(57)【要約】合成２パートアプタマー含有ガイドＲＮＡを含む組成物、および該合成２パートアプタマー含有ガイドＲＮＡをＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓアクチベーターシステムで用いる方法。
2020530992.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）クラスター化規則的配置短回文配列反復（ＣＲＩＳＰＲ）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）；および
（ｂ）トランス活性化型ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、
を含む合成２パートガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）であって、
ｃｒＲＮＡが、染色体ＤＮＡの標的配列に相補的な５’配列およびｔｒａｃｒＲＮＡの一部と塩基対合できる３’配列を含む、および
ｔｒａｃｒＲＮＡが、５’テトラループおよび少なくとも１つのステムループを含み、５’テトラループおよび／または少なくとも１つのステムループが、少なくとも１つのヘアピン形成ＲＮＡアプタマー配列を含むように修飾される、
ものである、合成２パートｇＲＮＡ。
【請求項２】
少なくとも１つのヘアピン形成ＲＮＡアプタマー配列が、ＭＳ２配列、ＰＰ７配列、ｃｏｍ配列、ボックスＢ配列、ヒストンｍＲＮＡ３’配列、ＡＵ−リッチ要素（ＡＲＥ）配列、またはその変異体である、請求項１に記載の合成２パートｇＲＮＡ。
【請求項３】
少なくとも１つのヘアピン形成ＲＮＡアプタマー配列が、ｔｒａｃｒＲＮＡの５’テトラループ、少なくとも１つのステムループ、および／または３’末端に位置する、請求項１または２に記載の合成２パートｇＲＮＡ。
【請求項４】
ｔｒａｃｒＲＮＡの少なくとも１つのステムループが、ステムループ１、ステムループ２、およびステムループ３を含み、少なくとも１つのヘアピン形成ＲＮＡアプタマー配列が、５’テトラループおよび／またはステムループ２に位置する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の合成２パートｇＲＮＡ。
【請求項５】
５’テトラループおよび／またはステムループ２が、伸長配列をさらに含む、請求項４に記載の合成２パートｇＲＮＡ。
【請求項６】
伸長配列が、約２ヌクレオチドから約３０ヌクレオチドを含む、請求項５に記載の合成２パートｇＲＮＡ．
【請求項７】
ｃｒＲＮＡが、ｔｒａｃｒＲＮＡの５’テトラループ内の伸長配列または５’テトラループ内の伸長配列の一部と塩基対合できる配列をさらに含む、請求項５または６に記載の合成２パートｇＲＮＡ。
【請求項８】
ｃｒＲＮＡが化学合成されたものである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の合成２パートｇＲＮＡ。
【請求項９】
ｔｒａｃｒＲＮＡがインビトロで酵素的に合成されたものである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の合成２パートｇＲＮＡ。
【請求項１０】
請求項１に規定されるｔｒａｃｒＲＮＡをコードする核酸。
【請求項１１】
インビトロＲＮＡ合成のためのファージＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモーター配列に作動可能に連結される、請求項１０に記載の核酸。
【請求項１２】
ベクターの一部である、請求項１０に記載の核酸。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれか１項に規定されるｔｒａｃｒＲＮＡまたは請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の核酸を含む、キット。
【請求項１４】
少なくとも１つの、請求項１、７または８に規定されるｃｒＲＮＡをさらに含む、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
少なくとも１つのｃｒＲＮＡがｃｒＲＮＡのライブラリーを含む、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
少なくとも１つの機能的ドメインに関連する少なくとも１つのＲＮＡアプタマー結合タンパク質、または少なくとも１つの機能的ドメインに関連する少なくとも１つのＲＮＡアプタマー結合タンパク質をコードする核酸をさらに含む、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１７】
ＲＮＡアプタマー結合タンパク質がＭＣＰ、ＰＣＰ、Ｃｏｍ、Ｎ２２、ＳＬＢＰ、またはＦＸＲ１であり、少なくとも１つの機能的ドメインが転写活性化ドメイン、転写リプレッサードメイン、エピジェネティック修飾ドメイン、マーカードメイン、またはそれらの組み合わせである、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
転写活性化ドメインが、ＶＰ１６活性化ドメイン、ＶＰ６４活性化ドメイン、ＶＰ１６０活性化ドメイン、ＮＦκＢからのｐ６５活性化ドメイン、熱ショック因子１（ＨＳＦ１）活性化ドメイン、ＭｙｏＤ１活性化ドメイン、ＧＣＮ４ペプチド、ウイルスＲトランス活性化因子（Ｒｔａ）、５３活性化ドメイン、ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質（ＣＲＥＢ）活性化ドメイン、Ｅ２Ａ活性化ドメイン、または活性化Ｔ細胞の核因子（ＮＦＡＴ）活性化ドメインである、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
転写リプレッサードメインが、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）リプレッサードメイン、誘導性ｃＡＭＰ初期リプレッサー（ＩＣＥＲ）ドメイン、ＹＹ１グリシンリッチリプレッサードメイン、Ｓｐ１様リプレッサードメイン、Ｅ（ｓｐｌ）リプレッサードメイン、ＩκＢリプレッサードメイン、またはメチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）リプレッサードメインである、請求項１７に記載のキット。
【請求項２０】
エピジェネティック修飾ドメインが、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、アミノ化活性、脱アミノ化活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、脱ミリストイル化活性、シトルリン化活性、アルキル化活性、脱アルキル化活性、ヘリカーゼ活性、酸化活性、またはヌクレオソーム相互作用活性を有している、請求項１７に記載のキット。
【請求項２１】
エピジェネティック修飾ドメインが、ｐ３００ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）、ＡＰＯＢＥＣシチジンデアミナーゼ、またはＴＥＴメチルシトシンジオキシゲナーゼである、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
マーカードメインが、蛍光タンパク質、精製タグ、またはエピトープタグである、請求項１７に記載のキット。
【請求項２３】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質をコードする核酸をさらに含む、請求項１３〜２２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２４】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質がヌクレアーゼ活性を有する、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質が非ヌクレアーゼ活性を有する、請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
ヌクレアーゼ活性を有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼまたは非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼドメインに連結された触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質である、請求項２４の記載のキット。
【請求項２６】
非ヌクレアーゼ活性を有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質が、非ヌクレアーゼドメインに連結された触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質である、請求項２４の記載のキット。
【請求項２７】
非ヌクレアーゼドメインが転写活性化ドメイン、転写リプレッサードメイン、またはエピジェネティック修飾ドメインである、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
転写活性化ドメインが、ＶＰ１６活性化ドメイン、ＶＰ６４活性化ドメイン、ＶＰ１６０活性化ドメイン、ＮＦκＢ  ｐ６５活性化ドメイン、熱ショック因子１（ＨＳＦ１）活性化ドメイン、ＭｙｏＤ１活性化ドメイン、ＧＣＮ４ペプチド、ウイルスＲトランス活性化因子（Ｒｔａ）、５３活性化ドメイン、ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質（ＣＲＥＢ）活性化ドメイン、Ｅ２Ａ活性化ドメイン、または活性化Ｔ細胞の核因子（ＮＦＡＴ）活性化ドメインである、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
転写リプレッサードメインが、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）リプレッサードメイン、ＹＹ１グリシンリッチリプレッサードメイン、Ｓｐ１様リプレッサードメイン、Ｅ（ｓｐｌ）リプレッサードメイン、ＩκＢリプレッサードメイン、またはメチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）リプレッサードメインである、請求項２７に記載のキット。
【請求項３０】
エピジェネティック修飾ドメインが、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、アミノ化活性、脱アミノ化活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、脱ミリストイル化活性、シトルリン化活性、アルキル化活性、脱アルキル化活性、ヘリカーゼ活性、酸化活性、またはヌクレオソーム相互作用活性を有している、請求項２７に記載のキット。
【請求項３１】
エピジェネティック修飾ドメインが、ｐ３００ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）、ＡＰＯＢＥＣシチジンデアミナーゼ、またはＴＥＴメチルシトシンジオキシゲナーゼである、請求項３０に記載のキット。
【請求項３２】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質が、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、請求項２３〜３１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３３】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質が、少なくとも１つの核局在化シグナル、少なくとも１つの細胞透過性ペプチド、少なくとも１つのマーカードメイン、またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項２３〜３２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３４】
（ａ）請求項１から９のいずれか１つで規定された合成２パートｇＲＮＡ；
（ｂ）請求項１６から２２のいずれか１つで規定された少なくとも１つのＲＮＡアプタマー結合タンパク質；および
（ｃ）請求項２３から３３のいずれか１つで規定されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、
を含む組成物。
【請求項３５】
（ａ）請求項１から９のいずれか１つで規定された合成２パートｇＲＮＡ；
（ｂ）請求項１６から２２のいずれか１つで規定された少なくとも１つのＲＮＡアプタマー結合タンパク質；および
（ｃ）請求項２３から３３のいずれか１つで規定されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、
を細胞に導入することを含む、真核細胞における標的化転写活性化、標的化転写抑制、標的化エピゲノム修飾、標的化ゲノム修飾、または標的化ゲノム遺伝子座の視覚化のための方法。
【請求項３６】
（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の組み合わせが、ｇＲＮＡがＲＮＡアプタマー配列を含まないＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムと比較して、増大した効率および／または特異性を有する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
１つ以上の追加のｃｒＲＮＡを導入することをさらに含み、各追加のｃｒＲＮＡが異なる５’配列であるがユニバーサル３’配列を含むものである、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項３８】
少なくとも１つのドナー配列を含むドナーポリヌクレオチドを真核細胞に導入することをさらに含み、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質がヌクレアーゼ活性を有するものである、請求項３５から３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
真核細胞がインビトロである、請求項３５から３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
真核細胞がインビボである、請求項３５から３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
真核細胞が哺乳動物細胞である、請求項３５から４０のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、ＲＮＡアプタマー配列を含む合成２パートガイドＲＮＡおよびその使用に関する
【背景技術】
【０００２】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９相乗的活性化メディエーター（ＳＡＭ）システム（Konermann et al., Nature, 2015, 517(7536):583-588）は、ＶＰ６４−ｄＣａｓ９人工転写因子と、追加の転写コアクチベーターを補充するアプタマー−ｓｇＲＮＡとの組み合わせにより、高レベルの転写活性化のプラットフォームを提供する。追加のアプタマー配列のため、単一のＳＡＭ−ｇＲＮＡの化学合成は依然として困難である。したがって、ｓｇＲＮＡの使用は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ＳＡＭシステムの使いやすさと効率を制限し得る。したがって、必要なことは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓアクチベーターシステムで使用するための、容易かつ効率的に生産できる２パートのアプタマーを含むｇＲＮＡシステムである。
【発明の概要】
【０００３】
概要
本開示の様々な態様には、合成２パートガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の提供があり、各々の２パートｇＲＮＡは、（ａ）クラスター化規則的配置短回文配列反復（ＣＲＩＳＰＲ）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）および（ｂ）トランス活性化型ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む。各々のｃｒＲＮＡは、染色体ＤＮＡの標的配列に相補的な５’配列とｔｒａｃｒＲＮＡの一部と塩基対合することができる３’配列を含み、各々のｔｒａｃｒＲＮＡは、５’テトラループと少なくとも１つのステムループを含み、および５’テトラループおよび／または少なくとも１つのステムループは、少なくとも１つのヘアピン形成ＲＮＡアプタマー配列を含むように修飾される。
【０００４】
一般に、少なくとも１つのヘアピン形成ＲＮＡアプタマー配列は、ＭＳ２配列、ＰＰ７配列、ｃｏｍ配列、ボックスＢ配列、ヒストンｍＲＮＡ３’配列、ＡＵ−リッチ要素（ＡＲＥ）配列、またはその変異体であり、少なくとも１つのヘアピン形成ＲＮＡアプタマー配列は、ｔｒａｃｒＲＮＡの５’テトラループ、少なくとも１つのステムループ、および／または３’末端に位置し得る。
【０００５】
いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡの少なくとも１つのステムループは、ステムループ１、ステムループ２、およびステムループ３を含み、少なくとも１つのヘアピン形成ＲＮＡアプタマー配列は、５’テトラループおよび／またはステムループ２に位置し得る。いくつかの例では、５’テトラループおよび／またはステムループ２は、約２ヌクレオチドから約３０ヌクレオチドの範囲であり得る伸長配列をさらに含み得る。特定の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡの５’テトラループ内の伸長配列または５’テトラループ内の伸長配列の一部と塩基対合することができる配列をさらに含む。
【０００６】
特定の実施形態では、ｃｒＲＮＡは化学的に合成され、ｔｒａｃｒＲＮＡはインビトロで酵素的に合成される。
【０００７】
本明細書では、上記のようなｔｒａｃｒＲＮＡをコードする核酸も提供される。
【０００８】
本開示の別の態様は、上記で定義されたｔｒａｃｒＲＮＡを含むキットを包含する。いくつかの実施形態では、キットは、上記の少なくとも１つのｃｒＲＮＡをさらに含む。いくつかの例では、少なくとも１つのｃｒＲＮＡはｃｒＲＮＡ分子のライブラリーを含む。
【０００９】
さらなる実施形態では、キットは、少なくとも１つの機能的ドメインに関連する少なくとも１つのＲＮＡアプタマー結合タンパク質、または少なくとも１つの機能的ドメインに関連する少なくとも１つのＲＮＡアプタマー結合タンパク質をコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡアプタマー結合タンパク質はＭＣＰ、ＰＣＰ、Ｃｏｍ、Ｎ２２、ＳＬＢＰ、またはＦＸＲ１であってもよく、少なくとも１つのＲＮＡアプタマー結合タンパク質に関連する少なくとも１つの機能的ドメインは転写活性化ドメイン、転写リプレッサードメイン、エピジェネティック修飾ドメイン、マーカードメイン、またはそれらの組み合わせであってもよい。様々な実施形態では、転写活性化ドメインは、ＶＰ１６活性化ドメイン、ＶＰ６４活性化ドメイン、ＶＰ１６０活性化ドメイン、ＮＦκＢからのｐ６５活性化ドメイン、熱ショック因子１（ＨＳＦ１）活性化ドメイン、ＭｙｏＤ１活性化ドメイン、ＧＣＮ４ペプチド、ウイルスＲトランス活性化因子（Ｒｔａ）、５３活性化ドメイン、ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質（ＣＲＥＢ）活性化ドメイン、Ｅ２Ａ活性化ドメイン、または活性化Ｔ細胞の核因子（ＮＦＡＴ）活性化ドメインであってもよい。別の実施形態では、転写リプレッサードメインは、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）リプレッサードメイン、誘導性ｃＡＭＰ初期リプレッサー（ＩＣＥＲ）ドメイン、ＹＹ１グリシンリッチリプレッサードメイン、Ｓｐ１様リプレッサードメイン、Ｅ（ｓｐｌ）リプレッサードメイン、ＩκＢリプレッサードメイン、またはメチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）リプレッサードメインであってもよい。さらに他の実施形態では、エピジェネティック修飾ドメインは、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、アミノ化活性、脱アミノ化活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、脱ミリストイル化活性、シトルリン化活性、アルキル化活性、脱アルキル化活性、ヘリカーゼ活性、酸化活性、またはヌクレオソーム相互作用活性を有してもよい。特定の実施形態では、エピジェネティック修飾ドメインは、ｐ３００ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）、ＡＰＯＢＥＣシチジンデアミナーゼ、またはＴＥＴメチルシトシンジオキシゲナーゼであってもよい。さらに他の実施形態では、マーカードメインは、蛍光タンパク質、精製タグ、またはエピトープタグであってもよい。特定の例において、ＲＮＡアプタマー結合タンパク質は、少なくとも１つの核局在化シグナル、少なくとも１つの細胞透過性ペプチド、少なくとも１つのマーカードメイン、またはそれらの組み合わせをさらに含むことができる。
【００１０】
さらなる実施形態では、キットは、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質をコードする核酸をさらに含むことができる。いくつかの例では、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質はヌクレアーゼ活性を有することができ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼまたは非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼドメインに連結された触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質であり得る。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質はＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼであり得る。他の例では、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、非ヌクレアーゼドメインに連結された触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質であり、非ヌクレアーゼドメインは転写活性化ドメイン、転写リプレッサードメイン、またはエピジェネティック修飾ドメインであってもよく、その例は上記のとおりである。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、非ヌクレアーゼドメインに連結された触媒的に不活性な（死んだ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９タンパク質であり得る。特定の例において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、少なくとも１つの核局在化シグナル、少なくとも１つの細胞透過性ペプチド、少なくとも１つのマーカードメイン、またはそれらの組み合わせをさらに含むことができる。
【００１１】
本開示のさらなる態様は、本明細書で定義される合成２パートｇＲＮＡ、本明細書で定義される少なくとも１つのＲＮＡアプタマー結合タンパク質、および本明細書で定義される少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質を含む組成物を含む。
【００１２】
本開示の他の態様は、真核細胞における標的化転写活性化、標的化転写抑制、標的化エピゲノム修飾、標的化ゲノム修飾、または標的化ゲノム遺伝子座視覚化のための方法を包含する。該方法は、真核細胞に（ａ）上記で定義される合成２パートｇＲＮＡ、（ｂ）本明細書で定義される少なくとも１つのＲＮＡアプタマー結合タンパク質またはそれをコードする核酸、および（ｃ）本明細書で定義される少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質またはそれをコードする核酸を導入することを含み、ここで、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および染色体ＤＮＡの標的配列の間の相互作用が、真核細胞の標的化転写活性化、標的化転写抑制、標的化エピゲノム修飾、標的化ゲノム修飾、または標的化ゲノム遺伝子座の可視化をもたらす。この方法は、１つまたは複数の追加のｃｒＲＮＡを導入することをさらに含んでもよく、各追加のｃｒＲＮＡは、異なる５’配列であるが、ユニバーサル３’配列を含む。
【００１３】
種々の実施形態では、真核細胞は、インビトロまたはインビボであり得る。他の状況では、真核細胞は、ヒト細胞などの哺乳動物細胞であり得る。
【００１４】
本開示の他の特徴および態様を、以下に詳述する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、２パートｃｒＲＮＡ（配列番号３８）およびアプタマー−ｔｒａｃｒＲＮＡ（配列番号３９）（設計＃１）の配列および二次構造を示す。ｔｒａｃｒＲＮＡのテトラループ伸長には下線が引かれ、ｔｒａｃｒＲＮＡのＭＳ２ステムループ構造は太字で示される。
【００１６】
【図２Ａ】図２Ａは、ＨＥＫ２９３細胞におけるＣＲＩＳＰＲ２パート合成ｃｒＲＮＡおよびアプタマー−ｔｒａｃｒＲＮＡシステムを用いたＰＯＵ５Ｆ１遺伝子の標的化活性化を示す。
【００１７】
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＨＥＫ２９３細胞におけるＣＲＩＳＰＲ２パート合成ｃｒＲＮＡおよびアプタマー−ｔｒａｃｒＲＮＡシステムを用いたＩＬ１Ｂ遺伝子の標的化活性化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本開示は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓアクチベーターシステムで使用するためのアプタマー配列を含む合成２パートガイドＲＮＡを提供する。２パートシステムは、標的特異的ｃｒＲＮＡおよびユニバーサルアプタマー−ｔｒａｃｒＲＮＡを含む。短い標的特異的ｃｒＲＮＡは容易に化学合成でき、より長いユニバーサルアプタマー−ｔｒａｃｒＲＮＡはインビトロで酵素的に合成でき、後の使用のために保存できる。あるいは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの両方を化学的に合成できる。本明細書では、合成２パートガイドＲＮＡを含む組成物、合成２パートガイドＲＮＡを含むキット、および合成２パートガイドＲＮＡを使用する方法も提供する。
【００１９】
（Ｉ）合成２パートガイドＲＮＡ
本開示の一態様は、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化型ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含むまたはからなる合成２パートガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を提供し、ここで、ｔｒａｃｒＲＮＡは少なくとも１つのヘアピン形成ＲＮＡアプタマー配列を含む。
【００２０】
（ａ）ｃｒＲＮＡ
本明細書に開示される合成２パートｇＲＮＡはｃｒＲＮＡを含む。各々のｃｒＲＮＡは、染色体ＤＮＡの標的配列に相補的な５’配列（すなわち、スペーサー配列）、およびｔｒａｃｒＲＮＡの一部と塩基対合が可能な３’配列を含む。５’スペーサー配列は各々のｃｒＲＮＡで異なるが、３’配列は一般に各々のｃｒＲＮＡで同じである。
【００２１】
ｃｒＲＮＡの５’末端のスペーサー配列は、ｃｒＲＮＡが標的配列とハイブリダイズできるように、染色体ＤＮＡの標的配列（すなわち、プロトスペーサー配列）に相補的である。標的配列には、配列がプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接していることを除いて、配列の制限はない。例えば、さまざまなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質のＰＡＭ配列には、５’−ＮＧＧ（ＳｐＣａｓ９）、５’−ＮＧＧＮＧ（Ｓｔ３Ｃａｓ９）、５’−ＮＮＡＧＡＡＷ（Ｓｔ１Ｃａｓ９）、５’−ＮＮＧＲＲＴ（ＳａＣａｓ９）、５’ＮＮＮＮＧＡＴＴ（ＮｍＣａｓ９）および５’−ＴＴＴＮ（ＡｓＣｐｆ１）が含まれ、ここでＮは任意のヌクレオチドとして定義され、ＷはＡまたはＴとして定義される。
【００２２】
標的配列と相補性を有する５’スペーサー配列の長さは、約１０ヌクレオチドから約２５ヌクレオチド超の範囲であり得る。いくつかの態様では、ｃｒＲＮＡのスペーサー配列と標的配列との間の塩基対の領域は、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３ヌクレオチド長であり得る。特定の実施形態では、ｃｒＲＮＡのスペーサー配列と標的配列との間の塩基対形成の領域は、１９、２０、または２１ヌクレオチド長であり得る。例えば、ＳｐＣａｓ９  ｃｒＲＮＡのスペーサー配列はＮ２０またはＧＮ１７−２０ＧＧを含むことができる。一般に、ｃｒＲＮＡのスペーサー配列と標的配列との間の配列同一性は、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％であり得る。当業者は、標的配列との配列同一性の増加により、オフターゲット効果がより少なくなり得ることを理解する。
【００２３】
ｃｒＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端付近の配列と塩基対合できる３’配列も含む。ｃｒＲＮＡの３’配列の長さは、約５ヌクレオチドから約２５ヌクレオチドの範囲であり得る。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡの３’配列の長さは、約９ヌクレオチドから約１５ヌクレオチドの範囲であり得る。特定の実施形態では、ｃｒＲＮＡの３’配列の長さは約１２ヌクレオチドであり得る。ｃｒＲＮＡの３’配列と相補的なｔｒａｃｒＲＮＡ配列の間の配列同一性は、一般に少なくとも約５０％である。したがって、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの間の塩基対形成は、少なくとも２つの連続した塩基対のストレッチ（例えば、ハイブリダイズしていない配列によって分離された３つ以上の連続した塩基対の２つ以上のストレッチ）を含み得る。
【００２４】
いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡの５’テトラループの伸長配列または５’テトラループの伸長配列の一部と塩基対合できる追加の３’配列をさらに含み得る（下記を参照）。ｃｒＲＮＡの追加の配列は、約２ヌクレオチドから約３０ヌクレオチドの範囲であり得る。ｃｒＲＮＡの追加配列と５’テトラループの伸長配列の配列同一性は、一般的に少なくとも約５０％である。
【００２５】
一般的に、ｃｒＲＮＡは固相合成技術を使用して化学的に合成される。したがって、ｃｒＲＮＡは標準リボヌクレオチドまたは修飾リボヌクレオチドを含み得る。修飾リボヌクレオチドには、塩基修飾（例えば、シュードウリジン、２−チオウリジン、Ｎ６−メチルアデノシンなど）および／または糖修飾（例えば、２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、２’−アミノ、ロックト核酸（ＬＮＡ）など）が含まれる。ｃｒＲＮＡの骨格は、ホスホロチオエートまたはボラノホスフェート結合またはペプチド核酸を含むように修飾することもできる。ｃｒＲＮＡの５’および３’末端は、蛍光色素（例えば、ＦＡＭ、ＴＭＲ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、テキサスレッド、オレゴングリーン、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒｓ、Ｈａｌｏタグなど）、検出タグ（例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン、量子ドット、金粒子など）、ポリマー、タンパク質などの機能的部分が結合し得る。当業者は、ｃｒＲＮＡをインビトロで酵素的に合成することもできることを理解するであろう。
【００２６】
（ｂ）アプタマー−ｔｒａｃｒＲＮＡ
本明細書に開示される合成２パートｇＲＮＡは、少なくとも１つのヘアピン形成ＲＮＡアプタマー配列を含むｔｒａｃｒＲＮＡも含む。本明細書に開示されるｔｒａｃｒＲＮＡは、５’から３’へ、５’テトラループ、ｃｒＲＮＡと塩基対合できる配列、少なくとも１つの内部ステムループ、および一本鎖３’配列を含む。少なくとも１つの内部ステムループは、１つのステムループ、２つのステムループ、３つのステムループ、４つのステムループ、５つのステムループ、または５つを超えるステムループを含み得る。特定の実施形態では、少なくとも１つの内部ステムループは、ステムループ１、ステムループ２、およびステムループ３を含み得る（図１を参照）。ｔｒａｃｒＲＮＡの内部ステムループは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質と相互作用して安定した三元ＤＮＡ−ｇＲＮＡ−タンパク質複合体を形成する二次構造を形成し得る。ｔｒａｃｒＲＮＡの配列および／または二次構造は、例えば、複合体を形成するように設計されているＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質（例えば、ＳｐＣａｓ９、ＳａＣａｓ９、ＣｊＣａｓ９など）の同一性に応じて変化し得る。
【００２７】
本明細書に開示されるｔｒａｃｒＲＮＡは、少なくとも１つのヘアピン形成ＲＮＡアプタマー配列をさらに含む。少なくとも１つのヘアピン形成ＲＮＡアプタマー配列は、ｔｒａｃｒＲＮＡの５’テトラループ、少なくとも１つの内部ステムループ、および／または３’末端に配置され得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヘアピン形成ＲＮＡアプタマー配列は、５’テトラループに位置し得る。他の実施形態では、少なくとも１つのヘアピン形成ＲＮＡアプタマー配列は、ｔｒａｃｒＲＮＡの少なくとも１つの内部ステムループに位置し得る。例えば、少なくとも１つのヘアピン形成ＲＮＡアプタマー配列はステムループ２に位置し得る。さらなる実施形態では、少なくとも１つのヘアピン形成ＲＮＡアプタマー配列はｔｒａｃｒＲＮＡの３’末端に位置し得る。さらに他の実施形態では、ヘアピン形成ＲＮＡアプタマー配列は、５’テトラループおよびステムループ２に位置し得る。他の実施形態では、ヘアピン形成ＲＮＡアプタマー配列は、ｔｒａｃｒＲＮＡの５’テトラループおよび３’末端に位置し得る。さらなる実施形態では、ヘアピン形成ＲＮＡアプタマー配列は、ｔｒａｃｒＲＮＡの５’テトラループ、ステムループ２、および３’末端に位置し得る。
【００２８】
様々なヘアピン形成ＲＮＡアプタマー配列が、本明細書に開示されているｔｒａｃｒＲＮＡに含まれ得る。ヘアピン形成ＲＮＡアプタマー配列は、以下に列挙されるアプタマー配列のいずれかの複数または組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヘアピン形成ＲＮＡアプタマー配列は、ＭＳ２バクテリオファージコートタンパク質（ＭＣＰ）に結合するＭＳ２アプタマー配列またはその変異体であり得る（Lowary et al., Nuc Acid Res, 1987, 15(24):10483-10493）。ＭＳ２変異体には、Ｆ５およびＦ６アプタマーが含まれる（Parrott et al., Nucl Acids Res, 2000, 28(2):489-497）。他の実施形態において、少なくとも１つのヘアピン形成ＲＮＡアプタマー配列は、ＰＰ７バクテリオファージコートタンパク質（ＰＣＰ）に結合するＰＰ７配列であり得る（Lim et al., J Biol Chem, 2001, 276(25):22507-22513）。他の実施形態では、少なくとも１つのヘアピン形成ＲＮＡアプタマー配列は、ＭｕバクテリオファージＣｏｍタンパク質に結合するｃｏｍ配列であり得る（Hattman, Pharmacol & Ther, 1999, 84(3):367-388）。さらなる実施形態では、少なくとも１つのヘアピン形成ＲＮＡアプタマー配列は、ラムダバクテリオファージＮ２２タンパク質に結合するボックスＢ配列であり得る（Daigle et al., Nat Methods, 2007, 4:633-636）。さらなる実施形態では、少なくとも１つのヘアピン形成ＲＮＡアプタマー配列は、脆弱Ｘ精神遅滞症候群関連タンパク質１（ＦＸＲ１）に結合するＡＵ−リッチ要素（ＡＲＥ）配列であり得る（Vasudevan et al., Science, 2007, 318(5858):1931-1934）。さらに他の実施形態では、少なくとも１つのヘアピン形成ＲＮＡアプタマー配列は、ステムループ結合タンパク質（ＳＬＢＰ）に結合するヒストンｍＲＮＡ３’配列であり得る。さらに他の実施形態では、少なくとも１つのヘアピン形成ＲＮＡアプタマー配列は、ＡＰ２０５、ＢＺ１３、ｆ１、ｆ２、ｆｄ、ｆｒ、ＩＤ２、ＪＰ３４／ＧＡ、ＪＰ５０１、ＪＰ３４、ＪＰ５００、ＫＵ１、Ｍ１１、Ｍ１２、ＭＸ１、ＮＬ９５、ＰＰ７、φＣｂ５、φＣｂ８ｒ、φＣｂ１２ｒ、φＣｂ２３ｒ、Ｑβ、Ｒ１７、ＳＰ−β、ＴＷ１８、ＴＷ１９、またはＶＫから選択されるバクテリオファージからのタンパク質に結合する配列であり得る。
【００２９】
ｔｒａｃｒＲＮＡの少なくとも１つのループに導入されるヘアピン形成ＲＮＡアプタマー配列の長さは、ヘアピン形成ＲＮＡアプタマー配列の同一性に応じて変化し得る、および変化するであろう。例えば、ＭＳ２アプタマー配列は約３４ヌクレオチド長であり得る。種々の実施形態では、ヘアピン形成ＲＮＡアプタマー配列は、長さが約１０ヌクレオチドから約５０ヌクレオチドの範囲であり得る。
【００３０】
少なくとも１つのヘアピン形成ＲＮＡアプタマー配列が５’テトラループおよび／または１つ以上の内部ステムループに位置する実施形態では、５’テトラループおよび／または内部ステムループは伸長配列をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヘアピン形成ＲＮＡアプタマー配列は５’テトラループに位置し、５’テトラループはさらに伸長配列を含む。そのような実施形態では、ｃｒＲＮＡは、５’テトラループに伸長配列に相補的な配列、または５’テトラループに伸長配列の一部をさらに含み得る（非限定的な例が図１に示される）。
【００３１】
伸長配列は、長さが約２ヌクレオチドから約３０ヌクレオチドの範囲であり得る。いくつかの実施形態では、伸長配列は、長さが約３ヌクレオチドから約２５ヌクレオチド、または約５ヌクレオチドから約２５ヌクレオチドの範囲であり得る。様々な実施形態では、伸長配列は、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチドを含み得る。特定の実施形態では、伸長配列は、４ヌクレオチド、６ヌクレオチド、８ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、または２０ヌクレオチドを含み得る。
【００３２】
アプタマー−ｔｒａｃｒＲＮＡの全長は、ＲＮＡアプタマー配列の同一性、ｔｒａｃｒＲＮＡに存在するＲＮＡアプタマー配列の数、および任意の伸長配列の長さに依存して変化し得る、および変化するであろう。一般に、アプタマー−ｔｒａｃｒＲＮＡの長さは約８０ヌクレオチドから約３００ヌクレオチドの範囲であり得る。様々な実施形態では、アプタマー−ｔｒａｃｒＲＮＡの全長は、最大約１２０ヌクレオチド、最大約１２５ヌクレオチド、最大約１５０ヌクレオチド、最大約１７５ヌクレオチド、最大約２００ヌクレオチド、最大約２２５ヌクレオチド、最大約２５０ヌクレオチド、最大約２７５ヌクレオチド、または最大約３００ヌクレオチドまでの範囲であり得る。
【００３３】
いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡはインビトロで酵素的に合成され得る。例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡは、以下のセクション（ＩＶ）で詳述されるように、ファージＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーター配列に作動可能に連結され得る。そのようなものとして、ｔｒａｃｒＲＮＡは標準リボヌクレオチド（またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用される酵素によって組み込まれ得るもの）を含む。他の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは化学的に合成でき、標準リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、標準ホスホジエステル結合、または修飾結合（例えば、ホスホロチオエート、ボラノホスフェート、またはペプチド核酸結合）を含み得る。
【００３４】
（ＩＩ）組成物
本開示の他の態様は、１）セクション（Ｉ）で上述した合成２パートガイドＲＮＡおよび少なくとも１つのＲＮＡアプタマー結合タンパク質、または２）合成２パートガイドＲＮＡ、少なくとも１つのＲＮＡアプタマー結合タンパク質、および少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、を含むまたはからなる組成物を包含する。一部の実施形態では、組成物は、少なくとも１つのＲＮＡアプタマー結合タンパク質および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を含み得る（以下のセクション（ＩＶ）を参照）。
【００３５】
（ａ）ＲＮＡアプタマー結合タンパク質
組成物は、少なくとも１つのＲＮＡアプタマー結合タンパク質を含む。ＲＮＡアプタマー結合タンパク質は、合成２パートガイドＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡにある１つ以上のアプタマー配列に結合する。ＲＮＡアプタマータンパク質は一般に、少なくとも１つの機能的ドメインと関連している。少なくとも１つの機能的ドメインは、転写活性化ドメイン、転写リプレッサードメイン、エピジェネティック修飾ドメイン、マーカードメイン、またはそれらの組み合わせであり得る。
【００３６】
（ｉ）ＲＮＡアプタマー結合タンパク質
適切なＲＮＡアプタマー結合タンパク質の非限定的な例には、ＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ）、ＰＰ７バクテリオファージコートタンパク質（ＰＣＰ）、ＭｕバクテリオファージＣｏｍタンパク質、ラムダバクテリオファージＮ２２タンパク質、ステムループ結合タンパク質（ＳＬＢＰ）、および脆弱Ｘ精神遅滞症候群関連タンパク質１（ＦＸＲ１）が含まれる。他の実施形態において、ＲＮＡアプタマー結合タンパク質は、ＡＰ２０５、ＢＺ１３、ｆ１、ｆ２、ｆｄ、ｆｒ、ＩＤ２、ＪＰ３４／ＧＡ、ＪＰ５０１、ＪＰ３４、ＪＰ５００、ＫＵ１、Ｍ１１、Ｍ１２、ＭＸ１、ＮＬ９５、ＰＰ７、φＣｂ５、φＣｂ８ｒ、φＣｂ１２ｒ、φＣｂ２３ｒ、Ｑβ、Ｒ１７、ＳＰ−β、ＴＷ１８、ＴＷ１９、またはＶＫから選択されるバクテリオファージからのタンパク質であり得る。
【００３７】
（ｉｉ）機能的ドメイン
ＲＮＡアプタマー結合タンパク質は、少なくとも１つの機能的ドメインと関連しており、機能的ドメインは、転写活性化ドメイン、転写リプレッサードメイン、エピジェネティック修飾ドメイン、マーカードメイン、またはそれらの組み合わせである。
【００３８】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの機能的ドメインは転写活性化ドメインであり得る。適切な転写活性化ドメインには、限定的ではないが、単純ヘルペスウイルスＶＰ１６ドメイン、ＶＰ６４（ＶＰ１６の四量体誘導体）、ＶＰ１６０（すなわち１０ｘＶＰ１６）、ＮＦκＢからのｐ６５活性化ドメイン、熱ショック因子１（ＨＳＦ１）活性化ドメイン、ＭｙｏＤ１活性化ドメイン、ＧＣＮ４ペプチド、１０ｘＧＣＮ４、ウイルスＲトランス活性化因子（Ｒｔａ）、ＶＰＲ（ＶＰ６４−ｐ６５−Ｒｔａの融合）、ｐ５３活性化ドメイン１および２、ＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質）活性化ドメイン、Ｅ２Ａ活性化ドメイン、または活性化Ｔ細胞の核因子（ＮＦＡＴ）活性化ドメインが含まれる。
【００３９】
他の実施形態では、少なくとも１つの機能的ドメインは転写リプレッサードメインであり得る。適切な転写リプレッサードメインの非限定的な例には、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）リプレッサードメイン、誘導性ｃＡＭＰアーリーリプレッサー（ＩＣＥＲ）ドメイン、ＹＹ１グリシンリッチリプレッサードメイン、Ｓｐ１様リプレッサー、Ｅ（ｓｐｌ）リプレッサー、ＩκＢリプレッサー、またはメチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）リプレッサードメインが含まれる。
【００４０】
さらなる実施形態では、少なくとも１つの機能的ドメインはエピジェネティック修飾ドメインであり得る。エピジェネティック修飾ドメインは、ＤＮＡまたはクロマチンの構造を変更し得る（ＤＮＡ配列を変更する場合もしない場合もある）。適切なエピジェネティック修飾ドメインの非限定的な例には、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性（例えば、シトシンメチルトランスフェラーゼ）、ＤＮＡデメチラーゼ活性、ＤＮＡ脱アミノ化（例えば、シトシンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、グアニンデアミナーゼ）、ＤＮＡアミノ化、ＤＮＡ酸化活性、ＤＮＡヘリカーゼ活性、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）活性（例えば、Ｅ１Ａ結合タンパク質ｐ３００に由来するＨＡＴドメイン）、ヒストンデアセチラーゼ活性、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性、ヒストンデメチラーゼ活性、ヒストンキナーゼ活性、ヒストンホスファターゼ活性、ヒストンユビキチンリガーゼ活性、ヒストン脱ユビキチン化活性、ヒストンアデニル化活性、ヒストン脱アデニル化活性、ヒストンＳＵＭＯ化活性、ヒストン脱ＳＵＭＯ化活性、ヒストンリボシル化活性、ヒストン脱リボシル化活性、ヒストンミリストイル化活性、ヒストン脱ミリストイル化活性、ヒストンシトルリン化活性、ヒストンアルキル化活性、ヒストン脱アルキル化活性、ヒストン酸化活性、またはヌクレオソーム相互作用／リモデリング活性が含まれる。特定の実施形態では、エピジェネティック修飾ドメインは、シチジンデアミナーゼ活性、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性、またはＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性を含み得る。特定の実施形態では、エピジェネティック修飾ドメインは、ｐ３００ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）、ＡＰＯＢＥＣシチジンデアミナーゼ、またはＴＥＴメチルシトシンジオキシゲナーゼであり得る。
【００４１】
さらに他の実施形態では、少なくとも１つの機能的ドメインはマーカードメインであり得る。マーカードメインには、蛍光タンパク質および精製タグまたはエピトープタグが含まれる。適切な蛍光タンパク質には、限定的ではないが、緑色蛍光タンパク質（例えば：ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ＧＦＰ−２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ１）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１）、青色蛍光タンパク質（例えば：ＢＦＰ、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａ１、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ−ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎ１、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（例えば：ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄ１、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）、およびオレンジ蛍光タンパク質（例えば：ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、Ｍｏｎｏｍｅｒｍｅｒｉｃ  Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）が含まれる。適切な精製またはエピトープタグの非限定的な例には、６ｘＨｉｓ、ＦＬＡＧ（登録商標）、ＨＡ、ＧＳＴ、Ｍｙｃなどが含まれる。
【００４２】
（ｉｉｉ）ＲＮＡ結合タンパク質と機能的ドメインとの関連
ＲＮＡアプタマー結合タンパク質は、少なくとも１つの機能的ドメインと関連する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡアプタマー結合タンパク質は、１つの機能的ドメインと関連し得る。他の実施形態では、ＲＮＡアプタマー結合タンパク質は、２つの機能的ドメインと関連し得る。さらなる実施形態では、ＲＮＡアプタマー結合タンパク質は、３つの機能的ドメインと関連し得る。追加の実施形態では、ＲＮＡアプタマー結合タンパク質は、４つの２つの機能的ドメインまたは４つより多い機能的ドメインと関連し得る。ＲＮＡアプタマー結合タンパク質に関連する機能的ドメインは、同じ機能を持つことも、異なる機能を持つこともできる。例えば、ＲＮＡアプタマー結合タンパク質は、２つの転写活性化ドメイン、２つのエピジェネティック修飾ドメイン、転写活性化ドメインおよびエピジェネティック修飾ドメイン、少なくとも１つの転写活性化ドメインおよびマーカードメインなどと関連し得る。
【００４３】
ＲＮＡアプタマー結合タンパク質は、化学結合を介して直接、またはリンカーを介して間接的に、少なくとも１つの機能的ドメインと結合し得る。化学結合は共有結合（例えば、ペプチド結合、エステル結合など）であり得る。あるいは、化学結合は非共有結合（例えば、イオン性、静電性、水素、疎水性、ファンデルワールス相互作用、またはπ効果）であり得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡアプタマー結合タンパク質は、非共有結合タンパク質−タンパク質、タンパク質−ＲＮＡ、またはタンパク質−ＤＮＡ相互作用を介して少なくとも１つの機能的ドメインと関連し得る。特定の実施形態では、ＲＮＡアプタマー結合タンパク質および関連ドメインは、ペプチド結合を介して直接連結され、それにより融合タンパク質を形成し得る。
【００４４】
他の実施形態では、ＲＮＡアプタマー結合タンパク質は、リンカーを介して少なくとも１つの機能的ドメインと結合し得る。リンカーは、少なくとも１つの共有結合を介して１つ以上の他の化学基と接続する化学基である。適切なリンカーには、アミノ酸、ペプチド、ヌクレオチド、核酸、有機リンカー分子（例えば、マレイミド誘導体、Ｎ−エトキシベンジルイミダゾール、ビフェニル−３，４’、５−トリカルボン酸、ｐ−アミノベンジルオキシカルボニルなど）、ジスルフィドリンカー、およびポリマーリンカー（例えば、ＰＥＧ）が含まれる。リンカーは、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、アラルケニル、アラルキニルなどを含むがこれらに限定されない１つまたは複数のスペーシング基を含み得る。リンカーは中性でもよく、または正または負の電荷を帯びていてもよい。さらに、リンカーは、ｐＨ、温度、塩濃度、光、触媒、または酵素などを含む特定の条件下で、リンカーを他の化学基に接続するリンカーの共有結合を破壊または切断できるように切断可能であり得る。
【００４５】
さらなる実施形態では、ＲＮＡアプタマー結合タンパク質は、ペプチドリンカーを介して少なくとも１つの機能的ドメインに連結し得る。ペプチドリンカーは、可動性アミノ酸リンカー（例えば、小さい、非極性または極性アミノ酸を含む）であり得る。可動性リンカーの非限定的な例には、ＬＥＧＧＧＳ（配列番号１）、ＴＧＳＧ（配列番号２）、ＧＧＳＧＧＧＳＧ（配列番号３）、および（ＧＧＧＧＳ）１−４（配列番号４）が含まれる。あるいは、ペプチドリンカーは剛性アミノ酸リンカーであり得る。そのようなリンカーには、（ＥＡＡＡＫ）１−４（配列番号５）、Ａ（ＥＡＡＡＫ）２−５Ａ（配列番号６）、およびＰＡＰＡＰ（配列番号７）が含まれる。適切なリンカーの例は当技術分野で周知であり、リンカーを設計するためのプログラムは容易に入手可能である（Crasto et al., Protein Eng., 2000, 13(5):309-312）。特定の実施形態では、ＲＮＡアプタマー結合タンパク質および関連ドメインは、ペプチドリンカーを介して直接結合され、それにより融合タンパク質を形成し得る。
【００４６】
少なくとも１つの機能的ドメインは、ＲＮＡアプタマー結合タンパク質のＮ末端、Ｃ末端、および／または内部位置と関連し得る。
【００４７】
（ｉｖ）任意の核局在化シグナルおよび／または細胞透過性ペプチド
ＲＮＡアプタマー結合タンパク質は、少なくとも１つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）および／または細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）をさらに含み得る。核局在化シグナルの非限定的な例には、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号８）、ＰＫＫＫＲＲＶ（配列番号９）、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号１０）、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１１）、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１２）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号１３）、ＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号１４）、ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号１５）、ＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号１６）、ＰＱＰＫＫＫＰＬ（配列番号１７）、ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号１８）、ＰＫＱＫＫＲＫ（配列番号１９）、ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号２０）、ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号２１）、ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号２２）、ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号２３）、ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号２４）、およびＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号２５）が含まれる。適切な細胞透過性ペプチドの例には、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２６）、ＰＬＳＳＩＦＳＲＩＧＤＰＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２７）、ＧＡＬＦＬＧＷＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２８）、ＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２９）、ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号３０）、ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ（配列番号３１）、ＴＨＲＬＰＲＲＲＲＲＲ（配列番号３２）、ＧＧＲＲＡＲＲＲＲＲＲ（配列番号３３）、ＲＲＱＲＲＴＳＫＬＭＫＲ（配列番号３４）、ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号３５）、ＫＡＬＡＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＫＨＬＡＫＡＬＡＫＡＬＫＣＥＡ（配列番号３６）、およびＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号３７）が含まれる。
【００４８】
少なくとも１つの核局在化シグナルおよび／または細胞透過性ペプチドは、ＲＮＡアプタマー結合タンパク質および／または少なくとも１つの機能的ドメインのＮ末端、Ｃ末端、および／または内部位置に関連し得る。
【００４９】
（ｂ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質
組成物は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質はヌクレアーゼ活性を有し、二本鎖ＤＮＡ配列の両方の鎖を切断することができる（すなわち、二本鎖切断を生成する）。他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、非ヌクレアーゼ活性を有する（すなわち、非ヌクレアーゼドメインに連結された触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質である）。適切な非ヌクレアーゼドメインには、転写活性化ドメイン、転写リプレッサードメイン、およびエピジェネティック修飾ドメインが含まれる。
【００５０】
一般に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質およびＲＮＡアプタマー結合タンパク質は、連携して機能するように選択される。例えば、ヌクレアーゼ活性を有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、ヌクレオソーム相互作用活性を有するドメインに関連するＲＮＡアプタマー結合タンパク質とともに使用し得る。同様に、転写活性化ドメインに連結された触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、転写活性化ドメインに関連するＲＮＡアプタマー結合タンパク質とともに使用し得る。当業者は多数の可能性を理解することができる。
【００５１】
（ｉ）ヌクレアーゼ活性を有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ。ヌクレアーゼ活性を有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、さまざまな細菌や古細菌に存在する、Ｉ型（すなわちＩＡ、ＩＢ、ＩＣ、ＩＤ、ＩＥ、またはＩＦ）、ＩＩ型（すなわちＩＩＡ、ＩＩＢ、またはＩＩＣ）、ＩＩＩ型（すなわちＩＩＩＡまたはＩＩＩＢ）、またはＶ型ＣＲＩＳＰＲ系に由来し得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系はストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）（例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓ．  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ストレプトコッカス・パストリアヌス（Ｓ．  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ））、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）（例えば：カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ））、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｓｐ．）（例えば：フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ））、アカリオクロリス属（Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｓｐ．）、アセトハロビウム属（Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ  ｓｐ．）、アシドアミノコッカス属（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、アシディチオバチルス属（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、アリシクロバチルス属（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、アロクロミウム属（Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ  ｓｐ．）、アンモニフェックス属（Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ  ｓｐ．）、アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ  ｓｐ．）、アルスロスピラ属（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｓｐ．）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、バークホルデリアレス属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ  ｓｐ．）、カルディセルロシラプトル属（Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ  ｓｐ．）、カンジダタス属（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  ｓｐ．）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．）、クロコスファラ属（Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ  ｓｐ．）、シアノセイス属（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．）、エグジゴバクテリウム属（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）、フィネゴルディア属（Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ  ｓｐ．）、クテドノバクター属（Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）、ラクノスピラ種（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｓｐ．）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、リングビア属（Ｌｙｎｇｂｙａ  ｓｐ．）、マリノバクター属（Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）、メタノハロビウム属（Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂ  ｓｐ．）、ミクロシラ属（Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ  ｓｐ．）、ミクロコレウス属（Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ  ｓｐ．）、ミクロキスティス属（Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．）、ナトラナエロビウス属（Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ  ｓｐ．）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｓｐ．）、ニトロソコッカス属属（Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、ノカルジオプシス属（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ  ｓｐ．）、ノドゥラリア属（Ｎｏｄｕｌａｒｉａ  ｓｐ．）、ノストック属（Ｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．）、オスキラトリア属（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ  ｓｐ．）、ポラロモナス属（Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、ペロトマキュラム属（Ｐｅｌｏｔｏｍｃｕｌｕｍ  ｓｐ．）、シュードアルテロモナス属（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、ペトロトガ属（Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ  ｓｐ．）、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｓｐ．）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、ストレプトスポランギウム属（Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ  ｓｐ．）、シネココッカス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、サーモシフォ属（Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ  ｓｐ．）、またはベルコミクロビア種（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ  ｓｐ．）由来であり得る。他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、古細菌のＣＲＩＳＰＲ系、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＸ系、またはＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＹ系に由来し得る(Burstein et al., Nature, 2017, 542(7640):237-241)。
【００５２】
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に由来し得る。他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に由来し得る。さらに他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に由来し得る。さらに特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に由来し得る。
【００５３】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、野生型または天然のタンパク質であり得る。あるいは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、改善された特異性、変更されたＰＡＭ特異性、減少したオフターゲット効果、増加した安定性などを有するように設計できる。
【００５４】
適切なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼの非限定的な例には、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３など）、Ｃｐｆタンパク質、Ｃ２ｃタンパク質（例えば、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃｄｃ３）、Ｃｍｒタンパク質、Ｃｓａタンパク質、Ｃｓｂタンパク質、Ｃｓｃタンパク質、Ｃｓｅタンパク質、Ｃｓｆタンパク質、Ｃｓｍタンパク質、Ｃｓｎタンパク質、Ｃｓｘタンパク質、Ｃｓｙタンパク質、Ｃｓｚタンパク質、およびそれらの誘導体または変異体が含まれる。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質、Ｖ型Ｃｐｆ１タンパク質、またはその誘導体であり得る。
【００５５】
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼはストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９（Ｓｔ１Ｃａｓ９またはＳｔ３Ｃａｓ９）、またはストレプトコッカス・パストリアヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ）（ＳｐａＣａｓ９）であり得る。他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼはカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）Ｃａｓ９（ＣｊＣａｓ９）であり得る。他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ）Ｃａｓ９（ＦｎＣａｓ９）であり得る。さらに他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）Ｃａｓ９（ＮｍＣａｓ９）であり得る。さらに他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、ナイセリア・シネレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｃｉｎｅｒｅａ）Ｃａｓ９（ＮｃＣａｓ９）であり得る。さらなる実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ）Ｃｐｆ１（ＦｎＣｐｆ１）、アシドアミノコッカス属（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）Ｃｐｆ１（ＡｓＣｐｆ１）、またはラクノスピラ科細菌ＮＤ２００６（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＮＤ２００６）Ｃｐｆ１（ＬｂＣｐｆ１）であり得る。
【００５６】
一般に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、ｔｒａｃｒＲＮＡと相互作用するＲＮＡ認識および／またはＲＮＡ結合ドメインを含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼはまた、エンドヌクレアーゼ活性を有する少なくとも１つのヌクレアーゼドメインを含む。例えば、Ｃａｓ９タンパク質はＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインおよびＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインを含み、Ｃｐｆ１タンパク質はＲｕｖＣ様ドメインおよびＮＵＣドメインを含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼはまた、ＤＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、ＲＮａｓｅドメイン、タンパク質間相互作用ドメイン、二量体化ドメイン、およびその他のドメインも含み得る。
【００５７】
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼがＤＮＡの一つの鎖のみを切断するように修飾されているＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓニッカーゼであり得る。オフセットガイドＲＮＡのペアと組み合わせて使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓニッカーゼ（すなわち、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓデュアルニッカーゼ）は、二本鎖配列に二本鎖切断を生成し得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、１つ以上の突然変異および／または欠失によってニッカーゼに変換され得る。例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼは、ヌクレアーゼドメインの１つ（例えば、ＲｕｖＣ様ドメインまたはＨＮＨ様ドメイン）に１つまたは複数の変異を含み得る。例えば、１つ以上の変異は、ＲｕｖＣ様ドメインのＤ１０Ａ、Ｄ８Ａ、Ｅ７６２Ａ、および／またはＤ９８６Ａであってもよく、ニッカーゼが二本鎖ＤＮＡ配列の１本の鎖のみを切断するようなＨＮＨ様ドメインのＨ８４０Ａ、Ｈ５５９Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８５６Ａ、および／またはＮ８６３Ａであってもよい。
【００５８】
非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼドメインに連結された触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質。追加の実施形態では、ヌクレアーゼ活性を有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼドメインに連結された触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質を含む。触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、すべてのヌクレアーゼ活性を欠くために、突然変異および／または欠失によって修飾される。例えば、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、ＲｕｖＣ様ドメインがＤ１０Ａ、Ｄ８Ａ、Ｅ７６２Ａ、および／またはＤ９８６Ａ変異を含み、ＨＮＨ様ドメインがＨ８４０Ａ、Ｈ５５９Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６５Ａ、および／またはＮ８６３Ａ変異を含む、触媒的に不活性な（死んだ）Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）であり得る。あるいは、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、ヌクレアーゼドメインに同等な変異を含む触媒的に不活性な（死んだ）Ｃｐｆ１タンパク質であり得る。
【００５９】
触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、制限エンドヌクレアーゼまたはホーミングエンドヌクレアーゼに由来するヌクレアーゼドメインに連結し得る。特定の実施形態では、ヌクレアーゼドメインは、ＩＩ−Ｓ型制限エンドヌクレアーゼに由来し得る。ＩＩ−Ｓ型エンドヌクレアーゼは、認識／結合部位から典型的には数塩基対離れた部位でＤＮＡを切断し、それ自体、分離可能な結合および切断ドメインを有する。これらの酵素は一般に、一時的に会合して二量体を形成し、互い違いの位置でＤＮＡの各鎖を切断する単量体である。適切なＩＩ−Ｓ型エンドヌクレアーゼの非限定的な例には、ＢｆｉＩ、ＢｐｍＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＭＩ、ＦｏｋＩ、ＭｂｏＩＩ、およびＳａｐＩが含まれる。特定の実施形態では、ヌクレアーゼドメインは、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインまたはその誘導体であり得る。ＩＩ−Ｓ型ヌクレアーゼドメインは、２つの異なるヌクレアーゼドメインの二量体化を促進するために修飾できる。例えば、ＦｏｋＩの切断ドメインは、特定のアミノ酸残基を変異させることにより修飾できる。特定の実施形態では、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインは、Ｑ４８６Ｅ、Ｉ４９９Ｌ、および／またはＮ４９６Ｄ突然変異を含む第１のＦｏｋＩハーフドメイン、ならびにＥ４９０Ｋ、Ｉ５３８Ｋ、および／またはＨ５３７Ｒ突然変異を含む第２のＦｏｋＩハーフドメインを含み得る。
【００６０】
触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、化学結合を介して直接またはリンカーを介して間接的に非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼドメインに連結し得る。化学結合は共有結合（例えば、ペプチド結合、エステル結合など）であり得る。あるいは、化学結合は非共有結合（例えば、イオン性、静電性、水素、疎水性、ファンデルワールス相互作用、またはπ効果）であり得る。適切なリンカーについては、セクション（ＩＩ）（ａ）（ｉｉｉ）で説明する。ヌクレアーゼドメインは、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質のＮ末端、Ｃ末端、および／または内部位置に連結し得る。
【００６１】
任意のタンパク質ドメイン。ヌクレアーゼ活性を有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、少なくとも１つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）、および／またはマーカードメインをさらに含み得る。少なくとも１つのＮＬＳ、ＣＰＰ、および／またはマーカードメインは、ヌクレアーゼ活性を有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質のＮ末端、Ｃ末端、および／または内部位置に直接または間接的に連結し得る。
【００６２】
核局在化シグナルの非限定的な例には、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号８）、ＰＫＫＫＲＲＶ（配列番号９）、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号１０）、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１１）、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１２）  ：１２）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号１３）、ＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号１４）、ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号１５）、ＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号１６）、ＰＱＰＫＫＫＰＬ（配列番号１７）、ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号１８）、ＰＫＱＫＫＲＫ（配列番号１９）、ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号２０）、ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号２１）、ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号２２）、ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号：  ２３）、ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号２４）、およびＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号２５）が含まれる。適切な細胞透過性ペプチドの例には、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２６）、ＰＬＳＳＩＦＳＲＩＧＤＰＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２７）、ＧＡＬＦＬＧＷＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２８）、ＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２９）、ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号３０）、ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ（配列番号３１）、ＴＨＲＬＰＲＲＲＲＲＲ（配列番号３２）、ＧＧＲＲＡＲＲＲＲＲＲ（配列番号３３）、ＲＲＱＲＲＴＳＫＬＭＫＲ（配列番号３４）、ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号３５）、ＫＡＬＡＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＫＨＬＡＫＡＬＡＫＡＬＫＣＥＡ（配列番号３６）、およびＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号３７）が含まれる。マーカードメインは、蛍光タンパク質および／または精製タグまたはエピトープタグであり得る。適切な蛍光タンパク質には、緑色蛍光タンパク質（例えば：ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ＧＦＰ−２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ１）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１）、青色蛍光タンパク質（例えば：ＢＦＰ、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａ１、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ−ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎ１、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（例えば：ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄ１、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）、およびオレンジ蛍光タンパク質（例えば：ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒ��−Ｏｒａｎｇｅ、Ｍｏｎｏｍｅｒｍｅｒｉｃ  Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）が含まれる。適切な精製またはエピトープタグの非限定的な例には、６ｘＨｉｓ、ＦＬＡＧ（登録商標）、ＨＡ、ＧＳＴ、Ｍｙｃなどが含まれる。
【００６３】
（ｉｉ）非ヌクレアーゼ活性を有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質
他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は非ヌクレアーゼ活性を有し得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、少なくとも１つの非ヌクレアーゼドメインと連結された触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質であり得る。上記のように、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、すべてのヌクレアーゼ活性を欠くように、突然変異および／または欠失によって修飾される。例えば、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、ＲｕｖＣ様ドメインがＤ１０Ａ、Ｄ８Ａ、Ｅ７６２Ａ、および／またはＤ９８６Ａ変異を含み、ＨＮＨ様ドメインがＨ８４０Ａ、Ｈ５５９Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６５Ａ、および／またはＮ８６３Ａ変異を含む触媒的に不活性な（死んだ）Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）であり得る。あるいは、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、ヌクレアーゼドメインに相当する変異を含む触媒的に不活性な（死んだ）Ｃｐｆ１タンパク質であり得る。
【００６４】
触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質に連結された少なくとも１つの非ヌクレアーゼドメインは、転写活性化ドメイン、転写リプレッサードメイン、またはエピジェネティック修飾ドメインであり得る。
【００６５】
いくつかの実施形態では、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、少なくとも１つの転写活性化ドメインに連結され得る。適切な転写活性化ドメインには、限定するわけではないが、単純ヘルペスウイルスＶＰ１６ドメイン、ＶＰ６４（ＶＰ１６の四量体誘導体）、ＶＰ１６０（すなわち１０ｘＶＰ１６）、ＮＦκＢからのｐ６５活性化ドメイン、熱ショック因子１（ＨＳＦ１）活性化ドメイン、ＭｙｏＤ１活性化ドメイン、ＧＣＮ４ペプチド、１０ｘＧＣＮ４、ウイルスＲトランス活性化因子（Ｒｔａ）、ＶＰＲ（ＶＰ６４−ｐ６５−Ｒｔａの融合）、ｐ５３活性化ドメイン１および２、ＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質）活性化ドメイン、Ｅ２Ａ活性化ドメイン、または活性化Ｔ細胞の核因子（ＮＦＡＴ）活性化ドメインが含まれる。いくつかの場合、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、１つの転写活性化ドメイン、２つの転写活性化ドメイン、３つの転写活性化ドメイン、または３つ以上の転写活性化ドメインに連結され得る。
【００６６】
他の実施形態では、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、少なくとも１つの転写リプレッサードメインに連結され得る。適切な転写リプレッサードメインの非限定的な例には、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）リプレッサードメイン、誘導性ｃＡＭＰ初期リプレッサー（ＩＣＥＲ）ドメイン、ＹＹ１グリシンリッチリプレッサードメイン、Ｓｐ１様リプレッサー、Ｅ（ｓｐｌ）リプレッサー、ＩκＢリプレッサー、またはメチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）リプレッサードメインが挙げられる。いくつかの場合には、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、１つの転写リプレッサードメイン、２つの転写リプレッサードメイン、３つの転写リプレッサードメイン、または３つ以上の転写リプレッサードメインに連結され得る。
【００６７】
さらなる実施形態では、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、少なくとも１つのエピジェネティック修飾ドメインに連結され得る。エピジェネティック修飾ドメインは、ＤＮＡまたはクロマチンの構造を改変し得る（ＤＮＡ配列を変更する場合もしない場合もある）。適切なエピジェネティック修飾ドメインの非限定的な例には、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性（例えば、シトシンメチルトランスフェラーゼ）、ＤＮＡデメチラーゼ活性、ＤＮＡ脱アミノ化（例えば、シトシンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、グアニンデアミナーゼ）、ＤＮＡアミノ化、ＤＮＡ酸化活性、ＤＮＡヘリカーゼ活性、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）活性（例えば、Ｅ１Ａ結合タンパク質ｐ３００に由来するＨＡＴドメイン）、ヒストンデアセチラーゼ活性、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性、ヒストンデメチラーゼ活性、ヒストンキナーゼ活性、ヒストンホスファターゼ活性、ヒストンユビキチンリガーゼ活性、ヒストン脱ユビキチン化活性、ヒストンアデニル化活性、ヒストン脱アデニル化活性、ヒストンＳＵＭＯ化活性、ヒストン脱ＳＵＭＯ化活性、ヒストンリボシル化活性、ヒストン脱リボシル化活性、ヒストンミリストイル化活性、ヒストン脱ミリストイル化活性、ヒストンシトルリン化活性、ヒストンアルキル化活性、ヒストン脱アルキル化活性、ヒストン酸化活性、またはヒストン相互作用／リモデリング活性が含まれる。特定の実施形態では、エピジェネティック修飾ドメインは、シチジンデアミナーゼ活性、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性、またはＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性を含むことができる。特定の実施形態では、エピジェネティック修飾ドメインは、ｐ３００ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）、ＡＰＯＢＥＣシチジンデアミナーゼ、またはＴＥＴメチルシトシンジオキシゲナーゼであり得る。いくつかの場合、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、１つのエピジェネティック修飾ドメイン、２つのエピジェネティック修飾ドメイン、３つのエピジェネティック修飾ドメイン、または３つ以上のエピジェネティック修飾ドメインに連結され得る。
【００６８】
触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、化学結合を介して直接、またはリンカーを介して間接的に、少なくとも１つの非ヌクレアーゼドメインに連結され得る。化学結合は共有結合であり得る（例えば、ペプチド結合、エステル結合など）。あるいは、化学結合は非共有結合（例えば、イオン性、静電性、水素、疎水性、ファンデルワールス相互作用、またはπ効果）であり得る。適切なリンカーについては、セクション（ＩＩ）（ａ）（ｉｉｉ）に記載する。少なくとも１つの非ヌクレアーゼドメインは、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質のＮ末端、Ｃ末端、および／または内部位置に連結され得る。
【００６９】
任意のタンパク質ドメイン。少なくとも１つの非ヌクレアーゼドメインに連結された触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、少なくとも１つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）、および／またはマーカードメインの少なくとも１つをさらに含み得る。適切なＮＬＳ、ＣＰＰ、およびマーカードメインの例は上記のセクション（ＩＩ）（ｂ）（ｉ）で詳述したとおり。少なくとも１つのＮＬＳ、ＣＰＰ、および／またはマーカードメインは、非ヌクレアーゼ活性を有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質のＮ末端、Ｃ末端、および／または内部位置に直接または間接的に連結され得る。
【００７０】
いくつかの実施形態では、非ヌクレアーゼ活性を有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、少なくとも１つの検出可能な標識をさらに含み得る。検出可能な標識は、蛍光色素（例えば、ＦＡＭ、ＴＭＲ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、テキサスレッド、オレゴングリーン、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒｓ、Ｈａｌｏタグ、または適切な蛍光色素）、ハプテン（例えば、ビオチン、ジゴキシゲニンなど）、量子ドット、または金粒子であり得る。
【００７１】
（ＩＩＩ）キット
本開示のさらに別の態様は、本明細書に開示されるアプタマー−ｔｒａｃｒＲＮＡ、合成２パートガイドＲＮＡ、ＲＮＡアプタマー結合タンパク質、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質を含むキットを提供する。
【００７２】
いくつかの実施形態では、キットは、セクション（Ｉ）（ｂ）で上述した少なくとも１つのアプタマー−ｔｒａｃｒＲＮＡ、またはセクション（ＩＶ）で後述する少なくとも１つのアプタマー−ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする核酸を含み得る。他の実施形態では、キットは、少なくとも１つのアプタマー−ｔｒａｃｒＲＮＡ（またはコード核酸）およびセクション（ＩＩ）（ａ）で上述した少なくとも１つのＲＮＡアプタマー結合タンパク質、またはセクション（ＩＶ）で後述する少なくとも１つのＲＮＡアプタマー結合タンパク質をコードする核酸を含み得る。さらに他の実施形態では、キットは、少なくとも１つのアプタマー−ｔｒａｃｒＲＮＡ（またはコード核酸）、少なくとも１つのＲＮＡアプタマー結合タンパク質（またはコード核酸）、およびセクション（ＩＩ）（ｂ）で上述した少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、または少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を含み得る。これらのキットのいずれも、少なくとも１つのｃｒＲＮＡ（例えば、ｃｒＲＮＡのライブラリー）または前記ｃｒＲＮＡをコードする核酸をさらに含み得る。あるいは、エンドユーザーは、キット内のアプタマー−ｔｒａｃｒＲＮＡと組み合わせて使用される少なくとも１つのｃｒＲＮＡを提供し得る。
【００７３】
他の実施形態では、キットは、セクション（Ｉ）で上述した合成２パートガイドＲＮＡの少なくとも１つを含み得る。他の実施形態では、キットは、少なくとも１つの合成２パートガイドＲＮＡおよびセクション（ＩＩ）（ａ）で上述した少なくとも１つのＲＮＡアプタマー結合タンパク質、またはセクション（ＩＶ）で後述する少なくとも１つのＲＮＡアプタマー結合タンパク質をコードする核酸を含み得る。さらに他の実施形態では、キットは、少なくとも１つの合成２部ガイドＲＮＡ、少なくとも１つのＲＮＡアプタマー結合タンパク質（またはコード核酸）、およびセクション（ＩＩ）（ｂ）で上述した少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、または少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を含み得る。
【００７４】
キットはさらに、トランスフェクション試薬、細胞増殖培地、選択培地、インビトロ転写試薬、核酸精製試薬、タンパク質精製試薬、緩衝液などを含み得る。本明細書で提供されるキットは一般に、以下に詳述する方法を実行するための指示書を含む。キットに含まれている指示書は、梱包材に添付されていてもよく、添付文書として含まれていてもよい。指示書は通常、書面または印刷物であるが、それに限定されるものではない。そのような指示を保存し、それらをエンドユーザーに伝えることができる任意の媒体が、本開示により企図される。そのような媒体には、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えば、ＣＤ  ＲＯＭ）などが含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用される「指示」という用語は、指示を提供するインターネットサイトのアドレスを含み得る。
【００７５】
（ＩＶ）核酸
本開示のさらなる態様は、アプタマー−ｔｒａｃｒＲＮＡ、合成２パートガイドＲＮＡ、ＲＮＡアプタマー結合タンパク質、および／または本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を提供する。核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡ、線状または環状、一本鎖または二本鎖であり得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、目的の真核細胞のタンパク質への効率的な翻訳のためにコドン最適化され得る。コドン最適化プログラムは、フリーウェアまたは商用ソースから利用可能である。
【００７６】
いくつかの実施形態では、アプタマー−ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする核酸はＤＮＡであり得る。アプタマー−ｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡは、インビトロＲＮＡ合成用のファージＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモーター配列に作動可能に連結され得る。例えば、プロモーター配列は、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６プロモーター配列、またはＴ７、Ｔ３、またはＳＰ６プロモーター配列のバリエーションであり得る。他の実施形態では、アプタマー−ｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡは、真核細胞での発現のためにプロモーター配列に作動可能に連結され得る。例えば、アプタマー−ｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ  ＩＩＩ）によって認識されるプロモーター配列に作動可能に連結され得る。適切なＰｏｌ  ＩＩＩプロモーターの例には、哺乳動物Ｕ６、Ｕ３、Ｈ１、および７ＳＬ  ＲＮＡプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。以下に詳述するように、アプタマー−ｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡはベクターの一部であり得る。同様に、ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡは、ファージプロモーター配列および／またはＰｏｌ  ＩＩＩプロモーター配列に作動可能に連結され得る。
【００７７】
さらなる実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡアプタマー結合タンパク質および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質をコードする核酸はＲＮＡであり得る。ＲＮＡはインビトロで酵素的に合成され得る。このため、上述のように、ＲＮＡアプタマー結合タンパク質またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡは、ファージプロモーター配列に機能的に連結され得る。そのような実施形態では、インビトロ転写されたＲＮＡは、精製、キャッピング、および／またはポリアデニル化され得る。
【００７８】
他の実施形態では、ＲＮＡアプタマー結合タンパク質および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質をコードするＲＮＡは、自己複製ＲＮＡの一部であり得る(Yoshioka et al., Cell Stem Cell, 2013, 13:246-254)。自己複製ＲＮＡは、非感染性の自己複製ベネズエラ馬脳炎（ＶＥＥ）ウイルスＲＮＡレプリコンに由来し得る。これは、限られた数の細胞分裂で自己複製できる正のセンス、一本鎖ＲＮＡであり、目的のタンパク質をコードするように修飾され得る(Yoshioka et al., Cell Stem Cell, 2013, 13:246-254)。
【００７９】
さらに他の実施形態では、ＲＮＡアプタマー結合タンパク質および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質をコードする核酸はＤＮＡであり得る。ＤＮＡコーディング配列は、目的の細胞での発現のために少なくとも１つのプロモーター制御配列に作動可能に連結され得る。特定の実施形態では、ＤＮＡコード配列は、細菌（例えば、大腸菌）細胞または真核生物（例えば、酵母、昆虫、または哺乳類）細胞におけるＲＮＡアプタマー結合タンパク質またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質の発現のためのプロモーター配列に作動可能に連結され得る。適切な細菌プロモーターには、Ｔ７プロモーター、ｌａｃオペロンプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター（ｔｒｐおよびｌａｃプロモーターのハイブリッド）、前述のいずれかのバリエーション、および前述のいずれかの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。適切な真核生物プロモーターの非限定的な例には、構成的、調節的、または細胞または組織特異的プロモーターが含まれる。適切な真核生物構成的プロモーター制御配列には、サイトメガロウイルス前初期プロモーター（ＣＭＶ）、シミアンウイルス（ＳＶ４０）プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、伸長因子（ＥＤ１）−アルファプロモーター、ユビキチンプロモーター、アクチンプロモーター、チューブリンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、その断片、または前述のいずれかの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。適切な真核生物の調節プロモーター制御配列の例には、熱ショック、金属、ステロイド、抗生物質、またはアルコールによって調節されるものが含まれるが、これらに限定されない。組織特異的プロモーターの非限定的な例には、Ｂ２９プロモーター、ＣＤ１４プロモーター、ＣＤ４３プロモーター、ＣＤ４５プロモーター、ＣＤ６８プロモーター、デスミンプロモーター、エラスターゼ−１プロモーター、エンドグリンプロモーター、フィブロネクチンプロモーター、Ｆｌｔ−１プロモーター、ＧＦＡＰプロモーター、ＧＰＩＩｂプロモーター、ＩＣＡＭ−２プロモーター、ＩＮＦ−βプロモーター、Ｍｂプロモーター、ＮｐｈｓＩプロモーター、ＯＧ−２プロモーター、ＳＰ−Ｂプロモーター、ＳＹＮ１プロモーター、およびＷＡＳＰプロモーターが含まれる。プロモーター配列は野生型であってもよいし、より効率的または効果的な発現のために修飾されていてもよい。いくつかの実施形態では、ＤＮＡコード配列は、ポリアデニル化シグナル（例えば、ＳＶ４０ポリＡシグナル、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡシグナルなど）および／または少なくとも１つの転写終結配列に連結され得る。いくつかの場合では、ＲＮＡアプタマー結合タンパク質および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は細菌または真核細胞から精製され得る。
【００８０】
種々の実施形態では、アプタマー−ｔｒａｃｒＲＮＡ、ＲＮＡアプタマー結合タンパク質、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質をコードする核酸がベクターに存在し得る。適切なベクターには、プラスミドベクター、ウイルスベクター、および自己複製ＲＮＡが含まれる(Yoshioka et al., Cell Stem Cell, 2013, 13:246-254)。いくつかの実施形態では、コード核酸はプラスミドベクターに存在し得る。適切なプラスミドベクターの非限定的な例には、ｐＵＣ、ｐＢＲ３２２、ｐＥＴ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、およびそれらの変異体が含まれる。他の実施形態では、コード核酸は、ウイルスベクターの一部であり得る（例えば、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクターなど）。プラスミドまたはウイルスベクターは、追加の発現制御配列（例えば、エンハンサー配列、コザック配列、ポリアデニル化配列、転写終結配列など）、選択マーカー配列（例えば、抗生物質耐性遺伝子）、複製起点などを含み得る。ベクターおよびその使用に関する追加情報は、”Current Protocols in Molecular Biology”Ausubel et al., John Wiley & Sons, New York, 2003または”Molecular Cloning: A Laboratory Manual”Sambrook & Russell, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 3rd edition, 2001を参照できる。
【００８１】
（Ｖ）標的化された転写調節、標的化されたエピゲノム修飾、または標的化されたゲノム修飾の方法
本開示の別の態様は、標的化転写活性化、標的化転写抑制、標的化エピゲノム修飾、または標的化ゲノム修飾のための方法を包含し、方法は、セクション（Ｉ）で上述した合成２パートガイドＲＮＡ、上記セクション（ＩＩ）（ａ）で定義した少なくとも１つのＲＮＡアプタマー結合タンパク質または少なくとも１つのＲＮＡアプタマー結合タンパク質をコードする核酸、および上記セクション（ＩＩ）（ｂ）で定義したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質をコードする核酸のいずれかを細胞に導入することを含む。本明細書で開示される方法では、標的化転写活性化、標的化転写抑制、標的化エピゲノム修飾、または標的化ゲノム修飾の効率および／または特異性は、ｔｒａｃｒＲＮＡがＲＮＡアプタマー配列を含まないＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムと比較して増加する。さらに、アプタマー−ｔｒａｃｒＲＮＡが伸長配列をさらに含む実施形態では、標的化転写活性化、標的化転写抑制、標的化エピゲノム修飾、または標的化ゲノム修飾の効率は、伸長配列を含まないアプタマー−ｔｒａｃｒＲＮＡと比較して増加する。
【００８２】
ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質を染色体ＤＮＡの標的配列に導く。これを達成するために、ｃｒＲＮＡは標的染色体配列、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質とも相互作用するｔｒａｃｒＲＮＡ、の両方とハイブリダイズする。さらに、少なくとも１つのＲＮＡアプタマー結合タンパク質は、ｔｒａｃｒＲＮＡの少なくとも１つのＲＮＡアプタマー配列と結合／相互作用し、それにより、ＲＮＡアプタマー結合タンパク質に関連するエフェクタードメインが、染色体ＤＮＡ、染色体ＤＮＡに関連するタンパク質、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質と相互作用することを許容する。これらの相互作用の結果として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質を介した標的化転写活性化、標的化転写抑制、標的化エピゲノム修飾、または標的化ゲノム修飾の有効性および／または特異性が向上する。
【００８３】
いくつかの実施形態では、方法は、多重化適用のために改変することができ、この方法は、さらなるｃｒＲＮＡを真核細胞に導入することをさらに含む。各ｃｒＲＮＡには異なる５’配列がある（つまり、異なる染色体配列を標的とする）が、ｔｒａｃｒＲＮＡと塩基対合できるユニバーサル３’配列を有する。
【００８４】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質が少なくとも１つの転写活性化ドメイン、転写リプレッサードメイン、またはエピゲノム修飾ドメインに連結した触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質である実施形態では、標的染色体配列の転写を修飾でき、ヒストン／ヌクレオソームは改変（例えば、アセチル化、メチル化、リン酸化、アデニル化など）でき、またはＤＮＡを改変（例えば、メチル化、脱アミノ化など）できる。そのような修飾の頻度および／または効率は、ｔｒａｃｒＲＮＡがＲＮＡアプタマー配列を含まないＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（または拡張配列を含まないアプタマー−ｔｒａｃｒＲＮＡ）と比較して増加する（実施例を参照）。
【００８５】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質がヌクレアーゼ活性を含む実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、二本鎖染色体配列の両方の鎖を切断できる（すなわち、二本鎖切断を生成する）。染色体配列の二本鎖切断は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復プロセスによって修復され得る。ＮＨＥＪは誤りがちであり、切断の修復中に、少なくとも１つの塩基対のインデル（すなわち、欠失または挿入）、少なくとも１つの塩基対の置換、またはそれらの組み合わせが発生し得る。したがって、標的化染色体配列は、修飾、突然変異、または不活化され得る。例えば、コード配列のリーディングフレームの欠失、挿入、または置換により、タンパク質の改変、またはタンパク質産物がなくなること（「ノックアウト」と称される）が生じ得る。いくつかの例では、方法は、相同性指向修復プロセス（ＨＤＲ）による二本鎖切断の修復の間、ドナーポリヌクレオチド中のドナー配列が、標的染色体配列で染色体配列と交換または組み込まれ得るように、標的染色体配列のいずれかの側に位置する配列と実質的な配列同一性を有する配列に隣接する少なくとも１つのドナー配列を含むドナーポリヌクレオチド（下記参照）を細胞に導入することをさらに含み得る。外因性配列の組み込みは、「ノックイン」と称される。そのような標的化ゲノム修飾の頻度および／または効率は、ｔｒａｃｒＲＮＡがＲＮＡアプタマー配列を含まないＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（または伸長配列を含まないアプタマー−ｔｒａｃｒＲＮＡ）と比較して増加する。
【００８６】
（ａ）細胞への導入
上述のように、この方法は、少なくとも１つの合成２パートｇＲＮＡ、少なくとも１つのＲＮＡアプタマー結合タンパク質またはコード核酸、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質またはコード核酸を細胞に導入することを含む。さまざまな手段によって、さまざまな分子を目的の細胞に導入し得る。
【００８７】
いくつかの実施形態では、細胞は適切な分子（すなわち、タンパク質、ＤＮＡ、および／またはＲＮＡ）でトランスフェクトされ得る。適切なトランスフェクション法には、ヌクレオフェクション（またはエレクトロポレーション）、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、カチオン性ポリマートランスフェクション（例えば、ＤＥＡＥ−デキストランまたはポリエチレンイミン）、ウイルストランスフェクション、ビロソームトランスフェクション、ビリオントランスフェクション、リポソームトランスフェクション、カチオン性リポソームトランスフェクション、免疫リポソームトランスフェクション、非リポソーム脂質トランスフェクション、デンドリマートランスフェクション、熱ショックトランスフェクション、マグネトフェクション、リポフェクション、遺伝子銃送達、インペイルフェクション、ソノポレーション、光トランスフェクション、および独自の薬剤増強核酸取り込みが含まれる。トランスフェクション法は、当技術分野で周知である（例えば、”Current Protocols in Molecular Biology”Ausubel et al., John Wiley & Sons, New York, 2003または”Molecular Cloning: A Laboratory Manual”Sambrook & Russell, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 3rd edition, 2001を参照）。他の実施形態では、分子はマイクロインジェクションにより細胞に導入され得る。例えば、分子は目的の細胞の細胞質または核に注入され得る。細胞に導入される各分子の量は変動し得るが、当業者は適切な量を決定する手段に精通している。
【００８８】
様々な分子が同時にまたは連続して細胞に導入され得る。例えば、少なくとも１つのＲＮＡアプタマー結合タンパク質およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、細胞に安定的に導入され得る。または、すべての成分が同時に導入され得る。
【００８９】
一般に、細胞は、細胞の成長および／または維持に適した条件下で維持される。適切な細胞培養条件は、当技術分野で周知であり、例えば、Santiago et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2008, 105:5809-5814; Moehle et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2007, 104:3055-3060; Urnov et al., Nature, 2005, 435:646-651; およびLombardo et al., Nat. Biotechnol., 2007, 25:1298-1306に記載される当業者は、細胞を培養する方法が当技術分野で知られており、細胞型に応じて変化する可能性があり、また変化することを理解する。すべての場合において、特定の細胞型に最適な手法を決定するために、定期的な最適化が使用され得る。
【００９０】
（ｂ）任意のドナーポリヌクレオチド
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質がヌクレアーゼ活性を有する実施形態では、方法は、少なくとも１つのドナーポリヌクレオチドを細胞に導入することをさらに含み得る。ドナーポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖、線状または環状、および／またはＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。いくつかの実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、ベクター、例えばプラスミドベクターであり得る。
【００９１】
ドナーポリヌクレオチドは、少なくとも１つのドナー配列を含む。いくつかの態様では、ドナーポリヌクレオチドのドナー配列は、内因性または天然の染色体配列の改変バージョンであり得る。例えば、ドナー配列は、ＤＮＡ修飾タンパク質が標的とする配列またはその近くの染色体配列の一部と本質的に同一であり得るが、少なくとも１つのヌクレオチド変化を含む。したがって、天然配列との組み込みまたは交換時に、標的化染色体位置の配列は少なくとも１つのヌクレオチド変化を含む。例えば、変化は、１つ以上のヌクレオチドの挿入、１つ以上のヌクレオチドの欠失、１つ以上のヌクレオチドの置換、またはそれらの組み合わせであり得る。修飾された配列の「遺伝子修正」組み込みの結果として、細胞は標的化染色体配列から修飾された遺伝子産物を産生し得る。
【００９２】
他の態様では、ドナーポリヌクレオチドのドナー配列は外因性配列であり得る。本明細書で使用される「外因性」配列は、細胞に固有ではない配列、またはその固有の位置が細胞のゲノムの異なる位置にある配列を指す。例えば、外因性配列はタンパク質コード配列を含んでもよく、これはゲノムへの組み込み時に、細胞が組み込み配列によってコードされるタンパク質を発現し得るように、外因性プロモーター制御配列に作動可能に連結し得る。あるいは、その発現が内因性プロモーター制御配列により調節されるように、外因性配列を染色体配列に組み込み得る。他の例では、外因性配列は、転写制御配列、他の発現制御配列、ＲＮＡコーディング配列などであり得る。上記のように、外因性配列の染色体配列への組み込みは「ノックイン」と称される。
【００９３】
当業者に理解されるように、ドナー配列の長さは変化し得る、および変化するであろう。例えば、ドナー配列の長さは、数ヌクレオチドから数百ヌクレオチド、さらに数十万ヌクレオチドまで変化し得る。
【００９４】
典型的に、ドナーポリヌクレオチド中のドナー配列は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質が標的とする配列のそれぞれ上流および下流に位置する配列と実質的な配列同一性を有する上流配列および下流配列に隣接している。これらの配列類似性のため、ドナーポリヌクレオチドの上流および下流配列は、ドナー配列が染色体配列に組み込まれる（または交換される）ように、ドナーポリヌクレオチドと標的化染色体配列の間の相同組換えを可能にする。
【００９５】
本明細書で用いられる上流配列とは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質が標的とする配列の上流の染色体配列と実質的な配列同一性を共有する核酸配列を指す。同様に、下流配列とは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質が標的とする配列の下流の染色体配列と実質的な配列同一性を共有する核酸配列を指す。本明細書で用いられる場合、「実質的な配列同一性」という語句は、少なくとも約７５％の配列同一性を有する配列を指す。したがって、ドナーポリヌクレオチドの上流および下流の配列は、標的配列の上流または下流の配列と約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有し得る。例示的な実施形態では、ドナーポリヌクレオチドの上流および下流配列は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質により標的化される配列の上流または下流の染色体配列と約９５％または１００％の配列同一性を有し得る。
【００９６】
いくつかの態様では、上流配列は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質により標的化される配列のすぐ上流に位置する染色体配列と実質的な配列同一性を共有する。他の実施形態では、上流配列は、標的配列から約１００ヌクレオチド上流内に位置する染色体配列と実質的な配列同一性を共有する。したがって、例えば、上流配列は、標的配列から約１〜約２０、約２１〜約４０、約４１〜約６０、約６１〜約８０、または約８１〜約１００ヌクレオチド上流に位置する染色体配列と実質的な配列同一性を共有し得る。いくつかの態様では、下流配列は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質が標的とする配列のすぐ下流に位置する染色体配列と実質的な配列同一性を共有する。他の実施形態では、下流配列は、標的配列から約１００ヌクレオチド下流内に位置する染色体配列と実質的な配列同一性を共有する。したがって、例えば、下流配列は、標的配列から約１〜約２０、約２１〜約４０、約４１〜約６０、約６１〜約８０、または約８１〜約１００ヌクレオチド下流に位置する染色体配列と実質的な配列同一性を共有し得る。
【００９７】
各々の上流または下流の配列は、長さが約２０ヌクレオチドから約５０００ヌクレオチドの範囲であり得る。いくつかの実施形態では、上流および下流の配列は、約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２８００、３０００、３２００、３４００、３６００、３８００、４０００、４２００、４４００、４６００、４８００、または５０００ヌクレオチドを含み得る。特定の実施形態では、上流および下流の配列は、長さが約５０〜約１５００ヌクレオチドの範囲であり得る。
【００９８】
（ｃ）標的化された転写調節、エピゲノム修飾、またはゲノム修飾
ｃｒＲＮＡと標的染色体ＤＮＡとの間、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの間、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡとＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質との間、ＲＮＡアプタマー結合タンパク質とｔｒａｃｒＲＮＡ中のＲＮＡアプタマー配列との間、およびＲＮＡアプタマー結合タンパク質と連結したエフェクタードメインと標的染色体配列および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質に関連するタンパク質との間、の相互作用は、標的化転写調節、標的化エピゲノム修飾、または標的化ゲノム修飾の効率を促進および向上させる。
【００９９】
さまざまな例では、標的化転写活性化、標的化転写抑制、標的化エピゲノム修飾、または標的化ゲノム修飾の効率は、ｔｒａｃｒＲＮＡがＲＮＡアプタマー配列を含まない（または伸長配列を含まないアプタマーｔｒａｃｒＲＮＡを含む）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムと比較して、少なくとも約０．１倍、少なくとも約０．５倍、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、または少なくとも約２０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、または約１００倍超まで増加され得る。
【０１００】
（ｄ）細胞型
様々な細胞が、本明細書に開示された方法での使用に適している。一般的に、細胞は真核細胞である。例えば、細胞は、ヒト哺乳類細胞、非ヒト哺乳類細胞、非哺乳類脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母細胞、または単細胞真核生物であり得る。いくつかの実施形態では、細胞は単細胞胚、例えば、ラット、ハムスター、げっ歯類、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、および霊長類の胚を含む非ヒト哺乳類胚、でもあり得る。さらに他の実施形態では、細胞は、胚性幹細胞、ＥＳ様幹細胞、胎児幹細胞、成体幹細胞などの幹細胞であり得る。一実施形態では、幹細胞はヒト胚性幹細胞ではない。さらに、幹細胞は、その全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２００３／０４６１４１、またはChung et al. (Cell Stem Cell, 2008, 2:113-117)に開示された技術により作製されたものを含んでもよい。細胞は、インビトロまたはインビボ（すなわち、生物内）であり得る。特定の実施形態では、細胞は哺乳動物細胞または哺乳動物細胞株である。特定の実施形態では、細胞はヒト細胞またはヒト細胞株である。
【０１０１】
適切な哺乳動物細胞または細胞株の非限定的な例には、ヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２）；ヒトＵ２−ＯＳ骨肉腫細胞、ヒトＡ５４９細胞、ヒトＡ−４３１細胞、およびヒトＫ５６２細胞；チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞；マウス骨髄腫ＮＳ０細胞、マウス胚線維芽細胞３Ｔ３細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）、マウスＢリンパ腫Ａ２０細胞；マウス黒色腫Ｂ１６細胞；マウス筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２細胞；マウス骨髄腫ＳＰ２／０細胞；マウス胚間葉Ｃ３Ｈ−１０Ｔ１／２細胞；マウス癌ＣＴ２６細胞、マウス前立腺ＤｕＣｕＰ細胞；マウス乳房ＥＭＴ６細胞；マウス肝癌Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞；マウス骨髄腫Ｊ５５８２細胞；マウス上皮ＭＴＤ−１Ａ細胞；マウス心筋ＭｙＥｎｄ細胞；マウス腎ＲｅｎＣａ細胞；マウス膵臓ＲＩＮ−５Ｆ細胞；マウス黒色腫Ｘ６４細胞；マウスリンパ腫ＹＡＣ−１細胞；ラット膠芽腫９Ｌ細胞；ラットＢリンパ腫ＲＢＬ細胞；ラット神経芽細胞腫Ｂ３５細胞；ラット肝癌細胞（ＨＴＣ）；バッファローラット肝臓ＢＲＬ  ３Ａ細胞；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ）；イヌ乳腺（ＣＭＴ）細胞；ラット骨肉腫Ｄ１７細胞；ラット単球／マクロファージＤＨ８２細胞；サル腎臓ＳＶ−４０形質転換線維芽細胞（ＣＯＳ７）細胞；サル腎臓ＣＶＩ−７６細胞；アフリカミドリザル腎臓（ＶＥＲＯ−７６）細胞が含まれる。哺乳類細胞株の広範なリストは、American Type Culture Collection catalog (ATCC, Manassas, VA)にある。
【０１０２】
（ＶＩ）特定のゲノム遺伝子座を検出する方法
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質が非ヌクレアーゼ活性を有する実施形態では、上で詳述した方法は、真核細胞の特定のゲノム遺伝子座を検出または視覚化するために修飾され得る。そのような実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、少なくとも１つの検出可能な標識をさらに含む。検出可能な標識は、蛍光色素（例えば、ＦＡＭ、ＴＭＲ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、テキサスレッド、オレゴングリーン、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒｓ、Ｈａｌｏタグ、または適切な蛍光色素）、精製タグ（例えば、ビオチン、ジゴキシゲニンなど）、量子ドット、または金粒子であり得る。本明細書に開示される様々な成分間の相互作用は、特定のゲノム遺伝子座または標的染色体配列の検出を促進および強化する。
【０１０３】
この方法は、少なくとも１つの合成２パートｇＲＮＡ、少なくとも１つのＲＮＡアプタマー結合タンパク質またはコード核酸、および検出可能に標識されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質またはコード核酸を真核細胞に導入し、標的染色体配列に結合した標識化ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓを検出することを含む。検出は、動的生細胞イメージング、蛍光顕微鏡法、共焦点顕微鏡法、免疫蛍光法、免疫検出法、ＲＮＡ−タンパク質結合、タンパク質−タンパク質結合などを介し得る。検出段階は、生細胞または固定細胞で実行され得る。
【０１０４】
本方法が生細胞のクロマチン構造ダイナミクスを検出することを含む実施形態では、成分はタンパク質または核酸として細胞に導入され得る。方法が固定細胞内の標的化染色体配列を検出することを含む実施形態では、成分はタンパク質（またはＲＮＡ−タンパク質複合体）として細胞に導入され得る。細胞を固定および透過処理する手段は、当技術分野で周知である。いくつかの実施形態では、固定化細胞を化学的および／または熱変性プロセスに供して、二本鎖染色体ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに変換し得る。他の実施形態では、固定化細胞は化学的および／または熱変性プロセスを受けない。
【０１０５】
実施形態では、ガイドＲＮＡは、インサイトゥ検出のための検出可能な標識（例えば、ＦＩＳＨまたはＣＩＳＨ）をさらに含み得る。検出可能な標識は当技術分野で周知である。
【０１０６】
（ＶＩＩ）応用
本明細書に開示される組成物および方法は、さまざまな治療、診断、産業、および研究用途で使用され得る。いくつかの実施形態では、本開示を使用して、遺伝子の機能をモデル化および／または研究するため、関心のある遺伝状態またはエピジェネティックな状態を研究するため、またはさまざまな病気や障害に関係する生化学的経路を研究するために、任意の染色体配列の転写を調節するか、または細胞、動物、または植物における関心のある任意の染色体配列を修正／編集し得る。例えば、疾患または障害に関連する１つまたは複数の核酸配列の発現が改変された、疾患または障害をモデル化するトランスジェニック生物を作成し得る。疾患モデルは、生物に対する突然変異の影響の研究、疾患の発生および／または進行の研究、疾患に対する薬学的に活性な化合物の効果の研究、および／または潜在的な遺伝子治療戦略の有効性の評価に使用され得る。
【０１０７】
他の実施形態では、組成物および方法は、特定の生物学的プロセスに関与する遺伝子の機能および、遺伝子発現における任意の変化がどのように生物学的プロセスに影響を与えることができるのかを研究し、または細胞表現型と組み合わせてゲノム遺伝子座の飽和またはディープスキャニング突然変異導入を実施するために使用され得る、効率的かつ費用効果の高い機能的ゲノムスクリーニングを実施するために使用され得る。飽和またはディープスキャニング突然変異導入は、例えば遺伝子発現、薬剤耐性、疾患の反転に必要な機能要素の重要な最小特徴および個別の脆弱性を決定するために使用され得る。
【０１０８】
さらなる実施形態では、本明細書において開示される組成物および方法は、疾患または障害の存在を確定する診断テストのため、および／または処置オプションの決定における使用のために使用され得る。適切な診断テストの例は、がん細胞における特異的変異の検出（例えば、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２等における特異的変異）、特定の疾患に関連する特異的変異の検出（例えば、トリヌクレオチド反復、鎌状赤血球疾患に関連するβグロビンにおける変異、特異的ＳＮＰ等）、肝炎の検出、ウイルス（例えばジカ）の検出等を含む。
【０１０９】
追加の実施形態では、本明細書において開示される組成物および方法は、特定の疾患または障害に関連する遺伝的変異を修正するため、例えば、鎌状赤血球症またはサラセミアに関連するグロビン遺伝子変異を修正する、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）に関連するアデノシンデアミナーゼ遺伝子における変異を修正する、ＨＴＴ、ハンチントン病の疾患を引き起こす遺伝子の発現を減少させる、または色素性網膜炎の処置のためのロドプシン遺伝子における変異を修正するために使用され得る。かかる修飾は、エクスビボで細胞において行われてもよい。
【０１１０】
さらに他の実施形態では、本明細書において開示される組成物および方法は、改善された特性または環境ストレスに対する増加した抵抗性を有する作物を生成するために使用され得る。本開示は、改善された特性を有する家畜または製造動物を生成するためにも使用され得る。例えば、ブタは、特に再生医療または異種移植において、生物医学モデルとして魅力的な多くの特徴を有する。
【０１１１】
列挙された実施形態
以下に列挙される実施形態は、本発明の特定の態様を例示するために提示され、その範囲を限定することを意図するものではない。
【０１１２】
１．（ａ）クラスター化規則的配置短回文配列反復（ＣＲＩＳＰＲ）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）および（ｂ）トランス活性化型（ｔｒａｎｓａｃｔｉｎｇ）ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む合成２パートガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）であって、ｃｒＲＮＡが染色体ＤＮＡの標的配列と相補的な５’配列およびｔｒａｃｒＲＮＡの一部と塩基対合できる３’配列を含み；ｔｒａｃｒＲＮＡが、５’テトラループおよび少なくとも１つのステムループを含み、５’テトラループおよび／または少なくとも１つのステムループが、少なくとも１つのヘアピン形成ＲＮＡアプタマー配列を含むように修飾される、合成２パートｇＲＮＡ。
【０１１３】
２．少なくとも１つのヘアピン形成ＲＮＡアプタマー配列がＭＳ２配列、ＰＰ７配列、ｃｏｍ配列、ボックスＢ配列、ヒストンｍＲＮＡ  ３’配列、ＡＵ−リッチ要素（ＡＲＥ）配列、またはその変異体である、列挙１の合成２パートｇＲＮＡ。
【０１１４】
３．少なくとも１つのヘアピン形成ＲＮＡアプタマー配列が、ｔｒａｃｒＲＮＡの５’テトラループ、少なくとも１つのステムループ、および／または３’末端に位置する、列挙１または２の合成２パートｇＲＮＡ。
【０１１５】
４．ｔｒａｃｒＲＮＡがステムループ１、ステムループ２、およびステムループ３を含み、少なくとも１つのヘアピン形成ＲＮＡアプタマーが５’テトラループおよび／またはステムループ２に位置する、列挙３の合成２パートｇＲＮＡ。
【０１１６】
５．５’テトラループおよび／またはステムループ２がさらに伸長配列を含む、列挙４の合成２パートｇＲＮＡ。
【０１１７】
６．伸長配列が約２ヌクレオチドから約３０ヌクレオチドを含む、列挙５の合成２パートｇＲＮＡ。
【０１１８】
７．ｃｒＲＮＡが、ｔｒａｃｒＲＮＡの５’テトラループの伸長配列または５’テトラループの伸長配列の一部と塩基対合できる配列をさらに含む、列挙５または６の合成２パートｇＲＮＡ。
【０１１９】
８．ｃｒＲＮＡが化学的に合成された、列挙１から７のいずれか１つの合成２パートｇＲＮＡ。
【０１２０】
９．ｔｒａｃｒＲＮＡがインビトロで酵素的に合成される、列挙１から７のいずれか１つの合成２パートｇＲＮＡ。
【０１２１】
１０．列挙１から６のいずれか１つのｔｒａｃｒＲＮＡをコードする核酸。
【０１２２】
１１．インビトロＲＮＡ合成のためのファージＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーター配列に作動可能に連結されている、列挙９の核酸。
【０１２３】
１２．ベクターの一部である、列挙９または１０の核酸。
【０１２４】
１３．列挙１から６のいずれか１つで定義されるｔｒａｃｒＲＮＡ、または列挙１０から１２のいずれか１つで定義される核酸を含むキット。
【０１２５】
１４．列挙１、７、または８のいずれか１つで定義される少なくとも１つのｃｒＲＮＡをさらに含む、列挙１３のキット。
【０１２６】
１５．少なくとも１つのｃｒＲＮＡがｃｒＲＮＡのライブラリーを含む、列挙１３または１４のキット。
【０１２７】
１６．少なくとも１つの機能的ドメインに関連する少なくとも１つのＲＮＡアプタマー結合タンパク質または少なくとも１つの機能的ドメインに関連する少なくとも１つのＲＮＡアプタマー結合タンパク質をコードする核酸をさらに含む、列挙１３から１５のいずれか１つのキット。
【０１２８】
１７．ＲＮＡアプタマー結合タンパク質がＭＣＰ、ＰＣＰ、Ｃｏｍ、Ｎ２２、ＳＬＢＰ、またはＦＸＲ１であり、少なくとも１つの機能ドメインが転写活性化ドメイン、転写リプレッサードメイン、エピジェネティック修飾ドメイン、マーカードメイン、またはその組み合わせである、列挙１６のキット。
【０１２９】
１８．転写活性化ドメインが、ＶＰ１６活性化ドメイン、ＶＰ６４活性化ドメイン、ＶＰ１６０活性化ドメイン、ＮＦκＢ由来のｐ６５活性化ドメイン、熱ショック因子１（ＨＳＦ１）活性化ドメイン、ＭｙｏＤ１活性化ドメイン、ＧＣＮ４ペプチド、ウイルスＲトランス活性化因子（Ｒｔａ）、５３活性化ドメイン、ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質（ＣＲＥＢ）活性化ドメイン、Ｅ２Ａ活性化ドメイン、または活性化Ｔ細胞の核因子（ＮＦＡＴ）活性化ドメインである、列挙１７のキット。
【０１３０】
１９．転写リプレッサードメインが、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）リプレッサードメイン、誘導性ｃＡＭＰ初期リプレッサー（ＩＣＥＲ）ドメイン、ＹＹ１グリシンリッチリプレッサードメイン、Ｓｐ１様リプレッサードメイン、Ｅ（ｓｐｌ）リプレッサードメイン、ＩκＢリプレッサードメイン、またはメチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）リプレッサードメインである、列挙１７のキット。
【０１３１】
２０．エピジェネティック修飾ドメインがアセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、アミノ化活性、脱アミノ化活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、脱ミリストイル化活性、シトルリン化活性、アルキル化活性、脱アルキル化活性、ヘリカーゼ活性、酸化活性、またはヌクレオソーム相互作用活性を有する、列挙１７のキット。
【０１３２】
２１．エピジェネティック修飾ドメインがｐ３００ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）、ＡＰＯＢＥＣシチジンデアミナーゼ、またはＴＥＴメチルシトシンジオキシゲナーゼである、列挙２０のキット。
【０１３３】
２２．マーカードメインが蛍光タンパク質、精製タグ、またはエピトープタグである、列挙１７のキット。
【０１３４】
２３．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質をコードする核酸をさらに含む、列挙１３から２２のいずれか１つのキット。
【０１３５】
２４．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質がヌクレアーゼ活性を有するか、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質が非ヌクレアーゼ活性を有する、列挙２３のキット。
【０１３６】
２５．ヌクレアーゼ活性を有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼまたは非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼドメインに連結された触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質である、列挙２４のキット。
【０１３７】
２６．非ヌクレアーゼ活性を有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質が、非ヌクレアーゼドメインに連結された触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質である、列挙２４のキット。
【０１３８】
２７．非ヌクレアーゼドメインが、転写活性化ドメイン、転写リプレッサードメイン、またはエピジェネティック修飾ドメインである、列挙２６のキット。
【０１３９】
２８．転写活性化ドメインがＶＰ１６活性化ドメイン、ＶＰ６４活性化ドメイン、ＶＰ１６０活性化ドメイン、ＮＦκＢｐ６５活性化ドメイン、熱ショック因子１（ＨＳＦ１）活性化ドメイン、ＭｙｏＤ１活性化ドメイン、ＧＣＮ４ペプチド、ウイルスＲトランス活性化因子（Ｒｔａ）、５３活性化ドメイン、ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質（ＣＲＥＢ）活性化ドメイン、Ｅ２Ａ活性化ドメイン、または活性化Ｔ細胞の核因子（ＮＦＡＴ）活性化ドメインである、列挙２７のキット。
【０１４０】
２９．転写リプレッサードメインがクルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）リプレッサードメイン、ＹＹ１グリシンリッチリプレッサードメイン、Ｓｐ１様リプレッサードメイン、Ｅ（ｓｐｌ）リプレッサードメイン、ＩκＢリプレッサードメイン、またはメチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）リプレッサードメインである、列挙２７のキット。
【０１４１】
３０．エピジェネティック修飾ドメインが、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、アミノ化活性、脱アミノ化活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、脱ミリストイル化活性、シトルリン化活性、アルキル化活性、脱アルキル化活性、ヘリカーゼ活性、酸化活性、またはヌクレオソーム相互作用活性を有する、列挙２７のキット。
【０１４２】
３１．エピジェネティック修飾ドメインがｐ３００ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）、ＡＰＯＢＥＣシチジンデアミナーゼ、またはＴＥＴメチルシトシンジオキシゲナーゼである、列挙３０のキット。
【０１４３】
３２．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質がＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼまたはＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼである、列挙２３から３１のいずれか１つのキット。
【０１４４】
３３．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質が、少なくとも１つの核局在化シグナル、少なくとも１つの細胞透過性ペプチド、少なくとも１つのマーカードメイン、またはそれらの組み合わせをさらに含む、列挙２３から３２のいずれか１つのキット。
【０１４５】
３４．（ａ）列挙１から９のいずれか１つで定義された合成２パートｇＲＮＡ；（ｂ）列挙１６から２２のいずれか１つで定義された少なくとも１つのＲＮＡアプタマー結合タンパク質；および（ｃ）列挙２３から３３のいずれかで定義されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、を含む組成物。
【０１４６】
３５．（ａ）列挙１から９のいずれか１つで定義された合成２パートｇＲＮＡ；（ｂ）列挙１６から２２のいずれか１つで定義された少なくとも１つのＲＮＡアプタマー結合タンパク質；および（ｃ）列挙２３から３３のいずれかで定義された少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、を細胞に導入することを含む、真核細胞における標的化転写活性化、標的化転写抑制、標的化エピゲノム修飾、標的化ゲノム修飾、または標的化ゲノム遺伝子座の視覚化のための方法。
【０１４７】
３６．（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の組み合わせが、ｇＲＮＡがＲＮＡアプタマー配列を含まないＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムと比較して、増大した効率および／または特異性を有する、列挙３５の方法。
【０１４８】
３７．１つ以上の追加のｃｒＲＮＡを導入することをさらに含み、各追加のｃｒＲＮＡが異なる５’配列であるがユニバーサル３’配列を含むものである、列挙３５または３６の方法。
【０１４９】
３８．少なくとも１つのドナー配列を含むドナーポリヌクレオチドを真核細胞に導入することをさらに含み、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質がヌクレアーゼ活性を有するものである、列挙３５から３７のいずれか１つの方法。
【０１５０】
３９．真核細胞がインビトロである、列挙３５から３８のいずれか１つの方法。
【０１５１】
４０．真核細胞がインビボである、列挙３５から３８のいずれか１つの方法。
【０１５２】
４１．真核細胞が哺乳動物細胞である、列挙３５から４０のいずれか１つの方法。
【０１５３】
定義
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、該発明が属する分野の当業者により一般に理解される意味を有する。以下の参考文献は、当業者に、本発明で使用される用語の多くの一般的定義を提供する：Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology（第２版1994）; The Cambridge Dictionary of Science and Technology（Walker ed., 1988）; The Glossary of Genetics, 第５版, R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991);およびHale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本明細書で使用される場合、以下の用語は、他に特定されない限り、それらに帰せられる意味を有する。
【０１５４】
本開示またはその好ましい実施形態の要素を導入する場合、冠詞「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」、「該（ｔｈｅ）」および「該（ｓａｉｄ）」は、該要素の１以上があることを意味するように意図される。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」なる用語は、包括的であるように、そしてリストされた要素以外の追加の要素があってもよいことを意味するように意図される。
【０１５５】
「約」なる用語は、数値ｘに関して使用される場合、例えばｘ±５％を意味する。
【０１５６】
本明細書で使用される場合、「相補的」または「相補性」なる用語は、特異的水素結合による塩基対合による二本鎖核酸の関連を指す。塩基対合は、標準的なワトソン−クリック塩基対合（例えば、５’−ＡＧＴＣ−３’が、相補的な配列３’−ＴＣＡＧ−５’とペアになる）であってもよい。塩基対合は、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン水素結合であってもよい。相補性は典型的に、二重領域に関して測定され、ゆえに、例えばオーバーハングを除く。二重領域の２本の鎖間の相補性は部分的であってもよく、塩基の一部（例えば７０％）のみが相補的である場合、パーセンテージ（例えば７０％）で表されてもよい。相補的でない塩基は「不一致」である。二重領域内の全ての塩基が相補的である場合、相補性は完全（すなわち１００％）であってもよい。
【０１５７】
本明細書で使用される場合、「ＣＲＩＳＰＲシステム」なる用語は、ＣＲＩＳＰＲタンパク質（すなわち、ヌクレアーゼ、ニッカーゼ、または触媒的に死んだタンパク質）およびガイドＲＮＡを含む複合体を指す。
【０１５８】
本明細書で使用される場合、「内因性配列」なる用語は、細胞に固有の染色体配列を指す。
【０１５９】
本明細書で使用される場合、「外因性」なる用語は、細胞に固有ではない配列、または細胞のゲノム中の固有の位置が異なる染色体位置にある染色体配列を指す。
【０１６０】
本明細書で使用される場合、「遺伝子」は、かかる調節配列がコーディングおよび／または転写された配列に隣接しているかどうかに関わらず、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域（エクソンおよびイントロンを含む）、ならびに遺伝子産物の製造を調節する全てのＤＮＡ領域を指す。したがって、遺伝子は、プロモーター配列、ターミネーター、リボソーム結合部位および内部リボソーム侵入部位等の翻訳調節配列、エンハンサー、サイレンサー、インシュレーター、境界要素、複製起点、マトリックス付着部位、および遺伝子座制御領域を含むが、必ずしもこれらに限定されない。
【０１６１】
「異種」なる用語は、目的の細胞にとって内因性または固有ではない実体を指す。例えば、異種のタンパク質は、外因性のソース由来であるか、またはもともと外因性のソース由来であった、外因的に導入された核酸配列等のタンパク質を指す。場合によりは、異種のタンパク質は通常、目的の細胞により製造されない。
【０１６２】
「ニッカーゼ」なる用語は、二本鎖核酸配列の１本の鎖を開裂する（すなわち、二本鎖配列にニックを入れる）酵素を指す。例えば、二重鎖開裂活性を有するヌクレアーゼは、ニッカーゼとして機能し、二本鎖配列の１本の鎖のみを開裂するように、変異および／または欠失により修飾され得る。
【０１６３】
本明細書で使用される場合、「ヌクレアーゼ」なる用語は、二本鎖核酸配列の両方の鎖を開裂する酵素を指す。
【０１６４】
「核酸」および「ポリヌクレオチド」なる用語は、直鎖または環状配座、および単一または二本鎖いずれかの形のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的のために、これらの用語は、ポリマーの長さに関して制限するものとして解釈されるべきではない。該用語は、天然のヌクレオチドの既知の類似体、ならびに塩基、糖および／またはリン酸部分（例えば、ホスホロチオエート骨格）において修飾されたヌクレオチドを包含することができる。一般に、特定のヌクレオチドの類似体は、同じ塩基対合特異性を有する；すなわち、Ａの類似体はＴと塩基対合する。
【０１６５】
「ヌクレオチド」なる用語は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを指す。ヌクレオチドは、標準的なヌクレオチド（すなわち、アデノシン、グアノシン、シチジン、チミジン、およびウリジン）、ヌクレオチド異性体、またはヌクレオチド類似体であってもよい。ヌクレオチド類似体は、修飾されたプリンまたはピリミジン塩基または修飾されたリボース部分を有するヌクレオチドを指す。ヌクレオチド類似体は、天然のヌクレオチド（例えば、イノシン、シュードウリジン等）または非天然のヌクレオチドであってもよい。ヌクレオチドの糖または塩基部分への修飾の非限定的な例は、アセチル基、アミノ基、カルボキシル基、カルボキシメチル基、ヒドロキシル基、メチル基、ホスホリル基、およびチオール基の付加（または除去）、ならびに塩基の炭素および窒素原子の他の原子（例えば、７−デアザプリン）での置換を含む。ヌクレオチド類似体は、ジデオキシヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、およびモルホリノも含む。
【０１６６】
「ポリペプチド」および「タンパク質」なる用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために互換的に使用される。
【０１６７】
「標的配列」、「標的染色体配列」、および「標的部位」なる用語は、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質が標的化される染色体ＤＮＡ中の特異的配列、および該プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質がＤＮＡまたは該ＤＮＡと関連するタンパク質を修飾する部位を指すために、交換可能に使用される。
【０１６８】
核酸およびアミノ酸配列同一性を決定するための技術は、当該分野で周知である。典型的に、そのような技術は、遺伝子のｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定すること、および／またはそれによりコードされるアミノ酸配列を決定すること、およびこれらの配列を第２のヌクレオチドまたはアミノ酸配列と比較することを含む。ゲノム配列もこの方法で決定および比較できる。一般に、同一性とは、それぞれ２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の正確なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の一致を指す。２つ以上の配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）は、それらの同一性パーセントを決定することにより比較され得る。２つの配列のパーセント同一性は、核酸配列かアミノ酸配列かにかかわらず、２つの整列した配列間の正確な一致の数をより短い配列の長さで除算し、１００を掛けたものである。核酸配列のおおよそのアラインメントは、Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)の局所相同性アルゴリズムにより提供される。該アルゴリズムは、Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M. O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USAにより開発されたスコアリングマトリックスを使用して、アミノ酸配列に適用され、そしてGribskov, Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763 (1986)により正規化され得る。配列のパーセント同一性を決定するための該アルゴリズムの例示的な実装は、「ＢｅｓｔＦｉｔ」実用出願におけるGenetics Computer Group (Madison, Wis.)により提供される。配列間のパーセント同一性または類似性を計算するための他の適切なプログラムは、一般に当技術分野で既知であり、例えば、別のアライメントプログラムはデフォルトのパラメータとともに使用されるＢＬＡＳＴである。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、次のデフォルトパラメータを使用して使用できる：genetic code=standard; filter=none; strand=both; cutoff=60; expect=10; Matrix=BLOSUM62; Descriptions=50 sequences; sort by=HIGH SCORE; Databases=non-redundant, GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+Swiss protein+Spupdate+PIR。これらのプログラムの詳細は、ＧｅｎＢａｎｋウェブサイトで見出だせる。
【０１６９】
本発明の範囲から逸脱することなく、上記の細胞および方法において種々の変化がなされ得るため、上の説明および以下に与えられる実施例に含有される全ての事項が、限定的な意味ではなく、例示として解釈されるべきであることが意図される。
【実施例】
【０１７０】
以下の実施例は、本開示の特定の態様を実証する。
【０１７１】
実施例１：２パートガイドＲＮＡの設計および合成
本明細書に開示される２パートｇＲＮＡは、標的特異的である１つのｃｒＲＮＡと、ユニバーサル配列を含む１つのアプタマー−ｔｒａｃｒＲＮＡとを含む。ＳｐＣａｓ９（設計＃１）の典型的な２パートｇＲＮＡの配列と二次構造を図１に示す。１．ＭＳ２ステムループ配列（各３４ｎｔ）がテトラループとステムループ２に挿入されている。伸長配列（下線付き）がテトラループに挿入されている。ｃｒＲＮＡには、２０ｎｔの個々のスペーサー（標的特異的）配列が含まれる。表１は、この配列と他のいくつかの２パートｇＲＮＡデザインの配列を示す（テトラループ伸長配列には下線が引かれている）。ｃｒＲＮＡは化学的に合成され、アプタマー−ｔｒａｃｒＲＮＡはインビトロで酵素的に合成された。
【表１】
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【０１７２】
実施例２：２パートガイドＲＮＡ  ｇＲＮＡによる標的遺伝子の活性化
上記の実施例１に記載された２２パートｇＲＮＡのいくつかを、ヒトＰＯＵ５Ｆ１およびＩＬ１Ｂ遺伝子の活性化について試験した。設計＃１（伸長テトラループ配列を含む）、設計＃５（長い伸長テトラループ配列を含む）、および設計＃４（伸長テトラループ配列を含まない）について試験した。対照ｃｒＲＮＡ＋ｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｓｙｇ）はアプタマー配列を含まない。ＰＯＵ５Ｆ１およびＩＬ１Ｂ遺伝子の両方は、ＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎臓）細胞でダウンレギュレートされているか、発現していないことが知られている。安定したＨＥＫ２９３細胞株は、レンチウイルスを介したＶＰ６４−ｄＣａｓ９およびＭＳ２−ＨＳＦ１−Ｐ６５の挿入を使用して作成された。細胞は、トランスフェクション試薬３μｌを使用して、１２ウェル組織培養プレート中で１５０，０００細胞あたり１００ｐｍｏｌの２パートｇＲＮＡでトランスフェクトされた。ＰＯＵ５Ｆ１用の標的配列（ＧＧＡＡＡＡＣＣＧＧＧＡＧＡＣＡＣＡＡＣ；配列番号：４８）またはＩＬ１Ｂ用の標的配列（ＡＡＡＧＧＧＧＡＡＡＡＧＡＧＴＡＴＴＧＧ；配列番号：４９）合成ｃｒＲＮＡに含まれ、１０ｍＭ  ＴＲＩＳ、ｐＨ７．５および０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ中で、９５℃で２分間、合成されたｔｒａｃｒＲＮＡと１：１のモル比で複合化し、０．５℃／秒で１２℃に冷却した。
【０１７３】
全ＲＮＡを採取し、Ｔａｑｍａｎプローブ（Ｈｓ００３００５１１１＿ｍ１、Ｈｓ００１７４０９７＿ｍ１）を使用して多重定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を実行することにより、遺伝子発現をアッセイした。発現は、ハウスキーピング遺伝子ＰＰＩＡの発現に対して正規化された。陰性対照は、ｐＭＡＸ−ＧＦＰ  ＤＮＡで細胞をトランスフェクトすることで得られた。標的の活性化を、アプタマー修飾を含まない対照ｃｒＲＮＡ＋ｔｒａｃｒＲＮＡと比較した。
【０１７４】
図２Ａおよび２Ｂに示すとおり、２パートガイドＲＮＡ設計＃１および設計＃５（両方ともアプタマーおよび伸長テトラループ配列を含む）は、陰性対照と比較して、ＰＯＵ５Ｆ１（図２Ａ）およびＩＬ１Ｂ（図２Ｂ）の両方で転写活性化を有意に促進できた。重要なことに、２パートガイドＲＮＡ設計＃４（アプタマー配列を含むが、伸長テトラループ配列を含まない）では、標的の活性化が不十分またはまったく生じなかった。これらのデータは、設計＃１または＃５のような伸長テトラループが重要であることを示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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