(57)【要約】ヌクレアーゼ、ならびに、これらのヌクレアーゼをＣＦＴＲ遺伝子の変更ならびに細胞および動物モデルの生成のために使用する方法。ＣＦＴＲ遺伝子座を変更するための方法および組成物が本明細書に開示される。ＣＦ遺伝子（例えば、ＣＦＴＲ）の機能を研究するためのモデル、ＣＦ薬発見のためおよびＣＦを処置するためのモデル、ならびにこれらのモデル系を作製し、使用する方法も記載される。上記方法は、治療レベルでの産生を含め、細胞に組み込まれた導入遺伝子からのＣＦＴＲタンパク質の産生を含み得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能性ドメインと、標的部位であるＣＦＴＲのイントロン１〜３もしくは６〜８またはａａＡＧＡＡＡＡＴＡＴＣＡＴＴＧＧｔｇｔｔｔｃｃｔａｔｇ（配列番号１０８）に示される標的部位に結合するＤＮＡ結合性ドメインとを含む融合分子。
【請求項２】
それぞれが切断ドメインとジンクフィンガーＤＮＡ結合性ドメイン（ＺＦＰ）とを含むジンクフィンガーヌクレアーゼの対を含むヌクレアーゼであって、前記対が、
（ｉ）５６５２６と称されるＺＦＰを含むＺＦＮおよび５６５２７と称されるＺＦＰを含むＺＦＮ；
（ｉｉ）５６５２６と称されるＺＦＰを含むＺＦＮおよび５６５２７または５６５２９と称されるＺＦＰを含むＺＦＮ；
（ｉｉｉ）５６５０６または５６５１１と称されるＺＦＰを含むＺＦＮおよび５６５２０または５６５１９と称されるＺＦＰを含むＺＦＮ；
（ｉｖ）５６３１６と称されるＺＦＰを含むＺＦＮおよび５６３１７と称されるＺＦＰを含むＺＦＮ；
（ｖ）５６２８２と称されるＺＦＰを含むＺＦＮおよび５６２８３と称されるＺＦＰを含むＺＦＮ；
（ｖｉ）５６４４５と称されるＺＦＰを含むＺＦＮおよび５６４４４と称されるＺＦＰを含むＺＦＮ；
（ｖｉ）５６１２６と称されるＺＦＰを含むＺＦＮおよび５６１２７と称されるＺＦＰを含むＺＦＮ；または
（ｖｉｉ）５６２５５と称されるＺＦＰを含むＺＦＮおよび５６２５４と称されるＺＦＰを含むＺＦＮ
からなる群から選択される、ヌクレアーゼを含む、請求項１に記載の融合分子。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の融合分子をコードするポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項３に記載のポリヌクレオチドを含むウイルスまたは非ウイルスベクター。
【請求項５】
ＡＡＶベクターを含む、請求項４に記載のウイルスベクター。
【請求項６】
請求項１もしくは請求項２に記載の融合分子または請求項３に記載のポリヌクレオチドまたは請求項４もしくは５に記載のベクターを含む医薬組成物。
【請求項７】
請求項１もしくは請求項２に記載の融合分子または請求項３に記載のポリヌクレオチドまたは請求項４もしくは５に記載のベクターまたは請求項６に記載の医薬組成物を含む単離された細胞。
【請求項８】
単離された細胞において１つまたは複数のＣＦＴＲ遺伝子を改変する方法であって、（ａ）前記細胞に、請求項２に記載の１つまたは複数のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを、前記ヌクレアーゼ（単数または複数）が発現され、前記１つまたは複数のＣＦＴＲ遺伝子が切断され、改変されるような条件下で導入するステップを含む方法。
【請求項９】
前記改変が、ＣＦＴＲ遺伝子内の挿入および／または欠失を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＣＦＴＲ遺伝子の断片を含む導入遺伝子を、前記細胞に、前記導入遺伝子が前記ＣＦＴＲ遺伝子に組み込まれると機能性ＣＦＴＲタンパク質が発現されるように導入するステップをさらに含む、請求項８または請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記導入遺伝子が、前記ＣＦＴＲ遺伝子のイントロン１、３、７または８に組み込まれる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞が、前記ＣＦＴＲ遺伝子におけるΔＦ５０８突然変異を含み、前記ヌクレアーゼが、ΔＦ５０８突然変異に特異的であり、前記方法が、前記突然変異を野生型配列に矯正するドナーヌクレオチド配列をさらに導入するステップであって、前記ＣＦＴＲ遺伝子が前記ヌクレアーゼによって切断された後、前記ドナーが前記ＣＦＴＲ遺伝子に組み込まれるステップをさらに含む、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１３】
ＣＦＴＲ遺伝子が請求項２に記載のヌクレアーゼによって切断された後に前記ＣＦＴＲ遺伝子に組み込まれた外因性配列を含む遺伝子改変細胞。
【請求項１４】
前記外因性配列が、ＣＦＴＲ遺伝子の断片または前記ＣＦＴＲ遺伝子における突然変異を矯正する配列を含む導入遺伝子を含み、したがって、前記外因性配列が組み込まれると、前記ＣＦＴＲ遺伝子が機能性ＣＦＴＲタンパク質をコードする、請求項１３に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項１５】
前記細胞が、肺細胞または幹細胞である、請求項１３または請求項１４に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項１６】
突然変異型ＣＦＴＲ遺伝子を含む細胞または細胞株または胚を作製する方法であって、野生型ＣＦＴＲ遺伝子を有する細胞を準備するステップと、請求項２に記載のヌクレアーゼまたは請求項３に記載のポリヌクレオチドを前記細胞に前記ＣＦＴＲ遺伝子が突然変異するように導入することによって前記野生型遺伝子を突然変異させるステップとを含む方法。
【請求項１７】
請求項１もしくは請求項２に記載の融合分子；請求項３に記載のポリヌクレオチド  ；請求項４もしくは５に記載のベクター；請求項６に記載の医薬組成物；または請求項１３から１５に記載の遺伝子改変細胞、細胞株または胚を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、２０１７年５月３日に出願された米国仮出願番号第６２／５００，８３２号、および２０１７年６月２１日に出願された米国仮出願番号第６２／５２２，８７０号の利益を主張しており、これら仮出願の開示は、それらの全体が参考として本明細書によって援用される。
【０００２】
技術分野
本開示は、ゲノム編集、具体的にはＣＦＴＲ遺伝子の改変の分野に存する。
【背景技術】
【０００３】
背景
嚢胞性線維症（ＣＦ）などの遺伝性障害を含めた肺疾患は小児集団において依然として問題となっている。
【０００４】
ＣＦは、１５００〜４０００件の出生に１件生じる常染色体劣性障害であり、最も一般的な遺伝性小児障害の１つである。ＣＦにおける主要欠陥は、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子によってコードされる塩化物イオンチャネルタンパク質による上皮塩化物イオン輸送の調節におけるものである。例えば、Keremら（１９８９年）、Science、２４５巻：１０７３〜１０８０頁；Kredaら（２００５年）、Mol  Biol  Cell、１６巻：２１５４〜２１６７頁を参照されたい。ＣＦ患者において観察される突然変異の約７０％は、ＣＦＴＲのヌクレオチド配列における３塩基対の欠失に起因し、これは、当該タンパク質の５０８位に位置するアミノ酸フェニルアラニンの喪失をもたらす（ΔＦ５０８と称される突然変異）。野生型ゲノムでは、アミノ酸５０７はイソロイシンであり、コドンＴＡＧによってコードされ、Ｇは、遺伝子のヌクレオチド１６５２である。アミノ酸５０８は、ＡＡＡによってコードされるフェニルアラニンである。Δ５０８突然変異では、５０８コドンの最初の２つのＡと一緒に５０７コドンからＧが欠失しており、したがって、当該突然変異は、欠失した５０７〜５０８コード位に配列ＴＡＡを有する。ＴＡＡもイソロイシンをコードするが、野生型５０８位のフェニルアラニンは喪失する。ΔＩ５０７欠失に関しては、５０６位または５０７位のイソロイシンのいずれかが欠失している。この突然変異に関しては、ヌクレオチド１６４８〜１６５０もしくは１６５１〜１６５３が喪失しているか、または結果生じるタンパク質中にイソロイシンが１つだけになるそれらのある組合せである。複合（ヘテロ接合性）突然変異（ΔＦ５０８およびΔＩ５０７）も実証されている。例えば、Orozcoら（１９９４年）、Am  J  Med  Genet.、５１巻（２号）：１３７〜９頁を参照されたい。ＣＦ患者は、複合ヘテロ接合性ΔＩ５０７／ΔＦ５０８またはホモ接合性ΔＦ５０８／ΔＦ５０８のいずれにせよ、十分にグリコシル化されたＣＦＴＲタンパク質を発現できず、部分的にグリコシル化されたタンパク質は、ＣＦＴＲ機能のために必要な細胞表面上での発現がなされない（例えば、Kredaら（２００５年）、Mol  Biol  Cell、１６巻：２１５４〜２１６７頁；Chengら（１９９０年）、Cell、６３巻：８２７〜８３４頁を参照されたい）。１つの対立遺伝子にだけΔＩ５０７またはΔＦ５０８  ＣＦＴＲ突然変異のいずれかを有する個体（すなわち、ｗｔ／ΔＩ５０７またはｗｔ／ΔＦ５０８）はＣＦ保因者であり、肺細胞機能の欠陥を示さない。例えば、Keremら（１９９０年）、Proc  Natl  Acad  Sci  USA、８７巻：８４４７〜８４５１頁を参照されたい。
【０００５】
いくつかの器官系がＣＦＴＲ遺伝子の突然変異によって影響を受けるが、再発性肺感染がＣＦ患者の死亡の８０〜９０％を占める。いずれのヒト肺細胞型がＣＦＴＲを発現するかに関しては議論がなされているが、最近のデータから、ＣＦＴＲ発現は近位肺において最大であり、また、表面気道上皮に存在する線毛細胞によって主に発現されることが示される。Kredaら（２００５年）、Mol  Biol  Cell、１６巻：２１５４〜２１６７頁；Engelhardtら（１９９２年）、Nat  Genet、２巻：２４０〜２４８頁；Engelhardtら（１９９４年）、J  Clin  Invest、９３巻：７３７〜７４９頁。
ｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子治療によってＣＦを処置するための試みは、ＣＦＴＲ導入遺伝子を送達するために使用されるウイルスベクターの免疫原性認識およびクリアランス、ＣＦＴＲの長期発現を検出できないこと、ならびに、肺内の関連する幹／前駆細胞集団への安定な形質導入を実現することができない可能性によって妨げられてきた（MuellerおよびFlotte（２００８年）、Clin  Rev  Allergy  Immunol、３５巻：１６４〜１７８頁；Ansonら（２００６年）、Curr  Gene  Ther、６巻：１６１〜１７９頁）。最近、ヒト肺幹細胞の単離が報告された（Kajsturaら（２０１１年）、New  England  Journal  of  Medicine、３６４巻（１９号）：１７９５頁を参照されたい）。著者らは、これらの細胞を単離し、培養物中で維持し、損傷を受けたマウス肺にｉｎ  ｖｉｖｏで再導入することができ、そこで、それらの細胞を組織中に構造的に組み込み、細気管支、肺胞および肺血管を再編成できたことを報告している。
ジンクフィンガータンパク質（「ＺＦＰ」）由来のＤＮＡ結合性ドメイン、ＴＡＬ−エフェクタードメイン（「ＴＡＬＥ」）、ならびにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ転写因子系（Ｃａｓおよび／またはＣｆｐ１系を含む）を含む組換え転写因子およびヌクレアーゼは、内因性遺伝子の遺伝子発現を制御する能力を有する。例えば、その開示が、あらゆる目的に関してそれらの全体が参照により組み込まれる、米国特許第９，３９４，５４５号；同第９，１５０，８４７号；同第９，２０６，４０４号；同第９，０４５，７６３号；同第９，００５，９７３号；同第８，９５６，８２８号；同第８，９３６，９３６号；同第８，９４５，８６８号；同第８，８７１，９０５号；同第８，５８６，５２６号；同第８，５６３，３１４号；同第８，３２９，９８６号；同第８，３９９，２１８号；同第６，５３４，２６１号；同第６，５９９，６９２号；同第６，５０３，７１７号；同第６，６８９，５５８号；同第７，０６７，３１７号；同第７，２６２，０５４号；同第７，８８８，１２１号；同第７，９７２，８５４号；同第７，９１４，７９６号；同第７，９５１，９２５号；同第８，１１０，３７９号；同第８，４０９，８６１号；米国特許出願公開第２００３／０２３２４１０号；同第２００５／０２０８４８９号；同第２００５／００２６１５７号；同第２００５／００６４４７４号；同第２００６／００６３２３１号；同第２００８／０１５９９９６号；同第２０１０／０２１８２６４号；同第２０１２／００１７２９０号；同第２０１１／０２６５１９８号；同第２０１３／０１３７１０４号；同第２０１３／０１２２５９１号；同第２０１３／０１７７９８３号；同第２０１３／０１７７９６０号；および同第２０１５／００５６７０５号；Perez-Pineraら（２０１３年）、Nature  Methods、１０巻：９７３〜９７６頁；Platekら（２０１４年）、Plant  Biotechnology  J.  doi：10.1111/pbi.12284）を参照されたい。さらに、標的化ヌクレアーゼは、ゲノム編集および遺伝子治療における使用の潜在性も有し得るＡｒｇｏｎａｕｔｅ系（例えば、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来、「ＴｔＡｇｏ」として公知、Swartsら（２０１４年）、Nature、５０７巻（７４９１号）：２５８〜２６１頁を参照されたい）に基づいて開発されている。ジンクフィンガータンパク質を含有する工学的に操作された転写因子を使用した臨床試験から、これらの新規の転写因子により種々の状態を処置することが可能であることが示されている。（例えば、Yuら（２００６年）、FASEB  J.、２０巻：４７９〜４８１頁を参照されたい）。ヌクレアーゼ媒介性切断は、標的ＤＮＡ配列に二本鎖切断（ＤＳＢ）またはニックを誘導し、その結果、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）などの誤りが生じるプロセスによる切断の修復、または修復鋳型を使用する修復（相同組換え修復またはＨＤＲ）により、遺伝子のノックアウトおよび／または目的の配列の挿入（標的化組込み）がもたらされ得るように工学的に操作されたヌクレアーゼの使用を伴う。外部から供給された修復鋳型（例えば、「ドナー」または「導入遺伝子」）の不在下での二本鎖切断の導入は、標的化された遺伝子を、細胞ＮＨＥＪ経路によって導入された突然変異（「インデル」として公知の挿入および／または欠失）によって不活化するために一般に使用される。例えば、米国特許第９，１６１，９９５号に、ＣＦＴＲ遺伝子を変更するための方法および組成物が開示されている。Craneら（２０１５年）、Stem  Cell  Reports、４巻（４号）：５６９〜７７頁も参照されたい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第９，３９４，５４５号明細書
【特許文献２】米国特許第９，１５０，８４７号明細書
【特許文献３】米国特許第９，２０６，４０４号明細書
【特許文献４】米国特許第９，０４５，７６３号明細書
【特許文献５】米国特許第９，００５，９７３号明細書
【特許文献６】米国特許第８，９５６，８２８号明細書
【特許文献７】米国特許第８，９３６，９３６号明細書
【特許文献８】米国特許第８，９４５，８６８号明細書
【特許文献９】米国特許第８，８７１，９０５号明細書
【特許文献１０】米国特許第８，５８６，５２６号明細書
【特許文献１１】米国特許第８，５６３，３１４号明細書
【特許文献１２】米国特許第８，３２９，９８６号明細書
【特許文献１３】米国特許第８，３９９，２１８号明細書
【特許文献１４】米国特許第６，５３４，２６１号明細書
【特許文献１５】米国特許第６，５９９，６９２号明細書
【特許文献１６】米国特許第６，５０３，７１７号明細書
【特許文献１７】米国特許第６，６８９，５５８号明細書
【特許文献１８】米国特許第７，０６７，３１７号明細書
【特許文献１９】米国特許第７，２６２，０５４号明細書
【特許文献２０】米国特許第７，８８８，１２１号明細書
【特許文献２１】米国特許第７，９７２，８５４号明細書
【特許文献２２】米国特許第７，９１４，７９６号明細書
【特許文献２３】米国特許第７，９５１，９２５号明細書
【特許文献２４】米国特許第８，１１０，３７９号明細書
【特許文献２５】米国特許第８，４０９，８６１号明細書
【特許文献２６】米国特許出願公開第２００３／０２３２４１０号明細書
【特許文献２７】米国特許出願公開第２００５／０２０８４８９号明細書
【特許文献２８】米国特許出願公開第２００５／００２６１５７号明細書
【特許文献２９】米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号明細書
【特許文献３０】米国特許出願公開第２００６／００６３２３１号明細書
【特許文献３１】米国特許出願公開第２００８／０１５９９９６号明細書
【特許文献３２】米国特許出願公開第２０１０／０２１８２６４号明細書
【特許文献３３】米国特許出願公開第２０１２／００１７２９０号明細書
【特許文献３４】米国特許出願公開第２０１１／０２６５１９８号明細書
【特許文献３５】米国特許出願公開第２０１３／０１３７１０４号明細書
【特許文献３６】米国特許出願公開第２０１３／０１２２５９１号明細書
【特許文献３７】米国特許出願公開第２０１３／０１７７９８３号明細書
【特許文献３８】米国特許出願公開第２０１３／０１７７９６０号明細書
【特許文献３９】米国特許出願公開第２０１５／００５６７０５号明細書
【特許文献４０】米国特許第９，１６１，９９５号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Keremら（１９８９年）、Science、２４５巻：１０７３〜１０８０頁
【非特許文献２】Kredaら（２００５年）、Mol  Biol  Cell、１６巻：２１５４〜２１６７頁
【非特許文献３】Orozcoら（１９９４年）、Am  J  Med  Genet.、５１巻（２号）：１３７〜９頁
【非特許文献４】Kredaら（２００５年）、Mol  Biol  Cell、１６巻：２１５４〜２１６７頁
【非特許文献５】Chengら（１９９０年）、Cell、６３巻：８２７〜８３４頁
【非特許文献６】Keremら（１９９０年）、Proc  Natl  Acad  Sci  USA、８７巻：８４４７〜８４５１頁
【非特許文献７】Kredaら（２００５年）、Mol  Biol  Cell、１６巻：２１５４〜２１６７頁
【非特許文献８】Engelhardtら（１９９２年）、Nat  Genet、２巻：２４０〜２４８頁
【非特許文献９】Engelhardtら（１９９４年）、J  Clin  Invest、９３巻：７３７〜７４９頁
【非特許文献１０】MuellerおよびFlotte（２００８年）、Clin  Rev  Allergy  Immunol、３５巻：１６４〜１７８頁
【非特許文献１１】Ansonら（２００６年）、Curr  Gene  Ther、６巻：１６１〜１７９頁
【非特許文献１２】Kajsturaら（２０１１年）、New  England  Journal  of  Medicine、３６４巻（１９号）：１７９５頁
【非特許文献１３】Perez-Pineraら（２０１３年）、Nature  Methods、１０巻：９７３〜９７６頁
【非特許文献１４】Platekら（２０１４年）、Plant  Biotechnology  J.  doi：10.1111/pbi.12284）
【非特許文献１５】Swartsら（２０１４年）、Nature、５０７巻（７４９１号）：２５８〜２６１頁
【非特許文献１６】Yuら（２００６年）、FASEB  J.、２０巻：４７９〜４８１頁
【非特許文献１７】Craneら（２０１５年）、Stem  Cell  Reports、４巻（４号）：５６９〜７７頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
それにもかかわらず、ＣＦＴＲタンパク質の産生、ＣＦのモデル系の開発および／またはＣＦの処置もしくは予防のための新規の組成物および方法の開発が依然として必要とされている。
【０００９】
要旨
ＣＦＴＲ遺伝子座を変更するための方法および組成物が本明細書に開示される。ＣＦ遺伝子（例えば、ＣＦＴＲ）の機能を研究するためのモデル、ＣＦ薬発見のためおよびＣＦを処置するためのモデル、ならびにこれらのモデル系を作製し、使用する方法も記載される。本明細書に記載の組成物および方法は、これらに限定されないが、ＣＦＴＲ遺伝子における標的化変更（挿入、欠失および／または置換突然変異）をもたらす動物細胞におけるＣＦＴＲ遺伝子の切断（これらの標的化変更の生殖細胞系列への組み入れを含む）；動物における、ＣＦＴＲ遺伝子（例えば、突然変異型または野生型）への導入遺伝子の標的化導入（例えば、野生型、機能性ＣＦＴＲ導入遺伝子の突然変異型ＣＦＴＲへの標的化導入）または他の非内在性核酸配列の標的化導入、ＣＦＴＲ遺伝子の部分的または完全な不活化；ＣＦＴＲ遺伝子の矯正（例えば、点突然変異の矯正）；ＣＦＴＲ遺伝子座において相同組換え修復を誘導する方法；それを必要とする患者に移植するための、矯正されたもしくは野生型（機能性）ＣＦＴＲ遺伝子を有する肺幹細胞集団の生成、および／またはＣＦＴＲ遺伝子座において改変されたトランスジェニック動物（例えば、齧歯類および非ヒト霊長類）の生成を含めたＣＦＴＲのゲノム編集のために使用することができる。ある特定の実施形態では、方法は、治療レベルでの産生を含め、細胞に組み込まれた導入遺伝子からのＣＦＴＲタンパク質の産生を含む。ＣＦＴＲ遺伝子座は、人工転写因子（例えば、ＣＦＴＲ結合性ＤＮＡドメインおよび転写制御（活性化または抑止）ドメインを含む）を使用して遺伝子の発現を変更することによって改変することもできる。
【００１０】
したがって、機能性ドメインと、標的部位であるＣＦＴＲ遺伝子のイントロン１〜３もしくは６〜８またはａａＡＧＡＡＡＡＴＡＴＣＡＴＴＧＧｔｇｔｔｔｃｃｔａｔｇ（配列番号１０８）に示される標的部位に結合するＤＮＡ結合性ドメインとを含む融合分子が本明細書に記載される。一部の実施形態では、融合分子は、人工転写因子（機能性ドメインが転写制御ドメインである）または人工ヌクレアーゼ（機能性ドメインが切断ドメインである）を含み、ＤＮＡ結合性ドメインは、ジンクフィンガータンパク質ＤＮＡ結合性ドメイン（ＺＦＰ）であり、ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼの対を含み、各ジンクフィンガーヌクレアーゼは、切断ドメインおよびジンクフィンガーＤＮＡ結合性ドメイン（ＺＦＰ）を含み、対は、（ｉ）５６５２６と称されるＺＦＰを含むＺＦＮおよび５６５２７と称されるＺＦＰを含むＺＦＮ；（ｉｉ）５６５２６と称されるＺＦＰを含むＺＦＮおよび５６５２７または５６５２９と称されるＺＦＰを含むＺＦＮ；（ｉｉｉ）５６５０６または５６５１１と称されるＺＦＰを含むＺＦＮおよび５６５２０または５６５１９と称されるＺＦＰを含むＺＦＮ；（ｉｖ）５６３１６と称されるＺＦＰを含むＺＦＮおよび５６３１７と称されるＺＦＰを含むＺＦＮ；（ｖ）５６２８２と称されるＺＦＰを含むＺＦＮおよび５６２８３と称されるＺＦＰを含むＺＦＮ；（ｖｉ）５６４４５と称されるＺＦＰを含むＺＦＮおよび５６４４４と称されるＺＦＰを含むＺＦＮ；（ｖｉ）５６１２６と称されるＺＦＰを含むＺＦＮおよび５６１２７と称されるＺＦＰを含むＺＦＮ；または（ｖｉｉ）５６２５５と称されるＺＦＰを含むＺＦＮおよび５６２５４と称されるＺＦＰを含むＺＦＮからなる群から選択される。本明細書に記載の融合分子（ヌクレアーゼ）のいずれかをコードするポリヌクレオチド（プラスミドもしくはｍＲＮＡなどの非ウイルスベクターおよび／またはＡＡＶ、ＡｄもしくはＩＤＬＶなどのウイルスベクター）も提供される。本明細書に記載の融合分子および／またはポリヌクレオチドのいずれかを含む医薬組成物および単離された細胞も提供される。細胞において１つまたは複数のＣＦＴＲ遺伝子を改変する（例えば、挿入および／または欠失）方法であって、（ａ）細胞に、本明細書に記載の１つまたは複数のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを、ヌクレアーゼ（単数または複数）が発現され、１つまたは複数のＣＦＴＲ遺伝子が切断され、改変されるような条件下で導入するステップを含む方法も提供される。一部の実施形態では、改変は、機能性ＣＦＴＲタンパク質をコードする配列を含む導入遺伝子を、細胞に、導入遺伝子がＣＦＴＲ遺伝子に組み込まれるように導入することを含む。他の実施形態では、矯正用配列を突然変異型ＣＦＴＲ配列（例えば、ΔＦ５０８）に、突然変異型配列が矯正され、機能性ＣＦＴＲタンパク質が発現されるように組み込む。一部の実施形態では、ＣＦＴＲ遺伝子の断片を含む導入遺伝子を、導入遺伝子がＣＦＴＲ遺伝子（例えば、イントロン１、３、７または８）に組み込まれると細胞において機能性ＣＦＴＲタンパク質が発現されるように導入する。他の実施形態では、細胞はＣＦＴ���遺伝子におけるΔＦ５０８突然変異を含み、ヌクレアーゼはΔＦ５０８突然変異に特異的であり、ＣＦＴＲ遺伝子がヌクレアーゼによって切断された後に、細胞において突然変異を野生型配列に矯正するドナーヌクレオチド配列がＣＦＴＲ遺伝子に組み込まれる。ＣＦＴＲ遺伝子が本明細書に記載のヌクレアーゼによって切断された後にＣＦＴＲ遺伝子に組み込まれた外因性配列（例えば、機能性ＣＦＴＲタンパク質をコードする配列またはＣＦＴＲ遺伝子における突然変異を、当該遺伝子が機能性ＣＦＴＲタンパク質をコードするように矯正する配列）を含む遺伝子改変細胞（例えば、肺細胞、幹細胞など）も提供される。ヌクレアーゼ（またはこれらのヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド）を使用して、矯正されたまたは突然変異ＣＦＴＲ遺伝子を含む細胞、細胞株および／または胚を作製し、使用する方法も提供される。本明細書に記載の組成物の１つまたは複数を含むキットも提供される。
【００１１】
一態様では、ゲノム内のＣＦＴＲ遺伝子内の標的部位に結合するＤＮＡ結合性ドメイン（例えば、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）、ＴＡＬＥエフェクタードメイン、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の単一ガイドＲＮＡ）が本明細書に記載される。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合性ドメインによって認識される標的部位は、ＣＦＴＲ遺伝子のイントロン、例えば、イントロン１、２、３、６、７または８内にある。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合性ドメインは、ＣＦＴＲ遺伝子のイントロン１、３、７または８内の配列を標的とする。ある特定の実施形態では、標的部位は、表２の標的部位に示されている配列のうちの１２〜２５ヌクレオチドまたはそれよりも多く（連続したまたは連続していない）の配列（１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５ヌクレオチドまたはそれよりも多くの標的部位を含む）を含む。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合性ドメインは、イントロン、例えば、野生型配列内のイントロンに特異的である（特異的に結合する）。他の実施形態では、ＤＮＡ結合性ドメインは、ΔＦ５０８突然変異に特異的である（特異的に結合する）。
【００１２】
一態様では、ＣＦＴＲ遺伝子内の標的部位、例えば、表２に示されている標的部位のいずれかうちの少なくとも１２塩基対の配列に結合する天然に存在しないジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）であって、１つまたは複数の工学的に操作されたジンクフィンガー結合性ドメインを含むＺＦＰが本明細書に記載される。一実施形態では、ＺＦＰは、ＣＦＴＲ遺伝子を切断するジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）であり、ＺＦＮは、１つまたは複数の工学的に操作されたジンクフィンガー結合性ドメインおよびヌクレアーゼ切断ドメインまたは切断ハーフドメインを含む。切断ドメインおよび切断ハーフドメインは、例えば、種々の制限エンドヌクレアーゼおよび／またはホーミングエンドヌクレアーゼから得ることができ、野生型であっても工学的に操作されたもの（突然変異体）であってもよい。一実施形態では、切断ハーフドメインは、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）に由来する。これらのジンクフィンガータンパク質を含むヌクレアーゼは、任意のリンカー配列（例えば、当該ジンクフィンガータンパク質を切断ドメインと連結する）および任意の切断ドメイン（例えば、ＥＬＤ突然変異体などの二量体形成突然変異体；４１６、４２２、４４７、４４８、および／もしくは５２５の１つまたは複数に突然変異を有するＦｏｋＩドメイン；ならびに／またはニッカーゼ機能性をもたらす触媒ドメイン突然変異体）を含んでよい。例えば、米国特許第８，７０３，４８９号；同第９，２００，２６６号；同第８，６２３，６１８号；および同第７，９１４，７９６号；ならびに米国特許出願公開第２０１８／００８７０７２号を参照されたい。ある特定の実施形態では、ＣＦＴＲ結合性ＺＦＰは、表２に示されている配列内の９〜１８ヌクレオチドまたはそれよりも多くの標的部位に結合する。ある特定の実施形態では、ＺＦＰは、突然変異型ＣＦＴＲ配列（野生型ＣＦＴＲと比較して、例えば、ΔＦ５０８突然変異体）に選択的に結合し、したがって、ヌクレアーゼとして製剤化されると、ＺＦＮまたはＺＦＰ−ＴＦは、突然変異型ＣＦＴＲ遺伝子を選択的に切断する（野生型ＣＦＴＲの切断と比較して）。他の実施形態では、ＺＦＰは、野生型ＣＦＴＲ配列（表２に示されているイントロン標的配列）に選択的に結合し、さらに別の実施形態では、ＺＦＰは、野生型ＣＦＴＲ配列および突然変異型ＣＦＴＲ配列のどちらにも結合する。本明細書に記載のＺＦＮはいずれも、対のメンバーの一方が突然変異型ＣＦＴＲ配列に結合し、対のメンバーの一方が野生型ＣＦＴＲ配列に結合するＺＦＮの対（例えば、左および右）を含み得る。あるいは、本明細書に記載のＺＦＮは、両方のＺＦＮが野生型に結合するまたは両方のＺＦＮが突然変異型ＣＦＴＲに結合する、ＺＦＮの対（左および右）を含み得る。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合性ドメインは、表１Ａの単一の行に示されている認識へリックス領域を有するジンクフィンガータンパク質を含む。ある特定の実施形態では、ＺＦＮは、配列番号１０５に示されている少なくとも１５ヌクレオチド（連続したまたは連続していない）の標的部位に結合するＤＮＡ結合性ドメインを含む第１のＺＦＮおよび配列番号１０６に示されている少���くとも１５ヌクレオチド（連続したまたは連続していない）の標的部位に結合するＤＮＡ結合性ドメインを含む第２のＺＦＮを含む。ある特定の実施形態では、ＺＦＮは、配列番号１０７に示されている少なくとも１５ヌクレオチド（連続したまたは連続していない）の標的部位に結合するＤＮＡ結合性ドメインを含む第１のＺＦＮおよび配列番号１０８に示されている少なくとも１５ヌクレオチド（連続したまたは連続していない）の標的部位に結合するＤＮＡ結合性ドメインを含む第２のＺＦＮを含む。ある特定の実施形態では、ＺＦＮは、ＺＦＮの対を含み、ＺＦＮの対は、５６５２６と称されるＺＦＰを含む第１のＺＦＮおよび５６５２７と称されるＺＦＰを含む第２のＺＦＮを含む。他の実施形態では、ＺＦＮは、ＺＦＮの対を含み、ＺＦＮの対は、５６５２６と称されるＺＦＰを含む第１のＺＦＮおよび５６５２９と称されるＺＦＰを含む第２のＺＦＮを含む。他の実施形態では、ＺＦＮは、ＺＦＮの対を含み、ＺＦＮの対は、５６５０６または５６５１１と称されるＺＦＰを含む第１のＺＦＮおよび５６５２０または５６５１９と称されるＺＦＰを含む第２のＺＦＮを含む。他の実施形態では、これらに限定されないが、５６３１６および５６３１７または５６２８２および５６２８３（イントロン１）；５６４４５および５６４４４（イントロン３）；５６１２６および５６１２７（イントロン７）；または５６２５５および５６２５４（イントロン８）と称されるＺＦＰを含むＺＦＮ対を含め、ＺＦＰは、イントロン１、イントロン３、イントロン７またはイントロン８内の標的部位に結合する。
【００１３】
別の態様では、ＣＦＴＲ遺伝子内の、表２に示されている標的配列の標的部位（例えば、少なくとも９または１２（例えば、９〜２０またはそれよりも多い）ヌクレオチドを含む標的部位）に結合する転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質であって、１つまたは複数の工学的に操作されたＴＡＬＥ結合性ドメインを含むＴＡＬＥが本明細書に記載される。一実施形態では、ＴＡＬＥは、目的の標的ゲノム領域を切断するヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）であって、１つまたは複数の工学的に操作されたＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合性ドメインおよびヌクレアーゼ切断ドメインまたは切断ハーフドメインを含むＴＡＬＥＮである。切断ドメインおよび切断ハーフドメインは、例えば、種々の制限エンドヌクレアーゼおよび／またはホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）から得ることができる。一実施形態では、切断ハーフドメインはＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）に由来する。他の実施形態では、切断ドメインはメガヌクレアーゼに由来し、メガヌクレアーゼドメインはＤＮＡ結合機能性も示し得る。ある特定の実施形態では、ＴＡＬＥＮは、突然変異型ＣＦＴＲ配列に選択的に結合し（野生型と比較して）、したがって、ＴＡＬＥＮは、突然変異型ＣＦＴＲ遺伝子を選択的に切断する（野生型ＤＮＡの切断と比較して）。さらなる実施形態では、ＴＡＬＥＮは、突然変異、例えば、ΔＦ５０８突然変異（野生型配列と比べて番号付けされた）を含む標的部位に選択的に結合する。本明細書に記載のＴＡＬＥＮはいずれも、対のメンバーの一方が突然変異型配列に結合し、対のメンバーの一方が野生型に結合するＴＡＬＥＮの対（例えば、左および右）を含み得る。あるいは、本明細書に記載のＴＡＬＥＮは、両方のＴＡＬＥＮが野生型に結合するまたは両方のＴＡＬＥＮが突然変異型ＣＦＴＲ配列に結合する、ＴＡＬＥＮの対（左および右）を含み得る。ある特定の実施形態では、ＴＡＬＥＮは、配列番号１０５に示されている少なくとも１５ヌクレオチド（連続したまたは連続していない）の標的部位に結合するＤＮＡ結合性ドメインを含む第１のＴＡＬＥＮおよび配列番号１０６に示されている少なくとも１５ヌクレオチド（連続したまたは連続していない）の標的部位に結合するＤＮＡ結合性ドメインを含む第２のＴＡＬＥＮを含む。ある特定の実施形態では、ＴＡＬＥＮは、配列番号１０７に示されている少なくとも１５ヌクレオチド（連続したまたは連続していない）の標的部位に結合するＤＮＡ結合性ドメインを含む第１のＴＡＬＥＮおよび配列番号１０８に示されている少なくとも１５ヌクレオチド（連続したまたは連続していない）の標的部位に結合するＤＮＡ結合性ドメインを含む第２のＴＡＬＥＮを含む。
【００１４】
別の態様では、ＣＦＴＲ遺伝子内の標的部位（例えば、イントロンまたはΔＦ５０８と称されるＣＦＴＲ突然変異体をコードする配列などの突然変異型配列）に結合するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系であって、１つまたは複数の工学的に操作された単一ガイドＲＮＡまたは機能的等価物、ならびにＣａｓ（例えば、Ｃａｓ９）ヌクレアーゼを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が本明細書に記載される。ある特定の実施形態では、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、ヒトＣＦＴＲに関して示されている標的部位の少なくとも１８ヌクレオチドを含む表２に示されている標的部位の９、１２、１５またはそれよりも多くの連続したヌクレオチドを含む配列に結合する。ある特定の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、突然変異型ＣＦＴＲ配列に選択的に結合し（野生型と比較して）、したがって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、突然変異型ＣＦＴＲを選択的に切断する（野生型の切断と比較して）。さらなる実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、野生型配列と比べて番号付けされ、当該位置の後ろのヌクレオチドが突然変異型配列を示すΔＦ５０８突然変異をコードする配列を含む標的部位に選択的に結合する。本明細書に記載のｓｇＲＮＡはいずれも、突然変異体に、あるいは、野生型ＣＦＴＲ配列に選択的に結合し得る。ｓｇＲＮＡの対を使用する場合、メンバーの一方または両方が、野生型または突然変異型ＣＦＴＲ配列に結合し得る。対の標的部位は、表２の任意の標的部位の対を含み得る。ある特定の実施形態では、Ｃａｓは、機能性ヌクレアーゼ（触媒）活性を欠く「デッド（ｄｅａｄ）」または「ｄＣａｓ」である。ｄＣａｓをＦｏｋヌクレアーゼドメインと融合して、ハーフ切断ドメインとして作用する融合タンパク質を生じさせることができる。ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮと同様に、この実施形態では、二量体を形成して標的ＤＮＡを切断するために２つのｄＣａｓ−Ｆｏｋパートナーが必要である。一部の実施形態では、ｄＣａｓ−Ｆｏｋパートナーの一方が野生型ＣＦＴＲ遺伝子に結合し得、他方が突然変異型ＣＦＴＲ遺伝子に結合する。一部の実施形態では、２つのｄＣＡＳ−Ｆｏｋパートナーの両方が野生型遺伝子に結合し、他の実施形態では、２つのパートナーの両方が突然変異型ＣＦＴＲ遺伝子に結合する。
【００１５】
一実施形態では、ＤＮＡ結合性ドメインは、機能性ドメインと会合して（例えば、融合分子として）、人工転写因子（例えば、機能性ドメインが転写制御ドメインである場合）または人工ヌクレアーゼ（例えば、機能性ドメインが切断ドメインである場合）を形成する。転写制御ドメインは活性化ドメインまたは抑止ドメインであり得る。
【００１６】
他の実施形態では、ＤＮＡ結合性ドメインは、少なくとも１つの切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）と会合して、人工ヌクレアーゼを形成する。切断ドメインおよび切断ハーフドメインは、例えば、種々の制限エンドヌクレアーゼおよび／またはホーミングエンドヌクレアーゼから得ることができる。一実施形態では、切断ハーフドメインは、エンドヌクレアーゼ、例えば、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）および／またはＣａｓエンドヌクレアーゼに由来する。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合性ドメインは、ＣＦＴＲ遺伝子内の標的部位を認識する。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合性ドメインは、突然変異ＣＦＴＲ遺伝子内の標的部位を認識し、その結果、ヌクレアーゼは、突然変異ＣＦＴＲ対立遺伝子のみを切断する。
【００１７】
ＤＮＡ結合性ドメイン（例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ｓｇＲＮＡなど）、人工ＴＦおよび／または人工ヌクレアーゼは、遺伝子のコード領域内、または、例えば、リーダー配列、トレーラー配列もしくはイントロンなどの遺伝子内もしくはそれに隣接する非コード配列内、または、非転写領域内の、コード領域の上流または下流のいずれかのＣＦＴＲに結合し、かつ／またはそれを切断し得る。ある特定の実施形態では、本明細書に記載のＤＮＡ結合性タンパク質は、ＣＦＴＲのイントロン、例えば、ＣＦＴＲ遺伝子のイントロン１、２、３、６、７または８内の配列に結合する。
【００１８】
さらに別の態様では、本明細書に記載のＤＮＡ結合性タンパク質または融合分子（またはその構成成分）の１つまたは複数をコードするポリヌクレオチドが提供される。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ウイルス（例えば、ＡＡＶまたはＡｄ）ベクターおよび／または非ウイルス（例えば、プラスミドまたはｍＲＮＡベクター）に担持される。これらのポリヌクレオチド（例えば、ＡＡＶベクター）を含む宿主細胞、ならびに／または本明細書に記載のポリヌクレオチド、タンパク質および／もしくは宿主細胞を含む医薬組成物も提供される。宿主細胞としては、これに限定されないが、肺幹細胞を含めた肺細胞が挙げられる。
【００１９】
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡである。一部の態様では、ｍＲＮＡは、化学修飾されていてよい（例えば、Kormannら（２０１１年）、Nature  Biotechnology、２９巻（２号）：１５４〜１５７頁を参照されたい）。他の態様では、ｍＲＮＡは、ＡＲＣＡキャップを含み得る（米国特許第７，０７４，５９６号および同第８，１５３，７７３号を参照されたい）。さらなる実施形態では、ｍＲＮＡは、修飾されていないヌクレオチドと修飾されたヌクレオチドの混合物を含み得る（米国特許出願公開第２０１２／０１９５９３６号を参照されたい）。
【００２０】
さらに別の態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチドのいずれかを含む遺伝子送達ベクターが提供される。ある特定の実施形態では、ベクターは、アデノウイルスベクター（例えば、Ａｄ５／Ｆ３５ベクター）、組込みコンピテントもしくは組込み欠陥レンチウイルスベクターを含めたレンチウイルスベクター（ＬＶ）、またはアデノウイルス随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）である。ある特定の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ６またはＡＡＶ９ベクターである。したがって、少なくとも１つのヌクレアーゼ（ＺＦＮもしくはＴＡＬＥＮ）をコードする配列および／または標的遺伝子への標的化組込みのためのドナー配列を含むアデノウイルス（Ａｄ）ベクター、ＬＶまたはアデノウイルス随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）も本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、Ａｄベクターは、キメラＡｄベクター、例えば、Ａｄ５／Ｆ３５ベクターである。ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、インテグラーゼ欠陥レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）または組込みコンピテントレンチウイルスベクターである。ある特定の実施形態では、ベクターは、ＶＳＶ−Ｇエンベロープ、または他のエンベロープを有する偽型である。
【００２１】
さらに、核酸および／またはタンパク質（例えば、ＺＦＰ、ＣａｓまたはＴＡＬＥまたはＺＦＰ、ＣａｓもしくはＴＡＬＥを含む融合タンパク質）を含む医薬組成物も提供される。例えば、ある特定の組成物は、制御配列に作動可能に連結した、本明細書に記載のＺＦＰ、ＣａｓまたはＴＡＬＥのうちの１つをコードする配列を含む核酸を、薬学的に許容される担体または希釈剤と組み合わせて含み、ここで、制御配列は、細胞における核酸の発現を可能にする。タンパク質に基づく組成物は、本明細書に開示される１つまたは複数のＺＦＰ、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓまたはＴＡＬＥおよび薬学的に許容される担体または希釈剤を含む。
【００２２】
さらに別の態様では、本明細書に記載のタンパク質、ポリヌクレオチドおよび／または組成物のいずれかを含む単離された細胞も提供される。
【００２３】
別の態様では、細胞において１つまたは複数のＣＦＴＲ遺伝子を切断するための方法であって、（ａ）細胞に、１つまたは複数の遺伝子内の標的部位に結合する１つまたは複数の人工ヌクレアーゼをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを、ヌクレアーゼ（単数または複数）が発現され、１つまたは複数のＣＦＴＲ遺伝子が切断される条件下で導入するステップを含む方法が本明細書に記載される。
【００２４】
別の実施形態では、細胞のゲノム内の１つまたは複数のＣＦＴＲ遺伝子配列を改変するための方法であって、（ａ）１つまたは複数のＣＦＴＲ配列を含む細胞を準備するステップと、（ｂ）本明細書に記載の１つまたは複数の人工転写因子および／または人工ヌクレアーゼを細胞において発現させ、その結果、ＣＦＴＲ遺伝子が改変されるステップとを含む方法が本明細書に記載される。ある特定の実施形態では、改変は、遺伝子の発現を転写レベルで改変すること（例えば、活性化または抑止）を含む。他の実施形態では、改変は、ＣＴＦＲ遺伝子配列の切断または変更（例えば、挿入および／もしくは欠失ならびに／または突然変異の矯正）を含む。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼの対を使用して切断を実施する。必要に応じて、切断により、外因性配列（導入遺伝子）の細胞への挿入がもたらされる。他の実施形態では、非相同末端結合により、ＣＦＴＲ遺伝子内、例えば、ヌクレアーゼの標的部位（単数または複数）および／または切断部位（単数または複数）内またはその間における挿入および／または欠失（「インデル」）がもたらされる。ある特定の実施形態では、欠失は、ＣＦＴＲ遺伝子の少なくとも２つの場所が切断され、第１の切断部位と第２の切断部位の間の配列が欠失することによって生じる。遺伝子配列内の欠失のサイズは、第１の切断部位と第２の切断部位の間の距離によって決定される。したがって、目的の任意のゲノム領域内の任意のサイズの欠失を得ることができる。２５、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００ヌクレオチド対、またはこの範囲内の任意の整数値のヌクレオチド対の欠失を得ることができる。さらに、１，０００ヌクレオチド対を超える任意の整数値のヌクレオチド対の配列の欠失を、本明細書に開示される方法および組成物を使用して得ることができる。これらの方法および組成物を使用し、公知のドメインの１つまたは複数を欠く突然変異型ＣＦＴＲタンパク質を開発することができる。次いで、これらの構築物を、細胞内のタンパク質の機能を研究するため、および／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏにおけるタンパク質産生のために使用することができる。
【００２５】
他の態様では、本発明は、ドナー核酸の標的細胞への送達を含む。ドナーは、ヌクレアーゼ（単数または複数）をコードする核酸の前、その後、またはそれと一緒に送達することができる。ドナー核酸は、細胞のゲノムに組み込まれる外因性配列（導入遺伝子）、例えば、内因性ＣＦＴＲ遺伝子に組み込まれる野生型（機能性）ＣＦＴＲタンパク質をコードする配列（例えば、ＣＦＴＲのエクソン２〜２７をコードする導入遺伝子）を含み得る。内因性ＣＦＴＲ遺伝子は、野生型と比較して１つまたは複数の突然変異、例えば、ＣＦ疾患を有する対象に存在する１つまたは複数の突然変異を含み得る。一部の実施形態では、ドナーは、標的化される切断部位と相同の領域に挟まれた全長遺伝子またはその断片を含み得る。ある特定の実施形態では、各相同アームは、２５０〜３５０塩基対またはそれよりも多くの塩基対を含む。一部の実施形態では、ドナーは、相同領域を欠き、相同性に依存しない機構（すなわち、ＮＨＥＪ）によって標的遺伝子座に組み込まれる。ドナーは、任意の核酸配列、例えば、ヌクレアーゼ誘導性二本鎖切断の相同組換え修復のための基質として使用した場合、内因性染色体遺伝子座においてドナー指定欠失が生じるように、または、その代わりに（またはそれに加えて）、内因性遺伝子座の新規の対立形質（例えば、転写因子結合性部位が除去される点突然変異）が創出されるように導く核酸を含み得る。一部の態様では、ドナー核酸はオリゴヌクレオチドであり、組込みにより遺伝子矯正事象または標的化欠失が導かれる。
【００２６】
別の態様では、ＣＦＴＲ遺伝子が本明細書に記載の組成物および方法を使用して改変された遺伝子改変細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、遺伝子改変細胞は、ＣＦＴＲ遺伝子内に本明細書に記載のヌクレアーゼによる細胞（例えば、肺細胞または幹細胞）におけるＣＦＴＲ遺伝子の切断後の外因性配列を含む。外因性配列は、機能性ＣＦＴＲタンパク質をコードする導入遺伝子、ＣＦＴＲタンパク質の機能性断片をコードする導入遺伝子、またはＣＦＴＲ遺伝子における突然変異を矯正する配列（例えば、オリゴヌクレオチド）を含み得る。一部の実施形態では、遺伝子改変細胞は、ＣＦＴＲタンパク質が細胞において異常に発現され、遺伝子改変により、突然変異配列の矯正（例えば、矯正用ドナーの挿入）によって、かつ／または機能性ＣＦＴＲ遺伝子もしくはＣＦＴＲ遺伝子の機能性断片をコードするドナーの組込み（突然変異の部位においてまたは表２に示されているイントロン内の標的部位の切断後のいずれか）によって機能性ＣＦＴＲを産生する細胞がもたらされるようなＣＦＴＲ遺伝子における突然変異を含む。一部の実施形態では、突然変異型ＣＦＴＲ遺伝子は、ヌクレアーゼ駆動性標的化組込み部位の３’側（下流）に突然変異した配列を含み、したがって、ＣＦＴＲ導入遺伝子の断片の挿入により、野生型ＣＦＴＲタンパク質をコードするＣＦＴＲ遺伝子がもたらされる。さらなる実施形態では、挿入されたＣＦＴＲ断片は、ポリＡシグナル配列を含み、したがって、突然変異型ＣＦＴＲ遺伝子の下流部分は発現されない。一部の実施形態では、ＣＦＴＲ導入遺伝子の断片は、エクソン２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６および２７を含む。他の実施形態では、ＣＦＴＲ導入遺伝子の断片は、エクソン４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６および２７を含む。他の実施形態では、ＣＦＴＲ導入遺伝子の断片は、エクソン８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６および２７を含み、一部の実施形態では、ＣＦＴＲ導入遺伝子の断片は、エクソン９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６および２７を含む。
【００２７】
一部の態様では、遺伝子改変されたＣＦＴＲ遺伝子を含む細胞を、矯正用配列を含むドナー配列（例えば、オリゴヌクレオチド）を使用して改変する。一部の実施形態では、突然変異型ＣＦＴＲ遺伝子を含む細胞を、内因性ＣＦＴＲ遺伝子の突然変異したヌクレオチドを矯正するオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ駆動性組込みを使用して矯正する。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１００、１２５、１５０、１７５、２００ヌクレオチドまたはそれよりも多くのヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、エクソン１１におけるＣＦＴＲ突然変異に組み込まれる。さらなる実施形態では、エクソン１１におけるＣＦＴＲ突然変異は、ΔＦ５０８突然変異である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＣＦＴＲ遺伝子のセンス鎖と相同であり、他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖と相同である。大多数の実施形態では、オリゴヌクレオチドの組込みにより、ＣＦＴＲ遺伝子の矯正がもたらされ、その結果、機能性ＣＦＴＲタンパク質がコードされ、改変された細胞のＣＦＴＲ機能の回復が回復する。
【００２８】
本明細書に記載の遺伝子改変細胞は、これらに限定されないが、タンパク質を産生させること（例えば、記載されているヌクレアーゼを使用して、かつ／もしくはＴＦ活性化因子を使用して、標的化された遺伝子を発現するように組み込まれた、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現される導入遺伝子の標的化ヌクレアーゼ媒介性組込みによって組み込まれた導入遺伝子の発現）；ｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて標的遺伝子の抑止および／もしくは不活化の影響をアッセイすること（例えば、ＴＦリプレッサーまたは工学的に操作されたヌクレアーゼを使用して、標的遺伝子を抑止および／または不活化すること）；タンパク質のｅｘ  ｖｉｖｏにおける産生；または、本明細書に記載の遺伝子改変細胞（例えば、幹細胞）を標的遺伝子の発現がモジュレートされる（例えば、活性化、抑止および／または不活化される）対象に提供することなどの、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおける目的を含めた種々の目的のために使用することができる。細胞において発現されるタンパク質は、細胞から分泌される場合もあり、細胞を溶解させ、タンパク質を単離することもできる。さらに、本明細書に記載の遺伝子改変細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、本明細書に記載の組成物を使用し、遺伝子改変細胞が対象において産生されるように、これらに限定されないが、注射、局所的適用、粘膜投与、吸入性などを含めた任意の適切な方法によって投与することにより生成することができる。ｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおける方法をタンパク質産生（例えば、酵素補充療法において使用するための野生型ＣＦＴＲの産生）のために、ならびに対象におけるＣＦの処置および／または防止のために使用することができる。
【００２９】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の遺伝子改変細胞は、矯正されるように（例えば、ドナーヌクレオチドにより、野生型配列を有する細胞を産生するように）、または異常に発現された突然変異型ＣＦＴＲ遺伝子を含む細胞において野生型タンパク質を発現するように改変された突然変異型細胞である。他の実施形態では、遺伝子改変細胞は、内因性野生型遺伝子と比較して、ＣＦＴＲ配列（挿入および／または欠失）における改変を含む。したがって、本明細書に記載の細胞は、ＣＦＴＲ遺伝子に対する改変（例えば、点突然変異または機能性の野生型ＣＦＴＲをコードする配列の挿入を含めた、ヌクレオチドの欠失および／または挿入）を含み得、改変は、これらに限定されないが、標的部位内および／もしくは２つの対の標的部位の間の配列に対する改変；切断の部位（単数または複数）および／もしくは結合性部位の上流、下流および／もしくは当該部位の１つもしくは複数の塩基対を含む１〜３００塩基対（もしくはその間の任意の数の塩基対）以内の改変；結合性部位および／もしくは切断部位（単数または複数）を含むおよび／もしくは当該部位の両側の１〜１００塩基対（もしくはその間の任意の数の塩基対）以内の改変；結合性部位および／もしくは切断部位（単数または複数）を含むおよび／もしくは当該部位の両側の１〜５０塩基対（もしくはその間の任意の数の塩基対）以内の改変；ならびに／またはヌクレアーゼ結合性部位および／もしくは切断部位内の１つもしくは複数の塩基対に対する改変を含めた、ヌクレアーゼ（単数または複数）結合性部位および／または切断部位（単数または複数）内またはその付近におけるものである。
【００３０】
本発明の改変細胞は、肺細胞（例えば、上皮細胞）、幹／前駆細胞（例えば、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、胚性幹細胞（例えば、ヒトＥＳ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、造血幹細胞（ＨＳＣ）、または間葉系幹細胞）であり得る。幹細胞は、全能性または多能性（例えば、多能性骨髄系もしくはリンパ系幹細胞または上皮幹細胞に分化する間葉系幹細胞および／または毛髪細胞を生じるバルジ幹細胞であるＨＳＣなどの部分的に分化したもの）であり得る。次いで、本明細書に記載の改変幹細胞（ＣＦＴＲ遺伝子座において改変されたもの）はいずれも、分化させて、本明細書に記載の幹細胞に由来する分化した（ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ）細胞を生成することができる。本明細書に記載の改変幹細胞はいずれも、他の目的の遺伝子にさらなる改変を含み得る。本明細書に記載の改変細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで改変することもでき、単離し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで改変することもできる。
【００３１】
別の態様では、突然変異を有する遺伝子の機能を理解するため、および／または突然変異型遺伝子の矯正に関連する表現型を発見するために、ＣＦＴＲに関連する特定の突然変異を細胞（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏ）において矯正することができる。次いで、そのような理解を使用して、薬物スクリーニングおよび薬物発見において使用するため、例えば、ＣＦを処置するための細胞、細胞株およびトランスジェニック動物を設計することができる。
【００３２】
別の態様では、ＣＦＴＲに部位特異的突然変異を有する細胞、細胞株または動物モデルを本明細書に記載の方法および組成物を使用して構築して、公知のまたは新規の突然変異を繰り返すことができる。例えば、ＣＦＴＲにおけるΔＦ５０８突然変異を細胞、細胞株、初代細胞またはトランスジェニック動物において構築することができる。一実施形態では、ＣＦＴＲに関してヘテロ接合性遺伝子型を有する細胞、細胞株またはトランスジェニック動物を構築し、別の実施形態では、所望の遺伝子座の対立遺伝子の両方に２つの突然変異体コピーを有するホモ接合性細胞、細胞株またはトランスジェニック動物を作製する。
【００３３】
別の態様では、１つまたは複数のタンパク質、ポリヌクレオチドおよび／またはベクターを本明細書に記載の細胞に導入することによって細胞におけるＣＦＴＲ遺伝子を不活化する方法が本明細書に記載される。本明細書に記載の方法のいずれかでは、ＣＦＴＲ標的化ヌクレアーゼにより、標的化突然変異誘発、細胞内ＤＮＡ配列の標的化欠失を誘導し、かつ／または所定の染色体遺伝子座における標的化組換えを容易にすることができる。したがって、ある特定の実施形態では、人工ヌクレアーゼにより、標的遺伝子の１つまたは複数のヌクレオチドが欠失し、かつ／または挿入される。一部の実施形態では、ヌクレアーゼ切断、その後の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によってＣＦＴＲ遺伝子を不活化する。他の実施形態では、標的遺伝子内のゲノム配列を、例えば、本明細書に記載のヌクレアーゼおよびヌクレアーゼを用いた標的化切断後に遺伝子に挿入される「ドナー」配列を使用して置き換える。ドナー配列は、ヌクレアーゼベクター内に存在してもよく、別々のベクター（例えば、ＡｄまたはＬＶベクター）に存在してもよく、あるいは、異なる核酸送達機構（例えば、ｍＲＮＡ）を使用して細胞に導入することもできる。一態様では、ドナー配列により公知の突然変異が引き起こされる。ある特定の実施形態では、ドナー配列は、ドナー配列の標的化組込み後に公知の突然変異を矯正する配列、例えば、デルタＦ５０８突然変異を矯正するドナーを含む。
【００３４】
別の態様では、１つまたは複数のタンパク質、ポリヌクレオチドおよび／またはベクターを本明細書に記載の細胞に導入することによって細胞における突然変異型ＣＦＴＲ遺伝子を矯正する方法が本明細書に記載される。突然変異型ＣＦＴＲ遺伝子の矯正により、本明細書に記載の組成物を受けていない細胞と比較して増大した、例えば野生型の機能性を有するＣＦＴＲタンパク質を産生する細胞がもたらされる。本明細書に記載の方法のいずれかでは、ヌクレアーゼにより、標的化突然変異誘発、細胞内ＤＮＡ配列の標的化欠失を誘導し、かつ／または所定の染色体遺伝子座における標的化組換えを容易にすることができる。したがって、ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼにより、標的遺伝子の１つまたは複数のヌクレオチドが欠失し、かつ／または標的遺伝子に１つまたは複数のヌクレオチドが挿入される。一部の実施形態では、ＣＦＴＲ遺伝子をヌクレアーゼ切断、その後の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって矯正する。他の実施形態では、標的遺伝子内のゲノム配列を、例えば、ヌクレアーゼ（またはヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド）およびＣＦＴＲの配列を矯正するヌクレアーゼを用いた標的化切断後に遺伝子に組み込まれる「ドナー」配列を使用して置き換える。本明細書に記載の実施形態のいずれかでは、矯正の結果、十分にグリコシル化され、細胞表面上に発現させることができるＣＦＴＲタンパク質の発現がもたらされる。本明細書に記載の方法は、ｅｘ  ｖｉｖｏで実施すること（突然変異型ＣＦＴＲが矯正された細胞を、それを必要とする対象に投与すること）もでき、ｉｎ  ｖｉｖｏで実施すること（本明細書に記載の組成物（ドナーおよび／またはヌクレアーゼ）を、ＣＦＴＲの野生型機能が回復するようなＣＦＴＲ遺伝子の矯正を必要とする対象に投与すること）もできる。
【００３５】
本明細書に記載の方法または組成物のいずれかでは、ＣＦＴＲ遺伝子座を含有する細胞は、幹細胞であり得る。本発明の方法および組成物と共に使用することができる特定の幹細胞型としては、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、造血幹細胞、神経幹細胞、皮膚幹細胞、筋肉幹細胞、肺幹細胞および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）が挙げられる。ｉＰＳＣは、患者試料または正常なドナーに由来し得、患者由来のｉＰＳＣを目的の遺伝子において正常な遺伝子配列に突然変異させることができる、または、正常な細胞を目的の遺伝子において公知の疾患対立遺伝子に変更することができる。これらのｉＰＳＣのパネルを使用して、内因性ＣＦＴＲ遺伝子座に１つまたは複数の突然変異を有する患者細胞および正常な細胞の両方を用いて同質遺伝子型細胞を創出することができる。疾患の重症度に関する多重遺伝子の影響およびＣＦに対する可能性のある治療的処置を研究するために、これらの細胞を使用して、目的の突然変異のみが異なる細胞株および／またはトランスジェニック動物を創出することができる。一部の実施形態では、細胞を使用して、突然変異を含むオルガノイド模倣性肺組織を発生させる。次いで、これらのオルガノイドを使用して、新規の治療薬を活性についてスクリーニングすることができる（Eisenstein（２０１８年）、Nature  Methods、１５巻：１９〜２２頁）。これらの研究のために使用することができる他の細胞型は、患者由来の線維芽細胞または患者由来の幹細胞である。別の態様では、本発明は、それを必要とする患者への移植のための肺（または他の）幹細胞を発生させるための方法および組成物を提供する。移植用の肺幹細胞を患者から得て、ＣＦＴＲ遺伝子座内の疾患関連部位において矯正し、患者に再導入することができる。他の態様では、肺幹細胞は、普遍的な供給源に由来し、野生型ＣＦＴＲ遺伝子を含有してよく、その場合、移植された細胞が患者に拒絶されないようにＨＬＡおよび／または他の自己マーカーを変更しておく。例えば、米国特許第８，９４５，８６８号を参照されたい。
【００３６】
別の態様では、少なくとも１つの目的のＣＦＴＲ遺伝子座において１つまたは複数の遺伝性突然変異型対立遺伝子を創出する方法であって、動物胚の１つまたは複数の細胞のゲノム内の１つまたは複数のＣＦＴＲ遺伝子座を、本明細書に記載の方法のいずれかによって改変するステップと、胚を性的成熟まで育てるステップと、性的成熟動物に子孫を生じさせるステップとを含み、子孫の少なくとも一部が突然変異型対立遺伝子を含む、方法が本明細書に記載される。ある特定の実施形態では、動物は小さな哺乳動物、例えば、ウサギまたはラット、マウスもしくはモルモットなどの齧歯類である。他の実施形態では、動物は、非ヒト霊長類である。
【００３７】
本明細書に記載の方法のいずれかでは、ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはこれらの組合せを含み得る。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、プラスミドを含む。他の実施形態では、ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡを含む。
【００３８】
さらに別の態様では、核酸配列を染色体のＣＦＴＲ遺伝子座に部位特異的に組み込むための方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、方法は、（ａ）胚に、（ｉ）組み込まれる核酸配列を挟む上流配列および下流配列を含む少なくとも１つのＤＮＡベクター、ならびに（ｉｉ）ＣＦＴＲ遺伝子座内の組込み部位を認識するヌクレアーゼをコードする少なくとも１つのＲＮＡ分子を注射するステップと、（ｂ）胚を培養してヌクレアーゼを発現させるステップであって、ヌクレアーゼにより組込み部位に導入される二本鎖切断がＤＮＡベクターを用いた相同組換えによって修復されて、核酸配列が染色体内に組み込まれるステップとを含む。
【００３９】
適切な胚は、哺乳動物、鳥類、爬虫類、両生類、および魚類種を含めたいくつかの異なる脊椎動物種に由来し得る。一般的に言うと、適切な胚は、採取し、注射し、培養してジンクフィンガーまたはＴＡＬＥヌクレアーゼを発現させることができる胚である。一部の実施形態では、適切な胚は、小さな哺乳動物（例えば、齧歯類、ウサギなど）、伴侶動物、家畜、または霊長類由来の胚を含み得る。齧歯類の非限定的な例としては、マウス、ラット、ハムスター、スナネズミ、およびモルモットを挙げることができる。伴侶動物の非限定的な例は、ネコ、イヌ、ウサギ、ヘッジホッグ、およびフェレットを含み得る。家畜の非限定的な例としては、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ラマ、アルパカ、およびウシを挙げることができる。霊長類の非限定的な例としては、オマキザル、チンパンジー、キツネザル、マカク、マーモセット、タマリン、クモザル、リスザル、およびサバンナモンキーを挙げることができる。他の実施形態では、適切な胚は、魚類、爬虫類、両生類、または鳥類由来の胚を含み得る。あるいは、適切な胚は、昆虫の胚、例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａの胚または蚊の胚であり得る。
【００４０】
組み込まれる核酸配列を挟む上流配列および下流配列を含む少なくとも１つのＤＮＡベクター、ならびに染色体上の組込み部位を認識するジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする少なくとも１つのＲＮＡ分子を含む胚も提供される。本明細書に記載の胚のいずれかに由来する生物体も提供される。
【００４１】
別の態様では、本発明の方法および組成物により、ＣＦを患っている動物の処置に使用するための薬物ライブラリーおよび／または他の治療用組成物（すなわち、抗体、構造的ＲＮＡなど）のスクリーニングにおける細胞、細胞株および動物（例えば、トランスジェニック動物）の使用が提供される。そのようなスクリーニングは、操作された細胞株または初代細胞を用いて細胞レベルで開始することができ、動物（例えば、ヒト）全体を処置するレベルまで進行させることができる。
【００４２】
別の態様では、本明細書に記載の組成物（ＣＦＴＲ遺伝子をモジュレートするために使用される改変された細胞、ポリヌクレオチドおよび／またはタンパク質）ならびに方法を、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏモデル系を提供するため（例えば、遺伝子改変細胞を有する動物または細胞を薬物発見のために使用することができる）、および／または、ＣＦなどの障害を処置するもしくは予防するもしくは好転させるためのタンパク質の産生（例えば、内因性遺伝子発現を活性化させて野生型ＣＦＴＲタンパク質を産生させることによって、または野生型ＣＦＴＲ導入遺伝子を突然変異型ＣＦＴＲ遺伝子に挿入することを含め、発現させる導入遺伝子を標的遺伝子に挿入することによって）に使用することができる。方法は、一般には、単離された細胞内または対象の肺内の関連する内因性ＣＦＴＲ遺伝子の、工学的に操作された転写因子および／もしくはヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮもしくはＴＡＬＥＮ）もしくは工学的に操作されたｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒ  ＲＮＡを用いたＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓもしくはＣｆｐ１／ＣＲＩＳＰＲなどのヌクレアーゼ系を使用した、またはＣＦＴＲ遺伝子がモジュレートされる（上方制御される、下方制御される、不活化される）ように工学的に操作された転写因子（例えば、ＺＦＮ−ＴＦ、ＴＡＬＥ−ＴＦ、Ｃｆｐ１−ＴＦまたはＣａｓ９−ＴＦ）を使用した任意の改変（上方制御、下方制御、切断など）；ならびに（ｂ）細胞を対象に導入するまたはＣＦＴＲ遺伝子をモジュレートするために使用したポリヌクレオチドおよび／もしくはタンパク質を適用し、それにより、ＣＦを処置または予防することを含み得る。組成物は、医薬組成物、例えば、対象への適用（例えば、肺への吸入など）のための本明細書に記載の工学的に操作された転写因子、ヌクレアーゼおよび／または細胞を含む局所用組成物であり得る。
【００４３】
本発明の遺伝子改変細胞、ヌクレアーゼおよび／または転写因子を含むキットも提供される。キットは、ヌクレアーゼおよび／もしくは転写因子をコードする核酸（例えば、適切な発現ベクターに含有される遺伝子をコードするＲＮＡ分子）、または一定分量のタンパク質、ドナー分子、適切な宿主細胞株、本発明の方法を実施するための指示などを含み得る。
【００４４】
これらおよび他の態様は本開示を全体として踏まえて当業者には容易に明らかになろう。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１は、示されているジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）対を使用したヒトＣＦＴＲのヌクレアーゼ媒介性改変を示すグラフである。具体的には、Ｋ５６２細胞における、ＣＦＴＲのイントロン１を標的としたＺＦＮ（５６３１６／５６３１７および５６３１６／５６３１７）、イントロン３を標的としたＺＦＮ（５６４４５／５６４４４）；イントロン７を標的としたＺＦＮ（５６１２６／５６１２７）、またはイントロン８を標的としたＺＦＮ（５６２５５／５６２５４）によって生じるＮＨＥＪ媒介性インデル（挿入および／または欠失）のパーセントが示されている。
【００４６】
【図２】図２は、示されているジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）対を使用したマウスＣＦＴＲのヌクレアーゼ媒介性改変を示すグラフである。具体的には、Ｎｅｕｒｏ２ａにおける、イントロン１を標的としたＺＦＮ（５６６９１／５６６９０、５６６６７／５６６６６、および５６６８７／５６６８６）、イントロン７を標的としたＺＦＮ（５６６３０／５６６２９および５６６３１／５６６２９）、またはイントロン８を標的としたＺＦＮ（５６６４４／５６６４３）によって生じるＮＨＥＪ媒介性インデルのパーセントが示されている。
【００４７】
【図３】図３は、示されている、ＣＦＴＲ遺伝子におけるΔＦ５０８突然変異を標的としたＺＦＮを使用したヌクレアーゼ媒介性改変を示すグラフである（米国特許第９，１６１，９９５号も参照されたい）。
【００４８】
【図４】図４は、初代ヒトΔＦ５０８基底気道上皮細胞における、示されている、ＣＦＴＲのイントロン１を標的としたヌクレアーゼ（５６１２６／５６１２７）またはイントロン８を標的とするヌクレアーゼ（５６２５４／５６２５５）またはΔＦ５０８突然変異を標的とするヌクレアーゼ（５６５２６と５６５２９または５６５２７）を使用したヌクレアーゼ媒介性改変（％インデル）を示すグラフである。
【００４９】
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、本試験で使用したドナーの概略図である。図５Ａは、ＧＦＰドナーを示す。「ＨＡ」は相同アームであり、「ＳＡ」はスプライスアクセプターであり、「２Ａ」は自己切断性ペプチドであり、「ｐＡ」はポリアデニル化シグナル配列である。図５Ｂは、部分的なＣＦＴＲドナーを示す。理論的なＣＦＴＲゲノム配列の描写が上のパネルに示されており、「Ｅｘ」はエクソンを表し「Ｉｎ」はイントロンを意味する。ゲノム概略図の下に異なる部分的なＣＦＴＲドナーが示されている。各ドナー配列は、エクソン２７を含めてエクソン２７までのエクソン配列で構成される。「ＨＡ」は相同アームを意味し、「ＳＡ」はスプライスアクセプターであり、「ｐＡ」はポリアデニル化シグナル配列である。稲妻は、イントロン１、３、７または８に特異的なＺＦＮ対の切断標的を示す。ハッシュマークは、エクソン９とエクソン２７の間の配列を示す。
【００５０】
【図６−１】図６Ａ〜６Ｅは、示されている細胞における示されている処理に関するゲノム改変を示すグラフである（各試料の左側の棒にＮＨＥＪが示され、右側の棒に標的化組込み（ＴＩ）が示されている）。図６Ａおよび６Ｂは、Ｋ５６２細胞における、ＣＦＴＲのイントロン１を標的としたＺＦＮ（図６Ａの５６２８２／５６２８３および図６Ｂの５６３１６／５６３１７）を使用した、不在下（ＺＦＮ）または存在下（ＺＦＮ＋ドナー）での改変であって、短い（約５０塩基対）相同アームを有するＳＡ−２Ａ−ＧＦＰ導入遺伝子ドナーＡＡＶ６であるドナーをＺＦＮ  ＤＮＡ  Ａｍａｘａエレクトロポレーションの直後に野生型Ｋ５６２細胞に添加し、３日後にＭｉｓｅｑでのインデルおよびＴＩ分析のために回収した、改変を示す。ＨＤＲ媒介性ＴＩは検出されなかった。図６Ｃは、Ｋ５６２細胞における、ＣＦＴＲのイントロン３を標的としたＺＦＮ（５６４４４／５６４４５）を使用した、不在下（ＺＦＮ）または存在下（ＺＦＮ＋ドナー）での改変であって、約１５０塩基対の相同アームを有するＳＡ−２Ａ−ＧＦＰ導入遺伝子ドナーＡＡＶ６であるドナーを野生型Ｋ５６２細胞へのＺＦＮ  ＤＮＡ  Ａｍａｘａエレクトロポレーションの直後に添加し、３日後にＭｉｓｅｑでのインデルおよびＴＩ分析のために回収した、改変を示す。ＨＤＲ媒介性ＴＩは検出されなかった。図６Ｄは、Ｋ５６２細胞における、ＣＦＴＲのイントロン７を標的としたＺＦＮ（５６１２６／５６１２７）を使用した、不在下（ＺＦＮ）または存在下（ＺＦＮ＋ドナー）でのゲノム改変であって、ＡＡＶ６ドナーが約２５０ｂｐの相同アームを含有するものであったゲノム改変を示す。ＮＨＥＪ（左側の棒）およびＨＤＲ媒介性ＴＩ（ＺＦＮ＋ドナーの右側の棒）がＭｉｓｅｑによって検出された。図５Ｅは、Ｋ５６２細胞における、ＣＦＴＲのイントロン８を標的としたＺＦＮ（５６２５４／５６２５５）を使用した、不在下（ＺＦＮ）または存在下（ＺＦＮ＋ドナー）でのゲノム改変であって、ＡＡＶ６ドナーが約３５０ｂｐの相同アームを含有するものであったゲノム改変を示す。ＮＨＥＪ（左側の棒）およびＨＤＲ媒介性ＴＩ（ＺＦＮ＋ドナーの右側の棒）の両方がＭｉｓｅｑによって検出された。
【図６−２】同上。
【図６−３】同上。
【００５１】
【図７−１】図７Ａ〜７Ｄは、ＣＦ  ΔＦ５０８突然変異を含むヒト基底気道上皮細胞において、図５に記載されているＺＦＮをｍＲＮＡの形態で示されている濃度で使用した、スプライスアクセプター配列および部分的な機能性ＣＦＴＲタンパク質コード配列をコードする導入遺伝子（導入遺伝子を挟む約５０ｂｐ、約２５０、または約３５０ｂｐのいずれかの相同アームを含むＡＡＶ６  ｃＤＮＡドナー）のＮＨＥＪ（「インデル」）またはＨＤＲ媒介性標的化組込み（ＴＩ）によるゲノム改変を示すグラフである。図７Ａは、ＣＦＴＲのイントロン＃１を標的としたヌクレアーゼ５６２８２／５６２８３を使用した、ＣＦＴＲ導入遺伝子を挟む約５０ｂｐの相同アームを有するドナーの不在下での（「２ｕｇ  ＺＦＮ  ｍＲＮＡ」と標識された左から２番目の棒および「４ｕｇ  ＺＦＮ  ｍＲＮＡ」と標識された中央の棒）またはドナーの存在下での（「ＳＡ−ｃＤＮＡドナーＡＡＶ６＋２ｕｇ  ＺＦＮ  ｍＲＮＡ」と標識された右から２番目の棒および「ＳＡ−ｃＤＮＡドナーＡＡＶ６＋４ｕｇ  ＺＦＮ  ｍＲＮＡ」と標識された右端の棒）遺伝子改変を示す。ＺＦＮ＋ドナー群において非常に少量のＨＤＲ媒介性ＴＩが検出可能であり、これはＺＦＮ用量依存的であった。図７Ｂは、ＣＦＴＲのイントロン＃１を標的としたヌクレアーゼ５６３１６／５６３１７を使用した、ＣＦＴＲ導入遺伝子を挟む約５０ｂｐの相同アームを有するドナーの不在下での（「２ｕｇ  ＺＦＮ  ｍＲＮＡ」と標識された左から２番目の棒）またはドナーの存在下での（「ＳＡ−ｃＤＮＡドナーＡＡＶ６＋２ｕｇ  ＺＦＮ  ｍＲＮＡ」と標識された右から２番目の棒および「ＳＡ−ｃＤＮＡドナーＡＡＶ６＋４ｕｇ  ＺＦＮ  ｍＲＮＡ」と標識された右端の棒）遺伝子改変を示す。ＺＦＮ＋ドナー群ではＨＤＲ媒介性ＴＩは検出可能でなかった。図７Ｃは、イントロン７を標的としたヌクレアーゼ５６１２６／５６１２７を使用した、ドナーの不在下での（「ＺＦＮ  ｍＲＮＡ」と標識された右から２番目の棒）またはドナーの存在下での（「ＳＡ−ｃＤＮＡドナーＡＡＶ６＋ＺＦＮ  ｍＲＮＡ」と標識された右端の棒）遺伝子改変（約２５０塩基対の相同アームを含むＡＡＶ  ｈＣＦＴＲドナーを用いたＮＨＥＪおよびＴＩによるインデル）を示す。非感染細胞（「ナイーブ」）、ＧＦＰ  ｍＲＮＡ対照（「ＧＦＰ  ｍＲＮＡ」）およびＺＦＮなし対照（「ＳＡ−ｃＤＮＡドナーＡＡＶ６」）も示されている。示されている通り、２５０ｂｐの相同アームはＨＤＲ媒介性ＴＩのために十分である。図７Ｄは、イントロン８を標的としたヌクレアーゼ５６２５４／５６２５５を使用した、ドナーの不在下での（「ＺＦＮ  ｍＲＮＡ」と標識された右側から２番目の棒）またはドナーの存在下での（「ＳＡ−ｃＤＮＡドナーＡＡＶ６＋ＺＦＮ  ｍＲＮＡ」と標識された右端の棒）遺伝子改変（約３５０塩基対の相同アームを含むＡＡＶ  ｈＣＦＴＲドナーを用いたＮＨＥＪおよびＴＩによるインデル）を示す。非感染細胞（「ナイーブ」）、ＧＦＰ  ｍＲＮＡ対照（「ＧＦＰ  ｍＲＮＡ」）およびＺＦＮなし対照（「ＳＡ−ｃＤＮＡドナーＡＡＶ６」）も示されている。ＨＤＲ媒介性ＴＩがＭｉｓｅｑによって検出され、それにより、３５０ｂｐの相同アームがこの遺伝子座および細胞型におけるＨＤＲ媒介性ＴＩのために実際に十分であることが示される。
【図７−２】同上。
【００５２】
【図８】図８は、ヒトＣＦＴＲ  ΔＦ５０８突然変異を標的とするＺＦＮ対５２６２６／５２５２７および５２５２６／５２５２９を、ｍＲＮＡとして、ホモ接合性ΔＦ５０８初代ヒト基底気道上皮細胞（ＫＫ００３）に、ＺＦＮ標的部位を挟む５０ｂｐの相同性に挟まれた矯正された野生型配列を含有する１００ｂｐの矯正用一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドドナー（センス鎖「Ｆ」またはアンチセンス鎖「Ｒ」のいずれかの「ｓｓＯＤＮ」）と一緒にエレクトロポレーションしたことを示すグラフである。３日後にインデルおよび遺伝子矯正（ＴＩ）に関するＭｉｓｅｑ分析のために細胞からゲノムＤＮＡを回収した。データから、矯正用オリゴヌクレオチドが細胞内に組み込まれたことが実証される。
【００５３】
【図９】図９は、初代ヒトΔＦ５０８基底気道上皮細胞（「ｈＢＡＥ」）におけるジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介性活性（％インデル）を示すグラフである。本試験に使用したＺＦＮ対はΔＦ５０８突然変異（５６５２６／５６５２９）を標的とし、３日後に細胞をＭｉＳｅｑディープシーケンシングによって分析した。ヌクレアーゼｍＲＮＡは、活性を増強するためにＷＰＲＥ  ３’ＵＴＲを含有する。
【００５４】
【図１０】図１０は、ＣＦ  ΔＦ５０８突然変異を含むヒト基底気道上皮細胞において、ｈＣＦＴＲイントロン８（５６２５４／５６２５５）を標的とするＺＦＮをｍＲＮＡ形態で示されている濃度で使用した、スプライスアクセプター配列および部分的な機能性ＣＦＴＲタンパク質コード配列をコードする導入遺伝子（導入遺伝子を挟む約３５０ｂｐの相同アームを含むＡＡＶ６  ｃＤＮＡドナー）のＮＨＥＪ（「インデル」）またはＨＤＲ媒介性標的化組込み（ＴＩ）によるゲノム改変を示すグラフである（インデルおよびＴＩについて、それぞれ緑色の実線および破線）。ヌクレアーゼｍＲＮＡは、活性を増強するためにＷＰＲＥ  ３’ＵＴＲを含有する。ＺＦＮ単独で処理した細胞のインデルおよびＴＩも示されている（それぞれ青色の実線および破線）。
【００５５】
【図１１】図１１Ａおよび１１Ｂは、ホモ接合性ΔＦ５０８初代ヒト基底気道上皮細胞に、ｍＲＮＡとして、ＺＦＮ標的部位を挟む５０ｂｐまたは１００ｂｐの相同性に挟まれた矯正された野生型配列を含有する１００ｂｐまたは２００ｂｐの矯正用一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドドナー（センス鎖「ｓｓＯＤＮ  １」またはアンチセンス鎖「ｓｓＯＤＮ  ２」のいずれかの「ｓｓＯＤＮ」）と一緒にエレクトロポレーションした、ヒトＣＦＴＲ  ΔＦ５０８突然変異を標的とするＺＦＮ対５２５２６／５２５２９を示すグラフである。３日後にインデルおよび遺伝子矯正（「ＴＩ」）のＭｉｓｅｑ分析のために細胞からゲノムＤＮＡを回収した。図１１Ａでは、等濃度のＺＦＮを使用した場合であっても、より長い２００ｂｐの矯正用オリゴヌクレオチド（「ｓｓＯＤＮ」）が、切断された細胞内ＤＮＡに１００ｂｐの矯正用オリゴヌクレオチドよりも高い効率で組み込まれたこと（改変された対立遺伝子のパーセントを示す棒の上部の淡い標的化組込みシグナルと比較する）が実証されている。図１１Ｂでは、センスおよびアンチセンス２００ｍｅｒ  ｓｓＯＤＮ矯正用オリゴヌクレオチドにより、ホモ接合性ΔＦ５０８初代ヒト基底気道上皮細胞において同様のレベル（ドナーオリゴヌクレオチドを用いた１０％改変よりも大きい）の遺伝子矯正がもたらされたことが実証されている。図１１Ａおよび１１Ｂは、２つの独立した実験によるものである。
【００５６】
【図１２】図１２は、ホモ接合性ΔＦ５０８初代ヒト基底気道上皮細胞に、ｍＲＮＡとして、矯正された野生型配列を含有する２００ｂｐの矯正用一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドセンス鎖ドナーと一緒にエレクトロポレーションしたヒトＣＦＴＲ  ΔＦ５０８突然変異を標的とするＺＦＮ対５２５２６／５２５２９を示すグラフである。オリゴヌクレオチドは、ＺＦＮ標的部位を挟む配列に対応する１００ｂｐの相同アームも含んだ。ＺＦＮ切断後のＤＮＡ修復をＮＨＥＪ（インデル）よりもＨＤＲ（遺伝子矯正）の方に曲げるためにピラジンＳＣＲ７を１ｍＭまたは５ｍＭの濃度で細胞に添加した。３日後にインデルおよび遺伝子矯正（ＴＩ）に関するＭｉｓｅｑ分析のために細胞からゲノムＤＮＡを回収した。データから、１ｍＭのＳＣＲ７により、インデルを犠牲にしてＴＩがわずかに増強することが実証される。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
詳細な説明
ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＣＦＴＲタンパク質を提供するための組成物および方法ならびにＣＦの処置を評価することにおいて有用なモデルを処置および／または開発する方法が本明細書に開示される。具体的には、ヌクレアーゼ媒介性切断および組込みを使用して、ＣＦＴＲ遺伝子における公知の突然変異を創出または修復する。これらの組成物および方法をｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにおいて任意の選択された遺伝的背景で特定のＣＦＴＲ突然変異を矯正または創出するために使用して、ＣＦに関する研究を可能にすることができる。
【００５８】
したがって、本明細書に記載の方法および組成物をＣＦＴＲにおける突然変異のセットの同質遺伝子型パネルを創出するために使用して、これらの突然変異の管理下試験を可能にすること、ある特定の突然変異と細胞機能障害の関連を調査すること、突然変異に関連する表現型または突然変異の矯正に関連する表現型を同定することができる。さらに、任意のＣＦＴＲ突然変異を患者由来の細胞、例えば、患者由来の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に導入して、患者細胞バックグラウンドにおけるある特定の突然変異の影響を調査することができる。さらに、インフレーム変更を用いたＣＦＴＲ突然変異体の創出も、これらのタンパク質の機能的ドメインについての微調整された分析を可能にするために、本明細書に記載の発明の一部である。さらに、ＣＦに関連するＣＦＴＲ突然変異をモデル動物（ラット、非ヒト霊長類など）におけるネイティブな遺伝子内に創出して、ＣＦモデルを生成することができる。これらの動物は、１つまたは複数の挿入されたＣＦＴＲ突然変異を含有し得る。
【００５９】
本明細書には、患者細胞における特定のＣＦＴＲ欠陥を変更するための方法および組成物も記載されている。例えば、突然変異ＣＦＴＲ遺伝子を、突然変異型対立遺伝子に対してのみ作用し、野生型遺伝子配列に対しては作用しない特異的なヌクレアーゼを使用することによってノックアウトすることができる。特定の遺伝子のノックアウトは、切断とその後のＮＨＥＪの結果、または遺伝子の大部分を欠失させる遺伝子内の２つの遺伝子座における切断によるもの、または切断とその後のオリゴヌクレオチドまたはより大きなドナーＤＮＡの標的化組込みによるものであり得る。さらに、患者細胞におけるＣＦＴＲ関連遺伝子の特定の突然変異を矯正するための方法および組成物が本明細書に記載される。次いで、そのような矯正された細胞を、ＣＦを処置するために患者に再度導入することができる。患者細胞は、肺細胞、幹細胞またはｉＰＳＣであり得る。本発明の方法を使用して普遍的な幹細胞を創出することもでき、次いで、それを任意のＣＦ患者を処置するために使用することができる。
一般
【００６０】
本明細書に開示されている方法の実施、ならびに組成物の調製および使用には、別段の指定のない限り、分子生物学、生化学、クロマチン構造および解析、コンピュータ化学、細胞培養物、組換えＤＮＡおよび当技術分野の技術の範囲内に入る関連する分野の従来の技法を使用する。これらの技法は、文献において十分に説明されている。例えば、Sambrookら、MOLECULAR  CLONING:  A  LABORATORY  MANUAL、第２版、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、１９８９年および第３版、２００１年；Ausubelら、CURRENT  PROTOCOLS  IN  MOLECULAR  BIOLOGY、John  Wiley  &  Sons、New  York、１９８７年および定期的更新；METHODS  IN  ENZYMOLOGYシリーズ、Academic  Press、San  Diego；Wolffe、CHROMATIN  STRUCTURE  AND  FUNCTION、第３版、Academic  Press、San  Diego、１９９８年；METHODS  IN  ENZYMOLOGY、３０４巻、「Chromatin」（P.M.  WassarmanおよびA.  P.  Wolffe編）、Academic  Press、San  Diego、１９９９年；およびMETHODS  IN  MOLECULAR  BIOLOGY、１１９巻、「Chromatin  Protocols」（P.B.  Becker編）Humana  Press、Totowa、１９９９年を参照されたい。
定義
【００６１】
「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に使用され、直鎖状または環状コンフォメーションであり、一本鎖形態または二本鎖形態のいずれかであるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的に関しては、これらの用語は、ポリマーの長さに関する限定とは解釈されるべきでない。当該用語は、天然のヌクレオチドの公知の類似体、ならびに塩基、糖および／またはリン酸部分（例えば、ホスホロチオエート骨格）が修飾されたヌクレオチドを包含し得る。一般に、特定のヌクレオチドの類似体は、同じ塩基対合特異性を有する；すなわち、Ａの類似体はＴと塩基対を形成する。
【００６２】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために互換的に使用される。当該用語は、１つまたは複数のアミノ酸が対応する天然に存在するアミノ酸の化学的な類似体または修飾誘導体であるアミノ酸ポリマーにも当てはまる。
【００６３】
「結合」は、巨大分子間（例えば、タンパク質と核酸の間）の配列特異的な非共有結合性の相互作用を指す。相互作用が全体として配列特異的である限りは、結合相互作用の構成成分の全てが配列特異的である必要はない（例えば、ＤＮＡ骨格内のリン酸残基との接触）。そのような相互作用は、一般に、１０−６Ｍ−１またはそれ未満の解離定数（Ｋｄ）を特徴とする。「親和性」は、結合の強度を指す：結合親和性の増大は低Ｋｄと相関する。
【００６４】
「結合性タンパク質」は、別の分子に非共有結合により結合することが可能なタンパク質である。結合性タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合性タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合性タンパク質）および／またはタンパク質分子（タンパク質結合性タンパク質）に結合することができる。タンパク質結合性タンパク質の場合では、それ自体に結合することができ（ホモ二量体、ホモ三量体などを形成する）、かつ／または、異なるタンパク質（単数または複数）の１つまたは複数の分子に結合することができる。結合性タンパク質は、１つよりも多くの型の結合活性を有し得る。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合活性、ＲＮＡ結合活性およびタンパク質結合活性を有する。
【００６５】
「ジンクフィンガーＤＮＡ結合性タンパク質」（または結合性ドメイン）は、亜鉛イオンの協調によって構造が安定化される結合性ドメイン内のアミノ酸配列の領域である１つまたは複数のジンクフィンガーを通じてＤＮＡに配列特異的に結合するタンパク質、またはより大きなタンパク質内のドメインである。ジンクフィンガーＤＮＡ結合性タンパク質という用語は、多くの場合、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと省略される。人工ヌクレアーゼおよび転写因子は、ＺＦＰ  ＤＮＡ結合性ドメインおよび機能性ドメイン（ＺＦＮについてはヌクレアーゼドメインまたはＺＦＰ−ＴＦについては転写制御ドメイン）を含み得る。「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」という用語は、１つのＺＦＮならびに二量体を形成して標的遺伝子を切断するＺＦＮの対（左および右ＺＦＮとしても公知の第１および第２のＺＦＮを含む）を含む。
【００６６】
「ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合性ドメイン」または「ＴＡＬＥ」は、１つまたは複数のＴＡＬＥリピートドメイン／単位を含むポリペプチドである。リピートドメインは、ＴＡＬＥのその同類標的ＤＮＡ配列への結合に関与する。単一の「リピート単位」（「リピート」とも称される）は、一般には３３〜３５アミノ酸の長さであり、天然に存在するＴＡＬＥタンパク質内の他のＴＡＬＥリピート配列と少なくともある程度の配列相同性を示す。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，５８６，５２６号を参照されたい。人工ヌクレアーゼおよび転写因子は、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合性ドメインおよび機能性ドメイン（ＴＡＬＥＮについてはヌクレアーゼドメインまたはＴＡＬＥＮ−ＴＦについては転写制御ドメイン）を含み得る。「ＴＡＬＥＮ」という用語は、二量体を形成して標的遺伝子を切断する１つのＴＡＬＥＮならびにＴＡＬＥＮの対（左および右ＴＡＬＥＮとしても公知の第１および第２のＴＡＬＥＮを含む）を含む。
【００６７】
ジンクフィンガーおよびＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合性ドメインは、例えば、天然に存在するジンクフィンガータンパク質の認識へリックス領域を工学的に操作すること（１つもしくは複数のアミノ酸を変更すること）により、またはＤＮＡ結合に関与するアミノ酸（リピート可変二残基（ｒｅｐｅａｔ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｉｒｅｓｉｄｕｅ）もしくはＲＶＤ領域）を工学的に操作することにより、所定のヌクレオチド配列に結合するように「工学的に操作され」得る。したがって、工学的に操作されたジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥタンパク質は、天然に存在しないタンパク質である。ジンクフィンガータンパク質およびＴＡＬＥを工学的に操作するための方法の非限定的な例は、設計および選択である。設計されたタンパク質は、設計／組成が合理的基準に主に起因する天然には存在しないタンパク質である。設計のための合理的基準は、既存のＺＦＰまたはＴＡＬＥ設計および結合データに関する情報が保存されているデータベース内の情報を処理するための置換規則およびコンピュータ化アルゴリズムの適用を含む。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号；同第６，１４０，０８１号；同第６，４５３，２４２号；および同第６，５３４，２６１号を参照されたい；国際特許公開第ＷＯ９８／５３０５８号；同第ＷＯ９８／５３０５９号；同第ＷＯ９８／５３０６０号；同第ＷＯ０２／０１６５３６号；および同第ＷＯ０３／０１６４９６号も参照されたい。
【００６８】
「選択された」ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、その産生がファージディスプレイ、相互作用トラップまたはハイブリッド選択などの経験的プロセスに主に起因する天然に見いだされないタンパク質である。例えば、米国特許第５，７８９，５３８号；同第５，９２５，５２３号；同第６，００７，９８８号；同第６，０１３，４５３号；および同第６，２００，７５９号；国際特許公開第ＷＯ９５／１９４３１号；同第ＷＯ９６／０６１６６号；同第ＷＯ９８／５３０５７号；同第ＷＯ９８／５４３１１号；同第ＷＯ００／２７８７８号；同第ＷＯ０１／６０９７０号；同第ＷＯ０１／８８１９７号；および同第ＷＯ０２／０９９０８４号を参照されたい。
【００６９】
「ＴｔＡｇｏ」は、遺伝子サイレンシングに関与すると考えられる原核生物アルゴノートタンパク質である。ＴｔＡｇｏは、細菌Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来する。例えば、Swartsら、同文献、G.  Shengら（２０１３年）、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.S.A.、１１１巻、６５２頁）を参照されたい。「ＴｔＡｇｏ系」は、例えばＴｔＡｇｏ酵素による切断のためのガイドＤＮＡを含む、必要とされる構成成分の全てである。
【００７０】
「組換え」は、２つのポリヌクレオチド間の遺伝情報を交換するプロセスを指す。本開示の目的に関しては、「相同組換え（ＨＲ）」は、例えば、細胞における二本鎖切断の相同組換え修復機構による修復中に起こる、そのような交換の特殊化された形態を指す。このプロセスでは、ヌクレオチド配列相同性が必要であり、「ドナー」分子を「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を受ける分子）の鋳型修復に使用し、また、ドナーから標的への遺伝情報の移行を導くので、「非クロスオーバー遺伝子変換」または「ショートトラクト遺伝子変換」として様々な名称で知られている。いかなる特定の理論にも制約されることなく、そのような移行は、切断された標的とドナーの間に形成されるヘテロ二重鎖ＤＮＡのミスマッチ矯正、および／または標的の一部になる遺伝情報を再合成するためにドナーを使用する「合成依存性鎖アニーリング」、および／または関連するプロセスを伴い得る。そのような特殊化されたＨＲの結果、多くの場合、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全部が標的ポリヌクレオチドに組み入れられるような標的分子の配列の変更がもたらされる。
【００７１】
本開示の方法では、本明細書に記載の１つまたは複数の標的化ヌクレアーゼにより、標的配列（例えば、細胞クロマチン）内の所定の部位において二本鎖切断が創出され、切断領域内のヌクレオチド配列に対する相同性を有する「ドナー」ポリヌクレオチドを細胞に導入することができる。二本鎖切断の存在は、ドナー配列の組込みを容易にすることが示されている。ドナー配列を物理的に組み込むこともでき、あるいは、ドナーポリヌクレオチドを相同組換えによる切断の修復のための鋳型として使用し、その結果、ヌクレオチド配列の全部または一部をドナーと同様に細胞クロマチンに導入する。したがって、細胞クロマチン内の第１の配列を変更することができ、ある特定の実施形態では、ドナーポリヌクレオチド内に存在する配列に変換することができる。したがって、「置き換える」または「置換え」という用語の使用は、１つのヌクレオチド配列の別のヌクレオチド配列による置換え（すなわち、情報という意味での配列の置換え）を表すと理解することができ、必ずしも１つのポリヌクレオチドの別のポリヌクレオチドによる物理的または化学的な置換えを必要とするものではない。
【００７２】
本明細書に記載の方法のいずれかでは、追加的なジンクフィンガータンパク質の対を細胞内の追加的な標的部位の追加的な二本鎖切断のために使用することができる。
【００７３】
細胞クロマチン内の目的の領域内の配列の標的化組換えおよび／または置換えおよび／または変更のための方法のある特定の実施形態では、染色体配列を、外因性「ドナー」ヌクレオチド配列を用いた相同組換えによって変更する。そのような相同組換えは、切断領域と相同な配列が存在する場合、細胞クロマチン内の二本鎖切断の存在によって刺激される。
【００７４】
本明細書に記載の方法のいずれかでは、第１のヌクレオチド配列（「ドナー配列」）は、目的の領域内のゲノム配列と相同であるが同一ではなく、それにより、相同組換えを刺激して、同一でない配列を目的の領域内に挿入させる配列を含有し得る。したがって、ある特定の実施形態では、目的の領域内の配列と相同なドナー配列の部分は、置き換えられるゲノム配列に対して約８０〜９９％（またはその間の任意の整数）の配列同一性を示す。他の実施形態では、例えば、１００を超える連続した塩基対のドナー配列とゲノム配列の間で１ヌクレオチドのみが異なる場合、ドナー配列とゲノム配列の間の相同性は、９９％よりも高い。ある特定の場合では、ドナー配列の非相同的部分は、目的の領域内には存在しない配列を含有し得、したがって、新しい配列が目的の領域に導入される。これらの例では、非相同配列は、一般に、目的の領域内の配列と相同または同一である５０〜１，０００塩基対（もしくはその間の任意の整数値）または１，０００を超える任意の数の塩基対の配列に挟まれている。他の実施形態では、ドナー配列は、第１の配列と非相同的であり、非相同的組換え機構によってゲノム内に挿入される。
【００７５】
本明細書に記載の方法はいずれも、目的の遺伝子（単数または複数）の発現を破壊するドナー配列の標的化組込みによる細胞内の１つまたは複数の標的配列の部分的または完全な不活化のために使用することができる。部分的にまたは完全に不活化された遺伝子を有する細胞株も提供される。
【００７６】
さらに、本明細書に記載の標的化組込みの方法を使用して、１つまたは複数の外因性配列を組み込むこともできる。外因性核酸配列は、例えば、１つもしくは複数の遺伝子もしくはｃＤＮＡ分子、または任意の型のコードもしくは非コード配列、ならびに１つまたは複数の調節エレメント（例えば、プロモーター）を含み得る。さらに、外因性核酸配列は、１つまたは複数のＲＮＡ分子（例えば、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）など）を産生し得る。
【００７７】
「切断」は、ＤＮＡ分子の共有結合骨格の破壊を指す。切断は、これらに限定されないが、リン酸ジエステル結合の酵素的または化学的加水分解を含めた種々の方法によって開始することができる。一本鎖切断および二本鎖切断のどちらも可能であり、二本鎖切断は、２つの別個の一本鎖切断事象の結果として起こり得る。ＤＮＡ切断の結果、平滑末端または付着末端のいずれかが生じ得る。ある特定の実施形態では、融合ポリペプチドを標的化二本鎖ＤＮＡ切断のために使用する。
【００７８】
「切断ハーフドメイン」は、第２のポリペプチド（同一であるかまたは異なる）と併せて、切断活性（好ましくは二本鎖切断活性）を有する複合体を形成するポリペプチド配列である。「第１および第２の切断ハーフドメイン」；「＋および−切断ハーフドメイン」ならびに「右および左切断ハーフドメイン」という用語は、二量体を形成する切断ハーフドメインの対を指すために互換的に使用される。
【００７９】
「工学的に操作された切断ハーフドメイン」は、別の切断ハーフドメイン（例えば、別の工学的に操作された切断ハーフドメイン）と偏性ヘテロ二量体を形成するように改変された切断ハーフドメインである。それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，８８８，１２１号；同第７，９１４，７９６号；同第８，０３４，５９８号；および同第８，６２３，６１８号ならびに米国特許出願公開第２０１１／０２０１０５５号も参照されたい。
【００８０】
「配列」という用語は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、直鎖状であっても、環状であっても分枝状であってもよく、また、一本鎖であっても二本鎖であってもよい、任意の長さのヌクレオチド配列を指す。「ドナー配列」という用語は、ゲノム内に挿入されるヌクレオチド配列を指す。ドナー配列は、任意の長さ、例えば、２から１０，０００ヌクレオチドの間の長さ（またはその間もしくはそれを超える任意の整数値）、好ましくは約１００から１，０００ヌクレオチドの間の長さ（またはその間の任意の整数）、より好ましくは約２００から５００ヌクレオチドの間の長さであってよい。
【００８１】
「クロマチン」は、細胞ゲノムを含む核タンパク質構造である。細胞クロマチンは、核酸、主にＤＮＡ、ならびに、ヒストンおよび非ヒストン染色体タンパク質を含めたタンパク質を含む。大多数の真核細胞クロマチンは、ヌクレオソームの形態で存在し、ヌクレオソームコアは、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４を２つずつ含む八量体と会合したおよそ１５０塩基対のＤＮＡを含み；リンカーＤＮＡ（生物体に応じて長さは変動する）はヌクレオソームコア間に伸びている。ヒストンＨ１の分子は、一般に、リンカーＤＮＡと会合している。本開示の目的に関しては、「クロマチン」という用語は、原核生物および真核生物の両方の細胞核タンパク質の全ての型を包含するものとする。細胞クロマチンは、染色体クロマチンおよびエピソームクロマチンの両方を含む。
【００８２】
「染色体」は、細胞のゲノムの全部または一部を含むクロマチン複合体である。細胞のゲノムは、多くの場合、細胞のゲノムを含む染色体の全ての収集物である核型によって特徴付けられる。細胞のゲノムは、１つまたは複数の染色体を含み得る。
【００８３】
「エピソーム」は、複製性核酸、核タンパク質複合体または細胞の染色体核型の一部ではない核酸を含む他の構造である。エピソームの例としては、プラスミドおよびある特定のウイルスゲノムが挙げられる。
【００８４】
「標的部位」または「標的配列」は、結合のために十分な条件が存在すれば結合性分子が結合する核酸の一部を定義する核酸配列である。例えば、配列５’ＧＡＡＴＴＣ３’は、Ｅｃｏ  ＲＩ制限エンドヌクレアーゼの標的部位である。
【００８５】
「外因性」分子は、通常は細胞に存在しないが、１つまたは複数の遺伝学的、生化学的または他の方法によって細胞に導入することができる分子である。「細胞に通常存在すること」は、細胞の特定の発生段階および環境条件に対して決定される。したがって、例えば、筋肉の胚発生の間にだけ存在する分子は、成体筋肉細胞に対して外因性分子である。同様に、熱ショックによって誘導される分子は、熱ショック処理されていない細胞に対して外因性分子である。外因性分子は、例えば、機能不良性内因性分子の機能性バージョンまたは通常機能性内因性分子の機能不良性バージョンを含み得る。
【００８６】
外因性分子は、とりわけ、コンビナトリアルケミストリープロセスによって生成されるものなどの低分子、またはタンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖、上記の分子の任意の修飾誘導体、もしくは上記の分子の１つもしくは複数を含む任意の複合体などの巨大分子であってよい。核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含み、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、直鎖状であっても、分枝状であっても環状であってもよく、また、任意の長さであってよい。核酸は、２重鎖を形成することが可能な核酸、ならびに３重鎖形成核酸を含む。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号および同第５，４２２，２５１号を参照されたい。タンパク質としては、これらに限定されないが、ＤＮＡ結合性タンパク質、転写因子、クロマチンリモデリング因子、メチル化されたＤＮＡ結合性タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、脱アセチル化酵素、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレースおよびヘリカーゼが挙げられる。
【００８７】
外因性分子は、内因性分子と同じ型の分子、例えば、外因性タンパク質または核酸であってよい。例えば、外因性核酸は、細胞に導入された感染性ウイルスゲノム、プラスミドもしくはエピソーム、または細胞内に通常は存在しない染色体を含み得る。外因性分子を細胞に導入するための方法は、当業者に公知であり、それらとして、これらに限定されないが、脂質媒介性移行（すなわち、中性およびカチオン性脂質を含めたリポソーム）、エレクトロポレーション、直接注射、細胞融合、粒子衝撃、リン酸カルシウム共沈澱、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性移行およびウイルスベクター媒介性移行が挙げられる。当該方法は、マイクロ流体系における細胞の圧入をもたらす機械力によるカーゴ送達も含み得る。外因性分子は、内因性分子と同じ型であるが、細胞が由来するものとは異なる種に由来する分子であってよい。例えば、ヒト核酸配列を元々はマウスまたはハムスターに由来する細胞株に導入することができる。
【００８８】
対照的に、「内因性」分子は、特定の環境条件下、特定の発生段階で特定の細胞に通常存在する分子である。例えば、内因性核酸は、染色体、ミトコンドリア、葉緑体もしくは他の細胞小器官のゲノム、または天然に存在するエピソーム核酸を含み得る。追加的な内因性分子は、タンパク質、例えば、転写因子および酵素を含み得る。
【００８９】
「融合」分子は、２つまたはそれよりも多くのサブユニット分子が、好ましくは共有結合により連結した分子である。サブユニット分子は、同じ化学種の分子の場合もあり、異なる化学種の分子の場合もある。第１の型の融合分子の例としては、これらに限定されないが、融合タンパク質（例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合性ドメインと１つまたは複数の活性化ドメインの融合物）および融合核酸（例えば、上記の融合タンパク質をコードする核酸）が挙げられる。第２の型の融合分子の例としては、これらに限定されないが、３重鎖形成核酸とポリペプチドの融合物、および副溝結合物質と核酸の融合物が挙げられる。当該用語はまた、ポリヌクレオチド構成成分とポリペプチド構成成分を会合させて機能性分子を形成する系（例えば、単一ガイドＲＮＡと機能性ドメインを会合させて遺伝子発現をモジュレートするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）も含む。
【００９０】
細胞における融合タンパク質の発現は、融合タンパク質の細胞への送達に起因してもよく、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの細胞への送達により生じてもよく、ここで、ポリヌクレオチドが転写され、転写物が翻訳されて融合タンパク質が生成される。トランス−スプライシング、ポリペプチド切断およびポリペプチドライゲーションも細胞におけるタンパク質の発現に関与し得る。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを細胞に送達するための方法は本開示の他の箇所に提示されている。
【００９１】
本開示の目的に関しては、「遺伝子」は、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域（下記を参照されたい）、ならびに遺伝子産物の産生を制御する全てのＤＮＡ領域を、そのような制御配列がコード配列および／または転写される配列に隣接しているか否かにかかわらず含む。したがって、遺伝子は、プロモーター配列、ターミネーター、リボソーム結合性部位および配列内リボソーム進入部位などの翻訳制御配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界エレメント、複製開始点、マトリックス付着部位および遺伝子座調節領域を含むが必ずしもこれらに限定されない。
【００９２】
「セーフハーバー」遺伝子座は、宿主細胞に対するいかなる有害作用も伴わずに遺伝子を挿入することができるゲノム内の遺伝子座である。挿入された遺伝子配列の発現が近隣の遺伝子由来のいかなるリードスルー発現によっても撹乱されないセーフハーバー遺伝子座が最も有益である。ヌクレアーゼ（単数または複数）によって標的とされるセーフハーバー遺伝子座の非限定的な例としては、ＣＣＲ５、ＣＣＲ５、ＨＰＲＴ、ＡＡＶＳ１、Ｒｏｓａおよびアルブミンが挙げられる。例えば、米国特許第７，９５１，９２５号；同第８，７７１，９８５号；同第８，１１０，３７９号；および同第７，９５１，９２５号；米国特許出願公開第２０１０／０２１８２６４号；同第２０１１／０２６５１９８号；同第２０１３／０１３７１０４号；同第２０１３／０１２２５９１号；同第２０１３／０１７７９８３号；同第２０１３／０１７７９６０号；同第２０１５／００５６７０５号；および同第２０１５／０１５９１７２号を参照されたい。
【００９３】
「遺伝子発現」とは、遺伝子に含有される情報の遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造的ＲＮＡまたは任意の他の型のＲＮＡ）またはｍＲＮＡの翻訳によって生じるタンパク質であり得る。遺伝子産物はまた、キャップ形成、ポリアデニル化、メチル化、および編集などのプロセスによって修飾されたＲＮＡ、ならびに、例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ−リボシル化、ミリスチル化、およびグリコシル化によって修飾されたタンパク質も含む。
【００９４】
遺伝子発現の「モジュレーション」とは、遺伝子の活性の変化を指す。発現のモジュレーションとしては、これらに限定されないが、遺伝子活性化および遺伝子抑止を挙げることができる。ゲノム編集（例えば、切断、変更、不活化、ランダム突然変異）を使用して、発現をモジュレートすることができる。遺伝子不活化は、本明細書に記載のＺＦＰを含まない細胞と比較した、遺伝子発現のあらゆる低減を指す。したがって、遺伝子不活化は、部分的または完全なものであり得る。
【００９５】
「目的の領域」は、例えば、外因性分子に結合することが望ましい、遺伝子内または遺伝子に隣接する遺伝子または非コード配列などの、細胞クロマチンの任意の領域である。結合は、標的化ＤＮＡ切断および／または標的化組換えを目的とするものであり得る。目的の領域は、例えば、染色体内、エピソーム内、細胞小器官のゲノム内（例えば、ミトコンドリア、葉緑体）、または感染性ウイルスゲノム内に存在し得る。目的の領域は、遺伝子のコード領域内、例えばリーダー配列、トレーラー配列もしくはイントロンなどの転写される非コード領域内、または非転写領域内のコード領域の上流または下流にあり得る。目的の領域は、一ヌクレオチド対ほど小さい場合もあり、２，０００ヌクレオチド対の長さ、または任意の整数値のヌクレオチド対に至る場合もある。一部の実施形態では、目的の領域は、３０００、４０００、５０００、７０００もしくは１００００塩基対の長さ、または任意の整数値のヌクレオチド対に至り得る。
【００９６】
「真核」細胞としては、これらに限定されないが、真菌細胞（酵母など）、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞およびヒト細胞（例えば、Ｔ細胞）が挙げられる。
【００９７】
「作動的な連結」および「作動的に連結した」（または「作動可能に連結した」）という用語は、２つまたはそれよりも多くの構成成分（配列エレメントなど）が近位にあり、両方の構成成分が正常に機能し、構成成分のうちの少なくとも１つが、他の構成成分のうちの少なくとも１つに対して発揮される機能を媒介し得る可能性が認められるように構成成分が配置されていることに関して互換的に使用される。実例として、プロモーターなどの転写制御配列は、１つまたは複数の転写制御因子の存在または非存在に応答して転写制御配列によりコード配列の転写のレベルが調節される場合、コード配列に作動的に連結している。転写制御配列は、一般に、コード配列とシスで作動的に連結しているが、コード配列に直接隣接している必要はない。例えば、エンハンサーは、連続していないにもかかわらず、コード配列に作動的に連結した転写制御配列である。
【００９８】
融合ポリペプチドに関して、「作動的に連結した」という用語は、構成成分のそれぞれが、他の構成成分と連結した状態で、そのように連結していない場合と同じ機能を発揮するという事実を指し得る。例えば、ＤＮＡ結合性ドメイン（例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ）が活性化ドメインと融合した融合ポリペプチドに関して、ＤＮＡ結合性ドメインと活性化ドメインは、融合ポリペプチドとして、ＤＮＡ結合性ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合性部位に結合することができると同時に、活性化ドメインが遺伝子発現を上方制御することができる場合、作動的に連結している。ＤＮＡ結合性ドメインが切断ドメインと融合した融合ポリペプチドの場合、ＤＮＡ結合性ドメインと切断ドメインは、融合ポリペプチドとして、ＤＮＡ結合性ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合性部位に結合することができると同時に、切断ドメインが標的部位の付近のＤＮＡを切断することができる場合、作動的に連結している。同様に、ＤＮＡ結合性ドメインが活性化または抑止ドメインと融合した融合ポリペプチドに関して、ＤＮＡ結合性ドメインと活性化または抑止ドメインは、融合ポリペプチドとして、ＤＮＡ結合性ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合性部位に結合することができると同時に、活性化ドメインが遺伝子発現を上方制御することができるまたは抑止ドメインが遺伝子発現を下方制御することができる場合、作動的に連結している。
【００９９】
タンパク質、ポリペプチドまたは核酸の「機能性断片」は、配列が全長タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同一ではないが、それでもなお全長タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同じ機能を保持するタンパク質、ポリペプチドまたは核酸である。機能性断片は、対応するネイティブな分子より多くの、より少ない、もしくは同じ数の残基を有し得、かつ／または、１つもしくは複数のアミノ酸もしくはヌクレオチド置換を含有し得る。核酸の機能（例えば、コード機能、別の核酸とハイブリダイズする能力）を決定するための方法は、当技術分野で周知である。同様に、タンパク質機能を決定するための方法が周知である。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合機能を、例えば、フィルター結合法、電気泳動移動度シフト、または免疫沈降アッセイによって決定することができる。ＤＮＡ切断は、ゲル電気泳動によってアッセイすることができる。Ausubelら、上記を参照されたい。タンパク質の別のタンパク質と相互作用する能力は、例えば、免疫共沈降、ツーハイブリッドアッセイまたは補完により、遺伝学的に、および生化学的の両方で決定することができる。例えば、Fieldsら（１９８９年）、Nature、３４０巻：２４５〜２４６頁；米国特許第５，５８５，２４５号および国際特許公開第ＷＯ９８／４４３５０号を参照されたい。
【０１００】
「ベクター」は、遺伝子配列を標的細胞に移行することができる。一般には、「ベクター構築物」、「発現ベクター」および「遺伝子導入ベクター」は、目的の遺伝子の発現を方向付けることができ、遺伝子配列を標的細胞に移行することができる任意の核酸構築物を意味する。したがって、この用語は、クローニング、および発現ビヒクル、ならびに組込みベクターを包含する。
【０１０１】
「レポーター遺伝子」または「レポーター配列」は、必ずではないが好ましくは常套的なアッセイで容易に測定されるタンパク質産物を産生する任意の配列を指す。適切なレポーター遺伝子としては、これらに限定されないが、抗生物質耐性（例えば、アンピシリン耐性、ネオマイシン耐性、Ｇ４１８耐性、ピューロマイシン耐性）を媒介するタンパク質をコードする配列、呈色または蛍光または発光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、高感度緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ）、ならびに細胞成長および／または遺伝子増幅の増強を媒介するタンパク質（例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ）をコードする配列が挙げられる。エピトープタグとして、例えば、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｔａｐ、ＨＡまたは任意の検出可能なアミノ酸配列の１つまたは複数のコピーが挙げられる。「発現タグ」は、目的の遺伝子の発現をモニタリングするために所望の遺伝子配列に作動可能に連結させることができるレポーターをコードする配列を含む。
【０１０２】
「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」および「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、本明細書で使用される場合、症状の重症度および／または発生頻度の低減、症状および／または根本原因の排除、症状および／またはそれらの根本原因の発生の予防、ならびに損傷の改善または修復を指す。がんおよび移植片対宿主病は、本明細書に記載の組成物および方法を使用して処置することができる状態の非限定的な例である。
ＤＮＡ結合性ドメイン
【０１０３】
任意のＣＦＴＲ遺伝子内の標的部位に特異的に結合するＤＮＡ結合性ドメインを含む組成物が本明細書に記載される。これらに限定されないが、ジンクフィンガーＤＮＡ結合性ドメイン、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合性ドメイン、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼのＤＮＡ結合性部分（ｓｇＲＮＡ）、またはメガヌクレアーゼ由来のＤＮＡ結合性ドメインを含めた任意のＤＮＡ結合性ドメインを本明細書に開示される組成物および方法に使用することができる。
【０１０４】
ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合性ドメインは、ジンクフィンガータンパク質を含む。ジンクフィンガータンパク質は、選択される標的部位に結合するように工学的に操作されているという点で天然に存在しないことが好ましい。例えば、全てそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれるBeerliら（２００２年）、Nature  Biotechnol.、２０巻：１３５〜１４１頁；Paboら（２００１年）、Ann.  Rev.  Biochem.、７０巻：３１３〜３４０頁；Isalanら（２００１年）、Nature  Biotechnol.、１９巻：６５６〜６６０頁；Segalら（２００１年）、Curr.  Opin.  Biotechnol.、１２巻：６３２〜６３７頁；Chooら（２０００年）、Curr.  Opin.  Struct.  Biol.、１０巻：４１１〜４１６頁；米国特許第６，４５３，２４２号；同第６，５３４，２６１号；同第６，５９９，６９２号；同第６，５０３，７１７号；同第６，６８９，５５８号；同第７，０３０，２１５号；同第６，７９４，１３６号；同第７，０６７，３１７号；同第７，２６２，０５４号；同第７，０７０，９３４号；同第７，３６１，６３５号；同第７，２５３，２７３号；および米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号；同第２００７／０２１８５２８号；同第２００５／０２６７０６１号を参照されたい。
【０１０５】
工学的に操作されたジンクフィンガー結合性ドメインは、天然に存在するジンクフィンガータンパク質と比較して新規の結合特異性を有し得る。工学的に操作する方法としては、これらに限定されないが、合理的設計および種々の型の選択が挙げられる。合理的設計は、例えば、トリプレット（またはクワドルプレット）ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースであって、各トリプレットまたはクワドルプレットヌクレオチド配列が特定のトリプレットまたはクワドルプレット配列に結合するジンクフィンガーの１つまたは複数のアミノ酸配列と関連付けられるデータベースを使用することを含む。例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号を参照されたい。
【０１０６】
ファージディスプレイおよびツーハイブリッド系を含めた例示的な選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号；同第５，９２５，５２３号；同第６，００７，９８８号；同第６，０１３，４５３号；同第６，４１０，２４８号；同第６，１４０，４６６号；同第６，２００，７５９号；および同第６，２４２，５６８号；ならびに国際特許公開第ＷＯ９８／３７１８６号；同第ＷＯ９８／５３０５７号；同第ＷＯ００／２７８７８号；および同第ＷＯ０１／８８１９７号ならびにＧＢ２，３３８，２３７に開示されている。さらに、ジンクフィンガー結合性ドメインに対する結合特異性の増強は、例えば、米国特許第６，７９４，１３６号に記載されている。
【０１０７】
さらに、これらおよび他の参考文献に開示されている通り、ジンクフィンガードメインおよび／またはマルチフィンガージンクフィンガータンパク質を、例えば、５アミノ酸またはそれよりも多くのアミノ酸の長さのリンカーを含めた任意の適切なリンカー配列を使用して連結することができる。６アミノ酸またはそれよりも多くのアミノ酸の長さの例示的なリンカー配列に関しては米国特許第６，４７９，６２６号；同第６，９０３，１８５号；および同第７，１５３，９４９号も参照されたい。本明細書に記載のタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間の適切なリンカーの任意の組合せを含み得る。さらに、ジンクフィンガー結合性ドメインに対する結合特異性の増強は、例えば、米国特許第６，７９４，１３６号に記載されている。
【０１０８】
さらに、これらおよび他の参考文献に開示されている通り、ジンクフィンガードメインおよび／またはマルチフィンガージンクフィンガータンパク質を、例えば、５アミノ酸またはそれよりも多くのアミノ酸の長さのリンカーを含めた任意の適切なリンカー配列を使用して連結することができる。６アミノ酸またはそれよりも多くのアミノ酸の長さの例示的なリンカー配列に関しては、米国特許第６，４７９，６２６号；同第６，９０３，１８５号；および同第７，１５３，９４９号も参照されたい。本明細書に記載のタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間の適切なリンカーの任意の組合せを含み得る。
【０１０９】
ＺＦＰを１つまたは複数のヌクレアーゼ（切断）ドメインに作動可能に結び付けて（連結して）、ＺＦＮを形成することができる。「ＺＦＮ」という用語は、二量体を形成して標的遺伝子を切断するＺＦＮの対を含む。方法および組成物を使用して、ヌクレアーゼ対を含めたＺＦＮの、その意図された標的に対する特異性をオフターゲット部位として公知の他の意図されていない切断部位と比べて増大させることもできる（米国特許出願公開第２０１８／００８７０７２号を参照されたい）。したがって、本明細書に記載のヌクレアーゼは、それらのＤＮＡ結合性ドメイン骨格領域の１つもしくは複数内の突然変異および／またはそれらのヌクレアーゼ切断ドメイン内の１つもしくは複数の突然変異を含み得る。これらのヌクレアーゼは、ＤＮＡ骨格上のリン酸と非特異的に相互作用し得るＺＦＰ  ＤＮＡ結合性ドメイン（「ＺＦＰ骨格」）内のアミノ酸に対する突然変異を含み得るが、ＤＮＡ認識へリックスには変化を含まない。したがって、本発明は、ヌクレオチド標的特異性には必要ないＺＦＰ骨格内のカチオン性アミノ酸残基の突然変異を含む。一部の実施形態では、ＺＦＰ骨格におけるこれらの突然変異は、カチオン性アミノ酸残基の中性またはアニオン性アミノ酸残基への突然変異を含む。一部の実施形態では、ＺＦＰ骨格におけるこれらの突然変異は、極性アミノ酸残基の中性または非極性アミノ酸残基への突然変異を含む。好ましい実施形態では、ＤＮＡ結合性へリックスに対して（−５）位、（−９）位および／または（−１４）位に突然変異を生じさせる。一部の実施形態では、ジンクフィンガーは、（−５）、（−９）および／または（−１４）に１つまたは複数の突然変異を含み得る。さらなる実施形態では、マルチフィンガージンクフィンガータンパク質内の１つまたは複数のジンクフィンガーは、（−５）、（−９）および／または（−１４）に突然変異を含み得る。一部の実施形態では、（−５）、（−９）および／または（−１４）のアミノ酸（例えば、アルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ））がアラニン（Ａ）、ロイシン（Ｌ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ａｓｐ（Ｎ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｔｙｒ（Ｙ）および／またはグルタミン（Ｑ）に突然変異している。
【０１１０】
一部の態様では、ＤＮＡ結合性ドメイン（例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ｓｇＲＮＡなど）は、突然変異型ＣＦＴＲ配列を野生型と比較して優先的に標的とする。対のヌクレアーゼでは、一方のＤＮＡ結合性ドメインが野生型配列を標的とし得、他方のＤＮＡ結合性ドメインが、突然変異型配列を標的とし得る。あるいは、両方のＤＮＡ結合性ドメインが野生型または突然変異型配列を標的とし得る。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合性ドメインは、表２に示されている突然変異型ＣＦＴＲ配列（例えば、ΔＦ５０８）内の部位（９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８またはそれよりも多くのヌクレオチド）を標的とする。標的部位の選択；融合タンパク質（およびそれをコードするポリヌクレオチド）を設計し構築するためのＺＦＰおよび方法は、当業者に公知であり、米国特許第６，１４０，０８１号；同第５，７８９，５３８号；同第６，４５３，２４２号；同第６，５３４，２６１号；同第５，９２５，５２３号；同第６，００７，９８８号；同第６，０１３，４５３号；および同第６，２００，７５９号；国際特許公開第ＷＯ９５／１９４３１号；同第ＷＯ９６／０６１６６号；同第ＷＯ９８／５３０５７号；同第ＷＯ９８／５４３１１号；同第ＷＯ００／２７８７８号；同第ＷＯ０１／６０９７０号；同第ＷＯ０１／８８１９７号；同第ＷＯ０２／０９９０８４号；同第ＷＯ９８／５３０５８号；同第ＷＯ９８／５３０５９号；同第ＷＯ９８／５３０６０号；同第ＷＯ０２／０１６５３６号；および同第ＷＯ０３／０１６４９６号において詳細に記載されている。
【０１１１】
さらに、これらおよび他の参考文献に開示されている通り、ジンクフィンガードメインおよび／またはマルチフィンガージンクフィンガータンパク質を、例えば、５アミノ酸またはそれよりも多くのアミノ酸の長さのリンカーを含めた任意の適切なリンカー配列を使用して連結することができる。６アミノ酸またはそれよりも多くのアミノ酸の長さの例示的なリンカー配列に関しては米国特許第６，４７９，６２６号；同第６，９０３，１８５号；および同第７，１５３，９４９号も参照されたい。本明細書に記載のタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間の適切なリンカーの任意の組合せを含み得る。
【０１１２】
ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合性ドメインは、ＡＲ遺伝子または毛髪成長制御遺伝子内の標的部位に結合する（配列特異的に）工学的に操作されたジンクフィンガータンパク質であり、毛髪成長遺伝子の発現をモジュレートする。一部の実施形態では、ジンクフィンガータンパク質は、ＰＴＧＤＳまたはＧＰＲ４４受容体（ＰＴＧＤＲ２またはＤＰ２Ｓとしても公知）内の標的部位に結合する。
【０１１３】
通常、ＺＦＰは、少なくとも３つのフィンガーを含む。ＺＦＰのいくつかは、４つ、５つまたは６つのフィンガーを含む。３つのフィンガーを含むＺＦＰは、一般には、９または１０ヌクレオチドを含む標的部位を認識し、４つのフィンガーを含むＺＦＰは、一般には、１２〜１４ヌクレオチドを含む標的部位を認識し、６つのフィンガーを有するＺＦＰは、１８〜２１ヌクレオチドを含む標的部位を認識し得る。ＺＦＰは、転写活性化または抑止ドメインであり得る１つまたは複数の制御ドメインを含む融合タンパク質であってもよい。
【０１１４】
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合性ドメインは、ヌクレアーゼに由来し得る。例えば、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩおよびＩ−ＴｅｖＩＩＩなどのホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼの認識配列が公知である。米国特許第５，４２０，０３２号；米国特許第６，８３３，２５２号；Belfortら（１９９７年）、Nucleic  Acids  Res.、２５巻：３３７９〜３３８８頁；Dujonら（１９８９年）、Gene、８２巻：１１５〜１１８頁；Perlerら（１９９４年）、Nucleic  Acids  Res.、２２巻、１１２５〜１１２７頁；Jasin（１９９６年）、Trends  Genet.、１２巻：２２４〜２２８頁；Gimbleら（１９９６年）、J.  Mol.  Biol.、２６３巻：１６３〜１８０頁；Argastら（１９９８年）、J.  Mol.  Biol.、２８０巻：３４５〜３５３頁およびＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓカタログも参照されたい。さらに、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性を、非天然標的部位に結合するように工学的に操作することができる。例えば、Chevalierら（２００２年）、Molec.  Cell、１０巻：８９５〜９０５頁；Epinatら（２００３年）、Nucleic  Acids  Res.、３１巻：２９５２〜２９６２頁；Ashworthら（２００６年）、Nature、４４１巻：６５６〜６５９頁；Paquesら（２００７年）、Current  Gene  Therapy、７巻：４９〜６６頁；米国特許出願公開第２００７／０１１７１２８号を参照されたい。
【０１１５】
他の実施形態では、ＤＮＡ結合性ドメインは、植物病原体Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ（Bochら（２００９年）、Science、３２６巻：１５０９〜１５１２頁ならびにMoscouおよびBogdanove、（２００９年）、Science  ３２６巻：１５０１頁を参照されたい）およびＲａｌｓｔｏｎｉａ（Heuerら（２００７年）、Applied  and  Environmental  Microbiology、７３巻（１３号）：４３７９〜４３８４頁）；米国特許出願公開第２０１１／０３０１０７３号および同第２０１１／０１４５９４０号を参照されたい）に由来するものと同様のＴＡＬエフェクター由来の工学的に操作されたドメインを含む。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属の植物病原性細菌は、重要な作物植物において多くの疾患を引き起こすことが公知である。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓの病原性は、２５種よりも多くの異なるエフェクタータンパク質を植物細胞に注射する保存されたＩＩＩ型分泌（Ｔ３Ｓ）系に依存する。これらの注射されたタンパク質としては、植物転写活性化因子を模倣し、植物トランスクリプトームを操作する転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）がある（Kayら（２００７年）、Science、３１８巻：６４８〜６５１頁を参照されたい）。これらのタンパク質は、ＤＮＡ結合性ドメインおよび転写活性化ドメインを含有する。最もよく特徴付けられたＴＡＬＥのうちの１つはＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｇｒｉｓ  ｐｖ．Ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ由来のＡｖｒＢｓ３である（Bonasら（１９８９年）、Mol  Gen  Genet、２１８巻：１２７〜１３６頁および国際特許公開第ＷＯ２０１０／０７９４３０号を参照されたい）。ＴＡＬＥは、タンデムリピートの集中ドメインを含有し、各リピートが、これらのタンパク質のＤＮＡ結合特異性に重要であるおよそ３４アミノ酸を含有する。さらに、ＴＡＬＥは、核局在化配列および酸性転写活性化ドメインを含有する（概説に関しては、Schornack  S.ら（２００６年）、J  Plant  Physiol、１６３巻（３号）：２５６〜２７２頁を参照されたい）。さらに、植物病原性の細菌であるＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍにおいて、Ｒ．ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ｂｉｏｖａｒ  １  ｓｔｒａｉｎ  ＧＭＩ１０００およびｂｉｏｖａｒ  ４  ｓｔｒａｉｎ  ＲＳ１０００においてＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓのＡｖｒＢｓ３ファミリーに相同であるｂｒｇ１１およびｈｐｘ１７と称される２つの遺伝子が見出されている（Heuerら（２００７年）、Appl  and  Envir  Micro、７３巻（１３号）：４３７９〜４３８４頁を参照されたい）。これらの遺伝子は、ヌクレオチド配列が互いと９８．９％同一であるが、ｈｐｘ１７のリピートドメイン内の１，５７５ｂｐの欠失により異なる。しかし、どちらの遺伝子産物もＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓのＡｖｒＢｓ３ファミリータンパク質との４０％未満の配列同一性を有する。
【０１１６】
これらのＴＡＬエフェクターの特異性は、タンデムリピート内に見いだされる配列に依存する。リピートされた配列は、およそ１０２塩基対を含み、リピートは、一般には、互いと９１〜１００％相同である（Bonasら、同文献）。リピートの多型は、通常、１２位および１３位に位置し、１２位および１３位の超可変二残基（リピート可変二残基またはＲＶＤ領域）の同一性とＴＡＬ−エフェクターの標的配列の連続したヌクレオチドの同一性の間には１対１の対応があると思われる（MoscouおよびBogdanove（２００９年）、Science  ３２６巻：１５０１頁およびBochら（２００９年）、Science、３２６巻：１５０９〜１５１２頁を参照されたい）。実験的に、これらのＴＡＬ−エフェクターのＤＮＡ認識についての天然のコードは、１２位および１３位のＨＤ配列（リピート可変二残基またはＲＶＤ）によりシトシン（Ｃ）への結合が導かれ、ＮＧがＴに結合し、ＮＩがＡ、Ｃ、ＧまたはＴに結合し、ＮＮがＡまたはＧに結合し、ＩＮＧがＴに結合するように決定されている。これらのＤＮＡ結合リピートは、新しい配列と相互作用し、植物細胞における非内在性レポーター遺伝子の発現を活性化することができる人工転写因子を作製するために、新しい組合せおよび数のリピートを有するタンパク質にアセンブルされている（Bochら、同文献）。工学的に操作されたＴＡＬタンパク質をＦｏｋＩ切断ハーフドメインと連結して、非定型的ＲＶＤを有するＴＡＬＥＮを含めたＴＡＬエフェクタードメインヌクレアーゼ融合物（ＴＡＬＥＮ）がもたらされている。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号を参照されたい。
【０１１７】
一部の実施形態では、ＴＡＬＥＮは、エンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）切断ドメインまたは切断ハーフドメインを含む。他の実施形態では、ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼは、メガＴＡＬである。これらのメガＴＡＬヌクレアーゼは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合性ドメインおよびメガヌクレアーゼ切断ドメインを含む融合タンパク質である。メガヌクレアーゼ切断ドメインは単量体で活性であり、活性のための二量体形成を必要としない。（Boisselら（２０１３年）、Nucl  Acid  Res：１〜１３巻、doi:10.1093/nar/gkt1224を参照されたい）。
【０１１８】
さらに別の実施形態では、ヌクレアーゼは、ｃｏｍｐａｃｔ  ＴＡＬＥＮを含む。これらは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合性ドメインとＴｅｖＩヌクレアーゼドメインが連結した単鎖融合タンパク質である。融合タンパク質は、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合性ドメインがＴｅｖＩヌクレアーゼドメインに対してどこに位置しているかに応じて、ＴＡＬＥ領域によって局在化されるニッカーゼとして作用し得るか、または二本鎖切断を創出し得る（Beurdeleyら（２０１３年）、Nat  Comm：１〜８巻、doi:10.1038/ncomms  2782を参照されたい）。さらに、ヌクレアーゼドメインもＤＮＡ結合機能性を示す場合がある。任意のＴＡＬＥＮを１つまたは複数のメガＴＡＬＥを有する追加的なＴＡＬＥＮ（例えば、１つまたは複数のＴＡＬＥＮ（ｃＴＡＬＥＮまたはＦｏｋＩ−ＴＡＬＥＮ）と組み合わせて使用することができる。
【０１１９】
さらに、これらおよび他の参考文献に開示されている通り、ジンクフィンガードメインおよび／またはマルチフィンガージンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥを、例えば、５アミノ酸またはそれよりも多くのアミノ酸の長さのリンカーを含めた任意の適切なリンカー配列を使用して連結することができる。６アミノ酸またはそれよりも多くのアミノ酸の長さの例示的なリンカー配列に関しては、米国特許第６，４７９，６２６号；同第６，９０３，１８５号；および同第７，１５３，９４９号も参照されたい。本明細書に記載のタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間の適切なリンカーの任意の組合せを含み得る。さらに、ジンクフィンガー結合性ドメインに対する結合特異性の増強は、例えば、米国特許第６，７９４，１３６号に記載されている。
【０１２０】
ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合性ドメインは、ＤＮＡに結合する単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含め、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系の一部である。例えば、米国特許第８，６９７，３５９号ならびに米国特許出願公開第２０１５／００５６７０５号および同第２０１５／０１５９１７２号を参照されたい。系のＲＮＡ構成成分をコードするＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された規則的な配置の短い回文配列リピート（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ））遺伝子座、およびタンパク質をコードするｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子座（Jansenら（２００２年）、Mol.  Microbiol.、４３巻：１５６５〜１５７５頁；Makarovaら（２００２年）、Nucleic  Acids  Res.、３０巻：４８２〜４９６頁；Makarovaら（２００６年）、Biol.  Direct  １巻：７頁；Haftら（２００５年）、PLoS  Comput.  Biol.、１巻：ｅ６０頁）によりＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系の遺伝子配列が構成される。微生物宿主におけるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子ならびにＣＲＩＳＰＲ媒介性核酸切断の特異性をプログラミングできる非コードＲＮＡエレメントの組合せを含有する。
【０１２１】
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲは、最もよく特徴付けられた系の１つであり、標的化ＤＮＡ二本鎖切断が４つの逐次的なステップで行われる。第１に、２つの非コードＲＮＡ、プレｃｒＲＮＡアレイおよびｔｒａｃｒＲＮＡがＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される。第２に、ｔｒａｃｒＲＮＡがプレｃｒＲＮＡのリピート領域にハイブリダイズし、プレｃｒＲＮＡの、個々のスペーサー配列を含有する成熟ｃｒＲＮＡへのプロセシングを媒介する。第３に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体により、機能性ドメイン（例えば、Ｃａｓなどのヌクレアーゼ）が標的ＤＮＡにｃｒＲＮＡ上のスペーサーと標的認識のための追加的な要件であるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の隣の標的ＤＮＡ上のプロトスペーサーの間のワトソン・クリック塩基対合を介して方向付けられる。最後に、Ｃａｓ９により標的ＤＮＡの切断が媒介されて、プロトスペーサー内の二本鎖切断が創出される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の活性は、３つのステップ：（ｉ）「適応」と称されるプロセスにおいて、異質ＤＮＡ配列がＣＲＩＳＰＲアレイに挿入されて、今後の攻撃が防止されるステップと、（ｉｉ）関連するタンパク質が発現され、ならびにアレイが発現およびプロセシングされるステップと、その後の（ｉｉｉ）異質核酸によるＲＮＡ媒介性干渉ステップとで構成される。したがって、細菌細胞では、いわゆる「Ｃａｓ」タンパク質のいくつかがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の天然の機能に関与し、異質ＤＮＡなどの挿入などの機能において役割を果たす。
【０１２２】
ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、天然に存在するＣａｓタンパク質の「機能性誘導体」であり得る。ネイティブな配列のポリペプチドの「機能性誘導体」は、ネイティブな配列のポリペプチドと共通する定性的な生物学的性質を有する化合物である。「機能性誘導体」は、これらに限定されないが、ネイティブな配列の断片、ならびに、対応するネイティブな配列のポリペプチドと共通する生物活性を有するのであれば、ネイティブな配列のポリペプチドの誘導体およびその断片を含む。本明細書において意図されている生物活性は、機能性誘導体のＤＮＡ基質を断片に加水分解する能力である。「誘導体」という用語は、ポリペプチドのアミノ酸配列バリアント、共有結合性の修飾物の両方、および誘導体Ｃａｓタンパク質などのその融合物を包含する。Ｃａｓポリペプチドの適切な誘導体またはその断片としては、これらに限定されないが、Ｃａｓタンパク質の突然変異体、融合物、共有結合性の修飾物またはその断片が挙げられる。Ｃａｓタンパク質またはその断片、ならびにＣａｓタンパク質の誘導体またはその断片を含むＣａｓタンパク質は、細胞から入手可能であるか、または化学的に合成することができるか、またはこれらの２つの手順の組合せによって入手可能である。細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然に産生する細胞であってもよく、あるいはＣａｓタンパク質を天然に産生し、内因性Ｃａｓタンパク質をより高い発現レベルで産生するように、または、内因性Ｃａｓと同じもしくは異なるＣａｓをコードする外因的に導入された核酸からＣａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作された細胞であってもよい。一部の場合では、細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然には産生せず、Ｃａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作される。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＡＡＶベクターを介して送達するための小さなＣａｓ９オルソログである（Ranら（２０１５年）、Nature  ５１０巻：１８６頁）。
【０１２３】
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合性ドメインはＴｔＡｇｏ系の一部である（Swartsら、同文献；Shengら、同文献を参照されたい）。真核生物では、遺伝子サイレンシングは、タンパク質のアルゴノート（Ａｇｏ）ファミリーによって媒介される。このパラダイムでは、Ａｇｏは、小さな（１９〜３１ｎｔ）ＲＮＡに結合する。このタンパク質−ＲＮＡサイレンシング複合体は、標的ＲＮＡを、低分子ＲＮＡと標的の間のワトソン・クリック塩基対合を介して認識し、標的ＲＮＡをヌクレオチド鎖切断的に切断する（Vogel（２０１４年）、Science、３４４巻：９７２〜９７３頁）。対照的に、原核生物Ａｇｏタンパク質は、小さな一本鎖ＤＮＡ断片に結合し、外来（多くの場合、ウイルス）ＤＮＡを検出し、除去するように機能する可能性がある（Yuanら（２００５年）、Mol.  Cell、１９巻：４０５頁；Olovnikovら（２０１３年）、Mol.  Cell、５１巻：５９４頁；Swartsら、同文献）。例示的な原核生物Ａｇｏタンパク質としては、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、およびＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来するものが挙げられる。
【０１２４】
最もよく特徴付けられた原核生物Ａｇｏタンパク質のうちの１つは、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来するものである（ＴｔＡｇｏ；Swartsら、同文献）。ＴｔＡｇｏは、５’リン酸基を有する１５ｎｔまたは１３〜２５ｎｔのいずれかの一本鎖ＤＮＡ断片と会合する。ＴｔＡｇｏが結合するこの「ガイドＤＮＡ」は、タンパク質−ＤＮＡ複合体をＤＮＡの第三者分子内のワトソン・クリック相補ＤＮＡ配列に結合するように方向付ける働きをする。これらのガイドＤＮＡ内の配列情報により標的ＤＮＡが同定されたら、ＴｔＡｇｏ−ガイドＤＮＡ複合体により標的ＤＮＡが切断される。そのような機構は、標的ＤＮＡに結合している間のＴｔＡｇｏ−ガイドＤＮＡ複合体の構造によっても支持される（G.  Shengら、同文献）。Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ由来のＡｇｏ（ＲｓＡｇｏ）は同様の性質を有する（Olovnikovら、同文献）。
【０１２５】
任意のＤＮＡ配列の外因性ガイドＤＮＡをＴｔＡｇｏタンパク質にローディングすることができる（Swartsら、同文献）。ＴｔＡｇｏ切断の特異性はガイドＤＮＡによって方向付けられるので、したがって、外因性の、研究者に指定されたガイドＤＮＡを用いて形成されたＴｔＡｇｏ−ＤＮＡ複合体によりＴｔＡｇｏ標的ＤＮＡ切断が相補的な研究者に指定された標的ＤＮＡに方向付けられる。このように、ＤＮＡにおける標的化二本鎖切断を創出することができる。ＴｔＡｇｏ−ガイドＤＮＡ系（または他の生物体由来のオルソロガスＡｇｏ−ガイドＤＮＡ系）の使用により、細胞内のゲノムＤＮＡの標的化切断が可能になる。そのような切断は、一本鎖または二本鎖であり得る。哺乳動物ゲノムＤＮＡの切断に関しては、哺乳動物細胞における発現に対してコドン最適化されたＴｔＡｇｏのバージョンの使用が好ましいと思われる。さらに、ＴｔＡｇｏタンパク質が細胞透過性ペプチドと融合している場合、細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて形成されたＴｔＡｇｏ−ＤＮＡ複合体で処理することが好ましい場合がある。さらに、３７℃における活性が改善されるように突然変異誘発によって変更されたＴｔＡｇｏタンパク質のバージョンを使用することが好ましい場合がある。Ａｇｏ−ＲＮＡ媒介性ＤＮＡ切断を使用して、ＤＮＡ切断の活用に関する当技術分野における標準の技法を使用した遺伝子ノックアウト、標的化遺伝子付加、遺伝子矯正、標的化遺伝子欠失を含めた多数の転帰に影響を及ぼすことができる。
【０１２６】
したがって、任意のＤＮＡ結合性ドメインを本発明の方法および組成物に使用することができる。
融合分子
【０１２７】
本明細書に記載のＤＮＡ結合性ドメイン（例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ、単一ガイドＲＮＡなどのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構成成分）および異種性制御（機能性）ドメイン（またはその機能性断片）を含む融合分子も提供される。一般的なドメインとして、例えば、転写因子ドメイン（活性化因子、リプレッサー、コアクチベーター、コリプレッサー）、サイレンサー、癌遺伝子（例えば、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍｙｂ、ｍａｘ、ｍａｄ、ｒｅｌ、ｅｔｓ、ｂｃｌ、ｍｙｂ、ｍｏｓファミリーメンバーなど）；ＤＮＡ修復酵素およびそれらの関連する因子および修飾因子；ＤＮＡ再構成酵素およびそれらの関連する因子および修飾因子；クロマチン関連タンパク質およびそれらの修飾因子（例えば、キナーゼ、アセチラーゼおよび脱アセチル化酵素）；ならびにＤＮＡ修飾酵素（例えば、メチルトランスフェラーゼ、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ）およびそれらの関連する因子および修飾因子が挙げられる。ＤＮＡ結合性ドメインとヌクレアーゼ切断ドメインの融合物に関する詳細については、それらの全体が本明細書において参照により組み込まれる米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号；同第２００６／０１８８９８７号および同第２００７／０２１８５２８号。
【０１２８】
活性化を実現するための適切なドメインとしては、ＨＳＶ  ＶＰ１６活性化ドメイン（例えば、Hagmannら（１９９７年）、J.  Virol.、７１巻：５９５２〜５９６２頁を参照されたい）、核ホルモン受容体（例えば、Torchiaら（１９９８年）、Curr.  Opin.  Cell.  Biol.、１０巻：３７３〜３８３頁を参照されたい）；核因子カッパＢのｐ６５サブユニット（BitkoおよびBarik（１９９８年）、J.  Virol.、７２巻：５６１０〜５６１８頁およびDoyleおよびHunt（１９９７年）、Neuroreport、８巻：２９３７〜２９４２頁）；Liuら（１９９８年）、Cancer  Gene  Ther.、５巻：３〜２８頁）、またはＶＰ６４などの人工キメラ機能性ドメイン（Beerliら（１９９８年）、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、９５巻：１４６２３〜３３頁）、およびデグロン（Molinariら（１９９９年）、EMBO  J.、１８巻、６４３９〜６４４７頁）が挙げられる。追加的な例示的な活性化ドメインとしては、Ｏｃｔ１、Ｏｃｔ−２Ａ、Ｓｐ１、ＡＰ−２、およびＣＴＦ１（Seipelら（１９９２年）、EMBO  J.、１１巻、４９６１〜４９６８頁）ならびにｐ３００、ＣＢＰ、ＰＣＡＦ、ＳＲＣ１  ＰｖＡＬＦ、ＡｔＨＤ２ＡおよびＥＲＦ−２が挙げられる。例えば、Robyrら（２０００年）、Mol.  Endocrinol.、１４巻：３２９〜３４７頁；Collingwoodら（１９９９年）、J.  Mol.  Endocrinol.、２３巻：２５５〜２７５頁；Leoら（２０００年）、Gene、２４５巻：１〜１１頁；Manteuffel-Cymborowska（１９９９年）、Acta  Biochim.  Pol.、４６巻：７７〜８９頁；McKennaら（１９９９年）、J.  Steroid  Biochem.  Mol.  Biol.、６９巻：３〜１２頁；Malikら（２０００年）、Trends  Biochem.  Sci.、２５巻：２７７〜２８３頁；およびLemonら（１９９９年）、Curr.  Opin.  Genet.  Dev.、９巻：４９９〜５０４頁を参照されたい。追加的な例示的な活性化ドメインとしては、これらに限定されないが、ＯｓＧＡＩ、ＨＡＬＦ−１、Ｃ１、ＡＰ１、ＡＲＦ−５、ＡＲＦ−６、ＡＲＦ−７、およびＡＲＦ−８、ＣＰＲＦ１、ＣＰＲＦ４、ＭＹＣ−ＲＰ／ＧＰ、ならびにＴＲＡＢ１が挙げられる。例えば、Ogawaら（２０００年）、Gene、２４５巻：２１〜２９頁；Okanamiら（１９９６年）、Genes  Cells、１巻：８７〜９９頁；Goffら（１９９１年）、Genes  Dev.、５巻：２９８〜３０９頁；Choら（１９９９年）、Plant  Mol.  Biol.、４０巻：４１９〜４２９頁；Ulmasonら（１９９９年）、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、９６巻：５８４４〜５８４９頁；Sprenger−Hausselsら（２０００年）、Plant  J.、２２巻：１〜８頁；Gongら（１９９９年）、Plant  Mol.  Biol.、４１巻：３３〜４４頁；およびHoboら（１９９９年）、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、９６巻：１５，３４８〜１５，３５３頁を参照されたい。
【０１２９】
ＤＮＡ結合性ドメインと機能性ドメインの間での融合タンパク質（またはそれをコードする核酸）の形成においては、活性化ドメインまたは活性化ドメインと相互作用する分子のいずれかが機能性ドメインとして適切であることは当業者には明らかになろう。活性化複合体および／または活性化活性（例えばヒストンアセチル化など）を標的遺伝子に動員することができる本質的に任意の分子が融合タンパク質の活性化ドメインとして有用である。融合分子における機能的ドメインとしての使用に適したインスレータードメイン、局在化ドメイン、ならびにＩＳＷＩ含有ドメインおよび／またはメチル結合性ドメインタンパク質などのクロマチンリモデリングタンパク質は、例えば、米国特許出願公開第２００２／０１１５２１５号および同第２００３／００８２５５２号ならびに国際特許公開第ＷＯ０２／４４３７６号に記載されている。
【０１３０】
例示的な抑止ドメインとしては、これらに限定されないが、ＫＲＡＢ  Ａ／Ｂ、ＫＯＸ、ＴＧＦ−ベータ誘導性初期遺伝子（ＴＩＥＧ）、ｖ−ｅｒｂＡ、ＳＩＤ、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＤＮＭＴファミリーのメンバー（例えば、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ）、Ｒｂ、およびＭｅＣＰ２が挙げられる。例えば、Birdら（１９９９年）、Cell、９９巻：４５１〜４５４頁；Tylerら（１９９９年）、Cell、９９巻：４４３〜４４６頁；Knoepflerら（１９９９年）、Cell、９９巻：４４７〜４５０頁；およびRobertsonら（２０００年）、Nature  Genet.、２５巻：３３８〜３４２頁を参照されたい。追加的な例示的な抑止ドメインとしては、これらに限定されないが、ＲＯＭ２およびＡｔＨＤ２Ａが挙げられる。例えば、Chemら（１９９６年）、Plant  Cell、８巻：３０５〜３２１頁；およびWuら（２０００年）、Plant  J.、２２巻：１９〜２７頁を参照されたい。
【０１３１】
融合分子は、当業者に周知のクローニングおよび生化学的コンジュゲーションの方法によって構築される。融合分子は、ＤＮＡ結合性ドメインおよび機能性ドメイン（例えば、転写活性化または抑止ドメイン）を含む。融合分子はまた、必要に応じて、核局在化シグナル（例えばＳＶ４０ミディアムＴ−抗原に由来するものなど）およびエピトープタグ（例えば、ＦＬＡＧおよび赤血球凝集素など）も含む。融合タンパク質（およびそれらをコードする核酸）は、翻訳の読み枠が融合物の構成成分の間で保存されるように設計する。
【０１３２】
一方の機能性ドメイン（またはその機能性断片）のポリペプチド構成成分と他方の非タンパク質ＤＮＡ結合性ドメイン（例えば、抗生物質、インターカレーター、副溝結合物質、核酸）の間の融合物は、当業者に公知の生化学的コンジュゲーションの方法によって構築される。例えば、Pierce  Chemical  Company  (Rockford、IL)  Catalogue.  Methods  and  compositions  for  making  fusions  between  a  minor  groove  binder  and  a  polypeptide  have  been  described.  Mappら（２０００年）、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、９７巻：３９３０〜３９３５頁を参照されたい。さらに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の単一ガイドＲＮＡは機能的ドメインと会合して活性な転写制御因子およびヌクレアーゼを形成する。
【０１３３】
ある特定の実施形態では、標的部位は、細胞クロマチンの到達可能な領域内に存在する。到達可能な領域は、例えば、米国特許第７，２１７，５０９号および同第７，９２３，５４２号に記載されている通り決定することができる。標的部位が細胞クロマチンの到達可能な領域内に存在しない場合、１つまたは複数の到達可能な領域を米国特許第７，７８５，７９２号および同第８，０７１，３７０号に記載されている通り生成することができる。追加的な実施形態では、融合分子のＤＮＡ結合性ドメインは、その標的部位が到達可能な領域内にあるか否かにかかわらず細胞クロマチンに結合することができる。例えば、そのようなＤＮＡ結合性ドメインは、リンカーＤＮＡおよび／またはヌクレオソームＤＮＡに結合することができる。この型の「パイオニア」ＤＮＡ結合性ドメインの例は、ある特定のステロイド受容体において、および肝細胞核因子３（ＨＮＦ３）において見いだされる（Cordingleyら（１９８７年）、Cell、４８巻：２６１〜２７０頁；Pinaら（１９９０年）、Cell、６０巻：７１９〜７３１頁；およびCirilloら（１９９８年）、EMBO  J.、１７巻：２４４〜２５４頁）。
【０１３４】
融合分子は、当業者には公知の通り、薬学的に許容される担体を用いて製剤化することができる。例えば、Remington's  Pharmaceutical  Sciences、第１７版、１９８５年；ならびに米国特許第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号を参照されたい。
【０１３５】
融合分子の機能性構成成分／ドメインは、融合分子が標的配列にＤＮＡ結合性ドメインを介して結合すると遺伝子の転写に影響を及ぼすことができる種々の異なる構成成分のいずれかから選択することができる。したがって、機能性構成成分としては、これらに限定されないが、活性化因子、リプレッサー、コアクチベーター、コリプレッサー、およびサイレンサーなどの種々の転写因子ドメインを挙げることができる。一部の実施形態では、機能性ドメインは、ｄｓＤＮＡ骨格の切断またはドナー鋳型を必要とせずに、１つの標的ＤＮＡ塩基を別の標的ＤＮＡ塩基にプログラム可能な様式で直接不可逆的に変換することを可能にする。一部の態様では、機能性ドメインは、シチジンデアミナーゼ活性を含み、シチジンからウリジンへの直接変換を媒介し、それにより、ＣからＴ（またはＧからＡ）への置換をもたらす。得られる「塩基エディタ」は、ＤＮＡ結合部位のおよそ５ヌクレオチドのウインドウ内のシチジンを変換し、ヒト疾患に関連する種々の点突然変異を効率的に引き起こすことができる（Komorら（２０１６年）、Nature、４月２０日、doi:10.1038/nature17946を参照されたい）。
【０１３６】
追加的な例示的な機能的ドメインは、例えば、米国特許第６，５３４，２６１号および同第６，９３３，１１３号において開示されている。
【０１３７】
外因性小分子またはリガンドによって制御される機能的ドメインも選択することができる。例えば、機能性ドメインの活性なコンフォメーションが外部ＲｈｅｏＣｈｅｍ（商標）リガンドの存在下でのみ想定される場合、ＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ（登録商標）技術を使用することができる（例えば、ＵＳ２００９／０１３６４６５を参照されたい）。したがって、ＺＦＰを調節可能な機能性ドメインに作動可能に連結することができ、得られるＺＦＰ−ＴＦの活性は外部リガンドにより調節される。転写スイッチ（例えば、低分子ＲＮＡまたは他の型の調節可能な分子スイッチ（Aschrafiら（２０１６年）、J  Psychiatry  Neurosci.、４１巻（３号）：１５０１５４頁））を使用することによって追加的な制御を実現することができる。
ヌクレアーゼ
【０１３８】
ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、ＤＮＡ結合性ドメインおよび切断（ヌクレアーゼ）ドメインを含む。したがって、遺伝子改変は、ヌクレアーゼ、例えば、工学的に操作されたヌクレアーゼを使用して実現することができる。工学的に操作されたヌクレアーゼの技術は、天然に存在するＤＮＡ結合性タンパク質を工学的に操作することに基づく。例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼを、調整されたＤＮＡ結合特異性を用いて工学的に操作することが記載されている。Chamesら（２００５年）、Nucleic  Acids  Res、３３巻（２０号）：ｅ１７８頁；Arnouldら（２００６年）、J.  Mol.  Biol.、３５５巻：４４３〜４５８頁。さらに、ＺＦＰを工学的に操作することも記載されている。例えば、米国特許第６，５３４，２６１号；同第６，６０７，８８２号；同第６，８２４，９７８号；同第６，９７９，５３９号；同第６，９３３，１１３号；同第７，１６３，８２４号；および同第７，０１３，２１９号を参照されたい。
【０１３９】
さらに、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮ−その意図された核酸標的をその工学的に操作された（ＺＦＰまたはＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合性ドメインを通じて認識し、ヌクレアーゼ活性によりＤＮＡをＤＮＡ結合性部位の付近でカットさせることができる機能性実体を創出するためにＺＦＰおよび／またはＴＡＬＥがヌクレアーゼドメインと融合されている。例えば、Kimら（１９９６年）、Proc  Nat'l  Acad  Sci  USA、９３巻（３号）：１１５６〜１１６０頁を参照されたい。ここ最近、そのようなヌクレアーゼが種々の生物体におけるゲノム改変のために使用されている。例えば、米国特許出願公開第２００３／０２３２４１０号；同第２００５／０２０８４８９号；同第２００５／００２６１５７号；同第２００５／００６４４７４号；同第２００６／０１８８９８７号；同第２００６／００６３２３１号；および国際特許公開第ＷＯ０７／０１４２７５号を参照されたい。
【０１４０】
したがって、本明細書に記載の方法および組成物は、広範に適用可能であり、任意の目的のヌクレアーゼを伴い得る。ヌクレアーゼの非限定的な例としては、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮおよびジンクフィンガーヌクレアーゼが挙げられる。ヌクレアーゼは、異種ＤＮＡ結合性および切断ドメイン（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ；異種性切断ドメインを有するメガヌクレアーゼＤＮＡ結合性ドメイン）を含み得る、あるいは、天然に存在するヌクレアーゼのＤＮＡ結合性ドメインを、選択された標的部位に結合するように変更することができる（例えば、同類の結合性部位とは異なる部位に結合するように工学的に操作されたメガヌクレアーゼ）。
【０１４１】
本明細書に記載のヌクレアーゼのいずれかでは、ヌクレアーゼは、工学的に操作されたＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合性ドメインおよびＴＡＬＥＮとも称されるヌクレアーゼドメイン（例えば、エンドヌクレアーゼおよび／またはメガヌクレアーゼドメイン）を含み得る。これらのＴＡＬＥＮタンパク質を使用者に選択された標的配列との頑強な部位特異的相互作用のために工学的に操作するための方法および組成物が公開されている（米国特許第８，５８６，５２６号を参照されたい）。一部の実施形態では、ＴＡＬＥＮは、エンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）切断ドメインまたは切断ハーフドメインを含む。他の実施形態では、ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼは、メガＴＡＬである。これらのメガＴＡＬヌクレアーゼは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合性ドメインおよびメガヌクレアーゼ切断ドメインを含む融合タンパク質である。メガヌクレアーゼ切断ドメインは単量体で活性であり、活性のための二量体形成を必要としない。（Boisselら（２０１３年）、Nucl  Acid  Res：１〜１３巻、doi:10.1093/nar/gkt1224を参照されたい）。さらに、ヌクレアーゼドメインもＤＮＡ結合機能性を示す場合がある。
【０１４２】
さらに別の実施形態では、ヌクレアーゼは、ｃｏｍｐａｃｔ  ＴＡＬＥＮ（ｃＴＡＬＥＮ）を含む。これらは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合性ドメインとＴｅｖＩヌクレアーゼドメインを連結する単鎖融合タンパク質である。融合タンパク質は、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合性ドメインがＴｅｖＩヌクレアーゼドメインに対してどこに位置しているかに応じて、ＴＡＬＥ領域によって局在化されるニッカーゼとして作用し得るか、または二本鎖切断を創出し得る（Beurdeleyら（２０１３年）、Nat  Comm：１〜８巻、doi:10.1038/ncomms2782を参照されたい）。任意のＴＡＬＥＮを追加的なＴＡＬＥＮ（例えば、１つまたは複数のメガＴＡＬを有する１つまたは複数のＴＡＬＥＮ（ｃＴＡＬＥＮまたはＦｏｋＩ−ＴＡＬＥＮ））または他のＤＮＡ切断酵素と組み合わせて使用することができる。
【０１４３】
ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、切断活性を示すメガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼ）またはその一部を含む。天然に存在するメガヌクレアーゼは、１５〜４０塩基対の切断部位を認識し、一般に、４つのファミリー：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー、ＧＩＹ−ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ−ＣｙｓボックスファミリーおよびＨＮＨファミリーに群分けされる。例示的なホーミングエンドヌクレアーゼとしては、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩおよびＩ−ＴｅｖＩＩＩが挙げられる。それらの認識配列は公知である。米国特許第５，４２０，０３２号；米国特許第６，８３３，２５２号；Belfortら（１９９７年）、Nucleic  Acids  Res.、２５巻：３３７９〜３３８８頁；Dujonら（１９８９年）、Gene、８２巻：１１５〜１１８頁；Perlerら（１９９４年）、Nucleic  Acids  Res.、２２巻：１１２５〜１１２７頁；Jasin（１９９６年）、Trends  Genet.、１２巻：２２４〜２２８頁；Gimbleら（１９９６年）、J.  Mol.  Biol.、２６３巻：１６３〜１８０頁；Argastら（１９９８年）、J.  Mol.  Biol.、２８０巻：３４５〜３５３頁およびＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓカタログも参照されたい。
【０１４４】
主にＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーに由来する、天然に存在するメガヌクレアーゼ由来のＤＮＡ結合性ドメインは、植物、酵母、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ、哺乳動物細胞およびマウスにおける部位特異的ゲノム改変を促進するために使用されているが、この手法は、メガヌクレアーゼ認識配列を保存する相同な遺伝子（Monetら（１９９９年）、Biochem.  Biophysics.  Res.  Common.、２５５巻：８８〜９３頁）または認識配列が導入されている予め工学的に操作されたゲノム（Routeら（１９９４年）、Mol.  Cell.  Biol.、１４巻：８０９６〜１０６頁；Chiltonら（２００３年）、Plant  Physiology.、１３３巻：９５６〜６５頁；Puchtaら（１９９６年）、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、９３巻：５０５５〜６０頁；Rongら（２００２年）、Genes  Dev.、１６巻：１５６８〜８１頁；Goubleら（２００６年）、J.  Gene  Med.、８巻（５号）：６１６〜６２２頁）のいずれかの改変に限られている。したがって、メガヌクレアーゼを医学的にまたはバイオテクノロジー的に関連する部位において新規の結合特異性を示すように工学的に操作する試みがなされている（Porteusら（２００５年）、Nat.  Biotechnol.、２３巻：９６７〜７３頁；Sussmanら（２００４年）、J.  Mol.  Biol.、３４２巻：３１〜４１頁；Epinatら（２００３年）、Nucleic  Acids  Res.、３１巻：２９５２〜６２頁；Chevalierら（２００２年）、Molec.  Cell、１０巻：８９５〜９０５頁；Epinatら（２００３年）、Nucleic  Acids  Res.、３１巻：２９５２〜２９６２頁；Ashworthら（２００６年）、Nature、４４１巻：６５６〜６５９頁；Paquesら（２００７年）、Current  Gene  Therapy、７巻：４９〜６６頁；米国特許出願公開第２００７／０１１７１２８号；同第２００６／０２０６９４９号；同第２００６／０１５３８２６号；同第２００６／００７８５５２号；および同第２００４／０００２０９２号）。さらに、メガヌクレアーゼ由来の天然に存在するまたは工学的に操作されたＤＮＡ結合性ドメインを異種性ヌクレアーゼ由来の切断ドメイン（例えば、ＦｏｋＩ）と作動可能に連結することができ、かつ／または、メガヌクレアーゼ由来の切断ドメインを異種ＤＮＡ結合性ドメイン（例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ）と作動可能に連結することができる。
【０１４５】
他の実施形態では、ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）またはＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合性ドメイン−ヌクレアーゼ融合物（ＴＡＬＥＮ）である。ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮは、選択された遺伝子内の標的部位に結合するように工学的に操作されたＤＮＡ結合性ドメイン（ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合性ドメイン）および切断ドメインまたは切断ハーフドメイン（例えば、本明細書に記載の制限ヌクレアーゼおよび／またはメガヌクレアーゼに由来する）を含む。
【０１４６】
上で詳細に記載されている通り、ジンクフィンガー結合性ドメインおよびＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合性ドメインを、選択された配列に結合するように工学的に操作することができる。例えば、Beerliら（２００２年）、Nature  Biotechnol.、２０巻：１３５〜１４１頁；Paboら（２００１年）、Ann.  Rev.  Biochem.、７０巻：３１３〜３４０頁；Isalanら（２００１年）、Nature  Biotechnol.、１９巻：６５６〜６６０頁；Segalら（２００１年）、Curr.  Opin.  Biotechnol.、１２巻：６３２〜６３７頁；Chooら（２０００年）、Curr.  Opin.  Struct.  Biol.、１０巻：４１１〜４１６頁を参照されたい。工学的に操作されたジンクフィンガー結合性ドメインまたはＴＡＬＥタンパク質は、天然に存在するタンパク質と比較して、新規の結合特異性を有し得る。工学的に操作する方法としては、これらに限定されないが、合理的設計および種々の型の選択が挙げられる。合理的設計は、例えば、トリプレット（またはクワドルプレット）ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーまたはＴＡＬＥアミノ酸配列を含むデータベースであって、各トリプレットまたはクワドルプレットヌクレオチド配列が、特定のトリプレットまたはクワドルプレット配列に結合するジンクフィンガーまたはＴＡＬＥリピート単位の１つまたは複数のアミノ酸配列に関連付けられるデータベースを使用することを含む。例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号を参照されたい。
【０１４７】
標的部位の選択；ならびに融合タンパク質（およびそれをコードするポリヌクレオチド）を設計し、構築するための方法は、当業者に公知であり、それらの全体が本明細書において参照により組み込まれる米国特許第７，８８８，１２１号および同第８，４０９，８６１号において詳細に記載されている。
【０１４８】
さらに、これらおよび他の参考文献に開示されている通り、ジンクフィンガードメイン、ＴＡＬＥおよび／またはマルチフィンガージンクフィンガータンパク質を、例えば、５アミノ酸またはそれよりも多くのアミノ酸の長さのリンカーを含めた任意の適切なリンカー配列を使用して連結することができる。例示的なリンカー配列に関しては、例えば、米国特許第６，４７９，６２６号；同第６，９０３，１８５号；および同第７，１５３，９４９号ならびに米国特許出願公開第２０１７／０２１８３４９号を参照されたい。本明細書に記載のタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間の適切なリンカーの任意の組合せを含み得る。米国特許第８，７７２，４５３号も参照されたい。
【０１４９】
したがって、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮおよび／またはメガヌクレアーゼなどのヌクレアーゼは、任意のＤＮＡ結合性ドメインおよび任意のヌクレアーゼ（切断）ドメイン（切断ドメイン、切断ハーフドメイン）を含み得る。上記の通り、切断ドメインは、ＤＮＡ結合性ドメイン、例えば、ジンクフィンガーまたはＴＡＬ−エフェクターＤＮＡ結合性ドメインおよびヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼＤＮＡ結合性ドメイン由来の切断ドメインおよび異なるヌクレアーゼ由来の切断ドメインに対して異種性であり得る。異種性切断ドメインは、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインが由来し得る例示的なエンドヌクレアーゼとしては、これらに限定されないが、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられる。例えば、２００２〜２００３年カタログ、New  England  Biolabs、Beverly、MA；およびBelfortら（１９９７年）、Nucleic  Acids  Res.、２５巻：３３７９〜３３８８頁を参照されたい。ＤＮＡを切断する追加的な酵素が公知である（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ；リョクトウヌクレアーゼ；膵臓ＤＮａｓｅ  Ｉ；小球菌ヌクレアーゼ；酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ；Linnら（編）Nucleases、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、１９９３年も参照されたい）。これらの酵素（またはその機能性断片）の１つまたは複数を切断ドメインおよび切断ハーフドメインの供給源として使用することができる。
【０１５０】
同様に、切断ハーフドメインは、上記の通り、切断活性のために二量体形成を必要とする任意のヌクレアーゼまたはその一部に由来し得る。一般に、融合タンパク質が切断ハーフドメインを含む場合、切断には２つの融合タンパク質が必要である。あるいは、２つの切断ハーフドメインを含む単一のタンパク質を使用することができる。２つの切断ハーフドメインが同じエンドヌクレアーゼ（またはその機能性断片）に由来してもよく、各切断ハーフドメインが異なるエンドヌクレアーゼ（またはその機能性断片）に由来してもよい。さらに、２つの融合タンパク質の標的部位は、２つの融合タンパク質のそれらのそれぞれの標的部位への結合により、切断ハーフドメインが互いに、切断ハーフドメインが例えば二量体形成によって機能性切断ドメインを形成することを可能にする空間的配向に置かれるように、互いに対して配置されることが好ましい。したがって、ある特定の実施形態では、標的部位の端付近は５〜８ヌクレオチドまたは１５〜１８ヌクレオチド隔てられている。しかし、任意の整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対が２つの標的部位間に介在してよい（例えば、２から５０ヌクレオチド対まで、またはそれよりも多く）。一般に、切断の部位は標的部位間に位置する。
【０１５１】
制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多くの種に存在し、ＤＮＡに配列特異的に結合し（認識部位において）、ＤＮＡを結合部位またはその付近で切断することができる。ある特定の制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、ＤＮＡを認識部位から出た部位で切断し、分離可能な結合および切断ドメインを有する。例えば、ＩＩＳ型酵素ＦｏｋＩは、一方の鎖上のその認識部位から９ヌクレオチド、および他方の鎖上のその認識部位から１３ヌクレオチドにおけるＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号；同第５，４３６，１５０号および同第５，４８７，９９４号；ならびにLiら（１９９２年）、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、８９巻：４２７５〜４２７９頁；Liら（１９９３年）、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、９０巻：２７６４〜２７６８頁；Kimら（１９９４年ａ）Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、９１巻：８８３〜８８７頁；Kimら（１９９４年ｂ）J.  Biol.  Chem.、２６９巻：３１，９７８〜３１，９８２頁を参照されたい。したがって、一実施形態では、融合タンパク質は、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素に由来する切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）、および工学的に操作されていてもされていなくてもよい１つまたは複数のジンクフィンガー結合性ドメインを含む。
【０１５２】
切断ドメインが結合性ドメインから分離可能である例示的なＩＩＳ型制限酵素は、ＦｏｋＩである。この特定の酵素は、二量体として活性である。Bitinaiteら（１９９８年）、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、９５巻：１０，５７０〜１０，５７５頁。したがって、本開示の目的に関しては、開示される融合タンパク質に使用されるＦｏｋＩ酵素の一部は、切断ハーフドメインと考えられる。したがって、ジンクフィンガー−ＦｏｋＩ融合物を使用した細胞の配列の標的化二本鎖切断および／または標的化置換えに関しては、それぞれがＦｏｋＩ切断ハーフドメインを含む２つの融合タンパク質を使用して、触媒として活性な切断ドメインを再構成することができる。あるいは、ジンクフィンガー結合性ドメインおよび２つのＦｏｋＩ切断ハーフドメインを含有する単一ポリペプチド分子を使用することもできる。ジンクフィンガー−ＦｏｋＩ融合物を使用した標的化切断および標的化配列変更に関するパラメーターは本開示の他の箇所に提示されている。
【０１５３】
切断ドメインまたは切断ハーフドメインは、切断活性を保持する、または多量体を形成（例えば、二量体を形成）して機能性切断ドメインを形成する能力を保持するタンパク質の任意の部分であってよい。
【０１５４】
例示的なＩＩＳ型制限酵素は、その全体が本明細書に組み込まれる国際特許公開第ＷＯ０７／０１４２７５号に記載されている。追加的な制限酵素は、分離可能な結合および切断ドメインも含有し、これらは本開示により意図されている。例えば、Robertsら（２００３年）、Nucleic  Acids  Res.、３１巻：４１８〜４２０頁を参照されたい。
【０１５５】
ある特定の実施形態では、例えば、その全ての開示全体が本明細書において参照により組み込まれる米国特許第７，９１４，７９６号；同第８，０３４，５９８号；および同第８，６２３，６１８号；ならびに米国特許出願公開第２０１１／０２０１０５５号に記載されている通り、切断ドメインはホモ二量体形成を最小限にするまたは防止する１つまたは複数の工学的に操作された切断ハーフドメイン（二量体形成ドメイン突然変異体とも称される）を含む。ＦｏｋＩの４４６位、４４７位、４７９位、４８３位、４８４位、４８６位、４８７位、４９０位、４９１位、４９６位、４９８位、４９９位、５００位、５３１位、５３４位、５３７位、および５３８位のアミノ酸残基は全てＦｏｋＩ切断ハーフドメインの二量体形成に影響を及ぼすための標的である。
【０１５６】
偏性ヘテロ二量体を形成するＦｏｋＩの例示的な工学的に操作された切断ハーフドメインとして、第１の切断ハーフドメインがＦｏｋＩの４９０位および５３８位のアミノ酸残基に突然変異を含み、第２の切断ハーフドメインがアミノ酸残基４８６および４９９に突然変異を含む対が挙げられる。
【０１５７】
したがって、一実施形態では、４９０位の突然変異によりＧｌｕ（Ｅ）がＬｙｓ（Ｋ）で置き換えられ；５３８位の突然変異によりＩｓｏ（Ｉ）がＬｙｓ（Ｋ）で置き換えられ；４８６位の突然変異によりＧｌｎ（Ｑ）がＧｌｕ（Ｅ）で置き換えられ；４９９位の突然変異によりＩｓｏ（Ｉ）がＬｙｓ（Ｋ）で置き換えられる。具体的には、本明細書に記載の工学的に操作された切断ハーフドメインを、１つの切断ハーフドメインの４９０位（Ｅ→Ｋ）および５３８位（Ｉ→Ｋ）を突然変異させて、「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」と称される工学的に操作された切断ハーフドメインを作出することによって、および別の切断ハーフドメインの４８６位（Ｑ→Ｅ）および４９９位（Ｉ→Ｌ）を突然変異させて、「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」と称される工学的に操作された切断ハーフドメインを作出することによって調製した。本明細書に記載の工学的に操作された切断ハーフドメインは、異常な切断が最小化または消失した偏性ヘテロ二量体突然変異体である。例えば、その開示全体があらゆる目的に関して参照によって組み込まれる米国特許出願公開第２００８／０１３１９６２号を参照されたい。ある特定の実施形態では、工学的に操作された切断ハーフドメインは、４８６位、４９９位および４９６位（野生型ＦｏｋＩと相対的に番号付けされた）における突然変異、例えば、４８６位の野生型Ｇｌｎ（Ｑ）残基がＧｌｕ（Ｅ）残基で置き換えられ、４９９位の野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基がＬｅｕ（Ｌ）残基で置き換えられ、４９６位の野生型Ａｓｎ（Ｎ）残基がＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）残基で置き換えられた突然変異（それぞれ「ＥＬＤ」および「ＥＬＥ」ドメインとも称される）を含む。他の実施形態では、工学的に操作された切断ハーフドメインは、４９０位、５３８位および５３７位（野生型ＦｏｋＩと相対的に番号付けされた）における突然変異、例えば、４９０位の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基がＬｙｓ（Ｋ）残基で置き換えられ、５３８位の野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基がＬｙｓ（Ｋ）残基で置き換えられ、５３７位の野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基がＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基で置き換えられた突然変異（それぞれ「ＫＫＫ」および「ＫＫＲ」ドメインとも称される）を含む。他の実施形態では、工学的に操作された切断ハーフドメインは、４９０位および５３７位（野生型ＦｏｋＩと相対的に番号付けされた）における突然変異、例えば、４９０位の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基がＬｙｓ（Ｋ）残基で置き換えられ、５３７位の野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基がＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基で置き換えられた突然変異（それぞれ「ＫＩＫ」および「ＫＩＲ」ドメインとも称される）を含む。例えば、その開示全体があらゆる目的に関して参照により組み込まれる米国特許第７，９１４，７９６号；同第８，０３４，５９８号；および同第８，６２３，６１８号を参照されたい。他の実施形態では、工学的に操作された切断ハーフドメインは、「Ｓｈａｒｋｅｙ」突然変異を含む（Guoら（２０１０年）、J.  Mol.  Biol.、４００巻（１号）：９６〜１０７頁を参照されたい）。
【０１５８】
あるいは、ヌクレアーゼを、いわゆる「分割酵素（ｓｐｌｉｔ−ｅｎｚｙｍｅ）」技術を使用し、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて核酸標的部位でアセンブルすることができる（例えば、米国特許出願公開第２００９／００６８１６４号を参照されたい）。そのような分割酵素の構成成分を別々の発現構築物上で発現させることもでき、１つのオープンリーディングフレームに連結することもでき、その場合、個々の構成成分は、例えば、自己切断性２ＡペプチドまたはＩＲＥＳ配列によって分離されている。構成成分は、個々のジンクフィンガー結合性ドメインまたはメガヌクレアーゼ核酸結合性ドメインのドメインであってよい。
【０１５９】
ヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮおよび／またはＴＡＬＥＮ）を、使用前に、例えば、米国特許第８，５６３，３１４号に記載されている通り、酵母に基づく染色体系において活性についてスクリーニングすることができる。
【０１６０】
ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含む。系のＲＮＡ構成成分をコードするＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された規則的な配置の短い回文配列リピート）遺伝子座、およびタンパク質をコードするｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子座（Jansenら（２００２年）、Mol.  Microbiol.、４３巻：１５６５〜１５７５頁；Makarovaら（２００２年）、Nucleic  Acids  Res.、３０巻：４８２〜４９６頁；Makarovaら（２００６年）、Biol.  Direct、１巻：７頁；Haftら（２００５年）、PLoS  Comput.  Biol.、１巻：ｅ６０頁）によりＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系の遺伝子配列が構成される。微生物宿主におけるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子ならびにＣＲＩＳＰＲ媒介性核酸切断の特異性をプログラミングできる非コードＲＮＡエレメントの組合せを含有する。
【０１６１】
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲは、最もよく特徴付けられた系の１つであり、標的化ＤＮＡ二本鎖切断が４つの逐次的なステップで行われる。第１に、２つの非コードＲＮＡ、プレｃｒＲＮＡアレイおよびｔｒａｃｒＲＮＡがＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される。第２に、ｔｒａｃｒＲＮＡがプレｃｒＲＮＡのリピート領域にハイブリダイズし、プレｃｒＲＮＡの、個々のスペーサー配列を含有する成熟ｃｒＲＮＡへのプロセシングを媒介する。第３に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体により、Ｃａｓ９が標的ＤＮＡにｃｒＲＮＡ上のスペーサーと標的認識のための追加的な要件であるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の隣の標的ＤＮＡ上のプロトスペーサーの間のワトソン・クリック塩基対合を介して方向付けられる。最後に、Ｃａｓ９により標的ＤＮＡの切断が媒介されて、プロトスペーサー内の二本鎖切断が創出される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の活性は、３つのステップ：（ｉ）「適応」と称されるプロセスにおいて、異質ＤＮＡ配列がＣＲＩＳＰＲアレイに挿入されて、今後の攻撃が防止されるステップと、（ｉｉ）関連するタンパク質が発現され、ならびにアレイが発現およびプロセシングされるステップと、その後の（ｉｉｉ）異質核酸によるＲＮＡ媒介性干渉ステップとで構成される。したがって、細菌細胞では、いわゆる「Ｃａｓ」タンパク質のいくつかがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の天然の機能に関与し、異質ＤＮＡなどの挿入などの機能において役割を果たす。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、機能性ヌクレアーゼ（触媒）活性を欠く「デッド（ｄｅａｄ）」または「ｄＣａｓ」である。ｄＣａｓをＦｏｋヌクレアーゼドメインと融合して、ハーフ切断ドメインとして作用する融合分子を生じさせることができる。ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮを用いる場合と同様に、この実施形態では、二量体を形成して標的ＤＮＡを切断するために２つのｄＣａｓ−Ｆｏｋパートナーが必要である。一部の実施形態では、ｄＣａｓ−Ｆｏｋパートナーの一方が野生型ＣＦＴＲ遺伝子に結合し得、他方が突然変異型ＣＦＴＲ遺伝子に結合する。一部の実施形態では、２つのｄＣＡＳ−Ｆｏｋパートナーの両方が野生型遺伝子に結合し、他の実施形態では、２つのパートナーの両方が突然変異型ＣＦＴＲ遺伝子に結合する。
【０１６２】
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系を使用する。Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｓｐｐにおいて同定されたＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系は、ヒト細胞における頑強なＤＮＡ干渉を媒介するクラス２ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系である。Ｃｐｆ１とＣａｓ９は、機能的に保存されているが、それらのガイドＲＮＡおよび基質特異性を含めた多くの側面が異なる（Fagerlundら（２０１５年）、Genom  Bio、１６巻：２５１頁を参照されたい）。Ｃａｓ９タンパク質とＣｐｆ１タンパク質の主要な差異は、Ｃｐｆ１はｔｒａｃｒＲＮＡを利用せず、したがって、ｃｒＲＮＡのみが必要であることである。ＦｎＣｐｆ１  ｃｒＲＮＡは、４２〜４４ヌクレオチド長（１９ヌクレオチドのリピートおよび２３〜２５ヌクレオチドのスペーサー）であり、二次構造を保持する配列の変化を許容する単一のステムループを含有する。さらに、Ｃｐｆ１  ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ９では必要とされる約１００ヌクレオチドの工学的に操作されたｓｇＲＮＡよりも有意に短く、ＦｎＣｐｆ１に対するＰＡＭ要件は、入れ替えられる鎖上の５’−ＴＴＮ−３’および５’−ＣＴＡ−３’である。Ｃａｓ９およびＣｐｆ１はどちらも標的ＤＮＡに二本鎖切断を生じさせるが、Ｃａｓ９では、そのＲｕｖＣ様ドメインおよびＨＮＨ様ドメインを使用してガイドＲＮＡのシード配列内に平滑末端カットを生じさせるが、Ｃｐｆ１では、ＲｕｖＣ様ドメインを使用してシードの外側に付着型カットを生じさせる。Ｃｐｆ１は付着型カットを重要なシード領域から離れて生じさせるので、ＮＨＥＪにより標的部位は破壊されず、したがって、Ｃｐｆ１が所望のＨＤＲ組換え事象が起こるまで同じ部位をカットし続けられることが確実になる。したがって、本明細書に記載の方法および組成物では、「Ｃａｓ」という用語は、Ｃａｓ９およびＣｆｐ１タンパク質の両方を含むことが理解される。したがって、本明細書で使用される場合、「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系」は、ヌクレアーゼおよび／または転写因子系の両方を含め、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓおよび／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｆｐ１系の両方を指す。
【０１６３】
ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、天然に存在するＣａｓタンパク質の「機能性誘導体」であり得る。ネイティブな配列のポリペプチドの「機能性誘導体」は、ネイティブな配列のポリペプチドと共通する定性的な生物学的性質を有する化合物である。「機能性誘導体」は、これらに限定されないが、ネイティブな配列の断片、ならびに、対応するネイティブな配列のポリペプチドと共通する生物活性を有するのであれば、ネイティブな配列のポリペプチドの誘導体およびその断片を含む。本明細書において意図されている生物活性は、機能性誘導体のＤＮＡ基質を断片に加水分解する能力である。「誘導体」という用語は、ポリペプチドのアミノ酸配列バリアント、共有結合性の修飾物の両方、およびその融合物を包含する。Ｃａｓポリペプチドの適切な誘導体またはその断片としては、これらに限定されないが、Ｃａｓタンパク質の突然変異体、融合物、共有結合性の修飾物またはその断片が挙げられる。Ｃａｓタンパク質またはその断片、ならびにＣａｓタンパク質の誘導体またはその断片を含むＣａｓタンパク質は、細胞から入手可能であるか、または化学的に合成することができるか、またはこれらの２つの手順の組合せによって入手可能である。細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然に産生する細胞であってもよく、あるいはＣａｓタンパク質を天然に産生し、内因性Ｃａｓタンパク質をより高い発現レベルで産生するように、または、内因性Ｃａｓと同じもしくは異なるＣａｓをコードする外因的に導入された核酸からＣａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作された細胞であってもよい。一部の場合では、細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然には産生せず、Ｃａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作される。
【０１６４】
一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、自己不活化性である（EpsteinおよびSchaffer（２０１６年）、ASGCT  poster  abstract、１１９巻（２０１６年）、Mol  Ther、２４巻（補遺１）：Ｓ１〜Ｓ３０４頁を参照されたい）。この系は、標的配列およびＣａｓ発現構築物を挟む配列の両方を認識することができるｓｇＲＮＡを使用し、したがって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系により標的およびそれ自体の発現系の両方が切断され、それにより、その発現が限定されるように設計される。
【０１６５】
ヌクレアーゼ（単数または複数）により、標的部位内に１つまたは複数の二本鎖および／または一本鎖カットを生じさせることができる。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、触媒として不活性な切断ドメイン（例えば、ＦｏｋＩおよび／またはＣａｓタンパク質）を含む。例えば、米国特許第９，２００，２６６号および同第８，７０３，４８９号ならびにGuillingerら（２０１４年）、Nature  Biotech.、３２巻（６号）：５７７〜５８２頁を参照されたい。触媒として不活性な切断ドメインは、触媒として活性なドメインと組み合わせることで、一本鎖カットを生じさせるニッカーゼとして作用し得る。したがって、２つのニッカーゼを組み合わせて使用して、特定の領域内に二本鎖カットを生じさせることができる。追加的なニッカーゼも当技術分野で公知である、例えば、McCafferyら（２０１６年）、Nucleic  Acids  Res.、４４巻（２号）：ｅ１１頁、doi:10.1093/nar/gkv878.  Epub、２０１５年１０月１９日。
ドナー
【０１６６】
上記の通り、ＣＦＴＲ遺伝子の変更は、例えば突然変異型遺伝子を矯正するための外因性配列（「ドナー配列」または「ドナー」とも称される）の挿入、機能性ＣＦＴＲタンパク質をコードする導入遺伝子、矯正用ドナー（例えば、オリゴ）または野生型遺伝子の突然変異（例えば、ＣＦ疾患モデルを創出するため）の挿入を含み得る。ドナー配列は一般には当該ドナー配列により置き換えられるゲノム配列と同一でないことは容易に明らかになろう。例えば、ドナーポリヌクレオチドの配列は、染色体配列との十分な相同性が存在する限りは、ゲノム配列に対して１つまたは複数の一塩基変化、挿入、欠失、反転または再構成を含み得る。あるいは、ドナー配列は、相同な２つの領域に挟まれた非相同配列を含み得る。ある特定の実施形態では、相同な領域のそれぞれは、切断部位の周囲（例えば、ＣＦＴＲの標的化イントロン内）のＣＦＴＲ遺伝子に対して少なくとも約５０〜３５０ヌクレオチド（またはその間の任意の値）の相同性を含む。ある特定の実施形態では、相同アームはそれぞれ２５０ｂｐであり、この短い長さにより機能性の治療的ＣＦＴＲをコードするＣＦＴＲ遺伝子のエクソン７〜２７を含むＣＦＴＲ導入遺伝子などの大きな導入遺伝子を含めることが有利に可能になる（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ＃１０８０）。例示的なドナーを図５に示し、実施例に記載する。
【０１６７】
さらに、ドナー配列は、細胞クロマチン内の目的の領域と相同でない配列を含有するベクター分子を含み得る。ドナー分子は、細胞クロマチンと相同である非連続的な領域をいくつか含有し得る。例えば、目的の領域内に通常存在しない配列の標的化挿入のために、前記配列はドナー核酸分子内に存在し、目的の領域内の配列と相同な領域に挟まれていてもよい。
【０１６８】
ドナーポリヌクレオチドはＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、直鎖状または環状の形態で細胞に導入することができる。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，２５５，２５９号；同第８，７０３，４８９号；および同第７，８８８，１２１号ならびに米国特許出願公開第２００９／０２６３９００号を参照されたい。直鎖状の形態で導入する場合、当業者に公知の方法によってドナー配列の末端を保護することができる（例えば、エキソヌクレアーゼによる分解から）。例えば、１つまたは複数のジデオキシヌクレオチド残基を直鎖状分子の３’末端に付加し、かつ／または、自己相補的オリゴヌクレオチドを一方または両方の末端にライゲーションする。例えば、Changら（１９８７年）、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、８４巻：４９５９〜４９６３頁；Nehlsら（１９９６年）、Science、２７２巻：８８６〜８８９頁を参照されたい。外因性ポリヌクレオチドを分解から保護するための追加的な方法としては、これらに限定されないが、末端アミノ基（単数または複数）の付加、ならびに、例えばホスホロチオエート、ホスホラミデート、およびＯ−メチルリボースまたはデオキシリボース残基などの修飾されたヌクレオチド間連結の使用が挙げられる。
【０１６９】
ポリヌクレオチドは、例えば、複製開始点、プロモーターおよび抗生物質耐性をコードする遺伝子などの追加的な配列を有するベクター分子の一部として細胞に導入することができる。さらに、ドナーポリヌクレオチドは、ネイキッド核酸として、リポソームまたはポロキサマーなどの作用物質と複合体を形成した核酸として導入することもでき、ウイルス（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルスおよびインテグラーゼ欠陥レンチウイルス（ＩＤＬＶ））によって送達することもできる。
【０１７０】
ドナーは、一般に、その発現が組込み部位の内因性プロモーター、すなわち、ＣＦＴＲ遺伝子の発現を駆動するプロモーターによって駆動されるように挿入する。しかし、ドナーは、プロモーターおよび／またはエンハンサー、例えば、構成的プロモーターまたは誘導性もしくは組織特異的プロモーターを含み得ることが明らかになろう。
【０１７１】
さらに、発現に必要ではないが、外因性配列は、転写または翻訳制御配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、インスレーター、配列内リボソーム進入部位、２Ａペプチドおよび／またはポリアデニル化シグナルをコードする配列であってもよい。
送達
【０１７２】
タンパク質（例えば、ヌクレアーゼおよび／もしくは転写因子）、ポリヌクレオチドならびに／または本明細書に記載のタンパク質および／もしくはポリヌクレオチドを含む組成物は、例えば、タンパク質および／またはポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）構成成分の投与によるものを含めた任意の適切な手段によって標的細胞に送達することができる。
【０１７３】
適切な細胞としては、これらに限定されないが、真核細胞および／または細胞株ならびに原核細胞および／または細胞株が挙げられる。そのような細胞から生成されるそのような細胞または細胞株の非限定的な例としては、肺細胞、Ｔ細胞、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３−Ｆ、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ）、およびｐｅｒＣ６細胞ならびにＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ）などの昆虫細胞、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、ＰｉｃｈｉａおよびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓなどの真菌細胞が挙げられる。ある特定の実施形態では、細胞株は、ＣＨＯ−Ｋ１、ＭＤＣＫまたはＨＥＫ２９３細胞株である。適切な細胞としては、例として、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、造血幹細胞、神経幹細胞、間葉系幹細胞およびバルジ幹細胞などの幹細胞も挙げられる。
【０１７４】
本明細書に記載のＤＮＡ結合性ドメインを含むタンパク質を送達する方法は、例えば、その全ての開示全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，４５３，２４２号；同第６，５０３，７１７号；同第６，５３４，２６１号；同第６，５９９，６９２号；同第６，６０７，８８２号；同第６，６８９，５５８号；同第６，８２４，９７８号；同第６，９３３，１１３号；同第６，９７９，５３９号；同第７，０１３，２１９号；および同第７，１６３，８２４号に記載されている。
【０１７５】
本明細書に記載のＤＮＡ結合性ドメインおよびこれらのＤＮＡ結合性ドメインを含む融合タンパク質は、ＤＮＡ結合性タンパク質の１つまたは複数をコードする配列を含有するベクターを使用して送達することもできる。さらに、追加的な核酸（例えば、ドナー）もこれらのベクターによって送達することができる。これらに限定されないが、プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター；ヘルペスウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターなどを含めた任意のベクター系を使用することができる。参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，５３４，２６１号；同第６，６０７，８８２号；同第６，８２４，９７８号；同第６，９３３，１１３号；同第６，９７９，５３９号；同第７，０１３，２１９号；および同第７，１６３，８２４号も参照されたい。さらに、これらのベクターはいずれも、１つもしくは複数のＤＮＡ結合性タンパク質をコードする配列および／または必要に応じて追加的な核酸を含み得ることが明らかになろう。したがって、本明細書に記載の１つまたは複数のＤＮＡ結合性タンパク質、および必要に応じて追加的なＤＮＡを細胞に導入する場合、これらを同じベクターで運ぶこともでき、異なるベクターで運ぶこともできる。多数のベクターを使用する場合、各ベクターが、１つまたは多数のＤＮＡ結合性タンパク質および所望の追加的な核酸をコードする配列を含んでよい。
【０１７６】
工学的に操作されたＤＮＡ結合性タンパク質をコードする核酸を細胞（例えば、哺乳動物細胞）および標的組織に導入するため、ならびに所望の追加的なヌクレオチド配列を共導入するために、従来のウイルスに基づく遺伝子移入法およびウイルスに基づくものではない遺伝子移入法を使用することができる。そのような方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて細胞に核酸（例えば、ＤＮＡ結合性タンパク質および／またはドナーをコードする）を投与するために使用することもできる。ある特定の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにおける遺伝子治療への使用のために核酸を投与する。非ウイルスベクター送達系としては、ＤＮＡプラスミド、ネイキッド核酸、およびリポソームまたはポロキサマーなどの送達ビヒクルと複合体を形成した核酸が挙げられる。ウイルスベクター送達系としては、エピソーム性または細胞への送達後に組み込まれるゲノムのいずれかを有するＤＮＡおよびＲＮＡウイルスが挙げられる。遺伝子治療手順の概説については、Anderson（１９９２年）、Science、２５６巻：８０８〜８１３頁；NabelおよびFelgner（１９９３年）、TIBTECH、１１巻：２１１〜２１７頁；MitaniおよびCaskey（１９９３年）、TIBTECH、１１巻：１６２〜１６６頁；Dillon（１９９３年）、TIBTECH、１１巻：１６７〜１７５頁；Miller（１９９２年）、Nature、３５７巻：４５５〜４６０頁；Van  Brunt（１９８８年）、Biotechnology、６巻（１０号）：１１４９〜１１５４頁；Vigne（１９９５年）、Restorative  Neurology  and  Neuroscience、８巻：３５〜３６頁；KremerおよびPerricaudet（１９９５年）、British  Medical  Bulletin、５１巻（１号）：３１〜４４頁；Haddadaら、Current  Topics  in  Microbiology  and  Immunology、DoerflerおよびBohm（編）（１９９５年）；ならびにYuら（１９９４年）、Gene  Therapy、１巻：１３〜２６頁を参照されたい。
【０１７７】
核酸の非ウイルス性送達の方法としては、エレクトロポレーション、リポフェクション、微量注射、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、ｍＲＮＡ、人工ビリオン、および作用物質により増強されるＤＮＡの取り込みが挙げられる。例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ  ２０００  ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｉｃｈ−Ｍａｒ）を使用したソノポレーションを核酸の送達のために使用することもできる。好ましい実施形態では、１つまたは複数の核酸をｍＲＮＡとして送達する。翻訳効率および／またはｍＲＮＡ安定性を増大させるために、キャップ形成されたｍＲＮＡを使用することも好ましい。ＡＲＣＡ（抗逆方向キャップ類似体（ａｎｔｉ−ｒｅｖｅｒｓｅ  ｃａｐ  ａｎａｌｏｇ））キャップまたはそのバリアントが特に好ましい。参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，０７４，５９６号および同第８，１５３，７７３号を参照されたい。
【０１７８】
追加的な例示的な核酸送達系としては、Ａｍａｘａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｌｏｇｎｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）、ＢＴＸ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ）およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｉｎｃにより提供されるものが挙げられる（例えば、米国特許第６，００８，３３６号を参照されたい）。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号；同第４，９４６，７８７号；および同第４，８９７，３５５号に記載されており、リポフェクション試薬は商業的に販売されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）、およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ）。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適したカチオン性および中性脂質としては、Ｆｅｌｇｎｅｒ、国際特許公開第ＷＯ９１／１７４２４号および同第ＷＯ９１／１６０２４号のものが挙げられる。送達は、細胞への送達（ｅｘ  ｖｉｖｏ投与）または標的組織への送達（ｉｎ  ｖｉｖｏ投与）であり得る。
【０１７９】
免疫脂質複合体などの標的化リポソームを含めた脂質：核酸複合体の調製は当業者に周知である（例えば、Crystal（１９９５年）、Science、２７０巻：４０４〜４１０頁；Blaeseら（１９９５年）、Cancer  Gene  Ther.、２巻：２９１〜２９７頁；Behrら（１９９４年）、Bioconjugate  Chem.、５巻：３８２〜３８９頁；Remyら（１９９４年）、Bioconjugate  Chem.、５巻：６４７〜６５４頁；Gaoら（１９９５年）、Gene  Therapy、２巻：７１０〜７２２頁；Ahmadら（１９９２年）、Cancer  Res.、５２巻：４８１７〜４８２０頁；米国特許第４，１８６，１８３号；同第４，２１７，３４４号；同第４，２３５，８７１号；同第４，２６１，９７５号；同第４，４８５，０５４号；同第４，５０１，７２８号；同第４，７７４，０８５号；同第４，８３７，０２８号；および同第４，９４６，７８７号を参照されたい）。
【０１８０】
追加的な送達方法としては、送達される核酸のＥｎＧｅｎｅＩＣ送達ビヒクル（ＥＤＶ）へのパッケージングの使用が挙げられる。これらのＥＤＶは、抗体の一方のアームが標的組織に対する特異性を有し、他方のアームがＥＤＶに対する特異性を有する二重特異性抗体を使用して標的組織に特異的に送達される。抗体によりＥＤＶが標的細胞表面に運ばれ、次いで、ＥＤＶがエンドサイトーシスによって細胞内に運ばれる。細胞内に入ったら、内容物が放出される（MacDiarmidら（２００９年）、Nature  Biotechnology、２７巻（７号）：６４３頁を参照されたい）。
【０１８１】
工学的に操作されたＤＮＡ結合性タンパク質をコードする核酸、および／または所望のドナー（例えば、ＣＡＲまたはＡＣＴＲ）を送達するための、ＲＮＡまたはＤＮＡウイルスに基づく系の使用では、体内の特定の細胞にウイルスをターゲティングし、ウイルスペイロードを核に輸送するための高度に進化したプロセスを利用する。ウイルスベクターを患者に直接投与することもでき（ｉｎ  ｖｉｖｏ）、ウイルスベクターを使用して細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで処理することができ、改変された細胞を患者に投与する（ｅｘ  ｖｉｖｏ）。核酸を送達するための従来のウイルスに基づく系としては、これらに限定されないが、遺伝子移入のためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴、ワクシニアおよび単純ヘルペスウイルスベクターが挙げられる。宿主ゲノムへの組込みは、レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ随伴ウイルスによる遺伝子移入法を用いて可能であり、多くの場合、挿入された導入遺伝子の長期発現がもたらされる。さらに、多くの異なる細胞型および標的組織において高い形質導入効率が観察されている。
【０１８２】
レトロウイルスのトロピズムは、外来エンベロープタンパク質を組み入れ、標的細胞の潜在的な標的集団を拡大することによって変更することができる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞に形質導入または感染することができ、一般には高ウイルス力価を生じさせるレトロウイルスベクターである。レトロウイルスによる遺伝子移入系の選択は標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、最大で６〜１０ｋｂの外来配列のパッケージング能力を有するシス作用性の長い末端反復で構成される。最小のシス作用性ＬＴＲがベクターの複製およびパッケージングに十分であり、次いで、これらを、治療用遺伝子を標的細胞に組み込んで恒久的な導入遺伝子発現をもたらすために使用する。広く使用されているレトロウイルスベクターとしては、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に基づくもの、およびこれらの組合せが挙げられる（例えば、Buchscherら（１９９２年）、J.  Virol.、６６巻：２７３１〜２７３９頁；Johannら（１９９２年）、J.  Virol.、６６巻：１６３５〜１６４０頁；Sommerfeltら（１９９０年）、Virol.、１７６巻：５８〜５９頁；Wilsonら（１９８９年）、J.  Virol.、６３巻：２３７４〜２３７８頁；Millerら（１９９１年）、J.  Virol.、６５巻：２２２０〜２２２４頁を参照されたい）。
【０１８３】
一過性発現が好ましい適用では、アデノウイルスに基づく系を使用することができる。アデノウイルスに基づくベクターでは、多くの細胞型において非常に高い形質導入効率が可能であり、また、細胞分裂が必要ない。そのようなベクターを用いて、高力価および高レベルの発現が得られている。このベクターは、比較的単純な系で多量に作出することができる。また、例えば、核酸およびペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける産生において、ならびにｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏにおける遺伝子治療手順のためにアデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターを使用して細胞に標的核酸を形質導入する（例えば、Westら（１９８７年）、Virology、１６０巻：３８〜４７頁；米国特許第４，７９７，３６８号；国際特許公開第ＷＯ９３／２４６４１号；Kotin（１９９４年）、Human  Gene  Therapy、５巻：７９３〜８０１頁；Muzyczka（１９９４年）、J.  Clin.  Invest.、９４巻：１３５１頁を参照されたい）。組換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号；Tratschinら（１９８５年）、Mol.  Cell.  Biol.、５巻：３２５１〜３２６０頁；Tratschinら（１９８４年）、Mol.  Cell.  Biol.、４巻：２０７２〜２０８１頁；HermonatおよびMuzyczka（１９８４年）、PNAS  USA、８１巻：６４６６〜６４７０頁；およびSamulskiら（１９８９年）、J.  Virol.、６３巻：０３８２２〜３８２８頁を含めたいくつかの刊行物に記載されている。
【０１８４】
少なくとも６つのウイルスベクター手法が臨床試験における遺伝子移入のために現在利用可能であり、これらは、欠陥ベクターを、ヘルパー細胞株に挿入された遺伝子によって補完して形質導入剤を生成することを伴う手法を利用する。
【０１８５】
ｐＬＡＳＮおよびＭＦＧ−Ｓは、臨床試験において使用されているレトロウイルスベクターの例である（Dunbarら（１９９５年）、Blood、８５巻：３０４８〜３０５頁；Kohnら（１９９５年）、Nat.  Med.、１巻：１０１７〜１０２頁；Malechら（１９９７年）、PNAS  USA、９４巻：２２号、１２１３３〜１２１３８頁）。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子治療試験において使用された最初の治療用ベクターであった（Blaeseら（１９９５年）、Science、２７０巻：４７５〜４８０頁）。ＭＦＧ−Ｓパッケージングベクターに関して５０％またはそれよりも高い形質導入効率が観察されている（Ellemら（１９９７年）、Immunol  Immunother.、４４巻（１号）：１０〜２０頁；Dranoffら（１９９７年）、Hum.  Gene  Ther.、１巻：１１１〜２頁。
【０１８６】
組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、欠陥および非病原性パルボウイルスアデノ随伴２型ウイルスに基づく有望な代替遺伝子送達系である。ベクターは全て、導入遺伝子発現カセットを挟むＡＡＶ  １４５ｂｐ末端逆位配列のみを保持するプラスミドに由来する。形質導入された細胞のゲノムへの組込みに起因する効率的な遺伝子移入および安定な導入遺伝子送達がこのベクター系の重要な特徴である（Wagnerら（１９９８年）、Lancet、３５１巻（９１１７号）：１７０２〜３頁；Kearnsら（１９９６年）、Gene  Ther.、９巻：７４８〜５５頁）。ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ９およびＡＡＶｒｈ１０を含めた他のＡＡＶ血清型ならびにＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５およびＡＡＶ２／６などのシュードタイピングされたＡＡＶを本発明に従って使用することもできる。肺を優先的に標的とするＡＡＶベクターを本明細書に記載のｉｎ  ｖｉｖｏにおける使用（ＣＦの処置）のために利用することができる。
【０１８７】
複製欠損性組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）は、高力価で作出することができ、いくつかの異なる細胞型に容易に感染する。大多数のアデノウイルスベクターは、導入遺伝子によりＡｄ  Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、および／またはＥ３遺伝子が置き換えられるように工学的に操作される；その後、複製欠陥性ベクターを、欠失した遺伝子機能をトランスで供給するヒト２９３細胞において繁殖させる。Ａｄベクターにより、肝臓、腎臓および筋肉において見いだされるものなどの非分裂性の分化細胞を含めた多数の型の組織にｉｎ  ｖｉｖｏにおいて形質導入することができる。従来のＡｄベクターは、大きな運搬容量を有する。臨床試験におけるＡｄベクターの使用の例では、筋肉内注射を用いた抗腫瘍免疫のためのポリヌクレオチド治療が伴った（Stermanら（１９９８年）、Hum.  Gene  Ther.、７巻：１０８３〜９頁）。臨床試験における遺伝子移入のためのアデノウイルスベクターの使用のさらなる例としては、Roseneckerら（１９９６年）、Infection、２４巻（１号）：５〜１０頁；Stermanら（１９９８年）、Hum.  Gene  Ther.、９巻（７号）：１０８３〜１０８９頁；Welshら（１９９５年）、Hum.  Gene  Ther.、２巻：２０５〜１８頁；Alvarezら（１９９７年）、Hum.  Gene  Ther.、５巻：５９７〜６１３頁；Topfら（１９９８年）、Gene  Ther.、５巻：５０７〜５１３頁；Stermanら（１９９８年）、Hum.  Gene  Ther.、７巻：１０８３〜１０８９頁が挙げられる。
【０１８８】
宿主細胞に感染することができるウイルス粒子を形成するためにパッケージング細胞を使用する。そのような細胞としては、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージングするψ２細胞またはＰＡ３１７細胞が挙げられる。遺伝子治療に使用されるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子中にパッケージングする産生細胞株によって生成される。ベクターは、一般には、パッケージングおよびその後の宿主への組込み（該当する場合）に必要な最小限のウイルス配列を含有し、他のウイルス配列は発現させるタンパク質をコードする発現カセットで置き換える。欠如したウイルスの機能はパッケージング細胞株によってトランスに供給される。例えば、遺伝子治療において使用されるＡＡＶベクターは、一般には、パッケージングおよび宿主ゲノムへの組込みに必要なＡＡＶゲノム由来の末端逆位配列（ＩＴＲ）配列のみを有する。ウイルスＤＮＡを、他のＡＡＶ遺伝子、すなわち、ｒｅｐおよびキャップをコードするヘルパープラスミドを含有するがＩＴＲ配列を欠く細胞株にパッケージングにする。細胞株にヘルパーとしてアデノウイルスも感染させる。ヘルパーウイルスにより、ＡＡＶベクターの複製およびヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現が促進される。ヘルパープラスミドはＩＴＲ配列を欠くので有意な量ではパッケージングされない。アデノウイルスのコンタミネーションは、例えば、アデノウイルスの感受性がＡＡＶよりも高い加熱処理によって低減することができる。
【０１８９】
多くの遺伝子治療の適用では、遺伝子治療ベクターが高い程度の特異性で特定の組織型に送達されることが望ましい。したがって、ウイルスベクターを、リガンドをウイルスの外表面上のウイルスコートタンパク質との融合タンパク質として発現させることにより、所与の細胞型に対する特異性を有するように改変することができる。リガンドは、目的の細胞型に存在することが公知の受容体に対する親和性を有するように選択される。例えば、Hanら（１９９５年）、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、９２巻：９７４７〜９７５１頁では、モロニーマウス白血病ウイルスを、ｇｐ７０と融合したヒトヘレグリンを発現するように改変することができ、組換えウイルスが、ヒト上皮増殖因子受容体を発現するある特定のヒト乳がん細胞に感染することが報告されている。この原理を、標的細胞が受容体を発現し、ウイルスが細胞表面受容体のリガンドを含む融合タンパク質を発現する他のウイルス−標的細胞対に拡張することができる。例えば、繊維状ファージを、事実上任意の選択された細胞受容体に対する特異的な結合親和性を有する抗体断片（例えば、ＦＡＢまたはＦｖ）をディスプレイするように工学的に操作することができる。上記の説明は主にウイルスベクターに当てはまるが、同じ原理を非ウイルスベクターに適用することができる。そのようなベクターを、特定の標的細胞による取り込みに有利な特定の取り込み配列を含有するように工学的に操作することができる。
【０１９０】
遺伝子治療ベクターは、個々の患者に、下記の通り、一般には全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、もしくは頭蓋内注入）または局所的適用によって投与することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏで送達することができる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載のタンパク質および／またはポリヌクレオチドを皮膚への局所的送達用の医薬組成物として製剤化する。ｉｎ  ｖｉｖｏ投与（例えば、局所的）のために、これらに限定されないが、１回限りの投与、毎日、１日２回、２日に１回、毎週などを含めた任意のレジームを使用することができる。
【０１９１】
あるいは、ベクターは、例えば、個々の患者から外植された細胞（例えば、リンパ球、骨髄穿刺液、組織生検材料、皮膚グラフト）または普遍的なドナー造血幹細胞などの細胞にｅｘ  ｖｉｖｏで送達することができ、その後、通常はベクターが組み入れられた細胞を選択した後、細胞を患者に再度埋め込む。ｅｘ  ｖｉｖｏ投与（例えば、皮膚グラフト）のために、任意のレジーム、例えば、１回限りのグラフトまたはそのようなグラフトの任意の多数回投与を使用することができる。
【０１９２】
診断、研究、移植のため、または遺伝子治療（例えば、トランスフェクトされた細胞の宿主生物体への再注入による）のためのｅｘ  ｖｉｖｏ細胞トランスフェクションは当業者に周知である。好ましい実施形態では、細胞を対象の生物体から単離し、ＤＮＡ結合性タンパク質の核酸（遺伝子またはｃＤＮＡ）をトランスフェクトし、対象の生物体（例えば、患者）に再注入する。ｅｘ  ｖｉｖｏトランスフェクションに適した種々の細胞型が当業者に周知である（例えば、Freshneyら、Culture  of  Animal  Cells、A  Manual  of  Basic  Technique（第３版、１９９４年））およびどのように細胞を患者から単離し、培養するかの考察に関してそこで引用されている参考文献を参照されたい）。
【０１９３】
一実施形態では、細胞トランスフェクションおよび遺伝子治療のためのｅｘ  ｖｉｖｏ手順に幹細胞を使用する。幹細胞を使用することの利点は、幹細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて他の細胞型に分化させることもでき、哺乳動物（例えば、細胞のドナー）に導入することもでき、そこで幹細胞が例えば骨髄または皮膚に生着することである。ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αなどのサイトカインを使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＣＤ３４＋細胞を臨床的に重要な免疫細胞型に分化させるための方法が公知である（Inabaら（１９９２年）、J.  Exp.  Med.、１７６巻：１６９３〜１７０２頁を参照されたい）。
【０１９４】
公知の方法を使用して幹細胞を形質導入および分化のために単離する。例えば、骨髄細胞をＣＤ４＋およびＣＤ８＋（Ｔ細胞）、ＣＤ４５＋（ｐａｎＢ細胞）、ＧＲ−１（顆粒球）、およびＩａｄ（分化した抗原提示細胞）などの望ましくない細胞に結合する抗体でパニングすることによって骨髄細胞から幹細胞を単離する（Inabaら（１９９２年）、J.  Exp.  Med.、１７６巻：１６９３〜１７０２頁を参照されたい）。
【０１９５】
一部の実施形態では、改変された幹細胞を使用することもできる。例えば、アポトーシスに対して抵抗性にした皮膚幹細胞であって、例えば、幹細胞においてＢＡＸ特異的ＺＦＮまたはＢＡＫ特異的ＺＦＮを使用してＢＡＸおよび／またはＢＡＫをノックアウトすることによってアポトーシスに対する抵抗性を誘導する改変も含有する幹細胞（米国特許第８，５９７，９１２号を参照されたい）、または例えばカスパーゼ−６特異的ＺＦＮを再度使用してカスパーゼを破壊した皮膚幹細胞を治療用組成物として使用することができる。
【０１９６】
治療用ＤＮＡ結合性タンパク質（またはこれらのタンパク質をコードする核酸）を含有するベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソームなど）をｉｎ  ｖｉｖｏにおける細胞の形質導入のために生物体に直接投与することもできる。あるいは、ネイキッドＤＮＡを投与することができる。投与は、これらに限定されないが、注射、注入、局所的適用およびエレクトロポレーションを含めた、分子を導入し、最終的に血液または組織細胞と接触させるために通常使用される経路のいずれかによるものである。送達を増大させるために種々の投与方法と併せて加熱を使用することができる。好ましい実施形態では、処置部位（例えば、頭皮）への直接の局所的投与を実施する。本明細書に記載のそのような核酸、タンパク質および細胞を投与する（例えば、局所的適用によって）適切な方法が利用可能であり、当業者に周知であり、また、特定の組成物を投与するために１つよりも多くの経路を使用することができるが、多くの場合、特定の経路により、別の経路よりも早急かつ有効な反応がもたらされ得る。ＣＦの場合では、肺への吸入形式による送達が好ましい可能性がある（AgentおよびParrott（２０１５年）、Breathe（Sheff）、１１巻（２号）：１１０〜８頁）。
【０１９７】
ＤＮＡを造血幹細胞に導入するための方法は、例えば、米国特許第５，９２８，６３８号において開示されている。導入遺伝子を造血幹細胞、例えば、ＣＤ３４＋細胞に導入するのに有用なベクターは、アデノウイルス３５型を含む。
【０１９８】
導入遺伝子を免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）に導入するのに適したベクターとしては、非組込み型レンチウイルスベクターが挙げられる。例えば、Oryら（１９９６年）、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、９３巻：１１３８２〜１１３８８頁；Dullら（１９９８年）、J.  Virol.、７２巻：８４６３〜８４７１頁；Zufferyら（１９９８年）、J.  Virol.、７２巻：９８７３〜９８８０頁；Follenziら（２０００年）、Nature  Genetics、２５巻：２１７〜２２２頁を参照されたい。
【０１９９】
一部の実施形態では、治療用ＤＮＡ結合性タンパク質をポリペプチドとして送達することができる。一部の例では、治療用ＤＮＡ結合性タンパク質をアニオン性核酸と複合体を形成したポリペプチドとして送達することができる。一部の態様では、核酸が結合したタンパク質または核酸が結合していないタンパク質を、カチオン性脂質トランスフェクション試薬を使用して送達する（Zurisら（２０１５年）、Nat  Biotechnol、３３巻：７３〜８０頁）。
【０２００】
薬学的に許容される担体は、投与される特定の組成物によって、ならびに組成物の投与に使用される特定の方法によって一部決定される。ある特定の実施形態では、局所的投与のための薬学的に許容される担体を使用する。したがって、下記の通り、利用可能な多種多様な適切な医薬組成物の製剤が存在する（例えば、Remington's  Pharmaceutical  Sciences、第１７版、１９８９年を参照されたい）。
【０２０１】
上記の通り、開示された方法および組成物は、これらに限定されないが、原核細胞、真菌細胞、古細菌の細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞、脊椎動物細胞、哺乳動物細胞ならびに任意の型のＴ細胞および幹細胞を含めたヒト細胞を含めた任意の細胞型において使用することができる。タンパク質発現のための適切な細胞株は、当業者に公知であり、それらとして、これらに限定されないが、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３−Ｆ、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ）、ｐｅｒＣ６、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ）などの昆虫細胞、ならびにＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、ＰｉｃｈｉａおよびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓなどの真菌細胞が挙げられる。これらの細胞株の後代、バリアントおよび誘導体を使用することもできる。
【０２０２】
コロイドナノ構造脂質担体（ＮＬＣ）は、固体脂質および液体脂質からなる比較的新型のコロイド薬物送達システムであり、固体脂質ナノ粒子と比較した薬物負荷能および放出性の改善という利点をもたらす。現在、毛嚢脂腺構造に関連する種々の障害（ざ瘡、脱毛症、および他の脂腺機能障害）を処置するための、ナノコロイド脂質に基づく送達系を使用した薬物の小胞による送達への関心が高まっている。薬物の小胞によるターゲティングにより、薬物用量が低減するとともに経口薬物投与に付随する潜在的な全身毒性が低減するという利点がもたらされる。例えば、アンドロゲン性脱毛症のモデルにおいてマウスにおいてスピロノラクトンの小胞による標的化送達を実施するためにＮＬＣが使用されている（ShammaおよびAburhama（２０１４年）、Int.  J  Nanomed、９巻：５４４９〜５４６０頁）。さらに、局所的適用によっておよび皮内注射によって送達された核酸により、マウスにおけるアルビノ突然変異の遺伝子型および表現型の矯正がもたらされた（Alexeevら（２０００年）、Nat  Biotechnol、１９巻：４３頁）。小胞による送達の別の方法は、小胞への送達のためのマイクロニードルの使用、およびまた治療用化合物のナノカプセル化の使用、その後のナノカプセル化された化合物のマイクロニードルによる送達である（Gomaaら（２０１４年）、Eur.  J  Biopharm、８６巻（２号）：１４５〜１５５頁）。
適用
【０２０３】
本発明は、ＣＦ疾患などの肺障害において、突然変異を導入もしくは修復するか、または機能性導入遺伝子（例えば、野生型ＣＦＴＲ）をもたらすために使用することができる方法および組成物を記載する。具体的には、ＣＦの発症の病因となることが示されたＣＦＴＲ遺伝子の特定の突然変異として、ΔＦ５０８およびΔＩ５０７が挙げられる。したがって、本発明の方法および組成物は、患者由来の幹細胞の修復によって、またはヌクレアーゼおよび野生型ＣＦＴＲ導入遺伝子（例えば、ＣＦＴＲ遺伝子のエクソン２〜２７）を含むドナー分子を含めたドナー分子のｉｎ  ｖｉｖｏ投与によってのいずれかで、ＣＦＴＲの突然変異を修復する（矯正）するか、またはＣＦＴＲの機能性の野生型配列を突然変異遺伝子に導入するのに有用である。
【０２０４】
ＣＦＴＲ突然変異に関連付けられる細胞内病理を研究するための細胞およびトランスジェニック動物モデルを開発するため、ならびに、生物体全体内でのこれらの突然変異の結果を研究するための同様に有用な方法が本明細書に記載される。したがって、特定のＣＦＴＲ突然変異（例えば、ＣＦＴＲのΔＦ５０８突然変異）をノックアウト、ノックインおよび／または矯正するために設計されたツールを使用して、基礎をなす生物学の理解を進めること、および特異的薬物治療の開発に有用な細胞および動物モデルを創出することができる。さらに、特定のＣＦＴＲ突然変異を標的とする特異的なヌクレアーゼを使用して、突然変異をノックアウトまたは矯正することができる。ＣＦＴＲ突然変異に特異的な治療薬を調査するための細胞株を開発するために、ヌクレアーゼを使用してＣＦＴＲ突然変異に特異的なタグの挿入を引き起こすこともできる。
【０２０５】
さらに、本明細書に記載の細胞、細胞株およびトランスジェニック動物は、薬物の開発に有用である。そのような細胞および動物により、特定の突然変異（例えば、ＣＦＴＲ  ΔＦ５０８）に関連する、またはその矯正に関連する表現型を明らかにすることができ、また、そのような細胞および動物を使用して、問題の突然変異（単数または複数）と特異的に相互作用するか、または患っている動物における疾患の処置に有用である薬物をスクリーニングすることができる。治療的に、ｉＰＳＣをＣＦ疾患に関連する公知の遺伝子突然変異を患っている患者からｅｘ  ｖｉｖｏにおいて得ることができ、ＺＦＮ媒介性遺伝子矯正またはＴＡＬＥＮ媒介性遺伝子矯正を使用して突然変異を矯正することができる。同様に、肺、皮膚または他の幹細胞を患者から単離し、次いで、本発明の方法および組成物を使用してＣＦＴＲ遺伝子座において矯正することができる。次いで、矯正された幹細胞を使用して患者を処置することができる。さらに、目的のＣＦＴＲ突然変異を含有する患者試料から細胞株を作製することができる。これらの細胞株により、患者に特異的なｉＰＳ細胞株における特定の突然変異の影響を調査するためのツールがもたらされ得る。例えば、並行の細胞株を生成することができ、その場合、１つの株が目的の突然変異において矯正される一方でその並行株ではこの矯正がなされない。これにより、疾患を引き起こす突然変異によってのみ異なる細胞株が創出される。結果生じる、内因性遺伝子座においてＣＦＴＲまたはＳＦＴＰＢの異なる対立形質を有するｉＰＳＣの同質遺伝子型パネルにより、疾患に特異的な突然変異の修復、薬物スクリーニングおよび発見、ならびに疾患機構の研究のための遺伝学的ツールがもたらされる。
【０２０６】
修復された突然変異および誘導された突然変異の両方、ならびにそれらの同質遺伝子型対照を有する患者に特異的なｉＰＳ細胞株が利用可能であることは、これらに限定されないが、これらの突然変異により疾患が引き起こされる機構の研究、および、「実験室での治癒」を、これらの突然変異によって誘導される疾患が実際に顕在化している患者を処置することに変換することを含めた様々な医学的適用においても有用である。さらに、当該株は、潜在的な治療用化合物をスクリーニングして、高度に特異的な挙動を示す化合物を同定することにおいて有用であり得る。
【０２０７】
肺幹／前駆細胞の細胞移植は、ＣＦなどの種々の遺伝性一遺伝子性肺疾患に対する潜在的な治療手法である。矯正されたＣＦ  ｉＰＳ細胞により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて種々の肺幹／前駆細胞に分化することができる、患者に特異的な細胞の潜在的な供給源がもたらされる（例えば、Chenら（２００９年）、Proc  Am  Thorac  Soc、６巻：６０２〜６０６頁；Kajsturaら（２０１１年）、N  Engl  J  Med、３６４巻：１７９５〜１８０６頁を参照されたい；自己由来肺細胞の移植のため、または失活させた肺足場をｅｘ  ｖｉｖｏにおいて播種して自己由来肺を生成するためのいずれか（例えば、Ottら（２０１０年）、Nat  Med、１６巻：９２７〜９３３頁を参照されたい）。さらに、肺損傷を有するマウスにｉｎ  ｖｉｖｏで与えると細気管支、肺胞、および肺血管を形成することができるヒト肺幹細胞が同定されたという報告が存在する（Kajsturaら、同文献を参照されたい）。したがって、肺または他の型の幹細胞を患者から単離し、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいてＺＦＮまたはＴＡＬＥＮによって改変し、次いで、患者に再導入し、したがって、疾患を処置することが可能であり得る潜在性がある。したがって、本明細書に記載の方法および組成物を使用して、ＣＦ疾患を引き起こす突然変異が矯正された（遺伝子型および表現型の両方）、移植に使用するための細胞（およびそれらの後代）を生成することができる。これらの移植された細胞は、レシピエントにおける免疫応答を引き出さないと思われる。影響を受けている患者由来の皮膚または血液細胞を使用して、自己由来人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を導き出す。次いで、部位特異的相同組換え修復を利用することにより、疾患を引き起こす突然変異が内因性の染色体ＤＮＡ配列において矯正される。最後に、定方向分化手法を使用して、移植のために、矯正されたｉＰＳ細胞から関連する肺幹／前駆細胞の高度に精製された集団を得る。
【０２０８】
以下の実施例は、ヌクレアーゼがジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を含む本開示の例示的な実施形態に関する。これは例証のみを目的とするものであること、およびＣＦＴＲのイントロン内の標的部位（例えば、表２に示されている配列を含む１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４またはそれよりも多くのヌクレオチドの標的部位を含めた、表２に示されている配列を含む少なくとも１２〜２４塩基対またはそれよりも多くの塩基対の標的部位）に結合する他のヌクレアーゼ、例えば、ＴＡＬＥＮおよび／またはＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼがＣＦＴＲイントロンを標的とすることが理解されよう。
【実施例】
【０２０９】
（実施例１）
材料および方法
ＺＦＮ
マウスまたはヒトＣＦＴＲ遺伝子のイントロン１、２、３、６、７、および８を標的とするＺＦＮを設計し、それぞれＮｅｕｒｏ２ａおよびＫ５６２細胞においてスクリーニングした。ヒトＣＦＴＲ遺伝子のエクソン１１内のΔＦ５０８突然変異を標的とするＺＦＮも設計し、対応するデルタＦ５０８突然変異を有する５つの対立遺伝子のうちの１つ、および４つの野生型対立遺伝子を含有するように工学的に操作されたＫ５６２細胞株においてスクリーニングし、表１Ａおよび１Ｂに示した。表１ＢのＳＢＳ＃３２４０１については米国特許第９，１６１，９９５号も参照されたい。標的部位は表２に示されている。ＺＦＰ認識へリックスにより標的とされる（それが接触する）標的部位内のヌクレオチドが大文字で示されており、非標的（接触）ヌクレオチドが小文字で示されている。
【０２１０】
ＺＦＮは、ＺＦＰ−ＦｏｋまたはＦｏｋ−ＺＦＰのいずれかの配向で作製し（米国特許第７，９７２，８５４号および米国特許出願公開第２０１７／０２１８３４９号）、偏性ヘテロ二量体を有する対（例えば、ＥＬＤおよびＫＫＲ）を使用した。例えば、米国特許第７，９１４，７９６号；同第８，０３４，５９８号；および同第８，６２３，６１８号を参照されたい。任意のリンカーを使用してＦｏｋＩヌクレアーゼドメインを連結することができる；例示的なリンカーも最初の列に示されている（米国特許出願公開第２０１５／０１３２２６９号を参照されたい）。例えば、ドメインリンカーＬ０のアミノ酸配列は、ＤＮＡ結合性ドメイン−ＱＬＶＫＳ−ＦｏｋＩヌクレアーゼドメイン（配列番号１０９）である。同様に、ドメインリンカーＮ７ａのアミノ酸配列は、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメイン−ＳＧＴＰＨＥＶＧＶＹＴＬ−ＤＮＡ結合性ドメイン（配列番号１１０）であり、Ｎ６ａの配列は、ＳＧＡＱＧＳＴＬＤＦ（配列番号１１１）である。さらに、ＺＦＮは、米国公開第２０１８００８７０７２号に記載の１つまたは複数の改変をさらに含み得る。
【表１Ａ−１】
2020518245.tif 000002
【表１Ａ−２】
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【表１Ａ−３】
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【表１Ａ−４】
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【表１Ｂ】
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【表２−１】
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【表２−２】
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【０２１１】
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を、Ｓａｎｇａｍｏ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓにおいて、改変されていないものを使用し、ＸｂａＩにより直線化されたｐＶＡＸ  ＺＦＮ構築物からｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）を使用して作出した。ｍＲＮＡを抗逆方向キャップ類似体（ＡＲＣＡ）キャップとの同時転写によりキャップ形成した。転写後、転写物を酵素によりポリアデニル化した。ｍＲＮＡを、シリカビーズカラムを通して精製した。表１に示されている全てのＺＦＰがそれらの標的部位に特異的に結合し、ＣＦＴＲ遺伝子を切断した。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ形質導入
【０２１２】
ＺＦＮ  ＤＮＡプラスミドを構築し、スクリーニングの間に細胞株中にＡｍａｘａ  ９６ウェルシャトルを介してエレクトロポレーションした。表１の全てのＺＦＮ対が有効であることが示された。次いで、有望なＺＦＮ候補をｍＲＮＡにし、ＢＴＸエレクトロポレーションデバイスで試験した。標的化組込み（ＴＩ）実験のために、導入遺伝子ドナーＤＮＡを細胞にＡＡＶ６形質導入によって送達した。リードＺＦＮを、デルタＦ５０８  ＣＦＴＲ突然変異についてホモ接合性の初代ヒト基底気道上皮細胞においてｍＲＮＡとして試験した（ＫＫ００３細胞）。
インデル分析
【０２１３】
ＺＦＮスクリーニングのために、プライマーを設計して、およそ２００ｂｐの、ＺＦＮカット部位を含有する総ゲノムＤＮＡ配列を増幅した。次いで、アンプリコンをＭｉｓｅｑ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）に流し、野生型ゲノム配列に対する挿入および欠失（インデル）を数量化した。標的化組込み（ＴＩ）分析のために、リードＺＦＮカット部位のすぐ５’側のプライマー結合性部位を導入遺伝子ドナー内の右側の相同アームのすぐ５’側にクローニングし、その後に野生型配列と同じ塩基組成であるがランダム化されたものであるＴＩ特異的配列を続けた。これにより、インデルおよびＴＩを同じＰＣＲ反応から同時に決定することが可能になった。
（実施例２）
ＣＦＴＲイントロン内の遺伝子改変
Ａ．ＮＨＥＪ改変（％インデル）
【０２１４】
ＣＦＴＲのイントロン１、２、３、６、７または８を標的とするヌクレアーゼ（上記の表１Ａ）を実施例１に記載の通りアッセイした。さらに、ΔＦ５０８突然変異を標的とするヌクレアーゼも活性について上記および米国特許第９，１６１，９９５号に記載の通りアッセイした。
【０２１５】
具体的には、ヒトＣＦＴＲに関して、イントロン６〜８を標的とする１１３種のＺＦＮ対およびイントロン１〜３を標的とする９５種のＺＦＮ対を試験し、リード候補を同定した。ＺＦＮをプラスミドＤＮＡとしてＡｍａｘａデバイスでＫ５６２細胞内にエレクトロポレーションし、３日後にＭｉｓｅｑでのインデル分析のために回収した。
【０２１６】
図１に示されている通り、ヒトＣＦＴＲについて同定されたリード候補は、イントロン１に対して（５６３１６／５６３１７−５２％インデル）、イントロン３に対して（５６４４５／５６４４４−３２．７％インデル）；イントロン７に対して（５６１２６／５６１２７−５５．４％インデル）、およびイントロン８に対して（５６２５５／５６２５４−５０．１％インデル）であった。
【０２１７】
同様に、マウスＣＦＴＲに関して、イントロン６〜８を標的とする４８種のＺＦＮ対およびイントロン１〜３を標的とする４８種のＺＦＮ対を、ＺＦＮをプラスミドＤＮＡとしてＮｅｕｒｏ２ａ細胞内にエレクトロポレーションし、３日後にＭｉｓｅｑによるインデル分析のために回収することによって試験した。イントロン１（５６６９１／５６６９０−６７．２％インデル）およびイントロン８（５６６４４／５６６４３−４９．２％インデル）に対するリード候補が同定された。
【０２１８】
図３は、ΔＦ５０８突然変異を特異的に標的とする１６８種のＺＦＮ対のスクリーニングから得られたリード候補の活性（％インデル）を示す。スクリーニングはＫ６５２細胞において実施した。２種のリードＺＦＮ対が同定された（それぞれ５６５２６／５６５２９および５６５２６／５６５２７−１９．６％および１６．８％インデル）。
【０２１９】
図４は、ｍＲＮＡとしてホモ接合性ΔＦ５０８初代ヒト基底気道上皮細胞（「ｈＢＡＥ」、ＫＫ００３、Ｌｏｎｚａ）に上記と同じ実験条件下でエレクトロポレーションし、３日後にＭｉｓｅｑでのインデル分析のために回収した、図１〜３において同定されたリード候補の活性を示す。細胞に、０．５μｇの低用量であっても活性を検出できることが実証されたΔＦ５０８特異的対５６５２６／５６５２９をコードするｍＲＮＡを種々の濃度で用いた処理も行った。
【０２２０】
図に示されている通り、ＣＦＴＲのイントロンを標的とするヌクレアーゼは、標的細胞において頑強な結合および切断活性を示した。
Ｂ．標的化組込み
【０２２１】
さらに、様々な長さの相同アームを有するドナーを使用した標的化組込みも試験した（ドナー設計に関しては図５を参照されたい）。簡単に述べると、ＡＡＶ６に保持されたＳＡ−２Ａ−ＧＦＰ導入遺伝子ドナーを野生型Ｋ５６２細胞へのＺＦＮ  ＤＮＡ  Ａｍａｘａエレクトロポレーションの直後に添加し、３日後にＭｉｓｅｑでのインデルおよび標的化組込み（ＴＩ）分析のために回収した。約５０塩基対、約１５０塩基対または約２５０塩基対のヌクレアーゼ標的部位を挟む配列に対する相同アームを含む導入遺伝子ドナーを使用した。
【０２２２】
図６に示されている通り、試験した全てのＺＦＮ（イントロン１、イントロン３、イントロン７またはイントロン８を標的とする）により、ゲノムがヌクレアーゼ駆動性ＮＨＥＪによって改変された。ＴＩはドナーが約２５０〜３５０ｂｐの相同アームを含む場合に観察された（図６Ｄおよび６Ｅ）。ＨＤＲ媒介性ＴＩをＭｉｓｅｑによって検出し、それにより、２５０および３５０ｂｐの相同アームが実際にこの遺伝子座および細胞型におけるＨＤＲ媒介性ＴＩに十分であることが示される。
【０２２３】
さらに、５０ｂｐ、１５０ｂｐ、２５０ｂｐ、または３５０ｂｐの相同アームを含む機能性ヒトＣＦＴＲ（ｈＣＦＴＲ）をコードする配列を含むＡＡＶ６ドナーを使用して標的化組込みを試験した。ドナー構築物では、スプライスアクセプターが５’相同アームの下流に位置し、また、転写の際にドナー配列が内因性ＣＦＴＲ転写物とインフレームになるように０〜２個の追加的なヌクレオチド塩基も含まれた。次に、ドナーは、イントロン１、３、７、または８ＺＦＮ標的部位に対してそれぞれエクソン２〜２７、４〜２７、８〜２７、または９〜２７を含有するヒトＣＦＴＲ  ｃＤＮＡを含む（図５を参照されたい）。ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）遺伝子に由来するポリアデニル化シグナルもドナー構築物内のｃＤＮＡ配列の下流に含めた。最後に、バーコード配列をポリＡ配列の下流に挿入して、ＨＤＲ媒介性標的化組込みおよび生成されたインデルの数を次世代シーケンシングによって同時に数量化することを可能にした。次いで、このＺＦＮ部位特異的配列の後ろにＺＦＮ部位特異的３’相同アームを続けた。ＺＦＮ（イントロン１、イントロン３、イントロン７またはイントロン８を標的とする）のホモ接合性ΔＦ５０８初代ヒト基底気道上皮細胞（ＫＫ００３）へのＺＦＮ  ｍＲＮＡエレクトロポレーション（２ｕｇまたは４ｕｇの濃度）の１６時間前にドナーを添加し、３日後にＭｉｓｅｑでのインデルおよびＴＩ分析のために回収した。
【０２２４】
図７に示されている通り、ＮＨＥＪによるヌクレアーゼ媒介性改変は用量依存的であり、指定のイントロン標的へのＣＦＴＲ導入遺伝子の相同性により方向付けられる標的化組込みが約２５０〜約３５０塩基対の相同アームを用いて実現された。以下に詳述されている通り、組み込まれた導入遺伝子から機能性ＣＦＴＲが発現された。さらに、イントロン８に特異的な対（５６２５４／５６２５５）を、上記と同じアッセイにおいて、ＣＦＴＲドナーの存在下または不在下で様々なｍＲＮＡ用量（最大４μｇ）にわたって試験した（図１０を参照されたい）。データから、ドナーの不在下で８０％を超える活性および最高用量において１０％を超えるドナーの標的化組込みが実証された。
【０２２５】
矯正用ｃＤＮＡ導入遺伝子の組込みが実証される上記の実験に加えて、より短いオリゴヌクレオチド（およそ１００ヌクレオチド）を組み込んでΔＦ５０８突然変異を部位特異的に矯正するための試験を行った。使用したオリゴヌクレオチドは、センス鎖（「Ｆ」）またはアンチセンス鎖（「Ｒ」）であり、オリゴは、以下に示す通り、矯正用ヌクレオチドを挟むおよそ５０ヌクレオチドの相同アームを含んだ：
【０２２６】
F-5’
【化１】
2020518245.tif 000009
【０２２７】
R-5’
【化２】
2020518245.tif 000010
【０２２８】
これらのオリゴヌクレオチドを、５６５２６／５６５２７または５６５２５／５６５２９  ＺＦＮ対のいずれかをコードするｍＲＮＡと一緒にＫＫ００３細胞に導入した。トランスフェクションの３日後、ゲノムＤＮＡを細胞から単離し、切断活性（インデル）ならびに矯正用オリゴヌクレオチドの標的化組込みについて分析した。データ（図８を参照されたい）から、ヌクレアーゼが活性であったこと、矯正用オリゴが遺伝子のおよそ２〜４％に組み込まれたことが示される。
【０２２９】
さらに、１００ｂｐ（「１００ｍｅｒ」）の矯正用オリゴヌクレオチドの組込みを２００ｂｐ（「２００ｍｅｒ」）の矯正用オリゴと比較し、データから、より長い２００ｍｅｒオリゴヌクレオチドがより小さなオリゴヌクレオチドよりも高いパーセンテージで組み込まれたことが実証された（図１１Ａ）。センス鎖（「ｓｓＯＤＮ１」）またはアンチセンス鎖（「ｓｓＯＤＮ２」）のいずれかに対応する矯正用２００ｍｅｒオリゴヌクレオチドを作製し、データから、両方の型のオリゴが切断されたゲノムＤＮＡに同様の頻度で組み込まれたことが示された（図１１Ｂ）。ＺＦＮ（５２５２６／５２５２９）切断後のＤＮＡ修復をＮＨＥＪ（インデル）ではなくＨＤＲ（遺伝子矯正）の方に曲げるためにピラジンＳＣＲ７を１ｍＭまたは５ｍＭのいずれかの濃度で細胞に添加することの効果を測定するために実験的セットアップも使用した。データから、ＳＣＲ７が存在することにより、ＨＤＲによるオリゴヌクレオチドの組込みが増大することが実証された（図１２）。
【０２３０】
細胞によって産生されるＣＦＴＲの量をアッセイし（例えば、Craneら、上記に記載されている通り）、デルタＦ５０８突然変異（ＫＫ００３）を含む基底上皮細胞における塩化物イオン伝導が本明細書に記載のＺＦＮ／ＣＦＴＲドナー処理後に正常なレベルまで矯正されることを含め、治療レベルで産生されることが見いだされた。具体的には、ＫＫ００３細胞のイントロン８における矯正用ヒトＣＦＴＲ  ｃＤＮＡドナー（ｈＣＦＴＲ９−２７、突然変異を矯正するために遺伝子の一部を含む）の標的化組込みにより、Ｕｓｓｉｎｇ  Ｃｈａｍｂｅｒ測定によって評価される通り、ＣＦＴＲ塩化物イオンチャネル電気生理学的活性の機能的矯正が導かれる。例えば、Liら（２００４年）、J.  Cystic  Fibrosis  ３巻、補遺２号：１２３〜１２６頁を参照されたい。簡単に述べると、このアッセイでは、基底上皮細胞層にわたる正味のイオン輸送に対応する電位差を測定する。読み取りは、分単位の経時的なマイクロアンペア数の短絡電流（Ｉｓｃ）である。アミロライドの添加により、ナトリウムイオンコンダクタンスが阻害されるが、その後、フォルスコリンを添加することにより、塩化物イオンコンダクタンスが増大する。その後の、ＣＦＴＲ塩化物イオンチャネル機能に対する市販の小分子阻害剤であるＣＦＴＲｉｎｈ−１７２の添加により、全体的なコンダクタンスが低下し、これにより、塩化物イオン輸送がＣＦＴＲイオンチャネルに特異的であることが示される。最後に、基底上皮細胞による塩化物イオン分泌を刺激するウリジン５’−三リン酸（ＵＴＰ）の添加により、Ｕｓｓｉｎｇ  ｃｈａｍｂｅｒ内の電流はＺＦＮ＋ドナー試料（ｎ＝４の生物学的反復実験）においてのみ増大し、ドナーのみ試料（ｎ＝３の生物学的反復実験）のいずれにおいても増大しない。
【０２３１】
イントロン８特異的ＺＦＮ対を使用した実験も実施すると同時に、イントロン７特異的ＺＦＮ対について繰り返した。シグナルはフォルスコリンの存在下でブーストされ、ＣＦＴＲ阻害剤であるＣＦＴＲ  Ｉｎｈ−１７ｓによって抑止され、これにより、ＺＦＮ駆動性標的化組込みを通じた部分的なＣＦＴＲドナーの添加によりＣＦＴＲ活性が回復することが実証された。
【０２３２】
したがって、本明細書に記載の組成物を使用して、単離された細胞において機能性ＣＦＴＲを産生させることができる。タンパク質を単離し、酵素補充療法のために、吸入製剤を含めた任意の適切な手段によって患者に投与することができる。
（実施例３）
ｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおける方法
【０２３３】
実施例２に記載の通り改変された患者由来の基底上皮肺細胞、肺幹細胞またはｉＰＳＣを、ＣＦを有する対象に、例えば吸入製剤として投与し、対象において移植された細胞にタンパク質を治療レベルで産生させる。
【０２３４】
あるいは、ヌクレアーゼ（例えば、イントロンを標的とするもの）およびＣＦＴＲドナーをＣＦ患者に、例えば吸入製剤によっておよび／またはベクター（例えば、肺細胞を特異的に標的とするＡＡＶ）を使用して投与する。同じまたは異なる送達ビヒクルを使用してＣＦＴＲドナーを対象の肺細胞に組み込み、肺細胞において機能性ＣＦＴＲを産生させ、それにより、対象を処置する。
【０２３５】
本明細書で言及されている全ての特許、特許出願および刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２３６】
開示は明瞭な理解のために例証および例としてある程度詳細に提示されているが、本開示の主旨または範囲から逸脱することなく種々の変化および改変を実施できることが当業者には明らかになるであろう。したがって、前述の説明および実施例は、限定するものと解釈されるべきではない。
【図１】
2020518245.tif 000011
【図２】
2020518245.tif 000012
【図３】
2020518245.tif 000013
【図４】
2020518245.tif 000014
【図５】
2020518245.tif 000015
【図６−１】
2020518245.tif 000016
【図６−２】
2020518245.tif 000017
【図６−３】
2020518245.tif 000018
【図７−１】
2020518245.tif 000019
【図７−２】
2020518245.tif 000020
【図８】
2020518245.tif 000021
【図９】
2020518245.tif 000022
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
2020518245000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年1月8日(2020.1.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４３】
ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、切断活性を示すメガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼ）またはその一部を含む。天然に存在するメガヌクレアーゼは、１５〜４０塩基対の切断部位を認識し、一般に、４つのファミリー：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー（配列番号１１４）、ＧＩＹ−ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ−ＣｙｓボックスファミリーおよびＨＮＨファミリーに群分けされる。例示的なホーミングエンドヌクレアーゼとしては、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩおよびＩ−ＴｅｖＩＩＩが挙げられる。それらの認識配列は公知である。米国特許第５，４２０，０３２号；米国特許第６，８３３，２５２号；Belfortら（１９９７年）、Nucleic  Acids  Res.、２５巻：３３７９〜３３８８頁；Dujonら（１９８９年）、Gene、８２巻：１１５〜１１８頁；Perlerら（１９９４年）、Nucleic  Acids  Res.、２２巻：１１２５〜１１２７頁；Jasin（１９９６年）、Trends  Genet.、１２巻：２２４〜２２８頁；Gimbleら（１９９６年）、J.  Mol.  Biol.、２６３巻：１６３〜１８０頁；Argastら（１９９８年）、J.  Mol.  Biol.、２８０巻：３４５〜３５３頁およびＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓカタログも参照されたい。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４４】
主にＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー（配列番号１１４）に由来する、天然に存在するメガヌクレアーゼ由来のＤＮＡ結合性ドメインは、植物、酵母、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ、哺乳動物細胞およびマウスにおける部位特異的ゲノム改変を促進するために使用されているが、この手法は、メガヌクレアーゼ認識配列を保存する相同な遺伝子（Monetら（１９９９年）、Biochem.  Biophysics.  Res.  Common.、２５５巻：８８〜９３頁）または認識配列が導入されている予め工学的に操作されたゲノム（Routeら（１９９４年）、Mol.  Cell.  Biol.、１４巻：８０９６〜１０６頁；Chiltonら（２００３年）、Plant  Physiology.、１３３巻：９５６〜６５頁；Puchtaら（１９９６年）、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、９３巻：５０５５〜６０頁；Rongら（２００２年）、Genes  Dev.、１６巻：１５６８〜８１頁；Goubleら（２００６年）、J.  Gene  Med.、８巻（５号）：６１６〜６２２頁）のいずれかの改変に限られている。したがって、メガヌクレアーゼを医学的にまたはバイオテクノロジー的に関連する部位において新規の結合特異性を示すように工学的に操作する試みがなされている（Porteusら（２００５年）、Nat.  Biotechnol.、２３巻：９６７〜７３頁；Sussmanら（２００４年）、J.  Mol.  Biol.、３４２巻：３１〜４１頁；Epinatら（２００３年）、Nucleic  Acids  Res.、３１巻：２９５２〜６２頁；Chevalierら（２００２年）、Molec.  Cell、１０巻：８９５〜９０５頁；Epinatら（２００３年）、Nucleic  Acids  Res.、３１巻：２９５２〜２９６２頁；Ashworthら（２００６年）、Nature、４４１巻：６５６〜６５９頁；Paquesら（２００７年）、Current  Gene  Therapy、７巻：４９〜６６頁；米国特許出願公開第２００７／０１１７１２８号；同第２００６／０２０６９４９号；同第２００６／０１５３８２６号；同第２００６／００７８５５２号；および同第２００４／０００２０９２号）。さらに、メガヌクレアーゼ由来の天然に存在するまたは工学的に操作されたＤＮＡ結合性ドメインを異種性ヌクレアーゼ由来の切断ドメイン（例えば、ＦｏｋＩ）と作動可能に連結することができ、かつ／または、メガヌクレアーゼ由来の切断ドメインを異種ＤＮＡ結合性ドメイン（例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ）と作動可能に連結することができる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２６】
F-5’
【化１】
2020518245.tif 000026
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３６】
開示は明瞭な理解のために例証および例としてある程度詳細に提示されているが、本開示の主旨または範囲から逸脱することなく種々の変化および改変を実施できることが当業者には明らかになるであろう。したがって、前述の説明および実施例は、限定するものと解釈されるべきではない。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
機能性ドメインと、標的部位であるＣＦＴＲのイントロン１〜３もしくは６〜８またはａａＡＧＡＡＡＡＴＡＴＣＡＴＴＧＧｔｇｔｔｔｃｃｔａｔｇ（配列番号１０８）に示される標的部位に結合するＤＮＡ結合性ドメインとを含む融合分子。
(項目２)
それぞれが切断ドメインとジンクフィンガーＤＮＡ結合性ドメイン（ＺＦＰ）とを含むジンクフィンガーヌクレアーゼの対を含むヌクレアーゼであって、前記対が、
（ｉ）５６５２６と称されるＺＦＰを含むＺＦＮおよび５６５２７と称されるＺＦＰを含むＺＦＮ；
（ｉｉ）５６５２６と称されるＺＦＰを含むＺＦＮおよび５６５２７または５６５２９と称されるＺＦＰを含むＺＦＮ；
（ｉｉｉ）５６５０６または５６５１１と称されるＺＦＰを含むＺＦＮおよび５６５２０または５６５１９と称されるＺＦＰを含むＺＦＮ；
（ｉｖ）５６３１６と称されるＺＦＰを含むＺＦＮおよび５６３１７と称されるＺＦＰを含むＺＦＮ；
（ｖ）５６２８２と称されるＺＦＰを含むＺＦＮおよび５６２８３と称されるＺＦＰを含むＺＦＮ；
（ｖｉ）５６４４５と称されるＺＦＰを含むＺＦＮおよび５６４４４と称されるＺＦＰを含むＺＦＮ；
（ｖｉ）５６１２６と称されるＺＦＰを含むＺＦＮおよび５６１２７と称されるＺＦＰを含むＺＦＮ；または
（ｖｉｉ）５６２５５と称されるＺＦＰを含むＺＦＮおよび５６２５４と称されるＺＦＰを含むＺＦＮ
からなる群から選択される、ヌクレアーゼを含む、項目１に記載の融合分子。
(項目３)
項目１または項目２に記載の融合分子をコードするポリヌクレオチド。
(項目４)
項目３に記載のポリヌクレオチドを含むウイルスまたは非ウイルスベクター。
(項目５)
ＡＡＶベクターを含む、項目４に記載のウイルスベクター。
(項目６)
項目１もしくは項目２に記載の融合分子または項目３に記載のポリヌクレオチドまたは項目４もしくは５に記載のベクターを含む医薬組成物。
(項目７)
項目１もしくは項目２に記載の融合分子または項目３に記載のポリヌクレオチドまたは項目４もしくは５に記載のベクターまたは項目６に記載の医薬組成物を含む単離された細胞。
(項目８)
単離された細胞において１つまたは複数のＣＦＴＲ遺伝子を改変する方法であって、（ａ）前記細胞に、項目２に記載の１つまたは複数のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを、前記ヌクレアーゼ（単数または複数）が発現され、前記１つまたは複数のＣＦＴＲ遺伝子が切断され、改変されるような条件下で導入するステップを含む方法。
(項目９)
前記改変が、ＣＦＴＲ遺伝子内の挿入および／または欠失を含む、項目８に記載の方法。
(項目１０)
前記ＣＦＴＲ遺伝子の断片を含む導入遺伝子を、前記細胞に、前記導入遺伝子が前記ＣＦＴＲ遺伝子に組み込まれると機能性ＣＦＴＲタンパク質が発現されるように導入するステップをさらに含む、項目８または項目９に記載の方法。
(項目１１)
前記導入遺伝子が、前記ＣＦＴＲ遺伝子のイントロン１、３、７または８に組み込まれる、項目１０に記載の方法。
(項目１２)
前記細胞が、前記ＣＦＴＲ遺伝子におけるΔＦ５０８突然変異を含み、前記ヌクレアーゼが、ΔＦ５０８突然変異に特異的であり、前記方法が、前記突然変異を野生型配列に矯正するドナーヌクレオチド配列をさらに導入するステップであって、前記ＣＦＴＲ遺伝子が前記ヌクレアーゼによって切断された後、前記ドナーが前記ＣＦＴＲ遺伝子に組み込まれるステップをさらに含む、項目８または９に記載の方法。
(項目１３)
ＣＦＴＲ遺伝子が項目２に記載のヌクレアーゼによって切断された後に前記ＣＦＴＲ遺伝子に組み込まれた外因性配列を含む遺伝子改変細胞。
(項目１４)
前記外因性配列が、ＣＦＴＲ遺伝子の断片または前記ＣＦＴＲ遺伝子における突然変異を矯正する配列を含む導入遺伝子を含み、したがって、前記外因性配列が組み込まれると、前記ＣＦＴＲ遺伝子が機能性ＣＦＴＲタンパク質をコードする、項目１３に記載の遺伝子改変細胞。
(項目１５)
前記細胞が、肺細胞または幹細胞である、項目１３または項目１４に記載の遺伝子改変細胞。
(項目１６)
突然変異型ＣＦＴＲ遺伝子を含む細胞または細胞株または胚を作製する方法であって、野生型ＣＦＴＲ遺伝子を有する細胞を準備するステップと、項目２に記載のヌクレアーゼまたは項目３に記載のポリヌクレオチドを前記細胞に前記ＣＦＴＲ遺伝子が突然変異するように導入することによって前記野生型遺伝子を突然変異させるステップとを含む方法。
(項目１７)
項目１もしくは項目２に記載の融合分子；項目３に記載のポリヌクレオチド  ；項目４もしくは５に記載のベクター；項目６に記載の医薬組成物；または項目１３から１５に記載の遺伝子改変細胞、細胞株または胚を含むキット。