(57)【要約】  Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）に特異的に結合する抗体、ＦＬＴ３に特異的に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、およびそのようなＣＡＲを発現する遺伝子操作された免疫細胞（例えば、ＦＬＴ３特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞）が本明細書に提供される。本発明はまた、そのような抗体、ＣＡＲ、および遺伝子操作された免疫細胞の作製も提供する。本発明はまた、例えば、ＦＬＴ３を発現する悪性細胞に関連する状態（例えば、癌）の治療のための、そのような抗体、ＣＡＲ、および遺伝子操作された免疫細胞の使用も提供する。
2020522252.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞外リガンド結合ドメイン、第１の膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記細胞外リガンド結合ドメインは、重鎖可変（ＶＨ）領域および軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含み、前記ｓｃＦｖは、配列番号２０２（ＦＬＴ３のドメイン４）または配列番号２００（ＦＬＴ３のドメイン２）に結合する、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項２】
細胞外リガンド結合ドメイン、第１の膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記細胞外ドメインは、重鎖可変（ＶＨ）領域および軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含み、
（ａ）前記ＶＨ領域は、（ｉ）配列番号３７、３８、３９、４３、４４、４５、４９、５０、５４、５５、５６、６０、６１、６２、６６、６７、６８、７２、７３、７４、７８、７９、８０、８４、８５、８６、９０、９１、９２、９６、９７、９８、１０２、１０３、１０４、１０８、１０９、１１０、１１４、１１５、１１６、１２０、１２１、１２２、１２６、１２７、１２８、１３２、１３３、１３４、１３８、１３９、１４０、２９４、２９５、２９６、３００、３０１、３０５、３０６、３０７、３１１、３１２、３１６、３１７、もしくは３１８に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、（ｉｉ）配列番号４０、４１、４６、４７、５１、５２、５７、５８、６３、６４、６９、７０、７５、７６、８１、８２、８７、８８、９３、９４、９９、１００、１０５、１０６、１１１、１１２、１１７、１１８、１２３、１２４、１２９、１３０、１３５、１３６、１４１、１４２、２９７、２９８、３０２、３０３、３０８、３０９、３１３、３１４、３１９、３２０、もしくは３２２に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、および（ｉｉｉ）配列番号４２、４８、５３、５９、６５、７１、７７、８３、８９、９５、１０１、１０７、１１３、１１９、１２５、１３１、１３７、１４３、２９９、３０４、３１０、３１５、もしくは３２１に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含み、かつ／または
（ｂ）前記ＶＬ領域は、（ｉ）配列番号１４４、１４７、１５０、１５３、１５６、１５９、１６２、１６５、１６８、１７１、１７４、１７７、１８０、１８３、１８６、１８９、１９２、１９５、３２３、３２６、３２８、３３１、３３６、３３８、３４０、３４３、３４５、３４８、もしくは３５０に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、（ｉｉ）配列番号１４５、１４８、１５１、１５４、１５７、１６０、１６３、１６６、１６９、１７２、１７５、１７８、１８１、１８４、１８７、１９０、１９３、１９６、３２４、３２９、３３２、３３４、３４１、もしくは３４６に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、および（ｉｉｉ）配列番号１４６、１４９、１５２、１５５、１５８、１６１、１６４、１６７、１７０、１７３、１７６、１７９、１８２、１８５、１８８、１９１、１９４、１９７、３２５、３２７、３３０、３３３、３３５、３３７、３３９、３４２、３４４、３４７、もしくは３４９に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含む、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項３】
細胞外リガンド結合ドメイン、第１の膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記細胞外ドメインは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、２６５、２６７、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５、２８７、２８９、２９１、または２９３に示される配列を有する重鎖可変（ＶＨ）領域を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項４】
細胞外リガンド結合ドメイン、第１の膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記細胞外ドメインは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、または２９２に示される配列を有する軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項５】
細胞外リガンド結合ドメイン、第１の膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記細胞外ドメインは、重鎖可変（ＶＨ）領域および軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含み、前記ＶＨ領域は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、２６５、２６７、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５、２８７、２８９、２９１、または２９３に示される配列を含み、前記ＶＬ領域は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、または２９２に示される配列を含む、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項６】
細胞外リガンド結合ドメイン、第１の膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記細胞外ドメインは、重鎖可変（ＶＨ）領域および軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含み、
（ａ）前記ＶＨ領域は、配列番号４９、４４、もしくは５０に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号５１もしくは５２に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および配列番号５３に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含み、前記ＶＬ領域は、配列番号１５０に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号１５１に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号１５２に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含むか、または
（ｂ）前記ＶＨ領域は、配列番号９０、９１、もしくは９２に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号９３もしくは９４に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および配列番号９５に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含み、前記ＶＬ領域は、配列番号１７１に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号１７２に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号１７３に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項７】
前記ＶＨ領域は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、２６５、２６７、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５、２８７、２８９、２９１、もしくは２９３に示される配列、またはＣＤＲ内にない残基に１個もしくは数個の保存的アミノ酸置換を有するそれらの変異体を含み、かつ／あるいは前記ＶＬ領域が、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、もしくは２９２に示されるアミノ酸配列、またはＣＤＲ内にないアミノ酸に１個もしくは数個のアミノ酸置換を有するそれらの変異体を含む、請求項２〜５のいずれか一項に記載のＦＬＴ３特異的ＣＡＲ。
【請求項８】
前記ＶＨ領域は、配列番号４９、４４、または５０に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号５１または５２に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および配列番号５３に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含み、前記ＶＬ領域は、配列番号１５０に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号１５１に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号１５２に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＦＬＴ３特異的ＣＡＲ。
【請求項９】
前記ＶＨ領域は、配列番号９０、９１、または９２に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号９３または９４に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および配列番号９５に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含み、前記ＶＬ領域は、配列番号１７１に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号１７２に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号１７３に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＦＬＴ３特異的ＣＡＲ。
【請求項１０】
前記ＶＨ領域は、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ領域は、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載のＦＬＴ３特異的ＣＡＲ。
【請求項１１】
前記ＶＨ領域は、配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ領域は、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含む、請求項９に記載のＦＬＴ３特異的ＣＡＲ。
【請求項１２】
前記ＶＨ領域は、配列番号４３、４４、または４５に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号４６または４７に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および配列番号４８に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含み、前記ＶＬ領域は、配列番号１４７に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号１４８に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号１４９に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＦＬＴ３特異的ＣＡＲ。
【請求項１３】
前記ＶＨ領域は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ領域は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載のＦＬＴ３特異的ＣＡＲ。
【請求項１４】
前記ＶＨ領域は、配列番号６０、６１、または６２に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号６３または６４に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および配列番号６５に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含み、前記ＶＬ領域は、配列番号１５６に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号１５７に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号１５８に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＦＬＴ３特異的ＣＡＲ。
【請求項１５】
前記ＶＨ領域は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ領域は、配列番号９に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載のＦＬＴ３特異的ＣＡＲ。
【請求項１６】
前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のＦＬＴ３特異的ＣＡＲ。
【請求項１７】
前記細胞内シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢドメインを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のＦＬＴ３特異的ＣＡＲ。
【請求項１８】
第２の細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のＦＬＴ３特異的ＣＡＲ。
【請求項１９】
前記第２の細胞内シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢドメインを含む、請求項１８に記載のＦＬＴ３特異的ＣＡＲ。
【請求項２０】
前記細胞外リガンド結合ドメインと前記第１の膜貫通ドメインとの間にストークドメインを含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のＦＬＴ３特異的ＣＡＲ。
【請求項２１】
前記ストークドメインは、ＣＤ８αヒンジ、ＩｇＧ１ヒンジ、およびＦｃγＲＩＩＩαヒンジからなる群から選択される、請求項２０に記載のＦＬＴ３特異的ＣＡＲ。
【請求項２２】
モノクローナル抗体に特異的な１つ以上のエピトープを含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のＦＬＴ３特異的ＣＡＲ。
【請求項２３】
前記エピトープは、ＣＤ５２エピトープ、ＣＤ２０エピトープ、ＣＤ３エピトープ、ＣＤ４１エピトープ、ＣＤ２５エピトープ、ＣＤ３０エピトープ、ＥＧＦＲエピトープ、ＴＮＦαエピトープ、ＶＥＧＦエピトープ、補体タンパク質Ｃ５エピトープ、ＣＤ１１ａエピトープ、ＣＤ３３エピトープ、α４インテグリンエピトープ、ＩｇＥ  Ｆｃ領域エピトープ、ＲＳＶタンパク質Ｆエピトープ、ＩＬ−６受容体エピトープ、ＨＥＲ２受容体エピトープ、インテグリンα４β７エピトープ、ＢＡＦＦ（Ｂ細胞活性化因子）エピトープ、ＩＬ−１βエピトープ、ＲＡＮＫＬエピトープ、ＣＴＬＡ４エピトープ、ＣＤ３４エピトープ、ＩＬ−１２エピトープ、ＩＬ−２３エピトープ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２２に記載のＦＬＴ３特異的ＣＡＲ。
【請求項２４】
前記エピトープは、アレムツズマブ、イブリツモマブチウキセタン、ムロモナブ−ＣＤ３、トシツモマブ、アブシキシマブ、バシリキシマブ、ブレンツキシマブベドチン、セツキシマブ、インフリキシマブ、リツキシマブ、ベバシズマブ、セルトリズマブペゴル、ダクリズマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、ゲムツズマブ、ナタリズマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、ラニビズマブ、トシリズマブ、トラスツズマブ、ベドリズマブ、アダリムマブ、ベリムマブ、カナキヌマブ、デノスマブ、ゴリムマブ、イピリムマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、ＱＢＥＮＤ−１０、またはウステキヌマブによって特異的に認識されるエピトープである、請求項２２または２３に記載のＦＬＴ３特異的ＣＡＲ。
【請求項２５】
前記エピトープはＣＤ２０エピトープである、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載のＦＬＴ３特異的ＣＡＲ。
【請求項２６】
前記ＣＤ２０エピトープは、配列番号２２９に示されるアミノ酸配列を含む、請求項２５に記載のＦＬＴ３特異的ＣＡＲ。
【請求項２７】
前記ＦＬＴ３特異的ＣＡＲは、配列番号２３５、２３６、２３７または２４２に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＦＬＴ３特異的ＣＡＲ。
【請求項２８】
前記ＦＬＴ３特異的ＣＡＲは、配列番号２３５に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＦＬＴ３特異的ＣＡＲ
【請求項２９】
前記ＦＬＴ３特異的ＣＡＲは、配列番号２３６に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＦＬＴ３特異的ＣＡＲ。
【請求項３０】
前記第１の膜貫通ドメインは、ＣＤ８α鎖膜貫通ドメインを含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載のＦＬＴ３特異的ＣＡＲ。
【請求項３１】
ＦＬＴ３に特異的ではない第２の細胞外リガンド結合ドメインを含む、請求項１〜３０のいずれか一項に記載のＦＬＴ３特異的ＣＡＲ。
【請求項３２】
前記細胞外リガンド結合ドメイン（複数可）、前記第１の膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメイン（複数可）は、単一のポリペプチド上にある、請求項１〜３１のいずれか一項に記載のＦＬＴ３特異的ＣＡＲ。
【請求項３３】
第２の膜貫通ドメインを含み、前記第１の膜貫通ドメインおよび前記細胞外リガンド結合ドメイン（複数可）は第１のポリペプチド上にあり、前記第２の膜貫通ドメインおよび前記細胞内シグナル伝達ドメイン（複数可）は第２のポリペプチド上にあり、前記第１の膜貫通ドメインは、高親和性ＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ）のα鎖由来の膜貫通ドメインを含み、前記第２の膜貫通ドメインは、ＦｃεＲＩのγ鎖またはβ鎖由来の膜貫通ドメインを含む、請求項１〜３２のいずれか一項に記載のＦＬＴ３特異的ＣＡＲ。
【請求項３４】
共刺激分子由来の細胞内シグナル伝達ドメインに融合した第３の膜貫通ドメインを含む第３のポリペプチドを含み、前記第３の膜貫通ドメインは、ＦｃεＲＩのγ鎖またはβ鎖由来の膜貫通ドメインを含む、請求項３３に記載のＦＬＴ３特異的ＣＡＲ。
【請求項３５】
請求項１〜３４のいずれか一項に記載のＦＬＴ３特異的ＣＡＲをコードする核酸配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項３６】
前記ポリヌクレオチドは、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２４２２７を有するベクターの核酸配列を含む、請求項３５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３７】
前記ポリヌクレオチドは、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２４２２８を有するベクターの核酸配列を含む、請求項３５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３８】
前記ポリヌクレオチドは、配列番号２５３に示される核酸配列を含む、請求項３５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３９】
前記ポリヌクレオチドは、配列番号２４８に示される核酸配列を含む、請求項３５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４０】
前記ポリヌクレオチドは、配列番号２４７に示される核酸配列を含む、請求項３５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４１】
前記ポリヌクレオチドは、配列番号２４６に示される核酸配列を含む、請求項３５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４２】
前記ポリヌクレオチドは、配列番号２４５に示される核酸配列を含む、請求項３５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４３】
請求項３５〜４２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項４４】
請求項１〜３４のいずれか一項に記載のＦＬＴ３特異的ＣＡＲを発現する、遺伝子操作された免疫細胞。
【請求項４５】
ＦＬＴ３に特異的ではない別のＣＡＲを含む、請求項４４に記載の遺伝子操作された免疫細胞。
【請求項４６】
自殺ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項４４または４５に記載の遺伝子操作された免疫細胞。
【請求項４７】
前記自殺ポリペプチドはＲＱＲ８である、請求項４６に記載の遺伝子操作された免疫細胞。
【請求項４８】
前記免疫細胞は、炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、調節性Ｔリンパ球、またはヘルパーＴリンパ球に由来する、請求項４４〜４７のいずれか一項に記載の遺伝子操作された免疫細胞。
【請求項４９】
１つ以上の内在性遺伝子の破壊を含み、前記内在性遺伝子は、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ５２、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）、デオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）、または免疫チェックポイントタンパク質をコードする、請求項４４〜４８のいずれか一項に記載の遺伝子操作された免疫細胞。
【請求項５０】
前記免疫チェックポイントタンパク質はプログラム死−１（ＰＤ−１）である、請求項４９に記載の遺伝子操作された免疫細胞。
【請求項５１】
前記免疫細胞は、健常なドナーから得られる、請求項４４〜５０のいずれか一項に記載の遺伝子操作された免疫細胞。
【請求項５２】
前記免疫細胞は、疾患または障害に罹患したドナーから得られる、請求項４４〜５０のいずれか一項に記載の遺伝子操作された免疫細胞。
【請求項５３】
薬物として使用するための、請求項４４〜５２のいずれか一項に記載の遺伝子操作された免疫細胞。
【請求項５４】
前記薬物は、多発性骨髄腫、悪性形質細胞腫瘍、ホジキンリンパ腫、結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫、カーレル病および骨髄腫症、形質細胞性白血病、形質細胞腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、有毛細胞白血病、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、濾胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、辺縁帯リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、骨髄性白血病、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫、小細胞型リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、縦隔（胸腺）原発Ｂ細胞性大細胞型リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、結節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾臓辺縁帯リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出液リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、Ｔ細胞／組織球豊富型大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性皮膚びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（脚型）、高齢者のＥＢＶ陽性びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、炎症関連びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ＡＬＫ陽性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、形質芽球性リンパ腫、ＨＨＶ８関連多中心性キャッスルマン病に生ずる大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫とバーキットリンパ腫の中間型特徴を有する分類不能Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫と古典的ホジキンリンパ腫の中間型特徴を有する分類不能Ｂ細胞リンパ腫、および他の造血細胞に関連する癌からなる群から選択される癌の治療において使用するための、請求項５３に記載の遺伝子操作された免疫細胞。
【請求項５５】
請求項４４〜５４のいずれか一項に記載の遺伝子操作された免疫細胞であって、前記ＦＬＴ３特異的ＣＡＲは、ＳｃＦｖを含む細胞外ドメインを含み、
−前記ｓｃＦｖは、１０ｎＭ〜８０ｎＭを含むＫＤでヒトＦＬＴ３の前記細胞外ドメインに結合するか、または
−前記ｓｃＦｖは、１ｎＭ〜１００ｎＭを含むＫＤでヒトＦＬＴ３の前記細胞外ドメインのドメイン４に結合するか、または
−前記ｓｃＦｖは、５ｎＭ〜３０ｎＭを含むＫＤでヒトＦＬＴ３の前記細胞外ドメインのドメイン２〜３に結合する、遺伝子操作された免疫細胞。
【請求項５６】
請求項４４〜５５のいずれか一項に記載の遺伝子操作された免疫細胞を含む細胞集団であって、
（ｉｉ）前記細胞集団は、２０％、３０％もしくは４０％を上回る幹細胞メモリーおよび中枢メモリー細胞のパーセンテージを含み、かつ／または
（ｉｉｉ）前記細胞集団は、１０％、２０％、３０％もしくは４０％を上回るＦＬＴ３発現する細胞の溶解のパーセンテージを達成する、遺伝子操作された免疫細胞を含む細胞集団。
【請求項５７】
ＦＬＴ３特異的ＣＡＲを発現する免疫細胞を遺伝子操作する方法であって、
ａ．免疫細胞を提供することと、
ｂ．  前記細胞に、請求項１〜３４のいずれか一項に記載のＦＬＴ３特異的ＣＡＲをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを導入することと、を含み、
それによって前記免疫細胞が前記ＦＬＴ３特異的ＣＡＲを発現する、方法。
【請求項５８】
免疫細胞を遺伝子操作する方法であって、
ａ．免疫細胞を提供することと、
ｂ．前記細胞に、請求項１〜３４のいずれか一項に記載のＦＬＴ３特異的ＣＡＲをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを導入することと、
ｃ．前記細胞に、ＦＬＴ３に特異的ではないＣＡＲをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを導入することと、を含む、方法。
【請求項５９】
治療を必要とする対象を治療する方法であって、
ａ．請求項１〜３４のいずれか一項に記載のＦＬＴ３特異的ＣＡＲを発現する免疫細胞集団を提供することと、
ｂ．前記免疫細胞集団を前記対象に投与することと、を含む、方法。
【請求項６０】
請求項４４〜５２のいずれか一項に記載の遺伝子操作された免疫細胞を含む、薬学的組成物。
【請求項６１】
治療を必要とする対象におけるＦＬＴ３に関連した疾患または障害を治療する方法であって、有効量の請求項６０に記載の薬学的組成物または請求項４４〜５２のいずれか一項に記載の遺伝子操作された免疫細胞を、前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項６２】
前記ＦＬＴ３に関連した疾患または障害は癌である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記癌は、多発性骨髄腫、悪性形質細胞腫瘍、ホジキンリンパ腫、結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫、カーレル病および骨髄腫症、形質細胞性白血病、形質細胞腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、有毛細胞白血病、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、濾胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、辺縁帯リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、骨髄性白血病、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫、小細胞型リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、縦隔（胸腺）原発Ｂ細胞性大細胞型リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、結節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾臓辺縁帯リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出液リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、Ｔ細胞／組織球豊富型大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性皮膚びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（脚型）、高齢者のＥＢＶ陽性びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、炎症関連びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ＡＬＫ陽性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、形質芽球性リンパ腫、ＨＨＶ８関連多中心性キャッスルマン病に生ずる大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫とバーキットリンパ腫の中間型特徴を有する分類不能Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫と古典的ホジキンリンパ腫の中間型特徴を有する分類不能Ｂ細胞リンパ腫、および他の造血細胞に関連する癌からなる群から選択される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
ＦＬＴ３を発現する悪性細胞を有する対象における腫瘍増殖または進行を阻害する方法であって、有効量の請求項６０に記載の薬学的組成物または請求項４４〜５２のいずれか一項に記載の遺伝子操作された免疫細胞を、前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項６５】
阻害を必要とする対象におけるＦＬＴ３を発現する悪性細胞の転移を阻害する方法であって、有効量の請求項６０に記載の薬学的組成物または請求項４４〜５２のいずれか一項に記載の遺伝子操作された免疫細胞を、前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項６６】
ＦＬＴ３を発現する悪性細胞を有する対象における腫瘍退縮を誘導する方法であって、有効量の請求項６０に記載の薬学的組成物または請求項４４〜５２のいずれか一項に記載の遺伝子操作された免疫細胞を、前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項６７】
前記方法は、ヌクレオシド類似体療法薬を前記対象に投与することを含む、請求項６１〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記ヌクレオシド類似体療法薬は、フルダラビンまたはクロファラビンである、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記方法は、受容体チロシンキナーゼ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、エピジェネティック修飾因子、プロテアソーム阻害剤、免疫調節剤、ヘッジホッグ阻害剤もしくはイソクエン酸脱水素酵素（ＩＤＨ）阻害剤、またはそれらの組み合わせを前記対象に投与することを含む、請求項６１〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記方法は、プロテアソーム阻害剤、免疫調節剤もしくはヘッジホッグ阻害剤、またはそれらの組み合わせを前記対象に投与することを含む、請求項６１〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
前記方法は、レナリドミドを前記対象に投与することを含む、請求項６１〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
免疫細胞集団のインビトロ選別のための方法であって、前記免疫細胞集団のサブセットは、請求項２２〜２６のいずれか一項に記載のＦＬＴ３特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する遺伝子操作された免疫細胞を含み、前記方法は、
ａ．前記免疫細胞集団を前記エピトープに特異的なモノクローナル抗体と接触させることと、
ｂ．前記モノクローナル抗体に結合する前記免疫細胞を選択して、遺伝子操作された免疫細胞に富む細胞集団を得ることと、を含む、方法。
【請求項７３】
前記エピトープに特異的な前記モノクローナル抗体はフルオロフォアにコンジュゲートされ、任意選択的に、前記モノクローナル抗体に結合する前記細胞を選別するステップは蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって行われる、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記エピトープに特異的な前記モノクローナル抗体は磁気粒子にコンジュゲートされ、任意選択的に、前記モノクローナル抗体に結合する前記細胞を選別するステップは磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）によって行われる、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
前記エピトープはＣＤ２０エピトープである、請求項７２〜７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
前記ＣＤ２０エピトープは配列番号２２９に示されるアミノ酸配列を有し、任意選択的に、前記モノクローナル抗体はリツキシマブである、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
遺伝子操作された免疫細胞に富む前記細胞集団は、少なくとも７０％のＦＬＴ３  ＣＡＲを発現する免疫細胞を含む、請求項７２〜７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
対象から遺伝子操作された免疫細胞を枯渇させるための方法であって、前記対象は、請求項２２〜２６のいずれか一項に記載のＦＬＴ３特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する遺伝子操作された免疫細胞を投与されており、前記方法は、前記エピトープに特異的なモノクローナル抗体を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項７９】
前記エピトープはＣＤ２０エピトープである、請求項７６に記載の方法。
【請求項８０】
前記ＣＤ２０エピトープは配列番号２２９に示されるアミノ酸配列を有し、任意選択的に、前記モノクローナル抗体はリツキシマブである、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記モノクローナル抗体は、補体系を活性化させることができる分子にコンジュゲートされている、請求項７８〜８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
細胞傷害性薬物が前記モノクローナル抗体に結合されている、請求項７８〜８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
請求項２２〜２６のいずれか一項に記載のＦＬＴ３特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する遺伝子操作された免疫細胞を投与された対象において、内在性ＦＬＴ３を発現する骨髄前駆体細胞の回収を促進するための方法であって、前記エピトープに特異的なモノクローナル抗体を前記患者に投与することを含む、方法。
【請求項８４】
前記エピトープはＣＤ２０エピトープである、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記ＣＤ２０エピトープは配列番号２２９に示されるアミノ酸配列を有し、任意選択的に、前記モノクローナル抗体はリツキシマブである、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記モノクローナル抗体は、補体系を活性化させることができる分子にコンジュゲートされている、請求項８３〜８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
細胞傷害性薬物は前記モノクローナル抗体に結合されている、請求項８３〜８５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年６月２日に出願された米国仮特許出願第６２／５１４，６３４号に対する優先権の利益を主張するものであり、その内容は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
２０１７年６月２日に出願された米国仮特許出願第６２／５１４，５７４号および２０１８年４月２０日に出願された同６２／６６０，９０８号、ならびに２０１８年５月３１日に出願されたＰＣＴ出願、表題「ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＳＰＥＣＩＦＩＣ  ＦＯＲ  ＦＬＴ３  ＡＮＤ  ＴＨＥＩＲ  ＵＳＥＳ」の内容は全て、ＦＬＴ３特異的抗体を開示しており、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０００３】
配列表の参照
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に出願されており、．ｔｘｔフォーマットで電子的に提出された配列表を含む。．ｔｘｔファイルは、２０１８年５月２４日に作成され、２３８ＫＢのサイズを有する「ＡＬＧＮ＿０１０＿０１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という表題の配列表を含む。この．ｔｘｔファイルに含まれる配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００４】
Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）特異的抗体、ＦＬＴ３に特異的に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）（ＦＬＴ３  ＣＡＲ）、ＦＬＴ３  ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、およびＦＬＴ３特異的ＣＡＲを含む遺伝子操作された免疫細胞（例えば、ＦＬＴ３特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞）が本明細書に提供される。本発明はさらに、ＦＬＴ３特異的ＣＡＲを発現するように免疫細胞を遺伝子操作するための方法、ならびにＦＬＴ３に関連する状態（例えば、ＦＬＴ３を発現する悪性細胞）を治療するために、ＦＬＴ３特異的抗体およびＦＬＴ３特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００５】
悪性腫瘍関連抗原を認識するように遺伝子組み換えされた免疫細胞の養子移入は、癌の治療に対する新しいアプローチとして有望である（例えば、Ｂｒｅｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２２（２）：２５１−２５７（２０１０）；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ，８（４）：２９９−３０８（２００８）を参照されたい）。Ｔ細胞は、抗原認識部分およびＴ細胞活性化ドメインからなる融合タンパク質であるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子組み換えすることができる（例えば、Ｅｓｈｈａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０（２）：７２０−７２４（１９９３）、およびＳａｄｅｌａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，２１（２）：２１５−２２３（２００９）を参照されたい）。
【０００６】
ＦＬＴ３は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）標的抗原であり、健康な細胞と比較してＡＭＬ患者の芽細胞に過剰発現し、大半の患者の細胞に発現する（Ｃａｒｏｗ  ｅｔ  ａｌ，Ｆｅｂ  ２，１９９６  Ｂｌｏｏｄ：８７（３）；Ｂｉｒｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｏｖ  １９９２  Ｂｌｏｏｄ：８０（１０））。ＦＬＴ３は、ＡＭＬ患者において頻繁に突然変異する遺伝子であり、突然変異は予後不良と関連している（Ａｂｕ−Ｄｕｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．２０００  Ｏｃｔ；１１１（１）：１９０−５，Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．Ａｐｒｉｌ  １５，２００１；Ｂｌｏｏｄ：９７（８））。小分子ＦＬＴ３阻害剤は、臨床試験において活性を示しているが、その応答は、抵抗性の獲得に起因して通常は一過性である。さらに、キナーゼ阻害剤は、ＦＬＴ３の突然変異型を発現する患者のごく一部を治療するに過ぎず、改善された治療薬の性急な必要性が強調される。
【０００７】
したがって、癌、および特にＦＬＴ３の異常発現に関与する悪性腫瘍の代替治療の必要性が存在する。この必要性に対応する方法および組成物が本明細書に提供される。
【発明の概要】
【０００８】
Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）に特異的に結合する抗体または抗原、ＦＬＴ３に特異的に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、およびそのようなＣＡＲを発現する遺伝子操作された免疫細胞（例えば、ＦＬＴ３特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞）が本明細書に提供される。また、そのような抗体、ＣＡＲ、および免疫細胞の作製も提供される。さらに、例えば、ＦＬＴ３を発現する悪性細胞に関連する状態（例えば、癌）の治療のための、そのような抗体、ＣＡＲ、および遺伝子操作された免疫細胞の使用も提供される。一態様において、ＦＬＴ３に特異的に結合する単離された抗体が本明細書に提供され、抗体は、表２に列挙される部分的なＶＨ配列のいずれか１つを有する重鎖可変（ＶＨ）領域および／または表２に列挙される部分的なＶＬ配列のいずれか１つを有する軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む。
【０００９】
別の態様において、ＦＬＴ３に特異的に結合する単離された抗体が本明細書に提供され、抗体は、（ａ）表３に列挙される相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変（ＶＨ）領域ならびに／（ｂ）表３に列挙されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む。
【００１０】
また、ＦＬＴ３に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）も本明細書に提供される。Ｔ細胞におけるＦＬＴ３特異的ＣＡＲの発現は、ＦＬＴ３と接触するとＴ細胞を活性化するのに効果的であることが実証されている。本明細書に提供されるＦＬＴ３特異的ＣＡＲは、ヒトＦＬＴ３に結合し、ＦＬＴ３を発現する細胞と接触すると細胞傷害活性を呈する。
【００１１】
したがって、別の態様において、細胞外リガンド結合ドメイン、第１の膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むＦＬＴ３特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が本明細書に提供され、細胞外ドメインは、ＦＬＴ３の細胞外ドメインに結合する単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）を含む。いくつかの実施形態において、細胞外リガンド結合ドメイン、第１の膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むＦＬＴ３  ＣＡＲが本明細書に提供され、細胞外ドメインは、ＦＬＴ３標的の特定のドメインに結合する、例えば、配列番号１９９（ドメイン１）、配列番号２００（ドメイン２）、配列番号２０１（ドメイン３）、配列番号２５４（ドメイン２−３）、配列番号２０２（ドメイン４）もしくは配列番号２０３（ドメイン５）、配列番号２５４（ドメイン２−３）または配列番号２０２（ドメイン４）に結合するｓｃＦｖを含む。
【００１２】
いくつかの実施形態において、ＦＬＴ３特異的ＣＡＲは、ｓｃＦｖを含む細胞外ドメインを含み、ｓｃＦｖは、ＦＬＴ３標的のドメイン４（配列番号２０２）に結合する。
【００１３】
いくつかの実施形態において、ＦＬＴ３特異的ＣＡＲは、ｓｃＦｖを含む細胞外ドメインを含み、ｓｃＦｖは、ＦＬＴ３標的のドメイン２（配列番号２００）に結合する。
【００１４】
ＦＬＴ３特異的ＣＡＲの細胞外ドメインはｓｃＦｖを含み、ｓｃＦｖは重鎖可変（ＶＨ）領域および軽鎖可変（ＶＬ）領域を含み、ＶＨおよびＶＬ領域は各々、ＦＬＴ３に特異的な３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【００１５】
いくつかの実施形態において、ＶＨ領域は、（ｉ）配列番号３７、３８、３９、４３、４４、４５、４９、５０、５４、５５、５６、６０、６１、６２、６６、６７、６８、７２、７３、７４、７８、７９、８０、８４、８５、８６、９０、９１、９２、９６、９７、９８、１０２、１０３、１０４、１０８、１０９、１１０、１１４、１１５、１１６、１２０、１２１、１２２、１２６、１２７、１２８、１３２、１３３、１３４、１３８、１３９、１４０、２９４、２９５、２９６、３００、３０１、３０５、３０６、３０７、３１１、３１２、３１６、３１７、もしくは３１８に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、（ｉｉ）配列番号４０、４１、４６、４７、５１、５２、５７、５８、６３、６４、６９、７０、７５、７６、８１、８２、８７、８８、９３、９４、９９、１００、１０５、１０６、１１１、１１２、１１７、１１８、１２３、１２４、１２９、１３０、１３５、１３６、１４１、１４２、２９７、２９８、３０２、３０３、３０８、３０９、３１３、３１４、３１９、３２０、もしくは３２２に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、および（ｉｉｉ）配列番号４２、４８、５３、５９、６５、７１、７７、８３、８９、９５、１０１、１０７、１１３、１１９、１２５、１３１、１３７、１４３、２９９、３０４、３１０、３１５、もしくは３２１に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含み、かつ／またはＶＬ領域は、（ｉ）配列番号１４４、１４７、１５０、１５３、１５６、１５９、１６２、１６５、１６８、１７１、１７４、１７７、１８０、１８３、１８６、１８９、１９２、１９５、３２３、３２６、３２８、３３１、３３６、３３８、３４０、３４３、３４５、３４８、もしくは３５０に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、（ｉｉ）配列番号１４５、１４８、１５１、１５４、１５７、１６０、１６３、１６６、１６９、１７２、１７５、１７８、１８１、１８４、１８７、１９０、１９３、１９６、３２４、３２９、３３２、３３４、３４１、もしくは３４６に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、および（ｉｉｉ）配列番号１４６、１４９、１５２、１５５、１５８、１６１、１６４、１６７、１７０、１７３、１７６、１７９、１８２、１８５、１８８、１９１、１９４、１９７、３２５、３２７、３３０、３３３、３３５、３３７、３３９、３４２、３４４、３４７、もしくは３４９に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖを含むＦＬＴ３特異的ＣＡＲが提供され、ｓｃＦｖは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、２６５、２６７、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５、２８７、２８９、２９１、または２９３に示される配列を有するＶＨ領域を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖを含むＦＬＴ３特異的ＣＡＲが提供され、ｓｃＦｖは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、または２９２に示される配列を有するＶＬ領域を含む。
【００１８】
いくつかの実施形態において、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含むｓｃＦＶを含むＦＬＴ３特異的ＣＡＲが提供され、ＶＨ領域は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、２６５、２６７、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５、２８７、２８９、２９１、または２９３に示される配列を有し、ＶＬ領域は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、または２９２に示される配列を有する。
【００１９】
いくつかの実施形態において、ＶＨ領域は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、２６５、２６７、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５、２８７、２８９、２９１、もしくは２９３に示される配列、またはＣＤＲ内にない残基に１個もしくは数個の保存的アミノ酸置換を有するその変異体を含み、かつ／あるいは、ＶＬ領域は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、もしくは２９２に示されるアミノ酸配列、またはＣＤＲ内にないアミノ酸に１個もしくは数個のアミノ酸置換を有するその変異体を含む。
【００２０】
いくつかの実施形態において、ＶＨ領域は、配列番号９０、９１、または９２に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号９３または９４に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および配列番号９５に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域（ＶＬ）は、以下のＣＤＲを含む：配列番号１７１に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号１７２に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号１７３に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３。
【００２１】
いくつかの実施形態において、ＶＨ領域は、配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含み、ＶＬ領域は、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含む。
【００２２】
いくつかの実施形態において、ＶＨ領域は、配列番号４３、４４、または４５に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号４６または４７に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および配列番号４８に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域（ＶＬ）は、以下のＣＤＲを含む：配列番号１４７に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号１４８に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号１４９に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３。
【００２３】
いくつかの実施形態において、ＶＨ領域は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含み、ＶＬ領域は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む。
【００２４】
いくつかの実施形態において、ＶＨ領域は、配列番号４９、４４、または５０に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号５１または５２に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および配列番号５３に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域（ＶＬ）は、以下のＣＤＲを含む：配列番号１５０に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号１５１に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号１５２に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３。
【００２５】
いくつかの実施形態において、ＶＨ領域は、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含み、ＶＬ領域は、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む。
【００２６】
いくつかの実施形態において、ＶＨ領域は、配列番号６０、６１、または６２に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号６３または６４に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および配列番号６５に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域（ＶＬ）は、以下のＣＤＲを含む：配列番号１５６に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号１５７に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号１５８に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３。
【００２７】
いくつかの実施形態において、ＶＨ領域は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含み、ＶＬ領域は、配列番号９に示されるアミノ酸配列を含む。
【００２８】
いくつかの実施形態において、各ＣＤＲは、Ｋａｂａｔの定義、Ｃｈｏｔｈｉａの定義、Ｋａｂａｔの定義とＣｈｏｔｈｉａの定義との組み合わせ、ＡｂＭ定義、またはＣＤＲの接触定義に従って定義される。
【００２９】
いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＦＬＴ３特異的ＣＡＲは、第２の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、第２の細胞内シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢドメインを含む。
【００３０】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＦＬＴ３特異的ＣＡＲは、細胞外リガンド結合ドメインと第１の膜貫通ドメインとの間にストークドメインを含み得る。いくつかの実施形態において、ストークドメインは、ＣＤ８αヒンジ、ＩｇＧ１ヒンジ、およびＦｃγＲＩＩＩαヒンジからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ストークドメインは、ヒトＣＤ８αヒンジ、ヒトＩｇＧ１ヒンジ、またはヒトＦｃγＲＩＩＩαヒンジである。
【００３１】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＦＬＴ３特異的ＣＡＲは、１つ以上のモノクローナル抗体に特異的な１つ以上のエピトープを含み得る。いくつかの実施形態において、モノクローナル抗体に特異的なエピトープは、ＣＤ２０エピトープである。いくつかの実施形態において、ＣＤ２０エピトープは、配列番号２２９または配列番号２３０に示されるアミノ酸配列を含む。
【００３２】
いくつかの実施形態において、ＦＬＴ３特異的ＣＡＲは、配列番号２３５、２３６、２３７または２４２に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＦＬＴ３特異的ＣＡＲは、配列番号２３５に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＦＬＴ３特異的ＣＡＲは、配列番号２３６に示されるアミノ酸配列を含む。
【００３３】
いくつかの実施形態において、第１の膜貫通ドメインはＣＤ８α鎖膜貫通ドメインを含む。
【００３４】
いくつかの実施形態において、ＦＬＴ３特異的ＣＡＲは、ＦＬＴ３に特異的ではない別の細胞外リガンド結合ドメインを含むことができる。
【００３５】
いくつかの実施形態において、細胞外リガンド結合ドメイン（複数可）、第１の膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメイン（複数可）は、単一のポリペプチド上にある。
【００３６】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、第２の膜貫通ドメインを含むことができ、第１の膜貫通ドメインおよび細胞外リガンド結合ドメイン（複数可）は第１のポリペプチド上にあり、第２の膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメイン（複数可）は第２のポリペプチド上にある。例示的な実施形態において、第１の膜貫通ドメインは、高親和性ＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ）のα鎖由来の膜貫通ドメインを含み、第２の膜貫通ドメインは、ＦｃεＲＩのγ鎖またはβ鎖由来の膜貫通ドメインを含む。
【００３７】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、共刺激分子由来の細胞内シグナル伝達ドメインに融合した第３の膜貫通ドメインを含む第３のポリペプチドを含むことができ、第３の膜貫通ドメインは、ＦｃεＲＩのγ鎖またはβ鎖由来の膜貫通ドメインを含む。
【００３８】
別の態様において、本明細書に記載のＦＬＴ３特異的ＣＡＲをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドが本明細書に提供される。
【００３９】
別の態様において、本明細書に記載のＦＬＴ３特異的ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターが本明細書に提供される。
【００４０】
別の態様において、その細胞表面膜に、本明細書に記載のＦＬＴ３特異的ＣＡＲを発現する遺伝子操作された免疫細胞が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、遺伝子操作された免疫細胞は、ＦＬＴ３に特異的ではない別のＣＡＲを含むことができる。いくつかの実施形態において、遺伝子操作された免疫細胞は、自殺ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施形態において、自殺ポリペプチドはＲＱＲ８である。
【００４１】
いくつかの実施形態において、遺伝子操作された免疫細胞は、炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、調節性Ｔリンパ球、またはヘルパーＴリンパ球に由来する。
【００４２】
いくつかの実施形態において、遺伝子操作された免疫細胞は、１つ以上の内在性遺伝子の破壊を含むことができ、内在性遺伝子は、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ５２、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）、デオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）、または免疫チェックポイントタンパク質、例えばプログラム死−１（ＰＤ−１）等をコードする。
【００４３】
いくつかの実施形態において、遺伝子操作された免疫細胞は、健常なドナーから得られる。いくつかの実施形態において、遺伝子操作された免疫細胞は、疾患または障害に苦しむ個体から得られる。
【００４４】
別の態様において、その細胞表面膜に、薬物として使用するための本明細書に記載のＦＬＴ３特異的ＣＡＲを発現する遺伝子操作された免疫細胞が本明細書に提供される。別の態様において、薬物として使用するためのＦＬＴ３特異的抗体が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、ＦＬＴ３特異的ＣＡＲを発現する免疫細胞またはＦＬＴ３特異的抗体を含む薬物は、ＦＬＴ３関連疾患または障害の治療に使用される。一実施形態において、ＦＬＴ３関連疾患または障害は、リンパ腫または白血病等の造血系起源の癌である。いくつかの実施形態において、癌は、多発性骨髄腫、悪性形質細胞腫瘍、ホジキンリンパ腫、結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫、カーレル病および骨髄腫症、形質細胞性白血病、形質細胞腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、ヘアリーセル白血病、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、濾胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、辺縁帯リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、骨髄性白血病、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫、小細胞型リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、縦隔（胸腺）原発Ｂ細胞性大細胞型リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、結節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾臓辺縁帯リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出液リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、Ｔ細胞／組織球豊富型大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性皮膚びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（脚型）、高齢者のＥＢＶ陽性びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、炎症関連びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ＡＬＫ陽性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、形質芽球性リンパ腫、ＨＨＶ８関連多中心性キャッスルマン病に生ずる大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫とバーキットリンパ腫の中間型特徴を有する分類不能Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫と古典的ホジキンリンパ腫の中間型特徴を有する分類不能Ｂ細胞リンパ腫、および他の造血細胞に関連する癌、例えば、ＡＬＬまたはＡＭＬからなる群から選択される。
【００４５】
一態様において、本明細書に記載のＦＬＴ特異的ＣＡＲを発現する遺伝子操作された免疫細胞を含む細胞集団が本明細書に提供され、（ｉｉ）上記細胞集団は、２０％、３０％もしくは４０％を上回る幹細胞メモリーおよび中枢メモリー細胞の割合を含み、かつ／または（ｉｉｉ）上記細胞集団は、１０％、２０％、３０％もしくは４０％を上回るＦＬＴ３を発現する細胞の溶解割合を達成する。
【００４６】
別の態様において、本明細書に記載のＦＬＴ３特異的ＣＡＲのいずれか１つを発現する免疫細胞を遺伝子操作する方法が本明細書に提供され、方法は、免疫細胞を提供することと、細胞に上記ＦＬＴ３特異的ＣＡＲをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを導入することと、を含み、それによって上記免疫細胞が上記ＦＬＴ３特異的ＣＡＲを発現する。
【００４７】
いくつかの実施形態において、方法は、免疫細胞を提供することと、細胞に上記ＦＬＴ３特異的ＣＡＲをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを導入することと、ＦＬＴ３に特異的ではないＣＡＲをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを導入することと、を含む。
【００４８】
別の態様において、ＦＬＴ３関連疾患または障害に罹患する対象を治療する方法が本明細書に提供され、方法は、表面に本明細書に記載のＦＬＴ３特異的ＣＡＲを発現する免疫細胞を提供することと、上記対象に上記免疫細胞を投与することと、を含む。本発明はまた、ＦＬＴ３関連疾患または障害に罹患する対象を治療する方法も提供し、方法は、本明細書に記載のＦＬＴ３特異的抗体を提供することと、上記対象に上記抗体を投与することと、を含む。
【００４９】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のＦＬＴ３特異的ＣＡＲを発現する遺伝子操作された免疫細胞を含む薬学的組成物が本明細書に提供される。他の実施形態において、本発明は、本明細書に記載のＦＬＴ３特異的抗体のいずれかを含む薬学的組成物を提供する。
【００５０】
別の態様において、対象におけるＦＬＴ３を発現する悪性細胞に関連する状態を治療する方法であって、本明細書に記載の遺伝子操作された免疫細胞または本明細書に記載のＦＬＴ３特異的抗体を含む有効量の薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、状態は癌である。いくつかの実施形態において、癌は、リンパ腫または白血病等の造血系起源の癌である。いくつかの実施形態において、癌は、多発性骨髄腫、悪性形質細胞腫瘍、ホジキンリンパ腫、結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫、カーレル病および骨髄腫症、形質細胞性白血病、形質細胞腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、ヘアリーセル白血病、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、濾胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、辺縁帯リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、骨髄性白血病、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫、小細胞型リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、縦隔（胸腺）原発Ｂ細胞性大細胞型リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、結節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾臓辺縁帯リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出液リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、Ｔ細胞／組織球豊富型大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性皮膚びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（脚型）、高齢者のＥＢＶ陽性びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、炎症関連びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ＡＬＫ陽性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、形質芽球性リンパ腫、ＨＨＶ８関連多中心性キャッスルマン病に生ずる大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫とバーキットリンパ腫の中間型特徴を有する分類不能Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫と古典的ホジキンリンパ腫の中間型特徴を有する分類不能Ｂ細胞リンパ腫、および他の造血細胞に関連する癌、例えば、ＡＬＬまたはＡＭＬからなる群から選択される。
【００５１】
別の態様において、ＦＬＴ３を発現する悪性細胞を有する対象における腫瘍の増殖または進行を阻害する方法であって、本明細書に記載の遺伝子操作された免疫細胞または本明細書に記載のＦＬＴ３特異的抗体を含む有効量の薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法が本明細書に提供される。
【００５２】
別の態様において、対象におけるＦＬＴ３を発現する悪性細胞の転移を阻害する方法であって、有効量の本明細書に記載の遺伝子操作された免疫細胞または本明細書に記載のＦＬＴ３特異的抗体を含む有効量の薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法が本明細書に提供される。
【００５３】
別の態様において、ＦＬＴ３を発現する悪性細胞を有する対象における腫瘍退縮を誘導する方法であって、有効量の本明細書に記載の遺伝子操作された免疫細胞または本明細書に記載のＦＬＴ３特異的抗体を含む有効量の薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法が本明細書に提供される。
【００５４】
いくつかの実施形態において、上記方法のいずれも、１つ以上の追加の治療薬、例えば、モノクローナル抗体および／または化学療法剤等を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、モノクローナル抗体は、例えば、チェックポイント阻害剤に結合する抗体、例えば、抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体等であり得る。いくつかの実施形態において、上記方法のいずれも、受容体チロシンキナーゼ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、エピジェネティック修飾因子、プロテアソーム阻害剤、免疫調節剤、例えば、レナリドミド、ヘッジホッグ阻害剤またはイソクエン酸脱水素酵素（ＩＤＨ）阻害剤を対象に投与することをさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】非形質導入対照と比較してＰ３Ａ１  ＣＡＲ構築物を用いた活性化Ｔ細胞の効率的な形質導入を示す代表的なＦＡＣＳプロットと、ＣＡＲ発現Ｔ細胞の割合および平均蛍光強度（ＭＦＩ）としての全構築物の形質導入効率を示す。
【図２】フローサイトメトリーによって評価した、種々のＣＡＲ構築物で形質導入されたＴ細胞における活性化マーカーＣＤ２５および４−１ＢＢの発現を示す。
【図３】ＣＤ６２Ｌおよび／またはＣＤ４５ＲＯマーカーの発現のフローサイトメトリー分析によって決定された、培養終了時のＣＡＲ−Ｔ細胞の表現型を示す。
【図４】長期死滅アッセイの全体的な実験デザインと、６日目の増殖倍率および細胞傷害活性（溶解の割合）として測定された、標的細胞への反復曝露に対する異なるＣＡＲ−Ｔ細胞の応答を示す。
【図５】ヒトＡＭＬの同所性マウスモデルを用いて、２つの用量でＰ３Ａ１またはＰ３Ｅ１０構築物を発現するＣＡＲ−Ｔ細胞の抗腫瘍活性を示す。全光束として定量化された生物発光シグナル（光子／秒）を、異なる時点で示す。
【図６】抗ＣＤ２０抗体リツキシマブによって誘導された補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）に対するＣＤ２０エピトープを含むＦＬＴ３特異的ＣＡＲを発現するＦＬＴ３特異的ＣＡＲの感受性を示す。
【図７】ＣＤ２０エピトープを発現する抗マウスＦＬＴ３  ＣＡＲ  Ｔ細胞で処理し、後にリツキシマブを投与したマウスにおける内在性骨髄前駆細胞の回復を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
一態様において、本明細書に開示される発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、およびＦＬＴ３（例えば、ヒトＦＬＴ３）に特異的に結合するＣＡＲを含む免疫細胞（例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞）を提供する。本発明はまた、これらのＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、これらのＣＡＲを発現する免疫細胞を含む組成物、ならびにこれらのＣＡＲおよびＣＡＲ発現免疫細胞を作製する方法および使用する方法も提供する。本発明はまた、本明細書に記載のＦＬＴ３特異的ＣＡＲおよびこれらのＣＡＲを発現する免疫細胞を使用して、ＦＬＴ３を発現する悪性細胞によって媒介される癌等の対象におけるＦＬＴ３媒介性病理に関連する状態を治療するための方法も提供する。
【００５７】
一態様において、本明細書に開示される発明は、ＦＬＴ３（例えば、ヒトＦＬＴ３）に特異的に結合する抗体を提供する。本発明はまた、これらの抗体を含む組成物およびこれらの抗体を使用する方法も提供する。例えば、これらの抗体を使用して、対象におけるＦＬＴ３媒介性病理、例えば、癌に関連する状態を治療するための方法が本明細書に提供される。
【００５８】
一般的な技法
本発明の実施は、別段の指示がない限り、当該技術分野の技術の範囲内である分子生物学（組換え技法を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の慣例的な技法を用いる。そのような技法は、文献、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，１９９８）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ  ａｎｄ  Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ  Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９９３−１９９８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ  ａｎｄ  Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  （Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８−１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  ａｎｄ  Ｃ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００）；Ｕｓｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９）；Ｔｈｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．Ｚａｎｅ��ｔｉ  ａｎｄ  Ｊ．Ｄ．Ｃａｐｒａ，ｅｄｓ．，Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）に完全に説明されている。
【００５９】
定義
本  明細書で使用される「細胞外リガンド結合ドメイン」という用語は、リガンドに結合することが可能であるか、または細胞表面分子と相互作用することが可能であるポリペプチドを指す。例えば、細胞外リガンド結合ドメインは、特定の病態に関連した標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するように選択され得る。
【００６０】
「ストークドメイン」または「ヒンジドメイン」は、膜貫通ドメインを細胞外リガンド結合ドメインに結合するように機能する任意のポリペプチドを指すために本明細書において互換的に使用される。特に、ストークドメインは、細胞外リガンド結合ドメインにより高い柔軟性および利便性を提供するために使用される。
【００６１】
「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクターシグナル機能シグナルを伝達し、特殊な機能を果たすよう細胞を誘導するタンパク質の一部を指す。
【００６２】
本明細書で使用される「共刺激分子」という用語は、共刺激リガンドと特異的に結合し、それによって、限定されないが増殖等の細胞による共刺激応答を媒介する免疫細胞、例えばＴ細胞上の同族結合パートナーを指す。共刺激分子は、限定されないが、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡおよびＴｏｌｌリガンド受容体を含む。共刺激分子の例として、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、およびＣＤ８３等に特異的に結合するリガンドが挙げられる。
【００６３】
「共刺激リガンド」は、Ｔ細胞上の同族共刺激シグナル分子に特異的に結合し、それによって、例えば、ペプチドを負荷したＭＨＣ分子とのＴＣＲ／ＣＤ３複合体の結合によって提供される一次シグナルに加えて、増殖活性化、分化等を含むがこれらに限定されないＴ細胞応答を媒介するシグナルを提供する抗原提示細胞上の分子を指す。共刺激リガンドは、限定されないが、ＣＤ７、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、誘導性共刺激リガンド（ＩＣＯＳ−Ｌ）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ−Ｇ、ＭＩＣＡ、Ｍ１ＣＢ、ＨＶＥＭ、リンホトキシンβ受容体、３／ＴＲ６、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、トールリガンド受容体に結合するアゴニストまたは抗体、およびＢ７−Ｈ３に特異的に結合するリガンドを含む。また、共刺激リガンドは、とりわけ、Ｔ細胞上に存在する共刺激分子に特異的に結合する抗体、例えば、限定されないが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＴＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３に特異的に結合するリガンドも包含する。
【００６４】
「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド等の標的に特異的に結合することが可能な免疫グロブリン分子である。本明細書で使用される場合、この用語は、インタクトなポリクローナルまたはモノクローナル抗体だけではなく、その断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ等）、単鎖（ｓｃＦｖ）およびドメイン抗体（例えば、サメおよびラクダ科抗体を含む）、ならびに抗体を含む融合タンパク質、ならびに抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の改変された構成も包含する。抗体は、任意のクラス、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＭ（またはそのサブクラス）の抗体を含み、また抗体は、任意の特定のクラスのものである必要はない。その重鎖の定常領域の抗体アミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを異なるクラスに割り当てることができる。５つの主要な免疫グロブリンのクラス、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭが存在し、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２にさらに分けることができる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常領域は、それぞれ、α、β、ε、γ、およびμと称される。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元立体配置は周知である。
【００６５】
抗体の「抗原結合断片」または「抗原結合部分」という用語は、本明細書で使用される場合、所与の抗体（例えば、ＦＬＴ３）に特異的に結合する能力を有するインタクトな抗体の１つ以上の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、インタクトな抗体の断片によって果たされ得る。抗体の「抗原結合断片」という用語に包含される結合断片の例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６，１９８９）、ならびに単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。
【００６６】
標的（例えば、ＦＬＴ３タンパク質）に「特異的に結合する」抗体、抗原結合断片、抗体コンジュゲート、またはポリペプチドは、当該技術分野で十分に理解されている用語であり、そのような特異的な結合を決定するための方法も当該技術分野で周知である。分子は、代替的な細胞または物質と反応または会合する場合と比較して、より頻繁に、より迅速に、より長い期間、かつ／またはより高い親和性で、特定の細胞または物質と反応または会合する場合に、「特異的結合」を示すといわれる。抗体は、他の物質と結合する場合と比較して、より高い親和性、結合活性で、より迅速に、かつ／またはより長い期間結合する場合に、標的と「特異的に結合する」。例えば、ＦＬＴ３エピトープに特異的に結合する抗体は、他のＦＬＴ３エピトープまたは非ＦＬＴ３エピトープに結合する場合と比較して、より高い親和性、結合活性で、より迅速に、かつ／またはより長い期間このエピトープと結合する抗体である。また、この定義を読むことにより、例えば、第１の標的に特異的に結合する抗体（または部分もしくはエピトープ）は、第２の標的に特異的に結合してもまたはしなくてもよいことも理解されたい。そのため、「特異的な結合」は、必ずしも排他的な結合を（含むことができるが）必要としない。必ずではないが、一般的に、結合への言及は特異的な結合を意味する。
【００６７】
抗体の「可変領域」は、単独でまたは組み合わせてのいずれかで、抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域を指す。当該技術分野で既知のように、重鎖および軽鎖の可変領域は、各々、超可変領域としても知られる３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって接続された４つのフレームワーク領域（ＦＲ）からなる。各鎖中のＣＤＲは、ＦＲによって極めて近接して一緒に保持され、他の鎖からのＣＤＲとともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。ＣＤＲを決定するための少なくとも２つの技術が存在する：（１）異種間の配列多様性に基づく手法（すなわち、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，（５ｔｈ  ｅｄ．，１９９１，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ＭＤ））、および（２）抗原−抗体複合体の結晶学的研究に基づく手法（Ａｌ−ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７−９４８）。本明細書で使用される場合、ＣＤＲは、いずれかの手法によって、または両方の手法の組み合わせによって定義されるＣＤＲを指し得る。
【００６８】
可変ドメインの「ＣＤＲ」は、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａの両方の集積、ＡｂＭ、接触の定義、ならびに／もしくは立体構造的定義、または当該技術分野で周知の任意のＣＤＲ決定方法に従って同定される、可変領域内のアミノ酸残基である。抗体のＣＤＲは、Ｋａｂａｔらによって最初に定義された超可変領域として同定され得る。例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，ＮＩＨ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．を参照されたい。また、ＣＤＲの位置は、Ｃｈｏｔｈｉａによって最初に記載された構造的ループ構造として同定することもできる。例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７−８８３，１９８９を参照されたい。ＣＤＲ同定のための他の手法として、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａの折衷案であり、Ｏｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェア（現在はＡｃｃｅｌｒｙｓ（登録商標））を用いて誘導される「ＡｂＭ定義」、またはＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６２：７３２−７４５，１９９６に記載されている、観察された抗原接触に基づくＣＤＲの「接触定義」が挙げられる。本明細書においてＣＤＲの「立体構造的定義」と称される別の手法において、ＣＤＲの位置は、抗原結合へのエンタルピー的寄与を行う残基として同定され得る。例えば、Ｍａｋａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８３：１１５６−１１６６，２００８を参照されたい。さらに他のＣＤＲ境界定義は、上記手法のうちの１つに厳密に従わなくてもよいが、それにもかかわらず、ＫａｂａｔのＣＤＲの少なくとも一部分と重複する：但し、特定の残基もしくは残基の群、またはさらにはＣＤＲ全体が、抗原結合に大幅な影響を与えないという予測または実験的発見を考慮して、短縮または伸長され得る。本明細書で使用される場合、ＣＤＲは、手法の組み合わせを含む、当該技術分野で既知の任意の手法によって定義されたＣＤＲを指すことができる。本明細書において使用される方法は、これらの手法のいずれかに従って定義されたＣＤＲを利用し得る。１つより多くのＣＤＲを含有する任意の所与の実施形態では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、拡張、ＡｂＭ、接触、および／または立体構造的定義のいずれかに従って定義され得る。
【００６９】
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る天然に存在する突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、単一抗原部位に対するものであり、高度に特異的である。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一決定基に対するものである。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均質な抗体の集団から得られるものとして抗体の特徴を示しているのであって、任意の特定の方法による抗体の産生を必要すると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５，１９７５によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製されてもよいか、または米国特許第４，８１６，５６７号に記載されるような組換えＤＮＡ法によって作製されてもよい。また、モノクローナル抗体は、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４，１９９０に記載される技法を用いて生成されるファージライブラリーから単離されてもよい。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「ヒト化」抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはその断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、もしくは抗体の他の抗原結合部分配列等）である、非ヒト（例えば、マウス）抗体の形態を指す。一態様において、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、またはウサギ等の非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基によって置き換えられたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体内にも移入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列内にも見られないが、抗体の性能をさらに洗練させ、かつ最適化するために含められる残基を含んでもよい。一般に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つの、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には、免疫グロブリン定常領域またはドメイン（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンの一部も含む。ＷＯ９９／５８５７２に記載されるように修飾されたＦｃ領域を有する応対が好ましい。ヒト化抗体の他の形態は、元の抗体に対して修飾された１つ以上のＣＤＲ（ＣＤＲ  Ｌ１、ＣＤＲ  Ｌ２、ＣＤＲ  Ｌ３、ＣＤＲ  Ｈ１、ＣＤＲ  Ｈ２、またはＣＤＲ  Ｈ３）を有し、これらはまた、元の抗体からの１つ以上のＣＤＲに「由来する」１つ以上のＣＤＲとも称される。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「ヒト抗体」は、ヒトによって産生される抗体のものに対応するアミノ酸配列を有する抗体、および／または当業者に既知のもしくは本明細書に開示されるヒト抗体を作製するための技法のいずれかを使用して作製された抗体を意味する。ヒト抗体のこの定義は、少なくとも１つのヒト重鎖ポリペプチドまたは少なくとも１つのヒト軽鎖ポリペプチドを含む抗体を含む。そのような例の１つは、マウス軽鎖およびヒト重鎖ポリペプチドを含む抗体である。ヒト抗体は、当該技術分野で既知の種々の技法を用いて産生することができる。一実施形態において、ヒト抗体はファージライブラリーから選択され、ファージライブラリーはヒト抗体を発現する（Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４：３０９−３１４，１９９６；Ｓｈｅｅｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９５：６１５７−６１６２，１９９８；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１，１９９１；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１，１９９１）。ヒト抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子座が内在性遺伝子座の代わりに遺伝子導入で導入された動物、例えば、内在性免疫グロブリン遺伝子が部分的にまたは完全に不活化されたマウスの免疫化によって作製することもできる。この手法は、米国特許第５，５４５，８０７号、同第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、および同第５，６６１，０１６号に記載されている。代替として、ヒト抗体は、標的抗原に対する抗体を産生するヒトＢリンパ球を不死化することによって調製されてもよい（そのようなＢリンパ球は、個体からもしくはｃＤＮＡの単一細胞クローニングから回収され得るか、またはインビトロで免疫されていてもよい）。例えば、Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７，１９８５；Ｂｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５，１９９１、および米国特許第５，７５０，３７３号を参照されたい。
【００７２】
「キメラ抗体」という用語は、可変領域配列がある種に由来し、定常領域配列が別の種に由来する抗体、例えば、可変領域配列がマウス抗体に由来し、定常領域配列がヒト抗体に由来する抗体を指すことを意図する。
【００７３】
「一価抗体」は、１分子当たり１つの抗原結合部位を含む（例えば、ＩｇＧまたはＦａｂ）。いくつかの場合において、一価抗体は、１つより多くの抗原結合部位を有することができるが、抗原結合部位は異なる抗原に由来する。
【００７４】
「二価抗体」は、１分子当たり２つの抗原結合部位を含む（例えば、ＩｇＧ）。いくつかの場合において、２つの結合部位は同じ抗原特異性を有する。しかしながら、二価抗体は二重特異性であり得る。
【００７５】
本発明の抗体は、当該技術分野で周知の技法、例えば、組換え技術、ファージディスプレイ技術、合成技術、もしくはそのような技術の組み合せ、または当該技術分野で容易に明らかとなる他の技術を使用して産生することができる（例えば、Ｊａｙａｓｅｎａ，Ｓ．Ｄ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，４５：１６２８−５０，１９９９およびＦｅｌｌｏｕｓｅ，Ｆ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．，３７３（４）：９２４−４０，２００７）を参照されたい。
【００７６】
当該技術分野で既知のように、本明細書において互換的に使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドの鎖を指し、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは塩基、および／またはそれらの類似体、あるいはＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼによって鎖に組み込むことができる任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド、例えば、メチル化ヌクレオチドおよびそれらの類似体を含んでもよい。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、鎖が集合する前または後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、標識成分とのコンジュゲーション等によって、重合後にさらに修飾されてもよい。他の種類の修飾として、例えば、「キャップ」、天然に存在するヌクレオチドの１つ以上の類似体による置換、ヌクレオチド間修飾、例えば、非荷電結合（例えば、ホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメート等）を有するものおよび荷電結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）を有するもの、ペンダント部分、例えば、タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジン等）を含有するもの、インターカレータ（例えば、アクリジン、ソラレン等）を有するもの、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化性金属等）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾結合（例えば、αアノマー核酸等）を有するもの、ならびにポリヌクレオチド（複数可）の未修飾型が挙げられる。さらに、糖に通常存在するヒドロキシル基のいずれも、例えば、ホスホネート基、リン酸基によって置き換えられ、標準的な保護基によって保護され、もしくは追加のヌクレオチドに対する追加の結合を調製するように活性化され得るか、または固体支持体にコンジュゲートされ得る。５’および３’末端ＯＨは、リン酸化することができるか、またはアミンもしくは１〜２０炭素原子の有機キャッピング基部分で置換することができる。他のヒドロキシルもまた、標準的な保護基に誘導体化され得る。また、ポリヌクレオチドは、例えば、２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−または２’−アジド−リボース、炭素環糖類似体、αまたはβ−アノマー糖、エピマー糖、例えば、アラビノース、キシロースまたはリキソース、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体およびメチルリボシド等の脱塩基ヌクレオシド類似体を含む、当該技術分野で一般的に既知であるリボース糖もしくはデオキシリボース糖の類似型も含有することができる。１つ以上のホスホジエステル結合が、代替の結合基によって置き換えられてもよい。これらの代替の結合基は、限定されないが、ホスフェートが、Ｐ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジオエート」）、（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ２（「ホルムアセタール」）（式中、各ＲまたはＲ’は、独立して、Ｈ、または任意選択的にエーテル（−Ｏ−）結合を含有する置換もしくは非置換のアルキル（１〜２０Ｃ）、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、またはアラルジルである）によって置き換えられた実施形態を含む。ポリヌクレオチドにおける全ての結合が同一である必要はない。前述の説明は、ＲＮＡおよびＤＮＡを含む、本明細書において言及される全てのポリヌクレオチドに適用される。
【００７７】
当該技術分野で既知のように、抗体の「定常領域」は、単独でまたは組み合わせてのいずれかで、抗体軽鎖の定常領域または抗体重鎖の定常領域を指す。
【００７８】
本明細書で使用される場合、「実質的に純粋な」は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、またはさらには少なくとも９９％純粋な（すなわち、混入物を含まない）材料を指す。
【００７９】
「宿主細胞」は、ポリヌクレオチドインサートを組み込むためのベクター（複数可）のレシピエントであり得るか、またはレシピエントであった、個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞は、単一宿主細胞の子孫を含み、該子孫は、天然の、偶発的な、または計画的な突然変異に起因して、（形態において、またはゲノムＤＮＡ補体において）元の親細胞と必ずしも完全に同一ではない場合がある。宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチド（複数可）をインビボでトランスフェクトした細胞を含む。
【００８０】
当該技術分野で既知のように、「Ｆｃ領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。「Ｆｃ領域」は、天然配列のＦｃ領域または変異体のＦｃ領域であり得る。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変動する場合があるが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、位置Ｃｙｓ２２６のアミノ酸残基から、またはＰｒｏ２３０から、そのカルボキシル末端に伸びるように定義される。Ｆｃ領域の残基の番号付けは、Ｋａｂａｔの場合と同様にＥＵインデックスのものである。Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１。免疫グロブリンのＦｃ領域は、一般に、ＣＨ２およびＣＨ３の２つの定常領域を含む。
【００８１】
当該技術分野で使用される場合、「Ｆｃ受容体」および「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を説明する。好ましいＦｃＲは、天然配列のヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体に結合するもの（γ受容体）であり、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含み、これらの受容体の対立遺伝子変異体および選択的にスプライシングされた形態を含む。ＦｃγＲＩＩ受容体は、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害性受容体」）を含み、主としてその細胞質ドメインが異なる同様のアミノ酸配列を有する。ＦｃＲは、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９：４５７−９２，１９９１；Ｃａｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ，４：２５−３４，１９９４；およびｄｅ  Ｈａａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，１２６：３３０−４１，１９９５に概説されている。「ＦｃＲ」はまた、新生児受容体ＦｃＲｎも含み、これは母親のＩｇＧを胎児に移行することに関与している（Ｇｕｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１７：５８７，１９７６；ａｎｄ  Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２４：２４９，１９９４）。
【００８２】
「競合する」という用語は、抗体に関して本明細書で使用される場合、第１の抗体またはその抗原結合断片（または部分）が、第２の抗体またはその抗原結合部分の結合と十分に同様の様式でエピトープに結合し、したがって、第１の抗体とその同族エピトープとの結合の結果が、第２の抗体の非存在下での第１の抗体の結合と比較して、第２の抗体の存在下で検出可能に低下することを意味する。第２の抗体のそのエピトープへの結合も第１の抗体の存在下で検出可能に低下する代替例は、当てはまる場合もあるが、その必要はない。すなわち、第１の抗体は、第１の抗体のそのそれぞれのエピトープへの結合を第２の抗体が阻害することなく、第２の抗体のそのエピトープへの結合を阻害することができるしかしながら、各抗体が、他の抗体のその同族エピトープまたはリガンドとの結合を、同じ程度まで、より高い程度まで、またはより低い程度まで、検出可能に阻害する場合、その抗体は、それらのそれぞれのエピトープ（複数可）の結合について互いに「交差競合する」と言われる。競合抗体および交差競合抗体は、どちらも本発明によって包含される。そのような競合または交差競合が起こる機構（例えば、立体障害、立体構造変化、または共通エピトープもしくはその部分への結合）にかかわらず、当業者は、本明細書に提供される教示に基づいて、そのような競合抗体および／または交差競合抗体が包含され、本明細書に開示される方法に有用であり得ることを理解するであろう。
【００８３】
本明細書で使用される場合、「自己」は、患者を治療するために使用される細胞、細胞株、または細胞集団が、上記患者に由来することを意味する。
【００８４】
本明細書で使用される場合、「同種」は、患者を治療するために使用される細胞または細胞集団が、上記患者に由来しないが、ドナーに由来することを意味する。
【００８５】
本明細書で使用される場合、「治療」は、有益なまたは所望の臨床結果を得るための手法である。本発明の目的のために、有益なまたは所望の臨床結果は、限定されないが以下のうちの１つ以上を含む：新生細胞もしくは癌性細胞の増殖の低減（もしくは破壊）、新生細胞の転移の阻害、ＦＬＴ３発現腫瘍のサイズの縮小もしくは減少、ＦＬＴ３関連疾患（例えば、癌）の緩解、ＦＬＴ３関連疾患（例えば、癌）から生じる症状の減少、ＦＬＴ３関連疾患（例えば、癌）を罹患している者の生活の質の向上、ＦＬＴ３関連疾患（例えば、癌）を治療するのに必要な他の薬物の用量の減少、ＦＬＴ３関連疾患（例えば、癌）の進行の遅延、ＦＬＴ３関連疾患（例えば、癌）の治癒、および／またはＦＬＴ３関連疾患（例えば、癌）を有する患者の生存時間の延長。
【００８６】
「寛解」は、ＦＬＴ３特異的ＣＡＲまたはＦＬＴ３特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞を投与しない場合と比較して１つ以上の症状の軽減または改善を意味する。「寛解」はまた、症状の継続期間の短縮または減少も含む。
【００８７】
本明細書で使用される場合、薬物、化合物、または薬学的組成物の「有効投与量」または「有効量」は、任意の１つ以上の有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分な量である。予防的使用に関して、有益なまたは所望の結果は、疾患、その合併症、および疾患の発症中に提示される中間的な病理学的表現型の生化学的、組織学的および／または行動的症状を含む、疾患のリスクの排除もしくは低減、重症度の軽減、または発症の遅延を含む。治療的使用に関して、有益なまたは所望の結果は、種々のＦＬＴ３関連疾患もしくは状態（例えば、多発性骨髄腫）の１つ以上の症状の発生率の低減もしくはその寛解、疾患を治療するのに必要な他の薬物の用量の減少、別の薬物の効果の増強、および／または患者のＦＬＴ３関連疾患の進行の遅延等の臨床結果を含む。有効投与量は、１回以上の投与で投与することができる。本発明の目的のために、薬物、化合物、または薬学的組成物の有効投与量は、直接的または間接的のいずれかで予防的または治療的処置を達成するのに十分な量である。臨床状況において理解されるように、薬物、化合物、または薬学的組成物の有効投与量は、別の薬物、化合物、または薬学的組成物と併せて達成されても、または達成されなくてもよい。したがって、「有効投与量」は、１つ以上の治療剤の投与に関連して考慮され得、１つ以上の他の薬剤と併せて、望ましい結果が達成され得るまたは達成される場合、単剤を有効量で投与することが考慮され得る。
【００８８】
「個体」、「患者」または「対象」は、本明細書において互換的に使用され、哺乳動物である。哺乳動物は、限定されないが、ヒト、サル、ブタ、他の家畜、競技用動物、ペット、霊長類、ウマ、イヌ、ネコ、げっ歯類（マウス、ラット、モルモット等を含む）を含む。対象は、哺乳動物であり、本明細書において互換的に使用される。いくつかの実施形態において、対象はヒトである。いくつかの実施形態において、対象は非ヒト霊長類である。いくつかの実施形態において、対象はヒトまたはサル、例えば、カニクイザルである。
【００８９】
本明細書で使用される場合、「ベクター」は、宿主細胞内で、対象となる１つ以上の遺伝子（複数可）または配列（複数可）を送達することが可能であり、いくつかの実施形態において、発現することが可能な構築物を意味する。ベクターの例として、限定されないが、ウイルスベクター、裸のＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミドまたはファージベクター、カチオン性縮合剤と会合したＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、リポソーム内に封入されたＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、および産生細胞等のある特定の真核細胞が挙げられる。
【００９０】
本明細書で使用される場合、「発現制御配列」は、核酸の転写を誘導する核酸配列を意味する。発現制御配列は、構成的もしくは誘導性プロモーター等のプロモーター、またはエンハンサーであり得る。発現制御配列は、転写される核酸配列に作動可能に連結される。
【００９１】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」または「薬学的に許容される賦形剤」は、活性成分と組み合わされたときに、成分が生物活性を保持することを可能にし、対象の免疫系と非反応性である任意の材料を含む。例として、限定されないが、標準的な薬学的担体、例えば、リン酸緩衝溶液、水、油／水エマルジョン等のエマルジョン、および種々の種類の湿潤剤のいずれかが挙げられる。エアロゾルまたは非経口投与用の例示的な希釈剤は、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）または（０．９％）生理食塩水である。そのような担体を含む組成物は、周知の従来の方法によって製剤化される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９０；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２１ｓｔ  Ｅｄ．Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２００５を参照されたい）。
【００９２】
「ｋｏｎ」という用語は、本明細書で使用される場合、抗体またはＣＡＲのｓｃＦｖの抗原への会合の速度定数を指す。
【００９３】
「ｋｏｆｆ」という用語は、本明細書で使用される場合、抗体／抗原複合体からの抗体またはＣＡＲのｓｃＦｖの解離の速度定数を指す。
【００９４】
「ＫＤ」という用語は、本明細書で使用される場合、抗体−抗原相互作用またはｓｃＦｖ−抗原相互作用の平衡解離定数を指す。
【００９５】
本明細書における「約」のついた値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータ自体を対象となる実施形態を含む（かつ説明する）。例えば、「約Ｘ」に言及する記述は、「Ｘ」の記述を含む。数値範囲は、その範囲を画定する数値を含む。
【００９６】
実施形態が「含む」という文言を用いて本明細書に記載される場合は必ず、「〜からなる」および／または「〜から本質的になる」の観点から記載された別様の類似の実施形態も提供されることを理解されたい。
【００９７】
本発明の態様または実施形態が選択肢のマーカッシュ群または他の代替的な分類の観点から記載される場合、本発明は、全体として列挙される群全体だけでなく、群の各メンバーを個々に、および主群の全ての考えられる亜群、また群メンバーの１つ以上を欠く主群も包含する。本発明はまた、請求される発明の群メンバーのいずれかの１つ以上を明示的に除外することも想定する。
【００９８】
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先する。本明細書および特許請求の範囲全体にわたって、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等の変形は、述べられた整数または整数の群の包含を暗示するが、任意の他の整数または整数の群の除外を暗示しないことが理解されよう。文脈上別段の必要がない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。
【００９９】
例示的な方法および材料が本明細書に記載されているが、本明細書に記載されるものと同様のまたは等価な方法および材料もまた、本発明の実行または試験において使用され得る。材料、方法、および例は、例示的であるに過ぎず、限定的であることを意図するものではない。
【０１００】
ＦＬＴ３抗体
本開示は、ＦＬＴ３［例えば、ヒトＦＬＴ３（例えば、受託番号：ＮＰ＿００４１１０または配列番号１９８）］に結合し、以下の特徴のうちのいずれか１つ以上を特徴とする抗体を提供する：（ａ）対象においてＦＬＴ３を発現する悪性細胞に関連する状態（例えば、ＡＭＬ等の癌）の１つ以上の症状を治療する、予防する、寛解させる、（ｂ）対象（ＦＬＴ３を発現する悪性腫瘍を有する）における腫瘍の増殖または進行を阻害する、（ｃ）対象（ＦＬＴ３を発現する１つ以上の悪性細胞を有する）においてＦＬＴ３を発現する癌（悪性）細胞の転移を阻害する、（ｄ）ＦＬＴ３を発現する腫瘍の退縮（例えば、長期退縮）を誘導する、（ｅ）ＦＬＴ３を発現する悪性細胞において細胞傷害活性を発揮する、（ｆ）まだ同定されていない他の因子とのＦＬＴ３相互作用をブロックする、および／または（ｇ）近傍でＦＬＴ３を発現していない悪性細胞を死滅させるもしくはその増殖を阻害するバイスタンダー効果を誘導する。
【０１０１】
一態様において、ＦＬＴ３に特異的に結合する単離された抗体が提供され、抗体は、（ａ）（ｉ）  ３７、３８、３９、４３、４４、４５、４９、５０、５４、５５、５６、６０、６１、６２、６６、６７、６８、７２、７３、７４、７８、７９、８０、８４、８５、８６、９０、９１、９２、９６、９７、９８、１０２、１０３、１０４、１０８、１０９、１１０、１１４、１１５、１１６、１２０、１２１、１２２、１２６、１２７、１２８、１３２、１３３、１３４、１３８、１３９、１４０、２４６、もしくは２４７に示される配列を含むＶＨ相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、（ｉｉ）配列番号４０、４１、４６、４７、５１、５２、５７、５８、６３、６４、６９、７０、７５、７６、８１、８２、８７、８８、９３、９４、９９、１００、１０５、１０６、１１１、１１２、１１７、１１８、１２３、１２４、１２９、１３０、１３５、１３６、１４１、１４２、２４８、２４９、２５１、２５２、２５３、もしくは２５５に示される配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号４２、４８、５３、５９、６５、７１、７７、８３、８９、９５、１０１、１０７、１１３、１１９、１２５、１３１、１３７、１４３、２４５、２５０、もしくは２５４に示される配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含む重鎖可変（ＶＨ）領域、ならびに／または（ｉ）配列番号１４４、１４７、１５０、１５３、１５６、１５９、１６２、１６５、１６８、１７１、１７４、１７７、１８０、１８３、１８６、１８９、１９２、１９５、２５７、２６１、２６３、２６５、２６８、２７０、２７３、もしくは２７５に示される配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号１４５、１４８、１５１、１５４、１５７、１６０、１６３、１６６、１６９、１７２、１７５、１７８、１８１、１８４、１８７、１９０、１９３、１９６、２５９、２６６、もしくは２７１に示される配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および（ｉｉｉ）配列番号１４６、１４９、１５２、１５５、１５８、１６１、１６４、１６７、１７０、１７３、１７６、１７９、１８２、１８５、１８８、１９１、１９４、１９７、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６７、２６９、２７２、もしくは２７４に示される配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む。
【０１０２】
別の態様において、ＦＬＴ３に特異的に結合する単離された抗体が提供され、抗体は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、２６５、２６７、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５、２８７、２８９、２９１、もしくは２９３に示される配列を含むＶＨ領域、および／または配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、もしくは２９２に示される配列を含むＶＬ領域を含む。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、ＦＬＴ３に特異的に結合する単離された抗体が提供され、抗体は、配列番号２７５、２８９、もしくは２９１に示される配列を含むＶＨ領域、および／または配列番号２７４、２８８、もしくは２９０に示される配列を含むＶＬ領域を含む。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、表２に列挙される部分的軽鎖配列のいずれか１つおよび／または表２に列挙される部分的重鎖配列のいずれか１つを有する抗体が提供される。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体は、定常領域を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ２Δａ、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブクラスのものである。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体は、グリコシル化された定常領域を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体は、１つ以上のヒトＦｃγ受容体（複数可）に対して減少した結合親和性を有する定常領域を含む。
【０１０６】
本明細書に提供される抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｃ等）、キメラ抗体、単鎖（ＳｃＦｖ）、および／またはヒト化抗体を包含し得る。抗体は、マウス、ラット、ヒト、または任意の他の起源（キメラもしくはヒト化抗体を含む）であり得る。
【０１０７】
ＦＬＴ３特異的ＣＡＲおよびその作製方法
ＦＬＴ３（例えば、ヒトＦＬＴ３（例えば、配列番号１９８）または受託番号：ＮＰ＿００４１１０）に結合するＣＡＲが本明細書に提供される。本明細書に提供されるＦＬＴ３特異的ＣＡＲは、単鎖ＣＡＲおよび多鎖ＣＡＲを含む。ＣＡＲは、モノクローナル抗体の抗原結合特性を利用して、Ｔ細胞の特異性および反応性をＭＨＣに制限されない様式でＦＬＴ３にリダイレクトする能力を有する。ＭＨＣに制限されない抗原認識は、ＣＡＲを発現するＴ細胞に、抗原プロセシングとは関係なく抗原を認識し、したがって腫瘍エスケープの主要な機構を回避する能力を与える。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるＣＡＲは、細胞外リガンド結合ドメイン（例えば、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ））、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインは、１つのポリペプチド内、すなわち、単鎖内に存在する。多鎖ＣＡＲおよびポリペプチドも本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、多鎖ＣＡＲは、膜貫通ドメインおよび少なくとも１つの細胞外リガンド結合ドメインを含む第１のポリペプチドと、膜貫通ドメインおよび少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含む第２のポリペプチドとを含み、ポリペプチドは一緒に集合して多鎖ＣＡＲを形成する。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、ＦＬＴ３特異的多鎖ＣＡＲは、ＩｇＥ（ＦｃεＲＩ）の高親和性受容体に基づく。肥満細胞および好塩基球上で発現されるＦｃεＲＩは、アレルギー反応を誘発する。ＦｃεＲＩは、単一のαサブユニット、単一のβサブユニット、および２つのジスルフィド結合γサブユニットからなる四量体複合体である。αサブユニットは、ＩｇＥ結合ドメインを含有する。βおよびγサブユニットは、シグナル伝達を媒介するＩＴＡＭを含有する。いくつかの実施形態において、ＦｃＲα鎖の細胞外ドメインが欠失され、ＦＬＴ３特異的細胞外リガンド結合ドメインによって置き換えられる。いくつかの実施形態において、多鎖ＦＬＴ３特異的ＣＡＲは、ＦＬＴ３に特異的に結合するｓｃＦｖ、ＣＤ８αヒンジ、およびＦｃＲβ鎖のＩＴＡＭを含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、ＦｃＲγ鎖を含んでも含まなくてもよい。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、細胞外リガンド結合ドメインは、柔軟なリンカーによって連結された標的抗原特異的モノクローナル抗体の軽鎖可変（ＶＬ）領域および重鎖可変（ＶＨ）領域を含むｓｃＦｖを含む。単鎖可変領域断片は、短い連結ペプチドを使用することにより軽鎖および／または重鎖可変領域を連結させることによって作製される（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６，１９８８）。連結ペプチドの一例は、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号２３２）を有するＧＳリンカーであり、これは、一方の可変領域のカルボキシ末端と他方の可変領域のアミノ末端との間のおよそ３．５ｎｍを架橋する他の配列のリンカーも設計および使用されている（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８、上記参照）。一般に、リンカーは、短い柔軟なポリペプチドであり得、例えば、約２０またはそれ未満のアミノ酸残基から構成され得る。リンカーは、ひいては、薬物の付着または固体支持体への付着等の追加の機能のために修飾することができる。単鎖変異体は、組換え、または合成のいずれかにより産生することができる。ｓｃＦｖの合成による産生のために、自動シンセサイザーが使用され得る。ｓｃＦｖの組換えによる産生には、ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドを含有する適切なプラスミドを、酵母、植物、昆虫、もしくは哺乳動物細胞等の真核生物、またはＥ．ｃｏｌｉ等の原核生物のいずれかの適切な宿主細胞内に導入することができる。対象となるｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのライゲーション等の日常的な操作によって作製することができる。結果として得られるｓｃＦｖは、当該技術分野で既知の標準的なタンパク質精製技法を使用して単離することができる。
【０１１１】
ＦＬＴ３細胞外ドメインは、５つの免疫グロブリンドメインからなり、ドメイン５が細胞膜に最も近接し、ドメイン１が最も離れている（直線状に、Ｖｅｒｓｔｒａｅｔｅ，Ｊｕｌｙ  ７，２０１１；Ｂｌｏｏｄ：１１８（１））。５つのＦＬＴ３細胞外ドメインの配列を下の表１に列挙する。
【表１】
2020522252.tif 000003
【０１１２】
ドメイン２−３は、ドメイン２およびドメイン３の配列（配列番号２５４）を含む。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のＦＬＴ３特異的ＣＡＲの細胞外リガンド結合ドメインは、ＦＬＴ３細胞外ドメインのドメイン１、２、３、４または５に結合する。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のＦＬＴ３特異的ＣＡＲの細胞外リガンド結合ドメインは、ＦＬＴ３細胞外ドメインのドメイン１に結合する。
【０１１５】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のＦＬＴ３特異的ＣＡＲの細胞外リガンド結合ドメインは、ＦＬＴ３細胞外ドメインのドメイン２に結合する。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のＦＬＴ３特異的ＣＡＲの細胞外リガンド結合ドメインは、ＦＬＴ３細胞外ドメインのドメイン３に結合する。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のＦＬＴ３特異的ＣＡＲの細胞外リガンド結合ドメインは、ＦＬＴ３細胞外ドメインのドメイン４に結合する。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のＦＬＴ３特異的ＣＡＲの細胞外リガンド結合ドメインは、ＦＬＴ３細胞外ドメインのドメイン５に結合する。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のＦＬＴ３特異的ＣＡＲの細胞外リガンド結合ドメインは、ＦＬＴ３細胞外ドメインのドメイン２−３に結合する。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のＦＬＴ３特異的ＣＡＲの細胞外リガンド結合ドメインは、ＦＬＴ３細胞外ドメインのドメイン２−３または４に結合する。
【０１２１】
別の態様において、ＦＬＴ３に特異的に結合するＣＡＲが提供され、ＣＡＲは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、２６５、２６７、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５、２８７、２８９、２９１、もしくは２９３に示される配列を有するＶＨ領域、および／または配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、もしくは２９２に示される配列を有するＶＬ領域を含む細胞外リガンド結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＶＨおよびＶＬは、柔軟なリンカーによって一緒に連結される。いくつかの実施形態において、柔軟なリンカーは、配列番号２３２に示されるアミノ酸配列を含む。
【０１２２】
別の態様において、細胞外リガンド結合ドメイン、第１の膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むＦＬＴ３特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が提供され、細胞外ドメインは、重鎖可変（ＶＨ）領域および軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）を含み、ＶＨ領域は、（ｉ）配列番号３７、３８、３９、４３、４４、４５、４９、５０、５４、５５、５６、６０、６１、６２、６６、６７、６８、７２、７３、７４、７８、７９、８０、８４、８５、８６、９０、９１、９２、９６、９７、９８、１０２、１０３、１０４、１０８、１０９、１１０、１１４、１１５、１１６、１２０、１２１、１２２、１２６、１２７、１２８、１３２、１３３、１３４、１３８、１３９、１４０、２９４、２９５、２９６、３００、３０１、３０５、３０６、３０７、３１１、３１２、３１６、３１７、または３１８に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、（ｉｉ）配列番号４０、４１、４６、４７、５１、５２、５７、５８、６３、６４、６９、７０、７５、７６、８１、８２、８７、８８、９３、９４、９９、１００、１０５、１０６、１１１、１１２、１１７、１１８、１２３、１２４、１２９、１３０、１３５、１３６、１４１、１４２、２９７、２９８、３０２、３０３、３０８、３０９、３１３、３１４、３１９、３２０、または３２２に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、および（ｉｉｉ）配列番号４２、４８、５３、５９、６５、７１、７７、８３、８９、９５、１０１、１０７、１１３、１１９、１２５、１３１、１３７、１４３、２９９、３０４、３１０、３１５、または３２１に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含む。
【０１２３】
別の態様において、細胞外リガンド結合ドメイン、第１の膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むＦＬＴ３特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が提供され、細胞外ドメインは、重鎖可変（ＶＨ）領域および軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）を含み、ＶＬ領域（ｉ）配列番号１４４、１４７、１５０、１５３、１５６、１５９、１６２、１６５、１６８、１７１、１７４、１７７、１８０、１８３、１８６、１８９、１９２、１９５、３２３、３２６、３２８、３３１、３３６、３３８、３４０、３４３、３４５、３４８、または３５０に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、（ｉｉ）配列番号１４５、１４８、１５１、１５４、１５７、１６０、１６３、１６６、１６９、１７２、１７５、１７８、１８１、１８４、１８７、１９０、１９３、１９６、３２４、３２９、３３２、３３４、３４１、または３４６に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、および（ｉｉｉ）配列番号１４６、１４９、１５２、１５５、１５８、１６１、１６４、１６７、１７０、１７３、１７６、１７９、１８２、１８５、１８８、１９１、１９４、１９７、３２５、３２７、３３０、３３３、３３５、３３７、３３９、３４２、３４４、３４７、または３４９に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含む。
別の態様において、細胞外リガンド結合ドメイン、第１の膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むＦＬＴ３特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が提供され、細胞外ドメインは、重鎖可変（ＶＨ）領域および軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）を含み、（ａ）ＶＨ領域は、（ｉ）配列番号３７、３８、３９、４３、４４、４５、４９、５０、５４、５５、５６、６０、６１、６２、６６、６７、６８、７２、７３、７４、７８、７９、８０、８４、８５、８６、９０、９１、９２、９６、９７、９８、１０２、１０３、１０４、１０８、１０９、１１０、１１４、１１５、１１６、１２０、１２１、１２２、１２６、１２７、１２８、１３２、１３３、１３４、１３８、１３９、１４０、２９４、２９５、２９６、３００、３０１、３０５、３０６、３０７、３１１、３１２、３１６、３１７、または３１８に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、（ｉｉ）配列番号４０、４１、４６、４７、５１、５２、５７、５８、６３、６４、６９、７０、７５、７６、８１、８２、８７、８８、９３、９４、９９、１００、１０５、１０６、１１１、１１２、１１７、１１８、１２３、１２４、１２９、１３０、１３５、１３６、１４１、１４２、２９７、２９８、３０２、３０３、３０８、３０９、３１３、３１４、３１９、３２０、または３２２に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、および（ｉｉｉ）配列番号４２、４８、５３、５９、６５、７１、７７、８３、８９、９５、１０１、１０７、１１３、１１９、１２５、１３１、１３７、１４３、２９９、３０４、３１０、３１５、または３２１に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含み、（ｂ）ＶＬ領域は、（ｉ）配列番号１４４、１４７、１５０、１５３、１５６、１５９、１６２、１６５、１６８、１７１、１７４、１７７、１８０、１８３、１８６、１８９、１９２、１９５、３２３、３２６、３２８、３３１、３３６、３３８、３４０、３４３、３４５、３４８、または３５０に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、（ｉｉ）配列番号１４５、１４８、１５１、１５４、１５７、１６０、１６３、１６６、１６９、１７２、１７５、１７８、１８１、１８４、１８７、１９０、１９３、１９６、３２４、３２９、３３２、３３４、３４１、または３４６に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、および（ｉｉｉ）配列番号１４６、１４９、１５２、１５５、１５８、１６１、１６４、１６７、１７０、１７３、１７６、１７９、１８２、１８５、１８８、１９１、１９４、１９７、３２５、３２７、３３０、３３３、３３５、３３７、３３９、３４２、３４４、３４７、または３４９に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含む。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、本発明のＣＡＲは、表２に列挙される部分的軽鎖配列のいずれか１つおよび／または表２に列挙される部分的重鎖配列のいずれか１つを有する細胞外リガンド結合ドメインを含む。
【０１２５】
表２において、下線の配列はＫａｂａｔによるＣＤＲ配列であり、太線はＣｈｏｔｈｉａによるＣＤＲ配列であるが、例外として、Ｐ４Ｆ６、Ｐ４Ｃ７、Ｐ３Ａ１、Ｐ５Ａ３、Ｐ９Ｂ５、Ｐ９Ｆ１、Ｐ１Ｂ４、Ｐ１Ｂ１１、Ｐ７Ｈ３、Ｐ３Ｅ１０、Ｐ１Ａ５、Ｐ５Ｆ７、Ｐ４Ｈ１１、Ｐ１５Ｆ７、Ｐ１２Ｂ６、Ｐ８Ｂ６、Ｐ１４Ｇ２、およびＰ７Ｆ９の重鎖ＣＤＲ２配列では、ＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲ配列に下線が引かれ、ＫａｂａｔのＣＤＲ配列が太字で示されている。
【表２−１】
2020522252.tif 000004
【表２−２】
2020522252.tif 000005
【表２−３】
2020522252.tif 000006
【表２−４】
2020522252.tif 000007
【表２−５】
2020522252.tif 000008
【表２−６】
2020522252.tif 000009
【表２−７】
2020522252.tif 000010
【表２−８】
2020522252.tif 000011
【０１２６】
また、ＦＬＴ３に対する抗体の抗原結合ドメインのＣＤＲ部分またはＦＬＴ３に対するＣＡＲの細胞外リガンド結合ドメインのＣＤＲ部分（Ｃｈｏｔｈｉａ、ＫａｂａｔのＣＤＲ、およびＣＤＲ接触領域を含む）も本明細書に提供される。ＣＤＲ領域の決定は、十分に当該技術分野の技術の範囲内である。いくつかの実施形態において、ＣＤＲはＫａｂａｔのＣＤＲとＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲとの組み合わせ（「組み合わせたＣＲ」または「拡張されたＣＤＲ」とも称される）であり得ることを理解されたい。いくつかの実施形態において、ＣＤＲはＫａｂａｔのＣＤＲである。他の実施形態において、ＣＤＲはＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲである。換言すると、１つより多くのＣＤＲを含む実施形態では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、組み合わせＣＤＲ、またはそれらの組み合わせのいずれかであり得る。表３は、本明細書に提供されるＣＤＲ配列の例を提供する。
【表３−１】
2020522252.tif 000012
【表３−２】
2020522252.tif 000013
【表３−３】
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【表３−４】
2020522252.tif 000015
【０１２７】
本発明は、ＣＡＲの特性に著しく影響を与えない修飾を有する機能的に等価なＣＡＲ、ならびに増強または低下した活性および／または親和性を有する変異体を含む、表２に示す本発明のＣＡＲおよびポリペプチドに対する修飾を包含する。例えば、アミノ酸配列を突然変異させて、ＦＬＴ３に対する所望の結合親和性を有する抗体を得ることができる。ポリペプチドの修飾は、当該技術分野におけるルーティンであり、本明細書に詳細に記載する必要はない。修飾ポリペプチドの例として、アミノ酸残基の保存的置換、機能的活性を著しく有害に変化させない、またはポリペプチドのそのリガンドに対する親和性を成熟させる（増強する）アミノ酸の１つ以上の欠失もしくは付加、または化学的類似体の使用を有するポリペプチドが挙げられる。
【０１２８】
アミノ酸配列挿入は、１個の残基から、１００個以上の残基を含有するポリペプチドまでの長さの範囲のアミノおよび／またはカルボキシル末端融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例として、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体、またはエピトープタグと融合された抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入変異体は、血液循環中の抗体の半減期を延長する酵素またはポリペプチドの、抗体のＮ末端またはＣ末端への融合を含む。
【０１２９】
置換変異体は、抗体分子中の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、その代わりに異なる残基が挿入されている。置換突然変異誘発の最も興味深い部位は超可変領域を含むが、ＦＲの変更もまた企図される。保存的置換は、「保存的置換」の見出しの下で表４に示されている。そのような置換が生物活性に変化をもたらす場合、表４に「例示的置換」と示されるか、またはアミノ酸クラスを参照してさらに詳細に後述される、より実質的な変化が導入され得、生成物がスクリーニングされ得る。
表４：アミノ酸置換
【表４】
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【０１３０】
いくつかの実施形態において、Ｐ４Ｆ６、Ｐ４Ｃ７、Ｐ３Ａ１、Ｐ５Ａ３、Ｐ９Ｂ５、Ｐ９Ｆ１、Ｐ１Ｂ４、Ｐ１Ｂ１１、Ｐ７Ｈ３、Ｐ３Ｅ１０、Ｐ１Ａ５、Ｐ５Ｆ７、Ｐ４Ｈ１１、Ｐ１５Ｆ７、Ｐ１２Ｂ６、Ｐ８Ｂ６、Ｐ１４Ｇ２、Ｐ７Ｆ９、Ｐ０８Ｂ０６ＥＥ、Ｐ０４Ａ０４、Ｐ０１Ａ０５、Ｐ０８Ｂ０３、Ｐ５Ｆ７ｇ、Ｐ１０Ａ０２ｇ、Ｐ１０Ａ０４ｇ、Ｐ１０Ａ０５ｇ、Ｐ１０Ａ０７ｇ、Ｐ１０Ｂ０３ｇ、Ｐ１０Ｂ０６ｇ、Ｐ５Ｆ７ｇ２、Ｐ５Ｆ７ｇ３、およびＰ５Ｆ７ｇ４を含む細胞外ドメインを含むＣＡＲを含む本明細書に記載のＣＡＲとＦＬＴ３への結合について競合する細胞外リガンド結合ドメインを含むＣＡＲが本明細書に提供される。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、ＦＬＴ３に特異的に結合するＣＡＲが本明細書に提供され、ＣＡＲは、配列番号４に示される配列を含むＶＨ領域および／または配列番号３に示される配列を含むＶＬ領域を含む。いくつかの実施形態において、ＦＬＴ３に特異的に結合するＣＡＲが本明細書に提供され、ＣＡＲは、配列番号６に示される配列を含むＶＨ領域および／または配列番号５に示される配列を含むＶＬ領域を含む。いくつかの実施形態において、本発明はＦＬＴ３に特異的に結合するＣＡＲを提供し、ＣＡＲは、配列番号１０に示される配列を含むＶＨ領域および／または配列番号９に示される配列を含むＶＬ領域を含む。いくつかの実施形態において、ＦＬＴ３に特異的に結合するＣＡＲが本明細書に提供され、ＣＡＲは、配列番号２０に示される配列を含むＶＨ領域および／または配列番号１９に示される配列を含むＶＬ領域を含む。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、本発明はまた、ＣＡＲ接触領域に基づくＦＬＴ３抗体に対する抗体のＣＤＲ部分を含むＣＡＲも提供する。ＣＤＲ接触領域は、抗原に対する抗体に特異性を付与する抗体の領域である。一般に、ＣＤＲ接触領域は、ＣＤＲ内、および抗体が特異的抗原に結合するための適切なループ構造を維持するために限定されたＶｅｒｎｉｅｒゾーン内に残基位置を含む。例えば、Ｍａｋａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８３：１１５６−１１６６，２００７を参照されたい。ＣＤＲ接触領域の決定は、十分に当該技術分野の技術の範囲内である。
【０１３３】
ＦＬＴ３（ヒトＦＬＴ３（例えば、（配列番号１９８）等）に対する本明細書に記載のＦＬＴ３特異的ＣＡＲのリガンド結合ドメインの結合親和性（ＫＤ）は、例えば、約０．１〜約１０００ｎＭ、例えば約０．５ｎＭ〜約５００ｎＭ、または例えば、約１ｎＭ〜約２５０ｎＭであり得る。いくつかの実施形態において、結合親和性は、約１０００ｎｍ、７５０ｎｍ、５００ｎｍ、４００ｎｍ、３００ｎｍ、２５０ｎｍ、２００ｎＭ、１００ｎＭ、９０ｎＭ、８０ｎＭ、７０ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４５ｎＭ、４０ｎＭ、３５ｎＭ、３０ｎＭ、２５ｎＭ、２０ｎＭ、１９ｎｍ、１８ｎｍ、１７ｎｍ、１６ｎｍ、１５ｎＭ、１０ｎＭ、８ｎＭ、７．５ｎＭ、７ｎＭ、６．５ｎＭ、６ｎＭ、５．５ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．５ｎＭ、０．３ｎＭまたは０．１ｎＭのいずれかであり得る。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、ＦＬＴ３に対する本明細書に記載のＦＬＴ３特異的ＣＡＲのリガンド結合ドメインのｓｃＦｖの結合親和性（ＫＤ）は、約１０ｎＭ〜約１００ｎＭ、約１０ｎＭ〜約９０ｎＭ、約１０ｎＭ〜約８０ｎＭ、約２０ｎＭ〜約７０ｎＭ、約２５ｎＭ〜約７５ｎＭ、または約４０ｎＭ〜約１１０ｎＭである。一実施形態において、本段落に記載されるｓｃＦｖの結合親和性は、ヒトＦＬＴ３に対するものである。
【０１３５】
いくつかの実施形態において、ヒトＦＬＴ３の細胞外ドメインのドメイン４に対する本明細書に記載のＦＬＴ３特異的ＣＡＲのリガンド結合ドメインのｓｃＦｖの結合親和性（ＫＤ）は、約１ｎＭ〜約１００ｎＭ、約１０ｎＭ〜約１００ｎＭ、約２０ｎＭ〜約１００ｎＭ、約２５ｎＭ〜約１０５ｎＭ、約４０ｎＭ〜約８０ｎＭ、約４０ｎＭ〜約１００ｎＭ、または約５０ｎＭ〜約１００ｎＭである。
【０１３６】
いくつかの実施形態において、ヒトＦＬＴ３の細胞外ドメインのドメイン２−３に対する本明細書に記載のＦＬＴ３特異的ＣＡＲのリガンド結合ドメインのｓｃＦｖの結合親和性（ＫＤ）は、約５ｎＭ〜３０ｎＭ、約５ｎＭ〜約２５ｎＭ、約１０ｎＭ〜約３０ｎＭ、約１０ｎＭ〜約４０ｎＭ、または約１０ｎＭ〜約２５ｎＭである。
【０１３７】
例示的な実施形態において、ＳｃＦｖのＫＤは実施例１に開示されるように測定される。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、結合親和性は、約１０００ｎｍ、９００ｎｍ、８００ｎｍ、２５０ｎＭ、２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、７．５ｎＭ、７ｎＭ、６．５ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭのいずれかよりも低い。
【０１３９】
モノクローナル抗体特異的エピトープ
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＦＬＴ３特異的ＣＡＲのいずれか１つの細胞外ドメインは、モノクローナル抗体に特異的な（すなわち、モノクローナル抗体によって特異的に認識される）１つ以上のエピトープを含み得る。これらのエピトープは、本明細書においてｍＡｂ特異的エピトープとも称される。これらの実施形態において、細胞外ドメインは、ＦＬＴ３に特異的に結合するＶＨおよびＶＬポリペプチド、ならびに１つ以上のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）に結合する１つ以上のエピトープを含む。ｍＡｂ特異的エピトープを含むＣＡＲは、単鎖または多鎖であり得る。
【０１４０】
本明細書に記載のＣＡＲの細胞外ドメインにモノクローナル抗体に特異的なエピトープを含めることにより、ＣＡＲを発現する遺伝子操作された免疫細胞の選別および枯渇を可能にする。いくつかの実施形態において、この特徴はまた、ＣＡＲを発現する遺伝子操作された免疫細胞の投与によって枯渇された内在性ＦＬＴ３を発現する細胞の回復を促進する。
【０１４１】
したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、ｍＡｂ特異的エピトープを含むＣＡＲを有する遺伝子操作された免疫細胞を選別するおよび／または枯渇させるための方法、ならびに骨髄前駆細胞等の内在性ＦＬＴ３を発現する細胞の回復を促進するための方法に関する。
【０１４２】
いくつかのエピトープ−モノクローナル抗体対、具体的には、非限定的な例としてＣＤ２０エピトープ／リツキシマブ等の医学的使用が既に承認されているものを用いて、モノクローナル抗体特異的エピトープを含むＣＡＲを生成することができる。
【０１４３】
いくつかの実施形態において、エピトープに特異的なモノクローナル抗体は、細胞傷害性薬物にコンジュゲートされ得る。また、補体系の成分（複数可）を移植した遺伝子操作された抗体を用いてＣＤＣ細胞傷害性を促進することも可能である。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ−Ｔ細胞の活性化は、エピトープを認識する抗体を用いて細胞を枯渇させることによって調節することができる。
【０１４４】
本発明はまた、ｍＡｂ特異的エピトープ（複数可）を発現するＦＬＴ３特異的ＣＡＲを有する遺伝子操作された免疫細胞を選別するための方法、ならびにこれらのＣＡＲを有する遺伝子操作された免疫細胞の活性化が上記ＣＡＲの外部リガンド結合ドメインを標的とする抗体を用いて細胞を枯渇させることによって調節される治療方法も包含する。
【０１４５】
モノクローナル抗体によって特異的に認識される１つ以上のエピトープを含むＣＡＲは、ＷＯ２０１６／１２０２１６に開示されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。エピトープは、当該技術分野で既知の任意の数のエピトープから選択され得る。いくつかの実施形態において、エピトープは、医学的使用が承認されているモノクローナル抗体の標的、例えば、限定されないが、リツキシマブによって認識されるＣＤ２０エピトープ等であり得る。いくつかの実施形態において、エピトープは、配列番号２２９に示されるアミノ酸配列を含む。
ＣＰＹＳＮＰＳＬＣ（配列番号２２９）
【０１４６】
いくつかの実施形態において、エピトープは、ＣＡＲのｓｃＦｖとヒンジとの間に位置し得る。いくつかの実施形態において、リンカーによって分離された同じエピトープの２つの例がＣＡＲに使用され得る。例えば、ＧＳＧＧＧＧＳＣＰＹＳＮＰＳＬＣＳＧＧＧＧＳＣＰＹＳＮＰＳＬＣＳＧＧＧＧＳ（配列番号２３０）に示されるような、リンカーによって分離された配列番号２２９に示されるエピトープの２つのコピーを含むポリペプチドは、軽鎖可変領域とヒンジとの間に位置するＣＡＲ内に使用することができる。
【０１４７】
いくつかの実施形態において、ＶＨおよびＶＬポリペプチドならびにｍＡｂ特異的エピトープ（複数可）を含むＣＡＲの細胞外結合ドメインは、エピトープの挿入位置およびリンカーの使用に応じて異なる構造を有し得る。例えば、ｍＡｂ特異的エピトープを含むＦＬＴ３特異的ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、以下の構造のうちの１つを有してもよく、
Ｖ１−Ｌ１−Ｖ２−（Ｌ）ｘ−エピトープ１−（Ｌ）ｘ−；
Ｖ１−Ｌ１−Ｖ２−（Ｌ）ｘ−エピトープ１−（Ｌ）ｘ−エピトープ２−（Ｌ）ｘ−；
Ｖ１−Ｌ１−Ｖ２−（Ｌ）ｘ−エピトープ１−（Ｌ）ｘ−エピトープ２−（Ｌ）ｘ−エピトープ３−（Ｌ）ｘ−；
（Ｌ）ｘ−エピトープ１−（Ｌ）ｘ−Ｖ１−Ｌ１−Ｖ２；
（Ｌ）ｘ−エピトープ１−（Ｌ）ｘ−エピトープ２−（Ｌ）ｘ−Ｖ１−Ｌ１−Ｖ２；
エピトープ１−（Ｌ）ｘ−エピトープ２−（Ｌ）ｘ−エピトープ３−（Ｌ）ｘ−Ｖ１−Ｌ１−Ｖ２；
（Ｌ）ｘ−エピトープ１−（Ｌ）ｘ−Ｖ１−Ｌ１−Ｖ２−（Ｌ）ｘ−エピトープ２−（Ｌ）ｘ；
（Ｌ）ｘ−エピトープ１−（Ｌ）ｘ−Ｖ１−Ｌ１−Ｖ２−（Ｌ）ｘ−エピトープ２−（Ｌ）ｘ−エピトープ３−（Ｌ）ｘ−；
（Ｌ）ｘ−エピトープ１−（Ｌ）ｘ−Ｖ１−Ｌ１−Ｖ２−（Ｌ）ｘ−エピトープ２−（Ｌ）ｘ−エピトープ３−（Ｌ）ｘ−エピトープ４−（Ｌ）ｘ−；
（Ｌ）ｘ−エピトープ１−（Ｌ）ｘ−エピトープ２−（Ｌ）ｘ−Ｖ１−Ｌ１−Ｖ２−（Ｌ）ｘ−エピトープ３−（Ｌ）ｘ−；
（Ｌ）ｘ−エピトープ１−（Ｌ）ｘ−エピトープ２−（Ｌ）ｘ−Ｖ１−Ｌ１−Ｖ２−（Ｌ）ｘ−エピトープ３−（Ｌ）ｘ−エピトープ４−（Ｌ）ｘ−；
Ｖ１−（Ｌ）ｘ−エピトープ１−（Ｌ）ｘ−Ｖ２；
Ｖ１−（Ｌ）ｘ−エピトープ１−（Ｌ）ｘ−Ｖ２−（Ｌ）ｘ−エピトープ２−（Ｌ）ｘ；
Ｖ１−（Ｌ）ｘ−エピトープ１−（Ｌ）ｘ−Ｖ２−（Ｌ）ｘ−エピトープ２−（Ｌ）ｘ−エピトープ３−（Ｌ）ｘ；
Ｖ１−（Ｌ）ｘ−エピトープ１−（Ｌ）ｘ−Ｖ２−（Ｌ）ｘ−エピトープ２−（Ｌ）ｘ−エピトープ３−（Ｌ）ｘ−エピトープ４−（Ｌ）ｘ；
（Ｌ）ｘ−エピトープ１−（Ｌ）ｘ−Ｖ１−（Ｌ）ｘ−エピトープ２−（Ｌ）ｘ−Ｖ２；または
（Ｌ）ｘ−エピトープ１−（Ｌ）ｘ−Ｖ１−（Ｌ）ｘ−エピトープ２−（Ｌ）ｘ−Ｖ２−（Ｌ）ｘ−エピトープ３−（Ｌ）ｘ；
式中、
Ｖ１はＶＬであり、かつＶ２はＶＨであるか、またはＶ１はＶＨであり、かつＶ２はＶＬであり、
Ｌ１は、ＶＨ鎖をＶＬ鎖に連結するのに適切なリンカーであり、
Ｌは、グリシン残基およびセリン残基を含むリンカーであり、細胞外結合ドメインにおける各Ｌの存在は、同じ細胞外結合ドメイン内の他のＬの存在と同一であってもまたは異なってもよく（例えば、ＳＧＧＧＧ、ＧＧＧＧＳ、またはＳＧＧＧＧＳ）、
ｘは、０または１であり、各ｘの存在は、他のものとは独立して選択され、
エピトープ１、エピトープ２、エピトープ３およびエピトープ４は、ｍＡｂ特異的エピトープであり、同一であってもまたは異なってもよい。いくつかの実施形態において、エピトープ１、エピトープ２およびエピトープ４は、配列番号２２９のアミノ酸配列を有するｍＡｂ特異的エピトープであり、エピトープ３は、配列番号２３１のアミノ酸配列を有するｍＡｂ特異的エピトープである。
【０１４８】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、以下の配列
Ｖ１−Ｌ１−Ｖ２−（Ｌ）ｘ−エピトープ１−（Ｌ）ｘ−エピトープ２−（Ｌ）ｘ−；または
（Ｌ）ｘ−エピトープ１−（Ｌ）ｘ−Ｖ１−Ｌ１−Ｖ２−（Ｌ）ｘ−エピトープ２−（Ｌ）ｘ−エピトープ３−（Ｌ）ｘ−エピトープ４−（Ｌ）ｘ−を含み、式中、Ｖ１、Ｖ２、Ｌ１、Ｌ、ｘおよびエピトープ１、エピトープ２、エピトープ３およびエピトープ４は、上で定義した通りである。
【０１４９】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＦＬＴ３特異的ＣＡＲのいずれか１つは、ＣＤ５２エピトープ、ＣＤ２０エピトープ、ＣＤ３エピトープ、ＣＤ４１エピトープ、ＣＤ２５エピトープ、ＣＤ３０エピトープ、ＥＧＦＲエピトープ、ＴＮＦαエピトープ、ＶＥＧＦエピトープ、補体タンパク質Ｃ５エピトープ、ＣＤ１１ａエピトープ、ＣＤ３３エピトープ、αー４インテグリンエピトープ、ＩｇＥ  Ｆｃ領域エピトープ、ＲＳＶタンパク質Ｆエピトープ、ＩＬ−６受容体エピトープ、ＨＥＲ２受容体エピトープ、インテグリンα４β７エピトープ、ＢＡＦＦ（Ｂ細胞活性化因子）エピトープ、ＩＬ−１βエピトープ、ＲＡＮＫＬエピトープ、ＣＴＬＡ４エピトープ、ＣＤ３４エピトープ、ＩＬ−１２エピトープ、および／またはＩＬ−２３エピトープから選択される１つ以上のｍＡｂ特異的エピトープを含み得る。
【０１５０】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＦＬＴ３特異的ＣＡＲは、アレムツズマブ、イブリツモマブチウキセタン、ムロモナブ−ＣＤ３、トシツモマブ、アブシキシマブ、バシリキシマブ、ブレンツキシマブベドチン、セツキシマブ、インフリキシマブ、リツキシマブ、ベバシズマブ、セルトリズマブペゴル、ダクリズマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、ゲムツズマブ、ナタリズマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、ラニビズマブ、トシリズマブ、トラスツズマブ、ベドリズマブ、アダリムマブ、ベリムマブ、カナキヌマブ、デノスマブ、ゴリムマブ、イピリムマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、ＱＢＥＮＤ−１０および／またはウステキヌマブによって特異的に認識されるエピトープから選択される１つ以上のｍＡｂ特異的エピトープを含み得る。
【０１５１】
いくつかの実施形態において、ＦＬＴ３特異的ＣＡＲは、表５に開示されるエピトープから選択される１つ以上のｍＡｂ特異的エピトープを含む。
表５：本発明のＦＬＴ３特異的ＣＡＲの細胞外結合ドメインにおいて使用することができるｍＡｂ特異的エピトープの例（例えば、ミモトープおよびエピトープならびに対応するｍＡｂ等）
【表５】
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【０１５２】
本発明によるＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫細胞の活性化および免疫応答をもたらす、細胞外リガンド結合ドメインの標的への結合の後の細胞内シグナル伝達に関与する。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲが発現される免疫細胞の正常なエフェクター機能のうちの少なくとも１つを活性化する能力を有する。例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、細胞溶解活性、またはサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であり得る。
【０１５３】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲにおいて使用される細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、限定されないが、抗原受容体の会合後にシグナル伝達を開始するために協調的に作用するＴ細胞受容体および共受容体の細胞質配列、ならびに同じ機能的能力を有するこれらの配列の誘導体または変異体および合成配列であり得る。細胞内シグナル伝達ドメインは、抗原依存性の一次活性化を開始するもの、および二次または共刺激シグナルを提供するために抗原非依存的に作用するものの、２つの異なるクラスの細胞質シグナル配列を含む。一次細胞質シグナル伝達配列は、ＩＴＡＭの免疫受容体チロシンベース活性化モチーフとして知られるシグナル伝達モチーフを含むことができる。ＩＴＡＭは、ｓｙｋ／ｚａｐ７０クラスチロシンキナーゼのための結合部位として機能する様々な受容体の細胞質内テールに見られる十分に定義された細胞シグナル伝達モチーフである。本明細書において使用されるＩＴＡＭの例は、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＦｃＲε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂおよびＣＤ６６ｄに由来するものを非限定的な例として含むことができる。いくつかの実施形態において、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号２１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも約７０％、例えば、少なくとも８０％、または少なくとも９０％、９５％、９７％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＣＤ３ζシグナル配達ドメインを含むことができる。いくつかの実施形態において、本発明のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激分子のドメインを含む。
【０１５４】
いくつかの実施形態において、本発明のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、４１ＢＢ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ５３１３３．）およびＣＤ２８（ＮＰ＿００６１３０．１）の断片からなる群から選択される共刺激分子の一部を含む。いくつかの実施形態において、本発明のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号２０９および配列番号２１３に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、例えば、少なくとも８０％、または少なくとも９０％、９５％、９７％、もしくは９９％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本発明のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号２０９および配列番号２１４に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、例えば、少なくとも８０％、または少なくとも９０％、９５％、９７％、もしくは９９％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む。
【０１５５】
ＣＡＲは、細胞の表面膜上に発現される。したがって、ＣＡＲは、膜貫通ドメインを含むことができる。本明細書に開示されるＣＡＲのための適切な膜貫通ドメインは、（ａ）例えば、免疫細胞、例えば、限定されないが、リンパ球またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞等の細胞の表面に発現され、（ｂ）予め定義された標的細胞に対する免疫細胞の細胞応答を誘導するためにリガンド結合ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインと相互作用する能力を有する。膜貫通ドメインは、天然由来、または合成起源に由来するかのいずれかでもよい。膜貫通ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。非限定的な例として、膜貫通ポリペプチドは、α、β、γもしくはδ等のＴ細胞受容体のサブユニット、ＣＤ３複合体を構成するポリペプチド、ＩＬ−２受容体のｐ５５（α鎖）、ｐ７５（β鎖）もしくはγ鎖、Ｆｃ受容体、具体的にはＦｃγ受容体ＩＩＩのサブユニット、またはＣＤタンパク質であり得る。代替として、膜貫通ドメインは合成であってもよく、ロイシンおよびバリン等の疎水性残基を主に含み得る。いくつかの実施形態において、上記膜貫通ドメインは、ヒトＣＤ８α鎖（例えば、ＮＰ＿００１１３９３４５．１）に由来する。
【０１５６】
膜貫通ドメインは、ストークドメイン（ヒンジドメインとも称される）によって細胞外リガンド結合ドメインに連結される。ストークドメインは、最大３００個のアミノ酸、例えば、１０〜１００個のアミノ酸または２５〜５０個のアミノ酸を含み得る。ストーク領域は、天然に存在する分子の全部または一部、例えば、ＣＤ８、ＣＤ４、もしくはＣＤ２８の細胞外領域の全部もしくは一部、または抗体定常領域の全部もしくは一部に由来し得る。代替として、ストークドメインは、天然に存在するストーク配列に対応する合成配列であり得るか、または完全に合成のストーク配列であり得る。いくつかの実施形態において、上記ストークドメインは、ヒトＣＤ８α鎖（例えば、ＮＰ＿００１１３９３４５．１）の一部である。別の具体的な実施例において、上記膜貫通ドメインおよびヒンジドメインは、例えば、配列番号２０６および２０８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、９５％、９７％、もしくは９９％の配列同一性を含むヒトＣＤ８α鎖の一部を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のＦＬＴ３特異的ＣＡＲのストークドメインは、ＣＤ８αヒンジ、ＩｇＧ１ヒンジ、またはＦｃγＲＩＩＩαヒンジを含む。いくつかの実施形態において、ストークドメインは、ヒトＣＤ８αヒンジ、ヒトＩｇＧ１ヒンジ、またはヒトＦｃγＲＩＩＩαヒンジを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＣＡＲは、ＦＬＴ３に特異的に結合する細胞外リガンド結合ドメイン、ＣＤ８αヒトヒンジおよび膜貫通ドメイン、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、および４−１ＢＢシグナル伝達ドメインを含むことができる。
【０１５７】
表６は、本明細書に開示されるＣＡＲに使用することができるドメインの例示的な配列を提供する。
表６：ＣＡＲ成分の例示的な配列
【表６−１】
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【表６−２】
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【０１５８】
標的抗原の下方制御または突然変異は、癌細胞において一般的に観察され、抗原を消失したエスケープ変異体を形成する。したがって、腫瘍エスケープを相殺し、免疫細胞を標的に対してより特異的にするために、ＦＬＴ３特異的ＣＡＲは、標的において異なる要素に同時に結合し、それによって免疫細胞の活性化および機能を強化するために、１つ以上の追加の細胞外リガンド結合ドメインを含むことができる。いくつかの実施形態において、細胞外リガンド結合ドメインは、同じ膜貫通ポリペプチド上にタンデムで配置されてもよく、また任意選択的にリンカーによって分離されてもよい。いくつかの実施形態において、上記異なる細胞外リガンド結合ドメインは、ＣＡＲを校正する異なる膜貫通ポリペプチド上に配置されてもよい。いくつかの実施形態において、本発明は、各ＣＡＲが異なる細胞外リガンド結合ドメインを含むＣＡＲの集団に関する。具体的には、本発明は、免疫細胞を提供することと、各ＣＡＲが異なる細胞外リガンド結合ドメインを含むＣＡＲの集団を該細胞の表面に発現させることとを含む、免疫細胞を遺伝子操作する方法に関する。別の具体的な実施例において、本発明は、免疫細胞を提供することと、各々が異なる細胞外リガンド結合ドメインを含むＣＡＲの集団を構成するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを該細胞に導入することとを含む、免疫細胞を遺伝子操作する方法に関する。ＣＡＲの集団とは、各々が異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれ以上のＣＡＲを意味する。本明細書による異なる細胞外リガンド結合ドメインは、例えば、標的において異なる要素に同時に結合し、それによって免疫細胞の活性化および機能を強化することができる。本発明はまた、各々が異なる細胞外リガンド結合ドメインを含むＣＡＲの集団を含む単離された免疫細胞にも関する。
【０１５９】
別の態様において、本明細書に記載のＣＡＲおよびポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドが本明細書に提供される。ポリヌクレオチドは、当該技術分野で既知の手順によって作製し、発現させることができる。
【０１６０】
別の態様において、本発明の細胞のいずれかを含む組成物（薬学的組成物等）が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、組成物は、本明細書に記載のＣＡＲのいずれかをコードするポリヌクレオチドを含む細胞を含む。さらに他の実施形態において、組成物は、以下の配列番号２４５および配列番号２４６に示されるポリヌクレオチドのいずれかまたは両方を含む。
Ｐ３Ｅ１０重鎖可変領域
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＡＧＣＧＧＡＧＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＣＡＧＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＴＧＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＴＣＴＧＧＣＧＧＣＡＣＡＴＴＣＴＣＴＡＧＣＴＡＣＧＣＣＡＴＣＣＡＧＴＧＧＧＴＧＣＧＧＣＡＧＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡＧＧＡＡＴＣＧＴＧＧＧＡＡＧＣＴＧＧＧＧＣＣＴＧＧＣＡＡＡＣＴＡＣＧＣＣＣＡＧＡＡＧＴＴＴＣＡＧＧＧＣＡＧＡＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＣＣＧＡＴＡＡＧＴＣＴＡＣＡＡＧＣＡＣＣＧＣＣＴＡＴＡＴＧＧＡＧＣＴＧＴＣＣＴＣＴＣＴＧＡＧＧＴＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＡＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＣＧＣＣＡＣＣＴＣＣＧＣＣＴＴＣＧＧＣＧＡＧＣＴＧＧＣＡＴＣＴＴＧＧＧＧＡＣＡＧＧＧＣＡＣＡＣＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＡＧＣＴＣＣ（配列番号２４５）
Ｐ３Ｅ１０軽鎖可変領域
ＧＡＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＡＣＡＧＡＧＣＣＣＡＧＧＣＡＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＴＣＣＴＧＴＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＡＧＴＣＣＧＴＧＣＣＴＴＣＴＡＧＣＣＡＧＣＴＧＧＣＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＣＣＡＧＧＣＣＣＣＣＡＧＡＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＴＧＡＣＧＣＣＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＣＣＡＣＡＧＧＣＡＴＣＣＣＡＧＡＴＡＧＧＴＴＣＴＣＴＧＧＣＡＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣＡＣＣＧＡＣＴＴＴＡＣＡＣＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＴＴＴＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＡＣＧＧＣＡＧＣＴＣＣＣＣＴＣＴＧＡＣＡＴＴＴＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧＧ（配列番号２４６）
【０１６１】
さらに他の実施形態において、組成物は、以下の配列番号２４７および配列番号２４８に示されるポリヌクレオチドのいずれかまたは両方を含む。
Ｐ３Ａ１重鎖可変領域
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＡＧＣＧＧＡＧＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＡＧＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＴＧＴＣＴＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＡＴＴＣＴＣＴＡＧＣＴＡＣＧＡＴＡＴＣＴＣＴＴＧＧＧＴＧＡＧＧＣＡＧＧＣＣＣＣＡＧＧＣＣＡＧＧＧＡＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡＧＧＡＡＴＣＡＴＣＣＣＣＧＴＧＡＧＣＧＧＡＡＧＧＧＣＡＡＡＣＴＡＣＧＣＡＣＡＧＡＡＧＴＴＴＣＡＧＧＧＣＣＧＧＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＣＡＧＡＣＡＡＧＴＣＣＡＣＡＴＣＴＡＣＣＧＣＣＴＡＴＡＴＧＧＡＧＣＴＧＴＣＣＴＣＴＣＴＧＡＧＡＡＧＣＧＡＧＧＡＴＡＣＡＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＣＧＣＣＡＧＡＧＴＧＡＧＧＣＣＴＡＣＣＴＡＣＴＧＧＣＣＡＣＴＧＧＡＣＴＡＴＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＡＣＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＡＧＣＴＣＣ（配列番号２４７）
Ｐ３Ａ１軽鎖可変領域
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＣＣＣＡＴＣＴＡＧＣＣＴＧＡＧＣＧＣＣＴＣＣＧＴＧＧＧＣＧＡＴＡＧＡＧＴＧＡＣＡＡＴＣＡＣＣＴＧＴＡＧＧＧＣＣＴＣＴＣＡＧＡＧＣＡＴＣＴＣＣＴＣＴＴＡＣＣＴＧＡＡＴＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＡＡＧＧＣＣＣＣＴＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＧＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＣＣＴＧＣＡＧＴＣＣＧＧＡＧＴＧＣＣＡＴＣＴＣＧＧＴＴＣＴＣＣＧＧＣＴＣＴＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＣＡＧＡＣＴＴＴＡＣＡＣＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＴＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＡＴＴＴＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＴＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＣＣＴＡＴＴＣＴＡＣＡＣＣＡＣＴＧＡＣＣＴＴＴＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＡＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧ（配列番号２４８）
【０１６２】
さらに他の実施形態において、組成物は、以下の配列番号２４９および配列番号２５０に示されるポリヌクレオチドのいずれかまたは両方を含む。
Ｐ９Ｂ５重鎖可変領域
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＧＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＣＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＴＧＧＣＧＧＣＴＣＴＣＴＧＡＧＡＣＴＧＡＧＣＴＧＣＧＣＡＧＣＡＴＣＣＧＧＣＴＴＣＡＴＣＴＴＴＧＣＣＴＣＴＴＡＣＧＣＡＡＴＧＡＧＣＴＧＧＧＴＧＡＧＧＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＣＡＡＧＧＧＡＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＧＡＧＣＧＡＧＡＴＣＡＧＣＴＣＣＴＣＴＧＧＣＧＧＣＡＧＣＡＣＣＡＣＡＴＡＴＧＣＣＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＣＴＴＣＡＣＡＡＴＣＡＧＣＣＧＧＧＡＣＡＡＣＴＣＴＡＡＧＡＡＴＡＣＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＣＣＣＴＧＡＧＡＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＡＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＣＧＣＣＡＧＡＧＡＴＡＧＡＧＴＧＡＴＧＧＣＣＧＧＣＣＴＧＧＧＣＴＡＴＧＡＣＣＣＡＴＴＴＧＡＴＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＡＣＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＡＧＣＴＣＣ（配列番号２４９）
Ｐ９Ｂ５軽鎖可変領域
ＣＡＧＡＧＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＣＣＧＣＣＴＣＴＧＧＡＡＣＡＣＣＣＧＧＣＣＡＧＡＧＧＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＴＧＴＴＣＣＧＧＣＴＣＴＡＧＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＧＧＣＴＣＣＡＡＴＴＡＣＧＴＧＴＡＴＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＣＴＧＣＣＣＧＧＣＡＣＡＧＣＣＣＣＴＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＡＧＡＡＡＣＡＡＴＣＡＧＡＧＧＣＣＡＴＣＴＧＧＣＧＴＧＣＣＣＧＡＣＣＧＣＴＴＣＴＣＴＧＧＣＡＧＣＡＡＧＴＣＣＧＧＣＡＣＣＴＣＴＧＣＣＡＧＣＣＴＧＧＣＡＡＴＣＡＧＣＧＧＡＣＴＧＣＧＧＴＣＣＧＡＧＧＡＣＧＡＧＧＣＣＧＡＴＴＡＣＴＡＴＴＧＣＧＣＡＧＣＡＴＧＧＧＡＣＧＡＴＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＧＡＧＴＧＧＴＧＴＴＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＡＡＡＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧ（配列番号２５０）
【０１６３】
さらに他の実施形態において、組成物は、以下の配列番号２５１および配列番号２５２に示されるポリヌクレオチドのいずれかまたは両方を含む。
Ｐ４Ｃ７重鎖可変領域
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＡＧＣＧＧＡＧＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＣＡＧＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＴＧＴＣＴＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＡＴＴＣＴＣＴＡＧＣＴＡＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＴＧＧＧＴＧＣＧＧＣＡＧＧＣＣＣＣＡＧＧＣＣＡＧＧＧＡＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡＧＧＡＡＴＣＡＴＣＣＣＡＧＣＣＴＴＣＧＧＣＡＴＣＧＣＣＡＡＣＴＡＣＧＣＣＣＡＧＡＡＧＴＴＴＣＡＧＧＧＣＣＧＣＧＴＧＡＣＡＡＴＣＡＣＣＧＣＣＧＡＣＡＡＧＴＣＣＡＣＡＴＣＴＡＣＣＧＣＣＴＡＴＡＴＧＧＡＧＣＴＧＴＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＧＡＧＣＧＡＧＧＡＴＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＣＧＣＣＡＡＧＧＧＣＧＧＣＡＧＣＴＡＣＴＣＣＣＴＧＧＡＣＴＡＴＴＴＴＧＡＴＡＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＡＣＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＡＧＣＴＣＣ（配列番号２５１）
Ｐ４Ｃ７軽鎖可変領域
ＧＡＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＡＣＡＧＴＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＡＧＣＣＣＡＧＧＣＧＡＧＡＧＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＴＣＣＴＧＴＡＧＧＧＣＡＴＣＴＣＡＧＴＡＣＧＴＧＴＣＣＧＣＣＴＣＴＣＴＧＣＴＧＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＣＣＡＧＧＣＣＣＣＡＡＧＡＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＧＧＡＧＣＡＴＣＣＡＣＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣＧＧＣＡＴＣＣＣＣＧＡＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣＴＣＴＧＧＡＡＣＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＴＡＧＡＣＴＧＧＡＧＣＣＴＧＡＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＡＴＧＣＣＡＧＧＴＣＴＡＧＣＡＣＡＴＴＴＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧ（配列番号２５２）
【０１６４】
発現ベクター、およびポリヌクレオチド組成物の投与が、本明細書にさらに記載される。
【０１６５】
別の態様において、本明細書に記載のポリヌクレオチドのいずれかを作製する方法が本明細書に提供される。
【０１６６】
そのような任意の配列に相補的なポリヌクレオチドも本発明によって包含される。ポリヌクレオチドは、一本鎖（コードもしくはアンチセンス）または二本鎖であってもよく、ＤＮＡ分子（ゲノム、ｃＤＮＡもしくは合成）またはＲＮＡ分子であってもよい。ＲＮＡ分子は、イントロンを含有し、かつＤＮＡ分子と一対一の様式で対応するＨｎＲＮＡと、イントロンを含有しないｍＲＮＡ分子とを含む。追加のコード配列または非コード配列が、必ずではないが、本発明のポリヌクレオチド内に存在してもよく、ポリヌクレオチドは、必ずではないが、他の分子および／または支持物質に連結されてもよい。
【０１６７】
ポリヌクレオチドは、天然の配列（すなわち、抗体またはその一部をコードする内在性配列）を含んでもよいか、またはそのような配列の変異体を含んでもよい。ポリヌクレオチド変異体は、コードされたポリペプチドの免疫反応性が、天然の免疫反応性分子と比較して減衰されないように、１つ以上の置換、付加、欠失、および／または挿入を含有する。コードされたポリペプチドの免疫反応性に対する影響は、一般に、本明細書に記載されるように評価され得る。変異体、一般に、天然の抗体またはその一部をコードするポリヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％の同一性、または少なくとも約８０％の同一性、またはさらには少なくとも約９０％もしくは９５％の同一性を示す。
【０１６８】
２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、以下に記載されるように最大限一致するように整列させたときに２つの配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸の配列が同じである場合に「同一」であると言われる。２つの配列間の比較は、典型的には、比較ウィンドウにわたって配列を比較し、配列類似性の局所的領域を同定することによって行われる。本明細書で使用される「比較ウィンドウ」は、２つの配列を最適に整列させた後、配列が、連続した位置の同じ数の参照配列と比較され得る、少なくとも約２０の連続した位置、通常３０〜約７５、または４０〜約５０のセグメントを指す。
【０１６９】
比較のための配列の最適なアラインメントは、バイオインフォマティクスソフトウェアのＬａｓｅｒｇｅｎｅスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）内のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを使用して、デフォルトパラメータを用いて実施され得る。このプログラムは、以下の参考文献に記載されるいくつかのアラインメントスキームを具現化する：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．，１９７８，Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．Ｉｎ  Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（ｅｄ．）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ  Ｖｏｌ．５，Ｓｕｐｐｌ．３，ｐｐ．３４５−３５８；Ｈｅｉｎ  Ｊ．，１９９０，Ｕｎｉｆｉｅｄ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ  ｐｐ．６２６−６４５  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．１８３，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．，１９８９，ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３；Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．ａｎｄ  Ｍｕｌｌｅｒ  Ｗ．，１９８８，ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１−１７；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．，１９７１，Ｃｏｍｂ．Ｔｈｅｏｒ．１１：１０５；Ｓａｎｔｏｕ，Ｎ．，Ｎｅｓ，Ｍ．，１９８７，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４：４０６−４２５；Ｓｎｅａｔｈ，Ｐ．Ｈ．Ａ．ａｎｄ  Ｓｏｋａｌ，Ｒ．Ｒ．，１９７３，Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ｔｈｅ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ，Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ；Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：７２６−７３０。
【０１７０】
一般に、「配列同一性の割合」は、少なくとも２０の位置の比較ウィンドウにわたって最適に整列させた２つの配列を比較することにより決定され、この場合、これらの２つの配列の最適なアラインメントのために、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の一部が、参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して、２０パーセント以下、通常は５〜１５パーセント、または１０〜１２パーセントの付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。割合は、両方の配列中に同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が存在する位置の数を決定して、マッチする位置の数を得、マッチする位置の数を参照配列中の位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）で除し、その結果に１００を乗じて配列同一性の割合を得ることによって算出される。
【０１７１】
変異体は、または代替として、天然の遺伝子、またはその一部もしくは補体に実質的に相同であってもよい。そのようなポリヌクレオチド変異体は、中程度にストリンジェントな条件下で、天然の抗体をコードする天然に存在するＤＮＡ配列（または相補的配列）とハイブリダイズすることができる。
【０１７２】
適切な「中程度にストリンジェントな条件」は、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中で予備洗浄し、５０℃〜６５℃、５×ＳＳＣで一晩ハイブリダイズした後、０．１％ＳＤＳを含有する２×、０．５×および０．２×ＳＳＣの各々により６５℃で２０分間、２回洗浄することを含む。
【０１７３】
本明細書で使用される場合、「高度にストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー条件」は、以下の通りである。（１）洗浄のために低イオン強度および高温を用いる、例えば、５０℃の０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウム；（２）ハイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性剤、例えば、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、および０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）、および７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを４２℃で用いる；または（３）５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハルト液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％硫酸デキストランを４２℃で用い、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中４２℃および５０％ホルムアミド中５５℃で洗浄した後、ＥＤＴＡを含有する０．１×ＳＳＣからなる高ストリンジェンシー洗浄を５５℃で行う。当業者は、プローブ長さ等の因子に対応するように、温度、イオン強度等を必要に応じてどのように調節するかを認識するであろう。
【０１７４】
遺伝暗号の縮重の結果として、本明細書に記載のポリペプチドをコードする多くのヌクレオチド配列が存在することが当業者に理解されるであろう。これらのポリヌクレオチドの中には、任意の天然の遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小限の相同性を有するものがある。それにもかかわらず、コドン使用における差異のために異なるポリヌクレオチドは、本発明によって明確に企図される。さらに、本明細書で提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子は、本発明の範囲内である。対立遺伝子は、ヌクレオチドの欠失、付加および／または置換等の１つ以上の突然変異の結果として変化した内在性遺伝子である結果として得られるｍＲＮＡおよびタンパク質は、必ずではないが、変化した構造または機能を有し得る。対立遺伝子は、標準的な技法（ハイブリダイゼーション、増幅および／またはデータベース配列の比較）を用いて同定してもよい。
【０１７５】
本発明のポリヌクレオチドは、化学合成、組換え法、またはＰＣＲを用いて得ることができる。化学的なポリヌクレオチド合成の方法は当該技術分野で周知であり、本明細書に詳細に記載する必要はない。当業者は、本明細書に提供される配列および市販のＤＮＡ合成機を使用して、所望のＤＮＡ配列を産生することができる。
【０１７６】
本明細書においてさらに論じられるように、組換え法を用いてポリヌクレオチドを調製するために、所望の配列を含むポリヌクレオチドを適切なベクターに挿入することができ、次にベクターを複製および増幅のために適切な宿主細胞に導入することができる。ポリヌクレオチドは、当該技術分野で既知の任意の手段によって宿主細胞に挿入され得る。細胞は、直接的な取り込み、エンドサイトーシス、トランスフェクション、Ｆ−交配または電気穿孔を用いて外因性ポリヌクレオチドを導入することにより形質転換される。一旦導入されると、外因性ポリヌクレオチドは、非組込みベクターとして細胞内に維持され得るか（プラスミド等）、または宿主細胞ゲノムに組み込まれ得る。そのように増幅されたポリヌクレオチドは、当該技術分野で周知の方法により宿主細胞から単離することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９を参照されたい。
【０１７７】
代替として、ＰＣＲはＤＮＡ配列の複製を可能にする。ＰＣＲ技術は当該技術分野で周知であり、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，８００，１５９号、同第４，７５４，０６５号および同第４，６８３，２０２号、ならびにＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｂｉｒｋａｕｓｗｅｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｓｔｏｎ，１９９４に記載されている。
【０１７８】
ＲＮＡは、適切なベクター中に単離されたＤＮＡを用いること、および適切な宿主細胞にそれを挿入することによって得ることができる。細胞が複製し、ＤＮＡがＲＮＡに転写されると、次いでＲＮＡは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９（上記参照）に記述されるような、当業者に周知の方法を用いて単離することができる。
【０１７９】
適切なクローニングベクターは、標準的な技法に従って構築されてもよいか、または当該技術分野において利用可能な多数のクローニングベクターから選択されてもよい。選択されたクローニングベクターは、使用されることが意図される宿主細胞によって変化し得るが、有用なクローニングベクターは、一般に、自己複製する能力を有し、特定の制限エンドヌクレアーゼのための単一の標的を有してもよく、かつ／またはベクターを含有するクローンを選択する際に使用することができるマーカーの遺伝子を保持してもよい。適切な例として、プラスミドおよび最近ウイルス、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（例えば、ｐＢＳ  ＳＫ＋）およびその誘導体ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ＲＰ４、ファージＤＮＡ、ならびにｐＳＡ３およびｐＡＴ２８等のシャトルベクターが挙げられる。これらのおよび多くの他のクローニングベクターは、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ等の商業的供給業者から入手可能である。
【０１８０】
発現ベクターは、一般に、本発明によるポリヌクレオチドを含有する複製可能なポリヌクレオチド構築物である。発現ベクターは、エピソームとして、または染色体ＤＮＡの不可欠な部分としてのいずれかで、宿主細胞において複製可能でなければならないことが暗示される。適切な発現ベクターとして、限定されないが、プラスミド、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レトロウイルスおよびコスミドを含むウイルスベクター、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ８７／０４４６２号に開示される発現ベクター（複数可）が挙げられる。ベクター成分は、限定されないが、以下のうちの１つ以上を含み得る：シグナル配列；複製の起点；１つ以上のマーカー遺伝子；適当な転写調節要素（プロモーター、エンハンサー、およびターミネーター等）。発現（すなわち、翻訳）には、リボソーム結合部位、翻訳開始部位、および停止コドン等の、１つ以上の翻訳調節要素も通常は必要である。
【０１８１】
対象となるポリヌクレオチドを含有するベクターは、電気穿孔、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、または他の物質を用いるトランスフェクション；微粒子銃；リポフェクション；および感染（例えば、ベクターがワクシニアウイルス等の感染病原体である場合）を含む、多くの適切な手段のいずれかによって宿主細胞に導入することができる。ベクターまたはポリヌクレオチドを導入する選択は、細胞宿主の特徴に依存することが多い。
【０１８２】
本明細書に開示のＦＬＴ３特異的ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドは、発現カセットまたは発現ベクター（例えば、細菌宿主細胞に導入するためのプラスミド、またはウイルスベクター、例えば、昆虫宿主細胞のトランスフェクションのためのバキュロウイルスベクター、またはプラスミドもしくはウイルスベクター、例えば、哺乳動物宿主細胞のトランスフェクションのためのレンチウイルス）中に存在し得る。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドまたはベクターは、リボソームスキップ配列をコードする核酸配列、例えば、限定されないが、２Ａペプチドをコードする配列を含むことができる。ピコルナウイルスのアフトウイルス亜群において同定された２Ａペプチドは、あるコドンから次のコドンへと、該コドンによってコードされる２つのアミノ酸間にペプチド結合を形成することなく、リボソーム「スキップ」を引き起こす（（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ａｎｄ  Ｅｌｌｉｏｔｔ  ２００１；Ａｔｋｉｎｓ，  Ｗｉｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．２００７；Ｄｏｒｏｎｉｎａ，Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．２００８）を参照されたい）。「コドン」とは、リボソームによって１つのアミノ酸残基に翻訳されたｍＲＮＡ上の（またはＤＮＡ分子のセンス鎖上の）３つのヌクレオチドを意味する。したがって、ポリペプチドがインフレームの２Ａオリゴペプチド配列によって分離されている場合、ｍＲＮＡ内の単一の連続したオープンリーディングフレームから２つのポリペプチドを合成することができる。そのようなリボソームスキップ機構は、当該技術分野において周知であり、単一のメッセンジャーＲＮＡによってコードされたいくつかのタンパク質の発現のために、いくつかのベクターによって使用されることが分かっている。
【０１８３】
膜貫通ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に誘導するために、いくつかの実施形態において、分泌シグナル配列（リーダー配列、プレプロ配列またはプレ配列としても知られる）が、ポリヌクレオチド配列またはベクター配列に提供される。分泌シグナル配列は、膜貫通核酸配列に作動可能に連結される、すなわち、２つの配列が正しいリーディングフレームにおいて結合し、新しく合成されたポリペプチドを宿主細胞の分泌経路内に誘導するように配置される。分泌シグナル配列は、一般的に、対象となるポリペプチドをコードする核酸配列の５’に位置するが、ある特定の分泌シグナル配列は、目的となる核酸配列の他の場所に位置してもよい（例えば、Ｗｅｌｃｈらの米国特許第５，０３７，７４３号、Ｈｏｌｌａｎｄらの米国特許第５，１４３，８３０号を参照されたい）。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、配列番号２０４または２１５に示されるアミノ酸配列を含む。当業者は、遺伝暗号の縮重を考慮して、これらのポリヌクレオチド分子間においてかなりの配列変動が可能であることを認識するであろう。いくつかの実施形態において、本発明の核酸配列は、哺乳動物細胞における発現のために、例えば、霊長類（例えば、ヒトまたはサル）細胞における発現のためにコドン最適化される。コドン最適化は、対象となる配列において、所与の種の高発現遺伝子において通常は稀であるコドンを、そのような種の高発現遺伝子において通常は高頻度であるコドンへと交換することを指し、そのようなコドンは、交換されるコドンとしてアミノ酸をコードする。
【０１８４】
免疫細胞を遺伝子操作する方法
免疫療法に使用するための免疫細胞を調製する方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、方法は、免疫細胞を得ること、本発明によるＣＡＲを免疫細胞に導入すること、および細胞を増殖させることを含む。いくつかの実施形態において、細胞を提供すること、および細胞の表面に少なくとも１つの上述のＣＡＲを発現させることを含む、免疫細胞を遺伝子操作する方法に関する。免疫細胞を遺伝子操作するための方法は、例えば、ＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ／２０１４／０３９５２３号、同第ＷＯ／２０１４／１８４７４１号、同第ＷＯ／２０１４／１９１１２８号、同第ＷＯ／２０１４／１８４７４４号、および同第ＷＯ／２０１４／１８４１４３号に記載されており、これらは各々、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、方法は、上述のＣＡＲをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを細胞にトランスフェクトすること、および細胞においてポリヌクレオチドを発現させることを含む。
【０１８５】
細胞を遺伝子操作する前に、様々な非限定的な方法によって対象から細胞の起源を得ることができる。細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾組織、および腫瘍を含む、多数の非限定的な起源から得ることができる。いくつかの実施形態において、入手可能であり、当業者に既知である任意の数のＴ細胞株が使用され得る。いくつかの実施形態において、細胞は、健常なドナー、または疾患もしくは障害に罹患するドナー、例えば、癌と診断された固体もしくは感染症と診断された固体に由来してもよい。いくつかの実施形態において、細胞は、異なる表現型の特徴を提示する混合細胞集団の一部であってもよい。
【０１８６】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、細胞において安定に発現されるようにレンチウイルスベクターに存在する。
【０１８７】
いくつかの実施形態において、方法は、例えば、限定されないが、ＴＣＲの成分、免疫抑制剤の標的、ＨＬＡ遺伝子、および／または免疫チェックポイントタンパク質、例えば、ＰＤＣＤ１もしくはＣＴＬＡ−４等を発現する少なくとも１つの遺伝子を破壊または不活性化することによって細胞を遺伝子組み換えするステップをさらに含んでもよい。遺伝子を破壊または不活性化することにより、対象となる遺伝子が機能的タンパク質の形態では発現されないことが意図される。いくつかの実施形態において、破壊または不活性化される遺伝子は、例えば、限定されないが、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ５２、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）、デオキシシチジンキナーゼ（ＤＣＫ）、ＰＤ−１、およびＣＴＬＡ−４からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、方法は、選択的ＤＮＡ切断によって遺伝子を選択的に不活性化することができるレアカットエンドヌクレアーゼを細胞に導入することにより１つ以上の遺伝子を不活性化することを含む。いくつかの実施形態において、レアカットエンドヌクレアーゼは、例えば、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼ）またはＣａｓ９エンドヌクレアーゼであり得る。
【０１８８】
いくつかの実施形態において、標的遺伝子を不活性化する能力を強化するために、レアカットエンドヌクレアーゼとともに追加の触媒ドメインが使用される。例えば、追加の触媒ドメインは、ＤＮＡ末端プロセシング酵素であってもよい。ＤＮＡ末端プロセシング酵素の非限定的な例として、５−３′エキソヌクレアーゼ、３−５′エキソヌクレアーゼ、５−３′アルカリ性エキソヌクレアーゼ、５′フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、ホスファターゼ、加水分解酵素および鋳型非依存性ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。そのような触媒ドメインの非限定的な例は、ｈＥｘｏＩ（ＥＸＯ１＿ＨＵＭＡＮ）、酵母ＥｘｏＩ（ＥＸＯ１＿ＹＥＡＳＴ）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥｘｏＩ、ヒトＴＲＥＸ２、マウスＴＲＥＸ１、ヒトＴＲＥＸ１、ウシＴＲＥＸ１、ラットＴＲＥＸ１、ＴｄＴ（末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ）ヒトＤＮＡ２、酵母ＤＮＡ２（ＤＮＡ２＿ＹＥＡＳＴ）からなる群から選択されるタンパク質ドメインまたは該タンパク質ドメインの触媒的に活性な誘導体からなる。いくつかの実施形態において、追加の触媒ドメインは、３′−５′−エキソヌクレアーゼ活性を有することができ、いくつかの実施形態において、上記追加の触媒ドメインはＴＲＥＸ、例えば、ＴＲＥＸ２触媒ドメイン（ＷＯ２０１２／０５８４５８）である。いくつかの実施形態において、上記触媒ドメインは、単鎖ＴＲＥＸポリペプチドによってコードされる。追加の触媒ドメインは、ヌクレアーゼ融合タンパク質またはキメラタンパク質に融合され得る。いくつかの実施形態において、追加の触媒ドメインは、例えば、ペプチドリンカーを用いて、融合される。
【０１８９】
いくつかの実施形態において、方法は、標的核酸配列と外因性核酸との間で相同組換えが起こるように、少なくとも標的核酸配列の一部に相同な配列を含む外因性核酸を細胞に導入するステップをさらに含む。いくつかの実施形態において、上記外因性核酸は、それぞれ標的核酸配列の領域５′および３′に相同な第１および第２の部分を含む。外因性核酸はまた、標的核酸配列の領域５′および３′と相同性を有しない、第１の部分と第２の部分との間に位置する第３の部分を含んでもよい。標的核酸配列の切断後、相同組換え事象は、標的核酸配列と外因性核酸との間で刺激される。いくつかの実施形態において、少なくとも約５０ｂｐ、約１００ｂｐ超、または約２００ｂｐ超の相同配列が、ドナー基質内で使用され得る。外因性核酸は、例えば、限定されないが、約２００ｂｐ〜約６０００ｂｐ、例えば、約１０００ｂｐ〜約２０００ｂｐであり得る。共有される核酸相同性は、破断部位の上流および下流に隣接する領域に位置し、導入される核酸配列は１つのアーム間に位置する。
【０１９０】
いくつかの実施形態において、核酸は、上記切断の上流の配列に対する第１の相同性領域、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ５２、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）、デオキシシチジンキナーゼ（ＤＣＫ）、および免疫チェックポイントタンパク質、例えば、プログラム死−１（ＰＤ−１）からなる群から選択される標的遺伝子を不活性化するための配列、ならびに切断の下流の配列に対する第２の相同性領域を連続して含む。ポリヌクレオチド導入ステップは、レアカットエンドヌクレアーゼの導入または発現と同時、その前、またはその後であり得る。破断事象が発生した標的核酸配列の位置に応じて、例えば、外因性核酸が遺伝子のオープンリーディングフレーム内に位置する場合、または新しい配列または対象となる遺伝子を導入するために、そのような外因性核酸を用いて遺伝子をノックアウトすることができる。そのような外因性核酸の使用による配列挿入は、遺伝子の修正もしくは置換（非限定的な例として対立遺伝子の交換）によって、既存の標的遺伝子を改変するために使用することができるか、または標的遺伝子の修正もしくは置換（非限定的な例としてプロモーター交換）によって、標的遺伝子の発現を上方制御もしくは下方制御するために使用することができる。いくつかの実施形態において、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ５２、ＧＲ、ＤＣＫ、および免疫チェックポイントタンパク質からなる群から選択される遺伝子の不活性化は、特定のＴＡＬＥ−ヌクレアーゼによって標的とされる正確なゲノム位置で行うことができ、この場合、上記ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼは切断を触媒し、外因性核酸は、少なくとも相同性領域と、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ５２、ＧＲ、ＤＣＫ、相同組換えによって組み込まれる免疫チェックポイントタンパク質からなる群から選択される１つの標的遺伝子を不活性化するための配列とを連続して含む。いくつかの実施形態において、いくつかの遺伝子は、それぞれいくつかのＴＡＬＥ−ヌクレアーゼを用いること、および、特定の遺伝子不活性化のための１つの定義された遺伝子およびいくつかの特定のポリヌクレオチドを特異的に標的とすることにより、連続的にまたは同時に不活性化することができる。
【０１９１】
いくつかの実施形態において、方法は、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ５２、ＧＲ、ＤＣＫ、および免疫チェックポイントタンパク質からなる群から選択される１つ以上の追加の遺伝子の不活性化を含む。いくつかの実施形態において、遺伝子の不活性化は、レアカットエンドヌクレアーゼが細胞ゲノムの標的配列における切断を特異的に触媒するように、少なくとも１つのレアカットエンドヌクレアーゼを細胞に導入すること、ならびに任意選択的に、切断の上流の配列に対する第１の相同性領域、細胞のゲノムに挿入される配列、および切断の下流の配列に対する第２の相同性領域を連続して含む外因性核酸を細胞に導入することによって達成することができ、この場合、導入された外因性核酸が遺伝子を不活性化し、少なくとも１つの対象となる組換えタンパク質をコードする少なくとも１つの外因性ポリヌクレオチド配列を組み込む。いくつかの実施形態において、外因性ポリヌクレオチド配列は、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ５２、ＧＲ、ＤＣＫ、および免疫チェックポイントタンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコードする遺伝子内に組み込まれる。
【０１９２】
別の態様において、細胞を遺伝子組み換えするステップは、免疫抑制剤の標的を発現する少なくとも１つの遺伝子を不活性化することによりＴ細胞を修飾すること、および任意選択的に免疫抑制剤の存在下で細胞を増殖させることを含み得る。免疫抑制剤は、いくつかの作用機序のうちの１つによって免疫機能を抑制する薬剤である。免疫抑制剤は、免疫応答の程度および／またはｖｏｒａｃｉｔｙを低減する。免疫抑制剤の非限定的な例として、カルシニューリン阻害剤、ラパマイシンの標的、インターロイキン−２α鎖遮断薬、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤、ジヒドロ葉酸還元酵素、コルチコステロイド、および代謝拮抗型免疫抑制薬が挙げられる。いくつかの細胞傷害性免疫抑制剤は、ＤＮＡ合成を阻害することにより作用する。他は、Ｔ細胞の活性化を通して、またはヘルパー細胞の活性化を阻害することによって作用し得る。本明細書による方法は、Ｔ細胞における免疫抑制剤の標的を不活性化することにより、免疫療法のためにＴ細胞に免疫抑制耐性を付与することができる。非限定的な例として、免疫抑制剤の標的は、例えば、限定されないが、ＣＤ５２、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）、ＦＫＢＰファミリー遺伝子メンバー、およびシクロフィリンファミリー遺伝子メンバー等の免疫抑制剤に対する受容体であり得る。
【０１９３】
いくつかの実施形態において、本発明の遺伝子組み換えは、レアカットエンドヌクレアーゼが１つの標的遺伝子における切断を特異的に触媒し、それによって標的遺伝子を不活性化するように、１つのレアカットエンドヌクレアーゼの、遺伝子操作するために提供された細胞における発現に関与する。いくつかの実施形態において、細胞を遺伝子操作する方法は、以下のステップのうちの少なくとも１つを含む：例えば、細胞培養物から、または血液試料から、Ｔ細胞を提供するステップ；免疫抑制剤の標的を発現するＴ細胞において遺伝子を選択するステップ；ＤＮＡ切断によって、例えば、免疫抑制剤の標的をコードする遺伝子の二本鎖破壊によって、選択的に不活性化することができるレアカットエンドヌクレアーゼをＴ細胞に導入するステップ、および任意選択的に免疫抑制剤の存在下で、細胞を増殖させるステップ。
【０１９４】
いくつかの実施形態において、方法は、例えば、細胞培養物から、または血液試料から、Ｔ細胞を提供すること；遺伝子が免疫抑制剤の標的を発現するＴ細胞において遺伝子を選択すること；ＤＮＡ切断によって、例えば、免疫抑制剤の標的をコードする遺伝子の二本鎖破壊によって、選択的に不活性化することができるレアカットエンドヌクレアーゼをコードする核酸をＴ細胞にトランスフェクトして、レアカットエンドヌクレアーゼをＴ細胞に発現させること；および任意選択的に免疫抑制剤の存在下で、細胞を増殖させることを含む。
【０１９５】
いくつかの実施形態において、レアカットエンドヌクレアーゼは、ＣＤ５２またはＧＲを特異的に標的とする。いくつかの実施形態において、不活性化のために選択された遺伝子はＣＤ５２をコードし、免役抑制療法はＣＤ５２抗原を標的とするヒト化抗体を含む。いくつかの実施形態において、不活性化のために選択された遺伝子はＧＲをコードし、免役抑制療法はデキサメタゾン等のコルチコステロイドを含む。いくつかの実施形態において、不活性化のために選択された遺伝子はＦＫＢＰファミリー遺伝子メンバーまたはその変異体であり、免役抑制療法はタクロリムスまたはフジマイシンとしても知られるＦＫ５０６を含む。いくつかの実施形態において、ＦＫＢＰファミリー遺伝子メンバーはＦＫＢＰ１２またはその変異体である。いくつかの実施形態において、不活性化のために選択された遺伝子はシクロフィリンファミリー遺伝子メンバーまたはその変異体であり、免役抑制療法はシクロスポリンを含む。
【０１９６】
いくつかの実施形態において、レアカットエンドヌクレアーゼは、例えば、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、またはＴＡＬＥ−ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）であり得る。いくつかの実施形態において、レアカットエンドヌクレアーゼはＴＡＬＥ−ヌクレアーゼである。
【０１９７】
また、免疫療法に適したＴ細胞を遺伝子操作する方法も本明細書に提供され、方法は、少なくとも免疫チェックポイントタンパク質を不活性化することによりＴ細胞を遺伝子組み換えすることを含む。いくつかの実施形態において、免疫チェックポイントタンパク質は、例えば、ＰＤ−１および／またはＣＴＬＡ−４である。いくつかの実施形態において、細胞を遺伝子組み換えする方法は、少なくとも１つの免疫チェックポイントタンパク質を不活性化することによりＴ細胞を修飾すること、および細胞を増殖させることを含む。免疫チェックポイントタンパク質は、限定されないが、免疫細胞を直接阻害する、プログラム死１（ＰＤ−１、ＰＤＣＤ１またはＣＤ２７９としても知られる、受託番号：ＮＭ＿００５０１８）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４、ＣＤ１５２としても知られる、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ４１４１２０．１）、ＬＡＧ３（ＣＤ２２３としても知られる、受託番号：ＮＭ＿００２２８６．５）、Ｔｉｍ３（ＨＡＶＣＲ２としても知られる、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＪＸ０４９９７９．１）、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２としても知られる、受託番号：ＮＭ＿１８１７８０．３）、ＢＹ５５（ＣＤ１６０としても知られる、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＣＲ５４１８８８．１）、ＴＩＧＩＴ（ＶＳＴＭ３としても知られる、受託番号：ＮＭ＿１７３７９９）、Ｂ７Ｈ５（Ｃ１０ｏｒｆ５４としても知られる、マウスＶＩＳＴＡ遺伝子の相同体、受託番号：ＮＭ＿０２２１５３．１）、ＬＡＩＲ１（ＣＤ３０５としても知られる、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＣＲ５４２０５１．１）、ＳＩＧＬＥＣ１０（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号：ＡＹ３５８３３７．１）、２Ｂ４（ＣＤ２４４としても知られる、受託番号：ＮＭ＿００１１６６６６４．１）。例えば、ＣＴＬＡ−４は、ある特定のＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞上に発現される細胞表面タンパク質であり、抗原提示細胞上でそのリガンド（Ｂ７−１およびＢ７−２）によって会合されると、Ｔ細胞活性化およびエフェクター機能が阻害される。
【０１９８】
いくつかの実施形態において、細胞を遺伝子操作するための上記方法は、以下のステップのうちの少なくとも１つを含む：例えば、細胞培養物から、または血液試料から、Ｔ細胞を提供するステップ；ＤＮＡ切断によって、例えば、免疫チェックポイントタンパク質をコードする１つの遺伝子の二本鎖破壊によって、選択的に不活性化することができるレアカットエンドヌクレアーゼをＴ細胞に導入するステップ；および細胞を増殖させるステップ。いくつかの実施形態において、方法は、例えば、細胞培養物から、または血液試料から、Ｔ細胞を提供すること；ＤＮＡ切断によって、例えば、免疫チェックポイントタンパク質をコードする遺伝子の二本鎖破壊によって、選択的に不活性化することができるレアカットエンドヌクレアーゼをコードする核酸を上記Ｔ細胞にトランスフェクトすること；レアカットエンドヌクレアーゼをＴ細胞に発現させること；細胞を増殖させることを含む。いくつかの実施形態において、レアカットエンドヌクレアーゼは、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３、Ｔｉｍ３、ＢＴＬＡ、ＢＹ５５、ＴＩＧＩＴ、Ｂ７Ｈ５、ＬＡＩＲ１、ＳＩＧＬＥＣ１０、２Ｂ４、ＴＣＲα、およびＴＣＲβからなる群から選択される遺伝子を特異的に標的とする。いくつかの実施形態において、レアカットエンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはＴＡＬＥ−ヌクレアーゼであり得る。いくつかの実施形態において、レアカットエンドヌクレアーゼはＴＡＬＥ−ヌクレアーゼである。
【０１９９】
いくつかの実施形態において、本発明は、同種免疫療法に特に適切であり得る。そのような実施形態において、細胞は、Ｔ細胞中のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の成分をコードする少なくとも１つの遺伝子を不活性化すること、およびＴ細胞を増殖させることを含む方法によって改変されてもよい。いくつかの実施形態において、本方法の遺伝子組み換えは、レアカットエンドヌクレアーゼが１つの標的遺伝子における切断を特異的に触媒し、それによって標的遺伝子を不活性化するように、１つのレアカットエンドヌクレアーゼの、遺伝子操作するために提供された細胞における発現に依存する。いくつかの実施形態において、細胞を遺伝子操作する上記方法は、以下のステップのうちの少なくとも１つを含む：例えば、細胞培養物から、または血液試料から、Ｔ細胞を提供するステップ；ＤＮＡ切断によって、例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の成分をコードする少なくとも１つの遺伝子の二本鎖破壊によって、選択的に不活性化することができるレアカットエンドヌクレアーゼをＴ細胞に導入するステップ、および細胞を増殖させるステップ。
【０２００】
いくつかの実施形態において、方法は、例えば、細胞培養物から、または血液試料から、Ｔ細胞を提供すること；ＤＮＡ切断によって、例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の成分をコードする少なくとも１つの遺伝子の二本鎖破壊によって、選択的に不活性化することができるレアカットエンドヌクレアーゼをコードする核酸を上記Ｔ細胞にトランスフェクトすること；レアカットエンドヌクレアーゼをＴ細胞に発現させること；細胞表面上でＴＣＲを発現しない形質転換されたＴ細胞を選別すること；および細胞を増殖させることを含む。
【０２０１】
いくつかの実施形態において、レアカットエンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはＴＡＬＥ−ヌクレアーゼであり得る。いくつかの実施形態において、レアカットエンドヌクレアーゼはＴＡＬＥ−ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼは、ＴＣＲαまたはＴＣＲβをコードする配列を認識して切断する。いくつかの実施形態において、ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼは、配列番号２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、または２２６に示されるアミノ酸配列から選択されるポリペプチド配列を含む。
ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼのポリペプチド配列：
反復配列ＴＲＡＣ＿Ｔ０１−Ｌ
ＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＮＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＮＩＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＡＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＮＩＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＡＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＮＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＮＩＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＡＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＮＩＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＡＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＲＰＡＬＥ（配列番号２１９）
反復配列ＴＲＡＣ＿Ｔ０１−Ｒ
ＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＮＩＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＡＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＮＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＮＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＮＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＮＩＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＡＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＮＩＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＡＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＮＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＲＰＡＬＥ（配列番号２２０）
反復配列ＴＲＢＣ＿Ｔ０１−Ｌ
ＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＮＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＮＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＮＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＮＩＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＡＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＮＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＮＩＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＡＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＮＩＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＡＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＲＰＡＬＥ（配列番号２２１）
反復配列ＴＲＢＣ＿Ｔ０１−Ｒ
ＮＰＱＲＳＴＶＷＹＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＮＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＮＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＮＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＮＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＮＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＮＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＮＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＲＰＡＬＥ（配列番号２２２）
反復配列ＴＲＢＣ＿Ｔ０２−Ｌ
ＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＮＩＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＡＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＮＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＮＩＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＡＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＮＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＮＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＮＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＲＰＡＬＥ（配列番号２２３）
反復配列ＴＲＢＣ＿Ｔ０２−Ｒ
ＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＮＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＮＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＮＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＮＩＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＡＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＮＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＮＩＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＡＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＮＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＲＰＡＬＥ（配列番号２２４）
反復配列ＣＤ５２＿Ｔ０２−Ｌ
ＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＮＩＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＡＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＮＩＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＡＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＮＩＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＡＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＲＰＡＬＥ（配列番号２２５）
反復配列ＣＤ５２＿Ｔ０２−Ｒ
ＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＮＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＮＩＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＡＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＮＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＮＩＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＡＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＲＰＡＬＥ（配列番号２２６）
【０２０２】
別の態様において、細胞を遺伝子組み換えする１つの別のステップは、ｐＴα（プレＴＣＲαとしても知られる）またはその機能的変異体をＴ細胞に導入し、任意選択的にＣＤ３複合体の刺激を介して該細胞を増殖させることを含む、ＴＣＲα欠損Ｔ細胞を増殖させる方法であってもよい。いくつかの実施形態において、方法は、ａ）ＣＤ３表面発現を支持するために少なくともｐＴαの断面をコードする核酸を細胞にトランスフェクトすること、ｂ）上記ｐＴαを細胞に発現させること、およびｃ）任意選択的にＣＤ３複合体の刺激を介して該細胞を増殖させることを含む。
【０２０３】
また、Ｔ細胞の増殖のための方法のステップを含む、免疫療法のためにＴ細胞を調製する方法も提供される。いくつかの実施形態において、ｐＴαポリヌクレオチド配列は、ランダムに、または相同組換えによって導入することができる。いくつかの実施形態において、挿入は、ＴＣＲα遺伝子の不活性化に関連し得る。
【０２０４】
ｐＴαの異なる機能的変異体が使用されてもよい。ペプチドの「機能的変異体」は、ペプチド全体またはその断片のいずれかに実質的に類似する分子を指す。ｐＴαまたはその機能的変異体の「断片」は、分子の任意のサブセット、すなわち、全長ｐＴαよりも短いペプチドを指す。いくつかの実施形態において、ｐＴαまたは機能的変異体は、例えば、全長ｐＴαまたはＣ末端切断ｐＴα型であり得る。Ｃ末端切断ｐＴαは、Ｃ末端に１つ以上の残基を欠く。非限定的な例として、Ｃ末端切断ｐＴα型は、タンパク質のＣ末端から１８、４８、６２、７８、９２、１１０または１１４個の残基を欠く。ペプチドのアミノ酸配列変異体は、ペプチドをコードするＤＮＡにおける突然変異によって調製することができる。そのような機能的変異体は、アミノ酸配列内の残基の、例えば、欠失、または挿入もしくは置換を含む。欠失、挿入、および置換の任意の組み合わせもまた最終構築物に到達するために作製され得るが、但し、最終構築物は、所望の活性、具体的には機能的ＣＤ３複合体の修復を有するものとする。例示的な実施形態において、二量体化に影響を与えるように、少なくとも１つの突然変異が上述の異なるｐＴα型に導入される。非限定的な例として、突然変異した残基は、ヒトｐＴαタンパク質の少なくともＷ４６Ｒ、Ｄ２２Ａ、Ｋ２４Ａ、Ｒ１０２ＡもしくはＲ１１７Ａ、またはｐＴαファミリーもしくは相同体メンバーにＣＬＵＳＴＡＬＷ法を用いて整列させた位置であり得る。例えば、上述のｐＴαまたはその変異体は、突然変異した残基Ｗ４６Ｒまたは突然変異した残基Ｄ２２Ａ、Ｋ２４Ａ、Ｒ１０２ＡおよびＲ１１７Ａを含む。いくつかの実施形態において、上記ｐＴαまたは変異体はまた、非限定的な例としてＣＤ２８、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）およびＣＤ８等のシグナル伝達ドメインに融合される。上述のｐＴαまたは変異体の細胞外ドメインは、ＴＣＲαタンパク質の断片、特にＴＣＲαの膜貫通および細胞内ドメインに融合することができる。ｐＴα変異体はまた、ＴＣＲαの細胞内ドメインに融合することもできる。
【０２０５】
いくつかの実施形態において、ｐＴα型は、細胞外リガンド結合ドメインに融合することができる。いくつかの実施形態において、ｐＴαまたはその機能的変異体は、柔軟なリンカーによって連結された標的抗原特異的モノクローナル抗体の軽鎖および重鎖可変断片を含む単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）に融合される。
【０２０６】
「ＴＣＲα欠損Ｔ細胞」という用語は、機能的ＴＣＲα鎖の発現を欠く単離されたＴ細胞を指すこれは、異なる手段によって達成され得、非限定的な例として、Ｔ細胞がその細胞表面上でいずれの機能的ＴＣＲαも発現しないようにＴ細胞を遺伝子操作することによって、またはＴ細胞がその表面上でごく少量の機能的ＴＣＲα鎖を産生するようにＴ細胞を遺伝子操作することによって、またはＴＣＲα鎖の突然変異もしくは切断型を発現するようにＴ細胞を遺伝子操作することによって、達成され得る。ＴＣＲα欠損細胞は、もはやＣＤ３複合体を介して増殖することはできない。したがって、この問題を克服し、ＴＣＲα欠損細胞の増殖を可能にするために、ｐＴαまたはその機能的変異体を細胞に導入し、そうすることで機能的ＣＤ３複合体を修復する。いくつかの実施形態において、方法は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の１つの成分をコードする１つの遺伝子のＤＮＡ切断によって選択的に不活性化することができるレアカットエンドヌクレアーゼを上記Ｔ細胞に導入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、レアカットエンドヌクレアーゼはＴＡＬＥ−ヌクレアーゼである。
【０２０７】
いくつかの実施形態において、本発明によるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、電気穿孔によって細胞内に直接的に導入されるｍＲＮＡであり得る。いくつかの実施形態において、ｃｙｔｏＰｕｌｓｅ技術を用いて、細胞内に材料を送達するために生細胞を一時的に透過性にすることができる。パラメータは、最小限の死亡率を伴う高トランスフェクション効率のための条件を決定するために改変することができる。
【０２０８】
また、Ｔ細胞をトランスフェクトする方法も本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、方法は、Ｔ細胞をＲＮＡと接触させることと、（ａ）１センチメートル当たり約２２５０〜３０００Ｖの電圧範囲の電気パルス；（ｂ）０．１ｍｓのパルス幅；（ｃ）ステップ（ａ）とステップ（ｂ）の電気パルスの間の約０．２〜１０ｍｓのパルス間隔；（ｄ）約１００ｍｓのパルス幅、およびステップ（ｂ）の電気パルスとステップ（ｃ）の第１の電気パルスとの間の約１００ｍｓのパルス間隔を伴う、約２２５０〜３０００Ｖの電圧範囲の電気パルス；ならびに（ｅ）約０．２ｍｓのパルス幅および４回の電気パルスの各々の間の２ｍｓのパルス間隔を伴う、約３２５Ｖの電圧の４つの電気パルスからなるアジャイルパルスシーケンスをＴ細胞に印加することと、を含む。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞をトランスフェクトする方法は、上記Ｔ細胞をＲＮＡと接触させることと、（ａ）１センチメートル当たり約２２５０、２３００、２３５０、２４００、２４５０、２５００、２５５０、２４００、２４５０、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００または３０００Ｖの電圧の電気パルス；（ｂ）０．１ｍｓのパルス幅；（ｃ）ステップ（ａ）とステップ（ｂ）の電気パルスの間の約０．２、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ｍｓのパルス間隔；（ｄ）１００ｍｓのパルス幅、およびステップ（ｂ）の電気パルスとステップ（ｃ）の第１の電気パルスとの間の１００ｍｓのパルス間隔を伴う、約２２５０、２２５０、２３００、２３５０、２４００、２４５０、２５００、２５５０、２４００、２４５０、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００または３０００Ｖの電圧範囲の１つの電気パルス、および（ｅ）約０．２ｍｓのパルス幅および４回の電気パルスの各々の間の約２ｍｓのパルス間隔を伴う、約３２５Ｖの電圧の４つの電気パルスからなるアジャイルパルスシーケンスをＴ細胞に印加することとを含む。上述の値の範囲に含まれる任意の値が、本出願において開示される。電気穿孔培地は、当該技術分野で既知の任意の適切な培地であり得る。いくつかの実施形態において、電気穿孔培地は、約０．０１〜約１．０ミリシーメンスに及ぶ範囲の伝導性を有する。
【０２０９】
いくつかの実施形態において、非限定的な例として、ＲＮＡは、レアカッティングエンドヌクレアーゼ、半ＴＡＬＥヌクレアーゼ等のレアカッティングエンドヌクレアーゼの１つのモノマー、ＣＡＲ、多鎖キメラ抗原受容体の少なくとも１つの成分、ｐＴαまたはその機能性変異体、外因性核酸、および／または１つの追加の触媒ドメインをコードする。
【０２１０】
遺伝子操作された免疫細胞
本発明はまた、本明細書に記載のＣＡＲポリヌクレオチドのいずれかを含む遺伝子操作された免疫細胞も提供する。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、プラスミドベクターを介して導入遺伝子として免疫細胞に導入することができる。いくつかの実施形態において、プラスミドベクターは、例えば、ベクターを受容する細胞の同定および／または選択を提供する選択マーカーも含有し得る。
【０２１１】
ＣＡＲポリペプチドは、細胞にＣＡＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入した後に、細胞内でインサイツで合成されてもよい。代替として、ＣＡＲポリペプチドは、細胞外で産生して、次いで細胞に導入してもよい。ポリヌクレオチド構築物を細胞に導入するための方法は、当該技術分野で既知である。いくつかの実施形態において、安定な形質転換法を用いて、ポリヌクレオチド構築物を細胞のゲノムに組み込むことができる。他の実施形態において、一過性形質転換法を用いて、ポリヌクレオチド構築物を一過性に発現させることができ、ポリヌクレオチド構築物は細胞のゲノムに組み込まれない。他の実施形態において、ウイルス媒介法が用いられてもよい。ポリヌクレオチドは、例えば、組換えウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス）、リポソーム等の任意の適切な手段によって細胞に導入され得る。一過性形質転換法として、例えば、限定されないが、マイクロインジェクション、電気穿孔または微粒子中が挙げられる。ポリヌクレオチドは、例えば、プラスミドベクターまたはウイルスベクター等のベクターに含まれてもよい。
【０２１２】
また、本明細書に提供される細胞を遺伝子操作する上述の方法によって得られる単離された細胞および細胞株も本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、単離された細胞は、少なくとも１つの上述のＣＡＲを含む。いくつかの実施形態において、単離された細胞は、各ＣＡＲが異なる細胞外リガンド結合ドメインを含むＣＡＲの集団を含む。
【０２１３】
また、上述の方法のいずれか１つに従って得られる免疫細胞も本明細書に提供される。異種ＤＮＡを発現させることができる任意の免疫細胞を、対象となるＣＡＲを発現させる目的に使用することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲのいずれか１つを発現させるために使用される免疫細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態において、ＣＡＲを発現させるために使用される免疫細胞は、例えば、限定されないが、幹細胞に由来し得る。幹細胞は、成人幹細胞、非ヒト胚性幹細胞、より具体的には非ヒト幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、人工多能性幹細胞、全能性幹細胞または造血幹細胞であり得る。代表的なヒト幹細胞はＣＤ３４＋細胞である。
【０２１４】
いくつかの実施形態において、細胞表面膜に本発明のＦＬＴ３特異的ＣＡＲを発現する遺伝子操作された免疫細胞は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、または６０％を超える幹細胞メモリーおよび中枢メモリー細胞の割合を含む。いくつかの実施形態において、細胞表面膜に本発明のＦＬＴ３特異的ＣＡＲを発現する遺伝子操作された免疫細胞は、約１０％〜約６０％、約１０％〜約５０％、約１０％〜約４０％、約１５％〜約５０％、約１５％〜約４０％、約２０％〜約６０％、または約２０％〜約７０％の幹細胞メモリーおよび中枢メモリー細胞の割合を含む。
【０２１５】
いくつかの実施形態において、幹細胞メモリーおよび中枢メモリー細胞の割合は、実施例２ｄに開示されるように測定される。
【０２１６】
本明細書に記載のＣＡＲのいずれか１つを発現させるために使用される免疫細胞はまた、樹状細胞、キラー樹状細胞、肥満細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、または炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、調節性Ｔリンパ球もしくはヘルパーＴリンパ球からなる群から選択されるＴ細胞であり得る。いくつかの実施形態において、細胞は、ＣＤ４＋Ｔリンパ球およびＣＤ８＋Ｔリンパ球からなる群に由来し得る。
【０２１７】
一実施形態において、免疫細胞は、本明細書に記載のＣＡＲのいずれか１つを発現させる炎症性Ｔリンパ球である。一実施形態において、免疫細胞は、本明細書に記載のＣＡＲのいずれか１つを発現させる細胞傷害性Ｔリンパ球である。一実施形態において、免疫細胞は、本明細書に記載のＣＡＲのいずれか１つを発現させる調節性Ｔリンパ球である。一実施形態において、免疫細胞は、本明細書に記載のＣＡＲのいずれか１つを発現させるヘルパーＴリンパ球である。
【０２１８】
また、上述の方法のいずれかに従って形質転換されたＴ細胞から得られる細胞株も本明細書に提供される。また、免役抑制療法に耐性を示す改変された細胞も本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、本発明による単離された細胞は、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む。
【０２１９】
本発明の免疫細胞は、例えば、限定されないが、米国特許第６，３５２，６９４号、第６，５３４，０５５号、第６，９０５，６８０号、第６，６９２，９６４号、第５，８５８，３５８号、第６，８８７，４６６号、第６，９０５，６８１号、第７，１４４，５７５号、第７，０６７，３１８号、第７，１７２，８６９号、第７，２３２，５６６号、第７，１７５，８４３号、第５，８８３，２２３号、第６，９０５，８７４号、第６，７９７，５１４号、第６，８６７，０４１号、および米国特許出願公開第２００６０１２１００５号に概説される方法を用いて、Ｔ細胞の遺伝子組み換えの前または後のいずれかに活性化および増殖させることができる。Ｔ細胞はインビトロまたはインビボで増殖させることができる。一般に、本発明のＴ細胞は、例えば、Ｔ細胞の表面上でＣＤ３  ＴＣＲ複合体および共刺激分子を刺激してＴ細胞の活性化シグナルを発生させる作用物質との接触によって増殖させることができる。例えば、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）、またはフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）のような分裂促進性レクチン等の化学物質を使用して、Ｔ細胞の活性化シグナルを発生させることができる。
【０２２０】
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞集団は、例えば、表面上に固定化された抗ＣＤ３抗体もしくはその抗原結合断片、または抗ＣＤ２抗体との接触によって、あるいはカルシウムイオノフォアと併せたプロテインキナーゼＣ活性化因子（例えば、ブリオスタチン）との接触によって、インビトロで刺激することができる。Ｔ細胞表面上のアクセサリー分子の共刺激には、アクセサリー分子に結合するリガンドが使用される例えば、Ｔ細胞の集団を、Ｔ細胞の増殖を刺激するのに適した条件下で、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と接触させることができる。Ｔ細胞培養に適切な条件は、血清（例えば、ウシ胎仔血清）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＴＧＦｐ、およびＴＮＦ、または当業者に基地の細胞成長用の他の添加剤を含む、増殖および生存に必要な因子を含有し得る適切な培地（例えば、最小必須培地またはＲＰＭＩ培地１６４０、またはＸ−ｖｉｖｏ  ５、（Ｌｏｎｚａ））を含む。細胞成長用の他の添加剤として、限定されないが、界面活性剤、プラズマネート、および還元剤、例えば、Ｎ−アセチル−システインおよび２−メルカプトエタノールが挙げられる。培地は、無血清、あるいは適切な量の血清（もしくは血漿）または所定のホルモンのセット、ならびに／またはＴ細胞の成長および増殖に十分な量のサイトカイン（複数可）を補充したかのいずれかの、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、およびビタミンを添加した、ＲＰＭＩ  １６４０、Ａ１Ｍ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ａ−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｘ−Ｖｉｖｏ  １、およびＸ−Ｖｉｖｏ  ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒを含み得る。抗生物質、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンは、実験培養物にのみ含まれ、対象に注入される細胞の培養物には含まれない。標的細胞は、成長を支持するのに必要な条件下で、例えば、適切な温度（例えば、３７℃）および雰囲気（例えば、空気＋５％ＣＯ２）下で維持される。様々な刺激時間に曝露されたＴ細胞は、異なる特徴を示し得る。
【０２２１】
いくつかの実施形態において、本発明の細胞は、組織または細胞と共培養することによって増殖させることができる。細胞はまた、インビボで、例えば、対象に細胞を投与した後に対象の血液中で増殖させることもできる。
【０２２２】
いくつかの実施形態において、本発明による単離された細胞は、ＣＤ５２、ＧＲ、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３、Ｔｉｍ３、ＢＴＬＡ、ＢＹ５５、ＴＩＧＩＴ、Ｂ７Ｈ５、ＬＡＩＲ１、ＳＩＧＬＥＣ１０、２Ｂ４、ＨＬＡ、ＴＣＲαおよびＴＣＲβからなる群から選択される１つの不活性化遺伝子を含み、かつ／またはＣＡＲ、多鎖ＣＡＲ、および／もしくはｐＴα導入遺伝子を発現する。いくつかの実施形態において、単離された細胞は、多鎖ＣＡＲを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、本発明による単離された細胞は、ＣＤ５２およびＧＲ、ＣＤ５２およびＴＣＲα、ＣＤＲ５２およびＴＣＲβ、ＧＲおよびＴＣＲα、ＧＲおよびＴＣＲβ、ＴＣＲαおよびＴＣＲβ、ＰＤ−１およびＴＣＲα、ＰＤ−１およびＴＣＲβ、ＣＴＬＡ−４およびＴＣＲα、ＣＴＬＡ−４およびＴＣＲβ、ＬＡＧ３およびＴＣＲα、ＬＡＧ３およびＴＣＲβ、Ｔｉｍ３およびＴＣＲα、Ｔｉｍ３およびＴＣＲβ、ＢＴＬＡおよびＴＣＲα、ＢＴＬＡおよびＴＣＲβ、ＢＹ５５およびＴＣＲα、ＢＹ５５およびＴＣＲβ、ＴＩＧＩＴおよびＴＣＲα、ＴＩＧＩＴおよびＴＣＲβ、Ｂ７Ｈ５およびＴＣＲα、Ｂ７Ｈ５およびＴＣＲβ、ＬＡＩＲ１およびＴＣＲα、ＬＡＩＲ１およびＴＣＲβ、ＳＩＧＬＥＣ１０およびＴＣＲα、ＳＩＧＬＥＣ１０およびＴＣＲβ、２Ｂ４およびＴＣＲα、２Ｂ４およびＴＣＲβからなる群から選択される２つの不活性化遺伝子を含み、かつ／またはＣＡＲ、多鎖ＣＡＲ、およびｐＴα導入遺伝子を発現する。
【０２２３】
いくつかの実施形態において、ＴＣＲは、ＴＣＲα遺伝子および／またはＴＣＲβ遺伝子（複数可）を不活性化することにより本発明による細胞において機能的ではなくなる。いくつかの実施形態において、個体に由来する改変された細胞を得るための方法が提供され、細胞は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）シグナル伝達経路とは無関係に増殖することができる。本発明によって得れらやすい、ＭＨＣシグナル伝達経路とは無関係に増殖することができる改変された細胞は、本発明の範囲に包含される本明細書に開示される改変された細胞は、宿主対移植片（ＨｖＧ）拒絶反応および移植片対宿主疾患（ＧｖＨＤ）に対して、それを必要とする個体を治療する際に使用することができ、したがって、上記個体に不活性化されたＴＣＲαおよび／またはＴＣＲβ遺伝子を含む有効量の改変された細胞を投与することを含む、宿主対移植片（ＨｖＧ）拒絶反応および移植片対宿主疾患（ＧｖＨＤ）に対してそれを必要とする患者を治療する方法は、本発明の範囲内である。
【０２２４】
いくつかの実施形態において、免疫細胞は１つ以上の化学療法薬に対して耐性であるように遺伝子操作される。化学療法薬は、例えば、プリンヌクレオチド類似体（ＰＮＡ）であってもよく、したがって、免疫細胞を養子免疫療法と化学療法を組み合わせた癌治療に適したものにする。例示的なＰＮＡとして、例えば、単独のまたは組み合わせた、クロファラビン、フルダラビン、およびシタラビンが挙げられる。ＰＮＡは、デオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）によってモノ−、ジ−、およびトリ−リン酸ＰＮＡに代謝される。これらのトリ−リン酸形態は、ＤＮＡ合成についてＡＴＰと競合し、アポトーシス促進剤として作用し、トリヌクレオチド産生に関与するリボヌクレオチドレダクターゼ（ＲＮＲ）の強力な阻害剤である。不活性化されたｄＣＫ遺伝子を含むＦＬＴ３特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、ｄＣＫノックアウト細胞は、例えば、ｍＲＮＡの電気穿孔によってｄＣＫ遺伝子に向けられた特異的ＴＡＬ−ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを用いて、Ｔ細胞のトランスフェクションによって作製される。ｄＣＫノックアウトＦＬＴ３特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、例えば、クロファラビンおよび／またはフルダラビンを含むＰＮＡに耐性を示し、ＦＬＴ３を発現する細胞に対するＴ細胞細胞傷害活性を維持する。
【０２２５】
いくつかの実施形態において、本発明の単離された細胞または細胞株は、ｐＴαまたはその機能的変異体を含み得る。いくつかの実施形態において、単離された細胞または細胞株は、ＴＣＲα遺伝子を不活性化することによりさらに遺伝子組み換えされ得る。
【０２２６】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、例えばＲＱＲ８等の自殺ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１３１５３３９１Ａを参照されたい。ポリヌクレオチドを含むＣＡＲ−Ｔ細胞において、ＣＡＲ−Ｔ細胞の表面に自殺ポリペプチドを発現させる。いくつかの実施形態において、自殺ポリペプチドは、配列番号２２７に示されるアミノ酸配列を含む。
ＣＰＹＳＮＰＳＬＣＳＧＧＧＧＳＥＬＰＴＱＧＴＦＳＮＶＳＴＮＶＳＰＡＫＰＴＴＴＡＣＰＹＳＮＰＳＬＣＳＧＧＧＧＳＰ  ＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳ  ＬＶＩＴＬＹＣＮＨＲＮＲＲＲＶＣＫＣＰＲＰＶＶ（配列番号２２７）
【０２２７】
自殺ポリペプチドは、アミノ末端にシグナルペプチドも含み得る。いくつかの実施形態において、自殺ポリペプチドは、配列番号２２８に示されるアミノ酸配列を含む。
ＭＧＴＳＬＬＣＷＭＡＬＣＬＬＧＡＤＨＡＤＡＣＰＹＳＮＰＳＬＣＳＧＧＧＧＳＥＬＰＴＱＧＴＦＳＮＶＳＴＮＶＳＰＡＫＰＴＴＴＡＣＰＹＳＮＰＳＬＣＳＧＧＧＧＳＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＮＨＲＮＲＲＲＶＣＫＣＰＲＰＶＶ（配列番号２２８）
【０２２８】
自殺ポリペプチドをＣＡＲ−Ｔ細胞の表面に発現させる場合、リツキシマブのポリペプチドのリツキシマブエピトープへの結合が細胞の溶解を引き起こす。１つより多くのリツキシマブの分子が、細胞表面に発現されるポリペプチドごとに結合し得る。ポリペプチドの各リツキシマブエピトープは、リツキシマブの別個の分子に結合し得る。例えば、対象にリツキシマブを投与することにより、ＦＬＴ３特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の欠失がインビボで起こり得る。移入された細胞を欠失させる決定は、例えば、容認できないレベルの毒性が検出される場合等、移入された細胞に起因する、対象において検出される望ましくない効果から生じ得る。
【０２２９】
いくつかの実施形態において、患者に投与されると、細胞表面に本明細書に記載のＦＬＴ３特異的ＣＡＲのいずれか１つを発現する遺伝子操作された免疫細胞は、患者の内在性ＦＬＴ３を発現する細胞を減少させる、死滅させる、または溶解することができる。一実施形態において、本明細書に記載のＦＬＴ３特異的ＣＡＲのいずれか１つを発現する遺伝子操作された免疫細胞による、ＦＬＴ３を発現する内在性細胞またはＦＬＴ３を発現する細胞株の細胞の縮小または溶解の割合は、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％以上である。一実施形態において、本明細書に記載のＦＬＴ３特異的ＣＡＲのいずれか１つを発現する遺伝子操作された免疫細胞による、ＦＬＴ３を発現する内在性細胞またはＦＬＴ３を発現する細胞株の細胞の縮小または溶解の割合は、約５％〜約９５％、約１０％〜約９５％、約１０％〜約９０％、約１０％〜約８０％、約１０％〜約７０％、約１０％〜約６０％、約１０％〜約５０％、約１０％〜約４０％、約２０％〜約９０％、約２０％〜約８０％、約２０％〜約７０％、約２０％〜約６０％、約２０％〜約５０％、約２５％〜約７５％、または約２５％〜約６０％である。一実施形態において、内在性ＦＬＴ３を発現する細胞は、内在性ＦＬＴ３を発現する骨髄細胞である。
【０２３０】
一実施形態において、細胞表面膜に本発明のＦＬＴ３特異的ＣＡＲを発現する遺伝子操作された免疫細胞による、標的細胞、例えば、ＦＬＴ３を発現する細胞株の縮小または溶解の割合は、実施例２ｅに開示されるアッセイを用いて測定することができる。
【０２３１】
ＣＡＲ陽性免疫細胞を選別するための方法
一態様において、免疫細胞集団のインビトロ選別のための方法が提供され、免疫細胞集団のサブセットは、本明細書に記載のモノクローナル抗体に特異的なエピトープを含むＦＬＴ３特異的ＣＡＲのいずれか１つを発現する遺伝子操作された免疫細胞を含む。方法は、免疫細胞集団をエピトープに特異的なモノクローナル抗体と接触させることと、モノクローナル抗体に結合する免疫細胞を選択して、ＦＬＴ３特異的ＣＡＲを発現する遺伝子操作された免疫細胞が濃縮された細胞集団を得ることと、を含む。
【０２３２】
いくつかの実施形態において、上記エピトープに特異的な上記モノクローナル抗体は、任意選択的にフルオロフォアにコンジュゲートされる。この実施形態において、モノクローナル抗体に結合する細胞を選択するステップは、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって行われ得る。いくつかの実施形態において、上記エピトープに特異的な上記モノクローナル抗体は、任意選択的に磁器粒子にコンジュゲートされる。この実施形態において、モノクローナル抗体に結合する細胞を選択するステップは、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）によって行われ得る。
【０２３３】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、配列番号２６２のｍＡｂ特異的エピトープを含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、配列番号２６２のｍＡｂ特異的エピトープを含み、免疫細胞集団を接触させるために使用される抗体はＱＢＥＮＤ−１０である。
【０２３４】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、配列番号２２９のｍＡｂ特異的エピトープを含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、配列番号２２９のｍＡｂ特異的エピトープを含み、免疫細胞集団を接触させるために使用される抗体はリツキシマブである。
【０２３５】
いくつかの実施形態において、上述の免疫細胞のインビトロ選別のための方法を用いて得られるＦＬＴ３  ＣＡＲ発現免疫細胞の集団は、ＦＬＴ３  ＣＡＲ発現免疫細胞の少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％を含む。いくつかの実施形態において、上述のＣＡＲ発現免疫細胞のインビトロ選別のための方法を用いて得られるＦＬＴ３  ＣＡＲ発現免疫細胞の集団は、ＦＬＴ３  ＣＡＲ発現免疫細胞の少なくとも８５％を含む。
【０２３６】
いくつかの実施形態において、インビトロ選別法に使用されるｍＡｂは、当業者によって日常的に実現されるようなカラムまたはビーズ等の支持体に先に結合される。いくつかの実施形態において、ＣＡＲを発現する免疫細胞はＴ細胞である。
【０２３７】
本発明によれば、レシピエントに投与される細胞は、起源集団からインビトロで濃縮され得る。起源集団を増殖させる方法は当該技術分野において周知であり、当業者に周知の密度遠心分離、免疫磁気ビーズ精製、アフィニティクロマトグラフィ、および蛍光活性化細胞選別の組み合わせを用いた、ＣＤ３４抗原等の抗原を発現する細胞の選択を含み得る。
【０２３８】
フローサイトメトリーは、当該技術分野において広く使用されており、細胞集団内の特定の細胞型を選別および定量化するための、当業者に周知の方法である。一般に、フローサイトメトリーは、主として光学的手段によって、細胞の成分または構造的特性を定量化するための方法である。構造的特性を定量化することによって異なる細胞型を区別することができるため、フローサイトメトリーおよび細胞選別は、混合物中の異なる表現型の細胞を計数および選別するために使用することができる。
【０２３９】
フローサイトメトリー分析は、２つの基本的なステップを含む：１）選択された細胞型を、１つ以上の標識されたマーカーによって標識するステップ、および２）集団内の細胞の総数に対する標識された細胞の数を決定するステップ。
【０２４０】
細胞型を標識する主な方法は、標識された抗体を、特定の細胞型によって発現されるマーカーに結合させることによる。抗体は、蛍光化合物で直接標識されるか、または、例えば、一次抗体を認識する蛍光標識された二次抗体を使用して間接的にかのいずれかで標識される。
【０２４１】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲを発現する免疫細胞を選別するために用いられる方法は、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）である。
【０２４２】
磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）は、超常磁性ナノ粒子およびカラムを使用することにより、表面抗原（ＣＤ分子）に応じて種々の細胞集団の分離のための方法である。それは、純粋な細胞集団を得るために少数の単純なステップを要する。単一細胞懸濁駅中の細胞を、ミクロビーズで磁気的に標識する。細胞に優しいコーティングで覆われた強磁性球から構成されるカラムに試料を適用し、細胞の迅速かつ穏やかな分離を可能にする。未標識の細胞は通過するが、磁気的に標識された細胞はカラム内に保持される。フロースルーは、未標識の細胞画分として収集することができる。短い洗浄ステップの後、カラムを分離機から取り外し、磁気的に標識された細胞をカラムから溶出させる。
【０２４３】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲを発現する免疫細胞を選別するための方法に使用されるｍＡｂは、アレムツズマブ、イブリツモマブチウキセタン、ムロモナブ−ＣＤ３、トシツモマブ、アブシキシマブ、バシリキシマブ、ブレンツキシマブベドチン、セツキシマブ、インフリキシマブ、リツキシマブ、ベバシズマブ、セルトリズマブペゴル、ダクリズマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、ゲムツズマブ、ナタリズマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、ラニビズマブ、トシリズマブ、トラスツズマブ、ベドリズマブ、アダリムマブ、ベリムマブ、カナキヌマブ、デノスマブ、ゴリムマブ、イピリムマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、ＱＢＥＮＤ−１０および／またはウステキヌマブから選択される。いくつかの実施形態において、上記ｍＡｂはリツキシマブである。別の実施形態において、上記ｍＡｂはＱＢＥＮＤ−１０である。
【０２４４】
治療用途
ＦＬＴ３特異的ＣＡＲを発現する、上述の方法によって得られる単離された細胞、またはそのような単離された細胞に由来する細胞株は、薬物として使用することができる。同様に、本明細書に開示されるＦＬＴ３特異的抗体も、薬物として使用することができる。いくつかの実施形態において、そのような薬物は、ＦＬＴ３関連疾患または障害を治療するために使用することができる。いくつかの実施形態において、ＦＬＴ３関連疾患または障害は、ＦＬＴ３を発現する悪性細胞、例えば、癌を含む。いくつかの実施形態において、癌は、リンパ腫または白血病等の造血系起源の癌である。いくつかの実施形態において、癌は、多発性骨髄腫  悪性形質細胞腫瘍、ホジキンリンパ腫、結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫、カーレル病および骨髄腫症、形質細胞性白血病、形質細胞腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、ヘアリーセル白血病、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、濾胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、辺縁帯リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、骨髄性白血病、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫、小細胞型リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、縦隔（胸腺）原発Ｂ細胞性大細胞型リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、結節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾臓辺縁帯リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出液リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、Ｔ細胞／組織球豊富型大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性皮膚びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（脚型）、高齢者のＥＢＶ陽性びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、炎症関連びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ＡＬＫ陽性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、形質芽球性リンパ腫、ＨＨＶ８関連多中心性キャッスルマン病に生ずる大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫とバーキットリンパ腫の中間型特徴を有する分類不能Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫と古典的ホジキンリンパ腫の中間型特徴を有する分類不能Ｂ細胞リンパ腫、または他の造血細胞関連癌である。例示的な実施形態において、癌はＡＭＬである。例示的な実施形態において、癌はＡＬＬである。
【０２４５】
いくつかの実施形態において、本発明による単離された細胞、または単離された細胞に由来する細胞株、または抗体は、それを必要とする対象における癌を治療するための薬物の製造に使用することができる。
【０２４６】
また、対象を治療するための方法も本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、方法は、本発明の免疫細胞を、それを必要とする対象に提供することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、本発明の形質転換された免疫細胞を、それを必要とする対象に投与するステップを含む。いくつかの実施形態において、方法は、本発明の抗体を、それを必要とする対象に投与することを含む。
【０２４７】
いくつかの実施形態において、本発明のＴ細胞は、ロバストなインビボＴ細胞増殖を受けることができ、長期間にわたって存続し得る。
【０２４８】
本発明の治療方法は、寛解的、治癒的、または予防的であり得る。本発明の方法は、自己免疫療法の一部であるか、または同種免疫療法の処置の一部であるかのいずれかであり得る。本発明は、特に同種免疫療法に適している。標準的なプロトコルを用いて、ドナー由来のＴ細胞を非アロ反応性細胞に形質転換することができ、必要に応じて複製し、それによって１人または数人の対象に投与され得るＣＡＲ−Ｔ細胞を産生することができる。そのようなＣＡＲ−Ｔ細胞療法は、「既製の」治療製品として利用可能にすることができる。
【０２４９】
開示された方法を用いて使用され得る方法は、前の項に記載されている。治療は、例えば、癌と診断された対象を治療するために使用することができる。治療され得る癌として、例えば、限定されないが、上に列挙した癌のいずれかを含むＢリンパ球に関与する癌が挙げられる。本発明のＣＡＲおよびＣＡＲ−Ｔ細胞で治療される癌の種類として、限定されないが、ある特定の白血病またはリンパ悪性腫瘍が挙げられる。成人腫瘍／癌および小児腫瘍／癌も含まれる。いくつかの実施形態において、治療は、抗体療法、化学療法、サイトカイン療法、樹状細胞療法、遺伝子療法、ホルモン療法、レーザー光療法、および放射線療法からなる群から選択される癌に対する１つ以上の両方と組み合わせることができる。
【０２５０】
いくつかの実施形態において、治療は、免役抑制療法を受けている対象に施すことができる。実際に、本発明は概して、免疫抑制剤の受容体をコードする遺伝子の不活性化に起因して、少なくとも１つの免疫抑制剤に耐性を示すように作製された細胞または細胞集団に依存する。この態様において、免役抑制療法は、対象内での本発明によるＴ細胞の選択および増殖の助けとなるべきである。本発明による細胞または細胞集団の投与は、エアロゾル吸入、注射、経口摂取、輸血、埋入または移植によるものを含む任意の都合のよい様式で実行され得る。本明細書に組成物は、対象に、皮下、皮内、腫瘍内、節内、髄内、筋肉内に、静脈内もしくはリンパ管内注射によって、または腹腔内に投与され得る。いくつかの実施形態において、本発明の細胞組成物は、静脈内注射によって投与される。
【０２５１】
いくつかの実施形態において、細胞または細胞集団の投与は、例えば、体重１ｋｇ当たり約１０４〜約１０９個の細胞（これらの範囲内の細胞数の全ての整数値を含む）の投与を含み得る。いくつかの実施形態において、細胞または細胞集団の投与は、例えば、体重１ｋｇ当たり約１０５〜１０６個の細胞（これらの範囲内の細胞数の全ての整数値を含む）の投与を含み得る。細胞または細胞集団は、１回以上の用量で投与され得る。いくつかの実施形態において、上記有効量の細胞が単回用量として投与され得る。いくつかの実施形態において、上記有効量の細胞が、ある期間にわたって１回より多くの用量として投与され得る。投与のタイミングは、担当医師の判断の範囲内であり、対象の臨床状態に依存する。細胞または細胞集団は、血液バンクまたはドナー等の任意の起源から得ることができる。個々の必要性は異なるが、特定の疾患または状態のための所与の細胞型の有効量の最適な範囲の決定は、当該技術分野の範囲内である。有効量は、治療効果または予防効果を提供する量を意味する。投与される投与量は、レシピエントの年齢、健康、および体重、ある場合には同時治療の種類、治療の頻度、ならびに所望される効果の性質に依存する。いくつかの実施形態において、有効量の細胞またはこれらの細胞を含む組成物は、非経口的に投与される。いくつかの実施形態において、投与は静脈内投与であり得る。いくつかの実施形態において、投与は腫瘍内注射によって直接行われてもよい。
【０２５２】
本発明のいくつかの実施形態において、細胞は、限定されないが、モノクローナル抗体療法、ＣＣＲ２アンタゴニスト（例えば、ＩＮＣ−８７６１）、抗ウイルス療法、シドホビルおよびインターロイキン−２、シタラビン（ＡＲＡ−Ｃとしても知られる）等の薬剤を用いた治療、またはＭＳ患者のためのナタリズマブ治療、または乾癬患者のためのエファリズマブ治療、またはＰＭＬのための他の治療を含む、任意の数の関連する治療モダリティと併せて（例えば、その前に、それと同時に、またはその後に）対象に投与される。いくつかの実施形態において、ＦＬＴ３特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、以下のうちの１つ以上と併せて対象に投与される：抗ＰＤ−１抗体（例えば、ニボルマブペムブロリズマブ、もしくはＰＦ−０６８０１５９１）、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（例えば、アベルマブ、アテゾリズマブ、またはデュルバルマブ）、抗ＯＸ４０抗体（例えば、ＰＦ−０４５１８６００）、抗４−１ＢＢ抗体（例えば、ＰＦ−０５０８２５６６）、抗ＭＣＳＦ抗体（例えば、ＰＤ−０３６０３２４）、抗ＧＩＴＲ抗体、および／または抗ＴＩＧＩＴ抗体。いくつかの実施形態において、配列番号２３６に示されるアミノ酸配列を含むＦＬＴ３特異的ＣＡＲは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体アベルマブと併せて対象に投与される。さらなる実施形態において、本発明のＴ細胞は、化学療法、放射線、免疫抑制剤、例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキセート、ミコフェノール酸、およびＦＫ５０６、抗体、またはＣＡＭＰＡＴＨ等の他の免疫除去剤、抗ＣＤ３抗体もしくは他の抗体療法剤、サイトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン、および／または照射と組み合わせて使用されてもよい。これらの薬物は、カルシウム依存性ホスファターゼカルシニューリンを阻害するか（シクロスポリンおよびＦＫ５０６）、または増殖因子誘導性のシグナル伝達にとって重要なｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害する（ラパマイシン）（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｎａｙａ  ｅｔ  ａｌ．１９９１；Ｌｉｕ，Ａｌｂｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９２；Ｂｉｅｒｅｒ，Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９３）。さらなる実施形態において、本発明のＴ細胞は、ミドスタウリンおよびスニチニブ等の受容体チロシンキナーゼ阻害剤、ラパマイシンおよびエベロリムス等のｍＴＯＲ阻害剤、ボリノスタット等のエピジェネティック修飾因子、ボルテゾミブ等のプロテアソーム阻害剤、レナリドミド等の免疫調節剤、エリスモデギブおよびＰＦ−０４４４９９１３等のヘッジホッグ阻害剤、またはＡＧ−１２０およびＡＧ−２２１等のＡＧ−１２０およびＡＧ−２２１イソクエン酸脱水素酵素（ＩＤＨ）阻害剤と組み合わせて使用されてもよい。さらなる実施形態において、本発明の細胞組成物は、骨髄移植、フルダラビン等の化学療法剤、体外照射療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミド、またはＯＫＴ３もしくはＣＡＭＰＡＴＨ等の抗体のいずれかを用いたＴ細胞除去療法と併せて（例えば、その前に、それと同時に、またはその後に）対象に投与される。いくつかの実施形態において、本発明の細胞組成物は、ＣＤ２０と反応する薬剤、例えば、リツキサン等のＢ細胞除去療法の後に投与される。例えば、いくつかの実施形態において、対象は、高用量化学療法に続いて末梢血幹細胞移植を用いる標準的な治療を受けることができる。ある特定の実施形態において、移植後に、対象は、増殖した本発明の免疫細胞の注入を受ける。いくつかの実施形態において、増殖細胞は手術の前または後に投与される。
【０２５３】
いくつかの実施形態において、上記細胞を投与された対象からＦＬＴ３特異的ＣＡＲを発現する遺伝子操作された免疫細胞を枯渇させるための方法が提供される。枯渇は、阻害または排除によるものであり得る。
【０２５４】
一態様において、モノクローナル抗体に特異的なエピトープを含むＦＬＴ３特異的ＣＡＲを発現する遺伝子操作された免疫細胞を枯渇させるための方法は、上記遺伝子操作された免疫細胞をエピトープに特異的なモノクローナル抗体と接触させることを含む。
【０２５５】
いくつかの実施形態において、モノクローナル抗体に特異的なエピトープを含むＦＬＴ３特異的ＣＡＲを発現する遺伝子操作された免疫細胞を投与された対象から枯渇させるための方法は、エピトープに特異的なモノクローナル抗体を対象に投与することを含む。これらの実施形態において、ＣＡＲの細胞外ドメインに存在するエピトープに特異的なモノクローナル抗体の対象への投与は、遺伝子操作されたＣＡＲ発現免疫細胞の活性を対象から排除するまたは阻害する。一態様において、遺伝子操作されたＣＡＲ発現免疫細胞の枯渇は、ＦＬＴ３を発現する細胞の内在性集団の回復を可能にする。
【０２５６】
一態様において、本発明は、モノクローナル抗体に特異的なエピトープを含むＦＬＴ３特異的ＣＡＲを細胞表面に発現する遺伝子操作された免疫細胞を投与された対象において、内在性ＦＬＴ３を発現する細胞の回復を促進するための方法に関し、方法は、エピトープに特異的なモノクローナル抗体を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、内在性ＦＬＴ３を発現する細胞は、内在性ＦＬＴ３を発現する骨髄細胞である。一態様において、「回復」という用語は、内在性ＦＬＴ３を発現する細胞の数を増加させることを指す。内在性ＦＬＴ３を発現する細胞の数は、ＦＬＴ３  ＣＡＲを発現する遺伝子操作された免疫細胞による内在性ＦＬＴ３を発現する細胞の増殖の増加に起因して、かつ／または内在性ＦＬＴ３を発現する細胞の排除の低下に起因して増加し得る。いくつかの実施形態において、対象へのモノクローナル抗体の投与は、ＦＬＴ３  ＣＡＲを発現する遺伝子操作された免疫細胞を枯渇させ、対象における内在性ＦＬＴ３を発現する細胞、例えば、内在性ＦＬＴ３を発現する骨髄前駆細胞の数を増加させる。一実施形態において、対象へのモノクローナル抗体の投与は、内在性ＦＬＴ３を発現する細胞の数を、モノクローナル抗体の投与前の内在性ＦＬＴ３を発現する細胞の数と比較して少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％増加させる。
【０２５７】
一態様において、対象におけるＦＬＴ３媒介性の状態を治療するための方法が提供され、方法は、（ａ）１つ以上のモノクローナル抗体に特異的な１つ以上のエピトープを含むＦＬＴ３特異的ＣＡＲを細胞表面に発現する遺伝子操作された免疫細胞を対象に投与することと、（ｂ）後に、エピトープに特異的な１つ以上のモノクローナル抗体を対象に投与することにより、対象から遺伝子操作された免疫細胞を枯渇させることと、を含む。
【０２５８】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲを発現する遺伝子操作された免疫細胞を枯渇させるための方法において使用されるｍＡｂは、アレムツズマブ、イブリツモマブチウキセタン、ムロモナブ−ＣＤ３、トシツモマブ、アブシキシマブ、バシリキシマブ、ブレンツキシマブベドチン、セツキシマブ、インフリキシマブ、リツキシマブ、ベバシズマブ、セルトリズマブペゴル、ダクリズマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、ゲムツズマブ、ナタリズマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、ラニビズマブ、トシリズマブ、トラスツズマブ、ベドリズマブ、アダリムマブ、ベリムマブ、カナキヌマブ、デノスマブ、ゴリムマブ、イピリムマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、ＱＢＥＮＤ−１０、ウステキヌマブ、およびそれらの組み合わせから選択される。
【０２５９】
いくつかの実施形態において、モノクローナル抗体に特異的な上記エピトープ（ｍＡｂ特異的エピトープ）は、ＣＤ２０エピトープまたはミモトープ、例えば、配列番号２２９であり、エピトープに特異的なｍＡｂはリツキシマブである。
【０２６０】
いくつかの実施形態において、対象にモノクローナル抗体を投与するステップは、対象にモノクローナル抗体を注入することを含む。いくつかの実施形態において、対象に投与されるエピトープ特異的ｍＡｂの量は、対象においてＣＡＲを発現する免疫細胞の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％を排除するのに十分である。
【０２６１】
いくつかの実施形態において、対象にモノクローナル抗体を投与するステップは、対象に３７５ｍｇ／ｍ２のリツキシマブを１週間に１回または数回注入することを含む。
【０２６２】
いくつかの実施形態において、ｍＡｂ特異的エピトープを含むＣＡＲを発現する免疫細胞（ＣＡＲ発現免疫細胞）を、エピトープ特異的ｍＡｂを用いたＣＤＣアッセイにおいて枯渇させる場合、生存するＣＡＲ発現免疫細胞の量は、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％減少する。
【０２６３】
いくつかの実施形態において、細胞傷害性薬物は、ＣＡＲ発現免疫細胞を枯渇させるために使用されるエピトープ特異的ｍＡｂにカップリングされる。モノクローナル抗体の標的化能力を細胞傷害性薬物の細胞死滅能と組み合わせることにより、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、薬物単独の使用と比較して、健常組織と疾患組織との間の高精度の識別を可能にする。いくつかのＡＤＣについて販売承認が得られた：それらを作成するための技術、具体的にはリンカーに関する技術は、以下の先行技術に豊富に提示されている（Ｐａｙｎｅ，Ｇ．（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ３：２０７−２１２；Ｔｒａｉｌ  ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５２：３２８−３３７；Ｓｙｒｉｇｏｓ  ａｎｄ  Ｅｐｅｎｅｔｏｓ（１９９９）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９：６０５−６１４；Ｎｉｃｕｌｅｓｃｕ−Ｄｕｖａｚ  ａｎｄ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（１９９７）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．２６：１５１−１７２；米国特許第４，９７５，２７８号）。
【０２６４】
いくつかの実施形態において、注入されるエピトープ特異的ｍＡｂは、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を促進することができる分子と予めコンジュゲートされる。したがって、補体系は、生物から病原体を取り除く抗体の能力を補助するかまたは補完する。いくつかあるうちの１つによって刺激されると、細胞を死滅させる膜攻撃複合体の応答および活性化の大量の増幅として、活性化カスケードが誘発される。グリカン等の異なる分子がｍＡｂをコンジュゲートするために用いられ得る［Ｃｏｕｒｔｏｉｓ，Ａ，Ｇａｃ−Ｂｒｅｔｏｎ，Ｓ．，Ｂｅｒｔｈｏｕ，Ｃ，Ｇｕｅｚｅｎｎｅｃ，Ｊ．，Ｂｏｒｄｒｏｎ，Ａ．ａｎｄ  Ｂｏｉｓｓｅｔ，Ｃ．（２０１２，Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｉｓ  ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｂｙ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ｇｌｙｃａｎ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ，Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＩＳＳＮ：０７１７−３４５８；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｊｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．ｉｎｆｏ  ＤＯＩ：１０．２２２５／ｖｏｌｌ５−ｉｓｓｕｅ５）。
【０２６５】
キット
本発明はまた、本発明の方法に使用するためのキットも提供する。本発明のキットは、本明細書に記載されるＦＬＴ３特異的ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、ＦＬＴ３特異的ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子操作された免疫細胞、またはＦＬＴ特異的抗体を含む１つ以上の容器、および本明細書に記載の本発明の方法のいずれかに従って使用するための指示書を含む。一般に、これらの指示書は、上述の治療的処置のための遺伝子操作された免疫細胞の投与の説明を含む。
【０２６６】
本明細書に記載される遺伝子操作された免疫細胞または抗体の使用に関する指示書は、一般に、目的の治療のための投与量、投与スケジュール、および投与経路に関する情報を含む。容器は、単位用量、バルクパッケージ（例えば、複数回用量パッケージ）または部分単位用量であり得る。本発明のキットにおいて供給される指示書は、典型的には、ラベルまたは添付文書（例えば、キットに含まれる紙シート）上に書かれた指示であるが、機械可読指示（例えば、磁気または光学式記憶ディスク上に保持された指示）も許容可能である。
【０２６７】
本発明のキットは、適切にパッケージングされている。適切なパッケージングは、限定されないが、バイアル、ビン、ジャー、可撓性パッケージング（例えば、密封されたマイラーバッグまたはプラスチックバッグ）等を含む。また、吸入器、鼻腔内投与デバイス（例えば、噴霧器）またはミニポンプ等の注入デバイス等の特定のデバイスと組み合わせて使用するためのパッケージも企図される。キットは、無菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針によって穿孔可能な栓を有する静脈内輸液バッグまたはバイアルであってもよい）。容器もまた、無菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針によって穿孔可能な栓を有する静脈内輸液バッグまたはバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも１つの活性薬剤は、ＦＬＴ３特異的ＣＡＲまたはＦＬＴ３特異的抗体である。容器はさらに、第２の薬学的活性薬剤を含んでもよい。
【０２６８】
キットは、任意選択的に、緩衝液等の追加成分および解釈情報を提供し得る。通常、キットは、容器と、容器上のまたは容器に関連付けられたラベルまたは添付文書（複数可）とを含む。
【０２６９】
以下の実施例は、例示目的のために提供されるに過ぎず、決して本発明の範囲を限定することを意図するものではない。実際に、本明細書に示されかつ記載されるものに加えて、本発明の種々の修正が、前述の記載から当業者に明らかになり、かつ添付の特許請求の範囲の範疇内に属する。
【０２７０】
本発明の代表的な材料は、２０１７年６月１日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．２０１１０−２２０９，ＵＳＡ）において寄託された。ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２４２２８を有するベクターＰ３Ｅ１０−ＶＬは、Ｐ３Ｅ１０軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドであり、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２４２２７を有するベクターＰ３Ｅ１０−ＶＨは、Ｐ３Ｅ１０重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドである。寄託は、「特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の条項およびその下位の規制」（ブダペスト条約）の下で行われた。これにより、寄託の日から３０年間にわたり寄託物の生存培養の維持が保証される。寄託物は、ブダペスト条約の条項の下で、かつＰｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．とＡＴＣＣとの間の合意を条件として、ＡＴＣＣによって利用可能となり、これは関連米国特許の発行または任意の米国もしくは外国特許出願の公衆への公開がなされた場合、いずれか早い方に際して、公衆が寄託物の培養物の子孫を恒久的かつ無制限に利用可能であることを保証し、また米国特許商標庁長官が米国特許法第１２２条およびそれに準ずる長官規則（特に８８６ＯＧ６３８に関して米国特許規則１．１４を含む）に従って資格があると決定した者が子孫を利用可能であることを保証する。
【０２７１】
本出願の譲受人は、寄託された材料の培養物が適切な条件下で培養されている時に、死滅するか、紛失するか、破壊された場合には、通知後直ちにその材料が別の同じ材料と交換されることに同意している。寄託された材料の利用可能性は、任意の政府当局によりその特許法に従って付与された権利に違反して本発明を実施することの許諾であると解釈されるべきではない。
【実施例】
【０２７２】
実施例１：３７℃でのヒトＦＬＴ３／ＦＬＴ３抗体の相互作用の動態および親和性
本実施例は、３７℃での種々の抗ＦＬＴ３抗体の動態および親和性を決定する。全ての実験は、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００表面プラズモン共鳴バイオセンサー（ＧＥ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ  ＮＪ）で行われた。
【０２７３】
センサーチップの調製は、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０（ｐＨ７．４）の）ランニング緩衝液を用いて２５℃で行われた。抗ヒトＦｃセンサーチップは、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＣＭ４センサーチップの全てのフローセルを４００ｍＭ  ＥＤＣおよび１００ｍＭ  ＮＨＳの１：１（ｖ／ｖ）混合物で７分間、１０μＬ／分の流速で活性化することにより作製された。抗ヒトＦｃ試薬（ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ、ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈカタログ番号２０８１−０１）を１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）中で３０μｇ／ｍＬに希釈し、７分間２０μＬ／分で全てのフローセルに注入した。全てのフローセルを１５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）中の１００ｍＭエチレンジアミンで７分間１０μＬ／分でブロックした。
【０２７４】
実験は、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０（ｐＨ７．４）、１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡのランニング緩衝液を用いて３７℃で行われた。ＦＬＴ３抗体を未希釈の上清から１０μＬ／分の流速で１分間下流のフローセル（フローセル２、３および４）上に捕捉した。各フローセル上に異なる抗体を捕捉した。フローセル１は、参照表面として使用された。ＦＬＴ３抗体の捕捉後、分析物（緩衝液、ｈＦＬＴ３）を３０μＬ／分で全てのフローセルに２分間注入した。分析物注入後、解離を１０分間モニタリングし、続いて７５ｍＭリン酸の１分間注入を３回行って全てのフローセルを再生させた。各捕捉ＦＬＴ３抗体について以下の分析物注入を行った：緩衝液、１１ｎＭ  ｈＦＬＴ３、３３ｎＭ  ｈＦＬＴ３、１００ｎＭ  ｈＦＬＴ３および３００ｎＭ  ｈＦＬＴ３。二重参照の目的で各捕捉ＦＬＴ３抗体の緩衝液サイクルを収集した（Ｍｙｓｚｋａ，Ｄ．Ｇ．Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１２，２７９−２８４（１９９９）に記載されるような二重参照）。二重参照したセンサーグラムを、マストランスポート結合モデルを用いて単純な１：１のラングミュアに全体的に適合させた。
【０２７５】
試験した抗ＦＬＴ３抗体の動態および親和性パラメータを表７に示す。表７に示される抗体は、同じ名称を有する表８に示されるＣＡＲと同じＶＨおよびＶＬ領域を共有する。
【表７】
2020522252.tif 000020
【０２７６】
実施例２：ＦＬＴ３特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の生成
ａ）プラスミド
下の表８に列挙される以下のコドン最適化されたＦＬＴ３  ＣＡＲ配列を合成し、ＥｃｏＲＩ（５’）およびＭｌｕＩ（３’）制限部位を使用してｐＬＶＸ−ＥＦ１ａ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）等のレンチウイルスベクターにサブクローニングした（したがってＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏカセットを除去した）。
表８：例示的ＦＬＴ３特異的ＣＡＲ
【表８−１】
2020522252.tif 000021
【表８−２】
2020522252.tif 000022
【表８−３】
2020522252.tif 000023
【表８−４】
2020522252.tif 000024
【表８−５】
2020522252.tif 000025
【表８−６】
2020522252.tif 000026
【表８−７】
2020522252.tif 000027
【表８−８】
2020522252.tif 000028
【０２７７】
いくつかの実験において、ＣＡＲをコードする配列の前にはＢＦＰ（青色蛍光タンパク質）等の蛍光タンパク質をコードする配列があり、自己切断２Ａペプチドをコードする配列によってそのような配列から分離されている。レンチウイルスは、ｐｓＰＡＸ２、ＨＩＶ−１  ｇａｇ−ｐｏｌパッケージングプラスミド、およびＶＳＶ−Ｇ発現プラスミドｐＭＤ２．Ｇを用いて産生された。
【０２７８】
ｂ）Ｔ細胞活性化およびレンチウイルス形質導入
Ｐａｎ  Ｔ  Ｃｅｌｌ単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から未処理のＴ細胞を単離し、ヒトＣＤ２、ＣＤ３、およびＣＤ２８に対する抗体で３日間活性化した（Ｔ細胞活性化／増殖キット、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）。レンチウイルスベクター（ＬＶ）は、６ウェルプレートにおいて、サブコンフルエントなＨＥＫ−２９３Ｔ／１７（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ））細胞の一過性トランスフェクションによって産生された。端的に述べると、ｐＬＶＸ、ｐｓＰＡＸ２プラスミド、およびｐＭＤ２．Ｇプラスミドを、製造業者の説明に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、それぞれ４：３：１の比でトランスフェクトした。翌日、培地をＴ細胞培養培地（Ｘ−ｖｉｖｏ−１５培地中の５％ヒトＡＢ血清（Ｌｏｎｚａ））と交換し、トランスフェクションの４８時間後にＬＶ上清を採取し、０．４５μｍシリンジフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して濾過した。活性化されたＴ細胞を、４０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−２を含有するＴ細胞培養培地において０．２５×１０６細胞／ｍＬで播種し、等しい量の新鮮なＬＶ上清を加えることによって形質導入した。以下のＣＡＲ構築物を含むＬＶをこれらの実験に使用した：Ｐ１Ａ５、Ｐ１Ｂ４、Ｐ３Ａ１、Ｐ３Ｅ１０、Ｐ４Ｃ７、Ｐ４Ｈ１１、Ｐ７Ｈ３、Ｐ９Ｂ５、Ｐ１２Ｂ６、およびＰ１４Ｇ２。細胞を３７℃および５％ＣＯ２で３日間培養し、フローサイトメトリー分析に使用するか、または２０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−２を含有する新鮮なＴ細胞培養培地において増殖させた。
【０２７９】
ｃ）フローサイトメトリーによる形質導入効率の測定
異なるＦＬＴ３  ＣＡＲレンチウイルス構築物の形質導入効率を決定するために、形質導入の７２時間後にＴ細胞のフローサイトメトリー分析を行った。端的に述べると、前方散乱および側方散乱パラメータを用いて単一細胞にゲートをかけ、形質導入効率をＢＦＰ陽性細胞の割合として算出した。他の場合には、ＣＡＲ分子中のＣＤ２０エピトープに結合する抗ＣＤ２０抗体リツキシマブで染色した後、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ヒトＩｇＧで染色することによりＣＡＲを発現する細胞を検出した。図１は、活性化Ｔ細胞が、様々な効率（３０％〜７０％）の異なるＦＬＴ３  ＣＡＲ構築物で効率的に形質導入されたことを示す。
【０２８０】
ｄ）ＦＬＴ３ＦＬＴ３  ＣＡＲ−Ｔ細胞は培養中に分化するが、高い割合のメモリーＴ細胞サブセットを維持する
培養中のＣＡＲ−Ｔ細胞における活性化マーカーＣＤ２５および４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）の発現は、Ｔ細胞の疲弊およびエフェクターメモリー表現型への分化の増加と関連付けられている（Ｌｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。この実験では、Ｐ１Ａ５、Ｐ１Ｂ４、Ｐ３Ａ１、Ｐ３Ｅ１０、Ｐ４Ｃ７、Ｐ４Ｈ１１、Ｐ７Ｈ３、Ｐ９Ｂ５、Ｐ１２Ｂ６、およびＰ１４Ｇ２  ＣＡＲで形質導入されたＴ細胞を、刺激後１０日目にＣＤ２５およびＣＤ１３７抗体で染色し、フローサイトメトリーにより分析した。ＣＤ２５および４−１ＢＢに陽性のＣＡＲ−Ｔ細胞の割合によってＴ細胞活性化の程度を決定した非形質導入（ＮＴ）Ｔ細胞集団は、比較のために含まれる（図２）。いくつかのＦＬＴ３ＦＬＴ３  ＣＡＲ（Ｐ１Ａ５、Ｐ１２Ｂ６およびＰ１４Ｇ２）の発現は、「活性化された」状態と関連していたのに対し（図２）、Ｐ９Ｂ５、Ｐ３Ｅ１０、Ｐ４Ｃ７、およびＰ３Ａ１を含む他のＦＬＴ３ＦＬＴ３  ＣＡＲの発現は、非形質導入細胞に匹敵する活性化マーカーのレベルをもたらした。（図２）。より高いレベルの活性化マーカーの発現は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の分化の増加につながり、それは刺激後１５日目にそれらの細胞表面上のＣＤ６２ＬおよびＣＤ４５ＲＯの発現を測定することにより評価することができる。この実験では、ＣＡＲ−Ｔ細胞を特異的抗体を用いてそのようなマーカーで染色し、増加する分化の程度により４つの異なるカテゴリーまたはサブセットに分類した：１）ＣＤ６２ＬＨＩＧＨ  ＣＤ４５ＲＯＬＯＷ幹細胞メモリー（Ｔｓｃｍ）細胞；２）ＣＤ６２ＬＨＩＧＨ  ＣＤ４５ＲＯＨＩＧＨ中枢メモリー（Ｔｃｍ）細胞；ＣＤ６２ＬＬＯＷ  ＣＤ４５ＲＯＨＩＧＨエフェクターメモリー（Ｔｅｍ）細胞；およびＣＤ６２ＬＬＯＷ  ＣＤ４５ＲＯＬＯＷエフェクター（Ｔｅｆｆ）細胞。図３は、刺激後１５日目のＰ９Ｂ５  ＣＡＲ−Ｔ細胞（低分化）およびＰ１４Ｇ２  ＣＡＲ−Ｔ細胞（高分化）の代表的なＦＡＣＳプロット、ならびに全ての異なるＦＬＴ３ＦＬＴ３  ＣＡＲ−Ｔ細胞のＴ細胞サブセット組成物を示す。培養が終了するまでには、「活性化された」表現型を呈するＣＡＲ−Ｔ細胞も、より分化した表現型（すなわち、より高い割合のＴｅｍ細胞およびより低い割合のＴｓｃｍ細胞）を示した（図３）。具体的には、Ｐ９Ｂ５、Ｐ３Ａ１、Ｐ７Ｈ３、およびＰ３Ｅ１０  ＦＬＴ３  ＣＡＲの発現は、高い割合の幹細胞メモリーおよび中枢メモリー細胞と関連しており、それはＡＬＬおよびＣＬＬ対象における残留性および抗腫瘍効果の増加と相関されている（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１４；１２３（２４）：３７５０−３７５９）。
【０２８１】
ｅ）インビトロ増殖および長期死滅活性アッセイ
同族抗原を発現する標的細胞を増殖および溶解させるＣＡＲ−Ｔ細胞の能力は、それらのインビトロでの活性を評価するための有効な手段である。標的細胞の生存を発光によりモニタリングするために、ルシフェラーゼ遺伝子を発現するようＦＬＴ３発現Ｍｏｌｍ１３細胞を安定に形質導入した。これらのＬｕｃ＋標的細胞を、次いでＦＬＴ３  ＣＡＲ−Ｔ細胞とともにインキュベートし、ＣＡＲ−Ｔ細胞の死滅活性および増殖を、それぞれ、発光および生存細胞計数により測定した。エフェクター細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）にストレスをかけるように設計された、よりストリンジェントなアッセイでは、元の培養物に新しい標的細胞を定期的に加え、培養終了時に発光によりＣＡＲ−Ｔ細胞の長期死滅活性を決定した（図４）。幹細胞メモリーおよび中枢メモリーＴ細胞のより高い増殖能と一致して、Ｐ９Ｂ５、Ｐ３Ａ１、Ｐ７Ｈ３、およびＰ３Ｅ１０  ＣＡＲ−Ｔ細胞集団は、インビトロでより高い標的依存性増殖および長期細胞傷害活性を示したのに対し、Ｐ１２Ｂ６およびＰ１４Ｇ２等の分化の程度がより高いＣＡＲ−Ｔ細胞は、標的細胞の存在下では十分に増殖せず、低い死滅活性を示した。
【０２８２】
ｆ）同所性マウスアッセイにおけるＦＬＴ３特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の活性
本実施例は、Ｅｏｌ１同所性モデルを用いて、ＦＬＴ３  ＣＡＲ−Ｔ細胞によるＡＭＬの治療を示す。同所性モデルにおいて、ルシフェラーゼおよびＧＦＰを発現するＥｏｌ１細胞を用いてＦＬＴ３  ＣＡＲ−Ｔ細胞のインビボ有効性試験を行った。３０万個のＥｏｌ１  Ｌｕｃ２ＡＧＦＰ細胞を、尾静脈を介して６〜８週齢の雌ＣＢ１７／ＳＣＩＤ動物に静脈内注射した。Ｄ−ルシフェリン（Ｒｅｇｉｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍｏｒｔｏｎ  Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）（１５ｍｇ／ｍＬで動物１匹当たり２００ｕＬ）の腹腔内注射に続くイ  ソフルランによる麻酔、およびその後の全身生物発光イメージング（ＢＬＩ）により、腫瘍量のモニタリングが可能になる。腫瘍細胞によって発現されたルシフェラーゼとルシフェリンとの相互作用によって放出された生物発光シグナルを、ＩＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ＣＴ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、ＭＡ）を使用したイメージングにより取得し、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ４．４（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）を使用して全光束（光子／秒）として定量化した。
【０２８３】
全光束が全ての動物で平均３０Ｅ６に達したとき（腫瘍移植後１０日目）、動物を３つの群に無作為化した。各群に以下の細胞のうちの１つを投与した：１）対照として使用された非形質導入Ｔ細胞、２）Ｐ３Ｅ１０を発現するＦＬＴ３  ＣＡＲ−Ｔ細胞（「Ｐ３Ｅ１０  Ｖ１」）、または３）Ｐ３Ａ１を発現するＦＬＴ３  ＣＡＲ−Ｔ細胞（「Ｐ３Ａ１  ｖ１」）。細胞１〜３は全てＴＣＲαを有する。ＦＬＴ３  ＣＡＲ−Ｔ細胞を上記実施例に記載されるように調製した。ＦＬＴ３  ＣＡＲ構築物Ｐ３Ｅ１０およびＰ３Ａ１を上の表８に示す。単回用量の２５０万個または５００万個の対照（ＮＴ）またはＦＬＴ３  ＣＡＲ−Ｔ（Ｐ３Ｅ１０もしくはＰ３Ａ１）細胞を、ボーラス尾静脈注射によって投与した。Ｅｏｌ１同所性モデルのエンドポイントである全体重の１５％超が減少したときに動物を屠殺した。
【０２８４】
試験の結果を図５に要約する。単回用量の５００万個のＰ３Ｅ１０もしくはＰ３Ａ１  ＦＬＴ３  ＣＡＲ−Ｔ細胞または２５０万個のＰ３Ｅ１０  ＦＬＴ３  ＣＡＲ−Ｔ細胞では、腫瘍移植後１３〜４３日目から陰性対照と比較してより低い全光束が得られたしたがって、ＦＬＴ３  ＣＡＲ−Ｔ細胞による治療は、陰性対照と比較して腫瘍の進行を阻害した。
【０２８５】
これらの結果は、ＦＬＴ３  ＣＡＲ−Ｔ細胞が腫瘍の進行を阻害するのに効果的であることを実証するものである。
【０２８６】
実施例３：ＣＤ２０エピトープを発現するＦＬＴ３特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞の枯渇
ａ）ＣＤ２０エピトープを発現するＦＬＴ３特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞は、リツキシマブの存在下において補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）に対して感受性である。
抗ＣＤ２０抗体の存在下におけるＦＬＴ３特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞の補体に対する感受性を、ＣＤＣアッセイを用いてインビトロで評価した。この実験のために、細胞外ドメインにＣＤ２０エピトープを含有するＦＬＴ３  ＣＡＲの発現のためのレンチウイルス構築物で形質導入したＴ細胞を、リツキシマブ（１００μｇ／ｍＬ）の存在下または非存在下で２５％の補体（ＡｂＤセロテック）と混合し、３７℃および５％ＣＯ２で４時間インキュベートした。ビオチン化ＦＬＴ３タンパク質を用いたフローサイトメトリー分析によりＦＬＴ３  ＣＡＲ−Ｔ細胞の枯渇を決定した。図６は、ＦＬＴ３  ＣＡＲおよびＣＤ２０エピトープを発現する細胞が、抗体および補体の存在下で効率的に枯渇されたこと、一方で、ＣＤ２０エピトープを発現しない対照ＦＬＴ３特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞には最小限の影響しか見られなかったことを示す。
【０２８７】
これらの結果は、ＣＤ２０エピトープを発現するＦＬＴ３特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞が、リツキシマブおよび補体の存在下においてインビトロで枯渇され得ることを実証するものである。
【０２８８】
ｂ）リツキシマブ投与後のＦＬＴ３  ＣＡＲ  Ｔ細胞の枯渇は、ＮＳＧマウスにおけるＦＬＴ３を発現する骨髄前駆細胞の回復を可能にする。
ＣＤ２０エピトープを発現するＦＬＴ３特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞の枯渇を媒介し、骨髄の回復を促進する抗ＣＤ２０抗体リツキシマブの能力をマウスにおいて試験した。この実験では、骨髄前駆細胞（α−マウスＦＬＴ３  ＣＡＲ  Ｔ）の表面上のマウスＦＬＴ３タンパク質に結合することができ、かつリツキシマブによって認識されるＣＤ２０エピトープを含むＦＬＴ３  ＣＡＲ、またはマウスＦＬＴ３タンパク質への結合は無視できるほど低い対照ＣＡＲのいずれかを発現するＴ細胞でマウスを処理した。骨髄細胞のフローサイトメトリー分析を用いて、対照ＣＡＲ  Ｔ細胞を投与したマウスまたは未処理のマウスと比較して前駆細胞の減少として認められる、ＦＬＴ３を発現する造血前駆細胞に対するＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞傷害活性を実証した（図７、パネルＢ）。ＣＡＲ  Ｔ細胞死滅活性が確認された後、連続４日間、マウスにリツキシマブを投与し、１３日目にフローサイトメトリーによって循環する残存ＣＡＲ  Ｔ細胞を数えた。図７、パネルＣは、これらのマウスの血液中のＦＬＴ３  ＣＡＲ  Ｔ細胞が、リツキシマブを投与されなかった対照群と比較して枯渇されたことを示す。最後に、骨髄細胞のフローサイトメトリー分析により、リツキシマブ（２０日目）を投与したマウスのみが骨髄細胞の回復を示したことを実証した（図７、パネルＤ）。
【０２８９】
この実験は、ＣＤ２０エピトープを発現するＦＬＴ３  ＣＡＲ  Ｔ細胞のリツキシマブ依存性枯渇が骨髄等のＦＬＴ３発現組織に対する損傷を軽減し、残存前駆細胞からの迅速な骨髄の回復を可能にすることを実証するものである。
【０２９０】
種々の用途、方法、キット、および組成物を参照して開示した教示を説明してきたが、本明細書の教示および後述の特許請求される発明から逸脱することなく、種々の変更および修正が行われ得ることを理解されたい。前述の実施例は、開示される教示をより良好に例示するために提供されるものであって、本明細書に提示される教示の範囲を限定することを意図するものではない。本教示をこれらの例示的な実施形態の観点から説明してきたが、当業者は、これらの例示的な実施形態の多数の変形および修正が過度の実験を用いることなく可能であることを容易に理解するであろう。全てのそのような変形および修正は、本教示の範囲内である。
【０２９１】
特許、特許出願、論文、教科書等を含む本明細書に引用される全ての参考文献、およびそれらに引用されている参考文献は、それらが既に組み込まれていない程度に、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。限定されないが、定義された用語、用語の使用法、記載された技法を含む、組み込まれた文献および同様の材料のうちの１つ以上が本出願と異なるまたは矛盾する事象では、本出願が支配する。
【０２９２】
前述の説明および実施例は、本発明のある特定の具体的な実施形態を詳述し、本発明者らによって企図されるベストモードを記載するしかしながら、前述の記載が文面上いかに詳細であろうとも、本発明は、多くの様式で実施することができ、本発明は、添付の特許請求の範囲およびその任意の均等物に従って解釈されるべきであることを理解されたい。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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