(57)【要約】  コルチコステロイドに対する予測反応バイオマーカー。本発明は、コルチコステロイド医療レジメンに対する被験者の反応性を医療レジメンの開始前に予測する方法を提供する。本方法は、被験者の単離された試験サンプル中のｍｉＲ２１８−５ｐの量を決定する工程を含み、ｍｉＲ２１８−５ｐ量がサンプル中に存在しない場合、被験者が医療レジメンに対するレスポンダーであることを示唆し、ｍｉＲ２１８−５ｐが試験サンプル中に検出される場合、被験者が医療レジメンに反応しないことを示唆する。本発明はまた、コルチコステロイド医療レジメンに対する被験者の反応性を予測するための、ｍｉＲ２１８−５ｐの量を決定する手段の使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
コルチコステロイド医療レジメンに対する被験者の反応性を、前記医療レジメンの開始前に予測する方法であって、前記方法が、前記被験者の単離された試験サンプル中のｍｉＲ２１８−５ｐの量を決定する工程を含み、ｍｉＲ２１８−５ｐ量が前記サンプル中に存在しない場合、前記被験者が前記医療レジメンに対するレスポンダーであることが示唆され、ｍｉＲ２１８−５ｐが前記試験サンプル中に検出される場合、前記被験者が前記医療レジメンに反応しないことが示唆される、方法。
【請求項２】
次のマーカー：ｍｉＲ６７５４−５Ｐ、ｍｉＲ４７６７、及びＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）の量の１つ以上を決定する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記方法が、ｍｉＲ２１８−５ｐ、ｍｉＲ６７５４−５Ｐ、及びｍｉＲ４７６７の量を決定する工程を含むか、又は代替的にｍｉＲ２１８−５ｐ及びＣＲＰの量を決定する工程を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記コルチコステロイドがグルココルチコイド医療レジメンである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記医療レジメンが経口又は静脈内投与のためのものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記被験者が炎症性疾患に罹患している、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記炎症性疾患が胃腸炎症性疾患である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記胃腸炎症性疾患が腸炎症性疾患である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記腸疾患が潰瘍性結腸炎である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記単離された試験サンプルが血漿、血清、血液、組織、尿、及び排便から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１に記載のコルチコステロイド医療レジメンに対する被験者の反応性を予測するための、ｍｉＲ２１８−５ｐの量を決定するプライマー又はプローブの使用。
【請求項１２】
コルチコステロイド医療レジメンに対する被験者の反応性を前記医療レジメンの開始前に予測するマーカーとしてのｍｉＲ２１８−５ｐの使用。
【請求項１３】
コルチコステロイド医療レジメンに対する被験者の反応性を前記医療レジメンの開始前に予測するための、ｍｉＲ６７５４−５ｐ、ｍｉ−Ｒ４７６７、及びＣＲＰの１つ以上との組合せでの、請求項１１に記載のｍｉＲ−２１８−５ｐの使用。
【請求項１４】
コルチコステロイド医療レジメンに対する被験者の反応性を前記医療レジメンの開始前に予測するための、ＣＲＰとの組合せでの、請求項１１に記載のｍｉＲ−２１８−５ｐの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１７年５月３日出願の欧州特許出願第１７３８２２４６号に基づく利益を主張する。
【０００２】
本発明は、被験者においてコルチコステロイドベースの療法に対する反応を予測する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景技術
炎症性疾患は、きわめて多様なヒト疾患の根底にある大きな一群の障害である。免疫系は、アレルギー反応及びいくつかの筋症の両方で実証される炎症性障害を伴うことが多く、免疫系障害の多くは、異常炎症を引き起こす。多種多様なタンパク質が炎症に関与し、そのいずれかは、そのタンパク質の正常な機能及び発現を損なうか、さもなければディスレギュレートする遺伝子突然変異を受けやすい。
【０００４】
炎症を伴う障害の例としては、特に、尋常性座瘡、喘息、自己免疫疾患、自己炎症性疾患、セリアック病、慢性前立腺炎、憩室炎、糸球体腎炎、化膿性汗腺炎、炎症性腸疾患、耳炎、骨盤内炎症性疾患、又は関節リウマチが挙げられる。
【０００５】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、クローン病（ＣＤ）及び潰瘍性結腸炎（ＵＣ）を含み、両方とも長期にわたる腸の損傷を引き起こすことで知られる。最近では、顕微鏡的結腸炎のコラーゲン性結腸炎及びリンパ球性結腸炎も、ＩＢＤに含められている。外部抗原と免疫反応障害と遺伝因子との組合せは、ＩＢＤの病因に寄与するように思われるが、腸炎症を開始する機序は依然として不明である。
【０００６】
ＣＤでは、腸のいずれの部分も罹患する可能性があるが、最も一般的なのは回盲部（５０％）及び結腸（３０％）の罹患である。また、患者の約１／４は随伴性肛門周囲疾患を有する。小腸のいくつかの短域が罹患することがあり、スキップ病変として知られることが多い。組織病理学的には、炎症は経壁性であり、肉芽腫を伴うリンパ球及びマクロファージの密な浸潤が患者の６０％までに見られる。ＵＣは、通常、直腸を含んで近位方向に広がり、広がりは個々の患者ごとにさまざまであるが、疾患は、常に結腸に制限された状態で残る。全結腸炎という用語は、炎症が右結腸曲も含む場合に用いられる。微視的には、粘膜炎症は表在性であり、リンパ球及び顆粒球に富む。潰瘍化及び陰窩膿瘍がよく見受けられる。下痢（血液を含有することが多い）、栄養失調、発熱、疼痛などの長期炎症の症状と共に、患者は、腸において長期にわたり上皮異形成及び最後には癌を発症するリスクも有する。ＩＢＤ患者の約１５％は不確定結腸炎を有するので、ＣＤ又はＵＣの確定診断を決定できない。
【０００７】
さらに重要なこととして、劇症結腸炎の患者では、診断に関する不確実性が存在することが多い。緊急の医学的治療及びより長期の展望に立って最良の外科的治療を決定する場合、適正な診断が重要である。
【０００８】
活動性ＵＣは、結腸粘膜内への活性化された顆粒球及び単球／マクロファージの浸潤により特徴付けられる。これらの浸潤細胞は、炎症促進性サイトカインの主要な供給源である。ＩＢＤ患者は、医学的治療に対する耐性を発生するおそれがある。考えられる原因は、ステロイドレセプターの発現を含めて顆粒球やサイトカインの分布又は免疫細胞の機能特性の変化である。
【０００９】
現在、ＩＢＤの診断及びステージ判定は、臨床パラメーター（アルブミン、ＳＲ、ＣＲＰ、発熱、排便回数）と内視鏡的基準及び組織病理学との組合せに基づく。
【００１０】
より適切な療法により疾患を効率的に治療するには、疾患の早期の正確な診断が必要である。
【００１１】
コルチコステロイドは、脊椎動物の副腎皮質で産生されるステロイドホルモンのクラスさらにはこうしたホルモンの合成アナログである。コルチコステロイドの２つの主要なクラスのグルココルチコイド及びミネラルコルチコイドは、ストレス反応、免疫反応、並びに炎症、炭水化物代謝、タンパク質異化、血中電解質レベル、及び挙動のレギュレーションをはじめとする広範にわたる生理学的プロセスに関与する。
【００１２】
コルチコステロイド様作用を有する合成医薬剤は、炎症の低減及び免疫系の抑制のために、脳腫瘍から皮膚疾患に至るまでさまざまな病態に使用される。それらは、特に、喘息、アレルギー性鼻炎及び蕁麻疹様枯草熱（蕁麻疹）、アトピー性湿疹、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、疼痛及び炎症を伴う関節、筋肉、及び腱、狼瘡、クローン病及び潰瘍性結腸炎を含む炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、巨細胞性動脈炎及びリウマチ性多発筋痛症、多発性硬化症（ＭＳ）などの病態を治療するために使用される。コルチコステロイドはまた、生体により天然に産生されないある特定のホルモンを置き換えるために、たとえばアジソン病の人々において、使用可能である。
【００１３】
デキサメタゾン及びその誘導体は、ほぼ純グルココルチコイドであり、一方、プレドニゾン及びその誘導体は、グルココルチコイド作用に加えていくらかのミネラルコルチコイド作用を有する。フルドロコルチゾン（Florinef）は合成ミネラルコルチコイドである。ヒドロコルチゾン（コルチゾール）は、典型的には補充療法に、たとえば副腎不全及び先天性副腎過形成に使用される。コルチコステロイドは菌状息肉症の治療剤である。
【００１４】
コルチコステロイドは、錠剤（経口ステロイド剤）、注射剤（血管、関節、若しくは筋肉に注射可能）、インヘラー剤（たとえば経口若しくは経鼻スプレー剤）、ローション剤、ゲル剤、又はクリーム剤（局所ステロイド剤）をはじめとするさまざまな形態で入手可能である。
【００１５】
コルチコステロイドの使用は数年間にわたりごく普通に行われてきたが、それは必ずしも有効なわけではなく、適正な治療反応を惹起しないにもかかわらず顕著な副作用を起こす。
【００１６】
考えられる副作用の数が多いことを考慮して、コルチコステロイドは、治療の潜在的利益がリスクを上回る場合にのみ処方されるにすぎず、処方される場合には最短可能期間にわたり最小有効用量で処方される。
【００１７】
一方、グルココルチコステロイド（ＧＣ）は、依然として中等度〜重度の活動性潰瘍性結腸炎（ＵＣ）の第１選択の治療剤である。しかしながら、患者の４０％までは好適な反応を示さず、カルシニューリン剤、抗ＴＮＦ剤、又は結腸切除などのレスキュー療法さえ必要とする（Llao J. et al.,“Improved outcome of acute severe ulcerative colitis while using early predictors of corticosteroid failure and rescue therapies”, Dig Liver Dis. 2016 Jun;48(6):608-12）。臨床及び生物学的パラメーター（主に、便通回数／日、直腸出血、及びＣ反応性タンパク質レベル）を用いて、ＧＣ療法の３〜５日後にステロイド不応性を予測可能である。残念ながら、これまでのところ、ＧＣに反応しない患者を治療開始前に同定することはできない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
したがって、特定の被験者がコルチコステロイド治療に確実に反応可能であるか否かをその投与開始前に決定するツールを提供する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
発明の概要
本発明者らは、ＩＢＤ特にＵＣに罹患している一群の被験者と協働して、被験者から単離されたサンプル中にｍｉＲ２１８−５ｐが検出された場合、それはコルチコステロイドベースの療法に対する被験者の反応の信頼できる予測因子であることを見いだした。
【００２０】
特定的には、本発明者らは、驚くべきことに、コルチコステロイド療法の施行開始前に得られた血漿サンプルにおいて、後で治療レスポンダーとして確認された被験者ではｍｉＲ−２１８−５ｐが不在であるが、後でノンレスポンダーのサンプルとして確認された被験者ではこのマーカーが実質的量で存在することを見いだした。すなわち、被験者がコルチコステロイド療法に対するノンレスポンダーである場合、試験サンプル中にｍｉＲ２１８−５ｐが検出される（以下の表２を参照されたい）。
【００２１】
また、さらにより顕著であったことは、表１に示されるようにｍｉＲ２１８−５ｐがグルココルチコイドのレスポンダーとノンレスポンダーとの分類を１００％の感度で可能にするという事実であった。このことは、このマーカーがレスポンダーとノンレスポンダーとの区別で偽陽性を提供しないことを意味する。
【００２２】
したがって、医師は、血漿サンプルなどの非侵襲的技術を用いてｍｉＲ−２１８−５ｐの存在を単にチェックするだけで、コルチコステロイド療法を潜在的に必要とする被験者が確実に反応するかを高確度で容易に決定できるので、本出願に提供されたデータは、コルチコステロイド管理における大きな進歩を意味する。この急速試験を用いれば、医師は、ｍｉＲ２１８−５ｐレベルに依存して療法の最適化及び再調整を行うことが可能になろう。
【００２３】
また最後に、ｍｉＲ２１８−５ｐがコルチコステロイド療法の有効性に関する情報を提供可能であることは、このマーカーが癌、なかでも特に、転移結腸直腸癌、膠芽細胞腫癌、多形間葉膠芽細胞腫、脳癌、又は髄芽腫に関連するとしてこれまで報告されてきた技術の現状を考えても、驚くべきことである。
【００２４】
そのため、一態様では、本発明は、コルチコステロイド医療レジメンに対する被験者の反応性を予測する方法を提供する。本方法は、被験者の単離された試験サンプル中のｍｉＲ２１８−５ｐの量を決定する工程を含む。
【００２５】
第２の態様では、本発明は、本発明の第１の態様に規定されるようにコルチコステロイド医療レジメンに対する被験者の反応性を予測するための、ｍｉＲ２１８−５ｐの量を決定する手段の使用を提供する。
【００２６】
第３の態様では、本発明は、コルチコステロイド医療レジメンに対する被験者の反応性を予測するマーカーとしての、ｍｉＲ２１８−５ｐ単独又はｍｉＲ６７５４−５ｐ、ｍｉＲ４７６７、及びＣＲＰの１つ以上との組合せの使用を提供する。
【００２７】
本発明者らはまた、驚くべきことに、ｍｉＲＮＡ２１８−５ｐ、ｍｉＲＮＡ６７５４、及びｍｉＲ４７６７のレベルを決定することによりＵＣなどの胃腸炎症性疾患に罹患している被験者と健常被験者とを正確に区別可能であることも見いだした。
【００２８】
特定的には、以下に示されるように、このｍｉＲＮＡの組合せは、健常被験者と比較したときＵＣ被験者では１／２０であった。この顕著な差は、組合せの特異性及び選択性の証拠である。
【００２９】
したがって、第４の態様では、本発明は、炎症性胃腸疾患の診断、予後予測、又は発症リスク予測を行う方法を提供する。本方法は、単離された試験サンプル中のｍｉＲ２１８、ｍｉＲ６７５４、及びｍｉＲ４７６７の量を決定する工程を含む。
【００３０】
第５の態様では、本発明は、炎症性胃腸疾患に罹患している疑いのある被験者を同定する方法を提供する。本方法は、
ａ）単離された試験サンプル中のｍｉＲ２１８、ｍｉＲ６７５４、及びｍｉＲ４７６７の量をｉｎ  ｖｉｔｒｏで決定することと、
ｂ）工程（ａ）から得られた全量と参照対照レベルとを比較することと、
を含み、工程（ａ）で決定されたレベルが参照対照レベルよりも低い場合、被験者が炎症性胃腸障害に罹患している疑いがあることを示唆する。
【００３１】
第６の態様では、本発明は、炎症性胃腸疾患に罹患している疑いのある被験者の医療レジメンを開始するかの決定又は推奨を行う方法を提供する。本方法は、
ａ）単離された試験サンプル中のｍｉＲ２１８、ｍｉＲ６７５４、及びｍｉＲ４７６７の量をｉｎ  ｖｉｔｒｏで決定する工程と、
ｂ）組合せの量が参照対照レベルよりも低い場合、炎症性胃腸疾患の診断又は被験者が炎症性胃腸疾患に罹患している疑いがあるかの決定を行う工程と、
を含み、
ｉ）被験者が炎症性胃腸疾患に罹患している又は被験者が炎症性胃腸疾患に罹患している疑いがあると診断された場合、医療レジメンの開始が推奨され、且つ
ｉｉ）患者が炎症性胃腸疾患に罹患していないと診断された場合、任意選択的に医師により患者の検査結果を考慮して追跡調査が実施される。
【００３２】
さらに、炎症性胃腸疾患に罹患しているため又はその疑いがあるため、被験者が医療レジメンを開始しなければならないと決定された場合、本発明のマーカーを用いてレジメンの効率をモニター可能である。
【００３３】
そのため、第７の態様では、本発明は、炎症性胃腸疾患とすでに診断された被験者において医療レジメンの有効性を決定する方法を提供する。本方法は、
（ａ）被験者から単離されたサンプル中のｍｉＲ２１８、ｍｉＲ６７５４、及びｍｉＲ４７６７の量をｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定する工程と、
（ｂ）医療レジメンの施行開始後、被験者から単離されたサンプル中の前記マーカーのレベルをｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定する工程と、
（ｃ）工程（ａ）及び（ｂ）で測定されたレベルを比較する工程と、
を含み、かかる方法では、工程（ｂ）で測定されたレベルが工程（ａ）で測定されたレベルよりも高い場合、医療レジメンが炎症性胃腸疾患の治療に有効であることを示唆する。
【００３４】
特定の療法に対する反応をその施行前に予測することは、臨床医にも有利でありうる。そのほか、ステロイド不応性の予測により、ステロイド剤に対する副作用が低減されるであろう。
【００３５】
そのため、第８の態様では、本発明は、炎症性腸疾患とすでに診断された被験者において医療レジメンに対する反応を予測する方法を提供する。本方法は、
（ａ）被験者から単離されたサンプル中のｍｉＲ２１８、ｍｉＲ６７５４、及びｍｉＲ４７６７の量をｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定することと、
（ｂ）医療レジメンの施行開始後、被験者から単離されたサンプル中の前記マーカーのレベルをｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定することと、
（ｃ）工程（ａ）及び（ｂ）で測定されたレベルを比較することと、
を含み、かかる方法では、工程（ｂ）で測定されたレベルが工程（ａ）で測定されたレベルよりも高い場合、被験者が医療レジメンに確実に反応するであろうことを示唆する。
【００３６】
最後に、第９の態様では、本発明は、本発明の第３の態様に規定されるように炎症胃腸疾患の診断若しくは予後予測を行うための、本発明の第４の態様に規定されるように炎症胃腸疾患に罹患している疑いのある被験者を同定するための、本発明の第５の態様に規定されるように炎症性胃腸疾患に罹患している疑いのある被験者の医療レジメンを開始するかの決定若しくは推奨を行うための、本発明の第６の態様に規定されるように炎症性胃腸疾患とすでに診断された患者において医療レジメンの有効性を決定するための、又は本発明の第７の態様に規定されるように医療レジメンに対する反応をその施行前に予測するための、ｍｉＲ２１８、ｍｉＲ６７５４、及びｍｉＲ４７６７の量を決定する手段の使用を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
発明の詳細な説明
本出願の明細書で用いられる用語はすべて、特に明記されていない限り、当技術分野で公知のそれらの通常の意味で理解すべきである。本出願で用いられるある特定の用語の他のより特定的な定義は、以下に示される通りであり、特に明記された定義がより広義の定義を提供しない限り、本明細書及び特許請求の範囲全体を通じて一様に適用することが意図される。
【００３８】
本発明は、第１の態様では、コルチコステロイド医療レジメンに対する被験者の反応性を予測する方法を提供する。本方法は、被験者の単離された試験サンプル中のｍｉＲ２１８−５ｐの量を決定する工程を含む。
【００３９】
本発明では、「コルチコステロイド医療レジメン」という用語は、１つ以上のコルチコステロイド薬剤の投与を含む医学的治療を意味する。
【００４０】
本発明の第１の態様の一実施形態では、本方法は、コルチコステロイド薬剤に対する被験者の反応性を予測するためのものである。
【００４１】
本発明では、当該技術の現状で「ｈｓａ−ｍｉＲ２１８−５ｐ」又は「ｈｓａ−ｍｉＲ−２１８」としても知られるｍｉＲ−２１８−５ｐは、配列番号１：ＵＵＧＵＧＣＵＵＧＡＵＣＵＡＡＣＣＡＵＧＵの配列を有する。ｍｉＲ−２１８−５ｐに関してはほとんど知られていない。それは幹細胞レギュレーションを介して癌発生に関連付けられてきた。ｍｉＲ−２１８前駆体ファミリーは、運動ニューロン発生のキープレーヤーであると報告されている。ｍｉＲ−２１８−５ｐは、７９４の検証された標的を示すが（MirTarBase[http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw］）、かなり信頼できる技術を用いて検証されているのは、ＢＭＩ１、ＣＤＨ２、ＣＤＫ６、ＤＫＫ２、ＧＬＩ２、ＨＭＧＢ１、ＨＯＸＢ３、ＩＫＢＫＢ、ＬＡＭＢ３、ＬＥＦ１、ＭＩＴＦ、ＯＴＵＤ７Ｂ、ＰＤＧＦＲＡ、ＲＥＴ、ＲＵＮＸ２、ＳＦＲＰ２、ＳＯＳＴ、ＳＰ１、及びＴＦＦ１の１９のみにすぎない。
【００４２】
以上に明記されたように、ｍｉＲ２１８−５ｐは、コルチコステロイド医療レジメンに対するノンレスポンダーとレスポンダーとの区別を可能にする。そのため、本発明の第１の態様の一実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、本方法は、コルチコステロイド薬剤に対するノンレスポンダーとレスポンダーとを診断することを含む。
【００４３】
以下に例示されるように、レスポンダー被験者のサンプルはバイオマーカーを有していないが、ノンレスポンダーはそれを有している。そのため、ｍｉＲ２１８−５ｐにより提供される情報に基づいて定性的基準を確立可能であり、試験サンプル中にｍｉＲ２１８−５ｐが検出されない場合、被験者がレスポンダーであることを示唆し、一方、ｍｉＲ２１８−５ｐがいずれかの量で試験サンプル中に検出された場合、被験者がノンレスポンダーであることを示唆しうる。
【００４４】
代替的に、決定された量と参照値とを比較することにより医療レジメンに対する被験者の反応性を予測する定量的基準も確立可能である。そのため、本発明の第１の態様の他の一実施形態では、本方法は、（ａ）ｍｉＲ２１８−５ｐの量を決定することと、（ｂ）（ｃ）で得られた量と参照値とを比較することと、を含む。
【００４５】
本発明では、本明細書で参照される「参照値」という用語は、所与の分子マーカー、この場合には本発明さらには特に実施形態のバイオマーカーのいずれかのあらかじめ規定された値と理解すべきであり、これは、サンプル中又は一群のサンプル中の前記分子マーカーのレベルから導出される。サンプルは、疾患の存在、不在、ステージ、又は経過があらかじめ適正に決められた被験者又は一群の被験者から得られる。この場合には、被験者は、コルチコステロイドレスポンデントとすでに診断された被験者でありうる。この値は、レスポンダーとノンレスポンダーとを識別する閾値として使用可能である。選択された一群の被験者から参照値を得る方法は、当該技術の現状で周知である（Burtis C. A. et al., 2008, Chapter 14, section “Statistical Treatment of Reference Values”）。当業者であれば分かるであろうが、最適なカットオフ値は、診断法又は予後予測法の特定の用途に従って、すなわち、診断又は予後予測の目的、目標集団、特異度と感度とのバランスなどに従って、規定されるであろう。
【００４６】
本発明の第１の態様の方法の他の一実施形態では、本方法は、ｍｉＲ−６７５４−５Ｐ、ｍｉＲ−４７６７、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、又はそれらの組合せの少なくとも１つの量を決定することをさらに含む。
【００４７】
当該技術の現状で「ｈｓａ−ｍｉＲ６７５４−５ｐ」としても知られるｍｉＲ−６７５４−５ｐは、配列番号２：ＣＣＡＧＧＧＡＧＧＣＵＧＧＵＵＵＧＧＡＧＧＡの配列を有する。
【００４８】
当該技術の現状で「ｈｓａ−ｍｉＲ４７６７」としても知られるｍｉＲ−４７６７は、配列番号３：ＣＧＣＧＧＧＣＧＣＵＣＣＵＧＧＣＣＧＣＣＧＣＣの配列を有する。
【００４９】
本発明の第１の態様又は本発明の第１の態様の実施形態のいずれかで参照されるこれらのｍｉＲＮＡの量は、定量ＰＣＲなどのルーチン法により決定可能である。代替的に、ｍｉＲＮＡの量の決定は、（ｉ）単離された試験サンプルのｍｉＲＮＡ分を抽出することと、（ｉｉ）ｍｉＲＮＡをシーケンスすることと、（ｉｉｉ）アライメントアルゴリズムを用いてリードの数を決定することと、により実施可能である。
【００５０】
Ｃ反応性タンパク質は、血漿中に見いだされる環状ペンタマータンパク質であり、そのレベルは、炎症に反応して上昇する。ＣＲＰは、主に炎症のマーカーとして使用される。ＥＬＩＳＡ、免疫比濁法、ネフェロメトリー、迅速免疫拡散法、及び視覚的凝集法はすべて、ＣＲＰの測定に使用される方法であり、その決定のためのキットは入手可能である。
【００５１】
以下に例示されるように、レスポンダー群及びノンレスポンダー群のサンプルにおいてグルココルチコイド前のｍｉＲ−２１８−５ｐ、ｍｉＲ−６７５４−５Ｐ、及びｍｉＲ−４７６７の発現レベルを決定した場合、得られるスコアは、ノンレスポンダーではレスポンダーの約１／２０を示すことが分かった。すなわち、ｍｉＲＮＡのこれらの特定の組合せは、両方の集団を比較した場合に十分に区別されたプロファイルを有し、区別の感度及び確度が高いことを示唆する。
【００５２】
本発明の方法のいずれかが２つ以上のバイオマーカーのレベルを測定することを含む場合、こうして得られた実験データは、単一の値（スコア）を得るためにBowtie2アルゴリズム（Langmead B. et al., 2012; Griffiths-Jones S. et al., 2006）などの統計的方法又はアルゴリズムに付される。代替的に、こうして得られた実験データは、コンピューターシステムの生物学ベースの方法又はアルゴリズム（Herrando-Grabulosa M. et al., “Novel Neuroprotective Multicomponent Therapy for Amyotrophic Lateral Sclerosis Designed by Networked Systems”, PLoS One 2016, vol. 11:e0147626; Gomez-Serrano M. et al., “Proteome-wide alterations on adipose tissue from obese patients as age-, diabetes- and gender-specific hallmarks”, Sci. Rep., 2016, vol. 6:25756）により統合される。こうして試験サンプルから得られたスコアは、対照サンプルから得られたスコア（参照値）と比較されるであろう（表２及び３を参照されたい）。
【００５３】
本明細書に提供される教示を考慮して、当業者であれば、一般知識を用いて、バイオマーカーの組合せにより提供された情報からスコアを取得する他のアルゴリズムを開発することが可能である。スコアの取得に使用される特定のアルゴリズムは、なんら本発明のバイオマーカーの有用性を限定するものではない。
【００５４】
本発明の第１の態様の一実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、本方法は、ｍｉＲ−６７５４−５ｐ及びｍｉＲ−４７６７の量を決定することをさらに含む。
【００５５】
本発明の第１の態様の他の一実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、本方法は、ｍｉＲ６７５４−５ｐ、ｍｉＲ−４７６７、及びＣＲＰの量を決定することをさらに含む。
【００５６】
また、以下に例示されるように、ｍｉＲ−２１８−５ｐ及びＣＲＰを決定する場合、得られるスコアは、レスポンダーとノンレスポンダーとを有意に区別するのに有用な情報を提供する。
【００５７】
そのため、本発明の第１の態様の他の一実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、本方法は、試験サンプル中のｍｉＲ２１８−５ｐ及びＣＲＰの量を決定することを含む。本発明の第１の態様の他の一実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、本方法は、（ａ）ｍｉＲ２１８−５ｐの量を決定することと、（ｂ）ＣＲＰの濃度を決定することと、（ｃ）ｍｉＲ２１８−５−ｐ／ＣＲＰのスコアを決定することと、（ｃ）工程（ｃ）のスコアと参照値とを比較することと、を含む。この実施形態では、コルチコステロイドレスポンダーとしてすでに同定されている被験者又は一群の被験者から参照値を得る場合、比の値が参照値を超えれば、被験者はノンレスポンダーであることが示唆されよう。
【００５８】
本発明の第１の態様の他の一実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、コルチコステロイド医療レジメンはグルココルチコイド医療レジメンである。
【００５９】
本発明では、「グルココルチコイド医療レジメン」とは、医療レジメンが１つ以上のグルココルチコイドを含むことを意味する。
【００６０】
限定されるものではないがグルココルチコイドの例示的な例は、特に、コルチゾール（ヒドロコルチゾン）、コルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、酢酸フルドロコルチゾン、及び酢酸デオキシコルチコステロンである。一実施形態では、グルココルチコイド療法剤はプレドニゾン又はプレドニゾロンである。
【００６１】
本発明の第１の態様の他の一実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、医療レジメンは経口又は静脈内療法に供される。
【００６２】
本発明の第１の態様の他の一実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、被験者は、全身性紅斑性狼瘡、関節リウマチ、アルコール性肝炎、喘息、自己免疫性肝炎、ＣＯＰＤ、糸球体腎炎、又は炎症性胃腸疾患などの炎症性疾患に罹患している。本発明の第１の態様の他の一実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、炎症性疾患は炎症性胃腸疾患である。本発明の第１の態様の他の一実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、炎症性胃腸疾患は炎症性腸疾患である。本発明の第１の態様の他の一実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、腸疾患は潰瘍性結腸炎である。
【００６３】
本発明の第１の態様の他の一実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、単離された試験サンプルは、血漿、血清、血液、組織、尿、及び排便から選択される。本発明の第１の態様の他の一実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、単離された試験サンプルは血漿である。
【００６４】
本発明の第１の態様の他の一実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、本方法は、コルチコステロイド医療レジメンに対する被験者の反応性を予測するためのものであり、本方法は、被験者の単離された試験サンプル中のｍｉＲ２１８−５ｐの量を決定する工程を含み、ｍｉＲ２１８−５ｐの検出は、被験者がコルチコステロイド薬剤のノンレスポンダーであることを示唆する。
【００６５】
本発明の第１の態様の他の一実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、本方法は、コルチコステロイド医療レジメンに対する被験者の反応性を予測するためのものであり、本方法は、被験者の単離された試験サンプル中のｍｉＲ２１８−５ｐの量を決定する工程を含み、ｍｉＲＮＡ２１８−５ｐの量の決定は、（ｉ）単離された試験サンプルのｍｉＲＮＡ分を抽出することと、（ｉｉ）ｍｉＲＮＡをシーケンスすることと、（ｉｉｉ）アライメントを用いてリードの数を決定することと、により実施され、ｍｉＲ２１８−５ｐの検出レベルは、被験者がコルチコステロイド薬剤のノンレスポンダーであることを示唆する。
【００６６】
本発明の第１の態様の他の一実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、本方法は、コルチコステロイド医療レジメンに対する被験者の反応性を予測するためのものであり、本方法は、被験者の単離された試験サンプル中のｍｉＲ２１８−５ｐの量を決定する工程を含み、ｍｉＲＮＡ２１８−５ｐの量の決定は、（ｉ）単離された試験サンプルのｍｉＲＮＡ分を抽出することと、（ｉｉ）ＰＣＲ（たとえばリアルタイムＰＣＲ）によりマイクロＲＮＡを定量することと、により実施される。
【００６７】
本発明の第１の態様の他の一実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、本方法は、コルチコステロイド医療レジメンに対する被験者の反応性を予測するためのものであり、本方法は、被験者の単離された試験サンプル中のｍｉＲ２１８−５ｐ、ｍｉＲ６７５４−５ｐ、及びｍｉＲ４７６７の量を決定する工程を含み、ｍｉＲＮＡの量の決定は、（ｉ）単離された試験サンプルのｍｉＲＮＡ分を抽出することと、（ｉｉ）マイクロＲＮＡの量を定量することと、により実施される。
【００６８】
本発明の第１の態様の他の一実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、本方法は、コルチコステロイド医療レジメンに対する被験者の反応性を予測するためのものであり、本方法は、被験者の単離された試験サンプル中のｍｉＲ２１８−５ｐ、ｍｉＲ６７５４−５ｐ、及びｍｉＲ４７６７の量を決定する工程を含み、ｍｉＲＮＡの量の決定は、（ｉ）単離された試験サンプルのｍｉＲＮＡ分を抽出することと、（ｉｉ）ＰＣＲ（たとえばリアルタイムＰＣＲ）によりマイクロＲＮＡを定量することと、により実施される。
【００６９】
上述したように、２つ以上のｍＲＮＡを本発明の方法のいずれかで使用する場合、さまざまなバイオマーカーの尺度から開始して単一のスコアを得るために統計的方法又はアルゴリズムが使用される。
【００７０】
本発明の第１の態様の他の一実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、本方法は、コルチコステロイド医療レジメンに対する被験者の反応性を予測するためのものであり、本方法は、被験者の単離された試験サンプル中のｍｉＲ２１８−５ｐ及びＣＲＰの量を決定する工程を含み、（ａ）ｍｉＲ２１８−５ｐの量が決定され、（ｂ）ＣＲＰの濃度が決定され、（ｃ）ｍｉＲ２１８−５−ｐとＣＲＰとのスコアが決定され、且つ（ｃ）工程（ｃ）の値と参照値とが比較される。
【００７１】
第２の態様では、本発明は、本発明の第１の態様に規定されるようにコルチコステロイド医療レジメンに対する被験者の反応性を予測するための、ｍｉＲ２１８−５ｐの量を決定する手段の使用を提供する。
【００７２】
本発明の第２の態様の実施形態では、本使用は、ｍｉＲ６７５４−５ｐ、ｍｉＲ４７６７、及びＣ反応性タンパク質の１つ以上の量を決定する手段をさらに含む。本発明の第２の態様の他の一実施形態では、本手段は、ｍｉＲ２１８−５ｐ、ｍｉＲ６７５４−５Ｐ、及びｍｉＲ４７６７の量を決定するためのものである。本発明の第２の態様の他の一実施形態では、本手段は、ｍｉＲ２１８−５ｐ及びＣＲＰの量を決定するためのものである。
【００７３】
本発明の第２の態様の他の一実施形態では、本手段は、特異的プライマー又はプローブ（任意選択的に標識される）である。
【００７４】
プライマー及びプローブは両方とも、ルーチンバイオインフォマティクスツールを用いて特定のｍｉＲＮＡ配列から設計可能である。
【００７５】
第３の態様では、本発明は、コルチコステロイド医療レジメンに対する被験者の反応性を予測するマーカーとしての、ｍｉＲ２１８−５ｐ単独又はｍｉＲ６７５４−５ｐ、ｍｉＲ４７６７、及びＣＲＰの１つ以上との組合せの使用を提供する。
【００７６】
本発明の第１の態様の以上に提供された実施形態はすべて、本発明の第３の態様の実施形態でもある。
【００７７】
第４の態様では、本発明は、炎症性胃腸疾患の診断又は予後予測の方法を提供する。
【００７８】
「診断」という用語は当業者に公知である。本明細書で用いられる場合、「診断」とは、被験者における特定の医学的病態の合併症若しくはリスクの認識、疾患若しくは病態の性質の決定、又は疾患若しくは病態の互いの識別と理解される。それは、考えられる疾患又は障害の決定又は同定を試みるプロセス及びこのプロセスにより達成される所見の両方を意味する。診断は、診断手順という意味では、治療及び予後予測の実施に関する医学的決定を可能にする分離された識別可能なカテゴリーに個体の病態を分類する試みと見なしうる。続いて、多くの場合、疾患又は他の病態により診断所見が記述される。しかしながら、診断は多くの形態をとりうる。存在の検出及び疾患、病変、機能不全、又は障害の指定の問題でありうる。それは管理又は予後予測のためにカテゴリーを帰属する行為でありうる。それは連続体の異常の程度又は分類の異常の種類のどちらかを示唆しうる。
【００７９】
本発明の第４の態様のｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断方法は、（ａ）無症候被験者、（ｂ）炎症性胃腸疾患に罹患している疑いがあるとしてすでに同定されている被験者、（ｃ）補完的確認診断アッセイとして炎症性胃腸疾患とすでに診断された被験者、又は（ｄ）疾患に罹患するリスクが高い被験者のサンプルを用いて実施可能である。
【００８０】
本明細書で用いられる「予後予測」とは、疾患の進行可能性及びアウトカムの予測を意味する。
【００８１】
本発明により提供される態様のいずれかで参照される「炎症性胃腸疾患又は障害」という用語は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、結腸炎、腸管侵入性結腸炎、Ｃ．ディフィシル（C. difficile）結腸炎、潰瘍性結腸炎（ＵＣ）、炎症性腸症候群（ＩＢＳ）、嚢炎、憩室炎、胃腸炎、仙痛、虫垂炎、虫垂炎、上行性胆管炎、食道炎、胃炎、又は腸炎などの炎症胃腸疾患又は障害を含む。第４〜第８の態様のいずれか１つの一実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、炎症性胃腸疾患は炎症性腸疾患である。第４〜第８の態様のいずれか１つの一実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、炎症性腸疾患は、クローン病及び潰瘍性結腸炎からなる群から選択される。第８までの態様のいずれか１つの一実施形態では、以上又は以下に提供される実施形態のいずれかと任意選択的に組み合わせて、炎症性腸疾患は潰瘍性結腸炎である。
【００８２】
第４〜第７の態様のいずれかで参照されるｍｉＲ２１８−５ｐ、ｍｉＲ６７５４−５ｐ、及びｍｉＲ４７６７の量を決定する工程は、定量的増幅又はリアルタイムＰＣＲなどの当業者にはルーチンのプロトコルを用いて実施可能である。それぞれのバイオマーカーの量は、個別試験で又は同時に決定可能である。検出に関する詳細はすでに以上に説明されており、以下の「実施例」のセクションには特定の実施形態が提供される。
【００８３】
次いで、以上に説明したように、以上に提供されたようなアルゴリズムを用いて非依存尺度から開始して単一のスコアを決定可能である。
【００８４】
ｍｉＲ２１８−５ｐ、ｍｉＲ６７５４−５ｐ、及びｍｉＲ４７６７を定量する手段は、特異的プライマー又はプローブである。
【００８５】
バイオマーカーの量の測定に使用される手段は、キットの一部を形成可能である。
【００８６】
本発明の第４〜第８の態様の他の一実施形態では、Ｃ反応性タンパク質の濃度も決定される。
【００８７】
Ｃ反応性タンパク質の濃度は、市販のキットのいずれかを用いて決定可能である。Ｃ反応性タンパク質の濃度を決定した後、この値をｍｉＲ２１８−５ｐの全量と一緒に統計処理して１つの単一値を達成することが可能である。また、これらのデータを適切に操作して１つの単一値を得るアルゴリズムは、当該技術の現状で入手可能である。ｍｉＲＮＡの組合せに類似して、アルゴリズムを用いて、個別にそれぞれのバイオマーカーの尺度から出発して単一値（スコア）を得ることが可能である。
【００８８】
本発明では、「参照値」という用語は、第４、第５、第６、第７、及び第８の態様を参照する場合、所与の分子マーカーのあらかじめ規定された値として理解すべきであり、これはサンプル中又は一群のサンプル中の前記分子マーカーのレベルから導出される。サンプルは、疾患の存在、不在、ステージ、又は経過があらかじめ適正に決められた被験者又は一群の被験者から得られる。この値は、レスポンダーとノンレスポンダーとを識別する閾値として使用される。選択された一群の被験者から参照値を得る方法は、当該技術の現状で周知である（Burtis C. A. et al., 2008, Chapter 14, section “Statistical Treatment of Reference Values”）。当業者であれば分かるであろうが、最適なカットオフ値は、診断法又は予後予測法の特定の用途に従って、すなわち、診断又は予後予測の目的、目標集団、特異度と感度とのバランスなどに従って、規定されるであろう。
【００８９】
第４〜第８の態様のいずれかの他の一実施形態では、参照対照は、健常被験者又は一群の被験者から規定される。
【００９０】
第４〜第８の態様のいずれかの他の一実施形態では、単離されたサンプルは、血漿、血清、血液、組織、尿、及び排便から選択される。第４〜第８の態様のいずれかの他の一実施形態では、単離されたサンプルは血漿である。
【００９１】
本明細書及び特許請求の範囲全体を通じて、「comprise（〜を含む）」という語及びその語の変化形は、他の技術的特徴、添加剤、成分、又は工程を除外することを意図するものではない。さらに、「comprise（〜を含む）」という語は、「consisting of（〜からなる）」の場合を包含する。本発明のそのほかの目的、利点、及び特徴は、本明細書を吟味することにより、又は本発明を実施すれば当業者に明らかになるであろう。以下の実施例及び図面は、例示を目的として提供されたものであり、本発明を限定することを意図したものではない。図面に関連する及び特許請求の範囲で括弧内に配置される参照記号は、特許請求の範囲の理解度を向上させる試みにすぎず、特許請求の範囲の限定と解釈しないものとする。さらに、本発明は、本明細書に記載の特定の及び好ましい実施形態のすべての可能な組合せをカバーする。
【実施例】
【００９２】
実施例
１．材料及び方法
１．１．患者
中等度〜重度に活動性のＵＣを有する２４名の患者及び１０名の健常対照者を含めた。臨床疾患活動性は、モントリオール基準（Silverberg M. S. et al., 2005）に従って評価した。
【００９３】
健常対照者は、内視鏡検査ユニットから同定し、ＩＢＤの家族歴も個人歴もなく完全結腸内視鏡検査で病理学的知見が観測されなかった場合に参加するように依頼した。
【００９４】
すべての患者及び対照者から書面によるインフォームドコンセントを得た。
【００９５】
ＵＣ患者はすべて、中等度のフレアに対しては０．７５〜１ｍｇ／ｋｇ／日の経口プレドニゾン又は重度の活動性の場合には１ｍｇ／ｋｇ／日の静脈内プレドニゾロンで治療した。ＧＣ療法の３〜５日後、依然として８回超の排便／日を呈した場合、又はBN-ProSpecネフェロメーター（Dade Behring, GMBH, Marburg, Germany）で超高感度ＣＲＰ試験（N High Sensitivity CRP）を用いて自動イムノアッセイにより測定されるＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）＞４５ｍｇ／Ｌを伴って４〜８回の排便／日を呈した場合、患者に対してシクロスポリン若しくはインフリキシマブでレスキュー療法を開始した。ベースラインから７日目、患者を臨床評価して、ステロイド反応性（モントリオール分類の重症度基準に従って軽度の活動性若しくは非活動性の疾患を有する場合）又はステロイド不応性（中度若しくは重度の臨床活動性が依然として存在するか若しくはレスキュー療法を開始した場合）として分類した。
【００９６】
１．２．血漿サンプルからの低分子ＲＮＡの抽出
製造業者の説明書に従ってmiRCURY RNA単離キット（EXIQON, Cat. No.300112）を用いて３００μｌの血漿から低分子ＲＮＡ（＜１０００ｎｔ）を単離した。次いで、miRCURY（商標）microRNA QC PCRキット（EXIQON, Cat. No.203848）を用いて、単離されたマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）のＲＮＡ品質を評価した。
【００９７】
１．３．血漿中ｍｉＲＮＡのシーケンシング
いくつかの変更を加えてTruSeq Small RNA Sample Prep Kit（Illumina, USA）を用いて循環低分子ＲＮＡのシーケンシングを行った。ライブラリー（１３５〜１６０ｂｐ）の選択は、PippinPrepソフトウェアv.6.0を利用してBioanalyzer（Agilent）でPippinPrep３％アガロースカセット（BluePippin（商標）カセットキット, Sage Science Inc., USA）により自動で実施した。そのほか、サイズ選択の前後でQIAquickカラム精製を実施するとともに、Kappa Library Quantification KitをＰＣＲ定量に使用した。シーケンシングは、TruSeq SRクラスターキットv3（Part#15023335）及びHiSeq GA（Part#15050107）に適合化されたプロトコルを用いて並びにcBot（商標）（Part#15006165）及びHiSeq2500 System（Part#15035786）のガイドラインに従って、HiSeq2500プラットフォーム（Illumina Inc.）で行った。Real Time Analysisソフトウェアv. 1.17.21.3及びSequence Analysis Viewerソフトウェアv. 1.8.20（Illumina Inc.）により生データを解析した。
【００９８】
１．４．データ編集及びマッピング
マイクロＲＮＡ：
Trimmomatic法に従ってマイクロＲＮＡシーケンシングの生データの品質管理を実施して、リードからアダプター配列を除去した（Bolger A. M. et al., 2014）。Bowtie2アルゴリズム（Langmead B. et al., 2012; Griffiths-Jones S. et al., 2006）を用いて各サンプルのデータをｍｉＲＮＡ配列にアライメントした。各サンプルに対して、特定のｍｉＲＮＡ配列にマッピングされるリードの数をカウントした（Langmead B. et al., 2012; Griffiths-Jones S. et al., 2006）。十分なシグナルが存在しないｍｉＲＮＡを廃棄した（どのサンプルもｍｉＲＮＡのカウント数１０を有していない場合及び／又はどのサンプルも百万当たりカウント数２を有していない場合）。Ｍ値の加重トリム平均を介してカウントマトリクスを規格化した（Robinson M. D. et al., 2010）。次いで、edgeR及びlimmaのvoom法を介して差次的発現を計算した（Robinson M. D. et al., 2010; Ritchie M. E. et al., 2015）。次の基準を満たすｍｉＲＮＡは、差次的に発現されて機能的に適合するとみなした。調整ｐ値（ＦＤＲ）＜０．０５又は分類ｐ値＜０．０５又は非調整ｐ値＜０．０１、及びＬｏｇＦＣ＞０．５８（すなわち、一方のコホートのカウント数は他方のものよりも少なくとも５０％多い）。
【００９９】
１．５．バイオマーカーの同定
以上のセクション１．３に開示されるようにシーケンスすることにより測定された各ｍｉＲＮＡのサンプルごとの発現サンプルを用いて、レスポンダー及びノンレスポンダーのＵＣ患者のサンプルをより良好に分類するｍｉＲＮＡを同定した。
【０１００】
レスポンダー及びノンレスポンダーのサンプルを分類するｍｉＲＮＡの最良の組合せを同定するために、Kira et al., 1992により開示された方法を用いてｍｉＲＮＡデータからバイオマーカーの潜在的セットを同定した。これらの計算は、シーケンスされたすべてのｍｉＲＮＡを用いて又はよりＭｏＡに関連するｍｉＲＮＡを用いて実施した。このプロトコルを血漿サンプルにおいてベース時及び治療の３日目に実施して、両方の時点で潜在的バイオマーカーを同定した。以下のパラメーターを上位にランク付けられるｍｉＲＮＡの選択に使用した。
−確度：適正に分類されたサンプルの割合。
−汎化能力：リーブワンアウトストラテジーを用いて高スループットの２つのコホートのサンプルのセットを分類する確率、すなわち、これまで解析されなかったサンプルを適正に予測する確率。それは、分析に使用されるデータセットにかなり依存するので、データセットの量及び質の関数である。
−感度：適正にそれとして同定される陽性の割合。［感度＝真陽性／陽性］
−特異度：適正にそれとして同定される陰性の割合。［特異度＝真陰性／陰性］
−精度：真陽性の陽性として分類されるサンプルの割合。［精度＝真陽性／陽性コール］
−陰性的中率（ＮＰＶ）：真陰性の陰性として分類されるサンプルの割合。［ＮＰＶ＝真陰性／陰性コール］
【０１０１】
１．６．血漿サンプル中のＣ反応性タンパク質濃度の定量
BN-ProSpecネフェロメーター（Dade Behring, GMBH, Marburg, Germany）で超高感度ＣＲＰ試験（Ｎ High Sensitivity CRP）を用いて血漿中高感度Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）を測定したところ、２．３８及び５２．２ｍｇ／ｌのＣＲＰ濃度に対してアッセイ間変動係数はそれぞれ３．７及び３．５％であった。アッセイは、希釈サンプルを用いてトリプリケートで実施した。
【０１０２】
１．７．組合せアルゴリズム
予測アルゴリズムは、レスポンダー及びノンレスポンダーの患者の実験データで提示される各特徴の分類能力の評価から得られた３つ（ＰＣＲ＋ｍｉＲ−２１８−５Ｐ）又は４つ（３ｍｉＲＮＡ）のシャロー人工ニューラルネットワーク（２つのノードを有する１つの隠れ層を用いた多層パーセプトロン）のアンサンブルにより形成される。
【０１０３】
ｉ）３つのｍｉＲＮＡの組合せのアルゴリズム：
【０１０４】
【表１】
2020518274.tif 000002
【０１０５】
ｉｉ）Ｃ反応性タンパク質とｈｓａ−ｍｉＲ−２１８−５ｐとの組合せのアルゴリズム
【０１０６】
【表２】
2020518274.tif 000003
【０１０７】
１．７．定量リアルタイムＰＣＲを用いたｍＲＮＡの定量
全ＲＮＡ（ｍＲＮＡとｍｉＲＮＡ）は、製造業者の推奨に従って保持カラムmiRCURY RNA Isolation_Biofluids（Exiqon, USA）に基づく市販のキットを用いて血漿サンプルから抽出した。溶解緩衝液及びイソプロパノールを用いて２００μｌの非溶血血漿からタンパク質を沈殿させる。遠心分離後、上清を保持カラムに移して、ＲＮＡをＰＣＲグレード水を用いて回収する。全ＲＮＡの完全性は、TapeStationシステム（Agilent Technologies, Spain）で評価される。
【０１０８】
リアルタイムＰＣＲによるｍｉＲＮＡの評価は、選択されたｍｉＲＮＡプライマーを用いてあらかじめ設計されたプラークを含むPick-&-Mix microRNA PCRパネル（Exiqon）で行われる。Pick-&-Mixパネルは、LNA（商標）（Locked Nucleic Acid（商標）、Exiqon）オリゴヌクレオチド法を利用して作製される。
【０１０９】
全ＲＮＡは、Universal cDNA合成キット（Exiqon）を用いてｃＤＮＡにレトロ転写（ＲＴ）される。２０ｎｇの得られたｃＤＮＡは、各ウェル中１０μｌの最終体積のSYBR（著作権） Green Master Mix（Exiqon）溶液に添加される。各サンプルは、LightCycler 480（Roche, USA）サーモサイクラーを用いて蛍光シグナルによりトリプリケートで評価される。合成ｍｉＲＮＡ（Spike-ins, Exiqon）及び６つの低分子ＲＮＡ／マイクロＲＮＡ参照遺伝子（Ｕ６、ＳＮＯＲＤ３８Ｂ、ＳＮＯＲＤ４９Ａ、ｍｉＲ−１０３−３ｐ、ｍｉＲ−１９１−５ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−４２３−５ｐ）は、それぞれ、内部対照として又はハウスキーピング遺伝子として使用される（https://www.exiqon.com/mirna-pcr）。データの正規化及び定量は、Exiqon GenEx qPCR分析ソフトウェアを用いて行われる（http://www.exiqon.com/qpcr-software）。値は相対量又は変化倍率として表され、サンプル及び参照対照のＰＣＲ効率及びクロスポイント変位から得られる（Pfaffl M. W. Nucleic Acid Res 2001, 29(9):e45）。
【０１１０】
２．結果
患者及び対照者
ＧＣ治療の開始７日後まで、試験に含まれる２４名のＵＣ患者のうち、１３名はレスポンダーとして及び１１名はノンレスポンダーとして分類された。主要な疫学的及び臨床変数を比較した場合、レスポンダーとノンレスポンダーとの間に、フレアアップの重症度に関連する統計学的有意差が見られた（モントリオールベーサルレート及びベーサルＰＣＲ）。
【０１１１】
ＧＣ反応の循環マイクロＲＮＡ予測因子の同定
潜在的ｍｉＲＮＡバイオマーカーを同定するために、血液のｍｉＲＮＡトランスクリプトームを以上に記載のSystems Biology法により統計解析した。より高い確度、より高い汎化能力、及びより少数のｍｉＲＮＡでｍｉＲＮＡの最良の組合せを選択した。
【０１１２】
最良のマイクロＲＮＡ又はその組合せは、ｍｉＲＮＡの全プールの分析を介して得た。その際、ｍｉＲ−２１８−５ｐは、ＧＣ反応に基づいてＵＣ患者の分類子として最良の値を示した（確度＝８４．２１％、汎化能力＝８４．２１％、感度＝１００％、特異度＝６６．６７％、精度＝７６．９２％、ＮＰＶ＝１００％）（表１）。
【０１１３】
そのほか、前述のｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−６７５４−５ｐ及びｍｉＲ−４７６７を併用した分類子の最高の組合せに含まれていた（確度＝９４．７４％、汎化能力＝７５．４４％、感度＝７０％、特異度＝８１．４８％、精度＝８１．４５％、ＮＰＶ＝７０．７７％）。
【０１１４】
このｍｉＲＮＡの組合せは、ｍｉＲ−２１８−５ｐ単独よりも良好な確度、特異度、及び精度を提供する。
【０１１５】
【表３】
2020518274.tif 000004
【０１１６】
表２は、選択されたマイクロＲＮＡ値の平均及び四分位間範囲を示す。非依存サンプル（患者ｖｓ対照者、ステロイド反応性ｖｓステロイド不応性、ステロイド反応性ｖｓ対照、ステロイド不応性ｖｓ対照）ではノンパラメトリックマンホイットニーＵ検定を用いて及びベースライン時とＧＣ開始３日後との比較ではウィルコクソン検定を用いて、これらの発現値を統計的に比較した。結果は、ベースライン時においてステロイド感受性ＵＣ患者よりもステロイド不応性患者の方がより高レベルのｍｉＲ−２１８−５ｐを示した（ｐ＝０．０１３）。ベースライン時においてｍｉＲ−２１８−５ｐとｍｉＲ−６７５４−５ｐとｍｉＲ−４７６７との組合せで得られたスコアは、異なるＧＣ反応を有する両群の患者（ｐ＝０．０００）さらにはステロイド不応性患者と対照者（ｐ＝０．０３１）を完全に分類した。したがって、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１８−５Ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６７５４−５ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−４７６７は、組み合わせると、ＵＣにおいてステロイド不応性の大きな予測能力を有する。
【０１１７】
【表４】
2020518274.tif 000005
【０１１８】
マイクロＲＮＡの組合せは健常被験者とＵＣ被験者との区別を可能にする
得られたデータのうち、ｍｉＲ２１８−５ｐ、ｍｉＲ６７５４−５ｐ、及びｍｉＲ４７６７のｍｉＲＮＡの組合せは、健常被験者及びＵＣ被験者において示差的に発現されることが分かった。
【０１１９】
特定的には、健常被験者では組合せは相対単位１．００で発現され、ＵＣ患者では組合せは相対単位０．０５で発現されることが分かった。すなわち、組合せは、健常被験者と比較したときＵＣ被験者において１／２０で発現された。
【０１２０】
これらのことから、このｍｉＲＮＡの組合せは、健常被験者とＵＣ被験者とを効率的に区別するのに使用可能であると結論付けることができる。
【０１２１】
ｍｉＲ２１８−５ｐとＣ反応性タンパク質との組合せはレスポンダーとノンレスポンダーとの効率的な区別を可能にする
以下の表３に示されるように、ｍｉＲ２１８−５ｐ発現をＣ反応性タンパク質濃度との組合せで使用した場合、それはレスポンダー／ノンレスポンダーとして被験者を分類する正確な基準として使用可能であることが分かった。特定的には、ｍｉＲ−１２８とＣＲＰとの組合せのスコア値は、ステロイドレスポンダー患者では対照と対比して実質的に増加するが、ステロイド不応性患者では実質的に低減することが分かった。
【０１２２】
【表５】
2020518274.tif 000006
【０１２３】
このことは、ＣＲＰを含むｍｉＲＮＡの組合せがこの病院コホートにおいてコルチコステロイド反応ときわめて良好に相関することを意味する。
【０１２４】
本出願で引用された参照文献
Burtis C. A. et al., 2008, Chapter 14, section “Statistical Treatment of Reference Values”
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2020518274.tif 000009