(57)【要約】本発明は、ＰＤ−１を標的とする薬物の調製における、式ＩまたはＩＩで表されるサポニン系化合物またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、溶媒和物の用途を開示する。前記ＰＤ−１を標的とする薬物は、ＰＤ−１とそのリガンドの結合を阻害することにより疾患を治療する薬物であり、前記疾患は、腫瘍、細菌、ウイルスまたは真菌によって引き起こされる感染症または炎症性疾患である。2020526594.tif 000030
2020526594.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＤ−１を標的とする薬物の調製における、下記式ＩまたはＩＩで表されるサポニン系化合物またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、溶媒和物の用途であって、
【化１】
2020526594.tif 000021
式において、
Ｒ１は、Ｈ、
【化２】
2020526594.tif 000022
から選択され、
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立的にＨ、置換または非置換のＣ１−６アルキル、ＯＨ、置換または非置換のＣ１−６アルキレンヒドロキシルから選択され、
Ｒ４は、Ｈ、ＯＨ、置換または非置換のＣ１−６アルコキシ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ１１から選択され、Ｒ１１は、水素または置換または非置換のＣ１−６アルキルから選択され、好ましくはＨまたは置換または非置換のＣ１−３アルキルであり、
Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立的にＨ、置換または非置換のＣ１−６アルキルから選択され、
Ｒ７は、Ｈ、ＯＨから選択され、
Ｒ８は、Ｈ、１−３個の炭素原子のカルボキシル基、２−７個の炭素
原子的置換または非置換のエステル、
【化３】
2020526594.tif 000023
から選択され、
Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立的にＨ、置換または非置換のＣ１−６アルキル、ＯＨから選択される、前記ＰＤ−１を標的とする薬物の調製における、式ＩまたはＩＩで表されるサポニン系化合物またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、溶媒和物の用途。
【請求項２】
式Ｉで表される化合物において、
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立的にＨ、置換または非置換のＣ１−３アルキル、ＯＨ、置換または非置換のＣ１−３アルキレンヒドロキシルから選択され、
Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立的にＨ、置換または非置換のＣ１−３アルキルから選択され、
Ｒ８は、Ｈ、−ＣＯＯＨ、
【化４】
2020526594.tif 000024
から選択され、
Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立的にＨ、置換または非置換のＣ１−３アルキル、ＯＨから選択され、
Ｒ１、Ｒ４及びＲ７は、請求項１に記載のとおりであることを特徴とする
請求項１に記載のＰＤ−１を標的とする薬物の調製における、式ＩまたはＩＩで表されるサポニン系化合物またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、溶媒和物の用途。
【請求項３】
式ＩＩで表される化合物は、下記式で表される化合物であり、
【化５】
2020526594.tif 000025
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０はそれぞれ、請求項１に限定されたとおりであることを特徴とする
請求項１に記載のＰＤ−１を標的とする薬物の調製における、式ＩまたはＩＩで表されるサポニン系化合物またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、溶媒和物の用途。
【請求項４】
式ＩまたはＩＩで表される化合物は、以下の群から選択されることを特徴とする
【表１−１】
2020526594.tif 000026
【表１−２】
2020526594.tif 000027
【表１−３】
2020526594.tif 000028
【表１−４】
2020526594.tif 000029
請求項１に記載のＰＤ−１を標的とする薬物の調製における、式ＩまたはＩＩで表されるサポニン系化合物またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、溶媒和物の用途。
【請求項５】
前記ＰＤ−１を標的とする薬物は、ＰＤ−１とそのリガンドの結合を阻害することにより疾患を治療する薬物であることを特徴とする
請求項１〜４のいずれか一項に記載のＰＤ−１を標的とする薬物の調製における、式ＩまたはＩＩで表されるサポニン系化合物またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、溶媒和物の用途。
【請求項６】
前記疾患は、腫瘍、細菌、ウイルスまたは真菌によって引き起こされる感染症または炎症性疾患であることを特徴とする
請求項５に記載のＰＤ−１を標的とする薬物の調製における、式ＩまたはＩＩで表されるサポニン系化合物またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、溶媒和物の用途。
【請求項７】
前記腫瘍は、黒色腫、肺がん、腎臓がん、卵巣がん、前立腺がん、乳がん、大腸がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、子宮がん、直腸がん、肛門がん、胃がん、精巣腫瘍、卵管がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膣がん、外陰がん、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道がん、小腸がん、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部肉腫、尿道がん、陰茎がん、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、小児固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱がん、腎臓または尿管がん、腎がん、中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍、原発性ＣＮＳリンパ腫、脊髄軸索、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮癌、Ｔ細胞リンパ腫を含むが、これらに限定されず、
前記ウイルスは、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、コロナウイルス、麻疹ウイルス、デングウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルスを含むが、これらに限定されず、
前記細菌は、クラミジア、リケッチア、マイコバクテリア、ブドウ球菌、肺炎球菌、コレラ菌、破傷風菌を含むが、これらに限定されず、
前記真菌は、カンジダ、アスペルギルス、皮膚炎芽酵母を含むが、これらに限定されず、
前記炎症性疾患は、強直性脊椎炎、自己免疫性溶血性貧血、関節炎、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、悪性貧血、多発性筋炎を含むが、これらに限定されないことを特徴とする
請求項６に記載のＰＤ−１を標的とする薬物の調製における、式ＩまたはＩＩで表されるサポニン系化合物またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、溶媒和物の用途。
【請求項８】
前記肺がんは、非小細胞肺がんであり、前記肝炎ウイルスは、Ａ型、Ｂ型またはＣ型肝炎ウイルスであることを特徴とする
請求項７に記載のＰＤ−１を標的とする薬物の調製における、式ＩまたはＩＩで表されるサポニン系化合物またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、溶媒和物の用途。
【請求項９】
ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の結合を阻害する方法であって、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、溶媒和物、または前記化合物を含む薬物組成物を使用してＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の結合を阻害するステップを含む、前記ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の結合を阻害する方法。
【請求項１０】
薬物組成物であって、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、溶媒和物及び薬学的に許容される賦形剤を含む、前記薬物組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物化学分野に関し、具体的に、本発明は、ＰＤ−１を標的とする、特にｈＰＤ−１のサポニン系化合物及び腫瘍、細菌、ウイルスまたは真菌によって引き起こされる感染症または炎症性疾患を治療するための薬物の調製におけるその応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫療法は現在、がんを治療する一般的な方法であり、外科的切除、放射線療法、化学療法などの従来の方法と比較して、免疫療法は安全性、有効性、低毒性などの利点がある。ブロッキング剤を使用して免疫チェックポイントをブロックすることは、免疫療法においてより効果的な方法である。プログラム細胞死受容体１（ＰＤ−１）は、より成熟した免疫チェックポイントの１つである。ＰＤ−１とその受容体ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２との相互作用のブロッキングは、がんの治療に使用することができる。ＰＤ−１またはその受容体を標的とするブロッキング剤の研究は現在注目を集めている。
従って、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１の相互作用をブロックする候補薬物としての小分子ブロッキング剤の研究開発は、重要な臨床的意義との見通しがある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１の相互作用をブロッキングして、腫瘍、細菌、ウイルスまたは真菌によって引き起こされる感染症または炎症性疾患を治療する薬物として使用することができる小分子ブロッキング剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
第１の態様において、本発明は、
【化１】
2020526594.tif 000003
式において、
Ｒ１は、Ｈ、
【化２】
2020526594.tif 000004
から選択され、
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立的にＨ、置換または非置換のＣ１−６アルキル、ＯＨ、置換または非置換のＣ１−６アルキレンヒドロキシルから選択され、
【０００５】
Ｒ４は、Ｈ、ＯＨ、置換または非置換のＣ１−６アルコキシ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ１１から選択され、Ｒ１１は、水素または置換または非置換のＣ１−６アルキルから選択され、好ましくはＨまたは置換または非置換のＣ１−３アルキルであり、
Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立的にＨ、置換または非置換のＣ１−６アルキルから選択され、
Ｒ７は、Ｈ、ＯＨから選択され、
Ｒ８は、Ｈ、１−３個の炭素原子のカルボキシル基、２−７個の炭素
原子的置換または非置換のエステル、
【化３】
2020526594.tif 000005
から選択され、
【０００６】
Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立的にＨ、置換または非置換のＣ１−６アルキル、ＯＨから選択される、ＰＤ−１を標的とする薬物の調製における、式ＩまたはＩＩで表されるサポニン系化合物またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、溶媒和物の用途を提供する。
好ましい実施形態では、前記ＰＤ−１は、ヒトＰＤ−１、即ちｈＰＤ−１である。
具体的な実施形態では、式Ｉで表される化合物において、
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立的にＨ、置換または非置換のＣ１−３アルキル、ＯＨ、置換または非置換のＣ１−３アルキレンヒドロキシルから選択され、
Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立的にＨ、置換または非置換のＣ１−３アルキルから選択され、
Ｒ８は、Ｈ、−ＣＯＯＨ、
【化４】
2020526594.tif 000006
から選択され、
Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立的にＨ、置換または非置換のＣ１−３アルキル、ＯＨから選択され、
Ｒ１、Ｒ４及びＲ７は、上記のとおりである。
具体的な実施形態において、式ＩＩで表される化合物は、下記式で表される化合物であり、
【化５】
2020526594.tif 000007
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０はそれぞれ、上記とおりである。
具体的な実施形態において、式ＩまたはＩＩで表される化合物は、以下の群から選択される。
【表１−１】
2020526594.tif 000008
【表１−２】
2020526594.tif 000009
【表１−３】
2020526594.tif 000010
【表１−４】
2020526594.tif 000011
具体的な実施形態において、前記ＰＤ−１を標的とする薬物は、ＰＤ−１とそのリガンドの結合を阻害することにより疾患を治療する薬物である。
具体的な実施形態において、前記疾患は、腫瘍、細菌、ウイルスまたは真菌によって引き起こされる感染症または炎症性疾患である。
【０００７】
具体的な実施形態において、前記腫瘍は、黒色腫、肺がん、腎臓がん、卵巣がん、前立腺がん、乳がん、大腸がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、子宮がん、直腸がん、肛門がん、胃がん、精巣腫瘍、卵管がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膣がん、外陰がん、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道がん、小腸がん、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部肉腫、尿道がん、陰茎がん、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、小児固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱がん、腎臓または尿管がん、腎がん、中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍、原発性ＣＮＳリンパ腫、脊髄軸索、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮癌、Ｔ細胞リンパ腫を含むが、これらに限定されず、
【０００８】
前記ウイルスは、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、コロナウイルス、麻疹ウイルス、デングウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルスを含むが、これらに限定されず、
前記細菌は、クラミジア、リケッチア、マイコバクテリア、ブドウ球菌、肺炎球菌、コレラ菌、破傷風菌を含むが、これらに限定されず、
前記真菌は、カンジダ、アスペルギルス、皮膚炎芽酵母を含むが、これらに限定されず、
【０００９】
前記炎症性疾患は、強直性脊椎炎、自己免疫性溶血性貧血、関節炎、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、悪性貧血、多発性筋炎を含むが、これらに限定されない。
具体的な実施形態において、前記肺がんは、非小細胞肺がんであり、前記肝炎ウイルスは、Ａ型、Ｂ型またはＣ型肝炎ウイルスである。
【００１０】
第２の態様において、本発明は、本発明の第１の態様に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、溶媒和物、または前記化合物を含む薬物組成物を使用してＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の結合を阻害するステップを含む、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の結合を阻害する方法を提供する。
好ましい実施形態では、前記方法は、非治療目的で使用される。
【００１１】
第３の態様において、本発明は、本発明の第１の態様に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、溶媒和物及び薬学的に許容される賦形剤を含む、薬物組成物を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の範囲内で、本発明の上記の技術的特徴及び以下に（例えば、実施例）具体的に説明する技術的特徴を互いに組み合わせて、新規または好ましい技術的解決策を形成できることを理解されたい。スペースの制限のため、ここでは繰り返さない。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例２の１４％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動により精製後のＰＤ−１組換えタンパク質を分析した結果を示す。当該標的バンド位置の分子量の大きさは１３ ｋＤａであり、理論分子量の大きさと一致する。
【図２】実施例３の精製後のヒトＰＤ−１のＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ同定図を示す。
【図３】化合物１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３及びヒトＰＤ−１タンパク質を定数に結合して測定したＳＰＲ図を示す。
【図４】化合物１、２、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３及びＰＤ−Ｌ１タンパク質がヒトＰＤ−１タンパク質にに競合的に結合するＳＰＲ〜を示し、化合物がヒトＰＤ−１及びヒトＰＤ−Ｌ１の結合をブロックすることができることを示す。
【図５】化合物６、８、１０、１１、１３が枯渇したＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞がＩＬ−２を分泌する能力を回復できることを示し、化合物がＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞の関連する免疫機能をある程度回復できることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
広範囲にわたる綿密な研究の後、発明者らは、一連の構造的に近いサポニン化合物がＰＤ−１を標的とし、それによってＰＤ−１とその受容体間の相互作用をブロッキングし、腫瘍、細菌、ウイルスまたは真菌によって引き起こされる感染症または炎症性疾患を治療することを発現した。本発明は、これに基づいて完成された。
【００１５】
ＰＤ−１
ＰＤ−１は、Ｔ細胞の表面の重要な免疫抑制受容体であり、２８８アミノ酸からなる免疫グロブリンスーパーファミリーＩ型膜貫通糖タンパク質であり、最初はマウスのアポトーシスハイブリドーマ及び造血前駆細胞株からサブトラクティブハイブリダイゼーション技術によってクローンして獲得され、アポトーシスに関連すると考えられて、プログラムされた死の分子−１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｄｅａｔｈ−１，ＰＤ−１）と名付けられた。ＰＤ−１タンパク質は、主にＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞で誘導的にアップレギュレートされて発現される。ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２は、ＰＤ−１の２つの内因性リガンドであり、ＰＤ−Ｌ１は、活性化されたＴ細胞、Ｂ細胞、単球及び多くの種類の腫瘍細胞ですべて発現されるが、ＰＤ−Ｌ２は主に、活性化されたマクロファージ、樹状細胞、骨髄由来間質細胞及び個々の腫瘍細胞で発現される。従って、ＰＤ−Ｌ１はＰＤ−Ｌ２より一般的である。多数の研究により、活性化されたＴ細胞上のＰＤ−１とそのリガンドとの相互作用は、エフェクターＴ細胞の生物学的機能を著しく阻害して、一部の腫瘍の自己免疫回避、自己免疫疾患、ウイルス感染症疾患などを引き起こす可能性があることが示されている。ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２間の相互作用をブロックすることは、優れた応用見通しがある。
【００１６】
現在、ＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１経路に対する抗体は、主に１、ＰＤ−１に結合してＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の相互作用をブロックし、２、ＰＤ−Ｌ１に結合してＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の相互作用をブロックする２つのタイプに分類される。ＰＤ−１に結合する抗体は主にＮｉｖｏｌｕｍａｂとＰｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂを代表とし、ＰＤ−Ｌ１に結合する抗体は主にＢＭＳ−９３６５５９とＭＰＤＬ３２８０Ａを代表とする。しかし、これらの大分子抗体薬物は、製造コストが高く、免疫原性が生成されやすいなどの欠点がある。したがって、生産コストが低く、免疫原性が生成しにくく、組織に浸透しやすく、安定性がより良い小分子薬物の研究は、優れた応用見通しがある。
具体的な実施形態において、本発明によるＰＤ−１は、ヒトＰＤ−１、即ちｈＰＤ−１である。
【００１７】
本発明のサポニン系化合物
本明細書で言及されるいくつかのラジカルは、次のように定義される。
本明細書において、「アルキル基」とは低級アルキルを指し、即ち、１〜６個の炭素原子の炭素鎖長を有する飽和分岐鎖または直鎖アルキルを指す。アルキル基の例は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ヘキシルなどを含むが、これらに限定されない。アルキル基は、ハロゲンまたはハロゲン化アルキル基などの１つまたは複数の置換基で置換されていてもよい。例えば、アルキル基は、１〜４個のフッ素原子で置換されたアルキル基であってもよく、またはフルオロアルキル基で置換されたアルキル基であってもよい。
【００１８】
本明細書において、用語「置換された」が置換されたアルコキシ基などのある基を定義または修飾するために使用される場合、定義または修飾された基が１つまたは複数の置換基で置換され得ることを意味する。例えば、定義または修飾されたラジカルは、置換基の数がラジカルの原子価要件を満たす限り、１〜６、１〜３、または１つの置換基で置換される。具体的な実施形態において、前記置換基は、ハロゲン（ただし、これに限定されない）、低級アルキル（例えば、１〜３個の炭素原子のアルキル基）基、ヒドロキシル基、ニトロ基、シアノ基などである。
本明細書において、「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素、及びヨウ素を指す。
【００１９】
本明細書において、「カルボキシ基」は、構造式が「−ＲＣＯＯＨ」である基を指し、ここで、Ｒは、１〜３個の炭素原子の低級アルキル基などの置換または非置換アルキル基である。具体的な実施形態において、カルボキシル基はＣＯＯＨである。
【００２０】
本明細書において、前記「エステル基」とは、構造式が「−ＲａＣＯＯＲｂ」である基を指し、ここで、Ｒａは０〜３の炭素原子のアルキル基であり、Ｒｂは１〜３の炭素原子のアルキル基であるため、本明細書に記載のエステル基は、２〜７個の炭素原子の置換または非置換エステル基であってもよい。具体的な実施形態において、本明細書に記載のエステル基には、ギ酸メチル、ギ酸エチル、ギ酸プロピル、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、プロピオン酸メチル、プロピオン酸エチル、プロピオン酸プロピルを含むが、これらに限定されない。
【００２１】
具体的な実施形態において、本発明の式ＩまたはＩＩで表されるサポニン系化合物またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、溶媒和物は、ＰＤ−１を標的とする薬物の調製に使用することができ、
【化６】
2020526594.tif 000012
式において、
Ｒ１は、Ｈ、
【化７】
2020526594.tif 000013
から選択され、
【００２２】
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立的にＨ、置換または非置換のＣ１−６アルキル（好ましくは、置換または非置換のＣ１−３アルキル）、ＯＨ、置換または非置換のＣ１−６アルキレンヒドロキシル（好ましくは、置換または非置換のＣ１−３アルキレンヒドロキシル）から選択され、
【００２３】
Ｒ４は、Ｈ、ＯＨ、置換または非置換のＣ１−６アルコキシ（好ましくは、置換または非置換のＣ１−３アルコキシ）、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ１１から選択され、Ｒ１１は、水素または置換または非置換のＣ１−６アルキルから選択され、好ましくはＨまたは置換または非置換のＣ１−３アルキルであり、
Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立的にＨ、置換または非置換のＣ１−６アルキル（好ましくは、置換または非置換のＣ１−３アルキル）から選択され、
Ｒ７は、Ｈ、ＯＨから選択され、
Ｒ８は、Ｈ、１−３個の炭素原子のカルボキシル基、２−７個の炭素原子的置換または非置換のエステル、
【化８】
2020526594.tif 000014
から選択され、
Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立的にＨ、置換または非置換のＣ１−６アルキル（好ましくは、置換または非置換のＣ１−３アルキル）、ＯＨから選択される。
【００２４】
当業者は、上記式ＩＩで表される化合物中のＲ１及びＲ８も特定の立体配置を有し得ることを知っている。従って、さらなる実施形態において、式ＩＩで表される化合物は、下記式で表される化合物であり、
【化９】
2020526594.tif 000015
式中のＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０はそれぞれ、上記で限定されたとおりである。
例えば、本発明の式ＩまたはＩＩで表されるサポニン系化合物は、以下の群から選択される化合物である。
【表２−１】
2020526594.tif 000016
【表２−２】
2020526594.tif 000017
【表２−３】
2020526594.tif 000018
【表２−４】
2020526594.tif 000019
【００２５】
本発明の化合物は、ＰＤ−１とそのリガンドの結合を阻害することにより疾患を治療する薬物である。前記疾患は、疾患は、腫瘍、細菌、ウイルスまたは真菌によって引き起こされる感染症または炎症性疾患であることができる。例えば、前記腫瘍は、黒色腫、肺がん、腎臓がん、卵巣がん、前立腺がん、乳がん、大腸がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、子宮がん、直腸がん、肛門がん、胃がん、精巣腫瘍、卵管がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膣がん、外陰がん、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道がん、小腸がん、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部肉腫、尿道がん、陰茎がん、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、小児固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱がん、腎臓または尿管がん、腎がん、中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍、原発性ＣＮＳリンパ腫、脊髄軸索、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮癌、Ｔ細胞リンパ腫を含むが、これらに限定されず、前記ウイルスは、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、コロナウイルス、麻疹ウイルス、デングウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルスを含むが、これらに限定されず、前記細菌は、クラミジア、リケッチア、マイコバクテリア、ブドウ球菌、肺炎球菌、コレラ菌、破傷風菌を含むが、これらに限定されず、前記真菌は、カンジダ、アスペルギルス、皮膚炎芽酵母を含むが、これらに限定されず、前記炎症性疾患は、強直性脊椎炎、自己免疫性溶血性貧血、関節炎、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、悪性貧血、多発性筋炎を含むが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、前記肺がんは、非小細胞肺がんであり、前記肝炎ウイルスは、Ａ型、Ｂ型またはＣ型肝炎ウイルスである。
【００２６】
これに基づいて、本発明は、本発明のサポニン系化合物またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、溶媒和物、または前記化合物を含む薬物組成物を使用してＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の結合を阻害するステップを含むＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の結合を阻害する方法をさらに提供する。当業者は、前記方法が、科学研究目的などに限定されず、非治療目的に使用できることを理解するであろう。
【００２７】
本発明の化合物の薬学的に許容される塩の例は、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、マンデル酸塩およびシュウ酸塩などの無機および有機酸塩、及び水酸化ナトリウム、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ、トロメタミン）およびＮ−メチルグルコサミンなどの塩基で形成される無機および有機塩基塩を含むが、これらに限定されない。
【００２８】
人それぞれの需要は異なるが、当業者は投与される化合物の量を決定できる。投与量は、１つまたは複数の状態を改善または排除するのに有効な量である。特定の疾患の治療のために、有効量とは、疾患に関連する症状を改善または何らかの方法で軽減するのに十分な量である。そのような用量は、単回用量として投与されてもよいし、効果的な治療計画に従って投与されてもよい。投与量は疾患を治すこともできが、通常は疾患の症状を改善するために投与される。症状の望ましい改善を達成するには、一般的に繰り返し投与が必要である。薬の投与量は、患者の年齢、健康状態、体重、同時治療の種類、治療の頻度、必要な治療効果に基づいて決定される。
【００２９】
本発明の化合物は、腫瘍やその他の疾患の治療に使用される非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮、経口、髄腔内、頭蓋内、鼻腔内、または局所投与経路用に製剤化されたものを含むがこれらに限定されない様々な投与経路に適した製剤に製剤化することもできる。
【００３０】
本発明の化合物を含む薬物製剤は、本発明の化合物の治療効果が得られる限り、任意の哺乳動物に投与することができる。これらの哺乳類の中で最も重要なのは人間である。
【００３１】
本発明の化合物を含む薬物製剤は、既知の方法で製造することができる。例えば、従来の混合、造粒、インゴット製造、溶解、または凍結乾燥プロセスによって製造される。経口製剤を製造する場合、固体賦形剤と活性化合物を組み合わせて、混合物を選択的に粉砕することができる。需要であるか、必要な場合、適切な量のアジュバントを加えた後、顆粒混合物を加工して錠剤または錠剤芯を獲得する。
【００３２】
適切な賦形剤は、特に、ラクトースまたはスクロースなどの糖、マンニトールまたはソルビトールなどの充填剤と、リン酸三カルシウムまたは二塩基性リン酸カルシウムなどのセルロース製剤またはリン酸カルシウムと、及びコーンスターチ、小麦スターチ、米スターチ、ジャガイモスターチ、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、またはポリビニルピロリドンを含むスターチペーストなどの結合剤である。需要に応じて、上記のデンプン、及びカルボキシメチルデンプン、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸またはアルギン酸ナトリウムなどのその塩などの崩壊剤を添加してもよい。アジュバントは、特に、流量調節剤および潤滑剤、例えば、シリカ、タルク、ステアリン酸マグネシウムカルシウム、ステアリン酸またはポリエチレングリコールなどのステアリン酸塩系である。需要に応じて、錠剤芯に胃液に耐性のある適切なコーティングを施してもよい。この目的のために、濃縮糖液を適用することができる。この溶液は、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコールおよび／または二酸化チタン、ラッカー溶液および適切な有機溶媒または溶媒混合物を含んでもよい。胃液耐性コーティングを調製するには、セルロースアセテートフタレートまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートなどの適切なセルロース溶液を使用することができる。錠剤または錠剤芯のコーティングに染料または顔料を追加することができる。これは、例えば、活性成分の投与量の組み合わせを特定したり、特徴付けたりするためである。
【００３３】
具体的な投与方法は、当該分野で公知の種々の投与方法に限定されないが、患者の実際の状況に従って決定することができる。これらの方法は、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮、経口、髄腔内、頭蓋内、鼻腔内、または局所投与経路を含むが、これらに限定されない。
【００３４】
本発明の利点：
１．本発明は、ＰＤ−１とそのリガンドの結合を阻害することができる一連のサポニン化合物を初めて発見した。
２．本発明の化合物は天然物であるため、入手が容易であり、毒性および副作用が低いという利点がある。
３．本発明の化合物は、ＰＤ−１、特にｈＰＤ−１の阻害剤の開発のための新しい物質的基礎を提供する。
【００３５】
以下、具体的な実施例と結び付けて、本発明の技術的解決策をさらに説明するが、以下の実施例は本発明を限定するものではなく、本発明の原理および技術的手段に従って採用される様々な適用方法はすべて、本発明の範囲に属する。
【００３６】
以下の実施例に具体的な条件のない実験方法は、通常、従来の条件またはメーカーが推奨する条件に基づく。特に明記しない限り、パーセンテージおよび部数は重量によって計算される。
【００３７】
実施例１．ＰＤ−１発現ベクターの構築
関連文献により、標的遺伝子がヒトＰＤ−１である３４−１５０アミノ酸を選択した。ＮＣｏＩ及びＮｄｅＩの２つの酵素分解ポイントを使用して、標的遺伝子をｐＥＴ−２８ａベクターにクローニングした。最初に、ヒトＰＤ−１遺伝子をＰＣＲ増幅するために、ＮＣｏＩ及びＮｄｅＩの２つの酵素分解ポイントに基づいて特異的なプライマーを設計した。次に、従来のクローニング方法を使用してベクタープラスミドとＰＣＲ産物をＮＣｏＩ及びＮｄｅＩの２つを制限酵素で二重消化し、Ｔ４リガーゼの作用下で連結して組換えプラスミドを形成し、最後に組換えプラスミドを大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換した。一晩培養した後、同定のために単一のクローンを選択した。
【００３８】
実施例２．ＰＤ−１タンパク質の発現及び精製
会社のシーケンシング後、序列が完全に一致する細菌溶液を選択して一晩培養し、プラスミドを抽出した後、プラスミドを発現用宿主大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換して発現した。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換された単一のクローンを取り、カナマイシンを含む２０ ｍＬの２×ＹＴ培地に入れ、３７ ℃のシェーカーで一晩培養した。翌日、培養された産物をカナマイシン含有ＴＢ培地に移し、３７ ℃でＯＤ６００が０.６〜０.８になるまで培養し、０.５ ｍＭ  ＩＰＴＧを添加して、３７ ℃で５〜７ 時間誘導した。４０００ ｒｐｍで遠心分離して細菌を収集し、大腸菌を溶解バッファー（５０ ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８.０、５０ ｍＭ  ＮａＣｌ、１ ｍＭ  ＤＴＴ、０.５ ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ ％のグリセロール）で溶解し、高圧下で粉砕し、１２０００ｒｐｍで６０ 分間遠心分離し、沈殿物を取った。洗浄バッファー（２０ ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８.０、２ Ｍ尿素、２.５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）で３回洗浄し、沈殿物を取った。次に、タンパク質を溶解バッファー（２０ ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８.０、８ Ｍ尿素）に溶解し、上清を遠心分離した。３ ｋＤａの限外ろ過濃縮チューブを使用してタンパク質を５ ｍＬ程度に濃縮し、１ Ｌの再生バッファー（５０ ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８.０、５０ ｍＭ  Ｌ−Ａｒｇ、２４ ｍＭ  ＮａＣｌ、１ ｍＭ  ＫＣｌ、１ ｍＭ  ＥＤＴＡ）に追加し、４ ℃で２４時間希釈法により再生した。次に、３ｋＤａ濃縮チューブを使用してタンパク質を約２０ ｍＬ程度に濃縮し、タンパク質を透析バッグに入れ、透析バッファー（５０ ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８.０、１５０ ｍＭ  ＮａＣｌ、１ ｍＭ  ＤＴＴ）で一晩透析した。その目的は、再生バッファーのＬ−Ａｒｇを置換することである。濃縮し、陽イオン交換カラムおよびモレキュラーシーブにより精製した。モレキュラーシーブ後のタンパク質を１４ ％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動にかけ、精製後のタンパク質の純度を同定した。結果は、図１に示されたように、精製して得られたタンパク質の分子量は１３ ｋＤａ程度であり、これは理論的に計算されたヒトＰＤ−１タンパク質の分子量と一致し、タンパク質の純度は高かった。
【００３９】
実施例３．ＰＤ−１タンパク質の同定
精製した後のＰＤ−１タンパク質を１４  ％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動にかけ、膜を転写し、膜転写電流を３００ ｍＡに設定し、膜転写時間を４５分にした。次に、膜を室温で５ ％脱脂粉乳で２時間ブロックした。取り出した後、マウス抗ヒトＰＤ−１モノクローナル抗体で４ ℃で一晩インキュベートし、１×ＴＢＳＴ溶液で３回すすぎ、ヤギ抗マウスモノクローナル抗体で室温で２時間インキュベートし、１×ＴＢＳＴで３回すすいだ。現像液を追加した後、完全自動の化学発光画像解析システムで現像した。結果は図２に示されたように、１０〜１５ ｋＤａの間にタンパク質バンドがあり、ＰＤ−１抗体の下で現像できるため、精製して得られたタンパク質が確実にヒトＰＤ−１タンパク質であることを示している。
【００４０】
実施例４．ＳＰＲによりサポニン系天然産物のＰＤ−１への結合定数の測定
実施例で使用されている天然産物は、宝鶏市辰光生物有限公司から購入した。
表面プラズモン共鳴技術（ＳＰＲ）を使用して、天然産物とＰＤ−１タンパク質間との結合親和性を測定した。具体的な実験手順は次のとおりである：最初に、精製した後のタンパク質を５０ ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ  ８.０、２５０  ｍＭ  ＮａＣｌ、１ ｍＭ  ＤＴＴバッファーに交換し、タンパク質をｐＨ  ４.５酢酸ナトリウムで５０ μｇ／ｍｌに希釈し、アミノカップリングキットでタンパク質をＣＭ７チップにカップリングし、１０ μｌ／ｍｉｎの流速で６００秒間結合し、最終的なカップリング量は約１３０００ＲＵである。カップリングが完了した後、ＣＭ７チップをバッファー（１.０５×ＰＢＳ、０.０５ ％Ｐ２０）で安定状態に平衡化した。次に、ランニングバッファー（１.０５×ＰＢＳ、０.０５ ％Ｐ２０、１ ％ＤＭＳＯ）で化合物を一連の異なる濃度に希釈し、ランニングバッファーでチップ表面を流し、流速は３０ μＬ／分であり、結合時間は９０秒であり、解離時間は１２０秒である。最終データを、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ２.０ソフトウェアで分析し、定常状態フィッティングによってＫＤ値を取得した。測定された化合物のＫＤ値を以下の表１に示した。
表１、本発明における小分子化合物と組換えヒトＰＤ−１タンパク質の結合親和性ＫＤ値
【表３】
2020526594.tif 000020
【００４１】
実施例５．ＰＤ−Ｌ１タンパク質とサポニン系天然産物がＰＤ−１に競争的結合するＳＰＲ実験
上記の実施例の結果に基づいて、本発明者らは、化合物とＰＤ−Ｌ１をＰＤ−１に競合的に結合させ、化合物がＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１への結合をブロックできるかどうかを調べた。ＰＤ−Ｌ１タンパク質はＢｅｉｊｉｎｇ  Ｙｉｑｉａｏ  Ｓｈｅｎｚｈｏｕ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄから購入した。具体的な実験手順は次のとおりである。アミノカップリング方法により５０ μｇ／ｍｌ  ＰＤ−Ｌ１タンパク質をＣＭ５チップにカップリングした。カップリング量は約３７８０ＲＵである。異なる濃度の化合物と３ μＭＰＤ−１タンパク質を氷上で３０分間インキュベートした。ランニングバッファー（１.０５×ＰＢＳ、０.０５ ％Ｐ２０、１ ％ＤＭＳＯ）がチップ表面を流し、流速は３０ μＬ／分であり、結合時間は９０秒であり、解離時間は１２０秒である。最終データをＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ２.０ソフトウェアで分析し、結果は、図３に示したとおりである。化合物濃度が増加すると、チップ上のＰＤ−Ｌ１タンパク質に結合したＰＤ−１タンパク質が減少するため、応答値が減少した。この実験の結果は、化合物がＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１への結合をブロックできることを示している。
【００４２】
実施例６．ＥＬＩＳＡによるＴ細胞におけるＩＬ-２分泌レベルの検出
本発明者らは、細胞機能実験の評価のためにいくつかの化合物を選択した。刺激されたＢｘＰＣ−３腫瘍細胞とＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞を３：１の比率で９６ウェルプレートで共培養し、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞を陰性対照として単独培養した。実験群に５０ μＭの化合物を添加し、同じＤＭＳＯ含有量のＤ−ｈａｎｋ’ｓ溶液を陰性対照として使用した。二酸化炭素セルインキュベーターで４８時間インキュベートした。上清培養培地を収集し、ＥＬＩＳＡキットによりＩＬ−２の分泌量を検出した。実験は３回繰り返した。結果は、図４に示し多様に、腫瘍細胞とＴ細胞を共培養した後、そのＴ細胞によって産生されるＩＬ−２の量は５５ ％程度抑制され、そして、５０ μＭの化合物６を加えるとＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞によって産生されるＩＬ−２の量を３０ ％程度増加させ、５０ μＭの化合物８を加えるとＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞によって産生されるＩＬ−２の量を１７ ％程度増加させ、５０ μＭの化合物１０を加えるとＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞によって産生されるＩＬ−２の量を３０％程度増加させ、５０ μＭの化合物１１を加えるとＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞によって産生されるＩＬ−２の量を１２ ％程度増加させ、５０  μＭの化合物１３を加えるとＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞によって産生されるＩＬ−２の量を２３ ％程度増加させ、３回の繰り返した実験にすべてこの効果があった。当該実験の結果は、化合物がＴ細胞の機能をある程度回復できることを示している。
【００４３】
論議：本発明の化合物及びその天然サポニン系産物は、ＰＤ−１タンパク質に結合することができ、ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１の結合を遮断することができる。また、ＥＬＩＳＡ実験では、化合物がＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞によって分泌されたＩＬ−２のレベルをある程度回復できる、即ちＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞の機能をある程度回復できることが分かった。
【００４４】
本発明で言及されるすべての文書は、あたかも各文書が個々に参照により組み込まれたかのように、本出願に参照により組み込まれている。さらに、本発明の上記の教示内容を読んだ後、当業者は本発明に様々な変更または修正を加えることができ、これらの同等の形態も本願に添付された特許請求の範囲によって定義される範囲内にあることを理解されたい。
【図１】
2020526594.tif 000031
【図２】
2020526594.tif 000032
【図３−１】
2020526594.tif 000033
【図３−２】
2020526594.tif 000034
【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
2020526594.tif 000037
【図３−６】
2020526594.tif 000038
【図３−７】
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【図４−１】
2020526594.tif 000040
【図４−２】
2020526594.tif 000041
【図４−３】
2020526594.tif 000042
【図４−４】
2020526594.tif 000043
【図４−５】
2020526594.tif 000044
【図４−６】
2020526594.tif 000045
【図４−７】
2020526594.tif 000046
【図５−１】
2020526594.tif 000047
【図５−２】
2020526594.tif 000048
【図５−３】
2020526594.tif 000049
【国際調査報告】
2020526594.tif 000050
2020526594.tif 000051
2020526594.tif 000052
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2020526594.tif 000054
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2020526594.tif 000056
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