(57)【要約】  タバコ葉の表面上に存在する所望の多環式化合物のレベルを測定するための方法であって、（ａ）タバコ葉の表面上に存在する所望の多環式化合物の約１０ｗｔ．％以下がタバコ葉の表面から除去されるように、非極性溶媒を少なくとも含む溶媒でタバコ葉の表面を洗浄するステップと；（ｂ）ステップ（ａ）から溶媒を回収するステップと；（ｃ）回収した溶媒を蛍光分光法に供して、所望の多環式化合物のレベルを測定するステップとを含む、方法が提供される。
2020512526.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タバコ葉の表面上に存在する所望の多環式化合物のレベルを測定するための方法であって、
（ａ）前記タバコ葉の前記表面上に存在する前記所望の多環式化合物の約１０ｗｔ．％以下が前記タバコ葉の前記表面から除去されるように、非極性溶媒を少なくとも含む溶媒で前記タバコ葉の前記表面を洗浄するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）から前記溶媒を回収するステップと、
（ｃ）回収した前記溶媒を蛍光分光法に供して、前記所望の多環式化合物の前記レベルを測定するステップと
を含む、前記方法。
【請求項２】
所望の多環式化合物が、芳香族多環式化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
所望の多環式化合物が、ピレンである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ピレンが、ベンゾピレンである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ベンゾピレンが、ベンゾ（アルファ）ピレンである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
溶媒が、ヘキサンである、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
タバコ葉の表面上に存在する所望の多環式化合物の約０．０１〜約１０ｗｔ．％が、前記タバコ葉の前記表面から除去される、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
タバコ葉の表面上に存在する所望の多環式化合物の約２〜約８ｗｔ．％が、前記タバコ葉の前記表面から除去される、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
タバコ葉の表面上に存在する所望の多環式化合物の約４〜約６ｗｔ．％が、前記タバコ葉の前記表面から除去される、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
蛍光分光法に供された回収した溶媒が、約５ｐｇ／ｍＬ〜約５００ｐｇ／ｍＬの量の所望の多環式化合物を含有する、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
蛍光分光法に供された回収した溶媒が、タバコ葉１ｇ当たり約５ｎｇ〜タバコ葉１ｇ当たり約５００ｎｇの量の所望の多環式化合物を含有する、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
タバコ葉を洗浄するために使用される溶媒の量が、タバコ葉１ｇ当たり約１０〜約５０ｍｌの溶媒である、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
タバコ葉を洗浄するために使用される溶媒の量が、タバコ葉１ｇ当たり約２０〜約４０ｍｌの溶媒である、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ｂ）において、タバコ葉が、溶媒により、約１０分未満の間にわたって洗浄される、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
ステップ（ｂ）において、タバコ葉が、溶媒により、約０．５〜約５分の間にわたって洗浄される、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
ステップ（ｂ）において、タバコ葉が、約１０〜約３０℃の温度で洗浄される、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
ステップ（ｂ）において、タバコ葉が、大気圧で洗浄される、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
蛍光分光法が、回収した溶媒のスペクトルにおいて少なくとも第１のピーク及び第２のピークを同定するステップを含み、前記第１のピークが、所望の多環式化合物の第１の特異的な発光波長に対応し、前記第２のピークが、前記所望の多環式化合物の第２の特異的な発光波長に対応する、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
第１のピークが、３１０〜３７０ｎｍの範囲内の波長を持つ発光である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
第２のピークが、３８５〜４２５ｎｍの範囲内の波長を持つ発光である、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
蛍光比を取得するために、第１のピーク及び第２のピークの強度を互いに対して比較するステップを含む、請求項１８、１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
タバコ葉の表面上における所望の多環式化合物のレベルを測定するために、蛍光比を予め定められた蛍光比と比較するステップを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
溶媒中に存在する所望の多環式化合物のレベルを測定するためのデバイスであって、
（ａ）前記所望の多環式化合物を含有する前記溶媒のための容器と、
（ｂ）前記所望の多環式化合物の蛍光を起こすための励起源と、
（ｃ）蛍光を測定するためのセンサーと、
（ｄ）
（ｉ）回収した前記溶媒の発光スペクトルにおいて少なくとも第１のピーク及び第２のピークを同定し、前記第１のピークが、前記所望の多環式化合物の第１の特異的な発光波長に対応し、前記第２のピークが、前記所望の多環式化合物の第２の特異的な発光波長に対応し、
（ii）蛍光比を取得するために、２つの前記ピークの強度を互いに対して比較し、
（iii）前記所望の多環式化合物の前記レベルを測定するために、前記蛍光比を予め定められた蛍光比と比較する
ように操作可能なプロセッサーと
を備える、前記デバイス。
【請求項２４】
実施例を参照して本明細書において実質的に定義される通りの方法。
【請求項２５】
実施例を参照して本明細書において実質的に定義される通りのデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、タバコ中における所望の多環式化合物のレベルを測定するための方法及びそれを測定するためのデバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
多環式化合物、例として多環芳香族炭化水素（ＰＡＨ，polycyclic aromatic hydrocarbon）は、タバコにおいて自然発生しないが、硬化（例えば、煙道硬化タバコにおいて）及び／又は輸送中にタバコに移行する場合があり、並びにタバコからの煙草の煙に移行する場合がある、公知の発癌性物質である。
【０００３】
したがって、タバコ葉中におけるＰＡＨ及び他の毒物のレベルを測定することが重要である。硬化タバコ中におけるＰＡＨのレベルは、タバコ葉品質を評価するために使用される１つの基準である。ガスクロマトグラフィー−質量分析法（ＧＣ／ＭＳ，Gas chromatography-mass spectrometry）は、タバコ葉中におけるＰＡＨのレベルを測定するための業界標準試験である。しかしながら、ＧＣ／ＭＳは、複雑なプロセスであり、資源集約的であり、故に、比較的高価である。さらに、ＧＣ／ＭＳは、タバコ試料を最初に野外又は使用の現場（例えば）から試験をするための実験室まで移送しなくてはならないため、試験にかかる時間の長さを増大させ得る実験室においてのみ行うことができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
一部の実施形態において、本発明は、タバコ葉の表面上における所望の多環式化合物のレベルを測定するための、改良された方法及び改良されたデバイスを提供することを求める。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の態様は、添付の請求項において定義される。
【０００６】
本明細書において記述されている一部の実施形態に従い、タバコ葉の表面上に存在する所望の多環式化合物のレベルを測定するための方法であって、
（ａ）タバコ葉の表面を溶媒で洗浄し、溶媒が、タバコ葉の表面上に存在する所望の多環式化合物の約１０ｗｔ．％以下がタバコ葉の表面から除去されるような非極性溶媒を少なくとも含むステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）から溶媒を回収するステップと、
（ｃ）回収した溶媒を蛍光分光法に供して、所望の多環式化合物のレベルを測定するステップと
を含む、方法が提供される。
【０００７】
本明細書において記述されている一部の実施形態に従い、溶媒中に存在する所望の多環式化合物のレベルを測定するためのデバイスであって、
（ａ）所望の多環式化合物を含有する溶媒のための容器と、
（ｂ）所望の多環式化合物の蛍光を起こすための励起源と、
（ｃ）蛍光を測定するためのセンサーと、
（ｄ）
（ｉ）回収した溶媒の発光スペクトルにおいて少なくとも第１のピーク及び第２のピークを同定し、第１のピークが、所望の多環式化合物の第１の特異的な発光波長に対応し、第２のピークが、所望の多環式化合物の第２の特異的な発光波長に対応し、
（ii）蛍光比を取得するために、少なくとも２つのピークの強度を互いに対して比較し、
（iii）所望の多環式化合物のレベルを測定するために、蛍光比を予め定められた蛍光比と比較する
ように操作可能なプロセッサーと
を備える、デバイスが提供される。
【０００８】
本発明者らは、驚くべきことに、本明細書において記述されている方法を実行して、タバコ葉の表面上における所望の多環式化合物のレベルを、比較的短い時間枠で首尾よく測定し得ることを見出した。換言すれば、本明細書において記述されている方法は、既知の方法よりも短い時間尺度で試験の結果を提供するために、比較的迅速に実行され得ることが見出された。本明細書において記述されている方法は、小規模で、及び、例えば、タバコ葉の表面上における多環式化合物のレベルがインサイチュで（すなわち、例えば、野外において、硬化部屋で、緑葉脱穀（ＧＬＴ，Green Leaf Threshing）環境において、品質管理実験室で、購入地点で、葉の販売地で、サプライチェーン全体の品質管理において、又は喫煙物品の生産現場で）実行され得るようなポータブルデバイス、例としてハンドヘルドデバイスを使用して、実行することができることも見出された。
【０００９】
参照を容易にするために、本発明のこれら及びさらなる態様を、ここで、適切な節見出し下で論じる。しかしながら、各節下での教示は、各特定の節に必ずしも限定されるとは限らない。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
本発明の実施形態を、ほんの一例として、添付の図面を参照して記述する。
【図１】ベンゾ［ａ］ピレンの吸光度スペクトルを示す図である。
【図２】メタノールに溶解されたベンゾ［ａ］ピレンについての励起−発光マトリックスを示す図である。
【図３】ヘキサンに溶解されたベンゾ［ａ］ピレンについての励起−発光マトリックスを示す図である。
【図４】２５５ｎｍの固定励起波長での励起−発光マトリックスから抽出された、メタノール及びヘキサン中における蛍光発光スペクトルの比較を示す図である。
【図５】異なる葉領域の低ベンゾ［ａ］ピレンレベルタバコ葉試料の４回繰り返しによる直接的な葉分析のための励起−発光マトリックスを示す図である。
【図６】異なる葉領域の中ベンゾ［ａ］ピレンレベルタバコ葉試料の３回繰り返しによる直接的な葉分析のための励起−発光マトリックスを示す図である。
【図７】異なる葉領域の高ベンゾ［ａ］ピレンレベルタバコ葉試料の４回繰り返しによる直接的な葉分析のための励起−発光マトリックスを示す図である。
【図８】高レベルベンゾ［ａ］ピレンタバコ葉に関する、ブランク（左上）、３０秒（右上）、６０秒（左下）及び１８０秒（右下）メタノール葉洗浄試料についての励起−発光マトリックスを示す図である。
【図９ａ】ヘキサン中で３００秒間にわたって洗浄された高レベルのベンゾ［ａ］ピレンを有するタバコ葉試料についての励起−発光マトリックスを示す図である。
【図９ｂ】メタノール中で６０秒間にわたって洗浄された高レベルのベンゾ［ａ］ピレンを有するタバコ葉試料についての励起−発光マトリックスを示す図である。
【図１０】ヘキサン溶媒中のみでの３０秒（左上）、６０秒（右上）、１８０秒（左下）及び３００秒（右下）洗浄についてのブランク励起−発光マトリックスを示す図である。
【図１１】ヘキサン中で、３０秒（最上段）、６０秒（第２段）、１８０秒（第３段）及び３００秒（最下段）の間にわたって洗浄された低レベルのベンゾ［ａ］ピレンを有するタバコ葉試料についての励起−発光マトリックスを示す図である。
【図１２】ヘキサン中で、３０秒（最上段）、６０秒（第２段）、１８０秒（第３段）及び３００秒（最下段）の間にわたって洗浄された高レベルのベンゾ［ａ］ピレンを有するタバコ葉試料についての励起−発光マトリックスを示す図である。
【図１３】２５５ｎｍの固定励起波長での励起−発光マトリックスから抽出された、低レベルのベンゾ［ａ］ピレンに関するヘキサン葉洗浄試料についての発光スペクトルを示す図である。
【図１４】２５５ｎｍの固定励起波長での励起−発光マトリックスから抽出された、高レベルのベンゾ［ａ］ピレンに関するヘキサン葉洗浄試料についての発光スペクトルを示す図である。
【図１５】種々の濃度のベンゾ［ａ］ピレンにおける、１０ｎｍ（±５ｎｍ）のバンドパスがある３３０ｎｍの発光ピークでのヘキサン葉洗浄試料についての平均蛍光を示す図である。
【図１６】種々の濃度のベンゾ［ａ］ピレンにおける、１０ｎｍ（±５ｎｍ）のバンドパスがある４００ｎｍの発光ピークでのヘキサン葉洗浄試料についての平均蛍光を示す図である。
【図１７】種々の濃度のベンゾ［ａ］ピレンにおけるヘキサン葉洗浄試料についての平均蛍光比（４００／３３０ｎｍ）を示す図である。
【図１８】１８０秒の間にわたってヘキサン中で洗浄された２つの校正タバコ葉試料についての励起−発光マトリックスを示す図であり、ここで、試料は、低レベルのベンゾ［ａ］ピレンをそれぞれ有する。
【図１９】１８０秒の間にわたってヘキサン中で洗浄された２つの校正タバコ葉試料についての励起−発光マトリックスを示す図であり、ここで、試料は、中レベルのベンゾ［ａ］ピレンをそれぞれ有する。
【図２０】１８０秒の間にわたってヘキサン中で洗浄された２つの校正タバコ葉試料についての励起−発光マトリックスを示す図であり、ここで、試料は、高レベルのベンゾ［ａ］ピレンをそれぞれ有する。
【図２１】２５５ｎｍの固定励起波長での励起−発光マトリックスから抽出された、６つの校正ヘキサン葉洗浄試料についての発光スペクトルを示す図である。
【図２２】種々の濃度のベンゾ［ａ］ピレンにおける６つの校正ヘキサン葉洗浄試料についての平均蛍光比（４００／３３０ｎｍ）を示す図である。
【図２３】種々の濃度のベンゾ［ａ］ピレンにおける６つの校正ヘキサン葉洗浄試料についての平均蛍光比（４００／３３０ｎｍ）の拡大プロットを、実施例１の２つのヘキサン葉洗浄試料と一緒に示す図である。
【図２４】低、中及び高ベンゾ［ａ］ピレン含有量についてヘキサン葉洗浄含有量からのデータ点を含むベンゾ［ａ］ピレン波長に対する蛍光応答を示す図である。
【図２５】低、中及び高ベンゾ［ａ］ピレン含有量についてヘキサン葉洗浄含有量からのデータ点を含むバックグラウンド蛍光応答を示す図である。
【図２６】低、中及び高ベンゾ［ａ］ピレン含有量についてヘキサン葉洗浄含有量からのデータ点を含むクロロフィル波長に対する蛍光応答を示す図である。
【図２７ａ】盲検タバコ葉試料１〜６についての励起−発光マトリックスを示す図である。
【図２７ｂ】盲検タバコ葉試料７〜１２についての励起−発光マトリックスを示す図である。
【図２７ｃ】盲検タバコ葉試料１３〜１８についての励起−発光マトリックスを示す図である。
【図２８】種々の濃度のベンゾ［ａ］ピレンにおける各盲検タバコ葉試料についての平均蛍光比（４００／３３０ｎｍ）を示す図である。
【図２９】各盲検タバコ葉試料についての蛍光比（４００／３３０ｎｍ）を、種々の濃度のベンゾ［ａ］ピレンにおける６つの校正試料と一緒に示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、種々の修正及び代替形態を受け入れる余地があるが、具体的な実施形態が、例として図面に示されており、本明細書において詳細に記述されている。しかしながら、具体的な実施形態の図面及び詳細な記述は、本発明を、開示されている特定の形態に限定するように意図されていないことを理解すべきである。それどころか、本発明は、本発明の範囲内にあるすべての修正、均等物及び代替物を、別記の請求項によって定義されているものとして網羅する。
【００１２】
上述した通り、本開示は、タバコ葉の表面上に存在する所望の多環式化合物のレベルを測定するための方法であって、
（ａ）タバコ葉の表面を溶媒で洗浄し、溶媒が、タバコ葉の表面上に存在する所望の多環式化合物の約１０ｗｔ．％以下がタバコ葉の表面から除去されるような非極性溶媒を少なくとも含むステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）から溶媒を回収するステップと、
（ｃ）回収した溶媒を蛍光分光法に供して、所望の多環式化合物のレベルを測定するステップと
を含む、方法に関する。
【００１３】
一部の実施形態において、所望の多環式化合物は、環式環系が、接合、縮合によって、単一原子を介して、又はそれらの組合せで連結されている、多環式化合物である。一部の実施形態において、所望の多環式化合物は、若干数の縮合環を含む。一部の実施形態において、所望の多環式化合物は、２〜１０個の縮合環を含む。一部の実施形態において、所望の多環式化合物は、２〜７個の縮合環を含む。一部の実施形態において、所望の多環式化合物は、３〜６個の縮合環を含む。一部の実施形態において、所望の多環式化合物は、４〜６個の縮合環を含む。一部の実施形態において、所望の多環式化合物は、５個の縮合環を含む。
【００１４】
一部の実施形態において、所望の多環式化合物は、芳香族多環式化合物である。本明細書において使用される場合、用語「芳香族多環式化合物」は、複数の芳香族環で構成される多環式化合物を指す。一部の実施形態において、所望の多環式化合物は、多環芳香族炭化水素（ＰＡＨ）である。本明細書において使用される場合、用語「多環芳香族炭化水素」は、炭素及び水素原子のみを含む芳香族多環式化合物を指す。一部の実施形態において、所望の多環式化合物は、ヘテロ芳香族多環式化合物である。本明細書において使用される場合、用語「ヘテロ芳香族多環式化合物」は、複数の芳香族環で構成され、芳香族環系の少なくとも１つが、少なくとも１個のヘテロ原子、例として窒素、硫黄又は酸素を含む、多環式化合物を指す。
【００１５】
一部の実施形態において、所望の多環式化合物は、多核芳香族炭化水素（ＰＮＡ，polynuclear aromatic hydrocarbon）である。本明細書において使用される場合、用語「多核芳香族炭化水素」は、芳香族環が一緒に縮合しているＰＡＨを指す。
【００１６】
一部の実施形態において、所望の多環式化合物は、２〜１０個の炭化水素環を含むＰＡＨ（好ましくはＰＮＡ）である。一部の実施形態において、所望の多環式化合物は、２〜７個の炭化水素環を含むＰＡＨ（好ましくはＰＮＡ）である。一部の実施形態において、所望の多環式化合物は、３〜６個の炭化水素環を含むＰＡＨ（好ましくはＰＮＡ）である。一部の実施形態において、所望の多環式化合物は、４〜６個の炭化水素環を含むＰＡＨ（好ましくはＰＮＡ）である。一部の実施形態において、所望の多環式化合物は、５個の炭化水素環を含むＰＡＨ（好ましくはＰＮＡ）である。
【００１７】
一部の実施形態において、所望の多環式化合物は、ナフタレン、アントラセン、フェナントレン、アセナフチレン、アセナフテン、フルオレン、テトラセン、フルオランテン、クリセン、トリフェニレン、ペリレン、ピレン、メチルコラントレン、ペンタセン、コラヌレン、コロネン及びオバレンからなる群から選択されるＰＡＨである。一部の実施形態において、所望の多環式化合物は、ベンズ［ｊ］アセアントリレン、ベンゾ［ｂ］フラン、クリセン、シクロペンタ［ｃ，ｄ］ピレン、ジベンゾ［ａ，ｈ］ピレン、ジベンゾ［ａ，ｌ］ピレン、ナフタレン、ベンズ［ａ］アントラセン、５−メチルクリセン、ベンゾ［ｊ］フルオランテン、ベンゾ［ｂ］フルオランテン、ベンゾ［ｋ］フルオランテン、ベンゾ［ｃ］フェナントレン、ベンゾ［ａ］ピレン、ベンゾ［ｇ，ｈ，ｉ］ペリレン、メチルコラントレン、ジベンズ［ａ，ｈ］アントラセン、インデノ［１，２，３−ｃｄ］ピレン、ジベンゾ［ａ，ｅ］ピレン及びジベンゾ［ａ，ｉ］ピレンから選択されるＰＡＨである。
【００１８】
一部の実施形態において、所望の多環式化合物は、ピレンである。一部の実施形態において、所望の多環式化合物は、ベンゾピレンである。一部の実施形態において、所望の多環式化合物は、ベンゾ［ａ］ピレン（別名ベンゾ（アルファ）ピレン又はＢａＰとして知られている）及びベンゾ［ｅ］ピレンから選択されるベンゾピレンである。一部の実施形態において、所望の多環式化合物は、ベンゾ［ａ］ピレン（ＢａＰ，benzo[a]pyrene）である。
【００１９】
一部の実施形態において、タバコ葉は、ホール又はカットタバコ葉である。一部の実施形態において、タバコ葉は、ホールである。一部の実施形態において、タバコ葉は、カットである。
【００２０】
本明細書において記述されている通り、方法は、タバコ葉の表面を溶媒で洗浄し、溶媒が、タバコ葉の表面上に存在する所望の多環式化合物の約１０ｗｔ．％以下がタバコ葉の表面から除去されるような非極性溶媒を少なくとも含むステップ（ａ）を含む。本明細書において記述されている通り、本発明の方法において使用される溶媒は、非極性溶媒を少なくとも含む。一部の実施形態において、本発明の方法において使用される溶媒は、極性溶媒、例として極性プロトン性溶媒又は極性非プロトン性溶媒をさらに含む。
【００２１】
本明細書において使用される場合、用語「極性溶媒」は、１５以上の誘電率を有するあらゆる溶媒を指す。本明細書において使用される場合、用語「非極性溶媒」は、１５未満の誘電率を有するあらゆる溶媒を指す。本明細書において使用される場合、用語「極性プロトン性溶媒」は、負に帯電したイオンを溶媒和するあらゆる極性溶媒を指す。本明細書において使用される場合、用語「極性非プロトン性溶媒」は、正に帯電したイオンを溶媒和するあらゆる極性溶媒を指す。
【００２２】
一部の実施形態において、本発明の方法において使用される溶媒は、有機系溶媒を含む。一部の実施形態において、本発明の方法において使用される溶媒は、アルカン、シクロアルカン、ハロアルカン、アルケン、アルキン、アレーン、アルコール、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、エステル、エーテル、アミン、アミド、ニトリル、硫化物、スルホキシド、水及びそれらの混合物からなる群から選択される溶媒を含む。一部の実施形態において、本発明の方法において使用される溶媒は、アルカン、シクロアルカン、ハロアルカン、アレーン、エーテル、アミン及びそれらの混合物からなる群から選択される溶媒を含む。一部の実施形態において、本発明の方法において使用される溶媒は、メタノール、トルエン、ヘキサン及びそれらの混合物から選択される溶媒を含む。一部の実施形態において、本発明の方法において使用される溶媒は、少なくとも１つの非極性溶媒及びメタノールを含む。一部の実施形態において、本発明の方法において使用される溶媒は、メタノール及びトルエンの混合物である。一部の実施形態において、本発明の方法において使用される溶媒は、ヘキサンである。
【００２３】
一部の実施形態において、本発明の方法において使用される溶媒は、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、シクロペンタン、シクロヘキサン、シクロヘプタン、クロロホルム（ＣＨＣｌ３）、ベンゼン、トルエン、ジエチルエーテル、１，４−ジオキサン、イソオクタン、デカン及びそれらの組合せからなる群から選択される非極性溶媒を少なくとも含む。一部の実施形態において、本発明の方法において使用される溶媒は、ヘキサン、シクロヘキサン又はそれらの混合物を含む。一部の実施形態において、本発明の方法において使用される溶媒は、ヘキサンである。
【００２４】
本明細書において記述されている通り、方法は、タバコ葉の表面上に存在する所望の多環式化合物の約１０ｗｔ．％以下がタバコ葉の表面から除去されるように、溶媒で前記タバコ葉の前記表面を洗浄するステップ（ａ）を含む。一部の実施形態において、方法は、タバコ葉の表面上に存在する所望の多環式化合物の約０．０１〜約１０ｗｔ．％がタバコ葉の表面から除去されるように、溶媒で前記タバコ葉の前記表面を洗浄するステップ（ａ）を含む。一部の実施形態において、方法は、タバコ葉の表面を溶媒で洗浄し、タバコ葉の表面上に存在する所望の多環式化合物の約０．１〜約１０ｗｔ．％がタバコ葉の表面から除去されるような、ステップ（ａ）を含む。一部の実施形態において、方法は、タバコ葉の表面上に存在する所望の多環式化合物の約１〜約１０ｗｔ．％がタバコ葉の表面から除去されるように、溶媒でタバコ葉の表面を洗浄するステップ（ａ）を含む。一部の実施形態において、方法は、タバコ葉の表面上に存在する所望の多環式化合物の約１〜約９ｗｔ．％がタバコ葉の表面から除去される、例としてタバコ葉の表面上に存在する所望の多環式化合物の約２〜約８ｗｔ．％がタバコ葉の表面から除去される、例としてタバコ葉の表面上に存在する所望の多環式化合物の約３〜約７ｗｔ．％がタバコ葉の表面から除去される、例としてタバコ葉の表面上に存在する所望の多環式化合物の約４〜約６ｗｔ．％がタバコ葉の表面から除去されるように、溶媒でタバコ葉の表面を洗浄するステップ（ａ）を含む。
【００２５】
タバコ葉の表面からの所望の多環式化合物の約１０ｗｔ．％以下の除去は、非常に強い蛍光スペクトルを有するとともに、所望のピークを曖昧にし、故にタバコ葉の表面上に存在する所望の多環式化合物のレベルの測定に悪影響を及ぼし得る、葉内からの他の物質（例えば、クマリン等）の抽出を低減させことが、本発明者らによって見出された。当業者には分かるであろう通り、典型的にはタバコの納屋での乾燥中における一時的発光の結果として生じるタバコ葉の多環式化合物汚染の性質は、多環式化合物は、葉自体の中よりも葉の表面上に大部分が存在することを意味する。葉の表面からの多環式化合物の除去は、したがって、タバコ葉の表面上に存在する所望の多環式化合物の約１０ｗｔ．％以下がタバコ葉の表面から除去されるような、制御方式で実現されてよい。
【００２６】
本明細書において使用される場合、用語「所望の多環式化合物のｗｔ．％」は、タバコ葉の表面上における所望の多環式化合物の総量の重量による所望の多環式化合物のパーセント量を指す。
【００２７】
一部の実施形態において、方法は、タバコ葉（ホール又はカット）の表面を溶媒で洗浄し、タバコ葉の表面上に存在する所望の多環式化合物の約５ｗｔ．％以下がタバコ葉の表面から除去されるような、ステップ（ａ）を含む。一部の実施形態において、方法は、タバコ葉の表面を溶媒で洗浄し、タバコ葉の表面上に存在する所望の多環式化合物の約０．０１〜約５ｗｔ．％がタバコ葉の表面から除去されるような、ステップ（ａ）を含む。一部の実施形態において、方法は、タバコ葉の表面を溶媒で洗浄し、タバコ葉の表面上に存在する所望の多環式化合物の約０．１〜約５ｗｔ．％がタバコ葉の表面から除去されるような、ステップ（ａ）を含む。一部の実施形態において、方法は、タバコ葉の表面を溶媒で洗浄し、タバコ葉の表面上に存在する所望の多環式化合物の約１〜約５ｗｔ．％がタバコ葉の表面から除去されるような、ステップ（ａ）を含む。溶媒洗浄は、タバコ葉の表面から他の物質を除去し得ること、５ｗｔ．％以下の多環式化合物の除去は、共抽出物のシグナルが所望の多環式化合物のシグナルを凌駕しない場合があることを意味することが、本発明者らによって見出された。
【００２８】
一部の実施形態において、タバコ葉の表面を洗浄するために使用される溶媒の量は、タバコ葉１ｇ当たり約１０〜約５０ｍｌの溶媒、例としてタバコ葉１ｇ当たり約１５〜約４５ｍｌの溶媒、例としてタバコ葉１ｇ当たり約２０〜約４０ｍｌの溶媒、例としてタバコ葉１ｇ当たり約２０〜約３５ｍｌの溶媒、例としてタバコ葉１ｇ当たり約２０〜約３０ｍｌの溶媒、例としてタバコ葉１ｇ当たりおよそ２５ｍｌの溶媒である。
【００２９】
一部の実施形態において、タバコ葉は、本発明による方法のステップ（ａ）において、溶媒により、１０分未満の間にわたって、例として約８分未満の間にわたって、例として約５分以下の間にわたって、洗浄される。一部の実施形態において、タバコ葉は、本発明による方法のステップ（ａ）において、溶媒により、少なくとも約０．５分の間にわたって、例として少なくとも約１分の間にわたって、例として少なくとも約１．５分の間にわたって、例として少なくとも約２分の間にわたって、洗浄される。一部の実施形態において、タバコ葉は、本発明による方法のステップ（ａ）において、溶媒により、約０．５分〜約１０分の間にわたって、例として約１分〜約７分の間にわたって、例として約２分〜約５分の間にわたって、洗浄される。一部の実施形態において、タバコ葉は、溶媒により、約０．５分〜約５分の間にわたって洗浄される。
【００３０】
一部の実施形態において、タバコ葉は、本発明による方法のステップ（ａ）において、溶媒により、約１０〜約３０℃の温度で、例として約１５〜約２５℃の温度で、例として約２０〜約２５℃の温度で洗浄される。
【００３１】
一部の実施形態において、タバコ葉は、本発明による方法のステップ（ａ）において、溶媒により、約５０〜約１５０ｋＰａの圧力で洗浄される。一部の実施形態において、タバコ葉は、本発明による方法のステップ（ａ）において、溶媒により、大気圧で洗浄される。
【００３２】
本明細書において記述されている通り、方法は、回収した溶媒を蛍光分光法に供して、所望の多環式化合物のレベルを測定する、ステップ（ｃ）を含む。一部の実施形態において、蛍光分光法に供される回収した溶媒は、約５ｐｇ／ｍＬ〜約５００ｐｇ／ｍＬ、例として約１０ｐｇ／ｍＬ〜約５００ｐｇ／ｍＬ、例として約２０ｐｇ／ｍＬ〜約５００ｐｇ／ｍＬ、例として約３０ｐｇ／ｍＬ〜約５００ｐｇ／ｍＬ、例として約４０ｐｇ／ｍＬ〜約５００ｐｇ／ｍＬ、例として約５０ｐｇ／ｍＬ〜約５００ｐｇ／ｍＬの量の所望の多環式化合物を含有する。
【００３３】
一部の実施形態において、蛍光分光法に供される回収した溶媒は、タバコ葉１ｇ当たり約１ｎｇ〜タバコ葉１ｇ当たり約５００ｎｇ、例としてタバコ葉１ｇ当たり約５ｎｇ〜タバコ葉１ｇ当たり約５００ｎｇ、例としてタバコ葉１ｇ当たり約１０ｎｇ〜タバコ葉１ｇ当たり約５００ｎｇの量の所望の多環式化合物を含有する。
【００３４】
当業者には分かるであろう通り、一部の溶解した芳香族化合物がＵＶ光を吸収する場合、化合物は、このエネルギーのごく一部を、蛍光としてより長い波長で再放出し得る。故に、回収した溶媒が供される蛍光分光法は、入射ＵＶ放射線の吸収による試料中での分子の励起、及び分子がそれらの基底状態配置に戻る際のその後の分子の発光（蛍光）を伴い、ここで、各発光波長における蛍光の強度は、適切な検出器によって測定される。当業者には分かるであろう通り、蛍光強度は、試料種の濃度に正比例する。
【００３５】
典型的には、多環式化合物の蛍光分光法において、入射ＵＶ放射線は、約２００〜約５００ｎｍの波長を有してよい。本発明の実施形態において、入射ＵＶ放射線は、励起源、例として白熱タングステンフィラメントランプ、白熱タングステンハロゲンランプ、キセノンガス及び／若しくは水銀蒸気を含有する放電ランプ、レーザー又はＵＶ光発光ダイオード（ＬＥＤ，light-emitting-diode）光源によって提供されてよい。
【００３６】
一部の実施形態において、蛍光分光法に供される回収した溶媒の蛍光は、光電子増倍管（ＰＭＴ，photomultiplier）検出器、サーモパイル、フォトセル、フォトダイオード及び電荷結合素子（ＣＣＤ，charge-coupled device）検出器から選択される検出器を使用して検出される。一部の実施形態において、蛍光分光法に供される回収した溶媒の蛍光は、ＰＭＴ検出器を使用して検出される。
【００３７】
一部の実施形態において、蛍光分光法は、吸光度スペクトル及び発光スペクトルの両方を同時に測定することができる装置を使用して実行されて、回収した溶媒についての励起−発光マトリックス（ＥＥＭ，excitation-emission matrix）を提供し、所望の多環式化合物のレベルを測定する。
【００３８】
一部の実施形態において、蛍光分光法は、回収した溶媒の発光スペクトルにおいて少なくとも第１のピーク及び第２のピークを同定するステップを含み、第１のピークは、所望の多環式化合物の第１の特異的な発光波長に対応し、第２のピークは、所望の多環式化合物の第２の特異的な発光波長に対応する。
【００３９】
回収した溶媒の発光スペクトルは、入射放射線のある特定の予め定められた励起波長で回収した溶媒によって産生される蛍光（又は発光）シグナルの構成要素となる。本明細書において記述されている通り、第１のピークは、マトリックスバックグラウンドから目立たない（discreet）所望の多環式化合物の第１の特異的な発光波長に対応する。本明細書において使用される場合、マトリックスバックグラウンドは、所望の多環式化合物によって産生される発光ではない、回収した溶媒の発光スペクトルにおける波長を指す。一部の実施形態において、第１のピークは、回収した溶媒の発光スペクトルにおいて発光極大の構成要素となるように選択され、ここで、前記発光極大は、所望の多環式化合物によって産生される。
【００４０】
一部の実施形態において、発光スペクトルは、２００〜５００ｎｍ、例として２００〜４００ｎｍ、例として２００〜３００ｎｍの範囲内の励起波長で取得される。一部の実施形態において、発光スペクトルは、２２０〜２８０ｎｍの範囲内の励起波長で取得される。一部の実施形態において、発光スペクトルは、２８０ｎｍの励起波長で取得される。一部の好ましい実施形態において、発光スペクトルは、２５５ｎｍの励起波長で取得される。
【００４１】
一部の実施形態において（例として励起波長が２５５ｎｍである場合）、第１のピークは、３００〜３７０ｎｍの範囲内、例として３１０〜３７０ｎｍの範囲内の波長を持つ発光である。一部の実施形態において（例として励起波長が２５５ｎｍである場合）、第１のピークは、３１０〜３６０ｎｍの範囲内の波長を持つ発光である。一部の実施形態において（例として励起波長が２５５ｎｍである場合）、第１のピークは、３２０〜３５０ｎｍの範囲内の波長を持つ発光である。一部の実施形態において（例として励起波長が２５５ｎｍである場合）、第１のピークは、３２０〜３４０ｎｍの範囲内の波長を持つ発光である。一部の実施形態において（例として励起波長が２５５ｎｍである場合）、第１のピークは、３２５〜３３５ｎｍの範囲内の波長を持つ発光である。一部の実施形態において（例として励起波長が２５５ｎｍである場合）、第１のピークは、およそ３３０ｎｍの波長を持つ発光である。本明細書において使用される場合、用語「およそ３３０ｎｍ」は、発光ピークについての±５ｎｍのバンドパスを包含する、３３０ｎｍでの発光ピーク（すなわち、３３０ｎｍ±５ｎｍ）を指す。
【００４２】
一部の実施形態において、２５５ｎｍの励起波長を使用して産生された回収した溶媒の発光スペクトル中、第１のピークは、３２０〜３４０ｎｍの波長を持つ発光である。一部の実施形態において、２５５ｎｍの励起波長を使用して産生された回収した溶媒の発光スペクトル中、第１のピークは、およそ３３０ｎｍの波長を持つ発光である。
【００４３】
一部の実施形態において、２５５ｎｍの励起波長を使用して産生された回収した溶媒の発光スペクトル中、例えば、溶媒が非極性溶媒、例えばヘキサンである場合、第１のピークは、３２５〜３３５ｎｍの範囲内、例としておよそ３３０ｎｍの波長を持つ発光である。
【００４４】
一部の実施形態において（例として励起波長が２５５ｎｍである場合）、第２のピークは、３８５〜４２５ｎｍの範囲内、例えば３９０〜４２０ｎｍの範囲内、例として３９０〜４１０ｎｍの範囲内の波長を持つ発光である。
【００４５】
一部の実施形態において（例として励起波長が２５５ｎｍである場合）、第２のピークは、３９５〜４０５ｎｍの範囲内、例としておよそ４００ｎｍの波長を持つ発光である。本明細書において使用される場合、用語「およそ４００ｎｍ」は、発光ピークについての±５ｎｍのバンドパスを包含する、４００ｎｍでの発光ピーク（すなわち、４００ｎｍ±５ｎｍ）を指す。
【００４６】
一部の実施形態において、２５５ｎｍの励起波長を使用して産生された回収した溶媒の発光スペクトル中、例えば、溶媒が非極性溶媒、例えばヘキサンである場合、第２のピークは、３９５〜４０５ｎｍの範囲内、例としておよそ４００ｎｍの波長を持つ発光である。
【００４７】
一部の実施形態において、蛍光分光法は、回収した溶媒の発光スペクトルにおいて少なくとも第１のピーク及び第２のピークを同定するステップを含み、第１のピークは、所望の多環式化合物の第１の特異的な発光波長に対応し、第２のピークは、所望の多環式化合物の第２の特異的な発光波長に対応し、ここで、蛍光分光法は、蛍光比を取得するために、第１のピーク及び第２のピークの強度を互いに対して比較するステップをさらに含む。本明細書において使用される場合、用語「蛍光比」は、回収した溶媒の発光スペクトルにおける第２のピークの蛍光強度の、発光スペクトルにおける第１のピークの蛍光強度に対する比を指し、ここで、第１のピークは、所望の多環式化合物の第１の特異的な発光波長に対応し、第２のピークは、所望の多環式化合物の第２の特異的な発光波長に対応する。
【００４８】
一部の実施形態において、蛍光分光法は、回収した溶媒の発光スペクトルにおいて２又は３以上のピークを同定し、ここで、ピークのうちの少なくとも２つが、所望の多環式化合物の特異的な発光波長に対応するステップと、蛍光比を取得するために、所望の多環式化合物の特異的な発光波長に対応するピークの強度を比較するステップとを含む。一部の実施形態において、蛍光分光法は、回収した溶媒の発光スペクトルにおいて３つのピークを同定し、ここで、３つのピークのうちの１つが、所望の多環式化合物の特異的な発光波長に対応するステップと、蛍光比を取得するために、所望の多環式化合物の特異的な発光波長に対応するピークの強度を、２つの残りのピークの強度に対して比較するステップとを含む。
【００４９】
一部の実施形態において、蛍光分光法は、回収した溶媒の発光スペクトルにおいて３又は４以上のピークを同定し、ここで、３又は４以上のピークのうちの少なくとも１つが、所望の多環式化合物の特異的な発光波長に対応するステップと、蛍光比を取得するために、所望の多環式化合物の特異的な発光波長に対応する少なくとも１つのピークの強度を、２又は３以上の残りのピークの強度に対して比較するステップとを含む。一部の実施形態において、蛍光分光法は、回収した溶媒の発光スペクトルにおいて３つのピークを同定し、ここで、３つのピークのうちの１つが、所望の多環式化合物の特異的な発光波長に対応するステップと、蛍光比を取得するために、所望の多環式化合物の特異的な発光波長に対応するピークの強度を、２つの残りのピークの強度に対して比較するステップとを含む。
【００５０】
一部の実施形態において、本明細書において記述されている方法は、タバコ葉の表面上における所望の多環式化合物のレベルを測定するために、蛍光比を予め定められた（又は校正）蛍光比と比較するステップをさらに含む。予め定められた蛍光比は、既知のレベルの所望の多環式化合物を有する少なくとも２つの参照試料について計算され、ここで、少なくとも１つの試料は低レベルの所望の多環式化合物を有し、少なくとも１つの試料は高レベルの所望の多環式化合物を有する。低レベルの所望の多環式化合物は、典型的には、タバコ葉の表面上における１０ｎｇ  ｇ−１未満の所望の多環式化合物の量であると考えられ、一方、高レベルの所望の多環式化合物は、典型的には、タバコ葉の表面上における３００ｎｇ  ｇ−１より大きい所望の多環式化合物の量であると考えられる。本発明の方法を使用して取得された蛍光比と既知のレベルの所望の多環式化合物を有する試料について計算されたそのような蛍光比との比較は、したがって、タバコ葉の表面から洗浄された所望の多環式化合物のレベルの測定を容易にする。
【００５１】
本発明は、溶媒中に存在する所望の多環式化合物のレベルを測定するためのデバイスであって、
（ａ）所望の多環式化合物を含有する溶媒のための容器と、
（ｂ）所望の多環式化合物の蛍光を起こすための励起源と、
（ｃ）蛍光を測定するためのセンサーと、
（ｄ）
（ｉ）回収した溶媒の発光スペクトルにおいて少なくとも第１のピーク及び第２のピークを同定し、第１のピークが、所望の多環式化合物の第１の特異的な発光波長に対応し、第２のピークが、所望の多環式化合物の第２の特異的な発光波長に対応し、
（ii）蛍光比を取得するために、２つのピークの強度を互いに対して比較し、
（iii）所望の多環式化合物のレベルを測定するために、蛍光比を予め定められた蛍光比と比較する
ように操作可能なプロセッサーと
を備える、デバイスも提供する。
【００５２】
一部の実施形態において、デバイスは、ポータブルである。本明細書において使用される場合、用語「ポータブル」は、簡単に持ち運ぶ又は移動させることができることを意味する。一部の実施形態において、デバイスは、使用中に違和感なくユーザーの手中に保持することができるようなサイズのものであってよい。一部の実施形態において、デバイスは、ポータブル、ハンドヘルドデバイスである。
【００５３】
一部の実施形態において、励起源は、白熱タングステンフィラメントランプ、白熱タングステンハロゲンランプ、キセノンガス及び／若しくは水銀蒸気を含有する放電ランプ、レーザー及びＵＶ  ＬＥＤ光源からなる群から選択されるＵＶ放射線源である。一部の実施形態において、励起源は、ＵＶ  ＬＥＤ光源であり、これは、単色光源である。
【００５４】
一部の実施形態において、蛍光を測定するためのセンサーは、光電子増倍管（ＰＭＴ）検出器、サーモパイル、フォトセル、フォトダイオード及び電荷結合素子（ＣＣＤ）検出器から選択される。一部の実施形態において、蛍光を測定するためのセンサーは、ＰＭＴ検出器である。
【００５５】
一部の実施形態において、デバイスは、Chelsea Technologies Group Ltd社（ＣＴＧ）によって製造されるUviLuxセンサーである。
【００５６】
一部の実施形態において、プロセッサーは、
（ｉ）回収した溶媒の発光スペクトルにおいて２又は３以上のピークを同定し、ここで、ピークのうちの少なくとも２つが、所望の多環式化合物の特異的な発光波長に対応し、
（ii）蛍光比を取得するために、所望の多環式化合物の特異的な発光波長に対応するピークの強度を比較し、
（iii）所望の多環式化合物のレベルを測定するために、蛍光比を予め定められた蛍光比と比較する
ように操作可能である。
【００５７】
一部の実施形態において、プロセッサーは、
（ｉ）回収した溶媒の発光スペクトルにおいて３つのピークを同定し、ここで、３つのピークのうちの１つが、所望の多環式化合物の特異的な発光波長に対応し、
（ii）蛍光比を取得するために、所望の多環式化合物の特異的な発光波長に対応するピークの強度を、２つの残りのピークの強度に対して比較し、
（iii）所望の多環式化合物のレベルを測定するために、蛍光比を予め定められた蛍光比と比較する
ように操作可能である。
【００５８】
ここで、下記の非限定的な例を参照して、本発明について記述する。
［実施例］
【実施例１】
【００５９】
３つの異なる試料調製物を、タバコ葉の表面上におけるベンゾ［ａ］ピレン（ＢａＰ）のレベルを測定するそれらの能力について評価した。
【００６０】
試験した試料
硬化タバコ葉試料は、表１に示す通り、低、中又は高レベルのＢａＰのいずれかとして定義される既知の含有量のＢａＰを有するタバコ葉試料として選択した。
【００６１】
【表１】
2020512526.tif 000003
【００６２】
試料番号２５９を、低レベルのＢａＰを有するとして選択し、試料番号２６１を、中レベルのＢａＰを有するとして選択し、試料番号２６３を、高レベルのＢａＰを有するとして選択した。
【００６３】
これらの試料のそれぞれを、以下の項目（１）〜（３）に記されている通りに分析した。以下の項目（１）及び（２）において行われた分析は、比較例とみなすことができることに留意されたい。
（１）既知の低、中及び高ＢａＰ含有量を持つタバコ葉試料を、タバコ葉上で直接的に励起−発光マトリックスを測定することによって調査した。各ＢａＰ含有量の葉について、同じＢａＰ含有量を有する葉内における変動が、低、中及び高ＢａＰ含有量のいずれかを有する葉の間での差異と比較して有意であるか否かを評価するために、葉の異なる部分における葉の蛍光の３〜４回繰り返しを獲得した。
（２）既知の低、中及び高ＢａＰ含有量を持つタバコ葉試料を、メタノールにより、周囲温度及び大気圧で洗浄し、ここで、葉の洗浄は、各葉試料について３０、６０及び１８０秒の間にわたって実行した。洗浄は、およそ１ｇの各タバコ葉試料を２５ｍＬのメタノールに入れることによって実行した。
（３）既知の低及び高ＢａＰ含有量を持つタバコ葉試料を、ヘキサンにより、周囲温度及び大気圧で洗浄し、ここで、葉の洗浄は、各葉試料について３０、６０、１８０及び３００秒の間にわたって実行し、各洗浄時間は、試料について２連で実施した。洗浄は、およそ１ｇの各タバコ葉試料を２５ｍＬのヘキサンに入れることによって実行した。使用した各葉試料の精密質量は表２に記録されており、吸光度及び蛍光データを１ｇのタバコに対して正規化するために使用した。
【００６４】
【表２】
2020512526.tif 000004
【００６５】
ＢａＰの吸光度スペクトル
参照する目的で、５ｐｐｍのＢａＰの吸光度スペクトルは、Cecil 5000シリーズデュアルビーム分光計を使用して、２ｎｍ分解能で獲得した。メタノールが参照溶媒として提供され、溶液は、１ｃｍ経路長キュベット（Starna Scientific Ltd社製、23/Q/10、Quartz）に含有されていた。ＢａＰの獲得した吸光度スペクトルを図１に示す。５ｐｐｍのＢａＰの吸光度スペクトルは、２６４ｎｍで極大を有し、他の極大は、２８２ｎｍ、２９４ｎｍ、３４６ｎｍ、３６４ｎｍ及び３８２ｎｍであった。吸光度スペクトルは、関連する振動構造を持つＢａＰにおける２つの電子バンド（２９４ｎｍ及び３８２ｎｍ）の存在を指示している。
【００６６】
図１における吸光度スペクトルから、２５５ｎｍ又は２８０ｎｍの励起波長は、ＢａＰ発光を標的化するのに適切であろうことが明らかとなった。
【００６７】
メタノール及びヘキサン中におけるＢａＰの励起−発光マトリックス
すべての試料についての励起−発光マトリックス（ＥＥＭ）は、HORIBA社製Aqualog（登録商標）機器を使用して獲得した。HORIBA社製Aqualog（登録商標）は、ＵＶ増強光源、二重格子励起モノクロメーター及び熱電冷却ＣＣＤ検出器からなり、あらゆる励起波長で全発光スペクトルの同時分解を可能にする。Aqualog（登録商標）は、アメリカ国立標準技術研究所（ＮＩＳＴ，National Institute of Standards and Technology）により追跡可能な補正蛍光スペクトルを自動的に生成する。これは、参照励起光出力によるシグナルＥＥＭの分割によって、考慮されるべき励起光のスペクトル出力を可能にする、参照検出器を包含する。加えて、シグナル及び参照検出器シグナルの両方は、保存されたスペクトル補正係数を使用して、機器のスペクトル応答に対して補正される。
【００６８】
すべてのＥＥＭについて、λｅｍｉｓｓｉｏｎ＝λｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ及び２λｅｍｉｓｓｉｏｎ＝λｅｘｃｉｔａｔｉｏｎにおけるレイリー線は、これらの領域におけるデータをゼロに設定することにより、除去しておいた。加えて、λｅｍｉｓｓｉｏｎがλｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ未満であるＥＥＭの領域も、ゼロに設定しておいた。ラマン線は、試料のＥＥＭからブランクＥＥＭを減じることによって大部分を除去することができ、但し、これらのＥＥＭは、いずれも同じ機器設定において獲得される。本明細書において記述されている実施例のすべてにおいて獲得されたＥＥＭはすべて試料ＥＥＭ−ブランクＥＥＭとして示され、ここで、ブランクＥＥＭは、溶媒のみの励起及び発光後に獲得される。
【００６９】
ブランクＥＥＭの減算及びレイリー線の除去後、各ＥＥＭは、いかなる内部フィルター効果（ＩＦＥ，inner filter effect）に対しても補正され、これは、励起又は発光光のいずれかの吸光度が有意になった場合に生じる。ＩＦＥ補正は、下記の方程式：
【００７０】
【数１】
2020512526.tif 000005
【００７１】
を使用して実行され、式中、Ａｅｘは、励起波長における吸光度であり、Ａｅｍは、発光波長における吸光度である。吸光度経路長は、１ｃｍ経路長セルにおいて０．５ｃｍであると推測される。ＩＦＥ補正された蛍光、Ｆｃｏｒｒは、測定された蛍光（Ｆｍｅａｓ）とＩＦＥ補正（ＩＦＥ）との積である：
【００７２】
【数２】
2020512526.tif 000006
【００７３】
ＩＦＥ補正は、試料の吸光度スペクトルがＥＥＭと同時に獲得されることから、Aqualog（登録商標）で大いに単純化される。
【００７４】
文献蛍光データとの比較を可能にするために、蛍光データを標準化するために使用される典型的な方法は、蛍光シグナルを、酸に溶解した１μｇ／ｍＬ（１ｍｇ／Ｌ又は１ｐｐｍ又は１．２８μＭ）硫酸キニーネからの３４７．５ｎｍの励起波長及び４５０ｎｍの発光波長における蛍光に対して正規化することである。本明細書において使用される場合、そのようなＥＥＭ強度単位を、硫酸キニーネ単位（ｐｐｍ）（ＱＳＵ，quinine sulphate units（ｐｐｍ））と称する。これは、異なる機器間にわたって回収されたデータの直接比較を可能にする。硫酸キニーネ及び酸ブランク（０．１０５Ｍ過塩素酸）の認定参照標準は、Starna Scientific Ltd.社から購入し（RM-QS00、セットシリアル番号１９８５５、セルシリアル番号４３０８４、ブランクシリアル番号４３０５２、証明書番号９７２９１、証明日０８／０９／１４）、いずれの溶液も、Spectrosil Quartzで構成される１ｃｍ経路長蛍光計セル中で提供された。
【００７５】
メタノールに溶解した２９６ｎＭ  ＢａＰのＥＥＭ（以下を参照）を除いて、本明細書において記述されている実施例のそれぞれにおいて獲得されたすべてのＥＥＭは、ＥＥＭを、３４７．５ｎｍの励起波長及び４５０ｎｍの発光波長において１ｎｇ／ｍＬ（１ｐｐｂ）硫酸キニーネから記録されるであろう蛍光強度で割ることによって正規化された。３４７．５ｎｍの励起波長における１ｐｐｍ硫酸キニーネ発光スペクトルの５回繰り返しのうちの最小をＥＥＭ獲得の各日に獲得し、その日に獲得されたＥＥＭを４５０ｎｍにおける平均発光で割り、１０００で割って、ｐｐｍからｐｐｂ硫酸キニーネに変換した。結果として得られたＥＥＭ強度単位を、硫酸キニーネ単位、ＱＳＵと称する。
【００７６】
２００〜５００ｎｍの範囲内の１ｎｍの励起波長増分を使用して、２５０〜８００ｎｍの範囲内の発光スペクトルを１．１２ｎｍ増分で回収した。直接的な葉分析には、０．０５秒の積分時間を使用し、一方、ＥＥＭの残りには、０．３秒の積分時間を使用した。このデータから、パイソンスクリプトを記入して、硫酸キニーネ補正係数を適用し、２４０〜４８０ｎｍ励起及び２５０〜５５０ｎｍの範囲内の励起−発光マトリックスをプロットした。
【００７７】
メタノール及びヘキサンに溶解した３９６ｎＭ  ＢａＰのＥＥＭを、それぞれ図２及び３に示す。ＥＥＭのそれぞれにおいて、蛍光強度を１００ｎＭ  ＢａＰに対して正規化し、ＱＳＵの単位で示す。上記に指示した通り、メタノールに溶解した３９６ｎＭ  ＢａＰのＥＥＭにおける蛍光強度は、酸に溶解した１μｇ／ｍＬ（１ｍｇ／Ｌ又は１ｐｐｍ又は１．２８μＭ）硫酸キニーネからの３４７．５ｎｍの励起波長の及び４５０ｎｍの発光波長における蛍光に対して正規化されたものとして示されるが、ｐｐｍからｐｐｂ硫酸キニーネへ単位を変換していない。換言すれば、図２のＥＥＭにおける蛍光強度は、ＱＳＵ（ｐｐｍ）の単位で示す。２５５ｎｍの固定励起波長におけるＥＥＭから抽出したメタノール及びヘキサン中における蛍光発光スペクトルの比較を図４に示し、メタノール及びヘキサン中における両方のスペクトルについての蛍光強度は、直接比較を可能にするためにＱＳＵの単位で示す。図４における結果から、メタノール中における蛍光は、ヘキサン中における蛍光よりもおよそ２．９倍強いことが分かる。ピーク位置は、ヘキサン中において、メタノール中と比較して２．５ｎｍ未満だけより短い波長にシフトする。図４から、メタノール中におけるＢａＰについての蛍光スペクトルにおいて２つのピーク発光波長：約４０５ｎｍ及び約４２９ｎｍがあることが明らかである。これらのピークは、ヘキサン中におけるＢａＰについてわずかにより短い波長にシフトする。
【００７８】
（１）直接的な葉分析（比較分析）
ＥＥＭは、各試料について、タバコ葉の表面の異なる面積における、低、中及び高ＢａＰ含有量の直接分析によって獲得した。低（試料２５９）、中（試料２６１）及び高（試料２６３）ＢａＰ含有量の葉についての直接的な葉分析の結果を、それぞれ図５、６及び７に示す。異なる葉領域の４回繰り返しを、低（試料２５９）及び高（試料２６３）ＢａＰ含有量の葉について、図５及び７に示す。異なる葉領域の３回繰り返しを、中（試料２６１）ＢａＰ含有量の葉について、図６に示す。これらの図のそれぞれから、葉の励起−発光スペクトルを直接的に（すなわち、最初にそれらを溶媒中で洗浄することなく）測定することは、ＢａＰ含有量を評価するための適切な方法ではないことが明らかである。典型的なＢａＰ蛍光は直接的なＥＥＭのいずれにおいても記録されず、同じ公称ＢａＰ含有量を有する葉試料について及び異なるＢａＰ含有量を有する葉試料についての両方で観察される、大きい及び種々の蛍光バックグラウンドがある。これは、葉が、直接的なＥＥＭアプローチにおいて記録された蛍光に有意に寄与していること、及び、したがって、直接的な葉分析は、タバコ葉試料中におけるＢａＰ汚染レベルを評価するために適切ではないことを指示している。
【００７９】
（２）メタノール中で洗浄したタバコ葉試料（比較分析）
ＥＥＭを、メタノール中、３０秒、６０秒及び１８０秒の洗浄時間で洗浄したタバコ葉試料について獲得した。高ＢａＰ含有量の葉に関する、ブランク（すなわち、メタノールのみ）（左上）、３０秒（右上）、６０秒（左下）及び１８０秒（右下）メタノール葉洗浄試料についてのＥＥＭを、図８に示す。
【００８０】
期待される発光波長における典型的なＢａＰ蛍光を図８において見ることができず、メタノール溶媒によるタバコ葉顔料の抽出により、比較的大きい及び種々の蛍光バックグラウンドがあることを示唆している。
【００８１】
図８から、葉洗浄時間を３０〜１８０秒に低減させても、典型的なＢａＰ蛍光は観察されないことが明白である。葉洗浄時間を３０秒未満に低減させることは実用的ではないため、これらの結果は、メタノールが、唯一の溶媒として使用される場合、葉中の顔料を抽出することもなく表面ＢａＰ汚染を洗い落とすための適切な溶媒ではないことを指示している。
【００８２】
これは、試料２６３（高ＢａＰ含有量）を、メタノール中で６０秒又はヘキサン中で３００秒の間にわたってのいずれかで洗浄することによって取得されたＥＥＭの比較によって、さらに見ることができる。この試料２６３をヘキサン中で３００秒間にわたって洗浄することによって獲得されたＥＥＭを図９ａに示し、この試料２６３をメタノール中で６０秒間にわたって洗浄することによって獲得されたＥＥＭを図９ｂに示す。ＢａＰシグナルは図９ａに示す試料のＥＥＭにおいて示される白色の枠内で明確に視認できるのに対し、図９ｂにおいてはＢａＰシグナルを見ることができないことが分かる。図９ｂにおける橙色の長方形は、ＢａＰシグナルが観察されるはずの領域を表すが、共抽出された物質からの蛍光によって曖昧になっている。これらの結果は、メタノールが、ただ１つの溶媒として使用される場合、葉中の顔料を抽出することもなく表面ＢａＰ汚染を洗い落とすための適切な溶媒ではないことをさらに指示している。
【００８３】
（３）ヘキサン中で洗浄したタバコ葉試料
ヘキサン中で洗浄したタバコ葉試料について評価された４つの洗浄時間（３０秒、６０秒、１８０秒、３００秒）についてのブランクＥＥＭ（すなわち、ヘキサンのみ）を獲得し、結果を図１０に示す。図１０において、３０秒ヘキサン洗浄についてのＥＥＭを左上に示し、６０秒ヘキサン洗浄についてのＥＥＭを右上に示し、１８０秒ヘキサン洗浄についてのＥＥＭを左下に示し、及び３００秒ヘキサン洗浄についてのＥＥＭを右下に示す。識別できる蛍光は検出されない。
【００８４】
低ＢａＰ含有量の葉試料（試料２５９）についてのＥＥＭを、評価した４つの葉洗浄時間に関して２連で獲得し、図１１に提示する。グループＡ（表２における同定を参照）における試料のＥＥＭを図１１の左に示し、グループＢにおける試料のＥＥＭを右に示す。最上段のＥＥＭは３０秒葉洗浄についてのものであり、第２段のＥＥＭは６０秒葉洗浄についてのものであり、第３段のＥＥＭは１８０秒葉洗浄についてのものであり、及び最下段のＥＥＭは３００秒葉洗浄についてのものである。３１０〜３４０ｎｍ発光波長の蛍光のレベルの増大は、葉洗浄時間を増大させると観察された。いかなるＢａＰ蛍光の識別できる証拠もなく、これは、４００ｎｍを上回る発光波長で提示されるであろう。
【００８５】
高ＢａＰ含有量の葉試料（試料２６３）についてのＥＥＭを、評価した４つの葉洗浄時間に関して２連で獲得し、図１２に提示する。グループＡにおける試料のＥＥＭを図１２の左に示し、グループＢにおける試料のＥＥＭを右に示す。最上段のＥＥＭは３０秒葉洗浄についてのものであり、第２段のＥＥＭは６０秒葉洗浄についてのものであり、第３段のＥＥＭは１８０秒葉洗浄についてのものであり、及び最下段のＥＥＭは３００秒葉洗浄についてのものである。ＢａＰ領域は、参照用に、図１２において白色の長方形としてマークされている。低ＢａＰ含有量試料に関しては、３１０〜３４０ｎｍの蛍光のレベルの増大は、葉洗浄時間を増大させると観察された。しかしながら、図１２において、図３と図１２との比較から明白なように、ＢａＰの特徴が現れる４００ｎｍを上回って観察される構造化蛍光もあることが分かる。図１１及び１２に示すデータは、ＥＥＭから、ヘキサン中で洗浄したタバコ葉試料が低又は高ＢａＰ含有量を有するものを視覚的に同定することが可能であることを指示している。
【００８６】
検出限界を推定するために、２５５ｎｍ励起における発光スペクトルを、各ＥＥＭから抽出し、低及び高ＢａＰ含有量葉洗浄試料についてそれぞれ図１３及び１４に示す。
【００８７】
２５５ｎｍ励起における発光スペクトルから、１又は２つの発光波長における平均蛍光を異なる葉洗浄時間について計算することにより、潜在的なセンサー表示を確立した。この分析を、３３０ｎｍ及び４００ｎｍ発光波長について、１、１０、２０、３０及び５０ｎｍの半値全幅（ＦＷＨＭ，full-width half-maximum）バンドパス領域で完了した。これらの波長は、３３０ｎｍが、低及び高ＢａＰ含有量葉洗浄試料の両方において観察された短波長蛍光の発光極大に近く、並びに４００ｎｍが、ＢａＰの発光極大に近く、高ＢａＰ含有量葉洗浄試料のみにおける上昇レベルで存在することから、選定したものである。バンドパスは、低すぎるレベルの蛍光を検出すること及び／又は蛍光における単一ナノメートルシフトに敏感であることと、バックグラウンド蛍光がＢａＰ蛍光検出領域に漏入するような広すぎる領域の蛍光を検出することとの間の妥協である。
【００８８】
±５ｎｍの発光バンドパスは最適であることが見出され、種々の葉洗浄時間で、１０ｎｍ（±５ｎｍ）バンドパスを持つ３３０ｎｍの発光ピークにおける平均蛍光を図１５に示し、種々の葉洗浄時間で、１０ｎｍ（±５ｎｍ）バンドパスを持つ４００ｎｍの発光ピークにおける平均蛍光を図１６に示す。
【００８９】
３３０ｎｍ及び４００ｎｍの両方における蛍光は、葉洗浄時間に伴って増大し、低ＢａＰ含有量の葉洗浄試料についてよりも、高ＢａＰ含有量のものについて一貫して高い。
【００９０】
しかしながら、特に３００秒未満では、２つのＢａＰ含有量試料の蛍光強度間に有意差はない（図１５及び１６を参照）。換言すれば、単一蛍光ピークを３００秒未満で使用する場合、高レベルのＢａＰと低レベルのＢａＰとの間を正確に区別するための蛍光強度における有意差はない。
【００９１】
４００／３３０ｎｍ蛍光比（すなわち、発光スペクトルにおける４００ｎｍでのピークの蛍光強度の３３０ｎｍでのピークの蛍光強度に対する比）を、異なる葉洗浄時間について計算し、図１７にプロットする。図１７において提示される４００ｎｍにおける蛍光比対３３０ｎｍにおける蛍光比は、４つの異なる葉洗浄時間にわたる及び各葉洗浄時間の２つの２連試料間の両方の、単一蛍光ピークにおける平均蛍光と比較して、有意により安定な結果を提供した。したがって、蛍光比（４００／３３０ｎｍ）は、ＢａＰ葉含有量を評価する抽出時間非依存方法（最大５分試験）を提供する。
【００９２】
低ＢａＰ含有量の葉試料についての平均蛍光比を測定すること、及び、検出限界を、ブランクを上回る標準偏差の３倍として測定することは、２５５ｎｍ励起におけるデュアル波長蛍光を介して、１０．０ｎＭ／Ｌ（２．５２ｐｇ  ＢａＰ／ｍｌ）ＢａＰの推定検出限界を提供する。これは、未知のＢａＰ含有量を持つ葉試料が、低、中又は高レベルのＢａＰのいずれを有するかを測定するのに十分であると思われた。
【００９３】
分析されたバンドパス領域の範囲についての２５５ｎｍ励起における結果を表３に示し、１０ｎｍバンドパスが、現在のデータセットについて最低の検出限界を提供することを示す。
【００９４】
【表３】
2020512526.tif 000007
【００９５】
より長い波長蛍光に移動することの効果も、例えば、第２の発光波長を４００から４３０ｎｍに移動させることによって評価した。しかしながら、これは、検出限界を推定１０．０ｎＭから２１．３ｎＭに悪化させた。
【００９６】
ベンチトップ型ＥＥＭは、吸光度に対して自動的に補正されるが、単一励起波長における比の追加の利益は、吸光度の大多数が励起波長において発生し、２つの蛍光発光領域が同じ励起波長において励起されるため、蛍光比が、ある程度まで、吸光度非依存性になることである。
【００９７】
このようにして、本発明者らは、タバコ葉洗浄試料のＥＥＭが、特にヘキサン中で洗浄したそれらの試料について、ＢａＰ含有量と相関していることを見出した。さらに、２５５ｎｍ励起での４００／３３０ｎｍ発光における蛍光比は、５分の洗浄時間以下では、抽出時間とは無関係であることが示された。
【実施例２】
【００９８】
低、中又は高レベルのＢａＰのいずれかとして定義されている既知の含有量のＢａＰを有する６つのタバコ葉試料を選択した。およそ１ｇの各タバコ葉試料を２５ｍＬのヘキサンに入れ、１８０秒の間にわたって洗浄した。表４に示す通り、６つのタバコ試料を分析のために選択した。これらの試料は、校正試料として使用するために調製した。実施例１においてヘキサン中で洗浄した場合、低ＢａＰ含有量試料２５９及び高ＢａＰ含有量試料２６３を調査したことに留意されたい。
【００９９】
【表４】
2020512526.tif 000008
【０１００】
試料２５９及び２５８は、低レベルのＢａＰを有すると考えられ、試料２６２及び２６１は、中レベルのＢａＰを有すると考えられ、試料２６０及び２６３は、高レベルのＢａＰを有すると考えられる。
【０１０１】
各事例における、ヘキサン中、１８０秒間にわたる試料の洗浄は、以下の表５に示すように、タバコ葉の表面から５ｗｔ．％未満のＢａＰの除去を引き起こした。表５は、徹底的な抽出、続いて、ガスクロマトグラフィー質量分析法（ＧＣ／ＭＳ）分析（「ＧＣ／ＭＳ総ＢａＰ」と題された第３列を参照）を使用することによって生成されたＢａＰ濃度レベルと、葉洗浄抽出物においてガスクロマトグラフィー高分解能質量分析法（ＧＣ／ＨＲ−ＭＳ，Gas Chromatography High Resolution Mass Spectrometry）分析（「ＰＣＡ  ＧＣ／ＨＲ−ＭＳ葉洗浄試料」と題された第２列を参照）によって測定された濃度レベルとの比較を示す。タバコ葉中における総ＢａＰと比較した葉洗浄試料からのＢａＰ含有量のパーセント比を、表５の第４列に示す：
【０１０２】
【表５】
2020512526.tif 000009
【０１０３】
表５に示す通り、ヘキサン及び１８０秒の洗浄時間を使用してタバコ葉の表面から洗浄したＢａＰの総量は、０．０４〜４．２ｗｔ．％の範囲内であった。
【０１０４】
使用した各葉試料の精密質量を、表６に示す。注目すべき点は、検討中の蛍光比が使用された正確な質量とは無関係であるため、この質量データがデータ処理の一部として使用されなかったことである。各葉試料の３つの複製を生成及び分析した。
【０１０５】
【表６】
2020512526.tif 000010
【０１０６】
ＥＥＭは、HORIBA社製Aqualog（登録商標）を使用し、実施例１において記述されている手順に準拠して獲得した。低ＢａＰ含有量試料のそれぞれについてのＥＥＭを図１８に示し、中ＢａＰ含有量試料のそれぞれについてのＥＥＭを図１９に示し、高ＢａＰ含有量試料のそれぞれについてのＥＥＭを図２０に示す。ＢａＰ蛍光のおよその領域は、参照用の各図において、第１のＥＥＭ上に長方形としてマークされている。図１８〜２０から、ＢａＰ蛍光は、高及び中ＢａＰ含有量試料においては視認でき、低ＢａＰ含有量試料には存在しないことが分かる。およそ３００〜３７０ｎｍの発光波長において観察されたバックグラウンドＵＶ蛍光のレベルは、異なる葉試料間で高度に可変であることも分かる。
【０１０７】
２５５ｎｍ励起における各葉洗浄試料についての平均発光スペクトルを抽出した。各葉洗浄試料についての得られた発光スペクトルを図２１に示し、異なる葉洗浄試料間にわたる葉のバックグラウンド蛍光における可変性を実証する。４０５ｎｍにおけるピーク（ＢａＰの存在を指示するものである）を、図２１において矢印でマークする。ＢａＰの存在は、試料２６３及び２６０（高ＢａＰ含有量）において４００ｎｍ前後で見ることができる。
【０１０８】
実施例１において、２５５ｎｍ励起におけるＢａＰ蛍光の４００／３３０ｎｍ蛍光比を使用して、最低（試料２５９）及び最高（試料２６３）ＢａＰ葉含有量試料を判別し得ることが見出された。４００／３３０ｎｍ蛍光比は、図１８〜２０に示すＥＥＭデータからこのようにして計算されたものである。種々の濃度のＢａＰにおける４００／３３０ｎｍ蛍光比を図２２に示す。図２２から、４００／３３０ｎｍ蛍光比は、ＢａＰ含有量との比較的良好な線形関係（Ｒ２＝０．９０５２）を提供することが分かる。ヘキサン中で洗浄した試料２５９及び２６３についての実施例１において産生されたデータを、これらの結果と組み合わせて、図２３に示すように、線形当てはめを改良した。この追加のデータを、３０、６０、１８０及び３００秒にわたって２連で獲得した。データは、各試料を調製するために使用されたタバコ葉の重量に対して補正されなかった。したがって、蛍光比は、タバコ葉の精密重量、溶媒試料容積及び抽出時間とは無関係であると見受けられる。
【０１０９】
検出限界を、ブランクを上回る標準偏差の３倍として測定すること（この事例では、抽出時間３０〜３００秒において２５９の１１回繰り返し）により、８．６ｎＭ／Ｌの推定検出限界を提供する。
【０１１０】
このようにして、２５５ｎｍ励起における４００／３３０ｎｍ蛍光比は、タバコの質量に対する補正なしに、抽出時間３０〜３００秒における６つの異なる葉試料間にわたる総ＢａＰ葉含有量に対して線形であることが示された。
【０１１１】
抽出されたＢａＰの比の測定
ＢａＰ対マトリックス共抽出物についての蛍光応答の比は、実施例２において上記で同定されたタバコ葉試料すべての蛍光分析から得られたデータの平行因子分析（ＰＡＲＡＦＡＣ，Parallel Factor Analysis）に由来していてよい。
【０１１２】
ＥＥＭのそれぞれにおけるデータは、試料（又はＢａＰ濃度）×励起波長×発光波長の３次元アレイの構成要素となる。
【０１１３】
ＢａＰ濃度と蛍光シグナルとの間に必要とされる予測力（又は高い相関）を提供するモデルを構築するために、ＰＡＲＡＦＡＣを使用して、他の変数、例として共抽出された物質からのシグナルが、モデルの予測力に寄与するか否かを確立した。高い相関を持つ別のシグナルは、モデルをかき乱し、その予測能力を混乱させるであろう。
【０１１４】
ＢａＰからの蛍光シグナルを、視覚的なピークピッキングに基づいて、又は単一発光波長若しくはデュアル発光波長のいずれかにおける蛍光を検証することによって、バックグラウンドから区別することができれば、これは、ＥＥＭデータを大いに単純化する。しかしながら、ＢａＰからの蛍光シグナルがバックグラウンド蛍光シグナルと密着しすぎている場合、より複雑なＥＥＭモデリングが必要とされ得る。おそらく、ＥＥＭデコンボリューションに使用される最も一般的なデータ分析ツールは、ＰＡＲＡＦＡＣである。
【０１１５】
ＥＥＭマトリックスは、３次元データアレイからなり、したがって、多くの場合、一意解に分解することができる。ＰＡＲＡＦＡＣにおいて、交互最小二乗法アプローチを採用して、
【０１１６】
【数３】
2020512526.tif 000011
【０１１７】
における残差の平方和を最小化することによって、３元データマトリックスを解き、式中、ｘｉｊｋは、アレイの一要素、発光波長ｊ及び励起波長ｋにおける試料ｉの蛍光強度である。Ｆは、成分の総数であり、ｆは、個々の成分であり、ここで、成分は、理想的には、個々のフルオロフォアに対応するはずである。最後の項ｅｉｊｋは、原因不明のシグナルからの残差（モデリング及びノイズによって説明されない変動）を表現する。モデルは、パラメーターａ、ｂ及びｃを出力し、これらは、モデル化されたフルオロフォアの、濃度、発光スペクトル及び励起スペクトルを表現するはずである。モデルにより、個々のフルオロフォアの組合せは各フルオロフォアからの寄与の和であること、換言すれば、各成分のＥＥＭは波長ではなく強度で変動し得ることが推測される。
【０１１８】
HORIBA社製Aqualog（登録商標）を、大きい及び可変のＵＶ蛍光バックグラウンドの存在下でＢａＰ蛍光を区別するために使用されてきたＰＡＲＡＦＡＣ用のソフトウェアパッケージEigenvector社製Soloとともにインストールした。
【０１１９】
上記で同定されたヘキサン洗浄葉試料中におけるマトリックス共抽出物の比（既知の低、中及び高ＢａＰ含有量を有する）は、図２４〜２６から広く推定することができる。図２４は、所望のＢａＰ波長についての蛍光応答を示し、これは、全濃度範囲にわたる応答のプロットであるため、ヘキサン葉洗浄試料のすべてからのデータ点（低〜高ＢａＰ含有量）を含み、図２５は、総バックグラウンドＵＶ蛍光を示す。図２４におけるシグナルと図２５におけるシグナルとの勾配比は、０．０４４１である。パーセントとしては、これは４．４％である。これは、ＢａＰと蛍光共マトリックス抽出物との比が、ＢａＰ蛍光シグナルのおよそ４．４％であるということを我々に伝えている。
【０１２０】
ＢａＰと蛍光マトリックス共抽出物との比をさらに調査するために、クロロフィルを例として選択した。クロロフィルは、ＢａＰの蛍光領域へのクロロフィルの寄与がなく、クロロフィルの発光が６８２ｎｍであるため、ＵＶ測定に干渉しないことから、選択された。図２６は、クロロフィルに対する蛍光応答を示す。
【０１２１】
図２４におけるシグナル（ＢａＰ）と図２６におけるシグナル（クロロフィル）との勾配比は、０．０３９４であり、これは、３．９％である。これは、ＢａＰと抽出されたクロロフィルとの比が、現在ＢａＰ蛍光シグナルのおよそ３．９％であるということを我々に伝えている。当然ながら、ＢａＰよりも有意により高いレベルのクロロフィルが期待できるが、これは、潜在的に、いかほどの過剰抽出が葉から発生したかを知らせる適切なマーカーであり得る。
【実施例３】
【０１２２】
未知のレベルのＢａＰを持つ１８の盲検試料を、実施例２において同定された葉試料２５８〜２６３から調製した。およそ１ｇの各盲検タバコ葉試料を２５ｍＬのヘキサンに入れ、１８０秒の間にわたって洗浄した。各盲検葉試料の精密質量を、以下の表７に収載する。
【０１２３】
【表７】
2020512526.tif 000012
【０１２４】
ＥＥＭは、盲検タバコ葉試料のそれぞれについて、HORIBA社製Aqualog（登録商標）を使用し、実施例１において記述されている手順に準拠して獲得した。１８の盲検タバコ葉試料のそれぞれについてのＥＥＭを、図２７ａ〜ｃに示す。
【０１２５】
数種の独立した方法を適用して、各盲検試料におけるＢａＰレベルを確立した。
【０１２６】
最初に、図２２に示す校正プロットを使用して、各盲検試料について２５５ｎｍ励起における４００／３３０ｎｍ蛍光比を個々のＥＥＭから抽出し、予測されるＢａＰ濃度に変換した。結果として得られたプロットを図２８に示し、ここで、低含有量ＢａＰ試料は、２０ｎＭ／Ｌ未満の濃度を持つものとして定義され、中含有量ＢａＰ試料は、２０〜６０ｎＭ／Ｌの濃度を持つものとして定義され、及び高含有量ＢａＰ試料は、６０ｎＭ／Ｌを超える濃度を持つものとして定義される。標準偏差エラーバーとともに示されるデータ点は、実施例２の校正試料を用いて測定される平均蛍光比を表すものである。
【０１２７】
加えて、図２７ａ〜ｃにおけるＥＥＭの視覚的検査は、とりわけＢａＰ蛍光のバックグラウンドが特に特徴的である場合、各盲検試料からの各葉洗浄試料の同一性の良好な指示を提供した。
【０１２８】
上記の方法を使用して、表８に示す通り、盲検試料のそれぞれについて割り当てを行った。
【０１２９】
【表８】
2020512526.tif 000013
【０１３０】
盲検試料のそれぞれを、盲検試料７及び盲検試料１０を除くそれぞれの葉洗浄試料２５８〜２６３に正しく割り当てた。換言すれば、試料の８９％を正しく割り当てた。注目すべき点は、中及び高ＢａＰ含有量葉洗浄試料間の差別化を必要とするため、盲検試料７及び１０の誤った割り当ては理解できると考えられることである。
【０１３１】
盲検試料の蛍光比を、正しい割り当て後、図２９に示す通り、校正試料の蛍光比とともにプロットした。校正及び盲検試料間の優れた一致は、蛍光法を使用して、盲検試料を同定すること及び故に未知のレベルのＢａＰを有するタバコ葉の表面上でのＢａＰのレベルを測定することができることを指示している。
【０１３２】
検出限界を、ブランクを上回る標準偏差の３倍として測定すること（この事例では、校正試料、実施例１からのデータの両方にわたる試料２５９、及びブランク試料）により、１０．８ｎＭの推定検出限界を提供する。この例において測定された検出限界間では、実施例１において分析した２つの試料のみ（２５９及び２６３）から予測されたものと比較して、良好な一致が取得され、ここで、１０．０ｎＭの検出限界が推定された。これは、蛍光比４００／３３０ｎｍが、タバコの精密質量に対する補正なしに、抽出時間３０〜３００秒における６つの異なる葉タイプにわたるＢａＰ含有量のマーカーであることを指示している。
【０１３３】
本明細書において記述されている種々の実施形態は、特許請求されている特色を理解すること及び教示することを補助するためだけに提示されている。これらの実施形態は、実施形態の代表試料としてのみ提供され、網羅的及び／又は排他的ではない。本明細書において記述されている利点、実施形態、例、機能、特色、構造及び／又は他の態様は請求項によって定義される通りの本発明の範囲に対する限定又は請求項の均等物に対する限定と考えられるべきではないこと、並びに他の実施形態が利用されてよく、及び特許請求されている発明の範囲から逸脱することなく修正が為され得ることを理解されたい。本発明の種々の実施形態は、適切に、本明細書において具体的に記述されているもの以外に、開示されている要素、成分、特色、部品、ステップ、手段等の適切な組合せを含むか、それらからなるか、それらから本質的になるものであってよい。加えて、本開示は、現在特許請求されていないが、将来特許請求され得る、他の発明を包含してよい。
【図１】
2020512526.tif 000014
【図２】
2020512526.tif 000015
【図３】
2020512526.tif 000016
【図４】
2020512526.tif 000017
【図５】
2020512526.tif 000018
【図６】
2020512526.tif 000019
【図７】
2020512526.tif 000020
【図８】
2020512526.tif 000021
【図９ａ】
2020512526.tif 000022
【図９ｂ】
2020512526.tif 000023
【図１０】
2020512526.tif 000024
【図１１−１】
2020512526.tif 000025
【図１１−２】
2020512526.tif 000026
【図１２−１】
2020512526.tif 000027
【図１２−２】
2020512526.tif 000028
【図１３】
2020512526.tif 000029
【図１４】
2020512526.tif 000030
【図１５】
2020512526.tif 000031
【図１６】
2020512526.tif 000032
【図１７】
2020512526.tif 000033
【図１８−１】
2020512526.tif 000034
【図１８−２】
2020512526.tif 000035
【図１９−１】
2020512526.tif 000036
【図１９−２】
2020512526.tif 000037
【図２０−１】
2020512526.tif 000038
【図２０−２】
2020512526.tif 000039
【図２１】
2020512526.tif 000040
【図２２】
2020512526.tif 000041
【図２３】
2020512526.tif 000042
【図２４】
2020512526.tif 000043
【図２５】
2020512526.tif 000044
【図２６】
2020512526.tif 000045
【図２７ａ−１】
2020512526.tif 000046
【図２７ａ−２】
2020512526.tif 000047
【図２７ｂ−１】
2020512526.tif 000048
【図２７ｂ−２】
2020512526.tif 000049
【図２７ｃ−１】
2020512526.tif 000050
【図２７ｃ−２】
2020512526.tif 000051
【図２８】
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【図２９】
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【国際調査報告】
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