(57)【要約】  本発明は、医薬としての使用のための、コアを含んでなるナノ粒子であって、前記コアが、非架橋アルブミンマトリックスおよびモノクローナル抗体を含んでなり、非イオン性ポリマーでコーティングされていてもよい前記ナノ粒子、前記ナノ粒子を含んでなる医薬組成物、ならびに癌および眼疾患の治療におけるそれらの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬における使用のためのナノ粒子であって、
前記ナノ粒子が、ソリッドコアを含んでなり、
前記ソリッドコアが、非架橋アルブミンマトリックスおよびモノクローナル抗体を含んでなり、
前記モノクローナル抗体が、前記アルブミンマトリックス全体に分布しており、
前記ソリッドコアが、非イオン性ポリマーでコーティングされていてもよい、前記ナノ粒子。
【請求項２】
前記ソリッドコアがコーティングされている場合、非イオン性ポリマーではない任意の他のポリマーコーティングが前記ナノ粒子に存在しない、請求項１に記載の使用のためのナノ粒子。
【請求項３】
前記モノクローナル抗体／アルブミン重量比率が、０．０１〜０．５の範囲である、請求項１〜２のいずれか一項に記載の使用のためのナノ粒子。
【請求項４】
前記非イオン性ポリマー／アルブミン比率が、０．０２〜５（ｗ／ｗ）の範囲である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用のためのナノ粒子。
【請求項５】
前記アルブミンが、ヒト血清アルブミンまたはウシ血清アルブミンである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用のためのナノ粒子。
【請求項６】
前記モノクローナル抗体が、ベバシズマブ、ラニビズマブ、トラスツズマブ、セツキシマブおよびリツキシマブから選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用のためのナノ粒子。
【請求項７】
前記非イオン性ポリマーが、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシ−ｎ−プロピルセルロース、ヒドロキシ−ｎ−ブチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、およびエチルヒドロキシエチルセルロースから選択される水溶性セルロース；デンプン；デキストラン；ポリビニルピロリドン、商品名Ｅｕｄａｇｒｉｔの化合物から選択されるポリエステル；またはポリアルキレングリコールである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用のためのナノ粒子。
【請求項８】
以下の工程：
ａ）アルブミンおよびモノクローナル抗体の水溶液を調製する工程；
ｂ）工程ａ）の水溶液をｐＨ４〜５に滴定する工程；
ｃ）工程ｂ）の水溶液に脱溶媒和剤を添加して、アルブミン−モノクローナル抗体ナノ粒子を形成する工程；
ｄ）所望により、工程ｃ）で形成されたアルブミン−モノクローナル抗体ナノ粒子を非イオン性ポリマーとともにインキュベートする工程；および、所望により、
ｅ）前記ナノ粒子を真空乾燥、噴霧乾燥または凍結乾燥によって乾燥させる工程
を含んでなる方法によって得られる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用のためのナノ粒子。
【請求項９】
ソリッドコアを含んでなるナノ粒子であって、
前記ソリッドコアが、非架橋アルブミンマトリックスおよびモノクローナル抗体を含んでなり、
前記モノクローナル抗体が、前記アルブミンマトリックス全体に分布しており、
前記ソリッドコアが、非イオン性ポリマーでコーティングされている、前記ナノ粒子。
【請求項１０】
複数のナノ粒子；および
薬学上許容可能な賦形剤、担体またはビヒクル
を含んでなる医薬組成物であって、
前記ナノ粒子が、非架橋アルブミンマトリックスおよびモノクローナル抗体を含んでなるソリッドコアを含んでなり、
前記モノクローナル抗体が、前記アルブミンマトリックス全体に分布しており、
前記ソリッドコアが、非イオン性ポリマーでコーティングされていてもよい、前記医薬組成物。
【請求項１１】
前記ナノ粒子が、乾燥粉末の形態である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
薬学上許容可能な前記賦形剤、担体またはビヒクルが、経口、局所または非経口投与に好適である、請求項１０または１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
眼疾患の治療における使用のためのナノ粒子であって、
前記ナノ粒子が、非架橋アルブミンマトリックスおよびモノクローナル抗体を含んでなるソリッドコアを含んでなり、
前記モノクローナル抗体が、前記アルブミンマトリックス全体に分布しており、
前記ソリッドコアが、任意のポリマーでコーティングされていてもよい、前記ナノ粒子。
【請求項１４】
前記眼疾患が、黄斑変性、角膜血管新生または血管形成、虹彩血管新生または血管形成、網膜血管新生または血管形成、糖尿病性増殖網膜症、非糖尿病性増殖網膜症、緑内障、感染性結膜炎、アレルギー性結膜炎、潰瘍性角膜炎、非潰瘍性角膜炎、上強膜炎、強膜炎、糖尿病性網膜症、ブドウ膜炎、眼内炎、感染状態および炎症状態から選択される、請求項１３に記載の使用のためのナノ粒子。
【請求項１５】
癌の治療における使用のためのナノ粒子であって、
前記ナノ粒子が、非架橋アルブミンマトリックスおよびモノクローナル抗体を含んでなるソリッドコアを含んでなり、
前記モノクローナル抗体が、前記アルブミンマトリックス全体に分布しており、
前記ソリッドコアが、非イオン性ポリマーでコーティングされていてもよい、前記ナノ粒子。
【請求項１６】
癌が、乳癌、肺癌、膵臓癌、多発性骨髄腫、腎細胞癌、前立腺癌、黒色腫、結腸癌、結腸直腸癌、腎臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、腎癌および胃癌、膀胱癌または扁平上皮癌である、請求項１５に記載の使用のためのナノ粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナノサイズ薬物送達システム、より詳細には、癌および眼疾患の治療で使用される、アルブミンおよびモノクローナル抗体のマトリックスを含有するナノ粒子に関する。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体は、癌、自己免疫疾患および慢性炎症性疾患などの種々の治療領域で、また、移植拒絶の治療でも使用される、興味深い糖タンパク質群として登場した。現時点では、規制当局（ＦＤＡおよびＥＭＥＡ）によって承認されているおよそ３０種のモノクローナル抗体が存在する。
【０００３】
これらのモノクローナル抗体の１種は、ＶＥＧＦ−Ａ（血管内皮細胞増殖因子）を標的とし、ＶＥＧＦの４つの主要なアイソフォームを含む免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）であるベバシズマブである。ベバシズマブは、２００４年にＦＤＡにより転移性結腸直腸癌の第一選択治療として承認され、その後、非小細胞肺癌または転移性乳癌のような他の癌でも承認された。最近、ベバシズマブは、角膜または網膜の血管新生、糖尿病性網膜症および加齢黄斑変性症を含む眼疾患の治療で使用され始めている。
【０００４】
眼の表面への局所適用は、薬物投与の一般的な経路である。しかしながら、防御機構（瞬目(slinking)、流涙および排液）は、処方物を迅速に除去することにより薬物のバイオアベイラビリティを低下させる。過去数年間、ベバシズマブの硝子体内注射は、滲出型の加齢黄斑変性症、増殖性糖尿病性網膜症および脈絡膜血管新生に対する非常に効率的な治療であることが見出されている。短期結果は、硝子体内ベバシズマブは、忍容性が良好で、ほとんどの患者で視力の改善、網膜の厚さの減少および血管造影の漏出の減少を伴うことを示唆した。しかしながら、視力の改善を達成し維持するためには、反復注射および経過観察の訪問が必要である。これは、眼内炎などの合併症の高いリスク浮くならびに眼への針の挿入に関連した疼痛、不安および苦痛の繰り返しを伴う。さらに、注射されたベバシズマブの硝子体内半減期はおよそ３日にすぎない。
【０００５】
癌療法の場合、現在の治療戦略は、通常、外科手術による切除の前に腫瘍を縮小させるための化学療法用のカテーテルの適用を含む侵入的処理を伴う。癌療法の有効性を向上させるための研究努力により、患者の生存率には実質的に改善がもたらされたものの有害な副作用および患者の生活の質の低さに関連する問題は依然として大きな問題である。
【０００６】
従って、ベバシズマブならびに他のモノクローナル抗体の送達を、癌および眼疾患の治療のために、低侵襲性で長時間効果のあるものにするために、効果的な薬物送達法を開発する必要がある。
【０００７】
この意味で、ナノ粒子は、薬物投与に好適なビヒクルとして登場し、眼科分野ならびに癌療法において有望な結果をもたらしている。そのようなナノサイズ送達システムの作製に使用することができる多種多様な材料がある。例えば、モノクローナル抗体ベバシズマブは、加齢黄斑変性症の治療[Hao et al., American Association of Pharmaceutical Scientists (AASP) Annual Meeting and Exposition, Los Angeles, California, November 2009; Li, F. et al., The Open Ophthalmology Journal, 2012, 6, 54-58]、ならびに網膜および脈絡膜の血管新生の治療[Pan CK et al., J. Ocul. Pharmacol. Ther., 2011, 27(3), 219-224; Varshochian, R. et al., European Journal of Pharmaceutical Sciences, 2013, 50, 341-352]のために、ＰＬＧＡのナノ粒子に組み込まれている。
【０００８】
しかしながら、合成材料よりも天然の生体高分子が好ましい。これに関連して、生体適合性、生分解性、非毒性および非免疫原性であるという事実から、薬物送達用ナノ粒子の調製にはヒト血清アルブミンが広く使用されている。アルブミンナノ粒子は、様々な薬物の結合能力が高いことと深刻な副作用がなく忍容性が良好であることから大きな注目を集めている。
【０００９】
この数年に、熱ゲル化、乳化および脱溶媒和（コアセルベーション）を含む、アルブミンナノ粒子の調製のための極めて多様な物理化学的プロセスが提案されてきた。いずれの場合でも、脱溶媒和に基づく手順が、それらの単純さと再現性から、最も人気があるようである。しかしながら、得られたばかりのナノ粒子は不安定であり、水性環境での半減期を延ばすため、かつ／またはタンパク質の大集塊の形成を防ぐために、物理的、化学的または酵素的安定化の補足工程を実施する必要がある。
【００１０】
一般的に、アルブミンの架橋は、アルブミンナノ粒子の安定化のための最もポピュラーな戦略の１つである。Elzoghby et al. [Journal of Controlled Release, 2012, 157, 168-182]は、アルブミンナノ粒子を調製するための種々の方法と、能動的薬物送達システムとしてのそれらの使用をまとめている。ナノ粒子が架橋されることを必要とする水性媒体中のナノ粒子の不安定性について特に言及されており、当技術分野で使用される一般的な化学架橋剤としてグルタルアルデヒドが挙げられている。また、Lohcharoenkal, W. et al. [BioMed Research International, 2014]は、アルブミンナノ粒子が溶解または合体して、架橋されない場合は別の相を形成する際のアルブミンナノ粒子の不安定性について言及している。Llabot et al. [19th International Symposium on Microencapsulation, 2013]は、ベバシズマブを封入するガントレッツと架橋されたアルブミンナノ粒子、ならびに角膜の血管形成におけるそれらの使用を記載している。
【００１１】
従って、架橋はアルブミンナノ粒子を安定化し、酵素分解ならびにナノ粒子からの有効成分の送達を低減する。
【００１２】
しかしながら、グルタルアルデヒドはナノ粒子の安定化に非常に効果的であるが、主にｉｎ  ｖｉｖｏ送達のためのその使用を妨げる毒性のため、その使用には問題がある。従って、架橋剤を可能な限り完全に除去することが不可欠である。さらに、グルタルアルデヒドは、ナノ粒子内の生体高分子、より詳細には、タンパク質薬物、抗体およびペプチドの安定性に影響を与える可能性があり、これは、グルタルアルデヒドがそれらの高分子中に存在する官能基（第一級アミン残基など）と反応し、それらの活性の重大な損失をもたらすためである。
【００１３】
この重大な欠点を解決するために、有毒な試薬を使用する必要なく、形成されたばかりのアルブミンナノ粒子を硬化または安定化するための種々の戦略が提案されている。とりわけ、ナノ粒子の安定化は、熱処理、高い動水圧またはゲニピンもしくはトランスグルタミナーゼでの酵素的架橋によって得ることができる。
【００１４】
アルブミンナノ粒子を安定化するために、表面コーティングも使用されている。例えば、ポリリジンまたはポリエチレンイミンなどの陽イオン性ポリマーを使用して、ウシ血清アルブミンナノ粒子をコーティングし、それらの安定性を改善している[Wang et al., Pharm. Res., 2008, 25(12), 2896-2909]。
【００１５】
ＷＯ２０１３／０４２１２５には、ベバシズマブが組み込まれたグルタルアルデヒド架橋ウシ血清アルブミンナノスフェアの調製と、その後の、イオン性ＰＬＧＡ被覆内への前記ナノスフェアの封入が記載されている。
【００１６】
ＷＯ２０１１／０５３８０３にはまた、眼疾患を治療するためのベバシズマブなどの治療薬を封入するポリマーシェルを有するナノ粒子が言及されている。
【００１７】
上記総てを考慮すると、モノクローナル抗体の完全性および活性を保存し、ナノ粒子からのその放出を制御する適切な送達システムが必要である。
【発明の概要】
【００１８】
発明の簡単な説明
本発明者らは、ベバシズマブなどのモノクローナル抗体をアルブミンのマトリックス内へ閉じ込めることによって水溶液中で高い安定性を有するナノ粒子を提供し、驚くべきことに、前記ナノ粒子は他の手段により架橋または安定化する必要がなく、従って、一度送達された抗体の３Ｄ構造ならびに生物活性の維持が可能になることを見出した。それどころか、以下の実験部分で示されるように、グルタルアルデヒド（アルブミンのナノ粒子を安定化するために先行技術で使用された最も一般的な架橋剤）の使用により抗体が不活性化され、従って、これらの種類の有効成分の封入に関する架橋ナノ粒子の使用は実現不可能になる。
【００１９】
本発明者らはまた、非イオン性ポリマー、そのようなヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣ−Ｐ）およびポリエチレングリコール３５，０００（ＰＥＧ３５）、ならびにＥｕｄａｇｒｉｔ（登録商標）Ｓ−１００で修飾された非架橋ナノ粒子を試験し、抗体の完全性も維持されることを観察した。
【００２０】
それに加えて、本明細書で以下に記載する方法に従って、モノクローナル付加アルブミンナノ粒子は、水または水溶液を単純に添加することによりすぐに分散および再構成できる乾燥粉末として製造することができる。
【００２１】
さらに、本発明のナノ粒子は、モノクローナル抗体の持続放出を可能にし、角膜血管新生動物モデルで得られた生物活性データによって指摘されるように、ｉｎ  ｖｉｖｏ用途に重要な薬物送達システムを構成する。
【００２２】
また、非イオン性ポリマーでコーティングされたアルブミンナノ粒子を用いて実施された体内分布アッセイにより、それらが腫瘍組織に濃縮可能であることが指摘されていることから、このアルブミンナノ粒子は、モノクローナル抗体を罹患組織に放出するための非常に有望なナノ粒子システムとなる。
【００２３】
実際、ｉｎ  ｖｉｖｏ試験では、水溶液中の同じモノクローナル抗体の投与と比較すると、血清中に存在する前記抗体の濃度が低くなっているため、本発明のナノ粒子は、腫瘍組織にモノクローナル抗体を放出可能であることが示された。さらに、腫瘍体積は大幅に減少する。
【００２４】
従って、本発明の第一の側面は、医薬における使用のためのナノ粒子であって、前記ナノ粒子が、ソリッドコアを含んでなり、前記ソリッドコアが、非架橋アルブミンマトリックスおよびモノクローナル抗体を含んでなり、前記モノクローナル抗体が、前記アルブミンマトリックス全体に分布しており、前記ソリッドコアが、非イオン性ポリマーでコーティングされていてもよい、医薬における使用のためのナノ粒子に関する。
【００２５】
本発明の第二の側面は、複数のナノ粒子；および薬学上許容可能な賦形剤、担体またはビヒクルを含んでなる医薬組成物であって、前記ナノ粒子が、非架橋アルブミンマトリックスおよびモノクローナル抗体を含んでなるソリッドコアを含んでなり、前記モノクローナル抗体が、前記アルブミンマトリックス全体に分布しており、前記ソリッドコアが、非イオン性ポリマーでコーティングされていてもよい、医薬組成物に関する。
【００２６】
別の側面では、本発明は、医薬における使用のための本発明の医薬組成物に関する。
【００２７】
本発明のさらなる側面は、眼疾患の治療における使用のためのナノ粒子であって、前記ナノ粒子が、ソリッドコアを含んでなり、前記ソリッドコアが、非架橋アルブミンマトリックスおよびモノクローナル抗体を含んでなり、前記モノクローナル抗体が、前記アルブミンマトリックス全体に分布しており、前記ソリッドコアが、非イオン性ポリマーでコーティングされていてもよい、眼疾患の治療における使用のためのナノ粒子である。
【００２８】
本発明の別の側面は、癌の治療における使用のためのナノ粒子であって、前記ナノ粒子が、ソリッドコアを含んでなり、前記ソリッドコアが、非架橋アルブミンマトリックスおよびモノクローナル抗体を含んでなり、前記モノクローナル抗体が、前記アルブミンマトリックス全体に分布しており、前記ソリッドコアが、非イオン性ポリマーでコーティングされていてもよい、癌の治療における使用のためのナノ粒子である。
【００２９】
最後に、本発明の別の側面は、ソリッドコアを含んでなるナノ粒子であって、前記ソリッドコアが、非架橋アルブミンマトリックスおよびモノクローナル抗体を含んでなり、前記モノクローナル抗体が、前記アルブミンマトリックス全体に分布しており、前記ソリッドコアが、非イオン性ポリマーでコーティングされている、ナノ粒子に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】得られるナノ粒子の積載に対するベバシズマブ／アルブミン比率の影響。ナノ粒子は、モノクローナル抗体とタンパク質を１０分間インキュベーションした後に調製した。データは平均±ＳＤ（ｎ＝３）として表している。
【図２】ベバシズマブ付加アルブミンナノ粒子（Ｂ−ＮＰ）のＴＥＭ写真。
【図３】Ａ）ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、グルタルアルデヒド（ＧＬＵ）、ＨＳＡとグルタルアルデヒドの物理的混合物（ＨＳＡ−ＧＬＵ）、およびグルタルアルデヒドと架橋しているナノ粒子（ＮＰ−ＧＬＵ）のＦＴ−ＩＲスペクトル。Ｂ）ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ベバシズマブ（ＢＥＶＡ）、ＨＳＡとベバシズマブの物理的混合物（ＨＳＡ−ＢＥＶＡ）、およびベバシズマブ付加ナノ粒子（Ｂ−ＮＰ）のＦＴ−ＩＲスペクトル。
【図４】ベバシズマブ（ＢＥＶＡ）、ベバシズマブ付加ナノ粒子（Ｂ−ＮＰ）およびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のＸ線スペクトル。
【図５】Ａ）天然ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）およびベバシズマブ（ＢＥＶＡ）；Ｂ）ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）とベバシズマブ（ＢＥＶＡ）の物理的混合物（ＰＭ）およびベバシズマブ付加アルブミンナノ粒子（Ｂ−ＮＰ）；Ｃ）天然ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）およびグルタルアルデヒド（ＧＬＵ）；Ｄ）ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）とグルタルアルデヒド（ＧＬＵ）の物理的混合物（ＰＭ）およびグルタルアルデヒドと架橋しているアルブミンナノ粒子（ＮＰ−ＧＬＵ）のＤＴＡサーモグラム。
【図６】ｐＨ７．４の水溶液に分散させた後のグルタルアルデヒドと架橋している空のナノ粒子（ＮＰ−ＧＬＵ）およびベバシズマブ付加ナノ粒子（Ｂ−ＮＰ）の平均サイズの進展。データは平均±ＳＤ（ｎ＝３）として表している。
【図７】ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中でのインキュベーション後のヒト血清アルブミンナノ粒子からのベバシズマブ放出プロフィール。データは平均±ＳＤ（ｎ＝３）として表している。
【図８】ＰＥＧ３５でペグ化されたベバシズマブ付加アルブミンナノ粒子（Ｂ−ＮＰ−ＰＥＧ３５）のＴＥＭマイクロ写真。
【図９】ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中でのインキュベーション後のアルブミンナノ粒子からのベバシズマブ放出プロフィール(・・・- - -)ベバシズマブ付加ＮＰ（Ｂ−ＮＰ）；(−)ＰＥＧ３５でコーティングされたベバシズマブ付加ＮＰ（Ｂ−ＮＰ−ＰＥＧ３５）；(・・・)Ｅｕｄａｇｒｉｔ（登録商標）Ｓ−１００でコーティングされたベバシズマブ付加ＮＰ（Ｂ−ＮＰ−Ｓ−１００）；(- - -)ＨＰＭＣ−Ｐでコーティングされたベバシズマブ付加ＮＰ（Ｂ−ＮＰ−ＨＰＭＣ−Ｐ）。データは平均±ＳＤ（ｎ＝３）として表している。
【図１０】ナノ粒子のマイクロ流体工学に基づく自動電気泳動（Ｌ：ラダー；１：ＰＥＧ３５でコーティングされた空のナノ粒子（ＮＰ−ＰＥＧ３５）；２：ベバシズマブ付加アルブミンナノ粒子（Ｂ−ＮＰ）；３：ＰＥＧ３５でコーティングされたベバシズマブ付加アルブミンナノ粒子（Ｂ−ＮＰ−ＰＥＧ３５）；４：ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）；５：ベバシズマブ)。
【図１１】ウィスターラットへの眼投与後の、９９ｍＴｃ標識Ｂ−ＮＰ−ＰＥＧ３５（下段）と比較した９９ｍＴｃ標識Ｂ−ＮＰ（上段）のｉｎ  ｖｉｖｏ  ＳＰＥＣＴ−ＣＴ画像。各段の画像は、図に示されている時点で調査された同じ動物に対応している。活性は眼投与後４時間〜８時間で消失するが、Ｂ−ＮＰ−ＰＥＧ３５では少なくとも８時間、眼に残っている。
【図１２】９９ｍＴｃ−Ｂ−ＮＰナノ粒子の眼投与後の異なる部位での放射能量の進展についての時間放射能曲線。関心体積(Volumes of interest)（ＶＯＩ）は、グラフに示された部分に設定され、平均値カウントは各ＶＯＩから得、データは減衰補正されプロットされた。
【図１３】ウィスターラットへの静脈内投与後の、９９ｍＴｃ標識Ｂ−ＮＰ−ＰＥＧ３５（下段）と比較した９９ｍＴｃ標識Ｂ−ＮＰ（上段）のｉｎ  ｖｉｖｏ  ＳＰＥＣＴ−ＣＴ画像。各段の画像は、図に示されている時点で調査された同じ動物に対応している。
【図１４】０時間（０日目）および２４時間（１日目）の最初の治療で起こる角膜の腐食を示すタイムラインの概略図。
【図１５】以下で治療した動物の角膜の写真：（Ａ）生理的血清［対照（−）］；（Ｂ）アバスチン（登録商標）（４ｍｇ／ｍＬベバシズマブ）；（Ｃ）ベバシズマブ付加アルブミンナノ粒子（Ｂ−ＮＰ）；（Ｄ）ＰＥＧ３５，０００でコーティングされたベバシズマブ付加アルブミンナノ粒子（Ｂ−ＮＰ−ＰＥＧ３５）；（Ｅ）：ヒト血清アルブミン溶液（ＨＳＡ）；（Ｆ）：アイリーア（登録商標）（ＥＹＬＥＡ）；（Ｇ）：デキサメタゾン（ＤＥＸＡ）。
【図１６】火傷により影響を受けた角膜面積のパーセンテージとして表される傷害面積。異なる群の傷害間に統計的な有意差は見られなかった。データは平均±ＳＤ（ｎ＝９）として示されている。
【図１７】浸潤面積（ＩＡ）、血管が存在する角膜面積の分率。データは平均±ＳＤ（ｎ＝９）として示されている。＊ｐ＜０．０１  対照（−）と有意に異なるＡＮＯＶＡとその後のテューキー検定＊＊ｐ＜０．０１  ＢＥＶＡと有意に異なるＡＮＯＶＡとその後のテューキー検定＊＊＊ｐ＜０．００５  Ｂ−ＮＰと有意に異なるＡＮＯＶＡとその後のテューキー検定
【図１８】傷害によって正規化した血管新生面積。データは平均±ＳＤ（ｎ＝９）として示されている。＊ｐ＜０．０１  対照（−）と有意に異なるＡＮＯＶＡとその後のテューキー検定＊＊ｐ＜０．００５  ＢＥＶＡと有意に異なるＡＮＯＶＡとその後のテューキー検定
【図１９】ベバシズマブで処置した正常角膜および血管新生角膜の角膜切片の顕微鏡写真。（ｅ、上皮層；ｓ、間質；ａｃ、前房；ｖ、間質微小血管)。Ａ）無傷上皮（ｅ）を示すラット正常角膜の顕微鏡写真、扁平な角膜実質細胞が間に存在する規則的な平行コラーゲンラメラを含む間質；Ｂ）ベバシズマブ付加アルブミンナノ粒子（Ｂ−ＮＰ）で処置した群のラット角膜の顕微鏡写真。正常範囲内の角膜の厚さ、無傷上皮およびわずかに無秩序でゆるんでいるが浸潤はあまり目立たない間質。Ｃ）ＰＥＧ３５でコーティングされたベバシズマブ付加アルブミンナノ粒子（Ｂ−ＮＰ−ＰＥＧ３５）で処置した群のラット角膜の顕微鏡写真。正常な上皮、多数の間質微小血管（ｖ）。正常値内の角膜の厚さ；ＤおよびＥ）：ベバシズマブで処置した群のラット角膜の顕微鏡写真。上皮は維持されるが肥大し、間質から分離している。多数の無秩序な(desorganized)繊維芽細胞、強度の細胞浸潤および浮腫(eodema)（＊）による間質の肥大；Ｆ）生理的血清で処置した群のラット角膜の顕微鏡写真。角膜内の重大な変化、中心部のびらんおよび厚さの増加。大きな無秩序な繊維芽細胞、中程度の炎症性浸潤および血管新生（ｖ）を伴う強度の繊維症。異常な修復の試みを示す上皮細胞からの嚢胞（ｃ）形成。スケールバー、２００μｍ、Ｈ．Ｅ．×１００。
【図２０】ＰＥＧ３５でコーティングされたアルブミンナノ粒子（ＮＰ−ＰＥＧ３５）で処置した動物の脚部および頸部腫瘍の腫瘍対非腫瘍比。値は、放射性標識されたナノ粒子の静脈内（ｉ．ｖ．）投与の１時間後（青色バー）および４時間後（赤色バー）に得られた３体の動物からの平均値に対応する。
【図２１】腫瘍体積（ｍｍ３）。データは平均±ＳＤ（ｎ≧６）として示されている。＊ｐ＜０．０５  生理的血清と有意に異なるＡＮＯＶＡとその後のテューキー検定＊＊ｐ＜０．０１  生理的血清と有意に異なるＡＮＯＶＡとその後のテューキー検定
【図２２】ベバシズマブ血清濃度（μｇ／ｍＬ）対時間(日)。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
発明の詳細な説明
前述のように、本発明の第一の側面は、医薬における使用のためのナノ粒子であって、前記ナノ粒子が、ソリッドコアを含んでなり、前記ソリッドコアが、非架橋アルブミンマトリックスおよびモノクローナル抗体を含んでなり、前記モノクローナル抗体が、前記アルブミンマトリックス全体に分布しており、前記ソリッドコアが、非イオン性ポリマーでコーティングされていてもよい、医薬における使用のためのナノ粒子に関する。
【００３２】
特定の実施形態では、本発明は、医薬における使用のためのナノ粒子であって、前記ナノ粒子が、ソリッドコアを含んでなり、前記ソリッドコアが、非架橋アルブミンマトリックスおよびモノクローナル抗体からなり、前記モノクローナル抗体が、前記アルブミンマトリックス全体に分布しており、前記ソリッドコアが、非イオン性ポリマーでコーティングされていてもよい、医薬における使用のためのナノ粒子に関する。
【００３３】
別の特定の実施形態では、本発明は、医薬における使用のためのナノ粒子であって、前記ナノ粒子が、ソリッドコアからなり、前記ソリッドコアが、非架橋アルブミンマトリックスおよびモノクローナル抗体を含んでなり、前記モノクローナル抗体が、前記アルブミンマトリックス全体に分布しており、前記ソリッドコアが、非イオン性ポリマーでコーティングされていてもよい、医薬における使用のためのナノ粒子に関する。
【００３４】
別の特定の実施形態では、本発明は、医薬における使用のためのナノ粒子であって、前記ナノ粒子が、ソリッドコアからなり、前記ソリッドコアが、非架橋アルブミンマトリックスおよびモノクローナル抗体からなり、前記モノクローナル抗体が、前記アルブミンマトリックス全体に分布しており、前記ソリッドコアが、非イオン性ポリマーでコーティングされていてもよい、医薬における使用のためのナノ粒子に関する。
【００３５】
本明細書で使用される場合、用語「ナノ粒子」は、球形または準球形の形状を有し、平均サイズが１μｍ未満のコロイド系を指す。特定の実施形態では、ナノ粒子は、１００〜９００ｎｍ、より好ましくは１５０〜８００ｎｍ、さらに好ましくは２００〜５００ｎｍ、さらに好ましくは２００〜４００ｎｍの範囲の平均サイズを有する。
【００３６】
「平均サイズ」は、水性媒体中で一緒に移動するナノ粒子集団の平均直径として理解される。これらのシステムの平均サイズは、当業者に知られている、例えば、以下の実験部分で、記載されている標準的な方法により測定することができる。
【００３７】
本発明において、ナノ粒子という用語は、ナノスフェアまたは修飾されたナノスフェアを指す。
【００３８】
「ナノスフェア」は、モノクローナル抗体が該マトリックス全体に分布し、従って、明確なコア／シェル構造を特徴としない、アルブミンのソリッド非架橋マトリックスまたはアルブミンの連続材料と理解されるべきである。
【００３９】
「修飾されたナノスフェア」は、アルブミンのソリッド非架橋マトリックスが非イオン性ポリマーでコーティングされているかまたは修飾されている、上記で定義されたナノスフェアと理解されるべきである。
【００４０】
それに従って、本発明のナノ粒子は、非イオン性ポリマーではない任意の他のポリマーコーティングが存在しない。
【００４１】
好ましい実施形態では、本発明のナノ粒子は、ソリッドコアがコーティングされている場合に、非イオン性ポリマーではない任意の他のポリマーコーティングが存在しないナノ粒子である。本発明のナノ粒子はコーティングポリマーを必要としないが、本発明者らは、非イオン性ポリマーではない任意の他のポリマーコーティングが存在しない場合に、前記ナノ粒子が、イオン性コーティングが使用されたときの同じ粒子と比べて有利な効果を示すことを見出した。例えば、本発明のナノ粒子がイオン性ポリマーでコーティングされている場合、前記ナノ粒子は抗体の非常に速い放出プロフィール（バースト放出）を示す。
【００４２】
従って、本発明で使用されるナノ粒子が非イオン性ポリマーでコーティングされていない場合、前記ナノ粒子は、上記の定義によるナノスフェアとみなされるべきであり、本発明で使用されるナノ粒子が非イオン性ポリマーでコーティングされている場合、前記ナノ粒子は、上記の定義による修飾されたナノスフェアとみなされるべきである。
【００４３】
アルブミンマトリックスが他の手段によって架橋または安定化される先行技術で使用されるナノ粒子とは対照的に、本発明で使用されるナノ粒子は、アルブミンの非架橋マトリックスのソリッドコアを有することを特徴とし、アルブミンとモノクローナル抗体の局所的相互作用から生じるそのような組織化された構造またはパターンとして理解される。従って、本発明の範囲において、ナノ粒子はソリッドマトリックス系を形成している。
【００４４】
従って、用語「ソリッドコア」は、モノクローナル抗体がマトリックス全体に分布している、好ましくは均一に分布している連続構造をアルブミンが形成しているソリッド非架橋マトリックス型構造を指す。
【００４５】
従って、本発明で使用されるナノ粒子のソリッドコアは、外部構造と内部構造を区別しておらず、従って、モノクローナル抗体は、アルブミンのマトリックス全体に分布している、より好ましくは均一に分布しているが、その中心部空洞内に封入されておらずまたは閉じ込められていない。
【００４６】
特定の実施形態では、本発明で使用されるナノ粒子は、上記で定義されたナノスフェアである。より詳細には、前記ナノ粒子において、ソリッドコアは非イオン性ポリマーでコーティングされていない。本文全体に記載され、実施例にも示されているとおり、本発明のナノ粒子は安定しており、いかなる封入も必要としない。本発明において、用語「安定した」は、粒子がその材料の分解なしに医薬で使用することができるような粒子の安定性の増加を指す。従って、特定の実施形態では、本発明のナノ粒子は、任意選択のコーティングポリマーの存在の有無にかかわらず、安定したナノ粒子である。
【００４７】
別の特定の実施形態では、本発明で使用されるナノ粒子は、上記で定義された修飾されたナノスフェアであり、すなわち、アルブミンのソリッドマトリックスまたはアルブミンの連続材料のソリッドコアを含んでなるかまたはそれからなり、ここで、モノクローナル抗体が前記マトリックス全体に分布しており、前記ソリッドコアが非イオン性ポリマーでコーティングされている。
【００４８】
実際、本発明のさらなる側面は、ソリッドコアを含んでなるナノ粒子であって、前記ソリッドコアが、非架橋アルブミンマトリックスおよびモノクローナル抗体を含んでなり、前記モノクローナル抗体が、前記アルブミンマトリックス全体に分布しており、前記ソリッドコアが、非イオン性ポリマーでコーティングされている、ナノ粒子に関する。
【００４９】
より詳細には、本発明はまた、ソリッドコアを含んでなるナノ粒子であって、前記ソリッドコアが、非架橋アルブミンマトリックスおよびモノクローナル抗体からなり、前記モノクローナル抗体が、前記アルブミンマトリックス全体に分布しており、前記ソリッドコアが、非イオン性ポリマーでコーティングされている、ナノ粒子に関する。
【００５０】
さらに詳細には、本発明は、ソリッドコアからなるナノ粒子であって、前記ソリッドコアが、非架橋アルブミンマトリックスおよびモノクローナル抗体を含んでなり、前記モノクローナル抗体が、前記アルブミンマトリックス全体に分布しており、前記ソリッドコアが、非イオン性ポリマーでコーティングされている、ナノ粒子に関する。
【００５１】
さらに詳細には、本発明はまた、ソリッドコアからなるナノ粒子であって、前記ソリッドコアが、非架橋アルブミンマトリックスおよびモノクローナル抗体からなり、前記モノクローナル抗体が、前記アルブミンマトリックス全体に分布しており、前記ソリッドコアが、非イオン性ポリマーでコーティングされている、ナノ粒子に関する。
【００５２】
アルブミン
本明細書で使用される場合、用語「アルブミン」は、球状の、負電荷を帯びたタンパク質のファミリーを指し、その最も一般的なものは血清アルブミンである。アルブミンファミリーの総てのタンパク質は水溶性で、濃厚塩溶液に適度に溶け、熱変性を起こす。アルブミンは、一般的に血漿中に見られ、グリコシル化されていないという点で他の血液タンパク質とは異なる。
【００５３】
アルブミンの一般的な構造は、血圧の調節に不可欠な比較的固定された形状の維持を可能にする複数の長いαヘリックスを特徴とする。
【００５４】
特定の実施形態では、前記アルブミンは血清アルブミンである。血清アルブミンは、肝臓で生成され、血漿中に溶解している、哺乳類で最も豊富なタンパク質である。
【００５５】
より好ましくは、血清アルブミンはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）であり、さらに好ましくは、血清アルブミンはヒト血清アルブミンである。
【００５６】
ヒト血清アルブミンはＡＬＢ遺伝子によってコードされているが、ウシ血清アルブミンなどの他の哺乳類型は化学的に類似している。
【００５７】
ヒト血清アルブミンは、およそ６５．０００Ｄａの分子量を有し、５８５個のアミノ酸からなる。ＨＳＡのアミノ酸配列は、合計１７つのジスルフィド架橋、１つの遊離チオール（Ｃｙｓ３４）、および唯一のトリプトファン（Ｔｒｐ２１４）を含む。
【００５８】
モノクローナル抗体
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」（ｍＡｂまたはｍｏＡｂ）は、Ｂリンパ球の単一クローンによってまたは１種類の抗体分子だけを分泌するハイブリドーマと呼ばれる単細胞によって産生される抗体または抗体フラグメントを指す。モノクローナル抗体は、当業者に公知の方法により、例えば、抗体産生細胞と骨髄腫または他の自己貫入性(self-penetrating)細胞系統との融合からハイブリッド抗体形成細胞を作製することにより作出される。
【００５９】
モノクローナル抗体は、同じエピトープ（抗体によって認識される抗原の部分）に結合するという点で、一価の親和性を有する。ほとんど総ての物質を考えると、その物質に特異的に結合するモノクローナル抗体を作出することが可能である。
【００６０】
本発明の目的では、ナノ粒子のアルブミンマトリックスに組み込まれるモノクローナル抗体は、眼組織内もしくは癌性組織内の少なくとも１つの標的に対して親和性を有するか、または組織自体に対して親和性を有するべきである。例えば、標的は、眼障害もしくは癌に関連する受容体または眼障害もしくは癌に関連するタンパク質であり得る。
【００６１】
特定の実施形態では、前記モノクローナル抗体は、新しい血管の形成を刺激する「血管内皮細胞増殖因子」（ＶＥＧＦ）と呼ばれる天然タンパク質の機能を阻害するベバシズマブ（アバスチン（登録商標））；ＶＥＧＦ−Ａとの強い結合を提供するラニビズマブ（ルセンティス（登録商標））；固形腫瘍で過剰発現されるＨＥＲ-２受容体を認識するトラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））；ＥＧＦＲ受容体を認識するセツキシマブ（アービタックス（登録商標））およびＣＤ２０を認識するリツキシマブ（マブセラ（登録商標））から選択される。
【００６２】
好ましい実施形態では、１種以上の抗ＶＥＧＦ抗体（またはそのフラグメント）が、アルブミンマトリックスに組み込まれるように選択され、それによって、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）自体の標的化が可能になる。従って、好ましい実施形態では、前記モノクローナル抗体は、ベバシズマブおよびラニビズマブから選択され、より好ましくはベバシズマブである。
【００６３】
別の好ましい実施形態では、１種以上の抗ＶＥＧＦ  Ｒ２抗体（またはそのフラグメント）が、アルブミンマトリックスに組み込まれるように選択され、それによって、血管内皮細胞増殖因子受容体２（ＶＥＧＦ  Ｒ２）を発現する網膜色素上皮細胞などの細胞の標的化が可能になる。抗ＶＥＧＦ  Ｒ２モノクローナル抗体の例としては、限定されるものではないが、ｍＡｂクローンＡｖａｓ１２ａ１およびｍＡｂ  ２Ｃ３が挙げられる。
【００６４】
網膜色素上皮細胞などの上皮細胞によるＶＥＧＦおよびＶＥＧＦ  Ｒ２受容体の過剰発現は、例えば、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）と関連している。
【００６５】
別の好ましい実施形態では、前記モノクローナル抗体は眼標的薬剤、すなわち、眼障害に関係している眼組織によって産生されるかまたはその眼組織に関連する抗原に特異的な抗体である。
【００６６】
特定の実施形態では、前記モノクローナル抗体／アルブミン重量比率は、０．０１〜０．５、より好ましくは０．０１〜０．２の範囲である。モノクローナル抗体／アルブミン重量比率が０．０１未満のナノ粒子は経時的に安定していないことが観察されている。
【００６７】
非イオン性ポリマー
本明細書で使用される用語「非イオン性ポリマー」は、ナノ粒子の調製条件では正味電荷を示さない親水性ポリマーを指す。さらに、前記非イオン性ポリマーは、生分解性である、すなわち、ｉｎ  ｖｉｖｏ使用中に分解する必要があるだけでなく、生体適合性である、すなわち、実質的に非毒性であるかまたは接触する生体組織または生物系に対して有害な影響を与えない必要がある。
【００６８】
本発明における使用のために好適な非イオン性ポリマーの例は、ポリビニルアルコール；ポリビニルピロリドン；ポリアリルアルコール；ポリビニルメチルエーテル；ポリビニルアセタール；ポリアルキレンアルコール；少なくとも１つのアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アルコキシアルキル基、またはそのような基の２つ以上の組合せで置換されていてもよい多糖類；ポリエステル；ポリアミド、ポリウレタンおよびポリエーテルである。
【００６９】
好ましい多糖類としては、限定されるものではないが、キサンタンガム、グアーガム、デンプン、セルロース、デキストランおよび前述のものの２つ以上の組合せが挙げられる。
【００７０】
デンプンとしては、例えば、トウモロコシデンプンおよびヒドロキシプロピルデンプンが挙げられる。
【００７１】
セルロース(Cellullose)としては、例えば、メチルセルロース、エチルセルロースおよびｎ−プロピルセルロースを含むＣ１−Ｃ６−アルキルセルロースなどのアルキルセルロース；ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシ−ｎ−プロピルセルロース、ヒドロキシ−ｎ−ブチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、およびエチルヒドロキシエチルセルロースなどのヒドロキシ−Ｃ１−Ｃ６−アルキルセルロースおよびヒドロキシ−Ｃ１−Ｃ６−アルキル−Ｃ１−Ｃ６−アルキルセルロースを含む置換アルキルセルロースが挙げられる。
【００７２】
特定の実施形態では、前記非イオン性ポリマーは、多糖類、ポリビニルピロリドン、ポリエステルおよびポリアルキレングリコールから選択される。好ましくは、前記非イオン性ポリマーは、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシ−ｎ−プロピルセルロース、ヒドロキシ−ｎ−ブチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、およびエチルヒドロキシエチルセルロース；デンプン；デキストラン；商品名Ｅｕｄａｇｒｉｔの化合物から選択されるポリエステル；またはポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールなどのポリアルキレングリコール(a polylakylene glycol)から選択される水溶性セルロースである。
【００７３】
別の特定の実施形態では、前記非イオン性ポリマーは、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、デンプン、デキストラン７０、Ｅｕｄａｇｒｉｔ（登録商標）ＮＭ；Ｅｕｄａｇｒｉｔ（登録商標）ＮＥ、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）から選択される。ポリエチレングリコールは、好ましくは、その分子量に応じてＰＥＧ−１０，０００、ＰＥＧ−２０，０００またはＰＥＧ−３５，０００である。
【００７４】
好ましくは、前記非イオン性ポリマーは、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートおよびＰＥＧ３５，０００から選択される。より好ましくは、前記非イオン性ポリマーは、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートおよびＰＥＧ３５，０００から選択される。さらに好ましくは、前記非イオン性ポリマーはＰＥＧ３５，０００である。
【００７５】
前記非イオン性ポリマーは、アルブミンナノ粒子のコーティングとして働き、より大きな安定性を与え、一般的に、ナノ粒子中に付加されるモノクローナル抗体の量の増加を可能にする。コーティングの存在がナノ粒子の物理的特性に大きな影響を与えないことが示されている。コーティングの性質によってのみ、サイズおよびゼータ電位がわずかに増加または減少し得る。
【００７６】
特定の実施形態では、非イオン性ポリマー／アルブミン比率は、０．０２〜５（ｗ／ｗ）、より好ましくは０．０５〜２（ｗ／ｗ）の範囲である。
【００７７】
別の特定の任意選択の実施形態では、本発明で使用されるナノ粒子は、ナノ粒子を乾燥させる過程、または従来の方法によって、例えば、噴霧乾燥によってナノ粒子を含有する懸濁液を乾燥させる過程で、アルブミンマトリックスを保護するための化合物をさらに含んでなる（以下、「保護剤」という）。前記保護剤は、ナノ粒子のソリッドマトリックスの一部を形成しないが、その構造が維持されるように、効率的な方法でナノ粒子の乾燥を促進する増量剤として働く。事実上、これらの特性を満たす任意の化合物は保護剤として使用することができる。特定の実施形態では、前記保護剤は糖類である。
【００７８】
本発明において使用することができる保護剤の限定されない例示的な具体例としては、ラクトース、マンニトール、スクロース、マルトース、トレハロース、マルトデキストリン、グルコース、ソルビトールなどだけでなく、プレバイオティクス特性を有する物質、例えば、オリゴフルクトース、ペクチン、イヌリン、オリゴ糖（例えば、ガラクトオリゴ糖、人乳オリゴ糖）、ラクツロース、食物繊維など、およびそれらの任意の組合せが挙げられる。特定の実施形態では、保護剤は、ラクトース、マンニトール、スクロース、マルトース、トレハロース、マルトデキストリン、グルコース、ソルビトールおよびそれらの組合せから選択される。好ましくは、保護剤はスクロースである。本発明で使用されるナノ粒子が保護剤を含む場合、アルブミンマトリックスと保護剤の重量比は広い範囲内で変動し得るが、特定の実施形態では、アルブミン：保護剤重量比は１：０．１〜５、典型的には１：０．５〜４、好ましくは約１：１である。
【００７９】
いくつかの実施形態では、本発明で使用されるナノ粒子は、治療送達の前、その間またはその後の粒子位置の画像化を可能にすることにより治療薬の画像誘導標的化送達を可能にする少なくとも１つの造影剤を含んでなる。さまざまな造影剤がナノ粒子の表面への結合に好適であり、限定されるものではないが、蛍光造影剤（インドシアニングリーン、シアニン５、シアニン７、シアニン９、フルオレセインおよび緑色蛍光タンパク質など）、放射性核種標識造影剤（ヨウ素−１２４、９９ｍＴｃを含んでなる薬剤など）および磁気共鳴造影剤（ガドリニウム造影剤など）が含まれる。
【００８０】
本発明で使用されるナノ粒子は、制御可能なプロセスでモノクローナル抗体を送達し得る。そのような制御は、長期にわたるモノクローナル抗体の送達を可能にし得る。例えば、送達は１〜３０日間にわたって起こり得ることが企図される。制御可能な方法で治療薬を送達するように作られるだけでなく、ナノ粒子は、治療薬の送達の前、その間またはその後のナノ粒子の検出および画像化のためのさまざまな選択肢を提供するように作られ得る。
【００８１】
本発明で使用されるナノ粒子は、併用療法も提供するために、第二のモノクローナル抗体または治療薬を含んでいてもよい。
【００８２】
前記治療薬としては、例えば、カルシトニン、インスリンまたはシクロスポリンＡなどの他のタンパク質が挙げられる。
【００８３】
第二のモノクローナル抗体は、ベバシズマブ（アバスチン（登録商標））、ラニビズマブ（ルセンティス（登録商標））、トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））、セツキシマブ（アービタックス（登録商標））またはリツキシマブ（マブセラ（登録商標））などの本明細書で前述したもののいずれかであり得る。
【００８４】
ナノ粒子の調製方法
本発明で使用されるナノ粒子は、精製および乾燥前に水性環境にタンパク質（アルブミンおよびモノクローナル抗体）を沈殿させることにより調製することができる。
【００８５】
この方法は、以下の工程：
ａ）アルブミンおよびモノクローナル抗体の水溶液を調製する工程；
ｂ）工程ａ）の水溶液をｐＨ４〜５に滴定する工程；
ｃ）工程ｂ）の水溶液に脱溶媒和剤を添加する工程
を含んでなる。
【００８６】
この方法は脱溶媒和処理に基づいており、アルブミンおよびモノクローナル抗体の水溶液を、一定の撹拌、温度およびｐＨ条件下で脱溶媒和剤（典型的にはエタノール、アセトンまたはＴＨＦなどの有機溶媒）を、滴下するなど、ゆっくりと添加することにより、ゆっくりと脱溶媒和する。
【００８７】
特定の実施形態では、工程ａ）の水溶液の調製に使用されるアルブミンは、ヒト血清アルブミンまたはウシ血清アルブミンであり、より好ましくはヒト血清アルブミンである。
【００８８】
別の特定の実施形態では、工程ａ）の水溶液の調製に使用されるモノクローナル抗体は、ベバシズマブ（アバスチン（登録商標））、ラニビズマブ（ルセンティス（登録商標））、トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））、セツキシマブ（アービタックス（登録商標））およびリツキシマブ（マブセラ（登録商標））から選択される。より好ましくは、前記モノクローナル抗体はベバシズマブまたはラニビズマブであり、さらに好ましくはベバシズマブである。
【００８９】
アルブミンおよびモノクローナル抗体の溶液は、当業者に知られている従来の方法により、例えば、アルブミンとモノクローナル抗体を水溶液に添加することにより調製することができる。
【００９０】
アルブミンとモノクローナル抗体は、好ましくは、室温で、すなわち、１８℃〜２５℃、好ましくは２０℃〜２２℃に含まれる温度で混合される。
【００９１】
水溶液に添加することができるアルブミンの量は広い範囲内で変動し得るが、特定の実施形態では、前記水溶液に添加する量は、０．１％〜１０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．５％〜５％（ｗ／ｖ）、さらに好ましくは１％〜２％（ｗ／ｖ）に含まれる。
【００９２】
同様に、水溶液に添加することができるモノクローナル抗体の量は広い範囲内で変動し得るが、特定の実施形態では、前記水溶液に添加する量は、０．００５％〜１％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．０１％〜０．５％（ｗ／ｖ）、さらに好ましくは０．０１％〜０．４％（ｗ／ｖ）に含まれる。
【００９３】
特定の実施形態では、アルブミンおよびモノクローナル抗体は、モノクローナル抗体：アルブミン重量比率が０．０１〜０．５、より好ましくは０．０１〜０．２の範囲であるように水溶液に添加される。
【００９４】
好ましい実施形態では、アルブミンおよびモノクローナル抗体の水溶液は、例えば、撹拌による、均質化に供される。
【００９５】
ナノ粒子の調製方法の工程ｂ）は、アルブミンおよびモノクローナル抗体を含有する水溶液のｐＨを弱酸性ｐＨに下げることを含む。これによりこの方法の後続工程でナノ粒子の沈澱が可能になる。これは、工程ａ）を実施した後に得られた水溶液に、ＨＣｌ  １Ｍなどの酸性成分を添加することにより行うことができる。
【００９６】
特定の実施形態では、前記水溶液は、室温で少なくとも１０分間インキュベートされる。
【００９７】
ナノ粒子の調製方法の工程ｃ）では、工程ｂ）を実施した後に得られた水溶液に脱溶媒和剤が添加される。
【００９８】
好ましい実施形態では、工程ｂ）を実施した後に得られた水溶液への脱溶媒和剤の添加は撹拌下で行われる。
【００９９】
別の好ましい実施形態では、前記脱溶媒和剤は、エタノールおよびテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）から選択された有機溶媒であり、より好ましくはエタノールである。
【０１００】
脱溶媒和剤は、撹拌下で水溶液にゆっくりと添加される。より好ましくは、得られた混合物を撹拌しながら、脱溶媒和剤が、アルブミンおよびモノクローナル抗体の水溶液に滴下される。
【０１０１】
好ましい実施形態では、前記添加は、窒素雰囲気下などの不活性雰囲気下で実施され得る。
【０１０２】
前述の条件下、すなわち、室温および撹拌下でアルブミンおよびモノクローナル抗体の水溶液に脱溶媒和剤を添加した後、本発明のナノ粒子が自発的に形成される。特定の実施形態では、前記ナノ粒子は、それらが得られた媒体中に懸濁している。
【０１０３】
従って、本発明の方法は、単純な脱溶媒和処理によってナノ粒子の均一な分散の形成を可能にし、モノクローナル抗体がアルブミンマトリックス全体に分布しているマトリックス型構造を有するソリッドナノスフェアをもたらす。
【０１０４】
従って、この処理によって得られたナノ粒子は、脱溶媒和剤添加後のモノクローナル抗体とアルブミンの局所的相互作用によって自発的に形成される自己集合ナノ粒子とみなすことができる。
【０１０５】
ナノ粒子の作出方法は、例えば、濾過技術、遠心分離または超遠心分離によって精製する付加的工程を含んでなり得る。
【０１０６】
同様に、前記方法は、本発明のナノ粒子を粉末形態で得るために、形成されたナノ粒子を乾燥させる付加的工程を含み得る。前記ナノ粒子のこの提案形態はナノ粒子の安定性に寄与し、医薬品におけるナノ粒子の最終用途にさらに特に有用である
【０１０７】
好ましい実施形態では、工程ｃ）を実施した後または精製した後に得られたナノ粒子は、従来の方法、例えば、真空乾燥によってまたは有利には噴霧乾燥によってもしくはフリーズドライ（凍結乾燥）によって、乾燥処理に供し、ナノ粒子を乾燥させる。
【０１０８】
特定の実施形態では、この乾燥処理は、特に噴霧乾燥によってまたは凍結乾燥によって行われる場合に、ナノ粒子が形成されたら保護剤をナノ粒子へ添加することを含んでなる。この保護剤、例えば、糖類などはその乾燥過程の間ナノ粒子を保護する。
【０１０９】
本発明において保護剤として使用することができる糖類の限定されない例示的な具体例としては、ラクトース、マンニトール、スクロース、マルトース、トレハロース、マルトデキストリン、グルコース、ソルビトールなどだけでなく、プレバイオティクス特性を有する多糖類、例えば、オリゴフルクトース、ペクチン、イヌリン、オリゴ糖（例えば、ガラクトオリゴ糖、人乳オリゴ糖）、ラクツロース、食物繊維などおよびそれらの混合物が挙げられる。特定の実施形態では、保護剤は、ラクトース、マンニトール、スクロース、マルトース、トレハロース、マルトデキストリン、グルコース、ソルビトールおよびそれらの組合せから選択される。ナノ粒子が保護剤を含む場合、これは好適な量で添加され；ナノ粒子のマトリックスと保護剤の重量比は広い範囲内で変動し得るが、特定の実施形態では、アルブミン：保護剤重量比は１：０．１〜５、典型的には１：０．５〜４、好ましくは約１：１である。
【０１１０】
ナノ粒子は噴霧乾燥によっても乾燥させることができる。そのために、ナノ粒子と保護剤を含有する懸濁液が噴霧乾燥機に導入され、処理条件［吸気温度、排気温度、空気圧、サンプルポンピング速度、吸引、および気流］が制御される。当業者は各場合に最も好適な処理条件を設定することができる。
【０１１１】
この方法によって、ナノ粒子を乾燥粉末の形態で得ることが可能になり、このことが制御された条件または環境条件下での長期保存中のナノ粒子の安定性に寄与し、また、種々の意図された固体および液体製品に容易にこれを組み込むこともできる。
【０１１２】
ナノ粒子は保護剤の添加前に形成されるため、これはアルブミンマトリックスとのコンジュゲートまたは複合体を形成しない。
【０１１３】
別の特定の実施形態では、本発明で使用されるナノ粒子が非イオン性ポリマーでコーティングされている場合、コーティングされたナノ粒子は、上記で定義された方法の工程ａ）〜Ｃ）に従って、すでに形成されたアルブミン−モノクローナルナノ粒子を、非イオン性ポリマーとともにインキュベートすることにより得ることができる。
【０１１４】
特定の実施形態では、前記非イオン性ポリマーは、上に記載したもののいずれかであり得る。好ましくは、前記非イオン性ポリマーは、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、デンプン、デキストラン７０、Ｅｕｄａｇｒｉｔ（登録商標）ＮＭ、Ｅｕｄａｇｒｉｔ（登録商標）ＮＥ、ポリビニルピロリドンおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）から選択される。より好ましくは、前記非イオン性ポリマーは、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートおよびＰＥＧ３５，０００から選択される。
【０１１５】
特定の実施形態では、非イオン性ポリマー／アルブミン比率は、０．０２〜５、より好ましくは０．０５〜２の範囲である。
【０１１６】
別の特定の実施形態では、非イオン性ポリマー中でのナノ粒子のインキュベーションは１時間未満、より好ましくは４５分未満、行われる。
【０１１７】
医薬組成物
上に記載したナノ粒子は、モノクローナル抗体を閉じ込め、処理および保存中だけでなく目的の生物学的部位に最終的に送達されるまでそれらを保護する能力を有する。従って、種々の意図された製品（例えば、医薬組成物または化粧用組成物）に組み込まれた後のモノクローナル抗体の失活(desactivation)は防止されるかまたは実質的に減少する。実際、実験的試験では、モノクローナル抗体がアルブミンマトリックス中でその完全性を維持することが指摘されている
【０１１８】
さらに、本発明のナノ粒子は、生物活性もまた完全に維持するモノクローナル抗体の持続放出を可能にすることから、角膜血管新生動物モデルで得られた生物活性データによって指摘されるように、ｉｎ  ｖｉｖｏ用途に重要な薬物送達システムを構成する。実際、実施されたｉｎ  ｖｉｖｏ試験(experimens)では、アルブミンおよびモノクローナル抗体のナノ粒子は、遊離形態の同じモノクローナル抗体の投与と比較すると、角膜の血管形成の影響を受ける眼表面の大幅な減少をもたらすことが示された。
【０１１９】
さらに、本発明のナノ粒子を用いて実施された体内分布アッセイにより、それらが腫瘍組織に濃縮可能であることが指摘されていることから、本発明のナノ粒子は、モノクローナル抗体を罹患癌性組織に放出するための非常に有望なナノ粒子システムとなる。
【０１２０】
従って、別の側面では、本発明は、懸濁液形態または乾燥粉末形態のいずれかの、上記で定義された複数のナノ粒子と、薬学上許容可能な賦形剤、担体またはビヒクルを含んでなる医薬組成物に関する。
【０１２１】
ナノ粒子の特性はすでに上記で定義されており、引用することにより本明細書の一部とされる。
【０１２２】
特定の実施形態では、本発明の医薬組成物に含まれるナノ粒子は乾燥粉末形態である。
【０１２３】
医薬組成物を投与するいずれの好適な手段も本発明において使用可能であり、好ましくは、医薬組成物は、ヒトまたは動物に、局所的または非経口的に、より好ましくは、 静脈内投与、動脈内投与、肺内投与、眼内投与、筋肉投与、経皮もしくは皮下投与、経口投与または吸入により投与される。
【０１２４】
より好ましくは、医薬組成物は、経口、局所または非経口投与に好適なビヒクルまたは担体を含んでなる。
【０１２５】
特定の投与様式に基づき、医薬組成物は、錠剤、丸剤、カプセル剤、サシェ剤、顆粒剤、散剤、懸濁液、エマルション、無水または含水局所処方物および溶液として処方され得る
【０１２６】
薬学上許容可能な担体またはビヒクルは当業者に周知であり、容易に一般に入手可能である。薬学上許容可能な担体またはビヒクルは、有効処方物およびその成分のそれぞれに対して化学的に不活性であるもの、ならびに使用条件下で有害な副作用または毒性がないものであることが好ましい。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、対象の循環系に治療薬を経口的、局所的、非経口的、または静脈内に輸送するための送達システムとして適合される。
【０１２８】
経口投与に好適な処方物としては、有効量のナノ粒子などの溶液、または水もしくは生理食塩水などの希釈液に溶解させた前記を含んでなる組成物；それぞれ所定量のナノ粒子を含有するカプセル剤、サシェ剤、錠剤、トローチ剤；適当な液体中の懸濁液；およびエマルションが含まれる。
【０１２９】
局所処方物としては、眼科用水溶液もしくは懸濁液、眼科用軟膏、眼内挿入物または外的眼表面にナノ粒子を供給できる任意の他の処方物が含まれる。好ましくは、局所処方物は、液滴として適用するためのナノ粒子を含有する眼科用溶液または懸濁液である。上述の処方物はいずれも、眼用処方物に一般に見られる好適な溶媒、防腐剤およびその他の薬学上許容可能な賦形剤を含み得る。
【０１３０】
非経口製剤は一般に、溶液中に０．５〜２５重量％のナノ粒子を含有する。前記処方物は、アンプルおよびバイアルなどの単位用量または多用量密閉容器に提供することができ、使用直前に滅菌液担体、例えば、注射水を加えるだけのフリーズドライ（凍結乾燥）条件下で保存することができる。
【０１３１】
治療される疾患
上述のように、アルブミンおよびモノクローナル抗体のナノ粒子は、眼疾患および癌の治療のための非常に有望な薬物送達システムであることが示されている。
【０１３２】
従って、本発明の別の側面は、眼疾患の治療における使用のための、上記で定義されたナノ粒子または組成物に関する。
【０１３３】
この側面の特定の実施形態では、前記ナノ粒子はソリッドコアを含んでなり、前記ソリッドコアは非架橋アルブミンマトリックスおよびモノクローナル抗体を含んでなり、前記モノクローナル抗体は前記アルブミンマトリックス全体に分布しており、前記ソリッドコアは、任意のポリマーでコーティングされていない。より詳細には、前記ソリッドコアは、非イオン性ポリマーでコーティングされていない。
【０１３４】
この側面の別の特定の実施形態では、前記ナノ粒子はソリッドコアを含んでなり、前記ソリッドコアは非架橋アルブミンマトリックスおよびモノクローナル抗体からなり、前記モノクローナル抗体は前記アルブミンマトリックス全体に分布しており、前記ソリッドコアは、任意のポリマーでコーティングされていない。より詳細には、前記ソリッドコアは、非イオン性ポリマーでコーティングされていない。
【０１３５】
この側面の別の特定の実施形態では、前記ナノ粒子はソリッドコアからなり、前記ソリッドコアは非架橋アルブミンマトリックスおよびモノクローナル抗体を含んでなり、前記モノクローナル抗体は前記アルブミンマトリックス全体に分布しており、前記ソリッドコアは、任意のポリマーでコーティングされていない。より詳細には、前記ソリッドコアは、非イオン性ポリマーでコーティングされていない。
【０１３６】
この側面の別の特定の実施形態では、前記ナノ粒子はソリッドコアからなり、前記ソリッドコアは非架橋アルブミンマトリックスおよびモノクローナル抗体からなり、前記モノクローナル抗体は前記アルブミンマトリックス全体に分布しており、前記ソリッドコアは、任意のポリマーでコーティングされていない。より詳細には、前記ソリッドコアは、非イオン性ポリマーでコーティングされていない。
【０１３７】
別の側面では、本発明はまた、眼疾患の治療のための方法であって、そのような治療を必要とする対象に上記のナノ粒子またはナノ粒子を含んでなる組成物を投与することを含んでなる方法に関する。
【０１３８】
さらに別の側面では、本発明はまた、眼疾患の治療用の医薬の製造のための、上記のナノ粒子またはナノ粒子を含んでなる組成物の使用に関する。
【０１３９】
前記組成物は、対象に経口的、局所的または眼内注射によって投与され得る。好ましい実施形態では、組成物は、局所的に、例えば、眼の粘膜に接近する経路により、または硝子体内注射により投与される。
【０１４０】
従って、好ましい実施形態では、ナノ粒子が眼疾患の治療のために投与される場合、前記ナノ粒子は、本明細書の先に記載したものなどの局所用または注射用医薬組成物で投与される。
【０１４１】
別の特定の実施形態では、治療される眼疾患は、黄斑変性、角膜血管新生または血管形成、虹彩血管新生または血管形成、網膜血管新生または血管形成、糖尿病性増殖網膜症、非糖尿病性増殖網膜症、緑内障、感染性結膜炎、アレルギー性結膜炎、潰瘍性角膜炎、非潰瘍性角膜炎、上強膜炎、強膜炎、糖尿病性網膜症、ブドウ膜炎、眼内炎、感染状態および炎症状態から選択される。
【０１４２】
本発明の別の側面は、癌の治療における使用のための、上記で定義されたナノ粒子または組成物に関する。
【０１４３】
この側面の特定の実施形態では、前記ナノ粒子はソリッドコアを含んでなり、前記ソリッドコアは非架橋アルブミンマトリックスおよびモノクローナル抗体を含んでなり、前記モノクローナル抗体は前記アルブミンマトリックス全体に分布しており、前記ソリッドコアは非イオン性ポリマーでコーティングされている。
【０１４４】
この側面の別の特定の実施形態では、前記ナノ粒子はソリッドコアを含んでなり、前記ソリッドコアは非架橋アルブミンマトリックスおよびモノクローナル抗体からなり、前記モノクローナル抗体は前記アルブミンマトリックス全体に分布しており、前記ソリッドコアは非イオン性ポリマーでコーティングされている。
【０１４５】
この側面の別の特定の実施形態では、前記ナノ粒子はソリッドコアからなり、前記ソリッドコアは非架橋アルブミンマトリックスおよびモノクローナル抗体を含んでなり、前記モノクローナル抗体は前記アルブミンマトリックス全体に分布しており、前記ソリッドコアは非イオン性ポリマーでコーティングされている。
【０１４６】
この側面の別の特定の実施形態では、前記ナノ粒子はソリッドコアからなり、前記ソリッドコアは非架橋アルブミンマトリックスおよびモノクローナル抗体からなり、前記モノクローナル抗体は前記アルブミンマトリックス全体に分布しており、前記ソリッドコアは非イオン性ポリマーでコーティングされている。
【０１４７】
別の側面では、本発明はまた、癌の治療のための方法であって、そのような治療を必要とする対象に上記のナノ粒子またはナノ粒子を含んでなる組成物を投与することを含んでなる方法に関する。
【０１４８】
さらに別の側面では、本発明はまた、癌の治療用の医薬の製造のための、上記のナノ粒子またはナノ粒子を含んでなる組成物の使用に関する。
【０１４９】
好ましい実施形態では、前記組成物は、個体に非経口的に、例えば、静脈投与、動脈内投与、筋肉投与または皮下投与により投与される。
【０１５０】
従って、好ましい実施形態では、ナノ粒子が癌の治療のために投与される場合、前記ナノ粒子は、本明細書の先に記載したものなどの非経口処方物で投与される。
【０１５１】
別の特定の実施形態では、治療される癌には、限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫および白血病が含まれる。ナノ粒子の投与により治療される癌の例としては、例えば、乳癌、肺癌、膵臓癌、多発性骨髄腫、腎細胞癌、前立腺癌、黒色腫、結腸癌、結腸直腸癌、腎臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、腎癌および胃癌、膀胱癌または扁平上皮癌が挙げられる。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、本発明で使用されるナノ粒子、またはそれらを含有する組成物は、眼疾患または癌の治療のいずれかのための第二の治療化合物および／または第二選択療法とともに投与され得る。
【０１５３】
本組成物と第二の化合物または第二選択療法の投与頻度は、治療の過程で調整可能である。いくつかの実施形態では、第一選択および第二選択療法は、同時、逐次、または併用投与される。別個に投与される場合、ナノ粒子組成物および第二化合物は、異なる投与頻度または投与間隔で投与することができる。
【０１５４】
あるいは、本発明で使用されるナノ粒子は、併用療法も提供するために、第二のモノクローナル抗体または治療薬を含んでいてもよい。
【０１５５】
前記治療薬としては、例えば、カルシトニン、インスリンまたはシクロスポリンＡなどの他のタンパク質が挙げられる。
【０１５６】
第二のモノクローナル抗体は、ベバシズマブ（アバスチン（登録商標））、ラニビズマブ（ルセンティス（登録商標））、トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））、セツキシマブ（アービタックス（登録商標））またはリツキシマブ（マブセラ（登録商標））などの本明細書で前述したもののいずれかであり得る。
【実施例】
【０１５７】
以下に示す実施例では、次の略語を使用する。
ＢＥＶＡ：ベバシズマブ
Ｂ−ＮＰ：ベバシズマブ付加アルブミンナノ粒子
ＨＳＡ：ヒト血清アルブミン
ＰＭ：物理的混合物
ＮＰ−Ｇｌｕ：グルタルアルデヒドと架橋しているアルブミンナノ粒子
Ｂ−ＮＰ−ＧＬＵ：グルタルアルデヒドと架橋しているベバシズマブ付加アルブミンナノ粒子
ＮＰ−ＰＥＧ３５：ポリエチレングリコール３５，０００でコーティングされたアルブミンナノ粒子
Ｂ−ＮＰ−ＰＥＧ３５：ポリエチレングリコール３５，０００でコーティングされたベバシズマブ付加アルブミンナノ粒子
Ｂ−ＮＰ−ＨＰＭＣ−Ｐ：ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートでコーティングされたベバシズマブ付加アルブミンナノ粒子
Ｂ−ＮＰ−Ｓ１００：Ｅｕｄａｇｒｉｔ  Ｓ−１００でコーティングされたベバシズマブ付加アルブミンナノ粒子
【０１５８】
材料
ヒト血清アルブミンまたはＨＳＡ（画分Ｖ、純度９６〜９９％）、ポリエチレングリコール３５，０００（ＰＥＧ３５）、およびグルタルアルデヒド（ＧＬＵ）２５％水溶液はＳｉｇｍａ（マドリード、スペイン）から入手した。
【０１５９】
ベバシズマブ（アバスチン（登録商標））は、Ｒｏｃｈｅ（スペイン）から購入した。ヒドロキシプロピルメチルセルロースＫ１００  ＬＶ（ＨＰＭＣ；ＭＷ１６４，０００）はＡｓｈｌａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｈｉｓｐａｎｉａ（スペイン）からのものであった。アバスチン（登録商標）は、シングルユースバイアルに注入溶液用の濃縮液として提供され、４ｍＬ中１００ｍｇのベバシズマブまたは１６ｍＬ中４００ｍｇのベバシズマブ（２５ｍｇ／ｍＬ濃度）の公称量を含有する。ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣ−Ｐ）は、Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃ（スペイン）から購入した。マイクロＢＣＡタンパク質アッセイキットは、Ｐｉｅｒｃｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．（イリノイ州、ＵＳＡ）から購入した。ベバシズマブの検出に使用するＳｈｉｋａｒｉ  Ｑ−ｂｅｖａ酵素イムノアッセイは、Ｍａｔｒｉｋｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（トルコ）。アセトンは、Ｐｒｏｌａｂｏ、ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｔｄ（英国）から購入し、塩化スズ二水和物および無水エタノールは、Ｐａｎｒｅａｃ  Ｐｈａｒｍａ（スペイン）から購入した。イソフルオロンはＢｒａｕｎから、安楽死剤Ｔ−６９  ＩｎｔｅｒｖｅｔはＳｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈからのものであった。テクネチウム−９９ｍペルテクネタート溶出剤は、Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃから購入したＤｒｙｔｅｃ（登録商標）９９Ｍｏ−９９ｍＴｃ発生装置から得た。
【０１６０】
物理化学的研究のためには、以下の装置を使用した：Ｔｈｅｒｍｏ／Ｎｉｃｏｌｅｔ  ３６０ＦＴ−ＩＲ（Ｅ．Ｓ．Ｐ．Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）、回折計Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｘｓ  Ｄ８  Ａｄｖａｎｃｅ（ドイツ）、熱重量分析（ＴＧ）および示差走査熱量測定には、（ＤＳＣ）Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ  ｄｓｃ８２２ｅをＭｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ  ＴＳＯ  ８０１ＲＯサンプルロボットおよびＪｕｌａｂｏ  ＦＴ９００クーラーとともに使用し、元素分析には、ＬＥＣＯ  ＣＨＮ−９００（ミシガン州  ＵＳＡ）からの元素分析計を使用した。
【０１６１】
放射性標識および体内分布研究のためには、以下の装置を使用した：Ｓｙｍｂｉａ  ＳＰＥＣＴ／ＣＴ、Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ドイツ、Ａｃｔｉｖｉｍｅｔｅｒ  ＡｔｏｍＬａｂ  ５００、Ｂｉｏｄｅｘ、ＵＳＡ、Ｇａｍｍａ  ｃｏｕｎｔｅｒ、ＬＫＢ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ。
【０１６２】
ナノ粒子の物理化学的特性決定（サイズ、ゼータ電位および形態）
ナノ粒子の粒径およびゼータ電位は、Ｚｅｔａ  Ｐｌｕｓ装置（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔ．  Ｃｏｒｐ．、ＵＳＡ）で決定した。ナノ粒子の直径は、超純水（１／１０）中に分散させた後に決定し、２５℃で動的光散乱角９０度によって測定した。ゼータ電位は次のように決定した：２００μＬのサンプルをｐＨ７．４に調整した１ｍＭ  ＫＣｌ溶液２ｍＬで希釈した。
【０１６３】
ナノ粒子の形態学的特徴は、Ｚｅｉｓｓ  ＤＳＭ９４０デジタル走査電子顕微鏡（Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）にて走査電子顕微鏡観察（ＳＥＭ）により調べた。この目的で、サンプルを水に分散させ、凍結保護剤を除去するために４℃にて２７，０００ｘｇで２０分間遠心分離した。次に、これらのペレットを、金属スタブ上に両面粘着テープで接着させたガラスプレートに載せて乾燥させた。それらを、ＭＴＭ−２０膜厚コントローラーを装備し、ロータリー−プラネタリー−チルトステージを備えたＣｒｅｓｓｉｎｇｔｏｎ  ｓｐｕｔｔｅｒ−ｃｏａｔｅｒ  ２０８ＨＲを用いて４ｎｍのパラジウム−白金層でコーティングした。ＳＥＭは、フィラメント電流約０．５ｍＡで１〜３ｋＶで作動するＬＥＯ  １５３０装置（ＬＥＯ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｉｎｃ、ソーンウッド、ＮＹ）を用いて実施した。
【０１６４】
収量
ナノ粒子に変換されたＨＳＡの量（収量）は、Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡにより、ナノ粒子を形成するＨＳＡの定量によって決定した。簡単に述べると、１０ｍｇのナノ粒子を秤量し、１０ｍＬの超純水に分散させ、４℃にて１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した（Ｒｏｔｏｒ  ３３３６、Ｂｉｏｆｕｇｅ  Ｈｅｒａｅｕｓ、ハーナウ、ドイツ）、次に、このペレットを１ｍＬのＮａＯＨ  ０，０２Ｎで崩壊させ、この溶液２００μＬを９６ウェルマイクロプレートに移し、分光光度計にて５６２ｎｍで、特定のマイクロＢＣＡタンパク質アッセイキットに従って進めた。
【０１６５】
アルブミン測定においてあり得る干渉を検出するために、他の賦形剤および薬物（グルタルアルデヒド、ＰＥＧ３５，０００、ＨＰＭＣまたはベバシズマブ）を含有する対照を使用することによってこのキットの選択性を判定した。データ解析は、下式を用いて行った：
収率（％）＝（Ｗｌｙｏｐ／Ｗｉｎｉｔｉａｌ）×１００  ［式１］
式中、Ｗｌｙｏｐは、ナノ粒子に変換されたＨＳＡであり、Ｗｉｎｉｔｉａｌは、ナノ粒子を調製するために使用したＨＳＡの量であった。
【０１６６】
ナノ粒子における薬物積載の定量
アルブミンナノ粒子における抗体付加量を酵素イムノアッセイ（Ｓｈｉｋａｒｉ  Ｑ−ＢＥＶＡ）により評価した。この目的で、１０ｍｇのナノ粒子を秤量し、１ｍＬの水に分散させた。この懸濁液を１０分間、１０，０００ｒｐｍで遠心分離した（Ｒｏｔｏｒ  ３３３６、Ｂｉｏｆｕｇｅ  Ｈｅｒａｅｕｓ、ハーナウ、ドイツ）。上清を除去した。次に、ナノ粒子を１ｍＬのＮａＯＨ  ０，０２Ｎで崩壊させた。得られた溶液２００μＬをヒト血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）でコーティングされた９６ウェルマイクロプレートに移し、ベバシズマブ（Ｑ−Ｂｅｖａ試験手順のための特定のＥＬＩＳＡ、Ｓｈｉｋａｒｉ  Ｑ−Ｂｅｖａ、Ｍａｔｒｉｋｓ  Ｂｉｏｔｅｋ）を行った。
【０１６７】
各サンプルを三反復でアッセイし、０．１〜１００μｇ／ｍＬの範囲の標準曲線を用いて計算を行った（ｒ２＞０．９９３）。検出限界および定量限界はそれぞれ０．１μｇ／ｍＬおよび１００μｇ／ｍＬであった（ｒ２＞０．９９３）。
【０１６８】
ベバシズマブ付加（ＤＬ）およびその封入効率（ＥＥ）は、下式に従って計算した：
ＤＬ＝［Ｗｅｎｃａｐ／Ｗｎｐ］  ［式２］
ＥＥ＝［Ｗｅｎｃａｐ／Ｗｔｏｔａｌ］×１００  ［式３］
式中、Ｗｅｎｃａｐはベバシズマブのカプセル封入量であり、Ｗｔｏｔａｌは使用した薬物の総量であり、Ｗｎｐはナノ粒子重量であった。
【０１６９】
ＦＴ−ＩＲの決定
ＨＳＡナノ粒子の分子構造を、ＦＴＩＲ分光法の手段によって調べた。ＫＢｒディスクにサンプル１％で分散させたサンプルの赤外スペクトルをＮＩＣＯＬＥＴ  ＦＴＩＲ分光計（Ｔｈｅｒｍｏ／Ｎｉｃｏｌｅｔ  ３６０ＦＴ−ＩＲ  Ｅ．Ｓ．Ｐ．Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）で記録した。これらのサンプルを４０００から４００ｃｍ−１までスキャンした。記録条件は次の通りとした：分解能８．０およびサンプルスキャン４０。データは、ＯＭＮＩＣソフトウエア（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を用いて解析した。
【０１７０】
Ｘ線試験
種々のナノ粒子サンプルにおけるポリマーマトリックスの結晶面の分布および結晶化度の変動を調べるためにＸ線試験を行った。この目的で、サンプルを粉末形態で回折計（Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｘｓ  Ｄ８  Ａｄｖａｎｃｅ、ドイツ）の金属プレート上に置き、室温にて３６０を超える測定を行った。回折図形は、プログラムＤｉｆｆｒａｃ．Ｓｕｉｔｅを用いて解析した。
【０１７１】
熱分析
温度変化に対する種々のナノ粒子の応答を熱分析（示唆熱分析ＤＴＡに連結した熱重量分析ＴＧＡ）により試験した。これがナノ粒子を形成するために反応する際のＨＳＡの官能基の熱的挙動の変動を分析した。これらの熱試験は、同時ＴＧＡ／ｓＤＴＡ  ８５１ｅ  Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ熱分析装置で行った。サーモグラムは、約５〜１０ｍｇのサンプルを細片アルミニウムるつぼ内で２５から２５０℃までスキャン速度１０℃／分にて加熱することによって取得した。熱分析は、静的空気雰囲気およびパージガスとしてのＮ２（２０ｍＬ分−１）の下で行った。測定は三反復で行った。
【０１７２】
元素分析
ナノ粒子の元素分析（Ｃ、Ｈ、ＯおよびＮ）は、種々の分解防止剤の会合を確認するために、ＬＥＣＯからのＨＳＡナノ粒子元素分析計（ＣＨＮ−９００、ミシガン州  ＵＳＡ）にて行った。簡単に述べると、１ｍｇの各サンプルを三反復で試験し、結果をパーセンテージ（％ｗ／ｗ）ＳＤ±０．４として表した。この技術は、他成分（グルタルアルデヒド、ＰＥＧ３５、ＨＰＭＣ−Ｐまたはベバシズマブ）を会合した場合のアルブミン（ＨＳＡ）の酸素、水素または窒素の組成の変化を示す。
【０１７３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出試験
ベバシズマブ付加アルブミンナノ粒子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出試験をＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で行った。１０ｍｇの各ナノ粒子処方物を含有するエッペンドルフ管を総容量１ｍＬのＰＢＳ中に分散させ、エッペンドルフ管に分布させ、６０ストローク／分の一定振盪の振盪浴（Ｕｎｉｔｒｏｎｉｃ  ３２０  ＯＲ、Ｓｅｌｅｃｔａ、マドリード、スペイン）中、３７℃に置いた。種々の時間間隔でエッペンドルフ管を取り出し、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した（Ｒｏｔｏｒ  ３３３６、Ｂｉｏｆｕｇｅ  Ｈｅｒａｅｕｓ、ハーナウ、ドイツ）。特異的ＥＬＩＳＡ試験（Ｓｈｉｋａｒｉ  Ｑ−Ｂｅｖａ、Ｍａｔｒｉｋｓ  Ｂｉｏｔｅｋ）で、上清のベバシズマブ含量を分析した。放出プロフィールは累積放出としてパーセンテージで表し、時間に対してプロットした。
【０１７４】
さらに、これらの放出プロフィールに基づき、Ｋｏｒｓｍｅｙｅｒ−Ｐｅｐｐａｓ式外挿モデル（式４）により動態を調べた：
Ｑ＝Ｋｔｎ  ［式４］
式中、Ｑは、ｔ時間に放出された薬物のパーセンテージであり、Ｋは、検討下の装置の構造的および幾何学的特徴を組み込んだ定数であり、「ｎ」は、拡散指数であり、一般に、投与形からの薬物輸送機構の指標として用いられる。
【０１７５】
ｎ≦０．４３の値は、薬物放出がフィックの拡散により制御されることを示し、ｎ≧０．８５の値は、薬物放出が腐食機構によって支配されることを示唆する。０．４３＜ｎ＜０．８５の値については、放出は、変則的と記載され、拡散と腐食の組合せが薬物放出の制御に寄与することを意味する[Gao Y., et al., In Vitro Release Kinetics of Antituberculosis Drugs from Nanoparticles Assessed Using a Modified Dissolution Apparatus. Biomed Research International 2013]。
【０１７６】
実施例１．  ベバシズマブ付加ヒト血清アルブミンナノ粒子の調製。得られるナノ粒子の物理化学的特性に対するベバシズマブ／ＨＳＡ比の影響
ベバシズマブ付加ナノ粒子は、ナノ粒子が精製および乾燥前に水性環境中でタンパク質の沈降によって得られる手順により調製した。
【０１７７】
この目的で、１００ｍｇのＨＳＡおよび変動量のベバシズマブ（ＢＥＶＡ）（１〜２０ｍｇ）を５〜１０ｍＬの注射水に溶解させ、次いで、この溶液をＨＣＬ  １ＭでｐＨ４．１〜４．４に滴定した。この混合物を室温にて１０分間インキュベートした。ナノ粒子は、室温にて、連続撹拌下（５００ｒｐｍ）で脱溶媒和剤として使用する１６ｍＬのエタノールを連続的に添加することにより得た。得られたナノ粒子は２つの異なる手順により精製した：超遠心分離および限外濾過。前者では、ナノ粒子を、４℃にて２１，０００ｘｇで２０分間の遠心分離（Ｓｉｇｍａ  ３Ｋ３０、Ｏｓｔｅｒｏｄｅａｍ  Ｈａｒｚ、ドイツ）を行い、ペレットを水で元の容量に再分散させることにより２回精製した。後者では、ナノ粒子を、孔径５０ｋＤａのポリスルホンメンブレンカートリッジ（Ｍｅｄｉｃａ  ＳＰＡ、イタリア）での限外濾過により精製した。最後に、再分散または５％スクロース水溶液の添加後にナノ粒子を１２ＥＬ装置（Ｖｉｒｔｉｓ、ニューヨーク州、ＵＳＡ）でフリーズドライした。これらの処方物は、それ以上の安定化なく、ベバシズマブ付加ヒト血清アルブミンナノ粒子であり、以下Ｂ−ＮＰ処方物という。
【０１７８】
ナノ粒子中へのモノクローナル抗体の封入について、２つの重要なパラメーターを特定した：ベバシズマブ／アルブミン比率およびナノ粒子の形成前の両化合物のインキュベーション時間。表１に、モノクローナル抗体／タンパク質比を変えることにより得られたナノ粒子の主要な物理化学的特性をまとめる。ベバシズマブ／アルブミン比率は低い場合（例えば、０．０１）、ナノ粒子は、経時的に不安定であった。０．０１より高い比では、得られたナノ粒子は安定であり、平均サイズは３００ｎｍ付近、表面負電荷は約−１５ｍＶであった。
【０１７９】
同様に、このプロセスの収率は８０％前後であると計算された。図１は、モノクローナル抗体付加に対するベバシズマブ／アルブミン比率の影響を示す。
【０１８０】
これらの結果によれば、ナノ粒子中に付加されたベバシズマブの量は、ＢＥＶＡ／ＨＳＡ比の上昇により増大した。これらの試験は総て、モノクローナル抗体とタンパク質との１０分のインキュベーション後に行った。興味深いことに、このパラメーターを増加させてもナノ粒子の物理化学的特性に有意な違いは見られなかった。
【０１８１】
【表１】
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【０１８２】
実施例２．  物理化学的特性に対するベバシズマブ付加ナノ粒子とグルタルアルデヒドの架橋の影響
ベバシズマブの不在下でのヒト血清アルブミンナノ粒子は不安定であり、形成直後に消失したという事実のために、対照ベバシズマブ付加ナノ粒子は、エタノール（３００μＬ）中で１２．５μｇのグルタルアルデヒドと架橋した後に得られ、以下、Ｂ−ＮＰ−ＧＬＵ処方物とする。この目的で、形成されたばかりのベバシズマブ付加ナノ粒子を、精製およびフリーズドライまでにグルタルアルデヒドとともに５分間インキュベートした。
【０１８３】
表２に、「ネイキッド」ＨＳＡナノ粒子（それ以上の安定化手順を行わない）およびグルタルアルデヒドとの架橋の後に得られた対照物の主要な物理化学的特性をまとめる。アルブミンナノ粒子へのベバシズマブの封入により、高い抗体含量の安定したナノ粒子が生成された。興味深いことに、ナノ粒子中に付加された有効モノクローナル抗体として計算される封入効率は９０％近くであり、ベバシズマブ付加は約１３％であった。ベバシズマブ付加ナノ粒子がグルタルアルデヒドと架橋された場合、得られたナノ粒子は、化学架橋剤を用いずに生成されたものよりもやや小さかった。しかしながら、ナノ粒子のグルタルアルデヒドによる処理はモノクローナル抗体を不活性化し、ＥＬＩＳＡ分析によって定量された抗体は極めて低レベルであった。
【０１８４】
【表２】
2020524715.tif 000003
【０１８５】
実施例３：  ベバシズマブ付加ナノ粒子の特徴
ＴＥＭ
図２は、球形および不規則な表面を有するベバシズマブ付加ナノ粒子（Ｂ−ＮＰ）の形態を示す。
【０１８６】
ＦＴ−ＩＲの測定
ＩＲは、タンパク質の二次構造における立体配座変化像を評価することを可能とする。図３は、モノクローナル抗体単独およびタンパク質、ならびにその物理的混合物の場合と比較したベバシズマブ付加ナノ粒子のＦＴ−ＩＲスペクトルを示す。
【０１８７】
タンパク質の赤外スペクトルはいくつかのアミド結合を示し、ペプチド部分の異なる振動を表す。このようなシグナル、１６００〜１７００ｃｍ−１の範囲のアミドＩ（主としてＣ＝Ｏ伸縮）および１５５０ｃｍ−１でのアミドＩＩ結合（Ｎ−Ｈ屈曲モードと結びついたＣ−Ｎ伸縮）は、この化学結合の存在の証拠として使用されており、それらのシグナルはタンパク質の二次構造に直接関連している。しかしながら、アミドＩ結合はアミドＩＩよりもタンパク質の二次構造の変化に感受性が高い。このように、これらのシグナルの振動数および強度の変化は、タンパク質との相互作用の証拠である。
【０１８８】
この場合、ナノ粒子が２種類の異なるタンパク質（アルブミンおよびベバシズマブ）により形成されるという事実のために、アミドＩピークに対応するシグナルの振動数に微細な変動が見られた（ＨＳＡでは１６４２ｃｍ−１、Ｂ−ＮＰでは１６４５ｃｍ−１）。
【０１８９】
対照として、グルタルアルデヒドと架橋しているナノ粒子も試験した。この場合にもまた、グルタルアルデヒドとアルブミンの間の相互作用の結果として、アミドＩの振動数に若干の移行（１６４２ｃｍ−１から１６４５ｃｍ−１へ）が見られた。
【０１９０】
Ｘ線試験
図４は、ヒト血清アルブミン、ベバシズマブおよびベバシズマブ付加ナノ粒子のＸ線スペクトルを示す。総ての場合で、これらのスペクトルは、非晶質構造を示す。
【０１９１】
熱分析
ＨＳＡとベバシズマブの官能基の間の反応を決定するために熱分析を行った。図５は、天然アルブミン（ＨＳＡ）およびベバシズマブ（ＢＥＶＡ）（Ａ）、ベバシズマブナノ粒子（Ｂ−ＮＰ）およびアルブミンとベバシズマブの物理的混合物（Ｐ．Ｍ．）（Ｂ）、天然アルブミン（ＨＳＡ）およびグルタルアルデヒド（ＧＬＵ）（Ｃ）、グルタルアルデヒド架橋ナノ粒子（ＮＰ−ＧＬＵ）およびアルブミンとグルタルアルデヒドの物理的混合物（Ｐ．Ｍ．）（Ｄ）のサーモグラムを示す。
【０１９２】
これらのサーモグラムは、天然アルブミンは３０℃前後で発熱効果を表すことを示し、これは、可逆的転移およびその付近での吸熱ガラス転移による二次的熱効果に相当する。
【０１９３】
ＮＰ中にアルブミンに相当する発熱シグナルが存在しないのは、アルブミンとタンパク質（ＢＥＶＡ）および架橋剤（グルタルアルデヒド）の両方との組合せのためである可能性がある。従って、ベバシズマブおよびアルブミンは複合体を形成すると思われる。
【０１９４】
元素分析
表３は、ヒト血清アルブミン、ベバシズマブ、グルタルアルデヒドと架橋しているアルブミンナノ粒子およびベバシズマブ付加アルブミンナノ粒子の元素分析を示す。ベバシズマブは、ヒト血清アルブミンよりも有意に低い炭素および窒素含量を示す。対照的に、モノクローナル抗体の酸素含量は、アルブミンの約２倍である。同様に、ベバシズマブ付加ナノ粒子（Ｂ−ＮＰ）は、天然アルブミンよりも低い窒素パーセンテージおよび高い酸素含量を示した。
【０１９５】
【表３】
2020524715.tif 000004
【０１９６】
実施例４：  ベバシズマブ付加ナノ粒子の安定性
ナノ粒子の安定性を超純水で評価した。サンプルを精製水に分散させ、室温で３日間保存した。種々の時間間隔で、ナノ粒子のサイズ、多分散指数およびゼータ電位を測定することにより安定性を評価した。
【０１９７】
水（ｐＨは７．４に調整）に分散させた後、ベバシズマブ付加ナノ粒子は少なくとも２４時間安定であった（図６）。それらの挙動は、グルタルアルデヒドと架橋している空のナノ粒子で見られるものと同様であった（図６）。同様に、Ｂ−ＮＰの多分散指数（ＰＤＩ）も試験中に影響を受けなかった。従って、ｔ＝０で、ＰＤＩは０．１９±０．０１であり、２４時間後、このパラメーターは０．１６±０．０３であると計算された（データは示されていない）。
【０１９８】
実施例５：  ナノ粒子からのベバシズマブのｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出
図７は、ＰＢＳ中でのアルブミンナノ粒子からのベバシズマブのｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出プロフィールを示す。このプロフィールは、付加された抗体の約２３％が最初の５分初期バースト効果を示し、その後、続いての２４時間に徐放性を示すことを特徴とする。試験の終了時には、付加されたベバシズマブの４０％前後が放出された。バースト放出はナノ粒子の表面に吸着した抗体に関連する可能性がある。
【０１９９】
実施例６．  ベバシズマブ付加コーティングされたアルブミンナノ粒子の調製および特性決定
種々の化合物で修飾されたヒト血清アルブミンナノ粒子中へのベバシズマブの封入は、４工程を含むプロセスによって行った。ベバシズマブ付加ナノ粒子を修飾する能力を調べるために、特に、非イオン性ＨＰＭＣ−ＰおよびＰＥＧ３５を選択した。イオン性コーティングＥｕｄｒａｇｉｔ  Ｓ−１００も使用した。
【０２００】
第一工程は、水性環境中でのナノ粒子の製造に特化したものである。次に、単に水性環境でのインキュベーションによりナノ粒子の表面を修飾した。第三工程は、得られたナノ粒子を精製するために使用し、これを最後に乾燥させた。
【０２０１】
第一工程：１００ｍｇのＨＳＡおよび様々な量のベバシズマブ（１〜２０ｍｇ）を５〜１０ｍＬの注射水に溶解させ、次いで、この溶液をＨＣｌ  １ＭでｐＨ４．１〜４．４に滴定した。この混合物を室温で１０分間インキュベートした。室温にて連続撹拌（５００ｒｐｍ）下、脱溶媒和剤としての１６ｍＬエタノールの連続添加によりナノ粒子を得た。
【０２０２】
第二工程：形成されたばかりのベバシズマブ付加ナノ粒子のコーティングのために、下記の化合物を添加した：ＰＥＧ  ３５，０００、ヒドロキシメチルプロピルセルロースフタレートまたはＥｕｄｒａｇｉｔ  Ｓ−１００。
【０２０３】
対照として、上記のように、エタノール（３００μＬ）中、１２．５μｇのグルタルアルデヒドで５分間架橋することによってバシズマブ付加ナノ粒子を安定化した。
【０２０４】
第三工程：得られたナノ粒子を精製した。２つの異なる手順を使用した：超遠心分離および限外濾過。前者では、ナノ粒子を、４℃にて２１，０００ｘｇで２０分間の遠心分離（Ｓｉｇｍａ  ３Ｋ３０、Ｏｓｔｅｒｏｄｅａｍ  Ｈａｒｚ、ドイツ）を行い、ペレットを水で元の容量に再分散させることにより２回精製した。後者では、ナノ粒子を、孔径５０ｋＤａのポリスルホンメンブレンカートリッジ（Ｍｅｄｉｃａ  ＳＰＡ、イタリア）での限外濾過により精製した。
【０２０５】
第四工程：最後に、ナノ粒子をＧｅｎｅｓｉｓ  １２ＥＬ装置（Ｖｉｒｔｉｓ、ニューヨーク州、ＵＳＡ）でフリーズドライした。超遠心分離を精製法として用いた場合には、最後の遠心分離からのペレットを５％スクロース水溶液に分散させた。限外濾過を用いた場合にも、凍結乾燥前にペレットを５％スクロース水溶液に分散させた。
【０２０６】
表４に、これらのナノ粒子の主要な物理化学的特性をまとめる。全体的にみて、ベバシズマブの付加量は常に同等であり、１４％付近であった。しかしながら、コーティングを目的とするベバシズマブ付加ナノ粒子と異なる賦形剤のインキュベーションは、物理化学的特性が改善されたナノ粒子をもたらした。従って、ベバシズマブを封入するＰＥＧ３５コーティングナノ粒子（Ｂ−ＮＰ−ＰＥＧ３５）は、ネイキッドベバシズマブ付加ナノ粒子（Ｂ−ＮＰ）と同様の平均サイズおよび負のゼータ電位を示した。対照的に、Ｂ−ＮＰ  をＨＰＭＣ−Ｐとインキュベートした場合には、得られるナノ粒子の平均サイズは、Ｂ−ＮＰに比べて有意に大きくなった。インキュベーションがイオン性Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｓ−１００ともに実施された場合、得られるナノ粒子は、Ｂ−ＮＰに比べて、サイズの縮小および陰性度を増したゼータ電位を示した。ＳＥＭによれば、アルブミンナノ粒子は、球形および平滑な表面を示した。
【０２０７】
【表４】
2020524715.tif 000005
【０２０８】
ＰＥＧ３５でコーティングされたベバシズマブ付加ナノ粒子（Ｂ−ＮＰ−ＰＥＧ３５）の形態学的試験（図８）は、それらが不規則な表面および均一な分散を有する球形であることを示す。
【０２０９】
実施例７：  コーティングナノ粒子からのベバシズマブのｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出
図９は、ｐＨ７．４のＰＢＳ中、２種類の非イオン性ポリマー（ＰＥＧ３５およびＨＰＭＣ−Ｐ）およびイオン性Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｓ１００でコーティングされたアルブミンナノ粒子からのベバシズマブのｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出プロフィールを示す。ＰＥＧ３５コーティングナノ粒子（Ｂ−ＮＰ−ＰＥＧ３５）については、プロフィールは、ネイキッドナノ粒子（Ｂ−ＮＰ）に関して見られたものと同様であったが、試験の終了時に、ベバシズマブの放出量がＢ−ＮＰよりも高いという違いがあった。いずれの場合でも、これらのペグ化ナノ粒子は、最初の５分での約２２％の初期バースト効果とその後の少なくとも２４時間のより持続的で緩慢な放出速度を特徴とする二相放出パターンを与えた。バースト放出は２２％近くであり、ナノ粒子の表面に吸着した抗体に関連する可能性がある。この二相区画を、最初の５分のバースト放出を無視して、Ｋｏｒｓｍｅｙｅｒ−Ｐｅｐｐａｓ式を用い、拡散プロフィールに対して補正を行った（ｎ＝０．５４；Ｒ２＝０．９９４）。拡散段階でのベバシズマブの放出は、最初の２時間後にプラトーに達するまで最大４８％であった。
【０２１０】
ＨＰＭＣ−Ｐでコーティングされナノ粒子（Ｂ−ＮＰ−ＨＰＭＣ−Ｐ）でも、最初の６０分ベバシズマブ放出量は約４０％であった。次に、残りの抗体の連続放出速度を観測した。しかしながら、この場合、ベバシズマブの放出速度はＢ−ＮＰまたはＢ−ＮＰ−ＰＥＧ３５よりも速かった。従って、８時間のインキュベーション後には、ＨＰＭＣ−Ｐでコーティングされたナノ粒子から１００％近くのベバシズマブ内容物が放出された。
【０２１１】
非イオン性ポリマーでコーティングされたナノ粒子に対して、イオン性Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｓ−１００（Ｂ−ＮＰ−Ｓ−１００）でコーティングされたナノ粒子は、即放出型のプロフィールを示した。
【０２１２】
実施例８．  アルブミンナノ粒子への封入後のベバシズマブの完全性
アルブミンナノ粒子中に付加されたベバシズマブの量を定量するために使用したＥＬＩＳＡキットで得られた結果を確認するために、種々のナノ粒子中に封入された抗体（ベバシズマブ）の完全性を、Ｅｘｐｅｒｉｏｎ（商標）自動電気泳動システム（Ｂｉｏ  Ｒａｄ、ＵＳ）を用いたマイクロ流体工学に基づく自動電気泳動によって分析した。これらのサンプルを非還元条件および２−メルカプトエタノールを用いた還元条件で評価した。得られたデータは、ソフトウエアＥｘｐｅｒｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて処理した。
【０２１３】
ナノ粒子を秤量し、１ｍＬ  ＮａＯＨ  ０，００５Ｎで崩壊させた。種々の溶液の濃度はタンパク質４００ｎｇ／μＬ前後とした（試験の直線動的範囲は５〜２，０００ｎｇ／μＬである）。遊離タンパク質（アルブミンおよびベバシズマブ）のサンプルを対照として使用した。これらのサンプルを総て、得られた際またはβ−メルカプトエタノールおよび熱で処理した後に評価した。次に、これらのサンプルをＥｘｐｅｒｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｐｒｏ２６０分析キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂ．、ＵＳＡ）のプロトコールに従って処理した。サンプルおよび対照がチップに付加されたところで、それらをＥｘｐｅｒｉｏｎ（商標）自動電気泳動システム（Ｂｉｏ  Ｒａｄ、ＵＳ）によって分析した。
【０２１４】
結果は実際のゲルにデンシトメトリーバンドとして得られた。各バンドは異なるサンプルに相当した。Ｅｘｐｅｒｉｏｎソフトウエアにより、異なるサイズピークを識別し、それらをシステム対照バンドのキロダルトン（「ｋＤａ」）として表した。
【０２１５】
これらの試験の結果を図１０に示す。レーン５に、ベバシズマブは１５０ｋＤａ前後の強いバンドとして現れている。同様のバンドがレーン２（Ｂ−ＮＰ）および３（Ｂ−ＮＰ−ＰＥＧ３５）に見られる。同様に、アルブミンに相当するバンド（レーン４）はまた、レーン１〜３にも明瞭に見られる。
【０２１６】
実施例９．  ウィスターラットにおける眼に投与したナノ粒子の体内分布試験
ＳＰＥＣＴ−ＣＴイメージングのためのウィスターラットにおけるＮＰ放射性標識および体内分布試験
他所に記載の方法に従って９９ｍＴｃ−ペルテクネタートを塩化スズで還元することにより９９ｍＴｃでナノ粒子の放射性標識を行った。簡単に述べると、注射水中、塩化スズ二水和物溶液２０μＬ、最終スズ濃度０．０２ｍｇ／ｍＬを９ｍｇの凍結乾燥ナノ粒子に加えた後、予め還元されたスズに６０μＬの９９ｍＴｃＯ４−溶出液を加えた。４μＬの放射性標識されたナノ粒子懸濁液（５ＭＢｑ）を０．６ｍｇの非標識ナノ粒子処方物と混合し、このような混合物を、イソフルオランで麻酔したウィスターラットの右眼に注意深く投与した。
【０２１７】
ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＳＰＥＣＴ−ＣＴイメージングのためのウィスターラットへの眼内投与
眼からの懸濁液の能動的除去を避けるために動物に１時間麻酔を維持し、次いで、覚醒させ、ナノ粒子の投与後５〜１７時間３０分の間の異なる６時点でＳＰＥＣＴ−ＣＴ画像を取得した。
【０２１８】
イメージング試験のために、動物を各試験の直前にイソフルオランで麻酔し、Ｓｙｍｂｉａ  Ｔ２  Ｔｒｕｅｐｏｉｎｔ  ＳＰＥＣＴ−ＣＴシステム（Ｓｉｅｍｅｎｓ）に腹臥位で設置した。１２８×１２８マトリックス、７画像／秒を用いて画像を取得し、ＣＴは、１１０ｍＡｓおよび１３０Ｋｖ、１３０画像  ３ｍｍ厚に設定した。画像の統合は、Ｓｙｎｇｏ  ＭＩ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ＴｒｕｅＤソフトウエアを用いて行った。画像はビルトインソフトウエアシステムを用いて処理および定量した。選択領域の３平面に等値曲面を自動描写することによって定量値は取得して関心体積（ＶＯＩ）を得、それから計数値の平均値を得た。
【０２１９】
図１１および１２は、点眼剤としての眼投与後のＢ−ＮＰおよびＢ−ＮＰ−ＰＥＧ３５の体内分布を示す。ナノ粒子に関連した放射能は、投与時点からゆっくり消失して胃腸管に移行するとしても、Ｂ−ＮＰの場合には少なくとも４時間、Ｂ−ＮＰ−ＰＥＧ３５の場合には８時間眼に残る。放射性標識されたナノ粒子の動物の咽頭への移行は、図１１の左の一番上に見出すことができる。図１１のＳＰＥＣＴ画像の強度は、動物身体の放射能の位置をより良く識別できるように各個の画像の最高強度点に対して縮尺を変更したものである。
【０２２０】
Ｂ−ＮＰに関し、半定量的減衰により補正した放射能の経時的推移を図１２にプロットする。Ｂ−ＮＰ−ＰＥＧ３５での結果も極めて類似していたが、前記ナノ粒子は眼により長く残るので、排出により時間がかかる。
【０２２１】
実施例１０．  雄ウィスターラットに対する静脈内投与後のナノ粒子の体内分布
ウィスターラットでのｉｎ  ｖｉｖｏ体内分布イメージング試験のために、９９ｍＴｃで標識したベバシズマブ付加ＨＳＡナノ粒子（Ｂ−ＮＰ）およびＰＥＧ３５でコーティングされたベバシズマブ付加ＨＳＡナノ粒子（Ｂ−ＮＰ−ＰＥＧ３５）を投与した。５ｍｇベバシズマブ／ｋｇ体重の単回用量を静脈内に投与し、投与後１０時間まで２時間毎に写真を撮影した。
【０２２２】
図１３に見て取れるように、静脈内投与１時間後に、Ｂ−ＮＰおよびＢ−ＮＰ−ＰＥＧ３５注射に関連する放射能は肝臓および腎臓見られた。また、Ｂ−ＮＰ−ＰＥＧ３５の肝臓取込みが低いことは注目に値する。Ｂ−ＮＰおよびＢ−ＮＰ−ＰＥＧ３５はいずれの臓器にも蓄積しない。
【０２２３】
実施例１１．  角膜血管新生に対するベバシズマブ付加アルブミンナノ粒子の効果
角膜血管新生のラットモデルにおけるベバシズマブ付加ナノ粒子の効力を評価するために、Ｈａｒｌａｎからおよそ２００ｇの雄ウィスターラットを入手した。試験は、動物実験に関する欧州規則に従って所内動物実験倫理委員会により承認された（プロトコール番号１７２−１４）。
【０２２４】
動物は、１００μＬの５ｍｇ／ｋｇキシラジン溶液（Ｘｉｌａｇｅｓｉｃ、Ｃａｌｉｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）および２００μＬの４０ｍｇ／ｋｇケタミン溶液（ＩＭＡＬＧＥＮＥ、Ｍｅｒｉａｌ）の腹膜内投与後に鎮静下で維持した。次に、１滴の毛様体筋麻痺洗眼剤（Ｃｏｌｉｒｉｃｕｓｉ  Ｔｒｏｐｉｃａｍｉｄａ、１０ｍｇ／ｍＬ、Ａｌｃｏｎ）をラットの各眼に投与した。５分後、眼の表面に５秒間、硝酸銀スティック（Ａｒｇｅｐｅｎａｌ、Ｂｒａｕｎ）を適用することによりラットの角膜を焼いた。最後に、０．９％ｐ／ｖのＮａＣｌ無菌溶液で洗眼した。
【０２２５】
１２時間後、動物をイソフルオラン（Ｉｓｏｖｅｔ、スペイン）で麻酔し、異なる群に分けた。動物の眼に以下の処置を適用した：（ｉ）７日間、１２時間毎に１０μＬの４ｍｇ／ｍＬベバシズマブ（アバスチン（登録商標））水溶液、（ｉｉ）７日間、１２時間毎に１０μＬの４ｍｇ／ｍＬアフリベルセプト（アイリーア（登録商標））水溶液、（ｉｉｉ）７日間、１２時間毎に１０μＬの０．１％リン酸デキサメタゾン（Ｃｏｌｉｒｉｃｕｌｉ  ｄｅｘａｍｅｔａｓｏｎａ（登録商標））水溶液、（ｉｖ）１週間、毎日、ベバシズマブ付加アルブミンナノ粒子（Ｂ−ＮＰ；４０μｇベバシズマブを含有する１０μＬ懸濁液）、および（ｖ）１週間、毎日、ＰＥＧ３５でコーティングされたベバシズマブ付加アルブミンナノ粒子（Ｂ−ＮＰ−ＰＥＧ３５；４０μｇベバシズマブを含有する１０μＬ懸濁液）。対照として、ある動物群に生理的血清（ＰＢＳ）を施し、別の動物群にＰＢＳ（ＨＳＡ）に溶解させたヒト血清アルブミンを、Ｂ−ＮＰ−ＰＥＧ３５の投与と同量で施した。
【０２２６】
図１４は、０時間（０日目）に行った角膜の腐食および２４時間（１日目）の初回処理を示す模式的タイムラインに相当する。
【０２２７】
計算のために、角膜のデジタル画像を取得し、ＩｍａｇｅＪソフトウエア（パブリックドメイン、http://rsb.info.nih.gov/ij/）を用いて解析した。画像は、画像を白黒形式に調整してバイナリーモードで解析した。これらの画像から、角膜の総面積を決定するとともに、硝酸銀による火傷が占める角膜表面（傷害）および新血管の形成（角膜血管新生）により影響を受けた面積を画素数により計算した。これらのパラメーターから、侵襲面積(invasive area)（ＩＡ）およびＣＮＶ（傷害表面により正規化した角膜血管新生(corneal neovascularization normalized by the lesion surface)）を次のように決定した：
ＩＡ＝［（新血管の形成により影響を受けた面積）／（総角膜面積）］×１００
ＣＮＶ＝ＩＡ／（火傷により影響を受けた眼の表面）
【０２２８】
表５は、種々のベバシズマブ処置の効力を傷害により誘導された血管新生により影響を受けた眼の表面の減少の結果としてまとめる（図１５）。総ての場合で、動物の眼に誘導された傷害は同等であり、４群間で傷害面積に統計的な差異は見られなかった（ｐ＞０．０５；図１６）。
【０２２９】
ベバシズマブ溶液（ＢＥＶＡ）で処置した動物群は、ＰＢＳ（陰性対照）を受容した動物よりも血管新生により影響を受けた眼の表面が少なかった。他方、ベバシズマブ付加ナノ粒子（Ｂ−ＮＰ）で処置した動物では、角膜血管新生により影響を受けた眼の表面は、アバスチン（登録商標）（ＢＥＶＡ）で処置した動物の場合の２．７分の１であることが判明した（図１７および１８）。動物がペグ化ナノ粒子中に付加されたベバシズマブで処置された場合、血管新生により影響を受けた表面の減少は、アバスチン（登録商標）で処置した動物の場合の約１．４分の１であった。ナノ粒子で処置した動物にはアバスチン（登録商標）で処置した動物に投与されたベバシズマブの５０％減が施されたことを強調することが重要である。もう一つの重要な所見は、本発明者らの実験条件下では、デキサメタゾンもアイリーア（登録商標）も血管新生にプラスの効果を示さなかったことであった（表９、図１５）。
【０２３０】
【表５】
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【０２３１】
組織学
角膜血管新生を伴う眼の組織学的研究のために、処置の終了時に、各群２眼を摘出した。眼の表面を生理食塩水で洗浄し、前極を後極から分離した。角膜を平らにマウントし、４％パラホルムアルデヒドで２４時間固定した後、サンプルに対してＰＢＳで数回の洗浄を行った。これらの角膜を後部切断および分析のために７０％メタノール中で維持した。
【０２３２】
角膜の分析のために、これらをパラフィンに封入し、角膜の中心および血管新生領域から４マイクロメーターの切片をスライスした。次に、それらをヘマトキシリン−エオシンで染色し、光学顕微鏡を用いて分析した。これらの切片の評価には、血管新生の強度、炎症、繊維症、浮腫の強度、および角膜の平均厚を含んだ。試験は処置群を知らされない検査者によって実施された。画像は、デジタルカメラＮｉｋｏｎ  ＤＳ−Ｒｉ  １を装備したＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｅｓｅ  Ｃｉ顕微鏡で採取した。これらの画像を、デジタル画像Ｎｉｋｏｎ’ｓ  ＮＩＳ−エレメンツ用の較正済み分析システムを用いて解析した。
【０２３３】
血管新生の強度の評価には、次のスコアを使用した：０＝血管新生無し；１＝最小のまたは陰性に近い血管形成；２＝軽度の血管形成；３＝上皮下および間質前領域(prestromal areas)における限定されたまたは局部的な血管形成（中等度の血管新生）；４＝極めて頻繁または強い；５＝散在しかつ強い血管形成。同様に、炎症の強度は次のようにスコア化した：０＝炎症無し；１＝最小のまたは陰性に近い炎症；２＝リンパ球、好中性白血球、および好塩基性白血球などの炎症細胞種の混在が局部的、少数；３＝中等度の炎症；４＝極めて頻繁または強い；５＝炎症細胞種の混在が強い、散在。繊維芽細胞の活性のスケーリングシステムは、０＝繊維芽細胞活性無し；１＝最小のまたは陰性に近い繊維芽細胞の活性；２＝局部的な繊維芽細胞活性；３＝中等度の繊維芽細胞活性；４＝極めて頻繁；５＝散在しかつ強い繊維芽細胞活性。最後に、浮腫は次のスコアで分類した：０＝浮腫無し；１＝最小のまたは陰性に近い浮腫；２＝軽度の浮腫；３＝中等度の浮腫；４＝極めて頻繁または強い；５＝散在しかつ強い浮腫。
【０２３４】
図１９は、試験に含まれる動物の眼の組織学的試験を示す。Ｂ−ＮＰ（図１９Ｂ）およびＢ−ＮＰ−ＰＥＧ３５（図１９Ｃ）で処置した角膜の傷害部は回復期にあり、それらは視力に一時的に影響を及ぼす前であるが、この時はそうではない。従って、損傷は可逆的である。対照的に、生理的血清で処置した角膜の傷害部は視力に極めて重大な影響を及ぼしており、不可逆的であると思われた（図１９Ｆ）。
【０２３５】
【表６】
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【０２３６】
表６に、異なる群における組織病理学的(hispopathological)評価をまとめる。血清で処置した角膜は、ベバシズマブで処置したものの１．４倍、Ｂ−ＮＰで処置したものの２．７倍の厚さを示した。他方、アバスチン（登録商標）（ＢＥＶＡ）で処置した角膜は、Ｂ−ＮＰで処置した角膜の２倍、Ｂ−ＮＰ−ＰＥＧ３５で処置したものの１．３倍の厚さを示した。同様に、Ｂ−ＮＰで処置した角膜は、繊維症の程度が低く、血管形成が低く、かつ、浮腫が存在しない最良の状態を示した。
【０２３７】
実施例１２．  腫瘍担持ヌードマウスに対する静脈内投与後のナノ粒子の体内分布
マウスにおける腫瘍イメージング試験のために、ヒト肝細胞癌細胞（ＨｅｐＧ２）を標準的な条件で培養し、播種１週間後に採取し、ＰＢＳに懸濁させた。腫瘍は、ヌードマウスにおいて、異なる２箇所：右肢および背の上部に５×１０５のＨｅｐＧ２細胞を皮下注射した後に誘導された。腫瘍増殖を、明瞭に視認できるまで１２〜１５日間経過観察し、その後、動物を、ＰＥＧ３５でコーティングされた９９ｍＴｃ標識ＨＳＡナノ粒子（ＮＰ−ＰＥＧ３５）の静脈注射の後に、ＳＰＥＣＴ−ＣＴ  ｉｎ  ｖｉｖｏイメージング試験のために使用した。ｉ．ｖ．投与１時間および４時間後に、動物を安楽死させ、両方の腫瘍および対側の肢からの筋肉の一部（腫瘍不含）を摘出した。９９ｍＴｃに関して較正したガンマカウンターでサンプルを計数し、サンプル重量および減衰に関して補正し、バックグラウンドとして対側の肢からの筋肉を用いて、腫瘍／非腫瘍比を計算した。
【０２３８】
図２０に見て取れるように、腫瘍担持マウスにおいて、静脈内注射したＮＰ−ＰＥＧ３５に関連する放射能は腫瘍内に濃縮される（正常組織と比較した場合）。このような現象は、ナノ粒子の投与４時間後に、腫瘍内に存在する量は、すでに高値で留まっているにもかかわらず（腫瘍／非腫瘍比＞６）に減少するので、時間依存的であると思われる。
【０２３９】
実施例１３．  マウス結腸直腸癌モデルに対するベバシズマブ付加アルブミンナノ粒子の効果
試験は、動物実験に関する欧州規則に従って所内動物実験倫理委員会により承認された（プロトコール番号１０７−１６）。試験のために、２０グラム前後、３週齢の４２個体の無胸腺ヌードマウスをＨａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ、Ｉｎｃから購入した。マウスは、施設のガイドラインに従い、管理された環境で維持した。食物および水は自由に摂らせた。
【０２４０】
ヒト結腸癌細胞（ＨＴ−２９）を標準的な条件で培養し、播種１週間後に採取し、ＰＢＳに懸濁させた。腫瘍誘導のため、マウスを吸入によるイソフランで麻酔し、２〜３×１０６のＨＴ−２９腫瘍細胞（ベバシズマブ感受性ヒト結腸癌細胞株）を含有する１００μＬを、各動物の片側の腹側部に皮下注射した。腫瘍増殖は、明瞭に視認できるまで（直径０．４〜０．６ｃｍ）、１２〜１５日間経過観察した後、処置を開始した。
【０２４１】
マウスを各群７個体の６群に無作為化した：（ｉ）ベバシズマブ（アバスチン）水溶液、（ｉｉ）ベバシズマブ付加アルブミンナノ粒子（Ｂ−ＮＰ）、（ｉｉｉ）ＰＥＧ３５，０００でコーティングされたベバシズマブ付加アルブミンナノ粒子（Ｂ−ＮＰ−ＰＥＧ３５）、（ｉｖ）生理的血清（ＰＢＳ）、（ｖ）Ｂ−ＮＰ−ＰＥＧ３５を投与する場合と同量の、ＰＥＧ３５，０００でコーティングされた空のナノ粒子（ＮＰ−ＰＥＧ３５）、および（ｖｉ）Ｂ−ＮＰを施した群と同量のアルブミンを含有するＨＳＡ水溶液。総ての場合で、ベバシズマブ５ｍｇ／体重ｋｇを含有する製剤１５０〜２００μＬを２回／週、静脈内に投与した。対照群には、同時点で０．９％生理食塩水の静脈内注射を施した。
【０２４２】
血液サンプルを０日目（初回投与の前）、初回投与後１５日目、２２日目および２６日目に採取した。ベバシズマブ血清濃度を、特異的な酵素イムノアッセイ（Ｓｈｉｋａｒｉ  Ｑ−Ｂｅｖａ）により測定した。
【０２４３】
腫瘍体積および重量を１〜２回／週記録した。腫瘍（Ｖ）は幅（Ｗ）と長さ（Ｌ）の二次元で、カリパスを用いて測定し、下式（式５）を用いて計算した：
Ｖ（ｍｍ３）＝長さ×（幅(with)）２×０．５  ［式５］
【０２４４】
図２１は、時間に対する腫瘍体積を示す。各群で同一の体積の腫瘍が増殖し、試験の開始時にこれらの６群間で腫瘍体積に統計的な差異は見られなかった（ｐ＞０．０５）。
【０２４５】
１２日目に、Ｂ−ＮＰ−ＰＥＧ３５を施した群は、残りの群よりも有意に低い腫瘍体積を示した（ｐ＜０．０５）。１４日目までに、ＢＥＶＡおよびＢ−ＮＰ−ＰＥＧ３５を施した群は、残りの群よりも有意に低い腫瘍体積を示した（ｐ＜０．０５）。２２日目に、処置を施さなかった群は、ベバシズマブ付加ナノ粒子（Ｂ−ＮＰ）、ベバシズマブ（ＢＥＶＡ）およびペグ化ナノ粒子中に付加されたベバシズマブ（Ｂ−ＮＰ−ＰＥＧ３５）で処置した動物よりも高い腫瘍体積を示した。試験の終了までに、ベバシズマブを施さなかった群の動物の半数が腫瘍内に潰瘍を発達させたことは言及する価値がある。
【０２４６】
図２２は、血清中のベバシズマブレベルを示す。サンプルは、０日目（投与前）、初回投与後１５日目、２２日目および２６日目に採取した。毎週の投与日の翌日に当たる２２日目に血清ベバシズマブレベルの上昇が見られることは注目に値する。図２２で、遊離薬物を施したマウスのベバシズマブの血清レベルは、ナノ粒子（Ｂ−ＮＰおよびＢ−ＮＰ−ＰＥＧ３５）を施した場合の最大６倍であることが見て取れる。
【０２４７】
ナノ粒子中に封入されたベバシズマブを投与するメリットは、ベバシズマブのより低い血清レベルにある。遊離ベバシズマブの静脈内投与後に、血流中には高濃度の薬物が存在し、これが副作用を引き起こす。この濃度は、プラトーに達するまでゆっくり低下する。しかしながら、新たな用量の投与の後に、血流中のベバシズマブ濃度は高まり（図２２参照）、それにより、副作用の可能性が増す。
【０２４８】
他方、ベバシズマブナノ粒子の静脈内投与の後には、薬物の血清レベルは、プラトーに達するまでゆっくり上昇する。この濃度は、遊離ベバシズマブで得られたものの６分の１であ、一定に留まる。また、新たな用量が投与されるたびごとの、血中のベバシズマブのピーク濃度はずっと低い。これにより副作用の見込みは低くなる。
【０２４９】
また、ポリエチレングリコールは、ナノ粒子の表面にバリアを付与してオプソニン化を防ぐ（オプソニン化は、ｉ．ｖ．注射後の数時間内に注射された用量（ＩＤ）の損失に関する主要な機構である）。
【０２５０】
Ｐｅｔイメージング
試験の終了時に、ベバシズマブおよびペグ化ナノ粒子に付加したベバシズマブ処置のマウス、ならびに生理的血清のマウス３個体を、１８Ｆ−ＦＤＧ−ＰＥＴイメージングを行うために選択した。このために、マウスを一晩絶食させ、ただし、水は自由に飲ませた。  翌日、マウスを１００％Ｏ２ガス中イソフラン２％で麻酔し、１８Ｆ−ＦＤＧ  ＰＥＴ中もなお維持した。スキャンの４０分前に１８Ｆ−ＦＤＧ（８０〜１００μＬ中、１０ＭＢｑ±２）を尾静脈から注射した。ＰＥＴイメージングは、Ｐｈｉｌｉｐｓ  Ｍｏｓａｉｃ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈ（クリーブランド、ＯＨ）にて、分解能２ｍｍ、体軸方向視野(axial field of view)（ＦＯＶ）１１．９ｃｍおよび断面内視野(transaxial FOV)１２．８ｃｍで行った。１５分のスタティック収集（サイノグラム）を行うために、麻酔したマウスをＰＥＴスキャナーベッドに水平に配置した。画像は、２反復および緩和パラメーター０．０２４で３Ｄ  Ｒａｍｌａアルゴリズム（真の３Ｄ再構成）を用いて、デッドタイム補正、減衰補正、ランダム補正および散乱補正を適用するボクセルサイズ１ｍｍを適用し、１２８×１２８マトリックスへと再構成した。腫瘍の１８Ｆ−ＦＤＧ取込みの評価のために、総ての試験をエクスポートし、ＰＭＯＤソフトウエア（ＰＭＯＤ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ．、アドリスヴィル、スイス）を用いて分析した。腫瘍全体を含む連続切片の冠状１ｍｍ厚、小動物ＰＥＴ画像に関心領域(Regions of interest)（ＲＯＩ）を描いた。最後に、最大標準化取込み値(standardized uptake value)（ＳＵＶ）を、式：
ＳＵＶ＝［組織活性濃度（Ｂｑ／ｃｍ３）／注射用量（Ｂｑ）］×体重（ｇ）
を用い、各腫瘍について計算した。
【０２５１】
表７に、種々の群のＰＥＴイメージング結果をまとめる。ＳＵＶｍａｘ（最大腫瘍取込み）に関して、最低値はＢ−ＮＰ−ＰＥＧ３５で処置した群に相当し、最高値は生理的血清を施した群に相当した。
【０２５２】
体積に関して、最低値はＢ−ＮＰ−ＰＥＧ３５およびＨＳＡで処置した群に属した。しかしながら、ＨＳＡ群の選択された動物は、それらだけ潰瘍が存在しなかったことから代表的なものではなかった。最高値は、この場合にも、処置を施さなかった（生理的血清）群に属した。Ｂ−ＮＰ−ＰＥＧ３５群は、生理的血清群の３分の１、また、ＢＥＶＡ群の１．５分の１の体積を呈した。
【０２５３】
最後に、ＴＬＧ（全病変解糖）は、Ｂ−ＮＰ−ＰＥＧ３５で処置した群に関して最小値を示し、それはＢＥＶＡで処置した群の１．５分の１、また、生理的血清を施した群の３．５分の１であった。
【０２５４】
【表７】
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【０２５５】
実施例１４．  ラニビズマブ付加ヒト血清アルブミンナノ粒子の調製
ラニビズマブ付加ＨＳＡナノ粒子は、実施例１でベバシズマブ付加アルブミンナノ粒子に関して記載したものと同じ手順に従って調製した。
【０２５６】
ラニビズマブ付加ナノ粒子に関して、最適抗体／アルブミン比率は０．１５であった。ラニビズマブナノ粒子は、およそ２１０ｎｍの粒径を示し、ＰＤＩは０．３未満、ゼータ電位は−１５ｍＶであった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【図１９Ｆ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年2月28日(2020.2.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノ粒子を含んでなる、眼疾患を治療するための医薬であって、
前記ナノ粒子が、ソリッドコアを含んでなり、
前記ソリッドコアが、非架橋アルブミンマトリックスおよびモノクローナル抗体を含んでなり、
前記モノクローナル抗体が、前記アルブミンマトリックス全体に分布しており、
前記ソリッドコアが、非イオン性ポリマーでコーティングされていてもよい、前記医薬。
【請求項２】
前記眼疾患が、黄斑変性、角膜血管新生または血管形成、虹彩血管新生または血管形成、網膜血管新生または血管形成、糖尿病性増殖網膜症、非糖尿病性増殖網膜症、緑内障、感染性結膜炎、アレルギー性結膜炎、潰瘍性角膜炎、非潰瘍性角膜炎、上強膜炎、強膜炎、糖尿病性網膜症、ブドウ膜炎、眼内炎、感染状態および炎症状態から選択される、請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
ナノ粒子を含んでなる、癌を治療するための医薬であって、
前記ナノ粒子が、ソリッドコアを含んでなり、
前記ソリッドコアが、非架橋アルブミンマトリックスおよびモノクローナル抗体を含んでなり、
前記モノクローナル抗体が、前記アルブミンマトリックス全体に分布しており、
前記ソリッドコアが、非イオン性ポリマーでコーティングされていてもよい、前記医薬。
【請求項４】
前記癌が、乳癌、肺癌、膵臓癌、多発性骨髄腫、腎細胞癌、前立腺癌、黒色腫、結腸癌、結腸直腸癌、腎臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、腎癌および胃癌、膀胱癌または扁平上皮癌である、請求項３に記載の医薬。
【請求項５】
前記ソリッドコアがコーティングされている場合、前記ソリッドコアが非イオン性ポリマーでコーティングされている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項６】
前記モノクローナル抗体／アルブミン重量比率が、０．０１〜０．５の範囲である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項７】
前記非イオン性ポリマー／アルブミン比率が、０．０２〜５（ｗ／ｗ）の範囲である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項８】
前記アルブミンが、ヒト血清アルブミンまたはウシ血清アルブミンである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項９】
前記モノクローナル抗体が、ベバシズマブ、ラニビズマブ、トラスツズマブ、セツキシマブおよびリツキシマブから選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項１０】
前記非イオン性ポリマーが、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシ−ｎ−プロピルセルロース、ヒドロキシ−ｎ−ブチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、およびエチルヒドロキシエチルセルロースから選択される水溶性セルロース；デンプン；デキストラン；ポリビニルピロリドン、商品名Ｅｕｄａｇｒｉｔの化合物から選択されるポリエステル；またはポリアルキレングリコールである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項１１】
前記ナノ粒子が、以下の工程：
ａ）アルブミンおよびモノクローナル抗体の水溶液を調製する工程；
ｂ）工程ａ）の水溶液をｐＨ４〜５に滴定する工程；
ｃ）工程ｂ）の水溶液に脱溶媒和剤を添加して、アルブミン−モノクローナル抗体ナノ粒子を形成する工程；
ｄ）所望により、工程ｃ）で形成されたアルブミン−モノクローナル抗体ナノ粒子を非イオン性ポリマーとともにインキュベートする工程；および、所望により、
ｅ）前記ナノ粒子を真空乾燥、噴霧乾燥または凍結乾燥によって乾燥させる工程
を含んでなる方法によって得られる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項１２】
ソリッドコアを含んでなるナノ粒子であって、
前記ソリッドコアが、非架橋アルブミンマトリックスおよびモノクローナル抗体を含んでなり、
前記モノクローナル抗体が、前記アルブミンマトリックス全体に分布しており、
前記ソリッドコアが、非イオン性ポリマーでコーティングされている、前記ナノ粒子。
【請求項１３】
複数のナノ粒子；および
薬学上許容可能な賦形剤、担体またはビヒクル
を含んでなる医薬組成物であって、
前記ナノ粒子が、非架橋アルブミンマトリックスおよびモノクローナル抗体を含んでなるソリッドコアを含んでなり、
前記モノクローナル抗体が、前記アルブミンマトリックス全体に分布しており、
前記ソリッドコアが、非イオン性ポリマーでコーティングされていてもよい、前記医薬組成物。
【請求項１４】
前記ソリッドコアがコーティングされている場合、前記ソリッドコアが非イオン性ポリマーでコーティングされている、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記ナノ粒子が、乾燥粉末の形態である、請求項１３または１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
薬学上許容可能な前記賦形剤、担体またはビヒクルが、経口、局所または非経口投与に好適である、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記アルブミンが、ヒト血清アルブミンまたはウシ血清アルブミンである、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記モノクローナル抗体が、ベバシズマブ、ラニビズマブ、トラスツズマブ、セツキシマブおよびリツキシマブから選択される、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記非イオン性ポリマーが、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシ−ｎ−プロピルセルロース、ヒドロキシ−ｎ−ブチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、およびエチルヒドロキシエチルセルロースから選択される水溶性セルロース；デンプン；デキストラン；ポリビニルピロリドン、商品名Ｅｕｄａｇｒｉｔの化合物から選択されるポリエステル；またはポリアルキレングリコールである、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
2020524715.tif 000036
2020524715.tif 000037
2020524715.tif 000038
2020524715.tif 000039