(57)【要約】  １つ以上の実施形態では、本発明は、ヒドロゲルなどの物体を形成するための水和が可能となり、３次元印刷および薬物送達用途に好適である、制約されて予測可能な材料特性を有する、低分子量で無害である吸収性のポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）−ブロック−ポリ（プロピレンフマレート）（ＰＰＦ）ジブロックコポリマーおよびポリ（プロピレンフマレート）（ＰＰＦ）−ブロック−ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）−ブロック−ポリ（プロピレンフマレート）（ＰＰＦ）トリブロックコポリマー（ならびにそれらの製造および使用のための関連方法）を提供する。連続デジタルライトプロセッシング（ｃＤＬＰ）ヒドロゲルを使用して、ジブロックおよびトリブロックコポリマーは、従来のジエチルフマレート（ＤＥＦ）に基づく印刷と比較して、破断点伸びにおいて１０倍の増加を有する構造体へと、水溶液から光化学的に印刷され得る。その上に、ＰＰＦ−ＰＥＧ−ＰＰＦトリブロックヒドロゲルは、多数の操作されたＭＣ３Ｔ３、ＮＩＨ３Ｔ３、および初代シュワン細胞に対して生体外で生体適合性があることも見出された。【選択図】図１Ａ
2020530055.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
約５重量％〜約９５重量％のＰＥＧを含むポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）およびポリ（プロピレンフマレート）（ＰＰＦ）のブロックコポリマー。
【請求項２】
約５００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａの数平均分子量（Ｍｎ）を有する、請求項１に記載のブロックコポリマー。
【請求項３】
前記ＰＥＧおよびＰＰＦのブロックコポリマーが、ＰＥＧ／ＰＰＦジブロックコポリマーである、請求項１に記載のブロックコポリマー。
【請求項４】
前記ＰＥＧおよびＰＰＦのブロックコポリマーが、次式を有するＰＥＧ／ＰＰＦジブロックコポリマーであり、
【化１】
2020530055.tif 000020
式中、ａは、約４〜約１００の整数であり、ｂは、約２〜約１００の整数であり、Ｒは、メチル基、ベンジル基、アルキン基、プロパルギル基、アリル基、アルケン基、４−ジベンジオシクロオクチン基、シクロオクチン基、ケトン基、アルデヒド基、三級ハロゲン基、ポリ（エチレングリコール）基、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される官能基である、請求項１に記載のブロックコポリマー。
【請求項５】
前記ＰＥＧおよびＰＰＦのブロックコポリマーが、次式を有するＰＥＧ／ＰＰＦジブロックコポリマーであり、
【化２】
2020530055.tif 000021
式中、ａは、約４〜約１００の整数であり、ｂは、約２〜約１００の整数である、請求項１に記載のブロックコポリマー。
【請求項６】
前記ＰＥＧおよびＰＰＦのブロックコポリマーが、ＰＰＦ／ＰＥＧ／ＰＰＦトリブロックコポリマーである、請求項１に記載のブロックコポリマー。
【請求項７】
前記ＰＥＧおよびＰＰＦのブロックコポリマーが、次式を有するＰＰＦ／ＰＥＧ／ＰＰＦトリブロックコポリマーであり、
【化３】
2020530055.tif 000022
式中、ａは、約２〜約１００の整数であり、各ｂは、約２〜約１００の整数である、請求項１に記載のブロックコポリマー。
【請求項８】
請求項１に記載のブロックコポリマーを製造するための方法であって、
Ａ）プロピレンオキシド、無水マレイン酸、ＰＥＧ開始剤、およびマグネシウム触媒を好適な溶媒中で溶解させることと、
Ｂ）前記ステップＡの溶液を約４０℃〜約８０℃の温度まで約１〜約２４時間加熱して、ポリ（エチレングリコール−ｂ−プロピレンマレエート）またはポリ（プロピレンマレエート−ｂ−エチレングリコール−ｂ−プロピレンマレエート）中間体を生成することと、
Ｃ）前記ポリ（エチレングリコール−ｂ−プロピレンマレエート）またはポリ（プロピレンマレエート−ｂ−エチレングリコール−ｂ−プロピレンマレエート）中間体を好適な溶媒中に溶解させて、ジエチルアミンを添加することと、
Ｄ）前記ステップＣの溶液を約１〜約２４時間加熱還流して、請求項１に記載のブロックコポリマーを生成することと、を含む、方法。
【請求項９】
前記ＰＥＧ開始剤が、約１００Ｄａ〜約１０，０００Ｄａの数平均分子量（Ｍｎ）を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＰＥＧ開始剤が、約２〜約５０個のエチレングリコール単位を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＰＥＧ開始剤が単官能性である、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＰＥＧ開始剤が、約１００〜約１０，０００の数平均分子量（Ｍｎ）を有するメチルエーテルＰＥＧである、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＰＥＧ開始剤が二官能性である、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＰＥＧ開始剤が、約１００Ｄａ〜約１０，０００Ｄａの数平均分子量（Ｍｎ）を有するＰＥＧジオールである、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
前記マグネシウム触媒が、Ｍｇ（ＢＨＴ）２（ＴＨＦ）２である、請求項８に記載の方法。
【請求項１６】
前記ステップＡの好適な溶媒が、トルエン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１７】
前記ステップＡの好適な溶媒がトルエンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１８】
前記ステップＣの好適な溶媒が、クロロホルム、ジクロロメタン、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１９】
前記ステップＣの好適な溶媒がクロロホルムである、請求項８に記載の方法。
【請求項２０】
重合度が、約２〜約１００である、請求項８に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１に記載のブロックコポリマーを含むミセル。
【請求項２２】
請求項１に記載のブロックコポリマーを含む３次元印刷されたポリマー構造体。
【請求項２３】
請求項１に記載のブロックコポリマーを含むヒドロゲル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年８月７日出願の「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｗｅｌｌ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｐｏｌｙ（Ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  Ｆｕｍａｒａｔｅ）  ａｎｄ  Ｐｏｌｙ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ）  Ｂｌｏｃｋ  Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ」と題された米国仮特許出願第６２／５４１，８８９号の利益を主張するものであり、その全体が本明細書に参照として組み込まれる。
【０００２】
連邦支援の研究または開発支援に関する声明
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈにより授与された契約番号Ｐ４１ＥＢ００１０４６の下で政府の支援によりなされた。政府は、本発明において特定の権利を有する。
【０００３】
共同研究契約の当事者の名称
本出願は、Ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａｋｒｏｎ  ｏｆ  Ａｋｒｏｎ，Ｏｈｉｏと３Ｄ  ＢｉｏＡｃｔｉｖｅｓ  ＬＬＣ  ｏｆ  Ｐｅｐｐｅｒ  Ｐｉｋｅ，Ｏｈｉｏとの間の共同研究契約に従ってなされた研究から生じている。
【０００４】
１つ以上の実施形態、本発明は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）およびポリ（プロピレンフマレート）（ＰＰＦ）のブロックコポリマーに関する。ある種の実施形態では、本発明は、様々な、ヒドロゲル、薬物送達および再生医療用途における使用のためのポリ（プロピレンフマレート）ＰＰＦ／ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）ジブロックコポリマーおよびポリ（プロピレンフマレート）（ＰＰＦ）−ブロック−ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）−ブロック−ポリ（プロピレンフマレート）（ＰＰＦ）トリブロックコポリマーに関する。
【背景技術】
【０００５】
組織工学用途のための材料は、臨床的に関連するいくつかの基準を満たさなければならない。細胞生存率に加えて、好適な機械的特性と形態学的に複雑な足場を生成するのに十分な加工の柔軟性とを結びつけることが望ましい。機械的特性と足場形態はどちらも、細胞挙動および分化に多大な影響を与えることができることが実証されており、したがって、機能性材料は、プロセシングハンドルを提供して、複雑な高分解能構造を生成すると同時に、標的組織に類似した機械的特性を付随して持ち合わせるべきである。
【０００６】
ヒドロゲルは、調節可能な機械的特性および内因性の網状形態の結果として、これらの設計パラメータを一致させるために容易に調整され得る親水性ポリマーの網状組織である。例えば、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）オキシムヒドロゲルの係数は、化学的性質、濃度、および化学量論と無関係な動力学的に制御された架橋反応を使用して調節され得ることが知られている。他のヒドロゲル系の係数は、ヒドロゲルの重量％を変化させることにより調節され得る。その上に、ヒドロゲルの容易な機能化により、細胞挙動上の外因性のバイオマーカーの役割に関する研究が提供されてきた。しかしながら、ヒドロゲル系の大部分は、鋳型製作技術に限定され、種類および生成され得る足場構築の分解能制御は、大きく限定されている。
【０００７】
近年、付加製造により、他のプロセシング法によって達成不可能だった形態学的に複雑な構造の生成に対する手段が提供されてきた。多孔性および増加された表面積などの特徴が、合成インプラントの宿主体への浸潤を促進することが知られたため、この技術は、組織工学の足場の開発において非常に重要な利点を提供する。熱溶解積層法（ＦＤＭ）などの付加製造のいくつかの技術は、ヒアルロン酸およびアルギン酸系ゲルなどのヒドロゲル系に適用されてきた。その上に、最近の報告では、ＰＥＧ−ジアクリレート（ＰＥＧ−ＤＡ）ヒドロゲルを印刷して高分解能構造にする、連続デジタルライトプロセッシング（ｃＤＬＰ）技術の使用が実証された。しかしながら、架橋の数と位置の両方が制限されたため、両方の技術に使用可能なヒドロゲル材料は、制限される。
【０００８】
ｃＤＬＰ付加製造は、紫外線硬化層の段階的な生成を使用して、光反応性の液状樹脂から構造を築く。この技術は、非常に精密な（例えば、＜１２０μｍ）特徴を生成することができ、コンピュータ支援モデリング（ＣＡＭ）の使用を通して、患者固有の欠陥用の足場を生みだすために調整され得る。しかしながら、ポリマー樹脂の粘度は、直ちに流れることができる（すなわち、η＊＜１〜３Ｐａ．ｓ．）ほど、十分に低くなければならず、多くのポリマーは希釈剤の使用を必要とする。
【０００９】
ｃＤＬＰ用に大きな実用性を示してきた、そのようなポリマーの１つが、ポリ（プロピレンフマレート）（ＰＰＦ）である。ポリ（プロピレンフマレート）（ＰＰＦ）は、フマル酸に基づく直鎖不飽和ポリエステルであり、クレブス回路を介して除去することができる小分子である。それは、無害で生分解性であり、調節可能な機械的特性を有し、広範囲の形状に３次元プリントされ得、多くの生物医学および薬物送達用途に非常に役立ち得る。最初にＭｉｋｏｓおよび同僚により報告され、骨組織再生用に特別に開発された、このＵＶ架橋性ポリマーは、頑健な機械的強度を提供しつつ、クレブス回路構成成分（フマル酸）およびユビキタス食品添加物（プロピレングリコール）へと分解する。
【００１０】
最初に記載された合成は逐次重合を利用し、一方、Ｃｏａｔｅｓ  ｅｌ  ａｌ．が、コバルト触媒の存在下でプロピレンオキシド（ＰＯ）と無水マレイン酸（ＭＡ）との開環共重合（ＲＯＣＯＰ）を行い、異性化によりＰＰＦに変換され得る、良好にコントロールされたＰＰＭを生成したことを実証した。（Ｄｉｃｉｃｃｉｏ，Ａ．Ｍ．；Ｃｏａｔｅｓ，Ｇ．Ｗ．Ｒｉｎｇ−Ｏｐｅｎｉｎｇ  Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍａｌｅｉｃ  Ａｎｈｙｄｒｉｄｅ  ｗｉｔｈ  Ｅｐｏｘｉｄｅｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１１，１３３，１０７２４−１０７２７を参照することとし、その開示は本発明において参考としてその全体が含まれる。）鎖分布は、分解、機械的特性、および足場組成物の忠実度に影響を与え得るため、分子質量分布の狭いポリマーを生成することが、組織工学用途において最重要である。その後、コバルトの毒性をあまり制御できないが回避して、ＰＰＦを生成するため、マグネシウムエトキシドをＲＯＣＯＰ触媒として利用してきた。粘度調整剤および反応性希釈剤としてジエチルフマレート（ＤＥＦ）を用いて、ＰＰＦは、ｃＤＬＰを使用して細胞の生存可能な足場に形成された。（Ｌｕｏ，Ｙ．；Ｄｏｌｄｅｒ，Ｃ．Ｋ．；Ｗａｌｋｅｒ，Ｊ．Ｍ．；Ｍｉｓｈｒａ，Ｒ．；Ｄｅａｎ，Ｄ．；Ｂｅｃｋｅｒ，Ｍ．Ｌ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｗｅｌｌ−Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｐｏｌｙ（Ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  Ｆｕｍａｒａｔｅ）  Ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ  ｉｎ  ３Ｄ  Ｐｒｉｎｔｅｄ  Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２０１６，１７（２），６９０−６９７を参照することとし、これらの開示は、その開示は本発明において参考としてその全体が含まれる。）
【００１１】
最近になって、ＰＰＦの良好にコントロールされたＲＯＣＯＰが、触媒としてＭｇ（ＢＨＴ）２（ＴＨＦ）２を使用して、Ｃｏａｔｅｓらにより報告されたそれらと同様の分子質量分布（Ｄｍ）を有毒性のコバルトを使用せずに得られたことが実証された。（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ａ．；Ｌｕｏｎｇ，Ｄ．；Ｋｌｅｉｎｆｅｈｎ，Ａ．Ｐ．；Ｓａｌｌａｍ，Ｓ．；Ｗｅｓｄｅｍｉｏｔｉｓ，Ｃ．；Ｂｅｃｋｅｒ，Ｍ．Ｌ．Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  Ｃａｔａｌｙｚｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  Ｐｏｌｙ（Ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  Ｍａｌｅａｔｅ）  ａｎｄ  Ｐｏｌｙ（Ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  Ｆｕｍａｒａｔｅ）  ｆｏｒ  ３Ｄ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１８，  １４０，  ２７７−２８４を参照することとし、その開示は本発明において参考としてその全体が含まれる。）その上に、鎖末端官能基は、機能性アルコール開始剤を使用すると同時に、重合後および印刷後の官能化のために反応性ハンドルを導入して、この系に達成された。遺憾ながら、しかし、それは、疎水性のガラス状固体であるため、ＰＰＦは、ヒドロゲルなどの水和が必要な用途にて使用されてこなかった。
【００１２】
この制限を回避するため、ＰＥＧ−ジオール鎖の端部からＰＰＦを重合させて、頑健で３次元印刷可能なヒドロゲルを生成する試みがなされてきた。広い分子質量分布を有する多元ブロックポリ（プロピレンフマレート−ｃｏ−エチレングリコール）ポリマーが、逐次エステル交換機構を用いて、エチレングリコールのサブ単位をＰＰＦに組み込むことが報告されてきた。しかしながら、３次元印刷に好適なＰＥＧおよびＰＰＦの秩序だったブロックコポリマーは、発見または発展してこなかった。
【００１３】
したがって、当該技術分野において必要とされるのは、３次元印刷に好適なＰＥＧおよびＰＰＦの秩序だったブロックコポリマーであり、組織工学、薬物送達、および他の生物医学の用途でのヒドロゲルとして使用するのに好適な膨潤、分解、および引張機械的特性を有することである。
【発明の概要】
【００１４】
１つ以上の実施形態では、本発明は、ヒドロゲルなどの物体を形成するための水和が可能となり、３次元印刷および薬物送達用途に好適である、制約されて予測可能な材料特性を有する低分子量で無害である吸収性のポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）−ブロック−ポリ（プロピレンフマレート）（ＰＰＦ）ジブロックコポリマー（ＰＥＧｎＰＰＦｍ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ）およびポリ（プロピレンフマレート）（ＰＰＦ）−ブロック−ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）−ブロック−ポリ（プロピレンフマレート）（ＰＰＦ）トリブロックコポリマー（ＰＰＦｍＰＥＧｎＰＰＦｍポリマー）（ならびにそれらの製造および使用のための関連方法）を提供する。連続デジタルライトプロセッシング（ｃＤＬＰ）ヒドロゲルを使用して、ジブロックおよびトリブロックコポリマーは、従来のジエチルフマレート（ＤＥＦ）に基づく印刷と比較して、破断点伸びにおいて１０倍の増加を有する構造体へと、水溶液から光化学的に印刷され得る。その上に、ＰＰＦ−ＰＥＧ−ＰＰＦトリブロックヒドロゲルは、多数の操作されたＭＣ３Ｔ３、ＮＩＨ３Ｔ３、および初代シュワン細胞に対して生体外で生体適合性があることも見出された。
【００１５】
第１の態様では、本発明は、約５重量％〜９５重量％のＰＥＧを含むポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）およびポリ（プロピレンフマレート）（ＰＰＦ）のブロックコポリマーを対象とする。これらの実施形態のいくつかでは、ブロックコポリマーは、約５００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａの数平均分子量（Ｍｎ）を有するであろう。１つ以上の実施形態では、本発明のブロックコポリマーは、ＰＥＧおよびＰＰＦのブロックコポリマーが、ＰＥＧ／ＰＰＦジブロックコポリマーである、本発明の第１の態様の上記の実施形態のうちの任意の１つ以上を含む。
【００１６】
１つ以上の実施形態では、本発明のブロックコポリマーは、ＰＥＧおよびＰＰＦのブロックコポリマーが、次式を有するＰＥＧ／ＰＰＦジブロックコポリマーである、本発明の第１の態様の上記の実施形態のうちの任意の１つ以上を含み、
【化１】
2020530055.tif 000003
式中、ａは、約４〜約１００の整数であり、ｂは、約２〜約１００の整数であり、Ｒは、メチル基、ベンジル基、アルキン基、プロパルギル基、アリル基、アルケン基、４−ジベンジオシクロオクチン基、シクロオクチン基、ケトン基、アルデヒド基、三級ハロゲン基、ポリ（エチレングリコール）基、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される官能基である。
【００１７】
１つ以上の実施形態では、本発明のブロックコポリマーは、ＰＥＧおよびＰＰＦのブロックコポリマーが、次式を有するＰＥＧ／ＰＰＦジブロックコポリマーである、本発明の第１の態様の上記の実施形態のうちの任意の１つ以上を含み、
【化２】
2020530055.tif 000004
式中、ａは、約４〜約１００の整数であり、ｂは、約２〜約１００の整数である。
【００１８】
１つ以上の実施形態では、本発明のブロックコポリマーは、ＰＥＧおよびＰＰＦのブロックコポリマーが、ＰＰＦ／ＰＥＧ／ＰＰＦトリブロックコポリマーである、本発明の第１の態様の上記の実施形態のうちの任意の１つ以上を含む。１つ以上の実施形態では、本発明のブロックコポリマーは、ＰＥＧおよびＰＰＦのブロックコポリマーが、次式を有するＰＰＦ／ＰＥＧ／ＰＰＦトリブロックコポリマーである、本発明の第１の態様の上記の実施形態のうちの任意の１つ以上を含み、
【化３】
2020530055.tif 000005
式中、ａは、約２〜約１００の整数であり、各ｂは、約２〜約１００の整数である。
【００１９】
第２の態様では、本発明は、プロピレンオキシド、無水マレイン酸、ＰＥＧ開始剤、およびマグネシウム触媒を好適な溶媒中で溶解させることと、溶液を約４０℃〜約８０℃までの温度に約１時間〜約２４時間加熱して、ポリ（エチレングリコール−ｂ−プロピレンマレエート）またはポリ（プロピレンマレエート−ｂ−エチレングリコール−ｂ−プロピレンマレエート）中間体を生成することと、ポリ（エチレングリコール−ｂ−プロピレンマレエート）またはポリ（プロピレンマレエート−ｂ−エチレングリコール−ｂ−プロピレンマレエート）中間体を好適な溶媒中で溶解させて、ジエチルアミンを添加することと、溶液を約１〜約２４時間加熱還流して、本発明の第１の態様のブロックコポリマーを生成することと、を含む、本発明の第１の態様ブロックコポリマーを生成するための方法を対象とする。
【００２０】
１つ以上の実施形態では、本発明の方法は、ＰＥＧ開始剤が、約１００Ｄａ〜約１０，０００Ｄａの数平均分子量（Ｍｎ）を有する、本発明の第２の態様の上記の実施形態のうちの任意の１つ以上を含む。１つ以上の実施形態では、本発明の方法は、ＰＥＧ開始剤が、約２〜約５０個のエチレングリコール単位を有する、本発明の第２の態様の上記の実施形態のうちの任意の１つ以上を含む。１つ以上の実施形態では、本発明の方法は、ＰＥＧ開始剤が単官能性である、本発明の第２の態様の上記の実施形態のうちの任意の１つ以上を含む。１つ以上の実施形態では、本発明の方法は、ＰＥＧ開始剤が、約１００〜約１０，０００の数平均分子量（Ｍｎ）を有するメチルエーテルＰＥＧである、本発明の第２の態様の上記の実施形態のうちの任意の１つ以上を含む。
【００２１】
１つ以上の実施形態では、本発明の方法は、ＰＥＧ開始剤が二官能性である、本発明の第２の態様の上記の実施形態のうちの任意の１つ以上を含む。１つ以上の実施形態では、本発明の方法は、ＰＥＧ開始剤が、約１００Ｄａ〜約１０，０００Ｄａの数平均分子量（Ｍｎ）を有するＰＥＧジオールである、本発明の第２の態様の上記の実施形態のうちの任意の１つ以上を含む。
【００２２】
１つ以上の実施形態では、本発明の方法は、マグネシウム開始剤がＭｇ（ＢＨＴ）２（ＴＨＦ）２である、本発明の第２の態様の上記の実施形態のうちの任意の１つ以上を含む。１つ以上の実施形態では、本発明の方法は、好適な溶媒が、トルエン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、本発明の第２の態様の上記の実施形態のうちの任意の１つ以上を含む。１つ以上の実施形態では、本発明の方法は、好適な溶媒がトルエンである、本発明の第２の態様の上記の実施形態のうちの任意の１つ以上を含む。
【００２３】
１つ以上の実施形態では、本発明の方法は、好適な溶媒が、クロロホルム、ジクロロメタン、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、本発明の第２の態様の上記の実施形態のうちの任意の１つ以上を含む。１つ以上の実施形態では、本発明の方法は、好適な溶媒がクロロホルムである、本発明の第２の態様の上記の実施形態のうちの任意の１つ以上を含む。１つ以上の実施形態では、本発明の方法は、重合度が、約２〜約１００である、本発明の第２の態様の上記の実施形態のうちの任意の１つ以上を含む。
【００２４】
別の態様では、本発明は、本発明の第１の態様のブロックコポリマーを含むミセルを対象とする。
【００２５】
別の態様では、本発明は、本発明の第１の態様のブロックコポリマーを含む３次元印刷されたポリマー構造体を対象とする。
【００２６】
別の態様では、本発明は、本発明の第１の態様のブロックコポリマーを含むヒドロゲルを対象とする。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
本発明の特徴および利点をさらに完全に理解するために、以下の添付された図面と併せて、発明を実施するための形態を参照する。
【００２８】
【図１Ａ】ポリ（エチレングリコール−ｂ−プロピレンマレエート）（図１Ａ）を生成するメチルエーテルＰＥＧにより開始される本発明による、ＰＥＧＰＰＦジブロックコポリマーの合成のための反応機構である。
【図１Ｂ】ポリ（プロピレンマレエート−ｂ−エチレングリコール−ｂ−プロピレンマレエート）（図１Ｂ）を生成するＰＥＧ−ジオールにより開始される本発明による、ＰＥＧＰＰＦジブロックコポリマーの合成のための反応機構である。
【図２Ａ】本発明のポリ（エチレングリコール−ｂ−プロピレンフマレート）（図２Ａ）コポリマーを得るため、触媒としてジエチルアミンを使用して異性化の結果を示す１Ｈ  ＮＭＲスペクトルである。
【図２Ｂ】本発明のポリ（プロピレンフマレート−ｂ−エチレングリコール−ｂ−プロピレンフマレート）（図２Ｂ）コポリマーを得るため、触媒としてジエチルアミンを使用して異性化の結果を示す１Ｈ  ＮＭＲスペクトルである。
【図３】ポリ（プロピレンフマレート−ｂ−エチレングリコール−ｂ−プロピレンフマレート）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルである。
【図４Ａ】（図４Ａ）ＰＥＧサブ単位に隣接したＰＰＦ中のカルボニル２連子共鳴の低集積度によりシャープなブロック界面を示す、本発明のＰＰＦｍＰＥＧｎＰＰＦｍトリブロックコポリマーの定量１３Ｃ  ＮＭＲ分光法スペクトルである。
【図４Ｂ】（図４Ｂ）ＰＰＦサブ単位に隣接したＰＥＧ共鳴の低集積度によりシャープなブロック界面を示す、本発明のＰＰＦｍＰＥＧｎＰＰＦｍトリブロックコポリマーの定量１３Ｃ  ＮＭＲ分光法スペクトルである。
【図５Ａ】（図５Ａ）ＰＥＧサブ単位に隣接したＰＰＦ中のカルボニル２連子共鳴の低集積度によりシャープなブロック界面を示す、ＰＥＧｎＰＰＦｍジブロックコポリマーの定量１３Ｃ  ＮＭＲ分光法スペクトルである。
【図５Ｂ】（図５Ｂ）ＰＰＦサブ単位に隣接したＰＥＧ共鳴の低集積度によりシャープなブロック界面を示す、ＰＥＧｎＰＰＦｍジブロックコポリマーの定量１３Ｃ  ＮＭＲ分光法スペクトルである。
【図６】ＰＰＦｍＰＥＧｎＰＰＦｍが０重量％、２５重量％、および５０重量％のＤＥＦを有する場合の粘度測定の実験結果を示すグラフである。ＤＥＦを、３次元印刷に最適だと考えられている５０重量％で、非常に粘稠なホモポリマー樹脂の粘度調整剤として使用した。図６は、また、他の樹脂配合物に対する粘度を評価するため、５０％のＤＥＦを用いて異なるＰＰＦブロックを有するＰＥＧｎＰＰＦｍジブロックコポリマーの結果を示す。
【図７Ａ】螺旋状に配置された足場のＣＡＤモデル（図７Ａ）を示す。
【図７Ｂ】ＤＥＦ中のＰＰＦ３ＰＥＧ２３ＰＰＦ３の５０重量％の溶液から印刷に成功した螺旋状に配置された足場を撮影した画像（図７Ｂ）を示す。
【図８】一定の水溶性ＰＰＦｍＰＥＧｎＰＰＦｍコポリマーの粘度を示すグラフである。ＰＥＧ含有量が２０００Ｄａ未満であるＰＰＦｍＰＥＧｎＰＰＦｍコポリマーが、〜２５重量％のポリマーでｃＤＬＰに好適な粘度を生成することが見出された。
【図９】ＰＰＦｍＰＥＧ４５ＰＰＦｍおよびＰＰＦｍＰＥＧ９１ＰＰＦｍヒドロゲルに対して実施した膨潤試験の結果を示すグラフである。
【図１０】水印刷されたＰＰＦ３ＰＥＧ４５ＰＰＦ３およびＤＥＦ印刷されたＰＰＦ３ＰＥＧ２３ＰＰＦ３ヒドロゲルの引張応力−引張ひずみ曲線を示すグラフである。
【図１１】ＰＰＦ７ＰＥＧ４５ＰＰＦ７の水中２５重量％のひずみスイープの結果を示すグラフである。
【図１２】ＰＰＦ３ＰＥＧ２３ＰＰＦ３の５０重量％のＤＥＦのひずみスイープの結果を示すグラフである。
【図１３】ＰＰＦｍＰＥＧｎＰＰＦｍヒドロゲルに対するスライドガラスコントロールに標準化されたＮＩＨ３Ｔ３、ＭＣ３Ｔ３、およびシュワン細胞の生存率を示すグラフである。生存率は、ほぼ定量的であった。
【図１４】ＰＰＦ６ＰＥＧ４５ＰＰＦ６、ＰＰＦ１５ＰＥＧ４５ＰＰＦ１５、ＰＰＦ２５ＰＥＧ４５ＰＰＦ２５、ＰＰＦ６ＰＥＧ９１ＰＰＦ６、ＰＰＦ１５ＰＥＧ９１ＰＰＦ１５、ＰＰＦ２５ＰＥＧ９１ＰＰＦ２５ヒドロゲル上に播種されたＮＩＨ３Ｔ３細胞の蛍光顕微鏡検査法の顕微鏡写真の一群である。
【図１５】ＰＰＦ６ＰＥＧ４５ＰＰＦ６、ＰＰＦ１５ＰＥＧ４５ＰＰＦ１５、ＰＰＦ２５ＰＥＧ４５ＰＰＦ２５、ＰＰＦ６ＰＥＧ９１ＰＰＦ６、ＰＰＦ１５ＰＥＧ９１ＰＰＦ１５、ＰＰＦ２５ＰＥＧ９１ＰＰＦ２５ヒドロゲル上に播種されたＭＣ３Ｔ３細胞の顕微鏡検査法の顕微鏡写真の一群である。
【図１６】Ｍｇ（ＢＨＴ）２（ＴＨＦ）２を触媒として使用した、メチルエーテルＰＥＧ  ＭＷ  ７５０開始（ｉｎｉｔｉａｔｅｄ）ポリ（エチレングリコール−ｂ−プロピレンマレエート）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルである（重合度２０）（３００ＭＨｚ、３０３Ｋ、ＣＤＣｌ３）。
【図１７】ＰＥＧ１７ＰＰＦ２０の１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルである。
【図１８】Ｍｇ（ＢＨＴ）２（ＴＨＦ）２を触媒として使用した、メチルエーテルＰＥＧ  ＭＷ  ７５０開始ポリ（エチレングリコール−ｂ−プロピレンマレエート）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルである（重合度５０）（３００ＭＨｚ、３０３Ｋ、ＣＤＣｌ３）。
【図１９】Ｍｇ（ＢＨＴ）２（ＴＨＦ）２を触媒として使用した、ＰＥＧ−ジオール  ＭＷ  １０００開始ポリ（プロピレンマレエート−ｂ−エチレングリコール−ｂ−プロピレンマレエート）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルである（３００ＭＨｚ、３０３Ｋ、ＣＤＣｌ３）。
【図２０】Ｍｇ（ＢＨＴ）２（ＴＨＦ）２を触媒として使用した、ＰＥＧ−ジオール  ＭＷ  １０００開始ポリ（エチレングリコール−ｂ−プロピレンマレエート）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルである（３００ＭＨｚ、３０３Ｋ、ＣＤＣｌ３）。
【図２１】Ｍｇ（ＢＨＴ）２（ＴＨＦ）２を触媒として使用した、メチルエーテルＰＥＧ  ＭＷ  ７５０開始ポリ（エチレングリコール−ｂ−プロピレンマレエート）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルである（重合度５０）（３００ＭＨｚ、３０３Ｋ、ＣＤＣｌ３）。
【図２２】ポリ（エチレングリコール−ｂ−プロピレンフマレート）（上部）と前駆ポリ（エチレングリコール−ｂ−プロピレンマレエート）（下部）との１Ｈ  ＮＭＲスペクトルの比較である（３００ＭＨｚ、３０３Ｋ、ＣＤＣｌ３）。
【図２３】Ｍｇ（ＢＨＴ）２（ＴＨＦ）２を触媒として使用した、メチルエーテルＰＥＧ  ７５０  ＭＷ開始ポリ（エチレングリコール−ｂ−プロピレンフマレート）の１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルである（１２５ＭＨｚ、３０３Ｋ、ＣＤＣｌ３）。
【図２４】ＭＷ  ７５０メチルエーテルポリ（エチレングリコール）により開始されたポリ（プロピレンフマレート）のＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳプロットである。
【図２５Ａ】ジブロックコポリマーの合成を確認するために使用されたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法（図２５Ａ）の結果を示すスペクトルである。
【図２５Ｂ】ジブロックコポリマーの合成を確認するために使用されたサイズ排除クロマトグラフィー（図２５Ｂ）の結果を示すスペクトルである。
【図２６Ａ】トリブロックコポリマーの合成を確認するために使用されたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法（図２６Ａ）の結果を示すスペクトルである。
【図２６Ｂ】トリブロックコポリマーの合成を確認するために使用されたサイズ排除クロマトグラフィー（図２６Ｂ）の結果を示すスペクトルである。
【図２７】Ｍｇ（ＢＨＴ）２（ＴＨＦ）２を触媒として使用した、ＰＥＧ−ジオール  ＭＷ  １０００開始ポリ（プロピレンフマレート−ｂ−エチレングリコール−ｂ−プロピレンフマレート）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルである（３００ＭＨｚ、３０３Ｋ、ＣＤＣｌ３）。
【図２８】ＰＰＦ１０ＰＥＧ２３ＰＰＦ１０の１３Ｃ  ＮＭＲである。
【図２９】ＰＰＦ繰り返し単位に隣接したＰＥＧ繰り返し単位を基準とするピークの低集積度によりブロック様の特徴を示すＰＥＧ−ジオールＭＷ  １０００開始ポリ（エチレングリコール−ｂ−プロピレンフマレート）の定量１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルである（１２５ＭＨｚ、３０３Ｋ、ＣＤＣｌ３）。
【図３０】ＬＡＰ光重合開始剤の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルである。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
１つ以上の実施形態では、本発明は、ヒドロゲルなどの物体を形成するための水和が可能となり、３次元印刷および薬物送達用途に好適である、制約されて予測可能な材料特性を有する低分子量で無害である吸収性のポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）−ブロック−ポリ（プロピレンフマレート）（ＰＰＦ）ジブロックコポリマーおよびポリ（プロピレンフマレート）（ＰＰＦ）−ブロック−ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）−ブロック−ポリ（プロピレンフマレート）（ＰＰＦ）トリブロックコポリマー（ならびにそれらの製造および使用のための関連方法）を提供する。連続デジタルライトプロセッシング（ｃＤＬＰ）ヒドロゲルを使用して、ジブロックおよびトリブロックコポリマーは、従来のジエチルフマレート（ＤＥＦ）に基づく印刷と比較して、破断点伸びにおいて１０倍の増加を有する構造体へと、水溶液から光化学的に印刷され得る。その上に、ＰＰＦ−ＰＥＧ−ＰＰＦトリブロックヒドロゲルは、また、多数の操作されたＭＣ３Ｔ３、ＮＩＨ３Ｔ３、および初代シュワン細胞に対して生体外で生体適合性があることも見出された。
【００３０】
第１の態様では、本発明は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）およびポリ（プロピレンフマレート）（ＰＰＦ）のブロックコポリマーを対象とする。１つ以上の実施形態では、本発明のＰＥＧ／ＰＰＦブロックコポリマーは、約５００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａの数平均分子量（Ｍｎ）を有するであろう。いくつかの実施形態では、本発明のＰＥＧ／ＰＰＦブロックコポリマーは、５，０００Ｄａ以上、他の実施形態では、１０，０００Ｄａ以上、他の実施形態では、２０，０００Ｄａ以上、他の実施形態では、３０，０００Ｄａ以上、他の実施形態では、４０，０００Ｄａ以上、および他の実施形態では、５０，０００Ｄａ以上の数平均分子量（Ｍｎ）を有するであろう。いくつかの実施形態では、本発明のＰＥＧ／ＰＰＦブロックコポリマーは、９０，０００Ｄａ以下、他の実施形態では、８０，０００Ｄａ以下、他の実施形態では、７０，０００Ｄａ以下、他の実施形態では、６０，０００Ｄａ以下、他の実施形態では、５０，０００Ｄａ以下、他の実施形態では、４０，０００Ｄａ以下の数平均分子量（Ｍｎ）を有するであろう。
【００３１】
１つ以上の実施形態では、本発明のＰＥＧ／ＰＰＦブロックコポリマーは、約５００Ｄａ〜約２００，０００Ｄａの重量平均分子量（ＭＷ）を有するであろう。いくつかの実施形態では、本発明のＰＥＧ／ＰＰＦブロックコポリマーは、約５０００Ｄａ〜約２００，０００Ｄａ、他の実施形態では、約２０，０００Ｄａ〜約２００，０００Ｄａ、他の実施形態では、約５０，０００Ｄａ〜約２００，０００Ｄａ、他の実施形態では、約１００，０００Ｄａ〜約２００，０００Ｄａ、他の実施形態では、約１５０，０００Ｄａ〜約２００，０００Ｄａ、他の実施形態では、約５００Ｄａ〜約１５０，０００Ｄａ、他の実施形態では、約５００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａ、他の実施形態では、約５００Ｄａ〜約７５，０００Ｄａ、および他の実施形態では、約５００Ｄａ〜約５０，０００Ｄａの重量平均分子量（Ｍｗ）を有するであろう。
【００３２】
１つ以上の実施形態では、本発明のＰＥＧ／ＰＰＦブロックコポリマーは、２．０以下、および好ましくは１．５以下の質量分布（Ｄｍ）を有し、Ｄｍ＝Ｍｗ／Ｍｎである。いくつかの実施形態では、本発明のＰＥＧ／ＰＰＦブロックコポリマーは、約１．０〜約２．０、他の実施形態では、約１．２〜約２．０、他の実施形態では、約１．４〜約２．０、他の実施形態では、約１．６〜約２．０、他の実施形態では、約１．８〜約２．０、他の実施形態では、約１．０〜約１．９、他の実施形態では、約１．０〜約１．７、他の実施形態では、約１．０〜約１．５、および他の実施形態では、約１．０〜約１．３の質量分布（Ｄｍ）を有するであろう。
【００３３】
１つ以上の実施形態では、本発明のＰＥＧ／ＰＰＦブロックコポリマーは、約５重量％〜約９５重量％のＰＥＧを含むであろう。いくつかの実施形態では、本発明のＰＥＧ／ＰＰＦブロックコポリマーは、２０重量％以上、他の実施形態では、３０重量％以上、他の実施形態では、４０重量％以上、他の実施形態では、５０重量％以上、他の実施形態では、６０重量％以上、他の実施形態では、７０重量％以上のＰＥＧポリマーを含むであろう。いくつかの実施形態では、本発明のＰＥＧ／ＰＰＦブロックコポリマーは、９０重量％以下、他の実施形態では、８０重量％以下、他の実施形態では、７０重量％以下、他の実施形態では、６０重量％以下、および他の実施形態では、５０重量％以下のＰＥＧポリマーを含むであろう。
【００３４】
１つ以上の実施形態では、本発明のＰＥＧ／ＰＰＦブロックコポリマーは、約５重量％〜約９５重量％のＰＥＧを含むであろう。いくつかの実施形態では、本発明のＰＥＧ／ＰＰＦブロックコポリマーは、１０重量％以上、他の実施形態では、２０重量％以上、他の実施形態では、３０重量％以上、他の実施形態では、４０重量％以上、他の実施形態では、５０重量％以上、他の実施形態では、６０重量％以上、および他の実施形態では、７０重量％以上のＰＰＦポリマーを含むであろう。いくつかの実施形態では、本発明のＰＥＧ／ＰＰＦブロックコポリマーは、９０重量％以下、他の実施形態では、８０重量％以下、他の実施形態では、７０重量％以下、他の実施形態では、６０重量％以下、他の実施形態では、５０重量％以下、他の実施形態では、４０重量％以下、および他の実施形態では、３０重量％以下のＰＰＦポリマーを含むであろう。
【００３５】
様々な実施形態では、本発明のＰＥＧ／ＰＰＦブロックコポリマーの各ＰＰＦブロックは、約５００ｇ／ｍｏｌ〜約２０，０００ｇ／ｍｏｌの数平均分子量（Ｍｎ）を有するであろう。いくつかの実施形態では、本発明のＰＥＧ／ＰＰＦブロックコポリマーの各ＰＰＦブロックは、約１０００ｇ／ｍｏｌ〜約２０，０００ｇ／ｍｏｌ、他の実施形態では、約３０００ｇ／ｍｏｌ〜約２０，０００ｇ／ｍｏｌ、他の実施形態では、約７０００ｇ／ｍｏｌ〜約２０，０００ｇ／ｍｏｌ、他の実施形態では、約１０，０００ｇ／ｍｏｌ〜約２０，０００ｇ／ｍｏｌ、他の実施形態では、約１５，０００ｇ／ｍｏｌ〜約２０，０００ｇ／ｍｏｌ、他の実施形態では、約５００ｇ／ｍｏｌ〜約１５，０００ｇ／ｍｏｌ、他の実施形態では、約５００ｇ／ｍｏｌ〜約１０，０００ｇ／ｍｏｌ、および他の実施形態では、約５００ｇ／ｍｏｌ〜約５０００ｇ／ｍｏｌの数平均分子量（Ｍｎ）を有するであろう。
【００３６】
様々な実施形態では、本発明のＰＥＧ／ＰＰＦブロックコポリマーのＰＥＧブロックは、約５００ｇ／ｍｏｌ〜約２０，０００ｇ／ｍｏｌの数平均分子量（Ｍｎ）を有するであろう。いくつかの実施形態では、本発明のＰＥＧ／ＰＰＦブロックコポリマーのＰＥＧブロックは、約１，０００ｇ／ｍｏｌ〜約２０，０００ｇ／ｍｏｌ、他の実施形態では、約３，０００ｇ／ｍｏｌ〜約２０，０００ｇ／ｍｏｌ、他の実施形態では、約７，０００ｇ／ｍｏｌ〜約２０，０００ｇ／ｍｏｌ、他の実施形態では、約１０，０００ｇ／ｍｏｌ〜約２０，０００ｇ／ｍｏｌ、他の実施形態では、約１５，０００ｇ／ｍｏｌ〜約２０，０００ｇ／ｍｏｌ、他の実施形態では、約５００ｇ／ｍｏｌ〜約１５，０００ｇ／ｍｏｌ、他の実施形態では、約５００ｇ／ｍｏｌ〜約１０，０００ｇ／ｍｏｌ、および他の実施形態では、約５００ｇ／ｍｏｌ〜約５０００ｇ／ｍｏｌの数平均分子量（Ｍｎ）を有するであろう。
【００３７】
１つ以上の実施形態では、本発明のＰＥＧ／ＰＰＦブロックコポリマーは、水溶性である。ＰＥＧは水溶性ポリマーであり、いくつかの実施形態では、本発明のＰＥＧ／ＰＰＦブロックコポリマー中のＰＥＧブロックが、これらのポリマーを水溶性にするであろう。当業者に理解されるように、これらのポリマー中のＰＥＧブロックが、これらを水溶性にするであろうという点が、ＰＥＧブロックの長さ、ポリマー中のＰＥＧとＰＰＦとの全体のモル比、温度、および圧力を含むが、これらに限定されない様々な要因に依存するであろう。他のすべての条件が同じ場合、本発明のＰＥＧ／ＰＰＦブロックコポリマー中のＰＥＧとＰＰＦとの比が高くなればなるほど、ポリマーはますます水溶性になるであろう。当業者は、不必要な実験をすることなく、水溶性である本発明のＰＥＧ／ＰＰＦブロックコポリマーを製造できるであろう。
【００３８】
１つ以上の実施形態では、本発明のＰＥＧ／ＰＰＦブロックコポリマーは、ＰＥＧ／ＰＰＦジブロックコポリマーである。１つ以上の実施形態では、これらのＰＥＧ／ＰＰＦジブロックコポリマーは、上記に記載の数平均分子量（Ｍｎ）および質量分布（Ｄｍ）を有するであろう。１つ以上の実施形態では、これらのＰＥＧ／ＰＰＦジブロックコポリマーのＰＰＦおよびＰＥＧブロックは、上記に記載の数平均分子量（Ｍｎ）を有するであろう。
【００３９】
これらの実施形態のいくつかでは、本発明のＰＥＧ／ＰＰＦブロックコポリマーは、次式を有するＰＥＧ／ＰＰＦジブロックコポリマーであり、
【化４】
2020530055.tif 000006
式中、ａは、約４〜約１００の整数であり、ｂは、約２〜約１００の整数である。いくつかの実施形態では、ａは１０以上、他の実施形態では、２０以上、他の実施形態では、３０以上、他の実施形態では、４０以上、他の実施形態では、５０以上、および他の実施形態では、６０以上の整数であろう。いくつかの実施形態では、ａは９０以下、他の実施形態では、８０以下、他の実施形態では、７０以下、他の実施形態では、６０以下、および他の実施形態では、５０以下の整数であろう。いくつかの実施形態では、ｂは５以上、他の実施形態では、１０以上、他の実施形態では、２０以上、他の実施形態では、３０以上、他の実施形態では、４０以上、および他の実施形態では、５０以上の整数であろう。いくつかの実施形態では、ｂは９０以下、他の実施形態では、８０以下、他の実施形態では、７０以下、他の実施形態では、６０以下、および他の実施形態では、５０以下の整数であろう。
【００４０】
これらの実施形態のいくつかでは、本発明のＰＥＧ／ＰＰＦブロックコポリマーは、次式を有するＰＥＧ／ＰＰＦジブロックコポリマーであり、
【化５】
2020530055.tif 000007
式中、ａは、約４〜約１００の整数であり、ｂは、約４〜約１００の整数であり、Ｒは、メチル基、ベンジル基、アルキン基、プロパルギル基、アリル基、アルケン基、４−ジベンジオシクロオクチン基、シクロオクチン基、ケトン基、アルデヒド基、三級ハロゲン基、ポリ（エチレングリコール）基、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される官能基である。
【００４１】
いくつかの実施形態では、ａは１０以上、他の実施形態では、２０以上、他の実施形態では、３０以上、他の実施形態では、４０以上、他の実施形態では、５０以上、および他の実施形態では、６０以上の整数であろう。いくつかの実施形態では、ａは９０以下、他の実施形態では、８０以下、他の実施形態では、７０以下、他の実施形態では、６０以下、および他の実施形態では、５０以下の整数であろう。いくつかの実施形態では、ｂは５以上、他の実施形態では、１０以上、他の実施形態では、２０以上、他の実施形態では、３０以上、他の実施形態では、４０以上、および他の実施形態では、５０以上の整数であろう。いくつかの実施形態では、ｂは９０以下、他の実施形態では、８０以下、他の実施形態では、７０以下、他の実施形態では、６０以下、および他の実施形態では、５０以下の整数であろう。
【００４２】
１つ以上の実施形態では、本発明のＰＥＧ／ＰＰＦブロックコポリマーは、ＰＰＦ／ＰＥＧ／ＰＰＦトリブロックコポリマーである。１つ以上の実施形態では、これらのＰＰＦ／ＰＥＧ／ＰＰＦトリブロックコポリマーは、上記に記載の数平均分子量（Ｍｎ）および質量分布（Ｄｍ）を有するであろう。１つ以上の実施形態では、これらのＰＰＦ／ＰＥＧ／ＰＰＦトリブロックコポリマーのＰＰＦおよびＰＥＧブロックは、上記に記載の数平均分子量（Ｍｎ）を有するであろう。これらの実施形態では、ほぼ同一寸法の２つの別個のＰＰＦブロックがあり、そのため、これらのポリマー中のＰＰＦの総Ｍｎは、約１０００ｇ／ｍｏｌ〜４０，０００ｇ／ｍｏｌであり得る。
【００４３】
これらの実施形態のいくつかでは、ＰＥＧ／ＰＰＦブロックコポリマーは、次式を有するＰＰＦ／ＰＥＧ／ＰＰＦトリブロックコポリマーであり、
【化６】
2020530055.tif 000008
式中、ａは、約４〜約１００の整数であり、各ｂは、約２〜約１００の整数である。いくつかの実施形態では、ａは１０以上、他の実施形態では、２０以上、他の実施形態では、３０以上、他の実施形態では、４０以上、他の実施形態では、５０以上、および他の実施形態では、６０以上の整数であろう。いくつかの実施形態では、ａは９０以下、他の実施形態では、８０以下、他の実施形態では、７０以下、他の実施形態では、６０以下、他の実施形態では、５０以下の整数であろう。いくつかの実施形態では、各Ｂは５以上、他の実施形態では、１０以上、他の実施形態では、２０以上、他の実施形態では、３０以上、他の実施形態では、４０以上、および他の実施形態では、５０以上の整数であろう。いくつかの実施形態では、各ｂは９０以下、他の実施形態では、８０以下、他の実施形態では、７０以下、他の実施形態では、６０以下、および他の実施形態では、５０以下の整数であろう。
【００４４】
別の態様では、本発明は、上述のＰＥＧ／ＰＰＦブロックコポリマーを製造するための方法を対象とする。様々な実施形態では、本方法は、プロピレンオキシド、無水マレイン酸、ＰＥＧ開始剤、およびマグネシウム触媒を好適な溶媒中で溶解させることにより開始される。当業者は、不必要な実験をすることなく、プロピレンオキシド、無水マレイン酸、ＰＥＧ開始剤、およびマグネシウム触媒に好適な溶媒を選択することができるであろう。様々な実施形態では、プロピレンオキシド、無水マレイン酸、ＰＥＧ開始剤、およびマグネシウム触媒に好適な溶媒は、トルエン、クロロホルム、ジオキサン、またはテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を含むが、これらに限定されなくてもよい。いくつかの実施形態では、プロピレンオキシド、無水マレイン酸、ＰＥＧ開始剤、およびマグネシウム触媒をトルエン中に溶解させる。いくつかの実施形態では、マグネシウム触媒は、Ｍｇ（ＢＨＴ）２（ＴＨＦ）２、ＭｇＥｔ２、またはこれらの組み合わせであり得るが、好ましくはＭｇ（ＢＨＴ）２（ＴＨＦ）２である。
【００４５】
これらの実施形態のいくつかでは、ＰＥＧ開始剤は、約１００Ｄａ〜約４０，０００Ｄａの数平均分子量（Ｍｎ）を有する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ開始剤は、１０００Ｄａ以上、他の実施形態では、２０００Ｄａ以上、他の実施形態では、３０００Ｄａ以上、他の実施形態では、４０００Ｄａ以上、他の実施形態では、５０００Ｄａ以上、他の実施形態では、６０００Ｄａ以上、および他の実施形態では、７０００Ｄａ以上の数平均分子量（Ｍｎ）を有するであろう。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ開始剤は、９０００Ｄａ以下、他の実施形態では、８０，０００Ｄａ以下、他の実施形態では、７０００Ｄａ以下、他の実施形態では、６０００Ｄａ以下、他の実施形態では、５０００Ｄａ以下、他の実施形態では、４０００Ｄａ以下、他の実施形態では、３０００Ｄａ以下の数平均分子量（Ｍｎ）を有するであろう。
【００４６】
これらの実施形態のいくつかでは、ＰＥＧ開始剤は、約２〜約５０個のエチレングリコール単位を有する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ開始剤は、５個以上、他の実施形態では、１０個以上、他の実施形態では、１５個以上、他の実施形態では、２０個以上、他の実施形態では、２５個以上、他の実施形態では、３０個以上のエチレングリコール単位を有するであろう。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ開始剤は、４５個以下、他の実施形態では、４０個以下、他の実施形態では、３５個以下、他の実施形態では、３０個以下、他の実施形態では、２５個以下、他の実施形態では、２０個以下のエチレングリコール単位を有するであろう。
【００４７】
これらの実施形態のいくつかでは、ＰＥＧ開始剤は、単一の官能性ヒドロキシル基を有する単官能性である。明らかなように、ＰＥＧ開始剤が単官能性である実施形態では、ＰＥＧ／ＰＰＦジブロックコポリマーを生成するであろう。これらの実施形態のいくつかでは、ＰＥＧ開始剤が、約１００〜約１０，０００の数平均分子量（Ｍｎ）を有するメチルエーテルＰＥＧである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ開始剤が、１０００Ｄａ以上、他の実施形態では、２０００Ｄａ以上、他の実施形態では、３０００Ｄａ以上、他の実施形態では、４０００Ｄａ以上、他の実施形態では、５０００Ｄａ以上、他の実施形態では、６０００Ｄａ以上、および他の実施形態では、７０００Ｄａ以上の数平均分子量（Ｍｎ）を有するメチルエーテルＰＥＧであろう。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ開始剤は、９０００Ｄａ以下、他の実施形態では、８０００Ｄａ以下、他の実施形態では、７０００Ｄａ以下、他の実施形態では、６０００Ｄａ以下、他の実施形態では、５０００Ｄａ以下、他の実施形態では、４０００Ｄａ以下、他の実施形態では、３０００以下の数平均分子量（Ｍｎ）を有するメチルエーテルＰＥＧであろう。
【００４８】
１つ以上の実施形態では、ＰＥＧ開始剤は、次式を有する単官能性ＰＥＧであり、
【化７】
2020530055.tif 000009
式中、ａは、約４〜約１００の整数であり、Ｒは、メチル基、ベンジル基、アルキン基、プロパルギル基、アリル基、アルケン基、４−ジベンジオシクロオクチン基、シクロオクチン基、ケトン基、アルデヒド基、三級ハロゲン基、ポリ（エチレングリコール）基、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される官能基である。いくつかの実施形態では、ａは１０以上、他の実施形態では、２０以上、他の実施形態では、３０以上、他の実施形態では、４０以上、他の実施形態では、５０以上、および他の実施形態では、６０以上の整数であろう。いくつかの実施形態では、ａは９０以下、他の実施形態では、８０以下、他の実施形態では、７０以下、他の実施形態では、６０以下、他の実施形態では、５０以下の整数であろう。
【００４９】
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ開始剤は、ジオールである。明らかなように、ＰＥＧ開始剤がジオールである実施形態、本発明の方法は、ＰＰＦ／ＰＥＧ／ＰＰＦトリブロックコポリマーを生成するであろう。１つ以上の実施形態では、ＰＥＧジオールは、次式を有し得、
【化８】
2020530055.tif 000010
式中、ａは、約４〜約１００の整数である。いくつかの実施形態では、ａは１０以上、他の実施形態では、２０以上、他の実施形態では、３０以上、他の実施形態では、４０以上、他の実施形態では、５０以上、および他の実施形態では、６０以上の整数であろう。いくつかの実施形態では、ａは９０以下、他の実施形態では、８０以下、他の実施形態では、７０以下、他の実施形態では、６０以下、および他の実施形態では、５０以下の整数であろう。
【００５０】
これらの実施形態のいくつかでは、ＰＥＧ開始剤は、約１００Ｄａ〜約４０，０００Ｄａの数平均分子量（Ｍｎ）を有するＰＥＧジオールである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ開始剤は、１０００Ｄａ以上、他の実施形態では、２０００Ｄａ以上、他の実施形態では、３０００Ｄａ以上、他の実施形態では、４０００Ｄａ以上、他の実施形態では、５０００Ｄａ以上、他の実施形態では、６０００Ｄａ以上、および他の実施形態では、７０００Ｄａ以上の数平均分子量（Ｍｎ）を有するＰＥＧジオールであろう。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ開始剤は、９０００Ｄａ以下、他の実施形態では、８０００Ｄａ以下、他の実施形態では、７０００Ｄａ以下、他の実施形態では、６０００Ｄａ以下、他の実施形態では、５０００Ｄａ以下、他の実施形態では、４０００Ｄａ以下、他の実施形態では、３０００以下の数平均分子量（Ｍｎ）を有するＰＥＧジオールであろう。
【００５１】
様々な実施形態では、溶液中のプロピレンオキシドおよび無水マレイン酸モノマーの濃度は、約０．５Ｍ〜約８Ｍである。いくつかの実施形態では、プロピレンオキシドおよび無水マレイン酸モノマーの濃度は、約１Ｍ〜約８Ｍ、他の実施形態では、約２Ｍ〜約８Ｍ、他の実施形態では、約４Ｍ〜約８Ｍ、他の実施形態では、約０．５Ｍ〜約６Ｍ、他の実施形態では、約０．５Ｍ〜約４Ｍ、および他の実施形態では、約１Ｍ〜約３Ｍである。いくつかの実施形態では、プロピレンオキシドおよび無水マレイン酸モノマーの濃度は、２Ｍである。いくつかの実施形態では、マグネシウム触媒は、Ｍｇ（ＢＨＴ）２（ＴＨＦ）２である。
【００５２】
次に、溶液を約４０℃〜８０℃の温度まで約１時間〜約４８時間加熱して、ポリ（エチレングリコール−ｂ−プロピレンマレエート）またはポリ（プロピレンマレエート−ｂ−エチレングリコール−ｂ−プロピレンマレエート）中間体を生成する。いくつかの実施形態では、溶液を約５０℃〜８０℃、他の実施形態では、約６０℃〜８０℃、他の実施形態では、約７０〜８０℃、他の実施形態では、約４０℃〜７０℃、他の実施形態では、約４０℃〜６０℃、および他の実施形態では、約４０℃〜５０℃の温度まで加熱する。いくつかの実施形態では、溶液を約１ｈ〜約４０ｈ、他の実施形態では、約１ｈ〜約３０ｈ、他の実施形態では、約１ｈ〜約２０ｈ、他の実施形態では、約１０ｈ〜約４８ｈ、および他の実施形態では、約２０ｈ〜約４８ｈ加熱する。いくつかの実施形態では、溶液を１００℃の温度まで７２時間加熱する。
【００５３】
いくつかの実施形態では、重合度が、約２〜約１００、他の実施形態では、約２〜約７５、他の実施形態では、約２〜約５０、他の実施形態では、約２〜約２５、他の実施形態では、約２５〜約１００、他の実施形態では、約５０〜約１００、および他の実施形態では、約７５〜約１００である。
【００５４】
ポリ（エチレングリコール−ｂ−プロピレンマレエート）またはポリ（プロピレンマレエート−ｂ−エチレングリコール−ｂ−プロピレンマレエート）中間体は、その目的で当該技術分野において既知の任意の方法によって収集および精製され得る。当業者は、不必要な実験をすることなく、ポリ（エチレングリコール−ｂ−プロピレンマレエート）またはポリ（プロピレンマレエート−ｂ−エチレングリコール−ｂ−プロピレンマレエート）中間体を収集および精製し得るであろう。１つ以上の実施形態では、ポリ（エチレングリコール−ｂ−プロピレンマレエート）またはポリ（プロピレンマレエート−ｂ−エチレングリコール−ｂ−プロピレンマレエート）中間体を過剰なジエチルエーテル中で沈殿させることにより収集および精製する。いくつかの実施形態では、中間体をリン酸緩衝液中で洗浄することにより、再び収集および精製し、一切の未反応のＰＥＧを除去する。
【００５５】
次に、本発明の１つ以上の実施形態に従って、ポリ（エチレングリコール−ｂ−プロピレンマレエート）またはポリ（プロピレンマレエート−ｂ−エチレングリコール−ｂ−プロピレンマレエート）中間体中のマレエート基のシス二重結合は、ポリ（エチレングリコール−ｂ−プロピレンマレエート）またはポリ（プロピレンマレエート−ｂ−エチレングリコール−ｂ−プロピレンマレエート）中間体を好適な溶媒中に溶解させることと、ジエチルアミンを添加することと、ステップＣの溶液を約１〜約２４時間加熱還流して、ブロックコポリマーを生成することと、によりフマレート対応物に異性化される。
【００５６】
当業者は、不必要な実験をすることなく、ポリ（エチレングリコール−ｂ−プロピレンマレエート）またはポリ（プロピレンマレエート−ｂ−エチレングリコール−ｂ−プロピレンマレエート）中間体に好適な溶媒を選択することができるであろう。好適な溶媒には、クロロホルム、ジクロロメタン、およびこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されなくてもよい。これらの実施形態のいくつかでは、ポリ（エチレングリコール−ｂ−プロピレンマレエート）またはポリ（プロピレンマレエート−ｂ−エチレングリコール−ｂ−プロピレンマレエート）中間体をクロロホルム中に溶解させる。
【００５７】
いくつかの実施形態では、本発明の１つ以上の実施形態に従って、ポリ（エチレングリコール−ｂ−プロピレンマレエート）またはポリ（プロピレンマレエート−ｂ−エチレングリコール−ｂ−プロピレンマレエート）中間体／ジエチルアミン溶液を約１〜約２０時間、他の実施形態では、約１〜約１５時間、約１〜約１０時間、約５〜約２４時間、約１０〜約２４時間、約１５〜約２４時間加熱還流して、ブロックコポリマーを生成し得る。
【００５８】
本発明のブロックコポリマーは、その目的で当該技術分野において既知の任意の方法によって収集および精製され得る。当業者は、不必要な実験をすることなく、本発明のブロックコポリマーを収集および精製できるであろう。１つ以上の実施形態では、本発明のブロックコポリマーは、過剰なヘキサン中に沈殿させることにより、収集および精製され得る。
【００５９】
いくつかの実施形態では、本発明のブロックコポリマーは、下記のスキーム１にて示すように合成されたジブロックコポリマーであり得、
【化９】
2020530055.tif 000011
式中、ａは、約４〜約１００の整数であり、ｂは、約２〜約１００の整数であり、Ｒは、メチル基、ベンジル基、アルキン基、プロパルギル基、アリル基、アルケン基、４−ジベンジオシクロオクチン基、シクロオクチン基、ケトン基、アルデヒド基、三級ハロゲン基、ポリ（エチレングリコール）基、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される官能基である。様々な実施形態では、Ｒはメチル基である。いくつかの実施形態では、ａは１０以上、他の実施形態では、２０以上、他の実施形態では、３０以上、他の実施形態では、４０以上、他の実施形態では、５０以上、および他の実施形態では、６０以上の整数であろう。いくつかの実施形態では、ａは９０以下、他の実施形態では、８０以下、他の実施形態では、７０以下、他の実施形態では、６０以下、および他の実施形態では、５０以下の整数であろう。いくつかの実施形態では、ｂは５以上、他の実施形態では、１０以上、他の実施形態では、２０以上、他の実施形態では、３０以上、他の実施形態では、４０以上、および他の実施形態では、５０以上の整数であろう。いくつかの実施形態では、ｂは９０以下、他の実施形態では、８０以下、他の実施形態では、７０以下、他の実施形態では、６０以下、および他の実施形態では、５０以下の整数であろう。
【００６０】
いくつかの実施形態では、本発明のブロックコポリマーは、下記のスキーム２にて示すように合成されたトリブロックコポリマーであり得、
【化１０】
2020530055.tif 000012
式中、ａは、約４〜約１００の整数であり、各ｂは、約２〜約１００の整数である。いくつかの実施形態では、ａは１０以上、他の実施形態では、２０以上、他の実施形態では、３０以上、他の実施形態では、４０以上、他の実施形態では、５０以上、および他の実施形態では、６０以上の整数であろう。いくつかの実施形態では、ａは９０以下、他の実施形態では、８０以下、他の実施形態では、７０以下、他の実施形態では、６０以下、および他の実施形態では、５０以下の整数であろう。いくつかの実施形態では、ｂは５以上、他の実施形態では、１０以上、他の実施形態では、２０以上、他の実施形態では、３０以上、他の実施形態では、４０以上、および他の実施形態では、５０以上の整数であろう。いくつかの実施形態では、ｂは９０以下、他の実施形態では、８０以下、他の実施形態では、７０以下、他の実施形態では、６０以下、および他の実施形態では、５０以下の整数であろう。
【００６１】
別の実施形態では、本発明は、上述のＰＥＧ／ＰＰＦブロックコポリマーを含むヒドロゲルを対象とする。当業者は、不必要な実験をすることなく、本発明のブロックコポリマーを使用して、ヒドロゲルを形成することができるであろう。１つ以上の実施形態では、ＰＥＧ／ＰＰＦブロックコポリマーの水混和性および／または水溶性種は、上記のように、水および水溶性光反応開始剤で水和され、選択された光開始剤に適切な波長で紫外線を照射して、ポリマーを硬化させて、ヒドロゲルを形成する。好適な水溶性光開始剤には、リチウムアシルホスフィネート（ＬＡＰ）が挙げられる、これらに限定されなくてもよい。
【００６２】
様々な実施形態では、ＰＥＧ／ＰＰＦブロックコポリマーは、これらのヒドロゲルの約２〜約５０重量％を構成するであろう。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ／ＰＰＦブロックコポリマーは、これらのヒドロゲルの約５重量％〜約５０重量％、他の実施形態上では、約１０重量％〜約５０重量％、他の実施形態上では、約１５重量％〜約５０重量％、他の実施形態上では、約２０重量％〜約５０重量％、他の実施形態上では、約２５重量％〜約５０重量％、他の実施形態上では、約２重量％〜約４０重量％、他の実施形態上では、約２重量％〜約３０重量％、他の実施形態上では、約２重量％〜約２０重量％を構成するであろう。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ／ＰＰＦブロックコポリマーは、これらのヒドロゲルの約２０〜約２５重量％を構成するであろう。
【００６３】
別の実施形態では、本発明は、上述したＰＥＧ／ＰＰＦジブロックコポリマーを含むミセルを対象とする。これらの実施形態では、本発明のジブロックコポリマーを、クロロホルム、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、１，４−ジオキサン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドなどのＰＥＧとＰＰＦの両方に好適な溶媒中に溶解させて、水または水性緩衝溶液を、ミセルを形成する溶液を含有するＰＥＧ／ＰＰＦジブロックコポリマーへゆっくりと添加した。当業者は、不必要な実験をすることなく、本発明のブロックコポリマーを使用して、ミセルを形成することができるであろう。
【００６４】
別の態様では、本発明は、上記のＰＥＧ／ＰＰＦブロックコポリマーを含むブロックコポリマーを含む３次元印刷されたポリマー構造体の方法を対象とする。様々な実施形態では、本発明のＰＥＧ／ＰＰＦブロックコポリマーは、連続デジタルライトプロセッシング（ｃＤＬＰ）技術などの従来の付加製造（３次元印刷）を使用して、実質的に任意の形状を有する３次元ポリマー構造体に形成され得る。これらの実施形態では、ＰＥＧ／ＰＰＦブロックコポリマーが最初に選択され、使用される装置に好適な粘度（一般に、約０．００１ｃＰ〜約１０．０ｃＰ）を有し、好ましくは、少なくとも１つの光開始剤を含有する３次元印刷可能な樹脂を形成するために使用される。１つ以上の実施形態では、樹脂を、ＤＥＦ、またはジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、もしくはジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）などの別の好適な溶媒で希釈して、印刷に好適な粘度にする。光開始剤は、特に限定されないが、使用されている３次元印刷装置により使用される光の波長で神経根を発生させることができるはずであり、使用されている樹脂に可溶性でなければならない。様々な実施形態では、好適な光開始剤には、ビス−アシルホスフィンオキシド（ＢＡＰＯ）およびＩＲＧＡＣＵＲＥ（商標）２９５９、ＩＲＧＡＣＵＲＥ（商標）７８４が挙げられるが、これらに限定されなくてもよい。いくつかの実施形態では、本発明のＰＥＧ／ＰＰＦブロックコポリマーを含有する３次元印刷可能な樹脂は、Ｄｅａｎ，Ｄ．；Ｊｏｎａｔｈａｎ，Ｗ．；Ｓｉｂｌａｎｉ，Ａ．；Ｗａｎｇ，Ｍ．Ｏ．；Ｋｉｍ，Ｋ．；Ｍｉｋｏｓ，Ａ．Ｇ．；Ｆｉｓｈｅｒ，Ｊ．Ｐ．Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｌｉｇｈｔ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  （ＣＤＬＰ）：Ｈｉｇｈｌｙ  Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ａｄｄｉｔｉｖｅ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｂｏｎｅ  Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ．Ｖｉｒｔｕａｌ  Ｐｈｙｓ．Ｐｒｏｔｏｔｙｐ．２０１２，７（１），１３−２４に記載のように製造され得、その開示は本発明において参考としてその全体が含まれる。
【００６５】
形成されると、これらの３次元印刷可能な樹脂は、従来の連続デジタルライトプロセッシング（ｃＤＬＰ）技術を使用して、３次元ポリマー構造体へと印刷され得る。
【００６６】
実験
本発明を評価し、さらに実行するために、ポリ（プロピレンマレエート）（ＰＰＭ）は、Ｍｇ（ＢＨＴ）２（ＴＨＦ）２触媒の存在下でＭＡおよびＰＯの開環交互共重合から形成されたが、それは、メチルエーテルＰＥＧとＰＥＧ−ジオールの両方のアルコール鎖末端から開始され、ジブロック（ＰＥＧｎＰＰＭｍ）およびトリブロック（ＰＰＭｍＰＥＧｎＰＰＭｍ）コポリマーを形成した（図１Ａ、１Ｂ；表１を参照すること）。１：５（触媒：開始剤）のモル比を使用して、重合の転化率が、１Ｈ  ＮＭＲ分光法にて無水マレイン酸のピークの積分により決定され、エントリー２および６を除いてすべての場合において、９０％を超えた。より低い転化率は、反応槽内のより大きなヘッドスペースに起因する可能性がある。ＰＯは３４℃で沸騰するので、凝集させて溶液に戻さなければならない。このヘッドスペースを最少化することにより、反応が高い転化率となる可能性があることを実験的に決定した。次に、ポリマーは、ジエチルアミンでの処理により、ＰＥＧｎＰＰＦｍおよびＰＰＦｍＰＥＧｎＰＰＦｍ種へ異性化された（図２Ａ〜Ｂ）。最終重合生成物は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって特徴付けられて、１５６Ｄａ（ダルトン）のＰＰＦ繰り返し単位および４４ＤａのＰＥＧ繰り返し単位を示した（図３を参照すること）。
【表１】
2020530055.tif 000013
【００６７】
明確に定義されたブロックコポリマーが合成されたことを実証するために、拡散秩序ＮＭＲ分光法（ＤＯＳＹ−ＮＭＲ）および定量１３Ｃ  ＮＭＲ分光法の実験を用いた。（図４Ａ〜Ｂ、５Ａ〜Ｂ）その上に、１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルで、ＰＰＦ繰り返し単位のカルボニル２連子共鳴（δ＝１６４．４および１６４．０ｐｐｍ）は、それらに隣接したＰＥＧ炭素により分裂された。ＰＥＧに隣接したカルボニルＰＰＦのピークの積分値は、ＰＰＦに隣接したそれらよりも低いので、２つのブロック間にシャープな界面が存在するのは当然である。これは、また、ＰＰＦブロック界面により分裂されたＰＥＧのピーク（δ＝７０．５５ｐｐｍ）からも観察することができる。
【００６８】
小角度振動剪断レオロジー
ｃＤＬＰ付加製造は、紫外線を使用して、光反応性ポリマー樹脂を架橋させて固体にする。この技術は、印刷された製品は、樹脂から立ち上げられるので、ポリマーを空隙に流すことができるように、十分に低い樹脂粘度（すなわち、＜３Ｐａ．ｓ）を必要とする。ＰＰＦ３ＰＥＧ２３ＰＰＦ３のブロックコポリマーの樹脂形態は、小角度振動剪断（ＳＡＯＳ）レオロジーにより測定された約３５〜５０Ｐａ．ｓの複素粘度を有する。これらの値は、この製造方法にはあまりにも粘稠であるので、希釈する必要がある。ポリマー：ＤＥＦの比が１：１である溶液により、ホモポリマーＰＰＦに使用可能な粘度（＜１Ｐａ．ｓ）を生じるため、ＤＥＦは、この目的に最適であることがわかっている。同様に、ＤＥＦ：ＰＰＦｍＰＥＧｎＰＰＦｍの比が３：１および１：１の場合、ＰＰＦｍＰＥＧ２３ＰＰＦｍおよびＰＥＧ２３ＰＰＦｍのすべての変異型に対する粘度が＜３Ｐａ．ｓとなった。（図６を参照すること）。
【００６９】
ＤＥＦ樹脂を用いたｃＤＬＰ印刷
ＰＰＦｍＰＥＧ２３ＰＰＦｍ（すなわち、１ｋＤａ（キロダルトン）のＰＥＧ）トリブロックコポリマーは、質量比が１：１のポリマー：ＤＥＦを使用して印刷に成功した。Ｄｅａｎらによりあらかじめ配合された３つの光開始剤の混合物を添加した。３重量％のＢＡＰＯ、アシルホスフィン光開始剤、０．４％のＩＲＧＡＣＵＲＥ（商標）７８４、チタノセン系開始剤／光散乱剤、および０．７％のオキシベンゾン、ラジカル捕捉剤。（Ｄｅａｎ，Ｄ．；Ｊｏｎａｔｈａｎ，Ｗ．；Ｓｉｂｌａｎｉ，Ａ．；Ｗａｎｇ，Ｍ．Ｏ．；Ｋｉｍ，Ｋ．；Ｍｉｋｏｓ，Ａ．Ｇ．；Ｆｉｓｈｅｒ，Ｊ．Ｐ．Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｌｉｇｈｔ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  （ＣＤＬＰ）：Ｈｉｇｈｌｙ  Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ａｄｄｉｔｉｖｅ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｂｏｎｅ  Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ．Ｖｉｒｔｕａｌ  Ｐｈｙｓ．Ｐｒｏｔｏｔｙｐ．２０１２，７（１），１３−２４を参照することとし、その開示は本発明において参考としてその全体が含まれる。）ＰＰＦ３ＰＥＧ２３ＰＰＦ３ポリマーの印刷解像度を実証するために、ストラットの直径が〜１００μｍである螺旋状に配置された足場は、コンピュータ合成モデルから印刷された（図７Ａ〜Ｂ）。印刷された構造体の光学像により、ｃＤＬＰ印刷からＰＰＦ３ＰＥＧ２３ＰＰＦ３の高解像度を実証する。
【００７０】
水溶液中でのｃＤＬＰ印刷
ＰＥＧブロックが＞１０００Ｄａである試験済みのＰＰＦｍＰＥＧｎＰＰＦｍ種にとって、ポリマーはＤＥＦに不溶性であるため、粘度調整剤としての使用を制限する。偶然にも、ＰＥＧブロック質量が２０００Ｄａ（すなわち、ＰＥＧ４５およびＰＥＧ９１）を超えると、ポリマーは、水溶性となり、溶解すると、ｃＤＬＰ印刷に使用可能な粘度であるη＊＜３Ｐａ．ｓを生じる（図８）。このことは、使用可能な粘度を達成することと同時に、反応性希釈剤として、印刷された足場に組み込まれ、したがって、材料特性を変化させるＤＥＦの必要性を取り除くことにより、あらかじめ利用したＰＰＦ：ＤＥＦ混合物に対して２倍の利点を提供する。
【００７１】
ｃＤＬＰの課題のひとつは、印刷配合物に光開始剤を選択することである。これらの実験用に水溶性ポリマーを架橋させるために、光開始剤リチウムアシルホスフィネート（ＬＡＰ）が使用された。水溶性に加えて、ＬＡＰは、また、広く使用されているＩＲＧＡＣＵＲＥ（商標）２９５９（３４０〜４２０ｎｍの範囲で）と比較すると、非常に高いモル吸光係数を有する。その上に、それを架橋性水溶性ＰＥＧＰＰＦ３４に理想的な光開始剤にすることは、細胞親和性でもある。印刷装置が４０５ｎｍの光を放射する場合、この特性の組み合わせにより、ＬＡＰは水溶液からｃＤＬＰ印刷を試みるための理想的な選択となり、ＰＰＦ３ＰＥＧ４５ＰＰＦ３の印刷に成功するのに成果を挙げた。
【００７２】
成型ＰＥＧＰＰＦヒドロゲル
ＰＰＦｍＰＥＧｎＰＰＦｍ（すなわち、ＰＥＧ４５およびＰＥＧ９１ブロック）の水溶性種は、光架橋されてヒドロゲルとなり、それらの膨潤特性および細胞生存率を調査した。各ゲルは、反応中心（二重結合）：ＬＡＰのモル比が５：１で水中２５重量％で形成されて、均一の架橋を確保した。ＰＰＦｍＰＥＧ９１ＰＰＦｍ（すなわち、４ｋＤａのＰＥＧ）種は、ＰＰＦブロック長が短いため、ＰＰＦｍＰＥＧ４５ＰＰＦｍよりもかなり大きく膨潤するが、ＰＰＦブロック長が増加すると素早く収束する（図９）．。これは、架橋間の距離を減少させて、足場の膨潤を抑制する架橋部位が増量した結果である。その上に、疎水性に伴って、ＰＰＦブロック長は増加して、より短い鎖と比較して反応中心の凝集を促進し、場合により、形成される架橋の数を増加させる。
【００７３】
３次元印刷されたＰＰＦｍＰＥＧｎＰＰＦｍのヒドロゲルの引張特性
水溶液からの３次元印刷により、ＤＥＦ系樹脂の溶液からの印刷と比較して、明確に異なる機械的特性が生じる。水印刷されたＰＰＦ３ＰＥＧ４５ＰＰＦ３材料の引張特性は、ＤＥＦ印刷されたＰＰＦ３ＰＥＧ２３ＰＰＦ３と比較して、破断ひずみが１０倍増加することが実証された（図１０〜１２）。このような拡張は、ＤＥＦを含まないことに起因し、それによって架橋間のより大きな間隔の網状組織を生成することができる。ＰＰＦ３ＰＥＧ２３ＰＰＦ３の場合、ＤＥＦは、最終の網状組織に組み込まれ、高度に架橋した、いくぶん脆性の材料を生成する。対照的に、水印刷されたヒドロゲルにおけるより低い架橋密度により、材料破壊前にそれらをさらに延長させることができる、ＰＥＧ鎖の立体配座緩和モデルの顕著な増加が提供される。驚くべきことに、２つの状態の係数は、類似（ＰＰＦ３ＰＥＧ４５ＰＰＦ３：９．１±０．１ｋＰａ；ＰＰＦ３ＰＥＧ２３ＰＰＦ３：８．９±０．１ｋＰａ）しており、破断点伸びを係数とは関係なく調整することができることを示している。
【００７４】
細胞生存率
末梢神経再生などの軟組織用途にて使用するＰＰＦｍＰＥＧｎＰＰＦｍ（ｎ＝４５、９１）のヒドロゲルの可能性は、生死判別試験を使用して３つの異なる細胞型を評価した。マウス前骨芽細胞様細胞ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１は、整形外科用材料用のベースラインの細胞応答を解明するために頻繁に使用されており、シュワン細胞は、末梢神経系にて神経細胞を支持する主要なグリアであり、ＮＩＨ３Ｔ３は、一般的に使用される線維芽細胞の細胞株である。驚くことではないが、細胞型のそれぞれが、架橋された試料のステラディスク上に培養された場合、２４時間の細胞培養後、ＰＰＦｍＰＥＧｎＰＰＦｍのヒドロゲルが高い生存率を有することを、生細胞から優位な緑色蛍光により実証した（図１３〜１５を参照すること）。これらの結果は、材料が無毒であり、３つの細胞型のそれぞれへの適合性を提示していることを意味する。これは、多数の多様な用途で翻訳的に適切となる生体材料としてのＰＰＦｍＰＥＧｎＰＰＦｍの可能性を促進するため、理想的だった。
【００７５】
結論
印刷可能な吸収性材料の利用の可能性および多様性は、再生医療において付加製造を使用することに重要な意味を持つであろう。マグネシウム触媒を使用して、メチルエーテルＰＥＧとＰＥＧ−ジオールの両方の鎖末端からＲＯＣＯＰにより、ＰＰＦの合成が成功して、一連のＰＥＧｎＰＰＦｍジブロックおよびＰＰＦｍＰＥＧｎＰＰＦｍトリブロックコポリマーをそれぞれ生成した。水溶液中で印刷されたヒドロゲルは、ＤＥＦ中で印刷された変異型と比較して、破断点伸びの顕著な増加が実証された。さらに、係数と無関係な破断ひずみを操作する能力が実証された。最後に、ＰＰＦｍＰＥＧｎＰＰＦｍ（ｎ＝４５、９１）のヒドロゲルが、ＭＣ３Ｔ３、ＮＩＨ３Ｔ３、およびシュワン細胞株と適合することが見出され、組織工学用途でのこれらの材料の可能性を実証する。
【実施例】
【００７６】
以下の実施例は、本発明をさらに詳細に説明することを提供するが、その範囲を制限すると解釈されるものではない。さらにまた、実施例のいくつかは、本発明が機能し得る方法についての結論を含み得る一方、発明者はそれらの結論に制約されることを意図するものではないが、考えられる説明としてのみそれらを提示する。さらに、過去時制の使用による記述がない限り、実施例の提示は、実験もしくは手順が行われたか、もしくは行われなかったか、または結果が実際に得られたか、もしくは得られなかったかを意味しない。使用された数字（例えば、量、温度など）に関する精度を確実なものとするために努力を行ってきたが、ある程度の実験誤差および偏差が存在し得る。特に指示がない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度はセ氏温度であり、圧力は大気圧またはその近傍である。
【００７７】
材料
メチルエーテルポリ（エチレングリコール）は、ＴＣＩ（Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）から購入した。他のすべての市販の試薬および溶媒は、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈまたはＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入し、別段の定めがある場合を除き、受け入れたままの状態で使用した。全ての反応は、別段の定めがある場合を除き、窒素下にて実施された。
【００７８】
計装
１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルは、Ｖａｒｉａｎ  ＮＭＲＳ  ５００ＭＨｚ分光器を使用して得られた。全ての化学シフトは、ｐｐｍ（δ）で報告され、残留溶媒の共鳴の化学シフトを基準とする（１Ｈ−ＮＭＲ、ＣＤＣｌ３δ＝７．２６ｐｐｍ、ＤＭＳＯ−ｄ６δ＝２．４９ｐｐｍ；１３Ｃ−ＮＭＲ  δ＝７７．１６ｐｐｍ）。多重度の略語を以下に記載する。ｓ＝ｓｉｎｇｌｅｔ、ｄ＝ｄｏｕｂｌｅｔ、ｔ＝ｔｒｉｐｌｅｔ、ｂｒ＝ｂｒｏａｄ  ｓｉｎｇｌｅｔ、ｍ＝ｍｕｌｔｉｐｌｅｔ。自己拡散係数配列スペクトルは、Ｖａｒｉａｎ  ＮＭＲＳ  ５００ＭＨｚ分光計を使用して得られ、ＭｅｓｔＲｅ  ＮｏｖａソフトウェアでＢａｙｅｓｉａｎ変換を使用して処理された。分子質量および分子質量分布（Ｄｍ）は、ＴＳＫｇｅｌ  ＧＭＨＨＲ−Ｍカラムと屈折率（ＲＩ）検出とを連続させて、Ｔｏｓｏｈ  ＥｃｏＳＥＣ  ＨＬＣ−８３２０ＧＰＣを用いて、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により決定した。ポリ（スチレン）標準からの検量線は、１．０ｍＬ  分−１で流動するテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）溶媒および１０．０ｍｇ  ｍＬ−１の試料濃度で分子質量を決定するために用いられた。
【００７９】
質量分析法は、３５５ｎｍで放出させるＮｄ：ＹＡＧレーザーを装備したＢｒｕｋｅｒ  ＵｌｔｒａＦｌｅｘ  ＩＩＩ  ＭＡＬＤＩ  ｔａｎｄｅｍ  ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ（ＴＯＦ／ＴＯＦ）質量分析計（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して実施した。マトリックスおよびカチオン化塩は、それぞれ、ＤＣＴＢ（２−［（２Ｅ）−３−（４−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル）−２−メチルプロプ−２−エニリデン］マロニトリル）およびトリフルオロ酢酸ナトリウムであった。ポリマー試料（１０ｍｇ・ｍＬ−１）と同様に、マトリックスの溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）およびカチオン化塩（１０ｍｇ・ｍＬ−１）を、ＣＨＣｌ３内で調製した。マトリックスおよびカチオン化剤溶液を１０：１（ｖ／ｖ）比で混合して、ターゲットに適用した。乾燥後、試料の１点に適用して、マトリックス／カチオン化剤を追加で落下させた（サンドイッチ方式）。３次元印刷溶液の粘度測定は、２ｍｍの空隙寸法を有する、２５ｍｍの平行平板ジオメトリを装備したＡＲＥＳ  Ｇ２  Ｒｈｅｏｍｅｔｅｒ（ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｎｅｗ  Ｃａｓｔｌｅ、ＤＥ）を使用して決定した。
【００８０】
実施例１
Ｍｇ（ＢＨＴ）２（ＴＨＦ）２溶媒の合成
窒素が充填され、オーブンで乾燥させた、突沸を防止するシュレンクフラスコ中に、１３．２２ｇ（０．０６ｍｏｌ）の２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノール（ＢＨＴ）を４０分間、高真空で乾燥させた。フラスコを窒素で充填して、続いて２０ｍＬの無水ＴＨＦ（０．３１ｍｏｌ）を注入した。ＢＨＴが溶解したら、ヘプタン（０．０３ｍｏｌ）中の３０ｍＬのジブチルマグネシウム１．０Ｍを、氷上で冷却させたフラスコで１時間にわたって滴下した。さらに２時間、反応生成物を氷上で撹拌すると、白色沈殿物が形成された。溶媒を真空供給により除去し、触媒を一晩乾燥させて、グローブボックス内に保管した。（１７．５ｇ、収率９６％）
【００８１】
実施例２
乾燥ポリ（エチレングリコール）出発物質
ポリ（エチレングリコール）ジオールおよびメチルエーテルポリ（エチレングリコール）出発物質は、Ｓｉｇｍａから購入（２ｋＤａおよび４ｋＤａのＰＥＧ−ジオールならびにメチルエーテルＰＥＧ）ならびにＴＣＩ（１ｋＤａのＰＥＧ−ジオールならびにメチルエーテルＰＥＧ）し、従来の文献に従って乾燥させた。（Ｋｉｎａｒｄ，Ｌ．；Ｋａｓｐｅｒ，Ｋ．；Ｍｉｋｏｓ，Ａ．Ｄｒｙｉｎｇ  Ｐｏｌｙ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ）．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｅｘｃｈ．２０１２を参照することとし、その開示は本発明において参考としてその全体が含まれる。）要するに、１０．００ｇの各ＰＥＧ誘導体を無水トルエン中に溶解させて、Ｄｅａｎ−Ｓｔａｒｋ装置で一晩還流した。次に、溶液を一晩かけて、３Åの分子ふるいで乾燥した丸底フラスコへカニューレで移送して、次に、一晩かけて、真空乾燥させた分子ふるいで別の乾燥した丸底フラスコへ移送した。トルエンを真空下にて除去し、ＰＥＧをグローブボックス内へ移送した。共沸蒸留後に反応生成物が十分に乾燥したことが見出されたため、拡大重合のために、ふるい乾燥ステップを省略した。
【００８２】
実施例３
メチルエーテルＰＥＧ（ＭＷ  ７５０）、重合度２０を使用したポリ（エチレングリコール−ｂ−プロピレンマレエート）の合成
以下のスキーム３にて示すように、ポリ（エチレングリコール−ｂ−プロピレンマレエート）は、メチルエーテルＰＥＧ（ＭＷ  ７５０）より開始して、Ｍｇ（ＢＨＴ）２（ＴＨＦ）２によって触媒された、重合度（ＤＰ）２０まで無水マレイン酸とプロピレンオキシドとの共重合により合成された。
【化１１】
2020530055.tif 000014
標準的なシュレンクライン技法を使用して、アンプルをＭｇ（ＢＨＴ）２（ＴＨＦ）２（５７．８ｍｇ、０．０９５ｍｍｏｌ）、メチルエーテルポリ（エチレングリコール）ＭＷ  ７５０（０．３５７３ｇ、０．４７６４ｍｍｏｌ）、プロピレンオキシド（０．６８３ｍＬ、９．７６ｍｍｏｌ）および無水マレイン酸（０．９５７１ｇ、９．７６ｍｍｏｌ）で充填した。溶液を２Ｍの総モノマー濃度までトルエンに溶解させた。アンプルを密封して、１００℃で７２時間加熱した。得られたポリマーを過剰なジエチルエーテル内に沈殿させて回収し、以下のように特徴付けた。１Ｈ  ＮＭＲ（（３００ＭＨｚ、３０３Ｋ、ＣＤＣｌ３）：δ＝６．２８−６．２４（ｔ，ＯＣ（＝Ｏ）ＣＨ＝ＣＨＣ（＝Ｏ）Ｏ）、５．３０−５．２０（ｍ，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）、４．２９−４．２２（ｍ，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）、３．６４（ｍ，ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）、３．３８（ｍ，ＣＨ３ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）、および１．３３−１．３１（ｍ，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏｐｐｍ）（図１６を参照すること）；１３Ｃ  ＮＭＲ（（１２５ＭＨｚ、３０３Ｋ、ＣＤＣｌ３）：δ＝１６４．３５および１６４．０３（ＭＡｎ＊−ＰＯ，Ｏ（Ｏ）Ｃ＊ＣＨ＝ＣＨ）、１３３．９０および１３３．４０（ＭＡｎ＊−ＰＯ，Ｏ（Ｏ）Ｃ＊ＣＨ＝ＣＨ）、７０．５４（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）、６９．２６（ＭＡｎ＊−ＰＯ，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）、６６．６０（ＭＡｎ＊−ＰＯ，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）および１６．３６（ＰＯ，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）ｐｐｍ（図１７を参照すること）；ならびにＳＥＣ（（ＴＨＦ）：Ｍｎ＝２．２ｋＤａ、Ｍｗ＝３．４ｋＤａ、Ｄｍ＝１．５）。
【００８３】
実施例４
メチルエーテルＰＥＧ（ＭＷ  ７５０）、重合度５０を使用したポリ（エチレングリコール−ｂ−プロピレンマレエート）の合成
以下のスキーム４にて示すように、ポリ（エチレングリコール−ｂ−プロピレンマレエート）は、メチルエーテルＰＥＧ（ＭＷ  ７５０）より開始されて、Ｍｇ（ＢＨＴ）２（ＴＨＦ）２によって触媒された、重合度（ＤＰ）５０まで無水マレイン酸とプロピレンオキシドとの共重合により合成された。
【化１２】
2020530055.tif 000015
標準的なシュレンクライン技法を使用して、アンプルをＭｇ（ＢＨＴ）２（ＴＨＦ）２（２３．８ｍｇ、０．０３９ｍｍｏｌ）、メチルエーテルポリ（エチレングリコール）ＭＷ  ７５０（０．１４７１ｇ、０．１９６１ｍｍｏｌ）、プロピレンオキシド（０．６９３ｍＬ、９．９０ｍｍｏｌ）および無水マレイン酸（０．９７０９ｇ、９．９０ｍｍｏｌ）で充填した。得られたポリマーを過剰なジエチルエーテル内に沈殿させて回収し、以下のように特徴付けた。１Ｈ  ＮＭＲ（（３００ＭＨｚ、３０３Ｋ、ＣＤＣｌ３）：δ＝６．２８−６．２４（ｔ，ＯＣ（＝Ｏ）ＣＨ＝ＣＨＣ（＝Ｏ）Ｏ）、５．３０−５．２０（ｍ，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）、４．２９−４．２２（ｍ，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）、３．６４（ｍ，ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）、３．３８（ｍ，ＣＨ３ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）、ならびに１．３３−１．３１（ｍ，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏｐｐｍ（図１８を参照すること）；１３Ｃ  ＮＭＲ（（１２５ＭＨｚ、３０３Ｋ、ＣＤＣｌ３）：δ＝１６４．３５および１６４．０３（ＭＡｎ＊−ＰＯ，Ｏ（Ｏ）Ｃ＊ＣＨ＝ＣＨ）、１３３．９０および１３３．４０（ＭＡｎ＊−ＰＯ，Ｏ（Ｏ）Ｃ＊ＣＨ＝ＣＨ）、７０．５４（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）、６９．２６（ＭＡｎ＊−ＰＯ，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）、６６．６０（ＭＡｎ＊−ＰＯ，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）ならびに１６．３６（ＰＯ，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）ｐｐｍ；ならびにＳＥＣ（（ＴＨＦ）：Ｍｎ＝１．７ｋＤａ、Ｍｗ＝２．５ｋＤａ、Ｄｍ＝１．５）。
【００８４】
実施例５
ＰＥＧジオール（ＭＷ  １０００）、重合度２０を使用したポリ（エチレングリコール−ｂ−プロピレンマレエート）の合成
以下のスキーム５にて示すように、ポリ（エチレングリコール−ｂ−プロピレンマレエート）は、ＰＥＧジオール（ＭＷ  １０００）より開始されて、Ｍｇ（ＢＨＴ）２（ＴＨＦ）２によって触媒された、重合度（ＤＰ）２０まで無水マレイン酸とプロピレンオキシドとの共重合により合成された。
【化１３】
2020530055.tif 000016
標準的なシュレンクライン技法を使用して、アンプルをＭｇ（ＢＨＴ）２（ＴＨＦ）２（０．９５ｇ、１．５７ｍｍｏｌ）、ポリ（エチレングリコール）ＭＷ  １０００（７．８６ｇ、７．８６ｍｍｏｌ）、プロピレンオキシド（３．３９ｍＬ、４８．５ｍｍｏｌ）および無水マレイン酸（４．７６ｇ、４８．５ｍｍｏｌ）で充填した。得られたポリマーを過剰なジエチルエーテル内に沈殿させて回収し、以下のように特徴付けた。１Ｈ  ＮＭＲ（１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、３０３Ｋ、ＣＤＣｌ３）：δ＝６．２８−６．２４（ｔ，ＯＣ（＝Ｏ）ＣＨ＝ＣＨＣ（＝Ｏ）Ｏ）、５．３０−５．２０（ｍ，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）、４．２９−４．２１（ｍ，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）、３．６４（ｍ，ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）、および１．３３−１．３１（ｍ，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏｐｐｍ）（図１９を参照すること）；１３Ｃ  ＮＭＲ（（１２５ＭＨｚ、３０３Ｋ、ＣＤＣｌ３）：δ＝１６４．３４および１６４．０３（ＭＡｎ＊−ＰＯ，Ｏ（Ｏ）Ｃ＊ＣＨ＝ＣＨ）、１３３．９０および１３３．４０（ＭＡｎ＊−ＰＯ，Ｏ（Ｏ）Ｃ＊ＣＨ＝ＣＨ）、７０．５９（ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣ（＝Ｏ）ＣＨ＝ＣＨ）、７０．５４（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）、６９．２６（ＭＡｎ＊−ＰＯ，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）、６６．５９（ＭＡｎ＊−ＰＯ，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）および１６．３５（ＰＯ，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）ｐｐｍ）；ならびにＳＥＣ（ＴＨＦ）：Ｍｎ＝４．８ｋＤａ、Ｍｗ＝１１．１ｋＤａ、Ｄｍ＝２．３。
【００８５】
実施例６
ＰＥＧジオール（ＭＷ  １０００）、重合度５０を使用したポリ（プロピレンマレエート−ｂ−エチレングリコール−ｂ−プロピレンマレエート）の合成
以下のスキーム６にて示すように、ポリ（プロピレンマレエート−ｂ−エチレングリコール−ｂ−プロピレンマレエート）ポリマー（ＰＰＦｍＰＥＧｎＰＰＦｍ）は、ＰＥＧジオール（ＭＷ  １０００）より開始されて、Ｍｇ（ＢＨＴ）２（ＴＨＦ）２によって触媒された、重合度（ＤＰ）５０まで無水マレイン酸とプロピレンオキシドとの共重合により合成された。
【化１４】
2020530055.tif 000017
標準的なシュレンクライン技法を使用して、アンプルをＭｇ（ＢＨＴ）２（ＴＨＦ）２（２３．８ｍｇ、０．０３９ｍｍｏｌ）、ポリ（エチレングリコール）ＭＷ  １０００（０．１４７１ｇ、０．１９６１ｍｍｏｌ）、プロピレンオキシド（０．６９３ｍＬ、９．９０ｍｍｏｌ）および無水マレイン酸（０．９７０９ｇ、９．９０ｍｍｏｌ）で充填した。得られたポリマーを過剰なジエチルエーテル内に沈殿させて回収し、以下のように特徴付けた。１Ｈ  ＮＭＲ（１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、３０３Ｋ、ＣＤＣｌ３）：δ＝６．２８−６．２４（ｔ，ＯＣ（＝Ｏ）ＣＨ＝ＣＨＣ（＝Ｏ）Ｏ）、５．３０−５．２０（ｍ，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）、４．２９−４．２１（ｍ，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）、３．６４（ｍ，ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）、ならびに１．３３−１．３１（ｍ，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏｐｐｍ）（図２０を参照すること）；１３Ｃ  ＮＭＲ（（１２５ＭＨｚ、３０３Ｋ、ＣＤＣｌ３）：δ＝１６４．３４および１６４．０３（ＭＡｎ＊−ＰＯ，Ｏ（Ｏ）Ｃ＊ＣＨ＝ＣＨ）、１３３．９０および１３３．４０（ＭＡｎ＊−ＰＯ，Ｏ（Ｏ）Ｃ＊ＣＨ＝ＣＨ）、７０．５９（ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣ（＝Ｏ）ＣＨ＝ＣＨ）、７０．５４（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）、６９．２６（ＭＡｎ＊−ＰＯ，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）、６６．５９（ＭＡｎ＊−ＰＯ，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）ならびに１６．３５（ＰＯ，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）ｐｐｍ）；ならびにＳＥＣ（（ＴＨＦ）：Ｍｎ＝４．０ｋＤａ、Ｍｗ＝６．４ｋＤａ、Ｄｍ＝１．６）。
【００８６】
実施例７
ポリ（エチレングリコール−ｂ−プロピレンマレエート）（ＰＥＧｎＰＰＦｍ）の合成
ポリ（エチレングリコール−ｂ−プロピレンマレエート）は、開環共重合により合成された。オーブンで乾燥させたアンプルに、メチルエーテルＰＥＧ（ＭＷ  ７５０）（０．３５７ｇ、０．４７６ｍｍｏｌ）、プロピレンオキシド（０．６８３ｍＬ、９．７６ｍｍｏｌ）、無水マレイン酸（０．９５７ｇ、９．７６ｍｍｏｌ）、およびＭｇ（ＢＨＴ）２（ＴＨＦ）２（５７．８ｍｇ、０．０９５ｍｍｏｌ）を１０ｍＬのトルエンに溶解させた。アンプルを密封して、１００℃で７２時間加熱した。得られたポリマーを直ちに急冷して、４０℃で過剰なヘキサン中に沈殿させて回収した。（転化率９５％）１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、３０３Ｋ、ＣＤＣｌ３）：δ＝６．２８−６．２４（ｔ，ＯＣ（＝Ｏ）ＣＨ＝ＣＨＣ（＝Ｏ）Ｏ）、５．３０−５．２０（ｍ，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）、４．２９−４．２２（ｍ，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）、３．６４（ｍ，ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）、３．３８（ｍ，ＣＨ３ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）、および１．３３−１．３１（ｍ，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）ｐｐｍ。
【００８７】
実施例８
ポリ（プロピレンマレエート−ｂ−エチレングリコール−ｂ−プロピレンマレエート）（ＰＰＭｍＰＥＧｎＰＰＭｍ）の合成
ＰＥＧ−ジオール（ＭＷ  １０００）（０．９１１ｇ、０．０９１ｍｍｏｌ）、プロピレンオキシド（０．６６８ｍＬ、９．５４ｍｍｏｌ）、無水マレイン酸（０．９３５ｇ、９．５４ｍｍｏｌ）、およびＭｇ（ＢＨＴ）２（ＴＨＦ）２（１１０．６ｍｇ、０．１８２ｍｍｏｌ）をオーブンで乾燥させたアンプル内の１０ｍＬのトルエン中に溶解させた。アンプルを密封して、１００℃で７２時間加熱した。得られたポリマーを４０℃で過剰なヘキサン中に沈殿させて回収し、リン酸緩衝液で洗浄し、過剰な出発物質を除去して、高真空で乾燥させた。（転化率９７％）１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、３０３Ｋ、ＣＤＣｌ３）：δ＝６．２８−６．２４（ｔ，ＯＣ（＝Ｏ）ＣＨ＝ＣＨＣ（＝Ｏ）Ｏ）、５．３０−５．２０（ｍ，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）、４．２９−４．２１（ｍ，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）、３．６４（ｍ，ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）、および１．３３−１．３１（ｍ，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）ｐｐｍ。
【００８８】
実施例９
メチルエーテルポリ（エチレングリコール−ｂ−プロピレンマレエート）重合度５０の異性化
実施例４のメチルエーテルポリ（エチレングリコール−ｂ−プロピレンマレエート）（重合度５０）は、以下のスキーム７にて示すように、ジエチルアミンを使用して異性化されて、ポリ（エチレングリコール−ｂ−プロピレンフマレート）を形成した。
【化１５】
2020530055.tif 000018
メチルエーテルポリ（エチレングリコール−ｂ−プロピレンマレエート）（１．００ｇ、１０ｍｏｌ当量オレフィン）をクロロホルム（５０ｍＬ）に溶解させた。ジエチルアミン（０．１５１ｍＬ、０．１５ｍｏｌ当量オレフィン）を溶液に添加して、窒素雰囲気下にて２４時間還流した。室温まで降温させた後、有機溶液をリン酸緩衝液（１５０ｍＬ、ｐＨ＝６）で洗浄し、ポリマーをヘキサンから沈殿を介して回収し、以下を使用して特徴付けた。１Ｈ  ＮＭＲ（（３００ＭＨｚ、３０３Ｋ、ＣＤＣｌ３）：δ＝６．８８−６．８２（ｍ，ＯＣ（＝Ｏ）ＣＨ＝ＣＨ（＝Ｏ）Ｏ）、５．３５−５．２５（ｍ，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）、４．４３−４．１８（ｍ，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）、３．６４（ｍ，ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）、３．３８（ｓ，Ｈ３ＣＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）および１．３６−１．３４（ｍ，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）ｐｐｍ）（図２１、２２を参照すること）、１３Ｃ  ＮＭＲ（図２３を参照すること）ならびにＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳ（図２４を参照すること）
【００８９】
実施例１０
ポリ（エチレングリコール−ｂ−プロピレンマレエート）の異性化
ポリ（エチレングリコール−ｂ−プロピレンフマレート）（１ｇ、１０ｍｏｌ当量オレフィン）をクロロホルム（５０ｍＬ）に溶解させた。ジエチルアミン（０．１５１ｍＬ、０．１５ｍｏｌ当量オレフィン）を溶液に添加して、窒素雰囲気下にて２４時間還流した。室温まで降温させた後、有機溶液をリン酸緩衝液（１５０ｍＬ、ｐＨ＝６）で洗浄し、ポリマーをヘキサンから沈殿を介して回収した。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、３０３Ｋ、ＣＤＣｌ３）：δ＝６．８８−６．８２（ｍ、ＯＣ（＝Ｏ）ＣＨ＝ＣＨ（＝Ｏ）Ｏ）、５．３５−５．２５（ｍ，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）、４．４３−４．１８（ｍ，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）、３．６４（ｍ，ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）、３．３８（ｓ，Ｈ３ＣＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）および１．３６−１．３４（ｍ，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）ｐｐｍ。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法（図２５Ａ）およびサイズ排除クロマトグラフィー（図２５Ｂ）を、トリブロックコポリマーの合成を確認するために使用した。
【００９０】
実施例１１
ポリ（プロピレンマレエート−ｂ−エチレングリコール−ｂ−プロピレンマレエート）の異性化
ポリ（ポリプロピレンマレエート−ｂ−エチレングリコール−ｂ−プロピレンマレエート）（１．００ｇ、１０ｍｏｌ当量オレフィン）をクロロホルム（５０ｍＬ）に溶解させた。ジエチルアミン（０．１５１ｍＬ、０．１５ｍｏｌ当量オレフィン）を溶液に添加して、窒素雰囲気下にて２４時間還流した。室温まで降温させた後、有機溶液をリン酸緩衝液（１５０ｍＬ、ｐＨ＝６）で洗浄し、ポリマーをヘキサンから沈殿を介して回収した。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、３０３Ｋ、ＣＤＣｌ３）：δ＝６．８８−６．８２（ｍ，ＯＣ（＝Ｏ）ＣＨ＝ＣＨ（＝Ｏ）Ｏ）、５．３０−５．２０（ｍ，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）、４．２９−４．２１（ｍ，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）、３．６４（ｍ，ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）、および１．３３−．３１（ｍ，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）ｐｐｍ．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法（図２６Ａ）およびサイズ排除クロマトグラフィー（図２６Ｂ）を、トリブロックコポリマーの合成を確認するために使用した。
【００９１】
実施例１２
ポリ（プロピレンマレエート−ｂ−エチレングリコール−ｂ−プロピレンマレエート）の異性化
実施例５にて形成したポリ（ポリプロピレンマレエート−ｂ−エチレングリコール−ｂ−プロピレンマレエート）ポリマー（ＰＰＭ１０ＰＥＧ２３ＰＰＭ１０）を実施例１１の上記の方法を使用して異性化した。得られたＰＰＦ１０ＰＥＧ２３ＰＰＦ１０ポリマーの１Ｈ  ＮＭＲ、１３Ｃ  ＮＭＲ、および定量１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルを図２７〜２９に示す。
【００９２】
実施例１３
フェニル−２、４，６−トリメチルベンゾイルホスフィン酸リチウム（ＬＡＰ）の合成
５００ｍＬの二つ口丸底フラスコに充填した窒素内で、１０．６９ｇの２、４，６−トリメチルベンゾイルクロライド（０．０６ｍｏｌ、１当量）を１０ｇのジメチルフェニルホスホニト（０．０６ｍｏｌ、１当量）に添加した。反応生成物を室温で１８時間撹拌して、１２５ｍＬの２−ブタノン中の２０．１３ｇの臭化リチウム（０．２３ｍｏｌ、４当量）を添加した。次に、反応生成物を５０℃まで１０分間加熱して、その間に白色沈殿物が形成された。次に、反応生成物を室温に達するまで３時間降温させた。白色生成物を３００ｍＬの２−ブタノンでブフナー漏斗中で洗浄して、一晩かけて真空で乾燥させた。（１３．２２ｇ、収率７７％）。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、３０３Ｋ、Ｄ２Ｏ）：δ＝７．８２−７．７８（ｔｏｔ，２Ｈ）、７．６７−７．６４（ｔｏｔ，１Ｈ）、７．５７−７．５４（ｍ，２Ｈ）、６．９８（ｓ，２Ｈ）、２．３３（ｓ，３Ｈ）、および２．１１（ｓ，６Ｈ）ｐｐｍ。（図３０を参照すること）
【００９３】
実施例１４
ヒドロゲルの製作
ヒドロゲルは、ポリマー骨格中の二重結合のモル比が１：５である開始剤（ＬＡＰ）を用いて、それらの個々の粘度に応じて、２０〜２５重量％で調製される。溶液が溶解した後、１０分間ＵＶオーブン（ＥｎｖｉｓｉｏｎＴｅｃ、Ｄｅａｒｂｏｒｎ、ＭＩ、７０Ｗ、５５Ｈｚ、λｍａｘ＝４００ｎｍ）内に配置し、硬化させた。
【００９４】
実施例１５
粘度測定法
水とＤＥＦの両方でのポリマー溶液の複素粘度測定値は、２５ｍｍのアルミニウム平行平板を装備したＡＲＥＳ  Ｇ２  Ｒｈｅｏｍｅｔｅｒ（ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｎｅｗ  Ｃａｓｔｌｅ、ＤＥ）で実施された。０．０１〜１００％のひずみスイープは、弾性（ＬＶＥ）レジームを決定するために用いられ、周波数スイープは、粘度を測定するために適切なひずみにて行った。報告値は、各ポリマーの３倍にした周波数スイープの平均である。（図１１、１２を参照すること）
【００９５】
実施例１６
ＰＰＦｍＰＥＧｎＰＰＦｍの３次元印刷
ＰＰＦｍＰＥＧ２３ＰＰＦｍは、４０５ｎｍの紫外線照射装置を使用して、ＥｎｖｉｓｉｏｎＴｅｃ  Ｍｉｃｒｏ＋Ａｄｖａｎｔａｇｅ３次元プリンタで印刷した。樹脂配合物を以下の通り調製した。ジエチルフマレート（ＤＥＦ）で印刷するため、ポリマーをＤＥＦ中に５０重量％溶解させて、さらに３重量％のＢＡＰＯ、０．７重量％のＩＲＧＡＣＵＲＥ（商標）７８４、および０．４重量％のオキシベンゾンを添加した。水溶液から印刷するため、ＰＰＦｍＰＥＧｎＰＰＦｍ（ｎ＝４５、９１）ポリマーを、ポリマー中の二重結合に対するモル比が１：５であるＬＡＰ光開始剤を用いて、それらの複素粘度に応じて、水に２０〜２５重量％溶解させた（１Ｈ  ＮＭＲによるＭｎにより決定）。
【００９６】
実施例１７
ゲル膨潤
ヒドロゲルを４８時間、脱イオン水中で膨潤させて、重量を量り、７２時間、凍結乾燥させて、過剰な水すべてを除去した。膨潤比Ｑは、
【数１】
2020530055.tif 000019
により規定され、式中、Ｍｓは、平衡膨潤したヒドロゲルの質量であり、Ｍｄは、完全に乾燥させたヒドロゲルの質量である。図９を参照すること。
【００９７】
実施例１８
滅菌
ヒドロゲル試料（８ｍｍ）をそれぞれ音波処理下２５分間、エタノール溶液（２１％のアセトン、４９％のエタノール、および３０ｖ／ｖ％の蒸留水）で２回ずつ洗浄し、ＰＢＳに浸漬して残留溶液を洗い流した。次に、試料は、滅菌のために液体を循環させながらＰＢＳ中でオートクレーブされた。試料は、２４ウェルプレートへ慎重に移され、１ｍＬの培地を各ウェルへ添加した。
【００９８】
実施例１９
細胞培養
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１前骨芽細胞様細胞は、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）、１００ｕｎｉｔｓ・ｍＬ−１ペニシリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）、および１００ｕｎｉｔｓ・ｍＬ−１ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を追加された、α−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）で増殖および培養された。ＮＩＨ  ３Ｔ３マウス線維芽細胞は、１０％のＦＢＳおよび各１００ｕｎｉｔｓ・ｍＬ−１のペニシリンおよびストレプトマイシンを追加された、ＤＭＥＭ培地で培養された。生体ラットの坐骨神経から分離した初代シュワン細胞（ＳＣ）株は、Ｆａｉｒｂａｎｋｓ，Ｂ．Ｄ．；Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｍ．Ｐ．；Ｂｏｗｍａｎ，Ｃ．Ｎ．；Ａｎｓｅｔｈ，Ｋ．Ｓ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｐｈｏｔｏｉｎｉｔｉａｔｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＥＧ−Ｄｉａｃｒｙｌａｔｅ  ｗｉｔｈ  Ｌｉｔｈｉｕｍ  Ｐｈｅｎｙｌ−２，４，６−Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｙｌｐｈｏｓｐｈｉｎａｔｅ：Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｒａｔｅ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００９，３０（３５），６７０２−６７０７ＳＣにて上述したような研究に利用され、その開示は本発明において参考としてその全体が含まれ、１０％のＦＢＳ、各１００ｕｎｉｔｓ・ｍＬ−１のペニシリンおよびストレプトマイシン、フォルスコリン（５μＭ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｎ２添加物（１ｖｏｌ／ｖｏｌ％、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、およびウシ下垂体抽出物（２０μｇ・ｍＬ−１、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を追加された、ＤＭＥＭ培地で増殖および培養された。細胞は、３７℃の５％ＣＯ２の加湿雰囲気下で保持された。細胞播種のため、細胞をＤＰＢＳで洗い、３７℃の５％のＣＯ２の加湿雰囲気下５分間、０．０５％のトリプシン／エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム塩（ＥＤＴＡ）溶液を使用してフラスコから取り出した。取り出した細胞を当量の培地を含有する円錐管に収集した。細胞を４００ｇで６分間遠心分離してペレットを形成し、培地／トリプシン溶液を吸引除去した。細胞を新鮮な培地に再懸濁して、血球計算盤を使用して計数して、５×１０５細胞／試料の密度でヒドロゲルに播種した。
【００９９】
実施例２０
生死判別試験
生存率は、哺乳類細胞用の生／死判定／細胞毒性キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、細胞培養の１日後に評価された。暗所で、１０ｍＬのＤＰＢＳにカルセイン−ＡＭ（４ｍＭ、５μＬ）およびエチジウムホモダイマー（５μＬ）を溶解させて染色液を調製した。試料をＤＰＢＳで１回洗い、３７℃下５％のＣＯ２で１０分間、１ｍＬの染色液中で培養した。顕微鏡写真は、倍率２０倍でＴｅｘａｓ  ＲｅｄおよびＧＦＰ用のフィルタを用いて、Ｋｅｙｅｎｃｅ  ＢＺ−Ｘ７００顕微鏡で撮影した。細胞計数プラグインを有するＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）ソフトウェアを使用して、生／死計数のために顕微鏡写真を分析した。緑色に染まった細胞を生細胞として計数し、赤色に染まった細胞を死細胞として計数した。すべての顕微鏡写真に対する生および死細胞計数は、スライドガラスコントロールと比較して各試験群の生存率を総計して算出した。図１３〜１５を参照すること。
【０１００】
前述の見地から、本発明は、構造上および機能上、様々な方法で改善されたＰＥＧ／ＰＰＦジブロックコポリマーおよびＰＰＧ／ＰＥＧ／ＰＰＦトリブロックコポリマー（ならびに製造および使用の関連方法）を提供することにより、当該技術を著しく前進させることが理解されるべきである。本発明の特定の実施形態は本明細書にて詳細に開示されてきたが、本発明は、本発明に対する改変は本明細書にて当業者に容易に理解されるため、これらまたはこれらによって限定されるものではないことが理解されるべきである。本発明の範囲は、続く特許請求の範囲から理解されるべきである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【国際調査報告】
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