(57)【要約】任意の供給源核酸から、ガイド核酸（ｇＮＡ）、ｇＮＡをコードする核酸、ｇＮＡの収集物、およびｇＮＡの収集物をコードする核酸を作製するための方法および組成物が、本明細書に提供される。種々の適用において、その結果生じたｇＮＡ、ｇＮＡをコードする核酸、ｇＮＡの収集物、およびｇＮＡの収集物をコードする核酸を使用するための方法および組成物も、本明細書に提供される。上記方法は、核酸ガイド化ヌクレアーゼのＰＡＭ部位をそれぞれ含む標的核酸を得るステップを含み得る。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸の収集物を作製する方法であって、
ａ．核酸ガイド化ヌクレアーゼのＰＡＭ部位をそれぞれ含む標的核酸を得るステップと、
ｂ．第１のプライマーを前記標的核酸の前記ＰＡＭ部位にハイブリダイズさせるステップであって、前記第１のプライマーが、（ｉ）前記ＰＡＭ部位に相補的なＭＡＰ部位、（ｉｉ）前記核酸ガイド化ヌクレアーゼの認識部位に相補的な相補的認識部位、および（ｉｉｉ）プロモーター部位に相補的な相補的プロモーター部位を含む、ステップと、
ｃ．鋳型として前記標的核酸を使用して、前記第１のプライマーを伸長させるステップであって、これによって、前記第１のプライマーの配列および前記標的核酸に相補的な配列を含む第１の伸長産物を産生するステップと、
ｄ．第２のプライマーを前記第１の伸長産物にハイブリダイズさせるステップと、
ｅ．鋳型として前記第１の伸長産物を使用して、前記第２のプライマーを伸長させるステップであって、これによって、前記ＰＡＭ部位、前記認識部位および前記プロモーター部位を含む第２の伸長産物を産生するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記第２のプライマーが、（ｉ）前記核酸ガイド化ヌクレアーゼのＰＡＭ部位、および（ｉｉ）ランダム配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ランダム配列が、約６〜約８塩基長の間である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１のプライマーが、制限酵素の制限酵素部位をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ｆ．アダプタを前記第２の伸長産物にライゲーションするステップであって、前記アダプタが、制限酵素の制限酵素部位を含む、ステップと、
ｇ．前記ＰＡＭ部位および前記制限部位が、前記認識部位から切断されるように、前記制限酵素で前記第２の伸長産物を切断するステップと
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記制限酵素が、ＭｍｅＩ、ＦｏｋＩまたはＭｌｙＩを含む、請求項４または請求項５に記載の方法。
【請求項７】
結合していない第１のプライマーまたは結合していない第２のプライマーを除去するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第１のプライマーを伸長させる前記ステップまたは前記第２のプライマーを伸長させる前記ステップが、標識されたヌクレオチドにより行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記標識されたヌクレオチドが、ビオチン化ヌクレオチドを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記認識部位が、約２０ヌクレオチドの長さである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記認識部位が、約１５〜約２５ヌクレオチドの長さである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼが、Ｃａｓ系タンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９系タンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記標的核酸が、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記標的核酸が、ヒトＤＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記標的核酸が、宿主ＤＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記標的核酸が、真核生物ＤＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記相補的認識部位が、少なくとも１個の改変された核酸結合を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記改変された核酸結合が、ロックド核酸（ＬＮＡ）、架橋された核酸（ＢＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ジップ核酸（ＺＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）およびホスホロチオエート（ＰＴＯ）からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記プロモーター部位を使用して、前記第２の伸長産物を転写するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
核酸の収集物を作製する方法であって、
ａ．核酸ガイド化ヌクレアーゼのＰＡＭ部位をそれぞれ含む標的核酸を得るステップと、
ｂ．プライマーを前記標的核酸の前記ＰＡＭ部位にハイブリダイズさせるステップであって、前記プライマーが、（ｉ）前記ＰＡＭ部位に相補的なＭＡＰ部位、（ｉｉ）前記核酸ガイド化ヌクレアーゼの認識部位に相補的な相補的認識部位、および（ｉｉｉ）プロモーター部位に相補的な相補的プロモーター部位を含む、ステップと、
ｃ．鋳型として前記標的核酸を使用して、前記プライマーを伸長させるステップであって、これによって、前記ＰＡＭ部位、前記認識部位および前記プロモーター部位を含む伸長産物を産生するステップと、
ｄ．前記標的核酸をニッキングするステップと、
ｅ．前記ニッキングされた標的核酸を消化するステップと
を含む方法。
【請求項２２】
前記伸長産物に、前記核酸ガイド化ヌクレアーゼのステムループ配列またはその相補体を含む核酸をライゲーションするステップをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
互い違いになっている二本鎖ステムループを前記伸長産物に付加するステップをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記プロモーター部位を使用して、前記伸長産物を転写するステップをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
結合していないプライマーを除去するステップをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記プライマーを伸長させる前記ステップが、標識されたヌクレオチドにより行われる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記標識されたヌクレオチドが、ビオチン化ヌクレオチドを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記相補的認識部位が、約２０ヌクレオチドの長さである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
前記相補的認識部位が、約１５〜約２５ヌクレオチドの長さである、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼが、Ｃａｓ系タンパク質を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９系タンパク質を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３２】
前記標的核酸が、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３３】
前記標的核酸が、ヒトＤＮＡを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３４】
前記標的核酸が、宿主ＤＮＡを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３５】
前記標的核酸が、真核生物ＤＮＡを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３６】
前記相補的認識部位が、少なくとも１個の改変された核酸結合を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３７】
前記改変された核酸結合が、ロックド核酸（ＬＮＡ）、架橋された核酸（ＢＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ジップ核酸（ＺＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）およびホスホロチオエート（ＰＴＯ）からなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
核酸の収集物を作製する方法であって、
ａ．核酸ガイド化ヌクレアーゼのＰＡＭ部位をそれぞれ含む標的核酸を得るステップと、
ｂ．第１のループアダプタを前記標的核酸の両末端にライゲーションするステップであって、前記第１のループアダプタが、プロモーター部位を含む、ステップと、
ｃ．前記ＰＡＭ部位で前記標的核酸を切断するステップであって、これによって、第１の末端における前記第１のループアダプタおよび第２の末端におけるＰＡＭ部位のうち１つをそれぞれ含むＤＮＡ切断産物を産生するステップと、
ｄ．第２のループアダプタを前記切断産物の前記第２の末端にライゲーションするステップであって、前記第２のループアダプタが、前記核酸ガイド化ヌクレアーゼのステムループ配列に相補的な相補的ステムループ配列を含む、ステップと、
ｅ．前記切断産物を増幅し、これにより、前記プロモーター部位、認識部位および前記ステムループ配列を含む増幅産物を産生するステップであって、前記認識部位が、前記標的核酸の１つにおいて前記ＰＡＭ部位に隣接した配列を含む、ステップと
を含む方法。
【請求項３９】
ガイド核酸の収集物を作製する方法であって、
ａ．標的核酸の配列リード配列リードを得るステップと、
ｂ．前記配列リードを少なくとも１つの参照配列にマッピングするステップと、
ｃ．前記配列リードの存在量値を決定するステップと、
ｄ．前記配列リードから認識部位を同定するステップであって、前記認識部位が、核酸ガイド化ヌクレアーゼのＰＡＭ部位に隣接する、ステップと、
ｅ．前記存在量値に基づき前記認識部位を選別するステップと
を含む方法。
【請求項４０】
前記ガイド核酸の収集物を合成するステップをさらに含み、前記ガイド核酸が、前記核酸ガイド化ヌクレアーゼの前記認識部位およびステムループ配列のうち１つをそれぞれ含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記ガイド核酸の収集物が、上位１００個の選別された認識部位、上位１０００個の選別された認識部位、または上位１０，０００個の選別された認識部位を有するガイド核酸を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記認識部位が、少なくとも１００塩基対、少なくとも２００塩基対、少なくとも５００塩基対または少なくとも１０００塩基対だけ、前記少なくとも１つの参照配列において互いに間隔をあけるように、前記認識部位をフィルタリングするステップをさらに含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
前記認識部位を選別する前記ステップが、前記配列リードを選別することにより行われる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
前記認識部位が、約２０塩基を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４５】
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼが、Ｃａｓ系タンパク質を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４６】
前記核酸の標的部位が、前記ＰＡＭ部位の５’に位置し、前記認識部位が、ステムループ配列の５’にある、請求項３９に記載の方法。
【請求項４７】
前記ＰＡＭ部位が、ＮＧＧまたはＮＡＧを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９系タンパク質を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記核酸の標的部位が、前記ＰＡＭ部位の３’に位置し、前記認識部位が、ステムループ配列の３’にある、請求項３９に記載の方法。
【請求項５０】
前記ＰＡＭ部位が、ＴＴＮ、ＴＣＮまたはＴＧＮを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼが、Ｃｐｆ１系タンパク質を含む、請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９系タンパク質を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項５３】
前記標的核酸が、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項５４】
前記標的核酸が、ヒトＤＮＡを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項５５】
前記標的核酸が、宿主ＤＮＡを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項５６】
前記標的核酸が、真核生物ＤＮＡを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項５７】
前記ガイド核酸を基材に結合させるステップをさらに含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項５８】
前記基材が、フローセル、流体チャネル、マイクロ流体チャネルまたはビーズを含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
ガイド核酸の収集物を作製する方法であって、
ａ．標的核酸の配列リードを得るステップと、
ｂ．前記配列リードから最も高頻度の認識部位を決定するステップであって、認識部位が、核酸ガイド化ヌクレアーゼのＰＡＭ部位に隣接する、ステップと、
ｃ．前記配列リードからその次に高頻度の認識部位を決定するステップと、
ｄ．条件が満たされるまでステップｃを反復するステップであって、前記条件が、（ｉ）設定された数の認識部位が決定されること、（ｉｉ）さらなる認識部位を決定することができないこと、（ｉｉｉ）設定されたパーセンテージの前記標的核酸が、前記認識部位によって網羅されること、（ｉｖ）前記認識部位におけるまたはその近傍における前記標的核酸の切断が、設定されたサイズを下回る最大断片サイズを生じること、からなる群から選択される、ステップと
を含む方法。
【請求項６０】
前記設定された数の認識部位が、少なくとも約１００、少なくとも約１０００または少なくとも約１０，０００個である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記設定されたパーセンテージが、少なくとも約１０％、少なくとも約３０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
前記設定されたサイズが、多くても約１０００ｂｐ、多くても約５００ｂｐ、多くても約２００ｂｐまたは多くても約１００ｂｐである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
前記ガイド核酸の収集物を合成するステップをさらに含み、前記ガイド核酸が、前記核酸ガイド化ヌクレアーゼの前記認識部位およびステムループ配列のうち１つをそれぞれ含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６４】
前記認識部位が、約２０塩基を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６５】
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼが、Ｃａｓ系タンパク質を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６６】
前記核酸の標的部位が、前記ＰＡＭ部位の５’に位置し、前記認識部位が、ステムループ配列の５’にある、請求項５９に記載の方法。
【請求項６７】
前記ＰＡＭ部位が、ＮＧＧまたはＮＡＧを含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９系タンパク質を含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記核酸の標的部位が、前記ＰＡＭ部位の３’に位置し、前記認識部位が、ステムループ配列の３’にある、請求項５９に記載の方法。
【請求項７０】
前記ＰＡＭ部位が、ＴＴＮ、ＴＣＮまたはＴＧＮを含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼが、Ｃｐｆ１系タンパク質を含む、請求項７０記載の方法。
【請求項７２】
前記標的核酸が、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項７３】
前記標的核酸が、ヒトＤＮＡを含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項７４】
前記標的核酸が、宿主ＤＮＡを含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項７５】
前記標的核酸が、真核生物ＤＮＡを含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項７６】
前記ガイド核酸を基材に結合させるステップをさらに含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項７７】
前記基材が、フローセル、流体チャネル、マイクロ流体チャネルまたはビーズを含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
ガイド核酸の収集物を含む組成物であって、
各ガイド核酸が、核酸ガイド化ヌクレアーゼの認識部位およびステムループ配列を含み、
各認識部位が、前記核酸ガイド化ヌクレアーゼのＰＡＭ部位に隣接する標的核酸の標的部位に相補的であり、
前記ガイド核酸の収集物の前記認識部位が相補的である前記標的部位が、約１０，０００塩基対未満の平均間隔で、前記標的核酸内に分布される、
組成物。
【請求項７９】
前記平均間隔が、約５，０００塩基対未満、約２，５００塩基対未満、約１，０００塩基対未満、約５００塩基対未満、約２５０塩基対未満または約１００塩基対未満である、請求項７８に記載の組成物。
【請求項８０】
前記ガイド核酸の収集物が、少なくとも約１００種の異なる認識部位、少なくとも１，０００種の異なる認識部位、少なくとも１０，０００種の異なる認識部位、少なくとも１００，０００種の異なる認識部位、または少なくとも１，０００，００種の異なる認識部位を有するガイド核酸を含む、請求項７８に記載の組成物。
【請求項８１】
前記認識部位が、約２０塩基を含む、請求項７８に記載の組成物。
【請求項８２】
前記核酸の標的部位が、前記ＰＡＭ部位の５’に位置し、前記認識部位が、ステムループ配列の５’にある、請求項７８に記載の組成物。
【請求項８３】
前記ＰＡＭ部位が、ＮＧＧまたはＮＡＧを含む、請求項８２に記載の組成物。
【請求項８４】
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９系タンパク質を含む、請求項８３に記載の組成物。
【請求項８５】
前記核酸の標的部位が、前記ＰＡＭ部位の３’に位置し、前記認識部位が、ステムループ配列の３’にある、請求項７８に記載の組成物。
【請求項８６】
前記ＰＡＭ部位が、ＴＴＮ、ＴＣＮまたはＴＧＮを含む、請求項８５に記載の組成物。
【請求項８７】
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼが、Ｃｐｆ１系タンパク質を含む、請求項８６記載の組成物。
【請求項８８】
前記標的核酸が、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む、請求項７８に記載の組成物。
【請求項８９】
前記標的核酸が、ヒトＤＮＡを含む、請求項７８に記載の組成物。
【請求項９０】
前記標的核酸が、宿主ＤＮＡを含む、請求項７８に記載の組成物。
【請求項９１】
前記標的核酸が、真核生物ＤＮＡを含む、請求項７８に記載の組成物。
【請求項９２】
前記ガイド核酸が基材に結合している、請求項７８に記載の組成物。
【請求項９３】
前記基材が、フローセル、流体チャネル、マイクロ流体チャネルまたはビーズを含む、請求項９２に記載の組成物。
【請求項９４】
標的核酸を枯渇させる方法であって、
ａ．標的核酸および非標的核酸を含む核酸を得るステップと、
ｂ．前記標的核酸が、標的部位においてまたはその近傍で切断されるように、前記標的核酸を、請求項７８から９１のいずれか一項に記載の収集物のガイド核酸と複合体形成した核酸ガイド化ヌクレアーゼの複合体と接触させるステップと
を含む方法。
【請求項９５】
前記非標的核酸が、免疫応答シグナル核酸を含む、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記非標的核酸が、アポトーシスシグナル核酸を含む、請求項９４に記載の方法。
【請求項９７】
前記非標的核酸が、がん関係のアポトーシスシグナル核酸を含む、請求項９４に記載の方法。
【請求項９８】
核酸ガイド化ヌクレアーゼの前記複合体が、基材に結合している、請求項９４に記載の方法。
【請求項９９】
前記基材が、フローセル、流体チャネル、マイクロ流体チャネルまたはビーズを含む、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
標的核酸を枯渇させる方法であって、
ａ．標的核酸および非標的核酸を含む核酸を得るステップと、
ｂ．前記標的核酸がニック部位でニッキングされるように、前記核酸を核酸ガイド化ニッカーゼタンパク質−ｇＮＡ複合体と接触させるステップであって、前記ｇＮＡが、５’ステムループ配列および３’標的化配列を含む、ステップと、
ｃ．前記ニック部位でニックトランスレーションを行うステップであって、前記ニックトランスレーションが、標識されたヌクレオチドにより行われる、ステップと、
ｄ．前記標識されたヌクレオチドを有する前記標的核酸を捕捉するステップと、
ｅ．前記非標的核酸から前記標的核酸を分離するステップと
を含む方法。
【請求項１０１】
前記標識されたヌクレオチドが、ビオチン化ヌクレオチドを含む、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記標的核酸が、基材に結合させることにより捕捉される、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０３】
前記基材が、フローセル、流体チャネル、マイクロ流体チャネルまたはビーズを含む、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記非標的核酸を解析するステップをさらに含む、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０５】
前記解析ステップが、配列決定を含む、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記解析ステップが、ハイブリダイゼーションを含む、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０７】
前記標的核酸が、宿主に由来し、前記非標的核酸が、非宿主に由来する、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０８】
前記非宿主が、感染病原体を含む、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
前記核酸ガイド化ニッカーゼタンパク質が、Ｃｐｆ１系ニッカーゼタンパク質を含む、請求項１００に記載の方法。
【請求項１１０】
前記Ｃｐｆ１系ニッカーゼタンパク質が、ＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａまたはＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓから単離されるまたはこれに由来するＣｐｆ１系タンパク質を含む、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
前記標的核酸が、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む、請求項１００に記載の方法。
【請求項１１２】
前記標的核酸が、ヒトＤＮＡを含む、請求項１００に記載の方法。
【請求項１１３】
前記標的核酸が、真核生物ＤＮＡを含む、請求項１００に記載の方法。
【請求項１１４】
標的核酸を枯渇させる方法であって、
ａ．標的核酸および非標的核酸を含む核酸を得るステップであって、前記核酸が、第１の末端にヘアピンループを含む、ステップと、
ｂ．ループアダプタを前記核酸の第２の末端にハイブリダイズさせるステップと、
ｃ．前記標的核酸がニッキングされるように、前記核酸を核酸ガイド化ニッカーゼタンパク質と接触させるステップと、
ｄ．ニッキングされた標的核酸を消化するステップと
を含む方法。
【請求項１１５】
前記非標的核酸の前記ループアダプタを切断するステップをさらに含む、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
前記切断ステップが、前記ループアダプタの制限部位で行われる、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
前記切断ステップが、前記ループアダプタの核酸ガイド化ヌクレアーゼ認識部位で行われる、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１８】
前記非標的核酸を解析するステップをさらに含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
前記解析ステップが、配列決定を含む、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
前記解析ステップが、ハイブリダイゼーションを含む、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２１】
前記消化ステップが、エキソヌクレアーゼにより行われる、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１２２】
前記核酸ガイド化ニッカーゼタンパク質が、基材に結合している、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１２３】
前記基材が、フローセル、流体チャネル、マイクロ流体チャネルまたはビーズを含む、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
配列決定ライブラリーを調製する方法であって、
ａ．請求項１００から１２３のいずれか一項に記載の枯渇方法、または捕捉方法を経た後に得られる、目的の部位を含むＤＮＡ分子を提供するステップと、
ｂ．３’末端をポリメラーゼによって伸長することができないように、前記ＤＮＡ分子の３’末端をブロックするステップと、
ｃ．第１のプライマーを前記ＤＮＡ分子にハイブリダイズさせるステップと、
ｄ．前記第１のプライマーを伸長させて、前記第１のプライマーの配列および前記目的の部位の配列を含む伸長産物を生じるステップと、
ｅ．第２のプライマーを前記伸長産物にハイブリダイズさせるステップと、
ｆ．前記第２のプライマーを使用して、前記伸長産物を増幅するステップと
を含む方法。
【請求項１２５】
前記第２のプライマーをハイブリダイズさせる前記ステップに先立ち、テイルを前記伸長産物に付加するステップをさらに含む、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２６】
前記第２のプライマーが、前記テイルにハイブリダイズされる、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
ステップｄの後に、ステップｃおよびｄを反復するステップをさらに含む、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２８】
前記第２のプライマーをハイブリダイズさせる前記ステップに先立ち、ハイブリダイズしていない第１のプライマーを除去するステップをさらに含む、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２９】
前記除去ステップが、消化を含む、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３０】
前記消化が、エキソヌクレアーゼ消化を含む、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３１】
前記除去ステップが、前記伸長産物中に取り込まれた標識されたヌクレオチドを結合させるステップを含む、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３２】
前記標識されたヌクレオチドが、ビオチン化ヌクレオチドを含む、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３３】
前記第１のプライマーおよび／または前記第２のプライマーが、配列決定アダプタ配列を含む、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１３４】
前記目的の部位が、一塩基多型（ＳＮＰ）を含む、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１３５】
前記目的の部位が、短いタンデム反復（ＳＴＲ）を含む、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１３６】
前記ＳＴＲが、ミニＳＴＲである、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１３７】
配列決定ライブラリーを調製する方法であって、
ａ．ｇＮＡ枯渇または捕捉方法に起因するＲＮＡ分子を提供するステップと、
ｂ．第１のハイブリダイゼーション部位を前記ＲＮＡ分子に付着させるステップと、
ｃ．第１のオリゴヌクレオチドを前記第１のハイブリダイゼーション部位にハイブリダイズさせるステップと、
ｄ．プライマーとして前記第１のオリゴヌクレオチドを使用して、前記ＲＮＡ分子の少なくとも一部を逆転写するステップであって、これによって、ｃＤＮＡを生成するステップと、
ｅ．第２のオリゴヌクレオチドを前記ｃＤＮＡのテイルにハイブリダイズさせるステップと、
ｆ．プライマーとして前記第２のオリゴヌクレオチドおよび／または前記第１のオリゴヌクレオチドを使用して、前記ｃＤＮＡを増幅するステップと
を含む方法。
【請求項１３８】
前記第１のハイブリダイゼーション部位が、テイルを含む、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１３９】
前記第１のハイブリダイゼーション部位が、ポリＡテイルを含む、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１４０】
前記第１のオリゴヌクレオチドが、少なくとも１個のバーコード配列を含む、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１４１】
前記第２のオリゴヌクレオチドが、少なくとも１個のバーコード配列を含む、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１４２】
前記第１のオリゴヌクレオチドおよび／または前記第２のオリゴヌクレオチドが、（ｉ）所与のＲＮＡ分子に特有の、特有の分子識別子配列、および（ｉｉ）同じ供給源由来のＲＮＡ分子の間で共有される、供給源バーコード配列からなる群から選択される１個または複数のバーコード配列を含む、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１４３】
前記第１のオリゴヌクレオチドおよび／または前記第２のオリゴヌクレオチドが、配列決定アダプタ配列を含む、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１４４】
核酸の収集物を作製する方法であって、
ａ．ＤＮＡ試料を制限エンドヌクレアーゼで消化して、ＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、
ｂ．前記ＤＮＡ断片の収集物をヌクレアーゼで処理するステップと、
ｃ．第１のアダプタを前記ＤＮＡ断片の収集物にライゲーションして、第１のアダプタＤＮＡ断片の収集物を産生するステップであって、
前記第１のアダプタをコードする配列が、ＭｍｅＩ制限部位およびＦｏｋＩ制限部位を含み、
前記ＭｍｅＩ部位が、ライゲーション後に前記ＦｏｋＩ部位および前記ＤＮＡ断片の間に位置する、ステップと、
ｄ．前記第１のアダプタＤＮＡ断片の収集物を、第１にＭｍｅＩで、第２にＦｏｋＩで消化して、Ｎ２０  ＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、
ｅ．第２のアダプタを前記Ｎ２０  ＤＮＡ断片の収集物にライゲーションするステップであって、
前記第２のアダプタをコードする配列が、プロモーター配列および核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列を含み、
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列が、前記第２のアダプタのライゲーション後に、前記Ｎ２０配列および前記プロモーターの間に位置する、ステップと
を含む方法。
【請求項１４５】
前記ヌクレアーゼが、マングビーンヌクレアーゼを含む、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１４６】
前記制限エンドヌクレアーゼが、ＭｓｅＩ、ＭｌｕＣＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＡｌｕＩ、ＤｎｐＩＩおよびＦａｔＩからなる群から選択される、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１４７】
前記プロモーター配列が、Ｔ７プロモーター配列、ＳＰ６プロモーター配列およびＴ３プロモーター配列からなる群から選択される、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１４８】
前記第１のアダプタが、二本鎖ＤＮＡアダプタである、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１４９】
前記第２のアダプタが、二本鎖ＤＮＡアダプタである、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１５０】
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質と適合性である、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１５１】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が、Ｃｐｆ１系タンパク質である、請求項１５０に記載の方法。
【請求項１５２】
前記ＤＮＡ試料が、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１５３】
前記ＤＮＡ試料が、ヒトＤＮＡを含む、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１５４】
前記ＤＮＡ試料が、宿主ＤＮＡを含む、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１５５】
前記ＤＮＡ試料が、真核生物ＤＮＡを含む、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１５６】
核酸の収集物を作製する方法であって、
ａ．ＤＮＡ試料における少なくとも２個の連続したアデノシンをイノシンに置き換えるステップと、
ｂ．前記ＤＮＡ試料をヒトアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｈＡＡＧ）で処理するステップと、
ｃ．前記ＤＮＡ試料をエンドヌクレアーゼで処理して、ＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、
ｄ．第１のライゲーションステップにおいて第１のアダプタを前記ＤＮＡ断片の収集物にライゲーションして、第１のアダプタＤＮＡ断片の収集物を生成するステップであって、
前記第１のアダプタが、二本鎖ＤＮＡ分子および前記二本鎖ＤＮＡ分子の５’末端における５’ＮＡＡ３’の一本鎖ＤＮＡオーバーハングを含み、
前記第１のアダプタが、ＭｍｅＩ部位およびＦｏｋＩ部位を含み、
前記ＭｍｅＩ部位が、前記第１のアダプタのライゲーション後に、前記ＦｏｋＩ部位および前記ＤＮＡ断片の間に位置する、ステップと、
ｅ．前記第１のアダプタライゲーションされた断片の収集物を、第１にＭｍｅＩで、第２にＦｏｋＩで消化して、Ｎ２０  ＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、
ｆ．第２のライゲーションステップにおいて、第２のアダプタを前記Ｎ２０  ＤＮＡ断片の収集物にライゲーションするステップであって、
前記第２のアダプタをコードする配列が、プロモーター配列および核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列を含み、
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列が、前記第２のアダプタのライゲーション後に、前記Ｎ２０配列および前記プロモーターの間に位置する、ステップと
を含む方法。
【請求項１５７】
前記エンドヌクレアーゼが、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩを含む、請求項１５６に記載の方法。
【請求項１５８】
前記プロモーター配列が、Ｔ７プロモーター配列、ＳＰ６プロモーター配列およびＴ３プロモーター配列からなる群から選択される、請求項１５６に記載の方法。
【請求項１５９】
前記第２のアダプタが、二本鎖ＤＮＡアダプタである、請求項１５６に記載の方法。
【請求項１６０】
前記第１のライゲーションステップが、高温リガーゼを使用して実行される、請求項１５６に記載の方法。
【請求項１６１】
前記第２のアダプタが、二本鎖ＤＮＡアダプタである、請求項１５６に記載の方法。
【請求項１６２】
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質と適合性である、請求項１５６に記載の方法。
【請求項１６３】
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、Ｃｐｆ１系タンパク質である、請求項１６２に記載の方法。
【請求項１６４】
前記ＤＮＡ試料が、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む、請求項１５６に記載の方法。
【請求項１６５】
前記ＤＮＡ試料が、ヒトＤＮＡを含む、請求項１５６に記載の方法。
【請求項１６６】
前記ＤＮＡ試料が、宿主ＤＮＡを含む、請求項１５６に記載の方法。
【請求項１６７】
前記ＤＮＡ試料が、真核生物ＤＮＡを含む、請求項１５６に記載の方法。
【請求項１６８】
核酸の収集物を作製する方法であって、
ａ．ＤＮＡ試料における少なくとも１個のチミジンをウラシルに置き換えて、少なくとも１個の塩基対ミスマッチを含むＤＮＡ試料を産生するステップと、
ｂ．少なくとも１種のＤＮＡ修復酵素により前記少なくとも１個のウラシルを切除して、少なくとも１塩基対の少なくとも１個の一本鎖領域を有するＤＮＡ試料を産生するステップと、
ｃ．前記ＤＮＡ試料をヌクレアーゼで処理して、ＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、
ｄ．第１のライゲーションステップにおいて前記ＤＮＡ断片の収集物に第１のアダプタをライゲーションして、第１のアダプタＤＮＡ断片の収集物を産生するステップであって、
前記第１のアダプタが、ＭｍｅＩ部位およびＦｏｋＩ部位を含み、
前記ＭｍｅＩ部位が、ライゲーション後に前記ＦｏｋＩ部位および前記ＤＮＡ断片の間に位置する、ステップと、
ｅ．前記第１のアダプタＤＮＡ断片の収集物を、第１にＭｍｅＩで、第２にＦｏｋＩで消化して、Ｎ２０  ＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、
ｆ．第２のライゲーションステップにおいて、第２のアダプタを前記Ｎ２０  ＤＮＡ断片の収集物にライゲーションするステップであって、
前記第２のアダプタをコードする配列が、プロモーター配列および核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列を含み、
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列が、ライゲーション後に前記Ｎ２０配列および前記プロモーターの間に位置する、ステップと
を含む方法。
【請求項１６９】
（ｂ）前記少なくとも１個のウラシルを切除するステップの後、かつ（ｃ）前記ヌクレアーゼで処理するステップの前に、前記ＤＮＡ試料をホスファターゼで処理するステップをさらに含む、請求項１６８に記載の方法。
【請求項１７０】
少なくとも１個のｄｄＴＴＰを、前記ＤＮＡ試料における少なくとも１塩基対の前記少なくとも１個の一本鎖領域の５’にある二本鎖ＤＮＡ領域の３’末端に付加するステップをさらに含む、請求項１６９に記載の方法。
【請求項１７１】
前記ヌクレアーゼが、マングビーンヌクレアーゼを含む、請求項１６８または１６９に記載の方法。
【請求項１７２】
前記少なくとも１種のＤＮＡ修復酵素が、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）およびエンドヌクレアーゼＶＩＩＩを含む、請求項１６８から１７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７３】
前記プロモーター配列が、Ｔ７プロモーター配列、ＳＰ６プロモーター配列およびＴ３プロモーター配列からなる群から選択される、請求項１６８に記載の方法。
【請求項１７４】
前記第２のアダプタが、二本鎖ＤＮＡアダプタである、請求項１６８に記載の方法。
【請求項１７５】
前記第１のライゲーションステップが、高温リガーゼを使用して実行される、請求項１６８に記載の方法。
【請求項１７６】
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質と適合性である、請求項１６８に記載の方法。
【請求項１７７】
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、Ｃｐｆ１系タンパク質である、請求項１７６に記載の方法。
【請求項１７８】
前記ＤＮＡ試料が、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む、請求項１６９に記載の方法。
【請求項１７９】
前記ＤＮＡ試料が、ヒトＤＮＡを含む、請求項１６８に記載の方法。
【請求項１８０】
前記ＤＮＡ試料が、宿主ＤＮＡを含む、請求項１６８に記載の方法。
【請求項１８１】
前記ＤＮＡ試料が、真核生物ＤＮＡを含む、請求項１６８に記載の方法。
【請求項１８２】
核酸の収集物を作製する方法であって、
ａ．ＤＮＡ試料をランダムに断片化して、ＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、
ｂ．第１のライゲーションステップにおいて、第１のアダプタを前記ＤＮＡ断片の収集物にライゲーションするステップであって、
前記第１のアダプタが、二本鎖ＤＮＡ分子および前記二本鎖ＤＮＡ分子の５’末端における５’ＮＡＡ３’の一本鎖ＤＮＡオーバーハングを含み、
前記第１のアダプタが、ＦｏｋＩ部位およびＭｍｅＩ部位を含み、
前記ＭｍｅＩ部位が、ライゲーション後に前記ＦｏｋＩ部位および前記ＤＮＡ断片の間に位置する、ステップと、
ｃ．前記第１のアダプタライゲーションされた断片の収集物を、第１にＭｍｅＩで、第２にＦｏｋＩで消化して、Ｎ２０  ＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、
ｄ．第２のライゲーションステップにおいて、第２のアダプタを前記Ｎ２０  ＤＮＡ断片の収集物にライゲーションするステップであって、
前記第２のアダプタをコードする配列が、プロモーター配列および核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列を含み、
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列が、ライゲーション後に前記Ｎ２０配列および前記プロモーターの間に位置する、ステップと
を含む方法。
【請求項１８３】
前記ＤＮＡが、非特異的ニッカーゼおよびエンドヌクレアーゼによりランダムに断片化される、請求項１８２に記載の方法。
【請求項１８４】
前記エンドヌクレアーゼが、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩである、請求項１８３に記載の方法。
【請求項１８５】
前記プロモーター配列が、Ｔ７プロモーター配列、ＳＰ６プロモーター配列およびＴ３プロモーター配列からなる群から選択される、請求項１８２に記載の方法。
【請求項１８６】
前記第２のアダプタが、二本鎖ＤＮＡアダプタである、請求項１８２に記載の方法。
【請求項１８７】
前記第１のライゲーションステップが、高温リガーゼを使用して実行される、請求項１８２に記載の方法。
【請求項１８８】
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質と適合性である、請求項１８２に記載の方法。
【請求項１８９】
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、Ｃｐｆ１系タンパク質である、請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９０】
前記ＤＮＡ試料が、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む、請求項１８２に記載の方法。
【請求項１９１】
前記ＤＮＡ試料が、ヒトＤＮＡを含む、請求項１８２に記載の方法。
【請求項１９２】
前記ＤＮＡ試料が、宿主ＤＮＡを含む、請求項１８２に記載の方法。
【請求項１９３】
前記ＤＮＡ試料が、真核生物ＤＮＡを含む、請求項１８２に記載の方法。
【請求項１９４】
核酸の収集物を作製する方法であって、
ａ．ＤＮＡ試料をランダムに剪断して、ＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、
ｂ．前記ＤＮＡ断片をメチラーゼでメチル化するステップと、
ｃ．前記ＤＮＡ断片の収集物を末端修復して、平滑末端化されたＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、
ｄ．第１のライゲーションステップにおいて第１のアダプタを前記平滑末端化されたＤＮＡ断片の収集物にライゲーションして、第１のアダプタＤＮＡ断片の収集物を産生するステップであって、
前記第１のアダプタが、５’から３’に、ＮｔＢｓｔＮＢＩ制限部位、前記第１のアダプタのリン酸骨格における改変された切断抵抗性結合、およびＰＡＭ配列に相補的な配列を含む、ステップと、
ｅ．前記第１のアダプタＤＮＡ断片を制限酵素およびＮｔＢｓｔＮＢＩで消化するステップと、
ｆ．第２のライゲーションステップにおいて第２のアダプタを前記消化された第１のアダプタＤＮＡ断片にライゲーションして、第２のアダプタＤＮＡ断片の収集物を産生するステップであって、
前記第２のアダプタが、ＦｏｋＩ部位およびＭｍｅＩ部位を含み、
前記ＭｍｅＩ部位が、ライゲーション後に前記ＦｏｋＩ部位および前記ＤＮＡ断片の間に位置する、ステップと、
ｇ．前記第２のアダプタライゲーションされた断片の収集物を、第１にＭｍｅＩで、第２にＦｏｋＩで消化して、Ｎ２０  ＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、
ｈ．第３のライゲーション反応において、第３のアダプタを前記Ｎ２０  ＤＮＡ断片の収集物にライゲーションするステップであって、
前記第３のアダプタをコードする配列が、プロモーター配列および核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードする配列を含み、
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列が、ライゲーション後に前記Ｎ２０配列および前記プロモーターの間に位置する、ステップと
を含む方法。
【請求項１９５】
前記ランダム剪断ステップが、機械的、酵素的または化学的剪断を含む、請求項１９４に記載の方法。
【請求項１９６】
前記メチラーゼが、ＥｃｏＧＩＩ  ＤＮＡメチルトランスフェラーゼを含む、請求項１９４に記載の方法。
【請求項１９７】
前記改変された切断抵抗性結合が、ホスホロチオエート結合を含む、請求項１９４に記載の方法。
【請求項１９８】
前記ＰＡＭ部位が、Ｃｐｆ１系タンパク質と適合性であるＰＡＭ部位を含む、請求項１９４に記載の方法。
【請求項１９９】
前記ＰＡＭ部位が、ＴＴＮを含み、前記制限酵素が、ＭｌｕＣＩまたはＭｓｅＩを含む、請求項１９４に記載の方法。
【請求項２００】
前記ＰＡＭ部位が、ＴＣＮを含み、前記制限酵素が、ＤｐｎＩＩを含む、請求項１９４に記載の方法。
【請求項２０１】
前記ＰＡＭ部位が、ＴＧＮを含み、前記制限酵素が、ＦａｔＩを含む、請求項１９４に記載の方法。
【請求項２０２】
前記プロモーター配列が、Ｔ７プロモーター配列、ＳＰ６プロモーター配列およびＴ３プロモーター配列からなる群から選択される、請求項１９４に記載の方法。
【請求項２０３】
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質と適合性である、請求項１９４に記載の方法。
【請求項２０４】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、Ｃｐｆ１系タンパク質である、請求項２０３に記載の方法。
【請求項２０５】
前記ＤＮＡ試料が、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む、請求項１９４に記載の方法。
【請求項２０６】
前記ＤＮＡ試料が、ヒトＤＮＡを含む、請求項１９４に記載の方法。
【請求項２０７】
前記ＤＮＡ試料が、宿主ＤＮＡを含む、請求項１９４に記載の方法。
【請求項２０８】
前記ＤＮＡ試料が、真核生物ＤＮＡを含む、請求項１９４に記載の方法。
【請求項２０９】
核酸の収集物を作製する方法であって、
ａ．ＤＮＡ試料をランダムに剪断して、ＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、
ｂ．前記ＤＮＡ断片の収集物を末端修復して、平滑末端化されたＤＮＡ断片を産生するステップと、
ｃ．第１のライゲーションステップにおいて第１のアダプタを前記平滑末端化されたＤＮＡ断片にライゲーションして、第１のアダプタＤＮＡ断片の収集物を産生するステップであって、
前記第１のアダプタが、５’から３’に、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ制限部位、およびＰＡＭ配列に相補的な配列を含む、ステップと、
ｄ．前記第１のアダプタＤＮＡ断片をＮｔ．ＢｓｔＮＢＩでニッキングするステップと、
ｅ．前記ニックから５’末端へと、３’から５’への方向で、前記第１のアダプタＤＮＡ断片のトップ鎖を分解するステップと、
ｆ．第２のライゲーションステップにおいて第２のアダプタを前記分解された第１のアダプタＤＮＡ断片にライゲーションして、第２のアダプタＤＮＡ断片の収集物を産生するステップであって、
前記第２のアダプタが、５’から３’の向きで、ＭｌｙＩ配列、前記ＰＡＭ配列に相補的な配列、および前記ＰＡＭ配列を含む、ステップと、
ｇ．前記第２のアダプタ断片をＭｌｙＩで消化するステップと、
ｈ．第３のライゲーションステップにおいて第３のアダプタを前記ＭｌｙＩ消化された第２のアダプタライゲーションされた断片にライゲーションして、第３のアダプタＤＮＡ断片の収集物を産生するステップであって、
前記第３のアダプタが、ＦｏｋＩ部位およびＭｍｅＩ部位を含み、
前記ＭｍｅＩ部位が、ライゲーション後に前記ＦｏｋＩ部位および前記ＤＮＡ断片の間に位置する、ステップと、
ｉ．前記第３のアダプタＤＮＡ断片の収集物を、第１にＭｍｅＩで、第２にＦｏｋＩで消化して、Ｎ２０  ＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、
ｊ．第４のライゲーション反応において、第４のアダプタを前記Ｎ２０  ＤＮＡ断片の収集物にライゲーションするステップであって、
前記第４のアダプタをコードする配列が、プロモーター配列および核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列を含み、
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列が、ライゲーション後に前記Ｎ２０配列および前記プロモーターの間に位置する、ステップと
を含む方法。
【請求項２１０】
前記第２のアダプタが、一本鎖ＤＮＡ分子である、請求項２０９に記載の方法。
【請求項２１１】
前記第３のアダプタが、二本鎖ＤＮＡ分子である、請求項２０９に記載の方法。
【請求項２１２】
（ｆ）の前記ライゲーションステップの後、かつＭｌｙＩ消化（ｇ）の前に、前記第２のアダプタＤＮＡ断片の収集物のＰＣＲ増幅をさらに含む、請求項２０９に記載の方法。
【請求項２１３】
前記ランダム剪断ステップが、機械的、酵素的または化学的剪断を含む、請求項２０９に記載の方法。
【請求項２１４】
エキソヌクレアーゼ３が、（ｅ）において前記トップ鎖を分解する、請求項２０９に記載の方法。
【請求項２１５】
前記第２のライゲーションステップが、高温リガーゼにより実行される、請求項２０９に記載の方法。
【請求項２１６】
前記ＰＡＭ部位が、Ｃｐｆ１系タンパク質と適合性であるＰＡＭ部位を含む、請求項２０９に記載の方法。
【請求項２１７】
前記ＰＡＭ部位が、ＴＴＮ、ＴＣＮまたはＴＧＮを含む、請求項２０９に記載の方法。
【請求項２１８】
前記プロモーター配列が、Ｔ７プロモーター配列、ＳＰ６プロモーター配列およびＴ３プロモーター配列からなる群から選択される、請求項２０９に記載の方法。
【請求項２１９】
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質と適合性である、請求項２０９に記載の方法。
【請求項２２０】
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、Ｃｐｆ１系タンパク質である、請求項２１９に記載の方法。
【請求項２２１】
前記ＤＮＡ試料が、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む、請求項２０９に記載の方法。
【請求項２２２】
前記ＤＮＡ試料が、ヒトＤＮＡを含む、請求項２０９に記載の方法。
【請求項２２３】
前記ＤＮＡ試料が、宿主ＤＮＡを含む、請求項２０９に記載の方法。
【請求項２２４】
前記ＤＮＡ試料が、真核生物ＤＮＡを含む、請求項２０９に記載の方法。
【請求項２２５】
核酸の収集物を作製する方法であって、
ａ．ＤＮＡ試料をランダムに剪断して、ＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、
ｂ．第１のライゲーション反応において環状アダプタを前記ＤＮＡ断片の収集物にライゲーションして、環状アダプタＤＮＡ断片の収集物を産生するステップであって、
前記環状アダプタが、ＰＡＭ配列に相補的な配列を含む、ステップと、
ｃ．前記環状アダプタＤＮＡ断片の収集物をメチラーゼでメチル化するステップと、
ｄ．前記環状アダプタＤＮＡ断片の収集物をエキソヌクレアーゼで消化するステップと、
ｅ．前記環状アダプタＤＮＡ断片の収集物を制限酵素で消化するステップと、
ｆ．第２のライゲーション反応において第２のアダプタを前記環状アダプタＤＮＡ断片の収集物にライゲーションして、第２のアダプタＤＮＡ断片の収集物を産生するステップであって、
前記第２のアダプタが、５’から３’に、ＰＡＭ部位に相補的な配列、ＰＡＭ部位、およびＭｌｙＩ部位を含む、ステップと、
ｇ．前記第２のアダプタＤＮＡ断片の収集物をＰＣＲ増幅するステップであって、
ＰＣＲプライマーが、前記第２のアダプタの配列または前記第２のアダプタの配列に相補的な配列を含み、ＰＣＲ増幅された第２のアダプタＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、
ｈ．前記ＰＣＲ増幅された第２のアダプタＤＮＡ断片の収集物をＭｌｙＩで消化するステップと、
ｉ．第３のライゲーション反応において第３のアダプタを前記ＰＣＲ増幅された第２のアダプタＤＮＡ断片の収集物にライゲーションして、第３のアダプタＤＮＡ断片の収集物を産生するステップであって、
前記第３のアダプタが、ＦｏｋＩ部位およびＭｍｅＩ部位を含み、
前記ＭｍｅＩ部位が、ライゲーション後に前記ＦｏｋＩ部位および前記ＤＮＡ断片の間に位置する、ステップと、
ｊ．前記第３のアダプタライゲーションされた断片の収集物を、第１にＭｍｅＩで、第２にＦｏｋＩで消化して、Ｎ２０  ＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、
ｋ．第４のライゲーション反応において、第４のアダプタを前記Ｎ２０  ＤＮＡ断片の収集物にライゲーションするステップであって、
前記第４のアダプタをコードする配列が、プロモーター配列および核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列を含み、
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列が、ライゲーション後に前記Ｎ２０配列および前記プロモーターの間に位置する、ステップと
を含む方法。
【請求項２２６】
前記ランダム剪断ステップが、機械的、酵素的または化学的剪断を含む、請求項２２５に記載の方法。
【請求項２２７】
前記エキソヌクレアーゼが、ラムダエキソヌクレアーゼを含む、請求項２２５に記載の方法。
【請求項２２８】
前記メチラーゼが、ＥｃｏＧＩＩメチルトランスフェラーゼを含む、請求項２２５に記載の方法。
【請求項２２９】
前記第２のライゲーションステップが、高温リガーゼを含む、請求項２２５に記載の方法。
【請求項２３０】
前記ＰＡＭ部位が、Ｃｐｆ１系タンパク質と適合性であるＰＡＭ部位を含む、請求項２２５に記載の方法。
【請求項２３１】
前記ＰＡＭ部位が、ＴＴＮ、ＴＣＮまたはＴＧＮを含む、請求項２２５に記載の方法。
【請求項２３２】
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質と適合性である、請求項２２５に記載の方法。
【請求項２３３】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、Ｃｐｆ１系タンパク質である、請求項２３２に記載の方法。
【請求項２３４】
前記ＤＮＡ試料が、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む、請求項２２６に記載の方法。
【請求項２３５】
前記ＤＮＡ試料が、ヒトＤＮＡを含む、請求項２２５に記載の方法。
【請求項２３６】
前記ＤＮＡ試料が、宿主ＤＮＡを含む、請求項２２５に記載の方法。
【請求項２３７】
前記ＤＮＡ試料が、真核生物ＤＮＡを含む、請求項２２５に記載の方法。
【請求項２３８】
核酸の収集物を作製する方法であって、
ａ．ＤＮＡ試料をランダムに剪断して、ＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、
ｂ．前記ＤＮＡ断片の収集物をＴ７エキソヌクレアーゼで消化するステップと、
ｃ．前記ＤＮＡ断片の収集物にアダプタをアニールするステップであって、
前記アダプタが、５’から３’に、５’リン酸、１２塩基対ランダム配列、プロモーター配列、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列、ＦｏｋＩ制限部位、ＦｏｋＩ制限部位に相補的な配列、ＰＡＭ配列、および８塩基対ランダム配列を含む、ステップと、
ｄ．前記アダプタを前記ＤＮＡ断片の収集物にライゲーションして、アダプタＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、
ｅ．前記アダプタＤＮＡ断片の収集物をＤＮＡエキソヌクレアーゼで処理するステップと、
ｆ．前記アダプタＤＮＡ断片の収集物に、前記ＦｏｋＩ部位の配列および前記ＦｏｋＩ部位に相補的な配列に相補的な配列を含む一本鎖ＤＮＡをアニールするステップと、
ｇ．ＦｏｋＩで消化して、ＦｏｋＩ消化されたアダプタＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、
ｈ．前記ＦｏｋＩ消化されたアダプタＤＮＡ断片をリガーゼで自己環状化するステップと
を含む方法。
【請求項２３９】
ＰＣＲ増幅をさらに含む、請求項２３８に記載の方法。
【請求項２４０】
前記ＰＣＲ増幅が、ローリングサークルＰＣＲ反応を含む、請求項２３９に記載の方法。
【請求項２４１】
前記ＦｏｋＩ消化されたアダプタＤＮＡ断片を線状にするステップをさらに含む、請求項２３８に記載の方法。
【請求項２４２】
前記ＦｏｋＩ消化されたアダプタＤＮＡ断片が、少なくとも１種のＤＮＡ修復酵素により直鎖化される、請求項２４１に記載の方法。
【請求項２４３】
前記少なくとも１種のＤＮＡ修復酵素が、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）およびエンドヌクレアーゼＶＩＩＩを含む、請求項２４２に記載の方法。
【請求項２４４】
ＰＣＲ増幅をさらに含む、請求項２４２または２４３に記載の方法。
【請求項２４５】
前記ＰＡＭ部位が、Ｃｐｆ１系タンパク質と適合性であるＰＡＭ部位を含む、請求項２３８に記載の方法。
【請求項２４６】
前記ＰＡＭ部位が、ＴＴＮ、ＴＣＮまたはＴＧＮを含む、請求項２３８に記載の方法。
【請求項２４７】
前記リガーゼが、ＨｉＦｉｄｅｌｉｔｙ  Ｔａｑリガーゼを含む、請求項２３８に記載の方法。
【請求項２４８】
前記ＤＮＡエキソヌクレアーゼが、エキソヌクレアーゼ１、エキソヌクレアーゼ３、またはそれらの組合せを含む、請求項２３８に記載の方法。
【請求項２４９】
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質と適合性である、請求項２３８に記載の方法。
【請求項２５０】
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、Ｃｐｆ１系タンパク質である、請求項２４９に記載の方法。
【請求項２５１】
前記ＤＮＡ試料が、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む、請求項２３８に記載の方法。
【請求項２５２】
前記ＤＮＡ試料が、ヒトＤＮＡを含む、請求項２３８に記載の方法。
【請求項２５３】
前記ＤＮＡ試料が、宿主ＤＮＡを含む、請求項２３８に記載の方法。
【請求項２５４】
前記ＤＮＡ試料が、真核生物ＤＮＡを含む、請求項２３８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１７年６月７日に出願された米国特許仮出願第６２／５１６，６１９号、および２０１７年８月２１日に出願された米国特許仮出願第６２／５４８，０３６号に基づく優先権の利益を主張しており、これら仮出願は全て、これにより、その全体が参考として本明細書によって援用される。
【背景技術】
【０００２】
背景
ＲＮＡに由来するｃＤＮＡライブラリー等、ヒト臨床ＤＮＡ試料および試料ライブラリーは、情報価値が殆どなく配列決定コストを増加させる、非常に豊富な配列を含有する。このような所望されない配列を枯渇させる方法（例えば、ハイブリダイゼーション捕捉による）が開発されたが、このような方法は時間がかかることが多く、非効率的であり得る。
【０００３】
ガイド核酸（ｇＮＡ）媒介性ヌクレアーゼ系（ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）媒介性Ｃａｓ系等）は、任意の標的ＤＮＡを効率的に枯渇させることができるが、非常に多い数の特異なＤＮＡ分子の標的化された枯渇は実現不可能である。例えば、ヒト血液に由来する配列決定ライブラリーは、＞９９％ヒトゲノムＤＮＡを含有し得る。ヒト血液中を循環する感染病原体を検出するために、このゲノムＤＮＡを枯渇させようと、ｇＲＮＡ媒介性Ｃａｓ９系に基づく方法を使用するということは、３０〜５０塩基対（ｂｐ）毎にｇＲＮＡが存在し、標的ＤＮＡが見逃されないことを確実にするために、極めて多い数のｇＲＮＡ（約１千万〜１億個のｇＲＮＡ）を必要とするであろう。非常に多数のｇＲＮＡが計算によって予測され、次いで化学合成され得るが、これは法外に高いコストがかかる。
【０００４】
したがって、当技術分野には、例えば、その配列に関する予備知識なしで、目的のＤＮＡからの所望されないＤＮＡ配列のゲノムワイド枯渇を可能にする、任意のＤＮＡをｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）ライブラリーへと変換する、対費用効果の高い方法を提供する必要がある。この必要に取り組む方法および組成物が、本明細書に提供される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
概要
ガイド核酸の収集物、これを作製する方法、およびこれを使用する方法が、本明細書に提供される。
【０００６】
一態様では、核酸の収集物を作製する方法であって、（ａ）核酸ガイド化ヌクレアーゼのＰＡＭ部位をそれぞれ含む標的核酸を得るステップと、（ｂ）第１のプライマーを標的核酸のＰＡＭ部位にハイブリダイズさせるステップであって、第１のプライマーが、（ｉ）ＰＡＭ部位に相補的なＭＡＰ部位、（ｉｉ）核酸ガイド化ヌクレアーゼの認識部位に相補的な相補的認識部位、および（ｉｉｉ）プロモーター部位に相補的な相補的プロモーター部位を含む、ステップと、（ｃ）鋳型として標的核酸を使用して、第１のプライマーを伸長させるステップであって、これによって、第１のプライマーの配列および標的核酸に相補的な配列を含む第１の伸長産物を産生するステップと、（ｄ）第２のプライマーを第１の伸長産物にハイブリダイズさせるステップと、（ｅ）鋳型として第１の伸長産物を使用して、第２のプライマーを伸長させるステップであって、これによって、ＰＡＭ部位、認識部位およびプロモーター部位を含む第２の伸長産物を産生するステップとを含む方法が、本明細書に提供される。
【０００７】
別の態様では、核酸の収集物を作製する方法であって、（ａ）核酸ガイド化ヌクレアーゼのＰＡＭ部位をそれぞれ含む標的核酸を得るステップと、（ｂ）プライマーを標的核酸のＰＡＭ部位にハイブリダイズさせるステップであって、プライマーが、（ｉ）ＰＡＭ部位に相補的なＭＡＰ部位、（ｉｉ）核酸ガイド化ヌクレアーゼの認識部位に相補的な相補的認識部位、および（ｉｉｉ）プロモーター部位に相補的な相補的プロモーター部位を含む、ステップと、（ｃ）鋳型として標的核酸を使用して、プライマーを伸長させるステップであって、これによって、ＰＡＭ部位、認識部位およびプロモーター部位を含む伸長産物を産生するステップと、（ｄ）標的核酸をニッキングするステップと、（ｅ）ニッキングされた標的核酸を消化するステップとを含む方法が、本明細書に提供される。
【０００８】
別の態様では、核酸の収集物を作製する方法であって、（ａ）核酸ガイド化ヌクレアーゼのＰＡＭ部位をそれぞれ含む標的核酸を得るステップと、（ｂ）第１のループアダプタを標的核酸の両末端にライゲーションするステップであって、第１のループアダプタが、プロモーター部位を含む、ステップと、（ｃ）ＰＡＭ部位において標的核酸を切断するステップであって、これによって、第１の末端における第１のループアダプタおよび第２の末端におけるＰＡＭ部位のうち１つをそれぞれ含むＤＮＡ切断産物を産生するステップと、（ｄ）第２のループアダプタを切断産物の第２の末端にライゲーションするステップであって、第２のループアダプタが、核酸ガイド化ヌクレアーゼのステムループ配列に相補的な相補的ステムループ配列を含む、ステップと、（ｅ）切断産物を増幅し、これにより、プロモーター部位、認識部位およびステムループ配列を含む増幅産物を産生するステップであって、認識部位が、標的核酸の１つにおけるＰＡＭ部位に隣接した配列を含む、ステップとを含む方法が、本明細書に提供される。
【０００９】
別の態様では、核酸の収集物を作製する方法であって、（ａ）標的核酸の配列リードを得るステップと、（ｂ）配列リードを少なくとも１つの参照配列にマッピングするステップと、（ｃ）配列リードの存在量値を決定するステップと、（ｄ）配列リード由来の認識部位を同定するステップであって、認識部位が、核酸ガイド化ヌクレアーゼのＰＡＭ部位に隣接する、ステップと、（ｅ）存在量値に基づき認識部位を選別するステップとを含む方法が、本明細書に提供される。
【００１０】
別の態様では、ガイド核酸の収集物を作製する方法であって、（ａ）標的核酸の配列リードを得るステップと、（ｂ）配列リードから最も高頻度の認識部位を決定するステップであって、認識部位が、核酸ガイド化ヌクレアーゼのＰＡＭ部位に隣接する、ステップと、（ｃ）配列リードからその次に高頻度の認識部位を決定するステップと、（ｄ）条件が満たされるまでステップｃを反復するステップであって、条件が、（ｉ）設定された数の認識部位が決定されること、（ｉｉ）さらなる認識部位を決定することができないこと、（ｉｉｉ）設定されたパーセンテージの標的核酸が、認識部位によって網羅されること、（ｉｖ）認識部位におけるまたはその近傍における標的核酸の切断が、設定されたサイズを下回る最大断片サイズを生じることからなる群から選択される、ステップとを含む方法が、本明細書に提供される。
【００１１】
別の態様では、ガイド核酸の収集物を含む組成物であって、各ガイド核酸が、核酸ガイド化ヌクレアーゼの認識部位およびステムループ配列を含み、各認識部位が、核酸ガイド化ヌクレアーゼのＰＡＭ部位に隣接する標的核酸の標的部位に相補的であり、ガイド核酸の収集物の認識部位が相補的である標的部位が、約１０，０００塩基対未満の平均間隔で標的核酸内に分布する、組成物が、本明細書に提供される。
【００１２】
別の態様では、標的核酸を枯渇させる方法であって、（ａ）標的核酸および非標的核酸を含む核酸を得るステップと、（ｂ）標的核酸がニック部位でニッキングされるように、核酸を核酸ガイド化ニッカーゼタンパク質−ｇＮＡ複合体と接触させるステップであって、ｇＮＡが、５’ステムループ配列および３’標的化配列を含む、ステップと、（ｃ）ニック部位でニックトランスレーションを行うステップであって、ニックトランスレーションが、標識されたヌクレオチドにより行われる、ステップと、（ｄ）標識されたヌクレオチドを有する標的核酸を捕捉するステップと、（ｅ）非標的核酸から標的核酸を分離するステップとを含む方法が、本明細書に提供される。
【００１３】
別の態様では、標的核酸を枯渇させる方法であって、（ａ）標的核酸および非標的核酸を含む核酸を得るステップであって、核酸が、第１の末端にヘアピンループを含む、ステップと、（ｂ）ループアダプタを核酸の第２の末端にハイブリダイズさせるステップと、（ｃ）標的核酸がニッキングされるように、核酸を核酸ガイド化ニッカーゼタンパク質と接触させるステップと、（ｄ）ニッキングされた標的核酸を消化するステップとを含む方法が、本明細書に提供される。
【００１４】
別の態様では、配列決定ライブラリーを調製する方法であって、（ａ）本開示の枯渇または捕捉方法を経た後に得られる、目的の部位を含むＤＮＡ分子を提供するステップと、（ｂ）３’末端をポリメラーゼによって伸長することができないように、ＤＮＡ分子の３’末端をブロックするステップと、（ｃ）第１のプライマーをＤＮＡ分子にハイブリダイズさせるステップと、（ｄ）第１のプライマーを伸長させて、第１のプライマーの配列および目的の部位の配列を含む伸長産物を生じるステップと、（ｅ）第２のプライマーを伸長産物にハイブリダイズさせるステップと、（ｆ）第２のプライマーを使用して伸長産物を増幅するステップとを含む方法が、本明細書に提供される。
【００１５】
別の態様では、配列決定ライブラリーを調製する方法であって、（ａ）ｇＮＡ枯渇または捕捉方法に起因するＲＮＡ分子を提供するステップと、（ｂ）第１のハイブリダイゼーション部位をＲＮＡ分子に付着させるステップと、（ｃ）第１のオリゴヌクレオチドを第１のハイブリダイゼーション部位にハイブリダイズさせるステップと、（ｄ）プライマーとして第１のオリゴヌクレオチドを使用して、ＲＮＡ分子の少なくとも一部を逆転写するステップであって、これによって、ｃＤＮＡを生成するステップと、（ｅ）第２のオリゴヌクレオチドをｃＤＮＡのテイルにハイブリダイズさせるステップと、（ｆ）プライマーとして第２のオリゴヌクレオチドおよび／または第１のオリゴヌクレオチドを使用して、ｃＤＮＡを増幅するステップとを含む方法が、本明細書に提供される。
【００１６】
別の態様では、核酸の収集物を作製する方法であって、（ａ）ＤＮＡ試料を制限エンドヌクレアーゼで消化して、ＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、（ｂ）ＤＮＡ断片の収集物をヌクレアーゼで処理するステップと、（ｃ）第１のアダプタをＤＮＡ断片の収集物にライゲーションして、第１のアダプタＤＮＡ断片の収集物を産生するステップであって、第１のアダプタをコードする配列が、ＭｍｅＩ制限部位およびＦｏｋＩ制限部位を含み、ＭｍｅＩ部位が、ライゲーション後にＦｏｋＩ部位およびＤＮＡ断片の間に位置する、ステップと、（ｄ）第１のアダプタＤＮＡ断片の収集物を、第１にＭｍｅＩで、第２にＦｏｋＩで消化して、Ｎ２０  ＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、（ｅ）第２のアダプタをＮ２０  ＤＮＡ断片の収集物にライゲーションするステップであって、第２のアダプタをコードする配列が、プロモーター配列および核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列を含み、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列が、第２のアダプタのライゲーション後に、Ｎ２０配列およびプロモーターの間に位置する、ステップとを含む方法が、本明細書に提供される。
【００１７】
別の態様では、核酸の収集物を作製する方法であって、（ａ）ＤＮＡ試料における少なくとも２個の連続したアデノシンをイノシンに置き換えるステップと、（ｂ）ＤＮＡ試料をヒトアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｈＡＡＧ）で処理するステップと、（ｃ）ＤＮＡ試料をエンドヌクレアーゼで処理して、ＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、（ｄ）第１のライゲーションステップにおいて第１のアダプタをＤＮＡ断片の収集物にライゲーションして、第１のアダプタＤＮＡ断片の収集物を生成するステップであって、第１のアダプタが、二本鎖ＤＮＡ分子および二本鎖ＤＮＡ分子の５’末端における５’ＮＡＡ３’の一本鎖ＤＮＡオーバーハングを含み、第１のアダプタが、ＭｍｅＩ部位およびＦｏｋＩ部位を含み、ＭｍｅＩ部位が、第１のアダプタのライゲーション後にＦｏｋＩ部位およびＤＮＡ断片の間に位置する、ステップと、（ｅ）第１のアダプタライゲーションされた断片の収集物を、第１にＭｍｅＩで、第２にＦｏｋＩで消化して、Ｎ２０  ＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、（ｆ）第２のライゲーションステップにおいて第２のアダプタをＮ２０  ＤＮＡ断片の収集物にライゲーションするステップであって、第２のアダプタをコードする配列が、プロモーター配列および核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列を含み、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列が、第２のアダプタのライゲーション後にＮ２０配列およびプロモーターの間に位置する、ステップとを含む方法が、本明細書に提供される。
【００１８】
別の態様では、核酸の収集物を作製する方法であって、（ａ）ＤＮＡ試料における少なくとも１個のチミジンをウラシルに置き換えて、少なくとも１個の塩基対ミスマッチを含むＤＮＡ試料を産生するステップと、（ｂ）少なくとも１個のウラシルを少なくとも１種のＤＮＡ修復酵素で切除して、少なくとも１塩基対の少なくとも１個の一本鎖領域を有するＤＮＡ試料を産生するステップと、（ｃ）ＤＮＡ試料をヌクレアーゼで処理して、ＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、（ｄ）第１のライゲーションステップにおいてＤＮＡ断片の収集物に第１のアダプタをライゲーションして、第１のアダプタＤＮＡ断片の収集物を産生するステップであって、第１のアダプタが、ＭｍｅＩ部位およびＦｏｋＩ部位を含み、ＭｍｅＩ部位が、ライゲーション後にＦｏｋＩ部位およびＤＮＡ断片の間に位置する、ステップと、（ｅ）第１のアダプタＤＮＡ断片の収集物を、第１にＭｍｅＩで、第２にＦｏｋＩで消化して、Ｎ２０  ＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、（ｆ）第２のライゲーションステップにおいて第２のアダプタをＮ２０  ＤＮＡ断片の収集物にライゲーションするステップであって、第２のアダプタをコードする配列が、プロモーター配列および核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列を含み、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列が、ライゲーション後にＮ２０配列およびプロモーターの間に位置する、ステップとを含む方法が、本明細書に提供される。
【００１９】
別の態様では、核酸の収集物を作製する方法であって、（ａ）ＤＮＡ試料をランダムに断片化して、ＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、（ｂ）第１のライゲーションステップにおいて第１のアダプタをＤＮＡ断片の収集物にライゲーションするステップであって、第１のアダプタが、二本鎖ＤＮＡ分子および二本鎖ＤＮＡ分子の５’末端における５’ＮＡＡ３’の一本鎖ＤＮＡオーバーハングを含み、第１のアダプタが、ＦｏｋＩ部位およびＭｍｅＩ部位を含み、ＭｍｅＩ部位が、ライゲーション後にＦｏｋＩ部位およびＤＮＡ断片の間に位置する、ステップと、（ｃ）第１のアダプタライゲーションされた断片の収集物を、第１にＭｍｅＩで、第２にＦｏｋＩで消化して、Ｎ２０  ＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、（ｄ）第２のライゲーションステップにおいて第２のアダプタをＮ２０  ＤＮＡ断片の収集物にライゲーションするステップであって、第２のアダプタをコードする配列が、プロモーター配列および核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列を含み、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列が、ライゲーション後にＮ２０配列およびプロモーターの間に位置する、ステップとを含む方法が、本明細書に提供される。
【００２０】
別の態様では、核酸の収集物を作製する方法であって、（ａ）ＤＮＡ試料をランダムに剪断して、ＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、（ｂ）ＤＮＡ断片をメチラーゼでメチル化するステップと、（ｃ）ＤＮＡ断片の収集物を末端修復して、平滑末端にされたＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、（ｄ）第１のライゲーションステップにおいて第１のアダプタを平滑末端化されたＤＮＡ断片の収集物にライゲーションして、第１のアダプタＤＮＡ断片の収集物を産生するステップであって、第１のアダプタが、５’から３’に、ＮｔＢｓｔＮＢＩ制限部位、第１のアダプタのリン酸骨格における改変された切断抵抗性結合、およびＰＡＭ配列に相補的な配列を含む、ステップと、（ｅ）第１のアダプタＤＮＡ断片を制限酵素およびＮｔＢｓｔＮＢＩで消化するステップと、（ｆ）第２のライゲーションステップにおいて第２のアダプタを消化された第１のアダプタＤＮＡ断片にライゲーションして、第２のアダプタＤＮＡ断片の収集物を産生するステップであって、第２のアダプタが、ＦｏｋＩ部位およびＭｍｅＩ部位を含み、ＭｍｅＩ部位が、ライゲーション後にＦｏｋＩ部位およびＤＮＡ断片の間に位置する、ステップと、（ｇ）第２のアダプタライゲーションされた断片の収集物を、第１にＭｍｅＩで、第２にＦｏｋＩで消化して、Ｎ２０  ＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、（ｈ）第３のライゲーション反応において第３のアダプタをＮ２０  ＤＮＡ断片の収集物にライゲーションするステップであって、第３のアダプタをコードする配列が、プロモーター配列および核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードする配列を含み、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列が、ライゲーション後にＮ２０配列およびプロモーターの間に位置する、ステップとを含む方法が、本明細書に提供される。
【００２１】
別の態様では、核酸の収集物を作製する方法であって、（ａ）ＤＮＡ試料をランダムに剪断して、ＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、（ｂ）ＤＮＡ断片の収集物を末端修復して、平滑末端化されたＤＮＡ断片を産生するステップと、（ｃ）第１のライゲーションステップにおいて第１のアダプタを平滑末端化されたＤＮＡ断片にライゲーションして、第１のアダプタＤＮＡ断片の収集物を産生するステップであって、第１のアダプタが、５’から３’に、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ制限部位、およびＰＡＭ配列に相補的な配列を含む、ステップと、（ｄ）第１のアダプタＤＮＡ断片をＮｔ．ＢｓｔＮＢＩでニッキングするステップと、（ｅ）ニックから５’末端へと、３’から５’への方向で、第１のアダプタＤＮＡ断片のトップ鎖を分解するステップと、（ｆ）第２のライゲーションステップにおいて第２のアダプタを分解された第１のアダプタＤＮＡ断片にライゲーションして、第２のアダプタＤＮＡ断片の収集物を産生するステップであって、第２のアダプタが、５’から３’の向きで、ＭｌｙＩ配列、ＰＡＭ配列に相補的な配列、およびＰＡＭ配列を含む、ステップと、（ｇ）第２のアダプタ断片をＭｌｙＩで消化するステップと、（ｈ）第３のライゲーションステップにおいて第３のアダプタをＭｌｙＩ消化された第２のアダプタライゲーションされた断片にライゲーションして、第３のアダプタＤＮＡ断片の収集物を産生するステップであって、第３のアダプタが、ＦｏｋＩ部位およびＭｍｅＩ部位を含み、ＭｍｅＩ部位が、ライゲーション後にＦｏｋＩ部位およびＤＮＡ断片の間に位置する、ステップと、（ｉ）第３のアダプタＤＮＡ断片の収集物を、第１にＭｍｅＩで、第２にＦｏｋＩで消化して、Ｎ２０  ＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、（ｊ）第４のライゲーション反応において第４のアダプタをＮ２０  ＤＮＡ断片の収集物にライゲーションするステップであって、第４のアダプタをコードする配列が、プロモーター配列および核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列を含み、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列が、ライゲーション後にＮ２０配列およびプロモーターの間に位置する、ステップとを含む方法が、本明細書に提供される。
【００２２】
別の態様では、核酸の収集物を作製する方法であって、（ａ）ＤＮＡ試料をランダムに剪断して、ＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、（ｂ）第１のライゲーション反応において環状アダプタをＤＮＡ断片の収集物にライゲーションして、環状アダプタＤＮＡ断片の収集物を産生するステップであって、環状アダプタが、ＰＡＭ配列に相補的な配列を含む、ステップと、（ｃ）環状アダプタＤＮＡ断片の収集物をメチラーゼでメチル化するステップと、（ｄ）環状アダプタＤＮＡ断片の収集物をエキソヌクレアーゼで消化するステップと、（ｅ）環状アダプタＤＮＡ断片の収集物を制限酵素で消化するステップと、（ｆ）第２のライゲーション反応において第２のアダプタを環状アダプタＤＮＡ断片の収集物にライゲーションして、第２のアダプタＤＮＡ断片の収集物を産生するステップであって、第２のアダプタが、５’から３’に、ＰＡＭ部位に相補的な配列、ＰＡＭ部位、およびＭｌｙＩ部位を含む、ステップと、（ｇ）第２のアダプタＤＮＡ断片の収集物をＰＣＲ増幅して、ＰＣＲ増幅された第２のアダプタＤＮＡ断片の収集物を産生するステップであって、ＰＣＲプライマーが、第２のアダプタの配列または第２のアダプタの配列に相補的な配列を含む、ステップと、（ｈ）ＰＣＲ増幅された第２のアダプタＤＮＡ断片の収集物をＭｌｙＩで消化するステップと、（ｉ）第３のライゲーション反応において第３のアダプタをＰＣＲ増幅された第２のアダプタＤＮＡ断片の収集物にライゲーションして、第３のアダプタＤＮＡ断片の収集物を産生するステップであって、第３のアダプタが、ＦｏｋＩ部位およびＭｍｅＩ部位を含み、ＭｍｅＩ部位が、ライゲーション後にＦｏｋＩ部位およびＤＮＡ断片の間に位置する、ステップと、（ｊ）第３のアダプタライゲーションされた断片の収集物を、第１にＭｍｅＩで、第２にＦｏｋＩで消化して、Ｎ２０  ＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、（ｋ）第４のライゲーション反応において第４のアダプタをＮ２０  ＤＮＡ断片の収集物にライゲーションするステップであって、第４のアダプタをコードする配列が、プロモーター配列および核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列を含み、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列が、ライゲーション後にＮ２０配列およびプロモーターの間に位置する、ステップとを含む方法が、本明細書に提供される。
【００２３】
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、標的核酸は、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む。一部の実施形態では、標的核酸は、ヒトＤＮＡを含む。一部の実施形態では、標的核酸は、真核生物ＤＮＡを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、ゲノムＤＮＡからｇＲＮＡの収集物（ｇＲＮＡライブラリー）を生成するための例示的なスキームを図解する。
【００２５】
【図２】図２は、ゲノムＤＮＡからｇＲＮＡの収集物（ｇＲＮＡライブラリー）を生成するための別の例示的なスキームを図解する。
【００２６】
【図３】図３は、ＤＮＡをニッキングし、その後にポリメラーゼ処理して平滑末端を生成するための例示的なスキームを図解する。
【００２７】
【図４】図４は、３種のアダプタを使用した、ｇＮＡのライブラリーの逐次生成のための例示的なスキームを図解する。
【００２８】
【図５】図５は、１種のアダプタおよび１種のオリゴ（oligo）を使用した、ｇＮＡのライブラリーの逐次生成のための例示的なスキームがどのようかを図解する。
【００２９】
【図６】図６は、ニッキング酵素媒介性ＤＮＡ増幅（ＮＥＭＤＡ）を使用した、平滑末端を有するＤＮＡ断片の大規模プールの生成のための例示的なスキームがどのようかを図解する。
【００３０】
【図７】図７は、核酸断片の生成のための例示的なスキームを図解する。
【００３１】
【図８Ａ】図８Ａは、インプット核酸からガイド核酸ライブラリーを構築するための例示的なスキームを図解する。
【００３２】
【図８Ｂ】図８Ｂは、インプット核酸からガイド核酸ライブラリーを構築するための例示的なスキームを図解する。
【００３３】
【図８Ｃ】図８Ｃは、インプット核酸からガイド核酸ライブラリーを構築するための例示的なスキームを図解する。
【００３４】
【図８Ｄ】図８Ｄは、インプット核酸からガイド核酸ライブラリーを構築するための例示的なスキームを図解する。
【００３５】
【図９Ａ】図９Ａおよび図９Ｂは、インプット核酸からガイド核酸ライブラリーを構築するための例示的なスキームを図解する。
【図９Ｂ】図９Ａおよび図９Ｂは、インプット核酸からガイド核酸ライブラリーを構築するための例示的なスキームを図解する。
【００３６】
【図１０】図１０は、ガイド核酸の収集物を設計するための例示的なスキームを図解する。
【００３７】
【図１１】図１１は、ガイド核酸の収集物を設計するための例示的なスキームを図解する。
【００３８】
【図１２】図１２は、標的化された核酸を枯渇、分配または捕捉するための例示的なスキームを図解する。
【００３９】
【図１３】図１３は、鎖スイッチング方法の例示的な模式図を図解する。
【００４０】
【図１４】図１４は、単一のワークフローでのライブラリー生成および濃縮のための例示的なスキームを図解する。
【００４１】
【図１５】図１５は、ＭｓｅＩまたはＭｌｕＣＩのいずれかで切断され、マングビーンヌクレアーゼで処理されて一本鎖オーバーハングを分解した、ＤＮＡ供給源からのガイド核酸ライブラリーのための例示的なスキームを図解する。
【００４２】
【図１６Ａ】図１６Ａおよび図１６Ｂは、アデノシンがイノシンに置き換えられた、ＤＮＡ供給源からのガイド核酸ライブラリーのための例示的なスキームを図解する。
【図１６Ｂ】図１６Ａおよび図１６Ｂは、アデノシンがイノシンに置き換えられた、ＤＮＡ供給源からのガイド核酸ライブラリーのための例示的なスキームを図解する。
【００４３】
【図１７Ａ】図１７Ａおよび図１７Ｂは、チミジンがウラシルに置き換えられた、ＤＮＡ供給源からのガイド核酸ライブラリーのための例示的なスキームを図解する。
【図１７Ｂ】図１７Ａおよび図１７Ｂは、チミジンがウラシルに置き換えられた、ＤＮＡ供給源からのガイド核酸ライブラリーのための例示的なスキームを図解する。
【００４４】
【図１８】図１８は、非特異的ニッカーゼおよびＴ７エンドヌクレアーゼＩ（フラグメンターゼ（fragmentase））でランダムに断片された、ＤＮＡ供給源からのガイド核酸ライブラリーのための例示的なスキームを図解する。
【００４５】
【図１９Ａ】図１９Ａおよび図１９Ｂは、ランダムに剪断され、メチル化された、ＤＮＡ供給源からのガイド核酸ライブラリーのための例示的なスキームを図解する。
【図１９Ｂ】図１９Ａおよび図１９Ｂは、ランダムに剪断され、メチル化された、ＤＮＡ供給源からのガイド核酸ライブラリーのための例示的なスキームを図解する。
【００４６】
【図２０Ａ】図２０Ａ、図２０Ｂおよび図２０Ｃは、ランダムに剪断されたＤＮＡ供給源からのガイド核酸ライブラリーのための例示的なスキームを図解する。
【図２０Ｂ】図２０Ａ、図２０Ｂおよび図２０Ｃは、ランダムに剪断されたＤＮＡ供給源からのガイド核酸ライブラリーのための例示的なスキームを図解する。
【図２０Ｃ】図２０Ａ、図２０Ｂおよび図２０Ｃは、ランダムに剪断されたＤＮＡ供給源からのガイド核酸ライブラリーのための例示的なスキームを図解する。
【００４７】
【図２１Ａ】図２１Ａおよび図２１Ｂは、環状アダプタのライゲーションを使用した、ランダムに剪断されたＤＮＡ供給源からのガイド核酸ライブラリーのための例示的なスキームを図解する。
【図２１Ｂ】図２１Ａおよび図２１Ｂは、環状アダプタのライゲーションを使用した、ランダムに剪断されたＤＮＡ供給源からのガイド核酸ライブラリーのための例示的なスキームを図解する。
【００４８】
【図２２Ａ】図２２Ａ、図２２Ｂ、図２２Ｃおよび図２２Ｄは、平滑末端修復された、ランダムに剪断されたＤＮＡ供給源からのガイド核酸ライブラリーのための例示的なスキームを図解する。
【図２２Ｂ】図２２Ａ、図２２Ｂ、図２２Ｃおよび図２２Ｄは、平滑末端修復された、ランダムに剪断されたＤＮＡ供給源からのガイド核酸ライブラリーのための例示的なスキームを図解する。
【図２２Ｃ】図２２Ａ、図２２Ｂ、図２２Ｃおよび図２２Ｄは、平滑末端修復された、ランダムに剪断されたＤＮＡ供給源からのガイド核酸ライブラリーのための例示的なスキームを図解する。
【図２２Ｄ】図２２Ａ、図２２Ｂ、図２２Ｃおよび図２２Ｄは、平滑末端修復された、ランダムに剪断されたＤＮＡ供給源からのガイド核酸ライブラリーのための例示的なスキームを図解する。
【００４９】
【図２３Ａ】図２３Ａ、図２３Ｂおよび図２３Ｃは、平滑末端修復された、ランダムに剪断されたＤＮＡ供給源からのガイド核酸ライブラリーのための例示的なスキームを図解する。
【図２３Ｂ】図２３Ａ、図２３Ｂおよび図２３Ｃは、平滑末端修復された、ランダムに剪断されたＤＮＡ供給源からのガイド核酸ライブラリーのための例示的なスキームを図解する。
【図２３Ｃ】図２３Ａ、図２３Ｂおよび図２３Ｃは、平滑末端修復された、ランダムに剪断されたＤＮＡ供給源からのガイド核酸ライブラリーのための例示的なスキームを図解する。
【００５０】
【図２４】図２４は、環状化された、ランダムに剪断されたＤＮＡ供給源からのガイド核酸ライブラリーのための例示的なスキームを図解する。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
発明の詳細な説明
当技術分野には、種々の下流適用のための多数の多様なガイド核酸（ｇＮＡ）（例えば、ｇＲＮＡ、ｇＤＮＡ）を生成するための、拡大縮小が可能な（scalable）低コストアプローチの必要がある。
【００５２】
本明細書で特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての専門用語および科学用語は、この発明が属する分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるそれらに類似するまたは同等であるいかなる方法および材料も本発明の実施または試験で使用することができるが、好ましい方法および材料を記載する。
【００５３】
数値範囲は、その範囲を規定する数を含む。
【００５４】
本明細書を解釈する目的で、次の定義が適用されるが、適切であれば、単数形で使用されている用語は、複数形も含み、その逆もまた真であり得る。下に示す任意の定義が、参照により本明細書に組み込まれる任意の文書と矛盾する場合、示されている定義が優先されるものとする。
【００５５】
本明細書で使用するように、単数形である「１つの（a）」、「１つの（an）」および「その（the）」は、他に断りがなければ、複数形の参照を含む。
【００５６】
本明細書に記載されている本発明の態様および実施形態が、「を含む」、「からなる」および「から本質的になる」態様および実施形態を含むことが理解される。
【００５７】
本明細書で使用する用語「約」は、当技術分野の当業者には直ちに分かる、それぞれの値の通常の誤差範囲を指す。本明細書における、「約」によるある値またはパラメータの参照は、当該値またはパラメータそれ自体を対象とする実施形態を含む（および記載する）。
【００５８】
本明細書で使用する用語「核酸」は、１個または複数の核酸サブユニットを含む分子を指す。核酸は、アデノシン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）、ならびにこれらの改変バージョンから選択される１個または複数のサブユニットを含むことができる。核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、これらの組合せまたは誘導体を含む。核酸は、一本鎖および／または二本鎖であってよい。
【００５９】
核酸は、「ヌクレオチド」を含み、これは、本明細書で使用するように、プリンおよびピリミジン塩基、ならびにこれらの改変バージョンを含有する部分を含むことが意図される。そのような改変には、メチル化されたプリンまたはピリミジン、アシル化されたプリンまたはピリミジン、アルキル化されたリボースまたは他の複素環が含まれる。さらに、用語「ヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」にはハプテンまたは蛍光標識を含有する部分が含まれ、従来のリボースおよびデオキシリボース糖だけでなく、他の糖も同様に含有することができる。改変ヌクレオシド、改変ヌクレオチドまたは改変ポリヌクレオチドには、例えば、ヒドロキシル基の１つまたは複数がハロゲン原子または脂肪族基で置き換えられるか、エーテル、アミンなどとして官能基化される、糖部分の改変も含まれる。
【００６０】
用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、本明細書において互換的に使用される。ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド、例えばデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドで構成される、任意の長さ、例えば、約２塩基より大きい、約１０塩基より大きい、約１００塩基より大きい、約５００塩基より大きい、１０００塩基より大きい、最高約１０，０００またはそれより多くの塩基の核酸ポリマーを記載するために使用され、酵素的または合成的に生成することができ（例えば、米国特許第５，９４８，９０２号およびその中の引用文献に記載されるＰＮＡ）、それは２つの天然に存在する核酸のそれに類似した配列特異的方法で天然に存在する核酸とハイブリダイズすることができ、例えば、ワトソン−クリック型塩基対形成相互作用に関与することができる。天然に存在するヌクレオチドには、グアニン、シトシン、アデニンおよびチミン（それぞれＧ、Ｃ、ＡおよびＴ）が含まれる。ＤＮＡおよびＲＮＡはデオキシリボースおよびリボース糖骨格をそれぞれ有するが、ＰＮＡの骨格は、ペプチド結合によって連結されている反復するＮ−（２−アミノエチル）−グリシン単位で構成される。ＰＮＡでは、様々なプリンおよびピリミジン塩基がメチレンカルボニル結合によって骨格に連結される。しばしばアクセス不可能なＲＮＡと呼ばれるロックト核酸（ＬＮＡ）は、改変ＲＮＡヌクレオチドである。ＬＮＡヌクレオチドのリボース部分は、２’酸素および４’炭素を接続する余分の橋で改変される。橋は３’−エンド（北（Ｎｏｒｔｈ））コンフォメーションでリボースを「ロック」し、それはＡ形二重鎖でしばしば見出される。所望のときはいつでも、ＬＮＡヌクレオチドがオリゴヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮＡ残基と混合していてもよい。用語「非構造化核酸」または「ＵＮＡ」は、低い安定性で互いに結合する非天然ヌクレオチドを含有する核酸である。例えば、非構造化核酸は、Ｇ’残基およびＣ’残基を含有することができ、ここで、これらの残基は、低い安定性で互いと塩基対を形成するが、天然に存在するＣおよびＧの残基とそれぞれ塩基対を形成する能力を保持する、ＧおよびＣの天然に存在しない形、すなわち類似体に対応する。非構造化核酸は米国特許出願公開第２００５０２３３３４０号に記載され、それはＵＮＡの開示のために参照により本明細書に組み込まれる。
【００６１】
本明細書で使用するように、用語「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドの一本鎖多量体を表す。
【００６２】
特に明記しない限り、核酸は左から右に５’から３’の向きで記述される。アミノ酸配列は、左から右にそれぞれアミノからカルボキシの向きで記述される。
【００６３】
本明細書で使用するように、用語「切断する」は、二本鎖ＤＮＡ分子の両方の鎖における２つの隣接したヌクレオチドの間のホスホジエステル結合を切断し、それによってＤＮＡ分子において二本鎖切断をもたらす反応を指す。
【００６４】
本明細書で使用する用語「ニッキング」は、二本鎖ＤＮＡ分子の一方の鎖のみにおける２個の隣接するヌクレオチドの間のホスホジエステル結合を切断し、これにより、ＤＮＡ分子の一方の鎖における切断をもたらす反応を指す。
【００６５】
本明細書で使用するように、用語「切断部位」は、二本鎖ＤＮＡ分子が切断された部位を指す。
【００６６】
「核酸ガイド化ヌクレアーゼ−ｇＮＡ複合体」は、核酸ガイド化ヌクレアーゼタンパク質とガイド核酸（ｇＮＡ、例えばｇＲＮＡまたはｇＤＮＡ）とを含む複合体を指す。例えば、「Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体」は、Ｃａｓ９タンパク質とガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とを含む複合体を指す。核酸ガイド化ヌクレアーゼは、野生型核酸ガイド化ヌクレアーゼ、触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼまたは核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼを非限定的に含む、任意のタイプの核酸ガイド化ヌクレアーゼであってよい。
【００６７】
用語「核酸ガイド化ヌクレアーゼ関連ガイドＮＡ」は、ガイド核酸（ガイドＮＡ）を指す。核酸ガイド化ヌクレアーゼ関連ガイドＮＡは、単離された核酸として、または核酸ガイド化ヌクレアーゼ−ｇＮＡ複合体、例えばＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の一部として存在することができる。
【００６８】
用語「捕捉」および「濃縮」は、本明細書で互換的に使用され、目的の配列、目的の標的化部位、目的外の配列または目的外の標的化部位を含有する核酸領域を選択的に単離するプロセスを指す。
【００６９】
用語「ハイブリダイゼーション」は、当技術分野で公知のように、核酸鎖が塩基対形成を通して相補鎖と結合するプロセスを指す。その２つの配列が中等度から高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションおよび洗浄条件の下でお互いと特異的にハイブリダイズするならば、核酸は参照核酸配列と「選択的にハイブリダイゼーションが可能である」と考えられる。中等度および高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は公知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３版、Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９５年およびＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、２００１年、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．を参照）。高ストリンジェンシー条件の１つの例は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×デンハルト液、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌの変性担体ＤＮＡ中で約４２℃でのハイブリダイゼーション、続いて、室温での２×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳにおける２回の洗浄と４２℃での０．１×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳにおける２回の追加の洗浄を含む。
【００７０】
本明細書で使用する用語「二重鎖」または「二重鎖の（ｄｕｐｌｅｘｅｄ）」は、塩基対を形成した、すなわち一緒にハイブリダイズした２つの相補的ポリヌクレオチドを記載する。
【００７１】
本明細書で使用するように用語「増幅する」は、鋳型として標的核酸を使用して標的核酸の１つまたは複数のコピーを生成することを指す。
【００７２】
本明細書で使用するように、用語「ゲノム領域」は、ゲノム、例えば動物または植物のゲノム、例えばヒト、サル、ラット、魚類または昆虫または植物のゲノムの領域を指す。ある特定の場合には、本明細書に記載される方法で使用されるオリゴヌクレオチドは、参照ゲノム領域、すなわち、公知のヌクレオチド配列のゲノム領域、例えば、その配列は例えばＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋデータベースまたは他のデータベースに寄託される染色体領域を使用して設計することができる。
【００７３】
本明細書で使用するように、用語「ゲノム配列」は、ゲノムに存在する配列を指す。ＲＮＡはゲノムから転写されるので、この用語は、生物体の核ゲノムに存在する配列、ならびにそのようなゲノムから転写されるＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）のｃＤＮＡコピーに存在する配列を包含する。
【００７４】
本明細書で使用するように、用語「ゲノム断片」は、ゲノム、例えば動物または植物のゲノム、例えばヒト、サル、ラット、魚類または昆虫または植物のゲノムの領域を指す。ゲノム断片は、染色体全体または染色体の断片であってもよい。ゲノム断片は、アダプタでライゲートされても（この場合、それは断片の片方もしくは両方の末端に、または分子の少なくとも５’末端にライゲートされたアダプタを有する）、またはアダプタでライゲートされなくてもよい。
【００７５】
ある特定の場合には、本明細書に記載される方法で使用されるオリゴヌクレオチドは、参照ゲノム領域、すなわち、公知のヌクレオチド配列のゲノム領域、例えば、その配列は例えばＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋデータベースまたは他のデータベースに寄託される染色体領域を使用して設計することができる。そのようなオリゴヌクレオチドは、試験ゲノムを含有する試料を使用するアッセイにおいて用いることができ、ここで試験ゲノムはオリゴヌクレオチドのための結合部位を含有する。
【００７６】
本明細書で使用するように、用語「ライゲートする」は、第１のＤＮＡ分子の５’末端の末端ヌクレオチドと第２のＤＮＡ分子の３’末端の末端ヌクレオチドとの、酵素によって触媒される結合を指す。
【００７７】
２つの核酸が「相補的である」場合は、核酸のうち１つの各塩基は他の核酸の中の対応するヌクレオチドと塩基対を形成する。用語「相補的な」および「完全に相補的な」は、本明細書において同義的に使用される。
【００７８】
本明細書で使用するように、用語「分離する」は、２つのエレメントの（例えば、サイズまたは親和性等による）物理的分離、ならびに１つのエレメントが分解し、他はインタクトなまま残ることを指す。例えば、切断された標的化配列を含む核酸を分離するために、サイズ排除を用いることができる。
【００７９】
細胞では、ＤＮＡは通常二本鎖の形態で存在し、このように、本明細書において「トップ」および「ボトム」鎖と呼ばれる２つの相補的な核酸鎖を有する。ある特定の場合には、染色体領域の相補鎖は、「プラス」および「マイナス」鎖、「第１」および「第２」の鎖、「コード」および「非コード」鎖、「ワトソン」および「クリック」鎖または「センス」および「アンチセンス」鎖と呼ぶことができる。トップまたはボトム鎖への鎖の割り当ては恣意的であり、いかなる特定の配向、機能または構造も意味しない。それらが共有結合するまで、第１および第２の鎖は別個の分子である。記載の容易さのために、トップおよびボトム鎖が共有結合している二本鎖核酸の「トップ」および「ボトム」鎖は、「トップ」および「ボトム」鎖としてなお記載される。言い換えると、この開示のために、二本鎖ＤＮＡのトップおよびボトム鎖は分離された分子である必要はない。いくつかの例示的な哺乳動物の染色体領域（例えば、ＢＡＣ、アセンブリー、染色体等）の第１の鎖のヌクレオチド配列が公知であり、例えば、ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋデータベースに見出すことができる。
【００８０】
本明細書で使用する用語「トップ鎖」は、核酸の両方の鎖でなく核酸のいずれかの鎖を指す。オリゴヌクレオチドまたはプライマーが「トップ鎖だけに」結合またはアニールするとき、それは１つの鎖だけに結合し、他には結合しない。本明細書で使用する用語「ボトム鎖」は、「トップ鎖」に相補的である鎖を指す。オリゴヌクレオチドが「１本の鎖だけに」結合またはアニールするとき、それは１本の鎖だけ、例えば第１または第２の鎖だけに結合し、他の鎖には結合しない。オリゴヌクレオチドが二本鎖ＤＮＡの両方の鎖に結合またはアニールする場合は、オリゴヌクレオチドは２つの領域を有することができ、第１の領域は二本鎖ＤＮＡのトップ鎖とハイブリダイズし、第２の領域は二本鎖ＤＮＡのボトム鎖とハイブリダイズする。
【００８１】
用語「二本鎖ＤＮＡ分子」は、トップおよびボトム鎖が共有結合していない二本鎖ＤＮＡ分子、ならびにトップおよびボトム鎖が共有結合している二本鎖ＤＮＡ分子の両方を指す。二本鎖ＤＮＡのトップおよびボトム鎖は、ワトソン−クリック相互作用により互いと塩基対を形成する。
【００８２】
本明細書で使用するように、用語「変性する」は、適する変性条件に二重鎖を置くことによる、核酸二重鎖の塩基対の少なくとも一部の分離を指す。変性条件は、当技術分野で周知である。一実施形態では、核酸二重鎖を変性させるために、二重鎖を二重鎖のＴｍより上の温度に曝露させ、それによって二重鎖の１本の鎖を他から解放することができる。ある特定の実施形態では、適する時間（例えば、少なくとも３０秒から３０分まで）、少なくとも９０℃の温度にそれを曝露させることによって、核酸を変性させることができる。ある特定の実施形態では、二重鎖の塩基対を完全に分離するために、完全変性条件を使用することができる。他の実施形態では、二重鎖のある特定の部分の塩基対を分離するために（例えば、Ａ−Ｔ塩基対が濃縮された領域は分離することができ、Ｇ−Ｃ塩基対が濃縮された領域は対を形成したままでいることができる）、部分的変性条件（例えば、完全変性条件より低い温度による）を使用することができる。核酸は、化学的に変性させることもできる（例えば、尿素またはＮａＯＨを使用する）。
【００８３】
本明細書で使用するように、用語「遺伝子型決定」は、核酸配列の任意のタイプの分析を指し、配列決定、多型（ＳＮＰ）分析および再配列を同定するための分析を含む。
【００８４】
本明細書で使用するように、用語「配列決定」は、ポリヌクレオチドの連続するヌクレオチドの同一性が得られる方法を指す。
【００８５】
用語「次世代配列決定」は、いわゆる並行化された合成による配列決定またはライゲーションによる配列決定プラットホーム、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓおよびＲｏｃｈｅ等によって現在用いられるものを指す。次世代配列決定方法は、ナノポア配列決定方法または電子検出に基づく方法、例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって商品化されたＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ技術を含むこともできる。
【００８６】
用語「相補的ＤＮＡ」またはｃＤＮＡは、ＲＮＡの（ランダムヘキサマーまたはオリゴｄＴプライマーなどのプライマーを使用した）逆転写と、続くＲＮａｓｅＨによるＲＮＡの消化およびＤＮＡポリメラーゼによる合成による第２の鎖の合成によってＲＮＡ試料から生成された二本鎖ＤＮＡ試料を指す。
【００８７】
用語「ＲＮＡプロモーターアダプタ」は、バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼ、例えば、バクテリオファージＴ３、Ｔ７、ＳＰ６などからのＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターを含有するアダプタである。
【００８８】
用語の他の定義は、明細書全体で出現することがある。
【００８９】
本明細書に記載されている構造的および機能的特徴のいずれかに関して、これらの特徴を決定する方法は、当技術分野で公知である。
【００９０】
ガイド核酸（ｇＮＡ）
任意の核酸供給源から得ることができるガイド核酸（ｇＮＡ）が、本明細書に提供される。ｇＮＡは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）またはガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ）であってよい。核酸供給源は、ＤＮＡまたはＲＮＡであってよい。単一の生物由来のＤＮＡ、または複数の生物由来のＤＮＡの混合物、または複数の種由来のＤＮＡの混合物、または臨床試料由来のＤＮＡ、または法医学的試料由来のＤＮＡ、または環境試料由来のＤＮＡ、またはメタゲノムＤＮＡ試料（例えば、２以上の生物種を含有する試料）由来のＤＮＡを含む、任意の供給源核酸からｇＮＡを生成するための方法が、本明細書に提供される。任意の供給源ＤＮＡの例は、任意のゲノム、任意のゲノム断片、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡまたはＤＮＡ収集物（例えば、ＳＮＰ収集物、ＤＮＡライブラリー）を非限定的に含む。本明細書に提供されているｇＮＡは、ゲノムワイド適用に使用することができる。
【００９１】
一部の実施形態では、ｇＮＡは、ゲノム配列（例えば、ゲノムＤＮＡ）に由来する。一部の実施形態では、ｇＮＡは、哺乳動物ゲノム配列に由来する。一部の実施形態では、ｇＮＡは、真核生物ゲノム配列に由来する。一部の実施形態では、ｇＮＡは、原核生物ゲノム配列に由来する。一部の実施形態では、ｇＮＡは、ウイルスゲノム配列に由来する。一部の実施形態では、ｇＮＡは、細菌ゲノム配列に由来する。一部の実施形態では、ｇＮＡは、植物ゲノム配列に由来する。一部の実施形態では、ｇＮＡは、微生物ゲノム配列に由来する。一部の実施形態では、ｇＮＡは、寄生生物、例えば、真核寄生生物由来のゲノム配列に由来する。
【００９２】
一部の実施形態では、ｇＮＡは、反復性ＤＮＡに由来する。一部の実施形態では、ｇＮＡは、豊富なＤＮＡに由来する。一部の実施形態では、ｇＮＡは、ミトコンドリアＤＮＡに由来する。一部の実施形態では、ｇＮＡは、リボソームＤＮＡに由来する。一部の実施形態では、ｇＮＡは、セントロメアＤＮＡに由来する。一部の実施形態では、ｇＮＡは、Ａｌｕエレメントを含むＤＮＡ（Ａｌｕ  ＤＮＡ）に由来する。一部の実施形態では、ｇＮＡは、長鎖散在核要素を含むＤＮＡ（ＬＩＮＥ  ＤＮＡ）に由来する。一部の実施形態では、ｇＮＡは、短鎖散在核要素を含むＤＮＡ（ＳＩＮＥ  ＤＮＡ）に由来する。一部の実施形態では、豊富なＤＮＡは、リボソームＤＮＡを含む。一部の実施形態では、豊富なＤＮＡは、宿主ＤＮＡ（例えば、宿主ゲノムＤＮＡまたは全宿主ＤＮＡ）を含む。一例では、宿主ＤＮＡ（例えば、ヒト、動物、植物）を枯渇させて、存在する他のＤＮＡ（例えば、細菌、ウイルスまたは他のメタゲノムＤＮＡ）のより容易な解析を可能にするために、ｇＮＡは、宿主ＤＮＡに由来し得る。別の例では、ｇＮＡは、メタゲノム試料中の１または複数の最も豊富な細菌種等、混合試料中の１または複数の最も豊富な型（例えば、種）に由来し得る。１または複数の最も豊富な型（例えば、種）は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１０を超える最も豊富な型（例えば、種）を含むことができる。最も豊富な型は、最も豊富な界、門（phylumまたはdivision）、綱、目、科、属、種または他の分類であり得る。最も豊富な型は、上皮細胞、骨細胞、筋肉細胞、血液細胞、脂肪細胞または他の細胞型等、最も豊富な細胞型であり得る。最も豊富な型は、非がん性細胞であり得る。最も豊富な型は、がん性細胞であり得る。最も豊富な型は、動物、ヒト、植物、真菌、細菌またはウイルスであり得る。ｇＮＡは、ヒトＤＮＡおよび１または複数の最も豊富な細菌種のＤＮＡの両方に由来等、試料中の宿主および１または複数の最も豊富な非宿主型（例えば、種）の両方に由来し得る。一部の実施形態では、豊富なＤＮＡは、試料中のより豊富な方のまたは最も豊富な細胞由来のＤＮＡを含む。例えば、特異的な試料のため、非常に豊富な細胞を抽出することができ、そのＤＮＡを使用して、ｇＮＡを生成することができる；このようなｇＮＡを使用して、枯渇ライブラリーを生成し、本来の試料に適用して、低存在量標的の配列決定または検出を可能にまたは増強することができる。
【００９３】
一部の実施形態では、ｇＮＡは、短い末端反復（ＳＴＲ）を含むＤＮＡに由来する。
【００９４】
一部の実施形態では、ｇＮＡは、ゲノムの領域を含むゲノム断片、または全ゲノムそれ自体に由来する。一実施形態では、ゲノムはＤＮＡゲノムである。別の実施形態では、ゲノムはＲＮＡゲノムである。
【００９５】
一部の実施形態では、ｇＮＡは、真核生物または原核生物の生物体；哺乳動物の生物体または非哺乳動物の生物体；動物または植物；細菌またはウイルス；動物寄生生物；または病原体に由来する。
【００９６】
一部の実施形態では、ｇＮＡは、任意の哺乳動物の生物体に由来する。一実施形態では、哺乳動物はヒトである。別の実施形態では、哺乳動物は畜産動物、例えばウマ、ヒツジ、ウシ、ブタまたはロバである。別の実施形態では、哺乳動物の生物体は、家庭用ペット、例えばネコ、イヌ、スナネズミ、マウス、ラットである。別の実施形態では、哺乳動物はサルの一種である。
【００９７】
一部の実施形態では、ｇＮＡは、任意のトリまたは鳥類の生物体に由来する。鳥類の生物体には、ニワトリ、シチメンチョウ、カモおよびガチョウが限定されずに含まれる。
【００９８】
一部の実施形態では、目的の配列は、昆虫に由来する。昆虫として、ミツバチ、単生バチ、アリ、ハエ、スズメバチまたは蚊が挙げられるがこれらに限定されない。
【００９９】
一部の実施形態では、ｇＮＡは、植物に由来する。一実施形態では、植物は、イネ、トウモロコシ、コムギ、バラ、ブドウ、コーヒー、果実、トマト、ジャガイモまたはワタである。
【０１００】
一部の実施形態では、ｇＮＡは、細菌の種に由来する。一実施形態では、細菌は、結核を引き起こす細菌である。
【０１０１】
一部の実施形態では、ｇＮＡは、ウイルスに由来する。
【０１０２】
一部の実施形態では、ｇＮＡは、真菌類の種に由来する。
【０１０３】
一部の実施形態では、ｇＮＡは、藻類の種に由来する。
【０１０４】
一部の実施形態では、ｇＮＡは、任意の哺乳動物寄生生物に由来する。
【０１０５】
一部の実施形態では、ｇＮＡは、任意の哺乳動物寄生生物に由来する。一実施形態では、寄生生物は虫である。別の実施形態では、寄生生物は、マラリアを引き起こす寄生生物である。別の実施形態では、寄生生物は、リーシュマニア症を引き起こす寄生生物である。別の実施形態では、寄生生物はアメーバである。
【０１０６】
一部の実施形態では、ｇＮＡは、核酸標的に由来する。企図される標的は、病原体；一塩基多型（ＳＮＰ）、挿入、欠失、タンデム反復もしくは転座；ヒトＳＮＰもしくはＳＴＲ；潜在的な毒素；または動物、真菌および植物を非限定的に含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、病原体に由来し、病原体特異的ｇＮＡである。
【０１０７】
一部の実施形態では、本発明のガイドＮＡは、１５〜２５０ｂｐである標的化配列を含む、第１のＮＡセグメントと；核酸ガイド化ヌクレアーゼ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）タンパク質結合配列を含む、第２のＮＡセグメントとを含む。一部の実施形態では、標的化配列は、２１ｂｐを超える、２２ｂｐを超える、２３ｂｐを超える、２４ｂｐを超える、２５ｂｐを超える、２６ｂｐを超える、２７ｂｐを超える、２８ｂｐを超える、２９ｂｐを超える、３０ｂｐを超える、４０ｂｐを超える、５０ｂｐを超える、６０ｂｐを超える、７０ｂｐを超える、８０ｂｐを超える、９０ｂｐを超える、１００ｂｐを超える、１１０ｂｐを超える、１２０ｂｐを超える、１３０ｂｐを超える、１４０ｂｐを超える、またはさらには１５０ｂｐを超える。例示的な実施形態では、標的化配列は、３０ｂｐを超える。一部の実施形態では、本発明の標的化配列は、サイズが３０〜５０ｂｐに及ぶ。一部の実施形態では、本発明の標的化配列は、サイズが３０〜７５ｂｐに及ぶ。一部の実施形態では、本発明の標的化配列は、サイズが３０〜１００ｂｐに及ぶ。例えば、標的化配列は、少なくとも１５ｂｐ、２０ｂｐ、２５ｂｐ、３０ｂｐ、３５ｂｐ、４０ｂｐ、４５ｂｐ、５０ｂｐ、５５ｂｐ、６０ｂｐ、６５ｂｐ、７０ｂｐ、７５ｂｐ、８０ｂｐ、８５ｂｐ、９０ｂｐ、９５ｂｐ、１００ｂｐ、１１０ｂｐ、１２０ｂｐ、１３０ｂｐ、１４０ｂｐ、１５０ｂｐ、１６０ｂｐ、１７０ｂｐ、１８０ｂｐ、１９０ｂｐ、２００ｂｐ、２１０ｂｐ、２２０ｂｐ、２３０ｂｐ、２４０ｂｐまたは２５０ｂｐであり得る。特定の実施形態では、標的化配列は、少なくとも２０ｂｐである。特定の実施形態では、標的化配列は、少なくとも２２ｂｐである。特定の実施形態では、標的化配列は、少なくとも３０ｂｐである。
【０１０８】
一部の実施形態では、標的特異的ｇＮＡは、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）タンパク質によって認識され得る、ＰＡＭ配列に対し５’にある標的化された核酸配列の反対の鎖における領域と相補的な核酸配列を含むことができる。一部の実施形態では、標的化された核酸配列は、ＰＡＭ配列に対しすぐ接して５’にある。特異的な実施形態では、標的核酸における領域と相補的なｇＮＡの核酸配列は、１５〜２５０ｂｐである。特異的な実施形態では、標的核酸における領域と相補的なｇＮＡの核酸配列は、２０、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、７５、８０、９０または１００ｂｐである。
【０１０９】
一部の特定の実施形態では、標的化配列は、２０ｂｐではない。一部の特定の実施形態では、標的化配列は、２１ｂｐではない。
【０１１０】
一部の実施形態では、ｇＮＡは、任意のプリンまたはピリミジン（および／またはこれらの改変バージョン）を含む。一部の実施形態では、ｇＮＡは、アデニン、ウラシル、グアニンおよびシトシン（および／またはこれらの改変バージョン）を含む。一部の実施形態では、ｇＮＡは、アデニン、チミン、グアニンおよびシトシン（および／またはこれらの改変バージョン）を含む。一部の実施形態では、ｇＮＡは、アデニン、チミン、グアニン、シトシンおよびウラシル（および／またはこれらの改変バージョン）を含む。
【０１１１】
一部の実施形態では、ｇＮＡは、標識を含むか、標識に付着されるか、または標識され得る。一部の実施形態では、ｇＮＡは、標識にさらに付着されることができる部分を含む。標識は、酵素、酵素基質、抗体、抗原結合性断片、ペプチド、発色団、発光団（lumiphore）、フルオロフォア、色素原、ハプテン、抗原、放射性同位元素、磁性粒子、金属ナノ粒子、酸化還元活性マーカー基（酸化還元反応を起こすことができる）、アプタマー、結合ペアの一方のメンバー、ＦＲＥＴペアのメンバー（ドナーまたはアクセプターフルオロフォアのいずれか）およびこれらの組合せを非限定的に含む。
【０１１２】
一部の実施形態では、ｇＮＡは、基材に付着されている。基材は、ガラス、プラスチック、シリコン、シリカベースの材料、官能化ポリスチレン、官能化ポリエチレングリコール、官能化有機ポリマー、ニトロセルロースまたはナイロン膜、紙、綿および合成に適した材料でできていてよい。基材は、平坦である必要はない。一部の実施形態では、基材は、２次元アレイである。一部の実施形態では、２次元アレイは、平坦である。一部の実施形態では、２次元アレイは、平坦でなく、例えば、アレイは、波状アレイである。基材は、球形（例えば、ビーズ）を含む任意の型の形状を含む。基材に付着される材料は、基材の任意の部分に付着されてよい（例えば、多孔性基材材料の内側部分に付着されてよい）。一部の実施形態では、基材は、３次元アレイ、例えば、マイクロスフェアである。一部の実施形態では、マイクロスフェアは、磁性である。一部の実施形態では、マイクロスフェアは、ガラスである。一部の実施形態では、マイクロスフェアは、ポリスチレンでできている。一部の実施形態では、マイクロスフェアは、シリカベースである。一部の実施形態では、基材は、内側表面を有するアレイであり、例えば、ストロー、チューブ、キャピラリー、円柱状またはマイクロ流体チャンバーアレイである。一部の実施形態では、基材は、複数のストロー、キャピラリー、チューブ、シリンダーまたはチャンバーを含む。
【０１１３】
ｇＮＡをコードする核酸
ｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡまたはｇＤＮＡ）をコードする核酸も、本明細書に提供される。一部の実施形態では、コードするとは、ｇＮＡが、ｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）をコードする核酸の転写に起因することを意味する。Ｔ７プロモーターが、本開示に記述されているが、他の適切なプロモーターの使用も企図される。一部の実施形態では、コードするとは、核酸が、ｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）の転写のための鋳型であることを意味する。一部の実施形態では、コードするとは、ｇＮＡが、ｇＮＡをコードする核酸の逆転写に起因することを意味する。一部の実施形態では、コードするとは、核酸が、ｇＮＡの逆転写のための鋳型であることを意味する。一部の実施形態では、コードするとは、ｇＮＡが、ｇＮＡをコードする核酸の増幅に起因することを意味する。一部の実施形態では、コードするとは、核酸が、ｇＮＡの増幅のための鋳型であることを意味する。
【０１１４】
一部の実施形態では、ｇＮＡをコードする核酸は、調節領域を含む第１のセグメントと；標的化配列を含む第２のセグメントであって、１５ｂｐ〜２５０ｂｐに及び得る第２のセグメントと；核酸ガイド化ヌクレアーゼ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）タンパク質結合配列をコードする核酸を含む第３のセグメントとを含む。
【０１１５】
一部の実施形態では、ｇＮＡをコードする核酸は、ＤＮＡを含む。一部の実施形態では、第１のセグメントは、二本鎖ＤＮＡである。一部の実施形態では、第１のセグメントは、一本鎖ＤＮＡである。一部の実施形態では、第２のセグメントは、一本鎖ＤＮＡである。一部の実施形態では、第３のセグメントは、一本鎖ＤＮＡである。一部の実施形態では、第２のセグメントは、二本鎖ＤＮＡである。一部の実施形態では、第３のセグメントは、二本鎖ＤＮＡである。
【０１１６】
一部の実施形態では、ｇＮＡをコードする核酸は、ＲＮＡを含む。
【０１１７】
一部の実施形態では、ｇＮＡをコードする核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。
【０１１８】
一部の実施形態では、調節領域は、転写因子に結合することができる領域である。一部の実施形態では、調節領域は、プロモーターを含む。一部の実施形態では、プロモーターは、Ｔ７、ＳＰ６およびＴ３からなる群から選択される。
【０１１９】
ｇＮＡの収集物
ｇＮＡの収集物（ライブラリーと互換的に称される）が、本明細書に提供される。
【０１２０】
本明細書で使用するように、ｇＮＡの収集物は、少なくとも１０２個の特異なｇＮＡを含有するｇＮＡの混合物を意味する。一部の実施形態では、ｇＮＡの収集物は、少なくとも１０２、少なくとも１０３、少なくとも１０４、少なくとも１０５、少なくとも１０６、少なくとも１０７、少なくとも１０８、少なくとも１０９、少なくとも１０１０個の特異なｇＮＡを含有する。一部の実施形態では、ｇＮＡの収集物は、総計で少なくとも１０２、少なくとも１０３、少なくとも１０４、少なくとも１０５、少なくとも１０６、少なくとも１０７、少なくとも１０８、少なくとも１０９、少なくとも１０１０個のｇＮＡを含有する。
【０１２１】
一部の実施形態では、ｇＮＡの収集物は、標的化配列を含む第１のＮＡセグメントと；核酸ガイド化ヌクレアーゼ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）タンパク質結合配列を含む第２のＮＡセグメントとを含み、収集物中のｇＮＡの少なくとも１０％のサイズが変動する。一部の実施形態では、第１および第２のセグメントは、５’から３’への順序である。一部の実施形態では、第１および第２のセグメントは、３’から５’への順序である。
【０１２２】
一部の実施形態では、第１のセグメントのサイズは、ｇＮＡの収集物にわたって１５〜２５０ｂｐ、または２０ｂｐ、または３０〜１００ｂｐ、または２０〜３０ｂｐ、または２２〜３０ｂｐ、または１５〜５０ｂｐ、または１５〜７５ｂｐ、または１５〜１００ｂｐ、または１５〜１２５ｂｐ、または１５〜１５０ｂｐ、または１５〜１７５ｂｐ、または１５〜２００ｂｐ、または１５〜２２５ｂｐ、または１５〜２５０ｂｐ、または２２〜５０ｂｐ、または２２〜７５ｂｐ、または２２〜１００ｂｐ、または２２〜１２５ｂｐ、または２２〜１５０ｂｐ、または２２〜１７５ｂｐ、または２２〜２００ｂｐ、または２２〜２２５ｂｐ、または２２〜２５０ｂｐ変動する。
【０１２３】
一部の実施形態では、収集物における第１のセグメントの少なくとも１０％または少なくとも１５％または少なくとも（at last）２０％または少なくとも２５％または少なくとも３０％または少なくとも３５％または少なくとも４０％または少なくとも４５％または少なくとも５０％または少なくとも５５％または少なくとも６０％または少なくとも６５％または少なくとも７０％または少なくとも７５％または少なくとも８０％または少なくとも８５％または少なくとも９０％または少なくとも９５％または１００％は、２０ｂｐを超えるまたはそれに等しい。一部の実施形態では、収集物における第１のセグメントの少なくとも１０％または少なくとも１５％または少なくとも２０％または少なくとも２５％または少なくとも３０％または少なくとも３５％または少なくとも４０％または少なくとも４５％または少なくとも５０％または少なくとも５５％または少なくとも６０％または少なくとも６５％または少なくとも７０％または少なくとも７５％または少なくとも８０％または少なくとも８５％または少なくとも９０％または少なくとも９５％または１００％は、２０ｂｐに等しい。
【０１２４】
一部の実施形態では、収集物中の第１のセグメントの少なくとも１０％、または少なくとも１５％、または少なくとも（ａｔ  ｌａｓｔ）２０％、または少なくとも２５％、または少なくとも３０％、または少なくとも３５％、または少なくとも４０％、または少なくとも４５％、または少なくとも５０％、または少なくとも５５％、または少なくとも６０％、または少なくとも６５％、または少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または１００％は、２１ｂｐを超える。
【０１２５】
一部の実施形態では、収集物中の第１のセグメントの少なくとも１０％、または少なくとも１５％、または少なくとも（ａｔ  ｌａｓｔ）２０％、または少なくとも２５％、または少なくとも３０％、または少なくとも３５％、または少なくとも４０％、または少なくとも４５％、または少なくとも５０％、または少なくとも５５％、または少なくとも６０％、または少なくとも６５％、または少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または１００％は、２５ｂｐを超える。
【０１２６】
一部の実施形態では、収集物中の第１のセグメントの少なくとも１０％、または少なくとも１５％、または少なくとも（ａｔ  ｌａｓｔ）２０％、または少なくとも２５％、または少なくとも３０％、または少なくとも３５％、または少なくとも４０％、または少なくとも４５％、または少なくとも５０％、または少なくとも５５％、または少なくとも６０％、または少なくとも６５％、または少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または１００％は、３０ｂｐを超える。
【０１２７】
一部の実施形態では、収集物中の第１のセグメントの少なくとも１０％、または少なくとも１５％、または少なくとも（ａｔ  ｌａｓｔ）２０％、または少なくとも２５％、または少なくとも３０％、または少なくとも３５％、または少なくとも４０％、または少なくとも４５％、または少なくとも５０％、または少なくとも５５％、または少なくとも６０％、または少なくとも６５％、または少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または１００％は、１５〜５０ｂｐである。
【０１２８】
一部の実施形態では、収集物中の第１のセグメントの少なくとも１０％、または少なくとも１５％、または少なくとも（ａｔ  ｌａｓｔ）２０％、または少なくとも２５％、または少なくとも３０％、または少なくとも３５％、または少なくとも４０％、または少なくとも４５％、または少なくとも５０％、または少なくとも５５％、または少なくとも６０％、または少なくとも６５％、または少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または１００％は、３０〜１００ｂｐである。
【０１２９】
一部の特定の実施形態では、第１のセグメントのサイズは、２０ｂｐではない。
【０１３０】
一部の特定の実施形態では、第１のセグメントのサイズは、２１ｂｐではない。
【０１３１】
一部の実施形態では、ｇＲＮＡの収集物中のｇＮＡおよび／またはｇＮＡの標的化配列は、特異な５’端を含む。一部の実施形態では、ｇＮＡの収集物は、収集物のメンバーにわたる、標的化配列の５’端の配列に可変性を呈する。一部の実施形態では、ｇＮＡの収集物は、収集物のメンバーにわたる、標的化配列の５’端の配列に少なくとも５％または少なくとも１０％または少なくとも１５％または少なくとも２０％または少なくとも２５％または少なくとも３０％または少なくとも３５％または少なくとも４０％または少なくとも４５％または少なくとも５０％または少なくとも５５％または少なくとも６０％または少なくとも６５％または少なくとも７０％の可変性または少なくとも７５％可変性を呈する。
【０１３２】
一部の実施形態では、ｇＮＡ標的化配列の３’端は、任意のプリンまたはピリミジン（および／またはこれらの改変バージョン）であってよい。一部の実施形態では、ｇＮＡ標的化配列の３’端は、アデニンである。一部の実施形態では、ｇＮＡ標的化配列の３’端は、グアニンである。一部の実施形態では、ｇＮＡ標的化配列の３’端は、シトシンである。一部の実施形態では、ｇＮＡ標的化配列の３’端は、ウラシルである。一部の実施形態では、ｇＮＡ標的化配列の３’端は、チミンである。一部の実施形態では、ｇＮＡ標的化配列の３’端は、シトシンではない。
【０１３３】
一部の実施形態では、ｇＮＡの収集物は、標的化されたＤＮＡと塩基対形成することができる標的化配列を含み、目的の標的は、目的のゲノムにわたって、少なくとも１ｂｐ毎の、少なくとも２ｂｐ毎の、少なくとも３ｂｐ毎の、少なくとも４ｂｐ毎の、少なくとも５ｂｐ毎の、少なくとも６ｂｐ毎の、少なくとも７ｂｐ毎の、少なくとも８ｂｐ毎の、少なくとも９ｂｐ毎の、少なくとも１０ｂｐ毎の、少なくとも１１ｂｐ毎の、少なくとも１２ｂｐ毎の、少なくとも１３ｂｐ毎の、少なくとも１４ｂｐ毎の、少なくとも１５ｂｐ毎の、少なくとも１６ｂｐ毎の、少なくとも１７ｂｐ毎の、少なくとも１８ｂｐ毎の、少なくとも１９ｂｐ毎の、２０ｂｐ、少なくとも２５ｂｐ毎の、少なくとも３０ｂｐ毎の、少なくとも４０ｂｐ毎の、少なくとも５０ｂｐ毎の、少なくとも１００ｂｐ毎の、少なくとも２００ｂｐ毎の、少なくとも３００ｂｐ毎の、少なくとも４００ｂｐ毎の、少なくとも５００ｂｐ毎の、少なくとも６００ｂｐ毎の、少なくとも７００ｂｐ毎の、少なくとも８００ｂｐ毎の、少なくとも９００ｂｐ毎の、少なくとも１０００ｂｐ毎の、少なくとも２５００ｂｐ毎の、少なくとも５０００ｂｐ毎の、少なくとも１０，０００ｂｐ毎の、少なくとも１５，０００ｂｐ毎の、少なくとも２０，０００ｂｐ毎の、少なくとも２５，０００ｂｐ毎の、少なくとも５０，０００ｂｐ毎の、少なくとも１００，０００ｂｐ毎の、少なくとも２５０，０００ｂｐ毎の、少なくとも５００，０００ｂｐ毎の、少なくとも７５０，０００ｂｐ毎のまたはさらには少なくとも１，０００，０００ｂｐ毎の間隔にある。
【０１３４】
一部の実施形態では、ｇＮＡの収集物は、標的化配列を含む第１のＮＡセグメントと；核酸ガイド化ヌクレアーゼ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）タンパク質結合配列を含む第２のＮＡセグメントとを含み、収集物中のｇＮＡは、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）のタンパク質メンバーに対し様々な特異性を有する種々の第２のＮＡセグメントを有することができる。例えば、本明細書に提供されているｇＮＡの収集物は、その第２のセグメントが、第１の核酸ガイド化ヌクレアーゼ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）タンパク質に特異的な核酸ガイド化ヌクレアーゼ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）タンパク質結合配列を含むメンバーを含むことができ；また、その第２のセグメントが、第２の核酸ガイド化ヌクレアーゼ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）タンパク質に特異的な核酸ガイド化ヌクレアーゼ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）タンパク質結合配列を含むメンバーも含み、この場合、第１および第２の核酸ガイド化ヌクレアーゼ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）タンパク質は、同じものではない。一部の実施形態では、本明細書に提供されているｇＮＡの収集物は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９またはさらには少なくとも２０種の核酸ガイド化ヌクレアーゼ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）タンパク質に対する特異性を呈するメンバーを含む。特異的な一実施形態では、本明細書に提供されているｇＮＡの収集物は、Ｃａｓ９タンパク質、ならびにＣｐｆ１、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ〜ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２およびＣｍ５からなる群から選択される別のタンパク質に対する特異性を呈するメンバーを含む。一部の実施形態では、第１および第２の核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質に特異的な核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列は、両者共に、標的化配列を含む第１のＮＡセグメントの５’にある。一部の実施形態では、第１および第２の核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質に特異的な核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列は、両者共に、標的化配列を含む第１のＮＡセグメントの３’にある。一部の実施形態では、第１の核酸ガイド化ヌクレアーゼ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）タンパク質に特異的な核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列は、標的化配列を含む第１のＮＡセグメントの５’にあり、第２の核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質に特異的な第２の核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列は、標的化配列を含む第１のＮＡセグメントの３’にある。標的化配列を含む第１のＮＡセグメントおよび核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列を含む第２のＮＡセグメントの順序は、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質に依存する。第１および第２のＮＡセグメントの適切な５’から３’への配置、ならびに核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質の選択は、当業者には明らかである。
【０１３５】
一部の実施形態では、収集物の複数のｇＮＡメンバーは、標識に付着されるか、標識を含むか、または標識され得る。一部の実施形態では、ｇＮＡは、標識にさらに付着されることができる部分を含む。例示的だが非限定的な部分は、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）およびフルオレセイン（ＦＩＴＣ）を含む。標識は、酵素、酵素基質、抗体、抗原結合性断片、ペプチド、発色団、発光団、フルオロフォア、色素原、ハプテン、抗原、放射性同位元素、磁性粒子、金属ナノ粒子、酸化還元活性マーカー基（酸化還元反応を起こすことができる）、アプタマー、結合ペアの一方のメンバー、ＦＲＥＴペアのメンバー（ドナーまたはアクセプターフルオロフォアのいずれか）およびこれらの組合せを非限定的に含む。
【０１３６】
一部の実施形態では、収集物の複数のｇＮＡメンバーは、基材に付着される。基材は、ガラス、プラスチック、シリコン、シリカベースの材料、官能化ポリスチレン、官能化ポリエチレングリコール、官能化有機ポリマー、ニトロセルロースまたはナイロン膜、紙、綿、および合成に適した材料でできていてよい。基材は、平坦である必要はない。一部の実施形態では、基材は、２次元アレイである。一部の実施形態では、２次元アレイは、平坦である。一部の実施形態では、２次元アレイは、平坦でなく、例えば、アレイは、波状アレイである。基材は、球形（例えば、ビーズ）を含む任意の型の形状を含む。基材に付着される材料は、基材の任意の部分に付着されてよい（例えば、多孔性基材材料の内側部分に付着されてよい）。一部の実施形態では、基材は、３次元アレイ、例えば、マイクロスフェアである。一部の実施形態では、マイクロスフェアは、磁性である。一部の実施形態では、マイクロスフェアは、ガラスである。一部の実施形態では、マイクロスフェアは、ポリスチレンでできている。一部の実施形態では、マイクロスフェアは、シリカベースである。一部の実施形態では、基材は、内側表面を有するアレイであり、例えば、ストロー、チューブ、キャピラリー、円柱状またはマイクロ流体チャンバーアレイである。一部の実施形態では、基材は、複数のストロー、キャピラリー、チューブ、シリンダーまたはチャンバーを含む。
【０１３７】
ｇＮＡをコードする核酸の収集物
ｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡまたはｇＤＮＡ）をコードする核酸の収集物（ライブラリーと互換的に称される）が、本明細書に提供される。一部の実施形態では、コードするとは、ｇＮＡが、ｇＮＡをコードする核酸の転写に起因することを意味する。一部の実施形態では、コードするとは、核酸が、ｇＮＡの転写のための鋳型であることを意味する。
【０１３８】
本明細書で使用するように、ｇＮＡをコードする核酸の収集物は、少なくとも１０２個の特異な（unique）核酸を含有する核酸の混合物を意味する。一部の実施形態では、ｇＮＡをコードする核酸の収集物は、少なくとも１０２、少なくとも１０３、少なくとも１０４、少なくとも１０５、少なくとも１０６、少なくとも１０７、少なくとも１０８、少なくとも１０９、少なくとも１０１０個の特異なｇＮＡをコードする核酸を含有する。一部の実施形態では、ｇＮＡをコードする核酸の収集物は、総計で少なくとも１０２、少なくとも１０３、少なくとも１０４、少なくとも１０５、少なくとも１０６、少なくとも１０７、少なくとも１０８、少なくとも１０９、少なくとも１０１０個の、ｇＮＡをコードする核酸を含有する。
【０１３９】
一部の実施形態では、ｇＮＡをコードする核酸の収集物は、調節領域を含む第１のセグメントと；標的化配列を含む第２のセグメントと；核酸ガイド化ヌクレアーゼ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）タンパク質結合配列をコードする核酸を含む第３のセグメントとを含み、収集物中の核酸の少なくとも１０％のサイズが変動する。
【０１４０】
一部の実施形態では、第１、第２および第３のセグメントは、５’から３’への順序である。
【０１４１】
一部の実施形態では、第１、第２および第３のセグメントは、５’から３’への順序で、第１のセグメント、第３のセグメント、次いで第２のセグメントを配置される。
【０１４２】
一部の実施形態では、ｇＮＡをコードする核酸は、ＤＮＡを含む。一部の実施形態では、第１のセグメントは、一本鎖ＤＮＡである。一部の実施形態では、第１のセグメントは、二本鎖ＤＮＡである。一部の実施形態では、第２のセグメントは、一本鎖ＤＮＡである。一部の実施形態では、第３のセグメントは、一本鎖ＤＮＡである。一部の実施形態では、第２のセグメントは、二本鎖ＤＮＡである。一部の実施形態では、第３のセグメントは、二本鎖ＤＮＡである。
【０１４３】
一部の実施形態では、ｇＮＡをコードする核酸は、ＲＮＡを含む。
【０１４４】
一部の実施形態では、ｇＮＡをコードする核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。
【０１４５】
一部の実施形態では、調節領域は、転写因子に結合することができる領域である。一部の実施形態では、調節領域は、プロモーターを含む。一部の実施形態では、プロモーターは、Ｔ７、ＳＰ６およびＴ３からなる群から選択される。
【０１４６】
一部の実施形態では、収集物中の第２のセグメント（標的化配列）のサイズは、ｇＮＡの収集物にわたって１５〜２５０ｂｐ、または３０〜１００ｂｐ、または２２〜３０ｂｐ、または１５〜５０ｂｐ、または１５〜７５ｂｐ、または１５〜１００ｂｐ、または１５〜１２５ｂｐ、または１５〜１５０ｂｐ、または１５〜１７５ｂｐ、または１５〜２００ｂｐ、または１５〜２２５ｂｐ、または１５〜２５０ｂｐ、または２２〜５０ｂｐ、または２２〜７５ｂｐ、または２２〜１００ｂｐ、または２２〜１２５ｂｐ、または２２〜１５０ｂｐ、または２２〜１７５ｂｐ、または２２〜２００ｂｐ、または２２〜２２５ｂｐ、または２２〜２５０ｂｐ変動する。
【０１４７】
一部の実施形態では、収集物中の第２のセグメントの少なくとも１０％、または少なくとも１５％、または少なくとも（ａｔ  ｌａｓｔ）２０％、または少なくとも２５％、または少なくとも３０％、または少なくとも３５％、または少なくとも４０％、または少なくとも４５％、または少なくとも５０％、または少なくとも５５％、または少なくとも６０％、または少なくとも６５％、または少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または１００％は、２０ｂｐを超えるかまたは２０ｂｐに等しい。
【０１４８】
一部の実施形態では、収集物中の第２のセグメントの少なくとも１０％、または少なくとも１５％、または少なくとも（ａｔ  ｌａｓｔ）２０％、または少なくとも２５％、または少なくとも３０％、または少なくとも３５％、または少なくとも４０％、または少なくとも４５％、または少なくとも５０％、または少なくとも５５％、または少なくとも６０％、または少なくとも６５％、または少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または１００％は、２１ｂｐを超える。
【０１４９】
一部の実施形態では、収集物中の第２のセグメントの少なくとも１０％、または少なくとも１５％、または少なくとも（ａｔ  ｌａｓｔ）２０％、または少なくとも２５％、または少なくとも３０％、または少なくとも３５％、または少なくとも４０％、または少なくとも４５％、または少なくとも５０％、または少なくとも５５％、または少なくとも６０％、または少なくとも６５％、または少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または１００％は、２５ｂｐを超える。
【０１５０】
一部の実施形態では、収集物中の第２のセグメントの少なくとも１０％、または少なくとも１５％、または少なくとも（ａｔ  ｌａｓｔ）２０％、または少なくとも２５％、または少なくとも３０％、または少なくとも３５％、または少なくとも４０％、または少なくとも４５％、または少なくとも５０％、または少なくとも５５％、または少なくとも６０％、または少なくとも６５％、または少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または１００％は、３０ｂｐを超える。
【０１５１】
一部の実施形態では、収集物における第２のセグメントの少なくとも１０％または少なくとも１５％または少なくとも２０％または少なくとも２５％または少なくとも３０％または少なくとも３５％または少なくとも４０％または少なくとも４５％または少なくとも５０％または少なくとも５５％または少なくとも６０％または少なくとも６５％または少なくとも７０％または少なくとも７５％または少なくとも８０％または少なくとも８５％または少なくとも９０％または少なくとも９５％または１００％は、１５〜５０ｂｐである。
【０１５２】
一部の実施形態では、収集物における第２のセグメントの少なくとも１０％または少なくとも１５％または少なくとも２０％または少なくとも２５％または少なくとも３０％または少なくとも３５％または少なくとも４０％または少なくとも４５％または少なくとも５０％または少なくとも５５％または少なくとも６０％または少なくとも６５％または少なくとも７０％または少なくとも７５％または少なくとも８０％または少なくとも８５％または少なくとも９０％または少なくとも９５％または１００％は、３０〜１００ｂｐである。
【０１５３】
一部の特定の実施形態では、第２のセグメントのサイズは、２０ｂｐではない。
【０１５４】
一部の特定の実施形態では、第２のセグメントのサイズは、２１ｂｐではない。
【０１５５】
一部の実施形態では、ｇＮＡの収集物中のｇＮＡおよび／またはｇＮＡの標的化配列は、特異な５’端を含む。一部の実施形態では、ｇＮＡの収集物は、収集物のメンバーにわたる、標的化配列の５’端の配列に可変性を呈する。一部の実施形態では、ｇＮＡの収集物は、収集物のメンバーにわたる、標的化配列の５’端の配列に少なくとも５％または少なくとも１０％または少なくとも１５％または少なくとも２０％または少なくとも２５％または少なくとも３０％または少なくとも３５％または少なくとも４０％または少なくとも４５％または少なくとも５０％または少なくとも５５％または少なくとも６０％または少なくとも６５％または少なくとも７０％の可変性または少なくとも７５％可変性を呈する。
【０１５６】
一部の実施形態では、核酸の収集物は、標的化配列を含み、目的の標的は、目的のゲノムにわたって、少なくとも１ｂｐ毎の、少なくとも２ｂｐ毎の、少なくとも３ｂｐ毎の、少なくとも４ｂｐ毎の、少なくとも５ｂｐ毎の、少なくとも６ｂｐ毎の、少なくとも７ｂｐ毎の、少なくとも８ｂｐ毎の、少なくとも９ｂｐ毎の、少なくとも１０ｂｐ毎の、少なくとも１１ｂｐ毎の、少なくとも１２ｂｐ毎の、少なくとも１３ｂｐ毎の、少なくとも１４ｂｐ毎の、少なくとも１５ｂｐ毎の、少なくとも１６ｂｐ毎の、少なくとも１７ｂｐ毎の、少なくとも１８ｂｐ毎の、少なくとも１９ｂｐ毎の、２０ｂｐ、少なくとも２５ｂｐ毎の、少なくとも３０ｂｐ毎の、少なくとも４０ｂｐ毎の、少なくとも５０ｂｐ毎の、少なくとも１００ｂｐ毎の、少なくとも２００ｂｐ毎の、少なくとも３００ｂｐ毎の、少なくとも４００ｂｐ毎の、少なくとも５００ｂｐ毎の、少なくとも６００ｂｐ毎の、少なくとも７００ｂｐ毎の、少なくとも８００ｂｐ毎の、少なくとも９００ｂｐ毎の、少なくとも１０００ｂｐ毎の、少なくとも２５００ｂｐ毎の、少なくとも５０００ｂｐ毎の、少なくとも１０，０００ｂｐ毎の、少なくとも１５，０００ｂｐ毎の、少なくとも２０，０００ｂｐ毎の、少なくとも２５，０００ｂｐ毎の、少なくとも５０，０００ｂｐ毎の、少なくとも１００，０００ｂｐ毎の、少なくとも２５０，０００ｂｐ毎の、少なくとも５００，０００ｂｐ毎の、少なくとも７５０，０００ｂｐ毎のまたはさらには少なくとも１，０００，０００ｂｐ毎の間隔にある。
【０１５７】
一部の実施形態では、ｇＮＡをコードする核酸の収集物は、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）タンパク質結合配列をコードする第３のセグメントを含み、収集物中のこのセグメントは、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）のタンパク質メンバーに対するその特異性が変動する。例えば、本明細書に提供されているｇＮＡをコードする核酸の収集物は、その第３のセグメントが、第１の核酸ガイド化ヌクレアーゼ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）タンパク質に特異的な核酸ガイド化ヌクレアーゼ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）タンパク質結合配列をコードするメンバーを含むことができ；また、その第３のセグメントが、第２の核酸ガイド化ヌクレアーゼ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）タンパク質に特異的な核酸ガイド化ヌクレアーゼ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）タンパク質結合配列をコードするメンバーも含み、この場合、第１および第２の核酸ガイド化ヌクレアーゼ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）タンパク質は、同じものではない。一部の実施形態では、本明細書に提供されているｇＮＡをコードする核酸の収集物は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９またはさらには少なくとも２０種の核酸ガイド化ヌクレアーゼ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）タンパク質に対する特異性を呈するメンバーを含む。特異的な一実施形態では、本明細書に提供されているｇＮＡをコードする核酸の収集物は、Ｃａｓ９タンパク質、ならびにＣｐｆ１、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ〜ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２およびＣｍ５からなる群から選択される別のタンパク質に対する特異性を呈するメンバーを含む。一部の実施形態では、第１および第２の核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質に特異的な核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列は、両者共に、標的化配列を含む第１のＮＡセグメントの５’にある。一部の実施形態では、第１および第２の核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質に特異的な核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列は、両者共に、標的化配列を含む第１のＮＡセグメントの３’にある。一部の実施形態では、第１の核酸ガイド化ヌクレアーゼ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）タンパク質に特異的な核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列は、標的化配列を含む第１のＮＡセグメントの５’にあり、第２の核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質に特異的な第２の核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列は、標的化配列を含む第１のＮＡセグメントの３’にある。標的化配列を含む第１のＮＡセグメントおよび核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列を含む第２のＮＡセグメントの順序は、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質に依存する。第１および第２のＮＡセグメントの適切な５’から３’への配置、ならびに核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質の選択は、当業者には明らかである。
【０１５８】
目的の配列
濃縮、枯渇、捕捉、分配、標識、調節および編集を非限定的に含む種々の適用のため、試料における目的の配列の標的化に使用することができる、任意の供給源ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、人工ＤＮＡ、ＤＮＡライブラリー）に由来するｇＮＡおよびｇＮＡの収集物が、本明細書に提供される。ｇＮＡは、目的の配列へと向けられた標的化配列を含む。
【０１５９】
一部の実施形態では、目的の配列は、ゲノム配列（ゲノムＤＮＡ）である。一部の実施形態では、目的の配列は、哺乳動物ゲノム配列である。一部の実施形態では、目的の配列は、真核生物ゲノム配列である。一部の実施形態では、目的の配列は、原核生物ゲノム配列である。一部の実施形態では、目的の配列は、ウイルスゲノム配列である。一部の実施形態では、目的の配列は、細菌ゲノム配列である。一部の実施形態では、目的の配列は、植物ゲノム配列である。一部の実施形態では、目的の配列は、微生物ゲノム配列である。一部の実施形態では、目的の配列は、寄生生物、例えば、真核寄生生物由来のゲノム配列である。一部の実施形態では、目的の配列は、宿主ゲノム配列（例えば、マイクロバイオーム（ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ）、寄生生物または病原体の宿主生物）である。一部の実施形態では、目的の配列は、豊富なゲノム配列（例えば、試料中の１または複数の最も豊富な種のゲノム由来の配列）である。
【０１６０】
一部の実施形態では、目的の配列は、反復性ＤＮＡを含む。一部の実施形態では、目的の配列は、豊富なＤＮＡを含む。一部の実施形態では、目的の配列は、ミトコンドリアＤＮＡを含む。一部の実施形態では、目的の配列は、リボソームＤＮＡを含む。一部の実施形態では、目的の配列は、セントロメアＤＮＡを含む。一部の実施形態では、目的の配列は、Ａｌｕエレメントを含むＤＮＡ（Ａｌｕ  ＤＮＡ）を含む。一部の実施形態では、目的の配列は、長鎖散在核要素（ＬＩＮＥ  ＤＮＡ）を含む。一部の実施形態では、目的の配列は、短鎖散在核要素（ＳＩＮＥ  ＤＮＡ）を含む。一部の実施形態では、豊富なＤＮＡは、リボソームＤＮＡを含む。
【０１６１】
一部の実施形態では、目的の配列は、一塩基多型（ＳＮＰ）、短いタンデム反復（ＳＴＲ）、がん遺伝子、挿入、欠失、構造的変種、エクソン、遺伝的突然変異または調節領域を含む。
【０１６２】
一部の実施形態では、目的の配列は、ゲノムの領域を含むゲノム断片、または全ゲノムそれ自体であり得る。一実施形態では、ゲノムはＤＮＡゲノムである。別の実施形態では、ゲノムはＲＮＡゲノムである。
【０１６３】
一部の実施形態では、目的の配列は、真核生物または原核生物の生物体；哺乳動物の生物体または非哺乳動物の生物体；動物または植物；細菌またはウイルス；動物寄生生物；または病原体からである。
【０１６４】
一部の実施形態では、目的の配列は、任意の哺乳動物の生物体からである。一実施形態では、哺乳動物はヒトである。別の実施形態では、哺乳動物は畜産動物、例えばウマ、ヒツジ、ウシ、ブタまたはロバである。別の実施形態では、哺乳動物の生物体は、家庭用ペット、例えばネコ、イヌ、スナネズミ、マウス、ラットである。別の実施形態では、哺乳動物はサルの一種である。
【０１６５】
一部の実施形態では、目的の配列は、任意のトリまたは鳥類の生物体からである。鳥類の生物体には、ニワトリ、シチメンチョウ、カモおよびガチョウが限定されずに含まれる。
【０１６６】
一部の実施形態では、目的の配列は、昆虫に由来する。昆虫として、ミツバチ、単生バチ、アリ、ハエ、スズメバチまたは蚊が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１６７】
一部の実施形態では、目的の配列は、植物からである。一実施形態では、植物は、イネ、トウモロコシ、コムギ、バラ、ブドウ、コーヒー、果実、トマト、ジャガイモまたはワタである。
【０１６８】
一部の実施形態では、目的の配列は、細菌の種からである。一実施形態では、細菌は、結核を引き起こす細菌である。
【０１６９】
一部の実施形態では、目的の配列は、ウイルスからである。
【０１７０】
一部の実施形態では、目的の配列は、真菌類の種からである。
【０１７１】
一部の実施形態では、目的の配列は、藻類の種からである。
【０１７２】
一部の実施形態では、目的の配列は、任意の哺乳動物寄生生物からである。
【０１７３】
一部の実施形態では、目的の配列は、任意の哺乳動物寄生生物から得られる。一実施形態では、寄生生物は虫である。別の実施形態では、寄生生物は、マラリアを引き起こす寄生生物である。別の実施形態では、寄生生物は、リーシュマニア症を引き起こす寄生生物である。別の実施形態では、寄生生物はアメーバである。
【０１７４】
一部の実施形態では、目的の配列は、病原体からである。
【０１７５】
標的化配列
本明細書で使用するように、標的化配列は、ｇＮＡを試料中の目的の配列に向ける配列である。例えば、標的化配列は、特定の目的の配列を標的とし、例えば、標的化配列は、目的のゲノム配列を標的とする。
【０１７６】
標的化配列を含むセグメントを含むｇＮＡおよびｇＮＡの収集物が、本明細書に提供される。標的化配列をコードするセグメントを含むｇＮＡをコードする核酸およびｇＮＡをコードする核酸の収集物も、本明細書に提供される。
【０１７７】
一部の実施形態では、標的化配列は、ＤＮＡを含む。
【０１７８】
一部の実施形態では、標的化配列は、ＲＮＡを含む。
【０１７９】
一部の実施形態では、標的化配列は、ＲＮＡを含み、ＲＮＡが、チミンの代わりにウラシルを含むことを除いて、目的の配列におけるＰＡＭ配列に対し５’にある配列に対し、少なくとも７０％配列同一性、少なくとも７５％配列同一性、少なくとも８０％配列同一性、少なくとも８５％配列同一性、少なくとも９０％配列同一性、少なくとも９５％配列同一性を共有する、または１００％配列同一性を共有する。一部の実施形態では、標的化配列は、ＲＮＡを含み、ＲＮＡが、チミンの代わりにウラシルを含むことを除いて、目的の配列上のＰＡＭ配列に対し３’にある配列に対し、少なくとも７０％配列同一性、少なくとも７５％配列同一性、少なくとも８０％配列同一性、少なくとも８５％配列同一性、少なくとも９０％配列同一性、少なくとも９５％配列同一性を共有する、または１００％配列同一性を共有する。一部の実施形態では、ＰＡＭ配列は、ＡＧＧ、ＣＧＧ、ＴＧＧ、ＧＧＧまたはＮＡＧである。一部の実施形態では、ＰＡＭ配列は、ＴＴＮ、ＴＣＮまたはＴＧＮである。
【０１８０】
一部の実施形態では、標的化配列は、ＤＮＡを含み、目的の配列上のＰＡＭ配列に対し５’にある配列に対し、少なくとも７０％配列同一性、少なくとも７５％配列同一性、少なくとも８０％配列同一性、少なくとも８５％配列同一性、少なくとも９０％配列同一性、少なくとも９５％配列同一性を共有する、または１００％配列同一性を共有する。一部の実施形態では、標的化配列は、ＤＮＡを含み、目的の配列上のＰＡＭ配列に対し３’にある配列に対し、少なくとも７０％配列同一性、少なくとも７５％配列同一性、少なくとも８０％配列同一性、少なくとも８５％配列同一性、少なくとも９０％配列同一性、少なくとも９５％配列同一性を共有する、または１００％配列同一性を共有する。
【０１８１】
一部の実施形態では、標的化配列は、ＲＮＡを含み、ＰＡＭ配列に対し５’にあるヌクレオチドの配列の反対の鎖に対し相補的である。一部の実施形態では、標的化配列は、ＰＡＭ配列に対し５’にあるヌクレオチドの配列の反対の鎖に対し、少なくとも７０％相補的、少なくとも７５％相補的、少なくとも８０％相補的、少なくとも８５％相補的、少なくとも９０％相補的、少なくとも９５％相補的である、または１００％相補的である。一部の実施形態では、標的化配列は、ＲＮＡを含み、ＰＡＭ配列に対し３’にあるヌクレオチドの配列の反対の鎖に対し相補的である。一部の実施形態では、標的化配列は、ＰＡＭ配列に対し３’にあるヌクレオチドの配列の反対の鎖に対し、少なくとも７０％相補的、少なくとも７５％相補的、少なくとも８０％相補的、少なくとも８５％相補的、少なくとも９０％相補的、少なくとも９５％相補的である、または１００％相補的である。一部の実施形態では、ＰＡＭ配列は、ＡＧＧ、ＣＧＧ、ＴＧＧ、ＧＧＧまたはＮＡＧである。一部の実施形態では、ＰＡＭ配列は、ＴＴＮ、ＴＣＮまたはＴＧＮである。
【０１８２】
一部の実施形態では、標的化配列は、ＤＮＡを含み、ＰＡＭ配列に対し５’にあるヌクレオチドの配列の反対の鎖に対し相補的である。一部の実施形態では、標的化配列は、ＰＡＭ配列に対し５’にあるヌクレオチドの配列の反対の鎖に対し、少なくとも７０％相補的、少なくとも７５％相補的、少なくとも８０％相補的、少なくとも８５％相補的、少なくとも９０％相補的、少なくとも９５％相補的である、または１００％相補的である。一部の実施形態では、標的化配列は、ＤＮＡを含み、ＰＡＭ配列に対し３’にあるヌクレオチドの配列の反対の鎖に対し相補的である。一部の実施形態では、標的化配列は、ＰＡＭ配列に対し３’にあるヌクレオチドの配列の反対の鎖に対し、少なくとも７０％相補的、少なくとも７５％相補的、少なくとも８０％相補的、少なくとも８５％相補的、少なくとも９０％相補的、少なくとも９５％相補的である、または１００％相補的である。一部の実施形態では、ＰＡＭ配列は、ＡＧＧ、ＣＧＧ、ＴＧＧ、ＧＧＧまたはＮＡＧである。一部の実施形態では、ＰＡＭ配列は、ＴＴＮ、ＴＣＮまたはＴＧＮである。
【０１８３】
一部の実施形態では、ｇＲＮＡの標的化配列をコードするＤＮＡは、ＰＡＭ配列に対し５’にあるヌクレオチドの配列の反対の鎖に対し、少なくとも７０％配列同一性、少なくとも７５％配列同一性、少なくとも８０％配列同一性、少なくとも８５％配列同一性、少なくとも９０％配列同一性、少なくとも９５％配列同一性を共有する、または１００％配列同一性を共有する。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの標的化配列をコードするＤＮＡは、ＰＡＭ配列に対し３’にあるヌクレオチドの配列の反対の鎖に対し、少なくとも７０％配列同一性、少なくとも７５％配列同一性、少なくとも８０％配列同一性、少なくとも８５％配列同一性、少なくとも９０％配列同一性、少なくとも９５％配列同一性を共有する、または１００％配列同一性を共有する。一部の実施形態では、ＰＡＭ配列は、ＡＧＧ、ＣＧＧ、ＴＧＧ、ＧＧＧまたはＮＡＧである。一部の実施形態では、ＰＡＭ配列は、ＴＴＮ、ＴＣＮまたはＴＧＮである。
【０１８４】
一部の実施形態では、ｇＲＮＡの標的化配列をコードするＤＮＡは、ＰＡＭ配列に対し５’にあるヌクレオチドの配列の反対の鎖に対し相補的であり、目的の配列におけるＰＡＭ配列に対し５’にある配列に対し、少なくとも７０％相補的、少なくとも７５％相補的、少なくとも８０％相補的、少なくとも８５％相補的、少なくとも９０％相補的、少なくとも９５％相補的である、または１００％相補的である。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの標的化配列をコードするＤＮＡは、ＰＡＭ配列に対し５’にあるヌクレオチドの配列の反対の鎖に対し相補的であり、目的の配列上のＰＡＭ配列に対し３’にある配列に対し、少なくとも７０％相補的、少なくとも７５％相補的、少なくとも８０％相補的、少なくとも８５％相補的、少なくとも９０％相補的、少なくとも９５％相補的である、または１００％相補的である。一部の実施形態では、ＰＡＭ配列は、ＡＧＧ、ＣＧＧ、ＴＧＧ、ＧＧＧまたはＮＡＧである。一部の実施形態では、ＰＡＭ配列は、ＴＴＮ、ＴＣＮまたはＴＧＮである。
【０１８５】
異なるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、異なるＰＡＭ配列を認識する。ＰＡＭ配列は、標的化配列の５’または３’に位置することができる。例えば、Ｃａｓ９は、標的化配列の３’末端に直に位置するＮＧＧ  ＰＡＭを認識することができる。Ｃｐｆ１は、標的化配列の５’末端に直に位置するＴＴＮ  ＰＡＭを認識することができる。全てのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質によって認識される全てのＰＡＭ配列が、本発明の範囲内にあるものとして想定される。当業者には、いずれのＰＡＭ配列が、特定のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質と適合性であるか容易に明らかとなる。
【０１８６】
核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質
核酸ガイド化ヌクレアーゼ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）タンパク質結合配列を含むセグメントを含む、ｇＮＡおよびｇＮＡの収集物が、本明細書に提供される。核酸ガイド化ヌクレアーゼ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）タンパク質結合配列をコードするセグメントを含む、ｇＮＡをコードする核酸およびｇＮＡをコードする核酸の収集物も、本明細書に提供される。核酸ガイド化ヌクレアーゼ系は、ＲＮＡガイド化ヌクレアーゼ系であってよい。核酸ガイド化ヌクレアーゼ系は、ＤＮＡガイド化ヌクレアーゼ系であってよい。
【０１８７】
本開示の方法は、核酸ガイド化ヌクレアーゼを利用し得る。本明細書で使用する場合、「核酸ガイド化ヌクレアーゼ」は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを切断し、特異性を付与するために１つまたは複数の核酸ガイド核酸（ｇＮＡ）を使用する任意のヌクレアーゼである。核酸ガイド化ヌクレアーゼには、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質ならびに非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が含まれる。
【０１８８】
本明細書で提供される核酸ガイド化ヌクレアーゼは、ＤＮＡによって誘導されるＤＮＡヌクレアーゼ；ＤＮＡによって誘導されるＲＮＡヌクレアーゼ；ＲＮＡによって誘導されるＤＮＡヌクレアーゼ；またはＲＮＡによって誘導されるＲＮＡヌクレアーゼであってよい。ヌクレアーゼはエンドヌクレアーゼであり得る。ヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼであり得る。一実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼは、核酸ガイド化ＤＮＡエンドヌクレアーゼである。一実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼは、核酸ガイド化ＲＮＡエンドヌクレアーゼである。
【０１８９】
核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列は、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系の任意のタンパク質メンバーに結合する核酸配列である。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質結合配列は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の任意のタンパク質メンバーに結合する核酸配列である。
【０１９０】
一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼは、ＣＡＳクラスＩ  Ｉ型、ＣＡＳクラスＩ  ＩＩＩ型、ＣＡＳクラスＩ  ＩＶ型、ＣＡＳクラスＩＩ  ＩＩ型およびＣＡＳクラスＩＩ  Ｖ型からなる群から選択される。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ  Ｉ型系、ＣＲＩＳＰＲ  ＩＩ型系およびＣＲＩＳＰＲ  ＩＩＩ型系由来のタンパク質を含む。一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ〜ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２、Ｃｍ５、Ｃｓｆ１、Ｃ２ｃ２およびＮｇＡｇｏからなる群から選択される。
【０１９１】
一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質）は、任意の細菌または古細菌種由来であってよい。
一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質）は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｌａｒｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ  ｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ  ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｃｉｎｅｒｅａ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ  ｇｌｏｂｕｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｏｌｕｍｎａｒｅ、Ｆｌｕｖｉｉｃｏｌａ  ｔａｆｆｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｃｏｐｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｍｏｂｉｌｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ  ａｌｏｃｉｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｓｕｔｅｒｅｌｌａ  ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍまたはＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ由来の核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質）由来であるまたはこれに由来する。
【０１９２】
一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）タンパク質の例は、天然に存在するまたは操作されたバージョンであってよい。
【０１９３】
一部の実施形態では、天然に存在する核酸ガイド化ヌクレアーゼ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）タンパク質は、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ〜ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２およびＣｍ５を含む。斯かるタンパク質の操作されたバージョンを用いることもできる。
【０１９４】
一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）タンパク質の操作された例は、触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質を含む。用語「触媒活性がない」は一般に、失活したヌクレアーゼ（例えば、ＨＮＨおよびＲｕｖＣヌクレアーゼ）を有する核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質を指す。斯かるタンパク質は、任意の核酸における標的部位に結合することができる（標的部位が、ガイドＮＡによって決定される場合）が、このタンパク質は、標的核酸（例えば、二本鎖ＤＮＡ）を切断するまたはこれにニックを入れることができない。一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系の触媒活性がないタンパク質は、触媒活性がないＣａｓ９（ｄＣａｓ９）等、触媒活性がないＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質である。したがって、ｄＣａｓ９は、混合物を非結合核酸およびｄＣａｓ９結合断片へと分離することを可能にする。一実施形態では、ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体は、ｇＲＮＡ配列によって決定される標的に結合する。結合したｄＣａｓ９は、他のマニピュレーションを進める間、Ｃａｓ９による切断を防止することができる。別の実施形態では、ｄＣａｓ９は、トランスポサーゼ等、別の酵素に融合して、該酵素の活性を特異的部位へと標的化することができる。天然に存在する触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質を用いることもできる。
【０１９５】
一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）系タンパク質の操作された例は、核酸ガイド化ニッカーゼ（例えば、Ｃａｓニッカーゼ）も含む。核酸ガイド化ニッカーゼは、単一の不活性触媒ドメインを含有する、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質の改変バージョンを指す。一実施形態では、核酸ガイド化ニッカーゼは、Ｃａｓ９ニッカーゼ等、Ｃａｓニッカーゼである。Ｃａｓ９ニッカーゼは、単一の不活性触媒ドメイン、例えば、ＲｕｖＣ−またはＨＮＨ−ドメインのいずれかを含有することができる。１個のみの活性ヌクレアーゼドメインにより、Ｃａｓ９ニッカーゼは、標的ＤＮＡの一方の鎖のみを切断し、一本鎖切断または「ニック」を作製する。どちらの突然変異体が使用されるかに応じて、ガイドＮＡハイブリダイズ鎖または非ハイブリダイズ鎖を切断することができる。反対の鎖を標的とする２個のｇＮＡに結合した核酸ガイド化ニッカーゼは、標的二本鎖ＤＮＡに二本鎖切断を作製する。この「二重ニッカーゼ」戦略は、両方の核酸ガイド化ヌクレアーゼ／ｇＮＡ（例えば、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ）複合体が、二本鎖切断が形成される前に、部位に特異的に結合することを必要とするため、切断の特異性を増加させることができる。天然に存在するニッカーゼ核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質を用いることもできる。
【０１９６】
一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質の操作された例は、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系融合タンパク質も含む。例えば、核酸ガイド化ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）系タンパク質は、別のタンパク質、例えば、活性化因子、リプレッサー、ヌクレアーゼ、蛍光分子、放射性タグまたはトランスポサーゼに融合されてよい。
【０１９７】
一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列は、ｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）ステムループ配列を含む。
【０１９８】
異なるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、異なる核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列と適合性である。当業者には、いずれのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、いずれの核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列と適合性であるか容易に明らかとなる。
【０１９９】
一部の実施形態では、ｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）ステムループ配列をコードする二本鎖ＤＮＡ配列は、一方の鎖に次のＤＮＡ配列（５’＞３’、ＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴＴＴＴ）を、他方の鎖にその逆相補的ＤＮＡ（５’＞３’、ＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧＴＧＣＣＡＣＴＴＴＴＴＣＡＡＧＴＴＧＡＴＡＡＣＧＧＡＣＴＡＧＣＣＴＴＡＴＴＴＴＡＡＣＴＴＧＣＴＡＴＴＴＣＴＡＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣ）を含む。
【０２００】
一部の実施形態では、ｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）ステムループ配列をコードする一本鎖ＤＮＡ配列は、次のＤＮＡ配列：（５’＞３’、ＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧＴＧＣＣＡＣＴＴＴＴＴＣＡＡＧＴＴＧＡＴＡＡＣＧＧＡＣＴＡＧＣＣＴＴＡＴＴＴＴＡＡＣＴＴＧＣＴＡＴＴＴＣＴＡＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣ）を含み、この一本鎖ＤＮＡは、転写鋳型として働く。
【０２０１】
一部の実施形態では、ｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）ステムループ配列は、次のＲＮＡ配列：（５’＞３’、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ）を含む。
【０２０２】
一部の実施形態では、ｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）ステムループ配列をコードする二本鎖ＤＮＡ配列は、一方の鎖に次のＤＮＡ配列（５’＞３’、ＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＴＧＣＴＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴＴＴＴＣ）を、他方の鎖にその逆相補的ＤＮＡ（５’＞３’、ＧＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧＴＧＣＣＡＣＴＴＴＴＴＣＡＡＧＴＴＧＡＴＡＡＣＧＧＡＣＴＡＧＣＣＴＴＡＴＴＴＴＡＡＣＴＴＧＣＴＡＴＧＣＴＧＴＴＴＣＣＡＧＣＡＴＡＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣ）を含む。
【０２０３】
一部の実施形態では、ｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）ステムループ配列をコードする一本鎖ＤＮＡ配列は、次のＤＮＡ配列：（５’＞３’、ＧＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧＴＧＣＣＡＣＴＴＴＴＴＣＡＡＧＴＴＧＡＴＡＡＣＧＧＡＣＴＡＧＣＣＴＴＡＴＴＴＴＡＡＣＴＴＧＣＴＡＴＧＣＴＧＴＴＴＣＣＡＧＣＡＴＡＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣ）を含み、この一本鎖ＤＮＡは、転写鋳型として働く。
【０２０４】
一部の実施形態では、ｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）ステムループ配列は、次のＲＮＡ配列：（５’＞３’、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵＣ）を含む。
【０２０５】
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、Ｃｐｆ１タンパク質である。一部の実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ属の種またはＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属の種から単離されるまたはこれに由来する。一部の実施形態では、ｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質結合配列は、次のＲＮＡ配列を含む：（５’＞３’、ＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵＧＵＵＧＵＡＧＡＵ）。
【０２０６】
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、Ｃｐｆ１タンパク質である。一部の実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ属の種またはＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属の種から単離されるまたはこれに由来する。一部の実施形態では、ｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質結合配列をコードするＤＮＡ配列は、次のＤＮＡ配列を含む：（５’＞３’、ＡＡＴＴＴＣＴＡＣＴＧＴＴＧＴＡＧＡＴ）。一部の実施形態では、ＤＮＡは、一本鎖である。一部の実施形態では、ＤＮＡは、二本鎖である。
【０２０７】
一部の実施形態では、調節領域を含む第１のセグメントと；標的化配列をコードする第２のセグメントと；核酸ガイド化ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）系タンパク質結合配列をコードする核酸を含む第３のセグメントとを含むｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）をコードする核酸が、本明細書に提供されている。一部の実施形態では、第３のセグメントは、転写後に、ＮＡ（例えば、ＲＮＡ）ステムループ配列を生じる、単一の転写構成成分を含む。一部の実施形態では、ｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）ステムループ配列をコードする単一の転写構成成分を含む第３のセグメントは、二本鎖であり、一方の鎖に次のＤＮＡ配列（５’＞３’、ＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴＴＴＴ）を、他方の鎖にその逆相補的ＤＮＡ（５’＞３’、ＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧＴＧＣＣＡＣＴＴＴＴＴＣＡＡＧＴＴＧＡＴＡＡＣＧＧＡＣＴＡＧＣＣＴＴＡＴＴＴＴＡＡＣＴＴＧＣＴＡＴＴＴＣＴＡＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣ）を含む。一部の実施形態では、ｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）ステムループ配列をコードする単一の転写構成成分を含む第３のセグメントは、一本鎖であり、次のＤＮＡ配列：（５’＞３’、ＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧＴＧＣＣＡＣＴＴＴＴＴＣＡＡＧＴＴＧＡＴＡＡＣＧＧＡＣＴＡＧＣＣＴＴＡＴＴＴＴＡＡＣＴＴＧＣＴＡＴＴＴＣＴＡＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣ）を含み、この一本鎖ＤＮＡは、転写鋳型として働く。一部の実施形態では、単一の転写構成成分からの転写後に、その結果生じるｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）ステムループ配列は、次のＲＮＡ配列：（５’＞３’、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ）を含む。一部の実施形態では、ｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）ステムループ配列をコードする単一の転写構成成分を含む第３のセグメントは、二本鎖であり、一方の鎖に次のＤＮＡ配列（５’＞３’、ＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＴＧＣＴＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴＴＴＴＣ）を、他方の鎖にその逆相補的ＤＮＡ（５’＞３’、ＧＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧＴＧＣＣＡＣＴＴＴＴＴＣＡＡＧＴＴＧＡＴＡＡＣＧＧＡＣＴＡＧＣＣＴＴＡＴＴＴＴＡＡＣＴＴＧＣＴＡＴＧＣＴＧＴＴＴＣＣＡＧＣＡＴＡＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣ）を含む。一部の実施形態では、ｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）ステムループ配列をコードする単一の転写構成成分を含む第３のセグメントは、一本鎖であり、次のＤＮＡ配列：（５’＞３’、ＧＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧＴＧＣＣＡＣＴＴＴＴＴＣＡＡＧＴＴＧＡＴＡＡＣＧＧＡＣＴＡＧＣＣＴＴＡＴＴＴＴＡＡＣＴＴＧＣＴＡＴＧＣＴＧＴＴＴＣＣＡＧＣＡＴＡＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣ）を含み、この一本鎖ＤＮＡは、転写鋳型として働く。一部の実施形態では、単一の転写構成成分からの転写後に、生じたｇＲＮＡステムループ配列は、次のＲＮＡ配列：（５’＞３’、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵＣ）を含む。一部の実施形態では、第３のセグメントは、転写後のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡをコードする２個のサブセグメントを含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、認識部位（例えば、Ｎ２０配列）、およびｔｒａｃｒＲＮＡとハイブリダイズすることができる余分な配列を含まない。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡとハイブリダイズすることができる余分な配列を含む。一部の実施形態では、２個のサブセグメントは、独立して転写される。一部の実施形態では、２個のサブセグメントは、単一の単位として転写される。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡは、Ｎ標的ＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＴＧＣＴＧＴＴＴＴＧを含み、式中、Ｎ標的は、標的化配列を表す。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡは、配列、ＧＧＡＡＣＣＡＴＴＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴＴＴＴを含む。
【０２０８】
一部の実施形態では、調節領域を含む第１のセグメントと；標的化配列をコードする第２のセグメントと；核酸ガイド化ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）系タンパク質結合配列をコードする核酸を含む第３のセグメントとを含むｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）をコードする核酸が、本明細書に提供されている。一部の実施形態では、第３のセグメントは、転写後に、核酸ガイド化ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）系タンパク質に結合することができるｇＲＮＡステムループ配列を生じるＤＮＡ配列を含む。一実施形態では、ＤＮＡ配列は、二本鎖であってよい。一部の実施形態では、第３のセグメント二本鎖ＤＮＡは、一方の鎖に次のＤＮＡ配列（５’＞３’、ＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴＴＴＴ）を、他方の鎖にその逆相補的ＤＮＡ（５’＞３’、ＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧＴＧＣＣＡＣＴＴＴＴＴＣＡＡＧＴＴＧＡＴＡＡＣＧＧＡＣＴＡＧＣＣＴＴＡＴＴＴＴＡＡＣＴＴＧＣＴＡＴＴＴＣＴＡＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣ）を含む。一部の実施形態では、第３のセグメント二本鎖ＤＮＡは、一方の鎖に次のＤＮＡ配列（５’＞３’、ＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＴＧＣＴＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴＴＴＴＣ）を、他方の鎖にその逆相補的ＤＮＡ（５’＞３’、ＧＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧＴＧＣＣＡＣＴＴＴＴＴＣＡＡＧＴＴＧＡＴＡＡＣＧＧＡＣＴＡＧＣＣＴＴＡＴＴＴＴＡＡＣＴＴＧＣＴＡＴＧＣＴＧＴＴＴＣＣＡＧＣＡＴＡＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣ）を含む。一実施形態では、ＤＮＡ配列は、一本鎖であってよい。一部の実施形態では、第３のセグメント一本鎖ＤＮＡは、次のＤＮＡ配列（５’＞３’、ＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧＴＧＣＣＡＣＴＴＴＴＴＣＡＡＧＴＴＧＡＴＡＡＣＧＧＡＣＴＡＧＣＣＴＴＡＴＴＴＴＡＡＣＴＴＧＣＴＡＴＴＴＣＴＡＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣ）を含み、この一本鎖ＤＮＡは、転写鋳型として働く。一部の実施形態では、第３のセグメント一本鎖ＤＮＡは、次のＤＮＡ配列（５’＞３’、ＧＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧＴＧＣＣＡＣＴＴＴＴＴＣＡＡＧＴＴＧＡＴＡＡＣＧＧＡＣＴＡＧＣＣＴＴＡＴＴＴＴＡＡＣＴＴＧＣＴＡＴＧＣＴＧＴＴＴＣＣＡＧＣＡＴＡＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣ）を含み、この一本鎖ＤＮＡは、転写鋳型として働く。一部の実施形態では、第３のセグメントは、転写後に、第２のＲＮＡ配列とハイブリッドを形成することができる第１のＲＮＡ配列を生じるＤＮＡ配列を含み、このハイブリッドは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質結合が可能である。一部の実施形態では、第３のセグメントは、一方の鎖にＤＮＡ配列：（５’＞３’、ＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＴＧＣＴＧＴＴＴＴＧ）を、他方の鎖にその逆相補的ＤＮＡ配列：（５’＞３’、ＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＴＡＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣ）を含む二本鎖ＤＮＡである。一部の実施形態では、第３のセグメントは、（５’＞３’、ＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＴＡＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣ）のＤＮＡ配列を含む一本鎖ＤＮＡである。一部の実施形態では、第２のセグメントおよび第３のセグメントは共に、ｃｒＲＮＡ配列をコードする。一部の実施形態では、ｇＲＮＡをコードする核酸の第３のセグメントによってコードされる第１のＲＮＡ配列とハイブリッドを形成することができる第２のＲＮＡ配列は、ｔｒａｃｒＲＮＡである。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、配列（５’＞３’、ＧＧＡＡＣＣＡＵＵＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ）を含む。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、（５’＞３’、ＧＧＡＡＣＣＡＴＴＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴＴＴＴ）の配列を含む二本鎖ＤＮＡによってコードされ、任意選択で、その５’端において調節配列と融合される。一部の実施形態では、調節配列は、転写因子が結合し得る。一部の実施形態では、調節配列は、プロモーターである。一部の実施形態では、調節配列は、（５’＞３’、ＧＣＣＴＣＧＡＧＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＡＧ）の配列を含むＴ７プロモーターである。一部の実施形態では、Ｔ７プロモーターは、５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ−３’の配列を含む。一部の実施形態では、Ｔ７プロモーターは、５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−３’の配列を含む。
【０２０９】
一部の実施形態では、ｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）をコードする核酸であって、調節領域を含む第１のセグメントと、標的化配列をコードする第２のセグメントと、核酸ガイド化ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）系タンパク質結合配列をコードする核酸を含む第３のセグメントとを含む核酸が、本明細書に提供される。一部の実施形態では、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質がＣｐｆ１系タンパク質である実施形態では、第１、第２および第３のセグメントは、５’から３’に、第１のセグメント（調節領域）、第３のセグメント（核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列）および第２のセグメント（標的化配列）に配置される。一部の実施形態では、第３のセグメントは、転写後にＮＡ（例えば、ＲＮＡ）ステムループ配列を生じる、単一の転写される構成成分を含む。一部の実施形態では、ｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）ステムループ配列をコードする、単一の転写される構成成分を含む第３のセグメントは、二本鎖であり、次のＤＮＡ配列を一方の鎖に（５’＞３’、ＡＡＴＴＴＣＴＡＣＴＧＴＴＧＴＡＧＡＴ）、その逆相補的ＤＮＡを他方の鎖に（５’＞３’、ＡＴＣＴＡＣＡＡＣＡＧＴＡＧＡＡＡＴＴ）含む。一部の実施形態では、ｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）ステムループ配列をコードする、単一の転写される構成成分を含む第３のセグメントは、一本鎖であり、次のＤＮＡ配列：（５’＞３’、ＡＴＣＴＡＣＡＡＣＡＧＴＡＧＡＡＡＴＴ）を含み、一本鎖ＤＮＡは、転写鋳型として機能する。一部の実施形態では、単一の転写される構成成分からの転写後に、得られるｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）ステムループ配列は、次のＲＮＡ配列：（５’＞３’、ＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵＧＵＵＧＵＡＧＡＵ）を含む。
【０２１０】
一部の実施形態では、調節領域を含む第１のセグメントと；標的化配列をコードする第２のセグメントと；核酸ガイド化ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）系タンパク質結合配列をコードする核酸を含む第３のセグメントとを含むｇＮＡをコードする核酸が、本明細書に提供されている。一部の実施形態では、第３のセグメントは、転写後切断後に、第１のＲＮＡセグメントおよび第２のＲＮＡセグメントを生じる、ＲＮＡ配列をコードする。一部の実施形態では、第１のＲＮＡセグメントは、ｃｒＲＮＡを含み、第２のＲＮＡセグメントは、ｔｒａｃｒＲＮＡを含み、これらは、ハイブリッドを形成し、共に、核酸ガイド化ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）系タンパク質結合をもたらすことができる。一部の実施形態では、第３のセグメントは、第１のＲＮＡセグメントおよび第２のＲＮＡセグメントの転写単位の間にスペーサーをさらに含み、このスペーサーは、酵素切断部位を含む。
【０２１１】
一部の実施形態では、標的化配列を含む第１のＮＡセグメントと、核酸ガイド化ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）系タンパク質結合配列を含む第２のＮＡセグメントとを含むｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）が、本明細書に提供されている。一部の実施形態では、第１のセグメントのサイズは、３０ｂｐを超える。一部の実施形態では、第２のセグメントは、ｇＲＮＡステムループ配列を含む単一のセグメントを含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡステムループ配列は、次のＲＮＡ配列：（５’＞３’、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ）を含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡステムループ配列は、次のＲＮＡ配列：（５’＞３’、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵＣ）を含む。一部の実施形態では、第２のセグメントは、２個のサブセグメントを含み、第１のＲＮＡサブセグメント（ｃｒＲＮＡ）は第２のＲＮＡサブセグメント（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とハイブリッドを形成し、これらは共に、核酸ガイド化ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）系タンパク質結合を向けるように作用する。一部の実施形態では、第２のサブセグメントの配列は、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧを含む。一部の実施形態では、第１のＲＮＡセグメントおよび第２のＲＮＡセグメントは共に、ｃｒＲＮＡ配列を形成する。一部の実施形態では、第２のＲＮＡセグメントとハイブリッドを形成する他のＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡである。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、５’＞３’、ＧＧＡＡＣＣＡＵＵＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵの配列を含む。
【０２１２】
一部の実施形態では、標的化配列を含む第１のＮＡセグメントと、核酸ガイド化ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）系タンパク質結合配列を含む第２のＮＡセグメントとを含む、ｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）が、本明細書に提供される。一部の実施形態では、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質がＣｐｆ１系タンパク質である実施形態では、第２のセグメントは、第１のセグメントの５’にある。一部の実施形態では、第１のセグメントのサイズは、２０ｂｐである。一部の実施形態では、第１のセグメントのサイズは、２０ｂｐを超える。一部の実施形態では、第１のセグメントのサイズは、３０ｂｐを超える。一部の実施形態では、第２のセグメントは、ｇＲＮＡステムループ配列を含む単一のセグメントを含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡステムループ配列は、次のＲＮＡ配列を含む：（５’＞３’、ＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵＧＵＵＧＵＡＧＡＵ）。
【０２１３】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系核酸ガイド化ヌクレアーゼ
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、本明細書に提供されている実施形態において使用される。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ  Ｉ型系、ＣＲＩＳＰＲ  ＩＩ型系およびＣＲＩＳＰＲ  ＩＩＩ型系由来のタンパク質を含む。
【０２１４】
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、任意の細菌または古細菌種に由来し得る。
【０２１５】
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、単離される、組換えにより産生されるか、または合成による。
【０２１６】
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｌａｒｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ  ｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ  ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｃｉｎｅｒｅａ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ  ｇｌｏｂｕｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｏｌｕｍｎａｒｅ、Ｆｌｕｖｉｉｃｏｌａ  ｔａｆｆｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｃｏｐｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｍｏｂｉｌｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ  ａｌｏｃｉｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｓｕｔｅｒｅｌｌａ  ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍまたはＰｒｅｖｏｔｅｌｌａからであるか、またはこれらに由来するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質に由来する。
【０２１７】
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質の例は、天然に存在し得るか、または操作されたバージョンであってよい。
【０２１８】
一部の実施形態では、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、ＣＡＳクラスＩタイプＩ、ＩＩＩもしくはＩＶ、またはＣＡＳクラスＩＩタイプＩＩもしくはＶに属することができ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ〜ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２、Ｃｍｒ５、Ｃｓｆ１、Ｃ２ｃ２およびＣｐｆ１を含むことができる。
【０２１９】
例示的な実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、Ｃａｓ９を含む。
【０２２０】
例示的な実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、Ｃｐｆ１を含む。
【０２２１】
「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＮＡ複合体」は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質およびガイドＮＡ（例えば、ｇＲＮＡまたはｇＤＮＡ）を含む複合体を指す。ｇＮＡがｇＲＮＡである場合、ｇＲＮＡは２つの分子、すなわち標的とハイブリダイズし、配列特異性を提供する１つのＲＮＡ（「ｃｒＲＮＡ」）、およびｃｒＲＮＡとハイブリダイズすることが可能である１つのＲＮＡ「ｔｒａｃｒＲＮＡ」で構成することができる。あるいは、ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含有する単一の分子（すなわち、ｇＲＮＡ）であってよい。あるいは、ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ配列を含有する単一の分子（すなわち、ｇＲＮＡ）であってよい。
【０２２２】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質と少なくとも６０％同一（例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％または９０％同一、少なくとも９５％同一または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一）であってよい。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質の全ての機能、または、結合活性、ヌクレアーゼ活性およびヌクレアーゼ活性を含む機能のうち１つもしくは一部だけを有することができる。
【０２２３】
用語「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質関連ガイドＮＡ」は、ガイドＮＡを指す。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質関連ガイドＮＡは、単離されたＮＡとして、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＮＡ複合体の一部として存在することができる。
【０２２４】
Ｃａｓ９
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質、核酸ガイド化ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９であるかまたはそれを含む。本発明のＣａｓ９は、単離されるか、組換えで生成されるか、または合成のものであってよい。
【０２２５】
本明細書の実施形態において使用することができるＣａｓ９タンパク質の例は、Ｆ．Ａ．  Ｒａｎ、Ｌ．  Ｃｏｎｇ、Ｗ．Ｘ．  Ｙａｎ、Ｄ．  Ａ．  Ｓｃｏｔｔ、Ｊ．Ｓ．  Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ、Ａ．Ｊ．  Ｋｒｉｚ、Ｂ．  Ｚｅｔｓｃｈｅ、Ｏ．  Ｓｈａｌｅｍ、Ｘ．  Ｗｕ、Ｋ．Ｓ．  Ｍａｋａｒｏｖａ、Ｅ．Ｖ．  Ｋｏｏｎｉｎ、Ｐ．Ａ．  ＳｈａｒｐおよびＦ．  Ｚｈａｎｇ；「Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｃａｓ９」、Ｎａｔｕｒｅ５２０巻、１８６〜１９１頁（２０１５年４月９日）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１４２９９、に見出すことができ、それは参照により本明細書に組み込まれる。
【０２２６】
一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｌａｒｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ  ｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ  ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｃｉｎｅｒｅａ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ  ｇｌｏｂｕｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｏｌｕｍｎａｒｅ、Ｆｌｕｖｉｉｃｏｌａ  ｔａｆｆｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｃｏｐｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｍｏｂｉｌｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ  ａｌｏｃｉｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｓｕｔｅｒｅｌｌａ  ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓまたはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａに由来するＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系である。
【０２２７】
一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系であり、ＰＡＭ配列は、標的特異的ガイド配列の３’末端に直に位置するＮＧＧである。例示的な細菌種からのＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のＰＡＭ配列は、以下を含むこともできる：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＮＧＧ）、Ｓｔａｐｈ  ａｕｒｅｕｓ（ＮＮＧＲＲＴ）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（ＮＮＮＮＧＡ  ＴＴ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（ＮＮＡＧＡＡ）およびＴｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ（ＮＡＡＡＡＣ）、これらは全て本発明から逸脱することなく使用可能である。
【０２２８】
例示的な一実施形態では、Ｃａｓ９配列は、例えば、細菌で発現させ、組換え６Ｈｉｓタグ付きタンパク質を精製するために、ＰＣＲによって再増幅され、次にｐＥＴ３０（ＥＭＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから）にクローニングされる、ｐＸ３３０プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅから入手可能）から得ることができる。
【０２２９】
「Ｃａｓ９−ｇＮＡ複合体」は、Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＮＡを含む複合体を指す。Ｃａｓ９タンパク質は、野生型Ｃａｓ９タンパク質と、例えばＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９タンパク質と少なくとも６０％同一（例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または９０％同一、少なくとも９５％同一、または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一）であってよい。Ｃａｓ９タンパク質は、野生型Ｃａｓ９タンパク質の全ての機能、または、結合活性、ヌクレアーゼ活性およびヌクレアーゼ活性を含む機能のうち１つもしくは一部だけを有することができる。
【０２３０】
用語「Ｃａｓ９関連ガイドＮＡ」は、前記のようなガイドＮＡを指す。Ｃａｓ９関連ガイドＮＡは、単離されて、またはＣａｓ９−ｇＮＡ複合体の一部として存在することができる。
【０２３１】
非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の核酸ガイド化ヌクレアーゼ
【０２３２】
一部の実施形態では、非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、本明細書で提供される実施形態で使用される。
【０２３３】
一部の実施形態では、非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、任意の細菌または古細菌種からのものであってよい。
【０２３４】
一部の実施形態では、非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、単離されるか、組換えで生成されるか、または合成のものである。
【０２３５】
一部の実施形態では、非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｌａｒｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ  ｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ  ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｃｉｎｅｒｅａ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ  ｇｌｏｂｕｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｏｌｕｍｎａｒｅ、Ｆｌｕｖｉｉｃｏｌａ  ｔａｆｆｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｃｏｐｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｍｏｂｉｌｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ  ａｌｏｃｉｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｓｕｔｅｒｅｌｌａ  ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ、Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｒｅｇｏｒｙｉまたはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａからのものであるかまたはそれに由来する。
【０２３６】
一部の実施形態では、非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、天然に存在するものまたは操作されたバージョンであってよい。
【０２３７】
一部の実施形態では、天然に存在する非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、ＮｇＡｇｏ（Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｒｅｇｏｒｙｉからのアルゴノート）である。
【０２３８】
「非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＮＡ複合体」は、非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質およびガイドＮＡ（例えば、ｇＲＮＡまたはｇＤＮＡ）を含む複合体を指す。ｇＮＡがｇＲＮＡである場合、ｇＲＮＡは２つの分子、すなわち標的とハイブリダイズし、配列特異性を提供する１つのＲＮＡ（「ｃｒＲＮＡ」）、およびｃｒＲＮＡとハイブリダイズすることが可能である１つのＲＮＡ「ｔｒａｃｒＲＮＡ」で構成することができる。あるいは、ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含有する単一の分子（すなわち、ｇＲＮＡ）であってよい。
【０２３９】
非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、野生型非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質と少なくとも６０％同一（例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または９０％同一、少なくとも９５％同一、または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一）であってよい。非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、野生型非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質の全ての機能、または、結合活性、ヌクレアーゼ活性およびヌクレアーゼ活性を含む機能のうち１つもしくは一部だけを有することができる。
【０２４０】
用語「非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質関連ガイドＮＡ」は、ガイドＮＡを指す。非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質関連ガイドＮＡは、単離されたＮＡとして、または非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＮＡ複合体の一部として存在することができる。
【０２４１】
Ｃｐｆ１
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質核酸ガイド化ヌクレアーゼは、Ｃｐｆ１系タンパク質であるまたはこれを含む。本発明のＣｐｆ１系タンパク質は、単離することができる、組換えにより産生することができる、または合成による。
【０２４２】
Ｃｐｆ１系タンパク質は、クラスＩＩ、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ系タンパク質である。一部の実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓから単離されるまたはこれに由来する。一部の実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質は、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ科の細菌またはＰｒｅｖｏｔｅｌｌａから単離されるまたはこれに由来する。
【０２４３】
Ｃｐｆ１系タンパク質は、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列（例えば、ステムループ）および標的化配列を含むシングルガイドＲＮＡに結合する。Ｃｐｆ１標的化配列は、標的核酸におけるＣｐｆ１  ＰＡＭ配列の３’に直に位置する配列を含む。Ｃａｓ９とは異なり、Ｃｐｆ１核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列は、Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡにおける標的化配列の５’に位置する。Ｃｐｆ１は、標的核酸において平滑末端の切断ではなく互い違いの切断を生じることもできる。標的核酸へ向けたＣｐｆ１タンパク質−ｇＲＮＡタンパク質複合体の標的化後に、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ由来のＣｐｆ１は、例えば、互い違いの様式で標的核酸を切断し、標的化配列の３’末端においてＰＡＭから１８〜２３塩基離れた箇所で、およそ５ヌクレオチドの５’オーバーハングを生成する。対照的に、野生型Ｃａｓ９による切断は、Ｃａｓ９  ＰＡＭの３ヌクレオチド上流に平滑末端を産生する。
【０２４４】
例示的なＣｐｆ１  ｇＲＮＡステムループ配列は、次のＲＮＡ配列を含む：（５’＞３’、ＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵＧＵＵＧＵＡＧＡＵ）。
【０２４５】
「Ｃｐｆ１タンパク質−ｇＮＡ複合体」は、Ｃｐｆ１タンパク質およびガイドＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）を含む複合体を指す。ｇＮＡが、ｇＲＮＡである場合、ｇＲＮＡは、標的にハイブリダイズし、配列特異性をもたらす、単一分子、すなわち、１個のＲＮＡ（「ｃｒＲＮＡ」）で構成され得る。
【０２４６】
Ｃｐｆ１タンパク質は、野生型Ｃｐｆ１タンパク質と少なくとも６０％同一（例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは９０％同一、少なくとも９５％同一、または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一）であり得る。Ｃｐｆ１タンパク質は、結合活性およびヌクレアーゼ活性を含む、野生型Ｃｐｆ１タンパク質の機能の全てを、または機能の１種のみもしくは一部を有することができる。
【０２４７】
Ｃｐｆ１系タンパク質は、種々のＰＡＭ配列を認識する。Ｃｐｆ１系タンパク質によって認識される例示的なＰＡＭ配列として、ＴＴＮ、ＴＣＮおよびＴＧＮが挙げられるがこれらに限定されない。追加的なＣｐｆ１  ＰＡＭ配列として、ＴＴＴＮが挙げられるがこれに限定されない。Ｃｐｆ１  ＰＡＭ配列の特色の１つは、Ｃａｓ９タンパク質によって使用されるＮＧＧまたはＮＡＧ  ＰＡＭ配列よりも高いＡ／Ｔ含量を有することである。標的核酸、例えば、異なるゲノムは、そのパーセントＧ／Ｃ含量が異なる。例えば、ヒトマラリア寄生虫Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのゲノムは、Ａ／Ｔリッチであることが公知である。あるいは、ゲノム内のタンパク質コード配列は、高頻度で、ゲノム全体としてよりも高いＧ／Ｃ含量を有する。標的ゲノムにおけるＡ／ＴヌクレオチドのＧ／Ｃヌクレオチドに対する比は、当該ゲノムにおける所与のＰＡＭ配列の分布および頻度に影響を与える。例えば、Ａ／Ｔリッチゲノムは、より少ないＮＧＧまたはＮＡＧ配列を有することができる一方、Ｇ／Ｃリッチゲノムは、より少ないＴＴＮ配列を有することができる。Ｃｐｆ１系タンパク質は、当業者に利用できるＰＡＭ配列のレパートリーを拡大し、ｇＲＮＡライブラリーの優れた柔軟性および機能をもたらす。
【０２４８】
触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ
一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼの操作された例には、触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の核酸ガイド化ヌクレアーゼまたは非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の核酸ガイド化ヌクレアーゼ）が含まれる。用語「触媒活性がない」は、不活性化ヌクレアーゼ、例えば、不活性化ＨＮＨおよびＲｕｖＣヌクレアーゼを有する核酸ガイド化ヌクレアーゼを一般的に指す。そのようなタンパク質は任意の核酸中の標的部位に結合することができるが（標的部位はガイドＮＡによって決定される）、タンパク質は核酸を切断することもニックを入れることもできない。
【０２４９】
したがって、触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼは、未結合の核酸および触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼに結合した断片への混合物の分離を可能にする。例示的な一実施形態では、ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体はｇＲＮＡ配列によって決定される標的に結合する。ｄＣａｓ９結合はＣａｓ９による切断を阻止できるが、他の操作は進行する。
【０２５０】
別の実施形態では、触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼは、トランスポザーゼなどの別の酵素に融合させて、その酵素の活性を特異的部位に標的化させることができる。
【０２５１】
一部の実施形態では、触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼは、ｄＣａｓ９、ｄＣｐｆ１、ｄＣａｓ３、ｄＣａｓ８ａ〜ｃ、ｄＣａｓ１０、ｄＣｓｅ１、ｄＣｓｙ１、ｄＣｓｎ２、ｄＣａｓ４、ｄＣｓｍ２、ｄＣｍ５、ｄＣｓｆ１、ｄＣ２Ｃ２またはｄＮｇＡｇｏである。
【０２５２】
例示的な一実施形態では、触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼタンパク質は、ｄＣａｓ９である。
【０２５３】
核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼ
一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼの操作された例には、核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼ（ニッカーゼ−核酸ガイド化ヌクレアーゼと互換的に呼ばれる）が含まれる。
【０２５４】
一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼの操作された例には、単一の不活性触媒ドメインを含有する、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ニッカーゼまたは非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ニッカーゼが含まれる。
【０２５５】
一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼは、Ｃａｓ９ニッカーゼ、Ｃｐｆ１ニッカーゼ、Ｃａｓ３ニッカーゼ、Ｃａｓ８ａ〜ｃニッカーゼ、Ｃａｓ１０ニッカーゼ、Ｃｓｅ１ニッカーゼ、Ｃｓｙ１ニッカーゼ、Ｃｓｎ２ニッカーゼ、Ｃａｓ４ニッカーゼ、Ｃｓｍ２ニッカーゼ、Ｃｍ５ニッカーゼ、Ｃｓｆ１ニッカーゼ、Ｃ２Ｃ２ニッカーゼまたはＮｇＡｇｏニッカーゼである。
【０２５６】
一実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼは、Ｃａｓ９ニッカーゼである。
【０２５７】
一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼは、標的配列に結合するために使用することができる。１つの活性ヌクレアーゼドメインだけのため、核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼは、標的ＤＮＡの１本の鎖だけを切断し、一本鎖切断または「ニック」を生成する。どの変異体が使用されるかによって、ガイドＮＡとハイブリダイズした鎖またはハイブリダイズしていない鎖を切断することができる。反対側の鎖を標的にする２つのｇＮＡに結合した核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼは、核酸において二本鎖切断を起こすことができる。この「二重ニッカーゼ」戦略は、両方の核酸ガイド化ヌクレアーゼ／ｇＮＡ複合体が、二本鎖切断が形成される前の部位で特異的に結合することを必要とするので、切断特異性を増加させる。
【０２５８】
例示的な実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼは、標的配列に結合するために使用することができる。用語「Ｃａｓ９ニッカーゼ」は、単一の不活性触媒ドメイン、すなわち、ＲｕｖＣ−またはＨＮＨ−ドメインを含有する、Ｃａｓ９タンパク質の改変バージョンを指す。１つの活性ヌクレアーゼドメインだけのため、Ｃａｓ９ニッカーゼは、標的ＤＮＡの１本の鎖だけを切断し、一本鎖切断または「ニック」を生成する。どの変異体が使用されるかによって、ガイドＲＮＡとハイブリダイズした鎖またはハイブリダイズしていない鎖を切断することができる。反対側の鎖を標的にする２つのｇＲＮＡに結合したＣａｓ９ニッカーゼは、ＤＮＡにおいて二本鎖切断を起こす。この「二重ニッカーゼ」戦略は、両方のＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体が、二本鎖切断が形成される前の部位で特異的に結合することを必要とするので、切断特異性を増加することができる。
【０２５９】
ＤＮＡの捕捉は、核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼを使用して実行することができる。例示的な一実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼは二本鎖核酸の１本の鎖を切断し、二本鎖の領域はメチル化ヌクレオチドを含む。
【０２６０】
解離可能および耐熱性の核酸ガイド化ヌクレアーゼ
一部の実施形態では、耐熱性の核酸ガイド化ヌクレアーゼが本明細書で提供される方法で使用される（耐熱性のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の核酸ガイド化ヌクレアーゼまたは耐熱性の非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の核酸ガイド化ヌクレアーゼ）。そのような実施形態では、反応温度が上昇し、タンパク質の解離を誘導する。反応温度は低下し、さらなる切断された標的配列の生成を可能にする。一部の実施形態では、少なくとも７５℃で少なくとも１分の間維持されるとき、耐熱性の核酸ガイド化ヌクレアーゼは、少なくとも５０％の活性、少なくとも５５％の活性、少なくとも６０％の活性、少なくとも６５％の活性、少なくとも７０％の活性、少なくとも７５％の活性、少なくとも８０％の活性、少なくとも８５％の活性、少なくとも９０％の活性、少なくとも９５％の活性、少なくとも９６％の活性、少なくとも９７％の活性、少なくとも９８％の活性、少なくとも９９％の活性または１００％の活性を維持する。一部の実施形態では、耐熱性の核酸ガイド化ヌクレアーゼは、少なくとも７５℃で、少なくとも８０℃で、少なくとも８５℃で、少なくとも９０℃で、少なくとも９１℃で、少なくとも９２℃で、少なくとも９３℃で、少なくとも９４℃で、少なくとも９５℃、９６℃で、少なくとも９７℃で、少なくとも９８℃で、少なくとも９９℃で、または少なくとも１００℃で少なくとも１分の間維持されるとき、少なくとも５０％の活性を維持する。一部の実施形態では、耐熱性の核酸ガイド化ヌクレアーゼは、少なくとも７５℃で少なくとも１分、２分、３分、４分または５分の間維持されるとき、少なくとも５０％の活性を維持する。一部の実施形態では、耐熱性の核酸ガイド化ヌクレアーゼは、温度を上昇させ、２５℃〜５０℃に低下させたとき、少なくとも５０％の活性を維持する。一部の実施形態では、温度は、２５℃に、３０℃に、３５℃に、４０℃に、４５℃に、または５０℃に低下させられる。例示的な一実施形態では、耐熱性酵素は、９５℃で１分間の後に少なくとも９０％の活性を保持する。
【０２６１】
一部の実施形態では、耐熱性の核酸ガイド化ヌクレアーゼは、耐熱性Ｃａｓ９、耐熱性Ｃｐｆ１、耐熱性Ｃａｓ３、耐熱性Ｃａｓ８ａ〜ｃ、耐熱性Ｃａｓ１０、耐熱性Ｃｓｅ１、耐熱性Ｃｓｙ１、耐熱性Ｃｓｎ２、耐熱性Ｃａｓ４、耐熱性Ｃｓｍ２、耐熱性Ｃｍ５、耐熱性Ｃｓｆ１、耐熱性Ｃ２Ｃ２または耐熱性ＮｇＡｇｏである。
【０２６２】
一部の実施形態では、耐熱性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、耐熱性Ｃａｓ９である。
【０２６３】
耐熱性の核酸ガイド化ヌクレアーゼは、単離すること、例えば、高温菌Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓのゲノムにおける配列相同性によって同定することができる。核酸ガイド化ヌクレアーゼ遺伝子は、発現ベクターに次にクローニングすることができる。例示的な一実施形態では、耐熱性のＣａｓ９タンパク質は単離される。
【０２６４】
別の実施形態では、耐熱性の核酸ガイド化ヌクレアーゼは、非耐熱性の核酸ガイド化ヌクレアーゼのｉｎ  ｖｉｔｒｏ進化によって得ることができる。核酸ガイド化ヌクレアーゼの配列は、その耐熱性を改善するために変異誘発させられ得る。
【０２６５】
ｇＮＡの収集物を作製する方法
任意の供給源核酸（例えば、ＤＮＡ）からの多数の多様なｇＲＮＡ、ｇＮＡの収集物の生成を可能にする方法が、本明細書に提供される。本明細書に提供されている方法は、消化、ライゲーション、伸長、オーバーハングを埋めること、転写、逆転写、増幅を非限定的に含む、酵素による方法を用いることができる。
【０２６６】
一般に、本方法は、核酸（例えば、ＤＮＡ）を提供するステップと；ＰＡＭ配列由来の残っているヌクレオチド配列が残るような仕方で、核酸におけるＰＡＭ配列の部分で切断する第１の酵素（または第１の酵素の組合せ）を用いるステップと；ＰＡＭ配列を排除するための距離に制限酵素ＩＩＳ型部位（その認識モチーフの外側だがその近傍を切断する酵素）が位置しているアダプタをライゲートするステップと；第２のＩＩＳ型酵素（または第２の酵素の組合せ）を用いるステップであって、アダプタと共にＰＡＭ配列を排除するステップと；核酸ガイド化ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）系のタンパク質メンバーによって認識され得る配列、例えば、ｇＲＮＡステムループ配列を融合させるステップとを含むことができる。一部の実施形態では、ＰＡＭ配列由来の残っているヌクレオチド配列が残り、ＰＡＭ配列に対しすぐ接して５’にあるヌクレオチド配列が、単にＰＡＭ配列に対し５’にあるシトシンを有するものではなく、例えば、単にＣ／ＮＧＧまたはＣ／ＴＡＧ等であるものではなく、任意のプリンまたはピリミジンであり得るような仕方で、第１の酵素反応は、ＰＡＭ配列の部分を切断する。
【０２６７】
表１は、異なる制限酵素を使用して、任意の供給源核酸（例えば、ＤＮＡ）をｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）の収集物へと変換するための例示的な戦略／プロトコールを示す。
【表１】
2020524491.tif 000003
【０２６８】
表２は、異なる制限酵素を使用して、任意の供給源核酸（例えば、ＤＮＡ）をｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）の収集物へと変換するためのさらなる例示的な戦略／プロトコールを示す。
【表２】
2020524491.tif 000004
【０２６９】
本明細書に記載されている組成物および方法の例示的な適用は、図１、図２、図３、図４、図５および図６に提示されている。これらの図面は、ゲノムＤＮＡ（例えば、ヒトゲノムＤＮＡ）等、インプット核酸（例えば、ＤＮＡ）からｇＮＡライブラリー（例えば、ｇＲＮＡライブラリー）を構築する方法を含む、本発明の非限定的な例示的な実施形態を描写する。本明細書におけるプロトコールの多くは、例えば、ＣＣＤの相補的配列（「ＭＡＰ」部位）と共に、ＮＧＧまたはＨＧＧのＰＡＭ部位を参照しつつ記載されている。これらの例は、非限定的なものであり、様々な核酸ガイド化ヌクレアーゼのための他のＰＡＭ部位が企図される。同様に、本明細書における方法と共に記載される例示的な制限酵素は、他のＰＡＭ配列と適合性の他の制限酵素の代わりになることができる。
【０２７０】
図１において、出発材料は、断片化されたゲノムＤＮＡ（例えば、ヒト）または他の供給源ＤＮＡであってよい。このような断片は、ライブラリーを構築する前に平滑末端化される（１０１）。Ｔ７プロモーターアダプタが、平滑末端化されたＤＮＡ断片にライゲートされ（１０２）、次いでこれはＰＣＲ増幅される。次に、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩを使用して、ＣＣＤ配列に対しすぐ接して５’に、ＰＣＲ産物の一方の鎖にニックを生成する（１０３）。Ｔ７エンドヌクレアーゼＩは、反対の鎖において、ニックの１、２または３ｂｐ  ５’を切断する（１０４）。その結果生じるＤＮＡ断片は、ＤＮＡ断片の末端にＨＧＧ配列を残しつつ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端化される（１０５）。その結果生じるＤＮＡは、ビーズにおいて浄化および回収される。ＭｌｙＩ認識部位を保有するアダプタが、ＨＧＧ配列のすぐ接して３’に、平滑末端化されたＤＮＡ断片にライゲートされる（１０６）。ＭｌｙＩは、ＨＧＧ配列に対しすぐ接して５’に平滑末端切断を生成し、アダプタ配列と共にＨＧＧを除去する（１０７）。その結果生じるＤＮＡ断片は、再度ビーズにおいて浄化および回収される。次に、ｇＲＮＡステムループ配列が、ＭｌｙＩによって切断された平滑末端にライゲートされ、ヒトゲノムを網羅するｇＲＮＡライブラリーを形成する（１０８）。次に、このＤＮＡライブラリーは、ＰＣＲ増幅され、ビーズにおいて浄化され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写の準備が整う。
【０２７１】
図２において、出発材料は、インタクトなゲノムＤＮＡ（例えば、ヒト）または他の供給源ＤＮＡであってよい（２０１）。Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩおよびＴ７エンドヌクレアーゼＩを使用して、ヒトゲノムＤＮＡの各鎖にニックを生成し、より小型のＤＮＡ断片をもたらす（２０２）。２００〜６００ｂｐのＤＮＡ断片が、ビーズにおいてサイズ選択され、次いで、５’にＧＧオーバーハングを保有するＹ字型アダプタとライゲートされる。Ｙ字型アダプタの一方の鎖は、ＭｌｙＩ認識部位を含有し、他方の鎖は、突然変異したＭｌｙＩ部位およびＴ７プロモーター配列を含有する（２０３）。これらの特色のため、ＰＣＲ増幅後に、Ｔ７プロモーター配列は、ＨＧＧ配列の遠位端にあり、ＭｌｙＩ配列は、ＨＧＧの後端（rear end）にある（２０４）。ＭｌｙＩによる消化は、ＨＧＧ配列のすぐ接して５’に切断を生成する（２０５）。ＭｌｙＩは、ＨＧＧ配列に対しすぐ接して５’に平滑末端切断を生成し、アダプタ配列と共にＨＧＧを除去する（２０６）。次に、ｇＲＮＡステムループ配列が、ＭｌｙＩによって切断された平滑末端にライゲートされ、ヒトゲノムを網羅するｇＲＮＡライブラリーを形成する。次に、このＤＮＡライブラリーは、ＰＣＲ増幅され、ビーズにおいて浄化され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写の準備が整う。
【０２７２】
図３において、例えば、ニッキング酵素により、供給源ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ）にニックを入れることができる（３０１）。場合によっては、ニッキング酵素は、３個またはそれよりも少ない塩基の長さである認識部位を有することができる。場合によっては、ＣＣＤ（式中、Ｄは、Ｃ以外の塩基を表す）の配列を認識し、そこにニックを入れることができるＣｖｉＰＩＩが使用される。ニックは、ガイドＲＮＡ認識部位（例えば、Ｎ２０配列）を得るために使用され得る、配列（より太い線によって表す）を含有する領域を囲む近位であってよい。ニックが近位である場合、二本鎖切断が生じ、５’または３’オーバーハングをもたらすことができる（３０２）。これらのオーバーハングは、例えば、ポリメラーゼ（例えば、Ｔ４ポリメラーゼ）により修復され得る。場合によっては、例えば５’鎖がある場合、修復は、相補鎖の合成を含むことができる。場合によっては、例えば３’鎖がある場合、修復は、オーバーハングの除去を含むことができる。修復は、認識部位（例えば、Ｎ２０ガイド配列）と、ニック認識配列に相補的な配列（例えば、ＨＧＧ、式中、Ｈは、Ｇ以外の塩基を表す）を含む平滑末端をもたらすことができる。
【０２７３】
図４において、例えば、図３の終わりから続けて、所望の切断を可能にするために、アダプタの異なる組合せがＤＮＡにライゲートされ得る。この部位から３塩基対を切断するヌクレアーゼ酵素の認識部位を有するアダプタ（例えば、ＭｌｙＩ）が、ライゲートされてよく（４０１）、該部位における消化を使用して、ＨＧＧ配列等、余剰の配列を除去することができる（４０２）。この部位から２０塩基対を切断するヌクレアーゼの認識部位を有するアダプタ（例えば、ＭｍｅＩ）（４０３）。これらのアダプタは、後に第１の認識部位（例えば、ＢｓａＸＩ）を除去するためにこの部位から適正な数のヌクレオチドを切断するヌクレアーゼの第２の認識部位を含んでいてもよい。第１の酵素を使用して、２０ヌクレオチドを切り出し、これにより、認識部位（例えば、Ｎ２０配列）を維持することができる（４０４）。次に、プロモーターアダプタ（例えば、Ｔ７）を認識部位（例えば、Ｎ２０配列）の隣にライゲートすることができる（４０５）。次に、第２の認識部位（例えば、ＢｓａＸＩ）に対応するヌクレアーゼを使用して、２０ヌクレオチドを切断する部位のためのアダプタを除去することができる（例えば、ＭｍｅＩ）（４０６）。最後に、ガイドＲＮＡステムループ配列アダプタは、認識部位（例えば、Ｎ２０配列）にライゲートして（４０７）、ガイドＲＮＡ生成に備えることができる。
【０２７４】
あるいは、図５に示すプロトコールは、図３に示すもの等のプロトコールの終わりに続くことができる。この部位から２５ヌクレオチドを切断するヌクレアーゼ酵素の認識部位を有するアダプタ（例えば、ＭｍｅＩまたはＥｃｏＰ１５Ｉ）を、ＤＮＡにライゲートすることができる（５０１）。このようなアダプタは、後に第１の認識部位（例えば、ＦｏｋＩまたはＢａｅＩ）およびＨＧＧ等の任意の他の余剰の配列を除去するためにこの部位から適正な数（またはそれより多く）のヌクレオチドを切断するヌクレアーゼの第２の認識部位を含んでいてもよい。次に、第１の認識部位（例えば、ＭｍｅＩまたはＥｃｏＰ１５Ｉ）に対応する酵素を使用して、認識部位（例えば、Ｎ２０配列）の後を切断することができる（５０２）。次に、プロモーターアダプタ（例えば、Ｔ７）を、認識部位（例えば、Ｎ２０配列）の隣にライゲートすることができる（５０３）。次に、第２の認識部位（例えば、ＦｏｋＩまたはＢａｅＩ）に対応する酵素を使用して、認識部位および残っている任意の配列（例えば、ＨＧＧ）を除去することができる（５０４）。最後に、ガイドＲＮＡステムループ配列アダプタを、認識部位（例えば、Ｎ２０配列）にライゲートすることができる（例えば、一本鎖ライゲーションによって）（５０５）。
【０２７５】
図３に示すもの等のプロトコールの代替として、図６に示すプロトコールを、図４または図５に示すもの等のプロトコールの調製において使用することができる。ニッキング酵素（例えば、ＣｖｉＰＩＩ）によってニックを導入することができる（６０１）。場合によっては、ニック認識部位は、３個またはそれよりも少ない塩基の長さである。場合によっては、ＣＣＤの配列を認識し、そこにニックを入れることができるＣｖｉＰＩＩが使用される。次に、ポリメラーゼ（例えば、Ｂｓｔ大断片ＤＮＡポリメラーゼ）を使用して、古い鎖を置換しつつ、ニックから開始する新しいＤＮＡ鎖を合成することができる（６０２）。ＤＮＡ合成により、ニックが塞がれ、再度ニックを入れるために利用することができる（６０３）。ニッキングおよび合成のその後のサイクルを使用して、大量の標的配列を得ることができる（６０４）。例えば、ランダムプライミングおよび伸長によって、標的配列のこれらの一本鎖コピーを二本鎖にすることができる。次に、図４または図５に示すもの等、本明細書に開示されている方法によって、認識部位（例えば、Ｎ２０配列を含むこれらの二本鎖核酸をさらに処理することができる。
【０２７６】
図３または図６に示すもの等のプロトコールの別の代替として、図７に示すプロトコールを、図４または図５に示すもの等のプロトコールの調製において使用することができる。ニッキング酵素（例えば、ＣｖｉＰＩＩ）によってニックを導入することができる（７０１）。場合によっては、ニッキング酵素認識部位は、３個またはそれよりも少ない塩基の長さである。場合によっては、ＣＣＤの配列を認識し、そこにニックを入れることができるＣｖｉＰＩＩが使用される。次に、ポリメラーゼ（例えば、Ｂｓｔ大断片ＤＮＡポリメラーゼ）を使用して、古い鎖を置換しつつ、ニックから開始する新しいＤＮＡ鎖を合成することができる（例えば、ニッキングエンドヌクレアーゼ媒介性鎖置換ＤＮＡ増幅（ＮＥＭＤＡ））。反応パラメータを調整して、生成される一本鎖ＤＮＡのサイズを制御することができる。例えば、ニッカーゼ：ポリメラーゼ比（例えば、ＣｖｉＰＩＩ：Ｂｔｓ大断片ポリメラーゼ比）を調整することができる。反応温度を調整することもできる。次に、プロモーター（例えば、Ｔ７プロモーター）（７０２）に続いてランダムｎ−ｍｅｒ（例えば、ランダム６−ｍｅｒ、ランダム８−ｍｅｒ）（７０３）を（５’＞３’方向で）有するオリゴヌクレオチドを付加することができる（７０４）。ランダムｎ−ｍｅｒ領域は、以前に生成された一本鎖ＤＮＡの領域に結合することができる。例えば、結合は、高温で変性させ、続いて急速にクールダウンさせることにより行うことができ、これにより、ランダムｎ−ｍｅｒ領域に、ＮＥＭＤＡによって生成された一本鎖ＤＮＡに結合させることができる。場合によっては、ＤＮＡは、９８℃で７分間変性され、次いで１０℃まで急速にクールダウンされる。伸長および／または増幅を使用して、二本鎖ＤＮＡを生成することができる。例えば、酵素により（例えば、２０℃におけるＤＮＡポリメラーゼＩ処理によって）、平滑末端を生成することができる。これは、プロモーター（例えば、Ｔ７プロモーター）で終わる一端と、任意のニッキング酵素認識部位（例えば、任意のＣＣＤ部位）で終わる他端とをもたらすことができる。次に、例えば、サイズ選択（例えば、ゲル精製、キャピラリー電気泳動または他の断片分離技法による）によって、このような断片を精製することができる。場合によっては、標的断片は、約５０塩基対の長さである（アダプタ配列（例えば、Ｔ７アダプタ）＋標的認識（例えば、Ｎ２０）配列＋ニッキング酵素認識部位または相補体（例えば、ＨＧＧ））。次に、断片は、適切な距離を切断してニッキング酵素認識部位を除去するヌクレアーゼのヌクレアーゼ認識部位を含むアダプタにライゲートすることができる（７０５）。例えば、３ヌクレオチド長のニッキング酵素認識部位（例えば、ＣｖｉＰＩＩのＣＣＤ）のため、ＢａｅＩを使用することができる。ＦｏｋＩ等、認識部位から少し遠く離れた箇所で切断する制限酵素を使用することもできる。次に、適切なヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩまたはＢａｅＩ）を使用して、ヌクレアーゼ認識部位およびニッキング酵素認識部位を除去することができる（７０６）。次に、残る核酸配列（例えば、認識部位）は、ガイドＲＮＡのための最終ステムループ配列にライゲートすることができる（７０７）。増幅（例えば、ＰＣＲ）を行うことができる。ガイドＲＮＡを生成することができる。
【０２７７】
図８Ａ、図８Ｂ、図８Ｃおよび図８Ｄは、インプット核酸（例えば、ＤＮＡ）、例えばゲノムＤＮＡ（例えば、ヒトゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ等から逆転写されたｃＤＮＡ）からｇＮＡライブラリー（例えば、ｇＲＮＡライブラリー）を構築するための追加的な技法を示す。
【０２７８】
図８Ａは、剪断されたゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡ等、核酸断片８０１から始まるプロトコールを示す。次いで、プライマー８０２をＧＧＨ位置または他のＰＡＭ部位にハイブリダイズさせることができる。プライマーは、配列、ＭＡＰ−認識−制限−プロモーターを含むことができ、ＭＡＰは、核酸ガイド化ヌクレアーゼのＰＡＭ部位に対する相補体を表し、認識は、核酸ガイド化ヌクレアーゼの認識部位を表し、制限は、制限酵素認識部位を表し、プロモーターは、プロモーター部位を表す。核酸ガイド化ヌクレアーゼの認識部位は、所与の核酸ガイド化ヌクレアーゼにとって適切な長さ（例えば、約１５〜約２５ヌクレオチドの間、場合によっては、２０ヌクレオチド）であり得る。一例では、プライマーは、配列、ＣＣＤＮ（１７）＋ＮＮＮ−Ｒｅｓｔ−Ｔ７またはその相補体を含むことができ、ＣＣＤは、ＭＡＰ部位を表し、＋は、改変された核酸結合を表し、Ｒｅｓｔは、適切な制限部位を表し、Ｔ７は、Ｔ７プロモーター部位または他の適切なプロモーター部位を表す。Ｎ核酸配列は、ランダムに生成することができ、各プライマーは、そのランダムＮ−ｍｅｒセグメントとマッチする配列を含む核酸断片にハイブリダイズする。改変された核酸の位置は、プライマー内で変動することができ、２個以上の改変された核酸部位を使用することができる。改変された核酸は、ロックド核酸（ＬＮＡ）、架橋された核酸（ＢＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ジップ（zip）核酸（ＺＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、および結合特異性または感受性が増加した改変された核酸等の他の改変された核酸を含むことができる。次いで、伸長反応８０３を行って、プライマーを伸長させ８０４、核酸断片に相補的な配列を取り込むことができる。次いで、鎖置換ポリメラーゼによりリバースプライミング８０５を行い、リバースプライマー８０６を伸長させて、例えば、制限酵素認識部位およびＴ７（または他のプロモーター）部位を含む第１のプライマーに相補的な配列８０７を取り込むことができる。リバースプライマーは、配列、Ｎ（６〜８）ＧＧＨを含むことができる。リバースプライマーの長さは、断片の末端における制限酵素（例えば、ＭｍｅＩ）活性に依存することができる。次いで、これらの産物をさらに処理して、本明細書に記述される通り、例えば、図４または図７に関して記述される通り、ガイド核酸（例えば、ｇＲＮＡ）を産生することができる。
【０２７９】
図８Ｂは、剪断されたゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡ等、核酸断片８１０から始まるプロトコールを示す。次いで、プライマー８１１をＧＧＨ位置または他のＰＡＭ部位にハイブリダイズさせることができる。プライマーは、配列、ＭＡＰ−認識−プロモーターを含むことができ、ＭＡＰは、核酸ガイド化ヌクレアーゼのＰＡＭ部位に対する相補体を表し、認識は、核酸ガイド化ヌクレアーゼの認識部位を表し、プロモーターは、プロモーター部位を表す。核酸ガイド化ヌクレアーゼの認識部位は、所与の核酸ガイド化ヌクレアーゼにとって適切な長さ（例えば、約１５〜約２５ヌクレオチドの間、場合によっては、２０ヌクレオチド）であり得る。一例では、プライマーは、配列、ＣＣＤＮ＊Ｎ（１６）＋Ｎ（３）−Ｔ７＊Ｎまたはその相補体を含むことができ、＋は、改変された核酸結合を表し、＊は、ホスホロチオエート（ＰＴＯ）核酸結合を表し、Ｔ７は、Ｔ７プロモーター部位または他の適切なプロモーター部位を表す。一例では、プライマーは、配列、ＣＣＤＨ＊Ｈ（４）Ｎ（１２）＋Ｎ（３）−Ｔ７＊Ｎを含むことができる。改変された核酸は、ロックド核酸（ＬＮＡ）、架橋された核酸（ＢＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ジップ核酸（ＺＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、および結合特異性または感受性が増加した改変された核酸等の他の改変された核酸を含むことができる。企図されるプライマー変種は、さらに改変されたおよび／またはＰＴＯ核酸を含むことができる。ＰＴＯの使用は、エキソヌクレアーゼによる分解から目的の産物（例えば、ガイド核酸）を保護することができる。次いで、プライマーを伸長させて８１２、核酸断片に相補的な配列８１３を取り込むことができる。場合によっては、伸長は、その後の精製のために、標識されたヌクレオチド（例えば、ビオチン化ウラシル）を使用して行うことができる。次に、伸長していないまたは結合していないプライマーを除去することができる８１４。場合によっては、プライマーは、標識を取り込んでいる伸長産物を捕捉することにより除去することができる（例えば、ビオチン化ヌクレオチドを捕捉するためにストレプトアビジンを使用して）。場合によっては、プライマーは、サイズ選択によって除去することができる（例えば、電気泳動、固相可逆的固定化（ＳＰＲＩ）ビーズ）。場合によっては、プライマーは、捕捉およびサイズ選択等、方法の組合せによって除去することができる。次に、核酸は、ＣｖｉＰＩＩ酵素等によりニッキングし、一本鎖エキソヌクレアーゼ（例えば、５’から３’エキソヌクレアーゼおよび３’から５’エキソヌクレアーゼの両方）等により消化することができる８１５。この操作は、核酸断片におけるＧＧＨ部位または他のＰＡＭ部位に隣接する配列に相補的な配列と共に、Ｔ７部位または他の適切なプロモーター部位を含むことができる、一本鎖産物８１６を後に残すことができる。次に、ライゲーション８１７を使用して、３’ブロックを有する５’ステムループ８１８を一本鎖産物にライゲーションすることができる。次いで、これらの産物を転写して（例えば、Ｔ７部位または他の適切なプロモーター部位を使用して）、ガイド核酸（例えば、ｇＲＮＡ）を産生することができる。
【０２８０】
図８Ｃは、剪断されたゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡ等、核酸断片８２０から始まるプロトコールを示す。次いで、プライマー８２１を、図中に「ＭＡＰ」で示される、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に相補的な位置にハイブリダイズさせることができる。プライマーは、配列、ＰＡＭ−認識−プロモーターを含むことができ、ＰＡＭは、核酸ガイド化ヌクレアーゼのＰＡＭ部位を表し、認識は、核酸ガイド化ヌクレアーゼの認識部位を表し、プロモーターは、プロモーター部位を表す。核酸ガイド化ヌクレアーゼの認識部位は、所与の核酸ガイド化ヌクレアーゼにとって適切な長さ（例えば、約１５〜約２５ヌクレオチドの間、場合によっては、２０ヌクレオチド）であり得る。一例では、プライマーは、配列、ＰＡＭ−Ｎ＊Ｎ（１６）＋Ｎ（３）−Ｔ７＊Ｎまたはその相補体を含むことができ、＋は、改変された核酸結合を表し、＊は、ホスホロチオエート（ＰＴＯ）核酸結合を表し、ＰＡＭは、プロトスペーサー隣接モチーフを表し、Ｔ７は、Ｔ７部位または他の適切なプロモーター部位を表す。改変された核酸は、ロックド核酸（ＬＮＡ）、架橋された核酸（ＢＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ジップ核酸（ＺＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、および結合特異性または感受性が増加した改変された核酸等の他の改変された核酸を含むことができる。一例では、プライマーは、配列、ＰＡＭ−Ｈ＊Ｈ（４）Ｎ（１２）＋Ｎ（３）−Ｔ７＊Ｎを含むことができる。Ｈ＊Ｈ領域は、非ＰＡＭ配列によって置き換えることもできる。企図されるプライマー変種は、さらに改変されたおよび／またはＰＴＯ核酸結合を含むことができる。企図されるプライマー変種は、異なる長さのランダムヌクレオチド（例えば、約１５〜約２５ヌクレオチドの間）も含む。次いで、プライマーを伸長させて８２２、核酸断片に相補的な配列８２３を取り込むことができる。場合によっては、伸長は、その後の精製のために、標識されたヌクレオチド（例えば、ビオチン化ウラシル）を使用して行うことができる。次に、伸長していないまたは結合していないプライマーを除去することができる８２４。場合によっては、プライマーは、標識を取り込んでいる伸長産物を捕捉することにより除去することができる（例えば、ビオチン化ヌクレオチドを捕捉するためにストレプトアビジンを使用して）。場合によっては、プライマーは、サイズ選択によって除去することができる（例えば、電気泳動、固相可逆的固定化（ＳＰＲＩ）ビーズ）。次に、核酸は、ＣｖｉＰＩＩ酵素またはウラシル特異的切除酵素（例えば、ＵＳＥＲまたはウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ））等によりニッキングし、一本鎖エキソヌクレアーゼ（例えば、５’から３’エキソヌクレアーゼおよび３’から５’エキソヌクレアーゼの両方）等により消化することができる８２５。この操作は、核酸断片におけるＧＧＨ部位または他のＰＡＭ部位に隣接する配列に相補的な配列と共に、Ｔ７部位または他の適切なプロモーター部位を含むことができる、一本鎖産物８２６を後に残すことができる。次に、ライゲーション８２７を使用して、３’ブロックを有する５’ステムループ８２８を一本鎖産物にライゲーションすることができる。次いで、これらの産物を転写して（例えば、Ｔ７部位または他の適切なプロモーター部位を使用して）、ガイド核酸（例えば、ｇＲＮＡ）を産生することができる。
【０２８１】
図８Ｄは、剪断されたゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡ等、核酸断片８３０から始まるプロトコールを示す。次いで、プライマー８３１を、図中に「ＭＡＰ」で示される、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に相補的な位置にハイブリダイズさせることができる。プライマーは、配列、ＰＡＭ−認識−プロモーターを含むことができ、ＰＡＭは、核酸ガイド化ヌクレアーゼのＰＡＭ部位を表し、認識は、核酸ガイド化ヌクレアーゼの認識部位を表し、プロモーターは、プロモーター部位を表す。核酸ガイド化ヌクレアーゼの認識部位は、所与の核酸ガイド化ヌクレアーゼにとって適切な長さ（例えば、約１５〜約２５ヌクレオチドの間、場合によっては、２０ヌクレオチド）であり得る。一例では、プライマーは、配列、ＰＡＭ−Ｎ＊Ｎ（１６）＋Ｎ（３）−Ｔ７＊Ｎまたはその相補体を含むことができ、＋は、改変された核酸結合を表し、＊は、ホスホロチオエート（ＰＴＯ）核酸結合を表し、ＰＡＭは、プロトスペーサー隣接モチーフを表し、Ｔ７は、Ｔ７部位または他の適切なプロモーター部位を表す。改変された核酸は、ロックド核酸（ＬＮＡ）、架橋された核酸（ＢＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ジップ核酸（ＺＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、および結合特異性または感受性が増加した改変された核酸等の他の改変された核酸を含むことができる。一例では、プライマーは、配列、ＰＡＭ−Ｈ＊Ｈ（４）Ｎ（１２）＋Ｎ（３）−Ｔ７＊Ｎを含むことができる。企図されるプライマー変種は、さらに改変されたおよび／またはＰＴＯ核酸結合を含むことができる。次いで、プライマーを伸長させて８３２、核酸断片に相補的な配列８３３を取り込むことができる。場合によっては、伸長は、その後の精製のために、標識されたヌクレオチド（例えば、ビオチン化ウラシル）を使用して行うことができる。次に、伸長していないまたは結合していないプライマーを除去することができる８３４。場合によっては、プライマーは、標識を取り込んでいる伸長産物を捕捉することにより除去することができる（例えば、ビオチン化ヌクレオチドを捕捉するためにストレプトアビジンを使用して）。場合によっては、プライマーは、サイズ選択によって除去することができる（例えば、電気泳動、固相可逆的固定化（ＳＰＲＩ）ビーズ）。次に、核酸は、ＣｖｉＰＩＩ酵素またはウラシル特異的切除酵素（例えば、ＵＳＥＲまたはウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ））等によりニッキングし、一本鎖エキソヌクレアーゼ（例えば、５’から３’エキソヌクレアーゼおよび３’から５’エキソヌクレアーゼの両方）等により消化することができる３３５。この操作は、核酸断片におけるＧＧＨ部位または他のＰＡＭ部位に隣接する配列に相補的な配列と共に、Ｔ７部位または他の適切なプロモーター部位を含むことができる、一本鎖産物８３６を後に残すことができる。次に、ライゲーション８３７を使用して、３’ブロックを有する５’ステムループ８２８を一本鎖産物にライゲーションすることができる。互い違いになっている二本鎖ステムループ８３９を付加することもできる。ステムループの末端Ｄ−Ｄは、Ｈ＊Ｈ領域に相補的な配列またはＰＡＭ配列に相補的な配列を含むことができる。次いで、これらの産物を転写して（例えば、Ｔ７部位または他の適切なプロモーター部位を使用して）、ガイド核酸（例えば、ｇＲＮＡ）を産生することができる。
【０２８２】
図９Ａおよび図９Ｂは、インプット核酸（例えば、ＤＮＡ）、例えばゲノムＤＮＡ（例えば、ヒトゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ等から逆転写されたｃＤＮＡ）からｇＮＡライブラリー（例えば、ｇＲＮＡライブラリー）を構築するための追加的な技法を示す。プロトコールは、剪断されたゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡ等、核酸断片９０１から始まることができ、これは、末端に環状アダプタがライゲーションされて、環状核酸を形成する。環状アダプタは、Ｔ７プロモーター部位または他の適切なプロモーター部位等、プロモーター部位を含むことができる。次いで、核酸は、例えば、ＣｖｉＰＩＩを使用して、ニッキングすることができる９０２。近傍のニックは、二本鎖切断を生じることができ、これは次いで、平滑末端化することができる（例えば、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼを使用して）。産物９０３の平滑末端は、ＨＧＧ／ＧＧＨ配列（または他のＰＡＭ部位）またはそれらの相補体（例えば、ＭＡＰ部位）を有することができる。環状アダプタ９０５を、産物の末端にライゲーションすることができる９０４。この環状アダプタは、ガイド核酸ステムループ配列に相補的な配列、１個または複数の制限部位（例えば、Ｎｔ．ＡｌｗＩ部位）を含むことができ、１個または複数のウラシルヌクレオチドを含有することができる。次いで、この産物は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）およびＤＮＡグリコシラーゼ−リアーゼエンドヌクレアーゼＶＩＩＩ等、ウラシル特異的切除酵素で処理して、Ｕ残基を除去し、その前および後に切断を生じることができる９０７。Ｎｔ．ＡｌｗＩによる処理を使用して、ＣＣＤモチーフまたは他のＭＡＰ部位の下流にニック９０８を導入することができる。次いで、ガイド核酸ステムループ配列に相補的な配列が、ガイド核酸９１０の認識領域（例えば、Ｎ２０領域）のための相補体の直接上流にライゲーションされるように、産物をライゲーションすることができる９０９（例えば、ＣｉｒｃＩＩＬｉｇａｓｅ等、環状リガーゼを使用して）。図９Ｂへと続き、次いで、産物は、プライマー９１４により、例えば、プロモーター部位（例えば、Ｔ７部位または他の適切なプロモーター部位）において、プライミングすることができる９１３。次いで、産物は、例えば、ローリングサークル増幅を使用して増幅することができる９１５。増幅は、Ｐｈｉ２９ポリメラーゼ等、ポリメラーゼにより行うことができる。増幅は、ガイド核酸のプロモーター部位、認識部位領域およびステムループ領域の多くの一本鎖コンカテマーを産生することができる。プロモーター−認識部位−ステムループ配列は、例えば、配列に対して５’および３’に位置する制限部位を使用して、いずれかの隣接配列から切除することができる９１７。これらのプロモーター−認識部位−ステムループ配列９１８の各々を、ガイド核酸前駆体として使用することができる。
【０２８３】
一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）標的配列を含む、核酸ガイド化ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）タンパク質を方向付けるために使用することができる、ヒトミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）を標的とするｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）の収集物が生成される。一部の実施形態では、このｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）の収集物の標的化配列は、表３の最右列に示される少なくとも２０ｎｔ配列を含むＤＮＡ配列によってコードされる（例えば、ＮＧＧ配列がマイナス鎖にある場合）。一部の実施形態では、ヒトミトコンドリアＤＮＡに対する特異性を有する、本明細書に提供されるｇＲＮＡ核酸の収集物は、複数のメンバーを含み、メンバーは、表３の最右列に示される複数の標的化配列を含む。
【表３】
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【０２８４】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系エンドヌクレアーゼと共に使用することができるいずれかの供給源核酸（例えば、ＤＮＡ）から多数の多様なｇＲＮＡ、ｇＮＡの収集物の生成を可能にする方法が、本明細書に提供される。３’核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列および５’標的化配列を有するｇＲＮＡの収集物の効率的合成のための一部の方法は、セグメントの当該配置を有するｇＮＡに特異的であり得る。５’核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列および３’標的化配列を有するｇＲＮＡの収集物の合成のための方法が、本明細書に提供される。５’核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列および３’標的化配列を有するｇＲＮＡと適合性の、あらゆるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼが、本開示の方法の範囲内として想定される。
【０２８５】
本明細書に提供される方法は、消化、ライゲーション、伸長、オーバーハングフィリング、転写、逆転写、増幅が挙げられるがこれらに限定されない、酵素による方法を用いることができる。
【０２８６】
いくつかの戦略が用いられる。一実施形態では、方法は、核酸（例えば、ＤＮＡ）を提供するステップと、ＰＡＭ配列由来の残渣ヌクレオチド配列が残される仕方で、核酸におけるＰＡＭ配列の一部で切断する第１の酵素（または第１の酵素の組合せ）を用いるステップと、ＰＡＭ配列を排除する距離に制限酵素ＩＩＳ型部位（その認識モチーフの外側であるがその近傍を切断する酵素）を配置するアダプタをライゲーションするステップと、第２のＩＩＳ型酵素（または第２の酵素の組合せ）を用いて、アダプタと共にＰＡＭ配列を排除するステップと、核酸ガイド化ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）系のタンパク質メンバーによって認識され得る配列、例えば、ｇＲＮＡステムループ配列を融合するステップとを含むことができる。一部の実施形態では、第１の酵素反応は、ＰＡＭ配列由来の残渣ヌクレオチド配列が残され、ＰＡＭ配列に対して直接３’にあるヌクレオチド配列が任意のプリンまたはピリミジンとなり得る仕方で、ＰＡＭ配列の一部を切断する。提供される核酸（例えば、ＤＮＡ）を、Ｃｐｆ１  ＰＡＭ部位で特異的に断片化するための代替戦略は、アデニンをイノシンにまたはチミジンをウラシルに置き換えるステップと、次いで、脱塩基またはミスマッチした部位で切断するステップに続いて、上に概要を述べる追加的なステップを行うステップを含む。
【０２８７】
追加的な代替法として、提供される核酸（例えば、ＤＮＡ）をランダムに剪断することができる。ランダムな機会で、ランダムな剪断によって生成される断片化部位の比率は、ＴＴＮ  ＰＡＭ配列と重複する。断片は、相補的オーバーハングを有するアダプタ、または末端ＰＡＭを有する断片にライゲーションされた場合にのみ機能的制限部位を再構成する平滑末端化されたアダプタのいずれかにライゲーションすることができる。これらの戦略は、提供される本来の核酸においてＰＡＭ配列の３’にあった断片のみを選択的に処理してｇＲＮＡとすることを可能にする。
【０２８８】
図１５は、インプット核酸（例えば、ＤＮＡ）、例えばゲノムＤＮＡ（例えば、ヒトゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ等から逆転写されたｃＤＮＡ）からｇＮＡライブラリー（例えば、ｇＲＮＡライブラリー）を構築するための追加的な技法を示す。プロトコールは、ＭｓｅＩ（１５０１）またはＭｌｕＣＩ（１５０２）のいずれかで切断された核酸断片から始まることができる。ＭｓｅＩは、ＴＴＡＡ部位内を切断する一方、ＭｌｕＣＩは、ＡＡＴＴ部位で切断する。ＭｓｅＩおよびＭｌｕＣＩ認識部位の両方が、ＴＴＮを含み、ＴＴＮは、ある特定の実施形態では、ＰＡＭ部位として機能する。例えば、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓから単離されたＣｐｆ１タンパク質は、ＴＴＮをＰＡＭとして認識する。ＭｓｅＩまたはＭｌｕＣＩで消化された出発ＤＮＡは、断片の末端が潜在的ＰＡＭ配列を含むような、消化された断片の収集物をもたらす。他のＰＡＭ配列内をまたはその隣接部を切断するＭｓｅＩおよびＭｌｕＣＩ以外の酵素も、本発明の範囲内にあるものとして想定される。末端ＰＡＭ配列を有する消化された断片を産生する制限酵素の例示的だが非限定的な例は、表７に収載されている。ＭｓｅＩまたはＭｌｕＣＩ消化されたＤＮＡ断片は、次いで、マングビーンヌクレアーゼで処理して、一本鎖オーバーハングを分解する（１５０３、１５０４、１５０５）。次いで、ＭｍｅＩおよびＦｏｋＩ制限部位を含むアダプタが、これらのＤＮＡ断片にライゲーションされる。アダプタ配列は、出発核酸材料が、ＭｓｅＩ（１５０６）で切断されたかまたはＭｌｕＣＩ（１５０７）で切断されたかに依存する。次いで、ＭｍｅＩ酵素を使用して、アダプタ配列におけるＭｍｅＩ部位から２０ｂｐ離れた箇所でＤＮＡ断片を切断し、２０ヌクレオチド核酸標的化配列（Ｎ２０）から所望されないＤＮＡ配列を除去する。ＭｍｅＩ消化後に、次いでＦｏｋＩ酵素を使用して、アダプタの隣接部を切断し、２０ヌクレオチド核酸標的化配列（Ｎ２０）を遊離させる（１５０８、１５０９）。Ｔ７プロモーター配列等のプロモーター配列および核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列を含む追加的なアダプタは次いで、Ｎ２０配列を含むＤＮＡ断片にライゲーションされる（１５１０、１５１１）。この操作は、ｃｒＲＮＡ  Ｎ２０ユニットのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写のための最終鋳型を産生して、ｇＮＡを産生する。
【０２８９】
図１６は、インプット核酸（例えば、ＤＮＡ）、例えばゲノムＤＮＡ（例えば、ヒトゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ等から逆転写されたｃＤＮＡ）からｇＮＡライブラリー（例えば、ｇＲＮＡライブラリー）を構築するための追加的な技法を示す。ある特定の実施形態では、ｇＮＡライブラリーを構築するための核酸出発材料は、アデニンがイノシンに置き換えられたＤＮＡを含む（図１６）。アデニンがイノシンに置き換えられた場合（１６０２）、ヒトアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｈＡＡＧ）を使用して、チミンと塩基対形成（based-paired）したイノシンを除去して、非塩基部位を後に残す（１６０３）。これらの非塩基部位は、塩基対形成することができず、これにより、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩによって認識および切断されるミスマッチを生じ（１６０４）、例えば、ＴＴＮオーバーハングを有するＤＮＡ断片をもたらす（１６０５）。ある特定の実施形態では、ＴＴＮは、ＰＡＭ部位として機能する。例えば、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓから単離されたＣｐｆ１タンパク質は、ＴＴＮをＰＡＭとして認識する。このＴＴＮオーバーハングを使用して、ＡＡＮオーバーハングを有するアダプタをライゲーションすることができる。このオーバーハングは、５’から３’方向で、５’−ＮＡＡ−３’であり、本方法によって産生されるＤＮＡ断片のＴＴＮオーバーハングに相補的である（１６０６）。このようなＡＡＮオーバーハング含有アダプタの特色は、このようなアダプタが、非塩基部位または他のミスマッチにライゲーションしないということであり、これにより、オーバーハングとしてＴＴＮ  ＰＡＭ部位を含むＮ２０含有断片に特異的なアダプタライゲーションがもたらされる。例えば、本方法のＴ７エンドヌクレアーゼＩによって切断されたＴＮＮ末端配列を有するＤＮＡ断片は、アダプタにライゲーションすることができない。この操作は、ＦｏｋＩおよびＭｍｅＩ制限部位を含むアダプタ等のアダプタ、ＴＴＮ配列、ならびに核酸標的化配列（Ｎ２０）を含む、核酸分子の収集物を産生する（１６０６）。次いで、ＭｍｅＩ制限酵素を使用して、アダプタ配列におけるＭｍｅＩ部位から２０ｂｐ離れた箇所で切断し、２０ヌクレオチド核酸標的化配列（Ｎ２０）から所望されないＤＮＡ配列を除去する。ＭｍｅＩ消化後に、ＦｏｋＩを使用して、アダプタの隣接部を切断し、２０ヌクレオチド核酸標的化配列（Ｎ２０）を遊離させる（１６０７）。Ｔ７プロモーター配列等のプロモーター配列および核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列を含む追加的なアダプタは次いで、Ｎ２０配列を含むＤＮＡ断片にライゲーションされる（１６０８）。この操作は、ｃｒＲＮＡ  Ｎ２０ユニットのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写のための最終鋳型を産生して、ｇＮＡを産生する。
【０２９０】
図１７は、インプット核酸（例えば、ＤＮＡ）、例えばゲノムＤＮＡ（例えば、ヒトゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ等から逆転写されたｃＤＮＡ）からｇＮＡライブラリー（例えば、ｇＲＮＡライブラリー）を構築するための追加的な技法を示す。ある特定の実施形態では、ｇＮＡライブラリーを構築するための核酸出発材料は、チミジンがウラシルに置き換えられたＤＮＡを含む（１７０２）。ＵＳＥＲ酵素（ウラシル特異的切除試薬、ＮＥＢ＃Ｍ５５０５Ｓ）は、ウラシルを除去および切除し、５’および３’リン酸を後に残す（１７０４）。ＵＳＥＲにより、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）は、ウラシル塩基の切除を触媒して、非塩基部位を生成し、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩは、非塩基部位の３’および５’側でホスホジエステル骨格を切断する。
【０２９１】
本方法のある特定の実施形態では、ホスファターゼ処理は、非塩基部位に隣接する３’リン酸を除去し、続いて、マングビーンヌクレアーゼによる処理に先立ち、ジデオキシリボ核酸ｄｄＴＴＰを使用して、単一塩基対伸長を行う。本発明の範囲内として、非塩基部位を産生することができる他のＤＮＡ修復酵素が構想される。例えば、ヒトオキソグアニングリコシラーゼ（ｈＯＧＧ１）等、ＤＮＡグリコシラーゼを使用して、ミスマッチした塩基対を切除し、非塩基部位を生成することができる。本方法の特色は、例えばＴＮ部位ではなく、ＴＴＮ部位における出発ＤＮＡの断片化に対する特異性が、一部には、ＵＳＥＲ媒介性切除およびｄｄＴＴＰ伸長の組合せに端を発することである。ＴＮ部位に関し、最終産物はニックであり、これは不十分な基質を作製する。ＴＴＮ（または２個を超えるＴ）に関し、少なくとも１塩基対ギャップが存在し、これはより効率的に切断される。代替実施形態では、ＵＳＥＲ媒介性ウラシル切除に続いて直ちに、一本鎖領域のマングビーンヌクレアーゼ分解が行われる。次いで、マングビーンヌクレアーゼは、一本鎖領域を認識および分解する（１７０５）。マングビーンヌクレアーゼ処理は、その５’末端がＴＴＮ部位のＴＴに隣接するＤＮＡ断片の収集物を産生する。ある特定の実施形態では、ＴＴＮは、ＰＡＭ部位として機能する。例えば、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓから単離されたＣｐｆ１タンパク質は、ＴＴＮをＰＡＭとして認識する。ＦｏｋＩおよびＭｍｅＩ部位を含むアダプタは、その結果得られる核酸断片にライゲーションされる（１７０６）。このようなアダプタの特色は、このようなアダプタが、３’リン酸にライゲーションしないということである。ＭｍｅＩ制限酵素を使用して、アダプタ配列におけるＭｍｅＩ部位から２０ｂｐ離れた箇所で切断し、２０ヌクレオチド核酸標的化配列（Ｎ２０）から所望されないＤＮＡ配列を除去し、ＦｏｋＩを使用して、アダプタの隣接部を切断し、２０ヌクレオチド核酸標的化配列（Ｎ２０）を遊離させる（１７０７）。Ｔ７プロモーター配列等のプロモーター配列および核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列を含む追加的なアダプタは次いで、Ｎ２０配列を含むＤＮＡ断片にライゲーションされる（１７０８）。この操作は、ｃｒＲＮＡ  Ｎ２０ユニットのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写のための最終鋳型を産生して、ｇＮＡを産生する。
【０２９２】
図１８は、インプット核酸（例えば、ＤＮＡ）、例えばゲノムＤＮＡ（例えば、ヒトゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ等から逆転写されたｃＤＮＡ）からｇＮＡライブラリー（例えば、ｇＲＮＡライブラリー）を構築するための追加的な技法を示す。ある特定の実施形態では、ｇＮＡライブラリーを構築するための核酸出発材料は、非特異的ニッカーゼおよびＴ７エンドヌクレアーゼＩ（フラグメンターゼ）でランダムに断片化されたＤＮＡを含む。ある特定の実施形態では、１６個の断片化部位につき１個が、ＴＴＮ  ＰＡＭ部位と完全に重複し（１８０２）、ＡＡＮオーバーハングを含むアダプタにライゲーションされ得るＴＴＮオーバーハングを産生する。この操作は、ＴＴＮ  ＰＡＭ配列に隣接したＮ２０配列を含むアダプタライゲーションＤＮＡ断片の収集物を産生する。例えば、ＦｏｋＩおよびＭｍｅＩ制限部位を含むアダプタが、ＤＮＡ断片にライゲーションされる（１８０３）。次いで、ＭｍｅＩ酵素を使用して、アダプタ配列におけるＭｍｅＩ部位から２０ｂｐ離れた箇所で切断し、２０ヌクレオチド核酸標的化配列（Ｎ２０）から所望されないＤＮＡ配列を除去し、ＦｏｋＩを使用して、アダプタの隣接部を切断し、２０ヌクレオチド核酸標的化配列（Ｎ２０）を遊離させる（１８０４）。Ｔ７プロモーター配列等のプロモーター配列および核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列を含む追加的なアダプタは次いで、Ｎ２０配列を含むＤＮＡ断片にライゲーションされる（１８０５）。この操作は、ｃｒＲＮＡ  Ｎ２０ユニットのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写のための最終鋳型を産生して、ｇＮＡを産生する。
【０２９３】
図１９は、インプット核酸（例えば、ＤＮＡ）、例えばゲノムＤＮＡ（例えば、ヒトゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ等から逆転写されたｃＤＮＡ）からｇＮＡライブラリー（例えば、ｇＲＮＡライブラリー）を構築するための追加的な技法を示す。ある特定の実施形態では、ｇＮＡライブラリーを構築するための核酸出発材料は、ランダムに剪断されたＤＮＡを含む。ある特定の実施形態では、１６個の断片につき１個が、５’ＰＡＭ末端を有する（１９０１）。ランダムに剪断されたＤＮＡ断片の５’末端は、ＥｃｏＧＩＩ  ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ等、ＤＮＡメチラーゼを使用してメチル化し、末端修復して、平滑末端を産生することができる（１９０１）。ＮｔＢｓｔＮＢＩ＊ｃＰＡＭは、Ｎ２０核酸標的化配列を含む、剪断されメチル化され末端修復されたＤＮＡ断片の末端にライゲーションされる（１９０２）。（＊）は、第２の鎖のカッティングを無効にする、切断抵抗性ホスホロチオエート結合を意味する。次いで、ＮｔＢｓｔＮＢＩ（Ｎｔ．ＮｓｔＮＢＩとも呼ばれる）は、ホスホロチオエート結合から４塩基対離れた箇所でＤＮＡのトップ鎖をニッキングする（１９０３）。一部の実施形態では、ＮｔＢｓｔＮＢＩ＊ｃＰＡＭアダプタは、ＤＮＡ断片のＰＡＭ配列へのアダプタの相補的ＰＡＭ（ｃＰＡＭ）配列の付加が、制限部位を生成するような配列を含む（ＰＡＭならびに関連する配列および制限酵素については、下の表７を参照）。この制限部位は、ＨａｅＩＩＩ、ＭｌｕＣＩ、ＡｌｕＩ、ＤｐｎＩＩまたはＦａｔＩ等の制限酵素によって切断され得る。ＰＡＭ部位を含む剪断されたＤＮＡ断片へのＮｔＢｓｔＮＢＩ＊ｃＰＡＭアダプタ（１９０３）のライゲーションによる制限部位の生成、および新たに生成された制限部位のその後の切断（１９０３、１９０４）は、末端ＰＡＭ配列を含有するＤＮＡ断片のみの選択的処理を可能にする。アダプタにおける切断抵抗性ホスホロチオエート結合は、制限酵素による第２の鎖のカッティングを無効にし、内部部位は、メチル化のため使用されない。例としてＡＡＴＴ  ＰＡＭおよびＭｌｕＣＩを使用すると、両方の鎖を切断するＭｌｕＣＩでカッティングする前に、ＮｔＢｓｔＮＢＩによりＰＡＭ部位でトップ鎖をニッキングしてＡＡＴＴ（切断）位置を産生することにより、ニックまたは４ｂｐオーバーハングとは対照的に、平滑末端化断片が産生される。平滑末端化断片のみが、アダプタにライゲーションすることができる。ＮｔＢｓｔＮＢＩニック（１９０３）および制限酵素切断は、Ｎ２０配列の隣に平滑末端を産生し（１９０５）、これに対して、ＦｏｋＩ部位およびＭｍｅＩ部位を含むアダプタがライゲーションされる（１９０６）。次いで、ＭｍｅＩ酵素は、アダプタ配列から２０ｂｐ離れた箇所で切断し、２０ヌクレオチド核酸標的化配列（Ｎ２０）から所望されないＤＮＡ配列を除去し、ＦｏｋＩは、アダプタの隣接部を切断し、２０ヌクレオチド核酸標的化配列（Ｎ２０）を遊離させる（１９０７）。Ｔ７プロモーター等のプロモーター配列および核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列を含む追加的なアダプタは次いで、Ｎ２０配列を含むＤＮＡ断片にライゲーションされる（１９０８）。この操作は、ｃｒＲＮＡ  Ｎ２０ユニットのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写のための最終鋳型を産生して、ｇＮＡを産生する。
【表７】
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【０２９４】
図２０は、インプット核酸（例えば、ＤＮＡ）、例えばゲノムＤＮＡ（例えば、ヒトゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ等から逆転写されたｃＤＮＡ）からｇＮＡライブラリー（例えば、ｇＲＮＡライブラリー）を構築するための追加的な技法を示す。ある特定の実施形態では、ｇＮＡライブラリーを構築するための核酸出発材料は、ランダムに剪断され、平滑末端化するように修復されたＤＮＡを含む。ある特定の実施形態では、１６個の断片につき１個が、５’ＰＡＭ末端を有する（２００１、ＰＡＭおよび相補的ＰＡＭ（ｃＰＡＭ）配列、示される通り）。ＮｔＢｓｔＮＢＩＡＡアダプタは、ランダムに剪断され平滑末端化されたＤＮＡ断片にライゲーションされ（２００２）、次いで、ＮｔＢｓｔＮＢＩは、４塩基対離れた場所でトップ鎖をニッキングする（２００３）。エキソヌクレアーゼ３は、ニックを認識し（２００４）、３’から５’方向でトップ鎖を分解し、ボトム鎖を露出させる（２００５）。ボトム鎖およびＰＡＭｃＰＡＭ配列に正確にアニールする、ＭｌｙＩプライマーが付加される。高温リガーゼは、ニックを塞ぎ（２００６）、これは、末端ＰＡＭ配列を含む剪断され平滑末端化されたＤＮＡ断片のみに対する特異性を生じ、ＮｔＢｓｔＮＢＩアダプタのライゲーション後にＰＡＭｃＰＡＭ配列を生じた。ＰＡＭｃＰＡＭ配列の生成のみが、正確なライゲーションを可能にする。他のいずれかの断片が、ライゲーション部位の近傍にミスマッチを有すると、これは、リガーゼの活性を無効にする。一部の実施形態では、回復されたＭｌｙＩアダプタは、２００６のＴＴ含有配列のみの選択的ＰＣＲ増幅を可能にし（図２０Ｂ）、２００７のＭｌｙＩ断片、すなわち、ＭｌｙＩ配列およびＰＡＭ隣接Ｎ２０配列の両方を含有するＰＣＲ増幅されたＤＮＡ断片を産生する。ＰＣＲ増幅は、プルーフリーディング３’から５’エキソヌクレアーゼ活性がない酵素により実行される。次いで、ＭｌｙＩは、５塩基対離れた場所で両方の鎖を切断し、平滑末端を後に残し、ＰＡＭｃＰＡＭ配列を除去する（２００８）。ＦｏｋＩおよびＭｍｅＩ制限部位を含む平滑末端化アダプタが次いで、ＭｌｙＩ消化されたＤＮＡ断片にライゲーションされる（２００９）。次いで、ＭｍｅＩ酵素は、アダプタ配列から２０ｂｐ離れた箇所で切断し、２０ヌクレオチド核酸標的化配列（Ｎ２０）から所望されないＤＮＡ配列を除去し、ＦｏｋＩは、アダプタの隣接部を切断し、２０ヌクレオチド核酸標的化配列（Ｎ２０）を遊離させる（２０１０）。Ｔ７プロモーター配列等のプロモーター配列および核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列を含有する追加的なアダプタが次いで、Ｎ２０配列を含むＤＮＡ断片にライゲーションされる（２０１１）。この操作は、ｃｒＲＮＡ  Ｎ２０ユニットのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写のための最終鋳型を産生して、ｇＮＡを産生する。
【０２９５】
図２１は、インプット核酸（例えば、ＤＮＡ）、例えばゲノムＤＮＡ（例えば、ヒトゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ等から逆転写されたｃＤＮＡ）からｇＮＡライブラリー（例えば、ｇＲＮＡライブラリー）を構築するための追加的な技法を示す。ある特定の実施形態では、ｇＮＡライブラリーを構築するための核酸出発材料は、ランダムに剪断され、平滑末端を有するように修復されたＤＮＡを含む。ある特定の実施形態では、１６個の断片につき１個が、５’ＰＡＭ末端を有する（２１０１、ＰＡＭおよび相補的（complimentary）ＰＡＭ（ｃＰＡＭ）、示される通り）。環状アダプタ（ｃｉｒｃアダプタ）は、このような平滑末端化されたＤＮＡ断片にライゲーションされ、両末端に環状アダプタがない断片は、ラムダエキソヌクレアーゼを使用して分解される（２１０２）。一部の実施形態では、ＤＮＡ断片のＰＡＭ配列への、アダプタ由来のｃＰＡＭ配列の付加は、制限部位を生成する（表７および２１０３を参照）。この制限部位は、ＨａｅＩＩＩ、ＭｌｕＣＩ、ＡｌｕＩ、ＤｐｎＩＩまたはＦａｔＩ等の制限酵素によって切断され得る。この部位が、ＨａｅＩＩＩ、ＭｌｕＣＩ、ＡｌｕＩ、ＤｐｎＩＩまたはＦａｔＩ等の制限酵素によって切断される場合、これは、ライゲーション可能末端を生成する。ＰＡＭ部位を含む剪断されたＤＮＡ断片への環状アダプタのライゲーションによる制限部位の生成（２１０２）、および新たに生成された制限部位のその後の切断（２１０３）は、末端ＰＡＭ配列を含有するＤＮＡ断片のみの選択的処理を可能にする。ＰＡＭ部位でライゲーションされていないアダプタを有する断片は、このステップにおいて制限酵素（例えば、ＭｌｕＣＩ）によって切断されず、よって、環状のままとなる。このような環状断片は、その後のライゲーションのラウンドに利用できない。ＰＡＭ部位でライゲーションされたアダプタを有する断片のみが、ラムダヌクレアーゼに抵抗し（２１０２）、次いで、制限酵素（例えば、ＭｌｕＣＩおよび２１０３）によって切断され、これにより、その後のライゲーションラウンドのために開環する。内部制限部位は、メチル化のため使用されない。前処理としてＥｃｏＧＩＩ等のメチルトランスフェラーゼを使用することができる。次いで、ＭｌｙＩ配列を含む追加的なアダプタが、ＤＮＡ断片にライゲーションされる（２１０４）。ＤＮＡ断片は、ＭｌｙＩアダプタ特異的ＰＣＲプライマーを使用してＰＣＲ増幅される（２１０５）。ＰＡＭ配列を含有するＤＮＡ分子のみが増幅される。次いで、増幅されたＰＣＲ産物をＭｌｙＩで切断して、アダプタを除去し（図２１Ｂ、２１０５）、ＦｏｋＩおよびＭｍｅＩ制限部位を含むアダプタが、その結果得られるＤＮＡ断片にライゲーションされる（２１０６）。次いで、ＭｍｅＩ酵素は、アダプタ配列から２０ｂｐ離れた箇所で切断し、２０ヌクレオチド核酸標的化配列（Ｎ２０）から所望されないＤＮＡ配列を除去し、ＦｏｋＩは、アダプタの隣接部を切断し、２０ヌクレオチド核酸標的化配列（Ｎ２０）を遊離させる（２１０７）。Ｔ７等のプロモーターおよび核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列を含有する追加的なアダプタは次いで、Ｎ２０配列を含むＤＮＡ断片にライゲーションされる（２１��８）。この操作は、ｃｒＲＮＡ  Ｎ２０ユニットのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写のための最終鋳型を産生して、ｇＮＡを産生する。
【０２９６】
図２２は、インプット核酸（例えば、ＤＮＡ）、例えばゲノムＤＮＡ（例えば、ヒトゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ等から逆転写されたｃＤＮＡ）からｇＮＡライブラリー（例えば、ｇＲＮＡライブラリー）を構築するための追加的な技法を示す。ある特定の実施形態では、ｇＮＡライブラリーを構築するための核酸出発材料は、ランダムに剪断され、平滑末端を有するように修復されたＤＮＡを含む。ある特定の実施形態では、１６個の断片につき１個が、５’ＴＴ末端を有する（２２０１、ＴＴＮおよびＡＡＮ、示される通り）。ある特定の実施形態では、ＴＴＮは、ＰＡＭ部位として使用することができる。例えば、ＴＴＮは、Ｃｐｆ１および関連するファミリーメンバーによって認識される。末端ＡＡを含むＮｔＢｓｔＮＢＩアダプタ（ＮｔＢｓｔＮＢＩＡＡ）が次いで、ＴＴ末端にライゲーションされる（２２０２）。ＤＮＡ断片由来の５’末端ＴＴへの、アダプタ由来の３’末端ＡＡの付加は、ＭｌｕＣＩ制限部位を生成する。ＭｌｕＣＩは、この新たに生成された部位において切断し（２２０３）、ＡＡＴＴ一本鎖オーバーハングを後に残し（２２０４）、これは、マングビーンヌクレアーゼによって分解されて、平滑末端化された断片を後に残す（２２０５）。末端ＴＴを有する剪断されたＤＮＡ断片への末端ＡＡを有するＮｔＢｓｔＮＢＩアダプタのライゲーションによるＡＡＴＴ  ＭｌｕＣＩ制限部位の生成は、ＴＴＮ  ＰＡＭ配列に隣接するＮ２０  ＤＮＡ断片の選択的処理を可能にする。ＦｏｋＩおよびＭｍｅＩ制限部位を含むアダプタは、その結果得られるＤＮＡ断片にライゲーションされる（２２０６）。
【０２９７】
あるいは、ＮｔＢｓｔＮＢＩアダプタのライゲーション後に、ＮｔＢｓｔＮＢＩを使用して、４塩基対離れた場所でトップ鎖をニッキングすることができ（２２０７）、ＭｌｕＣＩを使用して、トップおよびボトム鎖を切断することができる（２２０８）。ＮｔＢｓｔＮＢＩ由来のニックおよびＭｌｕＣＩ由来の切断は、Ｎ２０配列の隣に平滑末端を産生し（２２０９）、これに対して、ＦｏｋＩおよびＭｍｅＩ制限部位を含む平滑末端化されたアダプタがライゲーションされる（２２１０）。ある特定の実施形態では、ＮｔＢｓｔＮＢＩアダプタは、ＮｔＢｓｔＮＢＩ＊ＡＡアダプタであり得、（＊）は、切断抵抗性ホスホロチオエート結合を意味する（２２１１）。ＮｔＢｓｔＮＢＩを使用して、４塩基対離れた場所でトップ鎖をニッキングする（２２１２）。ＤＮＡ断片由来のＴＴへのアダプタ由来のＡＡの付加は、ＭｌｕＣＩ制限部位を生成し、ＭｌｕＣＩは、この制限部位のボトム鎖を切断する（２２１３）。ＮｔＢｓｔＮＢＩ由来のニックおよびＭｌｕＣＩ由来の切断は、Ｎ２０配列の隣に平滑末端を産生し（２２１４）、これに対して、ＦｏｋＩおよびＭｍｅＩ制限部位を含む平滑末端化されたアダプタがライゲーションされる（２２１５）。ＦｏｋＩおよびＭｍｅＩ制限部位を含む平滑末端化されたアダプタが、Ｎ２０配列を含むＤＮＡ断片にライゲーションされた後に、次いで、ＭｍｅＩ酵素は、アダプタ配列から２０ｂｐ離れた箇所で切断し、２０ヌクレオチド核酸標的化配列（Ｎ２０）から所望されないＤＮＡ配列を除去し、ＦｏｋＩは、アダプタの隣接部を切断し、２０ヌクレオチド核酸標的化配列（Ｎ２０）を遊離させる（２２１６）。Ｔ７等のプロモーターおよびｃｒＲＮＡ配列を含有する追加的なアダプタは次いで、Ｎ２０配列を含むＤＮＡ断片にライゲーションされる（２２１７）。この操作は、ｃｒＲＮＡ  Ｎ２０ユニットのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写のための最終鋳型を産生する。
【０２９８】
図２３は、インプット核酸（例えば、ＤＮＡ）、例えばゲノムＤＮＡ（例えば、ヒトゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ等から逆転写されたｃＤＮＡ）からｇＮＡライブラリー（例えば、ｇＲＮＡライブラリー）を構築するための追加的な技法を示す。ある特定の実施形態では、ｇＮＡライブラリーを構築するための核酸出発材料は、ランダムに剪断され、平滑末端を有するように修復されたＤＮＡを含む。ある特定の実施形態では、１６個の断片につき１個が、５’ＴＴ末端を有する（２３０１、ＴＴＮおよびＡＡＮ、示される通り）。ある特定の実施形態では、ＴＴＮは、ＰＡＭ部位として使用することができる。例えば、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓから単離されたＣｐｆ１タンパク質は、ＴＴＮをＰＡＭとして認識する。末端ＡＡを含むＮｔＢｓｔＮＢＩアダプタ（ＮｔＢｓｔＮＢＩＡＡ）は、剪断され平滑末端化されたＤＮＡ断片の末端にライゲーションされる（２３０２）。剪断され平滑末端化されたＤＮＡ断片が、末端ＴＴを含む場合、ＮｔＢｓｔＮＢＩアダプタのライゲーションは、ＡＡＴＴ配列を生成する（２３０２）。ＮｔＢｓｔＮＢＩ酵素を使用して、４塩基対離れた場所でトップ鎖をニッキングする（２３０３）。エキソヌクレアーゼ３は、ニックを認識し、３’から５’方向でトップ鎖を分解し、ボトム鎖を露出させる（２３０５）。ボトム鎖およびＡＡＴＴ配列に正確にアニールする、ＭｌｙＩプライマーが付加される（２３０６）。高温リガーゼは、ニックを塞ぎ（図２３Ａ、２３０６）、これは、末端ＴＴ配列を含む剪断され平滑末端化されたＤＮＡ断片のみに対する特異性を生じ、ＮｔＢｓｔＮＢＩ  ＡＡアダプタのライゲーション後にＡＡＴＴ配列を生じた。一部の実施形態では、回復されたＭｌｙＩアダプタは、ＡＡＴＴ含有ＤＮＡ断片、すなわち、ＴＴＮ  ＰＡＭ隣接Ｎ２０配列を有する断片のＰＣＲ選択的増幅を可能にする（２３０７、図２３Ｂ）。次いで、ＭｌｙＩは、５塩基対離れた場所で両方の鎖を切断し、平滑末端を後に残し、ＡＡＴＴ配列を除去する（２３０８）。ＦｏｋＩおよびＭｍｅＩ制限部位を含む平滑末端化アダプタは次いで、ＭｌｙＩ消化されたＤＮＡ断片にライゲーションされる（２３０９）。次いで、ＭｍｅＩ酵素は、アダプタ配列から２０ｂｐ離れた箇所で切断し、２０ヌクレオチド核酸標的化配列（Ｎ２０）から所望されないＤＮＡ配列を除去し、ＦｏｋＩは、アダプタの隣接部を切断し、２０ヌクレオチド核酸標的化配列（Ｎ２０）を遊離させる（２３１０）。Ｔ７等のプロモーターおよび核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列を含有する追加的なアダプタは次いで、Ｎ２０配列を含むＤＮＡ断片にライゲーションされる（２３１１）。この操作は、ｃｒＲＮＡ  Ｎ２０ユニットのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写のための最終鋳型を産生して、ｇＮＡを産生する。
【０２９９】
図２４は、インプット核酸（例えば、ＤＮＡ）、例えばゲノムＤＮＡ（例えば、ヒトゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ等から逆転写されたｃＤＮＡ）からｇＮＡライブラリー（例えば、ｇＲＮＡライブラリー）を構築するための追加的な技法を示す。本方法の特色は、高温でのライゲーションであり、これは、オリゴの環状化をもたらし、ランダム化されたＮ２０配列をＮ２０レパートリーに変換すると共に、ｃｒＲＮＡ分子のライブラリーを建設する。ある特定の実施形態では、ｇＮＡライブラリーを構築するための核酸出発材料は、ランダムに剪断され、平滑末端を有するように修復されたＤＮＡを含む。ある特定の実施形態では、１６個の断片につき１個が、５’ＴＴ末端を有する（２４０１、ＴＴＮおよびＡＡＮ、示される通り）。二本鎖ＤＮＡ断片は、Ｔ７エキソヌクレアーゼで処理して、一本鎖を露出させる（２４０２）。Ｔ７エキソヌクレアーゼによる処理後に、５’リン酸、５’末端におけるランダムＮ１２配列、Ｔ７＋ステムループ配列、２個の対向したＦｏｋ１部位、およびＴＴＮ配列と、それに続く３’におけるＮ８配列を含む直鎖状オリゴ（２４０３）が付加され、露出された一本鎖ＤＮＡにアニールされ、ＨｉＦｉｄｅｌｉｔｙ  Ｔａｑリガーゼを使用してライゲーションされる（２４０４）。高温リガーゼは、ライゲーションするために、ニックのどちらか側における１０ｂｐを超える完全相同性を要求する。低い相同性、ギャップまたはミスマッチが存在する場合、これはライゲーションしない。この操作は、環状化された産物を産生し、よって、ランダムヌクレオチド（Ｎ８＋Ｎ１２）は、ＴＴＮ  ＰＡＭ部位に隣接するＮ２０配列のライブラリーを形成する（例えば、図２４に示す通り、ヒトＮ２０配列のライブラリー）。残っているＤＮＡは全て、エキソヌクレアーゼ１およびエキソヌクレアーゼ３を使用して分解される。２個の対向したＦｏｋ１領域に相補的なオリゴが、環状ＤＮＡにアニールされ（２４０５）、その結果得られる産物は、Ｆｏｋ１で切断される。この操作は、（二本鎖の）対向したＦｏｋＩ部位を切除し、直鎖状一本鎖ＤＮＡ断片の収集物を産生する。ステムループの末端およびＮ２０の間のＴＴＮおよび所望されない配列は排除される（２４０６）。このようなＤＮＡ断片は、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（一本鎖ＤＮＡリガーゼ、Ｌｕｃｉｇｅｎ）を使用して自己環状化される（２４０７）。その結果得られる環状ＤＮＡを次いでローリングサークル増幅、またはＵＳＥＲによる直鎖化に続くＰＣＲのいずれかにより増幅して、ｃｒＲＮＡ（ｇＮＡ）生成のための鋳型を得る。
【０３００】
設計および合成
ガイド核酸の収集物を設計し（例えば、計算によって）、次いで使用のために合成することができる。ｇＮＡの合成は、標準オリゴヌクレオチド合成技法を用いることができる。場合によっては、ｇＮＡの前駆体を合成し、これからｇＮＡを産生することができる。一例では、ＤＮＡ前駆体が合成され、ＤＮＡ前駆体からｇＮＡが転写される（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写により）。
【０３０１】
図１０は、ガイド核酸の収集物を設計するための技法を図解する。標的核酸配列（例えば、標的ゲノム、標的トランスクリプトーム）の配列情報を得ることができる。標的核酸を含む複数の配列決定ライブラリーを生成することができ、このようなライブラリーを所望のカバレッジまで配列決定することができ、未加工の配列決定リードデータを生成することができる。配列決定されたライブラリーの各々に由来するリードは、適した参照配列（単数または複数）にマッピングすることができる。参照配列（単数または複数）に確実にマッピングする全てのリードを考慮して、配列リードアライメントファイル（例えば、バイナリーリードアライメントまたは「ＢＡＭ」ファイル）を作成することができ、所与の参照配列に起源を持つ標的リードの数（「存在量」）を計算することができる。標的配列につき得られる存在量尺度は、降順で選別することができる。複数の配列決定ライブラリー由来のファイルを統合して、単一のファイルを作成することができる。最小数のリードによって網羅される、配列アライメントの領域（本明細書では「標的領域」）を同定することができる。ガイド核酸配列（例えば、いずれかのＤＮＡ鎖上の「ＮＧＧ」モチーフもしくは他のＰＡＭ部位に直接先行する２０ヌクレオチド、またはいずれかのＤＮＡ鎖上の「ＴＴＮ」モチーフもしくは他のＰＡＭ部位に続く２０ヌクレオチド）は、標的領域から抽出することができる。次に、追加的なフィルタリング（filtration）ステップを行って、ｇＮＡが、最小数のヌクレオチドだけ間隔をあけていることを確実にすることができる。配列決定されたライブラリーの各々に由来するリードを、適した参照配列（単数または複数）にマッピングする。このアプローチは、標的配列におけるより豊富な配列（例えば、トランスクリプトームのためのより豊富なｍＲＮＡ分子由来のｃＤＮＡ）にウェイトを置くことができる。例えば、配列決定リードが、ｃＤＮＡに由来する場合、リードの数は、関連する転写物の存在量と相関し得る。
【０３０２】
図１１は、ガイド核酸の収集物を設計するための技法を図解する。標的核酸配列（例えば、標的ゲノム、標的トランスクリプトーム）の配列情報を得ることができる。最も高頻度のガイド核酸認識配列（別名、標的化配列）（例えば、いずれかのＤＮＡ鎖上の「ＮＧＧ」モチーフもしくは他のＰＡＭ部位に直接先行する２０ヌクレオチド（Ｎ２０）、またはいずれかのＤＮＡ鎖上の「ＴＴＮ」モチーフもしくは他のＰＡＭ部位に続く２０ヌクレオチド）を標的領域から抽出することができ、この最も高頻度のガイドを使用して、消化を行うまたはシミュレートすることができる。短い断片を除去することができ、２番目に高頻度のガイドを見出し、消化に使用することができる。短い断片を再度除去することができ、３番目に高頻度のガイドを見出し、消化に使用することができる。ガイドの数が、予め設定された数（例えば、アレイ等の合成方法の能力によって決定される予め設定された数）にマッチするまで、残っている断片が全て短くなるまで、ガイドを見出すことができなくなるまで、または許容される量の消化もしくは枯渇が、見出されたガイドによって可能にされるまで、このプロセスを繰り返すことができる。このプロセスは、ガイドの位置を特定し、標的核酸配列における消化をシミュレートして、計算によって行うことができる。所与の繰り返しにおいて、複数のガイドを見出すことができる。例えば、繰り返し毎により少ない潜在的ガイドを生じ得るため、場合によっては、何回か繰り返した後に、所与の繰り返しにおいて複数のガイドを見出すことができる。場合によっては、繰り返しにおいて最も高頻度のガイドを決定するのではなく、同定されるガイドは、カッティング後にある特定の閾値を下回る大部分の断片（例えば、短い断片）を生じるガイドである。このアプローチは、標的配列におけるより豊富な配列（例えば、トランスクリプトームのためのより豊富なｍＲＮＡ分子由来のｃＤＮＡ）にウェイトを置くことができる。
【０３０３】
短い断片は、約１００００ｂｐ、９０００ｂｐ、８０００ｂｐ、７０００ｂｐ、６０００ｂｐ、５０００ｂｐ、４０００ｂｐ、３０００ｂｐ、２０００ｂｐ、１０００ｂｐ、５００ｂｐ、４５０ｂｐ、４００ｂｐ、３５０ｂｐ、３００ｂｐ、２５０ｂｐ、２００ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ、９０ｂｐ、８０ｂｐ、７０ｂｐ、６０ｂｐ、５０ｂｐ、４０ｂｐ、３０ｂｐ、２０ｂｐまたは１０ｂｐ未満の核酸であり得る。ガイドの予め設定された数は、少なくとも約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、７００００、８００００、９００００、１０００００、２０００００、３０００００、４０００００、５０００００、６０００００、７０００００、８０００００、９０００００、１００００００、２００００００、３００００００、４００００００、５００００００、６００００００、７００００００、８００００００、９００００００または１０００００００個であり得る。枯渇の許容される量は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９９％または１００％であり得る。枯渇の量は、場合によっては、短い断片に切断される出発標的核酸のパーセンテージであり得る。
【０３０４】
適用
本明細書に提供されるｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）およびｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）の収集物は、目的の標的配列の枯渇、分配、捕捉または濃縮；ゲノムワイド標識；ゲノムワイド編集；ゲノムワイド機能スクリーニング；およびゲノムワイド調節を含む、種々の適用に有用である。
【０３０５】
一実施形態では、ｇＮＡは、宿主由来の生体試料における宿主核酸に対して選択的であるが、宿主由来の試料における非宿主核酸に対して選択的ではない。一実施形態では、ｇＮＡは、宿主由来の生体試料由来の非宿主核酸に対して選択的であるが、試料における宿主核酸に対して選択的ではない。一実施形態では、ｇＮＡは、宿主由来の生体試料における宿主核酸および非宿主核酸のサブセットの両方に対して選択的である。例えば、複合生体試料が、宿主核酸および２以上の非宿主生物由来の核酸を含む場合、ｇＲＮＡは、非宿主種のうち２以上に対して選択的であってよい。斯かる実施形態では、ｇＮＡは、目的外の配列を連続的に枯渇または分配するために使用される。例えば、ヒト由来の唾液は、ヒトＤＮＡと共に、２以上の細菌種のＤＮＡを含有するが、未知の病原生物のゲノム材料を含有する場合もある。斯かる実施形態では、ヒトＤＮＡおよび公知細菌へと向けられたｇＮＡを使用して、ヒトＤＮＡおよび公知細菌のＤＮＡを連続的に枯渇させ、これにより、未知の病原生物のゲノム材料を含む試料をもたらすことができる。
【０３０６】
例示的な実施形態では、ｇＮＡは、宿主由来の生体試料から得られるヒト宿主ＤＮＡに対して選択的であるが、試料から同様に得られる未知の病原体（単数または複数）由来のＤＮＡとハイブリダイズしない。
【０３０７】
一部の実施形態では、ｇＮＡは、試料における標的化された配列の枯渇および分配、非宿主核酸についての試料の濃縮、または試料における標的化された核酸の連続的な枯渇に有用であり、これらの方法は、試料から抽出された核酸を提供するステップと；（ｉ）本明細書に記載されているｇＮＡの収集物のうち任意の１種、および（ｉｉ）核酸ガイド化ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）系タンパク質を含む複数の複合体と試料とを接触させるステップとを含む。
【０３０８】
一部の実施形態では、ｇＮＡは、試料における標的化された配列の枯渇および分配方法であって、試料から抽出された核酸を提供するステップであって、抽出された核酸が、枯渇および分配の一方のための目的の配列および標的化された配列を含むステップと；核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、試料における核酸を切断する条件下で、（ｉ）本明細書に提供されているｇＮＡの収集物；および（ｉｉ）核酸ガイド化ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）系タンパク質を含む複数の複合体と試料とを接触させるステップとを含む方法に有用である。
【０３０９】
場合によっては、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質）由来のドメインを含む融合タンパク質を、ｇＮＡと共に使用することができる。核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質由来のドメインは、ガイド核酸複合体形成ドメイン、標的核酸認識および結合ドメイン、ヌクレアーゼドメイン、ならびに他のドメインを含むことができる。ドメインは、触媒活性があるバリアント、ニッカーゼバリアント、触媒失活したバリアント、およびこれらの組合せが挙げられるがこれらに限定されない、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質の異なるバリアントに由来し得る。融合タンパク質における他のドメインは、制限酵素、他のエンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）、ＤＮＡを改変する酵素（例えば、メチルトランスフェラーゼ）、またはタグ（例えば、アビジン、またはＧＦＰ等の蛍光タンパク質）を含むタンパク質に端を発することができる。例として、ガイド核酸と複合体形成し、標的核酸に結合するための核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質ドメインは、融合タンパク質において、制限酵素由来の核酸切断またはニッキングドメインと組み合わせることができる。場合によっては、融合タンパク質は、制限酵素の触媒ドメイン、プラス、核酸ガイド化ヌクレアーゼドメインを含む。場合によっては、融合タンパク質は、制限酵素の触媒ドメイン、プラス、触媒失活した核酸ガイド化ヌクレアーゼドメインを含む。例えば、制限酵素の触媒ドメインは、ＦｏｋＩの触媒ドメインであり得る。核酸ガイド化ヌクレアーゼドメインは、触媒失活したＣａｓ９ドメインを含むＣａｓ９ドメインであり得る。場合によっては、融合タンパク質は、制限酵素の触媒ドメイン、プラス、ヌクレオチド配列認識ドメインを含む。場合によっては、融合タンパク質は、制限酵素ドメイン、プラス、核酸ガイド化ヌクレアーゼドメインを含む。制限酵素ドメインは、機能するヌクレオチド配列認識ドメインを欠く突然変異体であり得る。例えば、制限酵素ドメインは、ＦｏｋＩであり得、これは場合によっては、ヌクレオチド配列認識ドメインを不活性化させるＮ１３Ｙ突然変異を有する。場合によっては、融合タンパク質は、制限酵素ドメイン、プラス、触媒失活した核酸ガイド化ヌクレアーゼドメインを含む。場合によっては、融合タンパク質は、制限酵素ドメイン、プラス、ヌクレオチド配列認識ドメインを含む。ヌクレオチド配列認識ドメインは、例えば、制限酵素または核酸ガイド化ヌクレアーゼに由来し得る。
【０３１０】
一部の実施形態では、ｇＮＡは、試料における標的化された核酸（例えば、宿主核酸）の枯渇、分配または捕捉に有用である。例えば、標的（例えば、宿主）核酸へと向けられた標的化配列を含むｇＮＡは、核酸ガイド化ニッカーゼ系タンパク質と複合体形成され、標的核酸のニッキングに使用される。次いで、ビオチン化ヌクレオチド等、標識されたヌクレオチドにより、ニックトランスレーションを行うことができる。ニックトランスレーションによって生成された標識された核酸配列を使用して、ストレプトアビジンを有する等、標的化された配列に結合することができる。この結合を使用して、標的核酸を捕捉することができる。次いで、捕捉された標的核酸を、捕捉されていない核酸から分離することができる。捕捉されていない核酸（例えば、非宿主核酸）は、配列決定等によりさらに解析することができる。それに代えてまたはその上、捕捉された標的核酸をさらに解析することもできる。図１２は、そのような方法の例示的な模式図を示す。図１２において、ヒトおよび非ヒト核酸を含む試料は、ヒト標的化ガイド核酸（例えば、ｇＲＮＡ）によってガイド化された、核酸ガイド化ヌクレアーゼニッカーゼ（例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼ）と接触させられる。ニッキングされた部位において、標識されたヌクレオチド（例えば、ビオチン化ヌクレオチド）によりニックトランスレーションが行われ、標識（例えば、ストレプトアビジン基質における）を使用して、標識された（例えば、ビオチン化された）核酸を捕捉することができる。次いで、例えば、配列決定または他のアッセイ（例えば、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ）によって、残っている非ヒト核酸をさらに解析することができる。
【０３１１】
ヘアピンループ（例えば、ナノポア配列決定アダプタ）を有する核酸を、枯渇のために標的化することもできる。核酸の一方の側にループ（例えば、配列決定アダプタ）を有する核酸の収集物（例えば、配列決定ライブラリー）を得ることができる。次いで、第２のループを核酸の他方の側に付加、核酸を環状にすることができる。第２のループは、公知制限部位または特定の核酸ガイド化ヌクレアーゼ部位を含むことができる。次いで、環状核酸の収集物を、標的特異的（例えば、宿主特異的、ヒト特異的）核酸ガイド化ヌクレアーゼまたはニッカーゼと接触させることができる。このような核酸ガイド化ヌクレアーゼまたはニッカーゼは、収集物中の他の核酸をインタクトに保ちながら、核酸収集物の標的化された構成物を切断またはニッキングすることができる。次いで、インタクトな核酸は消化せずに置きながら、切断またはニッキングされた核酸をエキソヌクレアーゼで消化し、これにより、収集物から標的化された核酸を枯渇させることができる。次いで、制限部位または特定の核酸ガイド化ヌクレアーゼ部位における消化により、第２のループを除去することができる。次いで、配列決定（例えば、ナノポア配列決定プラットフォームにおける配列決定）等により、枯渇されていない核酸（例えば、非宿主核酸）をさらに解析することができる。形成されるいずれかのアダプタ二量体が、アダプタ二量体に公知部位（例えば、制限酵素部位または特異的核酸ガイド化ヌクレアーゼ部位）をもたらし、これを適切な制限酵素または核酸ガイド化ヌクレアーゼによって消化することができるように、第２のループ等、アダプタを設計することもできる。そのようなアプローチは、例えば、第２のループの消化後にライブラリーを増幅することによる、Ｉｌｌｕｍｉｎａライブラリー等、ヘアピンアダプタを用いない配列決定プラットフォームのための配列決定ライブラリーのために用いることもできる。
【０３１２】
一部の実施形態では、枯渇のために標的化される核酸は、ヒトリボ核酸を含むことができる。場合によっては、全ヒトリボ核酸を、枯渇のために標的化することができる。
【０３１３】
一部の実施形態では、枯渇のために標的化される核酸は、対象において一般的なまたは蔓延した核酸を含む。例えば、枯渇される核酸は、免疫系因子に関連する核酸（例えば、ｍＲＮＡ）が挙げられるがこれらに限定されない、全ての細胞型に一般的な、または典型的なもしくは健康な細胞においてより豊富な核酸を含むことができる。枯渇後に、解析されるべき残っている核酸は、細胞型特異的核酸等、より一般的でないまたはより蔓延していない核酸を含むことができる。このようなより一般的でない核酸は、１種または複数の特定の細胞型の細胞死を含む、細胞死のシグナルであり得る。そのようなシグナルは、感染、がん、および他の疾患を示すことができる。場合によっては、シグナルは、特定の組織（単数または複数）におけるがん関係のアポトーシスのシグナルである。
【０３１４】
一部の実施形態では、ｇＮＡは、非宿主核酸についての試料の濃縮であって、宿主核酸および非宿主核酸を含む試料を提供するステップと；核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、試料における宿主核酸を切断する条件下で、（ｉ）宿主核酸へと向けられた標的化配列を含む本明細書に提供されているｇＮＡの収集物；および（ｉｉ）核酸ガイド化ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）系タンパク質を含む複数の複合体と試料とを接触させ、これにより、宿主核酸の試料を枯渇させ、非宿主核酸の濃縮を可能にするステップとを含む濃縮に有用である。
【０３１５】
一部の実施形態では、ｇＮＡは、試料における標的化された核酸の連続的な枯渇のための一方法であって、宿主核酸および非宿主核酸を含む宿主由来の生体試料を提供するステップであって、非宿主核酸が、少なくとも１つの公知非宿主生物由来の核酸および未知の非宿主生物由来の核酸を含むステップと；（ｉ）宿主核酸へと向けられた本明細書に提供されているｇＮＡの収集物；および（ｉｉ）核酸ガイド化ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）系タンパク質を含む複数の複合体を提供するステップと；宿主核酸における標的化された配列にハイブリダイズするように構成されたｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体（例えば、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質複合体）と生体試料由来の核酸とを混合するステップであって、複合体の少なくとも一部分が、宿主核酸における標的化された配列にハイブリダイズし、宿主核酸の少なくとも一部分が切断されるステップと；少なくとも１つの公知非宿主核酸における標的化された配列にハイブリダイズするように構成されたｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体と生体試料由来の残る核酸とを混合するステップであって、複合体の少なくとも一部分が、少なくとも１つの非宿主核酸における標的化された配列にハイブリダイズし、非宿主核酸の少なくとも一部分が切断されるステップと；未知の非宿主生物から残る核酸を単離し、さらなる解析に備えるステップとを含む方法に有用である。
【０３１６】
一部の実施形態では、本明細書で生成されるｇＮＡは、細胞集団におけるゲノムワイドまたは標的化された機能的スクリーニングの実行に使用される。斯かる実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写されたｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）のライブラリーまたはｇＮＡをコードするベクターは、ｇＮＡ指向性の核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質編集が、ゲノム全体にわたる配列またはゲノムの特異的領域に対して達成され得るような仕方で、核酸ガイド化ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）系タンパク質と共に、トランスフェクションまたは当技術分野で公知の他の実験室技法により細胞集団に導入することができる。一実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質は、ＤＮＡとして導入され得る。一実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質は、ｍＲＮＡとして導入され得る。一実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質は、タンパク質として導入され得る。例示的な一実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質は、Ｃａｓ９である。別の例示的な実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質は、Ｃｐｆ１である。
【０３１７】
一部の実施形態では、本明細書で生成されるｇＮＡは、目的の核酸配列の選択的な捕捉および／または濃縮に使用される。例えば、一部の実施形態では、本明細書で生成されるｇＮＡは、複数の核酸を含む試料を提供するステップと；（ｉ）本明細書に提供されているｇＮＡの収集物；および（ｉｉ）核酸ガイド化ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）系タンパク質を含む複数の複合体と試料とを接触させるステップとを含む、標的核酸配列の捕捉に使用される。目的の配列が捕捉されると、さらにこれをライゲートして、例えば、配列決定ライブラリーを作製することができる。
【０３１８】
一部の実施形態では、本明細書で生成されるｇＮＡは、（ａ）複数の核酸断片を含む試料を提供するステップと；（ｂ）（ｉ）本明細書に提供されているｇＮＡの収集物；および（ｉｉ）核酸ガイド化ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）系タンパク質−ニッカーゼ（例えば、Ｃａｓ９−ニッカーゼ）を含む複数の複合体と試料とを接触させるステップであって、ｇＮＡが、核酸断片における標的化された目的の部位に対して相補的であり、これにより、標的化された目的の部位に複数のニック核酸断片を生成するステップと；（ｃ）ニック部位において核酸合成を開始させることができる酵素および標識されたヌクレオチドと複数のニック核酸断片とを接触させるステップであって、これにより、標的化された目的の部位に標識されたヌクレオチドを含む複数の核酸断片を生成するステップとを含む、標的化された目的の部位における標識されたヌクレオチドの導入に使用される。
【０３１９】
一部の実施形態では、本明細書で生成されるｇＮＡは、（ａ）複数のアダプタライゲート核酸を含む試料を提供するステップであって、核酸が、一端において第１のアダプタにライゲートされ、他端において第２のアダプタにライゲートされているステップと；（ｂ）複数の活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ−ｇＮＡ複合体（例えば、ｄＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体）を含むｇＮＡの収集物と試料とを接触させるステップであって、活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ（例えば、ｄＣａｓ９）が、トランスポサーゼに融合されており、ｇＮＡが、核酸のサブセットに含有される標的化された目的の部位に対して相補的であり、活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ−ｇＮＡトランスポサーゼ複合体（例えば、ｄＣａｓ９−ｇＲＮＡトランスポサーゼ複合体）が、複数の第３のアダプタをロードされており、一端に第１または第２のアダプタのいずれかを、他端に第３のアダプタを含む複数の核酸断片を生成するステップとを含む、目的の標的核酸配列の捕捉に使用される。一実施形態では、本方法は、第１または第２のアダプタおよび第３のアダプタ特異的ＰＣＲを使用して、ステップ（ｂ）の産物を増幅するステップをさらに含む。
【０３２０】
一部の実施形態では、本明細書で生成されるｇＮＡは、細胞集団におけるゲノムワイドまたは標的化された活性化または抑圧の実行に使用される。斯かる実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写されたｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）のライブラリーまたはｇＮＡをコードするベクターは、ｇＮＡ指向性の触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質媒介性の活性化または抑圧が、ゲノム全体にわたる配列においてまたはゲノムの特異的領域に対して達成され得るような仕方で、活性化因子またはリプレッサードメインに融合された触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）系タンパク質（触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質−融合タンパク質）と共に、トランスフェクションまたは当技術分野で公知の他の実験室技法により、細胞集団に導入され得る。一実施形態では、触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質−融合タンパク質は、ＤＮＡとして導入され得る。一実施形態では、触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質−融合タンパク質は、ｍＲＮＡとして導入され得る。一実施形態では、触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質−融合タンパク質は、タンパク質として導入され得る。一部の実施形態では、ｇＮＡまたはｇＮＡをコードする核酸の収集物は、２種以上の核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質に対する特異性を呈する。例示的な一実施形態では、触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質は、ｄＣａｓ９である。
【０３２１】
一部の実施形態では、収集物は、Ｃａｓ９、ならびにＣｐｆ１、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ〜ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２およびＣｍ５からなる群から選択される１種または複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質に対する特異性を有するｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする核酸を含む。一部の実施形態では、収集物は、例えば、異なるゲノムまたはゲノムの部分の標識および／または可視化における使用のための、異なる染色体領域の標識および／または可視化における使用のための、またはゲノムへのウイルス遺伝子／ゲノムの組込みの標識および／または可視化における使用のための、異なるフルオロフォアに融合された、触媒活性がない様々なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質に対する特異性を有するｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする核酸を含む。
【０３２２】
一部の実施形態では、ｇＮＡ（またはｇＮＡをコードする核酸）の収集物は、異なる核酸ガイド化ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）系タンパク質に対する特異性を有し、例えば、異なる種に由来する異なる目的の配列を標的とする。例えば、第１の種由来のゲノムを標的とする、ｇＮＡ（または斯かるｇＮＡをコードする核酸の集団から転写される）の収集物由来のｇＮＡの第１のサブセットは、先ず、第１の核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質メンバー（または操作されたバージョン）と混合することができ；第２の種由来のゲノムを標的とする、ｇＮＡ（または斯かるｇＮＡをコードする核酸の集団から転写される）の収集物由来のｇＮＡの第２のサブセットは、第２の異なる核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質メンバー（または操作されたバージョン）と混合することができる。一実施形態では、異なる目的の標的化された配列、例えば、異なる種のゲノムまたはある一種の異なる染色体が、異なる蛍光標識によって標識され得るように、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質は、異なるフルオロフォアと融合された、触媒活性がないバージョン（例えば、ｄＣａｓ９）であってよい。例えば、異なる染色体領域は、遺伝的転座の可視化のため、異なるｇＲＮＡ標的化ｄＣａｓ９−フルオロフォアによって標識することができる。例えば、異なるウイルスゲノムは、宿主ゲノムへの異なるウイルスゲノムの組込みの可視化のため、異なるｇＲＮＡ標的化ｄＣａｓ９−フルオロフォアによって標識することができる。別の実施形態では、異なる目的の標的化された配列、例えば、ゲノムの異なる染色体が、差次的に調節され得るように、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質は、活性化または抑圧ドメインのいずれかと融合されたｄＣａｓ９であってよい。別の実施形態では、異なる目的の標的化された配列、例えば、試料混合物内の異なるＤＮＡ配列が、差次的に単離され得るように、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質は、異なる抗体によって認識され得る異なるタンパク質ドメインと融合されたｄＣａｓ９であってよい。
【０３２３】
ＲＮＡは、鎖スイッチング方法を使用して、配列決定のために調製することができる（例えば、ｃＤＮＡとして）。図１３は、そのような鎖スイッチング方法の例示的な模式図を示す。ＲＮＡ分子１３０１をポリアデニル化することができる１３０２、またはそこに他の仕方でテイル（例えば、ポリＡテイル）１３０３を付与することができる。アダプタ（本明細書では、「アダプタ２」）を含むオリゴヌクレオチド１３０４を、例えば、オリゴヌクレオチドのポリＴ領域を介して、ＲＮＡテイルにハイブリダイズさせることができる。次いで、逆転写１３０５を使用して、ｃＤＮＡ１３０６を合成することができる。ポリＣ領域１３０７等の領域を、例えば、鎖スイッチングを可能にすることができるＭＭＬＶを逆転写酵素として使用することにより、ｃＤＮＡに付加することができる。鎖スイッチングオリゴヌクレオチド１３０９を次いで、例えば、オリゴヌクレオチドのポリＧ領域を介して、ｃＤＮＡテイル（例えば、ポリＣテイル）にハイブリダイズさせることができる。鎖スイッチングオリゴヌクレオチドは、アダプタ（本明細書では、「アダプタ１」）を含むことができる。次いで、アダプタを、二本鎖ｃＤＮＡ配列決定ライブラリーの増幅および／または指標付け１３１０に使用することができる。
【０３２４】
アダプタは、配列決定アダプタ（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定アダプタ）を含むことができる。アダプタは、特有の分子識別子（ＵＭＩ）配列を含むことができる。ＵＭＩ配列は、本来のＲＮＡ分子の各々に特有の配列（例えば、ランダム配列）を含むことができる。これは、配列決定バイアスから免れた、ＲＮＡ量の定量化を可能にすることができる。アダプタは、「バーコード」配列を含むことができる。バーコード配列は、特定の供給源（対象、患者、環境試料、区画（例えば、液滴、ウェル、ビーズ）等）由来のＲＮＡ分子の間で共有されるバーコード配列を含むことができる。これは、その後の解析のために配列決定情報のプールを可能にすることができ、相互汚染の検出および排除を可能にすることができる。アダプタは、各ＲＮＡ分子に特有のＵＭＩ、特定の供給源由来のＲＮＡ分子の間で共有されるバーコード、および配列決定アダプタ等、複数の別個の配列を含むことができる。
【０３２５】
ｃＤＮＡライブラリーは、標的化された消化または他の枯渇による等、本開示の方法に従ってさらに処理することができる。例えば、宿主（例えば、ヒト）由来のｃＤＮＡを消化または他の仕方で枯渇させることができる一方、非宿主（例えば、感染病原体）由来のｃＤＮＡを残すことができる。ｃＤＮＡは、配列決定するまたは他の仕方で解析することができる（例えば、ハイブリダイゼーションアッセイ、増幅アッセイ）。
【０３２６】
ｇＮＡの収集物、核酸ガイド化ヌクレアーゼまたはそれらの複合体は、１個または複数の表面に配置することができる。表面における配置を使用して、試料がｇＮＡ、核酸ガイド化ヌクレアーゼまたはそれらの複合体に遭遇する量、タイミングおよび／または順序を制御することができる。例えば、ｇＮＡ、核酸ガイド化ヌクレアーゼまたはそれらの複合体は、試料が流動されるチャネルの表面に結合させることができる；チャネルの始めにより近い表面に結合されたｇＮＡ、核酸ガイド化ヌクレアーゼまたはそれらの複合体は、チャネルの終わりに向けて結合されたものの前に遭遇される。場合によっては、本アプローチを使用して、試料を、本明細書に記述される通りに設計および産生され得る、最も高頻度の認識配列に標的化されたｇＮＡ、核酸ガイド化ヌクレアーゼまたはそれらの複合体に遭遇させることができる。場合によっては、本アプローチを使用して、試料を、標的核酸におけるｇＮＡの頻度に比例して等、異なる量または相対量で、ｇＮＡ、核酸ガイド化ヌクレアーゼまたはそれらの複合体に遭遇させることができる。一例では、第１のｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ複合体は、第２のｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ複合体と比較して、２倍の頻度で標的ゲノムに出現する配列に標的化され、表面に結合される第２の複合体の数と比較して、２倍の数の第１の複合体が、表面に結合される。
【０３２７】
ｇＮＡの収集物、核酸ガイド化ヌクレアーゼまたはそれらの複合体は、アレイ、フローセル、チャネル、マイクロ流体チャネル、ビーズ、および他の基材が挙げられるがこれらに限定されない、種々の表面に結合させることができる。
【０３２８】
ライゲーションを用いない標的化配列決定
標的化配列決定は、アダプタをライゲーションせずに行うことができる。これは、高度に分解された試料等、他の仕方では配列決定が困難な試料の配列決定を可能にすることができる。高度に分解されたＤＮＡは、元来短い断片を含有することに加えて、他の分子への架橋を有することが多く、ライブラリーの配列決定に要求される端から端までの増幅を非効率的または不可能なものとする。その上、現存するプロトコールは、アダプタをライゲーションし、続いて時間のかかる濃縮および複数回のＰＣＲ増幅を行うことによる、試料全体からＤＮＡライブラリーへの変換を要求する場合がある。
【０３２９】
図１４は、ライブラリー生成および濃縮を単一のワークフローに統合するプロトコールを図解し、このプロトコールは、分解されたＤＮＡの回収において、より速くかつより効率的であり得る。先ず、抽出物におけるＤＮＡ分子１４０１の３’末端が改変されてブロックされ１４０３、いかなるポリメラーゼによっても伸長されなくなる。次に、配列決定アダプタテイル付けされたプライマー１４０４が、目的の部位１４０２（ほとんどの場合でＳＮＰだが、ミニＳＴＲまたは他の部位であってもよい）の近傍に結合するように設計され、目的の部位を越えてＤＮＡ断片の末端へと伸長される。使用されていないプライマーを除去した後に、ターミナルトランスフェラーゼが添加され、他の断片はブロックされているため、伸長されたプライマーのみがテイル１４０５を付与される。使用されていないプライマーの除去は、酵素により（例えば、エキソヌクレアーゼによる消化により）、または伸長に取り込まれた標識されたヌクレオチド（例えば、ビオチン化ヌクレオチド）の結合により行うことができる。テイルは、別のアダプタ含有プライマー１４０６によるリバースプライミングに使用され、ＤＮＡを、増幅および配列決定の準備ができているライブラリー１４０７へと変換する。より高い感度のため、伸長されていないプライマーの除去に先立つ第１の伸長ステップのサイクリングにより、線形増幅ステップを加えることができる。
【０３３０】
プライマーは、バーコードまたは特有の分子識別子配列を取り込み、定量的情報を獲得するための標的化された部位の分布の追跡、増幅エラーの除去、および他の試料からの相互汚染の防止を可能にすることもできる。２×８−ｍｅｒ  ＵＭＩにより、プライマーあたり４０億を超える組合せ（４１６）が可能となり、追加的な測定基準として、本来の分子のための３’ブレイクポイントが公知であり、同じ組合せに複数回遭遇することを事実上不可能にする。プライマー毎の以前に使用されたＵＭＩのデータベースにより、以前に取り扱った試料からの汚染をモニターすることができる。重要なことに、これらのデータは、プライバシー保護のために同定可能な情報を留めることなく保管することができる。
【０３３１】
そのようなプロトコールは、法医学または他の個体同定に使用することができる。例えば、目的の標的化された部位は、母方および父方ハプログループの割当てのためにｍｔＤＮＡおよびＹ染色体部位におけるＳＮＰおよび他のマーカーを含むことができる。ミニＳＴＲまたは他の同定領域を用いることができる。分解された試料に関して、その高コピー数および十分に特徴付けされたハプログループツリーのため、ミトコンドリアＤＮＡに目を向けることが有利な場合がよくある。
【０３３２】
そのようなプロトコールは、疾患診断学に使用することができる。例えば、目的の標的化された部位は、クレイドマーカーを含む分類学的マーカーを含むことができる。目的の標的化された部位は、病原性、ビルレンス、抵抗性、系統同定および他のマーカー等、疾患形質マーカーを含むことができる。
【０３３３】
目的の部位を使用して、対象の同一性を決定することができる。場合によっては、同一性は、状態同一性（identity by state）（ＩＢＳ）または家系同一性（identity-by-decent）（ＩＢＤ）を使用して決定することができる。異なる系統学的関係性の同定において、関係性は、Ｒ＝（ｋ０、ｋ１、ｋ２）として定義することができ、ｋｍは、ゲノムの画分にマッチし、２個体は、ｍ個のアレルを共有する。表４は、法医学において典型的に関連性がある関係性の期待値を有する。これは、次の通りにベイジアン項において公式化することができる：
【数１】
2020524491.tif 000007
【０３３４】
これを表４の期待値と組み合わせると、次の通りに尤度比検定をセットアップすることができる：
【数２】
2020524491.tif 000008
【０３３５】
有意性の尺度は、次の漸近的特性を活用することにより得られる：
【数３】
2020524491.tif 000009
式中、ｄは自由度である。
【表４】
2020524491.tif 000010
【０３３６】
ハイスループット配列決定は、現在のＳＴＲに基づく遺伝子型判定方法では手に負えない、分解された／微量の法医学試料の莫大なプールの解析を可能にすることができる。ＨＴＳによって生成されたＳＮＰデータは、研究の手掛かりの生成に使用することができる祖先および表現型予測を含む、ＳＴＲプロファイルにはない情報も含有する。したがって、本明細書に開示される方法は、部分的なＣＯＤＩＳプロファイルが生成され得るまたは生成されない試料の補足として機能することができ、ＣＯＤＩＳデータベースにおいてマッチが見出されない場合に、研究の手掛かりのための追加的なデータを加えることができる。しかし、法医学コミュニティが、ＨＴＳへと移行するには、可能な最も効率的、安価かつ標的化された仕方で、ＳＮＰデータを収集および解析するためのツールを必要とする。本明細書に開示される方法は、より短いＤＮＡ断片における抽出方法に着目し、配列決定を目的の部位に標的化し、続いて強い統計解析によって後援される合理化されたインフォマティクスパイプラインにより解析することにより、高度に分解された試料を検査する信頼のおける仕方を与えることができる。
【０３３７】
例示的組成物
一実施形態では、核酸断片、ニッカーゼ核酸ガイド化ヌクレアーゼ−ｇＮＡ複合体および標識ヌクレオチドを含む組成物が本明細書で提供される。例示的な一実施形態では、核酸断片、ニッカーゼＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体および標識ヌクレオチドを含む組成物が本明細書で提供される。そのような実施形態では、核酸はＤＮＡを含むことができる。ヌクレオチドは、例えばビオチンで標識することができる。ヌクレオチドは、抗体−コンジュゲート対の一部であってよい。
【０３３８】
一実施形態では、核酸断片および触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ−ｇＮＡ複合体を含む組成物であって、触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼはトランスポザーゼに融合されている、組成物が本明細書で提供される。例示的な一実施形態では、ＤＮＡ断片およびｄＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体を含む組成物であって、ｄＣａｓ９はトランスポザーゼに融合されている、組成物が本明細書で提供される。
【０３３９】
一実施形態では、メチル化ヌクレオチドを含む核酸断片、ニッカーゼ核酸ガイド化ヌクレアーゼ−ｇＮＡ複合体、およびメチル化されていないヌクレオチドを含む組成物が本明細書で提供される。例示的な一実施形態では、メチル化ヌクレオチドを含むＤＮＡ断片、ニッカーゼＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体およびメチル化されていないヌクレオチドを含む組成物が本明細書で提供される。
【０３４０】
一実施形態では、核酸ガイド化ＤＮＡエンドヌクレアーゼと複合体を形成したｇＤＮＡが本明細書で提供される。例示的な実施形態では、核酸ガイド化ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ＮｇＡｇｏである。
【０３４１】
一実施形態では、核酸ガイド化ＲＮＡエンドヌクレアーゼと複合体を形成したｇＤＮＡが本明細書で提供される。
【０３４２】
一実施形態では、核酸ガイド化ＤＮＡエンドヌクレアーゼと複合体を形成したｇＲＮＡが本明細書で提供される。
【０３４３】
一実施形態では、核酸ガイド化ＲＮＡエンドヌクレアーゼと複合体を形成したｇＲＮＡが本明細書で提供される。一実施形態では、核酸ガイド化ＲＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃ２ｃ２を含む。
【０３４４】
一実施形態では、本開示の方法によって産生または設計されるｇＮＡの収集物が、本明細書に提供される。
【０３４５】
キットおよび製造品
本願は、アダプタ、ｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）、ｇＮＡ収集物（例えば、ｇＲＮＡ収集物）、ｇＮＡ収集物をコードする核酸分子その他に限定されない、本明細書に記載されている組成物のうち任意の１種または複数を含むキットを提供する。
【０３４６】
例示的な一実施形態では、キットは、ｇＲＮＡのライブラリーとなるように転写することができるＤＮＡ分子の収集物を含み、ｇＲＮＡは、ヒトゲノムまたは他の供給源のＤＮＡ配列へと標的化される。
【０３４７】
一実施形態では、キットは、ｇＮＡの収集物を含み、ｇＮＡは、ヒトゲノムまたは他の供給源のＤＮＡ配列へと標的化される。
【０３４８】
一部の実施形態では、本明細書に記載されているｇＮＡをコードする核酸の収集物のいずれかを含むキットが、本明細書に提供される。一部の実施形態では、本明細書に記載されているｇＮＡの収集物のいずれかを含むキットが、本明細書に提供される。
【０３４９】
本願は、本明細書に記載されているｇＮＡおよびｇＮＡをコードする核酸の収集物を作製する方法を実施するための、あらゆる必須の試薬および説明書も提供する。一部の実施形態では、本明細書に記載されている個々のｇＮＡおよびｇＮＡの収集物を作製する方法を実施するための、あらゆる必須の試薬および説明書を含むキットが、本明細書に提供される。
【０３５０】
本明細書で生成されるｇＮＡ収集物と試料とを接触させる前後の情報をモニターするためのコンピュータソフトウェアも、本明細書に提供されている。例示的な一実施形態では、ソフトウェアは、オフターゲット標的化が生じないこと確実にするために、ｇＮＡ収集物を提供する前後の試料における非標的配列の存在量を算出および報告することができ、ソフトウェアは、試料へとｇＮＡ収集物を提供する前後の標的配列の存在量を比較することにより、標的化された枯渇／濃縮／捕捉／分配／標識／調節／編集の有効性をチェックすることができる。
【０３５１】
以下の実施例は例示目的のために含まれ、本発明の範囲を限定するものではない。
【０３５２】
実施形態の列挙
本発明は、次に列挙される図解的な実施形態を参照することにより定義することができる：
【０３５３】
実施形態１．  核酸の収集物を作製する方法であって、
（ａ）核酸ガイド化ヌクレアーゼのＰＡＭ部位をそれぞれ含む標的核酸を得るステップと、
（ｂ）第１のプライマーを前記標的核酸の前記ＰＡＭ部位にハイブリダイズさせるステップであって、前記第１のプライマーが、（ｉ）前記ＰＡＭ部位に相補的なＭＡＰ部位、（ｉｉ）前記核酸ガイド化ヌクレアーゼの認識部位に相補的な相補的認識部位、および（ｉｉｉ）プロモーター部位に相補的な相補的プロモーター部位を含む、ステップと、
（ｃ）鋳型として前記標的核酸を使用して、前記第１のプライマーを伸長させるステップであって、これによって、前記第１のプライマーの配列および前記標的核酸に相補的な配列を含む第１の伸長産物を産生するステップと、
（ｄ）第２のプライマーを前記第１の伸長産物にハイブリダイズさせるステップと、
（ｅ）鋳型として前記第１の伸長産物を使用して、前記第２のプライマーを伸長させるステップであって、これによって、前記ＰＡＭ部位、前記認識部位および前記プロモーター部位を含む第２の伸長産物を産生するステップと
を含む方法。
【０３５４】
実施形態２．  前記第２のプライマーが、（ｉ）前記核酸ガイド化ヌクレアーゼのＰＡＭ部位、および（ｉｉ）ランダム配列を含む、実施形態１に記載の方法。
【０３５５】
実施形態３．  前記ランダム配列が、約６〜約８塩基長の間である、実施形態２に記載の方法。
【０３５６】
実施形態４．  前記第１のプライマーが、制限酵素の制限酵素部位をさらに含む、実施形態１に記載の方法。
【０３５７】
実施形態５．  （ｆ）アダプタを前記第２の伸長産物にライゲーションするステップであって、前記アダプタが、制限酵素の制限酵素部位を含む、ステップと、
（ｇ）前記ＰＡＭ部位および前記制限部位が、前記認識部位から切断されるように、前記制限酵素で前記第２の伸長産物を切断するステップと
をさらに含む、実施形態１に記載の方法。
【０３５８】
実施形態６．  前記制限酵素が、ＭｍｅＩ、ＦｏｋＩまたはＭｌｙＩを含む、実施形態４または実施形態５に記載の方法。
【０３５９】
実施形態７．  結合していない第１のプライマーまたは結合していない第２のプライマーを除去するステップをさらに含む、実施形態１に記載の方法。
【０３６０】
実施形態８．  前記第１のプライマーを伸長させる前記ステップまたは前記第２のプライマーを伸長させる前記ステップが、標識されたヌクレオチドにより行われる、実施形態１に記載の方法。
【０３６１】
実施形態９．  前記標識されたヌクレオチドが、ビオチン化ヌクレオチドを含む、実施形態８に記載の方法。
【０３６２】
実施形態１０．  前記認識部位が、約２０ヌクレオチドの長さである、実施形態１に記載の方法。
【０３６３】
実施形態１１．  前記認識部位が、約１５〜約２５ヌクレオチドの長さである、実施形態１に記載の方法。
【０３６４】
実施形態１２．  前記核酸ガイド化ヌクレアーゼが、Ｃａｓ系タンパク質を含む、実施形態１に記載の方法。
【０３６５】
実施形態１３．  前記核酸ガイド化ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９系タンパク質を含む、実施形態１に記載の方法。
【０３６６】
実施形態１４．  前記標的核酸が、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む、実施形態１に記載の方法。
【０３６７】
実施形態１５．  前記標的核酸が、ヒトＤＮＡを含む、実施形態１に記載の方法。
【０３６８】
実施形態１６．  前記標的核酸が、宿主ＤＮＡを含む、実施形態１に記載の方法。
【０３６９】
実施形態１７．  前記標的核酸が、真核生物ＤＮＡを含む、実施形態１に記載の方法。
【０３７０】
実施形態１８．  前記相補的認識部位が、少なくとも１個の改変された核酸結合を含む、実施形態１に記載の方法。
【０３７１】
実施形態１９．  前記改変された核酸結合が、ロックド核酸（ＬＮＡ）、架橋された核酸（ＢＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ジップ核酸（ＺＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）およびホスホロチオエート（ＰＴＯ）からなる群から選択される、実施形態１８に記載の方法。
【０３７２】
実施形態２０．  前記プロモーター部位を使用して、前記第２の伸長産物を転写するステップをさらに含む、実施形態１に記載の方法。
【０３７３】
実施形態２１．  核酸の収集物を作製する方法であって、
（ａ）核酸ガイド化ヌクレアーゼのＰＡＭ部位をそれぞれ含む標的核酸を得るステップと、
（ｂ）プライマーを前記標的核酸の前記ＰＡＭ部位にハイブリダイズさせるステップであって、前記プライマーが、（ｉ）前記ＰＡＭ部位に相補的なＭＡＰ部位、（ｉｉ）前記核酸ガイド化ヌクレアーゼの認識部位に相補的な相補的認識部位、および（ｉｉｉ）プロモーター部位に相補的な相補的プロモーター部位を含む、ステップと、
（ｃ）鋳型として前記標的核酸を使用して、前記プライマーを伸長させるステップであって、これによって、前記ＰＡＭ部位、前記認識部位および前記プロモーター部位を含む伸長産物を産生するステップと、
（ｄ）前記標的核酸をニッキングするステップと、
（ｅ）前記ニッキングされた標的核酸を消化するステップと
を含む方法。
【０３７４】
実施形態２２．  前記伸長産物に、前記核酸ガイド化ヌクレアーゼのステムループ配列またはその相補体を含む核酸をライゲーションするステップをさらに含む、実施形態２１に記載の方法。
【０３７５】
実施形態２３．  互い違いになっている二本鎖ステムループを前記伸長産物に付加するステップをさらに含む、実施形態２１に記載の方法。
【０３７６】
実施形態２４．  前記プロモーター部位を使用して、前記伸長産物を転写するステップをさらに含む、実施形態２１に記載の方法。
【０３７７】
実施形態２５．  結合していないプライマーを除去するステップをさらに含む、実施形態２１に記載の方法。
【０３７８】
実施形態２６．  前記プライマーを伸長させる前記ステップが、標識されたヌクレオチドにより行われる、実施形態２１に記載の方法。
【０３７９】
実施形態２７．  前記標識されたヌクレオチドが、ビオチン化ヌクレオチドを含む、実施形態２６に記載の方法。
【０３８０】
実施形態２８．  前記相補的認識部位が、約２０ヌクレオチドの長さである、実施形態２１に記載の方法。
【０３８１】
実施形態２９．  前記相補的認識部位が、約１５〜約２５ヌクレオチドの長さである、実施形態２１に記載の方法。
【０３８２】
実施形態３０．  前記核酸ガイド化ヌクレアーゼが、Ｃａｓ系タンパク質を含む、実施形態２１に記載の方法。
【０３８３】
実施形態３１．  前記核酸ガイド化ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９系タンパク質を含む、実施形態２１に記載の方法。
【０３８４】
実施形態３２．  前記標的核酸が、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む、実施形態２１に記載の方法。
【０３８５】
実施形態３３．  前記標的核酸が、ヒトＤＮＡを含む、実施形態２１に記載の方法。
【０３８６】
実施形態３４．  前記標的核酸が、宿主ＤＮＡを含む、実施形態２１に記載の方法。
【０３８７】
実施形態３５．  前記標的核酸が、真核生物ＤＮＡを含む、実施形態２１に記載の方法。
【０３８８】
実施形態３６．  前記相補的認識部位が、少なくとも１個の改変された核酸結合を含む、実施形態２１に記載の方法。
【０３８９】
実施形態３７．  前記改変された核酸結合が、ロックド核酸（ＬＮＡ）、架橋された核酸（ＢＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ジップ核酸（ＺＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）およびホスホロチオエート（ＰＴＯ）からなる群から選択される、実施形態３６に記載の方法。
【０３９０】
実施形態３８．  核酸の収集物を作製する方法であって、
（ａ）核酸ガイド化ヌクレアーゼのＰＡＭ部位をそれぞれ含む標的核酸を得るステップと、
（ｂ）第１のループアダプタを前記標的核酸の両末端にライゲーションするステップであって、前記第１のループアダプタが、プロモーター部位を含む、ステップと、
（ｃ）前記ＰＡＭ部位で前記標的核酸を切断するステップであって、これによって、第１の末端における前記第１のループアダプタおよび第２の末端におけるＰＡＭ部位のうち１つをそれぞれ含むＤＮＡ切断産物を産生するステップと、
（ｄ）第２のループアダプタを前記切断産物の前記第２の末端にライゲーションするステップであって、前記第２のループアダプタが、前記核酸ガイド化ヌクレアーゼのステムループ配列に相補的な相補的ステムループ配列を含む、ステップと、
（ｅ）前記切断産物を増幅し、これにより、前記プロモーター部位、認識部位および前記ステムループ配列を含む増幅産物を産生するステップであって、前記認識部位が、前記標的核酸の１つにおいて前記ＰＡＭ部位に隣接した配列を含む、ステップと
を含む方法。
【０３９１】
実施形態３９．  ガイド核酸の収集物を作製する方法であって、
（ａ）標的核酸の配列リード配列リードを得るステップと、
（ｂ）前記配列リードを少なくとも１つの参照配列にマッピングするステップと、
（ｃ）前記配列リードの存在量値を決定するステップと、
（ｄ）前記配列リードから認識部位を同定するステップであって、前記認識部位が、核酸ガイド化ヌクレアーゼのＰＡＭ部位に隣接する、ステップと、
（ｅ）前記存在量値に基づき前記認識部位を選別するステップと
を含む方法。
【０３９２】
実施形態４０．  前記ガイド核酸の収集物を合成するステップをさらに含み、前記ガイド核酸が、前記核酸ガイド化ヌクレアーゼの前記認識部位およびステムループ配列のうち１つをそれぞれ含む、実施形態３９に記載の方法。
【０３９３】
実施形態４１．  前記ガイド核酸の収集物が、上位１００個の選別された認識部位、上位１０００個の選別された認識部位、または上位１０，０００個の選別された認識部位を有するガイド核酸を含む、実施形態４０に記載の方法。
【０３９４】
実施形態４２．  前記認識部位が、少なくとも１００塩基対、少なくとも２００塩基対、少なくとも５００塩基対または少なくとも１０００塩基対だけ、前記少なくとも１つの参照配列において互いに間隔をあけるように、前記認識部位をフィルタリングするステップをさらに含む、実施形態３９に記載の方法。
【０３９５】
実施形態４３．  前記認識部位を選別する前記ステップが、前記配列リードを選別することにより行われる、実施形態３９に記載の方法。
【０３９６】
実施形態４４．  前記認識部位が、約２０塩基を含む、実施形態３９に記載の方法。
【０３９７】
実施形態４５．  前記核酸ガイド化ヌクレアーゼが、Ｃａｓ系タンパク質を含む、実施形態３９に記載の方法。
【０３９８】
実施形態４６．  前記核酸の標的部位が、前記ＰＡＭ部位の５’に位置し、前記認識部位が、ステムループ配列の５’にある、実施形態３９に記載の方法。
【０３９９】
実施形態４７．  前記ＰＡＭ部位が、ＮＧＧまたはＮＡＧを含む、実施形態４６に記載の方法。
【０４００】
実施形態４８．  前記核酸ガイド化ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９系タンパク質を含む、実施形態４７に記載の方法。
【０４０１】
実施形態４９．  前記核酸の標的部位が、前記ＰＡＭ部位の３’に位置し、前記認識部位が、ステムループ配列の３’にある、実施形態３９に記載の方法。
【０４０２】
実施形態５０．  前記ＰＡＭ部位が、ＴＴＮ、ＴＣＮまたはＴＧＮを含む、実施形態４９に記載の方法。
【０４０３】
実施形態５１．  前記核酸ガイド化ヌクレアーゼが、Ｃｐｆ１系タンパク質を含む、実施形態５０記載の方法。
【０４０４】
実施形態５２．  前記核酸ガイド化ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９系タンパク質を含む、実施形態３９に記載の方法。
【０４０５】
実施形態５３．  前記標的核酸が、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む、実施形態３９に記載の方法。
【０４０６】
実施形態５４．  前記標的核酸が、ヒトＤＮＡを含む、実施形態３９に記載の方法。
【０４０７】
実施形態５５．  前記標的核酸が、宿主ＤＮＡを含む、実施形態３９に記載の方法。
【０４０８】
実施形態５６．  前記標的核酸が、真核生物ＤＮＡを含む、実施形態３９に記載の方法。
【０４０９】
実施形態５７．  前記ガイド核酸を基材に結合させるステップをさらに含む、実施形態３９に記載の方法。
【０４１０】
実施形態５８．  前記基材が、フローセル、流体チャネル、マイクロ流体チャネルまたはビーズを含む、実施形態５７に記載の方法。
【０４１１】
実施形態５９．  ガイド核酸の収集物を作製する方法であって、
（ａ）標的核酸の配列リードを得るステップと、
（ｂ）前記配列リードから最も高頻度の認識部位を決定するステップであって、認識部位が、核酸ガイド化ヌクレアーゼのＰＡＭ部位に隣接する、ステップと、
（ｃ）前記配列リードからその次に高頻度の認識部位を決定するステップと、
（ｄ）条件が満たされるまでステップｃを反復するステップであって、前記条件が、（ｉ）設定された数の認識部位が決定されること、（ｉｉ）さらなる認識部位を決定することができないこと、（ｉｉｉ）設定されたパーセンテージの前記標的核酸が、前記認識部位によって網羅されること、（ｉｖ）前記認識部位におけるまたはその近傍における前記標的核酸の切断が、設定されたサイズを下回る最大断片サイズを生じること、からなる群から選択される、ステップと
を含む方法。
【０４１２】
実施形態６０．  前記設定された数の認識部位が、少なくとも約１００、少なくとも約１０００または少なくとも約１０，０００個である、実施形態５９に記載の方法。
【０４１３】
実施形態６１．  前記設定されたパーセンテージが、少なくとも約１０％、少なくとも約３０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％である、実施形態５９に記載の方法。
【０４１４】
実施形態６２．  前記設定されたサイズが、多くても約１０００ｂｐ、多くても約５００ｂｐ、多くても約２００ｂｐまたは多くても約１００ｂｐである、実施形態５９に記載の方法。
【０４１５】
実施形態６３．  前記ガイド核酸の収集物を合成するステップをさらに含み、前記ガイド核酸が、前記核酸ガイド化ヌクレアーゼの前記認識部位およびステムループ配列のうち１つをそれぞれ含む、実施形態５９に記載の方法。
【０４１６】
実施形態６４．  前記認識部位が、約２０塩基を含む、実施形態５９に記載の方法。
【０４１７】
実施形態６５．  前記核酸ガイド化ヌクレアーゼが、Ｃａｓ系タンパク質を含む、実施形態５９に記載の方法。
【０４１８】
実施形態６６．  前記核酸の標的部位が、前記ＰＡＭ部位の５’に位置し、前記認識部位が、ステムループ配列の５’にある、実施形態５９に記載の方法。
【０４１９】
実施形態６７．  前記ＰＡＭ部位が、ＮＧＧまたはＮＡＧを含む、実施形態６６に記載の方法。
【０４２０】
実施形態６８．  前記核酸ガイド化ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９系タンパク質を含む、実施形態６７に記載の方法。
【０４２１】
実施形態６９．  前記核酸の標的部位が、前記ＰＡＭ部位の３’に位置し、前記認識部位が、ステムループ配列の３’にある、実施形態５９に記載の方法。
【０４２２】
実施形態７０．  前記ＰＡＭ部位が、ＴＴＮ、ＴＣＮまたはＴＧＮを含む、実施形態６９に記載の方法。
【０４２３】
実施形態７１．  前記核酸ガイド化ヌクレアーゼが、Ｃｐｆ１系タンパク質を含む、実施形態７０記載の方法。
【０４２４】
実施形態７２．  前記標的核酸が、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む、実施形態５９に記載の方法。
【０４２５】
実施形態７３．  前記標的核酸が、ヒトＤＮＡを含む、実施形態５９に記載の方法。
【０４２６】
実施形態７４．  前記標的核酸が、宿主ＤＮＡを含む、実施形態５９に記載の方法。
【０４２７】
実施形態７５．  前記標的核酸が、真核生物ＤＮＡを含む、実施形態５９に記載の方法。
【０４２８】
実施形態７６．  前記ガイド核酸を基材に結合させるステップをさらに含む、実施形態５９に記載の方法。
【０４２９】
実施形態７７．  前記基材が、フローセル、流体チャネル、マイクロ流体チャネルまたはビーズを含む、実施形態７６に記載の方法。
【０４３０】
実施形態７８．  ガイド核酸の収集物を含む組成物であって、
各ガイド核酸が、核酸ガイド化ヌクレアーゼの認識部位およびステムループ配列を含み、
各認識部位が、前記核酸ガイド化ヌクレアーゼのＰＡＭ部位に隣接する標的核酸の標的部位に相補的であり、
前記ガイド核酸の収集物の前記認識部位が相補的である前記標的部位が、約１０，０００塩基対未満の平均間隔で、前記標的核酸内に分布される、
組成物。
【０４３１】
実施形態７９．  前記平均間隔が、約５，０００塩基対未満、約２，５００塩基対未満、約１，０００塩基対未満、約５００塩基対未満、約２５０塩基対未満または約１００塩基対未満である、実施形態７８に記載の組成物。
【０４３２】
実施形態８０．  前記ガイド核酸の収集物が、少なくとも約１００種の異なる認識部位、少なくとも１，０００種の異なる認識部位、少なくとも１０，０００種の異なる認識部位、少なくとも１００，０００種の異なる認識部位、または少なくとも１，０００，００種の異なる認識部位を有するガイド核酸を含む、実施形態７８に記載の組成物。
【０４３３】
実施形態８１．  前記認識部位が、約２０塩基を含む、実施形態７８に記載の組成物。
【０４３４】
実施形態８２．  前記核酸の標的部位が、前記ＰＡＭ部位の５’に位置し、前記認識部位が、ステムループ配列の５’にある、実施形態７８に記載の組成物。
【０４３５】
実施形態８３．  前記ＰＡＭ部位が、ＮＧＧまたはＮＡＧを含む、実施形態８２に記載の組成物。
【０４３６】
実施形態８４．  前記核酸ガイド化ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９系タンパク質を含む、実施形態８３に記載の組成物。
【０４３７】
実施形態８５．  前記核酸の標的部位が、前記ＰＡＭ部位の３’に位置し、前記認識部位が、ステムループ配列の３’にある、実施形態７８に記載の組成物。
【０４３８】
実施形態８６．  前記ＰＡＭ部位が、ＴＴＮ、ＴＣＮまたはＴＧＮを含む、実施形態８５に記載の組成物。
【０４３９】
実施形態８７．  前記核酸ガイド化ヌクレアーゼが、Ｃｐｆ１系タンパク質を含む、実施形態８６記載の組成物。
【０４４０】
実施形態８８．  前記標的核酸が、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む、実施形態７８に記載の組成物。
【０４４１】
実施形態８９．  前記標的核酸が、ヒトＤＮＡを含む、実施形態７８に記載の組成物。
【０４４２】
実施形態９０．  前記標的核酸が、宿主ＤＮＡを含む、実施形態７８に記載の組成物。
【０４４３】
実施形態９１．  前記標的核酸が、真核生物ＤＮＡを含む、実施形態７８に記載の組成物。
【０４４４】
実施形態９２．  前記ガイド核酸が基材に結合している、実施形態７８に記載の組成物。
【０４４５】
実施形態９３．  前記基材が、フローセル、流体チャネル、マイクロ流体チャネルまたはビーズを含む、実施形態９２に記載の組成物。
【０４４６】
実施形態９４．  標的核酸を枯渇させる方法であって、
（ａ）標的核酸および非標的核酸を含む核酸を得るステップと、
（ｂ）前記標的核酸が、標的部位においてまたはその近傍で切断されるように、前記標的核酸を、実施形態７８から９１のいずれか一項に記載の収集物のガイド核酸と複合体形成した核酸ガイド化ヌクレアーゼの複合体と接触させるステップと
を含む方法。
【０４４７】
実施形態９５．  前記非標的核酸が、免疫応答シグナル核酸を含む、実施形態９４に記載の方法。
【０４４８】
実施形態９６．  前記非標的核酸が、アポトーシスシグナル核酸を含む、実施形態９４に記載の方法。
【０４４９】
実施形態９７．  前記非標的核酸が、がん関係のアポトーシスシグナル核酸を含む、実施形態９４に記載の方法。
【０４５０】
実施形態９８．  核酸ガイド化ヌクレアーゼの前記複合体が、基材に結合している、実施形態９４に記載の方法。
【０４５１】
実施形態９９．  前記基材が、フローセル、流体チャネル、マイクロ流体チャネルまたはビーズを含む、実施形態９８に記載の方法。
【０４５２】
実施形態１００．  標的核酸を枯渇させる方法であって、
（ａ）標的核酸および非標的核酸を含む核酸を得るステップと、
（ｂ）前記標的核酸がニック部位でニッキングされるように、前記核酸を核酸ガイド化ニッカーゼタンパク質−ｇＮＡ複合体と接触させるステップであって、前記ｇＮＡが、５’ステムループ配列および３’標的化配列を含む、ステップと、
（ｃ）前記ニック部位でニックトランスレーションを行うステップであって、前記ニックトランスレーションが、標識されたヌクレオチドにより行われる、ステップと、
（ｄ）前記標識されたヌクレオチドを有する前記標的核酸を捕捉するステップと、
（ｅ）前記非標的核酸から前記標的核酸を分離するステップと
を含む方法。
【０４５３】
実施形態１０１．  前記標識されたヌクレオチドが、ビオチン化ヌクレオチドを含む、実施形態１００に記載の方法。
【０４５４】
実施形態１０２．  前記標的核酸が、基材に結合させることにより捕捉される、実施形態１００に記載の方法。
【０４５５】
実施形態１０３．  前記基材が、フローセル、流体チャネル、マイクロ流体チャネルまたはビーズを含む、実施形態１０２に記載の方法。
【０４５６】
実施形態１０４．  前記非標的核酸を解析するステップをさらに含む、実施形態１００に記載の方法。
【０４５７】
実施形態１０５．  前記解析ステップが、配列決定を含む、実施形態１０４に記載の方法。
【０４５８】
実施形態１０６．  前記解析ステップが、ハイブリダイゼーションを含む、実施形態１０４に記載の方法。
【０４５９】
実施形態１０７．  前記標的核酸が、宿主に由来し、前記非標的核酸が、非宿主に由来する、実施形態１００に記載の方法。
【０４６０】
実施形態１０８．  前記非宿主が、感染病原体を含む、実施形態１０７に記載の方法。
【０４６１】
実施形態１０９．  前記核酸ガイド化ニッカーゼタンパク質が、Ｃｐｆ１系ニッカーゼタンパク質を含む、実施形態１００に記載の方法。
【０４６２】
実施形態１１０．  前記Ｃｐｆ１系ニッカーゼタンパク質が、ＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａまたはＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓから単離されるまたはこれに由来するＣｐｆ１系タンパク質を含む、実施形態１０９に記載の方法。
【０４６３】
実施形態１１１．  前記標的核酸が、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む、実施形態１００に記載の方法。
【０４６４】
実施形態１１２．  前記標的核酸が、ヒトＤＮＡを含む、実施形態１００に記載の方法。
【０４６５】
実施形態１１３．  前記標的核酸が、真核生物ＤＮＡを含む、実施形態１００に記載の方法。
【０４６６】
実施形態１１４．  標的核酸を枯渇させる方法であって、
（ａ）標的核酸および非標的核酸を含む核酸を得るステップであって、前記核酸が、第１の末端にヘアピンループを含む、ステップと、
（ｂ）ループアダプタを前記核酸の第２の末端にハイブリダイズさせるステップと、
（ｃ）前記標的核酸がニッキングされるように、前記核酸を核酸ガイド化ニッカーゼタンパク質と接触させるステップと、
（ｄ）ニッキングされた標的核酸を消化するステップと
を含む方法。
【０４６７】
実施形態１１５．  前記非標的核酸の前記ループアダプタを切断するステップをさらに含む、実施形態１１４に記載の方法。
【０４６８】
実施形態１１６．  前記切断ステップが、前記ループアダプタの制限部位で行われる、実施形態１１５に記載の方法。
【０４６９】
実施形態１１７．  前記切断ステップが、前記ループアダプタの核酸ガイド化ヌクレアーゼ認識部位で行われる、実施形態１１５に記載の方法。
【０４７０】
実施形態１１８．  前記非標的核酸を解析するステップをさらに含む、実施形態１１７に記載の方法。
【０４７１】
実施形態１１９．  前記解析ステップが、配列決定を含む、実施形態１１８に記載の方法。
【０４７２】
実施形態１２０．  前記解析ステップが、ハイブリダイゼーションを含む、実施形態１１８に記載の方法。
【０４７３】
実施形態１２１．  前記消化ステップが、エキソヌクレアーゼにより行われる、実施形態１１４に記載の方法。
【０４７４】
実施形態１２２．  前記核酸ガイド化ニッカーゼタンパク質が、基材に結合している、実施形態１１４に記載の方法。
【０４７５】
実施形態１２３．  前記基材が、フローセル、流体チャネル、マイクロ流体チャネルまたはビーズを含む、実施形態１２２に記載の方法。
【０４７６】
実施形態１２４．  配列決定ライブラリーを調製する方法であって、
（ａ）実施形態１００から１２３のいずれか一項に記載の枯渇方法または捕捉方法を経た後に得られる、目的の部位を含むＤＮＡ分子を提供するステップと、
（ｂ）３’末端をポリメラーゼによって伸長することができないように、前記ＤＮＡ分子の３’末端をブロックするステップと、
（ｃ）第１のプライマーを前記ＤＮＡ分子にハイブリダイズさせるステップと、
（ｄ）前記第１のプライマーを伸長させて、前記第１のプライマーの配列および前記目的の部位の配列を含む伸長産物を生じるステップと、
（ｅ）第２のプライマーを前記伸長産物にハイブリダイズさせるステップと、
（ｆ）前記第２のプライマーを使用して、前記伸長産物を増幅するステップと
を含む方法。
【０４７７】
実施形態１２５．  前記第２のプライマーをハイブリダイズさせる前記ステップに先立ち、テイルを前記伸長産物に付加するステップをさらに含む、実施形態１２４に記載の方法。
【０４７８】
実施形態１２６．  前記第２のプライマーが、前記テイルにハイブリダイズされる、実施形態１２５に記載の方法。
【０４７９】
実施形態１２７．  ステップｄの後に、ステップｃおよびｄを反復するステップをさらに含む、実施形態１２４に記載の方法。
【０４８０】
実施形態１２８．  前記第２のプライマーをハイブリダイズさせる前記ステップに先立ち、ハイブリダイズしていない第１のプライマーを除去するステップをさらに含む、実施形態１２４に記載の方法。
【０４８１】
実施形態１２９．  前記除去ステップが、消化を含む、実施形態１２８に記載の方法。
【０４８２】
実施形態１３０．  前記消化が、エキソヌクレアーゼ消化を含む、実施形態１２９に記載の方法。
【０４８３】
実施形態１３１．  前記除去ステップが、前記伸長産物中に取り込まれた標識されたヌクレオチドを結合させるステップを含む、実施形態１２８に記載の方法。
【０４８４】
実施形態１３２．  前記標識されたヌクレオチドが、ビオチン化ヌクレオチドを含む、実施形態１３１に記載の方法。
【０４８５】
実施形態１３３．  前記第１のプライマーおよび／または前記第２のプライマーが、配列決定アダプタ配列を含む、実施形態１２４に記載の方法。
【０４８６】
実施形態１３４．  前記目的の部位が、一塩基多型（ＳＮＰ）を含む、実施形態１２４に記載の方法。
【０４８７】
実施形態１３５．  前記目的の部位が、短いタンデム反復（ＳＴＲ）を含む、実施形態１２４に記載の方法。
【０４８８】
実施形態１３６．  前記ＳＴＲが、ミニＳＴＲである、実施形態１３５に記載の方法。
【０４８９】
実施形態１３７．  配列決定ライブラリーを調製する方法であって、
（ａ）ｇＮＡ枯渇または捕捉方法に起因するＲＮＡ分子を提供するステップと、
（ｂ）第１のハイブリダイゼーション部位を前記ＲＮＡ分子に付着させるステップと、
（ｃ）第１のオリゴヌクレオチドを前記第１のハイブリダイゼーション部位にハイブリダイズさせるステップと、
（ｄ）プライマーとして前記第１のオリゴヌクレオチドを使用して、前記ＲＮＡ分子の少なくとも一部を逆転写するステップであって、これによって、ｃＤＮＡを生成するステップと、
（ｅ）第２のオリゴヌクレオチドを前記ｃＤＮＡのテイルにハイブリダイズさせるステップと、
（ｆ）プライマーとして前記第２のオリゴヌクレオチドおよび／または前記第１のオリゴヌクレオチドを使用して、前記ｃＤＮＡを増幅するステップと
を含む方法。
【０４９０】
実施形態１３８．  前記第１のハイブリダイゼーション部位が、テイルを含む、実施形態１３７に記載の方法。
【０４９１】
実施形態１３９．  前記第１のハイブリダイゼーション部位が、ポリＡテイルを含む、実施形態１３７に記載の方法。
【０４９２】
実施形態１４０．  前記第１のオリゴヌクレオチドが、少なくとも１個のバーコード配列を含む、実施形態１３７に記載の方法。
【０４９３】
実施形態１４１．  前記第２のオリゴヌクレオチドが、少なくとも１個のバーコード配列を含む、実施形態１３７に記載の方法。
【０４９４】
実施形態１４２．  前記第１のオリゴヌクレオチドおよび／または前記第２のオリゴヌクレオチドが、（ｉ）所与のＲＮＡ分子に特有の、特有の分子識別子配列、および（ｉｉ）同じ供給源由来のＲＮＡ分子の間で共有される、供給源バーコード配列からなる群から選択される１個または複数のバーコード配列を含む、実施形態１３７に記載の方法。
【０４９５】
実施形態１４３．  前記第１のオリゴヌクレオチドおよび／または前記第２のオリゴヌクレオチドが、配列決定アダプタ配列を含む、実施形態１３７に記載の方法。
【０４９６】
実施形態１４４．  核酸の収集物を作製する方法であって、
（ａ）ＤＮＡ試料を制限エンドヌクレアーゼで消化して、ＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、
（ｂ）前記ＤＮＡ断片の収集物をヌクレアーゼで処理するステップと、
（ｃ）第１のアダプタを前記ＤＮＡ断片の収集物にライゲーションして、第１のアダプタＤＮＡ断片の収集物を産生するステップであって、
前記第１のアダプタをコードする配列が、ＭｍｅＩ制限部位およびＦｏｋＩ制限部位を含み、
前記ＭｍｅＩ部位が、ライゲーション後に前記ＦｏｋＩ部位および前記ＤＮＡ断片の間に位置する、ステップと、
（ｄ）前記第１のアダプタＤＮＡ断片の収集物を、第１にＭｍｅＩで、第２にＦｏｋＩで消化して、Ｎ２０  ＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、
（ｅ）第２のアダプタを前記Ｎ２０  ＤＮＡ断片の収集物にライゲーションするステップであって、
前記第２のアダプタをコードする配列が、プロモーター配列および核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列を含み、
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列が、前記第２のアダプタのライゲーション後に、前記Ｎ２０配列および前記プロモーターの間に位置する、ステップと
を含む方法。
【０４９７】
実施形態１４５．  前記ヌクレアーゼが、マングビーンヌクレアーゼを含む、実施形態１４４に記載の方法。
【０４９８】
実施形態１４６．  前記制限エンドヌクレアーゼが、ＭｓｅＩ、ＭｌｕＣＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＡｌｕＩ、ＤｎｐＩＩおよびＦａｔＩからなる群から選択される、実施形態１４４に記載の方法。
【０４９９】
実施形態１４７．  前記プロモーター配列が、Ｔ７プロモーター配列、ＳＰ６プロモーター配列およびＴ３プロモーター配列からなる群から選択される、実施形態１４４に記載の方法。
【０５００】
実施形態１４８．  前記第１のアダプタが、二本鎖ＤＮＡアダプタである、実施形態１４４に記載の方法。
【０５０１】
実施形態１４９．  前記第２のアダプタが、二本鎖ＤＮＡアダプタである、実施形態１４４に記載の方法。
【０５０２】
実施形態１５０．  前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質と適合性である、実施形態１４４に記載の方法。
【０５０３】
実施形態１５１．  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が、Ｃｐｆ１系タンパク質である、実施形態１５０に記載の方法。
【０５０４】
実施形態１５２．  前記ＤＮＡ試料が、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む、実施形態１４４に記載の方法。
【０５０５】
実施形態１５３．  前記ＤＮＡ試料が、ヒトＤＮＡを含む、実施形態１４４に記載の方法。
【０５０６】
実施形態１５４．  前記ＤＮＡ試料が、宿主ＤＮＡを含む、実施形態１４４に記載の方法。
【０５０７】
実施形態１５５．  前記ＤＮＡ試料が、真核生物ＤＮＡを含む、実施形態１４４に記載の方法。
【０５０８】
実施形態１５６．  核酸の収集物を作製する方法であって、
（ａ）ＤＮＡ試料における少なくとも２個の連続したアデノシンをイノシンに置き換えるステップと、
（ｂ）前記ＤＮＡ試料をヒトアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｈＡＡＧ）で処理するステップと、
（ｃ）前記ＤＮＡ試料をエンドヌクレアーゼで処理して、ＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、
（ｄ）第１のライゲーションステップにおいて第１のアダプタを前記ＤＮＡ断片の収集物にライゲーションして、第１のアダプタＤＮＡ断片の収集物を生成するステップであって、
前記第１のアダプタが、二本鎖ＤＮＡ分子および前記二本鎖ＤＮＡ分子の５’末端における５’ＮＡＡ３’の一本鎖ＤＮＡオーバーハングを含み、
前記第１のアダプタが、ＭｍｅＩ部位およびＦｏｋＩ部位を含み、
前記ＭｍｅＩ部位が、前記第１のアダプタのライゲーション後に、前記ＦｏｋＩ部位および前記ＤＮＡ断片の間に位置する、ステップと、
（ｅ）前記第１のアダプタライゲーションされた断片の収集物を、第１にＭｍｅＩで、第２にＦｏｋＩで消化して、Ｎ２０  ＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、
（ｆ）第２のライゲーションステップにおいて、第２のアダプタを前記Ｎ２０  ＤＮＡ断片の収集物にライゲーションするステップであって、
前記第２のアダプタをコードする配列が、プロモーター配列および核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列を含み、
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列が、前記第２のアダプタのライゲーション後に、前記Ｎ２０配列および前記プロモーターの間に位置する、ステップと
を含む方法。
【０５０９】
実施形態１５７．  前記エンドヌクレアーゼが、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩを含む、実施形態１５６に記載の方法。
【０５１０】
実施形態１５８．  前記プロモーター配列が、Ｔ７プロモーター配列、ＳＰ６プロモーター配列およびＴ３プロモーター配列からなる群から選択される、実施形態１５６に記載の方法。
【０５１１】
実施形態１５９．  前記第２のアダプタが、二本鎖ＤＮＡアダプタである、実施形態１５６に記載の方法。
【０５１２】
実施形態１６０．  前記第１のライゲーションステップが、高温リガーゼを使用して実行される、実施形態１５６に記載の方法。
【０５１３】
実施形態１６１．  前記第２のアダプタが、二本鎖ＤＮＡアダプタである、実施形態１５６に記載の方法。
【０５１４】
実施形態１６２．  前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質と適合性である、実施形態１５６に記載の方法。
【０５１５】
実施形態１６３．  前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、Ｃｐｆ１系タンパク質である、実施形態１６２に記載の方法。
【０５１６】
実施形態１６４．  前記ＤＮＡ試料が、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む、実施形態１５６に記載の方法。
【０５１７】
実施形態１６５．  前記ＤＮＡ試料が、ヒトＤＮＡを含む、実施形態１５６に記載の方法。
【０５１８】
実施形態１６６．  前記ＤＮＡ試料が、宿主ＤＮＡを含む、実施形態１５６に記載の方法。
【０５１９】
実施形態１６７．  前記ＤＮＡ試料が、真核生物ＤＮＡを含む、実施形態１５６に記載の方法。
【０５２０】
実施形態１６８．  核酸の収集物を作製する方法であって、
（ａ）ＤＮＡ試料における少なくとも１個のチミジンをウラシルに置き換えて、少なくとも１個の塩基対ミスマッチを含むＤＮＡ試料を産生するステップと、
（ｂ）少なくとも１種のＤＮＡ修復酵素により前記少なくとも１個のウラシルを切除して、少なくとも１塩基対の少なくとも１個の一本鎖領域を有するＤＮＡ試料を産生するステップと、
（ｃ）前記ＤＮＡ試料をヌクレアーゼで処理して、ＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、
（ｄ）第１のライゲーションステップにおいて前記ＤＮＡ断片の収集物に第１のアダプタをライゲーションして、第１のアダプタＤＮＡ断片の収集物を産生するステップであって、
前記第１のアダプタが、ＭｍｅＩ部位およびＦｏｋＩ部位を含み、
前記ＭｍｅＩ部位が、ライゲーション後に前記ＦｏｋＩ部位および前記ＤＮＡ断片の間に位置する、ステップと、
（ｅ）前記第１のアダプタＤＮＡ断片の収集物を、第１にＭｍｅＩで、第２にＦｏｋＩで消化して、Ｎ２０  ＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、
（ｆ）第２のライゲーションステップにおいて、第２のアダプタを前記Ｎ２０  ＤＮＡ断片の収集物にライゲーションするステップであって、
前記第２のアダプタをコードする配列が、プロモーター配列および核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列を含み、
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列が、ライゲーション後に前記Ｎ２０配列および前記プロモーターの間に位置する、ステップと
を含む方法。
【０５２１】
実施形態１６９．  （ｂ）前記少なくとも１個のウラシルを切除するステップの後、かつ（ｃ）前記ヌクレアーゼで処理するステップの前に、前記ＤＮＡ試料をホスファターゼで処理するステップをさらに含む、実施形態１６８に記載の方法。
【０５２２】
実施形態１７０．  少なくとも１個のｄｄＴＴＰを、前記ＤＮＡ試料における少なくとも１塩基対の前記少なくとも１個の一本鎖領域の５’にある二本鎖ＤＮＡ領域の３’末端に付加するステップをさらに含む、実施形態１６９に記載の方法。
【０５２３】
実施形態１７１．  前記ヌクレアーゼが、マングビーンヌクレアーゼを含む、実施形態１６８または１６９に記載の方法。
【０５２４】
実施形態１７２．  前記少なくとも１種のＤＮＡ修復酵素が、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）およびエンドヌクレアーゼＶＩＩＩを含む、実施形態１６８から１７０のいずれか一項に記載の方法。
【０５２５】
実施形態１７３．  前記プロモーター配列が、Ｔ７プロモーター配列、ＳＰ６プロモーター配列およびＴ３プロモーター配列からなる群から選択される、実施形態１６８に記載の方法。
【０５２６】
実施形態１７４．  前記第２のアダプタが、二本鎖ＤＮＡアダプタである、実施形態１６８に記載の方法。
【０５２７】
実施形態１７５．  前記第１のライゲーションステップが、高温リガーゼを使用して実行される、実施形態１６８に記載の方法。
【０５２８】
実施形態１７６．  前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質と適合性である、実施形態１６８に記載の方法。
【０５２９】
実施形態１７７．  前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、Ｃｐｆ１系タンパク質である、実施形態１７６に記載の方法。
【０５３０】
実施形態１７８．  前記ＤＮＡ試料が、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む、実施形態１６９に記載の方法。
【０５３１】
実施形態１７９．  前記ＤＮＡ試料が、ヒトＤＮＡを含む、実施形態１６８に記載の方法。
【０５３２】
実施形態１８０．  前記ＤＮＡ試料が、宿主ＤＮＡを含む、実施形態に記載の方法。
【０５３３】
実施形態１８１．  前記ＤＮＡ試料が、真核生物ＤＮＡを含む、実施形態１６８に記載の方法。
【０５３４】
実施形態１８２．  核酸の収集物を作製する方法であって、
（ａ）ＤＮＡ試料をランダムに断片化して、ＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、
（ｂ）第１のライゲーションステップにおいて、第１のアダプタを前記ＤＮＡ断片の収集物にライゲーションするステップであって、
前記第１のアダプタが、二本鎖ＤＮＡ分子および前記二本鎖ＤＮＡ分子の５’末端における５’ＮＡＡ３’の一本鎖ＤＮＡオーバーハングを含み、
前記第１のアダプタが、ＦｏｋＩ部位およびＭｍｅＩ部位を含み、
前記ＭｍｅＩ部位が、ライゲーション後に前記ＦｏｋＩ部位および前記ＤＮＡ断片の間に位置する、ステップと、
（ｃ）前記第１のアダプタライゲーションされた断片の収集物を、第１にＭｍｅＩで、第２にＦｏｋＩで消化して、Ｎ２０  ＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、
（ｄ）第２のライゲーションステップにおいて、第２のアダプタを前記Ｎ２０  ＤＮＡ断片の収集物にライゲーションするステップであって、
前記第２のアダプタをコードする配列が、プロモーター配列および核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列を含み、
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列が、ライゲーション後に前記Ｎ２０配列および前記プロモーターの間に位置する、ステップと
を含む方法。
【０５３５】
実施形態１８３．  前記ＤＮＡが、非特異的ニッカーゼおよびエンドヌクレアーゼによりランダムに断片化される、実施形態１８２に記載の方法。
【０５３６】
実施形態１８４．  前記エンドヌクレアーゼが、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩである、実施形態１８３に記載の方法。
【０５３７】
実施形態１８５．  前記プロモーター配列が、Ｔ７プロモーター配列、ＳＰ６プロモーター配列およびＴ３プロモーター配列からなる群から選択される、実施形態１８２に記載の方法。
【０５３８】
実施形態１８６．  前記第２のアダプタが、二本鎖ＤＮＡアダプタである、実施形態１８２に記載の方法。
【０５３９】
実施形態１８７．  前記第１のライゲーションステップが、高温リガーゼを使用して実行される、実施形態１８２に記載の方法。
【０５４０】
実施形態１８８．  前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質と適合性である、実施形態１８２に記載の方法。
【０５４１】
実施形態１８９．  前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、Ｃｐｆ１系タンパク質である、実施形態１８８に記載の方法。
【０５４２】
実施形態１９０．  前記ＤＮＡ試料が、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む、実施形態１８２に記載の方法。
【０５４３】
実施形態１９１．  前記ＤＮＡ試料が、ヒトＤＮＡを含む、実施形態１８２に記載の方法。
【０５４４】
実施形態１９２．  前記ＤＮＡ試料が、宿主ＤＮＡを含む、実施形態１８２に記載の方法。
【０５４５】
実施形態１９３．  前記ＤＮＡ試料が、真核生物ＤＮＡを含む、実施形態１８２に記載の方法。
【０５４６】
実施形態１９４．  核酸の収集物を作製する方法であって、
（ａ）ＤＮＡ試料をランダムに剪断して、ＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、
（ｂ）前記ＤＮＡ断片をメチラーゼでメチル化するステップと、
（ｃ）前記ＤＮＡ断片の収集物を末端修復して、平滑末端化されたＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、
（ｄ）第１のライゲーションステップにおいて第１のアダプタを前記平滑末端化されたＤＮＡ断片の収集物にライゲーションして、第１のアダプタＤＮＡ断片の収集物を産生するステップであって、
前記第１のアダプタが、５’から３’に、ＮｔＢｓｔＮＢＩ制限部位、前記第１のアダプタのリン酸骨格における改変された切断抵抗性結合、およびＰＡＭ配列に相補的な配列を含む、ステップと、
（ｅ）前記第１のアダプタＤＮＡ断片を制限酵素およびＮｔＢｓｔＮＢＩで消化するステップと、
（ｆ）第２のライゲーションステップにおいて第２のアダプタを前記消化された第１のアダプタＤＮＡ断片にライゲーションして、第２のアダプタＤＮＡ断片の収集物を産生するステップであって、
前記第２のアダプタが、ＦｏｋＩ部位およびＭｍｅＩ部位を含み、
前記ＭｍｅＩ部位が、ライゲーション後に前記ＦｏｋＩ部位および前記ＤＮＡ断片の間に位置する、ステップと、
（ｇ）前記第２のアダプタライゲーションされた断片の収集物を、第１にＭｍｅＩで、第２にＦｏｋＩで消化して、Ｎ２０  ＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、
（ｈ）第３のライゲーション反応において、第３のアダプタを前記Ｎ２０  ＤＮＡ断片の収集物にライゲーションするステップであって、
前記第３のアダプタをコードする配列が、プロモーター配列および核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードする配列を含み、
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列が、ライゲーション後に前記Ｎ２０配列および前記プロモーターの間に位置する、ステップと
を含む方法。
【０５４７】
実施形態１９５．  前記ランダム剪断ステップが、機械的、酵素的または化学的剪断を含む、実施形態１９４に記載の方法。
【０５４８】
実施形態１９６．  前記メチラーゼが、ＥｃｏＧＩＩ  ＤＮＡメチルトランスフェラーゼを含む、実施形態１９４に記載の方法。
【０５４９】
実施形態１９７．  前記改変された切断抵抗性結合が、ホスホロチオエート結合を含む、実施形態１９４に記載の方法。
【０５５０】
実施形態１９８．  前記ＰＡＭ部位が、Ｃｐｆ１系タンパク質と適合性であるＰＡＭ部位を含む、実施形態１９４に記載の方法。
【０５５１】
実施形態１９９．  前記ＰＡＭ部位が、ＴＴＮを含み、前記制限酵素が、ＭｌｕＣＩまたはＭｓｅＩを含む、実施形態１９４に記載の方法。
【０５５２】
実施形態２００．  前記ＰＡＭ部位が、ＴＣＮを含み、前記制限酵素が、ＤｐｎＩＩを含む、実施形態１９４に記載の方法。
【０５５３】
実施形態２０１．  前記ＰＡＭ部位が、ＴＧＮを含み、前記制限酵素が、ＦａｔＩを含む、実施形態１９４に記載の方法。
【０５５４】
実施形態２０２．  前記プロモーター配列が、Ｔ７プロモーター配列、ＳＰ６プロモーター配列およびＴ３プロモーター配列からなる群から選択される、実施形態１９４に記載の方法。
【０５５５】
実施形態２０３．  前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質と適合性である、実施形態１９４に記載の方法。
【０５５６】
実施形態２０４．  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、Ｃｐｆ１系タンパク質である、実施形態２０３に記載の方法。
【０５５７】
実施形態２０５．  前記ＤＮＡ試料が、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む、実施形態１９４に記載の方法。
【０５５８】
実施形態２０６．  前記ＤＮＡ試料が、ヒトＤＮＡを含む、実施形態１９４に記載の方法。
【０５５９】
実施形態２０７．  前記ＤＮＡ試料が、宿主ＤＮＡを含む、実施形態１９４に記載の方法。
【０５６０】
実施形態２０８．  前記ＤＮＡ試料が、真核生物ＤＮＡを含む、実施形態１９４に記載の方法。
【０５６１】
実施形態２０９．  核酸の収集物を作製する方法であって、
（ａ）ＤＮＡ試料をランダムに剪断して、ＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、
（ｂ）前記ＤＮＡ断片の収集物を末端修復して、平滑末端化されたＤＮＡ断片を産生するステップと、
（ｃ）第１のライゲーションステップにおいて第１のアダプタを前記平滑末端化されたＤＮＡ断片にライゲーションして、第１のアダプタＤＮＡ断片の収集物を産生するステップであって、
前記第１のアダプタが、５’から３’に、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ制限部位、およびＰＡＭ配列に相補的な配列を含む、ステップと、
（ｄ）前記第１のアダプタＤＮＡ断片をＮｔ．ＢｓｔＮＢＩでニッキングするステップと、
（ｅ）前記ニックから５’末端へと、３’から５’への方向で、前記第１のアダプタＤＮＡ断片のトップ鎖を分解するステップと、
（ｆ）第２のライゲーションステップにおいて第２のアダプタを前記分解された第１のアダプタＤＮＡ断片にライゲーションして、第２のアダプタＤＮＡ断片の収集物を産生するステップであって、
前記第２のアダプタが、５’から３’の向きで、ＭｌｙＩ配列、前記ＰＡＭ配列に相補的な配列、および前記ＰＡＭ配列を含む、ステップと、
（ｇ）前記第２のアダプタ断片をＭｌｙＩで消化するステップと、
（ｈ）第３のライゲーションステップにおいて第３のアダプタを前記ＭｌｙＩ消化された第２のアダプタライゲーションされた断片にライゲーションして、第３のアダプタＤＮＡ断片の収集物を産生するステップであって、
前記第３のアダプタが、ＦｏｋＩ部位およびＭｍｅＩ部位を含み、
前記ＭｍｅＩ部位が、ライゲーション後に前記ＦｏｋＩ部位および前記ＤＮＡ断片の間に位置する、ステップと、
（ｉ）前記第３のアダプタＤＮＡ断片の収集物を、第１にＭｍｅＩで、第２にＦｏｋＩで消化して、Ｎ２０  ＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、
（ｊ）第４のライゲーション反応において、第４のアダプタを前記Ｎ２０  ＤＮＡ断片の収集物にライゲーションするステップであって、
前記第４のアダプタをコードする配列が、プロモーター配列および核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列を含み、
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列が、ライゲーション後に前記Ｎ２０配列および前記プロモーターの間に位置する、ステップと
を含む方法。
【０５６２】
実施形態２１０．  前記第２のアダプタが、一本鎖ＤＮＡ分子である、実施形態２０９に記載の方法。
【０５６３】
実施形態２１１．  前記第３のアダプタが、二本鎖ＤＮＡ分子である、実施形態２０９に記載の方法。
【０５６４】
実施形態２１２．  （ｆ）の前記ライゲーションステップの後、かつＭｌｙＩ消化（ｇ）の前に、前記第２のアダプタＤＮＡ断片の収集物のＰＣＲ増幅をさらに含む、実施形態２０９に記載の方法。
【０５６５】
実施形態２１３．  前記ランダム剪断ステップが、機械的、酵素的または化学的剪断を含む、実施形態２０９に記載の方法。
【０５６６】
実施形態２１４．  エキソヌクレアーゼ３が、（ｅ）において前記トップ鎖を分解する、実施形態２０９に記載の方法。
【０５６７】
実施形態２１５．  前記第２のライゲーションステップが、高温リガーゼにより実行される、実施形態２０９に記載の方法。
【０５６８】
実施形態２１６．  前記ＰＡＭ部位が、Ｃｐｆ１系タンパク質と適合性であるＰＡＭ部位を含む、実施形態２０９に記載の方法。
【０５６９】
実施形態２１７．  前記ＰＡＭ部位が、ＴＴＮ、ＴＣＮまたはＴＧＮを含む、実施形態２０９に記載の方法。
【０５７０】
実施形態２１８．  前記第２のアダプタが、二本鎖ＤＮＡアダプタである、実施形態２０９に記載の方法。
【０５７１】
実施形態２１９．  前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質と適合性である、実施形態２０９に記載の方法。
【０５７２】
実施形態２２０．  前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、Ｃｐｆ１系タンパク質である、実施形態２１９に記載の方法。
【０５７３】
実施形態２２１．  前記ＤＮＡ試料が、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む、実施形態２０９に記載の方法。
【０５７４】
実施形態２２２．  前記ＤＮＡ試料が、ヒトＤＮＡを含む、実施形態２０９に記載の方法。
【０５７５】
実施形態２２３．  前記ＤＮＡ試料が、宿主ＤＮＡを含む、実施形態２０９に記載の方法。
【０５７６】
実施形態２２４．  前記ＤＮＡ試料が、真核生物ＤＮＡを含む、実施形態２０９に記載の方法。
【０５７７】
実施形態２２５．  核酸の収集物を作製する方法であって、
（ａ）ＤＮＡ試料をランダムに剪断して、ＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、
（ｂ）第１のライゲーション反応において環状アダプタを前記ＤＮＡ断片の収集物にライゲーションして、環状アダプタＤＮＡ断片の収集物を産生するステップであって、
前記環状アダプタが、ＰＡＭ配列に相補的な配列を含む、ステップと、
（ｃ）前記環状アダプタＤＮＡ断片の収集物をメチラーゼでメチル化するステップと、
（ｄ）前記環状アダプタＤＮＡ断片の収集物をエキソヌクレアーゼで消化するステップと、
（ｅ）前記環状アダプタＤＮＡ断片の収集物を制限酵素で消化するステップと、
（ｆ）第２のライゲーション反応において第２のアダプタを前記環状アダプタＤＮＡ断片の収集物にライゲーションして、第２のアダプタＤＮＡ断片の収集物を産生するステップであって、
前記第２のアダプタが、５’から３’に、ＰＡＭ部位に相補的な配列、ＰＡＭ部位、およびＭｌｙＩ部位を含む、ステップと、
（ｇ）前記第２のアダプタＤＮＡ断片の収集物をＰＣＲ増幅するステップであって、
ＰＣＲプライマーが、前記第２のアダプタの配列または前記第２のアダプタの配列に相補的な配列を含み、ＰＣＲ増幅された第２のアダプタＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、
（ｈ）前記ＰＣＲ増幅された第２のアダプタＤＮＡ断片の収集物をＭｌｙＩで消化するステップと、
（ｉ）第３のライゲーション反応において第３のアダプタを前記ＰＣＲ増幅された第２のアダプタＤＮＡ断片の収集物にライゲーションして、第３のアダプタＤＮＡ断片の収集物を産生するステップであって、
前記第３のアダプタが、ＦｏｋＩ部位およびＭｍｅＩ部位を含み、
前記ＭｍｅＩ部位が、ライゲーション後に前記ＦｏｋＩ部位および前記ＤＮＡ断片の間に位置する、ステップと、
（ｊ）前記第３のアダプタライゲーションされた断片の収集物を、第１にＭｍｅＩで、第２にＦｏｋＩで消化して、Ｎ２０  ＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、
（ｋ）第４のライゲーション反応において、第４のアダプタを前記Ｎ２０  ＤＮＡ断片の収集物にライゲーションするステップであって、
前記第４のアダプタをコードする配列が、プロモーター配列および核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列を含み、
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列が、ライゲーション後に前記Ｎ２０配列および前記プロモーターの間に位置する、ステップと
を含む方法。
【０５７８】
実施形態２２６．  前記ランダム剪断ステップが、機械的、酵素的または化学的剪断を含む、実施形態２２５に記載の方法。
【０５７９】
実施形態２２７．  前記エキソヌクレアーゼが、ラムダエキソヌクレアーゼを含む、実施形態２２５に記載の方法。
【０５８０】
実施形態２２８．  前記メチラーゼが、ＥｃｏＧＩＩメチルトランスフェラーゼを含む、実施形態２２５に記載の方法。
【０５８１】
実施形態２２９．  前記第２のライゲーションステップが、高温リガーゼを含む、実施形態２２５に記載の方法。
【０５８２】
実施形態２３０．  前記ＰＡＭ部位が、Ｃｐｆ１系タンパク質と適合性であるＰＡＭ部位を含む、実施形態２２５に記載の方法。
【０５８３】
実施形態２３１．  前記ＰＡＭ部位が、ＴＴＮ、ＴＣＮまたはＴＧＮを含む、実施形態２２５に記載の方法。
【０５８４】
実施形態２３２．  前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質と適合性である、実施形態２２５に記載の方法。
【０５８５】
実施形態２３３．  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、Ｃｐｆ１系タンパク質である、実施形態２３２に記載の方法。
【０５８６】
実施形態２３４．  前記ＤＮＡ試料が、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む、実施形態に記載の方法。
【０５８７】
実施形態２３５．  前記ＤＮＡ試料が、ヒトＤＮＡを含む、実施形態２２５に記載の方法。
【０５８８】
実施形態２３６．  前記ＤＮＡ試料が、宿主ＤＮＡを含む、実施形態２２５に記載の方法。
【０５８９】
実施形態２３７．  前記ＤＮＡ試料が、真核生物ＤＮＡを含む、実施形態２２５に記載の方法。
【０５９０】
実施形態２３８．  核酸の収集物を作製する方法であって、
（ａ）ＤＮＡ試料をランダムに剪断して、ＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、
（ｂ）前記ＤＮＡ断片の収集物をＴ７エキソヌクレアーゼで消化するステップと、
（ｃ）前記ＤＮＡ断片の収集物にアダプタをアニールするステップであって、
前記アダプタが、５’から３’に、５’リン酸、１２塩基対ランダム配列、プロモーター配列、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列、ＦｏｋＩ制限部位、ＦｏｋＩ制限部位に相補的な配列、ＰＡＭ配列、および８塩基対ランダム配列を含む、ステップと、
（ｄ）前記アダプタを前記ＤＮＡ断片の収集物にライゲーションして、アダプタＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、
（ｅ）前記アダプタＤＮＡ断片の収集物をＤＮＡエキソヌクレアーゼで処理するステップと、
（ｆ）前記アダプタＤＮＡ断片の収集物に、前記ＦｏｋＩ部位の配列および前記ＦｏｋＩ部位に相補的な配列に相補的な配列を含む一本鎖ＤＮＡをアニールするステップと、
（ｇ）ＦｏｋＩで消化して、ＦｏｋＩ消化されたアダプタＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、
（ｈ）前記ＦｏｋＩ消化されたアダプタＤＮＡ断片をリガーゼで自己環状化するステップと
を含む方法。
【０５９１】
実施形態２３９．  ＰＣＲ増幅をさらに含む、実施形態２３８に記載の方法。
【０５９２】
実施形態２４０．  前記ＰＣＲ増幅が、ローリングサークルＰＣＲ反応を含む、実施形態２３９に記載の方法。
【０５９３】
実施形態２４１．  前記ＦｏｋＩ消化されたアダプタＤＮＡ断片を線状にするステップをさらに含む、実施形態２３８に記載の方法。
【０５９４】
実施形態２４２．  前記ＦｏｋＩ消化されたアダプタＤＮＡ断片が、少なくとも１種のＤＮＡ修復酵素により直鎖化される、実施形態２４１に記載の方法。
【０５９５】
実施形態２４３．  前記少なくとも１種のＤＮＡ修復酵素が、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）およびエンドヌクレアーゼＶＩＩＩを含む、実施形態２４２に記載の方法。
【０５９６】
実施形態２４４．  ＰＣＲ増幅をさらに含む、実施形態２４２または２４３に記載の方法。
【０５９７】
実施形態２４５．  前記ＰＡＭ部位が、Ｃｐｆ１系タンパク質と適合性であるＰＡＭ部位を含む、実施形態２３８に記載の方法。
【０５９８】
実施形態２４６．  前記ＰＡＭ部位が、ＴＴＮ、ＴＣＮまたはＴＧＮを含む、実施形態２３８に記載の方法。
【０５９９】
実施形態２４７．  前記リガーゼが、ＨｉＦｉｄｅｌｉｔｙ  Ｔａｑリガーゼを含む、実施形態２３８に記載の方法。
【０６００】
実施形態２４８．  前記ＤＮＡエキソヌクレアーゼが、エキソヌクレアーゼ１、エキソヌクレアーゼ３、またはそれらの組合せを含む、実施形態２３８に記載の方法。
【０６０１】
実施形態２４９．  前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質と適合性である、実施形態２３８に記載の方法。
【０６０２】
実施形態２５０．  前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、Ｃｐｆ１系タンパク質である、実施形態２４９に記載の方法。
【０６０３】
実施形態２５１．  前記ＤＮＡ試料が、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む、実施形態２３８に記載の方法。
【０６０４】
実施形態２５２．  前記ＤＮＡ試料が、ヒトＤＮＡを含む、実施形態２３８に記載の方法。
【０６０５】
実施形態２５３．  前記ＤＮＡ試料が、宿主ＤＮＡを含む、実施形態２３８に記載の方法。
【０６０６】
実施形態２５４．  前記ＤＮＡ試料が、真核生物ＤＮＡを含む、実施形態２３８に記載の方法。
【実施例】
【０６０７】
（実施例１）
Ｔ７プロモーターヒトＤＮＡライブラリーからのｇＲＮＡライブラリーの構築
Ｔ７プロモーターライブラリー構築
Ｓ２  Ｃｏｖａｒｉｓ超音波処理器（Ｃｏｖａｒｉｓ）を８サイクル使用して、ヒトゲノムＤＮＡ（４００ｎｇ）を断片化して、２００〜３００ｂｐの長さの断片を得た。ＮＥＢＮｅｘｔ  Ｅｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｍｏｄｕｌｅ（ＮＥＢ）を使用して、断片化されたＤＮＡを修復し、２５℃で３０分間インキュベートし、次いで７５℃で２０分間熱失活させた。Ｔ７プロモーターアダプタを作製するために、オリゴＴ７−１（５’ＧＣＣＴＣＧＡＧＣ＊Ｔ＊Ａ＊ＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＡＧ３’、＊は、ホスホロチオエート骨格連結を表示）およびＴ７−２（配列５’Ｐｈｏｓ−ＣＴＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡ３’）を１５μＭで混合し、９８℃で３分間加熱し、次いで３０℃までゆっくり冷却した（０．１℃／分）。次に、Ｔ７プロモーター平滑アダプタ（総計１５ｐｍｏｌ）を、平滑末端化されたヒトゲノムＤＮＡ断片に添加し、Ｂｌｕｎｔ／ＴＡリガーゼマスターミックス（ＮＥＢ）と共に２５℃で３０分間インキュベートした（図１中の（２））。１０サイクルのＰＣＲ（９８℃で２０秒間、６３℃で２０秒間、７２℃で３５秒間）のため、Ｈｉ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ２×マスターミックス（ＮＥＢ）を使用して、２μＭオリゴＴ７−１によりライゲーションを増幅した。アガロースゲル電気泳動において少量のアリコートを泳動することにより、増幅を検証した。ＰＣＲ増幅された産物は、製造業者の説明書に従って０．６×ＡｘｙＰｒｅｐビーズ（Ａｘｙｇｅｎ）を使用して回収し、１５μＬの１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８に再懸濁した。Ｔ７以外の他の適切なプロモーター部位を使用することもできる。
【０６０８】
ＤＮＡの消化
ＰＣＲ増幅されたＴ７プロモーターＤＮＡ（消化につき総計２μｇ）を、１０μＬのＮＥＢバッファー２（５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．９、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ）における０．１μＬのＮｔ．ＣｖｉＰＩＩ（ＮＥＢ）により１０分間３７℃で消化し（図１中の（３））、次に、７５℃で２０分間熱失活させた。さらなる１０μＬのＮＥＢバッファー２と１μＬのＴ７エンドヌクレアーゼＩ（ＮＥＢ）を反応液に添加し、３７℃で２０分間インキュベートした（図１中の（４））。ＤＮＡの酵素消化をアガロースゲル電気泳動によって検証した。製造業者の説明書に従って、０．６×ＡｘｙＰｒｅｐビーズ（Ａｘｙｇｅｎ）を添加することにより、消化されたＤＮＡを回収し、１５μＬの１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８に再懸濁した。
【０６０９】
アダプタのライゲーションおよびＨＧＧの除去
次に、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を２０分間２５℃で使用して、ＤＮＡを平滑末端化し、続いて熱失活を７５℃で２０分間行った（図１中の（５））。
【０６１０】
ＭｌｙＩアダプタを作製するために、オリゴＭｌｙＩ−１（配列５’＞３’、５’Ｐｈｏｓ−ＧＧＧＡＣＴＣＧＧＡＴＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＴＡＣＡＡＡＧＡＣＧＡＴＧＡＣＧＡＣＡＡＧＣＧ）およびＭｌｙＩ−２（配列５’＞３’、ＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＣＣＧＡＧＴＣＣＣ）を１５μＭで混合し、９８℃で３分間加熱し、次いで３０℃までゆっくり冷却した（０．１℃／分）。次に、ＭｌｙＩアダプタ（総計１５ｐｍｏｌ）を、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ平滑末端化ＤＮＡに添加し、Ｂｌｕｎｔ／ＴＡリガーゼマスターミックス（ＮＥＢ）と共に２５℃で３０分間インキュベートした（図１中の（６））。ライゲーションを７５℃で２０分間熱失活させ、次に、ＨＧＧモチーフが排除できるように、ＭｌｙＩおよびＸｈｏＩ（ＮＥＢ）により１時間３７℃で消化した（図１中の（７））。次に、０．８×ＡｘｙＰｒｅｐビーズ（Ａｘｙｇｅｎ）を使用して、消化物を浄化し、ＤＮＡを１０μＬの１０ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ８に再懸濁した。
【０６１１】
ＳｔｌｇＲアダプタを作製するために、オリゴｓｔｌｇＲ（配列５’＞３’、５’Ｐｈｏｓ−ＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴＴＴＴＧＧＡＴＣＣＧＡＴＧＣ）およびｓｔｌｇＲｅｖ（配列５’＞３’、ＧＧＡＴＣＣＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧＴＧＣＣＡＣＴＴＴＴＴＣＡＡＧＴＴＧＡＴＡＡＣＧＧＡＣＴＡＧＣＣＴＴＡＴＴＴＴＡＡＣＴＴＧＣＴＡＴＴＴＣＴＡＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣ）を１５μＭで混合し、９８℃で３分間加熱し、次いで６０℃までゆっくり冷却した（０．１℃／分）。ＳｔｌｇＲアダプタ（総計５ｐｍｏｌ）を、ＨＧＧ除去ＤＮＡ断片に添加し、Ｂｌｕｎｔ／ＴＡリガーゼマスターミックス（ＮＥＢ）と共に２５℃で３０分間インキュベートした（図１中の（８））。次に、２μＭの両方のオリゴＴ７−１およびｇＲＵ（配列５’＞３’、ＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧＴＧ）を使用して、ライゲーションをＨｉ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ２×マスターミックス（ＮＥＢ）と共にインキュベートし、２０サイクルのＰＣＲ（９８℃で２０秒間、６０℃で２０秒間、７２℃で３５秒間）を使用して増幅させた。アガロースゲル電気泳動において少量のアリコートを泳動することにより、増幅を検証した。ＰＣＲ増幅された産物は、製造業者の説明書に従って０．６×ＡｘｙＰｒｅｐビーズ（Ａｘｙｇｅｎ）を使用して回収し、１５μＬの１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８に再懸濁した。
【０６１２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写
次に、ＨｉＳｃｒｉｂｅ  Ｔ７  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ転写キット（ＮＥＢ）を使用して、ＰＣＲ産物のＴ７／ｇＲＵ増幅されたライブラリーを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写のための鋳型として使用した。製造業者の説明書に従って、５００〜１０００ｎｇの鋳型を一晩３７℃でインキュベートした。ガイドライブラリーをｇＲＮＡへと転写するために、次のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応混合物をアセンブルした：１０μＬの精製されたライブラリー（ほぼ５００ｎｇ）、６．５μＬのＨ２Ｏ、２．２５μＬのＡＴＰ、２．２５μＬのＣＴＰ、２．２５μＬのＧＴＰ、２．２５μＬのＵＴＰ、２．２５μＬの１０×反応バッファー（ＮＥＢ）および２．２５μＬのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼミックス。反応液を３７℃で２４時間インキュベートし、次いで、ＲＮＡクリーンアップ（cleanup）キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して精製し、１００μＬのＲＮａｓｅフリーの水により溶出し、定量化し、使用まで−２０℃で貯蔵した。
【０６１３】
（実施例２）
インタクトなヒトゲノムＤＮＡからのｇＲＮＡライブラリーの構築
ＤＮＡの消化
ヒトゲノムＤＮＡ（図２中の（１）；消化につき総計２０μｇ）を、４０μＬのＮＥＢバッファー２（５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．９、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ）における０．１μＬのＮｔ．ＣｖｉＰＩＩ（ＮＥＢ）により１０分間３７℃で消化し、次いで７５℃で２０分間熱失活させた。さらなる４０μＬのＮＥＢバッファー２および１μＬのＴ７エンドヌクレアーゼＩ（ＮＥＢ）を反応液に添加し、３７℃で２０分間インキュベーションを行った（例えば、図２中の（２））。アガロースゲル電気泳動によって、少量のアリコートによりゲノムＤＮＡの断片化を検証した。０．３×ＡｘｙＰｒｅｐビーズ（Ａｘｙｇｅｎ）を添加し、２５℃で５分間インキュベートし、磁気スタンドにおいてビーズを捕捉し、上清を新しいチューブに移すことにより、２００〜６００ｂｐの間のＤＮＡ断片を回収した。６００ｂｐを下回るＤＮＡ断片は、このビーズ／ＤＮＡ比ではビーズに結合せず、上清中に残る。次に、０．７×ＡｘｙＰｒｅｐビーズ（Ａｘｙｇｅｎ）を上清に添加し（これは、２００ｂｐよりも長い全ＤＮＡ分子に結合し得る）、５分間結合させた。ビーズを磁気スタンドにおいて捕捉し、８０％エタノールで２回洗浄し、風乾した。次に、ＤＮＡを１５μＬの１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８に再懸濁した。Ｑｂｉｔアッセイ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ＤＮＡ濃度を決定した。
【０６１４】
アダプタのライゲーション
Ｔ７／ＭｌｙＩアダプタを作製するために、オリゴＭｌｙＩ−１（配列５’＞３’、５’Ｐｈｏｓ−ＧＧＧＧＧＡＣＴＣＧＧＡＴＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＴＡＣＡＡＡＧＡＣＧＡＴＧＡＣＧＡＣＡＡＧＣＧ）およびＴ７−７（配列５’＞３’、ＧＣＣＴＣＧＡＧＣ＊Ｔ＊Ａ＊ＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＣＣＡＡＧＴＣＣＣ、＊は、ホスホロチオエート骨格連結を表示）を１５μＭで混合し、９８℃で３分間加熱し、次いで３０℃までゆっくり冷却した（０．１℃／分）。次に、Ｂｌｕｎｔ／ＴＡリガーゼマスターミックス（ＮＥＢ）を２５℃で３０分間使用して、精製された、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ／Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ消化ＤＮＡ（１００ｎｇ）を、１５ｐｍｏｌのＴ７／ＭｌｙＩアダプタにライゲートした（図２中の（３））。次に、Ｈｉ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ２×マスターミックス（ＮＥＢ）、ならびに２μＭの両方のオリゴＴ７−１７（ＧＣＣＴＣＧＡＧＣ＊Ｔ＊Ａ＊ＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ、＊は、ホスホロチオエート骨格連結を表示）およびＦｌａｇ（配列５’＞３’、ＣＧＣＴＴＧＴＣＧＴＣＡＴＣＧＴＣＴＴＴＧＴＡ）を使用して、１０サイクルのＰＣＲ（９８℃で２０秒間、６０℃で２０秒間、７２℃で３５秒間）によってライゲーションを増幅した。ＰＣＲ増幅は、ＤＮＡの収量を増加させ、使用したＹ字型アダプタの性質を考慮すると、常に、ＨＧＧ部位に対し遠位に付加されたＴ７プロモーターと、ＨＧＧモチーフの隣に付加されたＭｌｙＩ部位をもたらした（図２中の（４））。
【０６１５】
次に、ＰＣＲ産物をＭｌｙＩおよびＸｈｏＩ（ＮＥＢ）により１時間３７℃で消化し、７５℃で２０分間熱失活させた（図２中の（５））。その後に、Ｂｌｕｎｔ／ＴＡリガーゼマスターミックス（ＮＥＢ）を２５℃で３０分間使用して、５ｐｍｏｌのアダプタＳｔｌｇＲ（実施例１における）をライゲートした（図２中の（６））。次に、Ｈｉ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ２×マスターミックス（ＮＥＢ）、２μＭの両方のオリゴＴ７−７およびｇＲＵ（実施例１における）ならびに２０サイクルのＰＣＲ（９８℃で２０秒間、６０℃で２０秒間、７２℃で３５秒間）を使用したＰＣＲによって、ライゲーションを増幅した。アガロースゲル電気泳動において少量のアリコートを泳動することにより、増幅を検証した。ＰＣＲ増幅された産物は、製造業者の説明書に従って０．６×ＡｘｙＰｒｅｐビーズ（Ａｘｙｇｅｎ）を使用して回収し、１５μＬの１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８に再懸濁した。
【０６１６】
次に、実施例１に記載されている通り、試料をｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応のための鋳型として使用した。
【０６１７】
（実施例３）
ＣｖｉＰＩＩによる直接的切断
３０μｇのヒトゲノムＤＮＡを、２ユニットのＮｔＣｖｉＰＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）により１時間３７℃で消化し、続いて、７５℃で２０分間熱失活を行った。断片分析計装置（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）を使用して、断片のサイズを２００〜１，０００塩基対であると検証した。１００ユニットのＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、１００μＭ  ｄＮＴＰを添加し、１２℃で３０分間インキュベートすることにより、５’または３’突出末端（例えば、図３に示す通り）を平滑末端に変換した。次に、ＰＣＲクリーンアップキット（Ｚｙｍｏ）を使用して、ＤＮＡを回収し、２０μＬ溶出バッファー中に溶出した。次に、ＤＮＡを、ＭｌｙＩアダプタ（例えば、実施例４を参照）またはＦｏｋＩ／ＭｍｅＩアダプタもしくはＢａｅＩ／ＥｃｏＰ１５Ｉアダプタ（例えば、実施例５を参照）にライゲートした。
【０６１８】
（実施例４）
ＭｌｙＩアダプタの使用
４０μＬの水において２μモルのＭｌｙＩ  Ａｄ１およびＭｌｙ  Ａｄ２を組み合わせることにより、アダプタＭｌｙＩを作製した。４０μＬの水において２μモルのオリゴＢｓＭｍ−Ａｄ１および２μモルのオリゴＢｓＭｍ−Ａｄ２を組み合わせることにより、アダプタＢｓａＸＩ／ＭｍｅＩを作製した。１００μＬの水において１．５μモルのＴ７−Ａｄ１およびＴ７−Ａｄ２オリゴを組み合わせることにより、Ｔ７アダプタを作製した。１００μＬの水において１．５μモルのｇＲ−ｔｏｐおよびｇＲ−ｂｏｔオリゴを組み合わせることにより、ステムループアダプタを作製した。全ての事例において、混合後に、アダプタを９８℃で３分間加熱し、次いでサーマルサイクラーにおいて１℃／分の冷却速度で室温まで冷却した。Ｔ７以外の他の適切なプロモーター部位を使用することもできる。
【０６１９】
次に、ｂｌｕｎｔ／ＴＡライゲーションマスターミックス（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を室温で３０分間使用して、ＣＣＤ平滑末端を含有するＤＮＡ（先のセクションから）を５０ｐモルのアダプタＭｌｙＩにライゲートした。次に、０．６×Ｋａｐａ  ＳＰＲＩビーズ（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と共に５分間インキュベートし、ビーズを磁気ラックにより捕捉し、８０％エタノールで２回洗浄し、ビーズを５分間風乾し、最後にＤＮＡを５０μＬのバッファー４（５０ｍＭ酢酸カリウム、２０ｍＭトリス酢酸塩、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１００μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、ｐＨ７．９）に再懸濁することにより、ＤＮＡを回収した。これらのステップは、小型の（＜１００ヌクレオチド）ＤＮＡおよびＭｌｙＩアダプタ二量体を排除する。
【０６２０】
次に、２０ユニットのＭｌｙＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を添加し、３７℃で１時間インキュベートすることにより、精製されたＤＮＡを消化して、アダプタ由来の配列およびＣＣＤ（および相補的ＨＧＧ）モチーフの両方を排除した。０．６×Ｋａｐａ  ＳＰＲＩビーズ（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と共に５分間インキュベートし、ビーズを磁気ラックにより捕捉し、８０％エタノールで２回洗浄し、ビーズを５分間風乾し、最後にＤＮＡを３０μＬのバッファー４に再懸濁することにより、消化物からＤＮＡを回収した。
【０６２１】
次に、ｂｌｕｎｔ／ＴＡライゲーションマスターミックス（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を室温で３０分間使用して、精製されたＤＮＡを５０ｐモルのアダプタＢｓａＸＩ／ＭｍｅＩにライゲートした。次に、０．６×Ｋａｐａ  ＳＰＲＩビーズ（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と共に５分間インキュベートし、ビーズを磁気ラックにより捕捉し、８０％エタノールで２回洗浄し、ビーズを５分間風乾し、最後にＤＮＡを５０μＬのバッファー４（５０ｍＭ酢酸カリウム、２０ｍＭトリス酢酸塩、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１００μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、ｐＨ７．９）に再懸濁することにより、ＤＮＡを回収した。次に、２０ユニットのＭｍｅＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）および４０ｐｍｏｌ／μＬのＳＡＭ（Ｓ−アデノシルメチオニン）を添加して３７℃で１時間放置し、続いて７５℃で２０分間熱失活させることにより、ＤＮＡを消化した。次に、ｂｌｕｎｔ／ＴＡライゲーションマスターミックス（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を室温で３０分間使用して、ＤＮＡを３０ｐモルのＴ７アダプタにライゲートした。次に、ＰＣＲクリーンアップキット（Ｚｙｍｏ）を使用してＤＮＡを回収し、２０μＬのバッファー４中に溶出し、次いで２０ユニットのＢｓａＸＩにより１時間３７℃で消化した。１５ｐモルのステムループアダプタを添加し、ｂｌｕｎｔ／ＴＡライゲーションマスターミックス（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を室温で３０分間使用することにより、ガイドＲＮＡステムループ配列を付加した。次に、ＰＣＲクリーンアップキット（Ｚｙｍｏ）を使用してＤＮＡを回収し、２０μＬの溶出バッファー中に溶出し、ＨｉＦｉｄｅｌｉｔｙ  ２×マスターミックス（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用してＰＣＲ増幅した。プライマーＴ７−Ａｄ１およびｇＲＵ（配列５’＞３’、ＡＡＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧＴＧ）を使用して、次の設定（９８℃で３分間；９８℃で２０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で２０秒間を３０サイクル）により増幅した。ＰＣＲアンプリコンは、ＰＣＲクリーンアップキットを使用してクリーンアップし、ＤＮＡ配列決定によって検証し、次いで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応のための鋳型として使用して、ガイドＲＮＡを生成した。
【０６２２】
（実施例５）
ＢａｅＩ／ＥｃｏＰ１５Ｉアダプタの使用
４０μＬの水において２μモルのＢＥ  Ａｄ１およびＢＥ  Ａｄ２を組み合わせることにより、アダプタＢａｅＩ／ＥｃｏＰ１５Ｉを作製した。１００μＬの水において１．５μモルのＴ７−Ａｄ３およびＴ７−Ａｄ４オリゴを組み合わせることにより、Ｔ７−Ｅアダプタを作製した。全ての事例において、混合後に、アダプタを９８℃で３分間加熱し、次いでサーマルサイクラーにおいて１℃／分の冷却速度で室温まで冷却した。Ｔ７以外の他の適切なプロモーター部位を使用することもできる。
【表５】
2020524491.tif 000011
【０６２３】
次に、ｂｌｕｎｔ／ＴＡライゲーションマスターミックス（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を室温で３０分間使用して、ＣＣＤ平滑末端を含有するＤＮＡ（先のセクションから）を５０ｐモルのアダプタＢａｅＩ／ＥｃｏＰ１５Ｉにライゲートした。次に、０．６×Ｋａｐａ  ＳＰＲＩビーズ（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と共に５分間インキュベートし、ビーズを磁気ラックにより捕捉し、８０％エタノールで２回洗浄し、ビーズを５分間風乾し、最後にＤＮＡを５０μＬのバッファー４（５０ｍＭ酢酸カリウム、２０ｍＭトリス酢酸塩、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１００μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、ｐＨ７．９）に再懸濁することにより、ＤＮＡを回収した。次に、回収されたＤＮＡを２０ユニットのＰｍｅＩにより３０分間３７℃で消化し；次いで、１．２×Ｋａｐａ  ＳＰＲＩビーズ（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と共に５分間インキュベートし、ビーズを磁気ラックにより捕捉し、８０％エタノールで２回洗浄し、ビーズを５分間風乾し、最後にＤＮＡを５０μＬのバッファー４に再懸濁することにより、ＤＮＡを回収した。これらのステップは、小型の（＜１００ヌクレオチド）ＤＮＡおよびＢａｅＩ／ＥｃｏＰ１５Ｉアダプタ多量体を排除する。
【０６２４】
次に、２０ユニットのＥｃｏＰ１５Ｉ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）および１ｍＭ  ＡＴＰを添加して３７℃で１時間放置し、続いて７５℃で２０分間熱失活させることにより、ＤＮＡを消化した。次に、ｂｌｕｎｔ／ＴＡライゲーションマスターミックス（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を室温で３０分間使用して、ＤＮＡを３０ｐモルのＴ７−Ｅアダプタにライゲートした。次に、ＰＣＲクリーンアップキット（Ｚｙｍｏ）を使用してＤＮＡを回収し、２０μＬのバッファー４中に溶出した。
【０６２５】
次に、２０ユニットのＢａｅＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、４０ｐｍｏｌ／μＬのＳＡＭ（Ｓ−アデノシルメチオニン）を添加し、３７℃で１時間インキュベートすることにより、精製されたＤＮＡを消化して、アダプタ由来の配列およびＣＣＤ（および相補的ＨＧＧ）モチーフの両方を排除した。次に、ＰＣＲクリーンアップキット（Ｚｙｍｏ）を使用してＤＮＡを回収し、２０μＬの溶出バッファー中に溶出した。
【０６２６】
次に、２０μＬのｓｓライゲーションバッファー（１０ｍＭビス−トリス−プロパン−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、２．５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、ｐＨ７、２５℃で）における２０ユニットのリガーゼ、２０ｐｍｏｌのｓｔｌｇＲオリゴを添加し、６５℃で１時間インキュベートし、続いて９０℃で５分間熱失活させることにより、熱安定性５’ＡｐｐＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、回収されたＤＮＡをｓｔｌｇＲオリゴにライゲートした。次に、ＨｉＦｉｄｅｌｉｔｙ  ２×マスターミックス（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、ＤＮＡ産物をＰＣＲ増幅した。プライマーＴ７−Ａｄ３およびｇＲＵ（配列５’＞３’、ＡＡＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧＴＧ）を使用して、次の設定（９８℃で３分間；９８℃で２０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で２０秒間を３０サイクル）により増幅した。ＰＣＲアンプリコンは、ＰＣＲクリーンアップキットを使用してクリーンアップし、ＤＮＡ配列決定によって検証し、次いで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応のための鋳型として使用して、ガイドＲＮＡを生成した。
【０６２７】
（実施例６）
ＦｏｋＩ／ＭｍｅＩアダプタの使用
【０６２８】
２μモルのｃｉｒｃＭＦオリゴを４０μＬの水に希釈することにより、アダプタＦｏｋＩ／ＭｍｅＩを作製した。１．５μモルのＴ７−Ａｄ３およびＴ７−Ａｄ４オリゴを１００μＬの水において組み合わせることにより、Ｔ７−Ｅアダプタを作製した。１．５μモルのＮ４ＵｓｔｌｇＲおよびＭＮＡオリゴを１００μＬの水において組み合わせることにより、Ｎ４ｓｔｌｇＲアダプタを作製した。全ての事例において、混合後に、アダプタを９８℃に３分間加熱し、次いで、サーマルサイクラーにおいて１℃／分の冷却速度で室温に冷却した。Ｔ７以外の他の適切なプロモーター部位を使用することもできる。
【表６】
2020524491.tif 000012
【０６２９】
次いで、平滑末端／ＴＡライゲーションマスターミックス（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、室温で２０分間、ＣＣＤ平滑末端（前のセクションより）を含有するＤＮＡを、５０ピコモルのアダプタＦｏｋＩ／ＭｍｅＩにライゲーションした。次いで、１０ユニットのＭｆｅＩおよび１０ユニットのラムダエキソヌクレアーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を補充した５０ｕｌのバッファー４（５０ｍＭ酢酸カリウム、２０ｍＭトリス・酢酸、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１００μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、ｐＨ７．９）を添加することにより、ライゲーション反応を停止し、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、０．６×Ｋａｐａ  ＳＰＲＩビーズ（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と共に５分間インキュベートし、ビーズを磁気ラックで捕捉し、８０％エタノールで２回洗浄し、ビーズを５分間風乾し、最後に、ＤＮＡを５０μＬのバッファー４に再懸濁することにより、ＤＮＡを回収した。次いで、回収されたＤＮＡを、２０ユニットのＰｍｅＩにより、３０分間３７℃で消化した；次いで、１．２×Ｋａｐａ  ＳＰＲＩビーズ（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と共に５分間インキュベートし、ビーズを磁気ラックで捕捉し、８０％エタノールで２回洗浄し、ビーズを５分間風乾し、最後に、ＤＮＡを５０μＬのバッファー４に再懸濁することにより、ＤＮＡを回収した。これらのステップは、ライゲーションされていないＤＮＡ、ライゲーションされていないＦｏｋＩ／ＭｍｅＩアダプタ、ＦｏｋＩ／ＭｍｅＩアダプタ多量体、および部分的にライゲーションされたＤＮＡを排除する。
【０６３０】
次いで、３７℃で４５分間の２０ユニットのＭｍｅＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）および０．０５ｍＭ  ＳＡＭ（Ｓ−アデノシルメチオニン）の添加によりＤＮＡを消化し、続いて７５℃で２０分間熱失活させた。次いで、平滑末端／ＴＡライゲーションマスターミックス（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、室温で３０分間、ＤＮＡを３０ピコモルのＴ７−Ｅアダプタにライゲーションした。次いで、１．６×Ｋａｐａ  ＳＰＲＩビーズ（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と共に５分間インキュベートし、ビーズを磁気ラックで捕捉し、８０％エタノールで２回洗浄し、ビーズを５分間風乾し、最後に、ＤＮＡを２０μＬのバッファー４に再懸濁することにより、ＤＮＡを回収した。
【０６３１】
次いで、２０ユニットのＦｏｋＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を添加し、３７℃で２０分間インキュベートすることにより、精製されたＤＮＡを消化して、アダプタ由来の配列およびＣＣＤ（および相補的ＨＧＧ）モチーフの両方を排除した。次いで、Ｑｕｉｃｋライゲーションキット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を室温で２０分間使用して、ＤＮＡを１０ピコモルのＮ４ｓｔｌｇＲアダプタにライゲーションした。次いで、反応物を７５℃で２０分間熱失活させた。
【０６３２】
次いで、ライゲーションされたＤＮＡを、ウラシル（Ｕ）残基を切除するＵＳＥＲ酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で処理して、Ｎ４ｓｔｌｇＲアダプタ二量体を排除した。次いで、１．６×Ｋａｐａ  ＳＰＲＩビーズ（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と共に５分間インキュベートし、ビーズを磁気ラックで捕捉し、８０％エタノールで２回洗浄し、ビーズを５分間風乾し、最後に、ＤＮＡを２０μＬのバッファー４に再懸濁することにより、ＤＮＡを回収した。
【０６３３】
次いで、ＨｉＦｉｄｅｌｉｔｙ  ２×マスターミックス（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、ＤＮＡ産物をＰＣＲ増幅した。プライマーＴ７−Ａｄ３およびｇＲＵ（配列５’＞３’  ＡＡＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧＴＧ）を使用して、次の設定（９８℃３分間；９８℃で２０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で２０秒間、３０サイクル）により増幅した。ＰＣＲアンプリコンを、ＰＣＲ浄化キットを使用して浄化し、ＤＮＡ配列決定によって検証し、次いで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応のための鋳型として使用して、ガイドＲＮＡを生成した。
【０６３４】
（実施例７）
ＮＥＭＤＡ方法（ＢａｅＩ／ＥｃｏＰ１５Ｉ）
５０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡを使用して、ＮＥＭＤＡ（ニッキングエンドヌクレアーゼ媒介性ＤＮＡ増幅）を実行した。０．３ｍＭ  ｄＮＴＰ、４０ユニットのＢｓｔ大断片ＤＮＡポリメラーゼおよび０．１ユニットのＮｔＣｖｉＰＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を補充した１００μＬのサーモ（thermo）ポリメラーゼバッファー（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭ  ＫＣｌ、６ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、ｐＨ８．８）において、ＤＮＡをサーマルサイクラーにおいて５５℃で４５分間、続いて６５℃で３０分間、最後に８０℃で２０分間インキュベートした。
【０６３５】
次に、２００ｐモルのＴ７−ＲＮＤ８オリゴ（配列５’＞３’、ｇｃｃｔｃｇａｇｃｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇａｇｎｎｎｎｎｎｎｎ）を補充した３００μＬのバッファー４でＤＮＡを希釈し、９８℃で１０分間煮沸し、続いて１０℃まで５分間急速に冷却した。Ｔ７以外の他の適切なプロモーター部位を使用することもできる。次に、反応液に、４０ユニットのＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩおよび０．１ｍＭ  ｄＮＴＰ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を補充し、室温で２０分間インキュベートし、続いて７５℃で２０分間熱失活させた。次に、ＰＣＲクリーンアップキット（Ｚｙｍｏ）を使用してＤＮＡを回収し、３０μＬの溶出バッファー中に溶出した。
【０６３６】
次に、ｂｌｕｎｔ／ＴＡライゲーションマスターミックス（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を室温で３０分間使用して、ＤＮＡを５０ｐモルのアダプタＢａｅＩ／ＥｃｏＰ１５Ｉにライゲートした。次に、０．６×Ｋａｐａ  ＳＰＲＩビーズ（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と共に５分間インキュベートし、ビーズを磁気ラックにより捕捉し、８０％エタノールで２回洗浄し、ビーズを５分間風乾し、最後にＤＮＡを５０μＬのバッファー４（５０ｍＭ酢酸カリウム、２０ｍＭトリス酢酸塩、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１００μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、ｐＨ７．９）に再懸濁することにより、ＤＮＡを回収した。次に、回収されたＤＮＡを２０ユニットのＰｍｅＩにより３０分間３７℃で消化し；次いで、１．２×Ｋａｐａ  ＳＰＲＩビーズ（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と共に５分間インキュベートし、ビーズを磁気ラックにより捕捉し、８０％エタノールで２回洗浄し、ビーズを５分間風乾し、最後にＤＮＡを５０μＬのバッファー４に再懸濁することにより、ＤＮＡを回収した。これらのステップは、小型の（＜１００ヌクレオチド）ＤＮＡおよびＢａｅＩ／ＥｃｏＰ１５Ｉアダプタ多量体を排除する。
【０６３７】
次に、２０ユニットのＢａｅＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、４０ｐｍｏｌ／μＬのＳＡＭ（Ｓ−アデノシルメチオニン）を添加し、３７℃で１時間インキュベートすることにより、精製されたＤＮＡを消化して、アダプタ由来の配列およびＣＣＤ（および相補的ＨＧＧ）モチーフの両方を排除した。次に、ＰＣＲクリーンアップキット（Ｚｙｍｏ）を使用してＤＮＡを回収し、２０μＬの溶出バッファー中に溶出した。
【０６３８】
次に、２０μＬのｓｓライゲーションバッファー（１０ｍＭビス−トリス−プロパン−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、２．５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、ｐＨ７、２５℃で）における２０ユニットのリガーゼ、２０ｐｍｏｌのｓｔｌｇＲオリゴを添加し、６５℃で１時間インキュベートし、続いて９０℃で５分間熱失活させることにより、熱安定性５’ＡｐｐＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、回収されたＤＮＡをｓｔｌｇＲオリゴにライゲートした。次に、ＨｉＦｉｄｅｌｉｔｙ  ２×マスターミックス（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、ＤＮＡ産物をＰＣＲ増幅した。プライマーＴ７−Ａｄ３（配列５’＞３’、ｇｃｃｔｃｇａｇｃｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇａｇ）およびｇＲＵ（配列５’＞３’、ＡＡＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧＴＧ）を使用して、次の設定（９８℃で３分間；９８℃で２０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で２０秒間、３０サイクル）により増幅した。ＰＣＲアンプリコンを、ＰＣＲ浄化キットを使用して浄化し、ＤＮＡ配列決定によって検証し、次いで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応のための鋳型として使用して、ガイドＲＮＡを生成した。
【０６３９】
（実施例８）
ＮＥＭＤＡ方法（ＦｏｋＩ／ＭｍｅＩ）
５０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡを使用して、ＮＥＭＤＡ（ニッキングエンドヌクレアーゼ媒介性ＤＮＡ増幅）を行った。０．３ｍＭ  ｄＮＴＰ、４０ユニットのＢｓｔ大断片ＤＮＡポリメラーゼおよび０．１ユニットのＮｔＣｖｉＰＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を補充した１００μＬのｔｈｅｒｍｏポリメラーゼバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭ  ＫＣｌ、６ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、ｐＨ８．８）において、５５℃で４５分間、続いて６５℃で３０分間、最後に８０℃で２０分間、サーマルサイクラー内でＤＮＡをインキュベートした。
【０６４０】
次いで、ＤＮＡを、２００ピコモルのＴ７−ＲＮＤ８オリゴ（配列５’＞３’  ｇｃｃｔｃｇａｇｃｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇａｇｎｎｎｎｎｎｎｎ）を補充した３００μＬのバッファー４で希釈し、９８℃で１０分間煮沸し、続いて１０℃に５分間急速冷却した。Ｔ７以外の他の適切なプロモーター部位を使用することもできる。次いで、反応物に、４０ユニットのＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩおよび０．１ｍＭ  ｄＮＴＰ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を補充し、室温で２０分間インキュベートし、続いて７５℃で２０分間熱失活を行った。次いで、ＰＣＲ浄化キット（Ｚｙｍｏ）を使用してＤＮＡを回収し、３０μＬの溶出バッファー中に溶出した。
【０６４１】
次いで、平滑末端／ＴＡライゲーションマスターミックス（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を室温で３０分間使用して、ＤＮＡを５０ピコモルのアダプタＦｏｋＩ／ＭｍｅＩにライゲーションした。次いで、１０ユニットのＭｆｅＩおよび１０ユニットのラムダエキソヌクレアーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を補充した５０ｕｌのバッファー４（５０ｍＭ酢酸カリウム、２０ｍＭトリス・酢酸、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１００μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、ｐＨ７．９）を添加することにより、ライゲーション反応を停止し、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、０．６×Ｋａｐａ  ＳＰＲＩビーズ（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と共に５分間インキュベートし、ビーズを磁気ラックで捕捉し、８０％エタノールで２回洗浄し、ビーズを５分間風乾し、最後に、ＤＮＡを５０μＬのバッファー４に再懸濁することにより、ＤＮＡを回収した。次いで、回収されたＤＮＡを、２０ユニットのＰｍｅＩにより３０分間３７℃で消化した；次いで、１．２×Ｋａｐａ  ＳＰＲＩビーズ（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と共に５分間インキュベートし、ビーズを磁気ラックで捕捉し、８０％エタノールで２回洗浄し、ビーズを５分間風乾し、最後に、ＤＮＡを５０μＬのバッファー４に再懸濁することにより、ＤＮＡを回収した。これらのステップは、ライゲーションされていないＤＮＡ、ライゲーションされていないＦｏｋＩ／ＭｍｅＩアダプタ、ＦｏｋＩ／ＭｍｅＩアダプタ多量体、および部分的にライゲーションされたＤＮＡを排除する。
【０６４２】
次いで、２０ユニットのＦｏｋＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を添加し、３７℃で２０分間インキュベートすることにより、精製されたＤＮＡを消化して、アダプタ由来の配列およびＣＣＤ（および相補的ＨＧＧ）モチーフの両方を排除した。次いで、Ｑｕｉｃｋライゲーションキット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を室温で２０分間使用して、ＤＮＡを１０ピコモルのＮ４ｓｔｌｇＲアダプタにライゲーションした。次いで、反応物を７５℃で２０分間熱失活させた。
【０６４３】
次いで、ライゲーションされたＤＮＡを、ウラシル（Ｕ）残基を切除するＵＳＥＲ酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で処理して、Ｎ４ｓｔｌｇＲアダプタ二量体を排除した。次いで、１．６×Ｋａｐａ  ＳＰＲＩビーズ（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と共に５分間インキュベートし、ビーズを磁気ラックで捕捉し、８０％エタノールで２回洗浄し、ビーズを５分間風乾し、最後に、ＤＮＡを２０μＬのバッファー４に再懸濁することにより、ＤＮＡを回収した。次いで、ＨｉＦｉｄｅｌｉｔｙ  ２×マスターミックス（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、ＤＮＡ産物をＰＣＲ増幅した。プライマーＴ７−Ａｄ３（配列５’＞３’  ｇｃｃｔｃｇａｇｃｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇａｇ）およびｇＲＵ（配列５’＞３’  ＡＡＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧＴＧ）を使用して、次の設定（９８℃で３分間；９８℃で２０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で２０秒間、３０サイクル）により増幅した。ＰＣＲアンプリコンを、ＰＣＲ浄化キットを使用して浄化し、ＤＮＡ配列決定によって検証し、次いで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応のための鋳型として使用して、ガイドＲＮＡを生成した。
【図１】
2020524491.tif 000013
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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