(57)【要約】本発明は、抗ＣＡ−ＩＸ抗体を用いた免疫捕捉による腫瘍由来エクソソームの単離方法、そのような単離されたエクソソームから腫瘍に関連する核酸配列を定量化する方法、および対象における腫瘍の存在をインビトロで判定する方法に関する。本発明はまた、これらの方法における使用のためのキットに関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＣＡ−ＩＸ抗体を用いて生体液の試料からエクソソームを捕捉することを含む、生体液から腫瘍由来エクソソームをインビトロで単離する方法。
【請求項２】
以下を含む、生体液から腫瘍に関連する核酸配列をインビトロで定量化する方法：
ａ）抗ＣＡ−ＩＸ抗体を用いて該生体液の試料からエクソソームを捕捉する工程、および
ｂ）工程ａ）において捕捉されたエクソソーム中に存在する腫瘍に関連する核酸配列のレベルを検出する工程。
【請求項３】
以下を含む、対象における腫瘍の存在をインビトロで判定する方法：
ａ）抗ＣＡ−ＩＸ抗体を用いて対象由来の生体液試料からエクソソームを捕捉する工程、
ｂ）工程ａ）において単離されたエクソソーム中に存在する腫瘍に関連する核酸配列のレベルを決定する工程、および
ｃ）工程ｂ）において決定された腫瘍に関連する核酸配列のレベルを１以上の参照値と比較する工程。
【請求項４】
腫瘍が、肺がん、乳がん、膀胱がん、腎がん、前立腺がん、大腸がん、胃がん、卵巣がん、および黒色腫のリストから選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
腫瘍に関連する核酸配列が、二本鎖ＤＮＡ配列、一本鎖ＤＮＡ配列、およびＲＮＡ配列のリストから選択される、請求項２または３に記載の方法。
【請求項６】
二本鎖ＤＮＡの腫瘍に関連する核酸配列が、ＢＲＡＦ遺伝子、ＫＲＡＳ遺伝子、ＮＲＡＳ遺伝子、ＥＧＦＲ遺伝子、およびＡＲ遺伝子からなる群から選択される標的遺伝子由来の野生型配列である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
二本鎖ＤＮＡの腫瘍に関連する核酸配列が、ＢＲＡＦ遺伝子、ＫＲＡＳ遺伝子、ＮＲＡＳ遺伝子、ＥＧＦＲ遺伝子、およびＡＲ遺伝子からなる群から選択される標的遺伝子由来の変異型配列である、請求項５記載の方法。
【請求項８】
変異型配列が、増幅、点変異、欠失および挿入のリストから選択される、請求項７記載の方法。
【請求項９】
二本鎖ＤＮＡの腫瘍に関連する核酸配列が、ＷＴ ＢＲＡＦ遺伝子増幅物、ＢＲＡＦ遺伝子点変異、ＷＴ ＫＲＡＳ遺伝子増幅物、ＫＲＡＳ遺伝子点変異、ＷＴ ＮＲＡＳ遺伝子増幅物、ＮＲＡＳ遺伝子点変異、ＷＴ ｃＭｙｃ遺伝子増幅物、ＷＴ ＥＧＦＲ遺伝子増幅物、ＥＧＦＲ遺伝子点変異、ＥＧＦＲ遺伝子欠失、ＥＧＦＲ遺伝子挿入、ＷＴ ＡＲ遺伝子、およびＡＲ遺伝子点変異のリストから選択される、請求項５記載の方法。
【請求項１０】
一本鎖ＤＮＡの腫瘍に関連する核酸配列が、ＷＴ ｃＭｙｃ遺伝子増幅物、長鎖散在反復配列（ＬＩＮＥ）レトロトランスポゾン、短鎖散在反復配列（ＳＩＮＥ）レトロトランスポゾン、およびヒト内在性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）レトロトランスポゾンのリストから選択される、請求項５記載の方法。
【請求項１１】
ＲＮＡ配列が、ＷＴ ｃＭｙｃ ｍＲＮＡ、ＬＩＮＥ ｍＲＮＡ、ＳＩＮＥ ｍＲＮＡ、ＨＥＲＶ ｍＲＮＡ、ＷＴアンドロゲン受容体（ＡＲ）ｍＲＮＡ、およびＡＲ遺伝子スプライシングバリアントｍＲＮＡのリストから選択される、請求項５記載の方法。
【請求項１２】
生体液が、血液、血漿、血清、尿および唾液のリストから選択される、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
生体液からの腫瘍由来エクソソームの単離における使用のためのキットであって、抗ＣＡ−ＩＸ抗体を含むキット。
【請求項１４】
生体液由来のエクソソーム中の腫瘍に関連する核酸配列の定量化における使用のためのキットであって、抗ＣＡ−ＩＸ抗体を含むキット。
【請求項１５】
生体液から単離されたエクソソームから対象における腫瘍の存在をインビトロで判定することにおける使用のためのキットであって、抗ＣＡ−ＩＸ抗体を含むキット。
【請求項１６】
腫瘍に関連する核酸配列を対象とする１組のプライマーをさらに含む、請求項１４または１５に記載のキット。
【請求項１７】
腫瘍が、肺がん、乳がん、膀胱がん、腎がん、前立腺がん、大腸がん、胃がん、卵巣がん、および黒色腫のリストから選択される、請求項１３〜１６のいずれかに記載のキット。
【請求項１８】
生体液が、血液、血漿、血清、尿および唾液のリストから選択される、請求項１３〜１７のいずれかに記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ＣＡ−ＩＸ抗体を用いた免疫捕捉による腫瘍由来エクソソームの単離方法、そのような単離されたエクソソームから腫瘍に関連する核酸配列を定量化する方法、および対象における腫瘍の存在をインビトロで判定する方法に関する。本発明はまた、これらの方法における使用のためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
エクソソームは、エンドサイトーシスを起源とする直径３０〜１００ｎｍの膜小胞である。エクソソームは、タンパク質および核酸配列の組成が親細胞の種類および状態を反映するように、精密に調節され、機能的に関連した様式でほとんどすべての細胞種によって産生および放出される天然の細胞外脂質ナノ小胞である。これらの小胞は本質的な安定性および生物学的障壁を通過する能力を有しており、種々の組織から生じたエクソソームは容易にアクセス可能な生体液（血液など）中で見出され得る。その生物学的役割および特徴を考慮すると、エクソソームは細胞および組織の恒常性および代謝の変化の初期の指標と考えられ、新規の疾患関連バイオマーカーの同定および液体生検パラダイムにおける公知の組織マーカーの表示のための魅力的な供給源である。これは、複雑な疾患（がんなど）の診断においてエクソソーム標的アッセイを使用することの主要な根拠および期待である。主な課題は、特定の条件においてエクソソームに関連するマーカーを特定の組織に関連付けること、信頼性が高く、安価で非侵襲性のエクソソーム標的溶液の最適化、ならびに臨床研究および診療において現実的に実施できるアッセイにある。
【０００３】
生物学的試料から腫瘍由来エクソソームを単離でき、腫瘍に関連する核酸配列（ＢＲＡＦ遺伝子の点変異であるＢＲＡＦＶ６００Ｅ、ＢＲＡＦＶ６００Ｋ、ＢＲＡＦＶ６００Ｒ、ＢＲＡＦＶ６００ＭおよびＢＲＡＦＶ６００Ｄ、野生型（ＷＴ）ＢＲＡＦ遺伝子増幅物（４，５）、ＫＲＡＳ遺伝子の点変異（ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｓ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ａ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ、ＫＲＡＳ Ｇ１３Ｄなど）およびＫＲＡＳ ＷＴ遺伝子増幅物（６）、ＮＲＡＳ遺伝子の点変異（ＮＲＡＳ Ｇ１２ＣおよびＮＲＡＳ Ｇ１２Ｄ、ＮＲＡＳ Ｑ６１Ｋ、ＮＲＡＳ Ｑ６１Ｒなど）（７，８）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）遺伝子の点変異（ＥＧＦＲＴ７９０Ｍ、ＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒ、ＥＧＦＲエクソン１９欠失、ＥＧＦＲエクソン２０欠失など）（９，１０）、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子の増幅物および過剰発現（１１，１２）、レトロトランスポゾンＲＮＡ転写物（短鎖散在反復配列（ＳＩＮＥ）および長鎖散在反復配列（ＬＩＮＥ）ならびにヒト内在性レトロウイルス反復配列（ＨＥＲＶ）など）（１２）、アンドロゲン受容体（ＡＲ）遺伝子の点変異（ＡＲ Ｌ７０２Ｈ、ＡＲ Ｗ７４２Ｃ、ＡＲ Ｈ８７５Ｙ、ＡＲ Ｆ８７７Ｌ、ＡＲ Ｔ８７８Ａなど）、スプライシングバリアントＡＲ−Ｖ７ならびにＡＲ ＷＴ遺伝子増幅物（１３−１５）など）を有意義な方法で検出および定量化できる方法および関連するキットを開発する必要がある。
【０００４】
先行技術
炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡ−ＩＸ）は、診断的価値および予後的価値を有する公知の腫瘍バイオマーカーであり、抗がん薬の開発の有望な標的である（１−２）。可溶型のＣＡ−ＩＸは、がん患者の血清中において検出され得る（３）。
【０００５】
ＷＯ２０１２１１５８８５には、エクソソームから測定可能なバイオマーカーとしてＣＡ−ＩＸが挙げられている。Dorai（１６）は、ＣＡ−ＩＸを過剰発現させた場合に、腎がん細胞がエクソソームの排出をどのように増加させるかを記述している。
【０００６】
モノクローナルまたはポリクローナルにかかわらず、様々な種（ヒト、ラットまたはマウスなど）を対象とする抗ＣＡ−ＩＸ抗体が、例えばThermoFisher Scientific Incから市販されている。
【発明の概要】
【０００７】
原文に記載なし。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、一般的な沈殿またはＣＡ−ＩＸを含む様々な抗体を用いた免疫捕捉のいずれかによってＶ６００Ｅ陽性患者の血漿から単離されたエクソソームから測定されたＢＲＡＦおよびＢＲＡＦＶ６００Ｅのレベルを示す。
【０００９】
【図２】図２ＡおよびＢは、抗ＣＡ−ＩＸ抗体を用いた免疫捕捉または一般的な沈殿のいずれかによって健常な患者、大腸がん患者または黒色腫患者の血漿から単離されたエクソソームにおいて測定されたＢＲＡＦ遺伝子のレベルを示す。図２Ｃは、抗ＣＡ−ＩＸ抗体を用いた免疫捕捉または一般的なＥＶ沈殿によって前立腺がん患者の血漿から単離されたエクソソームから測定されるＡＲ Ｔ８７８のアレル頻度を示す。
【００１０】
【図３】図３は、抗ＣＡ−ＩＸ抗体を用いた免疫捕捉または抗ＥＰＣＡＭ抗体を用いた免疫捕捉のいずれかによって健常な患者または大腸がん患者の血漿から単離されたエクソソームにおいて測定されたＢＲＡＦ遺伝子のレベルを示す。
【００１１】
【図４】図４は、抗ＣＡ−ＩＸ抗体を用いた免疫捕捉によって健常な患者または大腸がん患者の血漿から単離されたエクソソームから測定されたＢＲＡＦのレベルのＺスコアを示す。
【００１２】
【図５】図５は、抗ＣＡ−ＩＸ抗体を用いた免疫捕捉によって健常な患者または前立腺がん患者の血漿から単離されたエクソソームから測定されたＢＲＡＦのレベルのＺスコアを示す。
【００１３】
【図６】図６は、抗ＣＡ−ＩＸ抗体を用いた免疫捕捉によって健常な患者または胃がん患者の血漿から単離されたエクソソームから測定されたＢＲＡＦのレベルのＺスコアを示す。
【００１４】
【図７】図７は、抗ＣＡ−ＩＸ抗体を用いた免疫捕捉によって健常な患者または卵巣がん患者の血漿から単離されたエクソソームから測定されたＢＲＡＦのレベルのＺスコアを示す。
【００１５】
【図８】図８は、抗ＣＡ−ＩＸ抗体を用いた免疫捕捉によって健常な患者、大腸がん患者、前立腺肥大症患者または前立腺がん患者の血漿から単離されたエクソソームから測定されたＫＲＡＳのレベルのＺスコアを示す。
【００１６】
【図９】図９は、抗ＣＡ−ＩＸ抗体を用いた免疫捕捉によって健常な患者または肺がん患者の血漿から単離されたエクソソームから測定されたＥＧＦＲのレベルのスコアを示す。
【００１７】
【図１０】図１０は、抗ＣＡ−ＩＸ抗体を用いた免疫捕捉によって健常な患者または肺がん患者の血漿から単離されたエクソソームから測定されたＨＥＲＶ−Ｗのレベルのスコアを示す。
【００１８】
【図１１】図１１は、抗ＣＡ−ＩＸ抗体を用いた免疫捕捉によって健常な患者または肺がん患者の血漿から単離されたエクソソームから測定されたＬＩＮＥのレベルのスコアを示す。
【００１９】
【図１２】図１２は、抗ＣＡ−ＩＸ抗体を用いた免疫捕捉によって健常な患者または肺がん患者の血漿から単離されたエクソソームから測定されたｃ−Ｍｙｃのレベルのスコアを示す。
【００２０】
【図１３】図１３は、抗ＣＡ−ＩＸ抗体を用いた免疫捕捉によって健常な患者または乳がん患者の血漿から単離されたエクソソームから測定されたＨＥＲＶ−Ｗのレベルのスコアを示す。
【００２１】
【図１４】図１４は、抗ＣＡ−ＩＸ抗体を用いた免疫捕捉によって健常な患者または乳がん患者の血漿から単離されたエクソソームから測定されたＬＩＮＥのレベルのスコアを示す。
【００２２】
【図１５】図１５は、抗ＣＡ−ＩＸ抗体を用いた免疫捕捉によって健常な患者または前立腺がん患者の血漿から単離されたエクソソームから測定されたＡＲ−ＷＴのレベルのスコアを示す。
【００２３】
【図１６】図１６は、抗ＣＡ−ＩＸ抗体を用いた免疫捕捉によって健常な患者または前立腺がん患者の血漿から単離されたエクソソームから測定されたＡＲ−Ｔ８７８Ａのレベルのスコアを示す。
【００２４】
【図１７】図１７は、抗ＣＡ−ＩＸ抗体を用いた免疫捕捉によって健常な患者または大腸がん患者の血漿から単離されたエクソソームから測定されたＨＥＲＶ−Ｗのレベルのスコアを示す。
【００２５】
【図１８】図１８は、抗ＣＡ−ＩＸ抗体を用いた免疫捕捉によって健常な患者または大腸がん患者の血漿から単離されたエクソソームから測定されたＬＩＮＥのレベルのスコアを示す。
【００２６】
【図１９】図１９は、抗ＣＡ−ＩＸ抗体を用いた免疫捕捉によって健常な患者または胃がん患者の血漿から単離されたエクソソームから測定されたＨＥＲＶ−Ｗのレベルのスコアを示す。
【００２７】
【図２０】図２０は、抗ＣＡ−ＩＸ抗体を用いた免疫捕捉によって健常な患者または胃がん患者の血漿から単離されたエクソソームから測定されたＬＩＮＥのレベルのスコアを示す。
【００２８】
【図２１】図２１は、抗ＣＡ−ＩＸ抗体を用いた免疫捕捉によって健常な患者または卵巣がん患者の血漿から単離されたエクソソームから測定されたｃ−Ｍｙｃのレベルのスコアを示す。
【００２９】
【図２２】図２２は、抗ＣＡ−ＩＸ抗体を用いた免疫捕捉によって健常な患者または肺がん患者の血漿から単離されたエクソソームから測定されたＨＥＲＶ−Ｗのレベルのスコアを示す。
【００３０】
【図２３】図２３は、抗ＣＡ−ＩＸ抗体を用いた免疫捕捉によって健常な患者または肺がん患者の血漿から単離されたエクソソームから測定されたｃ−Ｍｙｃのレベルのスコアを示す。
【００３１】
【図２４】図２４は、抗ＣＡ−ＩＸ抗体を用いた免疫捕捉によって健常な患者または肺がん患者の血漿から単離されたエクソソームから測定されたＬＩＮＥのレベルのスコアを示す。
【００３２】
【図２５】図２５は、抗ＣＡ−ＩＸ抗体を用いた免疫捕捉によって健常な患者または大腸がん患者の血漿から単離されたエクソソームから測定されたＬＩＮＥのレベルのスコアを示す。
【００３３】
【図２６】図２６は、抗ＣＡ−ＩＸ抗体を用いた免疫捕捉によって健常な患者または大腸がん患者の血漿から単離されたエクソソームから測定されたＥＧＦＲのレベルのスコアを示す。
【００３４】
【図２７】図２７は、抗ＣＡ−ＩＸ抗体を用いた免疫捕捉によって健常な患者または大腸がん患者の血漿から単離されたエクソソームから測定されたＨＥＲＶ−Ｗのレベルのスコアを示す。
【００３５】
【図２８】図２８は、抗ＣＡ−ＩＸ抗体を用いた免疫捕捉によって健常な患者または乳がん患者の血漿から単離されたエクソソームから測定されたＬＩＮＥのレベルのスコアを示す。
【００３６】
【図２９】図２９は、抗ＣＡ−ＩＸ抗体を用いた免疫捕捉によって健常な患者または黒色腫患者の血漿から単離されたエクソソームから測定されたＨＥＲＶ−Ｗのレベルのスコアを示す。
【００３７】
【図３０】図３０は、抗ＣＡ−ＩＸ抗体を用いた免疫捕捉によって健常な患者または卵巣がん患者の血漿から単離されたエクソソームから測定されたＨＥＲＶ−Ｗのレベルのスコアを示す。
【００３８】
【図３１】図３１は、抗ＣＡ−ＩＸ抗体を用いた免疫捕捉によって健常な患者または前立腺がん患者の血漿から単離されたエクソソームから測定されたＡＲ−ＷＴのレベルのスコアを示す。
【００３９】
【図３２】図３２は、抗ＣＡ−ＩＸ抗体を用いた免疫捕捉によって健常な患者または前立腺がん患者の血漿から単離されたエクソソームから測定されたＡＲ−Ｖ７のレベルのスコアを示す。
【００４０】
【図３３】図３３は、抗ＣＡ−ＩＸ抗体を用いた免疫捕捉によって健常な患者または膀胱がん患者の尿から単離されたエクソソームから測定されたＬＩＮＥのレベルのスコアを示す。
【００４１】
【図３４】図３４は、抗ＣＡ−ＩＸ抗体を用いた免疫捕捉によって健常な患者または膀胱がん患者の尿から単離されたエクソソームから測定されたＨＥＲＶ−Ｗのレベルのスコアを示す。
【００４２】
【図３５】図３５は、抗ＣＡ−ＩＸ抗体を用いた免疫捕捉によって健常な患者または膀胱がん患者の尿から単離されたエクソソームから測定されたｃ−Ｍｙｃのレベルのスコアを示す。
【００４３】
【図３６】図３６は、抗ＣＡ−ＩＸ抗体を用いた免疫捕捉によって健常な患者または膀胱がん患者の尿から単離されたエクソソームから測定されたＬＩＮＥのレベルのスコアを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
本発明者らは驚くべきことに、抗ＣＡ−ＩＸ抗体を用いて生体液からエクソソームを捕捉した場合、腫瘍由来エクソソームの単離が可能となることを見出した。
【００４５】
したがって、本発明の第１の態様において、生体液から腫瘍由来エクソソームをインビトロで単離する方法を提供し、該方法は抗ＣＡ−ＩＸ抗体を用いてその生体液の試料からエクソソームを捕捉することを含む。
【００４６】
本発明者らはまた、驚くべきことに、抗ＣＡ−ＩＸ抗体を用いて生体液からエクソソームを捕捉した場合、腫瘍に関連する核酸配列の有意義な検出および定量化が可能となり、腫瘍に冒された患者と腫瘍に冒されていない患者とを判別することが可能となることを見出した。
【００４７】
したがって、本発明の第２の態様において、生体液から腫瘍に関連する核酸配列をインビトロで定量化する方法を提供し、該方法は以下を含む
ａ）抗ＣＡ−ＩＸ抗体を用いて該生体液の試料からエクソソームを捕捉する工程、および
ｂ）工程ａ）において捕捉されたエクソソーム中に存在する腫瘍に関連する核酸配列のレベルを検出する工程。
【００４８】
本発明の第３の態様において、以下を含む、対象における腫瘍の存在をインビトロで判定する方法を提供する
ａ）抗ＣＡ−ＩＸ抗体を用いて対象由来の生体液試料からエクソソームを捕捉する工程、
ｂ）工程ａ）において単離されたエクソソーム中に存在する腫瘍に関連する核酸配列のレベルを決定する工程、および
ｃ）工程ｂ）において決定された腫瘍に関連する核酸配列のレベルを１以上の参照値と比較する工程。
【００４９】
本発明の第４の態様において、生体液からの腫瘍由来エクソソームの単離における使用のためのキットを提供し、該キットは抗ＣＡ−ＩＸ抗体を含む。
【００５０】
本発明の第５の態様において、生体液由来のエクソソーム中の腫瘍に関連する核酸配列の定量化における使用のためのキットを提供し、該キットは抗ＣＡ−ＩＸ抗体を含む。
【００５１】
本発明の第６の態様において、生体液から単離されたエクソソームから対象における腫瘍の存在をインビトロで判定することにおける使用のためのキットを提供し、該キットは抗ＣＡ−ＩＸ抗体を含む。
【００５２】
本発明の第５および６の態様における具体的な実施態様において、該キットは、腫瘍に関連する核酸配列を対象とする１組のプライマーをさらに含む。
【００５３】
あらゆる態様における１つの実施態様において、腫瘍は、肺がん、乳がん、膀胱がん、腎がん、前立腺がん、大腸がん、胃がん、卵巣がん、および黒色腫のリストから選択される。
【００５４】
本発明のあらゆる態様における１つの実施態様において、生体液は、血液、血漿、血清、尿および唾液のリストから選択される。
【００５５】
本発明のあらゆる態様における１つの実施態様において、腫瘍に関連する核酸配列は、二本鎖ＤＮＡ配列、一本鎖ＤＮＡ配列、およびＲＮＡ配列のリストから選択される。
【００５６】
ある実施態様において、二本鎖ＤＮＡの腫瘍に関連する核酸配列は、ＢＲＡＦ遺伝子、ＫＲＡＳ遺伝子、ＮＲＡＳ遺伝子、ＥＧＦＲ遺伝子、およびＡＲ遺伝子からなる群から選択される標的遺伝子由来の野生型配列である。
【００５７】
別の実施態様において、二本鎖ＤＮＡの腫瘍に関連する核酸配列は、ＢＲＡＦ遺伝子、ＫＲＡＳ遺伝子、ＮＲＡＳ遺伝子、ＥＧＦＲ遺伝子、およびＡＲ遺伝子からなる群から選択される標的遺伝子由来の変異型配列である。具体的な実施態様において、変異型配列は、増幅、点変異、欠失および挿入のリストから選択される。
【００５８】
ある実施態様において、二本鎖ＤＮＡの腫瘍に関連する核酸配列は、ＷＴ ＢＲＡＦ遺伝子増幅物、ＢＲＡＦ遺伝子点変異、ＷＴ ＫＲＡＳ遺伝子増幅物、ＫＲＡＳ遺伝子点変異、ＷＴ ＮＲＡＳ遺伝子増幅物、ＮＲＡＳ遺伝子点変異、ＷＴ ｃＭｙｃ遺伝子増幅物、ＷＴ ＥＧＦＲ遺伝子増幅物、ＥＧＦＲ遺伝子点変異、ＥＧＦＲ遺伝子欠失、ＥＧＦＲ遺伝子挿入、ＷＴ ＡＲ遺伝子、およびＡＲ遺伝子点変異のリストから選択される。
【００５９】
ある実施態様において、一本鎖ＤＮＡの腫瘍に関連する核酸配列は、ＷＴ ｃＭｙｃ遺伝子増幅物、長鎖散在反復配列（ＬＩＮＥ）レトロトランスポゾン、短鎖散在反復配列（ＳＩＮＥ）レトロトランスポゾン、およびヒト内在性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）レトロトランスポゾンのリストから選択される。
【００６０】
ある実施態様において、ＨＥＲＶレトロトランスポゾンは、ＨＥＲＶ−Ｈ、ＨＥＲＶ−Ｋ、ＨＥＲＶ−ＣおよびＨＥＲＶ−Ｗのリストから選択される。
【００６１】
ある実施態様において、ＲＮＡ配列は、ＷＴ ｃＭｙｃ ｍＲＮＡ、ＬＩＮＥ ｍＲＮＡ、ＳＩＮＥ ｍＲＮＡ、ＨＥＲＶ ｍＲＮＡ、ＷＴアンドロゲン受容体（ＡＲ）ｍＲＮＡ、およびＡＲ遺伝子スプライシングバリアントｍＲＮＡのリストから選択される。
【００６２】
ある実施態様において、ＨＥＲＶ ｍＲＮＡ配列は、ＨＥＲＶ−Ｈ ｍＲＮＡ、ＨＥＲＶ−Ｋ ｍＲＮＡ、ＨＥＲＶ−Ｃ ｍＲＮＡおよびＨＥＲＶ−Ｗ ｍＲＮＡのリストから選択される。
【００６３】
ある実施態様において、ＢＲＡＦ遺伝子点変異は、ＢＲＡＦ Ｖ６００変異である。具体的な実施態様において、ＢＲＡＦＶ６００変異は、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ、ＢＲＡＦＶ６００Ｋ、ＢＲＡＦＶ６００Ｒ、ＢＲＡＦＶ６００ＭおよびＢＲＡＦＶ６００Ｄのリストから選択される。
【００６４】
ある実施態様において、ＫＲＡＳ遺伝子点変異は、ＫＲＡＳ Ｇ１２変異である。具体的な実施態様において、ＫＲＡＳ Ｇ１２変異は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｓ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ、ＫＲＡＳ Ｇ１２ＡおよびＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄのリストから選択される。
【００６５】
ある実施態様において、ＫＲＡＳ遺伝子点変異は、ＫＲＡＳ Ｇ１３変異である。具体的な実施態様において、ＫＲＡＳ Ｇ１３変異はＫＲＡＳ Ｇ１３Ｄである。
【００６６】
ある実施態様において、ＮＲＡＳ遺伝子点変異は、ＮＲＡＳ Ｇ１２変異である。具体的な実施態様において、ＮＲＡＳ Ｇ１２変異は、ＮＲＡＳ Ｇ１２ＣおよびＮＲＡＳ Ｇ１２Ｄのリストから選択される。
【００６７】
ある実施態様において、ＮＲＡＳ遺伝子点変異は、ＮＲＡＳ Ｑ６１変異である。具体的な実施態様において、ＮＲＡＳ Ｑ６１変異は、ＮＲＡＳ Ｑ６１ＫおよびＮＲＡＳ Ｑ６１Ｒのリストから選択される。
【００６８】
ある実施態様において、ＥＧＦＲ遺伝子点変異は、ＥＧＦＲ Ｔ７９０変異である。具体的な実施態様において、ＥＧＦＲ Ｔ７９０変異は、ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍである。
【００６９】
ある実施態様において、ＥＧＦＲ遺伝子点変異は、ＥＧＦＲ Ｌ８５８変異である。具体的な実施態様において、ＥＧＦＲ Ｌ８５８変異は、ＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒである。
【００７０】
ある実施態様において、ＥＧＦＲ遺伝子欠失は、ＥＧＦＲエクソン１９欠失である。
【００７１】
ある実施態様において、ＥＧＦＲ遺伝子挿入は、ＥＧＦＲエクソン２０挿入である。
【００７２】
ある実施態様において、ＡＲ遺伝子点変異は、ＡＲ Ｌ７０２変異、ＡＲ Ｗ７４２変異、ＡＲ Ｈ８７５変異、ＡＲ Ｆ８７７変異、およびＡＲ Ｔ８７８変異のリストから選択される。
具体的な実施態様において、ＡＲ Ｌ７０２変異は、ＡＲ Ｌ７０２Ｈである。
具体的な実施態様において、ＡＲ Ｗ７４２変異は、ＡＲ Ｗ７４２Ｃである。
具体的な実施態様において、ＡＲ Ｈ８７５変異は、ＡＲ Ｈ８７５Ｙである。
具体的な実施態様において、ＡＲ Ｆ８７７変異は、ＡＲ Ｆ８７７Ｌである。
具体的な実施態様において、ＡＲ Ｔ８７８変異は、ＡＲ Ｔ８７８Ａである。
【００７３】
ある実施態様において、ＡＲ遺伝子スプライスバリアントはＡＲ−Ｖ７である。
あらゆる実施態様が組み合わされ得る。
【実施例】
【００７４】
ここで、本発明を限定されない実施例によって説明する。実施例において言及されるヌクレオチド配列の一部は１以上のＬＮＡヌクレオシドを含み、これは記号「＋」およびそれに続く関連する文字（Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ／Ｕ）により特定される。ＬＮＡ修飾ヌクレオシドの構造式を以下に示す：
【表１】
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【００７５】
材料および方法
Ａ）採血および分取
すべての患者は、午前中の採血の前に夜中から断食していた。血液を、血漿用にＫ２−ＥＤＴＡチューブ（VACUTAINER（登録商標） Becton Dickinson, purple cap, REF 367864, 6.0ml）に採取し、または血清用に通常のチューブ（VACUTAINER（登録商標） Becton Dickinson, red cap, REF 366881, 5.0ml）に採取した。次いでチューブを５回または６回反転させ、垂直位置に保ち、室温（２０〜２５°Ｃ）で保存した。採取から１時間以内に２０〜２５℃において１５００ｇで１５分間遠心分離することにより、さらなる処理を行った。使い捨てのパスツールピペット（Steroglass, REF: LPMW032653; 5ml）を用いて血漿を採取し、バフィーコートの３〜４ｍｍ上で止めることによって再懸濁を回避した。試料を脂質、胆汁（Itterum）または溶血の痕跡について視覚的に確認した。血漿を１５ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブに収集し、穏やかに反転させ、ラベル付きのクライオチューブ（REF: n BSM 535, Biosigma）に分注し、−８０℃で保存した。
【００７６】
Ｂ）血漿および試薬の調製
血漿試料を室温（ＲＴ）において１２００ｇで２０分間遠心分離し、赤血球および細胞片を除去した。次に、上清を収集し、ＲＴにおいて１００００ｇで３０分間再度遠心分離し、より大きな小胞および細片を除去した。得られた上清を収集し、体積比１：１のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で希釈した。各試料にプロテアーゼ阻害剤カクテル（1000X; Sigma Cat. num. P-834）を１μｌ添加し、タンパク質バイオマーカーを維持した。ＤＮＡ精製のための試薬（洗浄緩衝液を含む）を、製造者の指示（HansaBioMed OU, Estonia）に従って調製した。プライマーおよびプローブをＭｉｌｌｉ−Ｑ水またはＴＥ緩衝液で再構成し、分注し、使用するまで−２０℃で保存した。
【００７７】
Ｃ）血漿からのエクソソームの単離
腫瘍由来エクソソームを捕捉するために使用される抗ＣＡＩＸおよび抗ＣＡＸＩＩ抗体は、Dr Reinhard Zeidler (Helmoltz Zentrum Munchen, Germany)によって快く提供された。抗ｃＭＥＴ（カタログ番号PA5-27235; Thermo Fisher）、抗ＣＤ７３（カタログ番号ab91086; Abcam）、抗ＣＡＶ（カタログ番号611338; BD Biosciences）、抗ＴＭ９ＳＦ４（カタログ番号LS-A9852; Lifespan Biosciences, Inc）および抗ＥＰＣＡＭ（カタログ番号PA5-29634; Thermo Fisher）抗体を市販の提供者から購入した。ラテックスビーズを市販の提供者（HansaBioMed OU, Estonia）から購入し、試料あたり１μｇの抗体を用いてコーティングした。一般的なエクソソーム集団を単離するため、Ｖｎ９６ペプチドを製造者の指示（ME-kit, New England Peptide, US）に従って用いた。
【００７８】
抗体でコーティングされたビーズ１０μｌまたはＶｎ９６ペプチド５０μｇを事前に清澄化および希釈した血漿試料に添加し、エクソソームを単離した。試料を上下にピペッティングすることにより混合し、回転させながらＲＴで２時間インキュベートした。インキュベーション後、試料をＲＴにおいて５０００ｇで１０分間遠心分離した。次いで、得られた上清をビーズペレットを乱さないように慎重に除去した。ペレットをＰＢＳで洗浄し、５０００ｇで１０分間遠心分離することにより遠沈させた。その後、洗浄工程を再度繰り返し、最後にペレットを２００μｌのＰＢＳ １Ｘ中に再懸濁した。
【００７９】
Ｄ）尿からのエクソソームの単離
単離する前に、１００ｋＤａのカットオフを有するＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅアミコンウルトラ−１５フィルターユニット（カタログ番号UFC910024、Millipore）を用いて尿を１０倍濃縮した。次に、１０μｌの抗ＣＡＩＸでコーティングしたビーズを１ｍＬの濃縮した尿に添加した。２時間の単離後、ビーズをペレット化し、ＲＮＡ抽出の前に先述のように洗浄した。
【００８０】
Ｅ）ＤＮＡ精製および濃縮
エクソソームに関連するＤＮＡ（ＥＶ−ＤＮＡ）を、市販の循環ＤＮＡ抽出キット（EXO-DNAc-PS; HansaBioMed OU, Estonia）を用いて抽出および濃縮した。簡潔に述べると、ビーズに結合したエクソソームを独自の溶解緩衝液を用いて溶解し、プロテイナーゼＫを用いて消化し、タンパク質複合体からＤＮＡを遊離させた。次に、試料にエタノールを添加し、シリカメンブレンスピンカラム上にロードし、１００００ｇで１分間遠心分離した。遠心分離後、フロースルーを捨てた。２つの洗浄工程を製造者の指示に従って行い、溶出前に混入している溶媒および血漿由来の阻害剤を除去した。溶出したＤＮＡに結合緩衝液およびエタノールを添加し、さらなる精製および濃縮のために新しいシリカメンブレンスピンカラム上に再度ロードした。精製したＥＶ−ＤＮＡをキットによって提供される最終容量１５μｌの溶出緩衝液中に溶出する前に、さらに２つの洗浄工程を適用した。
【００８１】
Ｆ）ＲＮＡ精製
市販のエクソソームＲＮＡ抽出キット（sortEV（商標）; Exosomics Siena Spa）を用いて、ＲＮＡをビーズペレットから直接抽出した。簡潔に述べると、ビーズに結合したエクソソームをフェノール系の緩衝液で溶解し、３０秒間ボルテックスした。次に、試料にクロロホルムを添加し、有機相から水相を分離するために１２０００ｇで１０分間遠沈させた。遠心分離後、水相を収集し、エタノールを添加し、シリカメンブレンスピンカラム上にロードした。ロードしたカラムを１４０００ｇで３０秒間遠心分離し、フロースルーを捨てた。２つの洗浄工程を製造者の指示に従って行い、溶出前に混入している溶媒および血漿由来の阻害剤を除去した。精製したＥＶ−ＲＮＡをキットによって提供される最終容量１５μｌの溶出緩衝液中に溶出した。
【００８２】
Ｇ）ＥＶ−ＤＮＡからのＢＲＡＦ、ＫＲＡＳ、ＥＧＦＲ、ｃＭｙｃ遺伝子のＰＣＲ増幅
ＥＶ−ＤＮＡのＰＣＲ増幅は、鋳型の低い存在量および高い断片化のために困難である。したがって、標的遺伝子ＢＲＡＦおよびＫＲＡＳの検出を改善するために、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）の上流のプロトコルに前増幅の工程を含めた。
【００８３】
プライマーおよびプローブ
ＢＲＡＦ ｐｒｅａｍｐプライマー：
ａ）ＷＴ ＦＷ：５’−ＴＡＧＧＴＧＡＴＴＴＴＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＡＧ＋Ｔ−３’（配列番号１）；
ｂ）ＷＴ ＲＷ：５’−ＴＴＡＡＴＣＡＧＴＧＧＡＡＡＡＡＴＡＧＣＣＴＣＡ−３’（配列番号２）；
ｃ）Ｖ６００Ｅ ＦＷ：５’−ＴＡＧＧＴＧＡＴＴＴＴＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＡＧ＋Ａ−３’（配列番号３）；
ｄ）Ｖ６００Ｅ ＲＷ：５’−ＴＴＡＡＴＣＡＧＴＧＧＡＡＡＡＡＴＡＧＣＣＴＣＡ−３’（配列番号４）；
ＫＲＡＳ ｐｒｅａｍｐプライマー：
ａ）ＷＴ ＦＷ：５’−ＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣ−３’（配列番号５）；
ｂ）ＲＷ：５’−ＴＧＡＴＴＣＴＧＡＡＴＴＡＧＣＴＧＴＡＴＣＧＴＣＡＡ−３’（配列番号６）；
ＢＲＡＦ ｑＰＣＲプライマーおよびプローブ：
ａ）ＷＴ： ＦＷ：５’−ＴＡＧＧＴＧＡＴＴＴＴＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＡＧ＋Ｔ−３’（配列番号７）；
ｂ）ＷＴ ＲＷ：５’−ＴＴＡＡＴＣＡＧＴＧＧＡＡＡＡＡＴＡＧＣＣＴＣＡ−３’（配列番号８）；
ｃ）Ｖ６００Ｅ ＦＷ：５’−ＴＡＧＧＴＧＡＴＴＴＴＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＡＧ＋Ａ−３’（配列番号９）；
ｄ）Ｖ６００Ｅ ＲＷ：５’−ＴＴＡＡＴＣＡＧＴＧＧＡＡＡＡＡＴＡＧＣＣＴＣＡ−３’（配列番号１０）；
ｅ）プローブ：５’−ＦＡＭ−ＣＣＧＡＡＧＧＧＧＡＴＣ＋ＣＡＧＡＣＡＡ＋ＣＴＧＴＴＣＡＡＡＣＴＧＣＣＴＴＣＧＧ−３ＢＨＱ１−３’（配列番号１１）；
ＫＲＡＳ ｑＰＣＲプライマーおよびプローブ：
ａ）ＷＴ ＦＷ：５’−ＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣ−３’（配列番号１２）；
ｂ）ＲＷ：５’−ＴＧＡＴＴＣＴＧＡＡＴＴＡＧＣＴＧＴＡＴＣＧＴＣＡＡ−３’（配列番号１３）；
ｃ）プローブ：５’−ＦＡＭ−ＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣＴＡＣＧＣ−ＭＧＢ−３’（配列番号１４）；
ＥＧＦＲ ｑＰＣＲプライマーおよびプローブ
ａ）ＦＷ：５’−ＧＣＡＧＣＡＴＧＴＣＡＡＧＡＴＣＡＣＡＧＡＴＴ−３’（配列番号１５）；
ｂ）ＲＷ：５’−ＣＣＴＣＣＴＴＣＴＧＣＡＴＧＧＴＡＴＴＣＴＴＴＣＴ−３’（配列番号１６）；
ｃ）プローブＷＴ（ＶＩＣ）：５’−ＡＧＴＴＴＧＧＣＣＡＧＣＣＣＡＡ−３’（配列番号１７）；
ｃＭｙｃ ｑＰＣＲプライマーおよびプローブ
ａ）ＦＷ：５’−ＣＣＣＴＣＣＡＣＴＣＧＧＡＡＧＧＡＣＴＡＴＣ−３’（配列番号１８）；
ｂ）ＲＷ：５’−ＡＧＧＡＣＴＣＴＧＡＣＡＣＴＧＴＣＣＡＡＣＴ−３’（配列番号１９）；
ｃ）プローブＷＴ（ＶＩＣ）：５’−ＴＧＡＣＣＣＴＣＴＴＧＧＣＡＧＣＡＧ−３’（配列番号２０）；
【００８４】
ＥＶ−ＤＮＡからの標的遺伝子の前増幅
すべての試薬をＲＴで少なくとも１時間解凍し、酵素の不活性化を回避するためにボルテックスせずに短時間混合した。それぞれの前増幅の反応物には、総容量２０μｌ中に７μｌの溶出ＤＮＡ、１Ｘ Ｂｉｏｒｏｎ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ緩衝液、３ｍＭ ＭｇＣｌ２；２００μＭ ｄＮＴＰ、１．２５ユニットのＳＮＰａｓｅポリメラーゼ（Bioron GmbH, Germany）および０．４μｌのプライマー（１０μＭ）が含まれていた。各反応を、以下のＰＣＲプログラムを実行するサーマルＰＣＲサイクラーにロードしたＰＣＲ適合性のマイクロバイアル中で行った：９８℃で３０’’、９８℃で１０’’、７２℃で５’、４℃で維持。前増幅したＤＮＡを８０μｌの滅菌水で希釈し、すぐにｑＰＣＲ分析に使用したか、または−２０℃で最大３ヶ月間保存した。
【００８５】
ｑＰＣＲによる標的遺伝子の増幅
ＥＶ−ＤＮＡからの標的遺伝子の増幅のために、各ｑＰＣＲ反応物には、総容量２５μｌ中に７μｌの前増幅したＤＮＡ、１Ｘ ＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｂｅｓ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Biorad; US）、０．６２５μｌのプライマー（１０μＭ）および０．３１２５μｌの蛍光プローブ（１０μＭ）が含まれていた。慎重に混合した後、各反応物を９６ウェルＰＣＲプレート上に二通りずつロードし、以下のｑＰＣＲプログラムを開始した：９５℃で３’、９５℃で５’’および６０℃で３０’’を４０サイクル、その後４℃で最後の維持の工程。
【００８６】
ＥＶ−ＲＮＡからの標的遺伝子の増幅のために、１μｌのＥＶ−ＲＮＡを２０μｌのワンステップＲＴ−ｑＰＣＲ反応物中に直接ロードし、製造者の指示に従って増幅した（iTaq Universal OneStep qPCR; Biorad）。
【００８７】
ｑＰＣＲによるレトロトランスポゾン因子の増幅
１μｌのＥＶ−ＤＮＡまたはＥＶ−ＲＮＡをｑＰＣＲ混合物中に直接ロードし、先述のように増幅した。以下のプライマーおよびプローブを用いた：
ＬＩＮＥ ｑＰＣＲプライマーおよびプローブ
ａ）ＦＷ：５’−ＴＣＡＡＣＡＡＧＡＡＧＡＧＣＴＡＡＣＴＡＴＣＣ−３’（配列番号２１）；
ｂ）ＲＷ：５’−ＴＴＧＴＡＧＧＴＣＡＣＴＣＡＧＧＡＣＴＴＧＣ−３’（配列番号２２）；
ｃ）プローブ（５，６−ＴＡＭＲＡ）−ＴＧＣＡＣＣＣＡＡＴＡＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＣＡＧＡＴＴＣＡ−ＢＨＱ２（配列番号２３）；
ＨＥＲＶ−Ｗ ｑＰＣＲプライマーおよびプローブ
ａ）ＦＷ：５’−ＣＴＴＣＣＡＧＡＡＴＴＧＡＡＧＣＴＧＴＡＡＡＧＣ−３’（配列番号２４）；
ｂ）ＲＷ：５’−ＧＧＧＴＴＧＴＧＣＡＧＴＴＧＡＧＡＴＴＴＣＣ−３’（配列番号２５）；
ｃ）プローブＦＡＭ−５’−ＴＴＣＴＴＣＡＡＡＴＧＧＡＧＣＣＣＣＡＧＡＴＧＣＡＧ−３’−ＴＡＭＲＡ（配列番号２６）；
【００８８】
Ｑ−ＰＣＲデータ解析および結果の解釈
標的遺伝子ＢＲＡＦおよびＫＲＡＳ ＷＴの定量化をサイクル閾値（Ｃｔ）として表し、逆向きのＹ軸上にプロットした。あるいは、Ｚスコア値を用いて、以前に公開されているように健常な試料と疾患試料を区別するように閾値を規定した（１５）。簡潔に述べると、正のＺスコア値を有する試料は疾患陰性であるとみなされ、負のＺスコアを有する試料はがん陽性と分類された。いくつかの極端な事例では、レトロトランスポゾン因子のレベルの下方制御の結果として逆のパターンが観察された。
【００８９】
デジタルＰＣＲによる標的遺伝子の増幅
変異検出のために、チップを用いたデジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）プラットフォーム（QuantStudio 3D Digital PCR System Platform, Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA）を用いた。ｄＰＣＲ変異検出は、ＡＲ Ｔ８７８Ａ変異を標的とするＦＡＭと結合したＴａｑＭａｎ−ＭＧＢプローブおよび対応する野生型遺伝子を標的とするＶＩＣと結合したＴａｑＭａｎ−ＭＧＢプローブに基づいていた（ＳＮＰジェノタイピングアッセイC_175239649_10; Fisher Scientific）。ＡＲ−ＷＴおよびＡＲ−Ｖ７スプライシングバリアントアッセイを、以下のプライマーおよびプローブを用いて特注した：
ａ）ＡＲ−ＷＴ ＦＷ：５’−ＣＡＧＣＣＴＡＴＴＧＣＧＡＧＡＧＡＧＣＴＧ−３’（配列番号２７）；
ｂ）ＡＲ−ＷＴ ＲＷ：５’−ＧＡＡＡＧＧＡＴＣＴＴＧＧＧＣＡＣＴＴＧＣ−３’（配列番号２８）；
ｃ）プローブＡＲ−ＷＴ：ＭＧＢ５’−ＡＧＴＴＣＡＣＴＴＴＴＧＡＣＣＴＧＣ−３’（配列番号２９）；
ｄ）ＡＲ−Ｖ７ ＦＷ：５’−ＣＣＡＴＣＴＴＧＴＣＧＴＣＴＴＣＧＧＡＡＡＴＧＴＴＡ−３’（配列番号３０）；
ｅ）ＡＲ−Ｖ７ ＲＷ：５’−ＴＴＴＧＡＡＴＧＡＧＧＣＡＡＧＴＣＡＧＣＣＴＴＴＣＴ−３’（配列番号３１）；
ｆ）プローブＡＲ−Ｖ７：ＭＧＢ５’−ＡＡＧＣＡＧＧＧＡＴＧＡＣＴＣＴＧ−３’（配列番号３２）。
【００９０】
８μｌの２Ｘ ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ３ＤデジタルＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Life Technologies）、０．４μｌの４０Ｘ ＴａｑＭａｎ−ＭＧＢ−ＦＡＭ−プローブアッセイ、１．１μｌの希釈されたＤＮＡ（５０ｎｇ／μｌ）および６．５μｌのヌクレアーゼを含まない水（Qiagen）を含む１６μｌの反応混合物を反応混合物中に調製した。陰性対照の反応混合物は、８μｌの２Ｘ ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ３ＤデジタルＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、０．４μｌの４０Ｘ ＴａｑＭａｎ−ＭＧＢ−ＦＡＭ−プローブアッセイ、および７．６μｌのヌクレアーゼを含まない水を含んでいた。
【００９１】
ＡＲ Ｔ８７８Ａ、ＡＲ−Ｖ７およびｗｔ遺伝子のコピーを定量化するため、１５μｌの反応混合物を自動チップローダーを用いて製造者の指示（Life Technologies）に従ってＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ３ＤデジタルＰＣＲ ２０Ｋチップ上にロードした。ロードすることにより、反応物はチップの表面上の２０．０００マイクロウェルに対応する最終容量８６５ｐＬの２０．０００の微量の反応物に分割される。ロードした各チップに、ＰｒｏＦｌｅｘ ＰＣＲシステムを用いて以下のサイクル条件を適用した：９５℃で８’、９５℃で１５’’および６０℃で１’を４０サイクル、その後６０℃で２’の最後の伸長工程。サーマルサイクル後、プローブが標的とする核酸配列の概算の濃度を計算するＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ３Ｄ装置によりチップを画像化した。分析の閾値を手動で設定し、異常な発光を除外した後、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ３Ｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｕｉｔｅ Ｃｌｏｕｄソフトウェアを用いてデータ解析を行った。すべての陰性対照の信号はＦＡＭにおいて５０００ＲＦＵの値以下で発生していため、この閾値をＡＲ Ｔ８７８Ａの陽性の発光と陰性の発光の判別のために固定し、ＶＩＣにおいて２１００ＲＦＵがＡＲ ｗｔの発光の閾値として生じた。また、１ｍｌあたり２コピー以下の変異体を含む試料を陰性とみなした。
【００９２】
実施例１：抗ＣＡ−ＩＸ抗体を用いたエクソソームの捕捉は、腫瘍由来エクソソームの濃縮を可能にする
図１は、抗炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、抗炭酸脱水酵素ＸＩＩ（ＣＡＸＩＩ）、抗ｃＭＥＴ、抗ＣＤ７３、抗カベオリン（ＣＡＶ）、および抗ＴＭ９ＳＦ４抗体でコーティングしたビーズを用いたエクソソームの免疫分離または一般的な細胞外小胞（ＥＶ）沈殿の後に、ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ陽性黒色腫患者の血漿から抽出したＤＮＡに対するリアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によるＢＲＡＦ野生型（ＷＴ）およびＶ６００Ｅ変異遺伝子の定量分析の結果を示す。抗体を、公知の腫瘍バイオマーカーを標的とする能力に基づいて選択した。抗ＣＡＩＸ抗体での免疫分離は、ＢＲＡＦ ＷＴ遺伝子と比較してＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ遺伝子のレベルが高いことによって示唆されるように、他のあらゆる免疫捕捉の手法および一般的なＥＶ沈殿よりも多くの腫瘍由来のエクソソームを濃縮した。データをサイクル閾値（Ｃｔ）として表し、逆向きのＹの尺度でプロットする。
【００９３】
実施例２：超遠心分離によるエクソソームの一般的な単離と比較して、抗ＣＡ−ＩＸ抗体を用いた免疫捕捉は、健常な患者とがん患者の判別を可能にする。
図２およびＢは、抗ＣＡＩＸ抗体でコーティングしたビーズを用いたエクソソームの免疫分離または一般的な細胞外小胞（ＥＶ）沈殿の後に、健常なドナー（ＨＤ）およびＡ）大腸がん（ＣＲＣ）患者またはＢ）転移性黒色腫（ＭＥＬ）患者の血漿から抽出したＤＮＡに対するｑＰＣＲによるＢＲＡＦ ＷＴ遺伝子の定量分析の結果を示す。腫瘍エクソソーム由来のＢＲＡＦ ＷＴ遺伝子のレベルが、抗ＣＡＩＸ免疫捕獲後において健常なドナーの血漿試料と比較してＣＲＣおよびＭＥＬ患者の両方の血漿で有意に高かったことが見出され、これはＣＡＩＸ陽性腫瘍由来のエクソソームの単離を示唆した。逆に、ＢＲＡＦ ＷＴ遺伝子のコピーを持つ腫瘍に由来しないエクソソームの同時分離のために、一般的なＥＶ沈殿後のコホート間では差異は観察されなかった。データをサイクル閾値（Ｃｔ）として表し、逆向きのＹの尺度でプロットする。同様に、図２Ｃは、２人の前立腺がん（ＰＣａ）患者におけるＡＲ Ｔ８７８対ＡＲ ＷＴアレル頻度の定量分析の結果を示す。
【００９４】
実施例３：抗ＥＰＣＡＭ抗体を用いた免疫捕捉によるエクソソームの単離と比較して、抗ＣＡ−ＩＸ抗体を用いた免疫捕捉は健康な患者とがん患者の判別を可能にする
図３は、抗ＣＡＩＸ抗体でコーティングしたビーズまたは抗上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）抗体でコーティングしたビーズを用いたエクソソームの免疫分離の後に、ＨＤ患者およびＣＲＣ患者の血漿から抽出したＤＮＡに対するｑＰＣＲによるＢＲＡＦ ＷＴ遺伝子の定量分析の結果を示す。ＥＰＣＡＭを参照の腫瘍エクソームマーカーとして選択した。抗ＣＡＩＸ抗体でコーティングしたビーズを用いて単離したエクソソームは、両方のＨＤ血漿試料において低いレベルのＢＲＡＦ ＷＴ遺伝子を有し、両方のＣＲＣ試料において高いレベルのＢＲＡＦ ＷＴ遺伝子を有していた。逆に、抗ＥＰＣＡＭ抗体でコーティングしたビーズを用いて単離したエクソソームは、１つのＨＤ試料および両方のＣＲＣ試料において高いレベルのＢＲＡＦ ＷＴ遺伝子を有していた。これは、抗ＥＰＣＡＭ抗体が抗ＣＡＩＸ抗体と比較してＣＲＣ由来のエクソソームを効率的に単離する能力が低いためである可能性がある。
【００９５】
実施例４：ＢＲＡＦを用いた大腸がんの診断
図４は、抗ＣＡＩＸ抗体でコーティングしたビーズを用いたエクソソームの免疫分離の後に、ＨＤ患者（ｎ＝１３）およびＣＲＣ患者（ｎ＝１３）の血漿から抽出したＤＮＡに対するｑＰＣＲによるＢＲＡＦ ＷＴ遺伝子の定量分析の結果を示す。０のＺスコア値を診断の閾値として用いた。正のＺスコアを有する試料をがん陰性とみなし、負のＺスコアを有する試料をがん陽性とみなした。本実験において、１３個のＨＤ試料のうち１０個（８０％）が正のＺスコアを有し、がん陰性とみなされた。逆に、１３個のＣＲＣ試料のうち１０個（８０％）が負のＺスコアを有し、がん陽性とみなされた。これらのデータは、記述された検査を用いて健常者とＣＲＣ患者を判別するための診断の閾値を規定する。
【００９６】
実施例５：ＢＲＡＦを用いた前立腺がんの診断
図５は、抗ＣＡＩＸ抗体でコーティングしたビーズを用いたエクソソームの免疫分離の後に、ＨＤ患者（ｎ＝５）、前立腺肥大症患者（ＢＰＨ；ｎ＝５）および前立腺がん患者（Ｐｃａ；ｎ＝５）から抽出したＤＮＡに対するｑＰＣＲによるＢＲＡＦ ＷＴ遺伝子の定量分析の結果を示す。先述されるように、０のＺスコア値を診断の閾値として用いた。本実験において、５個のＨＤ血漿試料またはＢＰＨ血漿試料のうち４個（８０％）が正のＺスコアを有し、がん陰性とみなされた。５個のＰＣａ試料のうち４個（８０％）が負のＺスコアを有し、がん陽性とみなされた。これらのデータは、記述された検査を用いて健常者またはＢＰＨ患者とＰＣａ患者を判別するための診断の閾値を規定する。
【００９７】
実施例６：ＢＲＡＦを用いた胃がんの診断
図６は、抗ＣＡＩＸ抗体でコーティングしたビーズを用いたエクソソームの免疫分離の後に、ＨＤ患者（ｎ＝５）および胃がん患者（Ｇａｓｔｒｉｃ Ｃａ；ｎ＝６）から抽出したＤＮＡに対するｑＰＣＲによるＢＲＡＦ ＷＴ遺伝子の定量分析の結果を示す。先述されるように、０のＺスコア値を診断の閾値として用いた。本実験において、５個のＨＤ血漿試料のうち５個（１００％）が正のＺスコアを有し、がん陰性とみなされた。６個のＰＣａ試料のうち５個（８３％）が負のＺスコアを有し、がん陽性とみなされた。これらのデータは、記述された検査を用いて健常者と胃がん患者を判別するための診断の閾値を規定する。
【００９８】
実施例７：ＢＲＡＦを用いた卵巣がんの診断
図７は、抗ＣＡＩＸ抗体でコーティングしたビーズを用いたエクソソームの免疫分離の後に、ＨＤ患者（ｎ＝５）および卵巣がん患者（Ｏｖａｒｙ；ｎ＝６）から抽出したＤＮＡに対するリアルタイムＰＣＲによるＢＲＡＦ野生型（ＷＴ）遺伝子の定量分析の結果を示す。先述されるように、０のＺスコア値を診断の閾値として用いた。本実験において、５個のＨＤ血漿試料のうち４個（８０％）が正のＺスコアを有し、がん陰性とみなされた。６個のＰＣａ試料のうち４個（６６％）が負のＺスコアを有し、がん陽性とみなされた。これらのデータは、記述された検査を用いて健常者と卵巣がん患者を判別するための診断の閾値を規定する。
【００９９】
実施例８：ＫＲＡＳを用いた大腸がんまたは前立腺がんの診断
図８は、抗ＣＡＩＸ抗体でコーティングしたビーズを用いたエクソソームの免疫分離の後に、ＨＤ患者、ＢＰＨ患者およびがん患者の試料から抽出したＤＮＡに対するリアルタイムＰＣＲによるＫＲＡＳ野生型（ＷＴ）遺伝子の定量分析の結果を示す。先述されるように、０のＺスコア値を診断の閾値として用いた。Ａ）５個のＨＤ血漿試料のうち４個（８０％）が正のＺスコアを有し、がん陰性とみなされた。５個のＣＲＣ血漿試料のうち４個（８０％）が負のＺスコアを有し、がん陽性とみなされた。Ｂ）５個のＨＤおよびＢＰＨ血漿試料のうち４個（８０％）が正のＺスコアを有し、がん陰性とみなされた。５個のＰＣａ血漿試料のうち４個（８０％）が負のＺスコアを有し、がん陽性とみなされた。全体としてこれらのデータは、健常者または良性疾患患者とがん患者を判別するための診断の閾値が、ＰＣＲの読み出しとしてＢＲＡＦ ＷＴ遺伝子の代わりにＫＲＡＳ ＷＴ遺伝子を用いて生成され得ることを示す。
【０１００】
実施例９：ＥＧＦＲを用いた肺がんの診断
図９は、抗ＣＡＩＸ抗体でコーティングしたビーズを用いたエクソソームの免疫分離の後に、ＨＤ患者および肺がん患者の試料から抽出したＤＮＡに対するリアルタイムＰＣＲによるＥＧＦＲ野生型（ＷＴ）遺伝子の定量分析の結果を示す。先述されるように、０のＺスコア値を診断の閾値として用いた。１５個のＨＤ血漿試料のうち１１個（７７％）が負のＺスコアを有し、がん陰性とみなされた。９個の肺がん血漿試料のうち５個（６０％）が正のＺスコアを有し、がん陽性とみなされた。全体としてこれらのデータは、健常者と肺がん患者を判別するための診断の閾値が、ＰＣＲの読み出しとしてＢＲＡＦ ＷＴ遺伝子の代わりにＥＧＦＲ ＷＴ遺伝子を用いて生成され得ることを示す。
【０１０１】
実施例１０：ＨＥＲＶ−Ｗを用いた肺がんの診断
図１０は、抗ＣＡＩＸ抗体でコーティングしたビーズを用いたエクソソームの免疫分離の後に、ＨＤ患者および肺がん患者の試料から抽出したＤＮＡに対するリアルタイムＰＣＲによるＨＥＲＶ−Ｗレトロトランスポゾン因子の定量分析の結果を示す。先述されるように、０のＺスコア値を診断の閾値として用いた。１０個のＨＤ血漿試料のうち８個（８０％）が正のＺスコアを有し、がん陰性とみなされた。７個の肺がん血漿試料のうち６個（８５％）が負のＺスコアを有し、がん陽性とみなされた。全体としてこれらのデータは、健常者と肺がん患者を判別するための診断の閾値が、ＰＣＲの読み出しとしてＢＲＡＦ ＷＴ遺伝子の代わりにＨＥＲＶ−Ｗレトロトランスポゾン因子を用いて生成され得ることを示す。
【０１０２】
実施例１１：ＬＩＮＥを用いた肺がんの診断
図１１は、抗ＣＡＩＸ抗体でコーティングしたビーズを用いたエクソソームの免疫分離の後に、ＨＤ患者および肺がん患者の試料から抽出したＤＮＡに対するリアルタイムＰＣＲによるＬＩＮＥレトロトランスポゾン因子の定量分析の結果を示す。先述されるように、０のＺスコア値を診断の閾値として用いた。１０個のＨＤ血漿試料のうち９個（９０％）が正のＺスコアを有し、がん陰性とみなされた。６個の肺がん血漿試料のうち４個（６７％）が負のＺスコアを有し、がん陽性とみなされた。全体としてこれらのデータは、健常者と肺がん患者を判別するための診断の閾値が、ＰＣＲの読み出しとしてＢＲＡＦ ＷＴ遺伝子の代わりにＬＩＮＥレトロトランスポゾン因子を用いて生成され得ることを示す。
【０１０３】
実施例１２：ｃ−Ｍｙｃ遺伝子を用いた肺がんの診断
図１２は、抗ＣＡＩＸ抗体でコーティングしたビーズを用いたエクソソームの免疫分離の後に、ＨＤ患者および肺がん患者の試料から抽出したＤＮＡに対するリアルタイムＰＣＲによるｃ−Ｍｙｃ遺伝子の定量分析の結果を示す。先述されるように、０のＺスコア値を診断の閾値として用いた。７個のＨＤ血漿試料のうち７個（１００％）が０または正のＺスコアを有し、がん陰性とみなされた。６個の肺がん血漿試料のうち４個（６７％）が負のＺスコアを有し、がん陽性とみなされた。全体としてこれらのデータは、健常者と肺がん患者を判別するための診断の閾値が、ＰＣＲの読み出しとしてＢＲＡＦ ＷＴ遺伝子の代わりにｃ−Ｍｙｃ遺伝子を用いて生成され得ることを示す。
【０１０４】
実施例１３：ＨＥＲＶ−Ｗを用いた乳がんの診断
図１３は、抗ＣＡＩＸ抗体でコーティングしたビーズを用いたエクソソームの免疫分離の後に、ＨＤ患者および乳がん患者の試料から抽出したＤＮＡに対するリアルタイムＰＣＲによるＨＥＲＶ−Ｗレトロトランスポゾン因子の定量分析の結果を示す。先述されるように、０のＺスコア値を診断の閾値として用いた。９個のＨＤ血漿試料のうち７個（７８％）が正のＺスコアを有し、がん陰性とみなされた。５個の乳がん血漿試料のうち４個（８０％）が負のＺスコアを有し、がん陽性とみなされた。全体としてこれらのデータは、健常者と乳がん患者を判別するための診断の閾値が、ＰＣＲの読み出しとしてＢＲＡＦ ＷＴ遺伝子の代わりにＨＥＲＶ−Ｗレトロトランスポゾン因子を用いて生成され得ることを示す。
【０１０５】
実施例１４：ＬＩＮＥを用いた乳がんの診断
図１４は、抗ＣＡＩＸ抗体でコーティングしたビーズを用いたエクソソームの免疫分離の後に、ＨＤ患者および乳がん患者の試料から抽出したＤＮＡに対するリアルタイムＰＣＲによるＬＩＮＥレトロトランスポゾン因子の定量分析の結果を示す。先述されるように、０のＺスコア値を診断の閾値として用いた。１０個のＨＤ血漿試料のうち９個（９０％）が正のＺスコアを有し、がん陰性とみなされた。５個の乳がん血漿試料のうち４個（８０％）が負のＺスコアを有し、がん陽性とみなされた。全体としてこれらのデータは、健常者と乳がん患者を判別するための診断の閾値が、ＰＣＲの読み出しとしてＢＲＡＦ ＷＴ遺伝子の代わりにＬＩＮＥレトロトランスポゾン因子を用いて生成され得ることを示す。
【０１０６】
実施例１５：ＡＲ−ＷＴを用いた前立腺がんの診断
図１５は、抗ＣＡＩＸ抗体でコーティングしたビーズを用いたエクソソームの免疫分離の後に、ＨＤ患者および前立腺がん患者の試料から抽出したＤＮＡに対するリアルタイムＰＣＲによるＡＲ ＷＴ遺伝子の定量分析の結果を示す。先述されるように、０のＺスコア値を診断の閾値として用いた。１個のＨＤ血漿試料のうち１個（１００％）が正のＺスコアを有し、がん陰性とみなされた。１６個の前立腺がん血漿試料のうち１５個（９３％）が負のＺスコアを有し、がん陽性とみなされた。全体としてこれらのデータは、健常者と前立腺がん患者を判別するための診断の閾値が、ＰＣＲの読み出しとしてＢＲＡＦ ＷＴ遺伝子の代わりにＡＲ ＷＴ遺伝子を用いて生成され得ることを示す。
【０１０７】
実施例１６：ＡＲ−Ｔ８７８Ａを用いた前立腺がんの診断
図１６は、抗ＣＡＩＸ抗体でコーティングしたビーズを用いたエクソソームの免疫分離の後に、ＨＤ患者および前立腺がん患者の試料から抽出したＤＮＡに対するリアルタイムＰＣＲによるＡＲ Ｔ８７８Ａ遺伝子の定量分析の結果を示す。先述されるように、０のＺスコア値を診断の閾値として用いた。１個のＨＤ血漿試料のうち１個（１００％）が正のＺスコアを有し、がん陰性とみなされた。２個の前立腺がん血漿試料のうち２個（１００％）が負のＺスコアを有し、がん陽性とみなされた。全体としてこれらのデータは、健常者と前立腺がん患者を判別するための診断の閾値が、ＰＣＲの読み出しとしてＢＲＡＦ ＷＴ遺伝子の代わりにＡＲ Ｔ８７８Ａ遺伝子を用いて生成され得ることを示す。
【０１０８】
実施例１７：ＨＥＲＶ−Ｗを用いた大腸がんの診断
図１７は、抗ＣＡＩＸ抗体でコーティングしたビーズを用いたエクソソームの免疫分離の後に、ＨＤ患者および大腸がん（ＣＲＣ）患者の試料から抽出したＤＮＡに対するリアルタイムＰＣＲによるＨＥＲＶ−Ｗレトロトランスポゾン因子の定量分析の結果を示す。先述されるように、０のＺスコア値を診断の閾値として用いた。１０個のＨＤ血漿試料のうち８個（８０％）が負のＺスコアを有し、がん陰性とみなされた。１０個のＣＲＣ血漿試料のうち９個（９０％）が正のＺスコアを有し、がん陽性とみなされた。全体としてこれらのデータは、健常者とＣＲＣ患者を判別するための診断の閾値が、ＰＣＲの読み出しとしてＢＲＡＦ ＷＴ遺伝子の代わりにＨＥＲＶ−Ｗレトロトランスポゾン因子を用いて生成され得ることを示す。
【０１０９】
実施例１８：ＬＩＮＥを用いた大腸がんの診断
図１８は、抗ＣＡＩＸ抗体でコーティングしたビーズを用いたエクソソームの免疫分離の後に、ＨＤ患者および大腸がん（ＣＲＣ）患者の試料から抽出したＤＮＡに対するリアルタイムＰＣＲによるＬＩＮＥレトロトランスポゾン因子の定量分析の結果を示す。先述されるように、０のＺスコア値を診断の閾値として用いた。９個のＨＤ血漿試料のうち７個（７７％）が負のＺスコアを有し、がん陰性とみなされた。１０個のＣＲＣ血漿試料のうち８個（８０％）が正のＺスコアを有し、がん陽性とみなされた。全体としてこれらのデータは、健常者とＣＲＣ患者を判別するための診断の閾値が、ＰＣＲの読み出しとしてＢＲＡＦ ＷＴ遺伝子の代わりにＬＩＮＥレトロトランスポゾン因子を用いて生成され得ることを示す。
【０１１０】
実施例１９：ＨＥＲＶ−Ｗを用いた胃がんの診断
図１９は、抗ＣＡＩＸ抗体でコーティングしたビーズを用いたエクソソームの免疫分離の後に、ＨＤ患者および胃がん患者の試料から抽出したＤＮＡに対するリアルタイムＰＣＲによるＨＥＲＶ−Ｗレトロトランスポゾン因子の定量分析の結果を示す。先述されるように、０のＺスコア値を診断の閾値として用いた。１０個のＨＤ血漿試料のうち７個（７０％）が正のＺスコアを有し、がん陰性とみなされた。５個の胃の血漿試料のうち４個（８０％）が負のＺスコアを有し、がん陽性とみなされた。全体としてこれらのデータは、健常者と胃がん患者を判別するための診断の閾値が、ＰＣＲの読み出しとしてＢＲＡＦ ＷＴ遺伝子の代わりにＨＥＲＶ−Ｗレトロトランスポゾン因子を用いて生成され得ることを示す。
【０１１１】
実施例２０：ＬＩＮＥを用いた胃がんの診断
図２０は、抗ＣＡＩＸ抗体でコーティングしたビーズを用いたエクソソームの免疫分離の後に、ＨＤ患者および胃がん患者の試料から抽出したＤＮＡに対するリアルタイムＰＣＲによるＬＩＮＥレトロトランスポゾン因子の定量分析の結果を示す。先述されるように、０のＺスコア値を診断の閾値として用いた。１０個のＨＤ血漿試料のうち７個（７０％）が正のＺスコアを有し、がん陰性とみなされた。５個の胃の血漿試料のうち４個（８０％）が負のＺスコアを有し、がん陽性とみなされた。全体としてこれらのデータは、健常者と胃がん患者を判別するための診断の閾値が、ＰＣＲの読み出しとしてＢＲＡＦ ＷＴ遺伝子の代わりにＬＩＮＥレトロトランスポゾン因子を用いて生成され得ることを示す。
【０１１２】
実施例２１：ｃ−Ｍｙｃを用いた卵巣がんの診断
図２１は、抗ＣＡＩＸ抗体でコーティングしたビーズを用いたエクソソームの免疫分離の後に、ＨＤ患者および卵巣がん患者の試料から抽出したＤＮＡに対するリアルタイムＰＣＲによるｃ−Ｍｙｃ遺伝子の定量分析の結果を示す。先述されるように、０のＺスコア値を診断の閾値として用いた。３個のＨＤ血漿試料のうち２個（７０％）が正のＺスコアを有し、がん陰性とみなされた。２個の卵巣血漿試料のうち２個（１００％）が負のＺスコアを有し、がん陽性とみなされた。全体としてこれらのデータは、健常者と卵巣がん患者を判別するための診断の閾値が、ＰＣＲの読み出しとしてＢＲＡＦ ＷＴ遺伝子の代わりにｃ−Ｍｙｃ遺伝子を用いて生成され得ることを示す。
【０１１３】
実施例２２：ＨＥＲＶ−Ｗを用いた肺がんの診断
図２２は、抗ＣＡＩＸ抗体でコーティングしたビーズを用いたエクソソームの免疫分離の後に、ＨＤ患者および肺がん患者の試料から抽出したＲＮＡに対するリアルタイムＰＣＲによるＨＥＲＶ−Ｗレトロトランスポゾン因子の定量分析の結果を示す。先述されるように、０のＺスコア値を診断の閾値として用いた。８個のＨＤ血漿試料のうち６個（７７％）が正のＺスコアを有し、がん陰性とみなされた。５個の肺がん血漿試料のうち４個（８０％）が負のＺスコアを有し、がん陽性とみなされた。全体としてこれらのデータは、健常者と肺がん患者を判別するための診断の閾値が、ＰＣＲの読み出しとしてＢＲＡＦ ＷＴ遺伝子の代わりにＲＮＡ由来のＨＥＲＶ−Ｗレトロトランスポゾン因子を用いて生成され得ることを示す。
【０１１４】
実施例２３：ｃ−Ｍｙｃ遺伝子を用いた肺がんの診断
図２３は、抗ＣＡＩＸ抗体でコーティングしたビーズを用いたエクソソームの免疫分離の後に、ＨＤ患者および肺がん患者の試料から抽出したＲＮＡに対するリアルタイムＰＣＲによるｃ−ＭｙｃメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の定量分析の結果を示す。先述されるように、０のＺスコア値を診断の閾値として用いた。５個のＨＤ血漿試料のうち４個（８０％）が正のＺスコアを有し、がん陰性とみなされた。６個の肺がん血漿試料のうち５個（８５％）が負のＺスコアを有し、がん陽性とみなされた。全体としてこれらのデータは、健常者と肺がん患者を判別するための診断の閾値が、ＰＣＲの読み出しとしてＢＲＡＦ ＷＴ遺伝子の代わりにｃ−Ｍｙｃ ｍＲＮＡを用いて生成され得ることを示す。
【０１１５】
実施例２４：ＬＩＮＥを用いた肺がんの診断
図２４は、抗ＣＡＩＸ抗体でコーティングしたビーズを用いたエクソソームの免疫分離の後に、ＨＤ患者および肺がん患者の試料から抽出したＲＮＡに対するリアルタイムＰＣＲによるＬＩＮＥレトロトランスポゾン因子の定量分析の結果を示す。先述されるように、０のＺスコア値を診断の閾値として用いた。１５個のＨＤ血漿試料のうち１２個（８０％）が正のＺスコアを有し、がん陰性とみなされた。６個の肺がん血漿試料のうち４個（６７％）が負のＺスコアを有し、がん陽性とみなされた。全体としてこれらのデータは、健常者と肺がん患者を判別するための診断の閾値が、ＰＣＲの読み出しとしてＢＲＡＦ ＷＴ遺伝子の代わりにＲＮＡ由来のＬＩＮＥレトロトランスポゾン因子を用いて生成され得ることを示す。
【０１１６】
実施例２５：ＬＩＮＥを用いた大腸がんの診断
図２５は、抗ＣＡＩＸ抗体でコーティングしたビーズを用いたエクソソームの免疫分離の後に、ＨＤ患者および大腸がん（ＣＲＣ）患者の試料から抽出したＲＮＡに対するリアルタイムＰＣＲによるＬＩＮＥレトロトランスポゾン因子の定量分析の結果を示す。先述されるように、０のＺスコア値を診断の閾値として用いた。９個のＨＤ血漿試料のうち７個（７７％）が負のＺスコアを有し、がん陰性とみなされた。５個のＣＲＣ血漿試料のうち４個（８０％）が正のＺスコアを有し、がん陽性とみなされた。全体としてこれらのデータは、健常者とＣＲＣ患者を判別するための診断の閾値が、ＰＣＲの読み出しとしてＢＲＡＦ ＷＴ遺伝子の代わりにＲＮＡ由来のＬＩＮＥレトロトランスポゾン因子を用いて生成され得ることを示す。
【０１１７】
実施例２６：ＥＧＦＲを用いた大腸がんの診断
図２６は、抗ＣＡＩＸ抗体でコーティングしたビーズを用いたエクソソームの免疫分離の後に、ＨＤ患者および大腸がん（ＣＲＣ）患者の試料から抽出したＲＮＡに対するリアルタイムＰＣＲによるＥＧＦＲ ＷＴメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の定量分析の結果を示す。先述されるように、０のＺスコア値を診断の閾値として用いた。５個のＨＤ血漿試料のうち５個（１００％）が負のＺスコアを有し、がん陰性とみなされた。５個のＣＲＣ血漿試料のうち３個（６０％）が正のＺスコアを有し、がん陽性とみなされた。全体としてこれらのデータは、健常者とＣＲＣ患者を判別するための診断の閾値が、ＰＣＲの読み出しとしてＢＲＡＦ ＷＴ遺伝子の代わりにＥＧＦＲ ＷＴ ｍＲＮＡを用いて生成され得ることを示す。
【０１１８】
実施例２７：ＨＥＲＶ−Ｗを用いた大腸がんの診断
図２７は、抗ＣＡＩＸ抗体でコーティングしたビーズを用いたエクソソームの免疫分離の後に、ＨＤ患者および大腸がん（ＣＲＣ）患者の試料から抽出したＲＮＡに対するリアルタイムＰＣＲによるＨＥＲＶ−Ｗレトロトランスポゾン因子の定量分析の結果を示す。先述されるように、０のＺスコア値を診断の閾値として用いた。８個のＨＤ血漿試料のうち６個（７５％）が負のＺスコアを有し、がん陰性とみなされた。５個のＣＲＣ血漿試料のうち４個（８０％）が正のＺスコアを有し、がん陽性とみなされた。全体としてこれらのデータは、健常者とＣＲＣ患者を判別するための診断の閾値が、ＰＣＲの読み出しとしてＢＲＡＦ ＷＴ遺伝子の代わりにＲＮＡ上のＨＥＲＶ−Ｗレトロトランスポゾンを用いて生成され得ることを示す。
【０１１９】
実施例２８：ＬＩＮＥを用いた乳がんの診断
図２８は、抗ＣＡＩＸ抗体でコーティングしたビーズを用いたエクソソームの免疫分離の後に、ＨＤ患者および乳がん患者の試料から抽出したＲＮＡに対するリアルタイムＰＣＲによるＬＩＮＥレトロトランスポゾン因子の定量分析の結果を示す。先述されるように、０のＺスコア値を診断の閾値として用いた。１５個のＨＤ血漿試料のうち１２個（８０％）が正のＺスコアを有し、がん陰性とみなされた。８個の乳がん血漿試料のうち５個（６２％）が負のＺスコアを有し、がん陽性とみなされた。全体としてこれらのデータは、健常者と乳がん患者を判別するための診断の閾値が、ＰＣＲの読み出しとしてＢＲＡＦ ＷＴ遺伝子の代わりにＲＮＡ由来のＬＩＮＥレトロトランスポゾン因子を用いて生成され得ることを示す。
【０１２０】
実施例２９：ＨＥＲＶ−Ｗを用いた黒色腫の診断
図２９は、抗ＣＡＩＸ抗体でコーティングしたビーズを用いたエクソソームの免疫分離の後に、ＨＤ患者および黒色腫患者の試料から抽出したＲＮＡに対するリアルタイムＰＣＲによるＨＥＲＶ−Ｗレトロトランスポゾン因子の定量分析の結果を示す。先述されるように、０のＺスコア値を診断の閾値として用いた。３個のＨＤ血漿試料のうち２個（６６％）が負のＺスコアを有し、がん陰性とみなされた。４個の黒色腫血漿試料のうち４個（１００％）が正のＺスコアを有し、がん陽性とみなされた。全体としてこれらのデータは、健常者と黒色腫患者を判別するための診断の閾値が、ＰＣＲの読み出しとしてＢＲＡＦ ＷＴ遺伝子の代わりにＲＮＡ由来のＨＥＲＶ−Ｗレトロトランスポゾン因子を用いて生成され得ることを示す。
【０１２１】
実施例３０：ＨＥＲＶ−Ｗを用いた卵巣がんの診断
図３０は、抗ＣＡＩＸ抗体でコーティングしたビーズを用いたエクソソームの免疫分離の後に、ＨＤ患者および卵巣がん患者の試料から抽出したＲＮＡに対するリアルタイムＰＣＲによるＨＥＲＶ−Ｗレトロトランスポゾン因子の定量分析の結果を示す。先述されるように、０のＺスコア値を診断の閾値として用いた。３個のＨＤ血漿試料のうち２個（６６％）が負のＺスコアを有し、がん陰性とみなされた。２個の卵巣がん血漿試料のうち２個（１００％）が正のＺスコアを有し、がん陽性とみなされた。全体としてこれらのデータは、健常者と卵巣がん患者を判別するための診断の閾値が、ＰＣＲの読み出しとしてＢＲＡＦ ＷＴ遺伝子の代わりにＲＮＡ由来のＨＥＲＶ−Ｗレトロトランスポゾン因子を用いて生成され得ることを示す。
【０１２２】
実施例３１：ＡＲ−ＷＴを用いた前立腺がんの診断
図３１は、抗ＣＡＩＸ抗体でコーティングしたビーズを用いたエクソソームの免疫分離の後に、ＨＤ患者および前立腺がん患者の試料から抽出したＲＮＡに対するリアルタイムＰＣＲによるアンドロゲン受容体（ＡＲ）−ＷＴ遺伝子の定量分析の結果を示す。先述されるように、０のＺスコア値を診断の閾値として用いた。１個のＨＤ血漿試料のうち１個（１００％）が正のＺスコアを有し、がん陰性とみなされた。１５個の前立腺がん血漿試料のうち１２個（８０％）が負のＺスコアを有し、がん陽性とみなされた。全体としてこれらのデータは、健常者と前立腺がん患者を判別するための診断の閾値が、ＰＣＲの読み出しとしてＢＲＡＦ ＷＴ遺伝子の代わりにＲＮＡ由来のＡＲ−ＷＴ遺伝子を用いて生成され得ることを示す。
【０１２３】
実施例３２：ＡＲ−Ｖ７を用いた前立腺がんの診断
図３２は、抗ＣＡＩＸ抗体でコーティングしたビーズを用いたエクソソームの免疫分離の後に、ＨＤ患者および前立腺がん患者の試料から抽出したＲＮＡに対するリアルタイムＰＣＲによるアンドロゲン受容体スプライシングバリアント７（ＡＲ−Ｖ７）遺伝子の定量分析の結果を示す。先述されるように、０のＺスコア値を診断の閾値として用いた。１個のＨＤ血漿試料のうち１個（１００％）が正のＺスコアを有し、がん陰性とみなされた。ＡＲ阻害剤に応答した６人の前立腺がん患者のうち４人（６７％）が負のＺスコアを有し、真の応答者であるとみなされた。ＡＲ阻害剤に応答しなかった１０個の前立腺がん血漿試料のうち５個（５０％）が正のＺスコアを有し、真の非応答者であるとみなされた。全体としてこれらのデータは、健常者および前立腺がん患者の応答者とがん患者の非応答者を判別するための診断の閾値が、ＲＮＡ由来のＡＲ−Ｖ７遺伝子を用いて生成され得ることを示す。
【０１２４】
実施例３３：ＬＩＮＥを用いた膀胱がんの診断
図３３は、抗ＣＡＩＸ抗体でコーティングしたビーズを用いたエクソソームの免疫分離の後に、ＨＤ患者および膀胱がん患者の試料から抽出したＤＮＡに対するリアルタイムＰＣＲによるＬＩＮＥレトロトランスポゾン因子の定量分析の結果を示す。先述されるように、０のＺスコア値を診断の閾値として用いた。２個のＨＤ尿試料のうち２個（１００％）が正のＺスコアを有し、がん陰性とみなされた。４個の膀胱がん尿試料のうち３個（７５％）が負のＺスコアを有し、がん陽性とみなされた。全体としてこれらのデータは、健常者と膀胱がん患者を判別するための診断の閾値が、ＬＩＮＥレトロトランスポゾン因子を用いて生成され得ることを示す。
【０１２５】
実施例３４：ＨＥＲＶ−Ｗを用いた膀胱がんの診断
図３４は、抗ＣＡＩＸ抗体でコーティングしたビーズを用いたエクソソームの免疫分離の後に、ＨＤ患者および膀胱がん患者の試料から抽出したＤＮＡに対するリアルタイムＰＣＲによるＨＥＲＶ−Ｗレトロトランスポゾン因子の定量分析の結果を示す。先述されるように、０のＺスコア値を診断の閾値として用いた。２個のＨＤ尿試料のうち２個（１００％）が正のＺスコアを有し、がん陰性とみなされた。４個の膀胱がん尿試料のうち３個（７５％）が負のＺスコアを有し、がん陽性とみなされた。全体としてこれらのデータは、健常者と膀胱がん患者を判別するための診断の閾値が、ＨＥＲＶ−Ｗレトロトランスポゾン因子を用いて生成され得ることを示す。
【０１２６】
実施例３５：ｃ−Ｍｙｃを用いた膀胱がんの診断
図３５は、抗ＣＡＩＸ抗体でコーティングしたビーズを用いたエクソソームの免疫分離の後に、ＨＤ患者および膀胱がん患者の試料から抽出したＤＮＡに対するリアルタイムＰＣＲによるｃ−Ｍｙｃ遺伝子の定量分析の結果を示す。先述されるように、０のＺスコア値を診断の閾値として用いた。２個のＨＤ尿試料のうち２個（１００％）が正のＺスコアを有し、がん陰性とみなされた。４個の膀胱がん尿試料のうち３個（７５％）が負のＺスコアを有し、がん陽性とみなされた。全体としてこれらのデータは、健常者と膀胱がん患者を判別するための診断の閾値が、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子を用いて生成され得ることを示す。
【０１２７】
実施例３６：ＬＩＮＥを用いた膀胱がんの診断
図３６は、抗ＣＡＩＸ抗体でコーティングしたビーズを用いたエクソソームの免疫分離の後におけるＨＤ患者および膀胱がん患者の試料からのリアルタイムＰＣＲによるＬＩＮＥレトロトランスポゾン因子ＲＮＡの定量分析の結果を示す。先述されるように、０のＺスコア値を診断の閾値として用いた。２個のＨＤ尿試料のうち２個（１００％）が正のＺスコアを有し、がん陰性とみなされた。４個の膀胱がん尿試料のうち３個（７５％）が負のＺスコアを有し、がん陽性とみなされた。全体としてこれらのデータは、健常者と膀胱がん患者を判別するための診断の閾値が、ＬＩＮＥレトロトランスポゾン因子を用いて生成され得ることを示す。
【０１２８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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