(57)【要約】  本発明は、異常な膣細菌叢を有する女性における体外受精の成功率を向上させるための方法を提供する。該方法は、（ｉ）異常な膣細菌叢（ＡＶＭ）を有することが疑われる女性を選択する工程と；（ｉｉ）前記女性が有する異常な膣細菌叢の量を低減させるのに有効な量及び期間で投与される適切な抗生物質を前記女性に投与する工程と；（ｉｉｉ）膣粘膜を定着させるのに十分な量で、膣内投与を介して、ラクトバチルスを前記女性に投与する工程と；並びに（ｉｖ）胚を前記女性に移植する工程と、を含む。
2020526582.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
異常な膣細菌叢を有する女性における体外受精の成功率を向上させるための方法であって、
ｉ）異常な膣細菌叢（ＡＶＭ）を有することが疑われる女性を選択する工程と；
ｉｉ）ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）及びアトポビウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ  ｖａｇｉｎａｅ）を含む細菌性膣炎付随細菌に対して活性を有する抗生物質を、工程ｉｉｉの前に少なくとも５日間、前記女性に投与する工程であって、前記抗生物質が、前記女性が有する異常な膣細菌叢の量を低減させるのに有効な量及び期間で投与される工程と；
ｉｉｉ）膣内投与を介してラクトバチルス種を前記女性に投与する工程であって、ラクトバチルスの量が工程ｉｉの抗生物質投与後に膣粘膜を定着させるのに十分であり、前記ラクトバチルス種が、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ラクトバチルス・ジェンセニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｅｎｓｅｎｉｉ）及びラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）からなる種の群から選択され、前記種が、有効な培養条件下で０．５ｐｐｍより多くの過酸化水素を産生する能力を有する工程と、並びに；
ｉｖ）ヒト接合子又は胚を前記女性に移植する工程と、
を含む、方法。
【請求項２】
前記患者に投与されるラクトバチルスの前記量が毎日投与であって、１回投与当たり１０８〜１０１０ＣＦＵである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗生物質が、クリンダマイシン及びメトロニダゾールからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記患者が、ＡＶＭを規定するものとして受け入れられている閾値を上回るガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）及び／又はアトポビウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ  ｖａｇｉｎａｅ）のレベルを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記患者に投与されるラクトバチルス種の前記量が、胚移植（ＥＴ）の前に、１日１回７日間及び１回投与当たり１０８〜１０１０ＣＦＵであり、その後、超音波及び／又は胎児の心拍の検出によって臨床妊娠が確定されるまで、週に２回、同じ用量で７週間である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ラクトバチルス種が、乾燥組成物として投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ラクトバチルス種が、動物由来の成分を含まない培地中で保存される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ラクトバチルス種が、乾燥の前に、
（ｉ）５〜１５％、ｗ／ｖのトレハロース；
（ｉｉ）２〜７％、ｗ／ｖのキシリトール；
（ｉｉｉ）０．５〜１．０％、ｗ／ｖのアスコルビン酸ナトリウム及び
（ｉｖ）１０〜３０ｍＭのリン酸ナトリウム
から実質的になる水性保存培地中に懸濁されている、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記ラクトバチルス種が、前記抗生物質と同時投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ラクトバチルス種の前記投与が、工程ｉｉの完了後に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ラクトバチルス種が、胚移植前の少なくとも７日間に渡って投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ラクトバチルス種がラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ラクトバチルス種が、エル・クリスパータス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）と少なくともさらに１つのラクトバチルスの種とを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
異常な膣細菌叢（ＡＶＭ）に罹患し、又は罹患が疑われ、及び処置後にＩＶＦを受けることが予定されている（及び／又はヒト接合子又は胚を移植される）女性の処置において使用するための、ラクトバチル種を含む組成物であって、前記女性が、ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）及びアトポビオウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｏｕｍ  ｖａｇｉｎａｅ）を含む細菌性膣炎付随細菌に対して活性を有する抗生物質で以前に（例えば、少なくとも５日間）処置されたことがあり、前記抗生物質が、前記女性が有する異常な膣細菌叢の量を低減するのに有効な量及び期間で投与されており；前記組成物が膣内投与用である、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１７年７月７日に出願された米国仮特許出願第６２／５２９，７３３号の優先権を主張し、その内容全体が、あらゆる目的のために、本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
一般に、健康な膣の細菌叢では、ラクトバチルス種が支配的であり、これは、乳酸の産生と膣の酸性化を介して又は過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）などの他の抗菌性産物の産生によって、感染に抵抗する上で重要な役割を果たしているグラム陽性桿菌である。世界中の女性の生殖器系から最も一般に単離されているラクトバチルスの種には、エル・クリスパータス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、エル・ジェンセニイ（Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ）、エル・ガセリ（Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ）及びエル・イナース（Ｌ．ｉｎｅｒｓ）が含まれる。例えば、Ａｎｔｏｎｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８０：１９５０−１９５６；Ｖａｓｑｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４０：２７４６−２７４９；Ｖａｌｌｏｒ，Ａ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．２００１  Ｄｅｃ  １，１８４（１１）：１４３１−６；Ｒａｖｅｌ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，ＵＳＡ．２０１１  Ｍａｒ  １５，１０８  Ｓｕｐｐｌ  １：４６８０−７を参照されたい。エル・クリスパータス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、エル・ジェンセニイ（Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ）及びエル・ガセリ（Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ）はＨ２Ｏ２を産生することができるのに対して、エル・イナース（Ｌ．ｉｎｅｒｓ）菌種は、一般にＨ２Ｏ２を産生しない。これらの種は、食品及び／又は環境に存在するラクトバチルス種とは、系統的に及び機能的に異なっている。これらの通性嫌気性菌は、グルコースを乳酸に代謝し、膣の非特異的生体防御の大部分を占める膣の低ｐＨ（４．０〜４．５）の維持に寄与している。Ｈ２Ｏ２産生菌種（例えば、エル・クリスパータス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）及びエル・ジェンセニイ（Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ））は、Ｈ２Ｏ２を産生しない菌種（エル・イナース（Ｌ．ｉｎｅｒｓ））より保護的である。実際に、支配的な膣ラクトバチルス細菌叢を有する女性では、淋病、クラミジア感染症、膣トリコモナス症及び細菌性膣炎の発生頻度が５０％低いことが実証されている。したがって、正常な膣の細菌叢に付随する有益なラクトバチルスは、保護的な「バイオフィルム」を提供すると考えることができる。例えば、Ｆａｌａｇａｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｄｒｕｇｓ，６６：１２５３−１２６１を参照されたい。
【０００３】
妊娠可能年齢の多くの健康な女性では、膣の細菌叢は、低い微生物の多様性を呈し、液体１ｇ当たり１０７〜１０９コロニー形成単位（ＣＦＵ）のラクトバチルスが支配的であり、同時に、膣は酸性で、低いレベルの炎症促進性サイトカインを含有する。残念なことに、妊娠可能年齢の女性の一部は、膣ラクトバチルスを有さないか、又は低いレベルの膣ラクトバチルスを有しており、これは、膣の微生物生態系が動的であり、月経周期、薬物、全般的な健康状態、性的行為及び衛生習慣並びに避妊によって影響を受け得るという事実によるものであり得る。支配的な膣ラクトバチルス種の喪失は、ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）及びアトポビウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ  ｖａｇｉｎａｅ）などの通性及び偏性嫌気性菌が生息するより多様性を有する異常な細菌叢、より高い膣のｐＨ、より高いレベルの炎症促進性サイトカイン（細菌性膣炎）をもたらす。
【０００４】
ＢＶは、魚のような匂いと４．５より大きいｐＨを有する均質な白い膣分泌物及び糸玉状細胞（接着性の細菌で覆われた扁平上皮細胞）の存在などの症状を含むＡｍｓｅｌの基準又はグラム染色された膣スメアに基づくＮｕｇｅｎｔスコアを使用して、通例診断される（Ａｍｓｅｌ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．７４：１４−２２及びＮｕｇｅｎｔ，Ｒ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２９：２９７−３０１）。しかしながら、全ての女性がＢＶの症状を示すわけではない。実際に、最近のある研究は、ＢＶ症例の最大５０％は無症候性であることを示した（Ｒａｖｅｌ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０８  Ｓｕｐｐｌ  １：４６８０−４６８７）。
【０００５】
性行為感染症（ＳＴＤ）を含む、異常な膣細菌叢の存在を伴う下部生殖管感染症は、妊娠可能年齢の女性における最も一般的な臨床上の問題の一部である。異常な膣細菌叢、特に細菌性膣炎（ＢＶ）は、妊娠時において最も一般的な生殖器感染症の１つである。妊娠中の異常な膣細菌叢の存在は、早期分娩、低出生体重及び新生児死亡率に関連している。妊娠中期に細菌性膣炎と診断された女性は、細菌性膣炎でない女性より、未熟な低出生体重の乳児を出産する可能性が４０％高い。例えば、Ｈａｙ，Ｐ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）ＢＭＪ．３０８：２９５−２９８；Ｈｉｌｌｉｅｒ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３３：１７３７−１７４２；Ｌａｒｓｓｏｎ，Ｐ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ａｃｔａ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｓｃａｎｄ．７９：３９０−３９６；Ｓｖａｒｅ，Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００６）ＢＪＯＧ  １１３：１４１９−１４２５；Ｔｈｏｒｓｅｎ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ａｃｔａ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｓｃａｎｄ．８５：９０６−９１１；及びＢｒｏｃｋｌｅｈｕｒｓｔ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｃｏｃｈｒａｎｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｓｙｓｔ．Ｒｅｖ．１：ＣＤ０００２６２を参照されたい。
【０００６】
さらに、細菌性膣炎は、不妊女性集団の約１９％中にも見出されている。例えば、Ｈａａｈｒ，Ｔ．ｅｔ．ａｌ．Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．２０１６  Ａｐｒ，３１（４）：７９５−８０３を参照されたい。不妊女性において行われたＢＶ研究は、ＡＶＭの存在は女性不妊に影響を与え、ＩＶＦ患者での臨床妊娠率と負の相関があることを示唆している（Ｈａａｈｒ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．２０１６  Ａｐｒ，３１（４）：７９５−８０３；Ｍａｎｇｏｔ−Ｂｅｒｔｒａｎｄ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ（２０１３）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．３２：５３５−５４１；Ｓａｌａｈ，Ｒ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｂｉｏｌ．１６７：５９−６３）。本発明は、ＩＶＦ手法に関連するこれら及びその他の要望に取り組む。
【発明の概要】
【０００７】
一態様において、本発明は、異常な膣細菌叢を有する女性における体外受精の成功率を向上させるための方法を提供する。この方法は、（ｉ）異常な膣細菌叢（ＡＶＭ）を有することが疑われる女性を選択すること；（ｉｉ）細菌性膣炎付随細菌（例えば、ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）及びアトポビウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ  ｖａｇｉｎａｅ））に対して活性を有する抗生物質を、工程ｉｉｉの前に少なくとも５日間、前記女性に投与し、前記抗生物質が、前記女性が有する異常な膣細菌叢の量を低減させるのに有効な量及び期間で投与されること；（ｉｉｉ）膣内投与を介してラクトバチルス種を前記女性に投与し、ラクトバチルスの前記量が工程ｉｉの抗生物質投与後に膣粘膜を定着させるのに十分であり、前記ラクトバチルス種が、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ラクトバチルス・ジェンセニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｅｎｓｅｎｉｉ）及びラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）からなる種の群から選択され、前記種が、有効な培養条件下で０．５ｐｐｍより多くの過酸化水素を産生する能力を有すること、並びに；（ｉｖ）ヒト接合子又は胚を前記女性に移植すること、を含む。
【０００８】
いくつかの実施形態において、異常な膣細菌叢を有する女性における体外受精の成功率を向上させるための前記方法は、１回投与当たり１０８〜１０１０ＣＦＵで、毎日、ラクトバチルスの前記量を投与することを含む。いくつかの実施形態において、異常な膣細菌叢を有する女性における体外受精の成功率を向上させるための前記方法は、抗生物質としてクリンダマイシン又は抗生物質としてメトロニダゾールのいずれかの投与を含む。別の実施形態において、患者は、ＡＶＭを規定するものとして受け入れられている閾値を上回るガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）及び／又はアトポビウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ  ｖａｇｉｎａｅ）のレベルを有する。別の実施形態において、ラクトバチルス種は、胚移植（ＥＴ）の前に、１日１回７日間、一投与当たり１０８〜１０１０ＣＦＵで患者に投与され、その後、超音波及び／又は胎児の心拍の検出によって臨床妊娠が確定されるまで、週に２回、同じ用量で７週間投与される。
【０００９】
いくつかの実施形態において、異常な膣細菌叢を有する女性における体外受精の成功率を向上させるための前記方法は、乾燥組成物としてラクトバチルスを投与することを含む。いくつかの実施形態において、ラクトバチルスは、乾燥の前に、水性保存培地中に懸濁される。いくつかの実施形態において、水性保存培地は、５〜１５％（ｗ／ｖ）のトレハロース、２〜７％（ｗ／ｖ）のキシリトール、０．５〜１．０％（ｗ／ｖ）のアスコルビン酸ナトリウム、１０〜３０ｍＭのリン酸ナトリウム、及び所望により含まれてもよい０〜５％（ｗ／ｖ）のグルタミン酸ナトリウムを含み得る。
【００１０】
本発明のいくつかの実施形態において、異常な膣細菌叢を有する女性における体外受精の成功率を向上させるための前記方法は、抗生物質とのラクトバチルス種の同時投与を含む。いくつかの実施形態において、ラクトバチルス種は、工程ｉｉの抗生物質処置の完了後に投与される。本明細書に記載されている方法の別の実施形態において、ラクトバチルス種は、胚移植の少なくとも７日前に投与される。いくつかの実施形態において、好ましいラクトバチルスの種はエル・クリスパータス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）であり、これは、単独で又は少なくともさらに１つのラクトバチルスの種と組み合わせて投与され得る。
【００１１】
一態様において、本発明は、異常な膣細菌叢（ＡＶＭ）に罹患し、又は罹患が疑われ、及び処置後にＩＶＦを受けることが予定されている（及び／又はヒト接合子又は胚が移植される）女性の処置において使用するためのラクトバチルス種を含む組成物であって、前記女性が、ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）及びアトポビオウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｏｕｍ  ｖａｇｉｎａｅ）を含む細菌性膣炎付随細菌に対して活性を有する抗生物質で以前に（例えば、少なくとも５日間）処置されたことがあり、前記抗生物質が、前記女性が有する異常な膣細菌叢の量を低減するのに有効な量及び期間で投与されており；前記組成物が膣内投与用である、組成物に関する。
【００１２】
本発明の別の態様は、本発明は、異常な膣細菌叢の処置において使用するための、及び／又は異常な膣細菌叢を有する若しくは有すると疑われる女性における体外受精の成功率を向上させる上で使用するための部品のキット（ｋｉｔ  ｏｆ  ｐａｒｔｓ）であって、ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）及びアトポビオウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｏｕｍ  ｖａｇｉｎａｅ）などの細菌性膣炎付随細菌に対して活性を有する１又は複数の抗生物質を備える第一の容器と、ラクトバチルス種を備える第二の容器と、並びに、場合によって備えてもよい、異常な膣細菌叢の処置における前記キットの使用説明書及び／又は異常な膣細菌叢を有する若しくは有すると疑われる女性における体外受精の成功率を向上させる上での使用説明書とを備える部品のキットに関する。
【００１３】
好ましい実施形態において、前記１又は複数の抗生物質は、前記ラクトバチルス種の投与前に、例えば少なくとも５日間前記女性に投与するためのものであり、前記抗生物質は、前記女性が有する異常な膣細菌叢の量を低減させるのに有効な量及び期間で投与するためのものであり、並びに前記ラクトバチルス種は、抗生物質投与後に膣粘膜を定着させるのに十分な量での膣内投与するためのものである。
【００１４】
このように、部品のキットは、好ましくは、ｉ）抗生物質の後に、ｉｉ）異常な膣細菌叢の処置における使用のための、及び／又は異常な膣細菌叢を有する若しくは有すると疑われる女性における体外受精の成功率を向上させる上での使用のためのラクトバチルス種を逐次投与することが予定されている。したがって、処置後に、女性は、体外受精の向上された成功率を有し得る。
【００１５】
一実施形態において、ラクトバチルスの前記量は、抗生物質治処置の後に膣粘膜を定着させるのに十分であり、ラクトバチルス種は、例えば、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ラクトバチルス・ジェンセニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｅｎｓｅｎｉｉ）及びラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）からなる種の群から選択され、前記種は、有効な培養条件下で、０．５ｐｐｍより多くの過酸化水素を産生する能力を有する。
【００１６】
本発明の態様の１つに関連して記載されている実施形態及び特徴は、本発明の別の態様にも当てはまることに注意すべきである。それ故、従属項である請求項２〜１３によって包含される全ての態様は、独立項である請求項１４に対しても当てはまり得ることを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】脱脂乳あり（下の線、丸）又は脱脂乳なし（上の線、三角）で調合されたＬＡＣＴＩＮ−Ｖの安定性。粉末試料を２５℃で保存し、ＭＲＳ寒天プレート上で培養し、コロニーを計数することによって、異なる時点で活性を測定した。
【図２】グルタミン酸ナトリウムあり又はグルタミン酸ナトリウムなしのラクトバチルス粉末調合物。グルタミン酸ナトリウムなし（丸、三角）又はグルタミン酸ナトリウムあり（四角、逆三角）の４つのＬＡＣＴＩＮ−Ｖ調合物の３７℃における加速された安定性を、経時的に生存性を測定することによって決定した。粉末試料を３７℃で９０日間保存し、ＭＲＳ寒天プレート上で培養し、コロニーを計数することによって、異なる時点で生存率を測定した。
【図３】ラクトバチルス投与から４、７、１４、２１及び２８日後における、アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ）中の膣内ラクトバチルス定着レベル（ＣＦＵ／ｍＬ）に対する、抗生物質前処置の効果。各四角は、各アカゲザルを表す。抗生物質で前処置されたアカゲザルは、黒い四角によって表されている。抗生物質で前処置されていないアカゲザルは、白い四角によって表されている。水平の棒は、各時点での中央値ＣＦＵ／ｍＬを表している。
【図４】ラクトバチルス投与から２週間後に、１６Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子をベースとする膣のマイクロビオーム分析によって、各アカゲザル中の膣細菌叢におけるラクトバチルスの百分率を分析した。各棒は、各アカゲザルを表す。抗生物質で前処置されたアカゲザルは、黒い棒によって表されている。抗生物質で前処置されていないアカゲザルは、白い棒によって表されている。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
Ｉ．序論
本発明は、女性に胚を移植する前に、抗生物質及びラクトバチルスの高効力調合物の処置計画を実施することによって、異常な膣細菌叢を有する女性における体外受精の成功率を向上させるための方法を提供する。高効力ラクトバチルス調合物は、当該調合物が高い定着効力を有し、動物由来の賦形剤を有していない場合に、処置として女性に投与するのに適している。具体的には、本発明に開示されているように、本発明は、異常な膣細菌叢に付随する細菌（例えば、ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）及び／又はアトポビウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ  ｖａｇｉｎａｅ））をラクトバチルスと置換し、女性における体外受精の成功率を増加するための手段として、正常な膣細菌叢に付随する保護的細菌を有する膣粘膜を再生息させる方法を提供する。以下でさらに詳しく記載されているように、本発明は、ＩＶＦのための抗生物質とラクトバチルス調合物の方法及び使用を教示する。
【００１９】
ＩＩ．定義
本明細書において使用される「体外受精」又は「ＩＶＦ」という用語は、生きたヒトの外で卵を受精させる方法を表す。ＩＶＦは、体外で（すなわち、インビトロで、この語は逐語的には「ガラスの中で」と翻訳されるが、例えば、研究室で又は他の人工的な状況で行われる方法を表すものと本分野では理解されている。）精子によって卵を受精させる方法である。いくつかの実施形態において、ＩＶＦ法は、女性の排卵過程をモニター及び／若しくは刺激すること、女性の卵巣から１つ若しくは複数の卵母細胞（１つ又は複数の卵）を取り出すこと、並びに／又は受精を達成するために、研究室中で（例えば、液体培地中で）精子と卵母細胞を互いに接触させること、を含み得る。いくつかの実施形態において、ＩＶＦは、増殖培地中で受精卵（接合子）を培養すること、及び／又は受精卵を女性の子宮内に着床するか、若しくは将来の分析及び／若しくは着床のために保存することを含む。いくつかの実施形態において、ＩＶＦは、特定の所望される特質（例えば、性別）に関して受精卵を選別することを含み得る。
【００２０】
本明細書において使用される「異常な膣細菌叢」又は「ＡＶＭ」又は「異常な膣マイクロビオーム」又は「膣の細菌叢異常（ｖａｇｉｎａｌ  ｄｙｓｂｉｏｓｉｓ）」という用語は、膣粘膜が十分な量の保護的ラクトバチルス種を欠き、著しい数の多様な非ラクトバチルス種が定着している状態を表す。異常な膣細菌叢、特に細菌性膣炎（ＢＶ）に付随する非ラクトバチルス種の例には、ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）及びアトポビウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ  ｖａｇｉｎａｅ）が含まれるが、これらに限定されない。症状は、症候性であり得、又は無症候性であり得る。「膣細菌叢」又は「膣マイクロビオーム」という用語は互換的に使用され、膣に定着する微生物を表すが、「細菌叢」及び「マイクロビオーム」が好ましい用語である。
【００２１】
本明細書において使用される「ＡＶＭ閾値レベル」という用語は、女性の膣マイクロビオームの健康を診断的に決定するために使用されるジー・バギナリス（Ｇ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ）及びエー・バギナエ（Ａ．ｖａｇｉｎａｅ）の標準化された量を表す。所定の閾値を下回るジー・バギナリス（Ｇ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ）及び／又はエー・バギナエ（Ａ．ｖａｇｉｎａｅ）細菌量を有する試料は、ＡＶＭに関して陰性であると決定される。所定の閾値を上回るジー・バギナリス（Ｇ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ）及び／又はエー・バギナエ（Ａ．ｖａｇｉｎａｅ）細菌量を有する試料は、ＡＶＭに関して陽性であると決定される。ＡＶＭ閾値レベルは、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）及びＲＯＣ曲線分析によって決定され、これらの方法は、以下で詳しく記載されている。
【００２２】
本明細書において使用される「抗生物質」という用語は、１若しくは複数の微生物（例えば、細菌、真菌、寄生生物など）又は異常に増殖している細胞（例えば、腫瘍細胞）の増殖を阻害し、及び／又はこれらを死滅させる能力を有するあらゆる化学療法剤（例えば、微生物によって及び／又は合成的に産生される薬剤）を表す。本明細書において使用される抗生物質は、当業者に周知である。抗生物質のクラスには、アミノグリコシド類（例えば、アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、パロモマイシンなど）、アンサマイシン類（例えば、ゲルダナマイシン、ハービマイシンなど）、カルバセフェム（例えば、ロラカルベフ）、カルバペネム類（例えば、エルタペネム、ドリペネム、イミペネム／シラスタチン、メロペネムなど）、セファロスポリン類（例えば、第一世代（例えば、セファドロキシル、セファゾリン、セファロチン、セファレキシンなど）、第二世代（例えば、セファクロル、セファマンドール、セフォキシチン、セフプロジル、セフロキシムなど）、第三世代（例えば、セフィキシム、セフジニル、セフジトレン、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフポドキシム、セフタジジム、セフチブテン、セフチゾキシム、セフトリアキソンなど）、第四世代（例えば、セフェピムなど）及び第五世代（例えば、セフトビプロールなど））、グリコペプチド類（例えば、テイコプラニン、バンコマイシンなど）、マクロライド類（例えば、テイコプラニン、バンコマイシンなど）、マクロライド類（例えば、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、ジリスロマイシン、エリスロマイシン、ロキシスロマイシン、トロレアンドマイシン、テリスロマイシン、スペクチノマイシンなど）、モノバタム類（ｍｏｎｏｂａｔａｍｓ）（例えば、アズトレオナムなど）、ペニシリン類（例えば、アモキシシリン、アンピシリン、アズロシリン、カルベニシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、メズロシリン、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、ペニシリン、ピペラシリン、チカシリン（ｔｉｃａｃｉｌｌｉｎ）など）、ポリペプチド類（例えば、バシトラシン、コリスチン、ポリミキシンＢなど）、キノロン類（例えば、シプロフロキサシン、エノキサシン、ガチフロキサシン、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、モキシフロキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、トロバフロキサシンなど）、スルホンアミド類（例えば、マフェニド、プロントジル、スルファセタミド、スルファメチゾール、スルファニルアミド、スルファサラジン、スルフイソキサゾール、トリメトプリム、トリメトプリム−スルファメトキサゾールなど）、テトラサイクリン類（例えば、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、テトラサイクリンなど）及びその他（例えば、アルスフェナミン、クロラムフェニコール、クリンダマイシン、リンコマイシン、エタンブトール、ホスホマイシン、フシジン酸、フラゾリドン、イソニアジド、リネゾリド、メトロニダゾール、ムピロシン、ニトロフラントイン、プラテンシマイシン、ピラジナミド、キヌプリスチン／ダルホプリスチン、リファンピン、チニダゾールなど）が含まれるが、これらに限定されない。（例えば、Ｒｏｂｅｒｔ  Ｂｅｒｋｏｗ（ｅｄ．）Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ−Ｈｏｍｅ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｐｏｃｋｅｔ（ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １９９９），ＩＳＢＮ  ０−６７１−０２７２７−１を参照）。クリンダマイシン、メトロニダゾール及びチニダゾールは、ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）及びアトポビウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ  ｖａｇｉｎａｅ）に対して特に活性を示す抗生物質の例である。
【００２３】
本明細書において使用される「ラクトバチルス」という用語は、グラム陽性の通性嫌気性細菌であり、グルコースなどの炭水化物源からラクテート（乳酸）を産生する能力によって特徴付けられる細菌を表す。これらの細菌は、食品中に存在し得、又は膣の若しくは胃腸の粘膜に定着する共生生物であり得る。
【００２４】
本明細書において使用される「ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）」又は「エル・クリスパータス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）」という用語は、ラクトバチルス属の種を表す。この種は、一般に、リボソームの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のポリヌクレオチド配列に基づいてその他のラクトバチルスから区別される。「ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）」又は「エル・ガセリ（Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ）」及び「ラクトバチルス・ジェンセニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｅｎｓｅｎｉｉ）」又は「エル・ジェンセニイ（Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ）」は、ラクトバチルスの他の種を表す。エル・クリスパータス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、エル・ガセリ（Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ）、エル・ジェンセニイ（Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ）は、過酸化水素を産生することができる膣種（ｖａｇｉｎａｌ  ｓｐｅｃｉｅｓ）である。
【００２５】
本明細書において使用される「定着させるのに十分な量」という用語は、膣粘膜上にラクトバチルスの健康で生存可能な複製している微生物集団の存在を確立するラクトバチルス種の量を表す。
【００２６】
本明細書において使用される「有効な培養条件」という用語は、ラクトバチルス細胞の増殖を促進するために、ラクトバチルス細胞がその中に置かれている、又はそれに曝露されているインビトロ環境を表す。したがって、本用語は、約０．５〜２．５時間の世代時間（細胞集団の倍加速度）を可能にする、細胞の増殖に影響を及ぼし得る培地、温度、大気条件、基質、撹拌条件などを表す。
【００２７】
本明細書において使用される、「胚移植」及び「接合子移植」という用語は、女性の子宮中にインビトロで受精された卵又は胚を導入する方法を表す。
【００２８】
本明細書において使用される「妊娠スキャン」という用語は、本分野において公知のあらゆる様々な技術を用いて、胚又は接合子がその中に移植された女性を評価することを表す。「生化学的妊娠スキャン」とは、胚又は接合子がその中に移植されている女性内のヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）の尿及び／又は血液レベルを評価することである。胚移植後のある時点（例えば、３〜４週）での、ある閾値（例えば、少なくとも２５ｍｔＵ／ｍＬ（ミリ国際単位／ミリリットル））を上回るｈＣＧレベルの検出は、生化学的に検出可能な妊娠の指標である。「臨床的妊娠スキャン」は、超音波スキャン又はドップラー検査を用いて、胚又は接合子がその中に移植された女性を評価することを表す。超音波又はドップラー検査において、胎嚢及び／又は心臓の動きが存在することは、着床及び臨床妊娠を示す。
【００２９】
本明細書において使用される「着床」という用語は、得られたヒト胚（この段階では未分化胚芽細胞（ｂｌａｓｔｏｃｙｔｅ））が子宮壁に付着する、ヒト卵子の受精後の事象を表す。
【００３０】
本明細書において使用される「乾燥組成物」という用語は、水分が除去されている組成物を表す。乾燥（ｄｒｙｉｎｇ）又は脱水乾燥（ｄｅｓｉｃｃａｔｉｏｎ）技術には、例えば、加熱（例えば、昇華）、低圧又は真空の適用、凍結乾燥（すなわち、フリーズドライ）及びこれらの組み合わせが含まれる。保存及び輸送を容易にするために、通常、組成物は脱水乾燥される。
【００３１】
本明細書で使用される「凍結乾燥」という用語は、物質を凍結し、次いで、生物学的又は化学的反応を支えないレベルまで、昇華及び／又は蒸発によって、水の濃度を低下させる工程を表す。
【００３２】
本明細書において使用される「動物由来の成分」という用語は、活性成分と考えられる物質を含む組成物中に含まれ得る、動物由来の不活性な物質を表す。非限定的な例には、ミルク、ヨーグルト、バター油、鶏脂、ラード、ゼラチン及び獣脂が含まれる。
【００３３】
本明細書において使用される「水性保存培地」又は「保存調合物」又は「保存培地」という用語は互換的に使用され、保存工程中に遭遇する損傷の影響を最小限に抑えながら、代謝的に不活性な状態に細菌培養物を保存及び維持することができる組成物を表す。一般に、保存培地への添加、凍結及び凍結乾燥を行うと、ラクトバチルス菌種は、活発に増殖する代謝状態から代謝的に不活性な状態へと転換される。したがって、保存培地は、再水和時に細胞が粘膜表面に接着し、完全な代謝活性へ復帰できるように、細胞の回復力を最適にするために調合することができる。水性保存培地は、例えば、炭化水素、ポリオール（糖アルコール）、抗酸化剤、緩衝剤を含み、所望により、アミノ酸を含んでもよい。水性保存培地は、約１０１０ＣＦＵ／ｍＬの濃度になるように、細菌の細胞沈渣を再懸濁するために使用され、この懸濁液は、乾燥して、２〜８℃で少なくとも２年間保存し、１５％未満のＣＦＵの低下で再懸濁することが可能である。
【００３４】
本明細書において使用される「賦形剤（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）」及び「不活性な賦形剤」という用語は互換的に使用され、薬物の活性成分とともに調合される不活性な物質であって、長期安定化、希釈、粉末調合物への嵩の付与の目的のために（したがって、しばしば「増量剤」、「賦形剤（ｆｉｌｌｅｒ）」又は「希釈剤」と称される。）含められ、又は薬物吸収を促進する、粘度を低下させる、若しくは溶解性を増強するなど、最終剤形中の活性成分に対して治療的な強化を付与するために含められる不活性な物質を表す。賦形剤の例には、セルロース、エチルセルロース、酢酸セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、微結晶セルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン（すなわち、クロスポビドン）、クロスカルメロースナトリウム、トラガカントガム、トラガカント粉末、アラビアガム、ポリオキシエチレンステアレート、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート、ポリエチレンソルビタンモノオレエート、ラクトース、グルコース、スクロース、トレハロース、マルトデキストリン、Ｐｈａｒｍａｓｐｅｒｓｅ（Ｒ）、アルファ化デンプン、麦芽、滑石、コロイダルシリカ、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、フマル酸ステアリルナトリウム、リン酸水素カルシウム、硫酸カルシウム、ピーナッツ油、綿実油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油及びポウロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、ポリエチレングリコール、寒天、アルギン酸、発熱物質を含まない水、等張食塩水、ホスフェート緩衝溶液又はこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【００３５】
ＩＩＩ．方法
異常な膣細菌叢（ＡＶＭ）を有する女性の診断
異常な膣細菌叢は、本分野において公知のいずれの適切な手段を用いても検出及び診断することができる。ＡＶＭは、症候性であり得、又は無症候性であり得る。症候には、一般的に、異常な匂い及び／又は分泌物、並びに痒み及び／又は痛みによる不快感が含まれる。膣感染によっては、診察を受けずに、市販の診断機器又はキットを用いて、女性が自分で検出することが可能である。
【００３６】
いくつかの症例では、医師がＡＶＭを検出及び診断し得る。臨床的基準は、上記されているものを含む、４．５より大きい膣液のｐＨ及び顕微鏡検査での糸玉状細胞の存在（例えば、多数の接着性球棹菌で覆われた膣上皮細胞）という少なくとも３つの症候の存在を要求する。医師は、ＡＶＭを検査するために、膣鏡診の際に円蓋後部から拭き取り検体を取得し得る。例えば、細菌性膣炎は、例えば、Ａｍｓｅｌ臨床基準又はグラム染色された膣スメア（Ｎｕｇｅｎｔスコアリングシステム）によって検出することができる。グラム染色された膣スメアは、ラクトバチルス（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）（グラム陽性細菌）、ＢＶに特徴的なグラム陰性及びグラム不定桿菌及び球菌（すなわち、ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、アトポビウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ  ｖａｇｉｎａｅ）、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）及びペプトストレプトコッカス（ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ））及び湾曲グラム陰性桿菌（すなわち、モビルンカス（Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ））の相対濃度を測定するために使用される。症候性の異常な膣細菌叢の検出及び診断方法は、本分野において周知であり、米国特許第８，３２９，４４７号に記載されている。Ｈａａｈｒ，Ｔ．ｅｔ．ａｌ．Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．２０１６  Ａｐｒ，３１（４）：７９５−８０３；Ｄａｔｃｕ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．ＢＭＣ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ２０１３，１３：４８０；ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｓｔｄ／ｔｇ２０１５／ｂｖ．ｈｔｍも参照されたい。
【００３７】
いくつかの症例では、異常な膣細菌叢を有すると疑われる女性は、無症候性のＡＶＭを有することがある。症候がないＡＶＭを有する女性を診断するために、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）法を使用することができる。例えば、膣マイクロビオームの特定の細菌を同定及び定量するためにｑＰＣＲを用いて、医師により、症候を有しない女性をＢＶに関して検査することが可能である。医師は、例えば、Ｆａｓｔ  ＤＮＡＴＭＳＰＩＮ  ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｓｏｉｌ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｓａｎｔａ  Ａｎａ，ＣＡ，ＵＳＡ）などの市販のＤＮＡ単離キットを用いて、膣試料から細菌のＤＮＡを抽出し、鋳型ＤＮＡの適切な量を用いてｑＰＣＲを実施することができる。
【００３８】
対象とする細菌（すなわち、ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）及びアトポビウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ  ｖａｇｉｎａｅ））に対する陽性対照及び特異性対照は、本分野で記載された標準的プロトコールを用いて、培養保存菌株からのＤＮＡ抽出によって取得される。対照は、受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線分析によってＡＶＭ閾値を決定するために使用され、細菌の集団は、ｑＰＣＲの結果に基づいて、分子的に規定される。閾値は、Ｎｕｇｅｎｔ  ＢＶスコアリングを至適診断基準として用いて、ＲＯＣ曲線分析によって最終的に定められるＮｕｇｅｎｔ  ＢＶ標準をそのｑＰＣＲ結果と相関させることによって、参照基準としてＢＶを規定するために、７〜１０のＮｕｇｅｎｔスコアが使用される。ジー・バギナリス（Ｇ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ）及びエー・バギナエ（Ａ．ｖａｇｉｎａｅ）に対する現行の閾値水準は、それぞれ、５．７×１０７及び５．７×１０６１６ＳｒＲＮＡ遺伝子コピー／ｍＬとして確立されている。カットオフ点（すなわち、ＲＯＣによって規定されたとおりの）を上回る細菌量を有する女性から収集された試料は、ＡＶＭに関して陽性と考えられ、カットオフ点を下回る細菌量を有する試料は、ＡＶＭに関して陰性と考えられる。無症候性の異常な膣細菌叢の検出及び診断方法は、Ｈａａｈｒ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．２０１６  Ａｐｒ，３１（４）：７９５−８０３及びＤａｔｃｕ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．ＢＭＣ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ２０１３，１３：４８０に詳述されている。上記診断方法のいずれかを用いてＡＶＭと診断された女性には、以下に記載されているように抗生物質が投与され得る。
【００３９】
抗生物質の投与
異常な膣細菌叢を有すると診断された女性には、ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）及びアトポビウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ  ｖａｇｉｎａｅ）に対して活性を有する抗生物質を投与することができる。抗生物質は、ＡＶＭの量を低下させるために、いかなる適切な量及び適切な期間でも投与することができる。異常な膣細菌叢（すなわち、ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）及びアトポビウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ  ｖａｇｉｎａｅ））を低下させるための適切な抗生物質は、本分野において周知である。このような抗生物質には、クリンダマイシン、メトロニダゾール及びチニダゾールが含まれるが、これらに限定されない。抗生物質は、個別に又は併用療法として投与することができる。
【００４０】
女性のＡＶＭの低下において使用するための抗生物質は、あらゆる適切な投与用形態であり得る。例えば、抗生物質は、局所的に（ゲル又はクリームとして）、又は経口若しくは膣錠剤、カプセル若しくは坐薬として送達され得る。特定の実施形態において、抗生物質は、経口カプセル又は外用ジェルとして投与される。いくつかの実施形態において、抗生物質は、経口錠剤として投与される。いくつかの実施形態において、抗生物質は、外用ジェルとして投与される。
【００４１】
抗生物質処置は、１日に１又は２回投与することができる。本発明のいくつかの実施形態において、抗生物質は、２〜７日間投与することができる。別の実施形態において、抗生物質は、２、３、４、５、６及び７日間投与することができる。いくつかの別の実施形態において、抗生物質は、２〜７日間、又は３〜６日間、又は４〜５日間、又は４〜７日間投与することができる。特定の実施形態において、抗生物質は、２〜７日間投与することができる。別の実施形態において、抗生物質は、７日間投与することができる。別の実施形態において、抗生物質は、５日間投与することができる。
【００４２】
抗生物質は、女性が有する異常な膣細菌叢の量を低下させるのに有効なあらゆる適切な用量で投与することができる。抗生物質処置は、約０．１ｍｇ〜約１０，０００ｍｇ又は約１ｍｇ〜約１，０００ｍｇ又は約１０ｍｇ〜約７５０ｍｇ又は約２５ｍｇ〜約５００ｍｇ又は約５０ｍｇ〜約２５０ｍｇの用量で、経口カプセルとして投与される。抗生物質の経口錠剤に関して適切な用量には、約１ｍｇ、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００又は１２００ｍｇが含まれる。いくつかの実施形態において、抗生物質の経口錠剤の用量は、約２００ｍｇ〜３００ｍｇである。
【００４３】
いくつかの実施形態において、抗生物質の経口錠剤の用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重／患者、又は０．５、１、５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、７５０又は１０００ｍｇ／ｋｇ体重／患者であり得る。他の実施形態において、抗生物質の経口錠剤の用量は、約０．１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重／患者、又は約０．５〜７５０、又は約１〜５００、又は約５〜２５０、又は約１０〜１００、又は約２５〜５０ｍｇ／ｋｇ体重／患者であり得る。さらに別の実施形態において、用量は、約０．５〜約２５ｍｇ／ｋｇ体重／患者、又は約５〜１５ｍｇ／ｋｇ体重／患者、又は約８〜約１２ｍｇ／ｋｇ体重／患者、又は約１０ｍｇ／ｋｇ体重／患者であり得る。
【００４４】
いくつかの実施形態において、抗生物質処置は、全ゲル調合物の約０．１％〜約２％又は約０．３％〜約１．７５％又は約０．５％〜約１．２５％又は約０．７５％〜約１％の用量で、外用ジェルとして投与される。抗生物質の外用ジェルに関して適切な用量には、約０．１％、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９又は２％が含まれる。いくつかの実施形態において、抗生物質の外用ジェルの用量は、約０．７５％である。他の実施形態において、抗生物質の外用ジェルの用量は、約１．０％である。上記抗生物質処置計画及び異常な膣細菌叢の低下を完了したら、女性には、以下に記載されているようなラクトバチルスが投与され得る。
【００４５】
ラクトバチルス種
本明細書に説明されているように、ＡＶＭを有し、上記のように抗生物質処置計画を受けた女性は、膣粘膜を定着又は定植させるのに十分な量で、適切なラクトバチルス種が投与される。本発明において使用するのに適したラクトバチルス種は、本明細書に記載された識別上の特徴を有するいずれのＨ２Ｏ２産生ラクトバチルス種でもあり得る。ラクトバチルス菌種は、本分野において公知である適切なスクリーニング技術を用いて、自然の取得源から検出し、単離することができる。具体的には、本発明の薬剤において使用するためのラクトバチルスの適切な菌種は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）若しくはＢｉｏｄｅｆｅｎｓｅ  ａｎｄ  Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ（ＢＥＩ，ｂｅｉｒｅｓｏｕｒｃｅｓ．ｏｒｇ）などの公に利用できる機関を通じて取得し、又はヒトの健康な膣から単離することができる。本発明において使用するのに適したラクトバチルス菌種の識別上の特徴及びこれらの特徴をスクリーニングする方法は、以下に詳しく論述されている。
【００４６】
本発明において使用するのに適したラクトバチルスの１つの識別上の特徴は、ラクトバチルス菌種が少なくとも約５０％のパーセント膣上皮細胞（ＶＥＣ）接着値を有することである。「パーセントＶＥＣ接着値」は、特定された群内のＶＥＣの総数中の、少なくとも１つのラクトバチルス細胞が接着しているＶＥＣの百分率として定義される。許容されるＶＥＣ接着値を決定するために使用される方法は本分野において周知であり、米国特許第６，４６８，５２６号明細書及び米国特許第６，０９３，３９４号明細書に見出すことができる。Ｋｗｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｕｒｏｌ．２００６，１７６：２０５０−２０５４も参照されたい。本発明に適した、ラクトバチルスの別の識別上の特徴は、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を産生する能力である。Ｈ２Ｏ２陽性表現型も、持続的な膣への定着と関連している。例えば、Ｖａｌｌｏｒ，Ａ．Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．２００１  Ｄｅｃ  １；１８４（１１）１４３１−６を参照されたい。好ましくは、ラクトバチルスは、通常の増殖条件下で、約０．５ｐｐｍ超のＨ２Ｏ２を産生することができる。より好ましくは、ラクトバチルスは、Ｈ２Ｏ２の産生を促進することができるあらゆる培地及び条件としてここで定義される有効な増殖条件下で、より好ましくは、ラクトバチルスは少なくとも約１０ｐｐｍのＨ２Ｏ２を産生することができ、さらにより好ましくは、ラクトバチルスは少なくとも約２０ｐｐｍのＨ２Ｏ２を産生することができる。過酸化水素を産生する膣のラクトバチルスには、Ａｎｔｏｎｉｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  １９９９，１８０：１９５０−６に記載されているような、多くのエル・クリスパータス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）及びエル・ジェンセニイ（Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ）菌種、及びエル・ガセリ（Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ）菌種の約半分が含まれる。
【００４７】
本発明において使用するのに適したラクトバチルスの別の識別上の特徴は、遺伝的同一性並びにインビボ及びインビトロの両方におけるラクトバチルス菌種の経時的安定性である。遺伝的同一性及び膣上皮細胞のインビトロでの保存後又はインビボでの定着後のラクトバチルスの菌種の経時的安定性を確認するために、反復配列ポリメラーゼ連鎖反応（Ｒｅｐ−ＰＣＲ）を使用することができる。ラクトバチルス菌種の遺伝的同一性を確認するために使用されるＲｅｐ−ＰＣＲ法は本分野において周知であり、米国特許第６，０９３，３９４号明細書中に見出すことができる。Ａｎｔｏｎｉｏ＆Ｈｉｌｌｉｅｒ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００３，４１：１８８１−１８８７も参照されたい。
【００４８】
本発明での使用に適した、ラクトバチルスの別の識別上の特徴は、乳酸を産生する能力である。乳酸は、インビトロで病原体の増殖を阻害することが示されている。好ましくは、ラクトバチルスは、有効な増殖条件下で、少なくとも約０．７５ｍｇ／１００ｍＬの乳酸、より好ましくは少なくとも約４ｍｇ／１００ｍＬの乳酸、さらにより好ましくは少なくとも約８．８ｍｇ／１００ｍＬの乳酸を産生する。適切なラクトバチルス菌種は、相対的に大きな細胞サイズを有し得る。ＢｅｒｇｅｙのＭａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙに記載されているように、典型的なラクトバチルスは、幅０．８〜１．６μｍ及び長さ２．３〜１１μｍである。本発明において使用するための好ましいラクトバチルス菌種は、幅約１〜約２ミクロン及び長さ約２〜約４ミクロンの細胞サイズを有する。
【００４９】
ラクトバチルスの公知の種及び菌株に加えて、公知の菌株又は新たに同定された菌株に由来する天然及び変異体菌株から得られる新たに同定された種及び菌株を、本発明の薬剤において使用することができる。本発明の薬剤において使用するのに適したラクトバチルスの識別上の特徴を有するラクトバチルスの親菌株の変異体は、例えば、突然変異誘発の割合を増大させるために、少なくとも１ラウンドの化学的及び／又は放射線突然変異誘発に親菌株を供し、これにより、改善された所望の特徴を有する微生物を取得する確率を増加させることによって、取得することができる。例えば、増加したパーセントＶＥＣ接着値を有するように微生物を遺伝子改変することによって取得され得る微生物も本発明の変異体微生物に含まれることが、当業者には自明であろう。本明細書において使用される「変異された微生物」は、天然に発生する変異、変異原への曝露の結果である変異又は遺伝子改変の結果である変異によってこのような微生物のヌクレオチド組成が改変されている、変異された親微生物である。
【００５０】
ラクトバチルスの好ましい種には、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）及びラクトバチルス・ジェンセニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｅｎｓｅｎｉｉ）、又は同定された種のいずれかの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列に対して９５％の配列相同性を有するラクトバチルスの種が含まれる。ラクトバチルスの特に好ましい菌株は、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＣＴＶ−０５菌株、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＳＪ−３Ｃ菌株の全ての識別上の特徴を有する菌株である。ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＣＴＶ−０５は、好ましい菌株である。ラクトバチルス菌株間を識別するために使用される方法には、Ａｎｔｏｎｉｏ＆Ｈｉｌｌｉｅｒ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００３，４１：１８８１−１８８７中に記載されているＲｅｐ−ＰＣＲ、当初は病原体の菌株を同定するために開発された多座配列タイピング（ＭＬＳＴ）（例えば、Ｍａｉｄｅｎ，Ｍ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．１９９８，Ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔｙｐｉｎｇ：ａ  ｐｏｒｔａｂｌｅ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９５：３１４０−２１４５）及び全ゲノム配列決定が含まれる。
【００５１】
ラクトバチルス種の調製
本発明にとって有用なラクトバチルス菌株は、あらゆる適切な液体培地中又は固体培地（例えば、寒天）上で増殖させることができる。本発明にとって有用なラクトバチルス菌株を増殖させるための細菌培地は公知であり、市販されており（例えば、ＢＤ  Ｄｉｆｃｏから）、例えば、ｄｅ  Ｍａｎ，Ｒｏｇｏｓａ及びＳｈａｒｐｅ（ＭＲＳ）及びＲｏｇｏｓａ培地が含まれる。ラクトバチルスは、好ましくは、嫌気的に又は微好気的に培養され、培養培地の温度は、ラクトバチルスの増殖に適したあらゆる温度であり得る。本発明のためのラクトバチルス菌株は、嫌気的条件で培養することができ、一般に約３７℃で増殖される。本発明にとって有用な膣ラクトバチルス菌株のための有効な培養条件は、本分野において周知である。ラクトバチルス菌株、特にエル・クリスパータス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）及びエル・ガセリ（Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ）を培養する具体的な培養条件、培養培地及び方法は、例えば、米国特許第８，３２９，４４７号明細書、米国特許第６，０９３，３９４号明細書及びＤａｖｉｓ，Ｃ．Ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ  ｓｔｒａｉｎｓ：Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｃｕｌｔｕｒｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｄ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｔｏ  ｑｕａｎｔｉｆｙ  ｖｉａｂｌｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４；１０３：９−１７中に見出すことができる。２０１４；１０３：９−１７．
【００５２】
合理的な増殖期間後に、保存培地に移すのに適した細胞密度（又は効力）を生じるのに十分な量で、ラクトバチルス菌株の活発に増殖している培養物を培養培地に播種する。本明細書において使用されるラクトバチルスの合理的な増殖期間の非限定的な例は、１〜２．５時間の世代時間である。細胞は、約１０８ＣＦＵ／ｍＬから約１０１０ＣＦＵ／ｍＬの範囲の好ましい細胞密度まで増殖させる。ＭＲＳ寒天プレート上にラクトバチルス培養物の系列希釈を播き、３７℃で嫌気的に４８時間温置する培養をベースとする方法が、細胞密度を決定するために使用される。プレート上のコロニーを計数し、試料中のＣＦＵ（コロニー形成単位）の数をＣＦＵ／ｍＬ又はＣＦＵ／グラムとして算出する。ＣＦＵを決定する方法は、以下に詳述されている。
【００５３】
好ましい細胞密度まで細胞が増殖されたら、細菌細胞は、培養培地から細胞を取り出すためのあらゆる適切な方法を用いて採集することができる。培養された細胞を採集するための非限定的な例示的方法には、ろ過、遠心及び沈降が含まれる。いくつかの例では、培養された細胞を採集することには、中空糸ろ過及び透析ろ過を介した洗浄が伴い得る。培養されたラクトバチルス細胞を採集するための方法は本分野において周知であり、実施例の部に詳しく記載されている。培養培地からの細胞の分離及び／又はバイオマスの洗浄後に、保存培地中への懸濁の準備として、細胞沈渣を形成するために細胞を遠心する。
【００５４】
採集されたラクトバチルス細菌細胞沈渣又はろ液又はバイオマスは、適切な水性保存培地中に再懸濁され、保存培地（ｍＬ）に対する細胞物質の湿潤重量（グラム）の重量比は、細胞物質のグラム：保存培地のミリリットルが１：１〜１：８であり得る。いくつかの実施形態において、細菌の細胞物質は、適切な水性保存培地中に再懸濁され、保存培地（ｍＬ）に対する細胞物質の湿潤重量（グラム）の重量比は、細胞物質のグラム：保存培地のミリリットルが１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７又は１．８であり得る。いくつかの実施形態において、細菌の細胞物質は、適切な水性保存培地中に再懸濁され、保存培地（ｍＬ）に対する細胞物質の湿潤重量（グラム）の重量比は、細胞物質のグラム：保存培地のミリリットルが１：１〜１：３であり得る。
【００５５】
水性保存培地には、保存工程中に遭遇される損傷の影響を最小限に抑える成分が含まれる。本発明とともに使用するための適切な保存培地は、本分野において公知のあらゆる保存培地であり得る。特定のラクトバチルス種及び菌株並びに使用される乾燥法の種類（該当する場合）に対して、特定の保存培地を最適化することができる。例えば、細菌の調製物が凍結乾燥される場合には、保存培地は、トレハロース又はスクロース溶液など、凍結損傷に対して保護することが知られている成分を含み得る。本発明とともに使用するのに適した例示的な保存培地は、米国特許第６，３７２，２０９号明細書に開示されている。本発明とともに使用するのに適した他の保存培地は、米国特許第５，６１４，２０９号明細書、米国特許第７，１２２，３７０号明細書及び米国特許第６，６１０，５３１号明細書に開示されているように、当業者に公知である。本発明とともに使用するのに適した保存マトリックスは、２〜８℃で、インビトロにおいて少なくとも２年間、遺伝学的に安定な微生物を維持することができる。さらなる乾燥法及び保護因子が、Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈ．６６：１８３−１９３による総説に開示されている。
【００５６】
いくつかの実施形態において、本発明に特に有用な保存培地は、動物由来の生成物が存在せず、炭水化物、ポリオール、抗酸化剤、緩衝剤を含み、所望により、アミノ酸を含んでもよい。保存培地とともに使用するのに適した非限定的な例示的炭水化物には、トレハロース、デキストロース、ラクトース、マルトース、スクロース及び／又はその他のあらゆる二糖又は多糖が含まれる。保存培地とともに使用するのに適した非限定的な例示的ポリオールには、キシリトール、アドニトール、グリセロール、ズルシトール、イノシトール、マンニトール、マルチトール、イソマルト、ラクチトール、エリスリトール、ソルビトール及び／又はアラビトールが含まれる。保存培地とともに使用するのに適した非限定的な例示的抗酸化剤には、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸、パルミチルアスコルベート、没食子酸プロピル及びビタミンＥ（α−トコフェロール）が含まれる。保存培地とともに使用するのに適した非限定的な例示的緩衝剤には、リン酸ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸カリウム、炭酸水素ナトリウム、ヒスチジン、アルギニン及びクエン酸ナトリウムが含まれる。いくつかの実施形態において、所望により含まれるアミノ酸は、適切なアミノ酸の塩形態であり得る。保存培地とともに使用するのに適した非限定的な例示的アミノ酸及び／又はそれらの塩には、グルタミン酸ナトリウム、グルタミン、グリシン、アルギニン、ヒスチジン及びリジンが含まれる。
【００５７】
いくつかの実施形態において、本発明に有用な保存培地は、重量／容積で保存培地の約５％〜２０％である炭水化物と、重量／容積で保存培地の約２％〜９％であるポリオールと、重量／容積で保存培地の約０．５％〜１．５％である抗酸化剤と、１０ｍＭ〜５０ｍＭの緩衝剤と、及び重量／容積で保存培地の約０％〜５％である所望により含まれるアミノ酸とを含む。別の実施形態において、本発明とともに使用するのに適した保存培地は、重量／容積で保存培地の約５％〜１５％である炭水化物と、重量／容積で保存培地の約２％〜７％であるポリオールと、重量／容積で保存培地の約０．５％〜１．０％である抗酸化剤と、１０ｍＭ〜３０ｍＭの緩衝剤と、及び重量／容積で保存培地の約０％〜５％である所望により含まれるアミノ酸とを含み得る。
【００５８】
いくつかの実施形態において、本発明とともに使用するのに特に有用な保存培地は、重量／容積で保存培地の約５％〜２０％である炭水化物としてトレハロースと、重量／容積で保存培地の約２％〜９％であるポリオールとしてキシリトールと、重量／容積で保存培地の約０．５％〜１．５％である抗酸化剤としてアスコルビン酸ナトリウムと、１０ｍＭ〜５０ｍＭである緩衝剤としてリン酸ナトリウムと、及び重量／容積で保存培地の約０％〜５％である所望により含まれるアミノ酸としてグルタミン酸ナトリウムとを含む。別の実施形態において、本発明に適した特に有用な保存培地は、重量／容積で保存培地の約５％〜１５％であるトレハロースと、重量／容積で保存培地の約２％〜７％であるキシリトールと、重量／容積で保存培地の約０．５％〜１．０％であるアスコルビン酸ナトリウムと、及び１０ｍＭ〜３０ｍＭであるリン酸ナトリウムとを含む。いくつかの別の実施形態において、本発明とともに使用するのに適した保存培地は、重量／容積で保存培地の約５％〜１５％であるトレハロースと、重量／容積で保存培地の約２％〜７％であるキシリトールと、重量／容積で保存培地の約０．５％〜１．０％であるアスコルビン酸ナトリウムと、１０ｍＭ〜３０ｍＭであるリン酸ナトリウムと、及び重量／容積で保存培地の約０％〜５％である所望により含まれるグルタミン酸ナトリウムとを含む。
【００５９】
採集されたラクトバチルス細胞をここに記載されている保存培地に導入すると、得られた混合物は、細胞−保存培地泥状物（ｓｌｕｒｒｙ）又は湿潤薬物調合物と称される。いくつかの実施形態において、細胞−保存培地泥状物（すなわち、湿潤薬物調合物）は、１０８ＣＦＵ／ｍＬか〜１０１１ＣＦＵ／ｍＬの活性を有し得る。より好ましい細胞−保存培地泥状物は、少なくとも約１０１０ＣＦＵ／ｍＬの活性を有し得る。当業者は、本明細書に開示されている基本的な培養、採集及び懸濁工程に対する変形を理解しており、したがって、本発明はこのような変形を組み込むことを理解すべきである。
【００６０】
上記細胞−保存培地泥状物は冷蔵し、液体（すなわち、湿潤薬物調合物）として使用することができ、又は乾燥し、原薬薬物粉末（すなわち、乾燥薬物調合物）として使用することができる。細胞−保存培地泥状物は、本分野において公知のあらゆる適切な乾燥法を用いて乾燥することが可能である。乾燥法及び保護因子は、Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈ．６６：１８３−１９３によって、総説中に開示されている。適切な乾燥法には、風乾、真空乾燥、オーブン乾燥、噴霧乾燥、気流乾燥、流動層乾燥、空気調整乾燥及び凍結乾燥（すなわち、フリーズドライ）が含まれる。いくつかの実施形態において、乾燥工程を補助するために、及び／又は乾燥された調合物中に水分が再吸収されるのを防ぐために、乾燥剤が使用される。いくつかの実施形態において、乾燥は、凍結乾燥機（すなわち、Ｖｉｒｔｉｓ、ＳＰ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて行われる。詳細な凍結乾燥法は当業者に公知であり、米国特許第６，０９３，３９４号明細書、米国特許第８，３２９，４４７号明細書及び米国特許第８，６４２，０２９号明細書に開示されている。原薬乾燥粉末の効力は、１０９ＣＦＵ／ｇ〜１０１２ＣＦＵ／ｇであり得る。より好ましい原薬粉末は、少なくとも約１０１０ＣＦＵ／ｇの活性を有し得る。
【００６１】
本発明のラクトバチルス調合物（湿潤及び／又は乾燥）は、本分野において公知のあらゆる適切な方法を用いて、調製工程を通じて、異なる時点で、効力に関して検査される。ラクトバチルス調合物の効力を測定するために使用されるこのような方法には、培養をベースとする方法が含まれ、Ｂｒｕｇｇｅｒ，Ｓ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｃｏｌｏｎｙ  Ｆｏｒｍｉｎｇ  Ｕｎｉｔｓ  ｏｎ  Ａｇａｒ  Ｐｌａｔｅｓ．ＰＬＯＳ  ＯＮＥ  ２０１２；７（３）：ｅ３３６９５にその詳細が開示されているが、これに限定されない。ラクトバチルスの細胞密度を測定するための光散乱法は、発酵過程をモニターするために使用され、細菌の試料の６００ｎｍでの光学密度を測定することを含む。
【００６２】
上記方法から得られた湿潤又は乾燥原薬ラクトバチルス薬物調合物は、通例、純度及び同一性に関して検査される。ラクトバチルス薬物調合物の純度は、本分野において周知の、米国薬局方方法＜６１＞生菌数試験及び米国薬局方方法＜６２＞特定微生物試験に記載されているような方法を用いて測定される。薬物調合物中のラクトバチルス種の遺伝的同定は、市販のキット（例えば、Ｐｏｗｅｒ  Ｓｏｉｌ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，Ｍｏ  Ｂｉｏ）を用いてゲノムＤＮＡを単離し、ＰＣＲによって、特異的プライマーを用いて１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を増幅し、商業的ＤＮＡ配列決定サービス（ＭＣＬＡＢ）を用いて遺伝子を配列決定し、参照基準に対して配列を比較することによって実施される。調合物中のラクトバチルス菌株の同定は、反復配列ポリメラーゼ連鎖反応（Ｒｅｐ−ＰＣＲ）など本分野において周知の、米国特許第６，０９３，３９４１号明細書、米国特許第８，３２９，４４７号及び米国特許第８，６４２，０２９号明細書に記載されているような方法を用いて決定される。
【００６３】
米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって合意及び策定された効力及び用量の指針を遵守するために、原薬ラクトバチルス薬物調合物の活性は、薬学的に許容される賦形剤を用いて希釈される。本分野において公知のあらゆる適切な不活性な薬学的に許容される賦形剤（すなわち、希釈剤）を、ラクトバチルス薬物調合物の効力を希釈するために使用することができる。希釈されたラクトバチルス薬物調合物は、（原薬湿潤調合物から得られる）液体薬物製品又は（原薬乾燥調合物から得られる）粉末薬物製品と称される。いくつかの実施形態において、希釈剤は、マルトデキストリン、アルファ化デンプン、スクロース、ラクトース、Ｐｈａｒｍａｓｐｅｒｓｅ（Ｒ）、マンニトール、キシリトール、微結晶セルロース、クロスポビドン、リン酸水素カルシウム又はこれらの組み合わせであり得る。他の実施形態において、原薬乾燥調合物を希釈するためにマルトデキストリン又はアルファ化デンプンを使用することができる。いくつかの実施形態において、原薬乾燥調合物を希釈するためにマルトデキストリンが使用される。１回投与当たり１０８ＣＦＵ〜１０１１ＣＦＵ又は１回投与当たり１０８ＣＦＵ〜１０１０ＣＦＵまでラクトバチルス薬物調合物の効力を低下するために、適切な希釈剤が使用される。より好ましい薬物製品（液体又は粉末）は、一投与当たり１０９ＣＦＵより高い活性を有することができる。
【００６４】
ラクトバチルス種の投与
ＡＶＭを有すると診断された女性には、上記抗生物質の投与と組み合わせて（例えば、同時に、前及び／又は後に）、胚移植前及び／又は後に、膣粘膜を定着させるのに十分な量で上記ラクトバチルスが投与される。ラクトバチルス種は、１日に１回又は２回投与することができる。いくつかの実施形態において、ラクトバチルスの投与は、抗生物質の投与計画の最後の数日の間（すなわち、抗生物質の投与計画の完了の２〜４日前）に行われる。いくつかの実施形態において、ラクトバチルスは、抗生物質が２、３、４、５、６又は７日間投与された後に投与される。いくつかの実施形態において、ラクトバチルスは、抗生物質が約７日間投与された後に投与される。いくつかの実施形態において、ラクトバチルスは、抗生物質が少なくとも５日間投与された後に投与される。
【００６５】
本発明のいくつかの実施形態において、ラクトバチルス種は、抗生物質の投与計画の完了後及び胚移植又は接合子移植前に、１〜１４日間投与され得る。他の実施形態において、ラクトバチルス種は、抗生物質の投与計画の完了後に、１、２、３、４、５、６、７、１０、１２又は１４日間投与され得る。特定の実施形態において、ラクトバチルス種は、抗生物質の投与計画の完了後に、５〜７日間投与され得る。別の実施形態において、ラクトバチルス種は、抗生物質の投与計画の完了後に、７日間投与され得る。
【００６６】
ラクトバチルス薬物製品は、１回投与当たり１０８ＣＦＵ〜１０１１ＣＦＵ又は１回投与当たり１０８ＣＦＵ〜１０１０ＣＦＵで投与される。他の実施形態において、ラクトバチルスは、少なくとも１０９ＣＦＵ／日の用量で投与される。ラクトバチルス薬物製品（すなわち、ラクトバチルス）は、約１００ｍｇ〜６００ｍｇの用量で、又は約１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００又は５５０ｍｇの用量で投与される。他の実施形態において、ラクトバチルス薬物製品は、約１５０ｍｇ〜４５０ｍｇ、又は約１５０ｍｇ〜約４００ｍｇ、又は約１５０ｍｇ〜約３５０ｍｇの用量で投与され得る。いくつかの実施形態において、ラクトバチルス薬物製品は、約１５０ｍｇ〜２５０ｍｇの用量で投与され得る。特定の実施形態において、ラクトバチルス薬物製品は、約２００ｍｇの用量で投与され得る。いくつかの実施形態において、ラクトバチルス薬物製品は、乾燥粉末組成物として投与され得る。
【００６７】
体外受精
ＡＶＭと診断され、上述のような抗生物質とラクトバチルスの投与後に体外受精を受けている女性に、ヒト接合子又は胚が移植される。一般に、胎生学を専門とする医師は、柔らかい移植カテーテルを使用して、頸管を通じて女性に胚を移植する。カテーテルは、内容物を排出し、胚を置く前に、好ましくは、子宮底から１〜２ｃｍのところに配置される。接合子又は胚移植を伴う方法及び手法は、当業者に公知である。例えば、米国特許第７，７８１，２０７号明細書及び米国特許出願第１３／６５５，２５７号明細書を参照されたい。
【００６８】
胚移植又は接合子移植は、上述のようにラクトバチルス種が投与された後に行われる。例えば、胚移植又は接合子移植は、ラクトバチルスが投与された後に、１日１回、７日間、１０８ＣＦＵ〜１０１１ＣＦＵ／１回投与量で行うことができ、各１回投与量は約１５０ｍｇ〜２５０ｍｇである。胚移植又は接合子移植の完了後に、さらなる期間、１０８ＣＦＵ〜１０１１ＣＦＵ／１回投与量で、所望により２回目の処置として、ラクトバチルスを投与することも可能である。ラクトバチルスの２回目の投与は、上述したあらゆるラクトバチルス投与量で投与することができる。第二のラクトバチルス処置は、第一のラクトバチルス処置と同じ用量で実施することができ、又は第一のラクトバチルス処置と異なる用量で実施することができる。例えば、胚移植又は接合子移植の完了後には、胚移植又は接合子移植前に使用されたラクトバチルスの用量を、１週当たり１〜５回再度投与し得る。いくつかの実施形態において、ラクトバチルスの２回目の投与は、胚移植又は接合子移植の完了後に、１週間に１、２、３、４又は５回投与することができる。別の実施形態において、ラクトバチルスの投与は、胚移植又は接合子移植の完了後に、１週間に１〜４回、又は１週間に２〜５回、又は１週間に１〜３回、又は１週間に１〜２回投与することができる。特定の実施形態において、ラクトバチルスの投与は、胚移植又は接合子移植の完了後に、１週間に２回投与することができる。第二のラクトバチルス処置は、乾燥組成物又は湿潤組成物として実施され得る。
【００６９】
第二のラクトバチルス処置（すなわち、胚移植後／接合子移植後）の期間は、１〜１４週であり、妊娠スキャンが、胚又は接合子の着床が成功したことを示すまでである。例えば、第二のラクトバチルス処置は、胚移植又は接合子移植の完了後に、２〜１３週間、又は３〜１２週間、又は４〜１１週間、又は５〜１０週間、又は６〜９週間、又は７〜８週間実施され得る。特定の実施形態において、第二のラクトバチルス処置は、胚移植又は接合子移植の完了後に、５〜１０週間実施され得る。別の実施形態において、第二のラクトバチルス処置は、胚移植又は接合子移植の完了後に、７週間実施され得る。別の実施形態において、第二のラクトバチルス処置期間は、７週間であり、妊娠スキャンが、胚又は接合子の着床が成功したことを示すまでである。
【００７０】
胚移植又は接合子移植の完了後に、通例、妊娠スキャンが行われるいくつかの事例では、妊娠スキャンは、上記されているような第二のラクトバチルス処置（すなわち、胚移植後／接合子移植後）の完了後に行われる。妊娠スキャンは、生化学的妊娠スキャン又は臨床的妊娠スキャンであり得る。ｈＣＧレベルは胚又は接合子の着床の数週以内に上昇する傾向があるので、少なくとも２５ｍｔＵ／ｍＬを上回るｈＣＧレベルを示す生化学的妊娠スキャンは、生化学的に検出可能な妊娠の指標となり得る。ｈＣＧのあるレベルの検出は、尿中より血液中に、より早期に実現され得る。いくつかの実施形態において、生化学的妊娠スキャンは、胚移植又は接合子移植の後に、少なくとも７〜３０日間又はそれ以上、実施することができる。別の実施形態において、生化学的妊娠スキャンは、胚移植又は接合子移植の後に、１４〜２１日、実施することができる。いくつかの実施形態において、生化学的妊娠スキャンは、上記のような第二のラクトバチルス処置の完了後に実施することができる。
【００７１】
いくつかの実施形態において、妊娠スキャンは、臨床的妊娠スキャンである。臨床的妊娠スキャンは、超音波スキャン又はドップラー検査を用いて、胚又は接合子がその中に移植された女性を評価することである。胎嚢及び／又は心臓の動きが存在することは、着床及び臨床妊娠が成功したことを示す。いくつかの実施形態において、臨床的妊娠スキャンは、胚移植又は接合子移植の完了後に行われる。いくつかの実施形態において、臨床的妊娠スキャンは、胚移植又は接合子移植の完了後に、７〜１４週間又はそれ以上、行われ得る。他の実施形態において、臨床的妊娠スキャンは、胚移植又は接合子移植後に、６〜８週間、行われ得る。いくつかの実施形態において、臨床的妊娠スキャンは、胚移植又は接合子移植後に、７週間、行われ得る。いくつかの実施形態において、臨床的妊娠スキャンは、上記のような第二のラクトバチルス処置の完了後に行われ得る。
【００７２】
本明細書において引用された全ての刊行物及び特許出願は、それぞれの各刊行物又は特許出願が具体的に及び個別的に参照により組み込まれることが示されているかのごとく、参照により本明細書に組み込まれる。
【００７３】
理解の明確化のために、先述の発明を、例示及び例として、いくぶん詳しく説明してきたが、本発明の教示に照らして、添付の特許請求の範囲の精神又は範囲から逸脱することなく、本発明にある種の変更及び改変を施し得ることが当業者には自明であろう。
【００７４】
ＩＶ．［実施例］
以下の実施例は、例示としてのみ提供されており、限定のために提供されているものではない。当業者は、実質的に同様の結果を与えるように変化又は改変され得る様々な重要でないパラメータを容易に認め得るであろう。
【００７５】
［実施例１］ラクトバチルスの乾燥組成物の調製
本実施例は、細菌の培養、保存培地中への懸濁、乾燥、希釈及び梱包を含む、医薬品として、粉末形態でラクトバチルスの乾燥組成物を調製するための一般的な戦略を詳述する。ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＳＪ−３Ｃの培養及び加工のために、ここに記載されている手法は、本発明とともに使用するのに適したあらゆる微生物に対して適用可能である。
【００７６】
最初のラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＳＪ−３Ｃ（ＳＪ−３Ｃ）細胞は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１０１３８で、寄託機関Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から取得することができる。これらの細胞のマスター細胞バンク及びワーキング細胞バンクが作製されており、引き続き、乾燥ラクトバチルス組成物の調製において使用することができる。
【００７７】
まず、ｄｅ  Ｍａｎ、Ｒｏｇｏｓａ及びＳｈａｒｐｅ（ＭＲＳ）改変寒天プレート上にＳＪ−３Ｃ細胞を播き、３７℃で７２時間、嫌気的条件下で増殖させる。プレートから得られた細胞を改変ＭＲＳ１０ｍＬ中に播種し、３７℃で２４時間、嫌気的に温置する。次いで、増殖培地４９０ｍＬにこの培養物を移し、３７℃で２４時間温置した後、５ＬのＢｅｌｌｃｏ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ中の培地４．５Ｌに移す。発酵槽接種菌液としての役割を果たすために、３７℃でさらに２４時間、この５リットル培養物を嫌気的に温置する。
【００７８】
発酵は、窒素ガスを散布された改変ＭＲＳ培地の存在下において、ｐＨ６．０で、発酵槽（１００リットルの発酵槽）中で行う。接種菌液の添加によって発酵を開始し、細胞が初期定常期に達して増殖が停止する約１５時間後に終了する。この時点で、グルコースは枯渇し、乳酸産生が停止し、６００ｎｍでの培養物の光学密度（ＯＤ６００）は一定に保たれ、細胞を採集する。
【００７９】
タンジェンシャルフロー膜を用いて、無菌密閉中空糸系中でのホスフェート緩衝化生理的食塩水への緩衝液交換（透析ろ過）によって、細胞を採集し、濃縮し、洗浄する。残存するラクテート濃度が採集時の最初の値の１０％に達し、透過液のｐＨが一定に保たれたら、採集系から細胞を無菌的に取り出し、１５００×ｇ、２０分間、２〜８℃）での遠心によって収集する。
【００８０】
細胞ペースト１ｇ当たり２．５ｍＬの保存溶液を用いて、細胞沈渣を保存培地溶液中に再懸濁する。保存培地溶液は、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中に１５％トレハロース、６％キシリトール及び１％アスコルビン酸ナトリウムを含有しており、採集されたＳＪ−３Ｃ泥状物のバッチを調製するために使用される。保存培地細胞泥状物の得られたバッチは、１×１０１０ＣＦＵ／ｍＬ〜１×１０１１ＣＦＵ／ｍＬの計算された活性を有するはずである。無菌のＬｙｏｇｕａｒｄＴＭトレイに泥状物を移し、Ｖｉｒｔｉｓ  Ｇｅｎｅｓｉｓ  Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｒ中で凍結乾燥する。凍結乾燥の前に、プレート計数によって、細胞泥状物の生存率を測定する。細胞ケークを含有するＬｙｏｇｕａｒｄＴＭトレイを、熱融着された袋の中に乾燥剤とともに入れ、窒素ガスを吹き込み、粉砕まで２〜８℃に保つ。
【００８１】
コーンミルを用いて、固化防止剤として０．５％コロイド状二酸化ケイ素を加えた、凍結乾燥された細胞ケークを粉砕することによって、ＳＪ−３Ｃ原薬物質を作製する。原薬粉末に窒素（Ｎ２）ガスを吹き込み、薬物製品の製造のために使用されるまで、２〜８℃で、熱融着された袋の中に乾燥剤とともに保存した。既述した当業者に公知の方法を用いて、純度、効力（ＣＦＵ）、同一性及び残存する水分に関して、ＳＪ−３Ｃ原薬物質を検査する。乾燥したＳＪ−３Ｃ原薬物質の得られたバッチの理想的活性は、５×１０１０ＣＦＵ／ｇ〜１．０×１０１１ＣＦＵ／ｇであるべきである。乾燥したＳＪ−３Ｃ原薬物質の理想的な水の活量は、０．２２０未満であるべきである。純度に関して検査される場合、得られたＳＪ−３Ｃ原薬物質は、２００ＣＦＵ／ｇ未満の総好気性菌数、２０ＣＦＵ／ｇ未満の総酵母及びカビを含有し、好ましくない生物は存在しないであろう。得られたＳＪ−３Ｃ原薬物質の同一性は、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列によって確認される。
【００８２】
マルトデキストリンで原薬物質を３〜１０倍希釈して、２×１０９ＣＦＵ／１回投与量〜５×１０９ＣＦＵ／１回投与量の最終用量を得る。用量は２００ｍｇである。１回投与量の希釈された薬物物質を医療用粉末散布機の中に入れ、最終医薬品として包装する。
【００８３】
［実施例２］動物由来の賦形剤を加えた及び加えない保存培地の比較
以下の実施例は、乾燥粉末ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）用の保存培地の開発を実証する。本実施例は、動物由来の賦形剤が保存培地から除去されたときに、乾燥ラクトバチルスの安定性が増加することを示す。
【００８４】
凍結乾燥用調合物の開発のために、ｐＨ６．０の改変ＭＲＳ培地１Ｌを含有する撹拌されたバイオリアクタ中で、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＳＪ−３Ｃのバッチ発酵を行う。発酵完了時の初期定常期に細胞を採集する。バッチ工程は、通例、９０％超の細胞生存率で、１．０×１０９〜１．５×１０９ＣＦＵ／ｍＬを与える。細胞を遠心によって回収し、ホスフェート緩衝食塩水で洗浄し、凍結乾燥用の１又は複数の保存溶液と混合する。主要な最終目標は、良好な室温安定性を有する無脱脂乳調合物を特定することである。次いで、この混合物をＶｉｒｔｉｓ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ凍結乾燥機中で凍結乾燥する。凍結乾燥されたケークを手作業で粉末化し、乾燥剤を入れたホイルの袋の中に入れ、Ｎ２を吹き込み、熱融着し、２５℃で保存した。ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）菌株ＣＴＶ−０５を使用したこの手順から得られた代表的な結果が図１に示されている。
【００８５】
粉末試料を定期的に取り出し、ＭＲＳ寒天上に播き、コロニーを計数することによって、活性を測定した。凍結保護と室温での安定性の最良の組み合わせは、１５％トレハロース、６％キシリトール、１％アスコルビン酸ナトリウム及びｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸ナトリウムを含有する保存溶液を用いて達成された（図１、上の線）。この調合物は、５％脱脂乳を含有する同じ調合物（図１、下の線）より優れた安定性を与えた
【００８６】
［実施例３］安定性を改善するためのグルタミン酸ナトリウムの使用
実施例２の手順の後、４つの異なる保存培地：１）１５％トレハロース、６％キシリトール、１％アスコルビン酸ナトリウム及びｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸ナトリウム（三角）；２）１）と同じ保存培地、さらに５％グルタミン酸ナトリウム（逆三角）；３）１２％トレハロース、８％キシリトール、１％アスコルビン酸ナトリウム及びｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸ナトリウム（丸）；並びに４）３）と同じ保存培地、さらに５％グルタミン酸ナトリウム（四角）中に、培養されたエル・クリスパータス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＣＴＶ−０５（ＬＡＣＴＩＮ−Ｖ）細胞を調合した。図２に示されているように、グルタミン酸ナトリウムは上昇した温度（３７℃）での両粉末調合物の安定性を向上させたが、最初の凍結保護に対しては効果がなかった。
【００８７】
［実施例４］アカゲザルモデルでの多様な膣細菌叢の処置
アカゲザルの膣マイクロビオームは、ヒトにおける異常な膣細菌叢と同様に、通例多様であり、ラクトバチルスのレベルが低い。この類似性の故に、ヒトの膣ラクトバチルスの定着に対する抗生物質前処理の効果をアカゲザルモデルにおいて研究した。
【００８８】
膣内アジスロマイシン２００ｍｇで、１日１回、５日間、雌のアカゲザル７匹を処置した後、１日１回、５日間、１０１０ＣＦＵ／１回投与量のヒトラクトバチルス・ジェンセニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｅｎｓｅｎｉｉ）１１５３を膣内投与した。比較のために、７匹のアカゲザルの別の群は、膣内エル・ジェンセニイ（Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ）で５日間処置したが、抗生物質での前処置はしなかった。ラクトバチルスの定着レベルを評価するために、ラクトバチルス投与から４、７、１４、２１及び２８日後に、膣液試料を収集した。試料をＭＲＳ寒天プレート上で培養し、コロニーを計数することによって、ラクトバチルスを数え、得られたエル・ジェンセニイ（Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ）濃度を、コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍＬとして表した。図３に示されているように、（アカゲザルで典型的な）多様な膣細菌叢の抗生物質による前処置は、非在来のヒト膣ラクトバチルスの長期にわたる膣への定着を向上させることができる。
【００８９】
類似の実験では、膣内アジスロマイシン２００ｍｇで、１日１回、５日間、雌のアカゲザル４匹を処置した後、１日１回、５日間、１０１０ＣＦＵ／１回投与量のヒトラクトバチルス・ジェンセニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｅｎｓｅｎｉｉ）１１５３を膣内投与した。比較のために、４匹のアカゲザルの別の群は、膣内エル・ジェンセニイ（Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ）で５日間処置したが、抗生物質で前処置しなかった。ラクトバチルス投与から約２週後に収集された膣の細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の配列決定によって、各アカゲザルに対して膣マイクロビオームの組成を分析した。１６ＳｒＲＮＡ分析の結果が図４に示されており、各アカゲザルに対して、膣細菌叢中のラクトバチルスの百分率を表している。図４に示されているように、（アカゲザルで典型的な）多様な膣細菌叢の抗生物質による前処置は、マイクロビオーム中のラクトバチルスの割合を顕著に増加させることができ、したがって、他の菌株による競合を制約する。
【００９０】
これは、経口クリンダマイシン及び膣エル・クリスパータス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）で前処置されたヒトの女性において達成されるべき効果である。重要な観察は、抗生物質での前処置が、（アカゲザルのような）異常な（多様な）膣細菌叢を有する対象の膣マイクロビオーム中に非在来のラクトバチルスが自己を生着させる能力を著しく向上させることが可能であるということである。その結果、ラクトバチルスの持続的な膣への定着が改善され、異常な細菌叢が減少し、ＩＶＦの成功率が（ラクトバチルスが支配的な細菌叢に伴って）向上するであろう。
【００９１】
［実施例５］ＩＶＦの成功率を増加させるための異常な膣細菌叢の処置
不妊に悩んでいる１８歳〜４２歳の女性患者が不妊治療医院に通院している。不妊に関わらず、女性患者は無症候性である。ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）及び／又はアトポビウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ  ｖａｇｉｎａｅ）を標的とするｑＰＣＲ診断法を用いて、異常な膣細菌叢の存在に関して、無症候性の女性患者を検査する。このｑＰＣＲ診断検査は、５．７×１０７コピー／ｍＬの閾値を上回るガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）の存在及び５．７×１０６コピー／ｍＬの閾値を上回るアトポビウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ  ｖａｇｉｎａｅ）の存在を検出し、患者には陽性のＡＶＭ診断が得られる。
【００９２】
ｑＰＣＲ検査を用いてＡＶＭと診断された女性患者は、１日２回、７日間、３００ｍｇのクリンダマイシン経口カプセルによる抗生物質処置を受ける。クリンダマイシン処置の完了後に、女性患者は、乾燥粉末の形態のラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）薬物製品（すなわち、ＬＡＣＴＩＮ−Ｖ）を用いた処置を開始する。予め充填した散布機を用いてＬＡＣＴＩＮ−Ｖ粉末を膣に投与する。それぞれの予め充填した散布機は、散布機１つ当たり２×１０９ＣＦＵで、ＬＡＣＴＩＮ−Ｖの２００ｍｇ用量を含有する。女性患者は、７日間連続で、毎日、ＬＡＣＴＩＮ−Ｖの投薬を１回受ける。
【００９３】
上述した最初のＬＡＣＴＩＮ−Ｖ処置を完了した後、次いで、女性は胚移植を受ける。胚移植の完了後、次いで、女性患者が臨床的妊娠スキャンを受けて、胎児の心拍の存在が実証されるまで、１週間に２回、７週間、散布機１つ当たり２×１０９ＣＦＵでＬＡＣＴＩＮ−Ｖの２００ｍｇ用量を投与することを含む第二のＬＡＣＴＩＮ−Ｖ処置を女性に投与する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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