疾患を有する膀胱癌患者との間のｐ＞１０５ｂｐに有意差はなかった。筋肉浸潤性膀胱（Ｔ２−Ｔ４）疾患は、長い尿中ｃｆＤＮＡ断片の割合がより大きいことを示した（マン・ホイットニーＵ検定Ｐ＝０．００５）。したがって、１０５ｂｐより長い断片の割合を使用して、Ｔ２−Ｔ４疾患を有するものと疾患を有さないものとを区別し得る。
【０１６０】
ＩＶ．血漿および尿中の異常の比較
癌は、全体的な低メチル化（３３）およびコピー数異常（３４）によって特徴付けられてもよく、これらの変化は癌患者の血漿中で検出されてもよい（７）。全ゲノムバイサルファイトシークエンシングは、１ＭＢビン（または所定の長さおよび／または位置を有し得る他のサイズの領域）によってゲノム全体のメチル化密度を決定し、ゲノム全体の遺伝子座にマッピングされた断片数に基づいてコピー数変化があるかどうかを決定することできる。正常対照におけるメチル化密度およびコピー数は、無癌サンプルからのｃｆＤＮＡの配列決定に基づいて決定することができる。対照と比較して３を超えるＺスコア差（または他の値、例えば所望の感度および特異度に基づいて選択される）がある場合、ＣＮＡおよびメチル化の変化は有意であるとみなすことができる。尿サンプルについては、他のサンプル、例えば血漿についての閾値とは異なる特定の閾値を決定することができる。
【０１６１】
Ａ．尿中の異常は腫瘍のメチル化およびＣＮＡの変化を反映する
筋肉侵襲性疾患を有する膀胱癌患者からの対をなす腫瘍組織および排泄尿を得た。全体的な低メチル化は、尿中ｃｆＤＮＡおよび原発性膀胱腫瘍の両方で見られた。膀胱腫瘍はまた、ゲノム全体にわたってコピー数異常を示した。尿中ｃｆＤＮＡにおける増減の位置は、腫瘍において見られたものを反映していた（図２０）。これらの結果は、尿中ｃｆＤＮＡにおいて観察可能な低メチル化およびコピー数異常が原発性膀胱癌において見られる異常の代表例であることを示した。
【０１６２】
図２０は、本発明の実施形態による、全体的なメチル化における一致および尿中ｃｆＤＮＡと膀胱癌組織との間のコピー数異常を示すＣｉｒｃｏｓプロットを示す。染色体位置は時計回りに昇順で表される。中心から周辺までの４つの環は、１）膀胱腫瘍メチル化（環２００２）、２）尿中ｃｆＤＮＡメチル化（環２００４）、３）膀胱腫瘍コピー数（環２００６）、および４）尿中ｃｆＤＮＡコピー数（環２００８）を表す。１Ｍｂビンの全体的なメチル化密度は環２００２および環２００４に表され、有意な低メチル化および高メチル化はそれぞれ赤および緑の点で表される。高メチル化はこれらのサンプルには存在しない。コピー数変化は、２つの外側の環で表される。コピー数の減少は赤い点（例えば、点２０１０）で表され、環の中心に向かっている。コピー数の増加は緑色の点（例えば、点２０１２）で表され、環の中心から外れている。灰色の点（例えば、点２０１４）は、対照から有意な逸脱がないことを表す。
【０１６３】
図２１Ａ〜２１Ｅは、本発明の実施形態による、５人の膀胱癌患者（Ａ〜Ｅ）からの尿中ｃｆＤＮＡの全体的なメチル化およびコピー数異常のＣｉｒｃｏｓプロットを示す。内側の環（例えば環２１０２）はメチル化密度を表し、外側の環（例えば環２１０４）はコピー数の変化を表す。低メチル化およびコピー数の減少は赤色に着色され（例えば、点２１０６）、環の中心に向かっているが、高メチル化およびコピー数の増加は緑色に着色され（例えば、点２１０８）、環の中心から離れている。灰色の点（例えば、点２１１０）は、対照から有意な逸脱がないことを表す。図２１Ａのデータは、図２０の尿中ｃｆＤＮＡ環のデータに対応する。
【０１６４】
４つのサンプル（図２１Ａ、２１Ｂ、２１Ｄ、および２１Ｅ）で尿中ｃｆＤＮＡの全体的な低メチル化、および５つの全サンプルでコピー数異常の証拠を発見した。注目すべきことに、筋肉侵襲性疾患を有することが術前に確認された２つの症例は、半分を超える染色体において大きなコピー数の変化を示した（図２１Ａおよび２１Ｂ）。図２１Ｂは、低メチル化に加えて高メチル化も示す。その後、ＴＵＲＢＴ後に広範な筋肉浸潤性疾患を有することが確認された症例（図２１Ｄ）も、染色体１ｑ、９、および１０ｑにおいて明らかな全体的な低メチル化および大きなコピー数の増加および喪失を示した。図２１Ａは、図１５Ａの術前サイズプロファイルに対応する患者Ｔ２２の結果を示す。図２１Ｂは、図１５Ｂの術前のサイズプロファイルに対応する患者Ｔ２３の結果を示す。図２１Ｃは、図１７ＢのＴＢＲ４０６を有する患者の結果を示す。図２１Ｄは、図１７ＡのＴＢＲ４１３を有する患者の結果を示す。図２１Ｅは、図１７ＣのＴＢＲ４１９を有する患者の結果を示す。非筋肉侵襲性疾患を伴う３例である図２１Ｃ、図２１Ｄ、および図２１Ｅは、軽度の低メチル化と、数および振幅に関してコピー数異常の比較的わずかな証拠を示した。
【０１６５】
全ゲノムバイサルファイトシークエンシングにより、異常なｃｆＤＮＡサイズプロファイル、コピー数、および膀胱癌に関連する全体的なメチル化の変化を同時に分析できる。バイサルファイト変換中のインビボでの分解およびｃｆＤＮＡの喪失にもかかわらず、尿中ｃｆＤＮＡにおいて検出された全体的な低メチル化およびコピー数の異常は原発腫瘍組織において見られる変化と密接に対応する。したがって、このアプローチは、膀胱腫瘍を代表するメチル化状態およびコピー数の変動を評価するための非侵襲的方法を提供する。
【０１６６】
コピー数異常は、一般的に膀胱癌において観察される（３８）。これらの変化は、膀胱癌患者からの５つの全尿サンプルにおいて観察可能であった。コピー数異常はまた、非常に低い悪性度の疾患を検出することがある。
【０１６７】
さらに、筋肉侵襲性疾患と高い腫瘍量を有する症例は、サイズプロファイル、コピー数、および全体的な低メチル化の顕著な撹乱を表す可能性が高い。単一バイサルファイトシークエンシングの実施から得たこれらの分析の組み合わせの実施可能性は、膀胱癌症例の検出を容易にし、より進行した疾患を有する症例を区別し得る。膀胱腫瘍および小腸の寄与における対応する変化を検出するメチル化デコンボリューションの能力はまた、この方法を、他の泌尿器、腎臓、または全身状態の検出のために、明確なｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃパターンを有するｃｆＤＮＡを放出する細胞由来の寄与の増加の検出に拡張することができることを示す。
【０１６８】
尿由来のｃｆＤＮＡ、および膀胱腫瘍から抽出されたＤＮＡ（グレード３尿路上皮癌、Ｔ３）を配列決定し、尿中で観察されたＣＮＡおよび全体的な１ＭＢ低メチル化が膀胱腫瘍の変化に非常に同等であることを見出した。
【０１６９】
図２２Ａおよび２２Ｂは、Ｔ２２の膀胱癌腫瘍（図２２Ａ）およびｃｆ尿（図２２Ｂ）についてのＣｉｒｃｏｓプロットを示す。内側の環（例えば環２２０２）はメチル化密度を表し、外側の環（例えば環２２０４）はコピー数の変化を表す。低メチル化およびコピー数の減少は赤色に着色され（例えば、点２２０６）、環の中心に向かっているが、高メチル化およびコピー数の増加は緑色に着色され（例えば、点２２０８）、環の中心から離れている。灰色の点（例えば、点２２１０）は、対照から有意な逸脱がないことを表す。膀胱癌腫瘍とｃｆ尿とのｃｉｒｃｏｓプロットを比較すると、両方に全体的な低メチル化がある。膀胱腫瘍および尿中にも多数のＣＮＡが存在し、これらの異常の位置は両方においてほぼ同一である。類似性の結果として、ｃｆ尿異常を用いて膀胱腫瘍を検出することができる。図２２Ｂは、図２０で使用したものと同じサンプルに対応する。
【０１７０】
Ｂ．膀胱癌に伴って上昇した高メチル化
高メチル化についてのｃｆＤＮＡを分析することによって癌を検出することは慣例的ではないが、高メチル化を使用して、癌のレベルの分類を決定できることを見出した。尿中ｃｆＤＮＡに寄与している正常組織（血球、腎臓、尿路上皮）において一貫してメチル化されていない１，０８２，７７４のＣｐＧ部位（例えば＜２％）を同定した。非メチル化は、２％、５％、または１０％未満でメチル化されている部位を指してもよい。これらの部位は、腫瘍においてより一般的にメチル化されており、したがって正常組織と比較して高メチル化されている。例として、高メチル化部位は、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％を超えてメチル化され得る。膀胱癌症例および対照からの尿サンプル中のこれらのＣｐＧ部位における全体的なメチル化密度を計算した。
【０１７１】
図２３Ａは、これらの１０８２７７４個のＣｐＧ部位における、膀胱癌症例および対照における全体的な高メチル化密度の箱ひげ図を示す。膀胱癌症例は、対照と比較してより高い全体的なメチル化密度を示した。図２３Ｂは、癌を検出するために高メチル化密度を使用するためのＲＯＣ曲線を示す。ＡＵＣは０．８１４であった。
【０１７２】
Ｃ．術前尿中のＣＮＡおよび低メチル化は術後尿中には存在しない。
図２４Ａ〜２４Ｄは、根治的膀胱摘出術を受けている２人の膀胱癌患者の術前（図２４Ａおよび２４Ｃ）および術後（図２４Ｂおよび２４Ｄ）のｃｆ尿を示す（Ｔ２２およびＴ２３）。内側の環（例えば環２４０２）はメチル化密度を表し、外側の環（例えば環２４０４）はコピー数変化を表す。低メチル化およびコピー数の減少は赤色に着色され（例えば、点２４０６）、環の中心に向かっているが、高メチル化およびコピー数増加は緑色に着色され（例えば、点２４０８）、環の中心から離れている。灰色の点（例えば、点２４１０）は、対照から有意な逸脱がないことを表す。膀胱癌に関連するＣＮＡおよび低メチル化は、術前尿中で明らかに観察可能であるが（図２４Ａおよび２４Ｃ）、術後サンプル中のｃｆ尿（図２４Ｂおよび２４Ｄ）は、無癌対照と同等のコピー数およびメチル化レベルで正規化する。
【０１７３】
図２５Ａ〜２５Ｄは、２人の患者についての全体的なメチル化およびＣＮＡの術前および術後のＣｉｒｃｏｓプロットを示す。図２５Ａおよび図２５Ｂは、３ｃｍのＴ１ＨＧ疾患を有する患者についての手術前後のｃｉｒｃｏｓプロットである。術後のＣｉｒｃｏｓプロットは、術前のサンプルに見られる全体的な低メチル化およびＣＮＡのクリアランスを示す。病理学によって尿路上皮腫瘍の明確なマージンを確認し、患者は術後サンプルが得られた再発を発症していない。
【０１７４】
図２５Ｃおよび図２５Ｄは、Ｔ３ａＨＧ疾患を有する患者についての手術前後のｃｉｒｃｏｓプロットである。術後のｃｉｒｃｏｓプロットは、全体的な低メチル化およびＣＮＡの持続性を示す。病理学的報告により、切除マージンに腫瘍が存在する筋肉浸潤性疾患の存在および残存疾患の存在を確認した。したがって、全ゲノムバイサルファイトシークエンシングを用いて残存疾患の存在を探すことができ、膀胱癌の治療を受けている患者における腫瘍由来ｃｆＤＮＡの長期モニタリングに使用することができる。
【０１７５】
メチル化レベルおよびコピー数異常の分析は、癌治療（手術を含む）の成功を評価するのに役立ち得る。さらに、分析は癌の寛解、進行、または重症度をモニターし得る。
【０１７６】
Ｄ．ＣＮＡおよび低メチル化は、無細胞尿および尿沈渣で検出することができる
図２６は、低悪性度（Ｔａ）の非侵襲性乳頭状尿路上皮腫瘍（ＰＵＮＬＭＰ）を有する膀胱癌患者におけるメチル化およびコピー数異常を示すＣｉｒｃｏｓプロットである。内側の環はメチル化密度を表し、外側の環はコピー数の変化を表す。低メチル化およびコピー数の減少は赤色に着色されて環の中心に向かっているが、高メチル化およびコピー数の増加は緑色に着色されて環の中心から離れている。灰色の点は対照から有意な偏差がないことを表す。図中のデータは、患者の尿の配列決定から得られた。第１０染色体のコピー数増加（セクション２６０２）は、低悪性度の組織像を有する超低悪性度疾患の患者に見られる。それゆえ、低悪性度疾患または早期癌は、コピー数異常を用いて同定することができる。
【０１７７】
尿サンプルは、遠心分離により細胞および細胞を含まない部分に分離することができ、細胞を含まない部分はさらなる濾過を受ける。ほとんどの尿サンプルには小さいながらも目に見える尿沈渣があり、そこからＤＮＡを抽出できる。尿沈渣は、３０００×ｇでの遠心分離後のチューブの底の内容物であってもよく、細胞性物質を含んでもよい。膀胱癌の尿サンプルからＤＮＡを抽出して、全ゲノムのバイサルファイトシークエンシングを行った。
【０１７８】
図２７Ａおよび２７Ｂは、同じ排泄尿から得られた膀胱癌患者（Ｔ２３）からのｃｆ尿（図２７Ａ）および尿沈渣（図２７Ｂ）についてのＣｉｒｃｏｓプロットを示す。内側の環（例えば環２７０２）はメチル化密度を表し、外側の環（例えば環２７０４）はコピー数の変化を表す。低メチル化およびコピー数の増加は赤色に着色され（例えばドット２７０６）、環の中心に向かっているが、高メチル化およびコピー数の増加は緑色に着色され（例えばドット２７０８）、環の中心から離れている。灰色の点（例えば、点２７１０）は、対照から有意な逸脱がないことを表す。存在する場合および実質的なＤＮＡが抽出された場合、尿沈渣は、膀胱癌を反映する全体的な低メチル化およびＣＮＡを示すように配列決定することができる。尿沈渣中のＣＮＡの低メチル化および位置は、ｃｆ尿中に見られる変化と同程度である。
【０１７９】
尿沈渣サイズは、異なるサンプル間で変化する。いくつかの尿サンプルは、遠心分離後に目に見える尿沈渣を有さない（すなわち、低い細胞含有量）。図２７Ａおよび図２７Ｂでは、尿沈渣中のＣＮＡの振幅および低メチル化は、無細胞ＤＮＡと比較して高く、これは、沈渣ベースのＣＮＡが場合によっては、より高感度であり得ることを示唆する。尿沈渣が存在するとき、腫瘍細胞からの寄与比率はいくつかの例においてより高くなり得る。
【０１８０】
尿沈渣分析は、通常、細胞診によって分析される。実施形態では、尿沈渣は配列決定されてもよい。尿沈渣は、ｃｆＤＮＡと同様に配列決定されてもよい。場合によっては、尿沈渣ＤＮＡを断片化（例えば、超音波処理）して、ｃｆＤＮＡと同じまたは類似の技術によって配列決定するために、より小さいサイズのＤＮＡを形成することができる。したがって、尿沈渣の分析は、ｃｆ尿と同様に疾患を検出する同一のまたは類似の様式で使用することができる。尿沈渣の分析は、ｃｆ尿の分析と組み合わせると、特異度および／または感度を高め得る。
【０１８１】
Ｅ．ＣＮＡおよび全体的な低メチル化は尿中に検出されるが血漿中には検出されない
明らかな転移が見られない膀胱癌を持つ２人の患者では、ＣＮＡおよび低メチル化は、尿中のｃｆＤＮＡで検出されたが、血漿のｃｆＤＮＡでは検出されなかった。
【０１８２】
図２８Ａ〜２８Ｄは、２人の膀胱癌患者（Ｔ２２およびＴ２３）からのｃｆ尿（図２８Ａおよび２８Ｃ）および血漿（図２８Ｂおよび２８Ｄ）についてのＣｉｒｃｏｓプロットを示す。内側の環はメチル化密度を表し、外側の環はコピー数の変化を表す。低メチル化およびコピー数の減少は赤色に着色されて環の中心に向かっているが、高メチル化およびコピー数の増加は緑色に着色されて環の中心から離れている。灰色の点は対照から有意な偏差がないことを表す。尿および血漿サンプルを同時に得た。これらの図は、メチル化レベルおよびコピー数異常が血漿中に現れないかまたは明らかに現れないため、メチル化レベルまたはコピー数に基づく膀胱癌の検出が、血漿のｃｆＤＮＡと比較して尿のｃｆＤＮＡにおいて容易であることを示す。
【０１８３】
図２９Ａおよび２９Ｂは、２つの膀胱癌症例、Ｔ２２およびＴ２３についてのＣＮＡまたは低メチル化の証拠を示す、ゲノム全体にわたる１ＭＢのビンの割合を示す。Ｔ２３については、血漿中、例えば染色体５ｐにＣＮＡの証拠がある。このコピー数の増加は尿のｃｆＤＮＡでも見られるが、他のＣＮＡおよび全体的な低メチル化は血漿と比較して尿中ではるかに明白である。Ｔ２３は一連のネオアジュバント化学療法を完了したが、その後根治的膀胱摘出術の約６ヵ月後に脳転移を発症した。これらのグラフはまた、より多くのビンが血漿中よりも尿中でＣＮＡまたは低メチル化を示すため、メチル化レベルまたはコピー数に基づく膀胱癌の検出が、血漿のｃｆＤＮＡと比較して尿のｃｆＤＮＡにおいてより容易であることを示している。
【０１８４】
Ｆ．特定の臓器の癌を同定する方法
図３０は、本発明の実施形態による、対象の第１のサンプルおよび血液サンプルを分析することによって対象の第１の臓器内の癌を同定する方法を示すフローチャートである。第１のサンプルが、第１の臓器由来であり、または第１のサンプルが生物を出るのと同様に第１の臓器を通過し、かつ血液サンプルとは異なる。第１のサンプルおよび血液サンプルは両方とも、正常細胞由来の、および潜在的に癌に関連する細胞由来のＤＮＡを含む。第１のサンプルおよび血液サンプルの両方において少なくとも一部のＤＮＡは無細胞である。第１のサンプルの例は、尿、唾液、または便である。
【０１８５】
ブロック３０１０において、生物学的サンプルからの複数のＤＮＡ分子を分析する。ＤＮＡ分子の分析は、生物のゲノム中のＤＮＡ分子の位置を同定すること、および任意に（例えば、メチル化分析が行われる場合に）ＤＮＡ分子が１つ以上の部位でメチル化されているかどうかを決定することを含むことができる。メチル化状態は、特定のシトシン残基が５−メチルシトシンまたは５−ヒドロキシメチルシトシンであるかどうかを含み得る。
【０１８６】
分析は、メチル化認識シークエンシングからシークエンスリードを受けることによって行うことができ、すなわち以前にＤＮＡから得られたデータにだけ分析を行うことができる。他の実施形態では、分析は、実際のシークエンシングまたはデータを得る他の能動的ステップを含み得る。シークエンスリードは、種々のシークエンシング技術、ＰＣＲ技術、アレイ、および断片の配列を同定するための他の適切な技術から得ることができる。シークエンスリードの部位のメチル化状態は、本明細書に記載のとおりに得ることができる。
【０１８７】
メチル化認識シークエンシングの一例は、亜硫酸水素ナトリウムでＤＮＡを処理した後、ＤＮＡシークエンシングを行うことを含む。メチル化認識シークエンシングは、重亜硫酸ナトリウムを使用せずに、ＤＮＡ分子（Ｎ６−メチルアデニン、５−メチルシトシン、および５−ヒドロキシメチルシトシンを含む）のメチル化状態をバイサルファイト変換なしで直接解明することを可能にする単一分子シークエンシングプラットフォームを使用して（ＡＢ  Ｆｌｕｓｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１０  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ；７：４６１−４６５；Ｊ  Ｓｈｉｍ  ｅｔ  ａｌ．２０１３  Ｓｃｉ  Ｒｅｐ；３：１３８９．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ０１３８９）、またはメチル化シトシンの免疫沈降によって（例えば、メチルシトシンに対する抗体を用いることによって、またはメチル化ＤＮＡ結合タンパク質もしくはペプチド（ＬＧ  Ａｃｅｖｅｄｏ  ｅｔ  ａｌ．２０１１  Ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓ；３：９３−１０１）とそれに続くシークエンシングを用いることによって、またはメチル化感受性制限酵素とそれに続くシークエンシングの使用によって、実施することができる。別の実施形態では、アレイ、デジタルＰＣＲ、および質量分析などの非シークエンシング技術を使用する。
【０１８８】
ブロック３０２０〜３０５０は、対象の複数の染色体領域の各染色体領域に対して繰り返される。複数の染色体領域は重複していなくてもよい。ゲノムは、１メガベース（Ｍｂ）の長さ、または５００Ｋｂもしくは２Ｍｂのような他のセグメント長の領域に分離することができる。領域のサイズは１Ｍｂ、またはその他の同じサイズにすることができる。その場合、全ゲノムは約３，０００の領域を含むことができ、それぞれの領域は所定のサイズおよび位置のものであってもよい。また、上記のように、そのような所定の領域は、使用される特定の染色体の長さまたは特定の数の領域、および本明細書中に記載される他の任意の基準に適応するように変動し得る。領域が異なる長さを有する場合、例えば本明細書に記載されるように、そのような長さを使用して結果を正規化することができる。
【０１８９】
ブロック３０２０において、染色体領域がコピー数異常の異常を示すかどうかの分類、または低メチル化は、第１のサンプルおよび血液サンプルのそれぞれについて決定される。ブロック３０２０は、ブロック３０３０〜３０５０を実行することによって実施することができる。コピー数の異常または低メチル化の検出に関するさらなる詳細は、米国特許第８，７４１，８１１号および同第９，１２１，０６９号、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ２０１４／０４３７６３号に見出すことができ、その全体が参照により組み込まれる。
【０１９０】
ブロック３０３０では、各サンプルからのＤＮＡ分子のそれぞれの群が、同定された位置に基づいて染色体領域からのものとして同定される。それぞれの群は、染色体領域の複数の遺伝子座のそれぞれに位置する少なくとも１つのＤＮＡ分子を含む。一実施形態では、その群は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第９，１２１，０６９号に記載されているように、染色体領域の特定のハプロタイプに整列する断片であり得る。別の実施形態では、その群は、例えば米国特許第９，１２１，０６９号にも記載されているように、染色体領域に整列する任意の断片であり得る。
【０１９１】
ブロック３０４０において、コンピュータシステムは、ＤＮＡ分子の各群の各値を計算する。それぞれの値は、それぞれの群のＤＮＡ分子の特性を定義する。特性は、メチル化レベル、第１の各群のＤＮＡ分子の量、または第１の各群のＤＮＡ分子のサイズプロファイルの統計値であり得る。量の一例として、各値は、正規化された値、例えば、サンプルのタグカウントの総数または参照領域のタグカウントの数で割った領域のタグカウントでもあり得る。各値は、（例えば、他のハプロタイプについての）他の値との差または比率でもあり得、それによってその領域に対する差の性質を提供する。
【０１９２】
ブロック３０５０では、各値を基準値と比較して、第１の染色体領域が、例えば、欠失もしくは増幅のコピー数異常、低メチル化もしくは高メチル化のメチル化異常、またはミスマッチなどの異常を示すかどうかの分類を決定する。この基準値は、本明細書に記載の任意の閾値または基準値であり得る。例えば、基準値は、正常サンプルについて決定された閾値であり得る。ハプロタイプ間の差が使用される場合、各値は２つのハプロタイプについてのタグカウントの差または比であり得、基準値は統計学的に有意な偏差が存在することを決定するための閾値であり得る。別の例として、基準値は別のハプロタイプまたは領域のタグカウントまたはサイズ値であり得、比較が差または比（またはそのような関数）をとること、次いで差または比が閾値より大きいかどうかを決定することを含むことができる。
【０１９３】
基準値は、他の領域の結果に基づいて変えることができる。例えば、隣接領域も偏差を示す場合（１つの閾値と比較して小さいが、例えば、３のｚスコア）、より低い閾値を使用することができる。例えば、３つの連続した領域が全て第１の閾値を超える場合は、癌の可能性が高くなり得る。したがって、この第１の閾値は、非連続領域から癌を同定するのに必要とされる別の閾値よりも低くなってもよい。わずかな偏差でさえも３つ（または３つ超）の領域を有することは、感度および特異度が保存され得るという偶然効果の十分に低い確率を有し得る。
【０１９４】
ブロック３０６０において、第１の癌のレベルは、第１のサンプルについて異常を示すものと分類された染色体領域の第１の量が第１の閾値を超えるかどうか基づいて決定される。例として、第１の癌のレベルに対応する分類は、生物が癌を有するかどうか、癌のステージ、および癌の予後であり得る。一実施形態では、全ての異常領域がカウントされ、その領域がどこに現れるかにかかわらず単一の閾値が使用される。別の実施形態では、閾値は、カウントされる領域の位置およびサイズに基づいて変わり得る。例えば、染色体の特定の染色体またはアーム上の領域の量は、その特定の染色体（またはアーム）の閾値と比較してもよい。複数の閾値を使用してもよい。例えば、特定の染色体（またはアーム）上の異常領域の量は第１の閾値を超えなければならず、ゲノム中の異常領域の総量は第２の閾値を超えなければならない。
【０１９５】
ブロック３０７０において、第２の癌のレベルは、血液サンプルについての異常を示すものと分類された染色体領域の第２の量が第２の閾値を超えるかどうかに基づいて決定される。ブロック３０７０は、ブロック３０６０と類似の様式で実施してもよい。
【０１９６】
ブロック３０８０において、第１の癌のレベルは対象が癌を有することを示し、第２の癌のレベルは対象が癌を有していないことを示す場合に、対象は第１の臓器の癌を有すると決定される。そのようなシナリオは、図２８Ａ〜２８Ｄに例示されている。したがって、全ゲノムバイサルファイトシークエンシングはまた、尿路上皮癌患者の無細胞尿および尿沈渣中の全体的な低メチル化およびコピー数異常（ＣＮＡ）を同定することができる。これらの変化は膀胱腫瘍に見られる変化に対応しており、体循環では検出されない。
【０１９７】
癌の判定後、治療計画を立ててもよい。癌は化学療法、薬物、食事療法、療法、および／または手術によって治療することができる。場合によっては、癌の存在は早期に検出され得るので、本明細書に記載の方法を用いない場合よりも癌は早く治療され得る。検出方法の結果として、死亡を含む合併症の危険性が低減され得る。
【０１９８】
Ｇ．ＣＮＡについての癌のレベルを決定する
ブロック３０６０および３０７０内の領域の量の閾値は、カウントされた領域に対する不均衡の強さに依存し得る。例えば、癌の分類を決定するための閾値として使用される領域の量は、各領域における異常を検出するために使用される特異度および感度（異常閾値）に依存し得る。例えば、異常閾値が低い（例えば、２のｚスコア）場合、量閾値は高い（例えば１５０）ように選択されてもよい。しかし、異常閾値が高い（例えば、３のｚスコア）場合、量閾値はより低くてもよい（例えば、５０）。異常を示す領域の量も重み付けされた値とすることができ、例えば、高い不均衡を示す１つの領域は、わずかな不均衡を示す領域よりも高く重み付けすることができる（すなわち、異常について正および負よりも多い分類がある）。
【０１９９】
したがって、有意に過剰または過小表現の正規化されたタグカウント（または群の特性についての他の各値）を示す染色体領域の量（数および／またはサイズを含んでもよい）は、病気の重症度を表すものとして使用することができる。異常な正規化されたタグカウントを有する染色体領域の量は、２つの要因、すなわち腫瘍組織における染色体異常の数（またはサイズ）および生物学的サンプル（例えば血漿）中の腫瘍由来ＤＮＡの分画濃度によって決定することができる。より進行した癌は、より多くの（そしてより大きな）染色体異常を示す傾向がある。それゆえ、より多くの癌関連染色体異常が潜在的にサンプル（例えば血漿）中で検出可能である。より進行した癌を有する患者では、高い腫瘍量が、血漿中のより高い分画濃度の腫瘍由来ＤＮＡをもたらすであろう。結果として、腫瘍関連染色体異常は血漿サンプル中でより容易に検出されるであろう。
【０２００】
癌のスクリーニングまたは検出の文脈では、正規化されたタグカウント（または他の値）の過剰または過小表現を示す染色体領域の量を使用して、試験された被験体の癌を有する可能性を決定することができる。±２のカットオフ（すなわち、ｚスコア＞２または＜２）を使用すると、偶然のみに起因して約５％の試験領域が対照対象の平均から有意に逸脱したｚスコアを与えると予想される。全ゲノムが１Ｍｂのセグメントに分割されると、全ゲノムには約３０００セグメントがあるだろう。したがって、約１５０セグメントは、＞２または＜２のｚスコアを有すると予想される。
【０２０１】
したがって、癌が存在する場合、ｚスコア＞２または＜−２のセグメント数について、１５０のカットオフ（閾値）値を使用することができる。異常ｚスコアを有するセグメントの数（例えば、１００、１２５、１７５、２００、２５０、および３００）についての他のカットオフ値は、診断目的に合うように選択することができる。より低いカットオフ値、例えば１００は、感度の高い試験をもたらすが、より低い特異度およびより高いカットオフ値は、より特異的であるがより感度が低いであろう。偽陽性分類の数は、ｚスコアのカットオフ値を増やすことによって減らすことができる。例えば、カットオフ値が３に増やされた場合、セグメントのわずか０．３％が偽陽性であるだろう。この状況では、異常なｚスコアを持つ３つを超えるセグメントを使用して癌の存在を示すことができる。異なる診断目的に合うように、他のカットオフ値、例えば１、２、４、５、１０、２０、および３０を選択することもできる。しかしながら、癌関連染色体異常を検出する感度は、診断を下すのに必要とされるセグメントの異常数が増えるにつれて減少するであろう。
【０２０２】
特異度を犠牲にすることなく、感度を改善するために可能なアプローチの１つは、隣接する染色体セグメントの結果を考慮に入れることである。一実施形態では、ｚスコアのカットオフは＞２および＜−２のままである。しかしながら、染色体領域は、２つの連続するセグメントが同じタイプの異常を示す場合、例えば両方のセグメントが＞２のｚスコアを有する場合にのみ、潜在的に異常であると分類される。正規化されたタグカウントの偏差がランダムエラーの場合、２つの連続したセグメントが同じ方向に誤ってポジティブになる確率は０．１２５％（５％×５％／２）になる。他方、染色体異常が２つの連続するセグメントを包含する場合、より低いカットオフ値は、血漿サンプル中のセグメントの過剰または過小表現の検出をより高感度にする。対照対象の平均からの正規化されたタグカウント（または他の値）の偏差はランダムエラーによるものではないので、連続分類要件は感度に重大な悪影響を及ぼさないであろう。他の実施形態では、より高いカットオフ値を使用して隣接セグメントのｚスコアを一緒に加算することができる。例えば、３つの連続するセグメントのｚスコアを合計することができ、５つのカットオフ値を使用することができる。この概念は、３つを超える連続したセグメントに拡張できる。
【０２０３】
量と異常閾値の組み合わせはまた、分析の目的に依存し、生物の任意の事前知識（またはその欠如）に依存し得る。例えば、正常な健康集団を癌についてスクリーニングする場合、潜在的に、領域（すなわち、領域の数に対する高い閾値）、およびある領域が異常を有すると同定されたときの異常閾値の両方の量において、典型的に高い特異度を使用する。しかし、リスクがより高い患者（例えば、しこりまたは家族歴、喫煙者、ＨＰＶウイルス、肝炎ウイルス、または他のウイルスを訴える患者）では、より高い感度（偽陰性がより少ない）を得るために、閾値を低くすることができる。
【０２０４】
一実施形態では、染色体異常を検出するために１Ｍｂの分解能および６．３％の腫瘍由来ＤＮＡの検出下限を使用する場合、各１Ｍｂセグメント中の分子の数は６０，０００個である必要があるだろう。これは、全ゲノムについて約１億８，０００万（６０，０００リード／Ｍｂ×３，０００Ｍｂ）の整列可能リードに翻訳されるであろう。
【０２０５】
Ｈ．メチル化についての癌のレベルの決定
メチル化について、態様は、ＣＮＡについてと同じであり得る。一実施形態では、全領域のメチル化レベルを決定し、閾値と比較することができる。
【０２０６】
いくつかの実施形態では、第一のメチル化レベルは、メチル化レベルが基準値を超える領域の数に対応できる。例えば、生物のゲノムの複数の領域を同定することができる。領域は、本明細書に記載の基準、例えば特定の長さまたは特定の数の部位を用いて同定することができる。１つ以上の部位（例えば、ＣｐＧ部位）が各領域内で同定され得る。領域メチル化レベルは各領域について計算することができる。第１のメチル化レベルは第１の領域についてのものである。領域メチル化レベルのそれぞれは、各領域カットオフ値と比較され、それは領域間で同一または異なってもよい。第１の領域に対する領域カットオフ値は第１のカットオフ値である。各領域のカットオフ値は、参照メチル化レベルからの特定量（例えば、０．５）であり得、それによって、参照から有意差を有する領域のみをカウントすることができ、それは非癌対象から決定され得る。
【０２０７】
領域が各領域のカットオフ値を超える、メチル化レベル領域の第１の数を決定し、閾値と比較して分類を決定することができる。一実施態様では、閾値はパーセントである。第１の数を閾値と比較することは、例えば正規化プロセスの一部として、閾値と比較する前に、領域の第１の数を領域の第２の数（例えば全ての領域）で除算することを含み得る。
【０２０８】
上述したように、生物学的サンプル中の腫瘍ＤＮＡの分画濃度を使用して、第１のカットオフ値を計算することができる。分画濃度は単純に最小値より大きいと推定することができるが、最小値より低い分画濃度を有するサンプルは、例えば分析に適さないとしてフラグを立てることができる。最小値は、参照メチル化レベルに対する腫瘍のメチル化レベルの予想される差に基づいて決定することができる。例えば、差が０．５である場合（例えば、カットオフ値として使用される場合）、特定の腫瘍濃度はこの差を見るのに十分に高いことが必要である。
【０２０９】
Ｖ．ＣＮＡ、グローバルメチル化、および腫瘍寄与の組み合わせ
全ゲノムバイサルファイトシークエンシングにより、全体的なメチル化状態、コピー数異常（ＣＮＡ）、およびメチル化デコンボリューションによる膀胱腫瘍寄与を同時に評価できる。４６人の膀胱癌患者と３９人の対照において膀胱癌を検出するこれらの分析方法の能力を評価した。対照の平均値に加えて、３つの標準偏差に基づいて、正常上限を設定した。これらの基準を用いて陽性と判定された対照はなく、１００％の特異度を示した。
【０２１０】
Ａ．パラメータの組み合わせに対する感度と特異度の結果
図３１Ａ〜３１Ｃは、４６人の膀胱癌患者および３９人の対照について、低メチル化を伴う１ｍｂビンの割合、コピー数異常を伴う１ｍｂビンの割合、およびメチル化デコンボリューションからの膀胱腫瘍寄与の箱ひげ図をそれぞれ示す。図３１Ｄ〜３１Ｆは、低メチル化についての対応するＲＯＣ曲線を示す図であり、図３１Ｄは図３１Ａに対応するＲＯＣ曲線を示し、図３１Ｅは図３１Ｂに対応するＲＯＣ曲線を示し、図３１Ｆは図３１Ｃに対応するＲＯＣ曲線を示す。膀胱腫瘍寄与は、組織特異的メチル化シグネチャおよび異なる組織にわたって変化する非組織特異的メチル化シグネチャを使用して導き出された。
【０２１１】
低メチル化を伴う１ｍｂのビンの割合（図３１Ａ）、ＣＮＡ（図３１Ｂ）、および膀胱腫瘍寄与（図３１Ｃ）は、対照と比較して膀胱癌症例において有意に高かった（マン・ホイットニーＵ検定Ｐ＜０．００１）。正常上限として対照の平均値に加えて３つの標準偏差を使用して、どの対照も陽性と判定されなかった。同じカットオフを使用して、４６の膀胱癌症例のうちの４３症例が、３つのパラメータのうちの少なくとも１つを用いて同定され得る。
【０２１２】
有意な低メチル化を有する１ｍｂビンの割合を使用して、７１．７％の感度で膀胱癌を検出することができた（ＲＯＣ  ＡＵＣ＝０．９３）（図３１Ｄ）。有意なＣＮＡを伴う１ｍｂビンの割合を使用して、６３．０％で膀胱癌を検出することができた（ＲＯＣ  ＡＵＣ＝０．９０）（図３１Ｅ）。メチル化デコンボリューションからの膀胱腫瘍寄与を用いて、７８．３％の感度で膀胱癌を検出することができた（ＲＯＣ  ＡＵＣ＝０．９３）（図３１Ｆ）。３つのパラメータのうちのいずれか１つが癌を示す場合、検出された癌を考慮することによって３つのパラメータを組み合わせることができる。３つ全てのパラメータを組み合わせることによって、３つのパラメータのうちの少なくとも１つについて陽性と判定された膀胱癌症例の感度は９３．４％に上昇した。特異度は１００％であった。３つ全てのパラメータを組み合わせることで、２９症例の高悪性度または浸潤性疾患（Ｔ１以上）全てを検出できた。
【０２１３】
パラメータは、パラメータの任意の組み合わせが癌を示す場合、検出癌を考慮して組み合わせてもよい。いくつかの実施形態では、最小数のパラメータが癌の検出に必要とされ得る。例えば、２つ、３つ、またはそれ以上のパラメータが必要とされ得る。いくつかの実施形態は、癌を検出するために、癌を示す特定のパラメータ（例えば、ＣＮＡ、低メチル化、またはデコンボリューション）を必要とし得る。表６にパラメータを組み合わせた場合の検出結果を示す。
【表６】
2020503003.tif 000011
【０２１４】
これらの結果は、現在の標準治療である、尿細胞診と比較することができる。４６人の膀胱癌患者のうちの４２人は、日常診療の一環として、泌尿器科手術前の６ヶ月以内に１〜３個の尿サンプルを尿細胞診に送った。尿細胞診が陽性であったのは４２人の膀胱癌患者のうちの４人（９．５％）のみだった。尿細胞診が陽性の４症例は浸潤性（Ｔ２ｂ−４）の高悪性度疾患であった。尿細胞診は、低メチル化、ＣＮＡ、および／または膀胱腫瘍寄与を使用するよりも膀胱癌の検出において正確性が低かった。
【０２１５】
一例として、非浸潤性低悪性度疾患（ＴａＬＧ）を有する１７の膀胱癌症例を配列決定した。低悪性度疾患を検出する分析方法の能力を評価した。
【０２１６】
図３２Ａ、３２Ｂ、および３２Ｃは、低侵襲性（Ｔａ）低悪性度疾患の１７人の膀胱癌患者および３９の対照について、低メチル化を伴う１ｍｂビンの割合、コピー数異常を伴う１ｍｂビンの割合、およびメチル化デコンボリューションからの膀胱腫瘍寄与の箱ひげ図をそれぞれ示す。図３２Ｄは、図３２Ａの対応するＲＯＣ曲線を示す。図３２Ｅは、図３２Ｂの対応するＲＯＣ曲線を示す。図３２Ｆは、図３２Ｃの対応するＲＯＣ曲線を示す。３つのパラメータのうちの少なくとも１つを使用して、非侵襲性の低悪性度疾患を有する１７人の患者のうちの１４人を同定することができた。
【０２１７】
有意な低メチル化を有する１ｍｂビンの割合を使用して、４１．１％の感度で膀胱癌を検出することができた（ＲＯＣ  ＡＵＣ＝０．８９）（図３２Ｄ）。有意なＣＮＡを有する１ｍｂビンの割合を使用して、１７．６％（ＲＯＣ  ＡＵＣ＝０．７８）で膀胱癌を検出することができた（図３２Ｅ）。メチル化デコンボリューションからの膀胱腫瘍寄与を使用して、４７．０％の感度で膀胱癌を検出することができた（ＲＯＣ  ＡＵＣ＝０．８１）（図３２Ｆ）。３つ全てのパラメータを組み合わせることにより、３つのパラメータのうち少なくとも１つについて陽性と判定された膀胱癌症例の感度は８２．４％に上昇した。特異度は１００％であった。
【０２１８】
３つを超えるパラメータを使用してもよい。表７は、低メチル化、ＣＮＡ、デコンボリューション、高メチル化、異なるカットオフを使用した１ミスマッチを使用した、および組み合わせた変異負荷の最大５つのパラメータの感度および特異度を示す。実証されたカットオフ値は、対照の平均プラス３標準偏差（ＳＤ）、および対照の平均プラス２ＳＤである。パラメータは、「ＯＲ」（少なくとも１つのパラメータで陽性の場合は陽性判定）、または「ＡＮＤ」（５つのパラメータ全てで陽性の場合は陽性判定）を使用して組み合わせることができる。
【表７】
2020503003.tif 000012
【０２１９】
カットオフ値として対照の平均＋２ＳＤを使用し、「ＯＲ」を使用した５つのパラメータを組み合わせて、９５．７％の感度および８２．１％の特異度を達成することができる。あるいは、ロジスティック回帰モデルを使用して、リーブワンアウト分析に基づいて、９１．３％の感度および８９．７％の特異度を達成することができる。
【０２２０】
リーブワンアウト分析を使用してロジスティック回帰モデルの性能を試験することができる。このような分析において、１つのサンプルがテストサンプルとして使用される。他の全てのサンプルは、ロジスティック回帰モデルに適合するためのトレーニングセットとして使用され、それによってモデルのパラメータ（例えば、係数および閾値）を取得する。次に、第２のサンプルをテストサンプルとして使用し、他の全てのサンプルを、係数を決定するためにトレーニングセットとして使用する。次に、この手順を各サンプルについて順番に繰り返す。
【０２２１】
いくつかの実施形態では、癌を有するカットオフ値として０．５の確率に基づくロジスティック回帰を使用して、癌を有する確率＝１−１／（１＋ｅｘｐ［−（−０．４４１３１２４＊低メチル化−０．６８６５２８４６＊ＣＮＡ−０．４４９８１３７４＊腫瘍寄与度＋１．０２３３２２２１＊高メチル化＋０．０７７１１７５５＊ミスマッチローディング＋１．３５４３６８７３）］）。
【０２２２】
平均＋３ＳＤにカットオフを調整することによって、９５．７％の感度および１００％の特異度を得ることができる。他の実施形態では、他の分類アルゴリズム、例えば、決定木、支持ベクトルマシン、単純ベイズ分類器、Ｋ最近傍法、ランダムフォレストツリー、および他の全ての機械学習アルゴリズムを使用することができるが、これらに限らない。したがって、本明細書に記載の分析方法を使用して、低悪性度疾患を検出してもよい。
【０２２３】
Ｂ．ＣＮＡ、全体的なメチル化、および腫瘍寄与を用いて尿サンプルを分析する方法
図３３は、生物の尿サンプルを分析する方法３３００を示す。生物は、本明細書に記載の任意の生物であり得る。尿サンプルは、正常細胞由来のおよび潜在的に癌に関連する細胞由来のＤＮＡを含み得る。尿サンプル中の少なくとも一部のＤＮＡは無細胞であり得る。
【０２２４】
ブロック３３１０において、尿サンプルからの複数のＤＮＡ分子を分析する。ＤＮＡ分子を分析することは、生物のゲノム中のＤＮＡ分子の位置を同定することを含み得る。位置を特定することは、コンピュータシステムによってであってもよい。
【０２２５】
ブロック３３２０において、染色体領域が、生物の複数の染色体領域の各染色体領域についてコピー数異常またはメチル化異常の少なくとも１つの異常を示すかどうかの分類を決定する。メチル化異常は、低メチル化または高メチル化であり得る。いくつかの実施形態では、異常は低メチル化または高メチル化の一方のみを含み得る。例えば、異常は、コピー数異常または低メチル化のうちの少なくとも１つであり得る。いくつかの実施形態では、染色体領域がミスマッチの異常を示すかどうかの分類が決定される。
【０２２６】
ブロック３３３０において、分類は、同定された位置に基づいて染色体領域からのものとして尿サンプルからのＤＮＡ分子の群を同定することによって決定され得る。この群は、染色体領域の複数の遺伝子座のそれぞれに位置する少なくとも１つのＤＮＡ分子を含んでもよい。
【０２２７】
ブロック３３４０において、分類はまた、コンピュータシステム、ＤＮＡ分子の群の値を用いて、計算することによって決定され得る。それぞれの値は、それぞれの群のＤＮＡ分子の性質を定義し得る。特性は、コピー数またはメチル化レベルのうちの少なくとも１つであり得る。所望により、その特性は、本明細書に記載のように、ミスマッチ変異荷重であり得る。
【０２２８】
ブロック３３５０において、分類はさらに、基準値と値を比較することによって決定され得る。基準値は、異常から正常値の間のカットオフを決定し得る。基準値は、３のｚスコアに基づき得る。例えば、基準値は、それを超えるとコピー数異常とみなされるコピー数の値であってもよい。いくつかの例では、基準値は、それを超えると領域が高メチル化または低メチル化とみなされるメチル化レベルの値であってもよい。
【０２２９】
ブロック３３６０において、第１の癌のレベルは、尿サンプルについてのコピー数異常を示すと分類された染色体領域の第１の量が第１の閾値を超えるかどうかに基づいて決定され得る。第１の閾値は、癌を有すると分かっている生物を、癌を有していてもいなくてもよい生物から区別することができる。他の実施形態では、第１の閾値は、癌を有していないことが分かっている生物を、癌を有するかどうか分からない生物から区別し得る。
【０２３０】
ブロック３３７０において、第２の癌のレベルは、尿サンプルについて低メチル化または高メチル化を示すと分類された染色体領域の第２の量が第２の閾値を超えるかどうかに基づいて決定され得る。第２の閾値がコピー数の代わりにメチル化レベルに適用され得ることを除いて、第２の閾値は第１の閾値と同様であり得る。
【０２３１】
ブロック３３８０において、第３の癌のレベルは、腫瘍組織の寄与度が第３の閾値を超えるかどうかに基づいて決定され得る。方法３３００は、腫瘍組織の寄与度を決定することをさらに含み得る。様々な実施形態において、寄与度は、腫瘍特異的体細胞変異、腫瘍特異的メチル化シグネチャ、腫瘍特異的断片のエンドパターン、または断片のサイズ分析（例えば、腫瘍ＤＮＡは非腫瘍ＤＮＡより統計的に長い）を用いることによって決定され得る。腫瘍特異的体細胞変異を用いて寄与度を決定することに関するさらなる詳細は、米国特許公開第２０１４／０１００１２１号に記載されている。腫瘍特異的メチル化シグネチャを使用することに関するさらなる詳細は、米国特許公開第２０１４／００８０７１５号および同第２０１６／００１７３１９号ならびにＰＣＴ特許公開第ＷＯ２０１４／０４３７６３号に記載されている。腫瘍特異的断片のエンドパターンを使用することに関するさらなる詳細は、米国特許公開第２０１７／００２４５１３号に記載されている。断片サイズ分析の使用に関するさらなる詳細は、米国特許公開第２０１６／０２０１１４２号に記載されている。これら全ての特許出願の内容は、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。腫瘍組織の寄与度はまた、本明細書中に記載されるデコンボリューション方法によって決定され得る。第３の閾値は、コピー数またはメチル化レベルの代わりに寄与度に適用され得ることを除いて、第１の閾値または第２の閾値のいずれかと同様であり得る。
【０２３２】
追加の閾値は、癌の追加のレベルであってもよい。例えば、癌のレベルは、ミスマッチを示すと分類された染色体領域の量が閾値を超えるかどうかに基づいて決定され得る。
【０２３３】
ブロック３３９０において、第１の癌のレベル、第２の癌のレベル、または第３の癌のレベルのうちの少なくとも１つが、生物が癌を有することを示す場合に、生物が癌を有すると決定され得る。少なくとも２つのレベルまたは３つのレベルが、生物が癌を有することを示す場合、生物は癌を有すると決定してもよい。癌の追加のレベルが使用されてもよい。少なくとも１つのレベルが、生物が癌を有することを示す場合、生物は癌を有すると決定され得る。いくつかの実施形態では、生物が癌を有することを全てのレベルが示す場合に、生物は癌を有すると決定され得る。他の実施形態では、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％以上のレベルによって生物が癌を有することを示す場合に、生物が癌を有すると決定され得る。
【０２３４】
方法３３００は、本明細書に記載の任意の様式で生物を治療することを含んでもよい。
【０２３５】
ＶＩ．ミスマッチおよび浅いシークエンシングを使用して腫瘍量を推定すること
１つのミスマッチを有するリードの割合を使用して、浅い深度のシーケンシングを用いて腫瘍量を推定した。これを使用して、膀胱癌症例を正常な対照と区別することができる。尿路上皮癌は体細胞変異の蓄積を特徴とする。膀胱癌は、高い体細胞変異率（メガベースあたり約８変異）を有し得る（Ｇｌａｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｕｒｏｌ．，２０１７）。膀胱癌患者における膀胱腫瘍に由来する尿中ｃｆＤＮＡは、参照ゲノムと比較してミスマッチを示す断片の割合が増加していてもよい。参照ゲノムと比較したミスマッチは、生殖細胞系列の変動、体細胞変異、またはシークエンシングエラーが原因で起こり得る。参照ゲノムと比較してミスマッチを有するリード数を評価できるが、ヒトゲノムの１倍カバレッジ未満での全ゲノムバイサルファイトシークエンシングは、体細胞変異を正確に同定するには不十分である。膀胱癌症例および対照由来の尿中ｃｆＤＮＡは、一般的な生殖細胞系の変動を抱えており、それは参照ゲノムに対するミスマッチとして検出することができる。これに加えて、膀胱癌症例における体細胞変異のより高い発生率は、ヒト参照ゲノムと比較して単一のミスマッチを有するより高い割合のリードに寄与し得る。
【０２３６】
図３４Ａは、４９の膀胱癌症例および３９の対照において１つのミスマッチを有するリードの割合についての箱ひげ図である。箱ひげ図は、膀胱癌症例が、対照と比較して１つのミスマッチを伴うより高い割合のリードを有することを示す（マン・ホイットニーＵ検定Ｐ＜０．００１）。図３４Ｂは、ＲＯＣ曲線が０．７９のＡＵＣを有することを示す。ミスマッチを有するリードの割合は、膀胱癌を検出するために使用され得る。
【０２３７】
図３５は、生物の生物学的サンプルを分析する方法３５００を示す。生物学的サンプルは、正常細胞および潜在的に癌に関連する細胞に由来するＤＮＡを含んでもよい。少なくとも一部のＤＮＡは、生物学的サンプル中で無細胞であり得る。生物学的サンプルは尿サンプルであってもよい。
【０２３８】
ブロック３５１０において、生物学的サンプルのＤＮＡ分子に対応する複数のシークエンスリードを受ける。シークエンスリードは、全ゲノムバイサルファイトシークエンシングからのものであってもよい。シークエンスリードは、１倍未満、１倍〜２倍、２倍〜３倍、３倍〜５倍、または５倍〜１０倍の深さ範囲であってもよい。複数のシークエンスリードは、５，０００万未満の固有マッピングリード、４，０００万未満の固有マッピングリード、３，０００万未満の固有マッピングリード、または２，０００万未満の固有マッピングリードを含む、８，０００万未満の固有マッピングリードであり得る。
【０２３９】
ブロック３５２０において、シークエンスリードのゲノム位置は、例えば本明細書に記載されているように、決定される。例えば、ゲノム位置は、参照ゲノムに基づいてコンピュータを用いて決定することができる。参照ゲノムは、集団に対する参照ゲノムまたは生物（例えば、ヒト）に対応する代表例であり得る。別の実施形態では、参照ゲノムは、その生物についての生殖系列（構成的）ゲノムを含めることによって対象に特異的であり得る。
【０２４０】
ブロック３５３０において、シークエンスリードは、参照ゲノムに対して１つのミスマッチを持つシークエンスリードを決定するために参照ゲノムと比較される。例として、ミスマッチとは、体細胞変異、シークエンシングエラー、または天然のミスマッチ（例えば、対象の生殖系列ゲノムと参照ゲノムとの違いから生じる多型）の結果であり得る。シークエンスリードごとに複数のミスマッチを使用してもよいが、ミスマッチを１つだけ使用するよりもパフォーマンスが悪くなることがある。各ＤＮＡ分子は一般に１００ｂｐ未満であり、短いＤＮＡ範囲内で２つ以上の真の体細胞変異を観察する確率は低い。
【０２４１】
ブロック３５４０において、パラメータは、参照ゲノムに対して１つのミスマッチを有するシークエンスリードの数に基づいて決定される。いくつかの実施形態では、シークエンスリードの数は、１つ以下のミスマッチを有するシークエンスリードのものであってもよい。他の実施形態では、シークエンスリードの数は、１つ以上のミスマッチ、例えば、２つ、３つ、またはそれ以上のミスマッチを有するシークエンスリードを含んでもよい。パラメータは、１つのミスマッチを有するシークエンスリードの正規化数であり得る。例えば、パラメータは、１つのミスマッチを有するシークエンスリードの密度、濃度、または割合であってもよい。場合によっては、パラメータは、１つのミスマッチを有するシークエンスリードの数と等しくてもよい。
【０２４２】
ブロック３５５０において、パラメータを閾値と比較する。閾値は、健康な生物についてのミスマッチに関するデータおよび／または癌を有する生物についてのミスマッチに関するデータを使用して決定され得る。例えば、閾値は、健康な生物の集団についての平均パラメータを超える１、２、または３標準偏差に設定され得る。
【０２４３】
ブロック３５６０において、癌のレベルの分類は、パラメータと閾値との比較を使用して決定される。パラメータが閾値を超える場合、癌のレベルの分類は、生物が癌を有することであり得る。本明細書に記載のように、追加の分類を使用することができる。例えば、癌のレベルの他の分類は、コピー数異常、低メチル化、高メチル化、または腫瘍寄与を使用してもよく、本明細書に記載の方法に従って決定してよい。例えば、癌を検出することは、ミスマッチに基づくもの以外のパラメータを含んでもよい。
【０２４４】
方法３５００は、ミスマッチがシークエンスエラーであるかどうか決定することを除外してもよい。ミスマッチの理由を決定しないことによって、癌のレベルの分類を決定することは、正確さを実質的に減少させることなくより効率的であり得る。
【０２４５】
方法３５００は、本明細書に記載の任意の技術によって癌を治療することを含んでもよい。
【０２４６】
ＶＩＩ．尿中メタゲノム解析は膀胱癌症例および対照を同定することができる
尿中細菌叢の研究は、尿路中の微生物が、尿路感染症の他に、泌尿器疾患と関連していることを提示した。ヒトゲノムにマッピングされていない配列決定されたｃｆＤＮＡリードのメタゲノム解析を行った。マッピングされていないリードは、病原体に存在する１Ｍマーカー遺伝子の参照にマッピングされた。病原体は、約１３，５００の細菌性および古細菌性ゲノムならびに約３，５００のウイルス性ゲノムを含み得、ＢＳＭａｐを用いてマッピングされ得る。サンプルあたり平均２５，０００個のリードをマーカー遺伝子参照にマッピングすることができた。Ｍｅｔａｐｈｌａｎ２を使用して、豊富な種の表の中で異なる微生物からの寄与比率を同定した。
【０２４７】
図３６は、３つの膀胱癌症例および５つの対照についての異なる微生物種の相対存在量を表示するヒートマップを示す。相対存在量は、特定の種にマッピングされたリード／メタゲノムデータベースにマッピングされたリード数の合計を特定の微生物のサイズ×１ｅ９（ＲＰＫＭ）で割ったものとして定義できる。３つの膀胱癌症例はＴ１８８、Ｔ１７９、およびＴＢＲ１８７５であった。５つの対照はＴＢＲ５３２、Ｔ１５９、Ｔ５６、Ｔ５９、およびＴ２９であった。各垂直線は単一の種を表す。色は、赤（例えば、セクション３６０２）が高い寄与比率、青（例えば、セクション３６０４）が低い寄与比率を表すように、各種についての対数存在量を表す。図３６は、膀胱癌の症例と対照を分離できることを示している。対照よりも膀胱癌症例において多かった種には、Ｈａｌｏｎｏｔｉｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｐｕｍｉｌｕｓ、およびＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓが含まれる。膀胱癌症例よりも対照においてより豊富な種には、ＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍおよびＮｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓがある。その結果、ヒトゲノムにマッピングされていないｃｆＤＮＡリードを使用して膀胱癌を検出することができる。
【０２４８】
対照と比較した膀胱癌症例において差分相対存在量を示す上位微生物としては、以下の細菌：Ｇｒａｎｕｌｉｃｅｌｌａ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｕｌｕｍ  ｓｃｈａａｌｉｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ／ｂｏｖｉｓ／ａｆｒｉｃａｎｕｍ／ｃａｎｅｔｔｉ、ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｉｌｕｍａｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃｏｃｃｉｎｅｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｋｏｒｉｂａｃｔｅｒ、Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ  ｃｕｒｔｉｓｉｉ、Ａｃｉｄｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｃｈｌｏｒａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｋｏｒａｒｃｈａｅｕｍ  ｃｒｙｐｔｏｆｉｌｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ  ｐａｃｉｆｉｃａ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ｃｏｎｒａｄｉｉ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍが挙げられる。
【０２４９】
上位微生物としてはさらに、Ｍｅｔｈａｎｏｃｕｌｌｅｕｓ，Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ，Ｍｅｔｈａｎｏｌｉｎｅａ  ｔａｒｄａ，Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ｖｏｌｃａｎｉｕｍ，Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｈａｅｒｕｌａ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ，Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ，Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｈａｅｒａ  ｓｔａｄｔｍａｎａｅ，Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｎｕｓ  ｐｅｔｒｏｌｅａｒｉｕｓ，Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ａｒｖｏｒｙｚａｅ，Ｍｅｔｈａｎｏｆｏｌｌｉｓ  ｌｉｍｉｎａｔａｎｓ，およびＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ａｅｏｌｉｃｕｓの古細菌が挙げられる。
【０２５０】
図３７は、ヒトの尿サンプルを分析する方法３７００を示す。尿サンプルは、正常細胞由来のおよび潜在的に癌に関連する細胞由来のＤＮＡを含み得る。尿サンプル中の少なくとも一部のＤＮＡは無細胞であり得る。
【０２５１】
ブロック３７１０において、尿サンプルのＤＮＡ分子に対応する複数のシークエンスリードが得られる。ブロック３７１０は、本明細書に記載の他のサンプルの測定ステップと類似の様式で実行することができる。
【０２５２】
ブロック３７２０において、複数のシークエンスリードのうちの各シークエンスリードについて、シークエンスリードは、コンピュータシステムによりヒト参照ゲノムに整列させることができる。シークエンスリードがヒト参照ゲノムに整列すると、シークエンスリードはヒトリードとして分類される。１回のリード当たり２つ以下のミスマッチがある場合、シークエンスリードは整列しているとみなすことができる。場合によっては、より多数のミスマッチが許容されてもよい。ヒト参照ゲノムは、尿サンプルを提供したのと同じ民族または人種の集団（例えば、東アジア、ヨーロッパ）に由来し得る。参照ゲノムは公開データベース（例えば、ＮＣＢＩまたはＵＣＳＣ）からのものであり得る。参照ゲノムはまた、尿サンプルが得られたヒトについてのｄｅ  ｎｏｖｏアセンブリ法であってもよい。言い換えれば、ヒトが癌に罹患していないと分かっている場合に、個人的な参照ゲノムが使用され得る。
【０２５３】
ブロック３７３０において、複数のシークエンスリードのうちの各シークエンスリードについて、シークエンスリードは、第１の病原体の種または属に対応する第１の病原体の参照ゲノムに、コンピュータシステムによって、整列させることができる。シークエンスリードが第１の病原体参照ゲノムに整列すると、シークエンスリードは第１の病原体リードとして分類される。細菌、ウイルス、および古細菌の参照ゲノムを含む複数の病原体参照ゲノムを試験することができる。使用する特定の病原体参照ゲノムは、特定の種または属の有病率、および異なる種が膀胱癌の異なる分類を示すかどうかに依存し得る。例えば、その種が全て膀胱癌を示し、有病率が比較的低い場合、その属の種由来のゲノムの相同部分から属の参照を構築することができる。
【０２５４】
方法３７００は、病原体リードの２つ以上の異なるタイプに対応するものとしてシークエンスリードを分類することを含んでもよい。例えば、シークエンスリードは、第１の細菌の参照ゲノムに整列させることができ、第２の細菌の参照ゲノムに整列させることもできる。２つ以上の病原体参照ゲノムへのそのようなアラインメントは、異なる病原体間で相同な遺伝子から生じ得る。アラインメントおよび分類は、異なるタイプの細菌、古細菌、またはウイルスの参照ゲノムに対するものであってもよい。様々な実施形態において、シークエンスリードが複数の病原体に整列する場合、最良のアラインメントを有する病原体を選択することができる。そのシークエンスリードが複数の病原体に等しく整列する場合、シークエンスリードは廃棄されるか、各病原体に割り当てられるか、または病原体を含む属に割り当てられる。
【０２５５】
方法３７００は、複数のシークエンスリードを複数のタイプの病原体リードに分類することを含み得る。例えば、複数のシークエンスリードのうちの第１のシークエンスリードは第１の古細菌参照ゲノムと整列して、それにより第１の病原体リードとしてシークエンスリードを分類することができ、複数のシークエンスリードのうちの第２のシークエンスリードは第２の古細菌と整列して、それにより第２の病原体リードとしてシークエンスリードを分類する。病原体参照ゲノムに整列する任意のシークエンスリードは、非ヒトリードとして分類され得る。
【０２５６】
ブロック３７４０において、方法３７００は、病原体リードの量に基づいてパラメータを決定することを含んでもよい。病原体リードの量は、例えば、複数の病原体参照ゲノムに整列する二重計数シークエンスリードを含まずに、病原体参照ゲノムに整列する全てのリードの合計（例えば、第１の病原体リード、第２の病原体リード）であり得る。いくつかの実施形態では、第１の病原体リードの量は、特定の病原体参照ゲノムに整列させたシークエンスリードの量であってもよい。例として、パラメータは、第１の病原体リードのローカウント、濃度、割合、または割合であり得る。
【０２５７】
方法３７００は、異なる病原体の参照ゲノムに整列させたリードについて、第２の病原体リードの第２の量に基づいて第２のパラメータを決定することを含んでもよい。例として、第２のパラメータは、第２の病原体リードのローカウント、濃度、割合、または割合であり得る。第２のパラメータは、第１のパラメータとして対応する方法で計算されたパラメータであってもよい。病原体参照ゲノムは、Ｈａｌｏｎｏｔｉｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｐｕｍｉｌｕｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ、または本明細書に記載の任意の病原体由来のゲノムを含んでもよい。さらに、病原体参照ゲノムは、本明細書に記載の任意の病原体から任意のゲノムを除外してもよい。病原体参照ゲノムは、細菌ゲノム、ウイルスゲノム、および古細菌ゲノムを含んでもよくまたは除外してもよい。
【０２５８】
病原体参照ゲノムは、ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ、ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、またはｃａｎｄｉｄａｔｕｓのうちの少なくとも１つからの参照ゲノムを含んでもよい。参照ゲノムは、ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ、ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、またはｃａｎｄｉｄａｔｕｓのうちのいずれか１つ、２つ、３つ、または４つを含んでもよい。
【０２５９】
ブロック３７５０において、方法３７００は、カットオフ値にパラメータを比較することを含んでもよい。いくつかのタイプのパラメータが異なるタイプの病原体リードの量に基づいて決定される場合、各タイプの量は１つ以上のカットオフ値と比較してもよい。一例として、パラメータのいくつかのタイプの各パラメータは、単一のカットオフ値と比較されてもよい。他の例では、各タイプのパラメータは、そのタイプのパラメータに特有のカットオフ値と比較される。いくつかの例では、異なるタイプのパラメータによって指定される座標を有する多次元点は、線、平面、またはより高次元の平面であり得るカットオフ値と比較され得る。カットオフ値（単数または複数）は、膀胱癌を有する参照サンプルの第１のセットおよび膀胱癌を有さない対照サンプルの第２のセットから決定されてもよい。
【０２６０】
ブロック３７６０において、方法３７００は、その比較を使用して、膀胱癌のレベルの分類を決定することを含んでもよい。方法３７００は、第１の病原体の量がカットオフ値を超える場合に、ヒトが膀胱癌を患っていると決定することを含んでもよい。いくつかのパラメータが異なるタイプの量の病原体リードに基づいて決定される場合、ヒトが膀胱癌を有すると決定することは、複数のパラメータが１つ以上のカットオフ値を超える場合であり得る。いくつかの実施形態では、膀胱癌は、パラメータの一定の割合（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％）が１つ以上のカットオフ値を超える場合に決定され得る。癌の重症度は、カットオフ値と比較してパラメータがどれほど高いかによって決定され得る。いくつかの実施形態では、癌の重症度は、いくつのパラメータが１つ以上のカットオフ値を超えるかによって決定されてもよい。
【０２６１】
方法３７００は、本明細書に記載の癌のための任意の治療することを含んでもよい。場合によっては、方法３７００は、尿サンプルだけでなく生物学的サンプルにも適用されてもよい。場合によっては、方法３７００は、膀胱癌だけでなく、癌のレベルを決定することを含んでもよい。
【０２６２】
ＶＩＩＩ．材料および方法
上記に示した特定の結果を得るために、特定の技術を以下に記載する。一例に使用されたそのような技術は、他の例にも使用することができる。
【０２６３】
Ａ．移植患者のためのサンプル採取と処理
移植データは、尿サンプルを１１人の腎移植患者と臨床的に安定した２人の造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）患者から採取した。尿サンプルはまた、腎結石を有する患者、および５人の膀胱癌患者から採取された。可能であれば早朝の尿サンプルは避けて、朝の来診中または手術前の朝に尿サンプルを採取した。前述したように、３０〜５０ｍＬの尿を単純滅菌ボトルに採取し、４℃で保存し、採取から１時間以内に処理した（１２、２３）。尿の無細胞部分を遠心分離および上清の濾過によって単離した。
【０２６４】
Ｂ．ライブラリ調製、バイサルファイト変換、および超並列ＤＮＡシークエンシング
ＤＮＡライブラリは、製造業者の説明書に従ってＫＡＰＡ  ＨＴＰライブラリ調製キット（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて最大５００ｎｇの尿中ｃｆＤＮＡで調製した（７）。７５ｂｐペアエンドモードを使用したＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ２５００シーケンサーを使用して、バイサルファイトおよび非バイサルファイトＤＮＡシークエンシングを前述のとおり実施した（２４、２５）。ベースコーリングおよび品質管理の後、データは、メチル化データ解析パイプラインＭｅｔｈｙ−Ｐｉｐｅにより処理された（２６）。
【０２６５】
最大５００ｎｇの尿中ｃｆＤＮＡをライブラリ調製のために使用した。ＤＮＡライブラリは、メーカーの説明書に従ってＫＡＰＡ  ＨＴＰライブラリ調製キット（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて調製した（７）。バイサルファイトおよび非バイサルファイトＤＮＡシークエンシングを、前述のとおり実施した（２４、２５）。非バイサルファイトシークエンシングは、バイサルファイトシークエンシングに十分なＤＮＡがない場合にのみ、サイズプロファイル分析に使用された。７５ｂｐペアエンドモードを使用したＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ２５００シーケンサーを用いて、ＤＮＡライブラリを配列決定した。塩基呼び出しの後、アダプター配列および低品質塩基（すなわち品質スコア＜５）は除去された。次いで、ＦＡＳＴＱ形式のトリミングリードは、メチル化データ解析パイプラインＭｅｔｈｙ−Ｐｉｐｅによって処理された（２６）。尿サンプルあたり１レーンの配列決定を使用して、ヒト参照ゲノムにマッピングされた８，０００万の一意的な非重複リードの中央値を得た。
【０２６６】
Ｃ．抽出および定量化
尿中ｃｆＤＮＡの抽出および定量化のために、尿中ｃｆＤＮＡは、前述のように抽出して定量化した（１１、１２、２３）。ほとんどのサンプルで３０〜５０ｍＬの尿、最大２５０ｍＬがインビトロ培養実験に必要であった。手短に言えば、新鮮な尿を簡素な無菌ボトルに採取し、アリコートをＳｉｅｍｅｎｓ  Ｍｕｌｔｉｓｔｉｘ１０ＳＧシステムを用いて試験し、Ｒｏｃｈｅ  Ｃｏｂａｓ８０００を用いてクレアチニン濃度についてアッセイした。残りの尿サンプルについて、ｐＨ８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で０．５モル／ＬのＥＤＴＡを添加して１０ミリモル／Ｌの最終ＥＤＴＡ濃度にし、ヌクレアーゼ活性を阻害した（９）。ＥＤＴＡはエチレンジアミン四酢酸に相当する。
【０２６７】
次いで、尿を１０分間４℃で遠心分離し、上清を０．４５μｍのフィルター（Ｍｉｌｅｘ−ＧＶ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して濾過し、無細胞成分を単離した。次いで、無細胞尿を−８０℃で貯蔵するか、または直ちに抽出した。処理した尿１０ｍＬごとに、６モル／Ｌのグアニジンチオシアネート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）１５ｍＬと樹脂（Ｗｉｚａｒｄ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ精製システム；Ｐｒｏｍｅｇａ）１ｍＬを加え、混合物を室温で２時間培養した。次いで、製造業者の指示のとおりに、Ｗｉｚａｒｄ−Ｐｌｕｓ  ＭｉｎｉｐｒｅｐｓＤＮＡ精製システムを用いて、樹脂−ＤＮＡ複合体を単離し、洗浄し、および溶出した。採取した１０ｍＬの尿ごとに、尿中ｃｆＤＮＡの溶出に約１００μＬを使用した。
【０２６８】
抽出されたｃｆＤＮＡは、ＬＥＰ遺伝子を標的とする６２ｂｐのアンプリコンを用いてリアルタイム定量ＰＣＲを用いて定量化した（１１）。絶対ＤＮＡ濃度は、１．２５〜４０００ＧＥ／μＬの範囲の１１点のＤＮＡ標準を用いて決定され、全ての尿中ｃｆＤＮＡ濃度は、ＧＥ／ｍＬ尿で表される。
【０２６９】
次のように、末梢血白血球および組織からのゲノムＤＮＡの抽出および定量化を行うことができる。製造業者のプロトコルに従って、Ｑｕａｇｅｎ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを使用してバフィーコートサンプルを処理し、Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを使用して組織サンプルを処理した。
【０２７０】
Ｄ．ＳＮＰアレイを用いたドナーおよびレシピエント特異的遺伝子型の判定
全ての腎移植およびＨＳＣＴ患者のために、約２５０万のドナーとレシピエントのＳＮＰを、メーカーのプロトコルに従って、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｏｍｎｉ２．５ＳＮＰアレイを使用して検索した。ドナーおよびレシピエント生殖細胞系ＤＮＡは、バッフィーコート、口腔スワブ、または腎臓組織のいずれかから得た。これにより、移植症例ごとにドナーおよびレシピエントに固有のＳＮＰを特定することができた。ドナーおよびレシピエント特異的対立遺伝子の知識を超並列シークエンシングの結果と組み合わせて使用して、尿中のドナーおよびレシピエント特異的ｃｆＤＮＡ断片の割合を正確に確かめることが可能になった。
【０２７１】
Ｅ．尿中ＤＮＡ組織マッピングのためのメチル化マーカーとしてのメチル化可変領域の同定。
異なるヒト組織由来の全ゲノムバイサルファイトシークエンシングデータを用いて、メチル化デコンボリューション用の参照メチロームを構築した。正常サンプル中の尿中ｃｆＤＮＡの主要原因は、血球（血漿ｃｆＤＮＡの主要成分であり、腎臓後系でも放出される可能性がある）、腎臓、および尿路全体を覆った尿路上皮であろうと仮定した。好中球、Ｂ細胞、およびＴ細胞のための全ゲノムバイサルファイトシークエンシングデータは、公的に利用可能なリソース（Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ、ｗｗｗ．ｇｅｎｂｏｒｅｅ．ｏｒｇ／ｅｐｉｇｅｎｏｍｅａｔｌａｓ／ｉｎｄｅｘ．ｒｈｔｍｌ）、（２８）から入手した。この研究を始めたとき、腎臓または尿路上皮に関して利用可能な全ゲノムのメチル化データはなかった。したがって、死体の腎移植症例由来の組織ならびに腎尿管摘出術および根治的膀胱摘出術を受けている患者由来の隣接正常組織を得ることによって独自の参照メチロームを構築した。腎臓参照は、６人の患者から得られた、皮質および髄質の腎臓組織からのバイサルファイトシークエンシングデータを使用して編集され、３５倍の一倍体ゲノムカバレッジに配列決定された。尿路上皮参照は、４０倍の一倍体ゲノムカバレッジに配列決定された６人の患者の尿管および膀胱から得られた尿路上皮を含む。膀胱癌参照は、根治的膀胱摘出術中に得られ、８．５倍の一倍体ゲノムカバレッジに配列決定された膀胱腫瘍に基づいた。
【０２７２】
前述のように、メチル化マーカーを選択した（２２）。常染色体のＣｐＧアイランドとショアを重ならない５００ｂｐ単位に細分し、各単位のメチル化密度を各参照組織について決定した。メチル化可変領域を使用して、Ｉ型およびＩＩ型マーカーを同定した。Ｉ型マーカーは、他の全ての参照組織の平均レベルと比較して、１つの組織において３ＳＤ高いまたは低いメチル化密度を有する任意のゲノム遺伝子座を指す。ＩＩ型マーカーは、全ての組織型にわたって非常に変動しやすいメチル化密度を示したゲノム遺伝子座であった。（Ａ）最も高メチル化された組織のメチル化密度が最も低メチル化された組織のメチル化密度よりも少なくとも２０％高い場合、および（Ｂ）群の平均メチル化密度（すなわち、変動係数）で割ったときの全組織型にわたるメチル化密度のＳＤが少なくとも０．２５であった場合に、遺伝子座は非常に変動しやすいと考えられた。
【０２７３】
Ｆ．尿中ｃｆＤＮＡ中の異なる組織の寄与比率を判定するためのメチル化デコンボリューション
メチル化デコンボリューションの目的は、尿中ｃｆＤＮＡ内の各組織の寄与比率を決定することであった。サンらにより記載されたようにメチル化デコンボリューションを行った（２２）。簡潔に言うと、特定のマーカーで観察されたメチル化密度は、各組織からの寄与比率、および各組織中のそのマーカーのメチル化密度によって影響を受けた。
【０２７４】
二次プログラミング（３９）を使用して連立方程式を解いた。Ｉ型およびＩＩ型マーカー（合計１９４１８マーカー）の組み合わせリスト上の各メチル化マーカーについての組織パネルおよびそれらに対応するメチル化密度を含むマトリックスをまとめた。参照メチロームは腎臓、尿路上皮、好中球、およびリンパ球からなり、全ての組織からの寄与比率は１００％になる。これらの組織型は、尿路上皮以外に、それぞれ腎移植またはＨＳＣＴによって検証可能であることから、選択された。膀胱癌患者の術前および術後の尿サンプルを評価する際に、膀胱癌および小腸メチローム由来のメチル化マーカーを参照セットに加えた。
【０２７５】
Ｇ．尿中ｃｆＤＮＡの低メチル化およびコピー数異常の同定
ゲノム全体のメチル化密度および１Ｍｂビンによるコピー数は、８人の正常対照からの尿中ｃｆＤＮＡデータを用いて決定された。メチル化密度またはコピー数の有意な増加または減少は、正常対照の平均と比較して３を超えるｚスコアとして定義された。全体的なメチル化密度およびコピー数変化は、ｃｉｒｃｏｓプロットを使用して表した（３５）。
【０２７６】
ＩＸ．実施例システム
図３８は、本発明の一実施形態によるシステム３８００を示す。示されたシステムは、サンプルホルダ３８１０内の無細胞ＤＮＡ分子などのサンプル３８０５を含み、サンプル３８０５はアッセイ３８０８と接触して物理的特徴３８１５の信号を提供することができる。サンプルホルダの例は、アッセイのプローブおよび／もしくはプライマー、または液滴が（アッセイを含む液滴と共に）移動するチューブを含むフローセルであり得る。サンプルからの蛍光強度値などの物理的特徴３８１５は、検出器３８２０によって検出される。検出器は、データ信号を構成するデータ点を得るために、間隔（例えば、周期的な間隔）を空けて測定を行うことができる。一実施形態では、アナログデジタル変換器は、検出器からのアナログ信号をデジタル形式へと複数回変換する。データ信号３８２５は、検出器３８２０から論理システム３８３０へ送信される。データ信号３８２５は、ローカルメモリ３８３５、外部メモリ３８４０、または記憶装置３８４５に保存することができる。
【０２７７】
論理システム３８３０は、コンピュータシステム、ＡＳＩＣ、マイクロプロセッサなどであってもよいかまたは含んでもよい。それは、ディスプレイ（例えば、モニター、ＬＥＤディスプレイなど）およびユーザ入力装置（例えば、マウス、キーボード、ボタンなど）を含むこともでき、またはこれらに連結されることもできる。論理システム３８３０および他の構成要素は、スタンドアローンもしくはネットワーク接続されたコンピュータシステムの一部であってもよく、またはサーマルサイクラー装置に直接取り付けられてもよいか、もしくは組み込まれてもよい。論理システム３８３０は、処理装置３８５０において実行する最適化ソフトウェアを含むこともできる。
【０２７８】
本明細書で言及されるコンピュータシステムはいずれも、任意の適切な数のサブシステムを利用してもよい。このようなサブシステムの例は、コンピュータシステム１０の図３９に示されている。いくつかの実施形態において、コンピュータシステムは単一のコンピュータ装置を含み、サブシステムはこのコンピュータ装置の構成要素であり得る。他の実施形態では、コンピュータシステムは、それぞれがサブシステムであり、内部構成要素を備えた複数のコンピュータ装置を含むことができる。コンピュータシステムは、デスクトップコンピュータおよびラップトップコンピュータ、タブレット、携帯電話、ならびに他の携帯装置を含むことができる。
【０２７９】
図３９に示すサブシステムは、システムバス７５を介して相互接続される。プリンタ７４、キーボード７８、記憶装置（複数可）７９、ディスプレイアダプタ８２へ連結されるモニター７６、およびその他などの追加のサブシステムが示されている。Ｉ／Ｏコントローラ７１へ連結する周辺機器および入出力（Ｉ／Ｏ）装置は、入出力（Ｉ／Ｏ）ポート７７（例えば、ＵＳＢ、ＦｉｒｅＷｉｒｅ（登録商標））など、当該技術分野で既知の任意の数の手段によって、コンピュータシステムへ接続することができる。例えば、Ｉ／Ｏポート７７または外部インターフェース８１（例えば、Ｅｔｈｅｒｎｅｔ、Ｗｉ−Ｆｉなど）を使用して、Ｉｎｔｅｒｎｅｔなどの広域ネットワーク、マウス入力装置、またはスキャナへ、コンピュータシステム１０を接続することができる。システムバス７５を介した相互接続は、中央処理装置７３が各サブシステムと通信し、システムメモリ７２または記憶装置（複数可）７９（例えば、ハードドライブまたは光ディスクなどの固定ディスク）からの複数の命令の実行、およびサブシステム間の情報交換を制御することを可能にする。システムメモリ７２および／または記憶装置（複数可）７９は、コンピュータ可読媒体を具現化してもよい。別のサブシステムは、カメラ、マイクロホン、および加速度計、ならびにこれらに類するものなどのデータ収集装置８５である。本明細書に言及されるデータのうちのいずれも、ある構成要素から別の構成要素へ出力することができ、ユーザに対して出力することができる。
【０２８０】
コンピュータシステムは、内部インターフェースによって、または１つの構成要素から別の構成要素に接続して取り外し可能な記憶装置を介して、例えば外部インターフェース８１によって互いに接続された、複数の同一構成要素またはサブシステムを含むことができる。いくつかの実施形態では、コンピュータシステム、サブシステム、または装置は、ネットワーク上で通信することができる。このような例において、１つのコンピュータをクライアント、別のコンピュータをサーバとみなすことができ、これらは各々、同一のコンピュータシステムの一部であり得る。クライアントおよびサーバは各々、複数のシステム、サブシステム、または構成要素を含むことができる。
【０２８１】
実施形態の態様は、ハードウェア（例えば、アプリケーション特異的集積回路またはフィールドプログラマブルゲートアレイ）を使用して、および／またはモジュール式もしくは統合様式で概してプログラム可能な処理装置と共にコンピュータソフトウェアを使用して、制御論理の形態で実装することができる。本明細書で使用する場合、処理装置は、シングルコア処理装置、同一の集積チップ上のマルチコア処理装置、または回路基板上もしくはネットワーク化された複数の処理ユニットを含む。本開示および本明細書に提供される教示に基づいて、当業者は、ハードウェアを用いておよびハードウェアとソフトウェアとを併用して、本発明の実施形態を実施するための他のやりかたおよび／または方法を知り、認識することになっている。
【０２８２】
本出願に記載されるソフトウェア構成要素または関数のうちのいずれも、例えば、Ｊａｖａ、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｃ＃、Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ−Ｃ、Ｓｗｉｆｔなどの何らかの適切なコンピュータ言語、または例えば、従来の技術もしくはオブジェクト指向の技術を使用するＰｅｒｌもしくはＰｙｔｈｏｎなどのスクリプト言語を使用する、処理装置によって実行されるソフトウェアコードとして実装されてもよい。ソフトウェアコードは、記憶および／または伝送のためのコンピュータ可読媒体上に一連の命令またはコマンドとして保存することができる。適切な非一過性コンピュータ可読媒体は、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、リードオンリーメモリ（ＲＯＭ）、磁気媒体（ハードドライブもしくはフロッピーディスクなど）、または光学媒体（コンパクトディスク（ＣＤ）もしくはＤＶＤ（デジタル多用途ディスク）など）、およびフラッシュメモリなどを含むことができる。コンピュータ可読媒体は、このような記憶装置または伝送装置の任意の組み合わせであってもよい。
【０２８３】
このようなプログラムはまた、コードされ、インターネットを含む種々のプロトコルに従う有線ネットワーク、光ネットワーク、および／または無線ネットワークを介した伝送に適合した搬送波信号を使用して、伝送されてもよい。このようなものとして、コンピュータ可読媒体は、このようなプログラムでコードされたデータ信号を用いて生成されてもよい。プログラムコードでコードされたコンピュータ可読媒体は、互換性のある装置でパッケージ化されていても、または（例えば、インターネットダウンロードを介して）他の装置とは別個に提供されてもよい。いずれのこのようなコンピュータ可読媒体も、単一のコンピュータ製品（例えば、ハードドライブ、ＣＤ、またはコンピュータシステム全体）の上または内部に存在してもよく、システムまたはネットワーク内の異なるコンピュータ製品上またはその内部に存在してもよい。コンピュータシステムは、モニター、プリンタ、または本明細書に記載の結果のうちのいずれかをユーザへ提供するための他の適切なディスプレイを含み得る。
【０２８４】
本明細書記載の方法のうちのいずれも、全体的または部分的に、ステップを実行するように構成され得る１つ以上の処理装置を含むコンピュータシステムを用いて実施することができる。したがって、実施形態は、本明細書に説明される方法のうちのいずれかのステップを実行するように構成されたコンピュータシステムを対象とし得、潜在的には異なる構成要素がそれぞれのステップまたはそれぞれのステップ群を実行する。番号付けされたステップとして提示されるものの、本明細書の方法のステップは、同時にまたは異なる順序で実行することができる。加えて、これらのステップの部分が、他の方法の他のステップの部分と併用されてもよい。また、ステップの全部または部分は任意であってもよい。さらに、いずれの方法のうちのステップのいずれも、モジュール、ユニット、回路、またはこれらのステップを実施するための他の手段で実施することができる。
【０２８５】
特定の実施形態の具体的な詳細は、本発明の実施形態の趣旨および範囲から逸脱することなく、任意の適切な様式で組み合わせることができる。しかしながら、本発明の他の実施形態は、各個々の態様、またはこれらの個々の態様の具体的な組み合わせに関する具体的な実施形態に向けられ得る。
【０２８６】
本発明の例となる実施形態に関する先の説明は、図示および説明の目的で提示されている。徹底的であること、または本発明を説明された正確な形態に限定することは意図されず、多くの修正および変更が、先の教示に鑑みて可能である。
【０２８７】
前述の説明では、説明の目的のために、多くの詳細が、本技術の様々な実施形態の理解を提供するために記載されている。しかしながら、特定の実施形態がこれら一部の詳細なしで、または追加の詳細と共に実施され得ることは当業者には明らかであろう。
【０２８８】
いくつかの実施形態を説明したが、様々な修正、代替構成、および均等物は、本発明の趣旨から逸脱することなく使用されてもよいことが当業者によって認識されるであろう。さらに、本発明を不必要に曖昧にすることを避けるために、いくつかの周知のプロセスおよび要素は記載されていない。さらに、任意の特定の実施形態の詳細は、その実施形態の変形形態に必ずしも存在するとは限らず、または他の実施形態に追加されてもよい。
【０２８９】
値の範囲が提供される場合、各介在値はまた、下限の単位の１０分の１まで、文脈上明確に指示されていない限り、その範囲の上限と下限との間で、具体的に開示されていると理解されている。記載範囲内の任意の記載値または介在値と、その記載範囲内の任意の他の記載値または介在値との間の各狭い範囲が包含される。これらのより狭い範囲の上限および下限は、独立してその範囲に含まれてもまたは除外されてもよく、より狭い範囲に、上限および下限のいずれかを含む、上限も下限も含まない、または上限および下限の両方を含む各範囲もまた本発明に包含され、記載範囲内の任意の具体的な除外される限界値に従うものとする。記載された範囲が限界の一方または両方を含む場合、それらの含まれた限界の一方またはその両方を除外した範囲も含まれる。
【０２９０】
「ａ」、「ａｎ」または「ｔｈｅ」の記述は、それとは反対に具体的に示されない限り、「１つ以上」を意味することが意図される。「または」の使用は、それとは反対に具体的に示されない限り、「を除いてまたは」ではなく「を含んでまたは」を意味することが意図される。「第１」の構成要素への参照は、第２の構成要素が提供されることを必ずしも必要としない。そのうえ、「第１」または「第２」の構成要素への参照は、明示的に述べられていない限り、参照される構成要素を特定の場所に限定するものではない。用語「〜に基づいて」は、「少なくとも一部に基づいて」を意味することを意図している。
【０２９１】
本明細書に言及される特許、特許出願、刊行物、および明細書は全て、それらの全体が全ての目的のために参照により組み込まれる。いかなるものも、先行技術であるとは認められていない。
Ｘ．参照
１．Ｓｔｒｏｕｎ  Ｍ，Ｍａｕｒｉｃｅ  Ｐ，Ｖａｓｉｏｕｋｈｉｎ  Ｖ，Ｌｙａｕｔｅｙ  Ｊ，Ｌｅｄｅｒｒｅｙ  Ｃ，Ｌｅｆｏｒｔ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｏｒｉｇｉｎ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ＤＮＡ．Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ２０００；９０６：１６１−８．
２．Ｌｏ  ＹＭ，Ｃｏｒｂｅｔｔａ  Ｎ，Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ  ＰＦ，Ｒａｉ  Ｖ，Ｓａｒｇｅｎｔ  ＩＬ，Ｒｅｄｍａｎ  ＣＷ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｆｅｔａｌ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｍａｔｅｒｎａｌ  ｐｌａｓｍａ  ａｎｄ  ｓｅｒｕｍ  Ｌａｎｃｅｔ  １９９７；３５０：４８５−７．
３．Ｃｈｅｎ  ＸＱ，Ｓｔｒｏｕｎ  Ｍ，Ｍａｇｎｅｎａｔ  ＪＬ，Ｎｉｃｏｄ  ＬＰ，Ｋｕｒｔ  ＡＭ，Ｌｙａｕｔｅｙ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｐｌａｓｍａ  ＤＮＡ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １９９６；２：１０３３−５．
４．Ｌｏ  ＹＭ，Ｔｅｉｎ  ＭＳ，Ｐａｎｇ  ＣＣ，Ｙｅｕｎｇ  ＣＫ，Ｔｏｎｇ  ＫＬ，Ｈｊｅｌｍ  ＮＭ  Ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｄｏｎｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｐｌａｓｍａ  ｏｆ  ｋｉｄｎｅｙ  ａｎｄ  ｌｉｖｅｒ−ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ．Ｌａｎｃｅｔ  １９９８；３５１：１３２９−３０．
５．Ｃｈｉｕ  ＲＷＫ，Ｃｈａｎ  ＫＣＡ，Ｇａｏ  Ｙ，Ｌａｕ  ＶＹＭ，Ｚｈｅｎｇ  Ｗ，Ｌｅｕｎｇ  ＴＹ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ  ｐｒｅｎａｔａｌ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｆｅｔａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙ  ｂｙ  ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｍａｔｅｒｎａｌ  ｐｌａｓｍａ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００８；１０５：２０４５８−６３．
６．Ｌｅａｒｙ  ＲＪ，Ｓａｕｓｅｎ  Ｍ，Ｋｉｎｄｅ  Ｉ，Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓ  Ｎ，Ｃａｒｐｔｅｎ  ＪＤ，Ｃｒａｉｇ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｗｈｏｌｅ−ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ２０１２；４：１６２ｒａ１５４．
７．Ｃｈａｎ  ＫＣＡ，Ｊｉａｎｇ  Ｐ，Ｃｈａｎ  ＣＷＭ，Ｓｕｎ  Ｋ，Ｗｏｎｇ  Ｊ，Ｈｕｉ  ＥＰ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｈｙｐｏｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｐｙ  ｎｕｍｂｅｒ  ａｂｅｒｒａｔｉｏｎｓ  ｂｙ  ｐｌａｓｍａ  ＤＮＡ  ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２０１３；１１０：１８７６１−８．
８．Ｄｅ  Ｖｌａｍｉｎｃｋ  Ｉ，Ｖａｌａｎｔｉｎｅ  ＨＡ，Ｓｎｙｄｅｒ  ＴＭ，Ｓｔｒｅｈｌ  Ｃ，Ｃｏｈｅｎ  Ｇ，Ｌｕｉｋａｒｔ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ＤＮＡ  ｅｎａｂｌｅｓ  ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｈｅａｒｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ．Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ２０１４；６：２４１ｒａ７７．
９．Ｂｏｔｅｚａｔｕ  Ｉ，Ｓｅｒｄｙｕｋ  Ｏ，Ｐｏｔａｐｏｖａ  Ｇ，Ｓｈｅｌｅｐｏｖ  Ｖ，Ａｌｅｃｈｉｎａ  Ｒ，Ｍｏｌｙａｋａ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｅｘｃｒｅｔｅｄ  ｉｎ  ｕｒｉｎｅ：ａ  ｎｅｗ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｆｒｏｍ  ｃｅｌｌｓ  ｄｙｉｎｇ  ｉｎ  ａｎ  ｏｒｇａｎｉｓｍ．Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２０００；４６：１０７８−８４．
１０．Ａｌ−Ｙａｔａｍａ  ＭＫ，Ｍｕｓｔａｆａ  ＡＳ，Ａｌｉ  Ｓ，Ａｂｒａｈａｍ  Ｓ，Ｋｈａｎ  Ｚ，Ｋｈａｊａ  Ｎ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｙ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｌａｓｍａ  ａｎｄ  ｕｒｉｎｅ  ｏｆ  ｐｒｅｇｎａｎｔ  ｗｏｍｅｎ  ｕｓｉｎｇ  ｎｅｓｔｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｐｒｅｎａｔ  Ｄｉａｇｎ  ２００１；２１：３９９−４０２．
１１．Ｔｓｕｉ  ＮＢＹ，Ｊｉａｎｇ  Ｐ，Ｃｈｏｗ  ＫＣＫ，Ｓｕ  Ｘ，Ｌｅｕｎｇ  ＴＹ，Ｓｕｎ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｓｉｚｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｆｅｔａｌ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｕｒｉｎｅ  ｏｆ  ｐｒｅｇｎａｎｔ  ｗｏｍｅｎ  ｂｙ  ｐａｉｒｅｄ−ｅｎｄ  ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２０１２；７：ｅ４８３１９．
１２．Ｈｕｎｇ  ＥＣＷ，Ｓｈｉｎｇ  ＴＫＦ，Ｃｈｉｍ  ＳＳＣ，Ｙｅｕｎｇ  ＰＣ，Ｃｈａｎ  ＲＷＹ，Ｃｈｉｋ  ＫＷ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｄｏｎｏｒ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｕｒｉｎｅ  ｏｆ  ｓｅｘ−ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｒｅｎａｌ  ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ．Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２００９；５５：７１５−２２．
１３．Ｓｕ  Ｙ−Ｈ，Ｗａｎｇ  Ｍ，Ｂｒｅｎｎｅｒ  ＤＥ，Ｎｏｒｔｏｎ  ＰＡ，Ｂｌｏｃｋ  ＴＭ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｅｄ  Ｋ−ｒａｓ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｕｒｉｎｅ，ｐｌａｓｍａ，ａｎｄ  ｓｅｒｕｍ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｒ  ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ  ｐｏｌｙｐｓ．Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ２００８；１１３７：１９７−２０６．
１４．Ｃｈａｎ  ＫＣＡ，Ｌｅｕｎｇ  ＳＦ，Ｙｅｕｎｇ  ＳＷ，Ｃｈａｎ  ＡＴＣ，Ｌｏ  ＹＭＤ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｒｅｎａｌ  ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ＥＢＶ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００８；１４：４８０９−１３．
１５．Ｚｈａｎｇ  Ｊ，Ｔｏｎｇ  Ｋ−Ｌ，Ｌｉ  ＰＫＴ，Ｃｈａｎ  ＡＹＷ，Ｙｅｕｎｇ  Ｃ−Ｋ，Ｐａｎｇ  ＣＣＰ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｄｏｎｏｒ−ａｎｄ  Ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ＤＮＡ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  Ｕｒｉｎｅ  Ｓａｍｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｒｅｎａｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ：Ｕｒｉｎａｒｙ  ＤＮＡ  Ｃｈｉｍｅｒｉｓｍ．Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  １９９９；４５：１７４１−６．
１６．Ｓｚａｒｖａｓ  Ｔ，Ｋｏｖａｌｓｚｋｙ  Ｉ，Ｂｅｄｉ  Ｋ，Ｓｚｅｎｄｒｏｉ  Ａ，Ｍａｊｏｒｏｓ  Ａ，Ｒｉｅｓｚ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ａｎｄ  ｕｒｉｎａｒｙ  ＤＮＡ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ：ｕｒｉｎｅ  ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ  ｖｅｒｓｕｓ  ｕｒｉｎｅ  ｓｅｄｉｍｅｎｔ．Ｏｎｃｏｌ  Ｒｅｐ  ２００７；１８：４０５−９．
１７．Ｂｉｒｋｅｎｋａｍｐ−Ｄｅｍｔｒｏｄｅｒ  Ｋ，Ｎｏｒｄｅｎｔｏｆｔ  Ｉ，Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  Ｅ，Ｈｏｙｅｒ  Ｓ，Ｒｅｉｎｅｒｔ  Ｔ，Ｖａｎｇ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｂｉｏｐｓｉｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｂｌａｄｄｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ．Ｅｕｒ  Ｕｒｏｌ  ２０１６；７０：７５−８２．
１８．Ｌｉ  Ｙ，Ｚｈｏｎｇ  ＸＹ，Ｋａｎｇ  Ａ，Ｔｒｏｅｇｅｒ  Ｃ，Ｈｏｌｚｇｒｅｖｅ  Ｗ，Ｈａｈｎ  Ｓ．Ｉｎａｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔ  ｃｅｌｌ  ｆｒｅｅ  ｆｅｔａｌ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｕｒｉｎｅ  ｏｆ  ｎｏｒｍａｌ  ｐｒｅｇｎａｎｔ  ｗｏｍｅｎ  ｎｏｒ  ｉｎ  ｔｈｏｓｅ  ａｆｆｅｃｔｅｄ  ｂｙ  ｐｒｅｅｃｌａｍｐｓｉａ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ＨＥＬＬＰ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｊ  Ｓｏｃ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．２００３；１０：５０３−８．
１９．Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  ＡＦ，Ａｓｓｅｎｏｖ  Ｙ，Ｍａｒｔｉｎ−Ｓｕｂｅｒｏ  ＪＩ，Ｂａｌｉｎｔ  Ｂ，Ｓｉｅｂｅｒｔ  Ｒ，Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．Ａ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ  ｏｆ  １６２８  ｈｕｍａｎ  ｓａｍｐｌｅｓ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  ２０１２；２２：４０７−１９．
２０．Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ＲＥ，Ｋｕｎｄａｊｅ  Ａ，Ｍｅｕｌｅｍａｎ  Ｗ，Ｅｒｎｓｔ  Ｊ，Ｂｉｌｅｎｋｙ  Ｍ，Ｙｅｎ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  １１１  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｇｅｎｏｍｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ２０１５；５１８：３１７−３０．
２１．Ｈｏｕｓｅｍａｎ  ＥＡ，Ａｃｃｏｍａｎｄｏ  ＷＰ，Ｋｏｅｓｔｌｅｒ  ＤＣ，Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ＢＣ，Ｍａｒｓｉｔ  ＣＪ，Ｎｅｌｓｏｎ  ＨＨ，ｅｔ  ａｌ．ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ａｒｒａｙｓ  ａｓ  ｓｕｒｒｏｇａｔｅ  ｍｅａｓｕｒｅｓ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｍｉｘｔｕｒｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ．ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２０１２；１３：８６．
２２．Ｓｕｎ  Ｋ，Ｊｉａｎｇ  Ｐ，Ｃｈａｎ  ＫＣＡ，Ｗｏｎｇ  Ｊ，Ｃｈｅｎｇ  ＹＫＹ，Ｌｉａｎｇ  ＲＨＳ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｓｍａ  ＤＮＡ  ｔｉｓｓｕｅ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｂｙ  ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｆｏｒ  ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ  ｐｒｅｎａｔａｌ，ｃａｎｃｅｒ，ａｎｄ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２０１５；１１２：Ｅ５５０３−１２．
２３．Ｙｕ  ＳＣＹ，Ｌｅｅ  ＳＷＹ，Ｊｉａｎｇ  Ｐ，Ｌｅｕｎｇ  ＴＹ，Ｃｈａｎ  ＫＣＡ，Ｃｈｉｕ  ＲＷＫ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｆｅｔａｌ  ＤＮＡ  ｃｌｅａｒａｎｃｅ  ｆｒｏｍ  ｍａｔｅｒｎａｌ  ｐｌａｓｍａ  ｂｙ  ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２０１３；５９：１２２８−３７．
２４．Ｃｈａｎ  ＫＣＡ，Ｊｉａｎｇ  Ｐ，Ｚｈｅｎｇ  ＹＷＬ，Ｌｉａｏ  ＧＪＷ，Ｓｕｎ  Ｈ，Ｗｏｎｇ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｉｎ  ｐｌａｓｍａ：ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃｏｐｙ  ｎｕｍｂｅｒ  ａｂｅｒｒａｔｉｏｎｓ，ｓｉｎｇｌｅ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｖａｒｉａｎｔｓ，ａｎｄ  ｔｕｍｏｒａｌ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｂｙ  ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２０１３；５９：２１１−２４．
２５．Ｌｕｎ  ＦＭＦ，Ｃｈｉｕ  ＲＷＫ，Ｓｕｎ  Ｋ，Ｌｅｕｎｇ  ＴＹ，Ｊｉａｎｇ  Ｐ，Ｃｈａｎ  ＫＣＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ  ｐｒｅｎａｔａｌ  ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｂｙ  ｇｅｎｏｍｅｗｉｄｅ  ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｍａｔｅｒｎａｌ  ｐｌａｓｍａ  ＤＮＡ．Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２０１３；５９：１５８３−９４．
２６．Ｊｉａｎｇ  Ｐ，Ｓｕｎ  Ｋ，Ｌｕｎ  ＦＭＦ，Ｇｕｏ  ＡＭ，Ｗａｎｇ  Ｈ，Ｃｈａｎ  ＫＣＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｙ−Ｐｉｐｅ：ａｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ｐｉｐｅｌｉｎｅ  ｆｏｒ  ｗｈｏｌｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｄａｔａ  ａｎａｌｙｓｉｓ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２０１４；９：ｅ１００３６０．
２７．Ｌｕｉ  ＹＹＮ，Ｃｈｉｋ  ＫＷ，Ｃｈｉｕ  ＲＷＫ，Ｈｏ  ＣＹ，Ｌａｍ  ＣＷＫ，Ｌｏ  ＹＭＤ．Ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｏｒｉｇｉｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｄｎａ  ｉｎ  ｐｌａｓｍａ  ａｎｄ  ｓｅｒｕｍ  ａｆｔｅｒ  ｓｅｘ−ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２００２；４８：４２１−７．
２８．Ｈｏｄｇｅｓ  Ｅ，Ｍｏｌａｒｏ  Ａ，Ｄｏｓ  Ｓａｎｔｏｓ  ＣＯ，Ｔｈｅｋｋａｔ  Ｐ，Ｓｏｎｇ  Ｑ，Ｕｒｅｎ  ＰＪ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｃｈａｎｇｅｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｓｔａｔｅｓ  ａｃｃｏｍｐａｎｙ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｄｕｌｔ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２０１１；４４：１７−２８．
２９．Ｉｔｏ  Ｋ，Ｍｉｎａｍｉｕｒａ  Ｎ，Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｔ．Ｈｕｍａｎ  ｕｒｉｎｅ  ＤＮａｓｅ  Ｉ：ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ  ｗｉｔｈ  ｈｕｍａｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ＤＮａｓｅ  Ｉ，ａｎｄ  ｅｎｚｙｍｉｃ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｎｚｙｍｅ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９８４；９５：１３９９−４０６．
３０．Ｎａｄａｎｏ  Ｄ，Ｙａｓｕｄａ  Ｔ，Ｋｉｓｈｉ  Ｋ．Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ａｎｄ  ｂｏｄｙ  ｆｌｕｉｄｓ  ｂｙ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｒａｄｉａｌ  ｅｎｚｙｍｅ−ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ．Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  １９９３；３９：４４８−５２．
３１．Ｊｉａｎｇ  Ｐ，Ｃｈａｎ  ＣＷＭ，Ｃｈａｎ  ＫＣＡ，Ｃｈｅｎｇ  ＳＨ，Ｗｏｎｇ  Ｊ，Ｗｏｎｇ  ＶＷ−Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｌｅｎｇｔｈｅｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ  ｏｆ  ｐｌａｓｍａ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２０１５；１１２：Ｅ１３１７−２５．
３２．Ｕｎｄｅｒｈｉｌｌ  ＨＲ，Ｋｉｔｚｍａｎ  ＪＯ，Ｈｅｌｌｗｉｇ  Ｓ，Ｗｅｌｋｅｒ  ＮＣ，Ｄａｚａ  Ｒ，Ｂａｋｅｒ  ＤＮ，ｅｔ  ａｌ．Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  ｏｆ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｔｕｍｏｒ  ＤＮＡ．ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ  ２０１６；１２：ｅ１００６１６２．
３３．Ｆｅｉｎｂｅｒｇ  ＡＰ，Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  Ｂ．Ｈｙｐｏｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｅｓ  ｇｅｎｅｓ  ｏｆ  ｓｏｍｅ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅｉｒ  ｎｏｒｍａｌ  ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔｓ．Ｎａｔｕｒｅ  １９８３；３０１：８９−９２．
３４．Ｂｅｒｏｕｋｈｉｍ  Ｒ，Ｍｅｒｍｅｌ  ＣＨ，Ｐｏｒｔｅｒ  Ｄ，Ｗｅｉ  Ｇ，Ｒａｙｃｈａｕｄｈｕｒｉ  Ｓ，Ｄｏｎｏｖａｎ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｌａｎｄｓｃａｐｅ  ｏｆ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｏｐｙ−ｎｕｍｂｅｒ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ  ａｃｒｏｓｓ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ２０１０；４６３：８９９−９０５．
３５．Ｋｒｚｙｗｉｎｓｋｉ  Ｍ，Ｓｃｈｅｉｎ  Ｊ，Ｂｉｒｏｌ  Ｉ，Ｃｏｎｎｏｒｓ  Ｊ，Ｇａｓｃｏｙｎｅ  Ｒ，Ｈｏｒｓｍａｎ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｉｒｃｏｓ：ａｎ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｅｓｔｈｅｔｉｃ  ｆｏｒ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  ２００９；１９：１６３９−４５．
３６．Ｌｏ  ＹＭＤ，Ｃｈａｎ  ＫＣＡ，Ｓｕｎ  Ｈ，Ｃｈｅｎ  ＥＺ，Ｊｉａｎｇ  Ｐ，Ｌｕｎ  ＦＭＦ，ｅｔ  ａｌ．Ｍａｔｅｒｎａｌ  ｐｌａｓｍａ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｔｈｅ  ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｅｔｕｓ．Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ２０１０；２：６１ｒａ９１．
３７．Ｓｎｙｄｅｒ  ＭＷ，Ｋｉｒｃｈｅｒ  Ｍ，Ｈｉｌｌ  ＡＪ，Ｄａｚａ  ＲＭ，Ｓｈｅｎｄｕｒｅ  Ｊ．Ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ＤＮＡ  Ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ  ａｎ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅ  Ｆｏｏｔｐｒｉｎｔ  ｔｈａｔ  Ｉｎｆｏｒｍｓ  Ｉｔｓ  Ｔｉｓｓｕｅｓ−Ｏｆ−Ｏｒｉｇｉｎ．Ｃｅｌｌ  ２０１６；１６４：５７−６８．
３８．Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｎｅｔｗｏｒｋ．Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｎａｔｕｒｅ  ２０１４；５０７：３１５−２２．
３９．Ｍｅｅｒｓｃｈｅ  Ｋ  Ｖａｎ  ｄｅｎ，Ｓｏｅｔａｅｒｔ  Ｋ，Ｏｅｖｅｌｅｎ  Ｄ  Ｖａｎ．ｘｓａｍｐｌｅ（）：Ａｎ  Ｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｓａｍｐｌｉｎｇ  Ｌｉｎｅａｒ  Ｉｎｖｅｒｓｅ  Ｐｒｏｂｌｅｍｓ．Ｊ  Ｓｔａｔ  Ｓｏｆｔｗ  ２００９；３０：１−１５．
【図１】
2020503003.tif 000013
【図２】
2020503003.tif 000014
【図３】
2020503003.tif 000015
【図４Ａ】
2020503003.tif 000016
【図４Ｂ】
2020503003.tif 000017
【図４Ｃ】
2020503003.tif 000018
【図５】
2020503003.tif 000019
【図６Ａ】
2020503003.tif 000020
【図６Ｂ】
2020503003.tif 000021
【図７Ａ】
2020503003.tif 000022
【図７Ｂ】
2020503003.tif 000023
【図８Ａ】
2020503003.tif 000024
【図８Ｂ】
2020503003.tif 000025
【図９Ａ】
2020503003.tif 000026
【図９Ｂ】
2020503003.tif 000027
【図１０Ａ】
2020503003.tif 000028
【図１０Ｂ】
2020503003.tif 000029
【図１１Ａ】
2020503003.tif 000030
【図１１Ｂ】
2020503003.tif 000031
【図１２Ａ】
2020503003.tif 000032
【図１２Ｂ】
2020503003.tif 000033
【図１３Ａ】
2020503003.tif 000034
【図１３Ｂ】
2020503003.tif 000035
【図１３Ｃ】
2020503003.tif 000036
【図１３Ｄ】
2020503003.tif 000037
【図１４】
2020503003.tif 000038
【図１５Ａ】
2020503003.tif 000039
【図１５Ｂ】
2020503003.tif 000040
【図１６Ａ】
2020503003.tif 000041
【図１６Ｂ】
2020503003.tif 000042
【図１６Ｃ】
2020503003.tif 000043
【図１７Ａ】
2020503003.tif 000044
【図１７Ｂ】
2020503003.tif 000045
【図１７Ｃ】
2020503003.tif 000046
【図１８】
2020503003.tif 000047
【図１９Ａ】
2020503003.tif 000048
【図１９Ｂ】
2020503003.tif 000049
【図２０】
2020503003.tif 000050
【図２１Ａ】
2020503003.tif 000051
【図２１Ｂ】
2020503003.tif 000052
【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【図２１Ｅ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２４Ｄ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２８Ｃ】
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【図２８Ｄ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３１Ｃ】
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【図３１Ｄ】
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【図３１Ｅ】
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【図３１Ｆ】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３２Ｃ】
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【図３２Ｄ】
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【図３２Ｅ】
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【図３２Ｆ】
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【図３３】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【国際調査報告】
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