(57)【要約】  本発明は、複数のアッセイウェルを有する透明な底部を有するマイクロタイタープレートと、複数のアッセイウェル内に液を同時に追加するためにマイクロタイタープレートの上に配置される分配システムと、マイクロタイタープレートの下にあり、透明な底部を通して同時に複数のアッセイウェルを照明するのに適した照明システムと、透明な底部を通して同時に複数のアッセイウェルまたはアッセイウェルすべてからの電磁放射を検出するのに適した検出システムとを備える、高時間分解能のハイスループットスクリーニングの高速動態蛍光測定のための方法およびシステムに関する。分配システムからの１アッセイウェルあたり０．５〜３００μｌの液の追加は０．５ｂａｒ〜２ｂａｒの範囲の圧力で５〜２００ｍｓで同時に複数のアッセイウェル内に行われる。透明な底部を通して同時に複数のアッセイウェルに行われる照明は、追加の開始の時点の前またはこの時点から照明システムを用いて行われる。同時に複数のアッセイウェルまたはアッセイウェルすべてからの電磁放射に行われる検出は、個々の測定点間の１〜１０００ｍｓの時間間隔で行われる。
2020503508.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高時間分解能のハイスループットスクリーニングの測定のための方法であって、
ａ．
ｉ．複数のアッセイウェルを有する透明な底部を有するマイクロタイタープレートと、
ｉｉ．複数のアッセイウェル内に液を同時に追加するために前記マイクロタイタープレートの上に配置される分配システムと、
ｉｉｉ．前記マイクロタイタープレートの下にあり、前記透明な底部を通して同時に前記複数のアッセイウェルを照明するのに適した照明システムと、
ｉｖ．前記透明な底部を通して同時に前記複数のアッセイウェルまたは前記アッセイウェルすべてからの電磁放射を検出するのに適した検出システムと
を用意するステップと、
ｂ．０．５ｂａｒ〜２ｂａｒの範囲の圧力で５〜２００ｍｓで前記分配システムから同時に前記複数のアッセイウェル内に１アッセイウェルあたり０．３〜３００μｌの液を追加するステップと、
ｃ．前記照明システムを用いて前記透明な底部を通して同時に前記複数のアッセイウェルを照明するステップであって、照明の開始が前記追加の開始の時点の前または前記時点からである、ステップと、
ｄ．個々の測定点間の１〜１０００ｍｓの時間間隔で同時に前記複数のアッセイウェルまたは前記アッセイウェルすべてからの前記電磁放射を検出するステップと
を備える方法。
【請求項２】
前記マイクロタイタープレートは３８４個または１５３６個のアッセイウェルを有することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記分配システムは２４個または４８個のアッセイウェル内に液を同時に追加するのに適していることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記分配システムによる前記液の前記追加は０．５から２ｂａｒの範囲の圧力、好ましくは０．５〜０．８５ｂａｒの圧力、特に好ましくは０．８ｂａｒの圧力で行われることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記分配システムからの１アッセイウェルあたり０．３〜３００μｌの液の前記追加は０．５ｂａｒ〜２ｂａｒの範囲の圧力で５〜２００ｍｓで同時に前記複数のアッセイウェル内に行われることを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記分配システムによる前記液の前記追加は前記マイクロタイタープレートの前記アッセイウェルの側壁に対して斜めまたは平行に行われることを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記照明は１２〜３６個のＬＥＤ光源を場合毎に有する１対のＬＥＤ照明モジュールによって行われ、前記ＬＥＤ照明モジュールは両側で前記マイクロタイタープレートの下に配置されて、２０〜８０度の範囲の角度で前記マイクロタイタープレートの前記底部を照明することを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記照明は感光性タンパク質の活性化および／または蛍光測定の励起のために波長の異なる複数のＬＥＤ照明モジュールによって行われることを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＬＥＤ光源は３４０〜８００ナノメートルの波長範囲で発光し、好ましくは減光フィルタを備えることを特徴とする、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記発光した光の前記検出は前記マイクロタイタープレートの前記底部に直角に行われ、前記検出システムは前記マイクロタイタープレートの下で中央に配置されることを特徴とする、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記発光した光の前記検出は様々な波長で同時に行われることを特徴とする、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
高時間分解能のハイスループットスクリーニングの高速動態測定のためのシステムであって、
ａ．複数のアッセイウェルを有する透明な底部を有するマイクロタイタープレートと、
ｂ．複数のアッセイウェル内に液を同時に追加するために前記マイクロタイタープレートの上に配置される分配システムと、
ｃ．前記マイクロタイタープレートの下にあり、前記透明な底部を通して同時に前記複数のアッセイウェルを照明するのに適した照明システムと、
ｄ．前記透明な底部を通して同時に前記複数のアッセイウェルまたは前記アッセイウェルすべてからの電磁放射を検出するのに適した検出システムと
を備えるシステム。
【請求項１３】
前記分配システムは、０．５ｂａｒ〜２ｂａｒの範囲の圧力で５〜２００ｍｓで同時に前記複数のアッセイウェル内に１アッセイウェルあたり０．３〜３００μｌの液に行われる前記追加に適していることを特徴とする、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１４】
前記検出システムは、個々の測定点間の１〜１０００ｍｓの時間間隔で同時に前記複数のアッセイウェルまたは前記アッセイウェルすべてからの前記電磁放射に行われる前記検出に適していることを特徴とする、請求項１２または１３に記載のシステム。
【請求項１５】
前記マイクロタイタープレートは３８４個または１５３６個のアッセイウェルを有することを特徴とする、請求項１２から１４のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１６】
前記分配システムは２４個または４８個または２×２４個または２×４８個のアッセイウェル内に液を同時に追加するのに適していることを特徴とする、請求項１２から１５のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１７】
前記分配システムは、前記分配システムによる前記液の前記追加が０．５から２ｂａｒの前記範囲の圧力、好ましくは０．５〜０．８５ｂａｒの圧力、特に好ましくは０．８ｂａｒの圧力で行われることを可能にするのに適した制御システムを備えることを特徴とする、請求項１２から１６のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１８】
前記分配システムは、前記分配システムからの１アッセイウェルあたり０．３〜３００μｌの液の前記追加が０．５ｂａｒ〜２ｂａｒの前記範囲の圧力で５〜２００ｍｓで同時に前記複数のアッセイウェル内に行われることを可能にするのに適した制御システムを備えることを特徴とする、請求項１３から１７のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１９】
前記照明システムは、両側で前記マイクロタイタープレートの下に配置されて、２０〜８０度の範囲の角度で前記マイクロタイタープレートの前記底部を照明する１２〜３６個の（ＵＶおよび／またはＶＩＳ）高出力ＬＥＤ光源を場合毎に有する１対のＬＥＤ照明モジュールを備えることを特徴とする、請求項１２から１８のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項２０】
前記照明システムは、波長の異なる複数のＬＥＤ照明モジュールを備えることを特徴とする、請求項１２から１８のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項２１】
前記高出力ＬＥＤ光源は３４０〜８００ナノメートルの波長範囲で発光し、好ましくは減光フィルタを備えることを特徴とする、請求項１２から２０のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項２２】
前記発光した光の前記検出は前記マイクロタイタープレートの前記底部に直角に行われ、前記検出システムは前記マイクロタイタープレートの下で中央に配置されることを特徴とする、請求項１２から２１のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項２３】
前記発光した光の前記検出は様々な波長で同時に行われることを特徴とする、請求項１２から２２のいずれか一項に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高時間分解能のハイスループットスクリーニングの測定のための方法およびシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
新規の原薬の識別および開発の目的は、リガンド結合、高分子立体構造変化または酵素反応などの生化学プロセスを調整する化合物を識別することである。小型化によって高速で費用効果が高く効果的な分析が確保されるので、莫大な数の化学構造を分析するのにハイスループットスクリーニング（ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）（ＨＴＳ）が通常利用されている。
【０００３】
その高い感度およびオートマタビリティのために、蛍光を基本とした分析はほぼ確実にＨＴＳに対する最も重要なアプローチである。酵素反応による蛍光の変化を追跡することに加えて、蛍光共鳴エネルギー移動（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）（ＦＲＥＴ）、生物発光共鳴エネルギー移動（ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）（ＢＲＥＴ）や蛍光偏光（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）（ＦＰ）によってタンパク質間相互作用またはリガンド結合を特定するのにラベル付与技術が利用される。
【０００４】
多くの生物学的プロセス、特に微小リガンドの結合の特性が、高速攪拌法（ｒａｐｉｄ  ｍｉｘｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ）を必要とする超高速動態によって示される。
【０００５】
しかし、アッセイウェルが３８４個または１５３６個あるプレートフォーマットを用いた装置は多くの場合に時間分解能に関して制限を受け、その結果、高速結合動態の特定はスループットが低い方法に制限される。マルチディスペンサを装備する装置のスクリーニングアプローチ（Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｊ．Ｅ．，＆Ｍａｈｅｒ，Ｍ．Ｐ．（２００２）Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｖｏｌｔａｇｅ／Ｉｏｎ  Ｐｒｏｂｅ  Ｒｅａｄｅｒ（ＶＩＰＲ  ＴＭ）：Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｉｏｎ  Ｃｈａｎｎｅｌ  ａｎｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｃｈａｎｎｅｌｓ  ８，２８３−２９５、Ｍｏｒｉ，Ｔ．，Ｉｔａｍｉ，Ｓ．，Ｙａｎａｇｉ，Ｔ．，Ｔａｔａｒａ，Ｙ．，Ｔａｋａｍｉｙａ，Ｍ．，＆Ｕｃｈｉｄａ，Ｔ．（２００９）Ｕｓｅ  ｏｆ  ａ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｌｙｌ  Ｉｓｏｍｅｒａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  １４，４１９−４２４、Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ，Ｋ．Ｓ．，＆Ｎｅａｇｌｅ，Ｂ．Ｄ．（１９９６）ＦＬＩＰＲ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ａｃｃｕｒａｔｅ，Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  １，７５−８０を参照）であっても、時間分解能を相当に改善してはいるが、多くの場合、数秒の時間範囲に制限される。
【０００６】
先行技術によって公知の高速攪拌法としては、連続フローデバイスまたはストップトフローデバイスがある。
【０００７】
連続フロー実験の場合、反応はミキサーの下流の経路の関数として平衡フロー状態で分析される。ミキサー設計を改善することで、不動作時間が１００μｓになり、さらに１００μｓ未満にもなる（Ｒｅｇｅｎｆｕｓｓ，Ｐ．，Ｃｌｅｇｇ，Ｒ．Ｍ．，Ｆｕｌｗｙｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．，Ｂａｒｒａｎｔｅｓ，Ｆ．Ｊ．，＆Ｊｏｖｉｎ，Ｔ．Ｍ．（１９８５）Ｍｉｘｉｎｇ  ｌｉｑｕｉｄｓ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｓｅｃｏｎｄｓ，Ｒｅｖ．Ｓｃｉ．Ｉｎｓｔｒｕｍ．５６，２９３−２９０、Ｓｈａｓｔｒｙ，Ｍ．Ｃ．Ｒ．，Ｌｕｃｋ，Ｓ．Ｄ．，＆Ｒｏｄｅｒ，Ｈ．（１９９８）Ａ  Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ−Ｆｌｏｗ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｍｉｘｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｔｏ  Ｍｏｎｉｔｏｒ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｍｉｃｒｏｓｅｃｏｎｄ  Ｔｉｍｅ  Ｓｃａｌｅ，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ７４，２７１４−２７２１、Ｒｏｄｅｒ，Ｈ．，Ｍａｋｉ，Ｋ．，Ｃｈｅｎｇ，Ｈ．，＆Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａ  Ｓｈａｓｔｒｙ，Ｍ．Ｃ．（２００４）Ｒａｐｉｄ  ｍｉｘｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｌｄｉｎｇ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３４，１５−２７）。しかし、効果的な攪拌を実現するには多量の流量と比較的大きい流路寸法とが必要であるが、これでは大量の材料を消費する。
【０００８】
市販のストップトフロー装置の場合、反応体が空気圧アクチュエータを用いて２つのシリンジを介して供給される。観察細胞を充填した後、ストッパシリンジがストッパブロックに当たると、流れが急に止まる。この装置では、数ミリ秒の不動作時間が常時生じる場合がある（Ｄｉｃｋｓｏｎ，Ｐ．Ｎ．，＆Ｍａｒｇｅｒｕｍ，Ｄ．Ｗ．（１９８６）Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ  ｆｉｒｓｔ−ｏｒｄｅｒ  ｒａｔｅ  ｃｏｎｓｔａｎｔｓ  ａｎｄ  ａｃｃｕｒａｔｅ  ｄｅａｄ−ｔｉｍｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｓｔｏｐｐｅｄ−ｆｌｏｗ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５８，３１５３−３１５８、Ｎａｋａｔａｎｉ，Ｈ．，＆Ｈｉｒｏｍｉ，Ｋ．（１９８０）Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｉｇｎａｌ  Ａｍｐｌｉｔｕｄｅ  ｉｎ  Ｓｔｏｐｐｅｄ−Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｇａｎｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ８７，１８０５−１８１０、Ｐｅｔｅｒｍａｎ，Ｂ．Ｆ．（１９７９）Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｅａｄ  ｔｉｍｅ  ｏｆ  ａ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｓｔｏｐｐｅｄ−ｆｌｏｗ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ９３，４４２−４４４．）。
【０００９】
連続フロー装置もストップトフロー装置も、１キュベットまたは１流路に制限されるスループットが低い方法である。しかし、新規の原薬の識別および開発において高速結合反応または酵素動態の特定が根源的な役割を果たすので、複数の反応抑制剤および濃度を分析する高速攪拌法が必要である。マイクロタイタープレートで高速動態を観察することを可能にするために、高時間分解能と大規模に並列化したシステムのスループットとを組み合わせた高速動態検出画像処理装置を基本とした新規の方法が開発された。これにより、新規の原薬の識別および開発に高速動態を効果的に適用することが初めて可能となっている。
【００１０】
独国特許出願公開第１０２００４０１６３６１号および国際公開第０３／１００３９８号には、マイクロタイタープレート上での蛍光測定向けの光学分析器が開示されている。マイクロタイタープレートは透明な底部を有する。マイクロタイタープレートの透明な底部に励起ビーム経路および評価ビーム経路が導かれる。マイクロタイタープレートの上には、マイクロタイタープレートのサンプル発光測定中に液を追加し、測定を連続的かつ同時に実行するためのディスペンサまたはピペッタが配置される。
【００１１】
独国特許出願公開第１０２００４０１６３６１号および国際公開第０３／１００３９８号による発明の基本的なアイデアは、複数の個々のサンプルがマイクロタイタープレート上にあることでサンプルスループットが高い場合は、個々のサンプルの励起と発光の記録とが同時に行われ、随意に液の追加もこれらと同時に行われるべきであり、マイクロプレートのすべてのサンプルの発光（蛍光またはルミネッセンス）を、理想的には録画器（たとえば増倍カメラ）を用いて、比較的長い時間にわたって終始検出することができるという考えに基づいている。
【００１２】
薬理的効果がある物質を追加した後の蛍光反応の動態を測定する必要がある場合が多い細胞生物学的分析については、すべてのウェルを同時に測定するので、分析器は、物質の追加前、追加中および追加後にサンプルの発光が測定されるという要件を満たす。蛍光励起とマイクロタイタープレートの発光の検出とが下から行われる場合、上から、物質および／または他の液を複数のウェル中で同時に行う場合であっても、任意の仕方で接触することなく追加したり、決められた時間に異なる量または濃度の異なる物質および／または他の液を接触することなく追加したりして連続的に観察することができる。特にＨＴＳ使用下では、ＣＣＤカメラを用いた当該並列測定にわたっていわゆる多重化効果を得ることができ、したがって、１ウェルあたりの測定時間が増加することが明らかであるにもかかわらず、高いサンプルスループットを実現することができる。
【００１３】
独国特許出願公開第１０２００４０１６３６１号および国際公開第０３／１００３９８号に記載の光学分析器を用いて高いサンプルスループットを実現することができるが、これは、微小リガンドの結合などのいくつかの生物学的プロセスにおける高速動態の解明に必要であるような１秒未満の時間分解能の強度測定向けには設計されてはいない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】独国特許出願公開第１０２００４０１６３６１号
【特許文献２】国際公開第０３／１００３９８号
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｊ．Ｅ．，＆Ｍａｈｅｒ，Ｍ．Ｐ．（２００２）Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｖｏｌｔａｇｅ／Ｉｏｎ  Ｐｒｏｂｅ  Ｒｅａｄｅｒ（ＶＩＰＲ  ＴＭ）：Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｉｏｎ  Ｃｈａｎｎｅｌ  ａｎｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｃｈａｎｎｅｌｓ  ８，２８３−２９５
【非特許文献２】Ｍｏｒｉ，Ｔ．，Ｉｔａｍｉ，Ｓ．，Ｙａｎａｇｉ，Ｔ．，Ｔａｔａｒａ，Ｙ．，Ｔａｋａｍｉｙａ，Ｍ．，＆Ｕｃｈｉｄａ，Ｔ．（２００９）Ｕｓｅ  ｏｆ  ａ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｌｙｌ  Ｉｓｏｍｅｒａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  １４，４１９−４２４
【非特許文献３】Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ，Ｋ．Ｓ．，＆Ｎｅａｇｌｅ，Ｂ．Ｄ．（１９９６）ＦＬＩＰＲ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ａｃｃｕｒａｔｅ，Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  １，７５−８０
【非特許文献４】Ｒｅｇｅｎｆｕｓｓ，Ｐ．，Ｃｌｅｇｇ，Ｒ．Ｍ．，Ｆｕｌｗｙｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．，Ｂａｒｒａｎｔｅｓ，Ｆ．Ｊ．，＆Ｊｏｖｉｎ，Ｔ．Ｍ．（１９８５）Ｍｉｘｉｎｇ  ｌｉｑｕｉｄｓ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｓｅｃｏｎｄｓ，Ｒｅｖ．Ｓｃｉ．Ｉｎｓｔｒｕｍ．５６，２９３−２９０
【非特許文献５】Ｓｈａｓｔｒｙ，Ｍ．Ｃ．Ｒ．，Ｌｕｃｋ，Ｓ．Ｄ．，＆Ｒｏｄｅｒ，Ｈ．（１９９８）Ａ  Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ−Ｆｌｏｗ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｍｉｘｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｔｏ  Ｍｏｎｉｔｏｒ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｍｉｃｒｏｓｅｃｏｎｄ  Ｔｉｍｅ  Ｓｃａｌｅ，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ７４，２７１４−２７２１
【非特許文献６】Ｒｏｄｅｒ，Ｈ．，Ｍａｋｉ，Ｋ．，Ｃｈｅｎｇ，Ｈ．，＆Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａ  Ｓｈａｓｔｒｙ，Ｍ．Ｃ．（２００４）Ｒａｐｉｄ  ｍｉｘｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｌｄｉｎｇ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３４，１５−２７
【非特許文献７】Ｄｉｃｋｓｏｎ，Ｐ．Ｎ．，＆Ｍａｒｇｅｒｕｍ，Ｄ．Ｗ．（１９８６）Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ  ｆｉｒｓｔ−ｏｒｄｅｒ  ｒａｔｅ  ｃｏｎｓｔａｎｔｓ  ａｎｄ  ａｃｃｕｒａｔｅ  ｄｅａｄ−ｔｉｍｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｓｔｏｐｐｅｄ−ｆｌｏｗ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５８，３１５３−３１５８
【非特許文献８】Ｎａｋａｔａｎｉ，Ｈ．，＆Ｈｉｒｏｍｉ，Ｋ．（１９８０）Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｉｇｎａｌ  Ａｍｐｌｉｔｕｄｅ  ｉｎ  Ｓｔｏｐｐｅｄ−Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｇａｎｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ８７，１８０５−１８１０
【非特許文献９】Ｐｅｔｅｒｍａｎ，Ｂ．Ｆ．（１９７９）Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｅａｄ  ｔｉｍｅ  ｏｆ  ａ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｓｔｏｐｐｅｄ−ｆｌｏｗ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ９３，４４２−４４４
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
特定された課題の解決手段は、高時間分解能のハイスループットスクリーニングの高速動態測定のための方法であって、
ａ．
ｉ．複数のアッセイウェルを有する透明な底部を有するマイクロタイタープレートと、
ｉｉ．複数のアッセイウェル内に液を同時に追加するためにマイクロタイタープレートの上に配置される分配デバイスを有する分配システムと、
ｉｉｉ．マイクロタイタープレートの下にあり、透明な底部を通して同時に複数のアッセイウェルを照明するのに適した照明システムと、
ｉｖ．透明な底部を通して同時に複数のアッセイウェルまたはアッセイウェルすべてからの電磁放射を検出するのに適した検出システムと
を用意するステップと、
ｂ．０．５ｂａｒ〜２ｂａｒの範囲の圧力で５〜２００ｍｓで分配デバイスから同時に複数のアッセイウェル内に１アッセイウェルあたり０．３〜３００μｌの液を追加するステップと、
ｃ．照明システムを用いて透明な底部を通して同時に複数のアッセイウェルを照明するステップであって、照明の開始が追加の開始の時点の前またはこの時点からである、ステップと、
ｄ．個々の測定点間の１〜１０００ｍｓの時間間隔で同時に複数のアッセイウェルまたはアッセイウェルすべてからの電磁放射を検出するステップと
を備える方法である。
【００１７】
本発明は、高時間分解能のハイスループットスクリーニングの高速動態測定のためのシステムであって、
複数のアッセイウェルを有する透明な底部を有するマイクロタイタープレートと、
複数のアッセイウェル内に液を同時に追加するためにマイクロタイタープレートの上に配置される分配デバイスを有する分配システムと、
マイクロタイタープレートの下にあり、透明な底部を通して同時に複数のアッセイウェルを照明するのに適した照明システムと、
透明な底部を通して同時に複数のアッセイウェルまたはアッセイウェルすべてからの電磁放射を検出するのに適した検出システムと
を備えるシステムも提供する。
【００１８】
好ましくはマイクロタイタープレートは３８４個または１５３６個のアッセイウェルを有する。
【００１９】
分配デバイス
分配デバイスは、少なくとも１つの圧力室を有するハウジングを備えており、ハウジングは、圧力室内に液を供給するための供給開口を有し、圧力室とハウジングの外側側面との間にある複数の通路を有しており、通路の各々には管が配置されており、管の第１の端は圧力室内まで突出し、管の第２の端は外側側面でハウジングから突出する。
【００２０】
好ましくは圧力室のある空間的寸法の大きさは、その他の２つの空間的寸法よりも大きい。圧力室の長手方向軸はこの大きい大きさの方向に延びる。さらに、圧力室の長手方向軸はハウジングの外側側面に平行に延びる。好ましい実施形態では、圧力室は円筒形または立方体形である。
【００２１】
通路は圧力室の壁の１つに配置され、圧力室の長手方向軸に平行に延びる。好ましくは、通路は互いに平行に配置される。少なくとも２つの通路が存在する。通路は、圧力室の長手方向軸に平行に１列以上で配置することができる。この点について、通路が１列あたり好ましくは１２個、特に好ましくは２４個または４８個ある。理想的には、１列あたりの通路の数は、分配デバイスによって分配が行われるマイクロタイタープレートの１列（長辺）中のウェルの数に対応する。
【００２２】
管は好ましくは金属またはプラスチック製の毛細管であり、毛細管、すなわち細管内では、液を用いて毛細管効果が起こる。管は０．１ｍｍ〜０．８ｍｍの範囲、好ましくは０．２ｍｍ〜０．６ｍｍの範囲の内径を有するべきである。外径は０．３５ｍｍ〜２ｍｍの範囲、好ましくは０．６ｍｍ〜１．１ｍｍの範囲にあることが可能である。管の長さは６ｍｍ〜１５ｍｍの範囲、好ましくは８．５ｍｍ〜１３ｍｍの範囲、特に好ましくは１０ｍｍ〜１３ｍｍの範囲にある。
【００２３】
液を上から垂直にするようにマイクロタイタープレートのウェルに供給するのか、所定の角度でウェルの側壁上に供給すなわち注出するのかに応じて、管がハウジングの外側側面と直交（９０°）するか、４０°以上９０°未満の範囲でハウジングの外側側面に対して所定の角度に傾けられるかするように管を配置する。
【００２４】
ハウジングの外側側面上に配置される管の疎水性を増すために、好ましくはプラスチック、たとえばテフロン（登録商標）（Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標））で被覆することができる。
【００２５】
毛細管は一端で圧力室内まで突出し、他端でハウジングから突出する。
【００２６】
一実施形態では、液の供給開口は、分配室の長手方向軸に垂直に配置される壁の１つに配置される。ハウジングは、分配室に液を充填する際に空気を強制的に出す排出開口をさらに備えることができる。前記排出開口は、分配室の長手方向軸に垂直に配置される壁の１つに配置することができる。
【００２７】
圧力室が６０ｍｍ２〜３００ｍｍ２の範囲の断面積を有するか、４ｍｍ〜１０ｍｍの範囲、好ましくは５．５ｍｍ〜６．５ｍｍの範囲の直径を有するかすることが可能である。
【００２８】
分配デバイスのハウジングは１つを超える圧力室、たとえば２つ、３つまたは４つの圧力室を備えることもでき、圧力室の長手方向軸は互いに平行に延びる。各圧力室には、圧力室内に液を供給するための別々の供給開口が属し、各圧力室は圧力室とハウジングの外側側面との間に複数の通路を有して、対応する通路および管を有する。好ましくは、異なる圧力室の通路および管は互いに平行に配置される。必要な場合、１つ以上の圧力室を有する複数のハウジングを互いに隣接して互いに平行に配置することも可能である。
【００２９】
圧力室内に突出する短い管が組み込まれる圧力室の容積は大きいので、圧力勾配は存在せず、したがって、液を超高速で量を正確に供給することが可能である。たとえば３８４ウェルまたは１５３６ウェルマイクロタイタープレート内にμｌ範囲で並列かつ正確かつ高速に分配することが可能になる。
【００３０】
分配システムは、ラインを介して分配デバイスの供給開口に接続される液溜め部を分配デバイス用にさらに備える。液溜め部への圧力によって、液溜め部から圧力室内への液のポンプ圧送が引き起こされる。これを実現するために、液溜め部を気密的に周囲大気から隔離して、必要な圧力を確立するポンプに接続する。複数圧力室の場合、各圧力室の供給開口を液の同じ溜め部または液の異なる溜め部に接続することができる。
【００３１】
ポンプの圧力とともに、液溜め部と供給開口との間のバルブの切り替え時間を通じて、各切り替えサイクル（通路開／閉）で圧力室に流入して、個々の管を介して流出する液の量を制御することが可能である。
【００３２】
本発明の一実施形態では、液溜め部からの液は０．５〜２ｂａｒの範囲の圧力、好ましくは０．５〜０．８５ｂａｒの範囲の圧力でバルブに向かって加圧され、バルブの切り替え時間は５ｍｓ〜２００ｍｓの範囲（ウェルが１５３６個あるマイクロタイタープレートの場合５〜６０ｍｓ、ウェルが３８４個あるマイクロタイタープレートの場合４０〜２００ｍｓ）、好ましくは５ｍｓ〜５０ｍｓの範囲にある。
【００３３】
バルブの切り替え時間とポンプによる圧力とは、分配デバイスの供給量が１毛細管あたり０．３〜３００μｌの範囲、好ましくは１〜３０μｌの範囲にあるように調節される。
【００３４】
照明
照明システムは、両側でマイクロタイタープレートの下に配置されて、２０〜８０度の角度でマイクロタイタープレートの透明な底部を照明する少なくとも１対のＬＥＤ照明モジュールを備える。
【００３５】
本発明に係るＬＥＤ照明モジュールは、最大発光がトリガ信号の開始後１０マイクロ秒未満で達することと、パルスがトリガ信号の終了後２０マイクロ秒以下でおさまりきっていることとを特徴とする。これにより、高速動態測定が可能である。同時に、光学配置によってマイクロタイタープレートの均一な照明が可能である。
【００３６】
ＬＥＤ照明モジュールは１列以上で配置されたＬＥＤ光源を含む。これとは別に、ロッド形状の平凸シリンドリカルレンズを含んでもよい。ＬＥＤ光源の発光がシリンドリカルレンズの平面側に入射し、シリンドリカルレンズの凸面側から出射するようにシリンドリカルレンズの平面側がＬＥＤ光源上に配置される。
【００３７】
ＬＥＤ光源が１２〜３６個あることが可能である。
【００３８】
好ましくは、ＬＥＤ光源はＬＥＤ基板上に配置され、ＬＥＤ基板は熱伝導するようにヒートシンクに接続される。
【００３９】
ＬＥＤ光源とシリンドリカルレンズとの間に減光フィルタを配置することができ、減光フィルタとシリンドリカルレンズとの間に保護ガラスまたは偏光フィルタを配置することができる。
【００４０】
好ましい実施形態では、ＬＥＤ光源は可視光（ｖｉｓｉｂｌｅ）（ＶＩＳ）波長範囲またはＵＶ波長範囲、好ましくは３４０ｎｍ〜８００ｎｍの波長範囲の高出力ＬＥＤ光源である。
【００４１】
いくつかの用途には、１対を超えるＬＥＤ照明モジュールを用いることも可能であったり、複数のＬＥＤ照明モジュールを用いることが可能であったりする。異なるＬＥＤ照明モジュールが異なる波長を有する場合には、同時に複数の波長で蛍光励起を実現することが可能である。
【００４２】
２対のＬＥＤ照明モジュールの各々を両側でマイクロタイタープレートの下に配置することができ、マイクロタイタープレートの透明な底部を同じ角度または異なる角度で照明することができる。２対以上のＬＥＤ照明モジュールの各々を、マイクロタイタープレートからの距離を異ならせてマイクロタイタープレートの同じ側に配置することができ、照明角度を異ならせてマイクロタイタープレートの透明な底部を各対によって照明することができる。
【００４３】
好ましくは、１つの対の２つのＬＥＤ照明モジュールを両側でマイクロタイタープレートの下に配置し、さらに、１つまたは２つの別のＬＥＤ照明モジュールをマイクロタイタープレートの下でより中央に配置すると、その結果として、当該追加ＬＥＤ照明モジュールの発光は、マイクロタイタープレートの平面に対して１組のＬＥＤ照明モジュールの光よりも大きい角度でマイクロタイタープレートの透明な底部に照射される。
【００４４】
波長が異なるＬＥＤ照明モジュールの一用途として、光遺伝学の分野がある。光遺伝学は、遺伝子操作された細胞を感光性タンパク質を用いて光によって制御するものである。これを実現するために、前記タンパク質を活性化して、乗り越えて細胞プロセスに作用するのに、ある波長を用いる。さらに、前記プロセスを観察することが可能であるために、対応するセンサまたは色素の蛍光測定用の蛍光発光を励起するのに別の波長を利用する。
【００４５】
検出
発光の検出はマイクロタイタープレートの底部に直角に行われる。
【００４６】
検出システムをマイクロタイタープレートの下で中央に配置して直接発光を受けることができ、かつ／または発光を適切な偏向ミラーまたはダイクロイックビームスプリッタを介して検出システムに導く。
【００４７】
発光の検出を様々な波長で同時に行うことができる。
【００４８】
検出システムは、個々の測定点間の１〜１０００ｍｓの時間間隔で同時に複数のアッセイウェルまたはアッセイウェルすべてからの電磁放射に行われる検出に適している。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】斜視図で示す２つの分配室を有する２つの分配デバイスである。
【図２】内部構成を含む斜視図で示す２つの分配室を有する分配デバイスである。
【図３】側面図で示す分配デバイスである。
【図４】側面図で示す分配デバイスの拡大断面（バルブ側）である。
【図５】液溜め部を有する分配システムである。
【図６】斜視図で示すＬＥＤ照明モジュールである。
【図７】分解図で示すＬＥＤ照明モジュールである。
【図８】横断面図で示すＬＥＤ照明モジュールである。
【図９】縦断面図で示すＬＥＤ照明モジュールである。
【図１０】長さの異なるトリガ信号時のＬＥＤ発光である。
【図１１】画像処理測定装置（１チャンネル検出）である。
【図１２】画像処理測定装置（２チャンネル検出）である。
【図１３】アッセイウェルが１５３６個あるマイクロタイタープレートの発光プロファイルである。
【図１４Ａ】画像処理測定装置を用いたＢＳＡに対するＡＮＳの結合の動態の測定値である。
【図１４Ｂ】画像処理測定装置を用いたＢＳＡに対するＡＮＳの結合の動態の測定値である。
【図１４Ｃ】画像処理測定装置を用いたＢＳＡに対するＡＮＳの結合の動態の測定値である。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
図１は本発明に係る２つの並列配置型分配デバイス１０を示し、各々が２つの圧力室を有する様子を斜視図に示している。分配デバイスの別の図が図２〜図４に示されている。各分配デバイス１０は、４〜１０ｍｍ径で１２０〜１４０ｍｍ長の管をなす２つの孔を有する立方体形のハウジング２を有する。前記孔は２つの並列する圧力室５を生成する。各孔は、円形の供給開口６を形成する開放端を有する。反対側の端はシステムの充填および排出のために開放しており、分配動作の際に密封される。この箇所には、漏出開口すなわち排出開口３がある。供給開口６があるハウジング２の側部は、前記ハウジングが水平にマウント７から離れるように突出するようにマウント７に取り付けられる。マウント７は各供給開口６用の凹所を有する。外方に突出したハウジング２の下側には、各圧力室５とハウジング２の下側との間にある４８個以下の通路の列が配置されており、通路の各々には、好ましくはステンレス鋼製の毛細管４が配置されている。毛細管４の第１の端は圧力室５内まで突出しており、毛細管４の第２の端は下側でハウジング２から突出している。毛細管の内径は０．１〜０．８ｍｍであり、毛細管は垂直に配置される。ハウジング２の下側から突出している管の部分は疎水被覆されている（好ましくはテフロン（登録商標）（Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標））で被覆）。
【００５１】
図３は分配デバイス１０を側面図で示す。円形部分Ａが図４に拡大して示されている。図４では、毛細管４がその高さの半分以下だけ圧力室内に突出していることが分かる。このことが均一な分配に特に有効であることが分かっている。
【００５２】
図５は本発明に係る分配システムを示す。分配デバイス１０の圧力室５（ハウジング２内に示されていない）が、ライン７１、バルブ７２およびさらに別のライン７０を介して液溜め容器に入っている液に接続されている。膜ポンプ６６および圧力ライン６８を介して室内空気が０．８ｂａｒの圧力で加圧して液溜め容器に導入される。室内空気の代わりにＮ２などの別のガスを用いることも可能である。膜ポンプの代わりに別の圧力供給システムを用いることも可能である。たとえば、パーカー・ハネフィン・コーポレーション（米国オハイオ州クリーブランド４４１２４）によって販売されているような、無駄な空間容積が少なく、切り替え時間が短いソレノイドバルブが適切なバルブであることが分かっている。
【００５３】
図６〜図９はＬＥＤ照明モジュール６１０の様々な図を示す。図６はＬＥＤ照明モジュール６１０を斜視図で示す。ＬＥＤ照明モジュール６１０は、底部６１５および２つの側壁を有するハウジング６１２と、冷却空気流入開口付きフロントハウジングカバー６１３とを有する。底部６１５の反対側にあるハウジング６１２の開放側は、保護ガラスマウント６１７および保護ガラス６１６によって閉止される。偏光測定の場合、保護ガラス６１６を偏光フィルタと交換することができる。保護ガラス６１６および保護ガラスマウント６１７の上には、ロッド形状の平凸シリンドリカルレンズを、保護ガラス６１６または保護ガラスマウント６１７の方向に平面側がある状態で取り付けることが可能である。フロントハウジングカバー６１３の反対側で、ハウジングの開放した延伸側には、冷却空気吸入ファン位置がある。ファン位置６１４の上には電気接続部６１８が配置されている。
【００５４】
ハウジング６１２内にはヒートシンク６３２が配置され、ヒートシンク６３２上には、１番目に電気接続部６１８が取り付けられ、２番目にＬＥＤ基板６３０が取り付けられる。ＬＥＤ基板６３０は、ＬＥＤ６３１が１２個〜３６個ある１列または並列する２列、好ましくは、ＬＥＤ６３１が２４個ある１列からなることが可能である。ＬＥＤ６３１は図面の上方向に動作中に発光するように配置される。ＬＥＤ６３１の上には、フィルタマウント６２３中の励起フィルタ６２２が配置される。ハウジングは保護ガラス６１６および保護ガラスマウント６１７によって閉止される。ハウジング底部６１５上には、保持磁石６３６およびＲＦＩＤトランスポンダ６３４が配置される。これは側壁に取り付けることもできる。
【００５５】
以下で説明する測定にはフィリップスの型式ＬＵＸＥＯＮ（登録商標）ＲｅｂｅｌのＬＥＤ６３１を有するＬＥＤ照明モジュール６１０を利用した。同様の使用に適した他のＬＥＤ６３１は、たとえば、
・オスラム：Ｇｏｌｄｅｎ  ＤＲＡＧＯＮ（登録商標）Ｐｌｕｓ、ＯＳＬＯＮ  ＳＳＬ  ８０／１５０、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＤＲＡＧＯＮ（登録商標）
・ＣＲＥＥ：ＸＬａｍｐ（登録商標）ＸＰ−Ｃ、ＸＬａｍｐ  ＸＲ−Ｃ、Ｘｌａｍｐ７０９０ＸＲＥ
・日亜：ＮＣＵ１３３Ａ、ＮＣＳＵ０３４Ｂ、ＮＣＳＵ０３３Ｂ
である。
【００５６】
前記ＬＥＤの発光出力は波長に応じて１００〜２０００ｍＷである。
【００５７】
図１０のａ）〜ｄ）は、長さの異なるトリガ信号６６０についてのＬＥＤ発光の経時過程の測定を示す。長さの異なるトリガ信号６６０が場合毎に基板６３０のＬＥＤ６３１に接続部６１８を介して与えられる。トリガ信号６６０の長さに応じて、強度および長さの異なるＬＥＤ発光が実現される。ｘ軸６６６は５マイクロ秒単位の時間を示す。
【００５８】
図１０のａ）は長さが２マイクロ秒のトリガ信号６６０についてのＬＥＤ発光を示す。ＬＥＤ発光はトリガ信号６６０の開始後僅か５マイクロ秒の不動作時間後に開始され、最大発光出力の６０％に達する。
【００５９】
図１０のｂ）は長さが５マイクロ秒のトリガ信号６６０についてのＬＥＤ発光を示す。ＬＥＤ発光６６２はトリガ信号６６０の開始後僅か５マイクロ秒の不動作時間後に開始され、最大発光出力の７０％に達する。
【００６０】
図１０のｃ）は長さが８マイクロ秒のトリガ信号６６０についてのＬＥＤ発光を示す。ＬＥＤ発光はトリガ信号６６０の開始後僅か５マイクロ秒の不動作時間後に開始され、最大発光出力の１００％に達する。
【００６１】
図１０のｄ）は長さが１４マイクロ秒のトリガ信号６６０についてのＬＥＤ発光６６４を示す。ＬＥＤ発光はトリガ信号６６０の開始後僅か５マイクロ秒の不動作時間後に開始され、最大発光出力の１００％に達する。
【００６２】
トリガ信号６６０の開始とモジュールのＬＥＤ６３１の最大発光出力との間の時間遅延は約８マイクロ秒である。トリガ信号６６０の終了後１７マイクロ秒で、ＬＥＤ発光は完全におさまっていた。ＬＥＤ強度はパルス幅調整（ｐｕｌｓｅ−ｗｉｄｔｈ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）または電流制御を介して制御することができる。
【００６３】
以下、高時間分解能のハイスループットスクリーニングの高速動態測定のためのシステムの動作を説明するのに図１１および図１２を用いる。
【００６４】
反応体を含む液の分配は、マイクロタイタープレート配置トレイ６２上に位置する透明な底部を有するマイクロタイタープレート６０の上側から行う。分配は、下からの斜めの照明、および下からの適切なカメラを用いた検出と組み合わされる。マイクロタイタープレート６０のアッセイウェルが４８個ある列の蛍光プロファイルを同時に記録することによって反応の進行を追跡する。これに関して、分配期間および攪拌期間を含めて動態プロセスを観察することがこの配置を用いて可能であるように分配照明システムを設計し制御する。
【００６５】
分配は分配システムを用いて行われる。分配デバイス１０は前記分配システムの一部である。分析される反応体を含む液溜め容器６４内の液６５はバルブ７２を介して分配デバイスの圧力室５（図示されていない）にポンプ圧送される（図５）。毛細管４は〜８００μｍの開口（＝内径）を有し、これにより、マイクロタイタープレートの４８個のアッセイウェルへの並列分配が可能になる（図５）。強い乱流の攪拌状態を実現するために、管４の分配放出口の向きは、特に、アッセイウェルが３８４個あるマイクロタイタープレートと、アッセイウェルが１５３６個あるマイクロタイタープレートとに適している。マイクロタイタープレート壁上に斜めに反応体を分配することによって、アッセイウェルが３８４個あるマイクロタイタープレートについて最良の攪拌結果が得られた。これとは対照的に、図５に示されているように、アッセイウェルが１５３６個あるマイクロタイタープレート６０に必要な少量の分配量が垂直に分配される。用いられる任意の圧力に対して記憶される較正関数（線形関数または３次多項式関数）によってバルブの切り替え時間が定められ、したがって、分配される量が定められる。高精度のマイクロタイタープレートマウント６２により、マイクロタイタープレート６０のウェルに対する分配デバイス１０の最適かつ再現性の高い向きが確保された。
【００６６】
配列されプレートに対して斜めに向けられる１２〜３６個の（ＵＶまたはＶＩＳ）高出力ＬＥＤ光源６３１を有する１対のＬＥＤ照明モジュール６１０によって、マイクロタイタープレート６０の底部を均一に照明することが実現される（図１１、図１２および図７）。用いられるＬＥＤ６３１によって３４０〜８００ｎｍの波長範囲で励起光９２が供給され、減光フィルタを用いることで、選択波長範囲を透過させることによって波長選択性が改善される。発光した蛍光９４は高速高感度背面照射式ＥＭＣＣＤ（電子増倍電荷結合素子（ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｙｉｎｇ  ｃｈａｒｇｅ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｄｅｖｉｃｅ））またはＩＣＣＤ（インテンシファイア電荷結合素子（ｉｎｔｅｎｓｉｆｉｅｄ  ｃｈａｒｇｅ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｄｅｖｉｃｅ））カメラ８２によって９０°の角度で検出される。カメラ８２には干渉フィルタ８４が設けられており、偏光フィルタ８５をさらに設けることができる。
【００６７】
２つのカメラ８２およびビームスプリッタミラー９０を用いて蛍光を検出することで、たとえば、フェルスター共鳴エネルギー移動（Ｆｏｒｓｔｅｒ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）（ＦＲＥＴ）に関する測定時、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）に関する測定時または蛍光偏光（ＦＰ）に関する測定時に、必要に応じて２つの発光信号の同時検出が可能になる。
【００６８】
図示されているＬＥＤユニットの下に、照明角度を変えて配置される別のＬＥＤ照明ユニットによって、図１１および図１２に示されている測定システムを拡張することが可能である。これらの追加ＬＥＤユニットが元のＬＥＤユニットと比較して異なる波長を有する場合、複数の波長で蛍光励起を実現することが可能である。
【００６９】
蛍光体溶液（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）が入ったアッセイウェルが１５３６個あるマイクロタイタープレートの発光の疑似カラー表示が図１３に例として示されている。アッセイウェルのデータは、１アッセイウェルあたり毎秒１０００個以下の箇所を撮像して視覚化し、専用設計のデータ処理ソフトウェアを用いてデータを処理することによって収集する。
【００７０】
性能試験
高速攪拌デバイスの性能を試験するのに通常用いられている方法としては、高速の試験反応の観察がある。蛍光を検討する場合、追跡に適した対象は、蛍光収量の激増に関連する、疎水性色素１−アニリノ−８−ナフタレンスルホン酸（ＡＮＳ）のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）への結合である。様々なＢＳＡ濃度に対する蛍光動態を指数関数にフィッティングして、共通の開始蛍光に外挿する。この共通の点により、反応の開始時点（ｔ０）での、ＢＳＡが存在しないＡＮＳの蛍光が得られる。この点から、フィッティングされた指数曲線上に載る最初のデータ点までの時間間隔により、測定の不動作時間の推定値が得られる。図１４Ａ〜図１４Ｃは、高速動態向けの特許性のある分配デバイスを有する画像処理測定装置で測定された、様々なＢＳＡ濃度での補正蛍光動態を示す。
【００７１】
５５ｍｓ後、アッセイウェルが１５３６個あるＢＳＡ注入済みマイクロタイタープレートに毛細管バルブを９ｍｓで切り替えてＡＮＳ溶液を１．６μｌ追加した（図１４Ａ）。毛細管バルブの切り替えは灰色の筋で示されている。ＡＮＳがＢＳＡに結合すると、ＡＮＳ蛍光が増大する。これは３６５ｎｍ（バンドパス３６ｎｍ）での励起後の４６０ｎｍ（バンドパス６０ｎｍ）で記録されている。ＡＮＳ・ＢＳＡ溶液を１００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ  ７．５）の状態で調製した。最終濃度：５μＭ  ＡＮＳならびに１．９（白丸），２．５（黒丸），３．４（逆三角），７．９（四角）および１０．６μＭ（三角）ＢＳＡ（図１４Ａ）。
【００７２】
蛍光動態の二重指数フィッティングおよび共通の開始時刻ｔ０への外挿によって結合反応の開始時点を特定した。蛍光動態（図１４Ａから収集）を前記開始時刻ｔ０に対して補正した（図１４Ｂ）。実線は、共通の時点ｔ０に外挿された二重指数関数を示す。
【００７３】
反応のｔ０はバルブ切り替えの時点に相当するものではないが、代わりに、反応のｔ０はアッセイウェルにおける反応体の注入および攪拌に対応する時間遅延を有する点に留意するべきである。ｔ０から、フィッティングされた指数曲線上で補正して特定された最初の点までの期間によって得られる装置の不動作時間は、分配時間および攪拌による乱れに基づいている。マイクロタイタープレートのアッセイウェル内に液が３μｌ存在し、少量である１．６μｌを前記マイクロタイタープレートの１５３６個のアッセイウェル内に分配する場合、数ミリ秒の商用ストップトフロー装置の時間分解能にほぼ対応する約１０ｍｓの不動作時間を実現することが可能である。
【００７４】
検出された蛍光の軌跡（図１４Ｂ）はきわめて低いノイズレベルを示し、これは動態データの品質が高いことを示す。図１４Ｃは、動態軌跡から特定された結合の見かけ上の速度定数のグラフをＢＳＡ濃度の関数として示す。低速の結合段階（黒丸）と高速の結合段階（白丸）とを検出することができた。ＢＳＡ濃度に対して、動態が低速である結合段階が線形依存性を示すことで、特定された軌跡の正確さおよび信頼性が確認されている。観察された速度定数（黒）を、従来のストップトフローデバイスを用いて得られたデータ（赤）と比較した。低速の結合段階の濃度依存に基づいて特定された見かけ上の速度定数および２次速度定数が、個々のキュベットのストップトフローデバイスで追加を行うことで得られたデータと著しく一致する。
【符号の説明】
【００７５】
１０  分配デバイス
１  バルブ
２  ハウジング
３  漏出／排出開口
４  管
５  圧力室
６  供給開口
７  マウント
８  被覆
６０  マイクロタイタープレート
６２  プレートホルダ
６４  液溜め容器
６５  液
６６  ポンプ
６８  圧力ライン
７０  ライン
７１  ライン
７２  バルブ
８２  カメラ
８４  発光フィルタ
８５  偏光フィルタ
９０  ビームスプリッタ
９２  励起光
９４  蛍光
６１０  ＬＥＤ照明モジュール
６１２  ハウジング
６１３  冷却空気流入開口付きフロントハウジングカバー
６１４  冷却空気吸入ファン位置
６１５  ハウジング底部
６１６  保護ガラスまたは偏光フィルタ
６１７  保護ガラスマウント
６１８  電気接続部
６２０  シリンドリカルレンズ
６２２  励起フィルタ
６２３  フィルタマウント
６３０  ＬＥＤ基板
６３１  ＬＥＤ
６３２  ヒートシンク
６３４  ＲＦＩＤトランスポンダ
６３６  保持磁石
６６０  トリガ信号
６６２  図１０のｂ）中のＬＥＤ発光の電圧プロファイル
６６４  図１０のｄ）中のＬＥＤ発光の電圧プロファイル
６６６  図１０中の時間軸
Ａ  図８の断面軸
Ｂ  図９の断面軸
【図１】
2020503508.tif 000003
【図２】
2020503508.tif 000004
【図３】
2020503508.tif 000005
【図４】
2020503508.tif 000006
【図５】
2020503508.tif 000007
【図６】
2020503508.tif 000008
【図７】
2020503508.tif 000009
【図８】
2020503508.tif 000010
【図９】
2020503508.tif 000011
【図１０ａ）】
2020503508.tif 000012
【図１０ｂ）】
2020503508.tif 000013
【図１０ｃ）】
2020503508.tif 000014
【図１０ｄ）】
2020503508.tif 000015
【図１１】
2020503508.tif 000016
【図１２】
2020503508.tif 000017
【図１３】
2020503508.tif 000018
【図１４Ａ】
2020503508.tif 000019
【図１４Ｂ】
2020503508.tif 000020
【図１４Ｃ】
2020503508.tif 000021
【手続補正書】
【提出日】令和1年8月21日(2019.8.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高時間分解能のハイスループットスクリーニングの測定のための方法であって、
ａ．
ｉ．複数のアッセイウェルを有する透明な底部を有するマイクロタイタープレートと、
ｉｉ．複数のアッセイウェル内に液を同時に追加するために前記マイクロタイタープレートの上に配置される分配システムと、
ｉｉｉ．前記マイクロタイタープレートの下にあり、前記透明な底部を通して同時に前記複数のアッセイウェルを照明するのに適した照明システムと、
ｉｖ．前記透明な底部を通して同時に前記複数のアッセイウェルまたは前記アッセイウェルすべてからの電磁放射を検出するのに適した検出システムと
を用意するステップと、
ｂ．０．５ｂａｒ〜２ｂａｒの範囲の圧力で５〜２００ｍｓで前記分配システムから同時に前記複数のアッセイウェル内に１アッセイウェルあたり０．３〜３００μｌの液を追加するステップと、
ｃ．前記照明システムを用いて前記透明な底部を通して同時に前記複数のアッセイウェルを照明するステップであって、照明の開始が前記追加の開始の時点の前または前記時点からである、ステップと、
ｄ．個々の測定点間の１〜１０００ｍｓの時間間隔で同時に前記複数のアッセイウェルまたは前記アッセイウェルすべてからの前記電磁放射を検出するステップと
を備える方法。
【請求項２】
前記マイクロタイタープレートは３８４個または１５３６個のアッセイウェルを有することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記分配システムは２４個または４８個のアッセイウェル内に液を同時に追加するのに適していることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記分配システムによる前記液の前記追加は０．５から２ｂａｒの範囲の圧力、好ましくは０．５〜０．８５ｂａｒの圧力、特に好ましくは０．８ｂａｒの圧力で行われることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記分配システムからの１アッセイウェルあたり０．３〜３００μｌの液の前記追加は０．５ｂａｒ〜２ｂａｒの範囲の圧力で５〜２００ｍｓで同時に前記複数のアッセイウェル内に行われることを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記分配システムによる前記液の前記追加は前記マイクロタイタープレートの前記アッセイウェルの側壁に対して斜めまたは平行に行われることを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記照明は１２〜３６個のＬＥＤ光源を場合毎に有する１対のＬＥＤ照明モジュールによって行われ、前記ＬＥＤ照明モジュールは両側で前記マイクロタイタープレートの下に配置されて、２０〜８０度の範囲の角度で前記マイクロタイタープレートの前記底部を照明することを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記照明は感光性タンパク質の活性化および／または蛍光測定の励起のために波長の異なる複数のＬＥＤ照明モジュールによって行われることを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＬＥＤ光源は３４０〜８００ナノメートルの波長範囲で発光し、好ましくは減光フィルタを備えることを特徴とする、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記発光した光の前記検出は前記マイクロタイタープレートの前記底部に直角に行われ、前記検出システムは前記マイクロタイタープレートの下で中央に配置されることを特徴とする、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記発光した光の前記検出は様々な波長で同時に行われることを特徴とする、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
高時間分解能のハイスループットスクリーニングの高速動態測定のためのシステムであって、
ａ．複数のアッセイウェルを有する透明な底部を有するマイクロタイタープレートと、
ｂ．複数のアッセイウェル内に液を同時に追加するために前記マイクロタイタープレートの上に配置される分配システムと、
ｃ．前記マイクロタイタープレートの下にあり、前記透明な底部を通して同時に前記複数のアッセイウェルを照明するのに適した照明システムと、
ｄ．前記透明な底部を通して同時に前記複数のアッセイウェルまたは前記アッセイウェルすべてからの電磁放射を検出するのに適した検出システムと
を備えるシステムにおいて、
前記分配システムは、０．５ｂａｒ〜２ｂａｒの範囲の圧力で５〜２００ｍｓで同時に前記複数のアッセイウェル内に１アッセイウェルあたり０．３〜３００μｌの液に行われる前記追加に適し、
前記検出システムは、個々の測定点間の１〜１０００ｍｓの時間間隔で同時に前記複数のアッセイウェルまたは前記アッセイウェルすべてからの前記電磁放射に行われる前記検出に適している
ことを特徴とするシステム。
【請求項１３】
前記マイクロタイタープレートは３８４個または１５３６個のアッセイウェルを有することを特徴とする、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１４】
前記分配システムは２４個または４８個または２×２４個または２×４８個のアッセイウェル内に液を同時に追加するのに適していることを特徴とする、請求項１２または１３に記載のシステム。
【請求項１５】
前記分配システムは、前記分配システムによる前記液の前記追加が０．５から２ｂａｒの前記範囲の圧力、好ましくは０．５〜０．８５ｂａｒの圧力、特に好ましくは０．８ｂａｒの圧力で行われることを可能にするのに適した制御システムを備えることを特徴とする、請求項１２から１４のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１６】
前記分配システムは、前記分配システムからの１アッセイウェルあたり０．３〜３００μｌの液の前記追加が０．５ｂａｒ〜２ｂａｒの前記範囲の圧力で５〜２００ｍｓで同時に前記複数のアッセイウェル内に行われることを可能にするのに適した制御システムを備えることを特徴とする、請求項１２から１５のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１７】
前記照明システムは、両側で前記マイクロタイタープレートの下に配置されて、２０〜８０度の範囲の角度で前記マイクロタイタープレートの前記底部を照明する１２〜３６個の（ＵＶおよび／またはＶＩＳ）高出力ＬＥＤ光源を場合毎に有する１対のＬＥＤ照明モジュールを備えることを特徴とする、請求項１２から１６のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１８】
前記照明システムは、波長の異なる複数のＬＥＤ照明モジュールを備えることを特徴とする、請求項１２から１７のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１９】
前記高出力ＬＥＤ光源は３４０〜８００ナノメートルの波長範囲で発光し、好ましくは減光フィルタを備えることを特徴とする、請求項１２から１８のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項２０】
前記発光した光の前記検出は前記マイクロタイタープレートの前記底部に直角に行われ、前記検出システムは前記マイクロタイタープレートの下で中央に配置されることを特徴とする、請求項１２から１９のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項２１】
前記発光した光の前記検出は様々な波長で同時に行われることを特徴とする、請求項１２から２０のいずれか一項に記載のシステム。
【国際調査報告】
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