(57)【要約】本発明は、Ｃａｓタンパク質の使用、標的核酸分子の検出方法、及びキットを提供する。標的核酸分子の検出方法は、ガイドＲＮＡ、Ｃａｓ１２ａ、及び核酸プローブを、検出される標的核酸分子を含む反応系に添加すること、及び反応完了後に核酸プローブを検出することを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸分子の検出方法であって、ガイドＲＮＡ、Ｃａｓタンパク質、核酸プローブ、及び緩衝溶液を、検出される前記標的核酸分子を含む系に添加し、次いで、前記核酸プローブを検出することを含む、前記方法。
【請求項２】
前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ１２ａであるか、またはＣａｓ１２ａのものと類似のコラテラル一本鎖ＤＮＡ切断活性を有するＣａｓタンパク質であり、
前記Ｃａｓ１２ａが、好ましくはＦｎＣａｓ１２ａ、ＡｓＣａｓ１２ａ、ＬｂＣａｓ１２ａ、Ｌｂ５Ｃａｓ１２ａ、ＨｋＣａｓ１２ａ、ＯｓＣａｓ１２ａ、ＴｓＣａｓ１２ａ、ＢｂＣａｓ１２ａ、ＢｏＣａｓ１２ａ、またはＬｂ４Ｃａｓ１２ａのうちの１つであり、前記Ｃａｓ１２ａが、好ましくはＬｂＣａｓ１２ａである、
請求項１に記載の標的核酸分子の検出方法。
【請求項３】
前記ガイドＲＮＡが、前記Ｃａｓタンパク質を標的ＤＮＡに特異的に結合するように誘導するＲＮＡを指す、請求項１に記載の標的核酸分子の検出方法。
【請求項４】
前記核酸プローブが一本鎖ＤＮＡであり、前記一本鎖ＤＮＡが好ましくは蛍光標識された一本鎖ＤＮＡであり、前記一本鎖ＤＮＡが好ましくは５’末端を蛍光基ＨＥＸで標識され、３’末端を消光基ＢＨＱ１で標識された蛍光プローブであり、好ましくは
前記核酸プローブの検出方法が好ましくは蛍光検出方法であり、前記蛍光検出方法が、好ましくはマイクロプレートリーダーまたは蛍光分光光度計を用いた検出方法である、
請求項１に記載の標的核酸分子の検出方法。
【請求項５】
検出される前記標的核酸分子の前記反応系において検出される前記標的核酸分子が、増幅により得られる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の標的核酸分子の検出方法。
【請求項６】
病原微生物、遺伝子変異、または特定の標的ＤＮＡを検出することができる、請求項５に記載の標的核酸分子の検出方法。
【請求項７】
前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ１２ｂ（すなわち、Ｃ２ｃ１）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
標的核酸分子の検出方法におけるＣａｓタンパク質の使用。
【請求項９】
標的ＤＮＡ、ガイドＲＮＡ、及びＣａｓタンパク質が三元複合体を形成する場合、前記複合体が系内の他の一本鎖ＤＮＡ分子を切断し、好ましくは、前記ガイドＲＮＡが前記標的ＤＮＡに特異的に結合するように前記Ｃａｓタンパク質を誘導するＲＮＡを指す、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
ガイドＲＮＡ、Ｃａｓタンパク質、及び核酸プローブを含む、標的核酸分子を検出するためのキット。
【請求項１１】
標的核酸分子を検出するための検出系であって、
（ａ）Ｃａｓ１２ａであるか、または前記Ｃａｓ１２ａのものと類似のコラテラル一本鎖ＤＮＡ切断活性を有するＣａｓタンパク質である、Ｃａｓタンパク質と、
（ｂ）前記標的核酸分子に特異的に結合するように前記Ｃａｓタンパク質を誘導するガイドＲＮＡと、
（ｃ）一本鎖ＤＮＡである核酸プローブと、を含み、
前記標的核酸分子が、標的ＤＮＡである、前記検出系。
【請求項１２】
Ｃａｓ１２ａのものと類似のコラテラル一本鎖ＤＮＡ切断活性を有する前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ１２ｂ（すなわち、Ｃ２ｃ１）からなる群から選択される、請求項１１に記載の検出系。
【請求項１３】
前記核酸プローブが、検出可能な標識を有する一本鎖ＤＮＡを含む、請求項１１に記載の検出系。
【請求項１４】
標的核酸分子を検出するためのキットであって、
ｉ）第１の容器、及び前記第１の容器内のＣａｓタンパク質であって、前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ１２ａ、または前記Ｃａｓ１２ａのものと類似のコラテラル一本鎖ＤＮＡ切断活性を有するＣａｓタンパク質である、前記第１の容器内のＣａｓタンパク質と、
ｉｉ）任意の第２の容器、及び前記第２の容器内のガイドＲＮＡであって、前記ガイドＲＮＡが前記標的核酸分子に特異的に結合するように前記Ｃａｓタンパク質を誘導する、前記第２の容器内のガイドＲＮＡと、
ｉｉｉ）第３の容器、及び前記第３の容器内の核酸プローブと、
ｉｖ）任意の第４の容器、及び前記第４の容器内の緩衝溶液と、を含み、
前記標的核酸分子が、標的ＤＮＡである、前記キット。
【請求項１５】
試料中に標的核酸分子が存在するかどうかを検出するための方法であって、以下の工程：
（ａ）請求項１１に記載の標的核酸分子を検出するための検出系を提供する工程であって、前記検出系が、検出される試料をさらに含む、前記提供する工程と、
（ｂ）前記検出系の前記核酸プローブがＣａｓタンパク質によって切断されているかどうかを検出する工程であって、前記切断が、コラテラル一本鎖ＤＮＡのトランス切断である、前記検出する工程と、を含み、
前記核酸プローブが前記Ｃａｓタンパク質によって切断される場合、それは前記試料中の前記標的核酸分子の存在を示し、前記核酸プローブが前記Ｃａｓタンパク質によって切断されない場合、それは前記試料中に前記標的核酸分子が存在しないことを示す、
前期検出するための方法。
【請求項１６】
前記核酸を増幅するための方法が、ＰＣＲ増幅、ＬＡＭＰ増幅、ＲＰＡ増幅、リガーゼ連鎖反応、分岐ＤＮＡ増幅、ＮＡＳＢＡ、ＳＤＡ、転写介在増幅、ローリングサークル増幅、ＨＤＡ、ＳＰＩＡ、ＮＥＡＲ、ＴＭＡ、及びＳＭＡＰ２からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
標的部位の上流及び下流（−２０ｎｔ〜＋２０ｎｔの範囲、好ましくは−１５ｎｔ〜＋１５ｎｔの範囲、より好ましくは−１０ｎｔ〜＋１０ｎｔの範囲）がＰＡＭ配列を欠く場合、ＰＡＭ導入プライマーを用いて核酸増幅を実施する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＰＡＭ導入プライマーが、５’−３’中に式Ｉ
Ｐ１−Ｐ２−Ｐ３（Ｉ）
の構造を有し、
式中、
Ｐ１は、５’末端に位置し、前記標的核酸分子の配列に相補的または非相補的である５’セグメント配列であり、
Ｐ２は、ＰＡＭ配列であり、
Ｐ３は、３’末端に位置し、前記標的核酸分子の配列に相補的である３’セグメント配列である、
請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記標的部位の上流及び下流（−２０ｎｔ〜＋２０ｎｔの範囲、好ましくは−１５ｎｔ〜＋１５ｎｔの範囲、より好ましくは−１０ｎｔ〜＋１０ｎｔの範囲）が前記ＰＡＭ配列を含む場合、前記ＰＡＭ配列を含むかまたは含まないプライマーを使用することができ、前記増幅産物が前記ＰＡＭ配列を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
コラテラル一本鎖ＤＮＡ切断に基づいて標的核酸分子を検出するための、検出試薬の調製またはキットにおけるＣａｓタンパク質の使用であって、前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ１２ａであるか、または前記Ｃａｓ１２ａのものと類似のコラテラル一本鎖ＤＮＡ切断活性を有するＣａｓタンパク質である、前記使用。
【請求項２１】
前記Ｃａｓ１２ａのものと類似のコラテラル一本鎖ＤＮＡ切断活性を有する前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ１２ｂ（またはＣ２ｃ１）からなる群から選択される、請求項２０に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はバイオテクノロジーの分野に属し、特に、標的核酸分子の検出方法に属する。
【背景技術】
【０００２】
特定の核酸検出方法は、病原体検出、遺伝病検出などの重要な応用価値を有する。病原体検出の一態様では、各病原微生物がその固有の特徴的な核酸分子配列を有するため、食品安全性、環境微生物汚染検出、ヒト病原体感染などの分野において非常に重要な核酸診断（ＮＡＤ）としても知られる、特定種の核酸分子検出を開発することが可能である。別の態様は、ヒトまたは他の種における一塩基多型（ＳＮＰ）の検出である。ゲノムレベルでの遺伝的変異と生物学的機能間の関係を理解することは、現代の分子生物学に新たな視点をもたらす。ＳＮＰは、生物学的機能、進化、及び疾患に密接に関連しているため、ＳＮＰ検出及び分析技術の開発は特に重要である。
【０００３】
現在、多くのＮＡＤ法が主に特定のＤＮＡ分子の検出のために確立されており、そしてＲＮＡ分子のためのいくつかの方法もまた存在する。一般的に、ＤＮＡ分子は非常に安定であるため、試験試料は一連の複雑な生体試料から得られ、ＲＮＡは非常に分解しやすいため、慎重に取り扱う必要がある。１９７０年代には、制限エンドヌクレアーゼ消化を用いた検出法が確立された。その後、核酸分子の特異的検出のためにサザン、ノーザン及びドット・ブロット・ハイブリダイゼーションなどの方法が開発された。１９８５年には、ＰＣＲが実験の常法になり、分子生物学において指数関数的な改善がもたらされた。現在確立されている特定の核酸分子の検出は、通常、２工程で行われる必要があり、第１の工程は標的核酸の増幅であり、第２の工程は標的核酸の検出である。ＰＣＲ技術は、最初に確立され、現在最も一般的に使用されている増幅方法である。現在、ＰＣＲ法に基づいて、標的の増幅状況をリアルタイムで検出することができるように、蛍光標識プローブが導入されており、これはリアルタイムＰＣＲと呼ばれている。リアルタイムＰＣＲ法は、迅速かつ高感度な検出法であるばかりでなく、定量分析法でもある。ＰＣＲ増幅法に加えて、リガーゼ連鎖反応、分岐ＤＮＡ増幅、ＮＡＳＢＡ、ＳＤＡ、転写介在増幅、ループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）などの多くの代替方法が確立されている。これらの代替方法の多くの利点は等温性である。すなわち、ＰＣＲで使用されるような熱サイクル装置を必要とせずに、反応を完了するのに１つの温度のみが必要とされる。核酸検出法のうち、増幅及び検出を直接完了することができるリアルタイムＰＣＲに加えて、ＦＩＳＨ（蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）技術は最も一般的に使用される検出法であり、標識した分子プローブを相補的標的配列とｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイズさせる方法である。さらに、次世代のシーケンシング技術及びＯｘｆｏｒｄｎａｎｏｐｏｒｅシーケンシング技術などの検出方法も開発されているが、これらの方法は通常、高価な実験装置を必要とする。
【０００４】
ＳＮＰの検出はまた、さらなる検出のために十分なＳＮＰ部位含有領域フラグメントを得るために、ＰＣＲなどの方法による増幅をまず必要とする。一般的に使用される方法には、プライマー伸長、ハイブリダイゼーション、ライゲーション、及び酵素切断が含まれる。上記の方法が完了すると、質量分析検出、蛍光検出、化学発光検出などのような特定の方法を検出に利用する必要がある。
【０００５】
上記のように、核酸検出のために多くの検出方法が開発されてきたが、ある特定の場合では、現場での病原菌の迅速な検出、薬物感受性ＳＮＰの迅速な検出などの、より迅速に、単純に、及びより安価に検出する方法が依然として重要な開発傾向である。２０１６年に、Ｃｏｌｌｉｎｓらは、標的配列を特異的に認識し切断するというＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９の特性に基づいて、ジカウイルスを検出するための迅速かつ安価な方法を開発した。２０１７年に、Ｆｅｎｇ  Ｚｈａｎｇらは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａの「コラテラル作用」の特徴を利用した迅速な核酸検出方法を確立した。「コラテラル作用」とは、Ｃａｓ１３ａが特定の標的ＲＮＡに結合した後、他の非標的ＲＮＡをランダムに切断することを意味し（ここで、ＲＮＡ分子はＲＮＡ蛍光レポートシステムとして設計される）、迅速な標的ＲＮＡ検出が等温増幅技術ＲＰＡと組み合わせることによって実現し、Ｆｅｎｇ  Ｚｈａｎｇのチームはこの検出方法をＳＨＥＲＬＯＣＫ（特異的高感度酵素レポーターアンロッキング（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｈｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ＵｎＬＯＣＫｉｎｇ））と呼んだ。ＳＨＥＲＬＯＣＫ法は、ＲＮＡテンプレートへの結合を含むため、ＤＮＡ検出が必要な場合、そのＤＮＡは、検出のためにまずＲＮＡテンプレートに転写される必要があり、ＲＮＡの不安定性を考えると、この方法は間違いなく操作の困難性を増大させる。
【０００６】
２０１５年には、Ｆｅｎｇ  Ｚｈａｎｇらは一般的に使用されているＣａｓ９タンパク質のように、ＲＮＡ誘導性特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼである新しいＣＲＩＳＰＲ関連エンドプロテイナーゼＣａｓ１２ａ（以前はＣｐｆ１として知られていた）を発見した；しかしながら、Ｃａｓ９と比較して、Ｃａｓ１２ａは固有の特性を有し、例えば、二本鎖ＤＮＡの特異的切断を誘導するためにｃｒＲＮＡのみが必要であり、粘着末端が産生される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の目的は、標的核酸分子の検出方法を提供することである。
【０００８】
本発明の別の目的は、標的核酸分子の検出方法においてＣａｓタンパク質の使用を提供することである。
【０００９】
本発明の第１の態様において、ガイドＲＮＡ、Ｃａｓタンパク質、核酸プローブ、及び緩衝溶液を含むキットが提供される。
【００１０】
標的核酸分子の検出方法は、検出される標的核酸分子を含む反応系に、ガイドＲＮＡ、Ｃａｓタンパク質、核酸プローブ、及び緩衝溶液を添加することと、その後、標的核酸を検出する（特に蛍光強度を検出する方法により）ことと、を含む。
【００１１】
好ましくは、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ１２ａであるか、またはＣａｓ１２ａのものと類似のコラテラル一本鎖ＤＮＡ切断活性を有するＣａｓタンパク質である。
【００１２】
好ましくは、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ１２ａである。
【００１３】
Ｃａｓ１２ａは、好ましくは、ＦｎＣａｓ１２ａ、ＡｓＣａｓ１２ａ、ＬｂＣａｓ１２ａ、Ｌｂ５Ｃａｓ１２ａ、ＨｋＣａｓ１２ａ、ＯｓＣａｓ１２ａ、ＴｓＣａｓ１２ａ、ＢｂＣａｓ１２ａ、ＢｏＣａｓ１２ａ、またはＬｂ４Ｃａｓ１２ａのうちの１つである。
【００１４】
好ましくは、Ｃａｓ１２ａは、ＬｂＣａｓ１２ａである。
【００１５】
好ましくは、ガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡに特異的に結合するようにＣａｓタンパク質を誘導するＲＮＡを指す。
【００１６】
別の好適な実施形態において、核酸プローブは一本鎖ＤＮＡであり、一本鎖ＤＮＡは好ましくは蛍光標識された一本鎖ＤＮＡであり、一本鎖ＤＮＡは好ましくは５’末端を蛍光基ＨＥＸで標識され、３’末端を消光基ＢＨＱ１で標識された蛍光プローブである。
【００１７】
別の好適な実施形態において、核酸プローブの検出方法は好ましくは蛍光検出方法であり、蛍光検出方法は好ましくはマイクロプレートリーダーまたは蛍光分光光度計を用いた検出方法である。
【００１８】
好ましくは、検出される標的核酸分子の反応系において検出される標的核酸分子は、増幅後に得られる。
【００１９】
好ましくは、本発明の検出方法は、病原微生物、遺伝子変異、または特定の標的ＤＮＡを検出するために使用され得る。
【００２０】
別の好適な実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）を含む。
【００２１】
本発明の第２の態様において、標的核酸分子の検出方法における、または標的核酸分子を検出するための配合物の調製における、Ｃａｓタンパク質の使用が提供される。
【００２２】
別の好適な実施形態において、標的ＤＮＡ、ガイドＲＮＡ、及びＣａｓタンパク質が三元複合体を形成する場合、この複合体は、系内の他の一本鎖ＤＮＡ分子を切断する。
【００２３】
好ましくは、ガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡに特異的に結合するようにＣａｓタンパク質を誘導するＲＮＡを指す。
【００２４】
本発明の第３の態様において、ガイドＲＮＡ、Ｃａｓタンパク質、及び核酸プローブを含むキットが提供される。
【００２５】
別の好適な実施形態において、キットは、緩衝溶液をさらに含む。
【００２６】
本発明の第４の態様において、標的核酸分子を検出するための検出系が提供され、該系は、
（ａ）Ｃａｓ１２ａであるか、またはＣａｓ１２ａのものと類似のコラテラル一本鎖ＤＮＡ切断活性を有するＣａｓタンパク質である、Ｃａｓタンパク質と、
（ｂ）標的核酸分子に特異的に結合するようにＣａｓタンパク質を誘導するガイドＲＮＡと、
（ｃ）一本鎖ＤＮＡである核酸プローブと、を含み、
該標的核酸分子が、標的ＤＮＡである、検出系が提供される。
【００２７】
別の好適な実施形態において、検出系は、（ｄ）緩衝溶液をさらに含む。
【００２８】
別の好適な実施形態において、検出系は、検出される標的核酸分子をさらに含む。
【００２９】
別の好適な実施形態において、検出系において検出される標的核酸分子の濃度は、１〜１００コピー／マイクロリットルまたは１０１５コピー／マイクロリットル、好ましくは１〜１０コピー／マイクロリットル、より好ましくは１〜５コピー／マイクロリットルである。
【００３０】
別の好適な実施形態において、検出系では、核酸プローブ対標的核酸分子のモル比は１０３：１〜１０１４：１、好ましくは１０４：１〜１０７：１である。
【００３１】
別の好適な実施形態において、標的核酸分子の検出部位は、ガイドＲＮＡのＰＡＭ配列の１〜１２位下流に位置する。
【００３２】
別の好適な実施形態において、ガイドＲＮＡの長さは、１５〜３０ｎｔ、好ましくは１５〜１８ｎｔである。
【００３３】
別の好適な実施形態において、標的ＤＮＡはｃＤＮＡを含む。
【００３４】
別の好適な実施形態において、標的ＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００３５】
別の好適な実施形態において、核酸プローブは、蛍光基及び消光基を有する。
【００３６】
別の好適な実施形態において、蛍光基及び消光基は、それぞれ独立して、核酸プローブの５’末端、３’末端、及び中間部分に位置する。
【００３７】
別の好適な実施形態において、核酸プローブの長さは、３〜３００ｎｔ、好ましくは５〜１００ｎｔ、より好ましくは６〜５０ｎｔ、最も好ましくは８〜２０ｎｔである。
【００３８】
別の好適な実施形態において、標的核酸分子は、植物、動物、昆虫、微生物、ウイルス、またはそれらの組み合わせからなる群に由来する標的核酸分子を含む。
【００３９】
別の好適な実施形態において、標的ＤＮＡは、人工的に合成されたＤＮＡまたは天然に存在するＤＮＡである。
【００４０】
別の好適な実施形態において、標的ＤＮＡは、野生型または変異体ＤＮＡを含む。
【００４１】
別の好適な実施形態において、標的ＤＮＡは、ＲＮＡの逆転写または増幅によって得られるＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡなど）を含む。
【００４２】
別の好適な実施形態において、Ｃａｓ１２ａは、ＦｎＣａｓ１２ａ、ＡｓＣａｓ１２ａ、ＬｂＣａｓ１２ａ、Ｌｂ５Ｃａｓ１２ａ、ＨｋＣａｓ１２ａ、ＯｓＣａｓ１２ａ、ＴｓＣａｓ１２ａ、ＢｂＣａｓ１２ａ、ＢｏＣａｓ１２ａ、Ｌｂ４Ｃａｓ１２ａ、またはそれらの組み合わせからなる群から選択され、より好ましくは、Ｃａｓ１２ａは、ＬｂＣａｓ１２ａである。
【００４３】
別の好適な実施形態において、Ｃａｓ１２ａのものと類似のコラテラル一本鎖ＤＮＡ切断活性を有するＣａｓタンパク質が、Ｃａｓ１２ｂ（すなわち、Ｃ２ｃ１）からなる群から選択される。
【００４４】
別の好適な実施形態において、Ｃａｓ１２ｂタンパク質は、ＡａｃＣａｓ１２ｂ（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、Ａａｃ２Ｃａｓ１２ｂ（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｓ）、ＡｋＣａｓ１２ｂ（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋａｋｅｇａｗｅｎｓｉｓ）、ＡｍＣａｓ１２ｂ（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｒｏｓｐｏｒａｎｇｉｉｄｕｓ）、ＡｈＣａｓ１２ｂ（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｒｂａｒｉｕｓ）、及びＡｃＣａｓ１２ｂ（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｓ）からなる群から選択される。
【００４５】
別の好適な実施形態において、核酸プローブは、検出可能な標識を有する一本鎖ＤＮＡを含む。
【００４６】
別の好適な実施形態において、一本鎖ＤＮＡは、蛍光標識及びビオチン標識された一本鎖ＤＮＡである。
【００４７】
別の好適な実施形態において、一本鎖ＤＮＡは、蛍光標識された一本鎖ＤＮＡである。
【００４８】
別の好適な実施形態において、一本鎖ＤＮＡは、５’末端を蛍光基ＨＥＸで標識され、３’末端を消光基ＢＨＱ１で標識された蛍光プローブである。
【００４９】
本発明の第５の態様において、標的核酸分子を検出するためのキットが提供され、該キットは、
ｉ）第１の容器、及び第１の容器内のＣａｓタンパク質であって、該Ｃａｓタンパク質がＣａｓ１２ａ、またはＣａｓ１２ａのものと類似のコラテラル一本鎖ＤＮＡ切断活性を有するＣａｓタンパク質である、第１の容器内のＣａｓタンパク質と、
ｉｉ）任意の第２の容器、及び第２の容器内のガイドＲＮＡであって、該ガイドＲＮＡが標的核酸分子に特異的に結合するようにＣａｓタンパク質を誘導する、第２の容器内のガイドＲＮＡと、
ｉｉｉ）第３の容器及び第３の容器内の核酸プローブと、
ｉｖ）任意の第４の容器及び第４の容器内にある緩衝溶液と、を含み、
該標的核酸分子が、標的ＤＮＡである、キットが提供される。
【００５０】
別の好適な実施形態において、第１、第２、第３、及び第４の容器の２つ、３つ、または４つ（または全て）は、同じ容器でも異なる容器でもよい。
【００５１】
別の好適な実施形態において、核酸プローブは、蛍光基及び消光基を有する。
【００５２】
本発明の第６の態様において、試料中に標的核酸分子が存在するかどうかを検出するための方法であって、以下の工程：
（ａ）本発明の第４の態様による標的核酸分子を検出するための検出系を提供する工程であって、該検出系が、検出される試料をさらに有する、提供する工程と、
（ｂ）検出系内の核酸プローブがＣａｓタンパク質によって切断されているかどうかを検出する工程であって、該切断が、コラテラル一本鎖ＤＮＡのトランス切断である、検出する工程と、を含み、
該核酸プローブが該Ｃａｓタンパク質によって切断される場合、それは試料中の標的核酸分子の存在を示し、該核酸プローブがＣａｓタンパク質によって切断されない場合、それは試料中に標的核酸分子が存在しないことを示す、
検出するための方法が提供される。
【００５３】
別の好適な実施形態において、検出される試料は、非増幅試料及び増幅（または核酸増幅）試料を含む。
【００５４】
別の好適な実施形態において、検出される試料は、増幅によって得られた試料である。
【００５５】
別の好適な実施形態において、核酸を増幅するための方法は、ＰＣＲ増幅、ＬＡＭＰ増幅、ＲＰＡ増幅、リガーゼ連鎖反応、分岐ＤＮＡ増幅、ＮＡＳＢＡ、ＳＤＡ、転写介在増幅、ローリングサークル増幅、ＨＤＡ、ＳＰＩＡ、ＮＥＡＲ、ＴＭＡ、及びＳＭＡＰ２からなる群から選択される。
【００５６】
別の好適な実施形態において、ＰＣＲは、高温ＰＣＲ、常温ＰＣＲ、及び低温ＰＣＲを含む。
【００５７】
別の好適な実施形態において、この方法は、ＳＮＰ、点変異、欠失、及び／または挿入が標的部位の核酸に存在するかどうかを検出するために使用される。
【００５８】
別の好適な実施形態において、標的部位の上流及び下流（−２０ｎｔ〜＋２０ｎｔの範囲、好ましくは−１５ｎｔ〜＋１５ｎｔの範囲、より好ましくは−１０ｎｔ〜＋１０ｎｔの範囲）がＰＡＭ配列を欠く場合、核酸増幅は、ＰＡＭ導入プライマーを用いて実施される。
【００５９】
別の好適な実施形態において、ＰＡＭ導入プライマーは、５’−３’中に式Ｉ：
Ｐ１−Ｐ２−Ｐ３（Ｉ）
の構造を有し、
式中、
Ｐ１は、５’末端に位置し、標的核酸分子の配列に相補的または非相補的である５’セグメント配列であり、
Ｐ２は、ＰＡＭ配列であり、
Ｐ３は、３’末端に位置し、標的核酸分子の配列に相補的である３’セグメント配列である。
【００６０】
別の好適な実施形態において、ＰＡＭプライマーは、標的核酸分子の上流または下流に特異的に結合する。
【００６１】
別の好適な実施形態において、Ｐ１の長さは、０〜２０ｎｔである。
【００６２】
別の好適な実施形態において、Ｐ３の長さは、５〜２０ｎｔである。
【００６３】
別の好適な実施形態において、ＰＡＭプライマーの長さは、１８〜５０ｎｔ、好ましくは２０〜３５ｎｔである。
【００６４】
別の好適な実施形態において、相補には、完全相補と部分相補が含まれる。
【００６５】
別の好適な実施形態において、ＰＡＭ配列を含む少なくとも１つのプライマーは、核酸増幅に使用される。
【００６６】
別の好適な実施形態において、標的部位の上流及び下流（−２０ｎｔ〜＋２０ｎｔの範囲、好ましくは−１５ｎｔ〜＋１５ｎｔの範囲、より好ましくは−１０ｎｔ〜＋１０ｎｔの範囲）がＰＡＭ配列を含む場合、ＰＡＭ配列を含むかまたは含まないプライマーを使用することができ、該増幅産物はＰＡＭ配列を含む。
【００６７】
別の好適な実施形態において、工程（ｂ）での検出は、蛍光検出法を含む。
【００６８】
別の好適な実施形態において、蛍光検出法は、検出にマイクロプレートリーダーまたは蛍光分光光度計を用いる。
【００６９】
本発明の第７の態様において、コラテラル一本鎖ＤＮＡ切断に基づいて標的核酸分子を検出するための、検出試薬の調製またはキットにおけるＣａｓタンパク質の使用が提供され、ここで、該Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ１２ａであるか、またはＣａｓ１２ａのものと類似のコラテラル一本鎖ＤＮＡ切断活性を有するＣａｓタンパク質である、Ｃａｓタンパク質の使用が提供される。
【００７０】
別の好適な実施形態において、Ｃａｓ１２ａは、ＦｎＣａｓ１２ａ、ＡｓＣａｓ１２ａ、ＬｂＣａｓ１２ａ、Ｌｂ５Ｃａｓ１２ａ、ＨｋＣａｓ１２ａ、ＯｓＣａｓ１２ａ、ＴｓＣａｓ１２ａ、ＢｂＣａｓ１２ａ、ＢｏＣａｓ１２ａ、Ｌｂ４Ｃａｓ１２ａ、またはそれらの組み合わせからなる群から選択され、より好ましくは、Ｃａｓ１２ａは、ＬｂＣａｓ１２ａである。
【００７１】
別の好適な実施形態において、Ｃａｓ１２ａのものと類似のコラテラル一本鎖ＤＮＡ切断活性を有するＣａｓタンパク質は、Ｃａｓ１２ｂ（または、Ｃ２ｃ１）からなる群から選択される。
【００７２】
別の好適な実施形態において、Ｃａｓ１２ｂタンパク質は、ＡａｃＣａｓ１２ｂからなる群から選択される。
本発明の範囲内で、本発明の上述の技術的特徴及び以下に（例えば、実施例において）詳細に説明する技術的特徴を互いに組み合わせて、新たなまたは好ましい技術的解決策を形成できることを理解されたい。長さによる制限のため、ここではこれ以上繰り返さない。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】標的一本鎖ＤＮＡの切断におけるＣａｓ１２ａのシス切断特性を示す。
【図２】標的一本鎖ＤＮＡを切断する場合、Ｃａｓ１２ａが二本鎖を切断するために必要とされるＰＡＭ配列に依存しないことを示す。
【図３】一本鎖ＤＮＡの切断におけるＣａｓ１２ａのトランス切断特性を示す。
【図４】１０種類のソースの試験Ｃａｓ１２ａｓを示し、これらのＣａｓ１２ａｓは全て、一本鎖ＤＮＡに対してシス切断及びトランス切断活性を有する。
【図５】Ｃａｓ１２ａの単一部位変異実験によりＣａｓ１２ａの一本鎖ＤＮＡに対するシス切断及びトランス切断活性におそらく関連する部位を特定する。
【図６】Ｃａｓ１２ａ及びＣａｓ１２ｂ（すなわち、Ｃ２ｃ１）モノマーならびにガイドＲＮＡ及び標的ＤＮＡとのそれらの複合体の構造を示す。
【図７】特定の二本鎖ＤＮＡ基質、及び蛍光検出プローブとして一本鎖ＤＮＡ（ＨＥＸ−Ｎ１２−ＢＨＱ１）を用いて異なるＣａｓ１２ａｓによって得られた蛍光値を示す。陰性対照群には、特定の基質を添加しない。
【図８】標的ＤＮＡ増幅、及びコラテラル一本鎖ＤＮＡに対するＣａｓ１２ａのトランス切断活性に基づいて、標的ＤＮＡを検出するためのＨＯＬＭＥＳ法の概略フローチャートを示す。
【図９】ＦｎＣａｓ１２ａまたはＬｂＣａｓ１２ａを直接使用するか、またはＨＯＬＭＥＳ法と組み合わせて使用することによる標的ＤＮＡの感度試験を示す。
【図１０】異なる長さのガイド配列のｃｒＲＮＡをＦｎＣａｓ１２ａまたはＬｂＣａｓ１２ａと組み合わせて使用するＨＯＬＭＥＳ法によって検出される、異なる単一点変異を有する標的配列の蛍光検出値を示す。
【図１１】ＦＡＭ標識蛍光プローブ及び１０個のＣａｓ１２ａタンパク質を利用することにより、標的一本鎖ＤＮＡが添加された後、ＦＡＭ標識一本鎖ＤＮＡプローブがトランス切断されるかどうかを試験したものである。
【図１２】プローブとしてＨＥＸ−Ｎ１２−ＢＨＱ１を用い、そして１０個のＣａｓ１２ａタンパク質を用いて、標的一本鎖ＤＮＡを添加した後の蛍光値を試験したものである。
【図１３】（Ａ）ｇｙｒＢ遺伝子フラグメントを標的配列として使用し、その両端をＨＥＸ及びＢＨＱ１で標識した一本鎖ＤＮＡ蛍光プローブを用いて、異なる濃度の純粋培養Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５を陽性対照テンプレートとして用いた場合のＨＯＬＭＥＳ検出値を示す。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５の蛍光応答値は、その濃度の減少とともに減少することが示される。（Ｂ）異なる場所での環境における水試料の検出値である。
【図１４】ＳＮＰ及び５つのＳＮＰ部位の蛍光検出値を検出するためのＨＯＬＭＥＳ法の概略フローチャートを示す。
【図１５】ＨＯＬＭＥＳ法により検出されたＴＰ５３遺伝子（がん関連遺伝子）の主要部位の蛍光検出値を示す。
【図１６】ＨＯＬＭＥＳ法により検出された５つのＳＮＰ部位（痛風に関連する）の検出値を示す。
【図１７】ＨＯＬＭＥＳ法により検出された１つのＳＮＰ部位（痛風に関連する）の検出値を示し、その試料は、２１人のボランティアからの試料である。
【図１８】任意の部位におけるＳＮＰのＨＯＬＭＥＳ検出のために使用され得る、本発明の一例のプライマー設計スキームを示す。
【図１９】ＬＡＭＰ及びＨＯＬＭＥＳの組み合わせを使用して、系内のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉを検出する。（Ａ）ＬＡＭＰにより増幅されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのｇｙｒＢ遺伝子の電気泳動図である。合計２組のプライマーｇｙｒＢ−１及びｇｙｒＢ−２を増幅に使用する。ｇｙｒＢはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの特徴的な遺伝子である。（Ｂ）ＨＯＬＭＥＳ検出系は、ＬＡＭＰの増幅産物を検出するために使用される。陰性対照：試料は滅菌水であり、ｇｙｒＢ−１増幅プライマーがｇｙｒＢ遺伝子の結果を増幅または検出するために使用される；ｇｙｒＢ−１：試料は検出されるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉであり、ｇｙｒＢ遺伝子増幅プライマーの第１のセットがｇｙｒＢ遺伝子の結果を増幅または検出するために使用される；ｇｙｒＢ−２：試料は検出されるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉであり、ｇｙｒＢ遺伝子増幅プライマーの第２のセットがｇｙｒＢ遺伝子の結果を増幅または検出するために使用される。
【図２０】ＬＡＭＰ及びＨＯＬＭＥＳの組み合わせを使用することにより、ヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞の遺伝子型を検出する。（Ａ）ＬＡＭＰにより増幅されたヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞の対応するＳＮＰ検出テンプレートの電気泳動図である。陰性対照：試料は滅菌水であり、その結果はｒｓ５０８２増幅プライマーを用いた増幅の結果である；ｒｓ５０８２：試料はヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞の全ゲノムであり、結果はｒｓ５０８２増幅プライマーを用いた増幅の結果である；ｒｓ１４６７５５８：試料はヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞の全ゲノムであり、結果はｒｓ１４６７５５８増幅プライマーを用いた増幅の結果である。（Ｂ）ＨＯＬＭＥＳ検出系は、ＬＡＭＰの増幅産物を検出するために使用される。ｒｓ５０８２部位は、それぞれｃｒＲＮＡ−Ｇ及びｃｒＲＮＡ−Ｔの２つのｃｒＲＮＡを用いて検出し（配列表５）、ｒｓ１４６７５５８部位は、それぞれｃｒＲＮＡ−Ｃ及びｃｒＲＮＡ−Ｔの２つのｃｒＲＮＡを用いて検出した（配列表５）。
【図２１】ＲＰＡ及びＨＯＬＭＥＳの組み合わせを使用して、系内のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉを検出する。（Ａ）ＲＰＡによるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのｇｙｒＢ遺伝子の増幅。合計２組のプライマーｇｙｒＢ−１及びｇｙｒＢ−２を増幅に使用する。ｇｙｒＢはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの特徴的な遺伝子である。（Ｂ）ＨＯＬＭＥＳ検出系は、ＲＰＡの増幅産物を検出するために使用される。陰性対照：試料は滅菌水であり、ｇｙｒＢ−１増幅プライマーがｇｙｒＢ遺伝子の結果を増幅または検出するために使用される；ｇｙｒＢ−１：試料は検出されるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉであり、ｇｙｒＢ増幅プライマーの第１のセットがｇｙｒＢ遺伝子の結果を増幅または検出するために使用される；ｇｙｒＢ−２：試料は検出されるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉであり、ｇｙｒＢ増幅プライマーの第２のセットがｇｙｒＢ遺伝子の結果を増幅または検出するために使用される。
【図２２】標的ＤＮＡとして一本鎖ＤＮＡを用いた場合のＣａｓ１２ｂのコラテラル一本鎖ＤＮＡ切断活性の検出を示す。コラテラル切断反応が完了した後、反応物を１２％尿素変性ゲル電気泳動によって分離し、蛍光イメージングシステムによって検出する。括弧内の数字は、ｎＭ単位の反応物の最終濃度を表す；標的ＤＮＡは、５０ｎＭの用量で６６ｎｔ長の一本鎖ＤＮＡである；一本鎖ＤＮＡプローブは、５０ｎＭの用量で５’末端にＦＡＭ標識を有する一本鎖ＤＮＡである。図に示すように、Ｃａｓ１２ｂ、ガイドＲＮＡ、及び標的ＤＮＡを入れた後、ＦＡＭ標識一本鎖ＤＮＡが断片に切断される、すなわち、Ｃａｓ１２ｂはコラテラル一本鎖ＤＮＡ切断活性を有する。
【図２３】標的ＤＮＡとして一本鎖ＤＮＡ及び二本鎖ＤＮＡを用いた場合の、Ｃａｓ１２ｂのコラテラル一本鎖ＤＮＡ切断活性の検出を示す。コラテラル切断反応が完了した後、反応物を蛍光マイクロプレートリーダーを用いて検出する。Ｃａｓ１２ｂ及びガイドＲＮＡの用量は両方とも５００ｎＭである；標的ＤＮＡは、５０ｎＭの用量で６６ｎｔ長の一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡである；そして一本鎖ＤＮＡプローブは、５００ｎＭの用量で蛍光レポート基及び消光基を含む一本鎖ＤＮＡプローブ（ＨＥＸ−Ｎ１２−ＢＨＱ１）である。図に示すように、一本鎖ＤＮＡテンプレートまたは二本鎖ＤＮＡテンプレートのどちらを使用するかに関係なく、Ｃａｓ１２ｂ及びガイドＲＮＡを添加後、コラテラル一本鎖ＤＮＡ切断活性が検出可能である。
【図２４】ＬＡＭＰ増幅と組み合わせた後の低濃度での標的ＤＮＡに対するＣａｓ１２ｂのコラテラル一本鎖ＤＮＡトランス切断活性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７４】
本発明の実施形態の目的、技術的解決策、及び利点をより明確にするために、以下に、本発明の実施形態における添付図面を参照して、本発明の実施形態における技術的解決策を明確かつ完全に説明する。説明した実施形態は、本発明の実施形態の全てではなく一部である。創造的な努力なしに本発明の実施形態に基づいて当業者によって得られる他の全ての実施形態は、本発明の保護範囲内に含まれる。
【００７５】
本発明者は、広範囲にわたる綿密な研究と、Ｃａｓ酵素（Ｃａｓ１２ａ及びＣａｓ１２ｂ酵素など）の切断特性に関する研究を通じて、標的核酸検出のための技術的解決策を開発した。実験結果は、例えば、水中にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉなどの微生物が特定の濃度で存在するかどうかの識別、及びＳＮＰ遺伝子型の迅速な識別のために、上記の技術的解決策を採用することにより、核酸が正常かつ迅速に検出されることを示す。本発明はこれに基づいて完成する。
【００７６】
用語
【００７７】
「ガイドＲＮＡ」という用語は、標的ＤＮＡ配列に特異的に結合するようにＣａｓタンパク質を導くＲＮＡを指す。
【００７８】
「ｃｒＲＮＡ」という用語は、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡを指し、これは標的ＤＮＡ配列に結合するようにＣａｓ１２ａを導く短いＲＮＡである。
【００７９】
「ＣＲＩＳＰＲ」という用語は、多くの原核生物の免疫系である、クラスター化され、規則的に間隔があいた短い回文の繰り返し（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔ）を指す。
【００８０】
「Ｃａｓタンパク質」という用語は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を指し、これはＣＲＩＳＰＲシステムの関連タンパク質である。
【００８１】
「Ｃａｓ１２ａ」（以前は「Ｃｐｆ１」と呼ばれていた）という用語は、ｃｒＲＮＡ依存性エンドヌクレアーゼを指し、これはＣＲＩＳＰＲシステム分類のＶ−Ａ型酵素である。
【００８２】
「Ｃａｓ１２ｂ」及び「Ｃ２ｃ１」という用語は、同じ意味で用いられ、ｃｒＲＮＡ依存性エンドヌクレアーゼを指し、これはＣＲＩＳＰＲシステム分類のＶ−Ｂ型酵素である。
【００８３】
「ＬＡＭＰ」という用語は、ループ介在等温増幅技術であり、これは遺伝子診断に適した等温核酸増幅技術である。
【００８４】
「ＰＡＭ」という用語は、Ｃａｓ１２ａ切断に必要なプロトスペーサー隣接モチーフを指す。ＦｎＣａｓ１２ａのＰＡＭはＴＴＮ配列であり、ＬｂＣａｓ１２ａのＰＡＭはＴＴＴＮ配列であり、ＡａｃＣａｓ１２ｂのＰＡＭはＴＴＮである。
【００８５】
本発明は、標的核酸分子を検出する方法（ガイドＲＮＡ、Ｃａｓタンパク質、核酸プローブ、及び緩衝溶液を、検出される標的核酸分子を含む反応系に添加し、その後、標的核酸分子の蛍光検出を実行することを含む）を開示する。
【００８６】
Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ１２ａまたはＣａｓ１２ｂである。
【００８７】
Ｃａｓ１２ａは、好ましくはＦｎＣａｓ１２ａ、ＡｓＣａｓ１２ａ、ＬｂＣａｓ１２ａ、Ｌｂ５Ｃａｓ１２ａ、ＨｋＣａｓ１２ａ、ＯｓＣａｓ１２ａ、ＴｓＣａｓ１２ａ、ＢｂＣａｓ１２ａ、ＢｏＣａｓ１２ａ、またはＬｂ４Ｃａｓ１２ａのうちの１つであり、Ｃａｓ１２ａは、好ましくはＬｂＣａｓ１２ａである。
【００８８】
Ｃａｓ１２ｂは、好ましくはＡａｃＣａｓ１２ｂ、Ａａｃ２Ｃａｓ１２ｂ、ＡｋＣａｓ１２ｂ、ＡｍＣａｓ１２ｂ、ＡｈＣａｓ１２ｂ、またはＡｃＣａｓ１２ｂである。
【００８９】
ガイドＲＮＡとは、Ｃａｓタンパク質がＤＮＡ配列を特異的に標的とするように導くＲＮＡを指す。
【００９０】
検出される標的核酸分子の反応系において検出される標的核酸分子は、増幅により得られる。
【００９１】
検出方法は、病原微生物、遺伝子変異、または特定の標的ＤＮＡを検出することができる。
【００９２】
標的核酸分子の検出方法におけるＣａｓタンパク質の使用。
【００９３】
標的ＤＮＡ、ガイドＲＮＡ、及びＣａｓタンパク質が三元複合体を形成する場合、該複合体は、系内の他の一本鎖ＤＮＡ分子を切断する。
【００９４】
ガイドＲＮＡとは、Ｃａｓタンパク質がＤＮＡ配列を特異的に標的とするように導くＲＮＡを指す。
【００９５】
本発明はまた、ガイドＲＮＡ、Ｃａｓタンパク質、及び核酸プローブを含むキットを提供する。さらに、本発明のキットは、緩衝溶液も含むことができる。
【００９６】
本発明は、高い特異性で標的核酸分子を迅速に検出するための検出方法を提供する。（一本鎖または二本鎖）標的ＤＮＡ、ｃｒＲＮＡ、及びＣａｓ１２ａタンパク質が三元複合体を形成すると、該複合体は、系内の他の一本鎖ＤＮＡ分子を切断する。設計によって、ｃｒＲＮＡは標的ＤＮＡ（検出されるＤＮＡ配列のセグメント）を標的とし、ｃｒＲＮＡ及びＣａｓ１２ａタンパク質が検出系に添加され、標的ＤＮＡが存在する場合、Ｃａｓ１２ａはｃｒＲＮＡ及び標的ＤＮＡと三元複合体を形成し、一方、複合体は、そのコラテラル切断活性を発揮し、蛍光シグナルにより標識された一本鎖ＤＮＡを切断し（一本鎖ＤＮＡの両末端は、それぞれ発光基及び消光基に接続されており、発光基は切断された後に発光する）、これにより蛍光を発する。したがって、検出される系に標的ＤＮＡ分子が含まれているかどうかは、蛍光検出によって確認することができる。本発明の方法を使用することにより、特定のＤＮＡ配列が試料に含まれているかどうかを迅速に検出することができる。検出方法の感度は、ＰＣＲ技術と組み合わせることで大幅に改善可能である。本発明における核酸プローブは、蛍光プローブであることが好ましい。
【００９７】
ＨＯＬＭＥＳ条件試験：
本発明は、核酸検出においてＣａｓ１２ａ及びＣａｓ１２ｂなどのＣａｓ１２酵素の使用を提供する。以下の説明では、Ｃａｓ１２ａを例として取り上げる。
【００９８】
Ｃａｓ１２ａの選択：研究によると、Ｃａｓ１２ａは、トランス切断活性を有する。つまり、標的ＤＮＡ、ｃｒＲＮＡ、及びＣａｓ１２ａタンパク質が三元複合体を形成すると、系内の他の一本鎖ＤＮＡ（コラテラル一本鎖ＤＮＡ）が切断される。この原則によると、特異的なＤＮＡ検出方法が設計される。まず、コラテラルＤＮＡは蛍光プローブとして設計されており、１２ｎｔのランダム配列で構成され、５’末端を蛍光基ＨＥＸ、３’末端を消光基ＢＨＱ１（ＨＥＸ−Ｎ１２−ＢＨＱ１）で標識される。標的ＤＮＡフラグメントが系に含まれている場合、標的ＤＮＡ、ｃｒＲＮＡ、及びＣａｓ１２ａタンパク質の三元複合体が形成される。この時点で、プローブが切断され、その間、ＨＥＸ蛍光基が、蛍光検出器により検出される蛍光（５３５ｎＭの励起光及び５５６ｎＭの発光光）を発する。次に、１０種類のＣａｓ１２ａｓが試験され、標的配列は図７に示すように二本鎖ＤＮＡである。標的二本鎖ＤＮＡ及び各Ｃａｓ１２ａタンパク質からなる複合体がトランス切断活性を実現できることがわかる。
【００９９】
ＨＯＬＭＥＳ応答感度：次に、標的ＤＮＡに対するＦｎＣａｓ１２ａ及びＬｂＣａｓ１２ａの応答感度を試験する。つまり、応答が発生し得る標的ＤＮＡの最低濃度を調べる。図９に示すように、試験標的を直接添加した場合、０．１ｎＭを超える濃度で標的ＤＮＡに応答することができ、濃度が１ｎＭを超えると応答が顕著になる。図８に示すように、ＰＣＲ技術（ＨＯＬＭＥＳ法）を組み合わせた場合、すなわちＰＣＲに続いてＣａｓ１２ａ切断反応を介して目的のフラグメントを増幅すると、応答感度は、図９に示すように、１０ａＭまで低下し得る。
【０１００】
ＳＮＰ試験：次に、ＨＯＬＭＥＳ法がＳＮＰ遺伝子型を検出できるかどうかを試験する。Ｔ１を標的配列とみなし、この部位のＰＡＭを変異させるか、または標的配列の１〜１８位をそれぞれ単一点変異させ、非変異配列と、異なる長さのｃｒＲＮＡによる変異配列間の検出差を比較する。
【０１０１】
図１０に示すように、標的の相補性配列が２４ｎｔのｃｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ−２４ｎｔ）である場合、８〜１８位での単一点変異は、野生型とそれほど違いはないが、一方、ＰＡＭ変異及び１〜７位の変異後、蛍光値は明らかに減少した。ｃｒＲＮＡが切断され、対をなす標的配列の長さが１８ｎｔの場合、８〜１６ｎｔの変異位置の蛍光値は、２４ｎｔの長さを有する標的配列の蛍光値と比較して明らかに減少しており、ｃｒＲＮＡの長さが１６ｎｔまたは１７ｎｔに短縮され続ける場合、変異した標的配列の蛍光値はさらに大幅に減少し、さらに１５ｎｔに短縮される場合、変異した標的配列の蛍光値は、この標的配列の蛍光値と比較して弱くなるが、変異した標的配列の蛍光強度は、他の標的配列の蛍光強度と比較して依然として高くなり得、したがって検出に使用することができる。まとめると、１５ｎｔ、１６ｎｔ、及び１７ｎｔのｃｒＲＮＡが、ＳＮＰ検出に最適である。
【０１０２】
本発明では、Ｃａｓ１２ａは、シス切断と呼ばれる、ＰＡＭ配列非依存プログラム切断様式で一本鎖ＤＮＡを切断するが、三元複合体Ｃａｓ１２ａ／ｃｒＲＮＡ／標的ＤＮＡが形成されると、トランス切断活性、すなわち系内の非標的一本鎖ＤＮＡを切断する活性を示すことを示す。
【０１０３】
Ｃａｓ１２ａの特性に基づいて、ＨＯＬＭＥＳ（１時間の低コスト多目的効率的簡易アッセイ（ｏｎｅ  ＨＯｕｒ  Ｌｏｗ−ｃｏｓｔ  Ｍｕｌｔｉｐｕｒｐｏｓｅ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｓｉｍｐｌｅ  ａｓｓａｙ））と呼ばれる、特定の核酸分子の検出方法を開発した。技術の名前通り、高速（１時間）、低価格、複数チャンネル、高効率、そして簡易な試験方法を特徴とする。この方法は、迅速な病原体検出、ＳＮＰ検出などの分野で使用可能である。
【０１０４】
コラテラル切断活性に基づく核酸検出
本発明はまた、Ｃａｓ１２酵素（Ｃａｓ１２ａまたはＣａｓ１２ｂを含む）のコラテラル切断活性に基づく核酸検出方法を提供する。
【０１０５】
好ましくは、本発明の検出がＳＮＰについて実施され得、特に、ＰＣＲ増幅がまず実施され、その後検出される。
【０１０６】
図１８を参照すると、プライマー設計スキームが得られる。
【０１０７】
ケース１．ＳＮＰ部位の近くにＰＡＭ部位が存在する場合、ＰＡＭ部位にしたがって設計されたガイド配列に基づいて合成されたｃｒＲＮＡをＨＯＬＭＥＳ検出に使用することができる。ＨＯＬＭＥＳ法が検出のために使用される場合、比較的低いバックグラウンドシグナルが示され、同じガイド配列については、異なるＳＮＰテンプレート間のシグナル差が非常に大きい。
【０１０８】
ケース２．ＳＮＰ部位の近くにＰＡＭ部位が存在しないか、または適切なＰＡＭ部位が存在しない場合、ＰＡＭ部位は、上記の実験スキームにしたがって導入され得る。
【０１０９】
典型的な工程は、ＳＮＰ部位の近くにプライマーを設計すること、及びＰＡＭ部位の３’末端に位置する配列がテンプレートＤＮＡと対合するべきプライマー上にＰＡＭ部位を保持することを含む。プライマーがテンプレートＤＮＡと対合でき、ＰＣＲ増幅に使用できる限り、他の末端のプライマーに特別な要求はない。図１８に示すように、ＰＡＭ部位は、ＰＣＲ増幅後に正常に導入することができる。
【０１１０】
図１０を参照すると、本発明において、ＰＡＭ部位の導入を設計する場合、ＳＮＰ部位は、通常、ｃｒＲＮＡガイド配列の５’末端の最初の１６塩基、好ましくは１〜１４位、より好ましくは１〜１２位、なおより好ましくは１〜１１または１〜１０位、最も好ましくは１〜８または１〜７位に位置する。
【０１１１】
本発明は、以下の主な利点を有する：
（１）高速：試験条件が整うと、試料採取時から試験結果を得るまで約１時間しかかからない。
（２）低コスト：実験に特別な材料または酵素がなく、少量の材料及び試薬を必要とするため、微量分析に用いることができる。
（３）高効率：本発明は極めて高感度であり、１０ａＭの濃度でＤＮＡを検出可能である。
（４）複数の用途：ＤＮＡ試料及びＲＮＡ試料を含む異なる核酸試料を検出可能である。
（５）単純性：特別な工程または複雑な工程がなく、キットを用意してプログラムを設定すれば、試料の添加などの単純な操作しか必要ではない。
【０１１２】
本発明を、以下に具体例を挙げて詳細に説明する。以下の実施例は、本発明の範囲を限定するのではなく、本発明を例示することのみを意図していることを理解されたい。特定の条件で指定されていない以下の実施例における実験方法は、一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載されているような従来の条件、または製造業者によって推奨されるものにしたがって実施される。別段の記載がない限り、パーセント及び部は、重量パーセント及び重量部である。
【０１１３】
具体的に別段の記載がない限り、本発明に伴う実験材料は、市販のルートから得ることができる。
【０１１４】
材料
１．ＲＮａｓｅ阻害剤をＴａＫａＲａから購入し、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼＫＯＤ  ＦＸをＴｏＹｏＢｏから購入する；プライマー（オリゴヌクレオチド）をＳａｎｇｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｃｏ．，Ｌｔｄ．によって合成し、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼをＴｈｅｒｍｏから購入する；ＲＮＡ精製及び濃縮キット（ＲＮＡ  Ｃｌｅａｎ＆ＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒＴＭ＿５）をＺｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈから購入する；Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  ＳｙｓｔｅｍをＰｒｏｍｅｇａから購入する；培地（例えば、トリプトン、酵母エキスなど）を全てＯＸＯＩＤから購入する。
【０１１５】
２．培地の処方：液体ＬＢ（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ）、そして固体ＬＢを調製する場合は、該液体ＬＢに２％寒天を添加するだけでよい。
【実施例】
【０１１６】
実施例１  一本鎖ＤＮＡ標的を検出することができるＣａｓ１２ａタンパク質検出（プローブはＦＡＭで標識されている）
一本鎖ＤＮＡ（標的−Ｔ１−Ｒ）を標的配列として選択し、異なるＣａｓ１２ａタンパク質によるその検出の応答値を試験した。
【０１１７】
１．ｃｒＲＮＡの調製：まず、表５に示すように、Ｔ７−ｃｒＲＮＡ−Ｆを合成オリゴヌクレオチドＴ７−Ｔ１−２４−Ｒにアニーリングすることによって転写テンプレートを調製した。具体的には、対オリゴヌクレオチド（４μＭ）を、１Ｘ  ＰＣＲ緩衝液（Ｔｒａｎｓｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）中、総体積５０μＬでアニーリングし、次いで、アニーリング手順（最初に９５℃で５分間変性後、サーマルサイクラーを使用して１℃／分の速度で９５℃から２０℃に冷却する）に供した。ｃｒＲＮＡをＴ７ハイスループット転写キットを用いて合成し、３７℃で一晩（約１６時間）反応させた。次いで、ＲＮＡ精製及び濃縮キットを用いてＲＮＡを精製し、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００Ｃ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で定量し、１０μＭの濃度に希釈し、−８０℃で冷蔵庫に保管した。
【０１１８】
２．Ｃａｓ１２ａ反応：工程１で精製したｃｒＲＮＡ（０．５μＭ）、Ｃａｓ１２ａ（０．２５μＭ）、標的一本鎖ＤＮＡ（標的−Ｔ１−Ｒ）（０．０１μＭ）、核酸プローブ（Ｎ２５−５’  ＦＡＭ）（０．０１μＭ）、ＮＥＢ緩衝液３．１の緩衝溶液、及び０．５μＬのＲＮａｓｅ阻害剤を２０μＬの反応系に添加した。ブランク対照反応は、一本鎖ＤＮＡ標的配列を除く全ての他の成分を添加した反応であった。３７℃で１５分間反応させ、次いで、９８℃で２分間停止させた。
【０１１９】
３．蛍光検出：反応物を尿素−アクリルアミドゲル電気泳動（Ｕｒｅａ−ＰＡＧＥ）にかけ、次いで蛍光発光イメージャーで検出した。図１１に示すように、異なるＣａｓ１２ａｓは、標的に対して異なる検出効果を有する。例えば、ＨｋＣａｓ１２ａなどでは、標的一本鎖ＤＮＡを添加しなくても、プローブの切断が起こった。ＬｂＣａｓ１２ａなどは、標的一本鎖ＤＮＡが添加された場合にのみプローブの切断が起こったため、Ｃａｓ１２ａタンパク質のより良好な候補である。
【０１２０】
実施例２  一本鎖ＤＮＡ標的を検出することができるＣａｓ１２ａタンパク質検出（プローブはＨＥＸ及びＢＨＱ１の２つの標識で標識されている）
一本鎖ＤＮＡ（標的−Ｔ１−Ｒ）を標的配列として選択し、異なるＣａｓ１２ａタンパク質によるその検出の応答値を試験した。
【０１２１】
１．ｃｒＲＮＡの調製：まず、Ｔ７−ｃｒＲＮＡ−Ｆを合成オリゴヌクレオチドＴ７−Ｔ１−２４−Ｒにアニーリングすることによって転写テンプレートを調製した（表５）。具体的には、対オリゴヌクレオチド（４μＭ）を、１Ｘ  ＰＣＲ緩衝液（Ｔｒａｎｓｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）中、総体積５０μＬでアニーリングし、次いで、アニーリング手順（最初に９５℃で５分間変性後、サーマルサイクラーを使用して１℃／分の速度で９５℃から２０℃に冷却する）に供した。ｃｒＲＮＡをＴ７ハイスループット転写キットを用いて合成し、３７℃で一晩（約１６時間）反応させた。次いで、ＲＮＡ精製及び濃縮キットを用いてＲＮＡを精製し、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００Ｃで定量し、１０μＭの濃度に希釈し、−８０℃で冷蔵庫に保管した。
【０１２２】
２．Ｃａｓ１２ａ反応：工程１で精製したｃｒＲＮＡ（０．５μＭ）、Ｃａｓ１２ａ（０．２５μＭ）、標的一本鎖ＤＮＡ（標的−Ｔ１−Ｒ）（０．０１μＭ）、蛍光プローブ（ＨＥＸ−Ｎ１２−ＢＨＱ１、すなわち５’末端をＨＥＸで標識され、３’末端をＢＨＱ１で標識された１２ｎｔの一本鎖ＤＮＡ）（０．５μＭ）、ＮＥＢ緩衝液３．１の緩衝溶液、及び０．５μＬのＲＮａｓｅ阻害剤を２０μＬの反応系に添加した。対照反応は、一本鎖ＤＮＡ標的配列を除く全ての他の成分を添加した反応であった。３７℃で１５分間反応させ、次いで、９８℃で２分間停止させた。
【０１２３】
３．蛍光検出：不活性化反応溶液２０μＬを９６ウェルプレートに添加し、マイクロプレートリーダー（励起光５３５ｎｍ、発光光５５６ｎｍ）により検出した。図１２に示すように、異なるＣａｓ１２ａｓは、標的に対して異なる検出効果を有する。例えば、ＨｋＣａｓ１２ａなどでは、標的一本鎖ＤＮＡを添加しなくても、プローブの切断が起こった。ＦｎＣａｓ１２ａなどは、標的一本鎖ＤＮＡが添加された場合にのみプローブの切断が起こったため、Ｃａｓ１２ａタンパク質のより良好な候補である。
【０１２４】
実施例３  二本鎖ＤＮＡ標的を検出することができるＣａｓ１２ａタンパク質検出
二本鎖ＤＮＡ（標的−Ｔ１）を標的配列として選択し、異なるＣａｓ１２ａタンパク質によるその検出の応答値を試験した。
【０１２５】
１．ｃｒＲＮＡの調製：まず、Ｔ７−ｃｒＲＮＡ−Ｆを合成オリゴヌクレオチドＴ７−Ｔ１−２４−Ｒにアニーリングすることによって転写テンプレートを調製した（表５）。具体的には、対オリゴヌクレオチド（４μＭ）を、１Ｘ  ＰＣＲ緩衝液（Ｔｒａｎｓｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）中、総体積５０μＬでアニーリングし、次いで、アニーリング手順（最初に９５℃で５分間変性後、サーマルサイクラーを使用して１℃／分の速度で９５℃から２０℃に冷却する）に供した。ｃｒＲＮＡをＴ７ハイスループット転写キットを用いて合成し、３７℃で一晩（約１６時間）反応させた。次いで、ＲＮＡ精製及び濃縮キットを用いてＲＮＡを精製し、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００Ｃで定量し、１０μＭの濃度に希釈し、−８０℃で冷蔵庫に保管した。
【０１２６】
２．Ｃａｓ１２ａ反応：工程１で精製したｃｒＲＮＡ（０．５μＭ）、Ｃａｓ１２ａ（０．２５μＭ）、標的二本鎖ＤＮＡ（標的−Ｔ１、プライマー標的−Ｔ１−Ｆを標的−Ｔ１−Ｒにアニーリングすることによって得られる）（０．０１μＭ）、蛍光プローブ（ＨＥＸ−Ｎ１２−ＢＨＱ１）（０．５μＭ）、ＮＥＢ緩衝液３．１の緩衝溶液、及び０．５μＬのＲＮａｓｅ阻害剤を２０μＬの反応系に添加した。３７℃で１５分間反応させ、次いで、９８℃で２分間停止させた。
【０１２７】
３．蛍光検出：不活性化反応溶液２０μＬを９６ウェルプレートに添加し、マイクロプレートリーダー（励起光５３５ｎｍ、発光光５５６ｎｍ）により検出した。図７に示すように、異なるＣａｓ１２ａｓは、標的に対して異なる検出効果を有する。ＬｂＣａｓ１２ａなどは、標的二本鎖ＤＮＡが添加された場合にのみプローブの切断が起こったため、Ｃａｓ１２ａタンパク質のより良好な候補である。
【０１２８】
実施例４  ＦｎＣａｓ１２ａ及びＬｂＣａｓ１２ａによる様々な濃度の標的の試験
標的−Ｔ１を標的ＤＮＡとして選択し、次いで、勾配で異なる濃度に希釈し、それらに対するＦｎＣａｓ１２ａ及びＬｂＣａｓ１２ａの応答感度を試験した。感度を高めるために、ＰＣＲ増幅工程を加えた。
【０１２９】
１．ｃｒＲＮＡの調製：まず、Ｔ７−ｃｒＲＮＡ−Ｆを合成オリゴヌクレオチドＴ７−Ｔ１−２４−Ｒにアニーリングすることによって転写テンプレートを調製した（表５）。具体的には、対オリゴヌクレオチド（４μＭ）を、１Ｘ  ＰＣＲ緩衝液（Ｔｒａｎｓｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）中、総体積５０μＬでアニーリングし、次いで、アニーリング手順（最初に９５℃で５分間変性後、サーマルサイクラーを使用して１℃／分の速度で９５℃から２０℃に冷却する）に供した。ｃｒＲＮＡをＴ７ハイスループット転写キットを用いて合成し、３７℃で一晩（約１６時間）反応させた。次いで、ＲＮＡ精製及び濃縮キットを用いてＲＮＡを精製し、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００Ｃで定量し、１０μＭの濃度に希釈し、−８０℃で冷蔵庫に保管した。
【０１３０】
２．ＰＣＲ増幅（任意選択）：標的の標的−Ｔ１（ｐＵＣ１８−Ｔ１）を含有するプラスミドをテンプレートとして使用し、勾配で希釈し、次いでＰＣＲ反応に使用した。各反応系の総体積は２０μＬであり、０．２５μＭのＭ１３Ｆ−４７及びＭ１３Ｒ−４８をそれぞれプライマーとして使用し（表４）、高忠実度酵素ＫＯＤ  ＦＸ（ＴｏＹｏＢｏ）をＰＣＲ反応に使用した。ＰＣＲ反応手順は９５℃で２分間であり、次いで、９８℃で１０秒間、６０℃で１５秒間、及び６８℃で１０秒間の３５サイクルを開始した。ＰＣＲの完了後、ＰＣＲ増幅産物をＣａｓ１２ａ反応に直接使用した。
【０１３１】
３．Ｃａｓ１２ａ反応：工程１で精製したｃｒＲＮＡ（０．５μＭ）、ＦｎＣａｓ１２ａまたはＬｂＣａｓ１２ａ（０．２５μＭ）、１μＬのＰＣＲ産物（または異なる濃度に直接希釈した標的ＤＮＡ）、蛍光プローブ（ＨＥＸ−Ｎ１２−ＢＨＱ１）（０．５μＭ）、ＮＥＢ緩衝液３．１の緩衝溶液、及び０．５μＬのＲＮａｓｅ阻害剤を２０μＬの反応系に添加した。３７℃で１５分間反応させ、次いで、９８℃で２分間停止させた。
【０１３２】
４．蛍光検出：不活性化反応溶液２０μＬを９６ウェルプレートに添加し、マイクロプレートリーダー（励起光５３５ｎｍ、発光光５５６ｎｍ）により検出した。図９に示すように、試験標的を直接添加した場合、０．１ｎＭを超える濃度の標的ＤＮＡは全て応答でき、１ｎＭを超える濃度の場合には応答が顕著であった。ＰＣＲ技術を組み合わせた場合（すなわち、ＰＣＲによる目的のフラグメントの増幅後にＣａｓ１２ａ切断反応）、応答感度は１０ａＭまで低下し得る。
【０１３３】
実施例５  ＦｎＣａｓ１２ａ及びＬｂＣａｓ１２ａによる単一点変異標的の試験
標的−Ｔ１を標的として選択し、野生型及び単一点変異後の同じものと異なる長さのいくつかのｃｒＲＮＡの応答値を試験するために、ＰＡＭ領域及び１〜１８位においてそれぞれ単一点変異に供した。
【０１３４】
１．ｃｒＲＮＡの調製：まず、Ｔ７−ｃｒＲＮＡ−Ｆを合成オリゴヌクレオチドＴ７−Ｔ１−２４−Ｒ、Ｔ７−Ｔ１−１５−Ｒ、Ｔ７−Ｔ１−１６−Ｒ、Ｔ７−Ｔ１−１７−Ｒ、及びＴ７−Ｔ１−１８−Ｒにそれぞれアニーリングすることによって転写テンプレートを調製した（表５）。具体的には、対オリゴヌクレオチド（４μＭ）を、１Ｘ  ＰＣＲ緩衝液（Ｔｒａｎｓｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）中、総体積５０μＬでアニーリングし、次いで、アニーリング手順（最初に９５℃で５分間変性後、サーマルサイクラーを使用して１℃／分の速度で９５℃から２０℃に冷却する）に供した。ｃｒＲＮＡをＴ７ハイスループット転写キットを用いて合成し、３７℃で一晩（約１６時間）反応させた。次いで、ＲＮＡ精製及び濃縮キットを用いてＲＮＡを精製し、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００Ｃで定量し、１０μＭの濃度に希釈し、−８０℃で冷蔵庫に保管した。
【０１３５】
２．ＰＣＲ増幅：標的の標的−Ｔ１（ｐＵＣ１８−Ｔ１）を含有するプラスミドをテンプレートとして使用した。各反応系の総体積は２０μＬであり、０．２５μＭのプライマーＭ１３Ｒ−４８、及び標的−Ｔ１−Ｆの各変異プライマーをそれぞれ使用し（表４）、高忠実度酵素ＫＯＤ  ＦＸ（ＴｏＹｏＢｏ）をＰＣＲ反応に使用した。ＰＣＲ反応手順は９５℃で２分間であり、次いで、９８℃で１０秒間、６０℃で１５秒間、及び６８℃で１０秒間の３５サイクルを開始した。ＰＣＲの完了後、該産物をＣａｓ１２ａ反応に直接使用した。
【０１３６】
３．Ｃａｓ１２ａ反応：工程１で精製したｃｒＲＮＡ（０．５μＭ）、ＦｎＣａｓ１２ａまたはＬｂＣａｓ１２ａ（０．２５μＭ）、１μＬのＰＣＲ産物、蛍光プローブ（ＨＥＸ−Ｎ１２−ＢＨＱ１）（０．５μＭ）、ＮＥＢ緩衝液３．１の緩衝溶液、及び０．５μＬのＲＮａｓｅ阻害剤を２０μＬの反応系に添加した。３７℃で１５分間反応させ、次いで９８℃で２分間停止させた。
【０１３７】
４．蛍光検出：不活性化反応溶液２０μＬを９６ウェルプレートに添加し、マイクロプレートリーダー（励起光５３５ｎｍ、発光光５５６ｎｍ）により検出した。図１０に示すように、標的の相補性配列が２４ｎｔのｃｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ−２４ｎｔ）であった場合、８〜１８位の単一点変異は野生型とそれほど違いはなかったが、一方、ＰＡＭ変異及び１〜７位の点変異後、蛍光値は明らかに減少した。ｃｒＲＮＡが切断され、対をなす標的配列の長さが１８ｎｔであった場合、８〜１６ｎｔの変異位置の蛍光値は２４ｎｔのものと比較して明らかに減少しており、長さが１６ｎｔまたは１７ｎｔである場合、変異標的配列の蛍光値の減少はより明白であり、長さが１５ｎｔである場合、標的配列及び変異標的配列の両方の蛍光値は非常に弱かったが、変異標的配列の蛍光強度は他の標的配列の蛍光強度と比較して依然として高くなり得、したがって検出に使用することができた。まとめると、１５ｎｔ、１６ｎｔ及び１７ｎｔのｃｒＲＮＡが、ＳＮＰ検出に最適である。
【０１３８】
実施例６  環境水中のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉなどの微生物の試験
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのｇｙｒＢ遺伝子を検出標的として選択し、水中のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉなどの微生物の濃度を間接的に試験した。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５を陽性対照として、環境中の水（下水及び水道水など）中の微生物の含有量を測定した。
【０１３９】
１．ｃｒＲＮＡの調製：まず、Ｔ７−ｃｒＲＮＡ−Ｆを合成オリゴヌクレオチドＴ７−ｃｒＲＮＡ−ｇｙｒＢにアニーリングすることによって転写テンプレートを調製した（表５）。具体的には、対オリゴヌクレオチド（４μＭ）を、１Ｘ  ＰＣＲ緩衝液（Ｔｒａｎｓｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）中、総体積５０μＬでアニーリングし、次いで、アニーリング手順（最初に９５℃で５分間変性後、サーマルサイクラーを使用して１℃／分の速度で９５℃から２０℃に冷却する）に供した。ｃｒＲＮＡをＴ７ハイスループット転写キットを用いて合成し、３７℃で一晩（約１６時間）反応させた。次いで、ＲＮＡ精製及び濃縮キットを用いてＲＮＡを精製し、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００Ｃで定量し、１０μＭの濃度に希釈し、−８０℃で冷蔵庫に保管した。
【０１４０】
２．ＰＣＲ増幅：陽性対照試料Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５をＯＤ６００が約０．５になるまで培養した場合、それをそれぞれ１０倍勾配（１０−ｆｏｌｄ  ｇｒａｄｉｅｎｔ）で希釈し、次いでテンプレートとして使用し、該試料は、周囲水（環境中の水道水及び泥水を含む）であった。各反応系の総体積は２０μＬであり、０．２５μＭのプライマーｇｙｒＢ−Ｆ及びｇｙｒＢ−Ｒをそれぞれ使用し（表４）、高忠実度酵素ＫＯＤ  ＦＸ（ＴｏＹｏＢｏ）をＰＣＲ反応に使用した。ＰＣＲ反応手順は９５℃で２分間であり、次いで、９８℃で１０秒間、６０℃で１５秒間、及び６８℃で１０秒間の３５サイクルを開始した。ＰＣＲの完了後、ＰＣＲ産物をＣａｓ１２ａ反応に直接使用した。
【０１４１】
３．Ｃａｓ１２ａ反応：工程１で精製したｃｒＲＮＡ（０．５μＭ）、ＬｂＣａｓ１２ａ（０．２５μＭ）、１μＬのＰＣＲ産物、蛍光プローブ（ＨＥＸ−Ｎ１２−ＢＨＱ１）（０．５μＭ）、ＮＥＢ緩衝液３．１の緩衝溶液、及び０．５μＬのＲＮａｓｅ阻害剤を２０μＬの反応系に添加した。３７℃で１５分間反応させ、次いで、９８℃で２分間停止させた。
【０１４２】
４．蛍光検出：不活性化反応溶液２０μＬを９６ウェルプレートに添加し、マイクロプレートリーダー（励起光５３５ｎｍ、発光光５５６ｎｍ）により検出した。図１３に示すように、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５の蛍光応答値は、濃度の減少とともに減少する。その中で、試料２、４、５、及び６において微生物がより明白に検出された。
【０１４３】
実施例７  ヒトＳＮＰの試験
ＳＮＰ試験では、ヒトＳＮＰの５つの部位、すなわちｒｓ５０８２、ｒｓ１４６７５５８、ｒｓ２９５２７６８、ｒｓ４３６３６５７、及びｒｓ６０１３３８を選択し、ＨＯＬＭＥＳ法のフィージビリティを試験した。
【０１４４】
１．ｃｒＲＮＡの調製：まず、Ｔ７−ｃｒＲＮＡ−Ｆを合成オリゴヌクレオチドにアニーリングすることにより、転写テンプレートを調製した（表５）。具体的には、対オリゴヌクレオチド（４μＭ）を、１Ｘ  ＰＣＲ緩衝液（Ｔｒａｎｓｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）中、総体積５０μＬでアニーリングし、次いで、アニーリング手順（最初に９５℃で５分間変性後、サーマルサイクラーを使用して１℃／分の速度で９５℃から２０℃に冷却する）に供した。ｃｒＲＮＡをＴ７ハイスループット転写キットを用いて合成し、３７℃で一晩（約１６時間）反応させた。ＲＮＡ  Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（商標）−５（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用してＲＮＡを精製し、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００Ｃで定量し、１０μＭの濃度に希釈し、−８０℃で冷蔵庫に保管した。
【０１４５】
２．ＰＣＲ増幅：反応系の総体積は２０μＬであり、０．２５μＭのプライマーをそれぞれ使用し（表４）、１ｎｇのヒトゲノム（ＨＥＫ２９３Ｔ）または直接剥離した口腔上皮粘膜をテンプレートとして使用し、高忠実度酵素ＫＯＤ  ＦＸ（ＴｏＹｏＢｏ）をＰＣＲ反応に使用した。ＰＣＲ反応手順は９５℃で２分間であり、次いで、９８℃で１０秒間、６０℃で１５秒間、及び６８℃で１０秒間の３５サイクルを開始した。ＰＣＲの完了後、該産物をＣａｓ１２ａ反応に直接使用した。（プライマー１−ｒｓ５０８２−Ｆ−Ｔ、２−ｒｓ１４６７５５８−Ｆ−Ｔ、及び３−ｒｓ２９５２７６８−Ｒ−ＣをＳＮＰの対応する変異産物に直接導入した）
【０１４６】
３．Ｃａｓ１２ａ反応：対応するｃｒＲＮＡ（１μＭ）、ＬｂＣａｓ１２ａ（０．５μＭ）、１μＬのＰＣＲ産物、及び蛍光プローブ（ＨＥＸ−Ｎ１２−ＢＨＱ１）（０．５μＭ）を２０μＬの反応系に添加した。３７℃で１５分間反応させ、次いで、９８℃で２分間停止させた。
【０１４７】
４．蛍光検出：不活性化反応溶液２０μＬを９６ウェルプレートに添加し、マイクロプレートリーダー（励起光５３５ｎｍ、発光光５５６ｎｍ）により検出した。図１４に示すように、ｃｒＲＮＡが対応する標的配列に対応する場合にのみ、より高い蛍光応答値が存在し、１つの点変異があった場合、その応答値は大幅に低下する。対応するＳＮＰの遺伝子型は、蛍光値によって決定でき、これらの結果を、シーケンシング結果によって確認した。
【０１４８】
実施例８  がん関連遺伝子の試験
ＴＰ５３遺伝子を試験遺伝子として選択した。ＴＰ５３遺伝子は、ヒトＴ２４細胞にナンセンス変異を有し、これは遺伝子の不活性化をもたらす。この部位に正常な遺伝子を持つ細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）、個々の遺伝子、及び変異細胞Ｔ２４をそれぞれ試験した。
【０１４９】
１．ｃｒＲＮＡの調製：まず、Ｔ７−ｃｒＲＮＡ−Ｆを合成オリゴヌクレオチドＴ７−ｃｒＲＮＡ−３４−ＴＰ５３−Ｔ２４−Ｃ−１６ｎｔ及びＴ７−ｃｒＲＮＡ−３４−ＴＰ５３−Ｔ２４−Ｇ−１６ｎｔにアニーリングすることにより、転写テンプレートを調製した（表５）。具体的には、対オリゴヌクレオチド（４μＭ）を、１Ｘ  ＰＣＲ緩衝液（Ｔｒａｎｓｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）中、総体積５０μＬでアニーリングし、次いで、アニーリング手順（最初に９５℃で５分間変性後、サーマルサイクラーを使用して１℃／分の速度で９５℃から２０℃に冷却する）に供した。ｃｒＲＮＡをＴ７ハイスループット転写キットを用いて合成し、３７℃で一晩（約１６時間）反応させた。ＲＮＡ  Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（商標）−５（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用してＲＮＡを精製し、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００Ｃで定量し、１０μＭの濃度に希釈し、−８０℃で冷蔵庫に保管した。
【０１５０】
２．ＰＣＲ増幅：反応系の総体積は２０μＬであり、０．２５μＭのプライマー３４−ＴＰ５３−Ｔ２４−Ｆ及び３４−ＴＰ５３−Ｔ２４−Ｒをそれぞれ使用し（表４）、１ｎｇのヒトゲノム（ＨＥＫ２９３Ｔ、Ｔ２４）または直接剥離した口腔上皮粘膜をテンプレートとして使用し、高忠実度酵素ＫＯＤ  ＦＸ（ＴｏＹｏＢｏ）をＰＣＲ反応に使用した。ＰＣＲ反応手順は９５℃で２分間であり、次いで、９８℃で１０秒間、６０℃で１５秒間、及び６８℃で１０秒間の３５サイクルを開始した。ＰＣＲの完了後、該産物をＣａｓ１２ａ反応に直接使用した。
【０１５１】
３．Ｃａｓ１２ａ反応：対応するｃｒＲＮＡ（１μＭ）、ＬｂＣａｓ１２ａ（０．５μＭ）、１μＬのＰＣＲ産物、及び蛍光プローブ（ＨＥＸ−Ｎ１２−ＢＨＱ１）（０．５μＭ）を２０μＬの反応系に添加した。３７℃で１５分間反応させ、次いで、９８℃で２分間停止させた。
【０１５２】
４．蛍光検出：不活性化反応溶液２０μＬを９６ウェルプレートに添加し、マイクロプレートリーダー（励起光５３５ｎＭ、発光光５５６ｎＭ）により検出した。図１５に示すように、この部位で正常であったＴＰ５３遺伝子がテンプレートであった場合、ｃｒＲＮＡ−Ｃの検出値はｃｒＲＮＡ−Ｇの値よりも著しく高かったが、変異細胞Ｔ２４のｃｒＲＮＡ−Ｇは著しく増加した。
【０１５３】
実施例９  ヒトＳＮＰ（痛風関連遺伝子）の試験
ＳＮＰ試験では、ヒトＳＮＰの５つの部位、すなわちｒｓ１０１４２９０、ｒｓ６４４９２１３、ｒｓ７３７２６７、ｒｓ１２６０３２６、及びｒｓ６４２８０３を選択し、ＨＯＬＭＥＳ法を試験した。
【０１５４】
１．ｃｒＲＮＡの調製：まず、Ｔ７−ｃｒＲＮＡ−Ｆを合成オリゴヌクレオチドにアニーリングすることにより、転写テンプレートを調製した（表５）。具体的には、対オリゴヌクレオチド（４μＭ）を、１Ｘ  ＰＣＲ緩衝液（Ｔｒａｎｓｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）中、総体積５０μＬでアニーリングし、次いで、アニーリング手順（最初に９５℃で５分間変性後、サーマルサイクラーを使用して１℃／分の速度で９５℃から２０℃に冷却する）に供した。ｃｒＲＮＡをＴ７ハイスループット転写キットを用いて合成し、３７℃で一晩（約１６時間）反応させた。ＲＮＡ  Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（商標）−５（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用してＲＮＡを精製し、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００Ｃで定量し、１０μＭの濃度に希釈し、−８０℃で冷蔵庫に保管した。
【０１５５】
２．ＰＣＲ増幅：反応系の総体積は２０μＬであり、０．２５μＭのプライマーをそれぞれ使用し（表４）、１ｎｇのヒトゲノム（ＨＥＫ２９３Ｔ）または直接剥離した口腔上皮粘膜をテンプレートとして使用し、高忠実度酵素ＫＯＤ  ＦＸ（ＴｏＹｏＢｏ）をＰＣＲ反応に使用した。ＰＣＲ反応手順は９５℃で２分間であり、次いで、９８℃で１０秒間、６０℃で１５秒間、及び６８℃で１０秒間の３５サイクルを開始した。ＰＣＲの完了後、該産物をＣａｓ１２ａ反応に直接使用した。（プライマー１−ｒｓ５０８２−Ｆ−Ｔ、２−ｒｓ１４６７５５８−Ｆ−Ｔ、及び３−ｒｓ２９５２７６８−Ｒ−ＣをＳＮＰの対応する変異産物に直接導入した）
【０１５６】
３．Ｃａｓ１２ａ反応：対応するｃｒＲＮＡ（１μＭ）、ＬｂＣａｓ１２ａ（０．５μＭ）、１μＬのＰＣＲ産物、及び蛍光プローブ（ＨＥＸ−Ｎ１２−ＢＨＱ１）（０．５μＭ）を２０μＬの反応系に添加した。３７℃で１５分間反応させ、次いで、９８℃で２分間停止させた。
【０１５７】
４．蛍光検出：不活性化反応溶液２０μＬを９６ウェルプレートに添加し、マイクロプレートリーダー（励起光５３５ｎｍ、発光光５５６ｎｍ）により検出した。図１６に示すように、ｃｒＲＮＡが対応する標的配列に対応する場合にのみ、より高い蛍光応答値が存在し、１つの点変異があった場合、その応答値は大幅に減少する。対応するＳＮＰの遺伝子型は蛍光値によって決定でき、これらの結果を、シーケンシング結果によって確認した。
【０１５８】
実施例１０  キットによるボランティアの臨床試料（痛風関連遺伝子）のＳＮＰ試験
事前混合した溶液を９６ウェルプレートに加えてキットを調製し、キットに２１名のボランティアのゲノムＤＮＡを添加して、痛風リスクに関連するｒｓ１０１４２９０部位を試験した。
【０１５９】
１．キットの調製：まず、Ｔ７−ｃｒＲＮＡ−Ｆを合成オリゴヌクレオチドにアニーリングすることにより、転写テンプレートを調製した（表５）。具体的には、対オリゴヌクレオチド（４μＭ）を、１Ｘ  ＰＣＲ緩衝液（Ｔｒａｎｓｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）中、総体積５０μＬでアニーリングし、次いで、アニーリング手順（最初に９５℃で５分間変性後、サーマルサイクラーを使用して１℃／分の速度で９５℃から２０℃に冷却する）に供した。ｃｒＲＮＡをＴ７ハイスループット転写キットを用いて合成し、３７℃で一晩（約１６時間）反応させた。ＲＮＡ  Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（商標）−５（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用してＲＮＡを精製し、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００Ｃで定量し、１０μＭの濃度に希釈した。
【０１６０】
２．ＰＣＲのための９６ウェルプレートでの事前混合：ＰＣＲ反応に必要な試薬を１９μＬシステムに添加した、プライマーは４１−ｒｓ１０１４２９０−Ｆ及び４１−ｒｓ１０１４２９０−Ｒとした。
【０１６１】
３．蛍光検出のための９６ウェルプレートでの事前混合：ｃｒＲＮＡ（１μＭ）、ＬｂＣａｓ１２ａ（０．５μｍ）、及び蛍光プローブ（ＨＥＸ−Ｎ１２−ＢＨＱ１）（０．５μＭ）を１９μＬシステムに添加し、９６ウェルプレートに加えた。
【０１６２】
４．ＰＣＲ増幅：ＰＣＲのための事前混合した９６ウェルプレートにボランティアのゲノムＤＮＡを添加し、次いでＰＣＲ反応に供した。ＰＣＲ反応手順は９５℃で２分間であり、次いで、９８℃で１０秒間、６０℃で１５秒間、及び６８℃で１０秒間の３５サイクルを開始した。
【０１６３】
５．Ｃａｓ１２ａ反応：１μＬのＰＣＲ反応溶液を取り、蛍光検出のために事前混合した９６ウェルプレートに添加し、３７℃で１５分間反応させ、その後、９８℃で２分間反応を停止した。
【０１６４】
６．蛍光検出：マイクロプレートリーダー（励起光５３５ｎｍ、発光光５５６ｎｍ）により検出した。図１７に示すように、遺伝子型Ａ：Ａの集団は痛風のリスクが高く、ボランティア番号５、７、及び９以外の人々は遺伝子型Ａ：ＧまたはＧ：Ｇであるため、痛風リスクに対してより注意を払う必要がある。
【０１６５】
実施例１１  Ｃａｓタンパク質と組み合わせたＬＡＭＰによる環境水中のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉなどの微生物の検出
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのｇｙｒＢ遺伝子を検出標的として選択し、水中にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉなどの微生物が存在するかどうかを間接的に試験した。
【０１６６】
１．ｃｒＲＮＡの調製：まず、Ｔ７−ｃｒＲＮＡ−Ｆを合成オリゴヌクレオチドＴ７−ｃｒＲＮＡ−ｇｙｒＢにアニーリングすることによって転写テンプレートを調製した（表５）。具体的には、対オリゴヌクレオチド（４μＭ）を、１Ｘ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ反応緩衝液（Ｔｒａｎｓｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）中、総体積５０μＬでアニーリングし、次いで、アニーリング手順（最初に９５℃で５分間変性後、サーマルサイクラーを使用して１℃／分の速度で９５℃から２０℃に冷却する）に供した。ｃｒＲＮＡをＴ７ハイスループット転写キットを用いて合成し、３７℃で一晩（約１６時間）反応させた。次いで、ＲＮＡ精製及び濃縮キットを用いてＲＮＡを精製し、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００Ｃで定量し、最終的に１０μＭの濃度に希釈し、後で用いるために−８０℃で冷蔵庫に保管した。
【０１６７】
２．ＬＡＭＰ増幅：滅菌水、及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉを含む汚染液を、それぞれ陰性対照及び検出する試料として使用した。各反応系の総体積は２５μＬであり、各１．６μＭのＬＡＭＰ−ＦＩＰ及びＬＡＭＰ−ＢＩＰ、各０．２μＭのＬＡＭＰ−Ｆ３及びＬＡＭＰ−Ｂ３、各０．４μＭのＬＡＭＰ−ＬｏｏｐＦ及びＬＡＭＰ−ＬｏｏｐＢのプライマーを使用し、ＬＡＭＰ反応に使用したキットは、ＷａｒｍＳｔａｒｔ（登録商標）ＬＡＭＰキット（ＮＥＢ）であった。ＬＡＭＰ反応手順は、６５℃で３０分間であった。ＬＡＭＰが完了した後、８０℃で１０分間アニーリングし、該産物をＣａｓ１２ａ反応に直接使用した。
【０１６８】
３．Ｃａｓ１２ａ反応：工程１で精製したｃｒＲＮＡ（０．５μＭ）、Ｃａｓ１２ａ（０．２５μＭ）、１μＬのＬＡＭＰ産物、蛍光プローブ（ＨＥＸ−Ｎ１２−ＢＨＱ１）（０．５μＭ）、ＮＥＢ緩衝液３．１の緩衝溶液、及び０．５μＬのＲＮａｓｅ阻害剤を２０μＬの反応系に添加した。３７℃で１５分間反応させた。
【０１６９】
４．蛍光検出：不活性化反応溶液２０μＬを９６ウェルプレートに添加し、マイクロプレートリーダー（励起光５３５ｎｍ、発光光５５６ｎｍ）により検出した。結果は図１９に示される。
【０１７０】
実施例１２  Ｃａｓタンパク質と組み合わせたＬＡＭＰ増幅を使用することによるＳＮＰの検出
【０１７１】
１．ｃｒＲＮＡの調製：まず、Ｔ７−ｃｒＲＮＡ−Ｆを合成オリゴヌクレオチドＴ７−ｃｒＲＮＡ−ｒｓ５０８２−Ｔ／Ｔ７−ｃｒＲＮＡ−ｒｓ５０８２−Ｇ／Ｔ７−ｃｒＲＮＡ−ｒｓ１４６７５５８−Ｔ／Ｔ７−ｃｒＲＮＡ−ｒｓ１４  ６７５５８−Ｃにアニーリングすることにより、転写テンプレートを調製した（表５）。具体的には、対オリゴヌクレオチド（４μＭ）を、１Ｘ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ反応緩衝液（Ｔｒａｎｓｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）中、総体積５０μＬでアニーリングし、次いで、アニーリング手順（最初に９５℃で５分間変性後、サーマルサイクラーを使用して１℃／分の速度で９５℃から２０℃に冷却する）に供した。ｃｒＲＮＡをＴ７ハイスループット転写キットを用いて合成し、３７℃で一晩（約１６時間）反応させた。次いで、ＲＮＡ精製及び濃縮キットを用いてＲＮＡを精製し、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００Ｃで定量し、最終的に１０μＭの濃度に希釈し、後で用いるために−８０℃で冷蔵庫に保管した。
【０１７２】
２．ＬＡＭＰ増幅：ヒトゲノムＨＥＫ２９３Ｔを試料として使用した。各反応系の総体積は２５μＬであり、各１．６μＭのＬＡＭＰ−ＦＩＰ及びＬＡＭＰ−ＢＩＰ、各０．２μＭのＬＡＭＰ−Ｆ３及びＬＡＭＰ−Ｂ３、各０．４μＭのＬＡＭＰ−ＬｏｏｐＦ及びＬＡＭＰ−ＬｏｏｐＢのプライマーを使用し、ＬＡＭＰ反応にはＷａｒｍＳｔａｒｔ（登録商標）ＬＡＭＰキット（ＮＥＢ）を使用した。ＬＡＭＰ反応手順は、６５℃で３０分間であった。ＬＡＭＰが完了した後、アニーリングを８０℃で１０分間行い、該産物をＣａｓ１２ａ反応に直接使用した。
【０１７３】
３．Ｃａｓ１２ａ反応：工程１で精製したｃｒＲＮＡ（０．５μＭ）、Ｃａｓ１２ａ（０．２５μＭ）、１μＬのＬＡＭＰ産物、蛍光プローブ（ＨＥＸ−Ｎ１２−ＢＨＱ１）（０．５μＭ）、ＮＥＢ緩衝液３．１の緩衝溶液、及び０．５μＬのＲＮａｓｅ阻害剤を２０μＬの反応系に添加した。３７℃で１５分間反応させた。
【０１７４】
４．蛍光検出：不活性化反応溶液２０μＬを９６ウェルプレートに添加し、マイクロプレートリーダー（励起光５３５ｎｍ、発光光５５６ｎｍ）により検出した。結果は図２０に示される。
【０１７５】
実施例１３  Ｃａｓタンパク質と組み合わせたＲＰＡ増幅による環境水中のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉなどの微生物の検出
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのｇｙｒＢ遺伝子を検出標的として選択し、水中にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉなどの微生物が存在するかどうかを間接的に試験した。
【０１７６】
１．ｃｒＲＮＡの調製：まず、Ｔ７−ｃｒＲＮＡ−Ｆを合成オリゴヌクレオチドＴ７−ｃｒＲＮＡ−ｇｙｒＢにアニーリングすることによって転写テンプレートを調製した（表５）。具体的には、対オリゴヌクレオチド（４μＭ）を、１Ｘ  ＰＣＲ緩衝液（Ｔｒａｎｓｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）中、総体積５０μＬでアニーリングし、次いで、アニーリング手順（最初に９５℃で５分間変性後、サーマルサイクラーを使用して１℃／分の速度で９５℃から２０℃に冷却する）に供した。ｃｒＲＮＡをＴ７ハイスループット転写キットを用いて合成し、３７℃で一晩（約１６時間）反応させた。次いで、ＲＮＡ精製及び濃縮キットを用いてＲＮＡを精製し、ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００Ｃで定量し、最終的に１０μＭの濃度に希釈し、後で用いるために−８０℃で冷蔵庫に保管した。
【０１７７】
２．ＲＰＡ増幅：滅菌水、及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉを含む汚染液を、それぞれ陰性対照及び検出する試料として使用した。各反応系の総体積は２５μＬであり、０．５μＭのプライマーＲＰＡ−ｇｙｒＢ−Ｆ（またはＲＰＡ−ｇｙｒＢ−Ｆ２）及びＲＰＡ−ｇｙｒＢ−Ｒ２をそれぞれ使用し、ＴｗｉｓｔＡｍｐ（登録商標）ベーシックキット（ＴｗｉｓｔＤＸ）をＲＰＡ反応に使用した。ＲＰＡ反応手順は、３７℃で３０分間であった。ＲＰＡが完了した後、アニーリングを８０℃で１０分間行い、該産物をＣａｓ１２ａ反応に直接使用した。
【０１７８】
３．Ｃａｓ１２ａ反応：工程１で精製したｃｒＲＮＡ（０．５μＭ）、Ｃａｓ１２ａ（０．２５μＭ）、１μＬのＲＰＡ産物、蛍光プローブ（ＨＥＸ−Ｎ１２−ＢＨＱ１）（０．５μＭ）、ＮＥＢ緩衝液３．１の緩衝溶液、及び０．５μＬのＲＮａｓｅ阻害剤を２０μＬの反応系に添加した。３７℃で１５分間反応させた。
【０１７９】
４．蛍光検出：不活性化反応溶液２０μＬを９６ウェルプレートに添加し、マイクロプレートリーダー（励起光５３５ｎｍ、発光光５５６ｎｍ）により検出した。結果は図２１に示される。
【０１８０】
実施例１４：コラテラル切断活性を有するＣａｓ１２ｂ
【０１８１】
１．ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の調製
まず、プラスミドｐＵＣ１８−ガイドＲＮＡ−Ｔ１を、プラスミドの骨格としてｐＵＣ１８を使用して構築した。プラスミドでは、Ｔ７プロモーター、及びガイドＲＮＡの転写のためのテンプレートＤＮＡ配列をｐＵＣ１８に挿入した（注：このテンプレートから転写されたガイドＲＮＡは、本研究ではＴ１と呼ばれる配列を標的にした）。この方法では、まずテンプレートとしてｐＵＣ１８プラスミドを、プライマーとしてＰＵＣ１８−１−Ｆ及びｐＵＣ１８−１−Ｒを使用し、ＰＣＲ産物をＴ４  ＤＮＡリガーゼに結合し、該産物をＤＨ１０ｂに形質転換し、配列決定することにより一連のＰＣＲを実施し、ｐＵＣ１８−ガイドＲＮＡ−Ｔ１−ｐｒｅと呼ばれる正しいクローンを得た。次いで、ｐＵＣ１８−ガイドＲＮＡ−Ｔ１−ｐｒｅをテンプレートとして、そしてｐＵＣ１８−２−Ｆ及びｐＵＣ１８−２−Ｒをプライマーとして使用し、同じようにＰＣＲ産物を結合及び形質転換することにより、２回目のＰＣＲを実施し、最終的に、シーケンシングされたとおりの正しいプラスミドｐＵＣ１８−ガイドＲＮＡ−Ｔ１を得た。
【０１８２】
次に、プラスミドｐＵＣ１８−ガイドＲＮＡ−Ｔ１をテンプレートとして使用することにより、ガイドＲＮＡをＴ７ハイスループット転写キット（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して合成し、３７℃で一晩（１２〜１６時間）反応させた。
【０１８３】
最後に、転写系にＤＮａｓｅ  Ｉを添加し（転写系５０μＬあたり２μＬのＤＮａｓｅ  Ｉを添加）、３７℃で３０分間水浴させてプラスミドＤＮＡを除去し、ＲＮＡ精製及び濃縮キットを使用してＲＮＡを精製し、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００Ｃで定量し、１０μＭの濃度に希釈し、後で用いるために−８０℃で冷蔵庫に保管した。
【０１８４】
２．標的ＤＮＡの調製
【０１８５】
（１）標的ＤＮＡが一本鎖の場合、６６ｂｐ長のオリゴヌクレオチドを、ガイドＲＮＡによって認識される２０ｂｐの標的配列（Ｔ１）を含む標的ＤＮＡ（標的−Ｔ１−Ｒ）として直接合成した。
【０１８６】
（２）標的ＤＮＡが二本鎖の場合、ガイドＲＮＡによって認識される２０ｂｐの標的配列（Ｔ１）を含む、２つの６６ｂｐ長の相補的オリゴヌクレオチド（標的−Ｔ１−Ｆ；標的−Ｔ１−Ｒ）を直接合成した。２つのオリゴヌクレオチドをアニーリングして、短い標的ＤＮＡを得た。具体的には、対オリゴヌクレオチド（１μＭ）を、１Ｘ  ＰＣＲ緩衝液（Ｔｒａｎｓｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）中、総体積２０μＬでアニーリングし、次いで、アニーリング手順（最初に９５℃で５分間変性後、サーマルサイクラーを使用して１℃／分の速度で９５℃から２０℃に冷却する）に供した。
【０１８７】
３．Ｃａｓ１２ｂ反応
【０１８８】
（１）ガイドＲＮＡのアニーリング：ガイドＲＮＡを適切な濃度（１０μＭ）に希釈し、ＰＣＲ装置でアニーリングした。アニーリング手順：７５℃で５分間変性後、１℃／分の低下速度で７５℃から２０℃に冷却した。
【０１８９】
（２）ガイドＲＮＡとＣ２ｃ１のインキュベーション：アニーリングしたガイドＲＮＡを等モル濃度でＣ２ｃ１と混合し、３０℃で２０〜３０分間放置した。
【０１９０】
（３）Ｃａｓ１２ｂ反応：工程（２）でインキュベートしたガイドＲＮＡ及びＣ２ｃ１の混合物（それらの最終濃度は両方とも２５０μＭまたは５００μＭであった）、標的ＤＮＡ（最終濃度５０ｎＭ）、ＦＡＭ標識オリゴヌクレオチド（標的−ＤＮＭＴ１−３−Ｒ−ＦＡＭ−５’）または蛍光消光プローブ（ＨＥＸ−Ｎ１２−ＢＨＱ１、最終濃度５００ｎＭ）、２μＬの１０Ｘ  ＮＥＢ緩衝液３．１、及び０．５μＬのＲＮａｓｅ阻害剤（４０Ｕ／μＬ）を２０μＬの反応系に添加した。均一に混合後、４８℃で３０分間反応させた。その後、ＰＣＲ装置中で９８℃で５分間加熱することにより不活性化した。
【０１９１】
４．尿素変性ゲル電気泳動によるＣａｓ１２ｂのトランス切断活性の検出：不活性化された反応溶液２０μＬを尿素変性ゲル電気泳動法により分離し、その後、蛍光イメージングシステムＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＬＡＳ  ４０００  ｍｉｎｉ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によりイメージングした。結果は図２２に示される。
【０１９２】
５．蛍光マイクロプレートリーダー法によるＣａｓ１２ｂのトランス切断活性の検出：不活性化反応溶液２０μＬを９６ウェルプレートに添加し、マイクロプレートリーダー（励起光５３５ｎｍ、発光光５５６ｎｍ）により検出した。結果は図２３に示される。
【０１９３】
実施例１５：Ｃａｓ１２ｂ反応の感度試験（トランス切断）
蛍光プローブ（ＨＥＸ−Ｎ１２−ＢＨＱ１）の励起蛍光強度を検出することにより、Ｃａｓ１２ｂがトランス切断活性を発揮するために必要な標的ＤＮＡ濃度、すなわちＣａｓ１２ｂトランス切断反応の感度、を決定した。
【０１９４】
１．ガイドＲＮＡの調製
まず、ｐＵＣ１８−ガイドＲＮＡ−Ｔ１をテンプレートとして使用し、そしてガイドＲＮＡ−ＤＮＭＴ１−３−Ｆ及びガイドＲＮＡ−ＤＮＭＴ１−３−Ｒをプライマーとして使用することにより、Ｔ１の標的ＤＮＡを標的とするガイドＲＮＡの２０塩基を、ＰＣＲにより、ＤＮＭＴ１−３を標的とするガイドＲＮＡで置き換え、別のプラスミドｐＵＣ１８−ガイドＲＮＡ−ＤＮＭＴ１−３を得た。
【０１９５】
次いで、プラスミドｐＵＣ１８−ガイドＲＮＡ−ＤＮＭＴ１−３をテンプレートとして使用することにより、ガイドＲＮＡをＴ７ハイスループット転写キット（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して合成し、３７℃で一晩（１２〜１６時間）反応させた。
【０１９６】
最後に、転写系にＤＮａｓｅ  Ｉを添加し（転写系５０μＬあたり２μＬのＤＮａｓｅ  Ｉを添加）、３７℃で３０分間水浴させてプラスミドＤＮＡを除去し、ＲＮＡ精製及び濃縮キットを使用してＲＮＡを精製し、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００Ｃで定量し、後で用いるために−８０℃で冷蔵庫に保管した。
【０１９７】
２．標的ＤＮＡの調製
標的ＤＮＡに関して、１つ目は、増幅せずに標的ＤＮＡをＣａｓ１２ｂ反応系に直接添加したことである。方法は次のとおりである：
（１）標的ＤＮＡが一本鎖の場合、５０ｂｐ長のオリゴヌクレオチドを、ガイドＲＮＡによって認識される２０ｂｐの標的配列（ＤＮＭＴ１−３）を含む標的ＤＮＡ（ＤＮＭＴ１−３（ＴＴＣ  ＰＡＭ）−Ｒ）として直接合成した。
（２）標的ＤＮＡが二本鎖の場合、ガイドＲＮＡによって認識される２０ｂｐの標的配列（ＤＮＭＴ１−３）を含む、２つの５０ｂｐ長の相補的オリゴヌクレオチド（ＤＮＭＴ１−３（ＴＴＣ  ＰＡＭ）−Ｆ；ＤＮＭＴ１−３（ＴＴＣ  ＰＡＭ）−Ｒ）を直接合成した。２つのオリゴヌクレオチドをアニーリングして、短い標的ＤＮＡを得た。具体的には、対になったオリゴヌクレオチド（２μＭ）を、１Ｘ  ＰＣＲ緩衝液（Ｔｒａｎｓｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）中、総体積２０μＬでアニーリングし、次いで、アニーリング手順（９５℃で５分間変性後、サーマルサイクラーを使用して１℃／分の速度で９５℃から２０℃に冷却する）に供した。
（３）一本鎖または二本鎖の標的ＤＮＡを、後で用いるために２μＭ、０．２μＭ、０．０２μＭ、０．００２μＭ、及び０．０００２μＭの勾配で希釈した。
【０１９８】
２つ目は、標的配列（ＤＮＭＴ１−３）を含むフラグメントを、ＬＡＭＰ反応による増幅のためにプラスミドベクターに挿入することであった。
【０１９９】
（１）標的配列（ＤＮＭＴ１−３）を含むフラグメントを、ＴｒａｎｓｇｅｎのｐＥａｓｙ−Ｂｌｕｎｔ  Ｚｅｒｏクローニングキットを使用してｐＥａｓｙ−Ｂｌｕｎｔ  Ｚｅｒｏクローニングベクターに挿入し、シーケンシングにより検証した後、正しいクローンを得た。
【０２００】
（２）ＬＡＭＰ拡張反応
上記のプラスミドをテンプレートとして使用して、ＬＡＭＰ増幅反応を実施した。テンプレートは、それぞれ０ｎＭ、１ｎＭ、及び０．１ｎＭで添加し、１０倍勾配で１０−１１ｎＭまで希釈した。各反応系の総体積は２５μＬであり、各１．６μＭのＬＡＭＰ−ＤＮＭ−ＦＩＰ及びＬＡＭＰ−ＤＮＭ−ＢＩＰ、各０．２μＭのＬＡＭＰ−ＤＮＭ−Ｆ３及びＬＡＭＰ−ＤＮＭ−Ｂ３、各０．４μＭのＬＡＭＰ−ＤＮＭ−ＬｏｏｐＦ及びＬＡＭＰ−ＤＮＭ−ＬｏｏｐＢのプライマーを使用し、ＬＡＭＰ反応に使用したキットは、ＷａｒｍＳｔａｒｔ（登録商標）ＬＡＭＰキット（ＮＥＢ）であった。ＬＡＭＰ反応手順は、６５℃で３０分間であった。ＬＡＭＰが完了した後、８０℃で１０分間不活性化させた。該産物をＣａｓ１２ｂ反応に直接使用した。
【０２０１】
３．Ｃａｓ１２ｂ反応
【０２０２】
（１）ガイドＲＮＡのアニーリング：ガイドＲＮＡを適切な濃度（５μＭ）に希釈し、ＰＣＲ装置でアニーリングした。アニーリング手順：７５℃で５分間変性後、１℃／分の低下速度で７５℃から２０℃に冷却した。
【０２０３】
（２）ガイドＲＮＡとＣａｓ１２ｂのインキュベーション：アニーリングしたガイドＲＮＡを等モル濃度でＣａｓ１２ｂと混合し、３０℃で２０〜３０分間放置した。
【０２０４】
（３）Ｃａｓ１２ｂ反応：工程（２）でインキュベートしたガイドＲＮＡ及びＣａｓ１２ｂの混合物（ガイドＲＮＡ及びＣａｓ１２ｂの最終濃度は両方とも２５０μＭであった）、１μＬの標的ＤＮＡもしく１μＬのＬＡＭＰ産物、蛍光プローブ（ＨＥＸ−Ｎ１２−ＢＨＱ１）（最終濃度５００ｎＭ）、２μＬの１０Ｘ  ＮＥＢ緩衝液３．１、及び０．５μＬのＲＮａｓｅ阻害剤（４０Ｕ／μＬ）を２０μＬの反応系に添加した。均一に混合後、４８℃で３０分間反応させた。その後、ＰＣＲ装置中で９８℃で５分間加熱することにより不活性化した。
【０２０５】
４．蛍光マイクロプレートリーダー法によるＣａｓ１２ｂのトランス切断活性の検出：
【０２０６】
不活性化反応溶液２０μＬを９６ウェルプレートに添加し、マイクロプレートリーダー（励起光５３５ｎｍ、発光光５５６ｎｍ）により検出した。ＬＡＭＰ増幅と組み合わせて、Ｃａｓ１２ｂは、１０ａＭという低い標的ＤＮＡ濃度に対して、顕著なコラテラル一本鎖ＤＮＡトランス切断活性をもたらす可能性がある。結果は図２４に示される。
【０２０７】
標的一本鎖ＤＮＡの切断におけるＣａｓ１２ａのシス切断特性：
【０２０８】
第１に、Ｃａｓ１２ａの一本鎖ＤＮＡ切断特性を試験するために、短い一本鎖ＤＮＡ（ＤＮＭＴ１−３）（表１）を標的とするいくつかのｃｒＲＮＡが設計されており、３’末端に５（６）−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）が標識されている。ＦｎＣａｓ１２ａによる切断後、反応産物を変性尿素−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（尿素−ＰＡＧＥ）により分析する。Ｃａｓ１２ａによる一本鎖ＤＮＡ切断がプログラムされていることが見出された。すなわち、切断部位が、図１Ａ及び図１Ｃに示すように、ｃｒＲＮＡガイド配列と対になる最初の標的配列の３’末端塩基から５’末端へと数えた標的配列の２２番目の塩基の近く（２１番目〜２３番目の塩基）にある。Ｃａｓ１２ａによる二本鎖ＤＮＡの切断にはＰＡＭ配列が必要であるが、Ｃａｓ１２ａによる一本鎖ＤＮＡの切断にはＰＡＭ配列は必要なく（図１Ａ、図１Ｂ及び図２）、これはＣａｓ９によって媒介される一本鎖ＤＮＡ切断と同様である。しかしながら、Ｃａｓ１２ａによって媒介される一本鎖ＤＮＡ切断活性は、図１Ａに示すようにｃｒＲＮＡのステムループ構造に依存するが、Ｃａｓ９はたった２０ｎｔの相補的ＲＮＡ配列を有する一本鎖ＤＮＡに対して依然として弱い切断活性を示す。ｃｒＲＮＡのステムループ構造はＣａｓ１２ａの構造を安定化するために重要であり、これが、ｃｒＲＮＡの環構造がＣａｓ１２ａによる一本鎖ＤＮＡの切断に必要な理由である。短いリード配列ｃｒＲＮＡが、Ｃａｓ１２ａの一本鎖ＤＮＡ切断部位を、該切断が認識部位の外側になるような方法で通過できるかどうかをさらに試験する。ガイド配列の長さが１６ｎｔ、１８ｎｔ、及び２０ｎｔの場合、これらのｃｒＲＮＡは全て、図１Ｂ及び図１Ｄに示すように、２２番目の塩基付近でＣｐｆ１による切断を引き起こし、これは、切断部位が認識部位の４ｎｔ、２ｎｔ、または０ｎｔ外側であることを意味する。次に、異なる基質上のＣａｓ１２ａの切断効率を、図１Ｆに示すように、それぞれ二本鎖ＤＮＡ及び一本鎖ＤＮＡの基質を使用して試験する。Ｃａｓ９切断の状況と同様に、図１Ｅから図１Ｇに示すように、一本鎖ＤＮＡの切断は二本鎖ＤＮＡの切断よりも遅い。これらの結果は、Ｃａｓ１２ａによる一本鎖ＤＮＡの認識及び切断のメカニズムが二本鎖ＤＮＡのメカニズムとは異なる可能性があり、これはＰＡＭに依存しない低効率の認識及び切断方法であり、ＰＡＭ配列がＣａｓ１２ａによる標的二本鎖ＤＮＡの認識及び／または切断を加速する、ということを示している。
【０２０９】
一本鎖ＤＮＡの切断におけるＣａｓ１２ａのトランス切断特性：
【０２１０】
標的一本鎖ＤＮＡが３’末端で標識されている場合、Ｃａｓ１２ａは、図１に示すように、２２番目の塩基付近で切断する。しかしながら、５’末端で標識されている場合、予測サイズの切断産物のバンドは観察されないが、図３Ｂに示すように、短い（６ｎｔ未満）ＦＡＭ標識産物が生成される。詳細な実験を通じて、三元複合体Ｃａｓ１２ａ／ｃｒＲＮＡ／標的一本鎖ＤＮＡが形成されると、５’末端で標識された標的一本鎖ＤＮＡ（ＤＮＭＴ１−３）（表１）が切断され、図３Ｃに示されるように、短いＦＡＭ標識産物が生成される。加えて、三元複合体は、図３Ｃ及び図３Ｄに示すように、他の反応系においてｃｒＲＮＡと相補的な配列を持たない一本鎖ＤＮＡ（すなわち、コラテラル一本鎖ＤＮＡ）も切断する。この切断現象はトランス切断と呼ばれ、プログラム可能なシス切断とは異なる。標的一本鎖ＤＮＡが３’末端で標識されている場合、トランス切断も観察されるが、図３Ｂに示すように、多くのシス切断産物が残る。これは、Ｃａｓ１２ａ／ｃｒＲＮＡ／標的一本鎖ＤＮＡによって形成された複合体が原因である可能性があり、標的一本鎖ＤＮＡは、その標識された３’末端が三元複合体のヌクレアーゼ活性部位への曝露から保護されるように保護されている。これらの切断プロセスは、図３Ａに示すとおりであり得る。
【０２１１】
上記で試験したＦｎＣａｓ１２ａに加えて、他の種のソースの９個のＣａｓ１２ａｓも試験する（表２及び図４Ａ）。Ｌｂ４Ｃａｓ１２ａを除き、全てのＣａｓ１２ａｓは、プラスミドＤＮＡに対して良好なエンドヌクレアーゼ活性を有し（図４Ｂに示すように）、全てのＣａｓ１２ａ三元複合体は一本鎖に対してシス及びトランス切断活性を示す（図４Ｃ及び図４Ｄに示すように）。これは、一本鎖ＤＮＡ上のＣａｓ１２ａのシス及びトランス活性が一般的な現象であることを示す。
【０２１２】
Ｃａｓ１２ａによって一本鎖ＤＮＡを切断するためのシス及びトランスの重要部位及びメカニズム。
Ｃａｓ１２ａの一本鎖ＤＮＡに対するシス及びトランス活性に関連する重要なアミノ酸残基を決定するために、Ｃａｓ１２ａのいくつかの候補残基を変異させて活性試験を実施した。第１に、ＦｎＣａｓ１２ａの３つの単一アミノ酸変異体（Ｈ８４３Ａ、Ｋ８５２Ａ、及びＫ８６９Ａ）を精製して試験し、それらの残基はＲＮａｓｅ活性に関連する。一本鎖ＤＮＡに対するトランス活性の研究結果は、図５Ａ及び図５Ｃに示すように、野生型ＦｎＣａｓ１２ａと３つの変異体間において、一本鎖ＤＮＡに対するシス及びトランス切断活性に明らかな違いが見られないことを示す。
【０２１３】
次に、ＦｎＣａｓ１２ａのエンドヌクレアーゼ活性部位、すなわち、ＲｕｖＣドメイン（Ｄ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ、またはＤ１２５５Ａ）及びＮｕｃドメイン（Ｒ１２１８Ａ）部位が変異した場合、図５Ｂ及び図５Ｄに示すように、一本鎖ＤＮＡに対するこれらの変異Ｃａｓ１２ａのシス及びトランス切断活性は両方とも影響を受ける。これらの結果は、標的二本鎖ＤＮＡの切断のためのＣａｓ１２ａの重要部位が、一本鎖ＤＮＡに対するシス及びトランス切断活性に密接に関連していることを示す。
【０２１４】
Ｃａｓ１２ｂ（すなわち、Ｃ２ｃ１）（伸長標的ＤＮＡまたは伸長非標的ＤＮＡとの複合体を含む）の最近の構造研究は、図６Ａ及び図６Ｂに示すように、両方の鎖がＲｕｖＣポケットにあることを示す。Ｃａｓ１２ｂ（すなわち、Ｃ２ｃ１）とＣａｓ１２ａのエンドヌクレアーゼ触媒残基を比較することにより、これらの部位は、Ｃａｓ１２ｂ（すなわち、Ｃ２ｃ１）及びＣａｓ１２ａの切断及び機能において同様の役割を果たす可能性が最も高い。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの単一アミノ酸変異実験の結果は、上記の仮説と一致していることを示す。つまり、Ｃａｓ１２ａは、１つのＲｕｖＣ触媒ポケットのみで２つの鎖を切断する可能性がある。
【０２１５】
Ｃａｓ１２ａ複合体のトランス切断活性：Ｃａｓ１２ｂ（すなわち、Ｃ２ｃ１）と追加の一本鎖ＤＮＡの複合体の構造では、図６Ｃに示すように、配列非依存性の一本鎖ＤＮＡも触媒ポケットの表面に位置し、これは、Ｃａｓ１２ａのコラテラル一本鎖ＤＮＡ基質のものと類似している。単一アミノ酸変異実験と組み合わせて、図６Ｄ、図６Ｅ、及び図６Ｆに示すように、標的ＤＮＡ、非標的ＤＮＡ、及びコラテラル一本鎖ＤＮＡは全てＣａｓ１２ａの単一のＲｕｖＣポケットで切断されることが提案されている。三元Ｃａｓ１２ａ複合体は、コラテラル一本鎖ＤＮＡトランス切断活性を有するが、モノマー複合体または二元複合体がコラテラル一本鎖ＤＮＡトランス切断活性を持たない理由は、モノマー複合体、二元複合体、及び三元複合体の構造を比較することにより説明することができる。モノマーＣａｓ１２ａの構造は無秩序であり、図６Ｇに示すように、二元複合体Ｃａｓ１２ａ／ｃｒＲＮＡは三角形の構造を持ち、一方、三元複合体Ｃａｓ１２ａ／ｃｒＲＮＡ／標的ＤＮＡは２枚葉構造に変換され、触媒ポケットが露出してコラテラル一本鎖ＤＮＡのトランス切断を実現する（図６Ｈに示すように）。
【０２１６】
核酸検出法の確立
Ｃａｓ１２ａの特性に基づいて、特定の核酸分子検出方法を開発し、これはＨＯＬＭＥＳ（１時間の低コスト多目的効率的簡易アッセイ）と呼ばれる。技術の名前通り、それは、１時間で、低価格、複数用途、そして高効率である簡易な試験方法を特徴とする。
【０２１７】
反応系全体で、この方法は、２つの主要な工程に分けることができる。１つはテンプレート核酸の増幅、もう１つはＣａｓ１２ａタンパク質による特定の核酸検出である。ここで、ＰＣＲ法は核酸増幅に使用されるが、実際には、任意の増幅方法を、等温増幅法ＲＰＡなど、第２工程の核酸検出と組み合わせることができる。最初の核酸は二本鎖ＤＮＡに限定されず、一本鎖ＤＮＡの場合もあり得る；あるいは、ＲＮＡを逆転写後も依然として検出可能であるため、この方法は様々な種類の核酸分子に適している。核酸検出フェーズでは、３つの成分、つまりＣａｓ１２ａ、ｃｒＲＮＡ、及び核酸プローブが実験の鍵である。実施例で言及した１０個のＣａｓ１２ａｓに加えて（これらの１０個のタンパク質はランダムに選択される）、他のＣａｓ１２ａタンパク質もこの方法に適している。加えて、他の種類のＣａｓタンパク質（例えば、Ｃ２ｃ１タンパク質）も本発明の特許請求の範囲に適している：実験結果により示されるように、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ  Ｃａｓ１２ｂ（すなわち、Ｃ２ｃ１）もまた、Ｃａｓ１２ａのものと類似のコラテラル一本鎖ＤＮＡトランス切断活性を有し、ｃｒＲＮＡ／標的ＤＮＡとのその複合体は、コラテラル一本鎖ＤＮＡを切断することも可能である。
【０２１８】
ガイドとして機能するｃｒＲＮＡの場合、例えば手動で改変するなどの操作後の系において、より安定する。核酸プローブの選択に関して、本発明は、ＨＥＸ及びＢＨＱ１で標識された短い一本鎖ＤＮＡを選択し、核酸プローブが切断されて検出可能な差が生じる限り、他の検出可能な標識方法を理論的に適用することができる。あるいは、核酸プローブは、化合物に結合した後に蛍光を発し、プローブが切断されたかどうかを検出するように設計することもできる。
【０２１９】
さらに、本発明の上記教示を読んだ後、当業者は、本発明に対して様々な変更または修正を加えることができ、これらの等価形態も、本出願に添付の特許請求範囲によって定められる本発明の範囲に包含されることが認識されるであろう。
表１  Ｃａｓ１２ａの特徴的な実験関連切断の基質配列
【表１−１】
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【表１−２】
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表２  Ｃａｓ１２ａタンパク質及びＣａｓ１２ｂ（つまり、Ｃ２ｃ１）タンパク質の名前及びＧＩ番号
【表２】
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表３  プラスミド情報
【表３−１】
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【表３−２】
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表４  ホルムズ法の試験で使用したプライマー
【表４−１】
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【表４−２】
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【表４−３】
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【表４−４】
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表５  ｃｒＲＮＡの転写のためのテンプレート配列
【表５−１】
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【表５−２】
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【表５−３】
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【表５−４】
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Ｃａｓ１２ａと組み合わせたＬＡＭＰを介したＤＮＡ増幅による検出に使用されるプライマー：
表６  ｇｙｒＢ−１の増幅に使用されるプライマー
【表６】
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表７  ｇｙｒＢ−２の増幅に使用されるプライマー
【表７】
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表８  ｒｓ１４６７５５８部位の増幅に使用されるプライマー
【表８】
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表９  ｒｓ５０８２部位の増幅に使用されるプライマー
【表９】
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表１０  Ｃａｓ１２と組み合わせたＲＰＡ増幅による検出に使用されるプライマー
【表１０】
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表１１  トランス切断活性を有するＣａｓ１２ｂを決定するために使用されるプライマー：
【表１１】
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表１２  Ｃａｓ１２ｂのトランス反応の感度試験に使用されるプライマー
【表１２】
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表１３  本発明に関与する他の配列
【表１３】
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【０２２０】
本発明で言及される全ての文書は、各文書が個々に参照により組み込まれるように、参照により本明細書に組み込まれる。さらに、本発明の上記教示を読んだ後、当業者は、本発明に対して様々な変更または修正を加えることができ、これらの等価形態も、本出願に添付の特許請求範囲によって定められる本発明の範囲に包含されることが認識されるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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