(57)【要約】  本開示は、ＡｘｌおよびＲｏｒ２に結合する、キメラ抗原受容体、およびＡｘｌおよびＲｏｒ２を認識する条件的活性型キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。さらに、本明細書で提供されるのは、これらのＣＡＲをコードする核酸ならびにＣＡＲの作製方法、および癌、特に、腎細胞癌などのＡｘｌおよび／またはＲｏｒ２を発現する癌を治療する方法を含む、ＣＡＲの使用方法である。本開示は、ＣＡＲを生成するように遺伝子改変された細胞を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡｘｌまたはＲｏｒ２に結合するためのキメラ抗原受容体であって、
ａ）７．４のｐＨに比べて、６．７のｐＨでＡｘｌまたはＲｏｒ２に対し増大した結合を示す、条件的活性型抗原特異的標的化領域（ＡＳＴＲ）；
ｂ）膜貫通ドメイン；および
ｃ）細胞内活性化ドメインを含み、前記膜貫通ドメインが前記ＡＳＴＲと前記細胞内活性化ドメインとの間に位置する、キメラ抗原受容体。
【請求項２】
前記ＡＳＴＲがＡｘｌに結合する、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項３】
前記ＡＳＴＲが、配列番号７９の抗体重鎖および配列番号８０の抗体軽鎖を含む単鎖可変抗体フラグメントと同じＡｘｌのエピトープに結合する、請求項２に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項４】
前記ＡＳＴＲが、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、（Ｆａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、および二価の単鎖抗体またはダイアボディから選択される抗体である、請求項３に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項５】
前記ＡＳＴＲが、重鎖および軽鎖を含む単鎖可変フラグメントである、請求項３に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項６】
前記Ａｘｌに結合するＡＳＴＲが、Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３配列を有する３つの相補性決定領域を含む抗体重鎖可変領域を含み、
ａ）前記Ｈ１配列が、Ｘ１ＧＸ２ＴＭＮ（配列番号８７）であり；
ｂ）前記Ｈ２配列が、ＬＩＫＰＳＮＧＧＴＳＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号８８）であり；および
ｃ）前記Ｈ３配列が、ＧＸ３ＹＸ４ＳＹＸ５ＡＭＤＹ（配列番号８９）であり、
Ｘ１はＴまたはＷであり；Ｘ２はＨまたはＡ；Ｘ３はＨまたはＤであり；Ｘ４はＥまたはＨであり；Ｘ５はＥまたはＦである、請求項２〜５のいずれかに記載のキメラ抗原受容体。
【請求項７】
前記重鎖可変領域が、配列番号７９のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項８】
前記ＡＳＴＲが、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３配列を有する３つの相補性決定領域を含む軽鎖可変領域を含み、
ｄ）前記Ｌ１配列が、ＫＡＳＱＤＶＸ６ＳＡＶＡ（配列番号９０）であり；
ｅ）前記Ｌ２配列が、ＷＸ７Ｘ８ＴＲＸ９Ｔ（配列番号９１）であり；および
ｆ）前記Ｌ３配列が、ＱＥＨＦＳＸ１０ＰＬＸ１１（配列番号９２）であり；
Ｘ６はＳまたはＶであり；Ｘ７はＡまたはＱであり；Ｘ８はＳまたはＤであり；Ｘ９はＨまたはＤであり；Ｘ１０はＴまたはＰであり；およびＸ１１はＴまたはＲである、請求項２〜６のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項９】
前記軽鎖可変領域が、配列番号８０のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１０】
前記重鎖可変領域が、配列番号７９のアミノ酸配列を含む、請求項９に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１１】
前記重鎖および軽鎖が、リンカーにより分離され、前記リンカーが、６〜１００アミノ酸長である、請求項５〜１０のいずれかに記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１２】
前記重鎖可変領域および前記軽鎖可変領域が、リンカー１（配列番号５３）、リンカー２（配列番号５４）、またはリンカー３（配列番号５５）により分離される、請求項１１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１３】
前記重鎖が前記軽鎖に対しＮ末端である、請求項１２に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１４】
前記ＡＳＴＲが、配列番号１２８、配列番号１２９、または配列番号１５９のアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１５】
前記軽鎖が前記重鎖に対しＮ末端である、請求項１２に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１６】
前記ＡＳＴＲが、配列番号１６０または配列番号１６１のアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１７】
前記キメラ抗原受容体が、ストークドメインおよび共刺激ドメインをさらに含む、請求項２〜１６のいずれかに記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１８】
前記キメラ抗原受容体が、アミノ末端からカルボキシ末端までに、前記ＡＳＴＲ、前記ストークドメイン、前記膜貫通ドメイン、前記共刺激ドメイン、および前記細胞内活性化ドメインを含む、請求項１７に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１９】
前記細胞内活性化ドメインが、ＣＤ３Ｚ活性化ドメインであり、前記共刺激ドメインがＩＣΔ共刺激ドメイン、Ｃ２８共刺激ドメインであり、またはＩＣΔ共刺激ドメインおよびＣＤ１３７共刺激ドメインの両方を含む、請求項１８に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項２０】
前記ストークドメインが、ＣＤ８ストークドメインまたはＣＤ２８ストークドメインであり、前記膜貫通ドメインが、ＣＤ８膜貫通ドメインまたはＣＤ２８膜貫通ドメインであり、前記細胞内活性化ドメインがＣＤ３Ｚ活性化ドメインであり、前記共刺激ドメインが、ＣＤ１３７共刺激ドメインまたはＩＣΔ共刺激ドメインである、請求項１８に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項２１】
前記共刺激ドメインがＩＣΔ共刺激ドメインである、請求項２０に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項２２】
前記ＡＳＴＲがＲｏｒ２に結合する、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項２３】
前記ＡＳＴＲが、配列番号８２または配列番号８３の抗体重鎖および配列番号８４の抗体軽鎖を含む抗体と同じＲｏｒ２のエピトープに結合するか、または前記ＡＳＴＲが、配列番号１５１の抗体重鎖および配列番号１５２の抗体軽鎖を含む単鎖可変抗体フラグメントと同じＲｏｒ２のエピトープに結合する、請求項２２に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項２４】
前記ＡＳＴＲが、配列番号８２または配列番号８３の抗体重鎖および配列番号８４の抗体軽鎖を含む単鎖可変抗体フラグメントと同じＲｏｒ２のエピトープに結合するか、または前記ＡＳＴＲが、配列番号１５１の抗体重鎖および配列番号１５２の抗体軽鎖を含む単鎖可変抗体フラグメントと同じＲｏｒ２のエピトープに結合する、請求項２２に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項２５】
前記ＡＳＴＲが、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、（Ｆａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、および二価の単鎖抗体またはダイアボディから選択される抗体である、請求項２３または２４に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項２６】
前記ＡＳＴＲが、重鎖および軽鎖を含む単鎖可変フラグメントである、請求項２３または２４に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項２７】
前記Ｒｏｒ２に結合するＡＳＴＲが、３つの相補性決定領域を含む重鎖可変領域を含み、前記領域が、Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３配列を有し、
ａ）Ｈ１配列が、ＧＹＴＸ１ＴＥＸ２ＴＸ３Ｈ（配列番号９５）またはＸ４ＧＹＳＩＴＴＧＹＹＷＮ（配列番号９６）であり；
ｂ）Ｈ２配列が、ＧＸ５ＮＸ６ＮＮＧＧＴＧＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号９７）またはＹＩＴＹＤＧＳＫＮＹＮＰＳＬＫＮ（配列番号９８）であり；
ｃ）Ｈ３配列が、ＧＳＬＹＳＹＧＮＳＹＦＤＹ（配列番号９９）またはＦＥＧＶＷＸ７ＧＬＤＹ（配列番号１００）であり、
Ｘ１はＦまたはＥであり；Ｘ２はＹまたはＤ；Ｘ３はＭまたはＤであり；Ｘ４はＴまたはＳであり；Ｘ５はＥまたはＩであり；Ｘ６はＴまたはＤであり；およびＸ７はＹまたはＧである、請求項２２〜２６のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項２８】
前記ＡＳＴＲが、配列番号８２または配列番号８３の抗体重鎖および配列番号８４の抗体軽鎖を含む抗体と同じＲｏｒ２のエピトープに結合し、前記重鎖可変領域が、配列番号８２または配列番号８３のアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項２９】
前記ＡＳＴＲが、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３配列を有する３つの相補性決定領域を含む軽鎖可変領域を含み、
ａ）前記Ｌ１配列が、ＳＡＴＳＳＸ８ＳＹＭＨ（配列番号１０１）またはＲＡＳＥＳＶＤＲＹＧＮＳＦＩＨ（配列番号１０２）であり；
ｂ）前記Ｌ２配列が、Ｘ９ＴＳＮＬＡＳ（配列番号１０３）またはＲＴＹＮＬＥＳ（配列番号１０４）であり；および
ｃ）前記Ｌ３配列が、ＱＱＲＳＳＹＰＦＴ（配列番号１０５）またはＱＱＴＮＥＤＰＷＴ（配列番号１０６）であり、Ｘ８がＥまたはＶであり；およびＸ９がＧまたはＨである、請求項２２〜２８のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項３０】
前記ＡＳＴＲが、配列番号８２または配列番号８３の抗体重鎖および配列番号８４の抗体軽鎖を含む、請求項２９に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項３１】
前記ＡＳＴＲが、配列番号８２または配列番号８３の抗体重鎖および配列番号８４の抗体軽鎖を含む抗体と同じＲｏｒ２のエピトープに結合し、前記ＡＳＴＲが、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５７、または配列番号１５８のアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項３２】
前記ＡＳＴＲが、配列番号１５１の抗体重鎖および配列番号１５２の抗体軽鎖を含む、請求項２９に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項３３】
前記ＡＳＴＲが、配列番号１５１の抗体重鎖および配列番号１５２の抗体軽鎖を含む抗体と同じＲｏｒ２のエピトープに結合し、前記ＡＳＴＲが、配列番号１５５または配列番号１５６のアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項３４】
前記キメラ抗原受容体が、ストークドメインおよび共刺激ドメインをさらに含む、請求項２２〜３３のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項３５】
前記キメラ抗原受容体が、アミノ末端からカルボキシ末端までに、前記ＡＳＴＲ、前記ストークドメイン、前記膜貫通ドメイン、前記共刺激ドメイン、および前記細胞内活性化ドメインを含む、請求項３４に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項３６】
前記ストークドメインが、ＣＤ８ストークドメインまたはＣＤ２８ストークドメインであり、前記膜貫通ドメインが、ＣＤ８膜貫通ドメインまたはＣＤ２８膜貫通ドメインであり、前記細胞内活性化ドメインがＣＤ３Ｚ活性化ドメインであり、前記共刺激ドメインがＣＤ１３７共刺激ドメインである、請求項３５に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項３７】
認識ドメインをさらに含む、請求項１〜３６のいずれかに記載のキメラ抗原受容体。
【請求項３８】
前記認識ドメインが、前記キメラ抗原受容体に共有結合して発現される、請求項３７に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項３９】
前記認識ドメインが、規制当局承認抗体により認識される、請求項３８に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項４０】
前記認識ドメインが、ＥＧＦＲの少なくとも２０個の連続アミノ酸である、請求項３８または３９に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項４１】
Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞中で活性なプロモーターに動作可能に連結された１つまたは複数の核酸配列を含むゲノムを含む、単離組換えＴ細胞および／またはＮＫ細胞であって、前記１つまたは複数の核酸配列が、請求項１〜４０のいずれかに記載のＡｘｌまたはＲｏｒ２に結合するためのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする、単離組換えＴ細胞および／またはＮＫ細胞。
【請求項４２】
前記ＣＡＲが、前記プロモーターに動作可能に連結された核酸配列によりコードされ、前記ＣＡＲをコードする核酸配列が、認識ドメインをさらにコードし、前記認識ドメインをコードする核酸が、リボソームスキップ配列により前記ＣＡＲをコードする核酸から分離される、請求項４１に記載の単離組換えＴ細胞またはＮＫ細胞。
【請求項４３】
Ｔ細胞またはＮＫ細胞を活性化する方法であって、標的哺乳動物細胞を、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞と７．０未満のｐＨの微小環境中で接触させることを含み、前記標的哺乳動物細胞がＡｘｌまたはＲｏｒ２を発現し、前記Ｔ細胞またはＮＫ細胞が、それぞれＡｘｌまたはＲｏｒ２に結合するためのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現し、前記ＣＡＲが請求項１〜４０に記載のＣＡＲのいずれかを含む、方法。
【請求項４４】
前記微小環境が、６．５〜６．８のｐＨを有する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
活性化が、サイトカインの発現および／または生成および／または分泌の増大を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
活性化時に、Ｔ細胞がＩＬ−２またはＩＦＮ−γの発現を増大させる、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
ＩＬ−２またはＩＦＮ−γの発現が、前記接触の前のＴ細胞またはＮＫ細胞によるＩＬ−２またはＩＦＮ−γの発現に比べて，少なくとも２倍増大される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
活性化時に、前記Ｔ細胞またはＮＫ細胞の細胞傷害活性が、前記接触の前のＴ細胞またはＮＫ細胞の細胞傷害活性に比べて、少なくとも２倍増大される、請求項４３〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記Ｔ細胞またはＮＫ細胞の活性化後に、前記標的哺乳動物細胞が溶解される、請求項４３〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記接触前に、前記Ｔ細胞またはＮＫ細胞を、ゲノム中に前記ＣＡＲをコードする複製不能組換えレトロウイルス粒子で形質導入し、前記Ｔ細胞またはＮＫ細胞を遺伝子改変することをさらに含む、請求項４３〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記形質導入がエクスビボで実施される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記微小環境のｐＨを７．０以上のｐＨに高め、それにより、前記Ｔ細胞またはＮＫ細胞の活性化を低減させることをさらに含む、請求項４３〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記微小環境が腫瘍である、請求項４３〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記腫瘍がヒト対象中にある、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記微小環境がインビトロまたはエクスビボである、請求項４３〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記方法で活性化される細胞がＴ細胞である、請求項４３〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
条件的結合性ＡｘｌまたはＲｏｒ２に対するキメラ抗原受容体を含む、条件的に活性化可能なＴ細胞またはＮＫ細胞を作製する方法であって、前記Ｔ細胞またはＮＫ細胞を、請求項１〜３５のいずれかに記載のキメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結されたプロモーターを含む発現ベクターで遺伝子改変することを含み、前記条件的結合が、７．４のｐＨに比べて、６．７のｐＨでＡｘｌまたはＲｏｒ２に対する結合が増大される、方法。
【請求項５８】
条件的結合性ＡｘｌまたはＲｏｒ２に対するキメラ抗原受容体を含む、条件的に活性化可能なＴ細胞および／またはＮＫ細胞のエクスビボ作製方法であって、
ａ）末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を濃縮して、単離血液からＴ細胞および／またはＮＫ細胞を含むＰＢＭＣを単離すること；
ｂ）前記単離ＰＢＭＣのＴ細胞および／またはＮＫ細胞を効果的な条件下で活性化すること；
ｃ）前記活性化Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞に複製不能組換えレトロウイルス粒子を用いて効果的な条件下で形質導入し、それにより、遺伝子改変Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を生成し、前記複製不能組換えレトロウイルス粒子がそれぞれ、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞中で活性なプロモーターに動作可能に連結された１つまたは複数の核酸配列を含むレトロウイルスゲノムを含み、前記１つまたは複数の核酸配列の第１の核酸配列が、請求項１〜３５のいずれかに記載のキメラ抗原受容体をコードし、および
ｄ）前記遺伝子改変Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を増殖し、それにより、前記条件的に活性化可能なＴ細胞および／またはＮＫ細胞を作製すること、を含む、方法。
【請求項５９】
方法が、前記増殖の後に、前記遺伝子改変Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を回収することをさらに含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記回収した遺伝子改変Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を対象に導入することをさらに含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
請求項５８〜６０のいずれかに記載の方法により生成された、改変Ｔ細胞。
【請求項６２】
請求項１〜４０のいずれかに記載のＡｘｌまたはＲｏｒ２に結合するためのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸、および前記発現ベクター上に配置され、前記ＣＡＲをコードする核酸の発現を促進するＴ細胞またはＮＫ細胞中で活性なプロモーターを含む、発現ベクター。
【請求項６３】
複製不能レトロウイルス粒子である、請求項６２に記載の発現ベクター。
【請求項６４】
前記発現ベクターがレンチウイルスベクターである、請求項６３に記載の発現ベクター。
【請求項６５】
請求項１〜４０のいずれかに記載のＡｘｌまたはＲｏｒ２に結合するためのキメラ抗原受容体をコードする単離核酸。
【請求項６６】
前記核酸が、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞中で活性なプロモーターをさらに含み、前記ＣＡＲをコードする核酸配列が、前記プロモーターに動作可能に連結される、請求項６５に記載の単離核酸。
【請求項６７】
前記単離核酸配列が、認識ドメインをさらにコードする、請求項６６に記載の単離核酸。
【請求項６８】
前記認識ドメインをコードする核酸が、リボソームスキップ配列により、前記ＣＡＲをコードする核酸から分離される、請求項６７に記載の単離核酸。
【請求項６９】
前記リボソームスキップ配列が２Ａ−１である、請求項６８に記載の単離核酸。
【請求項７０】
請求項６５〜６９のいずれかに記載の核酸を含む、複製不能組換えレトロウイルス粒子。
【請求項７１】
レンチウイルス粒子である、請求項７０に記載の複製不能組換えレトロウイルス粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／４４７，８９８号、２０１７年３月３日に出願された米国仮特許出願第６２／４６７，０５９号、および２０１７年７月８日に出願された米国仮特許出願第６２／５３０，１９３号の利益を主張する。この段落で引用されたこれらの仮出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願と同時に提出された電子配列表のデータは、参照により、本明細書に組み込まれる。電子配列表のデータは、２０１８年１月１７日に作成された、１２６ＫＢのサイズの「Ｆ１．００２．ＷＯ．０１＿Ｓｅｑｌｉｓｔ．ｔｘｔ」という名称のテキスト（．ｔｘｔ）ファイルとして提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００３】
共同研究契約
Ｆ１  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．およびＢｉｏＡｔｌａ，ＬＬＣは、本明細書で開示の主題に関する共同研究契約の当事者である。
【０００４】
開示の分野
本開示は、キメラ抗原受容体ならびに診断および治療法におけるキメラ抗原受容体の使用に関する。
【背景技術】
【０００５】
細胞ベース養子免疫療法では、患者から単離された免疫細胞を、合成タンパク質を発現するように改変して、その後、それらが患者に戻される場合に、免疫細胞に新しい治療機能を発揮させることができる。このような合成タンパク質の一例がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。現在使用されているＣＡＲの一例は、細胞外認識ドメイン（例えば、抗原特異的標的化領域またはＡＳＴＲ）、膜貫通ドメイン、および１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインの融合体である。抗原結合時には、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達部分は、腫瘍細胞死を誘導する細胞溶解性分子の放出などの免疫細胞中で活性化関連応答を開始できる。ＣＡＲおよびＣＡＲ−Ｔ療法は、血液癌の特定の型に対しては極めて効果的であるが、これまで、遙かに実現困難なことがわかっている固形腫瘍に対するＣＡＲおよびＣＡＲ−Ｔ療法の必要性が残されている。
【０００６】
ＣＡＲは、種々の疾患を治療するのに優れた方法であるが、最近、臨床試験中の有害事象のためにＣＡＲの安全性が問題になってきた。これらの有害事象を減らす１つの方法は、オンターゲット・オフ腫瘍（ｏｆｆ−ｔｕｍｏｒ）のＡＳＴＲ結合を減らすことによる方法である。条件的活性型ＡＳＴＲを有するＣＡＲは、腫瘍微小環境中に存在する場合などの、特定の条件下で抗原のみに結合し、正常な生理的条件中の抗原に結合せず、オンターゲット・オフ腫瘍結合を低減する。したがって、これらのＣＡＲの副作用は低減され、治療をより安全に進めることができる。
【０００７】
受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）は、リガンド制御チロシンキナーゼ活性により正常な細胞プロセスの範囲を調節する細胞表面受容体のファミリーである。過去２０年にわたり、ＲＴＫの調節解除は、癌発生および進行に重要な役割を果たすことが示されてきた。現在、ＲＴＫは、予後分子バイオマーカーおよび腫瘍治療薬の標的として認識されている。
【０００８】
ＡＸｌタンパク質（Ａｒｋ、ＵＦＯ、Ｔｙｒｏ−７としても知られる）は、Ｔｙｒｏ−３キナーゼファミリー中のＲＴＫである。Ｔｙｒｏ−３受容体キナーゼは、細胞外の領域および細胞質キナーゼドメイン中の２つの免疫グロブリン様ドメインおよび二重フィブロネクチンＩＩＩ型リピートの組み合わせを特徴とする。Ｔｙｒｏ−３受容体キナーゼのリガンドは、Ｇａｓ６（増殖−停止−特異的６）およびタンパク質Ｓ（４３％のアミノ酸配列同一性を示し、類似のドメイン構造を共有する、２つのビタミンＫ依存性タンパク質）である。各タンパク質は、１１ｇ−カルボキシグルタミン酸残基を含むＮ末端ＧＩａドメイン、続けて、４つの上皮増殖因子（ＥＧＦ）様モジュール、および２つのタンデム型ラミニンＧドメインからなるＣ末端性ホルモン結合グロブリン（ＳＨＢＧ）様構造を有する。ＳＨＢＧドメインは、両方ともＴｙｒｏ−３受容体キナーゼ結合に必要で、十分であり、一方、ＧＩａドメインは、負に帯電している膜リン脂質に結合し、Ｔｙｒｏ−３キナーゼアポトーシス細胞の媒介食作用に重要な役割を果たす。
【０００９】
ＡＸｌ活性化は、ＰＩ−３−キナーゼ／ＡｋｔおよびＲａｓ／Ｅｒｋおよびβ−カテニン／ＴＣＦなどの他の主要な経路を介したシグナル伝達をもたらす。ＡＸｌは、脳、心臓、骨格筋、いくつかのその他の臓器の臓器莢膜および結合組織を含む正常組織の範囲、および単球中で弱く発現しているが、リンパ球では発現していない。ＡＸｌにより誘導されたＡｋｔリン酸化は、線維芽細胞、内皮細胞、血管平滑筋細胞およびニューロンの生存において記載されてきた。さらに、ＡＸｌは、ＡＸｌノックアウト動物が、血小板インテグリンＩＩｂ３の活性化低下の結果として、障害性血小板凝集安定化および血栓形成を示すことから、細胞接着および走化性で一定の役割を果たしている。
【００１０】
ＡＸｌまたはそのリガンドＧａｓ６の調節不全は、種々のヒト癌の病因に結びつけられている。ＡＸｌ過剰発現は、種々の癌型、例えば、乳癌（Ｍｅｒｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．８，ｐｐ．３６１−３６７，２００２；Ｂｅｒｃｌａｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．，ｖｏｌ．１２，ｐｐ．８１９−８２４，２００１）、結腸癌（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，ｖｏｌ．８３，ｐｐ．５７９−５８４，１９９９；Ｃｒａｖｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，ｖｏｌ．６０，ｐｐ．７９１−７９７，１９９５）、前立腺癌（Ｊａｃｏｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔ．Ｐｒｅｙ．，ｖｏｌ．２３，ｐｐ．３２５−３３２，１９９９）、肺癌（Ｗｉｍｍｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，ｖｏｌ．３７，ｐｐ．２２６４−２２７４，２００１）、胃癌（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．２２，ｐｐ．１０７１−１０７８，２００２）、卵巣癌（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．６６，ｐｐ．４５０−４５７，２００４）、子宮内膜癌（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．，ｖｏｌ．１４，ｐｐ．８９８−９０６，２００３）、腎臓癌（Ｃｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．２２，ｐｐ．５３３−５４０，２００３）、肝細胞癌（Ｔｓｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，ｖｏｌ．５０，ｐｐ．３３１−３４０，１９９８）、甲状腺癌（Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｙｒｏｉｄ，ｖｏｌ．１２，ｐｐ．９７１−９７５，２００２；Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｙｒｏｉｄ，ｖｏｌ．９，ｐｐ．５６３−５６７，１９９９）、骨肉腫（Ｎａｋａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２７０，ｐｐ．５７０２−５７０５，２００３）、黒色腫（ｖａｎ  Ｇｉｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．６４，ｐｐ．１２８−１３４，２００４）、頭頸部扁平上皮癌（Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ  Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．，ｖｏｌ．９４，ｐｐ．１４４６−５１，２００６）、卵巣癌、腎臓癌、神経膠腫、内分泌腺癌、膵臓癌、リンパ腫、脳癌、肝臓癌、腎細胞癌、腎明細胞癌、膀胱癌、直腸癌、頸部扁平上皮細胞癌、およびさらに、リンパ腫ならびに慢性骨髄性白血病（Ｊａｎｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，ｖｏｌ．６，ｐｐ．２１１３−２１２０，１９９１；Ｂｒａｕｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，ｖｏｌ．１４，ｐｐ．２６１９−２６３１  １９９７；Ｏ’Ｂｒｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．１１，ｐｐ．５０１６−５０３１，１９９１）および急性骨髄性白血病（Ｒｏｃｈｌｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ，ｖｏｌ．１３，ｐｐ．１３５２−１３５８，１９９９）を含む種々の白血病で示されてきた。
【００１１】
ＡＸｌ発現は、標的化学療法剤により誘発され、薬剤誘発性ＡＸｌ発現は、急性骨髄性白血病の化学療法剤に対する耐性（Ｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，ｖｏｌ．２６８，ｐｐ．３１４−３２４，２００８）、ならびに、消化管間質腫瘍（Ｍｅｈａｄｅｖａｎ，ｅｔ  ａｌ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，ｖｏｌ．２６，ｐｐ．３９０９−３９１９，２００７）および乳癌（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．２８１，ｐｐ．６８７１−６８７８，２００９）におけるイマチニブおよびラパチニブ／ハーセプチンに対する耐性をそれぞれ付与する。
【００１２】
さらに、ＡＸｌは、非侵襲細胞に比べて、攻撃的乳癌細胞株中で発現上昇していることから、ＡＸｌは、腫瘍転移に関連することが特定された。インビトロでは、ＡＸｌ活性は、移動および浸潤のために必要とされることが見出され、この活性は、抗体治療により阻害され得る（国際公開第０４／００８１４７号）。同様に、ドミナントネガティブバージョンのＡＸｌの発現を介した（Ｖａｊｋｏｃｚｙ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｕ．Ｓ．Ａ．，ｖｏｌ．１０３，ｐｐ．５７９９−５８０４，２００５）、またはＡＸｌのｓｉＲＮＡ媒介発現低下による（Ｈｏｌｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．６５，ｐｐ．９２９４−９３０３，２００５）ＡＸｌ活性のインビボでの抑止は、マウス異種移植片実験において皮下および同所性細胞増殖を阻止した。
【００１３】
したがって、抗ＡＸｌモノクローナル抗体は、癌の治療における使用が示唆されている。例えば、抗ＡＸｌ抗体に関する文献には、国際公開第２００９／０６３９５号、同第２００９／０６２６９０号、同第２０１１／０１４４５７号、米国特許出願公開第２０１４／０２２７２８３号、および米国特許第８，８５３，３６９号が含まれる。米国特許出願公開第２０１４／０２２７２８３号は、モノクローナル抗ＡＸｌ抗体および診断および治療法におけるその使用を開示している。国際公開第２００９／０６２６９０号は、ＡＸｌタンパク質の細胞外ドメインに結合し、少なくとも部分的にＡＸｌ活性を阻害する抗体を開示している。しかし、モノクローナル抗体が確認され、試薬として入手できるＡＸｌなどの標的に対しては、ＡＸｌまたはＲｏｒ２に対する条件的活性型ＣＡＲを作成することを極めて困難にする多くの課題が、まだ存在する。
【００１４】
別のＲＴＫである、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体２とも呼ばれるＲｏｒ２は、正常骨および軟骨発生中に、Ｗｎｔ５Ａ糖タンパク質との結合を介して、非標準のＷｎｔシグナル伝達により活性化される膜結合型である。Ｒｏｒ２は、唯一つの膜貫通ドメインを有し、これは、その細胞外および細胞内ドメインを分離する。Ｒｏｒ２は、種々の臓器および組織の正常発生に重要な役割を果たすことが知られている。哺乳動物では、Ｒｏｒ２およびＷｎｔ５Ａ欠損マウスは、発生過程における形態形成中に類似の異常性を示し、収斂伸長運動および平面内細胞極性においてそれらの障害を反映している。さらに、ヒトＲｏｒ２遺伝子の変異は、遺伝的骨障害優性短指症Ｂ型および劣性ロビノウ症候群に関与している。Ｒｏｒ２は、分極細胞移動を媒介することが見出され、Ｒｏｒ２の機能不全は、遺伝性骨障害および腫瘍浸潤を生ずる（Ｍｉｎａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｒｏｒ−ｆａｍｉｌｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅｓ  ｉｎ  ｎｏｎｃａｎｏｎｉｃａｌ  Ｗｎｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ：ｔｈｅｉｒ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｄｉｓｅａｓｅｓ，”  Ｄｅｖ  Ｄｙｎ．，ｖｏｌ．２３９，ｐｐ．１−１５，２０１０）。さらに、Ｄｅｂｅｂｅら（“Ｒｏｒ２  ａｓ  ａ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ，”  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，ｖｏｌ．５０，ｐｐ．１４３−１４８，２０１５）は、Ｒｏｒ２が標準的および非標準のシグナル伝達経路の両方を媒介することを開示している。
【００１５】
Ｒｏｒ２はまた、腫瘍形成促進効果を有することが報告された。米国特許出願公開第２０１４／０３２２２３４号は、種々の癌中でのＲｏｒ２発現および活性が正常組織とは異なることを開示している。したがって、Ｒｏｒ２の調節不全は、種々のヒト癌の病因において一定の役割を果たしていることが示唆される。米国特許出願公開第２０１４／０３２２２３４号はまた、Ｒｏｒ２に対する抗体を、癌の診断および癌細胞増殖の抑制に使用し得ることを考察している。例えば、このような抗体を、Ｒｏｒ２を発現している癌細胞に対し高度の細胞傷害性を有する細胞傷害薬と複合化することが可能で、それにより、細胞傷害薬は、癌細胞を効果的に死滅させることができる。Ｒｏｒ２遺伝子はまた、癌中のＲｏｒ２発現パターンによる癌の分類にも使用し得る。
【００１６】
Ｒｏｒ２は、癌の発生および進行に関与する（“Ｔｈｅ  ｄｕａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｏｖｅｌ  Ｗｎｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ，Ｒｏｒ２，ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，”  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，ｖｏｌ．１３３，ｐｐ．７７９−７８７，２０１３）。具体的には、Ｒｏｒ２は、結腸癌、肝細胞癌、転移性黒色腫、および腎細胞癌を含む多数の癌の発癌で重要な役割を果たすことが見出されている。例えば、Ｒｏｒ２は、骨肉腫、黒色腫、腎細胞癌、前立腺癌、頭頸部の扁平上皮細胞癌、結腸癌、乳癌、リンパ腫、白血病、甲状腺癌、膵臓内分泌腺、脳癌、卵巣癌、腎臓乳頭癌、肺癌、膵臓癌、肝臓癌、腎明細胞癌、膀胱癌、子宮内膜癌、直腸癌、頸部扁平上皮細胞癌、および間質腫瘍で過剰発現している。これらの癌型の大部分では、Ｒｏｒ２発現は、侵襲性の強い癌状態と関連している。したがって、Ｒｏｒ２は、Ｗｎｔシグナル伝達経路を阻害することによる癌治療のための薬物標的となる可能性を有している。
【００１７】
免疫系の力を利用して癌と戦うが、オンターゲット・オフ腫瘍ならびにオフターゲット効果を低減または取り除いた、効果的治療の必要性がまだ残されている。Ｒｏｒ２およびＡＸｌに対するモノクローナル抗体は商業的に入手できるが、癌微小環境などの特定の環境中で、条件的活性型で、Ｒｏｒ２またはＡＸｌを標的とする抗体フラグメントを含み、Ｒｏｒ２またはＡＸｌのみを発現している細胞を効果的に標的とする、ＣＡＲが必要とされている。このような条件的活性型ＣＡＲの作製には、多数の課題が存在する。例えば、抗体フラグメントがＣＡＲの一部としてＴ細胞またはＮＫ細胞の表面上に発現される場合、ＡＸｌまたはＲｏｒ２に結合するだけでなく、さらに、癌細胞上に露出されているエピトープを認識する能力も持つ抗体フラグメントが作製および特定されなければならない。さらに、このようなＣＡＲは、条件的活性型の方式で、特に、正常な生理学的ｐＨと比べて、腫瘍の酸性のｐＨ下で、それらの標的に大部分が結合する。さらに、このような候補ＣＡＲは、それらの標的に結合する場合、ＣＡＲを発現しているＴ細胞またはＮＫ細胞を活性化して、細胞傷害性機能を発現させる必要がある。したがって、現在のＣＡＲ−Ｔ法により生じる問題を解くのを支援するために、このような抗体フラグメントを含むＣＡＲに対し、多くの要件がある。ＡＸｌまたはＲｏｒ２に対して、このような条件的活性型ＣＡＲは、ＣＡＲ−Ｔ療法を使った固形癌の治療に大いに期待でき、したがって、現在のＣＡＲ−Ｔ療法の大部分の制約を克服するであろう。
【発明の概要】
【００１８】
本開示は、ＡＸｌおよび／またはＲｏｒ２に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、およびＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、ならびに、ＡＸｌおよびＲｏｒ２に結合する条件的活性型生物学的（ＣＡＢ）ＣＡＲを提供する。本開示は、ＣＡＲを生成するように遺伝子改変された細胞、およびこのような細胞を作製する方法を提供する。本開示のＣＡＲは、各種方法で使用でき、また、これらの方法も提供され、これらの方法としては、閾値未満のｐＨなどの特定の条件下での免疫細胞活性化方法、ＣＡＲ療法、例えば、癌、例えば、腎細胞癌に対するＣＡＲ療法などの養子免疫細胞療法の実施方法が挙げられる。
【００１９】
本明細書で提供される態様および実施形態の詳細は、本開示を通して提供される。わかりやすいように、この要約セクションは、本明細書で提供される本開示の範囲を限定すると解釈されることを意図するものではなく、また、そのように解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ｅＴａｇ発現のＦＡＣＳ分析に基づくＣＤ３＋細胞のパーセント形質導入を示す棒グラフを提供する。
【図２Ａ−２Ｃ】ＡＸｌを認識する野性型ＡＳＴＲを有する対照ＣＡＲ発現Ｔ細胞（図２Ａ）およびＡＸｌを認識する条件的活性型ＡＳＴＲを有する、ＡＸｌを認識する候補ＣＡＢ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞（図２Ｂ〜２Ｆ）による、ｐＨ６．７およびｐＨ７．４でのＣＨＯ−Ａｘｌ細胞のリアルタイム死滅アッセイの結果を示す。標的に対するエフェクター比率は、図２Ａおよび２Ｂで３：１、図２Ｃ〜２Ｆで１：１であった。
【図２Ｄ−２Ｆ】ＡＸｌを認識する野性型ＡＳＴＲを有する対照ＣＡＲ発現Ｔ細胞（図２Ａ）およびＡＸｌを認識する条件的活性型ＡＳＴＲを有する、ＡＸｌを認識する候補ＣＡＢ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞（図２Ｂ〜２Ｆ）による、ｐＨ６．７およびｐＨ７．４でのＣＨＯ−Ａｘｌ細胞のリアルタイム死滅アッセイの結果を示す。標的に対するエフェクター比率は、図２Ａおよび２Ｂで３：１、図２Ｃ〜２Ｆで１：１であった。
【図３Ａ−３Ｃ】Ｒｏｒ２を認識する野性型ＡＳＴＲを有する対照ＣＡＲ発現Ｔ細胞（図３Ａ）およびＲｏｒ２を認識する条件的活性型ＡＳＴＲを有する、Ｒｏｒ２を認識する候補ＣＡＢ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞（図３Ｂ〜３Ｊ）による、ｐＨ６．７およびｐＨ７．４でのＣＨＯ−Ｒｏｒ２細胞のリアルタイム死滅アッセイの結果を示す。標的に対するエフェクター比率は、１：１であった。
【図３Ｄ−３Ｆ】Ｒｏｒ２を認識する野性型ＡＳＴＲを有する対照ＣＡＲ発現Ｔ細胞（図３Ａ）およびＲｏｒ２を認識する条件的活性型ＡＳＴＲを有する、Ｒｏｒ２を認識する候補ＣＡＢ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞（図３Ｂ〜３Ｊ）による、ｐＨ６．７およびｐＨ７．４でのＣＨＯ−Ｒｏｒ２細胞のリアルタイム死滅アッセイの結果を示す。標的に対するエフェクター比率は、１：１であった。
【図３Ｇ−３Ｈ】Ｒｏｒ２を認識する野性型ＡＳＴＲを有する対照ＣＡＲ発現Ｔ細胞（図３Ａ）およびＲｏｒ２を認識する条件的活性型ＡＳＴＲを有する、Ｒｏｒ２を認識する候補ＣＡＢ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞（図３Ｂ〜３Ｊ）による、ｐＨ６．７およびｐＨ７．４でのＣＨＯ−Ｒｏｒ２細胞のリアルタイム死滅アッセイの結果を示す。標的に対するエフェクター比率は、１：１であった。
【図３Ｉ−３Ｊ】Ｒｏｒ２を認識する野性型ＡＳＴＲを有する対照ＣＡＲ発現Ｔ細胞（図３Ａ）およびＲｏｒ２を認識する条件的活性型ＡＳＴＲを有する、Ｒｏｒ２を認識する候補ＣＡＢ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞（図３Ｂ〜３Ｊ）による、ｐＨ６．７およびｐＨ７．４でのＣＨＯ−Ｒｏｒ２細胞のリアルタイム死滅アッセイの結果を示す。標的に対するエフェクター比率は、１：１であった。
【図４Ａ】本明細書で提供される、ＡＸｌに対する条件的活性型ＣＡＲの１つを発現しているＴ細胞による、種々のｐＨでのＣＨＯ−Ａｘｌ細胞のリアルタイム死滅アッセイの代表的結果を示す。
【図４Ｂ】図４Ａと同じＣＡＢ−ＣＡＲに対する、示した種々のｐＨ下で２０時間の時点での溶解結果を示す。
【図５Ａ】本明細書で提供される、Ｒｏｒ２に対する条件的活性型ＣＡＢ−ＣＡＲの１つを発現しているＴ細胞による、種々のｐＨでのＣＨＯ−Ｒｏｒ２細胞のリアルタイム死滅アッセイの代表的結果を示す。
【図５Ｂ】図５Ａと同じＣＡＢ−ＣＡＲに対する、示した種々のｐＨ下で２０時間の時点での溶解結果を示す。
【図６Ａ−６Ｂ】図６Ａ：ＡＸｌに対する条件的活性型ＣＡＢ−ＣＡＲの１つを発現しているＴ細胞による、ｐＨ６．７およびｐＨ７．４でのヒトＣａｋｉ−１細胞のリアルタイム死滅アッセイの結果を示す。図６Ｂ：Ｒｏｒ２に対する条件的活性型ＣＡＢ−ＣＡＲの１つを発現しているＴ細胞による、ｐＨ６．７およびｐＨ７．４でのヒトＨＥＫ２９３細胞のリアルタイム死滅アッセイの結果を示す。
【図７Ａ−７Ｂ】図７Ａ：種々の濃度のセツキシマブで処理後ｅＴａｇ、または対照（同位体）を発現している、レンチウイルス発現ベクターで形質導入したＰＢＭＣに対する細胞枯渇結果を示す。図７Ｂ：非形質導入（Ｔ）細胞に対する形質導入（Ｅ）細胞の種々の比率での、セツキシマブで処理後ｅＴａｇ、または対照（同位体）を発現している、レンチウイルス発現ベクターで形質導入したＰＢＭＣに対する細胞枯渇結果を示す。
【図８Ａ−８Ｂ】ｐＨ６．７またはｐＨ７．４での、異なる細胞の同時インキュベーションの有無による培地中のサイトカインレベルの棒グラフを示す。次記の種々の細胞を使用した：ＧＭＣＳＦシグナル配列およびｅＴａｇ発現Ｔ細胞（Ｆ１−０−０１）、ＡＸｌ  ＣＡＢ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞（Ｆ１−２−１５）、Ｒｏｒ２  ＣＡＢ−ＣＡＲ（Ｆ１−１−１５）発現Ｔ細胞、ＣＨＯ細胞、ＡＸｌ発現ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−Ａｘｌ）、およびＲｏｒ２発現ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−ＲＯＲ２）。図８Ａは、Ｆ１−０−０１またはＦ１−２−１５  Ｔ細胞単独、またはＣＨＯまたはＣＨＯ−Ａｘｌと同時インキュベートした場合の培地中のＩＬ−２のレベルを示す。図８Ｂは、Ｆ１−０−０１またはＦ１−２−１５  Ｔ細胞単独、またはＣＨＯまたはＣＨＯ−Ａｘｌと同時インキュベートした場合の培地中のＩＦＮ−γのレベルを示す。ＣＨＯまたはＣＨＯ−Ａｘｌ細胞がエフェクターＴ細胞の非存在下でインキュベートされる場合の培地中のサイトカインレベルも、図８Ａおよび８Ｂに対照として示されている。図８Ｃは、Ｆ１−０−０１またはＦ１−１−１５  Ｔ細胞単独、またはＣＨＯまたはＣＨＯ−Ｒｏｒ２と同時インキュベートした場合の培地中のＩＬ−２のレベルを示す。図８Ｄは、Ｆ１−０−０１またはＦ１−１−１５  Ｔ細胞単独、またはＣＨＯまたはＣＨＯ−Ｒｏｒ２と同時インキュベートした場合の培地中のＩＦＮ−γのレベルを示す。ＣＨＯまたはＣＨＯ−Ｒｏｒ２細胞がエフェクターＴ細胞の非存在下でインキュベートされる場合の培地中のサイトカインレベルも、図８Ｃおよび８Ｄに対照として示されている。
【図８Ｃ−８Ｄ】ｐＨ６．７またはｐＨ７．４での、異なる細胞の同時インキュベーションの有無による培地中のサイトカインレベルの棒グラフを示す。次記の種々の細胞を使用した：ＧＭＣＳＦシグナル配列およびｅＴａｇ発現Ｔ細胞（Ｆ１−０−０１）、ＡＸｌ  ＣＡＢ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞（Ｆ１−２−１５）、Ｒｏｒ２  ＣＡＢ−ＣＡＲ（Ｆ１−１−１５）発現Ｔ細胞、ＣＨＯ細胞、ＡＸｌ発現ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−Ａｘｌ）、およびＲｏｒ２発現ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−ＲＯＲ２）。図８Ａは、Ｆ１−０−０１またはＦ１−２−１５  Ｔ細胞単独、またはＣＨＯまたはＣＨＯ−Ａｘｌと同時インキュベートした場合の培地中のＩＬ−２のレベルを示す。図８Ｂは、Ｆ１−０−０１またはＦ１−２−１５  Ｔ細胞単独、またはＣＨＯまたはＣＨＯ−Ａｘｌと同時インキュベートした場合の培地中のＩＦＮ−γのレベルを示す。ＣＨＯまたはＣＨＯ−Ａｘｌ細胞がエフェクターＴ細胞の非存在下でインキュベートされる場合の培地中のサイトカインレベルも、図８Ａおよび８Ｂに対照として示されている。図８Ｃは、Ｆ１−０−０１またはＦ１−１−１５  Ｔ細胞単独、またはＣＨＯまたはＣＨＯ−Ｒｏｒ２と同時インキュベートした場合の培地中のＩＬ−２のレベルを示す。図８Ｄは、Ｆ１−０−０１またはＦ１−１−１５  Ｔ細胞単独、またはＣＨＯまたはＣＨＯ−Ｒｏｒ２と同時インキュベートした場合の培地中のＩＦＮ−γのレベルを示す。ＣＨＯまたはＣＨＯ−Ｒｏｒ２細胞がエフェクターＴ細胞の非存在下でインキュベートされる場合の培地中のサイトカインレベルも、図８Ｃおよび８Ｄに対照として示されている。
【図９】本明細書で提供される、ＡＸｌに対する条件的活性型ＣＡＢ−ＣＡＲの１つを発現しているＴ細胞による、ｐＨ調節薬剤による処理の有無の場合の、ＣＨＯ−Ａｘｌ細胞のリアルタイム死滅アッセイの代表的結果を示す。図９Ａでは、培地は最初、ｐＨ６．７で、その後、矢印で示した時点で、実験細胞（実線）および対照細胞（破線）を、それぞれ、ＮａＨＣＯ３で処理したか、またはＮａＨＣＯ３なしで処理した。図９Ｂでは、培地は最初、ｐＨ６．７で、その後、矢印で示した時点で、実験細胞（実線）および対照細胞（破線）を、それぞれ、ＮａＯＨで処理したか、またはＮａＯＨなしで処理した。図９Ｃでは、培地は最初、ｐＨ７．４で、その後、実験細胞（実線）および対照細胞（破線）を、それぞれ、ＨＣｌで処理したか、またはＨＣｌなしで処理した。
【図１０】ＰＢＳまたは重炭酸塩の投与前後のＣＨＯ異種移植片担癌マウスにおけるＰｒｏＳｅｎｓｅ  ＦＡＳＴプローブによるＲＦＵパーセンテージを示すグラフである。
【図１１Ａ−１１Ｂ】図１１Ａ：ＰＢＳまたはＦ１−０−０１（ｅＴａｇ）もしくはＦ１−１−１５（Ｒｏｒ２に対する条件的活性型ＣＡＢ−ＣＡＲの１つ）をコードする核酸を含むレンチウイルス粒子で形質導入されたヒトＴ細胞を静脈内投与したＢ−ＮＳＧマウス中のＣＨＯ腫瘍の平均腫瘍体積を示す。図１１Ｂ：ＰＢＳまたはＦ１−０−０１もしくはＦ１−１−１５をコードする核酸を含むレンチウイルス粒子で形質導入されたヒトＴ細胞を静脈内投与したＢ−ＮＳＧマウス中のＣＨＯ−Ｒｏｒ２腫瘍の平均腫瘍体積を示す。
【図１２Ａ−１２Ｂ】図１２Ａ：ＰＢＳまたはＦ１−０−０１（ｅＴａｇ）もしくはＦ１−２−１５もしくはＦ１−２−２２をコードする核酸を含むレンチウイルス粒子で形質導入されたヒトＴ細胞を腫瘍内投与したＢ−ＮＳＧマウス中のＣＨＯ腫瘍の平均腫瘍体積を示す。Ｆ１−２−１５およびＦ１−２−２２は、ＡＸｌに対する条件的活性型ＣＡＢ−ＣＡＲの内の２つをコードする。図１２Ｂ：ＰＢＳまたはＦ１−０−０１もしくはＦ１−２−１５もしくはＦ１−２−２２をコードする核酸を含むレンチウイルス粒子で形質導入されたヒトＴ細胞を腫瘍内投与したＢ−ＮＳＧマウス中のＣＨＯ−Ａｘｌ腫瘍の平均腫瘍体積を示す。
【図１３Ａ−１３Ｂ】図１３Ａ：ＰＢＳまたはＦ１−０−０１（ｅＴａｇ）もしくはＦ１−２−１５もしくはＦ１−２−２２をコードする核酸を含むレンチウイルス粒子で形質導入されたヒトＴ細胞を静脈内投与したＢ−ＮＳＧマウス中のＣＨＯ腫瘍の平均腫瘍体積を示す。Ｆ１−２−１５およびＦ１−２−２２は、ＡＸｌに対する条件的活性型ＣＡＢ−ＣＡＲの内の２つをコードする。図１３Ｂ：ＰＢＳまたはＦ１−０−０１、Ｆ１−２−１５もしくはＦ１−２−２２をコードする核酸を含むレンチウイルス粒子で形質導入されたヒトＴ細胞を腫瘍内投与したＢ−ＮＳＧマウス中のＣＨＯ−Ａｘｌ腫瘍の平均腫瘍体積を示す。
【図１４Ａ−１４Ｂ】図１４Ａ：ＰＢＳまたはＦ１−０−０１（ｅＴａｇ）もしくはＦ１−２−１５もしくはＦ１−２−２２をコードする核酸を含むレンチウイルス粒子で形質導入されたヒトＴ細胞を静脈内投与したＢ−ＮＳＧマウス中のＣＨＯ腫瘍の平均腫瘍体積を示す。Ｆ１−２−１５およびＦ１−２−２２は、ＡＸｌに対する条件的活性型ＣＡＢ−ＣＡＲの内の２つをコードする。図１４Ｂ：ＰＢＳまたはＦ１−０−０１、Ｆ１−２−１５もしくはＦ１−２−２２をコードする核酸を含むレンチウイルス粒子で形質導入されたヒトＴ細胞を腫瘍内投与したＢ−ＮＳＧマウス中のＣＨＯ−Ａｘｌ腫瘍の平均腫瘍体積を示す。図１４Ａおよび１４ＢでＴ細胞を投与されたマウスはまた、腫瘍から離れた反対側の部位に、最初の３日間にわたり毎日、ＩＬ−２（５０，０００ＩＵ）の皮下注射も受けた。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
定義
本明細書で使用される場合、用語の「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」または「ＣＡＲ（複数）」は、抗原特異性を細胞、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、および幹細胞に移植する遺伝子改変受容体を意味する。本発明のＣＡＲは、少なくとも１つの抗原特異的標的化領域（ＡＳＴＲ）、ヒンジまたはストークドメイン（すなわち、細胞外ストークドメイン（ＥＳＤ））、膜貫通ドメイン（ＴＭ）、１つまたは複数の共刺激ドメイン（ＣＳＤ）、および細胞内活性化ドメイン（ＩＡＤ）を含み得る。特定の実施形態では、ＥＳＤおよび／またはＣＳＤは、オプションである。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＣＡＲは、特に記述されたドメイン（例えば、ＣＤ３Ｚ細胞内活性化ドメイン）を有する。このような特に記述されたドメインに対しては、そのドメインは、野性型ドメインの活性を保持し、それにより、ＣＡＲ中に効果的に採用でき（すなわち、ＣＡＲは、標的に結合する能力を保持し、それに応じて、ＣＡＲ内で認められる細胞内活性化ドメインを介してシグナルを送信する）、このような活性を与えるドメインのその部分に比較して、その特定のドメインが既知ヒト配列に対し少なくとも８０％の配列同一性を有することが意図されている。例えば、ＣＤ３Ｚ細胞内ドメインは、既知ヒトＣＤ３Ｚ配列に対してアミノ酸レベルで少なくとも８０％の配列同一性を有し、ＣＡＲ上で見つかる場合、ＣＡＲのＡＳＴＲの結合時に、シグナルをその標的に送信する能力を保持する。別の実施形態では、ＣＡＲは、二重特異性ＣＡＲであり、これは、２つの異なる抗原またはエピトープに特異的である。ＡＳＴＲが標的抗原に特異的に結合した後で、ＩＡＤは細胞内のシグナル伝達を活性化する。例えば、ＩＡＤは、非ＭＨＣ拘束的に、Ｔ細胞特異性および選択標的に対する反応性を向け直し、抗体の抗原結合特性を活用できる。非ＭＨＣ拘束的抗原認識は、ＣＡＲを発現しているＴ細胞に、抗原プロセシングとは独立した抗原を認識する能力を与え、それにより、腫瘍エスケープの主要機序をバイパスする。さらに、Ｔ細胞で発現する場合、ＣＡＲは好都合にも、内在性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファおよびベータ鎖と二量体化しない。
【００２２】
本明細書でＣＡＲまたはＡＳＴＲに関連して使用される場合、用語の「条件的活性型」は、正常な生理的環境中の条件下よりも、標的微小環境中の条件下で、１つまたは複数の標的抗原に対し、より低い結合親和性または、例示的実施形態では、より高い結合親和性を有するＣＡＲまたはＡＳＴＲを意味する。例示的実施形態では、本明細書で提供される条件的活性型ＣＡＲは、腫瘍微小環境中またはインビトロ腫瘍代替アッセイ中の条件下で、非腫瘍微小環境または正常な条件下に比べて、より活性である。腫瘍微小環境中の条件には、非腫瘍微小環境に比べて、より低いｐＨ、より高い濃度の乳酸およびピルビン酸、低酸素、より低い濃度のグルコース、および僅かに高い温度が含まれる。例えば、条件的活性型ＣＡＲは、特定の実施形態では、正常な体温では実質上不活性であるが、腫瘍微小環境中のより高い温度では、活性である。さらに別の実施形態では、条件的活性型ＣＡＲは、正常な酸素化血液中では低い活性であるが、腫瘍中のより低い酸素化環境下ではより活性が高い。本明細書で提供されるある例示的実施形態では、条件的活性型ＣＡＲは、正常な生理学的な７．２〜７．８のｐＨ中では低い活性であるが、腫瘍微小環境中に存在する６．０〜６．８の酸性ｐＨ下ではより活性が高い。条件的活性型ＣＡＲおよびＡＳＴＲが異なる結合親和性を有し、本発明の条件として同様に使用し得る当業者に既知の腫瘍微小環境中のその他の条件が存在する。本明細書では、条件的活性型ＣＡＲを、「条件的活性型生物学的ＣＡＲ」または「ＣＡＢ−ＣＡＲ」および「微小環境拘束性生物学的ＣＡＲ」または「ＭＲＢ−ＣＡＲ」と呼ぶこともある。
【００２３】
本明細書で使用される場合、用語の「微小環境」は、他の身体の領域または組織の領域とは、定常的または一時的に、物理的または化学的に差異を有する身体または組織のいずれかの部分または領域を意味する。腫瘍に対して、本明細書で使用される場合、用語の「腫瘍微小環境」は、腫瘍が存在する環境を意味し、これは、腫瘍内の非細胞部位および腫瘍組織の直接外側の領域であるが、癌細胞それ自体の細胞内の区画には属さない。腫瘍および腫瘍微小環境は、密接に関係し、常に相互作用している。腫瘍は、その微小環境を変えることができ、微小環境は、どのように腫瘍が増殖し、広がるかに影響を与えることができる。通常、腫瘍微小環境は、５．８〜７．０の範囲、より一般的には、６．０〜６．８の範囲、６．２〜６．８の範囲の低ｐＨを有する。他方では、正常な生理学的ｐＨは、７．２〜７．８の範囲である。腫瘍微小環境はまた、血漿と比較して、より低い濃度のグルコースおよびその他の栄養素を有することが知られているが、より高い濃度の乳酸を有することも知られている。さらに、腫瘍微小環境は、正常な生理学的温度よりも、０．３℃〜１℃高い温度を有する場合がある。腫瘍微小環境は、Ｇｉｌｌｅｓらの、“ＭＲＩ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｕｍｏｒ  Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，”  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ，ｖｏｌ．１６，ｐｐ．４３０−４５０，２００２中で考察されている。この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。用語の「非腫瘍微小環境」は、腫瘍以外の部位での微小環境を意味する。
【００２４】
本明細書で同じ意味で用いられる用語「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、任意の長さの高分子型のヌクレオチド、リボンヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチド、を意味する。したがって、この用語には、限定されないが、短鎖、二本鎖、または多重鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、またはプリンおよびピリミジン塩基またはその他の天然のヌクレオチド塩基、化学的にまたは生化学的に改変された、非天然の、誘導体化ヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれる。
【００２５】
用語の「抗体」および「免疫グロブリン」には、抗体または免疫グロブリンの任意のアイソタイプ、ならびにエピトープ、典型的には完全長抗体と同じエピトープに対する特異的結合を保持する抗体のフラグメントであって、抗体の重鎖および軽鎖の両方がアッセイで存在する場合、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、（Ｆａｂ’）２Ｆｖ、ｓｃＦｖ、二価ｓｃＦｖ、Ｆｄフラグメントを含むフラグメント、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、および抗体および非抗体タンパク質の抗原特異的標的化領域を含む融合タンパク質が挙げられる。
【００２６】
「抗体フラグメント」は、完全な抗体の一部、例えば、完全な抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメント；ディアボディ；直鎖抗体（Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５））；単鎖抗体分子；および抗体フラグメントから形成された多重特異的抗体が挙げられる。抗体のパパイン消化により、「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる、それぞれが単一抗原結合を有する２つの同一の抗原結合フラグメント、および残りの、名称が容易に結晶化する能力を表す、「Ｆｅ」フラグメントを生成する。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位を有し、まだ抗原を架橋できる、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを生じる。
【００２７】
「単鎖Ｆｖ」「ｓｃＦｖ」または「ｓＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインはポリペプチド単鎖中に存在する。いくつかの実施形態では、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨおよびＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これは、ｓＦｖが抗原結合のために所望の構造を形成することを可能とする。ｓＦｖの概要については、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）のＰｌｕｃｋｔｈｕｎを参照されたい。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「親和性」という用語は、２つの試薬の可逆的結合に対する平衡定数を意味し、解離定数（Ｋｄ）として表される。親和性は、無関係のアミノ酸配列に対する抗体の親和性よりも、少なくとも１倍大きい、少なくとも２倍大きい、少なくとも３倍大きい、少なくとも４倍大きい、少なくとも５倍大きい、少なくとも６倍大きい、少なくとも７倍大きい、少なくとも８倍大きい、少なくとも９倍大きい、少なくとも１０倍大きい、少なくとも２０倍大きい、少なくとも３０倍大きい、少なくとも４０倍大きい、少なくとも５０倍大きい、少なくとも６０倍大きい、少なくとも７０倍大きい、少なくとも８０倍大きい、少なくとも９０倍大きい、少なくとも１００倍大きい、または少なくとも１０００倍以上大きい値であり得る。抗体の標的タンパク質に対する親和性は、例えば、約１００ナノモル（ｎＭ）〜約０．１ｎＭ、約１００ｎＭ〜約１ピコモル（ｐＭ）、または約１００ｎＭ〜約１フェムトモル（ｆＭ）、またはこれ超であり得る。本明細書で使用される場合、「結合力」という用語は、２つ以上の試薬からなる複合体の希釈後の解離に対する抵抗を意味する。用語の「免疫反応性の」および「優先的に結合する」は、抗体および／または抗原結合フラグメントに関して、本明細書では同じ意味で用いられる。
【００２９】
用語の「結合」は、例えば、共有結合、静電気的結合、疎水性結合、およびイオン性および／または塩橋および水架橋などの相互作用を含む水素結合相互作用による２つの分子間の直接結合を意味する。非特異的結合は、約１０−７Ｍ未満の親和性での結合、例えば、１０−６Ｍ、１０−５Ｍ、１０−４Ｍなどの結合を意味する。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「ヒンジ領域」という用語は、隣接ポリペプチド領域に構造的可撓性および間隔を与え、天然または合成ポリペプチドから構成できる可撓性ポリペプチドコネクター領域（本明細書では、「ヒンジ」または「スペーサー」とも呼ばれる）を意味する。免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ１）由来の「ヒンジ領域」は通常、ヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６からＰｒｏ２３０までの伸張として定義される（Ｂｕｒｔｏｎ（１９８５）Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２２：１６１−２０６）。他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、重鎖間ジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合を形成している最初と最後のシステイン残基を同じ位置に配置することにより、ＩｇＧ１配列と整列させることができる。ヒンジ領域は、限定されないが、米国特許第５，６７７，４２５号に記載の改変ヒンジ領域を含む天然または非天然のものであってよい。ヒンジ領域は、異なるクラスまたはサブクラスの抗体由来の、ＣＨ１ドメインのヒンジ領域からの完全ヒンジ領域を含み得る。用語の「ヒンジ領域」はまた、ＣＤ８、ＣＤ２８、または隣接領域に可撓性および間隔を与えるという類似の機能を提供する他の受容体由来の領域も含み得る。
【００３１】
「単離された」ポリペプチドは、その天然環境の成分から特定および分離および／または回収されたポリペプチドである。その天然の環境の混入成分は、ポリペプチドに対する診断または治療的使用と干渉する可能性がある物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含み得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、（１）ローリー法で測定して抗体の重量の、９０重量％超、９５重量％超、または９８重量％超まで、例えば、９９重量％超まで、（２）Ｎ末端の少なくとも１５残基またはスピニングカップ配列決定機器を用いて内部アミノ酸配列を得るのに十分な程度まで、または（３）還元または非還元条件下でクーマシーブルーまたは銀染色を用いて、ナトリウムドデシルスルフェート−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による均質性まで精製される。単離ポリペプチドには、ポリペプチドの天然環境の少なくとも１つの成分が存在しないと思われるので、組み換え細胞内のインサイツポリペプチドが含まれる。いくつかの事例では、単離ポリペプチドは、少なくとも１つの精製ステップにより調製される。
【００３２】
本明細書で使用される場合、用語の「免疫細胞」は通常、骨髄中で生成される造血幹細胞（ＨＳＣ）から誘導される白血球細胞（白血球）を含む。「免疫細胞」は、例えば、リンパ球（Ｔ細胞（すなわち、Ｔリンパ球）、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）（ＣＤ３−ＣＤ５６＋）細胞）および骨髄由来細胞（好中球、好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ、樹状細胞）を含む。「Ｔ細胞」は、Ｔヘルパー細胞（ＣＤ４＋細胞）細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋細胞）、Ｔ調節細胞（Ｔｒｅｇ）およびγδ  Ｔ細胞、ならびにＮＫ  Ｔ細胞（ＣＤ３＋およびＣＤ５６＋）を含む全てのタイプのＣＤ３を発現している免疫細胞を含む。当業者なら、本開示を通して使用されるＴ細胞および／またはＮＫ細胞が、Ｔ細胞のみ、ＮＫ細胞のみ、または両Ｔ細胞およびＮＫ細胞を含むことができることを理解するであろう。本明細書で提供される特定の例示的実施形態および態様では、Ｔ細胞は活性化され、形質導入される。さらに、本明細書で提供される特定の例示的組成物の実施形態および態様では、Ｔ細胞が提供される。「細胞傷害性細胞」は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫ−Ｔ細胞、γδ  Ｔ細胞、および好中球が含まれ、これらは、細胞傷害性応答を媒介できる細胞である。
【００３３】
本明細書で使用される場合、用語の「幹細胞」は通常、多能性または多能性幹細胞を含む。「幹細胞」には、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ）；間葉系幹細胞（ＭＳＣ）；人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）；および方向付けされた前駆細胞（造血幹細胞（ＨＳＣ）；骨髄由来細胞、など）が含まれる。
【００３４】
本明細書で使用される場合、別段の指示がない限り、用語の「Ａｘｌ」は、霊長類（例えば、ヒト）およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来のいずれかの天然のＡｘｌを意味する。この用語は、「完全長」のプロセッシングされていないＡｘｌ、ならびに細胞中でのプロセッシングから生じた任意の形態のＡｘｌを包含する。この用語はまた、天然のＡｘｌバリアント、例えば、スプライスバリアントまたはアレルバリアントを包含する。ヒトＡｘｌのアミノ酸配列は当該技術分野において周知であり、ジェンバンクなどの公開データベースから入手可能である。
【００３５】
本明細書で使用される場合、用語の「Ａｘｌ活性化」は、Ａｘｌ受容体の活性化、またはリン酸化を意味する。一般に、Ａｘｌ活性化は、シグナル伝達（例えば、Ａｘｌまたは基質ポリペプチド中のチロシン残基をリン酸化するＡｘｌ受容体の細胞内キナーゼドメインにより引き起こされるシグナル伝達）をもたらす。Ａｘｌ活性化は、目的のＡｘｌ受容体に結合するＡｘｌリガンド（Ｇａｓ６）により媒介され得る。Ｇａｓ６のＡｘｌへの結合は、Ａｘｌのキナーゼドメインを活性化し、それにより、Ａｘｌ中のチロシン残基のリン酸化および／またはさらに、基質ポリペプチド中のチロシン残基のリン酸化を生じる。
【００３６】
本明細書で使用される場合、用語の「Ａｘｌ媒介抗アポトーシス」は、ヒト細胞、好ましくは、限定されないが、ヒト癌細胞のプログラム細胞死（アポトーシス）を妨げる全てのＡｘｌ関与プロセスを意味する。特に、Ａｘｌ媒介抗アポトーシスは、成長因子の撤退、低酸素、化学療法剤もしくは放射線への曝露、またはＦａｓ／Ａｐｏ−１受容体媒介シグナル伝達の開始による、ヒト細胞、好ましくは、限定されないが、ヒト癌細胞のアポトーシス誘導を防止するプロセスを意味し、好ましくは、Ａｘｌリン酸化および／またはＡｘｌ媒介シグナル伝達を含む、Ａｘｌの非触媒的または触媒活性により刺激または媒介される。
【００３７】
本明細書で使用される場合、用語の「Ｒｏｒ２」は、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体２を意味し、これは、インビトロプロテインキナーゼ活性を有する９４３アミノ酸のタンパク質と予測されており、ジェンバンク受入番号ＡＡＩ３０５２３に示されている。多くの系統限定受容体チロシンキナーゼは、最初に、既知の受容体に相同な「オーファン（ｏｒｐｈａｎ）」と見なされ、その後になって初めて、それらの未知の増殖因子を特定するために使用された。ＤｅＣｈｉａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）は、Ｒｏｒ２によりコードされる１つのこのようなオーファンを特定した。
【００３８】
本明細書で用いられる場合、用語の「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」などは、所望の薬理学的および／または生理的な効果を得ることを意味する。効果は、疾患またはその症状を完全にまたは部分的に防ぐという観点からの予防であってもよく、および／または疾患および／または疾患が原因の有害作用の部分的または完全治癒の観点からの治療であってもよい。本明細書で用いられる場合、「治療」は、ヒトなどの哺乳動物における疾患のなんらかの治療を包括し、（ａ）疾患に罹りやすいがまだそれとは診断されていない対象の疾患の発症を防ぐこと；（ｂ）疾患を抑制すること、すなわち、その発症を阻止すること；および（ｃ）その疾患を軽減すること、すなわち、その疾患を退行させること、を含む。
【００３９】
本明細書で同じ意味で用いられる用語の「個体」、「対象」、「宿主」、および「患者」は、限定されないが、ヒト、マウス（例えば、ラット、マウス）、ウサギ類（例えば、ウサギ）、非ヒト霊長類、ヒト、イヌ、ネコ、有蹄動物（例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ）、などを含む哺乳動物を意味する。
【００４０】
「治療有効量」または「有効量」は、疾患の治療のために哺乳動物またはその他の対象に投与する場合、疾患に対しこのような治療に影響を及ぼすのに十分な薬剤の量、または２種の薬剤の組み合わせた量を意味する。「治療有効量」は、薬剤、疾患、およびその重症度ならびに、治療される対象の年齢、体重、などに応じて変化する。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「進化（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）」、または「進化（ｅｖｏｌｖｉｎｇ）」という用語は、１種または複数の変異誘発法を使用して、それ自体改善された生体分子である、および／または別の改善された生体分子の生成に寄与する、異なるポリペプチドをコードする異なるポリヌクレオチドを生成することを意味する。
【００４２】
「生理学的」または「正常な」または「正常な生理的」条件は、限定されないが、温度、ｐＨ、浸透圧、オスモル濃度、酸化ストレスおよび電解質濃度、ならびにその他のパラメーターなどの、投与部位で、または作用部位の組織または臓器で、対象にとって正常な範囲内であると見なされる条件である。
【００４３】
本開示ならびに本明細書で提供される態様および実施形態は、無論、変更可能であるので、開示された特定の実施例に限定されないことを理解されたい。また、本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるものであるから、本明細書で使用される用語は、特定の実施例および実施形態を開示することのみを目的とするものであり、制限することを意図していないことも理解されたい。
【００４４】
値の範囲が提供される場合、文脈上別段の明確な記載がない限り、その範囲の上限および下限と、規定範囲の任意のその他の規定値または介在値との間の各介在値は、下限の単位の１０分の１まで本発明に包含されることを理解されたい。これらのより小さい範囲の上限値と下限値は、独立に、より小さい範囲に含まれてもよく、また、表示された範囲内のいずれかの特別に除外される範囲の存在を条件として、本発明の範囲内に包含される。示した範囲がその限界値の片方または両方を含む場合、それらの含まれる限界値のいずれかまたは両方を除外する範囲も本発明に含まれる。
【００４５】
特に断らなければ、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者により一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと同様または同等の任意の方法および材料を、本発明を実施または試験するためにも使用することが可能であるが、好ましい方法および材料を以下に記載する。引用された出版物に関連する方法および／または材料を開示し、説明するために、本明細書で言及の全ての出版物は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００４６】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、他に明記されない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は複数の指示物を含むことに留意しなければならない。従って、例えば、「キメラ抗原受容体」に対する言及は、複数のこのようなキメラ抗原受容体および当業者に既知のその等価物、等を含む。さらに、任意の選択要素を排除するよう請求項を作成してもよいことにも留意されたい。そのため、この記述は、特許請求の範囲の要素の記述と関連して「唯一（ｓｏｌｅｌｙ）」、「のみ（ｏｎｌｙ）」などの限定的用語を使用するための、または「否定的な」限定を使用するための先行詞となることが意図される。
【００４７】
明確にするため別個の実施形態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴が、単一の実施形態に組み合わせて提供され得ることは分かるであろう。逆に、簡潔にするために、単一の実施形態に照らして説明されている本発明の種々の特徴は、別々にまたは任意の好適な副組み合わせで提供してもよい。本発明に関連する実施形態の全ての組み合わせは、本発明により具体的に包含され、あたかもそれぞれおよび全ての組み合わせが個々に、および明示的に開示されるかのように、本明細書で開示される。さらに、種々の実施形態およびその要素の全ての副組合わせはまた、本発明により具体的に包含され、あたかもそれぞれおよび全ての副組み合わせが個々に、および明示的に本明細書で開示されるかのように、本明細書で開示される。
【００４８】
詳細な説明
本明細書で開示される態様および実施形態は、一態様では、Ａｘｌおよび／またはＲｏｒ２に結合するための条件的活性型キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供することにより、現在の治療法のオフ腫瘍効果の問題を克服する。Ａｘｌおよび／またはＲｏｒ２に結合するためのＣＡＲは、腫瘍環境中では活性であるが、正常な生理学的組織／臓器では活性ではない。Ａｘｌおよび／またはＲｏｒ２に結合するためにＣＡＲの種々の実施形態に加えて、本明細書で提供されるのは、本明細書で提供されるいずれかのＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む核酸の実施形態、ならびに、いずれかのＣＡＲを発現するためのウイルス構築物、少なくとも１つのウイルス構築物に感染した細胞、ならびに、ＣＡＲを発現する組み換え細胞である。本開示のＣＡＲは、各種方法で使用でき、これらの方法はまた、本開示のＣＡＲをコードする組換えウイルスベクターなどの発現ベクターのＴ細胞および他の細胞傷害性細胞への感染方法と一緒に、提供される。
【００４９】
キメラ抗原受容体
本開示は、本明細書では、簡略化のために「ＣＡＲ」と呼ばれる、キメラ抗原受容体を提供する。例示的実施形態では、本開示のＣＡＲは、ＡｘｌまたはＲｏｒ２に結合し、さらなる例示的実施形態では、ＣＡＲは、ＡｘｌまたはＲｏｒ２に条件的活性方式で結合する。特定の例示的実施形態では、本明細書で提供されるＣＡＲは、ａ）ｐＨ７．４と比較して、ｐＨ６．７で増大した結合を示す、少なくとも１つの条件的活性型抗原特異的標的化領域（ＡＳＴＲ）；ｂ）膜貫通ドメイン；およびｃ）細胞内活性化ドメインを含む。例示的実施形態では、ＣＡＲの抗原特異的標的化領域は、抗ＡＸｌまたは抗Ｒｏｒ２抗体の条件的活性型ｓｃＦｖ部分である。さらに、例示的実施形態では、ＡＳＴＲは、正常な生理的環境に比べて、腫瘍環境中またはインビトロ腫瘍代替アッセイ条件中で活性の増加を示す。
【００５０】
本開示のＣＡＲは、真核細胞、例えば、哺乳動物細胞の細胞膜中に存在でき、好適な哺乳動物細胞には、限定されないが、細胞傷害性細胞、Ｔリンパ球、幹細胞、幹細胞の子孫、前駆細胞、前駆細胞の子孫、およびＮＫ細胞、ＮＫ−Ｔ細胞、およびマクロファージが含まれる。真核細胞の細胞膜中に存在する場合、本開示のＣＡＲは、特定の条件下でＡＳＴＲに結合する、Ａｘｌおよび／またはＲｏｒ２の存在下で活性である。ＡｘｌおよびＲｏｒ２は、特異的結合対の第２のメンバーである。特異的結合対のＡｘｌおよび／またはＲｏｒ２は、可溶性（例えば、細胞に結合しない）因子；標的細胞などの細胞の表面上に存在する因子；固体表面上に提示された因子；脂質二重層中に存在する因子；などであり得る。ＡＳＴＲが抗体である場合、特異的結合対の第２のメンバーは抗原であり、抗原は、可溶性（例えば、細胞に結合しない）抗原；標的細胞などの細胞の表面上に存在する抗原；固体表面上に提示された抗原；脂質二重層中に存在する抗原；などであり得る。
【００５１】
いくつかの事例では、本開示のＣＡＲは、真核細胞の細胞膜中に存在し、Ａｘｌおよび／またはＲｏｒ２により活性化される場合、細胞中の少なくとも１つの核酸の発現を増大させる。例えば、いくつかの事例では、真核細胞の細胞膜中に存在する場合、本開示のＣＡＲは、Ａｘｌおよび／またはＲｏｒ２により活性化される場合、Ａｘｌおよび／またはＲｏｒ２の非存在下の核酸の転写のレベルに比べて、細胞中の少なくとも１つの核酸の発現を、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、または１０倍超、増大させる。
【００５２】
一例として、本開示のＣＡＲは、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）含有細胞内シグナル伝達ポリペプチドを含むことができ；このような場合には、本開示のＣＡＲは、真核細胞の細胞膜中に存在し、Ａｘｌおよび／またはＲｏｒ２により活性化される場合、活性化Ｔ細胞の核因子（ＮＦＡＴ）依存性転写を増大させる。ＮＦＡＴ依存性転写には、ＮＦＡＴファミリーの任意のメンバー、例えば、ＮＦＡＴｅｌ、ＮＦＡＴｃ２、ＮＦＡＴｃ３、ＮＦＡＴｃ４、ＮＦＡＴ５；ＡＰ−１；Ｓｐｌ；ＮＫＫＢ；などにより誘導される転写が含まれる。
【００５３】
本開示のＣＡＲは、真核細胞の細胞膜中に存在し、ＡｘｌまたはＲｏｒ２により活性化される場合、いくつかの事例では、細胞中の１つまたは複数のサイトカインの生成の増大をもたらす。例えば、真核細胞の細胞膜中に存在する場合、本開示のＣＡＲは、ＡｘｌまたはＲｏｒ２により活性化される場合、Ａｘｌおよび／またはＲｏｒ２の非存在下の細胞により生成されるサイトカインの量に比べて、細胞によるサイトカインの生成を、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、または１０倍超、増大させ得る。いくつかの実施形態では、真核細胞の細胞膜中に存在する場合、本開示のＣＡＲは、Ａｘｌおよび／またはＲｏｒ２により活性化される場合、Ａｘｌおよび／またはＲｏｒ２の非存在下で細胞により分泌されるサイトカインの量に比べて、細胞によるサイトカインの分泌を、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、または１０倍超、増大させ得る。生成が増大され得るサイトカインには、限定されないが、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−ａ）、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０；ケモカイン；増殖因子；などが挙げられる。
【００５４】
いくつかの事例では、本開示のＣＡＲは、真核細胞の細胞膜中に存在する場合、およびＡｘｌおよび／またはＲｏｒ２により活性化される場合、細胞中の核酸の転写の増大、細胞による、サイトカインの生成の増大、およびサイトカインの分泌の増大を生じ得る。
【００５５】
いくつかの事例では、本開示のＣＡＲは、真核細胞の細胞膜中に存在し、Ａｘｌおよび／またはＲｏｒ２により活性化される場合、その細胞表面上に、ＣＡＲの第１のポリペプチドの抗原結合ドメインが結合する抗原を発現する標的細胞に対する、細胞による細胞傷害活性を生ずる。例えば、真核細胞が細胞傷害性細胞（例えば、ＮＫ細胞または細胞傷害性Ｔリンパ球）である場合、本開示のＣＡＲは、真核細胞の細胞膜中に存在し、Ａｘｌおよび／またはＲｏｒ２により活性化される場合、その細胞表面上に、Ａｘｌおよび／またはＲｏｒ２を発現する標的細胞に対する、細胞の細胞傷害活性を増大させる。例えば、真核細胞がＮＫ細胞またはＴリンパ球である場合、本開示のＣＡＲは、細胞の細胞膜中に存在する場合、およびＡｘｌおよび／またはＲｏｒ２により活性化される場合、Ａｘｌおよび／またはＲｏｒ２の非存在下の細胞傷害活性に比べて、細胞の細胞傷害活性を、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、または１０倍超、増大させる。
【００５６】
いくつかの事例では、本開示のＣＡＲは、真核細胞の細胞膜中に存在し、Ａｘｌおよび／またはＲｏｒ２により活性化される場合、増殖および増大（細胞分裂の増大または抗アポトーシス性応答に起因して）などの他のＣＡＲ活性化関連事象をもたらし得る。
【００５７】
いくつかの事例では、本開示のＣＡＲは、真核細胞の細胞膜中に存在し、Ａｘｌおよび／またはＲｏｒ２により活性化される場合、細胞内シグナル伝達調節、細胞分化、または細胞死などの他のＣＡＲ活性化関連事象をもたらし得る。
【００５８】
本開示のＣＡＲは、真核細胞膜中に存在でき、そこでは、ＣＡＲの第１と第２のポリペプチドは、相互に共有結合していない。本開示のＣＡＲは、膜中のいずれか他のポリペプチドと共有結合していない単一ヘテロダイマーとして真核細胞膜中に存在できる。あるいは、本開示の第１のＣＡＲは、本開示の第２のＣＡＲに共有結合または非共有結合しているヘテロダイマーとして真核細胞膜中に存在できる。いくつかの事例では、第１のおよび第２のＣＡＲは、第１のＣＡＲの第１のポリペプチドと第２のＣＡＲの第１のポリペプチドの両方中に存在するヒンジ領域中に存在するシステイン間で形成されるジスルフィド結合を介して共有結合される。
【００５９】
いくつかの事例では、本開示のＣＡＲは、真核細胞膜中に存在でき、そこで、ＣＡＲの第１のポリペプチドは抗体フラグメントを含み、ＣＡＲの第２のポリペプチドはサイトカイン受容体由来のシグナル伝達ドメインを含み、それにより、ダイマー化時に、ＣＡＲは、ヘテロダイマーシグナロボディ（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ−ｓｉｇｎａｌｏｂｏｄｙ）ＣＡＲ、例えば、少なくとも２種の独立したポリペプチドから構成されるシグナロボディとなる。当該技術分野において既知の「シグナロボディ」は、抗体フラグメントおよびサイトカイン受容体由来のシグナル伝達ドメインから構成される単一キメラ高分子である。特定の事例では、本開示のヘテロダイマーシグナロボディＣＡＲは、真核細胞の細胞膜中に存在する場合、二量体化剤により二量体化され、抗原、例えば、オリゴマー化抗原により活性化されて、ヘテロダイマーシグナロボディＣＡＲのオリゴマー化を誘導し得る。このようなヘテロダイマーシグナロボディＣＡＲのリガンド誘導オリゴマー化は、活性化、例えば、増大させ得る、または永続化、例えば、維持し得る。シグナル伝達、例えば、ヘテロダイマーシグナロボディＣＡＲのリガンド誘導オリゴマー化は、細胞応答を誘発するシグナルを伝達し得る。いくつかの事例では、複数のヘテロダイマーシグナロボディＣＡＲを組み合わせて利用して、目的の細胞応答を誘発し得る。
【００６０】
抗原特異的標的化領域
本開示のＣＡＲは、特異的結合対のメンバーを含み、これは通常、ＡＳＴＲである。特異的結合対には、限定されないが、抗原−抗体結合対；リガンド−受容体結合対；などが含まれる。したがって、本開示のＣＡＲでの使用に好適する特異的結合対のメンバーには、抗体、抗原、リガンド、リガンドの受容体結合ドメイン、受容体、受容体のリガンド結合ドメイン、およびアフィボディであるＡＳＴＲを含む。
【００６１】
本開示のＣＡＲでの使用に好適するＡＳＴＲは、任意の抗原結合ポリペプチドであり得る。特定の実施形態では、ＡＳＴＲは、完全長抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、（Ｆａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、および二価の単鎖抗体またはダイアボディなどの抗体である。
【００６２】
いくつかの実施形態では、ＡＳＴＲは、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦＶ）である。いくつかの実施形態では、重鎖は、ＣＡＲの軽鎖のＮ末端に配置される。他の実施形態では、軽鎖は、ＣＡＲの重鎖のＮ末端に配置される。いずれかの開示実施形態では、重鎖および軽鎖は、本明細書でより詳細に考察されるように、リンカーにより分離され得る。いずれかの開示実施形態では、重鎖または軽鎖は、ＣＡＲのＮ−末端にあってよく、通常、シグナル配列またはペプチドなどの別のドメインのＣ末端にある。
【００６３】
その他の抗体ベース認識ドメイン（ｃＡＢ  ＶＨＨ（ラクダ抗体可変ドメイン）およびヒト化バージョン、ＩｇＮＡＲ  ＶＨ（サメ抗体可変ドメイン）およびヒト化バージョン、ｓｄＡｂ  ＶＨ（単一ドメイン抗体可変ドメイン）および「ラクダ化」抗体可変ドメインが、ＣＡＲおよび本開示のＣＡＲを用いた方法で使用するのに好適する。いくつかの事例では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ベース認識ドメイン、例えば、単鎖ＴＣＲ（ｓｃＴｖ、ＶαＶβ含有単鎖２ドメインＴＣＲ）も使用に好適する。
【００６４】
条件的活性型生物学的ＣＡＲ（ＣＡＢ−ＣＡＲ）
本開示のＣＡＲは通常、条件的活性型である。この特性は通常、ＣＡＲのＡＳＴＲドメインの条件的活性型性質の結果である。例示的実施形態では、本開示のＣＡＢ−ＣＡＲは、非腫瘍微小環境中の条件下より、腫瘍微小環境中の条件下で、ＡｘｌまたはＲｏｒ２に対しより高い結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、腫瘍微小環境中の条件および非腫瘍微小環境中の条件は、両方ｐＨである。したがって、ＣＡＢ−ＣＡＲは、典型的には、ＣＡＢ−ＣＡＲが、正常な生理的環境中で遭遇するｐＨである、７．２〜７．８のｐＨに比べて、腫瘍微小環境中で遭遇するｐＨである、約６．０〜６．８のｐＨで、ＡｘｌまたはＲｏｒ２に対してより高い結合親和性を有するので、条件的活性型方式でＡｘｌまたはＲｏｒ２に選択的に結合できる。例えば、ＣＡＢ−ＣＡＲは、ｐＨ７．４より、ｐＨ６．７でＡｘｌまたはＲｏｒ２に対し、より高い結合親和性を有し得る。追加でまたは代わりに、ＣＡＢ−ＣＡＲは、ｐＨ７．４より、ｐＨ６．０で、ＡｘｌまたはＲｏｒ２に対してより高い結合親和性を有し得る。このような条件は、下記でより詳細に記載したように、正常な生理学的組織中の対応する条件とは異なるインビボ腫瘍環境中で見つけられる１つまたは複数の条件下で、例えば、抗原結合および／またはＣＡＲ活性（例えば、細胞溶解）を試験するインビトロ腫瘍代替アッセイで試験できる。例えば、インビトロ腫瘍代替アッセイ条件は、生理学的ｐＨ（７．２〜７．８）に比べて、低ｐＨ（例えば、６．０〜６．８）であり得る。例示的実施例では、腫瘍代替アッセイ条件は、６．７のｐＨであり、一方、対応する生理学的ｐＨは７．４である。
【００６５】
いくつかの実施形態では、ＣＡＢ−ＣＡＲは、生理的条件下で特定された抗体のＶＨおよび／またはＶＬ（すなわち、親、「野生型」または「ｗｔ」抗体）を特定することにより得ることができる。抗体をその後、変異させて、試験できる（進化させる）。当業者なら、米国特許第８，７０９，７５５号で開示の条件的活性型抗体を特定する方法を利用して、本開示のＣＡＢ−ＣＡＲのためのＡＳＴＲで使用できる追加の条件的活性型抗体および抗体フラグメントを特定できる。相補性決定領域（ＣＤＲ）は、ＶＨおよびＶＬの相互作用により形成された３次元構造である。出発点（「ｗｔ」抗体）の結合特異性を変えるために、ＶＨ／ＶＬの片方または両方を変異されることにより、ＣＡＢ−ＣＡＲのＣＡＢ活性につながり得ることを予測することは理にかなっている。条件的活性型抗体を生成するために、ＶＨおよびＶＬの両方を典型的に生理的条件下で特定し、その後、ＶＨまたはＶＬまたはより典型的には、ＶＨおよびＶＬの両方を変異させ、６．０〜６．７のｐＨなどの非生理的条件下、または腫瘍微小環境の別の条件下で試験して、条件的活性型抗体を生成する。
【００６６】
野性型抗体のＶＨおよび／またはＶＬ領域をコードする核酸を、既知の方法を使用してクローニングできる。このような野性型ＶＨおよびＶＬ領域のバリアントはその後、重鎖および軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列中に改変を導入することにより調製できる。このような改変には、例えば、抗体または抗体フラグメントのアミノ酸配列内の残基からの欠失、および／またはそこへの挿入および／またはその置換が含まれる。欠失（単一または複数）、挿入（単一または複数）、および置換（単一または複数）の任意の組み合わせを実施して、条件的活性型抗体フラグメントに到達できる。
【００６７】
条件的活性型ＡＳＴＲの作製および／または単離の詳細な方法は、本明細書の別のセクションで提供される。
【００６８】
Ａｘｌを標的とする条件的活性型ＡＳＴＲ
本明細書で提供される種々の態様のいずれかの例示的実施形態は、７．４のｐＨに比べて、６．７のｐＨでＡｘｌタンパク質に特異的に結合する条件的活性型ＡＳＴＲを有するＣＡＲを含む。このようなＡＳＴＲおよびこのようなＡＳＴＲを含むＣＡＲの例は、本明細書の実施例で提供される。特定の実施形態では、ＡＳＴＲは、配列番号７９の重鎖および配列番号８０の軽鎖を含む抗体と同じＡｘｌのエピトープに結合する。例示的実施形態では、ＡＳＴＲは、配列番号７９の抗体重鎖および配列番号８０の抗体軽鎖を含む単鎖可変抗体フラグメントと同じＡｘｌのエピトープに結合する。
【００６９】
ＡＳＴＲは、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、（Ｆａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、および二価の単鎖抗体またはダイアボディであり得る。例示的実施形態では、Ａｘｌに結合する条件的活性型ＡＳＴＲは、重鎖および軽鎖を含む単鎖可変フラグメントである。
【００７０】
ＡＳＴＲが、Ａｘｌに結合し、例示的実施形態において、配列番号７９の抗体重鎖および配列番号８０の抗体軽鎖を含む単鎖可変抗体フラグメントと同じエピトープに結合するいくつかの実施形態では、重鎖可変領域は、３つの相補性決定領域を含むことができ、前記領域は、配列Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３を有し、
Ｈ１配列は、Ｘ１ＧＸ２ＴＭＮ（配列番号８７）であり；
Ｈ２配列は、ＬＩＫＰＳＮＧＧＴＳＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号８８）であり；および
Ｈ３配列は、ＧＸ３ＹＸ４ＳＹＸ５ＡＭＤＹ（配列番号８９）であり、Ｘ１はＴまたはＷであり；Ｘ２はＨまたはＡであり；Ｘ３はＨまたはＤであり；Ｘ４はＥまたはＨであり；およびＸ５はＥまたはＦである。
【００７１】
ＡＳＴＲが、Ａｘｌに結合し、例示的実施形態において、直ぐ上の重鎖実施形態を含む、配列番号７９の抗体重鎖および配列番号８０の抗体軽鎖を含む単鎖可変抗体フラグメントと同じエピトープに結合するいくつかの実施形態では、ＡＳＴＲは、３つの相補性決定領域を含む軽鎖可変領域を含むことができ、前記領域は、配列Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３を有し、
Ｌ１配列は、ＫＡＳＱＤＶＸ６ＳＡＶＡ（配列番号９０）であり；
Ｌ２配列は、ＷＸ７Ｘ８ＴＲＸ９Ｔ（配列番号９１）であり；および
Ｌ３配列は、ＱＥＨＦＳＸ１０ＰＬＸ１１（配列番号９２）であり；
Ｘ６はＳまたはＶであり；Ｘ７はＡまたはＱであり；Ｘ８はＳまたはＤであり；Ｘ９はＨまたはＤであり；Ｘ１０はＴまたはＰであり；およびＸ１１はＴまたはＲである。
【００７２】
ＡＳＴＲが、Ａｘｌに結合し、例示的実施形態において、配列番号７９の抗体重鎖および配列番号８０の抗体軽鎖を含む単鎖可変抗体フラグメントと同じエピトープに結合するいくつかの実施形態では、重鎖可変領域は、３つの相補性決定領域を含むことができ、前記領域は、配列Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３を有し、
Ｈ１配列は、Ｘ１ＧＸ２Ｘ３ＭＸ４（配列番号１３４）であり；
Ｈ２配列は、ＬＩＫＸ５ＳＮＧＧＴＸ６ＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号１３５）であり；および
Ｈ３配列は、ＧＸ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４ＤＹＸ１５Ｘ１６（配列番号１３６）であり、
Ｘ１はＴ、Ａ、またはＷであり；Ｘ２はＨまたはＡであり；Ｘ３はＴまたはＩであり；Ｘ４はＮまたはＩであり；Ｘ５はＰまたはＮであり；Ｘ６はＳ、Ｉ、またはＴであり；Ｘ７はＨ、Ｄ、Ｅ、Ｐ、Ｒ、またはＷであり；Ｘ８はＹまたはＮであり；Ｘ９はＥ、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｒ、Ｖ、またはＹであり；Ｘ１０はＳ、Ｄ、Ｍ、Ｎ、またはＱであり；Ｘ１１はＹ、Ｃ、Ｅ、またはＰであり；Ｘ１２はＦ、Ｅ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、またはＶであり；Ｘ１３はＡ、Ｄ、Ｇ、Ｌ、またはＹであり；Ｘ１４はＭ、Ｅ、またはＦであり；Ｘ１５はＷ、Ａ、Ｄ、Ｈ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、またはＴであり；およびＸ１６はＧまたはＨである。
【００７３】
ＡＳＴＲが、Ａｘｌに結合し、例示的実施形態において、直ぐ上の重鎖実施形態を含む、配列番号７９の抗体重鎖および配列番号８０の抗体軽鎖を含む単鎖可変抗体フラグメントと同じエピトープに結合するいくつかの実施形態では、ＡＳＴＲは、３つの相補性決定領域を含む軽鎖可変領域を含むことができ、前記領域は、配列Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３を有し、
Ｌ１配列は、ＫＡＳＱＤＸ１７Ｘ１８ＳＸ１９ＶＸ２０（配列番号１３７）であり；
Ｌ２配列は、Ｘ２１Ｘ２２Ｘ２３ＴＲＸ２４Ｔ（配列番号１３８）であり；および
Ｌ３配列は、ＱＥＸ２５Ｘ２６ＳＸ２７Ｘ２８Ｘ２９Ｘ３０（配列番号１３９）であり、
Ｘ１７はＶ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、またはＷであり；Ｘ１８はＳまたはＶであり；Ｘ１９はＡ、Ｌ、またはＭであり；Ｘ２０はＡ、Ｄ、Ｎ、またはＱであり；Ｘ２１はＷまたはＦであり；Ｘ２２はＡ、Ｉ、Ｎ、Ｐ、またはＱであり；Ｘ２３はＳまたはＤであり；Ｘ２４はＨまたはＤであり；Ｘ２５はＨ、Ｃ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＹであり；Ｘ２６はＦ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｎ、またはＳであり；Ｘ２７はＴ、Ｃ、またはＰであり；Ｘ２８はＰ、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＷであり；Ｘ２９はＬ、Ｇ、またはＲであり；およびＸ３０はＴ、Ｉ、またはＲである。
【００７４】
特定の例示的実施形態では、ＡＳＴＲは、配列番号８０の軽鎖可変領域および／または配列番号７９の重鎖可変領域を含む。これらの例示的実施形態は、軽鎖に対する重鎖Ｎ末端または重鎖に対する軽鎖Ｎ末端を含むことができる。例示的実施形態では、抗ＡＸｌ  ＡＳＴＲは、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１５９、配列番号１６０、または配列番号１６１のいずれかの配列を含み得る。
【００７５】
これらの抗ＡＸｌ実施形態のいずれかの重鎖および軽鎖は、２つの可変領域を含み、この可変領域は通常、リンカーにより分離されている。リンカーは、６〜１００アミノ酸長さであり得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、リンカー１（配列番号５３）、リンカー２（配列番号５４）、またはリンカー３（配列番号５５）である。例示的実施形態では、２つの可変領域は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域である。重鎖または軽鎖のいずれかは、ＡＳＴＲ上の他のものに対するＮ末端に位置することができる。特定の例示的実施形態では、重鎖は、軽鎖に対しＮ末端である。
【００７６】
ｐＨ７．４に比べて、ｐＨ６．７でＡｘｌに対する結合が増大した例示的条件的活性型ＣＡＲ（ＣＡＢ−ＣＡＲ）は、本明細書の実施例１で見つけられる。例示的実施形態では、ＣＡＲまたはＡＳＴＲは、配列番号７９の抗体重鎖および配列番号８０の抗体軽鎖を含む単鎖可変抗体フラグメントと同じＡｘｌのエピトープに結合できる。このような例示的実施形態のさらなる実施形態では、抗ＡＸｌ  ＣＡＲまたはＡＳＴＲは、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含むか、または単鎖可変フラグメントである。さらなる例示的実施例では、抗ＡＸｌ  ｓｃＦｖは、軽鎖に対しＮ末端である重鎖または重鎖に対しＮ末端である軽鎖を含む。ＣＡＲを含み、例示的実施形態において、配列番号７９の抗体重鎖および配列番号８０の抗体軽鎖を含む抗体と同じＡｘｌのエピトープに結合する本明細書の実施形態のいずれかでは、ＡＳＴＲは、配列番号１２８、１２９、１５９、１６０、または１６１のいずれかを含み得る。さらに、本明細書の実施形態のいずれかの抗ＡＸｌ  ＣＡＲは、本明細書で提供されるＣＡＲ成分のいずれかを含み得る。特定の例示的実施形態では、抗ＡＸｌ  ＣＡＲは、表１で記載のＣＡＲ成分を含むことができ、表１のＣＡＲのいずれかであり得る。抗ＡＸｌ  ＣＡＲを含む本明細書の任意の実施形態に関し、より典型的には、ＣＡＲはＣＡＢ−ＣＡＲであり、非限定的例示的実施形態では、ＣＡＲは、例えば、細胞傷害活性を示す表１で提供されるＣＡＢ−ＣＡＲ成分のいずれかおよびＣＡＢ−ＣＡＲのいずれかを含むことができる。例えば、抗ＡＸｌ  ＣＡＢ−ＣＡＲは、ＣＤ８シグナルペプチド、ＣＤ８またはＣＤ２８ストークドメイン／膜貫通ドメイン、ＣＤ１３７、ＩＣΔ共刺激ドメインおよびＣＤ１３７共刺激ドメイン、および／またはＣＤ３Ｚ活性化ドメインを含むことができる。さらに、抗ＡＸｌ  ＣＡＲおよび特に抗ＡＸｌ  ＣＡＢ−ＣＡＲを含む本明細書の実施形態のいずれかの例示的ＣＡＲは、非限定的例示的実施形態では、表１の条件的細胞傷害活性を示す抗ＡＸｌ  ＣＡＢ−ＣＡＲのいずれかを含む。このような例示的ＣＡＢ−ＣＡＲは、表１のＦ１−２−１、Ｆ１−２−２、Ｆ１−２−３、Ｆ１−２−６、Ｆ１−２−８、Ｆ１−２−１０、Ｆ１−２−１３、Ｆ１−２−１４、Ｆ１−２−１５、Ｆ１−２−２２、またはＦ１−２−２３を含む。ＡＳＴＲを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、ＡＳＴＲは、Ｆ１−２−１、Ｆ１−２−２、Ｆ１−２−３、Ｆ１−２−６、Ｆ１−２−８、Ｆ１−２−１０、Ｆ１−２−１３、Ｆ１−２−１４、Ｆ１−２−１５Ｆ１−２−２２、またはＦ１−２−２３のＡＳＴＲを含むことができる。さらに、抗ＡＸｌ  ＣＡＲおよび特に抗ＡＸｌ  ＣＡＢ−ＣＡＲを含む本明細書の実施形態のいずれかの例示的ＣＡＲは、非限定的例示的実施形態では、表１の高い条件的細胞傷害活性を示す抗ＡＸｌ  ＣＡＢ−ＣＡＲのいずれかを含む。このような例示的ＣＡＢ−ＣＡＲは、Ｆ１−２−１３、Ｆ１−２−１５、Ｆ１−２−２２、またはＦ１−２−２３を含む。したがって、ＡＳＴＲを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、ＡＳＴＲは、Ｆ１−２−１、Ｆ１−２−２、Ｆ１−２−３、Ｆ１−２−６、Ｆ１−２−８、Ｆ１−２−１０、Ｆ１−２−１３、Ｆ１−���−１４、Ｆ１−２−１５、Ｆ１−２−２２、またはＦ１−２−２３のＡＳＴＲを含むことができる。
【００７７】
本明細書で開示の重鎖可変領域ポリペプチドおよび軽鎖可変領域ポリペプチドは、米国特許第８．７０９，７５５号で開示の方法を用いて、親抗体重鎖可変領域（配列番号９３）および親抗体軽鎖可変領域（配列番号９４）から特定された。当業者なら、米国特許第８，７０９，７５５号で開示の条件的活性型抗体を特定する方法を利用して、本開示のＣＡＢ−ＣＡＲのためのＡＳＴＲで使用できる追加の条件的活性型抗体および抗体フラグメントを特定できる。
【００７８】
いくつかの実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１１２〜１１４であり得る。いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号１０８〜１１１であり得る。これらの重鎖および軽鎖可変領域は、特異的にＡｘｌに結合できる。これらの重鎖および軽鎖可変領域のいずれか１つを含む抗体は、ｐＨ７．４より、ｐＨ６．７でＡｘｌに対する高い結合親和性を有することが明らかになった。ｐＨ６．７は、腫瘍微小環境中で見出されたｐＨである。ｐＨ７．４は、非腫瘍の正常な生理学的微小環境中で見出されたｐＨである。
【００７９】
ＣＡＲはまた、Ａｘｌに特異的に結合できる配列番号１０８〜１１４の配列の重鎖および軽鎖可変領域のバリアントを含むことができる。これらのバリアントを得るために、重鎖可変領域（Ｈ１〜Ｈ３）の相補性決定領域（ＣＤＲ）および軽鎖可変領域（Ｌ１〜Ｌ３）のＣＤＲは、未変化のままである必要があることが明らかになった。これらの重鎖および軽鎖可変領域のバリアントは、適切な改変を重鎖および軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列中に導入することにより、またはペプチド合成により調製し得る。このような改変には、例えば、抗体または抗体フラグメントのアミノ酸配列内の残基からの欠失、および／またはそこへの挿入および／またはその置換が含まれる。欠失（単一または複数）、挿入（単一または複数）、および置換（単一または複数）の任意の組み合わせを実施して、最終構築物に到達できる。ただし、最終構築物が少なくとも１つの所望の特性、例えば、抗原結合を有するということが前提である。
【００８０】
Ｒｏｒ２を標的とする条件的活性型ＡＳＴＲ
本明細書で提供される種々の態様のいずれかの例示的実施形態は、７．４のｐＨに比べて、６．７のｐＨでＲｏｒ２タンパク質に特異的に結合する条件的活性型ＡＳＴＲを有するＣＡＲを含む。このようなＡＳＴＲおよびこのようなＡＳＴＲを含むＣＡＲの例は、本明細書の実施例で提供される。特定の実施形態では、ＡＳＴＲは、配列番号８２または配列番号８３の重鎖を含む抗体と同じＲｏｒ２のエピトープに結合するか、またはＡＳＴＲは、配列番号１５１の重鎖を含む抗体と同じＲｏｒ２のエピトープに結合する。例示的実施形態では、ＡＳＴＲは、配列番号８２または配列番号８３の抗体重鎖を含む単鎖可変抗体フラグメントと同じＲｏｒ２のエピトープに結合するか、またはＡＳＴＲは、配列番号１５１の抗体重鎖を含む単鎖可変抗体フラグメントと同じＲｏｒ２のエピトープに結合する。例示的実施形態では、ＡＳＴＲは、配列番号８２または配列番号８３の抗体重鎖および配列番号８４の抗体軽鎖を含む単鎖可変抗体フラグメントと同じＲｏｒ２のエピトープに結合するか、またはＡＳＴＲは、配列番号１５１の抗体重鎖および配列番号１５２の抗体軽鎖を含む単鎖可変抗体フラグメントと同じＲｏｒ２のエピトープに結合する。
【００８１】
ＡＳＴＲは、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、（Ｆａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、および二価の単鎖抗体またはダイアボディであり得る。例示的実施形態では、Ｒｏｒ２に結合する条件的活性型ＡＳＴＲは、重鎖および軽鎖を含む単鎖可変フラグメントである。
【００８２】
ＡＳＴＲがＲｏｒ２に結合するいくつかの実施形態では、ＡＳＴＲは、３つの相補性決定領域を有する重鎖可変領域を含むことができ、前記領域は、Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３配列を有し、
Ｈ１配列は、ＧＹＴＸ１ＴＥＸ２ＴＸ３Ｈ（配列番号９５）またはＸ４ＧＹＳＩＴＴＧＹＹＷＮ（配列番号９６）であり；
Ｈ２配列は、ＧＸ５ＮＸ６ＮＮＧＧＴＧＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号９７）またはＹＩＴＹＤＧＳＫＮＹＮＰＳＬＫＮ（配列番号９８）であり；
Ｈ３配列は、ＧＳＬＹＳＹＧＮＳＹＦＤＹ（配列番号９９）またはＦＥＧＶＷＸ７ＧＬＤＹ（配列番号１００）であり、
Ｘ１はＦまたはＥであり；Ｘ２はＹまたはＤ；Ｘ３はＭまたはＤであり；Ｘ４はＴまたはＳであり；Ｘ５はＥまたはＩであり；Ｘ６はＴまたはＤであり；およびＸ７はＹまたはＧである。
【００８３】
ＡＳＴＲが、Ｒｏｒ２に結合し、例示的実施形態において、配列番号１５１の抗体重鎖および配列番号１５２の抗体軽鎖を含む抗体と同じＲｏｒ２のエピトープに結合するいくつかの実施形態では、ＡＳＴＲは、３つの相補性決定領域を有する重鎖可変領域を含むことができ、前記領域は、Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３配列を有し、
Ｈ１配列は、ＧＹＴＸ１ＴＥＸ２ＴＸ３Ｈ（配列番号９５）であり；
Ｈ２配列は、ＧＸ５ＮＸ６ＮＮＧＧＴＧＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号９７）であり；および
Ｈ３配列は、ＧＳＬＹＳＹＧＮＳＹＦＤＹ（配列番号９９）であり、
Ｘ１はＦまたはＥであり；Ｘ２はＹまたはＤ；Ｘ３はＭまたはＤであり；Ｘ５はＥまたはＩであり；およびＸ６はＴまたはＤである。
【００８４】
ＡＳＴＲが、Ｒｏｒ２に結合し、例示的実施形態において、配列番号８２または配列番号８３の抗体重鎖および配列番号８４の抗体軽鎖を含む抗体と同じＲｏｒ２のエピトープに結合するいくつかの実施形態では、ＡＳＴＲは、３つの相補性決定領域を有する重鎖可変領域を含むことができ、前記領域は、Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３配列を有し、
Ｈ１配列は、Ｘ４ＧＹＳＩＴＴＧＹＹＷＮ（配列番号９６）であり；
Ｈ２配列は、ＹＩＴＹＤＧＳＫＮＹＮＰＳＬＫＮ（配列番号９８）であり；および
Ｈ３配列は、ＦＥＧＶＷＸ７ＧＬＤＹ（配列番号１００）であり、
Ｘ４はＴまたはＳであり；およびＸ７はＹまたはＧである。
【００８５】
上記Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３配列を有する重鎖を有するものを含むが、これらに限定されない、ＡＳＴＲがＲｏｒ２に結合するいくつかの実施形態では、ＡＳＴＲは、３つの相補性決定領域を有する軽鎖可変領域を含み、前記領域は、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３配列を有し、
Ｌ１配列は、ＳＡＴＳＳＸ８ＳＹＭＨ（配列番号１０１）またはＲＡＳＥＳＶＤＲＹＧＮＳＦＩＨ（配列番号１０２）であり；
Ｌ２配列は、Ｘ９ＴＳＮＬＡＳ（配列番号１０３）またはＲＴＹＮＬＥＳ（配列番号１０４）であり；および
Ｌ３配列は、ＱＱＲＳＳＹＰＦＴ（配列番号１０５）またはＱＱＴＮＥＤＰＷＴ（配列番号１０６）であり、
Ｘ８はＥまたはＶであり；およびＸ９はＧまたはＨである。
【００８６】
ＡＳＴＲが、Ｒｏｒ２に結合し、例示的実施形態において、配列番号１５１の抗体重鎖および配列番号１５２の抗体軽鎖を含む抗体と同じＲｏｒ２のエピトープに結合するいくつかの実施形態では、ＡＳＴＲは、３つの相補性決定領域を有する軽鎖可変領域を含むことができ、前記領域は、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３配列を有し、
Ｌ１配列は、ＳＡＴＳＳＸ８ＳＹＭＨ（配列番号１０１）であり；
Ｌ２配列は、Ｘ９ＴＳＮＬＡＳ（配列番号１０３）であり；および
Ｌ３配列は、ＱＱＲＳＳＹＰＦＴ（配列番号１０５）であり、
Ｘ８はＥまたはＶであり；およびＸ９はＧまたはＨである。
【００８７】
ＡＳＴＲが、Ｒｏｒ２に結合し、例示的実施形態において、配列番号８２または配列番号８３の抗体重鎖および配列番号８４の抗体軽鎖を含む抗体と同じＲｏｒ２のエピトープに結合するいくつかの実施形態では、ＡＳＴＲは、３つの相補性決定領域を有する軽鎖可変領域を含むことができ、前記領域は、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３配列を有し、
Ｌ１配列は、ＲＡＳＥＳＶＤＲＹＧＮＳＦＩＨ（配列番号１０２）であり；
Ｌ２配列は、ＲＴＹＮＬＥＳ（配列番号１０４）であり；および
Ｌ３配列は、ＱＱＴＮＥＤＰＷＴ（配列番号１０６）である。
【００８８】
ＡＳＴＲがＲｏｒ２に結合するいくつかの実施形態では、ＡＳＴＲは、３つの相補性決定領域を含む重鎖可変領域を含むことができ、前記領域は、Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３配列を有し、
Ｈ１配列は、ＧＹＴＸ１ＴＥＸ２Ｘ３Ｘ４Ｈ（配列番号１４０）またはＧＹＳＩＴＴＧＸ２９ＹＷＮ（配列番号１４１）であり；
Ｈ２配列は、Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＮＮＧＧＴＧＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号１４２）またはＹＩＴＹＤＧＳＸ３０ＮＹＮＰＳＬＫＮ（配列番号１４３）であり；および
Ｈ３配列は、Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１ＳＸ１２ＹＸ１３ＹＸ１４Ｘ１５ＳＹＦＸ１６Ｘ１７Ｘ１８（配列番号１４４）またはＣＳＸ３１Ｘ３２Ｘ３３Ｘ３４ＶＸ３５Ｘ３６Ｘ３７ＬＤＸ３８（配列番号１４５）であり、
Ｘ１はＦまたはＥであり；Ｘ２はＹまたはＤであり；Ｘ３はＴまたはＣであり；Ｘ４はＭ、Ｄ、Ｅ、またはＹであり；Ｘ５はＧまたはＳであり；Ｘ６はＩまたはＥであり；Ｘ７はＮ、Ｃ、Ｌ、またはＶであり；Ｘ８はＴ、ＤまたはＥであり；Ｘ９はＡ、Ｍ、またはＴであり；Ｘ１０はＲまたはＨであり；Ｘ１１はＧまたはＥであり；Ｘ１２はＬまたはＦであり；Ｘ１３はＳまたはＧであり；Ｘ１４はＧまたはＤであり；Ｘ１５はＮまたはＥであり；Ｘ１６はＤまたはＬであり；Ｘ１７はＹ、Ｃ、またはＴであり；Ｘ１８はＷまたはＬであり；Ｘ２９はＹ、Ｅ、Ｒ、またはＴであり；Ｘ３０はＫまたはＮであり；Ｘ３１はＲ、Ｇ、Ｈ、Ｗ、またはＹであり；Ｘ３２はＦ、Ｃ、Ｎ、またはＱであり；Ｘ３３はＥまたはＳであり；Ｘ３４はＧ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｍ、Ｑ、またはＳであり；Ｘ３５はＷ、Ａ、Ｉ、Ｐ、Ｑ、Ｔ、またはＶであり；Ｘ３６はＹ、Ｇ、Ｎ、またはＱであり；Ｘ３７はＧ、Ｓ、またはＴであり；およびＸ３８はＹまたはＩである。
【００８９】
ＡＳＴＲが、Ｒｏｒ２に結合し、例示的実施形態において、配列番号１５１の抗体重鎖および配列番号１５２の抗体軽鎖を含む抗体と同じＲｏｒ２のエピトープに結合するいくつかの実施形態では、ＡＳＴＲは、３つの相補性決定領域を含む重鎖可変領域を含むことができ、前記領域は、Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３配列を有し、
Ｈ１配列は、ＧＹＴＸ１ＴＥＸ２Ｘ３Ｘ４Ｈ（配列番号１４０）であり；
Ｈ２配列は、Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＮＮＧＧＴＧＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号１４２）であり；および
Ｈ３配列は、Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１ＳＸ１２ＹＸ１３ＹＸ１４Ｘ１５ＳＹＦＸ１６Ｘ１７Ｘ１８（配列番号１４４）であり、
Ｘ１はＦまたはＥであり；Ｘ２はＹまたはＤであり；Ｘ３はＴまたはＣであり；Ｘ４はＭ、Ｄ、Ｅ、またはＹであり；Ｘ５はＧまたはＳであり；Ｘ６はＩまたはＥであり；Ｘ７はＮ、Ｃ、Ｌ、またはＶであり；Ｘ８はＴ、ＤまたはＥであり；Ｘ９はＡ、Ｍ、またはＴであり；Ｘ１０はＲまたはＨであり；Ｘ１１はＧまたはＥであり；Ｘ１２はＬまたはＦであり；Ｘ１３はＳまたはＧであり；Ｘ１４はＧまたはＤであり；Ｘ１５はＮまたはＥであり；Ｘ１６はＤまたはＬであり；Ｘ１７はＹ、Ｃ、またはＴであり；およびＸ１８はＷまたはＬである。
【００９０】
ＡＳＴＲが、Ｒｏｒ２に結合し、例示的実施形態において、配列番号８２または配列番号８３の抗体重鎖および配列番号８４の抗体軽鎖を含む抗体と同じＲｏｒ２のエピトープに結合するいくつかの実施形態では、ＡＳＴＲは、３つの相補性決定領域を有する重鎖可変領域を含むことができ、前記領域は、Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３配列を有し、
Ｈ１配列は、ＧＹＳＩＴＴＧＸ２９ＹＷＮ（配列番号１４１）であり；
Ｈ２配列は、ＹＩＴＹＤＧＳＸ３０ＮＹＮＰＳＬＫＮ（配列番号１４３）であり；および
Ｈ３配列は、ＣＳＸ３１Ｘ３２Ｘ３３Ｘ３４ＶＸ３５Ｘ３６Ｘ３７ＬＤＸ３８（配列番号１４５）であり、
Ｘ２９はＹ、Ｅ、Ｒ、またはＴであり；Ｘ３０はＫまたはＮであり；Ｘ３１はＲ、Ｇ、Ｈ、Ｗ、またはＹであり；Ｘ３２はＦ、Ｃ、Ｎ、またはＱであり；Ｘ３３はＥまたはＳであり；Ｘ３４はＧ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｍ、Ｑ、またはＳであり；Ｘ３５はＷ、Ａ、Ｉ、Ｐ、Ｑ、Ｔ、またはＶであり；Ｘ３６はＹ、Ｇ、Ｎ、またはＱであり；Ｘ３７はＧ、Ｓ、またはＴであり；およびＸ３８はＹまたはＩである。
【００９１】
ＡＳＴＲがＲｏｒ２に結合するいくつかの実施形態では、ＡＳＴＲは、３つの相補性決定領域を含む軽鎖可変領域を含むことができ、前記領域は、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３配列を有し、
Ｌ１配列は、ＳＡＴＳＳＸ１９Ｘ２０Ｘ２１ＭＸ２２（配列番号１４６）またはＲＡＳＥＳＶＤＲＹＧＮＳＸ３９ＩＨ（配列番号１４７）であり；
Ｌ２配列は、Ｘ２３ＴＳＮＬＡＳ（配列番号１４８）またはＸ４０ＴＹＸ４１ＬＥＳ（配列番号１４９）であり；および
Ｌ３配列は、ＱＸ２４Ｘ２５ＳＸ２６ＹＰＦＸ２７Ｘ２８（配列番号１５０）またはＱＱＸ４２ＮＸ４３ＤＰＸ４４ＴＸ４５（配列番号８５）であり、
Ｘ１９はＶまたはＥであり；Ｘ２０はＳまたはＤであり；Ｘ２１はＹ、Ｃ、またはＤであり；Ｘ２２はＨ、Ｇ、またはＬであり；Ｘ２３はＧ、Ｃ、Ｈ、またはＰであり；Ｘ２４はＱまたはＥであり；Ｘ２５はＲまたはＨであり；Ｘ２６はＳ、Ｄ、Ｇ、Ｉ、Ｑ、またはＶであり；Ｘ２７はＴまたはＤであり；Ｘ２８はＦ、Ｄ、またはＥであり；Ｘ３９はＦ、Ｓ、またはＴであり；Ｘ４０はＲ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、またはＷであり；Ｘ４１はＮまたはＤであり；Ｘ４２はＴ、Ｉ、またはＰであり；Ｘ４３はＥまたはＶであり；Ｘ４４はＷまたはＴであり；およびＸ４５はＦまたはＴである。
【００９２】
ＡＳＴＲが、Ｒｏｒ２に結合し、例示的実施形態において、配列番号１５１の抗体重鎖および配列番号１５２の抗体軽鎖を含む抗体と同じＲｏｒ２のエピトープに結合するいくつかの実施形態では、ＡＳＴＲは、３つの相補性決定領域を含む軽鎖可変領域を含むことができ、前記領域は、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３配列を有し、
Ｌ１配列は、ＳＡＴＳＳＸ１９Ｘ２０Ｘ２１ＭＸ２２（配列番号１４６）であり；
Ｌ２配列は、Ｘ２３ＴＳＮＬＡＳ（配列番号１４８）であり；および
Ｌ３配列は、ＱＸ２４Ｘ２５ＳＸ２６ＹＰＦＸ２７Ｘ２８（配列番号１５０）であり、
Ｘ１９はＶまたはＥであり；Ｘ２０はＳまたはＤであり；Ｘ２１はＹ、Ｃ、またはＤであり；Ｘ２２はＨ、Ｇ、またはＬであり；Ｘ２３はＧ、Ｃ、Ｈ、またはＰであり；Ｘ２４はＱまたはＥであり；Ｘ２５はＲまたはＨであり；Ｘ２６はＳ、Ｄ、Ｇ、Ｉ、Ｑ、またはＶであり；Ｘ２７はＴまたはＤであり；およびＸ２８はＦ、Ｄ、またはＥである。
【００９３】
ＡＳＴＲがＲｏｒ２に結合し、例示的実施形態において、配列番号８２または配列番号８３の抗体重鎖および配列番号８４の抗体軽鎖を含む抗体と同じＲｏｒ２のエピトープに結合するいくつかの実施形態では、ＡＳＴＲは、３つの相補性決定領域を含む軽鎖可変領域を含むことができ、前記領域は、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３配列を有し、
Ｌ１配列は、ＲＡＳＥＳＶＤＲＹＧＮＳＸ３９ＩＨ（配列番号１４７）であり；
Ｌ２配列は、Ｘ４０ＴＹＸ４１ＬＥＳ（配列番号１４９）であり；および
Ｌ３配列は、ＱＱＸ４２ＮＸ４３ＤＰＸ４４ＴＸ４５（配列番号８５）であり、
Ｘ３９はＦ、Ｓ、またはＴであり；Ｘ４０はＲ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、またはＷであり；Ｘ４１はＮまたはＤであり；Ｘ４２はＴ、Ｉ、またはＰであり；Ｘ４３はＥまたはＶであり；Ｘ４４はＷまたはＴであり；およびＸ４５はＦまたはＴである。
【００９４】
いくつかの実施形態では、Ｒｏｒ２に結合する条件的活性型ＡＳＴＲ、および例示的実施形態において、配列番号１５１の抗体重鎖および配列番号１５２の抗体軽鎖を含む抗体と同じＲｏｒ２のエピトープに結合する条件的活性型ＡＳＴＲは、配列番号１１５〜１１９および配列番号１５１の配列から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。条件的活性型ＡＳＴＲが、配列番号１５１の抗体重鎖および配列番号１５２の抗体軽鎖を含み、任意選択で、前の文中に記載の重鎖を含む抗体と同じＲｏｒ２のエピトープに結合するこれらの例示的実施形態では、軽鎖は、配列番号８１、配列番号１２２〜１２４、または配列番号１５２の軽鎖を含むことができる。
【００９５】
特定の例示的実施形態では、条件的活性型ＡＳＴＲは、配列番号８２または配列番号８３の抗体重鎖を含む抗体、および配列番号８４の抗体軽鎖を含む抗体と同じＲｏｒ２のエピトープに結合し、配列番号１２０〜１２１および８２〜８３のいずれか１つの抗体重鎖可変領域を含む。条件的活性型ＡＳＴＲが、配列番号８２または配列番号８３の抗体重鎖および配列番号８４の抗体軽鎖を含み、任意選択で、前の文中に記載の重鎖を含む抗体を含む抗体と同じＲｏｒ２のエピトープに結合するこれらの例示的実施形態では、軽鎖は、配列番号８４または８６の軽鎖を含むことができる。
【００９６】
ｐＨ７．４に比べて、ｐＨ６．７でＲｏｒ２に対する結合が増大した例示的条件的活性型ＣＡＲ（ＣＡＢ−ＣＡＲ）は、本明細書の実施例１で見つけられる。例示的実施形態では、ＣＡＲまたはＡＳＴＲは、配列番号８２または配列番号８３の抗体重鎖および配列番号８４の抗体軽鎖を含む単鎖可変抗体フラグメントと同じＲｏｒ２のエピトープに結合できるか、またはＣＡＲまたはＡＳＴＲは、配列番号１５１の抗体重鎖および配列番号１５２の抗体軽鎖を含む単鎖可変抗体フラグメントと同じＲｏｒ２のエピトープに結合できる。このような例示的実施形態のさらなる実施形態では、抗Ｒｏｒ２  ＣＡＲまたはＡＳＴＲは、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含むかｓｃＦｖであり、さらなる例示的実施例では、重鎖に対しＮ末端である軽鎖または軽鎖に対しＮ末端である重鎖を含む。ＣＡＲまたはＡＳＴＲを含み、例示的実施形態において、配列番号８２または配列番号８３の抗体重鎖および配列番号８４の抗体軽鎖を含む単鎖可変抗体フラグメントと同じＲｏｒ２のエピトープに結合するか、または配列番号１５１の抗体重鎖および配列番号１５２の抗体軽鎖を含む単鎖可変抗体フラグメントと同じＲｏｒ２のエピトープに結合する本明細書の実施形態のいずれかでは、ＡＳＴＲは、配列番号１３０〜１３２、または１５３〜１５８のいずれかを含むことができる。さらに、本明細書の実施形態のいずれかの抗Ｒｏｒ２  ＣＡＲは、本明細書で提供されるＣＡＲ成分のいずれかを含み得る。特定の例示的実施形態では、抗Ｒｏｒ２  ＣＡＲは、表２で記載のＣＡＲ成分を含むことができ、表２のＣＡＲのいずれかであり得る。抗Ｒｏｒ２  ＣＡＲを含む本明細書の任意の実施形態に関し、より典型的には、ＣＡＲはＣＡＢ−ＣＡＲであり、非限定的例示的実施形態では、ＣＡＲは、例えば、細胞傷害活性を示す表２で提供されるＣＡＢ−ＣＡＲ成分のいずれかおよびＣＡＢ−ＣＡＲのいずれかを含むことができる。例えば、抗Ｒｏｒ２  ＣＡＢ−ＣＡＲは、ＣＤ８シグナルペプチド、ＣＤ８またはＣＤ２８ストークドメイン／膜貫通ドメイン、ＣＤ１３７共刺激ドメイン、および／またはＣＤ３Ｚ活性化ドメインを含むことができる。さらに、抗Ｒｏｒ２  ＣＡＲおよび特に抗Ｒｏｒ２  ＣＡＢ−ＣＡＲを含む本明細書の実施形態のいずれかの例示的ＣＡＲは、非限定的例示的実施形態では、表２の条件的細胞傷害活性を示す抗Ｒｏｒ２  ＣＡＢ−ＣＡＲのいずれかを含む。このような例示的ＣＡＢ−ＣＡＲには、Ｆ１−１−９、Ｆ１−１−１０、Ｆ１−１−１１、Ｆ１−１−１２、Ｆ１−１−１５、Ｆ１−１−１７、Ｆ１−１−１８、Ｆ１−１−１９、Ｆ１−１−２０、Ｆ１−１−２１、Ｆ１−１−２３、Ｆ１−１−２５、またはＦ１−１−２６が含まれる。抗Ｒｏｒ２  ＡＳＴＲを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、ＡＳＴＲは、表２の、Ｆ１−１−９、Ｆ１−１−１０、Ｆ１−１−１１、Ｆ１−１−１２、Ｆ１−１−１５、Ｆ１−１−１７、Ｆ１−１−１８、Ｆ１−１−１９、Ｆ１−１−２０、Ｆ１−１−２１、Ｆ１−１−２３、Ｆ１−１−２５、またはＦ１−１−２６のＡＳＴＲを含むことができる。さらに、抗Ｒｏｒ２  ＣＡＲおよび特に抗Ｒｏｒ２  ＣＡＢ−ＣＡＲを含む本明細書の実施形態のいずれかの例示��ＣＡＲは、非限定的例示的実施形態では、表２の高い条件的胞傷害活性を示す抗Ｒｏｒ２  ＣＡＢ−ＣＡＲのいずれかを含む。このような例示的ＣＡＢ−ＣＡＲには、Ｆ１−１−１１、Ｆ１−１−１２、Ｆ１−１−１５、Ｆ１−１−１７、Ｆ１−１−１９、Ｆ１−１−２０、またはＦ１−１−２３が含まれる。したがって、抗Ｒｏｒ２  ＡＳＴＲを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、ＡＳＴＲは、Ｆ１−１−１１、Ｆ１−１−１２、Ｆ１−１−１５、Ｆ１−１−１７、Ｆ１−１−１９、Ｆ１−１−２０、Ｆ１−１−２３のＡＳＴＲを含むことができる。
【００９７】
より一般的には、本明細書で提供される実施形態のいずれかに関して、ＡｘｌまたはＲｏｒ２に対するのかを問わず、ＡＳＴＲは、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、（Ｆａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、および二価の単鎖抗体またはダイアボディであり得る。例示的実施形態では、Ｒｏｒ２に結合する条件的活性型ＡＳＴＲは、重鎖および軽鎖を含む単鎖可変フラグメントである。
【００９８】
本明細書で開示の重鎖可変領域ポリペプチドおよび軽鎖可変領域ポリペプチドは、米国特許第８．７０９，７５５号で開示の方法を用いて、親抗体から特定された。当業者なら、米国特許第８，７０９，７５５号で開示の条件的活性型抗体を特定する方法を利用して、本開示のＣＡＢ−ＣＡＲのためのＡＳＴＲで使用できる追加の条件的活性型抗体および抗体フラグメントを特定できる。
【００９９】
いくつかの例示的ＡＳＴＲの重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号１１５〜１２１に示されている。これらの例示的ＡＳＴＲの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号８１、８６、および１２２〜１２４に示されている。これらの重鎖および軽鎖可変領域は、特異的にヒトＲｏｒ２に結合できる。これらの重鎖可変領域および軽鎖可変領域のいずれか１つを含む抗体または抗体フラグメントは、非腫瘍微小環境中または生理的条件中のｐＨよりも、腫瘍微小環境中のｐＨでＲｏｒ２に対する高い結合親和性を有することが明らかになった。例えば、抗体および抗体フラグメントは、ｐＨ７．４より、ｐＨ６．０でＲｏｒ２に対するより高い結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、抗体および抗体フラグメントは、ｐＨ７．４より、ｐＨ６．７でＲｏｒ２に対するより高い結合親和性を有する。
【０１００】
抗Ｒｏｒ２抗体または抗体フラグメントは、正常組織中のＲｏｒ２に対する結合親和性と比較して、腫瘍のＲｏｒ２に対するより高い結合親和性を有する。これらの抗Ｒｏｒ２抗体または抗体フラグメントは、当該技術分野において既知のモノクローナル抗Ｒｏｒ２抗体と比較して、より長い半減期および低減した副作用、ならびに同等の有効性を有すると考えられる。これらの特徴は、これらの抗Ｒｏｒ２抗体または抗体フラグメントのより高い投与量の患者への送達を可能とし、それにより、より効果的な治療オプションとなる。
【０１０１】
ＡＳＴＲは、配列番号８１、８６、および１１５〜１２４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むことができるが、本発明は、具体的には、ヒトＲｏｒ２に結合できるそのバリアントも提供する。これらのバリアントを得るために、重鎖可変領域（Ｈ１〜Ｈ３）の相補性決定領域（ＣＤＲ）および軽鎖可変領域（Ｌ１〜Ｌ３）の相補性決定領域は、未変化のままである必要がある。しかし、相補性決定領域の重鎖可変領域および軽鎖のアミノ酸配列は、置換、挿入および欠失の原理に従って変異させてよい。重鎖可変領域および軽鎖可変領域のバリアントは、適切な改変を重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列中に導入することにより、またはペプチド合成により調製し得る。このような改変には、例えば、重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列内の残基からの欠失、および／またはそこへの挿入および／またはその置換が含まれる。欠失、挿入、および置換の任意の組み合わせを実施して、ＣＡＲ用のＡＳＴＲに到達できる。ただし、それらが所望の特性、例えば、ヒトＲｏｒ２に対する条件的抗原結合を有するということが前提である。
【０１０２】
多重特異的ＡＳＴＲ
いくつかの実施形態では、ＡＳＴＲは、多重特異的、例えば、二重特異性抗体であり得る。二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位または標的に対する結合特異性を有する。特定の実施形態では、結合特異性の１つは、ＡｘｌまたはＲｏｒ２に対するものであり、残りは、別の抗原に対するものである。特定の実施形態では、二重特異性抗体は、ＡｘｌまたはＲｏｒ２の２つの異なるエピトープに結合し得る。二重特異性抗体はまた、細胞傷害薬をＡｘｌまたはＲｏｒ２を発現する細胞に局在化させるのにも使用し得る。二重特異性抗体は、完全長抗体または抗体フラグメントとして調製できる。特定の実施形態では、結合特異性の１つは、Ａｘｌに対し結合し、もう一方は、Ｒｏｒ２に結合し、この場合、両方が条件的活性型でない、または片方もしくは両方が条件的活性型であり得る。
【０１０３】
本開示のＣＡＲでの使用に好適するＡＳＴＲは、種々の抗原結合特異性を有し得る。例示的実施形態では、ＡＳＴＲは、ＡｘｌまたはＲｏｒ２に結合し、これらは、特定の癌細胞上に発現する（すなわち、癌特異的抗原である）ことがわかっている。いくつかの事例では、ＡＳＴＲは二重特異性であり、ＡｘｌまたはＲｏｒ２に、通常、条件的活性型方式で、結合する抗原結合ドメインに加えて、ＡＳＴＲは、癌細胞により発現されている（合成されている）、すなわち、癌細胞関連抗原である第２の抗原に特異的な第２の抗原結合ドメインを含み得る。癌細胞関連抗原は、例えば、乳癌細胞、Ｂ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫細胞、卵巣癌細胞、前立腺癌細胞、中皮腫、肺癌細胞（例えば、小細胞肺癌細胞）、非ホジキンＢ細胞リンパ腫（Ｂ−ＮＨＬ）細胞、卵巣癌細胞、前立腺癌細胞、中皮腫細胞、肺癌細胞（例えば、小細胞肺癌細胞）、黒色腫細胞、慢性リンパ性白血病細胞、急性リンパ性白血病細胞、神経芽腫細胞、神経膠腫、神経膠芽腫、髄芽腫、結腸直腸癌細胞、などに関連する抗原であり得る。癌細胞関連抗原はまた、非癌細胞により発現される場合もある。
【０１０４】
ＡｘｌまたはＲｏｒ２に加えて、ＣＡＲの二重特異性ＡＳＴＲが結合し得る抗原の非限定的例には、としては、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＤ３０、ＥｒｂＢ２、ＣＡ１２５、ＭＵＣ−１、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＣＤ４４表面接着分子、メソテリン、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、血管内皮細胞増殖因子受容体−２（ＶＥＧＦＲ２）、高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）、ＭＡＧＥ−Ａｌ、ＩＬ−１３Ｒ−ａ２、ＧＤ２、などが挙げられる。
【０１０５】
いくつかの事例では、ＡｘｌまたはＲｏｒ２に結合する特異的結合対メンバーに加えて、ＣＡＲの当該二重特異性ＡＳＴＲでの使用に好適する特異的結合対のメンバーは、受容体のリガンドに結合する。リガンドには、限定されないが、サイトカイン（例えば、ＩＬ−１３など）；増殖因子（例えば、ヘレグリン；血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）；など）；インテグリン結合ペプチド（例えば、配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐを含むペプチド）；などが挙げられる。
【０１０６】
当該二重特異性ＣＡＲの特異的結合対のメンバーがリガンドである場合、ＣＡＲは、特異的結合対の第２のメンバーの存在下で活性化され得る。この場合、特異的結合対の第２のメンバーは、リガンドの受容体である。例えば、リガンドがＶＥＧＦの場合、特異的結合対の第２のメンバーは、可溶性ＶＥＧＦ受容体を含むＶＥＧＦ受容体であり得る。
【０１０７】
上述のように、いくつかの事例では、当該二重特異性ＣＡＲに含められる特異的結合対のメンバーは、受容体、例えば、リガンド、共受容体のリガンドなどの受容体であるＡＳＴＲである。受容体は、受容体のリガンド結合フラグメントであり得る。好適な受容体には、限定されないが、増殖因子受容体（例えば、ＶＥＧＦ受容体）；キラー細胞レクチン様受容体サブファミリーＫ、メンバー１（ＮＫＧ２Ｄ）ポリペプチド（ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、およびＵＬＢ６に対する受容体）；サイトカイン受容体（例えば、ＩＬ−１３受容体；ＩＬ−２受容体；など）；ＣＤ２７；天然の細胞傷害性受容体（ＮＣＲ）（例えば、ＮＫＰ３０（ＮＣＲ３／ＣＤ３３７）ポリペプチド（ＨＬＡ−Ｂ−関連転写物３（ＢＡＴ３）およびＢ７−Ｈ６）；など）；などが挙げられる。
【０１０８】
ストーク領域
いくつかの事例では、ＣＡＲは、細胞の外側のＣＡＲ部分に位置し、ＡＳＴＲと膜貫通ドメインとの間に挿入されるヒンジドメイン（本明細書においては、「スペーサー」または「ストーク」とも呼ばれる）を含む。例示的実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８ストークドメインまたはＣＤ２８ストークドメインである。いくつかの事例では、ストークドメインは、野性型ＣＤ８ストーク領域（ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧ  ＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡ（配列番号１２５））に対し、少なくとも８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％の同一性を有するか、または野性型ＣＤ２８ストーク領域（ＦＣＫＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰ（配列番号１２６））に対し、少なくとも８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％の同一性を有するか、または野性型免疫グロブリン重鎖ヒンジ／ストーク領域に対し、少なくとも８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％の同一性を有する。いくつかの事例では、ストークドメインは、受容体由来のヒンジ領域（例えば、ＣＤＳ由来ヒンジ領域）ポリペプチドである。ＣＡＲでは、採用したストークは、条件的活性型抗原特異的標的化領域、および通常、全体ＣＡＲが、対応する生理的条件に対するインビトロ腫瘍代替アッセイ条件中で、そのＲｏｒ２またはＡｘｌに対する増大した結合特性を保持することを可能とする。
【０１０９】
ストーク領域は、約４アミノ酸〜約５０アミノ酸、例えば、約４ａａ〜約１０ａａ、約１０ａａ〜約１５ａａ、約１５ａａ〜約２０ａａ、約２０ａａ〜約２５ａａ、約２５ａａ〜約３０ａａ、約３０ａａ〜約４０ａａ、または約４０ａａ〜約５０ａａの長さを有し得る。
【０１１０】
いくつかの事例では、当該ＣＡＲのヒンジ領域は、少なくとも１つのシステインを含む。例えば、いくつかの事例では、ヒンジ領域は、配列Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（配列番号６２）を含み得る。存在する場合、第１のＣＡＲのヒンジ領域中のシステインは、第２のＣＡＲのヒンジ領域とジスルフィド結合を形成するために利用できる。
【０１１１】
免疫グロブリンヒンジ／ストーク領域アミノ酸配列は、当技術分野において既知である。例えば、Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１６２；およびＨｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：１７７９を参照されたい。非限定的例として、免疫グロブリンヒンジ領域は、次のアミノ酸配列のいずれかの一続きの少なくとも１０、１５、２０個または全てのアミノ酸に対し、少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の配列同一性を有するドメインを含むことができる：ＤＫＴＨＴ（配列番号６３）；ＣＰＰＣ（配列番号６２）；ＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲ（配列番号６４）（例えば、Ｇｌａｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：４１４９４を参照）；ＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴ（配列番号６５）；ＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰ（配列番号６６）；ＫＣＣＶＤＣＰ（配列番号６７）；ＫＹＧＰＰＣＰ（配列番号６８）；ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号６９）（ヒトＩｇＧ１ヒンジ）；ＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号７０）（ヒトＩｇＧ２ヒンジ）；ＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＣＰＲＣＰ（配列番号７１）（ヒトＩｇＧ３ヒンジ）；ＳＰＮＭＶＰＨＡＨＨＡＱ（配列番号７２）（ヒトＩｇＧ４ヒンジ）；など。ヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ヒンジ領域のアミノ酸配列を含み得る。ヒンジ領域は、野性型（天然）ヒンジ領域に比べて、１つまたは複数のアミノ酸置換および／または挿入および／または欠失を含み得る。例えば、ヒトＩｇＧ１ヒンジのＨｉｓ２２９は、ヒンジ領域が配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＹＴＣＰＰＣＰを含むように、Ｔｙｒと置換できる。例えば、Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８７：５８９１を参照されたい。ヒンジ領域は、ヒトＣＤ８由来のアミノ酸配列を含むことができ、例えば、ヒンジ領域は、アミノ酸配列：ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤ（配列番号７３）、またはそのバリアントを含むことができる。
【０１１２】
膜貫通ドメイン
本開示のＣＡＲは、真核細胞膜中に挿入するための膜貫通ドメインを含む。膜貫通ドメインは、ＡＳＴＲと共刺激ドメインとの間に挿入できる。膜貫通ドメインは、ヒンジ領域と共刺激ドメインとの間に挿入でき、それにより、キメラ抗原受容体は、アミノ末端（Ｎ−末端）からカルボキシル末端（Ｃ末端）に向けて順に：ＡＳＴＲ；ヒンジ領域；膜貫通ドメイン；および活性化ドメインを含む。
【０１１３】
真核生物（例えば、哺乳動物）細胞の細胞膜中にポリペプチドの挿入を提供する任意の膜貫通（ＴＭ）ドメインは、本明細書で開示の態様および実施形態での使用に好適する。本明細書で提供される特定の実施形態では、本明細書で提供されるＣＡＲを含むいずれかの態様のためのＴＭドメインは、Ｃ＊アルファＴＭドメイン、ＣＤ８  ＴＭドメイン、ＣＤ４  ＴＭドメイン、Ｃ３Ｚ  ＴＭドメイン、Ｃ２８  ＴＭドメイン、Ｃ１３４  ＴＭドメイン、ＣＤ７  ＴＭドメイン、ＣＤ８  ＴＭドメイン、またはＣＤ２８  ＴＭドメインである。本明細書で提供されるＣＡＲの例示的実施形態は、ＣＤ８  ＴＭドメインまたはＣＤ２８  ＴＭドメインを含む。本明細書で提供される態様または実施形態のいずれかに好適するＴＭドメインのさらなる非限定的例は、次のＴＭドメインの一続きの少なくとも１０、１５、２０個または全てのアミノ酸に対し、少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の配列同一性を有するドメインを含む：
ａ）ＣＤ８アルファ（ＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣ（配列番号４６））；
ｂ）ＣＤ８ベータ（ＬＧＬＬＶＡＧＶＬＶＬＬＶＳＬＧＶＡＩＨＬＣＣ（配列番号４７））；
ｃ）ＣＤ４（ＡＬＩＶＬＧＧＶＡＧＬＬＬＦＩＧＬＧＩＦＦＣＶＲＣ（配列番号４８））；
ｄ）ＣＤ３Ｚ（ＬＣＹＬＬＤＧＩＬＦＩＹＧＶＩＬＴＡＬＦＬＲＶ（配列番号４９）；
ｅ）ＣＤ２８（ＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶ（配列番号５０））；
ｆ）ＣＤ１３４（ＯＸ４０）：（ＶＡＡＩＬＧＬＧＬＶＬＧＬＬＧＰＬＡＩＬＬＡＬＹＬＬ（配列番号５１））；
ｇ）ＣＤ７（ＡＬＰＡＡＬＡＶＩＳＦＬＬＧＬＧＬＧＶＡＣＶＬＡ（配列番号５２））；
ｈ）ＣＤ８アルファストークおよびＴＭ（ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣ（配列番号７５））、および
ｉ）ＣＤ２８ストークおよびＴＭ（ＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶ（配列番号７６））。
【０１１４】
非限定的例として、本発明の態様の膜貫通ドメインは、配列番号４６の膜貫通ドメイン、ＣＤ８ベータ膜貫通ドメイン、ＣＤ４膜貫通ドメイン、ＣＤ３ゼータ膜貫通ドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ１３４膜貫通ドメイン、またはＣＤ７膜貫通ドメインに対して、少なくとも８０、９０、または９５％の配列同一性を有し得る。
【０１１５】
ＣＡＲリンカー
いくつかの事例では、ＣＡＲは、任意の２つの隣接ドメイン間でリンカーを含む。例えば、リンカーは、膜貫通ドメインと第１の共刺激ドメインとの間に存在し得る。別の例では、ＡＳＴＲは、抗体であり、リンカーは、重鎖と軽鎖との間に存在し得る。別の例では、リンカーは、ＡＳＴＲと膜貫通ドメインおよび共刺激ドメインとの間に存在し得る。別の例では、リンカーは、共刺激ドメインと第２のポリペプチドの細胞内活性化ドメインとの間に存在し得る。
【０１１６】
リンカーペプチドは、種々のアミノ酸配列のいずれかを有し得る。タンパク質は、通常、可撓性の性質のスペーサーペプチドにより連結され得るが、その他の化学的連結も排除されない。リンカーは、約１〜約１００アミノ酸長さ、または約１〜約２５アミノ酸長さのペプチドであり得る。これらのリンカーは、タンパク質を結合するためのリンカーをコードするオリゴヌクレオチドを用いて産生できる。ある程度の可撓性を有するペプチドリンカーを使用できる。連結ペプチドは、実質上任意のアミノ酸配列を有し得るが、好適なリンカーは、全体として可撓性ペプチドを生じる配列を有することに留意されたい。グリシンおよびアラニンなどの小型アミノ酸の使用は、可撓性ペプチドを作成するのに有用である。このような配列の作製は、当業者には日常的な作業である。
【０１１７】
好適なリンカーは、容易に選択でき、１アミノ酸（例えば、Ｇｌｙ）から２０アミノ酸、２アミノ酸〜１５アミノ酸、３アミノ酸〜１２アミノ酸、４アミノ酸〜１０アミノ酸、５アミノ酸〜９アミノ酸、６アミノ酸〜８アミノ酸、７アミノ酸〜８アミノ酸などの、異なった長さの任意の好適なものであり得、１、２、３、４、５、６、または７アミノ酸であってもよい。
【０１１８】
例示的可撓性リンカーには、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン−セリンポリマー（例えば、（ＧＳ）ｎ、ＧＳＧＧＳｎ、ＧＧＧＳｎ、およびＧＧＧＧＳｎを含む（ｎは少なくとも１の整数である）、グリシン−アラニンポリマー、アラニン−セリンポリマー、およびその他の当該技術分野において既知の可撓性リンカーが含まれる。グリシンおよびグリシン−セリンポリマーは、着目すべきである。理由は、これら両方のアミノ酸は、比較的不定形であり、したがって、成分間の中性テザーとして機能し得るためである。グリシンポリマーは、特に着目すべきである。理由は、グリシンが、アラニンよりもかなり多くΦ−Ψ空間にアクセスし、より長い側鎖の残基よりも遙かに拘束が少ないためである（Ｓｃｈｅｒａｇａ，Ｒｅｖ．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍ．１１１７３−１４２（１９９２）を参照）。例示的可撓性リンカーには、限定されないが、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５３）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５４）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５５）、ＧＧＳＧ（配列番号５６）、ＧＧＳＧＧ（配列番号５７）、ＧＳＧＳＧ（配列番号５８）、ＧＳＧＧＧ（配列番号５９）、ＧＧＧＳＧ（配列番号６０）、ＧＳＳＳＧ（配列番号６１）、などが挙げられる。当業者なら、上記の任意の要素に結合したペプチドの設計は、全体または部分的に可撓性であるリンカーを含めることができ、それにより、リンカーは、可撓性リンカーならびに可撓性のより少ない構造を付与する１つまたは複数の部分を含むことができることを理解するであろう。
【０１１９】
調節ドメイン
調節ドメインは、ＣＡＲ中の活性化ドメインの効果を変えることができ、これには、活性化ドメインの下流効果を高めるまたは抑制することまたは応答の性質を変えることが含まれる。本開示のＣＡＲで使用するのに好適し、ＣＡＲを含む本明細書のいずれかの態様の特定の例示的実施形態に含まれる調節ドメインは、共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、２つ以上の調節ドメイン（例えば、共刺激ドメイン）を含むことができ、またはＣＡＲの調節ドメイン（例えば、共刺激ドメイン）は、２つ以上のポリペプチドから誘導することができる。ＣＡＲに含めるのに好適する調節ドメイン（例えば、共刺激ドメイン）は、約３０アミノ酸〜約７０アミノ酸（ａａ）の長さを有することができ、例えば、調節ドメイン（例えば、共刺激ドメイン）は、約３０ａａ〜約３５ａａ、約３５ａａ〜約４０ａａ、約４０ａａ〜約４５ａａ、約４５ａａ〜約５０ａａ、約５０ａａ〜約５５ａａ、約５５ａａ〜約６０ａａ、約６０ａａ〜約６５ａａ、または約６５ａａ〜約７０ａａの長さを有し得る。他の事例では、調節ドメインは、約７０ａａ〜約１００ａａ、約１００ａａ〜約２００ａａ、または２００ａａ超の長さを有し得る。
【０１２０】
共刺激ドメインは通常、活性化ドメインの活性化に対する応答の性質を高めるおよび／または変える。本開示のＣＡＲでの使用に好適する共刺激ドメインは通常、受容体由来のポリペプチドである。いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、ホモ二量体化する。当該共刺激ドメインは、膜貫通タンパク質の細胞内部分であり得る（すなわち、共刺激ドメインは、膜貫通タンパク質から誘導され得る）。好適な共刺激ポリペプチドの非限定的例には、限定されないが、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、Ｌｃｋ結合欠失ＣＤ２８（ＩＣΔ）、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＢＴＬＡ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＬＦＡ−１、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＰＤ−１、ＴＩＬＲ２、ＴＩＬＲ４、ＴＩＬＲ７、ＴＩＬＲ９、Ｆｃ受容体γ鎖、Ｆｃ受容体ε鎖、またはＣＤ８３に特異的に結合するリガンド、が挙げられる。例えば、本発明の態様の共刺激ドメインは、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、Ｌｃｋ結合欠失ＣＤ２８（ＩＣΔ）、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＢＴＬＡ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＧＩＴＲ、またはＨＶＥＭの共刺激ドメインに対し、少なくとも８０％、９０％、または９５％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、２つ以上の共刺激ドメインを有することができ、例えば、ＣＡＲは、ＩＣΔ由来の共刺激ドメインおよび４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）由来の共刺激ドメインを含むことができる。
【０１２１】
いくつかの事例では、共刺激ドメインは、膜貫通タンパク質ＣＤ１３７（ＴＮＦＲＳＦ９；ＣＤ１３７；４−１ＢＢ；ＣＤｗ１３７；ＩＬＡ；などとしても知られる）の細胞内部分由来である。例えば、好適な共刺激ドメインは、次のアミノ酸配列中の一続きの少なくとも１０、１５、２０個の、または全てのアミノ酸に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含むことができる：ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号１）。これらの実施形態のいくつかでは、共刺激ドメインは、約３０ａａ〜約３５ａａ、約３５ａａ〜約４０ａａ、約４０ａａ〜約４５ａａ、約４５ａａ〜約５０ａａ、約５０ａａ〜約５５ａａ、約５５ａａ〜約６０ａａ、約６０ａａ〜約６５ａａ、または約６５ａａ〜約７０ａａの長さを有する。
【０１２２】
いくつかの事例では、共刺激ドメインは、膜貫通タンパク質ＣＤ２８（Ｔｐ４４としても知られる）の細胞内部分由来である。例えば、好適な共刺激ドメインは、次のアミノ酸配列中の一続きの少なくとも１０、１５、２０個の、または全てのアミノ酸に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含むことができる：ＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳ（配列番号２）。これらの実施形態のいくつかでは、共刺激ドメインは、約３０ａａ〜約３５ａａ、約３５ａａ〜約４０ａａ、約４０ａａ〜約４５ａａ、約４５ａａ〜約５０ａａ、約５０ａａ〜約５５ａａ、約５５ａａ〜約６０ａａ、約６０ａａ〜約６５ａａ、または約６５ａａ〜約７０ａａの長さを有する。
【０１２３】
いくつかの事例では、共刺激ドメインは、膜貫通タンパク質Ｌｃｋ結合欠失ＣＤ２８（ＩＣΔ）の細胞内部分由来である。例えば、好適な共刺激ドメインは、次のアミノ酸配列中の一続きの少なくとも１０、１５、２０個の、または全てのアミノ酸に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含むことができる：ＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＡＹＡＡＡＲＤＦＡＡＹＲＳ（配列番号３）。これらの実施形態のいくつかでは、共刺激ドメインは、約３０ａａ〜約３５ａａ、約３５ａａ〜約４０ａａ、約４０ａａ〜約４５ａａ、約４５ａａ〜約５０ａａ、約５０ａａ〜約５５ａａ、約５５ａａ〜約６０ａａ、約６０ａａ〜約６５ａａ、または約６５ａａ〜約７０ａａの長さを有する。
【０１２４】
いくつかの事例では、共刺激ドメインは、膜貫通タンパク質ＩＣＯＳ（ＡＩＬＩＭ、ＣＤ２７８、およびＣＶＩＤｌとしても知られる）の細胞内部分由来である。例えば、好適な共刺激ドメインは、次のアミノ酸配列中の一続きの少なくとも１０、１５、２０個の、または全てのアミノ酸に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含むことができる：ＴＫＫＫＹＳＳＳＶＨＤＰＮＧＥＹＭＦＭＲＡＶＮＴＡＫＫＳＲＬＴＤＶＴＬ（配列番号４）。これらの実施形態のいくつかでは、共刺激ドメインは、約３０ａａ〜約３５ａａ、約３５ａａ〜約４０ａａ、約４０ａａ〜約４５ａａ、約４５ａａ〜約５０ａａ、約５０ａａ〜約５５ａａ、約５５ａａ〜約６０ａａ、約６０ａａ〜約６５ａａ、または約６５ａａ〜約７０ａａの長さを有する。
【０１２５】
いくつかの事例では、共刺激ドメインは、膜貫通タンパク質ＯＸ４０（ＴＮＦＲＳＦ４、ＲＰ５−９０２Ｐ８．３、ＡＣＴ３５、ＣＤ１３４、ＯＸ−４０、ＴＸＧＰ１Ｌとしても知られる）の細胞内部分由来である。例えば、好適な共刺激ドメインは、次のアミノ酸配列中の一続きの少なくとも１０、１５、２０個の、または全てのアミノ酸に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含むことができる：ＲＲＤＱＲＬＰＰＤＡＨＫＰＰＧＧＧＳＦＲＴＰＩＱＥＥＱＡＤＡＨＳＴＬＡＫＩ（配列番号５）。
【０１２６】
これらの実施形態のいくつかでは、共刺激ドメインは、約３０ａａ〜約３５ａａ、約３５ａａ〜約４０ａａ、約４０ａａ〜約４５ａａ、約４５ａａ〜約５０ａａ、約５０ａａ〜約５５ａａ、約５５ａａ〜約６０ａａ、約６０ａａ〜約６５ａａ、または約６５ａａ〜約７０ａａの長さを有する。
【０１２７】
いくつかの事例では、共刺激ドメインは、膜貫通タンパク質ＣＤ２７（Ｓ１５２、Ｔ１４、ＴＮＦＲＳＦ７、およびＴｐ５５としても知られる）の細胞内部分由来である。例えば、好適な共刺激ドメインは、次のアミノ酸配列中の一続きの少なくとも１０、１５、２０個の、または全てのアミノ酸に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含むことができる：ＨＱＲＲＫＹＲＳＮＫＧＥＳＰＶＥＰＡＥＰＣＲＹＳＣＰＲＥＥＥＧＳＴＩＰＩＱＥＤＹＲＫＰＥＰＡＣＳＰ（配列番号６）。
【０１２８】
これらの実施形態のいくつかでは、共刺激ドメインは、約３０ａａ〜約３５ａａ、約３５ａａ〜約４０ａａ、約４０ａａ〜約４５ａａ、または約４５ａａ〜約５０ａａの長さを有する。
【０１２９】
いくつかの事例では、共刺激ドメインは、膜貫通タンパク質ＢＴＬＡ（ＢＴＬＡ１およびＣＤ２７２としても知られる）の細胞内部分由来である。例えば、好適な共刺激ドメインは、次のアミノ酸配列中の一続きの少なくとも１０、１５、２０個の、または全てのアミノ酸に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含むことができる：ＣＣＬＲＲＨＱＧＫＱＮＥＬＳＤＴＡＧＲＥＩＮＬＶＤＡＨＬＫＳＥＱＴＥＡＳＴＲＱＮＳＱＶＬＬＳＥＴＧＩＹＤＮＤＰＤＬＣＦＲＭＱＥＧＳＥＶＹＳＮＰＣＬＥＥＮＫＰＧＩＶＹＡＳＬＮＨＳＶＩＧＰＮＳＲＬＡＲＮＶＫＥＡＰＴＥＹＡＳＩＣＶＲＳ（配列番号７）。
【０１３０】
いくつかの事例では、共刺激ドメインは、膜貫通タンパク質ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８、ＤｌＳ１６６Ｅ、およびＫｉ−１としても知られる）の細胞内部分由来である。例えば、好適な共刺激ドメインは、次のアミノ酸配列の一続きの約１００アミノ酸〜約１１０アミノ酸（ａａ）、約１１０ａａ〜約１１５ａａ、約１１５ａａ〜約１２０ａａ、約１２０ａａ〜約１３０ａａ、約１３０ａａ〜約１４０ａａ、約１４０ａａ〜約１５０ａａ、約１５０ａａ〜約１６０ａａ、または約１６０ａａ〜約１８５ａａに対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含むことができる：ＲＲＡＣＲＫＲＩＲＱＫＬＨＬＣＹＰＶＱＴＳＱＰＫＬＥＬＶＤＳＲＰＲＲＳＳＴＱＬＲＳＧＡＳＶＴＥＰＶＡＥＥＲＧＬＭＳＱＰＬＭＥＴＣＨＳＶＧＡＡＹＬＥＳＬＰＬＱＤＡＳＰＡＧＧＰＳＳＰＲＤＬＰＥＰＲＶＳＴＥＨＴＮＮＫＩＥＫＩＹＩＭＫＡＤＴＶＩＶＧＴＶＫＡＥＬＰＥＧＲＧＬＡＧＰＡＥＰＥＬＥＥＥＬＥＡＤＨＴＰＨＹＰＥＱＥＴＥＰＰＬＧＳＣＳＤＶＭＬＳＶＥＥＥＧＫＥＤＰＬＰＴＡＡＳＧＫ（配列番号８）。
【０１３１】
いくつかの事例では、共刺激ドメインは、膜貫通タンパク質ＧＩＴＲ（ＴＮＦＲＳＦ１８、ＲＰ５−９０２Ｐ８．２、ＡＩＴＲ、ＣＤ３５７、およびＧＩＴＲ−Ｄとしても知られる）の細胞内部分由来である。例えば、好適な共刺激ドメインは、次のアミノ酸配列中の一続きの少なくとも１０、１５、２０個の、または全てのアミノ酸に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含むことができる：ＨＩＷＱＬＲＳＱＣＭＷＰＲＥＴＱＬＬＬＥＶＰＰＳＴＥＤＡＲＳＣＱＦＰＥＥＥＲＧＥＲＳＡＥＥＫＧＲＬＧＤＬＷＶ（配列番号９）。これらの実施形態のいくつかでは、共刺激ドメインは、約３０ａａ〜約３５ａａ、約３５ａａ〜約４０ａａ、約４０ａａ〜約４５ａａ、約４５ａａ〜約５０ａａ、約５０ａａ〜約５５ａａ、約５５ａａ〜約６０ａａ、約６０ａａ〜約６５ａａ、または約６５ａａ〜約７０ａａの長さを有する。
【０１３２】
いくつかの事例では、共刺激ドメインは、膜貫通タンパク質ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４、ＲＰ３−３９５Ｍ２０．６、ＡＴＡＲ、ＣＤ２７０、ＨＶＥＡ、ＨＶＥＭ、ＬＩＧＨＴＲ、およびＴＲ２としても知られる）の細胞内部分由来である。例えば、好適な共刺激ドメインは、次のアミノ酸配列中の一続きの少なくとも１０、１５、２０個の、または全てのアミノ酸に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含むことができる：ＣＶＫＲＲＫＰＲＧＤＶＶＫＶＩＶＳＶＱＲＫＲＱＥＡＥＧＥＡＴＶＩＥＡＬＱＡＰＰＤＶＴＴＶＡＶＥＥＴＩＰＳＦＴＧＲＳＰＮＨ（配列番号１０）。これらの実施形態のいくつかでは、第１および第２のポリペプチドの両方の共刺激ドメインは、約３０ａａ〜約３５ａａ、約３５ａａ〜約４０ａａ、約４０ａａ〜約４５ａａ、約４５ａａ〜約５０ａａ、約５０ａａ〜約５５ａａ、約５５ａａ〜約６０ａａ、約６０ａａ〜約６５ａａ、または約６５ａａ〜約７０ａａの長さを有する。
【０１３３】
細胞内活性化ドメイン
本開示のＣＡＲでの使用に好適する細胞内活性化ドメインは、活性化時に、１種または複数のサイトカインの生成；細胞死の増大および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、γδＴ細胞、および／または好中球増殖の増大；を誘導する。いくつかの実施形態では、細胞内活性化ドメインは、少なくとも１つの（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つなどの）後述のＩＴＡＭモチーフを含む。細胞内活性化ドメインは、本明細書においては、活性化ドメイン（ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ）または活性化ドメイン（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ）と呼ばれる。遺伝子改変シグナル伝達ポリペプチドで使用するための細胞内活性化ドメインは、免疫シグナル伝達受容体のいくつかのタイプの細胞内シグナル伝達ドメインを含むことができ、これには、ＣＤ３，Ｂ７ファミリー共刺激分子などの細胞内シグナル伝達タンパク質、および腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリー受容体；ＮＫｐ３０（Ｂ７−Ｈ６）、ＤＡＰ１２、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＤＡＰ１０、およびＣＤ３ＺなどのＮＫおよびＮＫＴ細胞により使用されるシグナル伝達ドメイン；およびＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＣ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、およびＦｃＲＬ５などの免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含むヒト免疫グロブリン受容体のシグナル伝達ドメインが含まれる。従って、本開示のいずれかの態様のためのＣＡＲの特定の実施形態では、細胞内活性化ドメインは、ＮＫｐ３０（Ｂ７−Ｈ６）、ＤＡＰ１２、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＤＡＰ１０、ＣＤ３ｚ、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＣ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、またはＦｃＲＬ５由来のシグナル伝達ドメインである。これらは、本明細書においては、ＮＫｐ３０（Ｂ７−Ｈ６）活性化ドメイン、ＤＡＰ１２活性化ドメイン、ＮＫＧ２Ｄ活性化ドメイン、ＮＫｐ４４活性化ドメイン、ＮＫｐ４６活性化ドメイン、ＤＡＰ１０活性化ドメイン、ＣＤ３Ｚ活性化ドメイン、ＦｃγＲＩ活性化ドメイン、ＦｃγＲＩＩＡ活性化ドメイン、ＦｃγＲＩＩＣ活性化ドメイン、ＦｃγＲＩＩＩＡ活性化ドメイン、またはＦｃＲＬ５活性化ドメインとそれぞれ呼ばれる。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、細胞内活性化ドメインは、ＤＡＰ１０／ＣＤ２８型シグナル伝達鎖を含む。いくつかの実施形態では、細胞内活性化ドメインは、膜結合ＣＡＲに共有結合していないが、代わりに、細胞質中に拡散する。非限定的例として、本ＣＡＲを含む発明のいずれかの態様の細胞内活性化ドメインは、ＣＤ３Ｚ活性化ドメイン、ＣＤ３Ｄ活性化ドメイン、ＣＤ３Ｅ活性化ドメイン、ＣＤ３Ｇ活性化ドメイン、ＣＤ７９Ａ活性化ドメイン、ＤＡＰ１２活性化ドメイン、ＦＣＥＲｌＧ活性化ドメイン、ＤＡＰ１０／ＣＤ２８活性化ドメイン、またはＺＡＰ７０活性化ドメインであり得る。非限定的例として、ＣＡＲを含む本発明のいずれかの態様の細胞内活性化ドメインは、後述のＣＤ３Ｚ、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ７９Ａ、ＤＡＰ１２、ＦＣＥＲｌＧ、ＤＡＰ１０／ＣＤ２８、またはＺＡＰ７０ドメインに対し、少なくとも８０％、９０％、または９５％の配列同一性を有し得る。
【０１３５】
ＩＴＡＭ
本開示のＣＡＲでの使用に好適する細胞内活性化ドメインは、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）含有細胞内シグナル伝達ポリペプチドを含む。ＩＴＡＭモチーフは、ＹＸ１Ｘ２Ｌ／Ｉであり、Ｘ１およびＸ２は、独立に任意のアミノ酸である。いくつかの事例では、当該ＣＡＲの細胞内活性化ドメインは、１、２、３、４、または５つのＩＴＡＭモチーフを含む。いくつかの事例では、ＩＴＡＭモチーフは、細胞内活性化ドメイン中で２回反復され、第１と第２のＩＴＡＭモチーフの実体は、６〜８アミノ酸により相互に、例えば、（ＹＸ１Ｘ２Ｌ／Ｉ）（Ｘ３）ｎ（ＹＸ１Ｘ２Ｌ／Ｉ）（式中、ｎは６〜８の整数、それぞれの６〜８つのＸ３は任意のアミノ酸であり得る）のように分離される。いくつかの事例では、当該ＣＡＲの細胞内活性化ドメインは、３つのＩＴＡＭモチーフを含む。
【０１３６】
好適な細胞内活性化ドメインは、ＩＴＡＭモチーフを含むポリペプチド由来のＩＴＡＭモチーフ含有部分であり得る。例えば、好適な細胞内活性化ドメインは、任意のＩＴＡＭモチーフを含むタンパク質由来のＩＴＡＭモチーフ含有ドメインであり得る。したがって、好適な細胞内活性化ドメインは、それが由来する全体タンパク質の全体配列を含む必要はない。好適なＩＴＡＭモチーフ含有ポリペプチドの例としては、ＣＤ３Ｚ（ＣＤ３ゼータ）；ＣＤ３Ｄ（ＣＤ３デルタ）；ＣＤ３Ｅ（ＣＤ３イプシロン）；ＣＤ３Ｇ（ＣＤ３γ）；ＣＤ７９Ａ（抗原受容体複合体関連タンパク質アルファ鎖）；ＤＡＰ１２；およびＦＣＥＲＩＧ（Ｆｃイプシロン受容体Ｉγ鎖）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３７】
いくつかの事例では、細胞内活性化ドメインは、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３ゼータ鎖（ＣＤ３Ｚ、Ｔ細胞受容体Ｔ３ゼータ鎖、ＣＤ２４７、ＣＤ３−ＺＥＴＡ、ＣＤ３Ｈ、ＣＤ３Ｑ、Ｔ３Ｚ、ＴＣＲＺ、などとしても知られる）由来である。例えば、好適な細胞内活性化ドメインは、次の配列の一続きの少なくとも１０、１５、２０個の、または全てのアミノ酸に対して、または次のアミノ酸配列（２アイソフォーム）のいずれかの近接している一続きの約１００アミノ酸〜約１１０アミノ酸（ａａ）、約１１０ａａ〜約１１５ａａ、約１１５ａａ〜約１２０ａａ、約１２０ａａ〜約１３０ａａ、約１３０ａａ〜約１４０ａａ、約１４０ａａ〜約１５０ａａ、または約１５０ａａ〜約１６０ａａに対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含むことができる：ＭＫＷＫＡＬＦＴＡＡＩＬＱＡＱＬＰＩＴＥＡＱＳＦＧＬＬＤＰＫＬＣＹＬＬＤＧＩＬＦＩＹＧＶＩＬＴＡＬＦＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬ［ＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬ］ＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬ［ＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩ］ＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬ［ＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬ］ＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号１１）またはＭＫＷＫＡＬＦＴＡＡＩＬＱＡＱＬＰＩＴＥＡＱＳＦＧＬＬＤＰＫＬＣＹＬＬＤＧＩＬＦＩＹＧＶＩＬＴＡＬＦＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬ［ＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬ］ＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＱＲＲＫＮＰＱＥＧＬ［ＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩ］ＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬ［ＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬ］ＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号１２）、この配列中で、ＩＴＡＭモチーフは、括弧で括って記載されている。
【０１３８】
同様に、好適な細胞内活性化ドメインポリペプチドは、完全長ＣＤ３ゼータアミノ酸配列のＩＴＡＭモチーフ含有部分を含み得る。したがって、好適な細胞内活性化ドメインは、次の配列の一続きの少なくとも１０、１５、２０個の、または全てのアミノ酸に対して、または次のアミノ酸配列のいずれかの近接している一続きの約１００アミノ酸〜約１１０アミノ酸（ａａ）、約１１０ａａ〜約１１５ａａ、約１１５ａａ〜約１２０ａａ、約１２０ａａ〜約１３０ａａ、約１３０ａａ〜約１４０ａａ、約１４０ａａ〜約１５０ａａ、または約１５０ａａ〜約１６０ａａに対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含むことができる：ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬ［ＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬ］ＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬ［ＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩ］ＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬ［ＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬ］ＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号１３）；ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬ［ＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬ］ＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＱＲＲＫＮＰＱＥＧＬ［ＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩ］ＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬ［ＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬ］ＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号１２７）；ＮＱＬ［ＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬ］ＤＫＲ（配列番号１４）；ＥＧＬ［ＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩ］ＧＭＫ（配列番号１５）；またはＤＧＬ［ＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬ］ＨＭＱ（配列番号１６）、この配列中で、ＩＴＡＭモチーフは、括弧で括って記載されている。
【０１３９】
いくつかの事例では、細胞内活性化ドメインは、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３ゼータ鎖（ＣＤ３Ｄ；ＣＤ３−ＤＥＬＴＡ；Ｔ３Ｄ；ＣＤ３抗原、デルタサブユニット；ＣＤ３デルタ；ＣＤ３ｄ抗原、デルタポリペプチド（ＴｉＴ３複合体）；ＯＫＴ３、デルタ鎖；Ｔ細胞受容体Ｔ３デルタ鎖；Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３デルタ鎖；などとしても知られる）由来である。したがって、好適な細胞内活性化ドメインは、次の配列の一続きの少なくとも１０、１５、２０個の、または全てのアミノ酸に対して、または次のアミノ酸配列のいずれかの近接している一続きの約１００アミノ酸〜約１１０アミノ酸（ａａ）、約１１０ａａ〜約１１５ａａ、約１１５ａａ〜約１２０ａａ、約１２０ａａ〜約１３０ａａ、約１３０ａａ〜約１４０ａａ、約１４０ａａ〜約１５０ａａ、または約１５０ａａ〜約１６０ａａに対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含むことができる：ＭＥＨＳＴＦＬＳＧＬＶＬＡＴＬＬＳＱＶＳＰＦＫＩＰＩＥＥＬＥＤＲＶＦＶＮＣＮＴＳＩＴＷＶＥＧＴＶＧＴＬＬＳＤＩＴＲＬＤＬＧＫＲＩＬＤＰＲＧＩＹＲＣＮＧＴＤＩＹＫＤＫＥＳＴＶＱＶＨＹＲＭＣＱＳＣＶＥＬＤＰＡＴＶＡＧＩＩＶＴＤＶＩＡＴＬＬＬＡＬＧＶＦＣＦＡＧＨＥＴＧＲＬＳＧＡＡＤＴＱＡＬＬＲＮＤＱＶ［ＹＱＰＬＲＤＲＤＤＡＱＹＳＨＬ］ＧＧＮＷＡＲＮＫ（配列番号１７）またはＭＥＨＳＴＦＬＳＧＬＶＬＡＴＬＬＳＱＶＳＰＦＫＩＰＩＥＥＬＥＤＲＶＦＶＮＣＮＴＳＩＴＷＶＥＧＴＶＧＴＬＬＳＤＩＴＲＬＤＬＧＫＲＩＬＤＰＲＧＩＹＲＣＮＧＴＤＩＹＫＤＫＥＳＴＶＱＶＨＹＲＴＡＤＴＱＡＬＬＲＮＤＱＶ［ＹＱＰＬＲＤＲＤＤＡＱＹＳＨＬ］ＧＧＮＷＡＲＮＫ（配列番号１８）、この配列中で、ＩＴＡＭモチーフは、括弧で括って記載されている。
【０１４０】
同様に、好適な細胞内活性化ドメインポリペプチドは、完全長ＣＤ３デルタアミノ酸配列のＩＴＡＭモチーフ含有部分を含み得る。したがって、好適な細胞内活性化ドメインは、次の配列中の一続きの少なくとも１０、１５、２０個の、または全てのアミノ酸に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含むことができる：ＤＱＶ［ＹＱＰＬＲＤＲＤＤＡＱＹＳＨＬ］ＧＧＮ（配列番号１９）、この配列中で、ＩＴＡＭモチーフは、括弧で括って記載されている。
【０１４１】
いくつかの事例では、細胞内活性化ドメインは、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３イプシロン鎖（ＣＤ３ｅ、Ｔ細胞表面抗原Ｔ３／Ｌｅｕ−４イプシロン鎖、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３イプシロン鎖、ＡＩ５０４７８３、ＣＤ３、ＣＤ３イプシロン、Ｔ３ｅ、などとしても知られる）由来である。したがって、好適な細胞内活性化ドメインは、次の配列の一続きの少なくとも１０、１５、２０個の、または全てのアミノ酸に対して、または次のアミノ酸配列の近接している一続きの約１００アミノ酸〜約１１０アミノ酸（ａａ）、約１１０ａａ〜約１１５ａａ、約１１５ａａ〜約１２０ａａ、約１２０ａａ〜約１３０ａａ、約１３０ａａ〜約１４０ａａ、約１４０ａａ〜約１５０ａａ、または約１５０ａａ〜約１６０ａａに対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含むことができる：ＭＱＳＧＴＨＷＲＶＬＧＬＣＬＬＳＶＧＶＷＧＱＤＧＮＥＥＭＧＧＩＴＱＴＰＹＫＶＳＩＳＧＴＴＶＩＬＴＣＰＱＹＰＧＳＥＩＬＷＱＨＮＤＫＮＩＧＧＤＥＤＤＫＮＩＧＳＤＥＤＨＬＳＬＫＥＦＳＥＬＥＱＳＧＹＹＶＣＹＰＲＧＳＫＰＥＤＡＮＦＹＬＹＬＲＡＲＶＣＥＮＣＭＥＭＤＭＳＶＡＴＩＶＩＶＤＩＣＩＴＧＧＬＬＬＬＶＹＹＷＳＫＮＲＫＡＫＡＫＰＶＴＲＧＡＧＡＧＧＲＱＲＧＱＮＫＥＲＰＰＰＶＰＮＰＤ［ＹＥＰＩＲＫＧＱＲＤＬＹＳＧＬ］ＮＱＲＲＩ（配列番号２０）、この配列中で、ＩＴＡＭモチーフは、括弧で括って記載されている。
【０１４２】
同様に、好適な細胞内活性化ドメインポリペプチドは、完全長ＣＤ３イプシロンアミノ酸配列のＩＴＡＭモチーフ含有部分を含み得る。したがって、好適な細胞内活性化ドメインは、次の配列中の一続きの少なくとも１０、１５、２０個の、または全てのアミノ酸に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含むことができる：ＮＰＤ［ＹＥＰＩＲＫＧＱＲＤＬＹＳＧＬ］ＮＱＲ（配列番号２１）、この配列中で、ＩＴＡＭモチーフは、括弧で括って記載されている。
【０１４３】
いくつかの事例では、細胞内活性化ドメインは、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３γ鎖（ＣＤ３Ｇ、Ｔ細胞受容体Ｔ３γ鎖、ＣＤ３−ＧＡＭＭＡ、Ｔ３Ｇ、γポリペプチド（ＴｉＴ３複合体）、などとしても知られる）由来である。したがって、好適な細胞内活性化ドメインは、次の配列の一続きの少なくとも１０、１５、２０個の、または全てのアミノ酸に対して、または次のアミノ酸配列の近接している一続きの約１００アミノ酸〜約１１０アミノ酸（ａａ）、約１１０ａａ〜約１１５ａａ、約１１５ａａ〜約１２０ａａ、約１２０ａａ〜約１３０ａａ、約１３０ａａ〜約１４０ａａ、約１４０ａａ〜約１５０ａａ、または約１５０ａａ〜約１６０ａａに対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含むことができる：ＭＥＱＧＫＧＬＡＶＬＩＬＡＩＩＬＬＱＧＴＬＡＱＳＩＫＧＮＨＬＶＫＶＹＤＹＱＥＤＧＳＶＬＬＴＣＤＡＥＡＫＮＩＴＷＦＫＤＧＫＭＩＧＦＬＴＥＤＫＫＫＷＮＬＧＳＮＡＫＤＰＲＧＭＹＱＣＫＧＳＱＮＫＳＫＰＬＱＶＹＹＲＭＣＱＮＣＩＥＬＮＡＡＴＩＳＧＦＬＦＡＥＩＶＳＩＦＶＬＡＶＧＶＹＦＩＡＧＱＤＧＶＲＱＳＲＡＳＤＫＱＴＬＬＰＮＤＱＬ［ＹＱＰＬＫＤＲＥＤＤＱＹＳＨＬ］ＱＧＮＱＬＲＲＮ（配列番号２２）、この配列中で、ＩＴＡＭモチーフは、括弧で括って記載されている。
【０１４４】
同様に、好適な細胞内活性化ドメインポリペプチドは、完全長ＣＤ３γアミノ酸配列のＩＴＡＭモチーフ含有部分を含み得る。したがって、好適な細胞内活性化ドメインは、次の配列中の一続きの少なくとも１０、１５、２０個の、または全てのアミノ酸に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含むことができる：ＤＱＬ［ＹＱＰＬＫＤＲＥＤＤＱＹＳＨＬ］ＱＧＮ（配列番号２３）、この配列中で、ＩＴＡＭモチーフは、括弧で括って記載されている。
【０１４５】
いくつかの事例では、細胞内活性化ドメインは、ＣＤ７９Ａ（Ｂ細胞抗原受容体複合体関連タンパク質アルファ鎖；ＣＤ７９ａ抗原（免疫グロブリン関連アルファ）；ＭＢ−１膜糖タンパク質；Ｉｇアルファ；膜結合型免疫グロブリン関連タンパク質；表面ＩｇＭ結合タンパク質、などとしても知られる）由来である。したがって、好適な細胞内活性化ドメインは、次の配列の一続きの少なくとも１０、１５、２０個の、または全てのアミノ酸に対して、または次のアミノ酸配列のいずれかの近接している一続きの約１００アミノ酸〜約１１０アミノ酸（ａａ）、約１１０ａａ〜約１１５ａａ、約１１５ａａ〜約１２０ａａ、約１２０ａａ〜約１３０ａａ、約１３０ａａ〜約１４０ａａ、約１４０ａａ〜約１５０ａａ、または約１５０ａａ〜約１６０ａａに対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含むことができる：ＭＰＧＧＰＧＶＬＱＡＬＰＡＴＩＦＬＬＦＬＬＳＡＶＹＬＧＰＧＣＱＡＬＷＭＨＫＶＰＡＳＬＭＶＳＬＧＥＤＡＨＦＱＣＰＨＮＳＳＮＮＡＮＶＴＷＷＲＶＬＨＧＮＹＴＷＰＰＥＦＬＧＰＧＥＤＰＮＧＴＬＩＩＱＮＶＮＫＳＨＧＧＩＹＶＣＲＶＱＥＧＮＥＳＹＱＱＳＣＧＴＹＬＲＶＲＱＰＰＰＲＰＦＬＤＭＧＥＧＴＫＮＲＩＩＴＡＥＧＩＩＬＬＦＣＡＶＶＰＧＴＬＬＬＦＲＫＲＷＱＮＥＫＬＧＬＤＡＧＤＥＹＥＤＥＮＬ［ＹＥＧＬＮＬＤＤＣＳＭＹＥＤＩ］ＳＲＧＬＱＧＴＹＱＤＶＧＳＬＮＩＧＤＶＱＬＥＫＰ（配列番号２４）またはＭＰＧＧＰＧＶＬＱＡＬＰＡＴＩＦＬＬＦＬＬＳＡＶＹＬＧＰＧＣＱＡＬＷＭＨＫＶＰＡＳＬＭＶＳＬＧＥＤＡＨＦＱＣＰＨＮＳＳＮＮＡＮＶＴＷＷＲＶＬＨＧＮＹＴＷＰＰＥＦＬＧＰＧＥＤＰＮＥＰＰＰＲＰＦＬＤＭＧＥＧＴＫＮＲＩＩＴＡＥＧＩＩＬＬＦＣＡＶＶＰＧＴＬＬＬＦＲＫＲＷＱＮＥＫＬＧＬＤＡＧＤＥＹＥＤＥＮＬ［ＹＥＧＬＮＬＤＤＣＳＭＹＥＤＩ］ＳＲＧＬＱＧＴＹＱＤＶＧＳＬＮＩＧＤＶＱＬＥＫＰ（配列番号２５）、この配列中で、ＩＴＡＭモチーフは、括弧で括って記載されている。
【０１４６】
同様に、好適な細胞内活性化ドメインポリペプチドは、完全長ＣＤ７９Ａアミノ酸配列のＩＴＡＭモチーフ含有部分を含み得る。したがって、好適な細胞内活性化ドメインは、次の配列中の一続きの少なくとも１０、１５、２０個の、または全てのアミノ酸に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含むことができる：ＥＮＬ［ＹＥＧＬＮＬＤＤＣＳＭＹＥＤＩ］ＳＲＧ（配列番号２６）、この配列中で、ＩＴＡＭモチーフは、括弧で括って記載されている。
【０１４７】
いくつかの事例では、細胞内活性化ドメインは、ＤＡＰ１２（ＴＹＲＯＢＰ；ＴＹＲＯプロテインチロシンキナーゼ結合タンパク質；ＫＡＲＡＰ；ＰＬＯＳＬ；ＤＮＡＸ活性化タンパク質１２；ＫＡＲ関連タンパク質；ＴＹＲＯプロテインチロシンキナーゼ結合タンパク質；キラー細胞活性化受容体関連タンパク質；キラー細胞活性化受容体関連タンパク質、などとしても知られる）由来である。例えば、好適な細胞内活性化ドメインは、次の配列の一続きの少なくとも１０、１５、２０個の、または全てのアミノ酸に対して、または次のアミノ酸配列（４アイソフォーム）のいずれかの近接している一続きの約１００アミノ酸〜約１１０アミノ酸（ａａ）、約１１０ａａ〜約１１５ａａ、約１１５ａａ〜約１２０ａａ、約１２０ａａ〜約１３０ａａ、約１３０ａａ〜約１４０ａａ、約１４０ａａ〜約１５０ａａ、または約１５０ａａ〜約１６０ａａに対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含むことができる：ＭＧＧＬＥＰＣＳＲＬＬＬＬＰＬＬＬＡＶＳＧＬＲＰＶＱＡＱＡＱＳＤＣＳＣＳＴＶＳＰＧＶＬＡＧＩＶＭＧＤＬＶＬＴＶＬＩＡＬＡＶＹＦＬＧＲＬＶＰＲＧＲＧＡＡＥＡＡＴＲＫＱＲＩＴＥＴＥＳＰ［ＹＱＥＬＱＧＱＲＳＤＶＹＳＤＬ］ＮＴＱＲＰＹＹＫ（配列番号２７）、ＭＧＧＬＥＰＣＳＲＬＬＬＬＰＬＬＬＡＶＳＧＬＲＰＶＱＡＱＡＱＳＤＣＳＣＳＴＶＳＰＧＶＬＡＧＩＶＭＧＤＬＶＬＴＶＬＩＡＬＡＶＹＦＬＧＲＬＶＰＲＧＲＧＡＡＥＡＴＲＫＱＲＩＴＥＴＥＳＰ［ＹＱＥＬＱＧＱＲＳＤＶＹＳＤＬ］ＮＴＱ（配列番号２８）、ＭＧＧＬＥＰＣＳＲＬＬＬＬＰＬＬＬＡＶＳＤＣＳＣＳＴＶＳＰＧＶＬＡＧＩＶＭＧＤＬＶＬＴＶＬＩＡＬＡＶＹＦＬＧＲＬＶＰＲＧＲＧＡＡＥＡＡＴＲＫＱＲＩＴＥＴＥＳＰ［ＹＱＥＬＱＧＱＲＳＤＶＹＳＤＬ］ＮＴＱＲＰＹＹＫ（配列番号２９）、またはＭＧＧＬＥＰＣＳＲＬＬＬＬＰＬＬＬＡＶＳＤＣＳＣＳＴＶＳＰＧＶＬＡＧＩＶＭＧＤＬＶＬＴＶＬＩＡＬＡＶＹＦＬＧＲＬＶＰＲＧＲＧＡＡＥＡＴＲＫＱＲＩＴＥＴＥＳＰ［ＹＱＥＬＱＧＱＲＳＤＶＹＳＤＬ］ＮＴＱＲＰＹＹＫ（配列番号３０）、この配列中で、ＩＴＡＭモチーフは、括弧で括って記載されている。
【０１４８】
同様に、好適な細胞内活性化ドメインポリペプチドは、完全長ＤＡＰ１２アミノ酸配列のＩＴＡＭモチーフ含有部分を含み得る。したがって、好適な細胞内活性化ドメインは、次の配列中の一続きの少なくとも１０、１５、２０個の、または全てのアミノ酸に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含むことができる：ＥＳＰ［ＹＱＥＬＱＧＱＲＳＤＶＹＳＤＬ］ＮＴＱ（配列番号３１）、この配列中で、ＩＴＡＭモチーフは、括弧で括って記載されている。
【０１４９】
いくつかの事例では、細胞内活性化ドメインは、ＦＣＥＲＩＧ（ＦＣＲＧ；Ｆｃイプシロン受容体Ｉγ鎖；Ｆｃ受容体γ鎖；ｆｃ−イプシロンＲＩ−γ；ｆｃＲγ；ｆｃｅＲＩγ；高親和性免疫グロブリンイプシロン受容体サブユニットγ；免疫グロブリンＥ受容体、高親和性、γ鎖、などとしても知られる）由来である。例えば、好適な細胞内活性化ドメインは、次の配列の一続きの少なくとも１０、１５、２０個の、または全てのアミノ酸に対して、または次のアミノ酸配列の近接している一続きの約５０アミノ酸〜約６０アミノ酸（ａａ）、約６０ａａ〜約７０ａａ、約７０ａａ〜約８０ａａ、または約８０ａａ〜約８８ａａに対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含むことができる：ＭＩＰＡＶＶＬＬＬＬＬＬＶＥＱＡＡＡＬＧＥＰＱＬＣＹＩＬＤＡＩＬＦＬＹＧＩＶＬＴＬＬＹＣＲＬＫＩＱＶＲＫＡＡＩＴＳＹＥＫＳＤＧＶ［ＹＴＧＬＳＴＲＮＱＥＴＹＥＴＬ］ＫＨＥＫＰＰＱ（配列番号３２）、この配列中で、ＩＴＡＭモチーフは、括弧で括って記載されている。
【０１５０】
同様に、好適な細胞内活性化ドメインポリペプチドは、完全長ＦＣＥＲ１Ｇアミノ酸配列のＩＴＡＭモチーフ含有部分を含み得る。したがって、好適な細胞内活性化ドメインは、次の配列中の一続きの少なくとも１０、１５、２０個の、または全てのアミノ酸に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含むことができる：ＤＧＶ［ＹＴＧＬＳＴＲＮＱＥＴＹＥＴＬ］ＫＨＥ（配列番号３３）、この配列中で、ＩＴＡＭモチーフは、括弧で括って記載されている。
【０１５１】
本開示のＣＡＲでの使用に好適する細胞内活性化ドメインは、ＤＡＰ１０／ＣＤ２８型シグナル伝達鎖を含む。ＤＡＰ１０シグナル伝達鎖の一例は、次記のアミノ酸配列である：ＲＰＲＲＳＰＡＱＤＧＫＶ［ＹＩＮＭ］ＰＧＲＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）。いくつかの実施形態では、好適な細胞内活性化ドメインは、次の配列中の一続きの少なくとも１０、１５、２０個の、または全てのアミノ酸に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含む：ＲＰＲＲＳＰＡＱＤＧＫＶ［ＹＩＮＭ］ＰＧＲＧ（配列番号３４）、この配列中で注目に値するモチーフは、括弧で括っている。
【０１５２】
ＣＤ２８シグナル伝達鎖の一例は、次記のアミノ酸配列である：ＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤ［ＹＭＮＭ］ＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳ（配列番号３５）。いくつかの実施形態では、好適な細胞内ドメインは、次の配列中の一続きの少なくとも１０、１５、２０個の、または全てのアミノ酸に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含む：ＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤ［ＹＭＮＭ］ＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳ（配列番号３５）。
【０１５３】
本開示のＣＡＲでの使用に好適な細胞内活性化ドメインは、次の配列の一続きの少なくとも１０、１５、２０個の、または全てのアミノ酸に対して、または次のアミノ酸配列の近接している一続きの約３００アミノ酸〜約４００アミノ酸、約４００アミノ酸〜約５００アミノ酸、または約５００アミノ酸〜６１９アミノ酸に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含むことができる：ＭＰＤＰＡＡＨＬＰＦＦＹＧＳＩＳＲＡＥＡＥＥＨＬＫＬＡＧＭＡＤＧＬＦＬＬＲＱＣＬＲＳＬＧＧＹＶＬＳＬＶＨＤＶＲＦＨＨＦＰＩＥＲＱＬＮＧＴＹＡＩＡＧＧＫＡＨＣＧＰＡＥＬＣＥＦＹＳＲＤＰＤＧＬＰＣＮＬＲＫＰＣＮＲＰＳＧＬＥＰＱＰＧＶＦＤＣＬＲＤＡＭＶＲＤＹＶＲＱＴＷＫＬＥＧＥＡＬＥＱＡＩＩＳＱＡＰＱＶＥＫＬＩＡＴＴＡＨＥＲＭＰＷＹＨＳＳＬＴＲＥＥＡＥＲＫＬＹＳＧＡＱＴＤＧＫＦＬＬＲＰＲＫＥＱＧＴＹＡＬＳＬＩＹＧＫＴＶＹＨＹＬＩＳＱＤＫＡＧＫＹＣＩＰＥＧＴＫＦＤＴＬＷＱＬＶＥＹＬＫＬＫＡＤＧＬＩＹＣＬＫＥＡＣＰＮＳＳＡＳＮＡＳＧＡＡＡＰＴＬＰＡＨＰＳＴＬＴＨＰＱＲＲＩＤＴＬＮＳＤＧＹＴＰＥＰＡＲＩＴＳＰＤＫＰＲＰＭＰＭＤＴＳＶＹＥＳＰＹＳＤＰＥＥＬＫＤＫＫＬＦＬＫＲＤＮＬＬＩＡＤＩＥＬＧＣＧＮＦＧＳＶＲＱＧＶＹＲＭＲＫＫＱＩＤＶＡＩＫＶＬＫＱＧＴＥＫＡＤＴＥＥＭＭＲＥＡＱＩＭＨＱＬＤＮＰＹＩＶＲＬＩＧＶＣＱＡＥＡＬＭＬＶＭＥＭＡＧＧＧＰＬＨＫＦＬＶＧＫＲＥＥＩＰＶＳＮＶＡＥＬＬＨＱＶＳＭＧＭＫＹＬＥＥＫＮＦＶＨＲＤＬＡＡＲＮＶＬＬＶＮＲＨＹＡＫＩＳＤＦＧＬＳＫＡＬＧＡＤＤＳＹＹＴＡＲＳＡＧＫＷＰＬＫＷＹＡＰＥＣＩＮＦＲＫＦＳＳＲＳＤＶＷＳＹＧＶＴＭＷＥＡＬＳＹＧＱＫＰＹＫＫＭＫＧＰＥＶＭＡＦＩＥＱＧＫＲＭＥＣＰＰＥＣＰＰＥＬＹＡＬＭＳＤＣＷＩＹＫＷＥＤＲＰＤＦＬＴＶＥＱＲＭＲＡＣＹＹＳＬＡＳＫＶＥＧＰＰＧＳＴＱＫＡＥＡＡＣＡ（配列番号３６）。
【０１５４】
追加のドメイン
ＣＡＲは、１つまたは複数の追加のポリペプチドドメインをさらに含むことができ、このようなドメインには、限定されないが、シグナル配列；エピトープタグ；親和性ドメイン；および検出可能なシグナルを生成するポリペプチドが含まれる。本明細書で提供されるいずれかの態様または実施形態に対する追加のドメインの非限定的例には、以下で説明される次記の配列：シグナル配列、エピトープタグ、親和性ドメイン、または検出可能なシグナルを生成するポリペプチド、のいずれかに対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインが含まれる。
【０１５５】
当該ＣＡＲ、例えば、当該ＣＡＲの第１のポリペプチド中での使用に好適するシグナル配列には、天然のシグナル配列、合成（例えば、人工の）シグナル配列などを含む、任意の真核生物シグナル配列が含まれる。いくつかの実施形態では、例えば、シグナル配列は、ＣＤ８シグナル配列ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ（配列番号７４）であり得る。
【０１５６】
エピトープエピトープタグには、限定されないが、赤血球凝集素（ＨＡ；例えば、ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ配列番号３７）；ＦＬＡＧ（例えば、ＤＹＫＤＤＤＤＫ；配列番号３８）；ｃ−ｍｙｃ（例えば、ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ；配列番号３９）、などが挙げられる。
【０１５７】
親和性ドメインには、結合相手、例えば、１つの固体支持体上に固定された、特定または精製に有用なもの、との相互作用できるペプチド配列が含まれる。複数の連続した単一アミノ酸、例えば、ヒスチジンをコードするＤＮＡ配列は、発現したタンパク質に融合される場合、ニッケルセファロースなどの樹脂カラムへの親和性結合により、組換えタンパク質の一段階精製に使用し得る。例示的親和性ドメインには、Ｈｉｓ５（ＨＨＨＨＨ；配列番号４０）、ＨｉｓＸ６（ＨＨＨＨＨＨ；配列番号４１）、ｃ−ｍｙｃ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ；配列番号３９）、Ｆｌａｇ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ；配列番号３８）、Ｓｔｒｅｐ  Ｔａｇ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ；配列番号４２）、赤血球凝集素、例えば、ＨＡタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ；配列番号３７）、ＧＳＴ、チオレドキシン、セルロース結合ドメイン、ＲＹＩＲＳ（配列番号４３）、Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ（配列番号４４）、キチン結合ドメイン、Ｓ−ペプチド、Ｔ７ペプチド、ＳＨ２ドメイン、Ｃ−末端ＲＮＡタグ、ＷＥＡＡＡＲＥＡＣＣＲＥＣＣＡＲＡ（配列番号４５）、金属結合ドメイン、例えば、亜鉛結合ドメインまたは例えば、カルモデュリン、トロポニンＣ、カルシニューリンＢ、ミオシン軽鎖、リカバリン、Ｓ−モジュリン、ビジニン、ＶＩＬＩＰ、ニューロカルシン、ヒポカルシン、フリクエニン、カルトラクチン、カルパイン大きなサブユニット、Ｓ１００タンパク質、パルブアルブミン、カルビンディンＤ９Ｋ、カルビンディンＤ２８Ｋ、およびカルレチニンなどのカルシウム結合タンパク質由来のものなどのカルシウム結合ドメイン、インテイン、ビオチン、ストレプトアビジン、ＭｙｏＤ、Ｉｄ、ロイシンジッパー配列、およびマルトース結合タンパク質が挙げられる。
【０１５８】
好適な検出可能なシグナル生成タンパク質には、例えば、蛍光タンパク質；検出可能なシグナルを生成物として生成する反応を触媒する酵素；などが挙げられる。
【０１５９】
好適な蛍光タンパク質には、限定されないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはそのバリアント、ＧＦＰの青色蛍光バリアント（ＢＦＰ）、ＧＦＰの青緑色蛍光バリアント（ＣＦＰ）、ＧＦＰの黄色蛍光バリアント（ＹＦＰ）、蛍光強化型ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、蛍光強化型ＣＦＰ（ＥＣＦＰ）、蛍光強化型ＹＦＰ（ＥＹＦＰ）、ＧＦＰＳ６５Ｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ｔｏｐａｚ（ＴＹＦＰ）、Ｖｅｎｕｓ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、ＧＦＰｕｖ、不安定化ＥＧＦＰ（ｄＥＧＦＰ）、不安定化ＥＣＦＰ（ｄＥＣＦＰ）、不安定化ＥＹＦＰ（ｄＥＹＦＰ）、ｍＣＦＰｍ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ＣｙＰｅｔ、ＹＰｅｔ、ｍＫＯ、ＨｃＲｅｄ、ｔ−ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄモノマー、Ｊ−Ｒｅｄ、ダイマー２、ｔ−ダイマー２（１２）、ｍＲＦＰｌ、ポシロポリン（ｐｏｃｉｌｌｏｐｏｒｉｎ）、ウミシイタケＧＦＰ、モンスターＧＦＰ、ｐａＧＦＰ、Ｋａｅｄｅタンパク質およびｋｉｎｄｌｉｎｇタンパク質、フィコビリンタンパク質およびＢ−フィコエリトリン、Ｒ−フィコエリトリンおよびアロフィコシアニンを含むフィコビリンタンパク質コンジュゲートが挙げられる。蛍光タンパク質の他の例には、ｍＨｏｎｅｙｄｅｗ、ｍＢａｎａｎａ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｄＴｏｍａｔｏ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＧｒａｐｅｌ、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＧｒａｐｅ２、ｍＰｌｕｍ（Ｓｈａｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２：９０５−９０９）などが挙げられる。例えば、Ｍａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：９６９−９７３に記載の花虫類由来の種々の蛍光および着色タンパク質のいずれかは、使用に好適する。
【０１６０】
好適な酵素には、限定されないが、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）、ベータガラクトシダーゼ（ＧＡＬ）、グルコース−６−ホスフェート脱水素酵素、ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、β−グルクロニダーゼ、インベルターゼ、キサンチンオキシダーゼ、ホタルルシフェラーゼ、グルコースオキシダーゼ（ＧＯ）、などが挙げられる。
【０１６１】
認識および／または除去ドメイン
本明細書で開示のいずれかのＣＡＲは、認識または除去ドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、認識または除去ドメインは、単純ヘルペスウイルス由来酵素チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）または誘導型カスパーゼ９から誘導でき、またはＦＬＡＧエピトープ（配列番号３８）であり得る。いくつかの実施形態では、認識または除去ドメインは、政府規制機関によりヒトでの使用が承認された抗体、例えば、限定されないが、セツキシマブ、リツキシマブ、またはハーセプチンなどにより認識される。いくつかの実施形態では、認識または除去ドメインは、米国特許第８，８０２，３７４号に記載のように、改変内在性細胞表面分子を含み得る。改変内在性細胞表面分子は、任意の細胞表面関連受容体、リガンド、糖タンパク質、細胞接着分子、抗原、インテグリン、または改変されている表面抗原分類（ＣＤ）であり得る。いくつかの実施形態では、改変内在性細胞表面分子は、切断型チロシンキナーゼ受容体である。一態様では、切断型チロシンキナーゼ受容体は、上皮成長因子受容体ファミリー（例えば、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４）のメンバーで、例えば、配列番号７８である。認識または除去ドメインは、ＣＡＲを同様に含む単一ポリペプチドの一部として発現され得る。いくつかの実施形態では、認識または除去ドメインは、単一ポリペプチドのＮ−末端またはその近傍、例えば、Ｎ末端シグナルペプチドの後方であり得る。いくつかの実施形態では、認識または除去ドメインは、ポリペプチドのＣ−末端またはその近傍であり得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドのＣ−末端またはその近傍の認識または除去ドメインは、ＣＡＲをコードするアミノ酸配列から、切断シグナルまたはリボソームスキップ配列により、分離され得る。切断シグナルは、当該技術分野において既知の任意の切断シグナルであり得る。リボソームスキップ配列は、当該技術分野において既知の任意のリボソームスキップ配列であり得、例えば、２Ａ−１アミノ酸配列ＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号７７）であり得る。いくつかの実施形態では、認識または除去ドメインは、ＣＡＲのいずれかのドメインの間、例えば、ストークと膜貫通ドメインの間にあり得、または認識または除去ドメインは、リンカー中、例えば、単鎖抗体の重鎖と軽鎖の間のリンカー中にあり得る。
【０１６２】
ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ１およびＨＥＲ１としても知られる上皮成長因子受容体は、細胞外リガンドの上皮増殖因子ファミリーメンバーに対する、細胞表面受容体である。ＥＧＦＲ活性の変化は、特定の癌に結びつけられる。いくつかの実施形態では、ヒト上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を含むＥＧＦＲポリペプチドをコードする遺伝子は、膜遠位のＥＧＦ結合ドメインおよび細胞質のシグナル伝達末端を含むポリペプチドをコードする核酸配列の除去により構築されるが、抗ＥＧＦＲ抗体により認識される細胞外の膜近位のエピトープを保持している。例示的実施形態では、抗体は、既知の商業的に入手できる抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体、例えば、セツキシマブ、マツズマブ、ネシツムマブ、またはパニツムマブである。
【０１６３】
抗ビオチンマイクロビーズと組み合わせた、ビオチン化セツキシマブの免疫磁気選択の適用は、レンチウイルスによりＥＧＦＲｔ含有構築物を形質導入したＴ細胞を２％もの低い集団から９０％を超える純度まで、細胞調製に対する観察可能な毒性なしに、うまく濃縮する。この不活性ＥＧＦＲ分子の構成的発現は、協調的に発現したキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、ＣＤ１９Ｒにより誘導されるＴ細胞表現型またはエフェクター機能に影響を与えない。フローサイトメトリー分析を介して、ＥＧＦＲが、マウスへのＴ細胞移植のためのインビボ追跡マーカーとして、うまく利用された。さらに、ＥＧＦＲは、アービタックス（登録商標）媒介抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）経路を介して、自殺遺伝子の潜在能力を有することが示された。したがって、ＥＧＦＲを、免疫療法の可能性を有する形質導入Ｔ細胞のための非免疫原性選択ツール、追跡マーカー、および自殺遺伝子として使用し得る。ＥＧＦＲ核酸はまた、当該技術分野において周知の方法により検出し得る。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲは、ＣＡＲを同様に含む単一ポリペプチドの一部として発現され得る。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ認識ドメインをコードするアミノ酸配列は、ＣＡＲをコードするアミノ酸配列から、切断シグナルまたはリボソームスキップ配列により、分離され得る。切断シグナルは、当該技術分野において既知の任意の切断シグナルであり得る。リボソームスキップ配列は、当該技術分野において既知の任意のリボソームスキップ配列であり得、例えば、２Ａ−１アミノ酸配列ＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号７７）であり得る。いくつかの実施形態では、認識ドメインをコードするポリヌクレオチド配列は、ＣＡＲと同じ転写物上に存在し得るが、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列から、配列内リボソーム進入部位により、分離され得る。
【０１６５】
配列の組換え
特定の事例では、ＣＡＲ、例えば、ＣＡＲドメインのポリペプチド配列は、部位特異的組換え技術の使用により、細胞中で、再構成または欠失させ得る。特定の実施形態では、特定のＣＡＲに対する細胞活性化関連応答は、部位特異的組換えにより変えることができ、例えば、第１の活性化関連応答を誘発するＣＡＲの第１の細胞内活性化ドメインは、第２の活性化関連応答を誘発する第２の細胞内活性化ドメインと交換し得る。当業者には明らかなように、部位特異的組換えを細胞中で用いて、ＣＡＲの任意のドメインまたは配列を、任意のその他の本明細書で開示のドメインまたは配列と交換できる。当業者には明らかなように、部位特異的組換えを細胞中で用いて、ＣＡＲの任意のドメインまたは配列を欠失させることができる。このような配列およびドメインの交換および切除は、当該技術分野において公知であり、例えば、Ｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，３２１９−３２２６に記載のシグナロボディ中のドメインスイッチングを参照されたい。この文献の開示は、参照により本明細書で開示される。部位特異的組換えをインビボで実施する機序および要件も、当該技術分野において周知であり、Ｇｒｉｎｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５６７−６０５およびＴｒｏｐｐ（２０１２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｎｅｓ  ＆  Ｂａｒｔｌｅｔｔ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｓｕｄｂｕｒｙ，ＭＡ）を参照されたい。この文献の開示は、参照により本明細書で開示される。
【０１６６】
ＣＡＲは、上記で考察した全ての異なるドメインを一緒に融合して、融合タンパク質を形成することにより生成されるキメラタンパク質である。ＣＡＲは通常、本明細書で考察したＣＡＲの異なるドメインをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターにより生成される。標的細胞上の抗原を認識し、結合するよう機能する本発明のＡＳＴＲは、条件的活性型である。具体的には、対応する野性型タンパク質のＡＳＴＲと比較して、標的抗原との結合に関して、ＡＳＴＲは、正常な生理的条件下では低い活性であるかまたは不活性であり、インビトロ腫瘍代替アッセイ条件下では活性である。
【０１６７】
標的抗原に対する少なくともその結合ドメインとして全体または一部で使用するのに好適する野性型または未変性タンパク質を、タンパク質ライブラリーを生成し、そのライブラリーを標的抗原に対する目的の結合親和性を有するタンパク質で選別することにより、本発明のＡＳＴＲとして、見つけ得る。野性型タンパク質は、ｃＤＮＡライブラリーの選別により見つけ得る。ｃＤＮＡライブラリーは、宿主細胞のコレクション中に挿入したクローン化ｃＤＮＡ（相補ＤＮＡ）フラグメントであり、これは、一緒に、生物のトランスクリプトームの一部を構成する。ｃＤＮＡは、完全転写ｍＲＮＡから生成され、したがって、生物の発現タンパク質のコード配列を含む。ｃＤＮＡライブラリー中の情報は、標的抗原に対する所望の結合親和性を有するタンパク質でライブラリーを選別することにより、望ましい特性を有するタンパク質を見つけるための強力で有用なツールである。
【０１６８】
腫瘍微小環境
固形腫瘍中の癌細胞は、それらの周囲で腫瘍微小環境を形成し、癌細胞の増殖と転移を支援することができる。腫瘍微小環境は、腫瘍が存在する細胞環境であり、これには、周辺血管、免疫細胞、線維芽細胞、他の細胞、可溶性因子、シグナル伝達分子、細胞外マトリックス、ならびに腫瘍性転化の促進、腫瘍増殖および浸潤の支援、宿主免疫からの腫瘍の保護、治療耐性の促進、および休眠転移の繁殖のための微小環境の提供を行うことができる機械的な手がかりが含まれる。腫瘍および周辺微小環境は、密接に関係し、常に相互作用している。腫瘍は、細胞外シグナルを放出し、腫瘍血管新生を促進し、末梢免疫寛容を誘導することによりそれらの微小環境に影響を与えることができ、一方、微小環境中の免疫細胞は、癌細胞の増殖と進化に影響を与えることができる。Ｓｗａｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．”Ｔｕｍｏｒ  Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ：Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｒｏｌｅｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，”  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，ｖｏｌ．，７２，ｐａｇｅｓ  ２４７３−２４８０，２０１２、を参照されたい。
【０１６９】
腫瘍微小環境は、低酸素性であることが多い。腫瘍量が増加するに伴い、腫瘍の内部は、既存の血液供給から離れてさらに遠くに成長し、これにより、腫瘍微小環境に十分に酸素を供給することが困難になる。腫瘍環境中の酸素分圧は、血漿中の約４０ｍｍＨｇの酸素分圧と比較して、局所的進行型固形腫瘍の５０％超で５ｍｍＨｇ未満である。対照的に、身体の他の部品は、低酸素性ではない。低酸素性環境は、遺伝的不安定性につながり、これは、ヌクレオチド切除修復およびミスマッチ修復経路の下方調節を介して、癌進行と関連している。低酸素はまた、低酸素誘導性因子Ｉアルファ（ＨＩＦ１−α）の上方制御を引き起こし、これは、血管新生を誘導し、より不良な予後および転移に関連する遺伝子の活性化と関連している。Ｗｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｔｈｅ  ｔｕｍｏｒ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，”  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２１，ｐａｇｅｓ  １７２−  １７７，２０１２  ａｎｄ  Ｂｌａｇｏｓｋｌｏｎｎｙ，”Ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ，”  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．５，ｐａｇｅｓ  １３−１７，２００４、を参照されたい。
【０１７０】
さらに、腫瘍細胞は、乳酸発酵から生成されるエネルギーに依存する傾向があり、これは酸素を必要としない。そのため、腫瘍細胞は、酸素が必要な通常の好気性呼吸を使用する可能性が低い。乳酸発酵の使用の結果は、他の身体の部分が中性または僅かにアルカリ性であるのとは対照的に、腫瘍微小環境は酸性（ｐＨ６．５〜６．９）であるということである。例えば、ヒト血漿のｐＨは、約７．４である。Ｅｓｔｒｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，”Ａｃｉｄｉｔｙ  Ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｔｕｍｏｒ  Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  Ｄｒｉｖｅｓ  Ｌｏｃａｌ  Ｉｎｖａｓｉｏｎ，”  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．７３，ｐａｇｅｓ  １５２４−１５３５，２０１３、を参照されたい。増殖癌細胞の比較的高い栄養素需要のために、身体の他の部分に位置する細胞と比較して、腫瘍微小環境中で栄養素を利用できる度合いもまた、低い。
【０１７１】
さらに、腫瘍微小環境はまた、身体の他の部分では通常見られない多くの独特の細胞型を含む。これらの細胞型には、内皮細胞およびそれらの前駆物質、周皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、癌腫関連線維芽細胞、筋線維芽細胞、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、ＴおよびＢリンパ球、ナチュラルキラー細胞およびマクロファージおよび樹状細胞などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）が含まれる（Ｌｏｒｕｓｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｔｈｅ  ｔｕｍｏｒ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｕｍｏｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｔｏｗａｒｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，”  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，ｖｏｌ．１３０，ｐａｇｅｓ  １０９１−１１０３，２００８）。
【０１７２】
したがって、腫瘍微小環境は、血漿中の生理的条件などの、身体の他の部分のものとは異なる、少なくともいくつかの生理的条件を有する。腫瘍微小環境は身体の他の部分、特に血漿（ｐＨ７．４）より低いｐＨ（酸性）を有する。腫瘍微小環境は、血漿などの身体の他の部分よりも、低い酸素濃度である。また、腫瘍微小環境は身体の他の部分、特に血漿より低い栄養素入手可能性を有する。また、腫瘍微小環境はまた、身体の他の部分、特に血漿では通常見られないいくつかの独特の細胞型を含む。
【０１７３】
例示的実施形態では、本発明のＣＡＲは、例えば、マウスまたはヒトなどの腫瘍治療の候補となり得る哺乳類生物から単離した野性型または天然の抗体などの野性型（すなわち、未変性）生体タンパク質から生成した条件的活性型ＡＳＴＲを含む。このような例示的実施形態では、条件的活性型ＡＳＴＲは、血漿などの腫瘍微小環境以外の身体の部分では、少なくとも１つの生理的条件下で、天然または野性型生体タンパク質より低い活性を有し、一方、腫瘍微小環境中の少なくとも１つの生理的条件下で、天然または野性型生体タンパク質よりも高い活性を有する。条件的活性型天然または生体タンパク質は、腫瘍を治療するために、腫瘍微小環境中の癌細胞に選択的に作用でき、したがって、副作用を引き起こす可能性が低下すると思われる。天然または生体タンパク質が腫瘍細胞上の抗原に対する抗体であって、その抗原が腫瘍微小環境中に露出されている実施形態では、条件的活性型抗体は、身体の他の部分では天然または野性型抗体より抗原に対するより低い親和性を有し、一方、腫瘍微小環境中では天然または野性型抗体より抗原に対するより高い親和性を有する。このような条件的活性型抗体は、身体の他の部分に対しては、弱く結合するか、または全く結合しないが、腫瘍微小環境中の抗原に対しては、より大きな結合性を有する、または強力に、しっかりと結合する。
【０１７４】
インビトロ腫瘍代替アッセイ
例示的実施形態では、ＣＡＲまたは本開示で使われるＡＳＴＲ、およびこのようなＡＳＴＲを含む本明細書のＣＡＲは通常、腫瘍環境および／またはインビトロ腫瘍代替アッセイ条件では条件的活性型である。インビトロ腫瘍代替アッセイ条件は、少なくとも一部の癌中で、インビボで認められる値またはレベルでのその条件を、生理的条件下の生理学的組織で認められる値またはレベルでのその条件に対して、インビトロで試験されるいずれかの条件であり得る。本明細書の実施例で提供されるのは、生理学的ｐＨ（例えば、７．４）に比較して、低ｐＨ（例えば、６．０または６．７）での細胞溶解のための非限定的インビトロ腫瘍代替アッセイである。本開示のＣＡＲが活性になり得るインビトロ腫瘍代替アッセイ条件には、限定されないが、高ヒアルロン酸、乳酸、および／またはアルブミンが挙げられ、正常な条件は、低レベルの乳酸、ヒアルロン酸、およびアルブミンである。別のインビトロ腫瘍代替アッセイ条件はｐＨであり、特に、インビトロ腫瘍代替アッセイ条件が正常な生理学的ｐＨより低い特定の条件である。例えば、腫瘍代替アッセイ条件は、範囲の下端値の６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、および６．５、と範囲の上端値の６．６、６．７、６．８、および６．９との間のｐＨであり得る。一方、生理学的ｐＨは、範囲の下端値の７．２、７．３、および７．４、と範囲の上端値の７．５、７．６、７．７、および７．８との間のｐＨであり得る。例示的実施形態では、インビトロ腫瘍代替アッセイ条件の低ｐＨは、６．５〜６．９であり、特に、６．７であり得る。生理学的ｐＨは７．２〜７．６であり、または特に、ｐＨ７．４に設定され得る。別の実施形態では、ｐＨは変化しないが、インビトロ腫瘍代替アッセイ条件は、乳酸の濃度でのみ異なる。別の実施形態では、インビトロ腫瘍代替アッセイ条件は、生理的環境に比べて、高レベルのアデノシンを含む。別の実施形態では、インビトロ腫瘍代替アッセイ条件は、生理的環境に比べて、高レベルのＲ−２−ヒドロキシグルタル酸を含む。他の実施形態では、ｓｃＦｖが、米国特許第８，７０９，７５５Ｂ２号および国際公開第２０１６／０３３３３１Ａ１号で記載のもののような、分子進化を経て微小環境特異性で選択されたモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖から移植される。
【０１７５】
核酸
本開示は、本開示の条件的活性型ＣＡＲのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。本開示の条件的活性型ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、いくつかの実施形態では、例えば、組換え発現ベクターを含むＤＮＡである。本開示の条件的活性型ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、いくつかの実施形態では、例えば、インビトロ合成ＲＮＡである。
【０１７６】
いくつかの事例では、核酸は、本開示のＣＡＲの生成、例えば、哺乳動物細胞における生成が提供される。他の事例では、当該核酸は、本開示のＣＡＲをコードする核酸の増幅を提供する。
【０１７７】
本開示のＣＡＲをコードするヌクレオチド配列は、転写調節領域、例えば、プロモーター、およびエンハンサー、などに動作可能に連結され得る。
【０１７８】
好適なプロモーターおよびエンハンサー配列は当技術分野において既知である。細菌細胞中での発現に好適なプロモーターには、限定されないが、ｌａｃｌ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、ラムダＰおよびｔｒｃが挙げられる。真核細胞での発現に好適するプロモーターには、限定されないが、軽鎖および／または重鎖免疫グロブリン遺伝子プロモーターおよびエンハンサー配列；サイトメガロウィルス最初期プロモーター；単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーター；初期および後期ＳＶ４０プロモーター；レトロウイルス由来の長末端反復配列中に存在するプロモーター；マウスメタロチオネイン−Ｉプロモーター；および当該分野で既知の種々の組織特異的プロモーターが挙げられる。
【０１７９】
可逆的誘導性プロモーターを含む好適な可逆的プロモーターは、当技術分野において既知である。このような可逆的プロモーターは、多くの生物、例えば、真核生物および原核生物から単離および誘導され得る。第１の生物に由来する可逆的プロモーターを第２の生物で使用する場合、例えば、第１が原核生物で第２が真核生物の場合や、第１が真核生物で第２が原核生物の場合などにおける、プロモーターの改変は本技術分野で周知である。このような可逆的プロモーター、ならびにこのような可逆的プロモーターをベースにするが追加の制御タンパク質も含む系としては、限定されないが、アルコール調節プロモーター（例えば、アルコールデヒドロゲナーゼＩ（ａｌｃＡ）遺伝子プロモーター、アルコールトランス活性化因子タンパク質（ＡｌｃＲ）に応答するプロモーターなど）、テトラサイクリン調節プロモーター（例えば、Ｔｅｔアクチベーター、ＴｅｔＯＮ、ＴｅｔＯＦＦなどを含むプロモーター系）、ステロイド調節プロモーター（例えば、ラット糖質コルチコイド受容体プロモーター系、ヒトエストロゲン受容体プロモーター系、レチノイドプロモーター系、甲状腺プロモーター系、エクジソンプロモーター系、ミフェプリストンプロモーター系など）、金属調節プロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター系など）、病因関連調節プロモーター（例えば、サリチル酸調節プロモーター、エチレン調節プロモーター、ベンゾチアジアゾール調節プロモーターなど）、温度調節プロモーター（例えば、ヒートショック誘導性プロモーター（例えば、ＨＳＰ−７０、ＨＳＰ−９０、ダイズヒートショックプロモーターなど）、光調節プロモーター、合成誘導性プロモーター、などが挙げられる。
【０１８０】
いくつかの事例では、適切なプロモーターを含む遺伝子座、構築物、またはトランス遺伝子は、誘導系による誘導を介して不可逆的にスイッチされる。不可逆的スイッチの誘導に好適する系は本技術分野で周知である。例としては、不可逆的スイッチの誘導は、Ｃｒｅ−ｌｏｘ媒介組換え法を利用し得る（例えば、Ｆｕｈｒｍａｎｎ−Ｂｅｎｚａｋｅｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ（２０００）２８：ｅ９９を参照されたい。本文献の開示は引用により本明細書に組み込まれる。本技術分野で既知のリコンビナーゼ、エンドヌクレアーゼ、リガーゼ、組換え部位などの任意の好適な組み合わせを用いて、不可逆的にスイッチ可能なプロモーターを生成することができる。本明細書の別の箇所に記載された、部位特異的組換えを行うための方法、機序、および要件を利用して、不可逆的にスイッチされるプロモーターを生成することは、本技術分野で周知である。 例えば、Ｇｒｉｎｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５６７−６０５およびＴｒｏｐｐ（２０１２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｎｅｓ  ＆  Ｂａｒｔｌｅｔｔ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｓｕｄｂｕｒｙ，ＭＡ）を参照されたい。これらの文献の開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１８１】
いくつかの事例では、プロモーターは、ＣＤ８細胞特異的プロモーター、ＣＤ４細胞特異的プロモーター、好中球特異的プロモーター、またはＮＫ特異的プロモーターである。例えば、ＣＤ４遺伝子プロモーターを用い得る。例えば、Ｓａｌｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：７７３９；およびＭａｒｏｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｌｏｏｄ  １０１：３４１６を参照されたい。別の例として、ＣＤ８遺伝子プロモーターを用い得る。Ｎｅｒｉ（ｐ４６）プロモーターを用いて、ＮＫ細胞特異的発現を実施し得る。例えば、Ｅｃｋｅｌｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｂｌｏｏｄ  １１７：１５６５を参照されたい。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、酵母細胞における発現に適したプロモーターには、例えば、構成的プロモーター、例えば、ＡＤＨｌプロモーター、ＰＧＫｌプロモーター、ＥＮＯプロモーター、ＰＹＫｌプロモーターなど；または調節可能なプロモーター、例えば、ＧＡＬＩプロモーター、ＧＡＬｌＯプロモーター、ＡＤＨ２プロモーター、ＰＨ０５プロモーター、ＣＵＰｌプロモーター、ＧＡＬ７プロモーター、ＭＥＴ２５プロモーター、ＭＥＴ３プロモーター、ＣＹＣｌプロモーター、ＨＩＳ３プロモーター、ＡＤＨｌプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰＤＨプロモーター、ＡＤＣｌプロモーター、ＴＲＰｌプロモーター、ＵＲＡ３プロモーター、ＬＥＵ２プロモーター、ＥＮＯプロモーター、ＴＰｌプロモーター、およびＡＯＸｌ（例えば、Ｐｉｃｈｉａで使用する場合）などが挙げられる。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、十分に当業者レベルの範囲内である。
【０１８３】
原核生物宿主細胞における使用に適したプロモーターには、限定されないが、バクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター；ｔｒｐプロモーター；ｌａｃオペロンプロモーター；ハイブリッドプロモーター、例えば、ｌａｃ／ｔａｃハイブリッドプロモーター、ｔａｃ／ｔｒｃハイブリッドプロモーター、ｔｒｐ／ｌａｃプロモーター、Ｔ７／ｌａｃプロモーター；ｔｒｃプロモーター；ｔａｃプロモーターなど；ａｒａＢＡＤプロモーター；インビボ調節プロモーター、例えば、ｓｓａＧプロモーター、または関連プロモーター（例えば、米国特許出願公開第２００４／０１３１６３７号参照）、ｐａｇＣプロモーター（Ｐｕｌｋｋｉｎｅｎ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ．，１９９１：１７３（１）：８６−９３；Ａｌｐｕｃｈｅ−Ａｒａｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，１９９２；８９（２１）：１００７９−８３）、ｎｉｒＢプロモーター（Ｈａｒｂｏｒｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｍａｌ．Ｍｉｃｒｏ．６：２８０５−２８１３）、など（例えば、Ｄｕｎｓｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６７：５１３３−５１４１；ＭｃＫｅｌｖｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｖａｃｃｉｎｅ  ２２：３２４３−３２５５；およびＣｈａｔｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：８８８−８９２を参照されたい）；シグマ７０プロモーター、例えば、コンセンサスシグマ７０プロモーター（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＸ７９８９８０、ＡＸ７９８９６１、およびＡＸ７９８１８３参照）；定常期プロモーター、例えば、ｄｐｓプロモーター、ｓｐｖプロモーターなど；病原性島ＳＰＩ−２に由来するプロモーター（例えば、国際公開第９６／１７９５１号参照）；ａｃｔＡプロモーター（例えば、Ｓｈｅｔｒｏｎ−Ｒａｍａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７０：１０８７−１０９６参照）；ｒｐｓＭプロモーター（例えば、Ｖａｌｄｉｖｉａ  ａｎｄ  Ｆａｌｋｏｗ（１９９６）．Ｍａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．２２：３６７参照）；ｔｅｔプロモーター（例えば、Ｈｉｌｌｅｎ，Ｗ．ａｎｄ  Ｗｉｓｓｍａｎｎ，Ａ．（１９８９）Ｉｎ  Ｓａｅｎｇｅｒ，Ｗ．ａｎｄ  Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ，Ｕ．（ｅｄｓ），Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．Ｍａｃｍｉｌｌａｎ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ，Ｖｏｌ．１０，ｐｐ．１４３−１６２参照）；ＳＰ６プロモーター（例えば、Ｍｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：７０３５参照）などが挙げられる。原核生物、例えば、大腸菌における使用に適した強力なプロモーターには、限定されないが、Ｔｒｃ、Ｔａｃ、Ｔ５、Ｔ７、およびＰＬａｍｂｄａが挙げられる。細菌宿主細胞における使用に適したオペレーターの非限定的な例には、ラクトースプロモーターオペレーター（Ｌａｃｉリプレッサータンパク質は、ラクトースに接触すると立体構造が変化し、これによりオペレーターへの結合を回避する）、トリプトファンプロモーターオペレーター（ＴｒｐＲリプレッサータンパク質は、トリプトフ���ンと複合体化すると、オペレーターに結合する立体構造を取る；トリプトファンの不在下では、ＴｒｐＲリプレッサータンパク質は、オペレーターに結合しない立体構造を取る）、およびｔａｃプロモーターオペレーター（例えば、ｄｅＢｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２１−２５参照）などが挙げられる。
【０１８４】
ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列は、発現ベクターおよび／またはクローニングベクター内に存在し得る。ＣＡＲが、２つの別々のポリペプチドを含む場合、２つのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、同じまたは別のベクターにクローン化され得る。発現ベクターは、選択可能なマーカー、複製起点、およびベクターの複製および／または維持を提供する他の特徴要素を含み得る。好適な発現ベクターには、例えば、プラスミド、ウイルスベクターなどが挙げられる。
【０１８５】
当業者には多数の好適なベクターおよびプロモーターが知られており、当該組換え構築物の生成用に多数が市販されている。次記のベクターは、例示のために提供される。細菌性ベクター：ｐＢｓ、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ＰｓｉＸｌ７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ、ｐＢｓ   ＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）；ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）。真核ベクター：ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳＶ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ＰＸＲｌ、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。
【０１８６】
発現ベクターは通常、異種タンパク質をコードする核酸配列の挿入を可能とするべく、好都合な制限部位をプロモーター配列近傍に有する。発現宿主内で作動可能な選択可能マーカーが存在していてもよい。適切な発現ベクターには、限定されないが、ウイルスベクター（例えば、ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；アデノウイルスに基づくウイルスベクター（例えば、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ３５：２５４３  ２５４９，１９９４；Ｂｏｒｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ６：５１５  ５２４，１９９９；Ｌｉ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄｓｏｎ，ＰＮＡＳ  ９２：７７００  ７７０４，１９９５；Ｓａｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ５：１０８８  １０９７，１９９９；国際公開第９４／１２６４９号、国際公開第９３／０３７６９号；国際公開第９３／１９１９１号；国際公開第９４／２８９３８号；国際公開第９５／１１９８４号、および国際公開第９５／００６５５号参照）；アデノ関連ウイルス（例えば、Ａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ９：８１  ８６，１９９８，Ｆｌａｎｎｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９４：６９１６  ６９２１，１９９７；Ｂｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ３８：２８５７  ２８６３，１９９７；Ｊｏｍａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ４：６８３  ６９０，１９９７，Ｒｏｌｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １０：６４１  ６４８，１９９９；Ａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  ５：５９１  ５９４，１９９６；国際公開第９３／０９２３９号中のＳｒｉｖａｓｔａｖａ、Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．（１９８９）６３：３８２２−３８２８；Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）１６６：１５４−１６５；ａｎｄ  Ｆｌｏｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ（１９９３）９０：１０６１３−１０６１７参照）；ＳＶ４０；単純ヘルペスウイルス；γレトロウイルス；ヒト免疫不全ウイルス（例えば、Ｍｉｙｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９４：１０３１９  ２３，１９９７；Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７３：７８１２  ７８１６，１９９９参照）；レトロウイルスベクター（例えば、マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ならびに他のレトロウイルス、例えば、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳腺腫瘍ウイルス等に由来するベクター）などが挙げられる。
【０１８７】
上述のように、いくつかの実施形態では、本開示の条件的活性型ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、いくつかの実施形態では、ＲＮＡ、例えばインビトロで合成されたＲＮＡである。ＲＮＡのインビトロ合成の方法は、本技術分野で公知である。任意の既知の方法を用いて、本開示の条件的活性型ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含むＲＮＡを合成することができる。ＲＮＡを宿主細胞に導入する方法は、本技術分野で既知である。例えば、Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１５：９０５３参照。本開示の条件的活性型ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含むＲＮＡの宿主細胞への導入は、インビトロまたはエクスビボまたはインビボで行い得る。例えば、インビトロまたはエクスビボで、宿主細胞（例えば、ＮＫ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球、など）を、本開示の条件的活性型ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含むＲＮＡを用いて、電気穿孔処理することができる。
【０１８８】
細胞
本開示のいくつかの態様は、細胞を含む、または細胞であり、例示的実施例では、この細胞は哺乳動物細胞であり、パッケージング細胞として使用して、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の形質導入のためのレンチウイルスなどのウイルスを作製する。多種多様の細胞のいずれかを、本発明に従って、偽型レトロウイルスなどのウイルスのインビトロ産生のために選択できる。真核細胞、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウマおよびげっ歯類細胞を含む、特に哺乳動物細胞が通常、使用される。例示的実施例では、細胞はヒト細胞である。さらに例示的実施形態では、細胞は、無期限に繁殖し、したがって、不死である。本発明で有利に使用され得る細胞の例には、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞、コス細胞、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓細胞、ヒト胎児２９３Ｔ細胞およびこのような細胞から誘導された任意の細胞、例えば、２９３Ｔ細胞から誘導されたｇｐｎｌｓｌａｃＺ  φＮＸ細胞が挙げられる。ヒト胎児腎臓２９３Ｔ細胞などの高度に遺伝子導入可能な細胞を使用できる。「高度に遺伝子導入可能な」は、少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７０％および最も好ましくは少なくとも約８０％の細胞が導入されたＤＮＡの遺伝子を発現できることを意味する。
【０１８９】
適切な哺乳動物細胞としては、初代細胞および不死化細胞株が挙げられる。適切な哺乳動物細胞株としては、ヒト細胞株、非ヒト霊長目細胞株、げっ歯類（例えば、マウス、ラット）細胞株などが挙げられる。適切な哺乳動物細胞株としては、限定されないが、ＨｅＬａ細胞（例えば、米国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）番号ＣＣＬ−２）、ＣＨＯ細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ９６１８、ＣＣＬ６１、ＣＲＬ９０９６）、２９３細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５７３）、Ｖｅｒｏ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１６５８）、Ｈｕｈ−７細胞、ＢＨＫ細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬｌＯ）、ＰＣ１２細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１７２１）、ＣＯＳ細胞、ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５１）、ＲＡＴｌ細胞、マウスＬ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬＩ．３）、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３）、ＨＬＨｅｐＧ２細胞、Ｈｕｔ−７８、Ｊｕｒｋａｔ、ＨＬ−６０、ＮＫ細胞株（例えばＮＫＬ、ＮＫ９２、およびＹＴＳ）などが挙げられる。
【０１９０】
免疫細胞の活性化方法
本開示は、免疫細胞をインビトロ、インビボ、またはエクスビボで活性化する方法を提供する。方法は通常、免疫細胞を（インビトロ、インビボ、またはエクスビボで）Ａｘｌおよび／またはＲｏｒ２と接触させることを含み、免疫細胞は、本開示の条件的活性型をＣＡＲ生成（すなわち、発現）するように遺伝子改変されている。Ａｘｌおよび／またはＲｏｒ２の存在下で、条件的活性型ＣＡＲは、免疫細胞を活性化し、それにより、活性化免疫細胞を生成する。免疫細胞には、例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球、ＮＫ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞、γδＴ細胞、ＮＫ−Ｔ細胞、好中球、などが含まれる。例示的実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞、特に、例示的実施形態では、免疫細胞はＴ細胞であり、これはＮＫ−Ｔ細胞を含む。このような例示的実施形態では、活性化は通常、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の細胞傷害活性の活性化である。このような方法は、複数の免疫細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）を用いて実施できる。さらなる例示的実施形態では、接触させることは、Ａｘｌおよび／またはＲｏｒ２を発現している標的哺乳動物細胞を免疫細胞と接触させることを含む。このようなＴ細胞またはＮＫ細胞を活性化する方法は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞によるＩＦＮ−γまたはＩＬ−２などのサイトカインの放出、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞のＡｘｌまたはＲｏｒ２に対する細胞傷害活性の増大、ＩＦＮγおよび／またはＩＬ−２のＴ細胞またはＮＫ細胞中での細胞内の発現の増大、および蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）分析により測定したＴ細胞またはＮＫ細胞によるＣＤ１０７ａおよび／またはＣＤ６９の発現の増大、を検出することにより検出できる。本明細書の実施例１、３、および４は、これらのＴ細胞および／またはＮＫ細胞の活性化の検出方法の内のいくつかについての詳細を提供する。
【０１９１】
本明細書で提供されるさらなる態様は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）の標的哺乳動物細胞への結合方法を含み、該方法は、標的哺乳動物細胞を免疫細胞とインビトロ、インビボ、またはエクスビボで接触させることを含み、標的哺乳動物細胞は、Ａｘｌおよび／またはＲｏｒ２を発現し、免疫細胞は、本明細書で提供されるＡｘｌまたはＲｏｒ２に結合するいずれかのＣＡＲを発現している。このような結合は、免疫細胞を活性化することができる。このような方法は、複数の免疫細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）を用いて実施できる。サイトカインの放出および細胞傷害活性の増加によりＴ細胞またはＮＫ細胞の活性を検出することにより検出されるこのような結合方法は、本明細書の実施例１、実施例３、および実施例４で提供される。
【０１９２】
免疫細胞の結合または活性化方法における接触させることは、本明細書の例示的実施形態では、７．４未満のｐＨの微小環境中で、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）を接触させることを含む。例えば、ｐＨは、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、または６．９未満、または５．８〜７．０の範囲、例示的実施形態では、６．０〜６．８の範囲、６．１〜６．９の範囲、６．２〜６．８の範囲、または範囲の下端値の６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、および６．５、と、範囲の上端値の６．６、６．７、６．８、および６．９との間、であり得る。このような例示的実施形態では、ＣＡＲは、本明細書で開示の、本明細書で提供されるＡｘｌまたはＲｏｒ２を認識する、いずれかのＣＡＢ−ＣＡＲである。
【０１９３】
遺伝子改変免疫細胞（例えば、Ｔリンパ球、ＮＫ細胞）をＡｘｌおよび／またはＲｏｒ２と接触させることは、免疫細胞によるサイトカインの生成を、Ａｘｌおよび／またはＲｏｒ２の非存在下で、免疫細胞により生成されるサイトカインの量に比べて、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、または１０倍超、増大させ得る。遺伝子改変免疫細胞（例えば、Ｔリンパ球、ＮＫ細胞）をＡｘｌおよび／またはＲｏｒ２と接触させることは、免疫細胞によるサイトカインの分泌を、Ａｘｌおよび／またはＲｏｒ２の非存在下で、免疫細胞により分泌されるサイトカインの量に比べて、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、または１０倍超、増大させ得る。生成を増大させ得るサイトカインには、限定されないが、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γが含まれる。
【０１９４】
遺伝子改変免疫細胞（例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球）をＡＡＲと接触させることは、細胞傷害性細胞の細胞傷害活性を、Ａｘｌおよび／またはＲｏｒ２の非存在下での細胞傷害性細胞の細胞傷害活性に比べて、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、または１０倍超、増大させ得る。
【０１９５】
遺伝子改変免疫細胞（例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球）をＡｘｌおよび／またはＲｏｒ２と接触させることは、細胞傷害性細胞の細胞傷害活性を、Ａｘｌおよび／またはＲｏｒ２の非存在下での細胞傷害性細胞の細胞傷害活性に比べて、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、または１０倍超、増大させ得る。
【０１９６】
他の実施形態では、例えば、遺伝子改変宿主細胞を抗原と接触させることは、細胞増殖、細胞生存、細胞死、などを、宿主免疫細胞に応じて、増大または低減させ得る。
【０１９７】
条件的活性型抗原特異的標的化領域の作製／単離方法
例示的実施形態では、本明細書で開示の抗ＡＸｌおよび抗Ｒｏｒ２抗原受容体は、条件的活性型であり、ｐＨ７．４（正常な生理的条件）に比べて、ｐＨ６．７（腫瘍環境および／またはインビトロ腫瘍代替アッセイの例示的ｐＨ）でＡｘｌまたはＲｏｒ２への結合の増大を示す。本明細書で開示のいずれかの態様のいくつかの例示的実施形態では、条件的活性型抗ＡＸｌまたは抗Ｒｏｒ２  ＡＳＴＲは、選別／進化前の、ライブラリーの変異／進化メンバーを含まないおよび／または任意の選別反復ラウンド中のまたはそのラウンド間の変異を含まない、初期ポリペプチドライブラリーから特定される。他の実施形態では、条件的活性型抗ＡＸｌまたは抗Ｒｏｒ２  ＡＳＴＲは、変異／進化を含む方法により特定され、いくつかの実施形態では、野性型抗体から出発する。例示的膜貫通ドメインおよび細胞内活性化ドメインは、ＣＡＲに対して本明細書で開示のもののいずれかであり得る。
【０１９８】
一態様では、本明細書で提供されるのは、条件的活性型抗ＡＸｌまたは抗Ｒｏｒ２  ＡＳＴＲを選択する方法であり、該方法は、ポリペプチドディスプレイライブラリーを下記によりパニングすることを含む：
ａ）ポリペプチドディスプレイライブラリーのポリペプチドをｐＨ７．４（またはその他の正常な生理的条件）でのＡｘｌまたはＲｏｒ２結合アッセイおよびｐＨ６．７（またはその他のインビトロ腫瘍代替アッセイ条件）でのＡｘｌまたはＲｏｒ２結合アッセイに供すること；および
ｂ）ｐＨ７．４に比べて、ｐＨ６．７での、または正常な生理的条件に比べて、その他のインビトロ腫瘍代替アッセイ条件でのＡｘｌまたはＲｏｒ２結合活性の増大を示すポリペプチドを選択し、それにより、条件的活性型抗原特異的標的化領域を選択すること。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、選択の単一ラウンドが実施されて、条件的活性型抗ＡＸｌまたは抗Ｒｏｒ２標的化領域が得られる。特定の実施形態では、選別またはパニング方法は、インビトロ腫瘍代替アッセイ条件下で抗原に結合し、生理的条件下では結合しなかった遊離抗体、またはこれらの特性を有する試験抗体を発現している細胞、または初期または前のラウンドでこのような特性を有する試験抗体でコーティングされたファージを特定後、反復される。いくつかの方法では、収集されたファージを用いて、収集したファージを増幅するために、ヘルパーファージにさらに感染できる細胞に感染させる。細胞表面上の抗体が試験されるその他の方法では、収集細胞を増殖させて、細胞により発現された抗体を、ポリペプチドをコードする細胞中で抗体を増幅することにより、「増幅」できる。いくつかの実施形態では、増幅は、特定された抗体をラウンド間で特定された抗体をコードする抗体を変異させるプロセスを実施することなく、特定された抗体を発現する細胞を増殖することにより行われる。したがって、前のラウンドで収集された抗体は、その後、これらの収集された抗体をコードする抗体を含む細胞を増幅することにより、濃縮される。
【０２００】
パニングまたは選別方法は、単回実施、または１〜１０００回反復できる。例示的実施形態では、パニングは、１〜２０回または２〜１０回または２〜５回反復される。
【０２０１】
その他の方法では、条件的活性型抗ＡＸｌまたは抗Ｒｏｒ２  ＡＳＴＲは、１回または複数のラウンドのパニングラウンド間の変異／進化を用いて生成される。一方法では、野性型タンパク質（例えば、抗体）が、例えば、ポリペプチドまたはタンパク質ライブラリーを生成し、ポリペプチドまたはタンパク質ライブラリーを、標的抗原に対する目的の結合親和性を有するポリペプチドまたはタンパク質で選別することにより、特定される。野性型タンパク質が抗体であるいくつかの実施形態では、野性型抗体は、ファージディスプレイ抗体ライブラリー、例えば、ファージディスプレイヒト化抗体ライブラリーを含むポリクローナルまたはモノクローナル抗体ライブラリーを生成し、選別することにより、見つけることができる。
【０２０２】
進化した抗ＡＸｌまたはＲｏｒ２  ＡＳＴＲは、野性型タンパク質、または野性型タンパク質をコードする核酸配列を、変異誘発プロセスに供し、正常な生理的環境下に比べて、腫瘍環境および／またはインビトロ腫瘍代替アッセイ条件下で増大した活性（例えば、標的抗原に対する向上した結合親和性）を有する変異ＡＳＴＲの選別により特定できる変異体ポリペプチド集団を産生することにより生成できる。このような方法の例は、国際出願第２０１６／０３３３３１号（“ＣＯＮＤＩＴＩＯＮＡＬＬＹ  ＡＣＴＩＶＥ  ＣＨＩＭＥＲＩＣ  ＡＮＴＩＧＥＮ  ＲＥＣＥＰＴＯＲＳ  ＦＯＲ  ＭＯＤＩＦＩＥＤ  Ｔ−ＣＥＬＬＳ”）または米国特許第８，７０９，７５５号で提供される。
【０２０３】
本明細書で提供される方法を用いて特定された条件的活性型抗ＡＸｌまたは抗Ｒｏｒ２  ＡＳＴＲは通常、ポリペプチド、より具体的には、ポリペプチド抗体であり、例示的実施形態では、本明細書でさらに詳細に考察される単鎖抗体である。これらのポリペプチドは、ＡｘｌまたはＲｏｒ２に対し、インビトロ腫瘍代替アッセイ条件対正常な生理的条件下で、より高いまたはより低い親和性で結合できるが、例示的実施形態では、正常な条件下よりもインビトロ腫瘍代替アッセイ条件下で、より高い親和性で結合できる。いくつかの実施形態では、これらのポリペプチドは、生理学的（すなわち、正常な）条件下よりも、インビトロ腫瘍代替アッセイ条件下で、それらの同族抗原に対し、１０％、２０％、２５％、５０％、７５％、９０％、９５％または９９％高い親和性で結合できる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法を用いて特定されたＡＳＴＲは、正常な生理的条件下ではそれらの同族抗原に対し、陰性対照抗体などの陰性対照を用いて得たバックグラウンドレベルを超える何らかの検出可能なレベルまで結合しない。
【０２０４】
条件的活性型抗ＡＸｌまたは抗Ｒｏｒ２  ＡＳＴＲをコードする、本明細書で提供される方法により単離されたヌクレオチド配列は、条件的活性型抗ＡＸｌまたは抗Ｒｏｒ２抗原特異的標的化を発現している収集細胞のヌクレオチドの塩基配列決定により決定できる。その後、このヌクレオチド配列情報を用いて、条件的活性型抗ＡＸｌまたは抗Ｒｏｒ２抗原特異的標的化領域、膜貫通ドメイン、および細胞内活性化ドメインを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを生成することにより、条件的活性型抗ＡＸｌまたは抗Ｒｏｒ２生物学的キメラ抗原受容体（ＣＡＢ−ＣＡＲ）を作製できる。条件的活性型抗ＡＸｌまたは抗Ｒｏｒ２抗原特異的標的化領域は、ＣＡＲ構築物発現系中にクローン化でき、これを用いて、それらのゲノム中にＣＡＲを含む組換えレンチウイルスを生成でき、その後、本明細書の実施例１に示すように、この組換えレンチウイルスを用いて、正常な生理的条件に比較して、腫瘍選択的環境中で、ＣＡＲ媒介ＡｘｌまたはＲｏｒ２発現標的細胞殺作用を試験するために、Ｔ細胞に形質導入できる。
【０２０５】
条件的に活性化可能な細胞の生成方法
本開示は、条件的に活性化可能な細胞を生成する方法を提供する。方法は通常、本開示の条件的活性型ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む、発現ベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）、またはＲＮＡ（例えば、インビトロ転写ＲＮＡ）を用いた哺乳動物細胞の遺伝子改変を含む。遺伝子改変細胞は、Ａｘｌおよび／またはＲｏｒ２の存在下で条件的に活性化可能である。遺伝子改変は、インビボ、インビトロ、またはエクスビボで実施できる。細胞は通常、免疫細胞（例えば、Ｔリンパ球、Ｔ−ヘルパー細胞、またはＮＫ細胞）、幹細胞、前駆細胞、などである。例示的実施形態では、細胞はＴ細胞である。
【０２０６】
いくつかの事例では、遺伝子改変は、エクスビボで行われる。例えば、Ｔリンパ球、幹細胞、Ｔ−ヘルパー細胞、またはＮＫ細胞は、個体から取得され、個体から得られた細胞は、本開示のＣＡＲを発現するように遺伝子改変される。遺伝子改変細胞は、Ａｘｌおよび／またはＲｏｒ２の存在下で条件的に活性化可能である。いくつかの事例では、遺伝子改変細胞は、エクスビボで活性化される。他の事例では、遺伝子改変細胞は、個体（例えば、その細胞が得られた個体）に導入され、遺伝子改変細胞はインビボで活性化される。例えば、Ａｘｌおよび／またはＲｏｒ２が個体の細胞表面上に存在する場合、抗原を投与する必要はない。遺伝子改変細胞は、個体の細胞表面上に存在する抗原と接触し、遺伝子改変細胞は活性化される。例えば、遺伝子改変細胞がＴリンパ球である場合、遺伝子改変細胞は、Ａｘｌおよび／またはＲｏｒ２を、ＣＡＲが結合するその表面上に発現する細胞に対する細胞傷害性を示すことができる。
【０２０７】
一態様では、本明細書で提供されるのは、条件的結合性ＡｘｌまたはＲｏｒ２に対するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、条件的に活性化可能なＴ細胞および／またはＮＫ細胞のエクスビボ作製方法であり、該方法は：
ａ）末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を濃縮して、単離血液からＴ細胞および／またはＮＫ細胞を含むＰＢＭＣを単離すること；
ｂ）濃縮ＰＢＭＣのＴ細胞および／またはＮＫ細胞を効果的な条件下で活性化すること；
ｃ）活性化Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞に複製不能組換えレトロウイルス粒子を用いて効果的な条件下で形質導入し、それにより、遺伝子改変Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を生成し、複製不能組換えレトロウイルス粒子がそれぞれ、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞中で活性なプロモーターに機能的に連結された１つまたは複数の核酸配列を含むレトロウイルスゲノムを含み、本明細書で提供されるいずれかの実施形態に従って、１つまたは複数の核酸配列の内の第１の核酸配列がＣＡＢ−ＣＡＲをコードすること；および
ｄ）遺伝子改変Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を増殖し、それにより、条件的に活性化可能なＴ細胞および／またはＮＫ細胞を作製すること、を含む。
【０２０８】
上記態様のいくつかの実施形態では、方法は、増殖した遺伝子改変Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を回収することをさらに含む。上記態様のいくつかの実施形態では、方法は、ＰＢＭＣを濃縮する前に、対象から採血することをさらに含む。さらなる実施形態では、方法は、回収し、増殖した遺伝子改変Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を対象中に導入することをさらに含む。さらなる実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞は、それらが対象中に導入された後で、対象中に、１、２、３、４、５、６、７、または１４日間、存在する。
【０２０９】
採血
ＰＢＭＣ含有血液は、当該技術分野において既知の任意の好適な方法により、対象から収集または取得できる。例えば、血液は、静脈穿刺または任意の他の血液および／またはＰＢＭＣの試料が収集される採血方法により収集できる。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、以下で考察するように、アフェレーシスにより得ることができる。
【０２１０】
ＰＢＭＣの濃縮
条件的に活性化可能Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を作製するエクスビボ法では、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を含む末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は、濃縮ステップでは、血液試料の他の成分から単離される。他の血液成分および血液細胞からのＰＢＭＣの濃縮は、当該技術分野において既知の任意の方法を用いて、例えば、アフェレーシス、および／または密度勾配遠心分離を用いて、実施できる。いくつかの実施形態では、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用できる。いくつかの実施形態では、自動化アフェレーシス分離器が用いられ、この装置は、対象から血液を採取し、血液を、特定の細胞型（例えば、ＰＢＭＣなど）を選別する装置を通し、残りを対象中に戻す。密度勾配遠心分離は、アフェレーシスの後で実施できる。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、濃縮され、白血球除去フィルター装置を用いて単離される。いくつかの実施形態では、磁気ビーズ活性化細胞選別がその後使用され、ＰＢＭＣから特定の細胞集団、例えば、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞が、細胞の表現型に応じて精製される（すなわち、正の選択）。いくつかの実施形態では、単球および／またはマクロファージが、当該技術分野において既知の方法を使用して、ＰＢＭＣから取り出すことができる。治療される対象を基準にして、細胞は、同種および／または自己であり得る。ＰＢＭＣ濃縮プロセス中、濃縮ＰＢＭＣが単離およびその後活性化される前に、１回または複数回の洗浄を当該技術分野において知られているよう実施できる。洗浄溶液は、血液および／またはＰＢＭＣを洗浄するのに好適する任意の溶液とすることができる。当該技術分野において既知の方法に従って、単離ＰＢＭＣは、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を培養するのに使用される任意の好適な基礎培地中に再懸濁できる。いくつかの実施形態では、培地には、ＨＳＡ、ヒトＡＢ＋血清、対象由来血清および／または血清置換物を補充できる。
【０２１１】
ＰＢＭＣの活性化
本明細書で提供される条件的に活性化可能なＴ細胞および／またはＮＫ細胞を作製するエクスビボ法は通常、１つまたは複数の活性剤により単離ＰＢＭＣを活性化または刺激して、活性化Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を生成するステップを含む。活性化は、新たに単離されたＰＢＭＣまたは前に凍結保存されたＰＢＭＣに対し実施できる。凍結保存細胞が使用される場合には、使用の前に、細胞は開発プロトコルを用いて解凍され得る。
【０２１２】
活性化中には通常、エクスビボプロセス用の当該技術分野において既知のものなどの培地が存在する（非限定的例としては、Ｘ−ＶＩＶＯ１５（Ｌｏｎｚａ）またはＣＴＳ培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ））。いくつかの実施形態では、培地には、ＨＳＡ、ヒトＡＢ＋血清、対象由来血清および／または血清置換物を補充できる。例示的実施形態では、培地は、ＣＴＳ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）などの血清置換物で補充できる。いくつかの実施形態では、培地には、ＨＳＡ、ヒトＡＢ＋血清、対象由来血清および／または血清置換物を補充できる。
【０２１３】
１つまたは複数の活性剤の任意の組み合わせを培地に添加して、活性化Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を生成できる。通常、反応混合物が形成されて活性化が行われる。いくつかの実施形態では、反応混合物は、１つまたは複数の活性剤を培地に添加することにより形成できる。本明細書で開示のいくつかの実施形態では、１つまたは複数の活性剤が、活性化Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞が生成されるような、有効量で使用される。
【０２１４】
条件的に活性化可能なＴ細胞および／またはＮＫ細胞を作製するための実施形態では、このような活性化は、単離された可溶性ＡｘｌまたはＲｏｒ２などのＡｘｌまたはＲｏｒ２を用いて、７．０未満のｐＨで細胞を活性化することを含むことは注目に値する。しかし、条件的に活性化可能なＴ細胞および／またはＮＫ細胞を作製する方法では、活性化は通常、より汎用的な活性剤を利用する。したがって、いくつかの実施形態では、活性剤は、ポリペプチドまたは抗体（例えば、抗ＣＤ２、抗ＣＤ３、および／または抗ＣＤ２８）またはＴ細胞刺激または共刺激分子を標的とするまたは結合するその機能性断片、Ｔ細胞サイトカイン、または任意のその他の好適なマイトジェン（例えば、テトラデカノイルホルボールアセテート（ＴＰＡ）、フィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）、リポ多糖類（ＬＰＳ）、ヤマゴボウマイトジェン（ＰＷＭ））、Ｔ細胞刺激または共刺激分子に対する天然リガンド、ホスホ抗原、またはゾレドロン酸などのアミノビスホスホン酸であり得る。種々の抗体およびその機能性断片は、当技術分野において、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を活性化または刺激することが知られている。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の抗体またはその機能性断片は、ビーズなどの固体表面上に固定できる。
【０２１５】
Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の形質導入
本明細書で提供される条件的に活性化可能なＴ細胞および／またはＮＫ細胞を作製するエクスビボ法は通常、活性化Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を形質転換または形質導入するステップを含む。このような方法のいくつかの実施形態では、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を、エクスビボで複製不能組換えレトロウイルス粒子などの発現ベクターと接触させて、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を遺伝子改変する。理論により制約されるべきではないが、接触時間の間に、複製不能組換えレトロウイルス粒子は、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞に結合し、その時点で、レトロウイルスおよび宿主細胞膜が融合を開始する。その後、形質導入のプロセスを通して、複製不能組換えレトロウイルス粒子から遺伝物質がＴ細胞および／またはＮＫ細胞に入り、通常は、宿主細胞ＤＮＡ中に組み込まれる。したがって、このような方法は、形質導入によるＴ細胞および／またはＮＫ細胞の遺伝子改変を含む。Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞にエクスビボで、複製不能組換えレンチウイルス粒子などの複製不能組換えレトロウイルス粒子を形質導入するための方法は当技術分野において既知である。例示的方法は、例えば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３５（９）：６８９−７０１；Ｃｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｌｏｏｄ．１０１：１６３７−１６４４；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．５０６：９７−１１４；およびＣａｖａｌｉｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｌｏｏｄ．１０２（２）：４９７−５０５に記載されている。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を、複製不能組換えレトロウイルス粒子と接触させることができる。例示的実施形態では、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を、複製不能組換えレンチウイルス粒子と接触させることができる。
【０２１６】
形質導入Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の増殖
本明細書で提供される条件的に活性化可能なＴ細胞および／またはＮＫ細胞を作製するエクスビボ法の例示的実施形態では、形質導入Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞は、回収の前に増殖される。本明細書で開示のいずれかの実施形態では、活性化および形質導入するための培地が存在し、形質導入後、増殖を実施するために培地をさらに添加または交換できる。いくつかの実施形態では、培地は、活性化中に形成された反応混合物に添加できる。増殖のための培地には通常、活性化および形質導入で使用されたのと同じ、エクスビボプロセス用の、特にＴ細胞および／またはＮＫ細胞用の、当該技術分野において既知のものなどの基本培地が含まれる（非限定的例としては、Ｘ−ＶＩＶＯ１５（Ｌｏｎｚａ）またはＯｐｔｉｍｉｚｅｒ  ＣＴＳ培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ））。いくつかの実施形態では、培地には、ＨＳＡ、ヒトＡＢ＋血清、対象由来血清および／またはＣＴＳ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）などの血清置換物を補充できる。ＩＬ−２、ＩＬ−７、またはＩＬ−１５などのサイトカイン、またはＨＳＡ中で見つかるものを、活性化、形質導入、および増殖の前、その間、および／またはその後に、培地に添加できる。細胞増殖は、特定の日数にわたり実施できる。いくつかの実施形態では、増殖は、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１日間にわたり実施できる。いくつかの実施形態では、増殖は、範囲の下端値の４、５、６、７、または８日と、範囲の上端値の９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１日との間で実施できる。特定の例示的実施形態では、増殖は、６〜１２日間、または８〜１０日間にわたり実施される。
【０２１７】
細胞回収
本明細書で提供される条件的に活性化可能なＴ細胞および／またはＮＫ細胞を作製するエクスビボ法では通常、増殖後に、遺伝子改変Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を回収することを含む。いくつかの実施形態では、形質導入Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を、当該技術分野において既知の方法を使用して、回収中に濃縮または収集することができる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を、当該技術分野において既知の任意の好適な洗浄溶液を用いて、回収中に１回または複数回洗浄できる。回収の終わりに、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を、当該技術分野において既知の任意の好適な培地中に再懸濁できる。本明細書で開示のいずれかの実施形態では、増殖したＴ細胞および／またはＮＫ細胞の回収を、増殖完了判定基準に基づいて実施できる。いくつかの実施形態では、増殖完了判定基準は、乳酸濃度、細胞密度、または増殖日数であり得る。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、回収した細胞を対象に、導入、戻し導入、再導入、輸注、または再輸注できる。いくつかの実施形態では、回収した細胞を、対象に再導入する前に、後述のように凍結保存できる。例示的実施形態では、回収した細胞を、最初に細胞を冷凍保存することなく、対象に、導入、戻し導入、再導入、輸注、または再輸注できる。対象は通常、血液が収集された対象と同じである。
【０２１９】
本開示を通して、形質導入Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞は、エクスビボ形質導入中に細胞に組み込まれた少なくとも１つの核酸を保持する形質導入細胞の子孫を含む。形質導入細胞の「再導入」を記述する本明細書の方法では、このような細胞は通常、対象の血液から収集される際には、形質導入された状態ではないと理解されよう。
【０２２０】
細胞導入／再導入
本明細書で開示される条件的に活性化可能なＴ細胞および／またはＮＫ細胞を作製するエクスビボ法の特定の実施形態では、回収Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞は、治療効果を求めて、対象に、導入、戻し導入、再導入、輸注、または再輸注できる。再導入されるＴ細胞および／またはＮＫ細胞の数は、治療有効量であり得る所定の投与量とすることができる。いくつかの実施形態では、所定の投与量は、細胞上に発現しているＣＡＲ（例えば、形質導入Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞上の抗原特異的標的化領域の親和性および密度）、標的細胞型、治療される疾患または病的状態の性質、またはこれらの組み合わせに依存し得る。いくつかの実施形態では、回収細胞の所定の投与量は、対象の体重、例えば、対象のキログラム当たりの細胞数（細胞数／ｋｇ）をベースにすることができる。
【０２２１】
細胞の凍結保存
本明細書で提供される条件的に活性化可能なＴ細胞および／またはＮＫ細胞を作製するエクスビボ法では、本明細書に記載の方法により生成した回収細胞を、その後の使用のために、所定の投与量で凍結保存できる。冷凍保存方法および試薬は、当該技術分野で周知である。凍結保存には、１種または複数の洗浄剤および／またはＴ細胞および／またはＮＫ細胞を濃縮するステップを含めることができる。方法はまた、凍結保存混合物を形成するステップを含むことができ、この混合物は、希釈溶液および好適な凍結保存溶液中にＴ細胞および／またはＮＫ細胞を含む。いくつかの実施形態では、方法は、当該技術分野において既知の凍結保存混合物を凍結するステップを含み得る。凍結保存Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を解凍する方法は、当技術分野において既知である。
【０２２２】
ｐＨを変えることによりＣＡＢ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞活性を調節する方法
特定の態様では、本明細書で提供されるのは、７．０未満（例えば、６．９または６．８未満）のｐＨの微小環境中で免疫細胞をＡｘｌまたはＲｏｒ２と接触させ、その後、ｐＨが７．０以上（例えば、７．１、７．２、または７．３超）になるように、微小環境ｐＨを変えることにより、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）の活性化を調節する方法である。この場合、免疫細胞は、本明細書で提供されるいずれかのＣＡＢ−ＣＡＲを発現している。例示的実施形態では、ＡｘｌまたはＲｏｒ２は、標的哺乳動物細胞の表面上に発現している。特定の実施形態では、このような活性化の調節方法は、本明細書で提供される免疫細胞を活性化する方法と同一であり、微小環境のｐＨを７．０以上（例えば、７．１、７．２、または７．３超）のｐＨに高め、それにより、免疫細胞の活性化を低減させるステップをさらに含む。例示的実施形態では、このようなｐＨの増加は免疫細胞を不活性化する。
【０２２３】
特定の態様では、本明細書で提供されるのは、標的組織内または１つまたは複数の非標的（例えば、健康／正常な）組織内の標的細胞を含む、微小環境内のｐＨの変化またはシフトを起こさせて、ＣＡＢ−ＣＡＲの標的細胞上のその同族抗原に対する結合を調節することにより、ＣＡＢ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞またはＮＫ細胞による標的細胞への結合の調節およびその結果の標的細胞の溶解／死滅を調節する方法である。この場合、同族抗原は、ＡｘｌポリペプチドもしくはそのエピトープまたはＲｏｒ２ポリペプチドまたはそのエピトープである。このような方法は通常、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）などの標的細胞をＣＡＢ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞またはＮＫ細胞と微小環境中で接触させた後に、ｐＨを低下させること、またはより典型的にはｐＨを高めることにより、微小環境のｐＨを変えることを含む。微小環境は、標的微小環境、例えば、腫瘍、またはオフターゲット微小環境であり得、オフターゲット結合は、副作用を生じ得る。いくつかの実施形態では、このような方法は、腫瘍微小環境感受性ＣＡＲ−Ｔ標的結合の一時的な低減をもたらすことができる。
【０２２４】
したがって、一態様では、本明細書で提供されるのは、条件的活性型生物学的キメラ抗原受容体（ＣＡＢ−ＣＡＲ）発現Ｔ細胞またはＮＫ細胞の、対象中のＣＡＢ−ＣＡＲの同族抗原を発現している細胞に対する結合を調節する方法であり、次記を含む：
ａ．ＣＡＢ−ＣＡＲをコードする核酸を含むＴ細胞および／またはＮＫ細胞を対象に導入し、導入後（および任意選択で、および／または導入中に）、ＣＡＢ−ＣＡＲをコードする核酸を含むＴ細胞および／またはＮＫ細胞がＣＡＢ−ＣＡＲを発現して、対象の同族抗原を発現している細胞に結合し、同族抗原がＡｘｌポリペプチドもしくはそのエピトープまたはＲｏｒ２ポリペプチドもしくはそのエピトープであること；および
ｂ．対象に、血液ｐＨおよび／または組織のｐＨおよび／または微小環境のｐＨを高めるのに十分な量の薬剤を投与し、投与が導入の前、その間、またはその後に実施され、血液、組織、および／または微小環境の高められたｐＨがＣＡＢ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の、血液、組織、または微小環境中の同族抗原を発現している細胞に対する結合を高められたｐＨで調節すること。
【０２２５】
本開示のｐＨ調節薬剤の投与ステップを含む態様におけるｐＨの変化／シフトは、ｐＨ調節する薬剤を対象に投与することによるなどの、標的または非標的細胞をｐＨ調節薬剤に曝露することにより実現できる。ｐＨ調節薬剤の非限定的例は、本明細書で提供される。特定の態様では、本明細書で提供されるのは、ＣＡＢ−ＣＡＲのその同族抗原の結合を調節する方法で使用するための、またはＣＡＢ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞のその同族抗原を発現する細胞に対する結合を調節するための、または対象のオンターゲット・オフ腫瘍毒性を低減または緩和するための、薬剤である。特定の実施形態のこのような態様は、腫瘍増殖、癌、過形成、または細胞増殖性障害の治療に関連する。
【０２２６】
他の態様では、本明細書で提供されるのは、薬物または遺伝子改変Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の対象中の標的哺乳動物細胞に対するインビボ結合を制御するためのキットの製造における使用のためのｐＨ調節薬剤の使用であり、標的細胞は、ＡｘｌポリペプチドもしくはそのエピトープまたはＲｏｒ２ポリペプチドもしくはそのエピトープを発現している。他の態様では、本明細書で提供されるのは、複製不能組換えレトロウイルス粒子含む容器、および腫瘍増殖を治療する方法を実施するためのその使用の説明書を含むキットであり、使用説明書は、ｐＨの調節により、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の標的哺乳動物細胞に対する結合を制御する方法を教示し、標的哺乳動物細胞は、ＡｘｌポリペプチドもしくはそのエピトープまたはＲｏｒ２ポリペプチドもしくはそのエピトープを発現している。このような方法は、ｐＨを変えることによりＣＡＢ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞活性を調節するために本明細書のこのセクションで提供されたいずれかの方法であり得る。組換えレトロウイルス粒子を含む容器は、チューブ、バイアル、プレートのウエル、または組換えレトロウイルス粒子および／またはｐＨ調節薬剤の貯蔵のためのその他の容器とすることができる。これらのいずれかは、工業用の強度およびグレードを有するものである。キットは、特定の実施形態では、２つ以上の容器を含み得る。１つの容器／器は、組換えレトロウイルス粒子を含み、別の容器／器は、ｐＨ調節薬剤を含み得る。このような方法では、薬剤は、血液ｐＨおよび／または組織のｐＨおよび／または微小環境のｐＨを高めて、ＣＡＢ−ＣＡＲを発現している改変／組換えＴ細胞および／またはＮＫ細胞のＣＡＢ−ＣＡＲの、高められたｐＨを有する血液および／または組織中のその同族抗原に対する結合を調節するのに十分な量で送達／投与される。十分な量で十分な時間にわたりｐＨ調節薬剤を投与するための非限定的例示的詳細は、本明細書で提供される。
【０２２７】
組織に対するオンターゲットまたはオフターゲットに関わらず、対象へのＣＡＢ−ＣＡＲの導入後に、標的細胞を、ｐＨ調節薬剤などのｐＨ調節薬と接触させることができる。したがって、例えば、オンターゲット・オフ腫瘍活性を緩和するために、および／または腫瘍細胞増殖などの標的細胞増殖を抑制するために、ＡｘｌポリペプチドもしくはそのエピトープまたはＲｏｒ２ポリペプチドもしくはそのエピトープに結合（すなわち、認識）できるＣＡＢ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞の結合および／または細胞傷害活性を調節するための本明細書で提供される例示的態様は、次のステップを含むことができる：
ａ．ＣＡＢ−ＣＡＲをコードする核酸を含むＴ細胞および／またはＮＫ細胞を対象に導入し、導入後、ＣＡＢ−ＣＡＲをコードする核酸を含むＴ細胞および／またはＮＫ細胞がＣＡＢ−ＣＡＲを発現し、ＣＡＢ−ＣＡＲがＡｘｌポリペプチドもしくはそのエピトープまたはＲｏｒ２ポリペプチドもしくはそのエピトープに結合でき、および任意に、対象の同族抗原を発現している細胞に結合するステップ、および
ｂ．薬剤を、血液ｐＨおよび／または組織のｐＨおよび／または微小環境のｐＨを高めて、ＣＡＢ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の、高められたｐＨを有する血液、組織、または微小環境中のＣＡＢ−ＣＡＲの同族抗原を発現している細胞に対する結合を調節するのに十分な量で対象に投与するステップ。ＣＡＢ−ＣＡＲをコードする核酸をＴ細胞および／またはＮＫ細胞に導入するために使用される特定の方法に応じて、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞は、それが対象中に導入される前に、ＣＡＢ−ＣＡＲを発現し得る、または発現し得ないことは理解されよう。しかし、対象に導入後のいくつかの時点で、例えば、２時間、４時間、８時間、１２時間、１日、２日、４日および／または７日、またはそれを超える時点で、ＣＡＢ−ＣＡＲをコードする核酸を含むＴ細胞および／またはＮＫ細胞はＣＡＢ−ＣＡＲを発現する。その後、このような細胞は通常、ＣＡＢ−ＣＡＲの同族抗原を発現している標的細胞に結合する。
【０２２８】
対象のリンパの球遺伝子改変および任意の増殖のための本明細書で提供される方法を用いて、ＣＡＢ−ＣＡＲをコードする核酸配列を対象のＴ細胞および／またはＮＫ細胞のゲノム中に導入して、ＣＡＢ−ＣＡＲを発現できるＴ細胞および／またはＮＫ細胞を生成し、その後、ＣＡＢ−ＣＡＲを発現できるＴ細胞および／またはＮＫ細胞を対象に導入でき、導入後、標的細胞／組織とＣＡＢ−ＣＡＲを接触させるために、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞はＣＡＢ−ＣＡＲを発現する。本開示は、異なるＣＡＲ成分のための種々の代替物と共に、このような方法を実施する方法の詳細を提供し、この内のいくつかは、ｐＨを変えてＣＡＢ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の、ＣＡＢ−ＣＡＲの同族抗原を発現している標的細胞に対する結合を調節することを含む本開示のいくつかの態様で使用できる。
【０２２９】
リンパ球を遺伝子改変および増殖するためのこのような方法は通常、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を、複製不能組換えレトロウイルス粒子と接触させて、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を形質導入することを含む。このような接触は通常、対象からリンパ球を取り出した後で、エクスビボで行われる。Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞はその後、対象、通常はそれらが取り出された対象に導入／再導入される。複製不能組換えレトロウイルス粒子は、ＣＡＢ−ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを有するゲノムを含む。このような複製不能組換えレトロウイルス粒子に関する多くの代替実施形態およびさらなる詳細が本明細書の他のセッションで提供され、ｐＨ依存性方式でＣＡＢ−ＣＡＲにより認識される同族の標的ポリペプチドを発現している細胞の微小環境中のｐＨを調節することにより、結合の調節およびその結果の、ＡｘｌポリペプチドもしくはそのエピトープまたはＲｏｒ２ポリペプチドもしくはそのエピトープに結合できるＴ細胞発現ＣＡＢ−ＣＡＲの溶解／死滅のための本明細書で提供される方法で使用できる。
【０２３０】
ＣＡＢ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞による標的細胞の結合の調節のためのこのような方法を用いて、例えば、対象中の血液および／または非腫瘍組織のｐＨを高めることにより、オフターゲット・オフ腫瘍毒性を低減できる。例えば、対象中の「正常」組織ｐＨが一次的により低くなる場合、正常組織のｐＨが高められ、一方で、腫瘍のｐＨがより低いままで残され、その時点でもＣＡＢ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞が標的腫瘍細胞に結合するｐＨであるように、ｐＨ調節薬を送達できる。これらの実施形態では、ｐＨ調節薬は、より低い濃度で、または標的化方式で、正常組織へ送達できる。
【０２３１】
いくつかの実施形態では、これは、腫瘍微小環境中のｐＨを、ＣＡＢ−ＣＡＲ  Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞が腫瘍内のその同族の標的発現細胞への結合をするのに十分低いまま維持されるのを可能としている間に実現できる。本明細書で提供される方法の例示的態様では、組織のｐＨは、ＣＡＢ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞が、ＣＡＢ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞がその同族抗原に接触し、結合するために十分な時間にわたり（例えば、２、４、８、１２、または２４時間、または２、４、７、１４、２８、または３０日間、または１、２、３、４、５、６、１２、２４ヶ月間、またはそれより長い期間）、その標的に結合するｐＨのままであり、その後、ｐＨは、例えば、組織のｐＨをＣＡＢ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の標的細胞に対する結合に影響を与える程度の大きさに高めることにより、シフト／変更される。
【０２３２】
したがって、一態様では、本明細書で提供されるのは、血管および組織ｐＨの薬理的変更による腫瘍微小環境感受性ＣＡＲ−Ｔ細胞標的結合の一次的低減方法であり、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、Ａｘｌポリペプチドもしくはそのエピトープ、またはＲｏｒ２ポリペプチドもしくはそのエピトープに結合できるＣＡＢ−ＣＡＲを発現する。これらの微小環境により制御されたＣＡＲ−Ｔ細胞中のＡＳＴＲは、Ｔ細胞結合を可能とするために腫瘍ローカル環境条件を必要とするオンターゲット・オフ腫瘍に対する追加のレベルの保護を提供する。一部のモノクローナル抗体療法のためには魅力的であるが、養子細胞療法は、それらのＣＡＲ−Ｔ標的に対し、一時的に許容的なローカル環境を形成し得る。例えば、低ｐＨを有する組織中で活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＡＲ構築物中に存在する細胞質ドメインに応じて、微小環境のｐＨをさらに低下させ得る。その他の場合、サイトカイン放出症候群およびその他の養子細胞療法に関連する罹患率は、血液の重炭酸塩緩衝能の低下を生じて、乳酸アシドーシスに繋がり得る。静脈内注入により投与された養子細胞療法剤は、一時的肺の閉じ込めを生じる。いくつかの細胞療法の場合、注入速度は、溶存酸素の常時モニタリングを必要とする（Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ．２００９  Ｊｕｎ；１８（５）：６８３−６９１）。肺の閉じ込めの程度は、細胞サイズ、活性化状態、細胞投与量、および注入速度に依存する。Ｃｒｕｚら（Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ．２０１０  Ｏｃｔ；１２（６）：７４３−７４９）は、３００回を超えるＴ細胞の注入から、低用量および低速注入は、肺の閉じ込めを減らす場合があるという有害所見を報告している。しかし、特定の高効力のＣＡＲ−Ｔ細胞を用いて、肺内皮上の、たとえ低いレベルで存在するＨｅｒ２などの標的でも（Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１０  Ａｐｒ；１８（４）：８４３−８５１）、注入後の肺中で、初期の高いＣＡＲ−Ｔ細胞濃度およびこれらの組織中のＴ細胞標的の存在に起因して、制御不能の速発毒性を生じることがあり、急速な患者の衰弱をもたらす。他の事例では、胆管などの他のオフターゲット組織中のＴ細胞標的の存在は、ステロイドまたは細胞除去エピトープなどの他の薬剤が利用できる前に、制御不能のオンターゲット・オフ腫瘍毒性（Ｌａｍｅｒｓ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１３  Ａｐｒ；２１（４）：９０４−１２）、および重度臓器毒性を生じ得る。静脈および動脈プラズマはアシドーシスに対し強力緩衝能を有するが、呼吸性アシドーシス、ショック、代謝アシドーシスおよび虚血性アシドーシスの条件は、養子細胞療法で治療した癌を有する患者で発生し得る。
【０２３３】
本明細書で提供されるいくつかの態様では、対象中のＣＡＢ−ＣＡＲの結合は、対象に血液、組織および／または微小環境のｐＨを上げるまたは下げる薬剤を投与することにより、調節できる。いくつかの態様では、対象中のオンターゲット・オフ腫瘍毒性は、対象に血液のｐＨ、および／または組織のｐＨおよび／または微小環境のｐＨを上げるまたは下げる薬剤を投与することにより、軽減できる。いくつかの態様では、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の標的哺乳動物細胞に対する結合は、血液のｐＨ、および／または組織のｐＨおよび／または微小環境のｐＨを上げるまたは下げる薬剤を導入することにより、制御できる。いくつかの態様では、遺伝子改変Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の対象中の標的哺乳動物細胞に対するインビボ結合は、ｐＨ調節薬剤を対象に投与することにより、制御できる。例示的実施形態では、血液のｐＨ、および／または組織のｐＨおよび／または微小環境のｐＨを上げることができる。いくつかの実施形態では、微小環境は、インビボ微小環境であり得る。例示的実施形態では、微小環境は、腫瘍微小環境であり得る。いくつかの実施形態では、微小環境には、標的哺乳動物細胞を含むことができ、標的哺乳動物細胞はその表面上に標的抗原を発現している。いくつかの実施形態では、薬剤の対象への投与により、血液のｐＨ、組織および／または微小環境のｐＨを、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、または６．９未満のｐＨから、少なくとも６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、または７．６のｐＨへ高めることができ、血液、組織、および／または微小環境のｐＨは、薬剤の投与後より、薬剤の投与前の方が低い。いくつかの実施形態では、薬剤の対象への投与により、血液のｐＨ、組織または微小環境のｐＨを、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、または７．６超のｐＨから、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、または７．０未満のｐＨへ低下させることができ、血液、組織、および／または微小環境のｐＨは、薬剤の投与後より、薬剤の投与前の方が高い。いくつかの実施形態では、対象への薬剤の投与は、対象の血液、組織および／または微小環境中でｐＨシフトを生じさせることができる。いくつかの実施形態では、薬剤の投与後のｐＨシフトは、薬剤の投与前のｐＨに比べて、少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、または１．８ｐＨ単位のいずれかの方向でのシフト、すなわち、ｐＨの増加または低下であり得る。例示的実施形態では、ｐＨシフトは、ｐＨの増加である。
【０２３４】
本開示のＣＡＢ−ＣＡＲは、別のｐＨと１ｐＨの違いでその同族抗原に対する結合を低下させたかもしれない。最も広い態様において、ＣＡＢ−ＣＡＲの特異的結合のための例示的ｐＨ値がまだ与えられていない例示的実施形態では、および一方で、このような態様に対するこれらの値の代わりにその他の実施形態に関して、ＣＡＢ−ＣＡＲが、より低いｐＨに比べて、より高いｐＨで結合を低下させたかもしれない。例えば、ＣＡＢ−ＣＡＲは、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、または７．０未満のｐＨの場合より、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、または７．５超のｐＨで、その同族抗原に対する結合を、低下させたかもしれない。他の実施形態では、ＣＡＢ−ＣＡＲは、より低いｐＨの場合より、より高いｐＨで結合を低下させたかもしれない。例えば、ＣＡＢ−ＣＡＲは、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、または７．５超のｐＨの場合より、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、または７．０未満のｐＨで、その同族抗原に対する結合を、低下させたかもしれない。いくつかの例示的実施形態では、ＣＡＢ−ＣＡＲは、７．４〜７．６のｐＨに比べて、６．５〜６．７のｐＨで増大した結合を示す。他の例示的実施形態では、ＣＡＢ−ＣＡＲは、７．４のｐＨに比べて、６．７のｐＨで増大した結合を示す。他の実施形態では、ＣＡＢ−ＣＡＲは、血液のｐＨに比べて、腫瘍のｐＨ中で増大した結合を示す。いくつかの実施形態では、ＣＡＢ−ＣＡＲは、抗原特異的標的化領域標的化領域、ストーク、および細胞内活性化ドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＢ−ＣＡＲはまた、共刺激ドメインも含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＢ−ＣＡＲは、腫瘍関連抗原に結合し得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＢ−ＣＡＲは、ＡｘｌポリペプチドもしくはそのエピトープまたはＲｏｒ２ポリペプチドもしくはそのエピトープに結合する。
【０２３５】
血液、組織、または微小環境のｐＨの調節を含む方法では、微小環境のｐＨは、７．０未満から７．０超に高めることができる。例えば、ｐＨは、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、または７．０未満のｐＨから、７．０、７．１、７．２、７．３、または７．４超のｐＨに高めることができる。いくつかの実施形態では、ＣＡＢ−ＣＡＲは、増大したｐＨで同族抗原に結合できるが、薬剤の導入前には、微小環境のｐＨでは結合できない。特定の実施形態では、ｐＨは、７．０未満から７．１〜８．０のｐＨまで、または７．１〜７．８のｐＨまで、または７．２〜７．８のｐＨまで、または７．２〜７．６のｐＨまで、または７．３〜７．６のｐＨまで、７．４〜７．８のｐＨまで、または７．４〜７．６のｐＨまで、高めることができる。このようなｐＨの増大は、投与される薬剤の種類と投与量に応じて、１、２、４、６、８、１２、または２４時間未満で、または１、２、４、６、８、１２、または２４時間超で起こり得る。特定の実施形態では、薬剤は、腫瘍などの標的組織中で、および例えば、標的組織（例えば、腫瘍）微小環境の少なくとも表面中で、標的組織（例えば、腫瘍）微小環境の少なくとも一部で、および例示的実施形態では、標的組織（例えば、腫瘍）微小環境全体を通して、ｐＨが、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、または７．５超に；または範囲の下端値の７．０、７．１、７．２、７．３と、範囲の上端値の７．４、７．５、７．６、７．７、または７．８との間に留まるように、投与される。微小環境は、腫瘍、組織、非腫瘍組織、正常組織、または一時的なｐＨシフトを受けた組織などのインビボ微小環境であり得る。例えば、通例、一時的なｐＨシフトを受ける組織には、嫌気性条件における筋組織または運動している筋組織または炎症性組織または炎症を生じている組織が含まれる。標的哺乳動物細胞を含むいくつかの実施形態では、標的哺乳動物細胞は、腫瘍細胞または非腫瘍細胞または正常細胞であり得る。
【０２３６】
いくつかの態様では、一時的に血管ｐＨを高めて、微小環境的に制御された、ＡｘｌポリペプチドもしくはそのエピトープまたはＲｏｒ２ポリペプチドもしくはそのエピトープを認識する、それらに結合できる、およびいくつかの実施形態では、それらに結合するＣＡＢ−ＣＡＲの親和性を低減させる方法が提供される。血液ｐＨの０．４Ｕのシフトは、ＣＡＢ−ＣＡＲの一部を形成する、特定のｓｃＦｖのそれらの同族抗原に対する親和性を、１０倍超、低下させることができる。いくつかの実施形態では、治療のためのｐＨ制御は、種々の薬剤のＩＶまたは経口投与経路を介して達成できる。例えば、いくつかの実施形態では、結合親和性の不活性化は、重炭酸塩または重炭酸ナトリウムを用いて達成できる。他の実施形態では、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（トロメタミン、トロメタモール、およびＴＨＡＭとしても知られる）および／またはＣａｒｂｉｃａｒｂ（商標）（重炭酸ナトリウムと炭酸ナトリウムとの等モル高張性溶液）を利用して、オンターゲット・オフ腫瘍毒性を軽減するのに十分な量で血液のｐＨを高めることができる。さらにその他の実施形態では、小分子プロトンポンプ阻害剤を利用して、オンターゲット・オフ腫瘍毒性を軽減するのに十分な量で、血液ｐＨおよび／または組織ｐＨを高めることができる。ｐＨ調節を含む方法で使用できるプロトンポンプ阻害剤には、限定されないが、エスオメプラゾール（Ｎｅｘｉｕｍ）、エスオメプラゾールおよびナプロキセン（Ｖｉｍｏｖｏ）、ランソプラゾール（Ｐｒｅｖａｃｉｄ）、オメプラゾール（ＰｒｉｌｏｓｅｃおよびＺｅｇｅｒｉｄ）、およびラベプラゾール（Ａｃｉｐｈｅｘ）が挙げられる。プロトンポンプ阻害剤の投与を効果的に長期間にわたり使用して、数日、数週間、数ヶ月、または数年にわたり、抗原結合ドメインのその同族抗原に対する結合親和性を調節できる。他の実施形態では、抗原結合ドメインのその同族抗原に対する親和性を、血液ｐＨおよび／または組織ｐＨを変えることにより、転写、翻訳、膜発現、およびトランスポーターおよびポンプの安定性を制御して、調節できる。変えられた発現がｐＨを調節するためであり得る、このようなトランスポーターおよびポンプの例には、限定されないが、プロトンポンプ、ナトリウムプロトン交換ファミリー（ＮＨＥ）のメンバー、重炭酸塩トランスポーターファミリー（ＢＣＴ）、およびモノカルボン酸トランスポーターファミリーが挙げられる。
【０２３７】
特定の実施形態では、例えば、重炭酸塩、ＴＨＡＭ、またはＣａｒｉｃａｒｂ（商標）などのｐＨ調節薬剤は、条件的活性型生物学的ＡＳＴＲ（例えば、ｓｃＦｖまたはｓｃＦｖＦｃ）を発現している患者のＣＡＲ−Ｔ細胞の注入の前に、またはそれと同時に投与される。このような処理は、これをしなければ、ＣＡＲ−Ｔ細胞注入の一時的肺の閉じ込めを伴う即時細胞毒性を軽減する。したがって、特定の態様では、本明細書で提供されるのは、血液ｐＨおよび／または組織ｐＨおよび／または微小環境ｐＨを高めるのに十分な量で薬剤を対象に投与することにより、対象の正常な健康組織に生ずる細胞傷害性を低減し；および同時にまたは後続して（例えば、１、２、４、６、８、１２、または２４時間後、または１、２、３、４、または７日後に）、ＣＡＢ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞またはＮＫ細胞を対象中に導入する方法である。特定の実施形態では、このような導入後の目標時間（例えば、１、２、４、６、８、１２、または２４時間後、または１、２、３、４、または７日後）で、薬剤の投与は、対象の血液、組織、または微小環境のｐＨを変えて、ＣＡＢ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞の結合／活性を調節するために、一定期間にわたりまたは無期限に終結される。
【０２３８】
当業者ならわかるように、ｐＨを調節できる（例えば、対象の血液ｐＨおよび／または組織ｐＨおよび／または微小環境ｐＨを高める）薬剤の投与のための種々の効果的投与計画を使用できる。本明細書では、投与は、薬剤をＩＶにより対象に注射することまたは薬剤の患者への経口投与または対象が薬剤を摂取することを含む、薬剤を対象に投与することを意味し得る。薬剤は、対象または患者に種々の時間長さにわたり、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、もしくは６日間；１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、もしくは１１週間；３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、もしくは１８ヶ月；または２、２．５、３、３．５、４、４．５、もしくは５年間または無期限の期間にわたり投与し得る。いくつかの実施形態では、薬剤は、重炭酸塩、重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）、または重炭酸ナトリウムおよび炭酸ナトリウムの溶液とすることができ、非経口またはＩＶ投与量は次記であり得る：０．２ｘ対象の体重（ｋｇ）ｘ対象の塩基欠乏；必要ＨＣＯ３（ｍＥｑ）＝０．５ｘ体重（ｋｇ）ｘ［２４−血清ＨＣＯ３（ｍＥｑ／Ｌ）］；または４〜８時間にわたる２〜５ｍＥｑ／ｋｇ  ＩＶ注入。いくつかの実施形態では、重炭酸塩／重炭酸ナトリウム、または重炭酸ナトリウムの溶液の標準的投与計画がアシドーシスの重症度に応じて使用できる。１Ｌの水中５％デキストロースに希釈した５０〜１５０ｍＥｑの重炭酸塩を、ＩＶ経由、１〜１．５Ｌ／時間の速度で投与できる。別の非限定的例では、１Ｌの水中５％デキストロースに希釈した９０〜１８０ｍＥｑの重炭酸塩を、ＩＶ経由、１〜１．５Ｌ／時間の速度で投与できる。薬剤が重炭酸塩または重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）であるいくつかの実施形態では、腸内または経口投与量は、例えば、３２５〜２０００ｍｇの重炭酸ナトリウムの１〜４回／日の対象への投与とすることができる。
【０２３９】
いくつかの実施形態では、薬剤は、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（トロメタミン、トロメタモール、およびＴＨＡＭとしても知られる）とすることができ、非経口またはＩＶ投与量は次記であり得る：必要なトロメタミン溶液（０．３Ｍの溶液のｍＬ）＝体重（ｋｇ）ｘ塩基欠乏（ｍＥｑ／リットル）ｘ１．１。いくつかの実施形態では、トリスヒドロキシメチルアミノメタンのＩＶ投与量は、シガールアンダーセン計算図表により決定した、ｍＥｑ／Ｌ単位の細胞外液の緩衝塩基欠乏から推定できる。いくつかの実施形態では、初期投与量は、遅いＩＶ輸注により注入される５００ｍｌ（１５０ｍＥｑ）（最大１０００ｍＬまで）のトリスヒドロキシメチルアミノメタンとすることができ、最大投与量は、１時間以上にわたる５００ｍｇ／ｋｇ（２２７ｍｇ／ｌｂ）の投与量である。
【０２４０】
いくつかの実施形態では、薬剤は、小分子プロトンポンプ阻害剤とすることができ、長期治療長さにわたり投与できる。例えば、小分子プロトンポンプ阻害剤は、少なくとも１、２、３、４、５、もしくは６日間；１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、もしくは１１週間；３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、もしくは１８ヶ月；または２、２．５、３、３．５、４、４．５、もしくは５年間または無期限の期間にわたり投与し得る。いくつかの実施形態では、プロトンポンプ阻害剤は、エスオメプラゾール（Ｎｅｘｉｕｍ）とすることができ、２０ｍｇまたは４０ｍｇのエスオメプラゾールを１日１回または２回経口投与できる。いくつかの実施形態では、プロトンポンプ阻害剤は、エスオメプラゾールおよびナプロキセン（Ｖｉｍｏｖｏ）の組み合わせとすることができ、２０ｍｇのエスオメプラゾールと３７５または５００ｍｇのナプロキセンを一緒に１日２回経口投与できる。いくつかの実施形態では、プロトンポンプ阻害剤は、ランソプラゾール（Ｐｒｅｖａｃｉｄ）とすることができ、１５、３０、または６０ｍｇのランソプラゾールを１日１回または２回経口投与できる。いくつかの実施形態では、ランソプラゾールは、ＩＶにより３０ｍｇのランソプラゾールを１日１回３０分間にわたり、最大７日間まで投与できる。その後、対象は、経口ランソプラゾールに切り替え、治療を継続できる。いくつかの実施形態では、プロトンポンプ阻害剤は、オメプラゾール（ＰｒｉｌｏｓｅｃおよびＺｅｇｅｒｉｄ）とすることができ、１０、２０ｍｇまたは４０ｍｇのオメプラゾールを１日１回または２回経口投与できる。いくつかの実施形態では、プロトンポンプ阻害剤は、ラベプラゾール（Ａｃｉｐｈｅｘ）とすることができ、２０または６０ｍｇのラベプラゾールを１日１回または２回経口投与でき、または１００ｍｇのラベプラゾールを１日１回経口投与できる。本明細書で開示のいずれかの実施形態では、薬剤は相互に組み合わせて使用できる。
【０２４１】
本明細書で開示される実施形態のいずれかでは、対象の血液、組織および／または微小環境、のｐＨを、薬剤の投与の前、その間、またはその後に測定できる。いくつかの実施形態では、対象に対するｐＨを高めるまたは低下させる薬剤の投与または投与継続の決定は、対象の血液、組織、および／または微小環境のｐＨ測定をベースにすることができる。対象の血液のｐＨおよび／または血液の重炭酸塩レベルは当該技術分野において周知である。いくつかの実施形態では、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）、磁気共鳴分光法（ＭＲＳ）、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）、および光学画像を用いて、微小環境、例えば、腫瘍中のインビボｐＨを測定できる（腫瘍のｐＨ測定の詳細については、Ｚｈａｎｇ  Ｘ，Ｌｉｎ  Ｙ，Ｇｉｌｌｉｅｓ  ＲＪ．Ｔｕｍｏｒ  ｐＨ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ．Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ．２０１０  Ａｕｇ；５１（８）：１１６７−７０を参照されたい）。
【０２４２】
別の態様では、本明細書で提供されるのは、対象のオンターゲット・オフ腫瘍毒性を軽減する方法であり、該方法は、次記を含む：
ａ．条件的活性型生物学的キメラ抗原受容体（ＣＡＢ−ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドを対象のＴ細胞またはＮＫ細胞中に導入し、ＣＡＢ−ＣＡＲを発現できるＴ細胞および／またはＮＫ細胞を生成し、ＣＡＢ−ＣＡＲが、Ａｘｌポリペプチドもしくはそのエピトープ、またはＲｏｒ２ポリペプチドもしくはそのエピトープに結合できるステップ；
ｂ．ＣＡＢ−ＣＡＲを発現できるＴ細胞および／またはＮＫ細胞を、対象に導入し、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞が、対象中でＣＡＢ−ＣＡＲを発現するステップ；および
ｃ．対象に、血液のｐＨおよび／または組織のｐＨおよび／または微小環境のｐＨを高めるのに十分な量の薬剤を投与し、血液、組織、および／または微小環境中のＣＡＢ−ＣＡＲのその同族抗原に対する結合を、高められたｐＨにより調節し、それにより、対象のオンターゲット・オフ腫瘍毒性を軽減するステップ。
【０２４３】
導入ステップでは、Ｔ細胞またはＮＫ細胞がＣＡＢ−ＣＡＲをコードする核酸を含むように遺伝子改変されているために、ＡｘｌポリペプチドもしくはそのエピトープまたはＲｏｒ２ポリペプチドもしくはそのエピトープに結合できるＣＡＢ−ＣＡＲを発現できる。この遺伝子改変は、遺伝子導入または形質導入によりＴ細胞またはＮＫ細胞の内部に導入されているベクター上のＣＡＢ−ＣＡＲコード配列の存在であり得る。例示的実施形態では、ＣＡＢ−ＣＡＲをコードする核酸は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞のゲノムに組み込まれる。
【０２４４】
当該技術分野において既知のポリヌクレオチドをＴ細胞および／またはＮＫ細胞中にポリヌクレオチドを導入する各種方法を、本明細書で提供されるＣＡＢ−ＣＡＲ  Ｔ細胞またはＮＫ細胞の、細胞上のその同族抗原に対する結合に影響を与えるように、ｐＨ調節薬剤などの薬剤を用いて、ｐＨを変えることを含む態様（本明細書においては、「ｐＨ切り替え態様」と称することもある）のための方法で使用可能であることが想定される。通常、ベクター、例示的実施例では、発現ベクターがポリヌクレオチドの送達に使用される。このようなベクターには、核酸をＴ細胞および／またはＮＫ細胞に送達するための当技術分野において既知の種々のベクターが含まれる。本発明の例示的態様は、レトロウイルスベクターおよびレトロウイルス粒子を利用し、いくつかの具体的な例示的実施形態では、レンチウイルスベクター、例示的実施形態では、組換えレンチウイルス粒子を利用する。
【０２４５】
その他の好適な発現ベクターを、本明細書で提供されるｐＨ切り替え態様で使用できる。このような発現ベクターには、限定されないが、ウイルスベクター（例えば、ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；アデノウイルスに基づくウイルスベクター（例えば、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ３５：２５４３  ２５４９，１９９４；Ｂｏｒｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ６：５１５  ５２４，１９９９；Ｌｉ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄｓｏｎ，ＰＮＡＳ  ９２：７７００  ７７０４，１９９５；Ｓａｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ５：１０８８  １０９７，１９９９；国際公開第９４／１２６４９号、国際公開第９３／０３７６９号；国際公開第９３／１９１９１号；国際公開第９４／２８９３８号；国際公開第９５／１１９８４号、および国際公開第９５／００６５５号参照）；アデノ関連ウイルス（例えば、Ａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ９：８１  ８６，１９９８，Ｆｌａｎｎｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９４：６９１６  ６９２１，１９９７；Ｂｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ３８：２８５７  ２８６３，１９９７；Ｊｏｍａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ４：６８３  ６９０，１９９７，Ｒｏｌｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １０：６４１  ６４８，１９９９；Ａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  ５：５９１  ５９４，１９９６；国際公開第９３／０９２３９号中のＳｒｉｖａｓｔａｖａ、Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．（１９８９）６３：３８２２−３８２８；Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）１６６：１５４−１６５；ａｎｄ  Ｆｌｏｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ（１９９３）９０：１０６１３−１０６１７参照）；ＳＶ４０；単純ヘルペスウイルス；またはレトロウイルスベクター（例えば、マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ならびにラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳腺腫瘍ウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクター）、例えば、γレトロウイルス；またはヒト免疫不全ウイルス（例えば、Ｍｉｙｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９４：１０３１９  ２３，１９９７；Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７３：７８１２  ７８１６，１９９９参照）；などが挙げられる。
【０２４６】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ含有ウイルス粒子が、組換えレトロウイルス粒子の代わりに利用される。このようなウイルス粒子は、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、サイトメガロウィルス、ポックスウイルス、トリポックスウイルス、インフルエンザウイルス、疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、またはシンドビスウイルスであり得る。当業者なら、異なるウイルスおよびレトロウイルスを用いて使用するために、本明細書で開示される方法を変更する方法がわかるであろう。ＤＮＡゲノムを含むウイルス粒子が使用される場合、当業者なら、機能単位がこのようなゲノム中に含められ、全てのまたは一部のウイルス粒子のＤＮＡゲノムの、このようなウイルスで形質導入されたＴ細胞および／またはＮＫ細胞のゲノムへの統合を誘導することを理解するであろう。あるいは、機能的ＤＮＡは、細胞中で発現されているＴ細胞および／またはＮＫ細胞に送達できるが、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞のゲノムに統合されない。
【０２４７】
例示的実施形態では、本開示のｐＨ切り替え態様で使用されるベクターは、組換えレトロウイルス粒子および特定の実施形態では、組換えレンチウイルス粒子である。このようなレトロウイルス粒子は通常、ウイルスエンベロープ中に位置するカプシド内にレトロウイルスゲノムを含む。本明細書の種々のセクションにおける本開示は、組換えレトロウイルス粒子の表面上またはその粒子内、および／または組換えレトロウイルス粒子のゲノム中に含むことができる要素を開示する、組換えレトロウイルス粒子の種々の実施形態を提供する。これらの組換えレトロウイルス粒子の実施形態のいずれかを、本明細書で提供されるｐＨ切り替え態様で使用できる。
【０２４８】
上記で開示の実施形態のいずれかでは、ＣＡＢ−ＣＡＲが結合する同族抗原は、ＡｘｌポリペプチドもしくはそのエピトープまたはＲｏｒ２ポリペプチドもしくはそのエピトープであり得る。いくつかの実施形態では、同族抗原は、ＡｘｌポリペプチドもしくはそのエピトープまたはＲｏｒ２ポリペプチドもしくはそのエピトープの一続きの少なくとも１０、１５、２０個の、または全てのアミノ酸に対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドであり得る。本明細書で開示のように、ＡｘｌポリペプチドもしくはそのエピトープまたはＲｏｒ２ポリペプチドもしくはそのエピトープに結合できるＣＡＢ−ＣＡＲは通常、７．４のｐＨの場合より、６．７のｐＨで、より高い結合親和性でその同族抗原に結合する。したがって、本開示のこのような抗Ｒｏｒ２および抗ＡＸＬ  ＣＡＢ−ＣＡＲは通常、生理学的ｐＨを有する正常組織よりも、腫瘍微小環境中で、より高い結合親和性でそれらの同族抗原に結合する。
【０２４９】
治療方法
本開示は、本明細書で提供される抗ＡＸｌまたは抗Ｒｏｒ２  ＣＡＢ−ＣＡＲを含む、障害に対する種々の治療方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、本開示のＣＡＢ−ＣＡＲが、Ｔリンパ球またはＮＫ細胞中に存在し、その細胞に発現されている場合、標的細胞に対する細胞傷害性を媒介できるという事実を利用する。本開示のＣＡＢ−ＣＡＲは、特定の標的条件下で、標的細胞上に存在する抗原に結合し、それにより、ＣＡＢ−ＣＡＲを生成するように遺伝子改変されたＴリンパ球またはＮＫ細胞による標的細胞の死滅を媒介する。ＣＡＢ−ＣＡＲのＡＳＴＲは通常、標的細胞表面上に存在する抗原に結合する。
【０２５０】
標的細胞には、限定されないが、癌細胞が含まれる。したがって、本開示は、標的癌細胞の死滅、または増殖抑制方法を提供し、該方法は、当該ＣＡＲを生成するように遺伝子改変された細胞傷害性免疫エフェクター細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞、またはＮＫ細胞）を接触させて、それにより、Ｔリンパ球またはＮＫ細胞が標的癌細胞の表面上に存在する抗原を認識し、標的細胞の死滅を媒介することを含む。このような方法の例示的態様は、癌治療するための方法を提供する。ＣＡＢ−ＣＡＲは、癌の治療または腫瘍または癌細胞の標的化のために使用することに限定されず、むしろ、循環障害、関節炎、多発性硬化症、自己免疫障害、皮膚疾患、ウイルス性疾患および障害の治療を含む１つまたは複数の適応症での使用ならびに種々の診断フォーマットでの使用に好適するであろう。
【０２５１】
特定の態様では、本開示は、癌を有する対象の癌を治療する方法を提供する。従って、本開示は、癌に対する養子細胞療法、特に、ＡｘｌまたはＲｏｒ２を発現する癌に対し、本明細書で提供される抗ＡＸｌおよび抗Ｒｏｒ２  ＣＡＢ−ＣＡＲを使用する方法を提供する。したがって、一態様では、方法は、次記を含む：Ａ．本明細書で提供されるＡｘｌまたはＲｏｒ２に対するＣＡＢ−ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列を発現するように構成された発現ベクターを、対象から得た末梢血細胞中に導入し、遺伝子改変細胞傷害性細胞（Ｔ細胞またはＮＫ細胞など）を生成するステップ；およびＢ．遺伝子改変細胞傷害性細胞を対象に投与するステップ。上記ステップＡの例示的実施形態を提供する細胞を、活性化、形質導入および通常は増殖するために、Ｔ細胞を処理する詳細な方法が、本明細書で提供される。
【０２５２】
癌は通常、それぞれ、Ｒｏｒ２またはＡｘｌを発現し、例示的実施形態では、癌は、このような癌の細胞がＲｏｒ２および／またはＡｘｌを発現する、腎細胞癌などのいずれかの癌である。ＣＡＲは、本明細書で開示のＡｘｌまたはＲｏｒ２を認識するいずれかのＣＡＢ−ＣＡＲ、特に、これらの抗原を発現している癌細胞に対し細胞傷害性であるＣＡＢ−ＣＡＲである。Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を含む末梢血白血球を、ベクターを用いて形質導入することにより、抗ＡＸｌ  ＣＡＢ−ＣＡＲまたは抗Ｒｏｒ２  ＣＡＢ−ＣＡＲをコードする発現ベクターを、末梢血細胞中に導入できる。特定の例示的実施形態では、ベクターは、組換えウイルス、例えば、いくつかの実施形態では、組換えレンチウイルスである、組換えレトロウイルスである。いくつかの実施形態では、癌は、Ｒｏｒ２を発現している軟部肉腫または中皮腫であり、対象（例えば、軟部肉腫患者または中皮腫患者）のＴ細胞および／またはＮＫ細胞は、抗Ｒｏｒ２  ＣＡＲ、例えば、本明細書で開示の抗Ｒｏｒ２  ＣＡＢ−ＣＡＲを形質導入される。
【０２５３】
本明細書で提供される障害を治療する方法は通常、本明細書で提供される抗ＡＸｌまたは抗Ｒｏｒ２  ＣＡＢ−ＣＡＲを発現する遺伝子改変Ｔ細胞またはＮＫ細胞を対象に投与することを含む。投与は、例えば、静脈内投与、皮下投与、または腫瘍内投与であり得る。遺伝子改変Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞が静脈内投与される方法では、通常、１ｘ１０４細胞／ｋｇ〜１ｘ１０８細胞／ｋｇが非経口的投与用の好適な緩衝液に入れて投与される。遺伝子改変Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞が腫瘍内投与される方法では、通常、１ｘ１０６細胞〜５ｘ１０８細胞が等張性溶液に入れて投与される。
【０２５４】
いくつかの実施形態では、投与は、インターロイキンまたはその改変型の投与の前に、それに付随しておよび／または、その後に行われる。例えば、本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、ＩＬ−２、または徐放性を有し、および／またはＴ細胞の増殖および／または殺作用活性を活性化する方向に偏らせる特定のＩＬ−２受容体に結合するＩＬ−２の改変型の同時投与を含む。例えば、改変ＩＬ−２は、特定の実施形態では、ペグ化ＩＬ−２であり、ＮＫＴＲ−２１４（Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）であり得る。他の実施形態では、改変ＩＬ−２は、ＡＬＫＳ４２３０（Ａｌｋｅｒｍｅｓ，Ｉｎｃ）である。
【０２５５】
本明細書で開示の方法による治療に適用できる癌腫には、限定されないが、食道癌、肝細胞癌、基底細胞癌（皮膚癌の１つの形）、扁平上皮細胞癌（種々の組織）、移行上皮癌（膀胱の悪性新生物）を含む膀胱癌、気管支原性癌、結腸癌、結腸直腸癌、胃癌、小細胞癌および非小細胞肺癌を含む肺癌、副腎皮質癌、甲状腺癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、腎細胞癌、乳管内上皮内癌または胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、子宮癌、精巣癌、骨原性癌、上皮癌、および上咽頭癌が挙げられる。
【０２５６】
本明細書で開示の方法による治療に適用できる肉腫には、限定されないが、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、脊索腫、骨原性肉腫、骨肉腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、およびその他の軟組織肉腫が挙げられる。
【０２５７】
本明細書で開示の方法による治療に適用できる他の固形腫瘍には、限定されないが、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、脊索腫、骨原性肉腫、骨肉腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、およびその他の軟組織肉腫が挙げられる。
【０２５８】
本明細書で開示の方法による治療に適用できる白血病には、限定されないが、ａ）慢性骨髄増殖性症候群（多能性造血幹細胞の腫瘍性疾患）；ｂ）急性骨髄性白血病（多能性造血幹細胞または制限された系統細胞への分化能を有する造血幹細胞の腫瘍性転化）；ｃ）Ｂ細胞ＣＬＬ、Ｔ細胞ＣＬＬ前リンパ球性白血病および有毛細胞白血病を含む、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ；免疫学的に未熟で、機能的に不適格な小リンパ球のクローン性増殖）；およびｄ）急性リンパ性白血病（リンパ芽球の蓄積により特徴づけられる）が挙げられる。当該方法を用いて治療できるリンパ腫には、限定されないが、Ｂ細胞リンパ腫（例えば、バーキットリンパ腫）；ホジキンリンパ腫；非ホジキンリンパ腫、などが挙げられる。
【０２５９】
本明細書で開示される方法による治療に適用できる他の癌には、非定型髄膜腫（脳）、膵島細胞癌（膵臓）、髄様癌（甲状腺）、間葉腫（腸）、肝細胞癌（肝臓）、肝芽腫（肝臓）、明細胞癌（腎臓）、および縦隔神経芽腫が挙げられる。
【０２６０】
併用療法
いくつかの実施形態では、ＣＡＲ細胞は、標準的癌療法に対する補助療法として投与される。標準的癌療法には、手術（例えば、癌性組織の外科的除去）、放射線療法、骨髄移植、化学療法的治療、抗体治療、生物学的応答調節物質治療、および前述の方法の特定の組み合わせが挙げられる。
【０２６１】
放射線療法には、限定されないが、外部から適用されるビームなどの発生源から、または小型放射性源の埋め込みにより送出されるＸ線またはγ線が挙げられる。
【０２６２】
癌治療に使用される好適な抗体には、限定されないが、裸の抗体（ｎａｋｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、例えば、トラスツズマブ（ベバシズマブ（アバスチン（商標））、セツキシマブ（アービタックス（商標））、パニツムマブ（ベクティビックス（商標））、イピリムマブ（ヤーボイ（商標））、リツキシマブ（リツキサン）、アレムツズマブ（ＬＥＭＴＲＡＤＡ（商標））、オファツムマブ（アーゼラ（商標））、オレゴボマブ（オバレックス（商標））、ラムブロリズマブ（ＭＫ−３４７５）、ペルツズマブ（パージェタ（商標））、ラニビズマブ（ルセンティス（商標））、など、およびコンジュゲート抗体、例えば、ゲムツズマブオゾガマイシン（Ｍｙｌｏｒｔａｒｇ（商標））、ブレンツキシマブベドチン、９０Ｙ標識イブリツモマブチウキセタン（ゼバリン（商標））、１３１Ｉ標識トシツモマブ（アドセトリス（商標））、（ベキサール（商標））、などが挙げられる。癌治療に使用される好適な抗体には、限定されないが、腫瘍関連抗原に対し産生された抗体が挙げられる。このような抗原には、限定されないが、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡ、ｇｐＡ３３、ムチン、ＴＡＧ−７２、ＣＡＩＸ、ＰＳＭＡ、葉酸結合タンパク質、ガングリオシド（例えば、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、など）、Ｌｅｙ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、インテグリンアルファ−Ｖ−ベータ−３、インテグリンアルファ−５−ベータ−ｌ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＭＥＴ、ＩＧＦｌＲ、ＥＰＨＡ３、ＴＲＡＩＬＲｌ、ＴＲＡＩＬＲ２、ＲＡＮＫＬ、ＰＡＰ、テネイシン、などが挙げられる。
【０２６３】
本開示の方法に関連して使用に好適する生物学的応答調節物質には、限定されないが、（１）チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）活性阻害剤；（２）セリン／トレオニンキナーゼ活性阻害剤；（３）腫瘍関連抗原アンタゴニスト、例えば、腫瘍抗原に特異的に結合する抗体；（４）アポトーシス受容体アゴニスト；（５）インターロイキン−２；（６）インターフェロンα；（７）インターフェロンγ；（８）コロニー刺激因子；（９）血管新生阻害剤；および（１０）腫瘍壊死因子のアンタゴニストが挙げられる。
【０２６４】
化学療法剤は、癌細胞の増殖を低減させる非ペプチド（すなわち、タンパク質性）化合物であり、細胞傷害薬および細胞分裂阻害剤を包含する。化学療法剤の非限定的例には、アルキル化剤、ニトロソウレア、代謝拮抗物質、抗腫瘍抗生物質、植物（ビンカ）アルカロイド、およびステロイドホルモンが挙げられる。
【０２６５】
細胞増殖を低減させる作用をする薬剤は、当技術分野において既知であり、広く使用されている。このような薬剤には、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、エチレンイミン誘導体、スルホン酸アルキル、およびトリアゼンなどのアルキル化剤が含まれ、これらには、限定されないが、メクロレタミン、シクロホスファミド（シトキサン（商標））、メルファラン（Ｌ−サルコリシン）、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、セムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）、ストレプトゾシン、クロロゾトシン、ウラシルマスタード、クロルメチン、イホスファミド、クロラムブシル、ピポブロマン、トリエチレンメラミン、トリエチレンチオホスホラミン、ブスルファン、ダカルバジン、およびテモゾロミドが挙げられる。
【０２６６】
代謝拮抗剤には、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体、およびアデノシンデアミナーゼ阻害剤が含まれ、これらには、限定されないが、シタラビン（ＣＹＴＯＳＡＲ−Ｕ）、シトシンアラビノシッド、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フロクスウリジン（ＦｕｄＲ）、６−チオグアニン、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）、ペントスタチン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、メトトレキセート、１０−プロパルギル−５，８−ジデアザ葉酸（ＰＤＤＦ、ＣＢ３７１７）、５，８−ジデアザテトラヒドロ葉酸（ＤＤＡＴＨＦ）、ロイコボリン、リン酸フルダラビン、ペントスタチン、およびゲムシタビンが挙げられる。
【０２６７】
好適な天然産物ならびにこれらの誘導体（例えば、ビンカアルカロイド、抗腫瘍抗生物質、酵素、リンホカイン、およびエピポドフィロトキシン）には、限定されないが、Ａｒａ−Ｃ、パクリタキセル（タキソール（登録商標））、ドセタキセル（タキソテール（登録商標））、デオキシコホルマイシン、マイトマイシン−Ｃ、Ｌ−アスパラギナーゼ、アザチオプリン；ブレキナル；アルカロイド、例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン、など；ポドフィロトキシン、例えば、エトポシド、テニポシド、など；抗生物質、例えば、アントラサイクリン、ダウノルビシン塩酸塩（ダウノマイシン、ルビドマイシン、ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ）、イダルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、およびモルホリノ誘導体、など；フェノキシゾンビスシクロペプチド、例えば、ダクチノマイシン；塩基性グリコペプチド、例えば、ブレオマイシン；アントラキノングリコシド、例えば、プリカマイシン（ミトラマイシン）；アントラセンジオン、例えば、ミトキサントロン；アジリノピロロインドールジオン、例えば、マイトマイシン；大環状免疫抑制剤、例えば、シクロスポリン、ＦＫ−５０６（タクロリムス、プログラフ）、ラパマイシン、など；などが挙げられる。
【０２６８】
他の抗増殖性細胞傷害薬は、ナベルベン、ＣＰＴ−１１、アナストロゾール、レトラゾール、カペシタビン、レロキサフィン、シクロホスファミド、ｉｆｏｓａｍｉｄｅ、およびドロロキサフィンである。
【０２６９】
抗増殖性作用を有する微小管作用剤もまた、使用に好適し、限定されないが、アロコルヒチン（Ａｌｌｏｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ、ＮＳＣ  ４０６０４２）、ハリコンドリンＢ（ＮＳＣ  ６０９３９５）、コルヒチン（ＮＳＣ  ７５７）、コルヒチン誘導体（例えば、ＮＳＣ  ３３４１０）、ドラスタチン１０（ＮＳＣ  ３７６１２８）、メイタンシン（ＮＳＣ  １５３８５８）、リゾキシン（ＮＳＣ  ３３２５９８）、パクリタキセル（タキソール（登録商標）、タキソール（登録商標）誘導体、ドセタキセル（タキソテール（登録商標））、チオコルヒチン（ＮＳＣ  ３６１７９２）、トリチルシステイン）、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン；エポチロンＡ、エポチロンＢ、ディスコデルモリド、エストラムスチン、ノコダゾール（これらに限定されない）を含む天然および合成エポチロン、などが挙げられる。
【０２７０】
使用に好適するホルモン調節薬およびステロイド（合成類似体を含む）には、限定されないが、副腎皮質ステロイド、例えば、プレドニゾン、デキサメタゾンなど；エストロゲンおよびプロゲスチン、例えば、ヒドロキシプロゲステロンカプロン酸エステル、メドロキシプロゲステロン酢酸エステル、メゲストロール酢酸エステル、エストラジオール、クロミフェン、タモキシフェン；など；および副腎皮質抑制剤、例えば、アミノグルテチミド；１７α−エチニルエストラジオール；ジエチルスチルベストロール、テストステロン、フルオキシメステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、テストラクトン、メチルプレドニゾロン、メチルテストステロン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、クロロトリアニセン、ヒドロキシプロゲステロン、アミノグルテチミド、エストラムスチン、メドロキシプロゲステロンアセテート、ロイプロリド、フルタミド（ドロゲニル）、トレミフェン（フェアストン）、およびゾラデックス（登録商標）が挙げられる。エストロゲンは、増殖および分化を刺激し、したがって、エストロゲン受容体に結合する化合物は、この活性を阻止するために使用される。副腎皮質ステロイドは、Ｔ細胞増殖を阻害し得る。
【０２７１】
その他の化学療法剤には、金属錯体が含まれ、これには、例えば、シスプラチン（シス−ＤＤＰ）、カルボプラチン、など；尿素、例えば、ヒドロキシ尿素；およびヒドラジン、例えば、Ｎ−メチルヒドラジン；エピポドフィロトキシン；トポイソメラーゼ阻害剤；プロカルバジン；ミトキサントロン；ロイコボリン；テガフール；などが挙げられる。その他の着目すべき抗増殖剤には、免疫抑制剤、例えば、ミコフェノール酸、サリドマイド、デオキシスパガリン、アザスポリン、レフルノミド、ミゾリビン、アザスピラン（ＳＫＦ１０５６８５）；イレッサ（登録商標）（ＺＤ１８３９、４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−メトキシ−６−（３−（４−モルホリニル）プロポキシ）キナゾリン）；などが挙げられる。
【０２７２】
「タキサン」は、パクリタキセル、ならびに任意の活性タキサン誘導体またはプロドラッグを含む。「パクリタキセル」（これは、本明細書では、類似体、製剤、および誘導体、例えば、ドセタキセル、タキソール（商標）、タキソテール（商標）（ドセタキセルの製剤）、パクリタキセルの１０−デスアセチル類似体およびパクリタキセルの３’Ｎ−デスベンゾイル−３’Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル類似体を含むと理解されるべきである）は、当業者に既知の技術を利用して容易に作製し得る（国際公開第９４／０７８８２号、同第９４／０７８８１号、同第９４／０７８８０号、同第９４／０７８７６号、同第９３／２３５５５号、同第９３／１００７６号；米国特許第５，２９４，６３７号；同第５，２８３，２５３号；同第５，２７９，９４９号；同第５，２７４，１３７号；同第５，２０２，４４８号；同第５，２００，５３４号；同第５，２２９，５２９号；および欧州特許第５９０，２６７号も参照されたい）、または例えば、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．を含む、種々の市販品入手源から入手し得る（セイヨウイチイ由来のＴ７４０２；または紅豆杉由来のＴ−１９１２）。
【０２７３】
パクリタキセルは、一般的に化学的に利用可能なパクリタキセルの形態のみでなく、類似体および誘導体（例えば、上述のように、タキソテール（商標）ドセタキセル）およびパクリタキセルコンジュゲート（例えば、パクリタキセル−ＰＥＧ、パクリタキセル−デキストラン、またはパクリタキセル−キシロース）を意味すると理解されるべきである。
【０２７４】
また、用語の「タキサン」に含まれるのは、親水性誘導体、および疎水性誘導体を含む既知の種々の誘導体である。タキサン誘導体には、限定されないが、国際公開第９９／１８１１３号に記載のガラクトースおよびマンノース誘導体；国際公開第９９／１４２０９号に記載のその他の誘導体；国際公開第９９／０９０２１号、国際公開第９８／２２４５１号、および米国特許第５，８６９，６８０号に記載のタキサン誘導体；国際公開第９８／２８２８８号に記載の６−チオ誘導体；米国特許第５，８２１，２６３号に記載のスルフェンアミド誘導体；および米国特許第５，４１５，８６９号に記載のタキソール誘導体が挙げられる。タキサンは、パクリタキセルのプロドラッグをさらに含み、これには、限定されないが、国際公開第９８／５８９２７号；国際公開第９８／１３０５９号；および米国特許第５，８２４，７０１号に記載のものが含まれる。
【０２７５】
治療に好適する対象
種々の対象が癌を治療する方法を用いて治療するのに好適する。好適な対象には、癌である、癌と診断されたことがある、癌を発症する危険がある、過去に癌であり、癌の再発の危険がある、癌のための薬剤で治療したことがあり、このような治療に応答しなかった、または  癌のための薬剤で治療したことがあるが、このような治療に対する初期の応答後に再発した、任意の個体、例えば、ヒトまたは非ヒト動物を含む。
【０２７６】
免疫調節法による治療に好適する対象には、自己免疫障害の個体；臓器または組織移植患者である個体；など；免疫無防備状態の個体；および病原体に感染した個体が含まれる。
【０２７７】
例示的実施形態
本開示は、Ａｘｌおよび／またはＲｏｒ２に結合する、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、およびＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、ならびに、ＡＸｌおよびＲｏｒ２に結合する条件的活性型ＣＡＲを提供する。本開示は、ＣＡＲを生成するように遺伝子改変された細胞、およびこのような細胞を作製する方法を提供する。本開示のＣＡＲは、各種方法で使用でき、ＣＡＲ療法、例えば、癌、例えば、腎細胞癌に対するＣＡＲ療法などの養子免疫細胞療法の実施方法を含む方法も提供される。
【０２７８】
本開示の態様であるいくつかの非限定的例示的実施形態が次の実施形態で提供される：
【０２７９】
実施形態１．下記を含む、ＡｘｌまたはＲｏｒ２に結合するためのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）：
ａ）７．４のｐＨに比べて、６．７のｐＨでＡｘｌまたはＲｏｒ２に対し増大した結合を示す、条件的活性型抗原特異的標的化領域（ＡＳＴＲ）；
ｂ）膜貫通ドメイン；および
ｃ）細胞内活性化ドメイン。
【０２８０】
実施形態Ａ１．下記を含む、ＡｘｌまたはＲｏｒ２に結合するためのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）：
ａ）正常な生理的環境に比べて、腫瘍微小環境中および／またはインビトロ腫瘍代替アッセイ条件中で活性の増加（すなわち、より大きい活性）を示す、ＡｘｌまたはＲｏｒ２に結合する条件的活性型抗原特異的標的化領域（ＡＳＴＲ）；
ｂ）膜貫通ドメイン；および
ｃ）細胞内活性化ドメイン。
【０２８１】
実施形態Ａ２．別義が明示的に記述されない限り、ＡＳＴＲは、抗体、抗原、リガンド、リガンドの受容体結合ドメイン、受容体、受容体のリガンド結合ドメイン、およびアフィボディである、実施形態１またはＡ１に記載の、または本明細書で提供されるいずれか他の実施形態に記載のＣＡＲ。
【０２８２】
実施形態Ａ３．別義が明示的に記述されない限り、ＡＳＴＲは、抗体フラグメントである、実施形態Ａ２に記載の、または本明細書で提供されるいずれか他の実施形態に記載のＣＡＲ。
【０２８３】
実施形態Ａ４．別義が明示的に記述されない限り、条件的活性型ＡＳＴＲが、対応する生理的条件に比べて、腫瘍微小環境中および／またはインビトロ腫瘍代替アッセイ条件中で、抗原結合の増大を示し、腫瘍微小環境および／またはインビトロ腫瘍代替アッセイ条件が、低酸素、酸性ｐＨ、より高濃度の乳酸、より高濃度のヒアルロン酸、より高濃度のアルブミン、より高濃度のアデノシン、より高濃度のＲ−２−ヒドロキシグルタル酸、およびより低い栄養素利用可能性からなる群より選択される、実施形態１またはＡ１〜Ａ３のいずれか１つに記載の、または本明細書で提供されるいずれか他の実施形態に記載のＣＡＲ。
【０２８４】
実施形態Ａ５．別義が明示的に記述されない限り、条件的活性型ＡＳＴＲが、７．４のｐＨに比べて、６．７のｐＨで抗原結合の増大（またはより高い抗原結合）を示す、実施形態Ａ１〜Ａ４のいずれか１つに記載の、または本明細書で提供されるいずれか他の実施形態に記載のＣＡＲ。
【０２８５】
実施形態Ａ６．別義が明示的に記述されない限り、細胞内活性化ドメインは、ヒトＣＤ３Ｚ活性化ドメイン、ヒトＣＤ３Ｄ活性化ドメイン、ヒトＣＤ３Ｅ活性化ドメイン、ヒトＣＤ３Ｇ活性化ドメイン、ヒトＣＤ２８活性化ドメイン、ヒトＣＤ７９Ａ活性化ドメイン、ヒトＤＡＰＩＯ活性化ドメイン、ヒトＤＡＰ１２活性化ドメイン、ヒトＦＣＥＲｌＧ活性化ドメイン、ヒトＣＤ１３７活性化ドメイン、またはヒトＺＡＰ７０活性化ドメインである、実施形態１またはＡ１〜Ａ５のいずれか１つに記載の、または本明細書で提供されるいずれか他の実施形態に記載のＣＡＲ。
【０２８６】
実施形態Ａ７．別義が明示的に記述されない限り、細胞内活性化ドメインとは異なるアミノ酸配列を有する第１、第２、第３、または第４の共刺激ドメインをさらに含む、実施形態１またはＡ１〜Ａ６のいずれか１つに記載の、または本明細書で提供されるいずれか他の実施形態に記載のＣＡＲ。
【０２８７】
実施形態Ａ８．別義が明示的に記述されない限り、第１、第２、第３および／または第４の共刺激ドメインが、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、Ｌｃｋ結合欠失ＣＤ２８（ＩＣΔ）、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＢＴＬＡ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＬＦＡ−１、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＰＤ−１、ＴＩＬＲ２、ＴＩＬＲ４、ＴＩＬＲ７、ＴＩＬＲ９、Ｆｃ受容体γ鎖、Ｆｃ受容体ε鎖、またはＣＤ８３に特異的に結合するリガンドを含む、実施形態Ａ７に記載の、または本明細書で提供されるいずれか他の実施形態に記載のＣＡＲ。
【０２８８】
実施形態Ａ９．別義が明示的に記述されない限り、第１の共刺激ドメインは、共刺激活性を保持し、ヒトＣＤ１３７共刺激ドメイン、ヒトＣＤ２８共刺激ドメイン、ヒトＩＣΔ共刺激ドメイン、ヒトＩＣＯＳ共刺激ドメイン、ヒトＯＸ４０共刺激ドメイン、ヒトＢＴＬＡ共刺激ドメイン、ヒトＣＤ２７共刺激ドメイン、ヒトＣＤ３０共刺激ドメイン、ヒトＧＩＴＲ共刺激ドメイン、またはヒトＨＶＥＭ共刺激ドメインである、実施形態Ａ７に記載の、または本明細書で提供されるいずれか他の実施形態に記載のＣＡＲ。
【０２８９】
実施形態Ｂ１．別義が明示的に記述されない限り、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞中で活性なプロモーターに動作可能に連結された１つまたは複数の核酸配列を含むレトロウイルスゲノムを含み、実施形態１またはＡ１〜Ａ９のいずれか１つに記載の、または本明細書で提供されるいずれか他の実施形態に記載のＣＡＲをコードする、複製不能組換えレトロウイルス粒子。
【０２９０】
実施形態Ｂ２．実施形態Ｂ１に記載の複製不能組換えレトロウイルス粒子で遺伝子改変された単離組換えＴ細胞またはＮＫ細胞。
【０２９１】
実施形態Ｂ３．実施形態Ｂ１に記載の複製不能組換えレトロウイルス粒子で遺伝子改変された単離組換えＴ細胞。
【０２９２】
実施形態Ｂ４．実施形態Ｂ１に記載の複製不能組換えレトロウイルス粒子、およびＴ細胞および／またはＮＫ細胞を含む反応混合物。
【０２９３】
実施形態Ｂ５．実施形態Ｂ１に記載の複製不能組換えレトロウイルス粒子、およびＴ細胞を含む反応混合物。
【０２９４】
実施形態Ｃ１．別義が明示的に記述されない限り、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞中で活性なプロモーターに動作可能に連結された１つまたは複数の核酸配列（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、または６つ以上の核酸配列）を含むゲノムを含み、１つまたは複数（２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、または６つ以上）の核酸配列が、実施形態１またはＡ１〜Ａ８のいずれか１つに記載の、または本明細書で提供されるいずれか他の実施形態に記載のＣＡＲをコードする、単離（例えば、組換えまたは遺伝子改変）Ｔ細胞またはＮＫ細胞。
【０２９５】
実施形態Ｃ２．単離細胞がＴ細胞である、実施形態Ｃ１に記載の単離（例えば、組換えまたは遺伝子改変）Ｔ細胞またはＮＫ細胞。
【０２９６】
実施形態Ｃ３．Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞中で活性なプロモーターに動作可能に連結された１つまたは複数の核酸配列を含み、１つまたは複数の核酸配列が、ＡｘｌまたはＲｏｒ２に結合するためのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードし、次記を含む、単離（例えば、組換えまたは遺伝子改変）Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞（特定の例示的実施形態では、Ｔ細胞）：
ａ）７．４のｐＨに比べて、６．７のｐＨでＡｘｌまたはＲｏｒ２に対し増大した結合を示す、条件的活性型抗原特異的標的化領域（ＡＳＴＲ）；
ｂ）膜貫通ドメイン；および
ｃ）細胞内活性化ドメイン。
【０２９７】
実施形態Ｄ１．別義が明示的に記述されない限り、標的哺乳動物細胞を、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞と７．４未満のｐＨ（例えば、ｐＨは、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、または６．９未満、または５．８〜７．０の範囲、例示的実施形態では、６．０〜６．８の範囲、６．１〜６．９の範囲、６．２〜６．８の範囲、または範囲の下端値の６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、および６．５、と、範囲の上端値の６．６、６．７、６．８、および６．９との間）の微小環境中で接触させることを含み、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞が、実施形態１またはＡ１〜Ａ８のいずれか１つに記載の、または本明細書で提供されるいずれか他の実施形態に記載のＣＡＲを発現し、標的哺乳動物細胞がＡｘｌおよび／またはＲｏｒ２を発現する、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を標的哺乳動物細胞に結合させる方法。
【０２９８】
実施形態Ｄ２．標的哺乳動物細胞を、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞と７．４未満のｐＨ（例えば、ｐＨは、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、または６．９未満、または５．８〜７．０の範囲、例示的実施形態では、６．０〜６．８の範囲、６．２〜６．８の範囲、または範囲の下端値の６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、および６．５、と、範囲の上端値の６．６、６．７、６．８、および６．９との間）の微小環境中で接触させることを含み、標的哺乳動物細胞がＡｘｌまたはＲｏｒ２を発現し、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞が、それぞれＡｘｌまたはＲｏｒ２に結合するためのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現し、ＣＡＲが次記を含む、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を標的哺乳動物細胞に結合させる方法：
ａ）７．４のｐＨに比べて、６．７のｐＨでＡｘｌまたはＲｏｒ２に対し増大した結合を示す、条件的活性型抗原特異的標的化領域（ＡＳＴＲ）；
ｂ）膜貫通ドメイン；および
ｃ）細胞内活性化ドメイン。
【０２９９】
実施形態Ｄ３．結合がＴ細胞および／またはＮＫ細胞を活性化する、実施形態Ｄ１〜Ｄ３のいずれか１つに記載の方法。
【０３００】
実施形態Ｄ４．標的哺乳動物細胞を、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞と７．４未満のｐＨ（例えば、ｐＨは、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、または６．９未満、または５．８〜７．０の範囲、例示的実施形態では、６．０〜６．８の範囲、６．２〜６．８の範囲、または範囲の下端値の６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、および６．５、と、範囲の上端値の６．６、６．７、６．８、および６．９との間）の微小環境中で接触させることを含み、標的哺乳動物細胞がＡｘｌまたはＲｏｒ２を発現し、Ｔ細胞またはＮＫ細胞が、それぞれＡｘｌまたはＲｏｒ２に結合するためのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現し、ＣＡＲが次記を含む、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を活性化させる方法：
ａ）７．４のｐＨに比べて、６．７のｐＨでＡｘｌまたはＲｏｒ２に対し増大した結合を示す、条件的活性型抗原特異的標的化領域（ＡＳＴＲ）；
ｂ）膜貫通ドメイン；および
ｃ）細胞内活性化ドメイン。
【０３０１】
実施形態Ｄ５．ＣＡＲが、別の実施形態、非限定的例示的実施例、実施形態１またはＡ１〜Ａ８に記載のいずれかである、実施形態Ｄ５に記載の方法。
【０３０２】
実施形態Ｄ６．ＣＡＲが、実施形態１またはＡ１〜Ａ８に記載のいずれかである、実施形態Ｄ５に記載の方法。
【０３０３】
実施形態Ｄ７．活性化が、サイトカインの発現および／または生成および／または分泌の増大を含む、実施形態Ｄ３〜Ｄ６のいずれか１つに記載の方法。
【０３０４】
実施形態Ｄ８．活性化時に、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞がＩＬ−２またはＩＦＮ−γの発現を増大させる、実施形態Ｄ３〜Ｄ７のいずれか１つに記載の方法。
【０３０５】
実施形態Ｄ９．ＩＬ−２またはＩＦＮ−γの発現が、接触の前の、Ｔ細胞またはＮＫ細胞により生成されるＩＬ−２またはＩＦＮ−γの量に比べて、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、または１０倍超、増大される、実施形態Ｄ８に記載の方法。
【０３０６】
実施形態Ｄ１０．ＩＬ−２またはＩＦＮ−γの分泌が、接触の前の、Ｔ細胞またはＮＫ細胞により分泌されるＩＬ−２またはＩＦＮ−γの量に比べて、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、または１０倍超、増大される、実施形態Ｄ８に記載の方法。
【０３０７】
実施形態Ｄ１１．活性化時に、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の細胞傷害活性が、接触の前の、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の細胞傷害活性に比べて、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、または１０倍超、増大される、実施形態Ｄ３〜Ｄ７のいずれか１つに記載の方法。
【０３０８】
実施形態Ｄ１２．Ｔ細胞またはＮＫ細胞の活性化後に、標的哺乳動物細胞が溶解される、実施形態Ｄ１〜Ｄ１１のいずれか１つに記載の方法。
【０３０９】
実施形態Ｄ１３．接触前に、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を、実施形態Ｂ１またはＢ２のいずれか１つに記載の複製不能組換えレトロウイルス粒子で形質導入し、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を遺伝子改変して、ＣＡＲを発現させることをさらに含む、実施形態Ｄ１〜Ｄ１２のいずれか１つに記載の方法。
【０３１０】
実施形態Ｄ１４．形質導入がエクスビボで実施される、実施形態Ｄ１３に記載の方法。
【０３１１】
実施形態Ｄ１５．微小環境のｐＨを７．０以上（例えば、７．１、７．２、または７．３超）のｐＨに高め、それにより、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の活性化を低減させることをさらに含む、実施形態Ｄ１〜Ｄ１４のいずれか１つに記載の方法。
【０３１２】
実施形態Ｄ１６．微小環境のｐＨを７．０以上（例えば、７．１、７．２、または７．３超）のｐＨに高め、それにより、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を不活化することをさらに含む、実施形態Ｄ１〜Ｄ１４のいずれか１つに記載の方法。
【０３１３】
実施形態Ｄ１７．微小環境が腫瘍である、実施形態Ｄ１〜Ｄ１６のいずれか１つに記載の方法。
【０３１４】
実施形態Ｄ１８．腫瘍がヒト対象中にある、請求項Ｄ１７に記載の方法。
【０３１５】
実施形態Ｄ１９．微小環境がインビトロまたはエクスビボである、実施形態Ｄ１〜Ｄ１６のいずれか１つに記載の方法。
【０３１６】
実施形態Ｅ１．Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞中で活性なプロモーターに動作可能に連結された１つまたは複数の核酸配列（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、または６つ以上の核酸配列）を含むポリヌクレオチドをそのゲノム中に含む複製不能組換えレトロウイルス粒子と接触させることを含み、１つまたは複数（２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、または６つ以上）の核酸配列が、実施形態１またはＡ１〜Ａ８のいずれか１つに記載の、または本明細書で提供されるいずれか他の実施形態に記載のキメラ抗原受容体をコードし、前記接触させることが、複製不能組換えレトロウイルス粒子によるＴ細胞および／またはＮＫ細胞の形質導入を容易にし、それにより、遺伝子改変Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を生成する、リンパ球を遺伝子改変する方法。
【０３１７】
実施形態Ｆ１．別義が明示的に記述されない限り、複製不能組換えレトロウイルス粒子が、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞中で活性なプロモーターに動作可能に連結された１つまたは複数の核酸配列（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、または６つ以上の核酸配列）を含むポリヌクレオチドをそのゲノム中に含み、１つまたは複数（２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、または６つ以上）の核酸配列が、実施形態１またはＡ１〜Ａ８のいずれか１つに記載の、または本明細書で提供されるいずれか他の実施形態に記載のキメラ抗原受容体をコードし、方法が、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を接触させることを含み、前記接触させることが、複製不能組換えレトロウイルス粒子によるＴ細胞および／またはＮＫ細胞の形質導入を容易にし、それにより、遺伝子改変Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を生成する、リンパ球を遺伝子改変する方法で使用するための複製不能組換えレトロウイルス粒子。
【０３１８】
実施形態Ｇ１．別義が明示的に記述されない限り、方法が、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞中で活性なプロモーターに動作可能に連結された１つまたは複数の核酸配列（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、または６つ以上の核酸配列）を含むポリヌクレオチドをそのゲノム中に含む複製不能組換えレトロウイルス粒子と接触させることを含み、１つまたは複数（２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、または６つ以上）の核酸配列が、実施形態１またはＡ１〜Ａ８のいずれか１つに記載の、または本明細書で提供されるいずれか他の実施形態に記載のキメラ抗原受容体をコードし、前記接触させることが、複製不能組換えレトロウイルス粒子によるＴ細胞および／またはＮＫ細胞の形質導入を容易にし、それにより、遺伝子改変Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を生成する、腫瘍増殖を治療するために、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を遺伝子改変する方法で使用するための複製不能組換えレトロウイルス粒子。
【０３１９】
実施形態Ｈ１．別義が明示的に記述されない限り、キットの使用が、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞中で活性なプロモーターに動作可能に連結された１つまたは複数の核酸配列（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、または６つ以上の核酸配列）を含むポリヌクレオチドをそのゲノム中に含む複製不能組換えレトロウイルス粒子と接触させることを含み、１つまたは複数（２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、または６つ以上）の核酸配列が、実施形態１またはＡ１〜Ａ８のいずれか１つに記載の、または本明細書で提供されるいずれか他の実施形態に記載のキメラ抗原受容体をコードし、前記接触させることが、複製不能組換えレトロウイルス粒子によるＴ細胞および／またはＮＫ細胞の形質導入を容易にし、それにより、遺伝子改変Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を生成する、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を遺伝子改変するためキットの製造における複製不能組換えレトロウイルス粒子の使用。
【０３２０】
実施形態Ｉ１．別義が明示的に記述されない限り、複製不能組換えレトロウイルス粒子が、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞中で活性なプロモーターに動作可能に連結された１つまたは複数の核酸配列（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、または６つ以上の核酸配列）を含むポリヌクレオチドをそのゲノム中に含み、１つまたは複数（２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、または６つ以上）の核酸配列が、実施形態１またはＡ１〜Ａ８のいずれか１つに記載の、または本明細書で提供されるいずれか他の実施形態に記載のキメラ抗原受容体をコードする、複製不能組換えレトロウイルス粒子およびその使用のための説明書を含む市販用容器。
【０３２１】
実施形態Ｊ１．複製不能組換えレトロウイルス粒子を含む容器、およびその使用のための説明書を含むキットであって、説明書が、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を標的哺乳動物細胞に結合させる方法を教示し、方法は次記を含む：
ａ）別義が明示的に記述されない限り、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞中で活性なプロモーターに動作可能に連結された１つまたは複数の核酸配列（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、または６つ以上の核酸配列）を含むポリヌクレオチドをそのゲノム中に含み、１つまたは複数（２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、または６つ以上）の核酸配列が、実施形態１またはＡ１〜Ａ８のいずれか１つに記載の、または本明細書で提供されるいずれか他の実施形態に記載のＣＡＲをコードする、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を複製不能組換えレトロウイルス粒子で形質導入すること；および
ｂ）標的哺乳動物細胞を、形質導入Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞と７．４未満のｐＨ（例えば、ｐＨは、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、または６．９未満、または５．８〜７．０の範囲、より一般的には、６．０〜６．８の範囲、６．２〜６．８の範囲、または範囲の下端値の６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、および６．５、と、範囲の上端値の６．６、６．７、６．８、および６．９との間）の微小環境中で接触させることであって、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞が、実施形態１またはＡ１〜Ａ８のいずれか１つに記載のＣＡＲを発現し、標的哺乳動物細胞がＡｘｌおよび／またはＲｏｒ２を発現していること。
【０３２２】
実施形態Ｋ１．別義が明示的に記述されない限り、標的哺乳動物細胞を、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞と７．４未満のｐＨ（例えば、ｐＨは、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、または６．９未満、または５．８〜７．０の範囲、より一般的には、６．０〜６．８の範囲、６．２〜６．８の範囲、または範囲の下端値の６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、および６．５、と、範囲の上端値の６．６、６．７、６．８、および６．９との間）の微小環境中で接触させることを含み、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞が、実施形態１またはＡ１〜Ａ８のいずれか１つに記載の、または本明細書で提供されるいずれか他の実施形態に記載のキメラ抗原受容体を発現し、標的哺乳動物細胞がＡｘｌおよび／またはＲｏｒ２を発現している、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を活性化する方法。
【０３２３】
実施形態Ｋ２．接触前に、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を、実施形態Ｂ１またはＢ２のいずれか１つに記載の複製不能組換えレトロウイルス粒子で形質導入することをさらに含む、実施形態Ｋ１に記載の方法。
【０３２４】
実施形態Ｋ３．活性化後に、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞が、サイトカインの発現および／または生成および／または分泌を誘導する、実施形態Ｋ１に記載の方法。
【０３２５】
実施形態Ｋ４．サイトカインがＩＬ−２またはＩＦＮ−γからなる群から選択される、実施形態Ｋ３に記載の方法。
【０３２６】
実施形態Ｌ１．別義が明示的に記述されない限り、標的哺乳動物細胞を、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞と７．４未満のｐＨ（例えば、ｐＨは、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、または６．９未満、または５．８〜７．０の範囲、より一般的には、６．０〜６．８の範囲、６．２〜６．８の範囲、または範囲の下端値の６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、および６．５、と、範囲の上端値の６．６、６．７、６．８、および６．９との間）の微小環境中で接触させることを含み、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞が、実施形態１またはＡ１〜Ａ８のいずれか１つに記載の、または本明細書で提供されるいずれか他の実施形態に記載のキメラ抗原受容体を発現し、標的哺乳動物細胞がＡｘｌおよび／またはＲｏｒ２を発現している、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞中のサイトカインの発現および／または生成を誘導する、および／またはＴ細胞および／またはＮＫ細胞からのサイトカインの分泌を誘導する方法。
【０３２７】
実施形態Ｌ２．接触前に、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を、実施形態Ｂ１またはＢ２のいずれか１つに記載の複製不能組換えレトロウイルス粒子で形質導入することをさらに含む、実施形態Ｌ１に記載の方法。
【０３２８】
実施形態Ｍ１．別義が明示的に記述されない限り、実施形態１またはＡ１〜Ａ８のいずれかに記載の、または本明細書で提供されるいずれか他の実施形態に記載の、ＡｘｌまたはＲｏｒ２に結合するためのキメラ抗原受容体をコードする単離核酸。
【０３２９】
実施形態Ｍ２．核酸が、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞中で活性なプロモーターをさらに含み、ＣＡＲをコードする核酸配列がそのプロモーターに動作可能に連結される、実施形態Ｍ１に記載の単離核酸。
【０３３０】
実施形態Ｍ３．単離核酸配列が認識ドメインをさらにコードする、実施形態Ｍ２に記載の単離核酸。
【０３３１】
実施形態Ｍ４．認識ドメインをコードする核酸が、リボソームスキップ配列により、ＣＡＲをコードする核酸から分離される、実施形態Ｍ３に記載の単離核酸。
【０３３２】
実施形態Ｍ５．リボソームスキップ配列が２Ａ−１である、実施形態Ｍ４に記載の単離核酸。
【０３３３】
実施形態Ｍ６．実施形態Ｍ１〜Ｍ５に記載の核酸のいずれかを含む、複製不能組換えレトロウイルス粒子。
【０３３４】
実施形態Ｍ７．複製不能組換えレトロウイルス粒子がレンチウイルス粒子である、実施形態Ｍ６に記載の複製不能組換えレトロウイルス粒子。
【０３３５】
実施形態Ｎ１．別義が明示的に記述されない限り、実施形態１またはＡ１〜Ａ８のいずれかに記載の、または本明細書で提供されるいずれか他の実施形態に記載のキメラ抗原受容体をコードする核酸を含む発現ベクター。
【０３３６】
実施形態Ｏ１．実施形態Ｎ１に記載の発現ベクターのいずれか１つに感染した哺乳動物細胞。
【０３３７】
実施形態Ｐ１．別義が明示的に記述されない限り、実施形態１またはＡ１〜Ａ８のいずれかに記載の、または本明細書で提供されるいずれか他の実施形態に記載のキメラ抗原受容体のいずれかを発現している哺乳動物細胞。
【０３３８】
実施形態Ｑ１．哺乳動物細胞を、ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結されたプロモーターを含む発現ベクターを用いて遺伝子改変することを含む、条件的結合性ＡｘｌまたはＲｏｒ２に対するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含み、ＣＡＲが次記を含む、条件的に活性化可能な細胞の作製方法：
ａ）正常な生理的環境に比べて、腫瘍環境中および／またはインビトロ腫瘍代替アッセイ条件中で活性の増大を示す、ＡｘｌまたはＲｏｒ２に結合する条件的活性型抗原特異的標的化領域（ＡＳＴＲ）；
ｂ）膜貫通ドメイン；および
ｃ）細胞内活性化ドメイン。
【０３３９】
実施形態Ｒ１．次記のステップを含む、対象の癌を治療する方法：
ａ）別義が明示的に記述されない限り、実施形態１またはＡ１〜Ａ８のいずれかに記載の、または本明細書で提供されるいずれか他の実施形態に記載のＣＡＲのいずれかをコードする核酸を含む発現ベクターを対象から得られた細胞傷害性細胞に導入し、遺伝子改変細胞傷害性細胞を生成するステップ；および
ｂ）遺伝子改変細胞傷害性細胞を対象に投与するステップ。
【０３４０】
実施形態Ｓ１．次記を含む、条件的結合性ＡｘｌまたはＲｏｒ２に対するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、条件的に活性化可能なＴ細胞および／またはＮＫ細胞のエクスビボ作製方法：
ａ）末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を濃縮して、単離血液からＴ細胞および／またはＮＫ細胞を含むＰＢＭＣを単離すること；
ｂ）濃縮ＰＢＭＣのＴ細胞および／またはＮＫ細胞を効果的な条件下で活性化すること；
ｃ）別義が明示的に記述されない限り、活性化Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞に複製不能組換えレトロウイルス粒子を用いて効果的な条件下で形質導入し、それにより、遺伝子改変Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を生成し、複製不能組換えレトロウイルス粒子がそれぞれ、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞中で活性なプロモーターに機能的に連結された１つまたは複数の核酸配列を含むレトロウイルスゲノムを含み、１つまたは複数の核酸配列の内の第１の核酸配列が、実施形態１またはＡ１〜Ａ８のいずれかに記載の、または本明細書で提供されるいずれか他の実施形態で記載のＣＡＲをコードすること；および
ｄ）遺伝子改変Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を増殖し、それにより、条件的に活性化可能なＴ細胞および／またはＮＫ細胞を作製すること。
【０３４１】
実施形態Ｔ１．実施形態Ｄ３、Ｅ１、Ｋ２、Ｑ１、Ｒ１、またはＳ１のいずれかに記載の方法により生成された改変Ｔ細胞。
【０３４２】
実施形態Ｕ１．実施形態Ｄ３、Ｅ１、Ｋ２、Ｑ１、Ｒ１、またはＳ１のいずれかに記載の方法により生成された改変ＮＫ細胞。
【０３４３】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む本明細書の実施形態のいずれかでは、抗原特異的標的化領域（ＡＳＴＲ）は、抗体、抗原、リガンド、リガンドの受容体結合ドメイン、受容体、受容体のリガンド結合ドメイン、およびアフィボディから選択できる。ＣＡＲを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、ＡＳＴＲは、完全長抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、（Ｆａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、および二価の単鎖抗体またはダイアボディから選択される抗体であり得る。ＣＡＲを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、ＡＳＴＲは、抗体由来の重鎖および軽鎖を含み得る。抗体を含むＡＳＴＲを有するＣＡＲを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、抗体は、重鎖および軽鎖を有する単鎖可変フラグメントであり得る。抗体由来の重鎖および軽鎖を含むＡＳＴＲを有するＣＡＲを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、重鎖および軽鎖は、リンカーにより分離でき、リンカーは、範囲の下端値の３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸長さと、範囲の上端値の２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、または２００アミノ酸長との間の長さであり得る。いくつかの実施形態では、ＡＳＴＲは、重鎖および軽鎖を含む単鎖可変フラグメントであり得、重鎖および軽鎖は、リンカーにより分離され、リンカーは、６〜１００アミノ酸長である。重鎖および軽鎖を含む単鎖可変フラグメントを含むＡＳＴＲを有するＣＡＲを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、重鎖および軽鎖は、リンカーにより分離でき、リンカーは、６〜１００アミノ酸長であり得、ＡＳＴＲは、条件的活性型抗体重鎖または条件的活性型抗体軽鎖を含み得、もうその他の抗体重鎖または抗体軽鎖は、野生型であり得る。
【０３４４】
抗体由来の重鎖および軽鎖を含むＡＳＴＲを有するＣＡＲを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、抗体は、キメラ抗原受容体上の軽鎖に対しＮ末端に配置でき、または軽鎖は、キメラ抗原受容体上の重鎖に対しＮ末端に配置できる。抗体由来の重鎖および軽鎖を含むＡＳＴＲを有するＣＡＲを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、重鎖および軽鎖は、条件的活性型抗体由来であり得る。ＣＡＲを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、ＣＡＲは、二重特異性ＡＳＴＲを含み得る。ＣＡＲを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、ＡＳＴＲは、条件的活性型ＡＳＴＲであり得る。条件的活性型ＡＳＴＲを有するＣＡＲを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、条件的活性型ＡＳＴＲは、対応する生理的条件に比べて、腫瘍微小環境中および／またはインビトロ腫瘍代替アッセイ条件中で、抗原結合の増大を示すことができ、腫瘍微小環境および／またはインビトロ腫瘍代替アッセイ条件が、低酸素、酸性ｐＨ、より高濃度の乳酸、より高濃度のヒアルロン酸、より高濃度のアルブミン、より高濃度のアデノシン、より高濃度のＲ−２−ヒドロキシグルタル酸、およびより低い栄養素利用可能性からなる群より選択できる。条件的活性型ＡＳＴＲを有するＣＡＲを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、条件的活性型ＡＳＴＲは、７．４のｐＨに比べて、６．７のｐＨで増大した抗原結合を示し得る。条件的活性型ＡＳＴＲを有するＣＡＲを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、条件的活性型ＡＳＴＲは、７．４のｐＨに比べて、６．０のｐＨ（６．７のｐＨの代わりに、またはそれに加えて）で抗原結合の増大を示し得る。
【０３４５】
ＣＡＲを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、ＡＳＴＲは、Ａｘｌに結合できる。Ａｘｌに結合するＡＳＴＲを有するＣＡＲを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、ＡＳＴＲは、配列番号７９の抗体重鎖および配列番号８０の抗体軽鎖を含む抗体と同じＡｘｌのエピトープに結合できる。
【０３４６】
Ａｘｌに結合し、例示的実施形態において、配列番号７９の抗体重鎖および配列番号８０の抗体軽鎖を含む抗体と同じＡｘｌのエピトープに結合するＡＳＴＲを有するＣＡＲを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、ＡＳＴＲは、Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３配列を有する３つの相補性決定領域を有する抗体重鎖可変領域を含むことができ、ａ）Ｈ１配列は、Ｘ１ＧＸ２ＴＭＮ（配列番号８７）であり；ｂ）Ｈ２配列は、ＬＩＫＰＳＮＧＧＴＳＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号８８）であり；およびｃ）Ｈ３配列は、ＧＸ３ＹＸ４ＳＹＸ５ＡＭＤＹ（配列番号８９）であり、Ｘ１はＴまたはＷであり；Ｘ２はＨまたはＡであり；Ｘ３はＨまたはＤであり；Ｘ４はＥまたはＨであり；Ｘ５はＥまたはＦである。Ａｘｌに結合し、例示的実施形態において、配列番号７９の抗体重鎖および配列番号８０の抗体軽鎖を含む抗体と同じＡｘｌのエピトープに結合するＡＳＴＲを有するＣＡＲを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、ＡＳＴＲは、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３配列を有する３つの相補性決定領域を有する抗体軽鎖可変領域を含むことができ、ｄ）Ｌ１配列は、ＫＡＳＱＤＶＸ６ＳＡＶＡ（配列番号９０）であり；ｅ）Ｌ２配列は、ＷＸ７Ｘ８ＴＲＸ９Ｔ（配列番号９１）であり；およびｆ）Ｌ３配列は、ＱＥＨＦＳＸ１０ＰＬＸ１１（配列番号９２）であり；Ｘ６はＳまたはＶであり；Ｘ７はＡまたはＱであり；Ｘ８はＳまたはＤであり；Ｘ９はＨまたはＤであり；Ｘ１０はＴまたはＰであり；およびＸ１１はＴまたはＲである。Ａｘｌに結合し、例示的実施形態において、配列番号７９の抗体重鎖および配列番号８０の抗体軽鎖を含む抗体と同じＡｘｌのエピトープに結合するＡＳＴＲを有するＣＡＲを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、ＡＳＴＲは、Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３配列を有する３つの相補性決定領域を有する抗体重鎖可変領域を含むことができ、ａ）Ｈ１配列は、Ｘ１ＧＸ２Ｘ３ＭＸ４（配列番号１３４）であり；ｂ）Ｈ２配列は、ＬＩＫＸ５ＳＮＧＧＴＸ６ＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号１３５）であり；およびｃ）Ｈ３配列は、ＧＸ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４ＤＹＸ１５Ｘ１６（配列番号１３６）であり、Ｘ１はＴ、Ａ、またはＷであり；Ｘ２はＨまたはＡであり；Ｘ３はＴまたはＩであり；Ｘ４はＮまたはＩであり；Ｘ５はＰまたはＮであり；Ｘ６はＳ、Ｉ、またはＴであり；Ｘ７はＨ、Ｄ、Ｅ、Ｐ、Ｒ、またはＷであり；Ｘ８はＹまたはＮであり；Ｘ９はＥ、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｒ、Ｖ、またはＹであり；Ｘ１０はＳ、Ｄ、Ｍ、Ｎ、またはＱであり；Ｘ１１はＹ、Ｃ、Ｅ、またはＰであり；Ｘ１２はＦ、Ｅ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、またはＶであり；Ｘ１３はＡ、Ｄ、Ｇ、Ｌ、またはＹであり；Ｘ１４はＭ、Ｅ、またはＦであり；Ｘ１５はＷ、Ａ、Ｄ、Ｈ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、またはＴであり；およびＸ１６はＧまたはＨである。Ａｘｌに結合し、例示的実施形態において、配列番号７９の抗体重鎖および配列番号８０の抗体軽鎖を含む抗体と同じＡｘｌのエピトープに結合するＡＳＴＲを有するＣＡＲを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、ＡＳＴＲは、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３配列を有する３つの相補性決定領域を有する抗体軽鎖可変領域を含むことができ、ｄ）Ｌ１配列は、ＫＡＳＱＤＸ１７Ｘ１８ＳＸ１９ＶＸ２０（配列番号１３７）であり；ｅ）Ｌ２配列は、Ｘ２１Ｘ２２Ｘ２３ＴＲＸ２４Ｔ（配列番号１３８）であり；およびｆ）Ｌ３配列は、ＱＥＸ２５Ｘ２６ＳＸ２７Ｘ２８Ｘ２９Ｘ３０（配列番号１３９）であり、Ｘ１７はＶ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、またはＷであり；Ｘ１８はＳまたはＶであり；Ｘ１９はＡ、Ｌ、またはＭであり；Ｘ２０はＡ、Ｄ、Ｎ、またはＱであり；Ｘ２１はＷまたはＦであり；Ｘ２２はＡ、Ｉ、Ｎ、Ｐ、またはＱであり；Ｘ２３はＳまたはＤであり；Ｘ２４はＨまたはＤであり；Ｘ２５はＨ、Ｃ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＹであり；Ｘ２６はＦ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｎ、またはＳであり；Ｘ２７はＴ、Ｃ、またはＰであり；Ｘ２８はＰ、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＷであり；Ｘ２９はＬ、Ｇ、またはＲであり；およびＸ３０はＴ、Ｉ、またはＲである。Ａｘｌに結合し、軽鎖可変領域を含むＡＳＴＲを有するＣＡＲを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、軽鎖可変領域は、配列番号１０８〜１１１から選択できる。Ａｘｌに結合し、重鎖可変領域を含むＡＳＴＲを有するＣＡＲを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、重鎖可変領域は、配列番号１１２〜１１４から選択できる。
【０３４７】
Ａｘｌに結合するＣＡＢ−ＣＡＲを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、重鎖は、軽鎖に対しＮ末端であり得る。これらの実施形態では、ＡＳＴＲは、配列番号１２８、配列番号１２９、または配列番号１５９のアミノ酸配列を含み得る。
【０３４８】
Ａｘｌに結合するＣＡＢ−ＣＡＲを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、軽鎖は、重鎖に対しＮ末端であり得る。これらの実施形態では、ＡＳＴＲは、配列番号１６０、または配列番号１６１のアミノ酸配列を含み得る。
【０３４９】
ＣＡＲを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、ＡＳＴＲは、Ｒｏｒ２に結合できる。Ｒｏｒ２に結合するＡＳＴＲを有するＣＡＲを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、ＡＳＴＲは、配列番号８２または配列番号８３の抗体重鎖および配列番号８４の抗体軽鎖を含む抗体同じＲｏｒ２のエピトープに結合できる、および／またはＡＳＴＲは、配列番号１５１の抗体重鎖および配列番号１５２の抗体軽鎖を含む単鎖可変抗体フラグメントと同じＲｏｒ２のエピトープに結合できる。Ｒｏｒ２に結合するＡＳＴＲを有するＣＡＲを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、ＡＳＴＲは、３つの相補性決定領域を有する重鎖可変領域を含むことができ、前記領域は、Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３配列を有し、ａ）Ｈ１配列は、ＧＹＴＸ１ＴＥＸ２ＴＸ３Ｈ（配列番号９５）またはＸ４ＧＹＳＩＴＴＧＹＹＷＮ（配列番号９６）であり；ｂ）Ｈ２配列は、ＧＸ５ＮＸ６ＮＮＧＧＴＧＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号９７）またはＹＩＴＹＤＧＳＫＮＹＮＰＳＬＫＮ（配列番号９８）であり；ｃ）Ｈ３配列は、ＧＳＬＹＳＹＧＮＳＹＦＤＹ（配列番号９９）またはＦＥＧＶＷＸ７ＧＬＤＹ（配列番号１００）であり、Ｘ１はＦまたはＥであり；Ｘ２はＹまたはＤ；Ｘ３はＭまたはＤであり；Ｘ４はＴまたはＳであり；Ｘ５はＥまたはＩであり；Ｘ６はＴまたはＤであり；およびＸ７はＹまたはＧである。Ｒｏｒ２に結合し、例示的実施形態において、配列番号１５１の抗体重鎖および配列番号１５２の抗体軽鎖を含む抗体と同じＲｏｒ２のエピトープに結合するＡＳＴＲを有するＣＡＲを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、ＡＳＴＲは、３つの相補性決定領域を有する重鎖可変領域を含むことができ、前記領域は、Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３配列を有し、ａ）Ｈ１配列は、ＧＹＴＸ１ＴＥＸ２ＴＸ３Ｈ（配列番号９５）であり；ｂ）Ｈ２配列は、ＧＸ５ＮＸ６ＮＮＧＧＴＧＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号９７）であり；およびｃ）Ｈ３配列は、ＧＳＬＹＳＹＧＮＳＹＦＤＹ（配列番号９９）であり、Ｘ１はＦまたはＥであり；Ｘ２はＹまたはＤ；Ｘ３はＭまたはＤであり；Ｘ５はＥまたはＩであり；およびＸ６はＴまたはＤである。Ｒｏｒ２に結合し、例示的実施形態において、配列番号８２または配列番号８３の抗体重鎖および配列番号８４の抗体軽鎖を含む抗体と同じＲｏｒ２のエピトープに結合するＡＳＴＲを有するＣＡＲを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、ＡＳＴＲは、３つの相補性決定領域を有する重鎖可変領域を含むことができ、前記領域は、Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３配列を有し、ａ）Ｈ１配列は、Ｘ４ＧＹＳＩＴＴＧＹＹＷＮ（配列番号９６）であり；ｂ）Ｈ２配列は、ＹＩＴＹＤＧＳＫＮＹＮＰＳＬＫＮ（配列番号９８）であり；およびｃ）Ｈ３配列は、ＦＥＧＶＷＸ７ＧＬＤＹ（配列番号１００）であり、Ｘ４はＴまたはＳであり；およびＸ７はＹまたはＧである。Ｒｏｒ２に結合するＡＳＴＲを有するＣＡＲを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、ＡＳＴＲは、３つの相補性決定領域を有する軽鎖可変領域を含むことができ、前記領域は、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３配列を有し、Ｌ１配列は、ＳＡＴＳＳＸ８ＳＹＭＨ（配列番号１０１）またはＲＡＳＥＳＶＤＲＹＧＮＳＦＩＨ（配列番号１０２）であり；ｂ）Ｌ２配列は、Ｘ９ＴＳＮＬＡＳ（配列番号１０３）またはＲＴＹＮＬＥＳ（配列番号１０４）であり；およびｃ）Ｌ３配列は、ＱＱＲＳＳＹＰＦＴ（配列番号１０５）またはＱＱＴＮＥＤＰＷＴ（配列番号１０６）であり、Ｘ８はＥまたはＶであり；およびＸ９はＧまたはＨである。Ｒｏｒ２に結合し、例示的実施形態において、配列番号１５１の抗体重鎖および配列番号１５２の抗体軽鎖を含む抗体と同じＲｏｒ２のエピトープに結合するＡＳＴＲを有するＣＡＲを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、ＡＳＴＲは、３つの相補性決定領域を有する軽鎖可変領域を含むことができ、前記領域は、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３配列を有し、ａ）Ｌ１配列は、ＳＡＴＳＳＸ８ＳＹＭＨ（配列番号１０１）であり；ｂ）Ｌ２配列は、Ｘ９ＴＳＮＬＡＳ（配列番号１０３）であり；およびｃ）Ｌ３配列は、ＱＱＲＳＳＹＰＦＴ（配列番号１０５）であり、Ｘ８はＥまたはＶであり；およびＸ９はＧまたはＨである。Ｒｏｒ２に結合し、例示的実施形態において、配列番号８２または配列番号８３の抗体重鎖および配列番号８４の抗体軽鎖を含む抗体と同じＲｏｒ２のエピトープに結合するＡＳＴＲを有するＣＡＲを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、ＡＳＴＲは、３つの相補性決定領域を有する軽鎖可変領域を含むことができ、前記領域は、配列Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３配列を有し、ａ）Ｌ１配列は、ＲＡＳＥＳＶＤＲＹＧＮＳＦＩＨ（配列番号１０２）であり；ｂ）Ｌ２配列は、ＲＴＹＮＬＥＳ（配列番号１０４）であり；およびｃ）Ｌ３配列は、ＱＱＴＮＥＤＰＷＴ（配列番号１０６）である。
【０３５０】
Ｒｏｒ２に結合するＡＳＴＲを有するＣＡＲを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、ＡＳＴＲは、３つの相補性決定領域を含む重鎖可変領域を含むことができ、前記領域は、Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３配列を有し、ａ）Ｈ１配列は、ＧＹＴＸ１ＴＥＸ２Ｘ３Ｘ４Ｈ（配列番号１４０）またはＧＹＳＩＴＴＧＸ２９ＹＷＮ（配列番号１４１）であり；ｂ）Ｈ２配列は、Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＮＮＧＧＴＧＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号１４２）またはＹＩＴＹＤＧＳＸ３０ＮＹＮＰＳＬＫＮ（配列番号１４３）であり；およびｃ）Ｈ３配列は、Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１ＳＸ１２ＹＸ１３ＹＸ１４Ｘ１５ＳＹＦＸ１６Ｘ１７Ｘ１８（配列番号１４４）またはＣＳＸ３１Ｘ３２Ｘ３３Ｘ３４ＶＸ３５Ｘ３６Ｘ３７ＬＤＸ３８（配列番号１４５）であり、Ｘ１はＦまたはＥであり；Ｘ２はＹまたはＤであり；Ｘ３はＴまたはＣであり；Ｘ４はＭ、Ｄ、Ｅ、またはＹであり；Ｘ５はＧまたはＳであり；Ｘ６はＩまたはＥであり；Ｘ７はＮ、Ｃ、Ｌ、またはＶであり；Ｘ８はＴ、ＤまたはＥであり；Ｘ９はＡ、Ｍ、またはＴであり；Ｘ１０はＲまたはＨであり；Ｘ１１はＧまたはＥであり；Ｘ１２はＬまたはＦであり；Ｘ１３はＳまたはＧであり；Ｘ１４はＧまたはＤであり；Ｘ１５はＮまたはＥであり；Ｘ１６はＤまたはＬであり；Ｘ１７はＹ、Ｃ、またはＴであり；Ｘ１８はＷまたはＬであり；Ｘ２９はＹ、Ｅ、Ｒ、またはＴであり；Ｘ３０はＫまたはＮであり；Ｘ３１はＲ、Ｇ、Ｈ、Ｗ、またはＹであり；Ｘ３２はＦ、Ｃ、Ｎ、またはＱであり；Ｘ３３はＥまたはＳであり；Ｘ３４はＧ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｍ、Ｑ、またはＳであり；Ｘ３５はＷ、Ａ、Ｉ、Ｐ、Ｑ、Ｔ、またはＶであり；Ｘ３６はＹ、Ｇ、Ｎ、またはＱであり；Ｘ３７はＧ、Ｓ、またはＴであり；およびＸ３８はＹまたはＩである。Ｒｏｒ２に結合し、例示的実施形態において、配列番号１５１の抗体重鎖および配列番号１５２の抗体軽鎖を含む抗体と同じＲｏｒ２のエピトープに結合するＡＳＴＲを有するＣＡＲを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、ＡＳＴＲは、３つの相補性決定領域を含む重鎖可変領域を含むことができ、前記領域は、Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３配列を有し、ａ）Ｈ１配列は、ＧＹＴＸ１ＴＥＸ２Ｘ３Ｘ４Ｈ（配列番号１４０）であり；ｂ）Ｈ２配列は、Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＮＮＧＧＴＧＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号１４２）であり；およびｃ）Ｈ３配列は、Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１ＳＸ１２ＹＸ１３ＹＸ１４Ｘ１５ＳＹＦＸ１６Ｘ１７Ｘ１８（配列番号１４４）であり、Ｘ１はＦまたはＥであり；Ｘ２はＹまたはＤであり；Ｘ３はＴまたはＣであり；Ｘ４はＭ、Ｄ、Ｅ、またはＹであり；Ｘ５はＧまたはＳであり；Ｘ６はＩまたはＥであり；Ｘ７はＮ、Ｃ、Ｌ、またはＶであり；Ｘ８はＴ、ＤまたはＥであり；Ｘ９はＡ、Ｍ、またはＴであり；Ｘ１０はＲまたはＨであり；Ｘ１１はＧまたはＥであり；Ｘ１２はＬまたはＦであり；Ｘ１３はＳまたはＧであり；Ｘ１４はＧまたはＤであり；Ｘ１５はＮまたはＥであり；Ｘ１６はＤまたはＬであり；Ｘ１７はＹ、Ｃ、またはＴであり；およびＸ１８はＷまたはＬである。Ｒｏｒ２に結合し、例示的実施形態において、配列番号８２または配列番号８３の抗体重鎖および配列番号８４の抗体軽鎖を含む抗体と同じＲｏｒ２のエピトープに結合するＡＳＴＲを有するＣＡＲを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、ＡＳＴＲは、３つの相補性決定領域を含む重鎖可変領域を含むことができ、前記領域は、Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３配列を有し、ａ）Ｈ１配列は、ＧＹＳＩＴＴＧＸ２９ＹＷＮ（配列番号１４１）であり；ｂ）Ｈ２配列は、ＹＩＴＹＤＧＳＸ３０ＮＹＮＰＳＬＫＮ（配列番号１４３）であり；およびｃ）Ｈ３配列は、ＣＳＸ３１Ｘ３２Ｘ３３Ｘ３４ＶＸ３５Ｘ３６Ｘ３７ＬＤＸ３８（配列番号１４５）であり、Ｘ２９はＹ、Ｅ、Ｒ、またはＴであり；Ｘ３０はＫまたはＮであり；Ｘ３１はＲ、Ｇ、Ｈ、Ｗ、またはＹであり；Ｘ３２はＦ、Ｃ、Ｎ、またはＱであり；Ｘ３３はＥまたはＳであり；Ｘ３４はＧ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｍ、Ｑ、またはＳであり；Ｘ３５はＷ、Ａ、Ｉ、Ｐ、Ｑ、Ｔ、またはＶであり；Ｘ３６はＹ、Ｇ、Ｎ、またはＱであり；Ｘ３７はＧ、Ｓ、またはＴであり；およびＸ３８はＹまたはＩである。
【０３５１】
Ｒｏｒ２に結合するＡＳＴＲを有するＣＡＲを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、ＡＳＴＲは、３つの相補性決定領域を含む軽鎖可変領域を含むことができ、前記領域は、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３配列を有し、ａ）Ｌ１配列は、ＳＡＴＳＳＸ１９Ｘ２０Ｘ２１ＭＸ２２（配列番号１４６）またはＲＡＳＥＳＶＤＲＹＧＮＳＸ３９ＩＨ（配列番号１４７）であり；ｂ）Ｌ２配列は、Ｘ２３ＴＳＮＬＡＳ（配列番号１４８）またはＸ４０ＴＹＸ４１ＬＥＳ（配列番号１４９）であり；およびｃ）Ｌ３配列は、ＱＸ２４Ｘ２５ＳＸ２６ＹＰＦＸ２７Ｘ２８（配列番号１５０）またはＱＱＸ４２ＮＸ４３ＤＰＸ４４ＴＸ４５（配列番号８５）であり、Ｘ１９はＶまたはＥであり；Ｘ２０はＳまたはＤであり；Ｘ２１はＹ、Ｃ、またはＤであり；Ｘ２２はＨ、Ｇ、またはＬであり；Ｘ２３はＧ、Ｃ、Ｈ、またはＰであり；Ｘ２４はＱまたはＥであり；Ｘ２５はＲまたはＨであり；Ｘ２６はＳ、Ｄ、Ｇ、Ｉ、Ｑ、またはＶであり；Ｘ２７はＴまたはＤであり；Ｘ２８はＦ、Ｄ、またはＥであり；Ｘ３９はＦ、Ｓ、またはＴであり；Ｘ４０はＲ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、またはＷであり；Ｘ４１はＮまたはＤであり；Ｘ４２はＴ、Ｉ、またはＰであり；Ｘ４３はＥまたはＶであり；Ｘ４４はＷまたはＴであり；およびＸ４５はＦまたはＴである。Ｒｏｒ２に結合し、例示的実施形態において、配列番号１５１の抗体重鎖および配列番号１５２の抗体軽鎖を含む抗体と同じＲｏｒ２のエピトープに結合するＡＳＴＲを有するＣＡＲを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、ＡＳＴＲは、３つの相補性決定領域を含む軽鎖可変領域を含むことができ、前記領域は、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３配列を有し、ａ）Ｌ１配列は、ＳＡＴＳＳＸ１９Ｘ２０Ｘ２１ＭＸ２２（配列番号１４６）であり；ｂ）Ｌ２配列は、Ｘ２３ＴＳＮＬＡＳ（配列番号１４８）であり；およびｃ）Ｌ３配列は、ＱＸ２４Ｘ２５ＳＸ２６ＹＰＦＸ２７Ｘ２８（配列番号１５０）であり、Ｘ１９はＶまたはＥであり；Ｘ２０はＳまたはＤであり；Ｘ２１はＹ、Ｃ、またはＤであり；Ｘ２２はＨ、Ｇ、またはＬであり；Ｘ２３はＧ、Ｃ、Ｈ、またはＰであり；Ｘ２４はＱまたはＥであり；Ｘ２５はＲまたはＨであり；Ｘ２６はＳ、Ｄ、Ｇ、Ｉ、Ｑ、またはＶであり；Ｘ２７はＴまたはＤであり；およびＸ２８はＦ、Ｄ、またはＥである。Ｒｏｒ２に結合し、例示的実施形態において、配列番号８２または配列番号８３の抗体重鎖および配列番号８４の抗体軽鎖を含む抗体と同じＲｏｒ２のエピトープに結合するＡＳＴＲを有するＣＡＲを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、ＡＳＴＲは、３つの相補性決定領域を含む軽鎖可変領域を含むことができ、前記領域は、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３配列を有し、ａ）Ｌ１配列は、ＲＡＳＥＳＶＤＲＹＧＮＳＸ３９ＩＨ（配列番号１４７）であり；ｂ）Ｌ２配列は、Ｘ４０ＴＹＸ４１ＬＥＳ（配列番号１４９）であり；およびｃ）Ｌ３配列は、ＱＱＸ４２ＮＸ４３ＤＰＸ４４ＴＸ４５（配列番号８５）であり、Ｘ３９はＦ、Ｓ、またはＴであり；Ｘ４０はＲ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、またはＷであり；Ｘ４１はＮまたはＤであり；Ｘ４２はＴ、Ｉ、またはＰであり；Ｘ４３はＥまたはＶであり；Ｘ４４はＷまたはＴであり；およびＸ４５はＦまたはＴである。
【０３５２】
Ｒｏｒ２に結合するＡＳＴＲを有するＣＡＲを含み、例示的実施形態において、ＡＳＴＲが、配列番号８２または配列番号８３の抗体重鎖および配列番号８４の抗体軽鎖を含む抗体と同じＲｏｒ２のエピトープに結合する本明細書の実施形態のいずれかでは、重鎖可変領域は、配列番号８２、配列番号８３、配列番号１２０または配列番号１２１のアミノ酸配列を含むことができる。
【０３５３】
Ｒｏｒ２に結合するＡＳＴＲを有するＣＡＲを含み、例示的実施形態において、ＡＳＴＲが、配列番号８２または配列番号８３の抗体重鎖および配列番号８４の抗体軽鎖を含む抗体と同じＲｏｒ２のエピトープに結合する本明細書の実施形態のいずれかでは、重鎖可変領域は、配列番号８２または配列番号８３のアミノ酸配列を含むことができる。ＡＳＴＲが、配列番号８２または配列番号８３の抗体重鎖および配列番号８４の抗体軽鎖を含む抗体と同じＲｏｒ２のエピトープに結合し、軽鎖可変領域が、配列番号８６のアミノ酸配列を含む、請求項２９３１に記載のキメラ抗原受容体。
【０３５４】
Ｒｏｒ２に結合するＡＳＴＲを有するＣＡＲを含み、例示的実施形態において、ＡＳＴＲが、配列番号８２または配列番号８３の抗体重鎖および配列番号８４の抗体軽鎖を含む抗体と同じＲｏｒ２のエピトープに結合する本明細書の実施形態のいずれかでは、軽鎖可変領域は、配列番号８４のアミノ酸配列を含むことができる。
【０３５５】
Ｒｏｒ２に結合するＡＳＴＲを有するＣＡＲを含み、例示的実施形態において、ＡＳＴＲが、配列番号８２または配列番号８３の抗体重鎖および配列番号８４の抗体軽鎖を含む抗体と同じＲｏｒ２のエピトープに結合する本明細書の実施形態のいずれかでは、重鎖可変領域は、配列番号８２、配列番号８３、配列番号１２０または配列番号１２１のアミノ酸配列を含むことができる。
【０３５６】
Ｒｏｒ２に結合するＡＳＴＲを有するＣＡＲを含み、例示的実施形態において、ＡＳＴＲが、配列番号８２または配列番号８３の抗体重鎖および配列番号８４の抗体軽鎖を含む抗体と同じＲｏｒ２のエピトープに結合する本明細書の実施形態のいずれかでは、重鎖可変領域は、配列番号８２または配列番号８３のアミノ酸配列を含むことができる。
【０３５７】
Ｒｏｒ２に結合するＡＳＴＲを有するＣＡＲを含み、例示的実施形態において、ＡＳＴＲが配列番号８２または配列番号８３の抗体重鎖および配列番号８４の抗体軽鎖を含む抗体と同じＲｏｒ２のエピトープに結合する本明細書の実施形態のいずれかでは、ＡＳＴＲは、配列番号１３０、配列番号１３１、または配列番号１３２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５７、または配列番号１５８のアミノ酸配列を含むことができる。
【０３５８】
Ｒｏｒ２に結合するＡＳＴＲを有するＣＡＲを含み、例示的実施形態において、ＡＳＴＲが、配列番号１５１の抗体重鎖および配列番号１５２の抗体軽鎖を含む抗体と同じＲｏｒ２のエピトープに結合する本明細書の実施形態のいずれかでは、軽鎖可変領域は、配列番号８１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、または配列番号１５２のアミノ酸配列を含むことができる。
【０３５９】
Ｒｏｒ２に結合するＡＳＴＲを有するＣＡＲを含み、例示的実施形態において、ＡＳＴＲが、配列番号１５１の抗体重鎖および配列番号１５２の抗体軽鎖を含む抗体と同じＲｏｒ２のエピトープに結合する本明細書の実施形態のいずれかでは、軽鎖可変領域は、配列番号１５２のアミノ酸配列を含むことができる。
【０３６０】
Ｒｏｒ２に結合するＡＳＴＲを有するＣＡＲを含み、例示的実施形態において、ＡＳＴＲが、配列番号１５１の抗体重鎖および配列番号１５２の抗体軽鎖を含む抗体と同じＲｏｒ２のエピトープに結合する本明細書の実施形態のいずれかでは、重鎖可変領域は、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、または配列番号１５１のアミノ酸配列を含むことができる。
【０３６１】
Ｒｏｒ２に結合するＡＳＴＲを有するＣＡＲを含み、例示的実施形態において、ＡＳＴＲが、配列番号１５１の抗体重鎖および配列番号１５２の抗体軽鎖を含む抗体と同じＲｏｒ２のエピトープに結合する本明細書の実施形態のいずれかでは、重鎖可変領域は、配列番号１５１のアミノ酸配列を含むことができる。
【０３６２】
Ｒｏｒ２に結合するＡＳＴＲを有するＣＡＲを含み、例示的実施形態において、ＡＳＴＲが、配列番号１５１の抗体重鎖および配列番号１５２の抗体軽鎖を含む抗体と同じＲｏｒ２のエピトープに結合する本明細書の実施形態のいずれかでは、ＡＳＴＲは、配列番号１５５または配列番号１５６のアミノ酸配列を含むことができる。
【０３６３】
ＣＡＲを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、膜貫通ドメインは、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列番号４６の配列に対する配列同一性、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のＣＤ８膜貫通ドメイン、例えば、配列番号４７または７５に対する配列同一性、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のＣＤ４膜貫通ドメイン、例えば、配列番号４８に対する配列同一性、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のＣＤ３ゼータ膜貫通ドメイン、例えば、配列番号４９に対する配列同一性、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のＣＤ２８膜貫通ドメイン、例えば、配列番号５０または７６に対する配列同一性、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のＯＸ４０膜貫通ドメイン、例えば、配列番号５１に対する配列同一性、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のＣＤ１３４膜貫通ドメインに対する配列同一性、または少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のＣＤ７膜貫通ドメイン、例えば、配列番号５２に対する配列同一性を有し得、ＡＳＴＲがＣＡＲの一部である場合、条件的活性型ＡＳＴＲは、対応する生理的条件に比べて、腫瘍微小環境および／またはインビトロ腫瘍代替アッセイ条件中で、Ｒｏｒ２またはＡｘｌに対する増大した結合を保持できる。ＣＡＲを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、膜貫通ドメインは、ＣＤ８膜貫通ドメインまたはＣＤ２８膜貫通ドメインであり得る。ＣＡＲを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、膜貫通ドメインは、ＡＳＴＲと細胞内活性化ドメインとの間に位置し得る。ＣＡＲを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、細胞内活性化ドメインは、活性化作用を保持でき、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のＣＤ３Ｚ活性化ドメイン、例えば、配列番号１１〜１６に対する配列同一性、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のＣＤ３Ｄ活性化ドメイン、例えば、配列番号１７〜１９に対する配列同一性、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のＣＤ３Ｅ活性化ドメイン例えば、配列番号２０〜２１に対する配列同一性、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のＣＤ３Ｇ活性化ドメイン、例えば、配列番号２２〜２３に対する配列同一性、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のＣＤ２８活性化ドメイン、例えば、配列番号３５に対する配列同一性、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のＣＤ７９Ａ活性化ドメイン、例えば、配列番号２４〜２６に対する配列同一性、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のＤＡＰ１０活性化ドメイン、例えば、配列番号３４に対する配列同一性、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のＤＡＰ１２活性化ドメイン、例えば、配列番号２７〜３１に対する配列同一性、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のＦＣＥＲ１Ｇ活性化ドメイン、例えば、配列番号３２〜３３に対する配列同一性、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のＣＤ１３７活性化ドメインに対する配列同一性、または少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のＺＡＰ７０活性化ドメイン、例えば、配列番号３６に対する配列同一性を有し得る。
【０３６４】
ＣＡＲを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、ＣＡＲは、ストークドメインをさらに含み得る。ＣＡＲを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、ＣＡＲは、共刺激ドメインをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ストークドメインおよび共刺激ドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、アミノ末端からカルボキシ末端へ、ＡＳＴＲ、ストークドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、および細胞内活性化を含み得る。
【０３６５】
ストークドメインを有するＣＡＲを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、ストークドメインは、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の任意の当該技術分野において既知のＣＤ８ストークドメイン、例えば、配列番号１２５に対する配列同一性、または少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の当該技術分野において既知のＣＤ２８ストークドメイン、例えば、配列番号１２６に対する配列同一性を有し得、ＡＳＴＲがＣＡＲの一部である場合、条件的活性型抗原特異的標的化領域は、対応する生理的条件に比べて、腫瘍微小環境および／またはインビトロ腫瘍代替アッセイ条件中で、Ｒｏｒ２またはＡｘｌに対する増大した結合を保持できる。
【０３６６】
ＣＡＲを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、ＣＡＲは、共刺激ドメインをさらに含み得る。共刺激ドメインを有するＣＡＲを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、細胞内共刺激ドメインは、ＤＡＰ１０／ＣＤ２８型シグナル伝達鎖または免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）含有細胞内シグナル伝達ポリペプチドを含み得る。共刺激ドメインを有するＣＡＲを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、ＣＡＲは、細胞内活性化ドメインとは異なるアミノ酸配列を有する共刺激ドメインを含み得る。共刺激ドメインを有するＣＡＲを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、共刺激ドメインは、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のＣＤ１３７共刺激ドメイン、例えば、配列番号１に対する配列同一性、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のＣＤ２８共刺激ドメイン、例えば、配列番号２に対する配列同一性、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のＩＣΔ共刺激ドメイン、例えば、配列番号３に対する配列同一性、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のＩＣＯＳ共刺激ドメイン、例えば、配列番号４に対する配列同一性、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のＯＸ４０共刺激ドメイン、例えば、配列番号５に対する配列同一性、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のＢＴＬＡ共刺激ドメイン、例えば、配列番号７に対する配列同一性、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のＣＤ２７共刺激ドメイン、例えば、配列番号６に対する配列同一性、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のＣＤ３０共刺激ドメイン、例えば、配列番号８に対する配列同一性、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のＧＩＴＲ共刺激ドメイン、例えば、配列番号９に対する配列同一性、または少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のＨＶＥＭ、例えば、配列番号１０に対する配列同一性を有し得る。共刺激ドメインを有するＣＡＲを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、共刺激ドメインは、ＣＤ２８共刺激ドメインまたはＣＤ１３７共刺激ドメインであり得る。共刺激ドメインを有するＣＡＲを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、共刺激ドメインは、ＩＣΔ共刺激ドメインであり得る。共刺激ドメインを有するＣＡＲを含む本明細書の実施形態のいずれかでは��共刺激ドメインは、ＩＣΔ共刺激ドメインであり、細胞内活性化ドメインは、ＣＤ３Ｚ活性化ドメインであり得る。ストークドメインおよび共刺激ドメインを有するＣＡＲを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、ストークドメインは、ＣＤ８ストークドメインまたはＣＤ２８ストークドメインであり、膜貫通ドメインは、ＣＤ８膜貫通ドメインまたはＣＤ２８膜貫通ドメインであり、細胞内活性化ドメインは、ＣＤ３Ｚ活性化ドメインであり、共刺激ドメインは、ＣＤ１３７共刺激ドメイン、ＩＣΔ共刺激ドメイン、またはＣＤ２８共刺激ドメインであり得、または  共刺激ドメインは、ＣＤ１３７共刺激ドメインおよびＩＣΔ共刺激ドメインの両方を含み得る。
【０３６７】
ＣＡＲを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、ＣＡＲは、認識ドメインをさらに含み得る。認識ドメインを有するＣＡＲを含む実施形態のいずれかでは、認識ドメインは、ＣＡＲと同じポリペプチド上に発現できる。ＣＡＲと同じポリペプチド上に認識ドメインを有するＣＡＲを含む実施形態のいずれかでは、認識ドメインは、Ｎ−末端から１０、２０、３０、４０、または５０アミノ酸以内などのＮ−末端またはその近傍に存在し得る。ＣＡＲと同じポリペプチド上に認識ドメインを有するＣＡＲを含む実施形態のいずれかでは、認識ドメインは、Ｃ−末端から１０、２０、３０、４０、または５０アミノ酸以内などのＣ−末端またはその近傍に存在し得る。ＣＡＲと同じポリペプチド上に認識ドメインを有するＣＡＲを含む実施形態のいずれかでは、認識ドメインは、ストークドメインと膜貫通ドメインとの間などのＣＡＲのいずれかのドメインの間に存在し得る。認識ドメインを有するＣＡＲを含む実施形態のいずれかでは、認識ドメインは、ＣＡＲに共有結合し、認識ドメインが切断シグナル配列またはリボソームスキップ配列によりＣＡＲから分離され得るように発現され得る。リボソームスキップ配列を含む認識ドメインを有するＣＡＲを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、リボソームスキップ配列は、２Ａ−１、例えば、配列番号７７であり得る。認識ドメインを有するＣＡＲを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、認識ドメインは、ＥＧＦＲの少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０の連続アミノ酸であり得る。認識ドメインを有するＣＡＲを含む実施形態のいずれかでは、認識ドメインは、ＦＬＡＧエピトープ（配列番号３８）であり得る。
【０３６８】
ＣＡＲを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、ＣＡＲは、シグナル配列をさらに含み得る。シグナル配列を有するＣＡＲを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、シグナル配列は、エピトープタグ、親和性ドメイン、および／または検出可能なシグナルを生成するポリペプチドであり得る。シグナル配列を有するＣＡＲを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、シグナル配列は、アミノ末端に存在し得る。
【０３６９】
ＣＡＲをコードする核酸を含む発現ベクターを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、発現ベクターは、認識ドメインをコードするヌクレオチドをさらに含み得る。ＣＡＲをコードする核酸および認識ドメインをコードするヌクレオチドを含む発現ベクターを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、認識ドメインをコードするヌクレオチドは、ＥＧＦＲの少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０の連続アミノ酸をコードする。ＣＡＲをコードする核酸および認識ドメインをコードするヌクレオチドを含む発現ベクターを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、認識ドメインをコードするヌクレオチドは、配列内リボソーム進入部位により、ＣＡＲをコードするヌクレオチドから分離されている。ＣＡＲをコードする核酸および認識ドメインをコードするヌクレオチドを含む発現ベクターを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、認識ドメインは、ＣＡＲをさらに含む単一ポリペプチドの一部として発現され得、単一ポリペプチド上の認識ドメインは、切断シグナルまたは２Ａ−１配列、例えば、配列番号７７であり得るリボソームスキップ配列によりＣＡＲから分離され得る。発現ベクターを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、発現ベクターは、ウイルスベクターであり得る。ウイルスベクターである発現ベクターを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、ウイルスベクターは、複製不能組換えレトロウイルス粒子、複製不能組換えレンチウイルス粒子、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＳＶ４０、単純ヘルペスウイルス、γレトロウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、レンチウイルス、またはアデノウイルスであり得る。
【０３７０】
ＣＡＲを発現する哺乳動物細胞を含む本明細書の実施形態のいずれかでは、細胞は、リンパ球であり得る。ＣＡＲを発現するリンパ球を含む本明細書の実施形態のいずれかでは、リンパ球は、Ｔ細胞であり得る。ＣＡＲを発現するＴ細胞を含む本明細書の実施形態のいずれかでは、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞であり得るか、またはＴ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞であり得る。ＣＡＲを発現するリンパ球を含む本明細書の実施形態のいずれかでは、リンパ球は、腫瘍微小環境中で抗原発現細胞を選択的に死滅させる細胞傷害性細胞であり得、リンパ球は、実施形態１またはＡ１〜Ａ８に記載のいずれかのＣＡＲをコードする核酸を含み得る。
【０３７１】
複製不能組換えレトロウイルス粒子およびそれを使用するための説明書を含む容器を含むキットを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、説明書は、十分な量のｐＨ調節薬剤を微小環境に導入することにより標的哺乳動物細胞を接触させて、それにより、標的哺乳動物細胞とＴ細胞および／またはＮＫ細胞の結合に影響を与えた後に、微小環境のｐＨを高めることをさらに含み得る。複製不能組換えレトロウイルス粒子およびそれを使用するための説明書を含む容器を含むキットを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、キットは、ｐＨ調節薬剤をさらに含み得る。複製不能組換えレトロウイルス粒子およびそれを使用するための説明書を含む容器を含むキットを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、説明書は、接触させる前に、ＣＡＲを発現できるＴ細胞および／またはＮＫ細胞を対象に導入するステップを含み得、導入後、ＣＡＲをコードする１つまたは複数の核酸配列を含むＴ細胞および／またはＮＫ細胞がＣＡＲを発現し、対象中の同族抗原を発現している標的哺乳動物細胞に結合する。
【０３７２】
癌の治療を含む本明細書の実施形態のいずれかでは、癌は、腎細胞癌であり得る。癌の治療を含む本明細書の実施形態のいずれかでは、癌は、軟部肉腫または中皮腫であり得る。癌の治療を含み、認識ドメインを有するＣＡＲを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、方法は、遺伝子改変細胞傷害性細胞を対象に投与後、一定用量の認識ドメインに対する抗体を投与することをさらに含み得る。癌の治療を含む本明細書の実施形態のいずれかでは、癌は、Ａｘｌを発現し得、ＣＡＲはＡｘｌに結合するＡＳＴＲを含み得る。癌の治療を含む本明細書の実施形態のいずれかでは、癌は、Ｒｏｒ２を発現し得、ＣＡＲはＲｏｒ２に結合するＡＳＴＲを含み得る。癌の治療を含む本明細書の実施形態のいずれかでは、細胞傷害性細胞は、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞であり得る。癌の治療を含む本明細書の実施形態のいずれかでは、細胞傷害性細胞は、Ｔ細胞であり得る。Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の増殖を含む本明細書の実施形態のいずれかでは、増殖後に、遺伝子改変Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を回収することをさらに含み得る。Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の回収を含む本明細書の実施形態のいずれかでは、方法は、回収した遺伝子改変Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を冷凍保存することをさらに含み得る。Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の冷凍保存を含む本明細書の実施形態のいずれかでは、凍結保存された遺伝子改変Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞は解凍され得る。Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の回収を含む本明細書の実施形態のいずれかでは、方法は、回収した遺伝子改変Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を対象に導入することをさらに含み得る。
【０３７３】
ｐＨ７．４に比べて、ｐＨ６．７でＡｘｌに対する結合が増大した例示的条件的活性型ＣＡＲ（ＣＡＢ−ＣＡＲ）は、本明細書の実施例１で見つけられる。例示的実施形態では、ＣＡＲまたはＡＳＴＲは、配列番号７９の抗体重鎖および配列番号８０の抗体軽鎖を含む単鎖可変抗体フラグメントと同じＡｘｌのエピトープに結合できる。このような例示的実施形態のさらなる実施形態では、抗Ａｘｌ  ＣＡＲまたはＡＳＴＲは、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含むか、または単鎖可変フラグメントである。さらなる例示的実施形態では、抗ＡＸｌ  ｓｃＦｖは、軽鎖に対しＮ末端である重鎖または重鎖に対しＮ末端である軽鎖を含む。ＣＡＲを含み、例示的実施形態において、配列番号７９の抗体重鎖および配列番号８０の抗体軽鎖を含む抗体と同じＡｘｌのエピトープに結合する本明細書の実施形態のいずれかでは、ＡＳＴＲは、配列番号１２８、１２９、１５９、１６０、または１６１のいずれかを含み得る。さらに、本明細書の実施形態のいずれかの抗ＡＸｌ  ＣＡＲは、本明細書で提供されるＣＡＲ成分のいずれかを含み得る。特定の例示的実施形態では、抗ＡＸｌ  ＣＡＲは、表１で記載のＣＡＲ成分を含むことができ、表１のＣＡＲのいずれかであり得る。抗ＡＸｌ  ＣＡＲを含む本明細書の任意の実施形態に関し、より典型的には、ＣＡＲはＣＡＢ−ＣＡＲであり、非限定的例示的実施形態では、ＣＡＲは、例えば、細胞傷害活性を示す表１で提供されるＣＡＢ−ＣＡＲ成分のいずれかおよびＣＡＢ−ＣＡＲのいずれかを含むことができる。例えば、抗ＡＸｌ  ＣＡＢ−ＣＡＲは、ＣＤ８シグナルペプチド、ＣＤ８またはＣＤ２８ストークドメイン／膜貫通ドメイン、ＣＤ１３７、ＩＣΔ共刺激ドメインおよびＣＤ１３７共刺激ドメイン、および／またはＣＤ３Ｚ活性化ドメインを含むことができる。さらに、抗ＡＸｌ  ＣＡＲおよび特に抗ＡＸｌ  ＣＡＢ−ＣＡＲを含む本明細書の実施形態のいずれかの例示的ＣＡＲは、非限定的例示的実施形態では、表１の条件的細胞傷害活性を示す抗ＡＸｌ  ＣＡＢ−ＣＡＲのいずれかを含む。このような例示的ＣＡＢ−ＣＡＲは、表１のＦ１−２−１、Ｆ１−２−２、Ｆ１−２−３、Ｆ１−２−６、Ｆ１−２−８、Ｆ１−２−１０、Ｆ１−２−１３、Ｆ１−２−１４、Ｆ１−２−１５、Ｆ１−２−２２、またはＦ１−２−２３を含む。ＡＳＴＲを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、ＡＳＴＲは、Ｆ１−２−１、Ｆ１−２−２、Ｆ１−２−３、Ｆ１−２−６、Ｆ１−２−８、Ｆ１−２−１０、Ｆ１−２−１３、Ｆ１−２−１４、Ｆ１−２−１５Ｆ１−２−２２、またはＦ１−２−２３のＡＳＴＲを含むことができる。さらに、抗ＡＸｌ  ＣＡＲおよび特に抗ＡＸｌ  ＣＡＢ−ＣＡＲを含む本明細書の実施形態のいずれかの例示的ＣＡＲは、非限定的例示的実施形態では、表１の高い条件的細胞傷害活性を示す抗ＡＸｌ  ＣＡＢ−ＣＡＲのいずれかを含む。このような例示的ＣＡＢ−ＣＡＲは、Ｆ１−２−１３、Ｆ１−２−１５、Ｆ１−２−２２、またはＦ１−２−２３を含む。したがって、ＡＳＴＲを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、ＡＳＴＲは、Ｆ１−２−１、Ｆ１−２−２、Ｆ１−２−３、Ｆ１−２−６、Ｆ１−２−８、Ｆ１−２−１０、Ｆ１−２−１３、Ｆ１���２−１４、Ｆ１−２−１５、Ｆ１−２−２２、またはＦ１−２−２３のＡＳＴＲを含むことができる。
【０３７４】
ｐＨ７．４に比べて、ｐＨ６．７でＲｏｒ２に対する結合が増大した例示的条件的活性型ＣＡＲ（ＣＡＢ−ＣＡＲ）は、本明細書の実施例１で見つけられる。例示的実施形態では、ＣＡＲまたはＡＳＴＲは、配列番号８２または配列番号８３の抗体重鎖および配列番号８４の抗体軽鎖を含む単鎖可変抗体フラグメントと同じＲｏｒ２のエピトープに結合できるか、またはＣＡＲまたはＡＳＴＲは、配列番号１５１の抗体重鎖および配列番号１５２の抗体軽鎖を含む単鎖可変抗体フラグメントと同じＲｏｒ２のエピトープに結合できる。このような例示的実施形態のさらなる実施形態では、抗Ｒｏｒ２  ＣＡＲまたはＡＳＴＲは、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含むかｓｃＦｖであり、さらなる例示的実施例では、重鎖に対しＮ末端である軽鎖または軽鎖に対しＮ末端である重鎖を含む。ＣＡＲまたはＡＳＴＲを含み、例示的実施形態において、配列番号８２または配列番号８３の抗体重鎖および配列番号８４の抗体軽鎖を含む単鎖可変抗体フラグメントと同じＲｏｒ２のエピトープに結合するか、または配列番号１５１の抗体重鎖および配列番号１５２の抗体軽鎖を含む単鎖可変抗体フラグメントと同じＲｏｒ２のエピトープに結合する本明細書の実施形態のいずれかでは、ＡＳＴＲは、配列番号１３０〜１３２、または１５３〜１５８のいずれかを含むことができる。さらに、本明細書の実施形態のいずれかの抗Ｒｏｒ２  ＣＡＲは、本明細書で提供されるＣＡＲ成分のいずれかを含み得る。特定の例示的実施形態では、抗Ｒｏｒ２  ＣＡＲは、表２で記載のＣＡＲ成分を含むことができ、表２のＣＡＲのいずれかであり得る。抗Ｒｏｒ２  ＣＡＲを含む本明細書の任意の実施形態に関し、より典型的には、ＣＡＲはＣＡＢ−ＣＡＲであり、非限定的例示的実施形態では、ＣＡＲは、例えば、細胞傷害活性を示す表２で提供されるＣＡＢ−ＣＡＲ成分のいずれかおよびＣＡＢ−ＣＡＲのいずれかを含むことができる。例えば、抗Ｒｏｒ２  ＣＡＢ−ＣＡＲは、ＣＤ８シグナルペプチド、ＣＤ８またはＣＤ２８ストークドメイン／膜貫通ドメイン、ＣＤ１３７共刺激ドメイン、および／またはＣＤ３Ｚ活性化ドメインを含むことができる。さらに、抗Ｒｏｒ２  ＣＡＲおよび特に抗Ｒｏｒ２  ＣＡＢ−ＣＡＲを含む本明細書の実施形態のいずれかの例示的ＣＡＲは、非限定的例示的実施形態では、表２の条件的細胞傷害活性を示す抗Ｒｏｒ２  ＣＡＢ−ＣＡＲのいずれかを含む。このような例示的ＣＡＢ−ＣＡＲには、Ｆ１−１−９、Ｆ１−１−１０、Ｆ１−１−１１、Ｆ１−１−１２、Ｆ１−１−１５、Ｆ１−１−１７、Ｆ１−１−１８、Ｆ１−１−１９、Ｆ１−１−２０、Ｆ１−１−２１、Ｆ１−１−２３、Ｆ１−１−２５、またはＦ１−１−２６が含まれる。抗Ｒｏｒ２  ＡＳＴＲを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、ＡＳＴＲは、表２の、Ｆ１−１−９、Ｆ１−１−１０、Ｆ１−１−１１、Ｆ１−１−１２、Ｆ１−１−１５、Ｆ１−１−１７、Ｆ１−１−１８、Ｆ１−１−１９、Ｆ１−１−２０、Ｆ１−１−２１、Ｆ１−１−２３、Ｆ１−１−２５、またはＦ１−１−２６のＡＳＴＲを含むことができる。さらに、抗Ｒｏｒ２  ＣＡＲおよび特に抗Ｒｏｒ２  ＣＡＢ−ＣＡＲを含む本明細書の実施形態のいずれかの例示��ＣＡＲは、非限定的例示的実施形態では、表２の高い条件的細胞傷害活性を示す抗Ｒｏｒ２  ＣＡＢ−ＣＡＲのいずれかを含む。このような例示的ＣＡＢ−ＣＡＲには、Ｆ１−１−１１、Ｆ１−１−１２、Ｆ１−１−１５、Ｆ１−１−１７、Ｆ１−１−１９、Ｆ１−１−２０、またはＦ１−１−２３が含まれる。したがって、抗Ｒｏｒ２  ＡＳＴＲを含む本明細書の実施形態のいずれかでは、ＡＳＴＲは、Ｆ１−１−１１、Ｆ１−１−１２、Ｆ１−１−１５、Ｆ１−１−１７、Ｆ１−１−１９、Ｆ１−１−２０、Ｆ１−１−２３のＡＳＴＲを含むことができる。
【０３７５】
別の態様では、本明細書で提供されるのは、条件的活性型生物学的キメラ抗原受容体（ＣＡＢ−ＣＡＲ）発現Ｔ細胞またはＮＫ細胞の、対象中のＣＡＢ−ＣＡＲの同族抗原を発現している細胞に対する結合を調節する方法であり、次記を含む：
ａ．ＣＡＢ−ＣＡＲをコードする核酸を含むＴ細胞および／またはＮＫ細胞を対象に導入し、導入後、ＣＡＢ−ＣＡＲをコードする核酸を含むＴ細胞および／またはＮＫ細胞がＣＡＢ−ＣＡＲを発現して、対象の同族抗原を発現している細胞に結合し、同族抗原がＡｘｌポリペプチドもしくはそのエピトープまたはＲｏｒ２ポリペプチドもしくはそのエピトープであること；および
ｂ．対象に、血液ｐＨおよび／または組織のｐＨおよび／または微小環境のｐＨを高めるのに十分な量の薬剤を投与し、投与が導入の前、その間、またはその後に実施され、血液、組織、および／または微小環境の高められたｐＨがＣＡＢ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の、血液、組織、または微小環境中の同族抗原を発現している細胞に対する結合を高められたｐＨで調節すること。
【０３７６】
別の態様では、本明細書で提供されるのは、対象のオンターゲット・オフ腫瘍毒性を軽減する方法であり、次記を含む：
ａ．条件的活性型生物学的キメラ抗原受容体（ＣＡＢ−ＣＡＲ）をコードする核酸を対象のＴ細胞またはＮＫ細胞中に導入し、ＣＡＢ−ＣＡＲをコードする核酸を含むＴ細胞および／またはＮＫ細胞を生成すること；
ｂ．ＣＡＢ−ＣＡＲをコードする核酸を含むＴ細胞および／またはＮＫ細胞を対象に導入し、導入後、ＣＡＢ−ＣＡＲをコードする核酸を含むＴ細胞および／またはＮＫ細胞がＣＡＢ−ＣＡＲを発現して、対象の同族抗原を発現している細胞に結合し、同族抗原がＡｘｌポリペプチドもしくはそのエピトープまたはＲｏｒ２ポリペプチドもしくはそのエピトープであること；および
ｃ．対象に、血液のｐＨおよび／または組織のｐＨおよび／または微小環境のｐＨを高めるのに十分な量の薬剤を投与し、血液、組織、および／または微小環境中のＣＡＢ−ＣＡＲのその同族抗原に対する結合を、高められたｐＨにより調節し、それにより、対象のオンターゲット・オフ腫瘍毒性を軽減するステップ。
【０３７７】
いくつかの実施形態では、核酸は、ベクターであり得る。例示的実施形態では、ベクターは、レトロウイルスベクターである。
【０３７８】
別の態様では、本明細書で提供されるのは、標的哺乳動物細胞に対するＴ細胞および／またはＮＫ細胞の結合を制御する方法であり、次記を含む：
ａ．微小環境中で標的哺乳動物細胞をＴ細胞および／またはＮＫ細胞と接触させることであって、標的哺乳動物細胞が同族抗原を発現し、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞が、ｐＨ７．４に比べて、ｐＨ６．７で差次的に同族抗原に結合する条件的活性型生物学的キメラ抗原受容体（ＣＡＢ−ＣＡＲ）を発現し、同族抗原がＡｘｌポリペプチドもしくはそのエピトープまたはＲｏｒ２ポリペプチドもしくはそのエピトープであること；および
ｂ．十分な量の薬剤を微小環境に導入することにより微小環境のｐＨを高め、それにより、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の標的哺乳動物細胞に対する結合を制御すること。
【０３７９】
別の態様では、本明細書で提供されるのは、条件的活性型生物学的キメラ抗原受容体（ＣＡＢ−ＣＡＲ）を発現しているＴ細胞および／またはＮＫ細胞の、対象中の標的哺乳動物細胞に対する結合をインビボで制御する方法であり、該方法は、対象中の微小環境のｐＨを高める効果的投与計画により、対象にｐＨ調節薬剤を投与することを含み、対象はＣＡＢ−ＣＡＲを発現しているＴ細胞および／またはＮＫ細胞を含み、ＣＡＢ−ＣＡＲは、ｐＨ７．４に比べて、ｐＨ６．７でその同族抗原に差次的に結合し、同族抗原がＡｘｌポリペプチドもしくはそのエピトープまたはＲｏｒ２ポリペプチドもしくはそのエピトープであり、微小環境が標的哺乳動物細胞を含み、標的哺乳動物細胞がその表面上に同族抗原を発現し、および微小環境のｐＨが高められる前と後で、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞が標的哺乳動物細胞に差次的に結合し、それにより、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の、対象中の標的哺乳動物細胞に対する結合をインビボで制御する。
【０３８０】
薬剤およびＣＡＢ−ＣＡＲを含む直ぐ上で提供される態様のいずれかでは、ＣＡＢ−ＣＡＲは、別のｐＨと１ｐＨの違いでその同族抗原に対する結合を低下させたかもしれない。最も広い態様において、ＣＡＢ−ＣＡＲの特異的結合のための例示的ｐＨ値がまだ与えられていない例示的実施形態では、および一方で、このような態様に対するこれらの値の代わりにその他の実施形態に関して、ＣＡＢ−ＣＡＲが、より低いｐＨに比べて、より高いｐＨで結合を低下させたかもしれない。例えば、ＣＡＢ−ＣＡＲは、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、または７．０未満のｐＨの場合より、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、または７．５超のｐＨで、その同族抗原に対する結合を、低下させたかもしれない。他の実施形態では、ＣＡＢ−ＣＡＲは、より低いｐＨの場合より、より高いｐＨで結合を低下させたかもしれない。例えば、ＣＡＢ−ＣＡＲは、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、または７．５超のｐＨの場合より、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、または７．０未満のｐＨで、その同族抗原に対する結合を、低下させたかもしれない。いくつかの例示的実施形態では、ＣＡＢ−ＣＡＲは、７．４〜７．６のｐＨに比べて、６．５〜６．７のｐＨで増大した結合を示す。他の例示的実施形態では、ＣＡＢ−ＣＡＲは、７．４のｐＨに比べて、６．７のｐＨで増大した結合を示す。他の実施形態では、ＣＡＢ−ＣＡＲは、血液のｐＨに比べて、腫瘍のｐＨ中で増大した結合を示す。いくつかの実施形態では、ＣＡＢ−ＣＡＲは、抗原特異的標的化領域標的化領域、ストーク、および細胞内活性化ドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＢ−ＣＡＲはまた、共刺激ドメインも含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＢ−ＣＡＲは、腫瘍関連抗原に結合し得る。
【０３８１】
薬剤およびＣＡＢ−ＣＡＲを含む直ぐ上で提供された態様のいずれかでは、微小環境のｐＨは、７．０未満から７．０超に高めることができる。例えば、ｐＨは、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、または７．０未満のｐＨから、７．０、７．１、７．２、７．３、または７．４超のｐＨに高めることができる。いくつかの実施形態では、ＣＡＢ−ＣＡＲは、増大したｐＨで同族抗原に結合できるが、薬剤の導入前には、微小環境のｐＨでは結合できない。特定の実施形態では、ｐＨは、７．０未満から７．１〜８．０のｐＨまで、または７．１〜７．８のｐＨまで、または７．２〜７．８のｐＨまで、または７．２〜７．６のｐＨまで、または７．３〜７．６のｐＨまで、７．４〜７．８のｐＨまで、または７．４〜７．６のｐＨまで、高めることができる。このようなｐＨの増大は、投与される薬剤の種類と投与量に応じて、１、２、４、６、８、１２、または２４時間未満で、または１、２、４、６、８、１２、または２４時間超で起こり得る。特定の実施形態では、薬剤は、腫瘍などの標的組織中で、および例えば、標的組織（例えば、腫瘍）微小環境の少なくとも表面中で、標的組織（例えば、腫瘍）微小環境の少なくとも一部で、および例示的実施形態では、標的組織（例えば、腫瘍）微小環境全体を通して、ｐＨが、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、または７．５超に；または範囲の下端値の７．０、７．１、７．２、７．３と、範囲の上端値の７．４、７．５、７．６、７．７、または７．８との間に留まるように、投与される。
【０３８２】
薬剤およびＣＡＢ−ＣＡＲを含む直ぐ上で提供された態様のいずれかでは、微小環境は、腫瘍、組織、非腫瘍組織、正常組織、または一時的なｐＨシフトを受けた組織などのインビボ微小環境であり得る。例えば、通例、一時的なｐＨシフトを受ける組織には、嫌気性条件における筋組織または運動している筋組織または炎症性組織または炎症を生じている組織が含まれる。標的哺乳動物細胞を含むいくつかの実施形態では、標的哺乳動物細胞は、腫瘍細胞または非腫瘍細胞または正常細胞であり得る。
【０３８３】
薬剤およびＣＡＢ−ＣＡＲを含む直ぐ上で提供された態様のいずれかでは、薬剤には、重炭酸ナトリウム、トリスヒドロキシルメチルアミノメタン、重炭酸ナトリウムと炭酸ナトリウムの等モル高張性溶液、またはエスオメプラゾール、エスオメプラゾールおよびナプロキセン、ランソプラゾール、オメプラゾール、およびラベプラゾールなどのプロトンポンプ阻害剤が含まれ得る。
【０３８４】
ＣＡＢ−ＣＡＲおよび薬剤を含む方法で、複製不能組換えレトロウイルス粒子を含む直ぐ上で提供されたいずれかの実施形態では、ＣＡＢ−ＣＡＲをコードするＴ細胞および／またはＮＫ細胞中で活性なプロモーターに機能的に連結された転写単位を含むポリヌクレオチドは、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞がＣＡＢ−ＣＡＲを発現できるように、これらの細胞により取り込まれる。例示的実施形態では、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞は、ポリヌクレオチドをそれらのゲノム中に統合する。
【０３８５】
ＣＡＢ−ＣＡＲおよび薬剤を含む方法で、複製不能組換えレトロウイルス粒子を含む直ぐ上で提供されたいずれかの実施形態では、複製不能組換えレトロウイルス粒子は、その表面上にモノクローナル抗体承認生物製剤の認識ドメインを含み得る。例えば、認識ドメインは、ＥＧＦＲ、またはそのエピトープを認識する抗体により認識されるポリペプチドを含み得る。
【０３８６】
別の態様では、本明細書で提供されるのは、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の、対象中の標的哺乳動物細胞へのインビボ結合を制御する方法で使用されるｐＨ調節薬剤であり、該方法は、対象中の微小環境のｐＨを高める効果的投与計画により、対象にｐＨ調節薬剤を投与することを含み、対象は、Ｔ細胞および／または前記細胞を含み、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞は、ｐＨ７．４に比べて、ｐＨ６．７でその同族抗原に差次的に結合する条件的活性型生物学的キメラ抗原受容体（ＣＡＢ−ＣＡＲ）を発現し、同族抗原がＡｘｌポリペプチドもしくはそのエピトープまたはＲｏｒ２ポリペプチドもしくはそのエピトープであり、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞がＣＡＢ−ＣＡＲを発現し、微小環境が標的哺乳動物細胞を含み、標的哺乳動物細胞がその表面上に同族抗原を発現し、およびｐＨ調節薬剤を投与することにより微小環境のｐＨが高められる前と後で、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞が標的哺乳動物細胞に差次的に結合し、それにより、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の、対象中の標的哺乳動物細胞に対する結合をインビボで制御する。
【０３８７】
別の態様では、本明細書で提供されるのは、腫瘍増殖を治療するために、条件的活性型生物学的キメラ抗原受容体（ＣＡＢ−ＣＡＲ）発現Ｔ細胞またはＮＫ細胞の、対象中のＣＡＢ−ＣＡＲの同族抗原を発現している細胞に対する結合を調節する方法で使用する薬剤であり、該方法は次記を含む：
ａ．ＣＡＢ−ＣＡＲを発現できるＴ細胞および／またはＮＫ細胞を対象に導入することであって、同族抗原がＡｘｌポリペプチドもしくはそのエピトープまたはＲｏｒ２ポリペプチドもしくはそのエピトープであり、ＣＡＢ−ＣＡＲが対象中で同族抗原を発現している細胞に結合し、導入後、ＣＡＢ−ＣＡＲをコードする核酸を含むＴ細胞および／またはＮＫ細胞がＣＡＢ−ＣＡＲを発現して、対象の同族抗原を発現している細胞に結合すること；および
ｂ．薬剤を、血液ｐＨおよび／または組織のｐＨおよび／または微小環境のｐＨを高めるのに十分な量で対象に投与し、ＣＡＢ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の、高められたｐＨを有する血液、組織、または微小環境中の同族抗原を発現している細胞に対する結合を調節すること。
【０３８８】
別の態様では、本明細書で提供されるのは、対象のオンターゲット・オフ腫瘍毒性を軽減する方法での使用のための薬剤であり、該方法は、次記を含む：
ａ．条件的活性型生物学的キメラ抗原受容体（ＣＡＢ−ＣＡＲ）をコードする核酸を対象のＴ細胞またはＮＫ細胞中に導入し、ＣＡＢ−ＣＡＲを発現できるＴ細胞および／またはＮＫ細胞を生成すること；
ｂ．ＣＡＢ−ＣＡＲを発現できるＴ細胞および／またはＮＫ細胞を対象に導入し、導入後、ＣＡＢ−ＣＡＲをコードする核酸を含むＴ細胞および／またはＮＫ細胞がＣＡＢ−ＣＡＲを発現して、対象の同族抗原を発現している細胞に結合すること；および
ｃ．対象に、血液のｐＨおよび／または組織のｐＨおよび／または微小環境のｐＨを高めるのに十分な量で薬剤を投与し、血液、組織、および／または微小環境中のその同族抗原に対する結合を高められたｐＨにより調節し、それにより、対象のオンターゲット・オフ腫瘍毒性を軽減すること。
【０３８９】
別の態様では、本明細書で提供されるのは、腫瘍増殖を治療するために、条件的活性型生物学的キメラ抗原受容体（ＣＡＢ−ＣＡＲ）を発現しているＴ細胞またはＮＫ細胞の、標的哺乳動物細胞に対する結合を制御する方法で使用するための薬剤であり、該方法は次記を含む：
ａ．微小環境中で標的哺乳動物細胞をＣＡＢ−ＣＡＲを発現しているＴ細胞および／またはＮＫ細胞と接触させることであって、標的哺乳動物細胞が同族抗原を発現し、同族抗原がＡｘｌポリペプチドもしくはそのエピトープまたはＲｏｒ２ポリペプチドもしくはそのエピトープであり、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞が、ｐＨ７．４に比べて、ｐＨ６．７で差次的に同族抗原に結合するＣＡＢ−ＣＡＲを発現すること；および
ｂ．十分な量の薬剤を微小環境に導入することにより微小環境のｐＨを高め、それにより、ＣＡＢ−ＣＡＲを発現しているＴ細胞および／またはＮＫ細胞の標的哺乳動物細胞に対する結合を制御すること。
【０３９０】
別の態様では、本明細書で提供されるのは、腫瘍増殖を治療するための、条件的活性型生物学的キメラ抗原受容体（ＣＡＢ−ＣＡＲ）を発現しているＴ細胞および／またはＮＫ細胞の、対象中の標的哺乳動物細胞に対する結合をインビボで制御する方法における使用のための薬剤であり、薬剤は、ｐＨ調節薬剤であり、該方法は、対象中の微小環境のｐＨを高める効果的投与計画により、対象にｐＨ調節薬剤を投与することを含み、対象はＣＡＢ−ＣＡＲを発現しているＴ細胞および／またはＮＫ細胞を含み、ＣＡＢ−ＣＡＲは、ｐＨ７．４に比べて、ｐＨ６．７でその同族抗原に差次的に結合し、同族抗原がＡｘｌポリペプチドもしくはそのエピトープまたはＲｏｒ２ポリペプチドもしくはそのエピトープであり、微小環境が標的哺乳動物細胞を含み、標的哺乳動物細胞がその表面上に同族抗原を発現し、および微小環境のｐＨが高められる前と後で、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞が標的哺乳動物細胞に差次的に結合する。
【０３９１】
別の態様では、本明細書で提供されるのは、腫瘍増殖を治療するための、条件的活性型生物学的キメラ抗原受容体（ＣＡＢ−ＣＡＲ）を発現しているＴ細胞および／またはＮＫ細胞の、対象中の標的哺乳動物細胞に対する結合をインビボで制御する方法における使用のためのｐＨ調節薬剤であり、該方法は、対象中の微小環境のｐＨを高める効果的投与計画により、対象にｐＨ調節薬剤を投与することを含み、対象はＣＡＢ−ＣＡＲを発現しているＴ細胞および／またはＮＫ細胞を含み、ＣＡＢ−ＣＡＲは、ｐＨ７．４に比べて、ｐＨ６．７でその同族抗原に差次的に結合し、同族抗原がＡｘｌポリペプチドもしくはそのエピトープまたはＲｏｒ２ポリペプチドもしくはそのエピトープであり、微小環境が標的哺乳動物細胞を含み、標的哺乳動物細胞がその表面上に同族抗原を発現し、およびｐＨ調節薬剤を投与することにより微小環境のｐＨが高められる前と後で、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞が標的哺乳動物細胞に差次的に結合する。
【０３９２】
別の態様では、本明細書で提供されるのは、条件的活性型生物学的キメラ抗原受容体（ＣＡＢ−ＣＡＲ）を発現しているＴ細胞および／またはＮＫ細胞の、対象中の標的哺乳動物細胞に対する結合をインビボで制御するための薬物の製造での使用のためのｐＨ調節薬剤の使用であり、ｐＨ調節薬剤は、対象中の微小環境のｐＨを高める効果的投与計画により、対象に投与されるものであり、対象はＣＡＢ−ＣＡＲを発現しているＴ細胞および／またはＮＫ細胞を含み、ＣＡＢ−ＣＡＲは、ｐＨ７．４に比べて、ｐＨ６．７でその同族抗原に差次的に結合し、同族抗原がＡｘｌポリペプチドもしくはそのエピトープまたはＲｏｒ２ポリペプチドもしくはそのエピトープであり、微小環境が標的哺乳動物細胞を含み、標的哺乳動物細胞がその表面上に同族抗原を発現し、およびｐＨ調節薬剤を投与することにより微小環境のｐＨが高められる前と後で、Ｔ細胞が標的哺乳動物細胞に差次的に結合する。
【０３９３】
ｐＨ調節薬剤もしくは方法で使用する薬剤およびＣＡＢ−ＣＡＲを含む、またはｐＨ調節薬剤の使用およびＣＡＢ−ＣＡＲを含む直ぐ上で提供された態様のいずれかでは、ＣＡＢ−ＣＡＲは、別のｐＨと１ｐＨの違いでその同族抗原に対する結合を低下させたかもしれない。最も広い態様において、ＣＡＢ−ＣＡＲの特異的結合のための例示的ｐＨ値がまだ与えられていない例示的実施形態では、および一方で、このような態様に対するこれらの値の代わりにその他の実施形態に関して、ＣＡＢ−ＣＡＲが、より低いｐＨに比べて、より高いｐＨで結合を低下させたかもしれない。例えば、ＣＡＢ−ＣＡＲは、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、または７．０未満のｐＨの場合より、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、または７．５超のｐＨで、その同族抗原に対する結合を、低下させたかもしれない。他の実施形態では、ＣＡＢ−ＣＡＲは、より低いｐＨの場合より、より高いｐＨで結合を低下させたかもしれない。例えば、ＣＡＢ−ＣＡＲは、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、または７．５超のｐＨの場合より、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、または７．０未満のｐＨで、その同族抗原に対する結合を、低下させたかもしれない。いくつかの例示的実施形態では、ＣＡＢ−ＣＡＲは、７．４〜７．６のｐＨに比べて、６．５〜６．７のｐＨで増大した結合を示す。他の例示的実施形態では、ＣＡＢ−ＣＡＲは、７．４のｐＨに比べて、６．７のｐＨで増大した結合を示す。他の実施形態では、ＣＡＢ−ＣＡＲは、血液のｐＨに比べて、腫瘍のｐＨ中で増大した結合を示す。いくつかの実施形態では、ＣＡＢ−ＣＡＲは、抗原特異的標的化領域標的化領域、ストーク、および細胞内活性化ドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＢ−ＣＡＲはまた、共刺激ドメインも含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＢ−ＣＡＲは、腫瘍関連抗原に結合し得る。
【０３９４】
ｐＨ調節薬剤もしくは方法で使用するための薬剤およびＣＡＢ−ＣＡＲを含む、またはｐＨ調節薬剤の使用およびＣＡＢ−ＣＡＲを含む直ぐ上で提供された態様のいずれかでは、微小環境のｐＨは、７．０未満から７．０超に高めることができる。例えば、ｐＨは、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、または７．０未満のｐＨから、７．０、７．１、７．２、７．３、または７．４超のｐＨに高めることができる。いくつかの実施形態では、ＣＡＢ−ＣＡＲは、増大したｐＨで同族抗原に結合できるが、薬剤の導入前には、微小環境のｐＨでは結合できない。特定の実施形態では、ｐＨは、７．０未満から７．１〜８．０のｐＨまで、または７．１〜７．８のｐＨまで、または７．２〜７．８のｐＨまで、または７．２〜７．６のｐＨまで、または７．３〜７．６のｐＨまで、７．４〜７．８のｐＨまで、または７．４〜７．６のｐＨまで、高めることができる。このようなｐＨの増大は、投与される薬剤の種類と投与量に応じて、１、２、４、６、８、１２、または２４時間未満で、または１、２、４、６、８、１２、または２４時間超で起こり得る。特定の実施形態では、薬剤は、腫瘍などの標的組織中で、および例えば、標的組織（例えば、腫瘍）微小環境の少なくとも表面中で、標的組織（例えば、腫瘍）微小環境の少なくとも一部で、および例示的実施形態では、標的組織（例えば、腫瘍）微小環境全体を通して、ｐＨが、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、または７．５超に；または範囲の下端値の７．０、７．１、７．２、７．３と、範囲の上端値の７．４、７．５、７．６、７．７、または７．８との間に留まるように、投与される。
【０３９５】
ｐＨ調節薬剤もしくは方法での使用のための薬剤およびＣＡＢ−ＣＡＲを含む、またはｐＨ調節薬剤の使用およびＣＡＢ−ＣＡＲを含む直ぐ上で提供された態様のいずれかでは、同族抗原は、ＡｘｌポリペプチドもしくはそのエピトープまたはＲｏｒ２ポリペプチドもしくはそのエピトープであり；微小環境は、インビボ微小環境、例えば、腫瘍、組織、非腫瘍組織、正常組織、または一時的なｐＨシフトを受けた組織などであり得る。例えば、通例、一時的なｐＨシフトを受ける組織には、嫌気性条件における筋組織または運動している筋組織または炎症性組織または炎症を生じている組織が含まれる。標的哺乳動物細胞を含むいくつかの実施形態では、標的哺乳動物細胞は、腫瘍細胞または非腫瘍細胞または正常細胞であり得る。
【０３９６】
ｐＨ調節薬剤もしくは方法で使用するための薬剤およびＣＡＢ−ＣＡＲを含む、またはｐＨ調節薬剤の使用およびＣＡＢ−ＣＡＲを含む直ぐ上で提供された態様のいずれかでは、同族抗原は、ＡｘｌポリペプチドもしくはそのエピトープまたはＲｏｒ２ポリペプチドもしくはそのエピトープであり、薬剤には、重炭酸ナトリウム、トリスヒドロキシルメチルアミノメタン、重炭酸ナトリウムと炭酸ナトリウムの等モル高張性溶液、またはエスオメプラゾール、エスオメプラゾールおよびナプロキセン、ランソプラゾール、オメプラゾール、およびラベプラゾールなどのプロトンポンプ阻害剤が含まれ得る。
【０３９７】
ｐＨ調節薬剤もしくは方法で使用するための薬剤およびＣＡＢ−ＣＡＲを含む、またはｐＨ調節薬剤の使用およびＣＡＢ−ＣＡＲを含む直ぐ上で提供された態様のいずれかでは、同族抗原は、ＡｘｌポリペプチドもしくはそのエピトープまたはＲｏｒ２ポリペプチドもしくはそのエピトープであり、薬剤は、癌、腫瘍、腫瘍増殖、または細胞増殖性障害の治療のための使用であり得る。
【０３９８】
別の態様では、本明細書で提供されるのは、複製不能組換えレトロウイルス粒子を含む容器、および腫瘍増殖を治療するためのその使用の説明書を含むキットであり、説明書が、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の標的哺乳動物細胞に対する結合を制御する方法を教示し、方法は次記を含む：
ａ．Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を、ｐＨ７．４に比べて、ｐＨ６．７で差次的に同族抗原に結合する条件的活性型生物学的キメラ抗原受容体（ＣＡＢ−ＣＡＲ）をそのゲノム中に含む複製不能組換えレトロウイルス粒子で形質導入し、ＣＡＢ−ＣＡＲを発現できるＴ細胞および／またはＮＫ細胞を生成し、同族抗原がＡｘｌポリペプチドもしくはそのエピトープまたはＲｏｒ２ポリペプチドもしくはそのエピトープであること；
ｂ．ＣＡＢ−ＣＡＲを発現できるＴ細胞および／またはＮＫ細胞を対象に導入し、導入後、ＣＡＢ−ＣＡＲをコードする核酸を含むＴ細胞および／またはＮＫ細胞がＣＡＢ−ＣＡＲを発現して、対象の同族抗原を発現している細胞に結合すること；
ｃ．微小環境中で標的哺乳動物細胞をＣＡＢ−ＣＡＲを発現しているＴ細胞および／またはＮＫ細胞と接触させることであって、標的哺乳動物細胞がＣＡＢ−ＣＡＲの同族抗原を発現し、およびＴ細胞および／またはＮＫ細胞が、ＣＡＢ−ＣＡＲを発現すること；および
ｄ．十分な量のｐＨ調節薬剤を微小環境に導入することにより微小環境のｐＨを高め、それにより、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の標的哺乳動物細胞に対する結合に影響を与えること。
いくつかの実施形態では、キットは、ｐＨ調節薬剤をさらに含み得る。
【０３９９】
キットのいくつかの実施形態では、ＣＡＢ−ＣＡＲは、ＡｘｌポリペプチドもしくはそのエピトープまたはＲｏｒ２ポリペプチドもしくはそのエピトープに対し、別のｐＨと１ｐＨの違いで結合を低下させたかもしれない。最も広い態様において、ＣＡＢ−ＣＡＲの特異的結合のための例示的ｐＨ値がまだ与えられていない例示的実施形態では、および一方で、このような態様に対するこれらの値の代わりにその他の実施形態に関して、ＣＡＢ−ＣＡＲが、より低いｐＨに比べて、より高いｐＨで結合を低下させたかもしれない。例えば、ＣＡＢ−ＣＡＲは、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、または７．０未満のｐＨの場合より、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、または７．５超のｐＨで、その同族抗原に対する結合を、低下させたかもしれない。他の実施形態では、ＣＡＢ−ＣＡＲは、より低いｐＨの場合より、より高いｐＨで結合を低下させたかもしれない。例えば、ＣＡＢ−ＣＡＲは、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、または７．５超のｐＨの場合より、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、または７．０未満のｐＨで、その同族抗原に対する結合を、低下させたかもしれない。いくつかの例示的実施形態では、ＣＡＢ−ＣＡＲは、７．４〜７．６のｐＨに比べて、６．５〜６．７のｐＨで増大した結合を示す。他の例示的実施形態では、ＣＡＢ−ＣＡＲは、７．４のｐＨに比べて、６．７のｐＨで増大した結合を示す。他の実施形態では、ＣＡＢ−ＣＡＲは、血液のｐＨに比べて、腫瘍のｐＨ中で増大した結合を示す。いくつかの実施形態では、ＣＡＢ−ＣＡＲは、抗原特異的標的化領域標的化領域、ストーク、および細胞内活性化ドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＢ−ＣＡＲはまた、共刺激ドメインも含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＢ−ＣＡＲは、腫瘍関連抗原に結合し得る。
【０４００】
キットのいくつかの実施形態では、微小環境のｐＨは、７．０未満から７．０超に高めることができる。例えば、ｐＨは、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、または７．０未満のｐＨから、７．０、７．１、７．２、７．３、または７．４超のｐＨに高めることができる。いくつかの実施形態では、ＣＡＢ−ＣＡＲは、増大したｐＨで同族抗原に結合できるが、薬剤の導入前には、微小環境のｐＨでは結合できない。特定の実施形態では、ｐＨは、７．０未満から７．１〜８．０のｐＨまで、または７．１〜７．８のｐＨまで、または７．２〜７．８のｐＨまで、または７．２〜７．６のｐＨまで、または７．３〜７．６のｐＨまで、７．４〜７．８のｐＨまで、または７．４〜７．６のｐＨまで、高めることができる。このようなｐＨの増大は、投与される薬剤の種類と投与量に応じて、１、２、４、６、８、１２、または２４時間未満で、または１、２、４、６、８、１２、または２４時間超で起こり得る。特定の実施形態では、薬剤は、腫瘍などの標的組織中で、および例えば、標的組織（例えば、腫瘍）微小環境の少なくとも表面中で、標的組織（例えば、腫瘍）微小環境の少なくとも一部で、および例示的実施形態では、標的組織（例えば、腫瘍）微小環境全体を通して、ｐＨが、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、または７．５超に；または範囲の下端値の７．０、７．１、７．２、７．３と、範囲の上端値の７．４、７．５、７．６、７．７、または７．８との間に留まるように、投与される。いくつかの実施形態では、微小環境は、腫瘍、組織、非腫瘍組織、正常組織、または一時的なｐＨシフトを受けた組織などのインビボ微小環境であり得る。例えば、通例、一時的なｐＨシフトを受ける組織には、嫌気性条件における筋組織または運動している筋組織または炎症性組織または炎症を生じている組織が含まれる。標的哺乳動物細胞を含むいくつかの実施形態では、標的哺乳動物細胞は、腫瘍細胞または非腫瘍細胞または正常細胞であり得る。
【０４０１】
キットのいくつかの実施形態では、薬剤は、重炭酸ナトリウム、トリスヒドロキシルメチルアミノメタン、重炭酸ナトリウムと炭酸ナトリウムの等モル高張性溶液、またはエスオメプラゾール、エスオメプラゾールおよびナプロキセン、ランソプラゾール、オメプラゾール、およびラベプラゾールなどのプロトンポンプ阻害剤が含まれ得る。
【０４０２】
上記で開示したように、ＣＡＢ−ＣＡＲが結合する同族抗原は、ＡｘｌポリペプチドもしくはそのエピトープまたはＲｏｒ２ポリペプチドもしくはそのエピトープであり得る。いくつかの実施形態では、同族抗原は、ＡｘｌポリペプチドもしくはそのエピトープまたはＲｏｒ２ポリペプチドもしくはそのエピトープの一続きの少なくとも１０、１５、２０個の、または全てのアミノ酸に対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドであり得る。本明細書で開示のように、ＡｘｌポリペプチドもしくはそのエピトープまたはＲｏｒ２ポリペプチドもしくはそのエピトープに結合できるＣＡＢ−ＣＡＲは通常、７．４のｐＨの場合より、６．７のｐＨで、より高い結合親和性でその同族抗原に結合する。
【０４０３】
当業者なら、明細書が「Ａｘｌ  ＣＡＢ」または「Ａｘｌ  ＣＡＢ−ＣＡＲ」に言及する場合、「Ａｘｌ」は、Ａｘｌまたはそのエピトープを認識するＡＳＴＲを意味することを理解するであろう。同様に、当業者なら、明細書が「Ｒｏｒ２  ＣＡＢ」または「Ｒｏｒ２  ＣＡＢ−ＣＡＲ」に言及する場合、「Ｒｏｒ２」は、Ｒｏｒ２またはそのエピトープを認識するＡＳＴＲを意味することを理解するであろう。
【０４０４】
本明細書で使用されるセクション見出しはいずれも、単に構成上の意図であり、記載主題を限定するものと解釈されるべきではない。
【０４０５】
実施例
以下の実施例は、当業者に、本発明をどのように作製および使用するかについての完全な開示および説明を提供するために提示されており、発明者らが考えている特許の範囲を限定するものでも、以下の実験が、実施した全ての実験または唯一の実験であることを示すものでもない。使用される数字（例えば、量、温度など）に関して正確さを確保すべく努めているが、いくらかの実験的な誤差および偏差が考慮されるべきである。特に指示がない限り、部は重量部、分子量は重量平均分子量、温度は℃、圧力は大気圧またはそれに近い圧力である。例えば、次記のような標準的略語が使用され得る。ｂｐ：塩基対；ｋｂ：キロベース；ｐｌ：ピコリットル；ｓまたはｓｅｃ：秒；ｍｉｎ：分；ｈまたはｈｒ：時間；ａａ：アミノ酸；ｋｂ：キロベース；ｂｐ：塩基対；ｎｔ：ヌクレオチド；ｉ．ｍ．：筋肉内の（筋肉内に）；ｉ．ｐ．：腹腔内の（腹腔内に）；ｓ．ｃ．：皮下の（皮下に）；ｉ．ｖ．：静脈内の（静脈内に）；など。
【０４０６】
実施例１：ＡｘｌおよびＲｏｒ２を標的とするキメラ抗原受容体の生成と分析
本実施例は、本発明の特定の実施形態の条件的活性型ＣＡＲの作製および使用方法を示す。ＡｘｌおよびＲｏｒ２を標的とする条件的活性型ＡＳＴＲをコードする核酸を得て、条件的活性型ＣＡＲをコードするレンチウイルス発現ベクターの生成に使用した。Ｔ細胞をこれらの発現ベクターを含むレンチウイルスで形質導入し、形質導入細胞を、標的細胞に対する種々のインビトロ腫瘍代替アッセイで試験した。
【０４０７】
条件的活性型ＣＡＲを発現するレンチウイルス発現ベクターの生成
Ａｘｌを標的とする条件的活性型ＡＳＴＲ（配列番号７９および８０を含むｓｃＦｖ構築物）をコードする１つの核酸およびＲｏｒ２を標的とする条件的活性型ＡＳＴＲ（配列番号８３および８４を含むｓｃＦｖ構築物、配列番号８２および８４を含むｓｃＦｖ構築物、ならびに配列番号１５１および１５２を含むｓｃＦｖ構築物）をコードする３つの核酸を得た。本明細書の詳細説明は、得られたＣＡＢを作製するために使用された抗体フラグメントを進化させて、選択することにより、ＣＡＢを作製する方法を含む、条件的活性型ＡＳＴＲ（条件的活性型生物学的（ＣＡＢ）と呼ばれることもある）を作製する方法を提供する。ヒト細胞中での発現のためのコドン最適化ならびにスプライスドナー部位およびアクセプター部位の除去を含む配列に対する僅かな改変を実施した。単鎖抗体の重鎖（配列番号７９、８３、および８２）および単鎖抗体の軽鎖（配列番号８０および８４）を種々の長さのリンカー（配列番号５３、５４、および５５）により連結し、表１および２に記載の候補ＣＡＲを作製するための他のドメインと共に、レンチウイルス発現ベクター中に組み込んだ。
【０４０８】
レンチウイルスの生成
２９３Ｔ細胞（Ｌｅｎｔｉ−Ｘ  ２９３Ｔ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のレンチウイルス発現ベクターを用いた一時的遺伝子導入により、レンチウイルスを生成した。ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３発現培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中での系列増殖により細胞を浮遊培養に適合させた。浮遊細胞を弱酸に溶解したＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて遺伝子導入した。細胞（３０ｍＬ）を１２５ｍＬの三角フラスコ中で、１ｘ１０６細胞に増殖させた。
【０４０９】
プラスミドＤＮＡを、３０ｍＬの細胞に対し、１．５ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地で希釈した。全ＤＮＡ（１μｇ／ｍＬの培養液量）を次のモル比の４種のプラスミドの混合物とした：２ｘゲノムプラスミド、１ｘＲｅｖ含有プラスミド、１ｘＶＳＶｇ含有プラスミド、および１ｘＧａｇｐｏｌ含有プラスミド。別に、ＰＥＩを１．５ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ中で２μｇ／ｍＬ（培養液量、ＤＮＡに対し２：１の比率）に希釈した。５分間の室温でのインキュベーション後、２種の溶液を一緒によく混合し、室温でさらに２０分間インキュベートした。最後の量（３ｍｌ）を細胞に加えた。その後、１２０ｒｐｍで回転を加えながら、５〜８％のＣＯ２下、細胞を３７℃で７２時間インキュベートした。
【０４１０】
７２時間後、１，０００ｇで１０分間遠心分離することにより、上清を回収した。上清を新しいチューブにデカントし、上清の量の１／４のＰＥＧ（ＰＥＧ−ＩＴ、Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中の溶液を加えた。４℃で一晩のインキュベーションに続けて、４℃、１，５００ｇで２０分の間の遠心分離により、ウイルスを沈殿させた。上清を取り出し、ウイルスを１：１００体積のＥｘ−Ｖｉｖｏ１５培地で再懸濁した。ＨＴ１０８０細胞上のＧＦＰにより、またはジャーカット細胞上のｅＴａｇ発現により、ウイルスの力価を測定した。
【０４１１】
ＡｘｌおよびＲｏｒ２に対するＴ細胞形質導入／増殖
Ｔ細胞形質導入および増殖のための初期の方法では、汎Ｔ細胞を全細胞（Ａｌｌｃｅｌｌｓ、ＰＢ００９−１Ｆ）から得た。抗ＡＸｌ  ＣＡＢ−ＣＡＲおよび抗Ｒｏｒ２  ＣＡＢ−ＣＡＲ複製不能組換えレンチウイルス粒子を上記で考察のようにして作製した。レンチウイルス形質導入の２日前に、細胞を解凍し、Ｘ−ＶＩＶＯ１５（Ｌｏｎｚａ  ＃０４−４１８Ｑ）、５％ヒトＡＢ血清（Ｖａｌｌｅｙ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｃ．，＃ＨＰ１０２２）、および１０ｍＭのＮ−アセチルＬ−システイン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ＃Ａ９１６５）からなるヒトＴ細胞培地中で培養した。組換えヒトＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ  ２０２−ＩＬ−０１０）を加えて、１００ＩＵ／ｍＬの最終濃度にした。ウイルス形質導入の２４時間前に、一次ヒトＴ細胞を１２ウェルプレート中に、０．５ｘ１０６細胞／ウエルで播種し、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｔ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｔｈｅｒｍｏ  ＃１１１３１Ｄ）を用いて、１：３の細胞：ビーズ比で活性化した。形質導入の日に、レンチウイルス粒子溶液を、Ａｘｌに対しＭＯＩ  ５およびＲｏｒ２に対しＭＯＩ  ２０でウエルに添加した。形質導入Ｔ細胞をヒトＴ細胞培地中で約１０６／ｍＬで３日間維持し、その後、３０ｍＬ／ウエルのＩＬ−２含有ヒトＴ細胞培地を含む６−ｗｅｌｌ−Ｇ−Ｒｅｘに移した。細胞を少なくとも１０日間培養した後、実験を行い、ＩＬ−２を１日おきに加えた。
【０４１２】
特定の後続実験を、僅かに変更した形質導入および増殖条件で実施した。該当する場合には、ＡｌｌＣｅｌｌ由来の汎Ｔ細胞の代わりに、Ｔ細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＲＥＭＩＵＭ（登録商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、製造業者の説明書に従って密度勾配遠心分離に続く、赤血球の溶解によりバフィーコート（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋ）から濃縮した。ヒト腎臓細胞株Ｃａｋｉ−１およびＨＥＫ２９３の条件的ＣＡＲ依存性死滅を調査するために、増殖前に、ＥａｓｙＳｅｐ  Ｈｕｍａｎ  ＣＤ５６  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ＳｅｌｅｃｔｉｏｎキットＩＩ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＃１７８５５）を用いて、ＣＤ５６＋細胞を形質導入汎Ｔ細胞（ＡｌｌＣｅｌｌｓ）から枯渇させた。
【０４１３】
ｅＴａｇ発現のＦＡＣＳ分析
形質導入一次Ｔ細胞（０．５ｘ１０６）を形質導入の８日後に収集し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ＋０．１％アジ化ナトリウム）中に再懸濁させた。細胞を０．９μｇ／ｍｌのビオチン化セツキシマブ（Ｐｒｏｍａｂ）含有１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液を用いて、氷上で３０分間染色した。染色した細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、ストレプトアビジンＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、１２−４３１７−８７、０．２ｍｇ／ｍｌ）、ＣＤ３−ＢＶ４２１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３１７３４４）、ＣＤ４−ＰＥ−Ｄａｚｚｌｅ  ５９４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３００５４８）、およびＣＤ８−ＢＶ５７０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３０１０３８）を用いて氷上で３０分間染色した。細胞をＦＡＣＳ緩衝液中で洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液とＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ（ＢＤ  ＃５５４６５５）の１：１混合物中で固定し、Ｎｏｖｏｃｙｔｅ（ＡＣＥＡ）で処理し、得られたデータをＮｏｖｏＥｘｐｒｅｓｓソフトウェア（ＡＣＥＡ）で分析した。
【０４１４】
リアルタイム細胞死滅アッセイ
形質導入Ｔ細胞の細胞傷害活性をｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＣＥＡ）により測定した。手短に説明すると、形質導入一次Ｔ細胞（エフェクター細胞）を上記のように生成し、冷凍保存し、解凍して、１００ＩＵ／ＭＬのＩＬ−２含有ヒトＴ細胞培地中で２日間再試験した。標的細胞には、ＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ）および安定に遺伝子導入されヒトＡｘｌ（ＣＨＯ−Ａｘｌ）またはＲＯＲ２（ＣＨＯ−ＲＯＲ２）を発現しているＣＨＯ細胞または、他の実験では、ＦＡＣＳ試験でそれぞれＡｘｌおよびＲＯＲ２陽性であった、ヒト腎細胞癌株Ｃａｋｉ−１（ソース）およびＨＥＫ２９３（Ｌｅｎｔｉ−Ｘ  ２９３Ｔ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を含めた。実験前に、４０ｍＭのＨＥＰＥＳおよびＰＩＰＥＳ含有ヒトＴ細胞培地を用いて、ｐＨ６．７および７．４で、またはｐＨ６．３〜ｐＨ７．４の範囲の０．１ｐＨ増分で、Ｅ−プレートで標的細胞を２０Ｋ細胞／ウエルで播種した。アッセイの日に、再試験したエフェクター細胞を、エフェクター細胞／標的細胞比率（Ｅ／Ｔ）３：１、１：１で、および一部の事例では、０．３：１の比率で、実験ウエルに加えた。エフェクター細胞添加後にインピーダンスの読み値を５分ごとに４０時間にわたり取得し、インピーダンスを細胞指数（ＣＩ）として報告した。特異的細胞溶解のパーセンテージを次記のように計算した：（（ＣＩ  標的＋対照ウイルス形質導入エフェクターＴ細胞）−（ＣＩ  標的＋ＡｘｌまたはＲｏｒ２に対するＣＡＲを形質導入したエフェクターＴ細胞））／（ＣＩ  標的＋対照ウイルス形質導入エフェクターＴ細胞））ｘ１００。
【０４１５】
結果
ＡｘｌまたはＲｏｒ２に対し、正常組織に比較して、腫瘍環境の低減されたｐＨで高められた活性を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）（本明細書では（ＣＡＢ−ＣＡＲ）と呼ばれることもある）を、条件的活性型単鎖抗体の重鎖および軽鎖を、他のＣＡＲドメインおよびｅＴａｇドメインと共に、レンチウイルス発現ベクターに組み込むことにより作製した。作製し、試験した野性型対照ＣＡＲおよび条件的活性型（ＣＡＢ）ＣＡＲには、表１（Ａｘｌ）および表２（Ｒｏｒ２）で示され、さらなる詳細な配列情報は表３で与えられる、異なるＣＡＲモジュール／成分の種々の組み合わせが含まれた。アミノからカルボキシ末端までのモジュールの種々の組み合わせは、表１および表２に示されている。これらのモジュールには、ＣＤ８シグナル配列ペプチド（“ｓｐ”）（Ｐ１）（配列番号７４）；Ａｘｌ  ＣＡＢ  ＶＨ（配列番号７９）、Ａｘｌ  ＣＡＢ  ＶＬ（配列番号８０）、Ａｘｌ  ＶＨ（配列番号９３）、Ａｘｌ  ＶＬ（配列番号９４）、Ｒｏｒ２  ＶＨ（配列番号１０７）、Ｒｏｒ２  ＶＬ（配列番号８４）、Ｒｏｒ２  ＣＡＢ  ＶＬ（配列番号１５２）Ｒｏｒ２  ＣＡＢ１  ＶＨ（配列番号８２）、Ｒｏｒ２  ＣＡＢ２  ＶＨ（配列番号８３）、Ｒｏｒ２  ＣＡＢ３  ＶＨ（配列番号１５１）（Ｐ２）および（Ｐ４）；リンカー１（配列番号５３）、リンカー２（配列番号５４）、またはリンカー３（配列番号５５）（Ｐ３）；ＣＤ８由来ストーク／ヒンジおよび膜貫通ドメイン（配列番号７５）またはＣＤ２８（配列番号７６）（Ｐ５）；ＣＤ１３７由来共刺激ドメイン（配列番号１）、ＣＤ２８（配列番号２）、ＩＣΔ（配列番号３）、またはＩＣΔおよびＣＤ１３７の両方（配列番号１３３）（Ｐ６）；ＣＤ３Ｚ由来活性化ドメイン（配列番号１３）（Ｐ７）；２Ａ−１リボソームスキップ配列（配列番号７７）（Ｐ８）；ｅＴＡＧ（配列番号７８）（Ｐ９）が含まれた。
【０４１６】
一次Ｔ細胞は、表１および表２の候補ＣＡＲを発現している組換えレンチウイルス粒子で形質導入され、パーセント遺伝子導入細胞がｅＴａｇを発現している細胞のパーセントを、ＦＡＣＳを用いて測定することにより、決定された。図１の代表的Ａｘｌ  ＣＡＲに関して示すように、一次Ｔ細胞は、候補ＣＡＲをコードする組換えレンチウイルス粒子で成功裏に形質導入された。
【０４１７】
ＡｘｌまたはＲｏｒ２を発現している標的細胞に対する候補ＣＡＲの細胞傷害活性をｐＨ７．４（生理学的ｐＨ）またはｐＨ６．７（代用腫瘍アッセイ条件）で分析した。以降でより詳細に説明されるように、多くの候補ＣＡＲは、ｐＨ７．４よりもｐＨ６．７で、標的細胞の溶解に関し、より効果的であった。ＣＡＢ活性は、完全野性型重鎖および軽鎖（すなわち、生理的条件下で特定され、それ以上進化しなかったＶＨおよびＶＬ鎖）を含む対照ＣＡＲでは検出しなかった。
【０４１８】
Ａｘｌに関連する特定の最初の実験では、１８個の抗ＡＸｌ  ＣＡＢ−ＣＡＲ（Ｆ１−２−１〜Ｆ１−２−１８）を、両方ともそれぞれ野生型重鎖および軽鎖から進化した、第１の条件的活性型重鎖および第１の条件的活性型軽鎖を用いて試験した。表１に示すように、最初に試験した１８個の抗ＡＸｌ  ＣＡＢ−ＣＡＲの内の９個は、検出可能な細胞傷害活性を有していた（表中では、「ＣＡＢ活性」として示した）。野生型ＡＳＴＲ抗体重鎖および軽鎖のみを有する試験ＣＡＢ−ＣＡＲのいずれも、条件的活性を有していなかった（表１では、「Ａｘｌ  ＶＨ」および「Ａｘｌ  ＶＬ」（Ｆ１−２−１９、Ｆ１−２−２０）と表示した）。上記で提供したのと同じ形質導入および増殖条件を用いた後続実験では、異なる共刺激ドメインを含む抗ＡＸｌ  ＣＡＢ−ＣＡＲは、条件的細胞傷害活性を示した（Ｆ１−２−２２およびＦ１−２−２３）。
【０４１９】
Ｒｏｒ２に関連する特定の最初の実験では、２つの異なるエピトープに対する条件的活性型ＡＳＴＲを分析した。エピトープ１に対するＲｏｒ２  ＣＡＢ−ＣＡＲ（Ｆ１−１−９〜Ｆ１−１−２４）に関しては、最初に試験した１６個の抗Ｒｏｒ２  ＣＡＢ−ＣＡＲの内の１１個が条件的細胞傷害活性を有していた（表２）。エピトープ２に対するＲｏｒ２  ＣＡＢ−ＣＡＲに関しては、最初の実験で死滅活性を示した６個の抗Ｒｏｒ２  ＣＡＢ−ＣＡＲの内の２個（Ｆ１−１−２５およびＦ１−１−２６）が条件的細胞傷害活性を有していた（表２）。野生型ＡＳＴＲ抗体重鎖および軽鎖のみを有する試験ＣＡＢ−ＣＡＲのいずれも、これらの死滅アッセイで条件的活性を有していなかった（表２では、「Ｒｏｒ２  ＶＨ」および「Ｒｏｒ２  ＶＬ」（Ｆ１−１−１、Ｆ１−１−８）と表示した）。
【０４２０】
まとめると、作製され、試験された多くの候補ＣＡＢ−ＣＡＲは、ｐＨ７．４よりもｐＨ６．７で、標的細胞に対する、より高い細胞傷害活性を有していた。ｐＨ７．４よりｐＨ６．７で標的細胞の溶解に関して、より効果的であった例示的ＣＡＢ−ＣＡＲには、抗Ａｘｌ  ＡＳＴＲ（配列番号１５９）を含むＣＡＢ−ＣＡＲ  Ｆ１−２−３、抗Ａｘｌ  ＡＳＴＲ（配列番号１６０）を含むＣＡＢ−ＣＡＲ  Ｆ１−２−８、抗Ａｘｌ  ＡＳＴＲ（配列番号１６１）を含むＣＡＢ−ＣＡＲ  Ｆ１−２−１０、抗Ａｘｌ  ＡＳＴＲ（配列番号１２９）を含むＣＡＢ−ＣＡＲ  Ｆ１−２−１３、抗Ａｘｌ  ＡＳＴＲ（配列番号１２８）を含むＣＡＢ−ＣＡＲ  Ｆ１−２−１５、抗Ｒｏｒ２  ＡＳＴＲ（配列番号１５７）を含むＣＡＢ−ＣＡＲ  Ｆ１−１−９、抗Ｒｏｒ２  ＡＳＴＲ（配列番号１５３）を含むＣＡＢ−ＣＡＲ  Ｆ−１−１１、抗Ｒｏｒ２  ＡＳＴＲ（配列番号１３２）を含むＣＡＢ−ＣＡＲ  Ｆ−１−１５、抗Ｒｏｒ２  ＡＳＴＲ（配列番号１５４）を含むＣＡＢ−ＣＡＲ  Ｆ−１−１７、抗Ｒｏｒ２  ＡＳＴＲ（配列番号１３０）を含むＣＡＢ−ＣＡＲ  Ｆ−１−１９、抗Ｒｏｒ２  ＡＳＴＲ（配列番号１５８）を含むＣＡＢ−ＣＡＲ  Ｆ１−１−２１、抗Ｒｏｒ２  ＡＳＴＲ（配列番号１３１）を含むＣＡＢ−ＣＡＲ  Ｆ１−１−２３、抗Ｒｏｒ２  ＡＳＴＲ（配列番号１５５）を含むＣＡＢ−ＣＡＲ  Ｆ−１−２５、および抗Ｒｏｒ２  ＡＳＴＲ（配列番号１５６）を含むＣＡＢ−ＣＡＲ  Ｆ−１−２６が含まれた。ＡＳＴＲは全て、生理的条件下で特定され、さらに進化した少なくとも１つのＶＨまたはＶＬのモジュールを含んだ。
【０４２１】
図２Ｂ〜２Ｆは、条件的活性型ではない野性型ＡＳＴＲを有する対照ＣＡＲと比較して、いくつかのＡｘｌに対するより高い条件的活性型ＣＡＢ−ＣＡＲの代表的ＣＨＯ−Ａｘｌ腫瘍の経時的インビトロ死滅を示す（図２Ａ）。図２Ａおよび２Ｂでは、エフェクターの標的細胞に対する３：１の比率を使用した。図２Ｃ〜２Ｆでは、エフェクターの標的に対する１：１の比率を使用した。同様に、図３Ｂ〜３Ｊは、条件的活性型ではない野性型ＡＳＴＲを有する対照ＣＡＲと比較して、いくつかのＲｏｒ２に対するより高い条件的活性型ＣＡＢ−ＣＡＲの代表的ＣＨＯ−Ｒｏｒ２腫瘍の、エフェクターの標的細胞に対する３：１の比率での、経時的インビトロ死滅を示す（図３Ａ）。
【０４２２】
いくつかの候補ＣＡＲの条件的活性を７．４〜６．７のｐＨの範囲で０．１ｐＨ（ｐＨ滴定）の増分で経時的に分析した。図４ＡのＣＡＢ−ＣＡＲ  Ｆ１−２−１３（Ａｘｌ）および図５ＡのＣＡＢ−ＣＡＲ  Ｆ１−１−１５（Ｒｏｒ２）に対する代表的曲線に示すように、条件的活性型ＡＳＴＲ（ＣＡＢ−ＣＡＲ）を含む全ての試験した候補ＣＡＲ（それぞれＡｘｌおよびＲｏｒ２に対する５個のＣＡＢ−ＣＡＲ）は、ｐＨ依存性の、それらの同族抗原を発現しているＣＨＯ細胞の死滅を示した。この死滅は、生理的ｐＨでは少なく、培養液がより産生になるに伴い増加した。図４Ｂは、ＣＡＢ−ＣＡＲ  Ｆ１−２−１３によるｐＨ依存性死滅は、ｐＨ７．４〜ｐＨ７．０まで増加し、ｐＨ７．０〜ｐＨ６．５まで一貫して高かったことを示す。図５Ｂは、ＣＡＢ−ＣＡＲ  Ｆ１−１−１５によるｐＨ依存性死滅は、ｐＨ７．４〜ｐＨ６．６まで徐々に増加することを示す。
【０４２３】
候補ＣＡＢ−ＣＡＲの条件的殺作用もまた、内在性レベルのＡｘｌおよびＲｏｒ２を発現するヒト腎臓細胞に対し、これらのタンパク質の導入遺伝子発現の非存在下で試験した。図６Ａは、Ａｘｌ発現Ｃａｋｉ−１細胞のＦ１−２−１５を発現しているＴ細胞による条件的死滅を示す。図６Ｂは、Ｒｏｒ２発現ＨＥＫ２９３細胞のＦ１−１−１５を発現しているＴ細胞による条件的死滅を示す。
【０４２４】
このように、本明細書で提供される方法は、インビトロでＴ細胞上に発現した場合に、条件的死滅活性を示すＡｘｌおよびＲｏｒ２に対する条件的活性型ＣＡＲを作製および特定するのに効果的であった。
【表１】
2020503885.tif 000003
【表２−１】
2020503885.tif 000004
【表２−２】
2020503885.tif 000005
【０４２５】
実施例２：ｅＴａｇ発現標的細胞の除去
除去に対するセツキシマブ濃度の影響
Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｒｅｍｉｕｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、４５−００１−７５１）を用いて、健康なドナー由来のＡＣＤ末梢血からＰＢＭＣを単離した。標的細胞を調製するために、プロモーターに動作可能に連結されたＧＦＰ蛍光タンパク質およびｅＴａｇ標的を発現するための、ＧＦＰおよびｅＴａｇのコード領域を含むレンチウイルスを用いてＰＢＭＣを形質導入した。形質導入しないで、同時に活性化および増殖したＰＢＭＣを非標的対照細胞として使用した。増殖させた標的細胞および非標的対照細胞を液体窒素中の凍結培地中で、使用するまで保存した。同じドナーから新たに単離したＰＢＭＣを、１０ｎｇ／ｍＬのｈｕＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、２１５−ＧＭ−０１０）で予備刺激し、エフェクター細胞として使用した。標的細胞および非標的細胞を、凍結保存から１日かけて回収した後、使用前に、非標的対照細胞をＣＴ−Ｖｉｏｌｅｔで標識した。標的細胞および非標的対照細胞を１：１で混合後、エフェクターＰＢＭＣと５０：１のエフェクター細胞：標的の比率で、Ｕ底９６ウェルプレート中で、異なる濃度のセツキシマブまたはアイソタイプ対照抗体と同時インキュベートした。２２時間インキュベーション後、試料を４００ｇで５分間遠心分離した。ペレット化細胞をＦＡＣＳ洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ＋０．１％アジ化ナトリウム）に再懸濁し、フローサイトメトリーの前に、等体積のＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ（ＢＤ  ＃５５４６５５）で固定した。標的細胞のみを含む対照試料を用いてＦＡＣＳゲーティングを設定した。標的細胞および非標的対照細胞の数を定量化した。生存標的細胞（ＧＦＰ＋）の、非標的対照細胞（ＣＴ−Ｖｉｏｌｅｔ）に対する比率を計算し、Ａｂ不含試料に正規化した。枯渇のパーセンテージは、次のように計算された：１−（（標的／非標的）／（Ａｂ不含標的／Ａｂ不含非標的））。
【０４２６】
エフェクター細胞：標的細胞の比率のセツキシマブ除去に対する効果
使用ＰＢＭＣが予め凍結され、標的細胞および非標的対照細胞が１：１の比率で混合された後に、エフェクターＰＢＭＣと５０：１、２５：１、５：１および１：１のエフェクター細胞：標的細胞の比率で、Ｕ底９６ウェルプレート中で、１μｇ／ｍＬのセツキシマブまたはアイソタイプ対照抗体と同時インキュベートしたこと以外は、上述のように、実験を実施した。
【０４２７】
結果
除去ドメインとしてのｅＴａｇの発現の有効性を、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）中で試験した。ＰＢＭＣは、単離およびプロモーターに動作可能に連結されたｅＴａｇを含むレンチウイルスベクターで形質導入された。対照細胞は形質導入されなかった。細胞を０〜１０ｕｇ／ｍｌの濃度のセツキシマブで処理し、細胞枯渇を、試験した全濃度でセツキシマブ投与の２２時間後に検出した（図７Ａ）。１ｕｇ／ｍｌのセツキシマブ濃度を用いて、枯渇を、すべての比率の形質導入エフェクター（Ｅ）細胞対対照（Ｔ）細胞で観察し、形質導入エフェクター（Ｅ）細胞の比率の増加と共に、枯渇が徐々に増加した（図７Ｂ）。したがって、ｅＴａｇを発現しているＴ細胞は、ＰＢＭＣの存在下で、ｅＴａｇに対する抗体により効果的に除去できる。ＦＬＡＧエピトープが、ＣＤ８シグナルペプチドと、ＣＡＢ−ＣＡＲ  Ｆ１−１−１５およびＦ１−２−１５との間に位置する条件的活性型ＡＳＴＲとの間に位置するＣＡＢ−ＣＡＲポリペプチドの一部として発現されたＦＬＡＧエピトープを用いて、追跡調査実験を実施したことは、注目すべきである。これらの初期非最適化構築物を用いたいくつかの事例では、わずかに減少したが、これらのＣＡＢ−ＣＡＲは、それらの同族抗原を発現している標的細胞を死滅させ、サイトカイン応答を誘発するそれらの能力を保持した。このように、除去ドメインは、その活性を破壊することなく、ＣＡＢ−ＣＡＲの一部として発現させることができる。
【０４２８】
実施例３．条件的活性型キメラ抗原受容体のサイトカインの誘導
この実施例は、ＡｘｌまたはＲｏｒ２を標的とする条件的活性型キメラ抗原受容体によるｐＨ依存性サイトカイン誘導を示す。対照ＣＨＯ細胞またはＡｘｌ（ＣＨＯ−Ａｘｌ）またはＲｏｒ２細胞（ＣＨＯ−ＲＯＲ２）と、抗ＡＸｌ  ＡＳＴＲを有するＣＡＢ−ＣＡＲ（Ｆ１−２−１５）を発現しているＴ細胞または抗Ｒｏｒ２  ＡＳＴＲを有するＣＡＢ−ＣＡＲ（Ｆ１−１−１５）を発現しているＴ細胞とを、それぞれ、ｐＨ６．７またはｐＨ７．４で同時インキュベートした後、培地中のＩＬ−２およびＩＦＮ−γのサイトカインレベルを測定した。これらの同時インキュベーション由来のサイトカインレベルを、陰性対照および陽性対照のサイトカインレベルと比較した。
【０４２９】
凍結保存エフェクター細胞を、汎Ｔ細胞（ＡｌｌＣｅｌｌｓ）にＣＡＢ−ＣＡＲ  Ｆ１−１−１５（Ｒｏｒ２）、Ｆ１−２−１５（Ａｘｌ）、またはｅＴａｇ単独（Ｆ１−０−０１）をコードするレンチウイルス粒子を形質導入することにより生成し、実施例１で記載のように増殖した。１日目に、エフェクター細胞を解凍し、Ｘ−ＶＩＶＯ１５（Ｌｏｎｚａ  ＃０４−４１８Ｑ）、５％ヒトＡＢ血清（Ｖａｌｌｅｙ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｃ．，＃ＨＰ１０２２）、１０ｍＭのＮ−アセチル  Ｌ−システイン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ＃Ａ９１６５）からなり、１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ２を補充したヒトＴ細胞培地中、３７℃および５％ＣＯ２下での培養により、凍結保存から２日間かけて回収した。２日目に、３．０ｘ１０４ＣＨＯ、ＣＨＯ−Ｒｏｒ２、またはＣＨＯ−Ａｘｌ標的細胞を９６ウエル平底組織培養プレートのウエルの１００μｌの、４０ｍＭのＨＥＰＥＳ／ＰＩＰＥＳを含み、ｐＨ６．７またはｐＨ７．４に調節したヒトＴ細胞培地中に播種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養した。３日目に、休息エフェクター細胞を、適切なｐＨの１４０μｌのヒトＴ細胞培地中の３：１のエフェクター細胞／標的細胞比率で実験ウエルに加えた。エフェクターおよび標的細胞を３７℃および５％ＣＯ２下で一晩同時インキュベートし、翌日上清を収集し、サイトカインレベルをＥＬＩＳＡによりアッセイした。各実験条件を３回繰り返して実施した。
【０４３０】
結果
図８Ａ〜８Ｄに示すように、抗ＡＸｌ  ＣＡＢ−ＣＡＲ  Ｆ−２−１５または抗Ｒｏｒ２  ＣＡＢ−ＣＡＲ  Ｆ−１−１５をコードする核酸を含むレンチウイルス粒子で形質導入したＴ細胞を、ＡｘｌまたはＲｏｒ２をそれぞれ発現しているＣＨＯ細胞の認識に応答して、ｐＨ依存的にサイトカインを分泌するように活性化した。図８Ａに示すように、抗Ａｘｌ  ＣＡＢ−ＣＡＲ  Ｆ１−２−１５をコードする核酸を含むレンチウイルス粒子で形質導入したＴ細胞は、ｐＨ６．７で培養した場合、ＩＬ−２を分泌したが、ｐＨ７．４の場合は分泌せず、また、Ａｘｌを発現しているＣＨＯ細胞の存在下でのみ分泌した。同様に、図８Ｂに示すように、抗Ａｘｌ  ＣＡＢ−ＣＡＲ  Ｆ１−２−１５をコードする核酸を含むレンチウイルス粒子で形質導入したＴ細胞は、ｐＨ６．７で培養した場合、ＩＦＮ−γを分泌したが、ｐＨ７．４の場合は分泌せず、また、Ａｘｌを発現しているＣＨＯ細胞の存在下でのみ分泌した。図８Ｃに示すように、抗Ｒｏｒ２  ＣＡＢ−ＣＡＲ  Ｆ−１−１５を発現しているＴ細胞は、ｐＨ７．４に比べて、ｐＨ６．７で培養した場合に、約２．５倍のＩＬ−２を分泌し、また、Ｒｏｒ２を発現しているＣＨＯ細胞の存在下でのみ、かなりの量のＩＬ−２を分泌した。同様に、図８Ｄに示すように、抗Ｒｏｒ２  ＣＡＢ−ＣＡＲ  Ｆ−１−１５を発現しているＴ細胞は、ｐＨ７．４に比べて、ｐＨ６．７で培養した場合に、Ｒｏｒ２を発現しているＣＨＯ細胞の存在下でのみ、約２倍のＩＦＮ−γを分泌した。抗ＡＸｌまたは抗Ｒｏｒ２  ＣＡＢ−ＣＡＲの代わりに、対照ＥＧＦＲポリペプチドを発現したエフェクターＴ細胞を含む試料は、いずれのｐＨでも、ＣＨＯ細胞のいずれかとの同時培養に応答した、ＩＬ２またはＩＦＮ−γの分泌の増大を生じなかった。このように、インビトロでＴ細胞上に発現する場合に本明細書で特定される、ＡｘｌおよびＲｏｒ２に対する例示的条件的活性型ＣＡＲは、ＣＡＲ同族抗原に曝露される場合、これらのＴ細胞からの条件的サイトカイン分泌を誘発した。さらに、これらの実験は、本明細書で提供されるＣＡＢ−ＣＡＲを発現する非限定的Ｔ細胞を活性化する例示的インビトロ法を提供する。
【０４３１】
実施例４．条件的活性型生物学的ＣＡＲ発現Ｔ細胞の細胞傷害活性は、ｐＨを変えることにより制御できる。
次の実施例は、ＣＡＢ−ＣＡＲを発現している形質導入Ｔ細胞（エフェクター細胞とも呼ばれる）の細胞傷害活性が微小環境のｐＨ中の変化によりどのように調節されるかを示す。この実施例では、同族抗原Ａｘｌ（抗ＡＸｌ）に結合できるＣＡＢ−ＣＡＲをコードする核酸を用いて、複製不能組換えレンチウイルス粒子を生成した。汎Ｔ細胞をレンチウイルス粒子で形質導入し、培地のｐＨの変化前後でリアルタイム細胞分析（ＲＴＣＡ）を用いてエフェクター細胞の細胞傷害活性を比較した。
【０４３２】
ＣＡＢ−ＣＡＲエフェクターＴ細胞の生成
Ａｘｌに対するＣＡＢ−ＣＡＲ（Ｆ１−２−１５）およびｅＴａｇ（配列番号７８）を含むがＣＡＲ（Ｆ１−０−０１）を欠く陰性対照（Ｃ１）をコードするレンチウイルス粒子を実施例１で記載のように生成した。これらのレンチウイルス粒子を用いて、汎Ｔ細胞（ＡｌｌＣｅｌｌｓ）に形質導入し、実施例１に記載のように、形質導入Ｔ細胞を１０〜１２日間増殖させた。これらの形質導入Ｔ細胞をエフェクター細胞として後で使用するために凍結保存した。
【０４３３】
ｐＨシフト細胞傷害性アッセイ
ＮａＨＣＯ３またはＮａＯＨの添加によるｐＨ変化の前後の形質導入Ｔ細胞の細胞傷害活性をｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍを使って測定した。手短に説明すると、実験の１日前に、標的細胞（細胞表面上にＡｘｌを発現する構築物で安定に遺伝子導入されたＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−Ａｘｌ細胞））を、９６ウエルＥプレート（ＡＣＥＡ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）中に、１０，０００細胞／ウエルで、４０ｍＭのＨＥＰＥＳおよび４０ｍＭのＰＩＰＥＳ含有Ｘ−ＶＩＶＯ１５培地、ｐＨ６．７中に播種した。上記で考察したように生成した、Ｆ１−２−１５またはＣ１（Ｆ１−２−１５ＶＰおよびＣ１ＶＰ、それぞれ）をコードする核酸を含むレンチウイルス粒子を予め形質導入した凍結保存エフェクター細胞を解凍し、１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）含有Ｘ−ＶＩＶＯ１５培地中で２日間培養した。実験の日に、Ｆ１−２−１５−ＶＰまたはＣ１ＶＰで形質導入した細胞を洗浄し、４０ｍＭのＨＥＰＥＳおよび４０ｍＭのＰＩＰＥＳ含有Ｘ−ＶＩＶＯ１５培地、ｐＨ６．７、中に再懸濁した後、１：１のエフェクター細胞／標的細胞比（Ｅ／Ｔ）で実験ウエルに加えた。
【０４３４】
ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＣＥＡ）で測定したインピーダンスの読み値を５分ごとに取り込み、細胞指数（ＣＩ）として報告し、細胞集密度を細胞増殖／細胞溶解の尺度として定量化した。エフェクター細胞添加の約３時間後、８μｌの７．５％ＮａＨＣＯ３または１４μｌの０．５Ｍ  ＮａＯＨを４０ｍＭのＨＥＰＥＳおよび４０ｍＭのＰＩＰＥＳを含むＸ−ＶＩＶＯ１５培地、ｐＨ６．７を含むウエルに加えて、ｐＨを６．７から７．４に高めた。エフェクター細胞添加後、インピーダンスの読み取りを約２０時間にわたり継続した。特異的細胞溶解のパーセンテージを次記のように計算した：（（ＣＩ  標的＋Ｃ１ＶＰ  形質導入エフェクターＴ細胞）−（ＣＩ  標的＋Ｆ１−２−１５−ＶＰ形質導入エフェクターＴ細胞））／（ＣＩ  標的＋Ｃ１ＶＰ形質導入エフェクターＴ細胞））ｘ１００。
【０４３５】
ＲＴＣＡ死滅アッセイに対するＨＣｌ切り替え
ＨＣｌの添加によるｐＨ変化の前後の形質導入Ｔ細胞の細胞傷害活性をｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍを使って測定した。手短に説明すると、実験の１日前に、ＣＨＯ−Ａｘｌ細胞を、９６ウエルＥプレート中に、１０，０００細胞／ウエルで、４０ｍＭのＨＥＰＥＳおよび４０ｍＭのＰＩＰＥＳ含有Ｘ−ＶＩＶＯ１５培地、ｐＨ７．４中に播種した。Ｃ１ＶＰまたはＦ１−２−１５−ＶＰで予め形質導入した凍結保存エフェクター細胞を解凍し、１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２含有Ｘ−ＶＩＶＯ１５培地中で２日間培養した。実験の日に、Ｆ１−２−１５−ＶＰまたはＣ１ＶＰで形質導入した細胞を洗浄し、４０ｍＭのＨＥＰＥＳおよび４０ｍＭのＰＩＰＥＳ含有Ｘ−ＶＩＶＯ１５培地、ｐＨ７．４、中に再懸濁した後、１：１のエフェクター細胞／標的細胞比（Ｅ／Ｔ）で実験ウエルに加えた。
【０４３６】
インピーダンスの読み値を５分ごとに取り込み、細胞指数（ＣＩ）として報告した。エフェクター細胞添加の約３時間後、８μｌの１Ｍ  ＨＣｌを４０ｍＭのＨＥＰＥＳおよび４０ｍＭのＰＩＰＥＳを含むＸ−ＶＩＶＯ１５培地、ｐＨ７．４、を含むウエルに加えて、ｐＨを７．４から６．７に切り替えた。エフェクター細胞添加後、インピーダンスの読み取りを約２０時間にわたり継続した。特異的細胞溶解のパーセンテージを次記のように計算した：（（ＣＩ  標的＋Ｃ１ＶＰ  形質導入エフェクターＴ細胞）−（ＣＩ  標的＋Ｆ１−２−１５−ＶＰ形質導入エフェクターＴ細胞））／（ＣＩ  標的  Ｃ１ＶＰ））ｘ１００。
【０４３７】
結果
低いｐＨで活性が増加する、同族抗原Ａｘｌに結合できるＣＡＢ−ＣＡＲの細胞傷害活性をｐＨ６．７とｐＨ７．４で比較した。Ｆ１−２−１５、抗ＡＸｌ  ＣＡＢ−ＣＡＲをコードする核酸を含むレンチウイルス粒子で形質導入したＴ細胞を用いて、Ａｘｌを発現しているＣＨＯ細胞を死滅させた後、ｐＨを高めて、細胞傷害活性がｐＨシフトにより抑制されたかどうかを判定した。図９Ａおよび９Ｂに示すように、培地のｐＨを高めるためのＮａＨＣＯ３またはＮａＯＨの、活性ＣＡＲ−Ｔ細胞の微小環境への添加は、ＣＡＢ−ＣＡＲを発現しているＴ細胞の細胞傷害活性を抑制した。これらの結果は、活性ＣＡＢ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞が標的発現細胞を死滅させることができ、その後、この死滅活性は、微小環境のｐＨを高めることにより抑制できる。
【０４３８】
ＣＡＢ−ＣＡＲを発現しているＴ細胞のｐＨ変化により活性化される細胞傷害活性の能力も決定した。図９Ｃに示すように、抗ＡＸｌ  ＣＡＢ−ＣＡＲを発現しているＴ細胞のＣＨＯ−Ａｘｌ細胞に対する細胞傷害活性は、ｐＨ７．４では低く、微小環境のｐＨを下げるためのＨＣｌの添加により増加する。
【０４３９】
Ｆ１−２−２２（Ａｘｌに対するＣＡＢ−ＣＡＲ）およびＦ１−１−１５（Ｒｏｒ２に対するＣＡＢ−ＣＡＲ）を用いてこれらの実験が繰り返された場合、類似の結果が得られた。まとめると、これらの結果は、ＣＡＢ−ＣＡＲを発現しているＴ細胞の細胞傷害活性は、微小環境中のｐＨのシフトにより、すなわち、ｐＨの増加後に細胞傷害活性を低減すること、およびｐＨの低下後に細胞傷害活性を増加させることの両方により、調節できることを示す。この非限定的例では、ｐＨは、ｐＨ６．７から高められ、ｐＨ７．４から下げられた。
【０４４０】
実施例５．重炭酸塩投与は、マウスの腫瘍微小環境のｐＨを高めることができる。
次の実施例は、インビボ腫瘍微小環境のｐＨが薬剤を投与することにより調節できることを示す。この実施例では、薬剤は重炭酸ナトリウムであり、腫瘍微小環境はマウスのＣＨＯ異種移植片腫瘍である。実施例は、インビボおよびエクスビボ両方の、２種の腫瘍微小環境ｐＨ測定方法を含む。
【０４４１】
ほとんどの固形腫瘍の細胞外の微小環境は酸性であり、ｐＨは通常、６．５〜６．９である。これに対して、正常組織ｐＨは塩基性であり、通常、７．２〜７．５である。しかし、腫瘍微小環境のインビボｐＨの直接測定は、困難であり得る。幸いにも、カテプシンの相対的プロテアーゼ活性は、より低いｐＨでより高く、より高いｐＨでより低い。したがって、腫瘍内カテプシン活性の測定を、腫瘍微小環境のｐＨの代用尺度として機能させることができる。カテプシンＢ、Ｌ、Ｓ、Ｋ、Ｖ、およびＤのインビボ活性を測定するために、近赤外ＰｒｏＳｅｎｓｅ７５０ＦＡＳＴプローブ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用した。重炭酸ナトリウムの投与による腫瘍微小環境中のｐＨの調節をさらに確認するために、摘出腫瘍をフェノールレッドで処理し、色を記録した。フェノールレッドは、ｐＨ指示薬であり、ｐＨ依存性色遷移を起こす。フェノールレッドのナトリウム塩は、ｐＨ値を特定するための細胞培養培地として広く使用される。フェノールレッドの溶液は、ｐＨ６．４以下で黄色であり、ｐＨ７．０近傍でオレンジ色、ｐＨ７．４近傍で赤色であり、ｐＨ７．８超で紫色である。
【０４４２】
マウスを動物実験委員会承認プロトコルに従って取り扱った。皮下（ｓｃ）チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）腫瘍異種移植片を１２〜１４週齡の雌ＮＯＤ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１／Ｂｅｇｅｎ（Ｂ−ＮＳＧ）マウス（Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．）の後部側腹で樹立した。手短に説明すると、培養したＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）をＤＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）で洗浄し、計数し、低温のＤＰＢＳ中に再懸濁し、適切な体積のマトリゲルＥＣＭ（Ｃｏｒｎｉｎｇ；最終濃度５ｍｇ／ｍＬ）と１．５ｘ１０６細胞／２００μｌの濃度で、氷上で混合した。
【０４４３】
標準的承認麻酔剤を用い、注入前に毛髪を除去して（ネア）、動物の注入のための準備をした。２００μｌのＥＣＭ中の細胞懸濁液をマウスのひ腹中にｓｃ注入した。腫瘍が触知可能になると、腫瘍をノギスで週２回測定した。腫瘍体積を、次の式を用いて計算した：（最大長の直径＊最短長の直径２）／２。平均腫瘍体積が２００ｍｍ３に達すると、マウスをそれぞれの処理群にランダムに割り付けた。
【０４４４】
重炭酸塩の投与の２日前に、Ｂ−ＮＳＧマウス用の飲料水を酸性から通常のｐＨのオートクレーブ精製水に変えた。翌日、７５０ＰｒｏＳｅｎｓｅ  ＦＡＳＴプローブを６匹のＣＨＯ異種移植片担癌マウスに１００μｌの尾静脈注入（４ｎｍのＰｒｏＳｅｎｓｅ  ７５０ＦＡＳＴプローブ／１００μｌ  ＰＢＳ）により投与した。別の群のＣＨＯ異種移植片担癌マウスを未処理のまま残した。翌日、重炭酸ナトリウムを投与し、ＰｒｏＳｅｎｓｅ  ７５０ＦＡＳＴプローブで処理したマウスの画像化を、Ｃａｌｉｐｅｒ  ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ  ＸＲを用いて実施した。手短に説明すると、マウスを２Ｌ／分のＯ２キャリアガス中の３％イソフルランを用いて麻酔した後、画像処置中、１．５％のイソフルランを麻酔したマウスに供給するノーズコーンと共に、置いた。画像取得は、近赤外プローブ（７４５／８１０ｎｍの励起／発光波長）に対し５秒の露出から構成した。蛍光画像をマウスの通常光画像に重ねた。時間０（処理前）画像を、ＰＢＳ（対照）または重炭酸ナトリウムの投与の前に取得した。その後マウスに１ｍｌ／マウスのＰＢＳ（対照、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）または１ｍｌ／マウスの１Ｍ  重炭酸ナトリウム（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏ．，ＬＴＤ）を腹腔内注入（ｉｐ）経由で投与した。その後、ＰＢＳまたは重炭酸塩の投与の３０分後にマウスの画像を取得した。収集した蛍光画像を、同一の最小、最大、および閾値を有するように調節した。この試験では、フォトンカウントを相対蛍光単位（ＲＦＵ）として定義した。欠くマウスの３０分の時点から処理前の時点まで（時間０；１００％）を正規化することによりＲＦＵを計算した。時間０処理前の値の各マウスの蛍光値の間の変動により、異なる時点での観察された蛍光強度値は個別のマウスに対してのみ正規化され、平均処理前値に対してではなかった。
【０４４５】
別の実験群では、ＮＩＲカテプシンプローブを受けなかった６匹のマウスは、ＰＢＳまたは重炭酸ナトリウムのｉｐ投与の１．５時間後に頸部の脱臼により安楽死させた。ＣＨＯ異種移植片腫瘍を各マウスから摘出した。異種移植片腫瘍をメスで２つの半切れに分割し、ペトリ皿上に置いた。腫瘍組織の半切れをその後、メスを使って、切断／スライスを繰り返した。水または０．０５％のフェノールレッド溶液（５０ｍｇのフェノールレッド／１００ｍｌの水）を各腫瘍半切れにそれぞれ滴加した。色を記録し、治療腫瘍異種移植片の画像を取得し、腫瘍異種移植片試料を取り除いたときに、ペトリ皿上に残っているフェノールレッド溶液の画像を取得した。
【０４４６】
結果
図１０は、ＰＢＳ（対照；ｎ＝３）または重炭酸塩（ｎ＝３）の投与前後のＣＨＯ異種移植片担癌マウスの腫瘍内カテプシン活性の画像化からのＲＦＵ結果（ＳＥＭ付き平均）を示す。これらの結果は、ｉｐ重炭酸ナトリウム投与後に観察されたカテプシン活性の低下からも明らかなように、重炭酸ナトリウム投与が腫瘍微小環境のｐＨをインビボで高めることを示唆している。
【０４４７】
ＰＢＳ処理マウス（ｎ＝３）と比較して、重炭酸ナトリウム処理マウス（ｎ＝３）から摘出した腫瘍組織を用いた場合、フェノールレッド指示薬の黄色／オレンジから赤までの色の変化が観察された。これらの結果は、フェノールレッド指示薬の黄色／オレンジから赤色への色の変化からも明らかなように、重炭酸ナトリウムの投与が、ｉｐ投与後に、腫瘍微小環境のｐＨをインビボで高めることを裏付けている。
【０４４８】
実施例６．ＲＯＲ２およびＡＸＬに対するＣＡＢ−ＣＡＲによる標的依存性腫瘍のインビボ死滅。
インビトロアッセイで、ＡｘｌまたはＲｏｒ２発現細胞に対する条件的細胞傷害活性を有するＣＡＢ−ＣＡＲが、ＡｘｌまたはＲｏｒ２発現腫瘍細胞に対する細胞傷害活性をインビボで有することを示す実験が実施された。ＣＡＢ−ＣＡＲの特異性および有効性を究明する手順として、抗ヒトｓｃＦｖ標的と非反応性であるＮＳＧ、またはＮＯＤ  Ｓｃｉｄ  Ｇａｍｍａマウスを用いた異種移植片モデルが選択された。ＮＳＧは、成熟Ｔ細胞、ＮＫ細胞、およびＢ細胞を欠くマウス株であり、現在まで記載された中で最も免疫不全のマウスである。これらの細胞成分の除去は、単核球由来のヒト末梢血を、宿主からの自然、体液性または獲得免疫反応なしに移植することを可能とするために必要である。照射またはリンパ球枯渇化学療法後にのみヒト中で通常存在する恒常性サイトカインの濃度は、マウスの細胞外の共通γ鎖の非存在により達成され、これにより、養子導入ヒト細胞がこのようなサイトカインを受けることが可能となる。同時に、これらの動物はまた、腫瘍異種移植片標的を移植して、ＣＡＲの標的発現腫瘍を死滅させる効果を調査するのに使用できる。エフェクター細胞生成物中の異種反応性Ｔ細胞受容体抗原の存在は、移植片対宿主病を最終的に生ずることになるが、これらのモデルは、動物薬理学および急性耐容性の短期評価を可能とする。
【０４４９】
親チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞およびヒトＲＯＲ２（ＣＨＯ−ＲＯＲ２）またはヒトＡｘｌ（ＣＨＯ−Ａｘｌ）を発現するように安定に遺伝子導入された遺伝子導入ＣＨＯ細胞を利用して、均一な標的腫瘍を生成し、ＣＡＢ−ＣＡＲエフェクター細胞の同族抗原発現腫瘍を死滅させるための特異性および有効性が特定される。３種全ての細胞株は、同じ異種反応性ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）およびその他の非特異的抗原を有するので、腫瘍微小環境中での腫瘍標的に対するＣＡＢ−ＣＡＲ細胞の特異性を、ドナーリンパ球および標的腫瘍細胞のＨＬＡ反応性の変動を考慮することなく試験できる。播種性悪性病変を有する親および遺伝子導入ＣＨＯバリアントは、ＮＳＧマウスへのマトリゲル人工基底膜と組み合わせた皮下投与後、急速に増殖した。
【０４５０】
ＰＢＭＣは、製造業者の説明書に従って、Ｓｅｐａｘ２  Ｓ−１００装置（Ｂｉｏｓａｆｅ；１４０００）でＣＳ−９００．２キット（Ｂｉｏｓａｆｅ；１００８）を用いて、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（登録商標））（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ）を使った密度勾配遠心分離によりインフォームドコンセントによる同意を得た健康なボランティア由来のＡＣＤ末梢血から単離された。５．０ｘ１０７個の生存ＰＢＭＣを１ＬのＧ−Ｒｅｘ（Ｗｉｌｓｏｎ−Ｗｏｌｆ）中に播種し、体積を、ウイルス形質導入のためにＰＢＭＣを活性化するように、１００ＩＵ／ｍｌ（ＩＬ−２）（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ）、１０ｎｇ／ｍｌ（ＩＬ−７）（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ）、および５０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３、Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ）を補充したＣｏｍｐｌｅｔｅ  ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）ＣＴＳ（商標）Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ＳＦＭを用いて１００ｍｌにした。３７℃および５％ＣＯ２下で一晩のインキュベーション後、実施例１で記載のように作製したＣＡＲ構築物をコードするレンチウイルス粒子を活性化ＰＢＭＣに直接加え、３７℃および５％ＣＯ２下で一晩インキュベートした。翌日、１０ｍＭのＮＡＣを補充したＣｏｍｐｌｅｔｅ  ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）ＣＴＳ（商標）Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ＳＦＭを用いて、それぞれのＧ−Ｒｅｘの培地の体積を１Ｌにした。さらに、２日目およびその後４８時間毎に、１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ）および１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ）を各ウエルに加えた。最初の採血（０日目）から１２日目まで、回収する前に細胞を増殖させた。
【０４５１】
ＲＯＲ２に対するＣＡＢ−ＣＡＲを試験するために、実施例５に記載のように、雌ＮＯＤ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１／Ｂｅｇｅｎ（Ｂ−ＮＳＧ）マウス（Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．）１２〜１４週齡に、氷上のマトリゲルＥＣＭ中の１．５ｘ１０６細胞／２００μｌの濃度で、親ＣＨＯ細胞またはＣＨＯ−ＲＯＲ２細胞を皮下に接種した。腫瘍が、大きい腫瘍負荷の治療のモデルとなる２００ｍｍ３超に到達すると、上記段落で提供された細胞処理プロトコルを用いて調製した、Ｆ１−１−１５（ｎ＝６）またはＦ１−０−０１（ｎ＝６）（構築物の詳細については、実施例１および３を参照されたい）をコードする核酸を含むレンチウイルス粒子で形質導入した４ｘ１０６Ｔ細胞またはＰＢＳ（ｎ＝６）を用いて尾静脈注入によりマウスの静脈内（ＩＶ）に投与した。腫瘍を、ノギスを用いて３回測定し、次の式を用いて腫瘍体積を計算した：（最大長の直径＊最短長の直径２）／２。全ての動物は、１３日目までに腫瘍量による剖検ガイドラインに到達した。
【０４５２】
ＡＸＬに対するＣＡＢ−ＣＡＲを試験するために、実施例５に記載のように、雌Ｂ−ＮＳＧマウス７〜９週齡に、氷上のマトリゲルＥＣＭ中の１．５ｘ１０６細胞／２００μｌの濃度（最終濃度５ｍｇ／ｍｌ）で、親ＣＨＯ細胞またはＣＨＯ−ＣＨＯ−Ａｘｌ細胞を皮下に接種した。腫瘍が大きい腫瘍負荷の治療のモデルとなる１００ｍｍ３超に到達すると、エフェクター細胞のＩＶまたは腫瘍内（ＩＴ）投与を開始した。第１群のマウスに、上記段落で提供した細胞処理プロトコルを使って調製した、Ｆ１−２−１５（ｎ＝６）、Ｆ１−２−２２（ｎ＝６）、またはＦ１−０−０１（ｎ＝６）（構築物の詳細については、実施例１および３を参照されたい）をコードする核酸を含むレンチウイルス粒子で形質導入した８ｘ１０６Ｔ細胞、またはＰＢＳ（ｎ＝６）を用いて、尾静脈注入によりマウスにＩＶ投与した。第２群のマウスに、Ｆ１−２−１５（ｎ＝６）、Ｆ１−２−２２（ｎ＝６）、またはＦ１−０−０１（ｎ＝６）をコードする核酸を含むレンチウイルス粒子で形質導入した８ｘ１０６Ｔ細胞、またはＰＢＳ（ｎ＝６）を用いて、ＩＴ投与した。第３群のマウスに、Ｆ１−２−１５（ｎ＝６）、Ｆ１−２−２２（ｎ＝６）、またはＦ１−０−０１（ｎ＝６）をコードする核酸を含むレンチウイルス粒子で形質導入した８ｘ１０６Ｔ細胞、またはＰＢＳ（ｎ＝６）を用いて尾静脈注入によりＩＶ投与し、さらに、マウスは、最初の３日間にわたり毎日、腫瘍から離れた反対側の皮下にＩＬ−２（５０ＫＩＵ）の皮下注入を受けた。腫瘍を、ノギスを用いて３回測定し、次の式を用いて腫瘍体積を計算した：（最大長の直径＊最短長の直径２）／２。腫瘍量による剖検ガイドラインに合致した全ての動物は、安楽死させられた。
【０４５３】
結果
Ｒｏｒ２もしくはＡｘｌを発現している、またはどちらも発現していない移植腫瘍細胞を使用して、実施例１で開示のいくつかの代表的ＣＡＢ−ＣＡＲのインビボ腫瘍細胞死滅活性をマウスモデルで試験した。図１１Ａに示すように、抗Ｒｏｒ２  ＣＡＢ−ＣＡＲに関しては、Ｆ１−１−１５をコードする核酸を含むレンチウイルス粒子を形質導入した４ｘ１０６Ｔ細胞をＩＶ投与されたマウスは、ＰＢＳ対照またはＥ−Ｔａｇのみのレンチウイルス形質導入Ｔ細胞（Ｆ１−０−０１）と比較して、ＲＯＲ２陰性腫瘍増殖に対し効果がなかった。対照的に、図１１Ｂに示すように、同じ細胞調製物のヒトＲｏｒ２発現腫瘍へのＩＶ投与は、Ｆ１−１−１５によってのみ、Ｒｏｒ２陽性腫瘍の有意な腫瘍抑制が示された。これらのデータは、腫瘍微小環境がこの移植腫瘍マウスモデル中で、インビボで再現されること、および本明細書で提供される例示的抗Ｒｏｒ２  ＣＡＢ−ＣＡＲを発現している遺伝子改変Ｔ細胞は、標的移植腫瘍細胞の急速な倍加時間にもかかわらず、固形腫瘍にアクセスでき、インビボで標的細胞の死滅を促進できることを示す。
【０４５４】
抗ＡＸｌ  ＣＡＢ−ＣＡＲに関しては、図１２Ａに示すように、Ｆ１−２−１５またはＦ１−２−２２をコードする核酸を含むレンチウイルス粒子で形質導入された８ｘ１０６Ｔ細胞を腫瘍内（ＩＴ）投与されたマウスは、ＰＢＳ対照またはＥ−Ｔａｇのみのレンチウイルス粒子形質導入Ｔ細胞（Ｆ１−０−０１）と比較して、Ａｘｌ陰性腫瘍増殖に対し効果がなかった。対照的に、図１２Ｂに示すように、同じ細胞調製物のヒトＡｘｌ発現腫瘍へのＩＴ投与は、Ｆ１−２−１５およびＦ１−２−２２によって、Ａｘｌ陽性腫瘍の有意な腫瘍抑制が示された。Ｆ１−２−１５またはＦ１−２−２２を発現している細胞は、Ｆ１−１−１５を発現している細胞のＲｏｒ２を発現している腫瘍を死滅させる能力に比べて、Ａｘｌを発現している腫瘍に対するインビトロ死滅アッセイで等効力であったが、インビボ腫瘍増殖抑制は、局所注入に比べて、ＩＶ投与後、経時的に持続しなかった（図１３Ａ対照対図１３Ｂ）。３日間にわたる動物中への全身ＩＬ−２投与（図１４Ａ対図１４Ｂ）は、ＩＬ−２なしのＩＶ投与に比べて、抗腫瘍活性の改善に繋がった。これらのデータは、この場合でも、腫瘍微小環境がこの移植腫瘍マウスモデル中で、インビボで再現されること、および本明細書で提供される例示的抗Ｒｏｒ２  ＣＡＢ−ＣＡＲ  Ｆ１−２−１５およびＦ１−２−２２を発現している遺伝子改変Ｔ細胞が固形腫瘍にアクセスでき、標的移植腫瘍細胞の急速な倍加時間にもかかわらずインビボで固形腫瘍にアクセスでき、細胞を死滅させることができることを示す。さらに、本明細書で提供される抗Ｒｏｒ２および抗ＡＸｌ  ＣＡＢ−ＣＡＲを用いるこれらの実験は、このようなＣＡＢ−ＣＡＲがこれらのＣＡＢ−ＣＡＲを発現するＴ細胞を活性化するインビボ法で効果的であることを示す。
【０４５５】
当業者なら、本開示の範囲と趣旨の範囲内で、多くの修正および他の実施形態を考案することができる。実際に、本開示の基本的な態様を変更することなく、記載された物質、方法、図面、実験、実施例、および実施形態の変形例が当業者により作成され得る。開示実施形態のいずれかを、任意の他の開示実施形態と組み合わせて使用できる。
【０４５６】
いくつかの事例では、一部の概念は特定の実施形態に関連して記載されている。しかし、当業者なら、種々の修正および変更を、以下の特許請求の範囲に記載の範囲から逸脱することなく、なし得ることを理解する。したがって、明細書および図面は、制限的な意味ではなく、例証的な意味として考慮されるべきであり、このような修正は、本発明の範囲内に含まれることが意図されている。
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
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【表３−５】
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【表３−６】
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【表３−７】
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【表３−８】
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【表３−９】
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【図１】
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【図２Ａ−２Ｃ】
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【図２Ｄ−２Ｆ】
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【図３Ａ−３Ｃ】
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【図３Ｄ−３Ｆ】
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【図３Ｇ−３Ｈ】
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【図３Ｉ−３Ｊ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ−６Ｂ】
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【図７Ａ−７Ｂ】
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【図８Ａ−８Ｂ】
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【図８Ｃ−８Ｄ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ−１１Ｂ】
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【図１２Ａ−１２Ｂ】
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【図１３Ａ−１３Ｂ】
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【図１４Ａ−１４Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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