(57)【要約】  本発明は、ＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニスト、リンカー、および−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ−Ｙ−Ｒ２０基を有するヒアルロン酸ヒドロゲルを含むコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩に関し、Ｙは、ＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニスト部分を表し；−Ｌは、式（Ｉａ）によるリンカー部分であり、点線は、アミド結合を形成することによるＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニスト部分のアミノ基の１つへの結合を示す。本発明はさらに、前記コンジュゲートを含む医薬組成物ならびにＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストにより治療することができる疾患または障害を治療または予防するための医薬としてのそれらの使用に関する。【化１】2020503278.tif 000084
2020503278.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルを含むコンジュゲートであって、
該架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルは、
単量体二糖単位の０．００１〜２０ｍｏｌ％が架橋剤により架橋され；
単量体二糖単位の０．２〜２０ｍｏｌ％が−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ−Ｙ−Ｒ２０基を有し；
Ｌ１は、場合により１つまたはそれ以上の炭素原子が、−Ｏ−、ＮＨ（Ｒ５ａａ）およびＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５ａａ）から選択される基によって置き換えられ、ＯＨおよびＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５ａａＲ５ａａａ）から独立に選択される１つまたはそれ以上の基により場合により置換されたＣ１−２０アルキル鎖であり、Ｒ５ａａおよびＲ５ａａａは、ＨおよびＣ１−４アルキルからなる群から独立に選択され；
Ｌ１は、ヒアルロン酸のベータ−１，３−Ｄ−グルクロン酸のカルボキシ基とアミド結合を形成して、末端アミノ基を介してヒドロゲルに結合しており、
Ｌ２は、単一化学結合、または場合により１つまたはそれ以上の炭素原子が、−Ｏ−およびＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ３ａａ）から選択される基によって置き換えられ、ＯＨおよびＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ３ａａＲ３ａａａ）から独立に選択される１つまたはそれ以上の基により場合により置換されたＣ１−２０アルキル鎖であり、Ｒ３ａａおよびＲ３ａａａは、ＨおよびＣ１−４アルキルからなる群から独立に選択され；
Ｌ２は、以下からなる群から選択される末端基を介してＬ１に結合しており；
【化１】
2020503278.tif 000065
Ｌ２は、点線により示されている１つの位置に結合し、Ｌ１は、他の点線により示されている位置に結合しており；
Ｌは、式（Ｉａ）のリンカー
【化２】
2020503278.tif 000066
（式中、点線は、アミド結合を形成することによるＹのＮ末端への結合を示し；
Ｘは、Ｃ（Ｒ４Ｒ４ａ）またはＮ（Ｒ４）であり；
Ｒ１、Ｒ１ａは、ＨおよびＣ１−４アルキルからなる群から独立に選択され；
Ｒ２、Ｒ２ａは、ＨおよびＣ１−４アルキルからなる群から独立に選択され；
Ｒ４、Ｒ４ａは、ＨおよびＣ１−４アルキルからなる群から独立に選択され；
Ｒ２、Ｒ２ａ、Ｒ４またはＲ４ａのうち１つはＬ２に結合している）であり；
Ｙは、式（Ｉｂ）を有するペプチド部分
Ｈｉｓ−Ｄ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−×１４−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（Ｉｂ）
であり、
×１４は、−ＮＨ２側鎖基が（Ｓ）−４−カルボキシ−４−ヘキサデカノイルアミノ−ブチリルにより官能基化されたＬｙｓを表し；
またはＹは、式（Ｉｃ）を有するペプチド部分
Ｈｉｓ−ｄＳｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−×１４−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（Ｉｃ）
であり、
×１４は、−ＮＨ２側鎖基が（Ｓ）−４−カルボキシ−４−オクタデカノイルアミノ−ブチリルにより官能基化されたＬｙｓを表し；
Ｒ２０は、ＯＨまたはＮＨ２である、
前記コンジュゲート
またはその塩もしくは溶媒和物。
【請求項２】
単量体二糖単位の０．００１〜２０ｍｏｌ％が架橋剤により架橋され；
単量体二糖単位の０．２〜２０ｍｏｌ％が−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ−Ｙ−Ｒ２０基を有し；
該架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルの単量体二糖単位の０．２〜３０ｍｏｌ％が−Ｌ１−Ｚ−ＯＨ基を有する該架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルを含み；
Ｌ１は、場合により１つまたはそれ以上の炭素原子が、−Ｏ−、ＮＨ（Ｒ５ａａ）およびＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５ａａ）から選択される基によって置き換えられ、ＯＨおよびＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５ａａＲ５ａａａ）から独立に選択される１つまたはそれ以上の基により場合により置換されたＣ１−２０アルキル鎖であり、Ｒ５ａａおよびＲ５ａａａは、ＨおよびＣ１−４アルキルからなる群から独立に選択され；
Ｌ１は、ヒアルロン酸のベータ−１，３−Ｄ−グルクロン酸のカルボキシ基とアミド結合を形成して、末端アミノ基を介してヒドロゲルに結合しており、
Ｌ２は、単一化学結合、または場合により１つまたはそれ以上の炭素原子が、−Ｏ−およびＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ３ａａ）から選択される基によって置き換えられ、ＯＨおよびＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ３ａａＲ３ａａａ）から独立に選択される１つまたはそれ以上の基により場合により置換されたＣ１−２０アルキル鎖であり、Ｒ３ａａおよびＲ３ａａａは、ＨおよびＣ１−４アルキルからなる群から独立に選択され；
Ｌ２は、以下からなる群から選択される末端基を介してＬ１に結合しており；
【化３】
2020503278.tif 000067
Ｌ２は、点線により示されている１つの位置に結合し、Ｌ１は、他の点線により示されている位置に結合しており；
Ｚは、場合により１つまたはそれ以上の炭素原子が、−Ｏ−およびＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ６ａａ）から選択される基によって置き換えられたＣ１−１６アルキル鎖であり、Ｒ６ａａは、水素またはＣ１−４アルキルであり；または
Ｚは、
【化４】
2020503278.tif 000068
であり；
Ｚは、以下からなる群から選択される末端基を介してＬ１に結合しており；
【化５】
2020503278.tif 000069
Ｚは、点線により示されている１つの位置に結合し、Ｌ１は、他の点線により示されている位置に結合しており；
Ｌは、式（Ｉａ）のリンカー
【化６】
2020503278.tif 000070
（式中、点線は、アミド結合を形成することによるＹのＮ末端への結合を示し；
Ｘは、Ｃ（Ｒ４Ｒ４ａ）またはＮ（Ｒ４）であり；
Ｒ１、Ｒ１ａは、ＨおよびＣ１−４アルキルからなる群から独立に選択され；
Ｒ２、Ｒ２ａは、ＨおよびＣ１−４アルキルからなる群から独立に選択され；
Ｒ４、Ｒ４ａは、ＨおよびＣ１−４アルキルからなる群から独立に選択され；
Ｒ２、Ｒ２ａ、Ｒ４またはＲ４ａのうち１つはＬ２に結合している）であり；
Ｙは、式（Ｉｂ）を有するペプチド部分
Ｈｉｓ−Ｄ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−×１４−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（Ｉｂ）
であり、
×１４は、−ＮＨ２側鎖基が（Ｓ）−４−カルボキシ−４−ヘキサデカノイルアミノ−ブチリルにより官能基化されたＬｙｓを表し；
またはＹは、式（Ｉｃ）を有するペプチド部分
Ｈｉｓ−ｄＳｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−×１４−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（Ｉｃ）
であり、
×１４は、−ＮＨ２側鎖基が（Ｓ）−４−カルボキシ−４−オクタデカノイルアミノ−ブチリルにより官能基化されたＬｙｓを表し；
Ｒ２０は、ＯＨまたはＮＨ２である、
請求項１に記載のコンジュゲート
またはその塩もしくは溶媒和物。
【請求項３】
−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ−が式（ＩＩａ）のリンカー部分
【化７】
2020503278.tif 000071
（式中、点線は、アミド結合を形成することによるＹへの結合を示し；
Ｒ１はＣＨ３であり；
Ｒ１ａはＣＨ３であり；
Ｒ２ａはＨであり；
−Ｌ１−Ｌ２は、請求項１または２に記載のように定義される）である、
請求項１または２に記載のコンジュゲート
またはその塩もしくは溶媒和物。
【請求項４】
Ｌ２は、場合により１つの炭素原子が、−Ｏ−およびＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ３ａａ）から選択される基によって置き換えられたＣ１−６アルキル鎖であり、Ｒ３ａａは、ＨおよびＣ１−４アルキルからなる群から独立に選択され；
Ｌ２は、以下からなる群から選択される末端基を介してＬ１に結合しており；
【化８】
2020503278.tif 000072
Ｌ２は、点線により示されている１つの位置に結合し、Ｌ１は、他の点線により示されている位置に結合する、
請求項１〜３のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項５】
架橋剤はジビニルスルホンである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項６】
Ｚは、−ＣＨ２−ＣＨ２−である；または
Ｚは、
【化９】
2020503278.tif 000073
であり；
Ｚは、以下からなる群から選択される末端基を介してＬ１に結合しており；
【化１０】
2020503278.tif 000074
Ｚは、点線により示されている１つの位置に結合し、Ｌ１は、他の点線により示されている位置に結合する、
請求項１〜５のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項７】
Ｚは、−ＣＨ２−ＣＨ２−であり；
Ｚは、末端基を介してＬ１に結合しており；
【化１１】
2020503278.tif 000075
Ｚは、点線により示されている１つの位置に結合し、Ｌ１は、他の点線により示されている位置に結合する、
請求項１〜６のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項８】
−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ−Ｙが式（ＩＩＩｂ）の部分
【化１２】
2020503278.tif 000076
である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項９】
−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ−Ｙが式（ＩＩＩａ）の部分
【化１３】
2020503278.tif 000077
である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項１０】
−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ−Ｙが式（ＩＩＩｃ）の部分
【化１４】
2020503278.tif 000078
である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項１１】
Ｙが、配列番号５から選択されるＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストである、
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項１２】
Ｙが、配列番号６から選択されるＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストである、
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項１３】
架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルであって、
単量体二糖単位の０．００１〜２０ｍｏｌ％がジビニルスルホンにより架橋され；
単量体二糖単位の０．５〜５ｍｏｌ％が−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ−Ｙ−Ｒ２０基を有し；
−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ−Ｙ基は式（ＩＩＩｂ）により表される構造を有し；
【化１５】
2020503278.tif 000079
Ｌ１は、ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−または−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−であり；
Ｌ１は、ヒアルロン酸のベータ−１，３−Ｄ−グルクロン酸のカルボキシ基とアミド結合を形成して、末端アミノ基を介してヒドロゲルに結合しており；
該架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルの単量体二糖単位の０．２〜３０ｍｏｌ％が−Ｌ１−Ｚ−ＯＨ基を有し；
Ｚは、−ＣＨ２−ＣＨ２−であり；
Ｚは、末端基を介してＬ１に結合しており；
【化１６】
2020503278.tif 000080
Ｚは、点線により示されている１つの位置に結合し、Ｌ１は、他の点線により示されている位置に結合しており；
Ｙは、配列番号５を有するペプチド部分である、
該架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルを含む、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のコンジュゲートまたはその薬学的塩を、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤と一緒に含む医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１４に記載の医薬組成物および粘度調整剤。
【請求項１６】
粘度調整剤がヒアルロン酸である、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
粘度調整剤は、５〜３０重量／容積パーセントの濃度のヒアルロン酸である、
請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
注射用製剤の形態の請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
内径が０．２６ｍｍ（２６ゲージ）より小さな針を介する注射によって投与することができる、注射用製剤の形態の、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
１ｍＬの容積を、２６ゲージの針を介して２０ニュートンに等しい／未満の力を加えることによって室温で１０秒以内に押し出すことができる、注射用製剤の形態の、請求項１８または１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
懸濁液の形態の請求項１４〜２０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のコンジュゲートが０．５〜８重量／容積パーセントの濃度を有する、懸濁液の形態の請求項１４〜２１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
請求項１〜１３いずれか１項に記載のコンジュゲートが１．５〜３重量／容積パーセントの濃度を有する、懸濁液の形態の請求項１４〜２２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
コンジュゲートが、１回の適用で治療有効量のＧＬＰ１／グルカゴンアゴニストを少なくとも６日間供給するのに十分なように組成物に加えられる、請求項１４〜２３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２５】
１回量組成物である、請求項１４〜２４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２６】
医薬として使用する請求項１〜１３のいずれか１項に記載のコンジュゲートまたは請求項１４〜２５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストにより治療することができる疾患または障害を治療または予防する方法における使用のための、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のコンジュゲートまたは請求項１４〜２５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
糖尿病を治療または予防する方法における使用のための、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のコンジュゲートまたは請求項１４〜２５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
異脂肪血症を治療または予防する方法における使用のための、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のコンジュゲートまたは請求項１４〜２５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
代謝症候群を治療または予防する方法における使用のための、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のコンジュゲートまたは請求項１４〜２５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
肥満を治療または予防する方法における使用のための、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のコンジュゲートまたは請求項１４〜２５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
肝臓脂肪症を治療または予防する方法における使用のための、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のコンジュゲートまたは請求項１４〜２５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
式（ＩＶａ）の中間体Ｌ２＊−Ｌ−Ｙ
【化１７】
2020503278.tif 000081
（式中、Ｙは、配列番号５または６のペプチドである）。
【請求項３４】
式（ＩＶｂ）の中間体Ｌ２＊−Ｌ−Ｙ
【化１８】
2020503278.tif 000082
（式中、Ｙは、配列番号５または６のペプチドである）。
【請求項３５】
式（ＩＶｃ）のＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニスト−リンカーコンジュゲート中間体Ｌ２＊−Ｌ−Ｙ
【化１９】
2020503278.tif 000083
（式中、Ｙは、配列番号５または６のペプチドである）。
【請求項３６】
１型糖尿病、２型糖尿病、肥満または高血糖の治療方法における使用のための、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の少なくとも１つのコンジュゲートを含む組成物であって、２６ゲージまたはそれより大きい針を有するチューブを含む注射装置を介して皮下投与されることを特徴とし、週１回投与される前記組成物。
【請求項３７】
注射装置であって、１型糖尿病、２型糖尿病、肥満または高血糖の治療方法における使用のための、２８またはそれより大きいゲージを有するチューブを含み、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のコンジュゲートをさらに含む前記注射装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＧＬＰ−１／グルカゴン二重アゴニスト、リンカーおよびヒアルロン酸を含むコンジュゲート、前記コンジュゲートを含む医薬組成物、ならびに例えば、糖尿病および肥満を含む、代謝症候群の障害の治療におけるＧＬＰ−１／グルカゴン二重アゴニストにより治療することができる疾患または障害を治療もしくは予防するための、ならびに過度の食物摂取の低減のための医薬としてのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＧＬＰ−１アゴニスト
エキセンディン−４は、毒腺を有するアメリカドクトカゲ（Ｈｅｌｏｄｅｒｍａ  ｓｕｓｐｅｃｔｕｍ）の唾液分泌物から単離された３９アミノ酸ペプチドである。それは、グルカゴン様ペプチドファミリーのいくつかのメンバーとある程度の配列類似性を有し、グルカゴン様ペプチド−１［７−３６］−アミド（ＧＬＰ−１）が５３％の最も高い相同性を有する。エキセンディン−４は、ＧＬＰ−１受容体に対するアゴニストとして作用し、単離ラット膵島におけるＧＬＰ−１様のインスリン分泌促進作用を有する。エキセンディン−４は、高い効力のアゴニストであり、切断型ＧＬＰ−１アゴニスト−（９−３９）−アミドは、インスリン分泌ベータ細胞のグルカゴン様ペプチド１−（７−３６）−アミド受容体におけるアンタゴニストである。エキセンディン−４（「エキセナチド」）は、メトホルミンおよび／またはスルホニル尿素を服用しているが、十分な血糖コントロールを達成しなかった２型糖尿病を有する患者における血糖コントロールを改善するために米国およびＥＵにおいて最近承認された。
【０００３】
エキセンディン−４のアミノ酸配列は、配列番号１
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−ＮＨ２として示される。
【０００４】
ＧＬＰ−１（７−３６）−アミドのアミノ酸配列は、配列番号２
ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ−ＮＨ２として示される。
【０００５】
グルカゴンは、循環グルコースが低い場合に血流中に放出される２９アミノ酸ペプチドである。グルカゴンのアミノ酸配列は、配列番号３
ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴ−ＯＨに示されている。
【０００６】
リラグルチドは、その他にも修飾はある中で、脂肪酸が２０位のリシンに連結しており、作用期間の延長をもたらす、化学的に修飾されている市販のＧＬＰ−１類似体である（非特許文献１；非特許文献２）。
【０００７】
リラグルチドのアミノ酸配列は、配列番号４
ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫ（（Ｓ）−４−カルボキシ−４−ヘキサデカノイルアミノ−ブチリル−）ＥＦＩＡＷＬＶＲＧＲＧ−ＯＨとして示される。
【０００８】
血糖値が正常値以下に低下する低血糖時に、グルカゴンは、グリコーゲンを分解し、グルコースを放出して、正常レベルに到達するように血糖値の上昇をもたらすシグナルを肝臓に伝達する。低血糖は、糖尿病に起因する高血糖（血糖値の上昇）を有する患者のインスリン治療の一般的な副作用である。したがって、グルコースの調節におけるグルカゴンの最も重要な役割は、インスリンの作用に対抗し、血糖値を維持することである。
【０００９】
ＧＬＰ−１、リラグルチドおよびエキセンディン−４などのＧＬＰ−１受容体アゴニストは、空腹時および食後グルコース（ＦＰＧおよびＰＰＧ）を減少させることによりＴ２ＤＭを有する患者における血糖コントロールを改善する３つの主要な薬理活性：（ｉ）グルコース依存性インスリン分泌の増加（第１および第２相の改善）、（ｉｉ）高血糖状態のもとでのグルカゴン抑制活性、（ｉｉｉ）食事由来のグルコースの吸収の遅延をもたらす胃排出速度の遅延を有する。
【００１０】
ＧＬＰ−１／グルカゴン（Ｇｌｃ）アゴニスト
Ｐｏｃａｉら（非特許文献３；非特許文献４）およびＤａｙら（非特許文献５）は、例えば、１つの分子におけるＧＬＰ−１およびグルカゴンの作用を組み合わせることによる、ＧＬＰ−１およびグルカゴン受容体の二重活性化が抗糖尿病作用および顕著な体重低下効果を伴う治療原理につながることを記載している。
【００１１】
グルカゴンおよびＧＬＰ−１受容体の両方に結合して活性化し（非特許文献６；非特許文献７）、体重増加を抑制し、食物摂取を減少させるペプチドは、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７、特許文献８、特許文献９、特許文献１０、特許文献１１、特許文献１２、特許文献１３、特許文献１４、特許文献１５、特許文献１６、特許文献１７および特許文献１８に記載されている。
【００１２】
Ｂｌｏｏｍら（特許文献１９）は、グルカゴンおよびＧＬＰ−１受容体の両方に結合し、活性化するペプチドは、Ｎ末端部分（例えば、残基１〜１４または１〜２４）がグルカゴンに由来し、Ｃ末端部分（例えば、残基１５〜３９または２５〜３９）がエキセンディン−４に由来する、グルカゴンおよびエキセンディン−４からのハイブリッド分子として構築することができることを開示している。
【００１３】
Ｏｔｚｅｎら（非特許文献８）は、基礎をなす残基の疎水性および／または高いβシート傾向のため、ＮおよびＣ末端疎水性パッチは、グルカゴンのフィブリル化に関与することを開示している。
【００１４】
特許文献２０は、少なくとも１４位のアミノ酸が半減期の延長のために側鎖を有し、それにより本発明における有効成分として適切となる、エキセンディン−４に由来するグルカゴンおよびＧＬＰ−１受容体の両方に結合し、活性化するペプチドを開示している。
【００１５】
長時間作用性ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニスト
理想的には、ペプチドは、週１回またはより長い注射頻度が得られる人体への適用の後少なくとも１週間にわたるヒトにおける血漿レベルの持続をもたらす方法で製剤化する。
【００１６】
長時間作用性ＧＬＰ−１アゴニストを用いた現行の療法は、２３ゲージ針を用いたグリコール−乳酸コポリマーに基づく週１回の注射用のデボ懸濁液中エキセンディン−４であるＢｙｄｕｒｅｏｎ（登録商標）である。
【００１７】
特許文献２１は、ペプチドがオキシントモジュリンに由来する、週１回投与用の免疫グロブリンのＦｃ領域にコンジュゲートされたＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストを記載している。
【００１８】
担体結合プロドラッグ
半減期などのｉｎ  ｖｉｖｏでの薬物の物理化学的または薬物動態特性を向上させるために、そのような薬物を担体にコンジュゲートすることができる。薬物を担体および／またはリンカーに一時的に結合させる場合、そのようなシステムは、一般的に担体結合プロドラッグと指定される。ＩＵＰＡＣにより示されている定義によれば、担体結合プロドラッグは、物理化学的または薬物動態特性の改善をもたらし、通常加水分解による切断によってｉｎ  ｖｉｖｏで容易に除去することができる所定の活性物質と担体グループとの一時的な結合を含むプロドラッグである。
【００１９】
そのような担体結合プロドラッグに用いられるリンカーは、一時的なものであり、これは、それらが、生理的条件（ｐＨ７．４の水性緩衝液、３７℃）下で非酵素的加水分解により分解可能（切断可能）であり、例えば、１時間から３カ月までの範囲の半減期を有するものであることを意味する。適切な担体は、ポリマーであり、直接または非切断性スペーサーを介してリンカーにコンジュゲートすることができる。
【００２０】
痕跡を残さないプロドラッグリンカーを介する一時的ポリマーコンジュゲーションは、ポリマーの結合に起因する長期の滞留時間、リンカー最適化による薬物放出制御、およびポリマーコンジュゲートからの放出後の天然ペプチドの元来の薬理作用の回復という利点を兼ね備えている。
【００２１】
ポリマー−リンカーコンジュゲートを用いることにより、天然未変化ペプチドは、リンカーの放出速度論およびポリマー担体の薬物動態によってのみ支配されて、患者への適用の後に徐々に放出される。理想的には、放出速度論は、一貫性があり、均一な放出パターンを保証するために体液中のプロテアーゼまたはエステラーゼのような酵素の存在と無関係である。
【００２２】
薬物の急性副作用の多くが、所与の薬物製剤の用量を限定し得る薬物ピークレベルに関連し得る。所与の用量での薬物ピークレベル（最大薬物濃度、Ｃｍａｘ）を低下させることで、急性副作用のリスクを上昇させることなく、その薬物をより高用量で投与することができる。より高用量の投与により投与頻度を減少させることができ、最終的に週１回、さらには月１回の投与間隔となる。
【００２３】
担体結合プロドラッグの投与により、特定の期間、薬物濃度が比較的平坦なままとなるように、薬物放出を制御することができる。薬物放出自体は、意図される投与間隔向けに最適化される必要があるリンカーによって主に制御される。
【００２４】
適切なポリマーは、そうでなければ薬物がまだポリマーに結合している間にポリマーの一部が除去されるため、リンカーの薬物放出半減期より顕著に長いクリアランス半減期を有する必要がある。したがって、短い担体半減期では、所与の用量での薬物の喪失およびより急峻な薬物濃度曲線がもたらされる。
【００２５】
特許文献２２、特許文献２３および特許文献２４は、リンカーが、ＧＬＰ−１アゴニストエキセンディン−４などの、生物学的に活性な部分に切断可能な結合を介して共有結合している、薬物リンカーコンジュゲートを含むプロドラッグに言及している。生物学的に活性な部分は、環状イミド形成による環化活性化によりプロドラッグから放出される。放出速度論は、ｐＨ値に依存し、４．５〜５のｐＨ値においてプロドラッグの保存のために最小限であり、およそ７．４〜７．５の生理的ｐＨにおいてその意図される放出速度に達する。リンカーがＬ−アラニンに基づくものであり、ポリマー担体がＰＥＧ−リシンベースのヒドロゲルである、ＧＬＰ−１アゴニストプロドラッグが記載されている。二重ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストプロドラッグは、記載されていない。
【００２６】
ヒアルロン酸（ＨＡ）
Ｄｈａｌら（非特許文献９）は、ヒアルロン酸を薬物コンジュゲート用の適切な担体として報告している。Ｋｏｎｇら（非特許文献１０）は、マウスにおいて３日間にわたりグルコース低下効果を示したエキセンディン−４−ヒアルロン酸コンジュゲートを報告している。使用されたＨＡは、薬物担持が約２．４〜１２％の範囲の線状ポリマーであった。
【００２７】
非特許文献１１は、ジビニルスルホンで修飾されており、ビニルスルホン基の一部が生理活性分子とコンジュゲートするのに用いられ、残りのビニルスルホン基がヒアルロン酸ヒドロゲルを形成するための架橋剤として用いられるヒアルロン酸を開示している。
【００２８】
特許文献２５は、薬物をヒアルロン酸とコンジュゲートさせるための縮合剤を用いて、水溶性修飾ヒアルロン酸を産生する方法を開示している。これらのコンジュゲートは、ｉ．ｖ．投与による血液中での薬物の滞留時間を向上させる。これらのコンジュゲートの架橋によりゲルが形成されることも開示された。
【００２９】
本発明の説明
本発明のコンジュゲートに適するＧＬＰ−１／グルカゴン二重アゴニストペプチドは、酸性および／または生理的ｐＨ値、例えば２５℃でｐＨ４．５および／またはｐＨ７．４で高い溶解度を有する。また４．５〜５のｐＨ値における化学的安定性は、長時間作用性のプロドラッグ製剤に関する重要な基準である。該プロドラッグは、好ましくは４℃で少なくとも６カ月の貯蔵寿命を得るためにこのｐＨ範囲で製剤化する。
【００３０】
本発明では、適用部位における局所貯留槽としてのその滞留時間が可溶性ＨＡよりもより長いため、架橋ヒアルロン酸のヒドロゲルが選択された。担体ポリマーとしてのヒアルロン酸（ＨＡ）の使用の重要な基準は、ポリマー自体における薬物担持および最終溶液／懸濁液の濃度によって決定される、最終医薬品における達成可能な薬物担持である。皮下薬物デポ剤の注射容量が１ｍＬに等しい／未満、好ましくは０．６ｍＬに等しい／未満に実際上限定されることが前提である。
【００３１】
ＨＡのポリマー溶液／懸濁液が濃縮されるほど、製剤がより粘稠になり、これがコンジュゲート製剤の注射針通過性に負の影響を及ぼす。粘稠な溶液は、注射器を加圧するプランジャーへの力を制限するためにより大きな直径の注射針を必要とする。注射の時間もより長い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００３２】
【特許文献１】国際公開第２００８／０７１９７２号
【特許文献２】国際公開第２００８／１０１０１７号
【特許文献３】国際公開第２００９／１５５２５８号
【特許文献４】国際公開第２０１０／０９６０５２号
【特許文献５】国際公開第２０１０／０９６１４２号
【特許文献６】国際公開第２０１１／０７５３９３号
【特許文献７】国際公開第２００８／１５２４０３号
【特許文献８】国際公開第２０１０／０７０２５１号
【特許文献９】国際公開第２０１０／０７０２５２号
【特許文献１０】国際公開第２０１０／０７０２５３号
【特許文献１１】国際公開第２０１０／０７０２５５号
【特許文献１２】国際公開第２０１１／１６０６３０号
【特許文献１３】国際公開第２０１１／００６４９７号
【特許文献１４】国際公開第２０１１／１５２１８１号
【特許文献１５】国際公開第２０１１／１５２１８２号
【特許文献１６】国際公開第２０１１／１１７４１５号
【特許文献１７】国際公開第２０１１／１１７４１６号
【特許文献１８】国際公開第２００６／１３４３４０号
【特許文献１９】国際公開第２００６／１３４３４０号
【特許文献２０】国際公開第２０１４／０５６８７２号
【特許文献２１】国際公開第２０１２／１７３４２２号
【特許文献２２】国際公開第２００８／１４８８３９号
【特許文献２３】国際公開第２００９／０９５４７９号
【特許文献２４】国際公開第２０１２／０３５１３９号
【特許文献２５】欧州特許第１７９０６６５  Ａ１号
【非特許文献】
【００３３】
【非特許文献１】Ｄｒｕｃｋｅｒ  ＤＪ  ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ．Ｒｅｖ．９巻、２６７〜２６８頁、２０１０年
【非特許文献２】Ｂｕｓｅ、Ｊ．Ｂ．ら、Ｌａｎｃｅｔ、３７４巻：３９〜４７頁、２００９年
【非特許文献３】Ｐｏｃａｉら、Ｏｂｅｓｉｔｙ．２０１２年、２０巻、１５６６〜１５７１頁
【非特許文献４】Ｐｏｃａｉら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ２００９年、５８巻、２２５８頁
【非特許文献５】Ｄａｙら、Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ２００９年、５巻、７４９頁
【非特許文献６】Ｈｊｏｒｔら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６９巻、３０１２１〜３０１２４頁、１９９４年
【非特許文献７】Ｄａｙ  ＪＷら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ、５巻、７４９〜７５７頁、２００９年
【非特許文献８】Ｏｔｚｅｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４５巻、１４５０３〜１４５１２頁、２００６年
【非特許文献９】Ｄｈａｌら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９巻、２０１３年、１〜１３頁
【非特許文献１０】Ｋｏｎｇら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、３１巻（２０１０年）、４１２１〜４１２８頁
【非特許文献１１】Ｓｈｅｎｄｉら（Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ  Ｂ、２０１６年、４巻、２８０３〜２８１８頁）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３４】
投与後の少なくとも６日間の期間にわたり活性型のＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストを放出し、患者コンプライアンスが良好になるように２６ゲージ注射針を介してまたはより小さな内径の針を介してすら注射することができる皮下デポ剤として投与するためのコンジュゲートを提供することが本発明の一目的であった。
【課題を解決するための手段】
【００３５】
本発明の目的は、架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルを含むコンジュゲートであって、
該架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルは、
単量体二糖単位の０．００１〜２０ｍｏｌ％が架橋剤により架橋され；
単量体二糖単位の０．２〜２０ｍｏｌ％が−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ−Ｙ−Ｒ２０基を有し；
Ｌ１は、場合により１つまたはそれ以上の炭素原子が、−Ｏ−、ＮＨ（Ｒ５ａａ）およびＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５ａａ）から選択される基によって置き換えられ、ＯＨおよびＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５ａａＲ５ａａａ）から独立に選択される１つまたはそれ以上の基により場合により置換されたＣ１−２０アルキル鎖であり、Ｒ５ａａおよびＲ５ａａａは、ＨおよびＣ１−４アルキルからなる群から独立に選択され；
Ｌ１は、ヒアルロン酸のベータ−１，３−Ｄ−グルクロン酸のカルボキシ基とアミド結合を形成して、末端アミノ基を介してヒドロゲルに結合しており、
Ｌ２は、単一化学結合、または場合により１つまたはそれ以上の炭素原子が、−Ｏ−およびＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ３ａａ）から選択される基によって置き換えられ、ＯＨおよびＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ３ａａＲ３ａａａ）から独立に選択される１つまたはそれ以上の基により場合により置換されたＣ１−２０アルキル鎖であり、Ｒ３ａａおよびＲ３ａａａは、ＨおよびＣ１−４アルキルからなる群から独立に選択され；
Ｌ２は、以下からなる群から選択される末端基を介してＬ１に結合しており；
【００３６】
【化１】
2020503278.tif 000003
Ｌ２は、点線により示されている１つの位置に結合し、Ｌ１は、他の点線により示されている位置に結合しており；
【００３７】
Ｌは、式（Ｉａ）のリンカー
【化２】
2020503278.tif 000004
（式中、点線は、アミド結合を形成することによるＹのＮ末端への結合を示し；
Ｘは、Ｃ（Ｒ４Ｒ４ａ）またはＮ（Ｒ４）であり；
Ｒ１、Ｒ１ａは、ＨおよびＣ１−４アルキルからなる群から独立に選択され；
Ｒ２、Ｒ２ａは、ＨおよびＣ１−４アルキルからなる群から独立に選択され；
Ｒ４、Ｒ４ａは、ＨおよびＣ１−４アルキルからなる群から独立に選択され；
Ｒ２、Ｒ２ａ、Ｒ４またはＲ４ａのうち１つはＬ２に結合している）であり；
Ｙは、式（Ｉｂ）を有するペプチド部分
Ｈｉｓ−Ｄ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｘ１４−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（Ｉｂ）
であり、
Ｘ１４は、−ＮＨ２側鎖基が（Ｓ）−４−カルボキシ−４−ヘキサデカノイルアミノ−ブチリルにより官能基化されたＬｙｓを表し；
またはＹは、式（Ｉｃ）を有するペプチド部分
Ｈｉｓ−ｄＳｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｘ１４−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（Ｉｃ）
であり、
Ｘ１４は、−ＮＨ２側鎖基が（Ｓ）−４−カルボキシ−４−オクタデカノイルアミノ−ブチリルにより官能基化されたＬｙｓを表し；
Ｒ２０は、ＯＨまたはＮＨ２である、
前記コンジュゲート、またはその薬学的に許容される塩である。
【００３８】
本発明は、投与後少なくとも６日間の期間にわたり活性型の皮下デポ剤からのＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストの放出をもたらすコンジュゲートに関する。
【００３９】
これは、患者が、ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストの血漿レベルおよびその結果として血糖の最適なコントロールを維持することができると同時に、注射の頻度を減少させる助けとなる。
【００４０】
さらに、本発明によるコンジュゲートは、Ｃｍａｘに関連した副作用リスクを低下させることにつながる、アゴニストの非常に平坦な薬物動態プロファイルをもたらす放出プロファイルで、二重ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストを放出することができる。
【００４１】
本発明のコンジュゲートのさらなる利点は、２６ゲージ針によるまたはより小さな内径の針によってすら良好な注射可能性である。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１ａ】高分子量（２５０万Ｄａ）ヒアルロナン（ＨＡ）のｉｎ  ｖｉｖｏ分解プロファイルおよび分解速度論を示す図である。植え込まれたＨＡをＭＲＩ技術によりモニターした。標準的（上側）およびＣＥＳＴ（下側）撮像技術の両方により得られた代表的なＭＲＩ画像。
【図１ｂ】ジビニルスルホン架橋ヒアルロナンのｉｎ  ｖｉｖｏ分解プロファイルおよび分解速度論を示すグラフである。１ｐｐｍでのピーク大きさをプロットすることにより分解速度論を決定した。
【図１ｃ】高分子量（２５０万Ｄａ）ヒアルロナン（ＨＡ）のｉｎ  ｖｉｖｏ分解プロファイルおよび分解速度論を示すグラフである。１ｐｐｍでのピーク大きさをプロットすることにより分解速度論を決定した。
【図２】配列番号５のペプチドのＨＡ−ヒドロゲル−Ａｉｂ−リンカーコンジュゲートの固体１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図３】ＨＡ−ヒドロゲル−Ａｉｂ−リンカーコンジュゲートからの配列番号５を有するペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出速度論を示す図である。
【図４】非架橋ＨＡを有する１回量（１日目）配列番号５で処理された雄ｄｂ／ｄｂマウスの給餌血糖プロファイルを示すグラフである。
【図５Ａ】４回量（１、８、１５、２２日目）の、配列番号５のペプチドを有するＨＡ−ヒドロゲル−Ａｉｂ−リンカーコンジュゲートで処理された雌食事誘導性肥満マウスの体重変化を示すグラフである。
【図５Ｂ】４回量（１、８、１５、２２日目）の、配列番号５のペプチドを有するＨＡ−ヒドロゲル−Ａｉｂ−リンカーコンジュゲートで処理された雌食事誘導性肥満マウスの餌消費を示すグラフである。
【図６】ＨＡ−Ａｉｂ−リンカー−コンジュゲート４．５ｍｇ／ｋｇを雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスに１回皮下投与した後の、配列番号５のペプチドの血漿濃度を示すグラフである。
【図７】ＨＡ−Ａｉｂ−リンカー−コンジュゲートとしての懸濁液（１６．０５％）０．６２３ｍｇ／ｋｇを雌Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎミニブタに１回皮下投与した後の、配列番号５のペプチドの血漿濃度を示すグラフである。
【図８】雄ｄｂ／ｄｂマウスにおける給餌血糖プロファイルを示すグラフである：配列番号５の架橋ＨＡコンジュゲート５０ｎｍｏｌ／ｋｇによる１回のｓ．ｃ．処理、および配列番号５の純ペプチド１．７ｎｍｏｌ／ｋｇによる１日１回ｓ．ｃ．処理
【発明を実施するための形態】
【００４３】
リンカー−Ｌ２−に結合したＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストは、「ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニスト部分」と呼ぶ。
【００４４】
「保護基」は、後の化学反応における化学的選択性を得るために合成中に分子の化学官能基を一時的に保護する部分を意味する。アルコールに対する保護基は、例えば、ベンジルおよびトリチルであり、アミンに対する保護基は、例えば、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニルおよびベンジルであり、チオールについての保護基の例は、２，４，６−トリメトキシベンジル、フェニルチオメチル、アセトアミドメチル、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブチルチオ、トリフェニルメチル、３−ニトロ−２−ピリジルチオ、４−メチルトリチルである。
【００４５】
「保護官能基」は、保護基により保護された化学官能基を意味する。
【００４６】
「アシル化剤」は、酸塩化物、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ペンタフルオロフェノールおよびパラ−ニトロフェノールなどの、脱離基に場合により連結された、アシル化反応においてアシル基を供給する、構造Ｒ−（Ｃ＝Ｏ）−の部分を意味する。
【００４７】
「アルキル」は、直鎖または分枝炭素鎖を意味する。アルキル炭素の各水素は、置換基により置換することができる。
【００４８】
「アルキレン」は、分子の２つの部分がアルキレン基に連結されている、直鎖または分枝炭素鎖を意味する。アルキレン炭素の各水素は、置換基により置き換えることができる。
【００４９】
「アリール」は、場合によりさらに置換することができる、複素環、例えば、フェニル、チオフェニル、インドリル、ナフチル、ピリジルを含む、単環もしくは多環または縮合芳香環に由来する置換基のいずれかを意味する。
【００５０】
「アシル」は、Ｒがアルキルまたはアリールである、構造Ｒ−（Ｃ＝Ｏ）−の化学官能基を意味する。
【００５１】
「Ｃ１−４アルキル」は、１〜４個の炭素原子を有するアルキル鎖、例えば、分子の末端に存在する場合には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、または分子の２つの部分がアルキル基によって連結されている場合には、例えば、−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ３）−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ（Ｃ２Ｈ５）−、−Ｃ（ＣＨ３）２−を意味する。Ｃ１−４アルキル炭素の各水素は、置換基により置換することができる。
【００５２】
「Ｃ１−６アルキレン」は、分子の２つの部分がアルキレン基に連結されている、１〜６個の炭素原子を有するアルキル鎖、例えば、−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ３）−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ（Ｃ２Ｈ５）−、−Ｃ（ＣＨ３）２−を意味する。Ｃ１−６アルキル炭素の各水素は、置換基により置換することができる。
【００５３】
したがって、「Ｃ１−１８アルキル」は、１〜１８個の炭素原子を有するアルキル鎖を意味し、「Ｃ８−１８アルキル」は、８〜１８個の炭素原子を有するアルキル鎖を意味する。したがって、「Ｃ１−５０アルキル」は、１〜５０個の炭素原子を有するアルキル鎖を意味する。
【００５４】
「ハロゲン」は、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨードを意味する。ハロゲンがフルオロまたはクロロであることが一般的に好ましい。
【００５５】
「ヒアルロン酸」は、ベータ−１，３−Ｄ−グルクロン酸およびベータ−１，４−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンならびにそれらのそれぞれのナトリウム塩からなる二糖のポリマーを意味する。これらのポリマーは、線状である。
【００５６】
【化３】
2020503278.tif 000005
【００５７】
「二糖単位」は、ベータ−１，３−Ｄ−グルクロン酸およびベータ−１，４−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンならびにそれらのそれぞれのナトリウム塩からなる二糖を意味し、ＨＡの単量体構築ブロックである。
【００５８】
「架橋ヒアルロン酸」は、ＨＡの異なる鎖が架橋剤により共有結合により連結されて、３次元ポリマー網目構造を形成している、ヒアルロン酸のポリマーを意味する。架橋の程度は、ポリマー網目構造における二糖単位と架橋剤単位とのモル比を指す。
【００５９】
「架橋剤」は、線状もしくは分枝状分子または化学基であり得、好ましくは各遠位末端に少なくとも化学官能基を有する線状分子である。
【００６０】
「官能基化ヒアルロン酸」は、ＨＡがその遠位末端に化学官能基を有するＬ１基により化学的に修飾されているヒアルロン酸のポリマーを意味する。官能基化の程度は、ポリマーにおける二糖単位とＬ１単位とのモル比を指す。
【００６１】
「化学官能基」という用語は、カルボン酸および活性化誘導体、アミノ、マレイミド、チオールおよび誘導体、スルホン酸および誘導体、カーボネートおよび誘導体、カルバメートおよび誘導体、ヒドロキシル、アルデヒド、ケトン、ヒドラジン、イソシアネート、イソチオシアネート、リン酸および誘導体、ホスホン酸および誘導体、ハロアセチル、ハロゲン化アルキル、アクリロイルおよび他のアルファ−ベータ不飽和マイケル受容体、フッ化アリールのようなアリール化剤、ヒドロキシルアミン、ピリジルジスルフィドのようなジスルフィド、ビニルスルホン、ビニルケトン、ジアゾアルカン、ジアゾアセチル化合物、オキシランならびにアジリジンを意味するが、これらに限定されない。
【００６２】
化学官能基が他の化学官能基と結合する場合、得られる化学構造を「結合」と呼ぶ。例えば、アミン基とカルボキシル基との反応は、アミド結合をもたらす。
【００６３】
「反応性官能基」は、多分枝部分に結合している主鎖部分の化学官能基である。
【００６４】
「官能基」は、「反応性官能基」、「分解性相互結合官能基」または「コンジュゲート官能基」について用いる総称である。
【００６５】
「ブロッキング基」または「キャッピング基」という用語は、同義で用いられ、反応性官能基に不可逆的に結合して、それらが例えば、化学官能基と反応することができないようにする部分を意味する。
【００６６】
「保護基（ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ）」または「保護基（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｇｒｏｕｐ）」という用語は、反応性官能基に可逆的に結合して、それらが特定の条件下で他の化学官能基と反応することができないようにする部分を意味する。
【００６７】
「活性化基」という用語は、当業者に公知の対応する化学官能基型を適切に活性化するための化学官能基を意味する。例えば、カルボキシル基の活性化型は、スクシンイミジルエステル、ベンゾトリアジルエステル、ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、アザベンゾトリアジルエステル、アシルハロゲン化物、混合または対称酸無水物、アシルイミダゾールを含むが、これらに限定されない。
【００６８】
「非酵素的に開裂可能なリンカー」という用語は、酵素活性によらずに生理的条件下で加水分解により分解可能であるリンカーを意味する。
【００６９】
「スペーサー」、「スペーサー基」、「スペーサー分子」および「スペーサー部分」という用語は、同義で用いられ、本発明のヒドロゲル担体に存在する部分を記述するために用いる場合、その断片が−ＮＨ−、−Ｎ（Ｃ１−４アルキル）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｃ１−４アルキル）−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−から選択される１つまたはそれ以上の基によって場合により中断される、Ｃ１−５０アルキルなどの、２つの部分を結合させるのに適する任意の部分を意味する。
【００７０】
「末端（ｔｅｒｍｉｎａｌ）」、「末端（ｔｅｒｍｉｎｕｓ）」または「遠位末端」という用語は、分子または部分内の官能基または結合の位置を意味し、そのような官能基は、化学官能基であり、結合は、分解性もしくは永続的結合であり、２つの部分の間の結合に隣接してもしくは結合内にまたはオリゴマーもしくはポリマー鎖の末端に位置することを特徴とする。
【００７１】
「結合した形態の（ｉｎ  ｂｏｕｎｄ  ｆｏｒｍ）」または「部分」という語句は、より大きい分子の一部である下部構造を意味する。「結合した形態の」という語句は、当技術分野で周知の試薬、出発物質または仮定の出発物質の名称を挙げるまたは列挙することによって単に部分について言及するために用いられ、「結合した形態の」は、例えば、１つもしくはそれ以上の水素ラジカル（−Ｈ）、または試薬もしくは出発物質に存在する１つもしくはそれ以上の活性化基もしくは保護基がその部分に存在しないことを意味する。
【００７２】
ポリマー部分を含むすべての試薬および部分は、分子量、鎖長もしくは重合度または官能基の数に関して変動性を示すことが公知の巨大分子実体を意味すると理解される。したがって、架橋試薬および架橋部分について示す構造は、代表的な例にすぎない。
【００７３】
試薬または部分は、線状または分枝状であり得る。試薬または部分が２つの末端基を有する場合、それは、線状試薬または部分と呼ばれる。試薬または部分が２つを超える末端基を有する場合、それは、分枝または多官能性試薬または部分とみなされる。
【００７４】
本発明のコンジュゲートに用いられるリンカーは、一時的なものであり、これは、それらが、生理的条件（ｐＨ７．４の水性緩衝液、３７℃）下で非酵素的加水分解により分解可能（切断可能）であり、例えば、１時間から３カ月までの範囲の半減期を有するものであることを意味する。
【００７５】
「ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストヒドロゲルコンジュゲート」という用語は、担体がヒドロゲルである、ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストの担体結合コンジュゲートを意味する。「ヒドロゲルコンジュゲート」および「ヒドロゲル結合コンジュゲート」という用語は、ヒドロゲルに一時的に連結された生物学的に活性な薬剤のコンジュゲートを意味し、同義で用いられる。
【００７６】
「ヒドロゲル」は、大量の水を吸収することができる３次元親水性または両親媒性ポリマー網目構造と定義することができる。網目構造は、ホモポリマーまたはコポリマーからなり、共有結合性化学的または物理的（イオン性、疎水相互作用、絡み合い）架橋の存在に起因して不溶性である。架橋は、網目構造および物理的完全性をもたらす。ヒドロゲルは、水性媒体中でそれらを膨潤させる水との熱力学的適合性を示す。網目構造の鎖は、細孔が存在し、これらの細孔のかなりの割合が１ｎｍから１０００ｎｍまでの間の寸法になるような様式で連結されている。
【００７７】
「遊離型」の薬物は、ポリマーコンジュゲートから放出された後などの、その非修飾で、薬理学的に活性な形態の、薬物、具体的にはＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストを意味する。
【００７８】
「薬物」、「生物学的に活性な分子」、「生物学的に活性な部分」、「生物学的に活性な薬剤」、「活性薬剤」という用語は、同義で用いられ、その結合または遊離型のＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストを意味する。
【００７９】
ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストの「治療有効量」は、本明細書で用いているように所定の疾患およびその合併症の臨床症状を治癒させる、軽減するまたは部分的に停止させるのに十分な量を意味する。これを達成するための十分な量は、「治療有効量」と定義される。各目的のための有効量は、疾患または傷害の重症度ならびに対象の体重および一般状態に依存する。適切な用量の決定は、値の行列を作り、行列における異なる箇所を試験することによって、常用の実験を用いて達成することができ、これらはすべて、訓練を受けた医師の通常の技術の範囲内にあることは、理解されよう。
【００８０】
「安定」および「安定性」は、表示貯蔵時間内においてヒドロゲルコンジュゲートがコンジュゲートされたままであり、実質的な程度に加水分解せず、ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストに関する容認できる不純物プロファイルを示すことを意味する。安定であるとみなされるためには、組成物は、５％未満のその遊離型の薬物を含む。
【００８１】
「薬学的に許容される」という用語は、動物、好ましくはヒトにおける使用についてＥＭＥＡ（ヨーロッパ）および／またはＦＤＡ（米国）などの規制当局および／または他の国家規制当局により承認済みであることを意味する。
【００８２】
「医薬組成物」または「組成物」は、１つもしくはそれ以上の有効成分、および１つもしくはそれ以上の不活性成分、ならびに任意の２つもしくはそれ以上の成分の組合せ、錯化もしくは凝集により、または１つもしくはそれ以上の成分の解離により、または１つもしくはそれ以上の成分の他の種類の反応もしくは相互作用により、直接的もしくは間接的に得られる任意の生成物を意味する。したがって、本発明の医薬組成物は、本発明の化合物および薬学的に許容される賦形剤（薬学的に許容される担体）を混合することによって製造された任意の組成物を包含する。
【００８３】
「乾燥組成物」は、ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストヒドロゲルコンジュゲート組成物を乾燥した形態で容器入りで提供することを意味する。乾燥のための適切な方法は、例えば、噴霧乾燥および凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）（凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ））である。ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストヒドロゲルコンジュゲートのそのような乾燥組成物は、最大１０％、好ましくは５％未満、より好ましくは２％未満の残留含水率（カールフィッシャー法により測定される）を有する。乾燥の好ましい方法は、凍結乾燥である。「凍結乾燥組成物」は、ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストヒドロゲルコンジュゲート組成物を最初に凍結し、その後、減圧という手段による水の減少に供することを意味する。この術語は、組成物を最終容器中に充填する前の製造プロセスで発生する追加の乾燥工程を排除しない。
【００８４】
「凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）」（凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ））は、組成物を凍結し、次いで周囲圧力を低下させ、場合により、熱を加えて、組成物中の凍結水を固相から気体に直接昇華させることを特徴とする、脱水法である。一般的に、昇華した水は、凝結により収集される。
【００８５】
「復元」は、乾燥組成物を液体または懸濁組成物の形態にするための乾燥組成物への液体の添加を意味する。「復元」という用語は、水の添加に限定されるものではなく、例えば、緩衝液または他の水性溶液を含む、任意の液体の添加を意味すると理解される。
【００８６】
「復元溶液」は、それを必要とする患者への投与の前にＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストヒドロゲルコンジュゲートの乾燥組成物を復元するために用いられる液体を意味する。
【００８７】
「容器」は、ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストヒドロゲルコンジュゲート組成物をそれに含め、復元時まで保存することができる容器を意味する。
【００８８】
「緩衝液」または「緩衝剤」は、ｐＨを所望の範囲に維持する化学化合物を意味する。生理的に耐容される緩衝剤は、例えば、リン酸、コハク酸、ヒスチジン、重炭酸、クエン酸および酢酸、ピルビン酸ナトリウムである。Ｍｇ（ＯＨ）２またはＺｎＣＯ３などの制酸剤も用いることができる。緩衝能は、ｐＨ安定性に最も感度の高い条件に適合するように調節することができる。
【００８９】
「賦形剤」は、治療薬と一緒に投与される化合物、例えば、緩衝剤、等張性調整剤、保存剤、安定剤、吸着防止剤、酸化保護剤または他の助剤を意味する。しかし、場合によっては、１つの賦形剤が二重または三重機能を有し得る。
【００９０】
「凍結乾燥防止剤」は、目的のタンパク質と組み合わせた場合、一般的に乾燥時の、とりわけ凍結乾燥およびその後の貯蔵中の化学的および／または物理的不安定性を著しく防止または低減する分子である。例示的な凍結乾燥防止剤は、スクロースまたはトレハロースなどの糖；アルギニン、グリシン、グルタミン酸またはヒスチジンなどのアミノ酸；ベタインなどのメチルアミン；硫酸マグネシウムなどの離液性塩；三価または高級糖アルコール、例えば、グリセリン、エリスリトール、グリセロール、アラビトール、キシリトール、ソルビトールおよびマンニトールなどのポリオール；エチレングリコール；プロピレングリコール；ポリエチレングリコール；プルロニック；ヒドロキシアルキルデンプン、例えば、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）ならびにそれらの組合せを含む。
【００９１】
「界面活性剤」は、液体の表面張力を低下させる湿潤剤を意味する。
【００９２】
「等張性調整剤」は、注射デポ剤における浸透圧差に起因する細胞損傷によってもたらされ得る疼痛を最小限にする化合物を意味する。
【００９３】
「安定剤」は、本発明のコンジュゲートを安定化するために用いられる化合物を意味する。安定化は、変性状態の不安定化による、タンパク質安定化力の増強によって、またはタンパク質への賦形剤の直接結合によって達成される。
【００９４】
「吸着防止剤」は、組成物の容器の内表面を被覆するかまたはそれに競合的に吸着するために用いられる、主としてイオン性もしくは非イオン性界面活性剤または他のタンパク質もしくは可溶性ポリマーを意味する。賦形剤の選択される濃度および種類は、避けるべき影響に依存するが、一般的に界面活性剤の単層がＣＭＣ値のすぐ上で界面に形成される。
【００９５】
「酸化保護剤」は、アスコルビン酸、エクトイン、グルタチオン、メチオニン、モノチオグリセロール、モリン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、没食子酸プロピル、ビタミンＥなどの抗酸化剤、クエン酸、ＥＤＴＡ、ヘキサホスフェート、チオグリコール酸などのキレート化剤を意味する。
【００９６】
「抗菌剤」は、細菌、真菌、酵母、原生動物を殺滅もしくはその増殖を抑制し、および／またはウイルスを壊滅する化学物質を意味する。
【００９７】
「容器を密封すること」は、気密であり、外側と内側の間の気体の交換を起こさせず、内容物を無菌状態に維持するような方法で容器が閉められていることを意味する。
【００９８】
「試薬」または「前駆体」という用語は、本発明のコンジュゲートをもたらす製造法に用いられる中間体または出発物質を意味する。
【００９９】
コンジュゲートの他の実施形態では、
−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ−は、式（ＩＩａ）のリンカー部分であり、
【化４】
2020503278.tif 000006
式中、点線は、アミド結合を形成することによるＹへの結合を示し；
Ｒ１、Ｒ１ａ、Ｒ２ａは、ＨおよびＣ１−４アルキルからなる群から独立に選択され；
−Ｌ１−Ｌ２−は、上述のように定義される。
【０１００】
コンジュゲートの他の実施形態では、
−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ−は、式（ＩＩａ）のリンカー部分であり、式中、
Ｒ１は、ＣＨ３であり；
Ｒ１ａは、Ｈであり；
Ｒ２ａは、Ｈであり；
−Ｌ１−Ｌ２−は、上述のように定義される。
【０１０１】
コンジュゲートの他の実施形態では、
−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ−は、式（ＩＩａ）のリンカー部分であり、式中、
Ｒ１は、Ｈであり；
Ｒ１ａは、ＣＨ３であり；
Ｒ２ａは、Ｈであり；
−Ｌ１−Ｌ２−は、上述のように定義される。
【０１０２】
コンジュゲートの他の実施形態では、
−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ−は、式（ＩＩａ）のリンカー部分であり、式中、
Ｒ１は、ＣＨ３であり；
Ｒ１ａは、ＣＨ３であり；
Ｒ２ａは、Ｈであり；
−Ｌ１−Ｌ２−は、上述のように定義される。
【０１０３】
コンジュゲートの他の実施形態では、
−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ−は、式（ＩＩｂ）のリンカー部分であり、
【化５】
2020503278.tif 000007
式中、点線は、アミド結合を形成することによるＹへの結合を示し；
Ｒ１は、ＨまたはＣ１−４アルキルから選択され、好ましくはＨであり；
Ｒ１ａは、ＨまたはＣ１−４アルキルから選択され、好ましくはＨであり；
Ｒ２、Ｒ２ａは、ＨおよびＣ１−４アルキルからなる群から独立に選択され；
−Ｌ１−Ｌ２−は、上述のように定義される。
【０１０４】
コンジュゲートの他の実施形態では、
−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ−は、式（ＩＩｂ）のリンカー部分であり、
【化６】
2020503278.tif 000008
式中、点線は、アミド結合を形成することによるＹへの結合を示し；
Ｒ１およびＲ１ａは、Ｈであり；
Ｒ２、Ｒ２ａは、ＨおよびＣＨ３からなる群から独立に選択され；
−Ｌ１−Ｌ２−は、上述のように定義される。
【０１０５】
コンジュゲートの他の実施形態では、
−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ−は、式（ＩＩｂ）のリンカー部分−Ｌであり、式中、
Ｒ１およびＲ１ａは、Ｈであり；
Ｒ２は、Ｈであり、Ｒ２ａは、ＣＨ３であり；
−Ｌ１−Ｌ２−は、上述のように定義される。
【０１０６】
コンジュゲートの他の実施形態では、
Ｌ２は、場合により１つまたは２つの炭素原子が、−Ｏ−およびＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ３ａａ）から選択される基によって独立に置き換えられたＣ１−１０アルキル鎖であり、Ｒ３ａａは、ＨおよびＣ１−４アルキルからなる群から独立に選択され；
Ｌ２は、以下からなる群から選択される末端基を介してＬ１に結合しており；
【０１０７】
【化７】
2020503278.tif 000009
Ｌ２は、点線により示されている１つの位置に結合し、Ｌ１は、他の点線により示されている位置に結合する。
【０１０８】
コンジュゲートの他の実施形態では、
Ｌ２は、場合により１つの炭素原子が、−Ｏ−およびＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ３ａａ）から選択される基によって独立に置き換えられたＣ１−６アルキル鎖であり、Ｒ３ａａは、ＨおよびＣ１−４アルキルからなる群から独立に選択され；
Ｌ２は、以下からなる群から選択される末端基を介してＬ１に結合しており；
【化８】
2020503278.tif 000010
Ｌ２は、点線により示されている１つの位置に結合し、Ｌ１は、他の点線により示されている位置に結合する。
【０１０９】
コンジュゲートの他の実施形態では、
Ｌ２は、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−または−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−であり、
以下の末端基を介してＬ１に結合しており；
【化９】
2020503278.tif 000011
Ｌ２は、点線により示されている硫黄原子に結合し、Ｌ１は、点線により示されている窒素原子に結合する。
【０１１０】
コンジュゲートの他の実施形態では、
Ｌ２は、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−または−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−であり、
以下の末端基を介してＬ１に結合しており；
【化１０】
2020503278.tif 000012
Ｌ２は、点線により示されている硫黄原子に結合し、Ｌ１は、点線により示されている窒素原子に結合する。
【０１１１】
コンジュゲートの他の実施形態では、
Ｌ１は、１つの遠位末端にアミノ基を有し、−Ｏ−およびＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５ａａ）から独立に選択される１つまたは２つの基によって場合により中断されているＣ１−１０アルキル鎖であり、Ｒ５ａａは、ＨおよびＣ１−４アルキルからなる群から独立に選択される。
【０１１２】
さらなる実施形態は、架橋剤がジビニルスルホンであるコンジュゲートに関する。
【０１１３】
さらなる実施形態は、
架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルにおいて、単量体二糖単位の０．００１〜１５ｍｏｌ％が架橋剤により架橋されている、コンジュゲートに関する。
【０１１４】
さらなる実施形態は、
架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルにおいて、単量体二糖単位の０．１〜５ｍｏｌ％が架橋剤により架橋されている、コンジュゲートに関する。
【０１１５】
さらなる実施形態は、
架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルの単量体二糖単位の０．２〜１０ｍｏｌ％が−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ−Ｙ−Ｒ２０基を有する、コンジュゲートに関する。
【０１１６】
さらなる実施形態は、
架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルの単量体二糖単位の０．５〜７ｍｏｌ％が−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ−Ｙ−Ｒ２０基を有する、コンジュゲートに関する。
【０１１７】
さらなる実施形態は、
架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルの単量体二糖単位の０．５〜５ｍｏｌ％が−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ−Ｙ−Ｒ２０基を有する、コンジュゲートに関する。
【０１１８】
さらなる実施形態は、
架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルの単量体二糖単位の１〜３．５ｍｏｌ％が−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ−Ｙ−Ｒ２０基を有する、コンジュゲートに関する。
【０１１９】
さらなる実施形態は、架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルを含むコンジュゲートであって、
該架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルは、
単量体二糖単位の０．００１〜２０ｍｏｌ％が架橋剤により架橋され；
単量体二糖単位の０．２〜２０ｍｏｌ％が−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ−Ｙ−Ｒ２０基を有し；
該架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルの単量体二糖単位の０．２〜３０ｍｏｌ％が−Ｌ１−Ｚ−ＯＨ基を有し；
Ｌ１は、場合により１つまたはそれ以上の炭素原子が、−Ｏ−、ＮＨ（Ｒ５ａａ）およびＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５ａａ）から選択される基によって独立に置き換えられ、ＯＨおよびＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５ａａＲ５ａａａ）から独立に選択される１つまたはそれ以上の基により場合により置換されたＣ１−２０アルキル鎖であり、Ｒ５ａａおよびＲ５ａａａは、ＨおよびＣ１−４アルキルからなる群から独立に選択され；
Ｌ１は、ヒアルロン酸のベータ−１，３−Ｄ−グルクロン酸のカルボキシ基とアミド結合を形成して、末端アミノ基を介してヒドロゲルに結合しており、
Ｌ２は、単一化学結合、または場合により１つまたはそれ以上の炭素原子が、−Ｏ−およびＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ３ａａ）から選択される基によって独立に置き換えられ、ＯＨおよびＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ３ａａＲ３ａａａ）から独立に選択される１つまたはそれ以上の基により場合により置換されたＣ１−２０アルキル鎖であり、Ｒ３ａａおよびＲ３ａａａは、ＨおよびＣ１−４アルキルからなる群から独立に選択され；
Ｌ２は、以下からなる群から選択される末端基を介してＬ１に結合しており；
【０１２０】
【化１１】
2020503278.tif 000013
Ｌ２は、点線により示されている１つの位置に結合し、Ｌ１は、他の点線により示されている位置に結合しており；
Ｚは、場合により１つまたはそれ以上の炭素原子が、−Ｏ−およびＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ６ａａ）から選択される基によって独立に置き換えられたＣ１−１６アルキル鎖であり、Ｒ６ａａは、水素またはＣ１−４アルキルであり；または
Ｚは、
【化１２】
2020503278.tif 000014
であり；
【０１２１】
Ｚは、以下からなる群から選択される末端基を介してＬ１に結合しており；
【化１３】
2020503278.tif 000015
Ｚは、点線により示されている１つの位置に結合し、Ｌ１は、他の点線により示されている位置に結合しており；
【０１２２】
Ｌは、式（Ｉａ）のリンカー
【化１４】
2020503278.tif 000016
（式中、点線は、アミド結合を形成することによるＹのＮ末端への結合を示し；
Ｘは、Ｃ（Ｒ４Ｒ４ａ）またはＮ（Ｒ４）であり；
Ｒ１、Ｒ１ａは、ＨおよびＣ１−４アルキルからなる群から独立に選択され；
Ｒ２、Ｒ２ａは、ＨおよびＣ１−４アルキルからなる群から独立に選択され；
Ｒ４、Ｒ４ａは、ＨおよびＣ１−４アルキルからなる群から独立に選択され；
Ｒ２、Ｒ２ａ、Ｒ４またはＲ４ａのうち１つはＬ２に結合している）であり；
Ｙは、式（Ｉｂ）を有するペプチド部分
Ｈｉｓ−Ｄ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｘ１４−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（Ｉｂ）
であり、
Ｘ１４は、−ＮＨ２側鎖基が（Ｓ）−４−カルボキシ−４−ヘキサデカノイルアミノ−ブチリルにより官能基化されたＬｙｓを表し；
またはＹは、式（Ｉｃ）を有するペプチド部分
Ｈｉｓ−ｄＳｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｘ１４−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（Ｉｃ）
であり、
Ｘ１４は、−ＮＨ２側鎖基が（Ｓ）−４−カルボキシ−４−オクタデカノイルアミノ−ブチリルにより官能基化されたＬｙｓを表し；
Ｒ２０は、ＯＨまたはＮＨ２である、
前記コンジュゲート、またはその薬学的に許容される塩である。
【０１２３】
さらなる実施形態は、
架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルの単量体二糖単位の０．２〜２０ｍｏｌ％が−Ｌ１−Ｚ−ＯＨ基を有する、上述の架橋ヒアルロン酸ヒドロゲル
を含むコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩である。
【０１２４】
さらなる実施形態は、
架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルの単量体二糖単位の０．２〜１０ｍｏｌ％が−Ｌ１−Ｚ−ＯＨ基を有する、上述の架橋ヒアルロン酸ヒドロゲル
を含むコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩である。
【０１２５】
さらなる実施形態は、
架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルが−Ｌ１−Ｚ−ＯＨ基を有し、
Ｚは、場合により１つまたはそれ以上の炭素原子が、−Ｏ−およびＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ６ａａ）から選択される基によって独立に置き換えられたＣ１−１６アルキル鎖であり、Ｒ６ａａは、水素またはＣ１−４アルキルであり；または
Ｚは、
【化１５】
2020503278.tif 000017
であり；
【０１２６】
Ｚは、以下からなる群から選択される末端基を介してＬ１に結合しており；
【化１６】
2020503278.tif 000018
Ｚは、点線により示されている１つの位置に結合し、Ｌ１は、他の点線により示されている位置に結合する、
上述の架橋ヒアルロン酸ヒドロゲル
を含むコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩である。
【０１２７】
さらなる実施形態は、
架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルが−Ｌ１−Ｚ−ＯＨ基を有し、
Ｚは、場合により１つまたはそれ以上の炭素原子が、−Ｏ−によって独立に置き換えられたＣ１−８アルキル鎖であり；または
Ｚは、
【化１７】
2020503278.tif 000019
であり；
【０１２８】
Ｚは、以下からなる群から選択される末端基を介してＬ１に結合しており；
【化１８】
2020503278.tif 000020
Ｚは、点線により示されている１つの位置に結合し、Ｌ１は、他の点線により示されている位置に結合する、
上述の架橋ヒアルロン酸ヒドロゲル
を含むコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩である。
【０１２９】
さらなる実施形態は、
架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルが−Ｌ１−Ｚ−ＯＨ基を有し、
Ｚは、−ＣＨ２−ＣＨ２−であり；または
Ｚは、
【化１９】
2020503278.tif 000021
であり；
Ｚは、以下からなる群から選択される末端基を介してＬ１に結合しており；
【化２０】
2020503278.tif 000022
Ｚは、点線により示されている１つの位置に結合し、Ｌ１は、他の点線により示されている位置に結合する、
上述の架橋ヒアルロン酸ヒドロゲル
を含むコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩である。
【０１３０】
さらなる実施形態は、
架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルが−Ｌ１−Ｚ−ＯＨ基を有し、
Ｚは、−ＣＨ２−ＣＨ２−であり；
Ｚは、以下からなる群から選択される末端基を介してＬ１に結合しており；
【化２１】
2020503278.tif 000023
Ｚは、点線により示されている１つの位置に結合し、Ｌ１は、他の点線により示されている位置に結合する、
上述の架橋ヒアルロン酸ヒドロゲル
を含むコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩である。
【０１３１】
コンジュゲートの他の実施形態では、−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ−Ｙ基は、式（ＩＩＩａ）により表される構造を有する。
【化２２】
2020503278.tif 000024
【０１３２】
コンジュゲートの他の実施形態では、−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ−Ｙ基は、式（ＩＩＩｂ）により表される構造を有する。
【化２３】
2020503278.tif 000025
【０１３３】
コンジュゲートの他の実施形態では、−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ−Ｙ基は、式（ＩＩＩｃ）により表される構造を有する。
【化２４】
2020503278.tif 000026
【０１３４】
コンジュゲートの他の実施形態では、−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ−Ｙ基は、式（ＩＩＩｄ）により表される構造を有する。
【化２５】
2020503278.tif 000027
【０１３５】
コンジュゲートの一実施形態では、Ｙは、配列番号５から選択されるＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストを意味する。
【０１３６】
コンジュゲートの一実施形態では、Ｙは、配列番号６から選択されるＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストを意味する。
【０１３７】
本発明の他の実施形態は、
架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルであって、
単量体二糖単位の０．００１〜２０ｍｏｌ％がジビニルスルホンにより架橋され；
単量体二糖単位の０．５〜５ｍｏｌ％が−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ−Ｙ−Ｒ２０基を有し；
−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ−Ｙ基は式（ＩＩＩｂ）により表される構造を有し；
【化２６】
2020503278.tif 000028
Ｌ１は、ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−または−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−であり；
Ｌ１は、ヒアルロン酸のベータ−１，３−Ｄ−グルクロン酸のカルボキシ基とアミド結合を形成して、末端アミノ基を介してヒドロゲルに結合しており；
Ｙは、配列番号５を有するペプチド部分である、
該架橋ヒアルロン酸ヒドロゲル
を含むコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩である。
【０１３８】
本発明の他の実施形態は、
架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルであって、
単量体二糖単位の０．００１〜２０ｍｏｌ％がジビニルスルホンにより架橋され；
単量体二糖単位の０．５〜５ｍｏｌ％が−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ−Ｙ−Ｒ２０基を有し；
−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ−Ｙ基は式（ＩＩＩｂ）により表される構造を有し；
【化２７】
2020503278.tif 000029
Ｌ１は、ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−または−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−であり；
Ｌ１は、ヒアルロン酸のベータ−１，３−Ｄ−グルクロン酸のカルボキシ基とアミド結合を形成して、末端アミノ基を介してヒドロゲルに結合しており；
該架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルの単量体二糖単位の０．２〜３０ｍｏｌ％が−Ｌ１−Ｚ−ＯＨ基を有し；
Ｚは、−ＣＨ２−ＣＨ２−であり；
Ｚは、末端基を介してＬ１に結合しており；
【化２８】
2020503278.tif 000030
Ｚは、点線により示されている１つの位置に結合し、Ｌ１は、他の点線により示されている位置に結合しており；
Ｙは、配列番号５を有するペプチド部分である、
該架橋ヒアルロン酸ヒドロゲル
を含むコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩である。
【０１３９】
【表１】
2020503278.tif 000031
【０１４０】
本発明のコンジュゲートが１つまたはそれ以上の酸性または塩基性基を含む場合、本発明は、対応する薬学的または毒性学的に許容される塩、とりわけそれらの薬学的に利用可能な塩も含む。したがって、酸性基を含む本発明のコンジュゲートは、例えば、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩としてまたはアンモニウム塩として本発明により用いることができる。そのような塩のより詳細な例は、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩またはアンモニアもしくは例えば、エチルアミン、エタノールアミン、トリエタノールアミンなどの有機アミンもしくはアミノ酸を含む塩を含む。１つまたはそれ以上の塩基性基を含む、すなわち、プロトンを付加することができる本発明のコンジュゲートは、無機または有機酸とのそれらの付加塩の形態で存在し得るものであり、本発明により用いることができる。本発明のコンジュゲートが分子内に酸性および塩基性基を同時に含む場合、本発明は、述べた塩の形態に加えて、分子内塩またはベタイン（両性イオン）も含む。本発明のコンジュゲートによるそれぞれの塩は、当業者に公知の通常の方法により、例えば、これらを溶媒もしくは分散剤中で有機もしくは無機酸もしくは塩基と接触させることにより、または他の塩との陰イオン交換もしくは陽イオン交換により得ることができる。本発明は、低い生理学的適合性のため、医薬品における使用に直接的に適していないが、例えば、化学反応の中間体としてまたは薬学的に許容される塩の調製に用いることができる本発明のコンジュゲートのすべての塩も含む。
【０１４１】
製造の方法
ヒアルロン酸ヒドロゲル合成
架橋ヒアルロン酸は、種々の方法により得ることができる。ＨＡと架橋剤との反応、修飾（活性化）ＨＡと架橋剤との反応、２つの異なる修飾ＨＡと架橋剤との反応である。例は、Ｏｈら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、１４１巻（２０１０年）、２〜１２頁に記載されている。実施例７に、スキーム１に示されるモノ二官能性架橋剤である、ジビニルスルホンによる非修飾ＨＡの架橋について記載する。架橋剤による非修飾ＨＡの架橋は、ヒドロキシル媒介アルキル化（スキーム２）、１−メチル−２−クロロピリジニウムヨージドによる自己架橋（スキーム３）、アミド形成（スキーム４）およびジオール−エポキシド化学反応（スキーム５）によっても達成可能である。
【０１４２】
２つの異なる修飾ＨＡから出発する架橋方法は、チオールとマレイミドとのマイケル付加反応（スキーム６）、ならびにスキーム７および８に示されるクリック化学反応である。
【０１４３】
修飾ＨＡから出発する架橋方法は、アルデヒド（ジオール酸化）（スキーム９）、ならびにスキーム１０および１１に示される２＋２環化付加反応である。
【０１４４】
【化２９】
2020503278.tif 000032
【０１４５】
【化３０】
2020503278.tif 000033
【０１４６】
【化３１】
2020503278.tif 000034
【０１４７】
【化３２】
2020503278.tif 000035
【０１４８】
【化３３】
2020503278.tif 000036
【０１４９】
【化３４】
2020503278.tif 000037
【０１５０】
【化３５】
2020503278.tif 000038
【０１５１】
【化３６】
2020503278.tif 000039
【０１５２】
【化３７】
2020503278.tif 000040
【０１５３】
【化３８】
2020503278.tif 000041
【０１５４】
【化３９】
2020503278.tif 000042
【０１５５】
リンカーＬは、実施例で記載され、国際公開第２００９／０９５４７９号、国際公開第２０１１／０１２７１８号および国際公開第２０１２／０３５１３９号に開示されている方法により製造される。
【０１５６】
ペプチド−リンカーコンジュゲート合成
非天然アミノ酸、およびリシン内などのアミノ基の側鎖修飾を含むペプチドを製造する好ましい方法は、適切な樹脂での固相合成法（ＳＰＰＳ）である。
【０１５７】
例は：ＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．、１９８４年；ＡｔｈｅｒｔｏｎおよびＳｈｅｐｐａｒｄ、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９年；ＰｅｎｎｉｎｇｔｏｎおよびＤｕｎｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、３５巻、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４年；Ｊｏｎｅｓ、Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、Ｃｌａｒｅｎｄｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９９１年で与えられる。
【０１５８】
ペプチドの固相合成は、固体支持体を有するリンカーと結合させた、Ｎ末端を保護したアミノ酸誘導体を用いて開始される。固体支持体は、ＳＰＰＳにおいて用いられる溶媒に適合し、アミノ酸誘導体を、そのカルボキシ基で樹脂（例えば、ペプチド酸が求められる場合、トリチル樹脂、クロロトリチル樹脂、Ｗａｎｇ樹脂、または、Ｆｍｏｃ法を用いることによりペプチドアミドが得られなければならない場合、Ｒｉｎｋ樹脂、Ｓｉｅｂｅｒ樹脂）に結合させることができる任意のポリマーであってよい。ペプチド合成中のα−アミノ基の脱保護に用いられる条件下で、ポリマー支持体の安定性がもたらされなければならない。
【０１５９】
Ｎ末端を保護した最初のアミノ酸をリンカー−樹脂構築物に結合させた後、ピペリジン／ジメチルホルムアミド混合物などの塩基でＮ末端保護基を切断する（Ｆｍｏｃ法）。遊離したアミノ基を、ＤＩＰＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）またはＮＭＭ（Ｎ−メチルモルホリン）などの第３級塩基、あるいはＤＩＣ（Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド）／ＨＯＢｔ水和物（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）とともに、例えばＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス（ジメチルアミノ）−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）、ＨＢＴＵ（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルアミニウムヘキサフルオロホスフェート）、ＨＡＴＵ（Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）などの結合試薬を用いて、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸誘導体と反応させる。このプロセスを、所望のアミノ酸配列が得られるまで繰り返す。
【０１６０】
アミノ酸誘導体の反応性側鎖官能基は、通常、固相ペプチド合成に用いられる条件下で安定である適切な保護基でブロッキングされる。保護基は、ペプチドが固相上に構築された後と同じ条件下で、所望の生成物が樹脂から切断されるのと同時に除去される。保護基およびその導入手順は、ＧｒｅｅｎｅおよびＷｕｔｓ、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第３版、Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９９年、またはＫｏｃｉｅｎｓｋｉ、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ、Ｇｅｏｒｇ  Ｔｈｉｅｍｅ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９４年で見ることができる。
【０１６１】
側鎖を修飾するため、ＳＰＰＳにおいて選択的に側鎖保護基を除去することも可能である。このような保護基を除去するための条件は、その他の保護基がすべて無傷のままであるようなものでなければならない。リシンは、ＤＭＦ中ヒドラジン溶液に対し不安定なｉｖＤｄｅまたはＤｄｅ基（Ｃｈｈａｂｒａら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３９巻、１６０３頁、１９９８年を参照）で保護することができる。Ｎ末端保護基およびすべての側鎖保護基が酸に不安定な保護基を有する状態になったら、ｉｖＤｄｅまたはＤｄｅ保護基をＤＭＦ中ヒドラジンで切断することができる。その後、リシン側鎖の遊離したアミノ基を、例えばその他のＦｍｏｃ−アミノ酸または脂肪酸で修飾することができる。
【０１６２】
Ｌｙｓ（１４）側鎖の修飾：ペプチドＹはその配列にリシンアミノ酸４つを有し、１４位のリシンは側鎖が修飾されている（式ＩおよびＩＩを参照）。したがって、ペプチド合成では、２つの異なる側鎖保護リシンが用いられる：１４位用の構築ブロックとしてＭｍｔ側鎖（モノメトキシトリチル）保護リシンが使用され、その他の構築ブロックにはＢｏｃ側鎖保護リシンが用いられる。
【０１６３】
これら２つの異なる保護基の切断は、互いに選択的に選択することができる。
【０１６４】
最後に、カクテル、例えばＫｉｎｇのカクテル（Ｋｉｎｇら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．３６巻、２５５〜２６６頁、１９９０年）を含むトリフルオロ酢酸の使用により、すべての側鎖保護基と同時に樹脂からペプチドを切断することができる。このようなカクテルは、例えば可変量のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、水、エタンジチオール（ＥＤＴ）、チオアニソール、フェノール、トリエチルシラン（ＴＥＳ）またはトリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）を含んでいてよい。
【０１６５】
特定の反応時間後に、樹脂を濾別し、粗ペプチドをエーテル、例えばジエチルエーテル、メチルｔｅｒｔ．ブチルエーテルまたはジイソプロピルエーテルで沈殿させる。沈殿物を濾別するか、遠心分離により溶液から分離することができる。
【０１６６】
したがって、本発明のさらなる目的は、
ａ）２位にＤ−Ｓｅｒを含むＹのペプチド配列を樹脂上に構築する工程；
ｂ）１位にＦｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨとしてＨｉｓを結合させる工程；
ｃ）Ｆｍｏｃを脱保護する工程；
ｄ）式Ｉａａのリンカー試薬Ｌ２＊−Ｌ−を結合させる工程
【化４０】
2020503278.tif 000043
（式中、Ｌ２＊は、−Ｏ−およびＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ３ａａ）から独立に選択される１つまたはそれ以上の基によって場合により中断され、ＯＨおよびＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ３ａａＲ３ａａａ）から独立に選択される１つまたはそれ以上の基により場合により置換されたＣ１−２０アルキル鎖であり、Ｒ３ａａおよびＲ３ａａａは、ＨおよびＣ１−４アルキルからなる群から独立に選択され；Ｌ１にコンジュゲートすることが意図される化学官能基を含み；
ＰＡはＯＨまたはｐ−ニトロフェニルエステルなどの活性化基である）；
ｅ）１４位のＭｍｔを脱保護する工程；
ｆ）１４位にＰａｌｍ−Ｇｌｕ（γОＳｕ）−ＯｔＢｕまたはＳｔｅａ−Ｇｌｕ（γОＳｕ）−ＯｔＢｕを結合させる工程；．
ｇ）樹脂から切断し、保護されたすべての基から脱保護する工程
を含む、リンカーコンジュゲートＬ２＊−Ｌ−Ｙの製造方法を提供することであった。
【０１６７】
方法の他の実施形態では、
Ｌ２＊は、−Ｏ−およびＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ３ａａ）から選択される１つの基によって場合により中断されているＣ１−６アルキル鎖であり、Ｒ３ａａは、ＨおよびＣ１−４アルキルからなる群から独立に選択され；チオールまたはマレイミドから選択される化学官能基を含む。
【０１６８】
方法の他の実施形態では、
Ｌ２＊は−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−または−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−であり、
化学官能基としてチオール基を含む。
【０１６９】
したがって、本発明の目的は、
ａ）２位にＤ−Ｓｅｒを含むＹのペプチド配列を樹脂上に構築する工程；
ｂ）１位にＦｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨとしてＨｉｓを結合させる工程；
ｃ）Ｆｍｏｃを脱保護する工程；
ｄ）式Ｉａｂのリンカー試薬Ｌ２＊−Ｌ−を結合させる工程
【化４１】
2020503278.tif 000044
（式中、定義は上述の通りである）；
ｅ）１４位のＭｍｔを脱保護する工程；
ｆ）１４位にＰａｌｍ−Ｇｌｕ（γОＳｕ）−ＯｔＢｕまたはＳｔｅａ−Ｇｌｕ（γОＳｕ）−ＯｔＢｕを結合させる工程；．
ｇ）樹脂から切断し、保護されたすべての基から脱保護する工程
を含む、リンカーコンジュゲートＬ２＊−Ｌ−Ｙの製造方法を提供することである。
【０１７０】
Ｌ中のＸがＮＨであるリンカーコンジュゲートＬ２＊−Ｌ−Ｙでは、代替方法が、まずアミノ酸部分を結合させ、次にリンカーの残りの部分を結合させる２つの工程でリンカー試薬Ｌ２＊−Ｌ−を結合させることである。
【０１７１】
したがって、本発明の目的は、
ａ）２位にＤ−Ｓｅｒを含むＹのペプチド配列を樹脂上に構築する工程；
ｂ）１位にＦｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨとしてＨｉｓを結合させる工程；
ｃ）Ｆｍｏｃを脱保護する工程；
ｄ）式Ｉｃｃのアミノ酸を結合させる工程
【化４２】
2020503278.tif 000045
（式中、Ｐは保護基、好ましくはＦｍｏｃである）；
ｅ）Ｆｍｏｃを脱保護する工程；
ｆ）式Ｉｃｄのリンカー試薬Ｌ２＊−Ｌ＊−を結合させる工程
【化４３】
2020503278.tif 000046
（式中、定義は上述の通りであり；ＰＡはＯＨまたはｐ−ニトロフェニルエステルなどの活性化基である）；
ｇ）１４位のＭｍｔを脱保護する工程；
ｈ）１４位にＰａｌｍ−Ｇｌｕ（γОＳｕ）−ＯｔＢｕまたはＳｔｅａ−Ｇｌｕ（γОＳｕ）−ＯｔＢｕを結合させる工程；
ｉ）樹脂から切断し、保護されたすべての基から脱保護する工程
を含み；
Ｒ１、Ｒ１ａ、Ｒ２ａは、ＨおよびＣ１−４アルキルからなる群から独立に選択され；
Ｌ２＊−は上述のように定義される、
Ｌ中のＸがＮＨであるリンカーコンジュゲートＬ２＊−Ｌ−Ｙの製造方法を提供することである。
【０１７２】
方法の一実施形態では、式ＩｃｃにおいてＲ１はＣＨ３であり、Ｒ１ａはＨである。
【０１７３】
方法の他の実施形態では、式ＩｃｃにおいてＲ１はＨであり、Ｒ１ａはＣＨ３である。
【０１７４】
方法の他の実施形態では、式ＩｃｃにおいてＲ１はＣＨ３であり、Ｒ１ａはＣＨ３である。
【０１７５】
したがって、本発明の他の目的は、
ａ）２位にＤ−Ｓｅｒを含むＹのペプチド配列を樹脂上に構築する工程；
ｂ）１位にＦｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨとしてＨｉｓを結合させる工程；
ｃ）Ｆｍｏｃを脱保護する工程；
ｄ）Ｆｍｏｃ−Ａｉｂ−ＯＨを結合させる工程；
ｅ）Ｆｍｏｃを脱保護する工程；
ｆ）式Ｉａｃのリンカー試薬Ｌ２＊−Ｌ＊−を結合させる工程；
【化４４】
2020503278.tif 000047
ｇ）１４位のＭｍｔを脱保護する工程；
ｈ）１４位にＰａｌｍ−Ｇｌｕ（γОＳｕ）−ＯｔＢｕまたはＳｔｅａ−Ｇｌｕ（γОＳｕ）−ＯｔＢｕを結合させる工程；．
ｉ）樹脂から切断し、保護されたすべての基から脱保護する工程
を含む、式Ｌ２＊−Ｌ−Ｙのリンカーコンジュゲートの製造方法を提供することである。
【０１７６】
本発明の他の目的は、
ａ）２位にＤ−Ｓｅｒを含むＹのペプチド配列を樹脂上に構築する工程；
ｂ）１位にＦｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨとしてＨｉｓを結合させる工程；
ｃ）Ｆｍｏｃを脱保護する工程；
ｄ）Ｆｍｏｃ−Ａｉｂ−ＯＨを結合させる工程；
ｅ）Ｆｍｏｃを脱保護する工程；
ｆ）式Ｉａｃのリンカー試薬Ｌ２＊−Ｌ＊−を結合させる工程；
【化４５】
2020503278.tif 000048
ｇ）１４位のＭｍｔを脱保護する工程；
ｈ）Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）を結合させる工程；
ｉ）Ｆｍｏｃを脱保護する工程；
ｊ）Ｐａｌｍ−ＮＨＳまたはＳｔｅａ−ＮＨＳを結合させる工程；
ｋ）樹脂から切断し、保護されたすべての基から脱保護する工程
を含む、式Ｌ２＊−Ｌ−Ｙのリンカーコンジュゲートの製造方法を提供することである。
【０１７７】
本発明の他の目的は、
ａ）２位にＤ−Ｓｅｒを含むＹのペプチド配列を樹脂上に構築する工程；
ｂ）１位にＦｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨとしてＨｉｓを結合させる工程；
ｃ）Ｆｍｏｃを脱保護する工程；
ｄ）Ｆｍｏｃ−Ａｉｂ−ＯＨを結合させる工程；
ｅ）１４位のＭｍｔを脱保護する工程；
ｆ）１４位にＰａｌｍ−Ｇｌｕ（γОＳｕ）−ＯｔＢｕまたはＳｔｅａ−Ｇｌｕ（γОＳｕ）−ＯｔＢｕを結合させる工程；
ｇ）Ｆｍｏｃを脱保護する工程；
ｈ）式Ｉａｄのリンカー試薬Ｌ２＊−Ｌ＊−を結合させる工程；
【化４６】
2020503278.tif 000049
ｉ）樹脂から切断し、保護されたすべての基から脱保護する工程；
ｊ）Ｓ−ｔＢｕ保護基を還元的に切断する工程
を含む、式Ｌ２＊−Ｌ−Ｙのリンカーコンジュゲートの製造方法を提供することである。
【０１７８】
上述の方法すべてにおける、さらに後の方法の工程は、クロマトグラフィーによる精製、および当技術分野で公知の方法による、式−Ｌ２＊−Ｌ−Ｙのペプチドリンカーコンジュゲートの単離である。
【０１７９】
本発明のコンジュゲートは、−Ｌ１＊による構築ブロックである活性化ヒアルロン酸ヒドロゲルおよび活性化ペプチドリンカーコンジュゲートＬ２＊−Ｌ−Ｙを合成することによって製造することができる。
【０１８０】
活性化基Ｌ１＊およびＬ２＊は、ペプチドをポリマーにコンジュゲートするために用いる。スキーム１２にペプチドを自己犠牲リンカーによりポリマーにコンジュゲートするために用いることができる種々の種類の結合化学を示す。したがって、チオール−マレイミド化学反応に加えて、他の生体直交性化学反応を用いることができる。スキーム１２において、点線は、Ｌ１およびＬ２が結合する位置を示す。
【０１８１】
ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニスト−リンカーコンジュゲートを官能基化ヒアルロン酸ヒドロゲルに担持した後、すべての残存官能基を適切なブロッキング試薬を用いて場合によりキャップして、望ましくない副反応を防ぐ。
【０１８２】
官能基化マレイミド基含有ＨＡ−ヒドロゲルの場合、メルカプトエタノールのようなチオール含有化合物が適切なブロッキング剤である。
【０１８３】
【化４７】
2020503278.tif 000050
【０１８４】
本発明の他の態様は、Ｌ２＊−Ｌ−Ｙを含む官能基化中間体である（式中、Ｌ２＊、ＬおよびＹは上述のように定義される）。
【０１８５】
Ｌ２＊−Ｌ−Ｙの一実施形態は、以下の式ＩＶをもたらす、チオール官能基化を含む。
ＨＳ−Ｌ２−Ｌ−Ｙ（ＩＶ）
（式中、Ｌ２、ＬおよびＹは、上述の意味を有する。）
【０１８６】
Ｌ２＊−Ｌ−Ｙの一実施形態は式（ＩＶａ）である。
【化４８】
2020503278.tif 000051
【０１８７】
Ｌ２＊−Ｌ−Ｙの一実施形態は式（ＩＶｂ）である。
【化４９】
2020503278.tif 000052
【０１８８】
Ｌ２＊−Ｌ−Ｙの一実施形態は式（ＩＶｃ）である。
【化５０】
2020503278.tif 000053
【０１８９】
他の実施形態では、本発明のコンジュゲートのためのヒドロゲルを、微粒子の形態で、製造方法から得ることができる。本発明の好ましい実施形態では、反応性のヒドロゲルは、メッシュまたはステントにより成形される。最も好ましくは、ヒドロゲルは、標準的な注射器を用いる皮下または筋肉内注射として投与することができる微粒子ビーズに形成される。このようなソフトビーズは、１〜５００マイクロメートルの間の直径を有していてよい。
【０１９０】
医薬組成物
本発明の他の態様は、薬学的に許容される賦形剤と共に本発明のコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物である。該医薬組成物を以下のパラグラフでさらに述べる。
【０１９１】
本発明のコンジュゲートの組成物は、懸濁液組成物または乾燥組成物として提供することができる。一実施形態では、本発明のコンジュゲートの医薬組成物は、乾燥組成物である。乾燥の適切な方法は、例えば、噴霧乾燥および凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）（凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ））である。好ましくは、本発明のコンジュゲートの医薬組成物は、凍結乾燥により乾燥する。
【０１９２】
他の実施形態では、本発明のコンジュゲートの医薬組成物は、すぐ使用できる懸濁液である。
【０１９３】
他の実施形態では、本発明のコンジュゲートの医薬組成物は、コンジュゲートが０．５〜８（重量／容積）％の濃度まで水／緩衝液で膨潤している、すぐ使用できる懸濁液である。
【０１９４】
他の実施形態では、本発明のコンジュゲートの医薬組成物は、コンジュゲートが１〜４（重量／容積）％の濃度まで水／緩衝液で膨潤している、すぐ使用できる懸濁液である。
【０１９５】
他の実施形態では、本発明のコンジュゲートの医薬組成物は、コンジュゲートが１．５〜３（重量／容積）％の濃度まで水／緩衝液で膨潤している、すぐ使用できる懸濁液である。
【０１９６】
好ましくは、本発明のコンジュゲートは、１回の適用で治療有効量のＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストを少なくとも３日間供給するのに十分なように組成物に加えられる。より好ましくは、本発明のコンジュゲートの１回の適用は、１週間にわたり十分なものである。
【０１９７】
本発明による本発明のコンジュゲートの医薬組成物は、１つまたはそれ以上の賦形剤を含む。
【０１９８】
非経口組成物に用いる賦形剤は、緩衝剤、等張性調整剤、保存剤、安定剤、吸着防止剤、酸化保護剤、増粘剤／粘性増強剤または他の助剤と分類することができる。場合によっては、これらの成分は、二重または三重機能を有し得る。本発明による本発明のコンジュゲートの組成物は、以下からなる群から選択される１つまたは１つ以上の賦形剤を含む：
（ｉ）緩衝剤：リン酸、重炭酸、コハク酸、ヒスチジン、クエン酸および酢酸、硫酸、硝酸、塩化、ピルビン酸ナトリウムなどのｐＨを所望の範囲に維持するための生理学的に耐容される緩衝剤。Ｍｇ（ＯＨ）２またはＺｎＣＯ３などの制酸剤も用いることができる。緩衝能は、ｐＨ安定性に最も感度の高い条件に適合するように調節することができる。
（ｉｉ）等張性調整剤：注射デポ剤における浸透圧差に起因する細胞損傷によってもたらされ得る疼痛を最小限にするため。グリセリンおよび塩化ナトリウムが例である。有効濃度は、血清について２８５〜３１５ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの推定オスモル濃度を用いて浸透圧測定により決定することができる。
（ｉｉｉ）保存剤および／または抗菌剤：複数回投与非経口製剤は、患者が注射により感染するリスクを最小限にするのに十分な濃度の保存剤の添加および対応する規制要件が確立されていることを必要とする。一般的な保存剤は、ｍ−クレゾール、フェノール、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、クロロブタノール、ベンジルアルコール、硝酸フェニル水銀、チメロサール、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、安息香酸、クロロクレゾールおよび塩化ベンザルコニウムを含む。
（ｉｖ）安定剤：安定化は、タンパク質安定化力の強化により、変性状態の不安定化により、またはタンパク質への賦形剤の直接的結合により、達成される。安定剤は、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、グリシン、ヒスチジン、リシン、プロリンなどのアミノ酸、グルコース、スクロース、トレハロースなどの糖、グリセロール、マンニトール、ソルビトールなどのポリオール、リン酸カリウム、硫酸ナトリウムなどの塩、ＥＤＴＡ、ヘキサホスフェートなどのキレート化剤、二価金属イオン（亜鉛、カルシウム等）などのリガンド、フェノール誘導体などの他の塩または有機分子であり得る。さらに、シクロデキストリン、デキストラン、デンドリマー、ＰＥＧもしくはＰＶＰまたはＨＳＡなどのオリゴマーもしくはポリマーを用いることができる。
（ｖ）吸着防止剤：組成物のもしくは組成物の容器の内表面を被覆するかまたはそれに競合的に吸着するために、主としてイオン性もしくは非イオン性界面活性剤または他のタンパク質もしくは可溶性ポリマーを用いる。例えば、ポロキサマー（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８）、ＰＥＧドデシルエーテル（Ｂｒｉｊ  ３５）、ポリソルベート２０および８０、デキストラン、ポリエチレングリコール、ＰＥＧ−ポリヒスチジン、ＢＳＡおよびＨＳＡならびにゼラチンなどである。賦形剤の選択される濃度および種類は、避けるべき影響に依存するが、一般的に界面活性剤の単層がＣＭＣ値のすぐ上で界面に形成される。
（ｖｉ）凍結乾燥および／または凍結防止剤：凍結乾燥または噴霧乾燥中に、賦形剤は、水素結合の切断および水の除去によってもたらされる不安定化作用を防ぐことができる。この目的のために、糖およびポリオールを用いることができるが、対応する正の効果は、界面活性剤、アミノ酸、非水性溶媒および他のペプチドについても認められた。トレハロースは、水分によってもたらされる凝集の低減に特に効果的であり、水へのタンパク質疎水性基の曝露により引き起こされる可能性がある熱安定性も改善する。マンニトールおよびスクロースも単独の凍結乾燥／凍結防止剤または互いの組合せとして用いることができ、マンニトール：スクロースのより高い比率のものが凍結乾燥ケーキの物理的安定性を高めることが公知である。マンニトールは、トレハロースとも組み合わせることができる。トレハロースをソルビトールと組み合わせるかまたはソルビトールを単独の防止剤としても用いることができる。デンプンまたはデンプン誘導体も用いることができる。
（ｖｉｉ）酸化保護剤：アスコルビン酸、エクトイン、メチオニン、グルタチオン、モノチオグリセロール、モリン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、没食子酸プロピル、ビタミンＥなどの抗酸化剤、クエン酸、ＥＤＴＡ、ヘキサホスフェート、チオグリコール酸などのキレート化剤
（ｖｉｉｉ）増粘剤または粘性増強剤：バイアルおよび注射器中の粒子の沈降を遅らせるものであり、粒子の混合および再懸濁を促進し、懸濁液を注射することをより容易にする（すなわち、注射器のプランジャーへの低い力）ために用いられる。適切な増粘剤または粘性増強剤は、例えば、Ｃａｒｂｏｐｏｌ９４０、Ｃａｒｂｏｐｏｌ  Ｕｌｔｒｅｚ１０のようなカルボマー増粘剤、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ヒプロメロース、ＨＰＭＣ）またはジエチルアミノエチルセルロース（ＤＥＡＥまたはＤＥＡＥ−Ｃ）のようなセルロース誘導体、コロイドケイ酸マグネシウム（Ｖｅｅｇｕｍ）またはケイ酸ナトリウム、ヒドロキシアパタイトゲル、リン酸三カルシウムゲル、キサンタン、ＳａｔｉａゴムＵＴＣ３０のようなカラゲナン、ポリ（Ｄ，Ｌ−もしくはＬ−乳酸）（ＰＬＡ）およびポリグリコール酸（ＰＧＡ）ならびにそれらのコポリマー（ＰＬＧＡ）などの脂肪族ポリヒドロキシ酸、Ｄ，Ｌ−ラクチド、グリコリドおよびカプロラクトンのターポリマー、ポロキサマー、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンのトリブロック（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標））を構成する親水性ポリオキシエチレンブロックおよび疎水性ポリオキシプロピレンブロック、ポリエチレングリコールテレフタレート／ポリブチレンテレフタレートコポリマーなどの、ポリエーテルエステルコポリマー、スクロースアセテートイソ酪酸（ＳＡＩＢ）、デキストランまたはその誘導体、デキストランおよびＰＥＧの組合せ、ポリジメチルシロキサン、コラーゲン、キトサン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）および誘導体、ポリアルキルイミド、ポリ（アクリルアミド−コ−ジアリルジメチルアンモニウム（ＤＡＤＭＡ））、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、デルマタン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ヒアルロナンなどのグリコサミノグリカン（ＧＡＧｓ）、ポリラクチド（ＰＬＡ）もしくはポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）などの疎水性Ａブロックおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）もしくはポリビニルピロリドンなどの親水性ＢブロックからなるＡＢＡトリブロックまたはＡＢブロックコポリマーである。そのようなブロックコポリマーならびに上述のポロキサマーは、逆熱ゲル化挙動を示し得る（投与を促進する室温における液体状態および注射後の体温でのゾル−ゲル転移温度以上でゲル状態）。
（ｉｘ）展着または拡散剤：結合組織の細胞間隙に見いだされるヒアルロン酸、多糖などであるが、これらに限定されない間質腔における細胞外マトリックスの成分の加水分解による結合組織の透過性を変化させる。ヒアルロニダーゼなどであるが、これに限定されない展着剤は、細胞外マトリックスの粘度を一時的に低下させ、注射薬物の拡散を促進する。
（ｘ）他の助剤：湿潤剤、粘度調整剤、抗生物質、ヒアルロニダーゼなど。塩酸および水酸化ナトリウムなどの酸および塩基は、製造中のｐＨの調整に必要な助剤である。
【０１９９】
一実施形態では、本発明のコンジュゲートの組成物は、１つまたは１つ以上の増粘剤および／または粘度調整剤を含む。
【０２００】
他の実施形態では、本発明のコンジュゲートの組成物は、増粘剤および／または粘度調整剤としてのヒアルロン酸を含む。
【０２０１】
他の実施形態では、本発明のコンジュゲートの組成物は、５〜３０重量％の濃度の増粘剤および／または粘度調整剤としてのヒアルロン酸を含む。
【０２０２】
他の実施形態では、本発明のコンジュゲートの組成物は、２００ｋＤａ〜６００万ｋＤａの分子量の増粘剤および／または粘度調整剤としてのヒアルロン酸を含む。
【０２０３】
他の実施形態では、本発明のコンジュゲートの組成物は、５００ｋＤａ〜３００万ｋＤａの分子量の増粘剤および／または粘度調整剤としてのヒアルロン酸を含む。
【０２０４】
他の実施形態では、組成物は、１型糖尿病、２型糖尿病、肥満または高血糖の治療方法における使用のための、本発明の少なくとも１つのコンジュゲートを含み、組成物は、２６ゲージまたはそれより大きい針を有するチューブを含む注射装置を介して皮下投与されることを特徴とし、前記組成物は週１回投与される。
【０２０５】
「賦形剤」という用語は、好ましくは、治療薬が共に投与される希釈剤、アジュバントまたは媒体を意味する。そのような医薬賦形剤は、無菌の液体であり得る。水は、医薬組成物を経口投与する場合に好ましい賦形剤である。生理食塩水および水性デキストロースは、医薬組成物を静脈内投与する場合に好ましい賦形剤である。生理食塩溶液ならびに水性デキストロースおよびグリセロール溶液は、好ましくは注射用溶液用の液体賦形剤として用いられる。
【０２０６】
適切な医薬賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどを含む。組成物は、所望の場合、少量の湿潤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤も含み得る。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放製剤などの形態をとり得る。そのような組成物は、患者への適切な投与のための形態を備えるように適量の賦形剤と一緒に、好ましくは精製された形の治療有効量の治療薬を含む。製剤は、投与方法に適合すべきである。
【０２０７】
一般的な実施形態では、本発明の医薬組成物は、乾燥した形態か、または懸濁剤としてか、または他の形態かを問わず、１回または複数投与組成物として提供することができる。
【０２０８】
本発明の一実施形態では、本発明のコンジュゲートの乾燥組成物は、それが供給される容器が１回分の医薬品の用量を含むことを意味する、１回量として提供される。
【０２０９】
したがって、本発明の他の態様では、組成物は、１回量組成物として提供される。
【０２１０】
本発明の他の態様では、組成物は、容器に含まれている。
【０２１１】
一実施形態では、容器は、デュアルチャンバーシリンジである。特に、本発明による乾燥組成物をデュアルチャンバーシリンジの第１のチャンバーに用意し、復元溶液をデュアルチャンバーシリンジの第２のチャンバーに用意する。
【０２１２】
本発明のコンジュゲートの乾燥組成物をそれを必要とする患者に適用する前に、乾燥組成物を復元する。復元は、バイアル、注射器、デュアルチャンバーシリンジ、アンプルおよびカートリッジなどの、本発明のコンジュゲートの乾燥組成物が用意されている容器中で行うことができる。復元は、所定の量の復元溶液を乾燥組成物に加えることによって行う。復元溶液は、保存剤および／または抗菌剤などの、さらなる添加剤をさらに含み得る、水または緩衝液などの、無菌の液体である。組成物が１回量として提供される場合、復元溶液は、１つまたはそれ以上の保存剤および／または抗菌剤を含み得る。好ましくは、復元溶液は、滅菌水である。
【０２１３】
本発明のさらなる態様は、復元組成物の投与方法に関する。組成物は、皮内、皮下、筋肉内、静脈内、骨内および腹腔内を含む、注射または注入の方法により投与することができる。
【０２１４】
さらなる態様は、治療有効量の本発明のコンジュゲート、および場合により１つまたはそれ以上の薬学的に許容される賦形を含む復元組成物を製造する方法であり、ここで、ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストは、ヒドロゲルに一時的に結合しており、方法は、
・    本発明の組成物を復元溶液と接触させる
工程を含む。
【０２１５】
他の態様は、治療有効量の本発明のコンジュゲート、および場合により１つまたはそれ以上の薬学的に許容される賦形剤を含む復元組成物であり、ここで、ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストは、上記の方法により得られるヒドロゲルに一時的に結合している。
【０２１６】
本発明の他の態様は、本発明のコンジュゲートの乾燥組成物を製造する方法である。一実施形態では、そのような懸濁組成物は、
（ｉ）本発明のコンジュゲートを１つまたはそれ以上の賦形剤と混合すること、
（ｉｉ）１回または複数回量に相当する量を適切な容器中に移すこと、
（ｉｉｉ）組成物を前記容器中で乾燥すること、および
（ｉｖ）容器を密封すること
によって製造される。
【０２１７】
適切な容器は、バイアル、注射器、デュアルチャンバーシリンジ、アンプルおよびカートリッジである。
【０２１８】
他の態様は、部品のキットである。投与装置が単に皮下注射器である場合、キットは、注射器、針および注射器と共に使用する乾燥組成物を含む容器ならびに復元溶液を含む第２の容器を含み得る。より好ましい実施形態では、注射装置は、単一皮下注射器以外のものであり、そのため、本発明の復元コンジュゲートを含む別個の容器は、使用において、容器中の液体組成物が注射装置の出口と流体連結するように注射装置と連結するように適合されている。投与装置の例は、皮下注射器およびペン型注入装置を含むが、これらに限定されない。特に好ましい注射装置は、ペン型注入器であり、この場合、容器は、カートリッジ、好ましくは使い捨てカートリッジである。
【０２１９】
好ましい部品のキットは、針および本発明による組成物を含む容器を含み、復元溶液を場合によりさらに含み、容器は、針と共に使用するように適合されている。好ましくは、容器は、デュアルチャンバーシリンジである。
【０２２０】
他の態様では、本発明は、ペン型注入装置と共に使用するための上述の本発明のコンジュゲートの組成物を含むカートリッジを提供する。カートリッジは、１回または複数回量のＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストを含み得る。
【０２２１】
本発明の一実施形態では、本発明のコンジュゲートの懸濁組成物は、本発明のコンジュゲートおよび１つまたは１つ以上の賦形剤だけでなく、遊離型のまたはコンジュゲートとしてのいずれかの、生物学的に活性な他の薬剤も含む。好ましくは、そのような追加の１つまたはそれ以上の生物学的に活性な薬剤は、コンジュゲート、より好ましくはヒドロゲルコンジュゲートである。そのような生物学的に活性な薬剤は、併用療法の中に記載の化合物を含むが、それらに限定されない。
【０２２２】
注射可能性
好ましくは、製剤は、内径が０．２６ｍｍ（２６ゲージ）より小さな針を介する、より好ましくは内径が０．１８ｍｍ（２８ゲージ）より小さな針を介する、最も好ましくは内径が０．１６ｍｍ（３０ゲージ）より小さな針を介する注射によって投与することができる。
【０２２３】
「注射によって投与することができる」、「注射可能」または「注射可能性」という用語は、特定の濃度（重量／容積）および特定の温度の液体で膨潤した本発明による生分解性ＨＡヒドロゲルを含む注射器のプランジャーに加えられる特定の力、そのような注射器の出口に接続された所定の内径の針ならびに針を介して注射器から特定の容積の本発明による生分解性ヒドロゲルを押し出すのに必要な時間のような因子の組合せを意味すると理解される。
【０２２４】
注射可能性を備えるために、水／緩衝液で膨潤し、注射器（直径４．７ｍｍのプランジャーを有する）に含まれている本発明による１ｍＬの容積のコンジュゲートは、２６ゲージの針を介して２０ニュートンに等しい／未満の力を加えることによって室温で１０秒以内に押し出すことができる。
【０２２５】
好ましい注射可能性は、３０ゲージの針を介して２０ニュートンに等しい／未満の力を加えることによって室温で１０秒以内に押し出すことができる、水／緩衝液で膨潤し、注射器（直径４．７ｍｍのプランジャーを有する）に含まれている本発明による１ｍＬの容積のコンジュゲートである。
【０２２６】
注射可能性を得るためには、水／緩衝液で少なくとも１．５％（重量／容積）の濃度まで膨潤させ、直径４．７ｍｍのプランジャーを有する注射器に含まれている本発明による１ｍＬの容積のコンジュゲートを、３０ゲージの針を介して３０ニュートン未満の力を加えることによって室温で１０秒以内に押し出すことができる。
【０２２７】
より好ましくは、注射可能性は、３０ゲージの針を介して３０ニュートン未満の力を加えることによって、少なくとも２％（重量／容積）の濃度まで水／緩衝液で膨潤させた本発明によるコンジュゲートで達成される。
【０２２８】
最も好ましくは、注射可能性は、３０ゲージの針を介して２０ニュートン未満の力を加えることによって、少なくとも２％（重量／容積）の濃度まで水／緩衝液で膨潤させた本発明によるコンジュゲートについて達成される。
【０２２９】
コンジュゲートの重要な特性は、その適用部位に留まる安定なデポ剤の形成である。ポリマーの分解は、薬物の放出後に始まるべきである。
【０２３０】
他の実施形態は、注射装置であって、１型糖尿病、２型糖尿病、肥満または高血糖の治療方法における使用のための、２８またはそれより大きいゲージを有するチューブを含み、本発明のコンジュゲートをさらに含む前記注射装置である。
【０２３１】
投与単位、パッケージ、ペン型装置および投与
本発明の化合物は、適切な医薬組成物における使用のために製造することができる。適切な医薬組成物は、１つまたはそれ以上の投与単位の形態であってよい。
【０２３２】
組成物は、本発明の化合物および担体（１つまたはそれ以上の追加の成分からなっていてよい）を接触させる工程を含む、任意の適切な医薬的方法により製造することができる。
【０２３３】
投与単位は、例えばカプセル剤、錠剤、糖衣錠、顆粒剤、サシェ（ｓａｃｈｅｔ）、ドロップ剤、液剤、懸濁剤、凍結乾燥物および散剤であってよく、そのそれぞれが規定量の本発明の化合物を含む。
【０２３４】
本発明の化合物の上述の投与単位または本発明の医薬組成物（投与単位）のそれぞれを、輸送および保存を容易にするためにパッケージとして提供することができる。投与単位は標準的な１回または複数回量パッケージングとしてパッケージングされ、その形態、材料および形状は、製造される単位の種類によって決まる。
【０２３５】
例えば、錠剤および固体投与単位のその他の形態を単一単位としてパッケージングすることができ、単一パッケージング単位を複数パック容器にパッケージングすることができる。
【０２３６】
液体製剤は、例えばバイアル、カートリッジ、注射器／プレフィルド注射器、注入バッグ、折り畳み式プラスチックバッグ、注入ビン、ブローフィルシールビンもしくは注入チューブなどの単一単位として、または１回もしくは複数回量注射用形態、例えばペン型装置、ポンプもしくは注射器の形態としてパッケージングすることができ、単一パッケージング単位を複数パック容器にパッケージングすることができる。単一パッケージは、１回または複数回投与単位を含んでいてよい。パッケージは、例えば紙、ボール紙、板紙、プラスチック、金属、紙、プラスチックおよび金属のうち１つもしくはそれ以上の組合せもしくは積層物、またはガラス製であってよい。例示的な実施形態は、ボール紙箱に入れて供給することができる例えば錠剤もしくはカプセル剤を含むブリスターパッケージ、例えば散剤を含むアルミニウムバリア積層物サシェ、例えば錠剤もしくは液剤を含むガラスもしくはプラスチックビン、または液剤もしくは懸濁剤を含むバイアル、カートリッジ、注射器、注入バッグ、注入ビン、注入チューブもしくはアンプルである。
【０２３７】
特定の実施形態では、投与単位を、適用のための装置と一緒に、例えば注射器、注射ペンまたは自己注射器と一緒に提供することができる。このような装置は、医薬組成物とは別に提供しても、医薬組成物であらかじめ充填してあってもよい。
【０２３８】
「ペン型注射装置」は大抵「注射ペン」と簡潔に呼ばれ、一般的に、筆記用の万年筆と類似した、伸長された形状を有する注射装置である。このようなペンは通常チューブ状の断面を有するが、三角、長方形または正方形、またはこれらの形状に近い任意の変形形態などの異なる断面を容易に有し得る。一般的に、ペン型注射装置は３つの主要な要素を含む：大抵は収納容器またはホルダー内に含まれるカートリッジを含むカートリッジ部分；カートリッジ部分の一方の末端に接続された針アセンブリ；およびカートリッジ部分の他方の末端に接続された投与部分。カートリッジは大抵「アンプル」とも呼ばれ、一般的に、医薬品で充填される液溜め、カートリッジ液溜めの一方の末端に位置する可動性ゴム型の栓またはストッパー、および他方の、大抵首を絞った、末端に位置する穿刺可能なゴム封止材を有する上端を含む。圧着された環状の金属バンドが、ゴム封止材を所定の位置に保持するために一般的に用いられる。カートリッジ収納容器は一般的にプラスチック製であってよいが、カートリッジ液溜めは従来ガラス製である。
【０２３９】
併用療法
ＧＬＰ−１およびグルカゴン受容体に対する二重アゴニストである、本発明のコンジュゲートは、Ｒｏｔｅ  Ｌｉｓｔｅ  ２０１６に記載されているすべての薬物のような、他の薬理学的に活性な化合物と、例えば、Ｒｏｔｅ  Ｌｉｓｔｅ  ２０１５の１章に記載されているすべての体重減量薬もしくは食欲抑制薬、Ｒｏｔｅ  Ｌｉｓｔｅ  ２０１６の５８章に記載されているすべての脂質低下薬、Ｒｏｔｅ  Ｌｉｓｔｅ  ２０１６に記載されているすべての抗高血圧薬および腎臓保護薬、またはＲｏｔｅ  Ｌｉｓｔｅ  ２０１６の３６章に記載されているすべての利尿薬と広く併用することができる。
【０２４０】
有効成分の組合せは、とりわけ作用の相乗的改善のために用いることができる。それらは、患者への有効成分の個別の投与によって、または複数の有効成分が１つの医薬品に存在する組合せ製品の形のいずれかで適用することができる。有効成分を有効成分の個別の投与によって投与する場合、これを同時または連続して行うことができる。
【０２４１】
そのような組合せに適する他の活性物質は、とりわけ、例えば、言及された適応症の１つに関する１つもしくはそれ以上の活性物質の治療効果を増強し、かつ／または１つもしくはそれ以上の活性物質の用量を減少させるものを含む。
【０２４２】
組合せに適する治療薬は、例えば、以下のような抗糖尿病薬を含む：
インスリンおよびインスリン誘導体、例えば：グラルギン／Ｌａｎｔｕｓ（登録商標）、２７０〜３３０Ｕ／ｍＬのインスリングラルギン（欧州特許第２３８７９８９号）、３００Ｕ／ｍＬのインスリングラルギン（欧州特許第２３８７９８９号）、グルリシン／Ａｐｉｄｒａ（登録商標）、デテミル／Ｌｅｖｅｍｉｒ（登録商標）、リスプロ／Ｈｕｍａｌｏｇ（登録商標）／Ｌｉｐｒｏｌｏｇ（登録商標）、デグルデク／デグルデクプラス、アスパルト、基礎インスリンおよび類似体（例えば、ＬＹ−２６０５５４１、ＬＹ２９６３０１６、ＮＮ１４３６）、ＰＥＧ化インスリンリスプロ、Ｈｕｍｕｌｉｎ（登録商標）、リンジェタ、ＳｕｌｉＸｅｎ（登録商標）、ＮＮ１０４５、インスリンプラスシムリン、ＰＥ０１３９、即効性および短時間作用型インスリン（例えば、リンジェタ、ＰＨ２０、ＮＮ１２１８、ＨｉｎｓＢｅｔ）、（ＡＰＣ−００２）ヒドロゲル、経口、吸入可能、経皮および舌下インスリン（例えば、Ｅｘｕｂｅｒａ（登録商標）、Ｎａｓｕｌｉｎ（登録商標）、アフレッザ、トレゴピル、ＴＰＭ０２、カプスリン、Ｏｒａｌ−ｌｙｎ（登録商標）、Ｃｏｂａｌａｍｉｎ（登録商標）経口インスリン、ＯＲＭＤ−０８０１、ＮＮ１９５３、ＮＮ１９５４、ＮＮ１９５６、ＶＩＡｔａｂ、Ｏｓｈａｄｉ経口インスリン）。さらに二官能性リンカーによりアルブミンまたは他のタンパク質に結合しているインスリン誘導体も含まれる。
ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１類似体およびＧＬＰ−１受容体アゴニスト、例えば：リキシセナチド／ＡＶＥ００１０／ＺＰ１０／リクスミア、イクセナチド／エキセンディン−４／ビエッタ／ビデュレオン／ＩＴＣＡ６５０／ＡＣ−２９９３、リラグルチド／ビクトザ、セマグルチド、タスポグルチド、シンクリア／アルビグルチド、デュラグルチド、ｒＥｘｅｎｄｉｎ−４、ＣＪＣ−１１３４−ＰＣ、ＰＢ−１０２３、ＴＴＰ−０５４、ラングレナチド／ＨＭ−１１２６０Ｃ、ＣＭ−３、ＧＬＰ−１エリゲン、ＯＲＭＤ−０９０１、ＮＮ−９９２４、ＮＮ−９９２６、ＮＮ−９９２７、ノデキセン、ビアドール−ＧＬＰ−１、ＣＶＸ−０９６、ＺＹＯＧ−１、ＺＹＤ−１、ＧＳＫ−２３７４６９７、ＤＡ−３０９１、ＭＡＲ−７０１、ＭＡＲ７０９、ＺＰ−２９２９、ＺＰ−３０２２、ＴＴ−４０１、ＢＨＭ−０３４．ＭＯＤ−６０３０、ＣＡＭ−２０３６、ＤＡ−１５８６４、ＡＲＩ−２６５１、ＡＲＩ−２２５５、エキセナチド−ＸＴＥＮおよびグルカゴン−Ｘｔｅｎ。
ＤＰＰ−４阻害薬、例えば：アログリプチン／ネシナ、トラジェンタ／リナグリプチン／ＢＩ−１３５６／オンデロ／トラジェンタ／トラドジェンタ／トラエンタ／トラドゼンタ、サキサグリプチン／オングリザ、シタグリプチン／ジャヌビア／キセレビア／テサベ／ジャヌメット／ベルメチア、ガルブス／ビリダグリプチン、アナグリプチン、ゲミグリプチン、テネリグリプチン、メログリプチン、トレラグリプチン、ＤＡ−１２２９、オマリグリプチン／ＭＫ−３１０２、ＫＭ−２２３、エボグリプチン、ＡＲＩ−２２４３、ＰＢＬ−１４２７、ピノキサシン。
ＳＧＬＴ２阻害薬、例えば：インボカナ／カナグリフロジン、ホルキシガ／ダパグリフロジン、レモグリフロジン、セルグリフロジン、エムパグリフロジン、イプラグリフロジン、トホグリフロジン、ルセオグリフロジン、ＬＸ−４２１１、エルツグリフロジン／ＰＦ−０４９７１７２９、ＲＯ−４９９８４５２、ＥＧＴ−０００１４４２、ＫＧＡ−３２３５／ＤＳＰ−３２３５、ＬＩＫ０６６、ＳＢＭ−ＴＦＣ−０３９、
ビグアニド（例えば、メトホルミン、ブホルミン、フェンホルミン）、チアゾリジンジオン（例えば、ピオグリタゾン、リボグリタゾン、ロシグリタゾン、トログリタゾン）、二重ＰＰＡＲアゴニスト（例えば、アレグリタザール、ムラグリタザール、テサグリタザール）、スルホニル尿素（例えば、トルブタミド、グリベンクラミド、グリメピリド／アマリル、グリピジド）、メグリチニド（例えば、ナテグリニド、レパグリニド、ミチグリニド）、アルファ−グルコシダーゼ阻害薬（例えば、アカルボース、ミグリトール、ボグリボース）、アミリンおよびアミリン類似体（例えば、プラムリンチド、シムリン）。
ＧＰＲ１１９アゴニスト（例えば、ＧＳＫ−２６３Ａ、ＰＳＮ−８２１、ＭＢＸ−２９８２、ＡＰＤ−５９７、ＺＹＧ−１９、ＤＳ−８５００）、ＧＰＲ４０アゴニスト（例えば、ファシグリファム／ＴＡＫ−８７５、ＴＵＧ−４２４、Ｐ−１７３６、ＪＴＴ−８５１、ＧＷ９５０８）。
【０２４３】
他の適切な組合せパートナーは、１１−ベータ−ＨＳＤの阻害薬である、シクロセット（例えば、ＬＹ２５２３１９９、ＢＭＳ７７０７６７、ＲＧ−４９２９、ＢＭＳ８１６３３６、ＡＺＤ−８３２９、ＨＳＤ−０１６、ＢＩ−１３５５８５）、グルコキナーゼの活性化剤（例えば、ＴＴＰ−３９９、ＡＭＧ−１５１、ＴＡＫ−３２９、ＧＫＭ−００１）、ＤＧＡＴの阻害薬（例えば、ＬＣＱ−９０８）、タンパク質チロシンホスファターゼ１の阻害薬（例えば、トロダスケミン）、グルコース−６−ホスファターゼの阻害薬、フルクトース−１，６−ビスホスファターゼの阻害薬、グリコーゲンホスホリラーゼの阻害薬、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼの阻害薬、グリコーゲンシンターゼキナーゼの阻害薬、ピルビン酸デヒドロキナーゼの阻害薬、アルファ２−アンタゴニスト、ＣＣＲ−２アンタゴニスト、ＳＧＬＴ−１阻害薬（例えば、ＬＸ−２７６１）である。
【０２４４】
例えば、以下のような、１つまたはそれ以上の脂質低下薬も組合せパートナーとして適している：ＨＭＧ−ＣｏＡ−レダクターゼ阻害薬（例えば、シンバスタチン、アトルバスタチン）、フィブレート（例えば、ベンザフィブレート、フェノフィブレート）、ニコチン酸およびその誘導体（例えば、ナイアシン）、
ＰＰＡＲ−（アルファ、ガンマまたはアルファ／ガンマ）アゴニストまたは調節薬（例えば、アレグリタザール）、
ＰＰＡＲ−デルタアゴニスト、ＡＣＡＴ阻害薬（例えば、アバシミブ）、コレステロール吸収阻害薬（例えば、エゼチミブ）、胆汁酸結合物質（例えば、コレスチラミン、コレセベラム）、回腸胆汁酸輸送阻害薬、ＭＴＰ阻害薬またはＰＣＳＫ９の調節薬。
以下のようなＨＤＬ上昇化合物：ＣＥＴＰ阻害薬（例えば、トルセトラピブ、アナセトラピド、ダルセトラピド、エバセトラピド、ＪＴＴ−３０２、ＤＲＬ−１７８２２、ＴＡ−８９９５）またはＡＢＣ１調節薬。
【０２４５】
他の適切な組合せパートナーは、例えば、以下のような、肥満の治療用の１つまたはそれ以上の活性物質である：シブトラミン、テソフェンシン、オルリスタット、カンナビノイド−１受容体のアンタゴニスト、ＭＣＨ−１受容体アンタゴニスト、ＭＣ４受容体アゴニスト、ＮＰＹ５またはＮＰＹ２アンタゴニスト（例えば、ベルネペリト）、ベータ−３−アゴニスト、レプチンまたはレプチン模倣薬、５ＨＴ２ｃ受容体のアゴニスト（例えば、ロルカセリン）またはブプロピオン／ナルトレキソン、ブプロピオン／ゾニサミド、ブプロピオン／フェンタルミンまたはプラムリンチド／メトレレプチンの組合せ。
【０２４６】
他の適切な組合せパートナーは、以下の通りである：
ペプチドＹＹ３〜３６（ＰＹＹ３〜３６）またはその類似体などのさらなる消化管ペプチド、膵臓ポリペプチド（ＰＰ）またはその類似体。
グルカゴン受容体アゴニストまたはアンタゴニスト、ＧＩＰ受容体アゴニストまたはアンタゴニスト、グレリンアンタゴニストまたは逆アゴニスト、キセニンおよびその類似体。
【０２４７】
さらに、例えば、以下のような、高血圧、慢性心不全またはアテローム動脈硬化症に影響を及ぼす薬物との組合せ：アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト（例えば、テルミサルタン、カンデサルタン、バルサルタン、ロサルタン、エプロサルタン、イルベサルタン、オルメサルタン、タソサルタン、アジルサルタン）、ＡＣＥ阻害薬、ＥＣＥ阻害薬、利尿薬、ベータ遮断薬、カルシウムアンタゴニスト、中枢性高血圧、アルファ−２−アドレナリン受容体のアンタゴニスト、中性エンドペプチダーゼの阻害薬、血小板凝集阻害薬およびその他またはそれらの組合せが適している。
【０２４８】
使用
他の態様では、本発明は、ＧＬＰ−１およびグルカゴンの受容体に結合することによって、またそれらの活性を調節することによって作用を及ぼすことができる疾患または状態の治療または予防に適する医薬を製造するための、組合せパートナーとして上述した活性物質の少なくとも１つと組み合わせた本発明によるコンジュゲートまたはその生理学的に許容される塩の使用に関する。
【０２４９】
前記組成物は、例えば、高血糖症の治療および予防のためのならびにあらゆる種類の糖尿病、例えば、インスリン依存性糖尿病、非インスリン依存性糖尿病、前糖尿病もしくは妊娠性糖尿病の治療および予防のための、代謝症候群および／または肥満および／または摂食障害、インスリン抵抗性症候群の予防および治療、血漿脂質レベルの低下、心臓リスクの低減、食欲の低減、体重の減少等のための、ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストおよびＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストアゴニストについて公知の疾患または障害を治療または予防する方法における使用のためのものである。
【０２５０】
前記コンジュゲートまたは組成物は、肝臓脂肪症、好ましくは非アルコール性肝臓疾患（ＮＡＦＬＤ）および非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の治療または予防に有用である。
【０２５１】
１つまたはそれ以上の活性物質と組み合わせた、本発明によるコンジュゲートまたはその生理学的に許容される塩の使用は、同時に、個別にまたは連続的に行うことができる。
【０２５２】
他の活性物質と組み合わせた、本発明によるコンジュゲートまたはその生理学的に許容される塩の使用は、同時にまたは時間をずらして、特に短時間内に行うことができる。それらを同時に投与する場合、２つの活性物質を一緒に患者に投与し；それらを時間をずらして使用する場合、２つの活性物質を１２時間以下、特に６時間以下の期間内に患者に投与する。
【０２５３】
したがって、他の態様では、本発明は、本発明によるコンジュゲートまたはそのような化合物の生理学的に許容される塩ならびに組合せパートナーとしての上述の活性物質の少なくとも１つを、場合により１つまたはそれ以上の不活性担体および／または希釈剤と一緒に含む医薬に関する。
【０２５４】
本発明によるコンジュゲートまたはその生理学的に許容される塩もしくは溶媒和物、ならびにそれと組み合わせるべき追加の活性物質は、両方が１つの製剤中、例えば、懸濁剤中に一緒に存在しても、または２つの同じもしくは異なる製剤中に個別に、例えば、いわゆる部品のキットとして存在してもよい。
【０２５５】
本発明のさらに他の態様は、治療有効量の本発明のコンジュゲートまたは本発明の医薬組成物もしくはその薬学的に許容される塩を患者に投与することを含む１つ以上の状態の治療を必要とする哺乳類患者、好ましくはヒトにおける治療、コントロール、遅延または予防する方法である。
【０２５６】
方法
用いる略語は、次の通りである。
ＡＡ          アミノ酸
ＡｃＯＨ      酢酸
ＡｃＯＥｔ    酢酸エチル
Ａｉｂ        アルファ−アミノ−イソ酪酸
ｃＡＭＰ      環状アデノシン一リン酸
Ｂｎ          ベンジル
Ｂｏｃ        ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル
ＢＯＰ        （ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
ＢＳＡ        ウシ血清アルブミン
ｔＢｕ        第三級ブチル
ｄＡｌａ      Ｄ−アラニン
ＤＢＵ        １，３−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデセン
ＤＣＣ        Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＤＣＭ        ジクロロメタン
Ｄｄｅ        １−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシリデン）−エチル
ｉｖＤｄｅ    １−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシリデン）３−メチル−ブチル
ＤＩＣ        Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド
ＤＩＰＥＡ    Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＡＰ      ジメチルアミノ−ピリジン
ＤＭＥＭ      ダルベッコ改変イーグル培地
ＤＭＦ        ジメチルホルムアミド
ＤＭＳ        ジメチルスルフィド
ＤＭＳＯ      ジメチルスルホキシド
ＤＴＴ        ＤＬジチオトレイトール
ＤＶＳ        ジ−ビニルスルホン
ＥＤＣ        １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
ＥＤＴ        エタンジチオール
ＥＤＴＡ      エチレンジアミン四酢酸
ｅｑ          化学量論的等価
ＥｔＯＨ      エタノール
ＦＡ          ギ酸
ＦＢＳ        ウシ胎児血清
Ｆｍｏｃ      フルオレニルメチルオキシカルボニル
ｇＧｌｕ      ガンマ−グルタミン酸（γＥ）
ＨＡＴＵ      Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＨＢＳＳ      ハンクス平衡塩類溶液
ＨＢＴＵ      ２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＨＥＰＥＳ    ２−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］エタンスルホン酸
ＨＯＢｔ      １−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＨＯＳｕ      Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
ＨＰＬＣ      高速液体クロマトグラフィー
ＨＴＲＦ      均一時間分解蛍光
ＩＢＭＸ      ３−イソブチル−１−メチルキサンチン
ＬＣ／ＭＳ    液体クロマトグラフィー／質量分析
Ｍａｌ        ３−マレイミドプロピル
Ｍａｌ−ＰＥＧ６−ＮＨＳ    Ｎ−（３−マレイミドプロピル）−２１−アミノ−４，７，１０，１３，１６，１９−ヘキサオキサ−ヘンエイコサン酸ＮＨＳエステル
Ｍｅ          メチル
ＭｅＯＨ      メタノール
Ｍｍｔ        ４−メトキシトリチル
ＭＳ          質量スペクトル／質量分析
ＭＴＢＥ      メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル
ＭＷ          分子質量
ＮＨＳ        Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
Ｐａｌｍ      パルミトイル
ｉＰｒＯＨ    ２−プロパノール
ＰＢＳ        リン酸緩衝生理食塩水
ＰＥＧ        ポリエチレングリコール
ＰＫ          薬物動態
ＰｙＢＯＰ    ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
Ｐｈｔｈ      フタルイミド
ＲＰ−ＨＰＬＣ    逆相高速液体クロマトグラフィー
ｒｐｍ        毎分回転数
ＲＴ          室温
ＳＥＣ        サイズ排除クロマトグラフィー
Ｓｔｅａ      ステアリル
ＴＣＥＰ      トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩
ＴＥＳ        トリエチルシラン
ＴＦＡ        トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ        テトラヒドロフラン
ＴＭＥＤＡ    Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン
Ｔｒｉｓ      トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
Ｔｒｔ        トリチル
ＵＰＬＣ      超高速液体クロマトグラフィー
ＵＶ          紫外線
Ｖ            容積
【０２５７】
ペプチド化合物の一般的合成
材料：
異なるＲｉｎｋ−Ａｍｉｄｅ樹脂（４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）−フェノキシアセトアミド−ノルロイシルアミノメチル樹脂、Ｍｅｒｃｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；４−［（２，４−ジメトキシフェニル）（Ｆｍｏｃ−アミノ）メチル］フェノキシアセトアミドメチル樹脂、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を０．２〜０．７ｍｍｏｌ／ｇの範囲の担持量でペプチドアミドの合成に用いた。
【０２５８】
Ｆｍｏｃ保護天然アミノ酸は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｓｅｎｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｍｅｒｃｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、Ｉｒｉｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＮａｇａｓｅまたはＢａｃｈｅｍから購入した。以下の標準アミノ酸を、合成を通して用いた：Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｍｍｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｓｅｒ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ。
【０２５９】
さらに、以下の特殊なアミノ酸は、上記と同じ供給業者から購入した：Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（ｉｖＤｄｅ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｉｂ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｌ−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（トルエン溶媒和物として入手できる）およびＢｏｃ−Ｌ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ。
【０２６０】
固相ペプチド合成は、標準Ｆｍｏｃ化学およびＨＢＴＵ／ＤＩＰＥＡ活性化を用いて、例えば、Ｐｒｅｌｕｄｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ）または同様な自動合成装置で実施した。ＤＭＦを溶媒として用いた。脱保護：２０％ピペリジン／ＤＭＦ、２×２．５分間。洗浄：７×ＤＭＦ。カップリング：ＤＭＦ中２：５：１０  ２００ｍＭ  ＡＡ／５００ｍＭ  ＨＢＴＵ／２Ｍ  ＤＩＰＥＡ、２×２０分間、洗浄：５×ＤＭＦ。
【０２６１】
Ｌｙｓ側鎖を修飾する場合、対応する位置にＦｍｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（ｉｖＤｄｅ）−ＯＨまたはＦｍｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｍｍｔ）−ＯＨを用いた。合成が完結した後、ｉｖＤｄｅ基は、改変された文献手順（Ｓ．Ｒ．Ｃｈｈａｂｒａら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３９巻、（１９９８年）、１６０３頁）に従って、ＤＭＦ中４％ヒドラジン水和物を用いて除去した。Ｍｍｔ基は、ジクロロメタン中１％ＴＦＡでの繰り返し処理により除去した。所望の酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルで樹脂を処理することにより、またはＨＢＴＵ／ＤＩＰＥＡもしくはＨＯＢｔ／ＤＩＣなどの結合試薬を用いることにより以下のアシル化を行った。
【０２６２】
合成されたすべてのペプチドを８２．５％ＴＦＡ、５％フェノール、５％水、５％チオアニソール、２．５％ＥＤＴからなるＫｉｎｇの切断カクテルを用いて樹脂から切断した。次いで粗ペプチドをジエチルまたはジイソプロピルエーテルで沈殿させ、遠心分離し、凍結乾燥した。ペプチドを分析用ＨＰＬＣにより分析し、ＥＳＩ質量分析により確認した。粗ペプチドを通常の分取ＨＰＬＣ精製法により精製した。
【０２６３】
分析用ＨＰＬＣ／ＵＰＬＣ
Ｗａｔｅｒｓ  ＸＢｒｉｄｇｅ  ＢＥＨ１３０  ３．５μｍ  Ｃ１８カラム（２．１×１５０ｍｍ）を用いるＡｇｉｌｅｎｔ１１００Ｓｅｒｉｅｓ  ＨＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍで、４０℃で、流量０．５ｍＬ／分の勾配溶出により分析用ＨＰＬＣを実施し、２１５および２８０ｎｍでモニターした。勾配は、１５分にわたり１０％Ｂ〜９０％Ｂ、次いで１分で９０％Ｂ、または１２．５分にわたり１５％Ｂ〜５０％Ｂ、次いで３分にわたり５０％Ｂ〜９０％Ｂに設定した。緩衝液Ａ＝水中０．１％ギ酸、Ｂ＝アセトニトリル中０．１％ギ酸。
【０２６４】
一般的分取ＨＰＬＣ精製法：
粗ペプチドをＡｋｔａ  Ｐｕｒｉｆｉｅｒ  ＳｙｓｔｅｍまたはＪａｓｃｏ  ｓｅｍｉｐｒｅｐ  ＨＰＬＣ  Ｓｙｓｔｅｍのいずれかで精製した。精製する粗ペプチドの量によって、異なるサイズの分取ＲＰ−Ｃ１８−ＨＰＬＣカラムおよび異なる流量を用いた。アセトニトリル＋０．１％ＴＦＡ（Ｂ）および水＋０．１％ＴＦＡ（Ａ）を溶出液として用いた。生成物含有画分を収集し、凍結乾燥して、精製された生成物を得た。
【０２６５】
ＬＣＭＳ方法Ａ：２１５ｎｍで検出
カラム：  Ａｅｒｉｓ  Ｗｉｄｅｐｏｒｅ、３．６μｍ、１００×２．１ｍｍ、４０℃
溶媒：    Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ：ＡＣＮ＋０．１％ＴＦＡ（流量１．５ｍｌ／分）
勾配：    ９０：１０（０分）〜１０：９０（１０分）〜１０：９０（１０．６７分）〜９０：１０（１１分）〜９０：１０（１２分）
【０２６６】
安定性−エキセンディン−４誘導体の試験
ペプチドバッチの溶解度および安定性の試験の前に、その含量を測定した。したがって、その純度（ＨＰＬＣ−ＵＶ）およびバッチの塩担持の量（イオンクロマトグラフィー）の２つのパラメータを検討した。
【０２６７】
安定性試験のために、溶解度の場合に得られた上清の一定分量を２５℃または４０℃で７日間保存した。その時間経過の後、サンプルを４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を、ＨＰＬＣ−ＵＶを用いて分析した。
【０２６８】
残存ペプチドの量の測定のために、ｔ０およびｔ７における標的化合物のピーク面積を比較し、以下の式に従って「残存ペプチド％」を得た。
残存ペプチド％＝［（ペプチドピーク面積  ｔ７）×１００］／ペプチドピーク面積  ｔ０
【０２６９】
可溶性分解生成物の量は、ｔ０において観測されたピーク面積の合計により引かれたすべての観測された不純物からのピーク面積の合計の比較（すなわち、新たに形成されたペプチドに関連した種の量を決定するため）から計算した。この値は、以下の式に従って、ｔ０におけるペプチドの初期の量に対するパーセントで示した。
可溶性分解生成物％＝｛［（不純物のピーク面積の合計  ｔ７）−（不純物のピーク面積の合計  ｔ０）］×１００｝／ペプチドピーク面積  ｔ０
【０２７０】
１００％と「残存ペプチド％」および「可溶性分解生成物％」の合計との可能な差は、以下の式に従って、ストレス条件で可溶性の状態に留まっていなかったペプチドの量を反映している。
沈殿物％＝１００−（［残存ペプチド％］＋［可溶性分解生成物％］）
【０２７１】
この沈殿物は、遠心分離によって分析から除外された、不溶性分解生成物、ポリマーおよび／またはフィブリルを含む。
【０２７２】
化学的安定性は、「残存ペプチド％」として表される。
【０２７３】
アニオンクロマトグラフィー
機器：Ｄｉｏｎｅｘ  ＩＣＳ−２０００、プレ／カラム：Ｉｏｎ  Ｐａｃ  ＡＧ−１８  ２×５０ｍｍ（Ｄｉｏｎｅｘ）／ＡＳ１８  ２×２５０ｍｍ（Ｄｉｏｎｅｘ）、溶出液：水性水酸化ナトリウム、流量：０．３８ｍＬ／分、勾配：０〜６分：２２ｍＭ  ＫＯＨ、６〜１２分：２２〜２８ｍＭ  ＫＯＨ、１２〜１５分：２８〜５０ｍＭ  ＫＯＨ、１５〜２０分：２２ｍＭ  ＫＯＨ、サプレッサー：ＡＳＲＳ  ３００  ２ｍｍ、検出：伝導度
【０２７４】
ＧＬＰ−１受容体およびグルカゴン受容体に対する効能に関するｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞アッセイ
配列番号５および６のペプチド化合物を、国際公開第２０１４０５６号に記載される方法に従って製造した。ＧＬＰ−１およびグルカゴン受容体におけるペプチド化合物の効力は、ヒトグルカゴン受容体（ｈＧｌｕｃａｇｏｎ  Ｒ）またはヒトＧＬＰ−１受容体（ｈＧＬＰ−１  Ｒ）を発現する細胞を列挙した漸増濃度の化合物に曝露し、形成されたｃＡＭＰを測定することによって決定した。受容体に対するペプチドのアゴニズムは、ヒトＧＩＰ、ＧＬＰ−１またはグルカゴン受容体を安定に発現するＨＥＫ−２９３細胞株のｃＡＭＰ応答を測定する機能アッセイにより決定された。
【０２７５】
細胞のｃＡＭＰ含量は、ＨＴＲＦ（均一時間分解蛍光）に基づくＣｉｓｂｉｏ  Ｃｏｒｐ．製のキット（カタログ番号６２ＡＭ４ＰＥＣ）を用いて測定した。準備のために、細胞をＴ１７５培養フラスコに分割して入れ、培地（ＤＭＥＭ／１０％  ＦＢＳ）中でほぼコンフルエントの状態に終夜増殖させた。次いで培地を除去し、細胞をカルシウムおよびマグネシウム不含有ＰＢＳで洗浄した後、ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号Ａ６９６４）を用いてプロテイナーゼ処理した。剥離細胞を洗浄し、アッセイ緩衝液（１×ＨＢＳＳ；２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．１％  ＢＳＡ、２ｍＭ  ＩＢＭＸ）に再懸濁し、細胞密度を測定した。次いでそれらを４０００００細胞／ｍｌに希釈し、２５μｌずつを９６ウエルプレートのウエルに分注した。測定のために、アッセイ緩衝液中試験化合物２５μｌをウエルに加えた後、室温で３０分間インキュベートした。溶解緩衝液（キット成分）で希釈したＨＴＲＦ試薬を添加した後、プレートを１時間インキュベートし、その後、６６５／６２０ｎｍにおける蛍光比を測定した。アゴニストのｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力は、最大応答の５０％の活性化を引き起こした濃度（ＥＣ５０）を測定することにより定量化した。
【０２７６】
ヒドロゲル分析方法
ヒアルロン酸ヒドロゲル中のマレイミド含量の推定
ＨＡヒドロゲルに取り込まれたマレイミド基の推定は、比色分析法により実施した。５−チオ２−ニトロ安息香酸は、ｐＨ７．５のＰＢＳ緩衝液中トリス−（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）による５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）の還元により調製した。２０ｍｏｌ％過剰の５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）を用いて、ＴＣＥＰとの副反応を防いだ。所定の量のマレイミド官能基化ヒドロゲルをｐＨ３．５の２０ｍＭコハク酸緩衝生理食塩水（ＳＢＳ）に懸濁した。上記の５−チオ２−ニトロ安息香酸溶液をヒドロゲル懸濁液に加え、反応混合物をボルテックス混合し（２×１０秒）、その後、２５℃で４５分間緩やかに撹拌した。その後、懸濁液を２５℃で１０分間遠心分離し、上清の一定分量を採取した。上清の吸光度を４１２ｎｍで測定した。溶液中の５−チオ２−ニトロ安息香酸の濃度を、校正曲線を用いて推定した。ヒドロゲル中のマレイミド濃度は、加えた５−チオ２−ニトロ安息香酸の量と上清中に存在するその量との差から計算される、反応したチオールのモル数に相当する。
【０２７７】
ヒドロゲルペプチドコンジュゲートにおけるペプチド担持量の推定の手順
所定の量のＨＡヒドロゲルペプチドコンジュゲートをＣＨＥＳ緩衝液（ｐＨ９．５）に懸濁し、懸濁液を７０℃で緩やかに撹拌した。懸濁液を遠心分離し、一定分量をＨＰＬＣ法によりペプチド含量について分析した。ＨＰＬＣ法は、Ａｇｉｌｅｎｔ１１００ＬＣを用いてｑＣ−１８Ｋｉｎｅｔｉｃｓカラム（内径＝４．６ｍｍおよび長さ＝１００ｍｍ、粒径２．６μｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を用いることを含む。移動相Ａの組成は、９０％水／１０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）であり、移動相Ｂは、１０％アセトニトリル／９０％水／０．０９％ＴＦＡである。勾配は、８分で移動相２５％Ｂ〜５５％Ｂである。流量は、１ｍＬ／分を維持した。純ペプチドを標準として用いて、ヒドロゲルから放出されたペプチドを定量した。
【０２７８】
１Ｈ−ＮＭＲ（核磁気共鳴）による定量分析
ＨＡ−ヒドロゲルコンジュゲートの特性決定に、固体または（ゲル）ＭＡＳ（マジック角回転）プロトンＮＭＲを用いた。一バージョンでは、得られるＮＭＲスペクトルの線形を増強するためにサンプルをＤ２Ｏで適宜膨潤させ、ＺｒＯ２（二酸化ジルコニウム）ローターに加えた。マジック角（５４．７°）条件下でサンプルを高回転（４〜１３ＫＨｚ）速度で回転させることができる４００ＭＨｚ磁石に取り付けられたＭＡＳプローブにローターを入れた。線形を顕著に狭めることで、以下を推定するのに有用なＮＭＲスペクトル取得につながる。
−  架橋の程度（ｐ．ｅ．ＤＶＳ）
−  ヒドロゲル官能基化の程度（ｐ．ｅ．マレイミド）
−  ＨＡヒドロゲルのペプチド担持量
−  ポリマー主鎖に結合していない遊離ペプチドの量
−  残留遊離低分子、例えば溶媒または試薬の決定
−  コンジュゲート純度の決定
【０２７９】
実験の一バージョンでは、広帯域等核デカップリングＴ２スピン−スピン緩和フィルターを用いて、ヒアルロン酸主鎖共鳴のブロードなシグナルを抑制した。
【０２８０】
実験の一バージョンでは、拡散整列ＮＭＲ（ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ｏｒｄｅｒｅｄ  ＮＭＲ）実験を用いて、ポリマーに結合していない低分子またはペプチド成分を抑制した。最大ＭＡＳ速度で、最大８００ｍｓのＤＯＳＹ混合時間を用いた。ＤＯＳＹフィルターにより、ポリマー主鎖に対する置換基の化学的置換を直接証明することが可能となった。実験はすべて、ＨＡバイオコンジュゲートを化学的に分解させることなしに、直接、膨潤した条件での天然の状態で実施された。
【０２８１】
分析の一バージョンでは、拡散およびＴ２スピン−スピン緩和フィルターをハイブリッド実験において組み合わせ、１）ポリマー主鎖に対する置換基の連結性、２）そのＴ２緩和速度による複合スピン系の編集を確立した。
【０２８２】
ＮＭＲ用のＨＡコンジュゲートのサンプル調製
保存溶液：
正確な量のマレイン酸５〜１０ｍｇを秤量して５ｍＬフラスコに入れ、２，２，２−トリフルオロエタノール−ｄ３  １．５ｍＬを加えた。次いでＤ２Ｏでフラスコを５ｍＬに満たした。この混合物を、後の凍結乾燥ＨＡ物質の膨潤のための保存溶液として用いた。
【０２８３】
ＨＡコンジュゲートゲルの調製：
正確な量のＨＡコンジュゲート３〜５ｍｇを秤量してＥｐｐｅｎｄｏｒｆ−Ｃａｐに入れ、保存溶液１５０μＬを加えた。ゲル形成が開始される前にＥｐｐｅｎｄｏｒｆ−Ｃａｐをボルテクサーで振盪した。ゲルを室温に終夜維持した。次いでゲルをＨＲ−ＭＡＳ−ローターに入れた。固体ＮＭＲ分光計において、プロトン共鳴の４００．１３ＭＨｚに対応する９．３９Ｔでローターを測定した。双極子間相互作用を低下させるため、ローターをマジック角約５４．７°に調節し、１０ＫＨｚで回転させた。プロトンスペクトルを待ち時間（Ｒｅｃｙｃｌｅ  Ｄｅｌａｙ）２５秒および２０４８スキャンで記録した。
【０２８４】
評価：
データを記録した後、ＦＩＤ（自由誘導減衰）に窓乗算（ｗｉｎｄｏｗ  ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ）およびフーリエ変換を行った。スペクトルを位相補正し、シグナル積分前にベースライン補正ルーチンをスペクトルに適用した。７．５〜約７ｐｐｍの芳香族官能基のプロトンシグナルを積分し、ペプチドの芳香族プロトンの対応する数に計算した。同じことを内部標準のマレイン酸シグナルについて行った。ペプチド担持量の推定のため、両値を比にした。コンジュゲートのその他の構造上の構成については、表２に示されるプロトンシグナルを用いた。
【０２８５】
【表２】
2020503278.tif 000054
【０２８６】
図２は、配列番号５のペプチドのＨＡ−ヒドロゲル−Ａｉｂ−リンカーコンジュゲートの一般的な１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【実施例】
【０２８７】
実施例１
配列番号５を有するＡｉｂ−リンカー−ペプチドコンジュゲートの合成
Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ  Ｒｉｎｋ−Ａｍｉｄｅ樹脂（４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）−フェノキシアセトアミド−ノルロイシルアミノメチル樹脂）、１００〜２００メッシュ、担持量０．３４ｍｍｏｌ／ｇで、固相合成法を行った。ＨＢＴＵ／ＤＩＰＥＡによる活性化を用いてＦｍｏｃ合成法を適用した。固相合成法プロトコールにおいて、１４位にはＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｍｔ）−ＯＨ、１位にはＦｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨを用いた。次いでＦｍｏｃ−Ａｉｂ−ＯＨを結合させた。
【０２８８】
次いで、ジクロロメタン中１％ＴＦＡによる繰り返し（８×）処理によりＭｍｔ基を樹脂上のペプチドから切断した。次いで樹脂をジクロロメタン中３％ＤＩＰＥＡで３×処理し、次いでジクロロメタンで３×、その後ＤＭＦで３×洗浄した。その後、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルＰａｌｍ−Ｇｌｕ（γОＳｕ）−ＯｔＢｕ（ＤＭＦ中３当量）を遊離したアミノ基と結合させ、その後Ｆｍｏｃ切断を行った。
【０２８９】
Ｆｍｏｃ切断後、リンカー試薬５ｃを結合させた（ＤＭＦ中２当量）。
【０２９０】
Ｋｉｎｇのカクテル（Ｄ．Ｓ．Ｋｉｎｇ、Ｃ．Ｇ．Ｆｉｅｌｄｓ、Ｇ．Ｂ．Ｆｉｅｌｄｓ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．３６巻、１９９０年、２５５〜２６６頁）により、ペプチドを樹脂から切断した。粗生成物を、アセトニトリル／水勾配（両方が０．１％ＴＦＡで緩衝された）を用いてＷａｔｅｒｓカラム（Ｓｕｎｆｉｒｅ、Ｐｒｅｐ  Ｃ１８）で分取ＨＰＬＣにより精製した。
【０２９１】
最後に、精製されたペプチドの分子質量をＬＣ−ＭＳにより確認した。
【０２９２】
実施例２
配列番号５を用いてのＡｓｎ−リンカー−ペプチドコンジュゲートの合成
方法に記載されるように、Ｒｉｎｋ−Ａｍｉｄｅ樹脂（４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）−フェノキシアセトアミド−ノルロイシルアミノメチル樹脂）で固相合成法を行った。ＨＢＴＵ／ＤＩＰＥＡによる活性化を用いてＦｍｏｃ合成法を適用した。固相合成法プロトコールにおいて、１４位にはＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（ｉｖＤｄｅ）−ＯＨ、１位にはＦｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨを用いた。
【０２９３】
リンカーの結合：標準的なプロトコールを用いるＮ末端Ｆｍｏｃ基の切断後、ＤＭＦ（ペプチド１ｍｍｏｌ当たり５０ｍｌ）中で２．５当量７ｅ、３当量ＰｙＢＯＰ、および３当量ＤＩＰＥＡを混合した。１５分後、樹脂結合ペプチドを加え、周囲温度で１６時間、緩やかな振盪下で混合物を反応させた。次いで溶媒を濾過により除去し、その後濾液をＤＭＦ、ＤＣＭ、イソプロパノールおよびジエチルエーテルにより洗浄した。
【０２９４】
リシンアシル化および切断：文献（Ｓ．Ｒ．Ｃｈｈａｂｒａら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３９巻、（１９９８年）、１６０３頁）に従って、ｉｖＤｄｅ基を樹脂上のペプチドから切断した。その後、塩基としてＤＩＰＥＡを用いて、Ｐａｌｍ−ｇＧｌｕ−ＯＳｕを遊離したアミノ基と結合させた。Ｋｉｎｇのカクテル（Ｄ．Ｓ．Ｋｉｎｇ、Ｃ．Ｇ．Ｆｉｅｌｄｓ、Ｇ．Ｂ．Ｆｉｅｌｄｓ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．３６巻、１９９０年、２５５〜２６６頁）により、ペプチドを樹脂から切断した。粗生成物を、アセトニトリル／水勾配（両方が０．１％ＴＦＡで緩衝された）を用いてＷａｔｅｒｓカラム（ＸＢｒｉｄｇｅ、ＢＥＨ１３０、Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ５μＭ）で分取ＨＰＬＣにより精製した。精製されたペプチド−リンカーコンジュゲートを、ＬＣＭＳ（方法Ａ）、分子イオンピーク、ｍ／ｚ１１８９、ｚ＝４により分析した。
【０２９５】
実施例３
リンカー試薬５ｃの合成
リンカー試薬５ｃは、以下のスキームに従って合成した。
【化５１】
2020503278.tif 000055
【０２９６】
リンカー試薬中間体５ａの合成：
塩化ｍ−メトキシトリチル（３ｇ、９．７１ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２０ｍＬ）に溶解し、ＤＣＭ（２０ｍＬ）中エチレンジアミン（６．５ｍＬ、９７．１ｍｍｏｌ）の溶液に１滴ずつ加えた。２時間後に溶液をジエチルエーテル（３００ｍＬ）中に注加し、３０／１（容積／容積）ブライン／０．１Ｍ  ＮａＯＨ溶液（各５０ｍｌ）で３回、ブライン（５０ｍｌ）で１回洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、揮発性物質を減圧下で除去した。Ｍｍｔ保護中間体（３．１８ｇ、９．５６ｍｍｏｌ）をさらなる精製を行わずに次の工程に用いた。
【０２９７】
Ｍｍｔ保護中間体（３．１８ｇ、９．５６ｍｍｏｌ）を無水ＤＣＭ（３０ｍＬ）に溶解した。６−（Ｓ−トリチルメルカプト）ヘキサン酸（４．４８ｇ、１１．４７ｍｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（５．６７ｇ、１１．４７ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（５．０ｍＬ、２８．６８ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で３０分間撹拌した。溶液をジエチルエーテル（２５０ｍＬ）で希釈し、３０／１（容積／容積）ブライン／０．１Ｍ  ＮａＯＨ溶液（各５０ｍｌ）で３回、ブライン（５０ｍｌ）で１回洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、揮発性物質を減圧下で除去した。５ａをフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。
収量：５．６９ｇ（８．０９ｍｍｏｌ）
ＭＳ：ｍ／ｚ７０５．４＝［Ｍ＋Ｈ］＋（計算ＭＷ＝７０５．０）
【０２９８】
リンカー試薬中間体５ｂの合成：
無水ＴＨＦ（５０ｍＬ）中５ａ（３．１９ｇ、４．５３ｍｍｏｌ）の溶液にＢＨ３・ＴＨＦ（１Ｍ溶液、８．５ｍＬ、８．５ｍｍｏｌ）を加え、溶液を室温で１６時間撹拌した。さらなるＢＨ３・ＴＨＦ（１Ｍ溶液、１４ｍＬ、１４ｍｍｏｌ）を加え、室温で１６時間撹拌した。メタノール（８．５ｍＬ）の添加により反応を停止させた。Ｎ，Ｎ−ジメチル−エチレンジアミン（３ｍＬ、２７．２ｍｍｏｌ）を加え、溶液を加熱還流し、３時間撹拌した。反応混合物を室温に冷却し、次いで酢酸エチル（３００ｍＬ）で希釈し、飽和Ｎａ２ＣＯ３水溶液（２×１００ｍＬ）および飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２×１００ｍＬ）で洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、揮発性物質を減圧下で除去して、粗アミン中間体（３．２２ｇ）を得た。
【０２９９】
アミン中間体（３．２２ｇ）をＤＣＭ（５ｍＬ）に溶解した。Ｂｏｃ２Ｏ（２．９７ｇ、１３．６９ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（５ｍＬ）に溶解し、ＤＩＰＥＡ（３．９５ｍＬ、２２．６５ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で３０分間撹拌した。混合物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、粗ＢｏｃおよびＭｍｔ保護中間体（３．００ｇ）を得た。
ＭＳ：ｍ／ｚ７９１．４＝［Ｍ＋Ｈ］＋、５１９．３＝［Ｍ−Ｍｍｔ＋Ｈ］＋（計
算ＭＷ＝７９１．１）
【０３００】
０．４Ｍ水性ＨＣｌ（４８ｍＬ）をアセトニトリル（４５ｍＬ）中ＢｏｃおよびＭｍｔ保護中間体の溶液に加えた。混合物をアセトニトリル（１０ｍＬ）で希釈し、室温で１時間撹拌した。その後、５Ｍ  ＮａＯＨ溶液の添加により反応混合物のｐＨ値を５．５に調整した。アセトニトリルを減圧下で除去し、水溶液をＤＣＭ（４×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、揮発性物質を減圧下で除去した。粗５ｂをさらなる精製を行わずに次の工程に用いた。
収量：２．５２ｇ（３．１９ｍｍｏｌ）
ＭＳ：ｍ／ｚ５１９．３＝［Ｍ＋Ｈ］＋（計算ＭＷ＝５１９．８ｇ／ｍｏｌ）
【０３０１】
リンカー試薬５ｃの合成：
中間体５ｂ（９８５ｍｇ、１．９ｍｍｏｌ）およびクロロギ酸ｐ−ニトロフェニル（３３０ｍｇ、２．５ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（１０ｍＬ）に溶解した。ＤＩＰＥＡ（０．６５３ｍＬ、３．７ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で２時間撹拌した。溶液を酢酸（１ｍＬ）の添加により酸性化した。５ｃをＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。
収量：７７６ｍｇ、（１．１３ｍｍｏｌ）
ＭＳ  ｍ／ｚ７０６．３＝［Ｍ＋Ｎａ］＋（計算ＭＷ＝７０６．３）
【０３０２】
実施例４
リンカー試薬７ｆの合成（Ａｓｎリンカー）
リンカー試薬７ｆは、以下のスキームに従って合成した。
【化５２】
2020503278.tif 000056
【０３０３】
ＭｅＯＨ（１０ｍＬ）および酢酸（０．５ｍＬ）中Ｎ−メチル−Ｎ−ｂｏｃ−エチレンジアミン（０．５ｍＬ、２．７９ｍｍｏｌ）およびＮａＣＮＢＨ３（１４０ｍｇ、２．２３ｍｍｏｌ）の冷却（０℃）溶液にＥｔＯＨ（１０ｍＬ）中２，４，６−トリメトキシベンズアルデヒド（０．５４７ｍｇ、２．７９ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。混合物を室温で２時間撹拌し、２Ｍ  ＨＣｌ（１ｍＬ）で酸性化し、飽和水性Ｎａ２ＣＯ３（５０ｍＬ）で中和した。すべての揮発性物質の蒸発、得られた水性スラリーのＤＣＭ抽出および有機画分の濃縮により、Ｎ−メチル−Ｎ−ｂｏｃ−Ｎ’−ｔｍｏｂ−エチレンジアミン（７ａ）が粗油として得られ、これをＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。
収量：５９３ｍｇ（１．５２ｍｍｏｌ）
ＭＳ：ｍ／ｚ３７７．３５＝［Ｍ＋Ｎａ］＋、（計算＝３７７．１４）
【０３０４】
Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｎ−Ｍｅ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（２２５ｍｇ、０．５２９ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（３ｍＬ）に溶解し、７ａ（３００ｍｇ、０．８４７ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（２０１ｍｇ、０．５２９ｍｍｏｌ）およびコリジン（０．４８ｍＬ、３．７０ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で２時間撹拌し、７ｂを得た。ｆｍｏｃ脱保護のためにピペリジン（０．２２ｍＬ、２．１６ｍｍｏｌ）を加え、撹拌を１時間続けた。酢酸（１ｍＬ）を加え、７ｃをＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。
収量：２８５ｍｇ（ＴＦＡ塩として０．４３６ｍｍｏｌ）
ＭＳ：ｍ／ｚ５６２．５４＝［Ｍ＋Ｎａ］＋、（計算＝５６２．６７）
【０３０５】
６−トリチルメルカプトヘキサン酸（０．８４７ｇ、２．１７ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（７ｍＬ）に溶解した。ＨＡＴＵ（０．８２５ｇ、２．１７ｍｍｏｌ）およびコリジン（０．８ｍＬ、６．１ｍｍｏｌ）ならびに７ｃ（０．７８ｇ、１．４４ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で６０分間撹拌し、ＡｃＯＨ（１ｍＬ）で酸性化し、ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。生成物画分を飽和水性ＮａＨＣＯ３で中和し、濃縮した。残存水相をＤＣＭで抽出し、溶媒の蒸発により７ｄを単離した。
収量：１．４ｇ（９４％）
ＭＳ：ｍ／ｚ９３４．７＝［Ｍ＋Ｎａ］＋、（計算＝９３４．５）
【０３０６】
ＭｅＯＨ（１２ｍＬ）およびＨ２Ｏ（２ｍＬ）中７ｄ（１．４０ｍｇ、１．５３ｍｍｏｌ）の溶液にＬｉＯＨ（２５０ｍｇ、１０．４ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を７０℃で１４時間撹拌した。混合物をＡｃＯＨ（０．８ｍＬ）で酸性化し、７ｅをＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。生成物画分を飽和水性ＮａＨＣＯ３で中和し、濃縮した。水相をＤＣＭで抽出し、溶媒の蒸発により７ｅを単離した。
収量：７８０ｍｇ（６０％）
ＭＳ：ｍ／ｚ８７８．８＝［Ｍ＋Ｎａ］＋、（計算＝８７８．４０）
【０３０７】
無水ＤＣＭ（４ｍＬ）中７ｅ（１７０ｍｇ、０．１９８ｍｍｏｌ）の溶液にＤＣＣ（１２３ｍｇ、０．５９ｍｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキシ−スクシンイミド（１１４ｍｇ、０．９９ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で１時間撹拌した。混合物を濾過し、濾液をＡｃＯＨ  ０．５ｍＬで酸性化し、７ｆをＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。生成物画分を飽和水性ＮａＨＣＯ３で中和し、濃縮した。残存水相をＤＣＭで抽出し、溶媒の蒸発により７ｆを単離した。
収量：１５４ｍｇ（０．１６１ｍｍｏｌ）
ＭＳ：ｍ／ｚ９５３．４＝［Ｍ＋Ｈ］＋、（計算＝９５３．４３）
【０３０８】
実施例５
リンカー試薬８ｅの合成
リンカー試薬８ｅは、以下のスキームに従って合成した。
【化５３】
2020503278.tif 000057
【０３０９】
リンカー試薬中間体８ｂの合成は、窒素雰囲気下で実施した。ＴＨＦ  ３０ｍＬ（乾燥、ｍｏｌ．ｓｉｅｖｅ）中アミン８ａ（１．６９ｇ、４．５ｍｍｏｌ、調製については国際公開第２００９／１３３１３７号を参照）の溶液を０℃に冷却した。ＴＨＦ  ３ｍＬ（乾燥、ｍｏｌ．ｓｉｅｖｅ）中クロロギ酸ブチル（６３０μｌ、４．９５ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（９８０μｌ、５．６３ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を０℃で１０分間撹拌し、冷却を除去し、混合物を室温でさらに２０分間撹拌した。ＴＨＦ中１Ｍ  ＬｉＡｌＨ４（９ｍＬ、９ｍｍｏｌ）を加え、混合物を１．５時間還流した。メタノール（１１ｍＬ）および１００ｍＬの飽和酒石酸Ｎａ／Ｋ溶液を徐々に加えることによって反応を停止させた。混合物を酢酸エチルで抽出し、有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、溶媒を減圧下で蒸発した。粗生成物８ｂ（１．９７ｇ）をさらなる精製を行わずに次の工程に用いた。
ＭＳ：ｍ／ｚ３９０．２＝［Ｍ＋Ｈ］＋（計算ＭＷ＝３８９．６）
【０３１０】
アセトニトリル１２０ｍＬ中粗生成物８ｂ（１．９７ｇ）、Ｎ−（ブロモエチル）−フタルイミド（１．４３ｇ、５．６３ｍｍｏｌ）およびＫ２ＣＯ３（１．２４ｇ、９．０ｍｍｏｌ）の溶液を６時間還流した。飽和ＮａＨＣＯ３溶液６０ｍＬを加え、混合物を酢酸エチルで３回抽出した。合わせた有機物を乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、溶媒を減圧下で除去した。ヘプタン（０．０２％ＮＥｔ３を含む）および漸増量の酢酸エチル（０．０２％ＮＥｔ３を含む）を溶出液として用いることによってフタルイミド８ｃをシリカ上で精製した。
収量：０．８２ｇ（１．４６ｍｍｏｌ）
ＭＳ：ｍ／ｚ５６３．３＝［Ｍ＋Ｈ］＋（計算ＭＷ＝５６２．８）
【０３１１】
フタルイミド８ｃ（８１９ｍｇ、１．４６ｍｍｏｌ）をエタノール３５ｍＬに溶解し、ヒドラジン水和物（１７６μｌ、３．６４ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を３時間還流した。沈殿物を濾別した。溶媒を減圧下で除去し、残留物をジクロロメタン１５ｍＬで処理した。沈殿物を濾別し、ジクロロメタンを減圧下で除去した。残留物をＲＰ  ＨＰＬＣにより精製した。プールしたＨＰＬＣ画分をＮａＨＣＯ３の添加によりｐＨ７に調整し、ジクロロメタンで数回抽出した。合わせた有機物を乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、溶媒を減圧下で除去して、アミン８ｄを得た。
収量：５７９ｍｇ（１．３４ｍｍｏｌ）
ＭＳ：ｍ／ｚ４３３．３＝［Ｍ＋Ｈ］＋（計算ＭＷ＝４３２．７）
【０３１２】
クロロギ酸ｐ−ニトロフェニル（４８３ｍｇ、２．４０ｍｍｏｌ）をジクロロメタン１０ｍＬ（乾燥、ｍｏｌ．ｓｉｅｖｅ）に溶解した。ジクロロメタン５ｍＬ（乾燥、ｍｏｌ．ｓｉｅｖｅ）中アミン８ｄ（１．００ｇ、２．３１ｍｍｏｌ）の溶液およびｓｙｍ−コリジン１．８ｍＬを加え、混合物を室温で４０分間撹拌した。ジクロロメタンを減圧下で除去し、残留物を酢酸で酸性化し、ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製して、ｐ−ニトロフェニルカルバメート８ｅを得た。
収量：３３９ｍｇ（０．５７ｍｍｏｌ）
ＭＳ：ｍ／ｚ５９８．３＝［Ｍ＋Ｈ］＋（計算ＭＷ＝５９７．８）
【０３１３】
実施例６
ＧＬＰ−１受容体およびグルカゴン受容体に対する効能に関するｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞アッセイ
配列番号５および６のペプチド化合物を、国際公開第２０１４０５６号に記載される方法に従って製造した。ＧＬＰ−１およびグルカゴン受容体におけるペプチド化合物の効力は、上述の方法により、ヒトグルカゴン受容体（ｈＧｌｕｃａｇｏｎ  Ｒ）またはヒトＧＬＰ−１受容体（ｈＧＬＰ−１  Ｒ）を発現する細胞を曝露して決定した。
【０３１４】
結果を以下の表３に示す。
【０３１５】
【表３】
2020503278.tif 000058
【０３１６】
ヒアルロン酸ヒドロゲルの合成
実施例７
ジビニルスルホン架橋ヒアルロン酸
実施例７ａ
０．２Ｍ水酸化ナトリウム（１６８．９ｇ）に溶解するまで撹拌しながら塩化ナトリウム（２３．４ｇ）を加えた。２時間続けた迅速な機械的撹拌下の溶液にヒアルロン酸ナトリウム（２５．４ｇ、４００〜５００ｋＤａ）を加えた。得られたポリマー溶液は、約１２重量／重量％の濃度を有する。イソプロパノール（１．６ｍＬ）中ジビニルスルホン（０．４１ｍＬ、０．４８ｇ）の溶液を調製し、約３０秒にわたって加えた（５×０．４ｍＬ）。混合物をさらに２分間撹拌し、２３×２８×６．５ｃｍガラストレー中に注加し、プラスチックカバーで密封した。室温で４時間放置した後、ゲルを一片として０．９％食塩水（３ｋｇ）中１Ｍ塩酸（１００．１ｇ）の溶液に移した。それを室温で緩やかに撹拌した。２４時間後に溶液のｐＨは、２．２８であった。溶液を捨て、ゲル（４１６．２ｇ）を残した。次いでゲルに０．９％食塩水（３ｋｇ）を加え、それを室温で１８時間緩やかに撹拌した。混合物に０、２、４、６および８時間目に１Ｍ水酸化ナトリウム（９．７ｍＬ）を加えた。ゲルを室温でさらに２４時間緩やかに撹拌し、ゲルのその時点のｐＨは、６．６５であった。ゲルを２〜８℃で１２０時間保存し、次いで１０ｍＭリン酸ナトリウム溶液ｐＨ７．４（２Ｌ）を加えた。ゲルをさらに２１時間撹拌し、洗浄液を捨てて、２．４％の最終ポリマー濃度を有するゲル（１０３６．２ｇ）を残した。
【０３１７】
実施例７ｂ
ジビニルスルホン架橋ヒアルロン酸の代替合成
ヒアルロン酸ナトリウム３５ｇに滅菌水９４６ｍＬを加えた。反応混合物を２〜８℃に７日間保持し、その間に透明溶液が形成された。この溶液に１．０Ｍ水酸化ナトリウム溶液１１１ｍＬを加え、得られた反応混合物を５分間激しく撹拌した。反応混合物を２〜８℃に９０分間保持した。その後、滅菌水１０ｍＬ中ジビニルスルホン６．７ｍＬの懸濁液をポリマー溶液に加え、得られた反応混合物を５分間激しく撹拌した。その後、反応混合物を２〜８℃で１５０分間、その後、２５℃で９０分間保存した。そのように形成されたポリマーゲルを０．９％滅菌食塩水で４日間洗浄した。懸濁液のｐＨを１．０Ｍ  ＮａＯＨまたは１．０Ｍ  ＨＣｌのいずれかで７．０に調整した。ゲル懸濁液の最終濃度は、０．５８％であった。
【０３１８】
実施例８
１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ３−（３−マレイミドプロピル）アミノプロパンの合成
【化５４】
2020503278.tif 000059
２５０ｍｌ丸底フラスコに１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ３−アミノプロパン）３．０ｇおよび無水クロロホルム１００ｍＬを入れた。反応混合物を透明な溶液が形成されるまで２５℃で撹拌した。この溶液に溶解するまで撹拌しながらＮ−スクシンイミジル３−マレイミドプロピオネート（５．０５ｇ）を、その後、ジイソプロピルエチルアミン３．４２ｍＬを加えた。得られた反応混合物を２５℃で１８時間撹拌した。溶液を１Ｍ塩酸（５０ｍＬ）、１０％ブライン（５０ｍＬ）、飽和重炭酸ナトリウム（５０ｍＬ）、半飽和ブライン（５０ｍＬ）で洗浄した。有機相を単離し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥した。濾過により硫酸ナトリウムを除去した後、溶液を減圧下で濃縮し、残留物を、酢酸エチル：ヘキサン勾配を移動相として用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。減圧下での溶媒の除去の後の真空乾燥により、所望の生成物を灰色がかった白色固体として得た（４．０３ｇ）。
【０３１９】
実施例９
１−アミノ３−（３−マレイミドプロピル）アミノプロパンメチルスルホネートの合成
【化５５】
2020503278.tif 000060
１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ３−アミノプロパン）０．２５ｍｏｌ（８０ｇ）をアセトン４００ｍＬに溶解した。メタンスルホン酸３５ｍＬ（２．１９当量）を３５℃で気体形成が終了するまで（１．５時間）１滴ずつ加えた。
【０３２０】
室温まで冷却した後、生成物をアセトン（３×５０ｍＬ）で洗浄し、４０℃および２０ｍｂａｒで乾燥させた。
【０３２１】
アセトン２００ｍＬにより５６℃で１時間処理することにより、粗生成物を精製した。４０℃で濾過した後、生成物をアセトン（３×５０ｍＬ）で洗浄し、４０℃および２０ｍｂａｒで乾燥させた（収量：赤みがかった固体７６．２ｇ、９６％）。
【０３２２】
実施例１０
３−（３−マレイミド−プロピル）アミノプロパン官能基化ＨＡヒドロゲルの合成の一般的方法
適切な量のジビニスルホン架橋ＨＡ懸濁液（実施例１１ｂ）に滅菌生理食塩水を加えて、約１重量／容積％のゲル濃度を得た。得られた懸濁液を２５℃で１５〜３０分間撹拌した。水混和性有機溶媒（好ましくはエタノール）を懸濁液に加え、得られた懸濁液をさらに３０〜６０分間撹拌した。この懸濁液に適切な量の４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチル−モルホリニウムクロリド（ＤＭＴ−ＭＭ）のエタノール溶液を加えた。ＤＭＴ−ＭＭ溶液を含む容器をエタノールで２回すすぎ、洗液を上記の懸濁液に加えた。得られた反応混合物を２５℃で９０分間撹拌した。適切な量の１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ３−（３−マレイミドプロピル）アミノプロパンをジクロロメタンに溶解した。この溶液にトリフルオロ酢酸を加えて、１：１（容積／容積）を得た。室温で６０〜９０分間撹拌した後、反応混合物を減圧下で蒸発乾固した。残留物をエタノールに溶解し、上記の懸濁液に加えた。マレイミド誘導体を含む容器をエタノールで２回すすぎ、洗液を懸濁液に加えた。懸濁液のｐＨを有機または無機塩基（例えば、エタノール中１０％Ｎ−メチルモルホリン）を用いてｐＨ６．４〜６．６に調整した。２５℃で１６〜２０時間撹拌した後、懸濁液を６０〜６５容積／容積％までエタノールで処理した。１２０Ｇでの遠心分離の後に上清をデカントすることにより、またはＮ２ガスのわずかな過圧を系にかけ、ガラスフリットもしくはフィルター膜を介して濾過することにより、溶媒を反応混合物から除去した。その後、残留物をｐＨ３．８の滅菌済み２０ｍＭコハク酸生理食塩水（０．９％）で約１５〜２０分間処理し、６０〜６５容積／容積％の容積までエタノールを加えることによって沈殿させた。上記の手順に従うことによって溶媒を反応混合物から除去した。この手順をもう１回繰り返した。
【０３２３】
実施例１１
マレイミド官能基化ＨＡヒドロゲルへのリンカーチオールペプチドのコンジュゲーション
マレイミド官能基化ＨＡヒドロゲルに対するチオール末端トレースリンカー保有ペプチドでの一般的手順
中多孔質フリットまたはフィルターを備えた滅菌済みおよび発熱性物質除去処理済み反応器に適切な量のマレイミド修飾ＨＡヒドロゲル（実施例１０）を入れた。その後、適切な量の濾過滅菌済み２０ｍＭоｌ  ＳＢ緩衝液（１５容積／容積％プロピレングリコールおよび０．０１重量／容積％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ３．８を含む）を、得られる懸濁液の濃度が約１重量／重量％となるように反応に加えた。懸濁液を緩やかに振盪しながら３０〜９０分間混合した。この時間の終了時に、濾過滅菌済み２０ｍＭоｌ  ＳＢ緩衝液（１５容積／容積％プロピレングリコールおよび０．０１重量／容積％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ３．８を含む）に溶解した適切な量のチオール末端トレースリンカー保有ペプチドを反応器に加え、得られた反応混合物を周囲温度で１．５〜２４時間緩やかに振盪した。反応の終了時に、窒素のわずかな過剰な圧力を用いた濾過によりまたは懸濁液の遠心分離により上清を除去した。残留物を、濾過滅菌済み２０ｍＭ  ＳＢＳ緩衝液（１５容積／容積％プロピレングリコールおよび０．０１重量／容積％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ３．０を含む）で処理して、０．７重量／容積％懸濁液を調製し、３分間振盪し、遠心分離し、デカントにより上清を除去した。このプロセスを５回繰り返した。残留物を、濾過滅菌済み２０ｍＭ  ＳＢＳ緩衝液（１５容積／容積％プロピレングリコールおよび０．０１重量／容積％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ３．０を含む）に溶解した１−ヒドロキシ−２−メルカプトエタンの１０ｍＭ溶液で処理して、約１重量％の懸濁液を調製し、緩やかな振盪／混合により３０分間緩やかに撹拌した。上述のように遠心分離とそれに続くデカントによって溶媒を除去した。１−ヒドロキシ−２−メルカプトエタン処理のこのプロセスを４回繰り返した。残留物を濾過滅菌済み２０ｍＭ  ＳＢＳ緩衝液（１５容積／容積％プロピレングリコールおよび０．０１重量／容積％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ３．０を含む）に懸濁して、約０．５重量％の濃度の懸濁液を調製し、３分間混合した後、遠心分離およびデカントにより除去した。得られた残留物を２０ｍＭ  ＳＢＳ緩衝液（１５容積／容積％プロピレングリコールおよび０．０１重量／容積％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ６．５を含む）に懸濁して、０．７重量％の懸濁液を調製し、２０分間撹拌し、濾過した。このプロセスをもう１回繰り返した後、残留物を、２０ｍＭ  ＳＢＳ緩衝液（１５容積／容積％プロピレングリコールおよび０．０１重量／容積％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ４．５を含む）に懸濁して、０．５重量％の懸濁液を調製し、１５分間撹拌し、濾過した。このプロセスを１回繰り返した。残留物を滅菌水（ｐＨ４．５）に懸濁し、５分間撹拌し、濾過した。このプロセスを５回繰り返した。残留物を滅菌済み膜フィルターを用いて無菌的に濾過し、凍結乾燥した。
【０３２４】
実施例１２
ＨＡ−Ａｉｂ−リンカー−ペプチド配列番号５コンジュゲートの代替合成
ジビニルスルホン架橋Ｈａヒドロゲル懸濁液（乾燥質量０．９２ｇ（０．００２２９ｍｏｌ））４０ｇに０．９％ＮａＣｌ水溶液１００ｍｌを加え、得られた懸濁液を２５℃で１０分間撹拌し、０．９％ＮａＣｌ  ２０ｍｌとともに反応器に移した。７０ｍＬを濾別した。
【０３２５】
エタノール５０ｍｌを懸濁液に加えた後、それをさらに３０分間撹拌した。それに続いて、エタノール１５ｍＬ中４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチル−モルホリニウム（ＤＭＴ−ＭＭ）クロリド０．６３ｇ（０．００２２９ｍｏｌ、１当量）溶液を加え、１時間３０分間撹拌した。
【０３２６】
これに続いて、０．９％ＮａＣｌ  ５ｍＬ中１−アミノ３−（３−マレイミドプロピル）アミノプロパン−メチルスルホネート０．１５ｇ（０．０００４６ｍｏｌ、０．２当量）溶液を加えた。エタノール１０ｍＬを加え、エタノール中１０％Ｎ−メチルモルホリンを用いてｐＨを６〜６．５に調整し、終夜撹拌した。
【０３２７】
懸濁液を濾別し、緩衝液ｐＨ３．８中７０％エタノール５０ｍＬで２×洗浄した。次いで、緩衝液ｐＨ３．８中５０％エタノール５０ｍＬ、次いで緩衝液ｐＨ３．８中２０％エタノール５０ｍＬ、次いで緩衝液ｐＨ３．８（２０ｍＭ乳酸、０．９％ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０、ＮａＯＨでｐＨ調整）５０ｍＬで洗浄した。次いで緩衝液ｐＨ３．８  ５０ｍＬを加えた。
【０３２８】
緩衝液ｐＨ３．８（２０ｍＭ乳酸、０．９％ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０、ＮａＯＨでｐＨ調整）１５ｍＬ中、配列番号５を有するＡｉｂ−リンカー−ペプチドコンジュゲート（実施例１）１０８ｍｇ（０．０１当量、０．０２ｍｍｏｌ）の溶液を反応器に加えた。コンジュゲート溶液を有するフラスコを緩衝液ｐＨ３．８  ５ｍＬで２×すすぎ、反応器に加えた。懸濁液を終夜撹拌した。
【０３２９】
反応器中の懸濁液を濾別し、緩衝液ｐＨ３．８  ５０ｍＬで５×洗浄した。
【０３３０】
残留物を、濾過滅菌済み２０ｍＭ  ＳＢＳ緩衝液（１５容積／容積％プロピレングリコールおよび０．０１重量／容積％  Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ３．８を含む）に溶解した１−ヒドロキシ−２−メルカプトエタンの１０ｍＭ溶液５０ｍＬで処理し、１、撹拌した。次いで濾過滅菌済み２０ｍＭ  ＳＢＳ緩衝液（１５容積／容積％プロピレングリコールおよび０．０１重量／容積％  Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ３．８を含む）中０．２Ｍ乳酸５０ｍＬを加え、２５分間撹拌した。濾過後、残留物を０．９％ＮａＣｌ  ｐＨ４．５（０．１Ｎ  ＨＣｌ）５０ｍＬで５×洗浄した。
【０３３１】
緩衝液ｐＨ４．５（０．１Ｎ  ＨＣｌ）７０ｍＬで残留物を反応器から除去し、反応器を緩衝液ｐＨ４．５（０．１Ｎ  ＨＣｌ）２０ｍＬですすぎ、２画分を統合および凍結乾燥した。
【０３３２】
ペプチド含量を１Ｈ−ＮＭＲにより決定し、表４で２バッチについて示した。
【０３３３】
【表４】
2020503278.tif 000061
【０３３４】
同様に様々なペプチド含量でバッチを製造した：
【０３３５】
【表５】
2020503278.tif 000062
【０３３６】
実施例１３
可溶性マレイミド官能基化ＨＡの合成
１００ｍＬフラスコにヒアルロン酸ナトリウム塩（分子量＝５００ｋＤａ）２００ｍｇおよびＤＩ水２４ｍＬを入れた。透明溶液が得られるまでそれを撹拌した。迅速撹拌ＨＡ溶液にエタノール１６ｍＬ、その後、水／エタノール中４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（５５ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）およびＮ−メチルモルホリン（２０μｌ、０．２ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を１時間撹拌した。次いで、１−（２−（２−アミノエトキシ）エチル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン・トリフルオロ酢酸塩（６０ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）の水溶液を加え、得られた反応混合物を１４時間撹拌した。反応物のｐＨをわずかに酸性に調整した。反応混合物を、あらかじめ洗浄したＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＣＧ−１２０樹脂（Ｎａ＋型）１５ｍｌで処理し、得られた反応混合物を２０分間撹拌した。樹脂を濾別し、脱イオン水で洗浄した。合わせた濾液を、あらかじめ洗浄したＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＣＧ−１２０樹脂（Ｎａ＋型）１５ｍｌで再び処理し、上記の手順に従った。Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）樹脂処理をもう１回繰り返した。濾液を水で希釈して、＜２０％エタノールを含む水性溶液を形成した。４つのＰＡＬＬ  Ｍａｃｒｏｓｅｐ（登録商標）遠心分離装置３０ｋＤａ分子量カットオフを用いて、速度５０００ｒｐｍで１５分間溶液を遠心濾過した。膜は、その上にスパチュラを緩やかになでつけ、密閉装置を激しく振盪することによって毎回清掃した。保持液を脱イオン水（＞２００ｍｌ）で数回洗浄した。得られた濃縮物を合わせ、凍結乾燥し、５０〜７５％の範囲の収量で灰色がかった白色固体を得た。１ＮＭＲ分光法により推定されるマレイミド組込みの程度は約２０モル％であることが見いだされた。
【０３３７】
実施例１４
ＨＡヒドロゲルのｉｎ  ｖｉｖｏ滞留時間の決定
皮下腔におけるｉｎ  ｖｉｖｏでのヒドロゲルの滞留時間を、ＣＥＳＴ（化学交換飽和移動）技術（ＺｉｈｌらＭａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ  Ｍｅｄ  ２０１１、６５巻（４）９２７〜９４８頁）と組み合わせた磁気共鳴撮像法（ＭＲＩ）により検討した。ヒドロゲルの内部の水プロトンコントラストの強度を用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏでのヒドロゲルの滞留時間を評価した。この目的のために、Ｃ５７Ｂマウスを動物４匹の群２つにおいて用いた。Ａｉｂ−リンカーを有するＨＡコンジュゲートペプチド配列番号５の溶液（可溶性）または懸濁液（ジビニルスルホン架橋ヒドロゲル）のいずれかを動物に注射した。投与されたサンプルは薬物物質ＨＡ誘導体を１〜３重量％含んでいた。すべての承認済み動物管理プロトコールに従って３１Ｇ針を用いてヒドロゲルを注射した。
【０３３８】
ヒドロゲル植込み後７７日間にわたって、７Ｔ−ＢＲＵＫＥＲスキャナーで、７２ｍｍボリュームコイルを用いて少なくとも７〜９回、マウスを連続的に撮像した。各時点で、スピンエコーパルスシーケンス（ＲＡＲＥ：ＴＲ／ＴＥ＝３３００／３３ｍｓ、ＮＥＸ＝２）を用いて、分解能０．１７×０．１７×１ｍｍ３および１０〜１５スライスで、脂肪抑制を行ったＴ２Ｗ画像の軸方向スタックを得て、ヒドロゲルスキャホールド全体をとらえた。Ｃｈｅｓｈｉｒｅ（Ｖ４．４．５、ＰＡＲＥＸＥＬ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）およびＡＭＩＲＡ  Ｖ６．０．１（ＦＥＩ、Ｈｉｌｌｓｂｏｒｏ、ＯＲ、ＵＳＡ）を用いて容量分析を実施し、ヒドロゲル容積を計算した。以下のパラメータで各群から動物を再選択することについて、ＣＥＳＴシーケンスを実施した：スライス厚１ｍｍ、ＦＯＶ＝４．５×４．５ｃｍ、マトリックス＝１２８×９６、ＲＡＲＥファクター＝１６、ＴＲ／ＴＥ＝３０００／３３ｍｓ、ＭＴモジュールＢ１＝１０μＴ／０．３ｓ（−６〜＋６ｐｐｍ、０．１７ｐｐｍステップ）。ＣＥＳＴの前に、Ｂ０シミングおよび水の線幅の評価のため、ヒドロゲル領域周囲に局所分光スキャンを行った。非対称プロット（ＣＥＳＴ_ａｓｙｍ）を用いて、ｚ−スペクトルにおける非対称の程度を評価した。ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、ＵＳＡ）およびＭＳ  Ｅｘｃｅｌを用いてデータ処理を実施した。試験終結（９０日目）の際に、各群の代表的なサンプルについて組織病理学診断を実施した。
【０３３９】
注射部位のＭＲＩ撮像を、１週間にわたり毎日行い、次いで１２にわたり毎週１回測定した。一方の群にジビニル架橋ＨＡヒドロゲルを注射し、他の群にヒドロゲルおよび２，５００，０００Ｄａ可溶性ＨＡの１：１（重量／重量）混合物を含む懸濁液を用いた。架橋ＨＡ純ヒドロゲルで処理された動物の場合、ゲルは、時間の関数として徐々にしかしゆっくりと強度を喪失しながら、試験（３カ月）終了を超えて認められた（図１ｂ）。他方で、可溶性ＨＡを含む高分子量混合物で処理された動物については、１日目に強かったＭＲシグナルは、４日目に著しく低下した（図１ｃ）。この観察は、長く持続する治療有用性をもたらすようにポリマー担体の滞留時間を改善するためには、非常に高い分子量を達成するためにＨＡポリマーが架橋形態で提示される必要があることを示唆するものである。
【０３４０】
図１ａ：高分子量（２５０万Ｄａ）ヒアルロナン（ＨＡ）のｉｎ  ｖｉｖｏ分解プロファイルおよび分解速度論。
植え込まれたＨＡをＭＲＩ技術によりモニターした。標準的（上側）およびＣＥＳＴ（下側）撮像技術の両方により得られた代表的なＭＲＩ画像。
【０３４１】
図１ｂ：ジビニルスルホン架橋ヒアルロナンのｉｎ  ｖｉｖｏ分解プロファイルおよび分解速度論。１ｐｐｍでのピーク大きさをプロットすることにより分解速度論を決定した。
【０３４２】
図１ｃ：高分子量（２５０万Ｄａ）ヒアルロナン（ＨＡ）のｉｎ  ｖｉｖｏ分解プロファイルおよび分解速度論。
１ｐｐｍでのピーク大きさをプロットすることにより分解速度論を決定した。
【０３４３】
実施例１５
ｉｎ  ｖｉｔｏでの放出速度論
配列番号５のペプチドを有するＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストＡｉｂ−リンカーヒドロゲル（０．５ｍｇ  ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニスト）の一定分量を、フィルターフリットを取り付け、ｐＨ７．４リン酸緩衝液（６０ｍＭ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０）で５回洗浄した注射器に移した。ヒドロゲルを同じ緩衝液に懸濁し、３７℃でインキュベートした。規定の時点（１〜７日間の各インキュベーション時間の後）に上清を交換し、放出されたＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストをＲＰ−ＨＰＬＣにより２１５ｎｍで定量した。放出されたＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストに相関するＵＶシグナルを積分し、インキュベーション時間に対してプロットした。
曲線当てはめソフトウエアを適用して、放出の対応する半減期を推定した。
【０３４４】
図３は、ＨＡヒドロゲルからのＡｉｂ−リンカーを有する配列番号５を有するペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの放出速度論を示す。
【０３４５】
実施例１６
給餌された、雄糖尿病ｄｂ／ｄｂマウスにおける血糖に対する、配列番号５の皮下処理後の効果
雄糖尿病肥満ＢＫＳ．ＣＧ−ｍ＋／＋Ｌｅｐｒ（ｄｂ）／ＪマウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒから取り寄せ、受領すると群で木くずの寝床とともに収容した。試験開始時、マウスは約１３〜１４週齢であった。
【０３４６】
１２時間明／暗周期（明期午前０６：００〜午後６：００）、２３〜２６℃の間の室温および３０〜７０％の間の相対湿度を含む動物施設条件下でマウスを収容した。すべての動物に水およびげっ歯類維持食（Ｓｓｎｉｆｆ  Ｒ／Ｍ−Ｈ）を自由に摂取させた。
【０３４７】
投与７日前に、体重およびＨｂＡ１ｃ測定を実施した。その後動物を処理群（ｎ＝８）および新たなケージに、ｄｂ／ｄｂ群の間で平均ＨｂＡ１ｃおよび体重に適合するように割り当てた。投与期の１日目に、非架橋ＨＡを有する配列番号５  ２５ｎｍｏｌ／ｋｇのｓ．ｃ．注射（２７Ｇ針）で１回、動物を処理した。投与を午前０８：３０〜０９：３０の間に開始および完了した。適用された容積は５ｍｌ／ｋｇであり、用量は各個体の最新の体重記録に調節した。
【０３４８】
実験中、動物に水および餌を制限なく摂取させた。投与期の１日目に、処理前および処理４時間後に血糖濃度を測定した。その後、毎日午前８：３０〜９：３０の間に血糖濃度を評価した。この目的のために、血液約２μＬを尾から採取し、血糖濃度を携帯式装置（Ａｃｃｕ  Ｃｈｅｋ）を用いて測定した。
【０３４９】
データは図４に平均値±ＳＥＭで示す。非架橋ＨＡを含む配列番号５  ２５ｎｍｏｌ／ｋｇによる１回のｓ．ｃ．処理で、血糖濃度の一時的な低下が生じ、動物は投与後７日目にほぼベースライン濃度に到達した。
【０３５０】
実施例１７
雌食事誘導性肥満（ＤＩＯ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける血糖、体重、全身脂肪含量、および餌消費に対する、皮下処理後の効果
雌Ｃ５７ＢＬ／６ＮＨｓｄマウスを、Ｅｎｖｉｇｏ  ＲＭＳ  Ｉｎｃ．から群で収容された状態で取り寄せ、群で収容された状態で輸送し、投与前期３８日目まで木くずの寝床を有する使い捨てシューボックスケージにおいて、輸送されたケージ仲間とともに群で収容された状態のままにした。試験開始時、マウスは２５〜２６週齢であった。
【０３５１】
１２時間明／暗周期（明期午前０４：００〜午後４：００）、２１〜２５℃の間の室温および３０〜７０％の間の相対湿度を含む動物施設条件下でマウスを収容した。薬理学的介入（投与期）前の１６週間、すべての動物に水および食事（ＤＩＯ：７５−ＴＤ９７３６６、Ｌｅａｎ：１０−Ｈａｒｌａｎ２０１４）を自由に摂取させた。投与前期３８日目まで毎週、かつ投与前期３８日目を最後に、餌を新しい餌と交換した。その後の投与期中は、残りの餌の一部を除去し、新しい餌と交換し、週１回ペレットを均一に混合した。
【０３５２】
投与前３８日目に、肥満ＤＩＯマウスを処理群（ｎ＝８）に、すべてのＤＩＯ群の間で平均体重に適合するように割り当てた。げっ歯類維持食を自由に摂取させた、年齢を適合させた群を、痩せ型対照群として試験に含めた。
【０３５３】
１日目は朝に、８、１５、および２２日目は午後１：００〜３：００の間に、３０Ｇ針を用いて、配列番号５  ０．８８ｍｇ／ｋｇ＊週の架橋ヒアルロン酸をｓ．ｃ．注射することによりマウスを処理した。適用された容積は動物当たり３００μｌであり、各週で別の注射部位を用いた（１回目注射：左肩甲骨、２回目注射：右肩甲骨、３回目注射：左側腹部、４回目注射：右側腹部）。
【０３５４】
投与期の２８日間を通して、毎日午後０１：００〜０３：００の間に体重および餌消費（１つのケージに収容されたマウス４匹の群について推定）を測定した。
【０３５５】
統計分析では、Ｓｉｇｍａｐｌｏｔ１２．５を用いて一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を実施した。実施された検定の検出力はアルファ＝０．０５０：０．９９９であり、ＤＩＯ−媒体群に対する比較をＤｕｎｎｅｔｔ法により実施した。痩せ型−媒体群データを、非肥満状態についての参照データセットとして使用した。
【０３５６】
配列番号５の第１の用量により、第２の用量が投与された８日目まで続く、顕著かつ持続する体重減少効果が引き出された。その後の３回の配列番号５の投与により、体重減少が維持された（図５Ａ左パネル）。２８日目まで、および４回の投与後、配列番号５で処理されたマウスの平均体重は約１３．６ｇであり、ＤＩＯ−媒体群の平均体重を統計的に著しく下回った（図５Ａ右パネル）。第１の用量の投与後の最初の急な体重減少は、顕著な餌消費の阻害に関連していた。８日以内に、配列番号５で処理されたマウスは餌消費が正常となり、それ以降はＤＩＯ−媒体群と同等の値を示した（図５Ｂ）。
【０３５７】
実施例１８
雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける薬物動態
雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス３０匹を本試験に使用した。全試験期間を通して動物に飼料および水を自由に摂取させた。ＨＡ−Ａｉｂ−リンカー−配列番号５の懸濁液４．５ｍｇ／ｋｇを動物に投与した。２、８、２４、４８、７２、１４４、１９２、２４０、３１２および３３６時間で血漿サンプルを採取した。ペプチドについてサンプルを分析した。定量結果はすべて、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより決定した。平均濃度の計算では、定量化の下限（ＬＬＯＱ＝血漿中１ｎｇ／ｍＬ）を下回る値をゼロに設定した。プログラムＷｉｎＮｏｎｌｉｎ６．４により、ノンコンパートメントモデルおよび線形台形補間計算を用いて薬物動態パラメータを計算した。
【０３５８】
図６：ＨＡ−Ａｉｂ−リンカー−コンジュゲート４．５ｍｇ／ｋｇを雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスに１回皮下投与した後の、配列番号５のペプチドの血漿濃度および薬物動態パラメータ。
【０３５９】
皮下投与後、血漿での半減期は、非常に長い約７日であった。
【０３６０】
実施例１９
雌Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎミニブタにおける薬物動態
平均体重３５０００ｇの、雌糖尿病Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎミニブタ４匹を本試験に使用した。全試験期間を通して動物に飼料および水を自由に摂取させた。ＨＡ−Ａｉｂ−リンカー−配列番号５の１６．０５％懸濁液０．６２３ｍｇ／ｋｇを動物に投与した。０、１、４、８、２４、４８時間、および３〜２１日目は１日１回同じ時間に血漿サンプルを採取した。ペプチドについてサンプルを分析した。定量結果はすべて、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより決定した。平均濃度の計算では、定量化の下限（ＬＬＯＱ＝血漿中１ｎｇ／ｍＬ）を下回る値をゼロに設定した。プログラムＷｉｎＮｏｎｌｉｎ６．４により、ノンコンパートメントモデルおよび線形台形補間計算を用いて薬物動態パラメータを計算した。図７は、１回の投与後の、時間に対する血漿濃度値を示す。
【０３６１】
平均血漿薬物動態パラメータは以下である：
【０３６２】
【表６】
2020503278.tif 000063
【０３６３】
皮下投与後、血漿での半減期は、非常に長い５．８日にあたる約１３９時間であった。
【０３６４】
図７：ＨＡ−Ａｉｂ−リンカー−コンジュゲートとしての懸濁液（１６．０５％）０．６２３ｍｇ／ｋｇを雌Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎミニブタに１回皮下投与した後の、配列番号５のペプチドの血漿濃度および薬物動態パラメータ。
【０３６５】
実施例２０
注射可能性試験
２０ｍｇ／ｍＬ  ＨＡ−ペプチドコンジュゲートの懸濁液（１）を適切な量のペプチドコンジュゲートをｐＨ４．５の２０ｍＭ酢酸緩衝液に分散させることによって注射器内で調製した。他の注射器において、天然ＨＡの２０ｍｇ／ｍＬ溶液（２）を、凍結乾燥ＨＡをｐＨ４．５の２０ｍＭ酢酸緩衝液に溶解することによって調製した。４：１の比で、連結具を介して（１）を（２）と混合し、得られた懸濁液（３）を２〜８℃で終夜保存した。（３）を室温に調節し、次いで注射可能性実験に使用した。１ｍＬ  ＢＤプラスチックルアーロック注射器では、２７Ｇ×１／２”または２９Ｇ×１／２”針を注射器に連結した。ＰＦＳ実験の場合、（３）を手作業で注射器に真空充填した。（３）を含む注射器をＬＦ  Ｐｌｕｓ装置の注射器ホルダーに装着した。異なる注射器について注射速度を１ｍＬ／１０秒に調節した。２つの異なる化合物（ＨＡコンジュゲート配列番号５、Ａｉｂリンカー）についての結果を表６に示す。
【０３６６】
【表７】
2020503278.tif 000064
【０３６７】
実施例２１
給餌された、雄糖尿病ｄｂ／ｄｂマウスにおける血糖に対する、配列番号５の皮下処理後の効果  −  純ペプチド配列番号５の、配列番号５の架橋ＨＡコンジュゲート（バッチＣ）との比較
雄糖尿病肥満ＢＫＳ．ＣＧ−ｍ＋／＋Ｌｅｐｒ（ｄｂ）／ＪマウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒから取り寄せ、受領すると群で木くずの寝床とともに収容した。試験開始時、マウスは約１３〜１４週齢であった。
【０３６８】
１２時間明／暗周期（明期午前０６：００〜午後６：００）、２３〜２６℃の間の室温および３０〜７０％の間の相対湿度を含む動物施設条件下でマウスを収容した。すべての動物に水およびげっ歯類維持食（Ｓｓｎｉｆｆ  Ｒ／Ｍ−Ｈ）を自由に摂取させた。
【０３６９】
投与７日前に、体重およびＨｂＡ１ｃ測定を実施した。その後動物を処理群（ｎ＝８）および新たなケージに、ｄｂ／ｄｂ群の間で平均ＨｂＡ１ｃおよび体重に適合するように割り当てた。
【０３７０】
投与間隔は以下であった：
ペプチド配列番号５：投与期の０日目に、１．７ｎｍｏｌ／ｋｇのｓ．ｃ．注射（２７Ｇ針）で動物を処理した。投与を午前０８：３０〜０９：３０の間に開始および完了し、１３日目まで毎日繰り返した。
配列番号５の架橋ＨＡコンジュゲート：投与期の０日目に、５０ｎｍｏｌ／ｋｇのｓ．ｃ．注射（２７Ｇ針）で１回動物を処理した。
【０３７１】
実験中、動物に水および餌を制限なく摂取させた。投与期の１日目に、処理前および処理４時間後に血糖濃度を測定した。その後、毎日午前８：３０〜９：３０の間に血糖濃度を評価した。この目的のために、血液約２μＬを尾から採取し、血糖濃度を携帯式装置（Ａｃｃｕ  Ｃｈｅｋ）を用いて測定した。
【０３７２】
データは図８に平均値±ＳＥＭで示す。
【０３７３】
配列番号５の架橋ＨＡコンジュゲート５０ｎｍｏｌ／ｋｇによる１回のｓ．ｃ．処理では、８日を超えて血糖濃度の強い低下、その後濃度上昇が生じた。
【０３７４】
配列番号５の純ペプチド１．７ｎｍｏｌ／ｋｇによる１日１回ｓ．ｃ．処理では、動物が投与されている限り、１３日目まで血糖濃度の強い低下が生じた。
【０３７５】
両処理における血糖低下レベルは、８日を超えて同等であった。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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