(57)【要約】本発明のある種の局面は、網膜症などの疾患の処置のために治療用細胞を提供するための体細胞の再プログラミングに指向している。本発明のある種の局面は、他の目的の細胞型への変換を化学的に誘導することができる5種類の低分子（5C）を含む再プログラミング組成物、ならびに体細胞を再プログラミングするためのそのような組成物の使用に指向している。2020524501.tif 000005
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）体細胞を目的の細胞へ変換する再プログラミング物質の存在下で該体細胞を培養する工程であって、（i）エピジェネティック修飾物質、（ii）グリコーゲン合成酵素キナーゼ3（GSK-3）阻害物質、（iii）TGFβR/ALK5阻害物質、（iv）cAMP上昇化合物を含む、第1の再プログラミング組成物と、増強物質を含む第2の再プログラミング組成物とを該再プログラミング物質が含み、該培養によって、再プログラミングされた細胞培養物が形成される、工程；および
（b）該再プログラミングされた細胞培養物中の該目的の細胞を同定する工程
を含む、該体細胞を目的の細胞へ化学的に変換する方法。
【請求項２】
前記エピジェネティック修飾物質がシトクロムP450 2C9（CYP2C9）阻害物質である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記シトクロムP450 2C9（CYP2C9）阻害物質がバルプロ酸である、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記グリコーゲン合成酵素キナーゼ3（GSK-3）阻害物質がCHIR99021である、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
前記TGFβR/ALK5阻害物質がRepsoxである、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
前記アデニルシクラーゼ活性化物質がフォルスコリンである、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
前記体細胞が、線維芽細胞、単球、上皮細胞、血液から単離された細胞、皮膚線維芽細胞、ケラチノサイト、または尿由来上皮細胞である、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
前記体細胞が、ミュラー細胞、または網膜に存在する細胞である、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
前記網膜に存在する細胞が、グリア細胞、アストロサイト、または免疫細胞である、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
前記増強物質が、WNT阻害物質、PKC阻害物質、p160ROCK阻害物質、神経原性物質、TGFβR阻害物質、MEK1/2阻害物質、ヒストン脱アセチル化酵素阻害物質、TGFβR/ALK5阻害物質、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害物質、および/またはGSK-3阻害物質などの増強物質である、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
前記増強物質がWNT阻害物質である、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
前記WNT阻害物質がIWR-1またはXAV939である、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
前記増強物質が、CHIR990211などのWNTアゴニストである、請求項1に記載の方法。
【請求項１４】
前記増強物質がWNTアゴニストおよびWNTアンタゴニストである、請求項12に記載の方法。
【請求項１５】
前記WNT阻害物質がIWR-1またはXAV939であり、かつ前記WNTアゴニストがCHIR99021である、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
アキシン2が、薬理学的に安定化されて、網膜細胞型につながるミトコンドリア活性酸素種生成およびエピジェネティック修飾をもたらす、請求項1に記載の方法。
【請求項１７】
前記目的の細胞が肝細胞、心筋細胞、感覚有毛細胞、または網膜細胞である、請求項1に記載の方法。
【請求項１８】
前記体細胞がマトリックス上で培養される、請求項1に記載の方法。
【請求項１９】
前記マトリックスがマトリゲルまたはフィブロネクチンである、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
前記培養する工程によって三次元オルガノイドが形成される、請求項1に記載の方法。
【請求項２１】
前記網膜細胞が、網膜光受容細胞、網膜神経節細胞、または網膜色素上皮細胞である、請求項17に記載の方法。
【請求項２２】
前記体細胞を培養する工程が、
該体細胞を播種すること；
（i）エピジェネティック修飾物質、（ii）グリコーゲン合成酵素キナーゼ3（GSK-3）阻害物質、（iii）TGFβR/ALK5阻害物質、（iv）cAMP上昇化合物を含む、第1の再プログラミング組成物に、誘導された細胞集団を形成する第1の誘導期の間、播種された該体細胞を曝露して、
増強物質を含む第2の再プログラミング組成物に、網膜細胞集団を形成する第2の誘導期の間、該誘導された細胞集団を曝露すること
を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項２３】
前記増強物質がWNT阻害物質である、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
前記WNT阻害物質がIWR-1である、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
変換前に前記体細胞を操作する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項２６】
操作が、欠陥のある遺伝性遺伝子を置換するための遺伝子編集を含む、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
請求項1〜24のいずれか一項に記載の方法によって作製された、肝細胞、心筋細胞、または網膜細胞。
【請求項２８】
光受容細胞、RGC細胞、またはRPE様細胞である、請求項27に記載の網膜細胞。
【請求項２９】
（a）体細胞を目的の細胞へ変換する再プログラミング物質の存在下で該体細胞を培養する工程であって、（i）エピジェネティック修飾物質、（ii）グリコーゲン合成酵素キナーゼ3（GSK-3）阻害物質、（iii）TGFβR/ALK5阻害物質、（iv）cAMP上昇化合物を含む、第1の再プログラミング組成物と、増強物質を含む第2の再プログラミング組成物とを該再プログラミング物質が含み、該培養によって、再プログラミングされた細胞培養物が形成される、工程；および
（b）該再プログラミングされた細胞培養物中の該目的の細胞を同定する工程
を含む、網膜色素上皮細胞を生成する方法。
【請求項３０】
変換前に前記体細胞を操作する工程をさらに含む、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
操作が、欠陥のある遺伝性遺伝子を置換するための遺伝子編集を含む、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
（a）体細胞を目的の細胞へ変換する再プログラミング物質の存在下で該体細胞を培養する工程であって、（i）エピジェネティック修飾物質、（ii）グリコーゲン合成酵素キナーゼ3（GSK-3）阻害物質、（iii）TGFβR/ALK5阻害物質、（iv）cAMP上昇化合物を含む、第1の再プログラミング組成物と、増強物質を含む第2の再プログラミング組成物とを該再プログラミング物質が含み、該培養によって、再プログラミングされた細胞培養物が形成される、工程；および
（b）該再プログラミングされた細胞培養物中の該目的の細胞を同定する工程
を含む、光受容細胞を生成する方法。
【請求項３３】
変換前に前記体細胞を操作する工程をさらに含む、請求項32に記載の方法。
【請求項３４】
操作が、欠陥のある遺伝性遺伝子を置換するための遺伝子編集を含む、請求項33に記載の方法。
【請求項３５】
（a）体細胞を目的の細胞へ変換する再プログラミング物質の存在下で該体細胞を培養する工程であって、（i）エピジェネティック修飾物質、（ii）グリコーゲン合成酵素キナーゼ3（GSK-3）阻害物質、（iii）TGFβR/ALK5阻害物質、（iv）cAMP上昇化合物を含む、第1の再プログラミング組成物と、増強物質を含む第2の再プログラミング組成物とを該再プログラミング物質が含み、該培養によって、再プログラミングされた細胞培養物が形成される、工程；および
（b）該再プログラミングされた細胞培養物中の該目的の細胞を同定する工程
を含む、網膜前駆細胞を生成する方法。
【請求項３６】
変換前に前記体細胞を操作する工程をさらに含む、請求項35に記載の方法。
【請求項３７】
操作が、欠陥のある遺伝性遺伝子を置換するための遺伝子編集を含む、請求項36に記載の方法。
【請求項３８】
それを必要とする対象の眼へ、請求項1〜35のいずれか一項によって作製された細胞の有効量を送達する工程を含む、該対象において眼の障害を処置する方法。
【請求項３９】
前記障害が、網膜委縮、視神経損傷、視神経萎縮、加齢黄斑変性、遺伝性網膜変性、糖尿病性網膜症、鎌状赤血球網膜症、緑内障、嚢胞様黄斑浮腫、網膜剥離、血管閉塞、光受容細胞変性、感染症、視力喪失、およびそれらの任意の組み合わせである、請求項38に記載の方法。
【請求項４０】
前記障害が緑内障である、請求項38に記載の方法。
【請求項４１】
それを必要とする対象の耳または頭皮へ、再プログラミング組成物または請求項1〜35のいずれか一項によって作製された細胞の有効量を送達する工程を含む、該対象において耳内の有毛細胞の再生もしくは幼若化によって聴覚喪失を処置するかまたは毛包内の幹細胞の再生、再活性化、もしくは幼若化によって脱毛症を処置する方法。
【請求項４２】
それを必要とする対象の眼へ、（i）エピジェネティック修飾物質と（ii）グリコーゲン合成酵素キナーゼ3（GSK-3）阻害物質と（iii）TGFβR/ALK5阻害物質と（iv）cAMP上昇化合物と（v）増強物質との組み合わせの有効量を送達する工程を含む、該対象において眼の障害を処置する方法。
【請求項４３】
低分子の組み合わせが眼内注射によって投与される、請求項42に記載の方法。
【請求項４４】
幹細胞または前駆細胞を分化させるため、低分子（VCRFIおよび/またはSTR）の全てまたは組み合わせを使用する方法。
【請求項４５】
前記幹細胞または前駆細胞が、3Dマトリックス中でまたはオルガノイドとして培養される、請求項44に記載の方法。
【請求項４６】
前記幹細胞または前駆細胞が網膜系統へ変換される、請求項44に記載の方法。
【請求項４７】
老化した細胞を幼若化するため、低分子（VCRFIおよび/またはSTR）の全てまたは組み合わせを使用する方法。
【請求項４８】
損傷した細胞、疾患を有する細胞、および/または老化した細胞の機能を回復するため、低分子（VCRFIおよび/またはSTR）の全てまたは組み合わせを使用する方法。
【請求項４９】
（a）体細胞を目的の細胞へ変換する再プログラミング物質の存在下で該体細胞を培養する工程であって、（i）エピジェネティック修飾物質、（ii）グリコーゲン合成酵素キナーゼ3（GSK-3）阻害物質、（iii）TGFβR/ALK5阻害物質、（iv）cAMP上昇化合物を含む、第1の再プログラミング組成物と、増強物質を含む第2の再プログラミング組成物とを該再プログラミング物質が含み、該培養によって、再プログラミングされた細胞培養物が形成される、工程；および
（b）該再プログラミングされた細胞培養物中の該目的の細胞を同定する工程
を含む、網膜神経節細胞を生成する方法。
【請求項５０】
変換前に前記体細胞を操作する工程をさらに含む、請求項49に記載の方法。
【請求項５１】
操作が、欠陥のある遺伝性遺伝子を置換するための遺伝子編集を含む、請求項50に記載の方法。
【請求項５２】
試験作用物質の有効性を判定するため、変換された細胞を該試験作用物質と接触させる工程を含む、診断またはスクリーニングの方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、参照によりその全体が本明細書中に組み入れられる2017年6月15日に出願された米国仮特許出願第62/520,290号に基づく優先権を主張する。
【０００２】
連邦政府の支援に関する項目
本発明は、National Institutes of Healthによって授与されたEY021171およびEY025667の下で政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明においてある特定の権利をする。
【０００３】
A.発明の分野
本発明は、一般に、体細胞を再プログラミングするための組成物および方法に関する。具体的には、組成物および方法は、心筋細胞または網膜細胞への体細胞の再プログラミングを含む。
【背景技術】
【０００４】
B.関連分野の説明
大部分の網膜疾患における視力喪失は、網膜光受容細胞および/または網膜色素上皮細胞（RPE）の喪失による。細胞置換治療は、機能を回復するかまたは保存するため、これらの失われた網膜細胞を置換するためのものである。幹細胞治療は、現在、細胞置換治療の最先端にあり、当技術分野において極めて精力的に研究されており、数件の初期ヒト臨床試験を有するいくつかのバイオテックスタートアップが生まれている。しかしながら、幹細胞アプローチは、政治的問題および倫理的問題、植え込まれた細胞の腫瘍成長に関する懸念、ウイルスの使用に関する懸念、ならびに宿主拒絶に関する懸念のため、限定されている。幹細胞を使用することなく、網膜置換細胞およびその他の細胞型を生成することは、有利であろう。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の組成物は、細胞置換治療、具体的には、幹細胞治療に関連した問題の解決策を提供する。具体的には、本発明は、幹細胞ではなく体細胞に基づく治療用細胞を提供する。例えば、本発明者らは、視力喪失などの疾患を処置するための適切な特徴を有する治療用細胞をもたらす、体細胞を再プログラミングするための方法を発見した。理論によって拘束されることは望まないが、本明細書中に記載された培養条件の使用は、筋細胞または網膜細胞のような特定の目的の細胞型への体細胞の再プログラミングをもたらすと考えられる。
【０００６】
網膜ニューロン機能障害および網膜ニューロン死は、多くの後天性および遺伝性の網膜症における失明の一般的な最終エンドポイントである。本発明のある種の局面は、網膜症のような疾患の処置のために治療用細胞を提供するための体細胞の再プログラミングに指向している。本発明のある種の局面は、他の目的の細胞型への変換を化学的に誘導することができる5種類の低分子（5C）を含む再プログラミング組成物、ならびに体細胞を再プログラミングするためのそのような組成物の使用に指向している。
【０００７】
具体的な局面において、線維芽細胞は、化学的に誘導された光受容細胞前駆細胞様細胞（CiPPC）、化学的に誘導された光受容細胞（ciPR）、化学的に誘導された網膜色素上皮細胞（ciRPE）、または化学的に誘導された網膜神経節細胞（ciRGC）へ変換される。集合的に、これらの細胞は、化学的に誘導された網膜細胞（ciRC）と呼ばれる。CiPPCは、ネイティブP5光受容細胞前駆細胞と比較して類似したトランスクリプトームサインを有し、杆体光受容細胞変性マウスであるRD1マウスにおいて、網膜電図（ERG）および瞳孔測定（PLR）の改善によって証拠付けられる機能的改善を示す。
【０００８】
本発明のある種の態様は、体細胞を目的の細胞へ化学的に変換する方法、およびこれらの方法によって作製された目的の細胞に指向している。ある種の局面において、目的の細胞は、肝細胞、心筋細胞、有毛感覚細胞、または網膜細胞である。方法は、（a）体細胞を目的の細胞へ変換する再プログラミング物質の存在下で体細胞を培養する工程であって、（i）エピジェネティック修飾物質、（ii）グリコーゲン合成酵素キナーゼ3（GSK-3）阻害物質、（iii）TGFβR/ALK5阻害物質、（iv）cAMP上昇化合物（例えば、アデニルシクラーゼ活性化物質）を含む、第1の再プログラミング組成物と、増強物質を含む第2の再プログラミング組成物とを再プログラミング物質が含み、培養によって、再プログラミングされた細胞培養物が形成される、工程；および（b）再プログラミングされた細胞培養物中の目的の細胞を同定する工程のうちの一つまたは複数を含み得る。培養の時間に基づき、様々な目的の細胞を同定し、単離することができる。網膜細胞は、網膜光受容細胞または網膜色素上皮細胞であり得る。
【０００９】
ある種の局面において、エピジェネティック修飾物質は、シトクロムP450 2C9（CYP2C9）阻害物質である。エピジェネティック修飾物質は、バルプロ酸（VPA）、5'-アザシチジン（5' Aza）、2-(ヘキサヒドロ-4-メチル-1H-1,4-ジアゼピン-1-イル)-6,7-ジメトキシ-N-[1-(フェニルメチル)-4-ピペリジニル]-4-キナゾリンアミン三塩酸塩水和物（BIX-01294）、またはそれらの組み合わせであり得る。具体的な局面において、エピジェネティック修飾物質は、VPAである。
【００１０】
グリコーゲン合成酵素キナーゼ3（GSK-3）阻害物質は、Li+、6-[2-[[4-(2,4-ジクロロフェニル)-5-(5-メチル-1H-イミダゾール-2-イル)ピリミジン-2-イル]アミノ]エチルアミノ]-ピリジン-3-カルボニトリル（CHIR99021）、(2'Z,3'E)-6-ブロモインディルビン-3'-オキシム（BIO）、3-(2,4-ジクロロフェニル)-4-(1-メチル-1H-インドール-3-イル)-1H-ピロール-2,5-ジオン（SB216763）、またはそれらの組み合わせであり得る。具体的な局面において、GSK-3阻害物質は、CHIR99021である。
【００１１】
TGFβR/ALK5阻害物質は、トランスフォーミング増殖因子受容体I型（TGFBR1）キナーゼ阻害物質（例えば、2-(3-(6-メチルピリジン-2-イル)-1H-ピラゾール-4-イル)-1,5-ナフチリジン（RepSox）、4-[4-(1,3-ベンゾジオキソール-5-イル)-5-(2-ピリジニル)-1H-イミダゾール-2-イル]ベンズアミド（SB-431542）、3-(6-メチル-2-ピリジニル)-N-フェニル-4-(4-キノリニル)-1H-ピラゾール-1-カルボチオアミド（A8301）、もしくはそれらの組み合わせ）、または抗TGFβ抗体、またはsiRNAなどの核酸物質のうちの1種類または複数種類などの、トランスフォーミング増殖因子β（TGFβ）シグナリング経路の阻害物質であり得る。具体的な局面において、TGFβR/ALK5阻害物質は、Repsoxである。
【００１２】
cAMP上昇化合物は、アデニルシクラーゼ活性化物質であり得る。具体的な局面において、アデニルシクラーゼ活性化物質は、フォルスコリンである。
【００１３】
増強物質は、再プログラミングされた細胞の作製の効率を増大させるか、または再プログラミングされた細胞の作製の速度を増加させる作用物質または化合物である。再プログラミングされた細胞の作製の「効率を増大させる」とは、所定の細胞集団の中の再プログラミングされた細胞の百分率が、増強物質によって処理されていないかまたは増強物質を投与されていない比較可能な細胞集団より、そのような作用物質によって処理された集団において、少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％であるか、またはそれより高いことを意味する。ある種の局面において、効率は、増強物質によって処理されていない集団より、2倍高いか、5倍高いか、10倍高いか、100倍高いか、1000倍高いか、またはそれ以上であり得る。再プログラミングされた細胞の作製の「速度を増加させる」とは、目的の細胞の誘導のために、より少ない時間、例えば、少なくとも2日少ないか、3日少ないか、4日少ないか、5日少ないか、6日少ないか、1週間少ないか、週間少ないか、3週間少ないか、またはそれより少ない時間がかかることを意味する。ある種の局面において、どの目的の細胞型がより多量に作製されるかを決定するのは、投与の型およびタイミング、ならびに増強物質への曝露の長さである。ある種の局面において、増強物質は、WNT阻害物質、PKC阻害物質、p160ROCK阻害物質、神経原性物質、TGFβR阻害物質、MEK1/2阻害物質、ヒストン脱アセチル化酵素阻害物質、TGFβR/ALK5阻害物質、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害物質、および/またはGSK-3阻害物質である。具体的な局面において、増強物質は、WNT阻害物質である。WNT阻害物質は、IWR-1またはXAV939であり得る。別の局面において、WNTアゴニストは、CHIR99021、GSK-3阻害物質である。CHIR99021はWNTアゴニストであり、IWR-1は、CHIR99021のWNTアゴニスト活性を弱め無効にし得ることが論理的に仮定されるため、WNTアンタゴニストであるIWR-1をVCRFコンボに追加することは直感的でない。しかしながら、本発明者らの研究は、両分子の添加が、網膜細胞の生成をもたらすことを示している。これは、両薬物がアキシン2を増大させるよう作用し、アキシン2が、ミトコンドリアに移行して、網膜細胞同一性につながる経路を惹起するために、起こる。ある種の態様において、増強物質は、WNTアゴニストおよびWNTアンタゴニストである。ある種の事例において、WNT阻害物質は、IWR-1またはXAV939であり、かつWNTアゴニストは、CHIR99021である。方法は、網膜細胞型につながるミトコンドリア活性酸素種生成およびエピジェネティック修飾をもたらす、薬理学的に安定化されたアキシン2をもたらすことができる。さらなる局面において、増強物質は、WNTのアゴニストおよびアンタゴニストの組み合わせであり得る。「WNTアンタゴニスト」という用語は、WNT経路のシグナリング（例えば、古典的WNTシグナリング）を部分的にもしくは完全に阻止するか、阻害するか、もしくは中和するか、またはWNT経路の構成要素の生物学的活性を部分的にもしくは完全に阻止するか、阻害するか、もしくは中和する任意の分子を含むよう、本明細書中で使用される。WNTアンタゴニストは、必ずしもWNTに結合しない。例えば、ある種の態様において、WNTアンタゴニストは���1種類または複数種類のFZD受容体などのWNT経路の1種類または複数種類の他の構成要素に結合する。適切なWNTアンタゴニスト分子には、可溶性FZD受容体および可溶性Frizzled関連タンパク質の誘導体（SFRP）を含む、ネイティブFZD受容体タンパク質の断片および/またはアミノ酸配列バリアント、ならびにRorタンパク質の誘導体が含まれるが、これらに限定されるわけではない。適切なWntアンタゴニスト分子には、1種類または複数種類のFZD受容体に特異的に結合する抗体、および1種類または複数種類のWNTポリペプチドに特異的に結合する抗体がさらに含まれるが、これらに限定されるわけではない。可溶性SFRPおよびRor受容体は、参照により本明細書中に組み入れられる米国特許公報第2011/0305695号に記載されている。
【００１４】
ある種の局面において、体細胞は、線維芽細胞、血液細胞、上皮細胞、肺細胞、グリア、ニューロン、脂肪細胞、または肝細胞である。具体的な局面において、体細胞は、線維芽細胞である。他の局面において、体細胞は、血液もしくは末梢に由来する免疫細胞、皮膚細胞（ケラチノサイト）、または尿から単離された上皮細胞であり得る。体細胞は、ミュラー細胞、または網膜に存在する他の細胞型であり得る。網膜に存在する細胞には、グリア細胞、アストロサイト、または免疫細胞が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００１５】
ある種の態様は、（i）体細胞を播種し；（ii）本明細書中に記載される第1の再プログラミング組成物に、誘導された細胞集団を形成する第1の誘導期の間、播種された体細胞を曝露して、増強物質を含む第2の再プログラミング組成物に、目的の細胞を形成する第2の誘導期の間、誘導された細胞集団を曝露することによって、体細胞を培養する工程を含む、方法に指向している。ある種の局面において、再プログラミング組成物は、バルプロ酸、CHIR99021、RepSox、およびフォルスコリンを含む。他の局面において、目的の細胞は、網膜細胞である。増強物質は、IWR-1などのWNT阻害物質であり得る。
【００１６】
他の態様は、本明細書中に記載された方法によって作製された、肝細胞、心筋細胞、感覚有毛細胞、または網膜細胞に指向している。網膜細胞は、光受容細胞、RGC細胞、またはRPE様細胞であり得る。
【００１７】
ある種の態様は、（a）体細胞を目的の細胞へ変換する再プログラミング物質の存在下で体細胞を培養する工程であって、バルプロ酸、CHIR99021、RepSox、およびフォルスコリンを含む、第1の再プログラミング組成物と、増強物質を含む第2の再プログラミング組成物とを再プログラミング物質が含み、培養によって、再プログラミングされた細胞培養物が形成される、工程；および（b）再プログラミングされた細胞培養物中の目的の細胞を同定する工程を含む、網膜色素上皮細胞を生成する方法に指向している。
【００１８】
他の態様は、（a）体細胞を目的の細胞へ変換する再プログラミング物質の存在下で体細胞を培養する工程であって、バルプロ酸、CHIR99021、RepSox、およびフォルスコリンを含む、第1の再プログラミング組成物と、増強物質を含む第2の再プログラミング組成物とを再プログラミング物質が含み、培養によって、再プログラミングされた細胞培養物が形成される、工程；ならびに（b）再プログラミングされた細胞培養物中の目的の細胞を同定する工程を含む、光受容細胞を生成する方法に指向している。
【００１９】
さらに他の態様は、（a）体細胞を目的の細胞へ変換する再プログラミング物質の存在下で体細胞を培養する工程であって、バルプロ酸、CHIR99021、RepSox、およびフォルスコリンを含む、第1の再プログラミング組成物と、増強物質を含む第2の再プログラミング組成物とを再プログラミング物質が含み、培養によって、再プログラミングされた細胞培養物が形成される、工程；ならびに（b）再プログラミングされた細胞培養物中の目的の細胞を同定する工程を含む、網膜前駆細胞を生成する方法に指向している。
【００２０】
ある種の態様は、それを必要とする対象の眼へ、本明細書中に記載された方法によって作製された網膜細胞の有効量を送達することによって、対象において眼の障害を処置する方法に指向している。障害は、網膜委縮、視神経損傷、視神経萎縮、加齢黄斑変性、遺伝性網膜変性、糖尿病性網膜症、鎌状赤血球網膜症、緑内障、嚢胞様黄斑浮腫、網膜剥離、血管閉塞、光受容細胞変性、感染症、視力喪失、およびそれらの任意の組み合わせであり得る。具体的な局面において、障害は、緑内障である。ある種の局面において、障害は、1種類または複数種類の再プログラミング物質の局所適用によって処置され得る聴覚喪失または脱毛症であり得る。別の局面において、障害は、耳内での感覚有毛細胞への細胞のインサイチューまたはエクスビボ再プログラミングによって処置され得る聴覚喪失であり得る。
【００２１】
他の態様は、それを必要とする対象の眼へ、バルプロ酸（V）とCHIR99021（C）とRepSox（R）フォルスコリン（F）と増強物質との組み合わせの有効量を送達する工程を含む、対象において眼の障害を処置する方法に指向している。低分子の組み合わせは、眼内注射によって投与される。
【００２２】
ある種の態様は、3Dマトリックス中でまたはオルガノイドとして培養されてもまたはされなくてもよい幹細胞または前駆細胞を、より効率的に網膜系統へ分化させるため、低分子（バルプロ酸（V）、CHIR99021（C）、RepSox（R）、フォルスコリン（F）、およびIWR1（I） 「VCRFI」；Shh（S）、タウリン（T）、レチノイン酸（R） 「STR」）の全てまたは組み合わせを使用する方法に指向している。
【００２３】
他の局面は、老化した細胞を幼若化しかつそれを若返らせるため、低分子（VCRFI、STR）の全てまたは組み合わせを使用する方法に指向している。
【００２４】
他の方法は、損傷した細胞、疾患を有する細胞、および/または老化した細胞の機能を回復するため、低分子（VCRFI、STR）の全てまたは組み合わせを使用する。
【００２５】
さらなる態様は、（a）体細胞を目的の細胞へ変換する再プログラミング物質の存在下で体細胞を培養する工程であって、（i）エピジェネティック修飾物質、（ii）グリコーゲン合成酵素キナーゼ3（GSK-3）阻害物質、（iii）TGFβR/ALK5阻害物質、（iv）cAMP上昇化合物を含む、第1の再プログラミング組成物と、増強物質を含む第2の再プログラミング組成物とを再プログラミング物質が含み、培養によって、再プログラミングされた細胞培養物が形成される、工程；および（b）再プログラミングされた細胞培養物中の目的の細胞を同定する工程を含む、網膜神経節細胞を生成する方法に指向している。
【００２６】
他の局面は、治療用化合物または可能性のある治療用化合物を試験するかまたはスクリーニングするための指標細胞またはモデル細胞として、変換された細胞を使用する診断法に指向している。ある種の局面において、化合物は、ニューロン変性を有する者を処置するために有用であり得る。
【００２７】
ある種の局面において、本明細書中に記載された方法は、変換前に体細胞を操作する工程をさらに含み得る。ある種の局面において、体細胞の操作は、任意の周知の方法による遺伝子編集を含む。遺伝子編集は、治療用細胞の移植前に、欠陥のある遺伝性遺伝子を置換するため、細胞変換前に実施され得る。
【００２８】
本発明の他の態様は、本願の全体にわたって記述される。本発明の一つの局面に関して記述された任意の態様が、本発明の他の局面に当てはまり、その逆も同様である。本明細書中に記載された各態様は、本発明の全ての局面に適用可能である本発明の態様であることが理解される。本明細書中に記述された任意の態様は、本発明の任意の方法または組成物に関して実行され得、その逆も同様であることが企図される。
【００２９】
「体細胞」とは、本明細書中で使用する場合、生物の身体を一部分形成する細胞をさす。体細胞の例には、線維芽細胞、ケラチノサイト、皮膚細胞、血液細胞、上皮細胞、肺細胞、グリア、ニューロン、脂肪細胞、および肝細胞が含まれるが、これらに限定されるわけではない。ある種の局面において、体細胞は、生検材料、針吸引液、血液、尿などを含むが、これらに限定されるわけではない組織または生物学的液体から単離され培養され得る。
【００３０】
「対象」には、本明細書中で使用する場合、障害、具体的には、眼の障害の処置が必要であるかまたは望まれる任意の動物が含まれる。いくつかの態様において、本発明の対象は、哺乳動物対象であってよく、それはヒト対象であってよい。対象には、獣医学または薬学的薬物開発のための動物対象、具体的には、イヌ、ネコ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ブタ、齧歯類、ウサギ、（非ヒト霊長類を含む）霊長類などのような哺乳動物対象も含まれ得る。
【００３１】
「治療的に有効な量」および「有効量」という用語は、本明細書中で使用する場合、他に示されない限り、同義であり、処置されている状態、疾患、もしくは障害を改善し、かつ/または所望の利益もしくは目標を達成するために十分である、本発明の細胞または組成物の量を意味する。
【００３２】
治療的に有効な量、ならびに剤形、投与ルート、および投薬頻度を含む、本発明の対象への本発明の組成物の効果的な投与に関連したその他の因子の決定は、処置されるかまたは取り組まれる対象および状態、具体的な対象における状態の重症度、利用される具体的な治療薬、利用される具体的な投与ルート、投薬の頻度、ならびに利用される具体的な製剤を含む、直面している状態の詳細に依り得る。本発明の対象のための治療的に有効な処置レジメンの決定は、医学または獣医学の当業者のレベルの範囲内である。単一剤形を作製するために担体材料と組み合わせられ得る活性成分の量は、処置される対象および具体的な投与モードに依って変動する。
【００３３】
「処置する」、「処置すること」、または「処置」とは、本明細書中で使用する場合、患者の状態の改善（例えば、一つまたは複数の症状の低下または寛解）、疾患の進行の遅延、疾患または障害の治癒、逆転などを含む利益を、疾患または障害を有する対象に付与する任意の型の行為または投与をさす。
【００３４】
本発明の組成物の投与は、眼への投与、例えば、眼への注射（即ち、例えば、網膜内注射、結膜下、脈絡膜上注射、網膜下注射、角膜内注射、房内注射、および/または硝子体内注射であり得る眼内注射）によってなされ得る。いくつかの態様において、投与は、インプラントによって、マトリックスを介して、ゲル、軟膏、液滴を介して、またはそれらの組み合わせによってなされてもよい。
【００３５】
「遺伝学的修飾」および「遺伝学的に修飾された」という用語は、核酸分子(即ち、細胞に対して外来性の核酸分子)の導入の後に細胞において誘導される永久または一過性の遺伝学的変化をさす。遺伝学的修飾は、宿主細胞のゲノムへの核酸分子の組み込みによって、または染色体外エレメントとしての核酸分子の一過性のもしくは安定的な維持によって達成され得る。
【００３６】
特許請求の範囲は、本発明の任意の要素を考慮にいれないよう作成され得ることがさらに留意される。従って、本書は、請求項の要素の列挙に関する「単独」、「のみ」などのような排他的な用語法の使用、または否定的な限定の使用のための先行する基礎として役立つものとする。
【００３７】
「1つの（a）」または「1つの（an）」という単語の使用は、特許請求の範囲および/または本明細書において「含む」という用語と共に使用される場合、「1」を意味することができるが、「1つまたは複数」、「少なくとも1つ」、および「1つまたは2つ以上」の意味とも一致する。
【００３８】
「約」または「およそ」という用語は、当業者によって理解されるように、近いこととして定義される。一つの非限定的な態様において、それらの用語は、10％以内、好ましくは、5％以内、より好ましくは、1％以内、最も好ましくは、0.5％以内であることとして定義される。
【００３９】
「実質的に」という用語およびその変化形は、10％以内、5％以内、1％以内、または0.5％以内の範囲を含むこととして定義される。
【００４０】
「阻害する」もしくは「低下させる」もしくは「防止する」という用語またはこれらの用語の変化形には、所望の結果を達成するための測定可能な減少または完全な阻害が含まれる。
【００４１】
「有効な」という用語は、本明細書および/または特許請求の範囲において使用する場合、所望の結果、期待された結果、または意図された結果を達成するために十分であることを意味する。
【００４２】
特許請求の範囲における「または」という用語の使用は、選択肢のみをさすかまたは選択肢が相互に排他的であることが明示されない限り「および/または」を意味するために使用されるが、本開示は、選択肢のみおよび「および/または」をさす定義を支持する。
【００４３】
本明細書および特許請求の範囲において使用する場合、「含む（comprising）」（ならびに「含む（comprise）」および「含む（comprises）」のような含む（comprising）の任意の形態）、「有する（having）」（ならびに「有する（have）」および「有する（has）」のような有する（having）の任意の形態）、「含む（including）」（ならびに「含む（includes）」および「含む（include）」のような含む（including）の任意の形態）、または「含有する（containing）」（ならびに「含有する（contains）」および「含有する（contain）」のような含有する（containing）の任意の形態）という単語は、包括的または非制限的であり、追加の列挙されていない要素または方法の工程を排除しない。
【００４４】
本発明の組成物ならびにそれを作製および使用する方法は、本明細書の全体にわたって開示された具体的な成分、構成要素、方法の工程など「を含む」、それら「から本質的になる」、またはそれら「からなる」ことができる。
【００４５】
本発明の他の目的、特色、および利点は、以下の詳細な説明から明白になるであろう。しかしながら、本発明の本旨および範囲に含まれる様々な変化および修飾が、この詳細な説明から当業者に明白になるため、詳細な説明および具体的な例は、本発明の具体的な態様を示すが、例示のために与えられているに過ぎないことが、理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明のある種の局面をさらに示すために含まれる。本発明は、本明細書中に提示された具体的な態様の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面のうちの一つまたは複数を参照することによって、よりよく理解され得る。
【図１】図1A〜1F. 低分子による網膜光受容細胞様細胞（CiPPC）への線維芽細胞の変換：（図1A）マウス再プログラミングプロトコールの模式図。d0において、Nrl-GFP MEFをIMR90培地に播種した。d1およびd3において、低分子をPIMに添加した。V、VPA；C、CHIR99021；R、Repsox；F、フォルスコリン；S、Shh；T、タウリン；R、レチノイン酸；PIM、光受容細胞誘導培地。（図1B）Nrl-GFPレポーターを発現する変換された細胞のd11（丸型）およびd15（ニューロン様）における蛍光顕微鏡像。（図1C）ヒトHFL-1-Nrl-DsRed細胞再プログラミングのスキーム。d2において、IWR1を添加し、d5において、STRを添加した。（図1D）変換されたDsRedを発現するヒト光受容細胞様細胞のd6（丸型）およびd8（ニューロン様）における蛍光顕微鏡写真。（図1E）各低分子を単独で用いた処理による変換プロトコール後（d11）のNrl-GFP陽性細胞の数。（図1F）示された低分子をカクテルから差し引いた時のNrl-GFP陽性細胞の数。
【図２】図2A〜2H. 化学的に変換された光受容細胞様細胞（CiPRLC）の特徴決定：（図2A）再プログラミングされたNrl-GFP陽性細胞の流動選別（ドットプロット）。（図2B）光受容細胞に特異的な示された遺伝子のmRNA発現を示すRT-PCR。（図2C）変換された（d11）Nrl-GFP陽性細胞がCrx陽性でもあることを示す蛍光顕微鏡写真。（図2D）変換されたNrl-GFP陽性細胞における光受容細胞マーカーChx10の発現を示す免疫蛍光。（図2E）d15における変換されたNrl-GFP陽性細胞におけるロドプシンの発現。（図2F）変換されたDsRed陽性ヒト光受容細胞様細胞におけるCrxの発現。（図2G）FSP1-tdtomato陽性細胞が変換後にd11においてNrlを発現していることを示す系統追跡。（図2H）流動選別されたtdTomato陽性MEFおよび陰性MEFから変換されたNrl-GFP発現細胞の数。
【図３】図3A〜3C. 変換された光受容細胞様細胞のトランスクリプトーム分析。（図3A）Nrl-GFPマウス網膜から単離されたP4またはP6の光受容細胞とのCiPPCの高い類似性を示す、全てのRNASeq試料についての主成分分析（PCA）。（図3B）化学的に再プログラミングされた細胞において、杆体に特異的な遺伝子が発現されており、錐体に特異的な遺伝子の大部分が発現されていないことを示すヒートマップ。（図3C）大部分の網膜に特異的な転写因子および網膜前駆細胞に特異的な遺伝子のいくつかを発現している化学的に変換された細胞。網膜神経節細胞に特異的な遺伝子の大部分の発現は存在しなかった。
【図４】図4A〜4H. 網膜変性（rd1）マウスにおける変換された細胞の機能性の試験。（図4A）CiPPCのインビボ網膜下注射および移植後の機能分析についてのタイムライン。（図4B）変換されたCiPPCの移植後の暗順応A波。（図4C）P59における変換されたマウス細胞の移植後の暗順応B波。（図4D）P128における細胞を移植された眼の低い光強度（50ルクス）による瞳孔分析。（図4E）化学的に変換された細胞の移植後の瞳孔収縮の定量化。（図4F）移植の3ヶ月後のrd1網膜におけるGFPを発現する化学的に変換された細胞の組み込みおよび生存。神経連絡の形成を示す高倍率顕微鏡写真（右）。（図4G、4H）Rd1網膜への移植の3ヶ月後の化学的に変換された細胞におけるリカバリン（recvrn）およびロドプシン（Rho）の発現。
【図５】図5A〜5G. NF-kBによってモジュレートされたAscl1発現はCiPRLC再プログラミングを媒介する。（図5A）再プログラミング中の異なる時点におけるAscl1の発現。出発MEFと比較された変化倍率（2-ΔΔCT）として提示されたqPCR結果。（図5B）shRNAによって媒介されたRNAiによるマウス胎仔線維芽細胞におけるAscl1の枯渇を示すqPCR。（図5C）Ascl1ノックダウンNrl-GFP MEFおよび野生型Nrl-GFP MEFの変換後のd11におけるNrl-GFP発現細胞の数。（図5D）化学的再プログラミングの異なる時点におけるNF-kB-ルシフェラーゼ活性。LPS（10ng/ml）によって4時間処理されたNF-kB-Luc-MEFを陽性対照として使用した。（図5E）3'UTR領域の下流の高度に保存されたNF-kB結合部位を示すヒトおよびマウスのAscl-1遺伝子のrVista配列アライメント。（図5F）Ascl-1遺伝子座におけるNF-kBの結合を示すクロマチン免疫沈降（ChIP）アッセイ。（図5G）再プログラミング8日目の3'遺伝子間領域と共にAscl-1プロモーターに融合したルシフェラーゼレポーターによる一過性トランスフェクション分析。プロットは、Ascl-1が、3'末端に位置する制御配列を通して、NF-kBによって正に制御されることを示す。
【図６】図6A〜6G. 化学的変換中に生成されたミトコンドリアROS（mROS）はNF-kBを活性化する。（図6A）d11における化学的に変換されたNrl-GFP陽性光受容細胞におけるmROS（MitoSox染色）の蓄積。（図6B）Mitosoxによる染色後のMEF。（図6C）化学的再プログラミング中のmROSの生成を示すMitoSox染色後の蛍光定量分析。（図6D）ShRNAによって媒介されたノックダウンおよび選択の後のMEFにおけるTfam（ミトコンドリア転写因子）の発現を示すqPCR。（図6E）mROSの（mitotempo処理による）枯渇または生成（Tfamノックダウン）の後のd11におけるNrl-GFP発現細胞の数についての定量化。（図6F）化学的変換のd11におけるmitotempo処理およびTfamノックダウンの後の（mitosox染色による）mROSの蛍光定量的測定。（図6G）mitosoxを用いた処理によるAscl-1遺伝子座における活性化NF-kBのより少ない結合を示すクロマチン免疫沈降アッセイ（ChIP）。
【図７】図7A〜7G. アキシン2の安定化およびミトコンドリア局在はmROSを生成する：（図7A）化学的再プログラミングの異なる時点におけるアキシン2の発現を示すウエスタンブロット。（図7B）MEFにおけるmitotrackerおよびアキシン2の染色を示す顕微鏡写真。これらの染色の間に共局在は見出されなかった。（図7C）化学的に変換されたNrl-GFP陽性細胞のミトコンドリアにおけるアキシン2局在を示す共焦点顕微鏡写真。（図7D）マウス胎仔線維芽細胞におけるshRNAによって媒介されたアキシン2のノックダウンを示すウエスタンブロット。（図7E）d11におけるアキシン2ノックダウン後のNrl-GFP発現細胞の数についての定量化。（図7F）d8およびd11における野生型対照と比較された化学的再プログラミング中のアキシン2枯渇細胞におけるより少ないmROSの生成を示す蛍光定量分析。（図7G）アキシン2ノックダウンが、d5およびd8における再プログラミング中間体における減少したAscl1発現に関連していることを示すqPCR分析。
【図８】図8A〜8C. Nrl-DsRed DNA構築物の調製およびクローニング：（図8A）NrlプロモーターおよびDsred配列が制限消化によって消化されたAddgeneベクターpNrl-DsRedのマップ。（図8B）pLenti X1 zeoデスティネーションベクターへのNrlプロモーターおよびDsRedのクローニングのための戦略。（図8C）デスティネーションベクターへクローニングされたNrl構築物およびDsRed構築物を示すDNAゲル。
【図９】図9A〜9D. 化学的に再プログラミングされたマウスおよびヒトの光受容細胞様細胞の特徴決定および系統追跡。（図9A）d16におけるNrl-GFPを発現する変換された細胞におけるCrxの発現を示す蛍光顕微鏡写真。（図9B）Nrl-Dsredを発現する化学的に変換されたヒト細胞におけるロドプシンの発現を示す蛍光顕微鏡写真。（図9C）ヒト光受容細胞様細胞における光受容細胞に特異的な遺伝子の発現を示すRT-PCR。（図9D）Fsp1Cre-tdTomato陽性MEFの選別。左のパネル：流動選別についてのドットプロット、中央のパネル：選別前のMEF、右のパネル：選別後のMEF。
【図１０】図10A〜10B. 化学的に変換された光受容細胞様細胞のBrdu染色：（図10A）光受容細胞様細胞へのNrl-GFP MEFの化学的再プログラミング中のBrdu染色プロトコールの模式図。（図10B）化学的再プログラミング11日目におけるBrdu染色を示す蛍光顕微鏡写真。
【図１１】図11A〜11C. 化学的再プログラミング中のNF-kB-ルシフェラーゼ活性およびmROS産生。（図11A）mitotempo処理による減少したNF-kB活性化およびTfam枯渇による増大したNF-kB活性を示すルシフェラーゼ活性測定。（図11B）d8およびd11におけるアキシン2ノックダウンMEFにおける減少したNF-kB活性化を示すルシフェラーゼ活性。（図11C）d8における蛍光顕微鏡下の細胞の各々におけるミトコンドリアROS（mitosox染色）の蓄積。
【図１２】図12A〜12F. ciRGCパッチクランプはニューロン活性を証明する。（図12A）電極を当てられたマウスciRGCの明視野画像。（図12B）測定された静止電位。保持は、-70mVであった。（図12C、12D）印加電圧による電流のサンプルトレース。（図12E、12F）マウスciRGC（n＝4細胞）およびヒトciRGC（n＝3細胞）におけるI/V関係。
【図１３】図13A〜13F. CiPCへのヒト成人皮膚線維芽細胞の変換。（A）ヒト成人皮膚線維芽細胞再プログラミングのための改変されたスキーム。（B）光受容細胞に特異的な遺伝子の増大した発現を示すHADFから変換されたCiPCのqPCR分析（変化倍率）。（C）Nrl染色されたHADFから変換されたCiPCの顕微鏡写真（左のパネル）。初期変換プロトコールと改変された変換プロトコールとの間の変換効率の比較。（D）（異なる供給元、Coriell Instituteからの）HADFから変換されたCiPCにおける光受容細胞に特異的な遺伝子（Crxおよびリカバリン）の発現。（E）（ATCCからの）HADFから変換されたCiPCにおける光受容細胞に特異的な遺伝子（Nrl、リカバリン、ロドプシン）の発現。
【図１４】図14A〜14B. CiRGCへのヒト成人皮膚線維芽細胞の変換。（A）ヒト成人皮膚線維芽細胞から変換されたヒトCiRGC。左d7、右d8。（B）d8におけるBrn3a、Brn3b、Isl1などのようなRGCに特異的な遺伝子の発現を示すリアルタイムqPCR。
【図１５】図15A〜15C. 化学物質による網膜神経節細胞へのマウス初代ミュラー細胞の変換。（A）変換前のミュラー細胞。（B）化学物質カクテルによる3日目における変換後のCiRGC細胞。（C）Brn3a、Brn3b、Isl1、Nefl、およびNeNのようなRGCに特異的な遺伝子の発現を示すリアルタイムqPCR分析。
【図１６】図16A〜16C. 化学物質による網膜神経節細胞（hCiRGC）へのヒト初代ミュラー細胞の変換。（A）変換前のヒトミュラー細胞。（B）化学物質カクテルによる3日目における変換後のhCiRGC細胞。（C）Brn3a、Brn3b、Isl1、Nefl、およびNeNのようなRGCに特異的な遺伝子の発現を示すリアルタイムqPCR分析。
【図１７】図17A〜17C. 化学物質によるニューロン様細胞へのES細胞の変換。（A）化学的処理前の1日目におけるマウスES細胞。（B）d6におけるES細胞に由来する化学的に変換されたニューロン様細胞。（C）d7におけるES細胞に由来する化学的に変換されたニューロン様細胞。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
発明の詳細な説明
多くの網膜症が、網膜ニューロン様光受容細胞およびRGC細胞における機能障害によって引き起こされる。これらの網膜ニューロンの喪失は、重度の永久の視力喪失をもたらす、そのような障害の一般的なエンドポイントである。いくつかの動物、例えば、爬虫類は、網膜を再生させる能力を有するが、哺乳動物における再生可能性は制限されている。過去数十年間の研究は、網膜障害の病原に関する理解を大いに高めた（Wright et al.Nature reviews.Genetics 11:273-84,2010；Bramall et al.,Annual review of neuroscience 33:441-72,2010）。しかしながら、処置の機会は、現在、限定されている。再生細胞治療は、これらの網膜ニューロパシーを管理するための有望なツールとして出現した（Schwartz et al.,Lancet 385:509-16,2015）。現在、これらの治療用細胞の二つの主な起源が存在し、一方は、ES（胚性幹）細胞またはiPS（誘導多能性幹）細胞からの分化であり、他方は、体細胞からの直接的または間接的な再プログラミングである（Mellough et al.,Stem cells(Dayton,Ohio)30:673-86,2012；Zhong et al.,Nature communications 5:4047,2014；Vierbuchen et al.,Nature 463:1035-41,2010）。例えば、ニューロンが、定義された転写因子によって線維芽細胞から変換されることが示された（Vierbuchen et al.,Nature 463:1035-41,2010）。しかしながら、異所性トランスジーンの導入は、治療的適用を限定する。
【００４８】
最近、低分子によって媒介される直接的または間接的な再プログラミングが、幹細胞分化に関連した限界を克服するための代替的な方法として出現した（Hu et al.,Cell stem cell 17:204-12,2015；Li et al.,Cell stem cell 17:195-203,2015）。この方法は、再生治療のためのニューロン、アストロサイト、および心筋細胞のような異なる細胞型を入手するために使用されている（Zhang et al.,Cell stem cell 17:735-47,2015；Tian et al.,Cell Rep 16:781-92,2016；Fu et al.,Cell research 25:1013-24,2015）。
【００４９】
いくつかの研究室は、限定培地の存在下での分化によって、ES細胞およびiPS細胞から、光受容細胞およびRGCのような網膜ニューロンを生成することに成功した（Mellough et al.,Stem cells 30:673-86,2012；Wright,Nature biotechnology 31:712-13；Osakada et al.,Nat Protoc 4:811-24,2009）。移植された場合、これらのESまたはiPSに由来する網膜ニューロンは、宿主網膜へ遊走し、組み込まれる（Gonzalez-Cordero et al.,Nature biotechnology 31:741-47,2013）。光受容細胞は、転写因子によって媒介される細胞再プログラミングによって、線維芽細胞からも入手され得る（Seko et al.,PloS one 7:e35611,2012）。これらの置換細胞は、網膜へ組み込まれ得るが、機能的な効率および効力は、現在、限定されている（Karl et al.,PNAS U.S.A.105:19508-13,2008；Chen et al.,Cell cycle 8:1158-60,2009；Venugopalan et al.,Nature communications 7:10472,2016）。例えば、変性網膜における光受容細胞の移植は、ERGの限定された一時的な回復をもたらした（Pearson et al.,Nature 485:99-103,2012）。この限界は、変換された細胞の不十分な質または移植された網膜の内部での限定された遊走による可能性がある。さらに、直接再プログラミングの基礎となる分子機序が、概して不明である。
【００５０】
これらの欠点は、変換の機序の詳細な研究が必要であることのさらなる証拠である。最近、ミトコンドリアが、心筋細胞の形成ならびに胚性幹細胞および造血幹細胞の運命の決定において必須の役割を果たすことが示された（Crespo et al.,Stem cells 28:1132-42,2010；Vannini et al.,Nature communications 7:13125,2016；Mahato et al.,Stem cells 32:2880-92,2014；Rajendran et al.,JBC 288:24351-62,2013）。ミトコンドリアの機能は、表皮毛包および脂肪細胞の分化においても役割を有することが示された（Tormos et al.,Cell metabolism 14:537-44,2011；Anso et al.,Nature cell biology,2017）。さらに、分裂促進シグナリングが、核再プログラミングおよび幹細胞系統コミットメントのために重要であることが見出された（Zhou et al.,Cell Rep 15:919-25,2016；Chandel et al.,Nature cell biology 18:823-32,2016；Shadel and Horvath,Cell 163:560-69,2015）。
【００５１】
本発明者らは、5種類の低分子（5C）を用いる処理によって、マウスおよびヒトの線維芽細胞からマウスおよびヒトの網膜ニューロン様細胞（CiPPC）を再プログラミングするための方法を、本明細書中に記載する。この化学的に変換された光受容細胞様細胞は、網膜変性を有するマウスモデルにおいて網膜機能を改善することができ、他の目的の細胞の作製にも適応し得る。さらに、本発明者らは、ミトコンドリアが網膜細胞運命を決定するためのシグナリング小器官として機能する分子機序を記載する。
【００５２】
A.体細胞の再プログラミング
細胞運命の可塑性について増大する証拠によって、実験室で体細胞を再プログラミングする可能性が開かれた。再プログラミングとは、他の体細胞型へのある体細胞型の変換をさし、その過程は、細胞の遺伝子発現プロファイルの再指示を必然的に伴う。再プログラミングされた体細胞は、細胞治療または組織治療のために使用され得るため、患者自身の細胞または組織適合性の細胞が、疾患または損傷の処置のために使用され得る。
【００５３】
各体細胞型は、独特の遺伝子レパートリーを発現しており、それは、制御性転写因子の発現および/または活性化/抑制、ならびに遺伝子が転写されるか否かを決定するDNA/クロマチンコンフォメーションのエピジェネティック修飾につながるシグナリングネットワークを通して、特定のプログラミングされた状態を引き起こしかつ/または維持する環境的な合図または因子によって制御され得る。これらの制御性のエレメントまたは環境のうちの一つまたは複数を操作することによって、細胞を、分化したまたは再プログラミングされた新しい状態にすることができる。理論によって限定されることは意図しないが、所定の型の体細胞は、その型の細胞になるよう他の細胞を再プログラミングするために十分であり得る、キーとなる制御性エレメントを含有していると、本発明者らは予想する。従って、レシピエント細胞は、低分子の活性化物質もしくは制御物質、または再プログラミング物質の模倣体、または再プログラミング物質の阻害物質のアンタゴニストを含む、再プログラミング物質/プロトコールへの曝露によって再プログラミングされ得る。
【００５４】
ある種の態様において、再プログラミング因子には、以下が含まれる。
【００５５】
（i）バルプロ酸（VPA）、5'-アザシチジン（5'Aza）、2-(ヘキサヒドロ-4-メチル-1H-1,4-ジアゼピン-1-イル)-6,7-ジメトキシ-N-[1-(フェニルメチル）-4-ピペリジニル]-4-キナゾリンアミン三塩酸塩水和物（BIX-01294）、またはそれらの組み合わせなどのエピジェネティック修飾物質。具体的な局面において、エピジェネティック修飾物質は、VPAである。
【００５６】
（ii）グリコーゲン合成酵素キナーゼ3（GSK-3）阻害物質は、Li+、6-[2-[[4-(2,4-ジクロロフェニル)-5-(5-メチル-1H-イミダゾール-2-イル）ピリミジン-2-イル]アミノ]エチルアミノ]-ピリジン-3-カルボニトリル（CHIR99021）、(2'Z,3'E)-6-ブロモインディルビン-3'-オキシム（BIO）、3-(2,4-ジクロロフェニル)-4-(1-メチル-1H-インドール-3-イル)-1H-ピロール-2,5-ジオン（SB216763）、またはそれらの組み合わせであり得る。具体的な局面において、GSK-3阻害物質は、CHIR99021である。
【００５７】
（iii）TGFβR/ALK5阻害物質は、トランスフォーミング増殖因子受容体I型（TGFBR1）キナーゼ阻害物質（例えば、2-(3-(6-メチルピリジン-2-イル)-1H-ピラゾール-4-イル)-1,5-ナフチリジン（RepSox）、4-[4-(1,3-ベンゾジオキソール-5-イル)-5-(2-ピリジニル)-1H-イミダゾール-2-イル]ベンズアミド（SB-431542）、3-(6-メチル-2-ピリジニル)-N-フェニル-4-(4-キノリニル)-1H-ピラゾール-1-カルボチオアミド（A8301）、もしくはそれらの組み合わせ）、または抗TGFβ抗体、またはsiRNAなどの核酸物質のうちの1種類または複数種類などの、トランスフォーミング増殖因子β（TGFβ）シグナリング経路の阻害物質であり得る。具体的な局面において、TGFβR/ALK5阻害物質は、Repsoxである。
【００５８】
（iv）cAMP上昇化合物が、本発明の方法において使用され得る。cAMP上昇化合物（cAMP上昇物質）は、cAMP分解酵素阻害物質、cAMPホスホジエステラーゼ阻害物質、cAMP上昇薬、cAMP上昇ホルモン、アデニルシクラーゼ活性化物質、cAMP類似体、IBMX、GLP-1、GIP、グルカゴン、フォルスコリン、ジブチリルcAMP、イソプロテレノール、またはそれらの組み合わせより選択される。cAMPの類似体には、8-pCPT-2-O-Me-cAMP（例えば、8-(4-クロロフェニルチオ)-2'-O-メチルアデノシン3',5'-サイクリックモノホスフェート)；8-Br-cAMP（例えば、8-ブロモアデノシン3',5'-サイクリックモノホスフェート）；Rp-cAMPS（例えば、Rp-アデノシン3',5'-サイクリックモノホスホロチオエート）；8-Cl-cAMP（例えば、8-クロロアデノシン3',5'-サイクリックモノホスフェート）；ジブチリルcAMP（例えば、N6,2'-O-ジブチリルアデノシン3',5'-サイクリックモノホスフェート）；pCPT-cAMP（例えば、8-(4-クロロフェニルチオ)アデノシン3',5'-サイクリックモノホスフェート）；およびN6-モノブチリルアデノシン3',5'-サイクリックモノホスフェートが含まれる。PDE阻害物質には、テオフィリン（例えば、3,7-ジヒドロ-1,3-ジメチル-1H-プリン-2,6-ジオン；2,6-ジヒドロキシ-1,3-ジメチルプリン；1,3-ジメチルキサンチン）、カフェイン（例えば、1,3,7-トリメチルキサンチン）；ケルセチン二水和物（例えば、2-(3,4-ジヒドロキシフェニル)-3,5,7-トリヒドロキシ-4H-1-ベンゾピラン-4-オン二水和物；3,3',4',5,7-ペンタヒドロキシフラボン二水和物）；ロリプラム（例えば、4-[3-(シクロペンチルオキシ)-4-メトキシフェニル]-2-ピロリジノン）；4-(3-ブトキシ-4-メトキシベンジル)イミダゾリン-2-オン；プロペントフィリン（例えば、3,7-ジヒドロ-3-メチル-1-(5-オキソベキシル（oxobexyl）)-7-プロピル-1H-プリン-2,6-ジオン；3-メチル-1-(5-オキソヘキシル)-7-プロピルキサンチン）；3-イソブチル-1-メチルキサンチン（例えば、3,7-ジヒドロ-1-メチル-3-(2-メチルプロピル)-1H-プリン-2,6-ジオン；IBMX；3-イソブチル-1-メチル-2,6(1H,3h)-プリンジオン；1-メチル-3-イソブチルキサンチン）；8-メトキシメチル-3-イソブチル-1-メチルキサンチン（例えば、8-メトキシメチル-IBMX）；エノキシモン（例えば、1,3-ジヒドロ-4-メチル-5-[4-メチルチオベンゾイル]-2H-イミダゾール-2-オン）；パパベリン塩酸塩（例えば、6,7-ジメトキシ1-ベラトリルイソキノリン塩酸塩）が含まれる。アデニル酸シクラーゼの活性化物質には、フォルスコリンが含まれる。
【００５９】
（v）IWR1、XAV-939、ICG-001などのWNT阻害物質などの増強物質。ある種の局面において、WNT阻害物質は、カルジオノーゲン1、カルフォスチンC、CCT031374臭化水素酸、FH535、ICG-001、iCRT14、IWP-2、IWP-4、IWP-12、IWP-L6、N-(キノリン-8-イル)-4-(エキソ-4-アザ-3,5-ジオキソトリシクロ[5.2.1.02,6]オクト-8-エン-4-イル)ベンズアミド（IWR1）、JW55、JW67、KY02111、LGK-974、MN64、PNU74654、QS11、TAK715、TC-E5001、WAY316606塩酸塩、WIKI4、WNT-059、またはXAV-939である。増強物質には、PKC阻害物質（例えば、Go 6983）、p160ROCK阻害物質（例えば、Y27632）、神経原性物質（例えば、ISX-9）、TGFβR阻害物質（例えば、SB431542）、MEK1/2阻害物質（例えば、PD0325901）、ヒストン脱アセチル化酵素阻害物質（例えば、スベラニロヒドロキサム酸（SAHA））、TGFβR/ALK5阻害物質（例えばA83-01）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害物質（例えば、BIX01294）、および/またはGSK-3阻害物質（例えば、BIO）も含まれ得る。
【００６０】
本開示による第1の再プログラミング組成物は、以下の化合物：（i）エピジェネティック修飾物質、（ii）グリコーゲン合成酵素キナーゼ3（GSK-3）阻害物質、（iii）TGFβR/ALK5阻害物質、（iv）cAMP上昇化合物（例えば、アデニルシクラーゼ活性化物質）のうちの1種類または複数種類を含んでいてよい。ある種の局面において、第1の再プログラミング組成物は、4つの型の阻害物質を全て含む。
【００６１】
第2の再プログラミング組成物または増強組成物は、WNT阻害物質、PKC阻害物質、p160ROCK阻害物質、神経原性物質、TGFβR阻害物質、TGFβR/ALK5阻害物質、MEK1/2阻害物質、ヒストン脱アセチル化酵素阻害物質、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害物質、および/またはGSK-3阻害物質などの増強物質のうちの1種類または複数種類、例えば、それらの全ての組み合わせを含むであろう。
【００６２】
目的の細胞は、任意の種のものであってよく、ドナー細胞に対して異種のもの、例えば、両生類、哺乳動物、トリのものであってよいが、哺乳動物細胞が好ましい。特に好ましい目的の細胞には、ヒトおよびその他の霊長類、例えば、チンパンジー、カニクイザル、ヒヒ、その他の旧世界ザル、ヤギ、ウマ、ブタ、ヒツジ、およびその他の有蹄類、マウス、イヌ、ネコ、ならびにその他の哺乳動物種の細胞が含まれる。
【００６３】
1.培養条件
体細胞を、培養プレートに播種することができる。体細胞を、0.1％ゼラチンコート上に播種し、第1の再プログラミング物質組成物に曝露することができる。2日後、3日後、4日後、5日後、6日後、7日後、8日後、またはそれ以降に、第1の再プログラミング物質組成物を増強物質と共に導入することができる。本発明のある種の局面は、本明細書中に記載される体細胞の再プログラミングのための培養培地および培養条件を含む。本発明の細胞培養培地は、（i）エピジェネティック修飾物質、（ii）グリコーゲン合成酵素キナーゼ3（GSK-3）阻害物質、（iii）TGFβR/ALK5阻害物質、（iv）cAMP上昇化合物（例えば、アデニルシクラーゼ活性化物質）；および（v）増強物質を含んでいてよく、ここで、培養培地は、体細胞を目的の細胞へ再プログラミングするために有効である。
【００６４】
細胞培養培地のいくつかの態様において、培養培地は、約50μM〜約5mMの濃度のエピジェネティック修飾物質を含む。いくつかの態様において、濃度は、約100μM〜約4mM、約200μM〜約3mM、約500μM〜約2mM、約250μM〜約1mMである。ある種の局面において、濃度は、500μMまたは約500μMである。
【００６５】
細胞培養培地のいくつかの態様において、培養培地は、約50nM〜約1mMの濃度のグリコーゲン合成酵素キナーゼ3（GSK-3）阻害物質を含む。いくつかの態様において、濃度は、約100nM〜約500μM、約250nM〜約250μM、約500nM〜約50μM、約750nM〜約10μMである。具体的な局面において、濃度は、5μMまたは約5μMである。
【００６６】
細胞培養培地のいくつかの態様において、培養培地は、約50nM〜約1mMの濃度のTGFβR/ALK5阻害物質を含む。いくつかの態様において、濃度は、約100nM〜約500μM、約250nM〜約250μM、約500nM〜約50μM、約750nM〜約10μMである。具体的な局面において、濃度は、2μMまたは約2μMである。
【００６７】
細胞培養培地のいくつかの態様において、培養培地は、約50nM〜約1mMの濃度のcAMP上昇化合物を含む。いくつかの態様において、濃度は、約100nM〜約500μM、約250nM〜約250μM、約500nM〜約50μM、約750nM〜約20μMである。具体的な局面において、濃度は、10μMである。
【００６８】
細胞培養培地のいくつかの態様において、培養培地は、約50nM〜約1mMの濃度の増強物質を含む。いくつかの態様において、濃度は、約100nM〜約500μM、約250nM〜約250μM、約500nM〜約50μM、約750nM〜約20μMである。具体的な局面において、濃度は、10μMである。
【００６９】
細胞培養中に、細胞は、2日〜8日の範囲の期間、具体的には、約3日間、（i）エピジェネティック修飾物質、（ii）グリコーゲン合成酵素キナーゼ3（GSK-3）阻害物質、（iii）TGFβR/ALK5阻害物質、および（iv）cAMP上昇化合物を含む細胞培養培地によって処理され得る。2〜8日後、増強物質が、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19〜20日の範囲の期間、培養培地に添加される。再プログラミングされた細胞が形成されるまで、細胞培養培地を定期的に交換することができる。
【００７０】
本明細書中に記載された再プログラミング物質に加えて、培養培地は、当技術分野において一般的に使用されている任意の細胞培養培地であり得る。例えば、培養培地は、一般に、生理食塩水を含む。細胞培養培地の例には、生理食塩水、pH7.4のPBS、DMEM培地、または線維芽細胞基本培地（FBM、Lonza）が含まれる。いくつかの態様において、培養培地は、追加の構成要素または作用物質を含み得る。
【００７１】
本明細書中で使用する場合、「十分な時間」という用語は、本明細書中に開示された培養培地によって哺乳動物細胞を再プログラミングするために十分に長い期間を意味するものとする。いくつかの態様において、「十分な時間」という用語は、数時間〜数日の範囲である。十分な時間には、8時間、12時間、16時間、20時間、24時間〜約2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、15日、16日、17日、18日、19日、20日が含まれ得る。具体的な局面において、再プログラミングのために十分な時間は、本明細書中に記載される再プログラミング条件での培養において、約9日〜約20日である。
【００７２】
いくつかの態様において、本明細書中に提供される方法は、培養培地を新鮮な培養培地に定期的に交換する工程をさらに含む。「定期的に」という用語は、1時間毎、2時間毎、1日4回、1日2回、毎日、2日に1回、週2回、毎週、月2回、または毎月の培養培地の交換を意味するものとする。
【００７３】
B.疾患の処置
細胞の機能障害に起因する多くの疾患が、再プログラミングされた細胞の投与による処置を受け入れ可能であり得る。これらには、心疾患、神経疾患、内分泌疾患、血管疾患、網膜疾患、皮膚疾患、および筋骨格系疾患、ならびにその他の疾患が含まれる。患者自身の細胞を、置換を必要とする所望の細胞型へ形質転換するかまたは変換することができる。従って、再プログラミングは、移植時に免疫拒絶を受けないであろう自己の遺伝学的にマッチした細胞の生成を可能にする。さらに、本明細書中に記載された方法によって作製された再プログラミングされた細胞株は、移植のための細胞の起源となり得る。
【００７４】
任意で、前記の様々な態様のいずれかまたは全てと組み合わせられる、方法のいくつかの態様において、障害は、網膜疾患、組織の外傷および損傷、骨格障害、器官疾患、または皮膚、筋肉、軟骨、腱、末梢神経、脊髄、血管、もしくは骨の損傷である。
【００７５】
好ましくは、細胞は、個々のレシピエントと組織適合性であるため、免疫抑制の望ましくない使用が減少するかまたは排除される。例えば、組織適合性の細胞は、患者、患者の血縁ドナー、または非血縁ドナーから入手され得る。任意で、細胞は、患者とより適合性になるよう、組織適合性プロファイルを変更するため、遺伝学的に修飾され得る。
【００７６】
これらの方法によって作製され得る再プログラミングされた細胞の中には、心筋細胞、ニューロン、オリゴデンドロサイト、網膜色素上皮、神経節細胞、光受容細胞、インスリン分泌細胞、骨格筋芽細胞、平滑筋細胞、肝細胞、およびその他のような需要の多い細胞がある。そのような細胞および組織は、組織および器官の修復のための未解決の医学的必要性を満たし、遺伝学的に異なる多様な細胞株のバンクを作成することによって、または患者に特異的な再プログラミングを介して、免疫拒絶のリスクを減少させるために生成され得る。細胞は、患者または器官への注射、足場上での成長および外科的な植え込み、損傷の部位への直接適用などを含む、当技術分野において公知の様々な方法において使用され得る。
【００７７】
本発明の再プログラミングされた体細胞は、そのような処置を必要とする対象を処置するために使用され得る。同様に、本発明の誘導されたRPE、誘導されたPR細胞、および/または誘導された網膜前駆細胞は、そのような処置を必要とする対象を処置するために使用され得る。本発明の細胞は、レシピエント対象（例えば、処置を必要とする対象）へ導入され得、ここで、対象への細胞の導入は、対象における状態または障害を処置する。従って、いくつかの態様において、処置の方法は、それを必要とする対象へ、本発明の再プログラミングされた体細胞の集団を投与する工程を含む。いくつかの態様において、本発明の処置の方法は、それを必要とする対象へ、本発明の誘導されたRPE、誘導されたPR細胞、誘導された神経節細胞、および/または誘導された網膜前駆細胞の集団を投与する工程を含む。細胞は対象に由来してもよいか、または細胞は対象以外の個体に由来してもよい。
【００７８】
いくつかの態様において、本開示は、それを必要とするレシピエント対象において、細胞移植を実施するための方法を提供し、方法は、一般に、（i）レシピエント対象と免疫適合性であるドナーから入手された体細胞から、誘導されたRPE、誘導されたPR細胞、誘導された網膜神経節細胞、および/または誘導された網膜前駆細胞を生成する工程；ならびに（ii）本発明の誘導された細胞のうちの1種類または複数種類をレシピエント対象へ移植する工程を含む。いくつかの態様において、レシピエント対象およびドナーは、同一の個体である。いくつかの態様において、レシピエント対象およびドナーは、同一の個体ではない。
【００７９】
いくつかの態様において、本開示は、（i）それを必要とするレシピエント対象と免疫適合性であるドナーから入手された体細胞を再プログラミングする工程；および（ii）再プログラミングされた体細胞のうちの1種類または複数種類をレシピエント対象へ移植する工程を含む、レシピエント対象において細胞移植を実施するための方法を提供する。いくつかの態様において、レシピエント対象およびドナーは、同一の個体である。いくつかの態様において、レシピエント対象およびドナーは、同一の個体ではない。
【００８０】
本開示は、それを必要とする対象へ、治療的に有効な量の（a）本発明の方法によって調製された、誘導されたRPEの集団、誘導されたPR細胞の集団、誘導された網膜神経節細胞、および/もしくは誘導された網膜前駆細胞の集団；ならびに/または（b）本発明の方法によって調製された、再プログラミングされた体細胞の集団を投与する工程を含む、個体における眼の障害を処置するための方法を提供する。
【００８１】
本発明の方法によって処置され得る眼の障害の非限定的な例には、網膜委縮、視神経損傷、視神経萎縮、加齢黄斑変性、遺伝性黄斑変性、糖尿病性網膜症、鎌状赤血球網膜症、緑内障、嚢胞様黄斑浮腫、網膜剥離、血管閉塞、光受容細胞変性、感染症、視力喪失、およびそれらの任意の組み合わせが含まれる。
【００８２】
哺乳動物対象への投与のため、本発明の方法を使用して生成された誘導されたRPE、誘導されたPR細胞、誘導された網膜前駆細胞の集団、および/または遺伝学的に修飾された体細胞の集団は、薬学的組成物として製剤化され得る。薬学的組成物は、無菌の水性または非水性の溶液、懸濁液、または乳濁液であってよく、それらは、生理学的に許容される担体（即ち、細胞の活性に干渉しない無毒の材料）をさらに含む。当業者に公知の任意の適切な担体が、本発明の薬学的組成物において利用され得る。担体の選択は、投与される物質（即ち、細胞または化学的化合物）の性質に一部分依るであろう。
【００８３】
本開示は、それを必要とする対象へ、治療的に有効な量の（a）本発明の方法によって調製された、誘導された感覚有毛細胞の集団もしくは誘導された感覚有毛細胞前駆細胞の集団；および/または（b）本発明の方法によって調製された、再プログラミングされた体細胞の集団を投与する工程を含む、聴覚喪失および脱毛症などの他の障害を処置するための方法も提供する。他の局面において、目的の体細胞を、本明細書中に記載された処理方法を使用して、インサイチューで処理することができる。
【００８４】
聴覚喪失  蝸牛感覚上皮は、頂端膜側表面の不動毛によって伝達される音の検出に適応した有毛細胞を含有している。哺乳動物において、発達中に産生された有毛細胞は、有系分裂後であり、喪失の後に、または正常な細胞代謝回転の一部として、置換されることはない。その結果、有毛細胞喪失による難聴は、不可逆性である。胎児期の有毛細胞発達は、複雑な一連の運命決定を含み、そこで、前感覚上皮細胞は、有毛細胞または支持細胞のいずれかという異なる運命を獲得する。本明細書中に記載された方法のある種の局面は、騒音性聴覚喪失後の聴覚の回復と相関する蝸牛有毛細胞を成体動物において再生させるために使用され得る。従って、一つの局面において、本発明は、新生児期後の哺乳動物において、蝸牛有毛細胞の喪失によって引き起こされた聴覚喪失を処置するための方法を特色とする。方法は、再プログラミング因子または再プログラミングされた細胞の治療的に有効な量またはレジメンを含む組成物を、哺乳動物へ全身投与するかまたはその耳へ局所投与する工程を含み、ここで、治療的に有効な量とは、1回または複数回で、聴覚を回復するために十分な量である。
【００８５】
さらに、本明細書中の特色である組成物および方法は、予防的に、例えば、聴覚喪失、難聴、または有毛細胞の喪失に関連したその他の聴力障害を防止するか、低下させるか、またはその進行を遅延させるため、使用され得る。
【００８６】
一般に、本明細書中に記載された化合物および方法は、（例えば、内耳、中耳、および/または外耳において）耳内の有毛細胞成長を生成するため、かつ/または耳内の有毛細胞の数を増加させるため、使用され得る。例えば、耳内の有毛細胞の数は、処置前の有毛細胞の数と比較して、約2倍、3倍、4倍、6倍、8倍、もしくは10倍、またはそれ以上、増加し得る。この新しい有毛細胞成長は、対象の聴力を効果的に回復させるかまたはその少なくとも部分的な改善を確立することができる。例えば、作用物質の投与は、約5％、10％、15％、20％、40％、60％、80％、100％、またはそれ以上、聴覚喪失を改善することができる。
【００８７】
脱毛症  他の態様には、毛包の細胞の再プログラミングによる脱毛症の処置が含まれる。哺乳動物の毛線維は、角質化された細胞から構成されており、毛包から発達する。毛包は、皮膚の表面の直下に存在する表皮のダウングロース（downgrowth）に由来する組織の杭である。毛包の遠位部分は、外部の皮膚表皮と直接連続している。毛包は、小さい構造であるが、同心列に配置された認識可能に異なる層の高度に組織化された系を含む。活動性の毛包は、真皮、（結合組織の緩い層である）皮下組織を通って、脂肪または脂質の層へ及ぶ。
【００８８】
活動性の毛包の基部には毛球が存在する。球は、表皮マトリックスとして公知の表皮細胞の反転したカップ（inverted cup）に含有されている、毛乳頭として公知の皮膚細胞の塊からなる。毛包の型に関係なく、この表皮マトリックスの最も基部において、発芽力のある表皮細胞が、いくつかの支持表皮層と共に、毛線維を産生する。最下の真皮鞘は、毛乳頭の基底ストークと連続しており、そこから、鞘は、組織の薄い覆いとして毛母基表皮層の全ての周りに外側にカーブしている。次いで、真皮鞘の最下部分は、毛包の全長のためのスリーブまたはチューブとして続いている。
【００８９】
本明細書中に記載された方法のある種の局面は、脱毛症からの回復のための発芽力のある表皮細胞を再生させるために使用され得る。従って、一つの局面において、本発明は、哺乳動物における発芽力のある表皮細胞の喪失によって引き起こされた脱毛症を処置するための方法を特色とする。方法は、再プログラミング因子または再プログラミングされた細胞の治療的に有効な量またはレジメンを含む組成物を、哺乳動物へ全身投与するかまたはその頭皮もしくは毛包へ局所投与する工程を含み、ここで、治療的に有効な量は、毛を成長させる能力を回復させるために十分な量である。
【００９０】
C.目的の細胞を同定および確認する方法
再プログラミングされた細胞は、様々な方法を使用して、同定されかつ確認され得る。これらの方法には、細胞およびコロニーの形態学の調査；細胞が目的の細胞型の機能的特徴を示すか否かの判定；細胞が目的の細胞型の特徴的なマーカーを発現するか否かの判定；ならびに遺伝子メチル化の目的の細胞型との比較が含まれる。
【００９１】
さらに、不要の遺伝学的および/またはエピジェネティックな変更が存在するか否かを判定するため、候補の再プログラミングされた細胞を分析することができる。例えば、細胞を、例えば、（古典的なスペクトル核型決定法を含む）細胞学的方法および/または配列決定に基づく方法（例えば、ディジタル核型決定）によって、核型決定することができる。例えば、未処理の細胞と再プログラミングされた細胞との間のゲノムワイドのSNPプロファイルの比較によって、ヘテロ接合性の喪失が起こったか否かを判定するため、細胞を試験することができ、ヘテロ接合性の喪失は、不要の組換えイベントが起こった可能性があることを示す。癌遺伝子および/または腫瘍抑制因子の異常な発現を検出するため、細胞を試験することもできる。任意で、特定の遺伝子（例えば、成長制御に関与する遺伝子）の配列を標的とする、部分的または完全なゲノム配列決定によって、不要のゲノム配列修飾について、細胞を試験することもできる。不要のヒストン修飾のような不要のエピジェネティック変化について、細胞を試験することもできる。
【００９２】
本発明はさらに、本発明のそれぞれの方法によって作製された誘導された網膜色素上皮細胞、誘導された光受容細胞、網膜神経節細胞、および/または誘導された網膜前駆細胞を提供する。本発明のそれぞれの方法によって作製された誘導された網膜色素上皮細胞の集団、誘導された光受容細胞の集団、および誘導された網膜前駆細胞の集団も、本明細書中に提供される。
【００９３】
本発明の追加の局面は、本発明の細胞の有効量を、対象（例えば、それを必要とする対象）の眼へ送達する工程を含む、対象において眼の障害を処置する方法を提供する。
【００９４】
本発明の方法において、再プログラミングされた目的の細胞を、それぞれ、内在性の網膜色素上皮細胞、内在性の光受容細胞、または内在性の網膜前駆細胞の特徴について分析することができる。内在性の網膜色素上皮細胞の特徴の非限定的な例には、RPE65、Cralbp、ベストロフィン、およびチロシナーゼの遺伝子およびタンパク質の発現、休止膜電位および経上皮電位、VEGFおよびPEDFの偏性分泌、ならびに貪食が含まれる。内在性の光受容細胞の特徴の非限定的な例には、ロドプシン、リカバリン、ペリフェリンの遺伝子およびタンパク質の発現、電気インパルスへの光刺激の変換が含まれる。内在性の網膜前駆細胞の特徴の非限定的な例には、網膜ニューロンサブタイプへ分化する能力、ネスチン、Sox2、ChxlO、Pax6、Six6、Six3、またはRaxの遺伝子およびタンパク質の発現が含まれる。
【００９５】
D.薬学的組成物および投与
本発明は、再プログラミングされた体細胞（例えば、誘導されたRPE、誘導されたPR細胞、および誘導された網膜前駆細胞；誘導されたRPE、誘導されたPR細胞、および誘導された網膜前駆細胞の子孫）と、適切な担体とを含む組成物を提供する。本発明の組成物は、本発明の再プログラミングされた細胞を含むことができ、いくつかの態様において、一つまたは複数の追加の構成要素を含むことができ、それらの構成要素は、一部分、本発明の再プログラミングされた細胞の意図された使用に基づき選択される。適切な構成要素には、塩；緩衝液；安定剤；プロテアーゼ阻害因子；細胞膜および/または細胞壁を保存する化合物、例えば、グリセロール、ジメチルスルホキシドなど；細胞にとって適切な栄養培地などが含まれる。
【００９６】
いくつかの態様において、本発明の組成物は、本発明の再プログラミングされた細胞と、マトリックスまたは支持体とを含むことができ、ここで、本発明の再プログラミングされた細胞は、マトリックスと会合している。「マトリックス」という用語は、再プログラミングされた細胞が、細胞複合物を形成するため、接着するかまたは付着することができる任意の適切な担体材料をさす。いくつかの態様において、マトリックスまたは担体材料は、既に、後の適用のために望まれる三次元形態で存在する。
【００９７】
例えば、（「生体適合性基質」とも呼ばれる）マトリックスは、対象への植え込みのために適切な材料であり得る。生体適合性基質は、対象に植え込まれた後、毒性のまたは有害な効果を引き起こさない。一つの態様において、生体適合性基質は、所望の構造または所望の構造の一部へ成形され得る表面を有するポリマーである。生体適合性基質は、細胞が接着しかつ/または成長することを可能にする支持フレームワークを提供することができる。適切なマトリックス構成要素には、コラーゲン；ゼラチン；フィブリン；フィブリノーゲン；ラミニン；グリコサミノグリカン；エラスチン；ヒアルロン酸；プロテオグリカン；グリカン；ポリ(乳酸)；ポリ(ビニルアルコール)；ポリ(ビニルピロリドン)；ポリ(エチレンオキシド)；セルロース；セルロース誘導体；デンプン；デンプン誘導体；ポリ(カプロラクトン)；ポリ(ヒドロキシ酪酸)；ムチンなどが含まれるが、これらに限定されるわけではない。本発明の再プログラミングされた細胞/マトリックス組成物は、1種類または複数種類の追加の構成要素をさらに含んでいてもよく、ここで、適切な追加の構成要素には、例えば、増殖因子；抗酸化剤；栄養素輸送体（例えば、トランスフェリン）；ポリアミン（例えば、グルタチオン、スペルミジンなど）などが含まれる。本発明の再プログラミングされた細胞/マトリックス組成物における細胞密度は、細胞約102個/mm3〜細胞約109個/mm3；細胞約102個/mm3〜細胞約104個/mm3；細胞約104個/mm3〜細胞約106個/mm3；細胞約106個/mm3〜細胞約107個/mm3、細胞約107個/mm3〜細胞約108個/mm3、または細胞約108個/mm3〜細胞約109個/mm3の範囲であり得る。
【００９８】
本発明の組成物は、薬学的に許容される担体を含んでいてよい。適切な担体には、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組み合わせが含まれる。さらに、所望により、担体は、湿潤剤、乳化剤、またはpH緩衝剤などの微量の補助物質を含有していてもよい。そのような組成物および/または製剤を調製する実際の方法は、当業者に公知であるかまたは明白であろう。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences.Mack Publishing Company,Easton,Pa.,latest editionを参照すること。
【００９９】
ビヒクル、佐剤、担体、または希釈剤などの薬学的に許容される賦形剤は、当技術分野において周知である。さらに、pH調整剤、緩衝剤、浸透圧調整剤、安定剤、湿潤剤などのような薬学的に許容される補助物質は、当技術分野において周知である。
【０１００】
代表的な担体には、生理食塩水溶液、ゼラチン、水、アルコール、天然もしくは合成の油、糖類溶液、グリコール、オレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステル、またはそのような材料の組み合わせが含まれる。任意で、薬学的組成物は、保存剤、ならびに/または、例えば、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤、および/もしくは不活性ガスなどのその他の添加剤、ならびに/または他の活性成分をさらに含有していてもよい。
【０１０１】
本発明の誘導されたRPE集団、誘導されたPR細胞集団、または網膜前駆細胞集団の単位剤形は、約10,000〜約10,000,000個の細胞を含有していてよい。
【０１０２】
本発明の誘導された細胞集団、および/または本発明の再プログラミングされた体細胞の集団は、ルーチンの手法によって凍結保存されてもよい。例えば、凍結保存は、適切な増殖培地、10％BSA、および7.5％ジメチルスルホキシドを含んでいてよい「凍結」培地において、約1〜1000万個の細胞に対して実施され得る。細胞を遠心分離する。成長培地を吸引し、凍結培地に交換する。細胞をスフェアとして再懸濁させる。細胞を、例えば、-80℃の容器に置くことによって、徐々に凍結させる。細胞を、37℃の浴槽内で回旋によって解凍し、新鮮な増殖培地に再懸濁させ、本明細書中に記載されるように成長させる。
【０１０３】
前記の方法において、対象の眼内の細胞は、線維芽細胞、網膜ニューロン、RPE細胞、PR細胞、網膜神経節細胞、ミュラーグリア細胞、およびそれらの任意の組み合わせであり得るが、これらに限定されるわけではない。本発明の組成物は、対象の眼内の処置部位またはその周辺に投与され得る。
【実施例】
【０１０４】
以下の実施例は、図面と同様に、本発明の好ましい態様を示すために含まれる。実施例または図面において開示された技術は、本発明の実施において良好に機能することが本発明者らによって発見された技術を表し、従って、その実施のための好ましいモードを構成すると見なされ得ることが、当業者によって認識されるべきである。しかしながら、本開示を考慮すれば、開示された具体的な態様に多くの変化を施しても、本発明の本旨および範囲から逸脱することなく、同様のまたは類似した結果を入手することが可能であることを、当業者は認識するべきである。
【０１０５】
実施例1
網膜細胞への線維芽細胞の化学的再プログラミング
A.結果
光受容細胞様細胞（CiPPC）の誘導のための低分子の同定  網膜ニューロンに特異的な運命を担う低分子を同定するため、本発明者らは、線維芽細胞をニューロンへ変換することができる低分子のセットを記載している以前の研究に従った（Hu et al.,Cell stem cell 17:204-12,2015；Zhang et al.,Cell stem cell 17:735-47,2015；Fu et al.,Cell research 25,2015；Cheng et al.,Cell research 25:1269-72,2015）。これらの研究において記載された6種類の低分子のうちの4種類、バルプロ酸（V）、CHIR（C）、Repsox（R）、およびフォルスコリン（F）は、線維芽細胞を混合前駆細胞段階へ変換することができる（Fu et al.,Cell research 25,2015）。本発明者らは、網膜ニューロンに特異的な運命の決定のために重要であり得る追加の低分子を見出すため、この現象を活用した。種々の培地組成および時点と共に、低分子のアレイを、可能性のある候補として試験した。光受容細胞特異的レポーターマウス（Nrl-GFP）由来のマウス胎仔線維芽細胞（MEF）を、再プログラミング研究のための出発細胞として使用する（Akimoto et al.,PNAS 103:3890-95,2006）。光受容細胞へ変換された場合に、これらのMEFは、NrlプロモーターからのGFP発現を有するであろう。多くの低分子および培養培地による数回の失敗の後、本発明者らは、d10〜d11の間にVCRFの存在下でGFP陰性MEFをGFP+陽性の丸形の光受容細胞様細胞へ変換することができるWnt/βカテニン阻害物質（IWR1）を同定した。この変換は、8日目（d8）に導入される3種類の追加の因子、ソニックヘッジホッグ（S）、タウリン（T）、およびレチノイン酸（R）を必要とする（図1Aおよび図1B）。ヒト線維芽細胞（HFL1、ATCC CCL153）も、これらの低分子によって光受容細胞様細胞へ変換され得る。本発明者らは、Nrlプロモーターの下流にレンチウイルスによって形質導入されたDsRedレポーターを有するHFL-1細胞株を最初に生成した。薬物によって選択されたHFL1-Nrl-DsRed細胞を、いくつかの改変を含み以前に記載されたマウスに特異的なプロトコールによる再プログラミングのために使用した（図1C）。丸形のニューロン様のNrlプロモーターによって駆動されたDsRed陽性細胞が、d6〜d8に明らかになり始めた（図1D）。IWR1濃度およびその導入の時期を変化させることによる方法の改変が、その細胞を入手するためには必須である。再プログラミング中のBDNF、GDNF、およびNT3の添加は、これらの変換されたヒト光受容細胞様細胞が、健常な形態学を有することを支援する。本発明者らは、出発細胞としてNrl-GFP MEFを使用することによって、再プログラミング過程における各低分子の重要性を試験した。それらの各々は、単独では、GFPレポーターを活性化することができず、このことから、低分子の間の相乗作用がその過程のために重大であることが示された（図1E）。次いで、本発明者らは、カクテルから低分子の各々を差し引き、Repsox、フォルスコリン、CHIR、およびIWR1の除去が再プログラミング過程に対して最悪の効果を有することを見出した。これらの結果は、低分子カクテル（5C）が、線維芽細胞を網膜光受容細胞様細胞へ変換することができることを明確に証明した。図12A〜12Fは、ciRGCがニューロン活性を有することを図示する。
【０１０６】
化学的に再プログラミングされた光受容細胞様細胞（CiPPC）の特徴決定  さらなる特徴決定のため、変換されたGFP+細胞をd11において流動選別し、RT-PCRによって遺伝子発現について分析した（図2A）。Otx2、Crx、Nrl、およびChx10のような初期光受容細胞マーカーの発現は、化学的に再プログラミングされた細胞において明らかであった（図2B）。さらに、これらの丸形GFP陽性細胞のd11における免疫染色は、Chx10、CD73、およびCrxの発現を示した（図2Cおよび図2D）。これらの結果は、d11における丸形GFP陽性細胞が光受容細胞様細胞（CiPPC）と推定されることを示した。分化培地においてさらに5日間培養した場合、丸形細胞は、NrlプロモーターからのGFPレポーター発現と共に、ニューロン様構造を示した。これらのニューロン様GFP+細胞は、ロドプシンおよびCrxについて陽性であった（図2Eおよび図9A）。分化過程で、これらのニューロン細胞は、急速に死滅した。
【０１０７】
次いで、本発明者らは、変換されたヒト光受容細胞様細胞の遺伝子発現状態を、RT-PCRおよび免疫染色によって調べた。DsRedを発現する光受容細胞様細胞は、Crx、ロドプシン、Chx10、およびOtx2の発現を有することが見出された（図2F、図9B、図9C）。
【０１０８】
線維芽細胞に特異的なマーカーFsp1を発現する最初の線維芽細胞の運命を追跡するため、Cre-LoxP系統追跡系を使用することによって、初期MEFが線維芽細胞に由来することを確認した。最初に、FSP1-Cre動物を、R26-f-STOP-f-Tdtomato動物と交雑させ、得られたFSP-1-Cre-f-STOP-f-Tdtomato胚（E12.5）を、MEF単離のために使用した（Fu et al.,Cell research 25:1013-24,2015）。これらのMEFは、Cre発現細胞におけるTdtomato発現を示した。次いで、流動選別されたTdtomato発現細胞を、化学的再プログラミングのために使用した。d11における化学的に変換された細胞は、tdTomatoおよびNrlの両方の発現を有することが見出された。tdTomatoのNrlとの共局在は、Nrl陽性細胞が線維芽細胞に真に由来することを示唆する（図2G）。選別後のtdTomato陰性集団から変換されたいくつかのGFP発現細胞も見出された（図2H）。これらの結果は、化学的に変換されたNrl陽性細胞が線維芽細胞に真に由来することを証明した。
【０１０９】
CiPPC生成は前駆細胞段階および増殖段階なしで直接的である  次に、本発明者らは、化学的再プログラミングの過程が、直接的であるか、それとも中間の前駆細胞段階を通したものであるかを研究した。Sox2-GFP MEF（sox2は網膜前駆細胞マーカーである）を、化学物質カクテルによる再プログラミングのための出発細胞として使用した。レポーター発現は、再プログラミング過程のいずれの段階においても見出されなかった（データ未提示）。本発明者らは、再プログラミングが中間の増殖段階を通過するか否かも試験した。これを試験するため、Nrl-GFP MEFを、化学的再プログラミングのための培養期間を通じて、低分子誘導と共に5-ブロモデオキシウリジン（BrdU）によって処理した。GFP+細胞の大多数（約95％）が、BrdU陰性であり、再プログラミングが直接的であることが示された（図10Aおよび図10B）。
【０１１０】
CiPPCは杆体光受容細胞と類似の遺伝子発現サインを保有する  次に、本発明者らは、これらの化学的に変換された細胞の詳細な遺伝子発現サインを研究した。本発明者らは、二つの局面に興味を持った。一つ目は、細胞がネイティブカウンターパートにどの程度近いか；二つ目は、MEFから光受容細胞様細胞への再プログラミングの中間段階において、化学物質による処理によって遺伝子発現サインがどのように変化するか。第1の局面に取り組むため、Nrl-GFPレポーターマウス（陽性対照）のP3およびP5の仔イヌから単離されたGFP+杆体光受容細胞と、化学的に変換された細胞（CiPPC）の遺伝子発現プロファイリングを比較した（Pearson et al.,Nature 485:99-103,2012；Kim et al.,Cell Rep 17:2460-73,2016；Barbera et al.,PNAS 110:354-59,2013）。第2の局面に取り組むため、再プログラミングのd5およびd8における2つの中間段階を含めた（RepInterm d5およびRepInterm d8）。さらに、出発MEFの転写プロファイリングをトランスクリプトーム分析に含めた。RNASeqデータについてのサニティ（Sanity）プロットは、各試料について2000万超のリードを示し、データがクリーンであり、バッチ効果が無視し得る程度であることを示した（図10C）。正規化されたFPKM値の平均値の教師なしピアソン相関分析（PCA）は、CiPRトランスクリプトームの、P4およびP6のNrl-GFP+細胞へのシフトを示した。P3の仔イヌから単離された細胞からは、ほとんど類似性が見出されなかった。再プログラミングされた細胞は、MEFならびにd5およびd8における再プログラミング中間体との類似性を有しないことが見出された。PCA分析も、出発MEFからの再プログラミング中間体のトランスクリプトームシフティングを示した（図3A）。
【０１１１】
PCAデータは、既知遺伝子の発現についてのヒートマップ分析によってさらにバリデートされた。化学的に再プログラミングされた細胞は、杆体に特異的な遺伝子の高い発現を有することが見出されたが、錐体、神経節、アマクリン、水平のようなその他の網膜ニューロンに特異的な遺伝子は、極めて低レベルに発現されていた（図3B、図3C、およびデータ未提示）。いくつかの双極細胞およびミュラー細胞に特異的な遺伝子の中程度の発現も、明らかであった。変換された細胞において網膜前駆細胞（RPC）に特異的な遺伝子の発現を検索した場合、Vsx2およびNotch1以外のRPCに特異的な遺伝子についての極めて低いレベルの発現が見出された（図3C）。これらの化学的に再プログラミングされた細胞は、Otx2、Nrl、およびCrxなどのような網膜に特異的な転写因子の高い発現を有することが見出され、その網膜同一性が確認された（図3C）。本発明者らが、その他のホメオボックス転写因子およびblH転写因子の発現を調べた場合、neurod1およびneurod4以外の極めて低レベルの発現が見出された。注目すべきことに、Rorb、Ascl1、Pias3、Thrb、Rxrgのような光受容細胞の特定化における報告された役割を有する転写因子のいくつかが、d5およびd8の中間体において誘導される（図3C）。これらの結果は、化学的に変換された光受容細胞様細胞が、レポーターマウスから単離されたネイティブカウンターパートと類似した遺伝子発現プロファイリングを有することを明確に示した。
【０１１２】
光受容細胞欠損rd1マウスにおける再プログラミングされた細胞の移植および機能的試験  化学的に変換された光受容細胞様細胞のマウス網膜内での機能性を試験するため、流動選別されたGFP+細胞を、網膜変性マウス（Rd1）の網膜下に移植し、網膜電図（ERG）および瞳孔測定について分析した。Rd1は、遺伝性網膜症である網膜色素変性症の臨床的に適切なマウスモデルである（Barbera et al.,PNAS 110:354-59,2013）。これらのマウスは、光受容細胞の進行性の喪失を経験し、3週間以内にほぼ完全な喪失が起こる。約100Kの再プログラミングされたNrl-GFP陽性細胞を、d31においてRd1マウスの6個の眼に網膜下移植した。PBSを注射された眼を、対照として使用した。細胞を移植されたマウスおよびPBSを注射されたマウスを、d45およびd59において暗順応A波およびB波の分析のため分析した（図4A）。d45において、これらの眼のうちの3個が、PBSを注射された対照と比較して改善された暗順応A波を示した（図4B）。これらのERG値は野生型対照より低かったが。本発明者らは、この時点で、検出可能な暗順応B波および明順応B波を観察しなかった。59日目に、1個の眼のみが、暗順応B波の有意な増大を示した（図4C）。本発明者らは、90日目に、類似したERG分析を実施したが、いずれの眼からも電気的応答を見出さなかった（データ未提示）。以前の報告は、網膜下注射における細胞の頑強な組み込みにも関わらず、暗順応ERG応答が明らかではないことを示唆しているが、そのような応答は野生型動物において容易に記録され得る（Pearson et al.,Nature 485:99-103,2012；Lamba et al.,Cell stem cell 4:73-79,2009）。一つの最近の報告は、瞳孔光応答（PLR）が、後期の時点（3ヶ月）で保存されており、その時、A波はほぼ検出不可能であり、微量のB波が存在することを示した（Zhu et al.,Cell stem cell,2016）。これらの観察から、本発明者らは、細胞を移植された動物においてPLRについて試験することにした。光によって媒介される瞳孔収縮は、網膜内層との機能的連絡を介して、光刺激を中脳核に送り、瞳孔筋に送り返す光受容細胞に依る。本発明者らは、瞳孔収縮を測定し、光受容細胞を移植された眼における瞳孔収縮が、PBS対照と比較して、約30％増大していることを見出した（図4Dおよび図4E）。最後に、凍結切片化されたCiPPCを注射された網膜を、GFP陽性光受容細胞様細胞の存在について試験した。移植された網膜において3ヶ月後に顆粒層（ONL）は明らかでなく、完全な網膜変性が示された。移植された細胞は、既存の内顆粒層および網膜下空間に存在した。これらの細胞は、相互の連絡および網膜の一部との連絡を形成していた（図4F）。網膜内のNrl-GFP+細胞は、光受容細胞マーカーであるOTX2、ロドプシン、およびリカバリンについて陽性であった（図4Gおよび図4H）。これらの結果は、化学的に再プログラミングされたNrl-GFP+細胞が、光受容細胞欠損（rd1）網膜において生存し、遊走し、分化したことを明確に証明した。
【０１１３】
NF-kBによって誘導されたASCL-1発現はCiPPC再プログラミングを媒介する  次に、本発明者らは、化学的再プログラミングの機序を研究した。以前の報告は、インビトロおよびインビボの両方で、前神経転写因子ASCL-1の過剰発現がミュラーグリア細胞を網膜ニューロンへ再プログラミングし得ることを証明した（Brzezinski et al.,Development 138:3519-31,2011；Ueki et al.,PNAS 112:13717-22,2015）。RNA Seq分析は、再プログラミング中間体のd8から始まるAscl-1の増大した発現を示した（図3C）。本発明者らは、qPCRによってRNASeqデータをバリデートし、Ascl-1発現の類似した傾向を見出した（図5A）。低分子を単独またはVCRFなどの組み合わせで用いた処理の間において、Ascl1誘導は明らかでなかった。従って、変換中のAscl-1発現の出現は、真に化学物質カクテル（5C）の組み合わせによるものであった。最近、光受容細胞に特異的な遺伝子発現が、インビトロおよびインビボのAscl-1過剰発現細胞において報告された（Ueki et al.,PNAS 112:13717-22,2015）。さらに、Ascl1が、いくつかの光受容細胞前駆細胞において、一過性に発現されることが報告された（Swaroop et al.,Nat Rev Neurosci 11:563-76,2010）。これらの観察に依って、Ascl1は、CiPPC再プログラミングにおいて役割を果たすと、本発明者らは予想する。これを試験するため、本発明者らは、shRNAテクノロジーによって、Nrl-GFPレポーターマウス由来のMEFにおいてAscl1を枯渇させた（図5B）。次いで、ピューロマイシンによって選択されたMEF（3日間）を、化学的変換のために使用した。実際、11日目に、対照shRNAと比較して70〜80％少ないGFP+丸形光受容細胞様細胞の生成が起こることが見出された（図5C）。
【０１１４】
次に、本発明者らは、ASCL-1による誘導の原因を調査した。初期の研究において、NF-kBのような転写因子が、神経幹細胞の初期分化および胎児神経生成において利用された（Zhang et al.,Stem cells 30:510-24,2012）。NF-kBは、異なる細胞刺激に対して迅速に作用する一次転写因子として作用する。それは、不活性状態で細胞内に存在し、機能性になるために新しいタンパク質合成を必要としない。これは、NF-kBが細胞刺激に対する最初の応答因子であることを可能にする。従って、NF-kBまたはその他の転写因子が、発現を誘導するため、Ascl-1の上流に含まれていることが推論された。NF-kB-ルシフェラーゼ構築物を形質導入されたMEFの化学的変換中に、NF-kB活性化を調べた。本発明者らは、NF-kBの活性化が、d5から始まり、d11において最高に達することを見出した（図5D）。これらの結果は、NF-kBが、発現を誘導するため、Ascl1の上流に含まれている可能性を示した。Ascl-1誘導におけるNF-kBの役割を確認するため、バイオインフォマティクス（rVista）を実施し、続いて、定量的ChIPアッセイを実施した（図5E）。Ascl-1コード領域の3'UTRの近くに位置する部位のうちの1個は、NF-kBについて陽性結合を示した（図5F）。さらに、ルシフェラーゼレポーター遺伝子による一過性トランスフェクション分析は、再プログラミングの8日目に、NF-kBが3'遺伝子間配列との結合によってAscl1を正に制御することを確認した（図5G）。これらの結果は、低分子処理が、NF-kB活性化を引き起こし、次に、それが、Ascl-1制御領域に結合し、その発現を調節することを明確に示した。
【０１１５】
ミトコンドリアROSは逆行性シグナリングによってCiPPC再プログラミングを調節するNF-kBを活性化する  次に、本発明者らは、NFkβ活性化の理由を調査した。NF-kBの公知の誘導物質は、高度に可変性であり、TNFα、LPS、電離放射線、およびミトコンドリアROSを含む（Formentini et al.,Mol Cell 45:731-42,2012；Andreakos et al.,Blood 103:2229-37,2004）。最近の報告は、ミトコンドリアによって生成されたROSが、NF-kBの活性化を通して、核に対する逆行性の応答を誘導し得ることを証明した（Formentini et al.,Mol Cell 45:731-42,2012）。従って、本発明者らは、低分子処理によって生成されたミトコンドリアROSがNF-kBを活性化すると予想した。これを立証するため、本発明者らは、最初に、蛍光定量および顕微鏡法によって、再プログラミング中の種々の時点においてミトコンドリアROSを測定した。本発明者らは、対照MEFと比較して、再プログラミング中のミトコンドリアROS指標mitosoxの増大した蓄積が、d5から始まることを見出した（図6A、図6B、および図6C）。化学的再プログラミングにおけるmROSの重要性を測定するため、変換実験を、ミトコンドリアROS消去剤mitotempoの存在下で実施した。化学的再プログラミング中のmROSの消去は、再プログラミングされた細胞の収率を有意に減少させた（20％）（図6E）。本発明者らは、mitoSox染色後の蛍光定量分析によって、mitotempoを用いて処理した時のmROS生成の減少を確認した（図6F）。注目すべきことに、IWR1なしの再プログラミングは、d8におけるmROS生成の増大を示さず、そのことから、単独または組み合わせでのmROS生成における役割が示唆された（図6F）。本発明者らは、異なる濃度のmitotempoの存在下でもNrl-GFP+の再プログラミングされた細胞の数を調べ、用量依存的な関係を見出した（データ未提示）。これらの結果は、mROSが光受容細胞の化学的再プログラミングにおいて重要な役割を果たすことを確認した。
【０１１６】
化学的再プログラミングにおけるmROSの関与をさらに確認するため、本発明者らは、mROS生成の遺伝学的モデルを使用した。ミトコンドリア転写因子（Tfam）の枯渇は、mROSを生成することが示されている（Vernochet et al.,Cell metabolism 16:765-76,2012）。初期の所見は、IWR1を取り除くことによって、再プログラミング効率およびmROS生成が低下することを示した。従って、本発明者らは、IWR1の非存在下で再プログラミングのためにTfam枯渇MEFを使用することを計画した。Tfam発現をノックダウンするため（図6C）、Nrl-GFP MEFは、Tfam shRNAを有する誘導可能レンチウイルス（Dharmacon）を用いて形質導入された。ピューロマイシンによって選択されたMEF（3日間）を、（IWR1を含まない）低分子による再プログラミングのために使用し、Tfam shRNAの誘導をd3において開始した。GFP陽性の変換された細胞の数は、対照wt Nrl-GFP陽性細胞と比較して、IWR1の非存在下でのTfamノックダウン時に増加した（図6Dおよび図6E）。本発明者らは、mitosox染色によって、Tfamノックダウン細胞におけるmROSの上昇したレベルを確認した（図6F）。これらの結果は、低分子処理によって生成されたミトコンドリアROSが、光受容細胞再プログラミングにおけるキープレーヤーであることを明確に示した。本発明者らは、カクテル中の他の低分子によるミトコンドリアROS生成の可能性を調べた。単独または組み合わせの全ての低分子によってMEFを処理した場合、ミトコンドリアROS生成の増大は存在しなかった（データ未提示）。
【０１１７】
mROSを通したNF-kB活性化の可能性を調べるため、ルシフェラーゼ活性を、ミトコンドリアROS消去剤の存在下でのNF-KB-Luc-MEFの化学的再プログラミング中に測定した。興味深いことに、再プログラミング中のmitotempo処理（d3から開始）は、5日目からNF-kB活性を有意に減少させ、このことから、活性化がmROS依存性であることが示された（図11A）。この観察をさらに確認するため、mROSを生成するTfamノックダウンMEFを、IWR1の非存在下での化学的変換のために使用した。再プログラミングの8日目に、Tfamノックダウン細胞において、対照と比較して、NF-kB活性の約2倍の増大が観察された（図11A）。さらに、本発明者らは、mitotempoによる処理時のAscl-1遺伝子座におけるNF-kBの結合を調べ、低下した結合を見出した（図6G）。これらの結果は、ミトコンドリアROSによって活性化されたNF-kBが、Ascl-1制御領域に結合し、その発現を調節することを明確に証明した。
【０１１８】
低分子によって誘導された、アキシン2の安定化および局在は、mROSを生成する  次に、化学的再プログラミング中のmROS生成の機序を調査した。一つの最近の報告は、CHIRおよびIWR1による外胚葉幹細胞の同時処理が、WNTシグナリングエフェクター分子アキシン2の安定化を引き起こすことを示唆した（Kim et al.,Nature communications 4:2403,2013）。さらに、XAV939（IWR1に機能的に類似しているWNTシグナリング阻害物質）によって数日間処理されたHepG2細胞も、サイトゾルにおいてアキシンを安定化することができる。これらの過剰量のアキシン分子は、ミトコンドリアへターゲティングされ、ETC複合体IVと会合するようになる（Shin et al.,Experimental cell research 340:12-21,2016）。アキシンのOXPHOS複合体IVとの会合は、レピロソーム（repirosome）を通した電子伝達を妨害することによって、最終的にミトコンドリアATP産生を低下させた。さらに、外来性Otx2は、F0/F1 ATPアーゼと相互作用することによって、網膜ニューロンのミトコンドリアに局在し、ATP産生を増大させることが見出された。これらの観察を考慮して、本発明者らは、（IWR1およびCHIRを含有している）化学物質カクテルによって生成された再プログラミングされた細胞が、サイトゾルにおいて安定化されたアキシン2を有し、それが後にミトコンドリアへターゲティングされると予想した。ミトコンドリアへのアキシン2のこの再局在は、ETC超複合体（supercomplex）との相互作用によってmROSを生成し、次に、それが、NF-kB機能を活性化する可能性がある。この仮説を試験するため、本発明者らは、最初に、再プログラミング中間体、変換された細胞、およびMEFにおいてアキシン1およびアキシン2の発現状態を調べた。中間体および変換された細胞は、出発MEFと比較して、より安定化されたアキシン2を有することが見出された（図7A）。アキシン1発現の変化は、これらの細胞型の間で明らかではなかった（データ未提示）。再プログラミングされた細胞におけるアキシン2の細胞内局在を、4色共焦点顕微鏡法によって試験した。Zセクショニング後の3D再構築は、アキシン2のmitotrackerとの共局在によって証拠付けられるように、アキシン2がミトコンドリアに局在することを示した（図7C）。反対に、アキシン2は、MEFのサイトゾルに局在し、mitotrackerとアキシン2との共局在は見出されなかった（図7B）。mROS生成および再プログラミングにおけるアキシン2の役割をさらに確認するため、アキシン2枯渇（Dharmaconから購入された誘導可能ShRNA）MEFを生成し、化学的再プログラミングのために使用した。アキシン2ノックダウンMEFから生成された変換中間体（図7D）は、全ての低分子の存在下で、野生型Nrl-GFP MEFと比較して低下したROS生成を示した（図7F）。さらに、アキシン2枯渇は、化学的変換後の変換されたNrl-GFP陽性桿体細胞の数を減少させる（図7E）。経路全体をさらに確認するため、本発明者らは、再プログラミングのd8において、再プログラミングされたアキシン2枯渇細胞におけるNF-kB活性化およびAscl1発現を測定した。d8における再プログラミング中間体において、NF-kBの減少した活性およびAscl1のより少ない発現が観察された（図7Gおよび図11B）。これらの結果は、アキシン2が、化学的に変換された細胞においてミトコンドリアに局在し、この小器官からの増大したROS生成を引き起こすことを明確に証明した。次���、ミトコンドリアROSは、Ascl1の発現を増大させるNF-kBを活性化した。次に、このNF-kBによって誘導されたAscl1が、光受容細胞への線維芽細胞の変換を調節する。
【０１１９】
B.方法
化学的に誘導された網膜ニューロンの生成  全ての低分子を、製造業者の説明書に従って、DMSOで希釈。0日目に、約35000個のMEFを、（0.1％ゼラチンによってO/Nコーティングされた）24穴プレートの各ウェルに播種した。1日目に、培地を、V（0.5mM）、C（4.8μM）、R（2μM）、F（10μM）を含む光受容細胞誘導培地（PIM）に交換した。3日目に、V、C、R、F＋IWR1（I、10μM）を含む培地（PIM）に交換した。d5およびd6において、VCRFIを含む培地（PIM）に交換した。8日目に、ソニックヘッジホッグ（S、3nM）、タウリン（T、100μM）、およびレチノイン酸（R、1μM）を添加した。9日目に、全ての低分子および因子を含む培地に交換した。最後に、11日目に、GFP発現を有する細胞を観察した。分化のため、培地を光受容細胞分化培地（PDM）に交換し、d15〜d16までそれを維持する。ヒト包皮線維芽細胞（HFF-1）変換のためのプロトコールは、d3において添加された5μM IWR1、5日目に添加されたS、T、R、BDNF、GDNF、およびNT3を除き、全て同一のままである。細胞は7日目に固定され分析された。
【０１２０】
動物モデルおよびMEF単離  全ての動物が、Institutional Animal Ethics Committeeのガイドラインに従って飼育され取り扱われた。Nrl-GFPレポーターマウス系統は、NEIのDr.Anand Swaroopから厚意により譲渡された。FSP1-CreマウスおよびfSftdTomatoマウスは、Jackson lab（Barr Harbor,MI,USA）から購入された。MEFは、以前に記載されたプロトコールに従って、頭部、四肢、および尾の除去の後に12.5d胚から調製された。FSP1-CreとFsF-tdTomatoとの交雑からのMEF調製のため、単離された胚を、蛍光顕微鏡下で調べ、赤色胚をMEF単離のために使用した。
【０１２１】
変換された細胞の移植  いくつかの10cmディッシュにおける変換の後、細胞をGFP発現に基づき選別した。次いで、細胞を培地（IMR90）に懸濁させ、一晩維持した。翌日、細胞を洗浄し、PBSに懸濁させた。2μlの細胞懸濁液（100K）を、d31において、rd1マウスへ網膜下注射した。PBS注射を対照として使用した。細胞およびPBSを移植された眼を、d45、d59、およびd90において、ERGについて分析した。
【０１２２】
瞳孔測定  暗順応マウスを、赤外線照明下で写真を撮るために使用した。移植された眼を、60ルクスの強度で、100Wグースアークランプからのライトガイドを通した白色光曝露に供した。低速度撮影写真を赤外線カメラによって得た（Sony、DCR-HC96）。露光前後の各マウスについての瞳孔面積を、ImageJソフトウェアによって測定した。瞳孔収縮の変化を、各マウスにおいて、暗所における瞳孔面積に対する、暗所および明所において測定された瞳孔面積の差によって表した。
【０１２３】
QPCRおよびRT PCR  全RNAを、Zymo Research（MicroPrep R1050）からのキットを使用することによって抽出した。cDNAを、製造業者の説明書に従って、Applied BiosystemsのHigh Capacity cDNA Reverse Transcriptionキットによって調製した。単離されたRNAを、c-DNA合成の前にDNAアーゼIによって処理した。RT-PCRおよびqPCRを、特異的なプライマーを使用することによって実施した。Applied BiosystemsからのサーマルサイクラーおよびOneStep Plus real time PCRを、増幅のために使用した。結果をGapdhまたはHPRTによって正規化した。プライマーの一覧については、表1を参照すること。
【０１２４】
（表１）プライマーの一覧表
2020524501.tif 000003
【０１２５】
免疫組織化学およびイムノブロッティング  4％パラホルムアルデヒドを、眼を固定するために使用した。次いで、凍結包埋された眼試料を、14μMの厚さに切片化した。固定された眼切片を、表2に列挙した一次抗体および二次抗体によって分析した。0.1％DAPIを、封入剤において核を染色するために使用した。画像を、Zeiss LSM510共焦点/Leica DMi8蛍光顕微鏡で得た。イムノブロッティングのため、全タンパク質を、市販の溶解緩衝液（Thermo Scientific、＃89900）によって抽出し、次いで、タンパク質の濃度をBCAタンパク質アッセイキット（Thermo Scientific ＃23227）によって測定した。等量のタンパク質を、各ウェルにローディングし、イムノブロットし、そして標準的な手法によって抗体染色した。
【０１２６】
（表２）抗体一覧表
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【０１２７】
網膜電図
免疫蛍光およびレーザー走査型共焦点顕微鏡法  共焦点顕微鏡法のため、変換されGFPによって選別された細胞を、チャンバー付きカバーガラス（Nunc）に播種し、一晩維持した。翌朝、細胞をMitotracker Red（500nM）によって30分間染色した。次いで、細胞を、4％PFAで20分間固定し、アキシン2 Ab（Santa Cruz 1:100）によって一晩染色した。顕微鏡写真をZeiss LSM 510共焦点顕微鏡において得た。データ分析および3D再構築は、ZEN liteソフトウェアの補助により行われた。免疫蛍光顕微鏡法のため、抗体によって染色された細胞を、Leica蛍光顕微鏡において分析した。必要に応じて、Alexa633、Alexa549、およびAlexa488のタグ付き二次抗体を使用した。一次抗体の一覧については、表2を参照すること。
【０１２８】
ミトコンドリアROSの測定  ミトコンドリアROSを検出し、定量化した。簡単に説明すると、GFPによって選別された細胞またはアキシン2 kd MEFを96穴プレートに播種し、化学的変換の後にまたは中間段階でMitosox RED（500nM）と共に30分間インキュベートした。次いで、細胞をPBSで2回洗浄し、510nm励起（Ex帯域幅：10nm）および595nm放射（Em帯域幅35nm）の波長に設定されたマイクロプレートリーダによって、蛍光をモニタリングした。mROS生成をLeica蛍光顕微鏡によって顕微鏡写真に撮り、Leica Application Suite Xソフトウェアにおいて定量化した。最初に、バックグラウンドを差し引き、各細胞について関心領域（ROI）を描写した。各ROI内の平均強度を測定し、Excelデータシートにエクスポートした。蛍光の変化の平均値を、各細胞型について算出した。各条件について、少なくとも3回反復した。
【０１２９】
FACS  FACS選別のため、変換された細胞を、40μmナイロンセルストレーナー（Falcon）に通し、3％血清を含有しているPBSに懸濁させた。出発Nrl-GFP MEFを陰性対照として使用した。細胞を、Core facility of UT Southwestern Medical Center、DallasにおいてBD LSRII Flow cytometerで選別した。選別された細胞を、IMR90培地に収集し、遠心沈殿させ、RNA抽出およびその他の下流の適用のために使用した。
【０１３０】
RNAi、およびshRNAを形質導入されたMEFの生成  アキシン2（SMARTベクター誘導可能マウスshRNA、12006）およびTfam（SMARTベクター誘導可能マウスshRNA、21780）についてのレンチウイルスShRNA構築物は、Dharmaconから購入された。レンチウイルス上清を4日間収集し、lenti-X濃縮試薬（Clonetech）によって濃縮した。次いで、濃縮されたレンチウイルスのアリコートを使用して、P0 Nrl-GFP MEFに形質導入した。細胞をピューロマイシン（1μg/ml）の存在下で3日間選択した。これらの細胞を低分子による変換実験のために使用した。
【０１３１】
クロマチン免疫沈降および増幅  リアルタイムPCRに基づく定量的ChIP分析を、Milliporeのキット（17-295）に従って実施した。簡単に説明すると、20000個の細胞を、静かに撹拌しながらRTで10分間ホルムアルデヒド（1％最終）によって架橋した。染色質のサイズが300〜500bpになるよう、細胞を超音波処理した。プロテインAアガロースによる予備清澄化の後、クロマチンを、NF-kB-p65に対する特異的抗体による免疫沈降のために使用した。免疫沈降したクロマチンを、Sigmaからの全ゲノム増幅キット（WGA2）によって増幅した。増幅産物を、アガロースゲルにおいて調べた。プライマーは、60〜100bpのアンプリコンを増幅するために設計されており、マウスについてのEnsembl Genome Browser内の配列に基づいていた。産物を、20μl反応においてApplied BiosystemsのFast SYBR Green Master Mixによって増幅した。産物の量を、インプットクロマチンの標準曲線に対して相対的に決定した。解離曲線は、アンプリコンについての単一の産物を示した。ChIP分析のためのプライマーについては、表1を参照すること。
【０１３２】
Nrl-DsRedプロモーターレポーター構築物の調製  Nrl-DsRedプロモーターレポーターを調製するため、プロモーターおよびレポーター断片を、特異的な制限酵素によって、市販のベクター（pNrl-DsRed、Addgeneプラスミド＃13764）から除去した。次いで、これらのベクターを、ゲートウェイエントリーベクターpENTR2B（ThermoFisher scientific A10463）へクローニングした。次いで、陽性クローンを、デスティネーションベクターpLentiX1 Zeo DEST（Addgeneプラスミド＃17299）へシャフリングした。次いで、この最終産物をレンチウイルス調製のために使用した。
【０１３３】
実施例2
光受容細胞（hCiPC）へのヒト成人皮膚線維芽細胞（HADF）の化学的再プログラミング
A.結果
ヒト成人皮膚線維芽細胞再プログラミングのための改変されたスキームは、図13Aに例示される。HADFから変換されたCiPCのqPCR分析（変化倍率）は、光受容細胞に特異的な遺伝子の増大した発現を示す。Nrlによって染色されたHADFの顕微鏡写真は、変換されたCiPCを示す。初期変換プロトコールと改変された変換プロトコールとの間の変換効率の比較。（異なる供給元、Coriell Instituteからの）HADFから変換されたCiPCにおける光受容細胞に特異的な遺伝子（Crxおよびリカバリン）の発現。（ATCCからの）HADFから変換されたCiPCにおける光受容細胞に特異的な遺伝子（Nrl、リカバリン、ロドプシン）の発現（図13および図14）。
【０１３４】
B.方法
改変プロトコール：D0：ヒト皮膚線維芽細胞をIMR-90培地において0.1％ゼラチンによって（O/N）コーティングされた6穴プレートに播種する（細胞106個/ウェル）。D1：培地をバルプロ酸（V、0.5mM）、CHIR（C、3μM）、Repsox（R、1μM）、フォルスコリン（F、10μM）、IWR1（I、10μM）を有する光受容細胞誘導培地（PIM）に交換する。D3：VCRFIを含む培地に交換する。D5：VCRFIを含む培地に交換する。D7：VCRFIを含む培地に交換する。D9：VCRFIを含む培地に交換する。遺伝子発現について細胞を分析する。D10：細胞を採集する。
【０１３５】
光受容細胞誘導培地（PIM）は、KO血清5ml、B27 1ml、ノギン12.5μl、IGF1 1.25μlを含有しているDMEM/F12を含む。最終体積を50mlにする。
【０１３６】
実施例3
網膜ニューロンへのマウスミュラーグリア細胞の化学的再プログラミング
図15は、網膜神経節細胞へのマウス初代ミュラー細胞の変換を示す。図15Aは、変換前のミュラー細胞を示す。図15Bは、3日目における化学物質カクテルによる変換後のCiRGC細胞を示す。図15Cは、Brn3a、Brn3b、Isl1、Nefl、およびNeNのようなRGCに特異的な遺伝子の発現を示すリアルタイムqPCR分析を示す。
【０１３７】
改変プロトコールは、以下を含む。D0： マウス初代ミュラー細胞を、DMEMおよび10％FBSを含有している培地において0.1％ゼラチンによって（O/N）コーティングされた6穴プレートに播種する（播種密度、細胞106個/ウェル）。D1： PIM（光受容細胞誘導培地、前記と同一の濃度）にIFVを添加する。D2〜D4： 網膜神経節細胞が出現した。
【０１３８】
実施例4
網膜ニューロンへのヒトミュラーグリア細胞の化学的再プログラミング
図16は、網膜神経節細胞（hCiRGC）へのヒト初代ミュラー細胞の変換を例示する。図16Aは、変換前のヒトミュラー細胞を示す。図16Bは、3日目における化学物質カクテルによる変換後のhCiRGC細胞を示す。図16Cは、Brn3a、Brn3b、Isl1、Nefl、およびNeNのようなRGCに特異的な遺伝子の発現を示すリアルタイムqPCR分析を示す。
【０１３９】
改変プロトコールは、以下を含む。D0： ミュラー細胞を、DMEMおよび10％FBS（細胞106個/ウェル）を含有している培地において、（0.1％ゼラチンによってO/Nコーティングされた）6穴プレートに播種する。D1： PIM（光受容細胞誘導培地）にVCRFIを添加する。D2〜D4： 網膜神経節細胞が出現した。
【０１４０】
実施例5
網膜ニューロンへの胚性幹（ES）細胞の化学的再プログラミング
図17は、化学物質によるニューロン様細胞へのES細胞の変換を示す。（A）化学的処理前の1日目のマウスES細胞。（B）d6におけるES細胞由来の化学的に変換されたニューロン様細胞。（C）d7におけるES細胞由来の化学的に変換されたニューロン様細胞。
【０１４１】
光受容細胞およびRGC細胞へのマウス胎仔線維芽細胞の変換と同一のプロトコールを使用した。プロトコールは、以下を含んでいた。D0： マウスES細胞を6穴プレートに播種する。D1： 培地をVCRF含有PIMに交換する。D3： 培地をVCRFI含有PIMに交換する。D5： VCRFIを含む培地に交換する。D6〜D7： 光受容細胞および神経節細胞に類似しているニューロン形の細胞が出現した。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
2020524501.tif 000013
【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ−１】
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【図３Ｃ−２】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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