(57)【要約】レンチウイルス粒子を発現するためのレンチウイルスベクター系が開示される。レンチウイルスベクター系は治療ベクターを含む。治療ベクターは、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）またはそのバリアントのうちの少なくとも１つを発現するためのＰＡＨ配列を含み、ＰＡＨ配列は切断されている。フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）またはそのバリアントのうちの少なくとも１つを発現するためのＰＡＨ配列、および少なくとも１つの予め定められた相補的ｍＲＮＡ配列に結合できる少なくとも１つのスモールＲＮＡ配列を含む、ウイルスベクター。
2020512815.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）またはそのバリアントのうちの少なくとも１つを発現するためのＰＡＨ配列
を含むウイルスベクターであって、前記ＰＡＨ配列が切断されている、ウイルスベクター。
【請求項２】
前記ＰＡＨ配列が、前記配列の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）で切断されている、請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項３】
前記ＰＡＨ配列が、配列番号２、配列番号３、または配列番号４のうちの少なくとも１つとの８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の同一性のうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項４】
少なくとも１つの予め定められた相補的ｍＲＮＡ配列に結合できる少なくとも１つのスモールＲＮＡ配列をさらに含む、請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項５】
前記少なくとも１つの予め定められた相補的ｍＲＮＡ配列が、全長３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む、請求項４に記載のウイルスベクター。
【請求項６】
前記少なくとも１つの予め定められた相補的ｍＲＮＡ配列が、ＰＡＨ  ｍＲＮＡ配列である、請求項４に記載のウイルスベクター。
【請求項７】
前記少なくとも１つのスモールＲＮＡ配列が、ｓｈＲＮＡを含む、請求項４に記載のウイルスベクター。
【請求項８】
前記少なくとも１つのスモールＲＮＡ配列が、配列番号５または配列番号６のうちの少なくとも１つとの８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の同一性のうちの少なくとも１つを有する配列を含む、請求項４に記載のウイルスベクター。
【請求項９】
前記少なくとも１つのスモールＲＮＡ配列が、第１のプロモーターの制御下にあり、前記ＰＡＨ配列が、第２のプロモーターの制御下にある、請求項４に記載のウイルスベクター。
【請求項１０】
前記第１のプロモーターが、Ｈ１プロモーターを含む、請求項９に記載のウイルスベクター。
【請求項１１】
前記第２のプロモーターが、肝臓特異的プロモーターを含む、請求項９に記載のウイルスベクター。
【請求項１２】
前記肝臓特異的プロモーターが、ｈＡＡＴプロモーターを含む、請求項１１に記載のウイルスベクター。
【請求項１３】
フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）またはそのバリアントのうちの少なくとも１つを発現するためのＰＡＨ配列、および
少なくとも１つの予め定められた相補的ｍＲＮＡ配列に結合できる少なくとも１つのスモールＲＮＡ配列
を含む、ウイルスベクター。
【請求項１４】
前記ＰＡＨ配列が、配列番号１との８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の同一性のうちの少なくとも１つを含む、請求項１３に記載のウイルスベクター。
【請求項１５】
パッケージング細胞により産生され標的細胞に感染できるレンチウイルス粒子であって、
標的細胞に感染できるエンベロープタンパク質、および
請求項４に記載のウイルスベクター
を含む、レンチウイルス粒子。
【請求項１６】
前記標的細胞が、肝細胞、筋肉細胞、上皮細胞、内皮細胞、神経細胞、神経内分泌細胞、内分泌細胞、リンパ球、骨髄細胞、実質臓器内に存在する細胞、または造血系列の細胞、造血幹細胞、もしくは前駆造血幹細胞のうちの少なくとも１つである、請求項１５に記載のレンチウイルス粒子。
【請求項１７】
被験体においてフェニルケトン尿症（ＰＫＵ）を処置する方法であって、前記被験体に治療有効量の請求項１５に記載のレンチウイルス粒子を投与することを含む、方法。
【請求項１８】
前記治療有効量の前記レンチウイルス粒子が、複数の単回用量の前記レンチウイルス粒子を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記治療有効量の前記レンチウイルス粒子が、単回用量の前記レンチウイルス粒子を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記被験体が子宮内にある、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
ＰＫＵ表現型と相関する前記被験体におけるＰＫＵ遺伝子型を診断することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記診断することが、前記被験体の出生前スクリーニングの間に行われる、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１７年４月３日に出願された“ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＴＲＥＡＴＩＮＧ  ＰＨＥＮＹＬＫＥＴＯＮＵＲＩＡ”と題する米国仮特許出願番号第６２／４８０，９６２号、および２０１７年４月２７日に出願された“ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＴＲＥＡＴＩＮＧ  ＰＨＥＮＹＬＫＥＴＯＮＵＲＩＡ，”と題する米国仮特許出願番号第６２／４９１，１１８号に基づく優先権を主張しており、これら仮特許出願の開示は、参考として本明細書中に援用される。
【０００２】
分野
本発明の態様は、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）を処置するための遺伝子医学に関する。より具体的には、本発明の態様は、ＰＡＨ含有レンチウイルスベクターなどのレンチウイルスベクターを使用して、ＰＫＵを処置することに関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）は、血液中のフェニルアラニンの濃度の増加、または高フェニルアラニン血症に繋がり得る異種の障害の群を指す。高フェニルアラニン血症は、処置されないままであると、罹患した子供において知的障害、発作、行動の問題、ならびに成長および発育不全を惹起し得る。高フェニルアラニン血症が知的障害を生じさせる機序は、高用量フェニルアラニンの驚くべき毒性を反映し、白質形成不全または神経系組織の脱髄に関与する。ＰＫＵは、北米において１２，０００人に１人の平均発生率が報告されており、男性および女性に等しく影響する。障害は、欧州またはネイティブアメリカンの家系の人々において最も一般的であり、東地中海地域においてはるかにより高いレベルに達する。
【０００４】
ＰＫＵ患者における神経学的変化が生後１ヶ月以内において実証されており、成人ＰＫＵ患者における磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）は脳において白質病変を示している。これらの病変のサイズおよび数は、血中フェニルアラニン濃度に直接的に関係する。対照の被験体と比較したＰＫＵを有する青少年および成人の認知プロファイルとしては、有意に低下したＩＱ、処理速度、運動制御および抑制能力、ならびに注意力の試験における成績の低下を挙げることができる。
【０００５】
ＰＫＵの大部分は、肝臓フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）の欠乏により惹起される。ＰＡＨは、分子状酸素およびその非タンパク質性補因子である触媒量のテトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）の存在下でフェニルアラニン（Ｐｈｅ）のチロシン（Ｔｙｒ）へのヒドロキシル化を触媒するマルチマーの肝臓酵素である。ＰＡＨの充分な発現の非存在下で、血液中のフェニルアラニンレベルは増加し、ＰＫＵ患者における高フェニルアラニン血症および有害な副作用に繋がる。ＰＡＨ活性の減少または非存在は、チロシンおよびその下流の生成物、例えば、メラニン、ｌ−チロキシンおよびドーパミンなどのカテコールアミン神経伝達物質などの欠乏に繋がり得る。
【０００６】
ＰＫＵは、ＰＡＨにおける変異および／またはＰＡＨ補因子（すなわち、ＢＨ４）の合成もしくは再生の欠陥により惹起され得る。顕著なことに、いくつものＰＡＨ変異が、小胞体におけるタンパク質フォールディングに影響して、酵素触媒活性を減弱または概ね棄損させるタンパク質構造におけるミスセンス変異（６３％）および小さい欠失（１３％）に起因して分解および／または凝集の加速を生じさせることが示されている。
【０００７】
一般に、血漿Ｐｈｅレベル、Ｐｈｅの摂取許容性および治療への潜在的な応答性に基づいてＰＫＵを分類するために３つの主な表現型の群が使用される。これらの群は、古典的ＰＫＵ（Ｐｈｅ＞１２００μΜ）、非定型または軽度ＰＫＵ（Ｐｈｅは６００〜１２００μΜ）、および永久的な軽度の高フェニルアラニン血症（ＨＰＡ、Ｐｈｅ  １２０〜６００μΜ）を含む。
【０００８】
ＰＫＵの検出は、ユニバーサル新生児スクリーニング（ＮＢＳ）に依拠する。ヒールスティックから回収された血液滴が、米国の全５０州において義務とされているスクリーニングにおいてフェニルアラニンレベルについて試験される。
【０００９】
現在、Ｐｈｅの生涯にわたる摂取制限およびＢＨ４補給がＰＫＵのただ２つの利用可能な処置オプションであり、罹患した乳児における最適な臨床アウトカムを確実にするために早期の治療的介入が不可欠である。しかしながら、高価な医薬および特別な低タンパク質の食事は患者に大きな負担を課し、特に、これらの製品が民間健康保険により充分にカバーされない場合、栄養不良、社会心理または神経認知の複雑な問題に繋がり得る。さらに、ＢＨ４治療は主に、ＢＨ４生合成の欠陥に関する軽度の高フェニルアラニン血症の処置に効果的である一方、軽度または古典的ＰＫＵを有する２０〜３０％の患者のみが応答性である。したがって、負担の大きいＰｈｅ制限食の代替としてのＰＫＵのための新たな処置モダリティーの必要性が緊急に存在する。したがって、フェニルケトン尿症の処置のための代替的な方法を開発することが望ましい。遺伝子医学は、ＰＫＵを効果的に処置する潜在能力を有する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の要旨
一態様では、ウイルスベクターが開示される。ウイルスベクターは、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）またはそのバリアントのうちの少なくとも１つを発現するためのＰＡＨ配列を含み、ＰＡＨ配列は切断されている。実施形態では、ＰＡＨ配列は、配列の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）で切断されている。実施形態では、ＰＡＨ配列は、配列番号２、配列番号３、または配列番号４のうちの少なくとも１つとの８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の同一性のうちの少なくとも１つを含む。
【００１１】
実施形態では、ウイルスベクターは、少なくとも１つの予め定められた相補的ｍＲＮＡ配列に結合できる少なくとも１つのスモールＲＮＡ配列をさらに含む。実施形態では、少なくとも１つの予め定められた相補的ｍＲＮＡ配列は、全長３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。実施形態では、少なくとも１つの予め定められた相補的ｍＲＮＡ配列は、ＰＡＨ  ｍＲＮＡ配列である。実施形態では、少なくとも１つのスモールＲＮＡ配列は、ｓｈＲＮＡを含む。実施形態では、少なくとも１つのスモールＲＮＡ配列は、配列番号５または配列番号６のうちの少なくとも１つとの８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の同一性のうちの少なくとも１つを有する配列を含む。実施形態では、少なくとも１つのスモールＲＮＡ配列は、第１のプロモーターの制御下にあり、ＰＡＨ配列は、第２のプロモーターの制御下にある。実施形態では、第１のプロモーターは、Ｈ１プロモーターを含む。実施形態では、第２のプロモーターは、肝臓特異的プロモーターを含む。実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、ｈＡＡＴプロモーターを含む。
【００１２】
別の態様では、ウイルスベクターが開示される。ウイルスベクターは、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）またはそのバリアントのうちの少なくとも１つを発現するためのＰＡＨ配列、および少なくとも１つの予め定められた相補的ｍＲＮＡ配列に結合できる少なくとも１つのスモールＲＮＡ配列を含む。実施形態では、ＰＡＨ配列は、配列番号１との８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の同一性のうちの少なくとも１つを含む。
【００１３】
別の態様では、パッケージング細胞により産生され標的細胞に感染できるレンチウイルス粒子が開示される。レンチウイルス粒子は、標的細胞に感染できるエンベロープタンパク質を含み、ウイルスベクターは、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）またはそのバリアントのうちの少なくとも１つを発現するためのＰＡＨ配列、および少なくとも１つの予め定められた相補的ｍＲＮＡ配列に結合できる少なくとも１つのスモールＲＮＡ配列を含む。実施形態では、標的細胞は、肝細胞、筋肉細胞、上皮細胞、内皮細胞、神経細胞、神経内分泌細胞、内分泌細胞、リンパ球、骨髄細胞、実質臓器内に存在する細胞、または造血系列の細胞、造血幹細胞、もしくは前駆造血幹細胞のうちの少なくとも１つである。
【００１４】
別の態様では、被験体においてフェニルケトン尿症（ＰＫＵ）を処置する方法が開示される。方法は、被験体に治療有効量のパッケージング細胞により産生され標的細胞に感染できるレンチウイルス粒子を投与することを含み、レンチウイルス粒子は、標的細胞に感染できるエンベロープタンパク質、ならびに、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）またはそのバリアントのうちの少なくとも１つを発現するためのＰＡＨ配列、および少なくとも１つの予め定められた相補的ｍＲＮＡ配列に結合できる少なくとも１つのスモールＲＮＡ配列を含むウイルスベクターを含む。
【００１５】
実施形態では、治療有効量のレンチウイルス粒子は、複数の単回用量のレンチウイルス粒子を含む。実施形態では、治療有効量のレンチウイルス粒子は、単回用量のレンチウイルス粒子を含む。実施形態では、被験体は子宮内にある。実施形態では、方法は、ＰＫＵ表現型と相関する被験体におけるＰＫＵ遺伝子型を診断することをさらに含む。実施形態では、診断は、被験体の出生前スクリーニングの間に行われる。実施形態では、診断は、投与の前に行われる。
【００１６】
別の態様では、被験体におけるフェニルケトン尿症（ＰＫＵ）の処置のための治療有効量のレンチウイルス粒子の使用が開示される。レンチウイルス粒子は、パッケージング細胞により産生され、標的細胞に感染することができ、標的細胞に感染できるエンベロープタンパク質、およびウイルスベクターを含む。実施形態では、ウイルスベクターは、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）またはそのバリアントのうちの少なくとも１つを発現するためのＰＡＨ配列を含み、ＰＡＨ配列は切断されている。実施形態では、ウイルスベクターは、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）またはそのバリアントのうちの少なくとも１つを発現するためのＰＡＨ配列、および少なくとも１つの予め定められた相補的ｍＲＮＡ配列に結合できる少なくとも１つのスモールＲＮＡ配列を含む。
【００１７】
本明細書中に記載する発明のその他の態様および利点は、本発明の態様を例により説明する添付の図面と合わせて、以下の詳細な説明から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、例示的な環状の３ベクターレンチウイルスベクター系を示す。
【００１９】
【図２】図２は、例示的な環状の４ベクターレンチウイルスベクター系を示す。
【００２０】
【図３】図３は、例示的な環状の３ベクターアデノ随伴ウイルスベクター系を示す。
【００２１】
【図４】図４は、（Ａ）ＰＡＨを発現するレンチウイルスベクターの直線状マップ、ならびに（Ｂ）ＰＡＨ  ｓｈＲＮＡ配列およびＰＡＨ配列を発現するレンチウイルスベクターの直線状マップを示す。
【００２２】
【図５】図５は、全長５’および３’ＵＴＲを含むフェニルアラニンヒドロキシラーゼオープンリーディングフレームを示す。
【００２３】
【図６】図６は、全長５’ＵＴＲおよび切断型３’ＵＴＲを含むフェニルアラニンヒドロキシラーゼオープンリーディングフレームを示す。
【００２４】
【図７】図７は、ヒトおよびマウスのＰＡＨ遺伝子について発現のレベルを比較するイムノブロットデータを示す。
【００２５】
【図８】図８は、Ｈｅｐａ１−６細胞における３’ＵＴＲ領域を有するまたは有しないｈＰＡＨのレンチウイルスで送達された発現を実証するデータを示す。
【００２６】
【図９】図９は、Ｈｅｐａ１−６細胞における切断型３’ＵＴＲを有するｈＰＡＨを発現するレンチウイルスベクターの結果を示す。
【００２７】
【図１０】図１０は、マウスＨｅｐａ１−６細胞におけるＷＰＲＥを有するまたは有しないコドン最適化ｈＰＡＨの発現を実証するデータを示す。
【００２８】
【図１１】図１１は、ｓｈＰＡＨ−１およびｓｈＰＡＨ−２がヒトＨｅｐ３Ｂ細胞においてｈＰＡＨの発現を低減させることを実証するデータを示す。
【００２９】
【図１２】図１２は、Ｈｅｐ３Ｂ細胞における内因性ｈＰＡＨおよびｈＡＡＴ−ｈＰＡＨ−３’ＵＴＲ２８９のｓｈＰＡＨ−１抑制を実証するデータを示す。
【００３０】
【図１３】図１３は、ｓｈＰＡＨ−２がＨｅｐＧ２細胞において内因性ｈＰＡＨを抑制するがｈＡＡＴ−ｈＰＡＨ−３’ＵＴＲ２８９を抑制しないことを実証するデータを示す。
【００３１】
【図１４】図１４は、ｈＡＡＴ−ＰＡＨ−ＵＴＲを用いてＰａｈ（ｅｎｕ２）マウスを処置した結果を実証するデータを示す。図１４Ａは、そこに示した群についての８週にわたる体重の変化を示す。図１４Ｂは、そこに示した群についての８週にわたる体重の変化を示す。図１４Ｃは、そこに示した群についての８週にわたる体重の変化を示す。図１４Ｄは、処置の１ヶ月後のフェニルアラニンのレベルを示す。
【００３２】
【図１５】図１５は、Ｈｅｐａ１−６マウスヘパトーマ細胞におけるｈＡＡＴおよびＣＭＶプロモーターを使用したヒトＰＡＨ遺伝子のレンチウイルスで送達された発現を実証するデータを示す。
【００３３】
【図１６】図１６は、マウスＨｅｐａ１−６細胞におけるｈＡＡＴプロモーターおよび肝臓特異的エンハンサーエレメントＡｐｏＥ（１）、ＡｐｏＥ（２）、またはプロトロンビンを有する発現構築物を使用したｈＰＡＨのレンチウイルスで送達された発現を実証するものを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
開示の概要
本開示は、治療ベクター、および細胞へのその送達に関する。実施形態では、治療ベクターは、ＰＡＨ配列またはそのバリアントを含む。実施形態では、治療ベクターはまた、宿主（内因性）ＰＡＨの発現を標的化するスモールＲＮＡを含む。
【００３５】
定義および解釈
本明細書中で別様に定義しない限り、本開示との関連で使用する科学技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有する。さらに、文脈上別様に要求されない限り、単数の語は複数を包含し、複数の語は単数を包含する。一般に、本明細書中に記載する細胞および組織の培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質および核酸の化学およびハイブリダイゼーションとの関連で使用する学術用語およびそれらの技術は周知であり、当該技術分野において一般に使用されている。本開示の方法および技術は、別段の記載がなければ、当該技術分野において周知の、本明細書全体で引用し議論する様々な一般的およびより具体的な参考文献に記載される従来の方法にしたがって一般に行われる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．およびＲｕｓｓｅｌｌ  Ｄ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（２０００年）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ，  Ｊｏｈｎ＆Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．（２００２年）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９９８年）；およびＣｏｌｉｇａｎら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｉｌｅｙ，  Ｊｏｈｎ＆Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．（２００３年）を参照。あらゆる酵素反応または精製技術は、当該技術分野において一般に遂行されるように、または本明細書中に記載するように、製造業者の仕様にしたがって行われる。本明細書中に記載する分析化学、合成有機化学、医薬品化学、および製薬化学との関連で使用する学術用語、ならびに実験の手順および技術は、当該技術分野において周知であり一般に使用されるものである。
【００３６】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用する場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は交換可能に使用し、文脈が明確にそうでないと示さない限り、複数形も包含すること、およびそれぞれの意味の範囲内に包含されることを意図する。また、本明細書中で使用する場合、「および／または」は、挙げた項目の１つまたは複数のあらゆる全ての可能な組み合わせ、ならびに、選択肢（「または」）として解釈する場合には組み合わせないことを指し、およびこれらを包含する。
【００３７】
例えば、ｐＨ、温度、時間、濃度、および分子量といった、範囲などの数値による全ての指定は、０．１の増分で（＋）または（−）に変動する近似値である。必ずしも明示的には述べないが、数値による全ての指定には「約」という用語が先行することを理解するべきである。必ずしも明示的には述べないが、本明細書中に記載する試薬は単に例示的なものであり、そのようなものの同等物が当該技術分野で公知であることも理解するべきである。
【００３８】
本明細書中で使用する場合、「約」という用語は、当業者によって理解され、また、それが使用される文脈に応じてある程度変動する。使用されている文脈を考慮すると当業者に明確でない用語が使用されている場合、「約」は、特定の用語のプラスまたはマイナス１０％までを意味する。
【００３９】
活性剤の「投与」または活性剤を「投与する」という用語は、処置を必要とする被験体に対して活性剤を、治療的に有用な形態かつ治療有効量でその個体の体内に導入できる形態で与えることを意味すると理解するべきである。
【００４０】
本明細書中で使用する場合、「含む」という用語は、組成物および方法が、記載した要素を含むが、他のものを除外しない意味であることを意図する。組成物および方法を定義するために使用する場合、「から本質的になる」は、組成物または方法に対して何らかの本質的な重要性を持つその他の要素を除外することを意味する。「からなる」は、特許請求される組成物および実体的な方法ステップにとって軽微ではないその他の成分の要素を除外することを意味する。これらの移行句のそれぞれによって定義される実施形態は、本開示の範囲内にある。したがって、方法および組成物は、追加のステップおよび成分を含み得るか（含む）、あるいは重要でないステップおよび組成物を含むか（から本質的になる）、あるいは記載した方法ステップまたは組成物のみを意図する（からなる）ことが意図される。
【００４１】
本明細書中で使用する場合、「発現」、「発現される」、または「コードする」という用語は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写される過程、および／または、転写されたｍＲＮＡがその後にペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳される過程をいう。発現は、真核細胞中でのｍＲＮＡのスプライシング、または転写後修飾もしくは翻訳後修飾というその他の形態を包含し得る。
【００４２】
本明細書で使用する場合、「フェニルケトン尿症」という用語は、本明細書において「ＰＫＵ」と称されることもあり、フェニルアラニンヒドロキシラーゼの慢性的欠乏の他に、疾患の軽度および古典的な形態などのそれに関連する全ての症状を指す。したがって、「フェニルケトン尿症」の処置は、ＰＫＵと関連付けられる症状の全てまたは一部の処置に関し得る。
【００４３】
本明細書で使用する場合、「フェニルアラニンヒドロキシラーゼ」という用語はまた、本明細書においてＰＡＨと称されることもある。ヒトＰＡＨはまた、本明細書においてｈＰＡＨと称されることもある。マウスＰＡＨはまた、本明細書においてｍＰＡＨと称されることもある。
【００４４】
本明細書で使用する場合、「ｓｈＰＡＨ」という用語は、ＰＡＨを標的化するスモールヘアピンＲＮＡを指す。
【００４５】
本明細書で使用する場合、「ｈＡＡＴ−ｈＰＡＨ−３’ＵＴＲ２８９」という用語はまた、本明細書においてＵ２８９、または一般に導入遺伝子発現性切断型ｈＰＡＨ  ３’ＵＴＲ、または一般に切断型３’ＵＴＲと称されることもある。
【００４６】
本明細書で使用する場合、「ｈＡＡＴ−ｈＰＡＨ−３’ＵＴＲ２３８」という用語はまた、本明細書においてＵ２３８、または一般に導入遺伝子発現性切断型ｈＰＡＨ  ３’ＵＴＲ、または一般に切断型３’ＵＴＲと称されることもある。
【００４７】
本明細書で使用する場合、「野生型ｈＰＡＨ」という用語はまた、本明細書において「内因性ＰＡＨ」または「全長ＰＡＨ」と称されることもある。
【００４８】
本明細書で使用する場合、切断型（または切断された）という用語は、本明細書において「短鎖型」または「有しない」と称されることもある。
【００４９】
本明細書で使用する場合、バリアントという用語は、本明細書においてアナログまたはバリエーションと称されることもある。バリアントは、ヌクレオチド配列に対する任意の置換、欠失、または付加を指す。
【００５０】
本明細書で使用する場合、「遺伝子医学」（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ）または「遺伝子医学」（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ）という用語は、一般に、臨床疾患または外徴を処置するために遺伝子標的に焦点を当てた治療法および治療戦略に関する。「遺伝子医学」という用語は、遺伝子療法などを包含する。
【００５１】
本明細書で使用する場合、「個体」、「被験体」、および「患者」という用語は本明細書中では交換可能に使用され、任意の個体である哺乳動物被験体（例えば、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、またはヒト）を指す。
【００５２】
本明細書で使用する場合、「ＬＶ」という用語は一般に「レンチウイルス」を指す。一例として、「ＬＶ−ｓｈＰＡＨ」への言及は、ＰＡＨを標的化するｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスへの言及である。
【００５３】
本明細書で使用する場合、「パッケージング細胞株」という用語は、レンチウイルス粒子を発現するために使用できる任意の細胞株を指す。
【００５４】
本明細書で使用する場合、２つまたはそれより多くの核酸配列またはポリペプチド配列の文脈における「同一性パーセント」という用語は、下記する配列比較アルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮ、または当業者に利用可能なその他のアルゴリズム）の１つを使用して、または目視検査によって測定されるように、最大の一致のために比較およびアラインメントした時に同一となるヌクレオチドまたはアミノ酸残基を特定のパーセンテージで有する２つまたはそれより多くの配列または部分配列を指す。適用に応じて、「同一性パーセント」は、比較されている配列の一領域にわたり（例えば、機能ドメインにわたり）存在し得るか、あるいは比較される２つの配列の全長にわたり存在し得る。配列比較のために、通常は１つの配列が、試験配列がそれに対して比較される参照配列の役目を持つ。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列をコンピューターに入力し、部分配列座標を指定し、必要であれば配列アルゴリズムプログラムのパラメーターを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。
【００５５】
比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．２巻：４８２頁（１９８１年）の局所相同性アルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．４８巻：４４３頁（１９７０年）の相同性アラインメントアルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５巻：２４４４頁（１９８８年）の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実行（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）、または目視検査（一般には後述のＡｕｓｕｂｅｌらを参照）によって実行することができる。
【００５６】
配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントを決定するために好適なアルゴリズムの一例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．２１５巻：４０３〜４１０頁（１９９０年）に記載されるＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイトを通じて公開されている。
【００５７】
２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍにおいて利用可能）中のＧＡＰプログラムを使用し、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックス、ならびに４０、５０、６０、７０、または８０のギャップ重み付け、および１、２、３、４、５、または６の長さ重み付けを使用して決定することができる。また、２つのヌクレオチド配列間またはアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれたＥ．  ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．  Ｍｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ、４巻：１１〜１７頁、（１９８９年））のアルゴリズムを使用し、ＰＡＭ１２０重み付け残基表、ギャップ長さペナルティーとして１２、およびギャップペナルティーとして４を使用して決定することもできる。加えて、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍにおいて利用可能）中のＧＡＰプログラムに組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．（４８巻）：４４４〜４５３頁（１９７０年））のアルゴリズムを使用し、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重み付け、および１、２、３、４、５、または６の長さ重み付けを使用して決定することができる。
【００５８】
本開示の核酸配列およびタンパク質配列は、例えば関連配列を同定するために、公共データベースに対して検索を行うための「クエリ配列」としてさらに使用することができる。そのような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０年）、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．２１５巻：４０３〜１０頁のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して行うことができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本開示中に提供される核酸分子に相同的なヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラムをスコア＝１００、ワード長＝１２で用いて行うことができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本開示のタンパク質分子に相同的なアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラムをスコア＝５０、ワード長＝３で用いて行うことができる。比較目的のギャップ付きアラインメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５巻（１７号）：３３８９〜３４０２頁に記載されるようにＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴプログラムおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、各プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトのパラメーターを使用することができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照。
【００５９】
本明細書中で使用する場合、「薬学的に許容される」という用語は、妥当な医学的判断の範囲内で、合理的な利益／リスク比に見合うように、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、またはその他の問題もしくは合併症を起こすことなくヒトおよび動物の組織、臓器、および／または体液との接触に使用するために好適な化合物、材料、組成物、および／または剤形を指す。
【００６０】
本明細書中で使用する場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、生理学的に適合性の、あらゆる全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤、および吸収遅延剤などを指す、およびそれらを包含する。組成物は、薬学的に許容される塩、例えば酸付加塩または塩基付加塩を含み得る（例えば、Ｂｅｒｇｅら、（１９７７年）Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ６６巻：１〜１９頁を参照）。
【００６１】
本明細書中で使用する場合、「配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）」という用語は、「配列ＩＤ番号（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＩＤ  Ｎｏ．）」という用語と同義である。
【００６２】
本明細書中で使用する場合、「スモールＲＮＡ」とは、一般に約２００ヌクレオチドまたはそれ未満の長さの、サイレンシング機能または干渉機能を持つノンコーディングＲＮＡをいう。その他の実施形態では、スモールＲＮＡは、約１７５ヌクレオチドまたはそれ未満、約１５０ヌクレオチドまたはそれ未満、約１２５ヌクレオチドまたはそれ未満、約１００ヌクレオチドまたはそれ未満、あるいは約７５ヌクレオチドまたはそれ未満の長さである。そのようなＲＮＡとしては、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、および短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が挙げられる。本開示の「スモールＲＮＡ」は、一般に、標的遺伝子のｍＲＮＡの破壊を生じさせる経路を通じて、標的遺伝子の遺伝子発現を阻害することまたはノックダウンすることができるべきである。
【００６３】
本明細書で使用する場合、「治療有効量」という用語は、所与の病気、傷害、疾患、または状態に罹患した患者に見られる症状、進行、または合併症の発症を処置し、または防止するために好適な組成物中および好適な剤形中の本開示の活性剤の十分な量を指す。治療有効量は、患者の状態の状況またはその重篤度、および処置される被験体の年齢、体重などに応じて変化する。治療有効量は、例えば、投与経路、被験体の状態などのいくつかの要因、ならびに当業者によって理解されるその他の要因のいずれかに応じて変化し得る。
【００６４】
本明細書中で使用する場合、「治療ベクター」という用語には、レンチウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターへの言及が非限定的に包含される。さらに、レンチウイルスベクター系に関して本明細書中で使用する場合、「ベクター」という用語は、「プラスミド」という用語と同義である。例えば、２ベクターおよび３ベクターのパッケージング系を含む３ベクター系および４ベクター系は、３プラスミド系および４プラスミド系とも称され得る。
【００６５】
本明細書で使用する場合、「処置」または「処置すること」という用語は、一般に、処置されている被験体の自然経過を変えようとする介入を指し、予防のため、または臨床病理の経過の間に行われ得る。望ましい効果としては、疾患の発生または再発の予防、症状の軽減、疾患の任意の直接的または間接的な病理学的帰結の抑制、減少、または阻害、疾患状態の改善または緩和、および寛解または予後改善の惹起が挙げられるが、これらに限定されない。よって、本明細書で使用する場合、特定の処置は、標的化される疾患状態、ならびに医薬療法および治療アプローチの現在または将来の状況に依存する。処置は、関連する毒性を有し得る。
【００６６】
本開示の態様および実施形態の説明
本開示の一態様では、ウイルスベクターが開示される。ウイルスベクターは治療カーゴ部分を含み、治療カーゴ部分は、ＰＡＨ配列またはそのバリアントを含む。実施形態では、ＰＡＨ配列またはそのバリアントは切断されている。実施形態では、切断されたＰＡＨ配列またはそのバリアントの部分は、ＰＡＨ配列またはそのバリアントの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）である。実施形態では、ＰＡＨ配列またはそのバリアントは、
【化１】
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【化２】
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【化３】
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【化４】
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と少なくとも８０％、または少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％またはより高いパーセントの同一性を有する配列を含む。実施形態では、バリアントは、上記の配列のいずれかに対して作製され得る。実施形態では、ＰＡＨ配列またはそのバリアントは、（配列番号１）、（配列番号２）、（配列番号３）、または（配列番号４）を含む。
【００６７】
実施形態では、治療カーゴ部分は、少なくとも１つの予め定められた相補的ｍＲＮＡ配列に結合できる少なくとも１つのスモールＲＮＡ配列を含む。実施形態では、少なくとも１つのスモールＲＮＡ配列は、全長ＵＴＲを含有する相補的ｍＲＮＡ配列を標的化する。実施形態では、少なくとも１つのスモールＲＮＡ配列は、切断型ＵＴＲを含有する相補的ｍＲＮＡ配列を標的化しない。実施形態では、切断型ＵＴＲは、本明細書において特定される切断型配列のいずれかまたはその任意のバリアントを含み得る。実施形態では、少なくとも１つの予め定められた相補的ｍＲＮＡ配列は、ＰＡＨ  ｍＲＮＡ配列である。実施形態では、少なくとも１つのスモールＲＮＡ配列は、ｓｈＲＮＡを含む。実施形態では、少なくとも１つのスモールＲＮＡ配列は、第１のプロモーターの制御下にあり、ＰＡＨ配列またはそのバリアントは、第２のプロモーターの制御下にある。実施形態では、第１のプロモーターは、Ｈ１プロモーターを含む。実施形態では、第２のプロモーターは、肝臓特異的プロモーターを含む。実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、ｈＡＡＴプロモーターを含む。実施形態では、少なくとも１つのスモールＲＮＡ配列は、
【化５】
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と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％またはより高いパーセントの同一性を有する配列を含む。実施形態では、バリアントは、上記の配列から作製され得る。実施形態では、少なくとも１つのスモールＲＮＡ配列は、（配列番号５）、または（配列番号６）を含む。実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターである。
【００６８】
別の態様では、標的細胞に感染できるレンチウイルス粒子が開示される。レンチウイルス粒子は、標的細胞に感染するために最適化されたエンベロープタンパク質を含み、本明細書に詳述されるようなウイルスベクターをさらに含む。実施形態では、標的細胞は肝細胞である。
【００６９】
別の態様では、被験体においてＰＫＵを処置する方法が開示される。方法は、被験体に治療有効量の本明細書に詳述されるようなレンチウイルス（lentirviral）粒子を投与することを含む。
【００７０】
別の態様では、被験体においてＰＫＵを予防する方法が開示される。方法は、被験体に治療有効量の本明細書に詳述されるようなレンチウイルス粒子を投与することを含む。実施形態では、治療有効量のレンチウイルス粒子は、複数の単回用量のレンチウイルス粒子を含む。実施形態では、治療有効量のレンチウイルス粒子は、単回用量のレンチウイルス粒子を含む。実施形態では、方法は、被験体にウイルスベクターを含む治療有効量の第１のレンチウイルス粒子および第２のレンチウイルス粒子を投与することを含む。実施形態では、第１のレンチウイルス粒子はＰＡＨ配列またはそのバリアントを含み、第２のレンチウイルス（lentival）粒子は、少なくとも１つの予め定められた相補的ｍＲＮＡ配列に結合できる少なくとも１つのスモールＲＮＡ配列を含む。
【００７１】
別の態様では、被験体においてＰＫＵを処置または予防する方法が開示される。実施形態では、被験体は子宮内にある。実施形態では、ＰＫＵを処置または予防する方法は、ＰＫＵ表現型と相関する被験体におけるＰＫＵ遺伝子型を診断することをさらに含む。実施形態では、ＰＫＵを処置または予防する方法は、被験体の出生前スクリーニングの間の診断を含む。しかしながら、実施形態では、被験体は、処置の前または後の任意の時点において診断され得る。
【００７２】
本明細書中に記載する発明のその他の態様および利点は、本発明の態様を例により説明する添付の図面と合わせて、以下の詳細な説明から明らかとなるであろう。
【００７３】
フェニルケトン尿症
ＰＫＵは、ＰＡＨの変異および／またはＰＡＨ補因子（すなわち、ＢＨ４）の合成もしくは再生の欠陥により惹起されると考えられている。顕著なことに、いくつものＰＡＨ変異が、小胞体におけるタンパク質フォールディングに影響して、酵素触媒活性を減弱または概ね棄損させるタンパク質構造におけるミスセンス変異（６３％）および小さい欠失（１３％）に起因して分解および／または凝集の加速を生じさせることが示されている。ＰＡＨの機能性に影響し得る多数の変異が存在するので、ＰＫＵを処置するための効果的な治療アプローチは、異常なＰＡＨおよび／または置換ＰＡＨが投与され得る様式に対処し得る。
【００７４】
一般に、ＰＫＵにおいて３つの主な表現型の群は、診断時に測定されるＰｈｅレベル、Ｐｈｅの摂取許容性および治療への潜在的な応答性に基づいて分類される。これらの群は、古典的ＰＫＵ（Ｐｈｅ＞１２００μΜ）、非定型または軽度ＰＫＵ（Ｐｈｅは６００〜１２００μΜ）、および永久的な軽度の高フェニルアラニン血症（ＨＰＡ、Ｐｈｅ  １２０〜６００μΜ）を含む。
【００７５】
ＰＫＵの検出は、典型的に、ユニバーサル新生児スクリーニング（ＮＢＳ）の間に行われる。ヒールスティックから回収された血液滴が、フェニルアラニンレベルについて試験される。ＮＢＳは、米国の全５０州において義務とされている。
【００７６】
遺伝子医学
遺伝子医学は、疾患の治療または予防の目的で遺伝子構築物を宿主細胞に送達するために使用されるウイルスベクターへの言及を含む。
【００７７】
遺伝子構築物としては、既存の欠陥を訂正または補完するための機能的な遺伝子または遺伝子の部分、調節タンパク質をコードするＤＮＡ配列、アンチセンスなどの調節ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列、短鎖相同ＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ、短鎖干渉ＲＮＡまたはその他のもの、および病態を変化させるために不可欠な細胞因子について競合するように設計されたＲＮＡまたはタンパク質のいずれかをコードするデコイ配列を挙げることができるがこれらに限定されない。遺伝子医学は、これらの治療遺伝子構築物を標的細胞に送達して、特定の疾患の処置または軽減を提供することに関与する。
【００７８】
機能的なＰＡＨ遺伝子を肝臓にｉｎ  ｖｉｖｏで送達することにより、その活性を再構成させることができ、それにより、血液中のＰｈｅの正常なクリアランスに繋がり、したがって、食事制限または頻繁な酵素置換療法の必要性を除去する。この治療アプローチの効果は、内因性ＰＡＨに対するｓｈＲＮＡの標的化により向上され得る。本開示の一態様では、胎児がＰＫＵ遺伝子型を有するリスクがあると同定された場合、特に、親の遺伝子型がわかっている場合に、機能的なＰＡＨ遺伝子またはそのバリアントが子宮内に送達され得る。処置は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたは子宮内において行われ得る。実施形態では、胎児がＰＫＵ表現型についてリスクがあるかどうかを判定するために診断ステップが実行され得る。診断ステップにより胎児がＰＫＵ表現型についてリスクがあると判定された場合、胎児は、本明細書に詳述される遺伝子医学を用いて処置され得る。
【００７９】
治療ベクター
本明細書における様々な態様および実施形態によるレンチウイルスのビリオン（粒子）は、ビリオン（ウイルス粒子）を産生するために必要なウイルスタンパク質をコードするベクター系により発現される。様々な実施形態では、プロモーターに作動可能に連結された、レンチウイルスのｐｏｌタンパク質をコードする核酸配列を含有する１つのベクターが、逆転写および組込みのために提供される。別の実施形態では、ｐｏｌタンパク質は、複数のベクターによって発現される。その他の実施形態では、プロモーターに作動可能に連結された、ウイルスカプシドを形成するためのレンチウイルスのＧａｇタンパク質をコードする核酸配列を含有するベクターが提供される。実施形態では、このｇａｇの核酸配列は、ｐｏｌの核酸配列の少なくとも一部とは別のベクター上にある。その他の実施形態では、ｇａｇの核酸は、ｐｏｌタンパク質をコードする全てのｐｏｌの核酸配列とは別のベクター上にある。
【００８０】
野生型復帰変異体を得る機会をさらに最小化するための粒子の作製に使用される多数の改変を、本明細書中のベクターに対して行うことができる。これらとしては、ＬＴＲのＵ３領域の欠失、ｔａｔの欠失、およびマトリックス（ＭＡ）の欠失が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖのベクターは、レンチウイルスパッケージング配列と称される、レンチウイルスＲＮＡをパッケージングするレンチウイルスゲノム由来のヌクレオチドを含有しない。
【００８１】
粒子を形成するベクターは、好ましくは、エンベロープタンパク質を発現するレンチウイルスゲノム由来の核酸配列を含有しない。好ましくは、プロモーターに作動可能に連結されたエンベロープタンパク質をコードする核酸配列を含有する別のベクターが使用される。このｅｎｖベクターもまた、レンチウイルスパッケージング配列を含有しない。一実施形態では、ｅｎｖの核酸配列は、レンチウイルスのエンベロープタンパク質をコードする。
【００８２】
別の実施形態では、エンベロープタンパク質は、レンチウイルス由来のものではなく、異なるウイルスに由来する。生じる粒子は、シュードタイプ化粒子と称される。エンベロープの適切な選択により、実質的にあらゆる細胞に「感染」することができる。例えば、エンドサイトーシス区画を標的化するエンベロープタンパク質をコードするｅｎｖ遺伝子を使用することができ、これらは、インフルエンザウイルス、ＶＳＶ−Ｇ、アルファウイルス（セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス）、アレナウイルス（リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス）、フラビウイルス（ダニ媒介性脳炎ウイルス、デングウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ＧＢウイルス）、ラブドウイルス（水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）、パラミクソウイルス（流行性耳下腺炎または麻疹）、およびオルトミクソウイルス（インフルエンザウイルス）などのものである。好ましく使用され得るその他のエンベロープとしては、ＭＬＶ−Ｅ、ＭＬＶ−Ａ、およびＧＡＬＶなどのモロニー白血病ウイルス由来のものが挙げられる。これら後者のエンベロープは、宿主細胞が初代細胞である場合に特に好ましい。その他のエンベロープタンパク質は、所望の宿主細胞に応じて選択され得る。
【００８３】
本明細書中に提供されるとおりのレンチウイルスベクター系は、通常、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、またはｒｅｖ遺伝子のうちの少なくとも１つを含む少なくとも１つのヘルパープラスミドを含む。ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、およびｒｅｖ遺伝子のそれぞれが個々のプラスミド上に提供されてもよいし、あるいは１つまたは複数の遺伝子が一緒に同一のプラスミド上に提供されてもよい。一実施形態では、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、およびｒｅｖ遺伝子は、同一のプラスミド上に提供される（例えば、図１）。別の実施形態では、ｇａｇ遺伝子およびｐｏｌ遺伝子は第１のプラスミド上に提供され、ｒｅｖ遺伝子は第２のプラスミド上に提供される（例えば、図２）。したがって、３ベクター系および４ベクター系の両方が、本明細書に記載するとおりのレンチウイルスを製造するために使用され得る。一実施形態では、治療ベクター、少なくとも１つのエンベローププラスミド、および少なくとも１つのヘルパープラスミドは、パッケージング細胞、例えば、パッケージング細胞株中にトランスフェクトされる。パッケージング細胞株の非限定的な例は、２９３Ｔ／１７  ＨＥＫ細胞株である。治療ベクター、エンベローププラスミド、および少なくとも１つのヘルパープラスミドがパッケージング細胞株中にトランスフェクトされた時に、レンチウイルス粒子が最終的に生産される。
【００８４】
別の態様では、レンチウイルス粒子を発現するためのレンチウイルスベクター系が開示される。系は、本明細書に記載するレンチウイルスベクター、細胞に感染するために最適化されたエンベロープタンパク質を発現するためのエンベローププラスミド、ならびにｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、およびｒｅｖ遺伝子を発現するための少なくとも１つのヘルパープラスミドを含み、レンチウイルスベクター、エンベローププラスミド、および少なくとも１つのヘルパープラスミドがパッケージング細胞株中にトランスフェクトされた時に、レンチウイルス粒子がパッケージング細胞株によって生産され、レンチウイルス粒子は、ＰＡＨの産生を阻害することおよび／または内因性ＰＡＨの発現を阻害することができる。
【００８５】
別の態様では、本明細書において治療ベクターと称されることもあるレンチウイルスベクターは、以下のエレメントを含む：ハイブリッド５’長鎖末端反復（ＲＳＶ／５’ＬＴＲ）（配列番号７〜８）、プサイ配列（ＲＮＡパッケージング部位）（配列番号９）、ＲＲＥ（Ｒｅｖ応答エレメント）（配列番号１０）、ｃＰＰＴ（ポリプリントラクト）（配列番号１１）、アンチアルファトリプシンプロモーター（ｈＡＡＴ）（配列番号１２）、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）（配列番号１〜４）、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（配列番号１３）、およびΔＵ３  ３’ＬＴＲ（配列番号１４）。実施形態では、置換、欠失、別の態様による配列変化、本明細書において治療ベクターと称されることもあるレンチウイルスベクターは、以下のエレメントを含む：ハイブリッド５’長鎖末端反復（ＲＳＶ／５’ＬＴＲ）（配列番号７〜８）、プサイ配列（ＲＮＡパッケージング部位）（配列番号９）、ＲＲＥ（Ｒｅｖ応答エレメント）（配列番号１０）、ｃＰＰＴ（ポリプリントラクト）（配列番号１１）、Ｈ１プロモーター（配列番号１５）、ＰＡＨ  ｓｈＲＮＡ（配列番号１〜４）、アンチアルファトリプシンプロモーター（ｈＡＡＴ）（配列番号１２）、ＰＡＨ  ｓｈＲＮＡ（配列番号１〜４）、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（配列番号１３）、およびΔＵ３  ３’ＬＴＲ（配列番号１４）。実施形態では、置換、欠失、付加、または変異による配列変化が、本明細書中で言及する配列を改変するために使用され得る。
【００８６】
別の態様では、ヘルパープラスミドは、以下のエレメントを含む：ＣＡＧプロモーター（配列番号１６）、ＨＩＶ構成成分ｇａｇ（配列番号１７）、ＨＩＶ構成成分ｐｏｌ（配列番号１８）、ＨＩＶのＩｎｔ（配列番号１９）、ＨＩＶのＲＲＥ（配列番号２０）、およびＨＩＶのＲｅｖ（配列番号２１）。別の態様では、ヘルパープラスミドは、ｇａｇ遺伝子およびｐｏｌ遺伝子を発現するための第１のヘルパープラスミド、ならびにｒｅｖ遺伝子を発現するための第２の別のプラスミドを含むように改変され得る。別の実施形態では、置換、欠失、付加、または変異による配列変化が、本明細書中で言及する配列を改変するために使用され得る。
【００８７】
別の態様では、エンベローププラスミドは、左から右に以下のエレメントを含む：ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター（ＣＭＶ）（配列番号２２）および水疱性口内炎ウイルスＧ糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）（配列番号２３）。別の実施形態では、置換、欠失、付加、または変異による配列変化が、本明細書中で言及する配列を改変するために使用され得る。
【００８８】
様々な態様では、レンチウイルスのパッケージングのために使用されるプラスミドは、ベクター機能を失うことなく様々なエレメントの置換、付加、除去または変異によって改変される。例えば、限定されないが、以下のエレメントは、パッケージング系を構成するプラスミド中の類似のエレメントの代わりとなり得る：伸長因子−１（ＥＦ−１）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、およびユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモーターは、ＣＭＶプロモーターまたはＣＡＧプロモーターの代わりとなり得る。ＳＶ４０ポリＡおよびｂＧＨポリＡは、ウサギベータグロビンポリＡの代わりとなり得る。ヘルパープラスミド中のＨＩＶ配列は、異なるＨＩＶの株またはクレードから構築され得る。ＶＳＶ−Ｇ糖タンパク質は、ネコ内因性ウイルス（ＲＤ１１４）、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）、狂犬病（ＦＵＧ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、Ａ型インフルエンザ家禽ペストウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｆｏｗｌ  ｐｌａｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ）（ＦＰＶ）、ロスリバーアルファウイルス（ＲＲＶ）、マウス白血病ウイルス１０Ａ１（ＭＬＶ）、またはエボラウイルス（ＥｂｏＶ）由来の膜糖タンパク質で置換することができる。
【００８９】
種々のレンチウイルスパッケージング系は市販のものを入手でき（例えば、Ｌｅｎｔｉ−ｖｐａｋ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｋｉｔ、ＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）、また本明細書中に記載するように設計することもできる。さらに、レンチウイルスパッケージング系の態様を置換または改変して、レンチウイルス粒子の生産効率などのいくつもの関連因子を向上させることは当業者の技術的範囲内である。
【００９０】
別の態様では、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを使用することができる。
【００９１】
ＡＡＶベクターの構築。ＰＡＨ  ｓｈＲＮＡ配列＃１（配列番号５）またはＰＡＨ  ｓｈＲＮＡ配列＃２（配列番号６）をｐＡＡＶプラスミド（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ）に挿入することができる。ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を含有するＰＡＨオリゴヌクレオチド配列をＥｕｒｏｆｉｎｓ  ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎによって合成することができる。重なり合うセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド配列を混合し、７０℃から室温へと冷却しながらアニーリングさせることができる。制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩを３７℃で１時間用いてｐＡＡＶを消化することができる。消化したｐＡＡＶプラスミドをアガロースゲル電気泳動によって精製し、Ｔｈｅｒｍｏ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＤＮＡゲル抽出キットを使用してゲルから抽出することができる。ＤＮＡ濃度を決定し、ベクターをオリゴに（３：１の比）混合し、アニールさせ、ライゲートさせることができる。ライゲーション反応は、室温で３０分間、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて行うことができる。２．５マイクロリットルのライゲーション混合物を２５マイクロリットルのＳＴＢＬ３コンピテント細菌細胞に加えることができる。４２℃での熱ショック後に形質転換を達成することができる。アンピシリンを含有する寒天プレート上に細菌細胞を広げ、薬物抵抗性コロニー（アンピシリン抵抗性プラスミドの存在を指し示す）を回収し、ＬＢブロス中で増殖させることができる。オリゴ配列の挿入を確認するために、Ｔｈｅｒｍｏ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＤＮＡミニプレップキットを用いて、回収した細菌培養物からプラスミドＤＮＡを抽出することができる。ｐＡＡＶプラスミド中へのｓｈＲＮＡ配列の挿入は、ｓｈＲＮＡの発現を調節するために使用されるプロモーター用の特異的プライマーを使用してＤＮＡシークエンシングによって検証することができる。
【００９２】
ＰＡＨ（配列番号１）を発現するための例示的なＡＡＶプラスミド系を図３に示す。簡潔に述べれば、一番左のＡＡＶヘルパープラスミドは、左ＩＴＲ（配列番号４７）、プロトロンビンエンハンサー（配列番号４８）、ヒトアンチアルファトリプシンプロモーター（配列番号１２）、ＰＡＨエレメント（配列番号１）、ポリＡエレメント（配列番号４９）、および右ＩＴＲ（配列番号５０）を含有する。図３の中央に示すＡＡＶプラスミドは、好適なプロモーターエレメント（配列番号１６；配列番号２２）、およびＥ２Ａエレメント（配列番号５１）、Ｅ４エレメント（配列番号５２）、ＶＡ  ＲＮＡエレメント（配列番号５３）、およびポリＡエレメント（配列番号４９）を含有するＡＡＶプラスミドを示す。一番右のプラスミドは、好適なプロモーターエレメント、Ｒｅｐエレメント（配列番号５４）、Ｃａｐエレメント（配列番号５５）、およびポリＡエレメント（配列番号４９）を含有するＡＡＶ  Ｒｅｐ／Ｃａｐプラスミドを示す。
【００９３】
ＡＡＶ粒子の製造。ＡＡＶ−ＰＡＨ  ｓｈＲＮＡプラスミドをプラスミドｐＡＡＶ−ＲＣ２（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ）およびｐＨｅｌｐｅｒ（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ）と組み合わせることができる。ｐＡＡＶ−ＲＣ２プラスミドは、ＲｅｐおよびＡＡＶ２カプシド遺伝子を含有することができ、ｐＨｅｌｐｅｒは、アデノウイルスのＥ２Ａ、Ｅ４、およびＶＡ遺伝子を含有することができる。ＡＡＶ粒子を製造するために、これらのプラスミドを１：１：１（ｐＡＡＶ−ｓｈＰＡＨ：ｐＡＡＶ−ＲＣ２：ｐＨｅｌｐｅｒ）の比で２９３Ｔ細胞にトランスフェクトすることができる。１５０ｍｍディッシュ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）中での細胞のトランスフェクションのために、１０マイクログラムの各プラスミドを一緒に１ｍｌのＤＭＥＭに加えることができる。別のチューブ中、６０マイクロリットルのトランスフェクション試薬ＰＥＩ（１マイクログラム／ｍｌ）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を１ｍｌのＤＭＥＭに加えることができる。２つのチューブを合わせ、１５分間インキュベートすることができる。次いで、トランスフェクション混合物を細胞に加えることができ、細胞を３日後に回収することができる。細胞をドライアイス／イソプロパノール中での凍結／解凍溶解により溶解させることができる。ベンゾナーゼヌクレアーゼ（Ｓｉｇｍａ）を細胞溶解液に３７℃で３０分間加えることができる。次いで、細胞破片を４℃、１２，０００ｒｐｍでの１５分間の遠心分離によりペレット化することができる。上清を回収した後、標的細胞に加えることができる。
【００９４】
投与および剤形
本開示のベクター組成物は、目的の遺伝子または配列の短期、中期、または長期の発現、ならびに本開示のベクターのエピソームの維持を可能とする。したがって、投薬レジメンは、処置されている状態および投与方法に基づいて変化し得る。
【００９５】
実施形態では、ベクター組成物は、必要とする被験体に様々な用量で投与され得る。具体的には、被験体は、約１０６以上の感染用量（１標的細胞への形質導入に平均で１用量が必要）を投与され得る。より具体的には、被験体は、約１０７以上、約１０８以上、約１０９以上、または約１０１０以上の感染用量、あるいはこれらの値の間の任意の数の用量を投与され得る。投薬の上限は、特定のがん種などの各疾患適応症について決定され、各個々の製品および製品ロットの毒性／安全性プロファイルに依存する。
【００９６】
さらに、本開示のベクター組成物は、１日に１回または２回、あるいは任意のその他の好適な期間で定期的に投与され得る。例えば、ベクター組成物は、週に１回、２週間に１回、３週間に１回、１カ月に１回、２カ月毎、３カ月毎、６カ月毎、９カ月毎、１年に１回、１８カ月毎、２年毎、３０カ月毎、または３年毎に、必要とする被験体に投与され得る。
【００９７】
実施形態では、本開示のベクター組成物は、医薬組成物として投与される。実施形態では、医薬組成物は、多様な剤形に製剤化され得、これらの剤形としては、臨床適用のための経鼻、経肺、経口、局所、または非経口の剤形が挙げられるが、これらに限定されない。各剤形は、様々な可溶化剤、崩壊剤、界面活性剤、充填剤、増粘剤、結合剤、湿潤剤などの希釈剤、またはその他の薬学的に許容される賦形剤を含み得る。医薬組成物は、注射、ガス注入（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｉｏｎ）、注入、または皮内曝露用にも製剤化され得る。例えば、注射製剤は、好適なｐＨおよび張度の水性または非水性の溶液中に本開示のベクターを含み得る。
【００９８】
本開示のベクター組成物は、腫瘍部位中へのまたは感染部位における直接の注射を介して被験体に投与され得る。一部の実施形態では、ベクターは、全身投与され得る。一部の実施形態では、ベクター組成物は、腫瘍または感染の部位のすぐ周囲の組織へのガイドされたカニューレ挿入を介して投与され得る。
【００９９】
本開示のベクター組成物は、例えば、鼻腔内投与、口腔内投与、舌下投与、経口投与、直腸投与、眼投与、非経口（静脈内、皮内、筋肉内、皮下、腹腔内）投与、経肺投与、腟内投与、局所投与、局部投与、乱切後の局部投与、粘膜投与、エアロゾルを介して、アガロースまたはゼラチンなどの半固体媒体中で、あるいは口腔内または経鼻噴霧製剤を介してなど、任意の薬学的に許容される方法を使用して投与され得る。
【０１００】
さらに、本開示のベクター組成物は、例えば、固体剤形、錠剤、丸剤、ロゼンジ、カプセル剤、液体分散物、ゲル剤、エアロゾル剤、肺エアロゾル剤、鼻エアロゾル剤、軟膏剤、クリーム剤、半固体剤形、液剤、乳剤、および懸濁剤などの任意の薬学的に許容される剤形に製剤化され得る。さらに、医薬組成物は、制御放出製剤、徐放製剤、即時放出性製剤、またはこれらの任意の組み合わせであり得る。さらに、医薬組成物は、経皮送達システムであり得る。
【０１０１】
実施形態では、医薬組成物は、経口投与用の固体剤形として製剤化され得、固体剤形は、散剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤、または丸剤であり得る。実施形態では、固体剤形は、例えば、炭酸カルシウム、デンプン、スクロース、ラクトース、微結晶性セルロース、またはゼラチンなどの１つまたは複数の賦形剤を含み得る。加えて、固体剤形は、賦形剤に加えて、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤を含み得る。一部の実施形態では、経口剤形は、即時放出形態または調節放出形態であり得る。調節放出剤形としては、制御放出または持続放出、腸管での放出などが挙げられる。調節放出剤形において使用される賦形剤は、当業者に一般に公知である。
【０１０２】
実施形態では、医薬組成物は、舌下剤形または口腔内剤形として製剤化され得る。そのような剤形は、舌下に投与される舌下錠または舌下溶液組成物、および頬と歯茎との間に置かれる口腔錠を含む。
【０１０３】
実施形態では、医薬組成物は、経鼻剤形として製剤化され得る。そのような本発明の剤形としては、経鼻送達用の溶液組成物、懸濁物組成物、およびゲル組成物が挙げられる。
【０１０４】
実施形態では、医薬組成物は、懸濁剤、乳剤、またはシロップ剤などの経口投与用の液体剤形として製剤化され得る。実施形態では、液体剤形は、水および液体パラフィンなどの一般に使用される単純な希釈剤に加えて、保湿剤、甘味剤、芳香剤、または防腐剤などの様々な賦形剤を含み得る。実施形態では、組成物は、小児患者への投与のために好適となるように製剤化され得る。
【０１０５】
実施形態では、医薬組成物は、滅菌水性液剤、懸濁剤、乳剤、非水性液剤、または坐剤などの非経口投与用剤形として製剤化され得る。実施形態では、液剤または懸濁剤は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、オレイン酸エチルなどの注射用エステルを含み得る。
【０１０６】
医薬組成物の投与量は、患者の体重、年齢、性別、投与の時間および様式、排泄速度、ならびに疾患の重篤度に応じて変化し得る。
【０１０７】
実施形態では、ベクター組成物は、静脈もしくは動脈へのカニューレ挿入または注射、皮内送達、筋肉内送達、または疾患部位近くの排液臓器（ｄｒａｉｎｉｎｇ  ｏｒｇａｎ）中への注射によって、脳脊髄液、血液、またはリンパ循環中に投与される。
【０１０８】
以下の実施例は、本発明の態様の実例を挙げるために与えたものである。しかしながら、本発明は、これらの実施例に記載する特定の条件または詳細に限定されないことを理解するべきである。本明細書中で参照する全ての出版物は、参照することにより具体的に組み込まれる。
【実施例】
【０１０９】
（実施例１：レンチウイルスベクター系の開発）
図１に要約するように、レンチウイルスベクター系を開発した（環状形態）。治療ベクター、エンベローププラスミド、およびヘルパープラスミドのトランスフェクション後に、２９３Ｔ／１７  ＨＥＫ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡより購入）中でレンチウイルス粒子を生産した。２９３Ｔ／１７  ＨＥＫ細胞のトランスフェクションにより、機能的なウイルス粒子が生産された。このトランスフェクションには、プラスミドＤＮＡの取込み効率を増加させるために試薬ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）を用いた。最初に、血清を含まない培養培地中にプラスミドおよびＤＮＡを３：１の比（ＤＮＡに対するＰＥＩの質量比）で別々に加えた。２〜３日後、細胞培地を回収し、高速遠心分離および／または濾過とその後の陰イオン交換クロマトグラフィーによってレンチウイルス粒子を精製した。レンチウイルス粒子の濃度は、形質導入単位／ｍｌ（ＴＵ／ｍｌ）で表すことができる。ＴＵの決定は、培養液中のＨＩＶ  ｐ２４レベルの測定（ｐ２４タンパク質はレンチウイルス粒子中に組み込まれる）、定量ＰＣＲによる形質導入された細胞あたりのウイルスＤＮＡコピー数の測定、または細胞の感染および光の使用（ベクターがルシフェラーゼまたは蛍光タンパ
ク質マーカーをコードする場合）によって達成した。
【０１１０】
上記の通り、３ベクター系（すなわち、２ベクターのレンチウイルスパッケージング系を含む）をレンチウイルス粒子の生産用に設計した。３ベクター系の概略図を図１に示す。図１に関して簡潔に述べれば、一番上のベクターはヘルパープラスミドであり、これはこの場合、Ｒｅｖを含む。図１の中央に見られるベクターはエンベローププラスミドである。一番下のベクターは、本明細書中に記載する治療ベクターである。
【０１１１】
図１に関して、ヘルパープラスＲｅｖプラスミドは、ＣＡＧエンハンサー（配列番号２４）、ＣＡＧプロモーター（配列番号１６）、ニワトリベータアクチンイントロン（配列番号２５）、ＨＩＶ  ｇａｇ（配列番号１７）、ＨＩＶ  Ｐｏｌ（配列番号１８）、ＨＩＶ  Ｉｎｔ（配列番号１９）、ＨＩＶ  ＲＲＥ（配列番号２０）、ＨＩＶ  Ｒｅｖ（配列番号２１）、およびウサギベータグロビンポリＡ（配列番号２６）を含む。
【０１１２】
エンベローププラスミドは、ＣＭＶプロモーター（配列番号２２）、ベータグロビンイントロン（配列番号２７）、ＶＳＶ−Ｇエンベロープ糖タンパク質（配列番号２３）、およびウサギベータグロビンポリＡ（配列番号２６）を含む。
【０１１３】
ヘルパー（プラスＲｅｖ）プラスミドおよびエンベローププラスミドからなる２ベクターレンチウイルスパッケージング系を含む３ベクター系の合成が開示される。
【０１１４】
材料および方法：
ヘルパープラスミドの構築：Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびインテグラーゼ遺伝子を含有するｐＮＬ４−３  ＨＩＶプラスミド（ＮＩＨ  Ａｉｄｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ）由来のＤＮＡ断片の初期ＰＣＲ増幅によってヘルパープラスミドを構築した。ｐＣＤＮＡ３プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の同じ部位に挿入するために使用され得るＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ制限部位を有する断片を増幅するためのプライマーを設計した。フォワードプライマーは（５’−ＴＡＡＧＣＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＡＴＴＴＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＴ−３’）（配列番号２８）であり、リバースプライマーは（５’−ＣＣＡＴＡＣＡＡＴＧＡＡＴＧＧＡＣＡＣＴＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＧＡＡＴ−３’）（配列番号２９）であった。
【０１１５】
Ｇａｇ、Ｐｏｌ、インテグラーゼの断片の配列は以下の通りであった：
【化６】
2020512815.tif 000008
【化７】
2020512815.tif 000009
【０１１６】
次に、ＸｂａＩおよびＸｍａＩ隣接制限部位と共にＲｅｖ、ＲＲＥ、およびウサギベータグロビンポリＡの配列を含有するＤＮＡ断片は、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓによって合成された。次いで、ＸｂａＩおよびＸｍａＩ制限部位においてＤＮＡ断片をプラスミドに挿入した。ＤＮＡ配列は以下の通りであった：
【０１１７】
【化８】
2020512815.tif 000010
【０１１８】
最後に、ｐＣＤＮＡ３．１のＣＭＶプロモーターをＣＡＧエンハンサー／プロモータープラスニワトリベータアクチンイントロン配列で置換した。ＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩ隣接制限部位と共にＣＡＧエンハンサー／プロモーター／イントロン配列を含有するＤＮＡ断片は、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓによって合成された。次いで、ＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位においてＤＮＡ断片をプラスミドに挿入した。ＤＮＡ配列は以下の通りであった：
【化９】
2020512815.tif 000011
【０１１９】
ＶＳＶ−Ｇエンベローププラスミドの構築：
【０１２０】
水疱性口内炎インディアナウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）配列は、隣接ＥｃｏＲＩ制限部位を用いてＥｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓによって合成された。次いで、ＥｃｏＲＩ制限部位においてＤＮＡ断片をｐＣＤＮＡ３．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入し、ＣＭＶ特異的プライマーを使用するシークエンシングによって正しい配向であることを決定した。
【０１２１】
ＤＮＡ配列は以下の通りであった：
【化１０】
2020512815.tif 000012
【０１２２】
本明細書中に記載する方法および材料を使用して、３ベクターレンチウイルスパッケージング系を含む４ベクター系も設計し、生産した。４ベクター系の概略図を図２に示す。図２に関して簡潔に述べれば、一番上のベクターはヘルパープラスミドであり、これはこの場合、Ｒｅｖを含まない。上から２つ目のベクターは別個のＲｅｖプラスミドである。下から２つ目のベクターはエンベローププラスミドである。一番下のベクターは、本明細書中に記載する治療ベクターである。
【０１２３】
図２に関して、ヘルパープラスミドは、ＣＡＧエンハンサー（配列番号２４）、ＣＡＧプロモーター（配列番号１６）、ニワトリベータアクチンイントロン（配列番号２５）、ＨＩＶ  ｇａｇ（配列番号１７）、ＨＩＶ  Ｐｏｌ（配列番号１８）、ＨＩＶ  Ｉｎｔ（配列番号１９）、ＨＩＶ  ＲＲＥ（配列番号２０）、およびウサギベータグロビンポリＡ（配列番号２６）を含む。
【０１２４】
Ｒｅｖプラスミドは、ＲＳＶプロモーター（配列番号７）、ＨＩＶ  Ｒｅｖ（配列番号２１）、およびウサギベータグロビンポリＡ（配列番号２６）を含む。
【０１２５】
エンベローププラスミドは、ＣＭＶプロモーター（配列番号２２）、ベータグロビンイントロン（配列番号２７）、ＶＳＶ−Ｇ（配列番号２３）、およびウサギベータグロビンポリＡ（配列番号２６）を含む。
【０１２６】
一態様では、治療用ＰＡＨレンチウイルスプラスミドは、図４Ａに示すエレメントの全てを含む。別の態様では、治療用ＰＡＨレンチウイルスプラスミドは、図４Ｂに示すエレメントの全てを含む。
【０１２７】
ヘルパープラスミド、Ｒｅｖプラスミド、およびエンベローププラスミドからなる３ベクターレンチウイルスパッケージング系を含む４ベクター系の合成が開示される。
【０１２８】
材料および方法：
Ｒｅｖを含まないヘルパープラスミドの構築：
【０１２９】
ＲＲＥおよびウサギベータグロビンポリＡ配列を含有するＤＮＡ断片を挿入することによって、Ｒｅｖを含まないヘルパープラスミドを構築した。この配列は、隣接ＸｂａＩおよびＸｍａＩ制限部位を用いてＥｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓによって合成された。次いで、ＸｂａＩおよびＸｍａＩ制限部位においてＲＲＥ／ウサギポリＡベータグロビン配列をヘルパープラスミドに挿入した。
【０１３０】
ＤＮＡ配列は以下の通りである：
【化１１】
2020512815.tif 000013
【化１２】
2020512815.tif 000014
【０１３１】
Ｒｅｖプラスミドの構築：
ＲＳＶプロモーターおよびＨＩＶ  Ｒｅｖ配列は、隣接ＭｆｅＩおよびＸｂａＩ制限部位を用いて、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓによって単一のＤＮＡ断片として合成された。次いで、ＣＭＶプロモーターがＲＳＶプロモーターで置換されたＭｆｅＩおよびＸｂａＩ制限部位において、ＤＮＡ断片をｐＣＤＮＡ３．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入した。ＤＮＡ配列は以下の通りであった：
【化１３】
2020512815.tif 000015
【０１３２】
パッケージング系において使用されるプラスミドは、類似のエレメントを用いて改変することができ、また、イントロン配列は、ベクター機能を失うことなく取り除くことが可能であり得る。例えば、以下のエレメントは、パッケージング系中の類似のエレメントの代わりとなり得る：
【０１３３】
プロモーター：伸長因子−１（ＥＦ−１）（配列番号３４）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）（配列番号３５）、およびユビキチンＣ（ＵｂＣ）（配列番号３６）は、ＣＭＶプロモーター（配列番号２２）またはＣＡＧプロモーター（配列番号１６）の代わりとなり得る。これらの配列を、付加、置換、欠失、または変異によってさらに変化させることもできる。
【０１３４】
ポリＡ配列：ＳＶ４０ポリＡ（配列番号３７）およびｂＧＨポリＡ（配列番号３８）は、ウサギベータグロビンポリＡ（配列番号２６）の代わりとなり得る。これらの配列を、付加、置換、欠失、または変異によってさらに変化させることもできる。
【０１３５】
ＨＩＶ  Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびインテグラーゼ配列：ヘルパープラスミド中のＨＩＶ配列は、異なるＨＩＶの株またはクレードから構築することができる。例えば、Ｂａｌ株由来のＨＩＶ  Ｇａｇ（配列番号１７）、ＨＩＶ  Ｐｏｌ（配列番号１８）、およびＨＩＶ  Ｉｎｔ（配列番号１９）を、本明細書中に概説したように、ヘルパー／ヘルパープラスＲｅｖプラスミド中に含有されるｇａｇ、ｐｏｌ、およびｉｎｔ配列と交換することができる。これらの配列を、付加、置換、欠失、または変異によってさらに変化させることもできる。
【０１３６】
エンベロープ：ＶＳＶ−Ｇ糖タンパク質は、ネコ内因性ウイルス（ＲＤ１１４）（配列番号３９）、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）（配列番号４０）、狂犬病（ＦＵＧ）（配列番号４１）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）（配列番号４２）、Ａ型インフルエンザ家禽ペストウイルス（ＦＰＶ）（配列番号４３）、ロスリバーアルファウイルス（ＲＲＶ）（配列番号４４）、マウス白血病ウイルス１０Ａ１（ＭＬＶ）（配列番号４５）、またはエボラウイルス（ＥｂｏＶ）（配列番号４６）由来の膜糖タンパク質と置換することができる。これらのエンベロープの配列は、本明細書中の配列部分として特定される。さらに、これらの配列を、付加、置換、欠失、または変異によってさらに変化させることもできる。
【０１３７】
要約すると、３ベクター系と４ベクター系とを以下の通りに比較および対比することができる。３ベクターレンチウイルスベクター系は以下を含有する：１．ヘルパープラスミド：ＨＩＶ  Ｇａｇ、Ｐｏｌ、インテグラーゼ、およびＲｅｖ／Ｔａｔ；２．エンベローププラスミド：ＶＳＶ−Ｇ／ＦＵＧエンベロープ；および３．治療ベクター：ＲＳＶ  ５’ＬＴＲ、プサイパッケージングシグナル、ＲＲＥ、ｃＰＰＴ、ＡｐｏＥエンハンサー、アンチアルファトリプシンプロモーター、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、３’ＵＴＲ、ＷＰＲＥ、および３’デルタＬＴＲ。４ベクターレンチウイルスベクター系は以下を含有する：１．ヘルパープラスミド：ＨＩＶ  Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびインテグラーゼ；２．Ｒｅｖプラスミド：Ｒｅｖ；３．エンベローププラスミド：ＶＳＶ−Ｇ／ＦＵＧエンベロープ；および４．治療ベクター：ＲＳＶ  ５’ＬＴＲ、プサイパッケージングシグナル、ＲＲＥ、ｃＰＰＴ、ＡｐｏＥエンハンサー、アンチアルファトリプシンプロモーター、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、ＷＰＲＥ、および３’デルタＬＴＲ。上記エレメントと対応する配列は、本明細書中の配列表の部分として特定される。
【０１３８】
（実施例２．治療ベクター）
例えば図４に示すように、例示的な治療ベクターを設計し、開発した。
【０１３９】
最初に図４Ａに関して、左から右に、鍵となる遺伝子エレメントは以下の通りである：ハイブリッド５’長鎖末端反復（ＲＳＶ／ＬＴＲ）、プサイ配列（ＲＮＡパッケージング部位）、ＲＲＥ（Ｒｅｖ応答エレメント）、ｃＰＰＴ（ポリプリントラクト）、ｈＡＡＴプロモーター、本明細書に詳述するＰＡＨまたはそのバリアント、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、およびＵ３領域に欠失を有するＬＴＲ。
【０１４０】
次に図４Ｂに関して、左から右に、鍵となる遺伝子エレメントは以下の通りである：ハイブリッド５’長鎖末端反復（ＲＳＶ／ＬＴＲ）、プサイ配列（ＲＮＡパッケージング部位）、ＲＲＥ（Ｒｅｖ応答エレメント）、ｃＰＰＴ（ポリプリントラクト）、Ｈ１プロモーター、本明細書に詳述するＰＡＨ  ｓｈＲＮＡ配列またはそのバリアント、ｈＡＡＴプロモーター、本明細書に詳述するＰＡＨ配列およびそのバリアントを含むＰＡＨ配列、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、およびＵ３領域に欠失を有するＬＴＲ。
【０１４１】
図４Ａおよび図４Ｂに概説するベクターを生産するために、以下の方法および材料を用いた。
【０１４２】
阻害性ＲＮＡの設計：ホモサピエンスフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）ｍＲＮＡの配列（ＮＭ＿０００２７７．１）を使用して、ヒト細胞においてＰＡＨレベルをノックダウンするための潜在的なｓｈＲＮＡ候補を検索した。Ｂｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅが主催するＧＰＰ  Ｗｅｂ  Ｐｏｒｔａｌ（ｈｔｔｐ：／／ｐｏｒｔａｌｓ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｇｐｐ／ｐｕｂｌｉｃ／）またはＴｈｅｒｍｏ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＢＬＯＣＫ−ｉＴ  ＲＮＡｉ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ（ｈｔｔｐｓ：／／ｒｎａｉｄｅｓｉｇｎｅｒ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｒｎａｉｅｘｐｒｅｓｓ／）などのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ設計プログラムによって選択された候補から潜在的なＲＮＡ  ｓｈＲＮＡ配列を選択した。ｓｈＲＮＡ発現を調節するために、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターＨ１（配列番号１５）のすぐ３’側において、個々の選択したｓｈＲＮＡ配列をレンチウイルスベクターに挿入した。これらのレンチウイルスｓｈＲＮＡ構築物を使用して細胞への形質導入を行い、特定のｍＲＮＡレベルの変化を測定した。
【０１４３】
ベクターの構築：ＰＡＨ  ｓｈＲＮＡのため、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を含有するオリゴヌクレオチド配列は、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎによって合成された。重複するセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド配列を混合し、７０℃から室温へと冷却しながらアニーリングさせた。３７℃で１時間、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩを用いてレンチウイルスベクターを消化した。消化したレンチウイルスベクターをアガロースゲル電気泳動により精製し、Ｔｈｅｒｍｏ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＤＮＡゲル抽出キットを使用してゲルから抽出した。ＤＮＡ濃度を決定し、ベクターをオリゴに混合し（３：１の比）、アニーリングおよびライゲートさせた。ライゲーション反応は、室温で３０分間、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて行った。２．５マイクロリットルのライゲーション混合物を２５マイクロリットルのＳＴＢＬ３コンピテント細菌細胞に加えた。４２℃での熱ショック後に形質転換を達成した。アンピシリンを含有する寒天プレート上に細菌細胞を広げ、薬物抵抗性コロニー（アンピシリン抵抗性プラスミドの存在を指し示す）を回収し、ＬＢ培地中で増殖させた。オリゴ配列の挿入を確認するために、Ｔｈｅｒｍｏ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＤＮＡミニプレップキットを用いて、回収した細菌培養物からプラスミドＤＮＡを抽出した。レンチウイルスベクター中へのｓｈＲＮＡ配列の挿入は、ｓｈＲＮＡの発現を調節するために使用されるプロモーター用の特異的プライマーを使用してＤＮＡシークエンシングによって検証した。以下の標的配列を使用して、ＰＡＨをノックダウンするための例示的なｓｈＲＮＡ配列を決定した。
【化１４】
2020512815.tif 000016
【０１４４】
（実施例３）
全長５’および３’ＵＴＲを含むフェニルアラニンヒドロキシラーゼオープンリーディングフレーム
Ｈｅｐａ１−６マウスヘパトーマ細胞を、図５に示すように、その全長５プライム非翻訳領域およびその全長３プライム非翻訳領域（配列番号３）を含むＰＡＨ遺伝子（配列番号１）を含有するレンチウイルスベクターに感染させた。図５は、ヒトＰＡＨのｃＤＮＡ発現構築物の全長ＤＮＡ配列（配列番号５７）を提供する。このバージョンは、インタクトな５’ＵＴＲ領域（太字で示す）、ｈＰＡＨのコーディング領域、および全長３’ＵＴＲ（太字で示す）を含む。これらの感染の結果を本明細書におけるさらなる実施例において詳述する。
【０１４５】
（実施例４）
全長５’ＵＴＲおよび切断型３’ＵＴＲを含むフェニルアラニンヒドロキシラーゼオープンリーディングフレーム
Ｈｅｐａ１−６マウスヘパトーマ細胞を、図６に示すように、その全長５プライム非翻訳領域および切断型３プライム非翻訳領域（配列番号４）を含むＰＡＨ遺伝子（配列番号１）を含有するレンチウイルスベクターに感染させた。図６は、５’ＵＴＲ（８９７ヌクレオチド）（太字で示す）、ｈＰＡＨのコーディング領域、および切断型３’ＵＴＲ（２８９ヌクレオチド）（太字で示す）（配列番号５８）を含むヒトＰＡＨのｃＤＮＡ配列を提供する。
【０１４６】
（実施例５）
ＰＡＨの材料および方法
ホモサピエンスフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ｈＰＡＨ）ｍＲＮＡの配列（Ｇｅｎ  Ｂａｎｋ：ＮＭ＿０００２７７．１）を遺伝子の遠位末端および近位末端に位置するＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ制限酵素部位と共に化学合成した。ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ制限酵素を用いて処理してｈＰＡＨを切断し、ＡｐｏＥ（ＮＭ＿０００００１．１１、Ｕ３５１１４．１）およびｈＡＡＴ（ＨＧ９８３８５．１）遺伝子座制御領域の部分を含むハイブリッドプロモーターの制御下でｐＣＤＨプラスミドにライゲートした。同様に、マウスＰＡＨ遺伝子（ｍＰＡＨ）（ＮＭ＿００８７７７．３）を合成し、同じハイブリッドプロモーターの制御下でｐＣＤＨに挿入した。さらに、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含むようにヒトＰＡＨを合成した。
【０１４７】
さらなる改変では、天然に存在するＵＴＲを切断して、肝臓特異的プロモーターｈＡＡＴによって制御された時のｈＰＡＨ遺伝子の発現を向上させた。ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を有する、ｈＰＡＨ、全長ＵＴＲを有するｈＰＡＨ、切断型ＵＴＲを有するｈＰＡＨまたはｍＰＡＨのみを含有するオリゴヌクレオチド配列はＥｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓによって合成された。オリゴヌクレオチド配列を７０℃でのインキュベーションおよび室温への冷却によってアニールさせた。３７℃で１時間、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩを用いてレンチウイルスベクターを消化した。消化したレンチウイルスベクターをアガロースゲル電気泳動により精製し、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＤＮＡゲル抽出キットを使用してゲルから抽出した。ＤＮＡ濃度を決定した後、ベクターをオリゴ配列に３：１の挿入物対ベクター比で使用して合成オリゴヌクレオチド（ｈＰＡＨまたはｍＰＡＨ）と混合した。混合物は、室温で３０分間、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼでライゲートした。２．５マイクロリットルのライゲーション混合物を２５マイクロリットルのＳＴＢＬ３コンピテント細菌細胞に加えた。４２℃での熱ショックによって形質転換を実行した。アンピシリンを含有する寒天プレート上に細菌細胞を塗り付けた後、コロニーをＬＢブロス中で増殖させた。オリゴ配列の挿入を確認するために、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＤＮＡミニプレップキットを用いて、回収した細菌培養物からプラスミドＤＮＡを抽出した。レンチウイルスベクター（ＬＶ）中へのｓｈＲＮＡ配列の挿入は、ｓｈＲＮＡの発現のために使用されるプロモーターに相補的なプライマーを使用して、ＤＮＡシークエンシングによって検証した。次いで、検証したｈＰＡＨまたはｍＰＡＨ配列を含有するレンチウイルスベクターを使用してレンチウイルス粒子をパッケージングして、ＰＡＨを発現するそれらの能力について試験した。哺乳動物細胞にレンチウイルス粒子を形質導入した。２〜４日後に細胞を回収し、ＰＡＨの発現についてウエスタンブロットによってタンパク質を分析した。
【０１４８】
ｈＰＡＨ配列の改変：
ｈＰＡＨ配列のいくつもの改変を組み込んで、細胞発現レベルを向上させた。最初に、通常のｈＰＡＨ  ３’非翻訳領域（ＵＴＲ）をＰＡＨコーディング領域の後ろおよびｍＲＮＡの末端の前に挿入した。これはＬＶ−ｈＡＡＴ−ｈＰＡＨ−ＵＴＲを生成させた。３’ＵＴＲを加えることによってｈＰＡＨの発現レベルは増加したが、類似のベクター中で発現されるｍＰＡＨのレベルに達しなかった。
【０１４９】
次に、ｈＰＡＨ  ＵＴＲ領域を改変して、肝臓特異的プロモーターの制御下での発現レベルを向上させた。配列の遠位の半分におおよそ等しい非翻訳領域の部分を除去した。この改変は、ＬＶ−ｈＡＡＴ−ｈＰＡＨ−ＵＴＲの発現を、ｍＰＡＨの発現について達成されたものと類似のレベルまで増加させた。驚くべきことに、ＵＴＲの切断は、肝臓特異的なｈＡＡＴプロモーターを使用した時に高レベルの発現のために必要とされるのみであった。ＣＭＶ最初期プロモーターの制御下のｈＰＡＨ発現構築物の生成は、ＵＴＲの存在または非存在にかかわらず、さらにＵＴＲが切断されているか否かにかかわらず、高レベルの発現を与えた。ｈＰＡＨ遺伝子座の構造機能の理解におけるこの重要な進歩は、ｈＰＡＨの高レベルの産生を依然として達成しつつ肝臓組織における特異的な発現のための構築物を生成することを可能とする。導入遺伝子の発現を肝細胞に制限することは、フェニルケトン尿症のための遺伝子医学におけるベクターの安全性および標的特異性のための重要な検討事項である。
【０１５０】
（実施例６）
ヒトおよびマウスのＰＡＨ遺伝子について発現のレベルを比較するイムノブロット解析
ヒトおよびマウスのＰＡＨ遺伝子について発現のレベルを比較するイムノブロット解析を図７に要約するように実行した。この実施例は、Ｈｅｐａ１−６マウス肝臓がん細胞（Ｈｅｐａ１−６）におけるマウスＰＡＨの発現は、Ｈｅｐａ１−６におけるヒトＰＡＨのほぼ検出不可能な発現と比較してより高いことを説明する。
【０１５１】
ヒトおよびマウスＰＡＨを合成し、レンチウイルスベクターに挿入した。次いで、配列の挿入をＤＮＡシークエンシングによって検証した。次いで、正しいｈＰＡＨまたはｍＰＡＨ配列を含有するレンチウイルスベクターを使用して、Ｈｅｐａ１−６マウス肝臓がん細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡから購入した）への形質導入を行った。２〜４日後に細胞を回収し、ＰＡＨの発現についてウエスタンブロットによってタンパク質を分析した。形質導入効率のためのマーカーとして緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含有するレンチウイルス粒子をＨｅｐａ１−６細胞に感染させた。ヒトまたはマウスＰＡＨの相対発現を、抗ＰＡＨ抗体（Ａｂｃａｍ）を使用してイムノブロットによって検出した。
【０１５２】
（実施例７）
Ｈｅｐａ１−６細胞における３’ＵＴＲ領域を有するまたは有しないｈＰＡＨのレンチウイルスで送達された発現
この実施例は、図８に示すように、レンチウイルスベクターが５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲの両方を含むｈＰＡＨを発現する時にＰＡＨの発現がＨｅｐａ１−６癌腫細胞において実質的に増加することを説明する。この実施例はまた、ｈＰＡＨのコーディング領域のみを発現するレンチウイルスベクターはＨｅｐａ１−６細胞においてＰＡＨタンパク質のレベルを増加させないことを説明する。
【０１５３】
ヒトＰＡＨを合成し、レンチウイルスベクターに挿入した。配列の挿入をＤＮＡシークエンシングによって検証した。次いで、検証したｈＰＡＨ配列を含有するレンチウイルスベクターを使用して、Ｈｅｐａ１−６マウス肝臓がん細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡから購入した）への形質導入を行った。レンチウイルスベクターは、その３’ＵＴＲを有するまたは有しないヒトＰＡＨ遺伝子を組み込んでいた。加えて、これらの構築物中のｈＰＡＨの発現をｈＡＡＴプロモーターによって推進させた。細胞にレンチウイルス粒子を形質導入し、２〜４日後にＰＡＨの発現についてウエスタンブロットによってタンパク質を分析した。形質導入効率のためのマーカーとして緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含有するレンチウイルス粒子をＨｅｐａ１−６細胞に感染させた。ヒトＰＡＨの相対発現を、抗ＰＡＨ抗体（Ａｂｃａｍ）を使用してイムノブロットによって検出した。
【０１５４】
図８に示すように、３つの群を比較する：Ｈｅｐａ１−６細胞のみを含む対照（レーン１）、ｈＰＡＨのコーディング領域のみを発現するレンチウイルスベクターを表す群（レーン２）、およびｈＰＡＨを発現し、５’および３’ＵＴＲ領域の両方を含むレンチウイルスベクター（レーン３）。顕著なことに、Ｈｅｐａ１−６癌腫細胞はマウス肝臓組織に由来し、したがって、レーン１においてＰＡＨの天然のバックグラウンド発現が観察される（標識されたｈＡＡＴ）。図８は、ＰＡＨ  ｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルス（ＬＶ）が５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲの両方を含む時にＰＡＨの発現がＨｅｐａ１−６癌腫細胞において実質的に増加することを実証する。
【０１５５】
（実施例８）
Ｈｅｐａ１−６細胞において切断型３’ＵＴＲを有するｈＰＡＨを発現するレンチウイルスベクター
この実施例は、図９に示すように、切断型３’ＵＴＲを有するｈＰＡＨ（ｈＰＡＨ−３’ＵＴＲ）を発現するレンチウイルスベクターが、全長３’ＵＴＲ配列を含有する構築物と比較してｈＰＡＨの実質的に増加した発現を実証することを説明する。
【０１５６】
ヒトＰＡＨを合成し、レンチウイルスベクターに挿入した。配列の挿入をＤＮＡシークエンシングによって検証した。次いで、検証したｈＰＡＨ配列を含有するレンチウイルスベクターを使用して、Ｈｅｐａ１−６肝臓がん細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡから購入した）への形質導入を行った。レンチウイルスベクターは、その３’ＵＴＲを有するまたは有しないヒトＰＡＨ遺伝子を組み込んでいた。加えて、これらの構築物中のｈＰＡＨの発現をｈＡＡＴプロモーターによって推進させた。細胞にレンチウイルス粒子を形質導入し、２〜４日後にＰＡＨの発現についてウエスタンブロットによってタンパク質を分析した。形質導入効率のためのマーカーとして緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含有するレンチウイルス粒子をＨｅｐａ１−６細胞に感染させた。ヒトＰＡＨの相対発現を、抗ＰＡＨ抗体（Ａｂｃａｍ）およびローディングコントロールのベータアクチンを使用してイムノブロットによって検出した。
【０１５７】
図９は、Ｈｅｐａ１−６癌腫細胞におけるｈＰＡＨ構築物の発現を示す。図９に示すように、３つの群を比較する：ｈＰＡＨのコーディング領域のみを発現する対照レンチウイルスベクター（レーン１）、ｈＰＡＨ−３’ＵＴＲを含有する構築物（レーン２）、および全長ｈＰＡＨ  ３’ＵＴＲ配列（レーン３）。顕著なことに、Ｈｅｐａ１−６癌腫細胞はヒト肝臓組織に由来し、したがって、レーン１においてＰＡＨの天然のバックグラウンド発現が観察される（標識されたｈＡＡＴ）。この実施例は、ｈＰＡＨ−３’ＵＴＲがＨｅｐａ１−６細胞において野生型３’ＵＴＲ配列と比べてｈＰＡＨの発現を増加させることを説明する。
【０１５８】
（実施例９）
マウスＨｅｐａ１−６細胞におけるＷＰＲＥを有するまたは有しないコドン最適化ｈＰＡＨの発現
この実施例は、図１０に示すように、ｈＡＡＴ−ｈＰＡＨ−３’ＵＴＲ２８９を含有するレンチウイルスベクターからのＷＰＲＥエレメントの除去はｈＰＡＨの発現を有意に低減させ、ＷＰＲＥは最適なタンパク質発現のために必要とされることを説明する。この実施例はまた、好ましいヒトコドンバイアスに基づくコドン選択の最適化（ＰＡＨ−ＯＰＴ）はｈＰＡＨの発現レベルを増加させなかったことを説明する。
【０１５９】
ヒトＰＡＨを合成し、レンチウイルスベクターに挿入した。配列の挿入をＤＮＡシークエンシングによって検証した。次いで、検証したｈＰＡＨ配列を含有するレンチウイルスベクターを使用して、マウスＨｅｐａ１−６細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡから購入した）への形質導入を行った。加えて、これらの構築物中のｈＰＡＨの発現をｈＡＡＴプロモーターによって推進させた。細胞にレンチウイルス粒子を形質導入し、２〜４日後にＰＡＨの発現についてウエスタンブロットによってタンパク質を分析した。ヒトＰＡＨの相対発現を、抗ＰＡＨ抗体（Ａｂｃａｍ）およびローディングコントロールのベータアクチンを使用してイムノブロットによって検出した。
【０１６０】
この実施例は、１）ｈＰＡＨコーディング領域のコドン最適化および２）ＷＰＲＥ遺伝子成分の欠失の、Ｈｅｐａ１−６細胞におけるｈＰＡＨの発現に対する効果を示す。マウスＨｅｐａ１−６細胞における様々なｈＰＡＨ構築物の発現を比較することによりこの疑問に取り組んだ。図１０に示すように、５つの群を比較する：ベータアクチンローディングコントロール（レーン１）、最適化コドン対照構築物（レーン２）、切断型ｈＰＡＨ  ３’ＵＴＲ配列を含有する最適化コドン構築物（レーン３）、切断型ｈＰＡＨ  ３’ＵＴＲ配列を含有する対照構築物（レーン４）、およびＷＰＲＥ配列を欠失し、切断型ｈＰＡＨ  ３’ＵＴＲを含有する構築物（レーン５）。Ｈｅｐａ１−６癌腫細胞はマウス肝臓組織に由来し、したがって、レーン１においてＰＡＨの天然のバックグラウンド発現が観察される（標識されたｈＡＡＴ）。この実施例は、好ましいヒトコドンバイアスに基づくコドン選択の最適化（ＰＡＨ−ＯＰＴ）はｈＰＡＨの発現レベルを増加させなかったことを説明する。野生型ｈＰＡＨ遺伝子を用いて観察されたように、切断型３’ＵＴＲ（ＵＴＲ２８９）を含めることは、ｈＰＡＨの発現を増加させるが、ＵＴＲ２８９に連結した野生型（非最適化）配列を用いて観察されたものより実質的に低いレベルに過ぎない。ｈＡＡＴ−ｈＰＡＨ−３’ＵＴＲ２８９を含有するレンチウイルスベクターからのＷＰＲＥエレメントの除去もまたｈＰＡＨの発現を低減させ、ＷＰＲＥは最適なタンパク質発現のために必要とされることを指し示す。
【０１６１】
（実施例１０）
ｓｈＰＡＨ−１およびｓｈＰＡＨ−２はヒトＨｅｐ３Ｂ細胞においてｈＰＡＨの発現を低減させる
この実施例は、図１１に示すように、レンチウイルスで送達されたＰＡＨ  ｓｈＲＮＡはヒトＨｅｐ３Ｂ細胞においてｈＰＡＨの発現を低減させることを実証する。
【０１６２】
ヒトＰＡＨを合成し、レンチウイルスベクターに挿入した。配列の挿入をＤＮＡシークエンシングによって検証した。次いで、ｈＰＡＨ配列を含有するレンチウイルスベクターを使用して、ヒトＨｅｐ３Ｂ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡから購入した）への形質導入を行った。加えて、これらの構築物中のｈＰＡＨの発現をｈＡＡＴプロモーターによって推進させた。細胞にレンチウイルス粒子を形質導入し、２〜４日後にＰＡＨの発現についてウエスタンブロットによってタンパク質を分析した。レンチウイルスベクター（ＬＶ）中のｓｈＲＮＡ配列の挿入を、ｓｈＲＮＡの発現を調節するために使用したプロモーターに相補的なプライマーを使用してＤＮＡシークエンシングによって検証した。ヒトＰＡＨの相対発現を、抗ＰＡＨ抗体（Ａｂｃａｍ）およびローディングコントロールのベータアクチンを使用してイムノブロットによって検出した。
【０１６３】
図１１は、Ｈｅｐ３Ｂ細胞においてｈＰＡＨの発現を低減させる２つの異なるｓｈＲＮＡ構築物、すなわちＰＡＨ  ｓｈＲＮＡ配列＃１（ｓｈＰＡＨ−１）およびＰＡＨ  ｓｈＲＮＡ配列＃２（ｓｈＰＡＨ−２）の能力を比較する。図１１に示すように、３つの構築物を比較する：Ｈｅｐ３Ｂ細胞のみを有する対照（レーン１）、構築物含有Ｈｅｐ３Ｂ細胞＋ｓｈＰＡＨ−１（レーン２）、および構築物含有Ｈｅｐ３Ｂ細胞＋ｓｈＰＡＨ−２（レーン３）。顕著なことに、Ｈｅｐ３Ｂ細胞は、有意なレベルで内因性ＰＡＨを発現する。この実施例は、ｓｈＰＡＨ−１およびｓｈＰＡＨ−２の両方は、内因性ｈＰＡＨの発現レベルの低減において効果的であったことを説明する。
【０１６４】
（実施例１１）
Ｈｅｐ３Ｂ細胞における内因性ｈＰＡＨおよびｈＡＡＴ−ｈＰＡＨ−３’ＵＴＲ２８９のｓｈＰＡＨ−１抑制
この実施例は、図１２に示すように、ｓｈＰＡＨ−１がＨｅｐ３Ｂ細胞において内因性ＰＡＨおよび切断型ｈＰＡＨ  ３’ＵＴＲ（ｈＡＡＴ−ｈＰＡＨ−３’ＵＴＲ２８９）の発現を抑制することを実証する。
【０１６５】
ヒトＰＡＨを合成し、レンチウイルスベクターに挿入した。配列の挿入をＤＮＡシークエンシングによって検証した。次いで、ｈＰＡＨ配列を含有するレンチウイルスベクターを使用して、ヒトＨｅｐ３Ｂ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡから購入した）への形質導入を行った。細胞にレンチウイルス粒子を形質導入し、２〜４日後にＰＡＨの発現についてウエスタンブロットによってタンパク質を分析した。ヒトＰＡＨの相対発現を、抗ＰＡＨ抗体（Ａｂｃａｍ）およびローディングコントロールのベータアクチンを用いてイムノブロットによって検出した。全長および３’ＵＴＲ切断型の両方の構築物におけるｈＰＡＨの発現をｈＡＡＴプロモーターによって推進させた。レンチウイルスベクターは、様々な事例において、その３’ＵＴＲを有するヒトＰＡＨ遺伝子、切断型３’ＵＴＲを有するヒトＰＡＨ遺伝子、および／またはｓｈＰＡＨ−１を組み込んでいた。レンチウイルスベクター（ＬＶ）中のｓｈＲＮＡ配列の挿入を、ｓｈＲＮＡの発現を調節するために使用したプロモーターに相補的なプライマーを使用してＤＮＡシークエンシングによって検証した。ｓｈＰＡＨ−１の標的配列は、全長および短鎖型の両方のバージョンにおいて保存された３’ＵＴＲの部分にある。
【０１６６】
図１２は、ヒトＨｅｐ３Ｂ細胞におけるｈＰＡＨおよびＰＡＨ  ｓｈＲＮＡの発現を示す。図１２に示すように、４つの群を比較する：Ｈｅｐ３Ｂ細胞のみを含む対照（レーン１）、Ｈｅｐ３Ｂ細胞＋ｓｈＰＡＨ−１を発現するレンチウイルスベクターを含む群（レーン２）、ｈＡＡＴ−ｈＰＡＨ−３’ＵＴＲ２８９のみを含む対照（レーン３）、およびｈＡＡＴ−ｈＰＡＨ−３’ＵＴＲ２８９およびｓｈＰＡＨ−１を発現するレンチウイルスベクターの両方を含有する群。顕著なことに、Ｈｅｐ３Ｂ細胞は単独で、有意なレベルの内因性ＰＡＨを発現する。この実施例は、ｓｈＰＡＨ−１は内因性ＰＡＨの発現およびｈＡＡＴ−ｈＰＡＨ−３’ＵＴＲ２８９の発現の両方を抑制することを説明する。さらに、これは、Ｈｅｐ３Ｂ細胞における内因性およびｈＡＡＴ−ｈＰＡＨ−３’ＵＴＲ２８９に対するｓｈＰＡＨ−１の有意な効力を裏付ける。
【０１６７】
（実施例１２）
ｓｈＰＡＨ−２はＨｅｐＧ２細胞において内因性ｈＰＡＨを抑制するがｈＡＡＴ−ｈＰＡＨ−３’ＵＴＲ２８９を抑制しない
この実施例は、図１３に示すように、ｓｈＰＡＨ−２はＨｅｐＧ２細胞において内因性ＰＡＨの発現を抑制するが、ｈＡＡＴ−ｈＰＡＨ−３’ＵＴＲ２８９の発現を抑制しないことを説明する。
【０１６８】
ヒトＰＡＨを合成し、レンチウイルスベクターに挿入した。配列の挿入をＤＮＡシークエンシングによって検証した。次いで、ｈＰＡＨ配列を含有するレンチウイルスベクターを使用して、ヒトＨｅｐ３Ｂ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡから購入した）への形質導入を行った。細胞にレンチウイルス粒子を形質導入し、２〜４日後にＰＡＨの発現についてウエスタンブロットによってタンパク質を分析した。ヒトＰＡＨの相対発現を、抗ＰＡＨ抗体（Ａｂｃａｍ）およびローディングコントロールのベータアクチンを使用してイムノブロットによって検出した。全長および３’ＵＴＲ切断型の両方の構築物におけるｈＰＡＨの発現をｈＡＡＴプロモーターによって推進させた。レンチウイルスベクターは、様々な事例において、その３’ＵＴＲを有するヒトＰＡＨ遺伝子、切断型３’ＵＴＲを有するヒトＰＡＨ遺伝子、および／またはｓｈＰＡＨ−２を組み込んでいた。レンチウイルスベクター（ＬＶ）中のｓｈＲＮＡ配列の挿入を、ｓｈＰＡＨ−２の発現を調節するために使用したプロモーターに相補的なプライマーを使用してＤＮＡシークエンシングによって検証した。ｓｈＰＡＨ−２の標的配列は、ｈＰＡＨ  ３’ＵＴＲの遠位部分にあり、これは全長ｈＰＡＨ構築物中に存在するが、切断型ｈＰＡＨ構築物（ｈＡＡＴ−ｈＰＡＨ−３’ＵＴＲ２８９）中には存在しない。
【０１６９】
図１３は、ヒトＨｅｐ３Ｂ細胞におけるｈＰＡＨおよびＰＡＨ  ｓｈＲＮＡの発現を示す。図１３に示すように、４つの群を比較する：ＨｅｐＧ２細胞のみを有する対照（レーン１）、ＨｅｐＧ２細胞＋ｓｈＰＡＨ−２を発現するレンチウイルスベクター（レーン２）、切断型ｈＰＡＨ  ３’ＵＴＲを発現するレンチウイルスベクターを有する対照（レーン３）、ならびに切断型ｈＰＡＨ  ３’ＵＴＲ（ｈＰＡＨ−３’ＵＴＲ）を発現するレンチウイルスベクターおよびｓｈＰＡＨ−２を発現するレンチウイルスベクターの両方を含有するレーン。この実施例は、ｓｈＰＡＨ−２配列は内因性ＰＡＨの発現を抑制するが、ｈＡＡＴ−ｈＰＡＨ−３’ＵＴＲ２８９の発現に対して認識し得る効果を有しないことを説明する。
【０１７０】
（実施例１３）
Ｐａｈ（ｅｎｕ２）マウスにおけるｈＡＡＴ−ＰＡＨ−ＵＴＲの予備試験
図１４は、ＰＫＵに関する実験研究のための標準モデルであるＰａｈ（ｅｎｕ２）マウス（Shedlovsky,  McDonaldら、１９９３年、Fang,  Eisensmithら、１９９４年、Mochizuki、Mizukamiら、２００４年、Oh,  Parkら、２００４年）におけるｈＡＡＴ−ＰＡＨ−ＵＴＲの予備試験からの結果を要約する。パネルＡは、新生Ｐａｈ（ｅｎｕ２）マウスの肝臓に直接的に注射したレンチウイルスベクターｈＡＡＴ−ＰＡＨは、ＰＡＨを発現しない対照レンチウイルスベクターのみを与えたマウスにおいて見られる成長異常を実質的に矯正することを示す。パネルＢは、パネルＡにおけるデータのクラスタープロット表示を提供し、これは、正常マウスとＬＶ−ｈＡＡＴ−ＰＡＨを用いて処置したＰａｈ（ｅｎｕ２）との間での体重増加曲線の明確な重なりを示す。パネルＣは、ＬＶ−ｈＡＡＴ−ＰＡＨは雌マウスにおいて効果的であったことを示す。雌におけるＰＡＨの欠陥は雄マウスと比較して矯正がより困難であるため、これは重要である。パネルＤは、対照（正常）マウス、ＬＶ−ｈＡＡＴ−ＰＡＨを用いて処置したＰａｈ（ｅｎｕ２）マウスおよびＰＡＨを発現しない対照レンチウイルスベクターを用いて処置したＰａｈ（ｅｎｕ２）マウスについての血漿フェニルアラニンレベルをプロットしたものである。
【０１７１】
実験の方法論：
１〜２日齢の新生マウスを各４匹の新生マウスの３つの群に分けた。新生マウスの第１の群は、正常なＰＡＨ発現活性を有する対照群を含む。新生マウスの第２および第３の群は、変異ＰＡＨ（ｅｎｕ２）を含有し、これは、ＰＡＨの酵素活性を阻害するＰＡＨ遺伝子における化学的に誘導された変異である。
【０１７２】
新生マウスの第１の群に、ｈＡＡＴプロモーター、ヒトＰＡＨ、伸長因子（ＥＦ１）、および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含むレンチウイルスベクターを注射した。新生マウスの第２の群に、ヒトＰＡＨを欠くが、ｈＡＡＴプロモーター、伸長因子（ＥＦ１）、および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含むレンチウイルスベクターを注射した。新生マウスの第３の群に、ｈＡＡＴプロモーター、ヒトＰＡＨ、伸長因子（ＥＦ１）、および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含むレンチウイルスベクターを注射した。
【０１７３】
通常の生理食塩水または血漿代替物１ｍＬ当たり１×１０６〜１×１０１０個の形質導入単位を含有する１０μＬのレンチウイルス粒子懸濁液を新生マウスの肝臓に直接的に注射した。注射の前に、新生マウスをクロドロネートリポソームを用いて処置して、肝臓クッパー細胞を枯渇させた。
【０１７４】
毛色の変化などの血液中のフェニルアラニンレベルの低減と関連付けられる表現型の変化、ＰＡＨおよびフェニルアラニンレベル、ならびに挙動について新生マウスをモニターした。注射の０、４、および８週後に、血中フェニルアラニンレベルを測定した。注射の０、２、４、および８週後に、新生マウスの体重を測定した。群３における新生マウスの成長が群２における新生マウスの成長に対して向上した場合、Ｔ迷路自発的交替試験およびウィン−ステイ（Ｗｉｎ−Ｓｔａｙ）８アーム放射状迷路課題などの行動試験を行う。注射の８週後に、各群から２匹のマウスを屠殺し、肝臓におけるヒトＰＡＨの発現を測定する。メチローム評価ならびに長骨および脊髄骨評価を屠殺したマウスに対して行う。残りのマウスを維持し、血中フェニルアラニンを注射の６ヶ月後に測定する。
【０１７５】
（実施例１４）
Ｈｅｐａ１−６マウスヘパトーマ細胞におけるｈＡＡＴおよびＣＭＶプロモーターを使用したヒトＰＡＨ遺伝子のレンチウイルスで送達された発現
この実施例は、図１５に示すように、ＣＭＶ最初期プロモーターの制御下のｈＰＡＨ発現構築物の利用は、３’ＵＴＲの存在または非存在にかかわらず、３’ＵＴＲが切断されているか否かにかかわらず、高レベルの発現を提供することを説明する。
【０１７６】
ヒトＰＡＨを合成し、レンチウイルスベクターに挿入した。配列の挿入をＤＮＡシークエンシングによって検証した。次いで、ｈＰＡＨ配列を含有するレンチウイルスベクターを使用して、ヒトＨｅｐ３Ｂ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡから購入した）への形質導入を行った。細胞にレンチウイルス粒子を形質導入し、２〜４日後にＰＡＨの発現についてウエスタンブロットによってタンパク質を分析した。ヒトＰＡＨの相対発現を、抗ＰＡＨ抗体（Ａｂｃａｍ）またはローディングコントロールとしての抗チューブリン抗体（Ｓｉｇｍａ）を使用してイムノブロットによって検出した。全長および３’ＵＴＲ切断型の両方の構築物におけるｈＰＡＨの発現をそれぞれｈＡＡＴプロモーターまたはＣＭＶプロモーターによって推進させた。レンチウイルスベクターは、様々な事例において、ｈＡＡＴプロモーターまたはＣＭＶプロモーターの非存在下または存在下において、その３’ＵＴＲを有するヒトＰＡＨ遺伝子、切断型３’ＵＴＲを有するヒトＰＡＨ遺伝子を組み込んでいた。
【０１７７】
図１５に示すように、４つの群を比較する：Ｈｅｐａ１−６細胞およびｈＡＡＴプロモーターのみを有する対照（レーン１）、ｈＡＡＴプロモーターの制御下の全長３’ＵＴＲ  ｈＰＡＨを発現するレンチウイルスベクター（レーン２）、ｈＡＡＴプロモーターの制御下の切断型３’ＵＴＲ  ｈＰＡＨを発現するレンチウイルスベクター（レーン３）、およびＣＭＶプロモーターの制御下の切断型３’ＵＴＲ  ｈＰＡＨを発現するレンチウイルスベクターを有する群。この実施例は、ＣＭＶ最初期プロモーターの制御下のｈＰＡＨの発現は、ＵＴＲの存在または非存在にかかわらず、ＵＴＲが切断されているか否かにかかわらず、高レベルの発現を生じさせることを説明する。これは、ｈＰＡＨの高レベル産生を依然として達成しつつ肝臓組織における特異的な発現のための構築物の生成を可能とする。顕著なことに、導入遺伝子の発現の肝細胞への制限は、フェニルケトン尿症のための遺伝子医学におけるベクターの安全性および標的特異性のための重要な検討事項である。
【０１７８】
（実施例１５）
マウスＨｅｐａ１−６細胞におけるｈＡＡＴプロモーターおよび肝臓特異的エンハンサーエレメントＡｐｏＥ（１）、ＡｐｏＥ（２）、またはプロトロンビンを有する発現構築物を使用したｈＰＡＨのレンチウイルスで送達された発現
この実施例は、マウスＨｅｐａ１−６細胞におけるＰＡＨの発現を増加させるためにＡｐｏＥ（１）、ＡｐｏＥ（２）、およびプロトロンビンエンハンサーを利用し得ることを説明する。
【０１７９】
ヒトＰＡＨを合成し、レンチウイルスベクターに挿入した。配列の挿入をＤＮＡシークエンシングによって検証した。次いで、ｈＰＡＨ配列を含有するレンチウイルスベクターを使用して、ヒトＨｅｐ３Ｂ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡから購入した）への形質導入を行った。細胞にレンチウイルス粒子を形質導入し、２〜４日後にＰＡＨの発現についてウエスタンブロットによってタンパク質を分析した。抗ＰＡＨ抗体およびローディングコントロール用の抗ベータアクチン抗体を使用してイムノブロットによってＰＡＨを検出した。
【０１８０】
図１６に示すように、４つの群を比較する：Ｈｅｐａ１−６細胞のみを有する対照（レーン１）、ｈＡＡＴプロモーターの制御下の全長３’ＵＴＲ  ｈＰＡＨを有するＡｐｏＥ（１）エンハンサーを発現するレンチウイルスベクター（レーン２）、ｈＡＡＴプロモーターの制御下の全長３’ＵＴＲ  ｈＰＡＨを有するＡｐｏＥ（２）エンハンサーを発現するレンチウイルスベクター（レーン３）、およびｈＡＡＴプロモーターの制御下の全長３’ＵＴＲ  ｈＰＡＨを有するプロトロンビンエンハンサーを発現するレンチウイルスベクター（レーン３）。この実施例は、ｈＡＡＴプロモーターの制御下でマウスＨｅｐａ１−６細胞においてＰＡＨの発現を増加させるためにＡｐｏＥ（１）、ＡｐｏＥ（２）、およびプロトロンビンエンハンサーをそれぞれ利用し得ることを説明する。
【０１８１】
上記実施例の実施形態の開示は、例示的であることを意図し、以下の特許請求の範囲およびその均等物により示される本発明の範囲を限定するものではない。明確な理解を与える目的で一部の詳細において本発明の実施例の実施形態を記載したが、以下の特許請求の範囲内で、ある特定の変更および改良が行われ得ることは明らかであろう。以下の特許請求の範囲において、特許請求の範囲に明示的に記載されているか、または本開示により暗黙的に要求されない限り、要素および／またはステップは、いかなる特定の操作順序も暗示するものではない。
【０１８２】
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【表１−７】
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【表１−８】
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【表１−９】
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【表１−１０】
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【表１−１１】
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【表１−１２】
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【表１−１３】
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【表１−１４】
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【表１−１５】
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【表１−１６】
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【表１−１７】
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【表１−１８】
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【表１−１９】
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【表１−２０】
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【表１−２１】
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【表１−２２】
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【表１−２３】
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【表１−２４】
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【表１−２５】
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【表１−２６】
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【表１−２７】
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【表１−２８】
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【表１−２９】
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【表１−３０】
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【表１−３１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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