(57)【要約】  疾患組織への標的化送達のためのメイタンシノイド薬とコンジュゲートした抗ＴＲＯＰ２抗体が本明細書で開示される。癌におけるＴＲＯＰ２陽性細胞を治療するためのそのような薬物複合体の調製及び使用に関する方法が提供される。
2020503243.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量の抗Ｔｒｏｐ２抗体ＢＡＴ０８０６、ＢＡＴ０８０７又はＢＡＴ０８０８を含む医薬組成物であって、ここでＢＡＴ０８０６又はＢＡＴ０８０７のアミノ酸配列はＣＨＯ−ＢＡＴ細胞において発現され、及びＢＡＴ０８０８のアミノ酸配列はＣＨＯ−ＢＡＴ−ＫＦ細胞において発現される、医薬組成物。
【請求項２】
癌治療を必要とする患者に有効量の抗Ｔｒｏｐ２抗体ＢＡＴ０８０６、ＢＡＴ０８０７又はＢＡＴ０８０８を投与することを含む癌治療の方法であって、ここでＢＡＴ０８０６又はＢＡＴ０８０７のアミノ酸配列はＣＨＯ−ＢＡＴ細胞において発現され、及びＢＡＴ０８０８のアミノ酸配列はＣＨＯ−ＢＡＴ−ＫＦ細胞において発現される、方法。
【請求項３】
癌が、トリプルネガティブ乳癌、膠芽腫、髄芽腫、尿路上皮癌、乳癌、頭頸部癌、腎臓癌、卵巣癌、カポジ肉腫、膵臓癌、及び肺癌を含むがこれらに限定されない、Ｔｒｏｐ２陽性癌からなる群より選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
腫瘍に対する抗Ｔｒｏｐ２抗体ＢＡＴ０８０６、ＢＡＴ０８０７又はＢＡＴ０８０８の活性を増強する方法であって、より有効な治療をもたらすために免疫抑制性受容体に対する第２又は第３の抗体を追加することを含む、方法。
【請求項５】
式Ｉａの化合物：
【化１】
2020503243.tif 000023
又はその塩、
［式中、
Ｘは水素又はハロであり；
Ｙは、水素、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル、及びＣ（＝Ｏ）Ｒ５からなる群より選択され；
Ｒ１は、水素、−ＯＨ、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ５及びＯＲ５からなる群より選択され；
Ｒ２は水素又はＣ１−Ｃ６アルキルであり；
Ｒ３はメチル、−ＣＨ２ＯＨ、又はＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）Ｒ６であり；
Ｒ４は−ＯＨ又はＳＨであり；
Ｒ５はＣ１−Ｃ６アルキル又はベンジルであり；
Ｒ６はＣ１−Ｃ６アルキル、フェニル又はベンジルであり；
Ｒ７は水素、Ｃ１−Ｃ６アルキル又はアミノ酸側鎖であり；
Ｒ８は水素又はＣ１−Ｃ６アルキルであり；
ｎは０、１、２、３、４、５、６、７又は８であり；
ｐは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０から選択され；ならびに
抗ＴＲＯＰ２は抗ＴＲＯＰ２（ＴＡＣＳＴＤ２）抗体である］。
【請求項６】
式Ｉｂの化合物
【化２】
2020503243.tif 000024
又はその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物である請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
式Ｉｃの化合物
【化３】
2020503243.tif 000025
［式中、抗ＴＲＯＰ２は抗ＴＲＯＰ２（ＴＡＣＳＴＤ２）抗体である］
又はその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物である、請求項５に記載の化合物。
【請求項８】
結合薬物Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（６−マレイミド−１−オキソ−ヘキシル）メイタンシン）が抗体に共有結合している、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
抗ＴＲＯＰ２抗体が、ＢＡＴ０８０６、ＢＡＴ０８０７もしくはＢＡＴ０８０８を含む抗体又はその抗原結合フラグメントである、請求項５〜８のいずれかに記載の化合物。
【請求項１０】
請求項５〜９のいずれかに記載の化合物を含む医薬組成物。
【請求項１１】
増殖性、炎症性又は免疫学的疾患又は状態を、その治療を必要とする患者において治療する方法であって、請求項５〜９のいずれかに記載の化合物又は請求項１０に記載の医薬組成物の有効量を投与することを含む、方法。
【請求項１２】
腫瘍に対する請求項５〜９に記載の抗Ｔｒｏｐ２抗体又は請求項１０に記載の医薬組成物の活性を増強する方法であって、より有効な治療をもたらすために免疫監視活性を増強する第２又は第３の抗体を追加することを含む、方法。
【請求項１３】
ＴＲＯＰ２陽性細胞を特徴とする増殖性、炎症性又は免疫学的疾患又は状態を、その治療を必要とする患者において治療する方法であって、式ＩＶａの化合物：
【化４】
2020503243.tif 000026
又はその塩の有効量を投与することを含み、ここで式ＩＶａの化合物は請求項５に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩を患者に投与した後の代謝化学反応の結果として生成され、ここでＡＡがアミノ酸、チオール化アミノ酸、又はシステインである、方法。
【請求項１４】
ＴＲＯＰ２陽性細胞を特徴とする増殖性、炎症性又は免疫学的疾患又は状態を、その治療を必要とする患者において治療する方法であって、式ＩＶｂの化合物：
【化５】
2020503243.tif 000027
又はその塩の有効量を投与することを含み、ここで式ＩＶｂの化合物は請求項６に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩を患者に投与した後の代謝化学反応の結果として生成され、ここでＡＡがアミノ酸、チオール化アミノ酸、又はシステインである、方法。
【請求項１５】
ＴＲＯＰ２陽性細胞を特徴とする増殖性、炎症性又は免疫学的疾患又は状態を、その治療を必要とする患者において治療する方法であって、式ＩＶｃの化合物：
【化６】
2020503243.tif 000028
又はその塩の有効量を投与することを含み、ここで式ＩＶｃの化合物は請求項７に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩を患者に投与した後の代謝化学反応の結果として生成され、ここでＡＡがアミノ酸、チオール化アミノ酸、又はシステインである、方法。
【請求項１６】
ＡＡが、
【化７】
2020503243.tif 000029
であり、ここで、
【化８】
2020503243.tif 000030
は分子の残りの部分への結合点を表す、請求項１２〜１４のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、ＴＲＯＰ２に結合する抗体、その抗原結合フラグメント、ポリペプチド、及び免疫複合体（ＴＡＣＳＴＤ２）を含む化合物に関する。本発明はまた、悪性腫瘍などの疾患を診断及び治療するためにそのようなＴＲＯＰ２結合分子を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＴＡＣＳＴＤ２遺伝子によってコードされる４０ｋＤａの膜貫通糖タンパク質であるヒト栄養芽層細胞表面抗原２（Ｔｒｏｐ−２）（Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．９２：１６４−６５（２００１））は、ヒト栄養芽層細胞株及び絨毛癌細胞株において最初に同定された（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．７８：５１４７−５０（１９８１））。その短い細胞質内尾部は、細胞間接着、細胞増殖、及び運動性などの細胞機能を調節するいくつかの経路を制御するのに重要な役割を果たす（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．３２：１５９４−６００（２０１３）；Ｄｅｖ  Ｄｙｎ．２４４：９９−１０９（２０１５））。Ｔｒｏｐ−２タンパク質の発現は、様々な上皮癌においてしばしば増加する（Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ  ５９：７０１−１０（２０１１）；Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ３２：２２２−３３（２０１３））。ヒトの前立腺癌幹細胞のマーカーとしての役割、特に癌の発症及び進行における役割が提案されている（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０５：２０８８２−８７（２００８））。Ｔｒｏｐ−２の過剰発現は、攻撃的悪性表現型及び予後不良と相関している（ＰＬｏＳ  ＯＮＥ．９：ｅ９６９９３（２０１４）；ＰＬｏＳ  ＯＮＥ．８：ｅ７５８６４（２０１３）；Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１２：３０５７−６３（２００６））。上記で検討されたデータは、Ｔｒｏｐ−２を魅力的な診断及び予後マーカー候補にしている。抗Ｔｒｏｐ−２抗体−薬物複合体は、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）ならびに非小細胞及び小細胞肺癌を含むいくつかの転移性腫瘍を有する患者を治療するのに使用されているため、Ｔｒｏｐ−２も現在、治療標的として試験されている（Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ  ６：２２４９６−５１２（２０１５））。
【０００３】
ＴＮＢＣの潜在的に改善された治療としてヒト化ＲＳ７抗体を使用する新しいＴｒｏｐ−２標的ＡＤＣの臨床的役割が提案されている（ｈｔｔｐ：／／ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ  ｎｕｍｂｅｒ  ＮＣＴ０１６３１５５２）。ＩＭＭＵ−１３２と命名されたこのＡＤＣは、中程度に毒性の薬物であるＳＮ−３８を使用しており、したがって有効性を達成するには薬物とモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の結合がはるかに高い比率（約８：１）でなければならない。しかしながら、ＩＭＭＵ−１３２  ＡＤＣは中程度に安定なリンカーを使用するので、ヒト血清中でのＩＭＭＵ−１３２からのＳＮ−３８の放出半減期は約２４時間である。さらに、マウス及びヒトの両方において、無傷のＩＭＭＵ−１３２の迅速なクリアランスが１１時間の半減期及び１５．４時間の平均滞留時間（ＭＲＴ）で観察され、これは臨床治療のためのより高い投与頻度をもたらし得る。ＩＭＭＵ−１３２は様々な上皮癌に対して有望な効果を示しているにもかかわらず、好中球減少症の発生率（用量制限事象）が最大５８％まで上昇することが示された。さらに、ＩＭＭＵ−１３２の使用は、ＳＮ−３８などのトポイソメラーゼ阻害剤に一般的な重度の下痢に関連していた。対照的に、Ｂａｔａｎｓｉｎｅ−０８０８は、より長いＭＲＴ及びより低い投与頻度に寄与し得たと考えられる安定なリンカーを利用する。したがって、部位特異的コンジュゲート技術は、ＡＤＣの均一性を改善するだけでなく、より良好な薬物動態（ＰＫ）性能ももたらすことができる。明らかに、Ｔｒｏｐ２標的に対してより有効でより安全な薬剤を開発することが当技術分野において必要とされている。
【０００４】
メイタンシノイドは、微小管タンパク質重合の形成を阻害する高度に細胞毒性の化合物である（Ｒｅｍｉｌｌａｒｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １８９：１００２−１００５（１９７５））。メイタンシンは、最初に東アフリカの低木メイテナス・セラタ（Ｍａｙｔｅｎｕｓ  ｓｅｒｒａｔａ）からＫｕｐｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ  ９４：１３５４−１３５６（１９７２））によって単離された。メイタンシノール及びメイタンシノールのＣ−３エステルを含むメイタンシノイドも、特定の微生物によって産生された（米国特許第４，１５１，０４２号）。種々の細胞毒性を有するメイタンシノールの様々な類似体も合成化学によって調製されている（総説についてはＣｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．５２（１）１−２６（２００４）を参照のこと）。メイタンシノイドの例には、メイタンシン、メルタンシン（ＭＤ１）、ＭＤ３及びＭＤ４が含まれる。メイタンシンは強力な有糸分裂阻害剤であり、ルイス肺癌腫及びＢ−１６黒色腫固形マウス腫瘍モデルを含む複数の腫瘍に対して有意な阻害活性を示す。メイタンシンは、１０−７ｇ／ｍＬという低い濃度でヒト急性リンパ芽球性白血病株Ｃ．Ｅ．Ｍ．を阻害することが報告された（Ｗｏｌｐｅｒｔ−ＤｅＦｉｌｌｉｐｐｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１７３５−１７３８（１９７５））。メイタンシンはまた、メトトレキサート、ダウノルビシン、及びビンクリスチンのような従来の化学療法剤よりも１００〜１０００倍細胞毒性が高いことが示された（米国特許第３，８９６，１１１号）。
【０００５】
細菌性メイタンシノイドであるアンサマイトシンは、メイタンシンと同様の活性スペクトル及び有効用量範囲を示す。それらは、０．８μｇ／ｋｇという低い一日量でＰ３８８白血病を抑制する。アンサマイトシンＰ３（ＡＰ３）もまた、複数の癌細胞株に対して有効であることが示された（総説についてはＣｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．５２（１）：１−２６（２００４）を参照のこと）。Ｎ−メチル−Ｌ−アラニン誘導体とのメイタンシノールＣ−３エステルは、対応する単純カルボン酸のエステルよりもはるかに細胞毒性が高く、Ｎ−メチル−Ｄ−アラニンに対応するそれらのエピマーよりも１００倍細胞毒性が高いことが認められている（米国特許第４，１３７，２３０号；同第４，２６０，６０８号；Ｋａｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３２：３４４１−３４５１（１９８４）；Ｗｉｄｄｉｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４９：４３９２−４４０８（２００６））。
【０００６】
メイタンシノイドは、それらの高度に毒性の性質及び複数の癌細胞株に対するインビトロ活性のために、多くの異なる癌を治療する能力を有すると予想された。しかしながら、この毒性はまた、副作用が多くの患者にとって耐容できないものであるので、このクラスの化合物をヒトの臨床試験において好ましくないものにした（Ｉｓｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ．Ｒｅｖ．５：１９９−２０７（１９７８））。したがって、副作用を軽減するために、毒性薬物をモノクローナル抗体に結合させる（抗体薬物複合体のＡＤＣ）ことによる癌細胞への細胞傷害性化合物の標的化送達が提案されている。
【０００７】
抗体薬物複合体（ＡＤＣ）は、抗体、リンカー、及び薬物の３つの重要な要素で構成される。特定の抗体及び薬物の選択は、特定の疾患に依存して有効性及び安全性に大きな影響を及ぼす。リンカーの安定性及び薬物を抗体にコンジュゲートする方法は、ＡＤＣ薬物開発の成功又は失敗に重要な役割を果たす。
【０００８】
ＡＤＣの有効性は、一部には、抗体の特異性や薬物の効力だけでなく、リンカーの安定性又は切断に対する感受性、細胞表面で誘発されるインターナリゼーション、輸送、及びその後の活性な細胞傷害性ペイロードの放出を含む、様々なパラメータの組み合わせに依存する。したがって、異なる薬物リンカーを含む、又は同じ標的に対する異なる抗体とのＡＤＣは、それらの有用性において有意に異なり得る。
【発明の概要】
【０００９】
一態様では、メイタンシノイド分子とコンジュゲートしており、したがって罹患細胞又は組織を標的とする抗ＴＲＯＰ２抗体が本明細書で提供される。抗ＴＲＯＰ２抗体は罹患細胞又は組織中の抗原に結合する。抗体にコンジュゲートした薬物は、抗原発現細胞に対して細胞傷害性、細胞増殖抑制性、又は免疫抑制性の作用を及ぼして、ＴＲＯＰ２陽性癌を治療する又はその再発を予防する。抗体薬物複合体の高い親和性は、細胞毒性メイタンシノイドが腫瘍細胞を標的とすることを確実にする。さもなければ、高度に毒性のメイタンシノイドが意図しない標的に全身的に結合するようになり、非常に高い、しばしば許容できない毒性をもたらす。本発明の技術は、抗原陰性細胞へのバイスタンダー殺傷作用などのメイタンシノイドの望ましくない副作用を最小限に抑えながら、ＴＲＯＰ２陽性細胞に対してメイタンシノイドの細胞阻害又は殺傷作用を及ぼすことによって癌を治療する方法を提供する。
【００１０】
別の態様では、メイタンシノイド化合物とコンジュゲートした抗ＴＲＯＰ２抗体が本明細書で提供され、ここでメイタンシノイド化合物は、酸不安定ではなく、ペプチダーゼカテプシン感受性ではなく、ジスルフィドを含まないリンカーを介して抗ＴＲＯＰ２抗体に連結され、いったん細胞内に入ると薬物を放出することができる一方で、循環中での安定性を提供する。そのようなリンカーは、循環中などのエンドサイトーシス前のコンジュゲートした分子に安定性を提供して、リンカーの早期分解及び毒性薬物の放出を防止し、したがって薬物の毒性作用を最小限に抑えると考えられる。いくつかの実施形態では、複合体のメイタンシノイド−リンカー部分は、Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（６−マレイミド−１−オキソ−ヘキシル）−メイタンシン（３ＡＡ−ＭＤＣもしくはｂａｔａｎｓｉｎｅ）、又はその誘導体である。いくつかの実施形態では、複合体は、改善された安全性及び活性のために、抗体あたり少なくとも１つの薬物分子の薬物負荷を有する。驚くべきことに、高い薬物負荷にもかかわらず、抗体は標的細胞への薬物の標的化送達のために十分に安定なままである。
【００１１】
いくつかの実施形態では、式Ｉａ又はＩｂ：
【化１】
2020503243.tif 000003
【化２】
2020503243.tif 000004
［式中、
Ｘは水素又はハロであり；
Ｙは、水素、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル、及びＣ（＝Ｏ）Ｒ５からなる群より選択され；
Ｒ１は、水素、−ＯＨ、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ５及びＯＲ５からなる群より選択され；
Ｒ２は水素又はＣ１−Ｃ６アルキルであり；
Ｒ３はメチル、−ＣＨ２ＯＨ、又はＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）Ｒ６であり；
Ｒ４は−ＯＨ又はＳＨであり；
Ｒ５はＣ１−Ｃ６アルキル又はベンジルであり；
Ｒ６はＣ１−Ｃ６アルキル、フェニル又はベンジルであり；
Ｒ７は水素、Ｃ１−Ｃ６アルキル又はアミノ酸側鎖であり；
Ｒ８は水素又はＣ１−Ｃ６アルキルであり；
ｎは０、１、２、３、４、５、６、７又は８であり；
ｐは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０から選択され；ならびに
抗ＴＲＯＰ２は抗ＴＲＯＰ２抗体である］
のメイタンシノイドリンカー抗ＴＲＯＰ２抗体複合体、又はその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物が本明細書で提供される。
【００１２】
別の態様では、式Ｉａの化合物などの上記のメイタンシノイド結合抗ＴＲＯＰ２抗体複合体を含む組成物が本明細書で提供される。
【００１３】
別の態様では、抗ＴＲＯＰ２抗体を、抗ＴＲＯＰ２抗体にコンジュゲートすることができる本明細書に記載の１つ以上のメイタンシノイド化合物と接触させることを含む、上記メイタンシノイド結合抗ＴＲＯＰ２抗体複合体を調製する方法が本明細書で提供される。
【００１４】
別の態様では、本明細書に記載のメイタンシノイドとコンジュゲートした抗ＴＲＯＰ２抗体を用いてメイタンシノイドをＴＲＯＰ２抗原陽性細胞又は組織に標的化する方法が本明細書で提供される。
【００１５】
いくつかの実施形態では、本発明によって提供される抗ＴＲＯＰ２抗体は、配列番号１に示す抗Ｔｒｏｐ２軽鎖及び配列番号２に示す抗ＴＲＯＰ２重鎖のアミノ酸配列を含むＢＡＴ０８０６であり得、ここで抗ＴＲＯＰ２抗体又はＴＲＯＰ２抗原結合単位は、ＣＨＯ−ＢＡＴによる発現ベクターを介して発現される。宿主細胞株はチャイニーズハムスター卵巣細胞株ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−６１）に由来し、懸濁増殖に適合された。いくつかの実施形態では、本発明によって提供される抗Ｔｒｏｐ２抗体は、配列番号３に示す抗ＴＲＯＰ２軽鎖及び配列番号４に示す抗ＴＲＯＰ２重鎖のアミノ酸配列を含むＢＡＴ０８０７であり得、ここで抗ＴＲＯＰ２抗体又はＴＲＯＰ２抗原結合単位は、ＣＨＯ−ＢＡＴによる発現ベクターを介して発現される。宿主細胞株はチャイニーズハムスター卵巣細胞株ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−６１）に由来し、懸濁増殖に適合された。他の実施形態では、本発明によって提供される抗ＴＲＯＰ２抗体は、配列番号３に示す抗Ｔｒｏｐ２軽鎖及び配列番号４に示す抗ＴＲＯＰ２重鎖のアミノ酸配列を含むＢＡＴ０８０８であり得、ここで抗ＴＲＯＰ２抗体又はＴＲＯＰ２抗原結合単位は、ＣＨＯ−ＢＡＴ−ＫＦによる発現ベクターによって発現される。宿主細胞株を、発現される抗体が０〜５％のフコース含量及びＡＤＣＣ増強作用を有することを特徴とするα−（１，６）−フコシルトランスフェラーゼに関してノックアウトした。宿主細胞は、受入番号：ＣＣＴＣＣ  ＮＯ：Ｃ２０１７１２７で中国タイプカルチャーコレクションに寄託された。
いくつかの実施形態では、本発明によって提供される抗ＴＲＯＰ２抗体は、他のＴＲＯＰ２抗原結合単位であり得る。
【００１６】
別の態様では、腫瘍などの増殖性疾患、移植片拒絶反応などの炎症性疾患又は免疫学的疾患、及び治療を必要とする対象において標的療法によって治療することができる他の疾患の治療方法が本明細書で提供され、ここで疾患は、抗ＴＲＯＰ２抗体に結合する抗原を含む細胞を特徴とし、前記方法は、本明細書に記載の抗ＴＲＯＰ２抗体薬物複合体の有効量を対象に投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】図１Ａは、寸法排除クロマトグラフィによるＢＡＴ０８０６の凝集速度の測定を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、寸法排除クロマトグラフィによるＢａｔａｎｉｎｅ−０８０６の凝集速度の測定を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、寸法排除クロマトグラフィによるＢＡＴ０８０８の凝集速度の測定を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、寸法排除クロマトグラフィによるＢａｔａｎｉｎｅ−０８０８の凝集速度の測定を示す。
【図３】図３は、抗体薬物複合体Ｂａｔａｎｓｉｎｅ−０８０６を分離するＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５（Ｍ）カラムのマップを示す。
【図４】図４は、抗体薬物複合体ＢＡＴ０８０６−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を分離するＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５（Ｍ）カラムのマップを示す。
【図５】図５は、抗体薬物複合体Ｂａｔａｎｓｉｎｅ−０８０８を分離するＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５（Ｍ）カラムのマップを示す。
【図６】図６は、ＬＯ２細胞に対するＤＭ１及びＣｙｓ−３ＡＡ−ＭＤＣの増殖抑制作用を示す。
【図７】図７は、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞に対するＢａｔａｎｓｉｎｅ−０８０６、Ｂａｔａｎｓｉｎｅ−０８０７及びＢａｔａｎｓｉｎｅ−０８０８の増殖抑制作用を示す。
【図８】図８は、Ａ４３１細胞に対するＢａｔａｎｓｉｎｅ−０８０６、Ｂａｔａｎｓｉｎｅ−０８０７及びＢａｔａｎｓｉｎｅ−０８０８の増殖抑制作用を示す。
【図９】図９は、Ｎ８７細胞に対するＢａｔａｎｓｉｎｅ−０８０６、Ｂａｔａｎｓｉｎｅ−０８０７及びＢａｔａｎｓｉｎｅ−０８０８の増殖抑制作用を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａは、非結合抗ＴＲＯＰ２抗体ＢＡＴ０８０６又はＢＡＴ０８０８がＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞に対して増殖抑制作用を及ぼさないことを示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、非結合抗ＴＲＯＰ２抗体ＢＡＴ０８０６又はＢＡＴ０８０８がＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞に対して増殖抑制作用を及ぼさないことを示す。
【図１１Ａ】図１１Ａは、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞に対するＢａｔａｎｓｉｎｅ−０８０８及びＢＡＴ０８０６−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の細胞増殖抑制作用を示す。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、Ａ４３１細胞に対するＢａｔａｎｓｉｎｅ−０８０８及びＢＡＴ０８０６−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の細胞増殖抑制作用を示す。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、Ｎ８７細胞に対するＢａｔａｎｓｉｎｅ−０８０８及びＢＡＴ０８０６−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の細胞増殖抑制作用を示す。
【図１２Ａ】図１２Ａは、Ｂａｔａｎｓｉｎｅ−０８０８媒介抗体依存性細胞傷害作用の増強を示す。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、Ｂａｔａｎｓｉｎｅ−０８０８媒介抗体依存性細胞傷害作用の増強を示す。Ｂａｔａｎｓｉｎｅ−０８０６、Ｂａｔａｎｓｉｎｅ−０８０７及びＢＡＴ０８０６−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８と比較して、Ｂａｔａｎｉｎｅ−０８０８は、はるかに低い濃度でヒトＴＲＯＰ２陽性皮膚癌細胞Ａ４３１の増殖を有意に抑制した。
【図１３】図１３は、ヒト正常肝細胞株ＬＯ２に対するＢａｔａｎｓｉｎｅ−０８０８及びＢＡＴ０８０６−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の細胞毒性を示す。
【図１４Ａ】図１４Ａは、抗体薬物複合体Ｂａｔａｎｓｉｎｅ−０８０６、Ｂａｔａｎｓｉｎｅ−０８０７及びＢＡＴ０８０６−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８がマウス異種移植片においてヒトＭＤＡ−ＭＢ−４６８腫瘍を根絶したことを示す。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、抗体薬物複合体Ｂａｔａｎｓｉｎｅ−０８０６、Ｂａｔａｎｓｉｎｅ−０８０７及びＢＡＴ０８０６−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８がマウス異種移植片においてヒトＭＤＡ−ＭＢ−４６８腫瘍を根絶したことを示す。
【図１５Ａ】図１５Ａは、抗体薬物複合体Ｂａｔａｎｓｉｎｅ−０８０８及びＢＡＴ０８０６−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８がマウス異種移植片においてヒトＭＤＡ−ＭＢ−４６８腫瘍を根絶したことを示す。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、抗体薬物複合体Ｂａｔａｎｓｉｎｅ−０８０８及びＢＡＴ０８０６−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８がマウス異種移植片においてヒトＭＤＡ−ＭＢ−４６８腫瘍を根絶したことを示す。
【図１６】図１６は、抗体薬物複合体Ｂａｔａｎｓｉｎｅ−０８０８がマウス異種移植片においてヒトＭＸ−１腫瘍を根絶したことを示す。
【図１７Ａ】図１７Ａは、抗ＴＲＯＰ２抗体ＢＡＴ０８０６の軽鎖及び重鎖アミノ酸配列を示す。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、抗ＴＲＯＰ２抗体ＢＡＴ０８０６の軽鎖及び重鎖アミノ酸配列を示す。
【図１８Ａ】図１８Ａは、抗ＴＲＯＰ２抗体ＢＡＴ０８０７及びＢＡＴ０８０８の軽鎖及び重鎖アミノ酸配列を示す。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、抗ＴＲＯＰ２抗体ＢＡＴ０８０７及びＢＡＴ０８０８の軽鎖及び重鎖アミノ酸配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
定義
本明細書で使用される場合、特に指示がない限り、以下の定義が適用される。
【００１９】
本明細書で使用される場合、特に明記されない限り、単数形「１つの」及び「その」は、複数の言及を含む。したがって、例えば「１つの化合物」への言及は複数の化合物を含む。
【００２０】
本明細書で使用される場合、「約」は、当業者によって理解され、それが使用される文脈に応じてある程度変動する。この用語の当業者に明らかではない使用がある場合、それが使用される文脈を考慮して、「約」は、特定の用語の最大±１０％又は±５％又は±１％までを意味する。
【００２１】
本明細書で使用される場合、「含む」という用語は、組成物及び方法が、列挙される要素を含むが他を除外しないことを意味することを意図されている。組成物及び方法を定義するのに使用される場合の「から本質的になる」は、その組み合わせにとって本質的に重要な他の要素を排除することを意味する。例えば、本明細書で定義される要素から本質的になる組成物は、特許請求される本発明の基本的で新規な特徴に実質的に影響を及ぼさない他の要素を排除しない。「からなる」とは、微量を超える他の成分及び列挙される実質的な方法工程を除外することを意味する。これらの接続句の各々によって定義される実施形態は、本発明の範囲内にある。
【００２２】
本明細書で使用される場合、「メイタンシノイド」は、その立体異性体を含むメイタンシン類似体を指す。メイタンシンは、メイテナス属の植物から単離することができる（米国特許第３，８９６，１１１号）。メイタンシノイドの式は：
【化３】
2020503243.tif 000005
である。
メイタンシノイドは、環上の置換基の１つ以上の修飾を伴うメイタンシンの環構造を有する化合物である。
【００２３】
「アルキル」は、１〜１０個の炭素原子、好ましくは１〜６個の炭素原子を有する一価の飽和脂肪族ヒドロカルビル基を指す。ｖが整数であるＣｖアルキルは、ｖ個の炭素を有するアルキルを表す。この用語には、例として、メチル（ＣＨ３−）、エチル（ＣＨ３ＣＨ２−）、ｎ−プロピル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２−）、イソプロピル（（ＣＨ３）２ＣＨ−）、ｎ−ブチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、イソブチル（（ＣＨ３）２ＣＨＣＨ２−）、ｓｅｃ−ブチル（（ＣＨ３）（ＣＨ３ＣＨ２）ＣＨ−）、ｔ−ブチル（（ＣＨ３）３Ｃ−）、ｎ−ペンチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、及びネオペンチル（（ＣＨ３）３ＣＣＨ２−）などの直鎖及び分枝鎖ヒドロカルビル基が含まれる。「アルキレン」は、１〜１０個の炭素原子、好ましくは１〜６個の炭素原子を有する二価の飽和脂肪族ヒドロカルビル基である。
【００２４】
「アルケニル」は、２〜６個の炭素原子、好ましくは２〜４個の炭素原子を有し、少なくとも１つ、好ましくは１つ〜２つのビニル（＞Ｃ＝Ｃ＜）不飽和部位を有する直鎖又は分枝鎖ヒドロカルビル基を指す。そのような基は、例えばビニル、アリル、及びブト−３−エン−１−イルによって例示される。シス及びトランス異性体又はこれらの異性体の混合物はこの用語に含まれる。
【００２５】
「アルキニル」は、２〜６個の炭素原子、好ましくは２〜３個の炭素原子を有し、少なくとも１つ、好ましくは１つ〜２つのアセチレン（−Ｃ≡Ｃ−）不飽和部位を有する直鎖又は分枝鎖の一価ヒドロカルビル基を指す。そのようなアルキニル基の例には、アセチレニル（−Ｃ≡ＣＨ）、及びプロパルギル（−ＣＨ２Ｃ≡ＣＨ）が含まれる。
【００２６】
「アミノ」は、基−ＮＲ’Ｒ”を指し、ここでＲ’及びＲ”は、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環からなる群より独立して選択され、ならびにここでＲ’とＲ”は、それらに結合している窒素原子と一緒になって複素環基又は置換複素環基を形成していてもよく、ただし、Ｒ’及びＲ”が両方とも水素であることはなく、ならびにここでアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、及び置換複素環は本明細書で定義される通りである。Ｒ’が水素であり、Ｒ”がアルキルである場合、置換アミノ基は、本明細書では時としてアルキルアミノと称される。Ｒ’及びＲ”がアルキルである場合、置換アミノ基は、本明細書では時としてジアルキルアミノと称される。一置換アミノに言及する場合、それは、Ｒ’及びＲ”のいずれかが水素であるが両方ではないことを意味する。二置換アミノに言及する場合、それは、Ｒ’及びＲ”のどちらも水素ではないことを意味する。
【００２７】
「アミノ酸」は、天然、非天然又は合成のいずれであるかにかわらず、アミノ基及びカルボキシ基の両方を含む任意の化合物を指す。アミノ酸の例としては、Ｄ及びＬの両方の光学異性体を含む、グリシン（ＮＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ）、システイン、アラニン、Ｎ−メチル−Ｌ−アラニンが挙げられるが、これらに限定されない。「アミノ酸側鎖」は、Ｎ−アルキルグリシン又はグリシンエステルなどのグリシン又はグリシン誘導体のメチレン基の水素を置換する置換基を指す。アミノ酸側鎖の例としては、天然アミノ酸の側鎖、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、及び置換複素環が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２８】
「アリール」又は「Ａｒ」は、単環（例えばフェニル）又は結合点が芳香族炭素原子にあることを条件として縮合環が芳香族であっても芳香族でなくてもよい（例えば２−ベンゾオキサゾリノン、２Ｈ−１，４−ベンゾオキサジン−３（４Ｈ）−オン−７−イルなど）複数の縮合環（例えばナフチルもしくはアントリル）を有する６〜１４個の炭素原子の一価芳香族炭素環式基を指す。好ましいアリール基はフェニル及びナフチルを含む。
【００２９】
「カルボニル」は、−Ｃ（＝Ｏ）−と等価である二価の基−Ｃ（Ｏ）−を指す。
【００３０】
「カルボキシ」又は「カルボキシル」は、−ＣＯＯＨ又はＣＯ２Ｈ又はそれらの塩を指す。
【００３１】
「カルボン酸」は、少なくとも１つのカルボキシを有する化合物を指す。
【００３２】
「シアノ」は基−ＣＮを指す。
【００３３】
「シクロアルキル」は、縮合、架橋、及びスピロ環系を含む単一又は複数の環を有する、３〜１０個の炭素原子の環状アルキル基を指す。結合点が非芳香族、非複素環炭素環を介することを条件として、１つ以上の環は、アリール、ヘテロアリール、又は複素環であり得る。適切なシクロアルキル基の例としては、例えばアダマンチル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、及びシクロオクチルが挙げられる。シクロアルキル基の他の例には、ビシクロ［２，２，２］オクタニル、ノルボルニル、及びスピロ［４．５］デカ−８−イルなどのスピロビシクロ基が含まれる：
【化４】
2020503243.tif 000006
シクロアルキレンは環状アルキレンを指す。
【００３４】
「シクロアルケニル」は、単一又は複数の環を有し、少なくとも１つの＞Ｃ＝Ｃ＜環不飽和、好ましくは１つ〜２つの＞Ｃ＝Ｃ＜環不飽和部位を有する、３〜１０個の炭素原子の非芳香族環状アルキル基を指す。
【００３５】
「ハロ」又は「ハロゲン」は、フルオロ、クロロ、ブロモ及びヨードを指し、好ましくはフルオロ又はクロロである。
【００３６】
「ハロアルキル」は、１〜５個、１〜３個、又は１〜２個のハロ基で置換されたアルキル基を指し、アルキル及びハロは本明細書で定義される通りである。
【００３７】
「ヒドロキシ」又は「ヒドロキシル」は、基−ＯＨを指す。
【００３８】
「ヘテロアリール」は、環内に６〜１０個の炭素原子と、酸素、窒素及び硫黄からなる群より選択される１〜４個のヘテロ原子とを有する芳香族基を指す。そのようなヘテロアリール基は、単環（例えばピリジニルもしくはフリル）又は複数の縮合環（例えばインドリジニルもしくはベンゾチエニル）を有することができ、縮合環は芳香族であっても芳香族でなくてもよく、及び／又は結合点が芳香族ヘテロアリール基の原子を介することを条件としてヘテロ原子を含む。一実施形態では、ヘテロアリール基の窒素及び／又は硫黄環原子は、酸化されて、Ｎ−オキシド（Ｎ→Ｏ）、スルフィニル、又はスルホニル部分を提供していてもよい。好ましいヘテロアリールには、ピリジニル、ピロリル、インドリル、チオフェニル、及びフラニルが含まれる。
【００３９】
「複素環」又は「複素環式」又は「ヘテロシクロアルキル」又は「ヘテロシクリル」は、３〜１０個の環炭素原子及び窒素、硫黄、又は酸素からなる群より選択される１〜４個の環ヘテロ原子を有する、飽和又は部分飽和であるが芳香族ではない基を指す。複素環は、縮合架橋及びスピロ環系を含む、単環又は複数の縮合環を包含する。縮合環系では、１つ以上の環は、結合点が非芳香族環を介することを条件としてシクロアルキル、アリール、又はヘテロアリールであり得る。一実施形態では、複素環式基の窒素原子及び／又は硫黄原子は、Ｎ−オキシド、スルフィニル、又はスルホニル部分を提供するように酸化されていてもよい。
【００４０】
複素環及びヘテロアリールの例としては、アゼチジン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドリジン、イソインドール、インドール、ジヒドロインドール、インダゾール、プリン、キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチルピリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、プテリジン、カルバゾール、カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、フェナントロリン、イソチアゾール、フェナジン、イソオキサゾール、フェノキサジン、フェノチアジン、イミダゾリジン、イミダゾリン、ピペリジン、ピペラジン、インドリン、フタルイミド、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン、４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン、チアゾール、チアゾリジン、チオフェン、ベンゾ［ｂ］チオフェン、モルホリニル、チオモルホリニル（チアモルホリニルとも称される）、１，１−ジオキソチオモルホリニル、ピペリジニル、ピロリジン、及びテトラヒドロフラニルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４１】
「置換アルキル」、「置換アルケニル」、「置換アルキニル」、「置換シクロアルキル」、「置換シクロアルケニル」、「置換アリール」、「置換ヘテロアリール」又は「置換複素環」は、それぞれ、アルキル、ハロアルキル、−Ｏ−Ｒ２０、−Ｓ−Ｒ２０、アルケニル、アルキニル、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ２０、−Ｃ（＝Ｓ）Ｒ２０、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ２０、−ＮＲ２０Ｃ（＝Ｏ）Ｒ２１、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ２１、−ＮＲ２０Ｒ２０、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ２０Ｒ２０、−Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ２０Ｒ２０、−ＮＲ２０Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ２０Ｒ２０、−ＮＲ２０Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ２０Ｒ２０、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ２０Ｒ２０、−ＳＯ２ＮＲ２０Ｒ２０、−ＯＳＯ２ＮＲ２０Ｒ２０、−ＮＲ２０ＳＯ２ＮＲ２０Ｒ２０、−Ｃ（＝ＮＲ２０Ｒ２０）ＮＲ２０Ｒ２０、アリール、−ＮＲ２０Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ２１、−ＯＣ（＝Ｏ）ＯＲ２１、シアノ、シクロアルキル、シクロアルケニル、−ＮＲ２０Ｃ（＝ＮＲ２０）ＮＲ２０Ｒ２０、ハロ、ヒドロキシ、ヘテロアリール、複素環、ニトロ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２Ｒ２１、及びＯＳＯ２Ｒ２１からなる群より選択される１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個の置換基で置換されている、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール又は複素環式基を指し、ここで各Ｒ２０は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロアリール、及び複素環からなる群より選択されるか、又はそれらに結合している１個又は複数の原子と共に２個のＲ２０は複素環を形成し、ならびにＲ２１は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロアリール、及び複素環からなる群より選択される。
【００４２】
「ニトロ」は基−ＮＯ２を指す。
【００４３】
「オキソ」は、原子（＝Ｏ）又は（−Ｏ−）を指す。
【００４４】
「スピロ環系」は、両方の環に共通の単一の環炭素原子を有する二環式環系を指す。
【００４５】
「チオール」は、基−ＳＨを指す。
【００４６】
「チオカルボニル」は、−Ｃ（＝Ｓ）−と等価である二価の基−Ｃ（Ｓ）−を指す。
【００４７】
「チオン」は、原子（＝Ｓ）を指す。
【００４８】
本明細書で使用される１又は複数の「化合物」は、示されている式の立体異性体及び互変異性体を含むことが意図されている。
【００４９】
１又は複数の「立体異性体」は、１つ以上の立体中心のキラリティが異なる化合物を指す。立体異性体にはエナンチオマー及びジアステレオマーが含まれる。
【００５０】
「互変異性体」は、エノール−ケト及びイミン−エナミン互変異性体などのプロトンの位置が異なる化合物の代替形態、又はピラゾール、イミダゾール、ベンゾイミダゾール、トリアゾール及びテトラゾールなどの環−ＮＨ−部分及び環＝Ｎ−部分の両方に結合した環原子を含むヘテロアリール基の互変異性形態を指す。
【００５１】
「溶媒和物」は、結晶形態の、化合物と溶媒との会合体を指す。溶媒会合は、典型的には、化合物の合成、結晶化、及び／又は再結晶化における溶媒の使用に起因する。「溶媒和物」は、結晶形態の、化合物と水との会合体である水和物を含む。
【００５２】
「患者」又は「対象」は哺乳動物を指し、ヒト及び非ヒト哺乳動物を含む。いくつかの実施形態では、この用語はヒトを指す。いくつかの実施形態では、この用語は、野生動物、及び家畜などの非ヒト哺乳動物を指す。さらに他の実施形態では、この用語は、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、又はチンパンジーなどの霊長動物を指す。
【００５３】
「薬学的に許容される塩」は、当技術分野において周知の様々な有機及び無機対イオンから誘導される、化合物の薬学的に許容される塩を指し、単なる例として、分子が酸性官能基を含む場合は、有機又は無機塩基の塩、例えばナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、２−ジメチルアミノエタノール、２−ジエチルアミノエタノール、ジシクロヘキシルアミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルカミン、テオブロミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、Ｎ−エチルピペリジン、ポリアミン樹脂及びテトラアルキルアンモニウムなどの塩、ならびに分子が塩基性官能基を含む場合は、塩酸塩、臭化水素酸塩、酒石酸塩、メシル酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、及びシュウ酸塩などの有機酸又は無機酸の塩が含まれる。酸の他の非限定的な例としては、硫酸、硝酸、リン酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸などが挙げられる。
【００５４】
患者において疾患を「治療すること」又は疾患の「治療」は、（１）疾患に罹患しやすい、もしくはまだ疾患の症状を示していない患者において疾患が発症するのを防止すること；（２）疾患を抑制するかもしくはその発症を阻止すること；又は（３）疾患を改善する又は疾患の後退を生じさせることを指す。
【００５５】
「有効量」は、疾患を治療することを含む、研究者、獣医、医師又は他の臨床医によって探求されている組織、系、動物、個体又はヒトにおける生物学的又は医学的応答を誘発する活性化合物又は医薬品の量を意味することが意図されている。
【００５６】
組成物を「投与すること」は、経口投与、注射、注入、非経口、静脈内、粘膜、舌下、筋肉内、皮内、鼻腔内、腹腔内、動脈内、皮下吸収、又は他の公知の技術と組み合わせた任意の方法によって達成され得る。本発明の一実施形態では、投与は全身的に行われる。
【００５７】
本明細書で使用される場合、「それを必要とする」という語句は、対象が特定の方法又は治療を必要とすると同定されていることを意味する。いくつかの実施形態では、同定は任意の診断手段によるものであり得る。本明細書に記載の方法及び治療のいずれにおいても、対象はそれを必要とし得る。
【００５８】
抗ＴＲＯＰ２抗体薬物複合体
一態様では、酸不安定ではなく、ペプチダーゼカテプシン感受性ではなく、細胞内で細胞傷害性薬物を放出することができる一方で、循環中で安定であるリンカーを介して抗ＴＲＯＰ２抗体にコンジュゲートされたメイタンシノイドが本明細書で開示される。別の態様では、薬物が抗体の重鎖上に位置する人工システイン部位に特異的に連結されており、抗体薬物複合体が抗体あたり２．０分子の平均薬物負荷を有する、抗体薬物複合体が本明細書で開示される。
【００５９】
連結基を結合するのに適したメイタンシノイドには、公知の方法に従って天然供給源から単離することができるか、バイオテクノロジーを用いて生成することができるか（例えばＹｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９９：７９６８−７９７３（２００２）参照）、又は公知の方法に従って合成によって調製することができる（例えばＣａｓｓａｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．５２（１）：１−２６（２００４）参照）、メイタンシノール及びメイタンシノール類似体が含まれる。
【００６０】
適切なメイタンシノール類似体の特定の例には、以下が含まれる：
（１）Ｃ−１９−デクロロ（米国特許第４，２５６，７４６号）（アンサマイトシンＰ２のＬＡＨ還元によって調製）；
（２）Ｃ−２０−ヒドロキシ（又はＣ−２０−デメチル）＋／−Ｃ−１９−デクロロ（米国特許第４，３６１，６５０号及び同第４，３０７，０１６号）（ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）又は放線菌属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）を用いた脱メチル化又は水素化アルミニウムリチウム（ＬＡＨ）を用いた脱塩素によって調製）；
（３）Ｃ−２０−デメトキシ、Ｃ−２０−アシルオキシ（−ＯＣＯＲ）、＋／−デクロロ（米国特許第４，２９４，７５７号）（塩化アシルを用いたアシル化によって調製）
（４）Ｃ−９−ＳＨ（米国特許第４，４２４，２１９号）（メイタンシノールとＨ２Ｓ又はＰ２Ｓ５との反応によって調製）；
（５）Ｃ−１４−ヒドロキシメチル（ＣＨ２ＯＨ）又はアシルオキシメチル（ＣＨ２ＯＣ（＝Ｏ）フェニルもしくはＣＨ２ＯＣ（＝Ｏ）（Ｃ１−Ｃ５アルキル））（米国特許第４，３３１，５９８号）（Ｎｏｃａｒｄｉａより調製）；
（６）Ｃ−１５−ヒドロキシ／アシルオキシ（米国特許第４，３６４，８６６号）（ストレプトミセス属によるメイタンシノールの変換によって調製）；
（７）Ｃ−１５−メトキシ（米国特許第４，３１３，９４６号及び同第４，３１５，９２９号）（トレウィア・ヌドルフローラ（Ｔｒｅｗｉａ  ｎｕｄｌｆｌｏｒａ）から単離）；
（８）Ｃ−１８−Ｎ−デメチル（米国特許第４，３６２，６６３号及び同第４，３２２，３４８号）（ストレプトミセス属によるメイタンシノールの脱メチル化によって調製）；ならびに
（９）４，５−デオキシ（米国特許第４，３７１，５３３号）（メイタンシノールの三塩化チタン／ＬＡＨ還元によって調製）。
【００６１】
使用されるリンカーの種類に依存して、メイタンシノール上の多くの位置が連結位置として有用であり得る。例えば、エステル結合を形成するためには、ヒドロキシル基を有するＣ‐３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ‐１４位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ‐１５位及びヒドロキシル基を有するＣ‐２０位がすべて適する。いくつかの実施形態では、連結位置はＣ‐３位である。
【００６２】
いくつかの実施形態では、Ｉａ又はＩｂ：
【化５】
2020503243.tif 000007
【化６】
2020503243.tif 000008
［式中、
Ｘは水素又はハロであり；
Ｙは、水素、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル、及びＣ（＝Ｏ）Ｒ５からなる群より選択され；
Ｒ１は、水素、−ＯＨ、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ５及びＯＲ５からなる群より選択され；
Ｒ２は水素又はＣ１−Ｃ６アルキルであり；
Ｒ３は、メチル、−ＣＨ２ＯＨ、又はＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）Ｒ６であり；
Ｒ４は−ＯＨ又はＳＨであり；
Ｒ５はＣ１−Ｃ６アルキル又はベンジルであり；
Ｒ６はＣ１−Ｃ６アルキル、フェニル又はベンジルであり；
Ｒ７は水素、Ｃ１−Ｃ６アルキル又はアミノ酸側鎖であり；
Ｒ８は水素又はＣ１−Ｃ６アルキルであり；
ｎは０、１、２、３、４、５、６、７又は８であり；
ｐは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０から選択され；ならびに
抗ＴＲＯＰ２は抗ＴＲＯＰ２抗体である］
の化合物又はその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物が提供される。
【００６３】
いくつかの実施形態では、Ｉａの化合物は、
【化７】
2020503243.tif 000009
又はその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物であり、ここで抗ＴＡＣＳＴＤ２は抗ＴＲＯＰ２（ＴＡＣＳＴＤ２）抗体である。
【００６４】
いくつかの実施形態では、抗Ｔｒｏｐ２抗体は、ＣＨＯ−ＢＡＴ−ＫＦ（受入番号：ＣＣＴＣＣ  ＮＯ：Ｃ２０１７１２７）により発現ベクターを介して発現される。細胞株を、ＡＤＣＣ機能の増強を特徴とするα−（１，６）−フコシルトランスフェラーゼに関してノックアウトした。これらの抗体には、ＢＡＴ０８０６、ＢＡＴ０８０７、ＢＡＴ０８０８、又は既に記載されている他の抗原結合フラグメントが含まれるが、これらに限定されない。
【００６５】
抗ＴＲＯＰ２抗体に結合することができる連結基を有するメイタンシノイド誘導体又はメイタンシノイドリンカー抗ＴＲＯＰ２抗体複合体のメイタンシノイド成分は、他の適切な細胞傷害性薬剤、例えばアウリスタチン、ＤＮＡ副溝結合剤、ＤＮＡ副溝アルキル化剤、エンジイン、レキシトロプシン、デュオカルマイシン、タキサン、ピューロマイシン、ドラスタチン、及びビンカアルカロイドで置換することができる。他の適切な細胞傷害性薬剤には、アウリスタチン、ビンカアルカロイド、ポドフィロトキシン、タキサン、バッカチン誘導体、クリプトフィシン、メイタンシノイド、コンブレタスタチン、又はドラスタチンなどの抗チューブリン剤が含まれる。いくつかの実施形態では、細胞傷害性薬剤は、ＡＦＰ、ＭＭＡＦ、ＭＭＡＥ、ＡＥＢ、ＡＥＶＢ、アウリスタチンＥ、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ＶＰ−１６、カンプトテシン、パクリタキセル、ドセタキセル、エポチロンＡ、エポチロンＢ、ノコダゾール、コルヒチン、コルセミド、エストラムスチン、セマドチン、ディスコデルモライド、メイタンシン、ＤＭ−１、ＤＭ−３、ＤＭ−４、又はエリューテロビンである。適切な免疫抑制剤としては、例えばガンシクロビル、エタネルセプト、シクロスポリン、タクロリムス、ラパマイシン、シクロホスファミド、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル、メトトレキサート、コルチゾール、アルドステロン、デキサメタゾン、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、５‐リポキシゲナーゼ阻害剤、又はロイコトリエン受容体アンタゴニストが挙げられる。いくつかの実施形態では、細胞傷害性薬剤は、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）又はその二量体、ＡＦＰ、ＭＭＡＦ、ＭＭＡＥ、ＡＥＢ、ＡＥＶＢ、アウリスタチンＥ、パクリタキセル、ドセタキセル、ＣＣ‐１０６５、ＳＮ‐３８、トポテカン、モルホリノ−ドキソルビシン、リゾキシノ、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、ドラスタチン−１０、エキノマイシン、コンブレタスタチン、カリケアマイシン、メイタンシン、ＤＭ−１、ＤＭ−３、ＤＭ−４、又はネトロプシンである。
【００６６】
抗ＴＲＯＰ２抗体に結合することができる連結基を有するメイタンシノイド誘導体及びメイタンシノイドリンカー抗ＴＲＯＰ２抗体複合体のメイタンシノイド成分もまた、適切な免疫抑制剤、例えばガンシクロビル、エタネルセプト、シクロスポリン、タクロリムス、ラパマイシン、シクロホスファミド、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル、メトトレキサート、コルチゾール、アルドステロン、デキサメタゾン、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、５−リポキシゲナーゼ阻害剤、又はロイコトリエン受容体アンタゴニストで置換することができる。
【００６７】
抗ＴＲＯＰ２抗体
抗ＴＲＯＰ２抗体には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖなどの抗体（ポリクローナル及びモノクローナル）のフラグメント（例えばＰａｒｈａｍ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３１：２８９５−２９０２（１９８３）；Ｓｐｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１３：４７０−４７８（１９７４）；Ｎｉｓｏｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．８９：２３０−２４４（１９６０）参照）；ラクダ抗体を含むドメイン抗体（ｄＡｂ）及びその抗原結合フラグメント（例えばＤｅｓｍｙｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ，３：７５２（１９９６）参照）；新抗原受容体（ＩｇＮＡＲ）と呼ばれるサメ抗体（例えばＧｒｅｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３７４：１６８（１９９５）；  Ｓｔａｎｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０５：１７７０−１７７３（２００４）参照）、ならびにＡＤＣＣ活性の増加のための遺伝子操作されたグリカンプロフィールを有する抗体、及びいくつかの場合には、部位特異的毒素結合のための遺伝子操作されたアミノ酸を有する抗体が含まれる。
【００６８】
モノクローナル抗体技術は、特異的モノクローナル抗体の形態の抗ＴＲＯＰ２抗体の産生を可能にする。標的細胞から単離された腫瘍特異的抗原などの関心対象の抗原でマウス、ウサギ、又は他の任意の哺乳動物を免疫することによって産生されるモノクローナル抗体を作製するための技術は、当技術分野において特に周知である。抗ＴＲＯＰ２抗体を作製する別の方法は、ｓｃＦｖ（一本鎖可変領域）、具体的にはヒトｓｃＦｖ（例えばＧｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，８８５，７９３号及び同第５，９６９，１０８号；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開第９２／０１０４７号；Ｌｉｍｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開第９９／０６５８７号参照）、又は酵母選択系を用いるドメイン抗体（例えば米国特許第７，１９５，５９５号参照）のファージライブラリを使用することである。加えて、キメラ化抗体又はヒト化抗体と同様に、米国特許第５，６３９，６４１号に開示されているもののような再表面化抗体も使用し得る。
抗体部分は、モノクローナル抗体、抗原結合抗体フラグメント、二重特異性抗体もしくは他の多価抗体、又は他の抗体ベースの分子であり得る。抗体は、様々なアイソタイプのものであり得、好ましくはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４、より好ましくはヒトＩｇＧ１ヒンジ及び定常領域配列を含むものであり得る。抗体又はそのフラグメントは、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｎｅｕｔ  Ｋｏｌｆｓｃｈｏｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１７：１５５４−１５５７（２００７）によって記載されているように、キメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体、ならびに半ＩｇＧ４抗体（「ユニボディ」と称される）などのその変形であり得る。より好ましくは、抗体又はそのフラグメントは、ＡＤＣがヒト対象に投与された場合に免疫原性の低減をもたらし得る、特定のアロタイプに属するヒト定常領域配列を含むように設計又は選択され得る。投与のための好ましいアロタイプには、Ｇ１ｍ３、Ｇ１ｍ３，１、Ｇ１ｍ３，２又はＧ１ｍ３，１，２などの非Ｇ１ｍ１アロタイプ（ｎＧ１ｍ１）が含まれる。より好ましくは、アロタイプは、ｎＧ１ｍ１、Ｇ１ｍ３、ｎＧ１ｍ１，２及びＫｍ３アロタイプからなる群より選択される。
【００６９】
特定の抗ＴＲＯＰ２抗体の選択は、標的とされるべき疾患の種類、細胞及び組織に依存する選択の問題である。
【００７０】
いくつかの実施形態では、抗ＴＲＯＰ２抗体は完全ヒトモノクローナル抗体であり、他の実施形態では、抗ＴＲＯＰ２抗体はヒト化モノクローナル抗体である。
【００７１】
腫瘍抗原に対して特異性を有する抗ＴＲＯＰ２抗体を使用することができる。本明細書で使用される「腫瘍抗原」は、腫瘍細胞において産生される抗原性物質を指し、すなわちそれは宿主において免疫応答を誘発する。腫瘍抗原は、腫瘍細胞を同定するのに有用であり、癌治療における使用のための潜在的な候補物である。体内の正常なタンパク質は抗原性ではない。しかしながら、ある種のタンパク質は腫瘍形成の間に産生又は過剰発現され、したがって身体にとって「外来性」に見える。これは、免疫系から十分に隔離されている正常タンパク質、通常極めて少量で産生されるタンパク質、通常は発生の特定段階でのみ産生されるタンパク質、又はその構造が突然変異のために改変されているタンパク質を含み得る。
【００７２】
抗ＴＲＯＰ２抗体は、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、胃癌、肺癌、口腔扁平上皮癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、甲状腺癌、膀胱癌、卵巣癌、神経膠腫、肝門部胆管癌、腎臓癌、結腸直腸癌、Ｔ細胞リンパ腫などを含む一連の固形腫瘍において高発現されるが、正常組織細胞ではまれにしか発現されないか、さらには全く発現されないＴＲＯＰ２に対して特異的な高親和性を示す。
【００７３】
Ｔｒｏｐ−２は、ヒト細胞（Ｆｏｒｎａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ６２：６１０−８（１９９５））及びマウス細胞（Ｓｅｗｅｄｙ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ７５：３２４−３０（１９９８））の両方からクローン化されているＩ型膜貫通タンパク質である。腫瘍関連カルシウムシグナル伝達物質としてのその役割に加えて（Ｒｉｐａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ７６：６７１−６（１９９８））、ヒトＴｒｏｐ−２の発現は腫瘍形成及び結腸癌細胞の侵襲性に必要であることが示され、これは、Ｔｒｏｐ−２の細胞外ドメインに対するポリクローナル抗体を投与することによって有効に低減することができた（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ７：２８０−５（２００８））。
【００７４】
固形癌の治療標的としてのＴｒｏｐ−２は、このタンパク質が乳癌（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１：４３５７−６４（２００５））、結腸直腸癌（Ｏｈｍａｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １２：３０５７−６３（２００６）；Ｆａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｄｉｓ  ２４：８７５−８４（２００９））及び口腔扁平上皮癌（Ｆｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐａｔｈｏｌ  ２１：１８６−９１（２００８））において過剰発現しているという報告のために関心が高まっている（Ｃｕｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １７９６：３０９−１４（２００９））。高レベルのＴｒｏｐ−２を発現する前立腺基底細胞がインビトロ及びインビボ幹様活性について濃縮されているという最新の証拠は特に注目に値する（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０５：２０８８２−７（２００８））。
【００７５】
例えば、フローサイトメトリ及び免疫組織化学染色試験は、抗ｔｒｏｐモノクローナル抗体であるＲＳ７  Ｍａｂが様々な種類の腫瘍上の抗原を検出し、正常なヒト組織への結合は限られていることを示した（Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０））。Ｔｒｏｐ−２は、主に肺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、及び前立腺癌などの癌によって発現される。動物モデルにおける放射性標識マウスＲＳ７  ＭＡｂを用いた局在化及び治療試験は、腫瘍標的化及び治療効果を実証した（Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）；  Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１））。
【００７６】
強いＲＳ７染色は、肺、乳房、膀胱、卵巣、子宮、胃、及び前立腺由来の腫瘍で実証されている（Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５５：９３８（１９９３））。肺癌症例は、扁平上皮癌と腺癌の両方を含んでいた（Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５５：９３８（１９９３））。両方の細胞型が強く染色され、ＲＳ７抗体は非小細胞肺癌の組織学的クラスを区別しないことを示した。
【００７７】
抗ＴＲＯＰ２抗体は、改善された抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を有するアミノ酸配列を導入するように修飾することができると考えられる。例えば、Ｆｃ及び／又はヒンジ領域内のアミノ酸は、改善されたＡＤＣＣを達成するように修飾することができる。改善されたＡＤＣＣを媒介するＩｇＧ１−Ｆｃの例、ならびにそのような配列についてスクリーニングする方法は、当技術分野において公知である（例えばＳｔｅｗａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ．２４（９）：６７１−８（２０１１））。抗体はまた、増加したＦｃγＩＩＩ親和性、したがって増加したＡＤＣＣ活性をもたらす、フコースの減少又は除去に関して操作することもできる。
【００７８】
抗ＴＲＯＰ２抗体への薬物の結合
論じたように、薬物（例えばメイタンシノイド薬物誘導体）は、リンカーを介して抗ＴＲＯＰ２抗体にコンジュゲートすることができる。一実施形態では、抗ＴＲＯＰ２抗体は適切な二官能性修飾剤で修飾することができる。いくつかの実施形態では、チオール（ＳＨ）基を含む基（チオ含有基とも称される）は、抗ＴＲＯＰ２抗体上の、リジンの側鎖などのアミノ酸残基の側鎖に導入することができる。例えば、抗ＴＲＯＰ２抗体上のリジン残基のアミノ基は、２−イミノチオラン（トラウト試薬）又はＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロパノアート（ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノアート（ＳＰＤＢ）などと反応させ、続いて２−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）又はトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）などの還元剤で還元することによってチオール含有基に変換することができる。いくつかの実施形態では、適切なカップリングを可能にするために、抗ＴＲＯＰ２抗体を、突然変異誘発によってシステインで操作するか、又は親和性、特異性、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、ＡＤＣＰ、及び免疫原性を含む抗体活性に最小限の影響をもたらす特定の位置に挿入することができる。例えば、操作されたシステイン残基は、ＴＲＯＰ２抗体の重鎖１１４及び／もしくは２３９ならびに／又は軽鎖１４９及び／もしくは２０５の位置に挿入され得、特定の部位で抗体に毒素をコンジュゲートするために使用することができる。複数のシステインを抗ＴＲＯＰ２抗体分子に対して操作することができる。
【００７９】
リジン残基の側鎖アミノ基を置換することができるチオール含有基の非限定的な例としては、−ＮＨＣ（＝ＮＨ）（ＣＨ２）ｎＳＨ及びＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎＳＨが挙げられ、式中、ｎは１、２、３、４、５又は６である。チオール含有基がアミノ酸残基に導入される場合、そのアミノ酸残基はチオール化アミノ酸と称される。例えば、リジン残基の側鎖アミノ基がチオ含有基に変換される場合、そのリジン残基はチオール化リジンと称される。抗ＴＲＯＰ２抗体に導入される遊離チオール（ＳＨ）基の数は、１〜約２０、又は１〜１０、及び／又は１〜５のように変動し得る。リンカー又は薬物−リンカーは、抗ＴＲＯＰ２抗体上のシステイン残基又はチオール化リジン残基の遊離チオール（ＳＨ）基と結合を形成することができる。いくつかの実施形態では、抗ＴＲＯＰ２抗体中のシステイン残基と結合を形成するリンカー又は薬物−リンカーの数は、１〜約１０である。いくつかの実施形態では、そのように形成される結合の数は少なくとも１、あるいは少なくとも２、又は３、又は４、又は５である。いくつかの実施形態では、そのように形成される結合の数は１０以下、あるいは９以下、又は８、７、６、５、又は４以下である。いくつかの実施形態では、各抗ＴＲＯＰ２抗体は、平均して、１〜４個の薬物分子、より具体的には平均２個の薬物分子とコンジュゲートされる。
【００８０】
別の実施形態では、薬物−リンカーは、システイン残基のチオール基に結合することによって抗ＴＲＯＰ２抗体にコンジュゲートすることができる。各抗ＴＲＯＰ２抗体は、典型的には複数のシステインを含むが、それらの全部ではないにせよ多くは互いにジスルフィド結合を形成し、したがってそのようなコンジュゲーションには利用できない。したがって、いくつかの実施形態では、抗ＴＲＯＰ２抗体のジスルフィド結合の１つ以上を、例えば２−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）又はトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）などの還元剤との反応によって破壊して、遊離チオール（ＳＨ）基を形成することができる。抗ＴＲＯＰ２抗体の構造安定性を保持するのに十分な数のジスルフィド結合を維持しつつ、十分な数のジスルフィド結合を破壊してコンジュゲーションを可能にするように、反応を監視及び／又は制御することができる。
【００８１】
いくつかの実施形態では、抗ＴＲＯＰ２抗体上の薬物−リンカーとシステイン残基との間で形成される結合の数は、１〜１０である。一実施形態では、そのような結合の数は少なくとも１、あるいは少なくとも２、又は４である。いくつかの実施形態では、そのように形成される結合の数は１０以下、あるいは９以下、又は８、７、６、５、又は４以下である。一実施形態では、各抗ＴＲＯＰ２抗体は、平均して、システインを介して２〜４個の薬物分子とコンジュゲートしている。
【００８２】
いくつかの実施形態では、薬物分子は、リジン残基とシステイン残基の混合物を介して抗ＴＲＯＰ２抗体にコンジュゲートされる。
【００８３】
抗ＴＲＯＰ２抗体は、例えば部位特異的突然変異誘発によって、さらなるチオール化リジン又はシステイン残基を導入して適切なコンジュゲーションを可能にするように修飾することができる。アミノ酸修飾の方法は当技術分野において周知である。次いで、修飾された抗ＴＲＯＰ２抗体をそれらの安定性及び抗原結合能について実験的に試験することができる。一実施形態では、少なくとも１つのチオール化リジン又はシステイン残基がそのような修飾によって導入される。別の実施形態では、少なくとも２つのチオール化リジン又はシステイン残基がそのような修飾によって導入される。別の実施形態では、抗ＴＲＯＰ２抗体のＦｃ部分は、増加したＡＤＣＣ活性を有するように操作される。
【００８４】
薬物負荷
抗ＴＲＯＰ２抗体への薬物負荷は、薬物の効力、大きさ、抗ＴＲＯＰ２抗体の安定性、抗ＴＲＯＰ２抗体上の利用可能なコンジュゲート可能基などのような多くの因子に依存して異なり得る。いくつかの実施形態では、１〜１０個のメイタンシノイド薬物分子が１個の抗ＴＲＯＰ２抗原結合単位とコンジュゲートしている。いくつかの実施形態では、平均２〜４個のメイタンシノイド薬物分子が１個の抗ＴＲＯＰ２抗原結合単位とコンジュゲートしている。いくつかの実施形態では、平均２個のメイタンシノイド薬物分子が１個の抗ＴＲＯＰ２抗原結合単位とコンジュゲートしている。
【００８５】
有効な薬剤を放出するメイタンシノイド−リンカー−抗ＴＲＯＰ２抗体複合体の代謝産物
いかなる理論にも束縛されることを望むものではないが、エンドサイトーシスの際に、式Ｉａ〜Ｉｃのいずれか１つの化合物は、細胞内タンパク質によって細胞毒性のメイタンシノイド部分を含む代謝産物に分解されると考えられる。いくつかの実施形態では、化合物は、式ＩＶａ、ＩＶｂ又はＩＶｃ：
【化８】
2020503243.tif 000010
【化９】
2020503243.tif 000011
【化１０】
2020503243.tif 000012
又はその塩であり、ここでＡＡは、
【化１１】
2020503243.tif 000013
から選択されるが、これらに限定されず、ここで
【化１２】
2020503243.tif 000014
は分子の残りの部分への結合点を表し、他の変数は本明細書で定義される通りである。
【００８６】
治療方法
別の態様では、有効量の、本明細書に記載の１つ以上の化合物、例えば式Ｉａ〜Ｉｃ及びＩＶａ〜ＩＶｃのいずれか１つの化合物を投与することを含む、増殖性、炎症性又は免疫学的疾患又は状態を、その治療を必要とする患者において治療する方法が本明細書で提供される。
【００８７】
化合物は、医薬組成物として製剤化することができ、選択された投与経路、すなわち経口的又は非経口的、静脈内（Ｉ．Ｖ．）、筋肉内、局所又は皮下経路による投与に適合された様々な形態で患者に投与することができる。化合物の量は、薬物の性質、リンカー、薬物負荷、細胞表面で誘発されるインターナリゼーションの程度、薬物の輸送及び放出、治療されている疾患、年齢、性別、体重などのような患者の状態に依存して異なり、当技術分野で公知の方法によって決定することができ、例えば米国特許第４，９３８，９４９号参照、最終的には主治医又は臨床医の裁量にゆだねられる。
【００８８】
一般に、適切な用量は、約０．１〜約２００ｍｇ／ｋｇ、例えば１〜４週間ごとに５２週間、３０〜９０分かけて約０．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重のＩＶ注入、１〜４週間ごとに５２週間、３０〜９０分かけて約１．０〜約２５ｍｇ／ｋｇ体重のＩＶ注入、１〜４週間ごとに５２週間、３０〜９０分かけて約１．５〜約１５ｍｇ／ｋｇ体重のＩＶ注入の範囲内、又は１〜４週間ごとに３０〜９０分かけて約１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重のＩＶ注入の範囲内である。いくつかの実施形態では、用量は、約１．０ｍｇ〜約１００ｍｇ／日、例えば１日あたり約２ｍｇ〜約５ｇ、１日あたり約１０ｍｇ〜約１ｇ、１日あたり約２０〜約５００ｍｇ、又は１日あたり約５０〜１００ｍｇの範囲内である。化合物は、毎日、毎週、毎月、例えば１日１回、１〜３週間ごと、又は１ヶ月ごとに投与することができる。あるいは、化合物は、数日間、例えば５日〜２１日間毎日投与し、一定期間、例えば１日〜７日間薬物を投与しないなどの周期で投与することができる。
【００８９】
いくつかの実施形態では、化合物は、３０〜９０分間にわたるＩＶ注入により１〜４ｍｇ／ｋｇの初期用量で投与され、続いて毎週又は１〜４週間ごとに５２週間、３０分間にわたるＩＶ注入により１〜２ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態では、化合物は、３０〜９０分間のにわたるＩＶ注入により２〜１０ｍｇ／ｋｇの初期用量で投与され、続いて１〜４週間ごとに５２週間、３０〜９０分間にわたるＩＶ注入により１〜５ｍｇ／ｋｇで投与される。
【００９０】
いくつかの実施形態では、化合物は別の療法と組み合わせて投与される。例えば、化合物は、癌を治療するための別の療法、例えば放射線療法又は当技術分野で公知の別の抗癌剤と同時投与することができる。
【００９１】
別の態様では、有効量の式ＩＶａの化合物を投与することを含む、増殖性、炎症性又は免疫学的疾患又は状態を、その治療を必要とする患者において治療する方法が本明細書で提供され、ここで式ＩＶａの化合物は、式Ｉａの化合物又はその薬学的に許容される塩を患者に投与した後の代謝化学反応の結果として生成される。
【００９２】
別の態様では、有効量の式ＩＶｂの化合物を投与することを含む、増殖性、炎症性又は免疫学的疾患又は状態を、その治療を必要とする患者において治療する方法が本明細書で提供され、ここで式ＩＶｂの化合物は、式Ｉｂの化合物又はその薬学的に許容される塩を患者に投与した後の代謝化学反応の結果として生成される。
【００９３】
別の態様では、有効量の式ＩＶｃの化合物を投与することを含む、増殖性、炎症性又は免疫学的疾患又は状態を、その治療を必要とする患者において治療する方法が本明細書で提供され、ここで式ＩＶｃの化合物は、式Ｉｃの化合物又はその薬学的に許容される塩を患者に投与した後の代謝化学反応の結果として生成される。
【００９４】
代謝化学反応とは、化学化合物が別の化学化合物に変換される、身体、例えば細胞、又は対象の内部で起こる反応を指す。変換は、代謝過程及び／又は化学的過程によるものであり得、１工程で又は一連の２以上の工程を通して起こり得る。代謝化学反応は、メイタンシノイドリンカー抗ＴＲＯＰ２抗体複合体のタンパク質又はペプチド成分を分解する反応を含む。
【００９５】
医薬組成物
さらなる態様では、本明細書に記載の１つ以上の化合物、例えば式Ｉａ〜Ｉｃのいずれか１つの化合物、及び１つ以上の薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が提供される。そのような組成物は少なくとも０．１％の活性化合物を含むべきである。組成物の割合は変動してもよく、所与の単位剤形の重量の約２〜約９０％であり得る。そのような治療上有用な組成物中の活性化合物の量は、有効投与量レベルが得られる量である。
【００９６】
注射又は注入に適した医薬組成物の例としては、薬学的に許容される液体担体もしくはビヒクル中の滅菌水溶液もしくは分散液、又はリポソーム中に封入されていてもよい、滅菌注射用又は注入用溶液もしくは分散液の即時調製に適した活性成分を含む滅菌粉末が挙げられ得る。医薬組成物の他の形態には、ゲル、軟膏、クリーム、ローション又は経皮パッチなどのような局所製剤が含まれる。医薬組成物は、当業者に周知の技術を使用することを含む。本明細書で言及されるもの以外の適切な薬学的に許容される担体は、当技術分野において公知である；例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０００，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，（Ｅｄｉｔｏｒｓ：Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．））を参照のこと。
【００９７】
さらなる態様では、本明細書に記載の化合物、例えば式Ｉａ〜ＩＶｃのいずれか１つの化合物と薬学的に許容される担体とを混合することを含む、医薬組成物の製造方法が提供される。活性成分を薬学的に許容される担体と混合する方法、例えば１又は複数の活性化合物を液体もしくは微細固体担体、又はその両方と必要な割合で均一に混合し、次いで必要に応じて、得られた混合物を所望の形状に成形する方法は、当技術分野において一般に公知である。
【００９８】
いくつかの実施形態では、式Ｉａ〜ＩＶｃのいずれか１つの化合物は、例えば４〜１０ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウム及び／又は５〜１２ｍｇ／ｍＬの酢酸ナトリウムを含む水溶液中２〜５０ｍｇ／ｍＬの濃度で、あるいは５〜１０ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウム、１〜５ｍｇ／ｍＬのリン酸ナトリウム二塩基性七水和物、０．１〜０．５ｍｇ／ｍＬのリン酸ナトリウム一塩基性一水和物を含む水溶液中２〜５０ｍｇ／ｍＬの濃度で、注射剤として製剤化される。
【００９９】
式Ｉａ〜ＩＶｃのいずれか１つの化合物の製剤の他の例には、０．５〜１．０％の塩化ナトリウム、０．０５〜０．１０％の一塩基性リン酸ナトリウム二水和物、１．０〜２．０％の二塩基性リン酸ナトリウム二水和物、０．０１〜０．０５％のクエン酸ナトリウム、０．１０〜０．２０％のクエン酸一水和物、１．０〜２．０％のマンニトール、０．１％〜０．２のポリソルベート８０、及び注射用蒸留水、ＵＳＰ、を含む水溶液中、２〜１００ｍｇ／ｍＬの濃度の化合物を有する注射製剤が含まれる。ｐＨを調整するために必要に応じて水酸化ナトリウムを添加する。
【０１００】
方法
本発明の化合物は、以下の一般的方法及び手順を用いて容易に入手可能な出発物質から調製することができる。典型的な又は好ましい工程条件（すなわち反応温度、時間、反応物のモル比、溶媒、圧力など）が与えられている場合、特に明記されない限り他の工程条件も使用できることが理解されるであろう。最適な反応条件は、使用される特定の反応物又は溶媒によって異なり得るが、そのような条件は、日常的な最適化手順により、当業者によって決定され得る。
【０１０１】
さらに、当業者には明らかなように、特定の官能基が望ましくない反応を受けるのを防ぐために従来の保護基が必要であり得る。様々な官能基のための適切な保護基、ならびに特定の官能基を保護及び脱保護するための適切な条件は、当技術分野において周知である。例えば、多数の保護基が、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９、及びその中で引用される参考文献に記載されている。
【０１０２】
さらに、本発明の化合物は１つ以上のキラル中心を含み得る。したがって、所望する場合は、そのような化合物を純粋な立体異性体として、すなわち個々のエナンチオマーもしくはジアステレオマーとして、又は立体異性体に富む混合物として調製又は単離することができる。特に指示がない限り、そのような立体異性体（及び濃縮混合物）はすべて本発明の範囲内に含まれる。純粋な立体異性体（又は濃縮混合物）は、例えば当技術分野において周知の光学活性な出発物質又は立体選択的試薬を使用して調製し得る。あるいは、そのような化合物のラセミ混合物は、例えばキラルカラムクロマトグラフィ、キラル分割剤などを使用して分離することができる。
【０１０３】
以下の反応のための出発物質は、一般的に公知の化合物であるか、又は公知の手順もしくはそれらの明らかな改変によって調製することができる。例えば、出発物質の多くは、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）、Ｂａｃｈｅｍ  （Ｔｏｒｒａｎｃｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）、Ｅｍｋａ−Ｃｈｅｍｃｅ又はＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，  Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）などの商業的供給者から入手可能である。他のものは、Ｆｉｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｆｉｅｓｅｒ’ｓ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  １−１５（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９１）、Ｒｏｄｄ’ｓ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｃａｒｂｏｎ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  １−５  ａｎｄ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌｓ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９８９）、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  １−４０（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９１）、Ｍａｒｃｈ’ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）、及びＬａｒｏｃｋ’ｓ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ（ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ．，１９８９）などの標準参照テキストに記載されている手順又はそれらの明らかな改変によって調製し得る。
【０１０４】
本発明の様々な出発物質、中間体、及び化合物は、必要に応じて沈殿、ろ過、結晶化、蒸発、蒸留、及びクロマトグラフィなどの従来の技術を用いて単離及び精製し得る。これらの化合物の特徴付けは、融点、質量スペクトル、核磁気共鳴、及び他の様々な分光分析などによる従来の方法を用いて実施し得る。
【０１０５】
カップリング試薬には、カルボジイミド、アミニウム及びホスホニウムベースの試薬が含まれる。カルボジイミド系試薬としては、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−ジカルボジイミド（ＥＤＣ）などが挙げられる。アミニウム塩には、Ｎ−［（ジメチルアミノ）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジン−１−イルメチレン］−Ｎ−メチルメタンアミニウムヘキサフルオロホスファートＮ−オキシド（ＨＡＴＵ）、Ｎ−［（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）（ジメチルアミノ）メチレン］−Ｎ−メチルメタンアミニウムヘキサフルオロホスファートＮ−オキシド（ＨＢＴＵ）、Ｎ−［（１Ｈ‐６−クロロベンゾトリアゾール−１−イル）（ジメチルアミノ）メチレン］−Ｎ−メチルメタンアミニウムヘキサフルオロホスファートＮ−オキシド（ＨＣＴＵ）、Ｎ−［（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）（ジメチルアミノ）メチレン］−Ｎ−メチルメタンアミニウムテトラフルオロボラートＮ−オキシド（ＴＢＴＵ）、及びＮ−［（１Ｈ‐６−クロロベンゾトリアゾール−１−イル）（ジメチルアミノ）メチレン］−Ｎ−メチルメタンアミニウムテトラフルオロボラートＮ−オキシド（ＴＣＴＵ）が含まれる。ホスホニウム塩には、７−アザベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ−オキシ−トリス（ピロリジノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＰｙＡＯＰ）及びベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ−オキシ−トリス（ピロリジノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＰｙＢＯＰ）が含まれる。アミド形成工程は、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）などの極性溶媒中で実施してもよく、またジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）又はジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）などの有機塩基を含んでもよい。
【０１０６】
例えば、式Ｉａ又はＩｂの化合物は、式Ａ又はＢの化合物［式中、変数は本明細書で定義される通りである］を、それぞれ、緩衝液などの適切な溶媒中で抗体と接触させることによって調製することができる。
【化１３】
2020503243.tif 000015
【化１４】
2020503243.tif 000016
【０１０７】
以下の例は、本発明の特定の態様を例示し、本発明を実施する際に当業者を助けるために提供される。これらの例は、決して本発明の範囲を限定するとみなされるべきではない。
例１
Ｆｍｏｃ−Ｎ−メチル−Ｌ−アラニンによるメイタンシノールのエステル化（Ｆｍｏｃ−Ｎ−Ｍｅ−Ｄ／Ｌ−Ａｌａ−ＭＤＣ）
【化１５】
2020503243.tif 000017
【０１０８】
Ｎ２の保護下で、ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）中のメイタンシノール（０．６００ｇ、１．０６２ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ‐Ｎ‐Ｍｅ‐Ｌ‐Ａｌａ（６．９１１ｇ、２１．２４ｍｍｏｌ）、Ｓｃ（ＯＴｆ）３（０．３１４ｇ、０．６３７ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（０．３８９ｇ、３．１８６ｍｍｏｌ）の混合物を−８℃で０．５時間撹拌した。ＤＩＣ（２．９４９ｇ、２３．３７ｍｍｏｌ）を滴下し、０．５時間撹拌し、緩やかに室温に温め、ろ過してルイス酸触媒を回収し、ろ液を希ＨＣｌでクエンチし、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。合わせた有機相をＮａＨＣＯ３水溶液、ブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を減圧下で除去した。クロマトグラフィ（シリカゲル、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ  ３０：１）により、所望の生成物をジアステレオマーＦｍｏｃ‐Ｎ‐Ｍｅ‐Ｄ／Ｌ‐Ａｌａ‐ＭＤＣの混合物として得た：白色固体（０．８３８５ｇ、９０．５％）。さらなるカラムクロマトグラフィ（シリカゲル、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ  １００：１から２０：１）により、２つの画分を純粋なジアステレオマーとして得た。高Ｒｆ画分はＤ−アミノアシルエステルジアステレオマー（Ｆｍｏｃ‐Ｎ‐Ｍｅ‐Ｄ‐Ａｌａ‐ＭＤＣ）であると決定され、一方低Ｒｆ画分は所望のＬ−アミノアシルエステル（Ｆｍｏｃ‐Ｎ‐Ｍｅ‐Ｌ‐Ａｌａ‐ＭＤＣ）であった。Ｆｍｏｃ‐Ｎ‐Ｍｅ‐Ｌ‐Ａｌａ‐ＭＤＣ：白色固体（０．４２６２ｇ、収率４６．０％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ０．７７（３Ｈ，ｓ），１．２２−１．３２（６Ｈ，ｍ），１．４０−１．４８（１Ｈ，ｍ），１．６３（３Ｈ，ｓ），２．１３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１４．４，２．８Ｈｚ），２．５３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１４．４，１０．８Ｈｚ），２．６４（３Ｈ，ｓ），２．８８（３Ｈ，ｓ），３．００（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ），３．０７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ），３．３５（３Ｈ，ｓ），３．４８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），３．５９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ），３．９７（３Ｈ，ｓ），４．１３−４．１９（１Ｈ，ｍ），４．１５（１Ｈ，ｓ），４．２４（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ），４．７２−４．７７（２Ｈ，ｍ），５．０３（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），５．６５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１５．２，９．２Ｈｚ），６．２９（１Ｈ，ｂｒ），６．４１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１５．２，１１．２Ｈｚ），６．５２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ），６．７０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ），６．７９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ），７．３３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），７．３６（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），７．３９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），７．４９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），７．７０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），７．７２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ）．ＬＣ−ＭＳ（Ｍ＋Ｎａ＋）計算値：８９４．３、実測値：８９４．３。Ｆｍｏｃ‐Ｎ‐Ｍｅ‐Ｄ‐Ａｌａ‐ＭＤＣ：白色固体（０．３９９３ｇ、収率４３．１％）、１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ０．８４（３Ｈ，ｓ），１．２２−１．２７（３Ｈ，ｍ），１．４０−１．４８（１Ｈ，ｍ），１．５１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），１．６７（３Ｈ，ｓ），２．２０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１４．４，２．８Ｈｚ  ），２．６３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１４．４，１２．４Ｈｚ），２．８５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ），２．９６（３Ｈ，ｓ），３．１７（３Ｈ，ｓ），３．２０（１Ｈ，ｓ），３．２４（３Ｈ，ｓ），３．４０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），３．５１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．８Ｈｚ），３．９９（３Ｈ，ｓ），４．２０−４．２８（２Ｈ，ｍ），４．３８−４．４３（２Ｈ，ｍ），４．８０−４．９８（２Ｈ，ｍ），５．８０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１５．２，１１．２Ｈｚ），６．１８（１Ｈ，ｓ），６．２５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ），６．４０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１５．２  ，１１．２Ｈｚ），６．７９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ），６．８４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ），７．３２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），７．４１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），７．６１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），７．７７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ）．ＬＣ−ＭＳ（Ｍ＋Ｎａ＋）計算値：８９４．３、実測値：８９４．３。
例２
Ｆｍｏｃ−Ｎ−Ｍｅ−Ｄ／Ｌ−Ａｌａ−ＭＤＣの脱保護（Ｎ−Ｍｅ−Ｄ／Ｌ−Ａｌａ−ＭＤＣ）
【化１６】
2020503243.tif 000018
【０１０９】
ＡＣＮ（２００ｍＬ）中のＦｍｏｃ‐Ｎ‐Ｍｅ‐Ｄ／Ｌ‐Ａｌａ‐ＭＤＣ（０．４６３ｇ、０．５３０７ｍｍｏｌ）にピペリジン（０．８６５ｇ、１０．１５ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で４時間撹拌し、水でクエンチし、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。合わせた有機相をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を減圧下で除去して粗生成物を得、これをさらに精製することなく次の工程に使用した。ＬＣ−ＭＳ（Ｍ＋Ｈ＋）計算値：６５０．３、実測値：６５０．３。Ｒｔ：３．９６分。
例３
Ｆｍｏｃ−Ｎ−Ｍｅ−Ｌ−Ａｌａ−ＭＤＣの脱保護（Ｎ−Ｍｅ−Ｌ−Ａｌａ−ＭＤＣ）
【化１７】
2020503243.tif 000019
【０１１０】
ＡＣＮ（２００ｍＬ）中のＦｍｏｃ‐Ｎ‐Ｍｅ‐Ｌ‐Ａｌａ‐ＭＤＣ（０．４６３ｇ、０．５３０７ｍｍｏｌ）にピペリジン（０．８６５ｇ、１０．１５ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で４時間撹拌し、水でクエンチし、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。合わせた有機相をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を減圧下で除去して粗生成物を得、これをさらに精製することなく次の工程に使用した。ＬＣ−ＭＳ（Ｍ＋Ｈ＋）計算値：６５０．３、実測値：６５０．３。Ｒｔ：３．９６分。
例４
Ｎ−Ｍｅ−Ｄ／Ｌ−Ａｌａ−ＭＤＣとＭＡ−ＡＣＰとの縮合（Ｄ−３ＡＡ−ＭＤＣ及びＬ−３ＡＡ−ＭＤＣ）
【化１８】
2020503243.tif 000020
【０１１１】
０℃でＤＭＦ（２５ｍＬ）中の上記で調製したＮ‐Ｍｅ‐Ｄ／Ｌ‐Ａｌａ‐ＭＤＣ（０．５３０７ｍｍｏｌ）及びＭＡ‐ＡＣＰ（０．４４８ｇ、２．１２３ｍｍｏｌ）に、ＥＤＣ（０．４０７ｇ、２．１２３ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で一晩撹拌し、水でクエンチし、ＥｔＯＡｃで抽出し、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を減圧下で除去した。クロマトグラフィ（シリカゲル：ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ  ３０：１）により、粗生成物を得た。ＹＭＣ  Ｃ‐１８カラム（２５０×２０ｍｍ、Ｓ１０μｍ）での分取ＨＰＬＣによるさらなる精製により、２つの画分（Ｒｔ＝６．５９分及び６．９８分）を白色固体として得た。高Ｒｔ画分はＤ−アミノアシルエステルジアステレオマー（Ｄ−３ＡＡ−ＭＤＣ、４５．２％）であると決定され、一方低Ｒｔ画分は所望のＬ−アミノアシルエステル（Ｌ−３ＡＡ−ＭＤＣ、５４．８％）であった。Ｌ−３ＡＡ−ＭＤＣ：白色固体（０．１３６４ｇ、２工程で全体的収率３０．５％）、１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ０．７９（３Ｈ，ｓ），１．１７−１．３２（３Ｈ，ｍ），１．２７（３Ｈ，ｓ），１．２９（３Ｈ，ｓ），１．４０−１．７６（７Ｈ，ｍ），２．１２−２．２３（２Ｈ，ｍ），２．３１−２．４５（１Ｈ，ｍ），２．５９（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝１２．８Ｈｚ），２．８２（３Ｈ，ｓ），３．０１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ），３．１０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），３．１７（３Ｈ，ｓ），３．３４（３Ｈ，ｓ），３．４２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），３．４８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），３．６２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．８Ｈｚ），３．９７（３Ｈ，ｓ），４．２７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ），４．７６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．６Ｈｚ），５．３６（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），５．６５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１５．２，９．２Ｈｚ），６．２５（１Ｈ，ｓ），６．４１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１５．２，１１．２Ｈｚ），６．６４（１Ｈ，ｓ），６．６５（２Ｈ，ｓ），６．７２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ），６．８２（１Ｈ，ｓ）．ＬＣ−ＭＳ（Ｍ＋Ｎａ＋）計算値：８６５．３、実測値：８６５．３。Ｒｔ：６．５９分。Ｄ−３ＡＡ−ＭＤＣ：白色固体（０．１１２８ｇ、２工程で全体的収率２５．２％）、１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ０．８６（３Ｈ，ｓ），１．２２−１．３８（４Ｈ，ｍ），１．２５（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），１．３８−１．４５（１Ｈ，ｍ），１．４８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），１．５６−１．７０（４Ｈ，ｍ），１．６８（３Ｈ，ｓ），１．７５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１３．６Ｈｚ），２．１９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１４．４，２．８Ｈｚ），２．２８−２．３６（２Ｈ，ｍ），２．６５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１４．２，１２．０Ｈｚ），２．８０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ），３．０１（３Ｈ，ｓ），３．１９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１３．２Ｈｚ），３．３２（３Ｈ，ｓ），３．４２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ），３．４７−３．５４（３Ｈ，ｍ），３．９８（３Ｈ，ｓ），４．２９（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝１０．４Ｈｚ），４．８８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．８，３．２Ｈｚ），５．０７（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），５．８４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１５．２��９．２Ｈｚ），６．２３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ），６．２７（１Ｈ，ｓ），６．４１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１５．２，１１．２Ｈｚ），６．６９（２Ｈ，ｓ），６．７９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ），６．８４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ）．ＬＣ−ＭＳ（Ｍ＋Ｎａ＋）計算値：８６５．３、実測値：８６５．３。Ｒｔ：６．９８分。
例５
Ｎ−Ｍｅ−Ｌ−Ａｌａ−ＭＤＣとＭＡ−ＡＣＰとの縮合（Ｌ−３ＡＡ−ＭＤＣ）
【化１９】
2020503243.tif 000021
【０１１２】
０℃でＤＭＦ（２５ｍＬ）中の上記で調製したＮ‐Ｍｅ‐Ｌ‐Ａｌａ‐ＭＤＣ（０．５３０７ｍｍｏｌ）及びＭＡ‐ＡＣＰ（０．４４８ｇ、２．１２３ｍｍｏｌ）に、ＥＤＣ（０．４０７ｇ、２．１２３ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で一晩撹拌し、水でクエンチし、ＥｔＯＡｃで抽出し、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を減圧下で除去した。クロマトグラフィ（シリカゲル：ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ  ３０：１）により、粗生成物を得た。ＹＭＣ  Ｃ−１８カラム（２５０×２０ｍｍ、Ｓ１０μｍ）での分取ＨＰＬＣによるさらなる精製により、所望のＬ−３ＡＡ−ＭＤＣを得た：白色固体（０．２８０ｇ、２工程で全体的収率６２．６％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ０．７９（３Ｈ，ｓ），１．１７−１．３２（３Ｈ，ｍ），１．２７（３Ｈ，ｓ），１．２９（３Ｈ，ｓ），１．４０−１．７６（７Ｈ，ｍ），２．１２−２．２３（２Ｈ，ｍ），２．３１−２．４５（１Ｈ，ｍ），２．５９（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝１２．８Ｈｚ），２．８２（３Ｈ，ｓ），３．０１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ），３．１０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），３．１７（３Ｈ，ｓ），３．３４（３Ｈ，ｓ），３．４２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），３．４８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），３．６２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．８Ｈｚ），３．９７（３Ｈ，ｓ），４．２７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ），４．７６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．６Ｈｚ），５．３６（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），５．６５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１５．２，９．２Ｈｚ），６．２５（１Ｈ，ｓ），６．４１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１５．２，１１．２Ｈｚ），６．６４（１Ｈ，ｓ），６．６５（２Ｈ，ｓ），６．７２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ），６．８２（１Ｈ，ｓ）．ＬＣ−ＭＳ（Ｍ＋Ｎａ＋）計算値：８６５．３、実測値：８６５．３。Ｒｔ：６．５９分。
【０１１３】
例６
組換え抗体の発現及び精製
抗ＴＲＯＰ２抗体を、基本的にＷｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５：３０１１（１９９０）に記載されているようにＣＨＯ細胞において作製した。簡潔には、各抗体遺伝子を公知の分子生物学技術（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）を用いて構築した。ここで、ＢＡＴ０８０６抗体の軽鎖及び重鎖ヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号１及び配列番号２に示した。ならびにＢＡＴ０８０７及びＢＡＴ０８０８の軽鎖及び重鎖ヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号３及び配列番号４に示した。チャイニーズハムスター卵巣細胞株ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−６１）の派生細胞株（ＣＨＯ−ＢＡＴ）を宿主細胞として使用した。高収率で安定な細胞株を構築する方法は以下の通りである：宿主細胞をＣＤ−ＣＨＯ培地（ＧＩＢＣＯ）中で増殖させた。エレクトロポレーションを用いてトランスフェクションを促進した。対数増殖期の宿主細胞を遠心分離によって回収し、次いで新鮮ＣＤ−ＣＨＯ培地に再懸濁してキュベットあたり約１×１０７細胞（６００μＬ）の細胞密度を達成し、次に線状プラスミド４０μｇを添加して十分に混合し、ここでＣＨＯ−ＢＡＴ細胞株をＢＡＴ０８０６及びＢＡＴ０８０７発現ベクターの宿主細胞として使用し、ＣＨＯ−ＢＡＴ−ＫＦ（フコースノックアウト）細胞株をＢＡＴ０８０８発現ベクターの宿主細胞として使用した。線状プラスミドＤＮＡ  ４０μｇを含む細胞の懸濁液を９６０μＦＤ及び３００Ｖで電気穿孔し、適切な選択薬を含む９６ウェル組織培養プレート中にウェルあたり１．２５×１０３細胞を播種した。９６ウェル組織培養プレート上の単離されたクローンの培養上清中の抗体発現レベルを酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）によって決定した。上清中の抗体価に基づき、高レベルの発現を有するクローンを、適切な培地を含む２４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移した。特異的抗体生産性（ｑＡｂ）及び特異的増殖速度（μ）を、６ウェル組織培養プレート中に培地５ｍＬを含むウェルあたり２×１０５細胞で細胞を播種し、２日間及び４日間培養することによってさらに分析し、通常２０〜３０個の高生産性クローン（親クローン）を連続選択のために振とうフラスコに移した。５〜８個の最高収量クローンをさらなるサブクローニング及び発現試験のために選択した。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、本発明によって提供される抗Ｔｒｏｐ２抗体は、配列番号１に示す軽鎖アミノ酸配列及び配列番号２に示す重鎖アミノ酸配列を含むＢＡＴ０８０６であり得る。いくつかの実施形態では、本発明によって提供される抗Ｔｒｏｐ２抗体は、配列番号３に示す軽鎖アミノ酸配列及び配列番号４に示す重鎖アミノ酸配列を含むＢＡＴ０８０７又はＢＡＴ０８０８、又はその等価物であり得る。
【０１１５】
細胞懸濁液を遠心分離し、上清を回収することによって精製を実施し、上清を遠心分離によってさらに清澄化した。Ｍａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などのプロテインＡアフィニティカラム及びＣａｐｔｏ  Ｓ（ＧＥ）などのイオン交換を使用して、発現された抗体を精製した。
【０１１６】
例７
抗ＴＲＯＰ２抗体ＢＡＴ０８０６と３ＡＡ−ＭＤＣとのコンジュゲーション
抗ＴＲＯＰ２抗体ＢＡＴ０８０６を溶液Ａ（２０ｍＭホスファート、１００ｍＭ  ＮａＣｌ及び２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）で８．０ｍｇ／ｍＬに希釈し、次いでＴＣＥＰ（３．２モル当量）で還元した。この工程に続いて、３７℃で６０分間インキュベートし、限外ろ過し、溶液Ｂ（１０ｍＭコハク酸、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）と交換した。スルフヒドリル抗体を、スルフヒドリルとＤＴＮＢ（５，５’−ジスルフィドダブル（２−ニトロ安息香酸）、Ａｌｄｒｉｃｈ  ｃｏｍｐａｎｙ）との反応生成物の４１２ｎｍでの吸光度を測定し、次いでチオールの濃度を決定することによって検定した。
【０１１７】
コンジュゲート反応におけるＤＭＡの濃度は１０％であった。３ＡＡ−ＭＤＣは例４及び５におけるように調製した。３ＡＡ−ＭＤＣ対スルフヒドリルの比は１．５：１．０（モル当量）であった。３ＡＡ−ＭＤＣを還元抗体に添加し、室温で３時間撹拌し、次に０．５時間撹拌を続けながら５ｍＭシステインを混合物に添加した。最終反応混合物を陽イオン交換カラムによって精製し、次に０．２２ミクロンフィルタで限外ろ過し、−８０℃で保存した。Ｂａｔａｎｓｉｎｅ−０８０６の抗体濃度、凝集及びカップリング薬物比を、それぞれ紫外線吸収、寸法排除クロマトグラフィ及び逆相高速液体クロマトグラフィによって測定した。本出願からのすべてのモノクローナル抗体及びＡＤＣは、９８％を超える純度を有していた。
【０１１８】
例８
抗ＴＲＯＰ２抗体ＢＡＴ０８０６とＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８とのコンジュゲーション
抗ＴＲＯＰ２抗体ＢＡＴ０８０６を溶液Ａ（２０ｍＭホスファート、１００ｍＭ  ＮａＣｌ及び２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）で８．０ｍｇ／ｍＬに希釈し、次いでＴＣＥＰ（３．２モル当量）で還元した。この工程に続いて、３７℃で６０分間インキュベートし、限外ろ過し、溶液Ｂ（１０ｍＭコハク酸、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）と交換した。スルフヒドリル抗体を、スルフヒドリルとＤＴＮＢ（５，５’−ジスルフィドダブル（２−ニトロ安息香酸）、Ａｌｄｒｉｃｈ  ｃｏｍｐａｎｙ）との反応生成物の４１２ｎｍでの吸光度を測定し、次いでチオールの濃度を決定することによって検定した。
【０１１９】
コンジュゲート反応におけるＤＭＳＯの濃度は１０％であった。ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８対スルフヒドリルの比は１．５：１．０（モル当量）であった。ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を還元抗体に添加し、室温で３時間撹拌し、次に０．５時間撹拌を続けながら５ｍＭシステインを添加した。反応混合物を陽イオン交換カラムによって精製し、次に０．２２ミクロンフィルタで限外ろ過し、−８０℃で保存した。ＢＡＴ０８０６−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の抗体濃度、凝集及びカップリング薬物比を、それぞれ紫外線吸収、寸法排除クロマトグラフィ及び逆相高速液体クロマトグラフィによって測定した。本出願からのすべてのモノクローナル抗体及びＡＤＣは、９８％を超える純度を有していた。
【０１２０】
例９
抗ＴＲＯＰ２抗体ＢＡＴ０８０７と３ＡＡ−ＭＤＣとのコンジュゲーション
抗ＴＲＯＰ２抗体ＢＡＴ０８０７を溶液Ａ（２０ｍＭホスファート、１００ｍＭ  ＮａＣｌ及び２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）で８．０ｍｇ／ｍＬに希釈し、次いで過剰のＴＣＥＰ（３．２モル当量）で完全に還元した。この工程に続いて、３７℃で６０分間インキュベートし、限外ろ過し、溶液Ｂ（１０ｍＭコハク酸、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）と交換した。スルフヒドリル抗体を、スルフヒドリルとＤＴＮＢ（５，５’−ジスルフィドダブル（２−ニトロ安息香酸）、Ａｌｄｒｉｃｈ  ｃｏｍｐａｎｙ）との反応生成物の４１２ｎｍでの吸光度を測定し、次いでチオールの濃度を決定することによって検定した。その後、過剰の硫酸銅（ＣｕＳＯ４）又は脱水素化アスコルビン酸（ｄＨＡＡ）によって酸化反応を媒介して抗体鎖間のジスルフィド結合を再結合し、１つ又は複数の部位変異システインを保存した。
【０１２１】
コンジュゲート反応におけるＤＭＡの濃度は１０％であった。３ＡＡ−ＭＤＣは例４及び５におけるように調製した。３ＡＡ−ＭＤＣ対スルフヒドリルの比は１．５：１．０（モル当量）であった。３ＡＡ−ＭＤＣを還元抗体に添加し、室温で３時間撹拌し、次に０．５時間撹拌を続けながら５ｍＭシステインを添加した。反応混合物を陽イオン交換カラムによって精製し、次に０．２２ミクロンフィルタで限外ろ過し、−８０℃で保存した。Ｂａｔａｎｓｉｎｅ−０８０７の抗体濃度、凝集及びカップリング薬物比を、それぞれ紫外線吸収、寸法排除クロマトグラフィ及び逆相高速液体クロマトグラフィによって測定した。本出願からのすべてのモノクローナル抗体及びＡＤＣは、９８％を超える純度を有していた。
【０１２２】
例１０
抗ＴＲＯＰ２抗体ＢＡＴ０８０８と３ＡＡ−ＭＤＣとのコンジュゲーション
抗ＴＲＯＰ２抗体ＢＡＴ０８０８を溶液Ａ（２０ｍＭホスファート、１００ｍＭ  ＮａＣｌ及び２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）で８．０ｍｇ／ｍＬに希釈し、次いで過剰のＴＣＥＰ（３．２モル当量）で完全に還元した。この工程に続いて、３７℃で６０分間インキュベートし、限外ろ過し、溶液Ｂ（１０ｍＭコハク酸、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）と交換した。スルフヒドリル抗体を、スルフヒドリルとＤＴＮＢ（５，５’−ジスルフィドダブル（２−ニトロ安息香酸）、Ａｌｄｒｉｃｈ  ｃｏｍｐａｎｙ）との反応生成物の４１２ｎｍでの吸光度を測定し、次いでチオールの濃度を決定することによって検定した。その後、過剰の硫酸銅（ＣｕＳＯ４）又は脱水素化アスコルビン酸（ｄＨＡＡ）によって酸化反応を媒介して抗体鎖間のジスルフィド結合を再結合し、１つ又は複数の部位変異システインを保存した。
【０１２３】
コンジュゲート反応におけるＤＭＡの濃度は１０％であった。３ＡＡ−ＭＤＣは例４及び５におけるように調製した。３ＡＡ−ＭＤＣ対スルフヒドリルの比は１．５：１．０（モル当量）であった。３ＡＡ−ＭＤＣを還元抗体に添加し、室温で３時間撹拌し、次いで０．５時間撹拌を続けながら５ｍＭシステインを添加した。反応混合物を陽イオン交換カラムによって精製し、次に０．２２ミクロンフィルタで限外ろ過し、−８０℃で保存した。Ｂａｔａｎｓｉｎｅ−０８０８の抗体濃度、凝集及びカップリング薬物比を、それぞれ紫外線吸収、寸法排除クロマトグラフィ及び逆相高速液体クロマトグラフィによって測定した。本出願からのすべてのモノクローナル抗体及びＡＤＣは、９８％を超える純度を有していた。
【０１２４】
例１１
抗体−薬物複合体Ｂａｔａｎｓｉｎｅ−０８０６の増殖抑制作用
Ｂａｔａｎｓｉｎｅ−０８０６の増殖抑制作用を、異なる派生ＴＲＯＰ２陽性腫瘍細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、Ｎ８７及びＡ４３１について評価した。手短に言えば、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、Ａ４３１及びＮ８７細胞を０．２５％（容量／容量）トリプシンで消化し、細胞培養フラスコから細胞を剥ぎ取り、遠心分離し、次いで完全培地で再懸濁した。次に、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８又はＡ４３１細胞を９６ウェルプレートのウェルに５０００細胞／穴／１００μｌの密度で播種し、Ｎ８７細胞を８０００細胞／ウェル／１００μｌで播種した。細胞を３７℃で一晩培養し、次いで異なる濃度のＢａｔａｎｓｉｎｅ−０８０６を含む培地１００μｌを細胞培養物に添加した。７２時間のインキュベーションの後、９６ウェルプレートをＰＢＳ（ｐＨ  ７．４）で洗浄した。細胞計数キット８（ＣＣＫ８）試薬を用いて相対的細胞増殖を分析した。図７、図８、図９及び図１０Ａに示すように、抗体−薬物複合体Ｂａｔａｎｓｉｎｅ−０８０６は、ＴＲＯＰ２陽性細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、Ａ４３１及びＮ８７の増殖をそれぞれ３．２１ｎＭ、０．５３ｎＭ及び０．３４ｎＭのＥＣ５０で有意に阻害し、一方裸の抗体ＢＡＴ０８０６はＭＤＡ−ＭＢ−４６８の増殖に影響を及ぼさない。
【０１２５】
例１２
抗体−薬物複合体Ｂａｔａｎｓｉｎｅ−０８０７の増殖抑制作用
Ｂａｔａｎｓｉｎｅ−０８０７の増殖抑制作用を、異なる派生ＴＲＯＰ２陽性腫瘍細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、Ｎ８７及びＡ４３１について評価した。手短に言えば、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、Ａ４３１及びＮ８７細胞を０．２５％（容量／容量）トリプシンで消化し、細胞培養フラスコから細胞を剥ぎ取り、遠心分離し、次いで完全培地で再懸濁した。次に、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８又はＡ４３１細胞を９６ウェルプレートのウェルに５０００細胞／穴／１００μｌの密度で播種し、Ｎ８７細胞を８０００細胞／ウェル／１００μｌで播種した。細胞を３７℃で一晩培養し、次いで異なる濃度のＢａｔａｎｓｉｎｅ−０８０７を含む培地１００μｌを細胞培養物に添加した。７２時間のインキュベーションの後、９６ウェルプレートをＰＢＳ（ｐＨ  ７．４）で洗浄した。細胞計数キット８（ＣＣＫ８）試薬を用いて相対的細胞増殖を分析した。図７、図８及び図９に示すように、抗体−薬物複合体Ｂａｔａｎｓｉｎｅ−０８０７は、ＴＲＯＰ２陽性細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、Ａ４３１及びＮ８７の増殖をそれぞれ２．８９ｎＭ、１．７３ｎＭ及び０．７７ｎＭのＥＣ５０で有意に阻害した。
【０１２６】
例１３
抗体−薬物複合体Ｂａｔａｎｓｉｎｅ−０８０８の増殖抑制作用
Ｂａｔａｎｓｉｎｅ−０８０８の増殖抑制作用を、異なる派生ＴＲＯＰ２陽性腫瘍細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、Ｎ８７及びＡ４３１について評価した。手短に言えば、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、Ａ４３１及びＮ８７細胞を０．２５％（容量／容量）トリプシンで消化し、細胞培養フラスコから細胞を剥ぎ取り、遠心分離し、次いで完全培地で再懸濁した。次に、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８又はＡ４３１細胞を９６ウェルプレートのウェルに５０００細胞／穴／１００μｌの密度で播種し、Ｎ８７細胞を８０００細胞／ウェル／１００μｌで播種した。細胞を３７℃で一晩培養し、次いで異なる濃度のＢａｔａｎｓｉｎｅ−０８０８を含む培地１００μｌを細胞培養物に添加した。７２時間のインキュベーションの後、９６ウェルプレートをＰＢＳ（ｐＨ  ７．４）で洗浄した。細胞計数キット８（ＣＣＫ８）試薬を用いて相対的細胞増殖を分析した。図７、図８、図９及び図１０Ｂに示すように、抗体−薬物複合体Ｂａｔａｎｓｉｎｅ−０８０８は、ＴＲＯＰ２陽性細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、Ａ４３１及びＮ８７の増殖をそれぞれ５．６１ｎＭ、１．５３ｎＭ及び１．４７ｎＭのＥＣ５０で有意に阻害し、一方裸の抗体ＢＡＴ０８０８はＭＤＡ−ＭＢ−４６８の増殖に顕著な作用を及ぼさない。
【０１２７】
例１４
抗体−薬物複合体Ｂａｔａｎｓｉｎｅ−０８０８とＢＡＴ０８０６−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の増殖抑制作用の比較
抗体−薬物複合体Ｂａｔａｎｓｉｎｅ−０８０８とＢＡＴ０８０６−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の増殖抑制作用の比較を、異なる派生ＴＲＯＰ２陽性腫瘍細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、Ｎ８７及びＡ４３１について評価した。手短に言えば、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、Ａ４３１及びＮ８７細胞を０．２５％（容量／容量）トリプシンで消化し、細胞培養フラスコから細胞を剥ぎ取り、遠心分離し、次いで完全培地で再懸濁した。次に、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８又はＡ４３１細胞を９６ウェルプレートのウェルに５０００細胞／穴／１００μｌの密度で播種し、Ｎ８７細胞を８０００細胞／ウェル／１００μｌで播種した。細胞を３７℃で一晩培養し、次いで異なる濃度のＢａｔａｎｓｉｎｅ−０８０８を含む培地１００μｌを細胞培養物に添加した。７２時間のインキュベーションの後、９６ウェルプレートをＰＢＳ（ｐＨ  ７．４）で洗浄した。細胞計数キット８（ＣＣＫ８）試薬を用いて相対的細胞増殖を分析した。図１１Ａ、図１１Ｂ、及び図１１Ｃに示すように、ＴＲＯＰ２陽性細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、Ａ４３１及びＮ８７に対する抗体−薬物複合体Ｂａｔａｎｓｉｎｅ−０８０８及びＢＡＴ０８０６−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８のＥＣ５０は同じレベルであった。
【０１２８】
例１５
Ｂａｔａｎｓｉｎｅ０８０８の増強されたＡＤＣＣ作用
Ｂａｔａｎｓｉｎｅ−０８０８に特徴的な増強されたＡＤＣＣを、ＴＲＯＰ２陽性ヒト皮膚癌細胞株Ａ４３１に対する増殖阻害アッセイによって評価した。標的細胞を、２％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ−Ｆ１２培地に再懸濁した。細胞濃度を１×１０５細胞／ｍｌに調整し、５０μｌ細胞／ウェルを９６ウェルプレートに播種した（５０００細胞／ウェル）。抗体−薬物複合体試料を、２％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ−Ｆ１２培地で希釈した（初期濃度は８μｇ／ｍｌであり、次いで１：５の比率で段階希釈した）。各濃度について２つの重複するウェルを設定した。８つの勾配を設定した。最終ＡＤＣ濃度は、２、０．４、０．８８、及び０．０１６、０．００３２、０．０００６４、０．０００１２８、０μｇ／ｍｌであった。次に、５０μｌ／ウェルの異なる濃度の抗体−薬物複合体試料を、細胞を播種したウェルに添加し、続いて３７℃、５％ＣＯ２で３０分間インキュベートした。ＰＢＭＣ細胞を８００ｒ／分で５分間遠心分離し、２％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ−Ｆ１２培地で２回洗浄し、次いで細胞濃度を２×１０５細胞／ｍｌに調整した。ＰＢＭＣ細胞を１００μｌ／ウェルで播種した細胞に添加し、ＰＢＭＣ細胞対標的細胞の最終比が１０：１又は５：１となるようにした。９６ウェルプレートを３７℃及び５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ（ｐＨ７．５）で２回洗浄した。細胞計数キット８（ＣＣＫ８）試薬を用いて相対的細胞増殖を分析した。図１２Ａ及び図１２Ｂに示すように、Ｂａｔａｎｓｉｎｅ−０８０６、Ｂａｔａｎｓｉｎｅ−０８０７又はＢＡＴ０８０６−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８と比較して同じ条件で、Ｂａｔａｎｓｉｎｅ−０８０８は、はるかに低い濃度でも、Ａ４３１細胞の増殖を有意に阻害した。
【０１２９】
本発明者らは、３つの異なる腫瘍細胞株に対する３つの抗ＴＲＯＰ２抗体−薬物複合体の増殖阻害能力を試験し、驚くべきことに、異なる抗体修飾及び異なる薬物カップリング方法がそれらのコンジュゲートに対する腫瘍細胞の感受性に有意に影響することを見出した。例えば、増殖阻害活性のみを試験した場合、従来のようにカップリングされたＢａｔａｎｓｉｎｅ−０８０６は、部位特異的にカップリングしたＢａｔａｎｓｉｎｅ−０８０７及びＢａｔａｎｓｉｎｅ−０８０８よりも優れていることが見出された。さらに、Ｂａｔａｎｓｉｎｅ−０８０６のＥＣ５０値は、後者の２つの抗体−薬物複合体の両方よりも約２〜５倍低いことが観察された。同時にＡＤＣＣ作用を考慮に入れると、本発明者らは、驚くべきことに、Ｂａｔａｎｓｉｎｅ−０８０８の細胞増殖阻害活性がＢａｔａｎｓｉｎｅ−０８０６、Ｂａｔａｎｓｉｎｅ−０８０７又はＢＡＴ０８０６−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８に比べて５〜１０倍優れていることを見出した（以下の表に示す）。
【表１】
2020503243.tif 000022
【０１３０】
例１６
ヒト正常肝細胞株ＬＯ２に対する抗体−薬物複合体Ｂａｔａｎｓｉｎｅ−０８０８及びＢＡＴ０８０６−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の細胞毒性
Ｂａｔａｎｓｉｎｅ−０８０８及びＢＡＴ０８０６−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の細胞毒性をＴＲＯＰ２陰性ヒト正常肝細胞株ＬＯ２で評価した。手短に言えば、ＬＯ２細胞を０．２５％（容量／容量）トリプシンで消化し、細胞培養フラスコから細胞を剥ぎ取り、遠心分離し、次いで完全培地で再懸濁した。次に、細胞を５０００細胞／穴／１００μｌの密度で９６ウェルプレートのウェルに播種した。細胞を３７℃で一晩培養し、次に異なる濃度のＢａｔａｎｓｉｎｅ−０８０８及びＢＡＴ０８０６−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を含む培地１００μｌを細胞培養物に添加した。７２時間のインキュベーションの後、９６ウェルプレートをＰＢＳ（ｐＨ  ７．４）で洗浄した。細胞計数キット８（ＣＣＫ８）試薬を用いて相対的細胞増殖を分析した。図１３に示すように、抗体−薬物複合体ＢＡＴ０８０６−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８のＥＣ５０は、Ｂａｔａｎｓｉｎｅ−０８０８のＥＣ５０よりはるかに低く（３２．７４ｎＭ対５１１．３ｎＭ）、これは、ＢＡＴ０８０６−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８が、少なくともこの細胞株では、Ｂａｔａｎｓｉｎｅ−０８０８よりも毒性であったことを意味する。
【０１３１】
例１７
Ｂａｔａｎｓｉｎｅ−０８０６、Ｂａｔａｎｓｉｎｅ−０８０７及びＢＡＴ０８０６−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８はヒトＭＤＡ−ＭＢ−４６８腫瘍異種移植片を根絶する
確立された腫瘍の増殖に対するこれらの抗ＴＲＯＰ２抗体−薬物複合体の作用をヒトＭＤＡ−ＭＢ−４６８腫瘍異種移植片について検討した。簡単に説明すると、ヒトＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞（中国科学院の上海細胞バンク）を、１０％ＦＢＳ及び２ｍＭグルタミンを添加したＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。採取したＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞をＰＢＳに再懸濁し、１００μｌあたり５×１０７細胞の濃度に調整した。８〜９週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの右腋窩に腫瘍細胞２００μｌを皮下注射した。腫瘍異種移植片の大きさが１５０〜２００ｍｍ３（０．５×（長さ×幅２）として計算）に達したとき、動物を無作為に群に分けた。次いで動物をＢａｔａｎｓｉｎｅ−０８０６（５又は１５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）、Ｂａｔａｎｓｉｎｅ−０８０７（１又は５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）又はＢＡＴ０８０６−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８（１又は５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）で処置した。動物に、１０μＬ／ｇの投与量で週に１回、合計４回の静脈内投与を行った。各群は１０匹のマウスで構成された。腫瘍サイズを週に２回測定した。初回投与の４９日後、動物を安楽死させ、腫瘍を摘出して秤量した。図１４Ａ及び１４Ｂに示すように、２５日目という早い時期から、迅速な腫瘍退縮がＢａｔａｎｓｉｎｅ−０８０６（５又は１５ｍｇ／ｋｇ）及びＢａｔａｎｓｉｎｅ−０８０７（５ｍｇ／ｋｇ）で観察された。他方で、ＢＡＴ０８０６−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を５ｍｇ／ｋｇで投与した場合、腫瘍サイズは継続的に成長していた。さらに、Ｂａｔａｎｓｉｎｅ−０８０６はインビトロでより良好な作用を示すにもかかわらず、部位特異的結合Ｂａｔａｎｓｉｎｅ−０８０７は５ｍｇ／ｋｇの用量でＢａｔａｎｓｉｎｅ−０８０６と同等の作用を示した。
【０１３２】
例１８
Ｂａｔａｎｓｉｎｅ−０８０８及びＢＡＴ０８０６−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８はヒトＭＤＡ−ＭＢ−４６８腫瘍異種移植片を根絶する
確立された腫瘍の増殖に対するこれらの抗ＴＲＯＰ２抗体−薬物複合体の作用をヒトＭＤＡ−ＭＢ−４６８腫瘍異種移植片について検討した。簡単に説明すると、ヒトＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞（中国科学院の上海細胞バンク）を、１０％ＦＢＳ及び２ｍＭグルタミンを添加したＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。採取したＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞をＰＢＳに再懸濁し、１００μｌあたり５×１０７細胞の濃度に調整した。８〜９週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの右腋窩に腫瘍細胞２００μｌを皮下注射した。腫瘍異種移植片の大きさが１５０〜２００ｍｍ３（０．５×（長さ×幅２）として計算）に達したとき、動物を無作為に群に分けた。次いで動物をＢａｔａｎｓｉｎｅ−０８０８（５、１５又は２５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）又はＢＡＴ０８０６−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８（１５又は２５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）で処置した。動物に、１０μＬ／ｇの投与量で週に１回、合計４回の静脈内投与を行った。各群は８匹のマウスで構成された。腫瘍サイズを週に２回測定した。初回投与の２８日後、動物を安楽死させ、腫瘍を摘出して秤量した。図１５Ａ及び１５Ｂに示すように、初回投与から迅速な腫瘍退縮がＢａｔａｎｓｉｎｅ−０８０８（５又は１５ｍｇ／ｋｇ）又はＢＡＴ０８０６−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８（１５又は２５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）のすべての群において観察され、ほぼ実験が終了したときすべての処置群の腫瘍サイズはほぼ同じである。
【０１３３】
例１９
Ｂａｔａｎｓｉｎｅ０８０８はヒトＭＸ−１腫瘍異種移植片を根絶する
確立された腫瘍の増殖に対するこれらの抗ＴＲＯＰ２抗体−薬物複合体の作用をヒトＭＸ−１腫瘍異種移植片について検討した。簡単に説明すると、ヒトＭＸ−１細胞（中国科学院の上海細胞バンク）を、１０％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。採取したＭＸ−１細胞をＰＢＳ中に再懸濁し、１００μｌあたり５×１０７細胞の濃度に調整した。８〜９週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの右腋窩に腫瘍細胞２００μｌを皮下注射した。腫瘍異種移植片の大きさが１５０〜２００ｍｍ３（０．５×（長さ×幅２）として計算）に達したとき、動物を無作為に群に分けた。次いで動物をＢａｔａｎｓｉｎｅ−０８０８（２５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）又は同容量のビヒクルで処置した。動物に、１０μＬ／ｇの投与量で週に１回、合計４回の静脈内投与を行った。各群は６匹のマウスで構成された。腫瘍サイズを週に２回測定した。初回投与後２８日目に投与を停止し、４２日目まで観察を続けた。図１６に示すように、２６日目という早い時期にＢａｔａｎｓｉｎｅ−０８０８群で迅速な腫瘍退縮が観察され、最終的に４２日目にすべての動物で消失した。
【図１Ａ】
2020503243.tif 000031
【図１Ｂ】
2020503243.tif 000032
【図２Ａ】
2020503243.tif 000033
【図２Ｂ】
2020503243.tif 000034
【図３】
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【図４】
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【図５】
2020503243.tif 000037
【図６】
2020503243.tif 000038
【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
2020503243.tif 000042
【図１０Ｂ】
2020503243.tif 000043
【図１１Ａ】
2020503243.tif 000044
【図１１Ｂ】
2020503243.tif 000045
【図１１Ｃ】
2020503243.tif 000046
【図１２Ａ】
2020503243.tif 000047
【図１２Ｂ】
2020503243.tif 000048
【図１３】
2020503243.tif 000049
【図１４Ａ】
2020503243.tif 000050
【図１４Ｂ】
2020503243.tif 000051
【図１５Ａ】
2020503243.tif 000052
【図１５Ｂ】
2020503243.tif 000053
【図１６】
2020503243.tif 000054
【図１７Ａ】
2020503243.tif 000055
【図１７Ｂ】
2020503243.tif 000056
【図１８Ａ】
2020503243.tif 000057
【図１８Ｂ】
2020503243.tif 000058
【配列表】
2020503243000001.app
【国際調査報告】
2020503243.tif 000059
2020503243.tif 000060
2020503243.tif 000061
2020503243.tif 000062
2020503243.tif 000063