(57)【要約】  本発明は、治療学的酵素と免疫グロブリンＦｃ領域の融合タンパク質、その製造方法、及びそれを含む組成物に関する。
2020530283.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療学的酵素に免疫グロブリンＦｃ領域が融合され、Ｆｃ領域が融合されていない治療学的酵素に比べて、生体内持続性が向上した、酵素融合タンパク質。
【請求項２】
前記酵素は、β−グルコシダーゼ（beta-glucosidase）、α−ガラクトシダーゼ（alpha-galactosidase）、β−ガラクトシダーゼ（beta-galactosidase）、イズロニダーゼ（iduronidase）、イズロン酸−２−スルファターゼ（iduronate-2-sulfatase）、ガラクトース−６−スルファターゼ（Galactose-6-sulfatase）、酸性α−グルコシダーゼ（acid alpha-glucosidase）、酸性セラミダーゼ（acid ceramidase）、酸性スフィンゴミエリナーゼ（acid sphingomyelinsase）、ガラクトセレブロシダーゼ（galactocerebrosidsase）、アリールスルファターゼ（arylsulfatase）Ａ、アリールスルファターゼ（arylsulfatase）Ｂ、β−ヘキソサミニダーゼ（beta-hexosaminidase）Ａ、β−ヘキソサミニダーゼ（beta-hexosaminidase）Ｂ、ヘパリン−Ｎ−スルファターゼ（heparin N-sulfatase）、α−Ｄ−マンノシダーゼ（alpha-D-mannosidase）、β−グルクロニダーゼ（beta-glucuronidase）、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（N-acetylgalactosamine-6 sulfatase）、リソソーム酸性リパーゼ（lysosomal acid lipase）、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（alpha-N-acetyl-glucosaminidase）、グルコセレブロシダーゼ（glucocerebrosidase）、ブチリルコリンエステラーゼ（butyrylcholinesterase）、キチナーゼ（Chitinase）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（glutamate decarboxylase）、イミグルセラーゼ（imiglucerase）、リパーゼ（lipase）、ウリカーゼ（Uricase）、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ（Platelet-Activating Factor Acetylhydrolase）、中性エンドペプチダーゼ（neutral endopeptidase）及びミエロペルオキシダーゼ（myeloperoxidase）からなる群から選択される、請求項１に記載の酵素融合タンパク質。
【請求項３】
前記酵素融合タンパク質は、治療学的酵素と免疫グロブリンＦｃ領域がペプチドリンカーで融合されたものである、請求項１に記載の酵素融合タンパク質。
【請求項４】
前記酵素融合タンパク質は、１分子の免疫グロブリンＦｃ領域と二量体の治療学的酵素が融合されたものである、請求項１に記載の酵素融合タンパク質。
【請求項５】
前記免疫グロブリンＦｃ領域は、天然免疫グロブリンＦｃ領域において少なくとも１つのアミノ酸に置換（substitution）、付加（addition）、欠失（deletion）、修飾（modification）及びそれらの組み合わせからなる群から選択される改変が行われたものである、請求項１に記載の酵素融合タンパク質。
【請求項６】
前記免疫グロブリンＦｃ領域は、配列番号８のアミノ酸配列を有する免疫グロブリンＦｃ領域の２番目のアミノ酸がプロリンに置換されるか、７１番目のアミノ酸がグルタミンに置換されるか、又は２番目のアミノ酸がプロリンに置換されると共に７１番目のアミノ酸がグルタミンに置換されたものである、請求項５に記載の酵素融合タンパク質。
【請求項７】
前記免疫グロブリンＦｃ領域は、鎖交換が起こらないものである、請求項６に記載の酵素融合タンパク質。
【請求項８】
前記酵素融合タンパク質は、Ｆｃ領域が融合されていない治療学的酵素に比べて、安定性が向上し、リソソーム受容体に対する結合力が低下し、組織分布性が向上したものである、請求項１に記載の酵素融合タンパク質。
【請求項９】
前記免疫グロブリンＦｃ領域は、（ａ）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメイン、（ｂ）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメイン、（ｃ）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメイン、（ｄ）ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン、（ｅ）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメインの少なくとも１つのドメインと免疫グロブリンヒンジ領域又はヒンジ領域の一部との組み合わせ、並びに（ｆ）重鎖定常領域の各ドメインと軽鎖定常領域の二量体からなる群から選択される、請求項１に記載の酵素融合タンパク質。
【請求項１０】
前記免疫グロブリンＦｃ領域は、（ａ）ジスルフィド結合を形成する部位が除去されること、（ｂ）天然ＦｃからＮ末端の一部のアミノ酸が欠失されること、（ｃ）天然ＦｃのＮ末端にメチオニン残基が付加されること、（ｄ）補体結合部位が除去されること、（ｅ）ＡＤＣＣ（antibody dependent cell mediated cytotoxicity）部位が除去されることから選択される少なくとも１つの特徴を有する、請求項１に記載の酵素融合タンパク質。
【請求項１１】
前記免疫グロブリンＦｃ領域が非グリコシル化されたことを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の酵素融合タンパク質。
【請求項１２】
前記免疫グロブリンＦｃ領域が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭに由来する免疫グロブリンＦｃフラグメントである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の酵素融合タンパク質。
【請求項１３】
前記免疫グロブリンＦｃ領域が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭからなる群から選択される免疫グロブリンに由来する異なる起源を有するドメインのハイブリッドである、請求項１２に記載の酵素融合タンパク質。
【請求項１４】
前記免疫グロブリンＦｃ領域はＩｇＧ４ Ｆｃ領域である、請求項１３に記載の酵素融合タンパク質。
【請求項１５】
前記免疫グロブリンＩｇＧ４ Ｆｃ領域のヒンジ領域が、ＩｇＧ１ヒンジ領域に置換されたものである、請求項１４に記載の酵素融合タンパク質。
【請求項１６】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の酵素融合タンパク質を含む、リソソーム蓄積症（lysosomal storage disorder, LSD）の予防又は治療用薬学的組成物。
【請求項１７】
前記リソソーム蓄積症は、ムコ多糖症（mucopolysaccharidosis, MPS）、グリコーゲン蓄積症（Glycogen storage disease）、スフィンゴ脂質症（sphingolipidosis）、ニーマン・ピック病（Niemann-Pick disease）、ファブリー病（Fabry’s disease）、ゴーシェ病（Gaucher disease）、ハンター症候群（Hunter syndrome）及びマロトー・ラミー症候群（Maroteaux-Lamy syndrome）からなる群から選択される、請求項１６に記載のリソソーム蓄積症の予防又は治療用薬学的組成物。
【請求項１８】
前記酵素は、イズロン酸−２−スルファターゼ（Iduronate-2-sulfatase, IDS）又はアリールスルファターゼＢ（Arylsulfatase B, ARSB）である、請求項１６に記載のリソソーム蓄積症の予防又は治療用薬学的組成物。
【請求項１９】
前記組成物は、酵素のリソソーム受容体に対する結合力を低下させるものである、請求項１６に記載のリソソーム蓄積症の予防又は治療用薬学的組成物。
【請求項２０】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の酵素融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２１】
請求項２０に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項２２】
請求項２１に記載の発現ベクターが導入された形質転換体。
【請求項２３】
（ａ）請求項２２に記載の形質転換体を培養して培養物を得るステップと、
（ｂ）培養物から酵素融合タンパク質を回収するステップとを含む、酵素融合タンパク質を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体治療学的酵素類の生体内半減期の延長を目的として酵素類に免疫グロブリンＦｃ領域が融合された治療学的酵素融合タンパク質、その製造方法、及びそれを含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
リソソームは、タンパク質、ポリヌクレオチド、多糖類、脂質などの巨大分子を分解する機能を有する細胞質小器官である。リソソームの内部は酸性雰囲気であり、生物学的巨大分子の加水分解を促進する加水分解酵素（hydrolase enzymes）を含有する。また、リソソームは、エンドサイトーシス（endocytosis）による分子の吸収において何らかの役割を果たすことが知られている。
【０００３】
リソソーム蓄積症（Lysosomal Storage Disorders, LSDs）は、遺伝的代謝疾患の一種であり、リソソームの機能が喪失することにより現れる。リソソーム蓄積症は、脂質、タンパク質、多糖類などの物質を分解する酵素の欠乏により、通常１００，０００人に１人の割合で現れ、劣性疾患として遺伝する。リソソーム蓄積症は、このように分解作用を行う特定酵素が欠乏するか、その量が非常に少ない場合に現れ、このように分解酵素が欠乏すると、過剰量の物質が分解されずに蓄積され、結局は細胞の機能にも問題を引き起こす。他の様々な遺伝疾患と同様に、リソソーム蓄積症は親から遺伝する。また、各疾患は、各種酵素を翻訳する各種遺伝子の変異により発生する。このような疾患の原因となる酵素は総じて類似した生化学的特性を有し、全てのリソソーム蓄積症はリソソーム内における異常な物質蓄積により発生する。現在知られている代表的なリソソーム蓄積症としては、ニーマン・ピック病（Niemann-Pick disease）、ファブリー病（Fabry’s disease）、ゴーシェ病（Gaucher disease）、ハンター症候群（Hunter syndrome）、マロトー・ラミー症候群（Maroteaux-Lamy syndrome）などの約５０余種の疾患が挙げられ、これらのリソソーム蓄積症を治療する方法の代表的なものとしては、酵素補充療法（ERT: enzyme-replacement therapy）が挙げられ、それに関する多くの研究が行われている（非特許文献１）。
【０００４】
代表的なリソソーム蓄積症であるハンター症候群は、イズロン酸−２−スルファターゼ（Iduronate-2-sulfatase, IDS）の欠乏によりグリコサミノグリカン（glycosaminoglycan, GAG）が分解されずにリソソーム内に蓄積されて現れる疾患であり、特異的な顔貌、大きな頭、肝臓や脾臓の肥大による腹部膨満などが認められ、聴力喪失、心臓弁膜疾患、閉塞性呼吸器疾患、睡眠時無呼吸なども伴う。ハンター症候群は、１６２，０００人に１人の割合で発生することが知られており、Ｘ染色体連鎖劣性（X-linked recessive）様式で遺伝する。現在、ハンター症候群治療のための酵素補充療法の薬物としては、Ｅｌａｐｒａｓｅ（recombinant IDS, Shire）が用いられている。
【０００５】
このような治療学的酵素類などのタンパク質は、一般に安定性が低いので変性しやすく、血液中のプロテアーゼにより分解され、血中濃度及び活性を維持するために患者に頻繁に投与する必要がある。しかし、主に注射剤の形態で患者に投与されるタンパク質医薬品において、活性ポリペプチドの血中濃度を維持するために頻繁に注射することは患者に多大な苦痛をもたらす。このような問題を解決するために、治療学的酵素類の血中安定性を向上させ、血中薬物濃度を高い濃度に長期間持続して薬効を最大化するための多くの努力がなされてきた。このような治療学的酵素類の持続性製剤は、治療学的酵素類の安定性を向上させると共に、薬物自体の活性が十分に高く維持されなければならず、患者に免疫反応を誘発しないものでなければならない。
【０００６】
特に、リソソーム蓄積症は、特定酵素の遺伝的欠陥により生じ、死亡に至る致命的な疾患であり、欠陥のある酵素の補充治療が必須である。酵素補充治療はリソソーム蓄積症において標準となる治療であり、不足した酵素を補充することにより既存の症状を緩和したり、疾患の進行を遅らせる効果を発揮する。しかし、継続して１〜２週間ごとに２〜６時間かけて薬物を静脈に投与しなければならず、患者及びその家族の日常生活が制限される。
【０００７】
リソソーム蓄積症の治療に用いられる組換え酵素のヒトにおける半減期は、短い場合は１０分、長くとも３時間未満であり、その持続時間が非常に短いので、生涯酵素を投与しなければならない患者に不便をかけており、その半減期の延長が強く求められている。
【０００８】
タンパク質を安定化して腎臓から除去されることを防止するために、最近は免疫グロブリンＦｃ領域を用いる融合タンパク質の研究が盛んに行われている。免疫グロブリンは、血液の主要構成成分であり、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥの５つの種類があるが、融合タンパク質の研究に主に用いられる種類はＩｇＧであり、これはＩｇＧ１〜４の４種類のｓｕｂｔｙｐｅに分類される。免疫グロブリンＦｃ領域を用いる融合タンパク質は、タンパク質のサイズを大きくして腎臓から除去されることを防止し、ＦｃＲｎ受容体と結合して細胞内へのエンドサイトーシス及びｒｅｃｙｃｌｉｎｇにより血中半減期を延長させる役割を果たす。
【０００９】
しかし、免疫グロブリンＦｃ領域には、非意図的な免疫反応を引き起こすという欠点がある。抗体依存性細胞傷害（ADCC, antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity）や補体依存性細胞傷害（CDC, complement-dependent cytotoxicity）などのエフェクター機能（effector function）を有する。このような機能は、免疫グロブリンＦｃ領域のＦｃ受容体との結合、補体結合、又はＦｃ領域のグリコシル化（glycosylation）により生じる。また、Ｆｃ自体の生体内不安定性が発生しやすい。
【００１０】
よって、目的とする融合タンパク質が生体内で安定せず、持続性が向上せず、融合タンパク質の活性が維持されないという欠点がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第９７／０３４６３１号
【特許文献２】国際公開第９６／０３２４７８号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Frances M. Platt et al., J Cell Biol. 2012 Nov 26;199(5):723-34
【非特許文献２】van der Neut Kolfschoten, et at., Science, 317: 1554-1557.2007
【非特許文献３】H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979
【非特許文献４】Urlaub et al., Somat. Cell. Mol. Genet., 12, 555-566, 1986
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、治療学的酵素に免疫グロブリンＦｃ領域が融合され、Ｆｃ領域が融合されていない治療学的酵素に比べて、生体内持続性が向上した酵素融合タンパク質を提供することを目的とする。
【００１４】
また、本発明は、前記治療学的酵素融合タンパク質を含む薬学的組成物を提供することを目的とする。さらに、本発明は、前記治療学的酵素融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び前記発現ベクターが導入された形質転換体を提供することを目的とする。さらに、本発明は、前記形質転換体を培養するステップを含む、酵素融合タンパク質を製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の一態様は、治療学的酵素と免疫グロブリンＦｃ領域が融合された酵素融合タンパク質である。
【００１６】
一具体例において、本発明は、治療学的酵素に免疫グロブリンＦｃ領域が融合され、Ｆｃ領域が融合されていない治療学的酵素に比べて、生体内持続性が向上した酵素融合タンパク質に関する。
【００１７】
以下、本発明のさらなる具体例について説明する。
【００１８】
具体的には、前記具体例による酵素融合タンパク質であって、前記酵素は、β−グルコシダーゼ（beta-glucosidase）、α−ガラクトシダーゼ（alpha-galactosidase）、β−ガラクトシダーゼ（beta-galactosidase）、イズロニダーゼ（iduronidase）、イズロン酸−２−スルファターゼ（iduronate-2-sulfatase）、ガラクトース−６−スルファターゼ（Galactose-6-sulfatase）、酸性α−グルコシダーゼ（acid alpha-glucosidase）、酸性セラミダーゼ（acid ceramidase）、酸性スフィンゴミエリナーゼ（acid sphingomyelinsase）、ガラクトセレブロシダーゼ（galactocerebrosidsase）、アリールスルファターゼ（arylsulfatase）Ａ、アリールスルファターゼ（arylsulfatase）Ｂ、β−ヘキソサミニダーゼ（beta-hexosaminidase）Ａ、β−ヘキソサミニダーゼ（beta-hexosaminidase）Ｂ、ヘパリン−Ｎ−スルファターゼ（heparin N-sulfatase）、α−Ｄ−マンノシダーゼ（alpha-D-mannosidase）、β−グルクロニダーゼ（beta-glucuronidase）、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（N-acetylgalactosamine-6 sulfatase）、リソソーム酸性リパーゼ（lysosomal acid lipase）、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（alpha-N-acetyl-glucosaminidase）、グルコセレブロシダーゼ（glucocerebrosidase）、ブチリルコリンエステラーゼ（butyrylcholinesterase）、キチナーゼ（Chitinase）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（glutamate decarboxylase）、イミグルセラーゼ（imiglucerase）、リパーゼ（lipase）、ウリカーゼ（Uricase）、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ（Platelet-Activating Factor Acetylhydrolase）、中性エンドペプチダーゼ（neutral endopeptidase）及びミエロペルオキシダーゼ（myeloperoxidase）からなる群から選択されることを特徴とする。
【００１９】
前記具体例のいずれかによる酵素融合タンパク質であって、前記酵素融合タンパク質は、治療学的酵素と免疫グロブリンＦｃ領域がペプチドリンカーで融合されたことを特徴とする。
【００２０】
前記具体例のいずれかによる酵素融合タンパク質であって、前記酵素融合タンパク質は、１つの免疫グロブリンＦｃ領域分子と二量体の治療学的酵素が融合されたことを特徴とする。
【００２１】
前記具体例のいずれかによる酵素融合タンパク質であって、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、天然免疫グロブリンＦｃ領域において少なくとも１つのアミノ酸に置換（substitution）、付加（addition）、欠失（deletion）、修飾（modification）及びそれらの組み合わせからなる群から選択される改変が行われたことを特徴とする。
【００２２】
前記具体例のいずれかによる酵素融合タンパク質であって、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、配列番号８の免疫グロブリンＦｃ領域の２番目のアミノ酸がプロリンに置換されるか、７１番目のアミノ酸がグルタミンに置換されるか、又は２番目のアミノ酸がプロリンに置換されると共に７１番目のアミノ酸がグルタミンに置換されたことを特徴とする。
【００２３】
前記具体例のいずれかによる酵素融合タンパク質であって、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、鎖交換反応が起こらないことを特徴とする。
【００２４】
前記具体例のいずれかによる酵素融合タンパク質であって、前記酵素融合タンパク質は、Ｆｃ領域が融合されていない治療学的酵素に比べて、安定性が向上し、リソソーム受容体に対する結合力が低下し、組織分布性が向上したことを特徴とする。
【００２５】
前記具体例のいずれかによる酵素融合タンパク質であって、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、（ａ）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメイン、（ｂ）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメイン、（ｃ）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメイン、（ｄ）ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン、（ｅ）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメインの少なくとも１つのドメインと免疫グロブリンヒンジ領域又はヒンジ領域の一部との組み合わせ、並びに（ｆ）重鎖定常領域の各ドメインと軽鎖定常領域の二量体からなる群から選択されることを特徴とする。
【００２６】
前記具体例のいずれかによる酵素融合タンパク質であって、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、（ａ）ジスルフィド結合を形成する部位が除去されること、（ｂ）天然ＦｃからＮ末端の一部のアミノ酸が欠失されること、（ｃ）天然ＦｃのＮ末端にメチオニン残基が付加されること、（ｄ）補体結合部位が除去されること、（ｅ）ＡＤＣＣ（antibody dependent cell mediated cytotoxicity）部位が除去されることから選択される少なくとも１つの特徴を有することを特徴とする。
【００２７】
前記具体例のいずれかによる酵素融合タンパク質であって、前記免疫グロブリンＦｃ領域が非グリコシル化されたことを特徴とする。
【００２８】
前記具体例のいずれかによる酵素融合タンパク質であって、前記免疫グロブリンＦｃ領域が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭに由来することを特徴とする。
【００２９】
前記具体例のいずれかによる酵素融合タンパク質であって、前記免疫グロブリンＦｃ領域が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭからなる群から選択される免疫グロブリンに由来する異なる起源を有するドメインのハイブリッドであることを特徴とする。
【００３０】
前記具体例のいずれかによる酵素融合タンパク質であって、前記免疫グロブリンＦｃ領域はＩｇＧ４ Ｆｃ領域であることを特徴とする。
【００３１】
前記具体例のいずれかによる酵素融合タンパク質であって、前記免疫グロブリンＩｇＧ４ Ｆｃ領域のヒンジ領域が、ＩｇＧ１ヒンジ領域に置換されたことを特徴とする。
【００３２】
本発明の他の態様は、リソソーム蓄積症（lysosomal storage disorder, LSD）の予防又は治療用薬学的組成物である。
【００３３】
一具体例において、本発明は、前記酵素融合タンパク質を含む、リソソーム蓄積症（lysosomal storage disorder, LSD）の予防又は治療用薬学的組成物に関する。
【００３４】
前記具体例による組成物であって、前記リソソーム蓄積症は、ムコ多糖症（mucopolysaccharidosis, MPS）、グリコーゲン蓄積症（Glycogen storage disease）、スフィンゴ脂質症（sphingolipidosis）、ニーマン・ピック病（Niemann-Pick disease）、ファブリー病（Fabry’s disease）、ゴーシェ病（Gaucher disease）、ハンター症候群（Hunter syndrome）及びマロトー・ラミー症候群（Maroteaux-Lamy syndrome）からなる群から選択されることを特徴とする。
【００３５】
前記具体例のいずれかによる組成物であって、前記酵素は、イズロン酸−２−スルファターゼ（Iduronate-2-sulfatase, IDS）又はアリールスルファターゼＢ（Arylsulfatase B, ARSB）であることを特徴とする。
【００３６】
前記具体例のいずれかによる組成物であって、前記組成物は、治療学的酵素のリソソーム受容体に対する結合力を低下させることを特徴とする。
【００３７】
本発明のさらに他の態様は、酵素融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドである。
【００３８】
本発明のさらに他の態様は、ポリヌクレオチドを含む発現ベクターである。
【００３９】
本発明のさらに他の態様は、発現ベクターが導入された形質転換体である。
【００４０】
本発明のさらに他の態様は、酵素融合タンパク質を製造する方法である。
【００４１】
一具体例において、本発明は、前記形質転換体を培養して培養物を得るステップと、前記培養物から酵素融合タンパク質を回収するステップとを含む、酵素融合タンパク質を製造する方法に関する。
【発明の効果】
【００４２】
本発明は、持続型治療学的酵素融合タンパク質に関し、特に免疫グロブリンＦｃ領域が融合されることにより、治療学的酵素の安定性が向上し、腎臓による酵素除去メカニズムが低下した酵素融合タンパク質に関する。本発明の酵素融合タンパク質は、持続時間が長いので患者に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】ＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質の発現を確認した図である。
【図２】ＡＲＳＢ−Ｆｃ融合タンパク質の発現を確認した図である。
【図３】本発明のＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質の薬物動態学的実験の結果を示す図である。
【図４】本発明のＡＲＳＢ−Ｆｃ融合タンパク質の薬物動態学的実験の結果を示す図である。
【図５】本発明のＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素活性を確認した図である。
【図６】本発明のＡＲＳＢ−Ｆｃ融合タンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素活性を確認した図である。
【図７】本発明のＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質をＩＤＳノックアウトマウスに静脈又は皮下投与して尿中のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）含有量を測定した結果である。
【図８】本発明のＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質をＩＤＳノックアウトマウスに静脈又は皮下投与して組織中のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）含有量を測定した結果である。
【図９】本発明のＡＲＳＢ−Ｆｃ融合タンパク質の組織分布性を確認した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
以下、本発明を実施するための形態について説明する。なお、本発明で開示される各説明及び実施形態はそれぞれ他の説明及び実施形態にも適用される。すなわち、本発明で開示される様々な要素のあらゆる組み合わせが本発明に含まれる。また、以下の具体的な記述に本発明が限定されるものではない。
【００４５】
また、当該技術分野における通常の知識を有する者であれば、通常の実験のみを用いて本発明に記載された本発明の特定の態様の多くの等価物を認識し、確認することができるであろう。さらに、このような等価物も本発明に含まれることが意図されている。
【００４６】
本明細書全体を通して、天然に存在するアミノ酸に対する通常の１文字及び３文字コードが用いられるだけでなく、Ａｉｂ（α−アミノイソブチル酸）、Ｓａｒ（N-methylglycine）などの他のアミノ酸に対して一般的に許容される３文字コードが用いられる。また、本明細書において略語で言及したアミノ酸は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ命名法に従って記載したものである。
アラニン  Ａ
アルギニン  Ｒ
アスパラギン  Ｎ
アスパラギン酸  Ｄ
システイン  Ｃ
グルタミン酸  Ｅ
グルタミン  Ｑ
グリシン  Ｇ
ヒスチジン  Ｈ
イソロイシン  Ｉ
ロイシン  Ｌ
リシン  Ｋ
メチオニン  Ｍ
フェニルアラニン  Ｆ
プロリン  Ｐ
セリン  Ｓ
トレオニン  Ｔ
トリプトファン  Ｗ
チロシン  Ｙ
バリン  Ｖ
【００４７】
本発明の一態様は、治療学的酵素に免疫グロブリンＦｃ領域が融合され、Ｆｃ領域が融合されていない治療学的酵素に比べて、生体内持続性が向上した酵素融合タンパク質を提供する。
【００４８】
本発明において、酵素融合タンパク質は、治療学的酵素に免疫グロブリンＦｃ領域が融合されたものであり、免疫グロブリンＦｃ領域の融合により、免疫グロブリンＦｃ領域に融合されていない治療学的酵素に比べて、治療学的酵素の活性が維持され、リソソーム受容体に対する結合力が低下し、血中半減期が延長されたものであってもよい。
【００４９】
本発明者らは、治療学的酵素類の血中半減期を延長させるために、免疫グロブリンＦｃ領域との融合タンパク質を製造した。ここで、Ｆｃ領域は、グリコシル化を抑制するために潜在的なグリコシル化配列を置換し、さらにＩｇＧ４ Ｆｃのｈｉｎｇｅ配列を置換することにより、鎖交換（chain exchange）が抑制されたＩｇＧ４ Ｆｃ誘導体（analog）を用いたところ、免疫グロブリンＦｃ領域に融合された治療学的酵素融合タンパク質が血中半減期を画期的に延長させ、公知の酵素と比較して同等の活性を維持することが確認され、新しい形態の治療学的酵素と免疫グロブリンＦｃ領域が融合された融合タンパク質構造を提供するに至った。
【００５０】
本発明の酵素融合タンパク質に含まれる治療学的酵素は、特に限定されるものではなく、融合されていない形態の治療学的酵素より生体内持続時間が延長されるという利点が得られる治療学的酵素であれば、いかなるものが本発明の酵素融合タンパク質に含まれてもよい。本発明の一実施形態における前記酵素融合タンパク質は、治療学的酵素の融合タンパク質である。
【００５１】
また、本発明の酵素融合タンパク質は、酵素補充療法（enzymatic replacement therapy, ERT）の薬物として用いられてもよい。前記酵素補充療法は、疾患の原因となる欠乏又は不足酵素を補充することにより、低下した酵素機能を回復させて疾患を予防又は治療することができる。
【００５２】
具体的な一態様として、前記治療学的酵素は、β−グルコシダーゼ（beta-glucosidase）、α−ガラクトシダーゼ（alpha-galactosidase）、β−ガラクトシダーゼ（beta-galactosidase）、イズロニダーゼ（iduronidase）、イズロン酸−２−スルファターゼ（iduronate-2-sulfatase）、ガラクトース−６−スルファターゼ（Galactose-6-sulfatase）、酸性α−グルコシダーゼ（acid alpha-glucosidase）、酸性セラミダーゼ（acid ceramidase）、酸性スフィンゴミエリナーゼ（acid sphingomyelinsase）、ガラクトセレブロシダーゼ（galactocerebrosidsase）、アリールスルファターゼ（arylsulfatase）Ａ、アリールスルファターゼ（arylsulfatase）Ｂ、β−ヘキソサミニダーゼ（beta-hexosaminidase）Ａ、β−ヘキソサミニダーゼ（beta-hexosaminidase）Ｂ、ヘパリン−Ｎ−スルファターゼ（heparin N-sulfatase）、α−Ｄ−マンノシダーゼ（alpha-D-mannosidase）、β−グルクロニダーゼ（beta-glucuronidase）、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（N-acetylgalactosamine-6 sulfatase）、リソソーム酸性リパーゼ（lysosomal acid lipase）、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（alpha-N-acetyl-glucosaminidase）、グルコセレブロシダーゼ（glucocerebrosidase）、ブチリルコリンエステラーゼ（butyrylcholinesterase）、キチナーゼ（Chitinase）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（glutamate decarboxylase）、イミグルセラーゼ（imiglucerase）、リパーゼ（lipase）、ウリカーゼ（Uricase）、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ（Platelet-Activating Factor Acetylhydrolase）、中性エンドペプチダーゼ（neutral endopeptidase）、ミエロペルオキシダーゼ（myeloperoxidase）からなる群から選択される治療学的酵素であってもよいが、疾患に対する治療効果を有する治療学的酵素であれば、酵素の由来や種類がいかなるものであっても本発明に含まれる。
【００５３】
本発明における「酵素融合タンパク質」は、「酵素持続型融合タンパク質」と混用されてもよい。
【００５４】
本発明における「治療学的酵素」とは、酵素の不足、欠乏、機能異常などにより発生する疾患を治療するための酵素であり、酵素補充療法（enzyme replacement therapy）、投与などにより前記疾患を有する個体を治療できる酵素を意味する。具体的には、リソソーム酵素の不足、欠乏などにより発症するリソソーム蓄積症の治療のための酵素であってもよいが、これに限定されるものではない。
【００５５】
具体的には、本発明の治療学的酵素は、アリールスルファターゼＢ（arylsulfatase B, ARSB）又はイズロン酸−２−スルファターゼ（iduronate-2-sulfatase）であってもよいが、目的とする疾患に対する治療効果を発揮する酵素であれば、これらに限定されるものではない。
【００５６】
本発明における「アリールスルファターゼＢ（arylsulfatase B, ARSB）」とは、肝臓、膵臓、腎臓のリソソームに存在するアリールスルファターゼ酵素であり、グリコサミノグリカンを分解することにより、サルフェートを加水分解する役割を果たす。前記アリールスルファターゼＢは、ムコ多糖症ＶＩ型（mucopolysaccharidosis VI, Maroteaux-Lamy syndrome）に関係することが知られている。アリールスルファターゼＢは、ガルスルファーゼ（galsulfase）と混用されてもよい。具体的には、前記アリールスルファターゼＢは、配列番号４のアミノ酸配列を含み、これは配列番号３のポリヌクレオチド配列によりコードされるものであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００５７】
本発明における「イズロン酸−２−スルファターゼ（iduronate-2-sulfatase）」とは、ハンター症候群（Hunter syndrome, MPS-II）に関するスルファターゼ酵素であり、ヘパラン硫酸（heparin sulfate）及びデルマタン硫酸（dermatan sulfate）のリソソーム分解に必要な酵素である。本発明における前記「イズロン酸−２−スルファターゼ（iduronate-2-sulfatase）」は、「イデュルスルファーゼ（idursulfase）」と混用されてもよい。前記イデュルスルファーゼは、イデュルスルファーゼアルファ又はイデュルスルファーゼベータであってもよいが、これらに限定されるものではない。具体的には、前記イズロン酸−２−スルファターゼは、配列番号２のアミノ酸配列を含み、これは配列番号１のポリヌクレオチド配列によりコードされるものであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００５８】
前記治療学的酵素は、当該技術分野で周知の方法で準備又は作製することができ、具体的には動物細胞発現ベクターを挿入した動物細胞を培養し、培養物から精製することもでき、市販されている酵素を購入して用いることもできるが、これらに限定されるものではない。
【００５９】
本発明の酵素融合タンパク質は、２つの鎖からなる二量体形態の１分子のＦｃ領域に１つ又は２つの酵素が結合した形態であってもよいが、これらに限定されるものではない。具体的には、単量体のＦｃ領域と酵素が融合されて発現し、その後２つの単量体Ｆｃ領域がジスルフィド結合により１分子の二量体Ｆｃ領域を形成し、２つの酵素は２つのＦｃ領域にそれぞれ連結された形態であってもよいが、これに限定されるものではない。前記酵素は、共有又は非共有結合により連結されたものであってもよく、互いに独立したものであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００６０】
具体的には、本発明の一実施例において、イズロン酸−２−スルファターゼ又はアリールスルファターゼＢの二量体と１つのＦｃ領域が融合された持続型酵素融合タンパク質は、Ｆｃ領域が融合されていない酵素に比べて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素活性が高いことが確認された。これは、治療学的酵素の二量体を含む酵素融合タンパク質の構造的特徴によるものであることが確認された（実施例５）。
【００６１】
また、具体的な他の態様として、本発明の酵素融合タンパク質は、免疫グロブリンＦｃ領域がペプチドリンカーを介して治療学的酵素に融合されたものであってもよい。
【００６２】
前記ペプチドリンカーは、１つ以上のアミノ酸を含んでもよく、例えば１個〜１０００個のアミノ酸を含んでもよいが、特にこれらに限定されるものではない。当該技術分野で公知の任意のペプチドリンカー、例えば［ＧＳ］ｘリンカー、［ＧＧＧＳ］ｘリンカー、［ＧＧＧＧＳ］ｘリンカーなどが挙げられ、ここで、ｘは１以上の自然数（例えば、１、２、３、４、５又はそれ以上）であってもよい。より具体的には、配列番号６のアミノ酸配列であってもよいが、これに限定されるものではない。
【００６３】
本発明の目的上、治療学的酵素の活性を維持しつつ治療学的酵素と免疫グロブリンＦｃ領域を連結できるものであれば、ペプチドリンカーが治療学的酵素及び免疫グロブリンＦｃに融合される位置は、いかなる位置であってもよい。具体的には、治療学的酵素及び免疫グロブリンＦｃ領域の両末端であってもよく、より具体的には、治療学的酵素のＣ末端、免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００６４】
本発明における「Ｎ末端」又は「Ｃ末端」とは、それぞれタンパク質のアミノ末端又はカルボキシル末端を意味し、例えば、これらに限定されるものではないが、Ｎ末端又はＣ末端の最末端のアミノ酸残基だけでなく、Ｎ末端又はＣ末端周辺のアミノ酸残基が全て含まれてもよく、具体的には最末端から１〜２０番目のアミノ酸残基が含まれてもよい。
【００６５】
本発明の一実施例においては、治療学的酵素とリンカー（配列番号６）−ＩｇＧ４を、オーバーラップ（overlapping）ＰＣＲにより、治療学的酵素のＣ末端にＩｇＧ４のＮ末端が融合された融合タンパク質（配列番号２３又は２５）を作製し、形質転換体で発現することを確認した（実施例１〜３）。
【００６６】
本発明の酵素融合タンパク質に含まれる治療学的酵素は、天然のものであってもよく、一部で構成されたフラグメント、又は一部のアミノ酸の置換（substitution）、付加（addition）、欠失（deletion）、修飾（modification）及びそれらの組み合わせからなる群から選択される改変が行われた治療学的酵素の誘導体（analog）も、天然治療学的酵素と同等の活性を有するものであれば本発明に全て含まれる。
【００６７】
また、前記治療学的酵素の誘導体には、天然治療学的酵素のＮ及び／又はＣ末端に少なくとも１つのアミノ酸が付加されたものが全て含まれる。
【００６８】
前記置換されるか、付加されるアミノ酸としては、ヒトタンパク質において通常観察される２０種のアミノ酸だけでなく、異常又は非天然アミノ酸を用いることができる。異常アミノ酸の市販元には、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＣｈｅｍＰｅｐ、Ｇｅｎｚｙｍｅ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓが含まれる。これらのアミノ酸が含まれるペプチドと定型的なペプチド配列は、民間のペプチド合成会社、例えば米国のＡｍｅｒｉｃａｎ ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｍｐａｎｙやＢａｃｈｅｍ、又は韓国のＡｎｙｇｅｎにおいて合成及び購入することができるが、特にこれらに限定されるものではない。
【００６９】
本発明における「フラグメント」とは、天然治療学的酵素又は天然治療学的酵素の誘導体のＮ末端又はＣ末端の少なくとも１つのアミノ酸が欠失した形態を意味する。治療学的酵素の活性を有するものであれば、フラグメントのサイズや欠失するアミノ酸の種類に関係なく本発明に含まれる。
【００７０】
前記治療学的酵素誘導体には当該治療学的酵素のバイオシミラーやバイオベターの形態が含まれるが、バイオシミラーの例として、公知治療学的酵素と発現宿主の差異、グリコシル化の様相と程度の差異、特定位置の残基が当該酵素の基準配列に対して１００％の置換でない場合はその置換の程度の差異も、本発明の酵素融合タンパク質に用いることができるバイオシミラー酵素に該当する。前記治療学的酵素は、当該技術分野で周知の方法で準備又は作製することができ、具体的には遺伝子組換えにより動物細胞、大腸菌、酵母、昆虫細胞、植物細胞、生きている動物などから生産することができ、生産方法はこれらに限定されるものではなく、市販されている治療学的酵素を購入して用いてもよいが、これらに限定されるものではない。
【００７１】
また、前記治療学的酵素又はその誘導体と８０％以上、具体的には９０％以上、より具体的には９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含んでもよく、前記治療学的酵素は組換え技術により微生物から得たものであってもよく、市販されているものであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００７２】
本発明における「相同性」とは、野生型（wild type）アミノ酸配列や野生型核酸配列と類似する程度を示すものであり、相同性の比較は肉眼で行うか、購入が容易な比較プログラムを用いて行う。市販のコンピュータプログラムは、２つ以上の配列間の相同性を百分率（％）で計算することができる。相同性（％）は、隣接する配列について計算してもよい。
【００７３】
前記治療学的酵素又はその誘導体の配列及びそれをコードする塩基配列の情報は、ＮＣＢＩなどの公知のデータベースから得られる。
【００７４】
本発明における「免疫グロブリンＦｃ領域」とは、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の可変領域を除いたものであり、重鎖定常領域２（ＣＨ２）及び／又は重鎖定常領域３（ＣＨ３）部分を含む部位を意味する。本発明の目的上、このようなＦｃ領域は、変異したヒンジ領域を含んでもよいが、これに限定されるものではない。
【００７５】
このような免疫グロブリンＦｃ領域は、重鎖定常領域にヒンジ（hinge）領域を含んでもよいが、これに限定されるものではない。また、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、天然のものと実質的に同等又は向上した効果を有するものであれば、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の可変領域を除き、一部又は全部の重鎖定常領域１（ＣＨ１）及び／又は軽鎖定常領域１（ＣＬ１）を含む拡張されたＦｃ領域であってもよい。さらに、ＣＨ２及び／又はＣＨ３に相当する非常に長い一部のアミノ酸配列が欠失した領域であってもよい。
【００７６】
具体的なさらに他の態様として、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメイン、２）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメイン、３）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメイン、４）ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン、５）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメインの少なくとも１つのドメインと免疫グロブリンヒンジ領域（又はヒンジ領域の一部）との組み合わせ、６）重鎖定常領域の各ドメインと軽鎖定常領域の二量体であってもよい。しかし、これらに限定されるものではない。
【００７７】
本発明における「鎖交換（chain exchange）」とは、ＩｇＧ４ Ｆｃをタンパク質融合体のキャリアとして使用すると、生体内に存在するＩｇＧ４とハイブリッドを形成したり、単量体で存在するので、元の構造を変えて治療学的に活性が低い構造にするという問題を意味し、タンパク質が融合された融合タンパク質であるタンパク質融合体を治療用目的で使用することは非常に困難であると報告されている（非特許文献２）。
【００７８】
本発明において、免疫グロブリンＦｃ領域内のヒンジ領域の配列を置換することにより、前記問題を解決しようとした。具体的には、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、グリコシル化を調節するために潜在的なグリコシル化配列が置換されたものであってもよく、鎖交換に関与する配列が置換されたものであってもよく、それら両方に該当するものであってもよい。
【００７９】
具体的な一態様として、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、鎖交換及びＮ−グリコシル化を防止するために、配列番号８の免疫グロブリンＦｃ領域の２番目のアミノ酸及び／又は７１番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたものであってもよい。より具体的には、配列番号８の免疫グロブリンＦｃ領域の１）２番目のアミノ酸（セリン）がプロリンに置換されるか、２）７１番目のアミノ酸（アスパラギン）がグルタミンに置換されるか、又は３）２番目のアミノ酸がプロリンに置換されると共に７１番目のアミノ酸がグルタミンに置換されたものであってもよいが、これらに限定されるものではない。前述した変異以外にも、治療学的酵素の安定性を向上させる、薬物のキャリアとして適した変異が含まれてもよい。
【００８０】
具体的には、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、免疫グロブリンＩｇＧ４ Ｆｃのヒンジ領域がＩｇＧ１ヒンジ領域に置換されたものであってもよいが、これに限定されるものではない。
【００８１】
本発明の一実施例においては、配列番号８で表される免疫グロブリンＦｃの２番目のアミノ酸をプロリンに置換すると共に７１番目のアミノ酸をグルタミンに置換することにより、鎖交換及びＮ−グリコシル化が低下するようにした。作製された免疫グロブリンＦｃの配列は、配列番号９のアミノ酸配列を有する（実施例１）。
【００８２】
一例として、前記ヒンジ領域は、次のアミノ酸配列を有するヒンジ配列の一部が欠失又は変異したものであってもよい。
Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ（配列番号２６）
【００８３】
具体的には、前記ヒンジ領域の一部が欠失し、１つのシステイン（Ｃｙｓ）残基のみ含むように変異したものであってもよく、鎖交換（chain exchange）に関与するセリン（Ｓｅｒ）残基がプロリン（Ｐｒｏ）残基に置換されたものであってもよい。より具体的には、前記ヒンジ配列の２番目のセリン残基がプロリン残基に置換されたものであってもよいが、これに限定されるものではない。
【００８４】
本発明においては、免疫グロブリンＦｃ領域が天然ヒンジ領域又は変異したヒンジ領域を含むので、Ｆｃ領域における鎖交換及び単量体形成が起こらないだけでなく、融合された治療学的酵素の安定性を向上させることができる。
【００８５】
また、具体的な他の態様として、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域には、天然アミノ酸配列だけでなく、その配列誘導体も含まれる。アミノ酸配列誘導体とは、天然アミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸残基に置換（substitution）、付加（addition）、欠失（deletion）、修飾（modification）及びそれらの組み合わせからなる群から選択される変異が起こったものを意味する。
【００８６】
例えば、ＩｇＧ Ｆｃの場合、結合に重要であることが知られている２１４〜２３８、２９７〜２９９、３１８〜３２２又は３２７〜３３１番目のアミノ酸残基が修飾に適した部位として用いられる。
【００８７】
また、ジスルフィド結合を形成する部位が除去された誘導体、天然ＦｃからＮ末端のいくつかのアミノ酸が欠失した誘導体、天然ＦｃのＮ末端にメチオニン残基が付加された誘導体など、様々な種類の誘導体が用いられる。さらに、エフェクター機能をなくすために、補体結合部位、例えばＣ１ｑ結合部位が除去されてもよく、ＡＤＣＣ（antibody dependent cell mediated cytotoxicity）部位が除去されてもよい。このような免疫グロブリンＦｃ領域の配列誘導体を作製する技術は、特許文献１、２などに開示されている。
【００８８】
分子の活性を全体的に変化させないタンパク質及びペプチドにおけるアミノ酸交換は当該分野において公知である（非特許文献３）。最も一般的な交換は、アミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｙ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ間の交換である。場合によっては、リン酸化（phosphorylation）、硫酸化（sulfation）、アクリル化（acrylation）、グリコシル化（glycosylation）、メチル化（methylation）、ファルネシル化（farnesylation）、アセチル化（acetylation）、アミド化（amidation）などにより修飾（modification）されてもよい。
【００８９】
また、前述したＦｃ誘導体は、本発明のＦｃ領域と同等の生物学的活性を示し、Ｆｃ領域の熱、ｐＨなどに対する構造的安定性を向上させたものであってもよい。
【００９０】
また、このようなＦｃ領域は、ヒト、及びウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットなどの動物の生体内から分離した天然のものから得てもよく、形質転換された動物細胞もしくは微生物から得られた組換えたもの又はその誘導体であってもよい。ここで、天然のものから得る方法は、全免疫グロブリンをヒト又は動物の生体から分離し、その後タンパク質分解酵素で処理することにより得る方法であってもよい。パパインで処理するとＦａｂ及びＦｃに切断され、ペプシンで処理するとｐＦ’ｃ及びＦ（ａｂ）２に切断される。これらは、サイズ排除クロマトグラフィー（size-exclusion chromatography）などを用いてＦｃ又はｐＦ’ｃを分離することができる。より具体的な実施形態において、ヒト由来のＦｃ領域は、微生物から得られた組換え免疫グロブリンＦｃ領域である。
【００９１】
また、免疫グロブリンＦｃ領域は、天然糖鎖、天然のものに比べて増加した糖鎖、天然のものに比べて減少した糖鎖、又は糖鎖が除去された形態であってもよい。このような免疫グロブリンＦｃ糖鎖の増減又は除去には、化学的方法、酵素学的方法、微生物を用いた遺伝工学的方法などの通常の方法が用いられてもよい。ここで、Ｆｃから糖鎖が除去された免疫グロブリンＦｃ領域は、補体（ｃ１ｑ）との結合力が著しく低下し、抗体依存性細胞傷害又は補体依存性細胞傷害が低減又は除去されるので、生体内で不要な免疫反応を誘発しない。このようなことから、糖鎖が除去されるか、非グリコシル化された免疫グロブリンＦｃ領域は、薬物のキャリアとしての本来の目的に適する。
【００９２】
本発明における「糖鎖の除去（Deglycosylation）」とは、酵素で糖を除去したＦｃ領域を意味し、非グリコシル化（Aglycosylation）とは、原核動物、より具体的な実施形態においては大腸菌で産生されてグリコシル化されていないＦｃ領域を意味する。
【００９３】
一方、免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒト起源、又はウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットなどの動物起源であってもよく、より具体的な実施形態においてはヒト起源である。
【００９４】
また、免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ由来であるか、又はそれらの組み合わせ（combination）もしくはそれらのハイブリッド（hybrid）によるＦｃ領域であってもよい。より具体的な実施形態においては、ヒト血液に最も豊富なＩｇＧ又はＩｇＭ由来であり、さらに具体的な実施形態においては、リガンド結合タンパク質の半減期を延長させることが知られているＩｇＧ由来である。一層具体的な実施形態において、前記免疫グロブリンＦｃ領域はＩｇＧ４ Ｆｃ領域であり、より一層具体的な実施形態において、前記免疫グロブリンＦｃ領域はヒトＩｇＧ４由来の非グリコシル化されたＦｃ領域であり、最も具体的な実施形態において、前記免疫グロブリンＦｃ領域は配列番号８のアミノ酸配列を有する免疫グロブリンＦｃ領域の２番目のアミノ酸がプロリンに置換される変異、及び／もしくは７１番目のアミノ酸がグルタミンに置換される変異を含むか、又は前記免疫グロブリンＦｃ領域のアミノ酸配列が配列番号９であり、それをコードするポリヌクレオチド配列は配列番号７であるが、これらに限定されるものではない。
【００９５】
一方、本発明における「組み合わせ（combination）」とは、二量体又は多量体を形成する際に、同一起源の単鎖免疫グロブリンＦｃ領域をコードするポリペプチドが異なる起源の単鎖ポリペプチドに結合することを意味する。すなわち、ＩｇＧ Ｆｃ、ＩｇＡ Ｆｃ、ＩｇＭ Ｆｃ、ＩｇＤ Ｆｃ及びＩｇＥ Ｆｃフラグメントからなる群から選択される少なくとも２つのフラグメントから二量体又は多量体を作製することができる。
【００９６】
また、本発明のタンパク質は、Ｎ末端及び／又はＣ末端が改変されていないものであってもよいが、生体内のタンパク質切断治療学的酵素から保護して安定性を向上させるために、そのＮ末端及び／又はＣ末端などが化学的に修飾された形態、有機団により保護された形態、又はペプチド末端などにアミノ酸が付加されて改変された形態も本発明によるタンパク質に含まれる。Ｃ末端が改変されていない場合、本発明によるタンパク質の末端はカルボキシル基を有するが、特にこれに限定されるものではない。
【００９７】
特に、化学的に合成したタンパク質の場合、Ｎ及びＣ末端が電荷を帯びているので、このような電荷を除去するために、Ｎ末端のアセチル化（acetylation）及び／又はＣ末端のアミド化（amidation）を行ってもよいが、特にこれらに限定されるものではない。
【００９８】
本明細書において、特に断らない限り、本発明による「酵素」又は「融合タンパク質」についての明細書の詳細な説明や請求の範囲の記述は、当該酵素又は融合タンパク質は言うまでもなく、当該酵素又は融合タンパク質の塩（例えば、前記融合タンパク質の薬学的に許容される塩）、又はその溶媒和物の形態が全て含まれるカテゴリーにも適用される。よって、明細書に「酵素」又は「融合タンパク質」とのみ記載されていたとしても、当該記載内容はその特定の塩、その特定の溶媒和物、その特定の塩の特定の溶媒和物にも同様に適用される。これらの塩の形態は、例えば薬学的に許容される任意の塩を用いた形態であってもよい。前記塩の種類は、特に限定されるものではない。もっとも、個体、例えば哺乳類に安全かつ効果的な形態であることが好ましいが、特にこれらに限定されるものではない。
【００９９】
前記「薬学的に許容される」とは、医薬学的判断の範囲内で、過度な毒性、刺激、アレルギー反応などを誘発することなく所望の用途に効果的に使用できる物質を意味する。
【０１００】
本発明における「薬学的に許容される塩」には、薬学的に許容される無機酸、有機酸又は塩基から誘導された塩が含まれる。好適な酸の例としては、塩酸、臭素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、トルエン−ｐ−スルホン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸，ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ベンゼンスルホン酸などが挙げられる。好適な塩基から誘導された塩には、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属、マグネシウムなどのアルカリ土類金属、アンモニウムなどが含まれる。
【０１０１】
また、本発明における「溶媒和物」とは、本発明による酵素、融合タンパク質又はその塩が溶媒分子と複合体を形成したものを意味する。
【０１０２】
本発明の酵素融合タンパク質は、当該技術分野で公知の方法で製造することができる。
【０１０３】
本発明の一実施例においては、治療学的酵素であるイズロン酸−２−スルファターゼ（Iduronate-2-sulfatase, IDS）及びアリールスルファターゼＢ（Arylsulfatase B, ARSB）をそれぞれペプチドリンカー−免疫グロブリンＦｃに融合された形態で発現する組換えベクターを作製し、それをＣＨＯ細胞株において発現させて製造した（実施例１〜３）。
【０１０４】
しかし、本発明の酵素融合タンパク質は、前記実施例に記載されている方法以外に、公知の他の方法により製造することもできる。本発明の酵素融合タンパク質は、配列番号２３又は２５のアミノ酸配列を含んでもよいが、これらに限定されるものではない。
【０１０５】
本発明による酵素融合タンパク質は、リソソーム蓄積症に対する治療効果を発揮する治療学的酵素と免疫グロブリンＦｃ領域を融合させることにより、治療学的酵素の活性を維持しつつ治療学的酵素の半減期を延長させることができる。特に、変異した免疫グロブリンＦｃ領域に融合された治療学的酵素は、鎖交換及びグリコシル化が低下し、Ｆｃ領域に融合されていない治療学的酵素に比べて、リソソーム受容体に対する結合力が低下し、持続性が向上するので、リソソーム蓄積症の治療に有用な効果を発揮する。
【０１０６】
本発明の一実施例において、本発明による酵素融合タンパク質は、Ｆｃ領域に融合されていない天然酵素に比べて、半減期（Ｔ1/2）、最高血中薬物濃度（Ｃmax）、バイオアベイラビリティ（ＡＵＣ）が著しく優れており（実施例４）、ｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素活性を維持することが確認され（実施例５）、それにより従来の薬物と比較して少ない投与頻度でも治療効果を発揮することが確認された（実施例６）。
【０１０７】
本発明の他の態様は、前記酵素融合タンパク質又は前記酵素融合タンパク質の製造方法により製造された酵素融合タンパク質を有効成分として含む、リソソーム蓄積症（lysosomal storage disorder, LSD）の予防又は治療用薬学的組成物を提供する。
【０１０８】
本発明による組成物は、治療学的酵素の生体内持続性及び安定性が向上することを特徴とする。
【０１０９】
具体的な一態様において、本発明の薬学的組成物の酵素融合タンパク質は、イズロン酸−２−スルファターゼ（Iduronate-2-sulfatase, IDS）又はアリールスルファターゼＢ（Arylsulfatase B, ARSB）が免疫グロブリンＦｃ領域に融合されたものであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【０１１０】
本発明における「リソソーム（lysosome）」とは、細胞質に存在する小器官の一つであり、加水分解酵素を多く含んでおり、体内で巨大分子、細菌などの異物を分解し、前記分解した産物が細胞の他の部分でリサイクルされるように助ける小器官である。前記リソソームの機能は複数の酵素により行われるが、変異や不足などにより特定酵素が機能を喪失すると、リソソームの分解機能が喪失することとなり、結局は分解されなければならない巨大分子などが細胞内に蓄積されて細胞の損傷などが誘発され、それによる疾患が発生する。
【０１１１】
本発明における「リソソーム蓄積症（lysosomal storage disease, LSD）」とは、このようなリソソーム機能の喪失による希少遺伝性疾患を意味し、欠陥のある酵素を補充する酵素補充療法（enzymatic replacement therapy）が必須である。前記リソソーム蓄積症は欠乏した酵素によって、ムコ多糖症（mucopolysaccharidosis, MPS）、グリコーゲン蓄積症（glycogen storage disease）、スフィンゴ脂質症（sphingolipidosis）、ニーマン・ピック病（Niemann-Pick disease）、ファブリー病（Fabry’s disease）、ゴーシェ病（Gaucher disease）、ハンター症候群（Hunter syndrome）、マロトー・ラミー症候群（Maroteaux-Lamy syndrome）などに分類される。
【０１１２】
以下、リソソーム蓄積症をその分類に従って詳細に説明する。
【０１１３】
本発明における「マロトー・ラミー症候群（Maroteaux-Lamy syndrome）」とは、ＭＰＳ（mucopolysaccharidosis）ＶＩ型疾患であり、グリコサミノグリカン（glycosaminoglycan）の分解に必要なアリールスルファターゼＢ（Arylsulfatase B, N-acetylgalactosamine-4-sulfatase）の不足により発生する常染色体劣性遺伝疾患である。骨、心臓弁膜、脾臓、肝臓、角膜などに前記酵素の不足により分解されていないデルマタン硫酸（dermatan sulfate）が沈着して現れる疾患である。
【０１１４】
本発明における「アリールスルファターゼＢ（arylsulfatase B, ARSB）」とは、肝臓、膵臓、腎臓のリソソームに存在するアリールスルファターゼ酵素であり、グリコサミノグリカンを分解することにより、サルフェートを加水分解する役割を果たす。前記アリールスルファターゼＢは、ムコ多糖症ＶＩ型（mucopolysaccharidosis VI, Maroteaux-Lamy syndrome）に関係することが知られている。アリールスルファターゼＢは、ガルスルファーゼ（galsulfase）と混用されてもよい。
【０１１５】
本発明における「ハンター症候群（Hunter syndrome, Hunter disease）」とは、性染色体劣性遺伝疾患であり、イズロン酸−２−スルファターゼ（Iduronate 2-sulfatase, IDS）の欠乏により発症し、前記酵素の欠乏によりヘパラン硫酸（heparan sulfate）及びデルマタン硫酸（dermatan sulfate）が蓄積されることが知られている。機能低下、進行性難聴、色素性網膜変性、うっ血乳頭（papilledema）、水頭症などの症状を示す。本発明において、「ムコ多糖症ＩＩ型」と「ハンター症候群」は混用されてもよい。
【０１１６】
本発明における「イズロン酸−２−スルファターゼ（iduronate-2-sulfatase）」とは、ハンター症候群（Hunter syndrome, MPS-II）に関するスルファターゼ酵素であり、ヘパラン硫酸（heparin sulfate）及びデルマタン硫酸（dermatan sulfate）のリソソーム分解に必要な酵素である。本発明における前記「イズロン酸−２−スルファターゼ（iduronate-2-sulfatase）」は、「イデュルスルファーゼ（idursulfase）」と混用されてもよい。前記イデュルスルファーゼは、イデュルスルファーゼアルファ又はイデュルスルファーゼベータであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【０１１７】
前記治療学的酵素は、当該技術分野で周知の方法で準備又は作製することができ、具体的には動物細胞発現ベクターを挿入した動物細胞を培養し、培養物から精製することもでき、市販されている治療学的酵素を購入して用いることもできるが、これらに限定されるものではない。
【０１１８】
本発明の組成物に含まれる酵素融合タンパク質は、リソソーム蓄積症に対する治療効果を発揮する治療学的酵素と免疫グロブリンＦｃ領域を融合させることにより、治療学的酵素の活性を維持しつつ治療学的酵素の半減期を延長させることができる。特に、変異した免疫グロブリンＦｃ領域に融合された治療学的酵素は、鎖交換及びグリコシル化が低下し、Ｆｃ領域に融合されていない治療学的酵素に比べて、リソソーム受容体に対する結合力が低下し、持続性が向上するので、リソソーム蓄積症の治療に有用な効果を発揮する。
【０１１９】
本発明の一実施例において、本発明の酵素融合タンパク質は、Ｆｃ領域に融合されていない酵素に比べて、少ない投与頻度にもかかわらず、ＩＤＳノックアウトマウスにおいてグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の数値を減少させることが確認され（実施例６）、また、本発明の他の実施例において、本発明の酵素融合タンパク質は、Ｆｃ領域に融合されていない天然酵素に比べて、骨髄及び脾臓において分布性が高いだけでなく、肺、腎臓、心臓などにおいて天然酵素の分布が確認されないのに対して、酵素融合タンパク質は当該組織に分布することが確認された（実施例７）。
【０１２０】
これは、本発明の酵素融合タンパク質が、高い安定性に基づいて、薬物投与時の投与頻度を低くして患者の利便性を向上させるだけでなく、組織分布性が高いため皮下投与も可能であることを示唆するものである。
【０１２１】
本発明における「予防」とは、前記酵素融合タンパク質又はそれを含む組成物の投与により目的とする疾患であるリソソーム蓄積症を抑制又は遅延させるあらゆる行為を意味し、「治療」とは、前記酵素融合タンパク質又はそれを含む組成物の投与により目的とする疾患、例えばリソソーム蓄積症の症状を好転又は有利に変化させるあらゆる行為を意味する。
【０１２２】
本発明における「投与」とは、任意の適切な方法で患者に所定の物質を導入することを意味し、前記組成物の投与経路は、特にこれらに限定されるものではないが、前記組成物を生体内標的に到達できるものであれば、一般的なあらゆる経路で投与することができ、例えば腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻腔内投与、肺内投与、直腸内投与などが挙げられる。しかし、経口投与の場合はペプチドが消化されるので、経口用組成物は、活性薬剤をコーティングしたり、胃での分解から保護されるように剤形化することが好ましい。具体的には、注射剤の形態で投与することが好ましい。また、薬学的組成物は、有効成分を標的細胞に送達することのできる任意の装置により投与することができる。
【０１２３】
本発明の組成物の総有効量は、単回投与量（single dose）で患者に投与してもよく、複数回投与量（multiple dose）で長期間投与される分割治療方法（fractionated treatment protocol）により投与してもよい。本発明の薬学的組成物は、疾患の程度に応じて有効成分の含有量を変えてもよい。具体的には、本発明の融合タンパク質の総用量は、１日体重１ｋｇ当たり約０．０００１ｍｇ〜５００ｍｇであることが好ましい。しかし、前記結合体の用量は、薬学的組成物の投与経路及び治療回数だけでなく、患者の年齢、体重、健康状態、性別、疾患の重症度、食餌、排泄率などの様々な要因を考慮して患者に対する有効投与量が決定されるので、これらを考慮すると、当該分野における通常の知識を有する者であれば、前記本発明の組成物の特定の用途に応じた適切な有効投与量を決定することができるであろう。本発明による薬学的組成物は、本発明の効果を奏するものであれば、その剤形、投与経路及び投与方法が特に限定されるものではない。
【０１２４】
本発明の酵素融合タンパク質の実際の投与量は、治療する疾患、投与経路、患者の年齢、性別及び体重、疾患の重症度などの様々な関連因子と共に、活性成分である治療学的酵素の種類により決定される。本発明の酵素融合タンパク質は、血中持続性と生体内活性が非常に優れるので、本発明の酵素融合タンパク質を含む薬学的組成物の投与量、投与回数及び頻度を大幅に減少させることができる。
【０１２５】
本発明による薬学的組成物は、薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤をさらに含んでもよい。このような担体は、非自然発生のものであってもよい。
【０１２６】
本発明における「薬学的に許容される」とは、治療効果を発揮する程度の十分な量と副作用を起こさないことを意味し、疾患の種類、患者の年齢、体重、健康状態、性別、薬物に対する感受性、投与経路、投与方法、投与回数、治療期間、配合、同時に用いられる薬物などの医学分野における公知の要素により当業者が容易に決定することができる。
【０１２７】
薬学的に許容される担体は、経口投与の場合は、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素、香料などを用いることができ、注射剤の場合は、緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張化剤、安定化剤などを混合して用いることができ、局所投与用の場合は、基剤、賦形剤、滑沢剤、保存剤などを用いることができる。
【０１２８】
本発明の薬学的組成物の剤形は、前述したような薬学的に許容される担体と混合して様々な形態に製造することができる。例えば、経口投与の場合は、錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウエハー剤などの形態に製造することができ、注射剤の場合は、使い捨てアンプル又は複数回投薬形態に製造することができる。その他、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル剤、徐放性製剤などに剤形化することができる。
【０１２９】
なお、製剤化に適した担体、賦形剤及び希釈剤の例としては、ラクトース、グルコース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、デンプン、アカシア、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、鉱物油などが挙げられる。また、充填剤、抗凝集剤、滑沢剤、湿潤剤、香料、乳化剤、防腐剤などをさらに含んでもよい。
【０１３０】
また、前記酵素融合タンパク質は、生理食塩水や有機溶媒のように薬剤に許容された様々な担体（carrier）と混合して用いることができ、安定性や吸収性を向上させるために、グルコース、スクロース、デキストランなどの炭水化物、アスコルビン酸（ascorbic acid）、グルタチオンなどの抗酸化剤（antioxidants）、キレート剤、低分子タンパク質、他の安定化剤（stabilizers）などを薬剤として用いることができる。
【０１３１】
これらに限定されるものではないが、本発明の前記薬学的組成物は、前記成分（有効成分）を０．０１〜９９％（ｗ／ｖ）含有してもよい。
【０１３２】
本発明のさらに他の態様は、本発明による酵素融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【０１３３】
本発明の酵素融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、これに限定されるものではないが、治療学的酵素をコードする部分とペプチドリンカー−免疫グロブリンＦｃ領域をコードする部分が連結された形態のポリヌクレオチドであってもよく、具体的には、これに限定されるものではないが、治療学的酵素のＣ末端に免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端がＧＧＧＧＳリンカーを介して連結された融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドであってもよい。より具体的には、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１又は３の配列を含むものであってもよいが、治療学的酵素と免疫グロブリンＦｃ領域の融合タンパク質をコードできるものであればいかなるものでもよい。
【０１３４】
本発明のさらに他の態様は、前記ポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターを提供する。
【０１３５】
本発明における「組換えベクター」とは、好適な宿主内で標的ペプチド、例えば酵素融合タンパク質を発現させることができるように、標的ペプチド、例えば酵素融合タンパク質が好適な調節配列に作動可能に連結されたＤＮＡ産物を意味する。本発明による組換えベクターは、典型的にクローニングのためのベクター又は発現のためのベクターとして構築されてもよく、原核細胞又は真核細胞を宿主細胞として構築されてもよい。
【０１３６】
前記調節配列には、転写を開始するプロモーター、その転写を調節するための任意のオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終結を調節する配列が含まれる。組換えベクターは、好適な宿主細胞内に形質転換されると、宿主ゲノムに関係なく複製及び機能することができ、ゲノム自体に組み込まれてもよい。
【０１３７】
本発明に用いられる組換えベクターは、宿主細胞内で複製可能なものであれば特に限定されるものではなく、当該技術分野で公知の任意のベクターを用いて作製することができる。通常用いられるベクターの例としては、天然状態又は組換え状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。本発明に使用可能なベクターは、特に限定されるものではなく、公知の発現ベクターを用いることができる。
【０１３８】
前記組換えベクターは、本発明の酵素融合タンパク質を生産するために、宿主細胞の形質転換に用いられる。また、本発明に含まれるこのような形質転換細胞は、本発明の核酸フラグメント及びベクターの増殖に用いられたか、本発明の酵素融合タンパク質の組換え生産に用いられた培養された細胞又は細胞株であってもよい。
【０１３９】
本発明における「形質転換」とは、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターを宿主細胞内に導入することにより、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質を発現させることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内で発現するものであれば、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、染色体外に位置するかに関係なく、それらが全て含まれるものである。
【０１４０】
また、前記ポリヌクレオチドは、標的タンパク質をコードするＤＮＡやＲＮＡを含むものである。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現するものであれば、いかなる形態で導入されるものでもよい。例えば、前記ポリヌクレオチドは、自ら発現する上で必要な全ての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（expression cassette）の形態で宿主細胞に導入されてもよい。通常、前記発現カセットは、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター（promoter）、転写終結シグナル、リボソーム結合部位及び翻訳終結シグナルを含む。前記発現カセットは、自己複製可能な発現ベクターの形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞において発現に必要な配列と作動可能に連結されたものであってもよいが、これに限定されるものではない。
【０１４１】
さらに、前記「作動可能に連結」されたものとは、本発明の標的ペプチドをコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介するプロモーター配列と前記遺伝子配列が機能的に連結されたものを意味する。
【０１４２】
本発明に適した宿主は、本発明のポリヌクレオチドを発現させるものであれば特に限定されるものではない。本発明に用いられる宿主の特定例としては、大腸菌（E. coli）などのエシェリキア（Escherichia）属細菌、枯草菌（Bacillus subtilis）などのバチルス（Bacillus）属細菌、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）などのシュードモナス（Pseudomonas）属細菌、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）などの酵母、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｆ９）などの昆虫細胞、及びＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＳＣなどの動物細胞が挙げられる。
【０１４３】
本発明のさらに他の態様は、前記発現ベクターが導入された形質転換体を提供する。
【０１４４】
本発明の発現ベクターが導入された形質転換体は、本発明の目的上、酵素融合タンパク質を発現及び生産するものであれば限定されるものではなく、大腸菌（E. coli）などのエシェリキア（Escherichia）属細菌、枯草菌（Bacillus subtilis）などのバチルス（Bacillus）属細菌、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）などのシュードモナス（Pseudomonas）属細菌、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）などの酵母、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｆ９）などの昆虫細胞、及びＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＳＣなどの動物細胞であってもよい。
【０１４５】
本発明のさらに他の態様は、本発明による酵素融合タンパク質を製造する方法を提供する。
【０１４６】
具体的には、前記製造方法は、（ａ）形質転換体を培養して培養物を得るステップと、（ｂ）培養物から酵素融合タンパク質を回収するステップとを含むが、これに限定されるものではない。
【０１４７】
本発明において、形質転換体の培養に用いられる培地は、好適な方法で宿主細胞培養の要件を満たさなければならない。宿主細胞の生長のために培地中に含まれる炭素源は、作製される形質転換体の種類に応じて当業者の判断により適宜選択されてもよく、培養の時期及び量を調節するために好適な培養条件が採用されてもよい。
【０１４８】
用いることのできる糖源としては、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、デンプン、セルロースなどの糖及び炭水化物、大豆油、ヒマワリ油、ヒマシ油、ココナッツ油などの油脂、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸などの脂肪酸、グリセリン、エタノールなどのアルコール、酢酸などの有機酸が挙げられる。これらの物質は、単独で用いることもでき、混合物として用いることもできる。
【０１４９】
用いることのできる窒素源としては、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、黄粉及び尿素、又は無機化合物、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムが挙げられる。窒素源も、単独で用いることもでき、混合物として用いることもできる。
【０１５０】
用いることのできるリン源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、又はそれらに相当するナトリウム含有塩が挙げられる。また、培養培地は、成長に必要な硫酸マグネシウム、硫酸鉄などの金属塩を含有してもよい。
【０１５１】
最後に、前記物質以外に、アミノ酸、ビタミンなどの必須成長物質が用いられてもよい。また、培養培地に好適な前駆体が用いられてもよい。前述した原料は、培養過程において培養物に好適な方法でバッチ毎に又は連続して添加されてもよい。水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアなどの塩基性化合物、又はリン酸、硫酸などの酸性化合物を好適な方法で用いて培養物のｐＨを調節することができる。また、脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を用いて気泡生成を抑制してもよい。好気状態を維持するために、培養物中に酸素又は酸素含有気体（例えば、空気）を注入する。
【０１５２】
本発明による形質転換体の培養は、通常２０℃〜４５℃、具体的には２５℃〜４０℃の温度で行われる。また、培養は、所望のインスリンアナログの最大の生成量が得られるまで続けるが、これらの目的上、通常１０〜１６０時間続ける。
【０１５３】
前述したように、宿主細胞に応じて適切な培養条件を整えると、本発明による形質転換体によりインスリンアナログが生産され、ベクターの構成及び宿主細胞の特徴に応じて、生産されるインスリンアナログは宿主細胞の細胞質内、細胞周辺腔（periplasmic space）又は細胞外に分泌される。
【０１５４】
宿主細胞の内外で発現したタンパク質は通常の方法で精製することができる。精製方法の例としては、塩析（例えば、硫酸アンモニウム沈殿、リン酸ナトリウム沈殿など）、溶媒沈殿（例えば、アセトン、エタノールなどを用いたタンパク質分画沈殿など）、透析、ゲル濾過、イオン交換、逆相カラムクロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー、限外濾過などの方法を単独で又は組み合わせて用いることができる。
【０１５５】
本発明のさらに他の態様は、前記酵素融合タンパク質又はそれを含む組成物を個体に投与するステップを含む、リソソーム蓄積症の予防又は治療方法を提供する。
【０１５６】
本発明の酵素融合タンパク質は、リソソーム蓄積症を予防又は治療することのできる治療学的酵素を含むので、それを含む酵素融合タンパク質又は前記酵素融合タンパク質を含有する薬学的組成物の投与により、リソソーム蓄積症の疑いのある個体を予防又は治療することができる。
【０１５７】
本発明における「個体」とは、リソソーム蓄積症（lysosomal storage disorder, LSD）の疑いのある個体であり、前記リソソーム蓄積症の疑いのある個体とは、当該疾患が発症したか、発症するリスクのある、ヒトをはじめとしてマウス、家畜などが含まれる哺乳動物を意味するが、本発明の酵素融合タンパク質又はそれを含む前記組成物で治療可能な個体であればいかなるものでもよい。
【０１５８】
本発明の方法は、酵素融合タンパク質を含む薬学的組成物を薬学的有効量で投与することを含んでもよい。好適な総１日使用量は正しい医学的判断の範囲内で担当医により決定されてもよく、１回又は数回に分けて投与することができる。しかし、本発明の目的上、特定の患者に対する具体的な治療的有効量は、達成しようとする反応の種類と程度、場合によっては他の製剤が用いられるか否か、具体的な組成物、患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別、食餌、投与時間、投与経路、組成物の分泌率、治療期間、具体的な組成物と共に又は同時に投与される薬物をはじめとする様々な因子や、医薬分野で周知の類似の因子に応じて異なる量であることが好ましい。
【０１５９】
一方、これらに限定されるものではないが、前記リソソーム蓄積症の予防又は治療方法は、少なくとも１つのリソソーム蓄積症に対する治療的活性を有する化合物又は物質を投与することをさらに含む併用療法であってもよい。
【０１６０】
本発明における「併用」とは、同時、順次又は個別投与を意味するものと理解されるべきである。前記投与が順次又は個別の場合、２次成分投与の間隔は、前記併用の有利な効果を失わないものでなければならない。
【０１６１】
前記リソソーム蓄積症に対する治療的活性を有する酵素融合タンパク質の投与用量は、患者の体重１ｋｇ当たり約０．０００１μｇ〜５００ｍｇであってもよいが、特にこれらに限定されるものではない。
【０１６２】
本発明のさらに他の態様は、前記酵素融合タンパク質又はそれを含む組成物をリソソーム蓄積症に対する予防又は治療用薬剤（又は薬学的組成物）の製造に用いる用途を提供する。
【０１６３】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例はあくまで本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明がこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【０１６４】
融合タンパク質発現ベクターの作製
酵素融合タンパク質を生産するために、天然イズロン酸−２−スルファターゼ（Iduronate-2-sulfatase, IDS, 配列番号１）及びアリールスルファターゼＢ（Arylsulfatase B, ARSB, 配列番号３）がそれぞれ挿入された発現ベクター（IDS cDNA, Cat No. EX-C0003-M02, Gencopoeia; ARSB cDNA, Cat No. EX-C0073-M02, Genecopoeia）と、合成されたリンカー（linker, 配列番号５）と、ＩｇＧ４ Ｆｃ領域（配列番号７）から、オーバーラップ（overlap）ＰＣＲにより、融合タンパク質発現ベクターを作製した。オーバーラップＰＣＲ法は、各酵素とリンカー−ＦｃをそれぞれＰＣＲ増幅する際に、プライマーに互いにオーバーラップする配列を含むので、生産されるＰＣＲ産物がオーバーラップする配列を含む。前記融合タンパク質の増幅のためのＰＣＲ条件は、１次では９５℃で１分間、５７℃で３０秒間、６８℃で３分間の過程を２５回繰り返し、２次では９５℃で１分間、５７℃で３０秒間、６８℃で４分間の過程を２５回繰り返して増幅した。
【０１６５】
具体的には、ＩＤＳは配列番号１０、１１のプライマーを用いてＰＣＲを行い、Ｌｉｎｋｅｒ−Ｆｃは配列番号１２、１３のプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、ＩＤＳ ＰＣＲ産物は３’側にｌｉｎｋｅｒ−Ｆｃ配列を含み、Ｌｉｎｋｅｒ−ＦｃＰＣＲ産物は５’側にＩＤＳ配列を含むようにした。
【０１６６】
前記１次ＰＣＲで得られた２つのＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号１０、１３のプライマーを用いて２次ＰＣＲを行い、ＩＤＳ−Ｆｃ配列を有するＰＣＲ産物が得られると、ＫｐｎＩ、ＸｈｏＩ制限酵素でオーバーラップ配列を切断し、前述したように得られたＰＣＲ産物をＸ０ＧＣ ｖｅｃｔｏｒに挿入してＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質発現ベクターを構築した（ｐＸ０ＧＣ−Ｅｎｚｙｍｅ−Ｆｃ）。
【０１６７】
同様の方法で配列番号１４、１５、１６、１７のプライマーを用いてＡＲＳＢ−Ｆｃ配列を有するＰＣＲ産物が得られると、ＫｐｎＩ、ＸｈｏＩ制限酵素で切断し、同じ制限酵素で切断されたＸ０ＧＣ ｖｅｃｔｏｒに挿入して融合タンパク質発現ベクターを構築した。
【０１６８】
【表１】
2020530283.tif 000003
【０１６９】
構築された融合タンパク質配列のＦｃ領域から鎖交換（chain exchange）とＮ−グリコシル化部位（N-glycosylation site）を除去するために、部位特異的変異（site-directed mutagenesis）ＰＣＲ法を用いた。
【０１７０】
具体的には、配列番号１８、１９のプライマーを用いて、鎖交換に関与するＦｃ領域（配列番号８）の２番目のアミノ酸であるセリン（Serine）をプロリン（Proline）に置換し、配列番号２０、２１のプライマーを用いて、Ｎ−グリコシル化が起こるＦｃ領域の７１番目のアミノ酸であるアスパラギン（Asparagine）をグルタミン（Glutamine）に置換した。表３のタンパク質配列において、太字はアミノ酸が置換された部分を示し、イタリック体はリンカーを示す。
【０１７１】
【表２】
2020530283.tif 000004
【０１７２】
前記実施例で作製した酵素融合タンパク質発現ベクターをＩＤＳ−Ｆｃベクター、ＡＲＳＢ−Ｆｃベクターと命名した。あるいは、前記ベクターは、ｐＸ０ＧＣ−Ｅｎｚｙｍｅ−Ｆｃと混用されてもよい。
【０１７３】
【表３】
2020530283.tif 000005
2020530283.tif 000006
2020530283.tif 000007
2020530283.tif 000008
2020530283.tif 000009
2020530283.tif 000010
【実施例２】
【０１７４】
融合タンパク質発現ベクターを用いたＣＨＯ細胞株の形質転換
実施例１で作製した組換え発現ベクターｐＸ０ＧＣ−Ｅｎｚｙｍｅ−ＦｃをＤＨＦＲ遺伝子が破壊されて核酸生合成過程が不完全なＤＧ４４／ＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−）（非特許文献４）に導入して形質転換体を得て、前記形質転換体から酵素融合タンパク質（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｆｃ）を発現させた。
【０１７５】
具体的には、前記ＤＧ４４／ＣＨＯ細胞株を培養容器の底が約８０〜９０％覆われる程度に培養し、次いで前記細胞をＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Gibco社, cat. No. 51985034）で３回洗浄した。
【０１７６】
一方、３ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭと５μｇの発現ベクターｐＸ０ＧＣ−Ｅｎｚｙｍｅ−Ｆｃの混合物と、３ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭと２０μｌのリポフェクタミン２０００（Gibco社, cat no. 11668-019）の混合物をそれぞれ常温で３０分間静置した。次に、前記各混合物を混合して前記培養したＤＧ４４／ＣＨＯ細胞株に加え、３７℃及び５％ＣＯ2の条件で約１８時間培養することにより、前記発現ベクターｐＸ０ＧＣ−Ｅｎｚｙｍｅ−ＦｃをＤＧ４４／ＣＨＯ細胞株に導入した。
【０１７７】
次に、前記培養した細胞を１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ−Ｆ１２（Gibco社, cat no. 11330）培地で３回洗浄し、次いで前記培地を加えてさらに４８時間培養した。培養した細胞にトリプシンを加えて培養した細胞をそれぞれ分離し、それらを選択培地（ＨＴ補充剤（Hypoxanthine-Thymidine）を含まず、１０％ＦＢＳ及び１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（Cellgro社, cat no. 61-234-RG）を含むα−ＭＥＭ培地（WELGENE社, cat no. LM008-02））に接種した。形質転換された細胞のみ生存してコロニーを形成するまで、前記選択培地を２日又は３日置きに交換して培養することにより、前記分離した細胞から形質転換された細胞を選択した。ここで、前記選択した形質転換された細胞において酵素融合タンパク質の発現レベルを向上させるために、１０ｎＭ ＭＴＸ（Sigma社, cat no. M8407）を選択培地に加え、次第にその濃度を増加し、１〜２週間後には２０ｎＭまでＭＴＸの含有量を増加した。
【実施例３】
【０１７８】
酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いたＩＤＳ−Ｆｃ、ＡＲＳＢ−Ｆｃ融合タンパク質の発現確認
実施例２で形質導入された細胞の一部を１７５−Ｔ細胞培養フラスコに１×１０7細胞数の濃度で移して培養容器の底がほとんど覆われる程度に培養し、その後１ｍＭの酪酸ナトリウム（Sigma社, cat no. B5887）が添加された無血清培地Ｅｘ−ｃｅｌｌ ｍｅｄｉａ（Sigma社注文製作, cat no. 14360C）を１５ｍＬずつ加え、５％ＣＯ2培養器にて３３℃で４８時間培養した。細胞の培養液を５０ｍＬチューブに移し、その後遠心分離により上清のみ再び回収してＩＤＳ−Ｆｃ及びＡＲＳＢ−Ｆｃ融合タンパク質の発現量を測定した。
【０１７９】
まず、ＩＤＳ−Ｆｃ発現量の測定は、ｉｎｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡ法を用いて行った。９６ ｗｅｌｌ ＥＬＩＳＡプレート（Nunk社, cat no. 44-2404-21）に、１μｇ／ｍＬでＰＢＳに希釈したヒトα−ＩＤＳ抗体（R&D systems社, cat no. AF2449）を１ｗｅｌｌ当たり１００μｌずつ加え、４℃の冷蔵庫で一晩反応させた。翌日、ＰＢＳ−Ｔバッファーで５回洗浄し、その後培養液試料と様々な濃度に希釈したＩＤＳ標準品（Shire社, Elaprase（登録商標）, lot no. TEPE09A17）を１ｗｅｌｌ当たり１００μｌずつそれぞれ分注し、常温で１時間反応させた。１時間後に、プレートを洗浄してｂｉｏｔｉｎが付着したヒトα−ＩＤＳ抗体（R&D systems社, cat no. BAF 2449）を加え、その後常温で１時間反応させた。最後に、ストレプトアビジン（streptavidin）−ＨＲＰ（GE healthcare社, cat no. RPN440IV）を１：３０，０００に希釈して１ｗｅｌｌ当たり１００μｌずつ加え、その後１時間反応させ、洗浄後に基質液を加えて約１０分間反応させ、反応停止液で反応を停止させ、その後４５０ｎｍの吸光度で測定した。ヒトＩＤＳ標準品の濃度と得られた吸光度値を用いて標準曲線及び関数を求め、それによりヒトＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質の量を定量化した。その結果、形質導入されて選択された細胞が所定量のヒトＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質を発現することが確認された（図１）。
【０１８０】
また、ＡＲＳＢ−Ｆｃ融合タンパク質の発現量測定は、ヒトＩｇＧを定量化する酵素免疫測定法（Bethyl社, cat no. E80-104）を用いて行った。９６ ｗｅｌｌ ＥＬＩＳＡプレート（Nunk社, cat no. 44-2404-21）に、１０μｇ／ｍＬで炭酸（carbonate）バッファー（0.05 M carbonate-bicarbonate, pH 9.6）に希釈したヒトＩｇＧ−Ｆｃ抗体（Bethyl社, cat no. A80-104A-9）を１ｗｅｌｌ当たり１００μｌずつ加え、常温で１時間反応させた。１時間後に、洗浄液でＥＬＩＳＡプレートを５回繰り返し洗浄し、培養液試料とヒトＩｇＧ定量キットに含まれるヒトＩｇＧ標準品（Bethyl社, cat no. RS10-110-4）を様々な濃度に希釈して１ｗｅｌｌ当たり１００μｌずつそれぞれ分注し、常温で１時間反応させた。１時間後に、プレートを洗浄してＨＲＰが付着したヒトＩｇＧ−Ｆｃ抗体（Bethyl社, cat no. A80-104P-87）を１：１５０，０００に希釈して加え、その後常温で１時間反応させた。最後に、ストレプトアビジン（streptavidin）−ＨＲＰ（GE healthcare社, cat no. RPN440IV）を１：３０，０００に希釈して１ｗｅｌｌ当たり１００μｌずつ加え、その後１時間反応させ、洗浄後に基質液を加えて約１５分間反応させ、反応停止液で反応を停止させ、その後４５０ｎｍの吸光度で測定した。
【０１８１】
ヒトＩｇＧ標準品の濃度と得られた吸光度値を用いて標準曲線及び関数を求め、それによりヒトＡＲＳＢ−Ｆｃ融合タンパク質の量を定量化した。その結果、形質導入されて選択された細胞が所定量のヒトＡＲＳＢ−Ｆｃ融合タンパク質を発現することが確認された（図２）。
【実施例４】
【０１８２】
酵素持続型融合タンパク質の薬物動態確認
前述したように製造した酵素持続型融合タンパク質及びＦｃ領域に融合されていない酵素の薬物動態を調査し、融合タンパク質の製造による効果を比較した。
【０１８３】
実施例４−１：イズロン酸−２−スルファターゼ持続型融合タンパク質の薬物動態学的実験
本発明者らは、前記実施例で製造したイズロン酸−２−スルファターゼ持続型融合タンパク質の薬物動態を調査し、本発明の融合タンパク質の薬効持続性効果を確認した。
【０１８４】
そのために、３匹のＩＣＲマウスにイズロン酸−２−スルファターゼ（Idursulfase, 対照群）とイズロン酸−２−スルファターゼ持続型融合タンパク質（ＩＤＳ−Ｆｃ融合タンパク質，実験群）をそれぞれ投与し、各群の各採血時点における血液中安定性及び薬物動態学的パラメーターを比較した。
【０１８５】
具体的には、対照群と実験群にイズロン酸−２−スルファターゼに換算してそれぞれ０．５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇずつ静脈内及び皮下注射を行い、その後静脈内注射投与群は注射して０、０．２５、０．５、１、２、４、８、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４及び１６８時間後に採血し、皮下注射投与群は注射して０、１、４、８、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、１６８、１９２及び２１６時間後に採血した。血清中のタンパク質量は、ヒト特異的抗イズロン酸−２−スルファターゼ抗体を用いてＥＬＩＳＡ法で測定した。その分析結果を図３及び表４に示す。
【０１８６】
【表４】
2020530283.tif 000011
【０１８７】
これらの結果から分かるように、本発明によるイズロン酸−２−スルファターゼ持続型融合タンパク質は、対照群に比べて有意に優れた薬物動態学的特性を示す。これらの結果は、実際の薬物投与において、本発明のイズロン酸−２−スルファターゼ持続型融合タンパク質が、融合タンパク質でない酵素に比べて、持続的な効能を示す効果により、薬物投与間隔を短くするという利点を示唆するものである。
【０１８８】
図３及び表４の薬物動態学的結果から分かるように、イズロン酸−２−スルファターゼ持続型融合タンパク質において、融合タンパク質でない対照群に比べて、半減期（Ｔ1/2）、最高血中薬物濃度（Ｃmax）、バイオアベイラビリティ（ＡＵＣ）が全て増加した。特に、イズロン酸−２−スルファターゼ持続型融合タンパク質のバイオアベイラビリティは６４．９％であり、融合タンパク質でない酵素に比べて優れたバイオアベイラビリティを示すことが確認された。
【０１８９】
実施例４−２：アリールスルファターゼＢ持続型融合タンパク質の薬物動態学的実験
本発明者らは、前記実施例で製造したアリールスルファターゼＢ持続型融合タンパク質（ＡＲＳＢ−Ｆｃ融合タンパク質）の薬物動態を調査するために、アリールスルファターゼＢ持続型融合タンパク質の薬物動態を測定し、アリールスルファターゼＢと比較した。
【０１９０】
具体的には、天然アリールスルファターゼＢ（ナグラザイム，バイオマリン社）を投与する対照群と、アリールスルファターゼＢ持続型融合タンパク質を投与する実験群において、ＩＣＲマウスにアリールスルファターゼＢに換算して５．０ｍｇ／ｋｇずつ静脈内及び皮下注射し、その後対照群は、投与方法に関係なく、注射して０、０．２５、０．５、０．７５、１、１．５、４、８及び２４時間後に採血した。実験群のうち静脈内注射投与群は、注射して０、０．２５、０．５、１、１．５、２、４、８、２４、４８、９６及び１６８時間後に採血し、実験群のうち皮下注射群は、注射して０、０．５、１、２、４、８、２４、４８、９６及び１６８時間後に採血した。
【０１９１】
採血した各群の血液は、遠心分離して血清に分離し、酵素活性測定方法で血中のアリールスルファターゼＢ持続型融合タンパク質及び天然アリールスルファターゼＢの量を定量化した。その分析結果を図４及び表５に示す。
【０１９２】
【表５】
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【０１９３】
これらの結果から分かるように、本発明によるアリールスルファターゼＢ持続型融合タンパク質は、天然アリールスルファターゼＢであるナグラザイムに比べて有意に優れた薬物動態学的特性を示す。これらの結果は、実際の薬物投与において、前記アリールスルファターゼＢ持続型融合タンパク質が天然アリールスルファターゼＢに比べて持続的な効能を示す効果により、薬物投与間隔を短くするという利点を示唆するものである。
【０１９４】
図４及び表５の薬物動態学的結果から分かるように、アリールスルファターゼＢ持続型融合タンパク質において、融合タンパク質でない対照群に比べて、半減期（Ｔ1/2）、最高血中薬物濃度（Ｃmax）、バイオアベイラビリティ（ＡＵＣ）が全て増加した。特に、アリールスルファターゼＢ持続型融合タンパク質のバイオアベイラビリティは６５．８％であり、融合タンパク質でない酵素に比べて優れたバイオアベイラビリティを示すことが確認された。
【０１９５】
実施例４−１及び４−２において酵素融合タンパク質の薬物動態を調査した結果、本発明の酵素融合タンパク質は、Ｆｃ領域に融合されていない酵素に比べて、半減期、バイオアベイラビリティなどが大幅に増加するので、持続的な薬物の効能を期待できることが確認された。
【実施例５】
【０１９６】
酵素持続型融合タンパク質の酵素活性確認
前述したように製造した酵素融合タンパク質に含まれる酵素の活性をＦｃ領域に融合されていない酵素と比較した。
【０１９７】
実施例５−１：イズロン酸−２−スルファターゼ持続型融合タンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素活性
本発明者らは、前記実施例で製造したイズロン酸−２−スルファターゼの持続型融合タンパク質の製造による酵素活性の変化を測定するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素活性測定を行った。
【０１９８】
具体的には、酵素基質として知られる４ＭＵ−α−ＩｄｏｐｙｒａＡ−２（4-Methylumbelliferyl a-L-Idopyranosiduronic Acid-2-sulfate Sodium Salt）をイズロン酸−２−スルファターゼ及びイズロン酸−２−スルファターゼ持続型融合タンパク質と３７℃で４時間反応させ、その後二次反応酵素であるα−イズロニダーゼ（Iduronidase）と３７℃でさらに２４時間反応させた。その後、最終的に生成された４ＭＵ（4-Methylumbelliferone）の蛍光を測定することにより、当該物質の酵素活性を確認した。
【０１９９】
その結果、イズロン酸−２−スルファターゼとイズロン酸−２−スルファターゼ持続型融合タンパク質の酵素活性（specific activity）がそれぞれ３２．０±１．５８ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＭ、８７．３±６．４９ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＭであることが確認された。イズロン酸−２−スルファターゼ持続型融合タンパク質は、２つのＦｃ鎖の二量体形態である１つのＦｃ分子と、２つのイズロン酸−２−スルファターゼとから構成されている構造であるので、融合タンパク質でないイズロン酸−２−スルファターゼに比べて、約２．７倍の高いｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素活性が測定された。これは、２つのイズロン酸−２−スルファターゼを有するイズロン酸−２−スルファターゼ持続型融合タンパク質の構造的な特徴が、酵素活性の面で融合タンパク質でないイズロン酸−２−スルファターゼより利点があることを示唆するものである（図５）。
【０２００】
実施例５−２：アリールスルファターゼＢ持続型融合タンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素活性
本発明者らは、前記実施例で製造したアリールスルファターゼＢ持続型融合タンパク質の酵素活性を天然酵素であるアリールスルファターゼＢ（ナグラザイム，バイオマリン社）と比較測定した。
【０２０１】
具体的には、前記アリールスルファターゼＢ持続型融合タンパク質及びアリールスルファターゼＢを４−ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ ｓｕｌｆａｔｅと３７℃で２０分間反応させ、その後硫酸基が切断されて生成した４−ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌの蛍光を測定する方法により、アリールスルファターゼＢ持続型融合タンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素活性を測定した。
【０２０２】
その結果、アリールスルファターゼＢとアリールスルファターゼＢ持続型融合タンパク質の酵素活性（specific activity）がそれぞれ４３８．５±２９．４ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／μＭ、８２３．８±３７．０ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／μＭであることが確認された。２つのＦｃ鎖の二量体形態である１つのＦｃ分子と、２つのアリールスルファターゼＢとから構成されているアリールスルファターゼＢ持続型融合タンパク質は、天然アリールスルファターゼＢに比べて約１．９倍の高いｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素活性を有することが確認された。これらの結果から分かるように、分子単位で天然アリールスルファターゼＢと差別化されたアリールスルファターゼＢ持続型融合タンパク質の構造的な特徴により優れた酵素活性を示す（図６）。
【０２０３】
実施例５−１及び５−２において酵素融合タンパク質の酵素活性を確認した結果、本発明の酵素融合タンパク質は、Ｆｃ領域に融合されていない酵素に比べて、高いｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素活性を有することが確認された。
【実施例６】
【０２０４】
イズロン酸−２−スルファターゼ持続型融合タンパク質の投与効能確認
イズロン酸−２−スルファターゼ（iduronate 2-sulfatase, IDS）ノックアウト（knock-out）マウスに薬物を投与し、組織及び尿中のグリコサミノグリカン（glycosaminoglycan, GAG）の含有量の変化を調査することにより、本発明の酵素融合タンパク質の投与効能を確認した。
【０２０５】
具体的には、陰性対照群の正常マウス群以外に、７〜１４週齢のＩＤＳノックアウトマウスを尿中のＧＡＧ含有量に基づいて１群当たり４匹となるように計４つの群に分けた。イズロン酸−２−スルファターゼ（エラプレース, genzyme）０．５ｍｇ／ｋｇを尾静脈に計４回（０日，７日，１４日，２１日）投与し（対照群）、イズロン酸−２−スルファターゼ持続型融合タンパク質は、２．０ｍｇ／ｋｇを尾静脈に１回（０日）投与する群と、４．０ｍｇ／ｋｇを１回（０日）皮下投与する群に分けた。
【０２０６】
各群のマウスから薬物投与前と投与７日、１４日、２１日及び２８日後にそれぞれ尿を回収し、肝臓、脾臓、心臓、骨髄を薬物投与２８日後に全て回収し、組織重量の５倍（骨髄は９倍）のボリュームの組織破砕バッファー（１ｕｇ／ｍＬのアプロチニン（aprotinin）、１ｍＭ ＰＭＳＦ、及び２ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ）を加えて超音波破砕機で破砕し、次いで遠心分離を行って得た上清を用いてＧＡＧ含有量を分析した。
【０２０７】
その後、前記回収した尿及び各組織の破砕後に得られた上清５０μｌを９６ウェルプレートに加え、ジメチルメチレンブルー（dimethylmethylene blue）溶液２５０μｌを添加して攪拌し、５２５ｎｍの波長でＧＡＧ含有量を定量化した。尿中のＧＡＧ含有量は、尿中のクレアチン含有量で補正して値を算出した。算出した値により一元配置分散分析（one-way ANOVA）を用いて対照群と試験群間の統計分析を行った。測定された尿及び各組織におけるＧＡＧ含有量をそれぞれ図７及び図８に示す。
【０２０８】
図７及び図８から分かるように、イズロン酸−２−スルファターゼ持続型融合タンパク質は、月１回の静脈及び皮下投与だけでも、Ｆｃ領域に融合されていない酵素（エラプレース）の週１回の静脈投与と同程度に、ＩＤＳノックアウトマウスに比べて尿及び各組織中のＧＡＧ数値を有意に減少させた。
【０２０９】
本実施例により、本発明のイズロン酸−２−スルファターゼ持続型融合タンパク質は、延長された血中半減期の特徴に基づいて、月１回投与だけでも週１回投与の従来の薬物用法と同程度の効力を示すことが確認された。また、月１回皮下投与した群においてもＧＡＧ数値を減少させる効能を示す結果から、本発明の融合タンパク質の投与経路として皮下注射の可能性が示された。よって、本発明によるイズロン酸−２−スルファターゼ持続型融合タンパク質は、ハンター症候群患者への月１回投薬及び皮下投薬の可能性を示唆する。
【実施例７】
【０２１０】
アリールスルファターゼＢ持続型融合タンパク質の組織分布確認
本発明者らは、前記実施例で製造した本発明の酵素融合タンパク質の組織分布性を確認した。
【０２１１】
そのために、３匹のＩＣＲマウス（mouse）にアリールスルファターゼＢ（対照群）とアリールスルファターゼＢ持続型融合タンパク質（実験群）をそれぞれ投与し、各群の各採血時点における組織及び臓器内の分布を比較した。
【０２１２】
具体的には、対照群と実験群にアリールスルファターゼＢに換算してそれぞれ５．０ｍｇ／ｋｇずつ静脈経路で注射した。対照群の天然アリールスルファターゼＢ（ナグラザイム）と実験群のアリールスルファターゼＢ持続型融合タンパク質は、薬物投与して１、４、８、２４時間後にマウスの臓器を摘出し、その後酵素活性測定法により組織（骨髄、肝臓、脾臓、肺、腎臓及び心臓）における各物質の濃度を測定及び比較した。
【０２１３】
その結果、対照群として用いたＦｃ領域に融合されていない天然アリールスルファターゼＢと比較して、同一時間帯においてアリールスルファターゼＢ持続型融合タンパク質は全ての組織で高い組織分布結果、又はより長時間の組織分布結果が認められた。
【０２１４】
特に、アリールスルファターゼＢ持続型融合タンパク質は、天然アリールスルファターゼＢと比較して、骨髄と脾臓において分布性が非常に高いことが確認され、肺、腎臓、心臓においてアリールスルファターゼＢが測定されないのに対して、アリールスルファターゼＢ持続型融合タンパク質は当該組織に分布することが確認された（図９）。
【０２１５】
これらの実験結果から、本発明によるアリールスルファターゼＢ持続型融合タンパク質は、天然アリールスルファターゼＢであるナグラザイムに比べて優れた薬物動態学的特性を示す。特に、従来の薬物において用いられていた週１回静脈投与を月１回投与、さらには皮下投与に変更できる可能性により、患者の生活の質の向上に寄与できることを示唆する。
【０２１６】
以上の説明から、本発明の属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、前記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明には、明細書ではなく請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態が含まれるものと解釈すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2020530283.tif 000024
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