(57)【要約】本発明は、エクソソームの表面上で富化すると新しく同定されたタンパク質を使用して治療用エクソソームを調製する方法に関する。具体的には、本発明は、エクソソームのアフィニティー精製のために該タンパク質を使用する方法を提供する。該タンパク質を使用することにより、治療ペプチドをエクソソーム上に局在化させ、エクソソームを特定の器官、組織または細胞に標的化する方法に関する。該方法は、エクソソームタンパク質の１つまたは複数を高密度で、またはエクソソームタンパク質の変異体もしくは断片を含む表面操作エクソソームの生成を伴う。【選択図】図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
エクソソームを単離する方法であって、
前記エクソソームを含む試料を提供するステップ；
前記試料を、標的タンパク質に対する親和性を有する結合剤と接触させるステップ、ここで前記標的タンパク質は、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、ＡＴＰ輸送体またはその断片もしくは変異体を含む；ならびに
前記標的タンパク質及び前記結合剤間の結合に基づいて前記エクソソームを単離するステップを含む、前記方法。
【請求項２】
前記試料が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖した細胞から得られ、任意選択で前記細胞がＨＥＫ２９３細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試料が、対象の体液から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞が、前記標的タンパク質を発現するように遺伝子改変される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞が、前記標的タンパク質をコードする発現プラスミドを含む、請求項２または４に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞が、前記結合剤に対する親和性を有するタグを発現する外因性配列を含むように遺伝子改変され、前記外因性配列が前記細胞のゲノムへと挿入される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記外因性配列が、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２またはＡＴＰ輸送体をコードする内因性配列の３’または５’末端に位置するゲノム部位に挿入される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記外因性配列が、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２またはＡＴＰ輸送体をコードする内因性配列内に位置するゲノム部位に挿入される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記標的タンパク質が、前記タグ、及びＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ２、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、ＡＴＰ輸送体またはその断片もしくは変異体を含む融合タンパク質である、請求項７〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞が、ＡＤＡＭ１０の発現が低下するように遺伝子改変される、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記エクソソームが、前記標的タンパク質を含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記標的タンパク質が、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ３、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２及びＡＴＰ輸送体から選択される、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記標的タンパク質が、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ２、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２またはＡＴＰ輸送体の断片または変異体を含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記標的タンパク質が、配列番号３３のポリペプチドを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記標的タンパク質が、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ２、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、ＡＴＰ輸送体またはその断片もしくは変異体、及び親和性タグを含む融合タンパク質であり、前記親和性タグが、前記結合剤に対する親和性を有する、請求項１３〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記結合剤が、免疫グロブリン、タンパク質、ペプチド、または低分子を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記結合剤が、固体支持体に付着しており、任意選択で、前記固体支持体が、多孔質アガロースビーズ、マイクロタイタープレート、磁気ビーズ、または膜を含む、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記固体支持体が、クロマトグラフィーカラムを形成する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記試料を前記結合剤と接触させるステップが、前記試料を前記クロマトグラフィーカラムに接触させることにより行われる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記試料のサブセットを、異なる標的タンパク質に対する親和性を有する異なる結合剤と接触させるステップ；ならびに
前記異なる標的タンパク質及び前記異なる結合剤間の結合に基づいて前記エクソソームを単離するステップをさらに含む、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記異なる標的タンパク質が、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ２、ＡＴＰ輸送体またはその断片もしくは変異体を含む、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記異なる標的タンパク質が、ＰＴＧＦＲＮまたはその断片もしくは変異体を含む、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記異なる標的タンパク質が、配列番号３３のポリペプチドを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれかに記載の方法により産生される、エクソソーム。
【請求項２５】
請求項２４に記載のエクソソーム及び賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項２６】
前記医薬組成物が、前記試料よりも低い濃度のマクロ分子を含み、前記マクロ分子が、核酸、夾雑タンパク質、脂質、炭水化物、代謝産物、またはその組み合わせである、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
前記医薬組成物が、前記マクロ分子を実質的に含まない、請求項２６に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
標的タンパク質を含むエクソソームであって、前記標的タンパク質の少なくとも一部が外因性配列から発現され、前記標的タンパク質が、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＧＳＦ２、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、ＡＴＰ輸送体またはその断片もしくは変異体を含む、前記エクソソーム。
【請求項２９】
前記標的タンパク質が、前記エクソソームの表面上に、異なるエクソソームの異なる標的タンパク質よりも高い密度で存在し、前記異なる標的タンパク質が、従来のエクソソームタンパク質またはその変異体を含む、請求項２８に記載のエクソソーム。
【請求項３０】
前記従来のエクソソームタンパク質が、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＰＤＧＦＲ、ＧＰＩアンカータンパク質、ラクトアドヘリン、ＬＡＭＰ２、ＬＡＭＰ２Ｂ、及びその断片からなる群より選択される、請求項２９に記載のエクソソーム。
【請求項３１】
前記標的タンパク質が、配列番号３３のポリペプチドを含む、請求項２８〜３０のいずれかに記載のエクソソーム。
【請求項３２】
前記標的タンパク質及び結合剤間の結合に基づいて単離される、請求項２８〜３１のいずれかに記載のエクソソーム。
【請求項３３】
前記外因性配列を含むように遺伝子改変された細胞から産生され、任意選択で、前記細胞がＨＥＫ２９３細胞である、請求項２８〜３２のいずれかに記載のエクソソーム。
【請求項３４】
前記細胞が、ＡＤＡＭ１０の発現が低下するように遺伝子改変される、請求項３３に記載のエクソソーム。
【請求項３５】
前記細胞が、前記外因性配列を含むプラスミドを含む、請求項３３〜３４のいずれかに記載のエクソソーム。
【請求項３６】
前記細胞が、前記細胞のゲノムへと挿入された前記外因性配列を含む、請求項３３〜３５のいずれかに記載のエクソソーム。
【請求項３７】
前記外因性配列が、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ２、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２またはＡＴＰ輸送体をコードするゲノム配列の３’または５’末端に位置するゲノム部位へと挿入される、請求項３６に記載のエクソソーム。
【請求項３８】
前記外因性配列が、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ２、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２またはＡＴＰ輸送体をコードするゲノム配列へと挿入される、請求項３６に記載のエクソソーム。
【請求項３９】
前記標的タンパク質が、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ２、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、ＡＴＰ輸送体、またはその断片もしくは変異体、及び親和性タグを含む融合タンパク質であり、前記親和性タグが、前記結合剤に対する親和性を有する、請求項２８〜３８のいずれかに記載のエクソソーム。
【請求項４０】
前記標的タンパク質が、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ２、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、ＡＴＰ輸送体、またはその断片もしくは変異体、及び治療ペプチドを含む融合タンパク質である、請求項２８〜３８のいずれかに記載のエクソソーム。
【請求項４１】
前記治療ペプチドが、天然ペプチド、組み換えペプチド、合成ペプチド、または治療化合物へのリンカーからなる群より選択される、請求項４０に記載のエクソソーム。
【請求項４２】
前記治療化合物が、ヌクレオチド、アミノ酸、脂質、炭水化物、及び低分子からなる群より選択される、請求項４０に記載のエクソソーム。
【請求項４３】
前記治療ペプチドが、抗体またはその断片もしくは変異体である、請求項４０に記載のエクソソーム。
【請求項４４】
前記治療ペプチドが、酵素、リガンド、受容体、またはその断片もしくは変異体である、請求項４０に記載のエクソソーム。
【請求項４５】
前記治療ペプチドが、抗微生物ペプチドまたはその断片もしくは変異体である、請求項４０に記載のエクソソーム。
【請求項４６】
前記標的タンパク質が、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ２、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、ＡＴＰ輸送体、またはその断片もしくは変異体、及び標的化部分を含む融合タンパク質である、請求項２８〜３８のいずれかに記載のエクソソーム。
【請求項４７】
前記標的化部分が、器官、組織、または細胞に特異的である、請求項４６に記載のエクソソーム。
【請求項４８】
異なる標的タンパク質をさらに含み、前記異なる標的タンパク質が、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ２、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、ＡＴＰ輸送体、またはその断片もしくは変異体を含む、請求項２８〜４７のいずれかに記載のエクソソーム。
【請求項４９】
前記異なる標的タンパク質及び異なる結合剤間の結合に基づいて単離される、請求項４８に記載のエクソソーム。
【請求項５０】
請求項２８〜４９のいずれかに記載のエクソソーム及び賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項５１】
マクロ分子を実質的に含まず、前記マクロ分子が、核酸、夾雑タンパク質、脂質、炭水化物、代謝産物、及びその組み合わせから選択される、請求項５０に記載の医薬組成物。
【請求項５２】
請求項２８〜４９のいずれかに記載のエクソソームを産生するための細胞株。
【請求項５３】
エクソソームを産生するための細胞株であって、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ２、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、またはＡＴＰ輸送体をコードするゲノム配列に挿入された外因性配列を含み、前記外因性配列及び前記ゲノム配列が、融合タンパク質をコードする、前記細胞株。
【請求項５４】
前記外因性配列が、親和性タグをコードする、請求項５３に記載の細胞株。
【請求項５５】
前記外因性配列が、治療ペプチドをコードする、請求項５３に記載の細胞株。
【請求項５６】
前記治療ペプチドが、天然ペプチド、組み換えペプチド、合成ペプチド、または治療化合物へのリンカーからなる群より選択される、請求項５５に記載の細胞株。
【請求項５７】
前記治療化合物が、ヌクレオチド、アミノ酸、脂質、炭水化物、及び低分子からなる群より選択される、請求項５５に記載の細胞株。
【請求項５８】
前記治療ペプチドが、抗体またはその断片もしくは変異体である、請求項５５に記載の細胞株。
【請求項５９】
前記治療ペプチドが、酵素、リガンド、受容体、またはその断片もしくは変異体である、請求項５５に記載の細胞株。
【請求項６０】
前記治療ペプチドが、抗微生物ペプチドまたはその断片もしくは変異体である、請求項５５に記載の細胞株。
【請求項６１】
前記外因性配列が、標的化部分をコードする、請求項５３に記載の細胞株。
【請求項６２】
前記標的化部分が、器官、組織、または細胞に特異的である、請求項６１に記載の細胞株。
【請求項６３】
前記細胞株が、ＡＤＡＭ１０の発現が低下するように遺伝子改変される、請求項５３〜６２のいずれかに記載の細胞株。
【請求項６４】
請求項５３〜６３のいずれかに記載の細胞株から産生される、エクソソーム。
【請求項６５】
前記エクソソームが、前記融合タンパク質を表面上に、異なるエクソソームの表面上の異なる融合タンパク質よりも高い密度で含み、前記異なるエクソソームが、従来のエクソソームタンパク質をコードする異なるゲノム配列へと挿入された前記外因性配列を含む異なる細胞株から産生され、前記外因性配列及び前記異なるゲノム配列が、前記異なる融合タンパク質をコードする、請求項６４に記載のエクソソーム。
【請求項６６】
前記従来のエクソソームタンパク質が、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＰＤＧＦＲ、ＧＰＩアンカータンパク質、ラクトアドヘリン、ＬＡＭＰ２、ＬＡＭＰ２Ｂ、及びその断片からなる群より選択される、請求項６５に記載のエクソソーム。
【請求項６７】
非エクソソーム物質を単離する方法であって、
エクソソーム及び前記非エクソソーム物質を含む試料を提供するステップ；
前記試料を、標的タンパク質に対する親和性を有する結合剤と接触させるステップ、ここで前記標的タンパク質は、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、ＡＴＰ輸送体またはその断片もしくは変異体を含み、それにより前記エクソソームを前記結合剤に結合させる；及び
前記非エクソソーム物質を単離するステップを含む、前記方法。
【請求項６８】
前記非エクソソーム物質が、ウイルスまたはタンパク質である、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記非エクソソーム物質が、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、または他のエンベロープウイルスもしくは非エンベロープウイルスである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記非エクソソーム物質が、組み換えタンパク質である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
前記単離された非エクソソーム物質が、実質的にエクソソームを含まない、請求項６７〜７０のいずれかに記載の方法。
【請求項７２】
前記標的タンパク質が、親和性タグをさらに含み、前記親和性タグが、前記結合剤に対する親和性を有する、請求項６７〜７１のいずれかに記載の方法。
【請求項７３】
前記標的タンパク質が、配列番号３３のポリペプチドを含む、請求項６７〜７２のいずれかに記載の方法。
【請求項７４】
前記結合剤が、免疫グロブリン、タンパク質、ペプチド、または低分子を含む、請求項６７〜７３のいずれかに記載の方法。
【請求項７５】
前記結合剤が、固体支持体に付着しており、任意選択で、前記固体支持体が、多孔質アガロースビーズ、マイクロタイタープレート、磁気ビーズ、または膜を含む、請求項６７〜７４のいずれかに記載の方法。
【請求項７６】
前記固体支持体が、クロマトグラフィーカラムを形成する、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記試料を前記結合剤と接触させるステップが、前記試料を前記クロマトグラフィーカラムに接触させることにより行われる、請求項７６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子提出された配列表を含有し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１８年８月２２日に作製され、名称は４０７１４ＰＣＴ＿ＣＲＦ＿ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔであり、サイズは１７５，０９２バイトである。
【背景技術】
【０００２】
エクソソームは、細胞間コミュニケーションの重要なメディエーターである。これらは、がんなどの多くの疾患の診断及び予後における重要なバイオマーカーでもある。薬物送達ビヒクルとして、エクソソームは、多くの治療分野における新しい処置モダリティとして、従来の薬物送達方法よりも多くの利点を提供する。
【０００３】
エクソソームを治療目的で使用するには、エクソソームが、夾雑タンパク質、ＤＮＡ、炭水化物、及び脂質を含むがこれらに限定されない不純物を含まないまたはほとんど含まないことが求められる。現在の精製方法では、有意な量のこれらの不純物を除去するための十分な選択性が得られないため、純度を向上させるために追加のプロセスが望まれる。
【０００４】
さらに、エクソソームがヒト疾患の処置においてより頻繁に使用されるようになるにつれ、分子標的化、免疫回避、及び制御薬物放出を付与するそれらの物理化学的パラメータが不均一性であるがゆえに、臨床的期待を満たすのに苦心する可能性がある。これは主に、エクソソーム特性（例えば、組成、サイズ、形状、剛性、表面電荷、親水性、安定性、ならびにリガンドの種類及び密度）、ペイロード特性（例えば、薬物の種類、可溶性、負荷、効力、投薬、免疫応答、及び放出速度論）及びエクソソーム輸送に対するｉｎ  ｖｉｖｏでの生理学的障壁（例えば、免疫監視、粒子血管外漏出、組織標的化、組織透過、及び細胞取り込み）の不均一性と複雑性によるものである。かなりの努力がなされてきたが、所望の特性を有する治療用エクソソーム、例えば、治療ペイロードを含有し、適切な標的化部分を有するエクソソームの個別の亜集団を得るための有効な方法は、まだ容易に利用できる状態ではない。
【０００５】
エクソソームに基づく技術の治療使用及び他の用途をより良く可能にするために、エクソソームの個別の亜集団を生成、単離及び精製するための好適な方法が必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の態様は、治療使用のためのエクソソームを調製する新しい方法に関する。具体的には、本方法は、エクソソームの表面上で富化すると新しく同定された表面マーカーを使用する。具体的には、タンパク質の群（例えば、プロスタグランジンＦ２受容体ネガティブレギュレーター（ＰＴＧＦＲＮ）；ベイシジン（ＢＳＧ）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー２（ＩＧＳＦ２）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー３（ＩＧＳＦ３）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー８（ＩＧＳＦ８）；インテグリンベータ−１（ＩＴＧＢ１）；インテグリンアルファ−４（ＩＴＧＡ４）；４Ｆ２細胞表面抗原重鎖（ＳＬＣ３Ａ２）；及びＡＴＰ輸送体タンパク質のクラス（ＡＴＰ１Ａ１、ＡＴＰ１Ａ２、ＡＴＰ１Ａ３、ＡＴＰ１Ａ４、ＡＴＰ１Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ１、ＡＴＰ２Ｂ２、ＡＴＰ２Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ４））を、エクソソームの表面上で高度に富化すると同定した。
【０００７】
新しく同定されたタンパク質を、本発明の様々な実施形態において使用することができる。本発明の一態様は、新しく同定されたエクソソームタンパク質及び治療タンパク質をコンジュゲートすることにより融合タンパク質を生成すること、ならびに表面上に融合タンパク質を含有する操作されたエクソソームを産生することに関する。治療タンパク質のネイティブ完全長または生物学的に活性な断片は、エクソソーム富化タンパク質にコンジュゲートすることによってエクソソームの表面へと輸送されることができる。本明細書に提供する新しく同定されたエクソソームタンパク質を使用する方法は、表面操作エクソソームを産生する点において、当該分野で公知のいくつかの他のエクソソーム足場タンパク質（例えば、Ｌａｍｐ２Ｂ、ＰＤＧＦＲ、ラクトアドヘリンＣＤ９、ＣＤ６３及び／もしくはＣＤ８１、またはその断片）を使用する方法よりも、優れている。理論により束縛されることを望まないが、新しく同定されたタンパク質は、当該分野で公知のエクソソーム足場タンパク質のいくつか−すなわち、テトラスパニン（ｔｅｔｒａｓｐａｎｎｉｎ）タンパク質、例えばＣＤ９、ＣＤ６３及びＣＤ８１がそのＣ末端及びＮ末端の両方をエクソソーム内腔内に有するために、より優れていると考えられる。
【０００８】
本発明の別の態様は、全てのエクソソームに共通する、または単一細胞型に由来する全てのエクソソームに共通するエクソソームタンパク質を使用する、不均一溶液、例えば細胞培養培地または血漿からのアフィニティー精製によるエクソソームの精製に関する。いくつかの実施形態は、エクソソームの亜集団に特異的な表面マーカーを使用することによる総エクソソームからのエクソソームの亜集団の単離に関する。
【０００９】
本発明の別の態様は、エクソソームが夾雑産物であるときに、試料からエクソソームを除去する方法に関する。例えば、天然または操作されたウイルスは、夾雑エクソソームから精製され得る。ゆえに、本明細書に記載のエクソソームタンパク質を使用して、類似のサイズ、形状、及び／または電荷の他の粒子が望ましい産物である場合に、生物学的プロセスからエクソソームを選択的に除去することができる。
【００１０】
本発明の別の態様は、より効率的なアフィニティー精製のために、または標的化部分もしくは治療関連タンパク質の表面上への提示のために、設計された表面操作エクソソームの生成または使用に関する。例えば、エクソソーム表面を、ネイティブ完全長エクソソームタンパク質及び／またはネイティブエクソソームタンパク質の断片もしくは改変タンパク質を表面上に高密度にて含有するように改変することができる。
【００１１】
本発明は、このような表面操作エクソソームを産生するための、産生細胞または産生細胞を生成する方法にさらに関する。外因性ポリヌクレオチドを、産生細胞へと一過的にまたは安定的に導入して、表面操作エクソソームを生成するための産生細胞を作成することができる。
【００１２】
具体的には、本発明のある態様は、エクソソームを単離する方法であって、（１）エクソソームを含む試料を提供するステップ；（２）試料を、標的タンパク質に対する親和性を有する結合剤と接触させるステップ、ここで標的タンパク質は、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、ＡＴＰ輸送体またはその断片もしくは変異体を含む；ならびに（３）標的タンパク質及び結合剤間の結合に基づいてエクソソームを単離するステップを含む、前記方法に関する。
【００１３】
いくつかの実施形態では、試料は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖した細胞から得られ、任意選択で、細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である。いくつかの実施形態では、試料は、対象の体液から得られる。
【００１４】
いくつかの実施形態では、細胞は、標的タンパク質を発現するように遺伝子改変される。いくつかの実施形態では、細胞は、標的タンパク質をコードする発現プラスミドを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、結合剤に対する親和性を有するタグを発現する外因性配列を含むように遺伝子改変され、外因性配列は、細胞のゲノムへと挿入される。いくつかの実施形態では、外因性配列は、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２またはＡＴＰ輸送体をコードする内因性配列の３’または５’末端に位置するゲノム部位に挿入される。いくつかの実施形態では、内因性配列は、ＩＧＳＦ８をコードしない。いくつかの実施形態では、外因性配列は、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２またはＡＴＰ輸送体をコードする内因性配列内に位置するゲノム部位に挿入される。
【００１５】
いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、タグ、及びＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、ＡＴＰ輸送体またはその断片もしくは変異体を含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、エクソソームは、標的タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、ＩＧＳＦ８またはその断片もしくは改変体ではない。いくつかの実施形態では、細胞は、ＡＤＡＭ１０の発現が低下するように遺伝子改変される。
【００１６】
いくつかの実施形態では、エクソソームは、標的タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２及びＡＴＰ輸送体から選択される。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２またはＡＴＰ輸送体の断片もしくは変異体を含む。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、配列番号３３のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、ＡＴＰ輸送体またはその断片もしくは変異体、及び親和性タグを含む融合タンパク質であり、親和性タグは、結合剤に対して親和性を有する。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、ＩＧＳＦ８またはその断片もしくは改変体を含まない。
【００１７】
いくつかの実施形態では、結合剤は、免疫グロブリン、タンパク質、ペプチド、または低分子を含む。いくつかの実施形態では、結合剤は、固体支持体に付着しており、任意選択で、固体支持体は、多孔質アガロースビーズ、マイクロタイタープレート、磁気ビーズ、または膜を含む。
【００１８】
いくつかの実施形態では、固体支持体は、クロマトグラフィーカラムを形成する。いくつかの実施形態では、試料を結合剤と接触させるステップは、試料をクロマトグラフィーカラムに接触させることにより行われる。
【００１９】
いくつかの実施形態では、本方法は、（１）試料のサブセットを、異なる標的タンパク質に対する親和性を有する異なる結合剤と接触させるステップ；ならびに（２）異なる標的タンパク質及び異なる結合剤間の結合に基づいてエクソソームを単離するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、異なる標的タンパク質は、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＡＴＰ輸送体またはその断片もしくは変異体を含む。いくつかの実施形態では、異なる標的タンパク質は、配列番号３３のポリペプチドを含む。
【００２０】
本発明の別の態様は、本明細書に提供する方法により産生されるエクソソームに関する。
【００２１】
なおも別の態様では、本発明は、本発明のエクソソーム及び賦形剤を含む医薬組成物に関する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、エクソソーム源を含む試料よりも低い濃度のマクロ分子を含み、マクロ分子は、核酸、夾雑タンパク質、脂質、炭水化物、代謝産物、またはその組み合わせである。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、マクロ分子を実質的に含まない。
【００２２】
本発明の別の態様は、標的タンパク質を含むエクソソームであって、標的タンパク質の少なくとも一部が外因性配列から発現され、標的タンパク質が、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、ＡＴＰ輸送体またはその断片もしくは変異体を含む、前記エクソソームに関する。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、ＩＧＳＦ８またはその断片もしくは変異体を含まない。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、配列番号３３のポリペプチドを含む。
【００２３】
いくつかの実施形態では、エクソソームは、標的タンパク質及び結合剤間の結合に基づいて単離される。
【００２４】
いくつかの実施形態では、エクソソームは、外因性配列を含むように遺伝子改変された細胞から産生され、任意選択で、細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＡＤＡＭ１０の発現が低下するように遺伝子改変される。
【００２５】
いくつかの実施形態では、細胞は、外因性配列を含むプラスミドを含む。
【００２６】
いくつかの実施形態では、細胞は、細胞のゲノムへと挿入された外因性配列を含む。いくつかの実施形態では、外因性配列は、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２またはＡＴＰ輸送体をコードするゲノム配列の３’または５’末端に位置するゲノム部位へと挿入される。いくつかの実施形態では、外因性配列は、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２またはＡＴＰ輸送体をコードするゲノム配列へと挿入される。いくつかの実施形態では、外因性配列は、ＩＧＳＦ８をコードしない。
【００２７】
いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、ＡＴＰ輸送体、またはその断片もしくは変異体、及び親和性タグを含む融合タンパク質であり、親和性タグは、結合剤に対する親和性を有する。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、ＩＧＳＦ８またはその断片を含まない。
【００２８】
いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、ＡＴＰ輸送体、またはその断片もしくは変異体、及び治療ペプチドを含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、ＩＧＳＦ８またはその断片を含まない。
【００２９】
治療ペプチドは、天然ペプチド、組み換えペプチド、合成ペプチド、または治療化合物へのリンカーからなる群より選択されることができる。治療化合物は、ヌクレオチド、アミノ酸、脂質、炭水化物、及び低分子からなる群より選択されることができる。
【００３０】
治療ペプチドは、抗体またはその断片もしくは変異体であることができる。治療ペプチドは、酵素、リガンド、受容体、またはその断片もしくは変異体であることができる。治療ペプチドは、抗微生物ペプチドまたはその断片もしくは変異体であることができる。
【００３１】
いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、ＡＴＰ輸送体、またはその断片もしくは変異体、及び標的化部分を含む融合タンパク質である。標的化部分は、器官、組織、または細胞に特異的であることができる。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、ＩＧＳＦ８またはその断片を含まない。
【００３２】
いくつかの実施形態では、エクソソームは、第二の、異なる標的タンパク質をさらに含み、異なる標的タンパク質は、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、ＡＴＰ輸送体、またはその断片もしくは変異体を含む。いくつかの実施形態では、エクソソームは、異なる標的タンパク質及び異なる結合剤間の結合に基づいて単離される。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、ＩＧＳＦ８またはその断片を含まない。
【００３３】
一態様では、本発明は、本発明のエクソソーム及び賦形剤を含む医薬組成物に関する。
【００３４】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、マクロ分子を実質的に含まず、マクロ分子は、核酸、夾雑タンパク質、脂質、炭水化物、代謝産物、及びその組み合わせから選択される。
【００３５】
一態様では、本発明は、本明細書に提示するエクソソームを産生するための細胞に関する。
【００３６】
具体的には、いくつかの実施形態は、エクソソームを産生するための細胞であって、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、またはＡＴＰ輸送体をコードするゲノム配列へと挿入された外因性配列を含み、外因性配列及びゲノム配列は、融合タンパク質をコードする、前記細胞に関連する。いくつかの実施形態では、ゲノム配列は、ＩＧＳＦ８をコードしない。
【００３７】
外因性配列は、親和性タグをコードすることができる。
【００３８】
外因性配列は、治療ペプチドをコードすることができる。治療ペプチドは、天然ペプチド、組み換えペプチド、合成ペプチド、または治療化合物へのリンカーからなる群より選択されることができる。治療化合物は、ヌクレオチド、アミノ酸、脂質、炭水化物、及び低分子からなる群より選択されることができる。治療ペプチドは、抗体またはその断片もしくは変異体であることができる。治療ペプチドは、酵素、リガンド、受容体、またはその断片もしくは変異体であることができる。治療ペプチドは、抗微生物ペプチドまたはその断片もしくは変異体であることができる。
【００３９】
外因性配列は、標的化部分をコードすることができる。標的化部分は、器官、組織、または細胞に特異的であることができる。
【００４０】
いくつかの実施形態では、細胞株は、ＡＤＡＭ１０の発現が低下するように遺伝子改変される。
【００４１】
一態様では、本発明は、本発明の細胞株から産生されるエクソソームを提供する。いくつかの実施形態では、エクソソームは、異なるエクソソームの表面上の異なる融合タンパク質よりも高い密度で表面上に融合タンパク質を含み、異なるエクソソームは、従来のエクソソームタンパク質をコードする異なるゲノム配列へと挿入された外因性配列を含む異なる細胞株から産生され、外因性配列及び異なるゲノム配列は、異なる融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、従来のエクソソームタンパク質は、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＰＤＧＦＲ、ＧＰＩアンカータンパク質、ＬＡＭＰ２、ＬＡＭＰ２Ｂ、及びその断片からなる群より選択される。
【００４２】
別の態様では、本発明は、非エクソソーム物質を単離する方法であって、エクソソーム及び非エクソソーム物質を含む試料を提供するステップ；試料を、標的タンパク質に対する親和性を有する結合剤と接触させるステップ、ここで標的タンパク質は、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、ＡＴＰ輸送体またはその断片もしくは変異体を含み、それによりエクソソームを結合剤に結合させる；及び非エクソソーム物質を単離するステップを含む、前記方法に関する。
【００４３】
いくつかの実施形態では、非エクソソーム物質は、ウイルスまたはタンパク質である。いくつかの実施形態では、非エクソソーム物質は、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、または他のエンベロープウイルスもしくは非エンベロープウイルスである。いくつかの実施形態では、非エクソソーム物質は、組み換えタンパク質である。いくつかの実施形態では、単離された非エクソソーム物質は、実質的にエクソソームを含まない。
【００４４】
いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、親和性タグをさらに含み、親和性タグは、結合剤に対する親和性を有する。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、配列番号３３のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、結合剤は、免疫グロブリン、タンパク質、ペプチド、または低分子を含む。いくつかの実施形態では、結合剤は、固体支持体に付着しており、任意選択で、固体支持体は、多孔質アガロースビーズ、マイクロタイタープレート、磁気ビーズ、または膜を含む。いくつかの実施形態では、固体支持体は、クロマトグラフィーカラムを形成する。いくつかの実施形態では、試料を結合剤と接触させるステップは、試料をクロマトグラフィーカラムに接触させることにより行われる。
【００４５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載する精製の方法は、ナノ小胞の精製のために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法は、ナノ小胞に関する。
【００４６】
図は、単に例示を目的として本発明の様々な実施形態を図示する。当業者は、本明細書に例示する構造及び方法の代替の実施形態が、本明細書に記載の本発明の原理から逸脱することなく採用され得ることを、以下の考察から容易に認識するだろう。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】試料を含有する超遠心分離後のＯｐｔｉｐｒｅｐ（商標）密度勾配の画像を提供する。括弧で記しているのは、エクソソームを含有する上部画分（「上」）、細胞デブリを含有する中部画分（「中」）及び高密度凝集体と細胞のデブリを含有する下部画分（「下」）である。
【図２】Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（商標）超遠心分離の上部画分（Ｙ軸）から同定されたタンパク質及び下部画分（Ｘ軸）から同定されたタンパク質を示す点グラフである。点線の上にプロットされたタンパク質は、エクソソーム富化タンパク質を表し、点線の下のものは、エクソソームに特異的でないタンパク質を表す。
【図３】ＰＴＧＦＲＮ（配列番号１）のトリプシンペプチドカバレッジマップを提供する。
【図４】ＩＧＳＦ８（配列番号１４）のトリプシンペプチドカバレッジマップを提供する。
【図５】ベイシジン（ＢＳＧ）（配列番号９）のトリプシンペプチドカバレッジマップを提供する。
【図６】図６Ａは、ＨＥＫ２９３細胞から収集した全細胞ライセート（左）及び精製されたエクソソーム集団（右）のタンパク質ブロッティングからの写真を示す。図６Ｂは、ＰＴＧＦＲＮに対する抗体を用いた図６Ａに提供したゲルのウェスタンブロッティングの結果を示す。右の列で検出されたバンドは、図６Ａの約１１０ｋＤａのバンドに対応する。
【図７】図７Ａは、自動的に形成されるＯｐｔｉｐｒｅｐ（商標）勾配を使用する精製から収集した１２の画分のタンパク質ブロッティングを示す。図７Ｂは、ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＢ１、ＰＴＧＦＲＮ、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ベイシジン、アリックス、またはシンテニンに対する抗体を用いた図７Ａに提示したゲルのウェスタンブロッティングの結果を示す。新規のエクソソーム表面タンパク質（ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＢ１、ＰＴＧＦＲＮ、ＩＧＳＦ８、ベイシジン）はそれぞれ、周知のエクソソームマーカータンパク質（アリックス、シンテニン）と同じ画分において検出される。
【図８】本発明の様々な実施形態に関して、例えば、エクソソームの表面上にある融合タンパク質の標的化に関して、またはエクソソームのアフィニティー精製のための標的として、使用されるエクソソーム表面タンパク質（ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＢ１、ＰＴＧＦＲＮ、ＩＧＳＦ８、ＢＳＧ）を示す。
【図９】図９Ａは、ＩｇＶドメインの境界の同定（矢印）を伴うＰＴＧＦＲＮの構造及びＰＴＧＦＲＮのＣ末端に融合したＧＦＰを示す。図９Ｂは、様々なＧＦＰ−ＰＴＧＦＲＮ融合タンパク質を過剰発現している細胞培養物から単離されたエクソソームのウェスタンブロッティングからのゲル写真を提供する。ＧＦＰ−ＰＴＧＦＲＮ融合タンパク質は、ＧＦＰに対する抗体を使用して検出された。
【図１０】様々なＧＦＰ−ＰＴＧＦＲＮ融合タンパク質を過剰発現する細胞から単離された精製エクソソームの総タンパク質を泳動させたゲル写真を提供する。
【図１１】図１１Ａは、ＩｇＶドメインの境界の同定（矢印）を伴うＰＴＧＦＲＮの構造及びＰＴＧＦＲＮのＮ末端に融合したＦＬＡＧを示す。図１１Ｂは、様々なＦＬＡＧ−ＰＴＧＦＲＮ融合タンパク質を過剰発現している細胞培養物から単離されたエクソソームのウェスタンブロッティングからのゲル写真を提供する。ＧＦＰ−ＰＴＧＦＲＮ融合タンパク質は、ＦＬＡＧタグに対する抗体を使用して検出された。
【図１２】図１２Ａは、各細胞が、完全長ＰＴＧＦＲＮ（ＰＴＧＦＲＮ−ＧＦＰ）または短縮ＰＴＧＦＲＮ（ＰＴＧＦＲＮ＿ＩｇＶ３−ＧＦＰ）を含有するＧＦＰ融合タンパク質を発現する、野生型細胞（ＡＤＡＭ１０＋）またはＡＤＡＭ１０ノックアウト細胞（ＡＤＡＭ１０−）から単離された精製エクソソームの総タンパク質を泳動させたゲル写真を提供する。図１２Ｂは、ＡＤＡＭ１０に対する抗体を使用した図１２Ａの試料のウェスタンブロッティングからのゲル写真を提供する。図１２Ｃは、ＧＦＰに対する抗体を使用した図１２Ａの試料のウェスタンブロッティングからのゲル写真を提供する。
【図１３】６つのＩｇＶドメインのうち５つを欠くＰＴＧＦＲＮ（ＰＴＧＦＲＮ＿ＩｇＶ６）、ＦＬＡＧタグ、及び融合パートナータンパク質を含有する融合タンパク質の構造を示す。
【図１４】図１４Ａは、ＰＴＧＦＲＮ＿ＩｇＶ６（番号４５１）（配列番号４２）及び４個（番号４５２）（配列番号４３）、８個（番号４５３）（配列番号４４）、または１２個（番号４５４）（配列番号４５）の追加のアミノ酸を欠くＰＴＧＦＲＮ＿ＩｇＶ６の連続短縮化突然変異体の配列を提供する。図１４Ｂは、融合タンパク質番号４５１、４５２、４５３または４５４を過剰発現している細胞から単離された精製エクソソームの総タンパク質を泳動させたゲル写真を提供する。図１４Ｃは、ＦＬＡＧに対する抗体を使用した図１４Ｂの試料のウェスタンブロッティングからのゲル写真を提供する。
【図１５】様々なＧＦＰ融合タンパク質を過剰発現している細胞から単離されたエクソソームから検出されたＧＦＰ蛍光シグナルを提供する。ＧＦＰ融合タンパク質は、しばしば使用されるｐＤｉｓｐｌａｙ足場（ＰＤＧＦ受容体）、ＰａｌｍＰａｌｍ（パルミトイル化配列）、ＣＤ８１、または完全長ＰＴＧＦＲＮ（ＦＬ）もしくはＰＴＧＦＲＮ＿４５４（ｓＩｇＶ）のいずれかの内腔側に融合したＧＦＰを含有する。
【図１６】図１６Ａは、ＩＧＳＦ８を含有する融合タンパク質の構造及びＩＧＳＦ８のＣ末端に融合したＧＦＰを示す。図１６Ｂは、トランスフェクトされていないＨＥＫ２９３細胞（ネイティブ）またはＩＧＦＳ８−ＧＦＰ融合タンパク質をコードする構築物で安定的にトランスフェクトされたＨＥＫ細胞から単離されたエクソソームの総タンパク質を泳動させたゲル写真を提供する。図１６Ｂは、下部に、ＧＦＰに対する抗体を用いた試料のウェスタンブロッティングからのゲル写真も提供する。
【図１７】様々なＧＦＰ融合タンパク質を過剰発現している細胞から単離されたエクソソームから検出されたＧＦＰ蛍光シグナルを提供する。ＧＦＰ融合タンパク質は、しばしば使用されるｐＤｉｓｐｌａｙ足場（ＰＤＧＦ受容体）、ＣＤ８１、完全長ＩＧＳＦ８、または完全長ＰＴＧＦＲＮ（ＦＬ）もしくはＰＴＧＦＲＮ＿４５４（ｓＩｇＶ）のいずれかの内腔側に融合したＧＦＰを含有する。
【図１８】ＰＴＧＦＲＮの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、Ｎ末端に内因性シグナルペプチド（ＳＰ）、ＰＡＲ１切断部位、及びＣ末端にＦｃドメインを含有する融合タンパク質の構造を提供する。図１８は、配列番号４６を開示する。
【図１９】図１９Ａは、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（Ｍｉｌｌｐｏｒｅ  Ｓｉｇｍａ）を２８０ｎｍ  ＵＶ蛍光にて使用したＰＢＳ  ｐＨ７．４中のＰＴＧＦＲＮの精製ＥＣＤのゲルろ過クロマトグラフィー結果を提供する。図１９Ｂは、ＰＴＧＦＲＮの精製されたＥＣＤを含有する溶出液のゲルろ過クロマトグラフィーからのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル写真を提供する。
【図２０】図２０Ａは、ＰＴＧＦＲＮ  ＥＣＤ、抗ＶＬＡ４抗体、及びＢＳＡのサイズ排除クロマトグラフィー／多角度光散乱検出器（ＳＥＣ−ＭＡＬＳ）結果を提供する。図２０Ｂは、塩化グアニジウム（ＧｕＨＣｌ）の不在化、または１Ｍ、もしくは２Ｍ塩化グアニジニウム（ＧｕＨＣｌ）の存在下のＰＴＧＦＲＮ  ＥＣＤのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）結果を提供する。ＰＴＧＦＲＮの単量体または二量体を表すピークを示す。
【図２１】ｐＨ７．４にて結合アッセイからＰＴＧＦＲＮエクトドメイン結合パートナーとして同定された上位３つのヒット（上部）、及びｐＨ５．６にて結合アッセイから同定された上位５つのヒット（下部）を提供する。
【図２２】漸増濃度のＬＧＡＬＳ１の存在下でのＰＴＧＦＲＮ及びＬＧＡＬＳ１間の相互作用を試験するためのバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）結果を提供する。
【図２３】漸増濃度のラクトースの存在下でＰＴＧＦＲＮ及びＬＧＡＬＳ１間の相互作用を試験するためのバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）結果を提供する。
【図２４】漸増濃度の抗ＣＤ３１５抗体の存在下でのＰＴＧＦＲＮ及び抗ＣＤ３１５抗体間の相互作用を検査するためのバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）結果を提供する。
【図２５】ＨＥＫ２９３から単離された漸増濃度のネイティブエクソソームの存在下での抗ＣＤ３１５抗体及びネイティブエクソソーム間の相互作用を試験するためのバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）結果を提供する。
【図２６】漸増濃度の改変エクソソームの存在下での抗ＣＤ３１５抗体及びＰＴＧＦＲＮを過剰発現するように改変されたエクソソーム（ＰＴＧＦＲＮ＋＋エクソソーム）間の相互作用を試験するためのバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）結果を提供する。
【図２７】抗ＣＤ３１５抗体及びネイティブエクソソーム間、または抗ＣＤ３１５抗体及びＰＴＧＦＲＮを過剰発現する（ＰＴＧＦＲＮ＋＋）改変エクソソーム間の相互作用を比較するためのバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）結果を提供する。
【図２８】抗ＣＤ３１５抗体及び完全長ＰＴＧＦＲＮ間または抗ＣＤ３１５抗体及びＰＴＧＦＲＮの一連の短縮突然変異体間の相互作用を試験するためのバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）結果を提供する。
【図２９】図２９Ａは、トランスフェクトされたＨＥＫ細胞から単離された組み換えＰＴＧＦＲＮの短縮突然変異体、及びＨＥＫ２９３細胞からの精製エクソソームを含むｉｎ  ｖｉｖｏビオチン化タンパク質を泳動させたゲル写真を提供する。図２９Ｂは、プールしたポリクローナルＰＴＧＦＲＮ抗体を使用した図２９Ａの試料のウェスタンブロッティングからのゲル写真を提供する。
【図３０】ポリクローナルＰＴＧＦＲＮ抗体及びＰＴＧＦＲＮの様々な短縮化突然変異体間の相互作用を試験するためのバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）結果を提供する。
【図３１】異なる起源の様々な細胞株（ＨＥＫ２９３ＳＦ、腎臓；ＨＴ１０８０、結合組織；Ｋ５６２、骨髄；ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、胸；Ｒａｊｉ、リンパ芽球；間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、骨髄）から精製されたエクソソームに関する表面タンパク質（ＰＴＧＦＲＮ、ＩＧＳＦ８、ＩＧＳＦ３、ＢＳＧ、ＳＬＣ３Ａ２、ＩＴＧＢ１、ＣＤ８１、及びＣＤ９）のペプチドスペクトルマッチ（ＰＳＭ）の数を提供する。
【図３２】図３２Ａは、ネイティブ及びＰＴＧＦＲＮノックアウト（ＫＯ）エクソソームを泳動させたゲル写真を提供する。図３２Ｂは、プールしたポリクローナルＰＴＧＦＲＮ抗体を使用した図３２Ａの試料のウェスタンブロッティングからのゲル写真を提供する。
【図３３】精製されたネイティブ（ｙ軸）エクソソーム及びＰＴＧＲＮ  ＫＯ（ｘ軸）エクソソームからのペプチドスペクトルマッチ（ＰＳＭ）の散布図を提供する。
【図３４】モノクローナル抗ＣＤ３１５抗体と、ネイティブ、ＰＴＧＦＲＮ＋＋、及びＰＴＧＦＲＮ  ＫＯエクソソームのいずれかの間の相互作用を試験するためのＢＬＩ結果を提供する。
【図３５】図３５Ａは、固定化モノクローナル抗ＰＴＧＦＲＮ抗体を使用したネイティブ及びＰＴＧＦＲＮノックアウト（ＫＯ）エクソソームのｉｎ  ｖｉｔｒｏエクソソーム精製からのポリアクリルアミドゲルの写真を提供する。図３５Ｂは、抗ＰＴＧＦＲＮ抗体を使用した図３５Ａの試料のウェスタンブロッティングからのゲル写真を提供する。
【図３６】図３６Ａは、ネイティブエクソソームまたはＰＴＧＦＲＮ−ＢＤＤＦＩＩＩを発現するように改変された改変エクソソームを泳動させたポリアクリルアミドゲルの写真を提供する。図３６Ｂは、ＣＤ８１抗体（上部）またはＦＶＩＩＩ抗体（下部）を使用した図３６Ａからの試料のウェスタンブロッティングからのゲル写真を提供する。
【図３７】図３７Ａは、ネイティブエクソソームまたはＸＴＥＮ−ＰＴＧＦＲＮ−ＧＦＰを発現するように操作された改変エクソソームを泳動させたポリアクリルアミドゲルの写真を提供する。図３７Ｂは、アリックス抗体（上部）またはＧＦＰ抗体（下部）を使用した図３７Ａからの試料のウェスタンブロッティングからのゲル写真を提供する。
【図３８】ＧＦＰ陽性粒子（黒色棒、左ｙ軸）及び平均蛍光強度（灰色棒、右ｙ軸）の割合（％）を、（ｉ）ＣＤ９−ＧＦＰ、（ｉｉ）ＣＤ８１−ＧＦＰ、もしくは（ｉｉｉ）ＰＴＧＦＲＮ−ＧＦＰを発現するように操作された改変エクソソーム、または（ｉｖ）改変されていない、ネイティブエクソソームの、４つの異なるエクソソームの群において提供するグラフである。
【図３９】それ自身のシグナルペプチドを伴うネイティブＰＴＧＦＲＮ（ＰＴＧＦＲＮ−ＧＦＰ）、短縮ＰＴＧＦＲＮ（４５４−ＰＴＧＦＲＮ−ＧＦＰ）またはＤｓｂＡ１１からの合成シグナルペプチドを伴う短縮ＰＴＧＦＲＮ（４５４−ＰＴＧＦＲＮ−ＧＦＰ）を含有するＧＦＰ融合タンパク質を発現する改変エクソソームのＧＦＰ蛍光強度（ＦＵ）を提供する。
【図４０】図４０Ａは、レクチンＣＬＥＣ９Ａ、完全長ＰＴＧＦＲＮ、ＧＦＰ及びＦＬＡＧタグを認識する一本鎖Ｆａｂ、からなる融合タンパク質の構造を示す。図４０Ｂは、抗アリックス抗体（上部）またはＧＦＰ抗体（下部）を使用したＯｐｔｉｐｒｅｐ（商標）精製エクソソームのウェスタンブロッティングからのゲル写真を提供する。
【図４１】ＣＬＥＣ９Ａ−Ｆｃと、レクチンＣＬＥＣ９Ａ、完全長ＰＴＧＦＲＮ、ＧＦＰ及びＦＬＡＧタグを認識する一本鎖Ｆａｂ（「αＣＬＥＣ９Ａ−ＰＴＧＦＲＮ」）からなる融合タンパク質を発現するように改変されたエクソソームとの間の相互作用を試験するためのＢＬＩ結果を提供する。
【図４２】ＰＴＧＦＲＮ、アリックス、ＴＳＧ１０１、ＣＤ６３、ＣＤ９、またはＣＤ８１に対する抗体を用いて、ＨＥＫ２９３ＳＦ細胞（「ＨＥＫ」）またはＭＳＣ（「ＭＳＣ」）から精製されたエクソソームのウェスタンブロッティングからのゲル写真を提供する。
【図４３】図４３Ａは、トランスフェクトされていないＨＥＫ細胞、ＦＬＡＧタグに融合した完全長ＰＴＧＦＲＮを発現するプラスミド（「ＰＴＧＦＲＮ−ＦＬＡＧプラスミド」）でトランスフェクトされたＨＥＫ細胞、トランスフェクトされていないＣＨＯ細胞、またはＰＴＧＦＲＮ−ＦＬＡＧプラスミドでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞から精製されたエクソソームを泳動させたポリアクリルアミドゲルの写真を提供する。図４３Ｂは、ＰＴＧＲＮに対する抗体を使用した図４３Ａからの試料のウェスタンブロッティングからのゲル写真を提供する。図４３Ｃは、ＦＬＡＧタグに対する抗体を使用した図４３Ａからの試料のウェスタンブロッティングからのゲル写真を提供する。
【図４４】図４４Ａ〜Ｂは、ＣＤ９（図４４Ａ）またはＰＴＧＦＲＮ（図４４Ｂ）を使用したエクソソーム内腔でのカーゴタンパク質の負荷を検査するための実験システムを示す。図４４Ａは、ＧＦＰ、ＦＬＡＧタグ及びＦＫＢＰに融合したＣＤ９を発現する細胞を示し、ラパマイシンの存在下で、Ｖ５タグに融合したｍＣｈｅｒｒｙ及びＦＫＢＰと相互作用することができる。図４４Ｂは、ＧＦＰ、ＦＬＡＧタグ及びＦＫＢＰに融合したＰＴＧＦＲＮを発現する細胞を示し、ラパマイシンの存在下で、Ｖ５タグに融合したｍＣｈｅｒｒｙ及びＦＫＢＰと相互作用することができる。
【図４５】図４５Ａは、図４４Ａ（ＣＤ９）または図４４Ｂ（ＰＴＧＦＲＮ）（上部）に示した細胞培養試料から精製されたエクソソームを泳動させたポリアクリルアミドゲルの写真を提供する。本図は、ＦＬＡＧ（αＦｌａｇ）またはＶ５（αＶ５）に対する抗体を使用したウェスタンブロッティング結果も提供する（下部）。図４５Ｂは、デンシトメトリーにより測定され、収集したエクソソームの量に対して正規化された、図４５ＡのウェスタンブロッティングからのＦＬＡＧ及びＶ５に関するバンド強度を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
１．定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用する全ての技術及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者により一般に理解される意味を有する。本明細書で用いる場合、以下の用語は、下記のそれらに帰する意味を有する。
【００４９】
本明細書で用いる場合、「細胞外小胞」または「ＥＶ」という用語は、内部空間を囲む膜を含む細胞由来の小胞を指す。細胞外小胞は、それらが由来する細胞より小さな直径を有する全て膜に包まれた小胞を含む。一般に、細胞外小胞は、２０ｎｍから１０００ｎｍの範囲の直径を有し、内部空間内に、細胞外小胞の外表面上に表示される、及び／または膜に貫通する様々なマクロ分子カーゴを含むことができる。前記カーゴは、核酸、タンパク質、炭水化物、脂質、低分子、及び／またはそれらの組み合わせを含むことができる。例として、限定されないが、細胞外小胞には、アポトーシス小体、細胞の断片、直接的または間接的な操作により（例えば、連続的な押し出しまたはアルカリ溶液を用いる処理により）細胞から誘導される小胞、小胞化したオルガネラ、及び生細胞から（例えば、直接的な原形質膜の発芽または後期エンドソームの原形質膜との融合により）産生される小胞が含まれる。細胞外小胞は、生きているもしくは死んだ生物、外植した組織もしくは器官、及び／または培養した細胞から誘導することができる。
【００５０】
本明細書で用いる場合、「エクソソーム」という用語は、内部空間を囲む膜を含む細胞由来の小さな（２０〜３００ｎｍの直径、より好ましくは４０〜２００ｎｍの直径）小胞を指し、これは直接的な原形質膜出芽または後期エンドソームの原形質膜との融合によって前記細胞から生じる。エクソソームは、脂質または脂肪酸及びポリペプチドを含み、任意選択でペイロード（例えば、治療剤）、レシーバ（例えば、標的化部分）、ポリヌクレオチド（例えば、核酸、ＲＮＡ、またはＤＮＡ）、糖（例えば、単糖、多糖、またはグリカン）または他の分子を含む。エクソソームは、産生細胞から誘導することができ、そのサイズ、密度、生化学的パラメータ、またはそれらの組み合わせに基づき、産生細胞から単離することができる。エクソソームは、細胞外小胞の一種である。一般に、エクソソーム産生／生合成は、産生細胞の破壊をもたらさない。
【００５１】
本明細書で用いる場合、「ナノ小胞」という用語は、内部空間を囲む膜を含む細胞由来の小さな（２０〜２５０ｎｍの直径、より好ましくは３０〜１５０ｎｍの直径）小胞を指し、これは直接的または間接的な操作によって前記細胞から生じ、前記ナノ小胞は前記操作無しには前記産生細胞から産生されない。前記産生細胞の適切な操作には、限定されないが、連続的な押し出し、アルカリ溶液を用いた処理、超音波処理、またはそれらの組み合わせが含まれる。ナノ小胞の産生は、いくつかの例では、前記産生細胞の破壊をもたらす可能性がある。好ましくは、ナノ小胞の集団は、原形質膜からの直接的出芽または後期エンドソームの原形質膜との融合の手段による産生細胞に由来する小胞を実質的に含まない。ナノ小胞は、脂質または脂肪酸及びポリペプチドを含み、任意選択でペイロード（例えば、治療剤）、レシーバ（例えば、標的化部分）、ポリヌクレオチド（例えば、核酸、ＲＮＡ、またはＤＮＡ）、糖（例えば、単糖、多糖、またはグリカン）または他の分子を含む。ナノ小胞は、ひとたび前記操作に従って産生細胞から生じると、そのサイズ、密度、生化学的パラメータ、またはそれらの組み合わせに基づき、産生細胞から単離することができる。ナノ小胞は、細胞外小胞の一種である。
【００５２】
本明細書で用いる場合、「表面操作エクソソーム」という用語は、その組成が改変された膜を有するエクソソームを指す。例えば、膜は、タンパク質、脂質、低分子、炭水化物、等の組成が改変されている。組成は、化学的、物理的、もしくは生物学的方法により、または化学的、物理的、もしくは生物学的方法により以前にもしくは同時に改変された細胞から産生されることにより変えることができる。具体的には、組成は、遺伝子工学により、または遺伝子工学により以前に改変された細胞から産生されることにより、変えることができる。
【００５３】
本明細書で用いる場合、タンパク質の「改変」という用語は、タンパク質の非突然変異アミノ酸配列に対して、少なくとも１５％同一性を有するタンパク質を指す。タンパク質の改変は、タンパク質の断片または変異体を含む。タンパク質の改変は、タンパク質の断片または変異体への化学的、または物理的改変も含むことができる。
【００５４】
本明細書で用いる場合、タンパク質の「断片」という用語は、天然に生じるタンパク質と比較して、Ｎ及び／またはＣ末端が欠失しているタンパク質を指す。好ましくは、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、またはＡＴＰ輸送体の断片は、エクソソームを特異的に標的とする能力を保持する。このような断片は、「機能性断片」とも称される。断片がその意味において機能性断片であるか否かは、エクソソームのタンパク質内容物を決定する任意の公知の方法により評価することができ、それには、ウェスタンブロット、ＦＡＣＳ分析及び、断片の、例えば、ＧＦＰのような自家蛍光タンパク質との融合が含まれる。特定の実施形態では、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、ＡＴＰ輸送体の断片は、天然に生じるＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、またはＡＴＰ輸送体の、エクソソームを特異的に標的とする能力の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％を保持する。
【００５５】
本明細書で用いる場合、タンパク質の「変異体」という用語は、当該分野で公知の方法により整列させた際に、ある特定のアミノ酸配列同一性を別のタンパク質と共有するタンパク質を指す。タンパク質の変異体は、別のタンパク質における置換、挿入、欠失、フレームシフトまたは再編成を含むことができる。特定の実施形態では、変異体は、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、ＡＴＰ輸送体またはＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、もしくはＡＴＰ輸送体の断片に対して少なくとも７０％同一性を有する変異体である。いくつかの実施形態では、ＰＴＧＦＲＮの変異体または断片の変異体は、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％配列同一性を、配列番号１に従うＰＴＧＦＲＮまたはその機能性断片と共有する。いくつかの実施形態では、ＢＳＧの変異体または断片の変異体は、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％配列同一性を、配列番号９に従うＢＳＧまたはその機能性断片と共有する。いくつかの実施形態では、ＩＧＳＦ２の変異体または断片の変異体は、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％配列同一性を、配列番号３４に従うＩＧＳＦ２またはその機能性断片と共有する。いくつかの実施形態では、ＩＧＳＦ３の変異体または断片の変異体は、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％配列同一性を、配列番号２０に従うＩＧＳＦ３またはその機能性断片と共有する。いくつかの実施形態では、ＩＧＳＦ８の変異体または断片の変異体は、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％配列同一性を、配列番号１４に従うＩＧＳＦ８またはその機能性断片と共有する。いくつかの実施形態では、ＩＴＧＢ１の変異体または断片の変異体は、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％配列同一性を、配列番号２１に従うＩＴＧＢ１またはその機能性断片と共有する。いくつかの実施形態では、ＩＴＧＡ４の変異体または断片の変異体は、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％配列同一性を、配列番号２２に従うＩＴＧＡ４またはその機能性断片と共有する。いくつかの実施形態では、ＳＬＣ３Ａ２の変異体または断片の変異体は、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％配列同一性を、配列番号２３に従うＳＬＣ３Ａ２またはその機能性断片と共有する。いくつかの実施形態では、ＡＴＰ１Ａ１の変異体または断片の変異体は、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％配列同一性を、配列番号２４に従うＡＴＰ１Ａ１またはその機能性断片と共有する。いくつかの実施形態では、ＡＴＰ１Ａ２の変異体または断片の変異体は、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％配列同一性を、配列番号２５に従うＡＴＰ１Ａ２またはその機能性断片と共有する。いくつかの実施形態では、ＡＴＰ１Ａ３の変異体または断片の変異体は、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％配列同一性を、配列番号２６に従うＡＴＰ１Ａ３またはその機能性断片と共有する。いくつかの実施形態では、ＡＴＰ１Ａ４の変異体または断片の変異体は、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％配列同一性を、配列番号２７に従うＡＴＰ１Ａ４またはその機能性断片と共有する。いくつかの実施形態では、ＡＴＰ１Ｂ３の変異体または断片の変異体は、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％配列同一性を、配列番号２８に従うＡＴＰ１Ｂ３またはその機能性断片と共有する。いくつかの実施形態では、ＡＴＰ２Ｂ１の変異体または断片の変異体は、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％配列同一性を、配列番号２９に従うＡＴＰ２Ｂ１またはその機能性断片と共有する。いくつかの実施形態では、ＡＴＰ２Ｂ２の変異体または断片の変異体は、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％配列同一性を、配列番号３０に従うＡＴＰ２Ｂ２またはその機能性断片と共有する。いくつかの実施形態では、ＡＴＰ２Ｂ３の変異体または断片の変異体は、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％配列同一性を、配列番号３１に従うＡＴＰ２Ｂ３またはその機能性断片と共有する。いくつかの実施形態では、ＡＴＰ２Ｂ４の変異体または断片の変異体は、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％配列同一性を、配列番号３２に従うＡＴＰ２Ｂ４またはその機能性断片と共有する。上記事例のそれぞれにおいて、変異体または断片の変異体が、エクソソームを特異的に標的とする能力を保持することが好ましい。
【００５６】
比較のための配列の整列方法は、当該分野で周知である。様々なプログラム及び整列アルゴリズムが、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．４８：４４３（１９７０）；Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３１（１９８８）；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ  ７３：１５  ２３７−４４（１９８８）；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−３（１９８９）Ｃｏｒｐｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：１０８８１−９０（１９８８）；Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐ．Ａｐｐｌ．ＢｉｏＳｃｉ．８：１５５−６５（１９９２）；及びＰｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３１（１９９４）に記載されている。ＮＣＢＩ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）［Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ２０  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０（１９９０）Ｊは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＢＣｌ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）を含む数箇所の供給源、ならびにインターネット上から入手可能であり、配列分析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｍ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘに関連して使用される。ＢＬＡＳＴ及び該プログラムを使用して配列同一性を決定する方法の説明は、ＮＩＨ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）下のＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）の公式ウェブサイトにてアクセスできる。
【００５７】
本明細書に提供する任意のタンパク質の列挙は、タンパク質の機能性変異体を包含する。タンパク質の「機能性変異体」という用語は、エクソソームを特異的に標的とする能力を保持するタンパク質の変異体を指す。
【００５８】
本明細書で用いる場合、「産生細胞」という用語は、エクソソームを生成するために使用される細胞を指す。産生細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養された細胞、またはｉｎ  ｖｉｖｏの細胞であることができる。産生細胞には、限定されないが、エクソソームの生成に有効であると知られている細胞、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、及び間葉系幹細胞（ＭＳＣ）が含まれる。
【００５９】
本明細書で用いる場合、「標的タンパク質」という用語は、エクソソームの表面を標的とすることができるタンパク質を指す。標的タンパク質は、エクソソーム膜を天然に標的とする非突然変異タンパク質、または非突然変異タンパク質の断片もしくは変異体であることができる。標的タンパク質は、フラグタグ、治療ペプチド、標的化部分、あるいは、非突然変異タンパク質または非突然変異タンパク質の変異体もしくは断片に付着した他のペプチドを含有する融合タンパク質であることができる。標的タンパク質は、リンカーにより膜に付着した膜貫通型タンパク質、内在性タンパク質、周辺タンパク質、または可溶性タンパク質であることができる。
【００６０】
本明細書で用いる場合、「夾雑タンパク質」という用語は、エクソソームと関連しないタンパク質を指す。例えば、夾雑タンパク質には、エクソソームに囲まれておらず、エクソソームの膜に付着していない、または組み込まれていないタンパク質が含まれる。
【００６１】
本明細書で用いる場合、「単離する（ｉｓｏｌａｔｅ）」、「単離された」、及び「単離する（ｉｓｏｌａｔｉｎｇ）」または「精製する」、「精製された」、及び「精製する（ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ）」ならびに「抽出された」及び「抽出する」という用語は、互換可能に使用され、精製の１つまたは複数のプロセス、例えば、所望のエクソソーム調製の選択または富化を受けている、所望のＥＶの調製の状態（例えば、複数の公知または未知の量及び／または濃度）を指す。いくつかの実施形態では、単離するまたは精製するは、本明細書で用いる場合、産生細胞を含有する試料からエクソソーム（例えば、画分）を除去する、部分的に除去するプロセスである。いくつかの実施形態では、単離されたエクソソーム組成物は、検出可能な望ましくない活性を有さない、またあるいは、望ましくない活性のレベルもしくは量が許容可能なレベルもしくは量以下である。他の実施形態では、単離されたエクソソーム組成物は、許容可能な量及び／または濃度以上の所望のエクソソームの量及び／または濃度を有する。他の実施形態では、単離されたエクソソーム組成物は、その組成物を得た出発物質（例えば、産生細胞調製物）と比較して、富化されている。この富化は、出発物質と比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９９％、９９．９９９９％、または９９．９９９９％超であることができる。いくつかの実施形態では、単離されたエクソソーム調製物は、残留生物由来物質を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、単離されたエクソソーム調製物は、任意の夾雑生物質を、１００％含まない、９９％含まない、９８％含まない、９７％含まない、９６％含まない、９５％含まない、９４％含まない、９３％含まない、９２％含まない、９１％含まない、または９０％含まない。残留生物由来物質は、非生物的物質（化学的な物質を含む）または不要な核酸、タンパク質、脂質、または代謝産物を含むことができる。残留生物由来物質を実質的に含まないということは、エクソソーム組成物が、検出可能な産生細胞を含有せず、エクソソームのみが検出可能であることも意味することができる。
【００６２】
「賦形剤」または「担体」という用語は、化合物の投与をさらに容易にするために医薬組成物に加えられる不活性物質を指す。「薬学的に許容され得る担体」または「薬学的に許容され得る賦形剤」という用語は、ヒトを含む動物における使用に関して米国連邦政府の規制当局によって承認されたまたは米国薬局方において列挙された任意の薬剤、ならびに著しい刺激を対象に引き起こさず、投与された化合物の生物学的活性及び特性を抑制しない、任意の担体または希釈剤を包含する。医薬組成物の調製において有用であり、一般に安全で、非毒性であり、望ましい賦形剤及び担体が含まれる。
【００６３】
本明細書で用いる場合、「ペイロード」という用語は、ＥＶと接触している標的（例えば、標的細胞）に作用する治療剤を指す。エクソソーム及び／または産生細胞へと導入され得るペイロードには、治療剤、例えば、ヌクレオチド（例えば、検出可能部分もしくは毒素を含むまたは転写を妨害するヌクレオチド）、核酸（例えば、ポリペプチド、例えば酵素をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡ分子、または制御機能を有するＲＮＡ分子、例えばｍｉＲＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、及びｓｉＲＮＡ）、アミノ酸（例えば、検出可能部分もしくは毒素を含むまたは翻訳を妨害するアミノ酸）、ポリペプチド（例えば、酵素）、脂質、炭水化物、及び低分子（例えば、低分子薬及び毒素）が含まれる。
【００６４】
本明細書で用いる場合、「哺乳動物対象」とは、ヒト、家畜（例えば、イヌ、ネコ等）、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ等）及び実験動物（例えば、サル、ラット、マウス、ウサギ、モルモット等）を含むがこれらに限定されない全ての哺乳動物を含む。
【００６５】
「個体」、「対象」、「宿主」、及び「患者」という用語は、本明細書にて互換可能に使用され、診断、処置、または治療が望まれる、任意の哺乳動物対象、特にヒトを指す。本明細書に記載の方法は、ヒト治療及び獣医学の両方の用途に適用可能である。いくつかの実施形態では、対象は、哺乳動物であり、他の実施形態では、対象は、ヒトである。
【００６６】
本明細書で用いる場合、「実質的に含まない」という用語は、エクソソームを含む試料が、質量／体積（ｍ／ｖ）パーセント濃度で１０％未満のマクロ分子を含むことを意味する。一部の画分は、０．００１％未満、０．０１％未満、０．０５％未満、０．１％未満、０．２％未満、０．３％未満、０．４％未満、０．５％未満、０．６％未満、０．７％未満、０．８％未満、０．９％未満、１％未満、２％未満、３％未満、４％未満、５％未満、６％未満、７％未満、８％未満、９％未満、または１０％未満（ｍ／ｖ）のマクロ分子を含有し得る。
【００６７】
本明細書で用いる場合、「マクロ分子」という用語は、核酸、夾雑タンパク質、脂質、炭水化物、代謝産物、またはその組み合わせを意味する。
【００６８】
本明細書で用いる場合、「従来のエクソソームタンパク質」という用語は、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＰＤＧＦＲ、ＧＰＩアンカータンパク質、ラクトアドヘリンＬＡＭＰ２、及びＬＡＭＰ２Ｂ、その断片、またはそれに結合するペプチドを含むがこれらに限定されない、エクソソームにおいて富化すると以前に知られているタンパク質を意味する。
【００６９】
２．他の解釈に関する規定
本明細書に列挙された範囲は、列挙された端点を含む、範囲内の全ての値の略記であると理解される。例えば、１〜５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、及び５０からなる群の任意の数、数の組み合わせ、または下位範囲を含むと理解される。
【００７０】
３．エクソソームタンパク質
本発明のある態様は、エクソソーム膜上で高度に富化する、エクソソームタンパク質の同定、使用及び改変に関する。このようなエクソソームタンパク質は、高度に精製されたエクソソームを、質量分析または当該分野で公知の他の方法を用いて、分析することにより同定することができる。
【００７１】
エクソソームタンパク質には、エクソソーム膜上で富化された、様々な膜タンパク質、例えば膜貫通型タンパク質、内在性タンパク質及び周辺タンパク質が含まれる。それらには、様々なＣＤタンパク質、輸送体、インテグリン、レクチン及びカドヘリンが含まれる。具体的には、タンパク質には、限定されないが、（１）プロスタグランジンＦ２受容体ネガティブレギュレーター（ＰＴＧＦＲＮ）、（２）ベイシジン（ＢＳＧ）、（３）免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー３（ＩＧＳＦ３）、（４）免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー８（ＩＧＳＦ８）、（５）インテグリンベータ−１（ＩＴＧＢ１）、（６）インテグリンアルファ−４（ＩＴＧＡ４）、（７）４Ｆ２細胞表面抗原重鎖（ＳＬＣ３Ａ２）、（８）ＡＴＰ輸送体タンパク質のクラス（ＡＴＰ１Ａ１、ＡＴＰ１Ａ２、ＡＴＰ１Ａ３、ＡＴＰ１Ａ４、ＡＴＰ１Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ１、ＡＴＰ２Ｂ２、ＡＴＰ２Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ４）、及び（９）、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー２（ＩＧＳＦ２）が含まれる。
【００７２】
本明細書にて同定された１つまたは複数のエクソソームタンパク質は、エクソソームの産生細胞、産生条件、精製方法、または意図される用途に応じて選択的に使用することができる。例えば、エクソソームの特定の集団上で富化されたエクソソーム（ｅｘｏｍｅ）タンパク質を使用して、エクソソームの特定の集団を精製することができる。特定のサイズ範囲、標的化部分、電荷密度、ペイロード等を有する、ある特定のエクソソームの表面上で富化したエクソソームタンパク質を、本発明のいくつかの実施形態において同定及び使用することができる。いくつかの実施形態では、１つを超えるエクソソームタンパク質を、治療用エクソソームの生成、精製、及び単離のために、同時にまたは続けて使用することができる。
【００７３】
４．表面操作エクソソーム
本発明の別の態様は、表面操作エクソソームの生成及び使用に関する。表面操作エクソソームは、その組成が改変された膜を有する。例えば、それらの膜組成は、膜のタンパク質、脂質またはグリカン含量を変えることにより改変することができる。
【００７４】
いくつかの実施形態では、表面操作エクソソームは、化学的及び／または物理的方法、例えばＰＥＧ誘導性融合及び／または超音波融合により生成される。
【００７５】
他の実施形態では、表面操作エクソソームは、遺伝子操作により生成される。遺伝子改変された産生細胞または遺伝子改変された細胞の後代から産生されたエクソソームは、改変された膜組成を含有することができる。いくつかの実施形態では、表面操作エクソソームは、エクソソームタンパク質を高いもしくは低い密度にて有する、またはエクソソームタンパク質の変異体または断片を含む。
【００７６】
例えば、表面操作エクソソームは、エクソソームタンパク質またはエクソソームタンパク質の変異体もしくは断片をコードする外因性配列で形質転換された細胞から産生されることができる。外因性配列から発現されるタンパク質を含むエクソソームは、改変された膜タンパク質組成を含むことができる。
【００７７】
エクソソームタンパク質の様々な改変体または断片を、本発明の実施形態に使用することができる。例えば、結合剤に対する親和性が亢進するように改変されたタンパク質は、結合剤を使用して精製することができる表面操作エクソソームを生成するために使用することができる。エクソソーム及び／または膜をより効果的に標的とするように改変されたタンパク質を使用することができる。エクソソーム膜への特異的及び効果的な標的化に必要な最小限の断片を含むように改変されたタンパク質も使用することができる。
【００７８】
融合タンパク質も使用することができ、例えば、親和性タグ（例えば、Ｈｉｓタグ、ＧＳＴタグ、グルタチオン−Ｓ−転移酵素、Ｓ−ペプチド、ＨＡ、Ｍｙｃ、ＦＬＡＧ（商標）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）、ＭＢＰ、ＳＵＭＯ、及びプロテインＡ）に融合したエクソソームタンパク質またはその断片を、親和性タグに特異的な結合剤を用いた表面操作エクソソームの精製または除去に使用することができる。
【００７９】
治療活性を有する融合タンパク質も、表面操作エクソソームを生成するために使用することができる。例えば、融合タンパク質は、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、ＡＴＰ輸送体、またはその断片もしくは変異体、及び治療ペプチドを含むことができる。治療ペプチドは、天然ペプチド、組み換えペプチド、合成ペプチド、または治療化合物へのリンカーからなる群より選択される。治療化合物は、ヌクレオチド、アミノ酸、脂質、炭水化物、または低分子であることができる。治療ペプチドは、抗体、酵素、リガンド、受容体、抗微生物ペプチドまたはその断片もしくは変異体であることができる。いくつかの実施形態では、治療ペプチドは、核酸結合タンパク質である。核酸結合タンパク質は、ダイサー、アルゴノートタンパク質、ＴＲＢＰ、またはＭＳ２バクテリオファージコートタンパク質であることができる。いくつかの実施形態では、核酸結合タンパク質は、追加で、１つまたは複数のＲＮＡまたはＤＮＡ分子を含むことができる。１つまたは複数のＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、ｌｉｎｃＲＮＡ、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、またはそれらの組み合わせであることができる。
【００８０】
いくつかの実施形態では、治療ペプチドは、タンパク質−タンパク質相互作用系の一部である。いくつかの実施形態では、タンパク質−タンパク質相互作用系は、ＦＲＢ−ＦＫＢＰ相互作用系、例えば、Ｂａｎａｓｚｙｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．２００５  Ａｐｒ  ６；１２７（１３）：４７１５−２１に記載のようなＦＲＢ−ＦＫＢＰ相互作用系を含む。
【００８１】
融合タンパク質は、エクソソームの表面を標的とし、治療活性をエクソソームに提供することができる。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＩＧＳＦ８またはその断片もしくは改変体を含まない。
【００８２】
いくつかの実施形態では、標的化部分を有する融合タンパク質を使用する。例えば、融合タンパク質は、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、ＡＴＰ輸送体、またはその断片もしくは変異体、及び標的化部分を含むことができる。標的化部分は、エクソソームを使用する処置のために、エクソソームを特定の器官、組織、または細胞に標的化するために使用することができる。いくつかの実施形態では、標的化部分は、抗体またはその抗原結合断片である。抗体及びその抗原結合断片には、全抗体、ポリクローナル、モノクローナル及び組み換え抗体、その断片が含まれ、一本鎖抗体、ヒト化抗体、マウス抗体、キメラ、マウス−ヒト、マウス−霊長類、霊長類−ヒトモノクローナル抗体、抗イディオタイプ抗体、抗体断片、例えば、例としてｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ１）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、及びＦｄ断片、ダイアボディ、及び抗体関連ポリペプチドがさらに含まれる。抗体及びその抗原結合断片には、所望の生物学的活性または機能を呈する限りにおいて二重特異性抗体及び多特異性抗体も含まれる。
【００８３】
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＩＧＳＦ８またはその断片もしくは改変体を含まない。
【００８４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の表面操作エクソソームは、当該分野で公知の表面操作エクソソームと比較して優れた特徴を実証する。例えば、本明細書で提供される新しく同定されたエクソソームタンパク質を使用することにより産生される表面操作エクソソームは、先行技術のエクソソーム、例えば、従来のエクソソームタンパク質を使用して産生されたものよりもその表面上で高度に富化された改変タンパク質を含有する。さらには、本発明の表面操作エクソソームは、当該分野で公知の表面操作エクソソームと比較して、より大きな、より特異的なまたはより制御された生物学的活性を有することができる。例えば、本明細書に記載のエクソソーム表面タンパク質またはその断片（例えば、ＰＴＧＦＲＮまたはその断片）に融合した治療または生物学的に関連する外因性配列を含む表面操作エクソソームは、当該分野で公知の足場への融合よりも、望ましい操作された特徴を多く有することができる。当該分野で公知の足場タンパク質には、テトラスパニン分子（例えば、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ９及びその他）、リソソーム関連膜タンパク質２（ＬＡＭＰ２及びＬＡＭＰ２Ｂ）、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、ＧＰＩアンカータンパク質、ラクトアドヘリン及びその断片、ならびにこれらのタンパク質またはその断片のいずれかに対して親和性を有するペプチドが含まれる。以前は、外因性タンパク質の過剰発現は、エクソソーム上への外因性タンパク質の確率的またはランダムな配置に依存して、表面操作されたエクソソームを産生していた。これは、エクソソーム上の外因性タンパク質の低レベルで予測不可能な密度をもたらした。ゆえに、本明細書に記載のエクソソーム表面タンパク質及びその断片は、新規エクソソーム組成物及びその作成方法における重要な進歩を提供する。
【００８５】
いくつかの実施形態では、外因性配列及び本明細書にて新しく同定されたエクソソーム表面タンパク質を含有する融合タンパク質を含む表面操作エクソソームは、当該分野で公知の従来のエクソソームタンパク質（例えば、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＰＤＧＦＲ、ＧＰＩアンカータンパク質、ラクトアドヘリンＬＡＭＰ２、及びＬＡＭＰ２Ｂ、その断片、またはそれに結合するペプチド）にコンジュゲートした外因性配列を含む同様に操作されたエクソソームよりも高密度の融合タンパク質を有する。いくつかの実施形態では、本明細書にて新しく同定されたエクソソームタンパク質を含有する前記融合タンパク質は、従来のエクソソームタンパク質を使用して同様に改変された他のエクソソーム表面上の融合タンパク質よりも、２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度にてエクソソーム表面上に存在する。いくつかの実施形態では、本明細書にて新しく同定されたエクソソームタンパク質を含有する前記融合タンパク質は、従来のエクソソームタンパク質を使用して同様に改変された他のエクソソーム表面上の融合タンパク質よりも、２〜４倍、４〜８倍、８〜１６倍、１６〜３２倍、３２〜６４倍、６４〜１００倍、１００〜２００倍、２００〜４００倍、４００〜８００倍、８００〜１，０００倍またはより高い密度にてエクソソーム表面上に存在する。
【００８６】
いくつかの実施形態では、ＰＴＧＦＲＮの融合タンパク質、その変異体、断片、断片の変異体または改変体は、ＣＤ９を使用して同様に改変された他のエクソソーム表面上の融合タンパク質よりも、２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度にてエクソソーム表面上に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＴＧＦＲＮの融合タンパク質、その変異体、断片、断片の変異体または改変体は、ＣＤ６３を使用して同様に改変された他のエクソソーム表面上の融合タンパク質よりも、２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度にてエクソソーム表面上に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＴＧＦＲＮの融合タンパク質、その変異体、断片、断片の変異体または改変体は、ＣＤ８１を使用して同様に改変された他のエクソソーム表面上の融合タンパク質よりも、２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度にてエクソソーム表面上に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＴＧＦＲＮの融合タンパク質、その変異体、断片、断片の変異体または改変体は、ＰＤＧＦＲを使用して同様に改変された他のエクソソーム表面上の融合タンパク質よりも、２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度にてエクソソーム表面上に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＴＧＦＲＮの融合タンパク質、その変異体、断片、断片の変異体または改変体は、ＧＰＩアンカータンパク質を使用して同様に改変された他のエクソソーム表面上の融合タンパク質よりも、２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度にてエクソソーム表面上に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＴＧＦＲＮの融合タンパク質、その変異体、断片、断片の変異体または改変体は、ラクトアドヘリンを使用して同様に改変された他のエクソソーム表面上の融合タンパク質よりも、２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度にてエクソソーム表面上に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＴＧＦＲＮの融合タンパク質、その変異体、断片、断片の変異体または改変体は、ＬＡＭＰ２を使用して同様に改変された他のエクソソーム表面上の融合タンパク質よりも、２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度にてエクソソーム表面上に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＴＧＦＲＮの融合タンパク質、その変異体、断片、断片の変異体または改変体は、ＬＡＭＰ２Ｂを使用して同様に改変された他のエクソソーム表面上の融合タンパク質よりも、２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度にてエクソソーム表面上に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＴＧＦＲＮの融合タンパク質、その変異体、断片、断片の変異体または改変体は、従来のエクソソームタンパク質の断片を使用して同様に改変された他のエクソソーム表面上の融合タンパク質よりも、２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度にてエクソソーム表面上に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＴＧＦＲＮの融合タンパク質、その変異体、断片、断片の変異体または改変体は、従来のエクソソームタンパク質の変異体を使用して同様に改変された他のエクソソーム表面上の融合タンパク質よりも、２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度にてエクソソーム表面上に存在する。
【００８７】
特定の実施形態では、ＰＴＧＦＲＮの融合タンパク質、その変異体、断片、断片の変異体または改変体は、従来のエクソソームタンパク質（例えば、ＣＤ６３のような、テトラスパニン分子）を使用して同様に改変された他のエクソソーム表面上の融合タンパク質よりも、２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度にてエクソソーム表面上に存在する。特定の実施形態では、ＢＳＧの融合タンパク質、その変異体、断片、断片の変異体または改変体は、従来のエクソソームタンパク質（例えば、ＣＤ６３のような、テトラスパニン分子）を使用して同様に改変された他のエクソソーム表面上の融合タンパク質よりも、２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度にてエクソソーム表面上に存在する。特定の実施形態では、ＩＧＳＦ２の融合タンパク質、その変異体、断片、断片の変異体または改変体は、従来のエクソソームタンパク質（例えば、ＣＤ６３のような、テトラスパニン分子）を使用して同様に改変された他のエクソソーム表面上の融合タンパク質よりも、２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度にてエクソソーム表面上に存在する。特定の実施形態では、ＩＧＳＦ３の融合タンパク質、その変異体、断片、断片の変異体または改変体は、従来のエクソソームタンパク質（例えば、ＣＤ６３のような、テトラスパニン分子）を使用して同様に改変された他のエクソソーム表面上の融合タンパク質よりも、２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度にてエクソソーム表面上に存在する。特定の実施形態では、ＩＧＳＦ８の融合タンパク質、その変異体、断片、断片の変異体または改変体は、従来のエクソソームタンパク質（例えば、ＣＤ６３のような、テトラスパニン分子）を使用して同様に改変された他のエクソソーム表面上の融合タンパク質よりも、２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度にてエクソソーム表面上に存在する。特定の実施形態では、ＩＴＧＢ１の融合タンパク質、その変異体、断片、断片の変異体または改変体は、従来のエクソソームタンパク質（例えば、ＣＤ６３のような、テトラスパニン分子）を使用して同様に改変された他のエクソソーム表面上の融合タンパク質よりも、２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度にてエクソソーム表面上に存在する。特定の実施形態では、ＩＴＧＡ４の融合タンパク質、その変異体、断片、断片の変異体または改変体は、従来のエクソソームタンパク質（例えば、ＣＤ６３のような、テトラスパニン分子）を使用して同様に改変された他のエクソソーム表面上の融合タンパク質よりも、２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度にてエクソソーム表面上に存在する。特定の実施形態では、ＳＬＣ３Ａ２の融合タンパク質、その変異体、断片、断片の変異体または改変体は、従来のエクソソームタンパク質（例えば、ＣＤ６３のような、テトラスパニン分子）を使用して同様に改変された他のエクソソーム表面上の融合タンパク質よりも、２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度にてエクソソーム表面上に存在する。特定の実施形態では、ＡＴＰ輸送体の融合タンパク質、その変異体、断片、断片の変異体または改変体は、従来のエクソソームタンパク質（例えば、ＣＤ６３のような、テトラスパニン分子）を使用して同様に改変された他のエクソソーム表面上の融合タンパク質よりも、２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度にてエクソソーム表面上に存在する。いくつかの実施形態では、本明細書にて新しく同定されたエクソソームタンパク質を含有する前記融合タンパク質は、従来のエクソソームタンパク質を使用して同様に改変された他のエクソソーム表面上の融合タンパク質よりも、２〜４倍、４〜８倍、８〜１６倍、１６〜３２倍、３２〜６４倍、６４〜１００倍、１００〜２００倍、２００〜４００倍、４００〜８００倍、８００〜１，０００倍またはより高い密度にてエクソソーム表面上に存在する。
【００８８】
本明細書に提供する融合タンパク質は、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、ＡＴＰ輸送体、またはその断片もしくは変異体、及び追加のペプチドを含むことができる。追加のペプチドは、エクソソームタンパク質またはその断片もしくは変異体のＮ末端またはＣ末端のいずれかに付着することができる。追加のペプチドは、エクソソームタンパク質に付着したエクソソームの内側（内腔側）または外側に位置することができる。
【００８９】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供する融合タンパク質は、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、ＡＴＰ輸送体、またはその断片もしくは変異体、及び２つの追加のペプチドを含む。２つの追加のペプチドは両方とも、エクソソームタンパク質またはその断片もしくは変異体のＮ末端またはＣ末端のいずれかに付着することができる。いくつかの実施形態では、２つの追加のペプチドのうちの一方がエクソソームタンパク質またはその断片もしくは変異体のＮ末端に付着し、２つの追加のペプチドのうちの他方がエクソソームタンパク質またはその断片もしくは変異体のＣ末端に付着する。追加のペプチドは、エクソソームタンパク質に付着したエクソソームの内側（内腔側）もしくは外側、または両側に位置することができる。
【００９０】
５．表面操作エクソソームの産生のための産生細胞
本発明のエクソソームは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させた細胞または対象の体液から産生することができる。エクソソームが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養物から産生される場合、様々な産生細胞、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を、本発明のために使用することができる。
【００９１】
産生細胞を、１つまたは複数の外因性配列を含むように遺伝子改変して、表面操作エクソソームを産生することができる。遺伝子改変された産生細胞は、一過性または安定した形質転換により導入された外因性配列を含有することができる。外因性配列は、産生細胞に、プラスミドとして導入されることができる。外因性配列は、産生細胞のゲノム配列へと、標的部位にて、またはランダムな部位で、安定して統合されることができる。いくつかの実施形態では、安定した細胞株が、表面操作エクソソームの産生のために生成される。
【００９２】
外因性配列は、エクソソームタンパク質をコードする内因性配列の上流（５’末端）または下流（３’末端）内に位置する産生細胞のゲノム配列へと挿入されることができる。当該分野で公知の様々な方法を、産生細胞への外因性配列の導入に使用することができる。例えば、様々な遺伝子編集方法（例えば、相同組み換え、トランスポゾン媒介システム、ｌｏｘＰ−Ｃｒｅシステム、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＴＡＬＥＮを使用する方法）を使用して改変された細胞は、本発明の範囲内である。
【００９３】
外因性配列は、エクソソームタンパク質またはエクソソームタンパク質の変異体もしくは断片をコードする配列を含むことができる。エクソソームタンパク質をコードする配列の余分なコピーを導入して、エクソソームタンパク質をより高い密度にて有する表面操作エクソソームを産生することができる。エクソソームタンパク質の変異体または断片をコードする外因性配列を導入して、エクソソームタンパク質の改変体または断片を含有する表面操作エクソソームを産生することができる。親和性タグをコードする外因性配列を導入して、エクソソームタンパク質に付着した親和性タグを含む融合タンパク質を含有する表面操作エクソソームを産生することができる。
【００９４】
いくつかの実施形態では、表面操作エクソソームは、同じまたは同様の産生細胞型から単離されたネイティブエクソソームよりも、高い密度のエクソソームタンパク質を有する。いくつかの実施形態では、前記エクソソームタンパク質は、前記ネイティブエクソソームよりも、２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度にて前記表面操作エクソソーム上に存在する。いくつかの実施形態では、前記エクソソームタンパク質は、前記ネイティブエクソソームよりも、２〜４倍、４〜８倍、８〜１６倍、１６〜３２倍、３２〜６４倍、６４〜１００倍、１００〜２００倍、２００〜４００倍、４００〜８００倍、８００〜１，０００倍またはより高い密度にて前記表面操作エクソソーム上に存在する。いくつかの実施形態では、エクソソームタンパク質を含む融合タンパク質は、前記ネイティブエクソソーム上の改変されていないエクソソームタンパク質よりも、２〜４倍、４〜８倍、８〜１６倍、１６〜３２倍、３２〜６４倍、６４〜１００倍、１００〜２００倍、２００〜４００倍、４００〜８００倍、８００〜１，０００倍またはより高い密度にて前記表面操作エクソソーム上に存在する。いくつかの実施形態では、エクソソームタンパク質の断片または変異体は、前記ネイティブエクソソーム上の改変されていないエクソソームタンパク質よりも、２〜４倍、４〜８倍、８〜１６倍、１６〜３２倍、３２〜６４倍、６４〜１００倍、１００〜２００倍、２００〜４００倍、４００〜８００倍、８００〜１，０００倍またはより高い密度にて前記表面操作エクソソーム上に存在する。
【００９５】
特定の実施形態では、ＰＴＧＦＲＮ、ＰＴＧＦＲＮの断片もしくは変異体、またはその改変体は、前記ネイティブエクソソーム上の改変されていないＰＴＧＦＲＮよりも、２〜４倍、４〜８倍、８〜１６倍、１６〜３２倍、３２〜６４倍、６４〜１００倍、１００〜２００倍、２００〜４００倍、４００〜８００倍、８００〜１，０００倍またはより高い密度にて前記表面操作エクソソーム上に存在する。特定の実施形態では、ＢＳＧ、ＢＳＧの断片もしくは変異体、またはその改変体は、前記ネイティブエクソソーム上の改変されていないＢＳＧよりも、２〜４倍、４〜８倍、８〜１６倍、１６〜３２倍、３２〜６４倍、６４〜１００倍、１００〜２００倍、２００〜４００倍、４００〜８００倍、８００〜１，０００倍またはより高い密度にて前記表面操作エクソソーム上に存在する。特定の実施形態では、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ２の断片もしくは変異体、またはその改変体は、前記ネイティブエクソソーム上の改変されていないＩＧＳＦよりも、２〜４倍、４〜８倍、８〜１６倍、１６〜３２倍、３２〜６４倍、６４〜１００倍、１００〜２００倍、２００〜４００倍、４００〜８００倍、８００〜１，０００倍またはより高い密度にて前記表面操作エクソソーム上に存在する。特定の実施形態では、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ３の断片もしくは変異体、またはその改変体は、前記ネイティブエクソソーム上の改変されていないＩＧＳＦ３よりも、２〜４倍、４〜８倍、８〜１６倍、１６〜３２倍、３２〜６４倍、６４〜１００倍、１００〜２００倍、２００〜４００倍、４００〜８００倍、８００〜１，０００倍またはより高い密度にて前記表面操作エクソソーム上に存在する。特定の実施形態では、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＢ１の断片もしくは変異体、またはその改変体は、前記ネイティブエクソソーム上の改変されていないＩＴＧＢ１よりも、２〜４倍、４〜８倍、８〜１６倍、１６〜３２倍、３２〜６４倍、６４〜１００倍、１００〜２００倍、２００〜４００倍、４００〜８００倍、８００〜１，０００倍またはより高い密度にて前記表面操作エクソソーム上に存在する。特定の実施形態では、ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡ４の断片もしくは変異体、またはその改変体は、前記ネイティブエクソソーム上の改変されていないＩＴＧＡ４よりも、２〜４倍、４〜８倍、８〜１６倍、１６〜３２倍、３２〜６４倍、６４〜１００倍、１００〜２００倍、２００〜４００倍、４００〜８００倍、８００〜１，０００倍またはより高い密度にて前記表面操作エクソソーム上に存在する。特定の実施形態では、ＳＬＣ３Ａ２、ＳＬＣ３Ａ２の断片もしくは変異体、またはその改変体は、前記ネイティブエクソソーム上の改変されていないＳＬＣ３Ａ２よりも、２〜４倍、４〜８倍、８〜１６倍、１６〜３２倍、３２〜６４倍、６４〜１００倍、１００〜２００倍、２００〜４００倍、４００〜８００倍、８００〜１，０００倍またはより高い密度にて前記表面操作エクソソーム上に存在する。特定の実施形態では、ＡＴＰ輸送体、ＡＴＰ輸送体の断片もしくは変異体、またはその改変体は、前記ネイティブエクソソーム上の改変されていないＡＴＰ輸送体よりも、２〜４倍、４〜８倍、８〜１６倍、１６〜３２倍、３２〜６４倍、６４〜１００倍、１００〜２００倍、２００〜４００倍、４００〜８００倍、８００〜１，０００倍またはより高い密度にて前記表面操作エクソソーム上に存在する。
【００９６】
いくつかの実施形態では、産生細胞は、追加の外因性配列を含むようにさらに改変される。例えば、追加の外因性配列を導入して、内因性遺伝子発現を調節する、またはある特定のポリペプチドをペイロードとして含むエクソソームを産生することができる。いくつかの実施形態では、産生細胞は、２つの外因性配列を含むように改変され、一方は、エクソソームタンパク質またはエクソソームタンパク質の変異体もしくは断片をコードし、他方は、ペイロードをコードする。いくつかの実施形態では、産生細胞は、追加の機能性、例えば、特異的標的化能、送達機能、酵素機能、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期の増加または低減、等をエクソソームに付与する追加の外因性配列を含むようにさらに改変されることができる。いくつかの実施形態では、産生細胞は、２つの外因性配列を含むように改変され、一方は、エクソソームタンパク質またはエクソソームタンパク質の変異体もしくは断片をコードし、他方は、追加の機能性をエクソソームに付与するタンパク質をコードする。
【００９７】
いくつかの実施形態では、産生細胞は、２つの外因性配列を含むように改変され、２つの外因性配列はそれぞれ、エクソソーム表面上の融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、産生細胞からの表面操作エクソソームは、同じまたは同様の細胞型の改変されていない細胞から単離されたネイティブエクソソームと比較して、より高い密度のエクソソームタンパク質を有する。いくつかの実施形態では、表面操作エクソソームは、エクソソームタンパク質を、同じまたは同様の細胞型の改変されていない細胞から単離されたネイティブエクソソームと比較して、２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍またはより高い密度にて含有する。いくつかの実施形態では、産生細胞は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の追加の外因性配列を含むようにさらに改変される。
【００９８】
より具体的には、表面操作エクソソームは、（１）プロスタグランジンＦ２受容体ネガティブレギュレーター（ＰＴＧＦＲＮ）、（２）ベイシジン（ＢＳＧ）、（３）免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー３（ＩＧＳＦ３）、（４）免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー８（ＩＧＳＦ８）、（５）インテグリンベータ−１（ＩＴＧＢ１）、（６）インテグリンアルファ−４（ＩＴＧＡ４）、（７）４Ｆ２細胞表面抗原重鎖（ＳＬＣ３Ａ２）、（８）ＡＴＰ輸送体タンパク質のクラス（ＡＴＰ１Ａ１、ＡＴＰ１Ａ２、ＡＴＰ１Ａ３、ＡＴＰ１Ａ４、ＡＴＰ１Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ１、ＡＴＰ２Ｂ２、ＡＴＰ２Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ４）、及び（９）免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー２（ＩＧＳＦ２）を含むがこれらに限定されない、１つまたは複数のエクソソーム表面タンパク質またはその変異体をコードする配列で形質転換された細胞から産生することができる。本明細書に記載する１つまたは複数のエクソソーム表面タンパク質はいずれも、プラスミド、ゲノムへと挿入された外因性配列または他の外因性核酸、例えば合成のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）から産生細胞にて発現することができる。
【００９９】
いくつかの実施形態では、１つまたは複数のエクソソーム表面タンパク質は、その完全長、内因性形態をコードする外因性配列で形質転換された細胞にて発現される。いくつかの実施形態では、このような外因性配列は、配列番号１のＰＴＧＦＲＮタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、このような外因性配列は、配列番号９のＢＳＧタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、このような外因性配列は、配列番号１４のＩＧＳＦ８タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、このような外因性配列は、配列番号２０のＩＧＳＦ３タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、このような外因性配列は、配列番号２１のＩＴＧＢ１タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、このような外因性配列は、配列番号２２のＩＴＧＡ４タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、このような外因性配列は、配列番号２３のＳＬＣ３Ａ２タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、このような外因性配列は、配列番号２４のＡＴＰ１Ａ１タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、このような外因性配列は、配列番号２５のＡＴＰ１Ａ２タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、このような外因性配列は、配列番号２６のＡＴＰ１Ａ３タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、このような外因性配列は、配列番号２７のＡＴＰ１Ａ４タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、このような外因性配列は、配列番号２８のＡＴＰ１Ｂ３タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、このような外因性配列は、配列番号２９のＡＴＰ２Ｂ１タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、このような外因性配列は、配列番号３０のＡＴＰ２Ｂ２タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、このような外因性配列は、配列番号３１のＡＴＰ２Ｂ３タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、このような外因性配列は、配列番号３２のＡＴＰ２Ｂ４タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、このような外因性配列は、配列番号３４のＩＧＳＦ２タンパク質をコードする。
【０１００】
表面操作エクソソームは、（１）プロスタグランジンＦ２受容体ネガティブレギュレーター（ＰＴＧＦＲＮ）、（２）ベイシジン（ＢＳＧ）、（３）免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー３（ＩＧＳＦ３）、（４）免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー８（ＩＧＳＦ８）、（５）インテグリンベータ−１（ＩＴＧＢ１）、（６）インテグリンアルファ−４（ＩＴＧＡ４）、（７）４Ｆ２細胞表面抗原重鎖（ＳＬＣ３Ａ２）、（８）ＡＴＰ輸送体タンパク質のクラス（ＡＴＰ１Ａ１、ＡＴＰ１Ａ２、ＡＴＰ１Ａ３、ＡＴＰ１Ａ４、ＡＴＰ１Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ１、ＡＴＰ２Ｂ２、ＡＴＰ２Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ４）、及び（９）免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー２（ＩＧＳＦ２）を含むがこれらに限定されない、１つまたは複数のエクソソーム表面タンパク質の断片をコードする配列で形質転換された細胞から産生することができる。いくつかの実施形態では、配列は、ネイティブタンパク質のＮ末端から少なくとも５、１０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、または８００個のアミノ酸を欠くエクソソーム表面タンパク質の断片をコードする。いくつかの実施形態では、配列は、ネイティブタンパク質のＣ末端から少なくとも５、１０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、または８００個のアミノ酸を欠くエクソソーム表面タンパク質の断片をコードする。いくつかの実施形態では、配列は、ネイティブタンパク質のＮ末端及びＣ末端の両方から少なくとも５、１０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、または８００個のアミノ酸を欠くエクソソーム表面タンパク質の断片をコードする。いくつかの実施形態では、配列は、ネイティブタンパク質の１つまたは複数の機能性または構造ドメインを欠くエクソソーム表面タンパク質の断片をコードする。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、エクソソーム表面タンパク質の断片は、１つまたは複数の異種タンパク質に融合している。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の異種タンパク質は、断片のＮ末端に融合している。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の異種タンパク質は、断片のＣ末端に融合している。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の異種タンパク質は、断片のＮ末端及びＣ末端に融合している。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の異種タンパク質は、哺乳動物タンパク質である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の異種タンパク質は、ヒトタンパク質である。
【０１０２】
表面操作エクソソームは、ＰＴＧＦＲＮの断片をコードする配列で形質転換された細胞から産生することができる。いくつかの実施形態では、ＰＴＧＦＲＮの断片は、１つまたは複数の機能性または構造ドメイン、例えばＩｇＶを欠く。例えば、ＰＴＧＦＲＮの断片は、配列番号２〜７、または３３のポリペプチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、ＰＴＧＦＲＮの断片は、１つまたは複数の異種タンパク質に融合している。１つまたは複数の異種タンパク質は、前記ＰＴＧＦＲＮ断片のＮ末端に融合することができる。１つまたは複数の異種タンパク質は、前記ＰＴＧＦＲＮ断片のＣ末端に融合することができる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の異種タンパク質は、前記ＰＴＧＦＲＮ断片のＮ末端及びＣ末端の両方に融合している。いくつかの実施形態では、異種タンパク質は、哺乳動物タンパク質である。いくつかの実施形態では、異種タンパク質は、ヒトタンパク質である。いくつかの実施形態では、前記ＰＴＧＦＲＮ断片に融合した前記異種タンパク質は、シグナル配列ペプチドをさらに含有する。シグナル配列ペプチドは、配列番号８のポリペプチドであることができる。
【０１０３】
表面操作エクソソームは、ベイシジンの断片をコードする配列で形質転換された細胞から産生することができる。いくつかの実施形態では、ベイシジンの断片は、１つまたは複数の機能性または構造ドメイン、例えばＩｇＶを欠く。例えば、ベイシジンの断片は、配列番号１０〜１２のポリペプチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、ベイシジンの断片は、１つまたは複数の異種タンパク質に融合している。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の異種タンパク質は、前記ベイシジン断片のＮ末端に融合している。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の異種タンパク質は、前記ベイシジン断片のＣ末端に融合している。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の異種タンパク質は、前記ベイシジン断片のＮ末端及びＣ末端の両方に融合している。いくつかの実施形態では、異種タンパク質は、哺乳動物タンパク質である。いくつかの実施形態では、異種タンパク質は、ヒトタンパク質である。いくつかの実施形態では、前記ベイシジン断片に融合した前記異種タンパク質は、シグナル配列ペプチドをさらに含有する。シグナル配列ペプチドは、配列番号１３のポリペプチドであることができる。
【０１０４】
表面操作エクソソームは、ＩＧＳＦ８の断片をコードする配列で形質転換された細胞から産生することができる。いくつかの実施形態では、ＩＧＳＦ８の断片は、１つまたは複数の機能性または構造ドメイン、例えばＩｇＶを欠く。例えば、ＩＧＳＦ８の断片は、配列番号１５〜１８のポリペプチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、ＩＧＳＦ８の断片は、１つまたは複数の異種タンパク質に融合している。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の異種タンパク質は、前記ＩＧＳＦ８断片のＮ末端に融合している。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の異種タンパク質は、前記ＩＧＳＦ８断片のＣ末端に融合している。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の異種タンパク質は、前記ＩＧＳＦ８断片のＮ末端及びＣ末端の両方に融合している。いくつかの実施形態では、異種タンパク質は、哺乳動物タンパク質である。いくつかの実施形態では、異種タンパク質は、ヒトタンパク質である。いくつかの実施形態では、前記ＩＧＳＦ８断片に融合した前記異種タンパク質は、シグナル配列ペプチドをさらに含有する。シグナル配列ペプチドは、配列番号１９のポリペプチドであることができる。
【０１０５】
表面操作エクソソームは、ＩＧＳＦ２の断片をコードする配列で形質転換された細胞から産生することができる。いくつかの実施形態では、ＩＧＳＦ２の断片は、１つまたは複数の機能性または構造ドメイン、例えばＩｇＶを欠く。いくつかの実施形態では、ＩＧＳＦ２の断片は、１つまたは複数の異種タンパク質に融合している。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の異種タンパク質は、前記ＩＧＳＦ２断片のＮ末端に融合している。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の異種タンパク質は、前記ＩＧＳＦ２断片のＣ末端に融合している。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の異種タンパク質は、前記ＩＧＳＦ２断片のＮ末端及びＣ末端の両方に融合している。いくつかの実施形態では、異種タンパク質は、哺乳動物タンパク質である。いくつかの実施形態では、異種タンパク質は、ヒトタンパク質である。いくつかの実施形態では、前記ＩＧＳＦ２断片に融合した前記異種タンパク質は、シグナル配列ペプチドをさらに含有する。シグナル配列ペプチドは、配列番号３５のポリペプチドであることができる。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、表面操作エクソソームは、（１）プロスタグランジンＦ２受容体ネガティブレギュレーター（ＰＴＧＦＲＮ）、（２）ベイシジン（ＢＳＧ）、（３）免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー３（ＩＧＳＦ３）、（４）免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー８（ＩＧＳＦ８）、（５）インテグリンベータ−１（ＩＴＧＢ１）、（６）インテグリンアルファ−４（ＩＴＧＡ４）、（７）４Ｆ２細胞表面抗原重鎖（ＳＬＣ３Ａ２）、（８）ＡＴＰ輸送体タンパク質のクラス（ＡＴＰ１Ａ１、ＡＴＰ１Ａ２、ＡＴＰ１Ａ３、ＡＴＰ１Ａ４、ＡＴＰ１Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ１、ＡＴＰ２Ｂ２、ＡＴＰ２Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ４）、及び（９）免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー２（ＩＧＳＦ２）を含むが、これらに限定されない、ネイティブエクソソーム表面タンパク質の完全長または断片に同一であるまたは類似する配列のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、前記ペプチドは、ネイティブエクソソーム表面タンパク質の完全長または断片に５０％同一である、例えば、配列番号１〜３４に５０％同一である。いくつかの実施形態では、前記ポリペプチドは、ネイティブエクソソーム表面タンパク質の完全長または断片に６０％同一である、例えば、配列番号１〜３４に６０％同一である。いくつかの実施形態では、前記ポリペプチドは、ネイティブエクソソーム表面タンパク質の完全長または断片に７０％同一である、例えば、配列番号１〜３４に７０％同一である。いくつかの実施形態では、前記ポリペプチドは、ネイティブエクソソーム表面タンパク質の完全長または断片に８０％同一である、例えば、配列番号１〜３４に８０％同一である。いくつかの実施形態では、前記ポリペプチドは、ネイティブエクソソーム表面タンパク質の完全長または断片に９０％同一である、例えば、配列番号１〜３４に９０％同一である。いくつかの実施形態では、前記ポリペプチドは、ネイティブエクソソーム表面タンパク質の完全長または断片に９５％同一である、例えば、配列番号１〜３４に９５％同一である。いくつかの実施形態では、前記ポリペプチドは、ネイティブエクソソーム表面タンパク質の完全長または断片に９９％同一である、例えば、配列番号１〜３４に９９％同一である。いくつかの実施形態では、前記ポリペプチドは、ネイティブエクソソーム表面タンパク質の完全長または断片に９９．９％同一である、例えば、配列番号１〜３４に９９．９％同一である。
【０１０７】
６．アフィニティー精製
本発明のいくつかの実施形態は、エクソソーム膜の上で富化したタンパク質及び固定された結合剤間の特異的結合相互作用を使用する、エクソソームの単離、精製、及び亜分画に関する。これらの方法は、一般に、（１）エクソソームを含む試料を供給または負荷するステップ、（２）エクソソームの標的タンパク質及び結合剤間の結合相互作用を維持する適切なバッファーを使用して結合しなかった試料成分を任意選択で洗い流すステップ、ならびに（３）結合相互作用がもう生じないようにバッファー条件を変化させることにより固定された結合剤からエクソソームを溶出（解離及び回収）するステップを含む。
【０１０８】
いくつかの実施形態は、エクソソーム膜上で富化したタンパク質及び固定された結合剤間の特異的結合相互作用を使用して、試料からエクソソームを除去する方法に関する。この場合、結合剤に結合したエクソソームは、結合剤から溶出されず、結合剤に結合しない画分を収集することができる。この方法を使用して、エクソソーム及び非エクソソーム物質、例えばウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、または任意の他のエンベロープウイルスまたは非エンベロープウイルス）または組み換えタンパク質（例えば、抗体、酵素または他のポリペプチド）を含む試料を精製することができ、この場合エクソソームは、夾雑粒子である。結合したエクソソームは、結合剤に結合したまま保持されることができ、非エクソソーム物質が回収され、実質的にエクソソームが含まれない。
【０１０９】
この単離、精製、亜分画または除去プロセスに使用される、標的タンパク質は、産生細胞のゲノムから産生された内因性タンパク質、遺伝子改変により産生細胞へと導入されたタンパク質、または化学的、物理的もしくは他の生物学的方法により改変されたタンパク質であることができる。いくつかの場合では、タンパク質は、非突然変異タンパク質または突然変異タンパク質、例えば、内因性タンパク質の変異体または断片である。いくつかの場合では、タンパク質は、融合タンパク質である。
【０１１０】
標的タンパク質に対して親和性を有する様々な結合剤を、本発明の実施形態に使用することができる。例えば、標的タンパク質に対する特異的親和性を有するタンパク質、ペプチド、及び低分子を、結合剤として使用することができる。いくつかの実施形態では、結合剤は、有機または無機源から得られる。有機源からの結合剤の例としては、血清タンパク質、レクチンまたは抗体が挙げられる。無機源からの結合剤の例としては、ボロン酸、金属キレート、及びトリアジン染料が挙げられる。
【０１１１】
結合剤を、結合剤に対して特異的な親和性を有するエクソソームが結合するように、固体支持体に化学的に固定化またはカップリングすることができる。様々な形態の固体支持体、例えば、多孔質アガロースビーズ、マイクロタイタープレート、磁気ビーズ、または膜を使用することができる。いくつかの実施形態では、固体支持体は、クロマトグラフィーカラムを形成し、エクソソームのアフィニティークロマトグラフィーに使用することができる。
【０１１２】
いくつかの場合では、エクソソームの単離、精製、亜分画及び除去は、結合剤及び固体支持体が充填されているカラムを使用するカラムクロマトグラフィーにより行われる。いくつかの実施形態では、エクソソームを含有する試料を、カラムに通して固定を可能とし、洗浄バッファーをカラムに通し、続いて溶出バッファーをカラムに接触させて、収集する。これらのステップは、雰囲気圧または追加の圧力をかけて行うことができる。
【０１１３】
いくつかの場合では、エクソソームの単離、精製、亜分画及び除去は、バッチ処理を使用して行われる。例えば、試料を、容器内の固体支持体に付着した結合剤に加え、混合し、固体支持体を分離し、液相を除去し、洗浄し、遠心分離し、溶出バッファーを加え、再び遠心分離し、溶出物を除去する。
【０１１４】
いくつかの場合では、ハイブリッド方法を採用することができる。例えば、試料を、容器内の固体支持体に付着した結合剤に加え、エクソソームに結合した固体支持体を続いてカラムに充填し、カラム上で洗浄し、溶出する。
【０１１５】
いくつかの場合では、エクソソームの単離、精製、亜分画及び除去は、マイクロタイタープレート、磁気ビーズ、または膜に付着した結合剤を使用して行われる。この場合、試料を、固体支持体に付着した結合剤に加え、その後、混合し、固体支持体を分離し、液相を除去し、洗浄し、洗浄バッファーを除去し、溶出バッファーを加え、溶出物を除去するステップが続く。
【０１１６】
結合剤及びエクソソーム上の標的タンパク質間の結合は、結合剤及びエクソソーム上の標的タンパク質間の特異的相互作用に最適な様々な生理学的条件にて行われる。結合したエクソソームの溶出は、塩濃度、ｐＨ、ｐＩ、電荷及びイオン強度を、直接または勾配を通して、変化させることにより達成することができる。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、ある種の結合剤を用いて単離された、精製されたまたは亜分画された試料は、その後、異なる結合剤を用いて処理される。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、１つを超えるカラムが直列に使用され、複数のカラムのそれぞれが、異なる標的タンパク質に特異的な異なる結合剤を含有する。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、単一のカラムは、それぞれが異なる標的タンパク質に特異的な、複数の結合剤を含有する。
【０１２０】
いくつかの場合では、結合剤及び固体支持体は、定期的な消毒ステップの導入により再使用される。例えば、それらは、プロピレングリコール、イソプロパノール、高イオン強度、及び／または水酸化ナトリウムの組み合わせを用いて消毒することができる。
【０１２１】
６．１．試料調製
本明細書に記載の方法を使用して、エクソソームを含む様々な試料からエクソソームを、精製する、単離する、亜分画するまたは除去することができる。いくつかの実施形態では、試料は、エクソソームを含有する、清澄化された回収物質である。いくつかの場合では、試料は、当該分野で周知の精製方法により部分的に精製されたエクソソームを含む。例えば、限外ろ過／ダイアフィルトレーション、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、深層ろ過、またはイオン交換結合／溶出クロマトグラフィーを使用して、アフィニティー精製のために結合剤に接触させる前に、エクソソームを部分的に精製することができる。
【０１２２】
いくつかの場合では、部分的に精製された物質は、結合剤との所望の相互作用のために、ある特定の生理学的条件（例えば、ｐＨ、温度、塩濃度、塩タイプ、極性）を有するようにさらに処理される。試料は、希釈または濃縮して、ある特定のエクソソーム濃度を得ることにより、または賦形剤を加えて、エクソソームの構造を変化させることにより調製することができる。いくつかの場合では、部分的に精製された物質は、いずれの操作も伴わずに結合剤に接触される。
【０１２３】
６．２．結合
本明細書に記載の方法は、エクソソームの標的タンパク質及び結合剤間の特異的相互作用を必要とする。有機修飾剤、エチレングリコール、プロピレングリコール、または尿素を用いて、塩濃度、ｐＨを変える、及び／または極性を低減させることを通して、ハイスループットスクリーニングを実行して、特異的結合に理想的なバッファー条件を同定することができる。標的タンパク質及び結合剤間の相互作用は、試料条件（例えば、クロマトグラフィー樹脂の体積当たりの負荷される試料量、エクソソームの濃度、不純物の濃度）、ローディングバッファー（例えば、ｐＨ、塩濃度、塩タイプ、極性）、及び他の物理的条件（例えば、温度）に応じても変わり得る。さらに、エクソソームの構造を変える賦形剤を加えることも、それらの相互作用を変え得る。加えて、不純物及びエクソソーム間の吸着速度差異に基づいて滞留時間を調整することができる。ゆえに、本明細書に記載の様々な精製条件を試験して、本ステップに理想的な条件を同定することができる。
【０１２４】
同様の手法を使用して、純度及び収率を改善し、エクソソームの亜集団の、富化、枯渇または単離を助けることができる。これらの特性は、負荷チャレンジを最大化し、よりストリンジェントな溶出条件を適用するとともに、エクソソームの濃度をさらに高めるために採用され得る。
【０１２５】
６．２．１．溶出
エクソソームの溶出は、塩濃度、ｐＨ、及び／または極性を、有機修飾剤、エチレングリコール、プロピレングリコール、または尿素を用いて変えることを通して、達成することができる。
【０１２６】
エクソソームの選択的溶出は、一価カチオン性ハロゲン化塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、臭化ナトリウム、塩化リチウム、ヨウ化ナトリウム、臭化カリウム、臭化リチウム、フッ化ナトリウム、フッ化カリウム、フッ化リチウム、ヨウ化リチウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸リチウム、ヨウ化カリウム）、二価または三価塩（例えば、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、硫酸カルシウム、硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、三塩化クロム、硫酸クロム、クエン酸ナトリウム、塩化鉄（ＩＩＩ）、塩化イットリウム（ＩＩＩ）、リン酸カリウム、硫酸カリウム、リン酸ナトリウム、塩化第一鉄、クエン酸カルシウム、リン酸マグネシウム、塩化第二鉄）、またはその組み合わせの、溶出バッファー中の濃度を、漸増勾配（段階的または線形）の、一価カチオン性ハロゲン化塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、臭化ナトリウム、塩化リチウム、ヨウ化ナトリウム、臭化カリウム、臭化リチウム、フッ化ナトリウム、フッ化カリウム、フッ化リチウム、ヨウ化リチウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸リチウム、ヨウ化カリウム）、二価または三価塩（例えば、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、硫酸カルシウム、硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、三塩化クロム、硫酸クロム、クエン酸ナトリウム、塩化鉄（ＩＩＩ）、塩化イットリウム（ＩＩＩ）、リン酸カリウム、硫酸カリウム、リン酸ナトリウム、塩化第一鉄、クエン酸カルシウム、リン酸マグネシウム、塩化第二鉄）、またはその組み合わせを、固定したｐＨにて、使用することで、増加させることにより達成することができる。
【０１２７】
実質的なエクソソーム純度は、カラム負荷段階中に不純物を流し、選択的賦形剤洗浄中に不純物を溶出し、溶出中に生成物を選択的に溶出する一方でカラムに結合した追加の不純物を残すことにより、達成することができる。カラム溶出液から測定される吸光度は、この方法により得られたエクソソームの精製を示すことができる。
【０１２８】
溶出は、ｐＨ範囲、塩、有機溶媒、低分子、洗浄剤、両性イオン、アミノ酸、ポリマー、温度、及び上記の任意の組み合わせを調節することによっても達成することができる。類似の溶出剤を使用して、純度を改善する、収率を改善する、及びエクソソームの亜集団を単離することができる。
【０１２９】
溶出は、異なる特性、例えばｐＨ、塩、有機溶媒、低分子、洗浄剤、両性イオン、アミノ酸、ポリマー、温度、及び上記の任意の組み合わせを有する、複数の溶出バッファーを用いて行うこともできる。複数の溶出画分を収集することができ、各画分で収集されたエクソソームは、異なる特性を有する。例えば、ある画分で収集されたエクソソームは、他の画分のエクソソームよりも、高い純度、小さいまたは大きい平均サイズ、好ましい組成等を有する。
【０１３０】
複数の溶出画分を収集する一方で、異なる特性を有する溶出バッファーを連続流として供給することができる。溶出画分は、イソクラティック溶出または勾配溶出中に収集することができる。少なくとも１つの溶出画分が収集されたら、溶出画分の組成を分析することができる。例えば、エクソソームの濃度、宿主細胞タンパク質、夾雑タンパク質、ＤＮＡ、炭水化物、または脂質を、各溶出画分において測定することができる。各溶出画分におけるエクソソームの他の特性も測定することが出る。特性には、平均サイズ、平均電荷密度、及び生体内分布、細胞取り込み、半減期、薬力学、効力、投与量、免疫応答、負荷効率、安定性、または他の化合物に対する反応性に関する他の生理学的な特性が含まれる。
【０１３１】
６．２．２．洗浄
任意選択で、エクソソームの純度は、溶出の前に試料を洗浄することにより、さらに改善することができる。いくつかの実施形態では、賦形剤は、洗浄バッファーであることができる。賦形剤は、特定のｐＨ範囲、塩、有機溶媒、低分子、洗浄剤、両性イオン、アミノ酸、ポリマー、及び上記の任意の組み合わせを有する溶液であることができる。
【０１３２】
より具体的には、賦形剤は、アルギニン、リジン、グリシン、ヒスチジン、カルシウム、ナトリウム、リチウム、カリウム、ヨウ化物、マグネシウム、鉄、亜鉛、マンガン、尿素、プロピレングリコール、アルミニウム、アンモニウム、グアニジニウムポリエチレングリコール、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、洗浄剤、塩化物、硫酸塩、カルボン酸、シアル酸、リン酸塩、酢酸塩、グリシン、ホウ酸塩、ギ酸塩、過塩素酸塩、臭素、硝酸塩、ジチオトレイトール、ベータメルカプトエタノール、またはリン酸トリ−ｎ−ブチルを含むことができる。
【０１３３】
賦形剤は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能な、セチルトリメチルアンモニウムクロリド、オクトキシノール−９、ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００（すなわち、ポリエチレングリコールｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテル）及びＴＲＩＴＯＮ（商標）ＣＧ−１１０；ドデシル硫酸ナトリウム；ラウリル硫酸ナトリウム；デオキシコール酸；ポリソルベート８０（すなわち、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）；ポリソルベート２０（すなわち、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）；アルコールエトキシレート；アルキルポリエチレングリコールエーテル；デシルグルコシド；オクトグルコシド；ＳａｆｅＣａｒｅ；ＤＯＷ  Ｃｈｅｍｉｃａｌから入手可能な、ＥＣＯＳＵＲＦ（商標）ＥＨ９、ＥＣＯＳＵＲＦ（商標）ＥＨ６、ＥＣＯＳＵＲＦ（商標）ＥＨ３、ＥＣＯＳＵＲＦ（商標）ＳＡ７、及びＥＣＯＳＵＲＦ（商標）ＳＡ９；ＢＡＳＦから入手可能な、ＬＵＴＥＮＳＯＬ（商標）Ｍ５、ＬＵＴＥＮＳＯＬ（商標）ＸＬ、ＬＵＴＥＮＳＯＬ（商標）ＸＰ及びＡＰＧ（商標）３２５Ｎ；ＡＩＲ  ＰＲＯＤＵＣＴＳから入手可能な、ＴＯＭＡＤＯＬ（商標）９００；ＣＲＯＤＡから入手可能な、ＮＡＴＳＵＲＦ（商標）２６５；Ｂｅｓｔｃｈｅｍから入手可能な、ＳＡＦＥＣＡＲＥ（商標）１０００、ＤＯＷから入手可能な、ＴＥＲＧＩＴＯＬ（商標）Ｌ６４；カプリル酸；Ｌｕｂｒｉｚｏｌから入手可能な、ＣＨＥＭＢＥＴＡＩＮＥ（商標）ＬＥＣ；及びＭａｃｋｏｌ  ＤＧからなる群より選択される、洗浄剤も含むことができる。
【０１３４】
６．３．結果を改善するための他の方法
クロマトグラフィー樹脂の体積当たりに負荷することができるエクソソームの量は、供給物質を調節する、例えば、エクソソームの濃度を増加させる、不純物の濃度を低減させる、ｐＨを変える、塩濃度を低減させる、イオン強度を低減させる、またはエクソソームの特定の亜集団を変えることにより、改善することができる。物質移動の制約及び樹脂へのエクソソームの吸着と脱着の遅さにより、クロマトグラフィー樹脂の体積当たりに負荷することができるエクソソームの量は、カラム負荷中の流速を遅くし、より長いカラムを採用して、滞留時間を長くすることにより増加させることができる。
【０１３５】
７．用途
７．１．エクソソームの精製
エクソソームを医療目的で使用するには、エクソソームが、マクロ分子、例えば核酸、夾雑タンパク質、脂質、炭水化物、代謝産物、低分子、金属、またはその組み合わせを含むがこれらに限定されない不純物を含まないまたはほとんど含まないことが求められる。本発明は、夾雑マクロ分子からエクソソームを精製する方法を提供する。いくつかの実施形態では、精製エクソソームは、夾雑マクロ分子を実質的に含まない。
【０１３６】
７．２．エクソソームの亜分画
本発明の実施形態は、その膜タンパク質、サイズ、電荷密度、リガンドタイプ（例えば、テトラスパニン）及びヘパリンまたは他の硫酸化炭水化物結合部位に基づいて、エクソソームの集団を亜分画するための方法をさらに提供する。親和性タグ、ローディング及び溶出バッファー組成及びプロトコルの選択は、エクソソームの異なる亜集団の溶出をもたらすことができる。
【０１３７】
例えば、本発明の実施形態は、小さいまたは大きいサイズのエクソソームの集団を精製する方法を提供する。エクソソームのサイズは、当該分野で利用可能な方法により決定することができる。例えば、サイズは、ナノ粒子トラッキング解析、多角度光散乱、単一角度光散乱、サイズ排除クロマトグラフィー、超遠心分析、流動場分離法、レーザー回析、可変抵抗パルスセンシング、または動的光散乱法により測定することができる。
【０１３８】
本発明の実施形態は、その電荷密度に基づいてエクソソームを亜分画する方法にさらに関する。エクソソームの電荷密度は、電位差滴定、陰イオン交換、陽イオン交換、等電点電気泳動、ゼータ電位、キャピラリー電気泳動、キャピラリーゾーン電気泳動、ゲル電気泳動により決定することができる。
【０１３９】
本発明の実施形態は、他の生理学的な特性、例えば生体内分布、細胞取り込み、半減期、薬力学、効力、投与量、免疫応答、負荷効率、安定性、または他の化合物に対する反応性に基づいて、エクソソームを亜分画する方法にも関する。この方法は、特定の用途に適切であるエクソソームの集団の単離を可能とする。
【０１４０】
８．エクソソームの特徴決定
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、各収集画分に含有されるエクソソームを特徴決定するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、エクソソームの内容物を、研究及び特徴決定のために抽出することができる。いくつかの実施形態では、エクソソームは、サイズ、形状、形態、または分子組成、例えば核酸、タンパク質、代謝産物、及び脂質を含むがこれらに限定されないメトリックによって単離及び特徴決定される。
【０１４１】
８．１．エクソソームの内容物の測定
エクソソームは、タンパク質、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、及び脂質を含むことができる。総ＲＮＡは、酸性フェノール：クロロホルム抽出を使用して抽出することができる。次いで、ＲＮＡを、ガラス繊維フィルターを、低分子ＲＮＡを含有する総ＲＮＡを回収する、またはｍＲＮＡなどのより長いＲＮＡ種から２００ヌクレオチド長未満の低分子ＲＮＡ種を分離するという条件下で使用して、精製することができる。ＲＮＡが少量で溶出されるため、アルコール沈殿ステップはＲＮＡの単離に必要ないだろう。
【０１４２】
エクソーム組成物は、トランスクリプトミックス、配列決定、プロテオミックス、質量分析、またはＨＰ−ＬＣを含むが、これらに限定されない当該分野で公知の方法により評価され得る。
【０１４３】
（ＲＮＡ及びＤＮＡを含む）単離されたエクソソームに関連するヌクレオチドの組成は、当業者に周知の様々な技術（例えば、定量的または半定量的ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット分析、溶液ハイブリダイゼーション検出）を使用して測定することができる。特定の実施形態では、少なくとも１種のＲＮＡのレベルは、エクソソーム組成からＲＮＡを逆転写して標的オリゴデオキシヌクレオチドのセットを提供し、この標的オリゴデオキシヌクレオチドを１つまたは複数のＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイ）にハイブリダイズさせて、エクソソーム組成のハイブリダイゼーションプロファイルを提供し、エクソソーム組成ハイブリダイゼーションプロファイルを、対照試料から生成されたハイブリダイゼーションプロファイルと比較することにより、測定される。対照試料と対比した検査試料中の少なくとも１種のＲＮＡのシグナルの変化は、ＲＮＡ組成を示す。
【０１４４】
また、マイクロアレイは、公知のＲＮＡ配列から生成された遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブから調製することができる。このアレイは、２つの異なるオリゴヌクレオチドプローブを各ＲＮＡに関して含有することができ、一方は活性な成熟配列を含有し、他方はＲＮＡの前駆体（例えばｍｉＲＮＡ及び初期ｍｉＲＮＡ）に特異的である。アレイは、数塩基のみがヒトオルソログと異なる１つまたは複数のマウス配列などの対照も含有することができ、これはハイブリダイゼーションのストリンジェンシー条件の対照として機能できる。両種からのｔＲＮＡ及び他のＲＮＡ（例えば、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ）を、マイクロチップ上にプリントすることもでき、これが特異的ハイブリダイゼーションのための、内部の比較的安定した陽性対照となる。非特異的ハイブリダイゼーションのための１つまたは複数の適切な対照も、マイクロチップ上に含めることができる。この目的のためには、どのような公知のＲＮＡとも全く相同性が存在しないことを基準に配列が選択される。
【０１４５】
マイクロアレイは、当該分野で公知の方法を使用して製作することが出来る。例えば、適当な長さ、例えば４０ヌクレオチドのプローブオリゴヌクレオチドをＣ６位で５’−アミン修飾し、市販のマイクロアレイシステム、例えば、ＧｅｎｅＭａｃｈｉｎｅ  ＯｍｎｉＧｒｉｄ（商標）１００  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｅｒ及びＡｍｅｒｓｈａｍ  ＣｏｄｅＬｉｎｋ（商標）を使用して活性化スライド上にプリントする。標的ＲＮＡに対応する標識ｃＤＮＡオリゴマーを、標識プライマーを用いて標的ＲＮＡを逆転写することにより調製する。第一の鎖合成の後、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを変性させ、ＲＮＡ鋳型を分解する。次いで、このように調製された標識された標的ｃＤＮＡを、例えば６×ＳＳＰＥ／３０％フォルムアミド、２５℃にて１８時間というハイブリダイゼーション条件下でマイクロアレイチップにハイブリダイズさせ、０．７５×ＴＮＴ中で３７℃にて４０分間洗浄する。固定されたプローブＤＮＡが試料中の相補的な標的ｃＤＮＡを認識するアレイ上の位置で、ハイブリダイゼーションが生じる。この標識された標的ｃＤＮＡは、結合が生じたアレイ上の正確な位置の印となり、自動検出及び定量が可能となる。アウトプットは、エクソソーム調製物中の特定のｃＤＮＡ配列の相対存在量、従って対応する相補的ＲＮＡの相対存在量を示す、ハイブリダイゼーション事象のリストからなる。一実施形態に従い、標識ｃＤＮＡオリゴマーはビオチン標識ｃＤＮＡであり、ビオチン標識プライマーから調製される。マイクロアレイは次いで、例えば、ストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ６４７コンジュゲートを用いたビオチン含有転写産物の直接的検出によって処理され、通常のスキャニング法を利用してスキャンされる。アレイ上の各スポットの画像強度は、エクソソーム中の対応するＲＮＡの存在量に比例する。
【０１４６】
データマイニング作業は、チップの走査、信号収集、画像処理、正規化、統計学的処理及びデータ比較ならびに経路分析を含む生物情報学により達成される。このように、マイクロアレイは、高いスループット能で、数百、数千のポリヌクレオチドを同時にプロファイリングできる。ｍＲＮＡ発現のマイクロアレイプロファイリング分析は、基礎研究において遺伝子発現研究に有益なデータを提供することに成功している。そして、この技術は、製薬産業及び臨床診断において実践されてきた。利用可能になるｍｉＲＮＡデータの量の増大及び遺伝子制御におけるｍｉＲＮＡの重要性についての証拠の蓄積に伴い、マイクロアレイは高スループットｍｉＲＮＡ研究に有用な技術となっている。ポリヌクレオチドプローブを利用するｍｉＲＮＡレベルの分析は、様々な物理的フォーマットにおいても実施することができる。例えば、マイクロタイタープレートの使用または自動操作を使用して、多数の検査試料のプロセシングを容易にすることができる。
【０１４７】
８．２．エクソソームのサイズの測定
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、精製された画分に含まれるエクソソーム及び／またはエクソソームの集団のサイズを測定することを含む。いくつかの実施形態では、エクソソームサイズは、最長の測定可能な寸法として測定される。一般に、エクソソームの最長の全体寸法は、その直径とも称される。
【０１４８】
エクソソームサイズは、当該分野で公知の様々な方法、例えば、ナノ粒子トラッキング解析、多角度光散乱、単一角度光散乱、サイズ排除クロマトグラフィー、超遠心分析、流動場分離法、レーザー回析、可変抵抗パルスセンシング、または動的光散乱法を使用して測定することができる。
【０１４９】
エクソソームサイズは、動的光散乱法（ＤＬＳ）及び／または多角度光散乱検出器（ＭＡＬＳ）を使用して測定することができる。エクソソームのサイズを測定するためにＤＬＳ及び／またはＭＡＬＳを使用する方法は、当業者に公知であり、ナノ粒子トラッキングアッセイ（ＮＴＡ、例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ  ＮＳ３００ナノ粒子トラッキングデバイスを使用する）が含まれる。特定の実施形態では、エクソソームサイズは、Ｍａｌｖｅｒｎ  ＮａｎｏＳｉｇｈｔ  ＮＳ３００を使用して決定される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のエクソソームは、ＮＴＡ（例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ  ＮａｎｏｓｉｇｈｔＮＳ３００を使用する）により測定して約２０〜１０００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソームは、ＮＴＡ（例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ  ＮａｎｏｓｉｇｈｔＮＳ３００を使用する）により測定して約４０〜１０００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソーム集団は、前記エクソソームの９０％が、ＮＴＡ（例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ  ＮＳ３００を使用する）により測定して約２０〜１０００ｎｍの最長寸法を有する、集団を含む。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソーム集団は、前記エクソソームの９５％が、ＮＴＡ（例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ  ＮＳ３００を使用する）により測定して約２０〜１０００ｎｍの最長寸法を有する、集団を含む。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソーム集団は、前記エクソソームの９９％が、ＮＴＡ（例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ  ＮＳ３００を使用する）により測定して約２０〜１０００ｎｍの最長寸法を有する、集団を含む。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソーム集団は、前記エクソソームの９０％が、ＮＴＡ（例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ  ＮＳ３００を使用する）により測定して約４０〜１０００ｎｍの最長寸法を有する、集団を含む。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソーム集団は、前記エクソソームの９５％が、ＮＴＡ（例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ  ＮＳ３００を使用する）により測定して約４０〜１０００ｎｍの最長寸法を有する、集団を含む。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソーム集団は、前記エクソソームの９９％が、ＮＴＡ（例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ  ＮＳ３００を使用する）により測定して約４０〜１０００ｎｍの最長寸法を有する、集団を含む。
【０１５０】
エクソソームサイズは、可変抵抗パルスセンシング（ＴＲＰＳ）を使用して測定することができる。特定の実施形態では、ＴＲＰＳにより測定されるエクソソームサイズは、ｉＺＯＮ  ｑＮＡＮＯ  Ｇｏｌｄを使用して決定される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のエクソソームは、ＴＲＰＳ（例えば、ｉＺＯＮ  ｑＮａｎｏ  Ｇｏｌｄを使用する）により測定して約２０〜１０００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソームは、ＴＲＰＳ（例えば、ｉＺＯＮ  ｑＮａｎｏ  Ｇｏｌｄを使用する）により測定して約４０〜１０００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソーム集団は、前記エクソソームの９０％が、ＴＲＰＳ（例えば、ｉＺＯＮ  ｑＮａｎｏ  Ｇｏｌｄを使用する）により測定して約２０〜１０００ｎｍの最長寸法を有する、集団を含む。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソーム集団は、前記エクソソームの９５％が、ＴＲＰＳ（例えば、ｉＺＯＮ  ｑＮａｎｏ  Ｇｏｌｄを使用する）により測定して約２０〜１０００ｎｍの最長寸法を有する、集団を含む。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソーム集団は、前記エクソソームの９９％が、ＴＲＰＳ（例えば、ｉＺＯＮ  ｑＮａｎｏ  Ｇｏｌｄを使用する）により測定して約２０〜１０００ｎｍの最長寸法を有する、集団を含む。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソーム集団は、前記エクソソームの９０％が、ＴＲＰＳ（例えば、ｉＺＯＮ  ｑＮａｎｏ  Ｇｏｌｄを使用する）により測定して約４０〜１０００ｎｍの最長寸法を有する、集団を含む。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソーム集団は、前記エクソソームの９５％が、ＴＲＰＳ（例えば、ｉＺＯＮ  ｑＮａｎｏ  Ｇｏｌｄを使用する）により測定して約４０〜１０００ｎｍの最長寸法を有する、集団を含む。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソーム集団は、前記エクソソームの９９％が、ＴＲＰＳ（例えば、ｉＺＯＮ  ｑＮａｎｏ  Ｇｏｌｄを使用する）により測定して約４０〜１０００ｎｍの最長寸法を有する、集団を含む。
【０１５１】
エクソソームサイズは、電子顕微鏡を使用して測定することができる。いくつかの実施形態では、エクソソームサイズを測定するために使用される電子顕微鏡法は、透過型電子顕微鏡法である。特定の実施形態では、エクソソームサイズを測定するために使用される透過型電子顕微鏡は、Ｔｅｃｎａｉ（商標）Ｇ２  Ｓｐｉｒｉｔ  ＢｉｏＴＷＩＮである。電子顕微鏡を使用してエクソソームサイズを測定する方法は、当業者に周知であり、任意のかかる方法は、エクソソームサイズを測定するのに適切であることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のエクソソームは、走査電子顕微鏡（例えば、Ｔｅｃｎａｉ（商標）Ｇ２  Ｓｐｉｒｉｔ  ＢｉｏＴＷＩＮ走査電子顕微鏡）により測定して約２０〜１０００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソームは、走査電子顕微鏡（例えば、Ｔｅｃｎａｉ（商標）Ｇ２  Ｓｐｉｒｉｔ  ＢｉｏＴＷＩＮ走査電子顕微鏡）により測定して約４０〜１０００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソーム集団は、前記エクソソームの９０％が、走査電子顕微鏡（例えば、Ｔｅｃｎａｉ（商標）Ｇ２  Ｓｐｉｒｉｔ  ＢｉｏＴＷＩＮ走査電子顕微鏡）により測定して約２０〜１０００ｎｍの最長寸法を有する、集団を含む。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソーム集団は、前記エクソソームの９５％が、走査電子顕微鏡（例えば、Ｔｅｃｎａｉ（商標）Ｇ２  Ｓｐｉｒｉｔ  ＢｉｏＴＷＩＮ走査電子顕微鏡）により測定して約２０〜１０００ｎｍの最長寸法を有する、集団を含む。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソーム集団は、前記エクソソームの９９％が、走査電子顕微鏡（例えば、Ｔｅｃｎａｉ（商標）Ｇ２  Ｓｐｉｒｉｔ  ＢｉｏＴＷＩＮ走査電子顕微鏡）により測定して約２０〜１０００ｎｍの最長寸法を有する、集団を含む。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソーム集団は、前記エクソソームの９０％が、走査電子顕微鏡（例えば、Ｔｅｃｎａｉ（商標）Ｇ２  Ｓｐｉｒｉｔ  ＢｉｏＴＷＩＮ走査電子顕微鏡）により測定して約４０〜１０００ｎｍの最長寸法を有する、集団を含む。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソーム集団は、前記エクソソームの９５％が、走査電子顕微鏡（例えば、Ｔｅｃｎａｉ（商標）Ｇ２  Ｓｐｉｒｉｔ  ＢｉｏＴＷＩＮ走査電子顕微鏡）により測定して約４０〜１０００ｎｍの最長寸法を有する、集団を含む。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソーム集団は、前記エクソソームの９９％が、走査電子顕微鏡（例えば、Ｔｅｃｎａｉ（商標）Ｇ２  Ｓｐｉｒｉｔ  ＢｉｏＴＷＩＮ走査電子顕微鏡）により測定して約４０〜１０００ｎｍの最長寸法を有する、集団を含む。
【０１５２】
８．３．エクソソームの電荷密度の測定
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、精製された画分に含まれるエクソソーム及び／またはエクソソームの集団の電荷密度を測定することを含む。いくつかの実施形態では、電荷密度は、電位差滴定、陰イオン交換、陽イオン交換、等電点電気泳動、ゼータ電位、キャピラリー電気泳動、キャピラリーゾーン電気泳動、またはゲル電気泳動により測定される。
【０１５３】
８．４．エクソソームタンパク質の密度の測定
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、エクソソーム表面上のエクソソームタンパク質の密度を測定することを含む。表面密度は、単位面積質量、面積当たりのタンパク質の数、エクソソーム当たりの分子の数または分子の強度、タンパク質のモル量、等として計算または提示することができる。表面密度は、当該分野で公知の方法により、例えば、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）、ＦＡＣＳ、ウェスタンブロッティング、蛍光（例えば、ＧＦＰ融合タンパク質）検出、ナノ−フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、ａｌｐｈａＬＩＳＡ、及び／またはタンパク質ゲル上のバンドを測定することによるデンシトメトリーを使用することにより、実験的に測定することができる。
【実施例】
【０１５４】
以下の実施例は、本発明をどのように実施し用いるのかを当業者に完全に開示し記載するためのものであって、本発明者らが彼らの発明であるとみなすものの範囲を限定することを意図するものではなく、以下の実験が全てであるまたはこれらのみが行われたと示すことを意図するものでもない。用いられる数値（例えば量、温度等）に関し、正確性を確保するよう努力が払われているが、実験的誤差及び偏差を考慮に入れなければならない。別段の指定がない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子重量であり、温度は摂氏温度であり、圧力は大気圧または大気圧付近である。標準的な略語を使用することができる、例えば、ｂｐ、塩基対（複数可）；ｋｂ、キロ塩基（複数可）；ｐｌ、ピコリットル（複数可）；ｓまたはｓｅｃ、秒（複数可）；ｍｉｎ、分（複数可）；ｈまたはｈｒ、時間（複数可）；ａａ、アミノ酸（複数可）；ｎｔ、ヌクレオチド（複数可）；等である。
【０１５５】
本発明の実践には、別段の指示がない限り、当該分野の技術範囲内で、タンパク質化学、生化学、組み換えＤＮＡ技術及び薬理学の従来の方法を採用するだろう。このような技術は、文献において十分に説明される。例えば、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）；ＡＬ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｄｄｉｔｉｏｎ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ  ａｎｄ  Ｎ．Ｋａｐｌａｎ  ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２１ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，２００５）；Ｃａｒｅｙ  ａｎｄ  Ｓｕｎｄｂｅｒｇ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３ｒｄ  Ｅｄ．（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ）Ｖｏｌｓ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ（ｌ９９２）を参照されたい。
【０１５６】
実施例１：エクソソームタンパク質の同定
１．エクソソームの収集
エクソソームを、９日後にＨＥＫ２９３  ＳＦ細胞の高密度懸濁培養物の上清から収集した。上清を濾過し、陰イオン交換クロマトグラフィーにより分画し、塩化ナトリウムの段階勾配にて溶出した。タンパク質濃度が最も高いピーク画分は、エクソソーム及び夾雑細胞成分を含有した。ピーク画分を単離し、超遠心分離によりＯｐｔｉｐｒｅｐ（商標）（６０％イオジキサノールｗ／ｖ）密度勾配でさらに分画した。
【０１５７】
エクソソーム画分を、３８．５ｍＬウルトラクリア（３４４０５８）チューブ内、ＳＷ  ３２  Ｔｉローターを１３３，９００×ｇで３時間４℃にて超遠心分離することより、濃縮した。ペレット化した物質を、１ｍＬ  ＰＢＳ及び３ｍＬのＯｐｔｉｐｒｅｐ（商標）に再懸濁し、最終イオジキサノール濃度を４５％とした。Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（商標）勾配に関しては、４段滅菌勾配を、ＳＷ  ４１  Ｔｉローター用に、１２ｍＬウルトラクリア（３４４０５９）チューブ中に、再懸濁物質を含有する４ｍＬの４５％イオジキサノール、３ｍＬの３０％イオジキサノール、２ｍＬの２２．５％イオジキサノール、２ｍＬの１７．５％イオジキサノール、及び１ｍＬ  ＰＢＳを用いて調製した。Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（商標）勾配を、１５０，０００×ｇで１６時間４℃にて超遠心分離して、エクソソーム画分を分離した。超遠心分離により、エクソソームを含有すると知られている上部画分、中密度の細胞デブリを含有する中間画分、及び高密度凝集体及び細胞デブリを含有する下部画分がもたらされた（図１）。エクソソーム層を、次いで、チューブの上部約３ｍＬから穏やかに収集した。
【０１５８】
エクソソーム画分を、３８．５ｍＬウルトラクリア（３４４０５８）チューブ内で約３２ｍＬ  ＰＢＳに希釈し、１３３，９００×ｇで３時間４℃にて超遠心分離して、精製エクソソームをペレット化した。ペレット化エクソソームを、次いで、最小容量のＰＢＳ（約２００μＬ）に再懸濁し、４℃にて保管した。
【０１５９】
２．ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析のための試料調製
エクソソームに特異的なタンパク質を決定するために、Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（商標）勾配の上部画分及び下部画分を、液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析により分析した。全ての試料は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）バッファーまたはＰＢＳ及び５％スクロースのいずれかにて受け取った。分析の前に、各試料の総タンパク質濃度を、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイにより決定し、その後、各試料を、ＰＢＳバッファー中１２５μｇ／ｍＬに適切に希釈した。次に、５０．０μＬの各試料を、等量のエクソソーム溶解バッファー（６０ｍＭトリス、４００ｍＭ  ＧｄｍＣｌ、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭ  ＴＣＥＰ、１．０％トリトンＸ−１００）を含有する別々の１．５ｍＬ微量遠心チューブに加えて、その後２．０μＬの１．０％トリトンＸ−１００溶液を移した。次いで、全ての試料を５５℃にて６０分間インキュベートした。
【０１６０】
タンパク質の沈殿は、１２５０μＬのエタノールを−２０℃にて加えることによって行った。効率を改善するために、試料を、おおよそ１０分間激しくボルテックスし、次いで、−２０℃にて６０分間インキュベートした。インキュベーション後、試料を、ウォーターバスで５分間超音波処理した。沈殿した物質を、５分間、１５，０００ｇで４℃にて遠心分離することによりペレット化した。上清をデカントし、ペレット化物質を、窒素ガスを使用して完全に乾燥させた。ペレットを、３０．０μＬ消化バッファー（３０ｍＭトリス、１．０Ｍ  ＧｄｍＣｌ、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  ＴＣＥＰ、ｐＨ８．５）に再懸濁し、またこれはジスルフィド結合を還元した。遊離システイン残基を、５．０μＬアルキル化溶液（３７５ｍＭヨードアセトアミド、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．５）を加え、得られた溶液を室温にて暗所で少なくとも３０分間インキュベートすることによりアルキル化した。
【０１６１】
インキュベーション後、各試料を、３０．０μＬの５０ｍＭトリスｐＨ８．５を使用して希釈し、タンパク質分解性消化を、２．０μｇトリプシンを加えることにより開始した。全ての試料を混合し、次いで、一晩３７℃にてインキュベートした。インキュベーション後、トリプシン活性を、５．０μＬの１０％ギ酸を加えることにより停止させた。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる分析の前に、各試料を、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃ１８スピンカラムを使用して脱塩した。このプロセスの最後に、各試料を乾燥させ、０．１％ギ酸を含む５０．０μＬの水にて再構成し、ＨＰＬＣバイアルに移して、分析した。
【０１６２】
３．ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析
試料を、ＵｌｔｉＭａｔｅ  ３０００  ＲＳＣＬｎａｎｏ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）低流量クロマトグラフィーシステムへと注入し、トリプシンペプチドを、ローディング移動相（ＭＰＬ：水、０．１％ギ酸）を１．０００μＬ／分の流量にて使用して、Ａｃｃｌａｉｍ  ＰｅｐＭａｐ  １００  Ｃ１８トラッピングカラム（７５μｍ×２ｃｍ、３μｍ粒子サイズ、１００Å孔サイズ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）へと負荷した。ペプチドを溶出し、移動相Ａ（ＭＰＡ：水、０．１％ギ酸）及び移動相Ｂ（ＭＰＢ：アセトニトリル、０．１％ギ酸）の勾配を、３００ｎＬ／分の流量にて、ＥＡＳＹ−Ｓｐｒａｙ  Ｃ１８分析用カラム（７５μｍ×２５ｃｍ、２μｍ粒子サイズ、１００Å孔サイズ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にわたって用いて、分離した。溶出に使用した段階的な勾配は、２％ＭＰＢで開始し、これを負荷中８分間保持した。パーセンテージＭＰＢを、次いで２〜１７％に３５分間かけて、再度１７〜２５％に４５分間かけて、そして最後に２５〜４０％に１０分間かけて増加させた。最も疎水性の高い種は、９８％ＭＰＢに５分間かけて増加し、そこに１０分間保持することにより除去した。本方法の合計実行時間は１３５分で、カラムの再平衡化に十分な時間であった。洗浄サイクルを、同一でない分析用注入の間に行って、キャリーオーバーを最小限に抑えた。
【０１６３】
質量分析は、Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ  Ｂａｓｉｃ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）質量分析計を用いて行った。前駆体イオン質量スペクトルを、４００〜１６００Ｄａのｍ／ｚ範囲にわたって、７０，０００の分解能にて測定した。最も強力な１０の前駆体イオンを選択し、２７の衝突エネルギーを使用して、ＨＣＤ細胞内で断片化し、ＭＳ／ＭＳスペクトルを、２００〜２０００Ｄａのｍ／ｚ範囲にわたって、３５，０００の分解能にて測定した。２〜４の電荷状態を有するイオンを、断片化のために選択し、動的排除時間を３０秒に設定した。１４の一般的なポリシロキサンを含有する排除リストを使用して、既知の夾雑物質の誤同定を最小限に抑えた。
【０１６４】
４．データ処理
タンパク質を、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒソフトウェア（バージョン２．１．１．２１、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び標的デコイＰＳＭバリデーターと組み合わせたＳｅｑｕｅｓｔ  ＨＴアルゴリズムを使用して、まず同定し、定量化（標識不含）した。検索は、完全Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔホモサピエンス（分類９６０６バージョン２０１７−０５−１０：４２、１５３エントリ）参照データベース、ならびにＥ１ａタンパク質（７エントリー）を含有するカスタムＵｎｉｐｒｏｔデータベースに対して行った。以下の検索パラメータを使用した：酵素、トリプシン；最大２か所の未切断サイト；最小ペプチド長は６残基；１０ｐｐｍの前駆体質量許容値；及び０．０２Ｄａ断片質量許容値。検索は、特異動的修飾（Ｍの酸化；ＮまたはＱの脱アミド化；Ｓ、Ｔ、またはＹのリン酸化；ペプチド末端Ｅのピログルタミル化；及びタンパク質Ｎ末端のアセチル化）及び静的修飾（Ｃのカルバミドメチル化）も含んだ。
【０１６５】
標的デコイＰＳＭバリデーターでは、Ｓｃａｆｆｏｌｄソフトウェア（バージョン４．８．２、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．）を使用してデータが再度検索されるため、最大デルタＣｎ及び厳密及び緩和の両方の標的偽発見率（ＦＤＲ）を１に設定した。Ｓｃａｆｆｏｌｄでは、データを、さらにＸ！タンデムオープンソースアルゴリズムを使用して検索して、９９．０％のタンパク質閾値、最小２つのペプチド、及び９５％のペプチド閾値を使用してタンパク質を同定した。
【０１６６】
新規エクソソーム特異的タンパク質の同一性を決定するために、総ペプチドスペクトル一致（ＰＳＭ）を、Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（商標）勾配の上部エクソソーム画分において見いだされるタンパク質を低画分のものに対して比較した。図２に示すように、上部画分タンパク質（Ｙ軸）及び下部画分タンパク質（Ｘ軸）の間には弱い相関があった。点線より上にプロットしたタンパク質は、エクソソーム富化タンパク質を表し、一方で点線より下のものは、夾雑物富化タンパク質を表す。重要なことに、（１）プロスタグランジンＦ２受容体ネガティブレギュレーター（ＰＴＧＦＲＮ）、（２）ベイシジン（ＢＳＧ）、（３）免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー３（ＩＧＳＦ３）、（４）免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー８（ＩＧＳＦ８）、（５）インテグリンベータ−１（ＩＴＧＢ１）、（６）インテグリンアルファ−４（ＩＴＧＡ４）、（７）４Ｆ２細胞表面抗原重鎖（ＳＬＣ３Ａ２）、及び（８）ＡＴＰ輸送体タンパク質のクラス（ＡＴＰ１Ａ１、ＡＴＰ１Ａ２、ＡＴＰ１Ａ３、ＡＴＰ１Ａ４、ＡＴＰ１Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ１、ＡＴＰ２Ｂ２、ＡＴＰ２Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ４）を含む、エクソソーム画分において高度に富化したと同定された膜関連タンパク質がいくつかあった。図３〜５のトリプシンペプチドカバレッジマップに示すように、質量分析試験は、ＰＴＧＦＲＮ（図３）、ＩＧＳＦ８（図４）、及びベイシジン（図５）の広範なカバレッジをもたらした。併せて、これらの結果は、不均一集団からエクソソームを精製するまたは操作エクソソームの生成における足場として使用するのに有用であり得る精製エクソソーム集団において多くの膜貫通型タンパク質が富化したことを実証する。
【０１６７】
実施例２：表面タンパク質発現の検証
質量分析試験において同定されたエクソソーム特異的タンパク質が、エクソソームの表面上で高度に富化されたことを確認するために、タンパク質ブロッティングを、総細胞ライセート及びＨＥＫ２９３細胞からの精製されたエクソソーム集団に実行した。図６Ａに示すように、総タンパク質パターンは、総細胞ライセート（左）及びエクソソームライセート（右）の間で実質的に異なった。具体的には、約１１０ｋＤａにて強いバンドが、エクソソームライセートでは見られたが、総細胞ライセートには存在しなかった。ＰＴＧＦＲＮのウェスタンブロッティングにより、約１１０ｋＤａの予想されるサイズでのバンドが、エクソソームライセートにはあるが、細胞ライセートにはないことが明らかとなり（図６Ｂ）、このことは、ＰＴＧＦＲＮがエクソソームにおいて高度に富化され、総エクソソームライセートにおいて視覚的に検出可能であり得ることを示す。
【０１６８】
質量分析試験は、いくつかの新規エクソソーム関連膜タンパク質の存在を示した。この関連をさらに確認するために、エクソソーム画分を、自動的に形成されるＯｐｔｉｐｒｅｐ（商標）勾配で精製し、ウェスタンブロッティングにより分析した。図７Ａに示すように、総タンパク質は、勾配の全ての画分において検出され、エクソソームマーカータンパク質アリックス及びシンテニンは、画分２〜６において富化される。重要なことに、分析された新規表面マーカータンパク質はそれぞれ、これらの同じ画分において富化しており、このことは、エクソソームとの強く特異的な関連を示している（図７Ｂ）。これらの膜貫通型タンパク質が、エクソソーム上で高度に発現され、富化されているという実証は、これらのタンパク質のいずれかを対象とする結合剤を使用することによりエクソソームを精製する、ならびにこれらの新規タンパク質のいずれかに融合した異種タンパク質を含有する高発現表面改変エクソソームを生成する機会を提供する（図８）。
【０１６９】
実施例３：ＰＴＧＦＲＮのドメイン特徴決定
ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ３、及びＩＧＳＦ８は全て、図８に図示するように、Ｎ末端が細胞外／小胞外環境に面し、Ｃ末端が細胞質／エクソソーム内腔に位置し、少なくとも２つの免疫グロブリンＶ（ＩｇＶ）反復を含有するＩ型１回膜貫通型タンパク質である。ＰＴＧＦＲＮは、図２に示す質量分析において検出された最も高度に富化した表面タンパク質であった。図９Ａ及びＢに記載するＧＦＰ及び完全長ＰＴＧＦＲＮまたはＰＴＧＦＲＮの様々なＩｇＶ短縮化突然変異体間の融合タンパク質をコードする発現構築物は、ＨＥＫ２９３細胞において安定して発現した。エクソソームを、ＨＥＫ２９３細胞培養物から、実施例１に記載の方法を使用して単離し、抗ＧＦＰ抗体を使用して、ウェスタンブロッティングにより分析した。図９Ｂに示すように、ＧＦＰ及び完全長または短縮ＰＴＧＦＲＮ間の融合タンパク質の発現が、精製エクソソームにおいて検出された。興味深いことに、第一のＩｇＶドメインの欠失は、低い分子量バンド（「切断産物」としてマークした）をもたらし、これは、完全長タンパク質の過剰発現では検出できなかった。この小さな産物は、全ての短縮化突然変異体において一貫して検出され、それがプロテアーゼ切断の結果として生成されたことが示された。様々なＧＦＰ−ＰＴＧＦＲＮ融合タンパク質を含有するエクソソームを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）ＴＧＸステインフリーゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｉｎｃ．）で分析して、総エクソソームタンパク質を測定した。結果を、図１０に提供する。ＧＦＰ及び完全長ＰＴＧＦＲＮの融合タンパク質の発現は、精製エクソソームにおいて総タンパク質の約５０％という高さのレベルにて、容易に検出可能であり、非常に豊富であった（レーン２）。低い分子量切断産物（「切断産物」としてマークした）は、はっきりと見えないため、ネイティブエクソソームまたはエクソソーム過剰発現完全長ＰＴＧＦＲＮでは存在せず（レーン１及び２）、このことは、タンパク質のＮ末端にある第一のＩｇＶドメイン（ＩｇＶ１）が、ＰＴＧＦＲＮの切断を防ぎ得ることを示す。
【０１７０】
完全長ＰＴＧＦＲＮ及び様々な短縮ＰＴＧＦＲＮ突然変異体を、次いで、Ｎ末端ＦＬＡＧタグを用いてＨＥＫ２９３細胞において安定的に発現させた（図１１Ａ）。細胞培養物からのエクソソームを収集し、抗ＦＬＡＧ抗体を用いてウェスタンブロッティングにより分析した。結果を、図１１Ｂに提供する。そのＣ末端にＧＦＰを有する融合タンパク質（図９及び１０）とは対照的に、Ｎ末端にＦＬＡＧタグを含有する融合タンパク質は、低分子量バンドを示さず（図１１Ｂで「切断産物無し」とマークした）、より短い短縮化が低レベルにて検出された。この結果は、切断事象が、ウェスタンブロッティングに使用されるＦＬＡＧエピトープに連結したタンパク質のＮ末端を除去する可能性が高いことを示す（図１１Ｂ）。
【０１７１】
ＰＴＧＦＲＮは、細胞ライセートにおいてほとんど検出されず、インタクト及び切断ＰＴＧＦＲＮの混合物が、精製エクソソームにおいて検出され、これは、図６Ａ及びＢにおいて提供したウェスタンブロット結果によって示される通りである。これは、ＰＴＧＦＲＮが、エクソソーム膜に局在化し統合されている間、またはエクソソームの形成中に切断されていることを示す。ＡＤＡＭ１０（ディスインテグリン及びメタロプロテアーゼドメイン１０）は、従来のエクソソームタンパク質及び膜関連メタロプロテアーゼである。ＨＥＫ２９３細胞を、Ｃａｓ９及びＡＤＡＭ１０遺伝子座を標的とする４つのガイドＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ３２１７４＿ＳＧ、ＣＲＩＳＰＲ７２６９２８＿ＳＧ、ＣＲＩＳＰＲ７２６９３１＿ＳＧ、及びＣＲＩＳＰＲ７２６９３３＿ＳＧ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でトランスフェクトして、ＡＤＡＭ１０ノックアウト細胞を生成した。ＡＤＡＭ１０ノックアウト細胞（ＡＤＡＭ１０−）または野生型細胞（ＡＤＡＭ１０＋）を次いで、ＧＦＰに融合した完全長ＰＴＧＦＲＮを含有する融合タンパク質をコードする構築物またはＧＦＰに融合した最初の３つのＩｇＶドメインを欠く短縮ＰＴＧＦＲＮ（ＰＴＧＦＲＮ＿ＩｇＶ３−ＧＦＰ）を含有する異なる融合タンパク質のいずれかを用いて安定的にトランスフェクトした。エクソソームを、これらの細胞から単離し、融合タンパク質の発現を、総タンパク質ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティングにより抗ＧＦＰ抗体を使用して測定した。図１２Ａは、各レーンに同等量の総タンパク質が負荷されたことを示す。抗ＡＤＡＭ１０抗体（ａｂ１２４６９５；Ａｂｃａｍ）を使用するウェスタンブロッティングは、ノックアウト細胞におけるＡＤＡＭ１０の有効な欠失を示した（図１２Ｂ）。抗ＧＦＰ抗体を使用するウェスタンブロッティングは、図１２Ｃに提供するように、野生型（ＡＤＡＭ１０＋）及びＡＤＡＭ１０ノックアウト細胞（ＡＤＡＭ１０−）の両方において完全長ＰＴＧＦＲＮ及びＧＦＰを含有する融合タンパク質の高レベル発現を示した（レーン１及び２）。この結果は、完全長ＰＴＧＦＲＮを含有する融合タンパク質の切断が検出されなかった図９Ｂの結果と一致する。興味深いことに、ＰＴＧＦＲＮ＿ＩｇＶ３−ＧＦＰに関して以前に検出された切断産物は、野生型細胞では検出されたが、ＡＤＡＭ１０ノックアウト細胞には存在しなかった（図１２Ｃ、レーン３及び４）。このことは、ＡＤＡＭ１０が、エクソソームのＰＴＧＦＲＮ断片の切断を媒介することを示す。この結果は、短縮ＰＴＧＦＲＮ断片を含有する融合タンパク質が、ＡＤＡＭ１０を欠く（ＡＤＡＭ１０−）細胞からのエクソソームでよりうまく発現され得ることも示す。
【０１７２】
ＰＴＧＦＲＮは、高密度エクソソーム装飾／負荷のための魅力的な融合パートナーとして使用することができるが、そのサイズ（約１００ｋＤａ）のために、より小さな短縮バージョンが、大きな生物学的に活性な分子の共発現を可能にするために好ましいだろう。ＩｇＶ短縮化突然変異体のそれぞれにおいて検出されたＡＤＡＭ１０依存性切断は、ある特定の割合（％）の任意の融合タンパク質がエクソソーム表面から切断され、負荷／表示の程度を低下し得るため、高密度負荷に関して問題を有する。プロテアーゼ切断を被らずに高密度エクソソーム表面表示を促進する最小ＰＴＧＦＲＮ断片を同定するために、６つのＩｇＶドメインのうちの５つを欠くＰＴＧＦＲＮ（ＰＴＧＦＲＮ＿ＩｇＶ６）を、ＦＬＡＧタグ及び融合パートナータンパク質への融合体として発現させた（図１３）。ＰＴＧＦＲＮ＿ＩｇＶ６を含有する融合タンパク質の発現により、以前に同定された予測切断産物が得られた（図１４Ｂ、番号４５１）。同時に４個の追加のアミノ酸を欠くＰＴＧＦＲＮ＿ＩｇＶ６の連続短縮化突然変異体も検査し、１２個のアミノ酸の除去により、ＰＴＧＦＲＮの切断を受けなかったエクソソームが得られた（図１４Ａ、図１４Ｂ、番号４５４）。ＰＴＧＦＲＮ番号４５４は、配列番号３３のポリペプチドである。加えて、ＦＬＡＧタグが、切断部位のＮ末端にあるため、ＰＴＧＦＲＮ＿ＩｇＶ６のより短い短縮化は、融合タンパク質のより高い発現をもたらし、このことは、切断はこれらの短縮化では生じないことを示す（図１４Ｃ）。
【０１７３】
図１５に提供する結果は、完全長ＰＴＧＦＲＮ（ＦＬ）及びＰＴＧＦＲＮ＿４５４（ｓＩｇＶ）が、エクソソーム上及び／または内の内腔（Ｃ末端融合）または表面（Ｎ末端）タンパク質の高密度発現に関して理想的な融合パートナーであり得ることをさらに示す。この仮説を検証するために、数種の足場タンパク質を、高密度表示エクソソームを産生する能力に関して検査した。足場タンパク質及びＧＦＰを含有する融合タンパク質を、具体的には、しばしば使用されるｐＤｉｓｐｌａｙ足場（ＰＤＧＦ受容体）、ＰａｌｍＰａｌｍ（パルミトイル化配列）、ＣＤ８１、または完全長ＰＴＧＦＲＮ（ＦＬ）もしくはＰＴＧＦＲＮ＿４５４（ｓＩｇＶ）のいずれかの内腔側に融合したＧＦＰを含有する融合タンパク質を、細胞培養物において発現させた。各融合タンパク質を安定的に発現する細胞から精製されたエクソソームの用量滴定により、ＰＴＧＦＲＮ融合タンパク質が、周知のエクソソームタンパク質ＣＤ８１を含むいずれの他の足場よりも大きなＧＦＰ蛍光をもたらしたことが実証された。ｐＤｉｓｐｌａｙ足場と比較して、完全長ＰＴＧＦＲＮ及びｓＩｇＶは、負荷効率において２５倍を超える亢進をもたらした（図１５）。これらの結果は、完全長ＰＴＧＦＲＮまたは切断部位を除去するのに十分に短い短縮ＰＴＧＦＲＮ（ｓＩｇＶ）の、融合パートナーとしての使用は、高密度表示またはエクソソーム負荷を可能にすることを示す。
【０１７４】
実施例４：ＩＧＳＦ８過剰発現は、高密度エクソソーム表示をもたらさない
ＰＴＧＦＲＮの発現レベルは、それが操作エクソソームの産生に理想的な融合パートナーであり得ることを示す。免疫グロブリン含有タンパク質ファミリーの他のメンバーがエクソソーム操作に好適であり得るか否かを決定するために、ＨＥＫ２９３細胞を、ＩＧＦＳ８−ＧＦＰ融合タンパク質で安定的にトランスフェクトし、結果得られたエクソソームを精製した（図１６Ａ）。ネイティブエクソソーム及びＩＧＳＦ８−ＧＦＰエクソソームを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）ＴＧＸステインフリーゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｉｎｃ．）で分析し、これにはトリプトファン結合染料を使用してタンパク質を検出した。これは図１６Ｂに提供する通りである。ＩＧＳＦ８は、１０のトリプトファン残基を含有し、その検出を容易にした。抗ＧＦＰ抗体を使用するウェスタンブロッティングにより、過剰発現エクソソーム上のＩＧＳＦ８−ＧＦＰの発現が確認された（図１６Ｂ、下部）。興味深いことに、ＩＧＳＦ８−ＧＦＰエクソソームを、ｐＤｉｓｐｌａｙ足場（ＰＤＧＦ受容体）、ＣＤ８１、または完全長ＰＴＧＦＲＮ（ＦＬ）もしくはＰＴＧＦＲＮ＿４５４（ｓＩｇＶ）のいずれかへのＧＦＰ融合体と比較して、ＧＦＰ蛍光に関して検査したとき、ＩＧＳＦ８（ＦＬ  ＩＧＳＦ８）は、ｐＤｉｓｐｌａｙで観察された低レベルの確率的表示を超えるＧＦＰ富化を示せなかった（図１７）。この結果は、全てのＩｇＶファミリーメンバーを高密度エクソソーム表面表示／内腔負荷を操作するための融合タンパク質として使用することができるわけではないこと、及びＰＴＧＦＲＮ及び他のファミリーメンバーが、この点でＩＧＳＦ８より優れていることが示される。ＩＧＳＦ８発現は、しかしながら、改変されていないエクソソームの表面上では高レベルで検出されたため、ＩＧＳＦ８をエクソソームアフィニティー精製の標的として使用することは許容されるだろう。
【０１７５】
実施例５：哺乳動物細胞におけるＰＴＧＦＲＮの細胞外ドメインの発現及び特徴決定
ＰＴＧＦＲＮの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、９８ｋＤａであり、６つのタンデムＩｇＶリピートを含有する。ＰＴＧＦＲＮのＥＣＤは、そのサイズ及び高発現レベルのために、エクソソームアフィニティー精製試薬の望ましい標的であり得る。ＰＴＧＦＲＮのこのセグメントを特徴決定するために、ＰＴＧＦＲＮ  ＥＣＤを、内因性シグナルペプチドをＮ末端（ＳＰ）に、ＰＡＲ１切断部位及びＦｃドメインをＣ末端に伴う融合タンパク質として発現させた（図１８）。ＰＡＲ１は、トロンビンの基質であり、プロテインＡ樹脂を使用してＦｃ融合タンパク質を溶出するために使用することができる。ＰＴＧＦＲＮは、９つの予測されるＮ結合型グリコシル化部位及び６つの予測されるジスルフィド結合を有し、これは内因性糖タンパク質の産生のための細菌発現系の使用を排除する。ＰＴＧＦＲＮ  ＥＣＤを、Ｅｘｐｉ２９３発現系（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して過剰発現させた。これは、高収率の哺乳動物組み換えタンパク質を産生するために使用される。トランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３細胞からの条件細胞培養液を、０．２μｍろ過し、プロテインＡで精製した後、低ｐＨグリシン溶出を行い、すぐに中和した。Ｆｃタグを、トロンビン処理で除去し、切断したタンパク質プールを、プロテインＡに再度流した。フロースルーを収集し、濃縮し、分取ＳＥＣで仕上げを実施（ｐｏｌｉｓｈ）した。精製されたＰＴＧＦＲＮ  ＥＣＤを、ゲルろ過クロマトグラフィーによりＰＢＳ  ｐＨ７．４中、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して分析し、２８０ｎｍ  ＵＶ蛍光にて検出した。変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）ＴＧＸステインフリーゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｉｎｃ．）で、溶出液ピークを分析したとき、図１９Ａは、単一溶出ピークを約５５ｍＬで示し、図１９Ｂは、ＰＴＧＦＲＮ  ＥＣＤの予測されたサイズでの単一タンパク質産物を示し、このことは、ＰＴＧＦＲＮ  ＥＣＤを哺乳動物細胞から精製できることを示す。
【０１７６】
ＰＴＧＦＲＮ  ＥＣＤの適切な発現を確認するため、精製されたタンパク質を、サイズ排除クロマトグラフィー／多角度光散乱検出器（ＳＥＣ−ＭＡＬＳ）により、ＢＳＡ及び抗ＶＬＡ４抗体を、比較のための標準として使用して、分析した。組み換えＰＴＧＦＲＮ  ＥＣＤを、その予測分子量の約２倍にて溶出した（予測分子量、９８ｋＤａに対して１９８ｋＤａ；図２０Ａ）。ＰＴＧＦＲＮ  ＥＣＤが溶液中でホモ二量体を形成するか否かを決定するために、組み換えＰＴＧＦＲＮ  ＥＣＤを、分析ＳＥＣカラム（Ｔｏｓｏｈ、７．８×３０ｃｍ、Ｇ３０００ＳＷ  ｘｌ）上、ＰＢＳ中、塩化グアニジウム（ＧｕＨＣｌ）の不在下または１Ｍもしくは２Ｍ塩化グアニジニウム（ＧｕＨＣｌ）の存在下で、泳動させた。図２０Ｂは、漸増ＧｕＨＣｌ（ＧｕＨＣｌ無し（「ＰＴＧＦＲＮ」とラベル付けされた曲線）、１Ｍ  ＧｕＨＣｌ（「ＰＴＧＦＲＮ＋１Ｍ  ＧｕＨＣｌ」とラベル付けされた曲線）、または２Ｍ  ＧｕＨＣｌ（「ＰＴＧＦＲＮ＋２Ｍ  ＧｕＨＣｌ」とラベル付けされた曲線））下でのＰＴＧＦＲＮ  ＥＣＤの溶出プロファイル、及び予測二量体ピークの単量体ピークへの変換を示す。これらの結果は、ＰＴＧＦＲＮ  ＥＣＤがホモ二量体を形成し、ＰＴＧＦＲＮ  二量体化がエクソソーム表面上で天然に生じ得ることを示す。
【０１７７】
実施例６：ＰＴＧＦＲＮプロテインアレイ
ＰＴＧＦＲＮは、文献においてあまり特徴決定されておらず、エクソソームタンパク質としてのその役割は、大部分が未解明である。ＰＴＧＦＲＮは、同じくエクソソームの表面上で見いだされる、ＣＤ９とのその相互作用のために、ＣＤ９パートナー１（ＣＤ９Ｐ−１）としても知られる。ＰＴＧＦＲＮがどのタンパク質に結合するのかをさらに理解するため、組み換えモノ−ビオチン化ヒトＰＴＧＦＲＮ  ＥＣＤを生成し、ヒトプロテオームの８１％を包含する２０，０００超のタンパク質を含有するタンパク質マイクロアレイ上にプローブした（ＣＤＩ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。結合分析を、それぞれ、ｐＨ５．６及び７．４にて行って、酸性化エンドソーム及びサイトゾルのｐＨを表した。９つの陽性ヒットがｐＨ７．４にて同定され、１６がｐＨ５．６にて同定された。３つのタンパク質（ＬＧＡＬＳ１、ガレクチン−１；ＦＣＮ１、フィコリン−１；ＭＧＡＴ４Ｂ、アルファ−１，３−マンノシル−糖タンパク質４−ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＢ）が、ｐＨ５．６及びｐＨ７．４の両方にて同定された（図２１）。ＬＧＡＬＳ１は、単量体の炭水化物及び複合グリカンに結合すると知られているが、ＰＴＧＦＲＮ結合パートナーとしては関係付けられてない。ＰＴＧＦＲＮ及びＬＧＡＬＳ１間の相互作用を確認するために、ビオチン化組み換えＰＴＧＦＲＮ  ＥＣＤを、ストレプトアビジン光学プローブに結合させ、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ＲＥＤ９６（Ｐａｌｌ）を使用してバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）により分析した。ガレクチン−１のＰＴＧＦＲＮへの用量依存性結合がＢＬＩにより確認された（図２２）。ＬＧＡＬＳ１及びＰＴＧＦＲＮ間の相互作用は、可逆的であり、用量依存的様式でラクトースと競合し（図２３）、この相互作用の特異性を実証する。これらの結果はまた、エクソソームが、ＰＴＧＦＲＮ結合パートナーを親和性試薬として使用することにより精製され得ることを示す。
【０１７８】
実施例７：ＰＴＧＦＲＮまたはエクソソームへの抗ＰＴＧＦＲＮ抗体の結合
ビオチン化ＰＴＧＦＲＮを、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ＲＥＤ９６（Ｐａｌｌ）のストレプトアビジンプローブに結合させ、ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０中で、漸増濃度の、ＰＴＧＦＲＮ（ＭＡＢＴ８８３，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｓｉｇｍａ）の別名であるＣＤ３１５に対するモノクローナルラット抗体とインキュベートした。用量依存性結合が検出され、抗体によるＰＴＧＦＲＮの特異的認識が示された（図２４）。抗ＣＤ３１５抗体がエクソソームに結合できたか否かを決定するため、抗ＣＤ３１５抗体を、プロテインＬプローブに結合させ、漸増量のＯｐｔｉｐｒｅｐ（商標）精製ＨＥＫ２９３エクソソームとインキュベートした（図２５）。図２５に示すように、精製エクソソームとのインキュベーション後の用量依存性の偏向は、抗ＣＤ３１５抗体がエクソソーム表面上の内因性ＰＴＧＦＲＮを認識できることを示す。同様の実験を、ＰＴＧＦＲＮ過剰発現エクソソーム（ＰＴＧＦＲＮ＋＋エクソソーム）を生成するように完全長ＰＴＧＦＲＮで安定的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を用いて行った。過剰発現エクソソームを、固定化抗ＣＤ３１５抗体とインキュベートし、用量依存性偏向がもたらされ、これにより抗体及びエクソソーム間の特異的結合が示された（図２６）。ネイティブまたはＰＴＧＦＲＮ過剰発現エクソソームに対する抗体結合の程度を比較するために、各種の１．１Ｅ１１エクソソームを、抗ＣＤ３１５抗体の存在下でインキュベートし、ＢＬＩにより測定した。図２７に示すように、ＰＴＧＦＲＮ過剰発現エクソソームは、ネイティブエクソソームよりも遥かに大きい偏向を引き起こし、このことは、ＰＴＧＦＲＮのレベルの増加がより高い結合をもたらし、それゆえＰＴＧＦＲＮ結合をエクソソーム精製に使用できることを示す。
【０１７９】
実施例８：抗ＰＴＧＦＲＮ抗体によるドメイン認識
実施例６及び７の結果は、エクソソームが、ＰＴＧＦＲＮとの親和性相互作用に基づいて精製され得ることを示す。完全長ＰＴＧＦＲＮ及び一連の短縮化突然変異体を、上記のＥｘｐｉ２９３系を使用してモノ−ビオチン化組み換えタンパク質として発現させた（図２８、左）。短縮化物をそれぞれ、抗ＣＤ３１５抗体とインキュベートし、結合をＢＬＩにより測定した。完全長ＰＴＧＦＲＮのみが抗ＣＤ３１５抗体に結合し、このことは、エピトープが、第一のＩｇＶドメインのタンパク質のＮ末端にあることを示す。
【０１８０】
ポリクローナル抗体プールを、ウサギに、図２８の構築物１に類似するがビオチン化配列を欠くＰＴＧＦＲＮの組み換え完全長エクトドメインを注射することにより生成した。ポリクローナル抗体プールを、終末出血からプロテインＡにより精製し、ＰＴＧＦＲＮ短縮化断片に対する活性に関して検査した。断片をそれぞれ、変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）ＴＧＸステインフリーゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｉｎｃ．）で分析し、正しい長さのタンパク質の発現を確認した（図２９Ａ）。次いで、ウェスタンブロッティングを、試料に、プールしたポリクローナルウサギ抗体を使用して行い、正しいサイズのバンドを対照ネイティブエクソソームと同じく各レーンにおいて検出し、ポリクローナルＰＴＧＦＲＮ抗体との特異的反応を確認した（図２９Ｂ）。この結果を確認するために、ビオチン化ＰＴＧＦＲＮ断片をそれぞれ、ＢＬＩにより分析し、結果を図３０に提供する。ポリクローナル抗体プールとのインキュベーションは、全ての条件で結合を示し、ＰＴＧＦＲＮのＩｇＶドメインのそれぞれに関する抗体との広範な反応性を実証した。
【０１８１】
実施例９：多様な細胞株からのエクソソームは、ＩｇＶファミリーメンバー及び他の新規表面タンパク質を発現する
起源の異なる組織の細胞株（ＨＥＫ２９３ＳＦ、腎臓；ＨＴ１０８０、結合組織；Ｋ５６２、骨髄；ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、乳房；Ｒａｊｉ、リンパ芽球）を、対数期まで増殖させ、エクソソームを枯渇させた血清を補充した培地に約６日間移した。骨髄由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を３Ｄマイクロキャリア上で５日間増殖させ、無血清培地に３日間補充した。上清を単離し、エクソソームを、上記のＯｐｔｉｐｒｅｐ（商標）密度−勾配超遠心分離法を使用して精製した。精製エクソソームをそれぞれ、上記のようにＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析し、数種のエクソソーム表面タンパク質のペプチドスペクトルマッチ（ＰＳＭ）の数を定量化し（ＰＴＧＦＲＮ、ＩＧＳＦ８、ＩＧＳＦ３、ＢＳＧ、ＳＬＣ３Ａ２、ＩＴＧＢ１、ＣＤ８１、及びＣＤ９）、結果を図３１に提供する。テトラスパニンＣＤ８１及びＣＤ９は、大半の精製エクソソーム集団において検出可能であったが、いくつかの場合では、他の表面マーカー以下であった（例えば、全ての細胞株においてＣＤ９を、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、及びＳＬＣ３Ａ２と比較する）。この知見は、ＩｇＶタンパク質ファミリーメンバーを含む、新しく同定された表面マーカーが、異なる組織に由来する数種の無関係な細胞株のエクソソームアフィニティー精製方法を開発するための好適な標的であることを示す。
【０１８２】
実施例１０：ＰＴＧＦＲＮノックアウト細胞及びエクソソームの生成
ＰＴＧＦＲＮノックアウト細胞を生成するために、ＨＥＫ２９３ＳＦ細胞を、組み換えＣａｓ９ならびにＰＴＧＦＲＮのエクソン２及び膜貫通領域を標的とするガイドＲＮＡを用いてトランスフェクトした。ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒにより生成されたエクソン２を標的とするガイドＲＮＡには、（１）ＣＧＴＴＧＧＣＡＧＴＣＣＧＣＣＴＴＡＡＣ、ＣＲＩＳＰＲ９２６０４５＿ＣＲ（配列番号３６）；（２）ＣＡＴＡＧＴＣＡＣＴＧＡＣＧＴＴＧＣＡＧ、ＣＲＩＳＰＲ９２６０５４＿ＣＲ（配列番号３７）；（３）ＴＴＧＴＧＧＡＧＣＴＴＧＣＡＡＧＣＡＣＣ、ＣＲＩＳＰＲ９２６０５５＿ＣＲ（配列番号３８）；及び（４）ＧＴＴＣＴＴＴＡＴＧＴＧＧＡＧＣＴＣＣＡ、ＣＲＩＳＰＲ９２６０７１＿ＣＲ（配列番号３９）が含まれる。ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒにより生成された膜貫通領域を標的とするガイドＲＮＡには、（１）ＴＡＴＣＣＣＴＴＧＣＴＧＡＴＣＧＧＣＧＴ、ＴＭｇＲＮＡ５．１．９７（配列番号４０）；（２）ＧＣＴＧＣＡＧＴＡＣＣＣＧＡＴＧＡＧＡＣ、ＴＭｇＲＮＡ３．７．８７（配列番号４１）が含まれる。
【０１８３】
ＰＴＧＦＲＮのエクソン２及び膜貫通領域の標的とする遺伝子の編集及び欠失を、ＰＣＲ及び配列決定により確認した。５つのクローンＰＴＧＦＲＮノックアウト（ＰＴＧＦＲＮ  ＫＯ）細胞株からのエクソソームを、上記のように精製し、ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティングにより実施例８に記載のポリクローナルウサギ抗体プールを使用して分析した。図３２Ｂに示すように、ＰＴＧＦＲＮに対応するバンドは、５つのノックアウトクローンのいずれにおいても検出されなかった。このことは、産生細胞及び精製エクソソームにおけるＰＴＧＦＲＮの標的欠失を実証する。重要なことに、エクソソーム産生収率及び全体のタンパク質バンドパターン（図３２Ａ）は、ＰＴＧＦＲＮ欠失の影響を受けず、ＰＴＧＦＲＮ  ＫＯエクソソームを実験目的に使用できることが示される。
【０１８４】
ＰＴＧＦＲＮ欠失が精製エクソソームのプロテオミクスプロファイルを変化させるか否かを決定するために、ネイティブエクソソーム及びＰＴＧＦＲＮ  ＫＯエクソソームを、比較質量分析により分析した。図３３に示すように、ネイティブ及びＰＴＧＦＲＮ  ＫＯエクソソームのタンパク質内容物は、ＰＴＧＦＲＮ  ＫＯエクソソームにおいて検出できなかったＰＴＧＦＲＮのみを除いて、非常に類似していた。エクソソームマーカーアリックス、ＣＤ８１、ＴＳＧ１０１、及びＣＤ９は、群間で有意な差はなかった。これらのデータは、エクソソームのプロテオミクスプロファイルを変化させることなく、ＰＴＧＦＲＮをエクソソームから除去できることを示す。
【０１８５】
ＰＴＧＦＲＮ欠失が、ＰＴＧＦＲＮの完全な機能性除去をもたらすことを検証し、実施例７に記載の抗ＰＴＧＦＲＮ（抗ＣＤ３１５）抗体がＰＴＧＦＲＮに特異的であることを実証するため、ＢＬＩを使用するエクソソーム結合実験を、ネイティブエクソソーム、ＰＴＧＦＲＮ過剰発現エクソソーム（ＰＴＧＦＲＮ＋＋）及びＰＴＧＦＲＮ  ＫＯエクソソームを用いて実行した。図２７及び実施例７に記載の実験結果と同様、ＰＴＧＦＲＮ＋＋エクソソームは、固定化抗ＣＤ３１５抗体に、ネイティブエクソソームよりも大きな親和性で結合した（図３４）。対照的に、同数のＰＴＧＦＲＮ  ＫＯエクソソームは、固定化抗体に結合できず（図３４）、ＰＴＧＦＲＮ欠失が、ＰＴＧＦＲＮ  ＫＯエクソソームと抗ＰＴＧＦＲＮ親和性試薬との相互作用を除くことを実証する。
【０１８６】
実施例１１：エクソソームを、ＰＴＧＦＲＮを認識する親和性試薬を用いて精製することができる
ＰＴＧＦＲＮに対するカスタムモノクローナル抗体を、実施例８に記載のように免疫化したウサギから生成した。エクソソームを、ＰＴＧＦＲＮを引き抜くことにより単離できるか否かを決定するために、５×１０１０個のネイティブまたはＰＴＧＦＲＮ  ＫＯエクソソームを、磁気プロテインＡビーズ（カタログ番号１０００１Ｄ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）または１０μｇのカスタム抗ＰＴＧＦＲＮモノクローナル抗体を用いて機能化されたプロテインＡビーズのいずれかに加えた。各エクソソーム−ビーズ混合物を、３０分間室温にてインキュベートし、ＰＢＳ＋０．１％ｖ／ｖ  ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を用いて３回洗浄した。洗浄したビーズを、溶出バッファー（２０ｍＭグリシンｐＨ３．６、２×Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（カタログ番号１６１０７３７，Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｉｎｃ．）、１０％β−メルカプトエタノール）中、９５℃にて１０分間インキュベートすることにより溶出し、煮沸した上清を、ＰＡＧＥ及び抗ＰＴＧＦＲＮウェスタンブロッティングにより、異なるカスタム抗ＰＴＧＦＲＮモノクローナル抗体を使用して分析した。ＰＡＧＥにより分析した総タンパク質は、ＰＴＧＦＲＮの分子量に対応するバンドをネイティブエクソソーム条件においてのみ抗ＰＴＧＦＲＮ抗体の存在下で示した（図３５Ａ）。このバンドは、ＰＴＧＦＲＮとして、ウェスタンブロッティングにより確認された（図３５Ｂ）。抗ＰＴＧＦＲＮ抗体の、それぞれ重鎖及び軽鎖に対応するＨＣ及びＬＣを精製に使用した。これらのデータは、ＰＴＧＦＲＮ含有エクソソームを、エクソソーム表面上のＰＴＧＦＲＮを引き抜くことにより、溶液から精製することができることを実証する。
【０１８７】
実施例１２：多様な異種タンパク質を、ＰＴＧＦＲＮに融合させて、エクソソーム上での過剰発現を促進することができる
図１１、１３、１４及び１５に提供する実験データは、数種のタンパク質が、ＰＴＧＦＲＮを過剰発現足場として使用することにより劇的に過剰発現できることを実証する。ＰＴＧＦＲＮを使用する過剰発現は、他のエクソソーム過剰発現足場を使用する発現よりも有意に優れていた。ＰＴＧＦＲＮに融合することで過剰発現に成功することができるタンパク質の幅を決定するために、数種の操作エクソソームを生成した。第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）は、凝固カスケードに関与する大きな酵素である。Ｂドメインを欠くＦＶＩＩＩの断片（ＢＤＤＦＶＩＩＩ）をＰＴＧＦＲＮのＮ末端（外側に面する側）に融合させ、ＨＥＫ２９３ＳＦ細胞において発現させた。精製エクソソームを、ＰＡＧＥ（図３６Ａ）及びウェスタンブロット（図３６Ｂ）により分析した。細胞培養において完全長ＦＶＩＩＩのプロセシングによって生成したＦＶＩＩＩの軽鎖は、ＦＶＩＩＩに対する抗体（図３６Ｂ；カタログ番号ＧＭＡ−８０２５、Ｇｒｅｅｎ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）を使用して、操作エクソソームにおいては容易に検出されたが、ネイティブエクソソームでは検出されなかった。完全長ＦＶＩＩＩは、１６５ｋＤａの分子量を有し、これはＰＴＧＦＲＮの分子量（約１２０ｋＤａ）より有意に大きく、酵素を含む非常に大きなタンパク質が、エクソソームの表面上でＰＴＧＦＲＮ融合体として発現に成功できることを実証する。
【０１８８】
上記のＰＴＧＦＲＮ融合パートナーは、全て規則正しい三次元構造を有するタンパク質である。ＸＴＥＮ（登録商標）ペプチド（Ａｍｕｎｉｘ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）は、長く、不規則な反復配列を有し、その一次配列と比較して劇的に増加した見かけの分子質量を有する。ＸＴＥＮ（８％Ａｌａ、１２％Ｇｌｕ、１８％Ｇｌｙ、１７％Ｐｒｏ、２８％Ｓｅｒ及び１７％Ｔｈｒを含むランダム化された２８８個のアミノ酸を含むタンパク質）、ＰＴＧＦＲＮの断片（配列番号３３）及びＧＦＰをコードする融合構築物を、ＨＥＫ２９３ＳＦ細胞において安定的に発現させた。精製エクソソームを単離し、ＰＡＧＥ（図３７Ａ）及びウェスタンブロッティング（図３７Ｂ）により分析した。図３７Ｂに示すように、融合タンパク質のＣ末端ＧＦＰは、ウェスタンブロッティングにより検出され、精製エクソソーム上の融合タンパク質のインフレーム翻訳を実証する。これらの結果は、構造不定のタンパク質もＰＴＧＦＲＮとの融合体として安定して発現できることを実証する。さらには、これらの結果は、異種タンパク質がＰＴＧＦＲＮのＮ末端及びＣ末端と同時に融合することができ、それぞれエクソソーム表面及び内腔にインタクトなタンパク質を表示することを示す。ゆえに、ＰＴＧＦＲＮは、Ｎ末端またはＣ末端の一方または両方上の様々な構築物及びクラスの数個のアミノ酸（例えば、ＦＬＡＧタグ）から１５０ｋＤａ（ＢＤＤＦＶＩＩＩ）超の範囲のサイズのタンパク質融合体に適した強力な足場である。
【０１８９】
実施例１３：ＰＴＧＦＲＮ配列は、他のエクソソーム過剰発現系よりもエクソソーム上での異種タンパク質の発現に優れている
実施例３及び図１５のデータは、ＰＴＧＦＲＮが、エクソソームのバルク集団における異種タンパク質の発現において他のエクソソーム足場よりも優れていることを実証する。これらの結果は、しかしながら、エクソソームのサブセットでの発現の増加と、精製された集団の全てのエクソソームにわたって均一に増加した発現を区別することができない。均一なエクソソーム治療薬を開発する目的のためには、高度に過剰発現するエクソソーム及び改変されていないエクソソームを含む不均一なエクソソーム集団よりも、発現が均一に増加した同種エクソソーム集団を有する方が、好ましい。この問題に取り組むために、本発明者らは、Ｆｌｏｗ  ＮａｎｏＡｎａｌｙｚｅｒ（ＮａｎｏＦＣＭ，Ｉｎｃ．；Ｘｉａｍｅｎ，Ｃｈｉｎａ）を使用してナノフローサイトメトリーにより粒子毎にエクソソーム集団における個々のエクソソームを特徴決定した。Ｆｌｏｗ  ＮａｎｏＡｎａｌｙｚｅｒは、直径１０ｎｍという小さな個々のナノ粒子の光散乱及び蛍光発光を測定することができる。ネイティブエクソソーム及びＣＤ９、ＣＤ８１、またはＰＴＧＦＲＮへの内腔ＧＦＰ融合をコードする改変エクソソームを、安定的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３ＳＦ細胞から単離し、上記のようにＯｐｔｉｐｒｅｐ（登録商標）密度勾配超遠心分離により精製した。励起４８８／発光５０９に設定したＦｌｏｗ  ＮａｎｏＡｎａｌｙｚｅｒによる分析は、粒子毎の分析においてＧＦＰ発現に関して、ＣＤ９−ＧＦＰエクソソームが約４８％陽性、ＣＤ８１−ＧＦＰエクソソームが約８０％陽性、及びＰＴＧＦＲＮ−ＧＦＰエクソソームが約９７％陽性であったことを実証した（図３８、左）。さらに、平均蛍光強度（ＭＦＩ）も同様の傾向をたどり、ＰＴＧＦＲＮ−ＧＦＰエクソソームは、ＣＤ８１−ＧＦＰエクソソームよりも全体的に約２倍明るかった（図３８、右）。これらのデータは、ＰＴＧＦＲＮ−ＧＦＰ融合タンパク質を発現するように改変されたエクソソームが、融合タンパク質を高度に発現する同種のエクソソーム集団であり、全体の発現レベルが、ネイティブまたは他のエクソソーム足場に融合したＧＦＰを発現する他の改変エクソソームよりも遥かに高かったことを実証する。
【０１９０】
ＰＴＧＦＲＮのＮ末端は、予測されるシグナルペプチド配列（アミノ酸１〜２１；配列番号８）からなる。この配列が、精製エクソソーム上で導入遺伝子の発現を亢進できるか否かを決定するために、ＰＴＧＦＲＮシグナルペプチドを、異種タンパク質ＤｓｂＡ１１のシグナルペプチドと比較した。ＨＥＫ２９３ＳＦ細胞を、（ｉ）ＧＦＰに融合した完全長野生型ＰＴＧＦＲＮ；（ｉｉ）ＧＦＰに融合した内因性ＰＴＧＦＲＮシグナルペプチドを含有するＰＴＧＦＲＮの短い断片（４５４−ＰＴＧＦＲＮ；配列番号３３）；または（ｉｉｉ）ＧＦＰに融合した、内因性ＰＴＧＦＲＮシグナルペプチドを細菌遺伝子ＤｓｂＡ１１からのシグナルペプチド（Ｋｏｅｒｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，４２７．２（２０１５）：５７６−５８６）で置換したＰＴＧＦＲＮの短い断片（４５４−ＰＴＧＦＲＮ；配列番号３３）をコードする発現構築物で安定的にトランスフェクトした。図３９に示すように、内因性ＰＴＧＦＲＮシグナルペプチドを含有する完全長または短縮ＰＴＧＦＲＮ−ＧＦＰを含有するＧＦＰ融合タンパク質を発現する細胞は、ＧＦＰを含むエクソソームを同様に高いレベルにて産生した。ＤｓｂＡ１１シグナルペプチドを伴う短縮ＰＴＧＦＲＮを含有するＧＦＰ融合タンパク質を発現する細胞は、しかしながら、遥かに低いレベルにてＧＦＰを発現するエクソソームを産生した。これらの結果は、ＰＴＧＦＲＮシグナルペプチドが、操作エクソソームの高密度装飾を促進することを実証する。
【０１９１】
実施例１４：抗体断片は、ＰＴＧＦＲＮを足場として使用して、エクソソーム表面上で、機能的に発現することができる
上記の実験データは、ＰＴＧＦＲＮが、多くのクラスのタンパク質の過剰発現に適した強力な足場であることを実証する。抗体及び抗体の抗原結合断片は、多くの疾患の多くの処置において多様な用途を有する治療ペプチドの重要なクラスである。機能性抗原結合断片が、ＰＴＧＦＲＮを足場として使用して、エクソソーム上で発現することができるか否かを決定するために、ＨＥＫ２９ＳＦ細胞を安定的にトランスフェクトして、レクチンＣＬＥＣ９Ａ（クローン１０Ｂ４、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｓｉｇｍａ、カタログ番号０４−１４８；及びＣａｍｉｎｓｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１１２：８（２００８）に記載）、完全長ＰＴＧＦＲＮ、ＧＦＰ、及びＦＬＡＧタグを認識する一本鎖Ｆａｂからなる融合タンパク質を過剰発現させた（図４０Ａ）。Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（商標）精製エクソソームを、ステインフリータンパク質ゲル上で泳動させ、ＦＬＡＧタグに対する抗体を用いてブロットし、これは完全長融合タンパク質の有意な過剰発現を示す（図４０Ｂ）。
【０１９２】
精製された抗ＣＬＥＣ９Ａエクソソームを、ＢＬＩにより、固定化ＣＬＥＣ９Ａ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号６０４９−ＣＬ−０５０；及びＵｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ７：１１２７３（２０１６）に記載）に対する結合に関して検査した。ＣＬＥＣ９Ａ−Ｆｃを、プロテインＡプローブにＰＢＳ＋０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０中０．５μｇ／ｍｌの最終濃度にて結合させ、１×１０１１個の改変されていないエクソソームまたは図４０Ａに示すレクチンＣＬＥＣ９Ａ、完全長ＰＴＧＦＲＮ、ＧＦＰ、及びＦＬＡＧタグを認識する一本鎖Ｆａｂ（「αＣＬＥＣ９Ａ−ＰＴＧＦＲＮ」）からなる融合タンパク質を発現するように改変されたエクソソームとインキュベートした。図４１に示すように、抗ＣＬＥＣ９Ａ−ＰＴＧＦＲＮエクソソームのみがＣＬＥＣ９Ａ−Ｆｃプローブに結合し、細胞表面マーカー及び抗原結合断片を過剰発現するように操作されたエクソソーム間の機能性認識を実証した。
【０１９３】
実施例１５：間葉系幹細胞は、ＰＴＧＦＲＮを発現する
いくつかの細胞型からの治療用エクソソームは、研究及び臨床目的のために使用されている。神経前駆幹細胞及び間葉系幹細胞を含む数種類の幹細胞には、治療効果があることが示されているが、これらの細胞を使用する大半の試験は、天然の、改変されていないエクソソームに依存する。それゆえ、特定のリガンドまたは他の標的タンパク質を過剰発現するようにこれらの細胞株を操作することが望ましいだろう。骨髄由来の間葉系幹細胞を、１．１Ｌマイクロキャリアベースの３Ｄバイオリアクターシステムにおいて増殖させた。５日間の細胞増殖後、増殖培地を廃棄し、細胞を、無血清培地にてさらに３日間培養した。無血清培地を、１００μｍフィルターを通してろ過して、マイクロキャリアを除去し、低速で遠心分離して、細胞デブリ及び夾雑物を除去した。清澄化した培地を、次いで、実施例１に記載のようにＯｐｔｉｐｒｅｐ（商標）密度−勾配超遠心分離により精製した。ＨＥＫ２９３ＳＦ細胞及びＭＳＣからの精製エクソソームを、ＰＴＧＦＲＮ、及び確立されたエクソソームタンパク質アリックス、ＴＳＧ１０１、ＣＤ６３、ＣＤ９、及びＣＤ８１についてウェスタンブロッティングにより分析した。図４２に示すように、これらのタンパク質は全て、ＨＥＫ２９３ＳＦ細胞及びＭＳＣの両方において発現し、このことは、エクソソームタンパク質、例えば、ＰＴＧＦＲＮを、表面操作ＭＳＣエクソソームを生成するための足場として使用することができることを示す。
【０１９４】
実施例１６：ＰＴＧＦＲＮは、非ヒト細胞からのエクソソーム上で過剰発現することができる
実施例９及び１５の結果は、多くのヒト由来細胞が、天然にＰＴＧＦＲＮ及び実施例１にて同定された他の新規エクソソームタンパク質を発現することを実証する。ＰＴＧＦＲＮをユニバーサルなエクソソーム足場タンパク質として使用することができるか否かを決定するために、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、ＦＬＡＧタグに融合した完全長ＰＴＧＦＲＮを発現するプラスミド（「ＰＴＧＦＲＮ−ＦＬＡＧプラスミド」）で安定的にトランスフェクトした。エクソソームを、野生型ＨＥＫ２９３ＳＦ細胞、ＰＴＧＦＲＮ−ＦＬＡＧプラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＳＦ細胞、ＣＨＯ細胞、及びＰＴＧＦＲＮ−ＦＬＡＧプラスミドでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞から、実施例１に記載の方法を使用して、精製した。図４３Ａ〜Ｃに示すように、ＰＴＧＦＲＮ−ＦＬＡＧを、ステインフリーＰＡＧＥ（図４３Ａ）及びＰＴＧＦＲＮ（図４３Ｂ）及びＦＬＡＧ（図４３Ｃ）に対する抗体を用いたウェスタンブロッティングにより検出して、ＨＥＫ２９３ＳＦ細胞及びＣＨＯ細胞の両方において過剰発現させることに成功した。この結果は、非ヒト細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）ならびにヒト細胞（例えば、ＨＥＫ細胞）が、ヒトＰＴＧＦＲＮを過剰発現するエクソソームを産生できることを実証する。この結果は、ＰＴＧＦＲＮが、操作エクソソームを多くの異なる細胞型及び種から生成するための、ユニバーサルな足場タンパク質であることを示す。
【０１９５】
実施例１７：ＰＴＧＦＲＮは、従来のエクソソームタンパク質と比較して改善された内腔カーゴの搭載を提供する
以前の実施例は、ＰＴＧＦＲＮ過剰発現が、従来のエクソソームタンパク質と比較して、より多くのタンパク質数及び／または活性を有するエクソソームをもたらすことを実証した（例えば、実施例１３；図１５）。ＰＴＧＦＲＮが膜貫通型タンパク質であり、そのＮ末端を小胞外面に、そのＣ末端をエクソソーム内腔に有するため、ＰＴＧＦＲＮは、エクソソームの内腔にカーゴタンパク質を搭載するのに好適な足場タンパク質であり得る。この可能性を調査するために、ＨＥＫ２９３ＳＦ細胞を操作して、低分子ラパマイシンを使用してタンパク質−タンパク質相互作用を促進する二分レポーターシステムを安定的に発現させた。ＣＤ９（図４４Ａ）またはＰＴＧＦＲＮ（図４４Ｂ）のいずれかをＧＦＰ、ＦＬＡＧタグ、及びＦＫＢＰに融合させた。細胞を、Ｖ５タグ及びＦＲＢに融合したｍＣｈｅｒｒｙを安定的に発現するようにも操作した。低分子ラパマイシンの存在下で、タンパク質ＦＲＢ及びＦＫＢＰは二量体化して、安定した複合体を形成する。ラパマイシンの存在下で細胞を培養することは、それゆえ、エクソソーム生合成中のｍＣｈｅｒｒｙカーゴタンパク質及びＣＤ９またはＰＴＧＦＲＮのいずれかの間の会合を可能とし得る。これらの細胞から精製されたエクソソームを、洗浄してラパマイシンを除去し、エクソソーム内腔への可溶性カーゴとしてのｍＣｈｅｒｒｙの放出が可能となるだろう。（図４４Ａ〜Ｂ）。
【０１９６】
ＣＤ９負荷レポーター細胞を、ラパマイシンの存在下で０、１、または２日間にわたって増殖させた。ＰＴＧＦＲＮ負荷レポーター細胞を、ラパマイシンの存在下で５日間にわたって増殖させた。エクソソームを、ラパマイシンの不在下で細胞培養物から精製し、エクソソーム内腔におけるカーゴ放出を可能とした。精製されたエクソソーム試料を、変性ポリアクリルアミドゲルで泳動させ、総タンパク質の存在について分析し、足場タンパク質（抗ＦＬＡＧ）またはｍＣｈｅｒｒｙカーゴ（抗Ｖ５）に対してウェスタンブロットした。ＰＴＧＦＲＮ試料を、ＣＤ９試料と比較して遥かに少ない物質を伴ってポリアクリルアミドゲルに負荷したが、ＰＴＧＦＲＮは、ＦＬＡＧウェスタンブロッティングにより容易に検出可能であった。カーゴｍＣｈｅｒｒｙも、ＰＴＧＦＲＮ及びＣＤ９足場試料間で同等のレベルにて検出された（図４５Ａ）。足場及びカーゴタンパク質バンドをデンシトメトリーにより測定し、収集したエクソソームの量に対して正規化したとき、ＰＴＧＦＲＮ足場は、より高いレベルで発現され、ＣＤ９足場タンパク質に含有されたものより遥かに多くのｍＣｈｅｒｒｙカーゴを搭載できた（図４５Ｂ）。これらのデータは、ＰＴＧＦＲＮが、従来のエクソソームタンパク質ＣＤ９より大きな程度までペプチドを搭載する内腔への融合タンパク質として発現できること、及びＰＴＧＦＲＮの使用が、従来のエクソソームタンパク質と比較して、より多くの指向性カーゴ搭載をもたらすことを示す。これらのデータは、複雑な、複数部分操作システムを、ＰＴＧＦＲＮ足場の状況において使用することができ、エクソソーム内腔における強いカーゴ搭載をもたらすことを示す。
【０１９７】
実施例１８：改変エクソソームタンパク質の生成
改変エクソソームタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、全エクソソームタンパク質または短縮エクソソームタンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用して生成する。特定の短縮エクソソームタンパク質を、様々な短縮エクソソームタンパク質をスクリーニングし、エクソソーム膜に組み込み、結合剤と相互作用する最適な能力を有する短縮タンパク質を選択することにより、選択する。エクソソーム膜への短縮タンパク質の標的化は、ナノフローサイトメトリーにより検査する。
【０１９８】
改変エクソソームタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、親和性タグ（グルタチオン−Ｓ−転移酵素、Ｓ−ペプチド、ＦＬＡＧタグ、ＧＦＰ、等）をコードするポリヌクレオチドを、全または短縮エクソソームタンパク質（例えば、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、及びＡＴＰ輸送体）をコードするポリヌクレオチドに加えることにより生成される。改変されたポリヌクレオチドは、融合タンパク質を発現する。ポリヌクレオチドを、さらに改変して、エクソソーム膜へのそれらの標的化及び／または結合剤に対するそれらの親和性を改善する。
【０１９９】
改変エクソソームタンパク質をコードする異なるタイプのポリヌクレオチドは、治療ペプチド（例えば、抗体、酵素、リガンド、受容体、抗微生物ペプチド、変異体またはその断片）をコードするポリヌクレオチドを、全または短縮エクソソームタンパク質（例えば、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、及びＡＴＰ輸送体）をコードするポリヌクレオチドに加えることにより生成される。改変されたポリヌクレオチドは、エクソソームの表面上に提示される融合タンパク質を発現する。融合タンパク質は、治療ペプチドの治療活性を維持する。
【０２００】
改変エクソソームタンパク質をコードする異なるタイプのポリヌクレオチドは、標的化部分（例えば、特定の器官、組織または細胞に特異的な標的化部分）をコードするポリヌクレオチドを、全または短縮エクソソームタンパク質（例えば、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、及びＡＴＰ輸送体）をコードするポリヌクレオチドに加えることにより生成される。改変されたポリヌクレオチドは、エクソソームの表面上に提示される融合タンパク質を発現する。融合タンパク質により、エクソソームは、特定の器官、組織または細胞を標的とすることができる。
【０２０１】
エクソソーム表面上の改変エクソソームタンパク質の局在化も、ナノフローサイトメトリーにより検査される。
【０２０２】
実施例１９：表面操作エクソソームの生成
表面操作エクソソームを生成する産生細胞は、エクソソームタンパク質またはエクソソームタンパク質の変異体もしくは断片をコードする外因性配列を導入することにより作成される。エクソソームタンパク質をコードするプラスミドを、一過的にトランスフェクトして、エクソソーム表面上でエクソソームタンパク質の高レベル発現を誘導する。改変エクソソームタンパク質をコードするプラスミドを、一過的にトランスフェクトして、改変エクソソームタンパク質を表面上に有するエクソソームを産生する。
【０２０３】
エクソソームタンパク質、エクソソームタンパク質の変異体もしくは断片をコードするポリヌクレオチド、または親和性タグ、治療ペプチドもしくは標的化部分をコードする外因性配列を、産生細胞へと安定的に形質転換して、表面操作エクソソームを産生する。親和性タグ、治療ペプチドまたは標的化部分をコードする外因性配列を、エクソソームタンパク質をコードするゲノム部位へと挿入して、エクソソームタンパク質に付着した親和性タグを含む融合タンパク質を生成する。改変エクソソームタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、エクソソームタンパク質をコードするゲノム部位にノックインする。
【０２０４】
産生細胞株は、それぞれエクソソームタンパク質、エクソソームタンパク質の変異体もしくは断片をコードする、少なくとも２つのポリヌクレオチドまたは外因性ペプチド（例えば、親和性タグ、標的化部分、治療ペプチド）を安定的にトランスフェクトすることにより生成される。異なる産生細胞株はまた、２つ以上の外因性配列（例えば、親和性タグ、マーカー、標的化ペプチド、治療ペプチド等をコードする外因性配列）を、エクソソームタンパク質をコードするゲノム配列内またはそれに近接する複数のゲノム部位へと挿入することによって生成して、複数の改変エクソソームタンパク質を含む表面操作エクソソームを生成する。複数の改変エクソソームタンパク質はそれぞれ、エクソソームの表面を標的とする。エクソソームは、２つの異なる結合剤に対して親和性を有し、いずれかまたは両方の結合剤により精製される。
【０２０５】
実施例２０：アフィニティー精製によるエクソソームの単離、精製及び亜分画
エクソソームのアフィニティー精製のための結合剤を、穏和な条件下で溶出するバイオパニング／定向進化により開発した。
【０２０６】
結合剤を、固体支持体（例えば、多孔質アガロースビーズ）に付着させ、従来のクロマトグラフィー系（例えば、ＧＥ  ＡＫＴＡ）を形成した。エクソソームを含有する試料を、アフィニティー精製のためにそのカラムに接触させる。
【０２０７】
参照による組み込み
本出願において引用される、全ての出版物、特許、特許出願及び他の文書は、それぞれ個々の出版物、特許、特許出願または他の文書が、あらゆる目的のために参照により組み込まれると個別に示されるのと同程度に、あらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２０８】
等価物
本開示は、とりわけ、カンナビノイドの組成物及び取り巻き組成物を提供する。本開示はまた、カンナビノイド及び取り巻き組成物を投与することにより神経変性疾患を処置する方法を提供する。様々な特定の実施形態を例示し説明してきたが、上記の明細書は制限的ではない。本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、様々な変更を行うことができることが理解されるだろう。本明細書を参照すると、多くの変形が当業者に明らかになるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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