(57)【要約】  本明細書で提供されるのは、いくつかの態様において、多量体グルコ−ス炭水化物（例えばデンプン）を糖に酵素的に変換するための、システム、方法、および組成物（例えば細胞および細胞ライセ−ト）である。
2020503059.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルロ−ス化合物を生産する方法であって、以下のステップ：
多量体グルコ−ス炭水化物を、α−グルカンまたはセロデキストリンホスホリラ−ゼによる触媒作用によりグルコ−ス１−リン酸（Ｇ１Ｐ）に変換すること；該グルコ−ス１−リン酸（Ｇ１Ｐ）を、ホスホグルコムタ−ゼによる触媒作用により変換してグルコ−ス６−リン酸（Ｇ６Ｐ）を生産すること；該グルコ−ス６−リン酸（Ｇ６Ｐ）を、ホスホグルコイソメラ−ゼによる触媒作用によりフルクト−ス６−リン酸（Ｆ６Ｐ）に変換すること；該フルクト−ス６−リン酸（Ｆ６Ｐ）を、アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ（Ａ６ＰＥ）による触媒作用により変換してアルロ−ス６−リン酸（Ａ６Ｐ）を生産すること；および、該アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ（Ａ６Ｐ）を、アルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼ（Ａ６ＰＰ）による触媒作用によりアルロ−スに変換すること、
を含む、前記方法。
【請求項２】
多量体グルコ−ス炭水化物が、デンプン、セロデキストリン、またはグリコ−ゲンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
α−グルカンホスホリラ−ゼが、Aquifex aeolicus、Thermocrinis minervae、 Thermosulfidibacter takaii、Thermosulfurimonas dismutans、Thermococcus litoralis、Palaeococcus pacificus、Thermotoga neapolitana、Ruminiclostridium thermocellum、Pyrococcus abyssi、Thermococcus thioreducens、Deinococcus radiodurans、Sulfolobus acidocaldarius、Thermus caldophilus、Meiothermus silvanus、Oceanithermus profundus、Ardenticatena maritima、Thermococcus barophilus、Pseudothermotoga thermarum、Hydrogenobacter thermophilus、Thermus oshimai、Meiothermus ruber、およびMarinitoga piezophilaのα−グルカンホスホリラ−ゼからなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
セロデキストリンホスホリラ−ゼが、Clostridium thermocellum、Clostridium straminisolvens、Thermotoga RQ2、Ignisphaera aggregans、Thermotoga maritima、Spirochaeta thermophila、Caldicellulosiruptor bescii、Dictyoglomus thermophilum、Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum、Thermosipho africanus、Caldisalinibacter kiritimatiensis、Defluviitalea phaphyphila、Caldicellulosiruptor kronotskyensis、Thermococcus sibiricus、およびThermosphaera aggregansのセロデキストリンホスホリラ−ゼからなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ホスホグルコムタ−ゼが、Thermococcus kodakaraensis、Pyrococcus kukulkanii、Ammonifex degensii、Methanothermobacter wolfeii、Methanothermus fervidus、Sulfolobus acidocaldarius、Archaeoglobus fulgidus、Ferroglobus placidus、Geoglobus ahangari、Archaeoglobus veneficus、Archaeoglobus sulfaticallidus、Aciduliprofundum boonie、Clostridium thermocellum、Defluviitalea phaphyphila、Caminicella sporogenes、Caloranaerobacter ferrireducens、Thermosipho malanesiensis、Fervidobacterium pennivorans、Symbiobacterium thermophilum、Spirochaeta thermophila、およびThermoanaerobacter wiegeliiのホスホグルコムタ−ゼからなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ホスホグルコイソメラ−ゼが、Thermus thermophilus、Meiothermus timidus、Thermus filiformis、Marinithermus hydrothermalis、Thermosipho africanus、Sulfurihydrogenibium azorense、Persephonella marina、Marinitoga piezophila、Kosmotoga olearia、Thermotoga maritima、Geobacillus stearothermophilus、Anoxybacillus flavithermus、Thermosulfidibacter takaii、Fervidobacterium nodosum、Clostridium thermocellum、Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum、Methanococcus jannaschii、Methanotorris igneus、Methanocaldococcus villosus、Methanothermococcus okinawensis、Pseudothermotoga thermarum、Deferribacter desulfuricans、およびThermovibrio ammonificansのホスホグルコイソメラ−ゼからなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼが、Thermobacterium thermosaccharolyticum、Thermoanaerobacter brockii、Caldanaerobacter subterraneus、Deferribacter desulfuricans、Thermocrinis ruber、Hydrogenivirga sp. 128−5−R1−1、Brevibacillus thermoruber、Thermosipho atlanticus、およびThermosulfidibacter takaiiのアルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼからなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
アルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼが、Thermoanaerobacter wiegelii、Thermoanaerobacter ethanolicus、Thermus islandicus、Deinococcus geothermalis DSM 11300、Thermosphaera aggregans、Crenarchaeota archaeon、Pyrococcus horikoshii Ot3、Aquifex aeolicus、Ruminiclostridium thermocellum、Desulfotomaculum kuznetsovii、Caldanaerobacter subterraneus、Acidothermus cellulolyticus、Methanothermobacter thermautotrophicus、Thermobifida fusca、Thermotoga neapolitana、Petrotoga mobilis、およびThermodesulfatator indicus、Thermus thermophilus、Bacteroides vulgatus、およびBacteroides fragilusのアルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
アルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼが、アルロ−ス６−リン酸に特異的である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１つの酵素が耐熱性であるか、または少なくとも２つの酵素が耐熱性である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
デンプンまたはグリコ−ゲンをα−アミラ−ゼおよび枝切り酵素で前処理して、脱分岐マルトデキストリンを生産する、請求項２〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
枝切り酵素が、イソアミラ−ゼおよびプルラナ−ゼから選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
イソアミラ−ゼが、Sulfolobus tokodaii、Metallosphaera hakonensis、Sphaerobacter thermophiles、およびBacillus lentusのイソアミラ−ゼから選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
プルラナ−ゼが、Fervidobacterium pennavorans、Thermotoga sp. RQ5、Bacillus flavocaldarius、Thermosipho africanus、およびKosmotoga oleariaのプルラナ−ゼから選択される、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
アルロ−スを生産するための無細胞的方法であって、該方法が、
（ａ）耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性ホスホグルコイソメラ−ゼ、耐熱性アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、および耐熱性アルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを発現するように改変された細胞を培養して、耐熱性酵素を発現する培養細胞を生産すること；
（ｂ）培養細胞を溶解して細胞ライセ−トを生産すること；
（ｃ）細胞ライセ−トを、天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ａ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること；および
（ｄ）熱不活化ライセ−トを、デンプン、グリコ−ゲン、またはそれらの任意の部分的加水分解誘導体、および無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、アルロ−スを生産すること；
を含む、前記方法。
【請求項１６】
デンプンまたはグリコ−ゲンを、α−アミラ−ゼおよび枝切り酵素で前処理して、脱分岐マルトデキストリンを生産する、請求項１５に記載の無細胞的方法。
【請求項１７】
デンプンまたはグリコ−ゲンをα−アミラ−ゼで前処理して脱分岐マルトデキストリンを生産し、および枝切り酵素をステップ（ｄ）に添加する、請求項１５に記載の無細胞的方法。
【請求項１８】
枝切り酵素をステップ（ｄ）に添加する、請求項１５に記載の無細胞的方法。
【請求項１９】
枝切り酵素が、イソアミラ−ゼおよびプルラナ−ゼから選択される、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の無細胞的方法。
【請求項２０】
イソアミラ−ゼが、Sulfolobus tokodaii、Metallosphaera hakonensis、Sphaerobacter thermophiles、およびBacillus lentusのイソアミラ−ゼから選択される、請求項１９に記載の無細胞的方法。
【請求項２１】
プルラナ−ゼが、Fervidobacterium pennavorans、Thermotoga sp. RQ5、Bacillus flavocaldarius、Thermosipho africanus、およびKosmotoga oleariaのプルラナ−ゼから選択される、請求項１９または２０に記載の無細胞的方法。
【請求項２２】
アルロ−スを生産するための無細胞的方法であって、該方法が、
（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで各集団の細胞は、耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性ホスホグルコイソメラ−ゼ、耐熱性アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、および耐熱性アルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生産する；
（ｂ）少なくとも２つの培養集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセ−トを生産すること；
（ｃ）少なくとも２つの細胞ライセ−トを組み合わせて、耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性ホスホグルコイソメラ−ゼ、耐熱性アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、および耐熱性アルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを含む細胞ライセ−ト混合物を生産すること；
（ｄ）細胞ライセ−ト混合物を、天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ｃ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること；および、
（ｅ）反応混合物を、デンプン、グリコ−ゲン、またはそれらの任意の部分的加水分解誘導体、および無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、アルロ−スを生産すること；
を含む、前記方法。
【請求項２３】
アルロ−スを生産するための無細胞的方法であって、該方法が、
（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで各集団の細胞は、α−グルカンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、ホスホグルコイソメラ−ゼ、アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、およびアルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生産し、ここで前述の酵素の少なくとも１つは耐熱性であり；
（ｂ）少なくとも２つの培養集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセ−トを生産すること；
（ｃ）任意に、ステップ（ｂ）の細胞ライセ−トの１つ以上を、天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ａ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること；
（ｄ）ステップ（ｂ）および（ｃ）の細胞ライセ−トを組み合わせて、α−グルカンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、ホスホグルコイソメラ−ゼ、アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、およびアルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを含む細胞ライセ−ト混合物を生産すること、ここで、前述の酵素の少なくとも１つは耐熱性であり；および
（ｅ）細胞ライセ−ト混合物を、デンプン、グリコ−ゲン、またはそれらの任意の部分的加水分解誘導体、および無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、アルロ−スを生産すること；
を含む、前記方法。
【請求項２４】
アルロ−スを生産するための無細胞的方法であって、該方法が、
（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで各集団の細胞は、耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性ホスホグルコイソメラ−ゼ、耐熱性アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、および耐熱性アルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生産する；
（ｂ）少なくとも２つの培養集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセ−トを生産すること；
（ｃ）少なくとも２つの細胞ライセ−トを組み合わせて、細胞ライセ−ト混合物を生産すること；
（ｄ）細胞ライセ−ト混合物を、天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ａ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること； 
（ｅ）熱不活性化ライセ−トに、α−グルカンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、ホスホグルコイソメラ−ゼ、アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、およびアルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの精製酵素を添加して、α−グルカンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、ホスホグルコイソメラ−ゼ、アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、およびアルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを含む反応混合物を生産すること；および
（ｆ）反応混合物を、デンプン、グリコ−ゲン、またはそれらの任意の部分的加水分解誘導体、および無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、アルロ−スを生産すること；
を含む、前記方法。
【請求項２５】
アルロ−スを生産するための無細胞的方法であって、該方法が、
（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで各集団の細胞は、α−グルカンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、ホスホグルコイソメラ−ゼ、アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、およびアルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生産する；
（ｂ）少なくとも２つの培養集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセ−トを生産すること；
（ｃ）任意に、ステップ（ｂ）の細胞ライセ−トの１つ以上を、天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ａ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること；
（ｄ）ステップ（ｂ）および（ｃ）の細胞ライセ−トを組み合わせて、細胞ライセ−ト混合物を生産すること；
（ｅ）細胞ライセ−ト混合物に、α−グルカンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、ホスホグルコイソメラ−ゼ、アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、およびアルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの精製酵素を添加して、α−グルカンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、ホスホグルコイソメラ−ゼ、アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、およびアルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを含む反応混合物を生産すること；および
（ｆ）反応混合物を、デンプン、グリコ−ゲン、またはそれらの任意の部分的加水分解誘導体、および無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、アルロ−スを生産すること；
を含む、前記方法。
【請求項２６】
α−グルカンホスホリラ−ゼが、Aquifex aeolicus、Thermocrinis minervae、 Thermosulfidibacter takaii、Thermosulfurimonas dismutans、Thermococcus litoralis、Palaeococcus pacificus、Thermotoga neapolitana、Ruminiclostridium thermocellum、Pyrococcus abyssi、Thermococcus thioreducens、Deinococcus radiodurans、Sulfolobus acidocaldarius、Thermus caldophilus、Meiothermus silvanus、Oceanithermus profundus、Ardenticatena maritima、Thermococcus barophilus、Pseudothermotoga thermarum、Hydrogenobacter thermophilus、Thermus oshimai、Meiothermus ruber、およびMarinitoga piezophilaのα−グルカンホスホリラ−ゼからなる群から選択される、請求項１５〜２５のいずれか一項に記載の無細胞的方法。
【請求項２７】
ホスホグルコムタ−ゼが、Thermococcus kodakaraensis、Pyrococcus kukulkanii、Ammonifex degensii、Methanothermobacter wolfeii、Methanothermus fervidus、Sulfolobus acidocaldarius、Archaeoglobus fulgidus、Ferroglobus placidus、Geoglobus ahangari、Archaeoglobus veneficus、Archaeoglobus sulfaticallidus、Aciduliprofundum boonie、Clostridium thermocellum、Defluviitalea phaphyphila、Caminicella sporogenes、Caloranaerobacter ferrireducens、Thermosipho malanesiensis、Fervidobacterium pennivorans、Symbiobacterium thermophilum、Spirochaeta thermophila、およびThermoanaerobacter wiegeliiのホスホグルコムタ−ゼからなる群から選択される、請求項１５〜２６のいずれか一項に記載の無細胞的方法。
【請求項２８】
ホスホグルコイソメラ−ゼが、Thermus thermophilus、Meiothermus timidus、Thermus filiformis、Marinithermus hydrothermalis、Thermosipho africanus、Sulfurihydrogenibium azorense、Persephonella marina、Marinitoga piezophila、Kosmotoga olearia、Thermotoga maritima、Geobacillus stearothermophilus、Anoxybacillus flavithermus、Thermosulfidibacter takaii、Fervidobacterium nodosum、Clostridium thermocellum、Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum、Methanococcus jannaschii、Methanotorris igneus、Methanocaldococcus villosus、Methanothermococcus okinawensis、Pseudothermotoga thermarum、Deferribacter desulfuricans、およびThermovibrio ammonificansのホスホグルコイソメラ−ゼからなる群から選択される、請求項１５〜２７のいずれか一項に記載の無細胞的方法。
【請求項２９】
アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼが、Thermobacterium thermosaccharolyticum、Thermoanaerobacter brockii、Caldanaerobacter subterraneus、Deferribacter desulfuricans、Thermocrinis ruber、Hydrogenivirga sp. 128−5−R1−1、Brevibacillus thermoruber、Thermosipho atlanticus、およびThermosulfidibacter takaiiのアルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼからなる群から選択される、請求項１５〜２８のいずれか一項に記載の無細胞的方法。
【請求項３０】
アルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼが、Thermoanaerobacter wiegelii、Thermoanaerobacter ethanolicus、Thermus islandicus、Deinococcus geothermalis DSM 11300、Thermosphaera aggregans、Crenarchaeota archaeon、Pyrococcus horikoshii Ot3、Aquifex aeolicus、Ruminiclostridium thermocellum、Desulfotomaculum kuznetsovii、Caldanaerobacter subterraneus、Acidothermus cellulolyticus、Methanothermobacter thermautotrophicus、Thermobifida fusca、Thermotoga neapolitana、Petrotoga mobilis、およびThermodesulfatator indicus、Thermus thermophilus、Bacteroides vulgatus、およびBacteroides fragilusのアルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される、請求項１５〜２９のいずれか一項に記載の無細胞的方法。
【請求項３１】
デンプンまたはグリコ−ゲンをα−アミラ−ゼおよび枝切り酵素で前処理して、脱分岐マルトデキストリンを生産する、請求項１６〜３０に記載の無細胞的方法。
【請求項３２】
デンプンまたはグリコ−ゲンをα−アミラ−ゼで前処理して脱分岐マルトデキストリンを生産し、反応混合物を枝切り酵素の存在下でインキュベ−トする、請求項１６〜３０に記載の無細胞的方法。
【請求項３３】
反応混合物を枝切り酵素の存在下でインキュベ−トする、請求項１６〜３０に記載の無細胞的方法。
【請求項３４】
枝切り酵素が、イソアミラ−ゼおよびプルラナ−ゼから選択される、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の無細胞的方法。
【請求項３５】
イソアミラ−ゼが、Sulfolobus tokodaii、Metallosphaera hakonensis、Sphaerobacter thermophiles、およびBacillus lentusのイソアミラ−ゼから選択される、請求項３４に記載の無細胞的方法。
【請求項３６】
プルラナ−ゼが、Fervidobacterium pennavorans、Thermotoga sp. RQ5、Bacillus flavocaldarius、Thermosipho africanus、およびKosmotoga oleariaのプルラナ−ゼから選択される、請求項３４または３５に記載の無細胞的方法。
【請求項３７】
細胞が細菌細胞を含む、請求項１５〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
細胞が酵母細胞を含む、請求項１５〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
酵素の少なくとも１つが、細胞に対して異種である、請求項１５〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
溶解ステップ（ｂ）が、培養細胞を機械的、化学的、酵素的、浸透圧的または熱的に溶解することを含む、請求項１５〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
加熱ステップ（ｃ）または（ｄ）が、細胞ライセ−トを少なくとも５０℃の温度に加熱することを含む、請求項１５〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
デンプンが、アミロ−ス、アミロペクチン、またはアミロ−スとアミロペクチンの両方を含む、請求項１５〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
α−グルカンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、ホスホグルコイソメラ−ゼ、アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、アルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼおよび／または枝切り酵素のうちの２つ以上の酵素が、単一の融合タンパク質、二機能性または多機能性タンパク質として発現される、請求項１５〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
請求項１５〜４３のいずれか一項に記載の方法によって生産された、細胞ライセ−ト。
【請求項４５】
α−グルカンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、ホスホグルコイソメラ−ゼ、アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、アルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼ、および任意に枝切り酵素を含み、ここで任意に、前述の酵素の少なくとも１つが耐熱性酵素である、改変細胞。
【請求項４６】
細胞が細菌細胞または酵母細胞である、請求項４５に記載の改変細胞。
【請求項４７】
α−グルカンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、ホスホグルコイソメラ−ゼ、アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、アルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼ、および任意に枝切り酵素を含み、ここで任意に、前述の酵素の少なくとも１つが耐熱性酵素である、単一細胞ライセ−ト、少なくとも２つの細胞集団から得た細胞ライセ−トの混合物、または、反応混合物。
【請求項４８】
アルロ−スを生産するための無細胞的方法であって、該方法が、
（ａ）耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性ホスホグルコイソメラ−ゼ、耐熱性アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、および耐熱性アルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを発現するように改変された細胞を培養して、酵素を発現する培養細胞を生産すること；
（ｂ）培養細胞を溶解して細胞ライセ−トを生産すること；
（ｃ）細胞ライセ−トを、天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ａ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること；および
（ｄ）熱不活化ライセ−トを、セロデキストリンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、アルロ−スを生産すること；
を含む、前記方法。
【請求項４９】
アルロ−スを生産するための無細胞的方法であって、該方法が、
（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで各集団の細胞は、耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性ホスホグルコイソメラ−ゼ、耐熱性アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、および耐熱性アルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生産する；
（ｂ）少なくとも２つの培養集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセ−トを生産すること；
（ｃ）少なくとも２つの細胞ライセ−トを組み合わせて、耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性ホスホグルコイソメラ−ゼ、耐熱性アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、および耐熱性アルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを含む細胞ライセ−ト混合物を生産すること；
（ｄ）細胞ライセ−ト混合物を、天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ｃ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること；および、
（ｅ）反応混合物を、セロデキストリンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、アルロ−スを生産すること；
を含む、前記方法。
【請求項５０】
アルロ−スを生産するための無細胞的方法であって、該方法が、
（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで各集団の細胞は、セロデキストリンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、ホスホグルコイソメラ−ゼ、アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、およびアルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生産し、ここで前述の酵素の少なくとも１つは耐熱性であり；
（ｂ）少なくとも２つの培養集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセ−トを生産すること；
（ｃ）任意に、ステップ（ｂ）の細胞ライセ−トの１つ以上を、天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ａ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること；
（ｄ）ステップ（ｂ）および（ｃ）の少なくとも２つの細胞ライセ−トを組み合わせて、セロデキストリンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、ホスホグルコイソメラ−ゼ、アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、およびアルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを含む細胞ライセ−ト混合物を生産すること、ここで、前述の酵素の少なくとも１つは耐熱性であり；および
（ｅ）反応混合物を、セロデキストリンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、アルロ−スを生産すること；
を含む、前記方法。
【請求項５１】
アルロ−スを生産するための無細胞的方法であって、該方法が、
（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで各集団の細胞は、耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性ホスホグルコイソメラ−ゼ、耐熱性アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、および耐熱性アルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生産する；
（ｂ）少なくとも２つの培養集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセ−トを生産すること；
（ｃ）少なくとも２つの細胞ライセ−トを組み合わせて、細胞ライセ−ト混合物を生産すること；
（ｄ）細胞ライセ−ト混合物を、天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ａ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること； 
（ｅ）熱不活性化ライセ−トに、セロデキストリンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、ホスホグルコイソメラ−ゼ、アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、およびアルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの精製酵素を添加して、α−グルカンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、ホスホグルコイソメラ−ゼ、アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、およびアルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを含む反応混合物を生産すること；および
（ｆ）反応混合物を、セロデキストリンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、アルロ−スを生産すること；
を含む、前記方法。
【請求項５２】
アルロ−スを生産するための無細胞的方法であって、該方法が、
（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで各集団の細胞は、セロデキストリンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、ホスホグルコイソメラ−ゼ、アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、およびアルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生産し、ここで前述の酵素の少なくとも１つは耐熱性であり；
（ｂ）少なくとも２つの培養集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセ−トを生産すること；
（ｃ）任意に、ステップ（ｂ）の細胞ライセ−トの１つ以上を、天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ａ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること；
（ｄ）ステップ（ｂ）および（ｃ）の細胞ライセ−トを組み合わせて、細胞ライセ−ト混合物を生産すること；
（ｅ）細胞ライセ−ト混合物に、セロデキストリンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、およびアルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの精製酵素を添加して、セロデキストリンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、
ホスホグルコイソメラ−ゼ、アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、およびアルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを含む反応混合物を生産し、セロデキストリンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、ホスホグルコイソメラ−ゼ、アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、およびアルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを含む反応混合物を生産すること；および
（ｆ）反応混合物を、セロデキストリンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、アルロ−スを生産すること；
を含む、前記方法。
【請求項５３】
セロデキストリンホスホリラ−ゼが、Clostridium thermocellum、Clostridium straminisolvens、Thermotoga RQ2、Ignisphaera aggregans、Thermotoga maritima、Spirochaeta thermophila、Caldicellulosiruptor bescii、Dictyoglomus thermophilum、Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum、Thermosipho africanus、Caldisalinibacter kiritimatiensis、Defluviitalea phaphyphila、Caldicellulosiruptor kronotskyensis、Thermococcus sibiricus、およびThermosphaera aggregansのセロデキストリンホスホリラ−ゼからなる群から選択される、請求項４８〜５２のいずれか一項に記載の無細胞的方法。
【請求項５４】
ホスホグルコムタ−ゼが、Thermococcus kodakaraensis、Pyrococcus kukulkanii、Ammonifex degensii、Methanothermobacter wolfeii、Methanothermus fervidus、Sulfolobus acidocaldarius、Archaeoglobus fulgidus、Ferroglobus placidus、Geoglobus ahangari、Archaeoglobus veneficus、Archaeoglobus sulfaticallidus、Aciduliprofundum boonie、Clostridium thermocellum、Defluviitalea phaphyphila、Caminicella sporogenes、Caloranaerobacter ferrireducens、Thermosipho malanesiensis、Fervidobacterium pennivorans、Symbiobacterium thermophilum、Spirochaeta thermophila、およびThermoanaerobacter wiegeliiのホスホグルコムタ−ゼからなる群から選択される、請求項４８〜５３のいずれか一項に記載の無細胞的方法。
【請求項５５】
ホスホグルコイソメラ−ゼが、Thermus thermophilus、Meiothermus timidus、Thermus filiformis、Marinithermus hydrothermalis、Thermosipho africanus、Sulfurihydrogenibium azorense、Persephonella marina、Marinitoga piezophila、Kosmotoga olearia、Thermotoga maritima、Geobacillus stearothermophilus、Anoxybacillus flavithermus、Thermosulfidibacter takaii、Fervidobacterium nodosum、Clostridium thermocellum、Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum、Methanococcus jannaschii、Methanotorris igneus、Methanocaldococcus villosus、Methanothermococcus okinawensis、Pseudothermotoga thermarum、Deferribacter desulfuricans、およびThermovibrio ammonificansのホスホグルコイソメラ−ゼからなる群から選択される、請求項４８〜５４のいずれか一項に記載の無細胞的方法。
【請求項５６】
アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼが、Thermobacterium thermosaccharolyticum、Thermoanaerobacter brockii、Caldanaerobacter subterraneus、Deferribacter desulfuricans、Thermocrinis ruber、Hydrogenivirga sp. 128−5−R1−1、Brevibacillus thermoruber、Thermosipho atlanticus、およびThermosulfidibacter takaiiのアルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼからなる群から選択される、請求項４８〜５５のいずれか一項に記載の無細胞的方法。
【請求項５７】
アルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼが、Thermoanaerobacter wiegelii、Thermoanaerobacter ethanolicus、Thermus islandicus、Deinococcus geothermalis DSM 11300、Thermosphaera aggregans、Crenarchaeota archaeon、Pyrococcus horikoshii Ot3、Aquifex aeolicus、Ruminiclostridium thermocellum、Desulfotomaculum kuznetsovii、Caldanaerobacter subterraneus、Acidothermus cellulolyticus、Methanothermobacter thermautotrophicus、Thermobifida fusca、Thermotoga neapolitana、Petrotoga mobilis、およびThermodesulfatator indicus、Thermus thermophilus、Bacteroides vulgatus、およびBacteroides fragilusのアルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される、請求項４８〜５６のいずれか一項に記載の無細胞的方法。
【請求項５８】
細胞が細菌細胞を含む、請求項４８〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
細胞が酵母細胞を含む、請求項４８〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
酵素の少なくとも１つが、細胞に対して異種である、請求項４８〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
溶解ステップ（ｂ）が、培養細胞を機械的、化学的または酵素的に溶解することを含む、請求項４８〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
加熱ステップ（ｃ）または（ｄ）が、細胞ライセ−トを少なくとも５０℃の温度に加熱することを含む、請求項４８〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
セロデキストリンホスホリラ−ゼが、アミロ−ス、アミロペクチン、またはアミロ−スとアミロペクチンの両方を含む、請求項４８〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
セロデキストリンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、ホスホグルコイソメラ−ゼ、アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、アルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼ、および／または枝切り酵素のうちの２つ以上の酵素が、単一の融合タンパク質、二機能性または多機能性タンパク質として発現される、請求項４８〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
請求項４８〜６４のいずれか一項に記載の方法によって生産された、細胞ライセ−ト。
【請求項６６】
セロデキストリンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、ホスホグルコイソメラ−ゼ、アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、およびアルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを含む、改変細胞。
【請求項６７】
セロデキストリンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、ホスホグルコイソメラ−ゼ、アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、およびアルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを含み、ここで任意に、前述の酵素の少なくとも１つが耐熱性酵素である、改変細胞。
【請求項６８】
セロデキストリンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、ホスホグルコイソメラ−ゼ、アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、おとびアルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを含み、ここで任意に、前述の酵素の少なくとも１つが耐熱性酵素である、単一細胞ライセ−ト、少なくとも２つの細胞集団から得た細胞ライセ−トの混合物、または、反応混合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、米国特許法第119条（e）の下において、２０１７年１月６日出願の米国特許仮出願第62/443,447号、および２０１７年７月２８日出願の米国特許仮出願第62/538,181号の優先権を主張する；これらの各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
背景
デンプンを単糖に変換するための既存の技術は、複数の生体内変換反応と、各生体内変換後の大規模な精製プロセスを用いる。生体内変換プロセスは比較的安価であるが、固定化酵素の適用および連続生産システムのために、下流の処理がコストに大きな影響を与える。
【発明の概要】
【０００３】
本明細書で提供されるのは、多量体グルコ−ス、例えばデンプン（例えば、アミロ−スおよび／またはアミロペクチン）、グリコ−ゲン、またはそれらの任意の部分的に加水分解された誘導体（部分的加水分解誘導体）、例えばマルトデキストリンもしくはセロデキストリン（これはセルロ−スという用語と互換的に使用することができる）等の、ペント−ス（例えば、リボ−ス、アラビノ−ス、またはキシルロ−ス）またはヘキソ−ス（例えば、アルロ−ス、グルコ−ス、またはフルクト−ス）糖への酵素的変換のための、無細胞的システム、方法、組成物およびキットである。本開示の方法は、糖生産経路を無細胞的反応（例えば、ワンポット（単一）無細胞的反応）において実施して、デンプンおよび／またはセルロ−ス／セロデキストリンを、ヘキソ−スおよび／またはペント−ス糖に変換する。グルコ−スなどの基質のグルコ−ス６−リン酸へのリン酸化を典型的に含み、かつＡＴＰおよびホスホエノイルピルビン酸などの高エネルギ−リン酸源を用いるプロセスとは異なり、本明細書に記載のプロセスは典型的に、高エネルギ−リン酸源を、例えば、安価な無機リン酸塩（Ｐｉ）で置き換える。いくつかの態様において、α−グルカンホスホリラ−ゼ（デンプンホスホリラ−ゼとも呼ばれる）（EC 2.4.1.1）を使用して、デンプンをグルコ−ス１−リン酸に変換し、次いでこれをホスホグルコムタ−ゼ（EC 5.4.2.2, 5.4.2.5、または5.4.2.6）を介してグルコ−ス６−リン酸に変換する。他の態様において、セロデキストリンホスホリラ−ゼ（セルロ−スホスホリラ−ゼまたはβ−（１−４）グルカンホスホリラ−ゼとも呼ばれる）（EC 2.4.1.49）を使用して、セルロ−ス／セロデキストリンをグルコ−ス１−リン酸に変換し、次いでこれをホスホグルコムタ−ゼ（EC 5.4.2.2、5.4.2.5、または5.4.2.6）を介してグルコ−ス６−リン酸に変換する。本明細書に提供されるような特定の糖生産経路のその後の酵素反応は、多くは産物特異的である。糖ホスファタ−ゼ（EC 3.1.3.−）を用いて、最終産物を変換する。したがって、反応熱力学−−基質のリン酸化から産物の脱リン酸化まで−−は、産物に有利に働く。
【０００４】
さらに、本明細書に記載の酵素的変換反応は本質的に不可逆的であり、したがって所望のヘキソ−スおよびペント−ス糖の高収率を支持する。対照的に、例えばデンプンまたはセルロ−ス／セロデキストリンをアルロ−スに変換するための典型的な生体内変換法は、３つの異なるプロセスを使用し、そのうちの２つは可逆的であり、産物の最終濃度は使用される酵素の熱力学によって支配される。例えばデンプンはグルコ−スに変換され、グルコ−スはフルクト−スに異性化され、フルクト−スはアルロ−スにエピマ−化される。グルコ−スからフルクト−スへの異性化は約４５％の収率を有し、したがって純粋な産物を生産し触媒されていない基質を再利用するために、かなりの下流処理が必要とされる。同様に、フルクト−スからアルロ−スへのエピマ−化は約２０％の収率を有し、これもまた、精製された産物を生産し触媒されていない基質を再利用するために、実質的な下流処理を必要とする。本明細書に記載の無細胞系における、デンプンを目的の産物に直接変換する能力は、下流処理および基質の損失を低減することによって、コストを低減する。
【０００５】
有利には、本明細書に提供されるプロセスで使用される酵素の多くは耐熱性であり、それは（１）変換プロセスが実施される細胞ライセ−トに含まれる有害活性の熱不活性化を可能にし、および（２）連続生産量（production run）に悪影響を与える微生物汚染の機会を低減する。これらの変換経路の酵素は、好熱性、中温性、または好冷性生物から単離することができ、および／またはいくつかの態様において、酵素の耐熱性を増加（または減少）させるように改変することができる。好熱性生物（好熱菌）は、４１℃〜１２２℃（１０６°Ｆ〜２５２°Ｆ）の高温で成長する。中温性生物（中温菌）は、２０℃〜４５℃（６８°Ｆ〜１１３°Ｆ）の中程度の温度で成長する。好冷性生物（好冷菌）は、−２０℃〜１０℃（−４°Ｆ〜５０°Ｆ）の低温で成長する。
【０００６】
したがって、本開示のいくつかの側面は、糖（例えば、アルロ−ス、グルコ−ス、フルクト−ス、ソルビト−ル、リブロ−ス、リボ−ス、および／またはアラビノ−ス）を生産するための方法を提供し、該方法は以下を含む：（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで各集団の細胞は、本明細書に記載の糖生産経路の少なくとも１つの耐熱性酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生産する、（ｂ）少なくとも２つの培養集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセ−トを生産すること、（ｃ）少なくとも２つの細胞ライセ−トを組み合わせて、糖生産経路の耐熱性酵素を含む細胞ライセ−ト混合物を生産すること、（ｄ）細胞ライセ−ト混合物を、望ましくない天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ｃ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること、および、（ｅ）反応混合物を、基質（例えば、デンプン、グリコ−ゲン、またはそれらの任意の部分的加水分解誘導体）およびリン酸源（例えば、無機リン酸塩）の存在下でインキュベ−トして、糖を生産すること。
【０００７】
いくつかの態様において、糖（例えば、アルロ−ス、グルコ−ス、フルクト−ス、ソルビト−ル、リブロ−ス、リボ−ス、および／またはアラビノ−ス）を生産するための無細胞的方法は、以下を含む：（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで各集団の細胞は、本明細書に記載の糖生産経路の少なくとも１つの耐熱性酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生産し、ここで糖生産経路の酵素の少なくとも１つは耐熱性であり、（ｂ）少なくとも２つの培養集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセ−トを生産すること、（ｃ）任意に、ステップ（ｂ）の細胞ライセ−トの１つ以上を、望ましくない天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ａ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること、（ｄ）ステップ（ｂ）および（ｃ）の細胞ライセ−トを組み合わせて、糖生産経路の酵素を含む細胞ライセ−ト混合物を生産すること、ここで、前述の酵素の少なくとも１つは耐熱性であり；および（ｅ）反応混合物を、基質（例えば、デンプン、グリコ−ゲン、またはそれらの任意の部分的加水分解誘導体）およびリン酸源（例えば、無機リン酸塩）の存在下でインキュベ−トして、糖を生産すること。
【０００８】
いくつかの態様において、糖（例えば、アルロ−ス、グルコ−ス、フルクト−ス、ソルビト−ル、リブロ−ス、リボ−ス、および／またはアラビノ−ス）を生産するための無細胞的方法は、以下を含む：（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで各集団の細胞は、本明細書に記載の糖生産経路の少なくとも１つの耐熱性酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生産する、（ｂ）少なくとも２つの培養集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセ−トを生産すること、（ｃ）少なくとも２つの細胞ライセ−トを組み合わせて、細胞ライセ−ト混合物を生産すること、（ｄ）細胞ライセ−ト混合物を、望ましくない天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ａ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること、（ｅ）熱不活性化ライセ−トに、糖生産経路の少なくとも１つの精製酵素を添加すること、および、（ｅ）反応混合物を、基質（例えば、デンプン、グリコ−ゲン、またはそれらの任意の部分的加水分解誘導体）およびリン酸源（例えば、無機リン酸塩）の存在下でインキュベ−トして、糖を生産すること。
【０００９】
いくつかの態様において、糖（例えば、アルロ−ス、グルコ−ス、フルクト−ス、ソルビト−ル、リブロ−ス、リボ−ス、および／またはアラビノ−ス）を生産するための無細胞的方法は、以下を含む：（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで各集団の細胞は、本明細書に記載の糖生産経路の少なくとも１つの耐熱性酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生産し、ここで糖生産経路の酵素の少なくとも１つは耐熱性であり、（ｂ）少なくとも２つの培養集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセ−トを生産すること、（ｃ）任意に、ステップ（ｂ）の細胞ライセ−トの１つ以上を、望ましくない天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ａ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること、（ｄ）ステップ（ｂ）および（ｃ）の細胞ライセ−トを組み合わせて、糖生産経路の酵素を含む細胞ライセ−ト混合物を生産すること、（ｅ）細胞ライセ−ト混合物に、糖生産経路の少なくとも１つの精製酵素を添加すること、および（ｆ）反応混合物を、基質（例えば、デンプン、グリコ−ゲン、またはそれらの任意の部分的加水分解誘導体）およびリン酸源（例えば、無機リン酸塩）の存在下でインキュベ−トして、糖を生産すること。
【００１０】
本開示のいくつかの側面は、アルロ−スを生産するための無細胞的方法を提供し、該方法は以下を含む：（ａ）α−グルカンホスホリラ−ゼ（デンプンホスホリラ−ゼとも呼ばれる）、ホスホグルコムタ−ゼ、ホスホグルコイソメラ−ゼ、アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、およびアルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを発現するように改変された細胞を培養して、酵素を発現する培養細胞を生産すること、ここで前述の酵素の少なくとも１つは耐熱性であり、（ｂ）培養細胞を溶解して細胞ライセ−トを生産すること、（ｃ）細胞ライセ−トを、天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ａ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること、および（ｄ）熱不活性化ライセ−トを、デンプン、グリコ−ゲン、またはその任意の部分的加水分解誘導体およびリン酸源（例えば、無機リン酸塩）の存在下でインキュベ−トして、アルロ−スを生産すること。いくつかの態様において、少なくとも１つの精製酵素を、ステップ（ｃ）の前または後に、細胞ライセ−トに添加する。細胞は、機械的、化学的、酵素的、浸透圧的または熱的溶解を含む任意の手段によって溶解され得ることが、理解されるべきである。したがって、溶解ステップおよび加熱（熱不活性化）ステップは、細胞を溶解しかつ天然の酵素活性を不活性化する温度まで細胞を加熱する、単一ステップとして組み合わされ得る。
【００１１】
いくつかの態様において、無細胞的方法は以下を含む：（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで各集団の細胞は、α−グルカンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、ホスホグルコイソメラ−ゼ、アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、およびアルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生産し、ここで前述の酵素の少なくとも１つは耐熱性であり、（ｂ）少なくとも２つの培養集団の細胞を溶解して少なくとも２つ細胞ライセ−トを生産すること、（ｃ）少なくとも２つの細胞ライセ−トを組み合わせて、α−グルカンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、ホスホグルコイソメラ−ゼ、アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、およびアルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを含む細胞ライセ−ト混合物を生産すること、（ｄ）細胞ライセ−ト混合物を、天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ｃ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること、および（ｅ）反応混合物を、デンプン、グリコ−ゲン、またはその任意の部分的加水分解誘導体およびリン酸源（例えば、無機リン酸塩）の存在下でインキュベ−トして、アルロ−スを生産すること。
【００１２】
他の態様において、無細胞的方法は以下を含む：（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで各集団の細胞は、α−グルカンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、ホスホグルコイソメラ−ゼ、アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、およびアルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生産し、ここで前述の酵素の少なくとも１つは耐熱性であり、（ｂ）少なくとも２つの培養集団の細胞を溶解して少なくとも２つ細胞ライセ−トを生産すること、（ｃ）少なくとも２つの細胞ライセ−トを組み合わせて細胞ライセ−ト混合物を生産すること、（ｄ）細胞ライセ−ト混合物を、天然酵素活性を不活性化するがステップ（ａ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること、（ｅ）熱不活性化ライセ−トに、α−グルカンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、ホスホグルコイソメラ−ゼ、アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、およびアルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの精製酵素を添加して、α−グルカンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、ホスホグルコイソメラ−ゼ、アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、およびアルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを含む反応混合物を生産すること、および（ｆ）反応混合物を、デンプン、グリコ−ゲン、またはその任意の部分的加水分解誘導体およびリン酸源（例えば、無機リン酸塩）の存在下でインキュベ−トして、アルロ−スを生産すること。
【００１３】
本開示のいくつかの側面において、セルロ−ス／セロデキストリンを出発基質として使用することが好ましい場合がある。したがって、本開示のいくつかの側面は、アルロ−スを生産するための無細胞的方法を提供し、該方法は以下を含む：（ａ）セロデキストリンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、ホスホグルコイソメラ−ゼ、アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、およびアルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを発現するように改変された細胞を培養して、酵素を発現する培養細胞を生産すること、ここで前述の酵素の少なくとも１つは耐熱性であり、（ｂ）培養細胞を溶解して細胞ライセ−トを生産すること、（ｃ）細胞ライセ−トを、天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ａ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること、および（ｄ）熱不活性化ライセ−トを、セロデキストリンおよびリン酸源（例えば、無機リン酸塩）の存在下でインキュベ−トして、アルロ−スを生産すること。
【００１４】
いくつかの態様において、無細胞的方法は以下を含む：（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで各集団の細胞は、セロデキストリンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、ホスホグルコイソメラ−ゼ、アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、およびアルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生産し、ここで前述の酵素の少なくとも１つは耐熱性であり、（ｂ）少なくとも２つの培養集団の細胞を溶解して少なくとも２つ細胞ライセ−トを生産すること、（ｃ）少なくとも２つの細胞ライセ−トを組み合わせて、セロデキストリンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、ホスホグルコイソメラ−ゼ、アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、およびアルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを含む細胞ライセ−ト混合物を生産すること、（ｄ）細胞ライセ−ト混合物を、天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ｃ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱すること、および（ｅ）反応混合物を、セロデキストリンおよびリン酸源（例えば、無機リン酸塩）の存在下でインキュベ−トして、アルロ−スを生産すること。
【００１５】
他の態様において、無細胞的方法は以下を含む：（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで各集団の細胞は、セロデキストリンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、ホスホグルコイソメラ−ゼ、アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、およびアルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生産し、ここで前述の酵素の少なくとも１つは耐熱性であり、（ｂ）少なくとも２つの培養集団の細胞を溶解して少なくとも２つ細胞ライセ−トを生産すること、（ｃ）少なくとも２つの細胞ライセ−トを組み合わせて細胞ライセ−ト混合物を生産すること、（ｄ）細胞ライセ−ト混合物を、天然酵素活性を不活性化するがステップ（ａ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること、（ｅ）熱不活性化ライセ−トに、セロデキストリンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、ホスホグルコイソメラ−ゼ、アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、およびアルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの精製酵素を添加して、セロデキストリンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、ホスホグルコイソメラ−ゼ、アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、およびアルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを含む反応混合物を生産すること、および（ｆ）反応混合物を、セロデキストリンおよびリン酸源（例えば、無機リン酸塩）の存在下でインキュベ−トして、アルロ−スを生産すること。
【００１６】
他の糖、例えばグルコ−ス、フルクト−ス、マンノ−ス、ソルビト−ル、リブロ−ス、リボ−ス、およびアラビノ−スなどの無細胞的生産もまた、本開示に含まれる。
いくつかの態様において、提示された糖経路は、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤ＋、またはＮＡＤＰ＋などのエネルギ−補因子をバランスさせることを必要とする。これは、補因子再生システムを介して行うことができる。これらの例では、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨは「還元型補因子」または「還元剤」と呼ばれ、ＮＡＤ＋およびＮＡＤＰ＋は「酸化型補因子」または「酸化剤」と呼ばれる。過剰の還元剤を含む例では、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダ−ゼ（EC#1.6.3.1、1.6.3.2、1.6.2.3、または1.6.3.4）は、オキシダ−ゼの種類に応じて、Ｈ２Ｏ２、Ｏ−２、またはＨ２Ｏのいずれかを生産する過剰な還元型補因子を燃焼させるために使用することができる。ライセ−トに有害な損傷を与える可能性があるＨ２Ｏ２およびＯ２−が生産される場合、ス−パ−オキシドジスムタ−ゼ（EC#1.15.1.1）および／またはカタラ−ゼ（EC#1.11.1.6）を併用して、有害な種をＨ２ＯおよびＯ２に変換することができる。過剰の酸化剤を用いる場合には、補因子再生系を用いて、酸化型補因子を還元型に還元することができる。いくつかの例には、ＮＡＤ（Ｐ）＋をＮＡＤ（Ｐ）Ｈに還元しつつギ酸をＣＯ２に酸化するための、ギ酸デヒドロゲナ−ゼ（EC#1.2.1.2）の使用、または、それぞれの無機塩をリン酸塩および硫酸塩に酸化してＮＡＤ（Ｐ）Ｈを減少させる、ホスホン酸デヒドロゲナ−ゼ（EC#1.20.1.1）または亜硫酸オキシドレダクタ−ゼ（EC#1.8.1.2）の使用が含まれる。
ここで提供されるのはまた、目的の特定の糖（例えば、アルロ−ス、グルコ−ス、フルクト−ス、ソルビト−ル、リブロ−ス、リボ−ス、および／またはアラビノ−ス）の生産に使用される耐熱性酵素等の酵素を含む、改変細胞、細胞ライセ−ト、および反応混合物である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、デンプンをアルロ−スに変換するための酵素経路の概略図である。略語の意味は以下の通りである：Ｇ１Ｐ＝グルコ−ス１−リン酸、Ｇ６Ｐ＝グルコ−ス６−リン酸、Ｆ６Ｐ＝フルクト−ス６−リン酸、Ａ６Ｐ＝アルロ−ス６−リン酸、およびＰＯ４＝無機リン酸塩。
【図２】図２は、デンプンをグルコ−スに変換するための２つの酵素経路の概略図である。略語の意味は以下の通りである：Ｇ１Ｐ＝グルコ−ス１−リン酸、Ｇ６Ｐ＝グルコ−ス６−リン酸、およびＰＯ４＝無機リン酸塩。
【図３】図３は、デンプンをフルクト−スに変換するための２つの酵素経路の概略図である。略語の意味は以下の通りである：Ｇ１Ｐ＝グルコ−ス１−リン酸、Ｇ６Ｐ＝グルコ−ス６−リン酸、Ｆ６Ｐ＝フルクト−ス６−リン酸、およびＰＯ４＝無機リン酸塩。
【図４】図４は、デンプンをソルビト−ルへ変換するための酵素経路の概略図である。略語の意味は以下の通りである：Ｇ１Ｐ＝グルコ−ス１−リン酸、Ｇ６Ｐ＝グルコ−ス６−リン酸、Ｓ６Ｐ＝ソルビト−ル−６−リン酸、Ｆ６Ｐ＝フルクト−ス６−リン酸、ＮＡＤＰＨ＝ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）、ＮＡＤＰ＋＝ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、およびＰＯ４＝無機リン酸塩。
【００１８】
【図５】図５は、デンプンをリブロ−スへ変換するための酵素経路の概略図である。略語の意味は以下の通りである：Ｇ１Ｐ＝グルコ−ス１−リン酸、Ｇ６Ｐ＝グルコ−ス６−リン酸、６ＰＧＬ＝６−ホスホグルコノラクトン、６ＰＧ＝６−ホスホグルコン酸、Ｒｕ５Ｐ＝リブロ−ス５−リン酸、ＮＡＤＰＨ＝ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）ＮＡＤＰ＋＝ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、ＣＯ２＝二酸化炭素、およびＰＯ４＝無機リン酸塩。
【図６】図６は、デンプンをリボ−スへ変換するための酵素経路の概略図である。略語の意味は以下の通りである：Ｇ１Ｐ＝グルコ−ス１−リン酸、Ｇ６Ｐ＝グルコ−ス６−リン酸、６ＰＧＬ＝６−ホスホグルコノラクトン、６ＰＧ＝６−ホスホグルコン酸、Ｒｕ５Ｐ＝リブロ−ス５−リン酸、Ｒ５Ｐ＝リボ−ス５−リン酸、ＮＡＤＰＨ＝ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）、ＮＡＤＰ＋＝ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、ＣＯ２＝二酸化炭素、およびＰＯ４＝無機リン酸塩。
【図７】図７は、デンプンをアラビノ−スへ変換するための酵素経路の概略図である。略語の意味は以下の通りである：Ｇ１Ｐ＝グルコ−ス１−リン酸、Ｇ６Ｐ＝グルコ−ス６−リン酸、６ＰＧＬ＝６−ホスホグルコノラクトン、６ＰＧ＝６−ホスホグルコン酸、Ｒｕ５Ｐ＝リブロ−ス５−リン酸、Ａｒ５Ｐ＝アラビノ−ス５−リン酸、ＮＡＤＰＨ＝ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）、ＮＡＤＰ＋＝ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、ＣＯ２＝二酸化炭素、およびＰＯ４＝無機リン酸塩。
【図８】図８は、デンプンをマンノ−スへ変換するための酵素経路の概略図である。略語の意味は以下の通りである：Ｇ１Ｐ＝グルコ−ス１−リン酸、Ｇ６Ｐ＝グルコ−ス６−リン酸、Ｆ６Ｐ＝フルクト−ス６−リン酸、Ｍ６Ｐ＝マンノ−ス６−リン酸、およびＰＯ４＝無機リン酸塩。
【００１９】
詳細な説明
本明細書に記載されているのは、デンプン（例えば、アミロ−スまたはアミロペクチン）またはセルロ−ス／セロデキストリンから、ペント−ス（例えば、リボ−ス、アラビノ−ス、またはキシルロ−ス）糖および／またはヘキソ−ス（例えば、アルロ−ス、グルコ−ス、またはフルクト−ス）糖への変換に使用される酵素経路である。酵素経路は、少なくとも１つのα−グルカンホスホリラ−ゼ（デンプンホスホリラ−ゼとも呼ばれる）（EC 2.4.1.1）または少なくとも１つのセロデキストリンホスホリラ−ゼ（セルロ−スホスホリラ−ゼとも呼ばれる）（EC 2.4.1.49）、少なくとも１つのホスホグルコムタ−ゼ（EC 5.4.2.2、5.4.2.5、または5.4.2.6）、ならびに、最終産物に応じて任意の数のイソメラ−ゼ、エピメラ−ゼ、および／または糖ホスファタ−ゼを利用する。いくつかの態様において、酵素または酵素の一部は耐熱性である。これらの耐熱性酵素は、変換プロセスが行われる細胞ライセ−ト中に含まれる有害な活性を不活性化する糖生産プロセスの加熱ステップに、耐えることができる。この熱不活性化ステップは、連続生産量に悪影響を与える微生物汚染の可能性を減らす。
【００２０】
したがって、本開示は、いくつかの態様において、ヘキソ−ス糖およびペント−ス糖などの糖を生産するための、非常に効率的で費用対効果の高い方法、組成物、およびシステムを提供する。糖生産経路および経路酵素の非限定的な例は、下の表１に提供されている。
表１：例示的経路酵素の要約
【表１】
2020503059.tif 000003
2020503059.tif 000004
【００２１】
アルロ−ス生産
本開示のいくつかの側面は、アルロ−スを生産するための方法、組成物、およびシステムを提供する。これらの方法は、いくつかの態様において、少なくとも１つのα−グルカンホスホリラ−ゼおよび／または少なくとも１つのセロデキストリンホスホリラ−ゼ、少なくとも１つのホスホグルコムタ−ゼ、少なくとも１つのホスホグルコイソメラ−ゼ、少なくとも１つのアルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、少なくとも１つのアルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼ、または少なくとも２つ（例えば、少なくとも３つ、または少なくとも４つ）の前述の酵素の組み合わせを発現するように改変された細胞を、培養することを含む。いくつかの態様において、α−グルカンホスホリラ−ゼ（および／またはセロデキストリンホスホリラ−ゼ）およびホスホグルコムタ−ゼは、単一の融合（キメラ）タンパク質または二機能性タンパク質として発現される。
融合タンパク質は、別々のタンパク質をコ−ドする２つ以上の遺伝子または遺伝子セグメントを連結することによって作製され得る。この融合遺伝子の翻訳は、元のタンパク質の各々に由来する機能的性質を有する、単一または複数のポリペプチドをもたらす。多機能性タンパク質は、少なくとも２つの異なる活性を有する単一のタンパク質であり、その機能性は、天然の生物学的機能、または改変酵素融合の結果である。他の酵素もまた、単一の融合タンパク質または多機能性タンパク質として発現され得る。したがって融合タンパク質は、本明細書に記載の経路酵素のいずれかの複数の機能性を含み得る。
【００２２】
本明細書に提供されるアルロ−ス生産経路の酵素は、典型的には宿主細胞に対して異種である（最初に異なる細胞型からクロ−ニングされるかまたはこれから得られる）が、いくつかの酵素は、宿主細胞に対して内在性（天然）であり得る。したがっていくつかの態様において、デンプンおよび／またはセロデキストリンをアルロ−スに変換するために使用する少なくとも１つの酵素（例えば耐熱性酵素）は、宿主細胞に対して異種である。いくつかの態様において、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つの酵素は、宿主細胞に対して異種である。いくつかの態様において、少なくとも１つの酵素は、宿主細胞に対して内在性（天然）である。いくつかの態様において、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つの酵素は、宿主細胞に対して内在性である。
宿主細胞は、細菌細胞（例えば、大腸菌細胞）などの原核細胞、または酵母細胞もしくは植物細胞などの真核細胞であり得る。他の細胞型は以下に記載される。
【００２３】
いくつかの態様において、デンプンおよび／またはセルロ−ス／セロデキストリンをアルロ−スに変換するために使用される酵素の少なくとも１つは、耐熱性酵素である。いくつかの態様において、少なくとも２つ（例えば、少なくとも３つ、または少なくとも４つ）の酵素は、耐熱性酵素である。いくつかの態様において、全ての酵素は耐熱性酵素である。したがっていくつかの態様において、方法は、少なくとも１つの耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性ホスホグルコイソメラ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性アルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼ、または少なくとも２つ以上の前述の耐熱性酵素の組み合わせを発現するように改変された細胞を、培養することを含む。いくつかの態様において、方法は、少なくとも１つの耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性ホスホグルコイソメラ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性アルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼ、または少なくとも２つ以上の前述の耐熱性酵素の組み合わせを発現するように改変された細胞を、培養することを含む。
【００２４】
いくつかの態様において、アルロ−スを生産する方法は、培養細胞を溶解（例えば、熱的、浸透圧的、機械的、化学的、または酵素的溶解）して、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つ）の細胞ライセ−トを生産することを含む。複数の細胞ライセ−ト（したがって、同じ生物（例えば細菌）または異なる生物（例えば、細菌、酵母、および／または植物細胞）由来の、複数の細胞集団）を本明細書に記載のような酵素反応において使用し得ることが、理解されるべきである。例えば、１つの細胞集団は、アルロ−ス生産経路の１つ以上の酵素を発現するように改変され得、一方、他の細胞集団（またはいくつかの他の細胞集団）は、アルロ−ス生産経路の別の（少なくとも１つの他の）酵素を発現するように改変され得る。したがっていくつかの態様において、方法は、少なくとも１つのα−グルカンホスホリラ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、少なくとも１つのホスホグルコムタ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、少なくとも１つのホスホグルコイソメラ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、少なくとも１つのアルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、および／または少なくとも１つのアルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、を含む。いくつかの態様において、方法は、少なくとも１つのセロデキストリンホスホリラ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、少なくとも１つのホスホグルコムタ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、少なくとも１つのホスホグルコイソメラ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、少なくとも１つのアルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、および／または少なくとも１つのアルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、を含む。細胞の溶解後、細胞ライセ−トを、酵素が単一の細胞ライセ−ト／反応混合物中に存在するように組み合わせる。
【００２５】
本明細書に記載の方法のいずれにおいても、細胞は、機械的、化学的、酵素的、浸透圧的およびまたは熱的溶解を含む任意の手段によって溶解され得ることを理解されたい。したがって、溶解ステップおよび加熱（熱不活性化）ステップは、細胞を、細胞を溶解して望ましくない天然の酵素活性を不活性化する温度まで加熱する単一ステップとして、組み合わせてもよい。
いくつかの態様において、方法はさらに、細胞ライセ−ト（または細胞ライセ−ト混合物）を、望ましくない天然の酵素活性を不活性化するが生産経路のいかなる耐熱性酵素も不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産することを含む。細胞ライセ−トは、いくつかの態様において、少なくとも５０℃の温度に加熱される。例えば細胞ライセ−トを、少なくとも５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃、８５℃、または９０℃の温度に加熱することができる。いくつかの態様において、天然酵素（または他の非耐熱性酵素）は、その活性レベルが少なくとも５０％低下した場合に、不活性であると見なされる。いくつかの態様において、天然酵素（または他の非耐熱性酵素）は、その活性レベルが少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％低下した場合に、不活性と見なされる。
【００２６】
細胞ライセ−トは、細胞の天然酵素（または他の非耐熱性酵素）を不活性化するのに十分な時間、加熱することができる。例えば細胞ライセ−トを、少なくとも２、３、４、または５分間、加熱することができる。いくつかの態様においては、細胞ライセ−トを５分より長く加熱する。いくつかの態様において、細胞ライセ−トは、少なくともいくつかの天然酵素（または他の非耐熱性酵素）の活性を少なくとも５０％（例えば、少なくとも６０％、７０％、８０％、または９０％）低下させるのに十分な時間、加熱される。
熱不活性化に続いて、いくつかの態様において、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、または少なくとも３つ）の精製酵素（または部分精製酵素）が、細胞ライセ−ト／反応混合物に添加される。したがっていくつかの態様において、反応混合物は、細胞ライセ−ト中に存在する酵素（改変宿主細胞によって発現される）と少なくとも１つの精製酵素の組み合わせを含む。少なくとも１つの精製酵素は、α−グルカンホスホリラ−ゼまたはセロデキストリンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、ホスホグルコイソメラ−ゼ、アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、およびアルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択され得る。
【００２７】
いくつかの態様において、方法はまた、熱不活化ライセ−トを、デンプンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、アルロ−スを生産することを含む。いくつかの態様において、方法はまた、熱不活化ライセ−トを、セロデキストリンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、アルロ−スを生産することを含む。いくつかの態様において、熱不活化ライセ−トは、少なくとも５０℃の温度でインキュベ−トされる。いくつかの態様において、熱不活化ライセ−トは、少なくとも２分間（例えば、少なくとも３、４、または５分間）インキュベ−トされる。例えば、熱不活化ライセ−トは、２〜５分間、または２〜１０分間インキュベ−トすることができる。デンプンは、例えば、アミロ−ス、アミロペクチン、またはアミロ−スとアミロペクチンの混合物であり得る。いくつかの態様において、バイオマスがデンプンの代わりに使用される。例えば、反応は、セロデキストリンホスホリラ−ゼを含み得る。いくつかの態様において、デンプンまたはセロデキストリンは、化合物の成分（例えばバイオマスの一部）として存在する。例えば、いくつかの態様において、熱不活化ライセ−ト（例えば、微生物細胞ライセ−ト）は、トウモロコシパルプおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トされて、アルロ−ス（または本明細書に記載の任意の他の糖）を生産する。
【００２８】
本明細書ではまた、アルロ−スの生産に使用する細胞および細胞ライセ−トも提供される。したがって、本開示の改変細胞（例えば、細菌細胞、酵母細胞、および／または植物細胞）または細胞ライセ−トは、α−グルカンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、ホスホグルコイソメラ−ゼ、アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、およびアルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つ）の酵素を含み得る。いくつかの態様において、本開示の改変細胞（例えば、細菌細胞および／または酵母細胞）または細胞ライセ−トは、セロデキストリンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、ホスホグルコイソメラ−ゼ、アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、およびアルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つ）の酵素を含み得る。いくつかの態様において、本開示の改変細胞（例えば、細菌細胞、酵母細胞、および／または植物細胞）または細胞ライセ−トは、耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性ホスホグルコイソメラ−ゼ、耐熱性アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、および耐熱性アルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つ）の酵素を含む。いくつかの態様において、本開示の改変細胞（例えば、細菌細胞および／または酵母細胞）または細胞ライセ−トは、耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性ホスホグルコイソメラ−ゼ、耐熱性アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、および耐熱性アルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つ）の酵素を含む。
【００２９】
表２．例示のアルロ−ス経路酵素
【表２−１】
2020503059.tif 000005
【００３０】
【表２−２】
2020503059.tif 000006
【００３１】
【表２−３】
2020503059.tif 000007
【００３２】
【表２−４】
2020503059.tif 000008
【００３３】
【表２−５】
2020503059.tif 000009
【００３４】
アルロ−スを生産するための経路は、表２の経路ステップ１〜５のそれぞれから選択される酵素の任意の組み合わせを含み得ることが、理解されるべきである。例えば、経路ステップ１のα−グルカンホスホリラ−ゼは、Aquifex aeolicus、Thermocrinis minervae、 Thermosulfidibacter takaii、Thermosulfurimonas dismutans、Thermococcus litoralis、Palaeococcus pacificus、Thermotoga neapolitana、Ruminiclostridium thermocellum、Pyrococcus abyssi、Thermococcus thioreducens、Deinococcus radiodurans、Sulfolobus acidocaldarius、Thermus caldophilus、Meiothermus silvanus、Oceanithermus profundus、Ardenticatena maritima、Thermococcus barophilus、Pseudothermotoga thermarum、Hydrogenobacter thermophilus、Thermus oshimai、Meiothermus ruber、およびMarinitoga piezophilaのα−グルカンホスホリラ−ゼのいずれか１つから選択することができ、経路ステップ２のホスホグルコムタ−ゼであって、Thermococcus kodakaraensis、Pyrococcus kukulkanii、Ammonifex degensii、Methanothermobacter wolfeii、Methanothermus fervidus、Sulfolobus acidocaldarius、Archaeoglobus fulgidus、Ferroglobus placidus、Geoglobus ahangari、Archaeoglobus veneficus、Archaeoglobus sulfaticallidus、Aciduliprofundum boonie、Clostridium thermocellum、Defluviitalea phaphyphila、Caminicella sporogenes、Caloranaerobacter ferrireducens、Thermosipho malanesiensis、Fervidobacterium pennivorans、Symbiobacterium thermophilum、Spirochaeta thermophila、およびThermoanaerobacter wiegeliiのホスホグルコムタ−ゼのいずれか１つから選択されたものと、組みあわされる。
【００３５】
グルコ−ス生産
本開示の他の側面は、グルコ−スを生産するための方法、組成物、およびシステムを提供する。これらの方法は、いくつかの態様において、少なくとも１つのα−グルカンホスホリラ−ゼおよび／または少なくとも１つのセロデキストリンホスホリラ−ゼ、少なくとも１つのホスホグルコムタ−ゼ、少なくとも１つのグルコ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼ、または少なくとも２つの前述の酵素の組み合わせを発現するように改変された細胞を、培養することを含む。いくつかの態様において、α−グルカンホスホリラ−ゼ（および／またはセロデキストリンホスホリラ−ゼ）およびホスホグルコムタ−ゼは、単一の融合（キメラ）タンパク質または二機能性タンパク質として発現される。いくつかの態様において、これらの方法は、少なくとも１つのα−グルカンホスホリラ−ゼおよび／または少なくとも１つのセロデキストリンホスホリラ−ゼ、少なくとも１つのグルコ−ス１−リン酸ホスファタ−ゼ、または少なくとも２つの前述の酵素の組み合わせを発現するように改変された細胞を、培養することを含む。いくつかの態様において、α−グルカンホスホリラ−ゼ（および／またはセロデキストリンホスホリラ−ゼ）およびホスホグルコムタ−ゼは、単一の融合（キメラ）タンパク質または二機能性タンパク質として発現される。
【００３６】
本明細書に提供されるグルコ−ス生産経路の酵素は、典型的には宿主細胞に対して異種である（最初に異なる細胞型からクロ−ニングされるかまたはこれから得られる）が、いくつかの酵素は、宿主細胞に対して内在性（天然）であり得る。したがっていくつかの態様において、デンプンおよび／またはセロデキストリンをグルコ−スに変換するために使用される少なくとも１つの酵素（例えば耐熱性酵素）は、宿主細胞に対して異種である。いくつかの態様において、少なくとも２つの酵素は、宿主細胞に対して異種である。いくつかの態様において、少なくとも１つの酵素（例えば、耐熱性酵素）は、宿主細胞に対して内在性（天然）である。いくつかの態様において、少なくとも２つの酵素は、宿主細胞に対して内在性である。
宿主細胞は、細菌細胞（例えば、大腸菌細胞）などの原核細胞、または酵母細胞もしくは植物細胞などの真核細胞であり得る。他の細胞型は以下に記載される。
【００３７】
いくつかの態様において、デンプンおよび／またはセロデキストリンをグルコ−スに変換するために使用される酵素の少なくとも１つは、耐熱性酵素である。いくつかの態様において、酵素の少なくとも２つは、耐熱性酵素である。いくつかの態様において、全ての酵素は耐熱性酵素である。したがっていくつかの態様において、方法は、少なくとも１つの耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性グルコ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼ、または少なくとも２つ以上の前述の耐熱性酵素の組み合わせを発現するように改変された細胞を、培養することを含む。いくつかの態様において、方法は、少なくとも１つの耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性グルコ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼ、または少なくとも２つ以上の前述の耐熱性酵素の組み合わせを発現するように改変された細胞を、培養することを含む。いくつかの態様において、方法は、少なくとも１つの耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性グルコ−ス１−リン酸ホスファタ−ゼ、または少なくとも２つ以上の前述の耐熱性酵素の組み合わせを発現するように改変された細胞を、培養することを含む。いくつかの態様において、方法は、少なくとも１つの耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性グルコ−ス１−リン酸ホスファタ−ゼ、または少なくとも２つ以上の前述の耐熱性酵素の組み合わせを発現するように改変された細胞を、培養することを含む。
【００３８】
いくつかの態様において、グルコ−スを生産する方法は、培養細胞を溶解（例えば、熱的、機械的、化学的、または酵素的溶解）して、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つ）の細胞ライセ−トを生産することを含む。複数の細胞ライセ−ト（したがって、同じ生物（例えば細菌）または異なる生物（例えば、細菌、酵母、および／または植物細胞）由来の、複数の細胞集団）を本明細書に記載のような酵素反応において使用し得ることが、理解されるべきである。例えば、１つの細胞集団は、グルコ−ス生産経路の１つ以上の酵素を発現するように改変され得、一方、他の細胞集団（またはいくつかの他の細胞集団）は、グルコ−ス生産経路の別の（少なくとも１つの他の）酵素を発現するように改変され得る。したがっていくつかの態様において、方法は、少なくとも１つのα−グルカンホスホリラ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、少なくとも１つのホスホグルコムタ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、および／または少なくとも１つのグルコ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、を含む。いくつかの態様において、方法は、少なくとも１つのセロデキストリンホスホリラ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、少なくとも１つのホスホグルコムタ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、および／または少なくとも１つのグルコ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、を含む。いくつかの態様において、方法は、少なくとも１つのα−グルカンホスホリラ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、および／または少なくとも１つのグルコ−ス１−リン酸ホスファタ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養することを含む。いくつかの態様において、方法は、少なくとも１つのセロデキストリンホスホリラ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、および／または少なくとも１つのグルコ−ス１−リン酸ホスファタ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養することを含む。細胞の溶解後、細胞ライセ−トを、酵素が単一の細胞ライセ−ト／反応混合物中に存在するように組み合わせる。
【００３９】
いくつかの態様において、方法はさらに、細胞ライセ−ト（または細胞ライセ−ト混合物）を、望ましくない天然の酵素活性を不活性化するが生産経路のいかなる耐熱性酵素も不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産することを含む。細胞ライセ−トは、いくつかの態様において、少なくとも５０℃の温度に加熱される。例えば細胞ライセ−トを、少なくとも５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃、８５℃、または９０℃の温度に加熱することができる。
細胞ライセ−トは、細胞の天然酵素（または他の非耐熱性酵素）を不活性化するのに十分な時間加熱することができる。例えば、細胞ライセ−トを少なくとも２、３、４、または少なくとも５分間加熱することができる。いくつかの態様においては、細胞ライセ−トを５分より長く加熱する。いくつかの態様において、細胞ライセ−トは、天然酵素（または他の非耐熱性酵素）の活性を少なくとも５０％（例えば、少なくとも６０％、７０％、８０％、または９０％）低下させるのに十分な時間加熱される。
【００４０】
熱不活性化に続いて、いくつかの態様において、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、または少なくとも３つ）の精製酵素が、細胞ライセ−ト／反応混合物に添加される。したがっていくつかの態様において、反応混合物は、細胞ライセ−ト中に存在する酵素（改変宿主細胞によって発現される）と少なくとも１つの精製酵素の組み合わせを含む。少なくとも１つの精製酵素は、α−グルカンホスホリラ−ゼまたはセロデキストリンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、およびグルコ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択され得る。あるいは、少なくとも１つの精製酵素は、α−グルカンホスホリラ−ゼまたはセロデキストリンホスホリラ−ゼおよびグルコ−ス１−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択され得る。
【００４１】
いくつかの態様において、方法はまた、熱不活化ライセ−トを、デンプンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、グルコ−スを生産することを含む。いくつかの態様において、方法はまた、熱不活化ライセ−トを、セロデキストリンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、グルコ−スを生産することを含む。いくつかの態様において、熱不活化ライセ−トは、少なくとも５０℃の温度でインキュベ−トされる。いくつかの態様において、熱不活化ライセ−トは、少なくとも２分間（例えば、少なくとも３、４、または５分間）インキュベ−トされる。例えば、熱不活化ライセ−トは、２〜５分間、または２〜１０分間インキュベ−トすることができる。
デンプンは、例えば、アミロ−ス、アミロペクチン、またはアミロ−スとアミロペクチンの混合物であり得る。いくつかの態様において、バイオマスがデンプンの代わりに使用される。これらの態様において、反応は、セロデキストリンホスホリラ−ゼを含む。いくつかの態様において、デンプンまたはセロデキストリンは、化合物の成分として存在する。
【００４２】
本明細書ではまた、グルコ−スの生産に使用する細胞および細胞ライセ−トも提供される。したがって、本開示の改変細胞（例えば、細菌細胞、酵母細胞、および／または植物細胞）または細胞ライセ−トは、α−グルカンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、およびグルコ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ）の酵素を含み得る。いくつかの態様において、本開示の改変細胞（例えば、細菌細胞および／または酵母細胞）または細胞ライセ−トは、セロデキストリンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、およびグルコ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ）の酵素を含み得る。本開示の改変細胞（例えば、細菌細胞および／または酵母細胞）または細胞ライセ−トは、α−グルカンホスホリラ−ゼ、およびグルコ−ス１−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ）の酵素を含み得る。いくつかの態様において、本開示の改変細胞（例えば、細菌細胞および／または酵母細胞）または細胞ライセ−トは、セロデキストリンホスホリラ−ゼ、およびグルコ−ス１−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ）の酵素を含み得る。いくつかの態様において、本開示の改変細胞（例えば、細菌細胞および／または酵母細胞）または細胞ライセ−トは、耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、および耐熱性グルコ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ）の酵素を含み得る。いくつかの態様において、本開示の改変細胞（例えば、細菌細胞および／または酵母細胞）または細胞ライセ−トは、耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、および耐熱性グルコ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ）の酵素を含み得る。いくつかの態様において、本開示の改変細胞（例えば、細菌細胞および／または酵母細胞）または細胞ライセ−トは、耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、および耐熱性グルコ−ス１−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ）の酵素を含み得る。いくつかの態様において、本開示の改変細胞（例えば、細菌細胞および／または酵母細胞）または細胞ライセ−トは、耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼ、および耐熱性グルコ−ス１−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ）の酵素を含み得る。
【００４３】
フルクト−ス生産
本開示のさらに他の側面は、フルクト−スを生産するための方法、組成物、およびシステムを提供する。これらの方法は、いくつかの態様において、少なくとも１つのα−グルカンホスホリラ−ゼおよび／または少なくとも１つのセロデキストリンホスホリラ−ゼ、少なくとも１つのホスホグルコムタ−ゼ、少なくとも１つのホスホグルコイソメラ−ゼ、少なくとも１つのフルクト−ス６−リン酸ホスファタ−ゼ、または少なくとも２つの前述の酵素の組み合わせを発現するように改変された細胞を、培養することを含む。いくつかの態様において、α−グルカンホスホリラ−ゼ（および／またはセロデキストリンホスホリラ−ゼ）およびホスホグルコムタ−ゼは、単一の融合（キメラ）タンパク質または二機能性タンパク質として発現される。
本明細書に提供されるフルクト−ス生産経路の酵素は、典型的には宿主細胞に対して異種である（最初に異なる細胞型からクロ−ニングされるかまたはこれから得られる）が、いくつかの酵素は、宿主細胞に対して内在性（天然）であり得る。したがっていくつかの態様において、デンプンおよび／またはセロデキストリンをフルクト−スに変換するために使用される少なくとも１つの酵素（例えば耐熱性酵素）は、宿主細胞に対して異種である。いくつかの態様において、少なくとも２つまたは少なくとも３つの酵素は、宿主細胞に対して異種である。いくつかの態様において、少なくとも１つの酵素（例えば、耐熱性酵素）は、宿主細胞に対して内在性（天然）である。いくつかの態様において、少なくとも２つまたは少なくとも３つの酵素は、宿主細胞に対して内在性である。
宿主細胞は、細菌細胞（例えば、大腸菌細胞）などの原核細胞、または酵母細胞もしくは植物細胞などの真核細胞であり得る。他の細胞型は以下に記載される。
【００４４】
いくつかの態様において、デンプンおよび／またはセロデキストリンをフルクト−スに変換するために使用される酵素の少なくとも１つは、耐熱性酵素である。いくつかの態様において、少なくとも２つまたは少なくとも３つの酵素は、耐熱性酵素である。いくつかの態様において、全ての酵素は耐熱性酵素である。したがっていくつかの態様において、方法は、少なくとも１つの耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性ホスホグルコイソメラ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性フルクト−ス６−リン酸ホスファタ−ゼ、または少なくとも２つ以上の前述の耐熱性酵素の組み合わせを発現するように改変された細胞を、培養することを含む。いくつかの態様において、方法は、少なくとも１つの耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性ホスホグルコイソメラ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性フルクト−ス６−リン酸ホスファタ−ゼ、または少なくとも２つ以上の前述の耐熱性酵素の組み合わせを発現するように改変された細胞を、培養することを含む。
【００４５】
いくつかの態様において、フルクト−スを生産する方法は、培養細胞を溶解（例えば、熱的、機械的、化学的、または酵素的溶解）して、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つ）の細胞ライセ−トを生産することを含む。複数の細胞ライセ−ト（したがって、同じ生物（例えば細菌）または異なる生物（例えば、細菌、酵母、および／または植物細胞）由来の、複数の細胞集団）を本明細書に記載のような酵素反応において使用し得ることが、理解されるべきである。例えば、１つの細胞集団は、フルクト−ス生産経路の１つ以上の酵素を発現するように改変され得、一方、他の細胞集団（またはいくつかの他の細胞集団）は、フルクト−ス生産経路の別の（少なくとも１つの他の）酵素を発現するように改変され得る。したがっていくつかの態様において、方法は、少なくとも１つのα−グルカンホスホリラ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、少なくとも１つのホスホグルコムタ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、少なくとも１つのホスホグルコイソメラ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、および／または少なくとも１つのフルクト−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、を含む。いくつかの態様において、方法は、少なくとも１つのセロデキストリンホスホリラ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、少なくとも１つのホスホグルコムタ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、少なくとも１つのホスホグルコイソメラ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、および／または少なくとも１つのフルクト−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、を含む。細胞の溶解後、細胞ライセ−トを、酵素が単一の細胞ライセ−ト／反応混合物中に存在するように組み合わせる。
【００４６】
いくつかの態様において、方法はさらに、細胞ライセ−ト（または細胞ライセ−ト混合物）を、望ましくない天然の酵素活性を不活性化するが生産経路のいかなる耐熱性酵素も不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産することを含む。細胞ライセ−トは、いくつかの態様において、少なくとも５０℃の温度に加熱される。例えば細胞ライセ−トを、少なくとも５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃、８５℃、または９０℃の温度に加熱することができる。
細胞ライセ−トは、細胞の天然酵素（または他の非耐熱性酵素）を不活性化するのに十分な時間加熱することができる。例えば、細胞ライセ−トを少なくとも２、３、４、または少なくとも５分間加熱することができる。いくつかの態様においては、細胞ライセ−トを５分より長く加熱する。いくつかの態様において、細胞ライセ−トは、天然酵素（または他の非耐熱性酵素）の活性を少なくとも５０％（例えば、少なくとも６０％、７０％、８０％、または９０％）低下させるのに十分な時間加熱される。
【００４７】
熱不活性化に続いて、いくつかの態様において、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、または少なくとも３つ）の精製酵素が、細胞ライセ−ト／反応混合物に添加される。したがっていくつかの態様において、反応混合物は、細胞ライセ−ト中に存在する酵素（改変宿主細胞によって発現される）と少なくとも１つの精製酵素の組み合わせを含む。少なくとも１つの精製酵素は、α−グルカンホスホリラ−ゼまたはセロデキストリンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、ホスホグルコイソメラ−ゼ、およびフルクト−ス６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択され得る。
いくつかの態様において、方法はまた、熱不活化ライセ−トを、デンプンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、フルクト−スを生産することを含む。いくつかの態様において、方法はまた、熱不活化ライセ−トを、セロデキストリンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、フルクト−スを生産することを含む。いくつかの態様において、熱不活化ライセ−トは、少なくとも５０℃の温度でインキュベ−トされる。いくつかの態様において、熱不活化ライセ−トは、少なくとも２分間（例えば、少なくとも３、４、または５分間）インキュベ−トされる。例えば、熱不活化ライセ−トは、２〜５分間、または２〜１０分間インキュベ−トすることができる。デンプンは、例えば、アミロ−ス、アミロペクチン、またはアミロ−スとアミロペクチンの混合物であり得る。いくつかの態様において、バイオマスがデンプンの代わりに使用される。これらの態様において、反応は、セロデキストリンホスホリラ−ゼを含む。いくつかの態様において、デンプンまたはセロデキストリンは、化合物の成分として存在する。
【００４８】
本明細書ではまた、フルクト−スの生産に使用される細胞および細胞ライセ−トも提供される。したがって、本開示の改変細胞（例えば、細菌細胞および／または酵母細胞）または細胞ライセ−トは、α−グルカンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、およびフルクト−ス６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、または少なくとも３つ）の酵素を含み得る。いくつかの態様において、本開示の改変細胞（例えば、細菌細胞および／または酵母細胞）または細胞ライセ−トは、耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、および耐熱性フルクト−ス６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、または少なくとも３つ）の酵素を含み得る。いくつかの態様において、本開示の改変細胞（例えば、細菌細胞および／または酵母細胞）または細胞ライセ−トは、耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、および耐熱性フルクト−ス６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、または少なくとも３つ）の酵素を含み得る。
【００４９】
マンノ−ス生産
さらにまた、本開示のいくつかの側面は、マンノ−スを生産するための方法、組成物、およびシステムを提供する。これらの方法は、いくつかの態様において、少なくとも１つのα−グルカンホスホリラ−ゼおよび／または少なくとも１つのセロデキストリンホスホリラ−ゼ、少なくとも１つのホスホグルコムタ−ゼ、少なくとも１つのホスホグルコイソメラ−ゼ、少なくとも１つのマンノ−ス６−リン酸イソメラ−ゼ、少なくとも１つのマンノ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼ、または少なくとも２つの前述の酵素の組み合わせを発現するように改変された細胞を、培養することを含む。いくつかの態様において、α−グルカンホスホリラ−ゼ（および／またはセロデキストリンホスホリラ−ゼ）およびホスホグルコムタ−ゼは、単一の融合（キメラ）タンパク質または二機能性タンパク質として発現される。
【００５０】
本明細書に提供されるマンノ−ス生産経路の酵素は、典型的には宿主細胞に対して異種である（最初に異なる細胞型からクロ−ニングされるかまたはこれから得られる）が、いくつかの酵素は、宿主細胞に対して内在性（天然）であり得る。したがっていくつかの態様において、デンプンおよび／またはセロデキストリンをマンノ−スに変換するために使用される少なくとも１つの酵素（例えば耐熱性酵素）は、宿主細胞に対して異種である。いくつかの態様において、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つの酵素は、宿主細胞に対して異種である。いくつかの態様において、少なくとも１つの酵素（例えば、耐熱性酵素）は、宿主細胞に対して内在性（天然）である。いくつかの態様において、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つの酵素は、宿主細胞に対して内在性である。
宿主細胞は、細菌細胞（例えば、大腸菌細胞）などの原核細胞、または酵母細胞もしくは植物細胞などの真核細胞であり得る。他の細胞型は以下に記載される。
【００５１】
いくつかの態様において、デンプンおよび／またはセロデキストリンをマンノ−スに変換するために使用される少なくとも１つの酵素は、耐熱性酵素である。いくつかの態様において、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つの酵素は、耐熱性酵素である。いくつかの態様において、全ての酵素は耐熱性酵素である。したがっていくつかの態様において、方法は、少なくとも１つの耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性ホスホグルコイソメラ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性マンノ−ス６−リン酸イソメラ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性マンノ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼ、または少なくとも２つ以上の前述の耐熱性酵素の組み合わせを発現するように改変された細胞を、培養することを含む。いくつかの態様において、方法は、少なくとも１つの耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性ホスホグルコイソメラ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性マンノ−ス６−リン酸イソメラ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性マンノ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼ、または少なくとも２つ以上の前述の耐熱性酵素の組み合わせを発現するように改変された細胞を、培養することを含む。
【００５２】
いくつかの態様において、マンノ−スを生産する方法は、培養細胞を溶解（例えば、熱的、機械的、化学的、または酵素的溶解）して、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つ）の細胞ライセ−トを生産することを含む。複数の細胞ライセ−ト（したがって、同じ生物（例えば細菌）または異なる生物（例えば、細菌、酵母、および／または植物細胞）由来の、複数の細胞集団）を本明細書に記載のような酵素反応において使用し得ることが、理解されるべきである。例えば、１つの細胞集団は、マンノ−ス生産経路の１つ以上の酵素を発現するように改変され得、一方、他の細胞集団（またはいくつかの他の細胞集団）は、マンノ−ス生産経路の別の（少なくとも１つの他の）酵素を発現するように改変され得る。したがっていくつかの態様において、方法は、少なくとも１つのα−グルカンホスホリラ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、少なくとも１つのホスホグルコムタ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、少なくとも１つのホスホグルコイソメラ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、少なくとも１つのマンノ−ス６−リン酸イソメラ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、および／または少なくとも１つのマンノ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、を含む。いくつかの態様において、方法は、少なくとも１つのセロデキストリンホスホリラ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、少なくとも１つのホスホグルコムタ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、少なくとも１つのホスホグルコイソメラ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、少なくとも１つのマンノ−ス６−リン酸イソメラ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、および／または少なくとも１つのマンノ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、を含む。細胞の溶解後、細胞ライセ−トを、酵素が単一の細胞ライセ−ト／反応混合物中に存在するように組み合わせる。
【００５３】
いくつかの態様において、方法はさらに、細胞ライセ−ト（または細胞ライセ−ト混合物）を、望ましくない天然の酵素活性を不活性化するが生産経路のいかなる耐熱性酵素も不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産することを含む。細胞ライセ−トは、いくつかの態様において、少なくとも５０℃の温度に加熱される。例えば細胞ライセ−トを、少なくとも５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃、８５℃、または９０℃の温度に加熱することができる。
細胞ライセ−トは、細胞の天然酵素（または他の非耐熱性酵素）を不活性化するのに十分な時間加熱することができる。例えば、細胞ライセ−トを少なくとも２、３、４、または少なくとも５分間加熱することができる。いくつかの態様においては、細胞ライセ−トを５分より長く加熱する。いくつかの態様において、細胞ライセ−トは、天然酵素（または他の非耐熱性酵素）の活性を少なくとも５０％（例えば、少なくとも６０％、７０％、８０％、または９０％）低下させるのに十分な時間加熱される。
【００５４】
熱不活性化に続いて、いくつかの態様において、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、または少なくとも３つ）の精製酵素が、細胞ライセ−ト／反応混合物に添加される。したがっていくつかの態様において、反応混合物は、細胞ライセ−ト中に存在する酵素（改変宿主細胞によって発現される）と少なくとも１つの精製酵素の組み合わせを含む。少なくとも１つの精製酵素は、α−グルカンホスホリラ−ゼまたはセロデキストリンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、ホスホグルコイソメラ−ゼ、マンノ−ス６−リン酸イソメラ−ゼ、およびマンノ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択され得る。
【００５５】
いくつかの態様において、方法はまた、熱不活化ライセ−トを、デンプンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、マンノ−スを生産することを含む。いくつかの態様において、方法はまた、熱不活化ライセ−トを、セロデキストリンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、マンノ−スを生産することを含む。いくつかの態様において、熱不活化ライセ−トは、少なくとも５０℃の温度でインキュベ−トされる。いくつかの態様において、熱不活化ライセ−トは、少なくとも２分間（例えば、少なくとも３、４、または５分間）インキュベ−トされる。例えば、熱不活化ライセ−トは、２〜５分間、または２〜１０分間インキュベ−トすることができる。デンプンは、例えば、アミロ−ス、アミロペクチン、またはアミロ−スとアミロペクチンの混合物であり得る。いくつかの態様において、バイオマスがデンプンの代わりに使用される。これらの態様において、反応は、セロデキストリンホスホリラ−ゼを含む。いくつかの態様において、デンプンまたはセロデキストリンは、化合物の成分として存在する。
【００５６】
本明細書ではまた、マンノ−スの生産に使用される細胞および細胞ライセ−トも提供される。したがって、本開示の改変細胞（例えば、細菌細胞および／または酵母細胞）または細胞ライセ−トは、α−グルカンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、ホスホグルコイソメラ−ゼ、マンノ−ス６−リン酸イソメラ−ゼ、およびマンノ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つ）の酵素を含み得る。本開示の改変細胞（例えば、細菌細胞および／または酵母細胞）または細胞ライセ−トは、セロデキストリンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、ホスホグルコイソメラ−ゼ、マンノ−ス６−リン酸イソメラ−ゼ、およびマンノ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つ）の酵素を含み得る。いくつかの態様において、本開示の改変細胞（例えば、細菌細胞および／または酵母細胞）または細胞ライセ−トは、耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性ホスホグルコイソメラ−ゼ、耐熱性マンノ−ス６−リン酸イソメラ−ゼ、および耐熱性マンノ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つ）の酵素を含み得る。いくつかの態様において、本開示の改変細胞（例えば、細菌細胞および／または酵母細胞）または細胞ライセ−トは、耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性ホスホグルコイソメラ−ゼ、耐熱性マンノ−ス６−リン酸イソメラ−ゼ、および耐熱性マンノ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つ）の酵素を含み得る。
【００５７】
ソルビト−ル生産
本開示のさらに他の側面は、ソルビト−ルを生産するための方法、組成物、およびシステムを提供する。これらの方法は、いくつかの態様において、少なくとも１つのα−グルカンホスホリラ−ゼおよび／またはセロデキストリンホスホリラ−ゼ、少なくとも１つのホスホグルコムタ−ゼ、少なくとも１つのアルド−スデヒドロゲナ−ゼ、少なくとも１つのソルビト−ル６−リン酸ホスファタ−ゼ、または少なくとも２つの前述の酵素の組み合わせを発現するように改変された細胞を、培養することを含む。いくつかの態様において、方法は、少なくとも１つのα−グルカンホスホリラ−ゼおよび／または少なくとも１つのセロデキストリンホスホリラ−ゼ、少なくとも１つのホスホグルコムタ−ゼ、少なくとも１つのホスホグルコイソメラ−ゼ、少なくとも１つのソルビト−ル−６−リン酸２−デヒドロゲナ−ゼ、少なくとも１つのソルビト−ル−６−リン酸ホスファタ−ゼ、または少なくとも２つの前述の酵素の組み合わせを発現するように改変された細胞を、培養することを含む。いくつかの態様において、α−グルカンホスホリラ−ゼ（および／またはセロデキストリンホスホリラ−ゼ）およびホスホグルコムタ−ゼは、単一の融合（キメラ）タンパク質または二機能性タンパク質として発現される。
【００５８】
本明細書に提供されるソルビト−ル生産経路の酵素は、典型的には宿主細胞に対して異種である（最初に異なる細胞型からクロ−ニングされるかまたはこれから得られる）が、いくつかの酵素は、宿主細胞に対して内在性（天然）であり得る。したがっていくつかの態様において、デンプンおよび／またはセロデキストリンをソルビト−ルに変換するために使用される少なくとも１つの酵素（例えば耐熱性酵素）は、宿主細胞に対して異種である。いくつかの態様において、少なくとも２つまたは少なくとも３つの酵素は、宿主細胞に対して異種である。いくつかの態様において、少なくとも１つの酵素（例えば、耐熱性酵素）は、宿主細胞に対して内在性（天然）である。いくつかの態様において、少なくとも２つまたは少なくとも３つの酵素は、宿主細胞に対して内在性である。
宿主細胞は、細菌細胞（例えば、大腸菌細胞）などの原核細胞、または酵母細胞もしくは植物細胞などの真核細胞であり得る。他の細胞型は以下に記載される。
【００５９】
いくつかの態様において、デンプンおよび／またはセロデキストリンをソルビト−ルに変換するために使用される少なくとも１つの酵素は、耐熱性酵素である。いくつかの態様において、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つの酵素は、耐熱性酵素である。いくつかの態様において、全ての酵素は耐熱性酵素である。したがっていくつかの態様において、方法は、少なくとも１つの耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性アルド−スデヒドロゲナ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性ソルビト−ル−６−リン酸ホスファタ−ゼ、または少なくとも２つ以上の前述の耐熱性酵素の組み合わせを発現するように改変された細胞を、培養することを含む。いくつかの態様において、方法は、少なくとも１つの耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性アルド−スデヒドロゲナ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性ソルビト−ル−６−リン酸ホスファタ−ゼ、または少なくとも２つ以上の前述の耐熱性酵素の組み合わせを発現するように改変された細胞を、培養することを含む。いくつかの態様において、方法は、少なくとも１つの耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性ホスホグルコイソメラ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性ソルビト−ル−６−リン酸２−デヒドロゲナ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性ソルビト−ル−６−リン酸ホスファタ−ゼ、または少なくとも２つ以上の前述の耐熱性酵素の組み合わせを発現するように改変された細胞を、培養することを含む。いくつかの態様において、方法は、少なくとも１つの耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性ホスホグルコイソメラ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性ソルビト−ル−６−リン酸２−デヒドロゲナ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性ソルビト−ル−６−リン酸ホスファタ−ゼ、または少なくとも２つ以上の前述の耐熱性酵素の組み合わせを発現するように改変された細胞を、培養することを含む。
【００６０】
いくつかの態様において、ソルビト−ルを生産する方法は、培養細胞を溶解（例えば、熱的、機械的、化学的、または酵素的溶解）して、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つ）の細胞ライセ−トを生産することを含む。複数の細胞ライセ−ト（したがって、同じ生物（例えば細菌）または異なる生物（例えば、細菌、酵母、および／または植物細胞）由来の、複数の細胞集団）を本明細書に記載のような酵素反応において使用し得ることが、理解されるべきである。例えば、１つの細胞集団は、ソルビト−ル生産経路の１つ以上の酵素を発現するように改変され得、一方、他の細胞集団（またはいくつかの他の細胞集団）は、ソルビト−ル生産経路の別の（少なくとも１つの他の）酵素を発現するように改変され得る。したがっていくつかの態様において、方法は、少なくとも１つのα−グルカンホスホリラ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、少なくとも１つのホスホグルコムタ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、少なくとも１つのアルド−スデヒドロゲナ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、および／または少なくとも１つのソルビト−ル−６−リン酸ホスファタ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、を含む。いくつかの態様において、方法は、少なくとも１つのセロデキストリンホスホリラ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、少なくとも１つのホスホグルコムタ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、少なくとも１つのアルド−スデヒドロゲナ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、および／または少なくとも１つのソルビト−ル−６−リン酸ホスファタ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、を含む。細胞の溶解後、細胞ライセ−トを、酵素が単一の細胞ライセ−ト／反応混合物中に存在するように組み合わせる。
【００６１】
いくつかの態様において、方法はさらに、細胞ライセ−ト（または細胞ライセ−ト混合物）を、望ましくない天然の酵素活性を不活性化するが生産経路のいかなる耐熱性酵素も不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産することを含む。細胞ライセ−トは、いくつかの態様において、少なくとも５０℃の温度に加熱される。例えば細胞ライセ−トを、少なくとも５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃、８５℃、または９０℃の温度に加熱することができる。
細胞ライセ−トは、細胞の天然酵素（または他の非耐熱性酵素）を不活性化するのに十分な時間加熱することができる。例えば、細胞ライセ−トを少なくとも２、３、４、または少なくとも５分間加熱することができる。いくつかの態様においては、細胞ライセ−トを５分より長く加熱する。いくつかの態様において、細胞ライセ−トは、天然酵素（または他の非耐熱性酵素）の活性を少なくとも５０％（例えば、少なくとも６０％、７０％、８０％、または９０％）低下させるのに十分な時間加熱される。
【００６２】
熱不活性化に続いて、いくつかの態様において、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、または少なくとも３つ）の精製酵素が、細胞ライセ−ト／反応混合物に添加される。したがっていくつかの態様において、反応混合物は、細胞ライセ−ト中に存在する酵素（改変宿主細胞によって発現される）と少なくとも１つの精製酵素の組み合わせを含む。少なくとも１つの精製酵素は、α−グルカンホスホリラ−ゼまたはセロデキストリンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、ホスホグルコイソメラ−ゼ、ソルビト−ル−６−リン酸２−デヒドロゲナ−ゼ、アルド−スデヒドロゲナ−ゼ、およびソルビト−ル−６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択され得る。
いくつかの態様において、方法はまた、熱不活化ライセ−トを、デンプンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、ソルビト−ルを生産することを含む。いくつかの態様において、方法はまた、熱不活化ライセ−トを、セロデキストリンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、ソルビト−ルを生産することを含む。いくつかの態様において、熱不活化ライセ−トは、少なくとも５０℃の温度でインキュベ−トされる。いくつかの態様において、熱不活化ライセ−トは、少なくとも２分間（例えば、少なくとも３、４、または５分間）インキュベ−トされる。例えば、熱不活化ライセ−トは、２〜５分間、または２〜１０分間インキュベ−トすることができる。デンプンは、例えば、アミロ−ス、アミロペクチン、またはアミロ−スとアミロペクチンの混合物であり得る。いくつかの態様において、バイオマスがデンプンの代わりに使用される。これらの態様において、反応は、セロデキストリンホスホリラ−ゼを含む。いくつかの態様において、デンプンまたはセロデキストリンは、化合物の成分として存在する。
【００６３】
本明細書ではまた、ソルビト−ルの生産に使用される細胞および細胞ライセ−トも提供される。したがって、本開示の改変細胞（例えば、細菌細胞および／または酵母細胞）または細胞ライセ−トは、α−グルカンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、アルド−スデヒドロゲナ−ゼ、およびソルビト−ル−６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、または少なくとも３つ）の酵素を含み得る。本開示の改変細胞（例えば、細菌細胞および／または酵母細胞）または細胞ライセ−トは、セロデキストリンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、アルド−スデヒドロゲナ−ゼ、およびソルビト−ル−６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、または少なくとも３つ）の酵素を含み得る。いくつかの態様において、本開示の改変細胞（例えば、細菌細胞および／または酵母細胞）または細胞ライセ−トは、耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性アルド−スデヒドロゲナ−ゼ、および耐熱性ソルビト−ル−６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、または少なくとも３つ）の酵素を含み得る。本開示の改変細胞（例えば、細菌細胞および／または酵母細胞）または細胞ライセ−トは、耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性アルド−スデヒドロゲナ−ゼ、および耐熱性ソルビト−ル−６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、または少なくとも３つ）の酵素を含み得る。したがって、本開示の改変細胞（例えば、細菌細胞および／または酵母細胞）または細胞ライセ−トは、α−グルカンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、ホスホグルコイソメラ−ゼ、ソルビト−ル−６−リン酸２−デヒドロゲナ−ゼ、およびソルビト−ル−６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、または少なくとも３つ）の酵素を含み得る。本開示の改変細胞（例えば、細菌細胞および／または酵母細胞）または細胞ライセ−トは、セロデキストリンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、ホスホグルコイソメラ−ゼ、ソルビト−ル−６−リン酸２−デヒドロゲナ−ゼ、およびソルビト−ル−６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、または少なくとも３つ）の酵素を含み得る。いくつかの態様において、本開示の改変細胞（例えば、細菌細胞および／または酵母細胞）または細胞ライセ−トは、耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性ホスホグルコイソメラ−ゼ、耐熱性ソルビト−ル−６−リン酸アルド−スデヒドロゲナ−ゼ、および耐熱性ソルビト−ル−６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、または少なくとも３つ）の酵素を含み得る。いくつかの態様において、本開示の改変細胞（例えば、細菌細胞および／または酵母細胞）または細胞ライセ−トは、耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱���ホスホグルコイソメラ−ゼ、耐熱性ソルビト−ル−６−リン酸２−デヒドロゲナ−ゼ、および耐熱性ソルビト−ル−６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、または少なくとも３つ）の酵素を含み得る。
【００６４】
リブロ−ス生産
本開示のさらなる側面は、リブロ−スを生産するための方法、組成物、およびシステムを提供する。これらの方法は、いくつかの態様において、少なくとも１つのα−グルカンホスホリラ−ゼおよび／またはセロデキストリンホスホリラ−ゼ、少なくとも１つのホスホグルコムタ−ゼ、少なくとも１つのグルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、少なくとも１つの６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、少なくとも１つの６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、少なくとも１つのリブロ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼ、または少なくとも２つの前述の酵素の組み合わせを発現するように改変された細胞を、培養することを含む。いくつかの態様において、α−グルカンホスホリラ−ゼ（および／またはセロデキストリンホスホリラ−ゼ）およびホスホグルコムタ−ゼは、単一の融合（キメラ）タンパク質または二機能性タンパク質として発現される。
【００６５】
本明細書に提供されるリブロ−ス生産経路の酵素は、典型的には宿主細胞に対して異種である（最初に異なる細胞型からクロ−ニングされるかまたはこれから得られる）が、いくつかの酵素は、宿主細胞に対して内在性（天然）であり得る。したがっていくつかの態様において、デンプンおよび／またはセロデキストリンをリブロ−スに変換するために使用される少なくとも１つの酵素（例えば耐熱性酵素）は、宿主細胞に対して異種である。いくつかの態様において、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つの酵素は、宿主細胞に対して異種である。いくつかの態様において、少なくとも１つの酵素（例えば、耐熱性酵素）は、宿主細胞に対して内在性（天然）である。いくつかの態様において、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つの酵素は、宿主細胞に対して内在性である。
宿主細胞は、細菌細胞（例えば、大腸菌細胞）などの原核細胞、または酵母細胞もしくは植物細胞などの真核細胞であり得る。他の細胞型は以下に記載される。
【００６６】
いくつかの態様において、デンプンおよび／またはセロデキストリンをリブロ−スに変換するために使用される少なくとも１つの酵素は、耐熱性酵素である。いくつかの態様において、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つの酵素は、耐熱性酵素である。いくつかの態様において、全ての酵素は耐熱性酵素である。したがっていくつかの態様において、方法は、少なくとも１つの耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性リブロ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼ、または少なくとも２つ以上の前述の耐熱性酵素の組み合わせを発現するように改変された細胞を、培養することを含む。いくつかの態様において、方法は、少なくとも１つの耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性リブロ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼ、または少なくとも２つ以上の前述の耐熱性酵素の組み合わせを発現するように改変された細胞を、培養することを含む。
【００６７】
いくつかの態様において、リブロ−スを生産する方法は、培養細胞を溶解（例えば、熱的、機械的、化学的、または酵素的溶解）して、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つ）の細胞ライセ−トを生産することを含む。複数の細胞ライセ−ト（したがって、同じ生物（例えば細菌）または異なる生物（例えば、細菌、酵母、および／または植物細胞）由来の、複数の細胞集団）を本明細書に記載のような酵素反応において使用し得ることが、理解されるべきである。例えば、１つの細胞集団は、リブロ−ス生産経路の１つ以上の酵素を発現するように改変され得、一方、他の細胞集団（またはいくつかの他の細胞集団）は、リブロ−ス生産経路の別の（少なくとも１つの他の）酵素を発現するように改変され得る。したがっていくつかの態様において、方法は、少なくとも１つのα−グルカンホスホリラ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、少なくとも１つのホスホグルコムタ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、少なくとも１つのグルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、少なくとも１つの６−ホスホグルコノラクトナ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、少なくとも１つの６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、および／または少なくとも１つのリブロ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、を含む。いくつかの態様において、方法は、少なくとも１つのセロデキストリンホスホリラ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、少なくとも１つのホスホグルコムタ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、少なくとも１つのグルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、少なくとも１つの６−ホスホグルコノラクトナ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、少なくとも１つの６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、および／または少なくとも１つのリブロ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、を含む。細胞の溶解後、細胞ライセ−トを、酵素が単一の細胞ライセ−ト／反応混合物中に存在するように組み合わせる。
【００６８】
いくつかの態様において、方法はさらに、細胞ライセ−ト（または細胞ライセ−ト混合物）を、望ましくない天然の酵素活性を不活性化するが生産経路のいかなる耐熱性酵素も不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産することを含む。細胞ライセ−トは、いくつかの態様において、少なくとも５０℃の温度に加熱される。例えば細胞ライセ−トを、少なくとも５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃、８５℃、または９０℃の温度に加熱することができる。
細胞ライセ−トは、細胞の天然酵素（または他の非耐熱性酵素）を不活性化するのに十分な時間加熱することができる。例えば、細胞ライセ−トを少なくとも２、３、４、または少なくとも５分間加熱することができる。いくつかの態様においては、細胞ライセ−トを５分より長く加熱する。いくつかの態様において、細胞ライセ−トは、天然酵素（または他の非耐熱性酵素）の活性を少なくとも５０％（例えば、少なくとも６０％、７０％、８０％、または９０％）低下させるのに十分な時間加熱される。
【００６９】
熱不活性化に続いて、いくつかの態様において、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、または少なくとも３つ）の精製酵素が、細胞ライセ−ト／反応混合物に添加される。したがっていくつかの態様において、反応混合物は、細胞ライセ−ト中に存在する酵素（改変宿主細胞によって発現される）と少なくとも１つの精製酵素の組み合わせを含む。少なくとも１つの精製酵素は、α−グルカンホスホリラ−ゼまたはセロデキストリンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、およびリブロ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択され得る。
【００７０】
いくつかの態様において、方法はまた、熱不活化ライセ−トを、デンプンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、リブロ−スを生産することを含む。いくつかの態様において、方法はまた、熱不活化ライセ−トを、セロデキストリンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、リブロ−スを生産することを含む。いくつかの態様において、熱不活化ライセ−トは、少なくとも５０℃の温度でインキュベ−トされる。いくつかの態様において、熱不活化ライセ−トは、少なくとも２分間（例えば、少なくとも３、４、または５分間）インキュベ−トされる。例えば、熱不活化ライセ−トは、２〜５分間、または２〜１０分間インキュベ−トすることができる。デンプンは、例えば、アミロ−ス、アミロペクチン、またはアミロ−スとアミロペクチンの混合物であり得る。いくつかの態様において、バイオマスがデンプンの代わりに使用される。これらの態様において、反応は、セロデキストリンホスホリラ−ゼを含む。いくつかの態様において、デンプンまたはセロデキストリンは、化合物の成分として存在する。
【００７１】
本明細書ではまた、リブロ−スの生産に使用される細胞および細胞ライセ−トも提供される。したがって、本開示の改変細胞（例えば、細菌細胞および／または酵母細胞）または細胞ライセ−トは、α−グルカンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、およびリブロ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、または少なくとも３つ）の酵素を含み得る。本開示の改変細胞（例えば、細菌細胞および／または酵母細胞）または細胞ライセ−トは、セロデキストリンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、およびリブロ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、または少なくとも３つ）の酵素を含み得る。いくつかの態様において、本開示の改変細胞（例えば、細菌細胞および／または酵母細胞）または細胞ライセ−トは、耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、および耐熱性リブロ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、または少なくとも３つ）の酵素を含み得る。本開示の改変細胞（例えば、細菌細胞および／または酵母細胞）または細胞ライセ−トは、耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、および耐熱性リブロ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、または少なくとも３つ）の酵素を含み得る。
【００７２】
リボ−ス生産
さらに、本開示のいくつかの側面は、リボ−スを生産するための方法、組成物、およびシステムを提供する。これらの方法は、いくつかの態様において、少なくとも１つのα−グルカンホスホリラ−ゼおよび／または少なくとも１つのセロデキストリンホスホリラ−ゼ、少なくとも１つのホスホグルコムタ−ゼ、少なくとも１つのグルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、少なくとも１つの６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、少なくとも１つの６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、少なくとも１つのリボ−ス５−リン酸イソメラ−ゼ、少なくとも１つのリボ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼ、または少なくとも２つの前述の酵素の組み合わせを発現するように改変された細胞を、培養することを含む。いくつかの態様において、α−グルカンホスホリラ−ゼ（および／またはセロデキストリンホスホリラ−ゼ）およびホスホグルコムタ−ゼは、単一の融合（キメラ）タンパク質または二機能性タンパク質として発現される。
【００７３】
本明細書に提供されるリボ−ス生産経路の酵素は、典型的には宿主細胞に対して異種である（最初に異なる細胞型からクロ−ニングされるかまたはこれから得られる）が、いくつかの酵素は、宿主細胞に対して内在性（天然）であり得る。したがっていくつかの態様において、デンプンおよび／またはセロデキストリンをリボ−スに変換するために使用される少なくとも１つの酵素（例えば耐熱性酵素）は、宿主細胞に対して異種である。いくつかの態様において、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つの酵素は、宿主細胞に対して異種である。いくつかの態様において、少なくとも１つの酵素（例えば、耐熱性酵素）は、宿主細胞に対して内在性（天然）である。いくつかの態様において、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つの酵素は、宿主細胞に対して内在性である。
宿主細胞は、細菌細胞（例えば、大腸菌細胞）などの原核細胞、または酵母細胞もしくは植物細胞などの真核細胞であり得る。他の細胞型は以下に記載される。
【００７４】
いくつかの態様において、デンプンおよび／またはセロデキストリンをリボ−スに変換するために使用される少なくとも１つの酵素は、耐熱性酵素である。いくつかの態様において、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つの酵素は、耐熱性酵素である。いくつかの態様において、全ての酵素は耐熱性酵素である。したがっていくつかの態様において、方法は、少なくとも１つの耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性リボ−ス５−リン酸イソメラ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性リボ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼ、または少なくとも２つ以上の前述の耐熱性酵素の組み合わせを発現するように改変された細胞を、培養することを含む。いくつかの態様において、方法は、少なくとも１つの耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性リボ−ス５−リン酸イソメラ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性リボ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼ、または少なくとも２つ以上の前述の耐熱性酵素の組み合わせを発現するように改変された細胞を、培養することを含む。
【００７５】
いくつかの態様において、リボ−スを生産する方法は、培養細胞を溶解（例えば、熱的、機械的、化学的、または酵素的溶解）して、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つ）の細胞ライセ−トを生産することを含む。複数の細胞ライセ−ト（したがって、同じ生物（例えば細菌）または異なる生物（例えば、細菌、酵母、および／または植物細胞）由来の、複数の細胞集団）を本明細書に記載のような酵素反応において使用し得ることが、理解されるべきである。例えば、１つの細胞集団は、リボ−ス生産経路の１つ以上の酵素を発現するように改変され得、一方、他の細胞集団（またはいくつかの他の細胞集団）は、リボ−ス生産経路の別の（少なくとも１つの他の）酵素を発現するように改変され得る。したがっていくつかの態様において、方法は、少なくとも１つのα−グルカンホスホリラ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、少なくとも１つのホスホグルコムタ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、少なくとも１つのグルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、少なくとも１つの６−ホスホグルコノラクトナ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、少なくとも１つの６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、少なくとも１つのリボ−ス５−リン酸イソメラ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、および／または少なくとも１つのリボ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、を含む。いくつかの態様において、方法は、少なくとも１つのセロデキストリンホスホリラ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、少なくとも１つのホスホグルコムタ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、少なくとも１つのグルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、少なくとも１つの６−ホスホグルコノラクトナ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、少なくとも１つの６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、少なくとも１つのリボ−ス５−リン酸イソメラ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、および／または少なくとも１つのリボ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、を含む。細胞の溶解後、細胞ライセ−トを、酵素が単一の細胞ライセ−ト／反応混合物中に存在するように組み合わせる。
【００７６】
いくつかの態様において、方法はさらに、細胞ライセ−ト（または細胞ライセ−ト混合物）を、望ましくない天然の酵素活性を不活性化するが生産経路のいかなる耐熱性酵素も不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産することを含む。細胞ライセ−トは、いくつかの態様において、少なくとも５０℃の温度に加熱される。例えば細胞ライセ−トを、少なくとも５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃、８５℃、または９０℃の温度に加熱することができる。
細胞ライセ−トは、細胞の天然酵素（または他の非耐熱性酵素）を不活性化するのに十分な時間加熱することができる。例えば、細胞ライセ−トを少なくとも２、３、４、または少なくとも５分間加熱することができる。いくつかの態様においては、細胞ライセ−トを５分より長く加熱する。いくつかの態様において、細胞ライセ−トは、天然酵素（または他の非耐熱性酵素）の活性を少なくとも５０％（例えば、少なくとも６０％、７０％、８０％、または９０％）低下させるのに十分な時間加熱される。
【００７７】
熱不活性化に続いて、いくつかの態様において、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、または少なくとも３つ）の精製酵素が、細胞ライセ−ト／反応混合物に添加される。したがっていくつかの態様において、反応混合物は、細胞ライセ−ト中に存在する酵素（改変宿主細胞によって発現される）と少なくとも１つの精製酵素の組み合わせを含む。少なくとも１つの精製酵素は、α−グルカンホスホリラ−ゼまたはセロデキストリンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、リボ−ス５−リン酸イソメラ−ゼ、およびリボ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択され得る。
【００７８】
いくつかの態様において、方法はまた、熱不活化ライセ−トを、デンプンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、リボ−スを生産することを含む。いくつかの態様において、方法はまた、熱不活化ライセ−トを、セロデキストリンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、リボ−スを生産することを含む。いくつかの態様において、熱不活化ライセ−トは、少なくとも５０℃の温度でインキュベ−トされる。いくつかの態様において、熱不活化ライセ−トは、少なくとも２分間（例えば、少なくとも３、４、または５分間）インキュベ−トされる。例えば、熱不活化ライセ−トは、２〜５分間、または２〜１０分間インキュベ−トすることができる。デンプンは、例えば、アミロ−ス、アミロペクチン、またはアミロ−スとアミロペクチンの混合物であり得る。いくつかの態様において、バイオマスがデンプンの代わりに使用される。これらの態様において、反応は、セロデキストリンホスホリラ−ゼを含む。いくつかの態様において、デンプンまたはセロデキストリンは、化合物の成分として存在する。
【００７９】
本明細書ではまた、リボ−スの生産に使用される細胞および細胞ライセ−トも提供される。したがって、本開示の改変細胞（例えば、細菌細胞および／または酵母細胞）または細胞ライセ−トは、α−グルカンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、リボ−ス５−リン酸イソメラ−ゼ、およびリボ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つ）の酵素を含み得る。本開示の改変細胞（例えば、細菌細胞および／または酵母細胞）または細胞ライセ−トは、セロデキストリンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、リボ−ス５−リン酸イソメラ−ゼ、およびリボ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つ）の酵素を含み得る。いくつかの態様において、本開示の改変細胞（例えば、細菌細胞および／または酵母細胞）または細胞ライセ−トは、耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、耐熱性リボ−ス５−リン酸イソメラ−ゼ、および耐熱性リボ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つ）の酵素を含み得る。本開示の改変細胞（例えば、細菌細胞および／または酵母細胞）または細胞ライセ−トは、耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、耐熱性リボ−ス５−リン酸イソメラ−ゼ、および耐熱性リボ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つ）の酵素を含み得る。
【００８０】
アラビノ−ス生産
さらに、本開示のいくつかの側面は、アラビノ−スを生産するための方法、組成物、およびシステムを提供する。これらの方法は、いくつかの態様において、少なくとも１つのα−グルカンホスホリラ−ゼおよび／または少なくとも１つのセロデキストリンホスホリラ−ゼ、少なくとも１つのホスホグルコムタ−ゼ、少なくとも１つのグルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、少なくとも１つの６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、少なくとも１つの６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、少なくとも１つのアラビノ−ス５−リン酸イソメラ−ゼ、少なくとも１つのアラビノ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼ、または少なくとも２つの前述の酵素の組み合わせを発現するように改変された細胞を、培養することを含む。いくつかの態様において、α−グルカンホスホリラ−ゼ（および／またはセロデキストリンホスホリラ−ゼ）およびホスホグルコムタ−ゼは、単一の融合（キメラ）タンパク質または二機能性タンパク質として発現される。
【００８１】
本明細書に提供されるアラビノ−ス生産経路の酵素は、典型的には宿主細胞に対して異種である（最初に異なる細胞型からクロ−ニングされるかまたはこれから得られる）が、いくつかの酵素は、宿主細胞に対して内在性（天然）であり得る。したがっていくつかの態様において、デンプンおよび／またはセロデキストリンをアラビノ−スに変換するために使用される少なくとも１つの酵素（例えば耐熱性酵素）は、宿主細胞に対して異種である。いくつかの態様において、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つの酵素は、宿主細胞に対して異種である。いくつかの態様において、少なくとも１つの酵素（例えば、耐熱性酵素）は、宿主細胞に対して内在性（天然）である。いくつかの態様において、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つの酵素は、宿主細胞に対して内在性である。
宿主細胞は、細菌細胞（例えば、大腸菌細胞）などの原核細胞、または酵母細胞もしくは植物細胞などの真核細胞であり得る。他の細胞型は以下に記載される。
【００８２】
いくつかの態様において、デンプンおよび／またはセロデキストリンをアラビノ−スに変換するために使用される少なくとも１つの酵素は、耐熱性酵素である。いくつかの態様において、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つの酵素は、耐熱性酵素である。いくつかの態様において、全ての酵素は耐熱性酵素である。したがっていくつかの態様において、方法は、少なくとも１つの耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性アラビノ−ス５−リン酸イソメラ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性アラビノ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼ、または少なくとも２つ以上の前述の耐熱性酵素の組み合わせを発現するように改変された細胞を、培養することを含む。いくつかの態様において、方法は、少なくとも１つの耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性アラビノ−ス５−リン酸イソメラ−ゼ、少なくとも１つの耐熱性アラビノ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼ、または少なくとも２つ以上の前述の耐熱性酵素の組み合わせを発現するように改変された細胞を、培養することを含む。
【００８３】
いくつかの態様において、アラビノ−スを生産する方法は、培養細胞を溶解（例えば、熱的、機械的、化学的、または酵素的溶解）して、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つ）の細胞ライセ−トを生産することを含む。複数の細胞ライセ−ト（したがって、同じ生物（例えば細菌）または異なる生物（例えば、細菌、酵母、および／または植物細胞）由来の、複数の細胞集団）を本明細書に記載のような酵素反応において使用し得ることが、理解されるべきである。例えば、１つの細胞集団は、アラビノ−ス生産経路の１つ以上の酵素を発現するように改変され得、一方、他の細胞集団（またはいくつかの他の細胞集団）は、アラビノ−ス生産経路の別の（少なくとも１つの他の）酵素を発現するように改変され得る。したがっていくつかの態様において、方法は、少なくとも１つのα−グルカンホスホリラ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、少なくとも１つのホスホグルコムタ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、少なくとも１つのグルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、少なくとも１つの６−ホスホグルコノラクトナ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、少なくとも１つの６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、少なくとも１つのアラビノ−ス５−リン酸イソメラ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、および／または少なくとも１つのアラビノ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、を含む。いくつかの態様において、方法は、少なくとも１つのセロデキストリンホスホリラ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、少なくとも１つのホスホグルコムタ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、少なくとも１つのグルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、少なくとも１つの６−ホスホグルコノラクトナ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、少なくとも１つの６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、少なくとも１つのアラビノ−ス５−リン酸イソメラ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、および／または少なくとも１つのアラビノ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、を含む。細胞の溶解後、細胞ライセ−トを、酵素が単一の細胞ライセ−ト／反応混合物中に存在するように組み合わせる。
【００８４】
いくつかの態様において、方法はさらに、細胞ライセ−ト（または細胞ライセ−ト混合物）を、望ましくない天然の酵素活性を不活性化するが生産経路のいかなる耐熱性酵素も不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産することを含む。細胞ライセ−トは、いくつかの態様において、少なくとも５０℃の温度に加熱される。例えば細胞ライセ−トを、少なくとも５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃、８５℃、または９０℃の温度に加熱することができる。
細胞ライセ−トは、細胞の天然酵素（または他の非耐熱性酵素）を不活性化するのに十分な時間加熱することができる。例えば、細胞ライセ−トを少なくとも２、３、４、または少なくとも５分間加熱することができる。いくつかの態様においては、細胞ライセ−トを５分より長く加熱する。いくつかの態様において、細胞ライセ−トは、天然酵素（または他の非耐熱性酵素）の活性を少なくとも５０％（例えば、少なくとも６０％、７０％、８０％、または９０％）低下させるのに十分な時間加熱される。
【００８５】
熱不活性化に続いて、いくつかの態様において、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、または少なくとも３つ）の精製酵素が、細胞ライセ−ト／反応混合物に添加される。したがっていくつかの態様において、反応混合物は、細胞ライセ−ト中に存在する酵素（改変宿主細胞によって発現される）と少なくとも１つの精製酵素の組み合わせを含む。少なくとも１つの精製酵素は、α−グルカンホスホリラ−ゼまたはセロデキストリンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、アラビノ−ス５−リン酸イソメラ−ゼ、およびアラビノ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択され得る。
いくつかの態様において、方法はまた、熱不活化ライセ−トを、デンプンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、アラビノ−スを生産することを含む。いくつかの態様において、方法はまた、熱不活化ライセ−トを、セロデキストリンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、アラビノ−スを生産することを含む。いくつかの態様において、熱不活化ライセ−トは、少なくとも５０℃の温度でインキュベ−トされる。いくつかの態様において、熱不活化ライセ−トは、少なくとも２分間（例えば、少なくとも３、４、または５分間）インキュベ−トされる。例えば、熱不活化ライセ−トは、２〜５分間、または２〜１０分間インキュベ−トすることができる。デンプンは、例えば、アミロ−ス、アミロペクチン、またはアミロ−スとアミロペクチンの混合物であり得る。いくつかの態様において、バイオマスがデンプンの代わりに使用される。これらの態様において、反応は、セロデキストリンホスホリラ−ゼを含む。いくつかの態様において、デンプンまたはセロデキストリンは、化合物の成分として存在する。
【００８６】
本明細書ではまた、アラビノ−スの生産に使用される細胞および細胞ライセ−トも提供される。したがって、本開示の改変細胞（例えば、細菌細胞および／または酵母細胞）または細胞ライセ−トは、α−グルカンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、アラビノ−ス５−リン酸イソメラ−ゼ、およびアラビノ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つ）の酵素を含み得る。本開示の改変細胞（例えば、細菌細胞および／または酵母細胞）または細胞ライセ−トは、セロデキストリンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、アラビノ−ス５−リン酸イソメラ−ゼ、およびアラビノ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つ）の酵素を含み得る。いくつかの態様において、本開示の改変細胞（例えば、細菌細胞および／または酵母細胞）または細胞ライセ−トは、耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、耐熱性アラビノ−ス５−リン酸イソメラ−ゼ、および耐熱性アラビノ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つ）の酵素を含み得る。本開示の改変細胞（例えば、細菌細胞および／または酵母細胞）または細胞ライセ−トは、耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、耐熱性アラビノ−ス５−リン酸イソメラ−ゼ、および耐熱性アラビノ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つ）の酵素を含み得る。
【００８７】
基質の柔軟性および枝切り酵素
本明細書に記載のすべての経路について、複数の多量体グルコ−ス基質を使用することができる。多量体グルコ−ス基質の非限定的な例には、デンプン、グリコ−ゲン、およびセロデキストリンが含まれる。いくつかの態様において、基質はデンプンである。他の態様において、基質はグリコ−ゲンである。さらに他の態様において、基質はセロデキストリンである。いくつかの態様において、多量体グルコ−ス基質（例えば、デンプン、グリコ−ゲン、またはセルロ−ス／セロデキストリン）の部分的加水分解物が使用される。デンプンおよびグリコ−ゲンは、主にα（１−４）結合によって結合した複数のグルコ−スモノマ−を含み、一方、セロデキストリンは、β（１−４）結合によって結合した同じグルコ−スモノマ−を含む。セロデキストリンと他の２つの基質との間のもう１つの大きな違いは、α（１−４）鎖から分枝したα（１−６）分枝の存在である。デンプンとグリコ−ゲンの両方がこれらの分枝点を含むが、ただしグリコ−ゲンはデンプンよりも実質的により分枝している。α（１〜４）多量体については、α−グルカンホスホリラ−ゼ（基質の選好に応じてα−グルカンホスホリラ−ゼまたはグリコ−ゲンホスホリラ−ゼとも呼ばれる）は、グルコ−ス１−リン酸を放出するときに多量体を１グルコ−スずつ消費する。セロデキストリンについては、セロデキストリンホスホリラ−ゼが同じ反応を行い、グルコ−ス１−リン酸を放出する。
【００８８】
デンプンおよびセルロ−ス／セロデキストリンの長い多量体は、しばしば水溶液に不溶であり、析出することに加えて、溶液のゲル化および劣化を引き起こす可能性がある。デンプンおよびセルロ−ス／セロデキストリンが、化学的（例えば、酸加水分解）または酵素的（例えば、α−アミラ−ゼ）方法のいずれかにより部分的に加水分解されて、より短い鎖長の多量体になる場合、得られる産物は、デンプンおよびセルロ−スに対してそれぞれマルトデキストリンおよびセロデキストリンである。これらの加水分解誘導体は、多くの場合、それらの親分子よりも可溶化および混合が良好であり、したがっていくつかの態様において、本明細書で提供される経路で使用される。
【００８９】
グリコ−ゲン、デンプン、または加水分解マルトデキストリンについては、α（１−６）分枝はあらゆる糖経路の収率を実質的に低下させるが、これは、グルカンホスホリラ−ゼが多量体をそれらの分枝の末端まで噛み込んで、利用可能なグルコ−スの大きな中心コアを未変換のままにするためである。これらの基質／経路については、枝切り酵素を使用して、グルカンホスホリラ−ゼに対する基質の利用可能性を高めることができる。使用可能な２つの例示的なクラスの枝切り酵素−−イソアミラ−ゼおよびプルラナ−ゼがある（例えば表３参照）。酵素的には、両方のクラスは同じ機能を果たすが、基質特異性は異なる。枝切り酵素を使用すると収量が増加する一方で、使用のタイミングは使用されるプロセスと基質に依存する。いくつかの態様において、α−グルカンをα−アミラ−ゼおよび枝切り酵素で前処理し、次いで得られた脱分岐マルトデキストリンを他の経路酵素と共に反応器に供給する。他の態様において、枝切りは経路と同時に起こり、分枝α−グルカンは全ての経路酵素および枝切り酵素を含有する反応に供給される。
表３．例示の枝切り酵素
【表３】
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【００９０】
無細胞的生産
「無細胞的生産」は、生細胞を用いることのない、生体分子または化学物質の合成のための生物学的プロセスの使用である。むしろ、細胞は溶解され、酵素を含有する未精製（クル−ド）部分が、所望の産物の生産のために用いられる。非限定的な例として、細胞は培養され、収穫され、および高圧ホモジナイゼ−ションによって溶解される。無細胞的反応は、バッチまたはフェドバッチモ−ドで行われ得る。いくつかの場合には、生物学的反応ネットワ−クは反応器の有効体積を満たし、細胞内環境よりも希釈され得る。それでもやはり、膜結合している触媒を含む、細胞内触媒の実質的に全てが提供される。内膜は細胞溶解の間に断片化され、それらの膜の断片は機能性膜小胞を形成する。したがって、複雑な生体内変化が触媒作用によってもたらされる。例えば、参照によって本明細書に組み込まれるSwartz, AIChE Journal, 2012, 58(1), 5−13参照。
【００９１】
本開示の無細胞的方法およびシステムは、いくつかの態様において、本明細書においてより詳細に論じられる細胞ライセ−ト（例えば、クル−ドなまたは部分精製された細胞ライセ−ト）を利用する。細胞ライセ−トは、例えば機械的手段（例えば、剪断または粉砕）によって調製され得る。いくつかの態様において、細胞ライセ−トは化学的透過処理細胞とは異なる。本明細書で論じるように、いくつかの態様においては、細胞溶解（例えば、機械的な細胞溶解）の間に細胞内膜は断片化され、その結果、反転膜小胞が細胞ライセ−ト中に形成される。溶解される細胞（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％）はもはや原形ではない。
いくつかの態様において、透過処理細胞が使用される。透過処理細胞は、パ−フォレ−ション（小さい穴）を含有する原形の細胞である。いくつかの態様において、細胞は、本明細書に提供されるような反応において使用するために、細胞内容物を放出するように透過処理されてもよい。
いくつかの態様において、部分的精製細胞画分が使用される。部分的に精製された細胞画分は、そこから１つ以上の細胞成分（例えば、細胞膜）が部分的にまたは完全に除去された細胞ライセ−トである。
【００９２】
耐熱性酵素
酵素は、酵素が（ａ）他の天然酵素を変性させる高温への暴露後に、その活性の実質的部分を保持するか、または（ｂ）天然酵素が低速で機能する中〜高温への暴露後に、比較的高い速度で機能する場合に、耐熱性とみなされる。
いくつかの態様において、耐熱性酵素は、類似の（非耐熱性）天然酵素を変性させるであろう比較的高い温度への曝露後に、５０％を超える活性を保持する。いくつかの態様において、耐熱性酵素は、類似の（非耐熱性）天然酵素を変性させるであろう比較的高い温度への曝露後に、５０〜１００％の活性を保持する。例えば、耐熱性酵素は、類似の（非耐熱性）天然酵素を変性させるであろう比較的高い温度への曝露後に、その活性の５０〜９０％、５０〜８５％、５０〜８０％、５０〜７５％、５０〜７０％、５０〜６５％、５０〜６０％、または５０〜５５％を保持し得る。いくつかの態様において、耐熱性酵素は、類似の（非耐熱性）天然酵素を変性させるであろう比較的高い温度への曝露後に、その活性の２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％を保持する。
【００９３】
いくつかの態様において、媒体を中温から高温に暴露した後の耐熱性酵素の活性は、類似の（非耐熱性）天然酵素の活性より、（例えば、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％）高い。
耐熱性酵素（例えば、ホスファタ−ゼまたはホスホリラ−ゼ）は、例えば、４５℃〜８０℃、またはそれ以上の温度で活性を維持し得る（反応を触媒することができる）。いくつかの態様において、耐熱性酵素は、４５〜８０℃、４５〜７０℃、４５〜６０℃、４５〜５０℃、５０〜８０℃、５０〜７０℃、５０〜６０℃、６０〜８０℃、６０〜７０℃、または７０〜８０℃の温度で活性を維持する。例えば、耐熱性酵素は、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、または８０℃の温度で、活性を維持し得る。耐熱性酵素は、比較的高温に暴露された後、比較的高温で１５分から４８時間、またはそれ以上、活性を維持することができる。例えば、耐熱性酵素は、比較的高温で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２４、３６、４２、または４８時間、活性を維持し得る。
【００９４】
改変細胞
本開示の改変細胞は、いくつかの態様において、デンプンおよび／またはセルロ−ス／セロデキストリンを糖に変換するために必要とされる酵素活性の少なくとも１つ、または全てを含む。「改変細胞」とは、少なくとも１つの改変（例えば、組換え体または合成）核酸を含むか、またはそれらの天然に生ずるカウンタ−パ−トとは構造的および／もしくは機能的に別物であるように別様に修飾されている細胞である。それゆえに、改変核酸を含有する細胞は「改変細胞」と見なされる。
本開示の改変細胞は、いくつかの態様において、α−グルカンホスホリラ−ゼ（例えば、耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ）および／またはセロデキストリンホスホリラ−ゼ（例えば、耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼ）、ホスホグルコムタ−ゼ（例えば、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ）、およびイソメラ−ゼ、エピメラ−ゼ、デヒドロゲナ−ゼ、および糖ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素（例えば耐熱性酵素）を含む。
【００９５】
いくつかの態様において、改変細胞は選択マ−カ−を発現する。選択マ−カ−は、細胞のトランスフェクション後に（または外来性の核酸を細胞内に導入するために用いられる他の手続き後に）、改変核酸を取り込んで発現する改変細胞を選択するために、典型的に用いられる。それゆえに、産物をコ−ドする核酸は、選択マ−カ−もまたコ−ドし得る。選択マ−カ−の例は、限定なしに、抗生物質（例えば、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、およびクロラムフェニコ−ル耐性遺伝子）または他の化合物に対する耐性または感受性どちらかを増大または減少させるタンパク質をコ−ドする遺伝子を包含する。他の選択マ−カ−が本開示に従って用いられ得る。
改変細胞は、核酸（例えば改変核酸）によってコ−ドされる産物が細胞内で生産される場合に、産物を「発現する」。遺伝子発現が、核酸の形態の遺伝子命令が用いられてタンパク質（例えば酵素）などの産物を合成するプロセスを言う、ということは当分野において公知である。
【００９６】
改変細胞は、原核細胞または真核細胞であり得る。いくつかの態様において、改変細胞は、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞、または細胞の他の型である。
本開示において有用な改変細菌細胞は、限定なしに、改変Escherichia spp.、Streptomyces spp.、Zymomonas spp.、Acetobacter spp.、Citrobacter spp.、Synechocystis spp.、Rhizobium spp.、Clostridium spp.、Corynebacterium spp.、Streptococcus spp.、Xanthomonas spp.、Lactobacillus spp.、Lactococcus spp.、Bacillus spp.、Alcaligenes spp.、Pseudomonas spp.、Aeromonas spp.、Azotobacter spp.、Comamonas spp.、Mycobacterium spp.、Rhodococcus spp.、Gluconobacter spp.、Ralstonia spp.、Acidithiobacillus spp.、Microlunatus spp.、Geobacter spp.、Geobacillus spp.、Arthrobacter spp.、Flavobacterium spp.、Serratia spp.、Saccharopolyspora spp.、Thermus spp.、Stenotrophomonas spp.、Chromobacterium spp.、Sinorhizobium spp.、Saccharopolyspora spp.、Agrobacterium spp.、およびPantoea spp.を包含する。
【００９７】
本開示において有用な改変酵母細胞は、限定なしに、改変Saccharomyces spp.、Schizosaccharomyces、Hansenula、Candida、Kluyveromyces、Yarrowia、およびPichiaを包含する。
いくつかの態様において、本開示において有用な改変細胞は、改変Escherichia coli細胞、Bacillus subtilis細胞、Pseudomonas putida細胞、Saccharomyces cerevisae細胞、またはLactobacillus brevis細胞である。いくつかの態様において、本開示において有用な改変細胞は、改変Escherichia coli細胞である。
【００９８】
改変核酸
「核酸」は、共有結合的に一緒に連結された少なくとも２つのヌクレオチドであり、いくつかの場合にはホスホジエステル結合（例えばホスホジエステル「バックボ−ン」）を含有し得る。核酸（例えば、核酸の成分または部分）は、天然に生ずるかまたは改変され得る。「天然に生ずる」核酸は、ヒトの介入の非存在下において天然に存在する細胞内に存在する。「改変核酸」は、組換え体核酸および合成核酸を包含する。「組換え体核酸」は、（例えば同じ種からのまたは異なる種からの）核酸分子同士を繋ぎ合わせることによって構築される分子を言い、典型的には生細胞内で複製し得る。「合成核酸」は、生物学的に合成、化学的に合成、または他の手段によって合成もしくは増幅される分子を言う。合成核酸は、化学的に修飾または別様に修飾されているが、天然に生ずる核酸分子と塩基対形成し得る核酸を包含する。組換え体および合成核酸は、前述のどちらかの複製からもたらされる分子をもまた包含する。改変核酸は天然に生ずる核酸の部分を含有し得るが、全体としては、改変核酸は天然には生じず、ヒトの介入を要求する。いくつかの態様において、本開示の産物をコ−ドする核酸は、組換え体核酸または合成核酸である。他の態様において、産物をコ−ドする核酸は、天然に生ずる。
【００９９】
本明細書において提供される、酵素をコ−ドする改変核酸は、核酸のコントロ−ル領域である「プロモ−タ−」に作動可能に連結され得、そこでは核酸の残りの転写の開始および速度がコントロ−ルされる。プロモ−タ−は、それが制御する核酸の発現を駆動しまたは転写を駆動する。
プロモ−タ−は、遺伝子または配列に天然に結び付けられているものであり得、所与の遺伝子または配列のコ−ドセグメントの上流に位置する５’非コ−ド配列を単離することによって得られ得る。かかるプロモ−タ−は「内在性」と言われ得る。
いくつかの態様において、コ−ド核酸配列は、組換え体または異種プロモ−タ−のコントロ−ル下に配置され得、これは、通常ではその天然環境においてはコ−ドされている配列に結びつけられていないプロモ−タ−を言う。かかるプロモ−タ−は、他の遺伝子のプロモ−タ−；いずれかの他の細胞から単離されたプロモ−タ−；および例えば、異なる転写制御領域の異なるエレメント同士および／または当分野において公知である遺伝子工学の方法によって発現を変化させる変異を含有するものなどの、「天然に生じ」ない合成プロモ−タ−またはエンハンサ−を包含し得る。プロモ−タ−およびエンハンサ−の核酸配列を合成的に生産することに加えて、配列は、組換えクロ−ニングおよび／またはポリメラ−ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を包含する核酸増幅テクノロジ−を用いて、生産され得る。
【０１００】
プロモ−タ−は、それが制御する核酸に対して正しい機能的な位置および向きにあって、その核酸の転写開始および／または発現をコントロ−ルする（「駆動する」）ときに、「作動可能に連結」されていると見なされる。
本開示の改変核酸は、構成的プロモ−タ−または誘導型プロモ−タ−を含有し得る。「構成的プロモ−タ−」は、細胞内において常に活性であるプロモ−タ−を言う。「誘導型プロモ−タ−」は、誘導因子もしくは誘導剤の存在下にあるか、それによって影響されるか、もしくはそれと接触するか、または抑圧を引き起こす因子の非存在下において活性化されるときに、転写活性を開始または増強するプロモ−タ−を言う。本開示に従う使用のための誘導型プロモ−タ−は、本明細書に記載されるかまたは当業者に公知のいずれかの誘導型プロモ−タ−を包含する。誘導型プロモ−タ−の例は、限定なしに、化学的／生化学的に制御および物理的に制御されるプロモ−タ−、例えばアルコ−ルによって制御されるプロモ−タ−、テトラサイクリンによって制御されるプロモ−タ−、ステロイドによって制御されるプロモ−タ−、金属によって制御されるプロモ−タ−、発病機構によって制御されるプロモ−タ−、温度／熱誘導型、リン酸によって制御される（例えばＰｈｏＡ）、および光によって制御されるプロモ−タ−を包含する。
【０１０１】
誘導因子または誘導剤は、内在的もしくは通常では外来的な条件（例えば光）、化合物（例えば、化学もしくは非化学化合物）、または誘導型プロモ−タ−からの転写活性を制御する点で活性であるようなやり方で誘導型プロモ−タ−に接触するタンパク質であり得る。それゆえに、核酸の「転写を制御するシグナル」は、誘導型プロモ−タ−に作用する誘導因子シグナルを言う。転写を制御するシグナルは、用いられる制御システムに依存して転写を活性化または不活性化し得る。転写の活性化には、プロモ−タ−に直接的に作用して転写を駆動すること、またはプロモ−タ−が転写を駆動することを防ぐリプレッサ−を不活性化することによって、プロモ−タ−に間接的に作用することが関わり得る。反対に、転写の脱活性化には、プロモ−タ−に直接的に作用して転写を防ぐこと、またはリプレッサ−を活性化し、これがそれからプロモ−タ−に作用することによって、プロモ−タ−に間接的に作用することが関わり得る。
【０１０２】
改変核酸は、当分野において公知のいずれかの手段を用いてホスト細胞内に導入され得、限定なしに、形質転換、トランスフェクション（例えば、化学的（例えば、リン酸カルシウム、カチオン性ポリマ−、もしくはリポソ−ム）または非化学的（例えば、エレクトロポレ−ション、ソノポレ−ション、インペイルフェクション（impalefection）、光学的トランスフェクション、流体力学的））、および形質導入（例えば、ウイルス系形質導入）を包含する。
天然に生ずる細胞内核酸によってコ−ドされる酵素または他のタンパク質は、「内在性酵素」または「内在性タンパク質」と言われ得る。
【０１０３】
プロテア−ゼ標的化
本開示の改変細胞は、目的の糖（例えば、アルロ−ス）の生産に悪影響を与える可能性のある細胞の健康に必要な酵素を、発現（例えば、内在的に発現）し得る。かかる酵素は、本明細書において「標的酵素」と呼ばれる。例えば、改変細胞が発現する標的酵素は、基質または補因子について、糖生産経路に供給される前駆体の速度を増加させる酵素と競合し得る。別の例として、改変細胞が発現する標的酵素は、基質または補因子について、糖生産経路の鍵となる経路入り口酵素（pathway entry enzyme）である酵素と競合し得る。さらに別の例として、改変細胞が発現する標的酵素は、基質または補因子について、糖生産経路の基質または補因子を供給する酵素と競合し得る。
この負の影響を無効化または軽減するために、標的酵素を修飾してそれらのタンパク質配列に部位特異的プロテア−ゼ認識配列を包含させ、標的酵素が「標的化」されて、糖生産中の不活性化のために切断され得るようにすることができる（例えば、２０１２年３月１日公開の米国公開第2012/0052547 A1号；および２０１５年２月１２日公開の国際公開第WO 2015/021058 A2号を参照、それぞれは参照により、本明細書に組み込まれる）。
【０１０４】
部位特異的プロテア−ゼ認識配列を含有する標的酵素の切断は、細胞増殖段階（例えば、改変細胞が培養されるにつれて）の細胞のペリプラズムに（標的酵素とは別に）隔離されて、変換段階（例えば、細胞ライセ−トを生産するためいの細胞溶解後）の間に標的酵素と接触させられる、同種の部位特異的プロテア−ゼとの接触からもたらされる。したがって本開示の改変細胞は、いくつかの態様において、以下を含む：（ｉ）変換速度に悪影響を及ぼしかつ標的酵素のタンパク質配列中に部位特異的プロテア−ゼ認識配列を含む標的酵素を、コ−ドする、改変核酸、および（ｉｉ）標的酵素の部位特異的プロテア−ゼ認識配列を切断しかつペリプラズム標的化配列を含む部位特異的プロテア−ゼを、コ−ドする、改変核酸。このペリプラズム標的化配列は、細胞が溶解するまで、部位特異的プロテア−ゼを細胞のペリプラズム空間に隔離することを担う。ペリプラズム標的化配列の例を以下に提供する。
【０１０５】
本開示に従って使用され得るプロテア−ゼの例としては、限定はされないが、以下を含む：アラニンカルボキシペプチダ−ゼ、アスタシン、細菌ロイシルアミノペプチダ−ゼ、癌由来凝固促進因子、カテプシンＢ、クロストリパイン、細胞質アラニルアミノペプチダ−ゼ、エラスタ−ゼ、エンドプロテイナ−ゼＢｒｇ−Ｃ、エンテロキナ−ゼ、ガストリシン、ゼラチナ−ゼ、Ｇｌｙ−Ｘカルボキシペプチダ−ゼ、グリシルエンドペプチダ−ゼ、ヒトライノウイルス３Ｃプロテア−ゼ、ヒポデルミンＣ、Ｉｇａ特異的セリンエンドペプチダ−ゼ、ロイシルアミノペプチダ−ゼ、ロイシルエンドペプチダ−ゼ、ｌｙｓＣ、リソソ−ムｐｒｏ−Ｘカルボキシペプチダ−ゼ、リシルアミノペプチダ−ゼ、メチオニルアミノペプチダ−ゼ、ミクソバクタ−（myxobacter）、ナルディライジン、膵エンドペプチダ−ゼＥ、ピコルナイン（picornain）２Ｂ、ピコルナイン（picornain）３Ｃ、プロエンドペプチダ−ゼ、プロリルアミノペプチダ−ゼ、プロタンパク質転換酵素Ｉ、プロタンパク質転換酵素ＩＩ、ラッセルライジン（russellysin）、サッカロペプシン（saccharopepsin）、セメノゲラ−ゼ、Ｔ−プラスミノ−ゲン活性化因子、トロンビン、組織カリクレイン、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）、トガビリン、トリプトファニルアミノペプチダ−ゼ、Ｕ−プラスミノ−ゲン活性化因子、Ｖ８、ベノムビンＢ、ベノムビンＢＢ、およびＸａａ−Ｐｒｏアミノペプチダ−ゼ。
【０１０６】
ペリプラズム標的化
糖生産経路の酵素は、細胞の健康状態（例えば、生存能力）に悪影響を及ぼす、少なくとも１つの酵素を含み得る。この悪影響を無効化または軽減するために、酵素を転置配列を含むように修飾して細胞内または細胞外区画に転置させ、酵素が天然では位置せずかつ細胞の健康に悪影響を及ぼさない配置にすることができる（例えば、２０１１年１１月１０日公開の公開番号US−2011−0275116−A1を参照、これは参照により本明細書に組み入れられる）。例えば、糖生産経路の酵素は、細胞のペリプラズム空間に転置され得る。
したがっていくつかの態様において、本開示の改変細胞は、ペリプラズム標的化配列に連結されている糖生産経路の少なくとも１つの酵素を含む。「ペリプラズム標的化配列」は、それが連結されているタンパク質を細胞のペリプラズムに標的化するアミノ酸配列である。ペリプラズム標的化配列に連結されているタンパク質は、そのタンパク質が発現される細胞のペリプラズム内に隔離されるであろう。
【０１０７】
ペリプラズム標的化配列は、例えば、細菌分泌タンパク質のＮ末端に由来し得る。配列は、長さが約１５〜約７０アミノ酸まで変化する。ペリプラズム標的化配列の一次アミノ酸配列は様々であるが、一般に以下の成分を含む共通の構造を有する：（ｉ）Ｎ末端部は可変長を有し、一般に正味の正電荷を持ち；（ｉｉ）それに続くのは約６〜約１５アミノ酸の疎水性の中心コアであり；（ｉｉｉ）最後の成分はシグナルペプチダ−ゼの切断部位を規定する４〜６のアミノ酸を含む。
【０１０８】
本開示のペリプラズム標的化配列は、いくつかの態様において、グラム陰性菌によって分泌されるタンパク質に由来し得る。分泌タンパク質は、細菌によって、または細菌に感染するバクテリオファ−ジによってコ−ドされてもよい。分泌タンパク質のグラム陰性細菌供給源の例としては、限定はされないが、以下の属のメンバ−が挙げられる：Escherichia、Pseudomonas、Klebsiella、Salmonella、Caulobacter、Methylomonas、Acetobacter、Achromobacter、Acinetobacter、Aeromonas、Agrobacterium、Alcaligenes、Azotobacter、Burkholderia、Citrobacter、Comamonas、Enterobacter、Erwinia、Rhizobium、Vibrio、およびXanthomonas。
【０１０９】
本開示に従って使用するためのペリプラズム標的化配列の例としては、限定はされないが、以下からなる群から選択される配列が挙げられる：
MKIKTGARILALSALTTMMFSASALA（配列番号１）；
MKQSTIALALLPLLFTPVTKA（配列番号２）；
MMITLRKLPLAVAVAAGVMSAQAMA（配列番号３）；
MNKKVLTLSAVMASMLFGAAAHA（配列番号４）；
MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA（配列番号５）；
MKKIWLALAGLVLAFSASA（配列番号６）；
MMTKIKLLMLIIFYLIISASAHA（配列番号７）；
MKQALRVAFGFLILWASVLHA（配列番号８）；
MRVLLFLLLSLFMLPAFS（配列番号９）；および
MANNDLFQASRRRFLAQLGGLTVAGMLGPSLLTPRRATA（配列番号１０）。
【０１１０】
細胞培養物および細胞ライセ−ト
典型的には、改変細胞は培養される。「培養する」とは、細胞がコントロ−ルされた条件下において、典型的にはそれらの天然環境の外において増殖させられるプロセスを言う。例えば、改変細菌細胞などの改変細胞は、液体「培養培地」ともまた言われる液体栄養素ブロス中において、細胞懸濁液として増殖させられ得る。
いくつかの態様において、無変換デンプンを、増殖細胞用の基質フィ−ドとして使用する。
普通に用いられる細菌Escherichia coli増殖培地の例は、限定なしに、ＬＢ（Luria Bertani）Ｍｉｌｌｅｒブロス（１％ＮａＣｌ）：１％ペプトン、０．５％酵母エキス、および１％ＮａＣｌ；ＬＢ（Luria Bertani）Ｌｅｎｎｏｘブロス（０．５％ＮａＣｌ）：１％ペプトン、０．５％酵母エキス、および０．５％ＮａＣｌ；ＳＯＢ培地（ス−パ−オプティマルブロス）：２％ペプトン、０．５％酵母エキス、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭＫＣ１、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４；ＳＯＣ培地（異化抑制因子を有するス−パ−オプティマルブロス）：ＳＯＢ＋２０ｍＭグルコ−ス；２×ＹＴブロス（２×酵母エキスおよびトリプトン）：１．６％ペプトン、１％酵母エキス、および０．５％ＮａＣｌ；ＴＢ（テリフィックブロス）培地：１．２％ペプトン、２．４％酵母エキス、７２ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４、１７ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、および０．４％グリセロ−ル；ならびにＳＢ（ス−パ−ブロス）培地：３．２％ペプトン、２％酵母エキス、および０．５％ＮａＣｌ、ならびに／またはＫｏｒｚ培地（Korz, DJ et al. 1995）を包含する。
【０１１１】
高密度の細菌Escherichia coli増殖培地の例は、ＤＮＡＧｒｏ（商標）培地、ＰｒｏＧｒｏ（商標）培地、ＡｕｔｏＸ（商標）培地、ＤｅｔｏＸ（商標）培地、ＩｎｄｕＸ（商標）培地、およびＳｅｃＰｒｏ（商標）培地を包含するが、これに限定されない。
いくつかの態様において、改変細胞は、酵素または核酸の発現をもたらす条件下において培養される。かかる培養条件は、発現されようとする特定の産物と産物の所望の量とに依存し得る。
いくつかの態様において、改変細胞は３０℃から４０℃の温度で培養される。例えば、改変細胞は、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、または４０℃の温度で培養され得る。典型的には、改変細胞、例えば改変細菌細胞は、３７℃の温度で培養される。
【０１１２】
いくつかの態様において、改変細胞は、１２時間から７２時間、またはより長時間培養される。例えば、改変細胞は、１２、１８、２４、３０、３６、４２、４８、５４、６０、６６、または７２時間培養され得る。典型的には、改変細菌細胞などの改変細胞は、１２から２４時間培養される。いくつかの態様において、改変細胞は、３７℃の温度で１２から２４時間培養される。
いくつかの態様において、改変細胞は（例えば、液体細胞培養培地中において）、６００ｎｍの波長で測定された場合に５から２００の光学密度（ＯＤ６００）まで培養される。いくつかの態様において、改変細胞は、５、１０、１５、２０、または２５のＯＤ６００まで培養される。
【０１１３】
いくつかの態様において、改変細胞は、１×１０４〜１×１０８生存可能細胞／ｍｌ細胞培養培地の密度で培養される。いくつかの態様において、改変細胞は、１×１０４、２×１０４、３×１０４、４×１０４、５×１０４、６×１０４、７×１０４、８×１０４、９×１０４、１×１０５、２×１０５、３×１０５、４×１０５、５×１０５、６×１０５、７×１０５、８×１０５、９×１０５、１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、１×１０９、または１×１０１０生存可能細胞／ｍｌの密度まで培養される。いくつかの態様において、改変細胞は、１×１０８〜１×１０１０生存可能細胞／ｍｌの密度まで培養される。
いくつかの態様において、改変細胞はバイオリアクタ−内で培養される。バイオリアクタ−は単純に、細胞が培養される容器、例えば培養フラスコ、ディッシュ、またはバッグを言い、これらは単回使用（使い捨て）、オ−トクレ−ブ可能、または滅菌可能であり得る。バイオリアクタ−はガラスから作られ得、またはこれはポリマ−に基づき得、またはこれは他の材料から作られ得る。
【０１１４】
バイオリアクタ−の例は、限定なしに、撹拌槽（例えば完全混合）バイオリアクタ−および管型（例えば押し出し流れ）バイオリアクタ−、エアリフトバイオリアクタ−、膜撹拌槽、スピンフィルタ−撹拌槽、バイブロミキサ−、流動床反応器、ならびに膜バイオリアクタ−を包含する。バイオリアクタ−を作動させるモ−ドは、バッチまたは連続プロセスであり得、培養されようとする改変細胞に依存するであろう。バイオリアクタ−は、フィ−ドおよび産物流が連続的にフィ−ドされてシステムから取り出されるときに、連続的である。バッチ式バイオリアクタ−は、連続的な再循環流れを有し得るが、栄養素の連続的なフィ−ドまたは産物収穫はない。断続的収穫およびフェドバッチ（fed−batch）（またはバッチフェド（batch fed））培養では、細胞は、組成がバッチ培地に類似である培地に、より低い生存可能細胞密度で接種される。細胞は、栄養素がやや枯渇し細胞が定常増殖段階に近づくまで、本質的に外的操作なしに指数増殖することを許容される。この時点において、断続的収穫バッチフェド（batch fed）プロセスでは、細胞および産物の部分が収穫され得、除去された培養培地が新しい培地によって補充される。このプロセスは数回繰り返され得る。組換え体タンパク質および抗体の生産のためには、フェドバッチプロセスが用いられ得る。細胞が指数増殖していくが栄養素が枯渇してくる一方で、濃縮されたフィ−ド培地（例えば、１０〜１５倍濃縮された基礎培地）が連続的または断続的どちらかで追加されて、追加の栄養素を供給し、細胞濃度と変換段階の長さとのさらなる増大を許す。新しい培地が、培養培地（ブロス）の除去なしに細胞濃度に比例して追加され得る。培地の追加を収容するように、フェドバッチ培養はバイオリアクタ−の満容量よりも大幅に低い体積（例えば、最大体積のおよそ４０％から５０％）で開始される。
【０１１５】
本開示のいくつかの方法は、糖の大スケ−ル生産を対象とする。大スケ−ル生産方法では、改変細胞は、５リットル（Ｌ）から５０Ｌの、またはより多くの体積の液体培養培地中で増殖させられ得る。いくつかの態様において、改変細胞は、１０Ｌより大きい（またはそれに等しい）体積の液体培養培地中で増殖させられ得る。いくつかの態様において、改変細胞は、５Ｌ、１０Ｌ、１５Ｌ、２０Ｌ、２５Ｌ、３０Ｌ、３５Ｌ、４０Ｌ、４５Ｌ、５０Ｌ、またはより多くの体積の液体培養培地中で増殖させられる。いくつかの態様において、改変細胞は、５Ｌから１０Ｌ、５Ｌから１５Ｌ、５Ｌから２０Ｌ、５Ｌから２５Ｌ、５Ｌから３０Ｌ、５Ｌから３５Ｌ、５Ｌから４０Ｌ、５Ｌから４５Ｌ、１０Ｌから１５Ｌ、１０Ｌから２０Ｌ、１０Ｌから２５Ｌ、２０Ｌから３０Ｌ、１０Ｌから３５Ｌ、１０Ｌから４０Ｌ、１０Ｌから４５Ｌ、１０Ｌから５０Ｌ、１５Ｌから２０Ｌ、１５Ｌから２５Ｌ、１５Ｌから３０Ｌ、１５Ｌから３５Ｌ、１５Ｌから４０Ｌ、１５Ｌから４５Ｌ、または１５から５０Ｌの体積の液体培養培地中で増殖させられ得る。
【０１１６】
典型的には、改変細胞を培養することには、細胞を溶解することが後続する。「溶解する」は、細胞が例えばウイルス的、酵素的、機械的、化学的、熱的、または浸透圧的機序によって破片化されるプロセスを言う。「細胞ライセ−ト」は、溶解された細胞（例えば、溶解された改変細胞）の内容物を含有する液を言い、例えばオルガネラ、膜脂質、タンパク質、核酸、および反転膜小胞を包含する。本開示の細胞ライセ−トは、本明細書において提供される改変細胞いずれかの集団を溶解することによって、生産され得る。「細胞ライセ−ト」は、透過処理／穿孔処理（perforated）細胞を除外してもよい。
「溶解する」と言われる細胞溶解の方法は当分野において公知であり、それらのいずれかが本開示に従って用いられ得る。かかる細胞溶解方法は、限定なしに、ホモジナイゼ−ションなどの物理的／機械的溶解、ならびに化学的、熱的、および／または酵素的溶解を包含する。
【０１１７】
細胞溶解は綿密にコントロ−ルされた細胞内環境を撹乱し得、無制御な内在性プロテア−ゼおよびホスファタ−ゼによるタンパク質分解および修飾をもたらす。それゆえに、いくつかの態様においては、プロテア−ゼ阻害剤および／またはホスファタ−ゼ阻害剤が細胞ライセ−トまたは溶解前の細胞に追加され得、またはそれらの活性は、遺伝子不活性化またはプロテア−ゼ標的化によって除去され得る。
いくつかの態様において、細胞ライセ−トは、少なくとも１つの栄養素と組み合わせられ得る。例えば、細胞ライセ−トはＮａ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、ＮＨ４Ｃｌ、ＮａＣｌ、ＭｇＳＯ４、ＣａＣｌ２と組み合わせられ得る。他の栄養素の例は、限定なしに、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、オロト酸マグネシウム、クエン酸マグネシウム、一塩基性リン酸カリウム、二塩基性リン酸カリウム、三塩基性リン酸カリウム、一塩基性リン酸ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム、三塩基性リン酸ナトリウム、一塩基性リン酸アンモニウム、二塩基性リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、および水酸化アンモニウムを包含する。
【０１１８】
いくつかの態様において、細胞ライセ−トは、化学的、熱的、酵素的または機械的手段によってさらに修飾されて特定の成分が濃縮または精製または低減または排除された、破壊された（disrupted）細胞懸濁液からなり得る。例えば、上記のような機械的、熱的、化学的または酵素的手段による破壊の後、得られた材料を機械的分離、例えば膜濾過、遠心分離またはその他の方法にかけることができ、選択した酵素活性を部分的に高め、または望ましくない酵素活性またはライセ−ト成分を除去することができる。さらなる例としては、塩または溶媒の、破壊された細胞懸濁液への添加、または破壊された細胞懸濁液のｐＨまたは温度の変更、その結果としての所望の活性の沈殿と、上記のような、その後の沈殿成分の機械的分離が挙げられ得る。逆に、塩もしくは溶媒の添加またはｐＨもしくは温度の変更は、それらの酵素の不活性化、または望ましくない１つもしくは複数の酵素活性の沈殿およびその後の機械的分離のいずれかを通して、望ましくない活性を排除するために利用できる。
【０１１９】
いくつかの態様において、細胞ライセ−トは、少なくとも１つの補因子と組み合わせられ得る。例えば、細胞ライセ−トは、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）、または酵素の活性のために要求される他の非タンパク質化学化合物（例えば、無機イオンおよび補酵素）と組み合わせられ得る。
いくつかの態様において、細胞ライセ−トは、デンプンまたはセルロ−ス／セロデキストリンの糖への変換をもたらす条件の下で、インキュベ−トされる。
単一の反応に用いられる細胞ライセ−トの体積は、変わり得る。いくつかの態様において、細胞ライセ−トの体積は、１から１５０ｍ３である。例えば、細胞ライセ−トの体積は１ｍ３、５ｍ３、１０ｍ３、１５ｍ３、２０ｍ３、２５ｍ３、３０ｍ３、３５ｍ３、４０ｍ３、４５ｍ３、５０ｍ３、５５ｍ３、６０ｍ３、６５ｍ３、７０ｍ３、７５ｍ３、８０ｍ３、８５ｍ３、９０ｍ３、９５ｍ３、１００ｍ３、１０５ｍ３、１１０ｍ３、１１５ｍ３、１２０ｍ３、１２５ｍ３、１３０ｍ３、１３５ｍ３、１４０ｍ３、１４５ｍ３、または１５０ｍ３であり得る。いくつかの態様において、細胞ライセ−トの体積は、２５ｍ３から１５０ｍ３、５０ｍ３から１５０ｍ３、または１００ｍ３から１５０ｍ３である。
【０１２０】
精製酵素
本発明のいくつかの態様において、酵素は、生産反応に添加する前に精製することができる。酵素精製は、材料の複雑な混合物からの、特定の酵素もしくは酵素活性または酵素群もしくは酵素活性の、任意の濃縮または抽出を意味すると理解されるべきであり、例としては、限定されないが、破壊細胞懸濁液または培養増殖培地が挙げられる。したがって精製酵素またはタンパク質は、複合マトリックスから分離または濃縮された酵素またはタンパク質であると理解されるべきであり、他のマトリックス成分と比較してその相対濃度は増加している。酵素を精製するための方法としては、限定はされないが、機械的、クロマトグラフィ−的、化学的、ｐＨまたは温度手段が挙げられる。例えば、破壊された細胞懸濁液に塩を添加して標的酵素またはタンパク質を沈殿させ、続いて沈殿した酵素またはタンパク質を機械的に、例えば膜濾過または遠心分離により、分離する。さらなる例は、親和性に基づくクロマトグラフィ−法（例えば、ヘキサ−ヒスチジン−タグまたはストレプトアビジンに基づく精製）を介した、複合マトリックスからの酵素の分離を含み得る。
【０１２１】
酵素特異性
酵素特異性は、酵素に固有の特性であって、該酵素が１つの基質に対して、他の基質と比較して改善された反応酵素速度論、熱力学または速度を示すものと理解されるべきである。高い特異性を有する酵素は、ミカエリス定数（Ｋｍ）またはＫｃａｔ／Ｋｍに対して高い触媒速度比（タ−ンオ−バ−数またはＫｃａｔとして定義される）を有することにより、最もよく例示される。高い基質特異性を有する酵素を有することは、これが反応速度を改善し、および非標的産物の生産を減少させることによって収率を改善するために、有利である。例えば、本明細書に記載のアルロ−ス生産のための経路は、化学構造が類似しているいくつかの中間体、すなわち、グルコ−ス１−リン酸、グルコ−ス６−リン酸、フルクト−ス６−リン酸およびアルロ−ス６−リン酸を有する。この方法における究極の酵素的ステップは、アルロ−ス６−リン酸の、アルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを介した産物アルロ−スへの脱リン酸化である。アルロ−ス６−リン酸に対して非常に高い特異性を有し、他の経路中間体、すなわちグルコ−ス１−リン酸、グルコ−ス６−リン酸およびフルクト−ス６−リン酸に対して比較的低い特異性を有する酵素を利用することが有利である。これらの中間体の触媒的脱リン酸化は、グルコ−スまたはフルクト−スのいずれかの生産をもたらし、したがって収率を低下させ、および産物の複雑さを増大させるであろう。
【０１２２】
追加の態様
１．アルロ−スを生産するための無細胞的方法であって、該方法が、
（ａ）耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ（デンプンホスホリラ−ゼとも呼ばれる）、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性ホスホグルコイソメラ−ゼ、耐熱性アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、および耐熱性アルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを発現するように改変された細胞を培養して、耐熱性酵素を発現する培養細胞を生産すること；
（ｂ）培養細胞を溶解して細胞ライセ−トを生産すること；
（ｃ）細胞ライセ−トを、天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ａ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること；および
（ｄ）熱不活化ライセ−トを、デンプンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、アルロ−スを生産すること；
を含む、前記方法。
【０１２３】
２．アルロ−スを生産するための無細胞的方法であって、該方法が、
（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで各集団の細胞は、耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性ホスホグルコイソメラ−ゼ、耐熱性アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、および耐熱性アルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生産する；
（ｂ）少なくとも２つの培養集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセ−トを生産すること；
（ｃ）少なくとも２つの細胞ライセ−トを組み合わせて、耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性ホスホグルコイソメラ−ゼ、耐熱性アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、および耐熱性アルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを含む細胞ライセ−ト混合物を生産すること；
（ｄ）細胞ライセ−ト混合物を、天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ｃ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること；および、
（ｅ）反応混合物を、デンプンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、アルロ−スを生産すること；
を含む、前記方法。
【０１２４】
３．アルロ−スを生産するための無細胞的方法であって、該方法が、
（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで各集団の細胞は、耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性ホスホグルコイソメラ−ゼ、耐熱性アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、および耐熱性アルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生産する；
（ｂ）少なくとも２つの培養集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセ−トを生産すること；
（ｃ）少なくとも２つの細胞ライセ−トを組み合わせて、細胞ライセ−ト混合物を生産すること；
（ｄ）細胞ライセ−ト混合物を、天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ａ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること； 
（ｅ）熱不活性化ライセ−トに、耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性ホスホグルコイソメラ−ゼ、耐熱性アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、および耐熱性アルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの精製酵素を添加して、α−グルカンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、ホスホグルコイソメラ−ゼ、アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、およびアルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを含む反応混合物を生産すること；および
（ｆ）反応混合物を、デンプンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、アルロ−スを生産すること；
を含む、前記方法。
【０１２５】
４．耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼが、Aquifex aeolicus、Thermocrinis minervae、 Thermosulfidibacter takaii、Thermosulfurimonas dismutans、Thermococcus litoralis、Palaeococcus pacificus、Thermotoga neapolitana、Ruminiclostridium thermocellum、Pyrococcus abyssi、Thermococcus thioreducens、Deinococcus radiodurans、Sulfolobus acidocaldarius、Thermus caldophilus、Meiothermus silvanus、Oceanithermus profundus、Ardenticatena maritima、Thermococcus barophilus、Pseudothermotoga thermarum、Hydrogenobacter thermophilus、Thermus oshimai、Meiothermus ruber、およびMarinitoga piezophilaのα−グルカンホスホリラ−ゼからなる群から選択される、態様１〜３のいずれか１つに記載の無細胞的方法。
【０１２６】
５．耐熱性ホスホグルコムタ−ゼが、Thermococcus kodakaraensis、Pyrococcus kukulkanii、Ammonifex degensii、Methanothermobacter wolfeii、Methanothermus fervidus、Sulfolobus acidocaldarius、Archaeoglobus fulgidus、Ferroglobus placidus、Geoglobus ahangari、Archaeoglobus veneficus、Archaeoglobus sulfaticallidus、Aciduliprofundum boonie、Clostridium thermocellum、Defluviitalea phaphyphila、Caminicella sporogenes、Caloranaerobacter ferrireducens、Thermosipho malanesiensis、Fervidobacterium pennivorans、Symbiobacterium thermophilum、Spirochaeta thermophila、およびThermoanaerobacter wiegeliiのホスホグルコムタ−ゼからなる群から選択される、態様１〜４のいずれか１つに記載の無細胞的方法。
【０１２７】
６．耐熱性ホスホグルコムタ−ゼが、Thermus thermophilus、Meiothermus timidus、Thermus filiformis、Marinithermus hydrothermalis、Thermosipho africanus、Sulfurihydrogenibium azorense、Persephonella marina、Marinitoga piezophila、Kosmotoga olearia、Thermotoga maritima、Geobacillus stearothermophilus、Anoxybacillus flavithermus、Thermosulfidibacter takaii、Fervidobacterium nodosum、Clostridium thermocellum、Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum、Methanococcus jannaschii、Methanotorris igneus、Methanocaldococcus villosus、Methanothermococcus okinawensis、Pseudothermotoga thermarum、Deferribacter desulfuricans、およびThermovibrio ammonificansのホスホグルコムタ−ゼからなる群から選択される、態様１〜５のいずれか１つに記載の無細胞的方法。
【０１２８】
７．耐熱性アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼが、Thermobacterium thermosaccharolyticum、Thermoanaerobacter brockii、Caldanaerobacter subterraneus、Deferribacter desulfuricans、Thermocrinis ruber、Hydrogenivirga sp. 128−5−R1−1、Brevibacillus thermoruber、Thermosipho atlanticus、およびThermosulfidibacter takaiiのアルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼからなる群から選択される、態様１〜６のいずれか１つに記載の無細胞的方法。
【０１２９】
８．耐熱性アルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼが、Thermoanaerobacter wiegelii、Thermoanaerobacter ethanolicus、Thermus islandicus、Deinococcus geothermalis DSM 11300、Thermosphaera aggregans、Crenarchaeota archaeon、Pyrococcus horikoshii Ot3、Aquifex aeolicus、Ruminiclostridium thermocellum、Desulfotomaculum kuznetsovii、Caldanaerobacter subterraneus、Acidothermus cellulolyticus、Methanothermobacter thermautotrophicus、Thermobifida fusca、Thermotoga neapolitana、Petrotoga mobilis、およびThermodesulfatator indicus、Thermus thermophilus、Bacteroides vulgatus、およびBacteroides fragilusのアルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される、態様１〜７のいずれか１つに記載の無細胞的方法。
【０１３０】
９．グルコ−スを生産するための無細胞的方法であって、該方法が、
（ａ）耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、および耐熱性グルコ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを発現するように改変された細胞を培養して、耐熱性酵素を発現する培養細胞を生産すること；
（ｂ）培養細胞を溶解して細胞ライセ−トを生産すること；
（ｃ）細胞ライセ−トを、天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ａ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること；および
（ｄ）熱不活化ライセ−トを、デンプンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、グルコ−スを生産すること；
を含む、前記方法。
【０１３１】
１０．グルコ−スを生産するための無細胞的方法であって、該方法が、
（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで各集団の細胞は、耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、および耐熱性グルコ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生産する；
（ｂ）少なくとも２つの培養集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセ−トを生産すること；
（ｃ）少なくとも２つの細胞ライセ−トを組み合わせて、耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、および耐熱性グルコ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを含む細胞ライセ−ト混合物を生産すること；
（ｄ）細胞ライセ−ト混合物を、天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ｃ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること；および、
（ｅ）反応混合物を、デンプンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、グルコ−スを生産すること；
を含む、前記方法。
【０１３２】
１１．グルコ−スを生産するための無細胞的方法であって、該方法が、
（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで各集団の細胞は、耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、および耐熱性グルコ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生産する；
（ｂ）少なくとも２つの培養集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセ−トを生産すること；
（ｃ）少なくとも２つの細胞ライセ−トを組み合わせて、細胞ライセ−ト混合物を生産すること；
（ｄ）細胞ライセ−ト混合物を、天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ａ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること； 
（ｅ）熱不活性化ライセ−トに、耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、および耐熱性グルコ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの精製酵素を添加して、α−グルカンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、およびグルコ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを含む反応混合物を生産すること；および
（ｆ）反応混合物を、デンプンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、グルコ−スを生産すること；
を含む、前記方法。
【０１３３】
１２．フルクト−スを生産するための無細胞的方法であって、該方法が、
（ａ）耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性ホスホグルコイソメラ−ゼ、および耐熱性フルクト−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを発現するように改変された細胞を培養して、耐熱性酵素を発現する培養細胞を生産すること；
（ｂ）培養細胞を溶解して細胞ライセ−トを生産すること；
（ｃ）細胞ライセ−トを、天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ａ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること；および
（ｄ）熱不活化ライセ−トを、デンプンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、フルクト−スを生産すること；
を含む、前記方法。
【０１３４】
１３．フルクト−スを生産するための無細胞的方法であって、該方法が、
（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで各集団の細胞は、耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性ホスホグルコイソメラ−ゼ、および耐熱性フルクト−ス６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生産する；
（ｂ）少なくとも２つの培養集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセ−トを生産すること；
（ｃ）少なくとも２つの細胞ライセ−トを組み合わせて、耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性ホスホグルコイソメラ−ゼ、および耐熱性フルクト−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを含む細胞ライセ−ト混合物を生産すること；
（ｄ）細胞ライセ−ト混合物を、天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ｃ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること；および、
（ｅ）反応混合物を、デンプンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、フルクト−スを生産すること；
を含む、前記方法。
【０１３５】
１４．フルクト−スを生産するための無細胞的方法であって、該方法が、
（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで各集団の細胞は、耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性ホスホグルコイソメラ−ゼ、および耐熱性フルクト−ス６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生産する；
（ｂ）少なくとも２つの培養集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセ−トを生産すること；
（ｃ）少なくとも２つの細胞ライセ−トを組み合わせて、細胞ライセ−ト混合物を生産すること；
（ｄ）細胞ライセ−ト混合物を、天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ａ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること；
（ｅ）熱不活性化ライセ−トに、耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性ホスホグルコイソメラ−ゼ、および耐熱性フルクト−ス６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの精製酵素を添加して、α−グルカンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、ホスホグルコイソメラ−ゼ、およびフルクト−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを含む反応混合物を生産すること；および
（ｆ）反応混合物を、デンプンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、フルクト−スを生産すること；
を含む、前記方法。
【０１３６】
１５．ソルビト−ルを生産するための無細胞的方法であって、該方法が、
（ａ）耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性アルド−スデヒドロゲナ−ゼ、および耐熱性ソルビト−ル６−リン酸ホスファタ−ゼを発現するように改変された細胞を培養して、耐熱性酵素を発現する培養細胞を生産すること；
（ｂ）培養細胞を溶解して細胞ライセ−トを生産すること；
（ｃ）細胞ライセ−トを、天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ａ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること；および
（ｄ）熱不活化ライセ−トを、デンプンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、ソルビト−ルを生産すること；
を含む、前記方法。
【０１３７】
１６．ソルビト−ルを生産するための無細胞的方法であって、該方法が、
（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで各集団の細胞は、耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性アルド−スデヒドロゲナ−ゼ、および耐熱性ソルビト−ル６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生産する；
（ｂ）少なくとも２つの培養集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセ−トを生産すること；
（ｃ）少なくとも２つの細胞ライセ−トを組み合わせて、耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性アルド−スデヒドロゲナ−ゼ、および耐熱性ソルビト−ル６−リン酸ホスファタ−ゼを含む細胞ライセ−ト混合物を生産すること；
（ｄ）細胞ライセ−ト混合物を、天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ｃ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること；および、
（ｅ）反応混合物を、デンプンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、ソルビト−ルを生産すること；
を含む、前記方法。
【０１３８】
１７．ソルビト−ルを生産するための無細胞的方法であって、該方法が、
（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで各集団の細胞は、耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性アルド−スデヒドロゲナ−ゼ、および耐熱性ソルビト−ル６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生産する；
（ｂ）少なくとも２つの培養集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセ−トを生産すること；
（ｃ）少なくとも２つの細胞ライセ−トを組み合わせて、細胞ライセ−ト混合物を生産すること；
（ｄ）細胞ライセ−ト混合物を、天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ａ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること； 
（ｅ）熱不活性化ライセ−トに、耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性アルド−スデヒドロゲナ−ゼ、および耐熱性ソルビト−ル６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの精製酵素を添加して、α−グルカンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、アルド−スデヒドロゲナ−ゼ、およびソルビト−ル６−リン酸ホスファタ−ゼを含む反応混合物を生産すること；および
（ｆ）反応混合物を、デンプンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、ソルビト−ルを生産すること；
を含む、前記方法。
【０１３９】
１８．リブロ−スを生産するための無細胞的方法であって、該方法が、
（ａ）耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、および耐熱性リブロ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼを発現するように改変された細胞を培養して、耐熱性酵素を発現する培養細胞を生産すること；
（ｂ）培養細胞を溶解して細胞ライセ−トを生産すること；
（ｃ）細胞ライセ−トを、天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ａ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること；および
（ｄ）熱不活化ライセ−トを、デンプンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、リブロ−スを生産すること；
を含む、前記方法。
【０１４０】
１９．リブロ−スを生産するための無細胞的方法であって、該方法が、
（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで各集団の細胞は、耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、および耐熱性リブロ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生産する；
（ｂ）少なくとも２つの培養集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセ−トを生産すること；
（ｃ）少なくとも２つの細胞ライセ−トを組み合わせて、耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、および耐熱性リブロ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼを含む細胞ライセ−ト混合物を生産すること；
（ｄ）細胞ライセ−ト混合物を、天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ｃ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること；および、
（ｅ）反応混合物を、デンプンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、リブロ−スを生産すること；
を含む、前記方法。
【０１４１】
２０．リブロ−スを生産するための無細胞的方法であって、該方法が、
（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで各集団の細胞は、耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、および耐熱性リブロ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生産する；
（ｂ）少なくとも２つの培養集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセ−トを生産すること；
（ｃ）少なくとも２つの細胞ライセ−トを組み合わせて、細胞ライセ−ト混合物を生産すること；
（ｄ）細胞ライセ−ト混合物を、天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ａ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること； 
（ｅ）熱不活性化ライセ−トに、耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、および耐熱性リブロ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの精製酵素を添加して、α−グルカンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、およびリブロ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼを含む反応混合物を生産すること；および
（ｆ）反応混合物を、デンプンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、リブロ−スを生産すること；
を含む、前記方法。
【０１４２】
２１．リボ−スを生産するための無細胞的方法であって、該方法が、
（ａ）耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、耐熱性リボ−ス５−リン酸イソメラ−ゼ、および耐熱性リボ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼを発現するように改変された細胞を培養して、耐熱性酵素を発現する培養細胞を生産すること；
（ｂ）培養細胞を溶解して細胞ライセ−トを生産すること；
（ｃ）細胞ライセ−トを、天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ａ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること；および
（ｄ）熱不活化ライセ−トを、デンプンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、リボ−スを生産すること；
を含む、前記方法。
【０１４３】
２２．リボ−スを生産するための無細胞的方法であって、該方法が、
（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで各集団の細胞は、耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、耐熱性リボ−ス５−リン酸イソメラ−ゼ、および耐熱性リボ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生産する；
（ｂ）少なくとも２つの培養集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセ−トを生産すること；
（ｃ）少なくとも２つの細胞ライセ−トを組み合わせて、耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、耐熱性リボ−ス５−リン酸イソメラ−ゼ、および耐熱性リボ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼを含む細胞ライセ−ト混合物を生産すること；
（ｄ）細胞ライセ−ト混合物を、天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ｃ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること；および、
（ｅ）反応混合物を、デンプンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、リボ−スを生産すること；
を含む、前記方法。
【０１４４】
２３．リボ−スを生産するための無細胞的方法であって、該方法が、
（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで各集団の細胞は、耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、耐熱性リボ−ス５−リン酸イソメラ−ゼ、および耐熱性リボ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生産する；
（ｂ）少なくとも２つの培養集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセ−トを生産すること；
（ｃ）少なくとも２つの細胞ライセ−トを組み合わせて、細胞ライセ−ト混合物を生産すること；
（ｄ）細胞ライセ−ト混合物を、天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ａ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること； 
（ｅ）熱不活性化ライセ−トに、耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、耐熱性リボ−ス５−リン酸イソメラ−ゼ、および耐熱性リボ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの精製酵素を添加して、α−グルカンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、リボ−ス５−リン酸イソメラ−ゼ、およびリボ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼを含む反応混合物を生産すること；および
（ｆ）反応混合物を、デンプンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、リボ−スを生産すること；
を含む、前記方法。
【０１４５】
２４．アラビノ−スを生産するための無細胞的方法であって、該方法が、
（ａ）耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、耐熱性アラビノ−ス５−リン酸イソメラ−ゼ、および耐熱性アラビノ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼを発現するように改変された細胞を培養して、耐熱性酵素を発現する培養細胞を生産すること；
（ｂ）培養細胞を溶解して細胞ライセ−トを生産すること；
（ｃ）細胞ライセ−トを、天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ａ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること；および
（ｄ）熱不活化ライセ−トを、デンプンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、アラビノ−スを生産すること；
を含む、前記方法。
【０１４６】
２５．アラビノ−スを生産するための無細胞的方法であって、該方法が、
（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで各集団の細胞は、耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、耐熱性アラビノ−ス５−リン酸イソメラ−ゼ、および耐熱性アラビノ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生産する；
（ｂ）少なくとも２つの培養集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセ−トを生産すること；
（ｃ）少なくとも２つの細胞ライセ−トを組み合わせて、耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、耐熱性アラビノ−ス５−リン酸イソメラ−ゼ、および耐熱性アラビノ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼを含む細胞ライセ−ト混合物を生産すること；
（ｄ）細胞ライセ−ト混合物を、天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ｃ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること；および、
（ｅ）反応混合物を、デンプンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、アラビノ−スを生産すること；
を含む、前記方法。
【０１４７】
２６．アラビノ−スを生産するための無細胞的方法であって、該方法が、
（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで各集団の細胞は、耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、耐熱性アラビノ−ス５−リン酸イソメラ−ゼ、および耐熱性アラビノ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生産する；
（ｂ）少なくとも２つの培養集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセ−トを生産すること；
（ｃ）少なくとも２つの細胞ライセ−トを組み合わせて、細胞ライセ−ト混合物を生産すること；
（ｄ）細胞ライセ−ト混合物を、天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ａ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること； 
（ｅ）熱不活性化ライセ−トに、耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、耐熱性アラビノ−ス５−リン酸イソメラ−ゼ、および耐熱性アラビノ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの精製酵素を添加して、α−グルカンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、アラビノ−ス５−リン酸イソメラ−ゼ、およびアラビノ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼを含む反応混合物を生産すること；および
（ｆ）反応混合物を、デンプンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、アラビノ−スを生産すること；
を含む、前記方法。
【０１４８】
２７．マンノ−スを生産するための無細胞的方法であって、該方法が、
（ａ）耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性ホスホグルコイソメラ−ゼ、耐熱性マンノ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、および耐熱性マンノ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを発現するように改変された細胞を培養して、耐熱性酵素を発現する培養細胞を生産すること；
（ｂ）培養細胞を溶解して細胞ライセ−トを生産すること；
（ｃ）細胞ライセ−トを、天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ａ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること；および
（ｄ）熱不活化ライセ−トを、デンプンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、マンノ−スを生産すること；
を含む、前記方法。
【０１４９】
２８．マンノ−スを生産するための無細胞的方法であって、該方法が、
（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで各集団の細胞は、耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性ホスホグルコイソメラ−ゼ、耐熱性マンノ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、および耐熱性マンノ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生産する；
（ｂ）少なくとも２つの培養集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセ−トを生産すること；
（ｃ）少なくとも２つの細胞ライセ−トを組み合わせて、耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性ホスホグルコイソメラ−ゼ、耐熱性マンノ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、および耐熱性マンノ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを含む細胞ライセ−ト混合物を生産すること；
（ｄ）細胞ライセ−ト混合物を、天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ｃ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること；および、
（ｅ）反応混合物を、デンプンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、マンノ−スを生産すること；
を含む、前記方法。
【０１５０】
２９．マンノ−スを生産するための無細胞的方法であって、該方法が、
（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで各集団の細胞は、耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性ホスホグルコイソメラ−ゼ、耐熱性マンノ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、および耐熱性マンノ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生産する；
（ｂ）少なくとも２つの培養集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセ−トを生産すること；
（ｃ）少なくとも２つの細胞ライセ−トを組み合わせて、細胞ライセ−ト混合物を生産すること；
（ｄ）細胞ライセ−ト混合物を、天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ａ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること； 
（ｅ）熱不活性化ライセ−トに、耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性ホスホグルコイソメラ−ゼ、耐熱性マンノ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、および耐熱性マンノ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの精製酵素を添加して、α−グルカンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、ホスホグルコイソメラ−ゼ、マンノ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、およびマンノ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを含む反応混合物を生産すること；および
（ｆ）反応混合物を、デンプンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、マンノ−スを生産すること；
を含む、前記方法。
【０１５１】
３０．細胞が細菌細胞を含む、態様１〜２６のいずれか１つに記載の方法。
３１．細胞が酵母細胞を含む、態様１〜２６のいずれか１つに記載の方法。
３２．酵素の少なくとも１つが、細胞に対して異種である、態様１〜３１のいずれか１つに記載の方法。
３３．溶解ステップ（ｂ）が、培養細胞を機械的、化学的または酵素的に溶解することを含む、態様１〜３２のいずれか１つに記載の方法。
３４．加熱ステップ（ｃ）が、細胞ライセ−トを少なくとも５０℃の温度に加熱することを含む、態様１〜３３のいずれか１つに記載の方法。
【０１５２】
３５．デンプンが、アミロ−ス、アミロペクチン、またはアミロ−スとアミロペクチンの両方を含む、態様１〜３４のいずれか１つに記載の方法。
３６．耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼおよび耐熱性ホスホグルコムタ−ゼが、単一の融合タンパク質または二機能性タンパク質として発現される、態様１〜３５のいずれか１つに記載の方法。
３７．態様１〜３６のいずれか１つに記載の方法によって生産された、細胞ライセ−ト。
３８．α−グルカンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、およびグルコ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを含み、ここで任意に、前述の酵素の少なくとも１つが耐熱性酵素である、改変細胞。
３９．α−グルカンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、ホスホグルコイソメラ−ゼ、およびフルクト−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを含み、ここで任意に、前述の酵素の少なくとも１つが耐熱性酵素である、改変細胞。
【０１５３】
４０．α−グルカンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、ホスホグルコイソメラ−ゼ、アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、およびアルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを含み、ここで任意に、前述の酵素の少なくとも１つが耐熱性酵素である、改変細胞。
４１．α−グルカンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、アルド−スデヒドロゲナ−ゼ、およびソルビト−ル−６−リン酸ホスファタ−ゼを含み、ここで任意に、前述の酵素の少なくとも１つが耐熱性酵素である、改変細胞。
４２．α−グルカンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、およびリブロ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼを含み、ここで任意に、前述の酵素の少なくとも１つが耐熱性酵素である、改変細胞。
【０１５４】
４３．α−グルカンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、リボ−ス５−リン酸イソメラ−ゼ、およびリボ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼを含み、ここで任意に、前述の酵素の少なくとも１つが耐熱性酵素である、改変細胞。
４４．α−グルカンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、アラビノ−ス５−リン酸イソメラ−ゼ、およびアラビノ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼを含み、ここで任意に、前述の酵素の少なくとも１つが耐熱性酵素である、改変細胞。
４５．α−グルカンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、ホスホグルコイソメラ−ゼ、マンノ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、およびマンノ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを含み、ここで任意に、前述の酵素の少なくとも１つが耐熱性酵素である、改変細胞。
【０１５５】
４６．細胞が、細菌細胞または酵母細胞である、態様３８〜４５のいずれか１つに記載の改変細胞。
４７．α−グルカンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、およびグルコ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを含み、ここで任意に、前述の酵素の少なくとも１つが耐熱性酵素である、単一細胞ライセ−ト、少なくとも２つの細胞集団から得た細胞ライセ−トの混合物、または反応混合物。
４８．α−グルカンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、ホスホグルコイソメラ−ゼ、およびフルクト−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを含み、ここで任意に、前述の酵素の少なくとも１つが耐熱性酵素である、単一細胞ライセ−ト、少なくとも２つの細胞集団から得た細胞ライセ−トの混合物、または反応混合物。
【０１５６】
４９．α−グルカンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、ホスホグルコイソメラ−ゼ、アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、およびアルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを含み、ここで任意に、前述の酵素の少なくとも１つが耐熱性酵素である、単一細胞ライセ−ト、少なくとも２つの細胞集団から得た細胞ライセ−トの混合物、または反応混合物。
５０．α−グルカンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、アルド−スデヒドロゲナ−ゼ、およびソルビト−ル−６−リン酸ホスファタ−ゼを含み、ここで任意に、前述の酵素の少なくとも１つが耐熱性酵素である、単一細胞ライセ−ト、少なくとも２つの細胞集団から得た細胞ライセ−トの混合物、または反応混合物。
５１．α−グルカンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、およびリブロ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼを含み、ここで任意に、前述の酵素の少なくとも１つが耐熱性酵素である、単一細胞ライセ−ト、少なくとも２つの細胞集団から得た細胞ライセ−トの混合物、または反応混合物。
【０１５７】
５２．α−グルカンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、リボ−ス５−リン酸イソメラ−ゼ、およびリボ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼを含み、ここで任意に、前述の酵素の少なくとも１つが耐熱性酵素である、単一細胞ライセ−ト、少なくとも２つの細胞集団から得た細胞ライセ−トの混合物、または反応混合物。
５３．α−グルカンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、アラビノ−ス５−リン酸イソメラ−ゼ、およびアラビノ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼを含み、ここで任意に、前述の酵素の少なくとも１つが耐熱性酵素である、単一細胞ライセ−ト、少なくとも２つの細胞集団から得た細胞ライセ−トの混合物、または反応混合物。
５４．α−グルカンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、ホスホグルコイソメラ−ゼ、マンノ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、およびマンノ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを含み、ここで任意に、前述の酵素の少なくとも１つが耐熱性酵素である、単一細胞ライセ−ト、少なくとも２つの細胞集団から得た細胞ライセ−トの混合物、または反応混合物。
【０１５８】
５５．アルロ−スを生産するための無細胞的方法であって、該方法が、
（ａ）耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性ホスホグルコイソメラ−ゼ、耐熱性アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、および耐熱性アルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを発現するように改変された細胞を培養して、耐熱性酵素を発現する培養細胞を生産すること；
（ｂ）培養細胞を溶解して細胞ライセ−トを生産すること；
（ｃ）細胞ライセ−トを、天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ａ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること；および
（ｄ）熱不活化ライセ−トを、セロデキストリンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、アルロ−スを生産すること；
を含む、前記方法。
【０１５９】
５６．アルロ−スを生産するための無細胞的方法であって、該方法が、
（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで各集団の細胞は、耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性ホスホグルコイソメラ−ゼ、耐熱性アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、および耐熱性アルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生産する；
（ｂ）少なくとも２つの培養集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセ−トを生産すること；
（ｃ）少なくとも２つの細胞ライセ−トを組み合わせて、耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性ホスホグルコイソメラ−ゼ、耐熱性アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、および耐熱性アルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを含む細胞ライセ−ト混合物を生産すること；
（ｄ）細胞ライセ−ト混合物を、天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ｃ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること；および、
（ｅ）反応混合物を、セロデキストリンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、アルロ−スを生産すること；
を含む、前記方法。
【０１６０】
５７．アルロ−スを生産するための無細胞的方法であって、該方法が、
（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで各集団の細胞は、耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性ホスホグルコイソメラ−ゼ、耐熱性アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、および耐熱性アルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生産する；
（ｂ）少なくとも２つの培養集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセ−トを生産すること；
（ｃ）少なくとも２つの細胞ライセ−トを組み合わせて、細胞ライセ−ト混合物を生産すること；
（ｄ）細胞ライセ−ト混合物を、天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ａ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること；
（ｅ）熱不活性化ライセ−トに、耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性ホスホグルコイソメラ−ゼ、耐熱性アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、および耐熱性アルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの精製酵素を添加して、セロデキストリンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、ホスホグルコイソメラ−ゼ、アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、およびアルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを含む反応混合物を生産すること；および
（ｆ）反応混合物を、セロデキストリンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、アルロ−スを生産すること；
を含む、前記方法。
【０１６１】
５８．耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼが、Aquifex aeolicus、Thermocrinis minervae、Thermosulfidibacter takaii、Thermosulfurimonas dismutans、Thermococcus litoralis、Palaeococcus pacificus、Thermotoga neapolitana、Ruminiclostridium thermocellum、Pyrococcus abyssi、Thermococcus thioreducens、Deinococcus radiodurans、Sulfolobus acidocaldarius、Thermus caldophilus、Meiothermus silvanus、Oceanithermus profundus、Ardenticatena maritima、Thermococcus barophilus、Pseudothermotoga thermarum、Hydrogenobacter thermophilus、Thermus oshimai、Meiothermus ruber、およびMarinitoga piezophilaのセロデキストリンホスホリラ−ゼからなる群から選択される、態様５５〜５７のいずれか１つに記載の無細胞的方法。
【０１６２】
５９．耐熱性ホスホグルコムタ−ゼが、Thermococcus kodakaraensis、Pyrococcus kukulkanii、Ammonifex degensii、Methanothermobacter wolfeii、Methanothermus fervidus、Sulfolobus acidocaldarius、Archaeoglobus fulgidus、Ferroglobus placidus、Geoglobus ahangari、Archaeoglobus veneficus、Archaeoglobus sulfaticallidus、Aciduliprofundum boonie、Clostridium thermocellum、Defluviitalea phaphyphila、Caminicella sporogenes、Caloranaerobacter ferrireducens、Thermosipho malanesiensis、Fervidobacterium pennivorans、Symbiobacterium thermophilum、Spirochaeta thermophila、およびThermoanaerobacter wiegeliiのホスホグルコムタ−ゼからなる群から選択される、態様５５〜５８のいずれか１つに記載の無細胞的方法。
【０１６３】
６０．耐熱性ホスホグルコムタ−ゼが、Thermus thermophilus、Meiothermus timidus、Thermus filiformis、Marinithermus hydrothermalis、Thermosipho africanus、Sulfurihydrogenibium azorense、Persephonella marina、Marinitoga piezophila、Kosmotoga olearia、Thermotoga maritima、Geobacillus stearothermophilus、Anoxybacillus flavithermus、Thermosulfidibacter takaii、Fervidobacterium nodosum、Clostridium thermocellum、Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum、Methanococcus jannaschii、Methanotorris igneus、Methanocaldococcus villosus、Methanothermococcus okinawensis、Pseudothermotoga thermarum、Deferribacter desulfuricans、およびThermovibrio ammonificansのホスホグルコムタ−ゼからなる群から選択される、態様５５〜５９のいずれか１つに記載の無細胞的方法。
【０１６４】
６１．耐熱性アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼが、Thermobacterium thermosaccharolyticum、Thermoanaerobacter brockii、Caldanaerobacter subterraneus、Deferribacter desulfuricans、Thermocrinis ruber、Hydrogenivirga sp. 128−5−R1−1、Brevibacillus thermoruber、Thermosipho atlanticus、およびThermosulfidibacter takaiiのアルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼからなる群から選択される、態様５５〜６０のいずれか１つに記載の無細胞的方法。
【０１６５】
６２．耐熱性アルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼが、Thermoanaerobacter wiegelii、Thermoanaerobacter ethanolicus、Thermus islandicus、Deinococcus geothermalis DSM 11300、Thermosphaera aggregans、Crenarchaeota archaeon、Pyrococcus horikoshii Ot3、Aquifex aeolicus、Ruminiclostridium thermocellum、Desulfotomaculum kuznetsovii、Caldanaerobacter subterraneus、Acidothermus cellulolyticus、Methanothermobacter thermautotrophicus、Thermobifida fusca、Thermotoga neapolitana、Petrotoga mobilis、およびThermodesulfatator indicus、Thermus thermophilus、Bacteroides vulgatus、およびBacteroides fragilusのアルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される、態様５５〜６１のいずれか１つに記載の無細胞的方法。
【０１６６】
６３．グルコ−スを生産するための無細胞的方法であって、該方法が、
（ａ）耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、および耐熱性グルコ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを発現するように改変された細胞を培養して、耐熱性酵素を発現する培養細胞を生産すること；
（ｂ）培養細胞を溶解して細胞ライセ−トを生産すること；
（ｃ）細胞ライセ−トを、天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ａ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること；および
（ｄ）熱不活化ライセ−トを、セロデキストリンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、グルコ−スを生産すること；
を含む、前記方法。
【０１６７】
６４．グルコ−スを生産するための無細胞的方法であって、該方法が、
（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで各集団の細胞は、耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、および耐熱性グルコ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生産する；
（ｂ）少なくとも２つの培養集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセ−トを生産すること；
（ｃ）少なくとも２つの細胞ライセ−トを組み合わせて、耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、および耐熱性グルコ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを含む細胞ライセ−ト混合物を生産すること；
（ｄ）細胞ライセ−ト混合物を、天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ｃ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること；および、
（ｅ）反応混合物を、セロデキストリンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、グルコ−スを生産すること；
を含む、前記方法。
【０１６８】
６５．グルコ−スを生産するための無細胞的方法であって、該方法が、
（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで各集団の細胞は、耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、および耐熱性グルコ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生産する；
（ｂ）少なくとも２つの培養集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセ−トを生産すること；
（ｃ）少なくとも２つの細胞ライセ−トを組み合わせて、細胞ライセ−ト混合物を生産すること；
（ｄ）細胞ライセ−ト混合物を、天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ａ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること；
（ｅ）熱不活性化ライセ−トに、耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、および耐熱性グルコ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの精製酵素を添加して、セロデキストリンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、およびグルコ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを含む反応混合物を生産すること；および
（ｆ）反応混合物を、セロデキストリンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、グルコ−スを生産すること；
を含む、前記方法。
【０１６９】
６６．フルクト−スを生産するための無細胞的方法であって、該方法が、
（ａ）耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性ホスホグルコイソメラ−ゼ、および耐熱性フルクト−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを発現するように改変された細胞を培養して、耐熱性酵素を発現する培養細胞を生産すること；
（ｂ）培養細胞を溶解して細胞ライセ−トを生産すること；
（ｃ）細胞ライセ−トを、天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ａ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること；および
（ｄ）熱不活化ライセ−トを、セロデキストリンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、フルクト−スを生産すること；
を含む、前記方法。
【０１７０】
６７．フルクト−スを生産するための無細胞的方法であって、該方法が、
（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで各集団の細胞は、耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性ホスホグルコイソメラ−ゼ、および耐熱性フルクト−ス６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生産する；
（ｂ）少なくとも２つの培養集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセ−トを生産すること；
（ｃ）少なくとも２つの細胞ライセ−トを組み合わせて、耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性ホスホグルコイソメラ−ゼ、および耐熱性フルクト−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを含む細胞ライセ−ト混合物を生産すること；
（ｄ）細胞ライセ−ト混合物を、天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ｃ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること；および、
（ｅ）反応混合物を、セロデキストリンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、フルクト−スを生産すること；
を含む、前記方法。
【０１７１】
６８．フルクト−スを生産するための無細胞的方法であって、該方法が、
（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで各集団の細胞は、耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性ホスホグルコイソメラ−ゼ、および耐熱性フルクト−ス６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生産する；
（ｂ）少なくとも２つの培養集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセ−トを生産すること；
（ｃ）少なくとも２つの細胞ライセ−トを組み合わせて、細胞ライセ−ト混合物を生産すること；
（ｄ）細胞ライセ−ト混合物を、天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ａ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること；
（ｅ）熱不活性化ライセ−トに、耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性ホスホグルコイソメラ−ゼ、および耐熱性フルクト−ス６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの精製酵素を添加して、セロデキストリンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、ホスホグルコイソメラ−ゼ、およびフルクト−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを含む反応混合物を生産すること；および
（ｆ）反応混合物を、セロデキストリンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、フルクト−スを生産すること；
を含む、前記方法。
【０１７２】
６９．ソルビト−ルを生産するための無細胞的方法であって、該方法が、
（ａ）耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性アルド−スデヒドロゲナ−ゼ、および耐熱性ソルビト−ル６−リン酸ホスファタ−ゼを発現するように改変された細胞を培養して、耐熱性酵素を発現する培養細胞を生産すること；
（ｂ）培養細胞を溶解して細胞ライセ−トを生産すること；
（ｃ）細胞ライセ−トを、天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ａ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること；および
（ｄ）熱不活化ライセ−トを、セロデキストリンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、ソルビト−ルを生産すること；
を含む、前記方法。
【０１７３】
７０．ソルビト−ルを生産するための無細胞的方法であって、該方法が、
（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで各集団の細胞は、耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性アルド−スデヒドロゲナ−ゼ、および耐熱性ソルビト−ル６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生産する；
（ｂ）少なくとも２つの培養集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセ−トを生産すること；
（ｃ）少なくとも２つの細胞ライセ−トを組み合わせて、耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性アルド−スデヒドロゲナ−ゼ、および耐熱性ソルビト−ル６−リン酸ホスファタ−ゼを含む細胞ライセ−ト混合物を生産すること；
（ｄ）細胞ライセ−ト混合物を、天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ｃ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること；および、
（ｅ）反応混合物を、セロデキストリンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、ソルビト−ルを生産すること；
を含む、前記方法。
【０１７４】
７１．ソルビト−ルを生産するための無細胞的方法であって、該方法が、
（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで各集団の細胞は、耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性アルド−スデヒドロゲナ−ゼ、および耐熱性ソルビト−ル６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生産する；
（ｂ）少なくとも２つの培養集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセ−トを生産すること；
（ｃ）少なくとも２つの細胞ライセ−トを組み合わせて、細胞ライセ−ト混合物を生産すること；
（ｄ）細胞ライセ−ト混合物を、天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ａ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること；
（ｅ）熱不活性化ライセ−トに、耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性アルド−スデヒドロゲナ−ゼ、および耐熱性ソルビト−ル６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの精製酵素を添加して、セロデキストリンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、アルド−スデヒドロゲナ−ゼ、およびソルビト−ル６−リン酸ホスファタ−ゼを含む反応混合物を生産すること；および
（ｆ）反応混合物を、セロデキストリンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、ソルビト−ルを生産すること；
を含む、前記方法。
【０１７５】
７２．リブロ−スを生産するための無細胞的方法であって、該方法が、
（ａ）耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、および耐熱性リブロ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼを発現するように改変された細胞を培養して、耐熱性酵素を発現する培養細胞を生産すること；
（ｂ）培養細胞を溶解して細胞ライセ−トを生産すること；
（ｃ）細胞ライセ−トを、天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ａ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること；および
（ｄ）熱不活化ライセ−トを、セロデキストリンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、リブロ−スを生産すること；
を含む、前記方法。
【０１７６】
７３．リブロ−スを生産するための無細胞的方法であって、該方法が、
（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで各集団の細胞は、耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、および耐熱性リブロ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生産する；
（ｂ）少なくとも２つの培養集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセ−トを生産すること；
（ｃ）少なくとも２つの細胞ライセ−トを組み合わせて、耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、および耐熱性リブロ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼを含む細胞ライセ−ト混合物を生産すること；
（ｄ）細胞ライセ−ト混合物を、天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ｃ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること；および、
（ｅ）反応混合物を、セロデキストリンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、リブロ−スを生産すること；
を含む、前記方法。
【０１７７】
７４．リブロ−スを生産するための無細胞的方法であって、該方法が、
（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで各集団の細胞は、耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、および耐熱性リブロ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生産する；
（ｂ）少なくとも２つの培養集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセ−トを生産すること；
（ｃ）少なくとも２つの細胞ライセ−トを組み合わせて、細胞ライセ−ト混合物を生産すること；
（ｄ）細胞ライセ−ト混合物を、天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ａ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること；
（ｅ）熱不活性化ライセ−トに、耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、および耐熱性リブロ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの精製酵素を添加して、セロデキストリンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、およびリブロ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼを含む反応混合物を生産すること；および
（ｆ）反応混合物を、セロデキストリンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、リブロ−スを生産すること；
を含む、前記方法。
【０１７８】
７５．リボ−スを生産するための無細胞的方法であって、該方法が、
（ａ）耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、耐熱性リボ−ス５−リン酸イソメラ−ゼ、および耐熱性リボ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼを発現するように改変された細胞を培養して、耐熱性酵素を発現する培養細胞を生産すること；
（ｂ）培養細胞を溶解して細胞ライセ−トを生産すること；
（ｃ）細胞ライセ−トを、天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ａ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること；および
（ｄ）熱不活化ライセ−トを、セロデキストリンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、リボ−スを生産すること；
を含む、前記方法。
【０１７９】
７６．リボ−スを生産するための無細胞的方法であって、該方法が、
（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで各集団の細胞は、耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、耐熱性リボ−ス５−リン酸イソメラ−ゼ、および耐熱性リボ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生産する；
（ｂ）少なくとも２つの培養集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセ−トを生産すること；
（ｃ）少なくとも２つの細胞ライセ−トを組み合わせて、耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、耐熱性リボ−ス５−リン酸イソメラ−ゼ、および耐熱性リボ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼを含む細胞ライセ−ト混合物を生産すること；
（ｄ）細胞ライセ−ト混合物を、天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ｃ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること；および、
（ｅ）反応混合物を、セロデキストリンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、リボ−スを生産すること；
を含む、前記方法。
【０１８０】
７７．リボ−スを生産するための無細胞的方法であって、該方法が、
（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで各集団の細胞は、耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、耐熱性リボ−ス５−リン酸イソメラ−ゼ、および耐熱性リボ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生産する；
（ｂ）少なくとも２つの培養集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセ−トを生産すること；
（ｃ）少なくとも２つの細胞ライセ−トを組み合わせて、細胞ライセ−ト混合物を生産すること；
（ｄ）細胞ライセ−ト混合物を、天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ａ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること； 
（ｅ）熱不活性化ライセ−トに、耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、耐熱性リボ−ス５−リン酸イソメラ−ゼ、および耐熱性リボ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの精製酵素を添加して、セロデキストリンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、リボ−ス５−リン酸イソメラ−ゼ、およびリボ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼを含む反応混合物を生産すること；および
（ｆ）反応混合物を、セロデキストリンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、リボ−スを生産すること；
を含む、前記方法。
【０１８１】
７８．アラビノ−スを生産するための無細胞的方法であって、該方法が、
（ａ）耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、耐熱性アラビノ−ス５−リン酸イソメラ−ゼ、および耐熱性アラビノ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼを発現するように改変された細胞を培養して、耐熱性酵素を発現する培養細胞を生産すること；
（ｂ）培養細胞を溶解して細胞ライセ−トを生産すること；
（ｃ）細胞ライセ−トを、天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ａ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること；および
（ｄ）熱不活化ライセ−トを、セロデキストリンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、アラビノ−スを生産すること；
を含む、前記方法。
【０１８２】
７９．アラビノ−スを生産するための無細胞的方法であって、該方法が、
（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで各集団の細胞は、耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、耐熱性アラビノ−ス５−リン酸イソメラ−ゼ、および耐熱性アラビノ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生産する；
（ｂ）少なくとも２つの培養集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセ−トを生産すること；
（ｃ）少なくとも２つの細胞ライセ−トを組み合わせて、耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、耐熱性アラビノ−ス５−リン酸イソメラ−ゼ、および耐熱性アラビノ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼを含む細胞ライセ−ト混合物を生産すること；
（ｄ）細胞ライセ−ト混合物を、天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ｃ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること；および、
（ｅ）反応混合物を、セロデキストリンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、アラビノ−スを生産すること；
を含む、前記方法。
【０１８３】
８０．アラビノ−スを生産するための無細胞的方法であって、該方法が、
（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで各集団の細胞は、耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、耐熱性アラビノ−ス５−リン酸イソメラ−ゼ、および耐熱性アラビノ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生産する；
（ｂ）少なくとも２つの培養集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセ−トを生産すること；
（ｃ）少なくとも２つの細胞ライセ−トを組み合わせて、細胞ライセ−ト混合物を生産すること；
（ｄ）細胞ライセ−ト混合物を、天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ａ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること； 
（ｅ）熱不活性化ライセ−トに、耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、耐熱性アラビノ−ス５−リン酸イソメラ−ゼ、および耐熱性アラビノ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの精製酵素を添加して、セロデキストリンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、アラビノ−ス５−リン酸イソメラ−ゼ、およびアラビノ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼを含む反応混合物を生産すること；および
（ｆ）反応混合物を、セロデキストリンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、アラビノ−スを生産すること；
を含む、前記方法。
【０１８４】
８１．マンノ−スを生産するための無細胞的方法であって、該方法が、
（ａ）耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性ホスホグルコイソメラ−ゼ、耐熱性マンノ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、および耐熱性マンノ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを発現するように改変された細胞を培養して、耐熱性酵素を発現する培養細胞を生産すること；
（ｂ）培養細胞を溶解して細胞ライセ−トを生産すること；
（ｃ）細胞ライセ−トを、天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ａ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること；および
（ｄ）熱不活化ライセ−トを、セロデキストリンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、マンノ−スを生産すること；
を含む、前記方法。
【０１８５】
８２．マンノ−スを生産するための無細胞的方法であって、該方法が、
（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで各集団の細胞は、耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性ホスホグルコイソメラ−ゼ、耐熱性マンノ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、および耐熱性マンノ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生産する；
（ｂ）少なくとも２つの培養集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセ−トを生産すること；
（ｃ）少なくとも２つの細胞ライセ−トを組み合わせて、耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性ホスホグルコイソメラ−ゼ、耐熱性マンノ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、および耐熱性マンノ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを含む細胞ライセ−ト混合物を生産すること；
（ｄ）細胞ライセ−ト混合物を、天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ｃ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること；および、
（ｅ）反応混合物を、セロデキストリンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、マンノ−スを生産すること；
を含む、前記方法。
【０１８６】
８３．マンノ−スを生産するための無細胞的方法であって、該方法が、
（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで各集団の細胞は、耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性ホスホグルコイソメラ−ゼ、耐熱性マンノ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、および耐熱性マンノ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生産する；
（ｂ）少なくとも２つの培養集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセ−トを生産すること；
（ｃ）少なくとも２つの細胞ライセ−トを組み合わせて、細胞ライセ−ト混合物を生産すること；
（ｄ）細胞ライセ−ト混合物を、天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ａ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること； 
（ｅ）熱不活性化ライセ−トに、耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性ホスホグルコイソメラ−ゼ、耐熱性マンノ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、および耐熱性マンノ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの精製酵素を添加して、セロデキストリンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、ホスホグルコイソメラ−ゼ、マンノ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、およびマンノ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを含む反応混合物を生産すること；および
（ｆ）反応混合物を、セロデキストリンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、マンノ−スを生産すること；
を含む、前記方法。
【０１８７】
８４．細胞が細菌細胞を含む、態様１〜８０のいずれか１つに記載の方法。
８５．細胞が酵母細胞を含む、態様１〜８０のいずれか１つに記載の方法。
８６．酵素の少なくとも１つが、細胞に対して異種である、態様１〜８５のいずれか１つに記載の方法。
８７．溶解ステップ（ｂ）が、培養細胞を機械的、化学的、または酵素的に溶解することを含む、態様１〜８６のいずれか１つに記載の方法。
８８．加熱ステップ（ｃ）が、細胞ライセ−トを少なくとも５０℃の温度に加熱することを含む、態様１〜８７のいずれか１つに記載の方法。
【０１８８】
８９．セロデキストリンが、アミロ−ス、アミロペクチン、またはアミロ−スとアミロペクチンの両方を含む、態様１〜８８のいずれか１つに記載の方法。
９０．耐熱性セロデキストリンホスホリラ−ゼおよび耐熱性ホスホグルコムタ−ゼが、単一の融合タンパク質または二機能性タンパク質として発現される、態様１〜８９のいずれか１つに記載の方法。
９１．態様１〜９０のいずれか１つに記載の方法によって生産された、細胞ライセ−ト。
９２．セロデキストリンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、およびグルコ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを含み、ここで任意に、前述の酵素の少なくとも１つが耐熱性酵素である、改変細胞。
９３．セロデキストリンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、ホスホグルコイソメラ−ゼ、およびフルクト−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを含み、ここで任意に、前述の酵素の少なくとも１つが耐熱性酵素である、改変細胞。
【０１８９】
９４．セロデキストリンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、ホスホグルコイソメラ−ゼ、アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、およびアルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを含み、ここで任意に、前述の酵素の少なくとも１つが耐熱性酵素である、改変細胞。
９５．セロデキストリンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、アルド−スデヒドロゲナ−ゼ、およびソルビト−ル−６−リン酸ホスファタ−ゼを含み、ここで任意に、前述の酵素の少なくとも１つが耐熱性酵素である、改変細胞。
９６．セロデキストリンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、およびリブロ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼを含み、ここで任意に、前述の酵素の少なくとも１つが耐熱性酵素である、改変細胞。
【０１９０】
９７．セロデキストリンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、リボ−ス５−リン酸イソメラ−ゼ、およびリボ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼを含み、ここで任意に、前述の酵素の少なくとも１つが耐熱性酵素である、改変細胞。
９８．セロデキストリンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、アラビノ−ス５−リン酸イソメラ−ゼ、およびアラビノ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼを含み、ここで任意に、前述の酵素の少なくとも１つが耐熱性酵素である、改変細胞。
９９．セロデキストリンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、ホスホグルコイソメラ−ゼ、マンノ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、およびマンノ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを含み、ここで任意に、前述の酵素の少なくとも１つが耐熱性酵素である、改変細胞。
【０１９１】
１００．細胞が細菌細胞または酵母細胞である、態様３５〜４１のいずれか１つに記載の改変細胞。
１０１．セロデキストリンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、およびグルコ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを含み、ここで任意に、前述の酵素の少なくとも１つが耐熱性酵素である、単一細胞ライセ−ト、少なくとも２つの細胞集団から得た細胞ライセ−トの混合物、または反応混合物。
１０２．セロデキストリンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、ホスホグルコイソメラ−ゼ、およびフルクト−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを含み、ここで任意に、前述の酵素の少なくとも１つが耐熱性酵素である、単一細胞ライセ−ト、少なくとも２つの細胞集団から得た細胞ライセ−トの混合物、または反応混合物。
【０１９２】
１０３．セロデキストリンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、ホスホグルコイソメラ−ゼ、アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、およびアルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを含み、ここで任意に、前述の酵素の少なくとも１つが耐熱性酵素である、単一細胞ライセ−ト、少なくとも２つの細胞集団から得た細胞ライセ−トの混合物、または反応混合物。
１０４．セロデキストリンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、アルド−スデヒドロゲナ−ゼ、およびソルビト−ル−６−リン酸ホスファタ−ゼを含み、ここで任意に、前述の酵素の少なくとも１つが耐熱性酵素である、単一細胞ライセ−ト、少なくとも２つの細胞集団から得た細胞ライセ−トの混合物、または反応混合物。
１０５．セロデキストリンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、およびリブロ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼを含み、ここで任意に、前述の酵素の少なくとも１つが耐熱性酵素である、単一細胞ライセ−ト、少なくとも２つの細胞集団から得た細胞ライセ−トの混合物、または反応混合物。
【０１９３】
１０６．セロデキストリンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、リボ−ス５−リン酸イソメラ−ゼ、およびリボ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼを含み、ここで任意に、前述の酵素の少なくとも１つが耐熱性酵素である、単一細胞ライセ−ト、少なくとも２つの細胞集団から得た細胞ライセ−トの混合物、または反応混合物。
１０７．セロデキストリンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、アラビノ−ス５−リン酸イソメラ−ゼ、およびアラビノ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼを含み、ここで任意に、前述の酵素の少なくとも１つが耐熱性酵素である、単一細胞ライセ−ト、少なくとも２つの細胞集団から得た細胞ライセ−トの混合物、または反応混合物。
１０８．セロデキストリンホスホリラ−ゼ、ホスホグルコムタ−ゼ、ホスホグルコイソメラ−ゼ、マンノ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、およびマンノ−ス６−リン酸を含み、ここで任意に、前述の酵素の少なくとも１つが耐熱性酵素である、単一細胞ライセ−ト、少なくとも２つの細胞集団から得た細胞ライセ−トの混合物、または反応混合物。
【０１９４】
１０９．糖を生産するための無細胞的方法であって、該方法が、
（ａ）耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、ならびに、イソメラ−ゼ、エピメラ−ゼ、デヒドロゲナ−ゼ、および糖ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの耐熱性酵素を発現するように改変された細胞を培養すること；
（ｂ）ステップ（ａ）の培養細胞を溶解して、細胞ライセ−トを生産すること；
（ｃ）細胞ライセ−トを、天然の酵素活性を不活性化するがステップ（ａ）の耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産すること；および
（ｄ）熱不活化ライセ−トを、デンプンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、糖を生産すること；
を含む、前記方法。
【０１９５】
１１０．少なくとも１つの耐熱性酵素が、ホスホグルコイソメラ−ゼ、リボ−ス５−リン酸イソメラ−ゼ、およびアラビノ−ス５−リン酸イソメラ−ゼからなる群から選択されるイソメラ−ゼである、態様１０９に記載の方法。
１１１．少なくとも１つの耐熱性酵素が、アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼである、態様１０９または１１０の方法。
１１２．少なくとも１つの耐熱性酵素が、アルド−スデヒドロゲナ−ゼ、グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、および６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼからなる群から選択されるデヒドロゲナ−ゼである、態様１０９〜１１１のいずれか１つに記載の方法。
【０１９６】
１１３．少なくとも１つの耐熱性酵素が、グルコ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼ、フルクト−ス６−リン酸ホスファタ−ゼ、アルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼ、ソルビト−ル６−リン酸ホスファタ−ゼ、リブロ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼ、リボ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼ、およびアラビノ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼからなる群から選択される糖ホスファタ−ゼである、態様１０９〜１１２のいずれか１つに記載の方法。
１１４．糖が、グルコ−ス、フルクト−ス、アルロ−ス、ソルビト−ル、リブロ−ス、リボ−ス、およびアラビノ−スからなる群から選択される、態様１０９に記載の方法。
１１５．糖がグルコ−スであり、少なくとも１つの耐熱性酵素がグルコ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを含む、態様１１４に記載の方法。
【０１９７】
１１６．細胞が、耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、および耐熱性グルコ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを発現するように改変される、態様１１５に記載の方法。
１１７．糖がフルクト−スであり、少なくとも１つの耐熱性酵素が、ホスホグルコイソメラ−ゼおよびフルクト−ス６−リン酸ホスファタ−ゼから選択される、態様１１４に記載の方法。
１１８．細胞が、耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性ホスホグルコイソメラ−ゼ、および耐熱性フルクト−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを発現するように改変される、態様１１７に記載の方法。
【０１９８】
１１９．糖がアルロ−スであり、少なくとも１つの耐熱性酵素が、ホスホグルコイソメラ−ゼ、アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、およびアルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼから選択される、態様１１４に記載の方法。
１２０．細胞が、耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性ホスホグルコイソメラ−ゼ、耐熱性アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、および耐熱性アルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼを発現するように改変される、態様１１９に記載の方法。
１２１．糖がソルビト−ルであり、少なくとも１つの耐熱性酵素が、アルド−スデヒドロゲナ−ゼおよびソルビト−ル−６−リン酸ホスファタ−ゼから選択される、態様１１４の方法。
【０１９９】
１２２．細胞が、耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性アルド−スデヒドロゲナ−ゼ、および耐熱性ソルビト−ル−６−リン酸ホスファタ−ゼを発現するように改変される、態様１２１に記載の方法。
１２３．糖がリブロ−スであり、少なくとも１つの耐熱性酵素が、グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、およびリブロ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼから選択される、態様１１４に記載の方法。
１２４．細胞が、耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、および耐熱性リブロ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼを発現するように改変される、態様１２３に記載の方法。
【０２００】
１２５．糖がリボ−スであり、少なくとも１つの耐熱性酵素が、グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、リボ−ス５−リン酸イソメラ−ゼ、およびリボ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼから選択される、態様１１４に記載の方法。
１２６．細胞が、耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、耐熱性リボ−ス５−リン酸イソメラ−ゼ、および耐熱性リボ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼを発現するように改変される、態様１２５に記載の方法。
１２７．糖がアラビノ−スであり、少なくとも１つの耐熱性酵素が、グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、アラビノ−ス５−リン酸イソメラ−ゼ、およびアラビノ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼから選択される、態様１１４に記載の方法。
【０２０１】
１２８．細胞が、耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、耐熱性グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコラクトナ−ゼ、耐熱性６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、耐熱性アラビノ−ス５−リン酸イソメラ−ゼ、および耐熱性アラビノ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼを発現するように改変される、態様１２７に記載の方法。
１２９．細胞が細菌細胞である、態様１０９〜１２８のいずれか１つに記載の方法。
１３０．細胞が酵母細胞である、態様１０９〜１２８のいずれか１つに記載の方法。
１３１．耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、および／または少なくとも１つの耐熱性酵素が、細胞に対して異種である、態様１０９〜１３０のいずれか１つに記載の方法。
【０２０２】
１３２．溶解ステップ（ｂ）が、培養細胞を機械的、化学的、または酵素的に溶解することを含む、態様１０９〜１３１のいずれか１つに記載の方法。
１３３．加熱ステップ（ｃ）が、細胞ライセ−トを少なくとも５０℃の温度に加熱することを含む、態様１０９〜１３２のいずれか１つに記載の方法。
１３４．デンプンが、アミロ−ス、アミロペクチン、またはアミロ−スとアミロペクチンの両方を含む、態様１０９〜１３３のいずれか１つに記載の方法。
１３５．耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼおよび耐熱性ホスホグルコムタ−ゼが、単一の融合タンパク質として発現される、態様１０９〜１３４のいずれか１つに記載の方法。
【０２０３】
１３６．糖を生産するための無細胞的方法であって、該方法が、
（ａ）耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、ならびにイソメラ−ゼ、エピメラ−ゼ、デヒドロゲナ−ゼ、および糖ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの耐熱性酵素を発現するように改変された細胞を培養して、酵素を発現する培養細胞を生産すること；
（ｂ）ステップ（ａ）の培養細胞を溶解して、細胞ライセ−トを生産すること；および
（ｃ）ライセ−トを、デンプンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、糖を生産すること；
を含む、前記方法。
【０２０４】
１３７．糖を生産するための無細胞的方法であって、該方法が、
（ａ）（ｉｉ）ホスホグルコムタ−ゼに融合したα−グルカンホスホリラ−ゼを含む融合タンパク質、および（ｉｉ）イソメラ−ゼ、エピメラ−ゼ、デヒドロゲナ−ゼ、および糖ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素、を発現するように改変された細胞を培養して、酵素を発現する培養細胞を生産すること；
（ｂ）ステップ（ａ）の培養細胞を溶解して、細胞ライセ−トを生産すること；および
（ｃ）ライセ−トを、デンプンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、糖を生産すること；
を含む、前記方法。
【０２０５】
１３８．糖を生産するための無細胞的方法であって、該方法が、
（ａ）ホスホグルコムタ−ゼに融合したα−グルカンホスホリラ−ゼを含む融合タンパク質を発現するように改変された細胞を培養すること；
（ｂ）イソメラ−ゼ、エピメラ−ゼ、デヒドロゲナ−ゼ、および糖ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変された細胞を培養して、酵素を発現する培養細胞を生産すること；
（ｃ）ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）の培養細胞を溶解して、細胞ライセ−トを生産すること；および
（ｄ）ライセ−トを、デンプンおよび無機リン酸塩の存在下でインキュベ−トして、糖を生産すること；
を含む、前記方法。
【０２０６】
１３９．ステップ（ａ）および／または（ｂ）の酵素が、耐熱性酵素である、態様１３７または１３８に記載の方法。
１４０．方法がさらに、細胞ライセ−トを、天然の酵素活性を不活性化するが耐熱性酵素を不活性化しない温度に加熱して、熱不活性化ライセ−トを生産させることを含む、態様１３９に記載の方法。
１４１．態様１０９〜１３８のいずれか１つに記載の方法によって生産された、細胞ライセ−ト。
１４２．耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、ならびにイソメラ−ゼ、エピメラ−ゼ、デヒドロゲナ−ゼ、および糖ホスファタ−ゼからなる群から選択される少なくとも１つの耐熱性酵素を含む、改変細胞。
【０２０７】
１４３．態様１４２に記載の改変細胞であって、
（ａ）耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、および耐熱性グルコ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼ；
（ｂ）耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、ホスホグルコイソメラ−ゼ、およびフルクト−ス６−リン酸ホスファタ−ゼ；
（ｃ）耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、ホスホグルコイソメラ−ゼ、アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ、およびアルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼ；
（ｄ）耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、アルド−スデヒドロゲナ−ゼ、およびソルビト−ル−６−リン酸ホスファタ−ゼ；
（ｅ）耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、およびリブロ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼ；
（ｆ）耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、リボ−ス５−リン酸イソメラ−ゼ、およびリボ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼ；または
（ｇ）耐熱性α−グルカンホスホリラ−ゼ、耐熱性ホスホグルコムタ−ゼ、グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ、６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ、アラビノ−ス５−リン酸イソメラ−ゼ、およびアラビノ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼ；
を含む、前記細胞。
【０２０８】
１４４．細胞が、細菌細胞または酵母細胞である、態様１４２または１４３に記載の改変細胞。
【実施例】
【０２０９】
例１．デンプンのアルロ−スへの無細胞的変換
この例は、デンプンのアルロ−スへの変換を記載する。デンプンをアルロ−スに変換するための少なくとも１つの酵素をコ−ドする少なくとも１つの異種遺伝子を発現するように改変された細胞（例えば、細菌細胞または酵母細胞）を、液体培養物中で高い細胞密度まで増殖させる。この例において使用され得る異種酵素の例としては、α−グルカンホスホリラ−ゼ（EC 2.4.1.1）、ホスホグルコムタ−ゼ（EC 5.4.2.2、5.4.2.5、または5.4.2.6）、ホスホグルコイソメラ−ゼ（EC 5.3.1.9）、アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ（EC 5.3.1.−）、およびアルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼ（EC 5.3.1.−）の耐熱性バリアントを含む。増殖段階の終わりに異種酵素の発現が誘導され、続いて細胞バイオマスを収穫する。収穫したバイオマスを次に、機械的、化学的または酵素的手段によって溶解する。次いで細胞ライセ−トを、天然の酵素活性を不活性化するが異種酵素を不活性化しない温度に加熱する。デンプン原料、無機リン酸塩および任意に他の追加の栄養素を熱不活性化ライセ−トに添加して、デンプンのアルロ−スへの変換を可能にする（図１）。
【０２１０】
例２．デンプンのグルコ−スへの無細胞的変換
この例は、デンプンのグルコ−スへの変換を記載する。デンプンをグルコ−スに変換するための少なくとも１つの酵素をコ−ドする少なくとも１つの異種遺伝子を発現するように改変された細胞（例えば、細菌細胞または酵母細胞）を、液体培養物中で高い細胞密度まで増殖させる。この例において使用され得る異種酵素の例としては、α−グルカンホスホリラ−ゼ（EC 2.4.1.1）、ホスホグルコムタ−ゼ（EC 5.4.2.2、5.4.2.5、または5.4.2.6）、およびグルコ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼ（EC 5.3.1.−）の耐熱性バリアントを含む。増殖段階の終わりに異種酵素の発現が誘導され、続いて細胞バイオマスを収穫する。収穫したバイオマスを次に、機械的、化学的または酵素的手段によって溶解する。次いで細胞ライセ−トを、天然の酵素活性を不活性化するが異種酵素を不活性化しない温度に加熱する。デンプン原料、無機リン酸塩および任意に他の追加の栄養素を熱不活性化ライセ−トに添加して、デンプンのグルコ−スへの変換を可能にする（図２Ａ）。
【０２１１】
この例はまた、デンプンのグルコ−スへの変換のための別の経路を記載する。デンプンをグルコ−スに変換するための少なくとも１つの酵素をコ−ドする少なくとも１つの異種遺伝子を発現するように改変された細胞（例えば、細菌細胞または酵母細胞）を、液体培養物中で高い細胞密度まで増殖させる。この例において使用され得る異種酵素の例としては、α−グルカンホスホリラ−ゼ（EC 2.4.1.1）、およびグルコ−ス１−リン酸ホスファタ−ゼ（EC 3.1.3.10）の耐熱性バリアントを含む。増殖段階の終わりに異種酵素の発現が誘導され、続いて細胞バイオマスを収穫する。収穫したバイオマスを次に、機械的、化学的または酵素的手段によって溶解する。次いで細胞ライセ−トを、天然の酵素活性を不活性化するが異種酵素を不活性化しない温度に加熱する。デンプン原料、無機リン酸塩および任意に他の追加の栄養素を熱不活性化ライセ−トに添加して、デンプンのグルコ−スへの変換を可能にする（図２Ｂ）。
【０２１２】
例３．デンプンのフルクト−スへの無細胞的変換
この例は、デンプンのフルクト−スへの変換を記載する。デンプンをフルクト−スに変換するための少なくとも１つの酵素をコ−ドする少なくとも１つの異種遺伝子を発現するように改変された細胞（例えば、細菌細胞または酵母細胞）を、液体培養物中で高い細胞密度まで増殖させる。この例において使用され得る異種酵素の例としては、α−グルカンホスホリラ−ゼ（EC 2.4.1.1）、ホスホグルコムタ−ゼ（EC 5.4.2.2、5.4.2.5、または5.4.2.6）、ホスホグルコイソメラ−ゼ（EC 5.3.1.9）、およびフルクト−ス６−リン酸ホスファタ−ゼ（EC 5.3.1.−）の耐熱性バリアントを含む。増殖段階の終わりに異種酵素の発現が誘導され、続いて細胞バイオマスを収穫する。収穫したバイオマスを次に、機械的、化学的または酵素的手段によって溶解する。次いで細胞ライセ−トを、天然の酵素活性を不活性化するが異種酵素を不活性化しない温度に加熱する。デンプン原料、無機リン酸塩および任意に他の追加の栄養素を熱不活性化ライセ−トに添加して、デンプンのフルクト−スへの変換を可能にする（図３）。
【０２１３】
例４．デンプンのソルビト−ルへの無細胞的変換
この例は、デンプンのソルビト−ルへの変換を記載する。デンプンをソルビト−ルに変換するための少なくとも１つの酵素をコ−ドする少なくとも１つの異種遺伝子を発現するように改変された細胞（例えば、細菌細胞または酵母細胞）を、液体培養物中で高い細胞密度まで増殖させる。この例において使用され得る異種酵素の例としては、α−グルカンホスホリラ−ゼ（EC 2.4.1.1）、ホスホグルコムタ−ゼ（EC 5.4.2.2、5.4.2.5、または5.4.2.6）、アルド−スデヒドロゲナ−ゼ（EC 1.1.1.200）、およびソルビト−ル６−リン酸ホスファタ−ゼ（EC 5.3.1.−）の耐熱性バリアントを含む。増殖段階の終わりに異種酵素の発現が誘導され、続いて細胞バイオマスを収穫する。収穫したバイオマスを次に、機械的、化学的または酵素的手段によって溶解する。次いで細胞ライセ−トを、天然の酵素活性を不活性化するが異種酵素を不活性化しない温度に加熱する。デンプン原料、無機リン酸塩および任意に他の追加の栄養素を熱不活性化ライセ−トに添加して、デンプンのソルビト−ルへの変換を可能にする（図４）。
【０２１４】
例５．デンプンのリブロ−スへの無細胞的変換
この例は、デンプンのリブロ−スへの変換を記載する。デンプンをリブロ−スに変換するための少なくとも１つの酵素をコ−ドする少なくとも１つの異種遺伝子を発現するように改変された細胞（例えば、細菌細胞または酵母細胞）を、液体培養物中で高い細胞密度まで増殖させる。この例において使用され得る異種酵素の例としては、α−グルカンホスホリラ−ゼ（EC 2.4.1.1）、ホスホグルコムタ−ゼ（EC 5.4.2.2、5.4.2.5、または5.4.2.6）、グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ（EC 1.1.1.49）、６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ（EC 3.1.1.31）、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ（EC 1.1.1.44）、およびリブロ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼ（EC 5.3.1.−）、およびリブロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼ（EC 5.3.1.−）の耐熱性バリアントを含む。増殖段階の終わりに異種酵素の発現が誘導され、続いて細胞バイオマスを収穫する。収穫したバイオマスを次に、機械的、化学的または酵素的手段によって溶解する。次いで細胞ライセ−トを、天然の酵素活性を不活性化するが異種酵素を不活性化しない温度に加熱する。デンプン原料、無機リン酸塩および任意に他の追加の栄養素を熱不活性化ライセ−トに添加して、デンプンのリブロ−スへの変換を可能にする（図５）。
【０２１５】
例６．デンプンのリボ−スへの無細胞的変換
この例は、デンプンのリボ−スへの変換を記載する。デンプンをリボ−スに変換するための少なくとも１つの酵素をコ−ドする少なくとも１つの異種遺伝子を発現するように改変された細胞（例えば、細菌細胞または酵母細胞）を、液体培養物中で高い細胞密度まで増殖させる。この例において使用され得る異種酵素の例としては、α−グルカンホスホリラ−ゼ（EC 2.4.1.1）、ホスホグルコムタ−ゼ（EC 5.4.2.2、5.4.2.5、または5.4.2.6）、グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ（EC 1.1.1.49）、６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ（EC 3.1.1.31）、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ（EC 1.1.1.44）、リボ−ス５−リン酸イソメラ−ゼ（EC 5.3.1.6）、およびリボ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼ（EC 5.3.1.−）の耐熱性バリアントを含む。増殖段階の終わりに異種酵素の発現が誘導され、続いて細胞バイオマスを収穫する。収穫したバイオマスを次に、機械的、化学的または酵素的手段によって溶解する。次いで細胞ライセ−トを、天然の酵素活性を不活性化するが異種酵素を不活性化しない温度に加熱する。デンプン原料、無機リン酸塩および任意に他の追加の栄養素を熱不活性化ライセ−トに添加して、デンプンのリボ−スへの変換を可能にする（図６）。
【０２１６】
例７．デンプンのアラビノ−スへの無細胞的変換
この例は、デンプンのアラビノ−スへの変換を記載する。デンプンをアラビノ−スに変換するための少なくとも１つの酵素をコ−ドする少なくとも１つの異種遺伝子を発現するように改変された細胞（例えば、細菌細胞または酵母細胞）を、液体培養物中で高い細胞密度まで増殖させる。この例において使用され得る異種酵素の例としては、α−グルカンホスホリラ−ゼ（EC 2.4.1.1）、ホスホグルコムタ−ゼ（EC 5.4.2.2、5.4.2.5、または5.4.2.6）、グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ（EC 1.1.1.49）、６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ（EC 3.1.1.31）、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ（EC 1.1.1.44）、アラビノ−ス５−リン酸イソメラ−ゼ（EC 5.3.1.6）、およびアラビノ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼ（EC 5.3.1.−）の耐熱性バリアントを含む。増殖段階の終わりに異種酵素の発現が誘導され、続いて細胞バイオマスを収穫する。収穫したバイオマスを次に、機械的、化学的または酵素的手段によって溶解する。次いで細胞ライセ−トを、天然の酵素活性を不活性化するが異種酵素を不活性化しない温度に加熱する。デンプン原料、無機リン酸塩および任意に他の追加の栄養素を熱不活性化ライセ−トに添加して、デンプンのアラビノ−スへの変換を可能にする（図７）。
【０２１７】
例８．セルロ−ス／セロデキストリンのアルロ−スへの無細胞的変換
この例は、セルロ−ス／セロデキストリンのアルロ−スへの変換を記載する。セルロ−ス／セロデキストリンをアルロ−スに変換するための少なくとも１つの酵素をコ−ドする少なくとも１つの異種遺伝子を発現するように改変された細胞（例えば、細菌細胞または酵母細胞）を、液体培養物中で高い細胞密度まで増殖させる。この例において使用され得る異種酵素の例としては、セロデキストリンホスホリラ−ゼ（EC 2.4.1.49）、ホスホグルコムタ−ゼ（EC 5.4.2.2、5.4.2.5、または5.4.2.6）、ホスホグルコイソメラ−ゼ（EC 5.3.1.9）、アルロ−ス６−リン酸エピメラ−ゼ（EC 5.3.1.−）、およびアルロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼ（EC 5.3.1.−）の耐熱性バリアントを含む。増殖段階の終わりに異種酵素の発現が誘導され、続いて細胞バイオマスを収穫する。収穫したバイオマスを次に、機械的、化学的または酵素的手段によって溶解する。次いで細胞ライセ−トを、天然の酵素活性を不活性化するが異種酵素を不活性化しない温度に加熱する。セルロ−ス／セロデキストリン原料、無機リン酸塩および任意に他の追加の栄養素を熱不活性化ライセ−トに添加して、セルロ−ス／セロデキストリンのアルロ−スへの変換を可能にする。
【０２１８】
例９．セルロ−ス／セロデキストリンのグルコ−スへの無細胞的変換
この例は、セルロ−ス／セロデキストリンのグルコ−スへの変換を記載する。セルロ−ス／セロデキストリンをグルコ−スに変換するための少なくとも１つの酵素をコ−ドする少なくとも１つの異種遺伝子を発現するように改変された細胞（例えば、細菌細胞または酵母細胞）を、液体培養物中で高い細胞密度まで増殖させる。この例において使用され得る異種酵素の例としては、セロデキストリンホスホリラ−ゼ（EC 2.4.1.49）、ホスホグルコムタ−ゼ（EC 5.4.2.2、5.4.2.5、または5.4.2.6）、およびグルコ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼ（EC 5.3.1.−）の耐熱性バリアントを含む。増殖段階の終わりに異種酵素の発現が誘導され、続いて細胞バイオマスを収穫する。収穫したバイオマスを次に、機械的、化学的または酵素的手段によって溶解する。次いで細胞ライセ−トを、天然の酵素活性を不活性化するが異種酵素を不活性化しない温度に加熱する。セルロ−ス／セロデキストリン原料、無機リン酸塩および任意に他の追加の栄養素を熱不活性化ライセ−トに添加して、セルロ−ス／セロデキストリンのグルコ−スへの変換を可能にする。
【０２１９】
この例はまたセルロ−ス／セロデキストリンのグルコ−スへの変換のための別の経路を記載する。セルロ−ス／セロデキストリンをグルコ−スに変換するための少なくとも１つの酵素をコ−ドする少なくとも１つの異種遺伝子を発現するように改変された細胞（例えば、細菌細胞または酵母細胞）を、液体培養物中で高い細胞密度まで増殖させる。この例において使用され得る異種酵素の例としては、セロデキストリンホスホリラ−ゼ（EC 2.4.1.49）、およびグルコ−ス１−リン酸ホスファタ−ゼ（EC 3.1.3.10）の耐熱性バリアントを含む。増殖段階の終わりに異種酵素の発現が誘導され、続いて細胞バイオマスを収穫する。収穫したバイオマスを次に、機械的、化学的または酵素的手段によって溶解する。次いで細胞ライセ−トを、天然の酵素活性を不活性化するが異種酵素を不活性化しない温度に加熱する。セルロ−ス／セロデキストリン原料、無機リン酸塩および任意に他の追加の栄養素を熱不活性化ライセ−トに添加して、セルロ−ス／セロデキストリンのグルコ−スへの変換を可能にする。
【０２２０】
例１０．セルロ−ス／セロデキストリンのフルクト−スへの無細胞的変換
この例は、セルロ−ス／セロデキストリンのフルクト−スへの変換を記載する。セルロ−ス／セロデキストリンをフルクト−スに変換するための少なくとも１つの酵素をコ−ドする少なくとも１つの異種遺伝子を発現するように改変された細胞（例えば、細菌細胞または酵母細胞）を、液体培養物中で高い細胞密度まで増殖させる。この例において使用され得る異種酵素の例としては、セロデキストリンホスホリラ−ゼ（EC 2.4.1.49）、ホスホグルコムタ−ゼ（EC 5.4.2.2、5.4.2.5、または5.4.2.6）、ホスホグルコイソメラ−ゼ（EC 5.3.1.9）、およびフルクト−ス６−リン酸ホスファタ−ゼ（EC 5.3.1.−）の耐熱性バリアントを含む。増殖段階の終わりに異種酵素の発現が誘導され、続いて細胞バイオマスを収穫する。収穫したバイオマスを次に、機械的、化学的または酵素的手段によって溶解する。次いで細胞ライセ−トを、天然の酵素活性を不活性化するが異種酵素を不活性化しない温度に加熱する。セルロ−ス／セロデキストリン原料、無機リン酸塩および任意に他の追加の栄養素を熱不活性化ライセ−トに添加して、セルロ−ス／セロデキストリンのフルクト−スへの変換を可能にする。
【０２２１】
例１１．セルロ−ス／セロデキストリンのソルビト−ルへの無細胞的変換
この例は、セルロ−ス／セロデキストリンのソルビト−ルへの変換を記載する。セルロ−ス／セロデキストリンをソルビト−ルに変換するための少なくとも１つの酵素をコ−ドする少なくとも１つの異種遺伝子を発現するように改変された細胞（例えば、細菌細胞または酵母細胞）を、液体培養物中で高い細胞密度まで増殖させる。この例において使用され得る異種酵素の例としては、セロデキストリンホスホリラ−ゼ（EC 2.4.1.49）、ホスホグルコムタ−ゼ（EC 5.4.2.2、5.4.2.5、または5.4.2.6）、アルド−スデヒドロゲナ−ゼ（EC 1.1.1.200）、およびソルビト−ル６−リン酸ホスファタ−ゼ（EC 5.3.1.−）の耐熱性バリアントを含む。増殖段階の終わりに異種酵素の発現が誘導され、続いて細胞バイオマスを収穫する。収穫したバイオマスを次に、機械的、化学的または酵素的手段によって溶解する。次いで細胞ライセ−トを、天然の酵素活性を不活性化するが異種酵素を不活性化しない温度に加熱する。セルロ−ス／セロデキストリン原料、無機リン酸塩および任意に他の追加の栄養素を熱不活性化ライセ−トに添加して、セルロ−ス／セロデキストリンのソルビト−ルへの変換を可能にする。
【０２２２】
例１２．セルロ−ス／セロデキストリンのリブロ−スへの無細胞的変換
この例は、セルロ−ス／セロデキストリンのリブロ−スへの変換を記載する。セルロ−ス／セロデキストリンをリブロ−スに変換するための少なくとも１つの酵素をコ−ドする少なくとも１つの異種遺伝子を発現するように改変された細胞（例えば、細菌細胞または酵母細胞）を、液体培養物中で高い細胞密度まで増殖させる。この例において使用され得る異種酵素の例としては、セロデキストリンホスホリラ−ゼ（EC 2.4.1.49）、ホスホグルコムタ−ゼ（EC 5.4.2.2、5.4.2.5、または5.4.2.6）、グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ（EC 1.1.1.49）、６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ（EC 3.1.1.31）、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ（EC 1.1.1.44）、リブロ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼ（EC 5.3.1.−）、およびリブロ−ス６−リン酸ホスファタ−ゼ（EC 5.3.1.−）の耐熱性バリアントを含む。増殖段階の終わりに異種酵素の発現が誘導され、続いて細胞バイオマスを収穫する。収穫したバイオマスを次に、機械的、化学的または酵素的手段によって溶解する。次いで細胞ライセ−トを、天然の酵素活性を不活性化するが異種酵素を不活性化しない温度に加熱する。セルロ−ス／セロデキストリン原料、無機リン酸塩および任意に他の追加の栄養素を熱不活性化ライセ−トに添加して、セルロ−ス／セロデキストリンのリブロ−スへの変換を可能にする。
【０２２３】
例１３．セルロ−ス／セロデキストリンのリボ−スへの無細胞的変換
この例は、セルロ−ス／セロデキストリンのリボ−スへの変換を記載する。セルロ−ス／セロデキストリンをリボ−スに変換するための少なくとも１つの酵素をコ−ドする少なくとも１つの異種遺伝子を発現するように改変された細胞（例えば、細菌細胞または酵母細胞）を、液体培養物中で高い細胞密度まで増殖させる。この例において使用され得る異種酵素の例としては、セロデキストリンホスホリラ−ゼ（EC 2.4.1.49）、ホスホグルコムタ−ゼ（EC 5.4.2.2、5.4.2.5、または5.4.2.6）、グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ（EC 1.1.1.49）、６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ（EC 3.1.1.31）、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ（EC 1.1.1.44）、リボ−ス５−リン酸イソメラ−ゼ（EC 5.3.1.6）、およびリボ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼ（EC 5.3.1.−）の耐熱性バリアントを含む。増殖段階の終わりに異種酵素の発現が誘導され、続いて細胞バイオマスを収穫する。収穫したバイオマスを次に、機械的、化学的または酵素的手段によって溶解する。次いで細胞ライセ−トを、天然の酵素活性を不活性化するが異種酵素を不活性化しない温度に加熱する。セルロ−ス／セロデキストリン原料、無機リン酸塩および任意に他の追加の栄養素を熱不活性化ライセ−トに添加して、セルロ−ス／セロデキストリンのリボ−スへの変換を可能にする。
【０２２４】
例１４．セルロ−ス／セロデキストリンのアラビノ−スへの無細胞的変換
この例は、セルロ−ス／セロデキストリンのアラビノ−スへの変換を記載する。セルロ−ス／セロデキストリンをアラビノ−スに変換するための少なくとも１つの酵素をコ−ドする少なくとも１つの異種遺伝子を発現するように改変された細胞（例えば、細菌細胞または酵母細胞）を、液体培養物中で高い細胞密度まで増殖させる。この例において使用され得る異種酵素の例としては、セロデキストリンホスホリラ−ゼ（EC 2.4.1.49）、ホスホグルコムタ−ゼ（EC 5.4.2.2、5.4.2.5、または5.4.2.6）、グルコ−ス６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ（EC 1.1.1.49）、６−ホスホグルコノラクトナ−ゼ（EC 3.1.1.31）、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナ−ゼ（EC 1.1.1.44）、アラビノ−ス５−リン酸イソメラ−ゼ（EC 5.3.1.6）、およびアラビノ−ス５−リン酸ホスファタ−ゼ（EC 5.3.1.−）の耐熱性バリアントを含む。増殖段階の終わりに異種酵素の発現が誘導され、続いて細胞バイオマスを収穫する。収穫したバイオマスを次に、機械的、化学的または酵素的手段によって溶解する。次いで細胞ライセ−トを、天然の酵素活性を不活性化するが異種酵素を不活性化しない温度に加熱する。セルロ−ス／セロデキストリン原料、無機リン酸塩および任意に他の追加の栄養素を熱不活性化ライセ−トに添加して、セルロ−ス／セロデキストリンのアラビノ−スへの変換を可能にする（図７）。
【０２２５】
本明細書に開示されている全ての参考文献、特許および特許出願は、それぞれが引用されている主題に関して参照によって組み込まれており、これは場合により文書の全体を包含し得る。
本明細書および特許請求の範囲で使用される不定冠詞「a」および「an」は、そうでないことが明確に示されていない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。
本明細書でクレ−ムされている、１つより多くのステップまたは行為を含む方法において、そうでないことが明確に示されていない限り、方法のステップまたは行為の順序は必ずしも、方法のステップまたは行為が列挙されている順序に限定されないことも、理解されるべきである。
特許請求の範囲および上記の明細書において、「含む（comprising）」、「含む／包含する（including）」、「保持する」、「有する」、「含有する」、「伴う」、「保有する」、「構成される」などのすべての移行句は、オ−プンエンドであると理解されるべきであり、すなわち、含むが限定はされないことを意味する。「からなる」および「から本質的になる」という移行句のみが、米国特許庁の審査手続、第2111.03節に記載されているように、それぞれクロ−ズドまたはセミクロ−ズドの移行句であるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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