(57)【要約】  本明細書に記載されるのは、グリコシル化タンパク質をインビトロ及びインビボで産生する組成物及び方法である。該方法は、宿主細胞を用いてグリコシル化タンパク質を産生することを含む。また本明細書に記載されるのは、そのような方法を用いて産生されるグリコシル化タンパク質及びその使用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
a.標的タンパク質をコードする組換え核酸;及び
b.異種グリコシルトランスフェラーゼをコードする組換え核酸
:を含む、リーシュマニア宿主細胞。
【請求項２】
前記異種グリコシルトランスフェラーゼが、N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ;及び/又は異種ガラクトシルトランスフェラーゼ;及び/又は異種シアリルトランスフェラーゼである、請求項1記載の宿主細胞。
【請求項３】
前記宿主細胞が、2以上のN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ;及び/又は2以上の異種ガラクトシルトランスフェラーゼ;及び/又は2以上の異種シアリルトランスフェラーゼを含む、請求項2記載の宿主細胞。
【請求項４】
前記異種シアリルトランスフェラーゼを含む宿主細胞がCMP-NeuAcを生成させることができる異種CMP-Sia生合成経路タンパク質をさらに含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の宿主細胞。
【請求項５】
N-グリカン生合成経路由来の1以上の内在性酵素が欠失させられ、突然変異させられ、及び/又は機能的に不活化されている、請求項1〜4のいずれか一項記載の宿主細胞。
【請求項６】
前記リーシュマニア細胞がリーシュマニア・タレントラエ細胞である、請求項1〜4のいずれか一項記載の宿主細胞。
【請求項７】
前記N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、及び/又はシアリルトランスフェラーゼのアミノ酸配列が、表9に掲載されているN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、もしくはシアリルトランスフェラーゼ、又はこれらの任意の機能性ホモログ、アイソフォーム、もしくは変異体に由来する、請求項2〜6のいずれか一項記載の宿主細胞。
【請求項８】
リーシュマニアシグナル及び/又は保持配列が、前記N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、及び/又はシアリルトランスフェラーゼに付加され、ここで、該シグナル配列が、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、及び/又はシアリルトランスフェラーゼを前記リーシュマニア宿主細胞の小胞体にターゲッティングし、かつ該保持配列が、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、及び/又はシアリルトランスフェラーゼをゴルジ装置に保持する、請求項1〜7のいずれか一項記載の宿主細胞。
【請求項９】
前記CMP-NeuAcを生成させることができるCMP-Sia生合成経路タンパク質が、表11に掲載されているCMP-Sia生合成経路タンパク質、又はその任意の機能性ホモログ、アイソフォーム、もしくは変異体と少なくとも約70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一である、請求項4〜8のいずれか一項記載の宿主細胞。
【請求項１０】
前記N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼがGnT-Iである、請求項1〜9のいずれか一項記載の宿主細胞。
【請求項１１】
前記N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼがGnT-IIである、請求項1〜9のいずれか一項記載の宿主細胞。
【請求項１２】
前記N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼがGnT-I及びGnT-IIである、請求項1〜9のいずれか一項記載の宿主細胞。
【請求項１３】
前記ガラクトシルトランスフェラーゼがB4GALT1である、請求項1〜9のいずれか一項記載の宿主細胞。
【請求項１４】
前記N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼがGnT-I及びGnT-IIであり、前記ガラクトシルトランスフェラーゼがB4GALT1である、請求項1〜9のいずれか一項記載の宿主細胞。
【請求項１５】
前記シアリルトランスフェラーゼが2,6-SiaT又は2,3-SiaTである、請求項1〜9のいずれか一項記載の宿主細胞。
【請求項１６】
前記N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼがGnT-I及びGnT-IIであり、前記ガラクトシルトランスフェラーゼがB4GALT1であり、前記シアリルトランスフェラーゼが2,6-SiaT又は2,3-SiaTである、請求項1〜9のいずれか一項記載の宿主細胞。
【請求項１７】
前記N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼがGnT-I及びGnT-IIであり、前記ガラクトシルトランスフェラーゼがB4GALT1であり、前記シアリルトランスフェラーゼが2,6-SiaT又は2,3-SiaTであり、かつ該シアリルトランスフェラーゼがCMP-NeuAcを生成させることができる異種CMP-Sia生合成経路タンパク質をさらに含む、請求項1〜9のいずれか一項記載の宿主細胞。
【請求項１８】
前記保持配列が前記N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ及び/又はガラクトシルトランスフェラーゼを前記宿主細胞のシスゴルジ区画に保持する、請求項8記載の宿主細胞。
【請求項１９】
前記保持配列が前記N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ及び/又はガラクトシルトランスフェラーゼを前記宿主細胞の中間ゴルジ区画に保持する、請求項8記載の宿主細胞。
【請求項２０】
前記保持配列が前記ガラクトシルトランスフェラーゼを前記宿主細胞のトランスゴルジ区画に保持する、請求項8記載の宿主細胞。
【請求項２１】
前記保持配列が前記シアリルトランスフェラーゼを前記宿主細胞のトランスゴルジ区画に保持する、請求項8記載の宿主細胞。
【請求項２２】
前記保持配列が前記シアリルトランスフェラーゼ及びガラクトシルトランスフェラーゼを前記宿主細胞のトランスゴルジ区画に保持する、請求項8記載の宿主細胞。
【請求項２３】
前記シグナル配列及び/又は保持配列がリーシュマニア・タレントラエに由来するシグナル配列又は保持配列である、請求項8又は10〜22のいずれか一項記載の宿主細胞。
【請求項２４】
前記シグナル配列がプロセシングされ、除去される、請求項23記載の宿主細胞。
【請求項２５】
前記保持配列がリーシュマニア・タレントラエタンパク質に由来する細胞質-膜貫通-ステム(CTS)配列である、請求項8又は10〜23のいずれか一項記載の宿主細胞。
【請求項２６】
前記CTS配列が、リーシュマニア・タレントラエMAN1、NTPDアーゼ1、又はNTPDアーゼ2に由来する、請求項25記載の宿主細胞。
【請求項２７】
前記CTS配列が、配列番号24、配列番号25、もしくは配列番号26、又はこれらの機能的活性断片の配列を含む、請求項25記載の宿主細胞。
【請求項２８】
前記CTS配列が、配列番号24の配列と少なくとも約70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％同一である配列又はその機能的活性断片;配列番号25の配列と少なくとも約70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％同一である配列又はその機能的活性断片;或いは配列番号26の配列と少なくとも約70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％同一である配列又はその機能的活性断片を含む、請求項25記載の宿主細胞。
【請求項２９】
前記CTSがリーシュマニア・タレントラエMAN1に由来する、請求項25記載の宿主細胞。
【請求項３０】
前記CTS配列が配列番号24の配列又はその機能的活性断片を含む、請求項25記載の宿主細胞。
【請求項３１】
前記保持配列がリーシュマニアに由来するGRIP配列又はその機能的活性断片を含む、請求項20〜22のいずれか一項記載の宿主細胞。
【請求項３２】
前記GRIP配列が配列番号27の配列又はその機能的活性断片を含む、請求項31記載の宿主細胞。
【請求項３３】
前記GRIP配列が、配列番号27の配列と少なくとも約70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％同一である配列又はその機能的活性断片を含む、請求項31記載の宿主細胞。
【請求項３４】
前記保持配列が、リーシュマニアタンパク質に由来するCTS配列又はその機能的活性断片、及びリーシュマニアに由来するGRIP配列又はその機能的活性断片を含む、請求項20〜22のいずれか一項記載の宿主細胞。
【請求項３５】
前記CTS配列が、リーシュマニア・タレントラエMAN1、NTPDアーゼ1、又はNTPDアーゼ2に由来する、請求項34記載の宿主細胞。
【請求項３６】
前記CTS配列が、配列番号24、配列番号25、又は配列番号26の配列を含み、前記GRIP配列が、配列番号27の配列又はその機能的活性断片を含む、請求項34記載の宿主細胞。
【請求項３７】
前記CTS配列がリーシュマニア・タレントラエMAN1に由来する、請求項34記載の宿主細胞。
【請求項３８】
前記CTS配列が配列番号24の配列を含み、前記GRIP配列が配列番号27の配列又はその機能的活性断片を含む、請求項34記載の宿主細胞。
【請求項３９】
前記標的タンパク質が前記リーシュマニア宿主細胞にとって異種である、請求項1〜38のいずれか一項記載の宿主細胞。
【請求項４０】
前記標的タンパク質がリーシュマニア由来のシグナル配列を含むように改変されている、請求項39記載の宿主細胞。
【請求項４１】
前記リーシュマニア由来のシグナル配列がリーシュマニア・タレントラエ由来のシグナル配列である、請求項40記載の宿主細胞。
【請求項４２】
前記シグナル配列が、配列番号28もしくは配列番号29又はこれらの機能的活性断片の配列を含む、請求項39記載の宿主細胞。
【請求項４３】
前記シグナル配列が配列番号28の配列又はその機能的活性断片を含む、請求項39記載の宿主細胞。
【請求項４４】
前記シグナル配列が、配列番号28の配列と少なくとも約70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％同一である配列又はその機能的活性断片を含む、請求項39記載の宿主細胞。
【請求項４５】
前記シグナル配列がプロセシングされ、前記標的タンパク質から除去される、請求項41〜44のいずれか一項記載の宿主細胞。
【請求項４６】
前記標的タンパク質が、ヒトインターフェロン-α(INF-α)、インターフェロン-β(INF-β)、インターフェロン-γ(INF-γ)、インターロイキン-2(IL2)、キメラジフテリアトキシン-IL-2(デニロイキンディフチトクス)、インターロイキン-1(IL1)、IL1B、IL3、IL4、IL11、IL21、IL22、IL1受容体アンタゴニスト(アナキンラ)、腫瘍壊死因子アルファ(TNF-α)、インスリン、プラムリンタイド、成長ホルモン(GH)、インスリン様成長因子(IGF1)、ヒト副甲状腺ホルモン、カルシトニン、グルカゴン様ペプチド-1アゴニスト(GLP-1)、グルカゴン、成長ホルモン放出ホルモン(GHRH)、セクレチン、甲状腺刺激ホルモン(TSH)、ヒト骨形成タンパク質2(hBMP2)、ヒト骨形成タンパク質7(hBMP7)、ゴナドトロピン放出ホルモン(GnRH)、ケラチノサイト成長因子(KGF)、血小板由来成長因子(PDGF)、線維芽細胞成長因子7(FGF7)、線維芽細胞成長因子20(FGF20)、線維芽細胞成長因子21(FGF21)、上皮成長因子(EGF)、血管内皮成長因子(VEGF)、ニューロトロフィン-3、ヒト濾胞刺激ホルモン(FSH)、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(HCG)、ルトロピン-α、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、CTLA4の細胞外ドメイン(例えば、FC-融合体)、又はTNF受容体の細胞外ドメイン(例えば、FC-融合体)のアミノ酸配列を含む、請求項39〜45のいずれか一項記載の宿主細胞。
【請求項４７】
前記標的タンパク質が治療用タンパク質である、請求項39〜45のいずれか一項記載の宿主細胞。
【請求項４８】
前記標的タンパク質が抗体である、請求項39〜45のいずれか一項記載の宿主細胞。
【請求項４９】
前記抗体がヒトタンパク質に対する抗体である、請求項48記載の宿主細胞。
【請求項５０】
前記抗体が、アダリムマブ(Humira); Remicade(インフリキシマブ); ReoPro(アブシキシマブ); Rituxan(リツキシマブ); Simulect(バシリキシマブ); Synagis(パリビズマブ); Herceptin(トラスツズマブ); Mylotarg(ゲムツズマブオゾガマイシン); Campath(アレムツズマブ); Zevalin(イブリツモマブチウキセタン); Xolair(オマリズマブ); Bexxar(トシツモマブ-I-131); Erbitux(セツキシマブ); Avastin(ベバシズマブ); Tysabri(ナタリズマブ); Actemra(トシリズマブ); Vectibix(パニツムマブ); Lucentis(ラニビズマブ); Soliris(エクリズマブ); Cimzia(セルトリズマブペゴール); Simponi(ゴリムマブ); Ilaris(カナキヌマブ); Stelara(ウステキヌマブ); Arzerra(オファツムマブ); Prolia(デノスマブ); Numax(モタビズマブ); ABThrax(ラキシバクマブ); Benlysta(ベリムマブ); Yervoy(イピリムマブ); Adcetris(ブレンツキシマブベドチン); Perjeta(ペルツズマブ); Kadcyla(アド-トラスツズマブエムタンシン);又はGazyva(オビヌツズマブ)のアミノ酸配列を有する、請求項48又は49記載の宿主細胞。
【請求項５１】
前記抗体が、全長抗体、Fab、F(ab')2、Scfv、又はsdAbである、請求項48〜50のいずれか一項記載の宿主細胞。
【請求項５２】
前記標的タンパク質が酵素又はその阻害因子のアミノ酸配列を含む、請求項39〜45のいずれか一項記載の宿主細胞。
【請求項５３】
前記標的タンパク質が、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、第X因子、第XIII因子、第VIIa因子、アンチトロンビンIII(AT-III)、プロテインC、組織プラスミノゲン活性化因子(tPA)及びtPA変異体、ウロキナーゼ、ヒルジン、ストレプトキナーゼ、グルコセレブロシダーゼ、アルグルコシダーゼ-α、ラロニダーゼ(α-L-イズロニダーゼ)、イデュルスルファーゼ(イズロン酸-2-スルファターゼ)、ガルスルファーゼ、アガルシダーゼ-β(ヒトα-ガラクトシダーゼA)、ボツリヌストキシン、コラゲナーゼ、ヒトDNアーゼ-I、ヒアルロニダーゼ、パパイン、L-アスパラギナーゼ、ウリカーゼ(尿酸オキシダーゼ)、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼ(グルカルピダーゼ)、α1プロテアーゼ阻害因子(α1アンチトリプシン)、ラクターゼ、膵酵素(リパーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ)、及びアデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列を含む、請求項52記載の宿主細胞。
【請求項５４】
前記治療用タンパク質が、アバタセプト(例えば、Orencia)、アフリベルセプト(例えば、Eylea)、アガルシダーゼベータ(例えば、Fabrazyme)、アルビグルチド(例えば、Eperzan)、アルデスロイキン(例えば、Proleukin)、アレファセプト(例えば、Amevive)、アルグルセラーゼ(例えば、Ceredase)、アルグルコシダーゼアルファ(例えば、LUMIZYME)、アリスキレン(例えば、Tekturna)、アルファ-1-プロテイナーゼ阻害因子(例えば、Aralast)、アルテプラーゼ(例えば、Activase)、アナキンラ(例えば、Kineret)、アニストレプラーゼ(例えば、Eminase)、ヒト炭疽菌免疫グロブリン(例えば、ANTHRASIL)、抗血友病因子(例えば、Advate)、アンチインヒビター血液凝固複合体(例えば、Feiba Nf)、アンチトロンビンアルファ、ヒトアンチトロンビンIII、抗胸腺細胞グロブリン(例えば、抗胸腺細胞グロブリン)、抗胸腺細胞グロブリン(ウマ)(例えば、ATGAM)、抗胸腺細胞グロブリン(ウサギ)(例えば、ATG-Fresenius)、アプロチニン(例えば、Trasylol)、アスフォターゼアルファ、アスパラギナーゼ(例えば、Elspar)、エルウィニア・クリサンテミアスパラギナーゼ(例えば、Erwinaze)、ベカプレルミン(例えば、REGRANEX)、ベラタセプト(例えば、Nulojix)、ベラクタント、ビバリルジン(例えば、Angiomax)、A型ボツリヌストキシン(例えば、BOTOXE)、B型ボツリヌストキシン(例えば、Myobloc)、ブレンツキシマブベドチン(例えば、Adcetris)、ブセレリン(例えば、Suprecur)、C1エステラーゼ阻害因子(ヒト)、C1エステラーゼ阻害因子(組換え体)(例えば、Ruconest)、セルトリズマブペゴール(例えば、Cimzia)、コリオゴナドトロピンアルファ(例えば、コリオゴナドトロピンアルファ)、絨毛性ゴナドトロピン(ヒト)(例えば、Ovidrel)、絨毛性ゴナドトロピン(組換え体)(例えば、Ovitrelle)、凝固因子ix(例えば、Alprolix)、凝固因子VIIa(例えば、NovoSeven)、ヒト凝固因子X(例えば、Coagadex)、凝固因子XIIIA-サブユニット(組換え体)、コラゲナーゼ(例えば、Cordase)、コネスタットアルファ、コルチコトロピン(例えば、H.P.Acthar)、コシントロピン(例えば、Cortrosyn)、ダルベポエチンアルファ(例えば、Aranesp)、デフィブロチド(例えば、Noravid)、デニロイキンディフチトクス(例えば、Ontak)、デシルジン、ジゴキシン免疫Fab(ヒツジ)(例えば、DIGIBIND)、ドルナーゼアルファ(例えば、Pulmozyme)、ドロトレコギンアルファ(例えば、Xigris)、デュラグルチド、エフモロクトコグアルファ(例えば、ELOCTA)、エロスルファーゼアルファ、エンフュービルタイド(例えば、FUZEON)、エポエチンアルファ(例えば、Binocrit)、エポエチンゼータ(例えば、Retacrit)、エプチフィバチド(例えば、INTEGRILIN)、エタネルセプト(例えば、Enbrel)、エキセナチド(例えば、Byetta)、第IX因子複合体(ヒト)(例えば、AlphaNine)、フィブリノリジン、別名、プラスミン(例えば、Elase)、フィルグラスチム(例えば、N.A.)、フィルグラスチム-sndz、フォリトロピンアルファ(例えば、Gonal-F)、フォリトロピンベータ(例えば、Follistim AQ)、ガルスルファーゼ(例えば、Naglazyme)、胃内因子、ゲムツズマブオゾガマイシン(例えば、Mylotarg)、グラチラマー酢酸塩(例えば、Copaxone)、グルカゴン組換え体(例えば、GlucaGen)、グルカルピダーゼ(例えば、Voraxaze)、グラミシジンD(例えば、Neosporin)、B型肝炎免疫グロブリン、ヒトカルシトニン、ヒト破傷風菌トキソイド免疫グロブリン、ヒト狂犬病ウイルス免疫グロブリン(例えば、Hyperabヒト狂犬病免疫グロブリン)、ヒトRho(D)免疫グロブリン(例えば、Hyp Rho D Inj 16.5％)、ヒト血清アルブミン(例えば、Albuminar)、ヒト水痘・帯状疱疹免疫グロブリン(例えば、Varizig)、ヒアルロニダーゼ(例えば、HYLENEX)、ヒアルロニダーゼ(ヒト組換え体)、イブリツモマブチウキセタン(例えば、Zevalin)、イズルスルファーゼ(例えば、Elaprase)、イミグルセラーゼ(例えば、Cerezyme)、ヒト免疫グロブリン、インスリンアスパルト(例えば、NovoLog)、ウシインスリン、インスリンデグルデク(例えば、Tresiba)、インスリンデテミル(例えば、LEVEMIR)、インスリングラルギン(例えば、Lantus)、インスリングルリジン(例えば、APIDRA)、インスリンリスプロ(例えば、Humalog)、ブタインスリン(例えば、Iletin II)、レギュラーインスリン(例えば、Humulin R)、ブタインスリン(例えば、vetsulin)、イソフェンインスリン(例えば、Novolin N)、インターフェロンアルファ-2a、組換え体(例えば、Roferon A)、インターフェロンアルファ-2b(例えば、INTRON A)、インターフェロンアルファコン-1(例えば、INFERGEN)、インターフェロンアルファ-n1(例えば、Wellferon)、インターフェロンアルファ-n3(例えば、Alferon)、インターフェロンベータ-1a(例えば、Avonex)、インターフェロンベータ-1b(例えば、Betaseron)、インターフェロンガンマ-1b(例えば、Actimmune)、静注用免疫グロブリン(例えば、Civacir)、ラロニダーゼ(例えば、Aldurazyme)、レノグラスチム(例えば、Granocyte)、レピルジン(例えば、Refludan)、ロイプロリド(例えば、Eligard)、リラグルチド(例えば、Saxenda)、ルシナクタント(例えば、Surfaxin)、ルトロピンアルファ(例えば、Luveris)、メカセルミン(例えば、N.A.)、メノトロピン(例えば、Menopur)、メトキシポリエチレングリコール-エポエチンベータ(例えば、Mircera)、メトレレプチン(例えば、Myalept)、天然アルファインターフェロンもしくはマルチフェロン(例えば、Intron/Roferon-A)、ネシリチド(例えば、NATRECOR)、オクリプラスミン(例えば、Jetrea)、オプレルベキン(例えば、Neumega)、OspAリポタンパク質(例えば、Lymerix)、オキシトシン(例えば、Pitocin)、パリフェルミン(例えば、Kepivance)、パンクレリパーゼ(例えば、Pancrecarb)、ウシペガデマーゼ(例えば、Adagen)、ペグアスパラガーゼ(例えば、Oncaspar)、ペグフィルグラスチム(例えば、Neulasta)、ペグインターフェロンアルファ-2a(例えば、Pegasys)、ペグインターフェロンアルファ-2b(例えば、PEG-Intron)、ペグインターフェロンベータ-1a(例えば、Plegridy)、ペグロティカーゼ(例えば、(Krystexxa))、ペグビソマント(例えば、SOMAVERT)、ポラクタントアルファ(例えば、Curosurf)、プラムリンタイド(例えば、Symlin)、プレオタクト(例えば、Preotact E)、プロタミン硫酸塩(例えば、プロタミン硫酸塩注射液、USP)、ヒトプロテインS(例えば、ヒトプロテインS)、プロトロンビン(例えば、Feiba Nf)、プロトロンビン複合体(例えば、Cofact)、プロトロンビン複合体濃縮製剤(例えば、Kcentra)、Rasbウリカーゼ(例えば、Elitek)、レテプラーゼ(例えば、Retavase)、リロナセプト(例えば、Arcalyst)、ロミプロスチム(例えば、Nplate)、サクロシダーゼ(例えば、Sucraid)、サケカルシトニン(例えば、Calcimar)、サルグラモスチム(例えば、Leucomax)、サツモマブペンデチド(例えば、OncoScint)、セベリパーゼアルファ(例えば、Kanuma)、セクレチン(例えば、SecreFlo)、セルモレリン(例えば、酢酸セルモレリン)、血清アルブミン(例えば、Albunex)、ヨウ素標識血清アルブ���ン(例えば、Megatope)、シモクトコグアルファ(例えば、Nuwiq)、シプリューセル-T(例えば、Provenge)、ソマトトロピン組換え体(例えば、NutropinAQ)、ソマトロピン組換え体(例えば、BioTropin)、ストレプトキナーゼ(例えば、Streptase)、スソクトコグアルファ(例えば、Obizur)、タリグルセラーゼアルファ(例えば、Elelyso)、テデュグルチド(例えば、Gattex)、テネクテプラーゼ(例えば、TNKase)、テリパラチド(例えば、Forteo)、テサモレリン(例えば、Egrifta)、トロンボモデュリンアルファ(例えば、Recomodulin)、サイマルファシン(例えば、Zadaxin)、サイログロブリン、チロトロピンアルファ(例えば、Thyrogen)、ツベルクリン精製タンパク質誘導体(例えば、Aplisol)、ツロクトコグアルファ(例えば、Zonovate)、ウロフォリトロピン(例えば、BRAVELLE)、ウロキナーゼ(例えば、Kinlytic)、バソプレッシン(例えば、Pitressin)、ベラグルセラーゼアルファ(例えば、Vpriv)、アブシキシマブ(例えば、ReoPro)、アダリムマブ(例えば、Humira)、アレムツズマブ(例えば、CAMPATH)、アリロクマブ(例えば、Praluent)、アルシツモマブ(例えば、CEA-Scan)、アテゾリズマブ(例えば、Tecentriq)、バシリキシマブ(例えば、Simulect)、ベリムマブ(例えば、Benlysta)、ベバシズマブ(例えば、Avastin)、ブリナツモマブ(例えば、Blincyto)、ブロダルマブ(例えば、Siliq)、カナキヌマブ(例えば、ILARISE)、カナキヌマブ(例えば、Ilaris)、カプロマブ(例えば、ProstaScint)、セツキシマブ(例えば、Erbitux)、ダクリズマブ(例えば、Zenapax)、ダラツムマブ(例えば、DARZALEX)、デノスマブ(例えば、Xgeva)、ジヌツキシマブ(例えば、unituxin)、エクリズマブ(例えば、Soliris)、エファリズマブ(例えば、RAPTIVA)、エロツズマブ(例えば、EMPLICITI)、エボロクマブ(例えば、Repatha)、ゴリムマブ(例えば、Simponi注射液)、イブリツモマブ(例えば、Zevalin)、イダルシズマブ(例えば、Praxbind)、インフリキシマブ(例えば、REMICADE)、イピリムマブ(例えば、YERVOY)、イキセキズマブ(例えば、Taltz)、メポリズマブ(例えば、Nucala)、ムロモナブ(例えば、ORTHOCLONE OKT3)、ナタリズマブ(例えば、Tysabri)、ネシツムマブ(例えば、Portrazza)、ニボルマブ(例えば、Opdivo)、オビルトキサキシマブ(例えば、Anthim)、オビヌツズマブ(例えば、Gazyva)、オファツムマブ(例えば、Arzerra)、オマリズマブ(例えば、Xolair)、パリビズマブ(例えば、Synagis)、パニツムマブ(例えば、Vectibix)、ペンブロリズマブ(例えば、Keytruda)、ペルツズマブ(例えば、Perjeta)、ラムシルマブ(例えば、Cyramza)、ラニビズマブ(例えば、Lucentis)、ラキシバクマブ(例えば、ラキシバクマブ)、リツキシマブ(例えば、Rituxan)、セクキヌマブ(例えば、Cosentyx)、シルツキシマブ(例えば、Sylvant)、トシリズマブ(例えば、ACTEMRA)、トシツモマブ(例えば、Bexxar)、トラスツズマブ(例えば、Herceptin)、ウステキヌマブ(例えば、Stelara)、又はベドリズマブ(例えば、Entyvio)のアミノ酸配列を含む、請求項47記載の宿主細胞。
【請求項５５】
前記標的タンパク質がFc-融合タンパク質である、請求項39〜54のいずれか一項記載の宿主細胞。
【請求項５６】
前記宿主細胞が
a.Stt3オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)を含み、かつ
b.内在性のN-グリカン伸長を有さない、
請求項1〜55のいずれか一項記載の宿主細胞。
【請求項５７】
前記宿主細胞が表13に掲載されている任意の株である、請求項1〜56のいずれか一項記載の宿主細胞。
【請求項５８】
前記宿主細胞が図53に示されている原核生物又は真核生物酵素を有するCMP-Neu5Ac経路を含む、請求項1〜57のいずれか一項記載の宿主細胞。
【請求項５９】
グリコシル化標的タンパク質を作製する方法であって、請求項1〜47のいずれか一項記載の宿主細胞を培養すること、及び該標的タンパク質を培養物から精製することを含む、前記方法。
【請求項６０】
請求項59記載の方法から得られるグリコシル化標的タンパク質の組成物。
【請求項６１】
前記組成物中の前記標的タンパク質のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列の少なくとも約90％〜100％が、以下の構造:
【化１】
2020530273.tif 000084
(ここで、四角は、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつ
ここで、Asnは、該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を含むオリゴ糖を担持する、請求項60記載のグリコシル化標的タンパク質の組成物。
【請求項６２】
前記標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約20％〜30％、25％〜35％、30％〜40％、35％〜45％、40％〜50％、45％〜55％、50％〜60％、55％〜65％、60％〜70％、65％〜75％、70％〜80％、75％〜85％、80％〜90％、85％〜95％、又は90％〜100％が、以下の構造:
【化２】
2020530273.tif 000085
(ここで、四角は、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつ
ここで、Asnは、該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とするG0-Gnグリカンである、請求項60記載のグリコシル化標的タンパク質の組成物。
【請求項６３】
前記標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約20％〜30％、25％〜35％、30％〜40％、35％〜45％、40％〜50％、45％〜55％、50％〜60％、55％〜65％、60％〜70％、65％〜75％、70％〜80％、75％〜85％、80％〜90％、85％〜95％、又は90％〜100％が、以下の構造:
【化３】
2020530273.tif 000086
(ここで、四角は、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつ
ここで、Asnは、該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とするG0グリカンである、請求項60記載のグリコシル化標的タンパク質の組成物。
【請求項６４】
前記標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約20％〜30％、25％〜35％、30％〜40％、35％〜45％、40％〜50％、45％〜55％、50％〜60％、55％〜65％、60％〜70％、65％〜75％、70％〜80％、75％〜85％、80％〜90％、85％〜95％、又は90％〜100％が、以下の構造:
【化４】
2020530273.tif 000087
(ここで、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつ
ここで、Asnは、該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とするG1-Gnグリカンである、請求項60記載のグリコシル化標的タンパク質の組成物。
【請求項６５】
前記標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約20％〜30％、25％〜35％、30％〜40％、35％〜45％、40％〜50％、45％〜55％、50％〜60％、55％〜65％、60％〜70％、65％〜75％、70％〜80％、75％〜85％、80％〜90％、85％〜95％、又は90％〜100％が、以下の構造:
【化５】
2020530273.tif 000088
(ここで、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつ
ここで、Asnは、該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)のうちの1つ又は複数を特徴とするG2又はG1グリカンである、請求項60記載のグリコシル化標的タンパク質の組成物。
【請求項６６】
前記標的タンパク質上のグリコシル化が、対象に導入されたときに、該標的タンパク質の薬物動態特性を最適化するようにさらに修飾されている、65記載のグリコシル化標的タンパク質の組成物。
【請求項６７】
前記標的タンパク質上のグリコシル化がシアリル化されている、請求項66記載のグリコシル化標的タンパク質の組成物。
【請求項６８】
前記標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約20％〜30％、25％〜35％、30％〜40％、35％〜45％、40％〜50％、45％〜55％、50％〜60％、55％〜65％、60％〜70％、65％〜75％、70％〜80％、75％〜85％、80％〜90％、85％〜95％、又は90％〜100％が、以下の構造:
【化６】
2020530273.tif 000089
(ここで、菱形は、シアル酸残基を表し、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつ
ここで、Asnは、該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)のうちの1つ又は複数を特徴とする、請求項67記載のグリコシル化標的タンパク質の組成物。
【請求項６９】
前記標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約20％〜30％、25％〜35％、30％〜40％、35％〜45％、40％〜50％、45％〜55％、50％〜60％、55％〜65％、60％〜70％、65％〜75％、70％〜80％、75％〜85％、80％〜90％、85％〜95％、又は90％〜100％が、以下の構造:
【化７】
2020530273.tif 000090
(ここで、菱形は、シアル酸残基を表し、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつ
ここで、Asnは、該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)のうちの1つ又は複数を特徴とする、請求項67記載のグリコシル化標的タンパク質の組成物。
【請求項７０】
前記N-結合型グリコシル化コンセンサス配列がAsn-X-Ser/Thrであり;
ここで、Xがプロリン以外の任意のアミノ酸である、
請求項61〜65、68、又は69のいずれか一項記載の組成物。
【請求項７１】
前記グリコシル化標的タンパク質が培養培地中に分泌され、ここで、該グリコシル化標的タンパク質が請求項52〜61のいずれか一項記載の通りにグリコシル化されている、請求項59記載の方法。
【請求項７２】
前記グリコシル化標的タンパク質が前記培養培地から精製される、請求項71の方法。
【請求項７３】
前記グリコシル化標的タンパク質が親和性精製又はイオン交換クロマトグラフィーによって前記培養培地から精製される、請求項72の方法。
【請求項７４】
前記グリコシル化標的タンパク質がFCドメインを含有し、プロテイン-Aによって前記培養培地から親和性精製される、請求項73記載の方法。
【請求項７５】
前記グリコシル化標的タンパク質が親和性タグを含有し、親和性精製される、請求項73記載の方法。
【請求項７６】
請求項59又は71〜75のいずれか一項記載の方法によって産生されるグリコシル化標的タンパク質を含む組成物であって、グリコシル化標的タンパク質の集団が少なくとも約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％均一である、前記組成物。
【請求項７７】
請求項59又は71〜75のいずれか一項記載の方法によって産生されるグリコシル化標的タンパク質を含む組成物であって、該標的タンパク質上のN-糖部位の90％〜100％がグリコシル化によって占有されている、前記組成物。
【請求項７８】
a.リーシュマニア由来のものではないN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼの触媒ドメイン;並びに
b.リーシュマニアの小胞体又はゴルジ区画における局在及び保持に関与するアミノ酸配列
を含む、ハイブリッドN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ。
【請求項７９】
前記リーシュマニアがリーシュマニア・タレントラエである、請求項78記載のハイブリッドN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ。
【請求項８０】
前記N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼがシグナル配列及び少なくとも1つの保持配列を含むように改変されており、ここで、該シグナル配列が該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼを前記リーシュマニア・タレントラエ宿主細胞の小胞体にターゲッティングし、かつ該保持配列が該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼを該小胞体又はゴルジ装置に保持する、請求項78又は79記載のハイブリッドN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ。
【請求項８１】
前記保持配列が前記N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼをシスゴルジ装置に保持する、請求項78記載のハイブリッドN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ。
【請求項８２】
前記保持配列が前記N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼを中間ゴルジ装置に保持する、請求項78記載のハイブリッドN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ。
【請求項８３】
前記保持配列が細胞質-膜貫通-ステム(CTS)配列である、請求項78〜82のいずれか一項記載のハイブリッドN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ。
【請求項８４】
前記N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼアミノ酸配列が、表9に掲載されているN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、又はその機能性ホモログ、アイソフォーム、もしくは変異体に由来する、請求項78〜83のいずれか一項記載のN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ。
【請求項８５】
a.リーシュマニア由来のものではないガラクトシルトランスフェラーゼの触媒ドメイン;並びに
b.リーシュマニアの小胞体又はゴルジ区画における局在及び保持に関与するアミノ酸配列
を含む、ハイブリッドガラクトシルトランスフェラーゼ。
【請求項８６】
前記リーシュマニアがリーシュマニア・タレントラエである、請求項85記載のハイブリッドガラクトシルトランスフェラーゼ。
【請求項８７】
前記ガラクトシルトランスフェラーゼがシグナル配列を含むように改変されており、ここで、該シグナル配列が該ガラクトシルトランスフェラーゼを前記リーシュマニア・タレントラエ宿主細胞の小胞体にターゲッティングし、かつ前記保持配列が該ガラクトシルトランスフェラーゼを該小胞体又はゴルジ装置に保持する、請求項85又は86記載のハイブリッドガラクトシルトランスフェラーゼ。
【請求項８８】
前記保持配列が前記ガラクトシルトランスフェラーゼをシスゴルジ装置に保持する、請求項87記載のハイブリッドガラクトシルトランスフェラーゼ。
【請求項８９】
前記保持配列が前記ガラクトシルトランスフェラーゼを中間ゴルジ装置に保持する、請求項87記載のハイブリッドガラクトシルトランスフェラーゼ。
【請求項９０】
前記保持配列が前記ガラクトシルトランスフェラーゼをトランスゴルジ装置に保持する、請求項87記載のハイブリッドガラクトシルトランスフェラーゼ。
【請求項９１】
前記保持配列が細胞質-膜貫通-ステム(CTS)配列である、請求項87〜89のいずれか一項記載のハイブリッドガラクトシルトランスフェラーゼ。
【請求項９２】
前記保持配列がGRIP配列である、請求項87〜89のいずれか一項記載のハイブリッドシアリルトランスフェラーゼ。
【請求項９３】
前記保持配列がCTS配列及びGRIP配列である、請求項87〜89のいずれか一項記載のハイブリッドシアリルトランスフェラーゼ。
【請求項９４】
前記ガラクトシルトランスフェラーゼアミノ酸配列が、表9に掲載されているガラクトシルトランスフェラーゼ、又はその機能性ホモログ、アイソフォーム、もしくは変異体に由来する、請求項87〜93のいずれか一項記載のガラクトシルトランスフェラーゼ。
【請求項９５】
a.リーシュマニア由来のものではないシアリルトランスフェラーゼの触媒ドメイン;並びに
b.リーシュマニアの小胞体又はゴルジ区画における局在及び保持に関与するアミノ酸配列
を含む、ハイブリッドシアリルトランスフェラーゼ。
【請求項９６】
前記リーシュマニアがリーシュマニア・タレントラエである、請求項95記載のハイブリッドシアリルトランスフェラーゼ。
【請求項９７】
前記シアリルトランスフェラーゼがシグナル配列を含むように改変されており、ここで、該シグナル配列が該シアリルトランスフェラーゼを前記リーシュマニア・タレントラエ宿主細胞の小胞体にターゲッティングし、かつ前記保持配列が該シアリルトランスフェラーゼを該小胞体又はゴルジ装置に保持する、請求項95又は96記載のハイブリッドシアリルトランスフェラーゼ。
【請求項９８】
前記保持配列が前記シアリルトランスフェラーゼをトランスゴルジ装置に保持する、請求項97記載のハイブリッドシアリルトランスフェラーゼ。
【請求項９９】
前記保持配列がCTS配列である、請求項97又は98記載のハイブリッドシアリルトランスフェラーゼ。
【請求項１００】
前記保持配列がGRIP配列である、請求項97又は98記載のハイブリッドシアリルトランスフェラーゼ。
【請求項１０１】
前記保持配列がCTS配列及びGRIP配列である、請求項97又は98記載のハイブリッドシアリルトランスフェラーゼ。
【請求項１０２】
前記シアリルトランスフェラーゼアミノ酸配列が、表9に掲載されているシアリルトランスフェラーゼ、又はその機能性ホモログ、アイソフォーム、もしくは変異体に由来する、請求項89〜101のいずれか一項記載のハイブリッドシアリルトランスフェラーゼ。
【請求項１０３】
前記CTSシグナルが、MAN1、NTPDアーゼ1、又はNTPDアーゼ2 CTSのアミノ酸配列を含む、請求項83、91、93、99、又は101のいずれか一項記載のハイブリッド。
【請求項１０４】
前記CTSシグナルが、配列番号24、配列番号25、又は配列番号26のアミノ酸配列を含む、請求項83、91、93、98、又は101のいずれか一項記載のハイブリッド。
【請求項１０５】
前記CTSシグナルが、MAN1 CTSのアミノ酸配列を含む、請求項83、91、93、99、又は101のいずれか一項記載のハイブリッド。
【請求項１０６】
前記CTSシグナルが配列番号24のアミノ酸配列を含む、請求項83、91、93、99、又は101のいずれか一項記載のハイブリッド。
【請求項１０７】
前記GRIP配列が配列番号27のアミノ酸配列を含む、請求項92、93、100、又は101のいずれか一項記載のハイブリッド。
【請求項１０８】
請求項78〜84のいずれか一項記載のハイブリッドN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼをコードする核酸。
【請求項１０９】
請求項85〜94のいずれか一項記載のハイブリッドガラクトシルトランスフェラーゼをコードする核酸。
【請求項１１０】
請求項95〜102のいずれか一項記載のハイブリッドシアリルトランスフェラーゼをコードする核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
(1.関連出願の相互参照)
本出願は、その内容全体が引用により本明細書中に組み込まれる、2017年6月30日に出願された米国仮出願第62/527,466号の優先権の恩典を主張する。
【０００２】
(2.配列表)
本出願は、ASCII形式で提出され、かつ引用により完全に本明細書中に組み込まれる配列表を含有する。2018年6月28日に作成された該ASCIIコピーは、14197-005-228_ST25_FINAL.txtと命名され、サイズが1,065,529バイトである。
【０００３】
(3.序論)
本明細書に記載されるのは、グリコシル化タンパク質をインビトロ及びインビボで産生する組成物及び方法である。該方法は、宿主細胞を用いて、グリコシル化タンパク質を産生することを含む。また本明細書に記載されるのは、そのような方法を用いて産生されるグリコシル化タンパク質及びその使用である。
【背景技術】
【０００４】
(4.背景)
タンパク質グリコシル化は、生物の全てのドメインに見られるユビキタスな翻訳後修飾である。動物システムには顕著な複雑性が存在しており、グリカン構造は、タンパク質フォールディング及び品質管理における寄与から、これらの分子の認識、安定性、作用、及び代謝回転のような多数の生物学的事象への関与までの極めて重要な生物学的かつ生理学的役割を有する(Moremenらの文献、2012)。モノクローナル抗体、酵素、及びホルモンのような治療用糖タンパク質は、バイオテクノロジー産業の主要製品であり(Lagasse, H A Danielらの文献、2017; Dimitrovの文献、2012)、グリカン不均一性の影響は、「重要品質特性」としてますます認識されている。製品の品質を決定する多くの特性のうち、グリコシル化は、タンパク質の生物学的活性、血清半減期、及び免疫原性に影響を及ぼす:最も重要な特性のうちの1つとさえみなされる。グリカンは、血清循環時間の増加に関係しており、承認済又は開発中の生物製剤の多くは、治療濃度を長時間にわたって維持するために頻繁な適用を必要とする不十分な半減期に悩まされている。半減期延長戦略は、改善された薬物動態を有する長時間作用性治療薬の作製を可能にするための鍵である(Kontermannの文献、2016)。グリコシル化は、例えば、凝集傾向の低下を通じて、タンパク質の溶解度及び安定性を向上させるように思われ、タンパク質分解の防止による循環寿命の増大をもたらす。さらに、異なる末端単糖を有するN-グリカンは、その分解をもたらすレクチンによって認識されることができる(Blaskoらの文献、2013; Varkiの文献、2017)。結果として、グリコシル化のモニタリング及び制御は、バイオ医薬品の製造及び規制当局の要件において極めて重要である(Costaらの文献、2014; Eon-Duvalらの文献、2012; Reusch及びTejadaの文献、2015)。これらの理由から、発現プラットフォームの糖鎖改変は、バイオ医薬品を多くの点で改善するための重要な戦略として次第に認識されつつある(Dicker及びStrasserの文献、2015)。
【０００５】
大半のタンパク質薬は、治療用タンパク質の性質に影響を及ぼすグリカン構造の付加によってグリコシル化されている。一般に、グリカンの数及び組成は、タンパク質のフォールディング、溶解度、及び細胞内輸送に重要な役割を果たす。グリカンは、タンパク質骨格を遮蔽して、免疫原性反応を妨げることができ、異なる細胞認識事象は、特異的なグリカン構造の存在に依存する。したがって、グリコシル化は、糖タンパク質の生物学的活性に対して大きな影響を有しており、治療効力を獲得するために製造中に注意深く制御される必要がある。生産宿主の種、細胞型、及び生理学的状態によって、組換え糖タンパク質上のグリコシル化パターンは、顕著に異なる。タンパク質上のグリカンは、一般に、構造的に非常に多様であり、様々な結合によって構築される一連の単糖からなる。いずれか1つのグリコシル化部位における成熟グリカンは、単一の糖と同じぐらい単純であっても、リン酸、硫酸、酢酸、又はホスホリルコリンで潜在的に修飾される、200を上回る糖のポリマーと同じぐらい複雑であってもよい(Stanleyの文献、2011)。哺乳動物グリカンの十分な多様性を生み出すために、約700種のタンパク質が必要であると推定されており(7,000種以上の構造になると推定される)、これは、わずか10種の単糖:フコース(Fuc)、ガラクトース(Gal)、グルコース(Glc)、N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)、N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)、グルクロン酸(GlcA)、イゾロン酸(IdoA)、マンノース(Man)、シアル酸(Sia)、及びキシロース(Xyl)から構築される(Moremenらの文献、2012)。
【０００６】
(抗体治療薬)
抗体(又は免疫グロブリン、Ig)、特に、IgG抗体は、過去10年間で開発された最も成功した治療薬の一部である(例えば、ベバシズマブ、リツキシマブ、インフリキシマブ、アダリムマブ、トラスツズマブ、又はセツキシマブ、その他多数)。これらは、極めて特異的で、長い血清半減期を有し、かつこれらは、過去30年の間に開発され、改善されてきた哺乳動物培養で常法により発現させることができる。抗体分子の基本構造は、2つの同一の重ポリペプチド鎖と2つの同一の軽ポリペプチド鎖で構築される。これらの鎖は、「Y」型構造を形成するジスルフィド結合によって連結されている。ヒト免疫グロブリンは、その重鎖によって、IgG、IgA、IgD、IgE、及びIgMの5つのクラスに分類される。IgG及びIgA抗体は、それぞれ、4つのサブクラス(IgG1〜4)及び2つのサブクラス(IgA1〜2)として見出される。特異的抗原の認識は、軽鎖及び重鎖の可変領域及び1つの定常ドメインを含む抗原結合断片(Fab)によって媒介される。エフェクター機能(図1)は、重鎖の定常領域の他の2つのドメイン(CH2及びCH3)に対応する断片結晶化可能領域(Fc)とFc受容体(FcR)などのエフェクタータンパク質との結合によって開始される。したがって、Fab断片は、軽鎖及び重鎖の可変ドメイン及び定常ドメインから構成されるが、Fc断片は、重鎖の定常ドメインから完全に構成される。このFcドメインは、新生児Fc受容体(FcRn)とのpH依存的な結合によって、抗体の血清半減期も延長し、それにより、タンパク質がエンドソームで分解されることから救い出され、それが循環し、血中に戻る(Jefferisの文献、2009)。
【０００７】
例えば、リガンドもしくはFc受容体に対するその結合特性を変化させることによるか、又はその半減期をさらに延長させることにより、治療用抗体の臨床的成功をさらに前進させるために、抗体エンジニアリングの手法が使用されている。典型的な手法は、突然変異の導入又は抗体のグリコシル化の改変である。Fc鎖への突然変異の導入は、天然の配列ではもはや機能しないという特有の欠点を有する。治療用タンパク質のグリコシル化は、通常、循環半減期を延長させるために許容されるが、抗体については、循環からのIgの排出速度に対するグリコシル化の効果に関する研究は、過去に結論の一致を見なかった。しかし、より最近の理解では、Fc部分のグリカン構造の違いが実際にクリアランスに影響を及ぼすことが示唆されている(Millwardらの文献、2008; Liuの文献、2015、2017)。抗体鎖の翻訳後修飾の間、小胞体及びゴルジ装置内の酵素は、炭水化物鎖を抗体のポリペプチド骨格に付加することができる。全IgGサブクラスのFc部分の位置297のアスパラギンに、単一のN-結合型グリカンが存在する。IgG抗体の約20％は、該分子上の別の場所にグリカンを含有する。ほとんどの組換え抗体薬は、単一のFcグリコシル化部位のみを含有するように改変又は選択されている。
【０００８】
抗体鎖が正しくフォールディングされて会合しているとき、位置297のオリゴ糖は、CH2ドメインによって囲まれる内部空間内に隔離され、オリゴ糖と抗体のアミノ酸の広範な非共有結合的相互作用が存在し、結果として、立体構造に対する影響が生じる。保存されたAsn-297部位に見られるオリゴ糖は、通常、フコシル化された二分岐複合型のものである。しかしながら、抗体分子間では、分岐の変化、鎖の長さ、及び/又は炭水化物部分の数の変化が原因で、炭水化物構造(グライコフォーム)にかなりの不均一性が存在する。実際、付加されるN-結合型オリゴ糖の構造は、プロセシングの程度に応じてかなり異なり、高マンノース、並びにバイセクティングGlcNAc及びコアフコース残基を有する又は有さない複合二分岐オリゴ糖を含むことができる(Wright及びMorrisonの文献、1997)。通常、所与のグリコシル化部位で付加されたコアオリゴ糖構造の不均一なプロセシングが存在し、モノクローナル抗体でさえも複数のグライコフォームとして存在するという結果を生じる。重要なことに、抗体グリコシル化の主要な違いは、抗体産生細胞株間で生じ、違いは、異なる培養条件下で成長させた所与の細胞株についても見られる。実際、哺乳動物N-グリカン生合成における各々の工程は、＜100％の効率であり、いくつかの酵素は、基質をめぐって競合し、多くの異なるグライコフォームを生じる。治療用タンパク質の産生において問題を引き起こす不均一なグリコシル化が認められる。例えば、グリカンは、薬物動態及び生物学的活性に影響を及ぼすことができる(Ferraraらの文献、2011; Elliottらの文献、2003; Krappらの文献、2003)。N-グリカンは、タンパク質フォールディングに重要であることが多いので、N-グリコシル化部位を完全に除去するか、又は小胞体の前もしくは小胞体の中でグリコシル化を妨害することにより、これらの問題を簡単に克服することはできない。しかしながら、抗体は、適切なフォールディングのためにN-グリカンを必要としないが(Feigeらの文献、2010)、グライコフォームの問題は、異なる又は一貫しないエフェクター機能をもたらし、これにより、治療上又は規制要件から抗体を使用することが難しくなり得る。Fc部分をN-297で脱グリコシル化することにより、Fc含有分子のエフェクター機能の消失、又は安定性の低下が生じ得る。重要なことに、ヒトで合成されないグライコフォームは、アレルギー性、免疫原性であり、かつ治療的投与の反復によって生じ得る抗薬物抗体による結合抗体の血漿クリアランスを加速することができる。
【０００９】
Fcドメインの改変によって効力を改善し、治療的投薬量を低下させ、かつ抗体の全体的な臨床成績を向上させることが、改変抗体の開発における次の課題である。抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性(ADCC)、補体依存性細胞傷害(CDC)、抗体依存性細胞性食作用(ADCP)などのエフェクター機能、及び分子の全体的な半減期に対する影響は、抗体治療薬の特性を改善するための主な目的である(図1)(Jennewein及びAlterの文献、2017)。市場全体は、2016年から2026年の間に、約40％の健全な年間成長率で急激に成長すると予想されている。
【００１０】
それらが認識する抗体の種類に基づいて、Fc受容体(FcR)は、異なるタイプ: Fcガンマ受容体(FcγR; IgGに結合する)、Fcアルファ受容体(FcαR; IgAに結合する)、Fcイプシロン受容体(FcεR; IgEに結合する)、及び新生児Fc受容体(FcRn)に分類される。このうち、最も重要なのは、「Fcガンマ」受容体である。Fcガンマ受容体は、オプソニン化された微生物の食作用の活性化に関与する。Fcガンマ受容体は、多様な分子構造の結果として、抗体に対するその親和性に応じたクラスにさらに分類される。これらの一部には、FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、及びFcγRIII(CD16)が含まれる。FcγRIII(CD16)は、大部分のナチュラルキラー(NK)細胞、顆粒球、単球、マクロファージ上に、及びT細胞のサブセット上に存在する。この受容体をコードする遺伝子は、FcγRIIIa又はFcγRIIIbである。FcγRIIIaは、NK細胞媒介性ADCCに関与するFc受容体である。Fcアルファ受容体は、2つの細胞外Ig様ドメインからなり、FcαRI(CD89)というただ1つのサブグループを有する。これらは、多鎖免疫認識受容体(MIRR)とIgスーパーファミリーの両方の部分を形成する。Fcイプシロン受容体は、2つのタイプからなる。該受容体の1つは、低親和性受容体のC-タイプレクチンであるFcεRII(CD23)であり、もう1つは、高親和性受容体のIgスーパーファミリーの1種であるFcεRIである。新生児受容体(FcRn)は、抗体のリソソーム分解の防止において役割を果たし、治療用抗体の半減期を増大させることが知られている。酸性エンドソーム内のFcRnは、トランスサイトーシスによって内在化したIgGに結合する。IgGは、細胞表面にリサイクルされ、血液のpHで放出され、リソソーム分解を妨げられる。アグリコシル化は、エフェクター機能に多大な影響を及ぼすが、IgG-FcとFcRnとの相互作用は、Fcグリコシル化と無関係であると考えられる。
【００１１】
グリカンによって、蹄鉄形のFc-断片が「開くこと」が決まり、Fcグリカンの切断によって、「閉じた」立体構造が生じる。「開いた」IgG-Fc構造は、FcγRIIIとの相互作用に最も有利な立体構造であり、これは、完全にガラクトシル化されているが、フコシル化されているIgG-Fcで観察された(Krappらの文献、2003)。独特の炭水化物-炭水化物相互作用がFcγRIIIとコアフコースを欠く抗体との間の高親和性結合に必要とされる。しかしながら、「フコース衝突」が原因で、コアフコシル化は、高親和性FcγRIII結合を妨げる。オリゴ糖部分のフコース残基は、治療用抗体とFcγRIIIaとの結合(Fc受容体の活性化)を立体的に障害することが示されている(図2A)。脱フコシル化は、Fc受容体機能のADCCを増強するのに重要な役割を果たす。重要なことに、(Chungらの文献、2012)は、％フコシル化とADCCの間に直線的な関係が存在することを示している。これにより、コアフコース残基を有さない一様なグリカンの優れた特性の事例が作られる。アフコシル化抗体は、α1,6コアフコシルトランスフェラーゼを阻害し、フコシル化の低下をもたらす構造であるコアのβ-ManにバイセクティングGlcNAcを付加するGnT-IIIを過剰発現する細胞株で産生された。この低下は、約50％のアフコシル化構造を生じさせ、これは、グリコプロファイリング(Gazyvaro(登録商標))によっても確認された(図42)。
【００１２】
これまでのデータを明確にしておくと、(Liらの文献、2017; Chenらの文献、2017)による新しい研究は、化学酵素的手法を用いて、均一なN-グリカンを生じさせ、2,6伸長型の二分岐シアル酸の場合でもFcR親和性が高度に保持され、それがADCCのようなエフェクター機能の改善につながることを示した。α1,6結合コアフコースを有する又は有さない構造的に明確でかつ均一なグリカンに基づくこのデータは、FcR結合及び関連する下流効果に関する理解を著しく進展させた(Liらの文献、2017; Sondermannらの文献、2013)(図2B)。さらに、N-グリカンの二分岐末端のα2,3結合シアル酸は、FcγR親和性の増大をもたらさず、したがって、それは、活性化経路に対するFc受容体機能の欠如により、抑制性グリカンとして機能すると想定することができる。したがって、シアル酸が末端にあることにより、抗炎症と抗体の循環半減期の増大とに対するシアル酸関連効果が示唆される。より長い循環半減期及び(例えば、潜在的に免疫原性である治療用mAbに対する抗薬物抗体の回避のための)免疫寛容化などの改善された特性を有するが、不均一なグリコシル化、又は抗原結合の低下などの欠点がない抗体及びFc含有分子を得ることが好都合である。さらに、機能カスタマイズされたN-グリカンは、目標とされる下流エフェクター機能のために分子を発展させる。
【００１３】
真核細胞の小胞体(ER)及びゴルジ区画におけるグリコシル化プロセスは、組換え糖タンパク質上に見られる不均一なグリカン構造の大部分を生成させる。治療における重要性が認識されているため、グリカン不均一性を克服するために、並びに均一な治療用糖タンパク質の効率的な産生のためのインビボ及びインビトロの糖鎖改変技術を確立するために、近年、相当な努力が行われてきた。いくつかの発現宿主でグリコシル化経路を修飾して、ヒト化グリカンを生成させる進展があるにもかかわらず、それには、適合性、生産性の損失、又は生存性の損失さえも伴い得る。重要なことに、特定の均一なN-グリカンを生成させるインビボの系は、これまで記載されていない。
【００１４】
したがって、そのような均一でかつ機能カスタマイズもされた特定のグリコシル化を有するそのような組換え治療用タンパク質を産生する発現技術は、増強された生物学的活性及び改善された特性を有する新しいクラスの安全かつ革新的な次世代薬を表す。
【００１５】
(N-グリコシル化経路)
最も顕著でかつ最もよく特徴付けられている形態のタンパク質グリコシル化は、グリカンと新たに合成されたタンパク質のアスパラギンの側鎖のアミドとの結合(N-グリコシル化)である。タンパク質のN-グリコシル化は、脂質キャリア上に構築された保存されたオリゴ糖前駆体(Glc3Man9GlcNAc2)の新生ポリペプチド鎖上に露出したAsn-X-Ser/Thr(ここで、Xは、プロリン以外の任意のアミノ酸である)コンセンサス配列への転移により、小胞体(ER)の内腔で始まる。この最初のグリカン転移反応は、ヘテロマーのオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)複合体によって触媒され、ERでのタンパク質のフォールディングよりも先に起こることになっている(Aebiの文献、2013)。オリゴ糖転移後すぐに、2つの末端グルコース残基がグルコシダーゼI及びIIによって切り離され、結果として生じるモノグルコシル化グリカン構造(Glc1Man9GlcNAc2)を有するポリペプチドは、ER内在性の膜結合レクチンであるカルネキシン又はその可溶性ホモログのカルレティキュリンと相互作用することができる。これらのレクチンは、グリカン依存的なタンパク質品質管理サイクルにおけるタンパク質フォールディングを支援する。そのネイティブな立体構造を獲得した分泌性糖タンパク質は、カルネキシン/カルレティキュリンサイクルから放出され、ERから出てゴルジ装置に入る。ゴルジ体では、フォールディングが成熟した糖タンパク質上のER由来オリゴマンノース型N-グリカンがさらなるN-グリカン伸長を受け、これにより、高度に多様な複合型N-グリカンが生成する(Stanleyの文献、2011)。
【００１６】
昆虫、酵母、及び植物は、哺乳動物細胞によって産生されるものとは顕著に異なるN-グリカンを生成させる。小胞体における最初のGlc2Man9GlcNAc2オリゴ糖からMan8GlcNAc2へのプロセシングは、これらの酵母から哺乳動物までの種間で顕著な類似性を示すが、ゴルジ体で非常に異なるプロセシング事象が起こる。例えば、酵母は、50個又はさらに多くのMan残基をMan8-9GlcNAc2に付加することができるのに対し、昆虫細胞は、通常、ほとんどの又は全てのMan残基を除去して、ポーシマンノース型のMan3-1GlcNAc2 N-グリカンを生成させる。植物細胞もMan残基を除去して、Man4-5GlcNAc2を生じさせ、複雑なGlcNAc又はGal修飾を有することもあるが、多くの場合、潜在的に免疫原性であるβ1,2-結合キシロース(Xyl)、及び昆虫細胞と一緒に、コアα1,3-結合フコース(Fuc)残基を付加する。
【００１７】
動物糖タンパク質のN-グリカンは、通常、ガラクトース、フコース、及び末端シアル酸を含む。これらの糖は、酵母及び糸状菌で産生される糖タンパク質上には見られない。ヒト及び他の非ヒト真核細胞において、全ての種類の糖ヌクレオチド前駆体(例えば、UDP-N-アセチルグルコサミン、UDP-N-アセチルガラクトサミン、CMP-N-アセチルノイラミン酸、UDP-ガラクトース、GDP-フコースなど)は、細胞質ゾルで合成されて、ゴルジ体に輸送され、そこで、これらは、グリコシルトランスフェラーゼ(「Gnt」)によって、コアオリゴ糖に付加される。
【００１８】
(糖鎖改変の手法)
遺伝子工学及び代謝工学の努力が、昆虫、酵母、及び植物のN-グリカンプロセシング経路を修飾するために行われ、シアリル化された複合型N-グリカンが昆虫細胞、酵母及び植物で産出されており、これにより、細胞株を改変して、潜在的に治療価値のある哺乳動物様糖タンパク質を産生することができることが示された(Geislerらの文献、2015a; Strasser 2016; Hamiltonらの文献、2006; Jacobsらの文献、2009)。蘚類、水生植物、藻類、及びカイコのような他の異種宿主が有益なグリコシル化について試験されたが、これらの系は、最適には程遠い(Calowらの文献、2016; Coxらの文献、2006; Tadaらの文献、2015)。これまで、下等真核生物の特定の異種発現グリコシルトランスフェラーゼが十分に翻訳されるどうか、触媒活性があるかどうか、又は分泌経路内の適切なオルガネラに局在するかどうかを予測する信頼性のある方法はない。さらに、グリコシル化経路の変化は、細胞生存及び/又は糖タンパク質の部位占有のいずれかを変化させ、生産性又は生成物品質の低下をもたらし得る。
【００１９】
シアル酸(Sia)は、ヒトデからヒトまでの後口動物系統の動物で遍在するN-アセチルノイラミン酸(Neu5Ac)の一群のN-又はO-置換誘導体である。これらの化合物は、ある種の細菌、原生動物、及び真菌を含む、いくつかの他の生物でも確認されている。病原性細菌及び哺乳動物細胞におけるシアル酸生合成は、十分に理解されている。病原性生物の表面のシアル酸は、主に、宿主免疫系から逃れる手段であると考えられるが、これらの同じシアル酸分子は、タンパク質ターゲッティング、細胞-細胞相互作用、細胞-基質認識、及び接着を含む、高等生物における多くのプロセスにも関与している(Varkiの文献、2017; Vimrらの文献、2004; Schauerの文献、2000)。シアル酸の存在は、インビボでの糖タンパク質の半減期に影響を及ぼす。例えば、シアル酸の重要性は、ヒトエリスロポエチン(hEPO)の研究で証明されている。この糖タンパク質のN-結合型グリカン上の末端シアル酸残基は、血液からのhEPOの急速なクリアランスを防ぎ、インビボ活性を向上させる。ガラクトース残基で末端が終わるアシアリル化hEPO(アシアロ-hEPO)は、インビボでの劇的に減少した赤血球産生活性を有する。この減少は、肝臓のアシアロ糖タンパク質受容体によるアシアロ-hEPOのクリアランスの増加によって引き起こされる(Fukudaらの文献、1989)。同様に、多くの治療用糖タンパク質上の末端シアル酸の欠如は、インビボでの効力を低下させ、そのため、より高頻度の患者投与レジメンを必要とし得る。
【００２０】
一般に、哺乳動物N-グリカン及び完全ヒト化N-グリカンを生成させる能力は、バイオテクノロジー産業を転換すると期待されているが、それは、一連の新しい生物が現れて、ヒトの健康に役立つ治療薬を産生するからである。本発明は、キネトプラスト類(Kinetoplastid)の種のリーシュマニア・タレントラエ(Leishmania tarentolae)におけるネイティブかつ新規のN-グリコシル化経路の解析、保存された経路との重要な違いの発見、及び糖鎖改変に対するその利用を記載している。糖鎖改変の手法がいくつかの例で提示されている。
【００２１】
このキネトプラスト目(Kinetoplastida)の糖鎖改変発現プラットフォームは、明確でかつ完全にカスタマイズされたN-グリカンをもたらし、単純なヒトポーシマンノースの土台の上に改変グリカンが構築されるために極めて均一なヒト化グリコシル化を有する、より安価で、より安全で、かつより一貫した治療薬の産生は、糖鎖改変の分野を著しく進展させる。特異的でかつ驚くほど独特なN-グリカン生合成は、新規性があり、これまで一度も記載されたことがなく、これにより、ピキア(Pichia)又は他の真核生物のような任意の他の生物に対する糖鎖改変の手法が区別される。さらに、哺乳動物細胞と比較したより短い開発期限及びより速い組換え株の作製は、この単純であるが、完全に機能カスタマイズされた発現プラットフォームを、治療用タンパク質に対する幅広い用途のために著しく発展させる。
【発明の概要】
【００２２】
(5.概要)
本明細書に記載されるのは、N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、及びシアリルトランスフェラーゼを含む、異種グリコシルトランスフェラーゼを含む単細胞キネトプラスト目の真核宿主細胞である。本明細書に記載される宿主細胞は、均一でかつ完全に機能カスタマイズされたN-グリカンを高い部位占有率で含む哺乳動物(例えば、ヒト)の治療用糖タンパク質を産生することができる。本明細書に提供される宿主細胞を用いて、全長の治療用抗体(例えば、抗CD20(リツキシマブ))及び他の治療用タンパク質(例えば、エリスロポエチン)を発現させることができる。
【００２３】
また本明細書に提供されるのは、哺乳動物酵素活性(例えば、N-アセチルグルコサミン伸長、ガラクトシル化、及びシアリル化に関与するもの)をキネトプラスト類の真核宿主細胞の細胞内区画にうまくターゲッティングし、そこで発現させることができる核酸及びコンビナトリアルライブラリーである。このプロセスにより、改変された宿主細胞が提供され、これを用いて、グリコシル化に関与する任意の望ましい遺伝子を発現させ、ターゲッティングすることができる。シアリル化糖タンパク質の産生のためのCMP-シアル酸生合成経路の設計も提供されている。
【００２４】
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)標的タンパク質をコードする組換え核酸;及び(b)異種グリコシルトランスフェラーゼをコードする組換え核酸を含むリーシュマニア宿主細胞である。
【００２５】
ある実施態様において、該異種グリコシルトランスフェラーゼは、N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ;及び/又は異種ガラクトシルトランスフェラーゼ;及び/又は異種シアリルトランスフェラーゼである。いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、2以上のN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼを含む宿主細胞である。他の実施態様において、該異種シアリルトランスフェラーゼを含む宿主細胞は、CMP-NeuAcを生成させることができる異種CMP-Sia生合成経路タンパク質をさらに含む。
【００２６】
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、N-グリカン生合成経路由来の1以上の内在性酵素が欠失させられ、突然変異させられ、及び/又は機能的に不活化されている宿主細胞である。
【００２７】
さらなる実施態様において、N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、及び/又はシアリルトランスフェラーゼのアミノ酸配列は、表9に掲載されているN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、もしくはシアリルトランスフェラーゼ、又はこれらの任意の機能性ホモログ、アイソフォーム、もしくは変異体に由来する。
【００２８】
さらなる実施態様において、CMP-NeuAcを生成させることができるCMP-Sia生合成経路タンパク質は、表11に掲載されているCMP-Sia生合成経路タンパク質、又はこれらの任意の機能性ホモログ、アイソフォーム、もしくは変異体と少なくとも約70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一である。
【００２９】
別の実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、GnT-Iである。別の実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、GnT-IIである。別の実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、GnT-I及びGnT-IIである。別の実施態様において、該ガラクトシルトランスフェラーゼは、B4GALT1である。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼがGnT-I及びGnT-IIであり、該ガラクトシルトランスフェラーゼがB4GALT1である宿主細胞である。別の実施態様において、該シアリルトランスフェラーゼは、2,6-SiaT又は2,3-SiaTである。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼがGnT-I及びGnT-IIであり、該ガラクトシルトランスフェラーゼがB4GALT1であり、該シアリルトランスフェラーゼが2,6-SiaT又は2,3-SiaTである宿主細胞である。具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼがGnT-I及びGnT-IIであり、該ガラクトシルトランスフェラーゼがB4GALT1であり、該シアリルトランスフェラーゼが2,6-SiaT又は2,3-SiaTであり、かつ該シアリルトランスフェラーゼがCMP-NeuAcを生成させることができる異種CMP-Sia生合成経路タンパク質をさらに含む、宿主細胞である。
【００３０】
ある実施態様において、該宿主細胞は、リーシュマニア・タレントラエ細胞である。他の実施態様において、該宿主細胞は、表13に掲載されている任意の株である。
【００３１】
ある実施態様において、該宿主細胞は、図53に示されている原核生物又は真核生物酵素を有するCMP-Neu5Ac経路を含む。
【００３２】
他の実施態様において、リーシュマニアシグナル及び/又は保持配列は、N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、及び/又はシアリルトランスフェラーゼに付加され、ここで、該シグナル配列は、N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、及び/又はシアリルトランスフェラーゼをリーシュマニア宿主細胞の小胞体にターゲッティングし、かつ該保持配列は、N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、及び/又はシアリルトランスフェラーゼを小胞体又はゴルジ装置に保持する。別の実施態様において、該保持配列は、N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ及び/又はガラクトシルトランスフェラーゼを宿主細胞の小胞体に保持する。別の実施態様において、該保持配列は、N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ及び/又はガラクトシルトランスフェラーゼを宿主細胞のシスゴルジ区画に保持する。別の実施態様において、該保持配列は、N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ及び/又はガラクトシルトランスフェラーゼを宿主細胞の中間ゴルジ区画に保持する。別の実施態様において、該保持配列は、ガラクトシルトランスフェラーゼを宿主細胞のトランスゴルジ区画に保持する。別の実施態様において、該保持配列は、シアリルトランスフェラーゼを宿主細胞のトランスゴルジ区画に保持する。別の実施態様において、該保持配列は、シアリルトランスフェラーゼ及びガラクトシルトランスフェラーゼを宿主細胞のトランスゴルジ区画に保持する。
【００３３】
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、N-グリカン生合成経路由来の1以上の内在性酵素が欠失させられ、突然変異させられ、及び/又は機能的に不活化されている宿主細胞である。
【００３４】
別の実施態様において、該シグナル配列及び/又は保持配列は、任意のリーシュマニア種に由来するシグナル配列又は保持配列である。さらなる実施態様において、該シグナル配列及び/又は保持配列は、リーシュマニア・タレントラエに由来するシグナル配列又は保持配列である。
【００３５】
別の実施態様において、該シグナル配列は、プロセシングされ、除去される。
【００３６】
さらなる実施態様において、該保持配列は、リーシュマニア・タレントラエタンパク質に由来する細胞質-膜貫通-ステム(CTS)配列である。別の実施態様において、該CTS配列は、リーシュマニア・タレントラエMAN1、NTPDアーゼ1、又はNTPDアーゼ2に由来する。別の実施態様において、該CTS配列は、配列番号24、配列番号25、もしくは配列番号26の配列、又はこれらの機能的活性断片を含む。さらに別の実施態様において、該CTS配列は、配列番号24の配列と少なくとも約70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％同一である配列又はその機能的活性断片;配列番号25の配列と少なくとも約70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％同一である配列又はその機能的活性断片;或いは配列番号26の配列と少なくとも約70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％同一である配列又はその機能的活性断片を含む。
【００３７】
別の実施態様において、該CTSは、リーシュマニア・タレントラエMAN1に由来する。別の実施態様において、該CTS配列は、配列番号24の配列又はその機能的活性断片を含む。さらなる実施態様において、該保持配列は、リーシュマニアに由来するGRIP配列又はその機能的活性断片を含む。別の実施態様において、該GRIP配列は、配列番号27の配列又はその機能的活性断片を含む。さらに別の実施態様において、該GRIP配列は、配列番号27の配列と少なくとも約70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％同一である配列又はその機能的活性断片を含む。さらなる実施態様において、該保持配列は、リーシュマニアタンパク質に由来するCTS配列又はその機能的活性断片、及びリーシュマニアに由来するGRIP配列又はその機能的活性断片を含む。
【００３８】
他の実施態様において、該標的タンパク質は、リーシュマニア宿主細胞にとって異種である。
【００３９】
別の実施態様において、該標的タンパク質は、リーシュマニア由来のシグナル配列を含むように改変されている。他の実施態様において、該シグナル配列は、リーシュマニア・タレントラエ由来のシグナル配列である。いくつかの実施態様において、該シグナル配列は、配列番号28もしくは配列番号29の配列又はこれらの機能的活性断片を含む。具体的な実施態様において、該シグナル配列は、配列番号28の配列又はその機能的活性断片を含む。さらに別の実施態様において、該シグナル配列は、配列番号28の配列少なくとも約70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％である配列又はその機能的活性断片を含む。他の実施態様において、該シグナル配列は、プロセシングされ、該標的タンパク質から除去される。
【００４０】
他の実施態様において、該標的タンパク質は、ヒトインターフェロン-α(INF-α)、インターフェロン-β(INF-β)、インターフェロン-γ(INF-γ)、インターロイキン-2(IL2)、キメラジフテリアトキシン-IL-2(デニロイキンディフチトクス)、インターロイキン-1(IL1)、IL1B、IL3、IL4、IL11、IL21、IL22、IL1受容体アンタゴニスト(アナキンラ)、腫瘍壊死因子アルファ(TNF-α)、インスリン、プラムリンタイド、成長ホルモン(GH)、インスリン様成長因子(IGF1)、ヒト副甲状腺ホルモン、カルシトニン、グルカゴン様ペプチド-1アゴニスト(GLP-1)、グルカゴン、成長ホルモン放出ホルモン(GHRH)、セクレチン、甲状腺刺激ホルモン(TSH)、ヒト骨形成タンパク質2(hBMP2)、ヒト骨形成タンパク質7(hBMP7)、ゴナドトロピン放出ホルモン(GnRH)、ケラチノサイト成長因子(KGF)、血小板由来成長因子(PDGF)、線維芽細胞成長因子7(FGF7)、線維芽細胞成長因子20(FGF20)、線維芽細胞成長因子21(FGF21)、上皮成長因子(EGF)、血管内皮成長因子(VEGF)、ニューロトロフィン-3、ヒト濾胞刺激ホルモン(FSH)、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(HCG)、ルトロピン-α、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、CTLA4の細胞外ドメイン(例えば、FC-融合体)、又はTNF受容体の細胞外ドメイン(例えば、FC-融合体)のアミノ酸配列を含む。
【００４１】
他の実施態様において、該標的タンパク質は、治療用タンパク質である。他の実施態様において、該標的タンパク質は、Fc-融合タンパク質である。他の実施態様において、該標的タンパク質は、抗体である。
【００４２】
別の実施態様において、該標的タンパク質は、ヒトタンパク質に対する抗体である。さらなる実施態様において、該抗体は、アダリムマブ(Humira); Remicade(インフリキシマブ); ReoPro(アブシキシマブ); Rituxan(リツキシマブ); Simulect(バシリキシマブ); Synagis(パリビズマブ); Herceptin(トラスツズマブ); Mylotarg(ゲムツズマブオゾガマイシン); Campath(アレムツズマブ); Zevalin(イブリツモマブチウキセタン); Xolair(オマリズマブ); Bexxar(トシツモマブ-I-131); Erbitux(セツキシマブ); Avastin(ベバシズマブ); Tysabri(ナタリズマブ); Actemra(トシリズマブ); Vectibix(パニツムマブ); Lucentis(ラニビズマブ); Soliris(エクリズマブ); Cimzia(セルトリズマブペゴール); Simponi(ゴリムマブ); Ilaris(カナキヌマブ); Stelara(ウステキヌマブ); Arzerra(オファツムマブ); Prolia(デノスマブ); Numax(モタビズマブ); ABThrax(ラキシバクマブ); Benlysta(ベリムマブ); Yervoy(イピリムマブ); Adcetris(ブレンツキシマブベドチン); Perjeta(ペルツズマブ); Kadcyla(アド-トラスツズマブエムタンシン);又はGazyva(オビヌツズマブ)のアミノ酸配列を有する。
【００４３】
他の実施態様において、該抗体は、全長抗体、Fab、F(ab')2、Scfv、又はsdAbである。他の実施態様において、該標的タンパク質は、酵素又はその阻害因子のアミノ酸配列を含む。別の実施態様において、該標的タンパク質は、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、第X因子、第XIII因子、第VIIa因子、アンチトロンビンIII(AT-III)、プロテインC、組織プラスミノゲン活性化因子(tPA)及びtPA変異体、ウロキナーゼ、ヒルジン、ストレプトキナーゼ、グルコセレブロシダーゼ、アルグルコシダーゼ-α、ラロニダーゼ(α-L-イズロニダーゼ)、イデュルスルファーゼ(イズロン酸-2-スルファターゼ)、ガルスルファーゼ、アガルシダーゼ-β(ヒトα-ガラクトシダーゼA)、ボツリヌストキシン、コラゲナーゼ、ヒトDNアーゼ-I、ヒアルロニダーゼ、パパイン、L-アスパラギナーゼ、ウリカーゼ(尿酸オキシダーゼ)、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼ(グルカルピダーゼ)、α1プロテアーゼ阻害因子(α1アンチトリプシン)、ラクターゼ、膵酵素(リパーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ)、及びアデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列を含む。
【００４４】
別の実施態様において、該治療用タンパク質は、アバタセプト(例えば、Orencia)、アフリベルセプト(例えば、Eylea)、アガルシダーゼベータ(例えば、Fabrazyme)、アルビグルチド(例えば、Eperzan)、アルデスロイキン(例えば、Proleukin)、アレファセプト(例えば、Amevive)、アルグルセラーゼ(例えば、Ceredase)、アルグルコシダーゼアルファ(例えば、LUMIZYME)、アリスキレン(例えば、Tekturna)、アルファ-1-プロテイナーゼ阻害因子(例えば、Aralast)、アルテプラーゼ(例えば、Activase)、アナキンラ(例えば、Kineret)、アニストレプラーゼ(例えば、Eminase)、ヒト炭疽菌免疫グロブリン(例えば、ANTHRASIL)、抗血友病因子(例えば、Advate)、アンチインヒビター血液凝固複合体(例えば、Feiba Nf)、アンチトロンビンアルファ、ヒトアンチトロンビンIII、抗胸腺細胞グロブリン(例えば、抗胸腺細胞グロブリン)、抗胸腺細胞グロブリン(ウマ)(例えば、ATGAM)、抗胸腺細胞グロブリン(ウサギ)(例えば、ATG-Fresenius)、アプロチニン(例えば、Trasylol)、アスフォターゼアルファ、アスパラギナーゼ(例えば、Elspar)、エルウィニア・クリサンテミ(erwinia chrysanthemi)のアスパラギナーゼ(例えば、Erwinaze)、ベカプレルミン(例えば、REGRANEX)、ベラタセプト(例えば、Nulojix)、ベラクタント、ビバリルジン(例えば、Angiomax)、A型ボツリヌストキシン(例えば、BOTOXE)、B型ボツリヌストキシン(例えば、Myobloc)、ブレンツキシマブベドチン(例えば、Adcetris)、ブセレリン(例えば、Suprecur)、C1エステラーゼ阻害因子(ヒト)、C1エステラーゼ阻害因子(組換え体)(例えば、Ruconest)、セルトリズマブペゴール(例えば、Cimzia)、コリオゴナドトロピンアルファ(例えば、コリオゴナドトロピンアルファ)、絨毛性ゴナドトロピン(ヒト)(例えば、Ovidrel)、絨毛性ゴナドトロピン(組換え体)(例えば、Ovitrelle)、凝固因子ix(例えば、Alprolix)、凝固因子VIIa(例えば、NovoSeven)、ヒト凝固因子X(例えば、Coagadex)、凝固因子XIIIA-サブユニット(組換え体)、コラゲナーゼ(例えば、Cordase)、コネスタットアルファ、コルチコトロピン(例えば、H.P.Acthar)、コシントロピン(例えば、Cortrosyn)、ダルベポエチンアルファ(例えば、Aranesp)、デフィブロチド(例えば、Noravid)、デニロイキンディフチトクス(例えば、Ontak)、デシルジン、ジゴキシン免疫Fab(ヒツジ)(例えば、DIGIBIND)、ドルナーゼアルファ(例えば、Pulmozyme)、ドロトレコギンアルファ(例えば、Xigris)、デュラグルチド、エフモロクトコグアルファ(例えば、ELOCTA)、エロスルファーゼアルファ、エンフュービルタイド(例えば、FUZEON)、エポエチンアルファ(例えば、Binocrit)、エポエチンゼータ(例えば、Retacrit)、エプチフィバチド(例えば、INTEGRILIN)、エタネルセプト(例えば、Enbrel)、エキセナチド(例えば、Byetta)、第IX因子複合体(ヒト)(例えば、AlphaNine)、フィブリノリジン、別名、プラスミン(例えば、Elase)、フィルグラスチム(例えば、N.A.)、フィルグラスチム-sndz、フォリトロピンアルファ(例えば、Gonal-F)、フォリトロピンベータ(例えば、Follistim AQ)、ガルスルファーゼ(例えば、Naglazyme)、胃内因子、ゲムツズマブオゾガマイシン(例えば、Mylotarg)、グラチラマー酢酸塩(例えば、Copaxone)、グルカゴン組換え体(例えば、GlucaGen)、グルカルピダーゼ(例えば、Voraxaze)、グラミシジンD(例えば、Neosporin)、B型肝炎免疫グロブリン、ヒトカルシトニン、ヒト破傷風菌(clostridium tetani)トキソイド免疫グロブリン、ヒト狂犬病ウ��ルス免疫グロブリン(例えば、Hyperabヒト狂犬病免疫グロブリン)、ヒトRho(D)免疫グロブリン(例えば、Hyp Rho D Inj 16.5％)、ヒト血清アルブミン(例えば、Albuminar)、ヒト水痘・帯状疱疹免疫グロブリン(例えば、Varizig)、ヒアルロニダーゼ(例えば、HYLENEX)、ヒアルロニダーゼ(ヒト組換え体)、イブリツモマブチウキセタン(例えば、Zevalin)、イズルスルファーゼ(例えば、Elaprase)、イミグルセラーゼ(例えば、Cerezyme)、ヒト免疫グロブリン、インスリンアスパルト(例えば、NovoLog)、ウシインスリン、インスリンデグルデク(例えば、Tresiba)、インスリンデテミル(例えば、LEVEMIR)、インスリングラルギン(例えば、Lantus)、インスリングルリジン(例えば、APIDRA)、インスリンリスプロ(例えば、Humalog)、ブタインスリン(例えば、Iletin II)、レギュラーインスリン(例えば、Humulin R)、ブタインスリン(例えば、vetsulin)、イソフェンインスリン(例えば、Novolin N)、インターフェロンアルファ-2a、組換え体(例えば、Roferon A)、インターフェロンアルファ-2b(例えば、INTRON A)、インターフェロンアルファコン-1(例えば、INFERGEN)、インターフェロンアルファ-n1(例えば、Wellferon)、インターフェロンアルファ-n3(例えば、Alferon)、インターフェロンベータ-1a(例えば、Avonex)、インターフェロンベータ-1b(例えば、Betaseron)、インターフェロンガンマ-1b(例えば、Actimmune)、静注用免疫グロブリン(例えば、Civacir)、ラロニダーゼ(例えば、Aldurazyme)、レノグラスチム(例えば、Granocyte)、レピルジン(例えば、Refludan)、ロイプロリド(例えば、Eligard)、リラグルチド(例えば、Saxenda)、ルシナクタント(例えば、Surfaxin)、ルトロピンアルファ(例えば、Luveris)、メカセルミン(例えば、N.A.)、メノトロピン(例えば、Menopur)、メトキシポリエチレングリコール-エポエチンベータ(例えば、Mircera)、メトレレプチン(例えば、Myalept)、天然αインターフェロンもしくはマルチフェロン(例えば、Intron/Roferon-A)、ネシリチド(例えば、NATRECOR)、オクリプラスミン(例えば、Jetrea)、オプレルベキン(例えば、Neumega)、OspAリポタンパク質(例えば、Lymerix)、オキシトシン(例えば、Pitocin)、パリフェルミン(例えば、Kepivance)、パンクレリパーゼ(例えば、Pancrecarb)、ウシペガデマーゼ(例えば、Adagen)、ペグアスパラガーゼ(例えば、Oncaspar)、ペグフィルグラスチム(例えば、Neulasta)、ペグインターフェロンアルファ-2a(例えば、Pegasys)、ペグインターフェロンアルファ-2b(例えば、PEG-Intron)、ペグインターフェロンベータ-1a(例えば、Plegridy)、ペグロティカーゼ(例えば、(Krystexxa))、ペグビソマント(例えば、SOMAVERT)、ポラクタントアルファ(例えば、Curosurf)、プラムリンタイド(例えば、Symlin)、プレオタクト(例えば、Preotact E)、プロタミン硫酸塩(例えば、プロタミン硫酸塩注射液、USP)、ヒトプロテインS(例えば、ヒトプロテインS)、プロトロンビン(例えば、Feiba Nf)、プロトロンビン複合体(例えば、Cofact)、プロトロンビン複合体濃縮製剤(例えば、Kcentra)、Rasbウリカーゼ(例えば、Elitek)、レテプラーゼ(例えば、Retavase)、リロナセプト(例えば、Arcalyst)、ロミプロスチム(例えば、Nplate)、サクロシダーゼ(例えば、Sucraid)、サケカルシトニン(例えば、Calcimar)、サルグラモスチム(例えば、Leucomax)、サツモマブペンデチド(例えば、OncoScint)、セベリパーゼアルファ(例えば、Kanuma)、セクレチン(例えば、SecreFlo)、セルモレリン(例えば、酢酸セルモレリン)、血清ア��ブミン(例えば、Albunex)、ヨウ素標識血清アルブミン(例えば、Megatope)、シモクトコグアルファ(例えば、Nuwiq)、シプリューセル-T(例えば、Provenge)、ソマトトロピン組換え体(例えば、NutropinAQ)、ソマトロピン組換え体(例えば、BioTropin)、ストレプトキナーゼ(例えば、Streptase)、スソクトコグアルファ(例えば、Obizur)、タリグルセラーゼアルファ(例えば、Elelyso)、テデュグルチド(例えば、Gattex)、テネクテプラーゼ(例えば、TNKase)、テリパラチド(例えば、Forteo)、テサモレリン(例えば、Egrifta)、トロンボモデュリンアルファ(例えば、Recomodulin)、サイマルファシン(例えば、Zadaxin)、サイログロブリン、チロトロピンアルファ(例えば、Thyrogen)、ツベルクリン精製タンパク質誘導体(例えば、Aplisol)、ツロクトコグアルファ(例えば、Zonovate)、ウロフォリトロピン(例えば、BRAVELLE)、ウロキナーゼ(例えば、Kinlytic)、バソプレッシン(例えば、Pitressin)、ベラグルセラーゼアルファ(例えば、Vpriv)、アブシキシマブ(例えば、ReoPro)、アダリムマブ(例えば、Humira)、アレムツズマブ(例えば、CAMPATH)、アリロクマブ(例えば、Praluent)、アルシツモマブ(例えば、CEA-Scan)、アテゾリズマブ(例えば、Tecentriq)、バシリキシマブ(例えば、Simulect)、ベリムマブ(例えば、Benlysta)、ベバシズマブ(例えば、Avastin)、ブリナツモマブ(例えば、Blincyto)、ブロダルマブ(例えば、Siliq)、カナキヌマブ(例えば、ILARISE)、カナキヌマブ(例えば、Ilaris)、カプロマブ(例えば、ProstaScint)、セツキシマブ(例えば、Erbitux)、ダクリズマブ(例えば、Zenapax)、ダラツムマブ(例えば、DARZALEX)、デノスマブ(例えば、Xgeva)、ジヌツキシマブ(例えば、unituxin)、エクリズマブ(例えば、Soliris)、エファリズマブ(例えば、RAPTIVA)、エロツズマブ(例えば、EMPLICITI)、エボロクマブ(例えば、Repatha)、ゴリムマブ(例えば、Simponi注射液)、イブリツモマブ(例えば、Zevalin)、イダルシズマブ(例えば、Praxbind)、インフリキシマブ(例えば、REMICADE)、イピリムマブ(例えば、YERVOY)、イキセキズマブ(例えば、Taltz)、メポリズマブ(例えば、Nucala)、ムロモナブ(例えば、ORTHOCLONE OKT3)、ナタリズマブ(例えば、Tysabri)、ネシツムマブ(例えば、Portrazza)、ニボルマブ(例えば、Opdivo)、オビルトキサキシマブ(例えば、Anthim)、オビヌツズマブ(例えば、Gazyva)、オファツムマブ(例えば、Arzerra)、オマリズマブ(例えば、Xolair)、パリビズマブ(例えば、Synagis)、パニツムマブ(例えば、Vectibix)、ペンブロリズマブ(例えば、Keytruda)、ペルツズマブ(例えば、Perjeta)、ラムシルマブ(例えば、Cyramza)、ラニビズマブ(例えば、Lucentis)、ラキシバクマブ(例えば、ラキシバクマブ)、リツキシマブ(例えば、Rituxan)、セクキヌマブ(例えば、Cosentyx)、シルツキシマブ(例えば、Sylvant)、トシリズマブ(例えば、ACTEMRA)、トシツモマブ(例えば、Bexxar)、トラスツズマブ(例えば、Herceptin)、ウステキヌマブ(例えば、Stelara)、又はベドリズマブ(例えば、Entyvio)のアミノ酸配列を含む。
【００４５】
さらなる実施態様において、該宿主細胞は、(a)Stt3オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)を含み、かつ(b)内在性のN-グリカン伸長を有さない。
【００４６】
別の実施態様は、グリコシル化標的タンパク質を作製する方法であって、宿主細胞を培養すること、及び該標的タンパク質を培養物から精製することを含む、方法を含む。
【００４７】
別の実施態様は、グリコシル化標的タンパク質の組成物を含む。
【００４８】
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
【化１】
2020530273.tif 000002
(ここで、四角は、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を含むオリゴ糖を担持する該組成物中の標的タンパク質のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列の少なくとも約90％〜100％を有する。
【００４９】
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
【化２】
2020530273.tif 000003
(ここで、四角は、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とするG0-Gnグリカンである、該標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約20％〜30％、25％〜35％、30％〜40％、35％〜45％、40％〜50％、45％〜55％、50％〜60％、55％〜65％、60％〜70％、65％〜75％、70％〜80％、75％〜85％、80％〜90％、85％〜95％、又は90％〜100％を有する。
【００５０】
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
【化３】
2020530273.tif 000004
(ここで、四角は、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とするG0グリカンである、該標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約10〜20％、20％〜30％、25％〜35％、30％〜40％、35％〜45％、40％〜50％、45％〜55％、50％〜60％、55％〜65％、60％〜70％、65％〜75％、70％〜80％、75％〜85％、80％〜90％、85％〜95％、又は90％〜100％を有する。
【００５１】
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
【化４】
2020530273.tif 000005
(ここで、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とするG1-Gnである、該標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約10〜20％、20％〜30％、25％〜35％、30％〜40％、35％〜45％、40％〜50％、45％〜55％、50％〜60％、55％〜65％、60％〜70％、65％〜75％、70％〜80％、75％〜85％、80％〜90％、85％〜95％、又は90％〜100％を有する。
【００５２】
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
【化５】
2020530273.tif 000006
(ここで、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とするG2グリカンである、該標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約10〜20％、20％〜30％、25％〜35％、30％〜40％、35％〜45％、40％〜50％、45％〜55％、50％〜60％、55％〜65％、60％〜70％、65％〜75％、70％〜80％、75％〜85％、80％〜90％、85％〜95％、又は90％〜100％を有する。
【００５３】
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
【化６】
2020530273.tif 000007
(ここで、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とするG1グリカンである、該標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約10〜20％、20％〜30％、25％〜35％、30％〜40％、35％〜45％、40％〜50％、45％〜55％、50％〜60％、55％〜65％、60％〜70％、65％〜75％、70％〜80％、75％〜85％、80％〜90％、85％〜95％、又は90％〜100％を有する。
【００５４】
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
【化７】
2020530273.tif 000008
(ここで、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とするG1グリカンである、該標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約10〜20％、20％〜30％、25％〜35％、30％〜40％、35％〜45％、40％〜50％、45％〜55％、50％〜60％、55％〜65％、60％〜70％、65％〜75％、70％〜80％、75％〜85％、80％〜90％、85％〜95％、又は90％〜100％を有する。
【００５５】
別の実施態様において、標的タンパク質上のグリコシル化は、対象に導入されたときに該標的タンパク質の薬物動態特性を最適化するようにさらに修飾される。別の実施態様において、標的タンパク質上のグリコシル化は、シアリル化される。
【００５６】
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
【化８】
2020530273.tif 000009
(ここで、菱形は、シアル酸残基を表し、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とする、該標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約10〜20％、20％〜30％、25％〜35％、30％〜40％、35％〜45％、40％〜50％、45％〜55％、50％〜60％、55％〜65％、60％〜70％、65％〜75％、70％〜80％、75％〜85％、80％〜90％、85％〜95％、又は90％〜100％を有する。
【００５７】
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
【化９】
2020530273.tif 000010
(ここで、菱形は、シアル酸残基を表し、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とする、該標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約10〜20％、20％〜30％、25％〜35％、30％〜40％、35％〜45％、40％〜50％、45％〜55％、50％〜60％、55％〜65％、60％〜70％、65％〜75％、70％〜80％、75％〜85％、80％〜90％、85％〜95％、又は90％〜100％を有する。
【００５８】
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
【化１０】
2020530273.tif 000011
(ここで、菱形は、シアル酸残基を表し、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とする、該標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約10〜20％、20％〜30％、25％〜35％、30％〜40％、35％〜45％、40％〜50％、45％〜55％、50％〜60％、55％〜65％、60％〜70％、65％〜75％、70％〜80％、75％〜85％、80％〜90％、85％〜95％、又は90％〜100％を有する。
【００５９】
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
【化１１】
2020530273.tif 000012
(ここで、菱形は、シアル酸残基を表し、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とする、該標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約10〜20％、20％〜30％、25％〜35％、30％〜40％、35％〜45％、40％〜50％、45％〜55％、50％〜60％、55％〜65％、60％〜70％、65％〜75％、70％〜80％、75％〜85％、80％〜90％、85％〜95％、又は90％〜100％を有する。
【００６０】
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
【化１２】
2020530273.tif 000013
(ここで、菱形は、シアル酸残基を表し、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とする、該標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約10〜20％、20％〜30％、25％〜35％、30％〜40％、35％〜45％、40％〜50％、45％〜55％、50％〜60％、55％〜65％、60％〜70％、65％〜75％、70％〜80％、75％〜85％、80％〜90％、85％〜95％、又は90％〜100％を有する。
【００６１】
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
【化１３】
2020530273.tif 000014
(ここで、菱形は、シアル酸残基を表し、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とする、該標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約10〜20％、20％〜30％、25％〜35％、30％〜40％、35％〜45％、40％〜50％、45％〜55％、50％〜60％、55％〜65％、60％〜70％、65％〜75％、70％〜80％、75％〜85％、80％〜90％、85％〜95％、又は90％〜100％を有する。
【００６２】
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
【化１４】
2020530273.tif 000015
(ここで、菱形は、シアル酸残基を表し、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とする、該標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約10〜20％、20％〜30％、25％〜35％、30％〜40％、35％〜45％、40％〜50％、45％〜55％、50％〜60％、55％〜65％、60％〜70％、65％〜75％、70％〜80％、75％〜85％、80％〜90％、85％〜95％、又は90％〜100％を有する。
【００６３】
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
【化１５】
2020530273.tif 000016
(ここで、菱形は、シアル酸残基を表し、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とする、該標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約10〜20％、20％〜30％、25％〜35％、30％〜40％、35％〜45％、40％〜50％、45％〜55％、50％〜60％、55％〜65％、60％〜70％、65％〜75％、70％〜80％、75％〜85％、80％〜90％、85％〜95％、又は90％〜100％を有する。
【００６４】
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
【化１６】
2020530273.tif 000017
(ここで、菱形は、シアル酸残基を表し、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とする、該標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約10〜20％、20％〜30％、25％〜35％、30％〜40％、35％〜45％、40％〜50％、45％〜55％、50％〜60％、55％〜65％、60％〜70％、65％〜75％、70％〜80％、75％〜85％、80％〜90％、85％〜95％、又は90％〜100％を有する。
【００６５】
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
【化１７】
2020530273.tif 000018
(ここで、菱形は、シアル酸残基を表し、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とする、該標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約10〜20％、20％〜30％、25％〜35％、30％〜40％、35％〜45％、40％〜50％、45％〜55％、50％〜60％、55％〜65％、60％〜70％、65％〜75％、70％〜80％、75％〜85％、80％〜90％、85％〜95％、又は90％〜100％を有する。
【００６６】
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
【化１８】
2020530273.tif 000019
(ここで、菱形は、シアル酸残基を表し、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とする、該標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約10〜20％、20％〜30％、25％〜35％、30％〜40％、35％〜45％、40％〜50％、45％〜55％、50％〜60％、55％〜65％、60％〜70％、65％〜75％、70％〜80％、75％〜85％、80％〜90％、85％〜95％、又は90％〜100％を有する。
【００６７】
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
【化１９】
2020530273.tif 000020
(ここで、菱形は、シアル酸残基を表し、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とする、該標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約10〜20％、20％〜30％、25％〜35％、30％〜40％、35％〜45％、40％〜50％、45％〜55％、50％〜60％、55％〜65％、60％〜70％、65％〜75％、70％〜80％、75％〜85％、80％〜90％、85％〜95％、又は90％〜100％を有する。
【００６８】
別の実施態様において、N-結合型グリコシル化コンセンサス配列は、Asn-X-Ser/Thrであり;ここで、Xは、プロリン以外の任意のアミノ酸である。
【００６９】
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質は、培養培地中に分泌され、ここで、該グリコシル化標的タンパク質は、グリコシル化されている。ある実施態様において、グリコシル化標的タンパク質は、培養培地から精製される。別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質は、親和性精製又はイオン交換クロマトグラフィーによって培養培地から精製される。別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質は、FCドメインを含有し、プロテイン-Aによって培養培地から親和性精製される。別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質は、親和性タグを含有し、親和性精製される。
【００７０】
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の集団は、少なくとも約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％均一である。さらなる実施態様において、グリコシル化によって占有されている標的タンパク質上のN-糖部位の90％〜100％。
【００７１】
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)リーシュマニア由来のものではないN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼの触媒ドメイン;及び(b)リーシュマニアのゴルジ区画における局在及び保持に関与するアミノ酸配列を含む、ハイブリッドN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼである。
【００７２】
ある実施態様において、該ハイブリッドN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、リーシュマニア・タレントラエ由来のものである。
【００７３】
他の実施態様において、該ハイブリッドN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、シグナル配列及び少なくとも1つの保持配列を含むように改変されており、ここで、該シグナル配列は、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼをリーシュマニア・タレントラエ宿主細胞の小胞体にターゲッティングし、該保持配列は、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼを小胞体又はゴルジ装置に保持する。
【００７４】
別の実施態様において、該ハイブリッドN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼを小胞体に保持する。別の実施態様において、該ハイブリッドN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼをシスゴルジ装置に保持する。別の実施態様において、該ハイブリッドN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼを中間ゴルジ装置に保持する。さらなる実施態様において、該ハイブリッドN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、細胞質-膜貫通-ステム(CTS)配列である。
【００７５】
ある他の実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、表9に掲載されているN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、又はその機能性ホモログ、アイソフォーム、もしくは変異体に由来する。
【００７６】
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)リーシュマニア由来のものではないガラクトシルトランスフェラーゼの触媒ドメイン;及び(b)リーシュマニアの小胞体又はゴルジ区画における局在及び保持に関与するアミノ酸配列を含む、ハイブリッドガラクトシルトランスフェラーゼである。
【００７７】
別の実施態様において、該ハイブリッドガラクトシルトランスフェラーゼは、リーシュマニア・タレントラエ由来のものである。
【００７８】
さらなる実施態様において、該ハイブリッドガラクトシルトランスフェラーゼは、シグナル配列を含むように改変されており、ここで、該シグナル配列は、該ガラクトシルトランスフェラーゼをリーシュマニア・タレントラエ宿主細胞の小胞体にターゲッティングし、該保持配列は、該ガラクトシルトランスフェラーゼを小胞体又はゴルジ装置に保持する。
【００７９】
ある実施態様において、該ハイブリッドガラクトシルトランスフェラーゼは、該ガラクトシルトランスフェラーゼを小胞体に保持する。ある実施態様において、該ハイブリッドガラクトシルトランスフェラーゼは、該ガラクトシルトランスフェラーゼをシスゴルジ装置に保持する。別の実施態様において、該ハイブリッドガラクトシルトランスフェラーゼは、該ガラクトシルトランスフェラーゼを中間ゴルジ装置に保持する。別の実施態様において、該ハイブリッドガラクトシルトランスフェラーゼは、該ガラクトシルトランスフェラーゼをトランスゴルジ装置に保持する。他の実施態様において、該ハイブリッドガラクトシルトランスフェラーゼは、細胞質-膜貫通-ステム(CTS)配列である。さらなる実施態様において、該ハイブリッドシアリルトランスフェラーゼは、GRIP配列である。ある実施態様において、該ハイブリッドシアリルトランスフェラーゼは、CTS配列及びGRIP配列である。
【００８０】
他の実施態様において、該ガラクトシルトランスフェラーゼは、表9に掲載されているガラクトシルトランスフェラーゼ、又はその機能性ホモログ、アイソフォーム、もしくは変異体に由来する。
【００８１】
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)リーシュマニア由来のものではないシアリルトランスフェラーゼの触媒ドメイン;並びに(b)リーシュマニアの小胞体又はゴルジ区画における局在及び保持に関与するアミノ酸配列を含む、ハイブリッドシアリルトランスフェラーゼである。
【００８２】
別の実施態様において、該ハイブリッドシアリルトランスフェラーゼは、リーシュマニア・タレントラエ由来のものである。
【００８３】
ある実施態様において、該ハイブリッドシアリルトランスフェラーゼは、シグナル配列を含むように改変されており、ここで、該シグナル配列は、該シアリルトランスフェラーゼをリーシュマニア・タレントラエ宿主細胞の小胞体にターゲッティングし、該保持配列は、該シアリルトランスフェラーゼを小胞体又はゴルジ装置に保持する。
【００８４】
ある実施態様において、該ハイブリッドガラクトシルトランスフェラーゼは、該ガラクトシルトランスフェラーゼを小胞体に保持する。別の実施態様において、該ハイブリッドシアリルトランスフェラーゼは、該シアリルトランスフェラーゼをトランスゴルジ装置に保持する。別の実施態様において、該ハイブリッドシアリルトランスフェラーゼは、CTS配列である。さらなる実施態様において、該ハイブリッドシアリルトランスフェラーゼは、GRIP配列である。他の実施態様において、該ハイブリッドシアリルトランスフェラーゼは、CTS配列及びGRIP配列である。
【００８５】
ある他の実施態様において、該ハイブリッドシアリルトランスフェラーゼは、表9に掲載されているシアリルトランスフェラーゼ、又はその機能性ホモログ、アイソフォーム、もしくは変異体に由来する。
【００８６】
他の実施態様において、本明細書に提供されるのは、ハイブリッドN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼをコードする核酸である。さらなる実施態様において、本明細書に提供されるのは、ハイブリッドガラクトシルトランスフェラーゼをコードする核酸である。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、ハイブリッドシアリルトランスフェラーゼをコードする核酸である。
【００８７】
(5.1  用語法及び略語)
「約」という用語は、数字と併用される場合、言及された数字の±1、±5、又は±10％以内の任意の数字を指す。
【００８８】
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、動物(例えば、鳥類、爬虫類、及び哺乳動物)を指す。別の実施態様において、対象は、非霊長類(例えば、ラクダ、ロバ、シマウマ、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ラット、及びマウス)並びに霊長類(例えば、サル、チンパンジー、及びヒト)を含む、哺乳動物である。ある実施態様において、対象は、非ヒト動物である。いくつかの実施態様において、対象は、家畜又はペット(例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ロバ、又はニワトリ)である。具体的な実施態様において、対象は、ヒトである。「対象」及び「患者」という用語は、本明細書で互換的に使用されてもよい。
【００８９】
「α[数字]」、「α[数字],[数字]」、「β[数字]」、又は「β[数字],[数字]」という略語は、炭水化物残基を別の基に接続する共有結合であるグリコシド結合(glycosidic bond)又はグリコシド結合(glycosidic linkage)を指す。α-グリコシド結合は、両方の炭素が同じ立体化学を有する場合に形成されるが、β-グリコシド結合は、2つの炭素が異なる立体化学を有する場合に生じる。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
(6.図面の簡単な説明)
【図１】図1:抗体の組合せ多様性は抗体エフェクター機能を推進する((Jennewein及びAlterの文献、2017)から抜粋)。IgG Fcを抗体のFcドメインに対する2つの変化:(i)グリコシル化の選択(36の選択肢)及び(ii)サブクラス(4つのサブクラス)の選択により修飾して、144の理論上の組合せ及び関連する機能的状態を作り出した。抗体-グリカン組合せに応じて、抗炎症応答;抗体依存性細胞性食作用(ADCP)、抗体依存性細胞性細胞傷害性(ADCC)などの機能的応答;又は補体活性化及びサイトカイン分泌を含む炎症応答の誘導を含む、多くの異なる機能的応答を誘発することができる。略語: IL、インターロイキン。
【００９１】
【図２】図2A、2B、及び2C: IgG Fc断片のグリコシル化による構造変化((Sondermannらの文献、2013)から抜粋)。図2A:シアリル化によるFc断片内の提案される構造変化のポンチ絵。非ガラクトシル化(G0F) Fc-断片は、FcγRの結合を可能にする開いた立体構造を維持している。三角は、フコース及び低結合を表す。図2B:完全にα2,6-シアリル化されたFc(G2FS2)において、α1,3-アームは、Cγ2ドメインのタンパク質コアと会合し、閉じた立体構造を誘導する。結果として得られる3次構造が変化したFc断片の閉じた立体構造によって、DC-SIGNの結合部位が露出するが、FcγRの結合部位は遮断される。図2C:(Chenらの文献、2017; Liらの文献、2017)に従って、このモデルを、FcγRに対するより高い親和性結合を可能にする、フコースを欠く糖鎖改変型N-グリカン上に開いた立体構造を有するように適合させることができる。フコースを含まないN-グリカンがシアル酸末端を有する二分岐状である場合、立体構造変化は、開いて密集している状態であることができる。Fc構造は、2つのグリカンラッチ(glycan latch)によって安定化され、Fcの適切な立体構造を維持するが、異なるグリカン残基によって媒介される。Chenの結果は、Fcの構造完全性の維持におけるN-グリコシル化の役割を示唆しており、末端シアル酸による調節によるグリカン-グリカン相互作用における多様な様式の可能性を示した。
【００９２】
【図３】図3A及び3B:リーシュマニア・タレントラエにおける小胞体(ER) N-グリカン生合成のバイオインフォマティクス的評価及び保存された経路との比較((Varkiの文献、2009)から抜粋)。図3A:リーシュマニア・タレントラエにおける欠損遺伝子は、×印と末梢線で表示されている。図3B:生合成の各々の工程を触媒する酵素は、主に、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)という酵母の突然変異体の研究から同定された。各々の酵母突然変異によって影響を受ける遺伝子は、ALG遺伝子(グリコシル化が変化した(altered in glycosylation )を表す)として知られている。ドリコール-P-P-GlcNAc2Man9Glc3の合成。ER膜の細胞質側に位置するドリコール(赤色の曲がりくねった曲線)リン酸(Dol-P)は、細胞質でUDP-GlcNAcからGlcNAc-1-Pを受け取って、Dol-P-P-GlcNAcを生成させる。Dol-P-P-GlcNAcは、表示されているALG酵素によって、Dol-P-P-GlcNAc2Man5へと伸長した後、ER膜を越えて、内腔側に「反転する」。ER膜の内腔側では、4つのマンノース残基がDol-P-Manから付加され、3つのグルコース残基がDol-P-Glcから付加される。Dol-P-Man及びDol-P-Glcは、ERの細胞質側でも作られ、内腔側に「反転する」。L.タレントラエに存在するホモログは、レ点で記されており、欠損ホモログは、×印で示されている。ALG12、6、8、9、及び10が存在せず、ALG3が機能喪失型突然変異を含むと推定されるので、man3構造は、反転して、それ以上マンノシル化されずに、ポリペプチドに直接転移されると考えられる。ALG5(ドリチル-リン酸β-グルコシルトランスフェラーゼ)は存在しない。OSTは、Stt3のみから構成される(表4)。
【００９３】
【図４】図4A、4B、及び4C:小胞体(ER) N-グリカン生合成、トリミング、及びタンパク質受容体への転移のバイオインフォマティクス的評価。図4A:×印と末梢線で表示された生合成におけるALGホモログの欠損は、縮小したMan3前駆体を示唆している。Man4又はMan5前駆体種の欠損(ALG3、9、11、12の欠損による)とグルコシル化前駆体種の欠損(ALG6、8、及び10、並びにALG5の欠損による)が推定されるにもかかわらず、図4Bに示されるトリミング酵素(GCS1、GNAB、MAN1)は存在している(欠損酵素は、末梢線で表示されている)。図4C:最終的なグリカンのMan3のみがStt3によってタンパク質アクセプターのN-コンセンサス部位に転移されると考えられる。フォールディング中間体のGlc1Man9GlcNAc2は、品質管理について、関与するレクチンのリガンドとは考えられない。
【００９４】
【図５】図5:(Moremenらの文献、2012)に基づく、タンパク質N-グリコシル化及びタンパク質フォールディングの品質管理のバイオインフォマティクス的評価。a)糖タンパク質生合成の間、新生ポリペプチドの翻訳に続いて、SEC61ポアを通るそのトランスロケーションとオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)による脂質結合中間体からペプチドアクセプターシークオンへのグリカンの同時転移が起こる。OSTのSTT3サブユニット中の1つの溝がAsn-X-Ser/Thrアクセプターシークオンをスキャンする一方、隣接する溝がグリカンドナーに結合する。b)Glc除去によるグリカントリミングは、α-グルコシダーゼI(GIsI)とα-グルコシダーゼIIのα-βヘテロ二量体(GIsIIα/β)による転移のすぐ後に起こる。Glc1Man9GlcNAc2構造を含有するフォールディング中間体は、ERp57との複合体で機能するレクチンであるカルネキシン(L.タレントラエには存在しない)又はカルレティキュリン(L.タレントラエには存在しない)のリガンドである。これらのレクチンからの解離に続いて、さらなるGlc切断が起こる。さらなるシャペロン支援は、ATP駆動型シャペロンBiP(GRP78としても知られる)によって提供される。正しくフォールディングされた糖タンパク質は、ゴルジ体への輸送のためにパッケージングされる。c)不完全にフォールディングされた糖タンパク質は、フォールディングセンサーであるUDP-Glc:糖タンパク質グルコシルトランスフェラーゼ(UGGT1、L.タレントラエには存在しない)によって認識される。その後、これらは、グリカン構造にGlc残基を付加し直すことにより再グルコシル化され、カルネキシンサイクルに再び組み入れられる。d)末端がミスフォールディングした糖タンパク質は、Manトリミング(ER α-マンノシダーゼI(ERManI＝L.タレントラエに存在するMAN1の活性を介する)又はゴルジManIA、ゴルジManIB、及びゴルジManIC(図示せず)による小胞体(ER)廃棄を受け、その後、ER分解増強α-マンノシダーゼ様1(EDEM1)、EDEM2、及びEDEM3(これは、酵母でMnl1としても知られるHtm1のホモログであり、全てL.タレントラエには存在しない)の活性を受ける。トリミングされたグリカンは、ERレクチンOS9又はXTP3B(図示せず)に結合し、細胞質ゾルのユビキチン結合タンパク質の駆動力とバロシン含有タンパク質(VCP; TER ATPアーゼとしても知られる;酵母でCdc48、Ufd1、又はNpl4としても知られる)のATPアーゼ機能とを用いて、デルリン1(DER1)とDER2とDER3の複合体(SEL1L複合体;酵母のHrd3)を介して細胞質ゾルに移行する。このペプチドは、細胞質ゾルのPNGアーゼ(L.タレントラエには存在しない)によって脱グリコシル化され、プロテアソーム149よって分解される。L.タレントラエに存在しないホモログは、×印で表示され、存在するホモログは、四角の枠の中に示されている。比較に関するさらなる詳細については、表8も参照されたい。
【００９５】
【図６】図6:野生型リーシュマニア・タレントラエと比較した、(Kellokumpuらの文献、2016)から抜粋した哺乳動物N-グリコシル化経路。模式的ポンチ絵は、小胞体(ER)及びゴルジ体におけるグリコシルトランスフェラーゼによるN-グリカンの逐次的プロセシングを示している。関与する酵素(グリコシルトランスフェラーゼ及びグリコシダーゼ)は、従来、成長しているオリゴ糖鎖に糖残基を一度に1つずつ特定の順序で付加するか又は成長しているオリゴ糖鎖から糖残基を一度に1つずつ特定の順序で除去することにより、個別に順々に機能すると考えられている(左側)(「哺乳動物」)。図6の右側は、哺乳動物系と比較して縮小した前駆体及び異なる成熟N-グリカンを有する野生型リーシュマニア・タレントラエを表している。
【００９６】
【図７】図7:野生型リーシュマニア・タレントラエと比較した、(Kellokumpuらの文献、2016)から抜粋した哺乳動物N-グリコシル化経路。哺乳動物経路の模式的ポンチ絵は、表示されたグリカンを糖鎖改変リーシュマニアで産生する糖鎖改変工程を用いて、図6を補完している。
【００９７】
【図８】図8:リーシュマニア・タレントラエにおける提案されたN-グリコシル化生合成経路。N-グリカン前駆体は、ERの細胞質側でMan3として構築され、その後、ER内腔に反転する。その後、このMan3グリカンは、通常見られるOST複合体の唯一のパーツであるStt3によって直接転移される。アクセプタータンパク質のN-糖部位上の最終的なグリカンはMan3であり、これは、シスゴルジに移行する。シスゴルジでは、異種酵素が、ヒト二分岐N-グリカンを構築するグリコシルトランスフェラーゼ反応を触媒する。これらは、最初の2つのGlcNAc残基を付加する哺乳動物又は昆虫源由来のGnt-I及びGnt-IIである。対応するグライコフォームは、そのテキスト略語とともに下の四角の枠の中に記載されている。トランスゴルジでは、リーシュマニアで発現した哺乳動物源由来のGalT及びSiaT酵素がN-グリカンの完成までの反応を触媒し、このN-グリカンは、α2,3又はα2,6結合シアル酸(Neu5Ac)に応じて異なる予想される機能を媒介する、均一で、フコースを含有しないが、二分岐シアリル化したヒト化グリカンである。
【００９８】
【図９】図9: 3つの異なるwt株における全リーシュマニア・タレントラエ細胞ペレット由来のPNGアーゼFもしくはPNGアーゼAにより放出され、かつRF標識されたN-グリカン又は模擬処理物のUPLC分離及びMSによるm/z決定。(Man)3(GlcNAc)2＝Man3は、MSにより、計算値m/z＝1222.7166; [M+Na]+ 1244.6985; [M+K]+ 1260.6724で検出された。Man3は、PNGアーゼF又はPNGアーゼAで放出された場合9.16; 9.27; 9.34のRTで、全てのペレット試料で観察されたが、模擬処理試料では観察されなかった。模擬処理試料は、例えば、細胞壁糖脂質(ポリヘキソースシグナチャーを有する)からの、株(真ん中及び下のパネル)への混入を示した。RT 15.76では、別のピークがFLRトレース中に観察されたが、良好なMSスペクトルが得られたにもかかわらず、化合物を同定することができなかった。通常、FLRトレース中にはそれほど多くのバックグラウンドは観察されないが、MSトレースには早いRTでかなりのバックグラウンドが観察された(＜8分のRT、図示せず)。
【００９９】
【図１０】図10A及び10B: SfGnT-I、TbGnT-I、又はTbGnT-IIインビトロ活性アッセイ後の2-AB標識N-グリカン反応産物のHPLC分離。SfGnT-I、TbGnT-I、又はTbGnT-IIを発現する組換えL.タレントラエ由来の免疫濃縮物(図10A)又は可溶化画分(図10B)を遊離ポーシマンノース(Man3)に対するインビトロアッセイで基質として使用した。洗浄され、2AB標識された反応産物をHPLCで分離し、標準のMan3-2AB、G0-Gn(NGA3-N)、及びG0(NGA2)と比較した。RT 76.7'のピークは、アステリスクで印が付けられた異種GnT-I酵素の活性を示している。
【０１００】
【図１１】図11A及び11B: MGAT1インビトロ活性アッセイ後の2-AB標識N-グリカン反応産物のHPLC分離。MGAT1を発現する組換えL.タレントラエ由来のSN又はペレット並びに可溶化画分及びライセート由来の免疫濃縮MGAT1を:(図11A)既知のN-グリコシル化経路におけるMGAT1の一般に使用される生合成アクセプターである2AB標識高マンノース(Man5)に対する又は(図11B)リーシュマニアのN-グリカン経路におけるゴルジ体での伸長のためのMan3アクセプターを模倣する基質としての2AB-ポーシマンノース(Man3)に対するインビトロアッセイで使用した。陰性対照として、wt L.タレントラエ細胞由来のライセートをこれらの反応で使用した。洗浄された2AB標識反応産物をHPLCで分離し、標準と比較した。図11A)Man5又は図11B)Man3; G0-Gn(NGA2-N、緑)。アステリスクで印が付けられたピークは、異種GnT-I酵素の活性を示している。
【０１０１】
【図１２】図12A及び12B: MGAT2インビトロ活性アッセイ後の2-AB標識N-グリカン反応産物のHPLC分離。組換えL.タレントラエ由来のSN又はペレット由来の免疫濃縮MGAT2を、既知のN-グリコシル化経路におけるMGAT2の一般に使用される生合成アクセプターである2AB標識G0-Gn(NGA2-N)に対する(図12A)又はMGAT2によって伸長されない、リーシュマニアのN-グリカン経路におけるゴルジ体での伸長のためのMan3アクセプターを模倣する基質としての2AB-ポーシマンノース(Man3)に対する(図12B)インビトロアッセイで使用した。洗浄された2AB標識反応産物をHPLCで分離し、標準のMan3、G0-Gn(NGA2-N)、及びG0(NGA2)と比較した。アステリスクで印が付けられたピークは、異種GnT-II酵素の活性を示している。
【０１０２】
【図１３】図13A、13B、及び13C: SfGnT-IIインビトロ活性アッセイ後の2-AB標識N-グリカン反応産物のHPLC分離。SfGnT-IIを発現する組換えL.タレントラエ由来の粗ライセートを:リーシュマニアのN-グリカン経路におけるゴルジ体での伸長のためのMan3アクセプターを模倣する基質としての2AB-ポーシマンノース(Man3)に対する(図13A);既知のN-グリコシル化経路におけるGnt-II反応のための一般に使用される生合成アクセプターである2AB-標識G0-Gn(NGA2-N)に対する(図13B)、又はGnT-IIの基質ではない2AB標識Man5に対する(図13C)インビトロアッセイで使用した。洗浄された2AB標識反応産物をHPLCで分離し、標準のMan3、G0-Gn(NGA2-N)、及びMan5と比較した。アステリスクで印が付けられたピークは、異種GnT-II酵素の活性を示している。
【０１０３】
【図１４】図14A、14B、及び14C: B4GALT1インビトロ活性アッセイ後の2-AB標識N-グリカン反応産物のHPLC分離。図14A:組換えL.タレントラエ由来の免疫濃縮B4GALT1を2AB-G0-Gn(NGA2-N)に対するインビトロアッセイで使用した。洗浄された2AB標識反応産物をHPLCで分離し、標準のG0-Gn(NGA2-N)、G1(NA2G1)、NA2(G2)と比較した。星で印が付けられたピークは、異種GalT酵素の活性を示している。図14Bは、市販のNGA2-N(G0-Gn)標準の組成物の模式的グライコフォーム表示及び2つの異なる分岐上のG1-Gn形態を示すB4GALT1インビトロアッセイ後の予想される反応結果を示している。図14Cは、G0(NGA2)をGalTの基質として使用した場合の予想される反応産物を表す。
【０１０４】
【図１５】図15:完全メチル化され、PNGアーゼFにより放出されたwt及び糖鎖改変リーシュマニア・タレントラエのN-グリカンの範囲m/z 1000〜2200のMALDI-TOF MSスペクトル。グライコフォームの注釈は、m/zピークの上に付けられている。
【０１０５】
【図１６】図16:同定されたグライコフォームのMALDI-TOF/TOF MSフラグメンテーションスペクトル。wt St10569からのm/z 1171.6(＝Man3)(上)、SfGnT-Iを発現する組換え株St11707のスペクトルからのm/z 1416.7(＝G0-Gn)(中)、及びSfGnT-I及びSfGnT-IIを共発現する組換えSt12320(下)のスペクトルからのm/z 1661.8(＝G0)のスペクトル中に存在するフラグメントイオンにより、Man3(上)、G0-Gn(中)、及びG0(下)の完全メチル化N-グリカンが確認される。
【０１０６】
【図１７】図17A、17B、及び17C: UPLC分離及び組換え糖鎖改変リーシュマニア・タレントラエ細胞ペレット由来のPNGアーゼFにより放出され、RF標識されたN-グリカン又は模擬処理物のMSによるm/z決定が図17Aに示されており、破線は、模擬試料中に見られるバックグラウンドピークを表している。RF標識されたN-グリカンを: 16.260−St11707(SfGnT-I)、PNGアーゼFによる; 16.261−St11707(SfGnT-I)−模擬; 16.263−St12525(SfGnT-I及びSfGnT-II)−PNGアーゼF、並びに16.264−St12767(SfGnT-I及びMGAT2)−PNGアーゼFから得て、重ね合わせた。m/zで確認されたグリカンピークは、太字の矢印で示されている。図17Bは、St 13065(MGAT1及びMGAT2)由来のN-グリカン、図17Cは、St13066(SfGnT-I及びB4GalT1)のN-グリカンを示しており、m/zは、上に図式化して注釈が付けられているピークにより確認され、[M+H] m/z＝1222 Man3、m/z＝1425 G0-Gn、m/z＝1628(G0)、及びm/z＝1587(G1-Gn)であった。標識されていないピークは、模擬消化物中にも見られ、細胞壁糖脂質断片と推定されるものを含有していた(破線矢印、「バックグラウンド」)。
【０１０７】
【図１８】図18:糖鎖改変リーシュマニアで発現された組換えhEPOのN-グリカン伸長。GnT-I候補のSfGnT-Iを組換え発現させて、ネイティブなN-グリカンをG0-Gnまで伸長させた。組換え標的タンパク質のヒトエリスロポエチン(rhEPO)を単独で発現させるか(St11521)又はSfGnT-Iとともに共発現させた(St11895)。rhEPOをリーシュマニアの分泌経路により分泌させ、培養上清から精製した。2つの精製EPO試料のクマシーSDS PAGE。分子量は、GlcNAc伸長を高分子量になるまで付加したときに変化する。
【０１０８】
【図１９】図19:ペプチドマッピングによるrhEPO部位占有。薄灰色:糖ペプチド濃縮工程のフロースルー画分中のEPOペプチド。灰色:フロースルー画分中及び濃縮糖ペプチド画分中に存在するペプチド。濃灰色: PNGアーゼA＋Fによる脱グリコシル化後の濃縮糖ペプチド画分中でその脱アミド化形態に見られるN-グリコシル化部位N24及びN38を包含するEPOペプチド。このペプチドは、その非グリコシル化形態では検出されなかった。N-グリコシル化部位N83を有するペプチドは、本研究で(その非グリコシル化形態でも、その脱グリコシル化形態でも)明白には検出されなかった。N-グリコシル化部位は、太字で表示されている。配列番号108が示されている。
【０１０９】
【図２０】図20:同定されたN-グリカンを有するrhEPOの糖ペプチド。N-グリコシル化N24及びN38部位が表示されている。配列番号109が示されている。
【０１１０】
【図２１】図21A及び21B:ネイティブな分泌糖タンパク質の同定。図21A)は、ワークフローを四角の枠の中にまとめたものであり、クマシーSDS PAGEは、ConA濃縮後の溶出プロファイル(E1〜E5)を示している。主要なタンパク質は、60〜80kDaの間を泳動した。溶出物をN-グリカン放出及び2AB標識に使用し、ペプチドマッピングを用いるプロテオミクス的手法を用いて、タンパク質を同定した。図21B:同定されたタンパク質は、＞96％の確率を示す配列カバレッジで同定されたペプチドの数とともに示されている。
【０１１１】
【図２２】図22A及び22B:ネイティブな分泌糖タンパク質であるインベルターゼのプロセシングされたN-末端の同定。図22A:ワークフローを四角の枠の中にまとめた。St10881の上清を(NH4)2SO4沈殿させ、ConAを用いて精製した。ConA溶出物E1〜E8がクマシーSDS PAGEで示されている。サイズ排除後、rhEPO以外の最も顕著な分泌タンパク質を回収し、EDMAN N-末端シークエンシングに供した。図22Bは、ペプチドマッピングによって同定されたインベルターゼの配列を示しており、薄灰色の印のペプチドが見出された。丸は、EDMAN N-末端シークエンシングからのプロセシングされたN-末端
【化２０】
2020530273.tif 000021
を示している。配列番号110が示されている。
【０１１２】
【図２３】図23: rhEPOは、インベルターゼ由来のインベルターゼ分泌配列に遺伝子融合されたときに分泌された。上清中に分泌されるために、分泌移行のための2つの異なるシグナルペプチドを付けて、EPOを発現させた。免疫ブロッティングしたSDS PAGE(左)又はクマシー染色したSDS PAGE(右)のいずれかに、15 ODの細胞に相当するTCA沈殿上清を充填した。各々5つの異なる単クローンを用いた、LMSAP分泌シグナル(St11376)又はインベルターゼ由来の分泌シグナル(St11377)のいずれかを有する両方のrhEPO変異体は、そのN-グリコシル化形態を示す分子量に泳動するSN中に見られた。
【０１１３】
【図２４】図24A及び24B:ネイティブなゴルジ体局在タンパク質のドメイン予測。ゴルジ体局在グリコシルトランスフェラーゼの大部分は、短いN-末端細胞質ドメイン、約20アミノ酸のらせん状TM-ドメイン、ステムドメイン、及び分泌経路の内腔内のC-末端球状触媒ドメインを有するII型膜タンパク質である(Kellokumpuらの文献、2016)。図24A。示されているのは、分泌シグナル及びN-末端のCTSと、それに続く、球状/触媒ドメインを有するGnt(Gnt-x)又はSfGnT-Iの代表例である。図24Bは、バイオインフォマティクス的比較によって同定され、かつ模式的バーの下に予測されたCTSドメインのアミノ酸配列を伴って掲載されている、L.タレントラエ由来のネイティブかつ推定上のゴルジタンパク質MAN1、LtaNTPDアーゼ1及び2を示している。GRIPドメインをLTAR_110005600.1(以前の命名体系: LtaP11.0070)中に同定した。このC末端アミノ酸配列は、バーの下に示されている。配列番号24〜27が示されている。
【０１１４】
【図２５】図25A、25B、及び25C: Gntのドメイン予測並びにゴルジターゲッティング、保持、及びホモ又はヘテロ二量体化の改善のためのハイブリッド設計。Gnt-Xは、示されている例のように、Sf-Gnt-Iである白色のバーとして表示されている。濃灰色のものは、Gnt-Y、示されている例では、MGAT1である。下の数字は、Gnt-y/MGAT1のCTSの後ろにあるハイブリッド設計の融合点を示している。図25Bは、N-末端切断型(Δ90、Δ110、Δ130、Δ150アミノ酸)のGnt-X/SfGnT-Iのヌクレオチドにヌクレオチド配列として遺伝子融合されたGnt-Y/MGAT1のN-末端の90、110、130、又は150アミノ酸を示している。全長(FL) Gnt-Y(MGAT1)は、図25Cに表示されているFLのGnt-X/SfGnT-I(上)又はN-末端でCTSが切断されたGnt-X/SfGnT-I(下)に融合されている。
【０１１５】
【図２６】図26A及び26B:経時的なrhEPO又はSfGnT-I組換え細胞の成長挙動並びにrhEPO又はSfGnT-Iの発現及び局在。rhEPOを発現する細胞(St11357)又はSfGnT-Iを発現する細胞(St11521)の静止培養物対振盪培養物で成長をモニタリングした−成長(OD)及び形状は、図26Aに示されているようにグラフで経時的に表示されている。rhEPO又はSfGnT-Iの経時的な発現率及びその局在を、抗Strep抗体を用いる免疫ブロットにより、TCA沈殿上清(SN)及び全細胞抽出物(WCE)で決定した(図26B)。
【０１１６】
【図２７】図27A及び27B: SfGnT-I、TbGnT-I、及びTbGnT-IIの局在。15 ODに相当する充填量の培養物SNからTCA沈殿されたか又はTritonXで可溶化された細胞ライセートからストレプトアビジンで親和性濃縮されたStrepタグ化Sf-GnT-Iを検出している免疫ブロット(図27A)。トリパノソーマに由来し、かつHAタグ化されたTbGnT-I及びTbGnT-IIを、免疫ブロットにより、粗画分及びTriton-X可溶化画分中で検出した(図27B)。
【０１１７】
【図２８】図28A及び28B: SfGnT-IのハイブリッドGnt変異体の局在。ネイティブなSfGnT-I或いはMan1-CTS又はLTaNTPDアーゼ1もしくは2のCTSのハイブリッドを発現させ、培養物SN(図28A)から、又はtritonを含む(TrX+)もしくはtritonを含まない(TrX-)もしくは不溶性部分(Ins)からホモジナイズされた粗ライセート(図28B)から沈殿させた。
【０１１８】
【図２９】図29: MGAT1の局在及び親和性濃縮。HAタグ化MGAT1を組換え細胞培養物SN由来又はペレット由来のいずれかの親和性濃縮画分からの精製(Purif.)から免疫ブロットにより検出した。Eluは、インビトロアッセイに使用された溶出物である。局在化のために、MGAT1を、tritonを含む(TrX+)もしくはtritonを含まない(TrX-)又は不溶性部分(Insol. fr.)もしくは残渣からホモジナイズされたライセート中で検出した。
【０１１９】
【図３０】図30: SfGnT-IIの局在及び親和性濃縮。HAタグ化SfGnT-IIを、組換え細胞培養物SN由来又はペレット由来のいずれかの親和性濃縮画分からの精製(Purif.)からの免疫ブロットにより検出した。Eluは、インビトロアッセイに使用された溶出物である。局在化のために、SfGnT-IIを、tritonを含む(TrX+)もしくはtritonを含まない(TrX-)又は不溶性部分(Insol. fr.)もしくは残渣からホモジナイズされたライセート中で検出した。
【０１２０】
【図３１】図31A及び31B: MGAT2の局在及び親和性濃縮。HAタグ化MGAT2を、組換え細胞培養物SN由来又はペレット(Pell)由来のいずれかの親和性濃縮画分(W、洗浄; Elu、溶出)からの精製(Purif.)からの免疫ブロットにより検出した。細胞を96時間又は72時間成長させた。Eluは、インビトロアッセイに使用された溶出物である。局在化のために、SfGnT-IIを、tritonを含む(TrX+)もしくはtritonを含まない(TrX-)又は不溶性部分(Insol. fr.)もしくは残渣からホモジナイズされたライセート中で検出した(図31A)。様々な継代にわたる沈殿させた細胞培養物SNのMGAT2の局在及び発現レベルは、抗HA免疫ブロットにより示されている(図31B)。
【０１２１】
【図３２】図32:カスタマイズされたFcグリカンは所望の下流エフェクター機能を媒介する。免疫活性化グリカンは、ADCC、ADCP、及びCDCのような効果を媒介する。上部の表示されたグリカンを、免疫活性化、免疫阻害、及び/又はPK最適化を媒介するための、Fc分子又は抗体発現用の糖鎖改変リーシュマニアプラットフォームを用いてカスタマイズする。二分岐グリカンがα2,6結合Neu5Acで終わる場合、機能は活性化することであるが、それがα2,3結合Neu5Acで終わる場合、その機能は免疫を阻害することである。裏付け証拠は、(Chenらの文献、2017; Liらの文献、2017)で論じられている。二分岐N-グリカンが、その特定の結合とは無関係に、シアル酸で終わる場合、シアル酸の存在によって循環半減期が増大することにより、PKが改善されることになる。さらに、潜在的に免疫原性である治療薬の抗薬物抗体(ADA)の発生を回避するために、α2,6結合Neu5Acの免疫寛容化効果が期待される。下部の免疫を阻害するグリカンは、CHO細胞プラットフォーム由来の典型的なグリカン誘導体(末端シアル酸を有さない)である、コアα1,6フコシル化グリカンである。
【０１２２】
【図３３】図33:抗CD20モノクローナル抗体である組換えリツキシマブのアミノ酸配列。修飾されたインベルターゼ分泌配列を有する軽鎖(LC)及び重鎖(HC)のタンパク質配列は太字で示され、Fc N-グリコシル化部位は太字でかつ下線を付して示されている。配列番号111及び112が示されている。
【０１２３】
【図３４】図34:抗CD20モノクローナル抗体の組換えリツキシマブを含有する、リーシュマニア・タレントラエへの安定な組込みのための発現カセット。関連領域、相同組換えによる18S rRNAをコードするssu遺伝子座への部位特異的組込みのための5'相同性部位である5'ssu;スプライスリーダーアクセプター配列を含む5'非翻訳末端反復である5'UTR、インベルターゼ分泌シグナルを含有するリーシュマニア用にコドン使用が最適化された軽鎖配列;ポリアデニル化のための3'UTR及び下流遺伝子の5'UTRを含有する第一の遺伝子間領域であるIR1;インベルターゼ分泌シグナルを含有するリーシュマニア用にコドン使用が最適化された重鎖配列;ポリアデニル化のための3'UTR及び下流耐性マーカー(sat)の5'UTRを含有する第二の遺伝子間領域であるIR2、それに続く、その3'UTR及びゲノムへの部位特異的組換えのための3'相同性(3'ssu)領域の略図。KpnIは、ドナー大腸菌(E.coli)維持プラスミドから切り出されたトランスフェクション線状DNA用の記載されている発現カセットを得るために使用される制限酵素である。
【０１２４】
【図３５】図35:リツキシマブ_LMTBを分泌する組換えリーシュマニア・タレントラエからの全長モノクローナル抗体の発現及び精製。ワークフローは、上部に四角の枠として記載されている。回収された上清及び透析濾過され、5倍濃縮されたSNのクマシー染色SDS PAGEが示されている(左)。プロテインA溶出(右)は、クマシー染色された2つの主要な形態を示しており、1つは、非還元条件(「non」)下、SDS PAGEでFLリツキシマブとして移動し、1つは約100kDaの分解産物である。還元条件(「red」)下では、HC、分解産物、及びLCは分離される。疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)溶出は、非還元条件下又は還元条件下で分離したときの、これら2つの形態の分離を示している。SDS PAGEゲルがクマシー染色されている。
【０１２５】
【図３６】図36A及び36B:組換えリーシュマニアから精製されたリツキシマブ_LMTBとCHO細胞で発現された同じタンパク質の市販製品であるMabthera(登録商標)の比較。図36A:クマシー染色SDS PAGEは、N-結合グリカンを放出するためのPNGアーゼF処理なし又はあり(+)の非還元条件下のFL抗体を示している。図36Bは、抗体分子、そのドメイン及びジスルフィド架橋の略図を示している。N糖部位は、炭水化物で表示されている。ポンチ絵の分子の左側には、リーシュマニア由来抗体の均一なMan3 N-グリカンが示されているのに対し、右側には、CHO発現抗体に由来する予想されるN-グリカン微少不均一性が示されている。
【０１２６】
【図３７】図37:組換えリーシュマニアから精製されたリツキシマブ_LMTBとCHO細胞で発現された同じタンパク質の市販製品であるMabthera(登録商標)のキャピラリーゲル電気泳動及び比較。CGEは、N-結合グリカンを放出するためのPNGアーゼF処理なし(-)又はあり(+)の非還元条件下のFL抗体を示している。
【０１２７】
【図３８】図38A及び38B:組換えリーシュマニアから精製されたリツキシマブ_LMTB(図38B)とCHO細胞で発現された同じタンパク質の市販製品であるMabthera(登録商標)(図38A)のサイズ排除クロマトグラフィー及び比較。
【０１２８】
【図３９】図39A及び39B:組換えリーシュマニアから精製されたリツキシマブ_LMTB(図39B)とCHO細胞で発現された同じタンパク質の市販製品であるMabthera(登録商標)(図39A)のRFを用いたN-グリカンプロファイリング及び比較。N-グリカンをPNGアーゼFにより放出させ、RFで標識した。UPLC分離が示され、m/z値は、ピークの上に注釈が付けられたN-グリカンについて確認されている。
【０１２９】
【図４０】図40:組換えリーシュマニアから精製されたリツキシマブ_LMTBとCHO細胞で発現された同じタンパク質の市販製品であるMabthera(登録商標)の完全メチル化を用いたN-グリカンプロファイリング及び定量的比較。N-グリカンをPNGアーゼFにより放出させ、完全メチル化した。N-グリカンの相対強度(％)を計算して、各々のスペクトルについてのN-グリカンプロファイルを確立した。このために、脱同位体化されたN-グリカンピークの強度の合計を決定し、100％に設定した。その後、各々のグリカンの相対強度(％)をこの値との関連において決定した。黒色のバーは、リツキシマブ_LMTB及び灰色のバーは、Mabthera(登録商標)(Roche)である。m/z値は、そのフラグメンテーションスペクトルによる確認を含め、ピークの上に注釈が付けられたN-グリカンについて確認されている。
【０１３０】
【図４１】図41A及び41B:組換えリーシュマニアから精製されたリツキシマブ_LMTB(図42B)とCHO細胞で発現された同じタンパク質の市販製品であるMabthera(登録商標)(図42A)の完全メチル化を用いたN-グリカンプロファイリング及び比較。3回の異なる獲得時にMabthera(登録商標)からPNGアーゼFにより放出された完全メチル化N-グリカンのMALDI-TOF MSスペクトル(図48A)及び2回の独立した獲得時にリツキシマブ_LMTBからPNGアーゼFにより放出された完全メチル化N-グリカンのMALDI-TOF MSスペクトル(図42B)。
【０１３１】
【図４２】図42:組換えリーシュマニアから精製されたリツキシマブ_LMTBとCHO細胞で発現された同じタンパク質の市販製品であるMabthera(登録商標)と糖鎖改変された第三世代抗CD-20 Gazyvaro(登録商標)(Roche)のN-グリカンの微少不均一性及び定量的比較。N-グリカンをPNGアーゼFにより放出させ、完全メチル化した。N-グリカンの相対強度(％)を計算して、各々のスペクトルのN-グリカンプロファイルを確立した。このために、脱同位体化されたN-グリカンピークの強度の合計を決定し、100％に設定した。その後、各々のグリカンの相対強度(％)をこの値との関連において決定した。灰色のバーは、リツキシマブ_LMTB、濃灰色のバーは、Mabthera(登録商標)(Roche)、薄灰色のバーは、Gazyvaro(登録商標)(Roche)である。m/z値は、そのフラグメンテーションスペクトルによる確認を含め、ピークの上に注釈が付けられたN-グリカンについて確認されている。
【０１３２】
【図４３】図43A及び43B:抗原結合についての組換えリーシュマニアから精製されたリツキシマブ_LMTBの機能性試験。図43Aは、対照IgG1κと比べたMabthera(登録商標)又はリツキシマブ_LMTBのFACSヒストグラムを示している。CD20抗原を発現するRaji細胞を用いて、抗CD20抗体の機能性を試験した。染色する順序は、表示された濃度のFcRブロッキング、IgG1ブロッキング、一次抗体Mabthera(登録商標)、リツキシマブ_LMTB、又は陰性対照IgG1κ、次いで、二次抗体抗IgG1 APCであった。ゲートをかけた後、各々の試料は、10000〜13000個の細胞の解析を表している。矢印は、抗CD20抗体とRaji細胞の表面のCD20抗原との結合を示す平均蛍光のシフトを示している。図43Bは、メンブレン上に漸増濃度でスポットされた大腸菌でGST融合体として組換え発現されたCD20の結果を示している。様々な濃度のMabthera(登録商標)又はリツキシマブ_LMTB又は対照抗体(抗マルトース結合タンパク質、大腸菌由来の抗GroEL熱ショックタンパク質、もしくは抗His IgG抗体)或いは一次抗体なしを用いて、メンブレンストリップをインキュベートした。洗浄後、二次抗体を抗ヒトIgG-HRPとした。
【０１３３】
【図４４】図44:組換えリーシュマニアから精製されたリツキシマブ_LMTBとCHO細胞で発現された同じタンパク質の市販製品であるMabthera(登録商標)の比較の略図及びまとめ。HC及びLCのN-末端配列、C末端アミノ酸、並びにグリカンプロファイルがリツキシマブ_LMTBについては右側に、Mabthera(登録商標)については左側に示されている。表示されているジスルフィド架橋は全て、両方の試料で同定された。
【０１３４】
【図４５】図45:様々なキネトプラスト類の完全メチル化を用いたN-グリカンプロファイリング及び定量的比較。クリチディア・ファシキュラータ(Crithidia fasciculata)、クリチジア・デアネイ(Crithidia deanei)(アンゴモナス(Angomonas))、及びフィトモナス・ダビディ(Phytomonas davidii)のN-グリカンをPNGアーゼFによる脱脂質化後に放出させ、完全メチル化した。N-グリカンの相対強度(％)を計算して、各々のスペクトルについてのN-グリカンプロファイルを確立した。このために、脱同位体化されたN-グリカンピークの強度の合計を決定し、100％に設定した。その後、各々のグリカンの相対強度(％)をこの値との関連において決定した。m/z値は、そのフラグメンテーションスペクトルによる確認を含め、ピークの上に注釈が付けられた全てのN-グリカンについて確認されている。
【０１３５】
【図４６】図46A及び46B: SfGnT-IのハイブリッドGnt変異体の局在。図46Bに模式的に示されたネイティブなSfGnT-I又はSfGnT-I触媒ドメインのハイブリッドを発現させ、図46Aに示されるように、培養物SNから又はtriton Xを含む粗ライセート(WCE)から沈殿させた。
【０１３６】
【図４７】図47A及び47B:様々なGnt-Iを発現するリーシュマニア(図47A)及び様々なSf-Gnt-Iハイブリッドを発現するリーシュマニア(図47B)のRFを用いたN-グリカン定量及び比較。細胞ペレット由来の全N-グリカンをPNGアーゼFにより放出させ、RFで標識した。UPLCピークの相対的定量が、糖鎖改変のための最初のGlcNAcのインビボ付加を表す、G0-Gn変換の％で示されている。エラーバーは、数回の独立した実験の標準偏差を示している。m/z値は、G0-Gn及びMan3を含有するUPLCピークについて確認されたが、模擬試料とPNGアーゼF放出試料の間で異なるピークは他に見られなかった。
【０１３７】
【図４８】図48A及び48B:示されているのは、リーシュマニアで発現された様々なシアリルトランスフェラーゼの局在(図48A)及び相対活性(図48B)である。HAタグ化シアリルトランスフェラーゼは、細胞培養物SNと比較したtriton可溶化細胞ライセート由来の親和性濃縮画分(elu)からの抗HA免疫ブロットにより検出される。Eluは、インビトロアッセイに使用された溶出物である(図48A)。
【０１３８】
【図４９】図49A、49B、49C、及び49D:リーシュマニアで発現されたHA親和性濃縮シアリルトランスフェラーゼの2-AB標識G2標準に対するインビトロ活性。図49A:マウスST6GAL1;図49B:ラットST6GAL1、図49C:最適化されたインベルターゼ分泌シグナルを含有する細菌CstI、図49D:マウスST3GAL3。HA濃縮シアリルトランスフェラーゼを用いたG2標準に対するインビトロ反応が示されており、RT比較は市販の標準G2及びシアリル化G2S2(破線矢印)に対して行われ、インビトロ反応は矢印で示され、結果として得られたグリカンピークはアステリスクで示されている。
【０１３９】
【図５０】図50A、50B、50C、50D、及び50E:リーシュマニアにより発現され、濃縮されたmST6GAL1は、フォールディングした全長mAbのガラクトシル化N-グリカンをシアリル化することができる。図50A:細胞ライセートからのマウスST6を発現するリーシュマニアのHA親和性濃縮並びに100％であることが明らかにされている2AB標識G2標準に対するその活性の試験(図50B)及びMabThera Fc N-グリカンに対するその活性の試験(図50C)。N-グリカン組成を、RF MS(図50D)により、mAb(薄灰色)に対して、及び模擬ライセート(黒色のバー)又はHA濃縮mST6GAL1(濃灰色のバー)のいずれかを用いたプロテインA精製Mabtheraのインビトロ反応後に評価した。単鎖及び二分岐の全シアリル化グリカンのまとめが図50Eに示されている。
【０１４０】
【図５１】図51:リーシュマニアにより発現され、濃縮されたmST6GAL1は、ST6反応物がオーバーレイされた模擬反応物のN-グリカンRF-MSプロファイルを有する、UPLC分析で示されているような、フォールディングした全長mAbのガラクトシル化N-グリカンをシアリル化することができる。
【０１４１】
【図５２】図52A及び52B: Sf-Gnt-I及びMGAT2で安定にトランスフェクトされ、リツキシマブをエピソーム性に発現する糖鎖改変株は、リツキシマブ上にG0 N-グリカンを生じさせる。株を1L中で成長させ、分泌されたリツキシマブをプロテインAにより上清から精製し(図52A)、PNGアーゼF及びRF-MS分析に使用し(図52B)、Man3について半定量した。
【０１４２】
【図５３】図53:糖鎖改変のためにリーシュマニアに組換えにより付加することができる原核生物及び真核生物の酵素を含む模式的に表示されたCMP-Neu5Ac経路。
【発明を実施するための形態】
【０１４３】
(7.詳細な説明)
本発明は、ネイティブな宿主細胞の性質、並びにN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、及びシアリルトランスフェラーゼを含む、一連のグリコシルトランスフェラーゼの異種発現との組合せによって、哺乳動物、例えば、ヒトの治療用糖タンパク質の産生のための宿主株になるように、治療用タンパク質上での高い部位占有を伴う、均一でかつ完全に機能カスタマイズされたN-グリカンを産生するように修飾されている単細胞キネトプラスト目の真核宿主細胞に関する。
【０１４４】
本発明は、哺乳動物の酵素活性(例えば、N-アセチルグルコサミン伸長、ガラクトシル化、及びシアリル化に関与するもの)をキネトプラスト類の真核宿主細胞の細胞内区画にうまくターゲッティングし、発現させるために使用することができる核酸分子及びコンビナトリアルライブラリーを提供する。シアリル化糖タンパク質の産生のためのCMP-シアル酸生合成経路の設計も提供される。
【０１４５】
(7.1  宿主細胞)
ある実施態様において、本発明は、グリコシル化に関与する任意の所望の遺伝子を発現させ、ターゲッティングするために使用することができる改変された宿主細胞を提供する。本発明は、哺乳動物、例えば、ヒトの治療用糖タンパク質の産生のための宿主株になるように、N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、及びシアリルトランスフェラーゼを含む、一連のグリコシルトランスフェラーゼの異種発現によって、機能カスタマイズされ、かつ均一なN-グリカンをタンパク質上に産生するように修飾されている真核宿主細胞を提供する。
【０１４６】
本発明は、全長治療用抗体を発現させ、ターゲッティングするために使用することができる改変された宿主細胞も提供する。この新規の宿主細胞は、エリスロポエチン又は抗CD20(リツキシマブ)などの糖タンパク質上の均一でかつ機能カスタマイズされたN-グリカンを合成し、発現し、かつ分泌する。
【０１４７】
本明細書に記載される発明は、本明細書に開示される特定の酵素、遺伝子、プラスミド、及びコンストラクトの使用に限定されない。当業者であれば、N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、及びCMP-Sia生合成経路酵素の合成に関与する遺伝子の任意のホモログ、変異体、及び誘導体を使用することができる。
【０１４８】
特定の実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)標的タンパク質をコードする組換え核酸;及び(b)異種グリコシルトランスフェラーゼをコードする組換え核酸を含むリーシュマニア宿主細胞である。ある実施態様において、異種グリコシルトランスフェラーゼは、N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ;及び/又は異種ガラクトシルトランスフェラーゼ;及び/又は異種シアリルトランスフェラーゼである。いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、2以上のN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼを含む宿主細胞である。他の実施態様において、異種シアリルトランスフェラーゼを含む宿主細胞は、CMP-NeuAcを生成させることができる異種CMP-Sia生合成経路タンパク質をさらに含む。
【０１４９】
一態様において、本明細書に提供されるのは、グリコシル化タンパク質を産生することができるリーシュマニア宿主細胞であり、ここで、該リーシュマニア宿主細胞は、(i)天然OST又は異種/組換えOST;(ii)異種N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、及びCMP-Sia生合成経路酵素、又はこれらの修飾バージョンをコードするヌクレオチド;並びに(iii)組換え標的タンパク質及び組換え標的タンパク質の修飾バージョンをコードするヌクレオチドを含む。さらなる実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、及び/又はシアリルトランスフェラーゼのアミノ酸配列は、表9に掲載されているN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、もしくはシアリルトランスフェラーゼ、又はこれらの任意の機能性ホモログ、アイソフォーム、もしくは変異体に由来する。
【０１５０】
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、N-グリカン生合成経路由来の1以上の内在性酵素が欠失させられ、突然変異させられ、及び/又は機能的に不活化されている宿主細胞である。さらなる実施態様において、該宿主細胞で欠失させられ、突然変異させられ、及び/又は機能的に不活化されている内在性酵素は、alg遺伝子によってコードされる。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、N-グリカン生合成経路由来の内在性酵素をコードする1以上の遺伝子が欠失させられ、突然変異させられ、及び/又は機能的に不活化されている宿主細胞である。さらに別の実施態様において、N-グリカン生合成経路由来の内在性酵素(単数又は複数)をコードする遺伝子(単数又は複数)は、当技術分野で公知の標準的な技法のいずれかを用いて(例えば、部位特異的相同組換え又はランダム突然変異誘発によって)、欠失させられ、突然変異させられ、及び/又は機能的に不活化される。ある実施態様において、該宿主細胞は、N-グリカン生合成経路由来の1以上の内在性酵素を含まないリーシュマニアの株である。
【０１５１】
ある実施態様において、リーシュマニア宿主細胞は、リーシュマニア・タレントラエ細胞である。特定の実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)標的タンパク質をコードする組換え核酸;及び(b)異種グリコシルトランスフェラーゼをコードする組換え核酸を含むリーシュマニア・タレントラエ宿主細胞である。ある実施態様において、異種グリコシルトランスフェラーゼは、N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ;及び/又は異種ガラクトシルトランスフェラーゼ;及び/又は異種シアリルトランスフェラーゼである。いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、2以上のN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼを含む宿主細胞である。他の実施態様において、異種シアリルトランスフェラーゼを含む宿主細胞は、CMP-NeuAcを生成させることができる異種CMP-Sia生合成経路タンパク質をさらに含む。
【０１５２】
一態様において、本明細書に提供されるのは、グリコシル化タンパク質を産生することができるリーシュマニア・タレントラエ宿主細胞であり、ここで、該リーシュマニア・タレントラエ宿主細胞は、(i)天然OST又は異種/組換えOST;(ii)異種N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、及びCMP-Sia生合成経路酵素、又はこれらの修飾バージョンをコードするヌクレオチド;並びに(iii)組換え標的タンパク質及び組換え標的タンパク質の修飾バージョンをコードするヌクレオチドを含む。さらなる実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、及び/又はシアリルトランスフェラーゼのアミノ酸配列は、表9に掲載されているN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、もしくはシアリルトランスフェラーゼ、又はこれらの任意の機能性ホモログ、アイソフォーム、もしくは変異体に由来する。
【０１５３】
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、リーシュマニアシグナル及び/又は保持配列が、N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、及び/又はシアリルトランスフェラーゼに付加されており、ここで、該シグナル配列が、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、及び/又はシアリルトランスフェラーゼをリーシュマニア宿主細胞の小胞体にターゲッティングし、該保持配列が、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、及び/又はシアリルトランスフェラーゼを小胞体又はゴルジ装置に保持する、宿主細胞である。別の実施態様において、該保持配列は、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ及び/又はガラクトシルトランスフェラーゼを宿主細胞の小胞体に保持する。別の実施態様において、該保持配列は、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ及び/又はガラクトシルトランスフェラーゼを宿主細胞のシスゴルジ区画に保持する。別の実施態様において、該保持配列は、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ及び/又はガラクトシルトランスフェラーゼを宿主細胞の中間ゴルジ区画に保持する。別の実施態様において、該保持配列は、該ガラクトシルトランスフェラーゼを宿主細胞のトランスゴルジ区画に保持する。別の実施態様において、該保持配列は、シアリルトランスフェラーゼを宿主細胞のトランスゴルジ区画に保持する。別の実施態様において、該保持配列は、シアリルトランスフェラーゼ及びガラクトシルトランスフェラーゼを宿主細胞のトランスゴルジ区画に保持する。別の実施態様において、該シグナル配列は、プロセシングされ、除去される。さらなる実施態様において、該保持配列は、リーシュマニア・タレントラエタンパク質に由来する細胞質-膜貫通-ステム(CTS)配列である。別の実施態様において、該CTS配列は、リーシュマニア・タレントラエMAN1、NTPDアーゼ1、又はNTPDアーゼ2に由来する。別の実施態様において、該CTS配列は、配列番号24、配列番号25、もしくは配列番号26の配列、又はその機能的活性断片を含む。別の実施態様において、該CTSは、リーシュマニア・タレントラエMAN1に由来する。別の実施態様において、該CTS配列は、配列番号24の配列又はその機能的活性断片を含む。さらなる実施態様において、該保持配列は、リーシュマニア又はその機能的活性断片に由来するGRIP配列を含む。別の実施態様において、該GRIP配列は、配列番号27の配列又はその機能的活性断片を含む。さらなる実施態様において、該保持配列は、リーシュマニアタンパク質に由来するCTS配列又はその機能的活性断片及びリーシュマニアに由来するGRIP配列又はその機能的活性断片を含む。
【０１５４】
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)標的タンパク質をコードする組換え核酸;及び(b)N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼをコードする組換え核酸を含むリーシュマニア宿主細胞である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)標的タンパク質をコードする組換え核酸;及び(b)ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする組換え核酸を含むリーシュマニア宿主細胞である。さらに別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)標的タンパク質をコードする組換え核酸;及び(b)シアリルトランスフェラーゼをコードする組換え核酸を含むリーシュマニア宿主細胞である。さらなる実施態様において、異種シアリルトランスフェラーゼを含む宿主細胞は、CMP-NeuAcを生成させることができる異種CMP-Sia生合成経路タンパク質をさらに含む。
【０１５５】
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)標的タンパク質をコードする組換え核酸;(b)N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼをコードする組換え核酸;及び(c)ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする組換え核酸を含むリーシュマニア宿主細胞である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)標的タンパク質をコードする組換え核酸;(b)N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼをコードする組換え核酸;及び(c)シアリルトランスフェラーゼをコードする組換え核酸を含むリーシュマニア宿主細胞である。さらに別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)標的タンパク質をコードする組換え核酸;(b)シアリルトランスフェラーゼをコードする組換え核酸;及び(c)ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする組換え核酸を含むリーシュマニア宿主細胞である。さらなる実施態様において、異種シアリルトランスフェラーゼを含む宿主細胞は、CMP-NeuAcを生成させることができる異種CMP-Sia生合成経路タンパク質をさらに含む。
【０１５６】
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)標的タンパク質をコードする組換え核酸;(b)N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼをコードする組換え核酸;(c)ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする組換え核酸;及び(d)シアリルトランスフェラーゼをコードする組換え核酸を含むリーシュマニア宿主細胞である。さらなる実施態様において、異種シアリルトランスフェラーゼを含む宿主細胞は、CMP-NeuAcを生成させることができる異種CMP-Sia生合成経路タンパク質をさらに含む。
【０１５７】
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)標的タンパク質をコードする組換え核酸;及び(b)N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼをコードする組換え核酸を含むリーシュマニア・タレントラエ宿主細胞である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)標的タンパク質をコードする組換え核酸;及び(b)ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする組換え核酸を含むリーシュマニア宿主細胞である。さらに別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)標的タンパク質をコードする組換え核酸;及び(b)シアリルトランスフェラーゼをコードする組換え核酸を含むリーシュマニア宿主細胞である。さらなる実施態様において、異種シアリルトランスフェラーゼを含む宿主細胞は、CMP-NeuAcを生成させることができる異種CMP-Sia生合成経路タンパク質をさらに含む。
【０１５８】
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)標的タンパク質をコードする組換え核酸;(b)N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼをコードする組換え核酸;及び(c)ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする組換え核酸を含むリーシュマニア・タレントラエ宿主細胞である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)標的タンパク質をコードする組換え核酸;(b)N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼをコードする組換え核酸;及び(c)シアリルトランスフェラーゼをコードする組換え核酸を含むリーシュマニア宿主細胞である。さらに別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)標的タンパク質をコードする組換え核酸;(b)シアリルトランスフェラーゼをコードする組換え核酸;及び(c)ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする組換え核酸を含むリーシュマニア宿主細胞である。さらなる実施態様において、異種シアリルトランスフェラーゼを含む宿主細胞は、CMP-NeuAcを生成させることができる異種CMP-Sia生合成経路タンパク質をさらに含む。
【０１５９】
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)標的タンパク質をコードする組換え核酸;(b)N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼをコードする組換え核酸;(c)ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする組換え核酸;及び(d)シアリルトランスフェラーゼをコードする組換え核酸を含むリーシュマニア宿主細胞である。さらなる実施態様において、異種シアリルトランスフェラーゼを含む宿主細胞は、CMP-NeuAcを生成させることができる異種CMP-Sia生合成経路タンパク質をさらに含む。
【０１６０】
ある実施態様において、「異種」という用語は、異なる種由来を意味する。例えば、宿主細胞内の「異種グリコシルトランスフェラーゼ」は、該宿主細胞以外の種に由来するグリコシルトランスフェラーゼである。ある実施態様において、「異種」という用語は、異なる株由来のものを意味する。例えば、宿主細胞内の「異種グリコシルトランスフェラーゼ」は、該宿主細胞以外の株に由来するグリコシルトランスフェラーゼである。より具体的な実施態様において、「異種」という用語は、異なる属由来を意味する。例えば、宿主細胞内の「異種グリコシルトランスフェラーゼ」は、該宿主細胞以外の属に由来するグリコシルトランスフェラーゼである。
【０１６１】
ある実施態様において、本明細書に提供される方法及び組成物とともに使用されるグリコシルトランスフェラーゼは、その野生型遺伝子から遺伝子修飾されているグリコシルトランスフェラーゼである。より具体的な実施態様において、そのようなグリコシルトランスフェラーゼは、同じ種又は同じ株のものである。他の実施態様において、そのようなグリコシルトランスフェラーゼは、同じ属、種、又は株のものである。
【０１６２】
(7.2  グリコシルトランスフェラーゼの細胞内局在)
いくつかの実施態様において、リーシュマニアシグナル及び保持配列は、N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、及び/又はシアリルトランスフェラーゼに付加されており、ここで、該シグナル配列は、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、及び/又はシアリルトランスフェラーゼをリーシュマニア宿主細胞の小胞体にターゲッティングし、該保持配列は、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、及び/又はシアリルトランスフェラーゼを小胞体又はゴルジ装置に保持する。いくつかの実施態様において、リーシュマニアシグナル及び保持配列は、N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ及びシアリルトランスフェラーゼに付加されており、ここで、該シグナル配列は、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ及びシアリルトランスフェラーゼをリーシュマニア宿主細胞の小胞体にターゲッティングし、該保持配列は、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ及びシアリルトランスフェラーゼを小胞体又はゴルジ装置に保持する。いくつかの実施態様において、リーシュマニアシグナル及び保持配列は、N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ及びガラクトシルトランスフェラーゼに付加されており、ここで、該シグナル配列は、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ及びガラクトシルトランスフェラーゼをリーシュマニア宿主細胞の小胞体にターゲッティングし、該保持配列は、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ及びガラクトシルトランスフェラーゼを小胞体又はゴルジ装置に保持する。いくつかの実施態様において、リーシュマニアシグナル及び保持配列は、シアリルトランスフェラーゼ及びガラクトシルトランスフェラーゼに付加されており、ここで、該シグナル配列は、該シアリルトランスフェラーゼ及びガラクトシルトランスフェラーゼをリーシュマニア宿主細胞の小胞体にターゲッティングし、該保持配列は、該シアリルトランスフェラーゼ及びガラクトシルトランスフェラーゼを小胞体又はゴルジ装置に保持する。
【０１６３】
他の実施態様において、リーシュマニアシグナル及び保持配列は、N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼに付加されており、ここで、該シグナル配列は、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼをリーシュマニア宿主細胞の小胞体にターゲッティングし、該保持配列は、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼを小胞体又はゴルジ装置に保持する。他の実施態様において、リーシュマニアシグナル及び保持配列は、N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼのN-末端に融合されている。別の実施態様において、リーシュマニアシグナル及び保持配列は、N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼのC-末端に融合されている。さらなる実施態様において、リーシュマニアシグナル及び保持配列は、N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼのN-末端に融合されていない。他の実施態様において、リーシュマニアシグナル及び保持配列は、N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼのC-末端に融合されていない。他の実施態様において、リーシュマニアシグナル及び保持配列は、N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼのポリペプチド内の1以上のアミノ酸に融合されている。
【０１６４】
他の実施態様において、リーシュマニアシグナル及び保持配列は、ガラクトシルトランスフェラーゼに付加されており、ここで、該シグナル配列は、該ガラクトシルトランスフェラーゼをリーシュマニア宿主細胞の小胞体にターゲッティングし、該保持配列は、該ガラクトシルトランスフェラーゼを小胞体又はゴルジ装置に保持する。他の実施態様において、リーシュマニアシグナル及び保持配列は、ガラクトシルトランスフェラーゼのN-末端に融合されている。別の実施態様において、リーシュマニアシグナル及び保持配列は、ガラクトシルトランスフェラーゼのC-末端に融合されている。さらなる実施態様において、リーシュマニアシグナル及び保持配列は、ガラクトシルトランスフェラーゼのN-末端に融合されていない。他の実施態様において、リーシュマニアシグナル及び保持配列は、ガラクトシルトランスフェラーゼのC-末端に融合されていない。他の実施態様において、リーシュマニアシグナル及び保持配列は、ガラクトシルトランスフェラーゼのポリペプチド内の1以上のアミノ酸に融合されている。
【０１６５】
他の実施態様において、リーシュマニアシグナル及び保持配列は、シアリルトランスフェラーゼに付加されており、ここで、該シグナル配列は、該シアリルトランスフェラーゼをリーシュマニア宿主細胞の小胞体にターゲッティングし、該保持配列は、該シアリルトランスフェラーゼを小胞体又はゴルジ装置に保持する。他の実施態様において、リーシュマニアシグナル及び保持配列は、シアリルトランスフェラーゼのN-末端に融合されている。別の実施態様において、リーシュマニアシグナル及び保持配列は、シアリルトランスフェラーゼのC-末端に融合されている。さらなる実施態様において、リーシュマニアシグナル及び保持配列は、シアリルトランスフェラーゼのN-末端に融合されていない。他の実施態様において、リーシュマニアシグナル及び保持配列は、シアリルトランスフェラーゼのC-末端に融合されていない。他の実施態様において、リーシュマニアシグナル及び保持配列は、シアリルトランスフェラーゼのポリペプチド内の1以上のアミノ酸に融合されている。
【０１６６】
別の実施態様において、該保持配列は、N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ及び/又はガラクトシルトランスフェラーゼを宿主細胞の小胞体に保持する。別の実施態様において、該保持配列は、N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ及び/又はガラクトシルトランスフェラーゼを宿主細胞のシスゴルジ区画に保持する。別の実施態様において、該保持配列は、N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ及び/又はガラクトシルトランスフェラーゼを宿主細胞の中間ゴルジ区画に保持する。別の実施態様において、該保持配列は、ガラクトシルトランスフェラーゼを宿主細胞のトランスゴルジ区画に保持する。別の実施態様において、該保持配列は、シアリルトランスフェラーゼを宿主細胞のトランスゴルジ区画に保持する。別の実施態様において、該保持配列は、シアリルトランスフェラーゼ及びガラクトシルトランスフェラーゼを宿主細胞のトランスゴルジ区画に保持する。
【０１６７】
別の実施態様において、該シグナル配列及び/又は保持配列は、任意のリーシュマニア種に由来するシグナル配列又は保持配列である。さらなる実施態様において、該シグナル配列及び/又は保持配列は、リーシュマニア・タレントラエに由来するシグナル配列又は保持配列である。
【０１６８】
さらなる実施態様において、該保持配列は、リーシュマニア・タレントラエタンパク質に由来する細胞質-膜貫通-ステム(CTS)配列である。別の実施態様において、該CTS配列は、リーシュマニア・タレントラエMAN1、NTPDアーゼ1、又はNTPDアーゼ2に由来する。別の実施態様において、該CTS配列は、配列番号24、配列番号25、もしくは配列番号26の配列、又はその機能的活性断片を含む。
【０１６９】
別の実施態様において、該CTSは、リーシュマニア・タレントラエMAN1に由来する。別の実施態様において、該CTS配列は、配列番号24の配列又はその機能的活性断片を含む。さらなる実施態様において、該CTS配列は、リーシュマニア・タレントラエMAN1に由来するCTSと少なくとも約70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一である。別の実施態様において、該CTS配列は、配列番号24の配列又はその機能的活性断片と少なくとも約70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一である配列を含む。
【０１７０】
別の実施態様において、該CTSは、リーシュマニア・タレントラエNTPDアーゼ1に由来する。別の実施態様において、該CTS配列は、配列番号25の配列又はその機能的活性断片を含む。さらなる実施態様において、該CTS配列は、リーシュマニア・タレントラエNTPDアーゼ1に由来するCTSと少なくとも約70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一である。別の実施態様において、該CTS配列は、配列番号25の配列又はその機能的活性断片と少なくとも約70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一である配列を含む。
【０１７１】
別の実施態様において、該CTSは、リーシュマニア・タレントラエNTPDアーゼ2に由来する。別の実施態様において、該CTS配列は、配列番号26の配列又はその機能的活性断片を含む。さらなる実施態様において、該CTS配列は、リーシュマニア・タレントラエNTPDアーゼ2に由来するCTSと少なくとも約70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一である。別の実施態様において、該CTS配列は、配列番号26の配列又はその機能的活性断片と少なくとも約70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一である配列を含む。
【０１７２】
さらなる実施態様において、該保持配列は、リーシュマニアに由来するGRIP配列又はその機能的活性断片を含む。別の実施態様において、該GRIP配列は、配列番号27の配列又はその機能的活性断片を含む。さらなる実施態様において、該保持配列は、リーシュマニアに由来するGRIP配列又はその機能的活性断片と少なくとも約70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％同一である。別の実施態様において、該GRIP配列は、配列番号27の配列又はその機能的活性断片と少なくとも約70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一である配列を含む。
【０１７３】
さらなる実施態様において、該保持配列は、リーシュマニアタンパク質に由来するCTS配列又はその機能的活性断片及びリーシュマニアに由来するGRIP配列又はその機能的活性断片を含む。別の実施態様において、該保持配列は、リーシュマニアタンパク質に由来するもの又はその機能的活性断片と少なくとも約70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるCTS配列及びリーシュマニアに由来するもの又はその機能的活性断片と少なくとも約70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一であるGRIP配列である。
【０１７４】
別の実施態様において、該標的タンパク質は、リーシュマニア由来のシグナル配列を含むように改変されている。他の実施態様において、該シグナル配列は、リーシュマニア・タレントラエ由来のシグナル配列である。いくつかの実施態様において、該シグナル配列は、配列番号28もしくは配列番号29の配列又はその機能的活性断片を含む。具体的な実施態様において、該シグナル配列は、配列番号28の配列又はその機能的活性断片を含む。さらに別の実施態様において、該シグナル配列は、配列番号28の配列又はその機能的活性断片と少なくとも約70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一である配列を含む。他の実施態様において、該シグナル配列は、プロセシングされ、該標的タンパク質から除去される。
【０１７５】
(7.3  N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ)
特定の実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)リーシュマニア由来のものではないN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼの触媒ドメイン;及び(b)リーシュマニアの小胞体又はゴルジ区画における局在及び保持に関与するアミノ酸配列を含む、ハイブリッドN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼである。
【０１７６】
ある実施態様において、該ハイブリッドN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、リーシュマニア・タレントラエ由来のものである。
【０１７７】
他の実施態様において、該ハイブリッドN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、シグナル配列及び少なくとも1つの保持配列を含むように改変されており、ここで、該シグナル配列は、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼをリーシュマニア・タレントラエ宿主細胞の小胞体にターゲッティングし、該保持配列は、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼを小胞体又はゴルジ装置に保持する。
【０１７８】
別の実施態様において、該ハイブリッドN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼを小胞体に保持する。別の実施態様において、該ハイブリッドN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼをシスゴルジ装置に保持する。別の実施態様において、該ハイブリッドN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼを中間ゴルジ装置に保持する。
【０１７９】
さらなる実施態様において、該保持配列は、細胞質-膜貫通-ステム(CTS)配列である。別の実施態様において、該CTS配列は、MAN1、NTPDアーゼ1、又はNTPDアーゼ2のアミノ酸配列を含む。別の実施態様において、該CTS配列は、配列番号24、配列番号25、もしくは配列番号26の配列、又はその機能的活性断片を含む。別の実施態様において、該CTSは、MAN1のアミノ酸配列を含む。別の実施態様において、該CTS配列は、配列番号24の配列又はその機能的活性断片を含む。さらなる実施態様において、該GRIP配列は、配列番号27のアミノ酸配列を含む。
【０１８０】
別の実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、GnT-Iである。別の実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、GnT-IIである。別の実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、GnT-I及びGnT-IIである。ある他の実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、表9に掲載されているN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、又はその機能性ホモログ、アイソフォーム、もしくは変異体に由来する。当技術分野で公知の任意のN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、又はそれをコードする核酸を本明細書に記載される宿主細胞及び方法に合わせて使用することができる。
【０１８１】
具体的な実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、ヒト(Homo sapiens)のN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ1である。別の実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、ヒトのマンノシル(α-1,6-)-糖タンパク質 β-1,2-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼである。ある実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、ヒト種のN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼと相同であるものである。例えば、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ又はそれをコードする核酸は、ヒトのN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ1又はマンノシル(α-1,6-)-糖タンパク質 β-1,2-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼと約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である。
【０１８２】
具体的な実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、ツマジロクサヨトウ(Spodoptera frugiperda)のN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ1である。別の実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、ツマジロクサヨトウのN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ2である。ある実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、ツマジロクサヨトウ種のN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼと相同であるものである。例えば、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ又はそれをコードする核酸は、ツマジロクサヨトウのN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ1又はN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ2と約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である。
【０１８３】
具体的な実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、トリパノソーマ・ブルセイ(Trypanosoma brucei)のN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ1である。別の実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、トリパノソーマ・ブルセイのN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ2である。ある実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、トリパノソーマ・ブルセイ種のN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼと相同であるものである。例えば、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ又はそれをコードする核酸は、トリパノソーマ・ブルセイのN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ1又はN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ2と約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である。
【０１８４】
具体的な実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、ラット(Rattus norvegicus)のN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ2である。ある実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、ラット種のN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼと相同であるものである。例えば、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ又はそれをコードする核酸は、ラットのN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ1又はN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ2と約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である。
【０１８５】
具体的な実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、ボノボ(Pan paniscus)のマンノシル(α-1,6-)-糖タンパク質 β-1,2-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼである。ある実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、ボノボ種のN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼと相同であるものである。例えば、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ又はそれをコードする核酸は、ボノボのマンノシル(α-1,6-)-糖タンパク質 β-1,2-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼと約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である。
【０１８６】
具体的な実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、イヌ(Canis lupus familiaris)のマンノシル(α-1,6-)-糖タンパク質 β-1,2-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼである。ある実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、イヌ種のN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼと相同であるものである。例えば、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ又はそれをコードする核酸は、イヌのマンノシル(α-1,6-)-糖タンパク質 β-1,2-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼと約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である。
【０１８７】
具体的な実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、ウシ(Bos taurus)のマンノシル(α-1,6-)-糖タンパク質 β-1,2-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼである。ある実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、ウシ種のN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼと相同であるものである。例えば、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ又はそれをコードする核酸は、ウシのマンノシル(α-1,6-)-糖タンパク質 β-1,2-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼと約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である。
【０１８８】
具体的な実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、マウス(Mus musculus)のマンノシドアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ2である。ある実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、マウス種のN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼと相同であるものである。例えば、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ又はそれをコードする核酸は、マウスのマンノシドアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ2と約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である。
【０１８９】
具体的な実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、ラットのマンノシル(α-1,6-)-糖タンパク質 β-1,2-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼである。ある実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、ラット種のN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼと相同であるものである。例えば、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ又はそれをコードする核酸は、ラットのマンノシル(α-1,6-)-糖タンパク質 β-1,2-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼと約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である。
【０１９０】
具体的な実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、ニワトリ(Gallus gallus)のマンノシル(α-1,6-)-糖タンパク質 β-1,2-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼである。ある実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、ニワトリ種のN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼと相同であるものである。例えば、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ又はそれをコードする核酸は、ニワトリのマンノシル(α-1,6-)-糖タンパク質 β-1,2-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼと約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である。
【０１９１】
具体的な実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、ネッタイツメガエル(Xenopus tropicalis)のマンノシル(α-1,6-)-糖タンパク質 β-1,2-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼである。ある実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、ネッタイツメガエル種のN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼと相同であるものである。例えば、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ又はそれをコードする核酸は、ネッタイツメガエルのマンノシル(α-1,6-)-糖タンパク質 β-1,2-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼと約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である。
【０１９２】
具体的な実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、ゼブラフィッシュ(Danio rerio)のマンノシル(α-1,6-)-糖タンパク質 β-1,2-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼである。ある実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、ゼブラフィッシュ種のN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼと相同であるものである。例えば、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ又はそれをコードする核酸は、ゼブラフィッシュのマンノシル(α-1,6-)-糖タンパク質 β-1,2-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼと約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である。
【０１９３】
ある実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、ガンビエハマダラカ(Anopheles gambiae)のAgaP_AGAP004397(GI: 1274542)である。ある実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、ガンビエハマダラカ種のN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼと相同であるものである。例えば、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ又はそれをコードする核酸は、ガンビエハマダラカのAgaP_AGAP004397(GI: 1274542)と約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である。
【０１９４】
ある実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、線虫(Caenorhabditis elegans)のAgaP_AGAP004397(GI: 1274542)である。ある実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、線虫種のN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼと相同であるものである。例えば、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ又はそれをコードする核酸は、線虫のAgaP_AGAP004397(GI: 1274542)と約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である。
【０１９５】
ある実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、線虫のgly-20(GI: 179562)である。ある実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、線虫種のN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼと相同であるものである。例えば、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ又はそれをコードする核酸は、線虫のgly-20(GI: 179562)と約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である。
【０１９６】
ある実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)のβ-1,2-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIIである。ある実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、シロイヌナズナ種のN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼと相同であるものである。例えば、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ又はそれをコードする核酸は、シロイヌナズナのgly β-1,2-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIIと約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である。
【０１９７】
ある実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、線虫のgly-20(GI: 179562)である。ある実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、線虫種のN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼと相同であるものである。例えば、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ又はそれをコードする核酸は、線虫のgly-20(GI: 179562)と約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である。
【０１９８】
ある実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、ニホンヤモリ(Gekko japonicus)の予測上のα-1,3-マンノシル-糖タンパク質 2-β-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ(XP_015280466.1)である。ある実施態様において、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼは、ニホンヤモリ種のN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼと相同であるものである。例えば、該N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ又はそれをコードする核酸は、ニホンヤモリのXP_015280466.1と約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である。
【０１９９】
他の実施態様において、本明細書に提供されるのは、ハイブリッドN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼをコードする核酸である。
【０２００】
(7.4  ガラクトシルトランスフェラーゼ)
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)リーシュマニア由来のものではないガラクトシルトランスフェラーゼの触媒ドメイン;及び(b)リーシュマニアの小胞体又はゴルジ区画における局在及び保持に関与するアミノ酸配列を含むハイブリッドガラクトシルトランスフェラーゼである。
【０２０１】
別の実施態様において、該ハイブリッドガラクトシルトランスフェラーゼは、リーシュマニア・タレントラエ由来のものである。
【０２０２】
さらなる実施態様において、該ハイブリッドガラクトシルトランスフェラーゼは、シグナル配列を含むように改変されており、ここで、該シグナル配列は、該ガラクトシルトランスフェラーゼをリーシュマニア・タレントラエ宿主細胞の小胞体にターゲッティングし、該保持配列は、該ガラクトシルトランスフェラーゼを小胞体又はゴルジ装置に保持する。
【０２０３】
ある実施態様において、該ハイブリッドガラクトシルトランスフェラーゼは、ガラクトシルトランスフェラーゼを小胞体に保持する。ある実施態様において、該ハイブリッドガラクトシルトランスフェラーゼは、ガラクトシルトランスフェラーゼをシスゴルジ装置に保持する。別の実施態様において、該ハイブリッドガラクトシルトランスフェラーゼは、ガラクトシルトランスフェラーゼを中間ゴルジ装置に保持する。別の実施態様において、該ハイブリッドガラクトシルトランスフェラーゼは、ガラクトシルトランスフェラーゼをトランスゴルジ装置に保持する。
【０２０４】
他の実施態様において、該保持配列は、細胞質-膜貫通-ステム(CTS)配列である。さらなる実施態様において、該ハイブリッドガラクトシルトランスフェラーゼは、GRIP配列である。ある実施態様において、該ハイブリッドガラクトシルトランスフェラーゼは、CTS配列及びGRIP配列である。別の実施態様において、該CTS配列は、MAN1、NTPDアーゼ1、又はNTPDアーゼ2のアミノ酸配列を含む。別の実施態様において、該CTS配列は、配列番号24、配列番号25、もしくは配列番号26の配列、又はその機能的活性断片を含む。別の実施態様において、該CTSは、MAN1のアミノ酸配列を含む。別の実施態様において、該CTS配列は、配列番号24の配列又はその機能的活性断片を含む。さらなる実施態様において、該GRIP配列は、配列番号27のアミノ酸配列を含む。
【０２０５】
他の実施態様において、該ガラクトシルトランスフェラーゼは、表9に掲載されているガラクトシルトランスフェラーゼ、又はその機能性ホモログ、アイソフォーム、もしくは変異体に由来する。当技術分野で公知の任意のガラクトシルトランスフェラーゼ又はそれをコードする核酸を本明細書に記載される宿主細胞及び方法に合わせて使用することができる。
【０２０６】
具体的な実施態様において、該ガラクトシルトランスフェラーゼは、ヒトのβ-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ1(B4GALT1)である。ある実施態様において、該ガラクトシルトランスフェラーゼは、ヒトの種のガラクトシルトランスフェラーゼと相同であるものである。例えば、該ガラクトシルトランスフェラーゼ又はそれをコードする核酸は、ヒトのβ-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ1と約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である。
【０２０７】
具体的な実施態様において、該ガラクトシルトランスフェラーゼは、チンパンジーのβ-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ1である。ある実施態様において、該ガラクトシルトランスフェラーゼは、チンパンジーの種のガラクトシルトランスフェラーゼと相同であるものである。例えば、該ガラクトシルトランスフェラーゼ又はそれをコードする核酸は、チンパンジーのβ-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ1と約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である。
【０２０８】
具体的な実施態様において、該ガラクトシルトランスフェラーゼは、アカゲザル(Macaca mulatta)のβ-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ1である。ある実施態様において、該ガラクトシルトランスフェラーゼは、アカゲザルの種のガラクトシルトランスフェラーゼと相同であるものである。例えば、該ガラクトシルトランスフェラーゼ又はそれをコードする核酸は、アカゲザルのβ-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ1と約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である。
【０２０９】
具体的な実施態様において、該ガラクトシルトランスフェラーゼは、イヌのβ-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ1である。ある実施態様において、該ガラクトシルトランスフェラーゼは、イヌの種のガラクトシルトランスフェラーゼと相同であるものである。例えば、該ガラクトシルトランスフェラーゼ又はそれをコードする核酸は、イヌのβ-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ1と約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である。
【０２１０】
具体的な実施態様において、該ガラクトシルトランスフェラーゼは、ウシのβ-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ1である。ある実施態様において、該ガラクトシルトランスフェラーゼは、ウシの種のガラクトシルトランスフェラーゼと相同であるものである。例えば、該ガラクトシルトランスフェラーゼ又はそれをコードする核酸は、ウシのβ-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ1と約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である。
【０２１１】
具体的な実施態様において、該ガラクトシルトランスフェラーゼは、マウスのβ-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ1である。ある実施態様において、該ガラクトシルトランスフェラーゼは、マウスの種のガラクトシルトランスフェラーゼと相同であるものである。例えば、該ガラクトシルトランスフェラーゼ又はそれをコードする核酸は、マウスのβ-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ1と約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である。
【０２１２】
具体的な実施態様において、該ガラクトシルトランスフェラーゼは、ラットのβ-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ1である。ある実施態様において、該ガラクトシルトランスフェラーゼは、ラットの種のガラクトシルトランスフェラーゼと相同であるものである。例えば、該ガラクトシルトランスフェラーゼ又はそれをコードする核酸は、ラットのβ-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ1と約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である。
【０２１３】
具体的な実施態様において、該ガラクトシルトランスフェラーゼは、ニワトリのβ-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ1である。ある実施態様において、該ガラクトシルトランスフェラーゼは、ニワトリの種のガラクトシルトランスフェラーゼと相同であるものである。例えば、該ガラクトシルトランスフェラーゼ又はそれをコードする核酸は、ニワトリのβ-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ1と約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である。
【０２１４】
具体的な実施態様において、該ガラクトシルトランスフェラーゼは、ネッタイツメガエルのβ-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ1である。ある実施態様において、該ガラクトシルトランスフェラーゼは、ネッタイツメガエルの種のガラクトシルトランスフェラーゼと相同であるものである。例えば、該ガラクトシルトランスフェラーゼ又はそれをコードする核酸は、ネッタイツメガエルのβ-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ1と約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である。
【０２１５】
具体的な実施態様において、該ガラクトシルトランスフェラーゼは、ゼブラフィッシュのβ-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ1である。ある実施態様において、該ガラクトシルトランスフェラーゼは、ゼブラフィッシュの種のガラクトシルトランスフェラーゼと相同であるものである。例えば、該ガラクトシルトランスフェラーゼ又はそれをコードする核酸は、ゼブラフィッシュのβ-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ1と約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である。
【０２１６】
さらなる実施態様において、本明細書に提供されるのは、ハイブリッドガラクトシルトランスフェラーゼをコードする核酸である。
【０２１７】
(7.5  シアリルトランスフェラーゼ)
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)リーシュマニア由来のものではないシアリルトランスフェラーゼの触媒ドメイン;及び(b)リーシュマニアの小胞体又はゴルジ区画における局在及び保持に関与するアミノ酸配列を含む、ハイブリッドシアリルトランスフェラーゼである。
【０２１８】
別の実施態様において、該ハイブリッドシアリルトランスフェラーゼは、リーシュマニア・タレントラエ由来のものである。
【０２１９】
ある実施態様において、該ハイブリッドシアリルトランスフェラーゼは、シグナル配列を含むように改変されており、ここで、該シグナル配列は、該シアリルトランスフェラーゼをリーシュマニア・タレントラエ宿主細胞の小胞体にターゲッティングし、該保持配列は、該シアリルトランスフェラーゼを小胞体又はゴルジ装置に保持する。別の実施態様において、該ハイブリッドシアリルトランスフェラーゼは、シアリルトランスフェラーゼをトランスゴルジ装置に保持する。
【０２２０】
別の実施態様において、該保持配列は、CTS配列である。さらなる実施態様において、該保持配列は、GRIP配列である。他の実施態様において、該保持配列は、CTS配列及びGRIP配列である。別の実施態様において、該CTS配列は、MAN1、NTPDアーゼ1、又はNTPDアーゼ2のアミノ酸配列を含む。別の実施態様において、該CTS配列は、配列番号24、配列番号25、もしくは配列番号26の配列、又はその機能的活性断片を含む。別の実施態様において、該CTSは、MAN1のアミノ酸配列を含む。別の実施態様において、該CTS配列は、配列番号24の配列又はその機能的活性断片を含む。別の実施態様において、該GRIP配列は、配列番号27の配列又はその機能的活性断片を含む。
【０２２１】
別の実施態様において、該シアリルトランスフェラーゼは、2,6-SiaT又は2,3-SiaTである。ある他の実施態様において、該ハイブリッドシアリルトランスフェラーゼは、表9に掲載されているシアリルトランスフェラーゼ、又はその機能性ホモログ、アイソフォーム、もしくは変異体に由来する。N-グリコシル化コンセンサス配列、例えば、Asn-X-Ser(Thr)(ここで、Xは、Pro以外の任意のアミノ酸であることができる)中のAsn残基(又は他の関連残基)に連結されているN-グリカンに連結された単糖(例えば、ガラクトース)に1以上のシアル酸残基を付加することができる任意のシアリルトランスフェラーゼ又はそれをコードする核酸を本明細書に記載される方法に合わせて使用することができ、例えば、本明細書に記載される宿主細胞に組み込むことができる。当技術分野で公知の任意のシアリルトランスフェラーゼ又はそれをコードする核酸を本明細書に記載される宿主細胞及び方法に合わせて使用することができる。
【０２２２】
具体的な実施態様において、該シアリルトランスフェラーゼは、ヒトのβ-ガラクトシド α-2,6-シアリルトランスフェラーゼ1である。別の具体的な実施態様において、該シアリルトランスフェラーゼは、ヒトのβ-ガラクトシド α-2,3-シアリルトランスフェラーゼ4である。ある実施態様において、該シアリルトランスフェラーゼは、ヒトのシアリルトランスフェラーゼと相同であるものである。例えば、該シアリルトランスフェラーゼ又はそれをコードする核酸は、ヒトのβ-ガラクトシド α-2,6-シアリルトランスフェラーゼ1又はβ-ガラクトシド α-2,3-シアリルトランスフェラーゼ4と約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である。
【０２２３】
具体的な実施態様において、該シアリルトランスフェラーゼは、マウスのβ-ガラクトシド α-2,6-シアリルトランスフェラーゼ1である。別の具体的な実施態様において、該シアリルトランスフェラーゼは、マウスのβ-ガラクトシド α-2,3-シアリルトランスフェラーゼ3である。ある実施態様において、該シアリルトランスフェラーゼは、マウスのシアリルトランスフェラーゼと相同であるものである。例えば、該シアリルトランスフェラーゼ又はそれをコードする核酸は、マウスのβ-ガラクトシド α-2,6-シアリルトランスフェラーゼ1又はβ-ガラクトシド α-2,3-シアリルトランスフェラーゼ3と約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である。
【０２２４】
具体的な実施態様において、該シアリルトランスフェラーゼは、ラットのβ-ガラクトシド α-2,6-シアリルトランスフェラーゼ1である。ある実施態様において、該シアリルトランスフェラーゼは、ラットの種のシアリルトランスフェラーゼと相同であるものである。例えば、該シアリルトランスフェラーゼ又はそれをコードする核酸は、ラットのβ-ガラクトシド α-2,6-シアリルトランスフェラーゼ1と約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である。
【０２２５】
具体的な実施態様において、該シアリルトランスフェラーゼは、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)のα-2,3-シアリルトランスフェラーゼである。ある実施態様において、該シアリルトランスフェラーゼは、カンピロバクター・ジェジュニの種のシアリルトランスフェラーゼと相同であるものである。例えば、該シアリルトランスフェラーゼ又はそれをコードする核酸は、カンピロバクター・ジェジュニのα-2,3-シアリルトランスフェラーゼと約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である。
【０２２６】
具体的な実施態様において、該シアリルトランスフェラーゼは、カンピロバクター・ジェジュニのα-2,3/8-シアリルトランスフェラーゼである。ある実施態様において、該シアリルトランスフェラーゼは、カンピロバクター・ジェジュニ種のシアリルトランスフェラーゼと相同であるものである。例えば、該シアリルトランスフェラーゼ又はそれをコードする核酸は、カンピロバクター・ジェジュニのα-2,3/8-シアリルトランスフェラーゼと約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である。
【０２２７】
具体的な実施態様において、該シアリルトランスフェラーゼは、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)(AAY89061.1)のα-2,3/2,6-シアリルトランスフェラーゼである。ある実施態様において、該シアリルトランスフェラーゼは、パスツレラ・ムルトシダの種のシアリルトランスフェラーゼと相同であるものである。例えば、該シアリルトランスフェラーゼ又はそれをコードする核酸は、パスツレラ・ムルトシダのα-2,3/2,6-シアリルトランスフェラーゼと約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である。
【０２２８】
具体的な実施態様において、該シアリルトランスフェラーゼは、フォトバクテリウム・ダムセラ(Photobacterium damselae)のα-2,6-シアリルトランスフェラーゼ(BAA25316.1)である。ある実施態様において、該シアリルトランスフェラーゼは、フォトバクテリウム・ダムセラの種のシアリルトランスフェラーゼと相同であるものである。例えば、該シアリルトランスフェラーゼ又はそれをコードする核酸は、フォトバクテリウム・ダムセラのα-2,6-シアリルトランスフェラーゼと約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である。
【０２２９】
具体的な実施態様において、該シアリルトランスフェラーゼは、フォトバクテリウム・ダムセラの仮想上のα-2,6-シアリルトランスフェラーゼ(WP_005298232.1)である。ある実施態様において、該シアリルトランスフェラーゼは、フォトバクテリウム・ダムセラの種のシアリルトランスフェラーゼと相同であるものである。例えば、該シアリルトランスフェラーゼ又はそれをコードする核酸は、フォトバクテリウム・ダムセラのα-2,6-シアリルトランスフェラーゼと約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である。
【０２３０】
具体的な実施態様において、該シアリルトランスフェラーゼは、フォトバクテリウム・レイオグナチ(Photobacterium leiognathi)の仮想上のα-2,6-シアリルトランスフェラーゼ(BAF91416.1)である。ある実施態様において、該シアリルトランスフェラーゼは、フォトバクテリウム・レイオグナチの種のシアリルトランスフェラーゼと相同であるものである。例えば、該シアリルトランスフェラーゼ又はそれをコードする核酸は、フォトバクテリウム・レイオグナチのα-2,6-シアリルトランスフェラーゼと約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である。
【０２３１】
具体的な実施態様において、該シアリルトランスフェラーゼは、フォトバクテリウム・レイオグナチの仮想上のα-2,6-シアリルトランスフェラーゼ(BAI49484.1)である。ある実施態様において、該シアリルトランスフェラーゼは、フォトバクテリウム・レイオグナチの種のシアリルトランスフェラーゼと相同であるものである。例えば、該シアリルトランスフェラーゼ又はそれをコードする核酸は、フォトバクテリウム・レイオグナチのα-2,6-シアリルトランスフェラーゼと約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である。
【０２３２】
具体的な実施態様において、該シアリルトランスフェラーゼは、フォトバクテリウム属の種の仮想上のα-2,6-シアリルトランスフェラーゼ(BAF92026.1)である。ある実施態様において、該シアリルトランスフェラーゼは、フォトバクテリウム属種の種のシアリルトランスフェラーゼと相同であるものである。例えば、該シアリルトランスフェラーゼ又はそれをコードする核酸は、フォトバクテリウム属の種のα-2,6-シアリルトランスフェラーゼと約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である。
【０２３３】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、ハイブリッドシアリルトランスフェラーゼをコードする核酸である。
【０２３４】
(7.6  CMP-Sia生合成経路)
他の実施態様において、異種シアリルトランスフェラーゼを含む宿主細胞は、CMP-NeuAcを生成させることができる異種CMP-Sia生合成経路タンパク質をさらに含む。
【０２３５】
さらなる実施態様において、CMP-NeuAcを生成させることができるCMP-Sia生合成経路タンパク質は、表11に掲載されているCMP-Sia生合成経路タンパク質又はその任意の機能性ホモログ、アイソフォーム、もしくは変異体と少なくとも約70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％同一である。当技術分野で公知の任意のシアル酸生合成酵素又はそれをコードする核酸を本明細書に記載される宿主細胞及び方法に合わせて使用することができる。
【０２３６】
具体的な実施態様において、該シアル酸生合成酵素は、マウスのUDP-GlcNAc 2-エピメラーゼ/N-アセチルマンノサミンキナーゼである。別の実施態様において、該シアル酸生合成酵素は、マウスのCMP-シアル酸トランスポーターである。ある実施態様において、該シアル酸生合成酵素は、マウスの種のシアル酸生合成酵素と相同であるものである。例えば、該シアル酸生合成酵素又はそれをコードする核酸は、マウスのUDP-GlcNAc 2-エピメラーゼ/N-アセチルマンノサミンキナーゼ又はCMP-シアル酸トランスポーターと約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である。
【０２３７】
具体的な実施態様において、該シアル酸生合成酵素は、ヒトのUDP-N-GlcNAc 2-エピメラーゼ/N-アセチルマンノサミンキナーゼである。具体的な実施態様において、該シアル酸生合成酵素は、ヒトのN-アセチルノイラミン酸ホスフェートシンターゼである。別の実施態様において、該シアル酸生合成酵素は、ヒトのNeu5Ac-9-Pホスファターゼである。具体的な実施態様において、該シアル酸生合成酵素は、ヒトのCMP-シアル酸シンテターゼである。他の実施態様において、該シアル酸生合成酵素は、ヒトのCMP-Neu5Acトランスポーターである。ある実施態様において、該シアル酸生合成酵素は、ヒトの種のシアル酸生合成酵素と相同であるものである。例えば、該シアル酸生合成酵素又はそれをコードする核酸は、ヒトのUDP-N-GlcNAc 2-エピメラーゼ/N-アセチルマンノサミンキナーゼ、N-アセチルノイラミン酸ホスフェートシンターゼ、Neu5Ac-9-Pホスファターゼ、CMP-シアル酸シンテターゼ、又はCMP-Neu5Acトランスポーターと約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である。
【０２３８】
具体的な実施態様において、該シアル酸生合成酵素は、ラットのUDP-N-GlcNAc 2-エピメラーゼ/N-アセチルマンノサミンキナーゼである。ある実施態様において、該シアル酸生合成酵素は、ラットの種のシアル酸生合成酵素と相同であるものである。例えば、該シアル酸生合成酵素又はそれをコードする核酸は、ラットのUDP-N-GlcNAc 2-エピメラーゼ/N-アセチルマンノサミンキナーゼと約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である。他の実施態様において、ラットのUDP-N-GlcNAc 2-エピメラーゼ/N-アセチルマンノサミンキナーゼは、シアル酸尿症患者のGNE/MNK由来の点突然変異を有する(Sonらの文献、2011)。
【０２３９】
具体的な実施態様において、該シアル酸生合成酵素は、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)のCMP-シアル酸シンテターゼである。別の実施態様において、該シアル酸生合成酵素は、髄膜炎菌のUDP-N-アセチルグルコサミン 2-エピメラーゼである。具体的な実施態様において、該シアル酸生合成酵素は、髄膜炎菌のCMP-シアル酸シンターゼである。ある実施態様において、該シアル酸生合成酵素は、髄膜炎菌の種のシアル酸生合成酵素と相同であるものである。例えば、該シアル酸生合成酵素又はそれをコードする核酸は、髄膜炎菌のCMP-シアル酸シンテターゼ、UDP-N-アセチルグルコサミン 2-エピメラーゼ、又はCMP-シアル酸シンターゼと約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である。
【０２４０】
具体的な実施態様において、該シアル酸生合成酵素は、大腸菌K1のCMP-シアル酸シンテターゼである。別の実施態様において、該シアル酸生合成酵素は、大腸菌K1のUDP-N-アセチルグルコサミン 2-エピメラーゼである。具体的な実施態様において、該シアル酸生合成酵素は、大腸菌K1のCMP-シアル酸シンターゼである。ある実施態様において、該シアル酸生合成酵素は、大腸菌K1の種のシアル酸生合成酵素と相同であるものである。例えば、該シアル酸生合成酵素又はそれをコードする核酸は、大腸菌K1のCMP-シアル酸シンテターゼ、UDP-N-アセチルグルコサミン 2-エピメラーゼ、又はCMP-シアル酸シンターゼと約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である。
【０２４１】
具体的な実施態様において、該シアル酸生合成酵素は、カンピロバクター・ジェジュニのN-アセチルグルコサミン-6-リン酸 2'-エピメラーゼ(CAM09378.1)であるGNPEである。別の実施態様において、該シアル酸生合成酵素は、カンピロバクター・ジェジュニのN-アセチルグルコサミン-6-リン酸 2'-エピメラーゼである。具体的な実施態様において、該シアル酸生合成酵素は、カンピロバクター・ジェジュニのN-アセチルグルコサミン-6-リン酸 2'-エピメラーゼシンターゼである。ある実施態様において、該シアル酸生合成酵素は、N-アセチルグルコサミン-6-リン酸 2'-エピメラーゼの種のシアル酸生合成酵素と相同であるものである。例えば、該シアル酸生合成酵素又はそれをコードする核酸は、カンピロバクター・ジェジュニのN-アセチルグルコサミン-6-リン酸 2'-エピメラーゼと約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である。
【０２４２】
具体的な実施態様において、該シアル酸生合成酵素は、髄膜炎菌のN-アセチルグルコサミン-6-リン酸 2'-エピメラーゼ(AAY27727.1)であるGNPEである。別の実施態様において、該シアル酸生合成酵素は、髄膜炎菌のN-アセチルグルコサミン-6-リン酸 2'-エピメラーゼである。具体的な実施態様において、該シアル酸生合成酵素は、髄膜炎菌のN-アセチルグルコサミン-6-リン酸 2'-エピメラーゼシンターゼである。ある実施態様において、該シアル酸生合成酵素は、N-アセチルグルコサミン-6-リン酸 2'-エピメラーゼの種のシアル酸生合成酵素と相同であるものである。例えば、該シアル酸生合成酵素又はそれをコードする核酸は、髄膜炎菌のN-アセチルグルコサミン-6-リン酸 2'-エピメラーゼと約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である。
【０２４３】
具体的な実施態様において、該シアル酸生合成酵素は、コリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)のN-アセチルノイラミン酸リアーゼ(NP_601846.1)であるCgNalである。別の実施態様において、該シアル酸生合成酵素は、コリネバクテリウム・グルタミクムのN-アセチルノイラミン酸リアーゼであるCgNalである。具体的な実施態様において、該シアル酸生合成酵素は、コリネバクテリウム・グルタミクムのN-アセチルノイラミン酸リアーゼであるCgNalである。ある実施態様において、該シアル酸生合成酵素は、N-アセチルノイラミン酸リアーゼであるCgNalの種のシアル酸生合成酵素と相同であるものである。例えば、該シアル酸生合成酵素又はそれをコードする核酸は、コリネバクテリウム・グルタミクムのN-アセチルノイラミン酸リアーゼであるCgNalと約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％相同である(Jiらの文献、2015)。
【０２４４】
(7.7  リーシュマニア属及びキネトプラスト目の株)
本明細書で使用される場合、宿主細胞は、リーシュマニア細胞である。ある実施態様において、宿主細胞は、リーシュマニア・タレントラエ細胞である。他の実施態様において、宿主細胞は、表13のリーシュマニア株である。
【０２４５】
ある実施態様において、宿主細胞は、リーシュマニア・エチオピカ(Leishmania aethiopica)細胞である。ある実施態様において、宿主細胞は、リーシュマニア・エチオピカ種複合体の一部である。ある実施態様において、宿主細胞は、リーシュマニア・アリスチデシ(Leishmania aristidesi)細胞である。ある実施態様において、宿主細胞は、リーシュマニア・デアネイ(Leishmania deanei)細胞である。ある実施態様において、宿主細胞は、リーシュマニア・ドノバニ(Leishmania donovani)種複合体の一部である。ある実施態様において、宿主細胞は、リーシュマニア・ドノバニ細胞である。ある実施態様において、宿主細胞は、リーシュマニア・カガシ(Leishmania chagasi)細胞である。ある実施態様において、宿主細胞は、リーシュマニア・インファンツム(Leishmania infantum)細胞である。ある実施態様において、宿主細胞は、リーシュマニア・ヘルチギ(Leishmania hertigi)細胞である。ある実施態様において、宿主細胞は、リーシュマニア・メジャー(Leishmania major)種複合体の一部である。ある実施態様において、宿主細胞は、リーシュマニア・メジャー細胞である。ある実施態様において、宿主細胞は、リーシュマニア・マルチニクエンシス(Leishmania martiniquensis)細胞である。ある実施態様において、宿主細胞は、リーシュマニア・メキシカーナ(Leishmania mexicana)種複合体の一部である。ある実施態様において、宿主細胞は、リーシュマニア・メキシカーナ細胞である。ある実施態様において、宿主細胞は、リーシュマニア・ピファノイ(Leishmania pifanoi)細胞である。ある実施態様において、宿主細胞は、リーシュマニア・トロピカ(Leishmania tropica)種複合体の一部である。ある実施態様において、宿主細胞は、リーシュマニア・トロピカ細胞である。
【０２４６】
ある実施態様において、宿主細胞は、キネトプラストのボド科(bodonidae)ファミリーに属する。具体的な実施態様において、宿主細胞は、ボド・サルタンス(Bodo saltans)細胞である。ある実施態様において、宿主細胞は、キネトプラストのイクチオボド科(ichthyobodonidae)ファミリーに属する。ある実施態様において、宿主細胞は、キネトプラストのトリパノソーマ科(trypanosomatidae)ファミリーに属する。
【０２４７】
ある実施態様において、宿主細胞は、トリパノソーマ科のブラストクリチジア(blastocrithidia)ファミリーに属する。ある実施態様において、宿主細胞は、トリパノソーマ科のブレコモナス(blechomonas)ファミリーに属する。ある実施態様において、宿主細胞は、トリパノソーマ科のヘルペトモナス(herpetomonas)ファミリーに属する。ある実施態様において、宿主細胞は、トリパノソーマ科のハエニモナス(jaenimonas)ファミリーに属する。ある実施態様において、宿主細胞は、トリパノソーマ科のラフォンテルラ(lafontella)ファミリーに属する。ある実施態様において、宿主細胞は、トリパノソーマ科のリーシュマニア(leishmaniinae)ファミリーに属する。ある実施態様において、宿主細胞は、トリパノソーマ科のノビモナス(novymonas)ファミリーに属する。ある実施態様において、宿主細胞は、トリパノソーマ科のパラトリパノソーマ(paratrypanosoma)ファミリーに属する。ある実施態様において、宿主細胞は、トリパノソーマ科のフィトモナス(phytomonas)ファミリーに属する。ある実施態様において、宿主細胞は、トリパノソーマ科のセルゲイア(sergeia)ファミリーに属する。ある実施態様において、宿主細胞は、トリパノソーマ科のストリゴモナジナエ(strigomonadinae)ファミリーに属する。ある実施態様において、宿主細胞は、トリパノソーマ科のトリパノソーマ(trypanosoma)ファミリーに属する。ある実施態様において、宿主細胞は、トリパノソーマ科のワルラセモナス(wallacemonas)ファミリーに属する。ある実施態様において、宿主細胞は、トリパノソーマ科のブラストクリチジア(blastocrithidia)ファミリーに属する。
【０２４８】
(7.8  さらなる改変リーシュマニア宿主細胞)
ある実施態様において、本明細書で使用される宿主細胞は、異種核酸、例えば、1以上のキャリアタンパク質をコードする異種核酸及び/又は1以上のタンパク質をコードする異種核酸、例えば、1以上のタンパク質をコードする遺伝子を含むように改変される。別の具体的な実施態様において、異種核酸は、本明細書に提供される挿入方法を用いて、本明細書に記載される宿主細胞に導入される。
【０２４９】
ある実施態様において、さらなる修飾を本明細書に記載される宿主細胞に(例えば、組換え技法を用いて)導入してもよい。例えば、競合又は妨害する可能性のあるグリコシル化経路の一部を形成する(例えば、宿主細胞に組換え導入されるグリコシル化に関与する1以上の異種遺伝子と競合するか又は該遺伝子を妨害する)タンパク質をコードする宿主細胞核酸(例えば、遺伝子)を、それらが不活性/機能不全になるように宿主細胞バックグラウンド(ゲノム)で欠失させるか又は修飾することができる(すなわち、欠失させられる/修飾される宿主細胞核酸は、機能的タンパク質をコードしないか、又は何であれタンパク質をコードしない)。ある実施態様において、核酸を本明細書に提供される宿主細胞のゲノムから欠失させる場合、それを所望の配列、例えば、糖タンパク質産生に有用である配列に置換する。そのような置換は、本明細書に記載される挿入方法のうちの1つ又は複数によるものであることができ、ここで、宿主細胞に挿入される異種挿入DNAは、宿主細胞から欠失させられる遺伝子の機能を置換することができる。
【０２５０】
ある実施態様において、本明細書に提供される宿主細胞は、遺伝子欠失を含み、ここで、対象となるDNA配列は、遺伝子欠失の部位で宿主細胞ゲノムに挿入されている。具体的な実施態様において、本明細書に提供される宿主細胞は、遺伝子欠失を有するリーシュマニアである。
【０２５１】
(7.9  宿主細胞への核酸の導入)
当技術分野で公知の任意の方法を用いて、核酸(例えば、その遺伝子断片)を宿主細胞、例えば、リーシュマニア・タレントラエに導入することができる。
【０２５２】
ある実施態様において、異種核酸は、プラスミドを用いて、本明細書に記載される宿主細胞に導入され、例えば、異種核酸は、プラスミド(例えば、発現ベクター)によって、宿主細胞で発現され、該プラスミドは、トランスフェクション、感染、もしくはエレクトロポレーション、熱ショックによる化学的形質転換、自然な形質転換、ファージ導入、又はコンジュゲーションによって、修飾された宿主細胞に導入される。具体的な実施態様において、該プラスミドは、安定なトランスフェクションによって、修飾された宿主細胞に導入される。
【０２５３】
具体的な実施態様において、線状化された異種核酸は、トランスフェクション、感染、もしくはエレクトロポレーション、熱ショックによる化学的形質転換、自然な形質転換、ファージ導入、又はコンジュゲーションを用いて、本明細書に記載される宿主細胞に導入される。さらなる実施態様において、異種核酸は、相同組換えによって、宿主細胞ゲノムに部位特異的に組み込まれる。
【０２５４】
(7.10  グリコシル化標的タンパク質産生の方法)
本明細書に提供されるのは、N-グリコシル化標的タンパク質を産生する方法である。
【０２５５】
一実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される宿主細胞を用いて、グリコシル化標的タンパク質をインビボで産生する方法である。具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、グリコシル化標的タンパク質を産生する方法であって、(i)本明細書に提供される宿主細胞をタンパク質産生に好適な条件下で培養すること、及び(ii)該標的タンパク質を単離することを含む、方法である。具体的な実施態様において、該宿主細胞は、(a)標的タンパク質をコードする組換え核酸;及び(b)異種グリコシルトランスフェラーゼをコードする組換え核酸を含む。ある実施態様において、該異種グリコシルトランスフェラーゼは、N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ;又は異種ガラクトシルトランスフェラーゼ;又は異種シアリルトランスフェラーゼである。ある実施態様において、該宿主細胞は、リーシュマニア細胞である。
【０２５６】
ある実施態様において、提供される宿主細胞によって産生される標的タンパク質は、治療用タンパク質、すなわち、疾患又は障害の治療で使用されるタンパク質である。例えば、本明細書に提供される宿主細胞によって産生される標的タンパク質は、酵素、サイトカイン、又は抗体であることができ、ここで、該標的タンパク質は、グリコシル化、例えば、シアリル化されている。標的タンパク質の非限定的なリストは、下の第7.12節に提供されている。
【０２５７】
(7.11  細胞を培養する方法)
本明細書に提供されるのは、宿主細胞を培養する方法である。
【０２５８】
一実施態様において、宿主細胞は、当技術分野で公知の標準的な培養技法のいずれかを用いて培養される。例えば、細胞は、全て5ug/mlのヘミンを含有する、ブレインハートインフュージョン、トリプチケースソイブロス、又は酵母抽出液のようなリッチ培地中で、常法により培養される。さらに、インキュベーションは、静止又は振盪培養として、暗所26℃で、2〜3日間行われる。いくつかの実施態様において、組換え細胞株の培養物は、適切な選択剤を含有する。選択剤の非限定的なリストは、表9に提供されている。
【０２５９】
(7.12  標的タンパク質)
当技術分野で公知の任意のタンパク質(又は該タンパク質に対応するペプチド/ポリペプチド)を本明細書に記載される方法に合わせて標的タンパク質として使用することができる。当業者は、既知のタンパク質及び新たに同定されたタンパク質の核酸配列を当技術分野で公知の方法を用いて容易に推定することができ、したがって、対象となる任意のタンパク質をコードする核酸を本明細書に提供される宿主細胞に導入すること(例えば、発現ベクター、例えば、プラスミドによるもの、例えば、相同組換えによる部位特異的組込み)が十分に当業者の能力の範囲内であることを容易に理解するであろう。
【０２６０】
他の実施態様において、標的タンパク質は、ヒトインターフェロン-α(INF-α)、インターフェロン-β(INF-β)、インターフェロン-γ(INF-γ)、インターロイキン-2(IL2)、キメラジフテリアトキシン-IL-2(デニロイキンディフチトクス)、インターロイキン-1(IL1)、IL1B、IL3、IL4、IL11、IL21、IL22、IL1受容体アンタゴニスト(アナキンラ)、腫瘍壊死因子アルファ(TNF-α)、インスリン、プラムリンタイド、成長ホルモン(GH)、インスリン様成長因子(IGF1)、ヒト副甲状腺ホルモン、カルシトニン、グルカゴン様ペプチド-1アゴニスト(GLP-1)、グルカゴン、成長ホルモン放出ホルモン(GHRH)、セクレチン、甲状腺刺激ホルモン(TSH)、ヒト骨形成タンパク質2(hBMP2)、ヒト骨形成タンパク質7(hBMP7)、ゴナドトロピン放出ホルモン(GnRH)、ケラチノサイト成長因子(KGF)、血小板由来成長因子(PDGF)、線維芽細胞成長因子7(FGF7)、線維芽細胞成長因子20(FGF20)、線維芽細胞成長因子21(FGF21)、上皮成長因子(EGF)、血管内皮成長因子(VEGF)、ニューロトロフィン-3、ヒト濾胞刺激ホルモン(FSH)、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(HCG)、ルトロピン-α、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、CTLA4の細胞外ドメイン(例えば、FC-融合体)、又はTNF受容体の細胞外ドメイン(例えば、FC-融合体)のアミノ酸配列を含む。具体的な実施態様において、本明細書に記載される方法及び宿主細胞に合わせて使用される標的タンパク質は、酵素又は阻害因子である。標的タンパク質として使用することができる例示的な酵素及び阻害因子としては、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、第X因子、第XIII因子、第VIIa因子、アンチトロンビンIII(AT-III)、プロテインC、組織プラスミノゲン活性化因子(tPA)及びtPA変異体、ウロキナーゼ、ヒルジン、ストレプトキナーゼ、グルコセレブロシダーゼ、アルグルコシダーゼ-α、ラロニダーゼ(α-L-イズロニダーゼ)、イデュルスルファーゼ(イズロン酸-2-スルファターゼ)、ガルスルファーゼ、アガルシダーゼ-β(ヒトα-ガラクトシダーゼA)、ボツリヌストキシン、コラゲナーゼ、ヒトDNアーゼ-I、ヒアルロニダーゼ、パパイン、L-アスパラギナーゼ、ウリカーゼ(尿酸オキシダーゼ)、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼ(グルカルピダーゼ)、α1プロテアーゼ阻害因子(α1アンチトリプシン)、ラクターゼ、膵酵素(リパーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ)、及びアデノシンデアミナーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２６１】
具体的な実施態様において、本明細書に記載される方法及び宿主細胞に合わせて使用される標的タンパク質は、サイトカインである。標的タンパク質として使用することができる例示的なサイトカインとしては、インターフェロン-α(INF-α)、インターフェロン-β(INF-β)、インターフェロン-γ(INF-γ)、インターロイキン-2(IL2)、キメラジフテリアトキシン-IL-2(デニロイキンディフチトクス)、インターロイキン-1(IL1)、IL1B、IL3、IL4、IL11、IL21、IL22、IL1受容体アンタゴニスト(アナキンラ)、及び腫瘍壊死因子アルファ(TNF-α)が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２６２】
具体的な実施態様において、本明細書に記載される方法及び宿主細胞に合わせて使用される標的タンパク質は、ホルモン又は成長因子である。標的タンパク質として使用することができる例示的なホルモン及び成長因子としては、インスリン、プラムリンタイド、成長ホルモン(GH)、インスリン様成長因子(IGF1)、ヒト副甲状腺ホルモン、カルシトニン、グルカゴン様ペプチド-1アゴニスト(GLP-1)、グルカゴン、成長ホルモン放出ホルモン(GHRH)、セクレチン、甲状腺刺激ホルモン(TSH)、ヒト骨形成タンパク質2(hBMP2)、ヒト骨形成タンパク質7(hBMP7)、ゴナドトロピン放出ホルモン(GnRH)、ケラチノサイト成長因子(KGF)、血小板由来成長因子(PDGF)、線維芽細胞成長因子7(FGF7)、線維芽細胞成長因子20(FGF20)、線維芽細胞成長因子21(FGF21)、上皮成長因子(EGF)、血管内皮成長因子(VEGF)、ニューロトロフィン-3、ヒト濾胞刺激ホルモン(FSH)、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(HCG)、ルトロピン-α、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、及び顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２６３】
具体的な実施態様において、本明細書に記載される方法及び宿主細胞に合わせて使用される標的タンパク質は、受容体である。標的タンパク質として使用することができる例示的な受容体としては、ヒトCTLA4の細胞外ドメイン(例えば、Fcに融合されているもの)及び可溶性TNF受容体(例えば、Fcに融合されているもの)が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２６４】
他の実施態様において、標的タンパク質は、治療用タンパク質である。他の実施態様において、標的タンパク質は、認可された生物製剤である。別の実施態様において、治療用タンパク質は、アバタセプト(例えば、Orencia)、アフリベルセプト(例えば、Eylea)、アガルシダーゼベータ(例えば、Fabrazyme)、アルビグルチド(例えば、Eperzan)、アルデスロイキン(例えば、Proleukin)、アレファセプト(例えば、Amevive)、アルグルセラーゼ(例えば、Ceredase)、アルグルコシダーゼアルファ(例えば、LUMIZYME)、アリスキレン(例えば、Tekturna)、アルファ-1-プロテイナーゼ阻害因子(例えば、Aralast)、アルテプラーゼ(例えば、Activase)、アナキンラ(例えば、Kineret)、アニストレプラーゼ(例えば、Eminase)、ヒト炭疽菌免疫グロブリン(例えば、ANTHRASIL)、抗血友病因子(例えば、Advate)、アンチインヒビター血液凝固複合体(例えば、Feiba Nf)、アンチトロンビンアルファ、ヒトアンチトロンビンIII、抗胸腺細胞グロブリン(例えば、抗胸腺細胞グロブリン)、抗胸腺細胞グロブリン(ウマ)(例えば、ATGAM)、抗胸腺細胞グロブリン(ウサギ)(例えば、ATG-Fresenius)、アプロチニン(例えば、Trasylol)、アスフォターゼアルファ、アスパラギナーゼ(例えば、Elspar)、エルウィニア・クリサンテミのアスパラギナーゼ(例えば、Erwinaze)、ベカプレルミン(例えば、REGRANEX)、ベラタセプト(例えば、Nulojix)、ベラクタント、ビバリルジン(例えば、Angiomax)、A型ボツリヌストキシン(例えば、BOTOXE)、B型ボツリヌストキシン(例えば、Myobloc)、ブレンツキシマブベドチン(例えば、Adcetris)、ブセレリン(例えば、Suprecur)、C1エステラーゼ阻害因子(ヒト)、C1エステラーゼ阻害因子(組換え体)(例えば、Ruconest)、セルトリズマブペゴール(例えば、Cimzia)、コリオゴナドトロピンアルファ(例えば、コリオゴナドトロピンアルファ)、絨毛性ゴナドトロピン(ヒト)(例えば、Ovidrel)、絨毛性ゴナドトロピン(組換え体)(例えば、Ovitrelle)、凝固因子ix(例えば、Alprolix)、凝固因子VIIa(例えば、NovoSeven)、ヒト凝固因子X(例えば、Coagadex)、凝固因子XIIIA-サブユニット(組換え体)、コラゲナーゼ(例えば、Cordase)、コネスタットアルファ、コルチコトロピン(例えば、H.P.Acthar)、コシントロピン(例えば、Cortrosyn)、ダルベポエチンアルファ(例えば、Aranesp)、デフィブロチド(例えば、Noravid)、デニロイキンディフチトクス(例えば、Ontak)、デシルジン、ジゴキシン免疫Fab(ヒツジ)(例えば、DIGIBIND)、ドルナーゼアルファ(例えば、Pulmozyme)、ドロトレコギンアルファ(例えば、Xigris)、デュラグルチド、エフモロクトコグアルファ(例えば、ELOCTA)、エロスルファーゼアルファ、エンフュービルタイド(例えば、FUZEON)、エポエチンアルファ(例えば、Binocrit)、エポエチンゼータ(例えば、Retacrit)、エプチフィバチド(例えば、INTEGRILIN)、エタネルセプト(例えば、Enbrel)、エキセナチド(例えば、Byetta)、第IX因子複合体(ヒト)(例えば、AlphaNine)、フィブリノリジン、別名、プラスミン(例えば、Elase)、フィルグラスチム(例えば、N.A.)、フィルグラスチム-sndz、フォリトロピンアルファ(例えば、Gonal-F)、フォリトロピンベータ(例えば、Follistim AQ)、ガルスルファーゼ(例えば、Naglazyme)、胃内因子、ゲムツズマブオゾガマイシン(例えば、Mylotarg)、グラチラマー酢酸塩(例えば、Copaxone)、グルカゴン組換え体(例えば、GlucaGen)、グルカルピダーゼ(例えば、Voraxaze)、グラミシジンD(例えば、Neosporin)、B型肝炎免疫グロブリン、ヒトカルシトニン、ヒト破傷風菌トキソイド免疫グロブリン、ヒト狂犬病ウイルス免疫グロブリン(例えば、Hyperabヒト狂犬病免疫グロブリン)、ヒトRho(D)免疫グロブリン(例えば、Hyp Rho D Inj 16.5％)、ヒト血清アルブミン(例えば、Albuminar)、ヒト水痘・帯状疱疹免疫グロブリン(例えば、Varizig)、ヒアルロニダーゼ(例えば、HYLENEX)、ヒアルロニダーゼ(ヒト組換え体)、イブリツモマブチウキセタン(例えば、Zevalin)、イズルスルファーゼ(例えば、Elaprase)、イミグルセラーゼ(例えば、Cerezyme)、ヒト免疫グロブリン、インスリンアスパルト(例えば、NovoLog)、ウシインスリン、インスリンデグルデク(例えば、Tresiba)、インスリンデテミル(例えば、LEVEMIR)、インスリングラルギン(例えば、Lantus)、インスリングルリジン(例えば、APIDRA)、インスリンリスプロ(例えば、Humalog)、ブタインスリン(例えば、Iletin II)、レギュラーインスリン(例えば、Humulin R)、ブタインスリン(例えば、vetsulin)、イソフェンインスリン(例えば、Novolin N)、インターフェロンアルファ-2a、組換え体(例えば、Roferon A)、インターフェロンアルファ-2b(例えば、INTRON A)、インターフェロンアルファコン-1(例えば、INFERGEN)、インターフェロンアルファ-n1(例えば、Wellferon)、インターフェロンアルファ-n3(例えば、Alferon)、インターフェロンベータ-1a(例えば、Avonex)、インターフェロンベータ-1b(例えば、Betaseron)、インターフェロンガンマ-1b(例えば、Actimmune)、静注用免疫グロブリン(例えば、Civacir)、ラロニダーゼ(例えば、Aldurazyme)、レノグラスチム(例えば、Granocyte)、レピルジン(例えば、Refludan)、ロイプロリド(例えば、Eligard)、リラグルチド(例えば、Saxenda)、ルシナクタント(例えば、Surfaxin)、ルトロピンアルファ(例えば、Luveris)、メカセルミン(例えば、N.A.)、メノトロピン(例えば、Menopur)、メトキシポリエチレングリコール-エポエチンベータ(例えば、Mircera)、メトレレプチン(例えば、Myalept)、天然アルファインターフェロンもしくはマルチフェロン(例えば、Intron/Roferon-A)、ネシリチド(例えば、NATRECOR)、オクリプラスミン(例えば、Jetrea)、オプレルベキン(例えば、Neumega)、OspAリポタンパク質(例えば、Lymerix)、オキシトシン(例えば、Pitocin)、パリフェルミン(例えば、Kepivance)、パンクレリパーゼ(例えば、Pancrecarb)、ウシペガデマーゼ(例えば、Adagen)、ペグアスパラガーゼ(例えば、Oncaspar)、ペグフィルグラスチム(例えば、Neulasta)、ペグインターフェロンアルファ-2a(例えば、Pegasys)、ペグインターフェロンアルファ-2b(例えば、PEG-Intron)、ペグインターフェロンベータ-1a(例えば、Plegridy)、ペグロティカーゼ(例えば、(Krystexxa))、ペグビソマント(例えば、SOMAVERT)、ポラクタントアルファ(例えば、Curosurf)、プラムリンタイド(例えば、Symlin)、プレオタクト(例えば、Preotact E)、プロタミン硫酸塩(例えば、プロタミン硫酸塩注射液、USP)、ヒトプロテインS(例えば、ヒトプロテインS)、プロトロンビン(例えば、Feiba Nf)、プロトロンビン複合体(例えば、Cofact)、プロトロンビン複合体濃縮製剤(例えば、Kcentra)、Rasbウリカーゼ(例えば、Elitek)、レテプラーゼ(例えば、Retavase)、リロナセプト(例えば、Arcalyst)、ロミプロスチム(例えば、Nplate)、サクロシダーゼ(例えば、Sucraid)、サケカルシトニン(例えば、Calcimar)、サルグラモスチム(例えば、Leucomax)、サツモマブペンデチド(例えば、OncoScint)、セベリパーゼアルファ(例えば、Kanuma)、セクレチン(例えば、SecreFlo)、セルモレリン(例えば、酢酸セルモレリン)、血清アルブミン(例えば、Albunex)、ヨウ素標識血清アルブミン(例えば、Megatope)、シモクトコグアルファ(例えば、Nuwiq)、シプリューセル-T(例えば、Provenge)、ソマトトロピン組換え体(例えば、NutropinAQ)、ソマトロピン組換え体(例えば、BioTropin)、ストレプトキナーゼ(例えば、Streptase)、スソクトコグアルファ(例えば、Obizur)、タリグルセラーゼアルファ(例えば、Elelyso)、テデュグルチド(例えば、Gattex)、テネクテプラーゼ(例えば、TNKase)、テリパラチド(例えば、Forteo)、テサモレリン(例えば、Egrifta)、トロンボモデュリンアルファ(例えば、Recomodulin)、サイマルファシン(例えば、Zadaxin)、サイログロブリン、チロトロピンアルファ(例えば、Thyrogen)、ツベルクリン精製タンパク質誘導体(例えば、Aplisol)、ツロクトコグアルファ(例えば、Zonovate)、ウロフォリトロピン(例えば、BRAVELLE)、ウロキナーゼ(例えば、Kinlytic)、バソプレッシン(例えば、Pitressin)、ベラグルセラーゼアルファ(例えば、Vpriv)、アブシキシマブ(例えば、ReoPro)、アダリムマブ(例えば、Humira)、アレムツズマブ(例えば、CAMPATH)、アリロクマブ(例えば、Praluent)、アルシツモマブ(例えば、CEA-Scan)、アテゾリズマブ(例えば、Tecentriq)、バシリキシマブ(例えば、Simulect)、ベリムマブ(例えば、Benlysta)、ベバシズマブ(例えば、Avastin)、ブリナツモマブ(例えば、Blincyto)、ブロダルマブ(例えば、Siliq)、カナキヌマブ(例えば、ILARISE)、カナキヌマブ(例えば、Ilaris)、カプロマブ(例えば、ProstaScint)、セツキシマブ(例えば、Erbitux)、ダクリズマブ(例えば、Zenapax)、ダラツムマブ(例えば、DARZALEX)、デノスマブ(例えば、Xgeva)、ジヌツキシマブ(例えば、unituxin)、エクリズマブ(例えば、Soliris)、エファリズマブ(例えば、RAPTIVA)、エロツズマブ(例えば、EMPLICITI)、エボロクマブ(例えば、Repatha)、ゴリムマブ(例えば、Simponi注射液)、イブリツモマブ(例えば、Zevalin)、イダルシズマブ(例えば、Praxbind)、インフリキシマブ(例えば、REMICADE)、イピリムマブ(例えば、YERVOY)、イキセキズマブ(例えば、Taltz)、メポリズマブ(例えば、Nucala)、ムロモナブ(例えば、ORTHOCLONE OKT3)、ナタリズマブ(例えば、Tysabri)、ネシツムマブ(例えば、Portrazza)、ニボルマブ(例えば、Opdivo)、オビルトキサキシマブ(例えば、Anthim)、オビヌツズマブ(例えば、Gazyva)、オファツムマブ(例えば、Arzerra)、オマリズマブ(例えば、Xolair)、パリビズマブ(例えば、Synagis)、パニツムマブ(例えば、Vectibix)、ペンブロリズマブ(例えば、Keytruda)、ペルツズマブ(例えば、Perjeta)、ラムシルマブ(例えば、Cyramza)、ラニビズマブ(例えば、Lucentis)、ラキシバクマブ(例えば、ラキシバクマブ)、リツキシマブ(例えば、Rituxan)、セクキヌマブ(例えば、Cosentyx)、シルツキシマブ(例えば、Sylvant)、トシリズマブ(例えば、ACTEMRA)、トシツモマブ(例えば、Bexxar)、トラスツズマブ(例えば、Herceptin)、ウステキヌマブ(例えば、Stelara)、又はベドリズマブ(例えば、Entyvio)のアミノ酸配列を含む。
【０２６５】
他の実施態様において、標的タンパク質は、抗体である。別の実施態様において、標的タンパク質は、ヒトタンパク質に対する抗体である。
【０２６６】
さらなる実施態様において、抗体は、アダリムマブ(Humira); Remicade(インフリキシマブ); ReoPro(アブシキシマブ); Rituxan(リツキシマブ); Simulect(バシリキシマブ); Synagis(パリビズマブ); Herceptin(トラスツズマブ); Mylotarg(ゲムツズマブオゾガマイシン); Campath(アレムツズマブ); Zevalin(イブリツモマブチウキセタン); Xolair(オマリズマブ); Bexxar(トシツモマブ-I-131); Erbitux(セツキシマブ); Avastin(ベバシズマブ); Tysabri(ナタリズマブ); Actemra(トシリズマブ); Vectibix(パニツムマブ); Lucentis(ラニビズマブ); Soliris(エクリズマブ); Cimzia(セルトリズマブペゴール); Simponi(ゴリムマブ); Ilaris(カナキヌマブ); Stelara(ウステキヌマブ); Arzerra(オファツムマブ); Prolia(デノスマブ); Numax(モタビズマブ); ABThrax(ラキシバクマブ); Benlysta(ベリムマブ); Yervoy(イピリムマブ); Adcetris(ブレンツキシマブベドチン); Perjeta(ペルツズマブ); Kadcyla(アド-トラスツズマブエムタンシン);又はGazyva(オビヌツズマブ)のアミノ酸配列を有する。
【０２６７】
他の実施態様において、抗体は、全長抗体、Fab、F(ab')2、Scfv、又はsdAbである。他の実施態様において、標的タンパク質は、酵素又はその阻害因子のアミノ酸配列を含む。別の実施態様において、標的タンパク質は、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、第X因子、第XIII因子、第VIIa因子、アンチトロンビンIII(AT-III)、プロテインC、組織プラスミノゲン活性化因子(tPA)及びtPA変異体、ウロキナーゼ、ヒルジン、ストレプトキナーゼ、グルコセレブロシダーゼ、アルグルコシダーゼ-α、ラロニダーゼ(α-L-イズロニダーゼ)、イデュルスルファーゼ(イズロン酸-2-スルファターゼ)、ガルスルファーゼ、アガルシダーゼ-β(ヒトα-ガラクトシダーゼA)、ボツリヌストキシン、コラゲナーゼ、ヒトDNアーゼ-I、ヒアルロニダーゼ、パパイン、L-アスパラギナーゼ、ウリカーゼ(尿酸オキシダーゼ)、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼ(グルカルピダーゼ)、α1プロテアーゼ阻害因子(α1アンチトリプシン)、ラクターゼ、膵酵素(リパーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ)、及びアデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列を含む。
【０２６８】
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質は、培養培地中に分泌され、ここで、該グリコシル化標的タンパク質は、グリコシル化されている。ある実施態様において、グリコシル化標的タンパク質は、培養培地から精製される。別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質は、親和性精製又はイオン交換クロマトグラフィーによって培養培地から精製される。別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質は、FCドメインを含有し、プロテイン-Aによって培養培地から親和性精製される。別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質は、親和性タグを含有し、親和性精製される。
【０２６９】
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の集団は、少なくとも約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％均一である。さらなる実施態様において、グリコシル化によって占有されている標的タンパク質上のN-糖部位の90％〜100％。他の実施態様において、本明細書に記載される方法及び宿主細胞に合わせて使用される標的タンパク質は、全長タンパク質、切断物、タンパク質ドメイン、領域、モチーフ、又はこれらのペプチドであることができる。
【０２７０】
他の実施態様において、標的タンパク質は、Fc-融合タンパク質である。
【０２７１】
別の実施態様において、標的タンパク質は、修飾され得る。別の実施態様において、標的タンパク質は、リーシュマニア由来のシグナル配列を含むように改変されている。他の実施態様において、該シグナル配列は、プロセシングされ、標的タンパク質から除去される。別の実施態様において、標的タンパク質は、1以上のタグを含むように改変されている。他の実施態様において、該タグは、プロセシングされ、標的タンパク質から除去される。
【０２７２】
(7.13  組成物)
(7.13.1  宿主細胞を含む組成物)
一態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される宿主細胞を含む組成物である(第7.1節を参照)。そのような組成物は、本明細書に記載されるグリコシル化標的タンパク質を作製する方法で使用することができ、例えば、宿主細胞を含む組成物は、タンパク質の産生に好適な条件下で培養することができる。その後、グリコシル化標的タンパク質は、当技術分野で公知の方法を用いて、該宿主細胞を含む組成物から単離することができる。
【０２７３】
本明細書に提供される宿主細胞を含む組成物は、本明細書に記載される宿主細胞の維持及び生存に好適なさらなる成分を含むことができ、宿主細胞によるタンパク質の産生に必要又は有益なさらなる成分、例えば、誘導性プロモーターの誘導因子、例えば、アラビノース、IPTGをさらに含むことができる。
【０２７４】
(7.13.2  グリコシル化標的タンパク質を含む組成物)
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
【化２１】
2020530273.tif 000022
(ここで、四角は、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を含むオリゴ糖を担持する組成物中の標的タンパク質のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列の少なくとも約10〜20％、20％〜30％、25％〜35％、30％〜40％、35％〜45％、40％〜50％、45％〜55％、50％〜60％、55％〜65％、60％〜70％、65％〜75％、70％〜80％、75％〜85％、80％〜90％、85％〜95％、又は90％〜100％を有する。
【０２７５】
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
【化２２】
2020530273.tif 000023
(ここで、四角は、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とするG0-Gnグリカンである、該標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約10〜20％、20％〜30％、25％〜35％、30％〜40％、35％〜45％、40％〜50％、45％〜55％、50％〜60％、55％〜65％、60％〜70％、65％〜75％、70％〜80％、75％〜85％、80％〜90％、85％〜95％、又は90％〜100％を有する。
【０２７６】
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
【化２３】
2020530273.tif 000024
(ここで、四角は、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とするG0グリカンである、該標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約10〜20％、20％〜30％、25％〜35％、30％〜40％、35％〜45％、40％〜50％、45％〜55％、50％〜60％、55％〜65％、60％〜70％、65％〜75％、70％〜80％、75％〜85％、80％〜90％、85％〜95％、又は90％〜100％を有する。
【０２７７】
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
【化２４】
2020530273.tif 000025
(ここで、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)のいずれかを特徴とするG1-Gnグリカンである、該標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約10〜20％、20％〜30％、25％〜35％、30％〜40％、35％〜45％、40％〜50％、45％〜55％、50％〜60％、55％〜65％、60％〜70％、65％〜75％、70％〜80％、75％〜85％、80％〜90％、85％〜95％、又は90％〜100％を有する。
【０２７８】
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
【化２５】
2020530273.tif 000026
(ここで、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とするG2グリカンである、該標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約10〜20％、20％〜30％、25％〜35％、30％〜40％、35％〜45％、40％〜50％、45％〜55％、50％〜60％、55％〜65％、60％〜70％、65％〜75％、70％〜80％、75％〜85％、80％〜90％、85％〜95％、又は90％〜100％を有する。
【０２７９】
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
【化２６】
2020530273.tif 000027
(ここで、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とするG2グリカンである、該標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約10〜20％、20％〜30％、25％〜35％、30％〜40％、35％〜45％、40％〜50％、45％〜55％、50％〜60％、55％〜65％、60％〜70％、65％〜75％、70％〜80％、75％〜85％、80％〜90％、85％〜95％、又は90％〜100％を有する。
【０２８０】
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
【化２７】
2020530273.tif 000028
を特徴とするG2グリカンである、該標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約10〜20％、20％〜30％、25％〜35％、30％〜40％、35％〜45％、40％〜50％、45％〜55％、50％〜60％、55％〜65％、60％〜70％、65％〜75％、70％〜80％、75％〜85％、80％〜90％、85％〜95％、又は90％〜100％を有する。
【０２８１】
ここで、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである。
【０２８２】
別の実施態様において、標的タンパク質上のグリコシル化は、対象に導入されたときに該標的タンパク質の薬物動態特性を最適化するようにさらに修飾される。別の実施態様において、標的タンパク質上のグリコシル化は、シアリル化される。
【０２８３】
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
【化２８】
2020530273.tif 000029
(ここで、菱形は、シアル酸残基を表し、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とする、該標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約10〜20％、20％〜30％、25％〜35％、30％〜40％、35％〜45％、40％〜50％、45％〜55％、50％〜60％、55％〜65％、60％〜70％、65％〜75％、70％〜80％、75％〜85％、80％〜90％、85％〜95％、又は90％〜100％を有する。
【０２８４】
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
【化２９】
2020530273.tif 000030
(ここで、菱形は、シアル酸残基を表し、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とする、該標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約10〜20％、20％〜30％、25％〜35％、30％〜40％、35％〜45％、40％〜50％、45％〜55％、50％〜60％、55％〜65％、60％〜70％、65％〜75％、70％〜80％、75％〜85％、80％〜90％、85％〜95％、又は90％〜100％を有する。
【０２８５】
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
【化３０】
2020530273.tif 000031
(ここで、菱形は、シアル酸残基を表し、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とする、該標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約10〜20％、20％〜30％、25％〜35％、30％〜40％、35％〜45％、40％〜50％、45％〜55％、50％〜60％、55％〜65％、60％〜70％、65％〜75％、70％〜80％、75％〜85％、80％〜90％、85％〜95％、又は90％〜100％を有する。
【０２８６】
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
【化３１】
2020530273.tif 000032
(ここで、菱形は、シアル酸残基を表し、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とする、該標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約10〜20％、20％〜30％、25％〜35％、30％〜40％、35％〜45％、40％〜50％、45％〜55％、50％〜60％、55％〜65％、60％〜70％、65％〜75％、70％〜80％、75％〜85％、80％〜90％、85％〜95％、又は90％〜100％を有する。
【０２８７】
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
【化３２】
2020530273.tif 000033
(ここで、菱形は、シアル酸残基を表し、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とする、該標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約10〜20％、20％〜30％、25％〜35％、30％〜40％、35％〜45％、40％〜50％、45％〜55％、50％〜60％、55％〜65％、60％〜70％、65％〜75％、70％〜80％、75％〜85％、80％〜90％、85％〜95％、又は90％〜100％を有する。
【０２８８】
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
【化３３】
2020530273.tif 000034
(ここで、菱形は、シアル酸残基を表し、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とする、該標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約10〜20％、20％〜30％、25％〜35％、30％〜40％、35％〜45％、40％〜50％、45％〜55％、50％〜60％、55％〜65％、60％〜70％、65％〜75％、70％〜80％、75％〜85％、80％〜90％、85％〜95％、又は90％〜100％を有する。
【０２８９】
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
【化３４】
2020530273.tif 000035
(ここで、菱形は、シアル酸残基を表し、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とする、該標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約10〜20％、20％〜30％、25％〜35％、30％〜40％、35％〜45％、40％〜50％、45％〜55％、50％〜60％、55％〜65％、60％〜70％、65％〜75％、70％〜80％、75％〜85％、80％〜90％、85％〜95％、又は90％〜100％を有する。
【０２９０】
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
【化３５】
2020530273.tif 000036
(ここで、菱形は、シアル酸残基を表し、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とする、該標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約10〜20％、20％〜30％、25％〜35％、30％〜40％、35％〜45％、40％〜50％、45％〜55％、50％〜60％、55％〜65％、60％〜70％、65％〜75％、70％〜80％、75％〜85％、80％〜90％、85％〜95％、又は90％〜100％を有する。
【０２９１】
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
【化３６】
2020530273.tif 000037
(ここで、菱形は、シアル酸残基を表し、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とする、該標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約10〜20％、20％〜30％、25％〜35％、30％〜40％、35％〜45％、40％〜50％、45％〜55％、50％〜60％、55％〜65％、60％〜70％、65％〜75％、70％〜80％、75％〜85％、80％〜90％、85％〜95％、又は90％〜100％を有する。
【０２９２】
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
【化３７】
2020530273.tif 000038
(ここで、菱形は、シアル酸残基を表し、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とする、該標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約10〜20％、20％〜30％、25％〜35％、30％〜40％、35％〜45％、40％〜50％、45％〜55％、50％〜60％、55％〜65％、60％〜70％、65％〜75％、70％〜80％、75％〜85％、80％〜90％、85％〜95％、又は90％〜100％を有する。
【０２９３】
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
【化３８】
2020530273.tif 000039
(ここで、菱形は、シアル酸残基を表し、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とする、該標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約10〜20％、20％〜30％、25％〜35％、30％〜40％、35％〜45％、40％〜50％、45％〜55％、50％〜60％、55％〜65％、60％〜70％、65％〜75％、70％〜80％、75％〜85％、80％〜90％、85％〜95％、又は90％〜100％を有する。
【０２９４】
別の実施態様において、グリコシル化標的タンパク質の組成物は、以下の構造:
【化３９】
2020530273.tif 000040
(ここで、菱形は、シアル酸残基を表し、白色の丸は、ガラクトース残基を表し、四角は、N-アセチルグルコサミン残基を表し、灰色の丸は、マンノース残基を表し;かつAsnは、該標的タンパク質中のN-結合型グリコシル化コンセンサス配列のAsnである)を特徴とする、該標的タンパク質上のグリコシル化の少なくとも約10〜20％、20％〜30％、25％〜35％、30％〜40％、35％〜45％、40％〜50％、45％〜55％、50％〜60％、55％〜65％、60％〜70％、65％〜75％、70％〜80％、75％〜85％、80％〜90％、85％〜95％、又は90％〜100％を有する。
【０２９５】
ある実施態様において、本明細書に記載されるグリコシル化標的タンパク質(第7.12節を参照)を含むことに加えて、本明細書に記載される組成物(例えば、医薬組成物)は、医薬として許容し得る担体を含む。本明細書で使用される場合、「医薬として許容し得る」という用語は、連邦もしくは州政府の規制当局によって認可されているか、又は動物での、より特には、ヒトでの使用について米国薬局方もしくは他の一般的に認められている薬局方に掲載されていることを意味する。医薬として許容し得る担体との関連において本明細書で使用される「担体」という用語は、それとともに医薬組成物が投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、又はビヒクルを指す。生理食塩水溶液並びに水性ブドウ糖及びグリセロール溶液も、特に、注射用溶液の液体担体として、利用することができる。好適な賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。好適な医薬担体の例は、E.W. Martin著、「レミントンの医薬科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)」に記載されている。
【０２９６】
ある実施態様において、本明細書に記載される組成物は、対象への意図される投与経路に好適であるように製剤化される。例えば、本明細書に記載される組成物は、皮下、非経口、経口、皮内、経皮、結腸直腸、腹腔内、及び直腸投与に好適であるように製剤化することができる。具体的な実施態様において、該医薬組成物は、静脈内、経口、腹腔内、鼻腔内、気管内、皮下、筋肉内、局所、皮内、経皮、又は肺投与用に製剤化することができる。
【０２９７】
ある実施態様において、本明細書に記載される組成物は、1以上のバッファー、例えば、リン酸バッファー及びリン酸グルタミン酸スクロースバッファーをさらに含む。他の実施態様において、本明細書に記載される組成物は、バッファーを含まない。
【０２９８】
ある実施態様において、本明細書に記載される組成物は、1以上の塩、例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸ナトリウム、グルタミン酸モノナトリウム、及びアルミニウム塩(例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、ミョウバン(硫酸カリウムアルミニウム)、又はそのようなアルミニウム塩の混合物)をさらに含む。他の実施態様において、本明細書に記載される組成物は、塩を含まない
【０２９９】
本明細書に記載される組成物は、投与の指示書と一緒にキット、容器、パック、又はディスペンサーに含めることができる。
【０３００】
本明細書に記載される組成物は、使用前に保存することができ、例えば、該組成物は、凍結させて(例えば、約-20℃でもしくは約-70℃で)保存するか;冷蔵条件で(例えば、約4℃で)保存するか;又は室温で保存することができる。
【０３０１】
(7.14  予防的及び治療的用途)
一態様において、本明細書に提供されるのは、対象の疾患又は障害を予防又は治療する方法であって、該対象に、本明細書に記載されるグリコシル化標的タンパク質又はその組成物を投与することを含む、方法である。本明細書にさらに提供されるのは、対象の疾患又は障害を予防する方法であって、該対象に、本明細書に記載されるグリコシル化標的タンパク質又はその組成物を投与することを含む、方法である。
【実施例】
【０３０２】
(8.実施例)
(8.1  実施例1  グリコシル化経路のバイオインフォマティクス的評価)
まず、リーシュマニア・タレントラエは、表1、表2、表3、表4、表5、表6、及び表7に記載されているように、分類学的に近いリーシュマニア・メジャーとさえも、初期の保存されたN-グリカン生合成工程が大きく異なることが比較ゲノム解析によって分かった。alg遺伝子の欠損により、N-グリカン前駆体の強い低下及び同じく前駆体トリミングの低下が示される(図3及び図4)(Varkiの文献、2009)。ALG3は存在するものの、ヒトALG3との比較から、ヒトALG3における機能喪失型突然変異(R171Q)に対応する、保存された残基127におけるグルタミンへの潜在的なミスセンス突然変異が明らかになっている(Sunらの文献、2005)。
表1  前駆体生合成
【表１】
2020530273.tif 000041
2020530273.tif 000042
表2  トリミング
【表２】
2020530273.tif 000043
表3  N-グリカン伸長
【表３】
2020530273.tif 000044
2020530273.tif 000045
表4  オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)
【表４】
2020530273.tif 000046
2020530273.tif 000047
表5  前駆体生合成(Neu5Ac)
【表５】
2020530273.tif 000048
表6  ヌクレオチド活性化糖の合成及び輸送
【表６】
2020530273.tif 000049
表7  リポホスホグリカン修飾酵素
【表７】
2020530273.tif 000050
【０３０３】
図3Bに概説されている驚くほど独特な生合成経路の後、トリミング及び小胞体(ER)品質管理(表1、表2、及び表8)の低下は、適切なフォールディングプロセスの保持と同時に高い部位占有に関して、糖鎖改変修飾の有益な特性を示唆している。図5は、表8にも概説されているような、通常、不適切にトリミングされたN-グリカン前駆体を逆方向に又はフォールディングされていないタンパク質をプロテアソーム分解のためのERAD経路に循環させるレクチン媒介(カルネキシン及びカルレティキュリン)経路が存在しない場合の正しい糖タンパク質フォールディングのための本シャペロン経路をより詳細に記載している(Moremenらの文献、2012)。重要なことに、OST複合体は、前駆体N-グリカンをタンパク質アクセプターのコンセンサスアスパラギンに転移するStt3からのみ構成される(表4)。L.タレントラエの場合、任意の他の記載されている真核生物と顕著に異なる縮小した前駆体がStt3によって転移され、OST複合体を含有する他の真核生物に見られる部位選好又は厳密な部位選好がないことが示唆される。
表8  ER品質管理
【表８】
2020530273.tif 000051
2020530273.tif 000052
【０３０４】
一般に認められている見方として、図6及び7は、真核細胞の小胞体及びゴルジ装置で起こるN-グリカンプロセシング工程の略図を示しており、図は、(Kellokumpuらの文献、2016)から抜粋したものである。L.タレントラエでは、切断され、縮小した前駆体は、タンパク質に転移され、それは、分泌経路を通るその輸送の間に、ゴルジ体でのそれ以上のN-グリカン伸長に失敗する。これは、GlcNAcトランスフェラーゼGnT-I及びGnT-II、Galトランスフェラーゼ、並びにシアリルトランスフェラーゼの欠如により結論付けられている(図6、表6)。さらに、比較データから、シアル酸生合成の工程の欠如が示された(表5)。密接に関連するトリパノソーマ・ブルセイのTbGnTI(Damerowらの文献、2014)及びTbGnTII(Damerowらの文献、2016)由来のゴルジ常在性GlcNAcグリコシルトランスフェラーゼは、L.タレントラエで明確には同定することができなかった。C-末端でエピトープタグ化されたTbGnTI及びTbGnTIIは、免疫蛍光によりゴルジに局在することが示された(Damerowらの文献、2014; Damerowらの文献、2016)。
【０３０５】
ヌクレオチド活性化糖供与体は、グリコシルトランスフェラーゼによって触媒される酵素反応に必要とされ、かつゴルジ区画の内腔の内側で利用可能である必要があるので、膜局在トランスポーターの存在がバイオインフォマティクスの手法により確認された。UDP-グルコースピロホスホリラーゼ、UDP-糖ピロホスホリラーゼ、UDP-ガラクトース 4-エピメラーゼ、並びにUDP-Gal/UDP-GlcNAcインポーター、GDP-Man/UDP-GlcNAcインポーター、UDP-GlcNAc/UDP-GalNAc、GDP-Manインポーター、及びUDP-Glcインポーターのホモログ(Roper及びFergusonの文献、2003; Roperらの文献、2002; Urbaniakらの文献、2006; Capulらの文献、2007)の存在が確認された(表6)。UDP-GlcNAcトランスポーター(T.クルージTcNST1及びT.ブルセイTbNST1〜4、L.メジャー)がL.タレントラエに存在し、UDP-Galトランスポーター(T.ブルセイTbNST 1及び2、L.メジャー)がL.タレントラエに存在する。これらの結果は、UDP-GlcNAcとUDP-Galの両方がゴルジ内腔に輸送されることができることを示している。したがって、LTAR_180008900.1、LTAR_240008400.1、LTAR_340034000.1、及びLTAR_300033500.1(以前の命名体系: LtaP18.0420、LtaP24.0350、LtaP34.3030、及びLtaP30.2670)は、ゴルジ内腔の内側でのGDP-Gal及びUDP-GlcNAcの利用可能性を示唆している。
【０３０６】
(8.2  実施例2  完全に機能カスタマイズされたN-グリカン変異体の糖鎖を改変するための手法)
図7及び8は、a)FcとFc受容体の相互作用の望ましい下流効果、及びb)半減期の増加(薬物動態PKの増加)、及びc)抗炎症特性(潜在的に免疫原性であるタンパク質治療薬におけるADAの発生を回避するための2,6結合Neu5Acの免疫寛容化利益のようなもの)のために、L.タレントラエにおいて均一でかつ機能カスタマイズされたN-グリカン伸長を生じさせるための糖鎖改変設計を表現している。図8は、糖鎖改変の有益な特性をもたらす主要かつ新規の違いを示す、提案されたL.タレントラエのN-グリカン生合成について記載している。本発明は、N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、及びシアリルトランスフェラーゼを含む、一連のグリコシルトランスフェラーゼの異種発現によって、機能カスタマイズされ、かつ均一なN-グリカンをタンパク質上に産生するように修飾されている真核宿主細胞に関する。
【０３０７】
(8.3  実施例3  キネトプラスト類のリーシュマニア・タレントラエにおける縮小し、かつ100％均一なN-グリカンの実験的証拠)
予想される有益な特性に基づいてL.タレントラエというキネトプラスト目の生物を選択した後、3種の野生型(wt)株(St10569、St10616、St11262)をそのネイティブなN-グリカンについて解析した。まず、細胞ペレットを変性させ、PNGアーゼA又はPNGアーゼFのいずれかにより媒介されるN-グリカン放出に供した。放出されたN-グリカンを、急速な酵素的放出及び迅速なN-グリカン標識のために、a)完全メチル化するか、又はb)Waters GlycoWorks(商標) RapiFluor-MS(商標) N-Glycanで標識した。
【０３０８】
RapiFluor(商標)を用いる蛍光標識とUPLC分離とにより、本発明者らは、計算上のm/z＝1222.7166; [M+Na]+ 1244.6985; [M+K]+ 1260.6724を有する(Man)3(GlcNAc)2に対応する1つの単一のN-グリカン形態のみを観察した。N-グリカンについては、3種の単離されたL.タレントラエ細胞の全てにおいて、ただ1つの均一なN-グリカン、いわゆる、ポーシマンノース又はMan3グリカンが同定された(図9)。
【０３０９】
本発明者らは、リーシュマニア・タレントラエの2つの異なるwt試料(St10569、St10616)のN-グリカンプロファイルを解明するために、完全メチル化も適用した。この手法(脱脂質化した細胞ペレットから得られたトリプシン消化ペプチドの脱グリコシル化又は細胞ペレットの脱脂質化後のインタクトタンパク質の直接的な脱グリコシル化)とは無関係に、1つのN-グリカン構造の存在を両方の株で確認した。基本的な(Man)3(GlcNAc)2コアに対応するこのN-グリカンは、脱グリコシル化に使用されるN-グリコシダーゼとは無関係に得られる。模擬対照は、ポリヘキソース記号によって示される、おそらくはリポホスホグリカン由来の細胞壁混入グリカンの存在を示した。ポリヘキソースの混入は抽出物のMALDIスペクトル中に観察されたが、本発明者らは、より複雑なN-グリカンに対応する可能性のあるイオンを発見しなかった。特に、α1,6又はα1,3結合フコースを有する想定された二分岐フコシル化グリカン(Gal)2(GlcNAc)2(Fuc)1+(Man)3(GlcNAc)2(G2F)(Breitlingらの文献、2002)(2244.1の理論上の完全メチル化質量[M+Na]+)は発見されなかった。スペクトルは、このm/z値を有するイオンの痕跡を含まなかった。コア構造と他の複雑なフコシル化、N-アセチルグルコサミニル化、又はガラクトシル化構造との間の可能性のある中間体が観察されなかったことに言及しておくことにも価値がある。ゴルジ体におけるN-グリコシル化経路の前駆体(例えば、Man5GlcNAc2)はいずれも同定されなかった。リーシュマニア・タレントラエにおけるN-グリカンの生合成が他の生物と同等ならば、この点は実に独特である。PNGアーゼF又はPNGアーゼAによる脱グリコシル化の後に得られるスペクトルは、同一であった。結果として、リーシュマニア・タレントラエ細胞ペレットのN-グリカンプロファイルがPNGアーゼFにより放出されないα1,3結合コアフコースを有するN-グリカンを含有するという徴候はなかった(データは示さない)。
【０３１０】
L.タレントラエのN-グリカンが他のキネトプラスト目のN-グリカンとどのように異なっているのかをさらに明らかにするために、クリチディア・ファシキュラータ、フィトモナス・ダビディ・ラフォント(Phytomonas davidi Lafont)、及びクリチジア・デアネイ(アンゴモナス)をゲノム解析及びN-グリカンプロファイリングによりさらに調べた。L.タレントラエと比較して、C.ファシキュラータは、実験的に証明された高マンノースグリカン(Man5GlcNAc2〜Man11GlcNAc2)の合成を説明するマンノシルトランスフェラーゼALG3、ALG9、及びALG11をさらに含有する(図45)。さらに、C.ファシキュラータは、L.タレントラエで欠損している品質管理シャペロンのカルレティキュリンを保有する。P.ダビディ・ラフォントについては、ゲノム情報が利用できない。PNGアーゼF及びPNGアーゼA並びにその後の完全メチル化及びMALDI-TOFによるN-グリカンプロファイリングにより、1つ又は2つのさらなるペントースを有する高マンノース型グリカン(Man9GlcNAc2)が明らかになった。C.デアネイ及びL.タレントラエのグリコシル化経路のバイオインフォマティクス的比較により、C.デアネイにおけるMAN1の欠如を除いて違いがないことが明らかになった。しかしながら、N-グリカンプロファイリングにより、コアN-グリカン(Man3GlcNAc2)が2つのヘキソース及び2つのデオキシヘキソースによってさらに修飾されることが示された(図45)。
【０３１１】
まとめると、様々な実験方法により、基本的なただ1つの均一なN-グリカンである(Man)3(GlcNAc)2が3種のL.タレントラエwt株で同定された。Man3又はポーシマンノースとも呼ばれる、(Man)3(GlcNAc)2を有する、この均一なN-グリコシル化は、これまで他のどの真核生物でも観察されたことがなく、均一なN-グリコシル化を目的としてこの生物を治療用タンパク質の発現宿主として使用し、高い部位占有を保持したままヒト化N-グリカンを糖鎖改変するための新規の特徴を表す。
【０３１２】
(8.4  実施例4  インビトロでネイティブなポーシマンノースN-グリカンを伸長させる異種グリコシルトランスフェラーゼの同定)
ヒト化された伸長二分岐N-グリカンを得るために、好適なGntをL.タレントラエで組換え発現させ、L.タレントラエの粗ライセート、膜可溶化画分、及び培養上清から親和性濃縮した。半精製酵素を、その適切な活性について、共因子及び関連する活性化ヌクレオチド糖供与体を用いてインビトロで試験した。基質は、「遊離」N-グリカン、2-アミノベンズアミド(2AB)標識N-グリカン、又はポーシマンノース(Man3)のみを含有するwt細胞由来の粗ライセートのいずれかであった。
【０３１３】
本発明は、その効果に関して、L.タレントラエ細胞から発現及び精製された昆虫又は哺乳動物源由来の試験された全ての異種Gnt候補が共因子及びその活性化糖供与体の存在下で遊離オリゴ糖基質又は2AB標識基質に対するその活性を発揮することができることを示すインビトロアッセイで解析された様々なかつ好適なグリコシルトランスフェラーゼ候補(表9)の発現を対象としている(図10〜14)。
表9  GnT候補
【表９】
2020530273.tif 000053
2020530273.tif 000054
2020530273.tif 000055
【０３１４】
分類学的に最も密接に関連する生物であるトリパノソーマ・ブルセイ由来のGnT-I(「TbGnT-I」)は、ネイティブなポーシマンノースを基質として含むwtライセートに対して活性を示さなかった(図10)。しかしながら、基質としての遊離ポーシマンノース(Man3)に対するわずかな活性(ピークの重複)が観察された。TbGnT-IIは、Man3基質に対する活性を示さず、これにより、GntIの先行活性という必要条件を示すこともできた。昆虫細胞由来のSfGnT-I活性は、ストレプトアビジン溶出により半精製した画分又は可溶化画分を遊離ポーシマンノースに対するインビトロアッセイで使用したとき、NGA2-N標準と一緒に移動するように見える特徴的なピークを伴って確認された。対照は、wtライセートのHA溶出物又はStrep溶出物のいずれかを含有していたが、使用された基質に対する修飾を示さなかった。
【０３１５】
hMGAT1をライセート+/-TritonX(TrX)から精製し、細胞ペレット由来のhMGAT1 HA-溶出画分は、2AB-Man5基質の〜100％の伸長(図11A)及び2AB-Man3基質の〜100％の伸長(図11B)基質を示した。上清(SN)のHA濃縮物由来のMGAT-I溶出画分は、2AB-Man5又は2AB-Man3に対する最小限の活性しか有さなかった。陰性対照としてのwt由来のライセートは、2AB-Man5保持時間に影響を及ぼすことも、標準を修飾することもなかった。
【０３１６】
上清又は膜画分(「ペレット」)からHA濃縮した場合のrMGAT2は、NGA2-N標準をG0(NGA2)型に効率的に変換した(図12A)。予想通り、rMGAT-2は、インビトロで2AB-Man3aをNGA2-Nへと伸長することができない(図12B)。MGAT2は、先行するGnT-I活性を必要とする。NGA2-N標準は、製造業者によると、各々約50％でα1,3結合Man分岐上のGlcNAcとα1,6結合Man分岐上のGlcNAcの両方の形態から構成されている。NGA2-N及びNGA2のピークは50/50であり、その後、α1,6のインビトロ変換は、rMGAT2により100％となる。
【０３１７】
SfGnT-IIは細胞内に局在し、細胞ライセート+/-1％(v/v) TritonX中で検出され、膜会合を示したが、非排他的ではなかった(図13)。SfGnT-IIは、検討された他のGnt候補のSfGnT-Iとは異なり、SN中に少量しか存在しなかった。HA画分を用いたインビトロ活性アッセイは、バックグラウンドノイズのために決定的なものではなかった。ライセート中のSfGnT-IIは、おそらく粗ライセート中に存在する量が少ないために、かなり低い程度のNGA2-Nの変換を示した(図13B)。SN又はライセート(+TrX)のいずれかのSfGnT-II HA溶出物を含むインビトロ活性試料は、基質として使用された純粋な2AB標準に対する強いバックグラウンド蛍光を示した(図示せず)。SfGnT-IIも、先行するGnT-I活性を必要とし(図13A)、かつMan5に対して作用しない(図13C)。
【０３１８】
基質NGA2-N(緑、76.8m)を用いて、インビトロのhB4GALT-I活性を評価した(図14A)。ストレプトアビジン精製hB4GALT-Iは、NGA2-N(緑)を仮説上同等の割合のα1-3及びα1-6 G1-Gn(a)とG1-Gn(b)に変換し(図14B);弱い(青)ピークが76.8mで検出されるので、変換は100％ではなかった。しかしながら、少なくとも＞90％の変換が予想される。B4GALT-I試料の「二重のピーク」は、G1標準(赤)由来の「二重の」ピークと同一のパターンを示しているが、構造中に1×GlcNAcが少ないため、保持時間はより短い。図14Cは、G2グライコフォームを生じるG0基質に対するB4GALT1のインビボでの予想される機能を示している。
【０３１９】
(8.5  実施例5  インビボでネイティブなタンパク質上にネイティブなポーシマンノースN-グリカンを伸長させる異種グリコシルトランスフェラーゼの同定)
次に、グリコシルトランスフェラーゼを発現する組換え宿主細胞を回収し、PNGアーゼFでそのN-グリカンを放出するように処理した。放出されたグリカンを完全メチル化又は2AB標識し、ネイティブな糖タンパク質アクセプターに対する活性を解析した。GnT-Iを発現する細胞(SfGnT-I、St11707)は、インビボでポーシマンノースを34％NGA2-N(G0-Gn)に変換した。試料は粗細胞抽出物由来のものであるので、小胞体(ER)局在糖タンパク質も含まれ、これらのタンパク質がGlcNAc伸長を達成するためにゴルジ体を通過しないことを意味する。GnT-II候補のみを発現する細胞(図示せず)は、インビトロ解析により裏付けられた知見であるGnT-Iの先行活性の必要性のため、予想通り、ポーシマンノースを伸長させることができなかった。GnT-IをGnT-II酵素と一緒に組換えにより共発現させたとき(SfGnT-I及びSfGnT-II、St12320)、2つのGlcNAcを有するポーシマンノースからG0形態への伸長が確認された(図15及び16)。
【０３２０】
完全メチル化及びMALDI TOFによって解析すると、細胞ペレット試料St10569 P16_378野生型は、ただ1つのN-グリカン構造(Man)3(GlcNAc)2(m/z 1171.6)を含有していた。リーシュマニア・タレントラエSt11707遺伝子型ssu::SfGnT-I由来の試料St11707 P16_378におけるGnt-Iの発現は、それぞれ、66％及び34％の相対強度で(Man)3(GlcNAc)2(m/z 1171.6)と(GlcNAc)1(Man)3(GlcNAc)2(m/z 1416.7)の両方の存在をもたらした。リーシュマニア・タレントラエSt12320遺伝子型ssu::SfGnT-I;ssu::SfGnT-II(ポリクローナル)由来のSt12320 P16_378におけるGnT1とGnT2の両方の共発現は、それぞれ、48％、15％、及び37％で、3つの異なるN-グリカン構造(Man)3(GlcNAc)2(m/z 1171.6)、(GlcNAc)1(Man)3(GlcNAc)2(m/z 1416.7)、及び(GlcNAc)2(Man)3(GlcNAc)2(m/z 1661.8)の存在をもたらした(図15)。
【０３２１】
さらに、N-グリカン構造に対応するイオンをMALDI-TOF/TOF MSによりフラグメント化した。m/z 1171.6のスペクトル中に存在するフラグメントイオンは、N-グリカン構造(Man)3(GlcNAc)2を裏付けるものである。m/z 1416.7のスペクトル中に存在するフラグメントイオンは、N-グリカン構造(GlcNAc)1(Man)3(GlcNAc)2を裏付けるものである。GnT-Iは、(Man)3(GlcNAc)2のα-1,3マンノースへのGlcNAcの転移を触媒する。本発明者らは、付加されたGlcNAcの位置を裏付け、m/z 560.26という予想された[M+Na]+質量を有するα-1,3マンノースに結合したGlcNAcフラグメントを識別するクロスリングフラグメントの存在について、m/z 1416.7におけるイオンのフラグメンテーションスペクトルを検索した。α-1,6結合マンノースに結合したGlcNAcの対応するクロスリングフラグメントは、m/z 546.25及び574.28の質量を有する。末端GlcNAcの結合を識別するクロスリングフラグメントは、スペクトル中に見られなかった。m/z 1661.8のスペクトル中に存在するフラグメントイオンは、N-グリカン構造(GlcNAc)2(Man)3(GlcNAc)2を裏付けるものである(図16)。
【０３２２】
細胞ペレットの脱脂質化後にインタクトタンパク質の直接的な脱グリコシル化を用いるリーシュマニア・タレントラエの3つの異なる試料のN-グリカンプロファイリングを行った。以前に解析された野生型試料について既に観察されたように、細胞ペレット試料St10569野生型は、ただ1つのN-グリカン構造(Man)3(GlcNAc)2(m/z 1171.6)を含有する。試料St11707遺伝子型ssu::GnT-IにおけるGnT-Iの発現は、(Man)3(GlcNAc)2(m/z 1171.6)と(GlcNAc)1(Man)3(GlcNAc)2(m/z 1416.7)の両方を示した。Gnt-Iは、ネイティブな糖タンパク質上に存在する(Man)3(GlcNAc)2の部分のα-1,3マンノースへのGlcNAcの転移を触媒する。St12320遺伝子型ssu::SfGnT-I; ssu::SfGnT-IIにおけるGnt-IとGnt-IIの両方の共発現は、(Man)3(GlcNAc)2(m/z 1171.6)、(GlcNAc)1(Man)3(GlcNAc)2(m/z 1416.7)、及び(GlcNAc)2(Man)3(GlcNAc)2(m/z 1661.8)という3つの異なるN-グリカンタイプの存在をもたらす。Gnt-IIのさらなる発現は、(GlcNAc)1(Man)3(GlcNAc)2のα-1,6マンノースへの第二のGlcNAc残基の転移を触媒する。
【０３２３】
したがって、これらのデータは、糖鎖改変におけるその使用のためにL.タレントラエで異種発現したときの昆虫細胞由来Gntのインビボ活性を裏付けるものである。さらに、ゴルジ内腔におけるUDP-GlcNAcの存在も示唆され、ネイティブなL.タレントラエにおける活性化ヌクレオチド糖トランスポーターの存在というバイオインフォマティクス的評価からの仮定を裏付けている。
【０３２４】
これらの知見は、GlycoWorks(商標) RapiFluor-MS(商標)を用いて、St11707及びSt12525株由来のN-グリカンを放出させ、標識し、それぞれ、SfGnT-Iのみ又はSfGnT-IIと一緒のSfGnT-Iのいずれかを発現させた場合に確認され、それについて、SfGnT-I細胞由来のG0-Gn及びSfGnT-I＋SfGnT-II細胞由来のG0グリカンが、そのm/zと一致して同定された(図17A)。St13065は、hMGAT1とrMGAT2を共発現し、そのネイティブな分泌タンパク質上にG0グリカンを生成させ、両方のGntがインビボで活性があることを示した(図17B)。
【０３２５】
興味深いことに、組合せのStrep-トリプルHAタグを有するか、Strepタグのみを有するか、又はネイティブなC-末端を有するかのいずれかのSfGnt-Iの様々な変異体に関して、活性は、それぞれ、全N-グリカンに対して20％〜75％の範囲であり、インビボでのポーシマンノースからNGA2-N(G0-Gn)への変換に対するC-末端タグのマイナスの影響を示した(図47B)。
【０３２６】
したがって、表9に示されるMGAT1ライブラリー由来の異種Gnt-I候補をC-末端タグなしで試験した。様々な種由来の組換えGnt-Iを発現するリーシュマニアは、ネイティブなMan3 N-グリカンをG0-Gnに変換した。活性は、muMGAT1(マウス)の10％のような非常に低い効率から、DrMGAT1(ゼブラフィッシュ)又はGjMGAT1(ニホンヤモリ)について示されているような、90％をさらに上回る範囲にまで及んだ(図47A)。
【０３２７】
SfGnT-I活性から得られるグリカンは、GlcNAcがα1,3 Man分岐に付加されているG0-Gnグリカンにまで至る。SfGnT-IとhB4GALT1を共発現するSt13066を作製した。GlcNAcは、インビトロでB4GALT1のアクセプターとしての役割を果たし(図14)、この活性は、m/z＝1587.63を有するG1-Gn(a)が保持時間15.32分におけるピークとして出現することにより、インビボで確認された(図17C)。
【０３２８】
これは、機能的Gntの選択、さらには、バイオインフォマティクス的評価から結論付けられるようなリーシュマニア・タレントラエのゴルジ区画におけるUDP-GlcNAc及びUDP-Galの利用可能性を支持する(表6)。したがって、インビボでの糖鎖改変が、改変され、かつ機能カスタマイズされたN-グリカンの産生のためのGntを共発現する新規のリーシュマニア・タレントラエ宿主細胞で確認された。
【０３２９】
(8.6  実施例6  インビボで組換えヒトエリスロポエチン上にネイティブなポーシマンノースN-グリカンを伸長する異種グリコシルトランスフェラーゼの同定)
ネイティブな糖タンパク質又は分泌糖タンパク質に対してばかりではないGnt活性を評価するために、組換え標的タンパク質のヒトエリスロポエチン(hEPO)をGnT-Iと共発現させた。上清中に分泌されるために、分泌移行のための2つの異なるシグナルペプチドを付けて、EPOを発現させた。ペプチドマッピング及びMSによるN-グリカン放出及び部位占有解析を行った。非糖鎖改変細胞で発現させたとき、均一なポーシマンノースがEPO上に確認されたが、GnT-Iと共発現されたEPOは、N-グリカン放出及び完全メチル化によって決定される、1つのGlcNAcを伴って伸長した約50％のN-グリカンを示した(図18)。
【０３３０】
部位占有をトリプシン消化ペプチドマッピングにより解析した(図19及び20)。両方のEPO試料の濃縮された糖ペプチド画分は、グリコシル化部位N24及びN38を有する占有された糖ペプチド
【化４０】
2020530273.tif 000056
に対応するイオンを含有する。対照的に、N83に対応する占有された糖ペプチドは検出されない。ペプチド
【化４１】
2020530273.tif 000057
上の両方のグリコシル化部位は、N-グリカンで占有されていた。野生型リーシュマニア・タレントーラ(Leishmania tarentola)株St11521で産生されたEPOは、両方のN-グリコシル化部位に結合した(Man)3(GlcNAc)2コア構造しか含有していなかった。St11895株におけるEPOとGnT-Iの共発現は、(Man)3(GlcNAc)2又は(GlcNAc)1(Man)3(GlcNAc)2のいずれかによるN-グリコシル化部位N24及びN38の占有をもたらした。両方のEPO試料において、糖ペプチド
【化４２】
2020530273.tif 000058
は、2つのN-グリコシル化部位のうちの1つだけがN-グリカンによって占有されている状態では見出されなかった。N-グリコシル化部位N24及びN38を有するペプチド[21-45]
【化４３】
2020530273.tif 000059
は、2つのN-グリカンだけで占有されているのが見出された。野生型リーシュマニア株St11521で産生されたEPOの場合、m/z 4588のイオンは、2つの(Man)3(GlcNAc)2 N-グリカンを保有する糖ペプチドに対応する。St11895株由来のEPOは、対照的に、3つの異なる糖ペプチドイオン: 2つの(Man)3(GlcNAc)2 N-グリカンを保有する糖ペプチドに対応するm/z 4588; 1つの(Man)3(GlcNAc)2及び1つの(GlcNAc)1(Man)3(GlcNAc)2を保有する糖ペプチドに対応するm/z 4792、並びに2つの(GlcNAc)1(Man)3(GlcNAc)2残基を保有する糖ペプチドに対応するm/z 4994を示した。St11521(rhEPO)株について、wt EPO N-グリコシル化部位N24及びN38は、(Man)3(GlcNAc)2コアN-グリカンだけで占有されていた。St11895(rhEPO＋SfgnT1)株について、EPOとGnT1の共発現は、(Man)3(GlcNAc)2又は(GlcNAc)1(Man)3(GlcNAc)2のいずれかによる両方の部位の占有をもたらした。これらの部位に結合した異なるN-グリカン構造を有するさらなるN-糖ペプチドイオンは、観察されなかった。
【０３３１】
タンパク質のトリプシン消化後に、本発明者らが明確に帰属可能なペプチドイオンを見出すことができなかったので、N-グリコシル化部位N83を有するペプチド[77-97]
【化４４】
2020530273.tif 000060
は、本研究で解析することができなかった。したがって、部位N83の占有に関する結論を導くことはできない。PNGアーゼによる脱グリコシル化により、明確に同定可能なイオンとしてのN-グリコシル化部位N83を有する脱グリコシル化ペプチド[77-97]
【化４５】
2020530273.tif 000061
の存在は明らかにならなかった。脱グリコシル化ペプチドの理論上のモノアイソトピック質量は2360.24Daである。St11895のP2813及びSt11521のP2814というスペクトルは、それぞれ、m/z 2361.5及び2360.01で、分離が悪い非常に微かなイオンを含有していた。これらのイオンが何であるかをフラグメンテーションによって確認することはできなかった。したがって、本発明者らは、その非グリコシル化又はその脱グリコシル化形態でのこのペプチドの存在の兆候を確認していない。
【０３３２】
両方のペプチド質量フィンガープリントにおいて、本発明者らが、N-グリコシル化部位N24及びN38を有するトリプシン消化ペプチド[21-45]
【化４６】
2020530273.tif 000062
又はN-グリコシル化部位N83を有するペプチド[77-97]
【化４７】
2020530273.tif 000063
をその非グリコシル化非含有形態で見出すことはなく、100％のN-グリコシル化占有が示された。これらのペプチドの切断の失敗は確認されなかった。3つのN-糖部位のうち2つしか専ら100％占有されていることが確認されなかったが、本発明者らは、3つ目の部位も占有されていたと推測しており、これは、以前に非糖鎖改変細胞に由来するEPOに対して実施されたインタクトタンパク質MSと相互に関連がある。
【０３３３】
(8.7  実施例7  ネイティブな分泌タンパク質からの分泌シグナルの同定)
当初、シグナルペプチドは、(Klatt及びKonthurの文献、2012)によって記載されたリーシュマニア・メキシカーナ由来のアルカリホスファターゼから得られた。本明細書において、シグナルペプチドは、ConA精製とその後のプロテオミクス的手法及びEDMAN N-末端シークエンシングを用いて同定されたネイティブな宿主細胞による分泌糖タンパク質から得られた。MSによってネイティブな宿主細胞により分泌された同定された糖タンパク質の中で、最も顕著なタンパク質は、インベルターゼ(スクロースヒドロラーゼ様タンパク質)(LTAR_040008100.1;以前の命名体系: LtaP04.0290)及びGP63変異体LTAR_100010400.1(以前の命名体系: LtaPcontig00616-1)であり(図21)、両方とも、N-グリコシル化コンセンサス部位を含有し、かつ均一なMan3ポーシマンノースN-グリカンを保有していた。EDMAN N-末端シークエンシングにより、インベルターゼ由来の推定上の分泌シグナルペプチド:
【化４８】
2020530273.tif 000064
が同定された(図22)。
【化４９】
2020530273.tif 000065
(＋異なるサイクルでさらなるアミノ酸が生じていた可能がある:第1サイクルでK、第2サイクルでP、第4サイクルでE)。これらの対応するヌクレオチドをhEPOヌクレオチドコード配列とインフレームで遺伝子融合することにより、C-末端でHis又はStrepIIタグ化されたEPOを組換え発現する宿主細胞を用いて、分泌された組換えEPOを精製した(図23)。
【０３３４】
(8.8  実施例8  正しい細胞内区画へのターゲッティング及び保持)
図6及び7で概説されているように、グリコシルトランスフェラーゼによるN-グリカンの逐次的プロセシングは、小胞体(ER)及びゴルジ体で起こる(Kellokumpuらの文献、2016)。関与する酵素(グリコシルトランスフェラーゼ及びグリコシダーゼ)は、従来、成長しているオリゴ糖鎖に糖残基を一度に1つずつ特定の順序で付加するか又は成長しているオリゴ糖鎖から糖残基を一度に1つずつ特定の順序で除去することにより、個別に順々に機能すると考えられている。これは、糖鎖改変に使用されるGntが分泌経路に沿った適切な局在及び保持によって改善され得ることを意味する。ゴルジ局在Gntの大半は、短いN-末端細胞質ドメイン(「C」)、約20アミノ酸のらせん状TMドメイン(「T」)、ステムドメイン(「S」)、そして次に、分泌経路の内腔内のC-末端球状触媒ドメインを有するII型膜タンパク質である(図24A)。グリコシル化にとってのその機能的重要性は、ホモマー又はヘテロマーとしてのその相互作用に基づくものであり得る。その分布率及びこれらの相互作用を媒介するタンパク質ドメインは、複合体形成時に生じる酵素活性変化をもたらし得る(Kellokumpuらの文献、2016)。したがって、a)正しい細胞内区画(中間ゴルジ及びトランスゴルジ、図8を参照)へのターゲッティング及び保持の改善、並びにb)糖鎖改変のためのより優れた活性をもたらすホモ及びヘテロ二量体化強化のために、ハイブリッド-Gntを設計した。
【０３３５】
図24Aは、図24Bに例示されているハイブリッドGnt設計のために本発明者らが示唆した、典型的なII型膜タンパク質の構造を示しており、この設計では、ネイティブなゴルジ体タンパク質の予測されるCTSを、異種GnT-x、以下の例では、SfGnT-Iの触媒ドメインに遺伝子融合した。図24Bは、予想されるL.タレントラエのゴルジ内在又は関連タンパク質を示している。トリパノソーマ及びリーシュマニアの分泌シグナル配列は、グラム陽性細菌と同様;哺乳動物では機能せず(Al-Qahtaniらの文献、1998)、シグナルペプチド配列の必要条件及び切断部位は、トリパノソーム(trypanosomes)と高等真核生物で異なるように思われる(La Flamme, A Cらの文献、1995)。トリパノソーマ科の分泌経路の構成は、別所で総説されている(McConvilleらの文献、2002b)。T.ブルセイの細胞表面タンパク質(GPIアンカー型)は、分泌のための非常に保存されたシグナルペプチドを含有する(Bohme及びCross, George A Mの文献、2002)。トランスゴルジネットワークのターゲッティング配列がトリパノソーマ・ブルセイに存在することが示されており、トリパノソーマ・ブルセイにおいて、T.ブルセイのGRIPドメインは、緑色蛍光タンパク質のC-末端に融合したとき(GFP-TbGRIP)、トランスフェクトされたCOS細胞のゴルジ装置に効率的に局在化した。さらに、これらのGRIPドメインはT.ブルセイ及びリーシュマニア・メキシカーナで機能したが、静止期のL.メキシカーナでは、GRIP輸送が減少した。GRIPタンパク質は、通常、GFP-GRIP融合タンパク質において、コイルドコイル領域を有すると記載されており、これらは、伸長したGRIP領域から導入される(McConvilleらの文献、2002a)。NTPDアーゼのヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼは、ヌクレオチドを加水分解し、パラサイト毒性において役割を果たし、リポホスホグリカン(LPG)伸長と関連している。L.メジャーにおいて、LmNTPDアーゼ1は、ゴルジ体に局在し、LmjF.15.0030は、TMドメイン、おそらくは、CTSモチーフを有する。LmNTPDアーゼ2は、分泌されることが示された。LmjF.10.0170は、予測されたシグナルペプチドを有する(Sansomらの文献、2014)。
【０３３６】
L.タレントラエにおけるホモログは、NTPDアーゼ1＝LTAR_150005200.1(以前の命名体系: LtaP15.0020)[LmjF.15.0030に対する最高のリバースヒット]及びNTPDアーゼ2＝LTAR_100006700.1(以前の命名体系: LtaP10.0140)[LmjF.10.0170に対する最高のrevヒット]として同定された。L.メジャーとは対照的に、両方のL.タレントラエNTPDアーゼは、CTSドメインを有する。本発明者らは、5アミノ酸を活性領域に; 10アミノ酸をハイブリッド配列の融合のためのCTS領域に設定している。CTSのステム領域の長さは、通常、明確に定義されておらず、(Geislerらの文献、2015b)は、TMドメインの後ろの13のアミノ酸を使用した。wt Gnt及びハイブリッド構造(Man1のCTS-SfGnT-I Strep; LtaNTPDアーゼ1のCTS-SfGnT-I Strep; TbGnTIのCTS-SfGnT-II)をL.タレントラエで異種発現させ、その後、その局在を粗分画実験により解析した。本発明者らはまた、GnT-y、以下の例では、ヒトMGAT1の予測されたCTSドメインを使用し、様々な長さのものをレシピエントGnT-x、以下の例では、SfGnT-Iに融合させた(図25)。これらのプラスミド(表10)を局在について試験した(図46)。増加する長さのMGAT1 N-末端ドメインをN-末端が減少するSfGnt-I触媒ドメインに融合したものを使用することにより(図46B)、細胞(膜)局在の改善が観察された(図46A)。これにより、L.タレントラエ由来のネイティブなゴルジ体局在タンパク質に由来するか又は異種ゴルジGnTに由来するかのいずれかの異なるN-末端保持シグナルを試験する仮説が強化される(MGAT1 N末端保持シグナルを使用することにより例証される)。しかしながら、N-グリカン変換に対する活性は低く、Strep-トリプルHAタグを使用したために、90MG1-SfGnT-I-3HA-Strepコンストラクトを発現するSt13561でしか検出されず、Strep-トリプルHAタグを有するネイティブなSf GnT-Iの活性は、Strepタグ化Sf-GnT-Iと比較した場合、約10％減少した(図46B)。
表10  ハイブリッド
【表１０】
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【０３３７】
まず、本発明者らは、分泌ペプチドを有する組換えヒトエリスロポエチン、又はそのネイティブなターゲッティングシグナルを含有するSfGnT-Iのいずれかを発現する組換え細胞株の通常の成長を検討した。ODをモニタリングし、細胞形状の変化を顕微鏡観察により追跡調査した。振盪培養物は高いODに達し、成長/発現は72時間でピークに達したが、96時間で減少した。静止培養物は、96時間でOD 1.8の最大成長及び発現に達し、活発な生産が持続した。成長の間、L.タレントラエ細胞は、細胞周期変化(G1＞S＞G2＞M＞G1…)に関連する形態を示した(図26A)。粗細胞ペレット(全細胞抽出物)及び上清の分離による発現及び大まかな局在は、EPOが主に分泌され、細胞内部に保持されないことを示した。また、予想されたゴルジ酵素Sf-GnT-Iは、上清中に切断形態で見出され、分泌経路を経由する潜在的なタンパク質分解的切断又はそれをL.タレントラエのゴルジ体に保持するのに適していないCTSが示唆された(図26B)。さらに、SfGnT-IもSNに分泌されるが、トリパノソーマ由来酵素は、粗画分及びTriton-X可溶化画分中にしか見られず、膜及びゴルジ局在を示した(図27)。TbGnT-I及びTbGnT-IIは、ほとんどが膜に会合していた(図27B)。SfGnT-Iは、Tb由来酵素とは対照的に、インビボ及びインビトロで十分に活性があり、したがって、本発明者らは、Sf-GnT-Iをハイブリッド設計用の触媒ドメインとして使用した。図24及び25に記載されているCTS N-末端領域をSf-GnT-Iの予測された触媒ドメインに遺伝子融合させた。図24Bの記載されているCTS変異体を除けば、TbGnT-I CTSを、機能的なGnT-I又はGnT-II酵素の触媒ドメインのN-末端に融合させるのに使用することもできた。CTS変異体は全て、機能的でかつゴルジ体に保持されるハイブリッドGntを作製するために、活性のある全てのGnt(GnT-I、GnT-II、GalT、SiaT)の触媒ドメインに使用されると仮定される。
【０３３８】
SfGnT-I全長及びそのCTS-ハイブリッドの局在は、図28に示されている。空ベクター対照はバンドを示さないが、SfGnT-I-Strep(St11898)は、抗Strep免疫ブロットにより、継代3回〜継代6回の培養物SNで、38kDa(二重のバンド)、30kDa、及び20kDaの分解物を伴って、50kDaの切断されたサイズで検出されたが、ライセート(+/-TrX)及び不溶性細胞残渣では、バンドが検出されなかった。CTS-Man1-SfGnT-I-Strep(St11899)は、47kDaのp3〜p6のSN、並びに38kDa(二重のバンド)、30kDa、及び20kDaの分解物で検出されたが(aStrep)、ライセート(+/-TrX)及び不溶性細胞残渣では、バンドが検出されなかった。CTS-LtaNTPDアーゼ1-SfGnT-I-Strep(St11900)は、それが膜画分中にもSN中にも検出されなかったので、発現されることも、安定であることも全くなかった。CTS-LtaNTPDアーゼ2-SfGnT-I-Strep(St11899)は、47kDaのp5、p6のSNで微かなバンドとして検出されたが、ライセート(+/-TrX)及び不溶性細胞残渣では、バンドが検出されなかった。これは、SfGnT-Iがより触媒ドメインの近くにタンパク質分解に利用しやすい部位を有するように思われ、CTSの増加を目指す第二の戦略を設計し、試験したときに、局在が変化しないことを示した(図25、表10、図46A、図47B)。細胞内局在は、これらの増加したハイブリッドで顕著に改善し、仮説が支持された(図47A)。しかしながら、第一に、ネイティブなSfGntIをSfGntI-Strepo及びSfGnt-I Strep-3HAと比較した場合、活性にマイナスの影響を与えるStrep-トリプルHAタグのために(図47B)、第二に、110アミノ酸のN-末端の切断も、おそらくは、SfGnT-Iの触媒活性を損なったので、N-グリカン変換を考慮することはできない。
【０３３９】
ネイティブなヒトGnt、3×HAでタグ化されたhMGAT1を発現するp5及びp6のSt12239を試験したとき、hMGAT1は、全細胞抽出物(WCE)とSNの両方で検出された。MGAT1は、細胞残渣でも検出された(図29)。これは、分泌/放出を示しているが、インビトロ活性酵素は、主に、膜画分から精製され、SNからは精製されなかった(図11)。
【０３４０】
p10のSt12318から発現されたSfGnT-II(ssu::SfGnT-II-3×HA)は、WCE及びSN中で検出され、低いレベルで分泌/放出された。SfGnT-IIはTrX-ライセート中で検出され、細胞質ゾル局在が示された。しかしながら、SfGNT-IIはTrX+ライセート中で強く検出され、膜会合が示された(図30)。
【０３４１】
p5及びp6のSt11897からのrMGAT2の相対的な強い発現(ssu::MGAT2-3×HA)が、SNへのrMGAT2の分泌、全細胞抽出物における存在、及びまたrMGAT2の細胞内/細胞質ゾル局在とともに観察された。rMGAT2は、TrX+ライセート及び不溶性画分中で強く膜に結合していることも見出された。約33〜35kDaでの分解も観察された(図31)。rMGAT2をインビトロ活性試験用にSN及びTrX+ペレットから精製した(図12)。
【０３４２】
したがって、これらの新規のハイブリッド戦略は、L.タレントラエのゴルジ区画における異種のかつ活性のあるGntの保持を支持するために必要である。
【０３４３】
(8.9  実施例9  シアル酸生合成及び二分岐N-グリカンのシアリル化)
哺乳動物及び細菌において、Neu5Acの同化及び異化は、異なる経路を通じて起こる(Angata及びVarkiの文献、2002)。2つの主要なクラスの酵素を用いて、Neu5Acを形成させることができる。N-アセチルノイラミン酸リアーゼ(Neu5Acリアーゼ)は、可逆反応でNeu5AcからN-アセチルマンノサミン(D-ManNAc)及びピルビン酸への切断を触媒することにより、シアル酸の異化に関与する。高濃度のD-ManNAc及びピルビン酸で、平衡をNeu5Acの合成にシフトさせることができる。グルコサミン 2-エピメラーゼ活性と共役させて、大腸菌由来のNeu5AcリアーゼをD-GlcNAcからの大規模なNeu5Ac産生に使用することができる。或いは、NeuBなどのNeu5Acシンターゼは、ホスホエノールピルビン酸(PEP)へのManNAcの縮合を触媒するために使用することができ、かつシアル酸の生合成に直接関与する(Tannerの文献、2005で総説されている)。CgNalは、Neu5Acの産生のためのコリネバクテリウム・グルタミクム由来のN-アセチルノイラミン酸リアーゼであり、これは、ManNAc及びピルビン酸からのNeu5Acの可逆的アルドール縮合を触媒するが、Neu5Acの切断ではなく、合成に有利である(Jiらの文献、2015)。哺乳動物のシアリル化経路における最初の工程は、活性化糖ヌクレオチド前駆体CMP-Neu5Acの生合成である。内在性に存在する代謝物質UDP-GlcNAcからのこの前駆体の生成を達成するために、少なくとも4つの酵素:(1)UDP-GlcNAcからManNAcへの変換及びManNAcからManNAc-6-リン酸へのリン酸化を触媒する二機能性酵素であるGNE;(2)ManNAc-6-リン酸とホスホエノールピルビン酸を縮合して、Neu5Ac-9-リン酸を生じさせるNANS;(3)Neu5Ac-9-リン酸に作用する特異的ホスファターゼ;並びに(4)結果として生じる核内の一級シアル酸をCMP-Neu5Acへと活性化するCMASの作用を使用することができる(Castilhoらの文献、2010)。さらに、細菌NanE又はGNPE(Geisler及びJarvisの文献、2012)は、GlcNAc-6-リン酸からの前駆体ManNAc-6-リン酸の形成にさらに有利であることができる(図53)。
【０３４４】
好適なシアリルトランスフェラーゼ(表9)をL.タレントラエで組換え発現させ、L.タレントラエの粗ライセート、膜可溶化画分、及び培養上清から親和性濃縮することができる。その後、半精製酵素(図49A)を、その適切な活性について、共因子及び活性化糖ヌクレオチド前駆体CMP-Neu5Acを用いてインビトロで試験した。図48Aは、1つのシアル酸(＝単鎖シアリル化)又は2つのシアル酸(二分岐シアリル化)を二分岐のガラクトシル化基質に転移することに関する、2AB標識G2基質に対するL.タレントラエ発現シアリルトランスフェラーゼの相対活性を示している。保持時間の比較により(図49)、2AB標識グリカンに対する結合決定を評価し、α2,6結合シアル酸又はα2,3結合シアル酸のいずれかと確認した。図48Bは、このスクリーニングアッセイにおける相対量を示している。次の手法では、主な候補(マウスmST6GAL1)を、完全にフォールディングしたモノクローナル抗体(MabThera)に対するその活性に関して試験した(図50A〜50E)。ライセートから抽出され、親和性濃縮されたmST6(図50A)は、2AB標識G2基質の100％の二分岐α2,6シアリル化をもたらしたが(図50B)、同じ酵素調製物は、主に、1つの分岐をシアリル化し(〜14％)、二分岐は、ほとんど検出不可能であった(0.4％)(図50C及び50D)。mST6のHA溶出物は、全N-グリカンの14.2％を変換(シアリル化)し(全ガラクトシル化N-グリカンの〜25％変換); rSAP＋mST6のHA溶出物は、全N-グリカンの15.36％を変換(シアリル化)した(全ガラクトシル化N-グリカン〜26.5％変換)。HA-タグを介してmST6を捕捉しているビーズ(溶出されていないもの)は、全N-グリカンの20.13％を変換(シアリル化)した(全ガラクトシル化N-グリカンの〜34.7％変換)。2μM dCTPは、mST6のHA溶出物のシアリルトランスフェラーゼ活性を阻害する(又はシアリダーゼ活性を増強する)ように思われ、全N-グリカンの4.12％の変換(シアリル化)しかもたらさなかった(全ガラクトシル化N-グリカンの〜6.9％変換)(図50D)。まとめると、mST6は、遊離状態(溶出されたもの)又は捕捉された状態(ビーズ形態)のいずれかで、MabTheraのガラクトシル化N-グリカンをインビトロでシアリル化することができ、rSAPは、ST-変換に対してわずかにプラスの効果を有し、dCTPは、ST変換を阻害する。
【０３４５】
宿主細胞を、機能的CMP-シアル酸(CMP-Sia)生合成経路を発現するように改変することができる。ピキア、昆虫細胞、及び植物のような他の多様な生物で以前に実施されているように、哺乳動物の生合成及び/又は細菌の生合成(表11)をL.タレントラエ宿主細胞で利用することができる(Aumillerらの文献、2003; Hamiltonらの文献、2006; Castilhoらの文献、2010)。CMP-NeuAcがL.タレントラエ宿主細胞のゴルジ体で利用可能となれば、特異的なシアリルトランスフェラーゼがシアル酸をアクセプター基質(例えば、β1,4-ガラクトシル化二分岐N-グリカン)に転移することができる。表9は、哺乳動物及び細菌のシアリルトランスフェラーゼを示し、図53は、生合成経路の予想される細胞内局在を示している。
表11  シアル酸生合成
【表１１】
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【０３４６】
CMP-Sia生合成経路を非ヒト真核細胞のものに改変する方法が提供されている。この方法は、内在性のシアリル化を欠くL.タレントラエ宿主細胞における哺乳動物起源、細菌起源、又はその両方のいくつかの酵素のクローニング及び発現を含む。改変されたCMP-Sia生合成経路は、シアリル化された糖脂質、O-グリカン、及びN-グリカンをインビボで産生するのに有用である。したがって、これは、内在性のシアリル化を欠く非ヒト宿主細胞におけるシアリル化された治療用糖タンパク質の生成を促進するのに有用である。
【０３４７】
α2,3-又はα2,6-シアリルトランスフェラーゼは、ヒトのトランスゴルジ及びトランスゴルジネットワーク(TGN)において、ガラクトース残基にシアル酸で蓋をし、成熟形態の糖タンパク質を生じさせる。このプロセシング工程を改変して、天然にはシアリルトランスフェラーゼ活性を欠く下等真核宿主細胞及び他の宿主細胞に導入するために、以下のもの、(1)α2,3-又はα2,6-シアリルトランスフェラーゼ活性及び(2)CMP-N-アセチルノイラミン酸の十分な供給を宿主細胞の後期ゴルジ体に組み込むことができる。分泌経路(例えば、後期ゴルジ)で十分なα2,3-又はα2,6-シアリルトランスフェラーゼ活性を得るために、例えば、既知のシアリルトランスフェラーゼ(例えば、哺乳動物又は細菌源由来のもの)の触媒ドメインを下等真核宿主細胞の分泌経路に誘導することができる。同様に、トランスポーターを改変して、分泌経路の同じ場所(例えば、後期ゴルジ)へのCMP-N-アセチルノイラミン酸の輸送を可能にすることができる。その結果、対応するグリコシルトランスフェラーゼに対する基質の十分な供給を確保するために、CMP-シアル酸の産生を代謝的に改変して、これらの宿主細胞に導入することができる。解析は全て、先に実施例4及び5で記載された通りに行うことができる。
【０３４８】
(8.10  実施例10  L.タレントラエにおける抗CD20「リツキシマブ」発現)
先に論じられ、図1及び2で模式的に示されているように、効力を改善し、治療的投薬量を低下させ、Fcグリカンによる改変によって抗体の全体的な臨床成績を向上させることにより、グリカンレパートリーの設計が様々な特性で選ばれるようになった(図32)。潜在的用途における概念を試すために、MabThera(登録商標)(Roche)として市販されている抗CD20モノクローナル抗体のリツキシマブを、その既知のADCC作用様式のテストケースとして選んだ。図33は、アミノ酸配列、シグナルペプチド、及び考察されたAsn 297糖部位を示している。図34は、L.タレントラエ宿主細胞に組み込まれる発現カセットを示している。得られた細胞株St12427を成長させ、「リツキシマブ_LMTB」と呼ばれる、培養上清中に分泌された抗体分子を回収した。濾過上清を用いて、まず、プロテインA捕捉精製、次いで、疎水性相互作用カラムという2工程で、精製を行った(図35)。
【０３４９】
図36Aは、リツキシマブ_LMTBとRoche製の市販の比較物質MabThera(登録商標)との比較を示している。非還元条件下において、リツキシマブ_LMTBは、何となく異なる強度で、MabThera(登録商標)と類似のバンドパターンを示した。分解産物の痕跡は、両方の試料で観察された。PNGアーゼFにより消化されたタンパク質は、リツキシマブ_LMTBよりもMabThera(登録商標)で大きく伸長したグリカンを有し、より大きな不均一性を示唆した。予想された違いが図36Bに示されている。キャピラリーゲル電気泳動により、これらの観察結果を裏付けた(図37)。
【０３５０】
リツキシマブ_LMTBの凝集体形成は、特にモノクローナル抗体の分離及び特徴解析用のサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)カラムである、MAbPac SEC-1を用いて、MabThera(登録商標)の0.3％と比較して、5.8％と決定された(図38)。
【０３５１】
次に、Waters GlycoWorks(商標) RapiFluor-MS(商標)手順(図39)又はPNGアーゼF放出及び完全メチル化とその後のMALDI-TOF(図40及び41)のいずれかを用いるN-グリカンプロファイリングを行って、リツキシマブ_LMTBと比較したMabThera(登録商標)のN-グリカン及びそのフコースレベルの不均一性に取り組んだ。実際、リツキシマブ_LMTBは、CHOで産生された抗体MabThera(登録商標)で見られる8つを上回るグライコフォームと比較して、100％均一なMan3グリカンを有していた。図40に示される完全メチル化に基づく定量的比較は、ADCCのFc媒介性受容体機能にとって最適ではない、大部分がフコシル化された構造を示している。実際、ADCCのために糖鎖改変だけでなく、タンパク質改変もされている第三世代の抗CD20抗体であるGazyvaro(登録商標)(Roche)は、アフコシル化N-グリカンが既に増加している(図42)。Gazyvaro(登録商標)の完全メチル化N-グリカンプロファイリングは、リーシュマニア・タレントラエで産生されたリツキシマブ及びRoche製のMabThera(登録商標)のプロファイルと顕著に異なる。主要な構造は、バイセクティングN-グリカンのG0B、G0BF、G1B、及びG1BFである。Gazyvaro(登録商標)のフコシル化レベルは、MabThera(登録商標)の94％と比較して、52％である。すなわち、リーシュマニア・タレントラエで産生されたリツキシマブ_LMTBは、Gazyvaro(登録商標)の48％及びMabThera(登録商標)のわずか6％と比較して、100％フコシル化されていない。しかし、リーシュマニア・タレントラエで産生されたリツキシマブは、Gazyvaro(登録商標)で見られる14の構造及びMabThera(登録商標)で見られる8つの構造と比較して、Man3 GlcNAc2に対応するただ1つの構造を示した。CHO細胞で産生された市販の比較物質MabThera(登録商標)の完全メチル化N-グリカンプロファイリングは、典型的なフコシル化二分岐構造であるG0F及びG1Fを主要な構造として有する8つの構造を示した。
【０３５２】
これは、治療用組換え抗体又はFc含有分子のためのリーシュマニア・タレントラエにおける均一でかつ機能カスタマイズされたN-グリカンの糖鎖改変という概念を強く支持する。
【０３５３】
さらに、FACS染色を用いて、Raji細胞でのCD20抗原結合能を決定し(図43A)、組換えCD20をスポットし、表示された抗体とともにインキュベートするドットプロット解析(図43B);両方のアッセイにおいて、リツキシマブ_LMTBは、MabThera(登録商標)と同程度に、その抗原(CD20)に結合していた。どちらの抗体も、FACSでIgG1対照抗体を上回る明白な用量依存的シグナルを生じるが、Mabtheraシグナルが若干強く見えた。
【０３５４】
図44は、表12にも掲載されている実施された模式的な品質評価をさらに示している。
表12  リツキシマブ品質基準
【表１２】
2020530273.tif 000068
【０３５５】
図52は、グリコシルトランスフェラーゼSfGnt-I Strep及びMGAT2-HAを安定に発現し;かつリツキシマブをpLMTB5026からエピソーム性に発現するリーシュマニア・タレントラエ株(St13418)におけるMan3からG0へのインビボグリカン伸長を示している。次に、分泌されたリツキシマブを1Lスケールで2日培養物からプロテインAにより精製した。20ugの精製リツキシマブ_LMTBをPNGアーゼF及びRF-MSにより解析し、これにより、インビボでの糖鎖改変が分泌標的タンパク質の全長モノクローナル抗体で成功することが示された。
【０３５６】
(8.11  材料及び方法)
(8.11.1  株、成長、及び遺伝的方法)
別途示されない限り、株(表13)は、5ug/mlのヘミンを含むブレインハートインフュージョン(BHIH)中、暗所26℃で、静止培養物又は振盪培養物として、2〜3日間、常法により成長させた。組換え細胞株の培養物は、適当な選択剤を含有していた(表14)。
表13  株
【表１３】
2020530273.tif 000069
2020530273.tif 000070
2020530273.tif 000071
表14  選択剤
【表１４】
2020530273.tif 000072
【０３５７】
安定細胞株を作製するためのトランスフェクションを下記の通りに行って、目的の異種遺伝子を組み込んだ。発現カセットは、1.)相同組換えによる部位特異的組込みのための相同性部位、2.)スプライスリーダーアクセプター配列を含有する5'非翻訳末端反復、3.)リーシュマニア(L.メジャー又はL.タレントラエのいずれか)用にコドン使用が最適化されたORFとしての目的の遺伝子、4.)例えば、ポリアデニル化配列の3'UTR及び下流遺伝子の5'UTRを含有する遺伝子間領域、5.)耐性マーカーと、それに続く、6.)その3'UTR、並びに7.)ゲノムへの部位特異的組込みのための3'相同性領域を含有している。
【０３５８】
ゲノムへの組込みのために、5〜10ugのドナープラスミドDNAを隣接する制限酵素で消化して、発現カセットをベクター骨格から切り出した。制限消化を最後まで又は30℃でo/n行い、DNAをEtOH沈殿により精製した(2容量の100％氷冷EtOHを1容量の消化したDNAに添加し、氷上で30分間インキュベートし、4℃で30分間、17'500×gで遠心分離した)。ペレットを70％EtOHで洗浄し、ペレットを最大15分間乾燥させ、ddH2Oに再懸濁させた。環状化したプラスミドの除去を最適化するために、ベクター骨格中に認識部位を有する1つ又は2つの制限酵素を選び、37℃で約1時間消化を行い、上記の通りに、EtOHにより精製した。
【０３５９】
大腸菌DH5αにおける100ngの消化したDNA、未消化の対照、及びddH2O対照の形質転換を熱ショックにより行って、インタクトなプラスミドDNAが残存しているかどうかを調べた。氷上で10〜15分間解凍した化学的にコンピテントなDH5αを100ngの消化したプラスミドDNAと慎重に混合し、氷上で25〜30分間インキュベートし、その後、42℃で90秒間、熱ショック処理し、氷上で5分間インキュベートした。1mlのLB又はSOC培地を添加し、37℃で1時間インキュベートした。その後、アリコートを、アンピシリンを含むLB上にプレーティングし、上下逆さまにして、37℃でo/nインキュベートした。
【０３６０】
トランスフェクション用のリーシュマニア培養物の調製を、26℃で静止状態で、トランスフェクション前日に、BHIH中の高密度成長培養物の1:10希釈により行った。ODを、使い捨てキュベット中で光度計を用いて600nmで測定し、最適な効率のために0.4〜1.0(4〜6×10*7細胞)の範囲にした。細胞は、対数期のものであるべきであり、これは、丸い形及び滴状の形の細胞からの混合集団によって示される。より丸い形の細胞が好ましかった。10mlの培養物を1回のトランスフェクションに使用し、1つの培養物を、それぞれの選択マーカーの陰性対照として、ddH2Oで必ずエレクトロポレーションした。トランスフェクションのために、培養物を、RTで5分間、1'800×gでスピンした。SNを除去し、ペレットを5mlのトランスフェクションバッファー(200mM Hepes pH 7.0、137mM NaCl、5mM KCl、0.7mM Na2HPO4、6mMブドウ糖、無水(グルコース)、0.22umで滅菌濾過済み)に再懸濁させた。細胞を再び遠心分離し、ペレットを400ulのトランスフェクションバッファーに再懸濁させた。400ulの細胞をDNAに添加し、キュベットに移し、氷上で10分間インキュベートした。低電圧プロトコル、指数的減衰: 450V、450uF、5〜6ms、キュベット: d＝2mmを用いて、Gene Pulser Xcell(商標)(Biorad)で、エレクトロポレーションを行った。直ちに、ちょうど10分間、氷上に置いた。キュベットの中身全体を、選択マーカーを含まない10mlのBHIHに移し、細胞を、通気して、静止状態で、暗所26℃で20〜24時間、成長させた。
【０３６１】
その後のクローン選択によるポリクローナル細胞株の選択のために、半分の濃度の選択マーカーを添加し、培養物を26℃で1〜2日間インキュベートし、10mlのBHIH＋最大濃度の選択マーカー中、1:10で継代した。新しい株番号を割り当て、継代数0とした。その後の全ての実験について、トランスフェクトした株の継代数を記録した。細胞を暗所26℃でさらに成長させた。7日後、培養物が濁った培養物に変わりつつある場合、細胞を、RTで5分間、1'800×gでスピンし、ペレットを、最大限の選択マーカー濃度を含む新しいBHIH培地に再懸濁させた。
【０３６２】
クローン選択のために、液体培養物が濁ってきたらすぐに、細胞をBHIHプレート(1.4％寒天を含有)及び適切な100％選択剤にストリークした。プレートをパラフィルムで密閉し、上下逆さまにして、暗所26℃で7〜10日間インキュベートした。単一のコロニー(1〜2mmの大きさ)を、1mlのBHIHを含有する24-ウェルプレートに移し、パラフィルムで密閉し、暗所26℃で、約7〜10日間インキュベートした。その後、1mlの培養物を24-ウェルプレートからフラスコ中の10mlのBHIに移し、通常通り静的に、さらに成長させた。
【０３６３】
標的とされたゲノム部位における組込みをPCR及びシークエンシングにより確認した。
【０３６４】
(8.11.2  プラスミド)
プラスミドは、大腸菌増殖用のpUC57ベクター骨格から得られ、アンピシリン部分マーカーを含有していた。発現カセットは、切り出しに好適な制限部位に隣接している。このカセットは、1.)相同組換えによる部位特異的組込みのための相同性部位、2.)スプライスリーダーアクセプター配列を含有する5'非翻訳末端反復、3.)リーシュマニア(L.メジャー又はL.タレントラエのいずれか)用にコドン使用が最適化されたORFとしての目的の遺伝子、4.)例えば、ポリアデニル化配列の3'UTR及び下流遺伝子の5'UTRを含有する遺伝子間領域、5.)耐性マーカーと、それに続く、6.)その3'UTR、並びに7.)ゲノムへの部位特異的組込みのための3'相同性領域を含有している。このプラスミドは、遺伝子合成供給業者により作製され、シークエンシングされた。http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=347515に見られるL.メジャー又はhttp://genomes.urv.es/OPTIMIZER/上のL.タレントラエのいずれかに由来する、リーシュマニア用に最適化されたコドン使用は、以下のコドン使用表を使用している:
【０３６５】
【化５０】
2020530273.tif 000073
【０３６６】
最適化された配列を制限部位の回避及びリピート又はホモポリマーストレッチの欠失のために手作業でキュレートした。プラスミド及び説明は、表15に見られる。
表15  プラスミド
【表１５】
2020530273.tif 000074
2020530273.tif 000075
2020530273.tif 000076
【０３６７】
(8.11.3  Gnt候補)
Gnt及びさらなるGntハイブリッドは、表9及び表10に掲載されている。
【０３６８】
(8.11.4  Rapifluor(RF)標識及びMSを用いたN-グリカンプロファイリング)
(a)試料調製
Watersのアプリケーションノート:≪品質管理及び自動化に適したGlycoWorks RapiFluor-MS N-Glycanによる試料調製(Quality control and Automation Friendly GlycoWorks RapiFluor-MS N-Glycan Sample Preparation)≫に従って、試料を調製した。簡潔に述べると、試料の量は10μlであり、精製タンパク質試料の場合、1.5mg/ml(15μg)又はペレットとして10*8細胞であった。3％RapiGestを100℃で3分間、RTで3分間添加した後、10μlのPNGアーゼF(Sigma、希釈済みの30μlのPNGアーゼ＋220μlの水)を添加し、50℃で5分間インキュベートした。RTで3分後、10μlのRFMS(110μlの無水DMF中、9mg)を添加し、RTで5分間インキュベートした。360μlのACNを添加し、試料を、3×30μlでの溶出を用いるSPEクリーンアップにより洗浄し、90μlまでプールした。完全ループ注入で10μlを注入する前に(4×過剰充填係数)、試料を100μlのDMF及び210μlのACNで希釈した。
【０３６９】
(b)カラムセッティング
液体クロマトグラフィーを、Waters Acquity UPLCシステムで、Glycan BEHアミドカラム(Waters; 130Å、1.7μm、2.1mm×150mm)を用いて行った。N-グリカンの分離を、20％の水中の0.1％ギ酸(FA)(バッファーA)及び80％のアセトニトリル中の0.1％FA(バッファーB)から始まり、3分で27％バッファーA、その後、32分以内に、37％のバッファーAに至る勾配を用いて、0.5mL/分の流速で行った。215nmでUV検出器を用いて、検出を行った。
【０３７０】
ESIモードでの質量決定のために、UPLCをWaters Q-TOF Synapt HDMSに直接接続した。ロック質量スプレー(ロイシンエンケファリン)をロック質量補正に用いて、質量をポジティブイオンモードでm/z 300〜3500で獲得した。
【０３７１】
ACQUITY UPLC Glycan BEHアミド130Å、1.7μm、2.1×150mm;バッファー: A: 50mM AmFor(H2O) pH 4.5、B: CAN;流速: 0.5ml/分;温度: 45℃;注入量: 10μl(完全ループ注入);勾配: 3分で80〜73％B、32分で73〜63％B(合計55分間)、LC法  ESI_RFMS_mAB_55_FLR; Synapt設定: 20161006_uba284_esi_RFMS)、MS法  ESI_RFMS_mAB_300_3500_vpos_55;キャップ電圧: 3kV;コーン電圧: 80V;ソース温度: 120℃;溶解温度: 350℃;溶存ガス: 800l/h;ロック質量:ロイシンエンケファリン、流速4uL/分で1ng/ul;蛍光検出: Ex 265/Em 425nm(RapiFluor-MS)(2Hz)。
【０３７２】
(8.11.5  完全メチル化及びMALDI-TOFによる粗細胞ペレットのN-グリカンプロファイリング)
(a)試料調製
10*8個の細胞を用いたペレットを、振盪させながら30分間、クロロホルム/メタノール(2:1)により脱脂質化した。遠心分離後、クロロホルムメタノール水(40:20:3)による2回目の脱脂質化工程を、振盪させながら、30分間実施した。遠心分離後、脱脂細胞ペレットを窒素流下で乾燥させた。
【０３７３】
細胞ペレットのタンパク質を、0.1％Rapigest(登録商標) SF(WATERS)及び10mM DTTを含有する200μlの50mM重炭酸アンモニウムバッファー中の3×90秒の超音波処理により抽出した。タンパク質を56℃で45分間変性させ、ヨードアセトアミド(50mM)により、暗所室温で60分間アルキル化した。その後、試料を10μgのトリプシン/Lys-Cミックス質量分析等級(PROMEGA)とともに37℃で16時間インキュベートして、消化されたタンパク質を得た。
【０３７４】
(b)N-グリカンのグリコシダーゼ消化及び完全メチル化
95℃で5分間、トリプシン/Lys-Cを不活化した後、試料を2つのアリコートに分割した。1つのアリコートを20ユニットのPNGアーゼF(Promega #175715)で脱グリコシル化し、2つ目のアリコートを、200mM酢酸バッファー(pH 5)でpH 5に合わせた15μlのPNGアーゼA(Roche #10472620)で脱グリコシル化した。4つの試料を37℃で16時間インキュベートした。消化されたタンパク質試料に0.5％TFAを添加することにより、加水分解性界面活性剤を除去し、37℃で30分間インキュベートし、15'000×gで10分間遠心分離した。トリプシン消化ペプチドをSEP PACK C18 200mgカラムに充填し、N-グリカンを含有するフロースルーを回収した。
【０３７５】
N-グリカンをUltra Clean SPE Carbograph(ALLTECH)で精製した。SPEを0.1％TFA中で平衡化した後、PNGアーゼにより放出されたN-グリカンを充填し、0.1％TFAで洗浄した。3mlの25％アセトニトリル、0.1％TFAによる溶出の後、N-グリカンを凍結乾燥させ、その後、完全メチル化した。約25mgの水酸化ナトリウム、500μlのDMSO、及び300μlのICH3を用いる完全メチル化を凍結乾燥試料に対して40分間行った。反応物を1mlの水でクエンチした後、3×500μlのクロロホルムを完全メチル化グリカンの抽出に用いた。クロロホルム相を等量の水で洗浄し、その後、乾燥させた。反応産物をC18 SepPak 200mg(WATERS)に充填し、2mlの80％アセトニトリル中で溶出させ、凍結乾燥させた後、MALDI-TOF MS解析した。
【０３７６】
(c)N-グリカンのMALDI-TOF分析
精製した完全メチル化グリカンを20μlの50:50メタノール/水中で可溶化した。2μlの希釈していないN-グリカンと1/2希釈したN-グリカンを2μlの2,5 DHB(LaserBiolabs)マトリックス溶液(10mg/mlの50:50メタノール/水)と混合した。ポジティブイオンリフレクトロンMALDI-TOF質量スペクトルを、Autoflex III質量分析計(Bruker)を用いて獲得した。スペクトルを4000ショットの蓄積により取得し、外部標準(Pepmix4 LaserBiolabs)で較正した。加速及びリフレクター電圧条件は、次のように設定した:電圧10.3×1954V、80％レーザー。
【０３７７】
(8.11.6  インビトロ活性アッセイのための親和性タグ化異種Gntの精製)
HA精製手順は、次の通りであった。異種Gntを発現する組換え細胞の培養物を目的のHAタグ化Gnt酵素の細胞内発現についてまず解析した。1×109個の細胞を回収し、遠心分離して(2000×g/5分)、親和性精製のために細胞ペレットを分離した。ペレットを、1％(v/v) Tritonを含有する1mLの抽出バッファー(25mM Tris pH 7.5、100mM NaCl、1％v/v Triton X-100、EDTA非含有プロテアーゼインヒビター[Roche]、1mM PMSF)に再懸濁させた。再懸濁した細胞を氷上で超音波処理して、いかなる種類の過熱も回避した。超音波処理[Bandelin Sonopuls]を、3工程で、20秒間、70％電源入力、7サイクルで実行した。ボルテキサーで10秒間激しく撹拌した。破壊された細胞の懸濁液を、4℃で1時間、13'000×gで遠心分離した。上清(ライセート)を慎重に除去し、精製に使用した。残りの固体画分を1×Laemmliに再懸濁させ、SDS-PAGE解析に使用した。ライセートを冷PBS(1×プロテアーゼインヒビター錠剤を含む)と1:2で混合し、100μLの抗HA磁気ビーズ[Thermo Scientific]とともに、RT、600rpmで30分間インキュベートした。HA磁気ビーズを磁気ラック[Thermo Scientific]を用いて2mLチューブに回収し、2mLの氷冷TBSで2回洗浄した。溶出を、70μLの溶出バッファー(TBS中の2mg/mL HAペプチド[Thermo Scientific])を用いて行った。溶出画分を、SDS-PAGE、次いで、抗HA WBで解析し、インビトロ活性アッセイに使用した。
【０３７８】
StrepTactin精製手順は、次の通りであった:異種Gntを発現する組換え細胞の培養物を目的のStrepタグ化Gnt酵素の細胞内発現について解析した。1×109個の細胞を回収し、遠心分離して(2000×g/5分)、親和性精製のために細胞ペレットを分離した。ペレットを、1％(v/v) Tritonを含有する1mLの抽出バッファーに再懸濁させた。再懸濁した細胞を氷上で超音波処理して、いかなる種類の過熱も回避した。超音波処理[Bandelin Sonopuls]を、3工程で、20秒間、70％電源入力、7サイクルで実行した。ボルテキサーで10秒間激しく撹拌した。破壊された細胞の懸濁液を、4℃で1時間、13'000×gで遠心分離した。上清(ライセート)を慎重に除去し、精製に使用した。残りの固体画分を1×Laemmliに再懸濁させ、SDS-PAGE解析に使用した。ライセートを冷PBS(1×プロテアーゼインヒビター錠剤を含む)と1:5で混合し、100μLのStrepTactinセファロース[VWR]とともに、RT、600rpmで30分間インキュベートした。StrepTactin精製の効果に対する細胞/培地のビオチンの干渉効果を軽減するために、PBS中で5倍希釈を行った。StrepTactinセファロースを遠心分離(2000×g/1分)によって2mLチューブに回収し、2mLの冷TBSで2回洗浄した。溶出を、70μLの溶出バッファー(1×TBS中の2.5mMのデスチオビオチン)を用いて行った。溶出画分を、SDS-PAGE、次いで、抗Strep WBで解析し、インビトロ活性アッセイに使用した。
【０３７９】
(8.11.7  インビトログリコシルトランスフェラーゼ活性アッセイ、グリカンの2-アミノベンズアミド(2AB)標識及び/又は洗浄並びにHPLC分離)
新たに調製した試薬を氷上の1.5mlチューブに以下の順番で添加して、HA精製又はストレプトアビジン精製GNTのインビトロ活性アッセイを行った: 1. 50ngの適当な2AB標識アクセプターグリカン(例えば、2AB-Man3a[Prozymes])又は500ngの適当な非標識アクセプターグリカン(例えば、Man3a[Prozymes]); 10mM MgCl2; 10mM MnCl2; 1.2mM活性化糖(例えば、UDP-GlcNAc又はUDP-Gal[Sigma Aldrich])。TBSバッファー(pH 8.0、25mM Tris pH 7.5、100mM NaCl)を用いて、容量を50μLに調整し; 20μLのHA濃縮もしくはストレプトアビジン濃縮GNT酵素を添加するか、又は対応する模擬対照用の水、例えば、溶出バッファーのみを添加した。その後、混合物を短時間遠沈し、RT、600rpmで、o/nインキュベートした。非標識基質の場合、HPLC実行前に、Sep-Pak C18クラシックカートリッジ[Waters]を用いて、グリカンを反応混合物から精製した。試料を(Biggeらの文献、1995)に従って2-ABで標識した。(Merryらの文献、2002)に記載されている濾紙円板法を用いて、グリカン洗浄を行った。インビトロアッセイにおける2AB標識基質の場合、HPLC実行前に、PTFE洗浄を行った。
【０３８０】
2AB標準を用いるシアリルトランスフェラーゼのインビトロ反応(Luley-Goedlらの文献、2016)は、40ngの2AB-G2(基質糖)、20μLのHA濃縮タンパク質SiaT; 24μLの100mM MES pH 6.5(最終50mM MES pH 6.5);最終0.1％(v/v) TritonX-100までの1μLのTritonX-100溶液(100mM MES中)、及び1μLの3.75mM CMP-Neu5AC(dH2Oに溶解)ストック溶液(最終0.75mM)を含む4μLを含有していた。反応を、37℃で12時間、400rpmで行い、4℃で冷却し、PTFE洗浄及びHPLC分析まで、-20℃で凍結させた。MabTheraを基質として用いて、さらなる反応を行った。
【０３８１】
MabThera抗体を用いるシアリルトランスフェラーゼのインビトロ活性アッセイは、50μg(5μL)の市販のMabThera(Roche、製剤化バッファー中)、20μLのHA濃縮タンパク質SiaT(溶出バッファーから得られる100mM MES中に40μgのHA ペプチドを含有); 22μLの100mM MES pH 6.5(最終〜100mM MES pH 6.5);最終0.1％(v/v) TritonX-100までの1μLのTritonX-100溶液(100mM MES中)を使用していた。1.5mM CMP-Neu5Acをまず添加し、6時間後、さらに1.5mM CMP-Neu5Acを追加で添加して、最終3mMのCMP-Neu5Acとした。反応を、37℃で12時間、400rpmで行い、4℃で冷却し、PNGアーゼFによるN-グリカン放出及びRF-MS標識(6.11.4  Rapifluor(RF)標識及びMSを用いたN-グリカンプロファイリングに準拠)まで、-20℃で凍結させた。
【０３８２】
2-AB標識グリカンの分離を、(Royleらの文献、2002)に従って、GlycoSep-N順相カラムを用いるHPLCにより行ったが、3溶媒系に修正した。溶媒Aは、80％アセトニトリル中の10mMギ酸アンモニウム、pH 4.4であった。溶媒Bは、40％アセトニトリル中の30mMギ酸アンモニウム、pH 4.4であった。溶媒Cは0.5％ギ酸であった。カラム温度は30℃であり、2-AB標識グリカンは、蛍光(λex＝330nm、λem＝420nm)により検出した。勾配条件は、0.4ml/分の流速で160分間かけて100％A〜100％B、次に、流速を1ml/分に上昇させて、2分間、100％B〜100％Cの線形勾配であった。カラムを、100％Cで5分間、100％Aに2分間かけて戻し、100％Aで1ml/分の流速で15分間、その後、流速を0.4ml/分に戻して5分間、実行した。試料は、水中で注入した。
【０３８３】
(8.11.8  非改変細胞株及び糖鎖改変細胞株からのrhEPOの発現及び精製)
両方の株の2×200mlの培養物を、140rpmで振盪させながら、BHIH中、26℃で72時間成長させた。培養物を回収し、2000×gで45分間遠心分離した。SNを硫酸アンモニウム沈殿用に回収した。簡潔に述べると、SNを、(NH4)2SO4(40％W/V)により、RTで45分間沈殿させた後、4°で1時間、11'000×gで遠心分離した。SNを除去し、再懸濁させ、残りの茶色い/黒いペレットを50mlの1×PBS pH 7.4に溶解させた。5LのPBSを用いて2時間、及び5Lに対して4℃でo/n、透析を行った。50mlの透析した試料を6ml StrepTactinカラムに充填した。20CVの1×PBS pH 7.4、0.5ml/分で、洗浄を行った。1ml画分中の1×PBS中の2.5mMデスチオビオチンで10CVを用いて、タンパク質を溶出させた。画分をプールし、プールした4.5mlの溶出物に冷アセトン(-20℃)を添加して-20℃でo/n沈殿させた。試料を8000gで2時間遠心分離し、ペレットを500ulのddH2Oに溶解させた。
【０３８４】
(8.11.9  N-グリコシル化部位占有及び部位特異的グリコシル化の決定)
(a)rhEPOのペプチド質量フィンガープリント
Rapigest(登録商標) SFを用いて、50mM重炭酸アンモニウム中での酵素によるタンパク質消化を増強した。250μLの各試料に対応する180μgのタンパク質を、Vivaspin 500 PES(5kDa)及び4回の遠心分離(15'000×g; 10分、4℃)により、50mM重炭酸アンモニウムバッファー、pH 8中に調製した。タンパク質の最終濃度は、約3mg/mlであった。
【０３８５】
タンパク質を、Rapigest(登録商標) SFプロトコル(WATERS)に従って、0.1％Rapigest(登録商標) SF中で変性させ、DTT(5mM)により60℃で45分間還元し、ヨードアセトアミド(15mM)により室温暗所で45分間アルキル化した。試料を、6.4μgのトリプシン/Lys-Cミックス、質量分析等級(Promega V507A #201254)とともに、37℃で16時間インキュベートして、消化されたタンパク質を得た。0.5％TFAを消化されたタンパク質試料に添加することにより、加水分解性界面活性剤を除去し、37℃で30分間インキュベートし、15000gで10分間遠心分離した。全てのトリプシン消化ペプチドを、SEP Pack C18、200mg(Waters)で、0.1％TFAを含む水中で精製した。溶出容量2mLの70％アセトニトリル、0.1％TFAを凍結乾燥により完全に乾燥させた。
【０３８６】
(b)糖ペプチド濃縮法
ProteoExtract(登録商標)糖ペプチド濃縮キットプロトコル72103-3(Novagen)に従って、ペプチドを40μLの超純水中で可溶化し、30μlを糖ペプチド濃縮に使用した。
【０３８７】
30μLの試料を150μLのZIC Glycocapture樹脂に添加し、結合しなかったペプチドを含有するフロースルーを回収した。糖ペプチドを225μLのZIC溶出バッファーで溶出させた。フロースルー及び溶出試料をスピードバック中で完全に蒸発させた。糖ペプチドを15μLのMilliQ水に再懸濁させた。シグナル/ノイズ比を改善するためにZip Tips MILLIPORE C18で精製した後、50％メタノール中の糖ペプチド溶液をmaldiプレート上で乾燥させ、1μlのCHCA(LaserBiolabs)マトリックス溶液(7mg/mLの50％アセトニトリル)を添加した。
【０３８８】
(c)濃縮画分の脱グリコシル化
5μLの懸濁糖ペプチドを50mM酢酸ナトリウムバッファーにまで調整し、1μLのPNGアーゼF(Promega V483A#226517)及び1μLのPNGアーゼA(Sigma # 01000353)を添加して、37℃で16時間脱グリコシル化した。Zip Tips MILLIPORE C18(SOP P17/2)で調製した後の脱グリコシル化ペプチドをCHCA(1:1)(LaserBiolabs)マトリックス溶液(7mg/mLの50:50アセトニトリル/水、0.1％TFA)と混合した。
【０３８９】
フロースルー画分を調製し、CHCA(1:1)(LaserBiolabs)マトリックス溶液(7mg/mLの50:50アセトニトリル/水、0.1％TFA)を用いて解析した。
【０３９０】
(d)MALDI-TOF MS解析
フロースルー画分中のペプチド、脱グリコシル化糖ペプチド、及び占有された糖ペプチドを、ポジティブモードリフレクトロン及びリニアモードのMALDI-TOF MS質量分析により分析した。リニアモードMALDI質量スペクトルは、MALDI-TOF/TOF Autoflex III(Bruker Daltonics)で獲得した。獲得条件は: 14.3×2904V、レーザー49％、6000ショットであった。ポジティブイオンリフレクトロンMALDI質量スペクトルは、MALDI-TOF/TOF Autoflex III(Bruker Daltonics)(SOP 44/1)で獲得した。RP850-3500 Bruker法での獲得条件は、40×2160V;レーザー97％、5000ショットであった。
【０３９１】
(8.11.10  リーシュマニア・タレントラエ分泌タンパク質の同定のためのペプチドマッピング)
St10569細胞を、振盪培養(140rpm)下、OD 3.4になるまで26℃で2日間、400mlのBHIH中で成長させた。上清を2000×gでの遠心分離により回収し、使用するまで-80℃で保存した。SNを4℃でo/n解凍し、プロテアーゼインヒビターカクテル錠剤(Roche、EDTA非含有)とともにRTで4時間保持した。
【０３９２】
分泌タンパク質を沈殿させるために、硫酸アンモニウム(NH4)2SO4沈殿を行った。簡潔に述べると、40g(NH4)2SO4を段階的にSNに添加した(パーセンテージでの出発濃度10％)。160gを添加した後、試料が濁り、40gの最終工程を行った。試料を撹拌しながらRTで40分間インキュベートした。遠心分離を、4℃で30分間、11000×gで行った。ペレットを20mlの1×結合バッファー(1×TBS＋1mM CaCl2＋1mM MnCl2)に再懸濁させた(「第一のSN」)。遠心分離を、4℃で15分間、4000×gで行い、BHIHの残りを含まないタンパク質のみをペレット化した。少量の黒っぽいペレットが観察され、これを10mlの1×結合バッファー(1×TBS＋1mM CaCl2＋1mM MnCl2)に再懸濁させた。SN及び再懸濁したペレットを、12〜14K MWCOで、1×TBS中、4℃でo/n透析して、(NH4)2SO4を除去した。バッファーを新たに調製した1×TBSと交換し、12〜14K MWCOで、4℃でさらに2.5時間透析した。1:50のビーズ対試料比のために、0.7ml ConAカラムを調製した(1.4mlのスラリー)。1mM CaCl2＋1mM MnCl2を第二のSNの試料に添加し、「再懸濁ペレット」試料用に1×結合バッファーを35mlまで充填した。ConAスラリーを試料に添加し、RTで4時間回転させた。以下の全ての工程について、遠心分離を、RTで5分間、1000×gで行った。フロースルー(FT)を回収し、100ulをSDS PAGEに利用した。スラリーを2CVの結合バッファーで4回洗浄し、洗浄画分を回収した。タンパク質を1CV(700ul)で6CVかけて溶出させ、一方、最初の2つの溶出物を溶出バッファー(Vectorlab)中で10分間インキュベートした。
【０３９３】
以下の手順を用いて、ペプチドマッピングを行った。5μlの試料を40μlのバッファー(10mM Tris/2mM CaCl2、pH 8.2)及び5μlのトリプシン(10mM HCl中、100ng/μl)と混合し、マイクロ波中、60℃で30分間処理した。試料を乾燥させ、20μlの0.1％ギ酸に溶解させ、0.1％FAで1:2希釈し、LC/MS/MS用のオートサンプラーバイアルに移した。1μlを測定のために注入した。
【０３９４】
検索プログラム中の以下のfastaファイルのデータベースであるMascot(swiss prot及びuniref(全ての種)を用いて、データベース検索を行った。
【０３９５】
TriTrypDB-26_LmajorFriedlin_AnnotatedProteins.fasta
TriTrypDB-26_LtarentolaeParrotTarII_AnnotatedProteins.fasta
【０３９６】
さらに、リーシュマニア及びトリパノソーマの既知のプロテオームを含むカスタムデータベースに対して、検索を行った:
【０３９７】
Uniprot:トリパノソーマ・ブルセイ(927/4 GUTat10.1株);トリパノソーマ・クルージ(Trypanosoma cruzi);トリパノソーマ・クルージ・マリンケルレイ(Trypanosoma cruzi marinkellei);トリパノソーマ・ビバックス(Trypanosoma vivax)(Y486株);トリパノソーマ・クルージDm28c;トリパノソーマ・ランゲリ(Trypanosoma rangeli)SC58;トリパノソーマ・コンゴレンス(Trypanosoma congolense)(IL3000株);トリパノソーマ・クルージ(CL Brener株);トリパノソーマ・ブルセイ・ガンビエンス(Trypanosoma brucei gambiense)(MHOM/CI/86/DAL972株);リーシュマニア・インファンツム;リーシュマニア・メジャー;リーシュマニア・ブラジリエンス(Leishmania braziliensis);リーシュマニア・メキシカーナ(MHOM/GT/2001/U1103株);リーシュマニア・ドノバニ(BPK282A1株)。
【０３９８】
TriTrypDB(http://tritrypdb.org/tritrypdb/):リーシュマニア・メジャー・フリートリン(Leishmania major Friedlin);リーシュマニア・タレントラエ・パロットタール(Leishmania tarentolae Parrot Tar) II;トリパノソーマ・ブルセイ・リスター(Trypanosoma brucei Lister) 427;トリパノソーマ・クルージDm28c。全タンパク質: 155'504
【０３９９】
検索結果をScaffoldにまとめた(存在する場合、トリプシン、ケラチン、他の一般的な混入物質、及びデコイのヒットは、表示されていない)。
【０４００】
(8.11.11  シグナルペプチドを同定するためのN-末端シークエンシング)
EDMAN分解によるシグナルペプチドのN-末端シークエンシングのために、Con A濃縮した分泌タンパク質をSEC 10/300 Superdex GLを用いてさらに精製した。このために、24mlのCV ConA溶出物をプールし、3K MWCO Amiconフィルターを用いて、1×PBS pH 7.4中に、500ulまで濃縮した。SECカラムに、0.5ml/分の流速で充填し、画分を0.5mlの容量で回収した。非常に低いmAU範囲で観測されるいくつかのピークを観測し、プールした。このプールは、異なるピーク/タンパク質を分離することができるように行った。Amicon 3K MWCOによる超遠心分離を行って、試料容量を濃縮した。試料をSDS PAGE上に充填し、PDVFメンブレン上にブロットし、ポンソーで染色し、タンパク質バンドを切り出し、EDMANシークエンシングに供した。
【０４０１】
(8.11.12  異なるシグナルペプチドを用いたrhEPO発現及び分泌の評価)
組換え細胞株St11376及びSt11377を、各々、5×400mlのBHIH中に1:40で、26℃で3日間(72時間)にわたって、140rpmで成長させた。2000×gで40分間沈降させた後、上清を回収した。15 ODに相当する上清を、次のように、トリクロロ酢酸(TCA)沈殿に使用した:上清を氷上で冷却し、100％TCAを最終10％まで添加し、氷上で15〜30分間インキュベートし、4℃で30分間、11'000×gで遠心分離し、1mLの氷冷アセトンで洗浄し、4℃で30分間、11'000×gで遠心分離した。ペレットを1×Laemmli(30μL)に再懸濁させ、最大5μLの1M TrisHCl(pH 8.0)を添加して、pHを調整した(黄色から青への色の表示)。分泌されたStrepタグ化rhEPOを含有するTCA沈殿上清をWB及びクマシー解析に使用した。15 ODのSN TCAを充填し、10％Bis-Trisゲル上で、MOPS泳動バッファーを用いて、200Vで60分間泳動させた。uDarpinLLを抗Strep免疫ブロット及びクマシー用の充填対照として2ugで使用した。ブロッティングを、iblot(商標)(Invitrogen) P0を用いて、20〜25Vで7分間行い、その後、メンブレンを10％ミルク中でブロッキングした。検出は、ポリクローナル抗Strep-タグII抗体(ウサギ、Abcam ab76949)を、1:1000で、30℃で1時間、その後、二次抗体ヤギ抗ウサギHRP(Biorad, 170-6515)を、1:1000で、30℃で1時間用いて行った。TMBを発色検出に使用した。クマシー染色は、o/nの染色及びo/nのddH20脱染色を用いて行った。
【０４０２】
(8.11.13  ゴルジ局在タンパク質のCTS領域のバイオインフォマティクス予測及びハイブリッド設計)
使用されたTM及びシグナルペプチド予測法は: 1)http://phobius.sbc.su.se/Phobius(Kallの文献、2004)、膜貫通トポロジー及びシグナルペプチドを組み合わせた予測法); 2)HMMに基づくシグナルペプチド及び膜貫通トポロジー予測(TMHMM及びSignalPよりも低い偽陽性率が主張される)、並びに3)SignalPであった。HMMは、4種類のタンパク質:シグナルペプチドあり/なしの膜貫通タンパク質、シグナルペプチドあり/なしの非膜貫通タンパク質に対してトレーニングされた。
【０４０３】
(8.11.14  細胞下分画のための親和性タグ化異種Gntの精製)
HA又はStrepタグ化GNT酵素を発現する細胞(50 ODに相当する1×109個)を回収し、遠心分離して(4000×g/10分)、細胞ペレットからSNを分離した。上清(5又は10 ODに相当)を、次のようにTCA沈殿に使用した:上清を氷上で冷却し、100％TCAを最終10％まで添加し、氷上で15〜30分間インキュベートし、11'000×g/4℃で30分間遠心分離し、1mLの氷冷アセトンで洗浄し、11'000×g/4℃で30分間遠心分離した。ペレットを1×Lammli(〜30μL)に再懸濁させ、最大5μLの1M TrisHCl(pH 8.0)を添加して、pHを調整した(黄色から青への色の表示)。TCA沈殿上清をWB解析に使用した。ペレットを、1％(v/v) TritonX-100を含むか又はそれを含まない、1mLの抽出バッファー(ExB、125mM Tris pH 7.5、100mM NaCl、EDTA非含有プロテアーゼインヒビター[Roche]、1mM PMSF)に再懸濁させた。再懸濁した細胞を氷上で超音波処理[Bandelin Sonopuls]して、いかなる種類の過熱も回避した。超音波処理を、3工程で、10秒間、70％電源入力、7サイクルで実行し、ボルテックスで10秒間激しく混合した。破壊された細胞懸濁液を4℃で1時間、13'000×gでスピンした。上清(ライセート)を慎重に除去し、ウェスタンブロット解析用の直接充填物(1×Laemmliを含む)としてとして使用した。残りのペレット(+/- TritonX)を、より良い均一化のために細胞ダウンサー(cell douncer)[Sigma Aldrich]を用いて、1％(v/v) TritonX-100が補充された500μLのExB中で別々に可溶化した。その後、細胞懸濁液を、4℃で1時間、13'000×gで遠心分離した。可溶性画分をWB解析用の直接充填物(1×Laemmliを含む)として使用した(「不溶性画分」と呼ばれる)。任意に、残りのペレット(細胞残渣と呼ばれる)を1×Laemmliに再懸濁させ、WB解析に使用する。全ての画分を、SDS-PAGE、続いて、適当な検出抗体を用いるWBで解析した。Gntの膜結合は、様々な画分(例えば、上清、ライセート+/-TritonX、細胞残渣)におけるWBバンドの存在及び強度に基づいて解釈することができる。
【０４０４】
SDS PAGEの条件は、次の通りであった:試料を1×Laemmli充填染料中で95℃まで10分間加熱し; 10％Bis-TrisゲルをMOPSバッファーを用いて200Vで60分間泳動させた。ブロッティングは、iblot(商標)(Invitrogen) P0を用いて、20〜25Vで7分間行い、その後、メンブレンを10％ミルク中でブロッキングした。検出は、30℃で1時間の1:1000のポリクローナル抗Strep-タグII抗体(ウサギ、abcam ab76949)又は1:1000のウサギ抗HAタグ抗体(Sigma, H6908)のいずれか、その後、1:1000又は1:2000の二次抗体ヤギ抗ウサギIgG HRP(Biorad, 170-6515)を30℃で1時間を用いて行った。TMBを発色検出に使用した。
【０４０５】
(8.12  L.タレントラエにおける抗CD20「リツキシマブ」の発現、精製、及び解析)
(a)発現
5×1000mlのSt12427(p13、p5026)の培養物を、140rpmで振盪させながら、BHIH中、26℃で72時間成長させた。培養物を回収し、2000×gで15分間、遠心分離した。4錠のプロテアーゼインヒビターカクテル(Roche)及びEDTA(最終濃度1mM)を5000mlの培地SNに添加した。5000mlの培地SNを0.22umフィルターに通して濾過した後、Vivaflow 200(50'000Da)で濃縮した。Vivaflowを、100mlのBSA(2g/L)を用いてブロッキングし、ブロッキング後、メンブレンを1LのddH2Oで洗浄した。SNをvivaflowの流速(600ml/分)で1000mlまで5倍濃縮した。
【０４０６】
(b)精製
培地SNを、オフラインで、蠕動ポンプを用いて4℃で一晩、10mlプロテインAカラムに連続的に充填した。カラムをNGCシステムに接続し、8CVの1×PBS pH 7.4で洗浄した。溶出は、0.15MグリシンpH 2.5を用いて行い、150ulの1M Tris pH 8.5を添加することにより、直接中和した。リツキシマブを含有するプール画分(10ml)を0.7g(NH4)2SO4で調整し、1mlのHIC(PhenylSepharose GE)に1ml/分の流速で充填し、20mM Tris、1M(NH4)2SO4 pH 7.0のバッファーAと20mM Tris pH 7.0のバッファーBの勾配で溶出させた。1000ulの画分を回収し、クマシーSDS PAGE及びウェスタンブロットにより解析した。
【０４０７】
(c)解析
(SDS PAGE及びキャピラリーゲル電気泳動:)
SDS PAGEを、クマシーの場合10ug、WBの場合2.5ugを用いて、還元条件下又は非還元条件下で行い、MOPSバッファーを用いて、4-12％ゲルで55分間分離した。タンパク質純度の決定は、10ugのタンパク質を用いてクマシー染色SDS-PAGEにより決定し、BSA標準曲線と比較した。不純物をImageQuantにより定量した。キャピラリーゲル電気泳動(CGE)を、プロトコルに従って、Agilent Protein 230キット(5067-1518)を用いて行った。
【０４０８】
(分析的SEC:)
MAbPac SEC-1(4×300mm)は、モノクローナル抗体(mAb)の分離及び特徴解析用に特別に設計されたサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)カラムであり、製造業者の推奨に従って使用された(温度: 30℃;溶離液: PBS 50mM NaPO4、300mM NaCl pH 6.8;溶出:アイソクラティック、30分;流量: 0.2mL/分;検出: 215nm;注入V: 5ugのタンパク質に相当する5uL)。
【０４０９】
(8.12.2  モノクローナル抗体試料のN-グリカンプロファイリング)
(a)N-グリカンのグリコシダーゼ消化及び完全メチル化:
IgG(200μg/40μl)を200μlの50mMリン酸バッファーpH 7.5に懸濁させ、0.5％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS Sigma L4509)及び1％βメルカプトエタノール中、90℃で10分間で変性させた。22μlのNP40を484μlの最終反応容量で添加した後、タンパク質を、15ユニットのPNGアーゼF(PROMEGA #226517 ref V483A)を用いる15時間の酵素消化により、リン酸バッファーpH 7.5中、37℃で脱グリコシル化した。脱グリコシル化を電気泳動により制御した。脱グリコシル化の前及び後の6.5μlの試料を70℃で10分間加熱し、NuPAGE(登録商標) MESバッファー(Invitrogen NP0002)＋抗酸化剤中、1.0MM、12wのNuPAGE(登録商標) Novex Bis-Tris 4-12％ゲル(Invitrogen)上に充填した。泳動時間35分、200V一定。ゲルをSimply BlueSafestain(Invitrogen)で1時間染色し、水中で脱染色した。
【０４１０】
N-グリカンをHypercarb Hypersep 200mg(Thermo Fisher)で精製した。SPEを0.1％TFA中で平衡化させた後、PNGアーゼにより放出されたN-グリカンを充填し、0.1％TFAで洗浄した。3mlの25％アセトニトリル、0.1％TFAによる溶出の後、完全メチル化の前に、N-グリカンを凍結乾燥させた。約25mgの水酸化ナトリウム、500μlのDMSO、及び300μlのICH3を用いた完全メチル化を凍結乾燥試料に対して40分間行った。反応物を1mlの水でクエンチした後、3×500μlのクロロホルムを完全メチル化グリカンの抽出に使用した。クロロホルム相を等量の水で洗浄し、その後、乾燥させた。反応産物をC18 SepPak 200mg(WATERS)に充填し、2mlの80％アセトニトリル中で溶出させ、凍結乾燥させた後、MALDI-TOF MS解析を行った。
【０４１１】
(8.12.3  N-グリカンのMALDI-TOF解析:)
精製した完全メチル化グリカンを20μlの50:50メタノール/水中で可溶化した。2μlの希釈していないN-グリカンと1/2希釈したN-グリカンを1μlのCHCA(LaserBiolabs)マトリックス溶液(7mg/mlの50:50アセトニトリル/水)とともにスポットした。ポジティブイオンリフレクトロンMALDI-TOF質量スペクトルを、Autoflex III質量分析計(Bruker)を用いて獲得した。スペクトルを4000ショットの蓄積により取得し、外部標準(Pepmix4 LaserBiolabs)で較正した。加速及びリフレクター電圧条件は、次のように設定した:電圧14.7×2008V、80％レーザー。
【０４１２】
モノアイソトピック質量[M+Na]+に対応するN-グリカン構造の解釈は、EXPAZY GlycoModツールを用いて行った。N-グリカンの相対強度(％)を計算して、各々のスペクトルのN-グリカンプロファイルを確立した。このために、脱同位体化したN-グリカンピークの強度の合計を決定し、100％に設定した。その後、各々のグリカンの相対強度(％)をこの値との関連で決定した。
【０４１３】
(8.12.4  FACS)
Raji細胞を抗CD20抗体検査に使用した。10マイクログラム/mlをフローサイトメトリーの予想最適濃度として用いて、5つの異なる濃度を想定した(表16)。染色する順序:−FcRブロッキング、−IgG1ブロッキング、−一次抗体、−二次抗体抗IgG1 APC。ゲートをかけた後、各々の試料は、10000〜13000個の細胞の解析を表している。対照IgG1抗体も若干のシグナルを生じる。理由は、不十分なブロッキング及びFc受容体を介する結合又はその特異性による結合であり得−対照抗体は、この目的のために一般に使用されるが、その特異性は不明である。ブロッキング対照は、それ自体に対するFcRブロッキングが、非標識抗ヒトIgG1を用いる第二のブロッキング工程によって再び解消される、低バックグラウンドシグナルを実際に生じることを示す(図示せず)。
【０４１４】
150×g(790rpm Hettich Rotixa RP Rotor 4210)で5分間スピンすることにより培養フラスコから回収されたRaji細胞を用いる抗CD20抗体の解析のために、上清を完全に除去し、細胞を、80μlの洗浄バッファー当たり107個の細胞で、洗浄バッファー(Ca++/Mg++を含まず、2％胎仔ウシ血清を添加し、4℃で保存したDPBS; Ca++/Mg++を含まないDPBS、Corning 21-031-CMR、Lot 21031494R)に再懸濁させ、20μlのFcRブロッキング試薬を添加した。インキュベーションを暗所4℃で10分間行った。107個の細胞当たり1.4mlのD-PBSを添加することにより洗浄を行い、細胞を250×g(1750rpm Eppendorf 5415C)で5分間スピンし、上清を完全に除去した。
【０４１５】
細胞を107細胞当たり80μlのDPBSに再懸濁させ、20μlの純粋な抗ヒトIgG1(＝20μg/ml)を添加し、暗所冷蔵庫で10分間インキュベートし、107細胞当たり1.4mlの洗浄バッファーを添加することにより洗浄し、細胞を250×gで5分間スピンし、上清を完全に除去した。細胞を2×106細胞当たり20μlの洗浄バッファーに再懸濁させ、一次抗体を下記の試料スケジュールに従って添加し、暗所冷蔵庫で10分間インキュベートし、107細胞当たり0.7mlの洗浄バッファーを添加することにより洗浄し、細胞を250×gで5分間スピンし、上清を完全に除去した。細胞を2×106細胞当たり20μlの洗浄バッファーに再懸濁させ、2μlの二次抗体抗ヒトIgG1-APCを下記の試料スケジュールに従って添加し、暗所冷蔵庫で10分間インキュベートし、107細胞当たり0.7mlの洗浄バッファーを添加することにより洗浄し、細胞を250×gで5分間スピンし、上清を完全に除去した。細胞を300μlの洗浄バッファーに再懸濁させ、フローサイトメトリーによる解析まで氷上で保持した。試薬を次のように使用した: FcRブロッキング試薬、Miltenyi 130-059-901、ロット5170330778;純粋な抗ヒトIgG1(1ml中、100μg)、Miltenyi 130-093-197、ロット5170426031;抗ヒトIgG1-APC、Miltenyi 130-099-126、ロット5170426074。
表16  FACS用の試料調製
【表１６】
2020530273.tif 000077
2020530273.tif 000078
【０４１６】
(ドット-ブロット:)
DotBlotマニフォールドを用いてNC-メンブレン上にブロットされた5〜1000ngのCD20-GST(Proteintech, #ag17309)を、10％ミルク/PBSTで、4℃でo/nブロッキングした。レーンを切り出し、5ug/mlのリツキシマブ_LMTB、MabThera(登録商標)、2ug/mlの抗GoEL、2ug/mlの抗MBP、1:2000の抗Hisとともに、PBST 1％ミルク中、RTで2時間インキュベートした。レーンをPBSTで3×5分間洗浄し、抗ヒトIgG-HRP(1:2000)又は抗マウスとともに、PBST 1％ミルク中、RTで1時間インキュベートした。レーンをPBSTで3×5分間洗浄し、ブロットをTMBを用いて発色させた。
【０４１７】
(リツキシマブのEDMAN分解、IP-MS、及びペプチドマッピング:)
試料の調製及び解析は、次の通りに行った:
【０４１８】
(還元、アルキル化:)
8Mウレア、50mM TEABバッファー中での可溶化、5mM TCEPによる還元、及びRTで20分間のインキュベーション。10mM IAAによるアルキル化及び暗所RTで20分間のインキュベーション。
【０４１９】
(脱グリコシル化:)
アルキル化した後、PNGアーゼF酵素バッファーの添加により、抗体試料を1:10希釈した。25μgの抗体の場合、0.5μlのPNGアーゼFを添加した。試料を37℃で1時間さらにインキュベートした。
【０４２０】
(SDS-PAGE:)
アルキル化し、脱グリコシル化した抗体試料をLammliバッファー中で可溶化した。5μgの試料のアリコートをSDS-PAGEゲル上に充填した。ゲル泳動後(150V、最大400mA、75分)、ゲルを50％エタノール、10％酢酸中で30分間インキュベートし、その後、クマシーブリリアントブルーでゲルを染色した。
【０４２１】
(ゲル内酵素切断:)
それぞれ、100mM TEAB又は50mM TEAB、60％ACN中で3回膨潤/収縮させることにより、SDS-PAGEゲルからのゲルスライスを酵素切断用に調製した。各々の工程をRTで30分間実施した。最後の収縮工程の後、ゲルスライスを蓋が開いたエッペンドルフチューブ(eppy)中で15分間乾燥させた。3容量の酵素溶液を1:40の酵素/タンパク質比で添加することにより、タンパク質分解を開始させた。タンパク質分解を一晩行った。得られたペプチドを0.5％(最終)ギ酸で酸性化した後、質量分析を行った。
【０４２２】
(インタクト質量決定:)
0.5％ACN、0.5％FAで約1pmol/μl(1:50)に希釈した後、脱グリコシル化し、還元した抗体を、そのサブ鎖のインタクト質量決定のために使用し、5μlをLC-システムによる質量分析計に適用した。検出は、Thermo Scientific Orbitrap XL質量分析計のLTQ及びFT検出器で行った。電荷のデコンボリューション処理は、Znovaアルゴリズムを用いて行った。
【０４２３】
(高分解能MS:)
Agilent 1100 nanoLCシステムをOrbitrap XL質量分析計と連動させた。酸性化の後、タンパク質分解由来の試料をnanoLC-ESI MS/MSに適用した。0.5％ACN/0.5％FA溶液を5分間用いて、濃縮カラム(Zorbax SB C18、0.3mm×5mm、Agilent)でペプチドを捕捉し、脱塩した後、ペプチドを5％〜40％ACNのACN/0.1％FA勾配を用いてZorbax 300 SB C18、75μm×150mmカラム(Agilent)で分離した。MSオーバービュースペクトルをnanoLC-ESI-MSMS分析用の製造業者の機器設定に従ってFT-モードで自動的に採取した。ペプチドフラグメンテーション(CID)及び検出もFT-モードで操作した。
【０４２４】
(データベース検索:)
高分解能質量分析により獲得されたデータセットを依頼人によって提供される配列のカスタムデータベースに対するデータベース検索に使用した。検索パラメータは、予想されるタンパク質修飾及び本研究で使用されるMS機器に従って設定した。配列アセンブリは、所与の酵素特異性に関して、PEAKS(Bioinformatics solutions)ソフトウェアにより完成させた。
【０４２５】
(6.13  ゲノムシークエンシング及びアノテーション)
(a)シークエンシング及び配列補正
St10569ゲノムDNAを12のPacBio RS2 SMRTセル(v3.0 P6/C4ケミストリー、製造業者の仕様によるライブラリー調製、及び8〜9kbpで選択されたサイズ)並びにIllumina HiSeq(2×150bpペアエンドシークエンシング;製造業者の仕様による400〜600bpの断片へのTruSeqライブラリー調製)でシークエンシングした。得られた生データは、6MのPacBioリードからなり、平均リード長は、6549bp及び14MのIlluminaリードである。
【０４２６】
PacBioの未加工のリードを、HGAP[https://github.com/PacificBiosciences/Bioinformatics-Training/wiki/HGAP-in-SMRT-Analysis]を用いて、長いコンティグにアセンブルし、2回のArrow [https://github.com/PacificBiosciences/GenomicConsensus]を用いて、エラーを補正した。Abacas2(Assefaらの文献、2009)を用いて、リーシュマニア・ドノバニ(Dumetzらの文献、2017)に基づく参照ゲノム(最小オーバーラップ1000bp、最小同一性15％)に沿って、得られたコンティグのスキャフォールドを作成した。PBjelly(Englishらの文献、2012)を用いて、PacBioポリッシングされた1kbよりも大きいリードに基づいて、残りのギャップを埋めようと試みた。Illuminaデータに基づく5回のPilonポリッシング(Walkerらの文献、2014)を行って、得られた染色体スキャフォールド中の残りのシークエンシングエラーを補正した。
【０４２７】
(b)アノテーション
ポリッシングされた染色体スキャフォールドに、参照としてのリーシュマニア・メジャー株フリートリン(Ivensらの文献、2005)の注釈付きゲノムに基づくCompanion(Steinbissらの文献、2016)を用いて注釈を付けた。
(出版目録)
【化５１】
2020530273.tif 000079
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2020530273.tif 000082
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【図１】
2020530273.tif 000091
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１Ａ】
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【図４１Ｂ】
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【図４２】
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【図４３Ａ】
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【図４３Ｂ】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９Ａ】
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【図４９Ｂ】
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【図４９Ｃ】
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【図４９Ｄ】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２Ａ】
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【図５２Ｂ】
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【図５３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年6月8日(2020.6.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
2020530273.tif 000160
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