(57)【要約】  本発明は、疼痛の治療または予防を必要とする対象において疼痛を治療または予防する方法を提供する。該方法は、炭酸アンヒドラーゼ１０または炭酸アンヒドラーゼ１１を産生するように該核酸が発現されるように、対象に、炭酸アンヒドラーゼ１０または炭酸アンヒドラーゼ１１をコードする核酸配列を含む発現ベクターを投与することを含む。代替的に、該方法は、炭酸アンヒドラーゼ８断片を生成するように該核酸が発現されるように、対象に、炭酸アンヒドラーゼ８断片をコードする核酸配列を含む発現ベクターを投与することを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
疼痛の治療または予防を必要とする対象において、疼痛を治療または予防する方法であって、炭酸アンヒドラーゼ１０または炭酸アンヒドラーゼ１１を産生するように前記核酸が発現されるように、炭酸アンヒドラーゼ１０または炭酸アンヒドラーゼ１１をコードする核酸配列を含む発現ベクターを前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記対象が、ヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記発現ベクターが、ウイルスベクターである、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルスベクターである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ウイルスベクターが、単純ヘルペスウイルスベクターである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記炭酸アンヒドラーゼ１０または炭酸アンヒドラーゼ１１をコードする核酸配列が、ＣＭＶプロモーター、ＴｒｋＡプロモーター、ＴｒｋＢ、ＴｒｋＣプロモーター、Ｎａｖ１．９プロモーター、Ｎａｖ１．８プロモーター、Ｎａｖ１．７プロモーター、ＮＭＤＡプロモーター、アドビリンプロモーター、ＣＧＲＰプロモーター、５ＨＴプロモーター、ＮＫ１プロモーター、ＡＳＩＣ３プロモーター、ＮＰＹプロモーター、およびＮＦ２００プロモーターからなる群から選択されるプロモーターに作動可能に連結されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記疼痛が、神経因性疼痛である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記疼痛が、炎症性疼痛である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記疼痛が、癌または脊髄損傷によって引き起こされる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記発現ベクターを前記対象の後根神経節に投与することを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
関節内注射を介して前記発現ベクターを投与することを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記発現ベクターを経口投与することを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記発現ベクターを三叉神経節に投与することを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
末梢神経注射を介して前記発現ベクターを投与することを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
疼痛が生じる部位にカテーテルを介して前記発現ベクターを投与することを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
疼痛が生じる部位に針を介して前記発現ベクターを投与することを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記発現ベクターを投与するための画像解析の使用を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
必要とする対象において疼痛を処置または予防する方法であって、前記断片を産生するように前記核酸が発現されるように、前記対象に、炭酸アンヒドラーゼ８の断片をコードする核酸配列を含む発現ベクターを投与することを含む、方法。
【請求項１９】
前記対象が、ヒトである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記発現ベクターが、ウイルスベクターである、請求項１８または請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルスベクターである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ウイルスベクターが、単純ヘルペスウイルスベクターである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記炭酸アンヒドラーゼ８の断片をコードする核酸配列が、ＣＭＶプロモーター、ＴｒｋＡプロモーター、ＴｒｋＢプロモーター、ＴｒｋＣプロモーター、Ｎａｖ１．９プロモーター、Ｎａｖ１．７プロモーター、Ｎａｖ１．８プロモーター、ＮＭＤＡプロモーター、アドビリンプロモーター、ＣＧＲＰプロモーター、５ＨＴプロモーター、ＮＫ１プロモーター、ＡＳＩＣ３プロモーター、ＮＰＹプロモーター、およびＮＦ２００プロモーターからなる群から選択されるプロモーターに作動可能に連結されている、請求項１８〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記疼痛が、神経因性疼痛である、請求項１８〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記疼痛が、炎症性疼痛である、請求項１８〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記疼痛が、癌または脊髄損傷によって引き起こされる、請求項１８〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記発現ベクターを前記対象の後根神経節に投与することを含む、請求項１８〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
関節内注射を介して前記発現ベクターを投与することを含む、請求項１８〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記発現ベクターを経口投与することを含む、請求項１８〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記発現ベクターを三叉神経節に投与することを含む、請求項１８〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
末梢神経注射を介して前記発現ベクターを投与することを含む、請求項１８〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
疼痛が生じる部位にカテーテルを介して前記発現ベクターを投与することを含む、請求項１８〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
疼痛が生じる部位に針を介して前記発現ベクターを投与することを含む、請求項１８〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記発現ベクターを投与するための画像解析の使用を含む、請求項１８〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記炭酸アンヒドラーゼ８の断片が、ＣＡ８−２０４である、請求項１８〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記炭酸アンヒドラーゼ８の断片が、ＣＡ８−２０４ＣまたはＣＡ８−２０４Ｇである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記炭酸アンヒドラーゼ８の断片が、ＣＡ８−２０２またはＣＡ８−２０３である、請求項１８〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
助成金の開示
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された助成番号ＤＥ０２２９０３の下で米国政府の支援を受けてなされた。米国政府は、本発明におけるある特定の権利を有する。
【０００２】
本発明は、疼痛を処置または予防するための材料および方法に関する。
【０００３】
電子的に提出された資料の参照による組込み
本出願は、本開示の別個の部分として、その全体が参照により組み込まれるコンピュータ可読形式の配列表（ファイル名：５１７７４Ａ＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ、サイズ：７３，７００２バイト、２０１８年７月１３日作成）を含む。
【背景技術】
【０００４】
持続的な疼痛には、医療費が年間約６５００億ドルかかり、生産性が喪失される。２０１２年に実施された米国国民健康調査では、ほぼ５０００万人の米国人成人がひどい慢性疼痛または激しい疼痛に罹患していると推定された。２０１５年８月１８日の米国疼痛学会の公式見解は、ａｍｅｒｉｃａｎｐａｉｎｓｏｃｉｅｔｙ．ｏｒｇ／ａｂｏｕｔ−ｕｓ／ｐｒｅｓｓ−ｒｏｏｍ／ｎｉｈ−ｓｔｕｄｙ−ｓｈｏｗｓ−ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ−ｏｆ−ｃｈｒｏｎｉｃ−ｏｒ−ｓｅｖｅｒｅ−ｐａｉｎ−ｉｎ−ｕ−ｓ−ａｄｕｌｔｓにおいて認められた。他の研究では、疼痛の負担が大きめであることが示唆されている。
【０００５】
現に利用可能な慢性疼痛の処置は、ほとんどの患者が不適切に処置されたままであるという不利な点と関係している。例えば、現行の局所麻酔薬は、感覚と運動の完全な遮断により短時間作用し、運動不能になる。モルヒネを含むオピオイド薬は、例えば術後および慢性疼痛の状態のための主要な処置である。慢性の非癌性疼痛を処置する上での長期的なオピオイドの使用は、過去数十年にわたって劇的に増加してきており、オピオイドの乱用、耐性および依存が主な公衆衛生の懸念事項である。実際、オピオイド投与の副作用（例えば、耐性、薬物依存／嗜癖、呼吸抑制、便秘、吐き気、掻痒症、鎮静、気分変動）は、オピオイドの治療可能性を制限し、好適な代替物の欠如は、オピオイドの過剰使用、乱用、および生命を脅かす合併症の流行をもたらしてきた。米国では、２００７年のオピオイド乱用への処方費用だけで約５５７億ドルと推定された。この費用のほぼ半分は、職場の費用（例えば、生産性の損失）、４５％が医療費（例えば、乱用の処置）、９％が刑事裁判費用に属していた。Ｂｉｒｎｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐａｉｎ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０１１；１２：６５７−６７。
【０００６】
疼痛の薬剤へかなりの量の研究が注力されたにもかかわらず、オピオイドの使用と関係する有害作用を最小化（または回避）しながら鎮痛を提供するという治療選択肢についての必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示は、必要とする対象（例えば、ヒト）において疼痛を処置または予防する方法を提供する。一態様において、本方法は、対象に、炭酸アンヒドラーゼ１０または炭酸アンヒドラーゼ１１をコードする核酸配列を含む発現ベクター（例えば、アデノ随伴ウイルスベクターまたは単純ヘルペスウイルスベクターなどのウイルスベクター）を投与することを含み、そのため、該核酸が発現されて、炭酸アンヒドラーゼ１０または炭酸アンヒドラーゼ１１を産生する。代替的に、発現ベクター（例えば、アデノ随伴ウイルスベクターまたは単純ヘルペスウイルスベクターなどのウイルスベクター）は、カルボキシルアンヒドラーゼ８または炭酸アンヒドラーゼ８断片をコードする核酸配列を含む。炭酸アンヒドラーゼのヒトおよびマウスの版が企図される（ＣＡ８／Ｃａｒ８，ＣＡ８／Ｃａｒ８断片，ＣＡ１０／Ｃａｒ１０および／またはＣＡ１１／Ｃａｒ１１）。炭酸アンヒドラーゼのヒト版（例えば，ＣＡ８，ＣＡ８断片，ＣＡ１０および／またはＣＡ１１）に関する本明細書の記載は、マウス版（Ｃａｒ８、Ｃａｒ８断片、Ｃａｒ１０、および／またはＣａｒ１１）にも当てはまることは認識されることになる。炭酸アンヒドラーゼ８（ＣＡ８ヒトまたはＣａｒ８マウス）の断片をコードする核酸配列は、炭酸アンヒドラーゼ８コード配列の最初の３つのエキソンを含む（かまたはそれらから本質的になる、またはそれらからなる）。任意選択的に、炭酸アンヒドラーゼ８の断片をコードする核酸配列は、伸長エキソン３と保持イントロンとを備えた最初の３つのエキソンを含む代替転写物ＣＡ８−２０４である。様々な態様において、炭酸アンヒドラーゼは、ＩＴＰＲ１活性化（ｐＩＴＰＲ１）およびＩＴＰＲ１を介した細胞内カルシウム放出のアンタゴニストである。
【０００８】
様々な態様において、疼痛は神経因性疼痛、癌性疼痛、または炎症性疼痛である。様々な態様において、本方法は、発現ベクターを対象の後根神経節に投与すること、または関節内注射、皮内送達、もしくは口腔内送達を介して発現ベクターを投与することを含む。
【０００９】
前述の概要は、本発明のすべての態様を定義することを意図したものではなく、追加の態様は、発明を実施するための形態などの他のセクションで記載される。文書全体は、統一された開示として関連することを意図しており、この文書の同じ文、または段落、またはセクションで特徴の組み合わせが合わせて見られない場合でも、本明細書に記載される特徴のすべての組み合わせが企図されることを理解されたい。さらに、本発明は、追加の態様として、上記で具体的に言及される変形例よりも範囲が狭い本発明のすべての実施形態を含む。「ａ」または「ａｎ」で記載または請求される本発明の態様に関して、文脈がより限定された意味を明確に要求しない限り、これらの用語は「１つ以上」を意味することを理解されたい。セット内の１つ以上として記載される要素に関して、セット内のすべての組み合わせが企図されることを理解されたい。本発明の態様が特徴を「含む」として記載される場合、実施形態も特徴「からなる」または「から本質的になる」と企図される。
【００１０】
出願人（複数可）は、本明細書に添付された特許請求の範囲の全範囲を発明したが、本明細書に添付された特許請求の範囲は、他者の先行技術を範囲内に包含することを意図しない。したがって、特許請求の範囲内の法定の先行技術が特許庁、または他の団体もしくは個人によって出願人に通知された場合、出願人（複数可）は、適用される特許法に基づいて修正権を行使して、そのような特許請求の範囲の主題を再定義して、そのような法定の先行技術または法定の先行技術の明らかな変形例をそのような特許請求の範囲から明確に除外する権利を留保する。そのような修正された特許請求の範囲によって定義される本発明の変形例も、本発明の態様として意図される。本出願の全体から、本発明の追加の特徴および変形例が当業者には明らかであり、そのような特徴のすべては、本発明の態様として意図される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】相対的ｐＩＴＰＲ１密度（図１Ａ）、相対的Ｖ５密度（図１Ｂ）、および相対的ｐＩＴＰＲ１密度（図１Ｃ）を示す棒グラフである。ＨＥＫ２９３細胞におけるＣａｒ１０／ＣＡ１０の過剰発現は、ホルスコリン誘導性ＩＴＰＲ１リン酸化（ｐＩＴＰＲ１）を阻害する。ＨＥＫ２９３細胞に、マウス（Ｃａｒ１０）およびヒト（ＣＡ１０）を発現するＡＡＶ−Ｖ５ベクターをトランスフェクトした。ウェスタンブロット分析は、ホルスコリンが用量依存的な様式でｐＩＴＰＲ１レベルを増加させることを実証している（図１Ａ）。Ｖ５−Ｃａｒ１０およびＶ５−ＣＡ１０ベクターのトランスフェクション後、ウェスタンブロット法でＶ５タグを使用してＣＡ１０およびＣａｒ１０タンパク質の過剰発現を実証した（図１Ｂ）。Ｃａｒ１０およびＣＡ１０の過剰発現は、ＨＥＫ２９３細胞における１マイクロモル濃度のホルスコリン刺激に応答してＩＴＰＲ１のリン酸化を低減させた（図１Ｃ）。Ｎ＝６であり、データは平均±平均の標準誤差として提示される＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、一元配置分散分析。
【図１Ｂ】相対的ｐＩＴＰＲ１密度（図１Ａ）、相対的Ｖ５密度（図１Ｂ）、および相対的ｐＩＴＰＲ１密度（図１Ｃ）を示す棒グラフである。ＨＥＫ２９３細胞におけるＣａｒ１０／ＣＡ１０の過剰発現は、ホルスコリン誘導性ＩＴＰＲ１リン酸化（ｐＩＴＰＲ１）を阻害する。ＨＥＫ２９３細胞に、マウス（Ｃａｒ１０）およびヒト（ＣＡ１０）を発現するＡＡＶ−Ｖ５ベクターをトランスフェクトした。ウェスタンブロット分析は、ホルスコリンが用量依存的な様式でｐＩＴＰＲ１レベルを増加させることを実証している（図１Ａ）。Ｖ５−Ｃａｒ１０およびＶ５−ＣＡ１０ベクターのトランスフェクション後、ウェスタンブロット法でＶ５タグを使用してＣＡ１０およびＣａｒ１０タンパク質の過剰発現を実証した（図１Ｂ）。Ｃａｒ１０およびＣＡ１０の過剰発現は、ＨＥＫ２９３細胞における１マイクロモル濃度のホルスコリン刺激に応答してＩＴＰＲ１のリン酸化を低減させた（図１Ｃ）。Ｎ＝６であり、データは平均±平均の標準誤差として提示される＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、一元配置分散分析。
【図１Ｃ】相対的ｐＩＴＰＲ１密度（図１Ａ）、相対的Ｖ５密度（図１Ｂ）、および相対的ｐＩＴＰＲ１密度（図１Ｃ）を示す棒グラフである。ＨＥＫ２９３細胞におけるＣａｒ１０／ＣＡ１０の過剰発現は、ホルスコリン誘導性ＩＴＰＲ１リン酸化（ｐＩＴＰＲ１）を阻害する。ＨＥＫ２９３細胞に、マウス（Ｃａｒ１０）およびヒト（ＣＡ１０）を発現するＡＡＶ−Ｖ５ベクターをトランスフェクトした。ウェスタンブロット分析は、ホルスコリンが用量依存的な様式でｐＩＴＰＲ１レベルを増加させることを実証している（図１Ａ）。Ｖ５−Ｃａｒ１０およびＶ５−ＣＡ１０ベクターのトランスフェクション後、ウェスタンブロット法でＶ５タグを使用してＣＡ１０およびＣａｒ１０タンパク質の過剰発現を実証した（図１Ｂ）。Ｃａｒ１０およびＣＡ１０の過剰発現は、ＨＥＫ２９３細胞における１マイクロモル濃度のホルスコリン刺激に応答してＩＴＰＲ１のリン酸化を低減させた（図１Ｃ）。Ｎ＝６であり、データは平均±平均の標準誤差として提示される＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、一元配置分散分析。
【００１２】
【図２】ＨＥＫ２９３細胞におけるＡＡＶ−Ｖ５−Ｃａｒ１０およびＡＡＶ−Ｖ５−ＣＡ１０の過剰発現が（Ｆｕｒａ−２（３４０／３８０比）によって示されるような１μＭのＡＴＰ誘導性細胞質カルシウム放出（ｙ軸）を阻害したことを示す棒グラフである。カルシウム画像解析データは、ｃａｒ１０およびＣＡ１０タンパク質の過剰発現が、空ベクター対照と比較したとき、ＨＥＫ２９３細胞における１μＭのＡＴＰ誘導性細胞質カルシウム放出を阻害することを実証した。ｃａｒ１０およびＣＡ１０の過剰発現は、遊離カルシウム放出を有意に阻害した（Ｐ＜０．００１）。Ｎ＝４カバーガラスおよび試料１個あたり合計２００個の細胞＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、二元配置分散分析に続くＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ検定による。
【００１３】
【図３】様々な試験日数（ｘ軸）における足引込め潜時（秒）（ｙ軸）を示す棒グラフであり、Ｖ５−Ｃａｒ１０およびＶ５−ＣＡ１０の遺伝子移入が結果として、カラギーナン炎症性疼痛マウスモデルにおける熱による痛覚過敏抑制を生じることを実証している。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける生理塩類溶液、ＡＡＶ８−なし、ＡＡＶ８−Ｖ５−Ｃａｒ１０ウイルス粒子およびＡＡＶ８−Ｖ５−ＣＡ１０ウイルス粒子（それぞれ１．０６Ｅ１４個のウイルス粒子および１．６６Ｅ１４個のウイルス粒子）の坐骨神経注射を介したＶ５−Ｃａｒ１０およびＶ５−ＣＡ１０の過剰発現後の熱応答。基礎熱潜時は、ＡＡＶ８−Ｖ５−Ｃａｒ１０ウイルス粒子およびＡＡＶ８−Ｖ５−ＣＡ１０ウイルス粒子の注射後１５日間増加したが、生理塩類溶液の後または空ベクターを含有するウイルス粒子の後では増加しなかった。１６日後の終わりにカラギーナンの注射後、生理塩類溶液およびＡＡＶ８−なしを含有するウイルス粒子は、基線熱潜時からの有意な低減を示した。しかしながら、ＡＡＶ８−Ｖ５−Ｃａｒ１０注射群およびＡＡＶ８−Ｖ５−ＣＡ１０注射群は、基線と差がなかった（Ｎ＝８。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、二元配置分散分析に続くＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定による）。
【００１４】
【図４】様々な試験日数（ｘ軸）における足引込め潜時（秒）（ｙ軸）を示す棒グラフであり、Ｖ５−Ｃａｒ１０およびＶ５−ＣＡ１０の遺伝子移入が結果として、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）慢性炎症性疼痛マウスモデルにおける熱による痛覚過敏抑制をもたらすことを実証している。生理塩類溶液、ＡＡＶ８−なし、ＡＡＶ８−Ｖ５−Ｃａｒ１０ウイルス粒子、およびＡＡＶ８−Ｖ５−ＣＡ１０ウイルス粒子（それぞれ１．０６Ｅ１４個のウイルス粒子および１．６６Ｅ１４個のウイルス粒子）の坐骨神経注射後の熱応答を示す。ＡＡＶ８−Ｖ５−Ｃａｒ１０ウイルス粒子およびＡＡＶ８−Ｖ５−ＣＡ１０ウイルス粒子の注射後１５日間、基礎熱潜時は増加したが、生理塩類溶液の後または空ベクターを含有するウイルス粒子の後では増加しなかった。１６日後の終わりのＣＦＡ注射の後（熱潜時を測定した後）、すべての群で基線からの有意な低減があった。２４日後から開始して、ＡＡＶ８−Ｖ５−Ｃａｒ１０注射群およびＡＡＶ８−Ｖ５−ＣＡ１０注射群は鎮痛を示した（基線を上回る熱による潜時、ウイルス注射１５日後および１６日後と同様）を示したのに対し、対照群はＣＦＡ注射前と変わらなかった。（Ｎ＝８。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、二元配置分散分析に続くＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定による）。
【００１５】
【図５】様々な試験日数（ｘ軸）における足引込め潜時（秒）（ｙ軸）を示す棒グラフであり、Ｖ５−Ｃａｒ１０およびＶ５−ＣＡ１０の遺伝子移入が神経因性（Ｃｈｕｎｇ）マウス疼痛モデルにおける機械的痛覚過敏を予防することを実証している。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける生理塩類溶液、ＡＡＶ８−なし、ＡＡＶ８−Ｖ５−Ｃａｒ１０ウイルス粒子およびＡＡＶ８−Ｖ５−ＣＡ１０ウイルス粒子（それぞれ１．０６Ｅ１４個のウイルス粒子および１．６６Ｅ１４個のウイルス粒子）の坐骨神経注射後の機械的引込め閾値を示す。ＡＡＶ８−Ｖ５−Ｃａｒ１０は、ウイルス注射１２日後に基線を上回る機械的引込め閾値（鎮痛）を増加させ、これは、１９日後の脊髄神経結紮にもかかわらず２２日後まで維持された。他の群においては、引込め閾値の同様の増加はなかった。（Ｎ＝８。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、二元配置分散分析に続くＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ検定による）。
【００１６】
【図６】モルヒネが与えられた（腹腔内投与）（ｘ軸）およそ３０分での足引込め潜時（秒）（ｙ軸）との関連性を示す棒グラフである。塩類溶液と比較したとき、１０、３０、および６０ｍｇ／ｋｇの用量で延長は有意であった。
【００１７】
【図７】６０ｋｇのヒトにおける足引込め潜時（秒）（ｘ軸）とモルヒネ等価経口用量（投与およそ３０分後に評価される腹腔内投与、データは、相対変換を用いてヒトの等価の投薬に外挿される）（ｙ軸）との関連性を示すグラフである。Ｖ５−Ｃａｒ１０およびＶ５−ＣＡ１０の移入後の足引込め潜時の延長は、ヒトの経口等価用量と比較した場合、図２〜図５に記載されるように、これらのマウスモデルにおいて顕著な鎮痛を生じさせる。
【００１８】
【図８】ＣＡ１０をコードするアミノ酸配列（配列番号９）である。
【００１９】
【図９】ＣＡ１０−２０３をコードするヌクレオチド配列（配列番号１２）である。
【００２０】
【図１０】ＣＡ８断片であるＣＡ８−２０４をコードするヌクレオチド配列（配列番号１３）である。
【００２１】
【図１１】様々な試験日数（ｘ軸）における足引込め潜時（秒）（ｙ軸）を示す棒グラフであり、神経因性（Ｃｈｕｎｇ）マウス疼痛モデルにおけるＶ５−ＣＡ８ＷＴ（左の棒＝脊髄神経結紮後ＣＡ８ＷＴ、右の棒＝脊髄神経結紮後ＣＡ８ＷＴ）およびＶ５−ＣＡ８ＭＴ（ＣＡ８ＭＴはタンパク質を不安定にし、プロテアソームによる急速な分解をもたらすＳ１００Ｐ点突然変異を表す；Ｔｕｒｋｍｅｎ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ  ５，ｅ１０００４８７）（中央の棒＝脊髄神経結紮後ＣＡ８ＭＴ）の発現の鎮痛効果を実証している。Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスにおけるＡＡＶウイルス粒子（およそ１．０×１０１４個のウイルス粒子）の坐骨神経注射後の機械的引込め閾値を示す。ＡＡＶ８−Ｖ５−ＣＡ８ＷＴは、投与後７日間、機械的引込め閾値を、基線（鎮痛）を上回って増加させ、３日後の脊髄神経結紮にもかかわらず３８日後まで維持された。ＡＡＶ８−Ｖ５−ＣＡ８ＭＴをコードする発現ベクターの投与後に、同様の引込め閾値の増加はなかった。（Ｎ＝８。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、二元配置分散分析に続くＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ検定による）。この試験結果は驚くべきものである。まず，ＣＡ８がマウスＩＴＰＲ１標的に対して機能するかどうかは不明であった。これらのデータは、ヒトのタンパク質がマウスの細胞／組織において機能すること、ならびに本明細書で記載するインビトロでのバイオアッセイを使用して、ＣＡ鎮痛性ペプチドおよび変異体の薬力学的特性を検査することができることを示している。さらに、神経因性疼痛は、炎症性疼痛とは異なる機序から生じると考えられている。その上、炎症性疼痛に十分に作用する薬剤は、神経因性疼痛モデルにおいて痛覚過敏抑制または異痛抑制を生じない。驚くべきことに，ＣＡ８は、神経因性疼痛を予防および処置する上で有効である。
【００２２】
【図１２Ａ】ＮＢＬ細胞において定量的ＰＣＲによって測定される、ＣＡ８コード配列の最初の３つのエキソンによってエンコードされたＣＡ８断片、すなわち選択的スプライス断片「ＣＡ  ＡＬＴ  Ｇ」（ＳＮＰ  ｒｓ６４７１８５９における「Ｇ」対立遺伝子）、および野生型ＣＡ８「ＣＡ  ＡＬＴ  Ｃ」（ＳＮＰ  ｒｓ６４７１８５９についてのＣ対立遺伝子）の遺伝子発現を示す棒グラフである。野生型ＣＡ８は通常スプライスし、ＮＢＬ細胞はＣＡ８の最初の３つのエキソンによってエンコード化されたこの断片を、ほぼ独占的に産生する。ＳＮＰ  ｒｓ６４７１８５９における「Ｇ」対立遺伝子の発現は、選択的スプライシングをもたらし、ＮＢＬ細胞内にイントロンが保持された拡張エキソン３を有するＣＡ８−２０４産物はほぼまったく検出不可能である。したがって、ＣＡ８の最初の３つのエキソンによってエンコードされる本質的にすべてのＣＡ８転写物およびタンパク質断片は、ＮＢＬ細胞内で産生され、安定している。
【図１２Ｂ】このＣＡ８断片（最初の３つのエキソンのみによってエンコードされる）がＮＢＬ細胞でのＡＴＰ刺激性カルシウム放出を阻害することを実証する棒グラフである。野生型ＣＡ８（ＳＮＰ  ｒｓ６４７１８５９についてのＣ対立遺伝子）は通常スプライスし、野生型遺伝子産物のこの断片はＮＢＬ細胞内で産生される。ＳＮＰ  ｒｓ６４７１８５９における「Ｇ」対立遺伝子の発現は、選択的スプライシングをもたらし、ＣＡ８−２０４タンパク質の産生はＮＢＬ細胞内で最小限である。この断片は、ＣＡ８−２０１（野生型タンパク質、左の棒）を発現するベクターまたは「Ｃ」対立遺伝子によって生成された切断型ＣＡ８断片（右の棒）を発現するベクターと比較して、これらの細胞内での阻害を媒介しない。
【００２３】
【図１３Ａ】定量的ＰＣＲによって測定したＨＥＫ２９３内でのＣＡ８断片の発現を示す棒グラフである。ＳＮＰ  ｒｓ６４７１８５９における「Ｇ」対立遺伝子の発現は、これらの細胞内での選択的スプライシングをもたらし、ＨＥＫ２９３細胞内でイントロンが保持された拡張エキソン３を有するＣＡ８−２０４産物を産生する（左の棒）。ＨＥＫ２９３細胞内で、検出可能な野生型ＣＡ８（ＳＮＰ  ｒｓ６４７１８５９のＣ対立遺伝子）は本質的に存在せず、該細胞は、ＣＡ８の最初の３つのエキソンに対応する断片を産生する。したがって、ＨＥＫ２９３細胞内での本質的にすべてのベクター発現は、ＣＡ８−２０４代替転写産物である。
【図１３Ｂ】ＣＡ８−２０４がＨＥＫ２９３細胞内でのＡＴＰ刺激性カルシウム放出を阻害することを実証する棒グラフである。ＳＮＰ  ｒｓ６４７１８５９における「Ｇ」対立遺伝子を発現するベクターは、ＨＥＫ２９３細胞内で認められるＣＡ８−２０４タンパク質の選択的スプライシングおよび産生をもたらし、野生型ＣＡ８（ＣＡ８−２０１）を発現するベクターおよび「Ｃ」対立遺伝子によってコードされる断片を発現するベクターと比較して、ＡＴＰ誘導性カルシウム放出を阻害する。
【００２４】
【図１４】ＣＡ８送達のための例示的なＨＳＶ発現ベクターの線図である。ＴｒｋＡｐ−ＣＡ８−Ｆｌａｇ、Ｎａｖ１．７ｐ−ＣＡ８−２０４−Ｆｌａｇ、Ｎａｖ１．８ｐ−ＣＡ８−２０４−Ｆｌａｇ、および（非表示の）Ｔｅｔ−Ａｄｖｉｌｌｉｎ−ＣＡ８−２０４−Ｆｌａｇ）カセットをＩＣＰ４遺伝子座に組み込むことができる。基本のベクターは、任意選択的に、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４  ＩＥ調節遺伝子、ジョイント領域、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、ＩＣＰ２２  ＩＥ遺伝子「ＴＡＡＴＧＡＲＡＴ」、およびＵＬ４１  ｖｈｓ遺伝子が削除されている。ｇＢ：Ｎ／Ｔ突然変異が存在する場合があり（様々な実施形態において、細胞侵入を増強する）、ＢＡＣ配列は遺伝子間領域内のｌｏｘＰ部位の間に位置する。また、ベクターコンストラクトは、ＣＡ８断片の送達に好適である。
【００２５】
【図１５】ＣＡ８送達のための例示的なＨＳＶ発現ベクターの図である。ＴｒｋＡｐ−ＣＡ８−Ｆｌａｇ、Ｎａｖ１．７ｐ−ＣＡ８−Ｆｌａｇ、Ｎａｖ１．８ｐ−ＣＡ８−Ｆｌａｇ、および（非表示）Ｔｅｔ−アドビリン−ＣＡ８−ＦｌａｇカセットをＩＣＰ４遺伝子座に組み込むことができる。基本のベクターは、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４  ＩＥ調節遺伝子、ジョイント領域、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、ＩＣＰ２２  ＩＥ遺伝子「ＴＡＡＴＧＡＲＡＴ」、およびＵＬ４１  ｖｈｓ遺伝子が削除されている。ｇＢ：Ｎ／Ｔ突然変異は細胞侵入を増強し、ＢＡＣ配列は遺伝子間領域内のｌｏｘＰ部位の間に位置する。
【００２６】
【図１６】ＣＡ１０バイオ治療送達のための例示的なＨＳＶ発現ベクターの線図である。ＴｒｋＡｐ−ＣＡ１０−Ｆｌａｇ、Ｎａｖ１．７ｐ−ＣＡ１０−Ｆｌａｇ、Ｎａｖ１．８ｐ−ＣＡ１０−Ｆｌａｇ、および（非表示の）Ｔｅｔ−アドビリン−ＣＡ１０−Ｆｌａｇカセットの線図を、ＩＣＰ４遺伝子座に組み込むことができる。基本のベクターは、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４  ＩＥ調節遺伝子、ジョイント領域、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、ＩＣＰ２２  ＩＥ遺伝子「ＴＡＡＴＧＡＲＡＴ」、およびＵＬ４１  ｖｈｓ遺伝子が削除されている。ｇＢ：Ｎ／Ｔ突然変異は細胞侵入を増強し、ＢＡＣ配列は遺伝子間領域内のｌｏｘＰ部位の間に位置する。
【００２７】
【図１７】ＣＡ１１送達のための例示的なＨＳＶ発現ベクターの線図である。また、誘導性プロモーターシステムを表すＴｒｋＡｐ−ＣＡ１１−Ｆｌａｇ、Ｎａｖ１．７ｐ−ＣＡ１１−Ｆｌａｇ、Ｎａｖ１．８ｐ−ＣＡ１１−Ｆｌａｇ、および（非表示の）Ｔｅｔ−アドビリン−ＣＡ１１−Ｆｌａｇカセットを、ＩＣＰ４遺伝子座に組み込むことができる。基本のベクターは、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４  ＩＥ調節遺伝子、ジョイント領域、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、ＩＣＰ２２  ＩＥ遺伝子「ＴＡＡＴＧＡＲＡＴ」、およびＵＬ４１  ｖｈｓ遺伝子が削除されている。ｇＢ：Ｎ／Ｔ突然変異は細胞侵入を増強し、ＢＡＣ配列は遺伝子間領域内のｌｏｘＰ部位の間に位置する。
【００２８】
【図１８】様々な用量のＮＧＦ（１、１０、１００ｎｇ／ｍＬ）（ｘ軸）に応じた、ＮＢＬ細胞内でのＮＧＦ誘導性細胞内カルシウム放出（ｙ軸）を示す棒グラフである。また、ＨＥＫ２９３細胞は、細胞内カルシウム放出の増加とともにＮＧＦに応答する（データ非表示）。
【００２９】
【図１９】ＮＢＬ細胞内でのＮＧＦ誘導性細胞内カルシウム放出（ｙ軸）が、野生型ＣＡ８の過剰発現によってほぼ完全であるが、ＣＡ８の突然変異体の過剰発現によってそうなることがないことを示す棒グラフである。また、ＡＴＰ誘導性細胞内カルシウム放出は、ＣＡ１０の過剰発現によって阻害される（データ非表示）。
【００３０】
【図２０】ＮＢＬ細胞内での選択的ＩＴＰＲ１阻害剤２−ＡＰＢによるＮＧＦ誘導性細胞内カルシウム放出の遮断を示す棒グラフである。したがって、ＮＢＬ細胞内でのＮＧＦシグナル伝達は、ほぼ独占的にＩＴＰＲ１を経てであり、このＩＴＰＲ１選択的阻害剤によってほぼ完全に阻害される。また、２−ＡＰＢによる同様の阻害は、ＨＥＫ２９３細胞内でも観察された（データ非表示）。
【００３１】
【図２１Ａ】５ＨＴ−３受容体プロモーターの概略図およびマウス配列（配列番号１４）とヒト配列（配列番号１５）の比較である（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １５，Ａｕｇｕｓｔ  １９９８，１８（１６）６１８６−６１９４）。
【００３２】
【図２１Ｂ】５ＨＴ−３受容体プロモーター配列（配列番号１６）を提供する。
【００３３】
【図２２】ＮＰＹ−Ｙ１受容体プロモーター−エキソン１Ａの配列（配列番号１７）を提供する（ＪＢＣ  Ｖｏｌ．２７０，Ｎｏ．４５，Ｉｓｓｕｅ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  １０，ｐｐ．２７２７２−２７２７６，１９９５）。
【００３４】
【図２３】ＮＰＹ−Ｙ１受容体プロモーター−エキソン１Ｂの配列（配列番号１８）を提供する（ＪＢＣ  Ｖｏｌ．２７０，Ｎｏ．４５，Ｉｓｓｕｅ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  １０，ｐｐ．２７２７２−２７２７６，１９９５）。
【００３５】
【図２４】ＮＰＹ−Ｙ１受容体プロモーター−エキソン１Ｃの配列（配列番号１９）を提供する（ＪＢＣ  Ｖｏｌ．２７０，Ｎｏ．４５，Ｉｓｓｕｅ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  １０，ｐｐ．２７２７２−２７２７６，１９９５）。
【００３６】
【図２５Ａ】マウス（配列番号２０）、ラット（配列番号２１）、およびヒト（配列番号２２）のＮａｖ１．８プロモーターＳＣＮ１０Ａの配列を提供する（Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．２００８  Ａｕｇｕｓｔ；１０６（３）：１２０９−１２２４）。
【００３７】
【図２５Ｂ】ヒトＮａｖ１．８プロモーターＳＣＮ１０Ａの配列（配列番号２３）を提供する。
【００３８】
【図２６】Ｎａｖ１．７プロモーターＳＣＮ９Ａの配列（配列番号２４）を提供する。
【００３９】
【図２７Ａ】ヒトＴｒｋ−Ａプロモーターの配列（配列番号２５）を提供する（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９８，２７３：３９−４４）。潜在的なＤＮＡ結合タンパク質結合部位は、箱形で標識されている。
【００４０】
【図２７Ｂ】Ｔｒｋ−Ａプロモーターの配列を提供する（配列番号２６）。
【００４１】
【図２８】アドビリンプロモーターの配列（配列番号２７）を提供する。
【００４２】
【図２９】ＣＧＲＰ受容体プロモーターの配列（配列番号２８）を提供する。
【００４３】
【図３０】ＧＲＩＮ３Ａプロモーターの配列（配列番号２９）を提供する。
【００４４】
【図３１】炎症性疼痛動物モデルにおけるＣＡ断片ＣＡ８２０４Ｃの遺伝子移入が鎮痛過形成抑制を生じたことを示すグラフである。
【００４５】
【図３２】炎症性疼痛動物モデルにおけるＣＡ断片ＣＡ８２０４Ｇの遺伝子移入が鎮痛過形成抑制を生じたことを示すグラフである。
【００４６】
【図３３】免疫沈降（ＩＰ）およびウェスタンブロット法（ＷＢ）の検出によって実証されるように、ＲＹＲ１がＣＡ１０（Ｃａｒ１０）に結合することを示すゲルを描いている。
【００４７】
【図３４Ａ】ゲルであり、Ｃａｒ１０およびＣＡ１０がホルスコリン誘導性ｐＩＴＰＲ１を阻害したことを示す棒グラフを提供する。図３４Ａは、未処理の対照（ホルスコリンなし）についての結果を提供する。図３４Ｂは、１μＭホルスコリンを用いた処理からの結果を提供する。
【図３４Ｂ】ゲルであり、Ｃａｒ１０およびＣＡ１０がホルスコリン誘導性ｐＩＴＰＲ１を阻害したことを示す棒グラフを提供する。図３４Ａは、未処理の対照（ホルスコリンなし）についての結果を提供する。図３４Ｂは、１μＭホルスコリンを用いた処理からの結果を提供する。
【００４８】
【図３５】ＨＥＫ２９３細胞におけるＶ５−Ｃａｒ１０およびＶ５−ＣＡ１０の発現がＡＴＰ誘導性細胞質カルシウム放出を阻害することを示す棒グラフである。
【００４９】
【図３６】ＮＢＬ細胞における５ＨＴ誘導性ＲＹＲ依存性カルシウム放出がリアノジンによって阻害されることを示す棒グラフである。
【００５０】
【図３７】ＮＢＬ細胞におけるＶ５−Ｃａｒ１０およびＶ５−ＣＡ１０の過剰発現が、５０μＭの５ＨＴ誘導性細胞質カルシウム放出を阻害することを示す棒グラフである。
【００５１】
【図３８】ｐＣＭＶ−Ｎ−ｆｌａｇ−ＣＡ８−２０４ＧおよびｐＣＭＶ  Ｎ−ｆｌａｇ−ＣＡ８−２０４Ｃの構造を示す。
【００５２】
【図３９】ｐＡＡＶ−ｆｌａｇ−ＣＡ８−２０４Ｇ（ＡＬＴ  Ｇ）およびｐＡＡＶ−ｆｌａｇ−ＣＡ８−２０４Ｃ（ＡＬＴ  Ｃ）の構造を示す。
【００５３】
【図４０】ＮＢＬ細胞におけるカルシウム放出（Ｃａ２＋Ｆｕｒａ２画像解析）のＣＡ８−２０４Ｇの阻害を示す。
【００５４】
【図４１Ａ】ＨＥＫ２９３細胞（図４１Ａ）およびＮＢＬ細胞（図４１Ｂ）におけるＣＡ８  ＡＬＴ（Ｇ）（ＣＡ８−２０４ＧおよびＣＡ８  ＡＬＴ（Ｃ）（ＣＡ８−２０４Ｃ）の差次的組織発現を示す。
【図４１Ｂ】ＨＥＫ２９３細胞（図４１Ａ）およびＮＢＬ細胞（図４１Ｂ）におけるＣＡ８  ＡＬＴ（Ｇ）（ＣＡ８−２０４ＧおよびＣＡ８  ＡＬＴ（Ｃ）（ＣＡ８−２０４Ｃ）の差次的組織発現を示す。
【００５５】
【図４２】ＣＡ８−２０４Ｃ断片およびＣＡ８−２０４Ｇ断片の組織発現が変化することを示すグラフである。
【００５６】
【図４３】ＣＡ８−２０４Ｃ断片が、ＮＢＬ細胞内でのＡＴＰ刺激性カルシウム放出を阻害することを示す。
【００５７】
【図４４】ＣＡ８−２０４Ｇペプチド断片またはＣＡ８−２０４Ｃペプチド断片が、ＨＥＫ２９３細胞またはＮＢＬ細胞において選択的に発現するように２８ｋＤａまたは２６ｋＤａであることを示すゲルである。
【００５８】
【図４５】ＣＡ８  ２０４Ｃが、ｐＩＴＰＲ１のホルスコリン誘導性リン酸化を阻害することを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
様々な態様において、本開示は、安全かつ有効な鎮痛を提供する材料および方法に関する。本開示は、炭酸アンヒドラーゼ１０（ＣＡ１０（ヒト）およびＣａｒ１０（齧歯類））が、例えば、慢性神経因性および炎症性疼痛モデルにおいて鎮痛を生じ、痛覚過敏予防することを示す最初の開示である。少なくとも一態様において、材料および方法は、運動および他の感覚機能に最小限に干渉しながら疼痛を緩和し、それによって、オピオイド使用についての必要性を最小化しながら、生活の質を改善する。
【００６０】
一態様において、本開示は、疼痛を処置または予防する必要のある対象において疼痛を処置または予防する方法を提供する。該方法は、対象に、炭酸アンヒドラーゼ１０または炭酸アンヒドラーゼ１１をコードする核酸配列を含む発現ベクターを投与することを含み、そのため、該核酸が発現されて、対象において炭酸アンヒドラーゼ１０または炭酸アンヒドラーゼ１１を産生する。代替的な実施形態において、該方法は、対象に、炭酸アンヒドラーゼ８の断片をコードする核酸配列を含む発現ベクターを投与することを含み、そのため、該核酸が発現されて、対象において該断片を産生する。炭酸アンヒドラーゼ８の断片をコードする核酸配列は、ＣＡ８の最初の３つのエキソンを含み、任意選択的にＣＡ８断片をコードする核酸配列は、本明細書に記載されるＣＡ８−２０４である。様々な実施形態において、発現ベクターは、アデノ随伴ウイルスベクターまたは単純ヘルペスウイルスベクターなどのウイルスベクターである。
【００６１】
本発明の態様を以下でさらに記載する。セクションの見出しの使用は、単に読みやすくするためのものであり、それ自体を制限することを意図したものではない。文書全体は、統一された開示と見なされることを意図しており、本明細書に記載される特徴のすべての組み合わせが企図されることを理解されたい。
【００６２】
炭酸アンヒドラーゼ
炭酸アンヒドラーゼ１０（ＣＡ１０）は、炭酸アンヒドラーゼ（ＣＡ）スーパー遺伝子ファミリーのメンバーであり、触媒として不活性である３つのＣＡアイソフォームのうちの１つである。ＣＡ１０は中心的な炭酸アンヒドラーゼモチーフを保持しているが、酵素活性に重要な触媒亜鉛配位残基を欠いている。ＣＡ１０の機能は、以前は不明のままであるであった。配列比較により、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、ラット（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、およびマウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）のＣＡ１０タンパク質間で１００％の同一性が、ならびにゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）とアミノ酸レベルで９０％の同一性が明らかになった。ヒトＣＡ１０をコードする９つの転写産物があり、結果として７つの機能的アイソフォームになる。ヒトＣＡ１０の核酸およびアミノ酸の配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ＿０２０１７８（配列番号３）、ＮＰ＿０６４５６３（配列番号４）、ＮＭ＿００１０８２５３４（配列番号５）、ＮＰ＿００１０７６００３（配列番号６）、ＮＭ＿００１０８２５３３（配列番号７）およびＮＰ＿００１０７６００２（配列番号８）に記載されており、ヒトＣＡ１０のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ  Ｑ９ＮＳ８５（配列番号９）においても提供されている。
【００６３】
様々な態様において、発現ベクターは、配列番号２と少なくとも９０％の同一性（例えば、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性）を含むペプチドをコードする核酸配列を含む。様々な態様において、発現ベクターは、配列番号１と少なくとも９０％の同一性（例えば、少なくとも９５％または１００％の同一性）を有する核酸配列を含む。本明細書で使用される場合、「少なくとも９０％の同一性」および同様の用語は、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％などの９０％〜１００％の任意の整数を包含する。また、「少なくとも￥［パーセンテージ］の同一性」という用語は、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸の数をヌクレオチドまたはアミノ酸の総数で除算した数以上である任意のパーセンテージを包含する（￥［少なくともパーセンテージの同一性］≧￥［同一のヌクレオチドまたはアミノ酸の数］］／￥［ヌクレオチドまたはアミノ酸の総数］）。２つ以上の配列の整列されたアミノ酸（またはヌクレオチド）の同一性パーセントの計算は、当技術分野でよく理解されており、既知のコンピュータープログラムを使用して従来どおり判定される。例えば、配列同一性パーセントを判定するための２つ以上の配列の整列は、国立バイオテクノロジー情報センターのウェブサイトで入手可能な、ＢＬＡＳＴ（基本的なローカル整列検索ツール）プログラムに組み込まれているＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９−４０２（１９９７））によって記載されているアルゴリズムを使用して任意選択的に実行される。遺伝子産物は、鎮痛またはＩＴＰＲ１活性化のアンタゴニスト（ｐＩＴＰＲ１）およびＩＴＰＲ１仲介性細胞内カルシウム放出など、少なくとも１つの炭酸アンヒドラーゼ（ＣＡ１０）活性を呈する。
【００６４】
ＣＡ８とＣＡ１０との間のかなりの配列の相違にもかかわらず、ＣＡ１０およびＣａｒ１０が本明細書に記載される活性（例えば、鎮痛）を示すことは驚くべきことである。ＣＡ１０のアミノ酸配列は、他のＣＡアイソザイムとの全体のパーセント同一性が２５〜５７％であるとともに、ＣＡ１１との最高パーセント同一性を実証している。具体的には、ＣＡ１０（ＮＰ＿００１０７６００３．１）は、アミノ酸レベルでＣＡ８（ＮＰ＿００１３０８７６６．１）と約３３％の同一性しか呈さない。実際、ＣＡ１０は、アミノ酸レベルでＣＡ８または他のファミリーメンバーと比較してＣＡ１１に最もよく似ており、ＣＡ１０はＣＡ１１と５８％、ＣＡ８と３３％の配列同一性を実証している。ＣＡ１０には、３つの亜鉛リガンド結合ヒスチジン残基のうちの２つが欠けており、ＣＡ酵素活性の欠如が示唆されている。ＣＡ１１はまた、亜鉛−リガンド結合部位を欠いており、酵素活性の欠如を示唆している。ＣＡ８と同様に、ＣＡ１０は、ＩＴＰＲ１のホルスコリン誘導性リン酸化（ｐＩＴＰＲ１）を阻害することが認められ、ＡＴＰ誘導性ＩＴＰＲ１は、ＨＥＫ２９３細胞およびＮＢＬ細胞における細胞内カルシウム放出を媒介した。ＣＡ８は、ＩＰ３リガンド結合およびＩＴＰＲ１の活性化の、細胞内カルシウム放出をもたらすアロステリック阻害剤であると考えられている。ＩＴＰＲ１活性化のアロステリック阻害は、以前はＩＴＰＲ１とのＣＡ８の結合に依存すると考えられていた（Ｈｉｒｏｔａ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３７２，４３５−４４１）。ＣＡ８とは異なって対照的に、ＣＡ１０およびＣａｒ１０は、等電点−ウェスタンにおいてＩＴＰＲ１を結合しない。驚くべきことに、ＩＴＰＲ１との結合がないにもかかわらず、ＣＡ１０／Ｃａｒ１０およびＣＡ８−２０４は、ＩＴＰＲ１活性化（ｐＩＴＰＲ１）およびＡＴＰ誘導性細胞内カルシウム放出を阻害し、顕著な鎮痛をインビボで生じる。
【００６５】
様々な態様において、発現ベクターは、ＣＡ８断片をコードする核酸配列を含む。該核酸配列は、ＣＡ８（またはＣａｒ８）コード配列の最初の３つのエキソンを含む（または該エキソンからなる）。任意選択的に、ＣＡ８断片をコードする核酸配列は、ＣＡ８−２０４であり、その配列は、図１０において本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、ＣＡ８断片は、ＣＡ８−２０４Ｃであり、その核酸配列は、配列番号３２に明らかにされている（アミノ酸配列は、配列番号３０に明らかにされている）。いくつかの実施形態において、ＣＡ断片は、ＣＡ８−２０４Ｇであり、その核酸配列は、配列番号３３に明らかにされている（アミノ酸配列は、配列番号３１に明らかにされている）。いくつかの実施形態において、ＣＡ−８断片は、ＣＡ８−２０２（配列番号３４）またはＣＡ−２０３（配列番号３５）である。様々な態様において、発現ベクターは、本明細書に記載のＣＡ８−２０４核酸配列と少なくとも９０％の同一性（例えば、少なくとも９５％または１００％の同一性）を有する核酸配列を含む。本明細書で使用される場合、「少なくとも９０％の同一性」および同様の用語は、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％などの９０％〜１００％の任意の整数を包含する。エキソン１〜３を含むＣＡ８断片の核酸配列は、配列番号１として提供される。エキソン１〜５を含むＣＡ８断片の核酸配列は、配列番号３５として提供される。エキソン１〜８を含むＣＡ８断片の核酸配列は、配列番号３４として提供される。ＣＡ１１のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、配列番号１０および配列番号１１として提供されている。本明細書に記載の配列のうちのいずれかの発現産物は、鎮痛またはＩＴＰＲ１活性化のアンタゴニスト（ｐＩＴＰＲ１）およびＩＴＰＲ１媒介性細胞内カルシウム放出などの少なくとも１つの炭酸アンヒドラーゼ活性を呈する。
【００６６】
ＣＡ８、ＣＡ１０、およびＣＡ１１に関する材料および方法の説明は、マウスにも適用される（タンパク質版はＣａｒ８、Ｃａｒ１０、およびＣａｒ１１であり、本開示の様々な態様における使用が企図される。
【００６７】
発現ベクター
「ベクター」または「発現ベクター」は、宿主細胞に導入するための核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を含む任意のタイプの遺伝子コンストラクトである。様々な実施形態において、発現ベクターは、ウイルスベクター、すなわち、核酸送達ビヒクルとして機能することができるウイルスゲノムの全部または一部を含むウイルス粒子である。また、関心対象の遺伝子産物をコードする外来性核酸（複数可）を含むウイルスベクターは、組換えウイルスベクターと称される。当技術分野で理解されるであろうように、いくつかの文脈において、「ウイルスベクター」という用語（および同様の用語）は、ウイルスカプシドの非存在下でのベクターゲノムを指すために使用され得る。本開示の文脈で使用するためのウイルスベクターには、例えば、レトロウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）系ベクター、パルボウイルス系ベクター、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）系ベクター、ＡＡＶ−アデノウイルスキメラベクター、およびアデノウイルス系ベクターが含まれる。これらのウイルスベクターはいずれも、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９４）、Ｃｏｅｎ  Ｄ．Ｍ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  ｉｎ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ（ｅｄｉｔｏｒ），Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）およびこれらに引用されている参考文献に記載されている標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して調製することができる。さらに、Ｇａｔｅｗａｙクローン形成（Ｈａｒｔｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  ２０００，１０：１７８８−１７９５）および／または「組換え工学」システム（Ｃｏｐｅｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  ２００１，２：７６９−７７９）を用いた標的ゲノム領域の相同組換え媒介性クローン形成および操作の応用を用いた５‘および３’調節配列を含む遺伝子全体を含む、ヒトおよび他の宿主種由来の大型ゲノムコード配列を使用してウイルスベクターを調製することができる。
【００６８】
様々な実施形態において、異なるカルボキシルアンヒドラーゼペプチドの前駆体をコードするＤＮＡが提供される無作為または半無作為ライブラリーが開発される。このようなライブラリーには、数百以上の異なる配列を含有することができる。様々な態様において、カルボキシルアンヒドラーゼペプチドの前駆体をコードするＤＮＡの配列が異なっている数千以上（少なくとも１０００または少なくとも１０，０００）の異なる発現カセットは、ライブラリーを構成する。このようなライブラリーは、最初に１つ以上の所望の特徴を有するペプチドの前駆体（例えば、ＣＡ８、ＣＡ１０またはＣＡ１１に類似するカルボキシルアンヒドラーゼペプチドの前駆体）をコードする無作為または半無作為オリゴヌクレオチドの集団を生成することにより構築することができる。次に、このオリゴヌクレオチドの集団をカセット骨格内へとクローン化することができる（すなわち、プレプロタンパク質シグナル配列および任意選択的なバイオマーカーとインフレームで）。
【００６９】
無作為または半無作為ライブラリーを構築するための方法の例では、ＧＡＴＥＷＡＹ（商標）ステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）を採用する。ＧＡＴＥＷＡＹ（商標）システムでは、ｃｃｄＢは負の選択可能マーカーとして使用され、存在する場合、バクテリア細胞を殺滅する。ｃｃｄＢは、改変されたラムダインテグラーゼによって実施される部位特異的組換えを通じて、無作為または半無作為配列によって置き換えられる。ＧＡＴＥＷＡＹ（商標）技術において、ｃｃｄＢ感受性およびｃｃｄＢ耐性という２つの細菌株が使用される。ｃｃｄＢ含有プラスミドは、ｃｃｄＢ耐性菌内で増殖し、精製される。次に、このプラスミドは、インビトロ組換えに使用される。組換え産物は、インビトロ組換え中にｃｃｄＢ遺伝子が目的の遺伝子によって置き換えられたプラスミドについて選択するｃｃｄＢ感受性細菌へと転換される。ｃｃｄＢを置き換えることによって、クローン形成およびライブラリー構築の背景が劇的に低減または排除され、遺伝子の出入りまたは様々なプラスミドの自由な移動が可能となる。出発点として、基本のプラスミドは、ｃｃｄＢの非常に限定された数の遺伝子型が利用可能である、ｃｃｄＢの毒性効果に耐性がある細菌内で成長する。本開示の脈絡においてＧＡＴＥＷＡＹ（商標）技術を採用するために、大型ウイルスベクターシステムを使用して、大型ＤＮＡ（ＢＡＣなど）への形質転換に適した細菌株を改変して、ｃｃｄＢに対する非感受性を与える遺伝子を発現させる。好ましい株は、ＢＡＣの増殖および操作において使用されるＤＨ１０Ｂ細菌株に由来し、非常に大型のＤＮＡによる形質転換の傾向を増加させる突然変異（ｆｈｕＡ：：ＩＳ２）も有している。
【００７０】
いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、ＨＳＶ系ベクターである。ＨＳＶは、ヒトを含む哺乳類に感染する、封入された正二十面体の二本鎖ＤＮＡウイルスである。野生型ＨＳＶは、最終分化した非分裂細胞と分裂細胞との両方で感染および複製する。ＨＳＶベクターの利点は、ウイルスが潜在的な段階に入り、結果として長期のＤＮＡ発現をもたらす能力である。さらに、ＨＳＶは、感覚神経に優先的に感染し、しばしば免疫監視から逃れ、中枢神経系／末梢神経系には拡散せず、優れた逆行性輸送（例えば、皮内、関節内、または末梢神経）を呈する。さらに、ＨＳＶは、Ｇａｔｅｗａｙおよび／または組換え工学技術を使用して、大型のゲノムインサートを可能にする。ＨＳＶの配列は、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ：８０／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ？ｃｍｄ＝Ｒｅｔｒｉｅｖｅ＆ｄｂ＝ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ＆ｌｉｓｔ＿ｕｉｄ−ｓ＝９６２９３７８＆ｄｏｐｔ＝ＧｅｎＢａｎｋ＆ｔｅｒｍ＝ｈｓｖ−１＆ｑｔｙ＝１で入手可能である。
【００７１】
任意選択的に、ＨＳＶベクターは複製欠除であり、例えば、複製またはパッケージングに不可欠な少なくとも１つのＨＳＶ遺伝子が非機能性にされる（変異または削除）。例えば、複製欠除ＨＳＶベクターは、ＨＳＶゲノムの初期領域、最初期領域、または後部領域の１つ以上の遺伝子機能を欠くことがある。様々な態様において、ＨＳＶベクターは「増殖欠除」であり、ウイルス複製に不可欠な複数の遺伝子機能が破壊されていることを意味する。例えば、増殖欠除ベクターは、ＨＳＶゲノムの初期、最初期、および後期のうちの２つ以上に由来する遺伝子機能を欠いていることがある。ＨＳＶベクターは任意選択的に、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される機能的な最初期遺伝子を欠いており、例えば、機能的ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、およびＩＣＰ４７遺伝子を欠いている（任意選択的に、欠失によって非機能性にされる）。また、ＨＳＶベクターなどのウイルスベクターから非必須遺伝子を除去して、外来性ＤＮＡの大きな断片を収容することができる。例えば、ＨＳＶベクターは本質的に、ＨＳＶゲノム全体を欠く可能性がある。この点において、ベクターは、好ましくは、ウイルスの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）および／またはパッケージングシグナルを含むが、これらの構成要素は本開示のすべての態様において必要とされるわけではない。任意選択的に、１つ以上のプロモーターまたはウイルスＩＴＲおよびパッケージングシグナルは未処置のままである（すなわち、ＨＳＶアンプリコン）。
【００７２】
ＣＡ１０（もしくはＣａｒ１０）またはＣＡ１１（もしくはＣａｒ１１）をコードするヌクレオチドは、任意選択的に、削除されたネイティブウイルス遺伝子の配列を置き換える（任意選択的に、ベクターを複製欠除にする）。ＣＡ８（もしくはＣａｒ８）またはＣＡ８断片（もしくはＣａｒ８断片）をコードするヌクレオチドは、任意選択的に、削除されたネイティブウイルス遺伝子の配列を置き換える（例えば、ベクターを複製欠除にする）。
【００７３】
ＨＳＶベクターは、複数のゲノムセグメントの欠失により複製欠除になったとき、スペーサー要素を任意選択的に含み、単独複製欠除ＨＳＶベクターにより達成されるものと同様の補完細胞株においてウイルス成長を提供する。スペーサー要素は、所望の長さでありかつ所望の鎮痛性炭酸アンヒドラーゼ分子をコードする、任意の核酸の１つまたは複数の配列を含むことができる。スペーサー要素の配列は、ＨＳＶゲノムに関してコードされるかまたは非コードであることができ、ネイティブまたは非ネイティブであることができるが、欠除領域に対する複製必須機能（複数可）を回復しない。さらに、欠除ＨＳＶ領域のいずれかまたはすべてにおいてスペーサー要素を含むことは、大型インサートについてのＨＳＶベクターの容量を減少させることになる。
【００７４】
様々な実施形態において、ＨＳＶベクターは、すべてのＩＥ遺伝子について機能的に欠失している複製欠除ＨＳＶ（ｒｄＨＳＶ）ベクターである。追加のＩＥ遺伝子を削除する利点には、ニューロンおよび他の細胞型の毒性を低減することが含まれるが、これに限定されない。代表的なベクター骨格の構造は、例えば、在留絶縁体／染色質境界要素（ＣＴＲＬまたはＣＴＣＦ）による発生サイレンシングに対して保護された潜伏期（ＬＡＴ）遺伝子座における２つの選択された部位に挿入された導入遺伝子カセットを含む。これらの要素は、ＨＳＶ  ＬＡＰ２プロモーターとともに、長期発現を用意する。ウイルスＵＬ５０−ＵＬ５１遺伝子間領域に挿入された導入遺伝子カセットに隣接する異所性絶縁体の配置は、初代ヒト細胞のこの遺伝子座からの長期にわたる導入遺伝子発現も増強する。好適なベクターの系の単なる例として、高力価に達するＨＳＶベクターの増殖は、Ｃｒｅ組換えによりベクターコンストラクト中に存在する阻害ＢＡＣ配列を除去するＩＣＰ４／ＩＣＰ２７／Ｃｒｅ発現Ｕ２ＯＳ細胞株を使用して実証された。
【００７５】
ＨＳＶベクターの異なる領域の欠失は、宿主の免疫応答を変える可能性があることを理解されたい。特に、異なる領域の欠失は、ＨＳＶベクターによって生じる炎症応答を低減させることができる。さらに、ＨＳＶベクターのタンパク質コートは、野生型タンパク質コートに対する中和抗体によって認識されるＨＳＶベクターの能力または不能を減少させるように改変することができる。
【００７６】
基本のベクター、補完細胞、および工学技術は、Ｇａｔｅｗａｙ導入プラスミド内の次のプロモーター、すなわち、感覚ニューロン特異的Ｎａｖ１．８（例えば、ナトリウムチャネル）、ニューロン特異的Ｎａｖ１．７（例えば、ナトリウムチャネル）、高親和性神経成長因子受容体（ＴｒｋＡ）、体性感覚特異的アドビリンＣＡ８駆動因子、および非特異的構成ＣＭＶプロモーターからの鎮痛を促進するために、ＣＡ１０（もしくはＣａｒ１０）、ＣＡ１１（もしくはＣａｒ１１）、ＣＡ８（もしくはＣａｒ８）、および／またはＣＡ８断片（もしくはＣａｒ８断片）の長期発現のための安全なベクターを生成することができる。テトラサイクリン応答性プロモーターなどの誘導性プロモーター配列もまた、本開示の文脈において適切である。ＨＳＶベクターを使用してヒト治療薬を送達する利点には、免疫不全の宿主においてでさえ、明確な組織特異性、免疫応答の欠如、潜在的な再活性化の欠如が含まれる。
【００７７】
様々な態様において、ＨＳＶベクターはＨＳＶ潜伏関連転写物（ＬＡＴ）インスレーターを含む。
【００７８】
ＨＳＶ系のベクターは、例えば、米国特許第５，８３７，５３２号、第５，８４６，７８２号、第５，８４９，５７２号、および第５，８０４，４１３号、ならびに国際特許公開番号第ＷＯ９１／０２７８８号、第ＷＯ９６／０４３９４号、第ＷＯ９８／１５６３７号、および第ＷＯ９９／０６５８３号を参照されたく、これらは全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【００７９】
本開示の文脈での使用のためのＨＳＶベクターの例は、拡張されたＩＣＰ４またはＩＣＰ２７欠失、好ましくは両方を含む。「拡張された」欠失とは、ＨＳＶベクターが、相同配列の産生に使用される補完細胞株と比較して、相同配列の遺伝子座のいずれかまたは両方に相同配列を含まないことを意味する。望ましくは、ウイルスには、ＩＣＰ４またはＩＣＰ２７（または両方）のコード配列またはプロモーター配列が残っていない。好ましくは、ＩＣＰ２７の欠失はＵＬ５５遺伝子座にも広がり、望ましくは両方の遺伝子が欠失している。したがって、本開示の文脈における使用のためのウイルスは、補完細胞株において使用されるＩＣＰ４、ＩＣＰ２７およびＵＬ５５遺伝子に対するウイルス相同性が存在しないように、これらの遺伝子において拡張された欠失を含む。望ましくは、ベクターは、補完細胞株において採用されるものに対するいかなる相同のＤＮＡ配列も含まない（例えば、異なる調節配列およびポリアデニル化配列を使用してでさえ）。
【００８０】
本開示の文脈において、ＨＳＶ系のベクター以外のベクターを使用することができることは理解されるであろう。例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）およびレトロウイルスベクターは、本開示の方法および組成物における使用に好適である。このようなベクターの構築は、当業者に知られている（例えば、米国特許第４，７９７，３６８号、第５，６９１，１７６号、第５，６９３，５３１号、第５，８８０，１０２号、第６，２１０，３９３号、第６，２６８，２１３号、第６，３０３，３６２号および第７，０４５，３４４号を参照されたい）。非ウイルス法も遺伝子送達に利用することができ、これにはプラスミドの遺伝子銃適用が含まれるが、それに限定されない（例えば、本明細書に記載の１つ以上のカルボキシルアンヒドラーゼの前駆体をコードする非ウイルス発現ベクター）。遺伝子送達の別の非ウイルス法は、電気穿孔法である。代替的な移植可能な細胞株を操作して、所望のペプチド（またはライブラリー）を産生することができる。
【００８１】
様々な態様において、ウイルスベクターは、ＡＡＶベクターである。ＡＡＶは、人間の疾患を引き起こすことが知られていないＤＮＡウイルスであり、これによって、それが望ましい遺伝子療法の選択肢となる。ＡＡＶゲノムは、ｒｅｐおよびｃａｐの２つの遺伝子で構成されており、ＤＮＡ複製およびウイルスパッケージングのための認識シグナルを含む逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接している。ＡＡＶは、効率的な複製のために、ヘルパーウイルス（すなわち、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）との同時感染、またはヘルパー遺伝子の発現を必要とする。療法用核酸の投与に使用されるＡＡＶベクターは、典型的には、親ゲノムの大部分が削除されているため、ＩＴＲのみが残存するが、これは必須ではない。ＡＡＶ  ｒｅｐタンパク質を送達すると、必要に応じて、ＡＡＶ  ＩＴＲを含むＡＡＶベクターをゲノムの特定の領域に組み込むことができる。統合されたＡＡＶゲノムを含む宿主細胞は、細胞の成長または形態の変化を示さない。したがって、ＡＡＶベクターからの療法因子の長期発現は、持続性および慢性疾患の治療に有用であり得る。ＡＡＶベクターは、任意選択的にＡＡＶタイプ１、ＡＡＶタイプ２、ＡＡＶタイプ３（タイプ３Ａおよびタイプ３Ｂを含む）、ＡＡＶタイプ４、ＡＡＶタイプ５、ＡＡＶタイプ６、ＡＡＶタイプ７、ＡＡＶタイプ８、ＡＡＶタイプ９、ＡＡＶタイプ１０、またはＡＡＶタイプ１１に基づいている。ＡＡＶのゲノム配列、ならびにＩＴＲ、Ｒｅｐタンパク質、およびカプシドサブユニットの配列は、当技術分野で知られている。例えば、国際特許公開番号第ＷＯ００／２８０６１号、同第ＷＯ９９／６１６０１号、同第ＷＯ９８／１１２４４号、ならびに米国特許第６，１５６，３０３号、Ｓｒｉｖｉｓｔａｖａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ４５：５５５、Ｃｈｉｏｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ（１９９８）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７１：６８２３、Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ（１９９９）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７３：３９９４、Ｓｈａｄｅ  ｅｔ  ａｌ（１９８６）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．５８：９２１、およびＧａｏ  ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９９：１１８５４を参照されたい。
【００８２】
発現ベクターは、典型的には、作動可能に連結されたコード配列の転写および翻訳に必要な様々な核酸配列を含む。例えば、発現ベクターは、複製起点、ポリアデニル化シグナル、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、プロモーター、エンハンサーなどを含み得る。本開示のベクターは、好ましくは、ＣＡ１０（もしくはＣａｒ１０）またはＣＡ１１（もしくはＣａｒ１１）コード配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む。様々な態様において、本開示のベクターは、好ましくは、ＣＡ８（もしくはＣａｒ８）またはＣＡ８断片（もしくはＣａｒ８断片）コード配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む。「作動可能に連結された」は、プロモーターなどの制御配列が別の核酸配列に対して正しい位置および向きにあり、核酸配列にその効果（例えば、転写の開始）を及ぼすことを意味する。プロモーターは、それが作動可能に連結される核酸配列に対してネイティブまたは非ネイティブであり得、特定の標的細胞型に対してネイティブまたは非ネイティブであり得、プロモーターは、様々な態様において、構成性プロモーター、組織特異的プロモーター、または誘導性プロモーターであり得る（例えば、Ｔｅｔオン／オフ要素、ＲＵ４８６誘導性プロモーター、エクジソン誘導性プロモーター、ラパマイシン誘導性プロモーター、またはメタロチオネインプロモーターを含むプロモーターの系）。例えば、様々な実施形態において、鎮痛性ペプチド産生の産生を誘導または停止するための小分子の使用を可能にする誘導性プロモーターの系が採用される。プロモーターの例としては、感覚ニューロン特異的プロモーター（Ｎａｖ１．８プロモーターなど）、体性感覚特異的プロモーター（アドビリンプロモーターなど）、ｐ１７５プロモーター、またはＴｒｋＡ（神経成長因子受容体）プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。他のプロモーターには、ＴｒｋＢ、ＴｒｋＣ、Ｎａｖ１．７、ＣＧＲＰ、ＡＳＩＣ３、ＮＰＹ、ＮＫ１、５ＨＴ、ＧＲＩＮ３Ａ、またはＮＦ２００プロモーターが含まれるが、これらに限定されない。本明細書では、様々なプロモーターの配列の非限定例を図２１Ａ〜３０として提供する。
【００８３】
任意選択的に、ウイルスのコートまたはカプシド（すなわち、粒子表面）は、ウイルスの向性を調整するために改変される。例えば、ウイルスのある血清型のゲノムは、例えば、免疫応答を回避するために、異なる血清型のウイルスのカプシド内にパッケージングすることができる。代替的に（または加えて）、カプシドの構成要素は、例えば、結果として得られるベクターによって形質導入される細胞型を拡張するか、望ましくない細胞型の形質導入を（全体的にまたは部分的に）回避するか、または所望の細胞型の形質導入効率を改善するために改変され得る。例えば、形質導入効率は、一般に、対照（すなわち、未修正の適合ウイルスベクター）を参照することによって判定される。形質導入効率の改善は、例えば、所定の細胞型の形質導入率の少なくとも約２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％の改善をもたらし得る。所望の場合、カプシドは、肝細胞または生殖細胞などの非標的組織に効率的に形質導入しないように改変され得る（例えば、所望の標的組織（複数可）の形質導入の５０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下のレベル）。
【００８４】
疼痛
「疼痛」は、一般に、持続期間、原因、および／または身体の患部の観点から説明される。本発明は、神経因性疼痛（例えば、体性感覚神経系の病変または疾患により開始または発症する疼痛）、炎症性疼痛（例えば、炎症性メディエーターによる侵害受容性疼痛経路の活性化および／または感作により発症する疼痛）、および／または侵害受容性疼痛（例えば、組織の傷害または損傷によって発症する疼痛）を含むあらゆるタイプの疼痛の治療を含む。多くの疼痛障害また疼痛事故は簡単に分類することができず、これらの一般的なクラスと重複する態様または特徴を伴うことがある。また、疼痛は、体内の位置に関して分類され、体性痛は、体表または筋骨格組織の痛覚受容体の活性化から結果として生じるのに対し、内臓痛は内臓で感じられ、通常、胸部、骨盤、または腹部の痛覚受容体の活性化によって発症する。
【００８５】
神経因性疼痛は、実際の神経損傷があるときに発生する。一次求心性体性感覚神経は、末梢の感覚神経を表し、脊髄後角の二次ニューロンとやりとりする。二次体性感覚神経は、脊髄を脳幹および三次ニューロンに接続する。外傷（例えば、損傷、手術、毒性曝露、癌、および／または代謝性もしくは感染性の疾患）はすべて、体性感覚経路を損傷し、自発痛を発症する可能性がある。神経因性疼痛は、灼熱感、チクチク感、電撃感、もしくは刺痛感として現れることがあり、または穿刺、穿孔（ｐｉｅｒｃｉｎｇ）、切断、もしくは穿孔（ｄｒｉｌｌｉｎｇ）を含むさらに重症の感覚と関係していることがある。この種類の疼痛は通常、周波数および強度の波で発生し、通常は身体の一部または全体に拡散する。神経因性疼痛状態の例としては、脊髄損傷媒介性疼痛、中枢性疼痛症候群（例えば、神経系内の病変によって発症する）、閉じ込め症候群による末梢神経損傷と関係する疼痛（例えば、手根管症候群、肘部管症候群、または足根管症候群）多発性硬化症、線維筋痛症、帯状疱疹、ウイルス関連神経障害、有痛性外傷性単神経障害、多発ニューロパチー、糖尿病性神経障害、術後疼痛症候群（例えば、乳房切除後症候群、開胸術後症候群、幻痛）、および複合性局所疼痛症候群（例えば、反射性交感神経性ジストロフィーおよび灼熱痛）が挙げられるが、これらに限定されない。神経因性疼痛の原因は多数あり、例えば、化学物質への曝露（例えば、化学療法）、外傷（例えば、切断、椎間板ヘルニア、または脊髄損傷）、放射線への曝露、代謝性疾患、感染、および癌が含まれる。
【００８６】
侵害受容性疼痛は、身体組織の損傷によって発症し、普通、鋭い、痛む、またはズキズキする痛みとして説明される。この種類の疼痛は、良性の病理学的特性から、または増殖して癌部位の近くの他の身体部分を密集させる腫瘍もしくは癌細胞による可能性がある。また、侵害受容性疼痛は、骨、筋肉、もしくは関節に広がる癌、または器官もしくは血管の閉塞によって発症する場合がある。侵害受容性疼痛は、例えば、関節炎性疼痛（関節リウマチまたは変形性関節症など）および炎症誘発性内臓痛（例えば、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群ＩＢＳなどと関係する疼痛）を含む炎症と関係している場合がある。侵害受容性疼痛の例としては、例えば、捻挫、骨折、熱傷、こぶ、打撲傷、炎症（例えば、感染、外傷、または関節障害に起因する炎症）または閉塞による疼痛、および筋膜痛（筋肉または腱の異常なストレスを示す場合がある）が挙げられる。癌性疼痛は、侵害受容性または神経因性である可能性がある。
【００８７】
様々な態様において、本方法は、例えば、長期の持続的な疼痛、慢性疼痛、突破性疼痛、亜急性疼痛、急性疼痛、および癌性疼痛の処置を含む。急性疼痛は、一般に、個別の身体損傷（例えば、炎症、手術、骨折、頭痛、捻挫、挫傷、熱傷、または化学物質への曝露）に対する限られた生理学的応答である。急性疼痛は、一般に、３〜６か月間続く。慢性疼痛は、個別の身体損傷からの治癒に期待されるであろうよりも長く、例えば、３か月超持続する。慢性疼痛は、背部痛、神経損傷（脊髄損傷を含む）を発症する外傷（例えば、手術または創傷）、筋膜痛、関節炎、癌関連疼痛、神経因性疼痛、および線維筋痛症などの傷害と関係している。いくつかの実施形態において、疼痛は、慢性疼痛に重なる急性疼痛を包含し、ここで急性疼痛の急速発症が、持続的な慢性疼痛に重なる。
【００８８】
疼痛を処置すること（すなわち、低減すること、軽減すること、抑制すること、または緩和すること）または予防することを必要とする対象における疼痛を処置または予防する上での有効性は、任意の好適な方法を使用して判定される。動物モデルでは、鎮痛有効性は、例えば、尾部引込め検査、尾部フリック検査、蜂毒検査、カプサイシン検査、または尾部クリップ検査を使用して測定される。動物疼痛モデルは、当技術分野で十分に特徴付けられており、例えば、Ｌａｒｉｖｉｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐａｉｎ  ９７（２００２）７５−８６に記載されている。ヒトでは、処置の有効性（または必要性）は、例えば、疼痛スコア、再投薬までの時間、および生活の質の測定値を使用して監視または判定される。疼痛強度の数値評価（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９），Ｐａｉｎ：Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ｎｕｒｓｉｎｇ  ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｍｏｓｂｙ  Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯを参照されたい）または疼痛を軽度、中等度、もしくは重度と分類する言語評価尺度を確立するために、いくつかのツールが臨床設定で使用される。被験者による疼痛評価（強度、頻度）の低減、活動を再開する能力、睡眠能力の増加、および鎮痛剤の必要性の低減は、鎮痛の指標である。
【００８９】
本開示は、疼痛を処置することを必要とする対象における疼痛を処置する方法を提供する。疼痛を「処置する」ために、対象の疼痛を１００％除去する必要はない。痛覚または症状のいかなる減少も、対象における有益な生物学的効果を構成する。様々な態様において、本方法は、疼痛の重篤度（これらの状態に一般的に使用される他の薬物および／または療法の必要性および／または量（例えば、曝露）を低減することを含み得る）、持続時間、および／または頻度を低減する。疼痛を「予防する」ために、痛覚を完全に排除する必要はなく、疼痛または関係する症状の発症の任意の減衰もしくは遅延が企図される。この点において、任意選択的に、発現ベクターは、疼痛の発症前に対象に予防として投与される。
【００９０】
本開示の様々な実施形態は、痛みを伝達する体性感覚神経（例えば、Ｎａｖ１．７；Ｎａｖ１．８；Ｎａｖ１．９；  Ｔｒｋ−Ａ；５ＨＴなど）を標的にして安全に鎮痛を生じさせることを可能にする。本方法は、いくつかの態様において、他の非経口（抗ＮＧＦ）またはイオンチャネル阻害剤と関係した望ましい体性感覚および／または運動機能の無差別な喪失など、望ましくないオフターゲット効果を最小化または回避する。任意選択的に、発現ベクターは、ウイルスカプシド（例えば、ウイルス粒子）内に含まれ、ＣＡ１０およびＣＡ１１（またはＣＡ８）の長期発現を可能にし、長期管理に現に必要な繰り返しの侵襲的介入の必要性を最小化することができる。
【００９１】
本開示はさらに、疼痛の処置または予防を必要とする対象の疼痛の処置または予防における炭酸アンヒドラーゼ１０または炭酸アンヒドラーゼ１１（もしくは炭酸アンヒドラーゼ８）をコードする核酸配列を含む発現ベクターの使用、炭酸アンヒドラーゼ１０または炭酸アンヒドラーゼ１１（もしくは炭酸アンヒドラーゼ８）をコードする核酸配列を含む発現ベクターの、疼痛を処置または予防することを必要とする対象の疼痛を処置または予防するための医薬品の調製における使用、および疼痛の処置または予防を必要とする対象の疼痛の処置または予防における使用のための、炭酸アンヒドラーゼ１０または炭酸アンヒドラーゼ１１（もしくは炭酸アンヒドラーゼ８）をコードする核酸配列を含む発現ベクターを提供する。
【００９２】
鎮痛スクリーニング
本開示はさらに、１つ以上の鎮痛薬候補ペプチドをコードする複数の遺伝子移入ベクターを含むストックを提供する。ストックは、ベクターの任意の所望の力価を有することができ、通常、ウイルスベクターの脈絡においてプラーク形成単位（ｐｆｕ）で測定される。通常、ストックは、約１０５ｐｆｕ／ｍｌ〜約１０８ｐｆｕ／ｍｌを有する。いくつかの実施形態において、ストックは、均質である。いくつかの実施形態において、候補鎮痛ペプチド（複数可）（またはその前駆体）をコードするＤＮＡ配列は、ストック内のベクター間で異なる。様々な実施形態において、ストック内のベクター間で候補鎮痛ペプチド（複数可）（またはその前駆体）をコードするそれぞれのＤＮＡ配列は、無作為または半無作為ペプチドライブラリーを規定する。任意選択的に、ＤＮＡ配列は、カルボキシルアンヒドラーゼペプチドの前駆体をコードする。
【００９３】
本開示は、所望の鎮痛特性を有するペプチドを検出するための方法を提供する。本明細書に記載の発現ベクターの集団は、コードされたペプチドの発現に好適な条件下で宿主細胞の集団に導入される（例えば、ＮＢＬ細胞またはＨＥＫ２９３細胞として）。次に、１つ以上の宿主細胞が、所望の鎮痛特性を表す所望の効果についてアッセイされる。必要に応じて、Ｃａｒ８／ＣＡ８について本明細書に記載されているものなど、陽性および／または陰性対照薬と比較して、宿主細胞（複数可）がアッセイされる。対照薬は、所望の効果を落とすことが知られている薬剤（陽性対照）または所望の効果を呈さないことが知られている薬剤（陰性対照）であり得る。任意選択的に、本方法は、所望の鎮痛特性を実証するペプチドをコードするＤＮＡ配列を推定することをさらに含む。
【００９４】
宿主細胞（複数可）は、インビボまたはインビトロであり得る。インビトロ適用の場合、アッセイは、任意選択的に、所望の薬力学および／または鎮痛効果についてのハイスループットスクリーニングを促進することができる複数ウェルプレート（例えば、９６ウェルプレート）において実施される。このような適用では、ライブラリーからの発現ベクターは、任意選択的に、１個のウェルあたり１ベクター未満の計算力価でウェルに導入され（通常、１個のウェルあたり約０．５ベクター）、複数のベクターが細胞にトランスフェクトされるかまたは感染することになる統計的確率を最小化する。いくつかの実施形態において、発現ベクターはウイルスベクターであり、他の実施形態において、発現ベクターはプラスミドまたはファージである。しかしながら、プラスミドまたはファージ（例えば、ＢＡＣ）にウイルスゲノムが含まれる場合、ウェル内の細胞はウイルス粒子を産生することになる。代替的に、（それぞれのＤＮＡ配列およびプロモーターを含む）ウイルスゲノムを含むＢＡＣシステムを使用して、より多数の細胞を形質転換し、ウイルス粒子をレスキューすることができる。次に、得られたウイルス粒子をアッセイに使用することができる。例えば、無作為または半無作為ライブラリーを保持するＨＳＶ骨格を含む約１０，０００個のＢＡＣを６ウェルディッシュの宿主細胞に導入する場合、約２４時間後に約１００，０００個のウイルス粒子を収集することができる。これらはアッセイに採用することができる。望ましくは、ライブラリーのすべてのメンバーがアッセイ中である尤度を増加させるために、約３０，０００個のウイルス粒子（元のベクター数の約３倍）を使用する必要がある。アッセイされることになる所望の効果は、アポトーシス、ＩＴＰＲ１活性化およびカルシウム放出の拮抗作用、またはこの細胞シグナル伝達経路の他の態様など、任意の好適に測定可能な効果であり得る。例示的なアッセイおよび方法論は、実施例において提供されており、実施例は、制限しているものと解釈されるべきではない。
【００９５】
いくつかの実施形態において、宿主細胞はインビボ（すなわち、動物モデル）であり、これは、アッセイされることになる所望の効果が本質的に挙動的であるときに特に好適である。例えば、鎮痛効果は、例えば、外部刺激または医学的状態によってもたらされる痛覚過敏または異痛の減少を含み得る。このような実施形態において、ライブラリーは、ベクターの複数の無作為ストック（この各々が実質的に相同である）にクローン増殖され、それぞれのストックが疼痛の動物モデルに導入され得る。次に、動物の疼痛応答を減少させる該ストック由来のベクターＤＮＡを配列決定して、コードされた鎮痛ペプチドを識別することができる。
【００９６】
製剤、投与レジメン
様々な態様において、発現ベクターは、生理学的に許容される（すなわち、薬理学的に許容される）担体、緩衝剤、賦形剤、または希釈剤を含む組成物（例えば、医薬組成物）で提供される。任意の好適な生理学的に許容可能な（例えば、薬学的に許容可能な）担体を本開示の文脈内で使用することができ、そのような担体は当技術分野で周知されている。担体の選択は、部分的に、本組成物が投与される特定の部位、および本組成物を投与するために使用される特定の方法によって決定されるだろう。本組成物はまた、宿主細胞への発現ベクターの取り込みを促進する薬剤も含むことができる。好適な組成物製剤には、水性および非水性溶液、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を血液と等張にする溶質を含有し得る等張無菌溶液、ならびに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、および防腐剤を含み得る水性および非水性無菌懸濁液が含まれる。本組成物は、アンプルおよびバイアルなどの単位用量または複数用量の密封容器で提供でき、例えば、使用する直前に水などの無菌液体担体を追加することのみを必要とする凍結乾燥された（凍結乾燥）状態で保存され得る。ＣＡ８、ＣＡ８断片、ＣＡ１０またはＣＡ１１をコードする発現ベクターを含む組成物は、一態様において、組成物の使用に関する指示を提供する包装材料とともに容器内に配置される。一般に、そのような指示には、試薬濃度、ならびにある特定の実施形態において、本組成物を再構成するのに必要になり得る賦形剤成分または希釈剤（例えば、水、生理食塩水、またはＰＢＳ）の相対量を説明する具体的な表現が含まれる。
【００９７】
様々な実施形態において、発現ベクターは、脂質小胞に取り込まれ（任意選択的に取り込みを増強する）、またはナノ粒子の形態で提供される（例えば、タンパク質、脂質、炭水化物、またはこれらの組み合わせを用いた組込みによる）。物理的衝撃を利用して、細胞によるベクターの取り込みを増加させることができる。任意選択的に、発現ベクターには化学物質系形質導入エンハンサーが提供される。形質導入エンハンサーの例としては、ポリプレックス技術が含まれ、この中で、正に帯電したＤＮＡを陰イオン性脂質および中性脂質と組み合わせてポリプレックスを構築し、取り込みを増強する。ポリプレックスは、発現単位についての化学送達複合体の別の形態を表す。一般的に、ポリプレックスは、陽イオン性ポリマーからなり、作製は、イオン相互作用および自己集合に基づいている。別の例である陽イオン性リポソームは、細胞膜と相互作用してエンドサイトーシスを経た取り込みを増強する。トランスフェクション効率を改善するために、ＤＯＰＥなどの電気的中性の脂質を添加して、細胞質への放出を増強し、リソソーム分解を回避する。別の実施形態において、リポソームの代替としてポリマーソームが使用される。ポリマーソームは、リポソームよりも安定しており、機械的に強く、貯蔵寿命が長い傾向にあるリポソーム（脂質二重層を有する小胞）の合成版である。エンドソーム溶解剤には、取り込み中に作られたエンドサイトーシス小胞からのナノ粒子の脱出を促進する不活化アデノウイルスが含まれる。
【００９８】
毒性が低く、運搬能力が高く、作製が容易なため、ポリカチオン性ナノ粒子は、有利な実施形態である。ポリエチレンイミンおよびキトサンは、発現ベクターの送達に好適な高分子担体である。他のポリカチオン性担体には、ポリ（ベータ−アミノエステル）およびポリホスホルアミダートが含まれる。デンドリマーは、発現単位の細胞ターゲティングを支援する上で有用な球状の、非常に分岐した高分子である。
【００９９】
一実施形態は、カチオン性デンドリマーの使用を含む。これらの分子は、自然にＤＮＡまたはＲＮＡなどの負に帯電した遺伝材料を引き付け、この複合体は、エンドサイトーシスを介して標的細胞内に取り込まれる。近年、デンドリマーは、速度および加工時間を削減する動態駆動化学を使用して製造されてきた。「プリオスター」デンドリマーは、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む様々な発現単位を保有し、毒性をほとんどまたはまったく伴わずに高い効率で標的細胞に効率的にトランスフェクトすることができる。
【０１００】
金、シリカ、酸化鉄、リン酸カルシウムなどの無機ナノ粒子は、核酸を標的細胞に送達する別の化学的手段を表す。無機ナノ粒子の利点には、安定した長期保存、低コストの製造、最小限の免疫原性、および微生物の攻撃に対する耐性が含まれる。ナノサイズの無機粒子（例えば、５００ｎｍ未満、好ましくは２５０ｎｍ未満、最も好ましくは１００ｎｍ未満）は、所望の場合、形質導入を増強するための別の選択肢を表す。ナノ粒子は、ＤＮＡまたはＲＮＡを効率的にトラップし、分解することなくエンドソームからの脱出を可能にする。
【０１０１】
ペプチド導入ドメイン（ＰＴＤ）とも呼ばれる細胞透過性ペプチドは、細胞膜を効率的に通過する一方で、様々な発現単位に共有結合または非共有結合し、細胞への進入を促進する短鎖ペプチド（４０アミノ酸未満）である。ＰＴＤは、局在化ペプチド配列を組み込むことにより、外来性核酸を特定の細胞小器官に放出するように構築することができる。
【０１０２】
発現単位を標的細胞に送達するいくつかの周知の物理的方法には、電気穿孔法、ソノポレーション（膜をキャビテーションして発現単位への進入をより高める超音波周波数）、マグネトフェクション（発現単位は、磁石を用いた標的細胞への進入を増強する磁気粒子と複合体形成する）、および流体力学的方法の使用が含まれる。
【０１０３】
様々な実施形態において、発現ベクターは、感染性ウイルス粒子（カプシド、一本鎖または二本鎖のＤＮＡ、ＲＮＡ、または必要なペプチド（複数可）をコードできる他の核酸を含む）を表すウイルスカプシド（ウイルス粒子）に組み込まれ、このことは、潜在的な感染と安定した長期鎮痛ペプチド産生とを支援するのに有利である。ペプチド発現は細胞内であり、鎮痛または痛覚過敏抑制を生じる方法でニューロンの興奮性および機能に影響を与えることができる。
【０１０４】
発現ベクター（例えば、ウイルス粒子）は、対象に何らかの改善または利益を提供する、すなわち対象の疼痛の感覚または知覚を低下または抑制するのに十分な量および場所で投与される。状況に応じて、発現ベクターを含む組成物は、体腔に適用もしくは点滴され、標的組織に直接適用され、および／または循環系に導入される。例えば、様々な状況において、発現ベクターを含む組成物を静脈内、腹腔内、口腔内、管腔内（例、膀胱、胆嚢、胆管、膵管、または副鼻腔）、筋肉内、眼内、経角膜、動脈内、門脈内、病巣内、皮内、関節内、ニューロン内、神経節内、神経節周囲、皮内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、吸入（例えば、上気道および／または下気道）、経腸、経膣、または経直腸手段によって送達することが望ましいだろう。様々な態様において、発現ベクターは膵管に直接投与され、これは、例えば、膵癌または膵炎と関係する疼痛を処置するのに有用である）。様々な態様において、発現ベクターは三叉神経節に投与される。所望の場合、発現ベクターは、目的の領域に供給する動脈内または静脈内投与を介して局所的に投与される。様々な態様において、本明細書に記載の発現ベクターは、末梢体性感覚神経に直接的にまたは間接的に投与される。一実施形態において、投与経路は、後根神経節、他の神経節もしくは体性感覚ニューロン、または脊髄への直接投与（例えば、注射または注入）を包含する。任意選択的に、発現ベクターは、関節内注射または末梢（例えば、坐骨）神経注射を介して投与される。様々な態様において、発現ベクターは、関節内挿入により投与され、例えば、罹患した関節炎の関節に供給する体性感覚神経を鎮静させることによって、慢性侵害受容性疼痛を処置する。他の実施形態において、発現ベクターは、マイクロカテーテルを介して、または内視鏡を使用して直接可視化して、様々な腔、管、洞、または器官に投与される。他の実施形態は、疼痛の領域への発現ベクターの局在化を促進するための針の使用を含む。例えば、本開示は、カテーテルまたは針を使用して疼痛が生じる部位（例えば、器官、または関節などの他の身体部位）への発現ベクターの投与を企図する。さらに他の実施形態は、例えば、蛍光透視法、超音波、ＣＴまたはＭＲＩを使用して発現ベクターの沈着を誘導するための画像解析の使用を含む。さらなる実施形態は、胃または上部消化管の劣化を回避することによって、皮内経路を介した腸への発現ベクターの送達を促進する製剤の使用を含む。
【０１０５】
様々な態様において、腸溶性コーティング封入を使用して、胃酸による分解および発現ベクターの不活性化を防ぐことができる。製剤は、発現ベクターを包む腸溶性ポリマーとしてＥｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ３０Ｄ−５５を使用して開発された腸溶性コーティング顆粒で構成されるカプセルの組込みを含んでもよい。カプセル製剤の最適化は、酸性培地中で２時間インキュベーション、およびｐＨ６．８の緩衝液中で１時間の崩壊時間の後に最多生ベクター数を実証するＥｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ３０Ｄ−５５を使用した最適な保護コーティングで達成されることができる。カプセル内のＥｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ３０Ｄ−５５の保護量は、胃液耐性と相関している。ベクター、トウモロコシデンプン、ラクトース一水和物、ポリビニルピロリドンで構成され、１２．５％（ｍ／Ｖ）のＥｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ３０Ｄ−５５でコーティングされた顆粒からカプセルを調製したとき、人工胃液に対する保護特性が観察される。他のコーティングを使用して、ゼラチンカプセル上でおよびＤＲｃａｐｓ（登録商標）上でも市販のポリマーＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）Ｌ１００−５５の腸溶性保護特性を提供することができる。さらに他の腸溶性コーティングには、例えば、有効な遅延放出、胃の保護、および軽度〜中等度の酸感受性を有する化合物の保護を可能にするポリマー配合物を組み込んだＶｃａｐｓ（登録商標）（Ｌｏｎｚａ）腸溶性コーティングカプセル、ならびに非常に酸感受性である小分子および大分子に腸溶性保護を提供するポリマー配合物を組み込んだｅｎＴＲｉｎｓｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙが含まれる。
【０１０６】
また、不安定なベクターに胃耐性を提供するさらに他の実施形態は、腸溶性ポリマー系を他の剤形に加えることによって得ることができる。錠剤、ミニ錠剤、ペレット剤および顆粒剤（普通、カプセルシェルに充填されている）は、他で言及されているポリマーを利用した最も一般的な腸溶性剤形である。
【０１０７】
様々な態様において、発現ベクターは、末梢神経（例えば、坐骨、大腿、眼窩下、三叉、顔面、または肩甲上）に注射されるか、または神経節内注射を介して注射される。他の実施形態において、発現単位は、環状であり、ヌクレアーゼ破壊に対して耐性があるむき出しの一本鎖または二本鎖ＤＮＡ発現単位であり得る。他の実施形態において、より良い吸収のために、ベクターを脂質小胞に組み込むことができる。さらに他の実施形態は、ナノ粒子としてタンパク質、脂質、炭水化物分子、またはこれらの組み合わせに組み込まれる一本鎖または二本鎖ＤＮＡ発現単位を含む。さらに他の実施形態は、標的細胞への物理的な進入方法を含む。例示的な実施形態は、標的細胞への発現ベクター進入の取り込みを増強するための化学的方法の使用を含む。他の実施形態は、標的細胞への発現ベクターの取り込みの増強のための物理的、化学的、および生物学的方法の組み合わせを利用する。
【０１０８】
代替的に、本組成物は、膜、スポンジまたは本組成物が吸収もしくはカプセル化された別の適切な材料の移植を介して局所的に投与される。移植デバイスが使用される場合、一態様において、デバイスは、好適な組織に移植され、発現ベクターの送達は、例えば、拡散、徐放性ボーラス、または継続投与を介する。
【０１０９】
特定の対象に対する特定の投与レジメンは、投与される療法薬の量、投与経路、ならびに任意の副作用の原因および程度に部分的に依存するであろう。本開示に従って対象（例えば、ヒトなどの哺乳類）に投与される量は、合理的な時間枠にわたって所望の応答に影響を及ぼすのに十分でなければならない。対象における疼痛を処置または予防する方法の様々な実施形態において、ＣＡ８（もしくはＣａｒ８）、ＣＡ８（もしくはＣａｒ８）断片（ＣＡ８−２０４、ＣＡ８−２０４Ｃ、ＣＡ８−２０４Ｇ、ＣＡ８−２０２およびＣＡ８−２０３）、ＣＡ１０（もしくはＣａｒ１０）またはＣＡ１１（もしくはＣａｒ１１）をコードする発現ベクターは、鎮痛を誘発する量で投与される。言い換えると、投与される組成物の用量は、疼痛を低減、軽減、抑制、または緩和するのに十分である。１０４〜１０１５個の導入単位（例えば、１０７〜１０１２個の形質導入単位）、あるいは、少なくとも約１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、もしくは１０１５、またはそれより多数の導入単位（例えば、約１０１０または１０１２個の導入単位など、少なくとも約１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３または１０１４個の導入単位）のゲノム等価力価のウイルス粒子の例示的な用量。いくつかの状態では、長期にわたる処置が必要であり、これは、経時的な複数回投与を伴っても伴わなくてもよい。発現単位の点で定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を用いてインビトロで定量することができるゲノム等価物におけるベクターの等価用量は、１０４〜１０１５である（発現単位とは、本明細書に記載の１つのペプチドを生成することができる個別の遺伝単位である）。様々な態様において、用量は、１０７〜１０１２発現単位、または少なくとも約１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４または１０１５発現単位以上（例えば、約１０１０または１０１２など、少なくとも約１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、または１０１４発現単位）。
【０１１０】
適宜、ＣＡ８、ＣＡ８断片（ＣＡ８−２０４、ＣＡ８−２０４Ｃ、ＣＡ８−２０４Ｇ、ＣＡ８−２０２およびＣＡ８−２０３を含む）、ＣＡ１０またはＣＡ１１（もしくはそれらのマウス版）をコードする核酸を含む発現ベクターは、他の物質（例えば、治療薬）および／または他の治療様式と併用投与され、追加の（もしくは補強された）生物学的効果を達成する。この態様には、発現ベクターおよび１つ以上の追加の好適な薬剤（複数可）の同時投与（すなわち、実質的に同時投与）および非同時投与（すなわち、重複するかどうかにかかわらず、任意の順序での異なる時間での投与）が含まれる。ある特定の態様において、異なる成分は、同じかまたは別々の組成物で、かつ同じかまたは異なる投与経路で投与されることが理解されよう。
【０１１１】
本開示のさらなる態様によると、本発明の任意の他の態様による使用または方法が提供され、この中で、ＣＡ８，ＣＡ８断片（ＣＡ８−２０４、ＣＡ８−２０４Ｃ、ＣＡ８−２０４Ｇ、ＣＡ８−２０２およびＣＡ８−２０３を含む）、ＣＡ１０またはＣＡ１１ベクターは、疼痛管理に有用な１つ以上の薬剤と組み合わせて、別々に、順次、または同時に投与される。さらなる薬剤の例としては、オピオイド鎮痛薬（例えば、モルヒネ、ヒドロモルホン、オキシモルホン、フェンタニル、コデイン、ジヒドロコデイン、オキシコドン、またはヒドロコドン）、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）（例えば、アスピリン、ジクロフェナク、イブプロフェン、ナプロキセン、オキサプロジン、またはシクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）阻害剤）、鎮静薬（例えば、バルビツール酸系鎮静薬）、筋弛緩薬、抗うつ薬、抗てんかん薬（例えば、カルバマゼピン、またはバルプロ酸）、追加の麻酔薬、およびコルチコステロイド（例えば、デキサメタゾン）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１２】
このように一般的に記載される本発明は、例示として提供され、本発明を限定することを意図しない以下の実施例を参照することによって、より容易に理解されるであろう。
【実施例】
【０１１３】
実施例１
本実施例は、炭酸アンヒドラーゼ８（ＣＡ８ヒト遺伝子記号、Ｃａｒ８げっ歯類オルソログ）、炭酸アンヒジラーゼ１０（ＣＡ１０ヒト遺伝子記号、Ｃａｒ１０げっ歯類オルソログ）および炭酸アンヒドラーゼ１１（ＣＡ１１ヒト遺伝子記号、Ｃａｒ１１げっ歯類オルソログ）が、ＩＴＰＲ１サイトソルの遊離カルシウムシグナル伝達経路を調節することを実証する。ＩＴＰＲは、炎症性疼痛挙動において重要な役割を担っているＩＴＰＲからのイノシトール１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）シグナル伝達分子および細胞内カルシウム放出を発生させる向代謝性受容体活性化から生じるシグナルを伝達すると考えられている。Ｚｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２０１５。本明細書で初めて記載されたデータは、ＣＡ８／Ｃａｒ８）、ＣＡ８／Ｃａｒ８断片（ＣＡ８−２０４を含む）、ＣＡ１０／Ｃａｒ１０、およびＣＡ１１／Ｃａｒ１１が、ＩＴＰＲ１カルシウム放出チャネルのＩＰ３活性化、細胞内カルシウム放出を阻害するように、驚くべきことに、細胞内カルシウム放出を阻害することにより治療用鎮痛薬（例えば、モルヒネおよびクロニジン）に対する鎮痛応答を阻害するように、さらにこれらのＣＡペプチドがモデルにおいて顕著な鎮痛を生じ、かつ慢性神経因性疼痛を処置または予防するように機能することを示す。また驚くべきことに、ＣＡ８／Ｃａｒ８断片（ＣＡ８−２０４を含む）およびＣＡ１０／Ｃａｒ１０はＩＴＰＲ１に結合しない（共免疫沈降によって実証）が、ＣＡ８（Ｃａｒ８）ペプチドとは明確に対照的に、ＣＡ８／Ｃａｒ８断片（ＣＡ８−２０４を含む）およびＣＡ１０／Ｃａｒ１０ペプチドの細胞内過剰発現は、ホルスコリンおよびＡＴＰ刺激性細胞内カルシウム放出に応答してＩＴＰＲ１活性化（リン酸化）を阻害する。
【０１１４】
さらに、本明細書で提供されるデータは、ＣＡ８の過剰発現が、ほぼ完全な２−ＡＰＢによって示されるように、ＩＴＰＲ１を経てＮＢＬ細胞内でほぼ排他的にシグナル伝達する神経成長因子（ＮＧＦ）を選択的に阻害することを初めて実証する。また、ＣＡ８は、ＮＧＦ誘導性ＩＴＰＲ１活性化（ｐＩＴＰＲ１）、細胞内カルシウム放出を阻害する。驚くべきことに、また、ＣＡ８（Ｃａｒ８）ＤＲＧの過剰発現は、脊髄神経（ＳＮＬ）根損傷後の慢性神経因性疼痛を予防しおよび治療することが実証されている。以下の実施例は、ＤＲＧ  ＣＡ８（Ｃａｒ８）およびＣＡ１０（Ｃａｒ１０）の導入ならびにＣＡ８（Ｃａｒ８）およびＣＡ１０（Ｃａｒ１０）タンパク質の過剰発現がＩＴＰＲ１活性化（例えば、Ｓｅｒ−１７５５におけるｐＩＴＰＲ１）を下方調節し、細胞内カルシウム放出を阻害することを確立する。驚くべきことに、ＣＡ８タンパク質とＣＡ１０（Ｃａｒ１０）タンパク質の間のアミノ酸相同性が欠如しているにもかかわらず、ＣＡ８タンパク質およびＣＡ１０（Ｃａｒ１０）タンパク質はまた、慢性炎症性および神経因性疼痛モデル（脊髄神経結紮（ＳＮＬ））における機械的異痛および熱痛覚過敏を予防する坐骨神経注射後に顕著な鎮痛を生じさせる。
【０１１５】
モルヒネは、細胞内カルシウムの放出を惹起することによって鎮痛を生じさせる。本明細書で提供されるデータは，ＣＡ過剰発現がＮＢＬ細胞におけるモルヒネ誘導性ＩＴＰＲ１媒介カルシウム放出を阻害することを実証する。具体的には、これらのデータは、ＤＲＧ  Ｃａｒレベルがモルヒネおよびクロニジンの最大半量の鎮痛応答に関連していることを示す。より高いＣａｒの発現は、モルヒネおよびクロニジンの最大半量のより高い鎮痛用量と関係している（Ｌｅｖｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。これらのデータは，ＣＡがクロニジンおよびモルヒネに対する用量応答を右に移行する鎮痛耐性を誘発する可能性があることを初めて示唆し（例えば、同じ量の鎮痛応答を生じるためにはより多量の用量の鎮痛薬が必要とされる）、これらの効果は細胞内カルシウム放出の阻害と関連している。このことは、モルヒネが、鎮痛応答を生じるために細胞内カルシウム放出を必要とすることを考慮すると、予期せぬことである。したがって、オピオイドおよびクロニジン鎮痛応答に必要とされるカルシウム調節経路を阻害することによって侵害受容性疼痛を生じる代わりに，ＣＡが顕著な鎮痛を生じさせることは驚くべきことである。
【０１１６】
材料および方法
動物：すべての実験と手順は、意識のある動物の実験的疼痛に関する研究者のための現行の指針によって行われ、マイアミ大学の動物管理使用委員会によって承認された。体重２０〜３５グラムの雄の成Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から取得し、食物および水を自由に摂取できるホームケージ環境内で維持した。動物を、湿度およい温度が制御されたウイルス／抗原非含有施設内で１２時間ごとの明暗周期において飼育した。動物を、手術前に７日間順化させ、検査前に実験装置に慣れさせた。
【０１１７】
ウイルスコンストラクトの生成：例として、マウスまたはヒトのＶ５−Ｃａｒ１０またはＶ５−ＣＡ１０タンパク質を発現するアデノ随伴ベクターを生成する方法を説明する。Ｃａｒ１０（マウス）およびＣＡ１０（ヒト）ｃＤＮＡをＡＴＣＣから購入した。これらの遺伝子産物を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｒｅｃｙｃｌｅｒ勾配（Ｍｏｄｅｌ５３３１）により増幅し、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−ＨｉｓＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）のＢａｍＨＩ制限部位とＸｈｏＩ（ＮＥＢ）制限部位の間で、順方向プライマー：ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴ−ＧＡＣＣＴＧＡＧＣＴＴＣＡＴＴＧおよび逆方向プライマー：ＴＴＴＣＴＣＧＡＧＣＴＧＡＡＡＧＧＣＣＧＣＴＣＧＧＡ−ＴＧを使用してクローン形成した。次に、Ｖ５−Ｃａｒ１０またはＶ５−ＣＡ１０コンストラクトをｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−ＨｉｓＡから増幅し、ＡＡＶ  Ｈｅｌｐｅｒ−Ｆｒｅｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）ヘルパーフリーシステムの１つの成分であるｐＡＡＶ−ＭＣＳベクターのＢａｍＨＩ制限部位とＢｇｌＩＩ制限部位の間に、順方向プライマー：ＣＴＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣおよび逆方向プライマー：ＣＴＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡ−ＣＣＡＴＧＧＣを用いてクローン形成した。
【０１１８】
組換えＡＡＶ８−Ｖ５−Ｃａｒ１０およびＡＡＶ８−Ｖ５−ＣＡ１０ウイルス粒子を産生した。手短に言えば、ベクタープラスミド、およびパッケージングプラスミドＡＡＶ８  ７３３（５）およびｐＨｅｌｐｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を、リン酸カルシウム沈殿法を使用して、７０％コンフルエンスでＨＥＫ２９３細胞内へ同時トランスフェクトした。細胞を３７℃および５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。４８時間後、細胞を収集し、細胞からＡＡＶ粒子を放出するために３回凍結解凍した。Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）Ｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）処理の３０分後、低速の遠心分離によって粗ライセートを清澄化した。上清をＯｐｔｉＳｅａｌ（商標）チューブ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）内の不連続イオジキサノール段階勾配に負荷し、Ｔｙｐｅ７０Ｔｉローター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）内で６９，０００ｒｐｍ（３５０，０００ｇ）、１８℃で１時間遠心分離した。ＡＡＶ粒子を含む画分を収集し、ＡＫＴＡ  ＦＰＬＣシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、５ｍｌのＨｉＴｒａｐカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのカラムクロマトグラフィーによってさらに精製した。溶離緩衝液（２０ｍＭのトリス、２１５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０）を使用して、約２５ｍＬをカラムから溶離し、ＡＡＶ粒子を濃縮し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５  ５０Ｋ濃縮装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してＨＢＳＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で２００μｌに緩衝液交換した。次に、精製されたＡＡＶ粒子を、ｑＰＣＲ法を使用して、ゲノム含有量（発現単位）について滴定した。１ｍＬあたり１〜３×１０１４個のＧＣ（ゲノムコピー）の範囲の力価を得た。
【０１１９】
細胞培養およびトランスフェクション：ヒトニューロン由来（例えば、ＮＢＬ）、ヒト非ニューロン由来（例えば、ＨＥＫ２９３）細胞、または分散したげっ歯類初代ＤＲＧ細胞を使用することができる。ＨＥＫ２９３細胞（カタログ番号ＣＲＬ−１５７３  ＡＴＣＣ  Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を、１０％ウシ胎児血清ＦＢＳ（カタログ番号１６１４０  ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（カタログ番号１５１４０  ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ−Ｇｌｕｔａｍａｘ  カタログ番号０５６６、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。細胞を６ウェルプレートに１ウェルあたり１．０×１０５個の密度で播種した。翌日、リポフェクタミンＬＴＸ試薬およびプラス（カタログ番号１５３３８  ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を介して、細胞にプラスミドをトランスフェクトした。各トランスフェクションについて、２μｇのＡＡＶ２−ＩＴＲ（対照）、ＡＡＶ２−Ｖ５−Ｃａｒ１０、またはＡＡＶ２−Ｖ５−ＣＡ１０ベクターを使用した。本明細書に記載の本開示の様々な実施形態において、ＡＡＶ２が、採用されたウイルスベクターではない状況下では２μｇの発現ベクター（陽性対照および陰性対照を含む）であった。
【０１２０】
発現ベクター（アデノ随伴ＡＡＶ８−Ｖ５−Ｃａｒ１０およびＡＡＶ８−Ｖ５−ＣＡ１０ベクター）の坐骨神経注射：マウスをケタミン、キシラジンおよびアセプロマジンカクテル（ＶＥＤＣＯ，Ｓａｉｎｔ  Ｊｏｓｅｐｈ，ＭＯ）の腹腔内注射により麻酔した。坐骨神経曝露後、約１．５μｌのＡＡＶ８−なしのウイルス粒子（１．３６Ｅ１３個のウイルス粒子、ＳＬ１００８３２  ＳｉｇｎａＧｅｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、ＡＡＶ８−Ｖ５−Ｃａｒ１０およびＡＡＶ８−Ｖ５−ＣＡ１０（それぞれ、１．０６Ｅ１４個のウイルス粒子および１．６６Ｅ１４個のウイルス粒子）を３５ゲージのＮａｎｏｆｉｌ針（Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｓａｒａｓｏｔａ，ＦＬ）を使用して坐骨神経に注射した。坐骨の注射部位は、第３指の先端からおよそ４５ｍｍとした。
【０１２１】
炎症性痛覚過敏モデル：マウスは、滅菌０．９％生理食塩水中の１％カラギーナン（カタログ番号２２０４９  Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）２．５ｍｇ／ｍｌまたは滅菌０．９％生理食塩水中の完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）（カタログ番号Ｆ５８８１  Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）０．５ｍｇ／ｍｌを左側後肢足へと３０μｌの皮内注射を受けた。Ｆｅｈｒｅｎｂａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１２；Ｃｈａｐｔｅｒ  ５：Ｕｎｉｔ  ５４。
【０１２２】
神経因性疼痛モデル：まず、末梢ニューロパチーの誘発のために、ケタミン、塩酸キシラジンおよびアセプロマジン（ＶＥＤＣＯ，Ｓａｉｎｔ  Ｊｏｓｅｐｈ，ＭＯ）の腹腔内注射によってマウスを麻酔した。次に、前述の手順を使用して、脊髄神経の緊密結紮（マウスモデルの左Ｌ５）を行った。Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐａｉｎ．１９９２；５０（３）：３５５−３６３。
【０１２３】
挙動検査：熱感度および機械的感度をそれぞれ、Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ検査およびｖｏｎ  Ｆｒｅｙフィラメント閾値計算により測定した。例えば、Ｂｏｙｃｅ−Ｒｕｓｔａｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０１０；６１７：４１−５５、Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐａｉｎ．１９８８；３２（１）：７７−８８、およびＣｈａｐｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９４；５３（１）：５５−６３を参照されたい。検査は、日光のような照明のある静かな部屋で行った。盲検研究者がデータを収集する前に１週間、挙動する部屋および装置に動物を少なくとも６０分間慣らした。熱感度検査は、一定温度（３０℃）のガラス板上にプラスチックボックスを置いたＩＩＴＣ  Ｐｌａｎｔａｒ  Ａｎａｌｇｅｓｉａ  Ｍｅｔｅｒ装置（ＩＩＴＣ  Ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗｏｏｄｌａｎｄ  Ｈｉｌｌｓ，ＣＡ）を使用して行った。マウスの足底表面を、足引込め誘導への放射熱のビームに曝露した。潜在的な負傷を防ぐために、最長２０秒をカットオフ値として、基線潜時を５〜９秒に調整した。高強度光線の開始から足の引込めまでの秒単位の潜時を、足の引込め潜時として定義した。足引込め潜時を確立するために、２つの連続した検査を平均した。機械的感度検査は、高床メッシュの上に置かれた倒立プラスチック製箱の中で行った。マウス後足を、各後足の足底表面に対して垂直に提示される、対数的に増分する剛性を備えた一連のｖｏｎ  Ｆｒｅｙフィラメント（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ  Ｃｏ，Ｗｏｏｄ  Ｄａｌｅ，ＩＬ）のうちの１つで１〜２秒間押下し、アップダウン法を用いて５０％の閾値を判定した。
【０１２４】
薬力学（カルシウム放出のバイオアッセイ）：１５ｍｍのカバーガラス（カタログ番号７２２２８  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈａｔｆｉｅｌｄ，ＰＡ）をポリ−Ｄ−リジン（Ｓｉｇｍａ）でコーティングした後、ラミニンおよび１×１０５個の細胞を各カバーガラス上に播種した。２４時間後、前述のように細胞にＡＡＶ２−ＩＴＲ、ＡＡＶ２−Ｖ５−Ｃａｒ１０、またはＡＡＶ２−Ｖ５−ＣＡ１０ベクターをトランスフェクトした。ＡＡＶ２が採用されない実施形態において、他の発現ベクター（ウイルスベクターを含む）を使用する。Ｆｕｒａ−２ＡＭ（カタログ番号Ｆ１２２１  ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）をＤＭＳＯ（５０μｌ中５０μｇ）および１％プルロン酸−１２７（カタログ番号Ｐ２４４３  Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中にストック溶液として溶解した。播種の４８時間後、細胞に、１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ、４．５ｍＭ  ＫＣｌ、１０グルコース、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．４．２５を含有する標準的なＣａ＋２緩衝液中に暗所で室温で４５分間、２μＭ  Ｆｕｒａ−２ＡＭ色素を負荷した。色素負荷後、カバーガラスをＣａ＋２緩衝液で洗浄した。画像解析およびＡＴＰ刺激実験のために、カバーガラスをＬｅｉｃａ  ＤＭＩ６０００Ｂ顕微鏡上の記録チャンバー（カタログ番号ＱＲ−４２ＬＰ  Ｗａｒｎｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｈａｍｄｅｎ，ＣＴ）に入れ、１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＭｇＣｌ、４．５ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭグルコース、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４を含有するＣａ＋２非含有緩衝液で室温（約２２℃）で灌流した。Ｆｕｒａ−２ＡＭのレシオメトリー画像解析について、励起光を超高速波長スイッチャーでフィルター処理して、３４０ｎｍおよび３８４ｎｍの波長を提供し、高速デジタルカメラ（Ｌｅｉｃａ  ＤＦＣ３６５ＦＸ）で捕捉した。ＩＴＰＲ１チャネルの活性化を、１μＭ  ＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の適用を介して達成した。データの取得および加工は、ＬＡＸＳソフトウェアを使用して行った。視野にわたる目的の領域を選択し、各フレームでの平均画素数強度を測定した。データを、蛍光強度と時間の比としてプロットし、その後、相対尺度に変換した。
【０１２５】
免疫沈降：５０μｌの磁気ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１μｇのｐＩＴＰＲ１抗体とともに４℃で４５分間インキュベートした。上清を捨て、ビーズを結合緩衝液で洗浄した。２００〜４００μｇの試料タンパク質を添加し、４℃で４時間ビーズとともにインキュベートした。次に、タンパク質複合体を洗浄緩衝液で３回洗浄し、ＳＤＳ試料緩衝液で溶離した。次に、試料を７０℃で１０分間加熱し、Ｃａｒ１０についてウェスタンブロット分析に供した。また、本明細書に記載の方法は、Ｃａｒ８，ＣＡ８，ＣＡ８断片（ＣＡ８−２０４）、ＣＡ１０、Ｃａｒ１１およびＣＡ１１に関しての使用に好適である。
【０１２６】
免疫組織化学（ＩＨＣ）：ＨＥＫ２９３細胞をカバーガラス１枚あたりの密度でポリ−Ｌ−リジン／ラミニン被覆カバーガラスに播種し、２４時間後に細胞にそれぞれＣａｒ１０、ＣＡ１０または空ベクターをトランスフェクトした。細胞を３７℃でさらに９６時間培養した後、ホルスコリン１μＭ（Ｆ６８８６  Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で５分間処理し、次に４％パラホルムアルデヒドで１５分間固定し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で１０分間透過処理し、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、ｓｉｇｍａ）で１時間ブロッキングした。次に、細胞を抗ｐＩＴＰＲ１（カタログ番号８５４８ｓ  ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗Ｃａｒ１０（カタログ番号ＳＡＢ１１０２２８６  Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、抗Ｖ５（カタログ番号Ｒ９６０  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、抗ＩＴＰＲ１（カタログ番号８５６８  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）抗体とともに４℃で一晩インキュベートした。翌日、細胞を対応する二次抗体（１：２００）とともに室温で１時間、暗所でインキュベートした。カバーガラスを乾燥させ、Ｄａｐｉ（カタログ番号Ｐ３６９３１  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む蛍光封入剤を使用してスライドに固定した。抗Ｃａｒ８、抗ＣＡ８、抗ＣＡ８断片（ＣＡ８−２０４）、抗ＣＡ１０、抗Ｃａｒ１１および抗ＣＡ１１抗体を使用するＩＨＣ法も企図されることは理解されよう。
【０１２７】
統計分析：データを平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表し、２群比較の場合はＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定、１つの分散を用いた多重比較（３群以上）の場合はＢｏｎｇｒｔｔｏｎｉの事後検定を用いた一元配置分散分析、２つの分散を用いた多重比較（３群以上）の場合はＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後検定を用いた二元配置分散分析により、統計的有意について分析した。すべてのデータ解析およびグラフィックスは、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５．０ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｉｎｃ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して行った。
【０１２８】
薬力学：ウイルスコンストラクトの電気生理学的特性の影響のバイオアッセイ（インビトロでのニューロンの興奮性の低減の検証）：ニューロンおよび他のトランスフェクト細胞を、室温（２０〜２５℃）で、パッチクランプ技術の電流クランプ穿孔ホールセル設定で試験する。アンホテリシンＢによって穿孔が得られ、十分な電流クランプ記録を確保すると同時に、試験されることになっている各細胞集団において未処置のサイトソルカルシウム濃度および適切なサイトゾソシグナル伝達装置を維持する。前述のように、パッチマイクロピペット（抵抗値３〜６Ｍ）を引っ張り、研磨する。Ｓａｒａｎｔｏｐｏｕｌｏｓ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００４；１３９（１）：６１−８、Ｓａｒａｎｔｏｐｏｕｌｏｓ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｇ  Ａｎｅｓｔｈ  Ｐａｉｎ  Ｍｅｄ．２００２；２７（１）：４７−５７、Ｋａｗａｎｏ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｐａｉｎ．２００９；５：１２、Ｓａｒａｎｔｏｐｏｕｌｏｓ  ＣＤ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．２００７；１１３２（１）：８４−９９、Ｈｏｇａｎ  ＱＨ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐａｉｎ．２０００；８６（１−２）：４３−５３。記録には、Ｍｕｌｔｉｃｌａｍｐ  ７００Ｂアンプを使用し（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｆｏｓｔｅｒ，ＣＡ，ＵＳＡ）、変換機（ＤｉｇｉＤａｔａ１４４０Ａ；Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して信号をデジタル化する。解析にはｐＣＬＡＭＰソフトウェア（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用する。前述のように、細胞外Ｔｙｒｏｄｅ液および内部ピペット液を使用して、細胞全体の電流クランプ記録を行う。興奮性パラメータを、発現パラメータによって分類された細胞の群間で比較する。発現パターン（例えば、ＴｒｋＡまたはＮａｖ１．８の正および負）、サイズ（大型対小型ＤＲＧ体性感覚ニューロン）、および興奮性が異なる細胞集団からの記録は、使用するウイルスベクターに応じて異なる。以下のパラメータ、すなわち（１）基線で少なくとも３分間記録した安静時膜電位（ＲＭＰ）および自発的電気活動（自発的活動電位（ＡＰ）数（スパイク数／分））を群間で比較する。安定した記録が少なくとも１分間確立された後、さらなる比較のためのＲＭＰを判定する。静止電位が−４５ｍＶよりも脱分極しているニューロンは、大きな漏れ電流を示しているため却下する。（２）ＡＰを、電流注入による閾値を超えた刺激に応答して惹起する。電流の閾値は、単形性のＡＰが引き起こされるまで順次の２５ｐＡの段階的な増分によって判定され、各閾値が記録されることになる。次に、ＡＰは単一の２ミリ秒超の閾値電流パルスによって惹起され、（ＡＰおよび後過分極（ＡＨＰ）の両パラメータを測定するために）５００ミリ秒続くその後の記録で捕捉される。（３）ＲＭＰ、ピークＡＰ振幅、ＡＰ閾値、および閾値でのＡＰ持続時間を含む群間で、ならびに５％および５０％の振幅で、ＡＰの特徴が測定されおよび比較される。ＡＰ閾値を、脱分極相の急激な上昇の開始時に測定する。また、ＡＰを、水平方向の時系列線がこのＡＰ閾値から引かれた地点から、下行する再分極相がこの線を交差する地点まで測定する。ＡＰ振幅を、ＲＭＰからＡＰピークまで測定する。ＡＰの持続時間を、ＲＭＰからＡＰピークまでの５％の電圧、およびＲＭＰからピークまでの５０％の電圧の中点で判定する。また、ＡＰの大きさを、曲線下面積として表す。ＡＨＰ振幅を、ＲＭＰからＡＨＰ相の最も過分極したレベルまで測定する。ＡＨＰ持続時間を、ＲＭＰへの５０％および９０％回復を表す地点で測定する。また、ＡＨＰの大きさを曲線下面積として表す。基電流（ＡＰを惹起する脱分極２００ミリ秒パルスの段階的に漸増する一連の最小電流振幅として判定される）、および細胞が単一のＡＰを生じるかまたは繰り返し発火するかのいずれかである基電流のＡＰスパイク発生のパターンの少なくとも２倍の電流注入工程中のＡＰスパイク発生のパターンを含む、細胞興奮性に関する他の２つの測定値を使用する。
【０１２９】
ＨＳＶ  ＴｒｋＡおよびＮａｖ１．８プロモーターは頑強な長期レポーター発現を駆動する：ウイルスは、インビトロでの逆行性輸送を介してＤＲＧ細胞体にのみ到達する。これらはｒｄＨＳＶであるので、近くの神経膠細胞、または局所注射部位に突出していない他のＤＲＧ細胞に感染させることはできない。３０日以上の後、げっ歯類においてＬＡＴ遺伝子座およびＩＣＰ４の両遺伝子座から強い発現を観察する。ＩＣＰ４遺伝子座は経時的に増加するので、発現カセット（ＴｒｋＡｐ−ＣＡ、Ｎａｖ１．８ｐ−ＣＡ、Ａｄｖｉｌｌｉｎｐ−ＣＡなど）のための部位として選択した。例えば、ニューロンにおける十分な発現が実証されていない場合、または発現が経時的に減少する場合、発現カセットをＬＡＴ遺伝子座に再配置することができる。
【０１３０】
薬物動態：用量応答および組織特異性（インビボでの構造的および機能的検証）：鎮痛および運動機能の検査には、機械的疼痛（ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ）、熱痛（Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ）、および非反射性の感覚機能および運動機能（自動測定を用いた自発的ホイール走の測定：ホイール走行の距離／時間、ホイール走行の時間、および歩間距離）の測定が含まれる。アッセイ条件につき１８匹の未処置の雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを使用する。鎮痛応答の初回の時間経過を、１４日後まで隔日で監視し、次に２８日後（寿命終了点）まで毎週監視する。臨床安全性評価を、各マウスの基線でおよび毎週行う（例えば、体重、全身の外観、摂餌量、血圧、体温）。制限されたニューロン発現を、ｑＰＣＲ（局所）および免疫組織化学（ＩＨＣ）（細胞のサブタイプ）を使用して、皮膚、末梢神経、ＤＲＧおよび後角（ＤＨ）におけるこれらの予備試験と同様に評価する。
【０１３１】
投与経路の評価：様々な態様において、発現ベクターは直接的な坐骨神経および大腿神経（ＳＦＮ）または関節内（ＩＡ）注射を介して投与される。これらの経路を使用して達成される生物学的応答を、皮内投与を使用して達成される応答と比較する。直接的な坐骨神経への注射は、腰部ＤＲＧの導入によって顕著な鎮痛を達成する。主要な関節の感覚神経支配は、直接的なＩＡ注射を経てアクセスできる。ＤＲＧ導入は、このアプローチを用いて達成され、臨床専門家による迅速な採用、アクセスの容易さ、およびすべての疾患に影響される皮膚分節の潜在的に適切なウイルス感染性を提供する。ラジオ波焼灼療法による直接的な末梢神経ブロックは、いくつかの主要な関節（例えば、膝ブロックを介した膝、肩甲上神経ブロックを介した肩）についての従来の技術を使用して代替手段として容易に達成され、他の関節の疼痛緩和のための末梢神経ブロックは実行不可能ではない（例えば、顎関節、股関節、足首、肘、手首など）。目下、顎関節症（ＴＭＪ）の疼痛を処置する選択肢は非常に限られており、本明細書に記載の発現ベクターの関節内注射は、症状の制御のための変形療法を表す。
【０１３２】
すべての測定は、処置に対してマスクされた個体によるものである。動物は、群に無作為に割り当てられる。アッセイは、当日のおよそ同じ時刻に実施される。定期的な臨床安全性評価が行われる（例えば、体重、全身の外観、摂餌量、脈拍、血圧、体温）。ＳＦＮおよびＩＡへの注射ならびに一連の希釈（最大１万倍）に最高到達用量（ＰＦＵ）が使用され、すべての発現ベクターについての後続パラメータが最適化される。１８匹の未処置の雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス／群が使用される。鎮痛応答は、１４日後まで隔日で、その後は２８日後（寿命終了時）まで毎週監視する（鎮痛、機械的および熱誘発応答に対する痛覚過敏抑制、自動自発走行ホイール（ホイール走行距離／時間、ホイール走行時間、ホイール走行速度、ストライド）。さらに、基線および毎週の臨床安全性評価を各マウスで行う（例えば、体重、全身の外観、摂餌量、血圧、体温など）。ニューロン発現の制限を、ＱＰＣＲ（局所）およびＩＨＣ（二重染色を用いた細胞サブタイプ）を使用して、末梢神経、ＤＲＧおよびＤＨで評価する。また、直接的なＤＲＧ導入は、経椎間孔硬膜外注射を使用して達成することができる。
【０１３３】
薬力学：鎮痛および痛覚過敏抑制のバイオアッセイ：慢性炎症性および慢性神経因性疼痛モデルの両方を採用する。これらの試験には、ＣＦＡに対する保護（予防）試行（疼痛の前に注射された発現ベクター）、ならびにＳＮＬおよびＯＡに対する保護および処置試行（神経損傷が発生し、経時的に評価された後に発現ベクターを注射する）が含まれる。直接的な坐骨神経注射は、ＳＮＬモデルの慢性神経因性疼痛を予防しおよび処置する（図７を参照されたい）。機序と関連する短期および長期の予備的な安全性試験およびオフターゲット毒性は、２つのモデルで実施することができる。すべての測定値は、処置に対してマスクされた記録された個体である。動物は、群に無作為に割り当てられる。アッセイは、当日のおよそ同じ時刻に実施されることになる。臨床病理学的特性、目視検査、器官重量、および組織病理学的特性を評価することになっており、ＣＡ８，ＣＡ８−２０４、ＣＡ１０、ＣＡ１１、ＩＴＰＲ１、ｐＩＴＰＲ１を、ＤＲＧ、脊髄、ＣＳＦおよび血液を使用して測定することになる。ＤＲＧのニューロンおよび神経膠のアポトーシスを検討する。有効性評価に加えて、臨床安全性評価を行う（例えば、体重、全身の外観、摂餌量、血圧、体温）。応答の時間経過に基づいて、可能な限り「処置」設計を採用する。直接的な神経「ブロック」アプローチは、慢性頭痛、三叉神経痛、および他の頭蓋顔面痛障害を含む様々な疼痛障害に潜在的に適用可能である。所望の場合、特定のモデルおよび潜在的な臨床応用に基づいて経路を変更する。例えば、ＩＡ経路は、特にＴＭＪＤと関連している。この技術はマウスでは難しいので、膝ＯＡモデルは代用として採用することができ、その理由は、これが実行可能であるとともに、慢性的な広く認められる臨床状態であるからである。ＴＭＪＤのような進行性ＯＡは、一般に非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）に耐性のある安静時疼痛（すなわち、自発性または神経因性疼痛）を引き起こす可能性があり、それゆえ、神経因性疼痛および侵害受容性疼痛の両方を特徴とする。この点において、マウスの関節骨溶解、軟骨侵食、ならびに関連する触覚および熱過敏症による体重支持の非対称性を惹起するＯＡの十分に確立されたヨード酢酸一ナトリウム（ＭＩＡ）関節内注射モデルが有用である。このモデルでは、自発痛がジクロフェナク、ＴＲＰＶ１およびＴＲＰＡ１アンタゴニストでは緩和されないが、関節内リドカインでは完全に緩和されることが以前に示されていた。このモデルでは、Ｎａｖ１．８特異的ＬＡＬＡ（Ｎａｖは、リドカインおよび他の短時間作用型局所麻酔薬の標的である）を媒介する発現ベクターのＩＡ注射が有効であることになる。
【０１３４】
プロモーター：本明細書に記載の試験の脈絡において有用なプロモーター配列には、ＣＡ８，ＣＡ８断片（ＣＡ８−２０４など）、ＣＡ１０、ＣＡ１１、ならびにＣａｒ８、Ｃａｒ１０およびＣａｒ１１を含む非ヒトオルソログを含むＣＡ発現配列の発現を駆動するためのＴｒｋＢ、ＴｒｋＣ、Ｎａｖ１．９、他のＮａｖ遺伝子プロモーター、ＮＭＤＡプロモーター、アドビリン、ＣＧＲＰ、５ＨＴ、ＮＫ１、ＡＳＩＣ３、ＮＰＹまたはＮＦ２００が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３５】
結果
Ｖ５−Ｃａｒ１０およびＶ５−ＣＡ１０タンパク質の過剰発現は、インビトロでのホルスコリン誘導性ｐＩＴＰＲ１を阻害する。本明細書に記載の結果は、例えば、ＩＰ３リガンドに対するＩＴＰＲ１の応答を増強するリン酸化によるＩＴＰＲ１の活性化（ｐＩＴＰＲ１）の調節に及ぼすＣａｒ１０の効果を検討するための薬力学的バイオアッセイの使用を実証する。ＨＥＫ２９３細胞に、Ｃａｒ１０およびＣＡ１０を過剰発現するＡＡＶ８−Ｖ５ベクター、空ベクターおよび対照としてのビヒクルをトランスフェクトした。外来性と内在性のＣＡ１０／Ｃａｒ１０発現を区別するために、Ｖ５配列をＣａｒ１０またはＣＡ１０のＣ末端領域に挿入した。ウェスタンブロット分析により、ホルスコリンは用量依存的様式でｐＩＴＰＲ１レベルを増加させることが実証された（図１Ａ）。Ｖ５タグを使用して、Ｖ５−Ｃａｒ１０およびＶ５−ＣＡ１０ベクターのトランスフェクション後にタンパク質の過剰発現を検出した（図１Ｂ）。Ｃａｒ１０およびＣＡ１０の過剰発現は、ＨＥＫ２９３細胞内ホルスコリン誘導性ＩＴＰＲ１リン酸化を低減させたのに対し、空ベクターはＩＴＰＲ１リン酸化を変化させなかった（図１Ｃ）。
【０１３６】
ＩＨＣを使用すると、空ベクター（ＡＡＶ−なし）をトランスフェクションした後、１μＭホルスコリンに応答してＨＥＫ２９３細胞でｐＩＴＰＲ１の増加が観察されたが、Ｖ５−Ｃａｒ１０およびＶ５−ＣＡ１０のトランスフェクション後、ｐＩＴＰＲ１の増加はなかった。これらのデータは、Ｃａｒ１０およびＣＡ１０がＨＥＫ２９３細胞のＳｅｒ−１７５５での調節ドメインのリン酸化を阻害するのに十分であり、ＩＴＰＲ１活性化およびＩＰ３誘導性カルシウム放出に重要であることを実証する。
【０１３７】
Ｖ５−Ｃａｒ１０およびＶ５−ＣＡ１０の過剰発現は、インビトロでのＡＴＰ誘導性遊離カルシウム放出を阻害する：ＩＴＰＲ１は、カルシウム、カルモジュリン、ＡＴＰ、および炭酸アンヒドラーゼ８（Ｃａｒ８）などの細胞内調節因子に応答する「調節」ドメインを含む、機能的に異なるドメインを含んでいる。ＡＴＰは、活性化濃度のＩＰ３およびカルシウムの存在下でチャネルの開口確率を増加させることにより、ＩＴＰＲ１依存性カルシウム放出を増加させる。ＩＴＰＲ１活性化のＣａｒ８媒介性阻害およびＡＴＰ媒介性カルシウム放出には、この調節ドメインへの結合が必要であると考えられている。それゆえ、ＣＡ８断片（例えば、ＣＡ８−２０４）、Ｃａｒ１０およびＣＡ１０がＩＴＰＲ１およびｐＩＴＰＲ１に結合する能力を検討した。ＨＥＫ２９３細胞のホルスコリン刺激の前後に、ＩＴＰＲ１およびｐＩＴＰＲ１を含むＶ５タグに対する抗体を用いた各タンパク質の共免疫沈降を行った。ウェスタンブロット法は、ＣＡ８−２０４、Ｃａｒ１０、およびＣＡ１０がＩＴＰＲ１に結合しないことを示す。驚くべきことに、ＩＴＰＲ１活性化（例えば、ｐＩＴＰＲ１）を査定する機能的バイオアッセイでは、これらのタンパク質の共免疫沈降により、これらの非結合タンパク質がすべて、ＩＴＰＲ１活性化を阻害することを示し、ｐＩＴＰＲ１の低減を示す。
【０１３８】
ＦＬＡＧ−ＣＡ８−２０４（データ非表示）、Ｖ５−Ｃａｒ１０およびＶ５−ＣＡ１０の過剰発現がＡＴＰ誘導性カルシウム放出を阻害することができるかどうかをさらに検討するため、これらのコンストラクトおよびリアルタイム細胞内カルシウム濃度が基線でおよびＡＴＰ刺激に応答して測定された場合、ＨＥＫ２９３細胞に各々を感染させた（図２）。ＡＴＰは、カルシウム放出およびサイトソル遊離カルシウムレベルの増加を用量依存的様式で刺激した。ＡＡＶ−なしトランスフェクション後の細胞質遊離カルシウムレベルは、ＨＥＫ２９３細胞の基線と比較して１μＭのＡＴＰに応答して増加した。対照的に、遊離カルシウム濃度は、ＡＡＶ−ＦＬＡＧ−ＣＡ８−２０４、ＡＡＶ−Ｖ５−Ｃａｒ１０およびＡＡＶ−Ｖ５−ＣＡ１０をトランスフェクションした後、基線およびＡＡＶ−Ｖ５−ＣＡ８と比較して１μＭのＡＴＰに応答して変化しなかった。これらのデータは、ＣＡ８−２０４、Ｃａｒ１０およびＣＡ１０がＩＴＰＲ１の活性化を阻害し、それによりこれらの細胞内のＡＴＰ刺激性細胞質遊離カルシウムレベルを低減させることができることを実証する。
【０１３９】
Ｃａｒ１０およびＣＡ１０坐骨神経遺伝子療法は鎮痛を生じ、炎症性疼痛挙動を抑制する：注射１５日後まで対照と比較すると、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける坐骨神経注射後に、ＡＡＶ８−Ｖ５−Ｃａｒ１０およびＡＡＶ８−Ｖ５−ＣＡ１０は両方とも、鎮痛を生じさせる（基線からの熱潜時の増加）。（熱検査後の）１６日後のカラギーナンの足底内注射は、１７日後および１８日後に生理食塩水およびＡＡＶ８−なし対照群で急性熱過敏症を生じさせた。しかしながら、ＡＡＶ８−Ｖ５−Ｃａｒ１０およびＡＡＶ８−Ｖ５−ＣＡ１０は両方とも、１６日後のカラギーナン注射後に過敏症を示さなかった（基線を下回る熱潜時）。鎮痛は、１８日後以降にＡＡＶ８−Ｖ５−Ｃａｒ１０群およびＡＡＶ８−Ｖ５−ＣＡ１０群の両方で再発し、２７日後まで維持された。対照群では同様の所見は観察されなかった。図３を参照されたい。
【０１４０】
同様に、ＡＡＶ８−Ｖ５−Ｃａｒ１０およびＡＡＶ８−Ｖ５−ＣＡ１０は両方とも、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）慢性炎症性疼痛マウスモデルにおけるウイルス注射後の１５日後まで、対照と比較して、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける坐骨神経注射後に鎮痛を生じさせる（基線からの熱潜時の増加）。１６日後（熱検査後）のＣＦＡの足底内注射は、１７〜１９日後にすべての群で急性熱過敏症を生じさせた。ＡＡＶ８−Ｖ５−Ｃａｒ１０群およびＡＡＶ８−Ｖ５−ＣＡ１０群は両方とも、２４日後までに回復するようであり、ＣＦＡ注射前の１６日後に観察されたのと同様に、３４日後まで鎮痛を実証した。図４を参照されたい。
【０１４１】
Ｃａｒ１０遺伝子療法は、鎮痛を生じ、神経因性疼痛挙動を抑制する：神経因性疼痛の予防における本開示のウイルスベクターの投与の効果を、Ｃｈｕｎｇマウスモデルを使用して検討した。Ｃｈａｐｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９４；５３（１）：５５−６３。ＡＡＶ８−Ｖ５−Ｃａｒ１０は、１９日後の脊髄神経結紮にもかかわらず、１２日後から２２日後に機械的引込め閾値で鎮痛応答を生じた。いかなる他の群においても、同様の引込め閾値の増加はなかった（図５）。
【０１４２】
考察
本明細書に記載するデータは、（１）インビトロでのＣＡ８断片（ＣＡ８−２０４）、ＣＡ１０、およびＣａｒ１０タンパク質の過剰発現が、ホルスコリンに応答してＳｅｒ−１７５５でのＩＴＰＲ１の調節ドメインのリン酸化を阻害すること、（２）ＣＡ８断片（ＣＡ８−２０４）、ＣＡ１０、およびＣａｒ１０の過剰発現が、インビトロでのＡＴＰ刺激性細胞内カルシウム放出を阻害すること、（３）炎症性および神経因性疼痛モデルを使用した、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスへの坐骨神経注射を介した侵害受容器へのＡＡＶ８−Ｖ５−ＣＡ１０およびＡＡＶ８−Ｖ５−Ｃａｒ１０の遺伝子移入は、顕著な鎮痛を生じ、痛覚過敏抑制を予防すること、を初めて実証する。これらの発見は、ＣＡ８断片（ＣＡ８−２０４）、ＣＡ１０、およびＣａｒ１０が侵害受容および疼痛に重要なＩＴＰＲ１サイトソル遊離カルシウムシグナル伝達経路を調節することを初めて確立する。
【０１４３】
ＣＡ１０は、軟骨細胞の調節を含む他の機能に関与している可能性がある。ＣＡ１０発現の喪失は潜在的に、ＩＴＰＲ１サイトソル遊離カルシウムシグナル伝達経路の調節不全を経て軟骨芽細胞腫の形成につながる可能性がある。それゆえ、軟骨芽細胞腫の処置は、ウイルスベクターを使用したＣＡ１０、ＣＡ８、またはＣＡ８断片の過剰発現によって得られる可能性がある。
【０１４４】
変形性関節症（ＯＡ）は、軟骨の劣化を特徴とする。Ａｋｋｉｒａｊｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．２０１５；３（４）：１７７−１９２。また、興味深いことに、韓国人集団におけるコピー数変異体（ＣＮＶ）とＯＡ易罹患性の間の近年のゲノム規模の関係で、ＯＡとＣＡ１０の間の強い関係が実証された。Ｍｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔ  Ｄｉｓｏｒｄ．２０１５；１６：７６。さらに、Ｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．は、ＣＡ８およびＣＡ１０の一塩基多型と、日本人女性の骨粗鬆症と関係する脊椎骨および大腿骨の骨無機質密度（ＢＭＤ）の間の遺伝的関係を説明した。Ｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｍｅｔａｂ．２００９；２７（２）：２１３−２１６。これらの研究者は、ＣＡ８およびＣＡ１０遺伝子座の遺伝的変異体が、これらのおよび潜在的に他の女性の骨粗鬆症の重要な決定因子である可能性があることを示唆した。これらの関連性がより広範な集団において当てはまる場合、ＣＡ８およびＣＡ１０遺伝子座の機能的変異体がＯＡ疾患の重症度、疼痛、および障害と関係しているかどうかを検査することは合理的であろう。その上、ＩＴＰＲ１サイトソル遊離カルシウムシグナル伝達経路の役割を検査することと、ＣＡ８、ＣＡ１０、およびＣＡ１１の機能的変異体が破骨細胞および軟骨細胞の調節においてＩＴＰＲ１媒介性カルシウム放出に異なる影響を与え、それによって骨粗鬆症および変形性関節症に異なる影響を与える可能性があるかどうかを検査することとは適切であるようだ。
【０１４５】
最後に、精神保健障害はしばしば慢性疼痛と共存する。トリヌクレオチド反復伸長は、脆弱Ｘ症候群、ハンチントン病、筋緊張性ジストロフィーおよび脊髄小脳性運動失調の遺伝率と関係している。Ａｋｋｉｒａｊｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．２０１５；３（４）：１７７−１９２。さらに、不安定な反復は、統合失調症および双極性障害にも関与している。Ｖｉｎｃｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｓｙｃｈｉａｔｒ  Ｇｅｎｅｔ．２０１６；２６（４）：１５６−１６５。その後の研究では、精神疾患のシグナルの多くは、染色体１３ｑ２１．３３、１７ｑ２１．３３−ｑ２２、および１８ｑ２１．２に大きな反復を有する３つの領域から発生していることが示されている。１７ｑトリヌクレオチド伸長は、ＣＡ１０遺伝子のイントロン内にある。Ｖｉｎｃｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，上述、Ｉｋｅｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．１９９８；４９（２）：３２１−３２６。本明細書に記載のＣＡ１０のついての新たな潜在的な役割を考慮すると、この不安定なトリヌクレオチド反復と変形性関節症、骨粗鬆症、慢性疼痛状態を含む、ＣＡ１０の機能的変異体による機能喪失と、これらの罹患個体におけるＣＡ１０過剰発現の使用の間の関連性を、これらの障害を処置するために本明細書に記載の組成物および方法を用いて再検討する価値がある。
【０１４６】
要約すると、本実施例は、疼痛を処置するためのＣＡ８，ＣＡ８断片（ＣＡ８−２０４）断片、およびＣＡ１０をコードするウイルスベクターのＰＫ／ＰＤバイオアッセイおよび動物モデルの有用性ならびに投与経路を実証する。特に、これらのデータは、本明細書に記載の材料および方法が鎮痛を生じ、炎症性疼痛および神経因性疼痛のいずれも抑制することを確立する。
【０１４７】
実施例２
以下の実施例は、本明細書に記載のＣＡ８断片をコードするアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ８−ＦＬＡＧ−ＣＡ８２０４Ｃ（ＣＡ８２０４Ｃ）およびＡＡＶ８−ｆｌａｇ−ＣＡ８２０４Ｇ（ＣＡ８２０４Ｇ）の投与が、臨床的に関連する動物モデルであるカラギーナン炎症疼痛モデルにおいて鎮痛痛覚過敏抑制を生じることを実証する。
【０１４８】
ｐＡＡＶ−ｆｌａｇ−ＣＡ８−２０４Ｇ（ＡＬＴ  Ｇ）およびｐＡＡＶ−ｆｌａｇ−ＣＡ８−２０４Ｃ（ＡＬＴ  Ｃ）の構築。プライマーを含むＳａｌＩ部位およびＫｐｎＩ部位は、ＳＮＰ  ｒｓ６４７１８５９で「Ｇ」または「Ｃ」を持つ完全長の選択的スプライシング変異体（ＣＡ８−２０４）を構築するために設計された。ｐＡＡＶ−ＭＣＳ発現コンストラクトを右側に示す（右側にベクターマップ）。図３９を参照されたい。
【０１４９】
足引込め熱潜時を基線およびウイルスベクター投与（坐骨神経注射（ＳＮ））および／またはカラギーナン注射（左足）の後の様々な日に測定した。投与の７日後、ＡＡＶ８−ＦＬＡＧ−ＣＡ８２０４Ｃ（ＣＡ８２０４Ｃ）またはＡＡＶ８−ＦＬＡＧ−ＣＡ８２０４Ｇ（ＣＡ８２０４Ｇ）のＳＮ注射を受けたマウス（１群あたりｎ＝８個体）（１．５μｌ、１×１０１３ゲノムコピー／ｍｌ）は、ＡＡＶ８−Ｖ５−ＣＡ８  ＷＴ（ＣＡ８  ＷＴ）（陽性対照）およびＡＡＶ８−Ｖ５−ＣＡ８  ＭＴ（ＣＡ８変異体）（陰性対照）を投与したマウスと比較して、足の引込め潜時が増加した。ウイルスベクター投与の１５日後に、カラギーナン注射を受けた後、ＣＡ８  ＭＴ（陰性対照）群のマウスは、１６〜１８日後に著しく足の引込めが低減したことを示し、カラギーナンによって誘発された炎症性疼痛から回復し損ねていることを示した。しかしながら、ＣＡ８  ＷＴ、ＣＡ８２０４Ｇ、ＣＡ８２０４Ｃの両群のマウスは、足の引込めの潜時の増強を実証し、ＣＡ８  ＷＴ、ＣＡ８２０４Ｇ、ＣＡ８２０４Ｃによって提供される痛覚過敏抑制の保護を示す（Ｎ＝８、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１＊＊＊Ｐ＜０．００１、二元配置分散分析統計群検定ＧｒａｐｈＰａｄ）。図３１および図３２を参照されたい。
【０１５０】
実施例３
本実施例は、共免疫沈降により実証されるように、ＣＡ１０がＲＹＲおよびｐＲＹＲに結合することを実証する。リポフェクタミン（ＬＴＸ）を使用して、ＮＢＬ細胞にＡＡＶ−Ｖ５−ＣＡ１０およびＡＡＶ−Ｖ５−Ｃａｒ１０をトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に細胞タンパク質を抽出した。
【０１５１】
結合を検出するために、免疫沈降法（ＩＰ）およびウェスタンブロット法（ＷＢ）を利用した。ウサギ抗ＲＹＲ１をＩＰに使用し、ニワトリ抗Ｖ５をＷＢ分析に使用した。ＩＰタンパク質の約１／１０をＷＢに使用して、ＷＢでＶ５標識ＣＡ１０またはＣａｒ１０を示した。Ｂアクチンを負荷対照として使用した。ＣＡ３３とＲＹＲとの共免疫沈降を確立する図３３を参照されたい。ＣＡ１０とＩＴＰＲ１で同様の結果を得た。
【０１５２】
また、これらのデータは、ＣＡ１０がＲＹＲ１およびＲＹＲ３への結合を経てＲＹＲ依存性カルシウム放出をおそらく調節する可能性があることを初めて示唆している。
【０１５３】
実施例４
本実施例は、Ｖ５−ＣＡ１０タンパク質の過剰発現がホルスコリン誘導性ｐＩＴＰＲ１をインビトロで阻害することを実証する。
【０１５４】
ＩＰ３リガンドに対するＩＴＰＲ１の応答を増強するＩＴＰＲ１リン酸化（ｐＩＴＰＲ１）の調節におけるＣＡ１０の役割を検討するために、ＨＥＫ２９３細胞にＡＡＶ８−Ｖ５−ＣＡ１０ベクターをトランスフェクトした。空ベクターを用いたトランスフェクションまたはビヒクルの適用は、対照として機能した。組織または細胞株における未処置のタンパク質の外来性発現と内在性発現を区別するために、Ｖ５配列をＣＡ１０のＣ末端領域に挿入した。細胞を核についてＤＡＰＩまたはｐＩＴＰＲ１で染色し、融合させた。
【０１５５】
Ｖ５タグを使用して、ＡＡＶ−Ｖ５−ＣＡ１０（およびマウスＶ５−Ｃａｒ１０コードベクター）のトランスフェクション後にタンパク質の過剰発現を、ウェスタンブロット分析を使用して観察した（図３４Ａ）。ＣＡ１０およびＣａｒ１０の過剰発現は、ＨＥＫ２９３細胞におけるホルスコリン誘導性ＩＴＰＲ１リン酸化を低減したのに対し、空ベクターはｐＩＴＰＲ１レベルを変化させなかった（図３４Ｂ）。これらの実験は、インビトロでのＮＢＬ細胞におけるＣＡ１０（およびマウスＣａｒ１０）の過剰発現が、ホルスコリンに応答してＳｅｒ−１７５５でのＩＴＰＲ１の調節ドメインのリン酸化を阻害することを示す。
【０１５６】
実施例５
以下の実施例は、ＣＡ１０の過剰発現が疼痛メディエーターに応答したＩＴＰＲ１およびＲＹＲ媒介性カルシウム放出を阻害することを実証する。驚くべきことに、本明細書に記載の試験は、ＮＢＬ細胞において、５ＨＴ媒介性ＲＹＲ依存性カルシウム放出がリアノジンによってほぼ完全に阻害されることを実証する。その上、また、ＮＢＬ細胞におけるＶ５−ＣＡ１０の過剰発現は、５ＨＴ媒介性カルシウム放出を阻害することが観察された。それゆえ、ＮＢＬ細胞における５ＨＴ媒介性シグナル伝達は、主にＲＹＲを経ているようである。
【０１５７】
次に、ＨＥＫ２９３細胞におけるＶ５−Ｃａｒ１０およびＶ５−ＣＡ１０の過剰発現は、ＡＴＰ誘導性の細胞質カルシウム放出を阻害することが判明した。Ｆｕｒａ２カルシウム画像解析データは、Ｃａｒ１０およびＣＡ１０タンパク質の過剰発現が、空ベクター対照と比較したとき、ＨＥＫ２９３細胞において１μＭのＡＴＰへのＩＴＰＲ１媒介性細胞質カルシウム放出を阻害することを実証した（Ｐ＜０．００１）。（Ｎ＝４枚のカバーガラスおよび１個の試料あたり合計２００個の細胞＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、二元配置分散分析に続くＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ検定による。）図３５を参照されたい。
【０１５８】
また、ＮＢＬ細胞における５ＨＴ誘導性ＲＹＲ依存性カルシウム放出はリアノジンによって阻害されることが判明した。Ｆｕｒａ２カルシウム画像解析データは、ＮＢＬ細胞での５０μＭ  ５ＨＴ誘導性細胞質カルシウム放出が、ビヒクル対照と比較したとき、リアノジンによって用量依存的様式で有意に阻害されることを実証した（Ｐ＜０．００１）。（Ｎ＝４枚のカバーガラスおよび１個の試料あたり合計２００個の細胞  ＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、二元配置分散分析に続くＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ検定による）。図３６を参照されたい。
【０１５９】
これらの発見は、ＣＡ１０が侵害受容および疼痛挙動に重要なＩＴＰＲ１サイトソル遊離カルシウムシグナル伝達経路を調節することを示唆する。さらに、本データは、５ＨＴがリアノジンによってほぼ完全に阻害されるカルシウム放出を刺激することを示しており、ＩＴＰＲ１ではなくＲＹＲを経るセロトニンを示唆する。
【０１６０】
次に、ＮＢＬ細胞でのＶ５−Ｃａｒ１０およびＶ５−ＣＡ１０の過剰発現は、５０μＭの５ＨＴ誘導性細胞質カルシウム放出を阻害することが判明した。図３７を参照されたい。Ｆｕｒａ２カルシウム画像解析データは、ＮＢＬ細胞での５０μＭ  ５ＨＴ誘導性細胞質カルシウム放出が、ビヒクル対照と比較したとき、１０ｎＭリアノジンによってほぼ完全に阻害されることを実証した（Ｐ＜０．００１）。さらに、ＮＢＬ細胞での５ＨＴ誘導性細胞質カルシウム放出はまた、空ベクター対照と比較したとき、ＮＢＬ細胞でのＶ５−Ｃａｒ１０およびＶ５−ＣＡ１０タンパク質の過剰発現によって阻害された（Ｐ＜０．００１）。（Ｎ＝４枚のカバーガラスおよび１個の試料あたり合計２００個の細胞  ＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、二元配置分散分析に続くＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ検定による）。
【０１６１】
実施例６
ｐＣＭＶ−Ｎ−ｆｌａｇ−ＣＡ８−２０４ＧおよびｐＣＭＶ  Ｎ−ｆｌａｇ−ＣＡ８−２０４Ｃの構築。ＳａｌＩ部位とＫｐｎＩ部位とを含むプライマーを、ｒｓ６４７１８５９  ＳＮＰでの「Ｇ」を有する完全長の代替変異体（ＣＡ８−２０４）をｐＣＭＶ−Ｎ−ｆｌａｇベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）内へ構築するために設計した。部位特異的突然変異誘発（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を利用して、ｒｓ６４７８５９に「Ｃ」対立遺伝子を有するエキソン３で終わる新規の断片を生成するｐＣＭＶ−Ｎ−ｆｌａｇ−ＣＡ８−２０４Ｃを構築した。図３８を参照されたい。
【０１６２】
ＨＥＫ２９３細胞におけるカルシウム放出のＣＡ８−２０４Ｇ阻害（Ｃａ２＋Ｆｕｒａ２画像解析）。ｐＣＭＶ−Ｎ−ｆｌａｇ−ＣＡ８−２０４Ｇ（１，６９５ｂｐ）、ｐＣＭＶ−Ｎ−ｆｌａｇ−ＣＡ８−２０４Ｃ、ＡＡＶ２−Ｖ５−ＣＡ８ＷＴ（陽性対照）、または空ベクター（陰性対照）をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞。（ｎ＝６、各実験のカバーガラスの数、実験の数＝３、Ｐ値＜０．００１、３群間の比較は、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定によって実施した（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）。図４０を参照されたい。
【０１６３】
ＨＥＫ２９３細胞およびＮＢＬ細胞におけるＣＡ８  ＡＬＴ（Ｇ）およびＣＡ８  ＡＬＴ（Ｃ）の差次的組織発現。ｒｓ６４７１８５９での「Ｇ」対立遺伝子を有する代替バリアントｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−Ｎ  ＣＡ８  ＡＬＴＧ（ＣＡ８−２０４のｂｐ１４１７）またはｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−Ｎ  ＣＡ８  ＡＬＴＣ（ｒｓ６４７１８５９の「Ｃ」対立遺伝子）を用いたトランスフェクション後の（ａ）ＨＥＫ２９３細胞および（ｂ）ニューロン細胞（ＮＢＬ）からの定量的ＲＴ−ＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。それぞれのベクターの量を、ベータアクチン（ＡＣＴＢ）遺伝子産物を使用して正規化した。使用したプライマーを、ＣＡ８−２０４の３’ＵＴＲ領域を網羅するように設計した。ＨＫ細胞は、変異体ｒｓ６４７１８５９のＣ遺伝子型を有する検出可能なＣＡ８−００２転写物を発現しない。Ｎ＝３、実験数＝３（統計分析はＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して行った、＊＊＝ｐ値＜０．００１、＊＊＊＝ｐ値＜０．０００１、一元配置分散分析を適用した後、Ｔｕｋｅｙ群比較行った。図４１Ａおよび図４１Ｂを参照されたい。
【０１６４】
ＣＡ８−２０４ＣおよびＣＡ８−２０４Ｇ断片は、変化する組織発現を示す。ＨＥＫ  ２９３（非ニューロン細胞）およびＮＢＬ（ニューロン細胞）に、ＣＡ８−２０４ＣおよびＣＡ８−２０４Ｇ転写産物を発現するベクターをトランスフェクトし、ＳｙＢｒグリーン（ＡＢ）を使用する定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に供し、ベータアクチンを内部対照として用いて正規化した。プライマーを、これらの細胞株で選択的に発現するＣＡ８−２０４ＣおよびＣＡ８−２０４Ｇ配列の３’ＵＴＲ領域に隣接するように設計した。本発明者らは、各断片の発現を指令する細胞特異的スプライシング因子と一致して、ＣＡ８−２０４Ｃが主としてＮＢＬ細胞において発現し、ＣＡ８−２０４Ｇが主としてＨＥＫ２９３細胞において発現するＣＡ８断片スプライシングおよび発現の顕著な差を観察する。（Ｎ＝４、＊＊＊Ｐ値＜０．００１、一元配置分散分析を適用した後にＴｕｋｅｙの事後検定が続いた）。図４２を参照されたい。
【０１６５】
ＣＡ８−２０４Ｃ断片は、ＮＢＬ細胞でのＡＴＰ刺激性カルシウム放出を阻害する。ＮＢＬ細胞に、ＣＡ８−２０４Ｃ、ＣＡ８−２０１（ＣＡ８野生型陽性対照）または空ベクター（陰性対照）を発現するヌクレオチドインサートを有するベクターをトランスフェクトし、１μＭのＡＴＰを細胞内カルシウム放出のための刺激因子として用いて、カルシウム画像解析（Ｆｕｒａ２，Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）に供した。ＣＡ８−２０４ＣおよびＣＡ８−２０１は、インビトロでのＮＢＬ細胞のＣａ２＋放出を阻害することができた。ＣＡ８−２０４Ｃによるカルシウム放出の阻害は、ＣＡ８−２０１（野生型完全長転写産物／ペプチド）の阻害を超過した。対照的に、空ベクター（陰性対照）は、本アッセイではカルシウム放出を阻害し損ねた。（Ｎ＝６、＊＊＊Ｐ＜０．００１、一元配置分散分析による統計分析、Ｔｕｋｅｙの事後検定を経た群比較、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ）。図４３を参照されたい。
【０１６６】
ＣＡ８−２０４ＧまたはＣＡ８−２０４Ｃペプチド断片は、ＨＥＫ２９３細胞またはＮＢＬ細胞で選択的に発現する２８ｋＤａまたは２６ｋＤａである。タンパク質を、ｆｌａｇ−ＣＡ８−２０４Ｇ、ｆｌａｇ−ＣＡ８−２０４Ｃ、またはＶ５−ＣＡ８−２０１（野生型完全長ＣＡ８）転写産物のいずれかを発現するベクターをトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞（中央）またはＮＢＬ細胞（右）から抽出し、同じゲル上で泳動し、抗ｆｌａｇ抗体または抗Ｖ５抗体のいずれかで免疫ブロット法を行った。ＨＥＫ２９３細胞では２８ｋＤａでｆｌａｇ−ＣＡ８−２０４Ｇペプチド断片のみを検出し、ＮＢＬ細胞では２６ｋＤＡでｆｌａｇ−ＣＡ８−２０４Ｃペプチド断片のみを検出した。免疫ブロット法の後にデータを融合させた。データをベータアクチン（対照）で正規化した。図４４を参照されたい。
【０１６７】
ＣＡ８２０４ Ｃは、ｐＩＴＰＲ１のホルスコリン誘導性リン酸化を阻害する。ＨＥＫ２９３細胞にＣＡ８ＷＴ、ＣＡ８２０４ Ｃまたは空ベクター（ビヒクル）を含むベクターをトランスフェクトした。ビヒクルを陰性対照として使用した。データを、ビンキュリンを内部対照として正規化した。図４５を参照されたい。
【０１６８】
本明細書で言及されるすべての出版物、特許、および特許出願は、各々の個別の出版物または特許出願が参照によって組み込まれることが具体的かつ個別に示されるように、参照によって本明細書に組み込まれる。前述の発明は、理解を明確にするために、例示および実施例によってある程度詳細に記載されているが、添付の特許請求の範囲の意図または範囲から逸脱することなく、本発明の教示に照らして、それらに対するある特定の変更および修正が可能であることは当業者には容易に明らかである。
【図１Ａ】
2020526554.tif 000002
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１Ａ】
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【図４１Ｂ】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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