(57)【要約】  本発明は、精製、特にタンパク質精製の分野にある。本発明は、タンパク質及び他の生体分子の工業規模精製のための改善された技術を提供する。より具体的には、本発明は、クロマトグラフィーステップ、好ましくは半連続クロマトグラフィーステップを使用して、タンパク質、好ましくは抗体又は抗体断片などの目的の化合物を精製する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体分子生成物を、前記生体分子生成物及び少なくとも１つの不純物を含む供給原料から精製するための工業規模の方法であって、以下のステップを含むもの：
ａ）前記生体分子生成物がクロマトグラフィーマトリックスに結合するように、前記供給原料からの供給材料を前記クロマトグラフィーマトリックスにロードするステップ；
ｂ）溶出溶液を前記クロマトグラフィーマトリックスに適用することによって、前記クロマトグラフィーマトリックスから溶離液に前記生体分子生成物を溶出するステップ、
前記溶離液は以下を含む：
−精製された生体分子生成物を含む第１の画分；及び
−前記生体分子生成物と少なくとも１つの不純物の両方を含む、１つ又は２つ以上の先行する画分及び／又は後続する画分を含む第２の画分、
前記第１の画分は前記第２の画分と分離されて回収される；
ｃ）１つ又は２つ以上の容器に前記第２の画分を保持するステップ；
ｄ）前記第２の画分中の前記生体分子生成物が前記クロマトグラフィーマトリックスに結合するように、前記１つ又は２つ以上の容器からの前記第２の画分及び前記供給原料からの追加の供給材料を前記クロマトグラフィーマトリックスにロードするステップ、前記追加の供給材料は前記第２の画分と同時に又は続いてロードされる；ならびに
ｅ）溶出溶液を前記クロマトグラフィーマトリックスに適用することによって、前記クロマトグラフィーマトリックスから溶離液に前記生体分子生成物を溶出するステップ、前記溶離液は精製された生体分子生成物を含む；
ステップ（ａ）、ステップ（ｂ）、ステップ（ｄ）及びステップ（ｅ）の前記クロマトグラフィーマトリックスは同じクロマトグラフィーマトリックスである。
【請求項２】
ステップ（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）が繰り返される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）が少なくとも２回実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
第２の画分が、（ｉ）第１の画分の直前の先行する画分；及び／又は（ｉｉ）前記第１の画分の直後の後続する画分を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
以下を含む請求項１〜４のいずれかに記載の方法：
−ステップ（ａ）及び（ｂ）が複数回繰り返され；
−各ステップ（ｂ）で回収された第２の画分が一緒にプールされ；
−ステップ（ｃ）が、１つ又は２つ以上の容器に前記プールされた第２の画分を保持する；
−ステップ（ｄ）が、前記プールされた第２の画分中の生体分子生成物がクロマトグラフィーマトリックスに結合するように、前記１つ又は２つ以上の容器からの前記プールされた第２の画分を前記クロマトグラフィーマトリックスにロードすること。
【請求項６】
ステップ（ａ）が、クロマトグラフィーマトリックスに結合しない未結合の生体分子生成物を含有するフロースルーを回収することをさらに含み；
ステップ（ｄ）が、前記フロースルーを第２の画分及び／又は追加の供給材料と同時に又は続いて、前記クロマトグラフィーマトリックスにロードすることをさらに含む、
請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
１つ又は２つ以上の第２の画分をプロセシングして、生体分子のクロマトグラフィーマトリックスへの結合を促進することをさらに含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
プロセシングがステップ（ｃ）及び／又はステップ（ｄ）の間に行われる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
プロセシングが、１つ又は２つ以上の第２画分のｐＨ、イオン強度、濃度、温度及び／又は溶媒を変更すること、ならびに／あるいは前記１つ又は２つ以上の第２の画分の混合及び／又は脱気を含む、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
１つ又は２つ以上の第２の画分を試験することをさらに含む、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
１つ又は２つ以上の第２の画分を試験することが、前記１つ又は２つ以上の第２の画分の生体分子生成物の濃度；不純物の濃度；不純物の正体；ｐＨ；イオン強度；温度；溶媒；及び／又はガス濃度の１つ又は２つ以上を決定することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｃ）が、１つ又は２つ以上の第２の画分を少なくとも５分間保持することを含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ｃ）が、１つ又は２つ以上の第２の画分を一晩保持することを含む、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
クロマトグラフィーマトリックスが保持時間中に交換、洗浄又は更新される、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
生体分子生成物がタンパク質、抗体、抗体断片、ポリヌクレオチド又はポリペプチドである、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
供給原料が少なくとも２０リットル、任意に、少なくとも１００リットルの容積を有する、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
クロマトグラフィーマトリックスが少なくとも４リットルのベッドボリュームを有する、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
ステップ（ｂ）において、溶離液の体積がクロマトグラフィーマトリックスのベッドボリュームの少なくとも２倍であり、任意に、前記溶離液の体積が前記クロマトグラフィーマトリックスのベッドボリュームの２倍〜２０倍である、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
クロマトグラフィーマトリックスが、
イオン交換クロマトグラフィーマトリックス；
疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックス；
アフィニティークロマトグラフィーマトリックス；
ミックスモードクロマトグラフィーマトリックス；
キラルクロマトグラフィーマトリックス；及び
誘電クロマトグラフィーマトリックス
から選択される、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
クロマトグラフィーマトリックスがクロマトグラフィーカラム内にある、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
クロマトグラフィーマトリックスがクロマトグラフィー膜又はモノリス吸着器である、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
クロマトグラフィーマトリックスからの生体分子生成物の溶出が、少なくとも約０．２クロマトグラフィーマトリックス容積／分の流速で行われる、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
第１の画分の各々を合わせることをさらに含む、請求項１〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
精製された生体分子生成物をダイアフィルトレーション及び／又は濃縮することをさらに含む、請求項１〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
精製された生体分子生成物をナノ濾過することをさらに含む、請求項１〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
精製された生体分子生成物をさらなるクロマトグラフィー精製に供することをさらに含む、請求項１〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
精製された生体分子生成物を化学的に修飾することをさらに含む、請求項１〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
精製された生体分子生成物を薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又はアジュバントと共に製剤化することをさらに含む、請求項１〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
請求項１〜２８のいずれかに記載の方法によって得られる精製された生体分子生成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、精製、特にタンパク質精製の分野にある。本発明は、タンパク質及び他の生体分子の工業規模精製のための改善された技術を提供する。より具体的には、本発明は、クロマトグラフィーステップ、好ましくは半連続クロマトグラフィーステップを使用して、タンパク質、好ましくは抗体又は抗体断片などの目的の化合物を精製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質及び核酸分子の大規模で経済的な精製は、バイオテクノロジー産業にとってますます重要な課題である。一般に、タンパク質は、そのタンパク質の遺伝子を含む組換えプラスミドの挿入によって目的のタンパク質を産生するように操作された哺乳動物又は細菌細胞株を使用して、細胞培養によって産生される。使用される細胞株が生物であるため、これらに糖、アミノ酸及び成長因子を含有する複雑な増殖培地を供給しなければならない。目的のタンパク質を、細胞に供給される化合物の混合物及び細胞自体の副産物（供給流）から、ヒト治療薬として使用するのに十分な純度まで単離しなければならない。供給流からの不純物に関して、ヒトへの投与を意図したタンパク質について保健当局によって設定された基準は非常に高い。
【０００３】
工業用タンパク質の精製は、典型的には非常に大規模に行われる。抗体などの治療用タンパク質を製造する商業的バイオリアクターは、典型的には数百、数千又は数万リットルの培養培地を含有する。細胞は典型的には、例えば約６００ｎｍなどの適切な波長で増殖培地の光学濃度を測定することによって決定され得る所望のレベルまで増殖され、光学濃度増加が増殖培地中の細胞濃度の増加に対応する。
【０００４】
所望のレベルに達すると、典型的には粗タンパク質抽出物が調製される。粗抽出物は、粗抽出物を生成するための溶解、濾過及び／又は初期濃縮などの従来技術によって調製され得る。商業的バイオリアクターから処理される大量の培養培地は、それに対応して大量の粗抽出物を生成する。例えば、２０００リットルの細胞培養は、典型的には、通常数キログラムの所望のタンパク質を含有する、数百リットルの粗タンパク質抽出物容積をもたらし得る。
【０００５】
工業用タンパク質合成技術で生成される大量の粗タンパク質抽出物は、専用の精製技術を要する。極めて少量（典型的には数十〜数百ミリリットル）の粗タンパク質抽出物（供給原料）の精製を意図した実験室規模の技術は、汚染の防止の困難さ、効率的な処理の必要性、自動化の要件等のために、典型的には工業レベルへの拡張性に乏しい。したがって、タンパク質などの生体分子の大規模精製のために、工業規模の精製技術が開発されてきた。
【０００６】
タンパク質精製は、通常、アフィニティークロマトグラフィー（目的のタンパク質とクロマトグラフィーマトリックスに結合した特定のリガンドとの間の可逆的相互作用に基づいてタンパク質を分離する）；イオン交換クロマトグラフィー（帯電基とクロマトグラフィーマトリックスに結合した反対に帯電した分子の非特異的静電相互作用に基づいてタンパク質を分離する）；置換クロマトグラフィー（クロマトグラフィーマトリックスに対する動的親和性に基づいてタンパク質を分離する）；及びサイズ排除クロマトグラフィー（サイズに基づいてタンパク質を分離する）などのクロマトグラフィー技術を使用して達成される。生体分子を分離するために使用されるこれらの及び他のクロマトグラフィー技術の１つの共通の特徴は、通常樹脂と呼ばれる適切な分離マトリックスの存在である。クロマトグラフィーマトリックスは、不可逆的汚染、マトリックス材料の劣化、マトリックスの官能基での望ましくない反応等のために、典型的には高価であり、使用寿命が限られている。工業用タンパク質精製で処理する必要がある大量の粗タンパク質抽出物は、それに対応する大量のクロマトグラフィーマトリックスを要する。このようなマトリックスの高コストが、精製技術の効率を可能な限り最大化するための原動力となる。
【０００７】
タンパク質精製技術を設計する際に考慮しなければならないさらなる側面は、目的のタンパク質から除去する必要がある不純物の特性である。典型的には、粗タンパク質抽出物は、目的のタンパク質と比較してクロマトグラフィーマトリックスへの結合特性が有意に異なる不純物を含有している。このような不純物は、典型的には容易に除去される。他の不純物は、典型的には目的のタンパク質と類似の結合特性を有する。典型的には、これらの不純物は、ある程度の重複が観察されるように、少なくとも部分的に所望のタンパク質とマトリックスから共溶出し得る。したがって、目的のタンパク質及び不純物を含む供給原料を、典型的には、３つの成分：目的の生成物（すなわち、生体分子生成物（product biomolecule））；目的の生成物よりも弱くクロマトグラフィーマトリックスに結合する不純物；及び目的の生成物よりも強くクロマトグラフィーマトリックスに結合する不純物を含むと見なすことができる。
【０００８】
このような成分を分離する伝統的な技術は、バッチカラムクロマトグラフィーに依存する。供給原料をカラムにロードし、カラム流出液を小さな画分で回収する。カラムに最も弱く結合する供給原料の成分が最初に溶出する。したがって、目的の生成物のみを含有する画分に加えて、先行する画分は目的の生成物と目的の生成物ほど強くなくクロマトグラフィーマトリックスに結合する不純物の両方を含み；後続する画分は、目的の生成物と目的の生成物よりも強くクロマトグラフィーマトリックスに結合する不純物の両方を含む。治療用途で使用されるタンパク質に対する厳しい純度要件のために、これらの「重複画分」（すなわち、先行する画分と後続する画分）は伝統的には廃棄され、精製方法全体の効率を低下させる。
【０００９】
伝統的なクロマトグラフィー技術のさらなる側面は、オーバーロードの概念である。クロマトグラフィーマトリックスの結合容量は限られている。この容量に達すると、過剰な目的の生成物はマトリックスに結合できず、典型的には「オーバーロード」として失われる。さらに、マトリックスの選択性は、典型的には結合容量に近づくにつれて低下する。伝統的な技術では、オーバーロードタンパク質試料が失われる、又はさらに処理しなければならなくなり、汚染のリスクが高まる。
【００１０】
使用される標準的な工業技術の１つは、マルチカラム向流溶媒勾配精製（ＭＣＳＧＰ）である。ＭＣＧＳＰは、複数のクロマトグラフィーカラムに依存して、粗タンパク質抽出物を所望のレベルまで精製するクロマトグラフィー技術である。ＭＣＧＳＰでは、複数のクロマトグラフィーカラムが、粗タンパク質抽出物の流れ方向と反対の位置に切り替えられる。要約すると、目的のタンパク質がクロマトグラフィーマトリックス（樹脂）に結合するように、粗タンパク質抽出物が第１のカラムにロードされる。弱吸収不純物がマトリックスから洗い流されると、目的のタンパク質の溶出が開始される。所望のタンパク質の純粋な画分は保持されるが、先行重複画分と後続重複画分の両方が第２のカラムに向けられ、さらなる供給材料（粗タンパク質溶液）と合わせられる。次いで、第２のカラムでこのプロセスが繰り返され、重複画分がさらなるカラムに向けられる。理論的には、重複画分を第１のカラムに向け直すことができるが、実際には、再使用前の各カラムの洗浄、再平衡化等の時間を確保するために一連のカラムが典型的に使用される。このようにして、不純な重複画分は繰り返し精製サイクルにかけられるため、所望のタンパク質を高純度で得ることができる。
【００１１】
ＭＣＳＧＰは工業での大規模な使用を意図しているが、重大な欠点を伴う。上記の要約から明らかなように、ＭＳＣＧＰは最低２つの一致したクロマトグラフィーカラムを必要とし、実際には方法の効率を可能な限り最大化するために通常３つ以上のカラムが使用されることが多い。クロマトグラフィーで使用されるマトリックス（樹脂）のコストが高いため、複数のカラムの要件は、タンパク質製造コストを大幅に増加させることを意味する。複数の一致したカラムに加えて、精巧な流量制御装置及び制御ソフトウェア、ならびに各追加のカラムのためのインラインミキサー、ポンプ、バルブ、検出器及びハウジングを含む追加のクロマトグラフィーハードウェアが必要とされ、これらの全てがコストを増加させ、部品故障の可能性を増加させ、エラーの検証プロセス及び複雑な診断の複雑性を増加させるので、ＭＳＣＧＰ技術の別の課題は必要とされる機器の高度に複雑な性質である。ＭＳＣＧＰ技術のさらなる課題は、プロセスを連続的に運転するための要件である。これは、精製が行われるのに必要な時間（例えば、大量の培養物容積からの粗タンパク質抽出物）が標準的な作業慣行に従って結論付けられない場合に問題となり得る；例えばオペレーターに２４時間体制で長時間作業することを要求する。さらなる課題は、十分な分離を達成するために、遅い流速及び／又は大きなマトリックス容積が要求されることである。
【００１２】
このような考慮事項に照らして、本発明者らは、大規模タンパク質精製のための改善された技術の必要性を認識した。したがって、本発明は、工業規模でタンパク質及び他の生体分子を精製するための改善された方法を提供し、上記の課題の一部又は全てを解決することを意図している。
【発明の概要】
【００１３】
ＭＣＳＧＰが大規模な工業用タンパク質精製に適用されているが、本発明者らは、単一クロマトグラフィーマトリックス、例えば単一カラムでの目的の生成物（すなわち、生体分子生成物）の分離ならびに重複画分及び任意に、オーバーロード画分の再利用から大きな利益が生じることを認識している。単一マトリックスの使用は、複数のカラムを使用する先行技術の技術を超える大きな利点に関連している。複数のカラムではなくただ１つのカラムのみが必要とされるので、必要とされるマトリックス（樹脂）のコストを大幅に削減できる。カラムを運転するために必要な機器（例えば）流量制御装置及び制御ソフトウェアの複雑さも大幅に減少し、インラインミキサー、ポンプ、バルブ、検出器等などのクロマトグラフィーハードウェアの必要性も減少する。重要なことに、プロセスを不連続に（非同期で）運転することができ、これによりおおよそ稼働日に精製を実行し、長期間中断したりすることさえ可能になる。また、以前から知られている技術と比較して、比較的高い流速及び／又は低いマトリックス容積を使用して、適切な分離を達成することができる。
【００１４】
以前、本発明者は、国際公開第２０１７／１４０８８１号パンフレットで、混合物からタンパク質を精製するためのクロマトグラフィープロセスを報告した。国際公開第２０１７／１４０８８１号パンフレットで報告されているプロセスは、マトリックスの結合容量を超えるようにクロマトグラフィーマトリックスをロードし、未結合のタンパク質を含有するフロースルーをマトリックスに通過させ、その後、さらなる運転クロマトグラフィーサイクルでフロースルーをマトリックスにリロードすることを含む。本発明者は、ここで、供給原料からの供給材料をクロマトグラフィーマトリックスにロードし、生成物を溶出し、生体分子生成物と少なくとも１つの不純物の両方を含む溶離液の画分をマトリックスにリロードすることを含む新たなクロマトグラフィー技術を開発した。このような方法は、国際公開第２０１７／１４０８８１号パンフレットで報告されている方法とは異なり、精製収率の向上を含む重大な有益な効果を伴う。本発明の方法は、粗抽出物からの供給原料の初期部分精製後の「仕上げ」ステップに特に適している。
【００１５】
したがって、本発明は、精製化合物の収率及び純度を維持又は改善しながら、クロマトグラフィーマトリックスのより効率的で費用対効果の高い使用を伴う、生体分子生成物（目的の化合物、特に目的のタンパク質）を精製する方法を提供する。
【００１６】
したがって、本発明は、生体分子生成物及び少なくとも１つの不純物を含む供給原料から生体分子生成物を精製するための工業規模の方法であって、
ａ）生体分子生成物がクロマトグラフィーマトリックスに結合するように、供給原料からの供給材料をクロマトグラフィーマトリックスにロードするステップと；
ｂ）溶出溶液をクロマトグラフィーマトリックスに適用することによって、クロマトグラフィーマトリックスから溶離液に生体分子生成物を溶出し、
溶離液は：
−精製された生体分子生成物を含む第１の画分；及び
−生体分子生成物と少なくとも１つの不純物の両方を含む第２の画分であって、１つ又は２つ以上の先行する画分及び／又は後続する画分を含む第２の画分
を含み、第１の画分は第２の画分と分離されて回収されるステップと；
ｃ）１つ又は２つ以上の容器に第２の画分を保持するステップと；
ｄ）第２の画分中の生体分子生成物がクロマトグラフィーマトリックスに結合するように１つ又は２つ以上の容器からの第２の画分及び供給原料からの追加の供給材料をクロマトグラフィーマトリックスにロードし；追加の供給材料は第２の画分と同時に又は続いてロードされるステップと；
ｅ）溶出溶液をクロマトグラフィーマトリックスに適用することによって、クロマトグラフィーマトリックスから溶離液に生体分子生成物を溶出し、溶離液は精製された生体分子生成物を含むステップと
を含み；
ステップ（ａ）、ステップ（ｂ）、ステップ（ｄ）及びステップ（ｅ）のクロマトグラフィーマトリックスは同じクロマトグラフィーマトリックスである方法を提供する。
【００１７】
好ましくは、本発明では、生体分子生成物がタンパク質、抗体、抗体断片、ポリヌクレオチド又はポリペプチドである。
【００１８】
精製された生体分子生成物を薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又はアジュバントと共に製剤化することをさらに含む、本発明による方法も提供される。本発明はまた、本発明の方法によって得られる精製された生体分子生成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の方法で使用するためのセットアップの概略図である。種々の液体緩衝液成分がタンクに保持されており、バルブを介して多孔質クロマトグラフィーマトリックスに順次ポンプで送られる。クロマトグラフィーマトリックスから出た後、溶離液の画分は、本明細書で溶離液の画分とも呼ばれる溶離液の個別の容積を分析する検出器を通過する。生成された生体分子生成物を含む「第１の画分」（すなわち、目的の化合物の所望の特性、例えば前記化合物の濃度又は前記化合物の純度を示す溶離液の１つ又は２つ以上の画分）が回収される。残りの画分から、生体分子生成物と少なくとも１つの不純物の両方を含む「第２の画分」（すなわち、所望の特性を示さないが、依然として目的の化合物を含有し、原則としてさらなるプロセシング（processing）に適した画分）が、同じクロマトグラフィーマトリックスへのリローディングのために回収される。図１のセットアップでは、容器「再利用１」及び「再利用２」に別々に回収される２つの画分が存在する。  図２〜図７は、本発明による方法の図を示している。典型的なクロマトグラフィー分離は、生体分子生成物（目的のタンパク質／標的化合物）が固定化マトリックスに結合する結合段階、及び生体分子生成物（標的化合物）がマトリックスから化学的に除去される溶出段階を含み得る。中間には、典型的には、さらなる不純物を除去し、マトリックスの品質を維持するための洗い流し及び調整ステップが存在し、その間、これらの材料は典型的には廃棄に向けられる。図２〜図７に示される方法では、本発明によると、生体分子生成物（目的の化合物）及び少なくとも１つの不純物を含む混合物がクロマトグラフィーマトリックスにロードされ、前記ロードされたクロマトグラフィーマトリックスが洗い流され、生体分子生成物（目的の化合物）がクロマトグラフィーマトリックスから溶出される。精製された生体分子生成物を含む溶離液の「１つ又は２つ以上の第１の画分」（すなわち、目的の化合物の所望の特性、例えば前記化合物の濃度又は前記化合物の純度を示す画分）の１つ又は２つ以上が回収され、生成物としてプロセスから回収及び除去される。図２〜図７に示されるプロセスでは、１つもしくは複数の第１の画分の前の溶離液の少なくとも１つの画分及び／又は１つもしくは複数の第１の画分の後の溶離液の少なくとも１つの画分が同じクロマトグラフィーマトリックスにリロードされる。この手順を数回繰り返すことができ、プロセスは典型的には、生体分子生成物を含む混合物の容積（すなわち、供給原料の総容積）が使い果たされるまで続けられる。
【図２】本発明の方法の例を示す図である。供給原料のクロマトグラフィーマトリックスへのロード後、精製された生体分子生成物を含有する第１の画分が溶出される。第２の画分は、クロマトグラフィーマトリックスにリロードする前に任意に、プロセシングされる（例えば、希釈により）先行する画分及び／又は後続する画分（本明細書で定義される）を含む。このサイクルが複数回繰り返される。図２は後続する画分と先行する画分の両方がリロードされていることを示しているが、当業者であれば、本発明の方法が両方の画分をそのようにリロードすることを要しない−例えば、後続（後の）及び／又は先行（前の）画分の一方のみをマトリックスにリロードしてもよいことを理解するだろう。
【図３】本発明の方法の別の例を示す図である。図３に示されるプロセスでは、少なくとも１つの前の（先行）画分及び／又は少なくとも１つの後の（後続）画分が、後の運転クロマトグラフィーサイクルで同じクロマトグラフィーマトリックスに別々にリロードする前にプロセシングされる。
【図４】少なくとも１つの前の（先行）画分及び少なくとも１つの後の（後続）画分が合わせられ、後の運転クロマトグラフィーサイクルで同じクロマトグラフィーマトリックスにリロードする前に合わせた画分としてプロセシングされるプロセスを示す図である。
【図５】溶離液の合わせた画分の容積が有意に増加していることを除いて、図４に示されるプロセスと極めて類似であるプロセスを示す図である。合わせた画分の合わせた容積は、例えば希釈によって増加し得る。希釈は、マトリックスへのリローディング前の合わせた画分のプロセシングの例である。
【図６】少なくとも１つの前の（先行）画分及び少なくとも１つの後の（後続）画分が、供給原料からのさらなる供給材料（すなわち、クロマトグラフィーマトリックスに運転クロマトグラフィーサイクルでロードされる混合物のさらなる容積又はさらなる容積の一部）と合わせられ、クロマトグラフィーマトリックスに適用されるプロセスを示す図である。繰り返すが、この手順は数回繰り返すことができる。図６は後続する画分と先行する画分の両方がリロードされていることを示しているが、当業者であれば、本発明の方法が両方の画分をそのようにリロードすることを要しない−例えば、後続及び／又は先行する画分の一方のみをマトリックスにリロードしてもよいことを理解するだろう。
【図７】少なくとも１つの前の（先行）画分及び少なくとも１つの後の（後続）画分がフロースルー（図７では「再利用」と呼ばれる）と合わせられるプロセスを示す図である。このようなフロースルーは、生体分子生成物（目的の化合物）を含有するロードがクロマトグラフィーマトリックスから漏れるまでクロマトグラフィーマトリックスに適用されると得られる。したがって、この図は、本明細書でより詳細に説明されるように、過剰ロードの例を示している。図７は後続する画分と先行する画分の両方がリロードされていることを示しているが、当業者であれば、本発明の方法が両方の画分をそのようにリロードすることを要しない−例えば、後続及び／又は先行する画分の一方のみをマトリックスにリロードしてもよいことを理解するだろう。  図８〜図１４は、本発明による方法の複数のサイクル中に記録されたクロマトグラムを示している。図８〜図１４は、７つの運転サイクルを含む本発明の方法の例を提供する（すなわち、請求項１の方法に関して、ステップ（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）が５回繰り返される）。図８〜図１４は、複数のサイクルの再現性を示しており、本発明の方法を使用して、目的の化合物（例えば、生体分子生成物）を高収率で再現性よく得ることができることを実証している。図８は、クロマトグラフィーマトリックスの平衡化の初期段階とそれに続くロード段階（本発明の方法のステップ（ａ））を示している。ローディングが完了した後、マトリックスは洗い流され、次いで、目的の化合物（生体分子生成物）が、例えば勾配溶出でマトリックスから溶出され得る（方法のステップ（ｂ））。２６０ｎｍ、２８０ｎｍ及び３０５ｎｍで記録されたピークは、マトリックスからのタンパク質の溶出を示している。図９〜図１４は、本発明の方法の後のサイクルを示している。図９〜図１４では、ロード段階が本発明の方法のステップ（ｄ）に対応する。
【図８】例のサイクル１のクロマトグラムを示す図である。
【図９】例のサイクル２のクロマトグラムを示す図である。
【図１０】例のサイクル３のクロマトグラムを示す図である。
【図１１】例のサイクル４のクロマトグラムを示す図である。
【図１２】例のサイクル５のクロマトグラムを示す図である。
【図１３】例のサイクル６のクロマトグラムを示す図である。
【図１４】例のサイクル７のクロマトグラムを示す図である。
【図１５】サイクル１〜７のクロマトグラムの重ね合わせを示す図である。図１５は、本発明による方法からの標的生体分子の高収率を示している。
【図１６】プロテインＧ  ＨＰＬＣによって決定されたＣＥＸ勾配溶出での融合不純物及びＦａｂピークを示す図である。
【図１７】保持プールの分析されたＦａｂの量を要約する表である（保持プールの分析された量（主に非Ｆａｂを含有する画分９〜２０及び主に目的のＦａｂを含有する画分２３〜３１））。
【図１８】後期陽イオン交換ピーク保持プールでの収率増加％を要約する表である。
【図１９】後期陽イオン交換ピーク保持プールの純度増加％を要約する表である（図１７〜図１９では、サイクル７が異なる範囲の含まれる画分を有すること−初期ピークでは１〜８、後期ピークでは２４〜３１に留意されたい）。
【図２０】ベースラインと共に、サイクルにわたる後期陽イオン交換ピークの収率及び純度増加を示す図である。（各画分で容積が一定であるので、総収率の増加はまた全体の濃度の増加に相当することに留意されたい）。このデータ及び図１７〜図２０に要約されるデータをもたらす実験を、例に記載する。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
当技術分野で知られているタンパク質の多くの精製方法は、例えば低もしくは高ｐＨ、高塩濃度、又は精製されるタンパク質の生物学的活性を不可逆的に危険にさらし得る他の極端な条件の適用を要するステップを含むので、適切ではない。したがって、所望のタンパク質を十分な純度まで分離することは、手強い課題である。歴史的に、タンパク質精製スキームは、精製されるタンパク質と望ましくないタンパク質汚染物質との間のサイズ、電荷及び溶解度という分子特性の違いに基づいてきた。これらのパラメータに基づくプロトコルには、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、示差沈殿などが含まれる。
【００２１】
抗体及び抗体断片は、様々な治療分野でますます重要になっている。抗体及び抗体断片を産生する最も重要な方法の１つは、組換え技術によるものである。このような技術は、宿主細胞を使用して所望の抗体を発現させ、次いで、これを産生培地から分離し、精製する。
【００２２】
抗体はグリコシル化を必要とするので、真核細胞、特にＣＨＯ、ＰＥＲ．Ｃ６、ＮＳ０、ＢＨＫ又はＳｐ２／０細胞などの哺乳動物細胞を使用した真核生物発現系で一般に発現される。真核生物発現系では、抗体などの発現される目的のタンパク質が、一般に細胞培養培地に分泌される。その後、培地を、例えば遠心分離又は濾過によって、タンパク質分泌細胞から容易に分離することができる。目的のタンパク質は、典型的には、例えばクロマトグラフィーによるさらなる精製を要する。
【００２３】
種々のクロマトグラフィー技術、特に大規模な工業規模の精製方法に使用されるクロマトグラフィーマトリックスは、非常に高価である。これらは一般的に、洗浄後に再使用される。使用される洗浄剤の過酷な性質のために、クロマトグラフィーマトリックスの効率は時間とともに低下する。典型的には、クロマトグラフィーマトリックスは、例えば、それらの完全な最大タンパク質結合容量が活用されないため、当技術分野ではあまり効率的に使用されない。当技術分野では、収率を改善するため、それらの完全容量を下回る目的のタンパク質がロードされるように、クロマトグラフィーマトリックスが使用される。タンパク質マトリックスに目的のタンパク質をその完全容量までロードすると、フロースルーで多くの目的のタンパク質が失われる。クロマトグラフィーマトリックスのコストが高く、寿命が限られているため、当技術分野では、クロマトグラフィーマトリックスを最適に使用する方法が必要である。
【００２４】
大規模な細胞培養方法からの粗タンパク質調製物は、典型的には、単一精製サイクルでは精製できない。精製されるタンパク質の量のため、細胞培養の産物を精製するために同じ精製方法のいくつかのサイクルが必要となる。したがって、精製されるタンパク質混合物は、複数のクロマトグラフィーサイクルも含む複数の精製サイクルでバッチごとに頻繁に精製される。生物製剤の大規模製造方法では、連続方法も実装されている。連続クロマトグラフィーでは、方法要件に応じて、いくつかの同一のカラムが、直列及び／又は並列で運転されることを可能にする配置で接続される。単一カラム又はバッチクロマトグラフィーと比較して、単一クロマトグラフィーサイクルは、ローディング、洗い流し、溶出及び再生などのいくつかの連続したステップに基づき、複数の同一のカラムに基づく連続クロマトグラフィーでは、これらのステップ全てがそれぞれ異なるカラムで同時に行われる。連続的なクロマトグラフィー運転により、クロマトグラフィー樹脂のより良い利用率が得られ、処理時間が短縮され、緩衝液要件が軽減され、これらの全てが方法の経済性に有益である。連続クロマトグラフィーを運転する特定の方法は、擬似移動床（ＳＭＢ）クロマトグラフィーと呼ばれる。擬似移動床クロマトグラフィーでは、系を構成する全てのクロマトグラフィーカラムが、試料流れと反対方向に定期的かつ同時に移動する。カラムの移動は、精巧なセットアップを必要とするカラムへの／からの入口及び出口流の適切なリダイレクションによって実現される。したがって、ＳＭＢ法などの連続クロマトグラフィー方法は、大きな複雑性を伴う。
【００２５】
当技術分野では、単一の大きなクロマトグラフィーカラムではなく、複数の小さなカラムを連続して使用し、より高い結合容量までロードする半連続クロマトグラフィー方法が記載されている。各カラムのフロースルーが、後のカラムに直接ロードされた。あるいは、第１のカラムのフロースルーが、目的のタンパク質との混合物を含む第１の容器に向けられ、次いで、第１のカラムにリロードされた（Ｍａｈａｊａｎ、Ｇｅｏｒｇｅら２０１２）。使用されるカラムは非常に小さな実験室規模のものであり、著者らは、複数のカラムを使用する連続モードクロマトグラフィーが処理時間を短縮できるという利点を提供すると結論付けた。
【００２６】
いくつかのクロマトグラフィーカラムを連続で使用するには、コストを増加させ、部品故障の可能性を増加させ、エラーの検証プロセス及び複雑な診断の複雑性を増させる精巧な流量制御装置及び制御ソフトウェア、ならびに各追加のカラムのためのポンプ、バルブ、検出器及びハウジングを含む追加のクロマトグラフィーハードウェアが必要である。さらに、あるカラムからのフロースルーを隣接する受入カラムのために連続して正しい期間に揃えるために、遅延期間を一致するように導入して、運転速度を低下させなければならない。各追加の受入カラムを、交互に開始及び停止して、これらの期間中非アクティブであるカラムを得なければならないので、運転が停止又は再開されるたびに追加の生産性ペナルティを被る。
【００２７】
したがって、クロマトグラフィーマトリックスの使用を伴う、タンパク質、例えば抗体を精製するための単純で、効率的で、費用対効果の高い方法が必要である。本発明の方法は、この必要性に対処することを意図している。
【００２８】
本発明の方法
本発明の根底にある課題は、本明細書で提供される方法によって解決される。
【００２９】
本発明は、生体分子生成物及び少なくとも１つの不純物を含む供給原料から生体分子生成物を精製するための工業規模の方法であって、
ａ）生体分子生成物がクロマトグラフィーマトリックスに結合するように、供給原料からの供給材料をクロマトグラフィーマトリックスにロードするステップと；
ｂ）溶出溶液をクロマトグラフィーマトリックスに適用することによって、クロマトグラフィーマトリックスから溶離液に生体分子生成物を溶出し、
溶離液は：
−精製された生体分子生成物を含む第１の画分；及び
−生体分子生成物と少なくとも１つの不純物の両方を含む第２の画分であって、１つ又は２つ以上の先行する画分及び／又は後続する画分を含む第２の画分
を含み、第１の画分は第２の画分と分離されて回収されるステップと；
ｃ）１つ又は２つ以上の容器に第２の画分を保持するステップと；
ｄ）第２の画分中の生体分子生成物がクロマトグラフィーマトリックスに結合するように、１つ又は２つ以上の容器からの第２の画分及び供給原料からの追加の供給材料をクロマトグラフィーマトリックスにロードし；追加の供給材料は第２の画分と同時に又は続いてロードされるステップと；
ｅ）溶出溶液をクロマトグラフィーマトリックスに適用することによって、クロマトグラフィーマトリックスから溶離液に生体分子生成物を溶出し、溶離液は精製された生体分子生成物を含むステップと
を含み；
ステップ（ａ）、ステップ（ｂ）、ステップ（ｄ）及びステップ（ｅ）のクロマトグラフィーマトリックスは同じクロマトグラフィーマトリックスである方法を提供する。
【００３０】
以下で詳細に説明されるように、ステップ（ｄ）は、供給原料からの追加の供給材料を第２の画分と同時に又は続いてクロマトグラフィーマトリックスにロードすることを含む。
【００３１】
好ましくは、本発明の方法では、ステップ（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）が繰り返される。好ましくは、ステップ（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）は、少なくとも２回、より好ましくは少なくとも３回、例えば少なくとも４回、例えば少なくとも５回、例えば少なくとも１０回又はそれ以上実行される。当業者であれば、供給原料の容積、供給原料中の生体分子生成物の純度、供給原料中に存在する不純物の特性等に従って、これらのステップを繰り返す適切な回数を容易に選択することができるだろう。
【００３２】
ステップ（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）が１回繰り返される場合、方法が３つのローディング／溶出サイクル（すなわち、ステップ（ａ）の第１のロードサイクル；ステップ（ｂ）の第１の溶出サイクル；ステップ（ｄ）の第２のロードサイクル；第２のステップ（ｂ）の第２の溶出サイクル；第２のステップ（ｄ）の第３のロードサイクル及びステップ（ｅ）の第３の溶出サイクル）を含むことが明らかであるだろう。ステップ（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）が２回繰り返される場合、本発明の方法は、４つのローディング／溶出サイクル（すなわち、ステップ（ａ）の第１のロードサイクル；ステップ（ｂ）の第１の溶出サイクル；ステップ（ｄ）の第２のロードサイクル；第２のステップ（ｂ）の第２の溶出サイクル；第２のステップ（ｄ）の第３のロードサイクル；第３のステップ（ｂ）の第３の溶出サイクル；第３のステップ（ｄ）の第４のロードサイクル及びステップ（ｅ）の第４の溶出サイクル）を含む。換言すると、ステップ（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）がｎ回繰り返される場合（ｎは正の整数である）、方法は（ｎ＋２）のロード／溶出サイクルを含む。
【００３３】
好ましくは、ステップ（ａ）及び（ｂ）が複数回繰り返される。したがって、供給原料からの供給材料は、複数の容積でクロマトグラフィーマトリックスに適用され、第１の画分及び第２の画分は、供給材料の各ローディング後にクロマトグラフィーマトリックスから溶出され得る。回収された第２の画分は、好ましくは一緒にプールされ得る。ステップ（ｃ）は、好ましくは１つ又は２つ以上の容器にプールされた第２の画分を保持することを含む。あるいは、ステップ（ａ）及び（ｂ）の各繰り返し後に得られる第２の画分は、１つ又は２つ以上の容器に別々に保持され得る。次いで、第２の画分は、第２の画分中の生体分子生成物がクロマトグラフィーマトリックスに結合するように、クロマトグラフィーマトリックスに単一容積又は複数の容積のいずれかとしてリロードされ得る。したがって、好ましくは、ステップ（ａ）及び（ｂ）が複数回繰り返され；各ステップ（ｂ）で回収された第２の画分が一緒にプールされ；ステップ（ｃ）が、１つ又は２つ以上の容器にプールされた第２の画分を保持することを含み；ステップ（ｄ）が、プールされた第２の画分中の生体分子生成物がクロマトグラフィーマトリックスに結合するように、１つ又は２つ以上の容器からのプールされた第２の画分をクロマトグラフィーマトリックスにロードすることを含む。
【００３４】
第２の態様では、目的の化合物を含む混合物から目的の化合物を精製する方法であって、
ａ）第１の運転クロマトグラフィーサイクルで、第１の容器からの目的の化合物を含む混合物を、化合物がクロマトグラフィーマトリックスに結合するように運転されるクロマトグラフィーマトリックスにロードするステップと；
ｂ）クロマトグラフィーマトリックスから目的の化合物を溶出し、目的の化合物を含有する溶離液を溶離液の画分として回収するステップと；
ｃ）溶離液の１つ又は２つ以上の画分を、目的の化合物がクロマトグラフィーマトリックスに結合するように運転される同じクロマトグラフィーマトリックスにリロードするステップと
を含む方法が提供される。
【００３５】
第２の態様では、好ましくは、ステップｃ）のリロードすることが、さらなる運転クロマトグラフィーサイクルで、溶離液の１つ又は２つ以上の画分を、目的の化合物がクロマトグラフィーマトリックスに結合するように運転される同じクロマトグラフィーマトリックスにリロードすることである。したがって、それによると、第２の態様の方法は、
ａ）第１の運転クロマトグラフィーサイクルで、第１の容器からの目的の化合物を含む混合物を、化合物がクロマトグラフィーマトリックスに結合するように運転されるクロマトグラフィーマトリックスにロードするステップと；
ｂ）クロマトグラフィーマトリックスから目的の化合物を溶出し、目的の化合物を含有する溶離液を溶離液の画分として回収するステップと；
ｃ）さらなるクロマトグラフィーサイクルで、溶離液の１つ又は２つ以上の画分を、目的の化合物がクロマトグラフィーマトリックスに結合するように運転される同じクロマトグラフィーマトリックスにリロードするステップと
を含み得る。
【００３６】
好ましくは、第２の態様では、さらなる運転クロマトグラフィーサイクルが、直後のクロマトグラフィーサイクルである。
【００３７】
あるいは、第２の態様の別の実施形態では、ステップｃ）のリロードすることが、同じ運転クロマトグラフィーサイクルで、溶離液の１つ又は２つ以上の画分を、目的の化合物がクロマトグラフィーマトリックスに結合するように運転される同じクロマトグラフィーマトリックスにリロードすることである。したがって、それによると、方法は、
ａ）第１の運転クロマトグラフィーサイクルで、第１の容器からの目的の化合物を含む混合物を、化合物がクロマトグラフィーマトリックスに結合するように運転されるクロマトグラフィーマトリックスにロードするステップと；
ｂ）クロマトグラフィーマトリックスから目的の化合物を溶出し、目的の化合物を含有する溶離液を溶離液の画分として回収するステップと；
ｃ）同じクロマトグラフィーサイクルで、溶離液の１つ又は２つ以上の画分を、目的の化合物がクロマトグラフィーマトリックスに結合するように運転される同じクロマトグラフィーマトリックス、すなわち第１の運転クロマトグラフィーサイクルにリロードするステップと
を含み得る。
【００３８】
好ましくは、目的の化合物が、本明細書で定義される生体分子生成物である。
【００３９】
上記の議論から、本発明の方法が、供給原料（すなわち、目的の化合物、すなわち、生体分子生成物を含む混合物）をマトリックスにロードし；マトリックスから生体分子生成物（目的の化合物）を溶出し；精製された生体分子生成物を含む「第１の画分」（すなわち、所望の特性を有する画分）ならびに生体分子生成物及び少なくとも１つの不純物を含む「第２の画分」（すなわち、所望の特性を有さない画分）を回収し；１つ又は２つ以上のこのような第２の画分を同じクロマトグラフィーマトリックスにリロードすることを含むことが明らかであるだろう。本発明のこれらの態様及び他の態様を以下で詳細に説明する。
【００４０】
保持される画分
上記のように、本発明の方法は、供給原料からの供給材料をクロマトグラフィーマトリックスにロードし、マトリックスから目的の化合物、すなわち生体分子生成物を溶出することを含む。したがって、溶離液は、精製された生体分子生成物を含む１つ又は２つ以上の「第１の画分」を含む。溶離液は、生体分子生成物及び少なくとも１つの不純物を含む１つ又は２つ以上の「第２の画分」も含む。
【００４１】
１つ又は２つ以上の第１の画分は、本明細書では「所望の特性を有する画分」、又は「同じクロマトグラフィーマトリックスにリロードされない溶離液の画分」とも呼ばれる。第２の画分は、本明細書では「望ましくない特性を有する画分」、又は「同じクロマトグラフィーマトリックスにリロードされる溶離液の画分」とも呼ばれる。
【００４２】
当業者であれば、容易に本発明の方法のステップ（ｄ）でクロマトグラフィーマトリックスに（リ）ロードされる溶離液の画分を特定し、精製された生体分子生成物を含む画分からこのような画分を区別することができるだろう。任意の適切な手段を使用して、本発明の方法のステップ（ｄ）でクロマトグラフィーマトリックスに（リ）ロードされる溶離液の画分を特定することができる。例えば、（リ）ロードされる画分は、得られた溶離液の体積又は方法の実行時間を決定することによって（すなわち、供給原料の性質ならびに第１及び第２の画分の特性の事前に学習された知識に基づいて）特定することができる。あるいは、（リ）ロードされる画分は、方法の過程で取得された測定値に基づいて特定することができる。例えば、第１の画分は、好ましくは最小濃度の生体分子生成物（目的の化合物）及び／又は最大濃度の生体分子生成物以外の化合物、すなわち不純物を有する。好ましくは、第１の画分は、最小濃度の生体分子生成物（目的の化合物）を有する。
【００４３】
同様に、本発明の方法のステップ（ｄ）でクロマトグラフィーマトリックスに（リ）ロードされる第２の画分は、好ましくは最大濃度の目的の化合物もしくは生体分子生成物及び／又は最小濃度の目的の化合物以外の化合物、すなわち不純物を有する。好ましくは、第２の画分は、最小濃度の目的の化合物以外の化合物（不純物）を有する。
【００４４】
溶離液の１つもしくは複数の画分及び／又はフロースルー（以下参照）中の目的のタンパク質又は任意の他の分子の濃度は、それだけに限らないが、光学吸光度又は蛍光の測定などの当技術分野で知られている任意の技術によって本発明の方法で測定することができる。
【００４５】
目的の化合物、特に目的のタンパク質は、試料中の他のタンパク質不純物によって引き起こされる、バックグラウンド紫外吸光度又は蛍光シグナルの定常レベルを超えた紫外吸光度又は蛍光シグナルの時間経過での増加又は減少を観察することによって、本発明の方法で、試料（例えば、第１の画分、第２の画分及び／又はフロースルー）において決定することができる。
【００４６】
試料（例えば、第１の画分、第２の画分及び／又はフロースルー）中の目的の化合物、特に目的のタンパク質の濃度は、当技術分野で知られている任意の適切な波長、例えば２８０ｎｍでの紫外吸光度又は蛍光によって、また試料中のタンパク質不純物からの過剰なシグナルが存在する場合には、試料中の目的のタンパク質の検出を可能にするために、好ましくは２９０ｎｍ、３００ｎｍ又は３１０ｎｍなどの最適以下励起及び／又は発光波長を使用して、本発明の方法で測定することができる。
【００４７】
試料中の目的の化合物の濃度は、オンライン、アットライン又はオフラインで決定され得る。濃度をオンラインで決定することは、濃度が、例えばクロマトグラフィーマトリックスの出口に接続されている、又は前記試料がリアルタイムで回収される１つもしくは複数の容器にもしくは容器内に配置されている検出器で、本発明の方法で決定されることを意味する。濃度をアットラインで決定することは、クロマトグラフィーマトリックスの出口又は前記試料が回収される１つもしくは複数の容器から採取された標本から濃度が決定されることを意味する。濃度をオフラインで決定することは、クロマトグラフィーマトリックスの出口又は前記試料が回収される１つもしくは複数の容器から採取される標本から濃度が決定され、マトリックスから離れて配置された、すなわち別室の検出器で遅延後に測定されることを意味する。好ましくは、試料の濃度がオンライン又はアットライン、より好ましくはオンラインで決定される。
【００４８】
当業者であれば、試料中の不純物の濃度を、試料中の生体分子生成物の濃度を測定するために使用されるのと同じ方法で測定することができることを認識するであろう。
【００４９】
したがって、当業者であれば、本発明において、１つ又は２つ以上の第１の画分が１つ又は２つ以上の第２の画分と異なることを理解するだろう。第１の画分は、第２の画分とは分離されて回収される。典型的には、第１の画分はクロマトグラフィーマトリックスに（リ）ロードされないが、第２の画分はさらなる精製のためにクロマトグラフィーマトリックスに（リ）ロードされる。第１の画分は精製された生体分子生成物を含み、１つ又は２つ以上の第２の画分は生体分子生成物と少なくとも１つの不純物を含む、すなわち、１つ又は２つ以上の第２の画分は、精製された生体分子生成物を含まない。
【００５０】
本明細書で使用される場合、「精製された」生体分子生成物という用語は、生体分子生成物が１００％純粋であることを必ずしも必要としない。精製された生体分子生成物は、許容されるレベル以下の不純物を含有してもよく、このようなレベルは、供給原料中の不純物のレベルよりも低いことを条件とする。精製された生体分子生成物は、不純物を実質的に含まないことができる（例えば画分中の全ての生体分子に対して、例えば重量％により決定すると、例えば、少なくとも５０％純粋、例えば少なくとも７０％純粋、より好ましくは少なくとも９０％純粋、例えば少なくとも９５％純粋、少なくとも９７％純粋、好ましくは少なくとも９８又は９９％純粋）。不純物は、生体分子生成物以外の生体分子を含んでもよい、又は修飾もしくは分解された生体分子生成物を含んでもよい。第２の画分中に存在する不純物は、典型的には第１の画分中に存在する又は保持される不純物と異なる。
【００５１】
同様に、上記の第２の態様を特に参照すると、同じクロマトグラフィーマトリックスにリロードされる溶離液の１つ又は２つ以上の画分は、所望の特性を有する溶離液の１つ又は２つ以上の画分と異なる。所望の特性を有する溶離液の１つ又は２つ以上の画分は、同じクロマトグラフィーマトリックスにリロードされない。以下にさらに記載されるように、このようなリロードされない画分が、クロマトグラフィー処理とは異なる方法によってさらに処理される、又は使用準備ができていることは本発明の範囲内である。リロードされない画分の数は、クロマトグラフィー処理の根底にある目的に応じて、当業者によって決定されるだろう。例えば、溶離液の１つ又はいくつかの画分で目的の化合物の一定の含有量又は濃度に達した場合、このような１つ又はいくつかの画分は同じクロマトグラフィーマトリックスにリロードされない。溶離液の１つ又は２つ以上の画分の１つ又はいくつかを同じクロマトグラフィーマトリックスにリロードするかどうかを決定する別の基準は、例えば不純物などの望ましくない化合物の非存在又は減少した濃度である。
【００５２】
先行する画分及び後続する画分
上記のように、生体分子の粗抽出物は、典型的には生体分子生成物（目的の化合物）と類似のクロマトグラフィーマトリックスへの結合特性を有する不純物を含有している。このような不純物の溶出プロファイルは、典型的には少なくとも部分的に生体分子生成物と重複する。したがって、「先行する画分」は、生体分子生成物（目的の化合物）と生体分子生成物ほど強くなくクロマトグラフィーマトリックスに結合する不純物の両方を含む。「後続する画分」は、生体分子生成物（目的の化合物）と生体分子生成物よりも強くクロマトグラフィーマトリックスに結合する不純物の両方を含む。先行する画分は生体分子生成物（目的の化合物）の前にクロマトグラフィーマトリックスから溶出し；後続する画分は生体分子生成物（目的の化合物）の後にクロマトグラフィーマトリックスから溶出する。先行する画分は「前の画分」とも呼ばれる。後続する画分は「後の画分」とも呼ばれる。
【００５３】
本発明の方法では、第２の画分が、本明細書で定義される１つもしくは複数の先行する画分及び／又は１つもしくは複数の後続する画分を含む。
【００５４】
好ましくは、第２の画分が１つもしくは複数の先行する画分を含む又は１つもしくは複数の先行する画分からなる。換言すれば、第２の態様を特に参照すると、同じクロマトグラフィーマトリックスにリロードされる溶離液の１つ又は２つ以上の画分が、好ましくは所望の特性を有する溶離液の１つ又は２つ以上の画分の前にクロマトグラフィーマトリックスから溶出する溶離液の少なくとも１つの画分である。本明細書でさらに詳細に記載される所望の特性を有する溶離液の１つ又は２つ以上の画分の前にクロマトグラフィーマトリックスから溶出するこのような溶離液の１つ又は２つ以上の画分の数を決定することは、当業者の技能の範囲内である。換言すれば、当業者であれば、本発明の方法で使用するための第２の画分に組み込むのに適した先行する画分を容易に特定することができるだろう。第２の画分に組み込むのに適した先行する画分を特定するために使用することができるパラメータには、目的の化合物もしくは生体分子生成物の最小濃度、及び／又は目的の化合物以外の化合物、すなわち不純物の最大濃度が含まれ；これらは上記のように決定することができる。
【００５５】
好ましくは、第２の画分が、好ましくは、第１の画分の直前の先行する画分を含む、又は第１の画分の直前の先行する画分からなる。換言すれば、所望の特性を有する溶離液の１つ又は２つ以上の画分と異なる溶離液の１つ又は２つ以上の画分が、好ましくは所望の特性を有する溶離液の１つ又は２つ以上の画分の前にクロマトグラフィーマトリックスから直ちに溶出する画分を含む。したがって、第２の画分が、好ましくは第１の画分に直接隣接し、第１の画分の直前にクロマトグラフィーマトリックスから溶出する画分を含む又はからなる。このような溶離液の画分を含めることによって、目的の化合物の精製及び／又は濃縮が特に増加する。例えば、第１の画分の直前の先行する画分は、典型的には第１の画分にさらに先行する先行する画分よりも高濃度の目的化合物／生体分子生成物を含有する。このような先行する画分を保持することによって、方法の全体的な精製収率が増加する。
【００５６】
好ましくは、第２の画分が、後続する画分を含む、又は後続する画分からなる。換言すれば、第２の態様を特に参照すると、同じクロマトグラフィーマトリックスにリロードされる溶離液の１つ又は２つ以上の画分が、好ましくは所望の特性を有する溶離液の１つ又は２つ以上の画分の後にクロマトグラフィーマトリックスから溶出する溶離液の少なくとも１つの画分である。第２の画分が先行する画分（上記）を含む又はからなる場合のように、当業者であれば、本発明の方法で使用するための第２の画分に組み込むのに適した後続する画分を容易に特定することができるだろう。第２の画分に組み込むのに適した後続する画分を特定するために使用することができるパラメータには、目的の化合物もしくは生体分子生成物の最小濃度、及び／又は目的の化合物以外の化合物、すなわち不純物の最大濃度が含まれ；これらは上記のように決定することができる。
【００５７】
好ましくは、第２の部分が、第１の画分の直後の後続する画分を含む、又は第１の画分の直後の後続する画分からなる。換言すれば、所望の特性を有する１つ又は２つ以上の画分と異なる溶離液の１つ又は２つ以上の画分が、好ましくは所望の特性を有する溶離液の１つ又は２つ以上の画分の後にクロマトグラフィーマトリックスから直ちに溶出する画分を含む。したがって、第２の画分が、好ましくは第１の画分に直接隣接し、第１の画分の直後にクロマトグラフィーマトリックスから溶出する画分を含む又はからなる。所望の特性を有する溶離液の１つ又は２つ以上の画分の直前に溶出する溶離液の画分をリロードする場合のように、このような溶離液の画分を含めることによって、目的の化合物の精製及び／又は濃縮が特異的に増加する。例えば、第１の画分の直後の後続する画分は、典型的には第１の画分にさらに続く後続する画分よりも高濃度の目的化合物／生体分子生成物を含有する。このような後続する画分を保持することによって、方法の全体的な精製収率が増加する。
【００５８】
好ましくは、第２の画分が、第１の画分の直前の先行する画分と第１の画分の直後の後続する画分の両方を含む又はからなる。換言すれば、第２の態様を特に参照すると、所望の特性を有する１つ又は２つ以上の画分と異なる溶離液の１つ又は２つ以上の画分、したがって同じクロマトグラフィーマトリックスにリロードされる１つ又は２つ以上の画分が、所望の特性を有する溶離液の１つ又は２つ以上の画分の前にクロマトグラフィーマトリックスから直ちに溶出する画分及び所望の特性を有する溶離液の１つ又は２つ以上の画分の後にクロマトグラフィーマトリックスから直ちに溶出する画分を含む。したがって、第２の画分が、好ましくは第１の画分に直接隣接し、第１の画分の直前にクロマトグラフィーマトリックスから溶出する画分及び第１の画分に直接隣接し、第１の画分の直後にクロマトグラフィーマトリックスから溶出する画分を含む又はからなる。
【００５９】
先行する画分と後続する画分の両方を含めることによって、方法の全体的な精製収率が増加し、本発明の方法で使用される機器を簡素化することも可能になり得る。例えば、第２の画分を保持するために使用される貯蔵容器の数を減らすことができるので、必要とされる供給ライン及び必要なバルブ位置の数を減らすことができる。さらなる利点は、先行する画分及び後続する画分をクロマトグラフィーマトリックスに均質にロードできることであり、これは、例えば溶出時間などの処理パラメータを容易に予測することを可能にするので有益である。
【００６０】
したがって、好ましくは、本発明の方法では、第２の画分が、第１の画分の直前の先行する画分及び／又は第１の画分の直後の後続する画分を含む又はからなる。好ましくは、先行する画分及び後続する画分が、クロマトグラフィーマトリックスに別々にリロードされる、又は合わせられ、同じクロマトグラフィーマトリックスにリロードされる。
【００６１】
同様に、上記の第２の態様を特に参照すると、好ましくは
ｉ）同じクロマトグラフィーマトリックスにリロードされる溶離液の１つ又は２つ以上の画分が、所望の特性を有する溶離液の１つ又は２つ以上の画分と異なる；
ｉｉ）クロマトグラフィーマトリックスにリロードされる溶離液の１つ又は２つ以上の画分が、所望の特性を有する溶離液の１つ又は２つ以上の画分の前にクロマトグラフィーマトリックスから溶出する；及び／又は
クロマトグラフィーマトリックスにリロードされる溶離液の１つ又は２つ以上の画分が、所望の特性を有する溶離液の１つ又は２つ以上の画分の後にクロマトグラフィーマトリックスから溶出する；
ならびに任意に、
ｉｉｉ）所望の特性を有する溶離液の１つ又は２つ以上の画分の前にクロマトグラフィーマトリックスから溶出するクロマトグラフィーマトリックスにリロードされる溶離液の１つ又は２つ以上の画分；及び所望の特性を有する溶離液の１つ又は２つ以上の画分の後にクロマトグラフィーマトリックスから溶出するクロマトグラフィーマトリックスにリロードされる溶離液の１つ又は２つ以上の画分が、
ｉ）同じクロマトグラフィーマトリックスに別々にリロードされる；又は
ｉｉ）合わせられ、同じクロマトグラフィーマトリックスにリロードされる。
【００６２】
複数の画分
上記のように、本発明の方法は、供給材料をクロマトグラフィーマトリックスにロードし、マトリックスから標的生体分子（目的の化合物）を溶出することを含む。精製された生体分子生成物を含む（したがって本明細書で定義される所望の特性を有する）第１の画分に加えて、溶離液はまた、少なくとも１つの不純物を含む（したがって本明細書で定義される望ましくない特性を有する）第２の画分も含む。本発明の方法は、１つ又は２つ以上のこのような第２の画分を生じさせることができる。以下により詳細に記載されるように、複数の第２の画分は、本発明の方法の単一サイクルから複数の第２の画分を回収すること、又は本発明の方法の複数のサイクルを実行し、各サイクルで単一もしくは複数の第２の画分を回収することを含む種々の方法で生じ得る。
【００６３】
好ましくは、本発明の方法では、２つ以上の第２の画分が回収され得る。このような状況では、回収された複数の第２の画分が、クロマトグラフィーマトリックスに個別に（リ）ロードされ得る；又は合わせられ（「一緒にプールされ」）、合わせた画分としてクロマトグラフィーマトリックスにリロードされ得る。換言すれば、溶離液の１つ又は２つ以上の画分が溶離液の２つ以上の画分である場合、溶離液の２つ以上の画分が同じクロマトグラフィーマトリックスに個別にリロードされる。あるいは、溶離液の２つ以上の画分が合わせられ、合わせた画分として同じクロマトグラフィーマトリックスにリロードされ得る。
【００６４】
本発明の方法は、種々の方法で複数の第２の画分を生じさせることができる。例えば、生体分子生成物を含む供給原料（すなわち、目的の化合物を含む混合物）は、複数の部分でクロマトグラフィーマトリックスにロードされ、各部分が第１の画分及び第２の画分を生じさせる。このような状況では、回収される第２の画分が、クロマトグラフィーマトリックスに個別に（リ）ロードされ得る。あるいは、第２の画分が一緒にプールされ；第２の画分中の生体分子生成物がクロマトグラフィーマトリックスに結合するように、プールされた第２の画分がクロマトグラフィーマトリックスにロードされ得る。
【００６５】
別の例は、先行する画分を含む第２の画分が、後続する画分を含む第２の画分と分離されて回収される。したがって、先行する画分を含む第２の画分及び後続する画分を含む第２の画分が、クロマトグラフィーマトリックスに個別に（リ）ロードされ得る。あるいは、第２の画分が一緒にプールされ；プールされた第２の画分中の生体分子生成物がクロマトグラフィーマトリックスに結合するように、プールされた第２の画分がクロマトグラフィーマトリックスにロードされ得る。
【００６６】
保持段階
本発明の方法では、供給原料からの供給材料がクロマトグラフィーカラムにロードされ、第１及び第２の画分が溶出されると、１つ又は２つ以上の第２の画分が、クロマトグラフィーマトリックスにリロードされる前に１つ又は２つ以上の容器に保持される。この保持段階は、特許請求される方法のステップ（ｃ）に対応する。
【００６７】
保持時間は、方法に応じて制御することができる。好ましくは、保持時間が少なくとも５分であり、より好ましくは少なくとも３０分、例えば少なくとも１時間、例えば少なくとも２時間である。少なくとも５時間、１０時間、２４時間、１日、２日、７日、１４日、１か月、２か月、６か月又は１年の保持時間などのより長い保持時間も適している。
【００６８】
したがって、本発明では、ステップ（ｃ）が、好ましくは１つ又は２つ以上の第２の画分を少なくとも５分間保持することを含む。ステップ（ｃ）は、好ましくは１つ又は２つ以上の第２の画分を一晩保持することを含み得る。
【００６９】
本発明の方法における保持ステップの利点は、必要に応じてクロマトグラフィー装置又は画分に修正を加えることができることである。例えば、以下でさらに記載されるように、クロマトグラフィーマトリックスから溶出した画分を、カラムにリロードする前にさらに処理することができる。あるいは、保持時間中にクロマトグラフィーマトリックスを交換、洗浄又は更新することができる。保持時間を長くすると、オペレーターの利便性の改善の点からも有利となり得る。例えば、保留時間を終夜又は週末にわたって実行するようにスケジュールできるので、オペレーターが反社会的時間に働く必要性がなくなり得る。保持ステップの別の利点は、クロマトグラフィーマトリックスから溶出した１つ又は２つ以上の画分（特に、１つ又は２つ以上の第２の画分）を、保持ステップ中に本明細書に記載されているように試験することができることである。
【００７０】
処理
本発明の方法では、クロマトグラフィーマトリックスにリロードされる１つ又は２つ以上の第２の画分が、クロマトグラフィーマトリックスによる生体分子の結合を促進するために処理され得る。１つ又は２つ以上の第２の画分は、好ましくはクロマトグラフィーマトリックスによる生体分子の結合を促進するために、クロマトグラフィーマトリックスへのリロードの前又は間に処理される。ただし、１つ又は２つ以上の第２の画分が、クロマトグラフィーマトリックスからの溶出中に処理されてもよい。したがって、本発明の特許請求される方法では、処理が、好ましくは方法のステップ（ｂ）及び／又はステップ（ｃ）及び／又はステップ（ｄ）の間、好ましくはステップ（ｃ）及び／又はステップ（ｄ）の間；最も好ましくは方法のステップ（ｃ）の間に行われる。
【００７１】
本発明の方法では、１つ又は２つ以上の第２の画分の処理が、好ましくは１つ又は２つ以上の第２の画分（すなわち、上記方法の第２の態様を参照すると、リロードの前又は間に処理される溶離液の１つ又は２つ以上の画分）のｐＨ、イオン強度、濃度、温度及び／又は溶媒を変更することを含む。処理は、混合及び／又は脱気も含み得る。処理は、かき混ぜ又は攪拌も含み得る。本明細書に記載される試料を処理するのに適した技術は、当技術分野で知られている。例えば、試料のｐＨの変更は、酸又は塩基の添加を含み得る。イオン強度の変更は、塩などのイオン性物質の添加もしくは封鎖によって、又は希釈（例えば、水もしくは緩衝液）によって達成され得る。濃度の変更は、試料の濃縮（例えば、真空フィルタアセンブリの使用）又は希釈（例えば、水もしくは緩衝液）によって達成され得る。温度の変更は、従来の機器を使用して加熱又は冷却することによって達成され得る。試料の溶媒の変更は、緩衝液又は溶媒交換、例えばダイアフィルトレーションによって達成され得る。
【００７２】
本発明の方法は、有益には、１つ又は２つ以上の第２の画分を試験することを含み得る。好ましくは、このような試験は、非破壊試験、好ましくは本明細書に記載されるインライン試験である。以下により詳細に記載されるように、１つ又は２つ以上の第２の画分を試験することは、好ましくは１つ又は２つ以上の第２の画分の生体分子生成物の濃度；不純物の濃度；不純物の正体；ｐＨ；イオン強度；温度；溶媒；及び／又はガス濃度の１つ又は２つ以上を決定することを含む。
【００７３】
溶離液の画分（すなわち、１つ又は２つ以上の第２の画分）を有効に処理するために、典型的には、目的の化合物のクロマトグラフィーマトリックスへの結合に影響を及ぼすこのような画分の特性を最初に決定することが必要である。例えば、試料のｐＨを変更する前に、典型的には試料のｐＨを決定することが必要である。同様に、試料のイオン強度、濃度及び／又は温度を変更する前に、典型的には試料のイオン強度、濃度及び／又は温度をそれぞれ決定することが必要である。前記特性を決定する方法は、当業者に知られている。
【００７４】
前記特性を決定するステップと画分を処理するステップは、互いに直に連結していてもよい、すなわち、処理された画分に含有される目的の化合物が、適用時にクロマトグラフィーマトリックスに結合し得るように、特性が決定され、決定直後に前記特性の１つ又は２つ以上が変更される。あるいは、前記特性を決定するステップと処理するステップが、互いに分離されていてもよい。このような分離は、時間の分離であってもよい、すなわち、前記特性の決定と溶離液の１つ又は２つ以上の画分の処理との間に時間ギャップが存在する、すなわち、特性が決定され、一定期間の経過後にのみ、処理された画分に含有される目的の化合物が適用時にクロマトグラフィーマトリックスに結合し得るように、前記特性の１つ又は２つ以上が変更される。典型的には、このような時間ギャップが、少なくとも３０分、１時間、２時間、５時間、１０時間、２４時間、１日、２日、７日、１４日、１か月、２か月、６か月又は１年である。２日を超えない、より好ましくは２４時間を超えない、例えば１０時間を超えない、例えば５時間を超えない、例えば２時間を超えない、より好ましくは１時間を超えない、例えば３０分を超えない時間ギャップなどの短い時間ギャップが、目的の化合物（すなわち、生体分子生成物）の分解及び／又は汚染の可能性を最小化することができるために有益となり得る。複数のバッチのタンパク質を精製しなければならない場合、２日を超える時間ギャップ、例えば少なくとも７日、例えば少なくとも１４日、１か月、２か月、６か月又は１年又はそれ以上の時間ギャップなどの長い時間ギャップが有益となり得る；典型的には、このような場合、溶離液の画分（すなわち、第２の画分）を遅延期間にわたって凍結して、分解及び／又は汚染の可能性を最小化する。
【００７５】
溶離液の１つ又は２つ以上の画分（すなわち、第２の画分）の特性は、オンライン、アットライン又はオフラインで決定され得る。前記特性をオンラインで決定することは、好ましくは、前記特性が、例えばクロマトグラフィーマトリックスの出口に接続されている、又は前記溶離液の１つもしくは複数の画分がリアルタイムで回収される１つもしくは複数の容器にもしくは容器内に配置されている検出器で、本発明による方法で決定されることを意味する。前記特性をアットラインで決定することは、好ましくは、前記特性が、クロマトグラフィーマトリックスの出口、又は前記溶離液の１つもしくは複数の画分が回収される１つもしくは複数の容器から採取される試料で決定されることを意味する。前記特性をオフラインで決定することは、好ましくは、前記特性が、クロマトグラフィーマトリックスの出口又は前記溶離液の１つもしくは複数の画分が回収される１つもしくは複数の容器から採取される試料で決定され、マトリックスから離れて配置された、すなわち別室の検出器で遅延後に測定されることを意味する。好ましくは、画分の特性がオンライン又はアットライン、より好ましくはオンラインで決定される。
【００７６】
追加の供給原料
本発明では、第２の画分が、供給原料からの追加の供給材料（すなわち、目的の化合物を含む追加の混合物）と共にクロマトグラフィーマトリックスにリロードされる。追加の供給材料は、第２の画分と同時に又は続いてロードされる。得られる混合物がクロマトグラフィーマトリックスにロードされる前に、追加の供給材料を、１つ又は２つ以上の容器に保持された１つ又は２つ以上の第２の画分に添加することができる。あるいは、１つ又は２つ以上の容器からの１つ又は２つ以上の第２の画分のローディングの前、間又は後に、追加の供給材料をクロマトグラフィーマトリックスにロードすることができる。
【００７７】
したがって、ステップ（ｄ）は、供給原料からの追加の供給材料を第２の画分と同時に又は続いてクロマトグラフィーマトリックスにロードすることを含む。換言すれば、上記の第２の態様を特に参照すると、溶離液の１つ又は２つ以上の画分が、目的の化合物を含む混合物、又は少なくとも前記混合物の一部と一緒に同じクロマトグラフィーマトリックスにリロードされる。溶離液の画分と一緒にクロマトグラフィーマトリックスにロードされる目的の化合物を含む混合物は、好ましくは本発明の方法の運転クロマトグラフィーサイクルを受けていない。しかしながら、このような混合物が既に何らかの形の下流処理を受けていることは本発明の範囲内である。
【００７８】
本発明では、ステップ（ｄ）が、供給原料からの追加の供給材料を第２の画分と同時に又は続いてクロマトグラフィーマトリックスにロードすることを含む。第２の画分が、好ましくは供給材料とリロードする前又は間に処理される。換言すれば、上記の第２の態様を特に参照すると、本発明では、溶離液の画分が、目的の化合物を含む混合物の全部又は一部と一緒にクロマトグラフィーマトリックスにリロードされ、好ましくは目的の化合物を含む混合物と合わせられた溶離液の１つ又は２つ以上の画分中に含有される目的の化合物がリローディング時にクロマトグラフィーマトリックスに結合するように、目的の化合物を含む混合物と合わせられた溶離液の１つ又は２つ以上の画分がリローディングの前又は間に処理される。
【００７９】
１つ又は２つ以上の第２の画分と供給原料からの追加の供給材料の組み合わせ（すなわち、溶離液の１つ又は２つ以上の画分と目的の化合物を含む混合物の組み合わせ）は、本明細書では合わせたロードとも呼ばれる。合わせたロードのこのような処理に関しては、上記の溶離液の１つ又は２つ以上の画分の処理に関連して本明細書で概説したのと同じことが当てはまる。
【００８０】
供給材料のローディング
本発明の上記の説明から明らかなように、本発明の方法は、生体分子生成物がクロマトグラフィーマトリックス結合するように、供給原料（すなわち、生体分子生成物、すなわち目的の化合物を含む混合物）からの供給材料をクロマトグラフィーマトリックスにロードすることを含む。
【００８１】
本発明は、除外されるわけではないが、供給原料全体が１つの容積でクロマトグラフィーマトリックスにロードされることを必要としない。したがって、本発明は、供給原料全体を１つの容積でクロマトグラフィーマトリックスにロードすることを含み得る。しかしながら、より好ましくは、供給原料の総容積の一部（すなわち、供給原料からの供給材料）がクロマトグラフィーマトリックスにロードされ、本発明の方法が実施される。次いで、本明細書に記載される本発明に従って、追加の供給材料がクロマトグラフィーマトリックスにロードされ得る。例えば、上で説明されるように、方法のステップ（ｄ）は、供給原料からの追加の供給材料を第２の画分と同時に又は続いてクロマトグラフィーマトリックスにロードすることを含む。
【００８２】
換言すれば、上記の第２の態様を特に参照すると、目的の化合物を含む混合物の第１の容積が、好ましくは第１の運転クロマトグラフィーサイクルで、第１の容器から目的の化合物がクロマトグラフィーマトリックスに結合するように運転されるクロマトグラフィーマトリックスにロードされる。したがって、このような実施形態では、本発明の方法に供される目的の化合物を含む混合物全体が、第１の運転クロマトグラフィーサイクルでクロマトグラフィーマトリックスにロードされるわけではない。
【００８３】
好ましくは、本発明では、供給原料が、所望のローディングに達するまでクロマトグラフィーマトリックスにロードされる。例えば、供給原料は、好ましくは、クロマトグラフィーマトリックスの静的結合容量の４０〜１００％、例えば５０％又は６０％〜９０％、例えば７０％〜８０％に達するまで、クロマトグラフィーマトリックスにロードされ得る。換言すれば、第１の容器からの目的の化合物を含む混合物を、目的の化合物がクロマトグラフィーマトリックスに結合するように運転されるクロマトグラフィーマトリックスにロードする場合、ローディングが、典型的には、クロマトグラフィーマトリックスの静的結合容量の４０〜１００％、５０〜１００％、６０〜１００％、７０〜１００％、８０〜１００％、９０〜１００％、７０〜９０％又は７０〜８０％、６０〜９０％、６０〜８０％に達するまで、目的の化合物がクロマトグラフィーマトリックスに結合するようなものである。マトリックスの静的結合容量の１００％未満のロードまで供給原料をクロマトグラフィーマトリックスにロードすることは、例えば、標的生体分子と不純物の分離の増加が望まれる用途でしばしば有利となり得る。
【００８４】
フロースルー
当業者が理解するように、生体分子生成物を含む供給原料をクロマトグラフィーマトリックスにロードする場合、供給材料中の生体分子生成物の総量の全部又は一部のみがクロマトグラフィーマトリックスに結合し得る。クロマトグラフィーマトリックスに結合しない過剰な生体分子生成物（目的の化合物）は、マトリックスによって捕捉されないままであり、フロースルーとしてクロマトグラフィーマトリックスから回収され得る。これは、マトリックスの静的結合容量を超えるように、過剰な供給材料がクロマトグラフィーマトリックスにロードされると生じ得る。
【００８５】
フロースルーは、存在する場合、状況によっては高レベルの生体分子生成物（目的の化合物）を含む場合があり、したがって、精製のために有用に回収され得る。マトリックスの静的結合容量を超えるように、供給原料からの過剰な供給材料がクロマトグラフィーマトリックスに添加された場合、例えばマトリックスの静的結合容量を少なくとも１０％、例えば少なくとも２０％、例えば少なくとも５０％超えた場合、例えばマトリックスの静的結合容量を少なくとも１００％又はそれ以上超え得る場合に、フロースルーが生じ得る。過剰なロードを、本発明の方法で意図的に適用して、例えば精製速度を最大化することができる。したがって、特許請求される方法のステップ（ａ）は、クロマトグラフィーマトリックスの動的結合容量を超えるように、供給原料からの供給材料をクロマトグラフィーマトリックスにロードし、未結合の生体分子生成物を含有するフロースルーを回収することを含み得る。このようにして回収されたフロースルーは、例えば方法のさらなるサイクルで、あるいは方法のステップ（ｄ）で溶離液の第２の画分及び／又は供給原料からの追加の供給材料と一緒に、クロマトグラフィーマトリックスにリロードされ得る。
【００８６】
フロースルーの潜在的な価値が高いということは、目的の化合物（生体分子生成物）を得るための回収及び精製が望ましいことを意味する。
【００８７】
したがって、本発明の特許請求される方法のステップ（ａ）は、好ましくはクロマトグラフィーマトリックスに結合しない未結合の生体分子生成物を含有するフロースルーを回収することをさらに含み；ステップ（ｄ）は、好ましくはフロースルーを１つもしくは複数の第２の画分及び／又は追加の供給材料と同時に又は続いてクロマトグラフィーマトリックスにロードすることをさらに含む。ステップ（ｄ）は、フロースルーの全部又は一部のみをロードすることを含み得る。フロースルーの一部のみがステップ（ｄ）でロードされる場合、フロースルーの残りは、好ましくは保持され、その後、例えば供給原料からの追加の供給材料と一緒に、クロマトグラフィーマトリックスにロードされる。フロースルーは、好ましくは以下で論じられるように保持時間の間、１つ又は２つ以上の容器に保持される。１つ又は２つ以上の容器は、１つ又は２つ以上の第２の画分を保持するために使用されるのと同じ１つ又は２つ以上の容器であり得る。あるいは、フロースルーを保持するために使用される１つ又は２つ以上の容器が、１つ又は２つ以上の第２の画分を保持するために使用される１つ又は２つ以上の容器と別であってもよい。フロースルーは、好ましくは生体分子生成物のクロマトグラフィーマトリックスへの結合を促進するように処理され得る。１つ又は２つ以上の第２の画分について上記の処理ステップのいずれかなどの、任意の適切な処理ステップを使用することができる。
【００８８】
フロースルーは、１つ又は２つ以上の第２の画分と同時に又は続いてクロマトグラフィーマトリックスにロードされ得るが、フロースルーが、代わりに１つ又は２つ以上の第２の画分と別にクロマトグラフィーマトリックスにリロードされてもよい。例えば、フロースルーを、供給原料からの追加の供給材料と同時に又は続いて（すなわち、方法のステップ（ａ）で）クロマトグラフィーマトリックスにロードすることができる。
【００８９】
方法のステップ（ｄ）又はステップ（ａ）にかかわらず、フロースルーがクロマトグラフィーマトリックスにリロードされる場合、クロマトグラフィーマトリックスが、好ましくはクロマトグラフィーマトリックスの静的結合容量の４０〜１００％、例えば５０％又は６０％〜９０％、例えば７０％〜８０％に達するまでロードされる。これにより、生体分子生成物が、クロマトグラフィーマトリックスによって結合されることなくマトリックスを繰り返し通過する可能性が低くなる。
【００９０】
したがって、上に論じられる第２の態様の方法を特に参照すると、このような方法は、好ましくは、クロマトグラフィーマトリックスから目的の化合物を溶出し、目的の化合物を含有する溶離液を溶離液の画分として回収する前に、
ａｂ）未結合の目的の化合物を含有するフロースルーを第２の容器に回収するステップと；
ａｃ）さらなる運転クロマトグラフィーサイクルで、第２の容器からのフロースルーを、目的の化合物がクロマトグラフィーマトリックスに結合するように運転される同じクロマトグラフィーマトリックスにリロードするステップと
を含む。
【００９１】
このような方法はまた、好ましくはクロマトグラフィーマトリックスから目的の化合物を溶出し、目的の化合物を含有する溶離液を溶離液の画分として回収する前に、
ａｂ）未結合の目的の化合物を含有するフロースルーを第２の容器に回収するステップと；
ａｃ）第２の容器からのフロースルーを同じクロマトグラフィーマトリックスにリロードし、さらに新たなロード混合物を目的のタンパク質がクロマトグラフィーマトリックスに結合するように運転されるさらなる運転クロマトグラフィーサイクルでロードするステップと
を含み得る。
【００９２】
新たなロード混合物は、供給原料からの供給材料の第２の容積であり得る。したがって、本方法は、好ましくは、第２の容器からのフロースルーをリロードし、第１の容器からの目的の化合物の第２の容積を、目的のタンパク質がクロマトグラフィーマトリックスに結合するように運転されるさらなる運転クロマトグラフィーサイクルで同じクロマトグラフィーマトリックスにロードするステップを含む。このような目的の化合物の第２の容積が、目的の化合物を含む混合物の第２の容積であることは本発明の範囲内である。
【００９３】
好ましくは、第２の容器からのフロースルーをリロードするステップでは、クロマトグラフィーマトリックスが、クロマトグラフィーマトリックスの静的結合容量の４０〜１００％、５０〜１００％、６０〜１００％、７０〜１００％、８０〜１００％、９０〜１００％、７０〜９０％又は７０〜８０％、６０〜９０％、６０〜８０％に達するまで運転される。好ましくは、クロマトグラフィーマトリックスの静的結合容量の４０〜１００％、例えば５０％又は６０％〜９０％、例えば７０％〜８０％に達してもよい。
【００９４】
好ましくは、上に論じられる第２の態様の方法を特に参照すると、第２の容器に回収されるフロースルー及び溶離液の１つ又は２つ以上の画分が、運転クロマトグラフィーサイクルで別々にリロードされる。フロースルーの一部のみ、すなわちフロースルーの容積の一部及び／又は溶離液の１つもしくは複数の画分の一部のみ、すなわち溶離液の１つ又は２つ以上の画分の容積の一部のみが運転クロマトグラフィーサイクルで別々にリロードされることは本発明の範囲内である。好ましくは、第２の容器に回収されるフロースルー及び１つ又は２つ以上の画分が、同じ運転クロマトグラフィーサイクル、好ましくは第１の運転クロマトグラフィーサイクルの直後のクロマトグラフィーサイクルで別々にリロードされる。
【００９５】
あるいは、第２の容器に回収されるフロースルー及び１つ又は２つ以上の画分が、好ましくは異なる運転クロマトグラフィーサイクルで別々にリロードされてもよい。溶離液の１つ又は２つ以上の画分が、第２の容器に回収されるフロースルーの前に同じクロマトグラフィーマトリックスにリロードされることは本発明の範囲内である。しかしながら、第２の容器に回収されるフロースルーが、溶離液の１つ又は２つ以上の画分の前に同じクロマトグラフィーマトリックスにリロードされることも本発明の範囲内である。
【００９６】
代替実施形態では、フロースルー及び溶離液の１つ又は２つ以上の画分が合わせられ、目的の化合物がクロマトグラフィーマトリックスに結合するように運転される同じクロマトグラフィーマトリックスに組み合わせとしてリロードされ得る。前記組み合わせが、溶離液の１つ又は２つ以上の画分の処理に関連して本明細書に開示されるように処理されることは本発明の範囲内である。
【００９７】
したがって、本発明の第２の態様では、目的の化合物を含む混合物の第１の容積が、好ましくは第１の運転クロマトグラフィーサイクルで、第１の容器からクロマトグラフィーマトリックスの動的結合容量を超えるように運転されるクロマトグラフィーマトリックスにロードされ得、本方法が、クロマトグラフィーマトリックスから目的の化合物を溶出し、目的の化合物を含有する溶離液を溶離液の画分として回収する前に、
ａｂ）未結合の目的の化合物を含有するフロースルーを第２の容器に回収するステップと；
ａｃ）さらなる運転クロマトグラフィーサイクルで、第２の容器からのフロースルーをリロードし、第１の容器からの目的の化合物の第２の容積を、クロマトグラフィーマトリックスの動的結合容量を超えるように運転される同じクロマトグラフィーマトリックスにロードするステップと
を含む。
【００９８】
このような目的の化合物の第２の容積が、目的の化合物を含む混合物の第２の容積であることは本発明の範囲内である。
【００９９】
好ましくは、目的の化合物を含む混合物の第１の容積を、第１の運転クロマトグラフィーサイクルで、第１の容器からクロマトグラフィーマトリックスの動的結合容量を超えるように運転されるクロマトグラフィーマトリックスにロードするステップでは、最大静的結合容量の少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％に達すると、目的のタンパク質のローディングが停止される。
【０１００】
好ましくは、本発明の方法では、フロースルーの回収が、フロースルー中の生体分子生成物（目的のタンパク質）の所定の第１の濃度で開始され、フロースルー中の生体分子生成物（目的のタンパク質）の所定の第２の濃度で停止される。フロースルー中の生体分子生成物（目的のタンパク質）の回収は、好ましくはフロースルー中の目的のタンパク質の濃度０．０５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ又は０．２ｍｇ／ｍｌで開始され、及び／又はフロースルー中の目的のタンパク質の濃度０．６ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ又は５ｍｇ／ｍｌで停止される。好ましくは、例えばフロースルーの５０％、４０％、３０％、２０％、１０％又は５％などのフロースルーの所定の画分が第２の容器に回収される。
【０１０１】
好ましくは、一実施形態では、（例えば、第２の容器に）回収されたフロースルーが、例えばさらなる運転クロマトグラフィーサイクルで、クロマトグラフィーマトリックス上にリロードされる前又は間に処理されない。好ましくは、（例えば、第２の容器に）回収されたフロースルーが、クロマトグラフィーサイクルの完了後、次の運転クロマトグラフィーサイクルでクロマトグラフィーマトリックスに直接リロードされる。好ましくは、別の実施形態では、（例えば、第２の容器に）回収されたフロースルーが、例えばさらなる運転クロマトグラフィーサイクルで、クロマトグラフィーマトリックス上にリロードされる前又は間に処理される。処理は、例えば、かき混ぜもしくは攪拌、希釈（例えば、水もしくは緩衝液）、濃度調整（例えば、真空フィルタアセンブリを使用）、ｐＨ調整、導電率調整、緩衝液もしくは溶媒交換、冷却もしくは加熱又はこれらの任意の組み合わせであり得る。処理は、第２の画分について前記の通りであり得る。
【０１０２】
好ましくは、（例えば、第２の容器内に）回収された複数の別個の運転クロマトグラフィーサイクル（すなわち、本発明の方法のいくつかのサイクル）からのフロースルーがプールされ、別のサイクルで同じクロマトグラフィーマトリックスにリロードされる。２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１以上の運転クロマトグラフィーサイクルからのフロースルーが（例えば、単一第２容器に又は第２、第３、第４もしくはさらなる容器に）回収され、例えばさらなる運転クロマトグラフィーサイクルで、クロマトグラフィーマトリックスにリロードされ得る。
【０１０３】
好ましくは、本発明の方法の一実施形態では、回収されたフロースルーが、目的のタンパク質を含有する第１の容器からの混合物の新たなバッチがクロマトグラフィーマトリックスにロードされる前に、その後の運転クロマトグラフィーサイクルで（例えば、第２の容器から）クロマトグラフィーマトリックスにリロードされる。目的の化合物、好ましくは目的のタンパク質を含有する第１の容器からの混合物の前にその後のクロマトグラフィーサイクルでフロースルーをリロードすることによって、再利用された目的の化合物、好ましくは目的のタンパク質の完全な結合が、これを２回のサイクルのみで確実に捕捉する空のカラムによって可能になる。あるいは、別の実施形態では、回収されたフロースルーが、好ましくは目的の化合物、好ましくは目的のタンパク質を含有する第１の容器からの混合物の新たなバッチがクロマトグラフィーマトリックスにロードされた後に又はこれと一緒に、その後の運転クロマトグラフィーサイクルで第２の容器からクロマトグラフィーマトリックスにリロードされる。換言すれば、フロースルーが、供給原料からの追加の供給材料と別に、又は供給原料からの追加の供給材料と一緒に、クロマトグラフィーマトリックスにロードされ得る。
【０１０４】
好ましくは、第２の容器に回収されたフロースルーが、少なくとも３０分、１時間、２時間、５時間、１０時間、２４時間、１日、２日、７日、１４日、１か月、２か月、６か月又は１年間貯蔵される。２日を超えない、より好ましくは２４時間を超えない、例えば１０時間を超えない、例えば５時間を超えない、例えば２時間を超えない、より好ましくは１時間を超えない、例えば３０分を超えない保持時間などの短い貯蔵期間（保持時間）が、フロースルー中の生体分子生成物（すなわち、目的の化合物）の分解及び／又は汚染の可能性を最小化することができるために有益となり得る。複数のバッチのフロースルーを精製しなければならない場合、２日を超える保持時間、例えば少なくとも７日、例えば少なくとも１４日、１か月、２か月、６か月又は１年又はそれ以上の保持時間などの長い保持時間が有益となり得る；典型的には、このような場合、フロースルーを保持時間にわたって凍結して、分解及び／又は汚染の可能性を最小化する。
【０１０５】
供給原料
本明細書に記載される場合、生体分子生成物（すなわち、目的の化合物）を含む混合物は、供給原料としても知られる。本発明の方法では、供給原料からの供給材料がクロマトグラフィーマトリックスにロードされる。
【０１０６】
好ましくは、一実施形態では、供給原料（混合物）が、生体分子生成物（すなわち、目的の化合物、好ましくは目的のタンパク質）；及び原核生物、例えば細菌、宿主細胞汚染物質、例えば宿主細胞タンパク質、核酸又は脂質を含む。好ましくは、別の実施形態では、供給原料（混合物）が、生体分子生成物（目的の化合物、好ましくは目的のタンパク質）及び真核生物、例えば哺乳動物、宿主細胞汚染物質、例えば宿主細胞タンパク質、核酸又は脂質を含む。
【０１０７】
好ましくは、本発明では、供給原料（すなわち、目的の化合物を含む混合物）が、少なくとも２０リットル、例えば少なくとも５０リットル、例えば少なくとも６０Ｌ、例えば少なくとも８０Ｌ、より好ましくは少なくとも１００リットル、例えば少なくとも５００リットル、例えば少なくとも１０００Ｌ又はそれ以上、例えば少なくとも５０００Ｌ、例えば少なくとも１００００Ｌ、例えば最大少なくとも５０，０００Ｌ、１００，０００Ｌ又はそれ以上の容積を有する。したがって、混合物／供給原料は、好ましくは１，０００Ｌ超、例えば１０００Ｌ〜５０，０００Ｌ又は１００，０００Ｌ、好ましくは５，０００Ｌ〜２０，０００Ｌ、例えば約１０，０００Ｌの容積を有し得る。２Ｌ〜１００Ｌ、例えば２０Ｌ〜５０Ｌというより小さい容積も使用され得る。
【０１０８】
好ましくは、生体分子生成物（すなわち、目的の化合物）が、タンパク質、抗体、抗体断片、核酸分子（すなわち、ポリヌクレオチド）、ポリペプチド及び小分子を含む群から選択され、例えば、目的の化合物（すなわち、生体分子生成物）が、好ましくはタンパク質、抗体、抗体断片、ポリヌクレオチド及びポリペプチドを含む群から選択される。好ましくは、生体分子生成物（すなわち、目的の化合物）がタンパク質、抗体、抗体断片、核酸分子及び小分子を含む群から選択される。好ましくは、生成生体分子（すなわち、目的の化合物）がタンパク質である。好ましくは、生成生体分子（すなわち、目的の化合物）が抗体又は抗体断片である。
【０１０９】
クロマトグラフィーマトリックス
多くのクロマトグラフィー技術が当技術分野で知られており、本発明の方法と適合性である。
【０１１０】
現在のほとんど全ての工業用抗体精製プラットフォームはプロテインＡを使用している。プロテインＡは、哺乳動物免疫グロブリンのＦｃ部分に結合する細菌黄色ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）の細胞壁に見られる細胞表面タンパク質である。プロテインＡは、ヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ２に対する高い親和性を有し、ヒトＩｇＭ、ＩｇＡ及びＩｇＥ抗体に対する中程度の親和性を有する。結果として、プロテインＡ精製は、Ｆｃ部分を欠く抗体断片にはあまり適していない。しかしながら、プロテインＡクロマトグラフィーはいくつかの抗体（特に、Ｆｃ部分を有するもの）によく適しており、本発明の方法と適合性である。アフィニティークロマトグラフィーは、目的のタンパク質（又はタンパク質群）とクロマトグラフィーマトリックスに結合した特異的リガンドとの間の可逆的相互作用に基づいてタンパク質を分離する。目的のタンパク質とクロマトグラフィーマトリックスに結合したリガンドとの間の相互作用は、静電気もしくは疎水性相互作用、ファンデルワールス力及び／又は水素結合の結果であり得る。親和性媒体から標的分子を溶出するために、競合リガンドを使用して特異的に、又はｐＨ、イオン強度もしくは極性を変化させることによって非特異的に、相互作用を逆転させることができる。アフィニティー精製は、クロマトグラフィーマトリックスに共有結合することができるリガンドを必要とする。結合したリガンドは、標的分子に対する特異的結合親和性を保持しなければならず、未結合の材料を洗い流した後、リガンドと標的分子との間の結合は、標的分子を活性型で除去できるよう可逆的でなければならない。その一般的な使用にもかかわらず、アフィニティークロマトグラフィーは、特に治療用タンパク質を精製するために必要な工業規模で高価である。本発明の方法は、アフィニティークロマトグラフィーと適合性であり、方法の効率を最大化することを意図しているので、少なくとも部分的に関連する高コストに対処する。
【０１１１】
イオン交換クロマトグラフィーを使用して、イオン化可能な分子を精製することができる。イオン化分子は、帯電基と、固相とより強力に相互作用するイオン化分子を遅らせる固相支持マトリックスに結合した反対に帯電した分子の非特異的静電相互作用に基づいて分離される。各タイプのイオン化分子の正味電荷とマトリックスに対する親和性は、帯電基の数、各基の電荷、及び帯電固相マトリックスとの相互作用について競合する分子の性質によって異なる。これらの違いにより、イオン交換クロマトグラフィーによって種々の分子タイプが分離される。固相に結合している分子の溶出は、一般に、緩衝液のイオン強度（すなわち、導電率）を増加させて、イオン交換マトリックスの帯電部位について溶質と競合することによって達成される。ｐＨを変化させ、それによって溶質の電荷を変更することが、溶質の溶出を達成する別の方法である。導電率又はｐＨの変化は、漸進的（勾配溶出）又は段階的（段階溶出）であり得る。相互作用の２つの一般的なタイプが知られている：正に帯電した表面と相互作用する負に帯電したアミノ酸側鎖（例えば、アスパラギン酸及びグルタミン酸）によって媒介される陰イオン交換クロマトグラフィー、及び負に帯電した表面と相互作用する正に帯電したアミノ酸残基（例えば、リジン及びアルギニン）によって媒介される陽イオン交換クロマトグラフィー。陰イオン交換体は、弱又は強として分類することができる。弱陰イオン交換体の電荷基は弱塩基であり、高ｐＨで脱プロトン化されるため、電荷を失う。ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セルロースが弱陰イオン交換体の例であり、アミノ基がｐＨ約９未満で正に帯電し、ｐＨ値が高くなると徐々にその電荷を失う。ＤＥＡＥ又はジエチル−（２−ヒドロキシプロピル）アミノエチル（ＱＡＥ）は、例えば、対イオンとしての塩化物イオンを有する。
【０１１２】
溶出緩衝液のイオン強度の増加による溶出（溶出クロマトグラフィー）の代替法は、結合タンパク質よりも固定相に対する動的親和性が高い分子を使用した溶出である。このイオン交換クロマトグラフィーを実行するモードは、置換クロマトグラフィーと呼ばれる。置換クロマトグラフィーは、溶質が移動相調整剤で脱着せず、移動速度の違いによって分離されるという点で、他のクロマトグラフィーのモードとは根本的に異なる。置換では、供給流の成分よりも固定相に対する親和性が高い置換剤分子の進行する衝撃波によって、分子がクロマトグラフィーカラムを下に移動させられる。この強制移動によって、他の運転モードと比較して生成物の濃度及び純度が高くなる。保持率が高く、引き続いて置換剤溶液がカラムに絶えず注入される。
【０１１３】
当技術分野で知られているこれら及び他のクロマトグラフィー技術は、本発明の方法と適合性である。上記の議論から明らかなように、本発明の方法は、生体分子生成物がクロマトグラフィーマトリックスに結合するように、生体分子生成物（目的のタンパク質）をクロマトグラフィーマトリックスにロードすることを必要とする。この種のクロマトグラフィーモードは、結合−及び溶出−モードとして知られている。このクロマトグラフィーは、国際公開第２０１４／１５８２３１号パンフレットに記載されているようなフロースルーモードと異なる。
【０１１４】
好ましくは、方法が２つ以上のクロマトグラフィーステップを含み、２つ、３つ、４つ又は全てのクロマトグラフィーステップが、未結合の目的のタンパク質を含有するフロースルーが（例えば、クロマトグラフィーマトリックスがロードされた容器以外の容器に）回収され、フロースルーが後の運転クロマトグラフィーサイクルで（例えば、このような容器から）同じクロマトグラフィーマトリックスにリロードされるように運転され得る。好ましくは、方法が、１つ、２つ、３つ、４つ又は５つ以上のクロマトグラフィーステップを含む。好ましくは、１つ、２つ、３つ、４つ又は全てのクロマトグラフィーステップがクロマトグラフィーカラムで実行される。好ましくは、方法が３つのクロマトグラフィーステップを含み、３つのクロマトグラフィーステップがプロテインＡクロマトグラフィー、引き続いて陽イオン交換クロマトグラフィー、引き続いて陰イオン交換クロマトグラフィーである。本発明の方法の一実施形態では、プロテインＡクロマトグラフィーの溶離液が、目的のタンパク質を含有する溶離液が回収される結合及び溶出モードで運転される陽イオン交換クロマトグラフィーに供され、このような溶離液が、陰イオン交換クロマトグラフィーに供されて、目的のタンパク質を含有するフロースルーを生成する。本発明による方法が３つのクロマトグラフィーステップの各々の間に例えばダイアフィルトレーションなどの他のステップを含んでもよいことが当業者によって理解される。
【０１１５】
好ましくは、クロマトグラフィーが、アフィニティークロマトグラフィー、例えばプロテインＡクロマトグラフィー、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ミックスモードクロマトグラフィー、例えばヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、キラルクロマトグラフィー又は誘電クロマトグラフィーから選択される。したがって、好ましくはクロマトグラフィーマトリックスが、
−イオン交換クロマトグラフィーマトリックス；
−疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックス；
−アフィニティークロマトグラフィーマトリックス；
−ミックスモードクロマトグラフィーマトリックス；
−キラルクロマトグラフィーマトリックス；及び
−誘電クロマトグラフィーマトリックス
から選択される。
【０１１６】
好ましくは、１つ、２つ、３つ、４つ又は全てのクロマトグラフィーステップのための１つ又は２つ以上のクロマトグラフィーマトリックスが、１つ又は２つ以上のクロマトグラフィーカラムである。換言すれば、好ましくは本発明の方法では、クロマトグラフィーマトリックスがクロマトグラフィーカラムにある。
【０１１７】
好ましくは、クロマトグラフィーマトリックスが、少なくとも１リットル、例えば少なくとも４リットル、例えば少なくとも５リットル、より好ましくは少なくとも１０Ｌ、例えば少なくとも２０Ｌ、例えば少なくとも３０Ｌ、好ましくは５０Ｌ超、典型的には７５Ｌ超、より好ましくは少なくとも１００Ｌ又は少なくとも２００Ｌ、例えば好ましくは２０Ｌ〜２００Ｌ、例えば３０Ｌ〜１００Ｌ、例えば５０Ｌ〜１００Ｌのベッドボリューム（ｂｅｄ  ｖｏｌｕｍｅ）を有する。換言すれば、好ましくは、クロマトグラフィーマトリックスの少なくとも１つが、１Ｌ超、２０Ｌ超、３０Ｌ超、５０Ｌ超、７５Ｌ超、１００Ｌ超又は２００Ｌ超、好ましくは２０Ｌ〜２００Ｌ、３０Ｌ〜１００Ｌ又は５０Ｌ〜１００Ｌのベッドボリュームを有するクロマトグラフィーカラムである。
【０１１８】
好ましくは、本発明の方法では、ステップ（ｂ）で、溶離液の体積がクロマトグラフィーマトリックスのベッドボリュームに少なくとも等しい。より好ましくは、溶離液の体積が、クロマトグラフィーマトリックスのベッドボリュームの少なくとも２倍、例えばクロマトグラフィーマトリックスのベッドボリュームの少なくとも５倍、例えばクロマトグラフィーマトリックスのベッドボリュームの少なくとも１０倍、例えばクロマトグラフィーマトリックスのベッドボリュームの少なくとも１５倍、例えばクロマトグラフィーマトリックスのベッドボリュームの少なくとも２０倍又はそれ以上である。好ましくは、溶離液の体積が、クロマトグラフィーマトリックスのベッドボリュームの２倍〜２０倍である。
【０１１９】
他の実施形態では、好ましくはクロマトグラフィーマトリックスがクロマトグラフィー膜又はモノリス吸着器である。
【０１２０】
好ましくは、１つ、２つ、３つ、４つ又は全てのクロマトグラフィーステップが、膜又はモノリス吸着器で運転される。
【０１２１】
好ましくは、１つ、２つ、３つ、４つ又は全てのクロマトグラフィーステップが、単一のクロマトグラフィーカラム、膜吸着器又はモノリス吸着器で運転される。
【０１２２】
本発明では、従来のクロマトグラフィー技術で典型的に使用されるよりも高い流速を使用することができる。部分的に、これは、供給原料（目的の化合物を含む混合物）中の標的生体分子（目的の化合物）と不純物との間の減少する分離が、さらなる精製のために第２の画分をクロマトグラフィーマトリックスにリロードすることによって補償されるために達成することができる。したがって、本発明の方法は、好ましくは、少なくとも０．０５〜０．５クロマトグラフィーマトリックス容積／分、例えば少なくとも約０．１〜約０．４クロマトグラフィーマトリックス容積／分、例えば少なくとも約０．２〜約０．３クロマトグラフィーマトリックス容積／分の流速でクロマトグラフィーマトリックスから生体分子生成物（目的の化合物）を溶出することを含み得る。
【０１２３】
本発明の方法は、好ましくは約６０〜約９００ｃｍ／ｈ（ｃｍ表記はクロマトグラフィーマトリックスのベッド高さを指し；典型的には約２０ｃｍ〜約３０ｃｍ、好ましくは約２０ｃｍであり；ｈ＝時間である）、例えば約１２０〜約７２０ｃｍ／ｈ、例えば約２４０〜約５４０ｃｍ／ｈ、例えば約３００〜約４５０ｃｍ／時間の流速でクロマトグラフィーマトリックスから生体分子生成物（目的の化合物）を溶出することを含み得る。
【０１２４】
上記の議論から明らかなように、本発明の方法の利点は、プロセスの長さがクロマトグラフィーマトリックスの容積に限定されないことである。換言すれば、リローディング前の第２の画分の回収により、クロマトグラフィーマトリックスの容積を超える供給原料の容積を、本発明の方法に従って処理することが可能になる。したがって、本発明の方法では、プロセスの長さが、好ましくはクロマトグラフィーマトリックスの容積よりも大きい。これは、容器を使用して１つ又は２つ以上の第２の画分（すなわち、クロマトグラフィーマトリックスにリロードされる溶離液の画分）を貯蔵することによって、有益に達成される。
【０１２５】
任意の適切な容器を使用して、例えば、１つもしくは複数の第２の画分及び／又はフロースルーを貯蔵することができる。当業者であれば、第２の容器がクロマトグラフィー装置と一致していてもよいし、又は外部容器であってもよいことを認識するであろう。適切なバルブ等によって、必要に応じて画分を容器に向けることができるだろう。
【０１２６】
追加の方法のステップ
好ましくは、本発明の方法の複数のサイクルからの第１の画分が合わせられる又は一緒にプールされ得る。したがって、本発明の方法は、好ましくは第１の画分の各々を合わせることを含む。
【０１２７】
本発明の方法は、好ましくは第１の画分（標的生体分子、すなわち目的の化合物を含む溶離液の画分）をダイアフィルトレーション及び／又は濃縮することを含み得る。第１の画分は、好ましくは任意のダイアフィルトレーションの後に、治療用途に適した最終的な所望の濃度まで濃縮される。
【０１２８】
本発明の方法は、好ましくは精製された生体分子生成物をナノ濾過することを含み得る。ナノ濾過は、任意の適切な装置を使用して実施され得る。典型的には、ナノ濾過は、約１ｎｍ〜約１０ｎｍの孔径を有するポリマー（例えば、ポリエチレンテレフタラート）又は金属（例えば、アルミニウム）膜を使用して実施される。
【０１２９】
本発明の方法は、好ましくは精製された生体分子生成物をさらなるクロマトグラフィー精製に供することをさらに含み得る。本明細書で論じられるクロマトグラフィーによるプロセスのいずれかなどの、任意の適切なクロマトグラフィー精製を使用することができる。
【０１３０】
本発明の方法は、好ましくは精製された生体分子生成物を化学的に修飾することを含み得る。任意の適切な化学修飾を行うことができる。例えば、生体分子生成物を、還元及び／又はペグ化によって修飾することができる。生体分子生成物を、放射性核種、薬物、毒素、ポリマー（例えば、ＰＥＧ）、金属キレート、フルオロフォア、ハプテンなどから選択される１つ又は２つ以上の実体に結合することによって修飾することができる。結合は、ＥＤＣ／ＮＨＳカップリングなどの任意の適切な手段によって、又はタンパク質の反応性チオール基間のジスルフィド形成を介して達成され得る。還元は化学還元剤を使用して達成することができる。
【０１３１】
本発明の方法は、好ましくは標的生体分子／目的の化合物を薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又はアジュバントと共に製剤化することをさらに含み得る。
【０１３２】
したがって、本発明はまた、目的のタンパク質を製造する方法であって、その任意の実施形態を含む本発明の方法を含み、標的生体分子の目的の化合物がタンパク質である方法も提供する。本発明はまた、このような方法によって得られる抗体又は抗体断片などのタンパク質も提供する。
【０１３３】
本発明はまた、本明細書に開示される本発明の方法によって得られる目的の化合物又は標的生体分子も提供する。
【０１３４】
定義
本明細書で使用される「陰イオン交換クロマトグラフィー」という用語は、固相が正に帯電している、例えば四級アミノ基などの１つ又は２つ以上の正に帯電したリガンドがそこに結合しているクロマトグラフィーを指す。市販の陰イオン交換マトリックスには、ＤＥＡＥセルロース、ＱＡＥ  ＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）、ＦＡＳＴ  Ｑ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）Ｃａｐｔｏ  Ｑ及びＣａｐｔｏ  Ｑ  Ｉｍｐｒｅｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｕｎｏｓｐｈｅｒｅ及びＮｕｖｉａ  Ｑ（ＢｉｏＲａｄ）、ＧｉｇａＣａｐ  Ｑ（Ｔｏｓｏｈ）、Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑ  ＸＴ（Ｐａｌｌ）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  Ｑ及びＥｓｈｍｕｎｏ  Ｑ（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ならびに陰イオン交換膜吸着器、例えばＳａｒｔｏＢｉｎｄ  Ｑ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）、ならびにモノリス吸着器、例えばＱＡモノリス（Ｂｉａ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）が含まれる。
【０１３５】
本明細書で使用される「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」又は「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」という用語は、２つの重鎖及び２つの軽鎖を含むモノクローナル又はポリクローナル四量体完全長抗体を指す。例えばＢｉｃｌｏｎｉｃｓ（登録商標）又はＤｕｏＢｏｄｙ（登録商標）などの二重特異性抗体において、２つの重鎖及び２つの軽鎖は同一であっても異なっていてもよい。免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）又は免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ）という用語は、それぞれ「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」又は「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」と同義で使用される。本明細書で使用される「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」又は「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」という用語には、それだけに限らないが、当技術分野で知られている組換え技術によって生成される組換え抗体が含まれる。「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」又は「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」は、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、ヒト、例えばチンパンジー、ヒヒ、アカゲザルもしくはカニクイザル）、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ウサギもしくはモルモット）、ヤギ、ウシ又はウマ種などの哺乳動物種を含む任意の起源のものであり得る。本明細書の抗体は、目的の「抗原」に対するものである。好ましくは、抗原は、生物学的に重要なポリペプチドであり、疾患又は障害を患っている哺乳動物への抗体の投与は、その哺乳動物に治療的利益をもたらし得る。しかしながら、非ポリペプチド抗原に対する抗体も考えられる。抗原がポリペプチドである場合、これは膜貫通分子（例えば、受容体）又はリガンド、例えば成長因子もしくはサイトカインであり得る。本発明に包含される抗体の好ましい分子標的には、ＣＤポリペプチド、例えばＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０及びＣＤ４０−Ｌ；ＦｃＲＮ；ＯＸ４０；ＨＥＲ受容体ファミリーのメンバー、例えばＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４受容体；細胞接着分子、例えばそのα又はβサブユニットのいずれかを含むＬＦＡ−１、Ｍａｃ１、ｐ１５０、９５、ＶＬＡ−４、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ及びａｖ／ｂ３インテグリン（例えば、抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８又は抗ＣＤ１１ｂ抗体）；ケモカイン及びサイトカイン又はそれらの受容体、例えばＩＬ−１α及びβ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−６受容体、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７Ａ及び／又はＩＬ−１７Ｆ、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＴＮＦα及びＴＮＦβ；成長因子、例えばＶＥＧＦ；ＩｇＥ；血液型抗原；ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体；肥満（ＯＢ）受容体；ｍｐｌ受容体；ＣＴＬＡ−４；ポリペプチドＣ；ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＣＳＫ９；スクレロスチン；等が含まれる。
【０１３６】
本明細書で使用される「抗体断片（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）」又は「抗体断片（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）」という用語は、抗体の一部、一般的にはその抗原結合領域又は可変領域を指す。抗体断片の例としては、Ｆｃ部分を欠く又はこれを有さない抗体が挙げられる。抗体断片の例としては、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ及びｓｃＦｖ断片；ならびにＢｉＴＥｓ（登録商標）（二重特異性Ｔ細胞エンゲイジャー（（Ｂｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ  Ｅｎｇａｇｅｒｓ））及びＤＡＲＴ（商標）（Ｄｕａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅ−Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ技術）などのフォーマットを含むダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ドメイン抗体（ｄＡｂｓ）、例えばｓｄＡｂｓ、ＶＨＨ及びＶＮＡＲ断片、それだけに限らないが、Ｆａｂ−Ｆｖ、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ、Ｆａｂ（Ｆｖ）２又はＦａｂ−（ｓｃＦｖ）２構築物を含む、抗体断片又は抗体から形成された単鎖抗体、二重特異性、三重特異性、四重特異性又は多重特異性抗体も挙げられる。上に定義される抗体断片及び誘導体は、当技術分野で知られている（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ２０１２）。明確にするために、Ｆａｂ−Ｆｖは、任意の順序で結合した１つのＦｖ領域と１つのＦａｂ領域を含有する構築物、すなわちＦａｂ−Ｆｖ又はＦｖ−Ｆａｂを指すと理解されるべきであり、１つの領域の最後のアミノ酸に、次の領域の最初のアミノ酸が続く、又はその逆である。同様に、Ｆａｂ−ｓｃＦｖは、任意の順序で、Ｆａｂの場合、いずれかのポリペプチド鎖に結合した１つのｓｃＦｖ領域と１つのＦａｂ領域を含有する構築物、すなわちＦａｂ−ｓｃＦｖ又はｓｃＦｖ−Ｆａｂを指すと理解されるべきであり、１つの領域の最後のアミノ酸に、次の領域の最初のアミノ酸が続く、又はその逆である。同様に、Ｆａｂ−（Ｆｖ）２は、任意の順序で結合した２つのＦｖ領域と１つのＦａｂ領域を含有する構築物、すなわちＦａｂ−Ｆｖ−Ｆｖ、Ｆｖ−Ｆａｂ−Ｆｖ又はＦｖ−Ｆｖ−Ｆａｂを指すと理解されるべきであり、１つの領域の最後のアミノ酸に、次の領域の最初のアミノ酸が続く、又はその逆である。同様に、Ｆａｂ−（ｓｃＦｖ）２は、任意の順序で、Ｆａｂの場合、いずれかのポリペプチド鎖に結合した２つのｓｃＦｖ領域と１つのＦａｂ領域を含有し、２０の可能な順列をもたらす構築物を指すと理解されるべきである。典型的には、これらの構築物は、第１の領域（例えば、Ｆａｂ）と第２の領域（例えば、Ｆｖ）との間にペプチドリンカーを含む。このようなリンカーは当技術分野で周知であり、典型的には当業者によって長さ及び組成が最適化された１つ又は２つ以上のアミノ酸であり得る。あるいは、前記領域が、直接、すなわちペプチドリンカーなしで連結されていてもよい。可変ドメインをＦａｂ又はＦａｂ’に連結するための適切なリンカー領域の例は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１３／０６８５７１号パンフレットに記載されており、それだけに限らないが、可撓性リンカー配列及び剛性リンカー配列が挙げられる。抗体断片を、アグリコシル化又はグリコシル化することができる。「抗体断片（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）」又��「抗体断片（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）」という用語は、別の抗体ドメイン、異なるタンパク質又は非タンパク質分子に共有結合した少なくとも１つの抗原結合又はｆｃ受容体結合抗体ドメインを含む抗体誘導体も指す。
【０１３７】
本明細書で使用される「核酸分子」という用語は、一本鎖又は二本鎖核酸を指す。核酸分子はプラスミド、ｍＲＮＡ、プライマー及びプローブを含む群から選択され得る。一実施形態では、核酸分子がＤ−ヌクレオチドを含む、又はＤ−ヌクレオチドからなる。代替実施形態では、核酸分子がＬ−ヌクレオチドを含む、又はＬ−ヌクレオチドからなる。「核酸分子」及び「ポリヌクレオチド」という用語は互換的に使用することができる。
【０１３８】
本明細書で使用される「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合によって結合された複数のアミノ酸を指す。ポリペプチドは、典型的には２〜１００個のアミノ酸、例えば１０〜５０個のアミノ酸を含む。ポリペプチドは、もっぱら天然アミノ酸を含んでもよく、又は１つもしくは複数の非天然アミノ酸、例えばβ−アミノ酸（β３及びβ２）；ホモアミノ酸；プロリン及びピルビン酸誘導体；３−置換アラニン誘導体；グリシン誘導体；環置換フェニルアラニン及びチロシン誘導体；直鎖コアアミノ酸及びＮ−メチルアミノ酸を含んでもよい。
【０１３９】
本明細書で使用される「陽イオン交換クロマトグラフィー」という用語は、固相が負に帯電している、例えば１つ又は２つ以上の負に帯電したリガンド、例えばカルボキシラート又はスルホナート基を有するクロマトグラフィーを指す。市販の陽イオン交換マトリックスには、カルボキシメチルセルロース、アガロースに固定化されたスルホプロピル（ＳＰ）及びアガロースに固定化されたスルホニル、例えばＣａｐｔｏ  Ｓ、Ｃａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ及びＣａｐｔｏ  Ｓ  Ｉｍｐｒｅｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｕｎｏｓｐｈｅｒｅ  Ｓ及びＮｕｖｉａ  Ｓ（ＢｉｏＲａｄ）、ＧｉｇａＣａｐ  Ｓ（Ｔｏｓｏｈ）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  Ｓ及びＥｓｈｍｕｎｏ  Ｓ（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）又は陽イオン交換膜吸着器、例えばＳａｒｔｏＢｉｎｄ  Ｓ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）及びモノリス吸着器、例えばＳＯ３モノリス（Ｂｉａ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）が含まれる。
【０１４０】
本明細書で使用されるクロマトグラフィーに関連する「クロマトグラフィーカラム」又は「カラム」という用語は、しばしばクロマトグラフィーマトリックスで満たされたシリンダー又は中空ピラーの形態の容器を指す。クロマトグラフィーマトリックスは、精製に使用される物理的及び／又は化学的特性を提供する材料である。
【０１４１】
本明細書で使用される「クロマトグラフィーサイクル」又は「運転クロマトグラフィーサイクル」という用語は、それだけに限らないが、以下のステップの連続組み合わせの中のいくらか〜１つ又は２つ以上を含み得るクロマトグラフィーマトリックスの所与の割り当てに対する一連の方法のステップの単一サイクルの運転を指す：平衡化ステップ、リロードステップ、ロードステップ、オーバーロードステップ、ロード後洗い流しステップ、第２の洗い流しステップ、溶出ステップ、再生ステップ、洗浄ステップ、貯蔵ステップ及び一時停止又は保持期間。したがって、さらなるサイクルは、同じ一連の処理ステップの繰り返しを含み得る。
【０１４２】
目的の化合物／標的生体分子のクロマトグラフィーマトリックスへの相互作用に関する「結合する（ｂｉｎｄ）」及び「結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）」という用語は、マトリックスによる化合物又は生体分子の捕捉を指す。当業者であれば、目的の化合物／標的生体分子がクロマトグラフィーマトリックスと相互作用する手段が当のマトリックスの性質に依存することを理解するだろう。「〜に結合する（ｂｉｎｄｓ  ｔｏ）」という用語は、必ずしも共有結合を意味するわけではない。イオン交換クロマトグラフィーの場合、「結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）」は、目的の化合物／標的生体分子とマトリックスとの間のイオン相互作用である。アフィニティークロマトグラフィーの場合、「結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）」は、目的の化合物／標的生体分子とマトリックスとの間の親和性相互作用である。疎水性相互作用クロマトグラフィーの場合、「結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）」は、目的の化合物／標的生体分子とマトリックスとの間の疎水性相互作用である。他のタイプのクロマトグラフィーに適用可能な関連する結合モードは、当業者に明らかであろう。
【０１４３】
本明細書で使用されるクロマトグラフィーに関連する「動的結合容量（ｄｙｎａｍｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃａｐａｃｉｔｙ）」という用語は、フロースルー中に有意な量の目的のタンパク質又は他の標的化合物を有することなく、一定流下でクロマトグラフィーマトリックスに結合することができる目的のタンパク質又は他の標的化合物の量を指す。クロマトグラフィーマトリックスの動的結合容量は、既知の濃度の目的のタンパク質を含有する試料をロードすることによって決定される。タンパク質試料のカラムへのロードを監視すると、未結合のタンパク質がマトリックスを通過する前に、一定のブレークポイントまでマトリックスに結合する。例えば、１０％のタンパク質の喪失での破過曲線から、動的結合容量を見つけ、実験を停止する。通常、動的結合容量は、目的のタンパク質の５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１５％、１７％又は２０％以下がフロースルー中に喪失される一定流下でマトリックスに結合することができる目的のタンパク質の量、好ましくは同じ時点でロードされている目的のタンパク質の濃度の量として定義される。
【０１４４】
本明細書で使用される「フロースルー」という用語は、混合物をクロマトグラフィーマトリックスに通過させることによって得られる液体組成物を指す。
【０１４５】
本明細書で使用される「疎水性相互作用クロマトグラフィー」という用語は、固相が疎水性である、例えば１つ又は２つ以上の疎水性リガンド、例えばフェニル又はブチル基を有するクロマトグラフィーを指す。市販の疎水性相互作用マトリックスには、アガロースに固定化されたフェニルもしくはブチル、例えばＣａｐｔｏ  ＰｈｅｎｙｌもしくはＣａｐｔｏ  Ｂｕｔｙｌ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＴｏｙｏＰｅａｒｌ  ＨＩＣ（Ｔｏｓｏｈ）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  Ｐｈｅｎｙｌ（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、又は膜吸着器に固定化されたたフェニルもしくはブチル、例えばＳａｒｔｏＢｉｎｄ  ＨＩＣ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）が含まれる。
【０１４６】
本明細書で使用されるクロマトグラフィーに関連する「膜吸着器」又は「膜クロマトグラフィー」という用語は、半透膜が、供給流が供給される容器に収容されており、その表面に精製に使用される物理的及び／又は化学的特性を提供する材料である樹脂又はリガンドが付着しているクロマトグラフィーフォーマットを指す。
【０１４７】
本明細書で使用されるクロマトグラフィーに関連する「モノリスクロマトグラフィー」又は「モノリス吸着器」という用語は、多孔質ポリマーの連続容積が、供給流が供給される容器に収容されており、その表面に精製に使用される物理的及び／又は化学的特性を提供する材料である樹脂又はリガンドが付着しているクロマトグラフィーフォーマットを指す。
【０１４８】
本明細書で使用される「ミックスモード」クロマトグラフィーという用語は、固相が、例えばヒドロキシアパタイトなどの、異なる帯電又は非帯電リガンドの混合物を有し得るクロマトグラフィーを指す。市販のミックスモアマトリックス（ｍｉｘｅｄ  ｍｏｒｅ  ｍａｔｒｉｃｅｓ）には、セラミックヒドロキシアパタイト（ＢｉｏＲａｄ）又はＣａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及びＨＡ  Ｕｌｔｒｏｇｅｌヒドロキシアパタイト（Ｐａｌｌ）が含まれる。
【０１４９】
本明細書で使用される「混合物」という用語は、同様に存在し得る宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ又は他の宿主細胞成分などの他の物質から精製しようとする少なくとも１つの目的のタンパク質を含む少なくとも部分的に液体の組成物を指す。混合物は、例えば、懸濁液、水溶液、有機溶媒系、又は水性／有機溶媒混合物もしくは溶液であり得る。混合物は、通常、多くの生物学的分子（タンパク質、抗体、ホルモン、ポリヌクレオチド及びウイルスなど）、小分子（塩、糖、脂質等など）及びさらには粒子状物質を含む複雑な混合物又は溶液である。生物起源の典型的な混合物は水溶液又は懸濁液として始まり得るが、溶媒沈殿、抽出などの初期の分離ステップで使用される有機溶媒を含有してもよい。本明細書で使用される場合、「混合物」という用語は、「供給原料」という用語と同一視され得る。混合物／供給原料の容積は、「供給原料からの供給材料」と呼ばれ得る。
【０１５０】
本明細書で使用されるクロマトグラフィーに関連する「静的結合容量（ｓｔａｔｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃａｐａｃｉｔｙ）」という用語は、フロースルー中に有意な量の目的のタンパク質又は他の標的化合物を有することなく、静的条件下でクロマトグラフィーマトリックスに結合することができる目的のタンパク質又は他の標的化合物の最大量を指す。静的結合容量は通常、ビーカー内の回分モードで測定され、通常、所与の溶媒及びタンパク質濃度条件でクロマトグラフィー媒体に結合したタンパク質の最大量と呼ばれる。
【０１５１】
「薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又はアジュバント」という用語は、生体分子生成物とは別の治療製剤の成分を指す。希釈剤には、例えばラクトース、デキストロース、ショ糖、セルロース、コーンスターチ又はジャガイモデンプンが含まれ；賦形剤には、潤滑剤、例えばシリカ、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウムもしくはカルシウム、及び／又はポリエチレングリコール；結合剤；例えばデンプン、アラビアゴム、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース又はポリビニルピロリドン；脱凝集剤、例えばデンプン、アルギン酸、アルギン酸塩又はデンプングリコール酸ナトリウム；発泡性混合物；染料；甘味剤；湿潤剤、例えばレシチン、ポリソルベート、ラウリル硫酸塩；ならびに一般に、医薬製剤に使用される非毒性で薬理学的に不活性な物質が含まれる。アジュバントには、鎮痛剤、無機化合物、例えばミョウバン、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム及びリン酸カルシウム水酸化物；鉱油、例えばパラフィン油；洗剤；サポニン、サイトカイン及び食品ベースの油が含まれる。当業者は、生体分子生成物の用途に応じて、適切な薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又はアジュバントを選択することができる。
【０１５２】
さらなる詳細
本発明の方法に従って精製することができる抗体又は抗体断片などの目的のタンパク質は、組換え抗体又は抗体断片をコードする１つ又は２つ以上の発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養することによって産生することができる。
【０１５３】
本発明の実施形態による宿主細胞は、例えば、原核生物、酵母（例えば、限定されないが、カンジダ・ボイジニイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）及び他のクルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）種、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））、粘菌類（Ｍｙｘｏｍｙｃｅｔｅ）（例えば、限定されないが、キイロタマホコリカビ（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ  ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ））、糸状菌類（例えば、限定されないが、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）及び他のトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種、クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）及び他のアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種）、コケ（例えば、限定されないが、ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）、ナミガタタチゴケ（Ａｔｒｉｃｈｕｍ  ｕｎｄｕｌａｔｕｍ））、昆虫又は哺乳動物細胞である。哺乳動物宿主細胞は、例えば、限定されないが、ＮＳＯ、ＳＰ２．０、３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞、ヒト骨肉腫細胞、ＭＲＣ−５細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＣＨＯ細胞、ｒＣＨＯ−ｔＰＡ細胞、ｒＣＨＯ−Ｈｅｐ  Ｂ表面抗原細胞、ＣＨＯ−Ｓ細胞、ＨＥＫ  ２９３細胞、ｒＨＥＫ  ２９３細胞、Ｃ１２７細胞、ｒＣ１２７−Ｈｅｐ  Ｂ表面抗原細胞、ヒト線維芽細胞、ストローマ細胞、肝細胞又はＰＥＲ．Ｃ６細胞である。
【０１５４】
宿主細胞は、好ましくは真核生物宿主細胞、好ましくは哺乳動物宿主細胞、より好ましくは例えばＤＧ４４系統の、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。
【０１５５】
真核宿主細胞（例えば、酵母、昆虫又は哺乳動物細胞）の場合、宿主の性質に応じて、異なる転写及び翻訳制御配列が使用され得る。これらは、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、シミアンウイルスなどのウイルス源に由来してもよく、制御シグナルは、高レベルの発現を有する特定の遺伝子に関連している。例としては、ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、酵母ｇａｌ４遺伝子プロモーター等がある。遺伝子の発現を調節できるように、抑制及び活性化を可能にする転写開始制御シグナルが選択され得る。導入されたＤＮＡによって安定的に形質転換された細胞は、発現ベクターを含有する宿主細胞の選択を可能にする１つ又は２つ以上のマーカーを導入することによっても選択することができる。マーカーはまた、栄養要求性宿主への光栄養、殺生物剤耐性、例えば限定されないが抗生物質、又は銅などの重金属などを提供し得る。選択可能なマーカー遺伝子を、発現されるＤＮＡ遺伝子配列に直接連結する、又はコトランスフェクションによって同じ細胞に導入することができる。本発明のタンパク質の最適な合成のために、追加の要素が必要となる場合もある。
【０１５６】
真核宿主細胞は、目的のタンパク質をコードする１つ又は２つ以上の発現ベクターでトランスフェクトされ、その後、目的のタンパク質の増殖及び発現を支持する任意の培地で培養される。培地は、動物血清及びペプトンなどの動物由来産物を含まない既知組成培地（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ）である。細胞増殖及びタンパク質産生を可能にする適切な濃度で存在する、ビタミン、アミノ酸、ホルモン、成長因子、イオン、緩衝液、ヌクレオシド、グルコース又は同等のエネルギー源の様々な組み合わせを含む、当業者に利用可能な様々な細胞培養培地が存在する。追加の細胞培養培地成分を、当業者に知られているであろう細胞培養サイクル中の異なる時間に適切な濃度で細胞培養培地に含めてもよい。
【０１５７】
哺乳動物細胞培養は、必要な製造規模に応じて流加モードで運転してもしなくてもよい振盪フラスコ又はバイオリアクターなどの任意の適切な容器で行うことができる。これらのバイオリアクターは、攪拌槽リアクター又はエアリフトリアクターのいずれかであり得る。容量が１，０００Ｌ超〜５０，０００Ｌ又は１００，０００Ｌ、好ましくは５，０００Ｌ〜２０，０００Ｌ、又は〜１０，０００Ｌの種々の大規模バイオリアクターが利用可能である。あるいは、２Ｌ〜１００Ｌなどの小規模のバイオリアクターを使用して本発明の方法による抗体を製造してもよい。
【０１５８】
本発明の方法及び方法により、ＣＨＯ細胞などの真核宿主細胞で産生される抗体又は抗原結合断片などの目的のタンパク質は、典型的には細胞培養物の上清に見られる。本発明の一実施形態では、前記上清が、本発明の方法で精製された混合物である。
【０１５９】
したがって、本発明の特定の実施形態では、本発明の方法及び方法が、本発明の方法によるさらなる精製のための目的のタンパク質を含有する混合物を得るために上清の遠心分離及び遠心分離後の液相の回収のステップを含む。
【０１６０】
あるいは、前記上清が、例えば深層濾過などの当業者に知られている清澄化技術を使用して回収され得る。したがって、本発明の特定の実施形態では、本方法が、本発明の方法によるさらなる精製のための目的のタンパク質を含有する混合物を得るために深層濾過のステップを含む。
【０１６１】
あるいは、宿主細胞が原核細胞、好ましくはグラム陰性細菌、好ましくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞原核細胞である。タンパク質発現のための原核生物宿主細胞は、当技術分野で周知である。宿主細胞は、抗体断片などの目的のタンパク質を産生するよう遺伝子操作された組換え細胞である。組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞は、ＭＣ４１００、ＴＧ１、ＴＧ２、ＤＨＢ４、ＤＨ５α、ＤＨ１、ＢＬ２１、Ｋ１２、ＸＬ１Ｂｌｕｅ及びＪＭ１０９を含む任意の適切な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株に由来し得る。一例は、組換えタンパク質発酵に一般的に使用される宿主株である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ  ２７，３２５）である。抗体断片はまた、改変された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株、例えば代謝変異体又はプロテアーゼ欠損大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を培養することによって産生することができる。
【０１６２】
本発明の方法に従って精製することができる抗体断片は、典型的には、タンパク質の性質、製造規模及び使用される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株に応じて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞のペリプラズム又は宿主細胞培養物上清のいずれかに見られる。タンパク質をこれらのコンパートメントに標的化する方法は、当技術分野で周知である。タンパク質を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のペリプラズムに向ける適切なシグナル配列の例としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰｈｏＡ、ＯｍｐＡ、ＯｍｐＴ、ＬａｍＢ及びＯｍｐＦシグナル配列が挙げられる。タンパク質は、自然分泌経路に依存するか、外膜の限られた漏出を誘導してタンパク質分泌を引き起こすことによって、上清を標的化することができ、その例は、ｐｅｌＢリーダー、プロテインＡリーダー、培養培地へのグリシンの添加を伴うバクテリオシン放出タンパク質、マイトマイシン誘導バクテリオシン放出タンパク質の同時発現、及び膜透過性のためのｋｉｌ遺伝子の同時発現の使用である。最も好ましくは、本発明の方法では、組換えタンパク質が宿主大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のペリプラズムで発現される。
【０１６３】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞における組換えタンパク質の発現は誘導性系の制御下にあってもよく、それによると、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における組換え抗体の発現は誘導性プロモーターの制御下にある。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）での使用に適した多くの誘導性プロモーターは当技術分野で周知であり、プロモーターに依存する；組換えタンパク質の発現は、温度又は増殖培地中の特定の物質の濃度などの様々な因子によって誘導することができる。誘導性プロモーターの例としては、ラクトース又は非加水分解性ラクトース類似体、イソプロピル−ｂ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導可能な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｌａｃ、ｔａｃ及びｔｒｃプロモーター、ならびにそれぞれホスファート、トリプトファン及びＬ−アラビノースによって誘導されるｐｈｏＡ、ｔｒｐ及びａｒａＢＡＤプロモーターが挙げられる。発現は、例えば、誘導因子の添加又は温度の変化によって誘導され得、誘導は温度依存性である。培養物への誘導因子の添加によって組換えタンパク質発現の誘導が達成される場合、誘導因子は、発酵系及び誘導因子に応じた任意の適切な方法によって、例えば、単回もしくは複数回添加によって、又は供給材料を通した誘導因子の漸進的添加によって添加され得る。誘導因子の添加とタンパク質発現の実際の誘導との間に遅延があり得、例えば、誘導因子がラクトースである場合、ラクトースの前に既存の炭素源が利用される間、タンパク質発現の誘導が起こる前に遅延があり得ることが理解さるだろう。
【０１６４】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞培養（発酵）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の増殖及び組換えタンパク質の発現を支持する任意の培地で培養され得る。培地は、例えばに記載されるような任意の既知組成培地であり得る。
【０１６５】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞の培養は、必要とされる製造規模に応じて、振盪フラスコ又は発酵槽などの適切な容器で行うことができる。容量が１，０００Ｌ超〜最大１００，０００Ｌの種々の大規模発酵槽が利用可能である。好ましくは、１，０００Ｌ〜５０，０００Ｌ、より好ましくは１，０００Ｌ〜１０，０００Ｌ又は１２，０００Ｌの発酵槽が使用される。容量が０．５Ｌ〜１，０００Ｌの小規模発酵槽も使用され得る。
【０１６６】
ＣＨＯ又は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの宿主細胞の発酵は、必要とされるタンパク質及び収率に応じて、任意の適切な系、例えば連続、回分又は流加モードで実行され得る。回分モードは、必要に応じて、栄養素又は誘導因子のショット添加で使用され得る。あるいは、流加培養を使用してもよく、発酵槽に最初に存在する栄養素を使用して維持することができる最大特定増殖率及び発酵が完了するまで増殖率を制御するために使用される１つ又は２つ以上の栄養素供給体制で回分モードの事前誘導で培養物を増殖してもよい。
【０１６７】
一実施形態では、本発明による方法が、第１のクロマトグラフィーマトリックスへのローディングの前に、捕捉ステップ、細胞培養収穫物の遠心分離のステップ、引き続いて抽出緩衝液の添加による宿主細胞の懸濁を含む。
【０１６８】
抗体断片などの目的のタンパク質が宿主細胞のペリプラズム空間に見られる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発酵プロセスの場合、宿主細胞からタンパク質を放出することが必要である。放出は、機械もしくは圧力処理、凍結−融解処理、浸透圧ショック、抽出剤又は熱処理による細胞溶解などの任意の適切な方法によって達成され得る。タンパク質放出のためのこのような抽出方法は、当技術分野で周知である。
【０１６９】
本発明の方法の特定の実施形態では、任意の実施形態による本発明の方法における混合物が、例えば、抗体又は抗体断片結合を破壊するのに適したｐＨを有する溶出緩衝液による、プロテインＡに結合した抗体又は抗体断片の溶出によって生成される。前記ｐＨは特定の分子に依存し、一般的に当業者によって経験的に決定され、所望の終点を達成するよう調整される。
【０１７０】
例えば、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（登録商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ａｂｓｏｌｕｔｅ（登録商標）（Ｎｏｖａｓｅｐ）、Ｃａｐｔｉｖ  Ａ（登録商標）（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ）又はＡｍｓｐｈｅｒｅ（登録商標）（ＪＳＲ）などの、前記天然組換えプロテインＡを含有する多くのクロマトグラフィー材料が当業者に利用可能である。
【０１７１】
プロテインＡクロマトグラフィーの洗い流し及び溶出緩衝液としての使用に適した緩衝液は、当技術分野で容易に入手可能であり、非限定的な例として、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリス、ヒスチジン、酢酸、クエン酸緩衝液、又はＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸イミダゾール）、ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−（ビス−２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）−プロパンスルホン酸）、又はＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸）緩衝液から選択され得る。
【０１７２】
以下の例は本発明を説明するものである。しかし、これは決して本発明を限定するものではない。これに関して、例に記載される特定の方法、ならびに純度及び収率を実証するために使用される方法は、本発明の方法の指標を提供するためにのみ設計されていることを理解することが重要である。生体分子の収率及び純度を決定するために利用可能な多くの方法が存在するので、いずれか１つの特定のアッセイでの否定的な結果は決定的ではない。
【０１７３】
例
濃度２．１８ｇ／Ｌ及び導電率約１４ｍＳ／ｃｍの裸のＦａｂを含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物から遠心分離及び熱抽出された凍結清澄化細胞培養液を、脱イオン水で、ｐＨ約４．５及び導電率約３．７６ｍＳ／ｃｍで濃度０．５ｇ／ｌに希釈した。３カラムボリューム（ＣＶ）相当の洗い流し緩衝液（５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．５  導電率４．０ｍＳ／ｃｍ）をカラムベースのクロマトグラフィーマトリックスに１５０ｃｍ／ｈでポンプで送ってカラムを平衡化し、引き続いて１７．５ｇ／Ｌ樹脂容積のロード負荷まで適用される目的のタンパク質を含有するロードを、２２５ｃｍ／時間でポンプで送り、引き続いて１５０ｃｍ／ｈでさらに５ＣＶの同じ洗い流し緩衝液、引き続いて１５０ｃｍ／時間で１０ＣＶにわたって低導電率洗い流し緩衝液から高導電率溶出緩衝液に上昇する線形溶出緩衝液勾配（５０ｍＭ酢酸ナトリウム  ２２５ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液ｐＨ４．５  導電率２６．４ｍＳ／ｃｍ）、引き続いて２ＣＶの高導電率再生緩衝液（５０ｍＭ酢酸ナトリウム  １Ｍ塩化ナトリウム  ｐＨ４．５  導電率８５ｍＳ／ｃｍ）を３００ｃｍ／時間で適用し、引き続いて２ＣＶの高ｐＨ洗浄緩衝液を３００ｃｍ／時間で適用し、この点で１５分間保持した後、さらなる２ＣＶの洗い流し緩衝液ですすぎ落とす、結合及び溶出クロマトグラフィーによるプロセスを実行した。使用したクロマトグラフィーマトリックスはＧＥ  ４．６６ｍｌ  １０ｃｍ  Ｃａｐｔｏ  Ｓ  ＨｉＳｃｒｅｅｎ陽イオン交換カラムで、作業はＧＥ  Ａｋｔａ  Ａｖａｎｔ機械で実行した。クロマトグラフィーの間中、カラムからの出力の導電率、ｐＨ、２８０ｎｍ吸光度、２６０ｎｍ吸光度及び３０５ｎｍ吸光度をインラインで測定し、リアルタイムで監視及び記録し、１０ＣＶ溶出中の出力液を捕捉し、６℃で９６ウェルディープウェルマイクロタイタープレートに１．５５ｍｌ画分を保存した。１０ＣＶ勾配溶出を通して振幅測定値を観察すると、２つの主に部分的に分離されたピークが強い重複で現れた；おおよそ２２番目の画分のはるかに大きな非対称ピーク頂点の直前のおおよそ１７番目の画分の別個の頂点を有する小さなピーク。各画分の３０ｕｌをサンプリングし、アフィニティープロテインＧ分析ＨＰＬＣステップで実行して画分の組成を決定し、プロテインＧ  ＨＰＬＣを通過する各試料の別個のフロースルーピーク及び溶離液ピークのＡ２８０吸光度を積分することによって、Ｃａｐｔｏ  Ｓ勾配溶出での初期の小さいピークに相当する非抗体成分（ＨＰＬＣのフロースルー、ここでは非Ｆａｂと呼ばれる）の量とＣａｐｔｏ  Ｓ勾配溶出の後期の大きなピークに相当する抗体成分（ＨＰＬＣの溶離液、ここではＦａｂと呼ばれる）の量の別個の決定が可能になり、両方の真のプロファイルを得た。
【０１７４】
この第１のサイクルでのＣＥＸ勾配溶出の２つのピーク間の重複領域からの２つの特定の画分（合計３２のうちの２１番目及び２２番目）の残りの保持容積（各画分の大部分を表す−それぞれからの５％未満をプロテインＧ  ＨＰＬＣアッセイに使用した）をプールし、容器内の前のクロマトグラフィー運転と同じ容積の新たなロードに添加し、脱イオン水を使用して再び同じ導電率３．７６ｍＳ／ｃｍに希釈してＣａｐｔｏ  Ｓクロマトグラフィーの次のサイクルで再びロードした。これらの画分を、高い含有量の目的のＦａｂ及び有意な含量の非Ｆａｂを有するので選択し、コンピュータモデルによって有効な選択を支援することができた（以下参照）。一方、これらの選択された２つの後の（２３番目〜３１番目、以下で保持プールと呼ばれる）、主にＦａｂを含有する画分の残りの保持容積の大部分をプールし、このプール中の得られたＦａｂ及び残りの不純物を計算した。いずれの場合も、各プールの純度を、Ｆａｂの量÷非Ｆａｂの量として計算し、収率を、保持プール中のＦａｂの量÷両溶出ピークをカバーする全ての画分（画分９〜３１）中の総Ｆａｂとして計算した。
【０１７５】
合わせたロード／再利用画分を、全て同じ運転で構成される後の第２のクロマトグラフィーサイクルでカラムに再適用し、再び同じ画分を回収し、同じ少量の各々をプロテインＧ  ＨＰＬＣによるアッセイのためにサンプリングし、もう一度、同じ２つの画分を保存し、追加の新たなロードとプールして、第３のサイクルに適用し、再び、２３番目の画分〜３１番目の画分をプールして、このセクションのＦａｂ及び非Ｆａｂの量及び収率を計算した。これを、第３及び第４のサイクルで同じ方法で繰り返した。これにより、生の新鮮な供給材料のみを受け、そのため伝統的な回分操作及び本発明の再利用運転の対照として運転していた初期サイクルと比較して、前のサイクルからの再利用画分を受けた第２、第３及び第４のサイクルの保持プール中のＦａｂの収率はそれぞれ２２％、２３％及び２５％有意に増加した。同時に、保持プールで測定されたＦａｂ１単位当たりの非Ｆａｂの比として計算された相対純度は、−４％、−４％及び＋１％と初期サイクルで観察された純度比に近いままであり、いくつかのサイクル後、初期サイクルと同じレベルに平衡化した。したがって、第１のサイクルの保持プールが、保持プールの所与の領域での特定の収率及び純度を与える伝統的なクロマトグラフィーの結合及び溶出分離を表す場合、本発明による前のサイクルからの再利用画分を組み込んだ後のクロマトグラフィーサイクルは、この純度を維持しながら、保持プールの同じ領域の収率を増加させることができた。容器に再利用される画分を貯蔵することによって、本発明の収率向上を単一クロマトグラフィーマトリックスで達成することができ、方法の平衡化能力に実質的に影響を及ぼすことなく、クロマトグラフィーの別々のサイクル間の柔軟な時間ギャップが可能になり、また同様にオフラインアッセイを使用して、サイクル間の画分間の性能を試験する時間も可能になり、新たなロードで希釈することによって、これらの画分のための別の希釈緩衝液の必要性が排除された。最後に、溶離液中の保持されたＦａｂの濃度も、伝統的な実行１と比較して、サイクル２、３、及び４で増加した。
【０１７６】
再利用のために選択された同じ２つの画分を、第４のサイクルから再度保存して、第５のサイクルで再適用し、第５のサイクルで、新たなロードを第１のサイクルと同様に脱イオン水で標的導電率３．７６ｍＳ／ｃｍに希釈した後、再利用された２１番目及び２２番目の画分を混合し、今度は、２つの画分に含有される溶出緩衝液からの追加の塩の流入後、導電率を３．７６ｍＳ／ｃｍに再度低下させるためにさらなる脱イオン水を添加しなかった。次のサイクルに適用される新たなロードの導電率は、結合を確保するために必要なものよりもはるかに低く、その容積は２つの再利用された画分の合わせた容積よりもはるかに大きかったので、これらを混合すると、次のサイクルのローディング中に通常の結合可能成分の結合を妨げないよう十分に画分中の高い導電率性塩を希釈する効果があるだろう。第５のサイクルの保持プールでは、１３％という初期（対照）サイクルに対する小さいが実質的な収率増加があり、６％の喪失というわずかに減少したがまだ同等の純度があり、純度＊収率バランスの全体的増加は１０６％であり、合わせた供給材料のさらなる希釈がなくても追加の全体的性能の増加を達成することができたことを実証している。
【０１７７】
もう一度、同じ２つの画分を回収し、第５から第６のサイクルまで再利用し、今回は、前と同じように合わせた供給材料を３．７６ｍＳ／ｃｍに希釈したところ、このサイクルでは、保持プールで収率と純度の両方の大幅な増加が同時に達成された。最後の第７のサイクルを実行し、ここでは第６のサイクルからの２０番目、２１番目、２２番目及び２３番目の画分を新たなロードと合わせ、脱イオン水で３．７６ｍＳ／ｃｍに希釈した後、第７のサイクルにロードした。この新しい拡張された範囲の画分が再利用されて将来の潜在的なサイクルが続く場合、保持プールに含まれる画分は必然的に１つ短くなり、２４番目の画分から３１番目の画分に及ぶ。この場合の保持プールは、初期サイクルの元の保持プールの範囲と比較してほぼ同じ収率（９７％）及び８％増加した純度を維持し、収率を維持しながら純度を増加させることができることを実証し、同じ画分を含む初期サイクルの保持プールと比較して、３２％高い収率及び１１％増加した純度をもたらした。第７以降サイクルが続かない場合、第７のサイクルの２３番目から３１番目の画分を含む保持プールは、初期サイクルからの同じ再利用プールと比較して、３４％高い収率及び１２％高い純度をもたらし、両者が有意に増加し得ることを実証した。
【０１７８】
全体純度増加を、所与のサイクルでの保持プールの純度÷初期サイクルでの保持プールの純度として計算し、全体収率増加を、所与のサイクルでの保持プールの収率÷初期サイクルでの保持プールの収率として計算した。
【０１７９】
したがって、あるサイクルから部分的に分離されたピークの重複から取られた選択画分を次のロードに再利用して、残りの再利用されない保持材料の収率もしくは純度又は両者の組み合わせを増加させて、標的生成物の効率的な精製を増強するよう仕向けることができることが実証されている。再利用する画分の合理的な選択は、コンピュータモデリングを通して支援することができる−初期サイクルで試料にわたるＦａｂ及び非Ｆａｂの量を決定した後、潜在的に再利用する所与の画分の選択でＦａｂ及び非Ｆａｂの量を計算し、それらがリサイクルされる場合の次の保持プールにおけるピーク組成及び量の変化をシミュレートし、反復を通して、複数のサイクルにわたって得られる純度及び収率の変化を予測することができるピーク分布のコンピュータモデルを作成した。次いで、このシミュレーションで再利用に選択された画分を変更して、所望のように純度もしくは収率又はその両方を増加させるであろう条件を反復的に見つけた。この方法は、再利用された画分の一方（後期画分）の保持プールのＦａｂ又は再利用された画分の他方（初期画分）の非Ｆａｂのいずれかを支持するよういずれかの方向に駆動することができた。同様に、標的生成物の濃度も同じ指示された方法で増強することができた。この方法は、最初の６サイクルで２１番目及び２２番目の画分を再利用するという選択を指示し、第６のサイクルのアッセイデータを使用してシミュレーションを再調整したら、第７のサイクルで２０番目から２３番目の画分の再利用を示した。
【０１８０】
この再利用アプローチは、異なる破過時間及びピーク形状をもたらす移動成分間の差動的分離が、それらと固定化リガンドと間の差動的な化学的及び／又は静電的相互作用に依存する所与のクロマトグラフィーについてそうであるように、破過時間及びピーク形状の点でピークの分離が同じままである限り、その部分的な分離が勾配溶出によって駆動されているかどうかに関係なく、記載されている例と同様に重複で溶出するピークを有する成分のクロマトグラフィーに自然に拡張されるだろう。さらに、この再利用アプローチは、２つの重複を有する３つの連続したピーク、又は３つの重複を有する４つのピーク、又はそれぞれ１つの重複を有する２つのペアに分割される４つのピークなど、複数のペアの重複を有する複数のピークを有する系にも自然に拡張されるだろう。いずれの場合も、後のサイクルに再利用される各重複の領域の最適化を使用して、重複するパートナーピークで優勢な望ましくない成分に対して、標的ピークの保持プールで優勢な所望の成分の収率（及び濃度）及び／又は純度を差動的に支持することができる、あるいは例えば所望の成分ピークが前後の２つの重複する望ましくない成分ピークに囲まれている場合、両方の重複する領域のセクションを再利用して、両方の隣接ピークに対して標的中央ピークを支持することができる。
【０１８１】
上記の例は、本発明による方法により、純度の向上、収率の向上、濃度の増加、自由な希釈、中断可能な運転、単一カラム運転、任意のリローディング順序を含む種々の利点が実現できることを示している。
【０１８２】
明細書、特許請求の範囲及び／又は図面に開示される本発明の特徴は、別々とそれらの任意の組み合わせの両方で、本発明をその種々の形態で実現するための材料となり得る。
【０１８３】
参考文献
Kontermann,R.E.(2012).“Dual targeting strategies with bispecific antibodies.”MAbs 4(2):182-197.
Mahajan,E.,A.George and B.Wolk(2012).“Improving affinity chromatography resin efficiency using semi-continuous chromatography.”J Chromatogr A 1227:154-162.
【０１８４】
ここで本発明を十分に説明したが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、また過度の実験をすることなく、広範囲の同等のパラメータ、濃度及び条件内で同じことを実施できることが当業者によって理解されるだろう。本発明をその具体的な実施形態に関連して説明してきたが、さらなる修正が可能であることが理解されるであろう。本出願は、一般に、本発明の原理に従って、本発明が属する技術分野内の既知の又は慣用的な慣習内にあり、添付の特許請求の範囲内で以上に示される本質的な特徴に適用され得るような本開示からの逸脱を含む本発明の変化、使用又は適応を網羅することを意図している。
【０１８５】
本明細書で使用される場合、「ａ」又は「ａｎ」は１つ又は２つ以上を意味し得る。本明細書における「又は（ｏｒ）」という用語の使用は、代替物のみを指すように明示的に示されていない限り、又は代替物が相互排他的でない限り、「及び／又は」を意味するために使用されるが、本開示は代替物のみ及び「及び／又は」を指す定義を支持する。本明細書で使用される場合、「別の（ａｎｏｔｈｅｒ）」は、少なくとも第２の又はそれ以上を意味し得る。
【０１８６】
本明細書で使用される場合、「Ｘ〜Ｙ（ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｘ  ａｎｄ  Ｙ）」は、Ｘ及びＹを含む範囲を意味し得る。
【０１８７】
雑誌論文もしくは要約、公開もしくは未公開の米国もしくは外国の特許出願、発行された米国もしくは外国の特許又はその他の参考文献を含む、本明細書で引用される全ての参考文献は、引用された参考文献に提示される全てのデータ、表、図及びテキストを含めて、全体が参照により本明細書に組み込まれる。さらに、本明細書で引用される参考文献内で引用される参考文献の内容全体も、全体が参照により組み込まれる。
【０１８８】
既知の方法ステップ、従来の方法ステップ、既知の方法又は従来の方法への言及は、決して本発明の任意の態様、説明又は実施形態が関連技術で開示、教示又は示唆されていることの自認ではない。
【０１８９】
以下は本発明の態様である：
１．目的の化合物を含む混合物から目的の化合物を精製する方法であって、
ａ）第１の運転クロマトグラフィーサイクルで、第１の容器からの目的の化合物を含む混合物を、化合物がクロマトグラフィーマトリックスに結合するように運転されるクロマトグラフィーマトリックスにロードするステップと；
ｂ）クロマトグラフィーマトリックスから目的の化合物を溶出し、目的の化合物を含有する溶離液を溶離液の画分として回収するステップと；
ｃ）溶離液の１つ又は２つ以上の画分を、目的の化合物がクロマトグラフィーマトリックスに結合するように運転される同じクロマトグラフィーマトリックスにリロードするステップと
を含む方法。
【０１９０】
２．ステップｃ）のリロードすることが、さらなる運転クロマトグラフィーサイクルで、溶離液の１つ又は２つ以上の画分を、目的の化合物がクロマトグラフィーマトリックスに結合するように運転される同じクロマトグラフィーマトリックスにリロードすることである、態様１に記載の方法。
【０１９１】
３．さらなる運転クロマトグラフィーサイクルが、直後のクロマトグラフィーサイクルである、態様２に記載の方法。
【０１９２】
４．同じクロマトグラフィーマトリックスにリロードされる溶離液の１つ又は２つ以上の画分が、所望の特性を有する溶離液の１つ又は２つ以上の画分と異なる、態様１から３のいずれか１つに記載の方法。
【０１９３】
５．同じクロマトグラフィーマトリックスにリロードされる溶離液の１つ又は２つ以上の画分が、所望の特性を有する溶離液の１つ又は２つ以上の画分の前にクロマトグラフィーマトリックスから溶出する溶離液の１つ又は２つ以上の画分の少なくとも１つ、及び所望の特性を有する溶離液の１つ又は２つ以上の画分の後にクロマトグラフィーマトリックスから溶出する溶離液の１つ又は２つ以上の画分の少なくとも１つである、態様４に記載の方法。
【０１９４】
６．所望の特性を有する溶離液の１つ又は２つ以上の画分の前にクロマトグラフィーマトリックスから溶出する溶離液の１つ又は２つ以上の画分の少なくとも１つ、及び所望の特性を有する溶離液の１つ又は２つ以上の画分の後にクロマトグラフィーマトリックスから溶出する溶離液の１つ又は２つ以上の画分の少なくとも１つが、同じクロマトグラフィーマトリックスに別々にリロードされる、態様５に記載の方法。
【０１９５】
７．所望の特性を有する溶離液の１つ又は２つ以上の画分の前にクロマトグラフィーマトリックスから溶出する溶離液の１つ又は２つ以上の画分の少なくとも１つ、及び所望の特性を有する溶離液の１つ又は２つ以上の画分の後にクロマトグラフィーマトリックスから溶出する溶離液の１つ又は２つ以上の画分の少なくとも１つが、合わせられ、このような合わせた画分が同じクロマトグラフィーマトリックスにリロードされる、態様５に記載の方法。
【０１９６】
８．溶離液の１つ又は２つ以上の画分がリローディングの前又は間に処理され、処理された溶離液の１つ又は２つ以上の画分が、リローディング時に目的の化合物がクロマトグラフィーマトリックスに結合することを可能にする、態様１から７のいずれか１つに記載の方法。
【０１９７】
９．クロマトグラフィーマトリックスから目的の化合物を溶出し、目的の化合物を含有する溶離液を溶離液の画分として回収する前に、
ａｂ）未結合の目的の化合物を含有するフロースルーを第２の容器に回収するステップと；
ａｃ）さらなる運転クロマトグラフィーサイクルで、第２の容器からのフロースルーを目的の化合物がクロマトグラフィーマトリックスに結合するように運転される同じクロマトグラフィーマトリックスにリロードするステップと
を含む、態様１から８のいずれか１つに記載の方法。
【０１９８】
１０．クロマトグラフィーマトリックスから目的の化合物を溶出し、目的の化合物を含有する溶離液を溶離液の画分として回収する前に、
ａｂ）未結合の目的の化合物を含有するフロースルーを第２の容器に回収するステップと；
ａｃ）第２の容器からのフロースルーを同じクロマトグラフィーマトリックスにリロードし、さらに新たなロード混合物を、目的のタンパク質がクロマトグラフィーマトリックスに結合するように運転されるさらなる運転クロマトグラフィーサイクルでロードするステップと
を含む、態様１から８のいずれか１つに記載の方法。
【０１９９】
１１．第２の容器に回収されるフロースルー及び溶離液の１つ又は２つ以上の画分が、運転クロマトグラフィーサイクルで別々にリロードされる、態様９から１０のいずれか１つに記載の方法。
【０２００】
１２．フロースルー及び溶離液の１つ又は２つ以上の画分が合わせられ、目的の化合物がクロマトグラフィーマトリックスに結合するように運転される同じクロマトグラフィーマトリックスに組み合わせとしてリロードされる、態様９から１０のいずれか１つに記載の方法。
【０２０１】
１３．目的の化合物がタンパク質、抗体、抗体断片、核酸分子及び小分子を含む群から選択される、態様１から１２のいずれか１つに記載の方法。
【０２０２】
１４．態様１から１３のいずれか１つに定義される精製プロセスを含む、目的のタンパク質を製造する方法であって、精製プロセスで目的の化合物がタンパク質である方法。
【０２０３】
１５．態様１４に定義される目的のタンパク質を製造する方法によって得られた、抗体又は抗体断片などのタンパク質。
【図１】
2020527553.tif 000002
【図２】
2020527553.tif 000003
【図３】
2020527553.tif 000004
【図４】
2020527553.tif 000005
【図５】
2020527553.tif 000006
【図６】
2020527553.tif 000007
【図７】
2020527553.tif 000008
【図８】
2020527553.tif 000009
【図９】
2020527553.tif 000010
【図１０】
2020527553.tif 000011
【図１１】
2020527553.tif 000012
【図１２】
2020527553.tif 000013
【図１３】
2020527553.tif 000014
【図１４】
2020527553.tif 000015
【図１５】
2020527553.tif 000016
【図１６】
2020527553.tif 000017
【図１７】
2020527553.tif 000018
【図１８】
2020527553.tif 000019
【図１９】
2020527553.tif 000020
【図２０】
2020527553.tif 000021
【国際調査報告】
2020527553.tif 000022
2020527553.tif 000023
2020527553.tif 000024