(57)【要約】  被験体においてＩＬ−６レベルを低減する方法であって、該方法は、それを必要とする被験体を同定することと、該被験体に、サイズが２マイクロメートルを超え、かつ６マイクロメートル未満の小細胞を含有する組成物を投与することとを含み、該小細胞は、（ｉ）多能性であるとともに、（ｉ）ＣＤ３４９（＋）、ＣＤ９（＋）、Ｏｃｔ４（＋）、Ｎａｎｏｇ（＋）、Ｌｇｒ５（＋）、ＣＤ６６ｅ（＋）、ＣＤ１３３（＋）、又はＣＤ３４（＋）である体性幹細胞を含む、方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体においてＩＬ−６レベルを低減する方法であって、該方法は、
それを必要とする被験体を同定することと、
該被験体に、サイズが２マイクロメートルを超え、かつ６マイクロメートル未満の小細胞を含有する組成物を投与することと、
を含み、
該小細胞は、（ｉ）多能性であるとともに、（ｉ）ＣＤ３４９（＋）、ＣＤ９（＋）、Ｏｃｔ４（＋）、Ｎａｎｏｇ（＋）、Ｌｇｒ５（＋）、ＣＤ６６ｅ（＋）、ＣＤ１３３（＋）、又はＣＤ３４（＋）である体性幹細胞を含む、方法。
【請求項２】
前記同定する工程が、対照レベルと比較した場合の前記被験体から得られた生体サンプル中のＩＬ−６レベルの増大の検出を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生体サンプルが血液サンプルである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記被験体が、ＩＬ−６レベルの増大に関連する病態、又はＩＬ−６アンタゴニストによって処置することができる病態を患う、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記被験体がＩ型糖尿病を患う、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記小細胞が血小板を更に含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記小細胞の７５％〜８５％が前記血小板であり、前記小細胞の２０％〜２５％が前記体性幹細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記組成物には、１０００万個〜５億個の前記体性幹細胞が含有されている、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記組成物が、
前記被験体又はドナー被験体から得られた血液サンプルと、二価カチオンキレート剤とを含有する混合物を準備することと、
該混合物を２℃〜１２℃の温度で３時間〜７２時間保存することにより、該混合物を、小細胞の集団を含有する上層と下層とに分離することと、
該上層を回収することにより、該組成物を調製することと、
を含むプロセスにより調製される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記二価カチオンキレート剤がＥＤＴＡである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記血液サンプル１ミリメートル当たり１．５ｍｇ〜２．０ｍｇの二価カチオンキレート剤を前記血液サンプルと混合して、前記混合物を得る、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記血液サンプルを得る前に、前記被験体又はドナー被験体に対して幹細胞数を増やす行動を実行する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記行動が、有効量のフコイダン又は顆粒球−コロニー刺激因子の投与である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記組成物を調製するプロセスが、前記上層を回収した後に、回収した上層に薬学的に許容可能な賦形剤を添加することを更に含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記組成物を調製するプロセスが、前記上層を回収した後に、該上層を遠心分離して細胞ペレットを得ることを更に含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記組成物を調製するプロセスが、前記ペレットを洗浄して、薬学的に許容可能な賦形剤中に懸濁することを更に含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記薬学的に許容可能な賦形剤が二価イオンを含まない、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記薬学的に許容可能な賦形剤が食塩溶液である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記組成物が静脈投与される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記投与する工程の後に、前記被験体から得られた生体サンプル中のＩＬ−６レベルを検出することを更に含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１６年１２月２３日付けで出願された米国仮特許出願第６２／４３８，６９９号に対する優先権を主張するものであり、その内容全体が引用することにより本明細書の一部をなす。
【背景技術】
【０００２】
インターロイキン６（ＩＬ−６）は、炎症及びＢ細胞の成熟に作用するインターロイキンである。このタンパク質は、主に急性炎症部位及び慢性炎症部位にて産生され、それらの部位にて分泌されることで、転写性の炎症反応を誘導する。ＩＬ−６は、糖尿病及び関節リウマチ等の多種多様な炎症性障害に関与する。
【０００３】
Ｉ型糖尿病は、膵臓が十分なインスリンを産生することができないことによって生じる。インスリン欠乏により血糖値が高くなる。Ｉ型糖尿病の原因については分かっていないが、一般的にはベータ細胞に対する自己免疫反応を起こす遺伝要因及び環境要因が関わっていると考えられている。生涯にわたるインスリン療法が生きていくのに必要とされている。
【発明の概要】
【０００４】
一態様では、被験体においてＩＬ−６レベルを低減する方法が本明細書に記載される。該方法は、それを必要とする被験体を同定することと、該被験体に、サイズが２マイクロメートルを超え、かつ６マイクロメートル未満の小細胞を含有する組成物を投与することとを含み、該小細胞は、（ｉ）多能性であるとともに、（ｉ）ＣＤ３４９（＋）、ＣＤ９（＋）、Ｏｃｔ４（＋）、Ｎａｎｏｇ（＋）、Ｌｇｒ５（＋）、ＣＤ６６ｅ（＋）、ＣＤ１３３（＋）、又はＣＤ３４（＋）である体性幹細胞を含む。
【０００５】
幾つかの実施の形態では、同定する工程が、対照レベルと比較した場合の被験体から得られた生体サンプル中のＩＬ−６レベルの増大の検出を含む。同定された被験体は、ＩＬ−６レベルの増大に関連する病態、又はＩＬ−６レベルの低減（例えば、ＩＬ−６アンタゴニストを用いる）によって処置することができる病態を患い得る。例えば、被験体はＩ型糖尿病を患い得る。
【０００６】
被験体に投与される組成物中の小細胞は、血小板を更に含んでいてもよい。例えば、小細胞の７５％〜８５％を血小板とすることができ、小細胞の２０％〜２５％を体性幹細胞とすることができる。幾つかの実施の形態では、組成物には、１０００万個〜５億個の体性幹細胞が含有されている。
【０００７】
幾つかの実施の形態では、組成物は、被験体又はドナー被験体から得られた血液サンプルと、二価カチオンキレート剤とを含有する混合物を準備することと、該混合物を２℃〜１２℃の温度で３時間〜７２時間保存することにより、該混合物を、小細胞の集団を含有する上層と下層とに分離することと、該上層を回収することにより、該組成物を調製することとを含むプロセスにより調製される。血液サンプル１ミリメートル（millimeter）当たり１．５ｍｇ〜２．０ｍｇの二価カチオンキレート剤を血液サンプルと混合して、混合物を得ることができる。二価カチオンキレート剤は、ＥＤＴＡであるのが好ましい。
【０００８】
任意に、組成物を調製するために血液サンプルを得る前に、被験体又はドナー被験体に対して幹細胞数を増やす行動（action）を実行する。この行動は、有効量のフコイダン又は顆粒球−コロニー刺激因子の投与とすることができる。
【０００９】
組成物を調製するプロセスは、上層を回収した後に、回収した上層に薬学的に許容可能な賦形剤を添加することを更に含み得る。代替的には、上記プロセスは、上層を回収した後に、上層を遠心分離して細胞ペレットを得ることを更に含み得る。このペレットを更に洗浄して、薬学的に許容可能な賦形剤中に懸濁させてもよい。薬学的に許容可能な賦形剤は、二価イオンを含まないものであり得る。幾つかの実施の形態では、薬学的に許容可能な賦形剤は食塩溶液である。
【００１０】
幾つかの実施の形態では、該方法は、投与する工程の後に、被験体から得られた生体サンプル中のＩＬ−６レベルを検出することを更に含む。
【００１１】
別の態様では、被験体においてＩＬ−６のレベルを低減する組成物が本明細書に記載される。組成物には、サイズが２マイクロメートルを超え、かつ６マイクロメートル未満の小細胞が含有されており、小細胞は、（ｉ）多能性であるとともに、（ｉ）ＣＤ３４９（＋）、ＣＤ９（＋）、Ｏｃｔ４（＋）、Ｎａｎｏｇ（＋）、Ｌｇｒ５（＋）、ＣＤ６６ｅ（＋）、ＣＤ１３３（＋）、又はＣＤ３４（＋）である体性幹細胞を含む。
【００１２】
１つ以上の実施形態の詳細を添付の図面及び下記明細書に記載する。本実施形態の他の特徴、目的、及び利点は、明細書及び図面及び特許請求の範囲から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ＳＢ細胞組成物で処置したＩ型糖尿病患者におけるＩＬ−６及びＨｂＡ１ｃのレベルを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
或る特定の小さな体性幹細胞（例えば、Ｌｇｒ５（＋）又はＣＤ３４９（＋）細胞）を含有する組成物は、被験体においてＩＬ−６レベルを低減することができることは予期せぬ発見であった。したがって、被験体においてＩＬ−６レベルを低減する、ＩＬ−６レベルの上昇に関連する病態を処置する、又はＩＬ−６アンタゴニストによって処置することができる病態を処置する方法及び組成物が本明細書に記載されている。
【００１５】
体性幹細胞
体性幹細胞には、全能性幹細胞、多能性幹細胞、複能性幹細胞、及び前駆幹細胞（単能性幹細胞とも呼ばれる）を含む様々な種類がある。卵割球様幹細胞（ＢＬＳＣ）は、全能性又は多能性の体性幹細胞である。極小胚様幹細胞（ＶＳＥＬ）は、多能性の体性幹細胞である。ＳＢ細胞は、多能性又は複能性の体性幹細胞である。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）及び造血系幹細胞（ＨＳＣ）は、複能性の体性幹細胞である。
【００１６】
細胞、例えば幹細胞のサイズ（Ｚ）は、本明細書で使用される場合、（１）細胞生物学分野又は幹細胞分野における細胞のサイズ若しくは代表長さの従来定義、（２）特に細胞が実質的に球体である場合、細胞の直径、（３）特に細胞が実質的に楕円体である場合、細胞の主軸の長さ、（４）細胞の形状が略正方形である場合、細胞の幅、（５）細胞の形状が略長方形である場合、細胞の長さ、又は（６）細胞の最大断面寸法若しくは横断寸法を指し得る。直径、長さ、幅、又は最大断面寸法若しくは横断寸法のいずれかであるサイズ（Ｚ）は、例えば、光学顕微鏡若しくは電子顕微鏡（例えば、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ））により得られた細胞の画像を用いて、又はフローサイトメーターにより得られた細胞のデータ（例えば、二次元のドットプロット、コンタープロット、又は密度プロット）を用いて決定又は測定することができる。光学顕微鏡又は電子顕微鏡により得られた細胞の画像は、細胞の二次元（２Ｄ）断面又は三次元（３Ｄ）構造であり得る。例としては、細胞のサイズ（Ｚ）は、光学顕微鏡又は電子顕微鏡（例えば、ＳＥＭ）により得られた２Ｄ断面画像において細胞の最大断面寸法又は横断寸法を測定することにより得ることができる。
【００１７】
「小細胞」（例えば、小さな体性幹細胞）という用語は、サイズが６マイクロメートル未満（例えば、２．０マイクロメートル〜６．０マイクロメートル）の細胞を指す。「大細胞」という用語は、サイズが６マイクロメートルを超える細胞を指す。
【００１８】
ＣＤ３４９（＋）ＳＢ細胞は、多能性又は複能性の体性幹細胞である。ＣＤ３４９（＋）ＳＢ細胞は、ＣＤ９（＋）、Ｏｃｔ４（＋）、及びＮａｎｏｇ（＋）、並びにＣＤ１３３（−）、ＣＤ９０（−）、ＣＤ３４（−）、及びＳｏｘ２（−）であってもよい。ＣＤ３４９（＋）ＳＢ細胞のそれぞれのサイズは、４マイクロメートル以下、５マイクロメートル以下、又は６マイクロメートル以下、例えば０．１マイクロメートル〜６．０マイクロメートル、０．５マイクロメートル〜６．０マイクロメートル、１．０マイクロメートル〜６．０マイクロメートル、２．０マイクロメートル〜６．０マイクロメートル、０．１マイクロメートル〜５．０マイクロメートル、０．５マイクロメートル〜５．０マイクロメートル、１．０マイクロメートル〜５．０マイクロメートル、０．１マイクロメートル〜４．０マイクロメートル、０．５マイクロメートル〜４．０マイクロメートル、又は１．０マイクロメートル〜４．０マイクロメートルである。サイズは、２マイクロメートルを超え、かつ６マイクロメートル未満であるのが好ましい。
【００１９】
Ｌｇｒ５（＋）ＳＢ細胞もまた、多能性又は複能性の体性幹細胞である。これらの細胞は、Ｏｃｔ４（＋）及びＮａｎｏｇ（＋）、並びにＣＤ１３３（−）、ＣＤ６６ｅ（−）、ＣＤ４（−）、ＣＤ８（−）、ＣＤ９（−）、ＣＤ１０（−）、ＣＤ１１（−）、ＣＤ１６（−）、ＣＤ１７（−）、ＣＤ１８（−）、ＣＤ１９（−）、ＣＤ２０（−）、ＣＤ２１（−）、ＣＤ３１（−）、ＣＤ４２（−）、ＣＤ６３（−）、ＣＤ３４（−）、Ｌｉｎ（−）、ＣＤ３８（−）、ＣＤ９０（−）、ＣＤ４５（−）、ＣＤ３４９（−）、及びＳｏｘ２（−）であってもよい。Ｌｇｒ５（＋）ＳＢ細胞のサイズは、４マイクロメートル以下、５マイクロメートル以下、又は６マイクロメートル以下、例えば０．１マイクロメートル〜６．０マイクロメートル、０．５マイクロメートル〜６．０マイクロメートル、１．０マイクロメートル〜６．０マイクロメートル、２．０マイクロメートル〜６．０マイクロメートル、０．１マイクロメートル〜５．０マイクロメートル、０．５マイクロメートル〜５．０マイクロメートル、１．０マイクロメートル〜５．０マイクロメートル、０．１マイクロメートル〜４．０マイクロメートル、０．５マイクロメートル〜４．０マイクロメートル、又は１．０マイクロメートル〜４．０マイクロメートルであり得る。Ｌｇｒ５（＋）ＳＢ細胞は、サイズが２マイクロメートルを超え、かつ６マイクロメートル未満であるのが好ましい。
【００２０】
卵割球様幹細胞（ＢＬＳＣ）は、ＣＤ６６ｅ（＋）の全能性又は多能性の体性幹細胞である。これらの細胞のサイズは、４マイクロメートル以下、５マイクロメートル以下、又は６マイクロメートル以下、例えば０．１マイクロメートル〜６．０マイクロメートル、０．５マイクロメートル〜６．０マイクロメートル、１．０マイクロメートル〜６．０マイクロメートル、２．０マイクロメートル〜６．０マイクロメートル、０．１マイクロメートル〜５．０マイクロメートル、０．５マイクロメートル〜５．０マイクロメートル、１．０マイクロメートル〜５．０マイクロメートル、０．１マイクロメートル〜４．０マイクロメートル、０．５マイクロメートル〜４．０マイクロメートル、又は１．０マイクロメートル〜４．０マイクロメートルであり得る。例えば、ＢＬＳＣのサイズは、２マイクロメートルを超え、かつ６マイクロメートル未満であり得る。
【００２１】
極小胚様幹細胞（ＶＳＥＬ）は、多能性の体性幹細胞であり、ＣＤ１３３（＋）又はＣＤ３４（＋）であってもよい。ＶＳＥＬは、ＣＤ４５（−）及びＬｉｎ（−）であってもよい。例えば、ＶＳＥＬは、ＣＤ１３３（＋）、ＣＤ４５（−）、及びＬｉｎ（−）、又はＣＤ３４（＋）、ＣＤ４５（−）、及びＬｉｎ（−）であってもよい。ＶＳＥＬのサイズは、４マイクロメートル以下、５マイクロメートル以下、又は６マイクロメートル以下、例えば０．１マイクロメートル〜６．０マイクロメートル、０．５マイクロメートル〜６．０マイクロメートル、１．０マイクロメートル〜６．０マイクロメートル、２．０マイクロメートル〜６．０マイクロメートル、０．１マイクロメートル〜５．０マイクロメートル、０．５マイクロメートル〜５．０マイクロメートル、１．０マイクロメートル〜５．０マイクロメートル、０．１マイクロメートル〜４．０マイクロメートル、０．５マイクロメートル〜４．０マイクロメートル、又は１．０マイクロメートル〜４．０マイクロメートルであり得る。ＶＳＥＬのサイズは、２マイクロメートルを超え、かつ６マイクロメートル未満であり得る。
【００２２】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、複能性の体性幹細胞である。ＭＳＣは、細胞表面マーカーＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、及びＣＤ１０５の１つ以上を発現することができる。ＭＳＣは、極めて不均一な集団を構成する。幾つかのタイプのＭＳＣは、４マイクロメートル以下、５マイクロメートル以下、又は６マイクロメートル以下、例えば０．１マイクロメートル〜６．０マイクロメートル、０．５マイクロメートル〜６．０マイクロメートル、１．０マイクロメートル〜６．０マイクロメートル、０．１マイクロメートル〜５．０マイクロメートル、０．５マイクロメートル〜５．０マイクロメートル、１．０マイクロメートル〜５．０マイクロメートル、０．１マイクロメートル〜４．０マイクロメートル、０．５マイクロメートル〜４．０マイクロメートル、又は１．０マイクロメートル〜４．０マイクロメートルのサイズであり得る。他のタイプのＭＳＣのサイズは、６マイクロメートル、７マイクロメートル、又は１０マイクロメートルを超えていてもよい。
【００２３】
造血系幹細胞（ＨＳＣ）は、複能性の体性幹細胞である。これらの細胞は、ＣＤ３４（＋）、ｃＫｉｔ（−）、ＣＤ３８（−）、Ｌｉｎ（−）の細胞、又はＣＤ１５０（＋）、ＣＤ２４４（−）、及びＣＤ４８（−）の細胞であってもよい。ＨＳＣは、４マイクロメートル以下、５マイクロメートル以下、又は６マイクロメートル以下、例えば０．１マイクロメートル〜６．０マイクロメートル、０．５マイクロメートル〜６．０マイクロメートル、１．０マイクロメートル〜６．０マイクロメートル、０．１マイクロメートル〜５．０マイクロメートル、０．５マイクロメートル〜５．０マイクロメートル、１．０マイクロメートル〜５．０マイクロメートル、０．１マイクロメートル〜４．０マイクロメートル、０．５マイクロメートル〜４．０マイクロメートル、又は１．０マイクロメートル〜４．０マイクロメートルのサイズであり得る。
【００２４】
幹細胞を増やす行動
行動（Ｘ）は、本明細書で使用される場合、ｉｎ  ｖｉｖｏ、例えば、ヒト被験体又は非ヒト被験体にて１種以上の幹細胞数を増やすのに有効であり得る行動である。行動（Ｘ）には、下記のものが含まれ得る。
１．合成薬物又は天然由来の化合物等の薬物の服用、
２．薬草又は漢方薬、例えばコルディセプス・シネンシス（Cordyceps sinensis：冬虫夏草）、チョウセンニンジン（ginseng）、リシウム・チャイニーズミル（Lycium Chinense Mill：枸杞子）、ガノデルマ・ルシダム（Ganoderma lucidum）（霊芝（lingzhi））、タイワノフンガス・カムホラツス（Taiwanofungus camphoratus：牛樟芝）、及び／又はブラジルキノコ（Brazil mushroom：アガリスク）の服用、
３．下記の材料又は成分：ビタミン（ビタミンＡ、Ｂ、Ｂコンプレックス、Ｂ12、Ｄ、Ｄ3、Ｅ等）、多量及び／又は微量ミネラル（例えば、カルシウム、ナトリウム、カリウム、フッ素、臭素、塩素、ヨウ素、ケイ素、セレン、ベリリウム、リチウム、コバルト、バナジウム、及び／又はニッケル）、多糖類、高分子量フコース含有糖タンパク質、海藻（緑藻類、藍藻類、褐藻類等を含む）、フコース、フコイダン（褐藻類の主成分）、オリゴフコイダン、藻類、フコイダンを含有する褐藻類（例えば、日本の沖縄に生育し、産生される褐藻類）、日本モズク（Japanese Mozuku）、緑藻類、藍藻類（又はラン藻類）、褐藻類（モズク、昆布、ワカメ属のもの（undaria）、サルガッスム・フシホルメ（sargassum fusiforme：ヒジキ）、ワカメ（pinnatifida）等を含む）、植物性化学物質（例えば、イソフラボン又はフィトエストロゲン）、リコペン、没食子酸エピガロカテキン（ＥＧＣＧ）、緑茶エキス、糖栄養素（例えば、キシロース、ガラクトース、グルコース、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、又はＮ−アセチルノイラミン酸）、魚油、香椿（China toona）（トーナ・シネンシス（toona sinensis））、及び／又は植物、葉、果物、野菜、魚、海藻、若しくは藻類から抽出された栄養素を含む栄養剤又は粉末等の栄養素又は栄養補助食品の摂取、
４．菜食の実施、
５．健康食品又は有機食品の摂取又は摂食、
６．代替（非伝統）薬の服用、
７．ゲルソン療法又はブレウス癌治療等の代替療法又は処置の実施、
８．鍼治療の実施、
９．足のマッサージ等のマッサージの実施、
１０．ウォーキング、ジョギング、ダンス、体操、ヨガ、エアロビクス運動、及び／又は太極拳（中国のシャドーエクササイズ（shadow exercise））等の運動、
１１．睡眠（睡眠の質を測定する目的）、
１２．瞑想、
１３．個人、医療従事者、又は医師により設計された健康改善プログラム又は疾患治療プログラムの実行、
１４．身体内の或る特定器官の健康改善のための或る特定の栄養素の摂取、例えば前立腺の健康改善のためのリコペンの摂取、
１５．損傷治癒、又は外科的処置により生じた傷の治癒、又は疾患の治療のためのリハビリテーションプログラムの実行、
１６．例えば、１種の漢方薬又は複数種の漢方薬を酒又はワインに、一定期間浸すことにより作製される医薬酒（medicinal liquor）（又は医薬ワイン（medicinal wine）、薬用酒（medicated liquor）、又は薬用ワイン（medicated wine）とも呼ばれる）、例えばチョウセンニンジンを高アルコール濃度の日本酒に１ヶ月間浸すことで作製されるチョウセンニンジンワインの摂取、
１７．特定疾患（例えば、或る種の癌、皮膚疾患、腎疾患等）の治療のための米国食品医薬品局（Ｕ．Ｓ．  ＦＤＡ）等の政府機関又は当局に認可された１種以上の薬物の服用、
１８．特定疾患（例えば、或る種の癌、皮膚疾患、又は腎疾患）の治療のための政府機関に認可された処置又は治療法の実施、
１９．平和のために祈りを捧げる又は神を崇拝する等の宗教活動の実践、
２０．日光又は太陽光（sunshine or sunlight）への直接又は間接的な曝露（例えば、日の出の１０分前から日の出の５０分後までの午前中（多大な量の赤外（ＩＲ）光が含有されている）、又は例えば、午前１１：３０から午後１２：３０までの正午前後（多大な量の紫外（ＵＶ）光が含有されている）、又は例えば、日没の５０分前から日没の１０分後までの午後中（多大な量の赤外（ＩＲ）光が含有されている））、
２１．全スペクトルの可視光、ＩＲ光、赤色光、緑色光、青色光、若しくはＵＶ光、又は上記の光の２種以上の組合せを含み得る、灯光又は発光ダイオード（ＬＥＤ）光への曝露、
２２．運動、又は身体の自然治癒を改善するためのプログラム、治療法、方法、装置及び／又はシステム、例えば自然治癒を改善するために損傷又は外科的処置後に行う方法又は治療法（例えば、高圧酸素療法）の実施、
２３．ブラックコーヒー等のコーヒーを飲むこと、
２４．緑茶、紅茶、又はジャスミン茶等の茶を飲むこと、
２５．赤ワインを飲むこと、
２６．メラトニンの摂取、
２７．モーツァルト又はベートーヴェンの交響曲等の音楽を聴くこと、
２８．フコイダン又はオリゴフコイダンを含有する物質（例えば、栄養素又はサプリメント）の注射、
２９．ホルモンサプリメントの摂取又はホルモン注射の実施、
３０．糖タンパク質である顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ又はＧＣＳＦ）の注射、
３１．一連のＧＣＳＦ注射の実施、並びに、
３２．（１）各種アミノ酸（例えば、アルギニン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、バリン、プロリン、グリシン、セレノシステイン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、チロシン、又はトリプトファン）、（２）バランスの取れたアミノ酸類（balanced amino acids）、又は（３）人体に必須の９種のアミノ酸（すなわち、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、及びバリン）を含有する、栄養素、栄養品、栄養流体（nutrient fluid）、栄養ドリンク、栄養液（nutrient liquid）、又は栄養食品、例えば、（ａ）小豆、サヤインゲン、黒豆の発酵により産生又は抽出される製品、（ｂ）果物又は果物の組合せ、例えばテンサイ、リンゴ、グァバ、キウイ、ブドウ、パイナップル、レッドピタヤ（red pitaya）（ドラゴンフルーツ）、グリーンパパイヤ、トマト、及び／又はアボガド等の発酵により産生される液体、流体、又は飲料、（ｃ）例えば、１種の漢方薬又は複数種の漢方薬を酒又はワインに、一定期間浸すことにより作製される医薬酒（又は医薬ワイン、薬用酒、若しくは薬用ワインとも呼ばれる）、例えばチョウセンニンジンを高アルコール濃度の日本酒に１ヶ月間浸すことで作製されるチョウセンニンジンワインの摂取。
【００２５】
幹細胞含有組成物
幹細胞含有組成物（例えば、幹細胞含有溶液）は、以下に説明される例示的な方法を用いて調製することができる。
【００２６】
上述の行動（Ｘ）の１つであり得る行動（Ｘ）が、被験体に対して実施される。被験体は、例えば、ヒト（例えば、小児、未成年（teenager）、成人、又は高齢者）、又は非ヒト動物である。非ヒト動物の例としては、霊長類（例えば、サル又はゴリラ）、イヌ、齧歯類（例えば、マウス又はモルモット）、ネコ、ウマ、雌ウシ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、鳥類、及びゾウが挙げられる。
【００２７】
例えば、被験体は、フコイダン含有化合物等の幹細胞動員剤を摂取することができる。フコイダン含有化合物は、褐藻類サプリメントとすることができる。褐藻類サプリメント剤には、８０％のモズク粉末と、１５％の結晶性セルロースと、３％のスクロース脂肪酸エステルと、２％の微小又は微細なシリカ（二酸化ケイ素を含有する）とが含有されている。モズク粉末は、日本の沖縄近海に生育する褐藻類であるモズク（海藻の一種）から抽出することができる。次いで、モズク粉末を、結晶性セルロース、スクロース脂肪酸エステル、及び微小又は微細なシリカ（二酸化ケイ素を含有する）と混合して、０．１グラムのフコイダンを含有する褐藻類サプリメント剤を形成する。被験体は、２０錠以上（例えば、少なくとも３０錠）の褐藻類サプリメント又は２グラム以上（例えば、少なくとも３グラム）のフコイダンを摂取することができる。別の例では、被験体に、顆粒球−コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、すなわち動員剤を注射しても、又は一連のＧＣＳＦ注射を実施してもよい。
【００２８】
行動（Ｘ）が行われた後、被験体は、一定期間（例えば、所定の期間）、例えば１５分〜６０分、２０分〜１００分、３０分〜４時間、６０分〜９０分、０．５時間〜３時間、１時間〜６時間、１時間〜１２時間、１２時間〜３６時間、又は３６時間〜５０時間、待機する。行動（Ｘ）を行うこと及び一定期間待機することで、１つ以上の特定種の体性幹細胞、例えばＳＢ細胞（すなわち、ＣＤ３４９（＋）及びＬｇｒ５（＋）ＳＢ細胞）を、例えば、被験体の骨髄から被験体の末梢血へと動員させることができる。このようにして、被験体の末梢血が、１つ以上の特定種の体性幹細胞で富化されることになる。１つ以上の特定種の体性幹細胞は、例えば、１種以上の上記の体性幹細胞であっても、又はそれらを含んでいてもよい。例えば、１つ以上の特定種の体性幹細胞は、サイズが６マイクロメートル未満であり、より好ましくはサイズが２マイクロメートルを超える体性幹細胞、例えばＣＤ３４９（＋）体性幹細胞及び／又はＬｇｒ５（＋）体性幹細胞であっても、又はそれらを含んでいてもよい。
【００２９】
行動（Ｘ）を行うこと及び一定期間待機することは、任意の工程である。換言すると、幹細胞含有組成物を作製するために、初めに被験体に対して行動（Ｘ）を一切実行せずに、被験体から血液サンプルを得ることができる。
【００３０】
上記待機の工程の直後（行動（Ｘ）及び待機の工程を行う場合）に、被験体の末梢血から血液サンプルを取得し、二価カチオンキレート剤の入った１つ以上の容器（例えば、バッグ、１つ以上のシリンジ、又は１つ以上のチューブ）に入れる。血液サンプルを容器内にて二価カチオンキレート剤と混合して、混合物を形成する。二価カチオンキレート剤、例えば抗凝血剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、例えばＫ２  ＥＤＴＡ抗凝血剤又はＫ３  ＥＤＴＡ抗凝血剤とすることができ、その重量は、例えば７０ｍｇを超える、例えば９０ｍｇ〜９００ｍｇ、１２０ｍｇ〜４５０ｍｇ、又は１５０ｍｇ〜４００ｍｇである。代替的には、二価カチオンキレート剤は、クエン酸塩とすることができ、その重量は、例えば７０ｍｇを超える、例えば９０ｍｇ〜９００ｍｇ、１２０ｍｇ〜４５０ｍｇ、又は１５０ｍｇ〜４００ｍｇである。血液サンプルには、サイズが６マイクロメートル未満の小細胞と、サイズが６マイクロメートルを超える大細胞とを含む複数種の細胞が含有されている。小細胞は、例えば、血小板と、サイズが６マイクロメートル未満の小さな体性幹細胞とを含有する。例えば、小さな体性幹細胞は、１つ以上の特定種の体性幹細胞（すなわち、例えばＳＢ細胞）と、ＢＬＳＣ（すなわち、ＣＤ６６ｅ（＋）体性幹細胞）と、ＶＳＥＬ（例えば、ＣＤ１３３（＋）体性幹細胞及びＣＤ３４（＋）体性幹細胞）とを含有する。大細胞は、例えば、サイズが６マイクロメートルを超える大きな体性幹細胞と、赤血球及び白血球等の系統細胞とを含有する。血液サンプル量は、４５ミリリットル以上、例えば６０ミリリットル〜５００ミリリットル、８０ミリリットル〜２５０ミリリットル、又は１００ミリリットル〜２００ミリリットルとすることができる。一例では、血液サンプルを、血液サンプル１ミリリットル当たり１．５ｍｇ以上、例えば１．６ｍｇ〜２．０ｍｇの二価カチオンキレート剤（例えば、Ｋ２  ＥＤＴＡ、Ｋ３  ＥＤＴＡ、又はクエン酸塩）と混合して、容器内にて混合物を形成することができる。
【００３１】
次に、混合物を処理して、幹細胞含有溶液を形成する。この処理には、幹細胞の活性化工程及び精製／単離工程が含まれ得る。「精製」又は「単離」という用語は、本明細書で使用される場合、大細胞（例えば、サイズが６マイクロメートルを超える細胞）からの小細胞（例えば、サイズが２マイクロメートルを超え、かつ６マイクロメートル未満の細胞）の実質的な分離を意味する。
【００３２】
混合物を、好適な設備（例えば、冷蔵庫又は物体を低温に維持するのに用いられる装置）にて摂氏２度（℃）〜１２℃、より好ましくは２℃〜７℃、又は４℃の温度で所定の期間、保存してもよい。所定の期間は、３時間〜７２時間、より好ましくは３時間〜６時間、６時間〜７２時間、６時間〜４８時間、１６時間〜７２時間、１６時間〜４８時間、３６時間〜６０時間、４８時間〜７２時間、又はおよそ４８時間とすることができる。混合物を所定の期間、保存した後、混合物中の１つ以上の特定種の体性幹細胞（例えば、ＳＢ細胞）を、二価カチオンキレート剤（例えば、Ｋ２  ＥＤＴＡ、Ｋ３  ＥＤＴＡ、又はクエン酸塩）によって活性化することができる、すなわち、１つ以上の特定種の体性幹細胞の細胞周期をＧ０からＧ１へと活性化させる。活性化は、二価カチオンキレート剤が（おそらくは、Ｚｎ2+をキレート化することにより）ｐ５３の機能を抑えることで、１つ以上の特定種の体性幹細胞（例えば、ＳＢ細胞）を細胞周期のＧ０静止期からＧ１期にする能力と関連しているかもしれない。ｐ５３タンパク質は、正確に折り畳まれ、機能性タンパク質を形成するには、Ｚｎ2+を必要とすることから、二価カチオンキレート剤によるＺｎ2+のキレート化は、１つ以上の特定種の体性幹細胞（例えば、ＳＢ細胞）を活性化するのに重要な工程となり得る。二価カチオンキレート剤は、他の二価イオン（例えば、Ｃａ2+）をキレート化することができ、それにより１つ以上の特定種の体性幹細胞を活性化し、これらの体性幹細胞を増殖及び拡大させることが可能である。
【００３３】
混合物が保存される際に、混合物が、重力により上層及び下層を含む複数の別々の層へと分離する。上層、又は上清の量は、２０ミリリットル〜２５０ミリリットル、４０ミリリットル〜１２５ミリリットル、又は５０ミリリットル〜１００ミリリットルとすることができる。上層には、血小板と、血清と、１つ以上の特定種の小さな体性幹細胞（すなわち、例えばＳＢ細胞）と、ＢＬＳＣ（すなわち、ＣＤ６６ｅ（＋）体性幹細胞）と、ＶＳＥＬ（例えば、ＣＤ１３３（＋）体性幹細胞及びＣＤ３４（＋）体性幹細胞）とが含有されている。血液サンプルの系統細胞及び大きな体性幹細胞を含有する大細胞のほとんど、例えば血液サンプルの大細胞の９５％超、９８％超、又は９９％超が下層にある。上清量と血液サンプル量との比は、例えば、３分の１から２分の１の範囲とすることができる。
【００３４】
次に、実質的に上層を全て、液体容器、例えば、バッグ、シリンジ、又はガラス瓶に回収し、又は移し、幹細胞含有溶液又は幹細胞混合物を作製することができる。上層、例えば、幹細胞含有溶液には、血小板と小さな体性幹細胞とを含む小細胞が含有されている。幹細胞含有溶液中の小さな体性幹細胞数は、１０００万以上（例えば、３０００万以上、５０００万以上、１０００万〜５億、２５００万〜３億、又は３０００万〜５億）とすることができる。幹細胞含有溶液には、二価カチオンキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）及び／又は成長因子が含有されていてもよい。
【００３５】
加えて、幹細胞含有溶液には、大細胞（例えば、大きな体性幹細胞及び系統細胞）がほとんど含まれていないか、又は実質的に排除されている。例えば、大細胞は、幹細胞含有溶液中の総細胞数の５％未満（例えば、１％未満、０．５％未満、又は０．０１％未満）を占め得る。例えば、幹細胞含有溶液（例えば、回収した上層）中の赤血球の数は、１ミリリットル当たり１０5未満又は１０4未満であり得る。幹細胞含有溶液１ミリリットル当たりの赤血球の数は、１０3未満であるのが好ましい。幹細胞含有溶液１ミリリットル当たりの白血球の数は、１０4未満（例えば、１０3未満）であり得る。幹細胞含有溶液１ミリリットル当たりの白血球の数は、１０2未満であるのが好ましい。
【００３６】
幹細胞含有溶液中の全ての細胞の９５％超（例えば、９９％又は９９．９９％）が小細胞であり得る。小細胞には、血小板、Ｌｇｒ５（＋）細胞、ＣＤ３４９（＋）細胞、ＣＤ１３３（＋）細胞、ＣＤ３４（＋）細胞、及びＣＤ６６ｅ（＋）細胞が含まれ得る。血小板は、幹細胞含有溶液中の小細胞の７５％〜８５％を占め得る。全ての小細胞の４％超（例えば、５％超又は４．５％〜１０％）がＬｇｒ５＋体性幹細胞であり得る。ＣＤ３４９（＋）体性幹細胞は、幹細胞含有溶液中の全ての小細胞の４％超（例えば、５％超又は４．５％〜１０％）を占め得る。小細胞の２％未満（例えば、１％未満又は０．５％未満）がＣＤ１３３（＋）細胞とＣＤ３４（＋）細胞とを合わせたものであり得る。小細胞の６％未満（例えば、５％未満又は４．５％未満）がＣＤ６６ｅ（＋）細胞であり得る。
【００３７】
任意の特定の小細胞を、フローサイトメトリー又は他の従来技法（例えば、抗体結合ビーズ等の抗体ベースの技法）を用いて、回収した上層から更に単離する又は枯渇させることもできる。
【００３８】
回収した上層を幹細胞含有溶液としてそのまま使用する（例えば、被験体に投与する、又は保存する）か、又は更に処理することができる。例えば、上層を更に精製する（例えば、濾過する）か、又は１つ以上の更なる成分と混合することができる。例えば、４００ミリリットルを超える、例えば５００ミリリットル〜９００ミリリットル量の好適なＣａ2+不含細胞媒体又は溶液を回収した上層に添加し、幹細胞含有溶液を作製することができる。ＮａＣｌ含有溶液等の好適なＣａ2+不含媒体又は溶液は、Ｍｇ2+を含む任意の二価イオンを更に含んでいなくてもよい。ＮａＣｌ含有溶液は、例えば、生理食塩水（例えば、０．９０％（ｗ／ｖ）、約３００ｍＯｓｍ／Ｌ、又は９．０グラム／リットルのＮａＣｌ溶液）とすることができる。
【００３９】
幹細胞含有溶液を、凍結保存温度、例えば、−７０℃以下又は−８０℃以下（例えば、−７５℃〜−８５℃）で長期間（例えば、１週間超、１ヶ月超、又は１年超）保存することができる。使用の準備が整ったら、凍結した幹細胞含有溶液を速やかに解凍し、任意に上述の好適なＣａ2+不含媒体又は溶液（例えば、０．９％のＮａＣｌ）と混合することができる。
【００４０】
処置方法
上記の手順により作製された幹細胞含有組成物を用いて、被験体においてＩＬ−６レベルを低減することができる。例えば、幹細胞含有組成物を用いて、ＩＬ−６のレベルの上昇に関連する病態、又はＩＬ−６アンタゴニストにより、若しくはＩＬ−６レベルを低減することにより処置することができる病態を処置することができる。
【００４１】
ＩＬ−６レベルは、被験体から得られた任意の生体サンプル、例えば血液サンプル、骨髄サンプル、尿サンプル、又は固形組織サンプル中のＩＬ−６のタンパク質レベル、ｍＲＮＡレベル、ｃＤＮＡレベル、又は機能レベルを表し得る。上昇したＩＬ−６レベルは、健康な個体、又はＩＬ−６レベルの上昇に関連する病態のない個体に見られるレベル又はレベル範囲よりも高いレベルである。例えば、正常な血中ＩＬ−６レベルは、約４．７ｐｇ／ｍｌ以下であり得る。タンパク質レベル、ｍＲＮＡレベル、ｃＤＮＡレベル、及び機能レベルを測定する方法は、当該技術分野にて既知であり、例としては、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング、及びリアルタイムＰＣＲがある。
【００４２】
幹細胞含有組成物を被験体に投与する前に、被験体のＩＬ−６レベルが上昇しているか否かを判定することができる。代替的には又は付加的には、組成物を投与した後に、被験体におけるＩＬ−６レベルを測定し、処置の有効性をモニタリングするとともに、処置の決定（treatment decisions）を行うことができる。任意に、被験体における疾患パラメーター又は症状（例えば、ＨｂＡ１ｃ又はグルコースレベル）を投与の前及び／又は後に評価することができる。
【００４３】
ヒト及び他の哺乳動物のＩＬ−６配列は、当該技術分野にて知られており、例としては、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０００５９１（ヒト）、ＮＰ＿００１３０５０２４（ヒト）、ＮＰ＿０３６７２１（ラット）、及びＮＰ＿１１２４４５（マウス）がある。
【００４４】
本明細書に記載の幹細胞含有組成物は、それを必要とする被験体に、任意の投与経路、例えば静脈内、関節内、結膜、頭蓋内、腹腔内、胸膜内、筋肉内、髄腔内、又は皮下の投与経路を介して投与することができる。組成物には、１０００万個〜５億個の小さな体性幹細胞が含有され得る。自己又は同種異系の体性幹細胞を使用することができる。組成物は、処置期間（例えば、１ヶ月〜３６ヶ月又は２年〜１０年）にわたって、例えば１日〜１４日毎、２週〜４週毎、１ヶ月〜６ヶ月毎、若しくは２ヶ月〜１２ヶ月毎、又は必要な場合にいつでも被験体に投与することができる。
【００４５】
幹細胞含有組成物で処置することができる病態としては、Ｉ型糖尿病、関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症、及び鬱病が挙げられる。
【００４６】
「被験体」は、ヒト又は非ヒト動物を指す。「処置すること」又は「処置」は、障害、障害の症状、障害に続発する疾患状態、又は障害の素因の治療、軽減、緩和、改善（remedy）、発症遅延、又は回復を目的として、障害を患う被験体に化合物又は組成物を投与することを指す。「有効量」は、処置対象の被験体において医学的に望ましい結果をもたらすことができる化合物又は組成物の量を指す。処置方法は、単独で、又は他の薬物若しくは治療法に併せて行うことができる。
【００４７】
以下の特定の実施例は単なる例示と解釈されるべきであり、それ以外の開示を何ら限定するものではない。更に詳述しなくても、当業者であれば本明細書における説明に基づき、最大限に本開示を使用することができると思われる。
【実施例】
【００４８】
１００ｍｌ〜１５０ｍｌの末梢血サンプルをＩ型糖尿病に罹患した１名の患者から得た。血液サンプルの入ったＥＤＴＡコーティングチューブを、血液が２つの異なる層に分離するまで４℃で６時間〜４８時間保存した。ＳＢ細胞を含有した上層を回収し、静脈注射により自己由来のものとして患者自身に戻した（delivered autologously back into the patient）。患者には２回の処置を施した。
【００４９】
各処置の後に、患者におけるＩＬ−６レベル及びヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）レベルを測定した。図１に示されるように、どちらのレベルも各処置の後に低減した。２回目の処置の後、ＨｂＡ１ｃレベルが６.５％未満であったことは意義深い。図１を参照されたい。ＨｂＡ１ｃレベルが６．５％より高い人は糖尿病であるとみなされる。
【００５０】
他の実施形態
本明細書に開示の特徴は全て、任意に組み合わせて併用することができる。本明細書に開示のそれぞれの特徴は、同じ、同等又は同様の目的に役立つ代替の特徴に置き換えることができる。したがって、他に明記されない限り、開示のそれぞれの特徴は、一般的な一連の同等又は同様の特徴の一例に過ぎない。
【００５１】
上記の説明から、当業者であれば記載の実施形態の本質的な特徴を容易に解明することができ、その趣旨及び範囲を逸脱することなく、様々な用途及び条件に合うように実施形態の種々の変化及び変更を適用させることができる。したがって、他の実施形態も特許請求の範囲内である。
【図１】
2020512296.tif 000003
【国際調査報告】
2020512296.tif 000004
2020512296.tif 000005