(57)【要約】本発明は、基板と電気的に連通する昆虫匂い物質受容体（ＯｒＸ）を含み、該基板の電気的な特徴における変化を検出するように設計されているセンサーデバイスを提供する。本発明はまた、基板と電気的に連通する昆虫匂い物質受容体（ＯｒＸ）を含むセンサーデバイスコンポネントも提供する。本発明はまた、センサーデバイス及びセンサーデバイスコンポネントの製造及び使用のための方法も提供する。本発明はまた、分析物を検出するためのセンサーの使用方法も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板と電気的に連通する昆虫の匂い物質受容体（ＯｒＸ）を含むセンサーデバイスであって、該基板の電気的な特徴における変化を検出するように設計されている、上記センサーデバイス。
【請求項２】
前記電気的な特徴における変化が、前記ＯｒＸへの分析物の結合に起因する、請求項１に記載のセンサーデバイス。
【請求項３】
前記基板の電気的な特徴における変化を検出することによって、前記ＯｒＸへの前記分析物の結合を検出することが可能である、請求項１または２に記載のセンサー。
【請求項４】
前記ＯｒＸが、前記分析物の結合に応答してコンフォメーション変化を受けることが可能な形態で存在する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のセンサー。
【請求項５】
前記ＯｒＸが、膜模倣物に存在する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のセンサー。
【請求項６】
膜模倣物が、リポソーム、アンフィポール、洗剤ミセル、ナノベシクル、脂質二重層、ナノディスク、および界面活性剤から選択される、請求項５に記載のセンサー。
【請求項７】
前記分析物の存在を、１×１０−３Ｍ未満の濃度で検出することができる、請求項３に記載のセンサー。
【請求項８】
前記基板が、電極、半導体材料、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）、グラフェン、酸化物、ドープシリコン、導電性ポリマー、および共振器要素の少なくとも１つから選択されるか、またはそれで構成される、請求項１〜７のいずれか一項に記載のセンサー。
【請求項９】
前記電気的な特徴が、導電率、抵抗、複合抵抗、インピーダンス、電気化学インピーダンス、電流の流れ、および交流電場により誘導された振動の共振振動数の少なくとも１つから選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載のセンサー。
【請求項１０】
分析物を検出する方法であって、
ａ）請求項１〜９のいずれか一項に記載のセンサーにおいて、分析物を昆虫ＯｒＸに結合させる工程、
ｂ）基板の電気的な特徴における変化を検出する工程
を含み、
該基板の電気的な特徴における変化は、該分析物の検出を示す、上記方法。
【請求項１１】
環境における分析物の存在を検出する方法であって、
ａ）請求項１〜９のいずれか一項に記載のセンサーを、分析物を含有する環境に曝露する工程、
ｂ）該センサーにおいて、該分析物を昆虫ＯｒＸに結合させる工程
ｃ）基板の電気的な特徴における変化を検出する工程
を含み、
該基板の電気的な特徴における変化は、該環境における該分析物の存在を示す、上記方法。
【請求項１２】
センサーデバイスを製造する方法であって、昆虫ＯｒＸとセンサーデバイスの基板との間に電気的な連通を確立する工程を含み、該センサーデバイスは、該基板の電気的な特徴における変化を検出するように設計されている、上記方法。
【請求項１３】
基板と電気的に連通する昆虫の匂い物質受容体（ＯｒＸ）を含むセンサーデバイスコンポネント。
【請求項１４】
請求項１３に記載のコンポネントを含むセンサーデバイスであって、基板の電気的な特徴における変化を検出するように設計されている、上記センサーデバイス。
【請求項１５】
センサーデバイスのコンポネントを製造する方法であって、昆虫ＯｒＸと基板との間に電気的な連通を確立する工程を含む、上記方法。
【請求項１６】
センサーデバイスを組み立てる方法であって、請求項１３に記載のセンサーデバイスコンポネントを、該センサーデバイスに付与することを含み、組み立てられたセンサーデバイスは、基板の電気的な特徴における変化を検出するように設計されている上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分析物を検出するためのセンサーおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
揮発性有機化合物（ＶＯＣ）や可溶性有機化学物質などの分析物（analytes）のリアルタイム検出は、健康状態や環境のモニタリング、加えて食品安全性や水の品質にとって重要な問題であり、手ごろで迅速な分析物センサーを開発しようとうする強い動機になっている。
【０００３】
便利な、高感度の、特異的な分析物センサーは、食物の品質／安全性（風味、熟成、汚染、および腐敗）、バイオセキュリティー（有害生物および疾患）、環境のモニタリング（有害汚染物質）、医療診断（例えば呼気診断）およびセキュリティー（違法な化合物および爆発物）に関連する分析物をモニターすることを含む多様な用途を有するであろう。
【０００４】
昆虫嗅覚受容体（olfactory receptor, ＯＲ）は、様々な天然および合成化学物質のなかでも特に、ＶＯＣを区別することができる。昆虫ＯＲは、ヘテロメリックなリガンド開口型カチオンチャネル（heteromeric ligand-gated cation channels）として機能し（図１）、Ｏｒｃｏおよび匂い物質特異的調整受容体（odorant-specific tuning receptor）（ＯｒＸ）として公知の必須のコレセプター（co-receptor）で構成される。
【０００５】
昆虫ＯＲは、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）として機能する哺乳類やCaenorhabditis elegansのＯＲとは構造的にも機能的にも大きく異なっている。
多くの著者が、アフリカツメガエル卵母細胞２、昆虫細胞株３、およびヒトＨＥＫ２９３細胞４を使用する昆虫ＯＲの機能１に関する細胞ベースのアッセイを記載している。しかしながらそれらの用途は、主として昆虫ＯＲの化合物の特異性を同定することに限定され、その一部は、害虫の行動制御のための活性化および阻害化合物を同定するのに使用される５。
【０００６】
多数の公開された特許文書が、昆虫ＯＲ細胞アッセイを記載している６〜１１。いずれも、害虫の制御のための新規の活性化および阻害化合物に関するアッセイへのアプローチを網羅したものである。細胞ベースのセンサーに関して、２つの公報１２、１３は、細胞ベースのセンサー様式における昆虫ＯＲを発現する細胞株の使用を記載している。一方の公報は、２つの電極電圧固定法を使用する、匂い物質を検出するための昆虫ＯＲでトランスフェクトしたアフリカツメガエル卵母細胞の使用を実証し１２、他方１３は、フェロモン受容体を発現する細胞株を、ガラス製マイクロ流体チップ（glass microfluidic chip）上で成長させること、および蛍光顕微鏡を使用したカルシウムイメージングによりフェロモン結合を検出することを記載している。
【０００７】
上述した昆虫ＯＲベースのシステム／センサーは全て、昆虫ＯｒＸと、それに関連するＯｒｃｏとを共に含む。
市販されているポータブルの揮発物質感知技術は、電子鼻または化学電子鼻に限定されているが、その性能は、感度および特異性に関して実質的に昆虫の嗅覚器系に劣る。さらに、出願人が知る限り、上記で論じられた昆虫ＯＲベースのシステムに基づく市販品はない。イオン移動度分光計や質量分析計などの他の技術は、電子鼻より改善された感度および特異性を提供するが、入手に非常に費用がかかり、使用者の広範な訓練を必要とし、可動性が極めて低い。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、本発明の目的は、少なくとも１つの昆虫受容体を利用する改善されたセンサーデバイスを提供すること、および／または公衆に有用な選択肢を少なくとも提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、センサーのディスプレイ表面／基板にカップリングされる昆虫ＯｒＸを含むセンサーデバイスを提供する。出願人が知る限り、これは、精製された昆虫ＯｒＸがセンサーディスプレイ表面／基板上に機能的に固定された最初のことである。
【００１０】
本発明者らは、驚くべきことに、新規のセンサーは、これまでに使用されてきた昆虫ＯＲベースのシステムに比べて極めて顕著な感度の増加を提供することを示した。さらに驚くべきことに、本発明者らは、新規のセンサーは、Ｏｒｃｏの非存在下で機能的であることを示した。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
センサーデバイス
第１の形態において、本発明は、基板と電気的に連通する昆虫の匂い物質受容体（odorant receptor）（ＯｒＸ）を含むセンサーデバイスであって、基板の電気的な特徴における変化を検出するように設計されている、上記センサーデバイスを提供する。
【００１２】
一実施態様において、電気的な特徴における変化は、ＯｒＸと分析物との相互作用に起因する。
さらなる実施態様において、相互作用は、ＯｒＸへの分析物の結合である。
【００１３】
さらなる実施態様において、分析物は、ＯｒＸに相補的（complementary to）である。
さらなる実施態様において、分析物とＯｒＸとの相互作用は、特異的（specific）である。
【００１４】
分析物の検出
したがって、一実施態様において、センサーは、基板の電気的な特徴における変化を検出することによって、ＯｒＸへの分析物の結合を検出することが可能である。
【００１５】
さらなる実施態様において、センサーは、昆虫ＯｒＸに結合する分析物の環境中での存在を検出することが可能である。
好ましくは、検出は、分析物に特異的である。
【００１６】
電気的な連通
一実施態様において、電気的な連通は、受容体が基板の電気的な特徴に影響を与えることができることを意味する。
【００１７】
さらなる実施態様において、分析物とＯｒＸとの相互作用は、ＯｒＸにおけるコンフォメーション変化をもたらす。
さらなる実施態様において、ＯｒＸにおけるコンフォメーション変化は、基板の電気的な特徴における変化をもたらす。
【００１８】
基板へのＯｒＸのカップリング
さらなる実施態様において、ＯｒＸは、基板にカップリングされる。
ＯｒＸの存在
さらなる実施態様において、ＯｒＸは、分析物との相互作用に応答してコンフォメーション変化を受けることが可能な形態で存在する。
【００１９】
さらなる実施態様において、ＯｒＸは、膜模倣物（membrane mimic）に存在する。
膜模倣物は、リポソーム、アンフィポール（amphipole）、洗剤ミセル、ナノベシクル、脂質二重層、およびナノディスクから選択することができる。
【００２０】
好ましくは、膜模倣物は、人工物である。
またＯｒＸは、界面活性剤に存在していてもよく、界面活性剤は、イオン性であってもよいし、または非イオン性であってもよい。
【００２１】
検出の感度
一実施態様において、センサーは、１×１０−３Ｍ未満、好ましくは１×１０−３Ｍ未満、より好ましくは１×１０−４Ｍ未満、より好ましくは１×１０−５Ｍ未満、より好ましくは１×１０−６Ｍ未満、より好ましくは１×１０−７Ｍ未満、より好ましくは１×１０−８Ｍ未満、より好ましくは１×１０−９Ｍ未満、より好ましくは１×１０−１０Ｍ未満、より好ましくは１×１０−１１Ｍ未満、より好ましくは１×１０−１２Ｍ未満、より好ましくは１×１０−１３Ｍ未満、より好ましくは１×１０−１４Ｍ未満、より好ましくは１×１０−１５Ｍ未満、より好ましくは１×１０−１６Ｍ未満、より好ましくは１×１０−１７Ｍ未満、より好ましくは１×１０−１８Ｍ未満の濃度で分析物の存在を検出することができる。
【００２２】
センサーデバイスにおけるＯｒｃｏの欠如
さらなる実施態様において、センサーは、昆虫の匂い物質コレセプター（insect odorant co-receptor）（Ｏｒｃｏ）を含まない。
【００２３】
基板
一実施態様において、基板は、電極、半導体材料、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）、グラフェン、酸化物、ドープシリコン（doped silicon）、導電性ポリマー、共振器要素（resonator component）の少なくとも１つから選択されるか、またはそれで構成される。
【００２４】
一実施態様において、共振器要素は、圧電材料、少なくとも１種の圧電性結晶、水晶（quartz crystal）であるかまたはそれで構成される。好ましい実施態様において、共振器要素は、水晶共振子（quartz crystal resonator）である。
【００２５】
電気的な特徴
一実施態様において、電気的な特徴は、導電率（conductivity）、抵抗、複合抵抗（complex resistance）、インピーダンス、電気化学インピーダンス、電流の流れ、および交流電場により誘導された振動の共振振動数の少なくとも１つから選択される。
【００２６】
検出器要素
さらなる実施態様において、センサーは、基板の電気的な特徴における変化を測定する検出器要素を含む。
【００２７】
電気化学インピーダンス分光法（ＥＩＳ）センサーデバイス
センサーデバイスの一実施態様において、基板は、電気化学セルの作用電極である。
一実施態様において、電気化学セルは、作用電極に加えて、対電極をさらに含む。
【００２８】
さらなる実施態様において、電気化学セルは、参照電極をさらに含む。
さらなる実施態様において、電気化学セルは、ポテンシオスタットをさらに含む。
さらなる実施態様において、電気的な特徴は、電気化学インピーダンスである。
【００２９】
したがって、一実施態様において、センサーデバイスは、電気化学セルの作用電極と電気的に連通するＯｒＸを含み、センサーデバイスは、作用電極の電気化学インピーダンスにおける変化を検出するように設計されている。
【００３０】
ＥＩＳセンサーデバイスの作用電極
一実施態様において、作用電極は、金で構成されるか、または金でコーティングされている。
【００３１】
ＥＩＳセンサーデバイスにおけるＯｒＸの存在
ＯｒＸは、上述したような膜模倣物に存在していてもよい。
一実施態様において、ＯｒＸは、リポソームに存在する。
【００３２】
さらなる実施態様において、ＯｒＸは、人工リポソームに存在する。
さらなる実施態様において、ＯｒＸは、脂質二重層に存在する。
さらなる実施態様において、ＯｒＸは、人工脂質二重層に存在する。
【００３３】
さらなる実施態様において、ＯｒＸは、ナノディスクに存在する。
ＥＩＳセンサーデバイスにおける電極への昆虫ＯｒＸのカップリング
一実施態様において、昆虫ＯｒＸは、作用電極にカップリングされる。
【００３４】
さらなる実施態様において、昆虫ＯｒＸは、リンカー分子を介して作用電極にカップリングされる。
さらなる実施態様において、リンカー分子は、ＯｒＸと電極との電気的な連通が可能になる程度に短い。
【００３５】
一実施態様において、リンカー分子は、電極が受容体から分離することを防ぐ程度に短い。
さらなる実施態様において、リンカー分子は、１６−メルカプトヘキサデカン酸（１６−ＭＨＤＡ）、６−メルカプトヘキサデカン酸（Mecaptohexadecanoic acid）（６−ＭＨＤＡ）および６−メルカプトヘキサン酸（ＭＨＡ）から選択される。
【００３６】
好ましい実施態様において、リンカー分子は、６−メルカプトヘキサン酸（ＭＨＡ）である。
さらなる実施態様において、リンカーは、自己組織化単分子（ＳＡＭ）層の一部である。
【００３７】
したがって、一実施態様において、昆虫ＯｒＸは、リンカー分子で構成されるＳＡＭ層を介して電極にカップリングされる。
好ましい実施態様において、昆虫ＯｒＸは、６−メルカプトヘキサン酸（ＭＨＡ）リンカー分子で構成されるＳＡＭ層を介して電極にカップリングされる。
【００３８】
ＥＩＳセンサーにおける分析物の検出
さらなる実施態様において、センサーは、昆虫ＯｒＸへの分析物の結合を検出することが可能である。
【００３９】
さらなる実施態様において、センサーは、環境において、昆虫ＯｒＸに結合する分析物の存在を検出することが可能である。
好ましくは、検出は、分析物に特異的である。
【００４０】
さらなる実施態様において、昆虫ＯｒＸへの分析物の結合は、作用電極の電気化学インピーダンスを変化させる。
好ましい実施態様において、作用電極の電気化学インピーダンスは、昆虫ＯｒＸに分析物が結合すると減少する。
【００４１】
好ましい実施態様において、センサーによって検出された分析物の量または昆虫ＯｒＸへの結合が変化すると、作用電極の電気化学インピーダンスは、減少する。
検出器要素
さらなる実施態様において、センサーは、検出器要素を含む。さらなる実施態様において、検出器要素は、作用電極の電気化学インピーダンスにおける変化を検出するか、または測定する。
【００４２】
半導体ベースのセンサーデバイス
センサーデバイスの一実施態様において、基板は、半導体材料である。あらゆる好適な半導体材料を使用することができる。
【００４３】
センサーデバイスの一実施態様において、半導体材料は、グラフェン、酸化物、ドープシリコン、導電性ポリマー、およびカーボンナノチューブ（ＣＮＴ）の少なくとも１つであるか、またはそれで構成される。
【００４４】
カーボンナノチューブ電界効果トランジスタ（ＣＮＴ−ＦＥＴ）センサーデバイス
一実施態様において、基板は、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）で構成される。カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）は、単壁、二重壁もしくは多重壁、またはそれらの組合せであってもよい。好ましい実施態様において、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）は、単壁である。
【００４５】
さらなる実施態様において、基板は、カーボンナノチューブ電界効果トランジスタ（ＣＮＴ−ＦＥＴ）装置のチャネルを形成する。
一実施態様において、ＣＮＴ−ＦＥＴ装置は、ソース電極およびドレイン電極を含む。
【００４６】
さらなる実施態様において、チャネルは、ソース電極とドレイン電極との間に見出されるか、またはそこに形成される。
さらなる実施態様において、チャネルは、ソース電極およびドレイン電極と電気的に連通する。
【００４７】
したがって、一形態において、本発明は、カーボンナノチューブ電界効果トランジスタ（ＣＮＴ−ＦＥＴ）装置のチャネルにおいて、少なくとも１つのカーボンナノチューブと電気的に連通する昆虫の匂い物質受容体（ＯｒＸ）を含むセンサーデバイスを提供する。
【００４８】
さらなる実施態様において、カーボンナノチューブ電界効果トランジスタ（ＣＮＴ−ＦＥＴ）装置はまた、ゲート電極で構成される。
ＣＮＴ−ＦＥＴセンサーデバイスにおけるＯｒＸの存在
ＯｒＸは、上述したような膜模倣物に存在していてもよい。
【００４９】
好ましい実施態様において、ＯｒＸは、ナノディスクに存在する。
カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）へのＯｒＸのカップリング
一実施態様において、ＯｒＸは、チャネルにおいて、カーボンナノチューブにカップリングされる。
【００５０】
さらなる実施態様において、カップリングにより、ＯｒＸがカーボンナノチューブと電気的に連通した状態になる。
昆虫ＯｒＸの機能化（官能基化、functionalisation）
一実施態様において、昆虫ＯｒＸは、ＣＮＴへのカップリングが容易になるように機能化される。
【００５１】
一実施態様において、昆虫ＯｒＸは、ｈｉｓ−タグで機能化される。
それゆえに、一実施態様において、ＯｒＸは、ｈｉｓ−タグを含む。
好ましくは、ｈｉｓ−タグは、ＯｒＸタンパク質のＮ末端にある。
【００５２】
ＣＮＴの機能化
一実施態様において、ＣＮＴは、昆虫ＯｒＸへのカップリングが容易になるように機能化される。
【００５３】
さらなる実施態様において、ＣＮＴは、ニッケル（Ｎｉ）−ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）で機能化される。
カップリング
さらなる実施態様において、ＯｒＸは、ｈｉｓ−タグとの親和性結合を介してＣＮＴにカップリングされる。
【００５４】
したがって、一実施態様において、ｈｉｓ−タグを有するＯｒｘは、Ｎｉ−ＮＴＡで機能化されたＣＮＴに結合する。
ＣＮＴ−ＦＥＴセンサーにおける分析物の検出
さらなる実施態様において、センサーは、昆虫ＯｒＸへの分析物の結合を検出することが可能である。
【００５５】
さらなる実施態様において、センサーは、環境において、昆虫ＯｒＸに結合する分析物の存在を検出することが可能である。
好ましくは、分析物の検出は、特異的である。
【００５６】
さらなる実施態様において、昆虫ＯｒＸへの分析物の結合は、ＣＮＴ−ＦＥＴ装置におけるソース−ゲイン電流を変化させる。
好ましい実施態様において、ソース−ゲイン電流は、昆虫ＯｒＸに分析物が結合すると減少する。
【００５７】
好ましい実施態様において、センサーによって検出される分析物の量または昆虫ＯｒＸへの結合が増加するにつれて、ソース−ゲイン電流は、より減少する。
検出器要素
さらなる実施態様において、センサーは、検出器要素を含む。さらなる実施態様において、検出器要素は、ソース−ドレイン電流における変化を検出または測定する。
【００５８】
水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）センサーデバイス
センサーデバイスの一実施態様において、基板は、水晶振動子マイクロバランスにおける共振器要素である。
【００５９】
一実施態様において、共振器要素は、圧電材料、少なくとも１種の圧電性結晶、および少なくとも１種の水晶振動子であるかまたはそれで構成される。好ましい実施態様において、共振器要素は、水晶共振子である。
【００６０】
一実施態様において、水晶振動子は、金でコーティングされている。
電気的な特徴
一実施態様において、電気的な特徴は、共振器要素に適用された交流電場により誘導された振動の共振振動数である。
【００６１】
ＱＣＭセンサーデバイスの電極
一実施態様において、共振器要素は、その対向する２つの側に電極が取り付けられている。
【００６２】
一実施態様において、電極は、金で構成されるか、または金でコーティングされている。
ＱＣＭセンサーデバイスにおけるＯｒＸの存在
ＯｒＸは、上述したような膜模倣物中に存在していてもよい。
【００６３】
一実施態様において、ＯｒＸは、リポソームに存在する。
さらなる実施態様において、ＯｒＸは、人工リポソームに存在する。
さらなる実施態様において、ＯｒＸは、脂質二重層に存在する。
【００６４】
さらなる実施態様において、ＯｒＸは、人工脂質二重層に存在する。
好ましい実施態様において、ＯｒＸは、リポソーム中に存在する。
ＱＣＭセンサーデバイスにおける共振器要素への昆虫ＯｒＸのカップリング
一実施態様において、昆虫ＯｒＸは、共振器要素にカップリングされる。
【００６５】
さらなる実施態様において、昆虫ＯｒＸは、リンカー分子を介して共振器要素にカップリングされる。
さらなる実施態様において、リンカー分子は、ＯｒＸと共振器要素との電気的な連通が可能になる程度に短い。
【００６６】
一実施態様において、リンカー分子は、共振器要素が受容体から分離することを防ぐ程度に短い。
さらなる実施態様において、リンカー分子は、１６−メルカプトヘキサデカン酸（１６−ＭＨＤＡ）、６−メルカプトヘキサデカン酸（６−ＭＨＤＡ）および６−メルカプトヘキサン酸（ＭＨＡ）から選択される。
【００６７】
好ましい実施態様において、リンカー分子は、６−メルカプトヘキサン酸（ＭＨＡ）である。
さらなる実施態様において、リンカーは、自己組織化単分子層（ＳＡＭ）の一部である。
【００６８】
したがって、一実施態様において、昆虫ＯｒＸは、リンカー分子で構成されるＳＡＭ層を介して共振器要素にカップリングされる。
好ましい実施態様において、昆虫ＯｒＸは、６−メルカプトヘキサン酸（ＭＨＡ）リンカー分子で構成されるＳＡＭ層を介して共振器要素にカップリングされる。
【００６９】
ＱＣＭセンサーを用いた分析物の検出
さらなる実施態様において、センサーは、昆虫ＯｒＸへの分析物の結合を検出することが可能である。
【００７０】
さらなる実施態様において、センサーは、環境において、昆虫ＯｒＸに結合する分析物の存在を検出することが可能である。
好ましくは、検出は、分析物に特異的である。
【００７１】
さらなる実施態様において、昆虫ＯｒＸへの分析物の結合は、共振器要素に適用された交流電場により誘導された共振振動数を変化させる。
一実施態様において、共振振動数は、昆虫ＯｒＸに分析物が結合すると増加する。
【００７２】
さらなる実施態様において、共振振動数は、昆虫ＯｒＸに分析物が結合すると減少する。
検出器要素
さらなる実施態様において、センサーは、検出器要素を含む。さらなる実施態様において、検出器要素は、共振器要素に適用された交流電場により誘導された共振器要素における共振振動数における変化を検出または測定する。
【００７３】
一実施態様において、検出器要素は、周波数分析器である。
本発明のセンサーデバイスを使用して分析物の結合を検出する方法
さらなる形態において、本発明は、分析物を検出する方法であって、
ａ）本発明のセンサーにおいて、分析物を昆虫ＯｒＸに結合させる工程、
ｂ）基板の電気的な特徴における変化を検出する工程
を含み、
基板の電気的な特徴における変化が分析物の検出を示す、上記方法を提供する。
【００７４】
本発明のセンサーデバイスを使用して環境における分析物の存在を検出する方法
さらなる形態において、本発明は、環境における分析物の存在を検出する方法であって、
ａ）本発明のセンサーを、分析物を含有する環境に曝露する工程、
ｂ）センサーにおいて、分析物を昆虫ＯｒＸに結合させる工程
ｃ）基板の電気的な特徴における変化を検出する工程
を含み、
基板の電気的な特徴における変化が環境における分析物の存在を示す、上記方法を提供する。
【００７５】
本発明のＥＩＳセンサーデバイスを使用して分析物の結合を検出する方法
さらなる形態において、本発明は、分析物を検出する方法であって、
ａ）本発明の電気化学セルにおいて、分析物を昆虫ＯｒＸに結合させる工程、
ｂ）作用電極における電気化学インピーダンスにおける変化を測定する工程
を含み、電気化学インピーダンスにおける変化が分析物の検出を示す、上記方法を提供する。
【００７６】
本発明のＥＩＳセンサーデバイスを使用して環境中の分析物の存在を検出する方法
さらなる形態において、本発明は、環境における分析物の存在を検出する方法であって、
ａ）本発明のセンサーを、分析物を含有する環境に曝露する工程、
ｂ）本発明の電気化学セルにおいて、分析物を昆虫ＯｒＸに結合させる工程、
ｃ）作用電極の電気化学インピーダンスにおける変化を測定すること
を含み、電気化学インピーダンスにおける変化が環境における分析物の存在を示す、上記方法を提供する。
【００７７】
本発明のＣＮＴ−ＦＥＴセンサーデバイスを使用して分析物の結合を検出する方法
さらなる形態において、本発明は、分析物を検出する方法であって、
ａ）本発明のセンサーにおいて、分析物を昆虫ＯｒＸに結合させる工程、
ｂ）ＣＮＴ−ＦＥＴ装置で、ソース−ゲイン電流における変化を測定する工程
を含み、ソース−ゲイン電流における変化が分析物の検出を示す、上記方法を提供する。
【００７８】
本発明のＣＮＴ−ＦＥＴセンサーデバイスを使用して環境中の分析物の存在を検出する方法
さらなる形態において、本発明は、環境における分析物の存在を検出する方法であって、
ａ）本発明のセンサーを、分析物を含有する環境に曝露する工程、
ｂ）センサーにおいて、分析物を昆虫ＯｒＸに結合させる工程
ｃ）ＣＮＴ−ＦＥＴ装置で、ソース−ゲイン電流における変化を測定する工程
を含み、ソース−ゲイン電流における変化はが環境における分析物の存在を示す、上記方法を提供する。
【００７９】
本発明のＱＣＭセンサーデバイスを使用して分析物の結合を検出する方法
さらなる形態において、本発明は、分析物を検出する方法であって、
ａ）本発明のセンサーにおいて、分析物を昆虫ＯｒＸに結合させる工程、
ｂ）ＱＣＭ装置で、共振器要素に適用された交流電場により誘導された共振器要素における共振振動数における変化を測定する工程
を含み、共振振動数における変化が分析物の検出を示す、上記方法を提供する。
【００８０】
本発明のＱＣＭセンサーデバイスを使用して環境中の分析物の存在を検出する方法
さらなる形態において、本発明は、環境における分析物の存在を検出する方法であって、
ｄ）本発明のセンサーを、分析物を含有する環境に曝露する工程、
ｅ）センサーにおいて、分析物を昆虫ＯｒＸに結合させる工程
ｆ）ＱＣＭ装置で、共振器要素に適用された交流電場により誘導された共振器要素の共振振動数の変化を測定する工程
を含み、共振振動数における変化が環境における分析物の存在を示す、上記方法を提供する。
【００８１】
本発明のセンサーデバイスの製造方法
さらなる形態において、本発明は、センサーデバイスを製造する方法であって、昆虫ＯｒＸとセンサーデバイスの基板との間に電気的な連通を確立する工程を含み、センサーデバイスは、基板の電気的な特徴における変化を検出するように設計されている、上記方法を提供する。
【００８２】
一実施態様において、本方法は、基板に昆虫ＯｒＸをカップリングする工程を含む。
一実施態様において、ＯｒＸがカップリングされた基板がセンサーデバイスに組み立てられる前に、ＯｒＸは、基板にカップリングされる。
【００８３】
好ましくは、センサーの要素、カップリングおよび機能化は、本明細書に記載される通りである。
本発明のＥＩＳセンサーデバイスの製造方法
実施態様において、基板は、本明細書に記載されるような電気化学セルの作用電極である。
【００８４】
したがって、一実施態様において、方法は、昆虫ＯｒＸと電気化学セルの作用電極との電気的な連通を確立する工程を含み、電気化学セルは、作用電極の電気化学インピーダンスにおける変化を検出するように設計されており、このようにしてセンサーデバイスが形成される。
【００８５】
一実施態様において、本方法は、作用電極に昆虫ＯｒＸをカップリングする工程を含む。
一実施態様において、ＯｒＸがカップリングされた作用電極がセンサーデバイスに組み立てられる前に、ＯｒＸは、作用電極にカップリングされる。
【００８６】
好ましくは、センサーの要素、カップリングおよび機能化は、本明細書に記載される通りである。
電極への昆虫ＯｒＸのカップリング
さらなる実施態様において、昆虫ＯｒＸは、リンカーを介して電極にカップリングされる。
【００８７】
一実施態様において、リンカー分子は、ＯｒＸと電極との電気的な連通が可能になる程度に短い。
さらなる実施態様において、リンカー分子は、電極が受容体から分離することを防ぐ程度に短い。
【００８８】
さらなる実施態様において、リンカー分子は、１６−メルカプトヘキサデカン酸（１６−ＭＨＤＡ）、６−メルカプトヘキサデカン酸（６−ＭＨＤＡ）および６−メルカプトヘキサン酸（ＭＨＡ）から選択される。
【００８９】
好ましい実施態様において、リンカー分子は、６−メルカプトヘキサン酸（ＭＨＡ）である。
さらなる実施態様において、リンカーは、自己組織化単分子（ＳＡＭ）層の一部である。
【００９０】
したがって、一実施態様において、昆虫Ｏｒｘは、リンカー分子で構成されるＳＡＭ層を介して電極にカップリングされる。
好ましい実施態様において、昆虫Ｏｒｘは、６−メルカプトヘキサン酸（ＭＨＡ）リンカー分子で構成されるＳＡＭ層を介して電極にカップリングされる。
【００９１】
さらなる実施態様において、リンカーまたはＭＨＡのカルボキシル基の活性化は、昆虫ＯｒＸのカップリングの前に実行される。
好ましくは、リンカーまたはＭＨＡのカルボキシル基の活性化は、電極に昆虫ＯｒＸをカップリングする前に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の溶液を使用して実行される。
【００９２】
センサーデバイスにおけるＯｒｃｏの欠如
好ましい実施態様において、センサーは、昆虫の匂い物質コレセプター（Ｏｒｃｏ）を含まない。
【００９３】
本発明のＣＮＴ−ＦＥＴセンサーデバイスの製造方法
実施態様において、基板は、本明細書に記載されるようなＣＮＴ−ＦＥＴ装置のチャネルである。
【００９４】
したがって、一実施態様において、方法は、昆虫ＯｒＸと、ＣＮＴ−ＦＥＴ装置のチャネルとの間に電気的な連通を確立する工程を含み、ＣＮＴ−ＦＥＴ装置は、ＣＮＴ−ＦＥＴ装置のソース−ゲイン電流における変化を検出するように設計されており、このようにしてセンサーデバイスが形成される。
【００９５】
一実施態様において、本方法は、チャネルに昆虫ＯｒＸをカップリングする工程を含む。
一実施態様において、ＯｒＸがカップリングされたチャネルがセンサーデバイスに組み立てられる前に、ＯｒＸは、チャネルにカップリングされる。
【００９６】
好ましくは、センサーの要素、カップリングおよび機能化は、本明細書に記載される通りである。
カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）へのＯｒＸのカップリング
一実施態様において、ＯｒＸは、チャネル中で、カーボンナノチューブにカップリングされる。
【００９７】
昆虫ＯｒＸの機能化
一実施態様において、昆虫ＯｒＸは、ＣＮＴへのカップリングが容易になるように機能化される。
【００９８】
一実施態様において、昆虫ＯｒＸは、ｈｉｓ−タグで機能化される。
それゆえに、一実施態様において、ＯｒＸは、ｈｉｓ−タグを含む。
好ましくは、ｈｉｓ−タグは、ＯｒＸタンパク質のＮ末端にある。
【００９９】
ＣＮＴの機能化
一実施態様において、ＣＮＴは、昆虫ＯｒＸへのカップリングが容易になるように機能化される。
【０１００】
さらなる実施態様において、ＣＮＴは、ニッケル（Ｎｉ）−ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）で機能化される。
カップリング
さらなる実施態様において、ＯｒＸは、ｈｉｓ−タグとの親和性結合を介してＣＮＴにカップリングされる。
【０１０１】
したがって、一実施態様において、ｈｉｓ−タグを有するＯｒＸは、Ｎｉ−ＮＴＡで機能化されたＣＮＴに結合する。
センサーデバイスにおけるＯｒｃｏの欠如
好ましい実施態様において、センサーは、昆虫の匂い物質コレセプター（Ｏｒｃｏ）を含まない。
【０１０２】
本発明のＱＣＭセンサーデバイスの製造方法
実施態様において、基板は、水晶振動子マイクロバランスの水晶共振子である。
したがって、一実施態様において、方法は、昆虫ＯｒＸと、水晶振動子マイクロバランスの共振器要素との間に電気的な連通を確立する工程を含み、水晶振動子マイクロバランスは、ＱＣＭ装置で、共振器要素に適用された交流電場により誘導された共振器要素の共振振動数における変化を検出するように設計されており、このようにしてセンサーデバイスが形成される。
【０１０３】
一実施態様において、本方法は、共振器要素に昆虫ＯｒＸをカップリングする工程を含む。
一実施態様において、ＯｒＸがカップリングされた作用共振器要素がセンサーデバイスに組み立てられる前に、ＯｒＸは、共振器要素にカップリングされる。
【０１０４】
好ましくは、共振器要素は、水晶共振子である。
好ましくは、センサーの要素、カップリングおよび機能化は、本明細書に記載される通りである。
【０１０５】
共振器要素への昆虫ＯｒＸのカップリング
さらなる実施態様において、昆虫ＯｒＸは、リンカーを介して共振器要素にカップリングされる。
【０１０６】
一実施態様において、リンカー分子は、ＯｒＸと共振器要素との電気的な連通が可能になる程度に短い。
さらなる実施態様において、リンカー分子は、共振器要素が受容体から分離することを防ぐ程度に短い。
【０１０７】
さらなる実施態様において、リンカー分子は、１６−メルカプトヘキサデカン酸（１６−ＭＨＤＡ）、６−メルカプトヘキサデカン酸（６−ＭＨＤＡ）および６−メルカプトヘキサン酸（ＭＨＡ）から選択される。
【０１０８】
好ましい実施態様において、リンカー分子は、６−メルカプトヘキサン酸（ＭＨＡ）である。
さらなる実施態様において、リンカーは、自己組織化単分子層（ＳＡＭ）の一部である。
【０１０９】
したがって、一実施態様において、昆虫Ｏｒｘは、リンカー分子で構成されるＳＡＭ層を介して共振器要素にカップリングされる。
好ましい実施態様において、昆虫Ｏｒｘは、６−メルカプトヘキサン酸（ＭＨＡ）リンカー分子で構成されるＳＡＭ層を介して共振器要素にカップリングされる。
【０１１０】
さらなる実施態様において、リンカーまたはＭＨＡのカルボキシル基の活性化は、昆虫ＯｒＸのカップリングの前に実行される。
好ましくは、リンカーまたはＭＨＡのカルボキシル基の活性化は、共振器要素に昆虫ＯｒＸをカップリングする前に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の溶液を使用して実行される。
【０１１１】
センサーデバイスにおけるＯｒｃｏの欠如
好ましい実施態様において、センサーは、昆虫の匂い物質コレセプター（Ｏｒｃｏ）を含まない。
【０１１２】
発明の詳細な説明
本出願人の発明は初めて、昆虫の匂い物質受容体（ＯｒＸ）の匂いを感知する力を便利なセンサー様式とうまく組み合わせている。
【０１１３】
改善された便利さに加えて、本発明のセンサーデバイスは、驚くべきことに、昆虫ＯＲの使用に基づく以前のアッセイシステムと比べて、検出の感度における極めて顕著な改善を提供する。
【０１１４】
さらに本発明のセンサーは、驚くべきことに、匂い物質コレセプター（Ｏｒｃｏ）の非存在下で機能することができ、それに対して全ての以前の昆虫ＯＲの使用に基づくアッセイシステムは、ＯｒＸとＯｒｃｏの両方を含むことに頼っている。
【０１１５】
昆虫の匂い物質受容体複合体
昆虫の匂い物質受容体（ＯＲ）は、リガンド開口型非選択的カチオンチャネルを形成する７回膜貫通タンパク質の新規のファミリーのメンバーである。図１に提示されるように、高度に保存された昆虫の匂い物質コレセプター（Ｏｒｃｏ）は、インビボで活性なチャネルを形成すると考えられ、匂い物質の特異性は、リガンド結合サブユニット（ＯｒＸ）の一群によって付与される。
【０１１６】
インビボにおいて、昆虫ＯｒＸタンパク質のＮ末端は、細胞質内であり、一方でＣ末端は、細胞外である。この形態は、哺乳類Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）と逆の形態である。加えて、哺乳類ＧＰＣＲとは異なり、昆虫ＯＲは、リガンド開口型非選択的カチオンチャネルとして機能し、シグナルの大部分はＧタンパク質と独立している１５。
【０１１７】
Ｈｏｐｆら、２０１５１６はさらに、昆虫ＯＲの予測された構造とそれが哺乳類ＧＰＣＲと無関係なことを論じている。
昆虫ＯｒＸタンパク質は、ＯｒＸポリペプチドと記載される場合もあり、当業者周知である。本発明で使用するために好適なＯｒＸ配列としては、多様なＶＯＣ（４４〜４６）を検出することができるキイロショウジョウバエＯＲ遺伝子ファミリー（４３）、多様なＶＯＣ（４８、４９）を検出することができるガンビアハマダラカ（Anopheles gambiae）ＯＲ遺伝子ファミリー（４７）の配列；加えて、公知のＯＲファミリーの近年のリストに記載された他の昆虫種からのＯＲ遺伝子ファミリーの配列が挙げられる。Montagne 2015（１）の表Ｉを参照されたい。一実施態様において、昆虫ＯｒＸタンパク質は、このような参考文献１、４３および４７で開示された配列、またはそれらのバリアント（variant）もしくは機能的なフラグメントを含む。
【０１１８】
一実施態様において、ＯｒＸは、組換え技術によって発現されたタンパク質である。
好ましい実施態様において、ＯｒＸは、組換え発現の後に精製されている。
一実施態様において、ＯｒＸは、昆虫嗅覚細胞から直接的に精製されていない。
【０１１９】
さらなる実施態様において、ＯｒＸは、センサーデバイスにおいて、昆虫嗅覚細胞中に存在しない。
本発明のセンサーデバイスで使用するための基板
本発明のセンサーデバイスで使用するための基板は、電気的な特徴における変化を測定できるあらゆる基板であってもよい。好ましくは、電気的な特徴における変化は、ＯｒＸと分析物との相互作用の結果としての変化である。
【０１２０】
基板は、ＯｒＸがカップリングできる表面も提供する。
好適な基板は、電極、半導体材料、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）、グラフェン、酸化物、ドープシリコン、導電性ポリマー、共振器要素の少なくとも１つを含むか、またはそれで構成される。
【０１２１】
一実施態様において、共振器要素は、圧電材料、少なくとも１種の圧電性結晶、および水晶振動子であるかまたはそれで構成される。好ましい実施態様において、共振器要素は、水晶共振子である。
【０１２２】
本発明のセンサーデバイスで測定するための電気的な特徴
一実施態様において、電気的な特徴は、導電率、抵抗、複合的な抵抗、インピーダンス、電気化学インピーダンス、電流の流れ、および交流電場により誘導された振動の共振振動数の少なくとも１つから選択される。
【０１２３】
ＥＩＳデバイス
一実施態様において、本発明のセンサーデバイスは、化学的セルの作用電極における電気化学インピーダンスにおける変化を検出するように設計されている。したがって、この実施態様におけるセンサーデバイスは、電気化学インピーダンス分光法（ＥＩＳ）に合わせて設計される。
【０１２４】
電気化学インピーダンス分光法（ＥＩＳ）
電気化学インピーダンス分光法は当業者周知であり、電気化学システムの研究に長く採用されてきた。インピーダンスを測定する場合、小さい正弦波ＡＣ電圧プローブ（典型的には２〜１０ｍＶ）が適用され、電流応答が決定される。同位相（in-phase）の電流応答は、インピーダンスの実際の（抵抗性の）要素を決定するが、一方で位相が異なる（out-of-phase）電流応答は、仮想の（容量性の）要素を決定する。ＡＣプローブ電圧は、システム応答が線形であり単純な等価回路分析が可能になる程度に十分小さくあるべきである。インピーダンス方法は、それらが、広範に異なる時間定数の物理化学的プロセスを特徴付けること、高い周波数で電子移動をサンプリングすること、および低い周波数で物質移動をサンプリングすることが可能であるという点でかなり強力である。
【０１２５】
インピーダンスの結果は、抵抗器およびキャパシタの等価回路、例えば単純な電気化学システムを説明するのにしばしば使用されるランドルス回路に通常フィッティングされる。図３に、定位相エレメント（ＣＰＥ）と直列であり、電荷移動抵抗（Ｒｃｔ）およびワールブルグ拡散エレメント（Ｗ）と並列の溶液抵抗（Ｒｓ）を含むランドルス回路の概略図［Ｒｓ＋ＣＰＥ／（Ｒｃｔ＋Ｗ）］を示す。
【０１２６】
分析物がこれらの等価回路パラメーターの１つまたはそれより多くに影響を与え、これらのパラメーターが干渉種（interfering species）の影響を受けない場合、インピーダンス方法は、分析物検出に使用することができる。
【０１２７】
ワールブルグインピーダンスは、有効な拡散係数を測定するのに使用できるが、分析用途に有用であることはめったにない。ほとんどの場合に分析物検出に有用な等価回路エレメントは、ＲｃｔおよびＣＰＥである。測定されたキャパシタンスは通常、金（Ａｕ）電極上の感知層に結合する分析物などのいくつかの要素の一連の組合せに起因する。
【０１２８】
電気化学インピーダンス分光法（ＥＩＳ）デバイス
ＥＩＳデバイスは、典型的には、
・作用電極（ＷＥ）
・対電極（ＣＥ）
・参照電極（ＲＥ）
・ポテンシオスタット／ガルバノスタット（ＰＧＳＴＡＴ）
を有する電気化学セルを含む。
【０１２９】
用途に応じて、電気化学セルへの機器の接続は、異なる方法で構築することができる（または構築されていなければならない）。
ポテンシオスタットモードでは、ポテンシオスタット／ガルバノスタット（ＰＧＳＴＡＴ）は、作用電極（ＷＥ）と参照電極（ＲＥ）との間の電位差が明確であり、使用者によって特定された値に相当するように、作用電極（ＷＥ）に対する対電極（ＣＥ）の電位を正確に制御するだろう。ガルバノスタットモードでは、ＷＥとＣＥとの間の電流の流れが制御される。ＲＥとＷＥとの間の電位差およびＣＥとＷＥとの間に流れる電流は、連続的にモニターされる。ＰＧＳＴＡＴを使用することによって、使用者によって特定された値（すなわち適用された電位または電流）は、負のフィードバックメカニズムを使用することによって、測定中いつも正確に制御される。
【０１３０】
対電極（ＣＥ）、は、電気化学セル中の電流回路を閉じるのに使用される電極である。これは通常、不活性材料（例えばＰｔ、Ａｕ、グラファイト、グラッシーカーボン）で作製され、通常、電気化学反応に参加しない。電流はＷＥとＣＥとの間に流れるため、ＣＥ（電子のソース／シンク）の合計表面積は、調査中の電気化学的プロセスの速度論においてそれが限定要因にならないように、ＷＥの面積より大きくなければならない。
【０１３１】
参照電極（ＲＥ）は、安定な周知の電極電位を有する電極であり、これは、電位の制御および測定に関する電気化学セルにおける基準点として使用される。参照電極電位の高い安定性は通常、酸化還元反応の各参加物質が一定（緩衝化または飽和）濃度を有する酸化還元系を採用することによって達成される。さらに、参照電極を通る電流の流れは、ゼロ近くに（理想的にはゼロに）維持され、これは、電位計での極めて高い入力インピーダンス（＞１００ＧＯｈｍ）と共に、ＣＥを用いてセルの電流回路を閉じることによって達成される。
【０１３２】
作用電極（ＷＥ）は、目的の反応が起こる電気化学システム中の電極である。一般的な作用電極は、Ａｕ、Ａｇ、Ｐｔ、グラッシーカーボン（ＧＣ）およびＨｇのドロップおよびフィルム（Hg drop and film）などの不活性材料で作製することができる。
【０１３３】
ＥＩＳデバイスはまた、作用電極の電気特性における変化を測定するための要素を含んでいてもよい。例えば、この要素は、周波数分析器であり得る。周波数分析器は、ポテンシオスタット／ガルバノスタットに連結されていてもよい。
【０１３４】
ＣＮＴ−ＦＥＴデバイス
一実施態様において、本発明のセンサーデバイスは、ＣＮＴ−ＦＥＴ装置のソース−ゲイン電流における変化を検出するように設計されている。
【０１３５】
カーボンナノチューブ電界効果トランジスタ（ＣＮＴ−ＦＥＴ）
カーボンナノチューブ電界効果トランジスタ（ＣＮＴ−ＦＥＴ）は、従来の金属酸化物半導体電界効果トランジスタ（ＭＯＳ−ＦＥＴ）構造におけるバルクシリコンの代わりに、チャネル材料として単一のカーボンナノチューブまたはカーボンナノチューブのアレイを利用する電界効果トランジスタである。
【０１３６】
ＣＮＴ−ＦＥＴデバイス
ＣＮＴ−ＦＥＴデバイスは、典型的には、
ａ）ソース電極（ＳＥ）
ｂ）ドレイン電極（ＤＥ）
ｃ）ゲート電極（ＧＥ）、および
ｄ）カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）で構成される少なくとも１つのチャネル
を含む。
【０１３７】
ゲート電極は、ソースおよびドレイン電極にわたり電流を制御するのに使用される。ゲート電極がオンのとき、電流の流れは、チャネルを通じてソースおよびドレイン電極にわたりモジュレートすることができる。
【０１３８】
電極は、典型的には少なくとも１種の金属で構成される。好ましい金属としては、これらに限定されないが、白金、金、クロム、銅、アルミニウム、ニッケル（tickle）、パラジウムおよびチタンが挙げられる。
【０１３９】
好ましい実施態様において、チャネルは、カーボンナノチューブで構成される。
ＣＮＴ−ＦＥＴデバイスはまた、ソース−ドレイン電流における変化を測定するための要素を含んでいてもよい。
【０１４０】
ＱＣＭデバイス
一実施態様において、本発明のセンサーデバイスは、水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）における共振器要素の共振振動周波数における変化を検出するように設計されている。
【０１４１】
一実施態様において、共振器要素は、圧電材料、少なくとも１種の圧電性結晶、および少なくとも１種の水晶振動子であるかまたはそれで構成される。好ましい実施態様において、共振器要素は、水晶共振子である。
【０１４２】
一実施態様において、水晶振動子は、金でコーティングされている。
水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）
水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）技術は当業者周知であり、水晶共振子の周波数における変化を測定することによって単位面積当たりの質量変動を測定する。共振（resonance）は、音響共振器表面における酸化物の成長／減衰またはフィルム堆積による小さい質量の付与または除去によって乱される。ＱＣＭは、真空、気相および液体環境中で使用することができる。これは、認識部位で機能化された表面への分子（特にタンパク質）の親和性を測定するのに極めて有効である。ＱＣＭはまた、生体分子間の相互作用を調査するのにも使用されてきた。周波数測定は、容易に高精度になるため、１μｇ／ｃｍ２未満もの低いレベルまで質量密度を簡単に測定することができる。周波数を測定することに加えて、誘電正接（dissipation factor）（共振帯域幅と同等である）が、分析を補助するためにしばしば測定される。誘電正接は、共振のＱ値（quality factor）の逆数、Ｑ−１＝ｗ／ｆｒであり、これは、系中の減衰を定量し、サンプルの粘弾性と関連する。
【０１４３】
水晶は、圧電性作用を受ける結晶のファミリーの一種である。適用された電圧と機械的な歪みとの関係は周知であり、これは、電気的な手段によって音響共振をプロービングすることを可能にする。水晶振動子に交流を適用することは、振動を誘導するだろう。適切にカットされた結晶の電極間の交流により、持続的な剪断波が生じる。Ｑ値は、周波数と帯域幅との比率であり、１０６もの高さになり得る。このような狭い共振により高度に安定なオシレーターが生じ、共振振動数決定において高い精度がもたらされる。ＱＣＭは、この容易さと精度を感知に活用する。一般的な器具によって、４〜６ＭＨｚの範囲の基本的な共振周波数を有する結晶において分解能を１Ｈｚまで下げることができる。
【０１４４】
水晶振動子の振動の周波数は、結晶の厚さに一部依存する。通常操作中、他の影響のある変数は一定のままであることから、厚さにおける変化は、周波数における変化に直接相関する。結晶表面上に物質が堆積するにつれて厚さは増加し、その結果として振動の周波数は、最初の値から減少する。一部の簡易化した仮定によれば、この周波数の変化は、定量して、Ｓａｕｅｒｂｒｅｙの方程式を使用して正確に質量変化に相関させることができる。
【０１４５】
水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）デバイス
典型的なＱＣＭのための装置は、水冷チューブ、保持ユニット、マイクロドットフィードスルーを介した周波数感知器具、加振源、ならびに測定および記録デバイスを含有する。
【０１４６】
ＱＣＭは、電極を両方の側に蒸着させた共振器要素（典型的には、薄い圧電性プレート）からなる。圧電効果により、電極にわたるＡＣ電圧は剪断変形を誘導し、逆もまた同様である。電気機械的なカップリングは、電気的な手段によって音響共振を検出する単純な方法を提供する。それ以外の状況において、それはあまり重要ではない。
【０１４７】
本発明のセンサーデバイス
第１の形態において、本発明は、基板と電気的に連通する昆虫の匂い物質受容体（ＯｒＸ）を含むセンサーデバイスであって、基板の電気的な特徴における変化を検出するように設計されている、上記センサーデバイスを提供する。
【０１４８】
センサーの要素
さらなる形態において、本発明は、本明細書で定義されるように基板と電気的に連通するＯｒＸを含む、センサーデバイスのための要素を提供する。この要素は、本発明に係るセンサーデバイスに付与するのに有用である。
【０１４９】
一形態において、本発明は、基板と電気的に連通する昆虫の匂い物質受容体（ＯｒＸ）を含むセンサーデバイスの要素を提供する。
一形態において、本発明は、基板の電気的な特徴における変化を検出するように設計されている、本発明のセンサーデバイスの要素を含むセンサーデバイスを提供する。
【０１５０】
さらなる形態において、本発明は、センサーデバイスの要素を製造する方法であって、昆虫ＯｒＸと基板との間に電気的な連通を確立する工程を含む、上記方法を提供する。
さらなる形態において、本発明は、センサーデバイスを組み立てる方法であって、本発明のセンサーデバイスの要素を、センサーデバイスに付与することを含み、組み立てられたセンサーデバイスは、基板の電気的な特徴における変化を検出するように設計されている、上記方法を提供する。
【０１５１】
センサーデバイスの要素およびセンサーデバイスのある特定の実施態様において、昆虫の匂い物質受容体（ＯｒＸ）、電気的な連通、基板、立体配置、および検出は、本明細書に記載した通りである。
【０１５２】
電気化学インピーダンス分光法（ＥＩＳ）装置
一実施態様において、センサーデバイスは、電気化学セルを含む。
一実施態様において、電気化学セルは、少なくとも２つの電極を含む。
【０１５３】
さらなる実施態様において、電気化学セルは、少なくとも：
ａ）作用電極（ＷＥ）、および
ｂ）対電極（ＣＥ）
を含む。
【０１５４】
好ましい実施態様において、電気化学セルはまた、参照電極（ＲＥ）も含む。
さらなる実施態様において、電気化学セルは、ポテンシオスタット／ガルバノスタット（ＰＧＳＴＡＴ）を含む。
【０１５５】
好ましい実施態様において、電気化学セルは、
ａ）作用電極（ＷＥ）、
ｂ）対電極（ＣＥ）、
ｃ）参照電極（ＲＥ）、および
ｄ）ポテンシオスタット／ガルバノスタット（ＰＧＳＴＡＴ）
の全てを含む。
【０１５６】
対電極
一実施態様において、対電極は、白金（Ｐｔ）、金（Ａｕ）、グラファイトまたはグラッシーカーボン（ＧＣ）から選択される材料で構成されるか、またはそれでコーティングされている。
【０１５７】
好ましくは、対電極は、白金（Ｐｔ）で構成される。
好ましくは、対電極は、白金（Ｐｔ）線である。
参照電極
好ましくは、参照電極は、銀／塩化銀（Ａｇ／ＡｇＣｌ）参照電極である。
【０１５８】
作用電極
一実施態様において、電気化学インピーダンス分光法（ＥＩＳ）装置は、少なくとも１つの作用電極を含む。
【０１５９】
電極は、あらゆる好適な材料で構成されていてもよいし、またはそれでコーティングされていてもよい。電極は、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、白金（Ｐｔ）、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）およびグラッシーカーボン（ＧＣ）から選択される材料で構成されていてもよいし、またはそれでコーティングされていてもよい。
【０１６０】
好ましい実施態様において、電極は、金で構成されるか、または金でコーティングされている。
ポテンシオスタット／ガルバノスタット（ＰＧＳＴＡＴ）
好ましくは、ポテンシオスタット／ガルバノスタット（ＰＧＳＴＡＴ）は、ポテンシオスタットモードで使用される。
【０１６１】
検出器要素
さらなる実施態様において、センサーは、検出器要素を含む。検出器要素は、基板の電気的な特徴における変化を検出または測定する。
【０１６２】
一実施態様において、検出器要素は、周波数分析器である。さらなる実施態様において、周波数分析器は、ポテンシオスタット／ガルバノスタット（ＰＧＳＴＡＴ）に連結されている。
【０１６３】
昆虫ＯｒＸの調製
昆虫ＯｒＸを組換え技術で発現させ、精製するための方法は、当業者公知である１４。
昆虫ＯｒＸの存在
さらなる実施態様において、ＯｒＸは、分析物との相互作用に応答してコンフォメーション変化を受けることが可能な形態で存在する。
【０１６４】
一実施態様において、昆虫ＯｒＸは、膜模倣物に存在する。
膜模倣物は、名前が示唆する通り、天然膜を模倣するものであり、インビボで見出されるのと同じかまたは類似したコンフォメーションで受容体を支持することができる。
【０１６５】
膜模倣物は、リポソーム、アンフィポール、洗剤ミセル、ナノベシクル、脂質二重層、およびナノディスクから選択することができる。
好ましくは、膜模倣物は、人工物である。
【０１６６】
一実施態様において、膜模倣物は、リポソームである。
一実施態様において、膜模倣物は、人工リポソームである。
さらなる実施態様において、膜模倣物は、脂質二重層である。
【０１６７】
さらなる実施態様において、膜模倣物は、人工脂質二重層である。
リポソームにおいて昆虫受容体を再構成するための方法は、当業界において公知である１４。
【０１６８】
作用電極上での昆虫ＯｒＸを含む脂質二重層の形成
理論に制限されることは望まないが、出願人は、一部の実施態様において、リポソーム中の昆虫ＯｒＸが作用電極に適用されると、リポソームが構造を変化させて電極上に脂質二重層を形成すると仮定している。出願人は、受容体のリガンド／分析物結合ドメインがリガンド／分析物に接近可能になるように、昆虫ＯｒＸは、インビボで細胞膜に見出されるものと類似のまたは同じコンフォメーションで脂質二重層中に埋め込まれると仮定している。
【０１６９】
理論に制限されることは望まないが、出願人は、他の実施態様において、リポソームは、作用電極に結合したとき、リポソームのままであることを仮定している。これは図２１に例示される。
【０１７０】
基板へのＯｒＸのカップリング
さらなる実施態様において、ＯｒＸは、基板にカップリングされる。
基板にタンパク質をカップリングするための多数の方法が当業者公知である。このような方法としては、共有結合による化学的カップリング、光化学的な架橋、表面のコーティング／修飾、金の表面化学、タンパク質親和性タグ、ビオチン−ストレプトアビジン連結、抗体固定、および操作された表面結合ペプチド配列の使用が挙げられる。
【０１７１】
また本発明のデバイスで使用するためのＯｒＸタンパク質は、アミン基、ヒスチジンタグ、または基板にタンパク質をカップリングするのに使用される一部の他の官能基を含んでいてもよい。アミン基を有するタンパク質の場合、使用者は、基板にカップリングされた脱離基をアミン基を用いて置換し、基板にタンパク質を結合させてもよい。カップリングは、必ずしも求核脱離基反応によって達成されなくてもよく、カップリングは、共有結合（例えばアミド結合）、イオン結合、水素結合、または金属配位によって行われてもよい。配位の一例として、ＯｒＸタンパク質は、ヒスチジンタグとニッケルとの配位によって、基板にカップリングされてもよい。またＯｒＸタンパク質は、システイン残基によって基板にカップリングされてもよい。一部の実施態様において、天然に結合されるＯｒＸタンパク質は、システイン残基を含む。これは、天然に存在するものでもよいし、またはこのような残基は、天然または組換えタンパク質に意図的に取り込まれていてもよい。さらなる情報は、ＷＯ２０１２／０５０６４６に見出すことができる。
【０１７２】
一部の実施態様において、基板の表面は、膜貫通タンパク質に基板を連結する官能基を含む。１つの非限定的な例において、材料の表面は、カルボキシル化されたジアゾニウム塩で機能化（官能化、fanctionalized）されていてもよく、これは、自発的にカーボンナノチューブなどの基板への共有結合を形成する。アミンおよびアミド官能基は、好適であるとみなされ、フェノール基／芳香族官能基も同様である。
【０１７３】
ＥＩＳのためのリンカー
さらなる実施態様において、昆虫ＯｒＸは、リンカーを介して電極にカップリングされる。
【０１７４】
一実施態様において、リンカー分子は、ＯｒＸと電極との電気的な連通が可能になる程度に短い。
さらなる実施態様において、リンカー分子は、電極が受容体から分離することを防ぐ程度に短い。
【０１７５】
さらなる実施態様において、リンカー分子は、１６−メルカプトヘキサデカン酸（１６−ＭＨＤＡ）、６−メルカプトヘキサデカン酸（６−ＭＨＤＡ）および６−メルカプトヘキサン酸（ＭＨＡ）から選択される。
【０１７６】
好ましい実施態様において、リンカーは、６−メルカプトヘキサン酸（ＭＨＡ）である。
さらなる実施態様において、リンカーは、自己組織化単分子（ＳＡＭ）層の一部である。
【０１７７】
したがって、一実施態様において、ＳＡＭ層は、６−メルカプトヘキサン酸（ＭＨＡ）で構成される。
さらなる実施態様において、ＭＨＡのカルボキシル基の活性化は、昆虫ＯｒＸのカップリングの前に実行される。
【０１７８】
好ましくは、ＭＨＡのカルボキシル基の活性化は、電極に昆虫ＯｒＸをカップリングする前に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の溶液を使用して実行される。
【０１７９】
分析物の検出
さらなる実施態様において、センサーは、昆虫ＯｒＸへの分析物の結合を検出することが可能である。
【０１８０】
さらなる実施態様において、センサーは、環境において、昆虫ＯｒＸに結合する分析物の存在を検出することが可能である。
好ましくは、分析物の検出は、特異的である。
【０１８１】
さらなる実施態様において、昆虫ＯＲへの分析物の結合は、作用電極における電気化学インピーダンスを変化させる。
カーボンナノチューブ電界効果トランジスタ（ＣＮＴ−ＦＥＴ）装置
好ましくは、カーボンナノチューブ電界効果トランジスタ（ＣＮＴ−ＦＥＴ）装置は、少なくとも２つの端部を含む。さらなる実施態様において、ＣＮＴ−ＦＥＴ装置は、少なくともソース電極およびドレイン電極を含む。
【０１８２】
一実施態様において、ＣＮＴ−ＦＥＴ装置は、
ａ）ソース電極
ｂ）ドレイン電極
ｃ）ゲート電極
ｄ）カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）で構成される少なくとも１つのチャネル
を含む。
【０１８３】
好ましくは、ゲート電極は、銀／塩化銀（Ａｇ／ＡｇＣｌ）線である。
検出器要素
さらなる実施態様において、センサーは、検出器要素を含む。検出器要素は、ソース−ドレイン電流における変化を検出または測定する。
【０１８４】
電気的な特徴における変化は、手動で、またはコンピューター制御下で操作される従来の電子機器を使用して測定することができる。例えば、コンピューター化された実験設定は、バイアス電圧および様々な値のゲート電圧を適用するための、ナショナルインスツルメンツ（National Instrument）のＰＣＩ−６７２２ＤＡＱボードを含んでいてもよい。次いでケースレー（Keithley）の６４８５ピコ電流計を、電流を測定するのに使用でき、それにより全Ｉ−Ｖｇ曲線を提供することができる。単一の基板上に配置された多くのデバイスを測定したいというケースにおいて、切り換えマトリックス（ケースレー７００１）または他のマルチプレクサーを使用してもよい。
【０１８５】
アジレント（Agilent）の４１５６Ｃパラメーター分析器も、全ての電気的な測定に使用することができる２０。パラメーター分析器は、優れた感度を有し、フェムトアンペアスケールで電流を正確に測定することができる。
【０１８６】
昆虫ＯｒＸの存在
さらなる実施態様において、ＯｒＸは、分析物との相互作用に応答してコンフォメーション変化を受けることが可能な形態で存在する。
【０１８７】
一実施態様において、昆虫ＯｒＸは、膜模倣物に存在する。
膜模倣物は、名前が示唆する通り、天然膜を模倣するものであり、インビボで見出されるのと同じかまたは類似したコンフォメーションで受容体を支持することができる。
【０１８８】
膜模倣物は、リポソーム、アンフィポール、洗剤ミセル、ナノベシクル、脂質二重層、およびナノディスクから選択することができる。
好ましくは、膜模倣物は、人工物である。
【０１８９】
好ましい実施態様において、膜模倣物は、ナノディスクである。
本発明のＣＮＴ−ＦＥＴデバイス中のチャネルへのＯｒＸのカップリング
一実施態様において、ＯｒＸは、チャネル中で、カーボンナノチューブにカップリングされる。
【０１９０】
昆虫ＯｒＸの機能化（官能化、fanctionalization）
一実施態様において、昆虫ＯｒＸは、ＣＮＴへのカップリングが容易になるように機能化される。
【０１９１】
一実施態様において、昆虫ＯｒＸは、ｈｉｓ−タグで機能化される。
それゆえに、一実施態様において、ＯｒＸは、ｈｉｓ−タグを含む。
好ましくは、ｈｉｓ−タグは、ＯｒＸタンパク質のＮ末端にある。
【０１９２】
ＣＮＴの機能化
一実施態様において、ＣＮＴは、昆虫ＯｒＸへのカップリングが容易になるように機能化される。
【０１９３】
さらなる実施態様において、ＣＮＴは、ニッケル（Ｎｉ）−ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）で機能化される。
カップリング
さらなる実施態様において、ＯｒＸは、ｈｉｓ−タグとの親和性結合を介してＣＮＴにカップリングされる。
【０１９４】
したがって、一実施態様において、ｈｉｓ−タグを有するＯｒｘは、Ｎｉ−ＮＴＡで機能化されたＣＮＴに結合する。
分析物の検出
さらなる実施態様において、センサーは、昆虫ＯｒＸへの分析物の結合を検出することが可能である。
【０１９５】
さらなる実施態様において、センサーは、環境において、昆虫ＯｒＸに結合する分析物の存在を検出することが可能である。
好ましくは、分析物の検出は、特異的である。
【０１９６】
さらなる実施態様において、分析物が昆虫ＯＲに結合することは、本発明のＣＮＴ−ＦＥＴ装置のチャネル中の電気的なソース−ゲイン電流を変化させる。
水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）装置
好ましくは、水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）装置は、
ａ）共振器要素
ｂ）加振源要素
ｃ）周波数を感知する要素
を含む。
【０１９７】
共振器要素
一実施態様において、共振器要素は、圧電材料、少なくとも１種の圧電性結晶、および少なくとも１種の水晶振動子であるかまたはそれで構成される。好ましい実施態様において、共振器要素は、水晶共振子である。
【０１９８】
一実施態様において、水晶振動子は、金でコーティングされている。
一実施態様において、共振器要素は、その対向する２つの側に電極が取り付けられている。
【０１９９】
一実施態様において、電極は、金で構成されるか、または金でコーティングされている。
好ましい実施態様において、共振器要素は、少なくとも１つの昆虫ＯｒＸと電気的に連通している。
【０２００】
加振源要素
一実施態様において、加振源要素は、共振器要素に交流電場を適用するように設計されている。
【０２０１】
一実施態様において、交流電場は、共振器要素の対向する側に取り付けられた電極を介して適用される。
周波数を感知する要素
一実施態様において、周波数を感知する要素は、共振器要素の振動周波数を測定するように設計されている。一実施態様において、周波数を感知する要素は、共振器要素の振動周波数における変化を測定するように設計されている。
【０２０２】
昆虫ＯｒＸの存在
さらなる実施態様において、ＯｒＸは、分析物との相互作用に応答してコンフォメーション変化を受けることが可能な形態で存在する。
【０２０３】
一実施態様において、昆虫ＯｒＸは、膜模倣物に存在する。
膜模倣物は、名前が示唆する通り、天然膜を模倣するものであり、インビボで見出されるのと同じかまたは類似したコンフォメーションで受容体を支持することができる。
【０２０４】
膜模倣物は、リポソーム、アンフィポール、洗剤ミセル、ナノベシクル、脂質二重層、およびナノディスクから選択することができる。
好ましくは、膜模倣物は、人工である。
【０２０５】
好ましい実施態様において、膜模倣物は、リポソームである。
さらなる実施態様において、膜模倣物は、脂質二重層である。
さらなる実施態様において、膜模倣物は、人工脂質二重層である。
【０２０６】
リポソームにおいて昆虫受容体を再構成するための方法は、当業界において公知である１４。
共振器要素上での昆虫ＯｒＸを含む脂質二重層の形成
理論に制限されることは望まないが、出願人は、一部の実施態様において、リポソーム中の昆虫ＯｒＸが作用電極に適用されると、リポソームが構造を変化させて共振器要素上に脂質二重層を形成すると仮定している。出願人は、受容体のリガンド／分析物結合ドメインがリガンド／分析物に接近可能になるように、昆虫ＯｒＸは、インビボで細胞膜に見出されるものと類似のまたは同じコンフォメーションで脂質二重層中に埋め込まれると仮定している。
【０２０７】
理論に制限されることは望まないが、出願人は、他の実施態様において、リポソームは、作用電極に結合したとき、リポソームのままであることを仮定している。これは図２１に例示される。
【０２０８】
ＱＣＭのためのリンカー
さらなる実施態様において、昆虫ＯｒＸは、リンカーを介して共振器要素にカップリングされる。
【０２０９】
一実施態様において、リンカー分子は、ＯｒＸと共振器要素との電気的な連通が可能になる程度に短い。
さらなる実施態様において、リンカー分子は、共振器要素が受容体から分離することを防ぐ程度に短い。
【０２１０】
さらなる実施態様において、リンカー分子は、１６−メルカプトヘキサデカン酸（１６−ＭＨＤＡ）、６−メルカプトヘキサデカン酸（６−ＭＨＤＡ）および６−メルカプトヘキサン酸（ＭＨＡ）から選択される。
【０２１１】
好ましい実施態様において、リンカーは、６−メルカプトヘキサン酸（ＭＨＡ）である。
さらなる実施態様において、リンカーは、自己組織化単分子層（ＳＡＭ）の一部である。
【０２１２】
したがって、一実施態様において、ＳＡＭ層は、６−メルカプトヘキサン酸（ＭＨＡ）で構成される。
さらなる実施態様において、ＭＨＡのカルボキシル基の活性化は、昆虫ＯｒＸのカップリングの前に実行される。
【０２１３】
好ましくは、ＭＨＡのカルボキシル基の活性化は、電極に昆虫ＯｒＸをカップリングする前に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の溶液を使用して実行される。
【０２１４】
分析物の検出
さらなる実施態様において、センサーは、昆虫ＯｒＸへの分析物の結合を検出することが可能である。
【０２１５】
さらなる実施態様において、センサーは、環境において、昆虫ＯｒＸに結合する分析物の存在を検出することが可能である。
好ましくは、分析物の検出は、特異的である。
【０２１６】
さらなる実施態様において、昆虫ＯｒＸへの分析物の結合は、共振器要素に適用された交流電場により誘導された共振器要素の共振振動数を変化させる。
検出の感度
上記で論じられたように、本発明のセンサーは驚くほどよく作用する。出願人は、本発明のセンサーデバイスが、昆虫ＯＲの使用を含む公知のアッセイのどれよりも顕著に高い感度を有することを示した。
【０２１７】
一実施態様において、センサーは、１×１０−３Ｍ未満、好ましくは１×１０−３Ｍ未満、より好ましくは１×１０−４Ｍ未満、より好ましくは１×１０−５Ｍ未満、より好ましくは１×１０−６Ｍ未満、より好ましくは１×１０−７Ｍ未満、より好ましくは１×１０−８Ｍ未満、より好ましくは１×１０−９Ｍ未満、より好ましくは１×１０−１０Ｍ未満、より好ましくは１×１０−１１Ｍ未満、より好ましくは１×１０−１２Ｍ未満、より好ましくは１×１０−１３Ｍ未満、より好ましくは１×１０−１４Ｍ未満、より好ましくは１×１０−１５Ｍ未満、より好ましくは１×１０−１６Ｍ未満、より好ましくは１×１０−１７Ｍ未満、より好ましくは１×１０−１８Ｍ未満の濃度で分析物の存在を検出することができる。
【０２１８】
ダイナミックレンジ
一実施態様において、センサーにおいて、分析物の検出に関するダイナミックレンジは、少なくとも２、好ましくは少なくとも３、より好ましくは少なくとも４、より好ましくは少なくとも５、より好ましくは少なくとも６、より好ましくは少なくとも７、より好ましくは少なくとも８、より好ましくは少なくとも９、より好ましくは少なくとも１０桁の分析物濃度である。
【０２１９】
センサーデバイスにおけるＯｒｃｏの欠如
これまでに公知の昆虫の匂い物質受容体を使用する全てのシステム／アッセイは、昆虫ＯｒＸおよび匂い物質コレセプター（Ｏｒｃｏ）の組合せを利用する。これは、コグネイトリガンド（cognate ligand）に特異的に結合してリガンドの結合に対する応答を変換することが可能な適切な組合せで、ＯｒＸ／Ｏｒｃｏを有する昆虫匂い物質受容体（ＯＲ）複合体を生産するために、従来技術ではＯｒＸとＯｒｃｏ要素の両方を要求したことについての非常に強いバイアスを意味する。
【０２２０】
これまでに論じられた通り、昆虫ＯＲ複合体（ＯｒｃｏおよびＯｒＸ）は、リガンド開口型イオンチャネルを形成し、これが、インビボで、またおそらくは従来技術のセンサーシステム／アッセイにおいて、シグナルを変換するイオンチャネルを通るイオンの輸送手段である。
【０２２１】
したがって、さらなる、そして非常に驚くべき本発明の特徴は、本発明のセンサーが、Ｏｒｃｏコレセプターの非存在下でリガンド／分析物結合を検出することができることである。
【０２２２】
一実施態様において、センサーは、１０：１より低い、好ましくは１：１より低い、好ましくは０．１：１より低い、好ましくは０．０１：１より低い、好ましくは０．００１：１より低い、好ましくは０．０００１：１より低い、好ましくは０．００００１：１より低い比率のＯｒＸ：Ｏｒｃｏを含む。
【０２２３】
好ましい実施態様において、センサーは、昆虫の匂い物質コレセプター（Ｏｒｃｏ）を含まない。
本発明のセンサーの他の利点
本発明のセンサーは、便利さ、携帯できること、安定性、迅速な検出、感度、および測定の容易さに関して、これまでに公知の昆虫ＯＲベースのシステム／アッセイを上回る多数のさらなる潜在的な利点を提供する。
【０２２４】
分析物の媒体
分析物は、ガス状または液状媒体中にあってもよい。
任意の捕獲要素
センサーデバイスは、加えて、分析物を捕獲し、受容体に分析物を提示するための要素を含んでいてもよい。一部の実施態様において、この要素は、ＯｒＸへ提示するために揮発性分析物を捕獲することに関して有用であり得る。これは、液相または気相のいずれかにおいて標的ＶＯＣを取り扱うためのマイクロチャネルの使用を含んでいてもよい（５０）。マイクロ流体システムは、液相中（５１、５２）および気相中（５３、５２、５４）でセンサー表面に標的分子を送達するように設計されている。
【０２２５】
多重化（multiplexing）
本発明は、複数の異なるＯｒＸタンパク質を使用する多重アプローチを予期する。この方法で、使用者は、複数の分析物に対して高感度を有する多重デバイスを構築することができる。このような多重デバイスは、本明細書で記載される通り、数十、数百、またはさらには数千ものセンサーを含んでいてもよい。また多重デバイスは、ダブルチェックをデバイスに導入するように、同じＯｒＸにカップリングされる２つまたはそれより多くのセンサーを含んでいてもよい。
【０２２６】
本発明はまた、それぞれ異なるまたは同じ受容体を含む複数のセンサー基板を有するチップの使用も予期する。本発明のセンサーデバイスの要素は、このようなチップであってもよい。
【０２２７】
本発明のセンサーデバイスを使用する方法
本発明は、上述したような分析物および／または環境における分析物の存在を検出するための本発明のセンサーデバイスの使用方法を提供する。
【０２２８】
対照および較正
使用者は、デバイスの電気的な特徴を、対照、公知の分析物、またはその両方にデバイスを曝露したときに測定された対応する電気的な特徴と比較することができる。使用者はまた、サンプル中の１種またはそれより多くの分析物の存在を見積もることもできる。これは、サンプルで観察された電気的な特徴を、目的の分析物の公知の量を有する対照または標準から集められたデータポイントに対応するその電気的な特徴の検量線と比較することによって達成することができる。この方法で、使用者は、デバイスが接触したサンプル中に存在する分析物の濃度を見積もることができる。
【０２２９】
使用者は、１つまたはそれより多くの公知の分析物へのデバイスの曝露に対応する、デバイスの１つまたはそれより多くの電気的な特徴のライブラリーを構築することができる。例えば、使用者は、デバイスを様々な濃度の分析物に曝露したときに観察される電気的な特徴を表す結果のライブラリーを構築することができる。
【０２３０】
本発明のセンサーデバイスの製造方法
センサーデバイス
さらなる形態において、本発明は、センサーデバイスを製造する方法であって、昆虫ＯｒＸとセンサーデバイスの基板との間に電気的な連通を確立する工程を含み、センサーデバイスは、基板の電気的な特徴における変化を検出するように設計されている、上記方法を提供する。
【０２３１】
一実施態様において、本方法は、基板に昆虫ＯｒＸをカップリングする工程を含む。
一実施態様において、ＯｒＸは、ＯｒＸがカップリングされた基板がセンサーデバイスに組み立てられる前に、基板にカップリングされる。
【０２３２】
好ましくは、センサーの要素、カップリングおよび機能化は、本明細書に記載される通りである。
センサーの要素
さらなる形態において、本発明は、センサーデバイスのための要素を生産するための方法であって、要素は、本明細書で定義されるように基板と電気的に連通するＯｒＸを含む、上記方法を提供する。本方法は、本明細書に記載されるように、ＯｒＸと基板との間に電気的な連通を確立する工程を含む。この要素は、本発明に係るセンサーデバイスに付与するのに有用である。
【０２３３】
さらなる実施態様において、本発明は、センサーデバイスを生産するための方法であって、本明細書で記載されるように、要素を他の要素に付与して、本発明に係るセンサーデバイスを生産することを含む、上記方法を提供する。
【０２３４】
本発明のＥＩＳセンサーデバイスの製造方法
実施態様において、基板は、本明細書に記載されるような電気化学セルの作用電極である。
【０２３５】
したがって、一実施態様において、方法は、昆虫ＯｒＸと電気化学セルの作用電極との電気的な連通を確立する工程を含み、電気化学セルは、作用電極の電気化学インピーダンスにおける変化を検出するように設計されており、このようにしてセンサーデバイスが形成される。
【０２３６】
一例として、本発明のＥＩＳデバイスの製造のための好適な方法は、実施例のセクションに記載される。この実施例は、本発明の範囲を限定することを意図していない。
本発明のＣＮＴ−ＦＥＴセンサーデバイスの製造方法
実施態様において、基板は、本明細書に記載されるようなＣＮＴ−ＦＥＴ装置のチャネルである。
【０２３７】
したがって、一実施態様において、方法は、昆虫ＯｒＸとＣＮＴ−ＦＥＴ装置のチャネルとの電気的な連通を確立する工程を含み、ＣＮＴ−ＦＥＴ装置のチャネルは、ＣＮＴ−ＦＥＴ装置のソース−ゲイン電流における変化を検出するように設計されており、このようにしてセンサーデバイスが形成される。
【０２３８】
一例として、本発明のＣＮＴ−ＦＥＴデバイスの製造のための好適な方法は、実施例のセクションに記載される。この実施例は、本発明の範囲を限定することを意図していない。
【０２３９】
本発明のＱＣＭセンサーデバイスの製造方法
実施態様において、基板は、本明細書に記載されるような水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）の共振器要素である。
【０２４０】
したがって、一実施態様において、方法は、昆虫ＯｒＸと、水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）との共振器要素との間に電気的な連通を確立する工程を含み、ＱＣＭは、共振器要素に適用された交流電場により誘導された振動の共振振動数における変化を検出するように設計されており、このようにしてセンサーデバイスが形成される。
【０２４１】
一例として、本発明のＱＣＭデバイスの製造のための好適な方法は、実施例のセクションに記載される。この実施例は、本発明の範囲を限定することを意図していない。
一般的な定義および方法
ＯｒＸタンパク質／ポリペプチドおよびフラグメント
用語「ポリペプチド」は、本明細書で使用される場合、アミノ酸残基が共有結合によるペプチド結合によって連結された、あらゆる長さを有する、ただし好ましくは全長タンパク質を含み、少なくとも５個のアミノ酸のアミノ酸鎖を含む。本発明で使用するためのポリペプチドは、好ましくは、組換えまたは合成技術を使用して部分的または全体的に生産される。
【０２４２】
ポリペプチドの「フラグメント」は、好ましくはポリペプチドの機能を発揮する、および／またはポリペプチドの３次元構造を提供するポリペプチドの部分配列である。
ＯｒＸポリペプチドの「機能的なフラグメント」は、分析物と結合し、分析物の結合のときにコンフォメーション変化を受ける機能を発揮することができるＯｒＸの部分配列であり、ここでコンフォメーション変化は、機能的なフラグメントを結合させた基板の電気特性における変化をもたらす。
【０２４３】
用語「組換え」は、その天然のコンテクスト中でその周りにある配列から除去され、および／またはその天然のコンテクストに存在しない配列と組み換えられるポリヌクレオチド配列を指す。
【０２４４】
「組換え」ポリペプチド配列は、「組換え」ポリヌクレオチド配列からの翻訳によって生産される。
バリアント
ＯｒＸポリペプチドのバリアントは、１つまたはそれより多くのアミノ酸残基が欠失、置換または付加された、具体的に同定された配列と異なるポリペプチド配列を指す。バリアントは、天然に存在する対立遺伝子バリアント（allelic variant）であってもよいし、または天然に存在しないバリアントであってもよい。バリアントは、同じ種由来であってもよいし、または他の種由来であってもよく、ホモログ、パラログおよびオルソログを含んでいてもよい。ある特定の実施態様において、同定されたポリペプチドのバリアントは、本発明のポリペプチドまたはポリペプチドの生物活性と同じまたは類似の生物活性を有する。好ましくは、ＯｒＸポリペプチドバリアントは、分析物と結合し、分析物の結合のときにコンフォメーション変化を受ける機能を発揮することができ、ここでコンフォメーション変化は、機能的なフラグメントが結合した基板の電気特性における変化をもたらす。
【０２４５】
バリアントポリペプチド配列は、好ましくは、本発明の配列に、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を呈示する。同一性は、好ましくは同定されたポリペプチドの全長にわたり計算される。
【０２４６】
ポリペプチド配列の同一性は、以下の方式で決定することができる。ワールドワイドウェブ上のＮＣＢＩウェブサイトftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/から公的に入手可能なｂｌ２ｓｅｑで、ＢＬＡＳＴＰ（プログラムのＢＬＡＳＴスイート、バージョン２．２．５［２００２年１１月］より）を使用して、対象のポリペプチド配列を候補ポリペプチド配列と比較する。
【０２４７】
ポリペプチド配列の同一性はまた、グローバル配列アライメントプログラムを使用して、候補ポリヌクレオチド配列と対象ポリヌクレオチド配列との間のオーバーラップの全長にわたり計算することもできる。上記で論じられたように、ＥＭＢＯＳＳ−ニードル（http:/www.ebi.ac.uk/emboss/align/で入手可能）およびギャップ（Huang, X. （1994）On Global Sequence Alignment. Computer Applications in the Biosciences 10、227〜235）も、ポリペプチド配列の同一性を計算するための好適なグローバル配列アライメントプログラムである。
【０２４８】
ポリペプチドの％配列同一性を計算するための好ましい方法は、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｘ（Jeanmouginら、1998、Trends Biochem. Sci.23、403〜405）を使用して比較するために配列を並べることに基づく。
【０２４９】
その生物活性を有意に変更しない記載されたポリペプチド配列の１つまたは数種のアミノ酸の保存的置換も本発明に含まれる。当業者は、表現型的にはサイレントのアミノ酸置換をなす方法を認識しているだろう（例えば、Bowieら、1990、Science 247、1306を参照）。
【０２５０】
ポリペプチドを生産するための方法
本発明で使用されるポリペプチドは、バリアントポリペプチドを含め、当業界において周知のペプチド合成方法、例えば固相技術を使用する直接のペプチド合成（例えばStewartら、1969、Solid-Phase Peptide Synthesis、WH Freeman Co、カリフォルニア州サンフランシスコ）、または例えばアプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）の４３１Ａペプチドシンセサイザー（カリフォルニア州フォスターシティー）を使用する自動合成を使用して調製することができる。ポリペプチドの突然変異した形態も、このような合成中に生産することができる。
【０２５１】
好ましくは、ポリペプチドおよびバリアントポリペプチドは、以下で論じられるように好適な宿主細胞中で組換え発現され、細胞から分離される。ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現するために、当業者周知の方法によって都合のよい形態で合成することができる。ポリヌクレオチド配列は、天然に存在するものであってもよいし、または例えば配列が組換え発現された細胞にとって好ましいコドン出現頻度（codon usage）の使用を介して、天然に存在する配列から適合させてもよい。
【０２５２】
コンストラクト（construct）およびベクターを生産するための方法
本発明で使用するための遺伝学的コンストラクトは、本発明で使用するためのＯｒＸポリペプチドをコードする１つまたはそれより多くのポリヌクレオチド配列を含み、例えば細菌、真菌、昆虫、哺乳類または植物などの生物を形質転換するのに有用であり得る。
【０２５３】
遺伝学的コンストラクトおよびベクターを生産および使用するための方法は当業界において周知であり、一般的に、Sambrookら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Press、1987；Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology、Greene Publishing、1987）に記載されている。
【０２５４】
ポリヌクレオチド、コンストラクトまたはベクターを含む宿主細胞を生産するための方法
ポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、本発明で使用するためのポリペプチドの組換え生産に関して、当業界において周知の方法（例えばSambrookら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Press、1987；Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology、Greene Publishing、1987）において有用である。このような方法は、本発明のポリペプチドの発現に好適な、またはそれを助長する条件下で、適切な培地で宿主細胞を培養することを含んでいてもよい。発現された組換えポリペプチドは、任意に培養物に分泌させてもよく、次いで、当業界において周知の方法（例えばDeutscher編、1990、Methods in Enzymology、182巻、Guide to Protein Purification）によって培地、宿主細胞または培養培地から分離してもよい。
【０２５５】
用語「含む」は、本明細書で使用される場合、「から少なくとも部分的になる」を意味する。本明細書における用語「含む」を含む各記述を解釈するとき、この用語の後に記載される１つまたは複数の特徴以外の特徴も存在し得る。「含むｋ（comprise）」および「含む（comprises）」などの関連用語は、同じように解釈されることとする。
【０２５６】
本明細書で開示された数値範囲への言及（例えば１〜１０）はまた、その範囲内の全ての合理的な数値への言及（例えば、１、１．１、２、３、３．９、４、５、６、６．５、７、８、９および１０）、さらに、その範囲内の合理的な数値のあらゆる範囲（例えば、２〜８、１．５〜５．５および３．１〜４．ｋ７）への言及も含むことが意図され、それゆえに、本明細書で明示的に開示された全ての範囲の全ての部分範囲がそれにより明示的に開示される。これらは具体的に意図されるものの単なる例であり、列挙された下限値から上限値の間の数値のあらゆる可能な組合せが、本出願において類似の方式で明示的に述べられているとみなされるものとする。
【０２５７】
代替の実施態様または構成は、本明細書において例示された、記載された、または言及されたパーツ、エレメントまたは機構の２つまたはそれより多くの、いずれかのまたは全ての組合せを含んでいてもよいことが理解されるものとする。
【０２５８】
本発明はまた、本願明細書で個々にまたは集合的に言及または示されたパーツ、エレメントおよび機構、ならびに前記パーツ、エレメントまたは機構のいずれか２つまたはそれより多くのいずれかのまたは全ての組合せで構成されるように幅広く述べることができる。
【０２５９】
本発明が関する分野の当業者であれば、添付の特許請求の範囲で定義した通りの本発明の範囲から逸脱することなく、構造における多くの変化および本発明の広範に様々な実施態様および適用に想到するであろう。本明細書における開示および記載は単に例示的なものであり、決して限定を意図していない。本明細書で、本発明が属する分野において公知の等価値がある具体的な整数が述べられる場合、このような公知の等価値は、個々に明示されたのと同様にして本明細書に含まれるとみなされる。
【０２６０】
本発明は、添付の非限定的な図面を参照してよりよく理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０２６１】
【図１】図１は、リガンド開口型非選択的カチオンチャネルを生産するための、匂い物質が結合したＯｒＸサブユニットおよびＯｒｃｏサブユニットで構成される昆虫ＯＲ膜複合体の概略図である。オレンジ色の丸は、結合した匂い物質を表す。
【図２】図２は、電極のクリーニングから始まり、続いてＳＡＭを形成し、ＳＡＭ層上にリポソームを共有結合させることで終わるセンサー製造の概略図である。電気化学的な読み出しは、３つの末端の電気化学的な構成で行われたＥＩＳ測定から得られる。扇形部分が切り抜かれた丸は、リポソームと一体化した昆虫ＯｒＸを表し、小さい三角形は、ＶＯＣリガンドを表す。
【図３】図３は、６４０ｐＭ〜１０μΜの濃度範囲を有するＥ２−ヘキセナールに対するｏｒ３５ａで機能化された電極のインピーダンスエボリューションである。実験データは、記号として提示し、等価回路フィッティング曲線は実線として提示する。
【図４】図４は、１２８ｐＭ〜２μΜの濃度範囲で、Ａ）サリチル酸メチル中でインキュベートしたＯｒ１０ａ、Ｂ）Ｅ２−ヘキセナール中でインキュベートしたＯｒ３５ａ、およびＣ）ヘキサン酸メチル中でインキュベートしたＯｒ２２ａの用量応答曲線である。ネガティブコントロールは、それぞれＯｒ１０ａヘキサン酸メチル、Ｏｒ３５ａ  ＶＵＡＡ１、Ｏｒ２２ａサリチル酸メチルである。
【図５】図５は、ＣＮＴ堆積プロセスの概略図である。（ａ）ＳｉＯ２／Ｓｉを、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）スタンピング方法により２−チオール−ピリジンで機能化し、（ｂ）２−チオール−ピリジンで機能化したＣＮＴ  ＦＥＴを、予め作製されたＣＮＴ  ＤＣＢ懸濁液に浸す。
【図６】電極は、標準的なミクロ電子工学製造の後にＣＮＴフィルムコート基板上に製作される。（ａ）基板にマスクを載せ、その後、紫外線に曝露する；（ｂ）ＡＺ３２６現像液中で現像した後；（ｃ）熱蒸発による金属堆積；（ｄ）アセトン中でのリフトオフ後。
【図７】図７は、絶縁ウェルとしてのフォトレジストにより電極を封止した後のＣＮＴ  ＦＥＴ構造の略図である。
【図８】図８は、ＡＺ１５１８を封止したＣＮＴ  ＦＥＴデバイスの最上部における手作りのＰＤＭＳウェルの写真画像である。
【図９】図９は、電気的な測定のためのセンサーの構成であり、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極が、ゲート電極としてＰＢＳ液体に挿入されている。ＣＮＴ  ＦＥＴ上の電極と接触する２つのプローブは、ソースおよびドレイン電極である。
【図１０】図１０は、元のＣＮＴ  ＦＥＴおよびＯｒ３５ａナノディスクの固定後の同じデバイスの変換特性である。Ｖｄｓ＝２００ｍＶ、ＰＢＳ緩衝液中。
【図１１】図１１は、ＯＲ３５ａナノディスクで機能化されたＣＮＴ  ＦＥＴ（１：１０希釈）からのＰＢＳおよび標的リガンドであるＥ−２−ヘキセナールに対するリアルタイム応答である。（ａ）リアルタイムの電流応答および（ｂ）対数目盛でのＥ−２−ヘキセナール濃度に対して正規化した値（ΔΙ／Ι０）。
【図１２】図１２は、Ｏｒ３５ａナノディスクで機能化されたＣＮＴ  ＦＥＴ（１：１０）、元のＣＮＴ  ＦＥＴおよび空のナノディスクで機能化されたＣＮＴ  ＦＥＴからのＥ−２−ヘキセナール応答に関するリアルタイムの測定である。全てのデバイスは、Ｖｌｇ＝０、Ｖｄｓ＝１００ｍＶおよびｔ＝１秒を有する。
【図１３】図１３は、Ｖｌｇ＝０、Ｖｄｓ＝１００ｍＶ、ｔ＝１秒における、対照リガンドであるヘキサン酸メチルに対するＯＲ３５ａナノディスク（１：１０）で機能化したＣＮＴ  ＦＥＴ応答である。（ａ）電流応答；（ｂ）正規化した電流。ここでＩ０は、分析物の付与を開始する前の電流である。
【図１４Ａ】図１４は、クーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ａ）空の１Ｅ３Ｄ１ナノディスク、ならびにＯｒ１０ａ、Ｏｒ３５ａ、Ｏｒ７１ａおよびＯｒ２２ａ受容体を含有するナノディスク；および（Ｂ）元のＣＮＴおよびＯｒ２２ａナノディスクで機能化されたＣＮＴの実施例の原子間力顕微鏡画像であり、黄色のドットは、Ｏｒ２２ａと会合したナノディスクである。
【図１４Ｂ】図１４は、クーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ａ）空の１Ｅ３Ｄ１ナノディスク、ならびにＯｒ１０ａ、Ｏｒ３５ａ、Ｏｒ７１ａおよびＯｒ２２ａ受容体を含有するナノディスク；および（Ｂ）元のＣＮＴおよびＯｒ２２ａナノディスクで機能化されたＣＮＴの実施例の原子間力顕微鏡画像であり、黄色のドットは、Ｏｒ２２ａと会合したナノディスクである。
【図１５Ａ】（Ａ）元のＣＮＴ  ＦＥＴおよびＯｒ１０ａナノディスクの固定後の同じデバイスの変換特性：Ｖｄｓ＝１００ｍＶ、ＰＢＳ緩衝液中。
【図１５Ｂ】（Ｂ）ＯＲ１０ａナノディスクで共有結合により機能化したＣＮＴ  ＦＥＴ（１：１００希釈）からの、ＰＢＳおよび標的リガンドであるサリチル酸メチル（ＭｅＳａｌ）に対するリアルタイムの電流応答。
【図１５Ｃ】（Ｃ）空のナノディスクで共有結合により機能化されたＣＮＴ  ＦＥＴ（１：１００希釈）からの、ＰＢＳおよび標的リガンドであるサリチル酸メチル（ＭｅＳａｌ）に対するリアルタイムの電流応答。
【図１５Ｄ】（Ｄ）ＯＲ１０ａナノディスクで共有結合により機能化されたＣＮＴ  ＦＥＴ（１：１００希釈）からの、対数目盛でのサリチル酸メチル濃度および陰性対照リガンドであるＥ２−ヘキセナール（Ｅ２Ｈｅｘ）に対して正規化した値（ΔΙ／Ι０）。
【図１５Ｅ】（Ｅ）空のナノディスクで共有結合により機能化されたＣＮＴ  ＦＥＴ（１：１００希釈）からの、対数目盛でのサリチル酸メチル濃度に対して正規化した値（ΔΙ／Ι０）。
【図１６】（Ａ）元のＣＮＴ  ＦＥＴおよびＯｒ２２ａナノディスクの固定後の同じデバイスの変換特性：Ｖｄｓ＝１００ｍＶ、ＰＢＳ緩衝液中。
【図１６Ｂ】（Ｂ）ＯＲ２２ａナノディスクで共有結合により機能化されたＣＮＴ  ＦＥＴ（１：１００希釈）からの、ＰＢＳおよび標的リガンドであるヘキサン酸メチル（ＭｅＨｅｘ）に対するリアルタイムの電流応答。
【図１６Ｃ】（Ｃ）空のナノディスクで共有結合により機能化されたＣＮＴ  ＦＥＴ（１：１００希釈）からの、ＰＢＳおよび標的リガンドであるヘキサン酸メチル（ＭｅＨｅｘ）に対するリアルタイムの電流応答。
【図１６Ｄ】（Ｄ）ＯＲ２２ａナノディスクで共有結合により機能化されたＣＮＴ  ＦＥＴ（１：１００希釈）からの、対数目盛でのヘキサン酸メチル濃度および陰性対照リガンドであるＥ２−ヘキセナール（Ｅ２Ｈｅｘ）に対して正規化した値（ΔΙ／Ι０）。
【図１６Ｅ】（Ｅ）空のナノディスクで共有結合により機能化されたＣＮＴ  ＦＥＴ（１：１００希釈）からの、対数目盛でのヘキサン酸メチル濃度に対して正規化した値（ΔΙ／Ι０）。
【図１７Ａ】（Ａ）元のＣＮＴ  ＦＥＴおよびＯｒ３５ａナノディスクの固定後の同じデバイスの変換特性：Ｖｄｓ＝１００ｍＶ、ＰＢＳ緩衝液中。
【図１７Ｂ】（Ｂ）ＯＲ３５ａナノディスクで共有結合により機能化されたＣＮＴ  ＦＥＴ（１：１００希釈）からの、ＰＢＳおよび標的リガンドであるＥ２−ヘキセナール（Ｅ２Ｈｅｘ）に対するリアルタイムの電流応答。
【図１７Ｃ】（Ｃ）空のナノディスクで共有結合により機能化されたＣＮＴ  ＦＥＴ（１：１００希釈）からの、ＰＢＳおよび標的リガンドであるＥ２−ヘキセナール（Ｅ２Ｈｅｘ）に対するリアルタイムの電流応答。
【図１７Ｄ】（Ｄ）ＯＲ３５ａナノディスクで共有結合により機能化されたＣＮＴ  ＦＥＴ（１：１００希釈）からの、対数目盛でのＥ２−ヘキセナール（Ｅ２Ｈｅｘ）濃度および陰性対照リガンドであるヘキサン酸メチル（ＭｅＨｅｘ）に対して正規化した値（ΔΙ／Ι０）。
【図１７Ｅ】（Ｅ）空のナノディスクで共有結合により機能化されたＣＮＴ  ＦＥＴ（１：１００希釈）からの、対数目盛でのＥ２−ヘキセナール（Ｅ２Ｈｅｘ）濃度に対して正規化した値（ΔΙ／Ι０）。
【図１８Ａ】（Ａ）元のＣＮＴ  ＦＥＴおよびＯｒ７１ａナノディスクの固定後の同じデバイスの変換特性を示す：Ｖｄｓ＝１００ｍＶ、ＰＢＳ緩衝液中。
【図１８Ｂ】（Ｂ）ＯＲ７１ａナノディスクで共有結合により機能化されたＣＮＴ  ＦＥＴ（１：１００希釈）からの、ＰＢＳおよび標的リガンドである４−エチルグアヤコール（４ＥＧ）に対するリアルタイムの電流応答。
【図１８Ｃ】（Ｃ）空のナノディスクで共有結合により機能化されたＣＮＴ  ＦＥＴ（１：１００希釈）からの、ＰＢＳおよび標的リガンドである４−エチルグアヤコール（４ＥＧ）に対するリアルタイムの電流応答。
【図１８Ｄ】（Ｄ）ＯＲ７１ａナノディスクで共有結合により機能化されたＣＮＴ  ＦＥＴ（１：１００希釈）からの、さらに、空のナノディスクで共有結合により機能化されたＣＮＴ  ＦＥＴ（１：１００希釈）からの、対数目盛での４−エチルグアヤコール（４ＥＧ）濃度に対して正規化した値（ΔΙ／Ι０）。
【図１９Ａ】Ａ）標的リガンドであるサリチル酸メチルおよび対照リガンドであるＥ２−ヘキセナールへの応答における、Ｏｒ１０ａナノディスクで機能化した金電極に関する用量応答曲線。
【図１９Ｂ】Ｂ）標的リガンドであるヘキサン酸メチルおよび対照リガンドであるＥ２−ヘキセナールへの応答における、Ｏｒ２２ａナノディスクで機能化した金電極に関する用量応答曲線。
【図１９Ｃ】Ｃ）標的リガンドであるＥ２−ヘキセナールおよび対照リガンドであるサリチル酸メチルへの応答における、Ｏｒ３５ａナノディスクで機能化した金電極に関する用量応答曲線。全ての３つの例において、標的および対照リガンドの結合測定も、空のナノディスクで機能化された金電極を用いて実行される。
【図２０】図２０は、Ｏｒ２２ａが会合したリポソーム調製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥの抗ＦＬＡＧウェスタンブロットを示す。レーンは、１：分子量標準、２：Ｈｉｓ−ＦＬＡＧ−ＣＦＰウェスタンブロット標準、３：ＦＣ１４洗浄剤中で精製されたＨｉｓ−ＦＬＡＧ−ＯＲ２２ａ、４：リポソームに再構成されたＨｉｓ−ＦＬＡＧ−ＯＲ２２ａ、５〜１２：下（レーン５）から上（レーン１２）にかけてのアキュデンツ（Accudenz）の浮遊勾配分画である。Ｈｉｓ−ＦＬＡＧ−ＯＲ２２ａのバンドが上の２つの分画にのみ存在しており、これは、リポソームに再構成されたことを示すことに留意されたい。
【図２１−１】図２１は、それぞれ、そのままの、ＳＡＭで改変された、ＮＨＳ−ＥＤＣとカップリングされた、およびＯｒ２２ａ／リポソームが固定された金表面の、ＡＦＭの高さの画像（ａ〜ｄ）、高さの画像上にマークされたラインによって示された粗さのプロファイル（ｅ〜ｈ）、および３Ｄ画像（ｉ〜ｌ）を示す。
【図２１−２】図２１は、それぞれ、そのままの、ＳＡＭで改変された、ＮＨＳ−ＥＤＣとカップリングされた、およびＯｒ２２ａ／リポソームが固定された金表面の、ＡＦＭの高さの画像（ａ〜ｄ）、高さの画像上にマークされたラインによって示された粗さのプロファイル（ｅ〜ｈ）、および３Ｄ画像（ｉ〜ｌ）を示す。
【図２１−３】図２１は、それぞれ、そのままの、ＳＡＭで改変された、ＮＨＳ−ＥＤＣとカップリングされた、およびＯｒ２２ａ／リポソームが固定された金表面の、ＡＦＭの高さの画像（ａ〜ｄ）、高さの画像上にマークされたラインによって示された粗さのプロファイル（ｅ〜ｈ）、および３Ｄ画像（ｉ〜ｌ）を示す。
【図２１−４】図２１は、それぞれ、そのままの、ＳＡＭで改変された、ＮＨＳ−ＥＤＣとカップリングされた、およびＯｒ２２ａ／リポソームが固定された金表面の、ＡＦＭの高さの画像（ａ〜ｄ）、高さの画像上にマークされたラインによって示された粗さのプロファイル（ｅ〜ｈ）、および３Ｄ画像（ｉ〜ｌ）を示す。
【図２２Ａ】Ａ）標的リガンドであるサリチル酸メチル、および対照リガンドであるヘキサン酸メチルへの応答における、Ｏｒ１０ａリポソームで機能化した金電極に関する用量応答曲線を示す。Ｃ）標的リガンドであるヘキサン酸メチルおよび対照リガンドであるサリチル酸メチルへの応答における、Ｏｒ２２ａリポソームで機能化した金電極に関する用量応答曲線を示す。
【図２２Ｂ】Ｄ）標的リガンドである４−エチルグアヤコールおよび対照リガンドであるＥ２ヘキセナールへの応答における、Ｏｒ７１ａリポソームで機能化した金電極に関する用量応答曲線を示す。各実施例において、標的および対照リガンドの結合測定も、空のリポソームで機能化された金電極を用いて実行される。
【図２３Ａ】（Ａ）ＳＡＭおよびＮＨＳ／ＥＤＣでの改変、Ｏｒ２２ａリポソーム固定、それに続く標的リガンドであるヘキサン酸メチルの結合に伴う、散逸（dissipation）モニタリング機能付き水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ−Ｄ）における周波数および散逸（dissipation）における変化を示す。
【図２３Ｂ】（Ｂ）Ｏｒ２２ａリポソーム固定ＱＣＭ−Ｄセンサーの場合の、濃度を増加させたヘキサン酸メチル（緩衝液のみ、１．６、８、４０および２００μΜ）に伴う周波数および散逸における変化の拡大図を示す。
【図２３Ｃ】（Ｃ）ＳＡＭおよびＮＨＳ／ＥＤＣでの改変、空のリポソーム固定、それに続く標的リガンドであるヘキサン酸メチルの結合に伴う、ＱＣＭ−Ｄセンサーにおける周波数および散逸における変化を示す。
【図２３Ｄ】（Ｄ）空のリポソーム固定ＱＣＭ−Ｄセンサーの場合の、濃度を増加させたヘキサン酸メチル（緩衝液のみ、１．６、８、４０および２００μΜ）に伴う周波数および散逸における変化の拡大図を示す。
【実施例】
【０２６２】
ここで本発明を以下の非限定的な例を参照しながら例示する。
上述の例のみに本発明の範囲を限定することは意図されない。当業者は理解しているであろうように、本発明の範囲から逸脱することなく多くのバリエーションが可能である。
【０２６３】
実施例１−電気インピーダンス分光法（ＥＩＳ）を用いた本発明のセンサーの例証
１．０  実験方法
１．１  材料
Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、リン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）ペレット、６−メルカプトヘキサン酸（ＭＨＡ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）をシグマアルドリッチ（Sigma Aldrich）から購入した。別段の指定がない限り、全ての水溶液を蒸留水（ミリＱ（Milli-Q）１８．２ΜΩ）を用いて調製し、マイクロサイエンス（Microscience）のヒドラフロン（Hydraflon）フィルター（０．２２μｍ）に通過させてろ過し、Ｎ２で１０分間フラッシングした。１．６ｍｍの金（Ａｕ）ディスク電極、白金（Ｐｔ）らせん形補助電極およびＡｇ／ＡｇＣｌ参照電極を、ＢＡＳＩから購入した。
【０２６４】
１．２  リポソームが会合したＯＲサブユニットの調製
Ｎ２ガス流下で、小さいガラスチューブ中で、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、およびコレステロール（ＣＨ）を５：３：３：１のモル比で含有する溶液を蒸発させ、次いで真空中で１時間乾燥させることによって生産されたリン脂質溶液を使用して、リポソームを調製した。
【０２６５】
これらの脂質を、５分間ボルテックスで混合することによって１ｍＬの再水和緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、３００ｍＭのＮａＣｌ）中に再懸濁し、続いてマイクロソン（Microson）超音波細胞破砕装置（メディソニック（Medisonic）、米国）で、２０％の出力、１０〜２０秒で５回音波破砕し、各超音波破砕工程間に１分間サンプルを氷上に置いた。リポソームの形成を促進するために、１０回の凍結／融解工程を、液体窒素から４０℃の水浴にチューブを移動させることによって実行した。
【０２６６】
次いで、アベスティン（Avestin）のＬｉｐｏｓｏＦＡＳＴ押出ユニット（アベスティン、ドイツ）を使用して、脂質溶液を１００ｎｍのポリカーボネート膜に１１回通してリポソームを所定サイズに分類した。最終容量の１０％の量でグリセロールを添加し、液体窒素中で１０ｍｇ／ｍＬのアリコートを急速冷凍し、−８０℃で貯蔵した。
【０２６７】
精製されたＯＲサブユニット４３を、Geertsmaら、（2008）３４のプロトコールに類似した方式で合成リポソームに再構成した。
それらの使用の前に、リポソームを氷上で解凍し、次いで０．２％のＣＨＡＰＳと共に室温で１５分インキュベートすることによって不安定化した。次いで２００μｇの精製した匂い物質受容体１４を１ｍｇのリポソームに添加し、１０ｒｐｍで１時間回転した。２５ｍｇのバイオビーズ（Bio-Beads）ＳＭ−２（バイオラッド（Bio-Rad）、米国）を４回添加し、それぞれ４℃で３０分、２時間、一晩およびさらに２時間インキュベートすることによって、過量の洗浄剤を除去した。各インキュベーション期間後にバイオビーズを除去した。ＯＲが一体化したリポソームを、１００，０００ｇで１時間の遠心分離によってペレット化し、５００μｌの再水和緩衝液中に再懸濁した。アキュデンツ（アキュレートケミカル＆サイエンティフィック（Accurate Chemical & Scientific）社、米国）を使用した密度勾配超遠心分離（ＤＧＵ）によって、リポソームへのＯｒＸの一体化を評価した。等しい体積の８０％アキュデンツ溶液の添加によって、一体化されたリポソームを４０％アキュデンツにし、超遠心分離管の底部に入れ、３０％アキュデンツ溶液、およびＤＧＵ緩衝液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール）を上に載せた。次いでサンプルを、１００，０００ｇ、４℃で４時間遠心分離した。リポソームは、それらの低密度のために、アキュデンツＤＧＵの後の勾配の最上部に浮遊するであろう。
【０２６８】
１．３  電極のクリーニング
金ディスク（２ｍｍ）電極をアルミナペーストで２分磨くことによってクリーニングし、純粋なエタノール中で、次いでミリＱ水中でそれぞれ５分、超音波破砕した。次いでチオール脱離の場合、３つの末端電気化学セルにおいて、それぞれ０．１ＭのＮａＯＨ中で−１．４Ｖを３０秒間適用した。電極を再度アルミナペーストで２分間磨き、純粋なエタノール中で、次いでミリＱ水中でそれぞれ５分間、超音波破砕した。５０ｍＶ／秒のスキャン速度で−０．２から１．６Ｖの間で５サイクルにわたり０．５ＭのＨ２ＳＯ４中に循環させることによって、残存する全ての有機分子をクリーニングした。
【０２６９】
１．４  自己組織化単分子層（ＳＡＭ）の調製および活性化
クリーニングされた電極を６−メルカプトヘキサン酸（ＭＨＡ）の２ｍＭのエタノール溶液に一晩浸した。その後、電極を無水エタノールおよびミリＱ水で処理した。
【０２７０】
ＭＨＡのカルボキシル基の活性化を、１００ｍＭの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）および５０ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の混合物を含有するＰＢＳ（ｐＨ６．５）溶液中で、２８℃で６０分間電極をインキュベートすることによって実行した。
【０２７１】
１．５  リポソームのインキュベーション
−ＣＯＯＨ活性化の後、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）でのリポソームの１：１００希釈液１００μｌ中で、室温で２０分間、電極をインキュベートした。次いでそれらを過量のＰＢＳ（ｐＨ７．４）で穏やかに濯いだ。
【０２７２】
１．６  標的匂い物質溶液の調製およびインキュベーション
標的溶液を１％ＤＭＳＯを含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈し、１２８ｐＭ、６４０ｐＭ、３．２ｎＭ、１６ｎＭ、８０ｎＭ、４００ｎＭおよび２μΜの濃度にした。電極を関連する匂い物質溶液中でそれぞれ５分間インキュベートし、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で穏やかに洗浄した。
【０２７３】
【表１】
2020503511.tif 000002
【０２７４】
１．７  電気化学インピーダンス分光法（ＥＩＳ）測定
続いて、対電極（ＣＥ）として白金（Ｐｔ）線、Ａｇ／ＡｇＣｌ（３ＭのＫＣｌ、ＳＨＥに対して＋０．１９７Ｖ）参照電極（ＲＥ）、および作用電極（ＷＥ）としてリポソームを含む１．６ｍｍの金ディスク電極を含む３つの末端の電気化学セルにおいて、１００ｋＨｚ〜０．２Ｈｚの間で、参照に対して−０．７Ｖを適用して、ＥＩＳ測定を実行した。表面の電荷移動抵抗は、各匂い物質のインキュベーション後、減少し、２μΜの匂い物質の添加後、不変のままであった。
【０２７５】
２．０  結果
きれいな金表面をＭＨＡと共に一晩インキュベートして、−ＣＯＯＨ基で表面機能化した。次いでリポソームを有する受容体（Ｏｒ３５ａ、Ｏｒ２２ａまたはＯｒ１０ａのいずれか）を、ＮＨＳ−ＥＤＣ化学を介してＭＨＡに共有結合させた（図２）。濃度を増加させた標的（リガンド）のインキュベーションの前および後にＥＩＳ測定を実行した。表１に、この研究で使用された受容体およびリガンドを示す。
【０２７６】
受容体−リガンド相互作用は、全体的な表面電荷を変更し、このような変化はＥＩＳで観察できると予測される。図３は、インピーダンススペクトルエボリューションが、Ｏｒ３５ａで機能化された電極上でのそれに続くリガンド（Ｅ２−ヘキサナール）のインキュベーションによってもたらされたことを表す。この論文で研究された全てのタイプの受容体にとって、電極のインピーダンスは、相互作用するリガンドの量が増加するにつれ減少した。
【０２７７】
電極の電荷移動抵抗（Ｒｃｔ）を、定位相エレメント（ＣＰＥ）と直列であり、電荷移動抵抗（Ｒｃｔ）およびワールブルグ拡散エレメントと並列の溶液抵抗（Ｒｓ）を含むランドルスの等価回路［Ｒｓ＋ＣＰＥ／（Ｒｃｔ＋Ｗ）］に、得られたデータをフィッティングすることによって計算した。次いで得られたＲｃｔ値をＲ０ｃｔ（ΔＲｃｔ）に正規化した。ここでＲ０ｃｔは、リガンドとのインキュベーションの前の電極を表す。センサー応答をΔＲｃｔ／Ｒ０ｃｔ対ｌｏｇ［Ｃ（リガンド）］と定義することによって検量線を得た（図４）。
【０２７８】
図４は、感知実験の３回の反復（ｏｒ１０ａおよびｏｒ３５ａ）および２回の反復（ｏｒ２２ａ）から得られた相対的に小さいエラーバーによって強調される検出の再現性を解明する。得られたセンサーは、３〜４桁のダイナミックレンジ以内の極めて低い検出限界を有する。シグナル／バックグラウンドの変動（ノイズ）が＞３とみなされる場合３５〜３８、匂い物質の最も低い検出可能な濃度を、Ｏｒ１０ａの場合、３．３×１０−１０Ｍのサリチル酸メチル、Ｏｒ３５ａの場合、３．６×１０−１１ＭのＥ２−ヘキセナール、およびＯｒ２２ａの場合、２．８×１０−１０Ｍのヘキサン酸メチルと計算した。これらの検出限界は、リポソームを使用せずに匂い物質結合タンパク質をセンサー表面上に直接固定させた以前の研究より顕著に低い。例えば、匂い物質結合タンパク質（ＢｄｏｒＯＢＰ２）を金基板上に直接固定させた場合、センサーは、クイーンフェロモン（ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル）、警報フェロモン（酢酸イソアミル）、リナロール、ゲラニオール、β−イオノン、４−アリルベラトロール、フェニルアセトアルデヒド、フタル酸ジブチルについて、マイクロモル（１０−６Ｍ）前後の検出限界を与えた３９。別の研究において、ショウジョウバエのＯＢＰ  ＬＵＳＨの配列を含有するペプチド溶液を再度金表面上に直接固定したところ、１−ヘキサノールの場合、４．９  １０−５Ｍ、３−メチルブタノールの場合、５．６  １０−５Ｍの検出限界が達成された４０。近年の研究において、金の代わりに、感知エレメントとしてカーボンナノチューブを採用し、再度ＯＢＰタンパク質をいかなる媒体なしに直接固定した４１。著者が報告するところによれば、１．８×１０−２Ｍの２−ヘプタノンおよび０．５２×１０−１０ＭのＴＮＴを検出することができた。
【０２７９】
得られたセンサーの感度を、各センサーの直線の範囲（最も低い３つの濃度）の傾きを使用することによって計算したところ３６、４２、３８、Ｏｒ１０ａの場合、０．３１３単位／［ｌｏｇ（濃度／Ｍ）］、Ｏｒ３５ａの場合、０．１１６単位／［ｌｏｇ（濃度／Ｍ）］、およびＯｒ２２ａの場合、０．１５６単位／［ｌｏｇ（濃度／Ｍ）］であることが見出された。
【０２８０】
３．０  考察
出願人は、最初に様々な自己組織化単分子層（ＳＡＭ層）を試験して、リポソームを金電極表面上に結合させるのに最適な長さのリンカーとして６−メルカプトヘキサン酸（ＭＨＡ）を同定した。事前に、１６−メルカプトヘキサデカン酸（１６−ＭＨＤＡ）酸を使用して、金表面を機能化し、リポソームを金電極上に結合させた。この実験が高い感度を示さなかったという結果は、検出可能なシグナルを生じるにはリポソームが電極表面から極端に離れていたことを示唆している。この障害を克服するために、出願人はその代わりに、より短い６−メルカプトヘキサン酸を使用した。出願人は、リンカーがより短ければ、金とリポソームとの間のより速い電子移動が提供されると予想され、したがってその表面上で起こるあらゆる事象をより高い感度でモニターできると仮定した。未加工の細胞膜中に哺乳類匂い物質受容体を固定した２つの論文のケースでは、著者らは、１６−メルカプトヘキサデカン酸（１６−ＭＨＤＡ）３４または６−メルカプトヘキサデカン酸（６−ＭＨＤＡ）１４のいずれかをＳＡＭ形成に使用した。
【０２８１】
比較データから、本明細書で開示される昆虫ＯＲ−ＥＩＳバイオセンサー様式は、昆虫の匂い物質受容体と共に使用されてきた他のセンサー様式より高い感度を有することが示される。
【０２８２】
表２に、匂い物質受容体ベースのデバイスに関する公開データをまとめる。本発明のデバイスは、細胞ベースのセンサーより１００〜１０，０００倍高い感度を提供する。
【０２８３】
【表２】
2020503511.tif 000003
【０２８４】
表３に、細胞アッセイから得られたデータをまとめる。本発明の昆虫ＯｒＸ−ＥＩＳセンサーデータは、ＨＥＫ２９３細胞およびアフリカツメガエル卵母細胞で発現されたＯｒＸ／Ｏｒｃｏより高い感度を有する。これらのシステムにおいて、一部のフェロモン受容体（ＰＲ）は、正常な匂い物質受容体よりかなり低い感度を呈示するが、これは、これらの受容体がそれらのフェロモン標的分子に精密に調整されているためと予測されることに留意されたい。
【０２８５】
【表３−１】
2020503511.tif 000004
【表３−２】
2020503511.tif 000005
【０２８６】
実施例２−カーボンナノチューブ電界効果トランジスタ（ＣＮＴ−ＦＥＴ）を用いた本発明のセンサーの例証
１．要約
出願人は、昆虫ＯｒＸ配列を使用する便利な高感度のセンサーデバイスを生産した。ナノディスク５５、５６中に埋め込まれたキイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）のＯＲ３５ａ４３昆虫ＯｒＸ受容体を、１−ピレンブタン酸スクシンイミジルエステル（ＰＢＡＳＥ）およびポリヒスチジン機能化によりＣＮＴ  ＦＥＴ上で機能化した。ＣＮＴ  ＦＥＴは、１ｆＭ濃度から開始したリアルタイムの電流測定モードで、標的リガンドであるＥ−２−ヘキセナールに対して明確な電子応答を示した。結合の特異性は、対照材料、ＰＢＳおよびヘキサン酸メチルに対するＯＲ３５ａで機能化したＣＮＴ  ＦＥＴ応答を試験することによって検証される。特異性をさらに確認するために、元のＣＮＴ  ＦＥＴ（pristine CNT FET）および空のナノディスクで機能化したＣＮＴ  ＦＥＴ（empty nanodisc functionalized CNT FET）のＥ−２−ヘキセナールに対する応答も、試験される。
【０２８７】
２．実験方法
２．１  カーボンナノチューブトランジスタデバイスの製作
カーボンナノチューブ電界効果トランジスタ（ＣＮＴ  ＦＥＴ）を製作するために、まず、センサープラットフォームであるＣＮＴを、界面活性剤を含まない溶液堆積方法（a solution deposition route with no surfactants）を使用してＳｉＯ２／Ｓｉ基板（ＳｉＯ２＝１００ｎｍ）上に堆積させる５８、５９。鋭いピンセットの先端の量のＣＮＴバッキーペーパー（９９．９％のナノインテグリス（Nano Integris）製のイソナノチューブ−Ｓ（IsoNanotube-S））を、１時間超音波破砕することによりジクロロベンゼン（ＤＣＢ）中に分散する。図５（ａ）で示されるようにして、ＳｉＯ２基板を、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）スタンピング方法により２−チオール−ピリジンの薄層（シグマアルドリッチ）で機能化する５８、５９。次いで、図５（ｂ）５８、５９で示されるように、２−チオール−ピリジンで機能化したＳｉＯ２／Ｓｉ基板を、３０分から６時間までの範囲の時間にわたりＣＮＴ  ＤＣＢ懸濁液中に浸す。本発明者らは、浸す時間によってＣＮＴ薄膜ネットワーク構造の制御を可能にする。ＣＮＴ懸濁液から基板を取り出し、エタノール中でクリーニングし、きれいなＮ２中で乾燥させる。その結果、基板表面全体をカバーする一様の薄膜ＣＮＴネットワークを得る。
【０２８８】
基板の全体がＣＮＴでコーティングされているため、ＦＥＴデバイスの活性なチャネルを形成するであろうＣＮＴの配置を制御することが必須である。そのようにするために、ＣＮＴフィルムをフォトレジストでコーティングし、その後、光学リソグラフィーを使用して制御された配置にパターン化する。フォトレジストでコーティングされたＣＮＴは、保護されたＣＮＴ  ＦＥＴチャネル領域を形成する。次いで反応性イオンエッチング（オックスフォード・インストゥルメンツ（Oxford Instruments）のプラズマラボ８０（Plasmalab 80））を使用して、露出したＣＮＴをエッチングで削る。エッチング条件は、６００ｍＴｏｒｒ、２００ワット、４０ｓｃｃｍのＯ２フロー、および３分のエッチング時間である。これにより、１００μｍ（長さ）×１００μｍ（幅）のＣＮＴ薄膜面積が制御された配置に残存する。次いでソースおよびドレイン電極を、第２のフォトリソグラフィー工程によって画定し、続いてＣｒ／Ａｕ（５ｎｍ／５０ｎｍ）電極を蒸着し、リフトオフする。図６に、このプロセスを模式的に提示する。
【０２８９】
最後に、フォトリソグラフィーによって電極をＡＺ１５１８フォトレジストで封止して、感知実験中の電気的な漏洩電流と電極の損傷を防ぐ電気絶縁ウェルとして機能させる（図７）。
【０２９０】
電極封止の後、露出したＣＮＴ面積は１００μｍ（幅）×１０μｍ（長さ）になり、これが最終的にデバイス２０の活性な感知領域になる。次いでフォトレジストで封止したＣＮＴ  ＦＥＴデバイスを、２００℃のホットプレート上で１０分ベークし、室温まで徐々に冷却する。次いで手作りのポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）ウェルを、図８で示されるようにして、ＣＮＴ  ＦＥＴの機能化および電気的試験のために基板に永続的に取り付ける。
【０２９１】
２．２  嗅覚受容体の固定
２．２．１  カーボンナノチューブの非共有結合による機能化
ＣＮＴの電子特性を損なうことなく嗅覚受容体をＣＮＴ表面上に固定するために、非共有結合による機能化方法を選ぶ。ＯｒＸ機能化は、ｈｉｓ−タグ化学反応を介してなされ、ここでＣＮＴ表面は、最初に１−ピレンブタン酸スクシンイミジルエステル（ＰＢＡＳＥ）（９５％純度、シグマアルドリッチ）で機能化される。ＰＢＡＳＥ溶液を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶媒中１０ｍＭの濃度で作製し、ＤＭＳＯ中にＰＢＡＳＥが完全に溶解するまで１６００ｒｐｍで３０秒撹拌する。ＰＤＭＳ試験ウェルに、１２０μｌのＰＢＡＳＥ溶液を室温で１時間かけて添加する。ＰＢＡＳＥで機能化した後、過量のＰＢＡＳＥを洗浄して取り除くために、ＣＮＴ  ＦＥＴを純粋なＤＭＳＯ溶媒中で３回クリーニングする。デバイス基板から残留したＤＭＳＯを除去するために、サンプルをリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ、ｐＨ＝７．４）中で３回洗浄する。
【０２９２】
２．２．２  ニトリロ三酢酸の機能化
次いでＰＢＡＳＥで機能化したＣＮＴ  ＦＥＴを、１１．３ｍＭ濃度のニトリロ三酢酸溶液に２時間浸すことによって、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ、Ｍｗ約１９１．１４ｇ／ｍｏｌ）で機能化する。ＰＢＳ中１１．３ｍＭのＮＴＡを、１００ｍＭのＮＴＡストック溶液（ストック溶液は、通常、使用しないときは４℃の冷蔵庫に保管される）から希釈し、１２０μｌのＮＴＡ溶液を、室温での機能化のためにＰＤＭＳウェルに添加する。ＰＢＳ中で３回洗浄し、続いて脱イオン水（脱イオン水、１８．２Ω・ｃｍ）中に少なくとも１時間浸漬することによって、過量のＮＴＡをクリーニングする。
【０２９３】
２．２．３  硫酸ニッケルでの機能化
ＮＴＡで機能化したＣＮＴを、１１．３ｍＭの硫酸ニッケル（ＮｉＳＯ４、Ｍｗ約１５４．７６ｇ／ｍｏｌ）溶液中で３０分インキュベートする。ＰＢＳ中１１．３ｍＭのＮｉＳＯ４を、１００ｍＭのＮｉＳＯ４ストック溶液（ストック溶液は、使用しないときは４℃の冷蔵庫で維持される）から希釈する。１２０μｌのＮｉＳＯ４溶液を、室温での機能化のためにＰＤＭＳウェルに添加する。ＰＢＳ中で３回洗浄することによって過量のＮｉＳＯ４を除去する。
【０２９４】
２．２．４  嗅覚受容体の機能化
ＯＲ／ナノディスク５５、５６は、ｈｉｓ−タグとの親和性結合を介して、Ｎｉ−ＮＴＡで機能化したＣＮＴ  ＦＥＴ上に固定される。ナノディスク溶液を調製するために、バルクのＯｒＸ／ナノディスク溶液を、ＰＢＳ緩衝液で１：１０または１：１００希釈のいずれかに希釈する。１：１０希釈液を作製するために、１０μｌのストックナノディスク溶液を、１００μｌのＰＢＳに添加する。１：１００希釈液を作製するために、１μｌのストックナノディスク溶液を、１００μｌのＰＢＳに添加する。ＯｒＸ／ナノディスクストック溶液は通常、使用しないときは−８０℃の冷凍庫で貯蔵されるか、または１週間まで−２０℃の冷凍庫中で貯蔵される。希釈したナノディスクをＰＤＭＳウェルに添加し、次いでＣＮＴ表面の全体を、機能化のためにナノディスク中に室温で３０分浸漬する。機能化プロセスの後、過量のナノディスクを、ＰＢＳ中で３回洗浄することによってクリーニングする。
【０２９５】
２．３  電気的な測定
電気的な測定を行うために、図９で示されるようにして、マイクロマニピュレーターおよびルッカー・アンド・コールス（Rucker and Kolls）のプローブステーションにより、ＰＤＭＳウェルならびにソース、ドレインおよびゲート電極を用いてデバイスを組み立てる。電気的な測定を開始する前に、１００μｌのＰＢＳ緩衝液（１％ＤＭＳＯ含有）を試験ウェルに添加した。ゲート電極は、プラスチックで覆ったＡｇ／ＡｇＣｌ線（インビボでの測定基準）である。ここで、ゲート電極の活性領域を変化させるときに生じることが知られている電気的な産物を回避するために、Ａｇ／ＡｇＣｌ端部の露出した領域は完全にＰＢＳ緩衝液に挿入された。アジレントの４１５６Ｃパラメーター分析器は、全ての電気的な測定に使用することができる２０。パラメーター分析器は、優れた感度を有し、フェムトアンペアスケールで電流を正確に測定することができる。
【０２９６】
移動（Ｖｌｇ−Ｉｄｓ）測定中、ゲート電圧（Ｖｌｇ）を−５００ｍＶから＋１Ｖの間でスイープし、ソースドレイン電圧（Ｖｄｓ）を固定値（５０ｍＶ、１００ｍＶまたは２００ｍＶ）として設定する。本発明者らのリアルタイム感知測定のために、Ｖｌｇを０に設定し、Ｖｄｓを固定値（５０ｍＶ、１００ｍＶまたは２００ｍＶ）、１秒の工程時間として設定する。
【０２９７】
２．４  リガンドの希釈
Ｅ−２−ヘキセナールリガンド溶液を、本発明者らの１００ｍＭのストック溶液から、感知実験に必要な濃度範囲に希釈する。ＤＭＳＯ中１００ｍＭのストックＥ−２−ヘキセナールを調製するために、本発明者らは、５μｌ体積の８．４ＭのＥ−２−ヘキセナール（シグマアルドリッチから購入）を取り、４１５μｌのＤＭＳＯ中で混合し、使用しないときは冷蔵庫中４℃で貯蔵する。この溶液を試験範囲までさらに希釈するために、ＰＢＳ緩衝液を使用する。ＰＢＳ（１％ＤＭＳＯ含有）中のＥ−２−ヘキセナールの測定範囲は、１ｆＭ〜１ｎＭ（１０倍の増加）または６４ｐＭ〜２００ｎＭ（５倍の増加）である。リアルタイムの測定中、ＰＢＳ溶液（１％ＤＭＳＯ含有）を最初に対照として添加し、加えて分析物を濃度を増加させて添加する。
【０２９８】
３．結果および考察
３．１  ＯＲ３５ａ／ナノディスクの機能化後のＣＮＴ  ＦＥＴの変換特性
感知測定を行う前に、ＣＮＴ  ＦＥＴ変換特性を測定して、機能化プロセスの成功を決定する。図１０は、ＯＲ３５ａナノディスクで機能化したＣＮＴ  ＦＥＴ（丸）と、元のＣＮＴ  ＦＥＴ（四角）との比較であり、それによれば、閾値電圧は、ＯＲ３５ａナノディスクの機能化後に負電圧方向にシフトしたことは明らかである。フォワードＩ−Ｖスキャンにおける閾値電圧は、０．６Ｖ（元）から０．４２Ｖ（ＯＲ３５ａナノディスクを含む）にシフトした。これは、Ｎｉ＋（ＮｉＳＯ４）の正電荷からの静電ゲーティング（electrostatic gating）作用に加えて、担体がＣＮＴの側壁に取り付けられたナノディスクによって散乱することに起因する可能性がある６０。ＣＮＴに係留されたアプタマーの負電荷が閾値電圧で正のシフトを引き起こすとき、これは、本発明者らの以前の調査と同様に、ＯｒＸ／ナノディスクの固定が成功したことを示す証拠である５８、６１。ＯＲでうまく機能化されたＣＮＴ  ＦＥＴの場合、閾値電圧は常に、負電圧方向にシフトする。
【０２９９】
３．２．  ＯＲ３５ａナノディスクおよびリガンド結合
３．２．１．ＯＲ３５ａナノディスクで機能化されたＣＮＴ  ＦＥＴ（１：１０希釈）
ＣＮＴ  ＦＥＴを、上述したようにして、ＯＲ３５ａナノディスクで、１：１０希釈で機能化した。ＰＢＳ緩衝液を試験ウェルに添加し、次いで、デバイスのソース−ドレイン電流を絶えずモニターしながら、Ｅ−２−ヘキセナールを、６４ｐＭ、３２０ｐＭ、１．６ｎＭ、８ｎＭ、４０ｎＭおよび２００ｎＭの順番で３分毎に添加する。図１１（ａ）において、ＰＢＳ緩衝液の添加による電流のわずかな増加がみられ、それに対して電流は、６４ｐＭのＥ−２−ヘキセナールへの曝露の後に即時の大きい減少を示す。この電流における減少は、ＯＲ３５ａとＥ−２−ヘキセナールとの結合がＣＮＴ  ＦＥＴへの有効なゲーティングを変化させることに起因する５８、６０、６２。３２０ｐＭ、１．６ｎＭ、８ｎＭおよび４０ｎＭのＥ−２−ヘキセナールへの曝露それぞれにおいて、さらなる電流の減少が観察される。
【０３００】
図１１（ｂ）は、Ｅ−２−ヘキセナールの濃度への正規化した電流応答の電流の依存性を示す。電流における変化ΔΙは、図１１（ａ）でのリアルタイムの測定に基づき、ΔΙ＝Ｉ−Ｉ０（式中Ｉは、Ｅ−２−ヘキセナールへの曝露の後に安定化した電流であり、Ｉ０は、６４ｐＭのＥ−２−ヘキセナールを試験ウェルに添加する前の初期電流である）によって計算される。６４ｐＭで、ΔΙ／Ι０は、１０％変化する。Ｓ字状のラングミュア吸着曲線を達成するためには、本発明者らの最初の測定を６４ｐＭ濃度のＥ−２−ヘキセナールを用いて行ったように、より低い濃度とより多くの測定が必要である。ここでΔΙ／Ι０は、より高い濃度のＥ−２−ヘキセナールをデバイスウェルに添加するにつれて増加し続ける。
【０３０１】
３．３  対照実験
電流応答が本当にＯＲ３５ａとＥ−２−ヘキセナールとの結合によるものであることを確認するために、対照実験を行った。これらの測定は、元のＣＮＴ  ＦＥＴおよび空のナノディスクで機能化されたＣＮＴ  ＦＥＴによるＥ−２−ヘキセナール応答である。図１２では、リアルタイムの電流測定をプロットして比較を示す。
【０３０２】
３．３．３  ＯＲ３５ナノディスクは対照リガンドに応答しないことの検証
非特異的なリガンド、このケースではヘキサン酸メチルに対するＯＲ３５ａナノディスクの電気的な応答も測定される（図１３）。図１３において測定された濃度範囲は、７０ｎＭから５００μΜであり、これは、図１２におけるＥ−２−ヘキセナール濃度の測定範囲より高い。Ｅ−２−ヘキセナールが添加される時間に明確な段階的応答が観察され、３分後に電流が安定状態に到達する図１１に示した結果とは異なり、図１３におけるヘキサン酸メチルリガンドに関するリアルタイムの測定は、経時的なバックグラウンドのドリフト電流を示すが、明確な応答を示さない。
【０３０３】
４．結論
この研究は、電子デバイスプラットフォームをベースとしたＯＲ３５ａおよび有望な嗅覚バイオセンサー用途の認識能力を実証した。ＣＮＴをＮｉ−ＮＴＡで機能化した後、ナノディスク中に埋め込まれたＯＲ３５ａを、ポリヒスチジンタグを介してＣＮＴ  ＦＥＴ上で機能化する。Ｎｉ−ＮＴＡを、ＰＢＡＳＥで機能化したＣＮＴ  ＦＥＴのＮ−ヒドロキシスクシンイミド基上に連結する。この方法を使用することによって、ＯＲ３５ａナノディスクで機能化したＣＮＴ  ＦＥＴは、リアルタイムで６４ｐＭのＥ−２−ヘキセナールリガンドに対する応答を実証し、ＰＢＳ緩衝液に対する応答はなかった。元のＣＮＴ  ＦＥＴにおける結果、加えて空のナノディスクで機能化したＣＮＴ  ＦＥＴと比較して、Ｅ−２−ヘキセナールに対する明確な電流応答は観察されない。ＯＲ３５ａの特異的な結合も、ＯＲ３５ａで機能化したＣＮＴ  ＦＥＴからの、ＰＢＳおよび対照リガンドであるヘキサン酸メチルに対する応答を試験することによって検証した。ＯＲ３５ａナノディスクで機能化したＣＮＴ  ＦＥＴは、経時的なＥ−２−ヘキセナールの特異的で高感度な検出を実証した。
【０３０４】
比較データは、ここで開示された昆虫ＯｒＸ−ＣＮＴ−ＦＥＴバイオセンサー様式が、昆虫の匂い物質受容体と共に使用されてきた他のセンサー様式より高い感度を有することを示す。
【０３０５】
表４に、匂い物質受容体ベースのデバイスの公開されたデータをまとめる。本発明者らは、本発明のデバイスが、細胞ベースのセンサーより１００〜１０，０００倍大きい感度を提供すると推測する。
【０３０６】
【表４】
2020503511.tif 000006
【０３０７】
表３に、細胞アッセイから得られたデータをまとめる。本発明の昆虫ＯｒＸ−ＣＮＴ−ＦＥＴセンサーデータは、ＨＥＫ２９３細胞およびアフリカツメガエル卵母細胞で発現されたＯｒＸ／Ｏｒｃｏより高い感度を有する。これらのシステムにおいて、一部のフェロモン受容体（ＰＲ）は、正常な匂い物質受容体よりかなり低い感度を呈示するが、これは、これらの受容体がそれらのフェロモン標的分子に対して精密に調整されているためと予測されることに留意されたい。
【０３０８】
実施例３−カーボンナノチューブ電界効果トランジスタ（ＣＮＴ−ＦＥＴ）を用いた本発明のさらなるセンサーの例証
１．要約
出願人はさらに、昆虫ＯｒＸ配列を使用する便利な高感度のセンサーデバイスを例示した。４種のキイロショウジョウバエＯｒＸ受容体（Ｏｒ１０ａ、Ｏｒ２２ａ、ＯＲ３５ａおよびＯｒ７１ａ）４３、６３をそれぞれ、ナノディスク５５、５６中に埋め込み、さらに最適化された条件下で１−ピレンブタン酸スクシンイミジルエステル（ＰＢＡＳＥ）およびアミン基反応（ＯｒＸおよび膜足場タンパク質上に存在する）によりＣＮＴ  ＦＥＴ上で機能化した。ＯｒＸで機能化したＣＮＴ  ＦＥＴのそれぞれは、１ｆＭ濃度から開始したリアルタイムの電流測定モードで、それらの標的リガンドに対して（Ｏｒ１０ａはサリチル酸メチル、Ｏｒ２２ａはヘキサン酸メチル、Ｏｒ３５ａはＥ−２−ヘキセナール、Ｏｒ７１ａは４−エチルグアヤコールに対して）明確な電子応答を示した。結合の特異性は、対照材料、ＰＢＳおよび非応答性リガンドに対する各ＯｒＸで機能化したＣＮＴ  ＦＥＴ応答を試験することによって検証される。特異性をさらに確認するために、元のＣＮＴ  ＦＥＴおよび空のナノディスクで機能化したＣＮＴ  ＦＥＴの標的リガンドに対する応答も、試験される。
【０３０９】
２．実験方法
２．１  材料
膜足場タンパク質ＭＳＰ１Ｅ３Ｄ１を、キューブバイオテック（Cube Biotech）（番号２６１５２）から購入し、５ｍｇ／ｍＬに水中に再懸濁した。１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）を、アバンティポーラーリピッド（Avanti polar lipids）（番号８５０４５７）から購入し、必要になるまでクロロホルム中１００ｍｇ／ｍＬのストック溶液として−２０℃で貯蔵した。
【０３１０】
２．２  カーボンナノチューブトランジスタデバイスの製作
この実験設定において、ランダムチャネルＣＮＴ  ＦＥＴセンサープラットフォームを、簡単な溶液堆積方法および標準的なフォトリソグラフィー技術を使用して、ＳｉＯ２／Ｓｉ基板（ＳｉＯ２＝１００ｎｍ）上に製作した２０、２１。まず第一に、ＳＷＮＴ懸濁液を、超音波破砕を使用して無水１，２−ジクロロベンゼン（ＤＣＢ）中で調製した。９９％の半導体グレードのＳＷＮＴバッキーペーパー（ナノインテグリス）の重さを量り、ＤＣＢ中に分散して、５μｇ／ｍｌ懸濁液を得た。透明な溶液が得られるまで分散液を超音波破砕した。温度を超音波破砕プロセス中ずっと２５℃に維持した。次いで、図５（ａ）で示されるようにして、ＳｉＯ２／Ｓｉ基板を、簡単なスタンピング方法によって、チオールピリジン分子で機能化した。１ｍｌのメタノール中に１０ｍｇの２−メルカプトピリジン（９９％、シグマアルドリッチ）を溶解させることによってチオールピリジン溶液を調製した。この溶液を、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）表面上に、２０００ｒｐｍで１分間スピンコーティングした。スピンコーティングプロセスの前に、ＰＤＭＳ表面を、湿潤性を改善するために１分にわたり５０Ｗの酸素プラズマによってクリーニングした。クリーニングされた基板を、ＰＤＭＳ表面上にひっくり返して３分置き、エタノール中で洗浄して、過量のチオールピリジン分子を除去した。次いで基板をＣＮＴ懸濁液に移し、懸濁液に１０分間浸した。懸濁液からサンプルを取り出し、エタノールにさらに１０分間浸して、ＳＷＮＴネットワーク中のチオールピリジン分子を除去した。フォトリソグラフィーおよび５ｎｍのクロムおよび５０ｎｍの金の熱蒸着によりマーカーを画定することによって、アライメントマーカーを堆積させる。１５分のアセトン浸漬とそれに続くイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）での洗浄およびＮ２でのブロー乾燥によって、金属のリフトオフを行った。その結果、基板表面全体をカバーする均一な薄膜ＣＮＴネットワークが得られる。
【０３１１】
フォトレジストでのＣＮＴフィルムのコーティングとそれに続くパターン形成、およびフォトレジストでの電極の封止は、実施例２のセクション２．１に記載した通りである。
２．２  嗅覚受容体の固定
２．２．１  精製されたＯＲサブユニットの調製
精製手順は、Ｃａｒｒａｈｅｒら、２０１３１４で詳述されたものの改変法である。バキュロウイルスに感染したＳｆ９細胞からタンパク質をｈｉｓ−タグ親和性により精製するために、５００ｍｌの２×１０６／ｍｌを０．１のＭＯＩでバキュロウイルスに感染させ、２７℃で７２時間インキュベートした。３８００ｇで室温で１０分の遠心分離によって細胞ペレットを収集し、次いで２５Ｕ／ｍＬベンゾナーゼ（Benzonase）を含む４０ｍｌの再懸濁緩衝液Ａ（２０ｍＭのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、１×プロテアーゼ阻害剤カクテル（ロシュ・ダイアグノスティックス社（Roche Diagnostics GmbH）、ドイツ））に再懸濁し、次いでエマルシフレックスＣ５（Emulsiflex C5）乳化装置（アベスティン、ドイツ）を１０，０００〜１５，０００ｐｓｉで２回通過させることによって溶解させた。次いでサンプルを１０００ｇで５分遠心分離して、細胞全体および核を除去した。上清を除去し、４℃、１００，０００ｇで１時間スピンした。膜ペレットを、１％ｗ／ｖ洗浄剤（ツヴィッタージェント（Zwittergent）３−１６）を含む４０ｍｌの緩衝液Ａに再懸濁し、室温で１時間、１０ｒｐｍで回転させた。次いでサンプルを、１８℃、１００，０００ｇで１時間遠心分離した。上清を除去し、１ｍｌのＮｉＮＴＡカラム（ＧＥヘルスケア（GE Healthcare））にローディングし、そこでツヴィッタージェント３−１６洗浄剤をフォス−コリン１４（Fos-Choline 14）（ＦＣ−１４）に交換した。カラム体積の１０倍の３００ｍＭのＮａＣｌおよび２０ｍＭのイミダゾールを含む緩衝液Ｂ（２０ｍＭのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、３．６ｍＭのＦＣ−１４）中で、さらにカラム体積の１０倍の１００ｍＭのＮａＣｌおよび５０ｍＭのイミダゾールを含む緩衝液Ｂ中でカラムを洗浄した。タンパク質を、１００ｍＭのＮａＣｌおよび５００ｍＭのイミダゾールを含むカラム体積の４倍の緩衝液Ｂで溶出した。クーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよびウェスタンブロッティングで純度を評価した。
【０３１２】
最終的なサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）工程を用いて精製を完了した。ＮｉＮＴＡ精製からの溶出画分をプールし、２０，０００ｇで５分遠心分離して、集合体（aggregate）と汚染物質を除去した。次いでＡｋｔａ−Ｐｕｒｅクロマトグラフィーシステム（ＧＥヘルスケア）に取り付けられたスーパーデックス２００（Superdex 200）１６／６０カラム（ＧＥヘルスケア）に５ｍＬのサンプルを注入した。１００ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液Ｂ中、１ｍＬ／分でサンプルを流し、２ｍＬ分画を収集し、１００ｋＤａのＭＷＣＯのビバスピン２（Vivaspin2）フィルターユニット（ザルトリウス（Sartorius）、ゲッティンゲン、ドイツ）を使用して濃縮し、−８０℃で貯蔵した。
【０３１３】
２．２．２  ナノディスクが会合したＯＲサブユニット（nanodisc associated OR subunits）の調製
Bayburtら、2010および2003５５、５６から改変したプロトコールを使用して、ナノディスクを調製した。１：０．２：１５０のＭＳＰ：タンパク質：脂質の比率でナノディスクを形成した。１００ｍｇ／ｍＬストックから必要な量の脂質を取り出し、窒素ガスの一定流下で乾燥させ、次いで真空中で一晩さらに乾燥させた。脂質を必要な体積の緩衝液（２０ｍＭのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのコール酸ナトリウム）中に再懸濁し、超音波破砕し、透明な脂質ストックを２０ｍｇ／ｍＬ濃度で得た。洗浄剤緩衝液中の精製した匂い物質受容体タンパク質を、ＭＳＰ１Ｅ３Ｄ１およびＰＯＰＣ脂質と必要な比率で混合し、氷上で１時間インキュベートした。系から洗浄剤を除去することによって再構成を開始させるために、バイオビーズＳＭ２（バイオラッド番号１５２３９２０）を、１：１の重量：体積比でサンプルに添加し、混合物を一定して回転させながら４℃で一晩インキュベートした。次いでバイオビーズを除去し、取り込まれたナノディスクを、必要になるまで−８０℃で凍結した。
【０３１４】
取り込みを、クーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって確認した。バイオビーズ添加前の再構成混合物のサンプルを、バイオビーズインキュベーション工程後のサンプルとクーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって比較したところ、ＭＳＰ１Ｅ３Ｄ１およびＯＲのバンドが明確に確認された。ＯＲタンパク質がナノディスクに取り込まれていなかったならば、バイオビーズによる洗浄剤の除去は、ＯＲタンパク質の沈殿を引き起こしていたであろうことから、バイオビーズインキュベーション後のサンプル中にＯＲが存在しなかったことになる。
【０３１５】
２．２．３  カーボンナノチューブの共有結合による機能化
嗅覚受容体ナノディスクをＣＮＴ表面上に固定するために、共有結合による機能化方法を選ぶ。ＯＲ機能化を、アミン／エステル反応を介して達成し、ここでＣＮＴ表面は、最初に１−ピレンブタン酸スクシンイミジルエステル（ＰＢＡＳＥ）（９５％純度、シグマアルドリッチ）で機能化された。これを行うために、体積１２０μｌのＰＢＡＳＥ溶液を、室温で１時間かけてＣＮＴチャネルに添加する。ＰＢＡＳＥ溶液を、１分間の超音波破砕によって、メタノール中１０ｍＭの濃度で作製する。ＰＢＡＳＥで機能化した後、過量のＰＢＡＳＥを洗浄して取り除くために、ＣＮＴ  ＦＥＴをメタノール中で３回クリーニングする。残留したメタノールを除去するために、デバイスをリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ、ｐＨ＝７．４）中で３回洗浄する。
【０３１６】
ＯＲ−ナノディスクは、膜足場タンパク質（ＭＳＰ）上に存在するアミン基に特異的なアミン／エステル反応およびＯＲが会合したナノディスクを構成するＯＲサブユニットを介して、ＰＢＡＳＥで機能化したＣＮＴ  ＦＥＴ上に固定される。ナノディスク溶液を調製するために、バルクのＯＲ−ナノディスク溶液を、１：１００希釈にＰＢＳ緩衝液で希釈する。ＯＲ−ナノディスクストック溶液は通常、使用しないときは−８０℃の冷凍庫で貯蔵される。希釈したナノディスクをＰＤＭＳウェルに添加し、次いでＣＮＴ表面の全体を、機能化のためにナノディスク中に室温で３０分浸漬する。機能化プロセスの後、過量のナノディスクを、ＰＢＳ中で３回洗浄することによって除去する。
【０３１７】
２．２．４  フィルムの特性評価（characterization）
ＣＮＴフィルム構造を評価するために、原子間力顕微鏡法を使用した。ナノサーフ（Nano surfe）（NaioAFM）を使用し、タッピングモードで画像を取った。ナノディスクの機能化の前および後にフィルムを評価した。
【０３１８】
２．２．５  電気的な測定
電気的な測定を、実施例２のセクション２．３で説明したようにして、以下の点を変更して実行した。ゲート電極は、Ａｇ／ＡｇＣｌ線（ＢＡＳｉ、ＭＦ２０５２）である。移動（Ｖｌｇ−Ｉｄｓ）測定中、ゲート電圧（Ｖｌｇ）を−５００ｍＶから＋１Ｖの間でスイープし、ソースドレイン電圧（Ｖｄｓ）は、１００ｍＶとして設定する。本発明者らのリアルタイム感知測定のために、Ｖｌｇを０に設定し、Ｖｄｓを、１００ｍＶ、１秒の工程時間として設定する。
【０３１９】
リガンド溶液を、１００ｍＭのストック溶液から感知実験に必要な濃度範囲に希釈する。リガンドのストック溶液を、ＤＭＳＯ中の１００ｍＭ濃度まで作製し、使用しないときは４℃で貯蔵した。この溶液を試験範囲までさらに希釈するために、ＰＢＳ緩衝液を使用する。ＰＢＳ（１％ＤＭＳＯ含有）中のリガンドの測定範囲は、１ｆＭ〜１０ｐＭ（１０倍の増加）である。リアルタイムの測定中、ＰＢＳ溶液（１％ＤＭＳＯ含有）を最初に対照として添加し、加えて分析物を濃度を増加させて添加する。
【０３２０】
２．２．６  リガンドの希釈
リガンド溶液を、１００ｍＭのストック溶液から感知実験に必要な濃度範囲に希釈する。リガンドのストック溶液を、ＤＭＳＯ中で１００ｍＭの濃度まで作製し、使用しないときは４℃で貯蔵した。この溶液を試験範囲までさらに希釈するために、ＰＢＳ緩衝液を使用する。ＰＢＳ（１％ＤＭＳＯ含有）中のリガンドの測定範囲は、１ｆＭ〜１０ｐＭ（１０倍の増加）である。リアルタイムの測定中、ＰＢＳ溶液（１％ＤＭＳＯ含有）を最初に対照として添加し、加えて分析物を濃度を増加させて添加する。
【０３２１】
３．０  結果
３．１  ＯｒＸ−ナノディスクの共有結合による機能化後のＣＮＴ  ＦＥＴの変換特性
図１４ａは、ＯｒＸが会合したナノディスクのそれぞれのクーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析を示し、元のおよびＯｒＸナノディスクで機能化されたＣＮＴのＡＦＭ画像の例から、ＣＮＴへのＯｒＸナノディスクの固定が確認される（図１４ｂ）。ここでＣＮＴ上の白色のドットに留意されたい。図１５ａは、ＯＲ１０ａナノディスクで機能化したＣＮＴ  ＦＥＴ（青色の線）と、元のＣＮＴ  ＦＥＴ（黒線）との比較であり、それによれば、閾値電圧が、ＯＲ１０ａナノディスクの機能化後に負電圧方向にシフトしたことは明らかである。実施例２のセクション３．１で説明したように、これは、ＯｒＸ−ナノディスク固定の成功の証拠である。図１６ａ、１７ａ、および１８ａの、それぞれＯｒ２２ａ、Ｏｒ３５ａおよびＯｒ７１ａでうまく機能化されたＣＮＴ  ＦＥＴで示されるように、閾値電圧は常に、負電圧方向にシフトした。
【０３２２】
３．２  ＯｒＸが会合したナノディスクおよびそれぞれのリガンド結合
３．２．１．ＯｒＸナノディスクで共有結合により機能化されたＣＮＴ  ＦＥＴ（１：１００希釈）
図１５（ｂ）は、ＰＢＳ緩衝液の添加により、ＯＲ１０ａナノディスクによって共有結合で機能化したＣＮＴ  ＦＥＴ（１：１００希釈）からの電流の小さい増加がみられるが、それに対して電流は、増加させたサリチル酸メチル添加への曝露の後に一貫して大きい減少を示すことを示す。この電流における減少は、ＯＲ１０ａとサリチル酸メチルとの結合が、ＣＮＴ  ＦＥＴへの有効なゲーティングを変化させることに起因する５８、６０、６２。図１５（ｃ）は、量を増加させたサリチル酸メチルの添加による、空のナノディスクで共有結合により機能化されたＣＮＴ  ＦＥＴ（１：１００希釈）からの電流の増加がないことを示しており、サリチル酸メチルとの結合におけるＯｒ１０ａの役割が確認される。図１５（ｄ）は、サリチル酸メチルの濃度に対する正規化した電流応答電流の依存性を示し、対照リガンドであるＥ２−ヘキセナールへの応答は、観察されない。図１５（ｅ）は、空のナノディスクで共有結合により機能化されたＣＮＴ−ＦＥＴ（１：１００希釈）において正規化した電流応答における変化がないことを示す。図１５（ｄおよびｅ）は、Ｏｒ１０ａナノディスクによって呈示されるサリチル酸メチルの検出限界が、１ｆＭ未満であることを示す。
【０３２３】
図１６、１７および１８は、それぞれＯｒ２２ａで共有結合により機能化されたＣＮＴ  ＦＥＴ（標的リガンド−ヘキサン酸メチル、対照リガンド−Ｅ２−ヘキセナール）、Ｏｒ３５ａ（標的リガンド−Ｅ２−ヘキセナール、対照リガンド−ヘキサン酸メチル）およびＯｒ７１ａ（標的リガンド−４−エチルグアヤコール）に関する類似の結果を示しており、各ＯｒＸナノディスクおよびそれらそれぞれの標的リガンドの検出限界は、全ての１ｆＭ未満であることが示される。
【０３２４】
４．結論
この研究はさらに、電子デバイスプラットフォームをベースとしたＯｒＸおよび有望な嗅覚バイオセンサー用途の認識能力を実証した。ナノディスク中に埋め込まれたＯｒＸは、共有結合でＣＮＴ  ＦＥＴ上で機能化され、経時的な１ｆＭの標的リガンドに対する電流応答を示すが、ＰＢＳ緩衝液に対する応答を示さない。これは、実施例２に記載のＣＮＴ−ＦＥＴセンサーより５倍高い感度であり、少なくとも４桁のダイナミックレンジを有する。空のナノディスクで機能化したＣＮＴ  ＦＥＴにおける結果と比較して、標的リガンドに対する明確な電流応答は観察されない。各ＯｒＸの特異的な結合も、ＯｒＸで機能化したＣＮＴ  ＦＥＴからのＰＢＳおよび対照リガンドに対する応答を試験することによって検証した。ＯｒＸ−ナノディスクで機能化したＣＮＴ  ＦＥＴは、経時的に、それらの標的リガンドの特異的で高感度な検出を実証した。
【０３２５】
実施例４−電気インピーダンス分光法（ＥＩＳ）を用いた本発明のセンサーのさらなる例証
１．要約
出願人はさらに、昆虫ＯｒＸ配列を使用する便利な高感度のセンサーデバイスを例示した。３つのＯｒＸ受容体（Ｏｒ１０ａおよびＯｒ２２ａ、ならびにＯＲ３５ａ）４３、６３をそれぞれナノディスク５５、５６中に埋め込み、ＥＩＳ測定のために金電極上で機能化した。ＯｒＸで機能化した金電極のそれぞれは、ｆＭレベルの濃度から開始して、それらの標的リガンドに対して（Ｏｒ１０ａはサリチル酸メチル、Ｏｒ２２ａはヘキサン酸メチル、およびＯｒ３５ａはＥ−２−ヘキセナールに対して）明確な電子応答をリアルタイムで示した。結合の特異性を、非応答性リガンドに対する各ＯｒＸナノディスクで機能化した電極の応答を試験することによって検証した。特異性をさらに確認するために、標的リガンドに対する空のナノディスクで機能化した金電極の応答も試験した。
【０３２６】
２．実験方法
２．１  材料
６−メルカプトヘキサン酸（ＭＨＡ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド）（ＥＤＣ）、リン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）タブレット、サリチル酸メチル、ヘキサン酸メチル、ヘキサン酸エチル、Ｅ２−ヘキセナールおよび４−エチルグアヤコールを、シグマアルドリッチから得た。電気化学的な測定のために、直径１．６ｍｍの金（Ａｕ）ディスク電極、コイル状の白金（Ｐｔ）線電極および漏れのない銀／塩化銀（Ａｇ／ＡｇＣｌ）電極を、ＢＡＳｉから購入した。
【０３２７】
２．２  ナノディスクが会合したＯＲサブユニットの調製
２．２．１  精製されたＯＲサブユニットの調製
ＯＲサブユニットを、実施例３セクション２．３．１に記載した通りに調製した。
【０３２８】
２．２．２  ナノディスクが会合したＯＲサブユニットの調製
ナノディスクを、実施例３セクション２．３．２に記載した通りに調製した。
２．３  電極の調製
金ディスク電極（直径１．６ｍｍ）を、各電極につき１分間、アルミナポリッシングパッド上でポリッシングアルミナスラリーを用いて磨いた。磨いた電極を脱イオン水（ミリＱ、１８．２ΜΩ・ｃｍ）で濯ぎ、続いて、残留したアルミナスラリーが電極から完全に除去されるまでエタノール（ＬＲグレード）および脱イオン水中で超音波処理した。−１．２Ｖでのクロノアンペロメトリーを超音波処理した電極の全てに適用し、３つの末端の電気化学セル中の０．１Ｍの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）電解質溶液、Ａｇ／ＡｇＣｌ（３ＭのＮａＣｌ、ＳＨＥに対して０．２０９Ｖ）参照電極、対電極としてコイル状の白金線、および作用電極として金ディスクを使用して、ＰａｌｍＳｅｎｓ３ポテンシオスタットを使用して、３０秒にわたり、電極表面上に存在するチオールのＳＡＭを脱着させた。次いで電極を再度脱イオン水で濯ぎ、エタノールと脱イオン水中で連続的に超音波処理した。最終的に、０．５Ｍ硫酸（Ｈ２ＳＯ４）溶液中、−０．２から１．６Ｖの間で、１００ｍＶ／秒のスキャン速度でサイクリックボルタンメトリーを１０サイクル実行して、他のあらゆる不純物を除去した（３つの電極セル、Ａｇ／ＡｇＣｌ（３ＭのＮａＣｌ中、ＳＨＥに対して０．２０９Ｖ）参照電極、対電極としてコイル状の白金線、および作用電極として金ディスク）。
【０３２９】
２．４  自己組織化単分子層（ＳＡＭ）の調製およびＥＤＣＮＨＳ活性化
５ｍｌエタノール（ＡＲグレード）中に１．３６μｌのＭＨＡを溶解させることによって、２ｍＭのＭＨＡを調製した。クリーニングされた電極をＭＨＡ溶液に浸し、一晩インキュベートした。次の日、未反応の酸を除去するために、全ての電極をエタノールと脱イオン水で徹底的に洗浄した。２：１のｍｏｌ：ｍｏｌ比のＥＤＣ：ＮＨＳ（１００ｍＭのＥＤＣ、５０ｍＭのＮＨＳ）を２ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ＝６．５）溶液中で調製した。次いでこの溶液中で電極を２８℃で１時間インキュベートして、ＭＨＡのカルボン酸（ＣＯＯＨ）基を活性化した。
【０３３０】
２．５  ＯＲが会合したナノディスクの電極への固定
ＰＢＳ溶液を、ＰＢＳの１つのタブレットを２００ｍｌのミリＱ水中に浸漬すること（製造元の説明書に従って）によって調製し、０．２μｍのシリンジフィルターを使用してろ過した。調製された緩衝溶液のｐＨをｐＨメーターで測定した。ＯＲをＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ＝７．４）で１００倍希釈し、その緩衝溶液中でＣＯＯＨ活性化電極を室温で１時間インキュベートした。次いで電極をＰＢＳ緩衝溶液で徹底的に洗浄して、全ての未結合のナノディスクを洗い落とした。
【０３３１】
２．５  標的匂い物質溶液の調製およびインキュベーション
ＰＢＳ溶液（ｐＨ＝７．４）を、電気化学的な測定；ＥＩＳおよびＣＶを実行するための電解質として使用した。電気化学的な測定の前に、ＰＢＳ緩衝液を１５分脱気した。リガンド溶液を、１００ｍＭのストック溶液から感知実験に必要な濃度範囲に希釈した。リガンドのストック溶液を、ＤＭＳＯ中で１００ｍＭの濃度まで作製し、使用しないときは４℃で貯蔵した。この溶液を試験範囲までさらに希釈するために、ＰＢＳ緩衝液を使用した。ＰＢＳ（１％ＤＭＳＯ含有）中のリガンドの測定範囲は、Ｏｒ１０ａナノディスクの場合、１ｆＭ〜１００ｎＭ（１０倍の増加）、Ｏｒ２２ａナノディスクの場合、１００ｆＭ〜１００ｐＭ（１０倍の増加）、およびＯｒ３５ａナノディスクの場合、１０ａＭ〜１ｐＭ（１０倍の増加）であった。
【０３３２】
２．６  電気化学インピーダンス分光法（ＥＩＳ）測定
ＯＲが固定された電極を、関連する匂い物質溶液中でそれぞれ約３０分間インキュベートし、ＥＩＳ測定の前にＰＢＳで穏やかに洗浄した。続いて、対電極（ＣＥ）として白金（Ｐｔ）線、Ａｇ／ＡｇＣｌ（３ＭのＫＣｌ、ＳＨＥに対して＋０．１９７Ｖ）参照電極（ＲＥ）、および作用電極（ＷＥ）としてナノディスクを含む１．６ｍｍの金ディスク電極を含む３つの末端の電気化学セルにおいて、１００ｍＨｚから１００ｋＨｚの間で、参照に対して−０．７Ｖを適用して、ＥＩＳ測定を実行した。
【０３３３】
３．０  結果
実施例１のセクション２．０で説明したようにして、ＥＩＳ測定を実行し、分析した。濃度を増加させた標的リガンドまたは対照リガンドとのインキュベーションの前および後に、ＥＩＳ測定を、ＯｒＸ（Ｏｒ１０ａ、Ｏｒ２２ａまたはＯｒ３５ａのいずれか）または空のナノディスクで機能化された金電極で実行した。センサー応答をΔＲｃｔ／Ｒ０ｃｔ対ｌｏｇ［Ｃ（リガンド）］と定義することによって検量線を得た（図１９）。図１９（ａ）は、Ｏｒ１０ａナノディスクが、サリチル酸メチルに高感度で（１０ｆＭのＬＯＤ）選択的に応答するが、予想通りに対照リガンドであるＥ２−ヘキセナールに応答しないことを示す。図１９（ｂ）は、Ｏｒ２２ａナノディスクが、ヘキサン酸メチルに高感度で（＜１００ｐＭのＬＯＤ）選択的に応答するが、予想通りに対照リガンドであるＥ２−ヘキセナールに応答しないことを示す。図１９（ｃ）は、Ｏｒ３５ａナノディスクが、Ｅ２−ヘキセナールに高感度で（＜１ｆＭのＬＯＤ）選択的に応答するが、予想通りに対照リガンドであるサリチル酸メチルに応答しないことを示す。図面のそれぞれにおいて、空のナノディスクは、試験された標的リガンドのいずれに対しても応答しないことから、各ＯｒＸの存在が各標的リガンドの検出にとって重要であることが実証される。
【０３３４】
４．結論
この研究はさらに、電子デバイスプラットフォームをベースとしたＯｒＸおよび有望な嗅覚バイオセンサー用途の認識能力を実証した。金電極に機能化されたナノディスク中に埋め込まれたＯｒＸは、ｆＭの標的リガンドに対して電気化学インピーダンス応答を示し、４桁のダイナミックレンジを示す。空のナノディスクで機能化した電極からの標的リガンドに対するインピーダンス応答は、観察されない。
【０３３５】
各ＯｒＸの特異的な結合も、ＯｒＸナノディスクで機能化した電極からの対照リガンドに対する応答を試験することによって検証した。ＯｒＸナノディスクで機能化した電極は、特異的かつ高感度でそれらの標的リガンドを検出するための高い将来性を示した。
【０３３６】
実施例５−電気インピーダンス分光法（ＥＩＳ）を用いた本発明のセンサーのさらなる例証
要約
出願人はさらに、昆虫ＯｒＸ配列を使用する便利な高感度のセンサーデバイスを例示した。３つのＯｒＸ受容体（Ｏｒ１０ａ、Ｏｒ２２ａ、ＯＲ７１ａ）４３、６３をそれぞれリポソーム５５、５６中に埋め込み、ＥＩＳ測定のために、さらなる最適化された実験条件下で金電極上で機能化した。ＯｒＸで機能化した金電極のそれぞれは、ｆＭ濃度から開始して、その標的リガンドに対する（Ｏｒ１０ａはサリチル酸メチル、Ｏｒ２２ａはヘキサン酸メチル、Ｏｒ７１ａは４−エチル−グアヤコールに対する）明確な電子応答を示した。結合の特異性は、非応答性リガンドに対する各ＯｒＸリポソームで機能化した電極応答を試験することによって検証される。特異性をさらに確認するために、標的リガンドに対する空のナノディスクで機能化した金電極の応答も試験した。
【０３３７】
１．実験方法
２．１  材料
実施例４のセクション２．１で説明した通りである。
【０３３８】
２．２  リポソームが会合したＯＲサブユニットの調製
２．２．１  精製されたＯＲサブユニットの調製
ＯＲサブユニットを、実施例３のセクション２．３．１で説明したようにして調製した。
【０３３９】
２．２．２  リポソームが会合したＯＲサブユニットの調製
ＯＲおよびＯＲ／Ｏｒｃｏが会合したリポソームを、実施例１のセクション１．２に記載した通りに調製した。
【０３４０】
２．３  電極の調製
実施例４のセクション２．３で説明した通りである。
２．４  自己組織化単分子層（ＳＡＭ）の調製およびＥＤＣＮＨＳ活性化
実施例４のセクション２．４で説明した通りである。
【０３４１】
２．５  ＯＲが会合したナノディスクの電極への固定
実施例４のセクション２．５で説明した通りである。
２．６  標的匂い物質溶液の調製およびインキュベーション
実施例４のセクション２．６で説明した通りである。
【０３４２】
２．７  電気化学インピーダンス分光法（ＥＩＳ）測定
実施例４のセクション２．７で説明した通りである。
３．０  結果
図２０は、Ｏｒ２２ａについてのＯＲが会合したリポソーム調製物の実施例のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析からのウェスタンブロットを示す。レーン４は、Ｏｒ２２ａが会合したリポソームの最終的な調製物を示し、この調製物にアキュデンツ勾配超遠心分離（レーン５〜１２）が適用されると、Ｏｒ２２ａが会合したリポソームは、勾配の最上部に浮遊し、上２つの勾配画分（レーン１１および１２）に見出される１４。
【０３４３】
著者は、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）を用いて、リポソームを金表面上に固定できることを検証した。図２１は、そのままの金表面からＯＲが会合したリポソームが固定された表面への表面構造および粗さのプロファイルにおいて変化がみられることを示す。そのままの金表面（図２１（ａ））は、約２ｎｍの表面粗さ値を有する様々なサイズの高密度に圧縮された平坦な金ナノ結晶を示す。ＳＡＭ改変の後（図２１（ｂ））およびＳＡＭで改変された金表面のＮＨＳ／ＥＤＣの活性化の後（図２１（ｃ））、表面構造においてごくわずかな変化が観察された。ＯＲが会合したリポソームをＥＤＣ／ＮＨＳ活性化されたＳＡＭで改変された金表面に導入したところ（図２１（ｄ））、表面上に固定された円形のリポソームを示す表面構造における変化は、顕著であった。それらの天然型において（in their native form）、表面全体にわたり様々なサイズの丸型のリポソームがみられ、すなわち破裂または二分子層形成は観察されなかった。これも、リポソーム膜中でＯＲがよく保持されていることを示す。また表面粗さ値の大幅な増加（＞３０ｎｍ）も、リポソームを含有するＯＲが、ＮＨＳ／ＥＤＣ活性化されたＳＡＭで改変された金表面にうまく取り付けられたことを実証する。
【０３４４】
実施例１のセクション２．０で説明したようにしてＥＩＳ測定を実行し、分析した。ＥＩＳ測定を、標的リガンドまたは対照リガンドを濃度を増加させてインキュベートする前およびインキュベートした後に、ＯｒＸが会合したリポソーム（Ｏｒ１０ａ、Ｏｒ２２ａまたはＯｒ７１ａのいずれか）、または空のリポソームで機能化された金電極上で実行した。センサー応答をΔＲｃｔ／Ｒ０ｃｔ対ｌｏｇ［Ｃ（リガンド）］と定義することによって検量線を得た（図２２（ａ）〜（ｃ））。図２２（ａ）は、Ｏｒ１０ａリポソームが、サリチル酸メチルに高感度で（１ｐＭのＬＯＤ）選択的に応答するが、予想通りに対照リガンドであるヘキサン酸メチルに応答しないことを示す。図２２（ｂ）は、Ｏｒ２２ａリポソームが、ヘキサン酸メチルに高感度で（１０ｆＭのＬＯＤ）選択的に応答するが、予想通りに対照リガンドであるサリチル酸メチルに応答しないことを示す。図２２（ｃ）は、Ｏｒ７１ａリポソームが、４−エチルグアヤコールに高感度で（０．１ｆＭのＬＯＤ）選択的に応答するが、対照リガンドであるサリチル酸メチルに応答しないことを示す。図面のそれぞれにおいて、空のナノディスクは、標的リガンドのいずれに対しても応答しないことから、各ＯｒＸの存在が各標的リガンドの検出にとって重要であることが実証される。
【０３４５】
４．結論
この研究はさらに、電子デバイスプラットフォームをベースとしたＯｒＸおよび有望な嗅覚バイオセンサー用途の認識能力を実証した。金電極上で機能化されるリポソーム中に埋め込まれたＯｒＸは、ｆＭレベルまで低い濃度の標的リガンドに対して極めて高感度の電気化学インピーダンス応答を示し、８桁を超えるダイナミックレンジを示す。空のナノディスクで機能化した電極における結果と比較して、標的リガンドに対する透明なインピーダンス応答は、観察されていない。各ＯｒＸの特異的な結合も、ＯｒＸリポソームで機能化した電極からの対照リガンドに対する応答を試験することによって検証した。ＯｒＸリポソームで機能化した電極は、特異的かつ高感度でそれらの標的リガンドを検出するための高い将来性を示した。
【０３４６】
実施例６−水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）圧電性トランスデューサーを用いた本発明のセンサーの例証
要約
出願人は、リポソーム中に埋め込まれたキイロショウジョウバエＯｒ２２ａ４３、６３配列を使用して、便利な圧電性センサーデバイスを生産した。散逸（dissipation）モニタリング機能付き水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ−Ｄ）は、結晶への質量負荷に伴い振動周波数が変化する質量検出型圧電性トランスデューサーである。ＱＣＭ−Ｄセンサーの振動周波数変化とそれにカップリングされたＯｒ２２ａリポソームをモニターすることによって、Ｏｒ２２ａと標的リガンドであるヘキサン酸メチルとの相互作用を検出した。結合の特異性を、ＱＣＭ−Ｄセンサーにカップリングされた空のリポソームの、試験した標的リガンドに対するに対する応答を試験することによって検証した。
【０３４７】
１．実験方法
２．１  材料
６−メルカプトヘキサン酸（ＭＨＡ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド）（ＥＤＣ）、リン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）タブレット、およびヘキサン酸メチルを、シグマアルドリッチから得た。金（１００ｎｍ）センサー結晶（ＱＳＸ３０１）を、ＡＴＡサイエンティフィックインスツルメンツ（ATA Scientific Instruments）から得た。
【０３４８】
２．２  ＯＲが会合したリポソームの調製
２．２．１  精製されたＯＲサブユニットの調製
ＯＲサブユニットを、実施例３のセクション２．２．１に記載した通りに調製した。
【０３４９】
２．２．２  ＯＲが会合したリポソームの調製
ＯＲ２２ａリポソームを、実施例１のセクション１．２に記載した通りに調製した。
２．３  水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）の調製およびデータ収集
金（１００ｎｍ）センサー結晶をそれぞれエタノールおよびミリＱ水中で１５分間超音波破砕した。５：１：１体積比のミリＱ水、アンモニア（２５％）、および過酸化水素（３０％）を５分で７５℃に加熱し、超音波破砕した結晶を加熱した溶液中に５分間入れた。次いで結晶を溶液から取り出し、ミリＱ水で濯ぎ、その後、窒素ガスで乾燥させた。過量のまたは緩く結合した分子を除去するために、それらをＭＨＡの２ｍＭエタノール溶液に一晩曝露し、続いてエタノール溶液で洗浄することによって、きれいな金結晶をチオールで機能化した。次いでＳＡＭで機能化した結晶をＱ−センス分析装置（ビオリンサイエンティフィック（Biolin Scientific））のチャンバーに入れ、ＰＢＳ緩衝溶液中のＮＨＳ／ＥＤＣ、ＯＲ２２ａ／リポソームおよび様々な濃度のヘキサン酸メチル（１．６μＭ、８μＭ、４０μＭ、２００μＭおよび１ｍＭ）と共に流動させて、周波数（Δｆ）および散逸（ΔＤ）値の変化を測定した。
【０３５０】
３．０  結果
図２３（ａ）は、ＳＡＭおよびＮＨＳ／ＥＤＣでの改変とそれに続く水晶振動子へのＯｒ２２ａリポソーム固定、次いで標的リガンドであるヘキサン酸メチルの結合のときの周波数および散逸（dissipation）における変化を示す。結合事象が結晶上で起こる場合、これは、振動周波数を低下させる質量における増加をもたらす６４。したがってセンサーの質量は、ＳＡＭ、ＮＨＳ／ＥＤＣ、およびＯｒ２２ａリポソーム固定に伴い増加する。しかしながらヘキサン酸メチル結合のケースでは、周波数における増加が観察されている（図２３（ｂ））。理論に制限されることは望まないが、本発明者らは、このセンサー上の質量の損失は、ヘキサン酸メチルがＯｒ２２ａ受容体に結合して、Ｏｒ２２ａリポソームの内部からの水およびイオンの放出を引き起こす、すなわちＯｒ２２ａが機能的なイオンチャネルを形成することに起因することを示唆している。この周波数の増加は、ヘキサン酸メチルの濃度を１．６から２００μＭの間に増加させると起こり、ヘキサン酸メチルがＯｒ２２ａ受容体に特異的に結合していることが示されるが、この周波数の増加は、ＱＣＭ上に固定された空のリポソームでは観察されなかった（図２３（ｃ）および（ｄ））。一兆分率（ｐｐｔ）濃度と同等なμＭレベルでのリガンド結合の検出は、Ｃ．エレガンスのＯＤＲ−１０でみられるものと同等であった６５。
【０３５１】
４．結論
この研究はさらに、電子デバイスプラットフォームをベースとしたＯｒＸおよび有望な嗅覚バイオセンサー用途の認識能力を実証した。水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）圧電性センサー上で機能化されるリポソーム中のＯｒＸは、標的リガンドに対する明確な圧電性応答が観察されなかったＱＣＭ上で機能化した空のリポソームにおける結果と比較して、それらの標的リガンドを特異的に検出することができる。ＯｒＸリポソームで機能化したＱＣＭは、特異的かつ高感度でそれらの標的リガンドを検出するための高い将来性を示す。
【０３５２】
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【図１】
2020503511.tif 000007
【図２】
2020503511.tif 000008
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2020503511.tif 000016
【図１１】
2020503511.tif 000017
【図１２】
2020503511.tif 000018
【図１３】
2020503511.tif 000019
【図１４Ａ】
2020503511.tif 000020
【図１４Ｂ】
2020503511.tif 000021
【図１５Ａ】
2020503511.tif 000022
【図１５Ｂ】
2020503511.tif 000023
【図１５Ｃ】
2020503511.tif 000024
【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
2020503511.tif 000026
【図１６】
2020503511.tif 000027
【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
2020503511.tif 000029
【図１６Ｄ】
2020503511.tif 000030
【図１６Ｅ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１８Ａ】
2020503511.tif 000037
【図１８Ｂ】
2020503511.tif 000038
【図１８Ｃ】
2020503511.tif 000039
【図１８Ｄ】
2020503511.tif 000040
【図１９Ａ】
2020503511.tif 000041
【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
2020503511.tif 000043
【図２０】
2020503511.tif 000044
【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２１−３】
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【図２１−４】
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【図２２Ａ】
2020503511.tif 000049
【図２２Ｂ】
2020503511.tif 000050
【図２３Ａ】
2020503511.tif 000051
【図２３Ｂ】
2020503511.tif 000052
【図２３Ｃ】
2020503511.tif 000053
【図２３Ｄ】
2020503511.tif 000054
【国際調査報告】
2020503511.tif 000055
2020503511.tif 000056
2020503511.tif 000057