(57)【要約】血液凝固因子である第ＩＸａ因子（ＦＩＸａ）および第Ｘ因子（ＦＸ）に結合し、ＦＸからＦＸａへのＦＩＸａ触媒活性化を強化する、二重特異性抗原結合分子（例えば、抗体）。血友病Ａ患者において欠乏している天然の第ＦＶＩＩＩａ補因子を補充することによる、出血を抑制するための二重特異性抗原結合分子の使用。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＩＸａ結合部位を含むＦＩＸａ結合ポリペプチドアームと、
ＦＸ結合部位を含むＦＸ結合ポリペプチドアームとを含み、
前記ＦＩＸａ結合ポリペプチドアームが、配列番号３２４と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＶＨドメインと、配列番号１０と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＶＬドメインとを含み、任意に、前記ＶＨドメインが、ＩＭＧＴ位置１１１．１に疎水性残基または正に荷電した残基を有するＨＣＤＲ３を含み、任意に、前記ＨＣＤＲ３アミノ酸配列が、配列番号４００、配列番号４０１、配列番号４０２、配列番号４０３、もしくは配列番号１７１であることを特徴とし、および／または
前記ＦＩＸａ結合部位が、ＦＩＸａ結合ポリペプチドアームの相補性決定領域（ＣＤＲ）のセットによって提供され、前記ＣＤＲのセットが、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、および／またはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、
ＨＣＤＲ１が、配列番号１であり、
ＨＣＤＲ２が、配列番号２であり、
ＨＣＤＲ３が、配列番号４００であり、
ＬＣＤＲ１が、配列番号６であり、
ＬＣＤＲ２が、配列番号７であり、
ＬＣＤＲ３が、配列番号８である、
ことを特徴とする二重特異性抗原結合分子。
【請求項２】
前記ＦＩＸａ結合部位が、ＦＩＸａ結合ポリペプチドアームの相補性決定領域（ＣＤＲ）のセットによって提供され、前記ＣＤＲのセットが、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、および／またはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、
ＨＣＤＲ１が、配列番号１であり、
ＨＣＤＲ２が、配列番号２であり、
ＨＣＤＲ３が、配列番号４０１、配列番号４０２、配列番号４０３、または配列番号１７１であり、
ＬＣＤＲ１が、配列番号６であり、
ＬＣＤＲ２が、配列番号７であり、
ＬＣＤＲ３が、配列番号８である、
請求項１に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項３】
ＦＩＸａ結合部位を含むＦＩＸａ結合ポリペプチドアームであって
（ｉ）免疫グロブリン重鎖ｖ、ｄ、およびｊ遺伝子セグメントの組換えにより生成されたＶＨドメインであって、前記ｖ遺伝子セグメントが、ＶＨ３−７（例えば、ＶＨ３−７＊０１）であり、および／または前記ｊ遺伝子セグメントが、ＪＨ６（例えば、ＪＨ６＊０２）である、ＶＨドメインと、
免疫グロブリン軽鎖ｖおよびｊ遺伝子セグメントの組換えにより生成されたＶＬドメインであって、前記ｖ遺伝子セグメントが、ＶＬ３−２１（例えば、ＶＬ３−２１＊ｄ０１）であり、前記ｊ遺伝子セグメントが、ＪＬ２（例えば、ＪＬ２＊０１）またはＪＬ３である、ＶＬドメインとを含む抗体Ｆｖ領域を含むＦＩＸａ結合ポリペプチドアームと、
（ｉｉ）ＦＸ結合部位を含むＦＸ結合ポリペプチドアームであって、
（ａ）免疫グロブリン重鎖ｖ、ｄ、およびｊ遺伝子セグメントの組換えにより生成されたＶＨドメインであって、前記ｖおよびｊ遺伝子セグメントが、ＶＨ１−３（例えば、ＶＨ１−３＊０１）およびＪＨ６（例えば、ＪＨ６＊０２）である、ＶＨドメインと、
免疫グロブリン軽鎖ｖおよびｊ遺伝子セグメントの組換えにより生成されたＶＬドメインであって、前記ｖおよびｊ遺伝子セグメントが、ＶＬ１−４７（例えば、ＶＬ１−４７＊０１）およびＪＬ１（例えば、ＪＬ１＊０１）である、ＶＬドメインとを含む、または、
（ｂ）免疫グロブリン重鎖ｖ、ｄ、およびｊ遺伝子セグメントの組換えにより生成されたＶＨドメインであって、前記ｖおよびｊ遺伝子セグメントが、ＶＨ３−３０（例えば、ＶＨ３−３０＊１８）およびＪＨ６（例えば、ＪＨ６＊０２）である、ＶＨドメインと、
免疫グロブリン軽鎖ｖおよびｊ遺伝子セグメントの組換えにより生成されたＶＬドメインであって、前記ｖおよびｊ遺伝子セグメントが、ＶＬ２−８（例えば、ＶＬ２−８＊０１）およびＪＬ２（例えば、ＪＬ２＊０１）である、ＶＬドメインとを含む、または、
（ｃ）免疫グロブリン重鎖ｖ、ｄ、およびｊ遺伝子セグメントの組換えにより生成されたＶＨドメインであって、前記ｖおよびｊ遺伝子セグメントが、ＶＨ４−６１（例えば、ＶＨ４−６１＊０１）およびＪＨ１（例えば、ＪＨ１＊０１）である、ＶＨドメインと、
免疫グロブリン軽鎖ｖおよびｊ遺伝子セグメントの組換えにより生成されたＶＬドメインであって、前記ｖおよびｊ遺伝子セグメントが、ＶＫ３−１１（例えば、ＶＫ３−１１＊０１）およびＪＫ５（例えば、ＪＫ５＊０１）である、ＶＬドメインとを含む
抗体Ｆｖ領域を含むＦＸ結合ポリペプチドアーム、
とを含む、二重特異性抗原結合分子。
【請求項４】
前記ＦＩＸａ結合ポリペプチドアームが、配列番号３２４と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するＶＨドメインを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項５】
前記ＦＩＸａ結合ポリペプチドアームが、配列番号１０と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するＶＬドメインを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項６】
前記ＦＩＸａ結合部位が、ＦＩＸａ結合ポリペプチドアームの相補性決定領域（ＣＤＲ）のセットによって提供され、前記ＣＤＲのセットが、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、および／またはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、
ＨＣＤＲ１が、配列番号１であり、
ＨＣＤＲ２が、配列番号２であり、
ＨＣＤＲ３が、配列番号１７１であり、
ＬＣＤＲ１が、配列番号６であり、
ＬＣＤＲ２が、配列番号７であり、
ＬＣＤＲ３が、配列番号８である、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項７】
前記ＦＩＸａ結合ポリペプチドアームが、ＶＨドメインアミノ酸配列の配列番号３２４およびＶＬドメインアミノ酸配列の配列番号１０を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項８】
ａＰＴＴアッセイにおいて、ＦＶＩＩＩ欠乏ヒト血漿の凝固時間を４０秒未満に短縮する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項９】
前記ＦＩＸａ結合ポリペプチドアームが、単一特異性形態で提供される場合、ＦＸからＦＸａへのＦＩＸａ触媒活性化を強化することが可能である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１０】
前記ＦＸ結合ポリペプチドアームが、配列番号６１と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＶＨドメインと、配列番号６６と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＶＬドメインとを含む、および／または
前記ＦＸ結合部位が、ＦＸ結合ポリペプチドアームの相補性決定領域（ＣＤＲ）のセットによって提供され、前記ＣＤＲのセットが、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、および／またはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、
ＨＣＤＲ１が、配列番号５７であり、
ＨＣＤＲ２が、配列番号５８であり、
ＨＣＤＲ３が、配列番号５９であり、
ＬＣＤＲ１が、配列番号６２であり、
ＬＣＤＲ２が、配列番号６３であり、
ＬＣＤＲ３が、配列番号６４である、
請求項１〜９のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１１】
前記ＦＸ結合ポリペプチドアームが、ＶＨドメインアミノ酸配列の配列番号６１およびＶＬドメインアミノ酸配列の配列番号６６を含む、請求項１０に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１２】
前記ＦＸ結合ポリペプチドアームが、配列番号７１と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＶＨドメインと、配列番号７６と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＶＬドメインとを含む、および／または
前記ＦＸ結合部位が、ＦＸ結合ポリペプチドアームの相補性決定領域（ＣＤＲ）のセットによって提供され、前記ＣＤＲのセットが、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、および／またはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、
ＨＣＤＲ１が、配列番号６７であり、
ＨＣＤＲ２が、配列番号６８であり、
ＨＣＤＲ３が、配列番号６９であり、
ＬＣＤＲ１が、配列番号７２であり、
ＬＣＤＲ２が、配列番号７３であり、
ＬＣＤＲ３が、配列番号７４である、
請求項１〜９のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１３】
前記ＦＸ結合ポリペプチドアームが、ＶＨドメインアミノ酸配列の配列番号７１およびＶＬドメインアミノ酸配列の配列番号７６を含む、請求項１２に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１４】
前記ＦＸ結合ポリペプチドアームが、配列番号１００と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＶＨドメインと、配列番号１０４と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＶＬドメインとを含む、および／または
前記ＦＸ結合部位が、ＦＸ結合ポリペプチドアームの相補性決定領域（ＣＤＲ）のセットによって提供され、前記ＣＤＲのセットが、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、および／またはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、
ＨＣＤＲ１が、配列番号９６であり、
ＨＣＤＲ２が、配列番号９７であり、
ＨＣＤＲ３が、配列番号９８であり、
ＬＣＤＲ１が、配列番号１０１であり、
ＬＣＤＲ２が、配列番号９２であり、
ＬＣＤＲ３が、配列番号１０２である、
請求項１〜９のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１５】
前記ＦＸ結合ポリペプチドアームが、ＶＨドメインアミノ酸配列の配列番号１００およびＶＬドメインアミノ酸配列の配列番号１０４を含む、請求項１４に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１６】
前記ＦＩＸａ結合ポリペプチドアームおよび／または前記ＦＸ結合ポリペプチドアームが、
Ｎ末端からＣ末端へ、ＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む抗体重鎖と、
Ｎ末端からＣ末端へ、ＶＬドメインおよびＣＬドメインを含む抗体軽鎖とを含む、
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１７】
前記抗体重鎖が、ＩｇＧ定常領域を含む、請求項１６に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１８】
ＦＩＸａ結合Ｆｖ領域を含む第１の重鎖−軽鎖対と、
ＦＸ結合Ｆｖ領域を含む第２の重鎖−軽鎖対とを含む、四量体免疫グロブリンであり、
各重鎖が、ＶＨドメインおよび定常領域を含み、各軽鎖が、ＶＬドメインおよび定常領域を含み、前記第１および第２の重鎖−軽鎖対は会合して、それらの重鎖定常領域のヘテロ二量体化により四量体免疫グロブリンを形成している、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１９】
前記免疫グロブリンが、ＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ４である、請求項１８に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項２０】
前記ＩｇＧが、配列番号１４３のＩｇＧ４−ＰＥヒト重鎖定常領域を含み、前記ＩｇＧ４−ＰＥヒト重鎖定常領域は、ヘテロ二量体化を促進するように、１以上のアミノ酸置換で操作されていてもよい、請求項１９に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか１項で定義される通りである、ＦＩＸａ結合部位を含む単離されたＦＩＸａ結合ポリペプチド。
【請求項２２】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子の前記ＦＩＸ結合ポリペプチドアームまたは前記ＦＸ結合ポリペプチドアームをコードする、単離された核酸。
【請求項２３】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子をコードする単離された核酸。
【請求項２４】
ＦＩＸａ結合部位を含むＦＩＸａ結合ポリペプチドであって、請求項１〜２０のいずれか１項で定義されたＦＩＸａ結合ポリペプチドアームであるＦＩＸａ結合ポリペプチド、または前記ポリペプチドをコードする核酸と、
ＦＸ結合部位を含むＦＸ結合ポリペプチドであって、請求項１〜２０のいずれか１項で定義されるＦＸ結合ポリペプチドアームであるＦＸ結合ポリペプチド、または前記ポリペプチドをコードする核酸とを含む、
請求項１〜２０のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子の製造のためのキット。
【請求項２５】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載の抗原結合分子、または請求項２３に記載の単離された核酸を、薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて含む、組成物。
【請求項２６】
前記抗原結合分子または核酸が、滅菌水溶液中にある、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子をコードする、または前記二重特異性抗原結合分子の前記ＦＩＸａ結合ポリペプチドアームおよび／または前記ＦＸ結合ポリペプチドアームをコードする、組換え核酸を含む宿主細胞であって、前記コードしている核酸が、発現のためのプロモーターに作動可能に連結されている、宿主細胞。
【請求項２８】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載の抗原結合分子を製造する、または、前記二重特異性抗原結合分子の前記ＦＩＸａ結合ポリペプチドアームもしくは前記ＦＸ結合ポリペプチドアームを製造する方法であって、前記抗原結合分子の発現のための条件下で請求項２７に記載の宿主細胞を培養することと、前記宿主細胞培養物から前記抗原結合分子または結合アームを回収することとを含む方法。
【請求項２９】
請求項２５または請求項２６に記載の組成物を患者に投与することを含む、患者における出血を抑制する方法。
【請求項３０】
ヒトまたは動物の身体の治療方法で使用するための、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子または請求項２５もしくは請求項２６に記載の組成物。
【請求項３１】
患者における出血の抑制に使用するための、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子、または請求項２５もしくは請求項２６に記載の組成物。
【請求項３２】
前記患者が、血友病Ａ患者である、請求項２９に記載の方法、または請求項３０もしくは請求項３１に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項３３】
前記患者が、血流中の阻害抗体の存在により、ＦＶＩＩＩでの治療に耐性がある、請求項３２に記載の方法または二重特異性抗原結合分子。
【請求項３４】
前記患者が、血流中の阻害抗体の存在により、ＦＩＸａおよびＦＸに対する別の二重特異性抗原結合分子での治療に耐性がある、請求項３２または請求項３３に記載の方法または二重特異性抗原結合分子。
【請求項３５】
患者が、エミシズマブでの治療に耐性がある、請求項３４に記載の方法または二重特異性抗原結合分子。
【請求項３６】
ＦＶＩＩＩａ活性補充ポリペプチドでの治療を受けている血友病Ａ患者における、阻害性抗薬物抗体の生成を低減する方法であって、
第１のＦＶＩＩＩａ活性補充ポリペプチド薬物を、１〜１２か月間、前記患者に投与することと、
前記患者を、１〜１２か月間、第２の異なるＦＶＩＩＩａ活性補充ポリペプチド薬物に切り替えることと、
前記患者を、１〜１２か月間、前記第１の抗原結合分子、または第３の異なるＦＶＩＩＩａ活性補充ポリペプチド薬物のいずれかに切り替えることと、を含み、
各場合において、前記ＦＶＩＩＩａ活性補充ポリペプチド薬物またはそのコード核酸が、前記患者においてＦＶＩＩＩａを機能的に補充する治療有効量で投与され、前記患者が、前記ＦＶＩＩＩａ活性補充ポリペプチド薬物のうちのいずれかに対して阻害性抗薬物抗体を生成するリスクが、そのＦＶＩＩＩａ活性補充ポリペプチド薬物での治療を受け続けている患者と比較して低減される、方法。
【請求項３７】
阻害性抗薬物抗体の生成を低減しながら、血友病Ａ患者を治療する方法で使用するための、ＦＶＩＩＩａ活性補充ポリペプチド薬物またはそのコード核酸を含む組成物であって、
第１のＦＶＩＩＩａ活性補充ポリペプチド薬物を、１〜１２か月間、前記患者に投与することと、
前記患者を、１〜１２か月間、第２の異なるＦＶＩＩＩａ活性補充ポリペプチド薬物に切り替えることと、
前記患者を、１〜１２か月間、前記第１の抗原結合分子、または第３の異なるＦＶＩＩＩａ活性補充ポリペプチド薬物のいずれかに切り替えることと、を含み、
各場合において、前記ＦＶＩＩＩａ活性補充ポリペプチド薬物またはそのコード核酸が、前記患者においてＦＶＩＩＩａを機能的に補充する治療有効量で投与され、前記患者が、前記ＦＶＩＩＩａ活性補充ポリペプチド薬物のうちのいずれかに対して阻害性抗薬物抗体を生成するリスクが、当該ＦＶＩＩＩａ活性補充ポリペプチド薬物での治療を受け続けている患者と比較して低減される、組成物。
【請求項３８】
前記第１、第２、および／または第３のＦＶＩＩＩａ活性補充ポリペプチド薬物が、ＦＩＸａおよびＦＸに対する二重特異性抗原結合分子である、請求項３６に記載の方法または請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
前記第１、第２および／または第３のＦＶＩＩＩａ活性補充ポリペプチド薬物が、エミシズマブである、請求項３６〜３８のいずれか１項に記載の方法または組成物。
【請求項４０】
前記第１、第２および／または第３のＦＶＩＩＩａ活性補充ポリペプチド薬物が、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子である、請求項３６〜３９のいずれか１項に記載の方法または組成物。
【請求項４１】
前記第１、第２および／または第３のＦＶＩＩＩａ活性補充ポリペプチド薬物が、組換えＦＶＩＩＩまたは血漿由来ＦＶＩＩＩである、請求項３６〜４０のいずれか１項に記載の方法または組成物。
【請求項４２】
インビトロでＦＩＸａおよびＦＸを結合するための、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子の使用。
【請求項４３】
血友病Ａの患者においてＦＶＩＩＩ機能を補充するための、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液凝固カスケード中の第ＩＸａ因子および第Ｘ因子凝固因子に結合する二重特異性抗原結合分子（例えば、抗体）に関する。そのような二重特異性分子は、第Ｘ因子を活性化することによって第ＶＩＩＩ因子を機能的に置換し、ＦＶＩＩＩが欠乏している患者、すなわちＡ型血友病患者に血液凝固能力を回復させる。
【背景技術】
【０００２】
血友病は、多くの凝固因子のうちの１つの機能（部分的または全体）の損失により、血液の凝固能力が低下する遺伝性疾患である。血友病Ａは、血液凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の欠乏である。この疾患は、患者が残存ＦＶＩＩＩ機能を保持する程度、および血液凝固カスケード中の他の構成成分のバランスに応じて、軽度、中程度、および重度の形態を有する。治療しない場合、血友病Ａは、制御不能な出血を引き起こし、これは、特に関節血症からの関節の損傷により、重度の障害を引き起こす可能性がある。この疾患はしばしば致死的であり、生命を脅かす可能性がある。血友病Ａの全世界での発生率は、約１：１０，０００と考えられている。血友病Ｂ（異なる血液凝固因子、第ＩＸ因子の欠乏）は、あまり一般的ではなく、発生率は、約１：５０，０００である。両方の疾患は、Ｘ染色体連鎖であるため、通常男性に見られ、男性出生における血友病Ａの発生率は、約５，０００人に１人である。
【０００３】
出血のエピソードの予防は、患者の生活の質を改善し、致命的な失血のリスクを減らすために不可欠である。血友病Ａの場合、失われた補因子は、ＦＶＩＩＩの投与によって補充され得る。患者への投与のためのＦＶＩＩＩは、組換え発現されてもよいか、または血漿から精製されてもよい。典型的には、この治療を受けている患者は、４８時間毎または１週間に３回、ＦＶＩＩＩを自己注射する。
【０００４】
ＦＶＩＩＩによる治療は、完璧な解決策ではない。重大な欠点は、体内で同種抗体の生産を誘発する可能性があることである。これは、同種抗体がＦＶＩＩＩに結合し、その活性を妨げ、出血が発生すると患者を危険な状況に置くため、ＦＶＩＩＩによる治療を効果のない状態にする。そのような阻害抗体は、重症血友病のためにＦＶＩＩＩで治療された患者の約３０％において発生する。
【０００５】
組換え型ではなく、血漿由来のＦＶＩＩＩによる治療は、患者において阻害抗体を誘発するリスクがより低いことが報告されている。これは、ＦＶＩＩＩに関連して自然に見られ、免疫原性エピトープを遮蔽し得るフォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）を保持している血漿由来の形態による可能性がある。しかしながら、阻害抗体のリスクを完全に回避するＦＶＩＩＩの形態はまだ製造されていない。
【０００６】
免疫原性がより高い可能性があるにもかかわらず、組換えＦＶＩＩＩは、安定性がより高く、貯蔵および輸送がより簡単かつ安価であるため、血漿由来の形態に比べていくつかの利点を提供する。寄贈された血漿からの製品を介して感染を伝播するリスクは、Ｃ型肝炎およびＨＩＶなどのウイルスが感染した血液製剤のレシピエントに不注意に広がっていた１９８０年代と比較して現在大幅に減少したが、当然のことながら、厳しい安全管理の必要性が残っている。
【０００７】
Ｂドメイン切断ポリペプチドであるツロクトコグアルファ（ｔｕｒｏｃｔｏｃｏｇ ａｌｆａ）（ＮｏｖｏＥｉｇｈｔ（登録商標））などのＦＶＩＩＩの新しい組換え型が開発されている。しかしながら、そのような製品は、ＦＶＩＩＩに対する中和抗体を発生させる患者には効果がない。一部の患者は、抗ＦＶＩＩＩ抗体の発生を防ぐために免疫寛容導入法をうまく受けている。しかしながら、阻害抗体を有する、または阻害抗体を発生させるリスクがある患者に使用するためのＦＶＩＩＩの代替手段に対するかなりの需要が残っている。
【０００８】
１つのそのような代替手段は、活性化されたエプタコグアルファ（ｅｐｔａｃｏｇ ａｌｆａ）（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）として既知の組換え第ＶＩＩａ因子である。しかしながら、それは半減期が短く、数時間毎に注射されなければならない。その使用は、長期的な保護治療の実行可能な選択肢ではなく、主として救援療法または阻害抗体を有する血友病患者における手術中の止血カバーの提供に制限されている。
【０００９】
別の利用可能な製品は、活性化プロトロンビン複合体濃縮物（ａＰＣＣ）であるＦＥＩＢＡ（第ＶＩＩＩ因子阻害剤迂回活性）であり、これは同様に、出血のエピソードを抑制し、第ＶＩＩＩ因子に対する阻害因子を有する血友病患者における外科的介入中の出血を防ぐために使用され得る。
【００１０】
現在、遺伝子療法、ｓｉＲＮＡを使用した抗トロンビンの抑制、ＴＦＰＩ（組織因子経路阻害剤）、コンシズマブに対する抗体など、様々な他の代替療法が追求されている。
【００１１】
１つの新しいアプローチは、第ＩＸａ因子（ＦＩＸａ）および第Ｘ因子（ＦＸ）の両方を標的とするヒト化二重特異性ＩｇＧ抗体である。二重特異性抗体は、一方のアームでＦＩＸａに、もう一方のアームでＦＸに結合し、これら２つの補因子を一緒にし、それによりＦＶＩＩＩと同じ方法でＦＸのＦＩＸａ触媒活性化を促進する。したがって、抗体は、血液凝固カスケード中のＦＶＩＩＩを機能的に補充する（図１）。その構造がＦＶＩＩＩとは完全に異なるため、抗体は、抗ＦＶＩＩＩ抗体によって中和できず、したがって投与されたＦＶＩＩＩに対する同種抗体が発生しているか、または発生させるリスクがある患者に適している。
【００１２】
２０１２年、Ｋｉｔａｚａｗａらは、９２の実験動物をヒトＦＩＸａまたはＦＸで免疫化し、抗ＦＩＸａおよび抗ＦＸ抗体遺伝子を発現のための宿主細胞に同時導入することによって製造された、約４０，０００の抗ＦＩＸａ／Ｘ二重特異性抗体のスクリーニングからの、ＦＸを活性化することが可能であったＦＩＸａ／Ｘ二重特異性抗体の単離を報告した［1］。選択した抗体を精製して、ｈＢＳ２３に指定されたヒト化抗体を生成し、これは、ＦＶＩＩＩ欠失血漿中の凝固活性および霊長類におけるインビボ止血活性を示した［1］。ｈＢＳ９１０［2］に指定されたこの抗体のより強力な型は、治験薬名ＡＣＥ９１０、ＩＮＮエミシズマブで臨床試験を開始した。ＡＣＥ９１０の開発は、世界の主要な抗体グループのうちの１つで行われた。それにもかかわらず、適切なインビボ有効性、ならびに臨床規模の製造に適した生化学的および生物物理学的特性を有する分子を操作するのに７年以上かかった。
【００１３】
最大１ｍｇ／ｋｇの用量でＡＣＥ９１０を皮下投与された４８名の健康な男性対象の第Ｉ相研究において、２名の対象が、抗ＡＣＥ９１０抗体の検査で陽性と出た［3］。抗体は、線形の薬物動態プロファイルおよび約４〜５週間の半減期を有することが報告された［3］。その後、エミシズマブを最大３ｍｇ／ｋｇの毎週の皮下用量で、１８名の日本人の重症血友病Ａ患者に投与し、これらの患者における出血を抑制するために、凝固因子の一時的使用を低減することが報告された［4］。２０１６年１２月、エミシズマブは、血友病Ａ患者における出血を低減するための第ＩＩＩ相臨床試験で、その主要評価項目を満たしたことが報告された（「ＨＡＶＥＮ １」研究）。予防処置を受けていない患者と比較して、エミシズマブ予防法で治療された患者に関して、出血数の統計的に有意な低減が報告された。この研究では、以前にバイパス剤予防治療を受けた人々における患者内比較において、エミシズマブ予防治療による経時的な出血数の統計的に有意な低減を含む、全ての副次的評価項目を満たしていることも報告された。したがって、エミシズマブの有効性データは有望であるが、ＨＡＶＥＮ １研究での患者の死亡によって安全性への懸念が高まった。承認された薬物は、エミシズマブと組み合わせてａＰＣＣを投与された患者における血栓性微小血管障害症および血栓塞栓症のリスクに関する枠組み警告文を伴う。上記のように、ａＰＣＣは、二重特異性抗体による治療の主要な患者群である、ＦＶＩＩＩに対する阻害抗体を有する患者において、出血を抑制するために使用される。
【００１４】
血友病の管理は、通常は乳児期にある診断の時点から始まり、患者の生涯にわたって継続的な治療が必要であり、副作用なしで許容され、かつ数十年またはさらには１００年にもわたって有効なままである療法を必要とすることに留意することが重要である。したがって、低免疫原性を含む長期の安全性は、数週間、数か月、またはさらには数年などのより短い継続期間にわたって投与されることを目的とする抗体と比較して、抗血友病抗体にとってより重要である。
【００１５】
近年、ＷＯ２０１８／０９８３６３は、ヒト抗体酵母ライブラリから単離されたＦＩＸおよびＦＸに結合する二重特異性抗体（Ａｄｉｍａｂ）を記載した。ＷＯ２０１８／０９８３６３は、二重特異性抗体の抗ＦＩＸａアームの親和性の増加が、ＦＶＩＩＩａ活性の増加をもたらすことを開示した（アッセイにおける血液凝固時間の減少によって表される）。二重特異性抗体「ＢＳ−０２７１２５」を、最初に選択された「親」抗体の親和性成熟によって生成し、これは、ＦＩＸａ結合アームの親和性を増加させた。ＢＳ−０２７１２５は、凝固一段法において約９０％のＦＶＩＩＩａ様活性を達成することが報告された。エミシズマブと比較した場合、ＢＳ−０２７１２５は、因子ＦＩＸチモーゲン、ＦＩＸａおよびＦＸチモーゲンに対するはるかに高い親和性結合、ならびにＦＸａへのはるかに低い結合（結合は検出されず）を提示することが報告された。
ＦＩＸ結合アーム「ＢＩＩＢ−９−１３３６」は報告によると、ＦＩＸチモーゲン（タンパク質分解活性化の前の成熟ＦＩＸ）よりもＦＩＸａ（活性化ＦＩＸ）に対する選択的結合を示し、ＦＶＩＩＩａによって結合したＦＩＸａエピトープと重複するエピトープに結合することがわかった。ＦＸ結合アーム「ＢＩＩＢ−１２−９１７」は報告によると、ＦＸチモーゲンに選択的に結合し、（活性化）ＦＸａへの検出可能な結合を欠き、（ＦＸａではなくＦＸチモーゲン中に存在する）活性化ペプチド内にあるＦＸのエピトープに結合したことを示した。次いで、ＢＩＩＢ−９−１３３６を含む選択されたＦＩＸ結合抗体にさらなる変異を導入し、ＦＩＸａに対する特異性および／または親和性がさらに増加した抗体を選択するためのライブラリを生成した。
【発明の概要】
【００１６】
本発明は、血液凝固第ＦＩＸａ因子および第ＦＸ因子に結合する改善された二重特異性抗原結合分子に関する。本発明の二重特異性抗原結合分子は、ＦＸのＦＸａへのＦＩＸａ触媒活性化を強化し、血友病Ａ患者において欠けている天然の第ＦＶＩＩＩａ補因子を効果的に補充し、患者の血液の凝固能力を回復させることができる。図２ｂを参照されたい。
【００１７】
本明細書で報告されるように、本発明者らは、ＦＸ活性化の強化における非常に高い効力を含む、治療製品としての開発に適した品質を有する多くの二重特異性抗原結合分子を生成することに成功した。抗ＦＩＸａおよび抗ＦＸに対する新規結合部位を有する二重特異性抗原結合分子について記載され、これは、血液凝固カスケード中でＦＶＩＩＩａに効果的に取って代わるために使用され得る。具体的には、抗ＦＩＸａ結合部位が記載され、それは異なる抗ＦＸ結合部位の配列と組み合わせて非常に活性であり、したがって様々な異なるＦＩＸａ−ＦＸ二重特異性抗体に組み込まれ得、製造の容易さなどのさらなる所望の特性を有する二重特異性抗体の選択に柔軟性を提供する。
【００１８】
第１の態様では、本発明は、（ｉ）ＦＩＸａ結合部位を含むＦＩＸａ結合ポリペプチドアームと、（ｉｉ）ＦＸ結合部位を含むＦＸ結合ポリペプチドアームとを含む、二重特異性抗原結合分子に関する。ＦＩＸａおよび／またはＦＸ結合ポリペプチドアームは、それぞれＦＩＸａまたはＦＸ結合部位を含む抗体Ｆｖ領域を含んでもよい。抗体Ｆｖ領域は、抗体ＶＨ−ＶＬドメイン対である。ＶＨドメインは、ＶＨドメインフレームワーク内にＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、ＶＬドメインは、ＶＬドメインフレームワーク内にＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む。ポリペプチドアームは、抗体重鎖（任意にＩｇＧ定常領域を含むもの）および／または抗体軽鎖を含んでもよい。
【００１９】
したがって、本発明の抗原結合分子は、第１および第２の抗体Ｆｖ領域、ＦＩＸａおよびＦＸの結合部位をそれぞれ含む第１および第２の抗体Ｆｖ領域、ならびにインビボの分子の半減期を延長するための半減期延長領域を含んでもよい。
【００２０】
半減期延長領域は、第１の抗体Ｆｖ領域に共有結合した（例えば、融合タンパク質として）第１のポリペプチドと、第２の抗体Ｆｖ領域に共有結合した（例えば、融合タンパク質として）第２のポリペプチドとを含む、ヘテロ二量体化領域であってもよく、２つのポリペプチドは、互いに共有結合的および／または非共有結合的に対になる。ヘテロ二量体化領域の第１および第２のポリペプチドは、同一または異なるアミノ酸配列を有してもよい。ヘテロ二量体化領域は、１つ以上の抗体定常ドメインを含んでもよく、例えば、それは、抗体Ｆｃ領域であってもよい。
【００２１】
本発明の二重特異性抗原結合分子は、ＦＩＸａ結合ポリペプチドアームのＦＩＸａ結合部位を通じてＦＩＸａに結合し、ＦＸ結合ポリペプチドアームのＦＸ結合部位を通じてＦＸに結合し、それによりＦＸからＦＸａへのＦＩＸａ触媒活性化を強化することが可能である。これは、本明細書に記載のインビトロＦＸ活性化アッセイで決定され得る。
【００２２】
ＦＩＸａ結合部位は、ＦＩＸａ結合ポリペプチドアームの相補性決定領域（ＣＤＲ）のセットによって提供されてもよく、ＣＤＲのセットは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ならびに／またはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、
ＨＣＤＲ１は、配列番号１であり、
ＨＣＤＲ２は、配列番号２であり、
ＨＣＤＲ３は、配列番号４００であり、
ＬＣＤＲ１は、配列番号６であり、
ＬＣＤＲ２は、配列番号７であり、
ＬＣＤＲ３は、配列番号８である。
ＦＩＸａ結合ポリペプチドアームのＣＤＲのセットは、次のＣＤＲのセットであってもよく、
ＨＣＤＲ１は、配列番号１であり、
ＨＣＤＲ２は、配列番号２であり、
ＨＣＤＲ３は、配列番号４０１、配列番号４０２、または配列番号４０３であり、
ＬＣＤＲ１は、配列番号６であり、
ＬＣＤＲ２は、配列番号７であり、
ＬＣＤＲ３は、配列番号８である。
ＦＩＸａ結合ポリペプチドアームのＣＤＲのセットは、次のＣＤＲのセットであってもよく、
ＨＣＤＲ１は、配列番号１であり、
ＨＣＤＲ２は、配列番号２であり、
ＨＣＤＲ３は、配列番号１７１であり、
ＬＣＤＲ１は、配列番号６であり、
ＬＣＤＲ２は、配列番号７であり、
ＬＣＤＲ３は、配列番号８である。
ＦＩＸａ結合部位は、ＦＩＸａ結合ポリペプチドアームの相補性決定領域（ＣＤＲ）のセットによって提供されてもよく、そのＣＤＲのセットは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ならびに／またはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、
ＨＣＤＲ１は、配列番号１４０であり、
ＨＣＤＲ２は、配列番号１４１であり、
ＨＣＤＲ３は、配列番号１４２であり、
ＬＣＤＲ１は、配列番号６であり、
ＬＣＤＲ２は、配列番号７であり、
ＬＣＤＲ３は、配列番号８である。
【００２３】
任意に、ＣＤＲのセットの１つ以上のアミノ酸は、これらの配列とは異なるように変異されてもよい。例えば、ＣＤＲのセットは、１、２、３、４、または５個のアミノ酸改変を含んでもよく、改変した残基は、重鎖または軽鎖ＣＤＲのいずれか１つ以上にある。例えば、ＣＤＲのセットは、１つまたは２つの保存的置換を含んでもよい。変異、例えば、置換の選択は、本明細書の実施例１４の分析（例えば、ＨＣＤＲ３について）によって、かつ／または得られる変異体の生物学的特性を確認するための実験的試験によって通知され得る。ＶＨドメイン、ＨＣＤＲのセットまたはＨＣＤＲ３における変異には、ＨＣＤＲ３配列番号１７１のＩＭＧＴ位置１１１．１のＩｌｅ、またはＨＣＤＲ３配列番号１７１のＩＭＧＴ位置１１１．１のＳｅｒに対する疎水性残基または正に荷電した残基の置換を含んでもよいか、またはそれからなってもよい。好ましくは、ＨＣＤＲ３は、この位置において疎水性残基、例えば、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ＶａｌまたはＴｒｐを含む。Ｉｌｅが特に好ましい。
【００２４】
ＦＩＸａ結合ポリペプチドアームは、ＨＣＤＲのセット、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む抗体ＶＨドメインを含んでもよい。ＨＣＤＲ１の配列は、任意に１つまたは２つのアミノ酸改変（例えば、置換）を有する配列番号１４０であってもよい。ＨＣＤＲ２の配列は、任意に１つまたは２つのアミノ酸改変（例えば、置換）を有する配列番号１４１であってもよい。ＨＣＤＲ３の配列は、任意に１つまたは２つのアミノ酸改変（例えば、置換）を有する配列番号１４２であってもよい。ＨＣＤＲ１の配列は、任意に１つまたは２つのアミノ酸改変（例えば、置換）を有する配列番号１であってもよい。ＨＣＤＲ２の配列は、任意に１つまたは２つのアミノ酸改変（例えば、置換）を有する配列番号２であってもよい。ＨＣＤＲ３の配列は、任意に１つまたは２つのアミノ酸改変（例えば、置換）を有する配列番号３であってもよい。任意に、ＨＣＤＲ１配列は、配列番号１４０または配列番号１である。任意に、ＨＣＤＲ２配列は、配列番号１４１または配列番号２である。任意に、ＨＣＤＲ３配列は、配列番号４００、配列番号４０１、配列番号４０２、配列番号４０３、または配列番号１７１である。ＨＣＤＲ１の配列は、配列番号１であってもよい。ＨＣＤＲ２の配列は、配列番号２であってもよい。ＨＣＤＲ３の配列は、配列番号１７１であってもよい。好ましい実施形態では、ＶＨドメインは、ＨＣＤＲ１配列番号１、ＨＣＤＲ２配列番号２、およびＨＣＤＲ３配列番号１７１を含む。
【００２５】
ＦＩＸａ結合ポリペプチドアームは、ＬＣＤＲのセット、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む抗体ＶＬドメインを含んでもよい。ＬＣＤＲ１の配列は、任意に１つまたは２つのアミノ酸改変（例えば、置換）を有する配列番号６であってもよい。ＬＣＤＲ２の配列は、任意に１つまたは２つのアミノ酸改変（例えば、置換）を有する配列番号７であってもよい。ＬＣＤＲ３の配列は、任意に１つまたは２つのアミノ酸改変（例えば、置換）を有する配列番号８であってもよい。
【００２６】
ＦＩＸａ結合ポリペプチドアームの抗体Ｆｖ領域は、免疫グロブリン重鎖ｖ、ｄ、およびｊ遺伝子セグメントの組換えにより生成されたＶＨドメインを含んでもよく、前記ｖ遺伝子セグメントが、ＶＨ３−７（例えば、ＶＨ３−７＊０１）であり、前記ｄ遺伝子セグメントが、ＤＨ１−２６（例えば、ＤＨ１−２６＊０１）であり、および／または前記ｊ遺伝子セグメントが、ＪＨ６（例えば、ＪＨ６＊０２）である、および／または、免疫グロブリン軽鎖ｖおよびｊ遺伝子セグメントの組換えにより生成されたＶＬドメインを含んでもよく、前記ｖ遺伝子セグメントが、ＶＬ３−２１（例えば、ＶＬ３−２１＊ｄ０１）であり、前記ｊ遺伝子セグメントが、ＪＬ３（例えば、ＪＬ３＊０２）である。ＦＩＸａ結合ポリペプチドアームの抗体Ｆｖ領域は、免疫グロブリン軽鎖ｖおよびｊ遺伝子セグメントの組換えにより生成されたＶＬドメインを含み得、前記ｖ遺伝子セグメントがＶＬ３−２１（例えば、ＶＬ３−２１ｄ＊０１）および前記ｊ遺伝子セグメントが、ＪＬ２（例えば、ＪＬ２＊０１）である。
【００２７】
本発明におけるＦＩＸａ結合ポリペプチドアームのＶＨドメインは、フレームワーク内にＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含んでもよく、該フレームワークは、フレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４のセットを含み、
ＦＲ１は、配列番号１３２であり、
ＦＲ２は、配列番号１３３であり、
ＦＲ３は、配列番号１３４であり、
ＦＲ４は、配列番号１３５であるか、
または、最大１０個のアミノ酸改変を有するフレームワーク領域のそのセットを含む、例えば、任意の１つ以上のフレームワーク領域内に１つまたは２つの保存的置換があってもよい。
ＦＲ１は、アミノ酸配列の配列番号１３２を有してもよく、任意に、ＦのＬ置換、ＡＶＳモチーフにおけるＡのＶ置換および／またはＶのＡ置換を有する。
ＦＲ２は、アミノ酸配列の配列番号１３３を有してもよい。
ＦＲ３は、アミノ酸配列の配列番号１３４を有してもよく、任意に、その配列の１番目の残基位置におけるＦのＹ置換、４番目の残基位置におけるＡのＤ置換、１２番目の残基位置におけるＭのＩ置換、１９番目の残基位置におけるＫのＮ置換、２１番目の残基位置におけるＶのＬ置換、および／またはその配列の２３番目の残基位置におけるＶのＬ置換を有する。
ＦＲ４は、アミノ酸配列の配列番号１３５を有してもよく、任意に、８番目の残基位置でＴのＳ置換を有する。
【００２８】
ＩＸａポリペプチド結合アームのＶＨドメインのアミノ酸配列は、配列番号３２４と少なくとも９０％の配列同一性を共有してもよい。配列同一性は、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であってもよい。ＶＨドメインは、ＨＣＤＲ３中のＩＭＧＴ位置１１１．１において疎水性残基または正に荷電した残基を有することが好ましい。ＨＣＤＲ３は、１５アミノ酸長であってもよい。好ましくは、ＨＣＤＲ３は、この位置に疎水性残基、例えば、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、またはＴｒｐを含む。Ｉｌｅが特に好ましい。ＨＣＤＲ３は、ＩＭＧＴ位置１１０、位置１１１、および／または位置１１２．１においてＳｅｒを含んでもよく、例えば、それは、位置１１０、１１１、および１１２．１のうちの２つまたは３つにＳｅｒを含んでもよい。本発明におけるＶＨドメインのＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、任意に、配列番号４００、配列番号４０１、配列番号４０２、配列番号４０３、または配列番号１７１である。
【００２９】
ＶＨドメインのアミノ酸配列は、配列番号５と少なくとも９０％の配列同一性を共有してもよい。配列同一性は、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であってもよい。
【００３０】
任意に、ＶＨドメインアミノ酸配列は、配列番号３２４である。任意に、ＶＨドメインアミノ酸配列は、配列番号５である。
【００３１】
本発明におけるＦＩＸａ結合ポリペプチドアームのＶＬドメインは、フレームワーク内にＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含んでもよく、フレームワークは、フレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４のセットを含み、
ＦＲ１は、配列番号１３６であり、
ＦＲ２は、配列番号１３７であり、
ＦＲ３は、配列番号１３８であり、
ＦＲ４は、配列番号１３９であるか、
または、最大１０個のアミノ酸改変を有するフレームワーク領域のそのセットを含む、例えば、任意の１つ以上のフレームワーク領域内に１つまたは２つの保存的置換があってもよい。
【００３２】
ＶＬドメインのアミノ酸配列は、配列番号１０と少なくとも９０％の配列同一性を共有してもよい。配列同一性は、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であってもよい。任意に、ＶＬドメインアミノ酸配列は、配列番号１０である。
【００３３】
本発明の二重特異性抗原結合分子のＦＩＸａ結合ポリペプチドアームは、二重特異性分子の状況外で単一特異性形態で提供される場合でさえ、ＦＸからＦＸａへのＦＩＸａ触媒活性化を強化することが可能であり得る。これは、本明細書に記載のインビトロＦＸ活性化アッセイで決定され得る。
【００３４】
ＦＩＸａおよびＦＸへの結合を決定し、抗原結合に対するポリペプチドアームの親和性を定量化するために、表面プラズモン共鳴が使用されてもよい。
【００３５】
ＦＸ結合部位は、ＦＸ結合ポリペプチドアーム内のＣＤＲのセットによって提供されてもよい。ＦＸ結合ポリペプチドアームは、抗体ＶＨ−ＶＬドメイン対（すなわち、抗体Ｆｖ領域）、フレームワーク内にＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含むＶＨドメイン、ならびにフレームワーク内にＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含むＶＬドメインを含んでもよい。
【００３６】
ＦＸ結合部位は、抗体Ｔ０２のＣＤＲ、すなわち、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３ならびに／またはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含むＣＤＲのセットによって提供されてもよく、
ＨＣＤＲ１は、配列番号５７であり、
ＨＣＤＲ２は、配列番号５８であり、
ＨＣＤＲ３は、配列番号５９であり、
ＬＣＤＲ１は、配列番号６２であり、
ＬＣＤＲ２は、配列番号６３であり、
ＬＣＤＲ３は、配列番号６４である。
【００３７】
ＦＸ結合ポリペプチドアームは、Ｔ０２ ＶＨドメイン配列番号６１と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＶＨドメインを含んでもよく、かつ／またはＴ０２ ＶＬドメイン配列番号６６と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＶＬドメインを含んでもよい。配列同一性は、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であってもよい。任意に、ＶＨドメインアミノ酸配列は、配列番号６１である。任意に、ＶＬドメインアミノ酸配列は、配列番号６６である。
【００３８】
ＦＸ結合部位は、抗体Ｔ０５のＣＤＲ、すなわち、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３ならびに／またはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含むＣＤＲのセットによって提供されてもよく、
ＨＣＤＲ１は、配列番号６７であり、
ＨＣＤＲ２は、配列番号６８であり、
ＨＣＤＲ３は、配列番号６９であり、
ＬＣＤＲ１は、配列番号７２であり、
ＬＣＤＲ２は、配列番号７３であり、
ＬＣＤＲ３は、配列番号７４である。
【００３９】
ＦＸ結合ポリペプチドアームは、Ｔ０５ ＶＨドメイン配列番号７１と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＶＨドメインを含んでもよく、かつ／またはＴ０５ ＶＬドメイン配列番号７６と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＶＬドメインを含んでもよい。配列同一性は、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であってもよい。任意に、ＶＨドメインアミノ酸配列は、配列番号６１である。任意に、ＶＬドメインアミノ酸配列は、配列番号７６である。
【００４０】
ＦＸ結合部位は、抗体Ｔ１４のＣＤＲ、すなわち、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３ならびに／またはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含むＣＤＲのセットによって提供されてもよく、
ＨＣＤＲ１は、配列番号９６であり、
ＨＣＤＲ２は、配列番号９７であり、
ＨＣＤＲ３は、配列番号９８であり、
ＬＣＤＲ１は、配列番号１０１であり、
ＬＣＤＲ２は、配列番号９２であり、
ＬＣＤＲ３は、配列番号１０２である。
【００４１】
ＦＸ結合ポリペプチドアームは、Ｔ１４ ＶＨドメイン配列番号１００と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＶＨドメインを含んでもよく、かつ／またはＴ１４ ＶＬドメイン配列番号１０４と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＶＬドメインを含んでもよい。配列同一性は、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であってもよい。任意に、ＶＨドメインアミノ酸配列は、配列番号１００である。任意に、ＶＬドメインアミノ酸配列は、配列番号１０４である。
【００４２】
ＦＸ結合ポリペプチドアームは、
（ａ）免疫グロブリン重鎖ｖ、ｄ、およびｊ遺伝子セグメントの組換えにより生成されたＶＨドメインであって、前記ｖおよびｊ遺伝子セグメントが、ＶＨ１−３（例えば、ＶＨ１−３＊０１）およびＪＨ６（例えば、ＪＨ６＊０２）である、ＶＨドメインと、
免疫グロブリン軽鎖ｖおよびｊ遺伝子セグメントの組換えにより生成されたＶＬドメインであって、前記ｖおよびｊ遺伝子セグメントが、ＶＬ１−４７（例えば、ＶＬ１−４７＊０１）およびＪＬ１（例えば、ＪＬ１＊０１）である、ＶＬドメインとを含むか、または、
（ｂ）免疫グロブリン重鎖ｖ、ｄ、およびｊ遺伝子セグメントの組換えにより生成されたＶＨドメインであって、前記ｖおよびｊ遺伝子セグメントが、ＶＨ３−３０（例えば、ＶＨ３−３０＊１８）およびＪＨ６（例えば、ＪＨ６＊０２）である、ＶＨドメインと、
免疫グロブリン軽鎖ｖおよびｊ遺伝子セグメントの組換えにより生成されたＶＬドメインであって、前記ｖおよびｊ遺伝子セグメントが、ＶＬ２−８（例えば、ＶＬ２−８＊０１）およびＪＬ２（例えば、ＪＬ２＊０１）である、ＶＬドメインとを含むか、または、
（ｃ）免疫グロブリン重鎖ｖ、ｄ、およびｊ遺伝子セグメントの組換えにより生成されたＶＨドメインであって、前記ｖおよびｊ遺伝子セグメントが、ＶＨ４−６１（例えば、ＶＨ４−６１＊０１）およびＪＨ１（例えば、ＪＨ１＊０１）である、ＶＨドメインと、
免疫グロブリン軽鎖ｖおよびｊ遺伝子セグメントの組換えにより生成されたＶＬドメインであって、前記ｖおよびｊ遺伝子セグメントが、ＶＫ３−１１（例えば、ＶＫ３−１１＊０１）およびＪＫ５（例えば、ＪＫ５＊０１）である、ＶＬドメインとを含む、
抗体Ｆｖ領域を含んでもよい。
【００４３】
ＦＸ結合ポリペプチドアームは、免疫グロブリン重鎖ｖ、ｄ、およびｊ遺伝子セグメントの組換えにより生成されたＶＨドメインであって、前記ｖおよび前記ｊ遺伝子セグメントが、
ＶＨ１−３（例えば、ＶＨ１−３*０１）およびＪＨ６（例えば、ＪＨ６*０２）、
ＶＨ３−３０（例えば、ＶＨ３−３０*１８）およびＪＨ６（例えば、ＪＨ６*０２）、
ＶＨ３−３３（例えば、ＶＨ３−３３*０１）およびＪＨ６（例えば、ＪＨ６*０２）、
ＶＨ４−３１（例えば、ＶＨ４−３１*０３）およびＪＨ４（例えば、ＪＨ４*０２）、または
ＶＨ４−５９（例えば、ＶＨ４−５９*０１）およびＪＨ４（例えば、ＪＨ４*０２）である、ＶＨドメインと、
ＶＬドメインとを含む、抗体Ｆｖ領域を含んでもよい。
【００４４】
ＦＸ結合ポリペプチドアームは、免疫グロブリン軽鎖ｖおよびｊ遺伝子セグメントの組換えにより生成されたＶＬドメインであって、前記ｖ遺伝子セグメントが、ＶＬ３−２１（例えば、ＶＬ３−２１*ｄ０１）であり、前記ｊ遺伝子セグメントが、ＪＬ３（例えば、ＪＬ３*０２）である、ＶＬドメインを含む、抗体Ｆｖ領域を含んでもよい。
【００４５】
ＦＩＸａ結合ポリペプチドアームおよびＦＸ結合ポリペプチドアームは各々、抗体Ｆｖを含んでもよく、各ＦｖのＶＬドメインは、同一のアミノ酸配列を有し、すなわち、二重特異性抗原結合分子は、共通のＶＬドメインを有する。分子は、可変領域および定常領域、任意にヒトλ定常領域を含む、共通の軽鎖を有してもよい。
【００４６】
二重特異性抗原結合分子は、ＦＩＸａ結合Ｆｖ領域を含む抗体重鎖および軽鎖の第１の対（重鎖−軽鎖対）、ＦＸ結合Ｆｖ領域を含む第２の重鎖−軽鎖対を含む、四量体免疫グロブリンであってもよく、
各重鎖は、ＶＨドメインおよび定常領域を含み、各軽鎖は、ＶＬドメインおよび定常領域を含み、第１および第２の重鎖−軽鎖対は、それらの重鎖定常領域のヘテロ二量体化により会合して、免疫グロブリン四量体を形成する。上記のように、軽鎖は、共通の軽鎖であってもよく、すなわち、第１および第２の重鎖−軽鎖対の軽鎖は、同一のアミノ酸配列を有する。例示的な免疫グロブリンアイソタイプは、ヒトＩｇＧ、例えばＩｇＧ４、任意にＩｇＧ４ ＰＥなどの定常ドメインが操作されたヒトＩｇＧを含む。
【００４７】
本明細書で例示される二重特異性抗体の有利な特徴は、それらがＫｙｍｏｕｓｅプラットフォームを使用して、ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントから生成されていることである。マウスＣＤＲをヒト抗体可変ドメインに移植すること、およびこれらの変化に起因する機能の損失を軽減するために操作された可変ドメインを繰り返し化精製することなどの「ヒト化」ステップを必要とし得る、通常の実験動物の免疫化から生成される抗体とは異なり、本発明の抗体は、最初から完全なヒト抗体可変ドメインを用いて生成および選択された。完全なヒト抗体の使用は、上記のように、低免疫原性が最も重要である血友病治療の状況において特に適している。本発明の二重特異性抗体の免疫原性が低いため、それらは、ＦＶＩＩＩなどの他の治療に対する阻害抗体を有するかまたは有しない患者を含む、血友病Ａ患者の治療に適したものとなる。本発明の抗原結合分子を投与されている患者は、療法に対する免疫原性応答を発生させるリスクが最小限であるべきである。
【００４８】
二重特異性分子の作用機序は、深部静脈血栓症および肺塞栓症などの合併症のリスクが低い良好な安全性プロファイルとも関連している。二重特異性分子の活性は、天然のＦＶＩＩＩの活性および既存の血液凝固経路に統合されている作用機構に匹敵し、天然の凝固カスケードの上流誘発の状況においてのみ活性化される。
【００４９】
他の望ましい特徴には、半減期の長さ（必要な投与頻度を低減する）、および高濃度での製剤に対する分子の適応性（家庭環境での皮下注射を促進する）が含まれる。
【００５０】
本発明のさらなる態様は、添付の特許請求の範囲に記載され、かつ本開示に記載されるように、二重特異性抗原結合分子、それらをコードする核酸、個々のポリペプチド結合アームを含む医薬組成物、分子の製造のためのシステムおよび方法、ならびに血友病Ａの治療用を含む薬剤におけるそれらの使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】血液凝固カスケード［5］。
【図２】Ａ．ＦＩＸａおよびＦＸと相互作用するＦＶＩＩＩａの補因子作用。Ｂ．ＦＩＸａおよびＦＸと相互作用する二重特異性抗体の補因子作用。
【図３】成熟タンパク質の残基番号付けを有する第ＩＸ因子のアミノ酸配列。シグナルペプチド（直線下線付き）は、分泌後に開裂される。プロペプチド（波下線付き）は、成熟すると開裂される。成熟第ＩＸ因子は、軽鎖（残基１〜１４５）および重鎖（残基１４６〜４１５）を含む。活性化ペプチド（枠付き）は、活性化時に開裂され、Ｃｙｓ１３２とＣｙｓ２８９との間のジスルフィド架橋によって結合された軽鎖（残基１〜１４５）および重鎖（残基１８１〜４１５、太字）を含む、活性化第ＩＸａ因子を生成する。
【図４】残基番号付けを有する第Ｘ因子のアミノ酸配列。残基１〜３１は、シグナルペプチドである（直線下線付き）。残基３２〜４０は、プロペプチドである（波下線付き）。ＦＸ軽鎖は、残基４１〜１７９である。ＦＸ重鎖は、残基１８３〜４８８である。ＦＸａ重鎖は、残基２３５〜４８８（太字）である。
【図５Ａ】二重特異性ＩｇＧ。（Ａ）共通の軽鎖を有する二重特異性ＩｇＧ。（Ｂ）異なる軽鎖を有する二重特異性ＩｇＧ。
【図５Ｂ】二重特異性ＩｇＧ。（Ａ）共通の軽鎖を有する二重特異性ＩｇＧ。（Ｂ）異なる軽鎖を有する二重特異性ＩｇＧ。
【図５Ｃ】二重特異性ＩｇＧ断片。（Ｃ）Ｆ（ａｂ’）２。（Ｄ）タンデム連結ｓｃＦｖ。
【図５Ｄ】二重特異性ＩｇＧ断片。（Ｃ）Ｆ（ａｂ’）２。（Ｄ）タンデム連結ｓｃＦｖ。
【図６】二重特異性抗体のＦＩＴ−Ｉｇ形式。（ｉ）集合ＦＩＴ−Ｉｇ抗体（ｉｉ）ＦＩＴ−Ｉｇ抗体に含まれるポリペプチド鎖。構築物１は、ＮからＣ方向に、抗体「Ａ」の軽可変領域（ＶＬ）および軽定常領域（ＣＬ）を含み、抗体「Ｂ」の重可変領域（ＶＨ）および重定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）に融合している、ポリペプチドである。好ましくは、ＣＬドメインとＶＨＢドメインとの間にリンカーは含まれない。構築物２は、抗体「Ａ」の重可変（ＶＨ）領域とＣＨ１とのポリペプチド融合体である。構築物３は、抗体「Ｂ」の軽可変（ＶＬ）領域と軽定常（ＣＬ）領域とのポリペプチド融合体である。ＦＩＴ−Ｉｇは、抗体「Ａ」が抗ＦＩＸａであり、抗体「Ｂ」が抗ＦＸであるか、または抗体「Ａ」がＦＸであり、抗体「Ｂ」が抗ＦＩＸａで構築されてもよい。
【図７】Ａ．実施例９に記載の二重特異性分子のＦＶＩＩＩ模倣活性のインビトロアッセイの原理。          Ｂ．陰性対照と比較したＦＩＸａ−ＦＸ二重特異性分子の陽性結果を示す、実施例９に記載のアッセイからの例示的なデータ。
【図８】テナーゼアッセイにおける二重特異性抗体の初期ハイスループット機能スクリーニングの結果。
【図９】Ｎ１２８Ｈ変異体の表。
【図１０】Ｎ１２８Ｈ ＣＤＲ３変異体のＦＸａｓｅ活性。
【図１１】ａＰＴＴアッセイにおけるＮ１２８Ｈ ＣＤＲ３変異体のＦＶＩＩＩ模倣活性。
【図１２】第ＩＸ因子特異性アームＮ４３６のインビトロテナーゼ（ＦＸａｓｅ）アッセイ活性。
【図１３】（ｉ）Ｔ０２Ｈ ＶＨドメインおよびＴ０２Ｌ ＶＬドメイン、（ｉｉ）Ｔ０５Ｈ ＶＨドメインおよびＴ０５ＬＶＬドメイン、または（ｉｉｉ）Ｔ１４Ｈ ＶＨドメインおよびＴ１４Ｌ ＶＬドメインによって提供されるＦＸ結合部位とヘテロ二量体化された、Ｎ４３６Ｈ ＶＨドメインおよびＮ１２８Ｌ ＶＬドメイン（ＦＩＸ結合部位を提供）を含む二重特異性抗体のＰＴＴアッセイ活性。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
血液凝固
血液凝固カスケードが、図１に示される。凝固（Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ）または凝固（ｃｌｏｔｔｉｎｇ）は、損傷した血管からの失血を止めて、血管が修復されることを可能にする、最も重要な生物学的プロセスのうちの１つである。凝固の機構には、フィブリンの沈着および成熟（maturation）とともに、血小板の活性化、接着、および凝集を伴う。凝固の誤調節は、過度の出血（血友病）または閉塞性凝固（血栓症）を引き起こす可能性がある。凝固は、全ての哺乳動物において高度に保存されている。それは、凝固因子の複雑なネットワークによって制御される。血管の内側を覆う内皮が損傷すると、凝固が開始する。内皮下組織因子（ＴＦ）の血漿第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）への曝露は、一次止血（外因性経路）をもたらし、損傷部位に緩い栓が形成される。追加の凝固因子、特に第ＩＸ因子（ＦＩＸ）および第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の活性化は、二次止血（内因性経路）をもたらし、フィブリン鎖が形成されて栓を強化する。外因性および内因性経路は、最終的に共通点に集中し、カルシウムと一緒に、かつリン脂質表面上に結合した第Ｘａ／Ｖａ因子複合体の形成が、プロトロンビン（第ＩＩ因子）からトロンビン（第ＩＩａ因子）を生成する。
【００５３】
ＦＶＩＩＩは、トロンビンまたは第Ｘａ因子（ＦＸａ）によって開裂され、結果として生じる第ＶＩＩＩａ因子（ＦＶＩＩＩａ）は、Ａ１サブユニット、Ａ２サブユニット、および軽鎖からなるヘテロ三量体構造を示す。活性化すると、かつカルシウムイオンおよびリン脂質表面（血小板上）の存在下で、ＦＶＩＩＩａは、その軽鎖およびＡ２サブユニットを介してＦＩＸａに結合し、同時にそのＡ１サブユニットを介してＦＸに結合し、活性な固有の「テナーゼ」または「Ｘａｓｅ」複合体を形成し、ＦＶＩＩＩａ補因子は、ＦＩＸａおよびＦＸを近接させ、ＦＩＸａの触媒速度定数をアロステリックに強化する。図２ａを参照されたい。第Ｘ因子は、ＦＩＸａのセリンプロテアーゼ活性によって活性化され、凝固カスケードが継続し、血餅の構造ポリマーであるフィブリンの沈着に至る。
【００５４】
血友病は、ＦＶＩＩＩ補因子活性の欠損（血友病Ａ）またはＦＩＸ酵素活性の欠損（血友病Ｂ）のいずれかによるＸａｓｅ複合体の欠乏によって生じる。
【００５５】
第ＩＸ因子（ＦＩＸ）
第ＩＸ因子は、補因子として第ＶＩＩＩ因子を必要とするセリンプロテアーゼである。それは、不活性な前駆体として血液中を循環し、上述のように、止血しようとする時に内因性または外因性経路により活性化される。
【００５６】
文脈が他の意味を必要としない限り、本明細書で言及される第ＩＸ因子は、ヒト第ＩＸ因子であり、第ＩＸａ因子は、ヒト第ＩＸａ因子である。
【００５７】
ヒト第ＩＸ因子のアミノ酸配列が、図３に示される。第ＩＸ因子遺伝子は、約３４ｋｂの長さであり、８つのエクソンを含む。転写物は、短い５’非翻訳領域、オープンリーディングフレームおよび終止コドン、ならびに３’非翻訳領域を含む。ＯＲＦは、４６１アミノ酸のプレ−プロ−タンパク質をコードし、プレ配列（シグナルペプチド）は、分泌のために第ＩＸ因子を方向付け、プロペプチド配列は、ビタミンＫ依存性カルボキシラーゼの結合ドメインを提供し、これは、隣接するＧＬＡドメイン中のある特定のグルタミン酸残基をカルボキシル化し、残りは、第ＩＸ因子チモーゲンを表し、これは、プレおよびプロ配列の除去後に循環に入る。成熟４１５残基ＦＩＸタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ、１２個のグルタミン酸残基が翻訳後にγカルボキシル化されるＧＬＡドメイン、２つの上皮成長因子（ＥＧＦ）様ドメイン、活性化ペプチド配列、および触媒セリンプロテアーゼドメインを含む。ＦＩＸは、内因性経路により生成された活性化第ＸＩ因子、または外因性経路のＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体のいずれかによって活性化される。いずれにせよ、活性化は、Ｒ１４５に続くペプチド結合の開裂（α−開裂）およびＲ１８０に続くペプチド結合の開裂（β−開裂）を伴い、介在配列に対応する活性化ペプチドを放出し、それにより活性化ＦＩＸａ分子を生成し、これは、軽鎖のＣ１３２と重鎖のＣ２８９との間のジスルフィド架橋によって結合された、Ｎ末端軽鎖（ＧＬＡ−ＥＧＦ−ＥＧＦ）およびＣ末端重鎖（触媒ドメイン）を有する。残基番号付けは、成熟ＦＩＸポリペプチド配列中のアミノ酸を指す。Ｘａｓｅ複合体が形成されるリン脂質表面上では、リン脂質と結合するのはＦＩＸａのＧＬＡドメインであり、一方、触媒ドメインは、リン脂質表面よりも高く（７０Å超）、ＦＶＩＩＩａのＡ２ドメインによって調整される［6, 7］。
【００５８】
ＦＩＸａ活性の欠失である血友病Ｂの分子基盤は多様であり、活性化開裂部位における様々な点変異、ナンセンス変異、ｍＲＮＡスプライス部位変異、欠失、挿入、またはミスセンス変異を含む［8］。
【００５９】
活性化ＦＩＸ（ＦＩＸａ）の触媒（プロテアーゼ）ドメインは、ＦＶＩＩＩａへの結合に関与する。このドメイン中の残基Ｅ２４５は、カルシウムイオンに結合し、この位置における変異は、ＦＶＩＩＩへの結合を低減し、血友病Ｂ、例えば、置換Ｅ２４５Ｖをもたらす可能性がある。残基３３０〜３３８によって形成されたＦＩＸヘリックス内の変異は、ＦＶＩＩＩへの結合の低減、その結果として血友病Ｂとも関連している。
【００６０】
一塩基多型（ＳＮＰ）および長多型を含む、第ＩＸ因子における非病原性変異もまた報告されており、［8］で概説されている。これらには、エクソン６中のＭｎＩＩ ＳＮＰが含まれ、残基１４８におけるＴ／Ａ置換（Ｍａｌｍｏ多型）をもたらし、これは、白人および黒人のアメリカ人集団では比較的一般的である［８］。
【００６１】
第Ｘ因子（ＦＸ）
文脈が他の意味を必要としない限り、本明細書で言及される第Ｘ因子は、ヒト第Ｘ因子であり、第Ｘａ因子は、ヒト第Ｘａ因子である。ヒト第ＦＸのアミノ酸配列が、図４に示される。
【００６２】
ＦＸは、スチュアート・プロワー因子としても既知である。それは、セリンエンドペプチダーゼである。ＦＸは、加水分解によって、第ＩＸ因子（上記のようにその補因子である第ＦＶＩＩＩ因子と共に）または第ＶＩＩ因子（その補因子である組織因子と共に）のいずれかによって第Ｘａ因子に活性化される。ＦＸは、Ａｒｇ−Ｔｈｒ結合において、次いでＡｒｇ−Ｉｌｅ結合においてプロトロンビンを２つの場所で開裂することによって作用して、活性トロンビンを得る。
【００６３】
抗原結合
二重特異性抗原結合分子の望ましい特徴は、結合したＦＩＸａが結合したＦＸを活性化することを可能にする方法で、ＦＩＸａおよびＦＸを結合することである。
【００６４】
ＦＩＸａおよびＦＸを一緒にし、それによりＦＩＸａによるＦＸの活性化を促進するために、二重特異性抗原結合分子は、これらの２つの補因子に同時に結合し得る。結合は連続して起こり得、例えば、初期の二元複合体が、第１の結合アームとその同種抗原との間に形成され得、第２の結合アームのその同種抗原への結合が後に続く。原則として、これら２つの結合事象は、ＦＩＸａに続いてＦＸ、またはＦＸに続いてＦＩＸａのいずれかの順序で生じ得る。分子振り付けは、２つの結合部位のそれぞれの抗原に対する相対的親和性の影響を受ける。二重特異性抗原結合分子、ＦＩＸａおよびＦＸの集団では、多くの異なる複合体が並行して存在すると予想される。したがって、そのプールは、遊離抗原結合分子、遊離ＦＩＸａ、遊離ＦＸ、抗原結合分子と複合体化されたＦＩＸａ、抗原結合分子と複合体化されたＦＸ、ならびにＦＩＸ、ＦＸ、および抗原結合分子の三元複合体を含み、これらの種の各々は、個々の相互作用の相対的な結合速度定数および解離速度定数に従って異なる割合で存在する。
【００６５】
二重特異性抗原結合分子は、ＦＸよりもＦＩＸａに対して高い親和性を有することが望ましくあり得る。そのような二重特異性分子は、ＦＩＸａと初期の複合体を形成することが想定され、これがＦＸに結合し、活性化する。ＦＸに対する比較的低い親和性は、不完全な抗体−抗原複合体中で結合するＦＸの割合を低減する（すなわち、ＦＩＸａなし）。これの潜在的な利点は、より大きい割合のＦＸが、患者の血液中に存在する可能性のある任意のＦＶＩＩＩと自由に関与する状態のままであることを可能にすることである。血友病Ａは、軽度の欠乏から機能的ＦＶＩＩＩの完全な欠如にまで及ぶ、幅広いＦＶＩＩＩの欠乏を包含する。ある程度機能的なＦＶＩＩＩを保持する患者の場合、この自然な活性を可能な限り保持することが望ましくあり得る。したがって、ＦＸ結合アームがＦＸへの結合についてＦＶＩＩＩと競合しない二重特異性抗原結合分子を提供することが望ましくあり得る。
【００６６】
好ましくは、ＦＸ結合アームは、ＦＸａよりもＦＸに対して高い親和性を有する。ＦＸａに対する低い親和性は、活性化された生成物の放出を促進し、凝固カスケードにおけるＦＶＩＩＩ模倣分子の役割を完了し、ＦＸ結合部位を再利用のために自由にする。
【００６７】
ＦＩＸａ結合
二重特異性抗原結合分子のＦＩＸａ結合アームは、ＦＩＸａの軽鎖および／または重鎖に結合し得る。初期の研究は、実施例に記載のＮ１２８系統のＦＩＸａ結合アームが、単独で（重鎖の非存在下で）ＦＩＸａ軽鎖に結合しないことを示した。
【００６８】
したがって、本発明の二重特異性抗原結合分子（またはそのＦＩＸａ結合ポリペプチドアーム）は、重鎖および軽鎖を含むＦＩＸａ分子に結合し、かつ重鎖の非存在下でＦＩＸ軽鎖に結合しないものであってもよい。任意に、ＦＩＸａ結合アームは、ＦＩＸａ重鎖および軽鎖の組み合わせによって形成されるか、または安定化されるエピトープを認識する。それは例えば、ＦＩＸａ分子中の軽鎖とのみ接触し、ＦＩＸａ分子中の重鎖と組み合わせて軽鎖が存在する場合にのみ曝露または安定化されるエピトープに結合し得る。あるいは、それは、軽鎖および重鎖の両方からの１つ以上の残基を含むか、または重鎖の残基のみを含むエピトープと接触してもよい。
【００６９】
本発明による抗原結合分子、またはそのＦＩＸａ結合ポリペプチドアームは、１０ｍＭ以下、好ましくは５ｍＭ以下、より好ましくは１ｍＭ以下の親和性（Ｋｄとして測定）でヒトＦＩＸａのＥＣドメインに結合し得る。例えば、Ｋｄは、１ｎＭ〜３μＭであってもよい。
【００７０】
ヒト第ＦＩＸａ因子に結合するためのＫｄは、０．１μＭ〜１μＭ、例えば、０．１５〜０．３μＭであってもよい。Ｋｄは、０．６μＭ以下、０．５μＭ以下、０．４μＭ以下、０．３μＭ以下、０．２５μＭ以下、または２μＭ以下であってもよい。Ｋｄは、少なくとも０．１μＭ、例えば、少なくとも０．２μＭであってもよい。
【００７１】
Ｋｄは、５０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、２ｎＭ以下、または１ｎＭ以下であってもよい。Ｋｄは、０．９ｎＭ以下、０．８ｎＭ以下、０．７ｎＭ以下、０．６ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、０．４ｎＭ以下、０．３ｎＭ以下、０．２ｎＭ以下、または０．１ｎＭ以下であってもよい。Ｋｄは、少なくとも０．００１ｎＭ、例えば、少なくとも０．０１ｎＭまたは少なくとも０．１ｎＭであってもよい。Ｋｄは、０．１〜１０ｎＭであってもよい。
【００７２】
本発明による抗原結合分子またはそのＦＩＸａ結合ポリペプチドのアームは、０．１μＭ〜１μＭ、例えば、０．１５〜０．３μＭの親和性（Ｋｄとして測定）でヒトＦＩＸに結合し得る。Ｋｄは、０．６μＭ以下、０．５μＭ以下、０．４μＭ以下、０．３μＭ以下、０．２５μＭ以下、または２μＭ以下であってもよい。Ｋｄは、少なくとも０．１μＭ、例えば、少なくとも０．２μＭであってもよい。
【００７３】
ＦＩＸとの相互作用のＫｄは、ＦＩＸａとの相互作用のＫｄに匹敵し得、例えば、ＦＩＸａに対する親和性と比較して、ＦＩＸに対するＦＩＸａ結合アームの親和性において２５％未満、任意に１０％未満の差が存在し得る。ＦＩＸａと比較して、ＦＩＸとの相互作用のＫｄにおいて統計的に有意な差が存在しない場合がある。
【００７４】
本明細書の他の箇所に記載されるように、親和性は、例えば、２５℃で、分析物として溶液中の抗原を用い、任意に二量体として（例えば、単一特異性ＩｇＧとして）固体表面に結合した結合アームを用いた、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して決定され得る。
【００７５】
ＦＸ結合
本発明による抗原結合分子、またはそのＦＸ結合ポリペプチドアームは、１０ｍＭ以下、好ましくは５ｍＭ以下、より好ましくは１ｍＭ以下のＫｄでヒトＦＸのＥＣドメインに結合し得る。例えば、Ｋｄは、５μＭ〜１ｎＭ、例えば、５μＭ〜１０ｎＭであってもよい。
【００７６】
Ｋｄは、０．１μＭ〜１μＭ、例えば、０．１５〜０．３μＭであってもよい。Ｋｄは、０．６μＭ以下、０．５μＭ以下、０．４μＭ以下、０．３μＭ以下、または０．２５μＭ以下であってもよい。Ｋｄは、少なくとも０．１μＭであってもよい。
【００７７】
Ｋｄは、５０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、２ｎＭ以下、または１ｎＭ以下であってもよい。Ｋｄは、０．９ｎＭ以下、０．８ｎＭ以下、０．７ｎＭ以下、０．６ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、０．４ｎＭ以下、０．３ｎＭ以下、０．２ｎＭ以下、または０．１ｎＭ以下であってもよい。Ｋｄは、少なくとも０．００１ｎＭ、例えば、少なくとも０．０１ｎＭまたは少なくとも０．１ｎＭであってもよい。例えば、Ｋｄは、１〜１００ｎＭであってもよい。Ｋｄは、１〜１０ｎＭであってもよい。
【００７８】
本明細書の他の箇所に記載されるように、親和性は、例えば、２５℃で、分析物として溶液中の抗原を用い、任意に二量体として（例えば、単一特異性ＩｇＧとして）固体表面に結合した結合アームを用いた、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して決定され得る。
【００７９】
抗原結合親和性の測定
ＦＩＸ、ＦＩＸａ、ＦＸ、およびＦＸａに結合するための抗原結合分子の親和性は、平衡解離定数Ｋｄ、会合のＫａ／Ｋｄ比または解離、または結合相互作用の結合速度定数（Ｋａ）および解離速度定数（ｋｄ）の観点から定量化され得る。抗原結合のためのＫｄ、ＫａおよびＫｄは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して測定され得る。
【００８０】
親和性の定量化は、一価形態の抗原結合ポリペプチドアーム、例えば、抗原結合部位を含む抗体ＦａｂもしくはＦｖ、または当該の抗原に対する単一抗原結合アームを有するヘテロ二量体免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）を用いたＳＰＲを使用して行え得る。あるいは、実施例３および実施例６、または実施例１５〜１６に示されるように、二価形態の抗原結合ポリペプチドアーム、例えば、ホモ二量体抗原結合アームを含むＩｇＧに対する親和性を決定することが便利であり得る。ＳＰＲは、抗原結合ポリペプチドアームの二量体をバイオセンサチップに（直接または間接的に）コーティングすること、抗原結合ポリペプチドアームを幅広い濃度の緩衝液中の抗原に曝露すること、結合を検出すること、および結合相互作用のための平衡解離定数Ｋｄを計算することを含んでもよい。ＳＰＲは、２５℃で行われてもよい。好適な緩衝液は、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％洗剤（例えば、Ｐ２０）、および３ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．６である。２．５ｍＭのＣａＣｌ２を有するＨＢＳ−Ｐ １Ｘ（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％ポリソルベート２０  ｐＨ７．６）が、例示的な緩衝液である。結合データは、使用する機器に固有であり得る標準アルゴリズムを使用して、１：１モデルに適合され得る。Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６（商標）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ（登録商標））、およびＫｉｎＥｘＡ（登録商標）（Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ）などの様々なＳＰＲ機器が既知である。
【００８１】
交差反応性
規制機関は、候補治療分子がヒトの臨床試験に進む前に、実験動物における治療効果を実証していることを要求し得る。後天性血友病Ａ動物モデルの一例は、ＦＶＩＩＩ中和抗体またはＦＶＩＩＩに対する小分子阻害剤の投与により血液凝固が欠乏した状態にされ、それによりヒト血友病Ａ患者の表現型を再現した、カニクイザルである。動物モデルにおける二重特異性抗原結合分子の試験を可能にするために、各アームの結合部位は、１つ以上の非ヒト哺乳動物からの対応する抗原と交差反応することが望ましい。したがって、抗原結合分子のＦＩＸａ結合部位は、ネズミ科（例えば、マウスもしくはラット）、ウサギ、または非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）ＦＩＸａならびにヒトＦＩＸａに結合し得、ＦＸ結合部位は、ネズミ科（例えば、マウスもしくはラット）、ウサギ、または非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）ＦＸａおよびヒトＦＸａに結合し得る。
【００８２】
抗原結合分子（またはより正確には、その抗原結合部位）の種交差反応性の程度を定量化するための一方法は、別の種の抗原と比較した抗原または１つの種に対する親和性の倍数差として、例えば、ヒト抗原対カニクイザル抗原に対する親和性の倍数差としてのものである。親和性は、Ｋｄとして定量化され得、抗原の抗原結合分子への結合の平衡解離定数を指す。Ｋｄは、本明細書の他の箇所に記載されるようにＳＰＲによって決定され得る。
【００８３】
種交差反応性結合分子は、３０倍以下、２５倍以下、２０倍以下、１５倍以下、１０倍以下、または５倍以下であるヒトおよび非ヒト抗原に結合するための親和性の倍数差を有し得る。言い換えると、ヒト抗原の細胞外ドメインに結合するＫｄは、非ヒト抗原の細胞外ドメインに結合するＫｄの１／３０〜３０倍、１／２５〜２５倍、１／２０〜２０倍、１／１５〜１５倍、１／１０〜１０倍、または１／５〜５倍であり得る。
【００８４】
好ましくは、ヒトおよび非ヒト抗原の結合親和性は、１／１０〜１０倍の範囲内、より好ましくは１／５〜５倍または１／２〜２倍である。例えば、表面プラズモン共鳴によって決定されるような、非ヒトＦＩＸａへの結合についてのＫｄは、ヒトＦＩＸａへの結合についてのＫｄよりも最大１０倍（好ましくは、最大５倍もしくは最大２倍）大きくてもよいか、またはせいぜい１／１０（好ましくは、せいぜい１／５もしくはせいぜい１／２）であってもよい。同様に、例えば、ＳＰＲによって決定されるような、非ヒトＦＸへの結合についてのＫｄは、ヒトＦＸへの結合についてのＫｄよりも最大１０倍（好ましくは、最大５倍もしくは最大２倍）大きくてもよいか、またはせいぜい１／１０（好ましくは、せいぜい１／５もしくはせいぜい１／２）であってもよい。親和性を決定する方法は、本明細書の他の箇所に記載されている。
【００８５】
結合分子はまた、両方の種の抗原に結合するためのＫｄが閾値を満たす場合、例えば、ヒト抗原に結合するＫｄおよび非ヒト抗原に結合するＫｄが両方、１０ｍＭ以下、好ましくは５ｍＭ以下、より好ましくは１ｍＭ以下である場合、種交差反応性であると見なされ得る。Ｋｄは、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、２ｎＭ以下、または１ｎＭ以下であってもよい。Ｋｄは、０．９ｎＭ以下、０．８ｎＭ以下、０．７ｎＭ以下、０．６ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、０．４ｎＭ以下、０．３ｎＭ以下、０．２ｎＭ以下、または０．１ｎＭ以下であってもよい。
【００８６】
異なる種の抗原に結合するための種交差反応性が有利であり得る一方で、それでもなお、望ましくない副作用を回避するためには、ＦＩＸａ結合アームおよびＦＸ結合アームのそれぞれの抗原に対する選択性が望ましい。したがって、体内では、ＦＩＸ／ＦＩＸａおよびＦＸ／ＦＸａが、好ましくは、抗原結合分子によって結合される唯一の抗原である。
【００８７】
ＦＸのＦＩＸａ介在活性化の強化
ＦＸのＦＸａへのＦＩＸａ介在活性化を強化する二重特異性抗原結合分子の能力は、インビトロまたはインビボアッセイで決定され得る。
【００８８】
好適なインビトロアッセイは、実施例９に例示され、図７に示されるＦＸ活性化アッセイである。そのアッセイは、
（ｉ）ＦＸａの形成に適した条件下（例えば、リン脂質の存在下、３７℃の緩衝液中）で、二重特異性抗原結合分子をＦＩＸａおよびＦＸと接触させることと、
（ｉｉ）ＦＸａによって開裂可能である基質を添加して、検出可能な生成物を生成することと、
（ｉｉｉ）検出可能な生成物の存在を検出し、任意に定量化すること、
とを含む。
生成物のレベルは、ＦＩＸａ−ＦＸ二重特異性抗原結合分子が反応混合物に存在しない対照アッセイと比較され得る。対照と比較した二重特異性分子を用いたアッセイにおける生成物レベルの有意差は、二重特異性分子がＦＸのＦＩＸａ介在活性化を強化することが可能であることを示す。ＦＶＩＩＩは、陽性対照として含まれる場合がある。
【００８９】
生成物のレベルは、ＦＩＸａ−ＦＸ二重特異性抗原結合分子がエミシズマブであるアッセイと比較され得る。本発明による二重特異性分子は、エミシズマブと同一もしくは同様の程度（例えば、１０％の差以内または５％の差以内）まで、またはより高い程度（例えば、検出可能な生成物のレベルによって測定されたエミシズマブで達成されるよりも１０％超多いＦＸからＦＸａへの活性化）まで、ＦＸからＦＸａへのＦＩＸａ介在活性化を強化し得る。
【００９０】
別の好適なアッセイは、ＦＶＩＩＩ欠乏血漿中の活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）を測定することであり、これは、阻害剤の存在下または非存在下で行われ得、二重特異性分子の活性を組換えヒトＦＶＩＩＩと比較するために使用され得る。このアッセイは、実施例１０および実施例１８に例示される。ａＰＴＴはエンドポイントアッセイであり、血餅形成の全体的な概要を提供し、アッセイ読み出しとして凝固時間を提供する。ＦＶＩＩＩ欠乏血漿は、典型的には、ａＰＴＴアッセイにおいて約８０〜９０秒の凝固時間を有する。本発明の二重特異性抗原結合分子は、ａＰＴＴアッセイにおける凝固時間を短縮するのに有効である（陰性対照と比較して）。本発明による二重特異性抗原結合分子を用いたａＰＴＴアッセイにおけるヒトＦＶＩＩＩ欠乏の凝固時間は、例えば、組換えヒトＦＶＩＩＩａを用いた凝固時間と同じか、またはそれより短い可能性がある。正常な（ＦＶＩＩＩ＋）ヒト血漿の生理学的凝固時間は、典型的には４０秒未満、例えば、３７〜３４秒の範囲である。活性化ＦＶＩＩＩａを提供すると、ＦＶＩＩＩ欠乏血漿でも同様の値が達成可能であり、これは、参照値に対する装置／測定の較正によりアッセイを標準化する便利な方法を提供する。あるいは、正常な（ＦＶＩＩＩ＋）ヒト血漿の凝固時間は、参照のために使用され得、ａＰＴＴアッセイは、カルシウムの添加による凝固の誘発によって開始される。
【００９１】
本発明の二重特異性抗原結合分子は、ａＰＴＴアッセイにおいて、ＦＶＩＩＩａの凝固時間の１０秒以内の凝固時間を与え得る（すなわち、ＦＶＩＩＩａを用いたａＰＴＴアッセイの凝固時間よりも最大１０秒長いか、または最大１０秒短い）。好ましくは、本発明の二重特異性抗原結合分子を用いたａＰＴＴアッセイにおける凝固時間は、ＦＶＩＩＩａを用いた凝固時間よりも短い。二重特異性抗原結合分子は、凝固時間を４０秒未満、３５秒未満、または３０秒未満に短縮し得る。凝固時間は、２０〜４０秒、例えば２０〜３０秒であり得る。
【００９２】
二重特異性抗原結合分子
二重特異性抗原結合分子は、ＦＩＸａ結合ポリペプチドアームとＦＸ結合ポリペプチドアームとを含む。それは、多鎖または単鎖ポリペプチド分子であってもよい。ＦＩＸａ結合ポリペプチドアームおよびＦＸ結合ポリペプチドアームは、二重特異性分子の異なる部分を表すが、１つのポリペプチドが任意に、ＦＩＸａ結合アームおよびＦＸ結合アームの両方の全部または一部を形成することができる。
【００９３】
ポリペプチド結合アームは、抗原（ＦＩＸａまたはＦＸ）のうちの１つに対する結合部位を含む二重特異性分子の領域である。二重特異性分子の一方または両方の抗原結合部位は、ポリペプチドアームの相補性決定領域（またはペプチドループ）のセットによって提供され得、ポリペプチドアームは、抗体（例えば、抗体Ｆｖ領域）または非抗体分子のものであるかどうかにかかわらず、任意の好適な足場ポリペプチドである。結合アームは、１つまたは２つ以上（例えば、２つ）のポリペプチドまたはその部分（例えば、ドメイン）を含んでもよい。
【００９４】
本発明は、二重特異性抗体に関して本明細書に詳細に記載され、抗原結合ポリペプチドアームのうちの少なくとも１つは、抗体ＶＨおよび／またはＶＬドメイン、任意にＦｖ領域におけるＣＤＲのセットによって提供される。
【００９５】
抗体は、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンドメインを含む分子である。抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、もしくはＩｇＥ分子、またはその抗原特異性抗体断片を含む分子であってもよい。「抗体」という用語は、抗体の抗原結合部位を含む任意のポリペプチドまたはタンパク質を含む。抗体の抗原結合部位（パラトープ）は、その標的抗原のエピトープに結合し、かつそれに相補的である抗体の一部である。「エピトープ」という用語は、抗体によって結合される抗原の領域を指す。エピトープは、構造的または機能的であると定義され得る。機能的エピトープは概して、構造的エピトープのサブセットであり、相互作用の親和性に直接寄与する残基を有する。エピトープはまた、立体構造的であり、すなわち、非線形アミノ酸で構成されてもよい。ある特定の実施形態では、エピトープは、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、またはスルホニル基などの分子の化学的に活性な表面グループである決定基を含んでもよく、ある特定の実施形態では、特定の三次元構造特性、および／または特定の電荷特性を有してもよい。
【００９６】
抗体の抗原結合部位は、抗体ＶＨおよび／またはＶＬドメインの相補性決定領域（ＣＤＲ）のセットによって提供され、抗原に結合することが可能である。一例において、抗体結合部位は、単一可変ドメイン、例えば、重鎖可変ドメイン（ＶＨドメイン）、または軽鎖可変ドメイン（ＶＬドメイン）によって提供される。別の例では、結合部位は、ＶＨ／ＶＬ対（Ｆｖ）または２つ以上のそのような対によって提供される。
【００９７】
抗体可変ドメインは、相補性決定領域（ＣＤＲ、すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）のアミノ酸配列、ならびにフレームワーク領域（ＦＲ）を含む、抗体の軽鎖および重鎖の部分である。したがって、ＶＨおよびＶＬドメインの各々の中にＣＤＲおよびＦＲがある。ＶＨドメインは、ＨＣＤＲのセットを含み、ＶＬドメインは、ＬＣＤＲのセットを含む。ＶＨは、重鎖の可変ドメインを指す。ＶＬは、軽鎖の可変ドメインを指す。各ＶＨおよびＶＬは典型的には、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成され、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４でアミノ末端からカルボキシ末端へ配置される。ＣＤＲおよびＦＲに割り当てられたアミノ酸の位置は、ＩＭＧＴ命名法に従って定義され得る。抗体は、ＶＨ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびにフレームワークを含む抗体ＶＨドメインを含んでもよい。あるいは、またはさらに、抗体は、ＶＬ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびにフレームワークを含む抗体ＶＬドメインを含んでもよい。抗体ＶＨおよびＶＬドメインならびにＣＤＲの例示的な配列は、本開示の一部を形成する。ＣＤＲは、ＩＭＧＴシステムに従って定義される［9］。本明細書に開示される全てのＶＨおよびＶＬ配列、ＣＤＲ配列、ＣＤＲのセット、およびＨＣＤＲのセット、およびＬＣＤＲのセットは、本発明の態様および実施形態を表す。本明細書に記載されるように、「ＣＤＲのセット」は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。したがって、ＨＣＤＲのセットは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を指し、ＬＣＤＲのセットは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を指す。特に明記しない限り、「ＣＤＲのセット」は、ＨＣＤＲおよびＬＣＤＲを含む。
【００９８】
抗体は、抗体フレームワーク内に１つ以上のＣＤＲ、例えば、ＣＤＲのセットを含んでもよい。フレームワーク領域は、ヒト生殖細胞遺伝子セグメント配列のものであり得る。したがって、抗体は、ヒト生殖細胞フレームワーク内にＨＣＤＲのセットを含むＶＨドメインを有するヒト抗体であってもよい。通常、抗体は、例えば、ヒト生殖細胞フレームワーク内にＬＣＤＲのセットを含むＶＬドメインも有する。抗体「遺伝子セグメント」、例えば、ＶＨ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、またはＪＨ遺伝子セグメントは、抗体のその部分が由来する核酸配列を有するオリゴヌクレオチドを指し、例えば、ＶＨ遺伝子セグメントは、ＦＲ１からＣＤＲ３の一部へポリペプチドＶＨドメインに対応する核酸配列を含むオリゴヌクレオチドである。ヒトｖ、ｄ、およびｊ遺伝子セグメントは、組み換えられてＶＨドメインを生成し、ヒトｖおよびｊセグメントは、組み換えられてＶＬドメインを生成する。Ｄドメインまたは領域は、抗体鎖の多様性ドメインまたは領域を指す。Ｊドメインまたは領域は、抗体鎖の結合ドメインまたは領域を指す。体細胞超変異は、対応する遺伝子セグメントと正確に一致しない、または整合しないフレームワーク領域を有する抗体ＶＨまたはＶＬドメインをもたらす可能性があるが、最も近い遺伝子セグメントを特定し、したがって特定のＶＨまたはＶＬドメインが遺伝子セグメントのどの特定の組み合わせに由来するかを特定するために、配列アライメントが使用され得る。抗体配列を遺伝子セグメントと整合する場合、抗体のアミノ酸配列が、遺伝子セグメントによってコードされるアミノ酸配列と整合されてもよく、または抗体ヌクレオチド配列が、遺伝子セグメントのヌクレオチド配列と直接整合されてもよい。本明細書に記載の例示的な抗体のフレームワーク領域に対応する生殖細胞遺伝子セグメントが、表１２に示される。
【００９９】
抗体は、定常領域を含む免疫グロブリン全体であってもよく、または抗体断片であってもよい。抗体断片は、無傷の抗体の一部分であり、例えば、無傷の抗体の抗原結合および／または可変領域を含む。抗体断片は、１つ以上の定常領域ドメインを含んでもよい。
【０１００】
本発明の抗体は、ヒト可変領域および非ヒト（例えば、マウス）定常領域を含むヒト抗体またはキメラ抗体であってもよい。本発明の抗体は、例えば、ヒト可変領域を有し、任意にヒト定常領域も有する。
【０１０１】
したがって、抗体は任意に、定常領域またはその一部、例えば、ヒトＩｇＧ４定常領域などのヒト抗体定常領域またはその一部を含む。例えば、ＶＬドメインは、そのＣ末端で抗体軽鎖κまたはλ定常ドメインに付着し得る。同様に、抗体ＶＨドメインは、そのＣ末端で、任意の抗体アイソタイプ、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、およびＩｇＭ、ならびにＩｇＧ１またはＩｇＧ４などのアイソタイプサブクラスのうちのいずれかに由来する、免疫グロブリン重鎖定常領域の全部または一部（例えば、ＣＨ１ドメインまたはＦｃ領域）に付着し得る。
【０１０２】
抗体は、非ヒト定常領域を有して生成されてもよい。例えば、抗体が遺伝子導入動物において製造される場合（その例は、本明細書の他の箇所に記載される）、ヒト可変領域および非ヒト定常領域を含むキメラ抗体が製造され得る。定常領域は、宿主動物、例えば、マウスに内因性の領域であってもよい。一部の遺伝子導入動物は、完全ヒト抗体を生成する。他の遺伝子導入動物は、キメラ重鎖および完全ヒト軽鎖を含む抗体を生成するように操作されている。抗体が１つ以上の非ヒト定常領域を含む場合、これらは、治療組成物としてのヒトへの投与により適した抗体を提供するために、ヒト定常領域で置き換えられてもよく、これは、それらの免疫定常性がそれにより低減されるためである。
【０１０３】
酵素パパインによる免疫グロブリン全体（二価）の消化は、「Ｆａｂ」断片および「Ｆｃ」断片として既知の２つの同一（一価）の抗原結合断片をもたらす。Ｆｃは、抗原結合活性を有しないが、結晶化する能力を有する。「Ｆａｂ」は、本明細書で使用される場合、重鎖および軽鎖の各々の１つの定常ドメインおよび１つの可変ドメインを含む抗体の断片を指す。本明細書における「Ｆｃ領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義し、天然配列Ｆｃ領域および可変Ｆｃ領域を含む。「Ｆｃ断片」は、ジスルフィドによってともに保持された両方のＨ鎖のカルボキシ末端部分を指す。
【０１０４】
酵素ペプシンによる抗体の消化は、抗体分子の２つのアームが連結されたままである、二価Ｆ（ａｂ’）２断片をもたらす。Ｆ（ａｂ’）２断片は、ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片である。単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）は、別の断片である。ｓｃＦｖなどの２つの異なる一価の単一特異性抗体断片が一緒に連結されて、二価の二重特異性抗体を形成してもよい。
【０１０５】
「Ｆｖ」は、本明細書で使用される場合、抗原認識部位および抗原結合部位の両方を保持する抗体の最小断片を指す。この領域は、強い非共有結合または共有結合によって会合した１つの重鎖可変ドメインおよび１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。この構成において、各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を規定する。集合的に、６つのＣＤＲにより、抗体に抗原結合特異性が付与される。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、通常は結合部位全体よりも低い親和性ではあるが、抗原を認識し、それに結合する能力を有する。
【０１０６】
二重特異性抗体は、多くの可能な形式を有することができる。概要のために、Ｓｐｉｅｓｓ，Ｚｈａｉ＆Ｃａｒｔｅｒ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６７：９５−１０６  ２０１５を参照されたく、二重特異性抗体の５つのカテゴリーを例示する：
−ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＤＡＦ（２−ｉｎ−１）、ＤＡＦ（４−ｉｎ−１）、ＤｕｔａＭａｂ、ＤＴ−ＩｇＧ、共通の軽鎖を有するノブ・イン・ホール（ＫＩＨ）、ＫＩＨ集合体、電荷対、Ｆａｂアーム交換、ＳＥＥＤボディ、トリオマブ、ＬＵＺ−Ｙ、ｍＡｂ２（この概要では「Ｆｃａｂ」と称される）、κλボディ、直交Ｆａｂによって例示される、二重特異性ＩｇＧ（約１５０ｋＤａ）；
−ＤＶＤ−ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｈ）−ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−（Ｈ）ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｌ）−ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−（Ｌ）ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｌ，Ｈ）−Ｆｖ、ＩｇＧ（Ｈ）−Ｖ、Ｖ（Ｈ）−ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｌ）−Ｖ、Ｖ（Ｌ）−ＩｇＧ、ＫＩＨ ＩｇＧ−ｓｃＦａｂ、２ｓｃＦｖ−ＩｇＧ、ＩｇＧ−２ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ４−Ｉｇ、ｚｙｂｏｄｙ、ＤＶＩ−ＩｇＧ（４−ｉｎ−１）によって例示される、付加されたＩｇＧ（１５０ｋＤａ超）；
−ナノボディ、ナノボディ−ＨＳＡ、タンデム連結ｓｃＦｖ（この概要では「ＢｉＴＥ」として例示される）、ダイアボディ（Diabody）、ＤＡＲＴ、ＴａｎｄＡｂ、ｓｃダイアボディ、ｓｃダイアボディ−ＣＨ３、ダイアボディ−ＣＨ３、トリプルボディ、ミニ抗体、ミニボディ、ＴｒｉＢｉミニボディ、ｓｃＦｖ−ＣＨ３ ＫＩＨ、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−ＣＨ−ＣＬ−ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）２−ｓｃＦｖ２、ｓｃＦｖ−ＫＩＨ、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ、四価ＨＣＡｂ、ｓｃダイアボディ−Ｆｃ、ダイアボディ−Ｆｃ、タンデムｓｃＦｖ−Ｆｃ；イントラボディ（intrabody）によって例示される、二重特異性抗体断片；
−ドック・アンド・ロック（Dock and Lock）、ＩｍｍＴＡＣ、ＨＳＡボディ、ｓｃダイアボディ−ＨＳＡ、タンデムｓｃＦｖ−毒素によって例示される、二重特異性融合タンパク質；
−ＩｇＧ−ＩｇＧ、Ｃｏｖ−Ｘ−ボディ、ｓｃＦｖ１−ＰＥＧ−ｓｃＦｖ２によって例示される、二重特異性抗体接合体（conjugate）。
【０１０７】
本発明の二重特異性抗原結合分子は、いかなる特定の形式にも限定されないが、一部の二重特異性抗体の形式は、特に好適な分子の例として本明細書により詳細に記載される。
【０１０８】
好ましくは、二重特異性抗体は、二重結合抗体、すなわち、両方の抗原結合ドメインがＶＨ／ＶＬ対によって形成される二重特異性抗体である。二重結合抗体としては、ＦＩＴ−Ｉｇ（参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１５／１０３０７２を参照されたい）、ｍＡｂ−ｄＡｂ、ドック・アンド・ロック、Ｆａｂアーム交換、ＳＥＥＤボディ、トリオマブ、ＬＵＺ−Ｙ、Ｆｃａｂ、κλ−ボディ、直交Ｆａｂ、ｓｃダイアボディ−Ｆｃ、ダイアボディ−Ｆｃ、タンデムｓｃＦｖ−Ｆｃ、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ、イントラボディ、ＢｉＴＥ、ダイアボディ、ＤＡＲＴ、ＴａｎｄＡｂ、ｓｃダイアボディ、ｓｃダイアボディ−ＣＨ３、ダイアボディ−ＣＨ３、トリプルボディ、ミニ抗体、ミニボディ、ｓｃＦｖ−ＣＨ３ ＫＩＨ、ｓｃＦｖ−ＣＨ−ＣＬ−ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２−ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−ＫＩＨ、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ、四価ＨＣａｂ、ＩｍｍＴＡＣ、ノブ・イン・ホール、共通の軽鎖を有するノブ・イン・ホール、共通の軽鎖および電荷対を有するノブ・イン・ホール、電荷対、共通の軽鎖を有する電荷対、ＤＴ−ＩｇＧ、ＤｕｔａＭａｂ、ＩｇＧ（Ｈ）−ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−（Ｈ）ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｌ）−ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−（Ｌ）ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｌ，Ｈ）−Ｆｖ、ＩｇＧ（Ｈ）−Ｖ、Ｖ（Ｈ）−ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｌ）−Ｖ、Ｖ（Ｌ）−ＩｇＧ、ＫＩＨ ＩｇＧ−ｓｃＦａｂ、２ｓｃＦｖ−ＩｇＧ、ＩｇＧ−２ｓｃＦｖ、およびｓｃＦｖ４−Ｉｇが挙げられる。
【０１０９】
一実施形態では、二重特異性抗体は、ＦＩＸａ結合ポリペプチドアームおよびＦＸ結合ポリペプチドアームを含む二重特異性ＩｇＧであり、各ポリペプチドアームは、重鎖および軽鎖を含む。ＩｇＧは、ＦＩＸａ結合Ｆｖ領域を含む抗体重鎖および軽鎖の第１の対（重鎖−軽鎖対）、ＦＸ結合Ｆｖ領域を含む第２の重鎖−軽鎖対を含む、四量体免疫グロブリンであり、各重鎖は、ＶＨドメインおよび定常領域を含み、各軽鎖は、ＶＬドメインおよび定常領域を含み、第１および第２の重鎖−軽鎖対は、それらの重鎖定常領域のヘテロ二量体化により会合して、免疫グロブリン四量体を形成する。
【０１１０】
任意に、２つのポリペプチドアームは、共通の軽鎖を含み、そのため、第１および第２の重鎖−軽鎖対の軽鎖は、同一のアミノ酸配列を有する（図５（Ａ））。あるいは、２つのポリペプチドアームは、異なる軽鎖を含んでもよい（図５（Ｂ））。
【０１１１】
別の実施形態では、二重特異性抗体は、ＦＩＸａ結合ＦａｂおよびＦＸ結合Ｆａｂを含む、Ｆａｂの連結対（二重特異性Ｆ（ａｂ’）２）であり、Ｆａｂ重鎖は、共有結合している（図５（Ｃ））。Ｆａｂは、ジスルフィド結合を介してそれらのＣＨ１ドメインにおいて接続され得る。１つのポリペプチド結合アーム（例えば、ＦＩＸａ結合アーム）は、重鎖−軽鎖対ＶＨ１−ＣＨ１およびＶＬ１−ＣＬを含み、他のポリペプチド結合アーム（例えば、ＦＸ結合アーム）は、重鎖−軽鎖対ＶＨ２−ＣＨ１およびＶＬ２−ＣＬを含む。任意に、２つの軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）は、配列が同一であり、すなわち、共通の軽鎖が存在する。
【０１１２】
別の実施形態では、二重特異性抗体は、タンデム連結ｓｃＦｖ対であり、任意にリンカーを介して第２のｓｃＦｖに接続された第１のｓｃＦｖを含む。分子は、いずれの方向の抗原結合アームでも製造され、すなわち、第１のｓｃＦｖ ＶＬ１−ＶＨ１がＦＩＸａに結合し、第２のｓｃＦｖ ＶＬ２−ＶＨ２がＦＸに結合するか、または第１のｓｃＦｖ ＶＬ１−ＶＨ１がＦＸに結合し、第２のｓｃＦｖ ＶＬ２−ＶＨ２がＦＩＸａに結合する。図５（Ｄ）を参照されたい。
【０１１３】
上記の実施形態に示されるように、二重特異性抗体は、ＦＩＸａへの結合およびＦＸへの結合に対して一価であってもよい。代替の実施形態では、二重特異性抗体は、一方または両方の標的抗原に対して二価であってもよい。例えば、抗体は、２つのＦＩＸａ結合Ｆａｂドメインおよび２つのＦＸ結合Ｆａｂドメインを含む、ＦＩＴ−Ｉｇであってもよい（図６）。したがって、この形式は、２つのＦＩＸａ結合ポリペプチドアームおよび２つのＦＸ結合ポリペプチドアームを含む。ＦＩＸａ結合Ｆａｂが「内側」Ｆａｂ対であり、ＦＸ結合Ｆａｂが「外側」Ｆａｂ対であってもよく、またはその逆であってもよい。ＦＩＴ−Ｉｇ形式は、ＷＯ２０１５／１０３０７２に記載され、ＦＩＴ−Ｉｇ足場の記載は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１４】
あるいは、二重特異性抗体は、ＤＶＤ−Ｉｇ形式で提示されてもよい。ＤＶＤ−Ｉｇは、ＤｉＧｉａｍｍａｒｉｎｏらによる“Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＶＤ−Ｉｇ（商標） ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｆｏｒ ｄｕａｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ”，Ｍｅｔｈ．Ｍｏ．Ｂｉｏｌ．，８８９：１４５−１５６ ２０１２によって記載されている。
【０１１５】
二重特異性抗体の別の二重二価形式は、２つのＦａｂドメインおよびＦｃ領域を含むｍＡｂ２であり、２つのＣＨ３ドメインは各々、抗原結合部位を形成する３つの結合ループを有し、操作されたＣＨ３ドメインは、Ｆｃａｂ領域と称される。Ｆｃａｂ／ｍＡｂ２形式の背景にある技術は、ＷＯ２００８／００３１０３により詳細に記載され、ｍＡｂ２形式の記載は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１６】
抗体定常領域
上述のように、抗体は、様々なアイソタイプで、かつ異なる定常領域とともに提供され得る。抗体のＦｃ領域は、Ｆｃ受容体によって認識され、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性、および抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）活性を含む、細胞性エフェクター機能を仲介する抗体の能力を決定する。これらの細胞性エフェクター機能は、Ｆｃ受容体を有する細胞の標的細胞の部位への動員を伴い、抗体結合細胞の死滅をもたらす。
【０１１７】
本発明の文脈において、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、および／またはＣＤＣなどの細胞性エフェクター機能を回避することが望ましい。したがって、本発明による二重特異性抗原結合分子は、Ｆｃエフェクター機能を欠いてもよく、例えば、それらは、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、または／もしくはＣＤＣを仲介しないＦｃ領域を含んでもよいか、あるいはそれらは、Ｆｃ領域を欠くか、または抗体定常領域を完全に欠いてもよい。抗体は、エフェクターヌルである定常領域を有してもよい。
【０１１８】
抗体は、１つ以上の型のＦｃ受容体に結合するが、細胞性エフェクター機能を誘発しない、すなわち、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、またはＡＤＣＰ活性を仲介しない、重鎖定常領域を有してもよい。そのような定常領域は、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、またはＡＤＣＰ活性を引き起こす原因となる特定のＦｃ受容体に結合できない場合がある。
【０１１９】
抗体は、Ｆｃγ受容体に結合しない重鎖定常領域を有してもよく、例えば、定常領域は、Ｌｅｕ２３５Ｇｌｕ変異を含んでもよく（すなわち、野生型ロイシン残基がグルタミン酸残基に変異される）、これは、「Ｅ」変異、例えば、ＩｇＧ４−Ｅと称され得る。重鎖定常領域の別の任意の変異は、Ｓｅｒ２２８Ｐｒｏ（「Ｐ」変異）であり、これは、Ｆａｂアーム交換を低減することによって安定性を高める。重鎖定常領域は、Ｌｅｕ２３５Ｇｌｕ変異およびＳｅｒ２２８Ｐｒｏ変異の両方を含むＩｇＧ４であってもよい。この「ＩｇＧ４−ＰＥ」重鎖定常領域は、エフェクターヌルである。代替のエフェクターヌルヒト定常領域は、機能しないＩｇＧ１である。
【０１２０】
以下で考察されるように、異なる抗原結合アームが定常領域を介してヘテロ二量体化される二重特異性ＩｇＧ形式または他の抗体形式では、定常領域は、ホモ二量体形成よりもヘテロ二量体形成を促進し、かつ／または異なる種の混合物からのヘテロ二量体の精製を促進するように操作され得る。
【０１２１】
ヘテロ二量体形成および／または精製を促進するための二重特異性抗体の操作
診療所で二重特異性抗体を使用することの難しさの１つは、歴史的に、大量かつ医薬品グレードの純度でそれらを製造することの難しさであった。「従来の」二重特異性ＩｇＧ形式は、重鎖および軽鎖の２つの異なる対、したがって４つの異なるポリペプチド鎖を含み、これは、一緒に発現すると、集合して１０の異なる潜在的な抗体分子になり得る。種の混合物は、ホモ二量体（ホモ二量体抗ＦＩＸａ結合アームおよびホモ二量体抗ＦＸ結合アーム）、一方または両方の軽鎖がＨ−Ｌ対間で交換される分子、ならびに「正しい」二重特異性ヘテロ二量体構造を含む。
【０１２２】
この潜在的な誤対合を回避する代替の分子形式が開発されており、いくつかの例が本明細書に提供される。これらには、例えば、化学的結合またはロイシンジッパー（ｆｏｓ：ｊｕｎ）集合体、ダイアボディ、およびｓｃＦｖヘテロ二量体によって調製されたＦ（ａｂ’）２が含まれる。それにもかかわらず、二重特異性ＩｇＧを使用して、血流中の抗体の本来の構造を反映し、かつ投与された治療用分子の免疫原性を最小限に抑えることが可能であることが依然として望ましい。加えて、完全長の二重特異性抗体は、より長い血清半減期を有し得る。
【０１２３】
二重特異性抗体を作製するための「ノブ・イントゥ・ホール」技術は、［12］、および参照により本明細書に組み込まれるＵＳ５，７３１，１６８に記載されている。その原理は、ヘテロ二量体重鎖の対になったＣＨ３ドメインを操作し、これにより、一方のＣＨ３ドメインが「ノブ」を含み、もう一方のＣＨ３ドメインが立体的に反対側の位置に「ホール」を含むことである。ノブが、ＣＨ３ドメイン間の界面において小さいアミノ酸側鎖を置き換えることによって作り出される一方で、ホールは、大きい側鎖をより小さいものと置き換えることによって作り出される。ノブは、ホールに挿入して、ホモ二量体形成を不安定にしながら、異なるＣＨ３ドメインのヘテロ二量体化を支持するように設計されている。したがって、集合して二重特異性抗体を形成する抗体の重鎖および軽鎖の混合物中で、対になったヘテロ二量体重鎖を有するＩｇＧ分子の割合が増加し、活性分子の収率および回収率を上昇させる。
【０１２４】
ＩｇＧ ＣＨ３ドメイン中に「ノブ」を形成するために、変異Ｙ３４９Ｃおよび／またはＴ３６６Ｗが含まれてもよい。ＩｇＧ ＣＨ３ドメイン中に「ホール」を形成するために、変異Ｅ３５６Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、および／またはＹ４０７Ｖが含まれてもよい。ノブおよびホールは、任意のヒトＩｇＧ ＣＨ３ドメイン、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ ＣＨ３ドメインに導入されてもよい。好ましい例は、ＩｇＧ４である。上述のように、ＩｇＧ４は、「Ｐ」および／または「Ｅ」変異などのさらなる改変を含んでもよい。例示的なＩｇＧ４−ＰＥ配列、およびノブ・イントゥ・ホール変異を含む他の例示的な定常領域が、表１１に示される。ＩｇＧ４タイプａ（「ｒａ」）配列は、置換Ｙ３４９ＣおよびＴ３６６Ｗ（「ノブ」）を含み、ＩｇＧ４タイプｂ（「γｂ」）配列は、置換Ｅ３５６Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ（「ホール」）を含む。ｒａおよびγｂの両方はまた、重鎖のヒンジ領域を安定化するために、ヒンジの２２８位における「Ｐ」置換（Ｓ２２８Ｐ）も含む。ｒａおよびγｂの両方はまた、ＦｃγＲへの結合を無効にするために、２３５位におけるＣＨ２領域内の「Ｅ」置換（Ｌ２３５Ｓ）も含む。したがって、ＩｇＧ４−ＰＥ重鎖の関連配列は、ｐｐｃｐＰｃｐａｐｅｆＥｇｇｐｓ（配列番号４０１）である。本発明の二重特異性抗原結合分子は、ＩｇＧ４ ＰＥヒト重鎖定常領域（例えば、配列番号１４３）、任意に２つのそのような対になった定常領域を含んでもよく、任意に、１つは、「ノブ」変異を有し、１つは、「ホール」変異を有し、例えば、１つの重鎖定常領域は、配列番号１４４（ノブ）の配列を有し、１つの重鎖定常領域は、配列番号１４５（ホール）の配列を有する。
【０１２５】
二重特異性ＩｇＧ操作のさらなる進歩は、ＷＯ９８／５０４３１に記載されるように、共通の軽鎖を使用するというアイデアであった。２つの重鎖−軽鎖対を含む二重特異性抗体が記載されており、両方の重鎖−軽鎖対の可変軽鎖は、共通の配列を有していた。ＷＯ９８／５０４３１は、共通の軽鎖アプローチを、重鎖ヘテロ二量体化界面における特定の相補的相互作用（ノブ・イントゥ・ホールなど）と組み合わせて、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨げることを記載している。組み合わせて、これらのアプローチは、望ましくないヘテロ二量体およびホモ二量体と比較して、所望のヘテロ二量体の形成を強化する。
【０１２６】
ノブ・イントゥ・ホール技術は、二重特異性ヘテロ二量体の対になったＣＨ３ドメインの界面において相補的な分子形状を作り出すように、アミノ酸の側鎖を操作することを伴うが、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨げるための別の方法は、反対に荷電するようにアミノ酸側鎖を操作することである。重鎖ヘテロ二量体のＣＨ３ドメインの会合が、反対に荷電した残基の対合によって支持される一方で、対になった正の電荷または対になった負の電荷は、ホモ二量体形成をエネルギー的にあまり好ましくないものにする。ＷＯ２００６／１０６９０５は、２つ以上のタイプのポリペプチド（２つの異なる抗体重鎖のヘテロ二量体など）からなるヘテロ多量体の製造方法を記載しており、ヘテロ多量体の会合が調節されるように、前記ポリペプチド間の界面を形成するアミノ酸残基における置換を含み、その方法は、
（ａ）１つ以上の多量体を形成するポリペプチド間の会合が、２つ以上のタイプの多量体を形成し得るヘテロ多量体において阻止されるように、元の核酸からのポリペプチド間の界面を形成するアミノ酸残基をコードする核酸を改変することと、
（ｂ）ステップ（ａ）によって改変された核酸配列が発現されるように、宿主細胞を培養することと、
（ｃ）宿主細胞培養物から前記ヘテロ多量体を回収することであって、
ステップ（ａ）の改変が、１つ以上のアミノ酸残基が界面において置換され、これにより界面を形成する変異残基を含む２つ以上のアミノ酸残基が、同じタイプの正に荷電または負に荷電するように、元の核酸を改変している、回収、
とを含む。
【０１２７】
この一例は、重鎖ホモ二量体の界面において静電反発力を導入することによって、例えば、ＣＨ３ドメインの界面において互いに接触するアミノ酸残基を改変することによって、重鎖間の会合を抑制することであり、
３５６位および４３９位
３５７位および３７０位
３９９位および４０９位、
ＥＵ番号付けシステムに従っている残基番号付け、を含む。
【０１２８】
第１の重鎖のＣＨ３ドメイン中に同様の電荷（両方とも正または両方とも負）を有するように、これらの残基の対のうちの１つ以上を改変することによって、重鎖ホモ二量体の対合は、静電反発力によって阻止される。第１の重鎖の対応する残基と比較して反対に荷電するように、第２の（異なる）重鎖のＣＨ３ドメイン中の同じ対または残基の対を操作することによって、第１および第２の重鎖のヘテロ二量体の対合が、静電引力によって促進される。
【０１２９】
一例では、抗体ＶＨおよびＶＬドメイン中の電荷対の導入を使用して、「誤った」ＶＨ−ＶＬ対の形成（一方の抗体からのＶＨともう一方の抗体のＶＬとの対合）を阻止した。一例では、ＶＨおよびＶＬのＱ残基をＫもしくはＲ（正）またはＥもしくはＤ（負）に変化させて、Ｑ側鎖間の水素結合を阻止し、静電反発力を導入した。別の例では、重鎖定常領域ＣＨ３界面におけるアミノ酸を改変して、電荷対を導入し、その変異は、ＷＯ２００６／１０６９０５の表１に列挙されている。重鎖位置３５６、３５７、３７０、３９９、４０９、および４３９においてアミノ酸を改変して、ＣＨ３界面において電荷誘起分子反発力を導入することが、意図する二重特異性抗体の形成効率を高める効果があったことが報告された。ＷＯ２００６／１０６９０５はまた、ＩｇＧ４のＣＨ３ドメインがノブ・イントゥ・ホール変異によって操作されたＦＸおよびＦＩＸａに結合する、二重特異性ＩｇＧ抗体を例示した。タイプａタイプａ（ＩｇＧ４γａ）は、Ｙ３４９ＣおよびＴ３６６Ｗにおいて置換されたＩｇＧ４であり、タイプｂ（ＩｇＧ４γｂ）は、Ｅ３５６Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖにおいて置換されたＩｇＧ４であった。
【０１３０】
電荷対のさらなる例は、ＷＯ２０１３／１５７９５４に開示されており、単一細胞からヘテロ二量体ＣＨ３ドメイン含有分子を製造する方法が記載され、分子は、界面を形成することが可能な２つのＣＨ３ドメインを含む。この方法は、細胞中に、
（ａ）第１のＣＨ３ドメイン含有ポリペプチド鎖をコードする第１の核酸分子（この鎖は、ＥＵ番号付けシステムに従って３６６位にＫ残基を含む）と、
（ｂ）第２のＣＨ３ドメイン含有ポリペプチド鎖をコードする第２の核酸分子（この鎖は、ＥＵ番号付けシステムに従って３５１位にＤ残基を含む）
とを提供することを含み、
この方法はさらに、宿主細胞を培養するステップと、２つの核酸分子の発現を可能にするステップと、培養物からヘテロ二量体ＣＨ３ドメイン含有分子を収集するステップとを含む。
【０１３１】
ホモ二量体形成よりもヘテロ二量体形成を促進するために、ポリペプチド鎖の静電相互作用を操作するさらなる方法は、ＷＯ２０１１／１４３５４５に記載されている。
【０１３２】
ＣＨ３−ＣＨ３界面における操作の別の例は、鎖交換操作ドメイン（ＳＥＥＤ）ＣＨ３ヘテロ二量体である。ＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＡおよびＩｇＧ ＣＨ３配列の交互セグメントからなり、これは、「ＳＥＥＤボディ」と称される相補的なＳＥＥＤヘテロ二量体の対を形成する［10；ＷＯ２００７／１１０２０５］。
【０１３３】
二重特異性分子はまた、プロテインＡなどの精製試薬に結合するためのそれらの親和性を変更するようにＣＨ３ドメインで差時的に改変されているヘテロ二量体化重鎖でも製造されている。ＷＯ２０１０／１５１７９２は、
Ｎ末端からＣ末端へ、第１のエピトープに選択的に結合する第１のエピトープ結合領域、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４から選択されるヒトＩｇＧの第１のＣＨ３領域を含む免疫グロブリン定常領域を含む、第１のポリペプチドと、
Ｎ末端からＣ末端へ、第２のエピトープに選択的に結合する第２のエピトープ結合領域、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４から選択されるヒトＩｇＧの第２のＣＨ３領域を含む免疫グロブリン定常領域を含む、第２のポリペプチド
とを含む、ヘテロ二量体二重特異性抗原結合タンパク質を記載し、第２のＣＨ３領域は、第２のＣＨ３ドメインのプロテインＡへの結合を低減または排除する改変を含む。
【０１３４】
本発明の二重特異性分子は、必要に応じてこれらの技術および分子形式のうちのいずれかを用い得る。
【０１３５】
抗体の生成および改変
抗体を同定および調製するための方法は、よく知られている。目的の抗原に結合する抗体は、当該抗原で免疫化された遺伝子導入マウス（例えば、Ｋｙｍｏｕｓｅ（商標）、Ｖｅｌｏｃｉｍｏｕｓｅ（登録商標）、Ｏｍｎｉｍｏｕｓｅ（登録商標）、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（登録商標）、ＨｕＭａｂ Ｍｏｕｓｅ（登録商標）、またはＭｅＭｏ Ｍｏｕｓｅ（登録商標））、ラット（例えば、Ｏｍｎｉｒａｔ（登録商標））、ラクダ科動物、サメ、ウサギ、ニワトリ、または他の非ヒト動物を使用して生成されてもよく、続いて任意に、定常領域および／または可変領域をヒト化して、ヒトまたはヒト化抗体を製造する。一例では、当業者には明らかになるように、酵母、ファージ、またはリボソームディスプレイなどのディスプレイ技術が使用され得る。例えば、ディスプレイ技術を使用した標準的な親和性成熟は、遺伝子導入動物、ファージディスプレイライブラリ、または他のライブラリからの抗体リードの単離後のさらなるステップで実施され得る。好適な技術の代表例は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＵＳ２０１２／００９３８１８（Ａｍｇｅｎ，Ｉｎｃ）に記載され、例えば、方法は、段落［０３０９］〜［０３４６］に記載されている。
【０１３６】
抗体の生成に続いて、免疫化またはインビトロライブラリのスクリーニングによるかにかかわらず、選択された抗体の抗体重鎖可変ドメインおよび／または抗体軽鎖可変ドメインをコードする核酸が単離され得る。そのような核酸は、完全な抗体重鎖および／もしくは軽鎖、または関連する定常領域のない可変ドメインをコードしてもよい。コードするヌクレオチド配列は、マウスの抗体産生細胞から直接得られてもよいか、またはＢ細胞が、不死化または融合されて、抗体を発現するハイブリドーマを生成し、その細胞からコードする核酸を得てもよい。任意に、可変ドメインをコードする核酸は、次いで、ヒト重鎖定常領域および／またはヒト軽鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列に接合されて、ヒト抗体重鎖および／またはヒト抗体軽鎖をコードする、例えば、重鎖および軽鎖の両方を含む抗体をコードする、核酸を提供する。このステップは、免疫化された哺乳動物が非ヒト定常領域を有するキメラ抗体を生産する場合に特に有用であり、これは、好ましくはヒト定常領域で置き換えられて、薬剤としてヒトに投与された場合に免疫原性がより低い抗体を生成する。特定のヒトアイソタイプ定常領域の提供も、抗体のエフェクター機能を決定するために重要であり、多くの好適な重鎖定常領域が、本明細書で考察されている。
【０１３７】
本明細書に記載されるように、残基の変異および変異体の生成など、抗体重鎖および／または軽鎖可変ドメインをコードする核酸に対する他の改変が行われ得る。
【０１３８】
単離された（任意に変異された）核酸は、考察されるように、宿主細胞、例えば、ＣＨＯ細胞に導入され得る。次いで、宿主細胞は、任意の所望の抗体形式で、抗体の、または抗体重鎖および／もしくは軽鎖可変ドメインの発現のための条件下で培養される。いくつかの可能な抗体形式、例えば、免疫グロブリン全体、抗原結合断片、および他の設計が本明細書に記載されている。
【０１３９】
ＶＨおよびＶＬドメインのうちのいずれかの可変ドメインアミノ酸配列変異体、またはその配列が本明細書に具体的に開示されているＣＤＲは、考察されるように、本発明に従って用いられ得る。
【０１４０】
大規模製造のための抗体配列の最適化、精製の促進、安定性の強化、または所望の医薬品製剤への含有適合性の改善を含む、変異体を作り出すことが望ましくあり得る理由は多く存在する。タンパク質操作の作業は、例えば、１つのアミノ酸を代替アミノ酸で置換し（任意に、ＣｙｓおよびＭｅｔを例外とする可能性もあるが、この位置において全ての天然型アミノ酸を含む変異体を生成すること）、かつ機能および発現への影響を監視して最適な置換を決定するために、抗体配列中の１つ以上の標的残基において実施され得る。場合によっては、残基をＣｙｓまたはＭｅｔで置換するか、またはこれらの残基を配列に導入することは、そうすることが、例えば、新しい分子内または分子間システイン−システイン結合の形成により、製造上の困難を引き起こす可能性があるため、望ましくない。リード候補が選択され、製造および臨床開発用に最適化されている場合、概して、その抗原結合特性を可能な限り変化させないか、または少なくとも親分子の親和性および効力を保持することが望ましいであろう。しかしながら、親和性、交差反応性、または中和能力などの重要な抗体特性を調節するために、変異体が生成されてもよい。
【０１４１】
本明細書に開示される抗体ＶＨまたはＶＬドメインのフレームワーク領域内で、１つ以上のアミノ酸変異が任意に行われてもよい。例えば、対応するヒト生殖細胞セグメント配列とは異なる１つ以上の残基が生殖細胞に戻され得る。本明細書の例示的な抗体のＶＨおよびＶＬドメインに対応するヒト生殖細胞遺伝子セグメント配列が、表１２に示される。
【０１４２】
二重特異性抗原結合分子において、抗原結合部位は、開示されたＨおよび／またはＬ  ＣＤＲのセット内に１つ以上のアミノ酸変異を有する、開示された抗ＦＩＸまたは抗ＦＸ抗体のうちのいずれかのＨおよび／またはＬ ＣＤＲのセットを含んでもよい。変異は、アミノ酸の置換、欠失、または挿入であってもよい。したがって、例えば、開示されたＨおよび／またはＬ ＣＤＲのセット内に１つ以上のアミノ酸置換があってもよい。例えば、Ｈおよび／またはＬ ＣＤＲのセット内に、最大１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、または２個の変異、例えば置換があってもよい。例えば、ＨＣＤＲ３には最大６、５、４、３、または２個の変異、例えば置換、および／またはＬＣＤＲ３には最大６、５、４、３、または２個の変異、例えば置換があってもよい。
【０１４３】
抗体は、表に示されるように、ＶＨドメインと少なくとも６０、７０、８０、８５、９０、９５、９８、もしくは９９％のアミノ酸配列同一性を有するＶＨドメイン、および／またはこれらの抗体のうちのいずれかのＶＬドメインと少なくとも６０、７０、８０、８５、９０、９５、９８、もしくは９９％のアミノ酸配列同一性を有するＶＬドメインを含んでもよい。２つのアミノ酸配列の同一性％を計算するために使用され得るアルゴリズムには、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、または例えば、デフォルトパラメータを用いるＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムが含まれる。特定の変異体は、１つ以上のアミノ酸配列の改変（アミノ酸残基の付加、欠失、置換、および／または挿入）を含んでもよい。
【０１４４】
１つ以上のフレームワーク領域および／または１つ以上のＣＤＲにおいて、改変が行われ得る。変異体は任意に、ＣＤＲ変異誘発によって提供される。改変は通常、機能の損失をもたらさず、そのため、そのように改変されたアミノ酸配列を含む抗体は、その抗原に結合する能力を保持し得る。それは、例えば、本明細書に記載のアッセイで測定されるように、改変が行われない抗体と同じ定量的結合能力を保持し得る。そのように改変されたアミノ酸配列を含む抗体は、その抗原に結合する改善された能力を有し得る。
【０１４５】
改変は、１つ以上のアミノ酸残基を非天然型もしくは非標準アミノ酸で置き換えること、１つ以上のアミノ酸残基を非天然型もしくは非標準形態に改変すること、または１つ以上の非天然型もしくは非標準アミノ酸を配列に挿入することを含み得る。本発明の配列における改変の数および位置の例は、本明細書の他の箇所に記載されている。天然型アミノ酸には、それらの標準一文字コードによってＧ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｐ、Ｆ、Ｗ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｃ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｅとして識別される、２０の「標準」Ｌ−アミノ酸が含まれる。非標準アミノ酸には、ポリペプチド骨格に組み込まれるか、または既存のアミノ酸残基の改変から生じる可能性のある任意の他の残基が含まれる。非標準アミノ酸は、天然型または非天然型であってもよい。
【０１４６】
本明細書で使用される「変異体」という用語は、１つ以上のアミノ酸または核酸の欠失、置換、または付加によって親ポリペプチドまたは核酸とは異なるが、それでもなお親分子の１つ以上の特定の機能または生物学的活性を保持する、ペプチドまたは核酸を指す。アミノ酸置換は、アミノ酸が異なる天然型アミノ酸残基で置き換えられる改変を含む。そのような置換は、「保存的」として分類され得、この場合、ポリペプチド中に含まれるアミノ酸残基は、極性、側鎖官能性、またはサイズのいずれかについて類似の特徴を有する別の天然型アミノ酸で置き換えられる。そのような保存的置換は、当該技術分野で公知である。本発明によって包含される置換はまた、「非保存的」であってもよく、ペプチド中に存在するアミノ酸残基が、異なるグループ由来の天然型アミノ酸等の異なる特性を有するアミノ酸で置換される（例えば、荷電したまたは疎水性のアミノ酸をアラニンで置換する）か、あるいは天然型アミノ酸が、非従来型アミノ酸で置換される。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、保存的である。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに関して使用される場合、変異体という用語に包含されるものは、それぞれ、参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドと比較して（例えば、野生型ポリヌクレオチドまたはポリペプチドと比較して）、一次、二次、または三次構造が異なり得るポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。
【０１４７】
いくつかの態様では、当該技術分野において公知の方法を使用して単離または生成された「合成変異体」、「組換え変異体」、または「化学改変」ポリヌクレオチド変異体もしくはポリペプチド変異体を使用することができる。「改変された変異体」は、以下に記載されるように、保存的または非保存的アミノ酸変化を含むことができる。ポリヌクレオチドの変化は、参照配列によってコードされるポリペプチド中のアミノ酸の置換、付加、欠失、融合、および切断をもたらすことができる。いくつかの態様の使用は、例えば、ヒトタンパク質中で通常生じないオルニチンの挿入であるがこれに限定されない、変異体の基盤であるペプチド配列中で通常生じない挿入変異体、欠失変異体、またはアミノ酸の置換を伴う置換変異体（アミノ酸および他の分子の挿入および置換を含む）を含む。「保存的置換」という用語は、ポリペプチドを説明する場合、ポリペプチドの活性を実質的に変化させないポリペプチドのアミノ酸組成の変化を指す。例えば、保存的置換は、同様の化学的性質（例えば、酸性、塩基性、正または負に荷電、極性または非極性など）を有する異なるアミノ酸残基を、アミノ酸残基で置換することを指す。保存的アミノ酸置換は、ロイシンのイソロイシンまたはバリンによる置き換え、アスパラギン酸のグルタミン酸による置き換え、またはトレオニンのセリンによる置き換えを含む。機能的に同様のアミノ酸を提供する保存的置換表は、当該技術分野において公知である。例えば、次の６つのグループは各々、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む：１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。（参照によりその全体が組み込まれるＣｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９８４）も参照されたい。）いくつかの実施形態では、単一のアミノ酸またはわずかな割合のアミノ酸を改変、付加、または欠失する個々の置換、欠失、または付加もまた、その変化がペプチドの活性を低減しない場合、「保存的置換」と見なされ得る。挿入または欠失は、典型的には、約１〜５アミノ酸の範囲である。保存的アミノ酸の選択は、ペプチド内で置換されるアミノ酸の位置、例えば、アミノ酸がペプチドの外側にあり溶媒に曝露している場合、または内側にあり溶媒に曝露していない場合に基づき選択され得る。
【０１４８】
溶媒へのその曝露を含む既存のアミノ酸の位置（すなわち、溶媒に曝露されていない内部局在アミノ酸と比較して、アミノ酸が溶媒に曝露されているか、またはペプチドもしくはポリペプチドの外側表面上に存在するか）に基づき、既存のアミノ酸を置換するアミノ酸を選択することができる。そのような保存的アミノ酸置換の選択は、例えば、Ｄｏｒｄｏら，Ｊ．ＭｏＩ Ｂｉｏｌ，１９９９，２１７，７２１−７３９、およびＴａｙｌｏｒら，Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．１１９（１９８６）；２０５−２１８、およびＳ．Ｆｒｅｎｃｈ ａｎｄ Ｂ．Ｒｏｂｓｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．１９（１９８３）１７１に開示されるように、当該技術分野において公知である。したがって、タンパク質またはペプチドの外側のアミノ酸（すなわち、溶媒に曝露されたアミノ酸）に適した保存的アミノ酸置換を選択することができ、例えば、次の置換：ＹのＦによる置換、ＴのＳまたはＫによる置換、ＰのＡによる置換、ＥのＤまたはＱによる置換、ＮのＤまたはＧによる置換、ＲのＫによる置換、ＧのＮまたはＡによる置換、ＴのＳまたはＫによる置換、ＤのＮまたはＥによる置換、ＩのＬまたはＶによる置換、ＦのＹによる置換、ＳのＴまたはＡによる置換、ＲのＫによる置換、ＧのＮまたはＡによる置換、ＫのＲによる置換、ＡのＳ、Ｋ、またはＰによる置換が使用され得るが、これらに限定されない。
【０１４９】
代替の実施形態では、タンパク質またはペプチドの内側のアミノ酸に適した、包含される保存的アミノ酸置換を選択することもでき、例えば、タンパク質またはペプチドの内側にあるアミノ酸（すなわち、アミノ酸は溶媒に曝露されていない）の好適な保存的置換を使用することができ、例えば、次の保存的置換：ＹはＦに置換され、ＴのＡまたはＳによる置換、ＩのＬまたはＶによる置換、ＷのＹによる置換、ＭのＬによる置換、ＮのＤによる置換、ＧのＡによる置換、ＴはＡまたはＳによる置換、ＤのＮによる置換、ＩのＬまたはＶによる置換、ＦのＹまたはＬによる置換、ＳのＡまたはＴによる置換、およびＡのＳ、Ｇ、Ｔ、またはＶによる置換を使用することができるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、非保存的アミノ酸置換も変異体の用語に包含される。
【０１５０】
本発明は、本明細書の表に示される抗体ＶＨおよび／またはＶＬドメインのＶＨおよび／またはＶＬドメイン変異体を含む、ポリペプチド結合アームを製造する方法を含む。変異体ＶＨドメインを含むＦＩＸａ結合ポリペプチドアームは、
（ｉ）親抗体ＶＨドメインのアミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸の付加、欠失、置換、または挿入によって、親抗体ＶＨドメインのアミノ酸配列変異体である抗体ＶＨドメインを提供することであって、
前記親抗体ＶＨドメインが、ＶＨドメインＮ１９２Ｈ、Ｎ２１２Ｈ、Ｎ２０５Ｈ、Ｎ２１１Ｈ、Ｎ２０３Ｈ、Ｎ１２８Ｈ、Ｎ２１５Ｈ、Ｎ２１６Ｈ、Ｎ２１７Ｈ、Ｎ２１８Ｈ、Ｎ２１９Ｈ、Ｎ２２０Ｈ、Ｎ２２１Ｈ、Ｎ２２２Ｈ、Ｎ２２３Ｈ、Ｎ２２４Ｈ、Ｎ２２５Ｈ、Ｎ２２６Ｈ、Ｎ２２７Ｈ、Ｎ２２８Ｈ、もしくはＮ２２９Ｈであるか、またはそれらのＶＨドメインのうちのいずれかの重鎖相補性決定領域を含むＶＨドメインである抗体ＶＨドメインを提供することと、
（ｉｉ）ＶＨ／ＶＬの組み合わせを提供するために、そのように提供されたＶＨドメインをＶＬドメインと組み合わせることと、
（ｉｉｉ）１つ以上の所望の特性を有する抗体を同定するために、そのように提供されたＶＨドメインまたはＶＨ／ＶＬドメインの組み合わせを試験すること、
とを含む方法によって製造され得る。
【０１５１】
ＶＨドメインは、その配列が表９Ａに示される任意のＶＨドメイン、または表９Ａに示されるＶＨドメインのＨＣＤＲのセット（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）を含む任意のＶＨドメインであってもよい。ＶＨドメインは、Ｎ４３６ ＶＨドメイン（配列番号３２４）であってもよい。ＶＨドメインは、Ｎ１２８ ＶＨドメイン（配列番号５）であってもよい。
【０１５２】
ＦＩＸａ結合ポリペプチドアーム、およびそれらを含む二重特異性抗ＦＩＸａ／ＦＸ結合分子の望ましい特性は、本明細書の他の箇所に詳述されている。例えば、その方法は、本明細書に記載されるように、ＶＨドメインまたはＶＨ／ＶＬドメインの組み合わせがＦＩＸａに結合することを確認することを含んでもよい。
【０１５３】
ＶＬドメインがその方法に含まれる場合、ＶＬドメインは、Ｎ１２８Ｌ ＶＬドメインであってもよいか、またはＮ１２８Ｌ ＶＬドメインのアミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸の付加、欠失、置換、または挿入によって提供される変異体であってもよいか、またはＮ１２８Ｌ ＶＬドメインの軽鎖相補性決定領域を含むＶＬドメインであってもよい。
【０１５４】
変異体抗体を生成する方法は、任意に、抗体またはＶＨ／ＶＬドメインの組み合わせのコピーを製造することを含んでもよい。方法は、例えば、コードする核酸の発現によって、ＦＩＸａ結合ポリペプチドアームを含む二重特異性抗体を製造することをさらに含んでもよい。宿主細胞における組換え発現を含む発現の好適な方法は、本明細書に詳細に記載されている。
【０１５５】
コードする核酸および発現方法
本発明に従って、二重特異性抗原結合分子、例えば、二重特異性抗体をコードする単離された核酸が提供され得る。核酸は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡであってもよい。合成起源のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、もしくは他のＲＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせは、抗体をコードすることができる。
【０１５６】
本発明は、上記の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むプラスミド、ベクター、転写、または発現カセットの形態の構築物を提供する。例示的なヌクレオチド配列は、表に含まれる。本明細書に記載されるヌクレオチド配列への言及は、文脈が他の意味を必要としない限り、特定の配列を有するＤＮＡ分子を包含し、ＴがＵに置換される特定の配列を有するＲＮＡ分子を包含する。
【０１５７】
本発明はまた、抗原結合分子をコードする１つ以上の核酸を含む組換え宿主細胞を提供する。コードされた分子を製造する方法は、例えば、核酸を含む組換え宿主細胞を培養することによる、核酸からの発現を含んでもよい。二重特異性分子は、そのように得てもよく、任意の好適な技術を使用して単離および／または精製され、次いで必要に応じて使用され得る。製造方法は、薬学的に許容される賦形剤などの少なくとも１つの追加の構成成分を含む組成物に、生成物を製剤化することを含んでもよい。
【０１５８】
様々な異なる宿主細胞中のポリペプチドのクローニングおよび発現のための系は、よく知られている。好適な宿主細胞には、細菌、哺乳動物細胞、植物細胞、糸状菌、酵母、およびバキュロウイルス系、ならびに遺伝子導入植物および動物が含まれる。
【０１５９】
原核細胞中の抗体および抗体断片の発現は、当該技術分野において十分に確立されている。一般的な細菌宿主は、大腸菌である。培養中の真核細胞中の発現は、製造のための選択肢として当業者にも利用可能である。異種ポリペプチドの発現のために当該技術分野において利用可能な哺乳動物細胞株には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＮＳＯマウス黒色腫細胞、ＹＢ２／０ラット骨髄腫細胞、ヒト胎児由来腎臓細胞、ヒト胎児由来網膜細胞、他多数が含まれる。
【０１６０】
ベクターは、必要に応じてプロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子、および他の配列を含む、適切な調節配列を含んでもよい。抗体をコードする核酸は、宿主細胞に導入され得る。核酸は、リン酸カルシウムの遺伝子導入、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム介在遺伝子導入、およびレトロウイルスまたは他のウイルス、例えば、ワクシニアまたは昆虫細胞の場合はバキュロウイルスを使用した形質導入を含む、様々な方法によって真核細胞に導入され得る。宿主細胞、特に真核細胞への核酸の導入は、ウイルスまたはプラスミド系を使用してもよい。プラスミド系は、エピソーム的に維持されてもよいか、または宿主細胞もしくは人工染色体に組み込まれてもよい。組み込みは、単一または複数の遺伝子座において１つ以上のコピーのランダム統合または標的統合のいずれかによるものであり得る。細菌細胞の場合、好適な技術には、バクテリオファージを使用した塩化カルシウムの形質転換、エレクトロポレーションおよび遺伝子導入が含まれる。導入に続いて、例えば、遺伝子の発現のための条件下で宿主細胞を培養し、次いで任意に、抗体を単離または精製することによって、核酸を発現させてもよい。
【０１６１】
本発明の核酸は、宿主細胞のゲノム（例えば、染色体）に統合されてもよい。標準的な技術に従って、ゲノムとの組換えを促進する配列を含むことによって、統合が促進され得る。
【０１６２】
本発明はまた、二重特異性抗原結合分子を発現させるために、発現系において本明細書に記載の核酸を使用することを含む方法を提供する。望ましくは、抗原結合分子は、初期発酵後の細胞上清中に少なくとも０．５ｇ／Ｌの収率で、好ましくは２ｇ／Ｌを超える収量で発現される。溶解度は、分子の著しい凝集または分解を伴わずに、１０ｍｇ／ｍＬ超、好ましくは５０ｍｇ／ｍＬ超でなければならない。
【０１６３】
製剤および投与
本発明による二重特異性抗原結合分子（「二重特異性分子」（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃｓ））、およびそれらをコードする核酸分子は、通常、単離された形態で提供される。二重特異性分子ＶＨおよび／またはＶＬドメイン、ならびに核酸は、それらの自然環境または製造環境から精製されて提供されてもよい。単離された抗原結合分子および単離された核酸は、それらがインビボで見られる他のポリペプチドまたは核酸、またはそれらが調製され（例えば、細胞培養）、そのような調製がインビトロでの組換えＤＮＡ技術によるものである環境など、それらが自然に結合される材料を含まないか、または実質的に含まない。任意に、単離された抗原結合分子または核酸は、（１）それが通常見られる少なくともいくつかの他のタンパク質を含まないか、（２）同じ源からの、例えば、同じ種からの他のタンパク質を本質的に含まないか、（３）異なる種の細胞によって発現されるか、（４）ポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、または自然界でそれが結合される他の材料の少なくとも約５０％から単離されているか、（５）それが自然界で結合されていないポリペプチドと作動可能に結合されているか（共有結合もしくは非共有結合相互作用によって）、または（６）自然界で生じない。
【０１６４】
二重特異性分子またはそれらをコードする核酸は、希釈剤またはアジュバントとともに製剤化され、それでもなお実際の目的のために単離され得、例えばそれらは、免疫アッセイに使用するためのマイクロタイタープレートをコーティングするために使用される場合、担体と混合されてもよく、療法に使用する場合、薬学的に許容される担体または希釈剤と混合されてもよい。本明細書の他の箇所に記載されるように、他の活性成分も治療調製物に含まれ得る。抗原結合分子は、インビボで自然に、またはＣＨＯ細胞などの異種真核細胞系によってグリコシル化されてもよく、または（例えば、原核細胞での発現によって製造された場合）非グリコシル化されてもよい。本発明は、改変グリコシル化パターンを有する抗体を包含する。
【０１６５】
典型的には、単離された生成物は、所与の試料の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、または少なくとも約５０％を構成する。二重特異性分子は、その自然環境または製造環境に見られる、その治療、診断、予防、研究、または他の使用を妨げるタンパク質またはポリペプチドまたは他の汚染物質を実質的に含まない可能性がある。
【０１６６】
本発明は、本明細書に記載の二重特異性分子を含む治療組成物を提供する。そのような二重特異性分子をコードする核酸を含む治療組成物も提供される。コードする化核酸は、本明細書の他の箇所でより詳細に記載され、ＤＮＡおよびＲＮＡ、例えばｍＲＮＡを含む。本明細書に記載の治療方法において、二重特異性分子をコードする核酸の使用、および／またはそのような核酸を含む細胞の使用は、二重特異性分子自体を含む組成物の代替手段として（またはそれに加えて）使用され得る。したがって、任意に核酸がゲノムに安定的に統合される、二重特異性分子をコードする核酸を含む細胞は、患者における治療的使用のための薬剤を表す。二重特異性分子をコードする核酸は、意図する患者に由来し、かつエクスビボで改変されたヒト細胞に導入されてもよい。コードする核酸を含む細胞の患者への投与は、二重特異性分子を発現させることが可能な細胞のリザーバを提供し、これは、単離された核酸または単離された二重特異性分子の投与と比較して、より長期間にわたって治療的便益を提供し得る。二重特異性分子をコードする核酸は、患者の細胞で核酸が発現され、遺伝性第ＶＩＩＩ因子欠乏症を補うなどの治療効果を提供するように、インビボで患者の細胞にコードする核酸を導入することを含む遺伝子療法に使用するために提供され得る。
【０１６７】
組成物は、好適な担体、賦形剤、ならびに改善された移動、送達、耐性などを提供するために製剤に組み込まれる他の作用剤を含んでもよい。多数の適切な製剤は、全ての製薬化学者に既知の処方集：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａで見ることができる。これらの製剤には、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、脂質（カチオン性またはアニオン性）含有小胞（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮＴ（商標）など）、ＤＮＡ共役体、無水吸収ペースト、水中油および油中水乳剤、カーボワックス（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、およびカーボワックスを含む半固体混合物が含まれる。Ｐｏｗｅｌｌら．”Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ｆｏｒ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”ＰＤＡ（１９９８）Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ ５２：２３８−３１１も参照されたい。組成物は、医療注射緩衝液および／またはアジュバントと組み合わせて、抗体または核酸を含んでもよい。
【０１６８】
二重特異性分子またはそれらをコードする核酸は、患者への所望の投与経路のために、例えば、注射用の液体（任意に水溶液）で製剤化されてもよい。
【０１６９】
様々な送達システムが既知であり、本発明の医薬組成物を投与するために使用され得る。導入方法としては、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口経路が挙げられるが、これらに限定されない。組成物は、任意の便利な経路によって、例えば、注入またはボーラス注射によって、上皮内層または粘膜皮膚内層（例えば、口腔粘膜、直腸および腸管膜など）を通した吸収によって投与されてもよく、他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与されてもよい。投与は、全身または局所であり得る。抗原結合分子は、好ましくは、皮下注射によって投与される。
【０１７０】
薬学的組成物はまた、小胞、特にリポソームで送達され得る（Ｌａｎｇｅｒ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３、Ｔｒｅａｔら．（１９８９）Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｆｉｄｌｅｒ（編集），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３５３−３６５、Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，同書，ｐｐ．３１７−３２７を参照されたく、概して同書を参照されたい）。
【０１７１】
ある特定の状況では、医薬組成物は、放出を制御するシステムで送達され得る。一実施形態では、ポンプが使用され得る（Ｌａｎｇｅｒ，上記、Ｓｅｆｔｏｎ（１９８７）ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１を参照されたい）。別の実施形態では、ポリマー材料が使用されてもよく、Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｓｅ（編集），ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．（１９７４）を参照されたい。さらに別の実施形態では、放出を制御するシステムが組成物の標的に近接して配置され得、したがって、全身用量のほんの一部のみを必要とする（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，上記，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５−１３８，１９８４を参照されたい）。
【０１７２】
注射用調製物は、静脈内、皮下、皮内、および筋肉内注射、点滴などのための剤形を含んでもよい。これらの注射用調製物は、公知の方法によって調製され得る。例えば、注射用調製物は、例えば、注射に従来使用されている滅菌水性媒体または油性媒体に上記の抗体またはその塩を溶解、懸濁、または乳化することによって調製され得る。注射用の水性媒体としては、例えば、生理食塩水、グルコースおよび他の補助剤を含む等張液などがあり、これらは、アルコール（例えば、エタノール）、多価アルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤［例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（硬化ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０ｍｏｌ）付加物）］などの適切な可溶化剤と組み合わせて使用されてもよい。油性媒体としては、例えば、ゴマ油、大豆油などがあり、これらは、安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどの可溶化剤と組み合わせて使用されてもよい。そのように調製された注射液は、適切なアンプルに充填され得る。本発明の医薬組成物は、標準的な針および注射器で皮下または静脈内に送達され得る。治療は、診療所での使用に限定されないことが想定される。したがって、無針デバイスを使用した皮下注入も有利である。皮下送達に関して、ペン送達デバイスは、本発明の医薬組成物の送達に容易に適用できる。そのようなペン送達デバイスは、再利用可能または使い捨てであり得る。再利用可能なペン送達デバイスは概して、医薬組成物を含む交換可能なカートリッジを利用する。いったんカートリッジ内の医薬組成物の全てが投与され、カートリッジが空になると、空のカートリッジは、容易に廃棄され、医薬組成物を含む新しいカートリッジと交換され得る。次いで、ペン送達デバイスは再利用され得る。使い捨てペン送達デバイスには、交換可能なカートリッジはない。むしろ、使い捨てペン送達デバイスは、医薬組成物がデバイス内のリザーバに保持されて予め充填されている。いったん医薬組成物がなくなりリザーバが空になると、デバイス全体が廃棄される。多数の再利用可能なペンおよび自動注射器送達デバイスが、本発明の医薬組成物の皮下送達に適用できる。例としては、ほんの数例を挙げると、ＡＵＴＯＰＥＮ（商標）（Ｏｗｅｎ Ｍｕｍｆｏｒｄ，Ｉｎｃ．，Ｗｏｏｄｓｔｏｃｋ，ＵＫ）、ＤＩＳＥＴＲＯＮＩＣ（商標）ペン（Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｕｒｇｈｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＨＵＭＡＬＯＧ ＭＩＸ ７５／２５（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＯＧ（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＩＮ ７０／３０（商標）ペン（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄ．）、ＮＯＶＯＰＥＮ（商標）Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩ（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＮＯＶＯＰＥＮ ＪＵＮＩＯＲ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＢＤ（商標）ペン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，Ｎ．Ｊ．）、ＯＰＴＩＰＥＮＴ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ ＰＲＯ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ ＳＴＡＲＬＥＴ（商標）、ならびにＯＰＴＩＣＬＩＫＴ（商標）（Ｓａ��ｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が挙げられるが、もちろんこれらに限定されない。本発明の医薬組成物の皮下送達に適用できる使い捨てペン送達デバイスの例としては、ＳＯＬＯＳＴＡＲ（商標）ペン（Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）、ＦＬＥＸＰＥＮ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）、およびＫＷＩＫＰＥＮ（商標）（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）が挙げられるが、もちろんこれらに限定されない。
【０１７３】
有利に、上記の経口または非経口使用のための医薬組成物は、活性成分の用量に適合するのに適した単位用量で剤形に調製される。単位用量のそのような剤形としては、例えば、錠剤、丸薬、カプセル、注射液（アンプル）、坐剤などが挙げられる。含まれる前述の抗体の量は、概して、単位用量の剤形当たり約５〜約５００ｍｇであり、特に注射液の形態では、前述の抗体は、約５〜約１００ｍｇで、他の剤形では約１０〜約２５０ｍｇで含まれてもよい。
【０１７４】
二重特異性抗体、核酸、またはそれを含む組成物は、薬瓶、注射器、ＩＶ容器、または注射デバイスなどの医療用容器に入れられてもよい。一例では、二重特異性抗体、核酸、または組成物は、インビトロであり、滅菌容器内にあってもよい。一例では、本明細書に記載されるような治療方法で使用するための二重特異性抗体、パッケージ、および説明書を含むキットが提供される。
【０１７５】
本発明の一態様は、本発明の二重特異性抗体または核酸と、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤とを含む組成物であり、その例は、上に列挙されている。「薬学的に許容される」とは、ＵＳＡ Ｆｅｄｅｒａｌもしくは州政府の規制機関によって承認されたか、または承認見込みのもの、またはＵ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａもしくはヒトを含む動物での使用が一般的に認められている薬局方に列挙されたものを指す。薬学的に許容される担体、賦形剤、またはアジュバントは、二重特異性薬剤、例えば、本明細書に記載の任意の抗体またはポリペプチド分子と一緒に患者に投与されることができ、治療量の薬剤を送達するのに十分な用量で投与された場合に、その薬理活性を破壊せず、無毒である。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、本発明による組成物中の唯一の活性成分である。したがって、組成物は、抗体から構成されてもよいか、または１つ以上の薬学的に許容される賦形剤とともに二重特異性抗体から構成されてもよい。しかしながら、本発明による組成物は任意に、１つ以上の追加の活性成分を含む。本発明による二重特異性抗体または核酸とともに投与することが望ましくあり得る他の治療薬には、鎮痛薬が含まれる。そのような薬剤または薬剤の組み合わせは、組み合わせ調製物であるか別個の調製物であるかにかかわらず、本発明による抗体または核酸と組み合わせて投与され得るか、またはそれらとの組成物として提供され得る。本発明による二重特異性分子または核酸は、言及されたものなどの別の治療薬とともに、別々に、順次に、または並行して、かつ任意に組み合わせ調製物として投与されてもよい。
【０１７７】
複数の組成物が別々または同時に投与され得る。別々の投与とは、異なる時間、例えば、少なくとも１０、２０、３０、もしくは１０〜６０分間空けて、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２時間空けて投与される２つの組成物を指す。組成物を２４時間あけて、またはさらにより長い時間を空けて投与することもできる。あるいは、２つ以上の組成物が同時に、例えば１０分未満または５分未満空けて投与され得る。同時に投与される組成物は、いくつかの態様では、構成成分の各々の同様のまたは異なる時間の放出機構の有無にかかわらず、混合物として投与され得る。
【０１７８】
二重特異性分子およびそれらをコードする核酸は、治療薬として使用され得る。本明細書の患者は、概して哺乳動物、典型的にはヒトである。二重特異性分子または核酸は、例えば、本明細書で言及される任意の投与経路によって哺乳動物に投与され得る。
【０１７９】
投与は通常、「治療的有効量」であり、これは、投与されて所望の効果を生じ、患者に便益を示すのに十分な量である。正確な量は、治療の目的によって決まり、既知の技術を使用して当業者によって確認可能である（例えば、Ｌｌｏｙｄ（１９９９）Ｔｈｅ Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇを参照されたい）。治療の処方、例えば、投与量の決定などは、一般開業医および他の医師の責任の範囲内であり、治療されている症状の重症度および／または疾患の進行によって決まり得る。二重特異性分子または核酸の治療的有効量または好適な用量は、動物モデルにおけるそのインビトロ活性およびインビボ活性を比較することによって決定され得る。マウスおよび他の試験動物における有効投与量をヒトに外挿するための方法は、知られている。
【０１８０】
二重特異性分子は、用量毎に以下の範囲のうちの１つの量： 
約１０μｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、
約５０μｇ／ｋｇ体重〜約５ｍｇ／ｋｇ体重、
約１００μｇ／ｋｇ体重〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、
約１００μｇ／ｋｇ体重〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重、
約０．５ｍｇ／ｋｇ体重〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重、または
約５ｍｇ／ｋｇ体重以下、例えば、４未満、３未満、２未満、または１ｍｇ／ｋｇ未満の抗体
で投与され得る。
【０１８１】
投与される抗原結合分子の用量は、最大１ｍｇ／ｋｇであってもよい。それは、例えば３０〜１５０ｍｇ／ｍＬなど、小児集団に対してはより低い強度で製剤化されてもよい。二重特異性分子は、小児集団に対してはより少量でパッケージ化されてもよく、例えば、２５〜７５ｍｇ、例えば３０〜６０ｍｇの薬瓶で提供されてもよい。
【０１８２】
本明細書に記載の治療方法では、１回以上の用量が投与されてもよい。場合によっては、長期的な便益を達成するために単一用量が有効である場合がある。したがって、方法は、単一用量の二重特異性分子、それをコードする核酸、または組成物を投与することを含んでもよい。あるいは、通常は順次に、かつ数日、数週間、または数か月の期間を空けて複数回用量が投与されてもよい。任意に、二重特異性分子は、月に１回、またはより少ない頻度で、例えば２か月毎または３か月毎に患者に投与されてもよい。
【０１８３】
本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療」、「治療すること」、または「寛解」という用語は、治療的処置を指し、その目的は、疾患または障害に関連する状態の進行または重症度を逆にする、軽減する、寛解する、阻止する、遅らせる、または停止することである。「治療すること」という用語は、状態、疾患、または障害の少なくとも１つの有害効果または症状を低減または軽減することを含む。１つ以上の症状または臨床マーカーが低減された場合、治療は概して、「有効」である。あるいは、疾患の進行が低減されたか、または食い止められた場合、治療は、「有効」である。つまり、「治療」には、症状またはマーカーの改善だけではなく、治療しない場合に予想される症状と比較して、症状の停止または少なくとも進行もしくは悪化の減速も含まれる。有益なまたは所望の臨床結果としては、１つ以上の症状の軽減、疾患の程度の減少、疾患の状態の安定化（すなわち、悪化しない）、疾患の進行の遅延もしくは減速、病的状態の寛解もしくは緩和、緩解（部分的もしくは全体的にかかわらず）、および／または死亡率の減少（検出可能もしくは検出不能にかかわらず）が挙げられるが、これらに限定されない。疾患の「治療」という用語には、疾患の症状または副作用の緩和を提供すること（待期療法を含む）も含まれる。治療が有効であるためには、完全な治癒は企図されない。方法は、ある特定の態様では治癒も含むことができる。本発明の文脈において、治療は、予防的処置であってもよい。
【０１８４】
長い半減期は、本発明の二重特異性分子において望ましい特徴である。半減期の延長は、血流中の分子の治療有効濃度を維持するために必要とされる注射回数がより少なくなり、より頻度の低い投与につながる。ヒトにおける本発明の抗原結合分子のインビボ半減期は、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、もしくは２１日、またはより長くあり得る。カニクイザルなどの非ヒト霊長類における抗原結合分子のインビボ半減期は、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、もしくは２１日、またはより長くてもうよい。
【０１８５】
抗原結合分子は、１週間、２週間、３週間、４週間、または１か月の一定間隔で投与するために提供されてもよい。
【０１８６】
治療的使用
本発明の二重特異性抗原結合分子は、療法によるヒトまたは動物の身体の治療方法で使用され得る。分子の治療指標は、
血友病Ａの治療のための使用、
遺伝性第ＶＩＩＩ因子欠乏症の治療のための使用、
血友病Ａ患者における出血インシデントの数の大幅な減少のための使用、
第ＶＩＩＩ因子機能の代わりになるための使用、
および／または
血液凝固の促進のための使用
を含む。
【０１８７】
患者は典型的には、ヒト患者である。患者は、血友病Ａもしくは遺伝性第ＶＩＩＩ因子欠乏症と診断されたヒト、または野生型と比較して第ＶＩＩＩ因子の発現もしくは活性が低い（またはない）ヒトであってもよい。患者は、小児患者（例えば、２歳〜１８歳未満）であっても、または成人であってもよい。患者は、第ＶＩＩＩ因子に対する阻害剤を有していても、有していなくてもよい。
【０１８８】
本発明の二重特異性分子、またはそのような二重特異性分子もしくはそれをコードする核酸を含む組成物は、任意のそのような方法で使用するために使用または提供され得る。任意のそのような方法で使用するための薬剤の製造のための、二重特異性分子、またはそれもしくはそれをコードする核酸を含む組成物の使用も想定される。方法は典型的には、抗体または組成物を哺乳動物、例えば、ヒト患者に投与することを含む。好適な製剤および投与方法は、本明細書の他の箇所に記載されている。
【０１８９】
ＦＶＩＩＩに対する阻害同種抗体を発生させる血友病Ａ患者の治療に対して、現在満たされていないニーズがある。本発明の抗原結合分子は、そのような患者での使用に適している。したがって、いくつかの態様では、本発明による二重特異性抗原結合分子で治療された患者は、血流中の阻害抗体の存在により、ＦＶＩＩＩでの治療に耐性がある可能性がある。治療に対する耐性は、治療の有効性の低下に現れ得る。そのような耐性は、患者からの血漿試料を用いたインビトロアッセイ（例えば、ａＰＴＴアッセイ）において検出され得、治療分子は、対照ＦＶＩＩＩ欠乏血漿を用いたアッセイと同じレベルまで凝固時間を短縮しない（後者は、治療分子に対する阻害抗体を欠いている）。
【０１９０】
ＦＩＸａおよびＦＸに対する二重特異性抗体など、血友病の他の治療を受けている患者も、それらの治療抗体に対する阻害抗体を発生させる可能性がある。述べられたように、本発明のようなヒト抗体の使用は、このリスクを最小限に抑えるべきであるが、それにもかかわらず、本発明の抗原結合分子またはＦＩＸａおよびＦＸに対する他の二重特異性抗原結合分子を受けている一部の患者において、阻害抗体が生成される可能性がある。本発明による二重特異性抗原結合分子で治療された患者は、血流中の阻害抗体の存在により、ＦＩＸａおよびＦＸに対する異なる二重特異性抗原結合分子に対する治療に耐性がある可能性がある。患者は、エミシズマブによる治療に耐性がある可能性がある。
【０１９１】
阻害抗体が製剤の長期治療投与により生成される可能性があるため、患者が複数の異なる治療を交互に受け、循環して、阻害抗体を発生させるリスクを低減することが有益であり得る。したがって、本発明の二重特異性抗原結合分子は、患者が阻害抗体を（まだ）発生させていない場合でさえ、異なるＦＶＩＩＩａ活性補充ポリペプチド薬物、例えば、ＦＩＸａおよびＦＸに対する二重特異性抗原結合分子、任意にエミシズマブによる治療を以前に受けた患者に投与され得る。同様に、エミシズマブもしくはＦＩＸａおよびＦＸに対する他の二重特異性抗原結合分子、または他のＦＶＩＩＩａ活性補充ポリペプチド薬物は、概して、本発明の二重特異性抗原結合分子ですでに治療された患者に投与され得る。治療レジメンは、第１の期間（例えば、１〜６か月間または６か月〜１年）にわたって第１のＦＶＩＩＩ活性補充ポリペプチド薬物を投与すること、続いて第２の期間（例えば、１〜６か月間または６か月〜１年）にわたって異なるＦＶＩＩＩ活性補充ポリペプチド薬物に切り替えること、続いて第１の薬物に再び切り替えること、またはさらに別のＦＶＩＩＩ活性補充ポリペプチド薬物に切り替えることを含んでもよい。異なる薬物治療の異なるアミノ酸配列は、ある薬物に対する阻害抗体を発生させるリスクのある患者が、異なる薬物（例えば、本発明の分子）に切り替えた後にもはや第１の薬物（例えば、エミシズマブ）に対する阻害抗体を発生させるリスクがないことを確実にするべきである。循環期間は、患者および医師の利便性および選好に応じて、変更または短縮されてもよい。
【０１９２】
コードする核酸の投与が代替療法を表し、ポリペプチド薬物を直接投与する代わりに実施され得ることが認識されるであろう。
【０１９３】
述べられたように、本発明の二重特異性抗原結合分子は、過敏症反応、同種抗体の発生、臓器毒性、または療法の中止につながるその他の有害事象のインシデントがない（または最小限である）ことに関連する、強力な安全性プロファイルを有すると考えられる。
【０１９４】
以下の番号付きの節および陳述は、本発明の実施形態を表し、本記載の一部である。
【０１９５】
節
節１．
ＦＩＸａ結合部位を含むＦＩＸａ結合ポリペプチドアームと、
ＦＸ結合部位を含むＦＸ結合ポリペプチドアームとを含み、
（ｉ）前記ＦＩＸａ結合部位が、ＦＩＸａ結合ポリペプチドアームの相補性決定領域（ＣＤＲ）のセットによって提供され、前記ＣＤＲのセットが、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、および／またはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、
ＨＣＤＲ１が、配列番号１４０であり、
ＨＣＤＲ２が、配列番号１４１であり、
ＨＣＤＲ３が、配列番号１４２であり、
ＬＣＤＲ１が、配列番号６であり、
ＬＣＤＲ２が、配列番号７であり、
ＬＣＤＲ３が、配列番号８であるか、
または、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸改変を有するＣＤＲのそのセットを含み、
（ｉｉ）前記ＦＩＸａ結合ポリペプチドアームが、
免疫グロブリン重鎖ｖ、ｄ、およびｊ遺伝子セグメントの組換えにより生成されたＶＨドメインであって、前記ｖ遺伝子セグメントが、ＶＨ３−７であり、および／または前記ｊ遺伝子セグメントが、ＪＨ６である、ＶＨドメイン、および／または
免疫グロブリン軽鎖ｖおよびｊ遺伝子セグメントの組換えにより生成されたＶＬドメインであって、前記ｖ遺伝子セグメントが、ＶＬ３−２１であり、前記ｊ遺伝子セグメントが、ＪＬ３である、ＶＬドメインとを含む抗体Ｆｖ領域を含み、および／または
（ｉｉｉ）前記ＦＩＸａ結合ポリペプチドアームが、単一特異性形態で提供される場合、ＦＸからＦＸａへのＦＩＸａ触媒活性化を強化することが可能である
ことを特徴とする二重特異性抗原結合分子。
【０１９６】
節２．前記ＦＩＸａ結合ポリペプチドアームが、免疫グロブリン重鎖ｖ、ｄ、およびｊ遺伝子セグメントの組換えにより生成されたＶＨドメインを含み、前記ｖ遺伝子セグメントが、ＶＨ３−７であり、前記ｄ遺伝子セグメントが、ＤＨ１−２６であり、前記ｊ遺伝子セグメントが、ＪＨ６である、節１に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０１９７】
節３．前期ＦＩＸａ結合ポリペプチドアームが、免疫グロブリン重鎖ｖ、ｄ、およびｊ遺伝子セグメントの組換えにより生成されたＶＨドメインを含み、前記ｖ遺伝子セグメントが、ＶＨ３−７*０１であり、前記ｊ遺伝子セグメントが、ＪＨ６*０２である、節１または節２に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０１９８】
節４．前記ＦＩＸａ結合ポリペプチドアームが、ＣＤＲのセットによって提供されるＦＩＸａ結合部位を含む抗体Ｆｖ領域を含み、前記ＣＤＲのセットが、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、および／またはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、
ＨＣＤＲ１が、配列番号１４０であり、
ＨＣＤＲ２が、配列番号１４１であり、
ＨＣＤＲ３が、配列番号１４２であり、
ＬＣＤＲ１が、配列番号６であり、
ＬＣＤＲ２が、配列番号７であり、
ＬＣＤＲ３が、配列番号８であるか、
または、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸改変を有するＣＤＲのそのセットを含む、節１〜３のいずれか１節に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０１９９】
節５．前記ＦＩＸａ結合ポリペプチドアームが、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む抗体ＶＨドメインを含み、
ＨＣＤＲ１が、配列番号１４０であり、
ＨＣＤＲ２が、配列番号１４１であり、
ＨＣＤＲ３が、配列番号１４２である、
節１〜４のいずれか１節に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０２００】
節６．ＨＣＤＲ１が、配列番号１であり、ＨＣＤＲ２が、配列番号２であり、ＨＣＤＲ３が、配列番号３である、節１〜５のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
【０２０１】
節７．
前記ＦＩＸａ結合ポリペプチドアームが、ＶＬ３−２１*ｄ０１遺伝子セグメントおよびＪＬ３*０２遺伝子セグメントの組換えにより生成されたＶＬドメインを含む、節１〜６のいずれか１節に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０２０２】
節８．前記ＦＩＸａ結合ポリペプチドアームが、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む抗体ＶＬドメインを含み、
ＬＣＤＲ１が、配列番号６であり、
ＬＣＤＲ２が、配列番号７であり、
ＬＣＤＲ３は、配列番号８である、
節１〜７のいずれか１節に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０２０３】
節９．前記ＦＩＸａ結合ポリペプチドアームが、フレームワーク内にＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含むＶＨドメインを含み、前記フレームワークが、フレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４のセットを含み、
ＦＲ１が、配列番号１３２であり、
ＦＲ２が、配列番号１３３であり、
ＦＲ３が、配列番号１３４であり、
ＦＲ４が、配列番号１３５であるか、
または前記フレームワークが、最大１０個のアミノ酸改変を有するフレームワーク領域のそのセットを含む、節１〜８のいずれか１節に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０２０４】
節１０．
ＦＲ１が、配列番号１３２であり、任意に残基１１におけるＦのＬの置換、残基２４におけるＡのＶの置換、および／または残基２４におけるＶのＡの置換を有し、
ＦＲ２が、配列番号１３３であり、
ＦＲ３が、配列番号１３４であり、任意に残基５９におけるＦのＹの置換、残基６２におけるＡのＤの置換、残基７０におけるＭのＩの置換、残基７７におけるＫのＮの置換、残基７９におけるＶのＬの置換、および／または残基８１におけるＶのＬの置換を有し、
ＦＲ４が、配列番号１３５であり、任意に残基１１９におけるＴのＳ置換を有し、残基番号付けが、ＩＭＧＴシステムに従っている、節９に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０２０５】
節１１．
ＦＲ１が、配列番号１３２であり、
ＦＲ２が、配列番号１３３であり、
ＦＲ３が、配列番号１３４であり、
ＦＲ４は、配列番号１３５である、節１０に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０２０６】
節１２．前記ＦＩＸａ結合ポリペプチドアームが、フレームワーク内にＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含むＶＬドメインを含み、前記フレームワークが、フレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４のセットを含み、
ＦＲ１が、配列番号１３６であり、
ＦＲ２が、配列番号１３７であり、
ＦＲ３が、配列番号１３８であり、
ＦＲ４が、配列番号１３９であるか、
または前記フレームワークが、最大１０個のアミノ酸改変を有するフレームワーク領域のそのセットを含む、節１〜１１のいずれか１節に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０２０７】
節１３．
ＦＲ１が、配列番号１３６であり、
ＦＲ２が、配列番号１３７であり、
ＦＲ３が、配列番号１３８であり、
ＦＲ４が、配列番号１３９である、節１２に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０２０８】
節１４．前記ＦＩＸａ結合ポリペプチドアームが、アミノ酸配列の配列番号５を有するＶＨドメインを含む、節１〜１３のいずれか１節に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０２０９】
節１５．前記ＦＩＸａ結合ポリペプチドアームＶＬドメインが、アミノ酸配列の配列番号１０を含む、節１〜１４のいずれか１節に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０２１０】
節１６．前記ＦＩＸａ結合ポリペプチドアームが、Ｎ末端からＣ末端へ、ＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む抗体重鎖を含む、節１〜１５のいずれか１節に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０２１１】
節１７．前記抗体重鎖が、ＩｇＧ定常領域を含む、節１６に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０２１２】
節１８．前記ＦＩＸａ結合ポリペプチドアームが、Ｎ末端からＣ末端へ、ＶＬドメインおよびＣＬドメインを含む抗体軽鎖を含む、節１〜１７のいずれか１節に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０２１３】
節１９．前記ＦＸ結合ポリペプチドアームが、ＣＤＲのセットによって提供されるＦＩＸａ結合部位を含む抗体Ｆｖ領域を含む、節１〜１８のいずれか１節に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０２１４】
節２０．前記抗体Ｆｖ領域が、免疫グロブリン重鎖ｖ、ｄ、およびｊ遺伝子セグメントの組換えにより生成されたＶＨドメインを含み、前記ｖおよびｊ遺伝子セグメントが、
ＶＨ１−３（例えば、ＶＨ１−３*０１）およびＪＨ６（例えば、ＪＨ６*０２）、
ＶＨ３−３０（例えば、ＶＨ３−３０*１８）およびＪＨ６（例えば、ＪＨ６*０２）、
ＶＨ３−３３（例えば、ＶＨ３−３３*０１）およびＪＨ６（例えば、ＪＨ６*０２）、
ＶＨ４−３１（例えば、ＶＨ４−３１*０３）およびＪＨ４（例えば、ＪＨ４*０２）、または
ＶＨ４−５９（例えば、ＶＨ４−５９*０１）およびＪＨ４（例えば、ＪＨ４*０２）である、節１９に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０２１５】
節２１．前記抗体Ｆｖ領域が、免疫グロブリン軽鎖ｖおよびｊ遺伝子セグメントの組換えにより生成されたＶＬドメインを含み、前記ｖ遺伝子セグメントが、ＶＬ３−２１（例えば、ＶＬ３−２１*ｄ０１）であり、前記ｊ遺伝子セグメントが、ＪＬ３（例えば、ＪＬ３*０２）である、節１９または節２０に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０２１６】
節２２．前記ＦＩＸａ結合ポリペプチドアームおよび前記ＦＸ結合ポリペプチドアームが、共通の抗体軽鎖を含む、節１〜２１のいずれか１節に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０２１７】
節２３．前記軽鎖が、λ定常領域を含む、節２２に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０２１８】
節２４．前記抗原結合分子が、
ＦＩＸａ結合Ｆｖ領域を含む第１の重鎖−軽鎖対、
ＦＸ結合Ｆｖ領域を含む第２の重鎖−軽鎖対を含む、四量体免疫グロブリンであり、各重鎖が、ＶＨドメインおよび定常領域を含み、各軽鎖が、ＶＬドメインおよび定常領域を含み、前記第１および第２の重軽−軽鎖対が会合して、それらの重鎖定常領域のヘテロ二量体化により四量体免疫グロブリンを形成している、節１〜２３のいずれか１節に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０２１９】
節２５．前記免疫グロブリンが、ＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ４である、節２４に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０２２０】
節２６．ＦＩＸａ結合部位を含む単離されたＦＩＸａ結合ポリペプチドであって、前記ＦＩＸａ結合ポリペプチドが、節１〜２５のいずれか１節で定義される通りである、単離されたＦＩＸａ結合ポリペプチド。
【０２２１】
節２７．ＦＩＸａ結合部位を含むＦＩＸａ結合ポリペプチドであって、節１〜２５のいずれか１節で定義されたＦＩＸａ結合ポリペプチドアームであるＦＩＸａ結合ポリペプチド、または前記ポリペプチドをコードする核酸と、
ＦＸ結合部位を含むＦＸ結合ポリペプチドであって、節１〜２５のいずれか１節で定義されるＦＸ結合ポリペプチドアームであるＦＸ結合ポリペプチド、または前記ポリペプチドをコードする核酸とを含む、
節１〜２５のいずれか１節に記載の二重特異性抗原結合分子の製造のためのキット。
【０２２２】
節２８．節１〜２５のいずれか１節に記載の抗原結合分子を、薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて含む、組成物。
【０２２３】
節２９．抗原結合分子が、滅菌水溶液中にある、節２８に記載の組成物。
【０２２４】
節３０．節１〜２５のいずれか１節に記載の二重特異性抗原結合分子をコードする、単離された核酸。
【０２２５】
節３１．節１〜２５のいずれか１節に記載の二重特異性抗原結合分子のＦＩＸａ結合ポリペプチドアームをコードする、単離された核酸。
【０２２６】
節３２．節１〜２５のいずれか１節に記載の二重特異性抗原結合分子をコードする、または前記二重特異性抗原結合分子のＦＩＸａ結合ポリペプチドアーム、あるいは前記ＦＸ結合ポリペプチドアームをコードする、組換え核酸を含む宿主細胞であって、前記コードしている核酸が、発現のためのプロモーターに作動可能に連結されている、宿主細胞。
【０２２７】
節３３．節１〜２５のいずれか１節に記載の抗原結合分子を製造する、または前記二重特異性抗原結合分子の前記ＦＩＸａ結合ポリペプチドアームもしくは前記ＦＸ結合ポリペプチドアームを製造する方法であって、前記抗原結合分子の発現のための条件下で節３２に記載の宿主細胞を培養することと、前記宿主細胞培養物から前記抗原結合分子または結合アームを回収することとを含む方法。
【０２２８】
節３４．節２９または節３０に記載の組成物を患者に投与することを含む、患者における出血を抑制する方法。
【０２２９】
節３５．ヒトまたは動物の身体の治療方法で使用するための、節１〜２５のいずれか１節に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０２３０】
節３６．患者における出血の抑制に使用するための、節１〜２５のいずれか１節に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０２３１】
節３７．前記患者が、血友病Ａ患者である、節３４に記載の方法、または節３５もしくは節３６に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０２３２】
節３８．前記患者が、血流中の阻害抗体の存在により、ＦＶＩＩＩでの治療に耐性がある、節３７に記載の方法または二重特異性抗原結合分子。
【０２３３】
節３９．インビトロでＦＩＸａおよびＦＸを結合するための、節１〜２５のいずれか１節に記載の二重特異性抗原結合分子の使用。
【０２３４】
節４０．血友病Ａの患者においてＦＶＩＩＩ機能を補充するための、節１〜２５のいずれか１節に記載の二重特異性抗原結合分子の使用。
【０２３５】
陳述
１．ＦＩＸａ結合部位を含むＦＩＸａ結合ポリペプチドアームと、
ＦＸ結合部位を含むＦＸ結合ポリペプチドアームとを含み、
前記ＦＩＸａ結合ポリペプチドアームが、配列番号３２４と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＶＨドメインと、配列番号１０と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＶＬドメインとを含み、任意に、前記ＶＨドメインが、ＩＭＧＴ位置１１１．１に疎水性残基または正に荷電した残基を有するＨＣＤＲ３を含み、任意に、前記ＨＣＤＲ３アミノ酸配列が、配列番号４００、配列番号４０１、配列番号４０２、配列番号４０３、もしくは配列番号１７１であることを特徴とし、および／または
前記ＦＩＸａ結合部位が、ＦＩＸａ結合ポリペプチドアームの相補性決定領域（ＣＤＲ）のセットによって提供され、前記ＣＤＲのセットが、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、および／またはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、
ＨＣＤＲ１が、配列番号１であり、
ＨＣＤＲ２が、配列番号２であり、
ＨＣＤＲ３が、配列番号４００であり、
ＬＣＤＲ１が、配列番号６であり、
ＬＣＤＲ２が、配列番号７であり、
ＬＣＤＲ３が、配列番号８である、
ことを特徴とする二重特異性抗原結合分子。
【０２３６】
２．前記ＦＩＸａ結合部位が、ＦＩＸａ結合ポリペプチドアームの相補性決定領域（ＣＤＲ）のセットによって提供され、前記ＣＤＲのセットが、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、および／またはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、
ＨＣＤＲ１が、配列番号１であり、
ＨＣＤＲ２が、配列番号２であり、
ＨＣＤＲ３が、配列番号４０１、配列番号４０２、配列番号４０３、または配列番号１７１であり、
ＬＣＤＲ１が、配列番号６であり、
ＬＣＤＲ２が、配列番号７であり、
ＬＣＤＲ３が、配列番号８である、
陳述１に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０２３７】
３．ＦＩＸａ結合部位を含むＦＩＸａ結合ポリペプチドアームであって
（ｉ）免疫グロブリン重鎖ｖ、ｄ、およびｊ遺伝子セグメントの組換えにより生成されたＶＨドメインであって、前記ｖ遺伝子セグメントが、ＶＨ３−７（例えば、ＶＨ３−７＊０１）であり、および／または前記ｊ遺伝子セグメントが、ＪＨ６（例えば、ＪＨ６＊０２）である、ＶＨドメインと、
免疫グロブリン軽鎖ｖおよびｊ遺伝子セグメントの組換えにより生成されたＶＬドメインであって、前記ｖ遺伝子セグメントが、ＶＬ３−２１（例えば、ＶＬ３−２１＊ｄ０１）であり、前記ｊ遺伝子セグメントが、ＪＬ２（例えば、ＪＬ２＊０１）またはＪＬ３である、ＶＬドメインとを含む抗体Ｆｖ領域を含むＦＩＸａ結合ポリペプチドアームと、
（ｉｉ）ＦＸ結合部位を含むＦＸ結合ポリペプチドアームであって、
（ａ）免疫グロブリン重鎖ｖ、ｄ、およびｊ遺伝子セグメントの組換えにより生成されたＶＨドメインであって、前記ｖおよびｊ遺伝子セグメントが、ＶＨ１−３（例えば、ＶＨ１−３＊０１）およびＪＨ６（例えば、ＪＨ６＊０２）である、ＶＨドメインと、
免疫グロブリン軽鎖ｖおよびｊ遺伝子セグメントの組換えにより生成されたＶＬドメインであって、前記ｖおよびｊ遺伝子セグメントが、ＶＬ１−４７（例えば、ＶＬ１−４７＊０１）およびＪＬ１（例えば、ＪＬ１＊０１）である、ＶＬドメインとを含む、または、
（ｂ）免疫グロブリン重鎖ｖ、ｄ、およびｊ遺伝子セグメントの組換えにより生成されたＶＨドメインであって、前記ｖおよびｊ遺伝子セグメントが、ＶＨ３−３０（例えば、ＶＨ３−３０＊１８）およびＪＨ６（例えば、ＪＨ６＊０２）である、ＶＨドメインと、
免疫グロブリン軽鎖ｖおよびｊ遺伝子セグメントの組換えにより生成されたＶＬドメインであって、前記ｖおよびｊ遺伝子セグメントが、ＶＬ２−８（例えば、ＶＬ２−８＊０１）およびＪＬ２（例えば、ＪＬ２＊０１）である、ＶＬドメインとを含む、または、
（ｃ）免疫グロブリン重鎖ｖ、ｄ、およびｊ遺伝子セグメントの組換えにより生成されたＶＨドメインであって、前記ｖおよびｊ遺伝子セグメントが、ＶＨ４−６１（例えば、ＶＨ４−６１＊０１）およびＪＨ１（例えば、ＪＨ１＊０１）である、ＶＨドメインと、
免疫グロブリン軽鎖ｖおよびｊ遺伝子セグメントの組換えにより生成されたＶＬドメインであって、前記ｖおよびｊ遺伝子セグメントが、ＶＫ３−１１（例えば、ＶＫ３−１１＊０１）およびＪＫ５（例えば、ＪＫ５＊０１）である、ＶＬドメインとを含む
抗体Ｆｖ領域を含むＦＸ結合ポリペプチドアーム、
とを含む、二重特異性抗原結合分子。
【０２３８】
４．前記ＦＩＸａ結合ポリペプチドアームが、配列番号３２４と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するＶＨドメインを含む、陳述１〜３のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
【０２３９】
５．前記ＦＩＸａ結合ポリペプチドアームが、配列番号１０と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するＶＬドメインを含む、陳述１〜４のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
【０２４０】
６．前記ＦＩＸａ結合部位が、ＦＩＸａ結合ポリペプチドアームの相補性決定領域（ＣＤＲ）のセットによって提供され、前記ＣＤＲのセットが、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、および／またはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、
ＨＣＤＲ１が、配列番号１であり、
ＨＣＤＲ２が、配列番号２であり、
ＨＣＤＲ３が、配列番号１７１であり、
ＬＣＤＲ１が、配列番号６であり、
ＬＣＤＲ２が、配列番号７であり、
ＬＣＤＲ３が、配列番号８である、
陳述１〜５のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
【０２４１】
７．前記ＦＩＸａ結合ポリペプチドアームが、ＶＨドメインアミノ酸配列の配列番号３２４およびＶＬドメインアミノ酸配列の配列番号１０を含む、陳述１〜６のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
【０２４２】
８．ａＰＴＴアッセイにおいて、ＦＶＩＩＩ欠乏ヒト血漿の凝固時間を４０秒未満に短縮する、陳述１〜７のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
【０２４３】
９．前記ＦＩＸａ結合ポリペプチドアームが、単一特異性形態で提供される場合、ＦＸからＦＸａへのＦＩＸａ触媒活性化を強化することが可能である、陳述１〜８のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
【０２４４】
１０．前記ＦＸ結合ポリペプチドアームが、配列番号６１と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＶＨドメインと、配列番号６６と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＶＬドメインとを含む、および／または
前記ＦＸ結合部位が、ＦＸ結合ポリペプチドアームの相補性決定領域（ＣＤＲ）のセットによって提供され、前記ＣＤＲのセットが、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、および／またはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、
ＨＣＤＲ１が、配列番号５７であり、
ＨＣＤＲ２が、配列番号５８であり、
ＨＣＤＲ３が、配列番号５９であり、
ＬＣＤＲ１が、配列番号６２であり、
ＬＣＤＲ２が、配列番号６３であり、
ＬＣＤＲ３が、配列番号６４である、
陳述１〜９のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
【０２４５】
１１．前記ＦＸ結合ポリペプチドアームが、ＶＨドメインアミノ酸配列の配列番号６１およびＶＬドメインアミノ酸配列の配列番号６６を含む、陳述１０に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０２４６】
１２．前記ＦＸ結合ポリペプチドアームが、配列番号７１と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＶＨドメインと、配列番号７６と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＶＬドメインとを含む、および／または
前記ＦＸ結合部位が、ＦＸ結合ポリペプチドアームの相補性決定領域（ＣＤＲ）のセットによって提供され、前記ＣＤＲのセットが、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、および／またはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、
ＨＣＤＲ１が、配列番号６７であり、
ＨＣＤＲ２が、配列番号６８であり、
ＨＣＤＲ３が、配列番号６９であり、
ＬＣＤＲ１が、配列番号７２であり、
ＬＣＤＲ２が、配列番号７３であり、
ＬＣＤＲ３が、配列番号７４である、
陳述１〜９のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
【０２４７】
１３．前記ＦＸ結合ポリペプチドアームが、ＶＨドメインアミノ酸配列の配列番号７１およびＶＬドメインアミノ酸配列の配列番号７６を含む、陳述１２に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０２４８】
１４．前記ＦＸ結合ポリペプチドアームが、配列番号１００と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＶＨドメインと、配列番号１０４と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＶＬドメインとを含む、および／または
前記ＦＸ結合部位が、ＦＸ結合ポリペプチドアームの相補性決定領域（ＣＤＲ）のセットによって提供され、前記ＣＤＲのセットが、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、および／またはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、
ＨＣＤＲ１が、配列番号９６であり、
ＨＣＤＲ２が、配列番号９７であり、
ＨＣＤＲ３が、配列番号９８であり、
ＬＣＤＲ１が、配列番号１０１であり、
ＬＣＤＲ２が、配列番号９２であり、
ＬＣＤＲ３が、配列番号１０２である、
陳述１〜９のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
【０２４９】
１５．前記ＦＸ結合ポリペプチドアームが、ＶＨドメインアミノ酸配列の配列番号１００およびＶＬドメインアミノ酸配列の配列番号１０４を含む、陳述１４に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０２５０】
１６．前記ＦＩＸａ結合ポリペプチドアームおよび／または前記ＦＸ結合ポリペプチドアームが、
Ｎ末端からＣ末端へ、ＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む抗体重鎖と、
Ｎ末端からＣ末端へ、ＶＬドメインおよびＣＬドメインを含む抗体軽鎖とを含む、
陳述１〜１５のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
【０２５１】
１７．前記抗体重鎖が、ＩｇＧ定常領域を含む、陳述１６に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０２５２】
１８．ＦＩＸａ結合Ｆｖ領域を含む第１の重鎖−軽鎖対と、
ＦＸ結合Ｆｖ領域を含む第２の重鎖−軽鎖対とを含む、四量体免疫グロブリンであり、
各重鎖が、ＶＨドメインおよび定常領域を含み、各軽鎖が、ＶＬドメインおよび定常領域を含み、前記第１および第２の重鎖−軽鎖対は会合して、それらの重鎖定常領域のヘテロ二量体化により四量体免疫グロブリンを形成している、陳述１〜１７のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
【０２５３】
１９．前記免疫グロブリンが、ＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ４である、陳述１８に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０２５４】
２０．前記ＩｇＧが、配列番号１４３のＩｇＧ４−ＰＥヒト重鎖定常領域を含み、前記ＩｇＧ４−ＰＥヒト重鎖定常領域は、ヘテロ二量体化を促進するように、１以上のアミノ酸置換で操作されていてもよい、陳述１９に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０２５５】
２１．陳述１〜２０のいずれか１つで定義される通りである、ＦＩＸａ結合部位を含む単離されたＦＩＸａ結合ポリペプチド。
【０２５６】
２２．陳述１〜２０のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子の前記ＦＩＸ結合ポリペプチドアームまたは前記ＦＸ結合ポリペプチドアームをコードする、単離された核酸。
【０２５７】
２３．陳述１〜２０のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子をコードする単離された核酸。
【０２５８】
２４．ＦＩＸａ結合部位を含むＦＩＸａ結合ポリペプチドであって、陳述１〜２０のいずれか１つで定義されたＦＩＸａ結合ポリペプチドアームであるＦＩＸａ結合ポリペプチド、または前記ポリペプチドをコードする核酸と、
ＦＸ結合部位を含むＦＸ結合ポリペプチドであって、陳述１〜２０のいずれか１つで定義されるＦＸ結合ポリペプチドアームであるＦＸ結合ポリペプチド、または前記ポリペプチドをコードする核酸とを含む、
陳述１〜２０のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子の製造のためのキット。
【０２５９】
２５．陳述１〜２０のいずれか１つに記載の抗原結合分子、または陳述２３に記載の単離された核酸を、薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて含む、組成物。
【０２６０】
２６．前記抗原結合分子または核酸が、滅菌水溶液中にある、陳述２５に記載の組成物。
【０２６１】
２７．陳述１〜２０のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子をコードする、または前記二重特異性抗原結合分子の前記ＦＩＸａ結合ポリペプチドアームおよび／または前記ＦＸ結合ポリペプチドアームをコードする、組換え核酸を含む宿主細胞であって、前記コードしている核酸が、発現のためのプロモーターに作動可能に連結されている、宿主細胞。
【０２６２】
２８．陳述１〜２０のいずれか１つに記載の抗原結合分子を製造する、または、前記二重特異性抗原結合分子の前記ＦＩＸａ結合ポリペプチドアームもしくは前記ＦＸ結合ポリペプチドアームを製造する方法であって、前記抗原結合分子の発現のための条件下で陳述２７に記載の宿主細胞を培養することと、前記宿主細胞培養物から前記抗原結合分子または結合アームを回収することとを含む方法。
【０２６３】
２９．陳述２５または陳述２６に記載の組成物を患者に投与することを含む、患者における出血を抑制する方法。
【０２６４】
３０．ヒトまたは動物の身体の治療方法で使用するための、陳述１〜２０のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子または陳述２５もしくは陳述２６に記載の組成物。
【０２６５】
３１．患者における出血の抑制に使用するための、陳述１〜２０のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子、または陳述２５もしくは陳述２６に記載の組成物。
【０２６６】
３３．前記患者が、血友病Ａ患者である、陳述２９に記載の方法、または陳述３０もしくは陳述３１に記載の二重特異性抗原結合分子。
【０２６７】
３４．前記患者が、血流中の阻害抗体の存在により、ＦＶＩＩＩでの治療に耐性がある、陳述３３に記載の方法または二重特異性抗原結合分子。
【０２６８】
３５．前記患者が、血流中の阻害抗体の存在により、ＦＩＸａおよびＦＸに対する別の二重特異性抗原結合分子での治療に耐性がある、陳述３３または陳述３４に記載の方法または二重特異性抗原結合分子。
【０２６９】
３６．患者が、エミシズマブでの治療に耐性がある、陳述３５に記載の方法または二重特異性抗原結合分子。
【０２７０】
３７．ＦＶＩＩＩａ活性補充ポリペプチドでの治療を受けている血友病Ａ患者における、阻害性抗薬物抗体の生成を低減する方法であって、
第１のＦＶＩＩＩａ活性補充ポリペプチド薬物を、１〜１２か月間、前記患者に投与することと、
前記患者を、１〜１２か月間、第２の異なるＦＶＩＩＩａ活性補充ポリペプチド薬物に切り替えることと、
前記患者を、１〜１２か月間、前記第１の抗原結合分子、または第３の異なるＦＶＩＩＩａ活性補充ポリペプチド薬物のいずれかに切り替えることと、を含み、
各場合において、前記ＦＶＩＩＩａ活性補充ポリペプチド薬物またはそのコード核酸が、前記患者においてＦＶＩＩＩａを機能的に補充する治療有効量で投与され、前記患者が、前記ＦＶＩＩＩａ活性補充ポリペプチド薬物のうちのいずれかに対して阻害性抗薬物抗体を生成するリスクが、そのＦＶＩＩＩａ活性補充ポリペプチド薬物での治療を受け続けている患者と比較して低減される、方法。
【０２７１】
３８．阻害性抗薬物抗体の生成を低減しながら、血友病Ａ患者を治療する方法で使用するための、ＦＶＩＩＩａ活性補充ポリペプチド薬物またはそのコード核酸を含む組成物であって、
第１のＦＶＩＩＩａ活性補充ポリペプチド薬物を、１〜１２か月間、前記患者に投与することと、
前記患者を、１〜１２か月間、第２の異なるＦＶＩＩＩａ活性補充ポリペプチド薬物に切り替えることと、
前記患者を、１〜１２か月間、前記第１の抗原結合分子、または第３の異なるＦＶＩＩＩａ活性補充ポリペプチド薬物のいずれかに切り替えることと、を含み、
各場合において、前記ＦＶＩＩＩａ活性補充ポリペプチド薬物またはそのコード核酸が、前記患者においてＦＶＩＩＩａを機能的に補充する治療有効量で投与され、前記患者が、前記ＦＶＩＩＩａ活性補充ポリペプチド薬物のうちのいずれかに対して阻害性抗薬物抗体を生成するリスクが、当該ＦＶＩＩＩａ活性補充ポリペプチド薬物での治療を受け続けている患者と比較して低減される、組成物。
【０２７２】
３９．前記第１、第２、および／または第３のＦＶＩＩＩａ活性補充ポリペプチド薬物が、ＦＩＸａおよびＦＸに対する二重特異性抗原結合分子である、陳述３７に記載の方法または陳述３８に記載の組成物。
【０２７３】
４０．前記第１、第２および／または第３のＦＶＩＩＩａ活性補充ポリペプチド薬物が、エミシズマブである、陳述３７〜３９のいずれか１つに記載の方法または組成物。
【０２７４】
４１．前記第１、第２および／または第３のＦＶＩＩＩａ活性補充ポリペプチド薬物が、陳述１〜２０のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子である、陳述３７〜４０のいずれか１つに記載の方法または組成物。
【０２７５】
４２．前記第１、第２および／または第３のＦＶＩＩＩａ活性補充ポリペプチド薬物が、組換えＦＶＩＩＩまたは血漿由来ＦＶＩＩＩである、陳述３７〜４１のいずれか１つに記載の方法または組成物。
【０２７６】
４３．インビトロでＦＩＸａおよびＦＸを結合するための、陳述１〜２０のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子の使用。
【０２７７】
４４．血友病Ａの患者においてＦＶＩＩＩ機能を補充するための、陳述１〜２０のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子の使用。
【０２７８】
本開示の観点から、本発明の様々なさらなる態様および実施形態が、当業者に明らかとなるであろう。参照される全ての特許または特許出願の公開された米国の対応物を含む、本明細書で言及されている全ての文書は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０２７９】
以下の実施例は、抗ＦＩＸａ抗体、抗ＦＸ抗体、ならびに抗ＦＩＸａ抗体および抗ＦＸ抗体のそれぞれのＦＩＸａ結合ポリペプチドアームおよびＦＸ結合ポリペプチドアームの組み合わせから生成された二重特異性抗体の生成、特性評価、および性能について記載する。抗体を、ヒト可変ドメインを有する抗体を生成することが可能な遺伝子導入マウスプラットフォームである、Ｋｙｍｏｕｓｅ（商標）を使用して生成した。Ｋｙｍｏｕｓｅ製の抗体は、ヒトｖ（ｄ）およびｊセグメントから生成されたヒト可変ドメインと、マウス定常ドメインとを有する。内因性マウス可変遺伝子は、サイレンシングされており、レパートリの非常に小さい部分を占めている（全ての重鎖可変領域の０．５％未満がマウス由来である）。Ｋｙｍｏｕｓｅ系は、Ｌｅｅら ２０１４［ｘｉ］、ＷＯ２０１１／００４１９２、ＷＯ２０１１／１５８００９、およびＷＯ２０１３／０６１０９８に記載されている。このプロジェクトは、重鎖遺伝子座および軽鎖κ遺伝子座がヒト化されたＫｙｍｏｕｓｅ ＨＫ株、ならびに重鎖遺伝子座および軽鎖λ遺伝子座がヒト化されたＫｙｍｏｕｓｅ ＨＬ株を用いた。マウスは、ヒトｖ、ｄ、およびｊ重鎖遺伝子セグメントの完全なレパートリ、ならびにヒトｖおよびｊκまたはλ軽鎖遺伝子セグメントの完全なレパートリを有する。
【０２８０】
実施例１．第ＩＸａ因子（ＦＩＸａ）に対する抗体の製造
４匹のＫｙｍｏｕｓｅ ＨＫマウス（オス、免疫化の開始時に４か月齢）および４匹のＫｙｍｏｕｓｅ ＨＬマウス（オス、免疫化の開始時に３か月齢）を、ヒト第ＩＸａ因子（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）に対して免疫化した。
【０２８１】
免疫化したマウスから脾臓組織を収集し、脾臓細胞を懸濁し、ＦＡＣＳによって選別して、抗原特異的Ｂ細胞を単離した。合計２，４６０個の第ＩＸａ因子特異的Ｂ細胞を、８匹の免疫化した動物から選別した。結合した抗体重鎖および軽鎖可変ドメイン配列を、ＲＮＡの逆転写および可変領域のＰＣＲ増幅によってＢ細胞から回収した。
【０２８２】
抗体をコードしている核酸を、発現のためにヒト細胞株Ｅｘｐｉ２９３Ｆに遺伝子導入し、上清を収集した。
【０２８３】
実施例２．第ＩＸａ因子抗体のＨＴＲＦ（登録商標）（均一時間分解蛍光）スクリーン
ＨＴＲＦアッセイを使用して、ＦＩＸａへの結合について抗ＦＩＸａ抗体をスクリーニングした。ＦＩＸａおよび抗体を、ドナーおよびアクセプターの２つの異なるフルオロフォアで標識した。２つの実体が互いに十分に近づくと、エネルギー源によるドナーの励起がアクセプターに向かうエネルギー移動を誘発し、これは、所与の波長で特定の蛍光を発する。したがって、その特異的抗体によるＦＩＸａの結合は、アクセプターの発光波長での検出によって検出され得る。
【０２８４】
Ｅｘｐｉ２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、抗ヒト第ＩＸ因子参照抗体、ＡｂＮおよびＣＭ７アイソタイプ対照抗体の連続希釈液を調製した。実施例１で生成された２，４６０個の抗体分泌ヒト細胞の各々からの上清５μＬをアッセイプレートに移した。５μＬのＡｂＮおよびＣＭ７アイソタイプ対照抗体を、それぞれ陽性対照および陰性対照として各アッセイプレートに移した。５μＬ（８０ｎＭ）のＡｌｅｘａ ６４７標識ヒト第ＩＸ因子、第ＩＸａ因子、または第ＩＸ因子軽鎖をアッセイプレートの各ウェルに添加し、室温（ＲＴ）で１時間インキュベートした。１０μＬの２Ｘ Ｍ２４−Ｋ溶液（原液から１：２０００希釈）をアッセイプレートの各ウェルに添加し、暗所で室温において２時間インキュベートした。ＥｎｖｉｓｉｏｎのＨＴＲＦ １００フラッシュプロトコルを使用して、アッセイプレートを読み取った（励起波長：３４０ｎｍ、発光波長１：６２０ｎｍ、発光波長２：６６５ｎｍ）。データを分析し、ＡｂＮ陽性対照に対して正規化した。
【０２８５】
抗ＦＩＸａ特異的Ｂ細胞由来の２，４６０個の抗体のうち、７３２個がこのアッセイにおいて第ＩＸ因子、第ＩＸａ因子、および／または第ＩＸ因子軽鎖への結合剤として同定された。
【０２８６】
実施例３．第ＩＸ因子抗体のＳＰＲ分析
製造業者の説明書に従って、抗マウスＩｇＧチップを調製した。実施例１からの上清を、ＨＢＳ−ＥＰ泳動用緩衝液（２０Ｘ ＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液から希釈、ｐＨ７．６（Ｂｉｏｑｕｏｔｅ））で１：５に希釈した。抗マウスＩｇＧ表面上で抗体を捕捉した。様々な濃度（２５６ｎＭおよび１０２４ｎＭ）のヒト第ＩＸ因子、ヒト第ＩＸａ因子、またはヒト第ＩＸ因子軽鎖を検体として使用した。１０ｍＭグリシン（ｐＨ１．７）で表面を再生した。結合センサグラムを、緩衝液注入（０ｎＭ）で二重参照した。データを、ＰｒｏｔｅＯｎ分析ソフトウェアに固有の１：１モデルに適合した。アッセイを２５℃で実施し、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液を泳動用緩衝液として使用した。
【０２８７】
実施例４．第Ｘ因子（ＦＸ）に対する抗体の製造
４匹のＫｙｍｏｕｓｅ ＨＫバージョン２マウス（オス、免疫化の開始時に３か月齢）および４匹のＫｙｍｏｕｓｅ ＨＬバージョン２マウス（オス、免疫化の開始時に３か月齢）を、ヒト第Ｘ因子（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）に対して免疫化した。免疫化したマウスから脾臓組織を収集し、脾臓細胞を懸濁し、ＦＡＣＳによって選別して、抗原特異的Ｂ細胞を単離した。合計１，７２２個の第Ｘ因子特異的Ｂ細胞を、８匹の免疫化した動物から選別した。結合した抗体重鎖および軽鎖可変ドメイン配列を、ＲＮＡの逆転写および可変領域のＰＣＲ増幅によってＢ細胞から回収した。
【０２８８】
抗体をコードしている核酸を、発現のためにヒト細胞株Ｅｘｐｉ２９３Ｆに遺伝子導入し、上清を収集した。
【０２８９】
実施例５．第Ｘ因子抗体のＨＴＲＦスクリーニング
Ｅｘｐｉ２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、参照抗ヒト第Ｘ因子抗体、ＡｂＴおよびＣＭ７アイソタイプ対照抗体の連続希釈液を調製した。実施例４で生成された１，７２２個の抗体分泌ヒト細胞の各々からの上清５μＬをアッセイプレートに移した。５μＬのＡｂＴおよびＣＭ７アイソタイプ対照抗体を、それぞれ陽性対照および陰性対照として各アッセイプレートに移した。５μＬ（８０ｎＭ）のＡｌｅｘａ ６４７標識ヒト第Ｘ因子、第Ｘａ因子、または第Ｘ因子軽鎖をアッセイプレートの各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。１０μＬの２Ｘ Ｍ２４−Ｋ溶液（原液から１：２０００希釈）を各ウェルに添加し、暗所で室温において２時間インキュベートした。ＥｎｖｉｓｉｏｎのＨＴＲＦ １００フラッシュプロトコルを使用して、アッセイプレートを読み取った（励起波長：３４０ｎｍ、発光波長１：６２０ｎｍ、発光波長２：６６５ｎｍ）。データを分析し、ＡｂＴ陽性対照に対して正規化した。
【０２９０】
抗ＦＸ特異的Ｂ細胞由来の１，７２２個の抗体のうち、４９７個がこのアッセイにおいて第Ｘ因子、第Ｘａ因子、および／または第Ｘ因子軽鎖への結合剤として同定された。
【０２９１】
実施例６．第Ｘ因子抗体のＳＰＲ分析
製造業者の指示に従って、抗マウスＩｇＧチップを調製した。実施例４からの上清を、ＨＢＳ−ＥＰ泳動用緩衝液（２０Ｘ  ＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液から希釈、ｐＨ７．６（Ｂｉｏｑｕｏｔｅ））で１：５に希釈した。抗マウスＩｇＧ表面上で抗体を捕捉した。様々な濃度（２５６ｎＭおよび１０２４ｎＭ）のヒト第Ｘ因子、ヒト第Ｘａ因子、またはヒト第Ｘ因子軽鎖を検体として使用した。１０ｍＭグリシン（ｐＨ１．７）で表面を再生した。結合センサグラムを、緩衝液注入（０ｎＭ）で二重参照した。データを、ＰｒｏｔｅＯｎ分析ソフトウェアに固有の１：１モデルに適合した。アッセイを２５℃で実施し、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液を泳動用緩衝液として使用した。
【０２９２】
実施例７．二重特異性抗体発現ベクターの構築
二重特異性ヒトＩｇＧ抗体の発現のためのプラスミドを、以下のように構築した。抗体可変領域をコードしているＤＮＡ断片を、実施例１および実施例４に記載されるように生成されたＰＣＲ生成物から調製した。クローニングのための抗体可変領域ＤＮＡ断片を調製するために、ＰＣＲを実施した後、反応溶液を０．８％アガロースゲル電気泳動に供した。添付の説明書に記載される方法によって、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、所望のサイズ（約４００ｂｐ）の増幅断片を精製し、３０ｍＬの溶出緩衝液（ＥＢ）を使用して溶出した。
【０２９３】
ＩｇＧ４のＣＨ３領域におけるアミノ酸置換生成物を、ＩｇＧ１のノブ・イントゥ・ホール技術［ｘｉｉ］を参照して調製して、各Ｈ鎖の異種分子を形成した。タイプａ（ＩｇＧ４ｒａ）は、Ｙ３４９ＣおよびＴ３６６Ｗの置換生成物であり、タイプｂ（ＩｇＧ４ｙｂ）は、Ｅ３５６Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖの置換生成物である。さらに、置換（−ｐｐｃｐＳｃｐ−−および−ｐｐｃｐＰｃｐ−）を、両方のタイプの置換生成物のヒンジ領域に導入した。本技術によると、Ｈ鎖のほぼ全てが、ヘテロ二量体を形成し得る。
【０２９４】
二重特異性抗体のＦＩＸａアームの発現のために、ＶＨドメインをプラスミドベクターｐＴＴ５＿Ｃａｍ＿ｃｃｄＢ＿ｈＩｇＧ４ｒａにクローニングして、完全長ヒトＩｇＧ４ｒａ抗体重鎖においてＶＨドメインをコードしているＤＮＡを提供し、ＶＬκドメインをｐＴＴ５＿Ｃａｍ＿ｃｃｄＢ＿ｈＩｇＫにクローニングして、完全長ヒトκ抗体軽鎖においてＶＬドメインをコードしているＤＮＡを提供し、ＶＬλドメインをｐＴＴ５＿Ｃａｍ＿ｃｃｄＢにクローニングして、完全長ヒトλ抗体軽鎖においてＶＬドメインをコードしているＤＮＡを提供した。
【０２９５】
ＨおよびＬ鎖可変領域（ＶＨおよびＶＬ）ＤＮＡ断片をＡａｒＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で消化し、製造業者の説明書に従ってＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して精製した。ｐＴＴ５＿Ｃａｍ＿ｃｃｄＢ＿ｈＩｇＧ４ｒａ（ＶＨの場合）、ｐＴＴ５＿Ｃａｍ＿ｃｃｄＢ＿ｈＩｇＫ（κクローンからのＶＬの場合）、またはｐＴＴ５＿Ｃａｍ＿ｃｃｄＢ（λクローンからのＶＬの場合）を、開裂部位がマルチクローニング部位にある制限ＡａｒＩで消化した。消化後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、製造業者の説明書に従ってベクターを精製した。
【０２９６】
ＡａｒＩで消化されたＡａｒＩ消化ＶＨまたはＶＬ断片、およびｐＴＴ５＿Ｃａｍ＿ｃｃｄＢ＿ｈＩｇＧ４ｒａ（ＶＨの場合）、ｐＴＴ５＿Ｃａｍ＿ｃｃｄＢ＿ｈＩｇＫ（κクローンからのＶＬの場合）、またはｐＴＴ５＿Ｃａｍ＿ｃｃｄＢ（λクローンからのＶＬの場合）を、製造業者の説明書に従って、Ｔ４リガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用してライゲーションした。Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ１０Ｂ株（ＥｌｅｃｔｒｏＭａｘ ＤＨ１０Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））をライゲーション溶液で形質転換した。ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、得られたアンピシリン耐性クローンからそれぞれのプラスミドＤＮＡを単離した。結果として生じるそれぞれのアンピシリン耐性形質転換体は、サンガーシーケンシングによって所望のＶＨおよびＶＬの挿入を有することが確認された。
【０２９７】
製造業者の説明書に従って、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、所望のクローンから抗ＦＩＸ結合アームおよび抗ＦＸ結合アームに対するプラスミドＤＮＡを単離し、最初に１００ｍＬの溶出緩衝液（ＥＢ）に溶解した。プラスミドＤＮＡ溶液を、Ｎａｎｏ−ｄｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって定量化し、５０ｎｇ／ｍＬに正規化した。抗ＦＩＸａ抗体Ｈ鎖発現ベクター、抗ＦＩＸａ抗体Ｌ鎖発現ベクター、抗ＦＸ抗体Ｈ鎖発現ベクター、および抗ＦＸ抗体Ｌ鎖発現ベクターを、Ｎｎ−ＩｇＧ４ｒａ、Ｎｎ−ＩｇＬ（またはＩｇＫ）、Ｔｎ−ＩｇＧ４ｒｂ、およびＴｎ−ＩｇＬ（またはＩｇＫ）と呼んだ。ＤＮＡミニプレップは、サンガーシーケンシングによって所望のＶＨまたはＶＬの挿入を有することが確認された。それぞれのプラスミド溶液を、使用するまで４℃で保存した。
【０２９８】
実施例８．二重特異性抗体の発現
８−１．ＤＮＡ溶液の調製
ＨＥＫ細胞の遺伝子導入のために、４種類のプラスミドＤＮＡを含む混合溶液を調製した。１ｍＬの細胞培養に対して、２５０ｎｇのＮｎ−ＩｇＧ４ｒａ、Ｎｎ−ＩｇＬ（またはＩｇＫ）、Ｔｎ−ＩｇＧ４ｒｂ、およびＴｎ−ＩｇＬ（またはＩｇＫ）の各々を使用した。
【０２９９】
８−２．宿主細胞の遺伝子導入
遺伝子導入の１日前に、細胞播種計算のために、培養したＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（ＨＥＫ細胞株）を集計した。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞を３００ｒｐｍで１０分間ペレット化した。細胞を予め加温した新鮮なＥｘｐｉ２９３発現培地に再懸濁して、２．４×１０６細胞／ｍＬの最終希釈液を得た。２００ｍＬの細胞懸濁液をＫｕｈｎｅｒ Ｓｈａｋｉｎｇ Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ（３７°Ｃ、１４０ｒｐｍ、８％ＣＯ２）で一晩インキュベートした。
【０３００】
遺伝子導入の日に、培養したＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞を集計し、新鮮なＥｘｐｉ２９３発現培地を使用して、４×１０６細胞／ｍＬに希釈した。Ｍｕｌｔｉｄｒｏｐ Ｃｏｍｂｉを使用して、５００μＬの細胞懸濁液を９６ウェルのディープウェルプレートの各ウェルに等分した。分注後、プレートをＤｕｅｔｚサンドイッチカバーで覆い、Ｋｕｈｎｅｒ Ｓｈａｋｉｎｇ Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ（３７°Ｃ、３００ｒｐｍ、５０ｍｍオービタルスロー、湿度８０％）で２〜２．５時間インキュベートした。
【０３０１】
各遺伝子導入について、２つの混合物を調製した。
混合物１：１ウェル当たり２５μＬのＢ細胞架橋生成物（４プラスミド混合物）＋５５μＬのＲＳＭ＋１００ｎｇのＨｙｐｅｒＰＢａｓｅ
混合物２：１μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３＋７９μＬのＲＳＭ
混合物２を混合物１に添加し、室温で１５分間インキュベートした。次いで、インキュベートした混合物を５００μＬの細胞培養液に添加し、Ｋｕｈｎｅｒ Ｓｈａｋｉｎｇ Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ（３７℃、３００ｒｐｍ、５０ｍｍオービタルスロー）で１週間インキュベートした。
【０３０２】
実施例９．活性化凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩａ）様活性アッセイ
二重特異性抗体のＦＶＩＩＩａ模倣活性、すなわち、ＦＸのＦＩＸａ媒介活性化を強化するその能力を、酵素アッセイによってインビトロで評価した。このアッセイでは、ＦＸａの形成に適した条件下で、リン脂質の存在下において、試験二重特異性分子をＦＩＸａおよびＦＸと接触させる。ＦＸａの基質を添加し、これは、ＦＸａによって開裂されると、検出可能な生成物を生成する。試験二重特異性抗体の存在下でのこの生成物の検出を、試験抗体が存在しない（対照抗体が含まれる場合がある）陰性対照と比較する。検出されたシグナルを、４０５ｎｍでの反応溶液の吸光度を記録することによって定量化する。吸光度を、アッセイにおける広範囲の抗体濃度にわたって測定し、ＥＣ５０値を、このアッセイにおける二重特異性抗体の効力の尺度として計算する。試験抗体と対照との間のＥＣ５０の有意差は、試験抗体がＦＸのＦＩＸａ媒介活性化を強化することが可能であることを示す。図７を参照されたい。
【０３０３】
−材料および方法
特に明記しない限り、全ての反応を３７℃で実施した。７．５μＬのＦＩＸ（３．７５μｇ／ｍＬ）、および組換え抗体を製造するＥｘｐｉ２９３細胞（実施例８）からの５μＬの上清をアッセイプレートの各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。２．５μＬのＦＸＩａ（１０ｎｇ／ｍＬ）、５μＬのＦＸ（５０ｎｇ／ｍＬ）、０．０５μＬのリン脂質（１０ｍｇ／ｍＬ）、および５μＬのＴＢＳＢ−Ｓ緩衝液の混合物を各ウェルに添加して、酵素反応（ＦＩＸａを生成するためのＦＸのＦＸａ開裂）を開始し、３７°Ｃで１時間インキュベートした。６０分後、５μＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡを添加することによって反応を終了した。１０μＬのＳ２７６５基質溶液を各ウェルに添加した後、４０５ｎｍ（参照波長６５５ｎｍ）での吸光度を３０分間測定した（１０分毎に１回読み取り）。
【０３０４】
ＴＢＳＢ：
０．１％ウシ血清アルブミンを含むトリス緩衝生理食塩水
７．５ｍＬのＴＢＳＢを作製するには：
０．１ｍＬの７．５％  ＢＳＡ溶液（Ｓｉｇｍａ）
７．４ｍＬの１Ｘ  ＴＢＳ溶液（２０Ｘ  ＴＢＳ溶液ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから希釈）
【０３０５】
ＴＢＳＢ−Ｓ：
５ｍＭのＣａＣｌ２および１ｍＭのＭｇＣｌ２を含むＴＢＳＢ
１００ｍＬのＴＢＳＢ−Ｓを作製するには：
９９．４ｍＬのＴＢＳＢ
０．５ｍＬの１Ｍ  ＣａＣｌ２（Ｓｉｇｍａ）
０．１ｍＬの１Ｍ  ＭｇＣｌ２（Ｓｉｇｍａ）
【０３０６】
ＦＸＩａ原液（１０μｇ／ｍＬ）：
１０ｍＬのＴＢＳＢ−Ｓを０．１ｍｇのＦＸＩａ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に添加して、１０μｇ／ｍＬの原液を作製する。
使用前に１０ｎｇ／ｍＬ（１：１，０００）の希釈標準溶液に希釈する。
【０３０７】
ＦＩＸ原液（３７．５μｇ／ｍＬ）：
１３．３ｍＬのＴＢＳＢ−Ｓを０．５ｍｇのＦＩＸ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に添加して、３７．５μｇ／ｍＬの原液を作製する。
使用前に３．７５μｇ／ｍＬ（１：１０）の希釈標準溶液に希釈する。
【０３０８】
ＦＸ希釈標準溶液（５０μｇ／ｍＬ）：
１６ｍＬのＴＢＳＢ−Ｓを０．８ｍｇのＦＸ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に添加して、５０μｇ／ｍＬの希釈標準溶液を作製する。
使用前にさらなる希釈は必要ない。
【０３０９】
Ｓ２７６５原液：
２５ｍｇのＳ２７６５（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）発色基質（０．０３５ｍｍｏｌ）
２ｍＭの原液を作製するには：
１７．４９３ｍＬの水をバイアルに添加し、振盪しながら溶解する。
【０３１０】
Ｐｅｆａｆｌｕｏｒ ＦＸａ原液：
１０μｍｏｌのＰｅｆａｆｌｕｏｒ  ＦＸａ蛍光基質（０．０１０ｍｍｏｌ）
１．５ｍＭの原液を作製するには：
６．６６７ｍＬの水をバイアルに添加し、振盪によって溶解する。
【０３１１】
ポリブレン溶液：
０．６ｇ／Ｌの臭化ヘキサジメトリン原液を作製するには：
０．１５ｇの臭化ヘキサジメトリン（Ｓｉｇｍａ）を２５０ｍＬの水に添加する。
使用前に０．６ｍｇ／Ｌ（１：１，０００）の希釈標準溶液に希釈する。
【０３１２】
Ｓ２７６５基質希釈標準溶液
２ｍＭのＳ−２７６５原液および０．６ｍｇ／Ｌのポリブレン溶液の１：１混合物。
【０３１３】
実施例１０．血漿凝固アッセイ
血友病Ａ患者の血液の凝固能力を修正する本発明の二重特異性抗体の能力を決定するために、ＦＶＩＩＩ欠乏血漿を使用した活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）に対するこれらの抗体の効果を検査した。
【０３１４】
様々な濃度を有する５０ｍＬの二重特異性抗体溶液、５０ｍＬのＦＶＩＩＩ欠乏血漿（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ）、および５０ｍＬのａＰＴＴ試薬（Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ）の混合物を、３７℃で３分間加温した。５０ｍＬの２０ｍＭ  ＣａＣｌ２（Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ）を混合物に添加することによって、凝固反応を開始した。凝固までの期間を測定した。これに使用した装置は、ＣＲ−Ａ（Ａｍｅｌｕｎｇ）に接続されたＫＣ１０Ａ（Ａｍｅｌｕｎｇ）であった。
【０３１５】
続いて、最高の凝固時間短縮効果を示した二重特異性抗体に対する濃度依存性を決定した。
【０３１６】
実施例１１：初期スクリーニングの要約
Ｎ１２８Ｈ  ＦＩＸ結合アームを含む二重特異性抗体は、他の大半の二重特異性分子よりもＦＸａｓｅアッセイにおいて劇的に活性が高く、Ｎ１２８Ｈ  ＦＩＸ結合アームは、幅広いＦＸ結合アームと活性な二重特異性分子を形成する能力を示した。図８。
【０３１７】
実施例１２：Ｎ１２８Ｈ変異体の生成
それぞれＮ１２８ＨおよびＮ１２８Ｌと指定される重鎖および軽鎖可変ドメインを有する抗ＦＩＸ抗体「Ｎ１２８」を、さらなる評価および最適化のために選択した。Ｎ１２８Ｈ ＣＤＲ３（配列番号３）は、ＩＭＧＴ残基位置１１０、１１１、１１１．１、および１１２．１のそれぞれにおいて、一連の４つのセリン残基を含む。各Ｓｅｒを、他の全ての天然型アミノ酸に個々に変異させ、図９に要約されるように、Ｎ１２８Ｈ  ＨＣＤＲ３において変異を生成した。
【０３１８】
この作業は、Ｎ１２８ ＦＩＸａ結合アームの変異体を含む一連の二重特異性抗体を製造し、以下に対するＦＩＸａ結合アームのさらなる可能性を研究する基礎を提供した。
１）第ＩＸａ因子を第Ｘ因子に理想的に近接させること。
２）第ＩＸａ因子の触媒活性を最大化するように第ＩＸａ因子を方向付けること。
【０３１９】
以下に報告されるように、Ｎ１２８と比較してＨＣＤＲ３において単一点変異を有するＦＩＸａ結合アームを各々含む二重特異性抗体を、哺乳動物細胞において発現させ、プロテインＡによって精製し（例１３）、機能的に特徴付けた（実施例１４）。次いで、Ｎ１２８Ｈアームを有する二重特異性抗体よりも優れた活性を示す選択された二重特異性抗体をさらに分析して、それらの結合特性および生物学的活性を確認した（実施例１５〜１８）。
【０３２０】
実施例１３：機能アッセイのための抗体の発現および精製
後続の実施例に記載される実験に使用するための抗体（単一特異性および二重特異性）の調製に、以下の手順を使用した。
【０３２１】
発現：
抗体を、ヒト（Ｅｘｐｉ２９３）細胞において一過性に発現させ、次いで、細胞培養上清から精製した。
【０３２２】
遺伝子導入の前日、Ｅｘｐｉ２９３細胞を自動細胞カウンター（Ｅｖｅ細胞カウンター）によって集計し、予め加温した発現培地に約１．７×１０６個／ｍＬの密度で播種し、オービタルシェーカーインキュベーター（３７°Ｃ、８％  ＣＯ２、１４０ｒｐｍ）で一晩インキュベートした。
【０３２３】
遺伝子導入の日に、細胞を集計し、細胞数を２．５×１０６細胞／ｍＬに調節した。２０００μＬの細胞懸濁液を２４個のディープウェルプレートに分注し、Ｋｕｈｎｅｒ振盪インキュベーター（３７°Ｃ、８％  ＣＯ２、２２５ｒｐｍ）に配置した。
【０３２４】
ＤＮＡ溶液を調製した。Ｅｘｐｉ２９３細胞の各遺伝子導入に、超純水で希釈した２μｇのＤＮＡプラスミド混合物を使用した。
【０３２５】
二重特異性抗体の場合、４種類のプラスミドＤＮＡを含む混合溶液を調製した。２ｍＬの細胞培養に対して、５００ｎｇのＮｎ−ＩｇＧ４ｒａ、Ｎｎ−ＩｇＬ（またはＩｇＫ）、Ｔｎ−ＩｇＧ４γｂ、およびＴｎ−ＩｇＬ（またはＩｇＫ）の各々を使用した。単一特異性抗体の場合、２ｍＬの細胞培養に対して、１μｇのＮｎ−ＩｇＧ４ＰＥおよびＮｎ−ＩｇＬ（もしくはＩｇＫ）、またはＴｎ−ＩｇＧ４ＰＥおよびＴｎ−ＩｇＬ（もしくはＩｇＫ）の各々を使用した。
【０３２６】
単一特異性または二重特異性抗体をコードするＤＮＡを同じ手順でトランスフェクトした。遺伝子導入用に２つの混合物を調製した。
混合物１：４０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ培地で希釈した２μｇのプラスミドＤＮＡ。
混合物２：８０μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３遺伝子導入試薬＋４０μＬのＯｐｔｉＭＥＭ  Ｉ培地。
混合物２を混合物１と組み合わせ、室温で２０〜３０分間インキュベートした。インキュベーションが完了した後、１６５μＬのＤＮＡ−ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３試薬複合体を２４ディープウェルプレートの各ウェルに分注した。細胞をＫｕｈｎｅｒ振盪インキュベーター（３７℃、８％  ＣＯ２、２２５ｒｐｍ）で６日間インキュベートした。遺伝子導入の６日後に細胞培養上清を収集した。
【０３２７】
精製：
９６ウェルプレート精製を用いて、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞培養上清から抗体（二重特異性または単一特異性）を精製した。この方法により、抗体スクリーニング実験における複数の試料の迅速な小規模親和性抗体精製が可能になる。高い回収率を達成するために、非常に動的な結合活性（６０ｍｇのヒトＩｇＧ／ｍＬ培地）、滞留時間の延長、アルカリ耐性、および低リガンド漏出を伴うプロテインＡ親和性であるＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ ＬＸを使用した。
【０３２８】
手順
１．ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ ＬＸ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を１×ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）で平衡化して、保存緩衝液を除去し、１０％スラリーの最終濃度にした。
２．６００μＬの１０％スラリーを９６ウェルプレートＡｃｒｏＰｒｅｐ（商標）Ａｄｖａｎｃｅ（Ｐａｌｌ）の各ウェルに添加する。
３．樹脂を４℃で１分間、７０×ｒｃｆで遠心分離した。
４．樹脂を１分間７０×ｒｃｆのスピンで、３００μＬの１×ＰＢＳで洗浄した。このステップを２回繰り返した。
５．２ｍＬの細胞培養上清（ｐＨ７〜８）を９６ウェル精製プレート内のＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ Ｌｘ樹脂上に装填し、７０〜１００×ｒｃｆで１分間遠心分離した。
６．６００μＬの１×ＰＢＳを使用してプレートを洗浄し、７０〜１００×ｒｃｆで１分間遠心分離した。このステップを合計４回実施する。
７．７０μＬの溶出緩衝液（ＩｇＧ Ｅｌｕｔｅ Ｐｉｅｒｃｅ）を各ウェルに添加し、１分間インキュベートした。
８．溶出液を収集するために、プレートを７０〜１００×ｒｃｆで１分間遠心分離した。このステップを合計２回実施する。
【０３２９】
実施例１４：Ｎ１２８Ｈ ＣＤＲ３変異体の機能分析
実施例１２に従って新たに生成された二重特異性抗体の機能的活性を、インビトロ発色第Ｘ因子活性化（ＦＸａｓｅ）アッセイおよび血漿凝固アッセイ（前述）を使用して決定した。変異体の比較を標準化するために、全てのＦＩＸａ結合アーム（Ｎ１２８ ＶＬと対になった変異体ＶＨ）を同じＦＸ結合アームでヘテロ二量体化した。
【０３３０】
ＣＤＲＨ３の突然変異誘発分析から、Ｎ１２８Ｈ ＣＤＲ３の一連の４つのセリンの３番目のセリン残基が、ＦＶＩＩＩ模倣活性に実質的に寄与するように思われることが注目された。際立って、この位置におけるいくつかの配列変動は、元のＮ１２８ ＦＩＸ結合アームと比較して、二重特異性抗体のＦＶＩＩＩ模倣活性を大幅に改善した（図１０）。特に、Ｎ１２８Ｈ ＣＤＲ３の３番目のセリンがイソロイシン、ロイシン、およびバリンのそれぞれによって置換された変異体Ｎ４３６Ｈ、Ｎ４３８Ｈ、およびＮ４４５Ｈ（図９）は、ＦＸａｓｅ活性の劇的な増加（約２〜３倍）を示した。ＦＸａｓｅ活性の有意な増加は、Ｎ４３５Ｈ、Ｎ４３７Ｈ、Ｎ４４２Ｈ、Ｎ４４３Ｈ、およびＮ４４６Ｈ変異体でも観察され、３番目のセリンがヒスチジン、リジン、グルタミン、アルギニン、およびトリプトファンのそれぞれに変異した。突然変異誘発分析はまた、この位置におけるＨＣＤＲ３の特定のアミノ酸の置換により、元の抗ＦＩＸアームＮ１２８Ｈと比較して、二重特異性抗体のＦＸａｓｅ活性が減少したことも明らかにした。変異体Ｎ４３０Ｈ（Ｃｙｓ）、Ｎ４４１Ｈ（Ｐｒｏ）、Ｎ４４７Ｈ（Ｔｙｒ）のテナーゼ活性も同様に、この位置における残基の重要性を示す。
【０３３１】
（Ｓｅｒ）４モチーフの他の位置においてセリンをある特定のアミノ酸で置換することも、中でも注目すべきは変異体Ｎ４５９Ｈ（４番目のＳｅｒからＰｒｏ）、Ｎ４６１Ｈ（４番目のＳｅｒからＡｒｇ）、Ｎ４６５Ｈ（４番目のＳｅｒからＴｙｒ）、Ｎ４７０Ｈ（１番目のＳｅｒからＰｈｅ）、Ｎ４７８Ｈ（１番目のＳｅｒからＰｒｏ）、Ｎ４８０Ｈ（１番目のＳｅｒからＡｒｇ）、Ｎ４９５Ｈ（２番目のＳｅｒからＡｓｎ）において、元の抗ＦＩＸアームと比較して活性を低減した。
【０３３２】
図１１中、Ｎ１２８Ｈ変異体のテナーゼ活性（４０５ｎｍでの吸光度として）を、凝固時間（秒でのａＰＴＴ）に対してプロットする。Ｎ１２８Ｈ変異体のＦＶＩＩＩ模倣活性を、二重特異性抗体ＡｂＥおよびＩＳＴＣと比較する。アイソタイプ対照（陰性対照、ＩＳＴＣ）は、高いａＰＴＴ値によって示されるように、テナーゼ活性がなく、血餅を形成する能力が不十分であることを示した。Ｎ４３６Ｈ、Ｎ４３８Ｈ、およびＮ４４５Ｈ変異体は、ＦＸａを生成し、ＦＶＩＩＩ免疫枯渇血漿の凝固を迅速に引き起こす（低いａＰＴＴ値、約３０秒）、強力な能力（高いＯＤ４０５値）を示した。
【０３３３】
これらの機能データを考慮すると、ＨＣＤＲ３の連続的ＩＭＧＴ位置１１０、１１１、１１１．１、および１１２．１の残基に対して、コンセンサス配列が生成され得る（表９Ａを参照されたい）。ＩＭＧＴ位置１１１．１（Ｎ１２８Ｈの３番目のＳｅｒに対応）を考慮すると、疎水性残基（例えば、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ）または正に荷電した残基（例えば、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ）が強力な機能活性と関連していた。活性を失うことなく（かつ潜在的に改善された活性を有して）この位置で置換され得る他の残基には、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、およびＭｅｔが含まれた。
【０３３４】
上記のスクリーニングで最も高い活性を示す二重特異性抗体のＦＩＸａ結合アームを、以下の実施例で報告されるように、さらなる特徴付けのために選択した。
【０３３５】
実施例１５．精製された抗ＦＩＸ抗体のＳＰＲ分析
ＳＰＲを使用して、ＦＩＸに対するＦＩＸａ結合アームの結合親和性（Ｋｄ）、反応速度定数オンレート（ｋon）およびオフレート（ｋoff）を決定した。Ｂｉａｃｏｒｅ  ８Ｋ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）システムを使用して分析を実施した。
【０３３６】
製造業者の説明書に従って、抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体をＣＭ４チップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅカタログ番号ＢＲ１００５３４）上に固定した。アミンカップリングキット（ＢｉｏＲａｄ）を使用して、チップの表面を活性化した。その後、表面を１Ｍエタノールアミンでブロックした。ＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％ポリソルベート２０  ｐＨ７．６）を固定化泳動用緩衝液として使用して、２５°Ｃで固定化実験を実施した。
【０３３７】
実施例１３からの精製された単一特異性抗体（リガンドと呼ばれる）を、約２μｇ／ｍＬで抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ ＣＭ４表面上で捕捉した。リガンドを、８つ全ての流動チャネルの全ての活性チャネルに１０μＬ／分で６０秒間注入した。中性ｐＨ（ｐＨ７．４）ＨＢＳ−Ｐ  １Ｘ（０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％ポリソルベート２０  ｐＨ７．６）＋ＣａＣｌ２  ２．５ｍＭを泳動用緩衝液として使用して、実験を２５°Ｃで実施した。ヒト第ＩＸ因子（ＦＩＸ）（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓカタログ番号ＨＦＩＸ ４７０６４）を、泳動用緩衝液中に１ｍｇ／ｍＬ（ＭＷ約５５ＫＤａ）で再構成し、検体として使用した。第ＩＸ因子を、複数サイクル反応速度（ＭＣＫ）モードで、３つの濃度（１．５μＭ、５００μＭ、および１６６．７ｎＭ）において、１２０秒の会合相および２００秒の解離相を用いて、活性チャネルおよび参照チャネルの両方において流速３０μＬ／秒で注入した。１０μＬ／分で６０秒間、１０ｍＭグリシンｐＨ１．５の３回の注射を再生相に使用した。
【０３３８】
アイソタイプ対照（ＩＳＴＣ）抗体ｈＩｇＧ４ＰＥを、参照チャネルにおいて１０μＬ／分で６０秒間、１μｇ／ｍＬで捕捉した。ｈＩｇＧ４ＰＥ ＩＳＴＣおよびｈＩｇＧ１ ＩＳＴＣも、陰性対照として活性チャネルで捕捉した。抗ＦＩＸ単一特異性抗体ＡｂＮを比較のために含んだ。
【０３３９】
データを参照し、緩衝液を差し引き、Ｌａｎｇｍｕｉｒ １：１モデルに適合した。モデルにおいて、解離の最初の３０秒を評価した。
【０３４０】
結果：
分析した抗ＦＩＸ抗体は、表１に示される親和性でのＦＩＸへの結合、ならびにＦＩＸの高速結合（ｋon）および解離（ｋoff）速度を示した。ＩＳＴＣではＦＩＸへの結合は観察されなかった。分析した抗ＦＩＸ抗体は、ＡｂＮと比較してＦＩＸに対して約１０倍高い親和性を示した。
【表１】
2020524510.tif 000002
表１．抗ＦＩＸ抗体の結合親和性ならびに反応速度定数結合速度定数（ｋon）および解離速度定数（ｋoff）。相互作用の結合および解離データを、生体分子反応モデル（１：１  Ｌａｎｇｍｕｉｒモデル）を使用して適合した。結合速度定数（ｋon）、解離速度定数（ｋoff）、および解離定数（ＫＤ）の値を、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアによって結合データから計算した。「ＮＢ」＝結合は観察されず。
【０３４１】
このアッセイがＦＩＸａではなくＦＩＸを使用したため、ここでの反応速度データは、ＦＩＸとの結合アームの相互作用の親和性を指す。ＦＩＸとＦＩＸａとの間の密接な構造的類似性を考慮して、ＦＩＸａに結合するための抗体の親和性は、ＦＩＸに結合するためのそれらの親和性に類似し得る。
【０３４２】
実施例１６．精製された抗ＦＸ抗体のＳＰＲ分析
ＳＰＲを使用して、ＦＸに対するＦＸ結合アームの結合親和性（Ｋｄ）、反応速度定数結合速度定数（ｋon）および解離速度定数（ｋoff）を決定した。Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）システムを使用して分析を実施した。
【０３４３】
製造業者の説明書に従って、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体をＣＭ５チップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅカタログ番号２９１０４９８８）上に固定した。アミンカップリングキット（ＢｉｏＲａｄ）を使用して、チップの表面を活性化した。その後、表面を１Ｍエタノールアミンでブロックした。ＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％ポリソルベート２０  ｐＨ７．６）を固定化泳動用緩衝液として使用して、２５°Ｃで固定化実験を実施した。
【０３４４】
実施例１３からの精製された単一特異性抗体（リガンドと呼ばれる）を、約１μｇ／ｍＬで抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ ＣＭ５表面上で捕捉した。リガンドを、８つ全ての流動セルの８つ全ての活性チャネルに１０μＬ／分で６０秒間注入した。中性ｐＨ（ｐＨ７．４）ＨＢＳ−Ｐ １Ｘ（０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％ポリソルベート２０  ｐＨ７．６）＋ＣａＣｌ２  ２．５ｍＭを泳動用緩衝液として使用して、実験を２５°Ｃで実施した。
【０３４５】
ヒト第Ｘ因子（ＦＸ）（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓカタログ番号ＨＦＸ１０１０）を、１ｍｇ／ｍＬ（ＭＷ約５８ＫＤａ）で再構成し、検体として使用した。第Ｘ因子を、複数サイクル反応速度（ＭＣＫ）モードで、３つの濃度（１．５μＭ、３７５ｎＭ、および９３．７５ｎＭ）において、１２０秒の結合相および３００秒の解離相を用いて、活性チャネルおよび参照チャネルの両方において流速３０μＬ／秒で注入した。１０ｕＬ／分で６０秒間、１０ｍＭグリシンｐＨ１．５の３回の注射を再生相に使用した。
【０３４６】
ｈＩｇＧ４ＰＥ  ＩＳＴＣを陰性対照として活性チャネルで捕獲した。抗ＦＸ単一特異性抗体ＡｂＴを比較のために含んだ。
【０３４７】
データを参照し、バッファーを差し引いて、Ｌａｎｇｍｕｉｒ １：１モデルに適合した。モデルにおいて、解離の最初の３０秒を評価した。
【０３４８】
結果：
分析した抗ＦＸ抗体は、表２に示される親和性でのＦＸへの結合、ならびにＦＸの高速結合（ｋon）および解離（ｋoff）速度を示した。ＩＳＴＣではＦＸへの結合は観察されなかった。
【０３４９】
分析した抗ＦＸ抗体は、ＡｂＴと比較して約１０倍〜１０００倍高いＦＸへの結合親和性を示した。抗体Ｔ１４（ＶＨドメインＴ１４Ｈ、ＶＬドメインＴ１４Ｌ）は、ＦＸに対して約０．１８μＭの親和性を有した。Ｔ１４と同様の配列を有する免疫化マウスから同定された２つの他の抗ＦＸ抗体ＶＨドメイン、Ｔ１９ＨおよびＴ２０Ｈを、比較のためにＴ１４  ＶＬドメインと対にした。これらは、それぞれ約０．２および０．０５μＭのＫＤでＦＸに結合した。他の試験した抗ＦＸ抗体、Ｔ１５、Ｔ２３、およびＴ２５は、ナノモル範囲のＫＤを有した。
【表２】
2020524510.tif 000003
表２．抗ＦＸ抗体の結合親和性ならびに反応速度定数結合速度定数（ｋon）および解離速度定数（ｋoff）。相互作用の結合および解離データを、生体分子反応モデル（１：１ Ｌａｎｇｍｕｉｒモデル）を使用して適合した。結合速度定数（ｋon）、解離速度定数（ｋoff）、および解離定数（ＫＤ）の値を、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアによって結合データから計算した。「ＮＢ」＝結合は観察されず。
【０３５０】
実施例１７：幅広いＦＸ結合アームと対になったＦＩＸ結合アームＮ４３６を用いたテナーゼ（ＦＸａｓｅ）アッセイ
第Ｘ因子の第ＩＸａ因子活性化を触媒する、異なる第Ｘ因子アームでヘテロ二量体化されたＮ４３６Ｈ＿ＩｇＧ４＿ｒａ第ＩＸ因子抗体アームの能力を、ヒト血漿から精製された凝固因子を使用するインビトロテナーゼ（ＦＸａｓｅ）アッセイを使用して決定した。
【０３５１】
最初のスクリーニングに使用されるＦＸａｓｅアッセイプロトコル（実施例９を参照されたい）を、本実験のために改良し、（細胞上清ではなく）プロテインＡによって精製された二重特異性抗体を使用した。第ＩＸ因子および第ＸＩａ因子ではなく、予め活性化された第ＩＸａ因子をこの更新されたアッセイプロトコルに追加し、アッセイ混合物を添加する前に、ＦＩＸを抗体溶液で予めインキュベートしなかった。３７℃でのインキュベーションを１時間から１０分に短縮した。
【０３５２】
簡潔に、この方法は以下のとおりであり、特に明記しない限り、全ての反応を３７℃で実施した。
【０３５３】
組換え発現した抗体を、実施例１３に記載されるように、プロテインＡを使用して組換えＥｘｐｉ２９３細胞からの上清から精製した。
【０３５４】
５μＬの精製組換え抗体をアッセイプレートの各ウェルに添加した。１．５μＬのＦＩＸａ（１μｇ／ｍＬ）、５μＬのＦＸ（５０μｇ／ｍＬ）、０．０５μＬのリン脂質（１０ｍｇ／ｍＬ）、および１３．４５μＬのＴＢＳＢ−Ｓ緩衝液の混合物を各ウェルに添加して、酵素反応（ＦＩＸａを生成するためのＦＸのＦＸａ開裂）を開始し、３７°Ｃで１０分間インキュベートした。１０分後、５μＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡを添加することによって反応を終了した。１０μＬのＳ２７６５基質溶液を各ウェルに添加した後、４０５ｎｍ（参照波長６５５ｎｍ）での吸光度を２５分間測定した（５分毎に１回読み取り）。
【０３５５】
Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ  Ｓ−２７６５は、活性化された第Ｘ因子の生成を決定するために使用される発色基質である。第Ｘａ因子は、Ｓ２７６５を開裂し、発色団ｐ−ニトロアニリン（ｐＮＡ）を放出し、４０５ｎｍで測光的に監視され得る色の変化をもたらす。４０５ｎｍでの吸光度の読み取り値は、生成された第Ｘａ因子の量に比例する。図７は、アッセイの原理を示す。
【０３５６】
このアッセイで試験した二重特異性抗体は、Ｎ４３６ＨのＶＨドメインおよびＮ１２８ＬのＶＬドメインを含むＦＩＸ結合アームを有した。これらを、それぞれ重鎖および軽鎖構築物Ｎ４３６Ｈ＿ＩｇＧ４＿ｒａおよびＮ１２８Ｌ＿ＩｇＬとして発現し、ＦＸ結合アームを提供する以下の重鎖および軽鎖構築物とヘテロ二量体化した。
Ｔ０２Ｈ＿ＩｇＧ４ｒｂ＋Ｔ０２Ｌ＿ＩｇＬ；
Ｔ０５Ｈ＿ＩｇＧ４ｒｂ＋Ｔ０５Ｌ＿ＩｇＬ；または
Ｔ１４Ｈ＿ＩｇＧ４ｒｂ＋Ｔ１４Ｌ＿ＩｇＫ。
【０３５７】
参考のために、陽性対照ＦＩＸ−ＦＸ二重特異性抗体（Ａｂ＿Ｅ）およびアイソタイプ対照（ＩＳＴＣ）も含んだ。
【０３５８】
結果が図１２に示される。
【０３５９】
Ｎ４３６Ｈ＿ＩｇＧ４ｒａ、Ｎ１２８Ｌ＿ＩｇＬは、Ｔ０２Ｈ＿ＩｇＧ４ｒｂ＋Ｔ０２Ｌ＿ＩｇＬ、Ｔ０５Ｈ＿ＩｇＧ４ｒｂ＋Ｔ０５Ｌ＿ＩｇＬ、またはＴ１４Ｈ＿ＩｇＧ４ｒｂ＋Ｔ１４Ｌ＿ＩｇＫのいずれかとヘテロ二量体化された二重特異性抗体として、ＦＸａｓｅ活性の用量依存的増加を実証した。観察されたＦＸ活性化は、二重特異性抗体Ａｂ＿Ｅに匹敵した。Ｎ４３６Ｈ＿ＩｇＧ４ｒａ、Ｎ１２８Ｌ＿ＩｇＬは、抗第Ｘ因子アームの非存在下で単独で発現したが、レベルは低下したにもかかわらず依然として第Ｘ因子を活性化することが可能であった。アイソタイプ対照は、ＦＸａｓｅ活性を実証しなかった。
【０３６０】
実施例１８：幅広いＦＸ結合アームと対になったＦＩＸ結合アームＮ４３６を用いた血漿凝固（ａＰＴＴ）アッセイ
この血漿凝固アッセイでは、写真−光学凝固システムを使用してａＰＴＴ測定値を得る。血餅が形成されると、試料を通過することが可能な光の量が減少する。この減少を時間の関数としてプロットし、波形が生成される。いったんフィブリン血餅が形成されると、凝固反応が終点まで完了し、凝固時間が自動的に計算される。本ａＰＴＴアッセイで使用される血漿は、ＦＶＩＩＩを欠乏しているため、ＦＩＸ−ＦＸ二重特異性抗体の添加効果は、凝固カスケードにおいてＦＶＩＩＩの代わりになるその能力によって測定可能である。二重特異性抗体の存在下での凝固時間は、陰性対照およびＦＶＩＩＩの存在下での凝固時間と比較され得る。
【０３６１】
様々な濃度を有する５μＬの二重特異性抗体溶液、２０μＬのＦＶＩＩＩ欠乏ヒト血漿（Ｈｅｌｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、および２５μＬのＳｉ Ｌ Ｍｉｎｕｓ ａＰＴＴ試薬（Ｈｅｌｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の混合物を、３７℃で２分間加温した。２５μＬの２０ｍＭ  ＣａＣｌ２（Ｈｅｌｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を混合物に添加することによって、凝固反応を開始した。凝固までの期間を測定した。これに使用した装置は、半自動凝固計、特にＣシリーズ写真−光学凝固システム（Ｈｅｌｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）であった。ａＰＴＴ試薬は、リン脂質および接触活性剤（ほぼコロイド状の粒子活性剤、すなわち、マグネシウム−アルミニウム−ケイ酸塩）を含み、これは、内因性血液凝固カスケードの「表面接触」活性化を提供する（参照のために図１を参照されたい）。続いて、最高の凝固時間短縮効果を示した二重特異性抗体に対する濃度依存性を決定した。
【０３６２】
結果が図１３に示される。ＦＶＩＩＩ枯渇ヒト血漿Ｎ４３６Ｈ＿ＩｇＧ４ｒａ、Ｎ１２８Ｌ＿ＩｇＬを使用したこの一段階ａＰＴＴ凝固アッセイは、Ｔ０２Ｈ＿ＩｇＧ４ｒｂ＋Ｔ０２Ｌ＿ＩｇＬ、Ｔ０５Ｈ＿ＩｇＧ４ｒｂ＋Ｔ０５Ｌ＿ＩｇＬ、またはＴ１４Ｈ＿ＩｇＧ４ｒｂ＋Ｔ１４Ｌ＿ＩｇＫのいずれかとヘテロ二量体化された二重特異性抗体として、ａＰＴＴ時間の用量依存的短縮を実証した。ａＰＴＴ時間の用量依存的短縮は、Ａｂ＿Ｅに匹敵した。アイソタイプ対照では、ａＰＴＴの短縮は観察されなかった。
【０３６３】
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【０３６４】
ＦＩＸａ結合アームポリペプチド配列
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
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【表３−５】
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【表３−６】
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【表３−７】
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【表３−８】
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【表３−９】
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【表３−１０】
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【表３−１１】
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【表３−１２】
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【表３−１３】
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【表３−１４】
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【表３−１５】
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【表３−１６】
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【表３−１７】
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【表３−１８】
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【表３−１９】
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【表３−２３】
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【表３−２７】
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【表３−２８】
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【表３−２９】
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【表３−３０】
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【表３−３１】
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【表３−３２】
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【表３−３３】
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【表３−３４】
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【表４−１】
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【表４−２】
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【表５】
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【表６】
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【表７−１】
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【表７−２】
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【表７−３】
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【表７−４】
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【表８−１】
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【表８−２】
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【表８−３】
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【表９】
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【表１０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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