(57)【要約】  本発明は、プロセシングを強化するために免疫細胞に癌抗原を送達するためのＬＡＭＰルーメンドメインの特定の断片を含むＬＡＭＰ構築物を提供する。これらのＬＡＭＰ構築物は、疾患、特に過剰増殖性障害および／または癌の治療に使用できる。ＬＡＭＰ構築物は、対象に投与されたときに免疫応答を生成するための適切に構成された３次元エピトープの提示を可能にする。ＬＡＭＰ構築物は多価分子であり得、および／または２つ以上のＬＡＭＰ構築物を含む多価ワクチンの一部として提供され得る。本明細書に記載のＬＡＭＰ構築物は、非ヒト脊椎動物に投与されたときに抗体を生じさせるためにも使用できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．ＬＡＭＰタンパク質のシステイン保存断片と、
ｂ．少なくとも１つの癌抗原と
を含む改善されたＬＡＭＰ構築物。
【請求項２】
ａ．前記抗原が前記システイン保存断片のＮ末端に配置されているか、
ｂ．前記抗原が単一のシステイン保存断片のＣ末端に配置されているか、または
ｃ．前記抗原が２つのシステイン保存断片の間に配置されている、
請求項１に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物。
【請求項３】
前記改善されたＬＡＭＰ構築物が表１の列１または列４に記載された少なくとも１つの断片／エピトープを含み、好ましくはＩＬＣ−１、ＩＬＣ−２、ＩＬＣ−３、ＩＬＣ−４、ＩＬＣ−５またはＩＬＣ−６に示すように構築されている、請求項１または２に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物。
【請求項４】
各抗原がリンカーによって分離されている、請求項３に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物。
【請求項５】
前記リンカーがアミノ酸配列ＧＰＧＰＧまたはＰＭＧＬＰから選択される、請求項４に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物。
【請求項６】
前記改善されたＬＡＭＰ構築物が２つ以上のシステイン保存断片を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物。
【請求項７】
前記システイン保存断片がＬＡＭＰタンパク質の相同ドメインを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物。
【請求項８】
前記改善されたＬＡＭＰ構築物が、ＬＡＭＰタンパク質の膜貫通ドメインをさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物。
【請求項９】
前記改善されたＬＡＭＰ構築物がシグナル配列をさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物。
【請求項１０】
前記シグナル配列がＬＡＭＰタンパク質に由来する、請求項９に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物。
【請求項１１】
前記ＬＡＭＰタンパク質が、ＬＡＭＰ−１、ＬＡＭＰ２、ＬＡＭＰ−３、ＬＩＭＰ２、Ｍａｃｒｏｓａｉｌｉｎ、Ｅｎｄｏｌｙｎ、ＬＡＭＰ５またはＬＩＭＢＩＣから選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物。
【請求項１２】
前記ＬＡＭＰタンパク質が配列番号１〜１１３のいずれか１つから選択される、および／または前記癌抗原が配列番号１１４〜１９７のいずれか１つから選択される、請求項１１に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物。
【請求項１３】
前記ＬＡＭＰタンパク質が、配列番号１〜１１３と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である、および／または前記癌抗原が、配列番号１１４〜１９７と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である、請求項１２に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項１４に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物、請求項１４に記載のポリヌクレオチド、または請求項１５に記載の宿主細胞を含む組成物。
【請求項１７】
疾患または障害を有する対象を治療する方法であって、それを必要とする対象に、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物、請求項１４に記載のポリヌクレオチド、請求項１５に記載の宿主細胞、または請求項１６に記載の組成物を、疾患または障害を軽減または治療するのに十分な量で投与することを含む、方法。
【請求項１８】
前記方法が、プライミングステップと少なくとも１回のブースティングステップとを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物、請求項１４に記載のポリヌクレオチド、請求項１５に記載の宿主細胞または請求項１６に記載の組成物がプライミングステップで使用される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ブースティングステップが、抗原、改善されたＬＡＭＰ構築物、改善されたＬＡＭＰ構築物によりコードされるポリペプチド、または改善されたＬＡＭＰ構築物を含む細胞の投与を含む、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
プライミングに使用される抗原がブースティングに使用される抗原と同じである、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
プライミングに使用される抗原が、ブースティングに使用される第２の抗原と同じタンパク質に由来する、請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
プライミングおよび／またはブースティングに２つ以上の抗原が使用される、請求項１７〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌抗原を含む改善されたＬＡＭＰ構築物、および過剰増殖性障害および／または癌に罹患している対象の治療におけるその使用に関する。本明細書に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物を利用するプライムブーストプロトコルも記載されている。
【背景技術】
【０００２】
以下の説明では、背景および前置きの目的で特定の物品と方法を記載する。ここに含まれるものは、先行技術の「承認」と解釈されるべきではない。出願人は、必要に応じて、ここで参照されている物品および方法が、適用される法定条項の下で先行技術を構成しないことを実証する権利を明示的に留保する。
【０００３】
ＤＮＡワクチンは、予防ワクチンと治療ワクチンの両方を開発するための新しい有望な候補である。ＤＮＡワクチンは安全であることが証明されており、臨床的利益を達成するためにワクチン接種の反復サイクルが必要である場合、ベクター骨格に対する免疫応答の欠如が決定的な利点になり得る。しかし、従来のＤＮＡワクチンに認められる欠点の１つは、ヒトでの免疫原性が低いことである。エピトープベースのＤＮＡワクチンの免疫原性における重要な制限的ステップは、Ｔ細胞へのＭＨＣＩＩ提示経路に対するエピトープのアクセスであり得、これは標的技術を含まないワクチンの場合には確率過程である可能性が高い。
【０００４】
米国特許第５，６３３，２３４号には、改変されたインフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）の抗原性ドメインと、抗原をその区画に効果的に標的化する細胞質エンドソーム／リソソーム標的化シグナルとを含むキメラタンパク質が記載されている。抗原性ドメインが処理され、それからのペプチドが主要組織適合性（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子と関連して細胞表面に提示された。ＬＡＭＰ−１の細胞質尾部を使用して、キメラタンパク質のエンドソーム／リソソーム標的化ドメインを形成した。
【０００５】
米国特許第８，３１８，１７３号は、これらの最初の観察を展開して、ＬＡＭＰ−１の全ルーメンドメインと膜貫通ドメインとの間に挿入されたＨＩＶ−１  Ｇａｇタンパク質を含むキメラタンパク質（およびこれらのタンパク質をコードする対応するＤＮＡ）を説明した。この構築物は樹状細胞に導入され、ＭＨＣ  ＩＩ経路を標的とすることが報告された。
【０００６】
このアプローチは、いくつかのウイルス抗原、ヒトパピローマウイルスＥ７、デングウイルス膜タンパク質、ＨＩＶ−１  ｇｐ１６０膜タンパク質、ＨＩＶ−１  ｐ５５  Ｇａｇ、西ナイル膜タンパク質、Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ３タンパク質およびサイトメガロウイルスｐｐ６５に対する細胞応答および体液性応答の増加に有用であることが証明されている（例えば、Ｂｏｎｉｎｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：５２５０−５２５７，２００１を参照）。強化された免疫応答は、ＬＡＭＰおよびＭＨＣ  ＩＩの共局在化、ならびに抗原ペプチドのより効率的なプロセシングおよび送達に起因する可能性がある。さらに、ＬＡＭＰ標的化は免疫原性エピトープの増加した数を示す結果となり、したがって、非標的抗原と比較して質的に拡大した免疫応答を誘導することが報告されている。例えばＦｅｒｎａｎｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０（８）：２３３３−４３では、ワクシニアベクターにコードされたＬＡＭＰ輸送ＯＶＡ抗原の提示されたペプチドの数の増加が実証された。外因的に供給されたＯＶＡから生成された１２個のペプチドのうち、９個がＯＶＡ／ＬＡＭＰキメラによって提示されたのに対し、ＬＡＭＰを含まない構築物では２個のみが提示された。
【０００７】
ＬＡＭＰの細胞質ドメインが（シグナル配列および膜貫通ドメインと共に）必要であることは確定しているが、すべての抗原のエンドソーム／リソソーム輸送に対して必ずしも十分ではない。それどころか、リソソーム小胞経路へのタンパク質の輸送にはＬＡＭＰの全ルーメンドメインも必要であることが示されている。
【０００８】
しかし、ＬＡＭＰの完全なルーメンドメインと完全な膜貫通／細胞質尾部（「完全なＬＡＭＰ構築物」）が存在する場合でも、特定の抗原が免疫応答を産生する効果は、これらの構造物で使用される特定の配列に高度に依存することがますます発見されている。実際、完全なＬＡＭＰ構築物に挿入した場合、同じタンパク質の異なる抗原断片は同じ免疫応答を誘発しないことがわかっている。抗原断片が免疫応答を生じる場合と、そうでない場合がある。これらの観察から、完全なＬＡＭＰ構築物で目的のタンパク質のどの特定の抗原配列が免疫応答を産生するかを事前に予測することは難しくなる。
【０００９】
さらに、完全なＬＡＭＰ構築物の生成において、抗原を適切に発現および処理するには全ルーメンドメインが必要であることが繰り返し観察されている。例えば、Ｇｏｄｉｎｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ９（６）：９（６）：ｅ９９８８７．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００９９８８７で著者らは、完全かつ無傷のルーメンドメインが、抗原をリソソームに標的化するために必要な最小限の領域であり、ルーメンドメインの断片は機能しないことを報告した。６ページのｉｄを参照。
【００１０】
具体的には、Ｇｏｄｉｎｈｏらは、第１の管腔ドメインおよびいくつかの第２の管腔ドメインを完全に除去することにより（すなわち、Ｔ１−Ｌｕｍ／ｇａｇ構築物）、タンパク質発現と抗体応答の両方が減少することを示した。同様に、第１の管腔ドメインの２５％を除去するが無傷の第２の管腔ドメインを有する場合（すなわち、Ｔ２−ｌｕｍ／ｇａｇ）、タンパク質発現と抗体応答の両方は比較的増加したが、完全なＬＡＭＰ構築物で得られた結果に比べると依然として少なかった。
【００１１】
さらに、著者らは、免疫応答を産生する能力が、特定の抗原およびこれらの完全なＬＡＭＰ構築物で使用されるエピトープに依存することを確認した。例えば、９ページの２列目で、著者らは「したがって、先の研究では、ＶＬＰとして、または可溶性の形態で分泌されるＧａｇを生成するＤＮＡワクチンが、異なるレベルのＴ細胞およびＢ細胞活性化を誘導することが実証され、これは細胞質のＧａｇが誘導する反応とも異なる」と述べている。さらに、文献に記載されているようにＬＡＭＰの全ルーメンドメインとＬＡＭＰの全膜貫通／細胞質ドメインとの間に抗原配列を挿入すると、非常に大きなポリヌクレオチド配列になり得、商業レベルで生産するにはコストがかかりすぎるか、科学的な観点からは非現実的になり得る。
【００１２】
したがって、例えば、過剰増殖性障害および／または癌を効果的に治療するためのワクチンとして使用できる、新しく改善されたＬＡＭＰ構築物を設計する必要がある。さらに、一旦改善されると、これらの新しいＬＡＭＰ構築物を使用して抗体を生成できる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】米国特許第５，６３３，２３４号
【特許文献２】米国特許第８，３１８，１７３号
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｂｏｎｉｎｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：５２５０−５２５７，２００１
【非特許文献２】Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０（８）：２３３３−４３
【非特許文献３】Ｇｏｄｉｎｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ９（６）：９（６）：ｅ９９８８７．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００９９８８７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
この概要は、以下の発明を実施するための形態でさらに説明される概念をいくつか選んで簡略化した形式で紹介するために提供されている。この概要は、特許請求される主題の重要なまたは本質的な特徴を特定することを意図しておらず、特許請求される主題の範囲を制限するために使用されることも意図していない。特許請求される主題の他の特徴、詳細、有用性、および利点は、添付の図面に例示され、かつ添付の特許請求の範囲に定義される態様を含む以下の発明を実施するための形態から明らかになる。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の目的は、増強された免疫応答を生じるために本明細書で特定される癌抗原を免疫系に効果的に提示するＬＡＭＰドメインの特定の断片および／または変異体を含む新規構築物（「改善されたＬＡＭＰ構築物」）を提供することである。これらの改善されたＬＡＭＰ構築物は、ヘルパーＴ細胞が優先的に刺激される、および／または抗体が生成されるように、抗原をリソソーム／エンドソーム区画に効果的に導き、そこで処理されて主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子に提示される。
【００１７】
本明細書に記載される改善されたＬＡＭＰ構築物および方法は、対象において免疫応答を誘発し得る。免疫応答は、改善されたＬＡＭＰ構築物（例えば、ワクチン）中の抗原のエピトープに対する免疫応答であり得る。ワクチンは、免疫系が対象におけるワクチンの抗原を含む免疫系を検出および破壊できるように、対象の免疫系を準備させる。本明細書に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物および方法は、対象においてＴｈ１免疫応答を誘発し得る。Ｔｈ１免疫応答には、免疫細胞のサブセット（例えば、抗原特異的Ｔ細胞）による炎症性サイトカイン（例えば、ＩＦＮγ、ＴＮＦα）の分泌が含まれ得る。場合によっては、炎症性サイトカインは、対象の抗原を含む免疫細胞を破壊する可能性のある免疫細胞の別のサブタイプ（例えば、細胞毒性Ｔ細胞）を活性化する。
【００１８】
場合によっては、本明細書に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物および方法で使用されるエピトープおよび／または抗原は、対象の免疫系によって認識されてＴｈ１免疫応答を誘発し、Ｉ型サイトカインを放出することができる。Ｔｈ１応答は、エピトープとＴ細胞、より具体的にはＴ細胞により発現される主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）との間の相互作用により開始され得る。例えば、エピトープのＭＨＣ受容体への高親和性結合は、Ｔｈ１応答を刺激する可能性がある。ＭＨＣ受容体は、複数のタイプのＭＨＣ受容体のうちの少なくとも１つであり得る。Ｔ細胞に関与するＭＨＣ受容体は、集団内の個人によって異なる可能性がある。
【００１９】
場合によっては、免疫応答はタイプ１の免疫応答である。場合によっては、免疫応答は、Ｉ型サイトカイン産生とＩＩ型サイトカイン産生との比が１を超えることを特徴とする。場合によっては、免疫応答は、Ｉ型サイトカイン産生とＩＩ型サイトカイン産生との比が１未満であることを特徴とする。場合によっては、免疫応答は、ＩＦＮγ産生とＩＬ−１０産生との比が１を超えることを特徴とする。場合によっては、免疫応答は、ＩＦＮγ産生とＩＬ−１０産生との比が１未満であることを特徴とする。
【００２０】
プライムブーストプロトコルも考えられる。例えば、本発明は、本明細書に記載の癌抗原を含む改善されたＬＡＭＰ構築物で対象をプライミングし、続いて抗原または関連抗原（例えば、同じまたは非常に類似したタンパク質配列に由来する第２の抗原）で対象を少なくとも１回ブースティングすることを含む、癌抗原に対して対象内に免疫応答を生じさせる方法をさらに提供する。抗原の混合物は、プライミングおよびブースティング工程のいずれかまたは両方で使用できる。プライミング工程およびそれに続く抗原のブースティング工程のための改善されたＬＡＭＰ構築物の使用は、より高い力価を有意に生成することが示されており、これは増強された抗体応答におけるＬＡＭＰの力を表している。
【００２１】
本発明のさらに別の目的は、ヘルパーＴ細胞の刺激によって抗腫瘍免疫応答を誘発することにより、癌および／または過剰増殖性障害の改善された治療方法を提供することである。
【００２２】
本発明はさらに、本明細書に記載の癌抗原を含む改善されたＬＡＭＰ構築物のいずれかをコードする核酸分子を提供する。本発明はまた、抗体を生成するための抗原を含む改善されたＬＡＭＰ構築物を提供する。改善されたＬＡＭＰ構築物は、核酸分子が発現制御配列に作動可能に連結されている核酸を含むことができる。好ましい一態様では、改善されたＬＡＭＰ構築物は、患者にワクチン接種するのに適したワクチンベクターである。別の態様では、本発明は、抗原をコードする核酸分子を細胞に導入しやすくするための改善されたＬＡＭＰ構築物を含む送達媒体を提供する。送達媒体は、脂質ベース（例えば、リポソーム製剤）、ウイルスベース（例えば、核酸分子をカプセル化するウイルスタンパク質を含む）、または細胞ベースであり得る。
【００２３】
好ましい実施形態では、本発明は、哺乳動物において癌抗原に対する免疫応答（例えば、抗体の生成）を誘発するための目的の癌抗原を含む改善されたＬＡＭＰ構築物を含む注射可能な組成物を提供する。好ましい実施形態では、このワクチンは、Ｔｈ２応答に対して優先的なＴｈ１応答を生じる。改善されたＬＡＭＰ構築物は、本明細書に記載の癌抗原の少なくとも１つのエピトープを含む。
【００２４】
本発明はまた、本明細書に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物のいずれかを含む細胞を提供する。一態様では、細胞は抗原提示細胞である。抗原提示細胞は、プロフェッショナル抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞など）または操作された抗原提示細胞（例えば、ＭＨＣクラスＩＩ分子など、抗原提示に必要な分子を発現するように操作された非プロフェッショナル抗原提示細胞）であってもよい。抗原提示に必要な分子は、他の細胞、例えば、天然発生の細胞に由来し得るか、またはそれ自体が操作されたもの（例えば、抗原性エピトープに対する親和性が高いまたは低いなど、所望の特性を発現するように変異または修飾されたもの）であり得る。一態様では、抗原提示細胞は共刺激シグナルを一切発現せず、抗原は自己抗原である。
【００２５】
本発明はさらに、本明細書に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物のいずれかを含む複数の細胞を含むキットを提供する。少なくとも２つの細胞が異なるＭＨＣクラスＩＩ分子を発現し、各細胞は同じＬＡＭＰ構築物を含む。一態様では、改善されたＬＡＭＰ構築物とベクターを受け取るための細胞とを含むキットが提供される。
【００２６】
本発明はまた、本明細書に記載の少なくとも１つの細胞および／または少なくとも１つの改善されたＬＡＭＰ構築物を含むトランスジェニック動物を提供する。本発明はまた、本明細書に記載の細胞の少なくとも１つを含むトランスジェニック動物を提供する。
【００２７】
本発明はさらに、動物（例えば、ヒトまたは非ヒト脊椎動物）において抗原に対する免疫応答を生じさせる方法を提供し、この方法は、上記の細胞を動物に投与することを含み、ここで細胞は、動物中に改善されたＬＡＭＰ構築物を発現するか、または動物における改善されたＬＡＭＰ構築物の発現を誘導することができる。一態様では、動物がＭＨＣクラスＩＩ分子に対する免疫応答を生成しないように、細胞は、動物のＭＨＣタンパク質と適合するＭＨＣクラスＩＩ分子を含む。好ましい一態様では、動物はヒトである。
【００２８】
さらなる態様において、本発明は、ヒトまたは非ヒト脊椎動物などの動物に、本明細書に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物のいずれかを投与することを含む、癌抗原に対する免疫応答を誘発する方法を提供する。好ましくは、改善されたＬＡＭＰ構築物は動物の細胞に対して感染性である。例えば、改善されたＬＡＭＰ構築物は、ワクシニア改善型ＬＡＭＰ構築物などのウイルスベクターであり得る。
【００２９】
例えば、本発明はさらに、本明細書に記載の抗原を含む改善されたＬＡＭＰ構築物で動物をプライミングし、続いて動物を少なくとも１回ブースティングすることを含む、癌抗原に対して動物中に免疫応答を生じさせる方法を提供する。プライミング工程およびそれに続く抗原のブースティング工程のための改善されたＬＡＭＰ構築物の使用は、より高い力価を有意に生成することが示されており、これは増強された抗体応答におけるＬＡＭＰの力を表している。
【００３０】
さらなる態様において、細胞は患者から得られ、本明細書に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物が細胞に導入され、細胞または細胞の子孫が患者内に再導入される。一態様では、細胞は、抗原提示細胞に分化することができる幹細胞である。ヒト患者の治療および獣医学的使用が特に考えられる。
【００３１】
本発明はまた、非ヒト脊椎動物中に抗体を生じさせる方法を含み、ここで、非ヒト脊椎動物には、本明細書に記載の目的の抗原を含む改善されたＬＡＭＰ構築物が注入される。次に、目的の癌抗原は、非ヒト脊椎動物のＬＡＭＰの助けを借りて免疫系に効率的に提示され、抗原に対する抗体を産生する。
【００３２】
具体的には、目的の抗原の提示をＬＡＭＰと組み合わせることにより、抗原を細胞質エンドソーム／リソソーム区画に効率的に輸送し、そこで抗原を処理し、そこからのペプチドを主要組織適合性（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子に関連して細胞表面に提示することができる。
【００３３】
これらの生成された抗体は、脊椎動物の血液から（ポリクローナルとして）単離し、標準的な技術を使用してモノクローナル抗体を生成するためにさらに単離することができる。
【００３４】
好ましい実施形態では、非ヒト脊椎動物のゲノムは、導入された部分的ヒト免疫グロブリン領域を含み、この導入された領域は、ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子座コード配列と非ヒト脊椎動物の内因性免疫グロブリン可変領域遺伝子座に基づく非コード配列とを含む。好ましくは、非ヒト脊椎動物のゲノムは、内因性免疫グロブリン領域の少なくとも一部またはすべてが除去されている。
【００３５】
さらに好ましい実施形態では、非ヒト脊椎動物におけるヒトモノクローナル抗体の産生には、宿主が、ヒト重鎖免疫グロブリンタンパク質を発現する少なくとも１つの遺伝子座と、ヒト軽鎖免疫グロブリンタンパク質を発現する１つの遺伝子座とを有する必要がある。
【００３６】
いくつかの態様では、部分的ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子座は、ヒトＶＨコード配列と非ヒト脊椎動物の内因性ＶＨ領域に基づく非コードＶＨ配列とを含む。これらの態様では、部分的ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子座はさらに、ヒトＤおよびＪ遺伝子コード配列と非ヒト脊椎動物宿主の内因性ゲノムに基づく非コードＤおよびＪ遺伝子配列とを含む。
【００３７】
他の態様において、免疫グロブリン領域は、ヒトＶＬコード配列と非ヒト脊椎動物の内因性ＶＬ領域に基づく非コードＶＬ配列とを含む導入された領域を含む。より好ましくは、ヒトＶＬコード配列を含む導入された部分的ヒト免疫グロブリン領域は、ヒトＪ遺伝子コード配列と非ヒト脊椎動物宿主の内因性ゲノムに基づく非コードＪ遺伝子配列とをさらに含む。
【００３８】
特定の態様では、脊椎動物は哺乳動物であり、好ましくは、哺乳動物はげっ歯類、例えばマウスまたはラットである。他の態様では、脊椎動物は鳥類、例えばニワトリである。その他の非ヒト脊椎動物には、ウサギ、ラマ、ラクダ、ウシ、モルモット、ハムスター、イヌ、ネコ、ウマ、非ヒト霊長類、類人猿（例えば、サルまたはエイプ）、サル（例えば、マーモセット、ヒヒ、アカゲザル）、またはエイプ（例えば、ゴリラ、チンパンジー、オランウータン、テナガザル）が含まれる。
【００３９】
さらなる実施形態では、部分的ヒト免疫グロブリン領域は、ヒトＶＨ遺伝子コード領域を含み、さらに、ｉ）ヒトＤおよびＪ遺伝子コード配列と、ｉｉ）非ヒト脊椎動物宿主の内因性ゲノムに基づく非コードＤおよびＪ遺伝子ならびにｐｒｅ−ＤＪ配列とを含む。他の態様では、ＶＨ遺伝子コード領域は他の供給源に（少なくとも部分的に）由来し、例えば、合理的またはそうでなければ設計された配列、ヒトと他の設計された配列との組み合わせである配列、あるいは非ヒト霊長類など他の種からの配列であり得る。
【００４０】
さらに別の特定の態様において、部分的ヒト免疫グロブリン領域は、ヒトＶＬ遺伝子コード領域を含み、さらに、ｉ）ヒトＪ遺伝子コード配列およびｉｉ）非ヒト脊椎動物宿主の内因性ゲノムに基づく非コードＪ遺伝子配列を含む。特定の態様において、部分的ヒト免疫グロブリン領域は、ヒトＶＨコード領域と、ヒトＤおよびＪ遺伝子コード配列と、非ヒト脊椎動物宿主の内因性ゲノムに基づく非コードＤおよびＪ遺伝子ならびにｐｒｅ−ＤＪ配列とを含む。
【００４１】
本明細書に記載の方法は、診断および治療用途のための、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体を含む抗体の産生および／または最適化に使用することができる。そのような抗体を産生するハイブリドーマも本発明のさらなる目的である。
【００４２】
これらおよびその他の態様、目的、特徴について以下でさらに詳しく説明する。
【００４３】
本発明の目的および特徴は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照してよりよく理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】本明細書で説明するように使用できる様々な種類の改善されたＬＡＭＰ構築物（ＩＬＣ−１、ＩＬＣ−２、ＩＬＣ−３、ＩＬＣ−４、ＩＬＣ−５、およびＩＬＣ−６として識別される）の一般的な図式を示す図である。
【００４５】
【図２】図２Ｂは本明細書で定義されるＬＡＭＰタンパク質のドメインを示し、図２ＡはヒトＬＡＭＰ−１（配列番号１）、ヒトＬＡＭＰ−２（配列番号２）、ヒトＬＡＭＰ−３（配列番号３）、ヒトＬＩＭＰ−２（配列番号４）、ヒトＥｎｄｏｌｙｎ（配列番号５）、ヒトＭａｃｒｏｓａｉｌｉｎ（配列番号８０）、ヒトＬＡＭＰ−５（配列番号９３）およびヒトＬＩＭＢＩＣ（配列番号６７）についてこれらのドメインの特定のアミノ酸境界を定義する図である。本明細書に記載されるように、改善されたＬＡＭＰ構築物ＩＬＣ−１、ＩＬＣ−２、ＩＬＣ−３、ＩＬＣ−４、ＩＬＣ−５およびＩＬＣ−６を生成するために、ＬＡＭＰルーメンドメイン、相同ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞質尾部およびシグナル配列を使用することができる。
【００４６】
【図３】ヒトＬＡＭＰ−１（配列番号１）と比較して他の種に見られるＬＡＭＰ−１タンパク質のアラインメントを示す図である。これらの他の種の同等のドメインは、本明細書に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物を生成するために使用でき、図２および図３でヒトＬＡＭＰ−１について特定されたドメインを図３に示すアラインメントと比較することによって容易に識別できる。
【００４７】
【図４】ヒトＬＡＭＰ−２（配列番号２）と比較して他の種に見られるＬＡＭＰ−２タンパク質のアラインメントを示す図である。これらの他の種の同等のドメインは、本明細書に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物を生成するために使用でき、図２および図４でヒトＬＡＭＰ−２について特定されたドメインを図４に示すアラインメントと比較することによって容易に識別できる。
【００４８】
【図５】ヒトＬＡＭＰ−３（配列番号３）と比較して他の種に見られるＬＡＭＰ−３タンパク質のアラインメントを示す図である。これらの他の種の同等のドメインは、本明細書に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物を生成するために使用でき、図２および図５でヒトＬＡＭＰ−３について特定されたドメインを図５に示すアラインメントと比較することによって容易に識別できる。
【００４９】
【図６】ヒトＬＩＭＰ−２（配列番号４）と比較して他の種に見られるＬＩＭＰ−２タンパク質のアラインメントを示す図である。これらの他の種の同等のドメインは、本明細書に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物を生成するために使用でき、図２および図６でヒトＬＩＭＰ−２について特定されたドメインを図６に示すアラインメントと比較することによって容易に識別できる。
【００５０】
【図７】ヒトＬＩＭＢＩＣ（配列番号６７）と比較して他の種に見られるＬＩＭＢＩＣタンパク質のアラインメントを示す図である。これらの他の種の同等のドメインは、本明細書に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物を生成するために使用でき、図２および図７でヒトＬＩＭＢＩＣについて特定されたドメインを図７に示すアラインメントと比較することによって容易に識別できる。
【００５１】
【図８】ヒトＥｎｄｏｌｙｎ（配列番号５）と比較して他の種に見られるＥｎｄｏｌｙｎタンパク質のアラインメントを示す図である。これらの他の種の同等のドメインは、本明細書に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物を生成するために使用でき、図２および図８でヒトＥｎｄｏｌｙｎについて特定されたドメインを図８に示すアラインメントと比較することによって容易に識別できる。
【００５２】
【図９】ヒトＭａｃｒｏｓａｉｌｉｎ（配列番号８０）と比較して他の種に見られるＭａｃｒｏｓａｉｌｉｎタンパク質のアラインメントを示す図である。これらの他の種の同等のドメインは、本明細書に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物を生成するために使用でき、図２および図９でヒトＭａｃｒｏｓａｉｌｉｎについて特定されたドメインを図９に示すアラインメントと比較することによって容易に識別できる。
【００５３】
【図１０】ヒトＬＡＭＰ−５（配列番号９３）と比較して他の種に見られるＬＡＭＰ−５タンパク質のアラインメントを示す図である。これらの他の種の同等のドメインは、本明細書に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物を生成するために使用でき、図２および図１０でヒトＬＡＭＰ−５について特定されたドメインを図１０に示すアラインメントと比較することによって容易に識別できる。
【００５４】
【図１１】マウスを０、７、および１４日目にＨＶＥＭ−ＬＡＭＰ、ＨＶＥＭ、またはＬＡＭＰで免疫したときに得られた結果を示す図である。２８日目に、マウスから採血し、血清試料を単離した。ＨＶＥＭ特異的ＩｇＧをＥＬＩＳＡで調べた。データは、抗体力価の幾何平均±幾何ＳＤ、ｎ＝６、＊＊ｐ値＜０．０１を表す。
【００５５】
【図１２】マウスを０、７、１４日目にＨＶＥＭ−ＬＡＭＰ、ＨＶＥＭ、またはＬＡＭＰで免疫したときに得られた結果を示す図である。３５日目に、ミョウバンアジュバントの存在下、５μｇのＨＶＥＭタンパク質でマウスをブーストした。４９日目にマウスから採血し、血清試料を単離した。ＨＶＥＭ特異的ＩｇＧをＥＬＩＳＡで調べた。データは、抗体力価の幾何平均±幾何ＳＤ、ｎ＝６、＊＊＊ｐ値＜０．００１、＊＊＊＊ｐ値＜０．０００１を表す。
【００５６】
【図１３】ＬＡＭＰがＨＶＥＭのＣＲＤ３／４でエピトープの結合親和性を変化させることを示す図である。
【００５７】
【図１４】試験した改善されたＬＡＭＰ構築物のタンパク質発現を確認する図である。図１４〜図２８の各々において、「完全なＬＡＭＰ構築物」、ＩＬＣ−１、ＩＬＣ−２、ＩＬＣ−３およびＩＬＣ−４のラベルは図１に示した構築物に対応している。
【００５８】
【図１５】改善されたＬＡＭＰ構築物が、ＩＮＦγを産生するＴｈ１エフェクターＴ細胞を誘導することを示す図である。
【００５９】
【図１６】特定の改善されたＬＡＭＰ構築物（例えば、図１に示すＩＬＣ−４）がすべてのサバイビンペプチドプールに対して有意に高いＴ細胞応答を誘発したことを示す図である。
【００６０】
【図１７】ＣＤ４  Ｔ細胞がＩＦＮγ産生細胞の主要な供給源であり、改善されたＬＡＭＰ構築物が完全なＬＡＭＰ構築物よりもＣＤ４エフェクター記憶細胞集団の増加を実証することを示す図である。
【００６１】
【図１８】改善されたＬＡＭＰ構築物がＢＡＬＢ／ｃマウスでより強いサバイビン特異的総ＩｇＧ応答を生じたことを示す図である。
【００６２】
【図１９】本明細書および図１〜図１０に記載のＬＡＭＰ構築物に、単独でまたは表１および段落［１５０］に記載の組み合わせでクローニングできる癌抗原のアミノ酸配列を示す図である。さらに、図１９は、実施例で試験したサバイビン−ＬＡＭＰ構築物のアミノ酸配列を提供する。各構築物のシグナル配列は、小文字と下線付きの文字で表され、サバイビン配列は大文字の白い文字で、黒い影を付けて表され、管腔ドメインは斜体の大文字で表され、膜貫通／細胞質ドメインは大文字で、灰色の影を付けて表され、ＩＬＣ−４では、第２の相同ドメインが太字になっている。追加のアミノ酸（ＬＥおよびＥＦ）がクローニングリンカーの一部として含まれ得る。
【００６３】
【図２１】ＩＧＦＢＰ２（３９−３２８）−ＩＬＣ−１構築物が、１０ｕｇ  ＩＭ／ＥＰ免疫化の用量で有意に高いＩＦＮγ産生エフェクターＴ細胞を誘導したことを示す図である。
【００６４】
【図２２】ＩＧＦＢＰ２（３９−３２８）−ＩＬＣ−１構築物が、１０ｕｇ  ＩＭ／ＥＰ免疫化の用量でＣＤ４＋およびＣＤ８＋エフェクター記憶Ｔ細胞を産生するＩＦＮγおよび／またはＴＮＦαを誘導したことを示す図である。
【００６５】
【図２３】ＩＭ／ＥＰ免疫化によりＩＧＦＢＰ２（３９−３２８）−ＩＬＣ−１構築物で免疫したＣ５７ＢＬ／６アルビノマウスにおけるＩＧＦＢＰ−２特異的ＩｇＧ産生を示す図である。
【００６６】
【図２４】ｐｐ６５ペプチドとｇＢペプチドの両方によるＩＦＮ誘導を示す図である。
【００６７】
【図２５】ＣＭＶトランスフェクト細胞ライセートに対する免疫マウスの血清中の総ＩｇＧ（左）およびＩｇＧ２ａ（右）抗体力価を示す図である。
【００６８】
【図２６】ＰＳＭＡ−ＩＬＣ−１  ＬＡＭＰ構築物が、２０ｕｇ  ＩＤ／ＥＰ免疫化の用量で有意に高いＩＦＮγ産生エフェクターＴ細胞を誘導したことを示す図である。
【００６９】
【図２７】ＰＳＭＡ−ＩＬＣ−１  ＬＡＭＰ構築物が、２０ｕｇ  ＩＤ／ＥＰ免疫化の用量でＩＦＮγ産生ＣＤ４＋およびＣＤ８＋エフェクター記憶Ｔ細胞を誘導したことを示す図である。
【００７０】
【図２８】ＩＤ／ＥＰを介した免疫化によりＰＳＭＡ−ＩＬＣ−１  ＬＡＭＰ構築物で免疫したＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＩｇＧおよびＩｇＧ２Ａの総産生量を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
本発明は、ワクチンを生成するために、および／または抗体を産生するために使用することができる改善されたＬＡＭＰ構築物を提供する。改善されたＬＡＭＰ構築物を使用して免疫応答を調節または強化することができる。好ましい一態様では、本発明は、本明細書に記載するような１つ以上の癌抗原を含む改善されたＬＡＭＰ構築物を提供することにより、癌または過剰増殖性障害の患者を治療する方法を提供する。改善されたＬＡＭＰ構築物を使用して、非ヒト脊椎動物、および好ましくは非ヒト哺乳動物中に抗体を産生することができる。
【００７２】
定義
以下の定義は、以下の説明で使用する特定の用語について提供される。
【００７３】
明細書および請求項で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の参照を含む。例えば、「細胞」という用語は、その混合物を含む複数の細胞を含む。「核酸分子」という用語は、複数の核酸分子を含む。
【００７４】
本明細書で使用する「含む」という用語は、改善されたＬＡＭＰ構築物および方法が列挙された要素を含むが、他の要素を除外しないことを意味することを意図している。「本質的に〜からなる」は、改善されたＬＡＭＰ構築物および方法を定義するために使用する場合、組み合わせにとって本質的に重要な他の要素を除外することを意味するものとする。したがって、本明細書で定義される要素から本質的になる改善されたＬＡＭＰ構築物は、単離および精製方法からの微量汚染物質、ならびにリン酸緩衝生理食塩水、防腐剤などの薬学的に許容される担体を除外しない。「からなる」とは、本発明の改善されたＬＡＭＰ構築物を投与するための他の成分の微量要素および実質的な方法ステップを除外することを意味するものとする。これらの移行用語の各々によって定義される実施形態は、本発明の範囲内にある。
【００７５】
「約」または「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値の許容範囲内であることを意味し、これは、値の測定方法または決定方法、例えば測定システムの限界に一部依存する。例えば、「約」は、所与の値の最大２０％、好ましくは最大１０％、より好ましくは最大５％、さらにより好ましくは最大１％の範囲を意味し得る。あるいは、特に生物学的システムまたはプロセスに関して、この用語は、値の１桁以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味し得る。特に明記しない限り、「約」という用語は、特定の値の許容誤差範囲内、例えば±１〜２０％、好ましくは±１〜１０％、より好ましくは±１〜５％を意味する。
【００７６】
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限との間の各介在値と、その記載された範囲内の任意の他の記載値または介在値が本発明に含まれることが理解される。これらのより小さな範囲の上限および下限は、より小さな範囲に独立して含まれてもよく、また、記載された範囲内の任意の具体的に除外された制限を条件として本発明に含まれる。記載された範囲が限界の一方または両方を含む場合、それらの含まれる両方の限界のいずれかを除外した範囲も本発明に含まれる。
【００７７】
本明細書で使用する「リソソーム／エンドソーム区画」とは、膜にＬＡＭＰ分子を含む膜結合酸性液胞、抗原プロセシングで機能する加水分解酵素、ならびに抗原認識および提示のためのＭＨＣクラスＩＩ分子を指す。この区画は、エンドサイトーシス、ファゴサイトーシス、およびピノサイトーシスを含む様々なメカニズムのいずれかによって細胞表面から内在化した異物、および特殊な自己分解現象によってこの区画に送達される細胞内物質の分解部位として機能する（ｄｅ  Ｄｕｖｅ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３７：３９１、１９８３）。本明細書および特許請求の範囲で使用される「エンドソーム」という用語は、リソソームを包含する。
【００７８】
本明細書で使用する「リソソーム関連オルガネラ」は、リソソームを含む任意のオルガネラを指し、ＭＩＩＣ、ＣＩＩＶ、メラノソーム、分泌顆粒、溶解顆粒、血小板高密度顆粒、好塩基球顆粒、ビルベック顆粒、ファゴリソソーム、分泌リソソームなどを含むがこれらに限定されない。好ましくは、そのようなオルガネラは、マンノース６−リン酸受容体を欠き、ＬＡＭＰを含むが、ＭＨＣクラスＩＩ分子を含んでも含まなくてもよい。レビューについては、例えば、Ｂｌｏｔｔ  ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００２；Ｄｅｌｌ’Ａｎｇｅｌｉｃａら、Ｔｈｅ  ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １４：１２６５−１２７８、２０００を参照。
【００７９】
本明細書で使用する「ポリヌクレオチド」および「核酸分子」という用語は、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指すために互換的に使用される。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および／またはそれらの類似体を含み得る。ヌクレオチドは、任意の３次元構造を有することができ、既知または未知の任意の機能を実行できる。「ポリヌクレオチド」という用語は、例えば、一本鎖、二本鎖および三重らせん分子、遺伝子または遺伝子断片、エクソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス分子、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、アプタマー、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマーを含む。核酸分子はまた、修飾された核酸分子（例えば、修飾された塩基、糖、および／またはヌクレオチド間リンカーを含む）を含み得る。
【００８０】
本明細書で使用する「ペプチド」という用語は、２つ以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸類似体、またはペプチド模倣物の化合物を指す。サブユニットは、ペプチド結合または他の結合（例えば、エステル、エーテルなど）によって連結されていることがある。
【００８１】
本明細書で使用する「アミノ酸」という用語は、グリシンおよびＤまたはＬ光学異性体の両方、ならびにアミノ酸類似体およびペプチド模倣体を含む、天然および／または非天然または合成アミノ酸を指す。３つ以上のアミノ酸のペプチドは、ペプチド鎖が短い場合、一般にオリゴペプチドと呼ばれる。ペプチド鎖が長い場合（例えば、約１０個より多いアミノ酸）、ペプチドは一般にポリペプチドまたはタンパク質と呼ばれる。「タンパク質」という用語は「ポリペプチド」という用語を包含するが、「ポリペプチド」は完全長未満のタンパク質であり得る。
【００８２】
本明細書で使用する「ＬＡＭＰポリペプチド」は、本明細書に記載するような哺乳動物のリソソーム関連膜タンパク質であるヒトＬＡＭＰ−１、ヒトＬＡＭＰ−２、ヒトＬＡＭＰ−３、ヒトＬＩＭＰ−２、ヒトＥｎｄｏｌｙｎ、ヒトＬＩＭＢＩＣ、ヒトＬＡＭＰ−５、またはヒトＭａｃｒｏｓａｉｌｉｎ、ならびにオルソログ（例えば、図３〜図１０に示すＬＡＭＰタンパク質など）、および対立遺伝子変異体を指す。
【００８３】
本明細書で使用する「発現」とは、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写される、および／またはペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現には、ゲノムＤＮＡから転写されたｍＲＮＡのスプライシングが含まれる場合がある。
【００８４】
本明細書で使用する「転写制御下」または「作動可能に連結された」とは、発現制御要素とコード配列の適切な並置によって制御されるポリヌクレオチド配列の発現（例えば、転写または翻訳）を指す。一態様では、発現制御配列がそのＤＮＡ配列の転写を制御および調節する場合、ＤＮＡ配列は発現制御配列に「作動可能に連結されている」。
【００８５】
本明細書で使用する「コード配列」は、適切な発現制御配列の制御下に置かれたときに転写されてポリペプチドに翻訳される配列である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンと３’（カルボキシル）末端の翻訳停止コドンによって決定される。コード配列は、原核生物配列、真核生物ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳動物）ＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列でさえ含むことができるが、これらに限定されない。ポリアデニル化シグナルと転写終結配列は通常、コード配列の３’に位置する。
【００８６】
本明細書で使用する場合、配列またはそれらの相補配列が同じアミノ酸配列をコードする場合には２つのコード配列は互いに「対応する」。
【００８７】
本明細書で使用する「シグナル配列」は、小胞体転座配列を示す。この配列はシグナルペプチドをコードし、シグナルペプチドは、細胞に連絡して、小胞体の小胞区画に（例えば化学結合を介して）結合しているポリペプチドがエキソサイトーシス／エンドサイトーシスのオルガネラに入り、細胞小胞区画、細胞表面に送達されるか、またはポリペプチドを分泌するように指示する。このシグナル配列は、タンパク質の成熟時に細胞によって切り取られることがある。原核生物および真核生物に固有の様々なタンパク質に関連するシグナル配列を見つけることができる。
【００８８】
本明細書で使用する「輸送」とは、粗面小胞体から抗原プロセシングおよびＭＨＣ  ＩＩへの結合が発生するエンドソーム／リソソーム区画または関連オルガネラまでの経路における、細胞オルガネラまたは区画を通して改善されたＬＡＭＰ構築物によってコードされるポリペプチドの移動または進行を意味する。
【００８９】
本明細書で使用する場合、「改善されたＬＡＭＰ構築物」および「抗原を含む改善されたＬＡＭＰ構築物」および「目的の抗原を含む改善されたＬＡＭＰ構築物」は互換的に使用される。改善されたＬＡＭＰ構築物の様々な配置は、図１にＩＬＣ１−ＩＬＣ６として示す。さらに、「改善されたＬＡＭＰ構築物」の使用は、改善されたＬＡＭＰ構築物のポリヌクレオチド配列、および改善されたＬＡＭＰ構築物のポリヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の両方を包含する。
【００９０】
本明細書で使用する「改善されたＬＡＭＰ構築物送達媒体」は、改善されたＬＡＭＰ構築物を宿主細胞（例えば、遺伝子または遺伝子断片、アンチセンス分子、リボザイム、アプタマーなど）に運ぶことができ、それが本明細書に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物と関連して生じる任意の分子または分子群または高分子として定義される。
【００９１】
本明細書で使用する「改善されたＬＡＭＰ構築物送達」または「改善されたＬＡＭＰ構築物移入」は、導入に使用される方法に関係なく、改善されたＬＡＭＰ構築物を宿主細胞に導入することを指す。導入された改善されたＬＡＭＰ構築物は、宿主細胞内で安定的または一時的に維持され得る。通常、安定した維持には、導入された改善されたＬＡＭＰ構築物に、宿主細胞と互換性のある複製起点が含まれているか、染色体外レプリコン（プラスミドなど）や核またはミトコンドリア染色体などの宿主細胞のレプリコンに組み込まれることが必要である。
【００９２】
本明細書で使用する「ウイルス改善型ＬＡＭＰ構築物」とは、インビボ、エクスビボまたはインビトロのいずれかで宿主細胞に送達される改善されたＬＡＭＰ構築物を含むウイルスまたはウイルス粒子を指す。ウイルス改善型ＬＡＭＰ構築物の例には、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが含まれるが、これらに限定されない。遺伝子移入がアデノウイルスベクターによって媒介される態様では、改善されたＬＡＭＰ構築物は、アデノウイルスゲノムまたはその一部、およびアデノウイルスキャプシドタンパク質に関連する選択された非アデノウイルス遺伝子を含む。
【００９３】
本明細書で使用する「アデノウイルス媒介遺伝子移入」または「アデノウイルス形質導入」とは、アデノウイルスが細胞に入ることにより、改善されたＬＡＭＰ構築物が宿主細胞に移入されるプロセスを指す。好ましくは、改善されたＬＡＭＰ構築物は、細胞内で複製および／または統合および転写され得る。
【００９４】
本明細書で使用する「アデノウイルス粒子」は、外部キャプシドおよび改善されたＬＡＭＰ構築物を含む個々のアデノウイルスビリオンであり、キャプシドはアデノウイルスエンベロープタンパク質をさらに含む。アデノウイルスエンベロープタンパク質は、例えば、アデノウイルス粒子を特定の細胞および／または組織型に標的化するために、ウイルスタンパク質に共有結合したポリペプチドリガンドを含む融合ポリペプチドを含むように修飾されてもよい。
【００９５】
本明細書で使用する場合、改善されたＬＡＭＰ構築物の「投与」または「免疫化」または「注入」という用語は、改善されたＬＡＭＰ構築物で細胞を形質導入、トランスフェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、または発射することを指す。いくつかの態様において、改善されたＬＡＭＰ構築物は、標的細胞を送達細胞と接触させることにより（例えば、細胞融合により、または送達細胞が標的細胞に近接している場合には送達細胞を溶解することにより）標的細胞内に導入される。
【００９６】
本明細書で使用する「プライムブースト」という語句は、Ｔ細胞応答をプライミングするために使用される本明細書に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物の使用、それに続く応答を高めるための抗原、抗原を含むＤＮＡワクチンまたは組換え抗原を含む第２の改善されたＬＡＭＰ構築物の使用（またはその逆）を表す。これらの異種プライムブースト免疫化は、同じベクターでプライミングおよびブースティングすることで達成できるよりも高度かつ長期に免疫応答を誘発する。抗原を含む改善されたＬＡＭＰ構築物によるプライミングは記憶細胞を起動させ、ブースティング工程は記憶応答を拡張する。好ましくは、互いに対する応答を産生しない、したがって互いの活動に干渉しない２つの異なる薬剤が使用される。抗原の混合物は、プライミングおよび／またはブースティング工程で特に考えられる。ブースティングは１回または複数回発生する可能性がある。
【００９７】
本明細書で使用する「ハイブリダイゼーション」とは、１または複数のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を介して安定化された複合体を形成する反応を指す。水素結合は、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ型塩基対、Ｈｏｏｇｓｔｅｉｎ結合、またはその他の配列固有の方法で発生する。複合体は、二重鎖構造を形成する２本の鎖、多重鎖複合体を形成する３本以上の鎖、単一の自己ハイブリッド形成鎖、またはこれらの任意の組み合わせを含み得る。ハイブリダイゼーション反応は、ＰＣＲ反応の開始、またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素的切断などのより広範なプロセスの工程を構成し得る。
【００９８】
本明細書で使用する場合、別の配列に対して特定の割合（例えば、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％）の「配列同一性」を有するポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域とは、当該技術分野で日常的なソフトウェアプログラムを使用して最大限に整列した場合に、その塩基（またはアミノ酸）の割合が２つの配列を比較して同じであることを意味する。
【００９９】
ヌクレオチドの少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８０％、そして最も好ましくは少なくとも約９０または９５％が、ＤＮＡ配列の定義された長さにわたって一致するとき、２つの配列は「実質的に相同」または「実質的に類似」である。同様に、ポリペプチドのアミノ酸残基の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約６６％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８０％、そして最も好ましくは少なくとも約９０または９５％が、ポリペプチド配列の定義された長さにわたって一致するとき、２つのポリペプチド配列は「実質的に相同」または「実質的に類似」である。実質的に相同な配列は、配列データバンクで利用可能な標準ソフトウェアを使用して配列を比較することにより識別できる。実質的に相同な核酸配列も、例えば、その特定のシステムに対して定義されたストリンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験で識別できる。適切なハイブリダイゼーション条件を定義することは、当技術分野の範囲内である。例えば、ストリンジェントな条件は、４２°Ｃで５ｘＳＳＣおよび５０％ホルムアミドでのハイブリダイゼーション、および６０°Ｃで０．１ｘＳＳＣおよび０．１％ドデシル硫酸ナトリウムでの洗浄であり得る。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のさらなる例には、約２５℃〜約３７℃のインキュベーション温度、約６ｘＳＳＣ〜約１０ｘＳＳＣのハイブリダイゼーション緩衝液濃度、約０％〜約２５％のホルムアミド濃度、および約６ｘＳＳＣの洗浄溶液が含まれる。中程度のハイブリダイゼーション条件の例には、約４０℃〜約５０℃のインキュベーション温度、約９ｘＳＳＣ〜約２ｘＳＳＣの緩衝液濃度、約３０％〜約５０％のホルムアミド濃度、および約５ｘＳＳＣ〜約２ｘＳＳＣの洗浄溶液が含まれる。高ストリンジェンシー条件の例には、約５５℃〜約６８℃のインキュベーション温度、約１ｘＳＳＣ〜約０．１ｘＳＳＣの緩衝液濃度、約５５％〜約７５％のホルムアミド濃度、および約１ｘＳＳＣ、０．１ｘＳＳＣ、または脱イオン水の洗浄溶液が含まれる。一般に、ハイブリダイゼーションのインキュベーション時間は５分〜２４時間で、１工程、２工程またはそれ以上の洗浄工程があり、洗浄インキュベーション時間は約１、２、または１５分である。ＳＳＣは０．１５Ｍ  ＮａＣｌと１５ｍＭクエン酸の緩衝液である。他の緩衝系を使用するＳＳＣの同等物を使用できることが理解される。類似性は配列決定により検証できるが、好ましくはまた、または代わりに、問題の特定のドメインに適したアッセイを使用して、機能（例えば、エンドソーム区画への輸送能力など）により検証される。
【０１００】
「パーセント（％）配列類似性」、「パーセント（％）配列同一性」などの用語は一般に、核酸分子の異なるヌクレオチド配列またはポリペプチドのアミノ酸配列間の同一性または一致の程度を指し、これらは共通の進化的起源を共有する場合としない場合がある（前出のＲｅｅｃｋらを参照）。配列の同一性は、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＤＮＡ  Ｓｔｒｉｄｅｒ、ＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、ＧＣＧパッケージのプログラムマニュアル、バージョン７、ウィスコンシン州マディソン）など、公開されている多数の配列比較アルゴリズムのいずれかを使用して決定できる。
【０１０１】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸分子間の同一性パーセントを決定するために、最適な比較目的で配列を並べる。２つの配列間の同一性パーセントは、配列が共有する同一位置の数の関数である（すなわち、同一性パーセント＝同一位置の数／位置の総数（例えば、重複する位置）ｘ１００）。一実施形態では、２つの配列は同じ長さであるか、またはほぼ同じ長さである。２つの配列間の同一性パーセントは、ギャップを許可するかどうかにかかわらず、以下で説明する手法に類似の手法を使用して決定できる。パーセント配列同一性の計算では、通常、完全一致がカウントされる。
【０１０２】
２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して実現できる。２つの配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの非限定的な例は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９０，８７：２２６４、修正版Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９３、９０：５８７３−５８７７である。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９０；２１５：４０３のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で実施して、本発明の配列に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で実施して、本発明のタンパク質配列に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較の目的でギャップのあるアラインメントを取得するには、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９７、２５：３３８９に記載されているように、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用できる。あるいは、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを使用して、分子間の遠い関係を検出する反復検索を実行できる。前出のＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）を参照。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトのパラメーター（ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴなど）を使用できる。ＷｏｒｌｄＷｉｄｅＷｅｂのｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／を参照。
【０１０３】
配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの別の非限定的な例は、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒのアルゴリズム、ＣＡＢＩＯＳ  １９８８；４：１  １−１７である。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重み残基表、ギャップ長さペナルティ１２、およびギャップペナルティ４を使用できる。
【０１０４】
好ましい実施形態では、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックス、ギャップ重み１６、１４、１２、１０、８、６または４、および長さ重み１、２、３、４、５または６のいずれかを用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（マサチューセッツ州バーリントンのアクセルリス、ＷｏｒｌｄＷｉｄｅＷｅｂのａｃｃｅｌｒｙｓ．ｃｏｍで入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９７０、４８：４４４−４５３）を使用して決定される。さらに別の好ましい実施形態では、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックス、ギャップ重み４０、５０、６０、７０、または８０、長さ重み１、２、３、４、５、または６を使用するＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを使用して決定される。特に好ましいパラメーターのセット（および分子が本発明の配列同一性または相同性の制限であるかどうかを決定するためにどのパラメーターを適用すべきかについて実施者が不明である場合に使用できるもの）は、ギャップオープンペナルティ１２、ギャップ拡張ペナルティ４、フレームシフトギャップペナルティ５でＢｌｏｓｓｕｍ  ６２スコアリングマトリックスを使用する。
【０１０５】
同一性パーセントを決定できる方法の別の非限定的な例は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ３０、セクション７．７．１８、表７．７．１に記載されているようなソフトウェアプログラムを使用することである。好ましくはアラインメントにデフォルトのパラメーターを使用する。推奨されるアラインメントプログラムは、デフォルトパラメーターを使用したＢＬＡＳＴである。特に、好ましいプログラムはＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰであり、ｆｉｌｔｅｒ＝ｎｏｎｅ；ｓｔｒａｎｄ＝ｂｏｔｈ；ｃｕｔｏｆｆ＝６０；ｅｘｐｅｃｔ＝１０；Ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２；Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ＝５０  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ；ｓｏｒｔ  ｂｙ＝ＨＩＧＨ  ＳＣＯＲＥ；Ｄａｔａｂａｓｅｓ＝ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲのデフォルトパラメーターを使用する。これらのプログラムの詳細は、次のインターネットアドレスｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴで確認できる。
【０１０６】
本明細書に記載される特性の統計分析は、標準的な試験、例えば、ｔ検定、ＡＮＯＶＡ、またはカイ二乗検定によって実行され得る。通常、統計的有意性はｐ＝０．０５（５％）、より好ましくはｐ＝０．０１、ｐ＝０．００１、ｐ＝０．０００１、ｐ＝０．０００００１のレベルまで測定される。
【０１０７】
ドメイン配列の「保存的に修飾された変異体」も提供され得る。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾された変異体とは、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一の配列を指す。具体的には、縮重コドン置換は、１または複数の選択された（またはすべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することによって実現できる（Ｂａｔｚｅｒら、１９９１、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１；大塚ら、１９８５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、１９９４、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８）。
【０１０８】
野生型タンパク質の「生物学的に活性な断片」、「生物学的に活性な形態」、「生物学的に活性な同等物」および「機能的誘導体」という用語は、活性の検出に適したアッセイを使用して測定された野生型タンパク質の生物活性に少なくとも実質的に等しい（例えば、有意に異ならない）生物学的活性を有する。
【０１０９】
本明細書で使用する「インビボ」核酸送達、核酸移入、核酸療法」などは、改善されたＬＡＭＰ構築物をヒトまたは非ヒト哺乳動物などの生物の体内に直接導入することを指し、これにより、改善されたＬＡＭＰ構築物がそのような生物の細胞にインビボで導入される。
【０１１０】
本明細書で使用する「インサイチュ」という用語は、改善されたＬＡＭＰ構築物が標的細胞に近接するタイプのインビボ核酸送達を指す（例えば、核酸は全身投与されない）。例えば、インサイチュ送達法は、限定ではないが、改善されたＬＡＭＰ構築物をある部位（例えば、腫瘍または心筋などの組織）に直接注入するか、開いた手術野を通して改善されたＬＡＭＰ構築物を細胞または組織に接触させるか、またはカテーテルなどの医療用アクセスデバイスを使用して改善されたＬＡＭＰ構築物をある部位に送達することを含む。
【０１１１】
本明細書で使用する「単離された」または「精製された」という用語は、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはそれらの断片が、通常自然界で関連する細胞およびその他の構成要素から分離（または実質的に遊離）することを意味する。例えば、改善されたＬＡＭＰ構築物に関して、単離されたポリヌクレオチドは、それが通常染色体に関連する５’および３’配列から分離されたものである。当業者には明らかなように、非天然発生のポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはそれらの断片は、その天然発生の対応物と区別するために「単離」を必要としない。実質的に遊離または実質的に精製されたとは、集団の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％が、それらが自然界で関連する成分を含まないことを意味する。
【０１１２】
本明細書で使用する「標的細胞」または「レシピエント細胞」は、本明細書に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物のレシピエントであることが望まれる、またはレシピエントであった個々の細胞または細胞を指す。この用語は、単一細胞の子孫を含むことも意図しており、子孫は、自然、偶発的、または意図的な突然変異のために（形態またはゲノムまたは全ＤＮＡ相補体において）元の親細胞と必ずしも完全に同一ではない場合がある。標的細胞は、他の細胞と接触している場合があるか（例えば、組織内のように）、または生物の体内で循環していることが見出される場合もある。
【０１１３】
本明細書で使用する「対象」は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。哺乳動物には、ネズミ、類人猿、ヒト、家畜、スポーツ動物、ペットが含まれるが、これらに限定されない。他の好ましい実施形態では、「対象」はげっ歯類（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ラマ、ラクダ、ウシ、モルモット、ハムスター、イヌ、ネコ、ウマ、非ヒト霊長類、類人猿（例えば、サルまたはエイプ）、サル（例えば、マーモセット、ヒヒ、アカゲザル）、またはエイプ（例えば、ゴリラ、チンパンジー、オランウータン、テナガザル）である。他の実施形態では、非ヒト哺乳動物、特にヒトの治療効果を実証するためのモデルとして従来使用されている哺乳動物（例えば、ネズミ科動物、霊長類、ブタ、イヌ科動物、またはウサギ動物）が使用される場合がある。
【０１１４】
「癌」、「新生物」および「腫瘍」という用語は互換的に使用され、単数形または複数形のいずれかで、宿主生物の病因となる悪性形質転換を受けた細胞を指す。原発性癌細胞の形質転換により、それらは宿主生物の病因になる。原発性癌細胞（すなわち、悪性形質転換部位の近くから得られた細胞）は、十分に確立された技術、特に組織学的検査により、非癌性細胞と容易に区別することができる。本明細書で使用する癌細胞の定義には、原発性癌細胞だけでなく、癌細胞祖先に由来する任意の細胞が含まれる。これには、転移した癌細胞、および癌細胞に由来するインビトロ培養物および細胞株が含まれる。通常固形腫瘍として現れるタイプの癌に言及する場合、「臨床的に検出可能な」腫瘍は、例えば、ＣＡＴスキャン、ＭＲイメージング、Ｘ線、超音波または触診などの手順により腫瘍塊に基づいて検出可能であるもの、および／または患者から得られる試料中の１または複数の癌特異的抗原の発現により検出可能であるものである。
【０１１５】
好ましい実施形態では、癌（過形成を含む進行のすべてのステージを含む）は、腺癌、肉腫、皮膚癌、黒色腫、膀胱癌、脳癌（多形性膠芽腫を含む）、乳癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌（ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、扁平上皮癌を含むがこれらに限定されない）、結腸直腸癌、肛門癌、直腸癌、子宮頸癌、肝臓癌、頭頸部癌、口腔癌、唾液腺癌、食道癌、膵臓癌、膵管腺癌（ＰＤＡ）、腎癌、胃癌、腎臓癌、多発性骨髄腫または脳の癌である。また、本明細書に記載のＬＡＭＰ構築物で治療される好ましい疾患には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）によって引き起こされる過剰増殖性障害または癌が含まれる。
【０１１６】
本明細書で使用する「薬学的に許容される担体」という用語は標準的な医薬担体、例えばリン酸緩衝生理食塩水、水、および油／水または水／油乳濁液などの乳濁液、ならびに様々な種類の湿潤剤などを包含する。改善されたＬＡＭＰ構築物を含む組成物は、安定剤および防腐剤も含むことができる。担体、安定剤、アジュバントの例については、Ｍａｒｔｉｎ  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ、第１５版（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌ．Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ（１９７５））を参照。
【０１１７】
そのような核酸が細胞内に導入された場合、改善されたＬＡＭＰ構築物によって細胞は「形質転換」、「形質導入」または「トランスフェクト」されている。形質転換ＤＮＡは、細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡと統合（共有結合）する場合としない場合がある。例えば、原核生物、酵母、および哺乳動物細胞では、改善されたＬＡＭＰ構築物は、プラスミドなどのエピソーム要素上で維持され得る。真核細胞では、安定に形質転換された細胞とは、改善されたＬＡＭＰ構築物が染色体に組み込まれ、染色体複製を通じて娘細胞に継承される細胞である。この安定性は、改善されたＬＡＭＰ構築物を含む娘細胞の集団から構成される細胞株またはクローンを確立する真核細胞の能力によって実証される。「クローン」とは、単一の細胞または有糸分裂による共通の祖先に由来する細胞の集団である。「細胞株」とは、多くの世代（例えば、少なくとも約１０世代）にわたってインビトロで安定した増殖が可能な初代細胞のクローンである。
【０１１８】
本明細書で使用する「有効量」とは、有益なまたは所望の結果に影響を与えるのに十分な量、例えば、改善されたＬＡＭＰ構築物の移入および／または発現、および／または所望の治療エンドポイントの達成の有効量などである。有効量は、１回以上の投与、適用または投与量で投与することができる。一態様では、改善されたＬＡＭＰ構築物の有効量は、少なくとも２つの細胞を含む細胞集団内の少なくとも１つの細胞を形質転換／形質導入／トランスフェクトするのに十分な量である。
【０１１９】
本明細書で使用する「治療有効量」は、異常な生理学的反応を予防、修正、および／または正常化するのに十分な量を意味するために本明細書で使用する。一態様では、「治療有効量」は、例えば、腫瘍塊のサイズ、抗体産生、サイトカイン産生、発熱または白血球数など病理学の臨床的に重要な特徴を少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも９０％減少させるのに十分な量である。
【０１２０】
「抗体」は、特定の抗原に結合する抗体およびその断片を含む任意の免疫グロブリンである。この用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、およびキメラ抗体（例えば、二重特異性抗体）を包含する。「抗体結合部位」は、抗原に特異的に結合する重鎖および軽鎖の可変および超可変領域から構成される抗体分子の構造部分である。例示的な抗体分子は、無傷の免疫グロブリン分子、実質的に無傷の免疫グロブリン分子、およびＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦ（ｖ）部分を含むパラトープを含有する免疫グロブリン分子の部分であり、これらの部分は本明細書に記載の治療方法で使用するのに好ましい。したがって、抗体という用語は、抗体分子全体だけでなく、抗体断片、ならびに抗体および抗体断片の変異体（融合タンパク質などの誘導体を含む）も包含する。本出願において「抗体」という用語によって説明される分子の例には、限定ではないが単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、Ｆｖ、およびＶＬまたはＶＨドメインのいずれかを含むかまたはそれらからなる断片が含まれる。本明細書で使用する「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」という用語は、抗体のＶＨドメインに連結された抗体のＶＬドメインを含むポリペプチドを指す。Ｃａｒｔｅｒ（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２４３を参照。
【０１２１】
さらに、本発明の抗体は、限定ではないが、モノクローナル、多重特異性、二重特異性、ヒト、ヒト化、マウス、またはキメラ抗体、単鎖抗体、ラクダ科抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）、ドメイン抗体および上記のいずれかのエピトープ結合断片を含む。本発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスのものであり得る。
【０１２２】
最も好ましくは、抗体はヒト抗体である。本明細書で使用する「ヒト」抗体には、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体が含まれ、ヒト免疫グロブリンライブラリ、およびヒト抗体を産生するように遺伝子操作されたゼノマウス（ｘｅｎｏｍｉｃｅ）または他の生物から単離された抗体が含まれる。本明細書に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物は、例示のプロトコルに記載されるようにヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を生成するための既知の技術と組み合わせて使用することができる。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９６／３３７３５、欧州特許第０５９８８７７号、米国特許第５，４１３，９２３号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、第５，５６９，８２５号、第５，６６１，０１６号、第５，５４５，８０６号、第５，８１４，３１８号、第５，８８５，７９３号、第５，９１６，７７１号、および第５，９３９，５９８号、ならびにＬｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）を参照。
【０１２３】
ヒト抗体または「ヒト化」キメラモノクローナル抗体は、改善されたＬＡＭＰ構築物を本明細書に記載のあるいは当技術分野で公知の技術と組み合わせて使用して産生することができる。例えば、キメラ抗体を産生するための標準的な方法は当技術分野で知られている。レビューについては、参考文献Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４（１９８６）；Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；谷口ら、欧州特許第１７１４９６号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、欧州特許第１７３４９４号；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、ＷＯ８６０１５３３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、ＷＯ８７０２６７１；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６４３（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：２６８（１９８５）を参照。
【０１２４】
本発明の抗体は、一価、二価、三価または多価であり得る。例えば、一価のｓｃＦｖは、化学的に、または別のタンパク質または物質と関連付けることにより多量体化することができる。ヘキサヒスチジンタグまたはＦｌａｇタグに融合したｓｃＦｖは、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）または抗Ｆｌａｇ抗体（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｃ．）を使用して多量体化することができる。さらに、改善されたＬＡＭＰ構築物を使用して、改善されたＬＡＭＰ構築物に含まれるコードされた抗原に対して単一特異性、二重特異性、三重特異性、またはより大きな多重特異性を生成することができる。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９３／１７７１５、ＷＯ９２／０８８０２、ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／０５７９３、Ｔｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９（１９９１）、米国特許第４，４７４，８９３号、第４，７１４，６８１号、第４，９２５，６４８号、第５，５７３，９２０号、第５，６０１，８１９号、Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３（１９９２）を参照。
【０１２５】
「エピトープ」は、通常、短いペプチド配列またはオリゴ糖で構成される構造であり、免疫系の成分によって特異的に認識または特異的に結合される。Ｔ細胞エピトープは、一般に線状オリゴペプチドであることが示されている。同じ抗体が特異的に結合できる場合、２つのエピトープは互いに対応する。両方が同じＢ細胞受容体または同じＴ細胞受容体に結合できる場合、２つのエピトープは互いに対応し、１つの抗体がそのエピトープに結合すると、他のエピトープによる結合が実質的に妨げられる（例えば、約３０％未満、好ましくは約２０％未満、より好ましくは約１０％、５％、１％、または約０．１％未満の他のエピトープが結合する）。本発明では、複数のエピトープが１つの抗原を構成することができる。
【０１２６】
本明細書で使用する「抗原」または「目的の抗原」という用語は、表１に示すように自然免疫応答または適応免疫応答を誘発するために使用される改善されたＬＡＭＰ構築物にクローニングされたポリヌクレオチド配列によってコードされる任意のポリペプチド配列を包含する。「抗原」は、改善されたＬＡＭＰ構築物にクローニングされた単一の抗原と複数の抗原配列（同じまたは異なるタンパク質に由来する）の両方を包含する。
【０１２７】
本明細書で使用する「抗原提示細胞」という用語は、主要組織適合遺伝子複合体分子、またはその一部、または１もしくは複数の非古典的ＭＨＣ分子、またはその一部に関連する抗原をその表面に提示する任意の細胞を含む。適切なＡＰＣの例は以下で詳細に説明し、マクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞、ハイブリッドＡＰＣ、および仮親抗原提示細胞などの細胞全体を含むが、これらに限定されない。
【０１２８】
本明細書で使用する場合、「操作された抗原提示細胞」とは、その表面に非天然分子部分を有する抗原提示細胞を指す。例えば、そのような細胞は、その表面に共刺激物質を自然に持たないか、その表面に自然の共刺激物質に加えて追加の人工共刺激物質を含むか、その表面に非天然のクラスＩＩ分子を発現することがある。好ましい実施形態では、操作された抗原提示細胞は、その表面上に改善されたＬＡＭＰ構築物から発現した抗原を有する。
【０１２９】
本明細書で使用する「免疫エフェクター細胞」とは、抗原に結合することができ、免疫応答を媒介する細胞を指す。これらの細胞には、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、ＮＫ細胞および細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、例えばＣＴＬ株、ＣＴＬクローン、および腫瘍、炎症性、または他の浸潤からのＣＴＬが含まれるが、これらに限定されない。
【０１３０】
本明細書で使用する場合、「部分的にヒト」とは、ヒトおよび非ヒト脊椎動物の両方からの配列を有する核酸を指す。部分的ヒト配列の文脈において、部分的ヒト核酸は、ヒト免疫グロブリンコード領域の配列、および非ヒト脊椎動物の内因性免疫グロブリン領域の非コード配列に基づく配列を有する。非ヒト脊椎動物由来の内因性非コード配列に関して使用される場合、「に基づく」という用語は、非コード配列に対応し、かつ宿主脊椎動物（例えば、ＥＳ細胞が由来する非ヒト脊椎動物）の内因性遺伝子座の非コード配列と比較的高度の相同性を共有する配列を指す。好ましくは、非コード配列は、非コード配列を含む部分的にヒトの分子が導入された非ヒト脊椎動物宿主細胞の内因性遺伝子座に見出される対応する非コード配列と少なくとも８０％、より好ましくは９０％の相同性を共有する。
【０１３１】
本明細書で使用する「免疫グロブリン可変領域」という用語は、抗体分子の可変領域のすべてまたは一部、または抗体分子の発現を制御する調節ヌクレオチド配列のすべてまたは一部をコードするヌクレオチド配列を指す。重鎖の免疫グロブリン領域には、Ｖ、Ｄ、Ｊ、およびイントロンを含むスイッチ領域のすべてまたは一部が含まれるが、これらに限定されない。軽鎖の免疫グロブリン領域には、軽鎖定常領域遺伝子に関連または隣接するＶおよびＪ領域、それらの上流フランキング配列、イントロンが含まれるが、これらに限定されない。
【０１３２】
「トランスジェニック動物」とは、その細胞の一部に染色体外要素として存在するか、またはその生殖系列ＤＮＡ（すなわち、その細胞のほとんどまたはすべてのゲノム配列）に安定的に組み込まれた外因性核酸配列を有する非ヒト動物、通常哺乳類を意味する。ヒト配列を含むトランスジェニック動物の作製において、部分的にヒトの核酸は、当技術分野で周知の方法に従って、例えば宿主動物の胚または胚性幹細胞の遺伝子操作により、そのようなトランスジェニック動物の生殖系列に導入される。
【０１３３】
「ベクター」には、プラスミドおよびウイルス、ならびに自己複製するかどうかに関係なく、細胞の形質転換またはトランスフェクションに使用できる任意のＤＮＡまたはＲＮＡ分子が含まれる。
【０１３４】
「単離された」または「精製された」細胞の集団は、自然界で関連する細胞および物質を実質的に含まない。実質的に遊離または実質的に精製されたＡＰＣとは、集団の少なくとも５０％がＡＰＣであり、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％が、それらが自然界で関連する非ＡＰＣ細胞を含まないことを意味する。
【０１３５】
本明細書で使用する「遺伝子改変」とは、細胞の正常なヌクレオチドへの任意の付加、欠失、または破壊を指す。ＡＰＣの遺伝的改変を達成できる方法は、本発明の精神および範囲内にある。当該分野で認められている方法には、ウイルス媒介遺伝子移入、リポソーム媒介移入、形質転換、トランスフェクションおよび形質導入、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびヘルペスウイルス、ならびにレトロウイルスベースのベクターなどのＤＮＡウイルスに基づく改善されたＬＡＭＰ構築物の使用などのウイルス媒介遺伝子移入が含まれる。
【０１３６】
本発明の実施は、別に明記しない限り、当技術分野の範囲内の従来の分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡ技術を使用する。そのような技術は、文献で完全に説明されている。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｆｒｉｔｓｃｈ＆Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｖｏｌｕｍｅ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｉ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８６）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）を参照。
【０１３７】
別に定義されない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で言及するすべての刊行物は、本明細書に記載される発明に関連して使用され得るデバイス、製剤、および方法論を説明および開示する目的で参照により組み込まれる。
【０１３８】
ＬＡＭＰ構築物
ＬＡＭＰ−１は、ｃＤＮＡクローンから推論されるように（Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：８７５４、１９８８）大きな（３４６残基）アミノ末端ルーメンドメインおよびそれに続く２４残基の疎水性膜貫通領域ならびに短い（１２残基）カルボキシル末端細胞質尾部を有する約３８２個のアミノ酸のポリペプチドコアからなる。図２Ａおよび図２Ｂを参照。ルーメンドメインは高度にグリコシル化され、約２０のアスパラギン結合複合型オリゴ糖で置換され、プロリン／セリンに富むヒンジ領域によって分離された２つの約１６０残基の「相同ドメイン」からなる。これらの「相同ドメイン」はそれぞれ、４つの均一に間隔を空けたシステイン残基を含み、ジスルフィド結合して、ルーメンドメインの２等分内に対称的に配置された４つの３６〜３８残基ループを形成する（Ａｒｔｅｒｂｕｒｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：７４１９、１９９０；また、Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５：２６３（１８）：８７５４−８、１９８８も参照）。図２Ａは、ＬＡＭＰ−１、ＬＡＭＰ−２、ＬＡＭＰ−３、Ｅｎｄｏｌｙｎ、ＬＩＭＢＩＣ、ＬＡＭＰ５、またはＭａｃｒｏｓａｉｌｉｎ間の保存されたドメインを模式的に示す。
【０１３９】
以前に報告されたＬＡＭＰ構築物は、この特定の配置で（ａ）ＬＡＭＰ−１タンパク質の全ルーメンドメイン、抗原、次にＬＡＭＰ−１タンパク質の全膜貫通／細胞質尾部、または（ｂ）ＬＡＭＰ−１タンパク質の抗原および全膜貫通／細胞質尾部の要素を含む。例（ａ）では、抗原配列は、ＬＡＭＰ−１タンパク質の全ルーメンドメインとＬＡＭＰ−１全膜貫通ドメイン／細胞質尾部との間に挿入される。両方の構築物は、抗原配列をリソソーム／エンドソームにうまく標的化することが示されており、本明細書に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物ＩＬＣ１−ＩＬＣ６と比較して、図１に示すように「完全なＬＡＭＰ構築物」と呼ばれる。本明細書に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物は、先行技術に記載された完全なＬＡＭＰ構築物を含まない。
【０１４０】
文献では、ＬＡＭＰ−１の全ルーメンドメインよりも小さい断片は、強い免疫応答を生成するのに効果的ではないことが広く報告されている（例えばＧｏｄｉｎｈｏらを参照）。対照的に、本発明者らは、特定の配置において、特定の断片が実際に免疫系に抗原を効果的に提示し、多くの場合、抗体の異なるレパートリーの生成を含むより強力な免疫応答を生成することを予期せずに発見した。例えば、本発明者らは、強い免疫応答を生成するのに有効な最小ＬＡＭＰルーメンドメイン断片は、（文献で広く報告されているように）全ルーメンドメインではなく、むしろＬＡＭＰタンパク質のルーメンドメインの単一の相同ドメインであることを特定した。
【０１４１】
例えば、構築物は、全ルーメンドメインではなく、ＬＡＭＰタンパク質のルーメンドメインの単一の相同ドメインを含むことができる。本明細書で使用する場合、「相同ドメイン」は、図３〜図１０に示す少なくとも４つの均一に間隔を空けたシステイン残基を含む。これらのシステインの存在は、図３〜図１０に示すように、各相同ドメインで１、２、３、および４とラベル付けされ（ＬＩＭＰ−２およびＭａｃｒｏｓａｉｌｉｎでは５つのシステインが識別され、ＬＩＭＢＩＣでは６つのシステインが識別され、Ｅｎｄｏｌｙｎでは８つのシステインが識別される）、本明細書では「システイン保存断片」と定義される。追加のアミノ酸をシステイン保存断片のＮ末端および／またはＣ末端のいずれかに含めて、ＬＡＭＰタンパク質の全相同ドメインまでを生成することができる。これらの追加の追加アミノ酸は、システイン保存断片が由来する相同ドメインまたは他のＬＡＭＰタンパク質相同ドメインに由来することができる。したがって、本明細書で使用する場合、ＬＡＭＰ相同ドメインは、１つのシステイン保存断片を含む、および／またはそれからなる。少なくとも２つのＬＡＭＰ相同ドメインは、ＬＡＭＰ−１、ＬＡＭＰ−２、ＬＡＭＰ−３、またはＥｎｄｏｌｙｎのルーメンドメインを構成する。
【０１４２】
具体的には、好ましい一実施形態において、改善されたＬＡＭＰ構築物は、表１に記載の少なくとも１つの癌抗原（好ましくは表１の列４に記載の配列／断片／エピトープ）および／または段落［１５０］に記載の組み合わせをＬＡＭＰタンパク質のルーメンドメインのＮ末端、ＬＡＭＰタンパク質の少なくとも１つの相同ドメイン、またはＬＡＭＰタンパク質の少なくとも１つのシステイン保存断片に融合したものを含む。例えば、図１のＩＬＣ−２およびＩＬＣ−６を参照。好ましい実施形態では、これらの構築物は、ＬＡＭＰタンパク質の膜貫通ドメイン、および／またはＬＡＭＰタンパク質のサイトゾル尾部も含む。他の好ましい実施形態では、抗原が膜貫通ドメインを含む場合、ＬＡＭＰタンパク質の膜貫通ドメインおよび／またはＬＡＭＰタンパク質のサイトゾル尾部は不要である。好ましい実施形態では、２つの相同ドメインが改善されたＬＡＭＰ構築物に含まれる（例えば、図１のＩＬＣ−１）。さらに好ましい実施形態では、２つの相同ドメインは、ＬＡＭＰ−１、ＬＡＭＰ−２、ＬＡＭＰ−３、またはＥｎｄｏｌｙｎタンパク質に由来する。あるいは、２つの相同ドメインは異なるＬＡＭＰタンパク質に由来する。２つの相同ドメインを含むこれらの構築物には、ＬＡＭＰヒンジドメインも含まれ得る。抗原は全ＬＡＭＰ−１ルーメンドメインと全ＬＡＭＰ−１膜貫通／細胞質尾部との間に常に配置され、ルーメンドメインの断片は強い免疫応答の生成に効果的ではないと報告されているため、この段落で説明した改善されたＬＡＭＰ構築物は先行技術の観点からは予想外である。
【０１４３】
別の好ましい実施形態では、改善されたＬＡＭＰ構築物は、表１に記載の少なくとも１つの癌抗原（好ましくは表１の列４に記載の配列／断片／エピトープ）および／または段落［１５０］に記載の組み合わせをＬＡＭＰタンパク質の単一の相同ドメインのＣ末端またはＬＡＭＰタンパク質の単一のシステイン保存断片に融合したもの（例えば、図１のＩＬＣ−５）を含む。好ましい実施形態では、これらの構築物は、ＬＡＭＰタンパク質の膜貫通ドメイン、および／またはＬＡＭＰタンパク質のサイトゾル尾部（例えば、図１のＩＬＣ−３）も含む。他の好ましい実施形態では、抗原が膜貫通ドメインを含む場合、ＬＡＭＰタンパク質の膜貫通ドメインおよび／またはＬＡＭＰタンパク質のサイトゾル尾部は不要である。表１に記載されている癌抗原は、図１に示すように、完全なＬＡＭＰ構築物に挿入することもできる。あるいは、２つの異なるＬＡＭＰタンパク質からの２つの相同ドメインを使用してもよい。抗原は全ＬＡＭＰ−１ルーメンドメインと全ＬＡＭＰ−１膜貫通／細胞質尾部との間に常に配置され、ルーメンドメインの断片は強い免疫応答の生成に効果的ではないと報告されているため、この段落で説明した改善されたＬＡＭＰ構築物は先行技術の観点からは予想外である。
【０１４４】
したがって、改善されたＬＡＭＰ構築物は、表１に記載の少なくとも１つの癌抗原（好ましくは表１の列４に記載の配列／断片／エピトープ）および／または段落［１５０］に記載の組み合わせをＬＡＭＰタンパク質の単一の相同ドメインのＣ末端またはＬＡＭＰタンパク質の単一のシステイン保存断片に融合したものを含む。例えば、図１のＩＬＣ−３およびＩＬＣ−５を参照。好ましい実施形態では、これらの構築物は、ＬＡＭＰタンパク質の膜貫通ドメイン、および／またはＬＡＭＰタンパク質のサイトゾル尾部も含む。他の好ましい実施形態では、抗原が膜貫通ドメインを含む場合、ＬＡＭＰタンパク質の膜貫通ドメインおよび／またはＬＡＭＰタンパク質のサイトゾル尾部は不要である。この段落で説明されている改善されたＬＡＭＰ構築物は、上記のように先行技術の観点から予想外である。
【０１４５】
別の好ましい実施形態では、改善されたＬＡＭＰ構築物は、ＬＡＭＰタンパク質の第１の相同ドメインとＬＡＭＰタンパク質の第２の相同ドメインとの間（または少なくとも２つのシステイン保存断片の間）に融合した少なくとも１つの対象抗原を含む。例えば、図１のＩＬＣ−４を参照。好ましい実施形態では、２つの相同ドメインは、ＬＡＭＰ−１、ＬＡＭＰ−２、ＬＡＭＰ−３、またはＥｎｄｏｌｙｎタンパク質に由来する。これらの構築物において、抗原はＬＡＭＰヒンジ領域に配置され得る。あるいは、２つの異なるＬＡＭＰタンパク質からの２つの相同ドメインを使用してもよい。表１に記載されている少なくとも１つの癌抗原（好ましくは表１の列４に記載されている配列／断片／エピトープ）および／または段落［１５０］に記載の組み合わせを２つのＬＡＭＰ相同ドメイン（システイン保存断片を含む）の間に融合したものは、上記のように先行技術の観点からは予想外である。
【０１４６】
上記で定義した改善されたＬＡＭＰ構築物の各々は、図で定義したドメインを使用して生成できる。例えば、図１に例示される改善されたＬＡＭＰ構築物に含まれるドメインは、例えば、オーソロガス配列に由来する配列から起こり得ることが特に企図される。例については図３〜図１０を参照。図２Ａおよび図２Ｂで定義される同等のドメインを使用して、オーソロガス配列について図１に例示した改善されたＬＡＭＰ構築物を生成することが明確に考えられる。さらに、図３〜図１０に示すオーソロガス配列は、ドメインの生成に使用できる配列を表している。他のオーソロガス配列および／またはアイソタイプを特定し、それらを図３〜図１０に示すアラインメントと比較することは、十分に当技術分野の技術の範囲内である。したがって、図３〜図１０に示すアラインメントを有するヒトＬＡＭＰタンパク質について、図２Ａおよび図２Ｂに定義される対応する境界を識別することにより、図１に例示の改善されたＬＡＭＰ構築物を生成できる。
【０１４７】
当業者によって十分に理解されるように、各ドメインの境界は近似値であり、クローニングの考慮事項および制限酵素の配置に基づいて少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸を調整することができる。したがって、特定のドメイン（例えば、ＬＡＭＰ相同ドメイン）が改善されたＬＡＭＰ構築物に含まれる場合、ドメインの開始と終了のアミノ酸は、図２Ａで定義されている境界のとおりに少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸で調整され得る。
【０１４８】
上記の改善されたＬＡＭＰ構築物の各々は、当技術分野で周知のように、クローニング目的のために各ドメイン間にシグナル配列および／または追加のアミノ酸をさらに含み得る。さらに、ＬＡＭＰ相同ドメイン、ＬＡＭＰルーメンドメイン、ＬＡＭＰ膜貫通ドメイン、および／またはＬＡＭＰサイトゾル尾部ドメインは、同じＬＡＭＰタンパク質（例えば、ヒトＬＡＭＰ−１）または異なるＬＡＭＰタンパク質（例えば、ヒトＬＡＭＰ−１からのルーメンドメインおよびヒトＬＡＭＰ−２からの膜貫通ドメイン、および／または同じ遺伝子ファミリー（例えば、ＬＡＭＰ−１）または異なる遺伝子ファミリー（ＬＡＭＰ−１およびＬＡＭＰ−２）のオーソロガスドメインの混合に由来し得る。
【０１４９】
記載されたＬＡＭＰ構築物のポリペプチド変異体が考えられる。例えば、本明細書に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物のいずれかに対して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のポリペプチドならびにこれらの変異体をコードするポリヌクレオチドが考えられる。改善されたＬＡＭＰ構築物の変異体は、抗原配列をリソソームに標的化することによって機能する能力を保持する。例えば、改変されたルーメン配列は、元のドメイン配列と比較して少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％の有効性、すなわち、免疫応答を開始するためのキメラ配列を含む細胞による十分な抗原提示をもたらす有効性で、膜および非膜抗原物質の両方をエンドソーム区画に輸送する能力を保持しなければならない。一態様では、適切な輸送シグナルを含む配列は、オボアルブミンの十分に特徴づけられた抗原性ドメイン、膜貫通ドメイン、および推定されるリソソーム／エンドソーム標的化シグナルを含むタンパク質の細胞質ドメインを含む改善されたＬＡＭＰ構築物を構築することにより特定され得る。標的化の効率は、改善されたＬＡＭＰ構築物を発現する抗原提示細胞がＨＡエピトープ特異的ＭＨＣクラスＩＩ拘束性Ｔ細胞を刺激する能力を測定することにより測定できる（例えば、米国特許第５，６３３，２３４号の実施例５を参照）。
【０１５０】
記載されている改善されたＬＡＭＰ構築物のいずれかをコードするポリヌクレオチドは、本明細書に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物ポリヌクレオチドのいずれかに対して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるポリヌクレオチドと共に、本発明の好ましい実施形態である。改善されたＬＡＭＰ構築物の変異体は、抗原配列をリソソームに標的化することによって機能する能力を保持する。例えば、改変されたルーメン配列は、元のドメイン配列と比較して少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％の有効性、すなわち、免疫応答を開始するためのキメラ配列を含む細胞による十分な抗原提示をもたらす有効性で、膜および非膜抗原物質の両方をエンドソーム区画に輸送する能力を保持しなければならない。一態様では、適切な輸送シグナルを含む配列は、オボアルブミンの十分に特徴づけられた抗原性ドメイン、膜貫通ドメイン、および推定されるリソソーム／エンドソーム標的化シグナルを含むタンパク質の細胞質ドメインを含む改善されたＬＡＭＰ構築物を構築することにより特定され得る。標的化の効率は、改善されたＬＡＭＰ構築物を発現する抗原提示細胞がＨＡエピトープ特異的ＭＨＣクラスＩＩ拘束性Ｔ細胞を刺激する能力を測定することにより測定できる（例えば、米国特許第５，６３３，２３４号の実施例５を参照）。
【０１５１】
癌抗原
表１に示す以下の抗原は、当業者に周知の技術を使用して、本明細書に記載される各ＬＡＭＰ構築物にクローニングされ得る。第４列に記載されている配列／断片／エピトープは、本明細書に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物にクローニングすることもできる。さらに、表１に列挙した癌抗原のいずれか１つを表１に列挙した他の抗原（第４列に記載されている配列／断片／エピトープを含む）と組み合わせて、本明細書に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物に挿入できることが特に考えられる。
【０１５２】
【表１−１】
2020518613.tif 000002
【０１５３】
【表１−２】
2020518613.tif 000003
【０１５４】
【表１−３】
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【０１５５】
【表１−４】
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【０１５６】
【表１−５】
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【０１５７】
【表１−６】
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【０１５８】
【表１−７】
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【０１５９】
【表１−８】
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【０１６０】
【表１−９】
2020518613.tif 000010
【０１６１】
【表１−１０】
2020518613.tif 000011
【０１６２】
【表１−１１】
2020518613.tif 000012
【０１６３】
【表１−１２】
2020518613.tif 000013
【０１６４】
【表１−１３】
2020518613.tif 000014
【０１６５】
【表１−１４】
2020518613.tif 000015
【０１６６】
【表１−１５】
2020518613.tif 000016
【０１６７】
【表１−１６】
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【０１６８】
【表１−１７】
2020518613.tif 000018
【０１６９】
さらに、表１に記載されている抗原（列４に示す配列／断片／エピトープを含む）は、個別に、または互いに組み合わせて、本明細書に記載のＬＡＭＰ構築物にクローニングできる。例えば、名称ｐｐ６５、ｇＢ、ＩＥ１、ＭＴＲＩＩ、ＵＳ２８、ＩＧＦＢＰ２、ＩＬ１０、ＵＬ１４４、ＵＬ１４１、ＵＳ１１、ＨＯＳ、ＩＥ２、ＴＥＲＴ、サバイビン、破傷風、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＶＥＭ、ＨＰＶ１６Ｅ６、ＨＰＶ１８Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ７、ＨＰＶ１８Ｅ７、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ  ｔｒｕｎｃ、ｇｐ３５０、ＬＭＰ２、ＧＣＰ３、ミドルＳ、Ｘタンパク質、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＭ８、ＴＥＭ１、ＨＥＲ２  ＥＣＤ＋ＴＭ、ＣＥＡ、ＴＡＲＰ、ＰＲＯＳＴＥＩＮ、ＰＳＭＡ、ＢＩＲＣ４、ムチン−１、ムチン−１  ｉｓｏ、ＣＤ４０−Ｌ、ＷＴ−１、ＷＴ−１  ｔｒｕｎｃ、ＰＲＡＭＥ、ＬＡＧＥ−１、および／またはＭＡＧＥ  Ａ３は表１に記載されているタンパク質を指し、一般的に、表１の列１に示す完全長配列を指すだけでなく、好ましくは図１９および図２０ならびに表１の第４列に記載されている配列／断片／エピトープも指すことを明確に意図している。したがって、表１の列４に記載されているエピトープ／断片を含む、表１の列１に示す各配列を使用して、ＬＡＭＰ構築物を生成できる。考えられる様々な組み合わせを説明するために、決して本開示を限定するものではないが、抗原の組み合わせ（表１の列１に示す配列および／または表１の列４に記載の配列／断片／エピトープを含む）を以下のようにＬＡＭＰ構築物にクローニングすることができる：（ａ）ｐｐ６５、および次のうち少なくとも１つ：ｇＢ、ＩＥ１、ＭＴＲＩＩ、ＵＳ２８、ＩＧＦＢＰ２、ＩＬ１０、ＵＬ１４４、ＵＬ１４１、ＵＳ１１、ＨＯＳ、ＩＥ２、ＴＥＲＴ、サバイビン、破傷風、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＶＥＭ、ＨＰＶ１６Ｅ６、ＨＰＶ１８Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ７、ＨＰＶ１８Ｅ７、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ  ｔｒｕｎｃ、ｇｐ３５０、ＬＭＰ２、ＧＣＰ３、ミドルＳ、Ｘタンパク質、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＭ８、ＴＥＭ１、ＨＥＲ２  ＥＣＤ＋ＴＭ、ＣＥＡ、ＴＡＲＰ、ＰＲＯＳＴＥＩＮ、ＰＳＭＡ、ＢＩＲＣ４、ムチン−１、ムチン−１  ｉｓｏ、ＣＤ４０−Ｌ、ＷＴ−１、ＷＴ−１  ｔｒｕｎｃ、ＰＲＡＭＥ、ＬＡＧＥ−１、および／またはＭＡＧＥ  Ａ３；（ｂ）ｇＢ、および次のうち少なくとも１つ：ｐｐ６５、ＩＥ１、ＭＴＲＩＩ、ＵＳ２８、ＩＧＦＢＰ２、ＩＬ１０、ＵＬ１４４、ＵＬ１４１、ＵＳ１１、ＨＯＳ、ＩＥ２、ＴＥＲＴ、サバイビン、破傷風、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＶＥＭ、ＨＰＶ１６Ｅ６、ＨＰＶ１８Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ７、ＨＰＶ１８Ｅ７、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ  ｔｒｕｎｃ、ｇｐ３５０、ＬＭＰ２、ＧＣＰ３、ミドルＳ、Ｘタンパク質、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＭ８、ＴＥＭ１、ＨＥＲ２  ＥＣＤ＋ＴＭ、ＣＥＡ、ＴＡＲＰ、ＰＲＯＳＴＥＩＮ、ＰＳＭＡ、ＢＩＲＣ４、ムチン−１、ムチン−１  ｉｓｏ、ＣＤ４０−Ｌ、ＷＴ−１、ＷＴ−１  ｔｒｕｎｃ、ＰＲＡＭＥ、ＬＡＧＥ−１、および／またはＭＡＧＥ  Ａ３；（ｃ）ＩＥ１、および次のうち少なくとも１つ：ｐｐ６５、ｇＢ、ＭＴＲＩＩ、ＵＳ２８、ＩＧＦＢＰ２、ＩＬ１０、ＵＬ１４４、ＵＬ１４１、ＵＳ１１、ＨＯＳ、ＩＥ２、ＴＥＲＴ、サバイビン、破傷風、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＶＥＭ、ＨＰＶ１６Ｅ６、ＨＰＶ１８Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ７、ＨＰＶ１８Ｅ７、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ  ｔｒｕｎｃ、ｇｐ３５０、ＬＭＰ２、ＧＣＰ３、ミドルＳ、Ｘタンパク質、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＭ８、ＴＥＭ１、ＨＥＲ２  ＥＣＤ＋ＴＭ、ＣＥＡ、ＴＡＲＰ、ＰＲＯＳＴＥＩＮ、ＰＳＭＡ、ＢＩＲＣ４、ムチン−１、ムチン−１  ｉｓｏ、ＣＤ４０−Ｌ、ＷＴ−１、ＷＴ−１  ｔｒｕｎｃ、ＰＲＡＭＥ、ＬＡＧＥ−１、および／またはＭＡＧＥ  Ａ３；（ｄ）ＭＴＲＩＩ、および次のうち少なくとも１つ：ｐｐ６５、ｇＢ、ＩＥ１、ＵＳ２８、ＩＧＦＢＰ２、ＩＬ１０、ＵＬ１４４、ＵＬ１４１、ＵＳ１１、ＨＯＳ、ＩＥ２、ＴＥＲＴ、サバイビン、破傷風、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＶＥＭ、ＨＰＶ１６Ｅ６、ＨＰＶ１８Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ７、ＨＰＶ１８Ｅ７、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ  ｔｒｕｎｃ、ｇｐ３５０、ＬＭＰ２、ＧＣＰ３、ミドルＳ、Ｘタンパク質、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＭ８、ＴＥＭ１、ＨＥＲ２  ＥＣＤ＋ＴＭ、ＣＥＡ、ＴＡＲＰ、ＰＲＯＳＴＥＩＮ、ＰＳＭＡ、ＢＩＲＣ４、ムチン−１  ムチン−１  ｉｓｏ、ＣＤ４０−Ｌ、ＷＴ−１、ＷＴ−１  ｔｒｕｎｃ、ＰＲＡＭＥ、ＬＡＧＥ−１、および／またはＭＡＧＥ  Ａ３；（ｅ）ＵＳ２８、および次のうち少なくとも１つ：ｐｐ６５、ｇＢ、ＩＥ１、ＭＴＲＩＩ、ＩＧＦＢＰ２、ＩＬ１０、ＵＬ１４４、ＵＬ１４１、ＵＳ１１、ＨＯＳ、ＩＥ２、ＴＥＲＴ、サバイビン、破傷風、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＶＥＭ、ＨＰＶ１６Ｅ６、ＨＰＶ１８Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ７、ＨＰＶ１８Ｅ７、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ  ｔｒｕｎｃ、ｇｐ３５０、ＬＭＰ２、ＧＣＰ３、ミドルＳ、Ｘタンパク質、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＭ８、ＴＥＭ１、ＨＥＲ２  ＥＣＤ＋ＴＭ、ＣＥＡ、ＴＡＲＰ、ＰＲＯＳＴＥＩＮ、ＰＳＭＡ、ＢＩＲＣ４、ムチン−１、ムチン−１  ｉｓｏ、ＣＤ４０−Ｌ、ＷＴ−１、ＷＴ−１  ｔｒｕｎｃ、ＰＲＡＭＥ、ＬＡＧＥ−１、および／またはＭＡＧＥ  Ａ３；（ｆ）ＩＧＦＢＰ２、および次のうち少なくとも１つ：ｐｐ６５、ｇＢ、ＩＥ１、ＭＴＲＩＩ、ＵＳ２８、ＩＬ１０、ＵＬ１４４、ＵＬ１４１、ＵＳ１１、ＨＯＳ、ＩＥ２、ＴＥＲＴ、サバイビン、破傷風、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＶＥＭ、ＨＰＶ１６Ｅ６、ＨＰＶ１８Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ７、ＨＰＶ１８Ｅ７、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ  ｔｒｕｎｃ、ｇｐ３５０、ＬＭＰ２、ＧＣＰ３、ミドルＳ、Ｘタンパク質、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＭ８、ＴＥＭ１、ＨＥＲ２  ＥＣＤ＋ＴＭ、ＣＥＡ、ＴＡＲＰ、ＰＲＯＳＴＥＩＮ、ＰＳＭＡ、ＢＩＲＣ４、ムチン−１、ムチン−１  ｉｓｏ、ＣＤ４０−Ｌ、ＷＴ−１、ＷＴ−１  ｔｒｕｎｃ、ＰＲＡＭＥ、ＬＡＧＥ−１、および／またはＭＡＧＥ  Ａ３；（ｇ）ＩＬ１０、および次のうち少なくとも１つ：ｐｐ６５、ｇＢ、ＩＥ１、ＭＴＲＩＩ、ＵＳ２８、ＩＧＦＢＰ２、ＵＬ１４４、ＵＬ１４１、ＵＳ１１、ＨＯＳ、ＩＥ２、ＴＥＲＴ、サバイビン、破傷風、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＶＥＭ、ＨＰＶ１６Ｅ６、ＨＰＶ１８Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ７、ＨＰＶ１８Ｅ７、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ  ｔｒｕｎｃ、ｇｐ３５０、ＬＭＰ２、ＧＣＰ３、ミドルＳ、Ｘタンパク質、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＭ８、ＴＥＭ１、ＨＥＲ２  ＥＣＤ＋ＴＭ、ＣＥＡ、ＴＡＲＰ、ＰＲＯＳＴＥＩＮ、ＰＳＭＡ、ＢＩＲＣ４、ムチン−１、ムチン−１  ｉｓｏ、ＣＤ４０−Ｌ、ＷＴ−１、ＷＴ−１  ｔｒｕｎｃ、ＰＲＡＭＥ、ＬＡＧＥ−１、および／またはＭＡＧＥ  Ａ３；（ｈ）ＵＬ１４４、および次のうち少なくとも１つ：ｐｐ６５、ｇＢ、ＩＥ１、ＭＴＲＩＩ、ＵＳ２８、ＩＧＦＢＰ２、ＩＬ１０、ＵＬ１４１、ＵＳ１１、ＨＯＳ、ＩＥ２、ＴＥＲＴ、サバイビン、破傷風、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＶＥＭ、ＨＰＶ１６Ｅ６、ＨＰＶ１８Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ７、ＨＰＶ１８Ｅ７、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ  ｔｒｕｎｃ、ｇｐ３５０、ＬＭＰ２、ＧＣＰ３、ミドルＳ、Ｘタンパク質、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＭ８、ＴＥＭ１、ＨＥＲ２  ＥＣＤ＋ＴＭ、ＣＥＡ、ＴＡＲＰ、ＰＲＯＳＴＥＩＮ、ＰＳＭＡ、ＢＩＲＣ４、ムチン−１、ムチン−１  ｉｓｏ、ＣＤ４０−Ｌ、ＷＴ−１、ＷＴ−１  ｔｒｕｎｃ、ＰＲＡＭＥ、ＬＡＧＥ−１、および／またはＭＡＧＥ  Ａ３；（ｉ）ＵＬ１４１、および次のうち少なくとも１つ：ｐｐ６５、ｇＢ、ＩＥ１、ＭＴＲＩＩ、ＵＳ２８、ＩＧＦＢＰ２、ＩＬ１０、ＵＬ１４４、ＵＳ１１、ＨＯＳ、ＩＥ２、ＴＥＲＴ、サバイビン、破傷風、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＶＥＭ、ＨＰＶ１６Ｅ６、ＨＰＶ１８Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ７、ＨＰＶ１８Ｅ７、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ  ｔｒｕｎｃ、ｇｐ３５０、ＬＭＰ２、ＧＣＰ３、ミドルＳ、Ｘタンパク質、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＭ８、ＴＥＭ１、ＨＥＲ２  ＥＣＤ＋ＴＭ、ＣＥＡ、ＴＡＲＰ、ＰＲＯＳＴＥＩＮ、ＰＳＭＡ、ＢＩＲＣ４、ムチン−１、ムチン−１  ｉｓｏ、ＣＤ４０−Ｌ、ＷＴ−１、ＷＴ−１  ｔｒｕｎｃ、ＰＲＡＭＥ、ＬＡＧＥ−１、および／またはＭＡＧＥ  Ａ３；（ｊ）ＵＳ１１、および次のうち少なくとも１つ：ｐｐ６５、ｇＢ、ＩＥ１、ＭＴＲＩＩ、ＵＳ２８、ＩＧＦＢＰ２、ＩＬ１０、ＵＬ１４４、ＵＬ１４１、ＨＯＳ、ＩＥ２、ＴＥＲＴ、サバイビン、破傷風、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＶＥＭ、ＨＰＶ１６Ｅ６、ＨＰＶ１８Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ７、ＨＰＶ１８Ｅ７、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ  ｔｒｕｎｃ、ｇｐ３５０、ＬＭＰ２、ＧＣＰ３、ミドルＳ、Ｘタンパク質、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＭ８、ＴＥＭ１、ＨＥＲ２  ＥＣＤ＋ＴＭ、ＣＥＡ、ＴＡＲＰ、ＰＲＯＳＴＥＩＮ、ＰＳＭＡ、ＢＩＲＣ４、ムチン−１、ムチン−１  ｉｓｏ、ＣＤ４０−Ｌ、ＷＴ−１、ＷＴ−１  ｔｒｕｎｃ、ＰＲＡＭＥ、ＬＡＧＥ−１、および／またはＭＡＧＥ  Ａ３；（ｋ）ＩＥ２、および次のうち少なくとも１つ：ｐｐ６５、ｇＢ、ＩＥ１、ＭＴＲＩＩ、ＵＳ２８、ＩＧＦＢＰ２、ＩＬ１０、ＵＬ１４４、ＵＬ１４１、ＵＳ１１、ＨＯＳ、ＴＥＲＴ、サバイビン、破傷風、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＶＥＭ、ＨＰＶ１６Ｅ６、ＨＰＶ１８Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ７、ＨＰＶ１８Ｅ７、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ  ｔｒｕｎｃ、ｇｐ３５０、ＬＭＰ２、ＧＣＰ３、ミドルＳ、Ｘタンパク質、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＭ８、ＴＥＭ１、ＨＥＲ２  ＥＣＤ＋ＴＭ、ＣＥＡ、ＴＡＲＰ、ＰＲＯＳＴＥＩＮ、ＰＳＭＡ、ＢＩＲＣ４、ムチン−１、ム���ン−１  ｉｓｏ、ＣＤ４０−Ｌ、ＷＴ−１、ＷＴ−１  ｔｒｕｎｃ、ＰＲＡＭＥ、ＬＡＧＥ−１、および／またはＭＡＧＥ  Ａ３；（ｌ）ＴＥＲＴ、および次のうち少なくとも１つ：ｐｐ６５、ｇＢ、ＩＥ１、ＭＴＲＩＩ、ＵＳ２８、ＩＧＦＢＰ２、ＩＬ１０、ＵＬ１４４、ＵＬ１４１、ＵＳ１１、ＨＯＳ、ＩＥ２、サバイビン、破傷風、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＶＥＭ、ＨＰＶ１６Ｅ６、ＨＰＶ１８Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ７、ＨＰＶ１８Ｅ７、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ  ｔｒｕｎｃ、ｇｐ３５０、ＬＭＰ２、ＧＣＰ３、ミドルＳ、Ｘタンパク質、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＭ８、ＴＥＭ１、ＨＥＲ２  ＥＣＤ＋ＴＭ、ＣＥＡ、ＴＡＲＰ、ＰＲＯＳＴＥＩＮ、ＰＳＭＡ、ＢＩＲＣ４、ムチン−１、ムチン−１  ｉｓｏ、ＣＤ４０−Ｌ、ＷＴ−１、ＷＴ−１  ｔｒｕｎｃ、ＰＲＡＭＥ、ＬＡＧＥ−１、および／またはＭＡＧＥ  Ａ３；（ｍ）サバイビン、および次のうち少なくとも１つ：ｐｐ６５、ｇＢ、ＩＥ１、ＭＴＲＩＩ、ＵＳ２８、ＩＧＦＢＰ２、ＩＬ１０、ＵＬ１４４、ＵＬ１４１、ＵＳ１１、ＨＯＳ、ＩＥ２、ＴＥＲＴ、破傷風、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＶＥＭ、ＨＰＶ１６Ｅ６、ＨＰＶ１８Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ７、ＨＰＶ１８Ｅ７、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ  ｔｒｕｎｃ、ｇｐ３５０、ＬＭＰ２、ＧＣＰ３、ミドルＳ、Ｘタンパク質、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＭ８、ＴＥＭ１、ＨＥＲ２  ＥＣＤ＋ＴＭ、ＣＥＡ、ＴＡＲＰ、ＰＲＯＳＴＥＩＮ、ＰＳＭＡ、ＢＩＲＣ４、ムチン−１、ムチン−１  ｉｓｏ、ＣＤ４０−Ｌ、ＷＴ−１、ＷＴ−１  ｔｒｕｎｃ．、ＰＲＡＭＥ、ＬＡＧＥ−１、および／またはＭＡＧＥ  Ａ３；（ｎ）破傷風、および次のうち少なくとも１つ：ｐｐ６５、ｇＢ、ＩＥ１、ＭＴＲＩＩ、ＵＳ２８、ＩＧＦＢＰ２、ＩＬ１０、ＵＬ１４４、ＵＬ１４１、ＵＳ１１、ＨＯＳ、ＩＥ２、ＴＥＲＴ、サバイビン、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＶＥＭ、ＨＰＶ１６Ｅ６、ＨＰＶ１８Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ７、ＨＰＶ１８Ｅ７、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ  ｔｒｕｎｃ、ｇｐ３５０、ＬＭＰ２、ＧＣＰ３、ミドルＳ、Ｘタンパク質、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＭ８、ＴＥＭ１、ＨＥＲ２  ＥＣＤ＋ＴＭ、ＣＥＡ、ＴＡＲＰ、ＰＲＯＳＴＥＩＮ、ＰＳＭＡ、ＢＩＲＣ４、ムチン−１、ムチン−１  ｉｓｏ、ＣＤ４０−Ｌ、ＷＴ−１、ＷＴ−１  ｔｒｕｎｃ、ＰＲＡＭＥ、ＬＡＧＥ−１、および／また
はＭＡＧＥ  Ａ３；（ｏ）ＮＹ−ＥＳＯ−１、および次のうち少なくとも１つ：ｐｐ６５、ｇＢ、ＩＥ１、ＭＴＲＩＩ、ＵＳ２８、ＩＧＦＢＰ２、ＩＬ１０、ＵＬ１４４、ＵＬ１４１、ＵＳ１１、ＨＯＳ、ＩＥ２、ＴＥＲＴ、サバイビン、破傷風、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＶＥＭ、ＨＰＶ１６Ｅ６、ＨＰＶ１８Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ７、ＨＰＶ１８Ｅ７、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ  ｔｒｕｎｃ、ｇｐ３５０、ＬＭＰ２、ＧＣＰ３、ミドルＳ、Ｘタンパク質、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＭ８、ＴＥＭ１、ＨＥＲ２  ＥＣＤ＋ＴＭ、ＣＥＡ、ＴＡＲＰ、ＰＲＯＳＴＥＩＮ、ＰＳＭＡ、ＢＩＲＣ４、ムチン−１、ムチン−１  ｉｓｏ、ＣＤ４０−Ｌ、ＷＴ−１、ＷＴ−１  ｔｒｕｎｃ、ＰＲＡＭＥ、ＬＡＧＥ−１、および／またはＭＡＧＥ  Ａ３；（ｐ）ＨＥＲ２、および次のうち少なくとも１つ：ｐｐ６５、ｇＢ、ＩＥ１、ＭＴＲＩＩ、ＵＳ２８、ＩＧＦＢＰ２、ＩＬ１０、ＵＬ１４４、ＵＬ１４１、ＵＳ１１、ＨＯＳ、ＩＥ２、ＴＥＲＴ、サバイビン、破傷風、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＥＲ３、ＨＶＥＭ、ＨＰＶ１６Ｅ６、ＨＰＶ１８Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ７、ＨＰＶ１８Ｅ７、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ  ｔｒｕｎｃ、ｇｐ３５０、ＬＭＰ２、ＧＣＰ３、ミドルＳ、Ｘタンパク質、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＭ８、ＴＥＭ１、ＨＥＲ２  ＥＣＤ＋ＴＭ、ＣＥＡ、ＴＡＲＰ、ＰＲＯＳＴＥＩＮ、ＰＳＭＡ、ＢＩＲＣ４、ムチン−１、ムチン−１  ｉｓｏ、ＣＤ４０−Ｌ、ＷＴ−１、ＷＴ−１  ｔｒｕｎｃ、ＰＲＡＭＥ、ＬＡＧＥ−１、および／またはＭＡＧＥ  Ａ３；（ｑ）ＨＥＲ３、および次のうち少なくとも１つ：ｐｐ６５、ｇＢ、ＩＥ１、ＭＴＲＩＩ、ＵＳ２８、ＩＧＦＢＰ２、ＩＬ１０、ＵＬ１４４、ＵＬ１４１、ＵＳ１１、ＨＯＳ、ＩＥ２、ＴＥＲＴ、サバイビン、破傷風、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＥＲ２、ＨＶＥＭ、ＨＰＶ１６Ｅ６、ＨＰＶ１８Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ７、ＨＰＶ１８Ｅ７、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ  ｔｒｕｎｃ、ｇｐ３５０、ＬＭＰ２、ＧＣＰ３、ミドルＳ、Ｘタンパク質、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＭ８、ＴＥＭ１、ＨＥＲ２  ＥＣＤ＋ＴＭ、ＣＥＡ、ＴＡＲＰ、ＰＲＯＳＴＥＩＮ、ＰＳＭＡ、ＢＩＲＣ４、ムチン−１、ムチン−１  ｉｓｏ、ＣＤ４０−Ｌ、ＷＴ−１、ＷＴ−１  ｔｒｕｎｃ、ＰＲＡＭＥ、ＬＡＧＥ−１、および／またはＭＡＧＥ  Ａ３；（ｒ）ＨＶＥＭ、および次のうち少なくとも１つ：ｐｐ６５、ｇＢ、ＩＥ１、ＭＴＲＩＩ、ＵＳ２８、ＩＧＦＢＰ２、ＩＬ１０、ＵＬ１４４、ＵＬ１４１、ＵＳ１１、ＨＯＳ、ＩＥ２、ＴＥＲＴ、サバイビン、破傷風、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＰＶ１６Ｅ６、ＨＰＶ１８Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ７、ＨＰＶ１８Ｅ７、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ  ｔｒｕｎｃ、ｇｐ３５０、ＬＭＰ２、ＧＣＰ３、ミドルＳ、Ｘタンパク質、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＭ８、ＴＥＭ１、ＨＥＲ２  ＥＣＤ＋ＴＭ、ＣＥＡ、ＴＡＲＰ、ＰＲＯＳＴＥＩＮ、ＰＳＭＡ、ＢＩＲＣ４、ムチン−１、ムチン−１  ｉｓｏ、ＣＤ４０−Ｌ、ＷＴ−１、ＷＴ−１  ｔｒｕｎｃ、ＰＲＡＭＥ、ＬＡＧＥ−１、および／またはＭＡＧＥ  Ａ３；（ｓ）ＨＯＳ、および次のうち少なくとも１つ：ｐｐ６５、ｇＢ、ＩＥ１、ＭＴＲＩＩ、ＵＳ２８、ＩＧＦＢＰ２、ＩＬ１０、ＵＬ１４４、ＵＬ１４１、ＵＳ１１、ＩＥ２、ＴＥＲＴ、サバイビン、破傷風、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＶＥＭ、ＨＰＶ１６Ｅ６、ＨＰＶ１８Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ７、ＨＰＶ１８Ｅ７、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ  ｔｒｕｎｃ、ｇｐ３５０、ＬＭＰ２、ＧＣＰ３、ミドルＳ、Ｘタンパク質、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＭ８、ＴＥＭ１、ＨＥＲ２  ＥＣＤ＋ＴＭ、ＣＥＡ、ＴＡＲＰ、ＰＲＯＳＴＥＩＮ、ＰＳＭＡ、ＢＩＲＣ４、ムチン−１、ムチン−１  ｉｓｏ、ＣＤ４０−Ｌ、ＷＴ−１、ＷＴ−１  ｔｒｕｎｃ、ＰＲＡＭＥ、ＬＡＧＥ−１、および／またはＭＡＧＥ  Ａ３；（ｔ）ＨＰＶ１６Ｅ６、および次のうち少なくとも１つ：ｐｐ６５、ｇＢ、ＩＥ１、ＭＴＲＩＩ、ＵＳ２８、ＩＧＦＢＰ２、ＩＬ１０、ＵＬ１４４、ＵＬ１４１、ＵＳ１１、ＨＯＳ、ＩＥ２、ＴＥＲＴ、サバイビン、破傷風、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＶＥＭ、ＨＰＶ１８Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ７、ＨＰＶ１８Ｅ７、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ  ｔｒｕｎｃ、ｇｐ３５０、ＬＭＰ２、ＧＣＰ３、ミドルＳ、Ｘタンパク質、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＭ８、ＴＥＭ１、ＨＥＲ２  ＥＣＤ＋ＴＭ、ＣＥＡ、ＴＡＲＰ、ＰＲＯＳＴＥＩＮ、ＰＳＭＡ、ＢＩＲＣ４、ムチン−１、ムチン−１  ｉｓｏ、ＣＤ４０−Ｌ、ＷＴ−１、ＷＴ−１  ｔｒｕｎｃ、ＰＲＡＭＥ、ＬＡＧＥ−１、および／またはＭＡＧＥ  Ａ３；（ｕ）ＨＰＶ１８Ｅ６、および次のうち少なくとも１つ：ｐｐ６５、ｇＢ、ＩＥ１、ＭＴＲＩＩ、ＵＳ２８、ＩＧＦＢＰ２、ＩＬ１０、ＵＬ１４４、ＵＬ１４１、ＵＳ１１、ＨＯＳ、ＩＥ２、ＴＥＲＴ、サバイビン、破傷風、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＶＥＭ、ＨＰＶ１６Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ７、ＨＰＶ１８Ｅ７、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ  ｔｒｕｎｃ、ｇｐ３５０、ＬＭＰ２、ＧＣＰ３、ミドルＳ、Ｘタンパク質、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＭ８、ＴＥＭ１、ＨＥＲ２  ＥＣＤ＋ＴＭ、ＣＥＡ、ＴＡＲＰ、ＰＲＯＳＴＥＩＮ、ＰＳＭＡ、ＢＩＲＣ４、ムチン−１、ムチン−１  ｉｓｏ、ＣＤ４０−Ｌ、ＷＴ−１、ＷＴ−１  ｔｒｕｎｃ、ＰＲＡＭＥ、ＬＡＧＥ−１、および／またはＭＡＧＥ  Ａ３；（ｖ）ＨＰＶ１６Ｅ７、および次のうち少なくとも１つ：ｐｐ６５、ｇＢ、ＩＥ１、ＭＴＲＩＩ、ＵＳ２８、ＩＧＦＢＰ２、ＩＬ１０、ＵＬ１４４、ＵＬ１４１、ＵＳ１１、ＨＯＳ、ＩＥ２、ＴＥＲＴ、サバイビン、破傷風、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＶＥＭ、ＨＰＶ１６Ｅ６、ＨＰＶ１８Ｅ６、ＨＰＶ１８Ｅ７、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ  ｔｒｕｎｃ、ｇｐ３５０、ＬＭＰ２、ＧＣＰ３、ミドルＳ、Ｘタンパク質、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＭ８、ＴＥＭ１、ＨＥＲ２  ＥＣＤ＋ＴＭ、ＣＥＡ、ＴＡＲＰ、ＰＲＯＳＴＥＩＮ、ＰＳＭＡ、ＢＩＲＣ４、ムチン−１、ムチン−１  ｉｓｏ、ＣＤ４０−Ｌ、ＷＴ−１、ＷＴ−１  ｔｒｕｎｃ、ＰＲＡＭＥ、ＬＡＧＥ−１、および／またはＭＡＧＥ  Ａ３；（ｗ）ＨＰＶ１８Ｅ７、および次のうち少なくとも１つ：ｐｐ６５、ｇＢ、ＩＥ１、ＭＴＲＩＩ、ＵＳ２８、ＩＧＦＢＰ２、ＩＬ１０、ＵＬ１４４、ＵＬ１４１、ＵＳ１１、ＨＯＳ、ＩＥ２、ＴＥＲＴ、サバイビン、破傷風、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＶＥＭ、ＨＰＶ１６Ｅ６、ＨＰＶ１８Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ７、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ  ｔｒｕｎｃ、ｇｐ３５０、ＬＭＰ２、ＧＣＰ３、ミドルＳ、Ｘタンパク質、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＭ８、ＴＥＭ１、ＨＥＲ２  ＥＣＤ＋ＴＭ、ＣＥＡ、ＴＡＲＰ、ＰＲＯＳＴＥＩＮ、ＰＳＭＡ、ＢＩＲＣ４、ムチン−１、ムチン−１  ｉｓｏ、ＣＤ４０−Ｌ、ＷＴ−１、ＷＴ−１  ｔｒｕｎｃ、ＰＲＡＭＥ、ＬＡＧＥ−１、
および／またはＭＡＧＥ  Ａ３；（ｘ）ＥＢＮＡ１、および次のうち少なくとも１つ：ｐｐ６５、ｇＢ、ＩＥ１、ＭＴＲＩＩ、ＵＳ２８、ＩＧＦＢＰ２、ＩＬ１０、ＵＬ１４４、ＵＬ１４１、ＵＳ１１、ＨＯＳ、ＩＥ２、ＴＥＲＴ、サバイビン、破傷風、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＶＥＭ、ＨＰＶ１６Ｅ６、ＨＰＶ１８Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ７、ＨＰＶ１８Ｅ７、ＥＢＮＡ  ｔｒｕｎｃ、ｇｐ３５０、ＬＭＰ２、ＧＣＰ３、ミドルＳ、Ｘタンパク質、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＭ８、ＴＥＭ１、ＨＥＲ２  ＥＣＤ＋ＴＭ、ＣＥＡ、ＴＡＲＰ、ＰＲＯＳＴＥＩＮ、ＰＳＭＡ、ＢＩＲＣ４、ムチン−１、ムチン−１  ｉｓｏ、ＣＤ４０−Ｌ、ＷＴ−１、ＷＴ−１  ｔｒｕｎｃ、ＰＲＡＭＥ、ＬＡＧＥ−１、および／またはＭＡＧＥ  Ａ３；（ｙ）ＥＢＮＡ１  ｔｒｕｎｃ、および次のうち少なくとも１つ：ｐｐ６５、ｇＢ、ＩＥ１、ＭＴＲＩＩ、ＵＳ２８、ＩＧＦＢＰ２、ＩＬ１０、ＵＬ１４４、ＵＬ１４１、ＵＳ１１、ＨＯＳ、ＩＥ２、ＴＥＲＴ、サバイビン、破傷風、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＶＥＭ、ＨＰＶ１６Ｅ６、ＨＰＶ１８Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ７、ＨＰＶ１８Ｅ７、ＥＢＮＡ１、ｇｐ３５０、ＬＭＰ２、ＧＣＰ３、ミドルＳ、Ｘタンパク質、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＭ８、ＴＥＭ１、ＨＥＲ２  ＥＣＤ＋ＴＭ、ＣＥＡ、ＴＡＲＰ、ＰＲＯＳＴＥＩＮ、ＰＳＭＡ、ＢＩＲＣ４、ムチン−１、ムチン−１  ｉｓｏ、ＣＤ４０−Ｌ、ＷＴ−１、ＷＴ−１  ｔｒｕｎｃ、ＰＲＡＭＥ、ＬＡＧＥ−１、および／またはＭＡＧＥ  Ａ３；（ｚ）ｇｐ３５０、および次のうち少なくとも１つ：ｐｐ６５、ｇＢ、ＩＥ１、ＭＴＲＩＩ、ＵＳ２８、ＩＧＦＢＰ２、ＩＬ１０、ＵＬ１４４、ＵＬ１４１、ＵＳ１１、ＨＯＳ、ＩＥ２、ＴＥＲＴ、サバイビン、破傷風、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＶＥＭ、ＨＰＶ１６Ｅ６、ＨＰＶ１８Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ７、ＨＰＶ１８Ｅ７、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ  ｔｒｕｎｃ、ＬＭＰ２、ＧＣＰ３、ミドルＳ、Ｘタンパク質、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＭ８、ＴＥＭ１、ＨＥＲ２  ＥＣＤ＋ＴＭ、ＣＥＡ、ＴＡＲＰ、ＰＲＯＳＴＥＩＮ、ＰＳＭＡ、ＢＩＲＣ４、ムチン−１、ムチン−１  ｉｓｏ、ＣＤ４０−Ｌ、ＷＴ−１、ＷＴ−１  ｔｒｕｎｃ、ＰＲＡＭＥ、ＬＡＧＥ−１、および／またはＭＡＧＥ  Ａ３；（ａａ）ＬＭＰ２、および次のうち少なくとも１つ：ｐｐ６５、ｇＢ、ＩＥ１、ＭＴＲＩＩ、ＵＳ２８、ＩＧＦＢＰ２、ＩＬ１０、ＵＬ１４４、ＵＬ１４１、ＵＳ１１、ＨＯＳ、ＩＥ２、ＴＥＲＴ、サバイビン、破傷風、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＶＥＭ、ＨＰＶ１６Ｅ６、ＨＰＶ１８Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ７、ＨＰＶ１８Ｅ７、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ  ｔｒｕｎｃ、ｇｐ３５０、ＧＣＰ３、ミドルＳ、Ｘタンパク質、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＭ８、ＴＥＭ１、ＨＥＲ２  ＥＣＤ＋ＴＭ、ＣＥＡ、ＴＡＲＰ、ＰＲＯＳＴＥＩＮ、ＰＳＭＡ、ＢＩＲＣ４、ムチン−１、ムチン−１  ｉｓｏ、ＣＤ４０−Ｌ、ＷＴ−１、ＷＴ−１  ｔｒｕｎｃ、ＰＲＡＭＥ、ＬＡＧＥ−１、および／またはＭＡＧＥ  Ａ３；（ａｂ）ＧＣＰ３、および次のうち少なくとも１つ：ｐｐ６５、ｇＢ、ＩＥ１、ＭＴＲＩＩ、ＵＳ２８、ＩＧＦＢＰ２、ＩＬ１０、ＵＬ１４４、ＵＬ１４１、ＵＳ１１、ＨＯＳ、ＩＥ２、ＴＥＲＴ、サバイビン、破傷風、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＶＥＭ、ＨＰＶ１６Ｅ６、ＨＰＶ１８Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ７、ＨＰＶ１８Ｅ７、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ  ｔｒｕｎｃ、ｇｐ３５０、ＬＭＰ２、ミドルＳ、Ｘタンパク質、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＭ８、ＴＥＭ１、ＨＥＲ２  ＥＣＤ＋ＴＭ、ＣＥＡ、ＴＡＲＰ、ＰＲＯＳＴＥＩＮ、ＰＳＭＡ、ＢＩＲＣ４、ムチン−１、ムチン−１  ｉｓｏ、ＣＤ４０−Ｌ、ＷＴ−１、ＷＴ−１  ｔｒｕｎｃ、ＰＲＡＭＥ、ＬＡＧＥ−１、および／またはＭＡＧＥ  Ａ３；（ａｃ）ミドルＳ、および次のうち少なくとも１つ：ｐｐ６５、ｇＢ、ＩＥ１、ＭＴＲＩＩ、ＵＳ２８、ＩＧＦＢＰ２、ＩＬ１０、ＵＬ１４４、ＵＬ１４１、ＵＳ１１、ＨＯＳ、ＩＥ２、ＴＥＲＴ、サバイビン、破傷風、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＶＥＭ、ＨＰＶ１６Ｅ６、ＨＰＶ１８Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ７、ＨＰＶ１８Ｅ７、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ  ｔｒｕｎｃ、ｇｐ３５０、ＬＭＰ２、ＧＣＰ３、Ｘタンパク質、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＭ８、ＴＥＭ１、ＨＥＲ２  ＥＣＤ＋ＴＭ、ＣＥＡ、ＴＡＲＰ、ＰＲＯＳＴＥＩＮ、ＰＳＭＡ、ＢＩＲＣ４、ムチン−１、ムチン−１  ｉｓｏ、ＣＤ４０−Ｌ、ＷＴ−１、ＷＴ−１  ｔｒｕｎｃ、ＰＲＡＭＥ、ＬＡＧＥ−１、および／またはＭＡＧＥ  Ａ３；（ａｄ）Ｘタンパク質、および次のうち少なくとも１つ：ｐｐ６５、ｇＢ、ＩＥ１、ＭＴＲＩＩ、ＵＳ２８、ＩＧＦＢＰ２、ＩＬ１０、ＵＬ１４４、ＵＬ１４１、ＵＳ１１、ＨＯＳ、ＩＥ２、ＴＥＲＴ、サバイビン、破傷風、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＶＥＭ、ＨＰＶ１６Ｅ６、ＨＰＶ１８Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ７、ＨＰＶ１８Ｅ７、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ  ｔｒｕｎｃ、ｇｐ３５０、ＬＭＰ２、ＧＣＰ３、ミドルＳ、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＭ８、ＴＥＭ１、ＨＥＲ２  ＥＣＤ＋ＴＭ、ＣＥＡ、ＴＡＲＰ、ＰＲＯＳＴＥＩＮ、ＰＳＭＡ、ＢＩＲＣ４、ムチン−１、ムチン−１  ｉｓｏ、ＣＤ４０−Ｌ、ＷＴ−１、ＷＴ−１  ｔｒｕｎｃ、ＰＲＡＭＥ、ＬＡＧＥ−１、および／またはＭＡＧＥ  Ａ３；（ａｅ）ＴＩＧＩＴ、および次のうち少なくとも１つ：ｐｐ６５、ｇＢ、ＩＥ１、ＭＴＲＩＩ、ＵＳ２８、ＩＧＦＢＰ２、ＩＬ１０、ＵＬ１４４、ＵＬ１４１、ＵＳ１１、ＨＯＳ、ＩＥ２、ＴＥＲＴ、サバイビン、破傷風、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＶＥＭ、ＨＰＶ１６Ｅ６、ＨＰＶ１８Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ７、ＨＰＶ１８Ｅ７、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ  ｔｒｕｎｃ、ｇｐ３５０、ＬＭＰ２、ＧＣＰ３、ミドルＳ、Ｘタンパク質、ＴＥＭ８、ＴＥＭ１、ＨＥＲ２  ＥＣＤ＋ＴＭ、ＣＥＡ、ＴＡＲＰ、ＰＲＯＳＴＥＩＮ、ＰＳＭＡ、ＢＩＲＣ４、ムチン−１、ムチン−１  ｉｓｏ、ＣＤ４０−Ｌ、ＷＴ−１、ＷＴ−１  ｔｒｕｎｃ、ＰＲＡＭＥ、ＬＡＧＥ−１、および／またはＭＡＧＥ  Ａ３；（ａｆ）ＴＥＭ８、および次のうち少なくとも１つ：ｐｐ６５、ｇＢ、ＩＥ１、ＭＴＲＩＩ、ＵＳ２８、ＩＧＦＢＰ２、ＩＬ１０、ＵＬ１４４、ＵＬ１４１、ＵＳ１１、ＨＯＳ、ＩＥ２、ＴＥＲＴ、サバイビン、破傷風、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＶＥＭ、ＨＰＶ１６Ｅ６、ＨＰＶ１８Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ７、ＨＰＶ１８Ｅ７、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ  ｔｒｕｎｃ、ｇｐ３５０、ＬＭＰ２、ＧＣＰ３、ミドルＳ、Ｘタンパク質、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＭ１、ＨＥＲ２  ＥＣＤ＋ＴＭ、ＣＥＡ、ＴＡＲＰ、ＰＲＯＳＴＥＩＮ、ＰＳＭＡ、ＢＩＲＣ４、ムチン−１、ムチン−１  ｉｓｏ、ＣＤ４０−Ｌ、ＷＴ−１、ＷＴ−１  ｔｒｕｎｃ、ＰＲＡＭＥ、ＬＡＧＥ−１、および／またはＭＡＧＥ  Ａ３；（ａｇ）ＴＥＭ１、および次のうち少なくとも１つ：ｐｐ６５、ｇＢ、ＩＥ１、ＭＴＲＩＩ、ＵＳ２８、ＩＧＦＢＰ２、ＩＬ１０、ＵＬ１４４、ＵＬ１４１、ＵＳ１１、ＨＯＳ、ＩＥ２、ＴＥＲＴ、サバイビン、破傷風、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＶＥＭ、ＨＰＶ１６Ｅ６、ＨＰＶ１８Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ７、ＨＰＶ１８Ｅ７、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ  ｔｒｕｎｃ、ｇｐ３５０、ＬＭＰ２、ＧＣＰ３、ミドルＳ、Ｘタンパク質、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＭ８、ＨＥＲ２  ＥＣＤ＋ＴＭ、ＣＥＡ、ＴＡＲＰ、ＰＲＯＳＴＥＩＮ、ＰＳＭＡ、ＢＩＲＣ４、ムチン−１、ムチン−１  ｉｓｏ、ＣＤ４０−Ｌ、ＷＴ−１、ＷＴ−１  ｔｒｕｎｃ、ＰＲＡＭＥ、ＬＡＧＥ−１、および／またはＭＡＧＥ  Ａ３；（ａｈ）ＨＥＲ２  ＥＣＤ＋ＴＭ、および次のうち少なくとも１つ：ｐｐ６５、ｇＢ、ＩＥ１、ＭＴＲＩＩ、ＵＳ２８、ＩＧＦＢＰ２、ＩＬ１０、ＵＬ１４４、ＵＬ１４１、ＵＳ１１、ＨＯＳ、ＩＥ２、ＴＥＲＴ、サバイビン、破傷風、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＶＥＭ、ＨＰＶ１６Ｅ６、ＨＰＶ１８Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ７、ＨＰＶ１８Ｅ７、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ  ｔｒｕｎｃ、ｇｐ３５０、ＬＭＰ２、ＧＣＰ３、ミドルＳ、Ｘタンパク質、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＭ８、ＴＥＭ１、ＣＥＡ、ＴＡＲＰ、ＰＲＯＳＴＥＩＮ、ＰＳＭＡ、ＢＩＲＣ４、ムチン−１、ムチン−１  ｉｓｏ、ＣＤ４０−Ｌ、ＷＴ−１、ＷＴ−１  ｔｒｕｎｃ、ＰＲＡＭＥ、ＬＡＧＥ−１、および／またはＭＡＧＥ  Ａ３；（ａｉ）ＣＥＡ、および次のうち少なくとも１つ：ｐｐ６５、ｇＢ、ＩＥ１、ＭＴＲＩＩ、ＵＳ２８、ＩＧＦＢＰ２、ＩＬ１０、ＵＬ１４４、ＵＬ１４１、ＵＳ１１、ＨＯＳ、ＩＥ２、ＴＥＲＴ、サバイビン、破傷風、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＶＥＭ、ＨＰＶ１６Ｅ６、ＨＰＶ１８Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ７、ＨＰＶ１８Ｅ７、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ  ｔｒｕｎｃ、ｇｐ３５０、ＬＭＰ２、ＧＣＰ３、ミドルＳ、Ｘタンパク質、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＭ８、ＴＥＭ１、ＨＥＲ２  ＥＣＤ＋ＴＭ、ＴＡＲＰ、ＰＲＯＳＴＥＩＮ、ＰＳＭＡ、ＢＩＲＣ４、ムチン−１、ムチン−１  ｉｓｏ、ＣＤ４０−Ｌ、ＷＴ−１、ＷＴ−１  ｔｒｕｎｃ、ＰＲＡＭＥ、ＬＡＧＥ−１、および／またはＭＡＧＥ  Ａ３；（ａｊ）ＴＡＲＰ、および次のうち少なくとも１つ：ｐｐ６５、ｇＢ、ＩＥ１、ＭＴＲＩＩ、ＵＳ２８、ＩＧＦＢＰ２、ＩＬ１０、ＵＬ１４４、ＵＬ１４１、ＵＳ１１、ＨＯＳ、ＩＥ２、ＴＥＲＴ、サバイビン、破傷風、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＶＥＭ、ＨＰＶ１６Ｅ６、ＨＰＶ１８Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ７、ＨＰＶ１８Ｅ７、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ  ｔｒｕｎｃ、ｇｐ３５０、ＬＭＰ２、ＧＣＰ３、ミドルＳ、Ｘタンパク質、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＭ８、ＴＥＭ１、ＨＥＲ２  ＥＣＤ＋ＴＭ、ＣＥＡ、ＰＲＯＳＴＥＩＮ、ＰＳＭＡ、ＢＩＲＣ４、ムチン−１、ムチン−１  ｉｓｏ、ＣＤ４０−Ｌ、���Ｔ−１、ＷＴ−１  ｔｒｕｎｃ、ＰＲＡＭＥ、ＬＡＧＥ−１、および／またはＭＡＧＥ  Ａ３；（ａｋ）ＰＲＯＳＴＥＩＮ、および次のうち少なくとも１つ：ｐｐ６５、ｇＢ、ＩＥ１、ＭＴＲＩＩ、ＵＳ２８、ＩＧＦＢＰ２、ＩＬ１０、ＵＬ１４４、ＵＬ１４１、ＵＳ１１、ＨＯＳ、ＩＥ２、ＴＥＲＴ、サバイビン、破傷風、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＶＥＭ、ＨＰＶ１６Ｅ６、ＨＰＶ１８Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ７、ＨＰＶ１８Ｅ７、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ  ｔｒｕｎｃ、ｇｐ３５０、ＬＭＰ２、ＧＣＰ３、ミドルＳ、Ｘタンパク質、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＭ８、ＴＥＭ１、ＨＥＲ２  ＥＣＤ＋ＴＭ、ＣＥＡ、ＴＡＲＰ、ＰＳＭＡ、ＢＩＲＣ４、ムチン−１、ムチン−１  ｉｓｏ、ＣＤ４０−Ｌ、ＷＴ−１、ＷＴ−１  ｔｒｕｎｃ、ＰＲＡＭＥ、ＬＡＧＥ−１、および／またはＭＡＧＥ  Ａ３；（ａｌ）ＰＳＭＡ、および次のうち少なくとも１つ：ｐｐ６５、ｇＢ、ＩＥ１、ＭＴＲＩＩ、ＵＳ２８、ＩＧＦＢＰ２、ＩＬ１０、ＵＬ１４４、ＵＬ１４１、ＵＳ１１、ＨＯＳ、ＩＥ２、ＴＥＲＴ、サバイビン、破傷風、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＶＥＭ、ＨＰＶ１６Ｅ６、ＨＰＶ１８Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ７、ＨＰＶ１８Ｅ７、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ  ｔｒｕｎｃ、ｇｐ３５０、ＬＭＰ２、ＧＣＰ３、ミドルＳ、Ｘタンパク質、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＭ８、ＴＥＭ１、ＨＥＲ２  ＥＣＤ＋ＴＭ、ＣＥＡ、ＴＡＲＰ、ＰＲＯＳＴＥＩＮ、ＢＩＲＣ４、ムチン−１、ムチン−１  ｉｓｏ、ＣＤ４０−Ｌ、ＷＴ−１、ＷＴ−１  ｔｒｕｎｃ、ＰＲＡＭＥ、ＬＡＧＥ−１、および／またはＭＡＧＥ  Ａ３；（ａｍ）ＢＩＲＣ４、および次のうち少なくとも１つ：ｐｐ６５、ｇＢ、ＩＥ１、ＭＴＲＩＩ、ＵＳ２８、ＩＧＦＢＰ２、ＩＬ１０、ＵＬ１４４、ＵＬ１４１、ＵＳ１１、ＨＯＳ、ＩＥ２、ＴＥＲＴ、サバイビン、破傷風、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＶＥＭ、ＨＰＶ１６Ｅ６、ＨＰＶ１８Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ７、ＨＰＶ１８Ｅ７、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ  ｔｒｕｎｃ、ｇｐ３５０、ＬＭＰ２、ＧＣＰ３、ミドルＳ、Ｘタンパク質、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＭ８、ＴＥＭ１、ＨＥＲ２  ＥＣＤ＋ＴＭ、ＣＥＡ、ＴＡＲＰ、ＰＲＯＳＴＥＩＮ、ＰＳＭＡ、ムチン−１、ムチン−１  ｉｓｏ、ＣＤ４０−Ｌ、ＷＴ−１、ＷＴ−１  ｔｒｕｎｃ、ＰＲＡＭＥ、ＬＡＧＥ−１、および／またはＭＡＧＥ  Ａ３；（ａｎ
）ムチン−１、および次のうち少なくとも１つ：ｐｐ６５、ｇＢ、ＩＥ１、ＭＴＲＩＩ、ＵＳ２８、ＩＧＦＢＰ２、ＩＬ１０、ＵＬ１４４、ＵＬ１４１、ＵＳ１１、ＨＯＳ、ＩＥ２、ＴＥＲＴ、サバイビン、破傷風、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＶＥＭ、ＨＰＶ１６Ｅ６、ＨＰＶ１８Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ７、ＨＰＶ１８Ｅ７、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ  ｔｒｕｎｃ、ｇｐ３５０、ＬＭＰ２、ＧＣＰ３、ミドルＳ、Ｘタンパク質、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＭ８、ＴＥＭ１、ＨＥＲ２  ＥＣＤ＋ＴＭ、ＣＥＡ、ＴＡＲＰ、ＰＲＯＳＴＥＩＮ、ＰＳＭＡ、ＢＩＲＣ４、ムチン−１  ｉｓｏ、ＣＤ４０−Ｌ、ＷＴ−１、ＷＴ−１  ｔｒｕｎｃ、ＰＲＡＭＥ、ＬＡＧＥ−１、および／またはＭＡＧＥ  Ａ３；（ａｏ）ムチン−１  ｉｓｏ、および次のうち少なくとも１つ：ｐｐ６５、ｇＢ、ＩＥ１、ＭＴＲＩＩ、ＵＳ２８、ＩＧＦＢＰ２、ＩＬ１０、ＵＬ１４４、ＵＬ１４１、ＵＳ１１、ＨＯＳ、ＩＥ２、ＴＥＲＴ、サバイビン、破傷風、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＶＥＭ、ＨＰＶ１６Ｅ６、ＨＰＶ１８Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ７、ＨＰＶ１８Ｅ７、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ  ｔｒｕｎｃ、ｇｐ３５０、ＬＭＰ２、ＧＣＰ３、ミドルＳ、Ｘタンパク質、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＭ８、ＴＥＭ１、ＨＥＲ２  ＥＣＤ＋ＴＭ、ＣＥＡ、ＴＡＲＰ、ＰＲＯＳＴＥＩＮ、ＰＳＭＡ、ＢＩＲＣ４、ムチン−１、ＣＤ４０−Ｌ、ＷＴ−１、ＷＴ−１  ｔｒｕｎｃ、ＰＲＡＭＥ、ＬＡＧＥ−１、および／またはＭＡＧＥ  Ａ３；（ａｐ）ＣＤ４０−Ｌ、および次のうち少なくとも１つ：ｐｐ６５、ｇＢ、ＩＥ１、ＭＴＲＩＩ、ＵＳ２８、ＩＧＦＢＰ２、ＩＬ１０、ＵＬ１４４、ＵＬ１４１、ＵＳ１１、ＨＯＳ、ＩＥ２、ＴＥＲＴ、サバイビン、破傷風、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＶＥＭ、ＨＰＶ１６Ｅ６、ＨＰＶ１８Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ７、ＨＰＶ１８Ｅ７、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ  ｔｒｕｎｃ、ｇｐ３５０、ＬＭＰ２、ＧＣＰ３、ミドルＳ、Ｘタンパク質、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＭ８、ＴＥＭ１、ＨＥＲ２  ＥＣＤ＋ＴＭ、ＣＥＡ、ＴＡＲＰ、ＰＲＯＳＴＥＩＮ、ＰＳＭＡ、ＢＩＲＣ４、ムチン−１、ムチン−１  ｉｓｏ、ＷＴ−１、ＷＴ−１  ｔｒｕｎｃ、ＰＲＡＭＥ、ＬＡＧＥ−１、および／またはＭＡＧＥ  Ａ３；（ａｑ）ＷＴ−１、および次のうち少なくとも１つ：ｐｐ６５、ｇＢ、ＩＥ１、ＭＴＲＩＩ、ＵＳ２８、ＩＧＦＢＰ２、ＩＬ１０、ＵＬ１４４、ＵＬ１４１、ＵＳ１１、ＨＯＳ、ＩＥ２、ＴＥＲＴ、サバイビン、破傷風、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＶＥＭ、ＨＰＶ１６Ｅ６、ＨＰＶ１８Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ７、ＨＰＶ１８Ｅ７、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ  ｔｒｕｎｃ、ｇｐ３５０、ＬＭＰ２、ＧＣＰ３、ミドルＳ、Ｘタンパク質、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＭ８、ＴＥＭ１、ＨＥＲ２  ＥＣＤ＋ＴＭ、ＣＥＡ、ＴＡＲＰ、ＰＲＯＳＴＥＩＮ、ＰＳＭＡ、ＢＩＲＣ４、ムチン−１、ムチン−１  ｉｓｏ、ＣＤ４０−Ｌ、ＷＴ−１  ｔｒｕｎｃ、ＰＲＡＭＥ、ＬＡＧＥ−１、および／またはＭＡＧＥ  Ａ３；（ａｒ）ＷＴ−１  ｔｒｕｎｃ、および次のうち少なくとも１つ：ｐｐ６５、ｇＢ、ＩＥ１、ＭＴＲＩＩ、ＵＳ２８、ＩＧＦＢＰ２、ＩＬ１０、ＵＬ１４４、ＵＬ１４１、ＵＳ１１、ＨＯＳ、ＩＥ２、ＴＥＲＴ、サバイビン、破傷風、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＶＥＭ、ＨＰＶ１６Ｅ６、ＨＰＶ１８Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ７、ＨＰＶ１８Ｅ７、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ  ｔｒｕｎｃ、ｇｐ３５０、ＬＭＰ２、ＧＣＰ３、ミドルＳ、Ｘタンパク質、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＭ８、ＴＥＭ１、ＨＥＲ２  ＥＣＤ＋ＴＭ、ＣＥＡ、ＴＡＲＰ、ＰＲＯＳＴＥＩＮ、ＰＳＭＡ、ＢＩＲＣ４、ムチン−１、ムチン−１  ｉｓｏ、ＣＤ４０−Ｌ、ＷＴ−１、ＰＲＡＭＥ、ＬＡＧＥ−１、および／またはＭＡＧＥ  Ａ３；（ａｓ）ＰＲＡＭＥ、および次のうち少なくとも１つ：ｐｐ６５、ｇＢ、ＩＥ１、ＭＴＲＩＩ、ＵＳ２８、ＩＧＦＢＰ２、ＩＬ１０、ＵＬ１４４、ＵＬ１４１、ＵＳ１１、ＨＯＳ、ＩＥ２、ＴＥＲＴ、サバイビン、破傷風、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＶＥＭ、ＨＰＶ１６Ｅ６、ＨＰＶ１８Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ７、ＨＰＶ１８Ｅ７、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ  ｔｒｕｎｃ、ｇｐ３５０、ＬＭＰ２、ＧＣＰ３、ミドルＳ、Ｘタンパク質、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＭ８、ＴＥＭ１、ＨＥＲ２  ＥＣＤ＋ＴＭ、ＣＥＡ、ＴＡＲＰ、ＰＲＯＳＴＥＩＮ、ＰＳＭＡ、ＢＩＲＣ４、ムチン−１、ムチン−１  ｉｓｏ、ＣＤ４０−Ｌ、ＷＴ−１、ＷＴ−１  ｔｒｕｎｃ、ＬＡＧＥ−１、および／またはＭＡＧＥ  Ａ３；（ａｔ）ＬＡＧＥ−１、および次のうち少なくとも１つ：ｐｐ６５、ｇＢ、ＩＥ１、ＭＴＲＩＩ、ＵＳ２８、ＩＧＦＢＰ２、ＩＬ１０、ＵＬ１４４、ＵＬ１４１、ＵＳ１１、ＨＯＳ、ＩＥ２、ＴＥＲＴ、サバイビン、破傷風、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＶＥＭ、ＨＰＶ１６Ｅ６、ＨＰＶ１８Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ７、ＨＰＶ１８Ｅ７、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ  ｔｒｕｎｃ、ｇｐ３５０、ＬＭＰ２、ＧＣＰ３、ミドルＳ、Ｘタンパク質、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＭ８、ＴＥＭ１、ＨＥＲ２  ＥＣＤ＋ＴＭ、ＣＥＡ、ＴＡＲＰ、ＰＲＯＳＴＥＩＮ、ＰＳＭＡ、ＢＩＲＣ４、ムチン−１、ムチン−１  ｉｓｏ、ＣＤ４０−Ｌ、ＷＴ−１、ＷＴ−１  ｔｒｕｎｃ、ＰＲＡＭＥ、および／またはＭＡＧＥ  Ａ３；および／または（ａｕ）ＭＡＧＥ  Ａ３、および次のうち少なくとも１つ：ｐｐ６５、ｇＢ、ＩＥ１、ＭＴＲＩＩ、ＵＳ２８、ＩＧＦＢＰ２、ＩＬ１０、ＵＬ１４４、ＵＬ１４１、ＵＳ１１、ＨＯＳ、ＩＥ２、ＴＥＲＴ、サバイビン、破傷風、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＶＥＭ、ＨＰＶ１６Ｅ６、ＨＰＶ１８Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ７、ＨＰＶ１８Ｅ７、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ  ｔｒｕｎｃ、ｇｐ３５０、ＬＭＰ２、ＧＣＰ３、ミドルＳ、Ｘタンパク質、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＭ８、ＴＥＭ１、ＨＥＲ２  ＥＣＤ＋ＴＭ、ＣＥＡ、ＴＡＲＰ、ＰＲＯＳＴＥＩＮ、ＰＳＭＡ、ＢＩＲＣ４、ムチン−１、ムチン−１  ｉｓｏ、ＣＤ４０−Ｌ、ＷＴ−１、ＷＴ−１  ｔｒｕｎｃ、ＰＲＡＭＥ、および／またはＬＡＧＥ−１。このリストはＬＡＭＰ構築物が含むものを説明し、必ずしも特定の構築物内の抗原の配置を説明するわけではないため、特定のＬＡＭＰ構築物における上記の抗原の組み合わせの順序は変わり得る。さらに、これらの抗原は単一のＬＡＭＰ構築物内で組み合わせることができるか、または複数のＬＡＭＰ構築物を含む１つの組成物で送達できることが特に想定される。
【０１７０】
改善されたＬＡＭＰ構築物をコードする配列のアセンブリ
目的の抗原を含む改善されたＬＡＭＰ構築物を構築する手順は、当技術分野で周知である（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１１：９５５、１９９０を参照）。目的のセグメントをコードするＤＮＡ配列は、容易に入手可能な組換えＤＮＡ材料から得ることができ、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（米国メリーランド州２０８５２、ロックビル、Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ１２３０１）、または所望のＤＮＡを含むＤＮＡライブラリから入手可能な材料が挙げられる。
【０１７１】
例えば、所望のドメイン配列に対応するＤＮＡセグメントは、組換えＤＮＡ方法論の通常の手順を使用して適切な制御およびシグナル配列で組み立てることができる。例えば、米国特許第４，５９３，００２号、およびＬａｎｇｆｏｒｄら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：３１９１、１９８６に記載されている。
【０１７２】
タンパク質またはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、化学的に合成するか、いくつかのアプローチのうちの１つによって単離できる。合成されるＤＮＡ配列は、所望のアミノ酸配列に適したコドンを使用して設計できる。一般に、配列が発現に使用される予定の宿主に好ましいコドンを選択する。完全な配列は、標準的な方法で調製された重複オリゴヌクレオチドから組み立てられ、完全なコード配列に組み立てられてもよい。例えば、Ｅｄｇｅ、Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：７５６、１９８１；Ｎａｍｂａｉｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２３：１２９９、１９８４；Ｊａｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：６３１１、１９８４を参照。
【０１７３】
一態様では、改善されたＬＡＭＰ構築物のドメイン配列をコードする１または複数の核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して個別に単離される（Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓら、Ｉｎ  ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９０）。ドメインは、それらを含むことが知られている公的に入手可能なクローンから単離されることが好ましいが、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリから単離されてもよい。好ましくは、単離された断片は、適合する制限エンドヌクレアーゼ部位に隣接し、それにより、癌抗原配列をコードする改善されたＬＡＭＰ構築物が構築される。この技術は当業者に周知である。ドメイン配列は、互いに直接融合するか（例えば、介在配列なしで）、互いに挿入するか（例えば、ドメイン配列が不連続である場合）、または介在配列により分離することができる（例えば、リンカー配列など）。
【０１７４】
オリゴヌクレオチドプライマー、プローブおよびＤＮＡライブラリを調製するための基本戦略、ならびに核酸ハイブリダイゼーションによるそれらのスクリーニングは当業者に周知である。例えば、前出のＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９；前出のＰｅｒｂａｌ、１９８４を参照。適切なゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリの構築は、当技術分野の範囲内である。例えば、前出のＰｅｒｂａｌ、１９８４を参照。あるいは、適切なＤＮＡライブラリまたは公的に入手可能なクローンは、ＣｌｏｎｅｔｅｃｈやＳｔｒａｔａｇｅｎｅなどの生物学的研究材料の供給者、およびＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎなどの公的な寄託機関から入手できる。
【０１７５】
選択は、ＤＮＡの発現ライブラリから配列を発現させ、発現したペプチドを免疫学的に検出することによって達成することができる。ＭＨＣ  ＩＩ分子および所望の抗体／Ｔ細胞受容体に結合するペプチドを発現するクローンが選択される。これらの選択手順は当業者に周知である（例えば、前出のＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９を参照）。
【０１７６】
所望のポリペプチド配列のコード配列を含むクローンが調製または単離されたら、配列を任意の適切なベクターにクローニングすることができ、好ましくは宿主細胞で配列を維持するための複製起点を含む。
【０１７７】
核酸送達媒体
一態様では、改善されたＬＡＭＰ構築物を含むワクチン組成物が細胞に導入される。細胞は、核酸を複製するため、または改善されたＬＡＭＰ構築物を発現するための宿主細胞であり得る。好ましくは、改善されたＬＡＭＰ構築物を発現するための宿主細胞は抗原提示細胞である（以下でさらに説明する）。
【０１７８】
好ましい実施形態では、改善されたＬＡＭＰ構築物は、標的細胞へ挿入するためのポリヌクレオチド配列と、細胞におけるポリヌクレオチド配列の発現（例えば、転写および／または翻訳）を制御するためにそれに機能的に連結された発現制御配列とをさらに含む。例には、プラスミド、ファージ、自律複製配列（ＡＲＳ）、動原体、およびインビトロまたは宿主細胞（細菌、酵母、昆虫細胞など）および／または標的細胞（例えば、哺乳動物細胞、好ましくは抗原提示細胞など）で複製できるかまたは複製され得る、および／または改善されたＬＡＭＰ構築物をコードする配列を標的細胞内の所望の位置に運ぶための他の配列が含まれる。
【０１７９】
組換え発現ベクターは、ヒト、ウマ、ウシ、ブタ、ラマ、キリン、イヌ、ネコ、またはニワトリを含む動物に容易に感染する微生物に由来する場合がある。好ましいベクターには、ワクシニアなどの生ワクチンとしてすでに使用されているものが含まれる。これらの組換え体は宿主に直接接種することができ、微生物ベクターだけでなく外来抗原を発現する免疫も付与する。本明細書で生組換えワクチンとして企図される好ましいベクターには、例えば、Ｆｌｅｘｎｅｒ、Ａｄｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２１：５１、１９９０に教示されているように、ＲＮＡウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、ワクシニアおよび他のポックスウイルスが含まれる。
【０１８０】
発現制御配列には、ＲＮＡポリメラーゼに結合するプロモーター配列、転写アクチベーターとリプレッサーにそれぞれ結合するエンハンサー配列または負の調節エレメント、および／またはリボソーム結合の翻訳開始配列が含まれるが、これらに限定されない。例えば、細菌発現ベクターは、ｌａｃプロモーターなどのプロモーターを含むことができ、転写開始のために、シャイン−ダルガルノ配列および開始コドンＡＵＧを含むことができる（前出のＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）。同様に、真核生物発現ベクターは、好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの異種、相同、またはキメラプロモーター、下流のポリアデニル化シグナル、開始コドンＡＵＧ、およびリボソームの分離のための終止コドンを含む。
【０１８１】
発現制御配列は、天然発生の遺伝子から取得しても、設計してもよい。設計された発現制御配列には、突然変異および／またはキメラ発現制御配列または合成またはクローニングされたコンセンサス配列が含まれるが、これらに限定されない。プロモーターと、ポリヌクレオチドを作動可能に連結できるクローニング部位との両方を含むベクターは、当技術分野で周知である。そのようなベクターは、インビトロまたはインビボでＲＮＡを転写することができ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（カリフォルニア州ラホーヤ）およびＰｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（ウィスコンシン州マディソン）などの供給元から市販されている。
【０１８２】
発現および／または転写を最適化するために、ベクターの５’および／または３’非翻訳部分を除去、追加または変更して、転写または翻訳のいずれかのレベルで発現に干渉するかまたは発現を減少させる可能性のある余分なまたは代替の翻訳開始コドンまたは他の配列を排除することが必要な場合がある。あるいは、コンセンサスリボソーム結合部位を、発現を増強するために開始コドンの５’に直接挿入することができる。多種多様な発現制御配列（それに機能的に連結されたＤＮＡ配列の発現を制御する配列）をこれらのベクターで使用して、本発明のＤＮＡ配列を発現させることができる。そのような有用な発現制御配列には、例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ワクシニア、ポリオーマ、アデノウイルス、ヘルペスウイルスの初期または後期プロモーター、および哺乳動物細胞の遺伝子の発現を制御することが知られている他の配列、およびそれらの様々な組み合わせが含まれる。
【０１８３】
一態様では、改善されたＬＡＭＰ構築物は、ベクターを複製するための複製起点を含む。好ましくは、起点は、標的細胞への送達に使用するのに十分な数の配列のコピーを生成するために使用できる少なくとも１種類の宿主細胞で機能する。したがって、適切な起点には、細菌細胞（例えば、エシェリヒア属、サルモネラ属、プロテウス属、クロストリジウム属、クレブシエラ属、バチルス属、ストレプトマイセス属、およびシュードモナス種）、酵母（例えば、サッカラマイセス種またはピキア種など）、昆虫細胞、および哺乳動物細胞で機能するものが含まれるが、これらに限定されない。好ましい一態様では、核酸送達媒体が導入される標的細胞（例えば、ヒト細胞などの哺乳動物細胞）で機能する複製起点が提供される。別の態様では、少なくとも２つの複製起点が提供され、１つは宿主細胞で機能し、もう１つは標的細胞で機能する。
【０１８４】
改善されたＬＡＭＰ構築物は、代替的または追加的に、核酸送達ベクターの少なくとも一部を標的細胞染色体に組み込みしやすくする配列を含み得る。例えば、改善されたＬＡＭＰ構築物は、標的細胞染色体ＤＮＡと相同の領域を含み得る。一態様では、送達ベクターは、改善されたＬＡＭＰ構築物をコードする核酸配列に隣接する２つ以上の組換え部位を含む。
【０１８５】
ベクターが標的細胞にうまく導入される、および／または標的細胞によって発現され得ることを確認するために、ベクターは、検出可能および／または選択可能なマーカーをさらに含んでもよい。これらのマーカーは、ＲＮＡ、ペプチド、またはタンパク質の産生などの活性をコードすることができるか、またはＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、無機および有機化合物または組成物などの結合部位を提供することができる。
【０１８６】
検出可能／選択可能なマーカー遺伝子の例には、毒性化合物に対する耐性を提供する生成物（例えば抗生物質）をコードするＤＮＡセグメント；レシピエント細胞に欠けている生成物（例えば、ｔＲＮＡ遺伝子、栄養要求性マーカー）をコードするＤＮＡセグメント；遺伝子産物の活性を抑制する生成物をコードするＤＮＡセグメント；容易に識別できる生成物（例えば、β−ガラクトシダーゼなどの表現型マーカー、蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＧ、ＢＦＰ、ＲＦＰ、ＥＧＦＰ、ＥＹＦＰ、ＥＢＦＰ、ｄｓＲｅｄ、それらの変異型、修飾型、または強化型など）、および細胞表面タンパク質）をコードするＤＮＡセグメント；細胞の生存および／または機能に有害である生成物を結合するＤＮＡセグメント；他の核酸セグメントの活性を阻害するＤＮＡセグメント（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）；基質を修飾する生成物（例えば、制限エンドヌクレアーゼ）を結合するＤＮＡセグメント；所望の分子を単離または識別するために使用できるＤＮＡセグメント（例えば、特定のタンパク質結合部位をコードするセグメント）；プライマー配列；存在しない場合、特定の化合物に対する抵抗性または感受性を直接的または間接的に付与するＤＮＡセグメント；および／またはレシピエント細胞に毒性のある生成物をコードするＤＮＡセグメントが含まれるが、これらに限定されない。
【０１８７】
マーカー遺伝子は、成功した遺伝子移入の立体構造のマーカーとして、および／または移入された遺伝子を発現する細胞を単離するため、および／または移入された遺伝子を細胞から回収するために使用できる。例えば、一態様では、マーカー遺伝子を使用して、改善されたＬＡＭＰ構築物を発現する抗原提示細胞を単離および精製する。
【０１８８】
実質的に類似の遺伝子、例えば、既知の遺伝子と約５０％超、約７０％超、８０％超、約９０％超上、好ましくは約９５％超の同一性を有する遺伝子を提供することができる。実質的に類似のドメイン配列は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で目的のドメイン配列に特異的にハイブリダイズする配列を選択することにより最初に特定することができる。相同、変異、または修飾されたドメイン配列の適合性を決定するためのアッセイの実行は、適切な活性を発現する配列のスクリーニングの問題に過ぎない。そのようなスクリーニングは、当技術分野では日常的である。
【０１８９】
改善されたＬＡＭＰ構築物は、裸の核酸として、または細胞への核酸の進入を促進するための１つ以上の分子に関連する送達媒体で提供され得る。適切な送達媒体には、リポソーム製剤、ポリペプチド、多糖、リポ多糖、ウイルス製剤（例えば、ウイルス、ウイルス粒子、人工ウイルスエンベロープなどを含む）、細胞送達媒体などが含まれるが、これらに限定されない。
【０１９０】
脂質ベースの製剤
改善されたＬＡＭＰ構築物の細胞内送達を促進するように設計された送達媒体は、（例えば、原形質膜、組織液、細胞内の区画など）非極性環境と極性環境の両方と相互作用する必要がある。したがって、好ましくは、送達媒体は、極性および非極性ドメインの両方、または改善されたＬＡＭＰ構築物を細胞に移行させるための移行配列を含むように設計されている。
【０１９１】
極性ドメインと非極性ドメインを有する化合物は両親媒性物質と呼ばれる。カチオン性両親媒性物質は、ＤＮＡなどの負に帯電したポリヌクレオチドと相互作用するために、生理学的ｐＨまたはその付近で正に帯電できる極性基を有する。
【０１９２】
本明細書に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物は、細胞膜を横切るベクターの移動を促進するために脂質単層または二重層を含む製剤で提供することができる。リポソームまたは任意の形態の脂質膜、例えば平面脂質膜または無傷の細胞、例えば赤血球の細胞膜を使用することができる。リポソーム製剤は、静脈内または経口投与を含む任意の手段によって投与することができる。
【０１９３】
リポソームおよびリポソーム製剤は、標準的な方法に従って調製することができ、当技術分野で周知である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ；Ａｋｉｍａｒｕ、１９９５、Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１：１９７−２１０；Ａｌｖｉｎｇ、１９９５、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１４５：５−３１；Ｓｚｏｋａ、１９８０、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７；米国特許第４，２３５，８７１号；第４，５０１，７２８号；および第４，８３７，０２８号を参照。一態様では、リポソームは、リポソーム、すなわち改善されたＬＡＭＰ構築物複合体を特定の細胞型に標的化するための標的分子を含む。特に好ましい態様において、標的分子は、血管または標的組織に見られる細胞の表面上の生体分子（例えば、受容体またはリガンド）に対する結合パートナー（例えば、リガンドまたは受容体）を含む。
【０１９４】
リポソームの電荷は血液からのリポソームのクリアランスにおける重要な決定因子であり、負に帯電したリポソームは細網内皮系によってより迅速に取り込まれ（Ｊｕｌｉａｎｏ、１９７５、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．６３：６５１）、したがって血流の半減期が短くなる。ホスファチジルエタノールアミン誘導体を組み込むと、リポソームの凝集が防止され、循環時間が延長される。例えば、Ｎ−（ω−カルボキシ）アシルアミドホスファチジルエタノールアミンをＬ−α−ジステアロイルホスファチジルコリンの大きな単ラメラ小胞に組み込むと、インビボのリポソーム循環寿命が劇的に増加する（例えば、Ａｈｌ、１９９７、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １３２９：３７０−３８２を参照）。循環半減期が長いリポソームは、通常、治療および診断用途に望ましい。薬物動態の一般的な議論については、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ、Ｃｈａｐｔｅｒｓ  ３７−３９、Ｌｅｅら、Ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ＡＧ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ  １９９６）を参照。
【０１９５】
典型的には、リポソームは、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリンまたはホスファチジルイノシトールなど、約５〜１５モル％の負に帯電したリン脂質で調製される。また、ホスファチジルグリセロールなどの負に帯電したリン脂質を追加すると、自発的なリポソーム凝集を防ぐ働きをするため、リポソーム凝集体が過小形成されるリスクを最小限に抑える。膜剛性化剤、例えば、少なくとも約５０モル％の濃度のスフィンゴミエリンまたは飽和中性リン脂質、および５〜１５モル％のモノシアリルガングリオシドも、剛性などの望ましいリポソーム特性を付与することができる（例えば、米国特許第４，８３７，０２８号を参照）。
【０１９６】
さらに、リポソーム懸濁液は、保存時のフリーラジカルおよび脂質過酸化損傷から脂質を保護する脂質保護剤を含むことができる。α−トコフェロールなどの親油性フリーラジカルクエンチャー、およびフェリオキシアニンなどの水溶性鉄特異的キレート剤が好ましい。
【０１９７】
本発明の改善されたＬＡＭＰ構築物は、不均一なサイズの多重ラメラ小胞を含むことができる。例えば、小胞形成脂質を適切な有機溶媒または溶媒系に溶解し、真空または不活性ガス下で乾燥させて、薄い脂質膜を形成することができる。必要に応じて、膜を第三級ブタノールなどの適切な溶媒に再溶解し、次に凍結乾燥して、より容易に水和される粉末状のより均質な脂質混合物を形成することができる。この膜は、ペプチドまたはポリペプチド複合体の水溶液で覆われ、典型的には撹拌しながら１５〜６０分かけて水和することができる。結果として得られる多重ラメラ小胞のサイズ分布は、より激しい撹拌条件下で脂質を水和させるか、デオキシコール酸などの可溶化界面活性剤を加えることによって、より小さなサイズに変えることができる。水和媒体は、好ましくは、最終リポソーム懸濁液中のリポソームの内部容積で望ましい濃度の核酸を含む。
【０１９８】
リポソーム調製後、リポソームは、所望のサイズ範囲およびリポソームサイズの比較的狭い分布を達成するようにサイズ調整することができる。１つの好ましいサイズ範囲は約０．２〜０．４ミクロンであり、これにより、従来のフィルター、典型的には０．２２ミクロンフィルターを介した濾過によりリポソーム懸濁液を滅菌することができる。リポソームのサイズが約０．２〜０．４ミクロンまで小さくなっている場合、フィルター滅菌はハイスループットで実行できる。リポソームを所望のサイズにサイジングするためのいくつかの技術が利用可能である（例えば、米国特許第４，７３７，３２３号を参照）。
【０１９９】
適切な脂質は、限定されるものではないが、ＤＯＴＭＡ（Ｆｅｌｇｎｅｒら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７４１３−７４１７）、ＤＯＧＳまたはＴｒａｎｓｆｅｃｔａｉｎ（商標）（Ｂｅｈｒら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：６９８２−６９８６）、ＤＮＥＲＩＥまたはＤＯＲＩＥ（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５：６７−７５）、ＤＣ−ＣＨＯＬ（Ｇａｏ  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ、１９９１、ＢＢＲＣ  １７９：２８０−２８５）、ＤＯＴＡＰ（商標）（ＭｃＬａｃｈｌａｎら、１９９５、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２：６７４−６２２）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）およびグリセロ脂質化合物（例えば、ＥＰ９０１４６３およびＷＯ９８／３７９１６を参照）を含む。
【０２００】
改善されたＬＡＭＰ構築物との複合化に適した他の分子には、カチオン分子、例えば、ポリアミドアミン（Ｈａｅｎｓｌｅｒ  ａｎｄ  Ｓｚｏｋａ、１９９３、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．４：３７２−３７９）、樹枝状ポリシン（ＷＯ９５／２４２２１）、ポリエチレンイリニンまたはポリプロピレンｈ−ナイン（ＷＯ９６／０２６５５）、ポリリジン（米国特許第５，５９５，８９７号；フランス特許ＦＲ  ２  ７１９  ３１６）、キトサン（米国特許第５，７４４，１６６号）、ＤＮＡ−ゼラチンコアセルベート（例えば、米国特許第６，２０７，１９５号；第６，０２５，３３７号；第５，９７２，７０７号を参照）またはＤＥＡＥデキストラン（Ｌｏｐａｔａら、１９８４、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１２：５７０７−５７１７）が含まれる。
【０２０１】
ウイルスベースの遺伝子送達媒体
一態様では、改善されたＬＡＭＰ構築物送達媒体は、ウイルスまたはウイルス粒子を含む。この態様において、好ましくは、改善されたＬＡＭＰ構築物はウイルスベクターを含む。レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスなどのウイルスベクターは、多くの場合、２つの成分、すなわち修飾されたウイルスゲノムとそれを囲むコート構造で構成されているが（例えば、Ｓｍｉｔｈら、１９９５、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４９：８０７−８３８を参照）、ウイルスベクターは裸の形で導入されたり、ウイルスタンパク質以外のタンパク質でコーティングされたりすることがある。現在のほとんどのベクターは、野生型ウイルスに似たコート構造を有する。この構造は、ウイルス核酸をパッケージングして保護し、標的細胞に結合して侵入する手段を提供する。
【０２０２】
好ましくは、本明細書に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物を含むウイルスベクターは、野生型ウイルスゲノムから改変されて、標的細胞でのウイルスの増殖を無効し、感染性粒子の調製に使用される宿主細胞（例えば、パッケージング細胞またはヘルパー細胞など）でのウイルスの増殖を可能にする。ベクター核酸は一般に、ヘルパー株での複製およびパッケージングのためのシス作用性ウイルス配列、および標的細胞に送達されるポリヌクレオチドの発現を調節するための発現制御配列に不可欠である。他のウイルス機能は、当技術分野で知られているように、特定のパッケージングまたはヘルパー細胞株にトランスで発現される。
【０２０３】
好ましい改善されたＬＡＭＰ構築物は、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、泡沫状ウイルス、レンチウイルス、セムリキフォレストウイルス、ＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス）、ポックスウイルス、アデノウイルスおよびレトロウイルスからなる群から選択されるウイルスに由来するウイルスベクターである。そのようなウイルスベクターは当技術分野で周知である。
【０２０４】
好ましい一態様では、使用されるウイルスベクターはアデノウイルスベクターである。アデノウイルスゲノムは、ウイルス複製サイクルを完了するために必要な約３０を超える遺伝子を運ぶ約３６ｋｂの線形二本鎖ＤＮＡ分子で構成されている。初期の遺伝子は、抗ウイルス宿主免疫応答を調節すると考えられているＥ３領域を除いて、ウイルス複製に不可欠な４つの領域（Ｅ１〜Ｅ４）に分けられる。Ｅ１領域（ＥＩＡおよびＥＩＢ）は、ウイルスゲノムの転写調節に関与するタンパク質をコードする。Ｅ２領域遺伝子（Ｅ２ＡおよびＥ２Ｂ）の発現は、ウイルス複製に必要なポリペプチドの合成をもたらす。Ｅ３領域によってコードされるタンパク質は、細胞傷害性Ｔ細胞および腫瘍壊死因子による細胞溶解を防ぐ（Ｗｏｌｄ  ａｎｄ  Ｇｏｏｄｉｎｇ、１９９１、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８４：１−８）。Ｅ４領域によってコードされるタンパク質は、ＤＮＡ複製、後期遺伝子発現、スプライシング、および宿主細胞の遮断に関与している（Ｈａｌｂｅｒｔら、１９８５、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５６：２５０−２５７）。後期遺伝子は一般に、ウイルスキャプシドに寄与する構造タンパク質をコードする。さらに、アデノウイルスゲノムは、シス作用性５’および３’ＩＴＲ（逆方向末端反復）およびＤＮＡ複製に不可欠なパッケージング配列を運ぶ。ＩＴＲにはＤＮＡ複製の起点があるが、感染粒子へのアデノウイルスＤＮＡのパッケージングにはキャプシド形成領域が必要である。
【０２０５】
Ｈｅｉｓｅ  ａｎｄ  Ｋｉｍ（２０００、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０５：８４７−８５  １）に記載されているように、特定の細胞（例えば増殖細胞など）で選択的に複製するために、アデノウイルスベクターを条件付きで複製するように操作できる（ＣＲＡｄベクター）。別の態様において、アデノウイルスベクターは、Ｅ１機能の複製欠損である（例えば、Ｅ１の全体的または部分的な欠失または突然変異誘発による）。ベクターのアデノウイルス骨格は、追加の修飾（１または複数のウイルス遺伝子の削除、挿入または突然変異）を含み得る。Ｅ２修飾の例は、ＤＢＰ（ＤＮＡ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）コード遺伝子に局在する温度感受性突然変異によって示されている（Ｅｎｓｉｎｇｅｒら、１９７２、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１０：３２８−３３９）。アデノウイルス配列は、Ｅ４領域の全部または一部を削除することもできる（例えば、欧州特許第９７４  ６６８号；Ｃｈｒｉｓｔら、２０００、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１１：４１５−４２７；Ｌｕｓｋｙら、１９９９、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：８３０８−８３１９）。非必須Ｅ３領域内の追加の欠失により、送達されるポリヌクレオチドのサイズを増加させることができる場合がある（Ｙｅｈら、１９９７、ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １１：６１５  ６２３）。しかし、ウイルスが免疫系（Ｇｏｏｄｉｎｇら、１９９０、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １０：５３−７１）または炎症反応（欧州特許第００４４０２６７．３号）から逃れることを可能にするポリペプチド（例えば、ｇｐ１９ｋなど）をコードするＥ３配列の全部または一部を保持することは有利かもしれない。
【０２０６】
ＩＴＲおよびパッケージング配列を保持し、ウイルス抗原の残留合成を無効にする実質的な遺伝子修飾を含む第２世代のベクターも、形質導入細胞における発現遺伝子の長期発現を改善するために使用できる（例えば、ＷＯ９４／２８１５２；Ｌｕｓｋｙら、１９９８、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ７２：２０２２−２０３２を参照）。
【０２０７】
細胞に導入される改善されたＬＡＭＰ構築物は、シス作用性配列を除いて、ウイルスゲノムの任意の場所に挿入され得る。好ましくは、改善されたＬＡＭＰ構築物は、削除された領域（Ｅ１、Ｅ３および／またはＥ４）の置換、好ましくは削除されたＥ１領域内に挿入される。
【０２０８】
アデノウイルスは、任意のヒトまたは動物源、特にイヌ科動物（例えばＣＡＶ−１またはＣＡＶ−２、それぞれＧｅｎｂａｎｋ  ｒｅｆ．ＣＡＶＩＧＥＮＯＭおよびＣＡＶ７７０８２）、鳥類（Ｇｅｎｂａｎｋ  ｒｅｆ．ＡＡＶＥＤＳＤＮＡ）、ウシ科動物（例えばＢＡＶ３；Ｒｅｄｄｙら、１９９８、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：１３９４  １４０２）、ネズミ科動物（Ｇｅｎｂａｎｋ  ｒｅｆ．ＡＤＲＭＵＳＭＡＶＩ）、ヒツジ、ネコ科動物、ブタまたは類人猿の供給源、あるいはハイブリッドウイルスの可能性がある。任意の血清型を使用できる。しかし、Ｃサブグループのヒトアデノウイルス、特にアデノウイルス２（Ａｄ２）および５（Ａｄ５）が好ましい。このようなウイルスは、例えばＡＴＣＣから入手できる。
【０２０９】
アデノウイルス粒子または空のアデノウイルスキャプシドもまた、米国特許第５，９２８，９４４号に記載されているように、ウイルス媒介共内在化プロセスによって改善されたＬＡＭＰ構築物を移入するために使用できる。このプロセスは、１または複数の脂質層を含むポリカルベンまたは脂質小胞などのカチオン剤の存在下で達成することができる。
【０２１０】
アデノウイルス粒子は、ウイルス複製に必要な欠損ウイルス遺伝子をトランスで供給する相補細胞株またはヘルパーウイルスを使用して、当技術分野の任意の従来技術（例えば、ＷＯ９６／１７０７０）に従って調製および増殖させることができる。細胞株２９３（Ｇｒａｈａｍら、１９７７、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９−７２）およびＰＥＲＣ６（Ｆａｌｌａｕｘら、１９９８、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ９：１９０９−１９１７）はＥ１欠失を補完するために一般的に使用されている。他の細胞株は欠陥ベクターを補完するように操作されている（Ｙｅｈら、１９９６、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：５５９−５６５；Ｋｒｏｕｇｈａｋ  ａｎｄ  Ｇｒａｈａｍ、１９９５、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．６：１５７５−１５８６；Ｗａｎｇら、１９９５、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：７７５−７８３；Ｌｕｓｋｙら、１９９８、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：２０２２−２０３；欧州特許第９１９６２７号およびＷＯ９７／０４１１９）。アデノウイルス粒子は、培養上清からも溶解後の細胞からも回収することができ、場合により標準的な技術（例えば、ＷＯ９６／２７６７７、ＷＯ９８／００５２４、ＷＯ９８／２６０４８およびＷＯ００／５０５７３に記載されているようなクロマトグラフィー、超遠心分離）に従ってさらに精製することができる。
【０２１１】
細胞型特異的標的化は、ウイルス表面タンパク質の修飾により、広範な宿主範囲を有するアデノウイルスに由来するベクターで達成され得る。例えば、アデノウイルスの感染の特異性は、許容細胞の表面に存在する細胞受容体への付着によって決定される。これに関して、アデノウイルスキャプシドの表面に存在する繊維およびペントンは、細胞付着において重要な役割を果たす（Ｄｅｆｅｒら、１９９０、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：３６６１−３６７３）。したがって、アデノウイルスの細胞標的化は、繊維および／またはペントンをコードするウイルス遺伝子の遺伝的修飾によって実行され、独自の細胞表面受容体との特異的相互作用が可能な修飾繊維および／またはペントンを生成できる。そのような修飾の例は、Ｗｉｃｋａｒｎら、１９９７、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：８２２１−８２２９；Ａｒｒｉｂｅｒｇら、１９９７、Ｖｉｒｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２６８：６８６６−６８６９；Ｒｏｕｘら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：９０７９−９０８３；Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｖｉｌｅ、１９９５、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．９：１９０−１９９；ＷＯ９３／０９２２１、ＷＯ９５／２８４９４に記載されている。
【０２１２】
特に好ましい態様では、アデノ随伴ウイルス配列がベクターとして使用される。ヒトパルボウイルスＡＡＶ−２（アデノ随伴ウイルス２型）に由来するベクターは、現在開発されている最も有望な遺伝子送達媒体の１つである。一本鎖ＤＮＡをパッケージングするためのこのシステムのいくつかの特徴は、送達用の裸のＤＮＡの可能な代替物としてそれを示唆している。主要な魅力的な特徴は、ワクシニアまたはアデノウイルスなどの他のウイルスベクターとは対照的に、ＡＡＶベクターがウイルス遺伝子をまったく発現しないことである。ワクチン構築物に含まれる唯一のウイルスＤＮＡ配列は、１４５  ｂｐ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）である。したがって、裸のＤＮＡによる免疫化の場合と同様に、発現される遺伝子は抗原または抗原キメラの遺伝子のみである。さらに、ＡＡＶベクターは、ヒト末梢血単球由来樹状細胞などの分裂細胞と非分裂細胞の両方に、導入遺伝子の持続的な発現を導入し、また粘膜免疫の生成のための経口および鼻腔内送達の可能性を導入することが知られている。さらに、必要なＤＮＡの量は数桁分も少ないように見え、裸のＤＮＡ用量５０ｕｇまたは約１０１５コピーとは対照的に、ＤＮＡ用量１０１０〜１０１１粒子またはコピーで最大の応答が得られる。
【０２１３】
一態様において、ＡＡＶベクターは、適切な細胞株（例えば、ヒト２９３細胞）を、構築物をコードするＡＡＶ  ＩＴＲキメラタンパク質に含まれるＤＮＡ、
およびＩＴＲのないＡＡＶコード領域（ＡＡＶ  ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子）を含むＡＡＶヘルパープラスミドＡＣＧ２と同時にトランスフェクトすることによってパッケージングされる。その後、細胞をアデノウイルスＡｄ５に感染させる。ベクターは、当技術分野で知られている方法（例えば、塩化セシウム密度勾配超遠心分離など）を使用して細胞ライセートから精製し、検出可能な複製競合ＡＡＶまたはアデノウイルスがないことを確認するために検証することができる（例えば、細胞変性効果バイオアッセイによる）。ＡＡＶ力価は、プロテイナーゼＫによる消化後に調製されたウイルスＤＮＡ試料を用いた定量的ＰＣＲによって決定され得る。好ましくは、そのような方法によって生成されるベクター力価は、ｍｌあたり約５ｘ１０１２〜１ｘ１０１３ＤＮａｓｅ耐性粒子である。
【０２１４】
他の態様では、レトロウイルスベクターが使用される。レトロウイルスは統合型ウイルスの一種であり、ウイルスにコードされた逆転写酵素を使用して複製し、ウイルスＲＮＡゲノムを感染細胞（例えば、標的細胞）の染色体ＤＮＡに組み込まれる二本鎖ＤＮＡに複製する。そのようなベクターには、マウス白血病ウイルス、特にモロニー（Ｇｉｌｂｏａら、１９８８、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２４１：２９）またはフレンドのＦＢ２９株（ＷＯ９５／０１４４７）に由来するものが含まれる。一般に、レトロウイルスベクターは、ウイルス遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖのすべてまたは一部が削除され、５’および３’  ＬＴＲおよびキャプシド形成配列を保持する。これらの要素を改変して、レトロウイルスベクターの発現レベルまたは安定性を高めることができる。そのような改変には、ＶＬ３０などのレトロトランスポゾンの１つによるレトロウイルスキャプシド形成配列の置換が含まれる（例えば、米国特許第５，７４７，３２３号を参照）。好ましくは、改善されたＬＡＭＰ構築物は、キャプシド形成配列の下流に、好ましくはレトロウイルスゲノムに対して反対方向に挿入される。細胞特異的標的化は、当技術分野で知られているように、レトロウイルスエンベロープタンパク質への抗体または抗体断片のコンジュゲーションによって達成され得る。
【０２１５】
レトロウイルス粒子は、ヘルパーウイルスの存在下、またはレトロウイルスベクターが欠損しているレトロウイルス遺伝子（例：ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ）をゲノムに組み込んだ適切な相補性（パッケージング）細胞株で調製される。そのような細胞株は、先行技術に記載されている（Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｓｍａｎ、１９８９、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ７：９８０；Ｄａｎｏｓ  ａｎｄ  Ｍｕｌｌｉｇａｎ、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：６４６０；Ｍａｒｋｏｗｉｔｚら、１９８８、Ｖｉｒｏｌ．１６７：４００）。ｅｎｖ遺伝子の産物は、標的細胞の表面に存在するウイルス受容体へのウイルス粒子の結合を担い、したがってレトロウイルス粒子の宿主範囲を決定する。本発明の文脈において、ヒトおよび他の種の標的細胞の感染を可能にするために、両指向性エンベロープタンパク質を含むＰＡ３１７細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  ９０７８）または２９３ＥＩ６（ＷＯ９７／３５９９６）などのパッケージング細胞株を使用することが有利である。レトロウイルス粒子は、培養上清から回収されることが好ましく、標準的な技術（例えば、クロマトグラフィー、超遠心分離）に従ってさらに精製されてもよい。
【０２１６】
他の適切なウイルスには、ポックスウイルスが含まれる。ポックスウイルス科のいくつかのメンバーのゲノムがマッピングされ、配列決定されている。ポックスウイルスベクターは、ポックスウイルス科の任意のメンバー、特にカナリア痘ウイルス、鶏痘ウイルスおよびワクシニアウイルスから得ることができる。適切なワクシニアウイルスには、コペンハーゲン株（Ｇｏｅｂｅｌら、１９９０、Ｖｉｒｏｌ．１７９：２４７−２６６；Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９３、Ｖｉｒｏｌ．１９６：３８１−４０１）、ワイエス株および改変アンカラ（ＭＶＡ）株（Ａｎｔｏｉｎｅら、１９９８、Ｖｉｒｏｌ．２４４：３６５−３９６）が含まれるが、これらに限定されない。ワクシニアウイルスベクターを構築するための一般的な条件は、当技術分野で知られている（例えば、欧州特許第８３  ２８６号および第２０６  ９２０号；Ｍａｙｒら、１９７５、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ３：６−１４；Ｓｕｔｔｅｒ  ａｎｄ  Ｍｏｓｓ、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０８４７−１０８５１を参照）。好ましくは、目的のポリヌクレオチドは、非コード遺伝子間領域または不活化または欠失がウイルスの成長および複製を著しく損なわない任意の遺伝子など、非必須遺伝子座内に挿入される。
【０２１７】
ポックスウイルス粒子は、当技術分野で記載されているように調製される（Ｐｉｃｃｉｎｉ他、１９８７、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５３：５４５−５６３；米国特許第４，７６９，３３０号；第４，７７２，８４８号；第４，６０３，１１２号；第５，１００，５８７号および第５，１７９，９９３号）。一般に、ドナープラスミドを構築し、大腸菌での増殖により増幅し、従来の手順により単離する。次に、それをポックスウイルスゲノムと共に適切な細胞培養物（例えば、ニワトリ胚線維芽細胞）に導入し、相同組換えによりポックスウイルス粒子を生成する。これらは、溶解ステップ（例えば、化学的溶解、凍結／解凍、浸透圧ショック、超音波処理など）の後に培養上清または培養細胞から回収できる。連続したプラーク精製を使用して、汚染している野生型ウイルスを除去できる。次に、当技術分野で知られている技術（例えば、クロマトグラフィー法または塩化セシウムまたはスクロース勾配での超遠心分離）を使用してウイルス粒子を精製することができる。
【０２１８】
天然痘を根絶するための世界的なキャンペーンで生ウイルスワクチンとしてワクシニアを使用したことにより、ワクシニアは、生組換えワクチンベクターとして開発用の明白な選択肢になった。１００種近くの異なる外来タンパク質を発現する生組換えワクシニアウイルスが報告されており、これらの多くは効果的な実験用ワクチンである（Ｍｏｓｓ  ａｎｄ  Ｆｌｅｘｎｅｒ、１９８７によるレビュー）。ワクシニアは、その大きなゲノムサイズ、少なくとも２５，０００塩基対の外来ＤＮＡを受け入れる能力、および昆虫細胞を含むほとんどの真核細胞タイプに感染する能力（同上）のため、発現ベクターとして特に用途が広い。他のＤＮＡウイルスとは異なり、ポックスウイルスは感染細胞の細胞質でのみ複製し、組換えウイルスＤＮＡと宿主染色体との遺伝的交換の可能性を減らす。組換えワクシニアベクターは、ヒト、他の哺乳動物、寄生虫、ＲＮＡおよびＤＮＡウイルス、バクテリアおよびバクテリオファージを含む様々な供給源からのタンパク質を適切に処理および発現することが示されている。
【０２１９】
外来タンパク質をコードするＤＮＡの発現は、上流のプロモーター配列や、必要に応じてＲＮＡプロセシングシグナルなど、宿主ウイルスの調節エレメントによって制御される。ワクシニアウイルスゲノムの非必須領域への外来ＤＮＡの挿入は、相同組換えによって行われている（Ｐａｎｉｃａｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７９：４９２７、１９８２；Ｍａｃｋｅｔｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７９：７４１５、１９８２）。
【０２２０】
改善されたＬＡＭＰ構築物による癌抗原の発現は、挿入部位またはその近くの転写調節エレメントによって、またはより正確な遺伝子工学によって発生する可能性がある。外来遺伝子の挿入および発現を大幅に促進するプラスミドベクターが構築されている（Ｍａｃｋｅｔｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、４９：８５７、１９８２）。これらのベクターは、ワクシニア転写プロモーターと、ワクシニアゲノムの非必須領域からＤＮＡが隣接する外来コード配列を挿入するための１つ以上の独自の制限エンドヌクレアーゼ部位とで構成される発現部位を含む。プロモーターの選択は発現の時間（例えば、早期または後期）と発現レベルの両方を決定し、フランキングＤＮＡ配列は相同組換えの部位を決定する。
【０２２１】
この手順で生成されたウイルス粒子のうち、組換え体であるのは約１０００分の１に過ぎない。組換えウイルスのプラークはＤＮＡハイブリダイゼーションによって特定できるが、効率的な選択手順が開発されている。非必須ワクシニアウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子のセグメントをフランキング配列として使用することにより、外来遺伝子はＴＫ遺伝子座に組み換えられ、挿入によりＴＫ遺伝子が不活性化される。ＴＫウイルスの選択は、５−ブロモデオキシウリジンの存在下でＴＫ細胞でウイルスプラークアッセイを実施することにより達成される。ヌクレオシド類似体のリン酸化とウイルスＤＮＡへの致命的な取り込みは、ＴＫ＋親ウイルスに感染した細胞でのみ起こる。トランスフェクションと組換えの効率に応じて、最大８０個のプラークが望ましい組換え体であり、残りは自発的なＴＫ変異体である。
【０２２２】
大腸菌のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子と２番目の遺伝子の発現部位とを含むプラスミドベクターは、親ウイルスと組換え体を区別する別の方法を可能にする（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ、５：３４０３、１９８５）。そのような組換え体によって形成されたプラークは、適切な指標を追加すると形成される青色によって明確に識別できる。ＴＫ選択とβ−ガラクトシダーゼ発現の両方を組み合わせることにより、組換えウイルスを容易かつ迅速に単離する。次に、組換え体を適切な細胞株での増殖によって増幅し、挿入された遺伝子の発現を適切な酵素学的、免疫学的または物理的手順によって確認する。
【０２２３】
ワクシニアウイルスゲノムに追加できる遺伝情報の量の上限はまだわかっていない。しかし、外来ＤＮＡのほぼ２５，０００塩基対を追加しても、ウイルス収量に明らかな悪影響はなかった（Ｓｍｉｔｈら、Ｇｅｎｅ、２５：２１、１９８３）。必要な場合、ワクシニアウイルスゲノムの大きなセグメントを削除して、追加の容量を提供できる（Ｍｏｓｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４０：３８７、１９８１）。
【０２２４】
ウイルスキャプシド分子は、細胞への標的化および／または進入を促進する標的化部分を含んでもよい。適切な標的分子には、化学的コンジュゲート、脂質、糖脂質、ホルモン、糖、ポリマー（例えば、ＰＥＧ、ポリリジン、ＰＥＩなど）、ペプチド、ポリペプチド（例えば、ＷＯ９４／４０９５８を参照）、ビタミン、抗原、レクチン、抗体およびその断片が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、そのような標的分子は、細胞特異的マーカー、組織特異的マーカー、細胞受容体、ウイルス抗原、抗原性エピトープまたは腫瘍関連マーカーを認識して結合する。
【０２２５】
ウイルス粒子に基づく改善されたＬＡＭＰ構築物を含む組成物は、１０〜１０１４ｉ．ｕ（感染単位）、好ましくは１０〜１０１１ｉ．ｕの用量の形態で製剤化され得る。力価は、従来の技術により決定され得る。ＬＡＭＰ構築物の用量は、好ましくは０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ、より具体的には０．１〜２ｍｇ／ｋｇで構成される。
【０２２６】
自己複製ＲＮＡ
本明細書に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物を使用して自己複製ＲＮＡウイルスベクター構築することもできる。例えば、アルファウイルス、フラビウイルス、麻疹ウイルスおよびラブドウイルスを使用して、自己複製ＲＮＡウイルスワクチンを生成することができる。自己複製ＲＮＡウイルスの好ましい株には、狂犬病ウイルス（ＲＡＢＶ）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、西ナイルウイルス、クンジンウイルス、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）および／またはベネズエラ馬脳炎ウイルス（ＶＥＥ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０２２７】
自己複製ＲＮＡウイルスは、組織への送達時にネイティブ抗原を発現するため、病原性への復帰のリスクを伴わずに弱毒生ワクチンを模倣する。また、自然免疫系を刺激し、反応を強化する。例えば、Ｌｊｕｎｇｂｅｒｇ、Ｋ．「自己複製アルファウイルスＲＮＡワクチン（Ｓｅｌｆ−ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ  ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ  ＲＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅｓ）」、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ（２）：１７７−９４（２０１５）；Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ、Ｋ、「癌免疫療法における腫瘍溶解性アルファウイルス（Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓｅｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）」、Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ５：９（２０１７）；Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ、Ｋ．「ワクチンとしてのレプリコンＲＮＡウイルスベクター（Ｒｅｐｌｉｃｏｎ  ＲＮＡ  Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｓ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ）」、Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ４：３９（２０１６）を参照（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。本明細書に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物を含む自己複製ワクチンの使用は、プライムブーストプロトコルでも使用することができる。
【０２２８】
さらに、本明細書に記載のように、リポソームよって自己複製ＲＮＡウイルスをカプセル化して、送達および標的化を改善することもできる。本明細書に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物を含む自己複製ＲＮＡウイルスによる免疫化は、抗原のより高い一時的発現レベルをもたらし、安全な条件下での中和抗体応答の生成と致死的チャレンジに対する保護をもたらす。
【０２２９】
細胞ベースの送達媒体
本発明による改善されたＬＡＭＰ構築物は、構築物を含む他の細胞（「送達細胞」）によって標的細胞に送達することができる。構築物を細胞に導入する方法は当技術分野で知られており、細胞の核へのＤＮＡのマイクロインジェクション（Ｃａｐｅｃｈｉら、１９８０、Ｃｅｌｌ  ２２：４７９−４８８）、ＣａＰ０４によるトランスフェクション（Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｏｋａｙａｍａ、１９８７、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７：２７４５  ２７５２）、エレクトロポレーション（Ｃｈｕら、１９８７、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１５：１３１１−１３２６）、リポフェクション／リポソーム融合（Ｆｅｉｇｎｅｒら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７４１３−７４１７）および粒子衝撃（Ｙａｎｇら、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：９５６８−９５７２）が含まれる。適切な細胞には、自己細胞および非自己細胞が含まれ、異種細胞が含まれてもよい。送達細胞は、細胞の死を誘導することにより（例えば、細胞に誘導性自殺遺伝子を提供することにより）、標的細胞にその内容物を送達するように誘導され得る。
【０２３０】
アクセサリー分子
本発明による改善されたＬＡＭＰ構築物を含む組成物は、細胞への改善されたＬＡＭＰ構築物の導入を促進し、および／または特定の治療効果を高め、および／または抗体産生を高めるための１つ以上のアクセサリー分子を含み得る。
【０２３１】
さらに、本発明による改善されたＬＡＭＰ構築物を含む組成物は、動物／人体内の分解を阻害するため、および／またはベクターの標的細胞へのトランスフェクション／感染を改善するために１つ以上の安定化物質、例えば脂質、ヌクレアーゼ阻害剤、ヒドロゲル、ヒアルロニダーゼ（ＷＯ９８／５３８５３）、コラゲナーゼ、ポリマー、キレート剤（欧州特許第８９０３６２号）を含んでもよい。そのような物質は、単独でまたは組み合わせて使用されてもよい（例えば、カチオン性脂質と中性脂質）。
【０２３２】
また、アデノウイルスタンパク質は、エンドソームを不安定化し、ＤＮＡの細胞への取り込みを促進できることが示されている。脂質複合体ＤＮＡベクターを含む溶液へのアデノウイルスの混合、またはタンパク質架橋剤を使用したアデノウイルスに共有結合したポリリジンへのＤＮＡの結合は、改善されたＬＡＭＰ構築物の取り込みと発現を大幅に改善する可能性がある（例えば、Ｃｕｒｉｅｌら、１９９２、Ａｍ．Ｉ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６：２４７−２５２を参照）。
【０２３３】
宿主細胞
本発明による改善されたＬＡＭＰ構築物は、限定ではないが原核細胞（例えば、大腸菌、ブドウ球菌種、バチルス種）、酵母細胞（例えば、サッカロマイセス属）、昆虫細胞、線虫細胞、植物細胞、両生類細胞（例えば、アフリカツメガエル）、鳥類細胞および哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞、マウス細胞、哺乳動物細胞株、解剖組織などからの初代培養哺乳動物細胞）を含む様々な宿主細胞で発現され得る。
【０２３４】
分子は、生物から単離された宿主細胞、生物の一部である宿主細胞、または生物に導入される宿主細胞で発現させることができる。一態様では、改善されたＬＡＭＰ構築物は、インビトロで、例えば培養中の宿主細胞で発現する。別の態様では、改善されたＬＡＭＰ構築物は、改善されたＬＡＭＰ構築物をコードする核酸を含む体細胞および／または生殖系列細胞を含むトランスジェニック生物（例えば、トランスジェニックマウス、ラット、ウサギ、ブタ、霊長類など）で発現する。トランスジェニック動物を構築する方法は当技術分野で周知であり、日常的である。
【０２３５】
改善されたＬＡＭＰ構築物は、インビトロで細胞に導入することもでき、その細胞（例えば、幹細胞、造血細胞、リンパ球など）を宿主生物に導入することができる。細胞は、宿主生物に関して異種または自己であってもよい。例えば、細胞は宿主生物から得られ、改善されたＬＡＭＰ構築物がインビトロで細胞に導入され、その後宿主生物に再導入される。
【０２３６】
抗原提示細胞
本発明の好ましい態様では、本明細書に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物は、天然または操作された抗原提示細胞に導入される。
【０２３７】
本明細書で使用する「抗原提示細胞」（ＡＰＣ）という用語は、主要組織適合遺伝子複合体分子、好ましくはクラスＩＩ分子、またはその一部に関連してその表面に抗原を提示する任意の細胞を意図する。適切なＡＰＣの例は以下で詳細に説明し、マクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞、ハイブリッドＡＰＣ、および仮親抗原提示細胞などの細胞全体を含むが、これらに限定されない。ハイブリッドＡＰＣを作製する方法は記述されており、当技術分野で知られている。
【０２３８】
樹状細胞（ＤＣ）は、強力な抗原提示細胞である。ＤＣはＴ細胞の活性化と増殖に必要なすべてのシグナルを提供することが示されている。これらのシグナルは２つのタイプに分類できる。第１のタイプは免疫応答に特異性を与え、Ｔ細胞受容体／ＣＤ３（「ＴＣＲ／ＣＤ３」）複合体とＡＰＣ表面の主要組織適合遺伝子複合体（前に定義した「ＭＨＣ」）クラスＩまたはＩＩタンパク質によって提示される抗原ペプチドとの相互作用によって媒介される。この相互作用は、Ｔ細胞の活性化が起こるために必要であるが、十分ではない。実際、第２のタイプのシグナルがなければ、第１のタイプのシグナルはＴ細胞アネルギーを引き起こす可能性がある。第２のタイプのシグナルは共刺激シグナルと呼ばれ、抗原特異的でもＭＨＣ拘束性でもないため、第１のタイプのシグナルの存在下でＴ細胞の全増殖反応とＴ細胞エフェクター機能の誘導をもたらすことができる。
【０２３９】
いくつかの分子が共刺激活性を高めることが示されている。これらの分子には、熱安定抗原（ＨＳＡ）、コンドロイチン硫酸修飾ＭＨＣ不変鎖（Ｉｉ−ＣＳ）、細胞内接着分子Ｉ（ＩＣＡＭ−１）、およびＡＰＣ表面のＢ７共刺激分子ならびにＴ細胞上のそのカウンター受容体ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４が含まれるが限定されない。
【０２４０】
他の重要な共刺激分子はＣＤ４０、ＣＤ５４、ＣＤ８０、ＣＤ８６である。本明細書で使用する「共刺激分子」という用語は、Ｔ細胞の表面上のＴＣＲにより結合されるペプチド／ＭＨＣ複合体と一緒に作用すると、ペプチドに結合するＴ細胞の活性化を達成する共刺激効果を提供する、任意の単一分子または分子の組み合わせを包含する。したがって、この用語は、Ｂ７、またはＡＰＣ上の他の共刺激分子、その断片（単独、別の分子と複合体化した、または融合タンパク質の一部）を包含し、これらは、ペプチド／ＭＨＣ複合体と共に認識リガンドに結合し、Ｔ細胞表面のＴＣＲがペプチドに特異的に結合するとＴ細胞の活性化をもたらす。共刺激分子は、例えばＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒを含む様々な供給元から市販されている。
【０２４１】
本発明の一態様では、Ｒｏｍａｎｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９６：１３５−１５１、１９９６、およびＢｅｎｄｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９６：１２１−１３５、１９９６に記載されている方法を使用して、ネズミ科動物、類人猿またはヒトなどの哺乳動物の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から未成熟および成熟樹状細胞を生成する。簡単に言えば、単離されたＰＢＭＣを前処理し、免疫磁気技術によってＴ細胞およびＢ細胞を枯渇させる。次に、リンパ球が枯渇したＰＢＭＣを、ヒト血漿（好ましくは自己血漿）およびＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４を補充したＲＰＭＩ培地９で培養して（例えば、約７日間）、樹状細胞を生成する。樹状細胞は、単球前駆細胞と比較すると非接着性である。したがって、およそ７日目に、非接着細胞をさらに処理するために収集する。
【０２４２】
ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の存在下でＰＢＭＣに由来する樹状細胞は未成熟であり、サイトカイン刺激が培養物から除去されると、非接着性を失い、マクロファージ細胞の運命に戻る可能性がある。未成熟状態の樹状細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ拘束性経路の天然タンパク質抗原のプロセシングに非常に効果的である（Ｒｏｍａｎｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９：１１６９、１９８９）。培養樹状細胞のさらなる成熟は、必要な成熟因子を含むマクロファージ馴化培地（ＣＭ）で３日間培養することにより達成される。成熟樹状細胞は、提示のために新しいタンパク質を捕捉する能力は低いが、休止Ｔ細胞（ＣＤ４とＣＤ８の両方）を刺激して成長および分化させることについてははるかに優れている。
【０２４３】
成熟樹状細胞は、形態の変化（より運動性の細胞質プロセスの形成など）によって、非接着性によって、ＣＤ８３、ＣＤ６８、ＨＬＡ−ＤＲまたはＣＤ８６のマーカーの少なくとも１つの存在によって、またはＣＤ  １１５などのＦｃ受容体の喪失によって特定できる（Ｓｔｅｉｎｍａｎ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：２７１、１９９１でレビュー）。成熟樹状細胞は、ＦＡＣＳｃａｎやＦＡＣＳｔａｒなどの典型的な細胞蛍光検査法および細胞選別技術およびデバイスを使用して収集および分析できる。フローサイトメトリーに使用される一次抗体は、成熟樹状細胞の細胞表面抗原に特異的なものであり、市販されている。二次抗体は、ビオチン化Ｉｇ、続いてＦＩＴＣまたはＰＥ結合ストレプトアビジンであり得る。
【０２４４】
あるいは、樹状細胞を上方制御（活性化）し、単球を活性化された樹状細胞表現型に変換する方法が報告されている。この方法では、培養培地にカルシウムイオノフォアを追加して、単球を活性化された樹状細胞に変換する。例えば、培養期間２４〜４８時間の開始時にカルシウム２１イオノフォアＡ２３１８７を追加すると、「単球＋ＤＣ」画分プールの均一な活性化と樹状細胞表現型変換が起こり、特徴的には、活性化された集団は均一にＣＤ  １４（Ｌｅｕ  Ｍ３）陰性になり、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＩＣＡＭ−１、１３７．１、および１３７．２が上方制御された。さらに、この活性化されたバルク集団は、さらに精製されると少数ベースでも機能する。サイトカインの特定の組み合わせは、カルシウムイオノフォアで達成される活性化／変換を増幅（または部分的に置換）するために成功裏に使用されており、これらのサイトカインはＧ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、およびＩＬ−４を含むが、これらに限定されない。単独で投与した場合、各サイトカインは最適な上方制御には不十分である。
【０２４５】
ＡＰＣを単離するための第２のアプローチは、血液中にすでに循環している比較的多数の事前にコミットしたＡＰＣを収集することである。コミットしたＡＰＣをヒト末梢血から単離するための以前の技術は、メトリザミド勾配と付着／非付着ステップ（Ｆｒｅｕｄｅｎｔｈａｌら、ＰＮＡＳ  ８７：７６９８−７７０２、１９９０）；パーコール勾配分離（Ｍｅｈｔａ−Ｄａｍａｎｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：９９６−１００３、１９９４）；および蛍光活性化細胞選別技術（Ｔｈｏｍａｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：６８４０−５２、１９９３）などの物理的手順の組み合わせを含んでいた。
【０２４６】
プロフェッショナル抗原提示細胞（またはその前駆体）を単離するための当技術分野で日常的な他の多くの方法があり、そのような方法および開発され得る他の方法は限定されず、本発明の範囲内に含まれる。
【０２４７】
一実施形態では、ＡＰＣ、したがって１または複数の抗原を提示する細胞は自己由来である。別の実施形態では、抗原を提示するＡＰＣは同種異系であり、すなわち異なる対象に由来する。
【０２４８】
本明細書で論じるように、改善されたＬＡＭＰ構築物は、上記の方法または当技術分野で知られている他の方法（限定ではないがトランスフェクション、エレクトロポレーション、融合、マイクロインジェクション、ウイルスベースの送達、または細胞ベースの送達を含む）を使用してＡＰＣに導入することができる。Ａｒｔｈｕｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４（ｌ）：１７−２５、１９９７には、ヒト樹状細胞における遺伝子導入法の比較が報告されている。
【０２４９】
コンセンサス配列を含むヒトＭＨＣ、アミノ酸およびヌクレオチド配列の遺伝子名称である既知の部分的および推定ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）は公開されており（例えば、Ｚｅｍｍｏｕｒ  ａｎｄ  Ｐａｒｈａｍ、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３３：３１０−３２０、１９９１を参照）、ＨＬＡ変異体を発現する細胞株は既知かつ一般に利用可能でもあり、多くはＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）から入手できる。したがって、ＭＨＣクラスＩＩをコードするヌクレオチド配列は、ＰＣＲを使用して本発明の発現ベクターに容易に作動可能に連結され、その後、発現のために適切な細胞を形質転換するために使用される。
【０２５０】
マクロファージ、Ｂ細胞、単球、樹状細胞およびランゲルハンス細胞などのプロフェッショナルＡＰＣを使用できる。これらは、標準的な手順を使用して１）自己ドナー、２）治療対象の宿主と異なるＨＬＡ特異性を有する異種ドナー、または３）異なる種の異種ドナーからの血液または組織から収集される（Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ｓｅｃｔｉｏｎ  ３  ａｎｄ  １４、１９９４）。細胞は、正常な宿主または感染症、癌、自己免疫疾患、またはアレルギーを有する患者から単離されてもよい。
【０２５１】
プロフェッショナルＡＰＣは、白血球除去および「ＦＩＣＯＬＬ／ＨＹＰＡＱＵＥ」密度勾配遠心分離（フィコールおよび不連続パーコール密度勾配による段階的遠心分離）を使用して、末梢血から取得できる。ＡＰＣによって内在化され得る抗原へのＡＰＣの曝露を回避する手順を利用して、目的の抗原に特異的ではないＴ細胞の活性化をもたらす。
【０２５２】
本来は抗原提示ではない細胞は、適切な分子をコードする配列を導入することにより、抗原提示になるように操作することができる。例えば、ＭＨＣクラスＩＩ分子、アクセサリー分子、共刺激分子および抗原プロセシング補助分子をコードする核酸配列は、そのような遺伝子を含む細胞からのＤＮＡの直接合成、クローニング、精製などの後に導入することができる。本明細書に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物および方法で使用される分子をコードする遺伝子を得るための１つの適切な手段は、選択されたオリゴヌクレオチドプライマー対を有する選択された核酸テンプレートのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅による。例えば、上皮細胞、内皮細胞、腫瘍細胞、線維芽細胞、活性化Ｔ細胞、好酸球、ケラチノサイト、アストロサイト、ミクログリア細胞、胸腺皮質上皮細胞、シュワン細胞、網膜色素上皮細胞、筋芽細胞、血管平滑筋細胞、軟骨細胞、腸細胞、甲状腺細胞および腎尿細管細胞を使用できる。これらは、宿主から最近外植された初代細胞で、確立された細胞株を形成するために細胞培養で広範囲に継代されていないか、確立された細胞株であるが比較的均質で何世代にもわたり無期限に増殖できる細胞株であり得る。
【０２５３】
プロフェッショナルＡＰＣではない細胞は、自己ドナー、異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）ドナーまたは異種（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ）ドナーの組織から単離され、単離は様々な既知の分離方法が使用して行われる（Ｄａｒｌｉｎｇ、Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉａ．Ｊ．Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９４；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ．Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８７）。非自己細胞、例えば異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）または異種（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ）細胞をエクスビボで操作して、既知のヒトＨＬＡ特異性に一致するＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩ分子を発現させることができる。次に、これらの細胞を、操作された細胞のＨＬＡ特異性に一致するヒト対象に導入することができる。細胞を、本発明による１または複数のＬＡＭＰ構築物を発現するようにエクスビボでさらに操作する。
【０２５４】
操作した細胞は、標準的な細胞培養法によって細胞培養内で維持する（Ｄａｒｌｉｎｇ，Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉａ”．Ｊ．Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ”．Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）。本発明で使用するための細胞株は、様々な供給源から得るか（例えば、ＡＴＣＣ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  ＆  Ｈｙｂｉｄｏｍａｓ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，第８版、１９９５）、または標準的な方法を用いて産生される（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９６）。非形質転換細胞株は、ヒト対象での使用に好ましい。
【０２５５】
一態様では、ＧＭ−ＣＳＦの影響下で樹状細胞に分化するＣＤ３４＋前駆体は、対象の身体から得られ、本発明によるＬＡＭＰ構築物をコードする核酸が細胞に導入され、その後、その細胞が対象に注入される。本明細書に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物を利用すると、特定の抗原に由来するペプチドと形質導入された抗原提示細胞上のＭＨＣクラスＩＩ分子との結合が強化され、結果として有意により強力な全身性Ｔ細胞依存性免疫応答および／または抗体産生がもたらされる。この戦略でトランスフェクトされた抗原提示細胞は好ましくは自己細胞であるが、宿主内で抗原を効果的に提示する任意のＭＨＣクラスＩＩ細胞を上記のように使用してもよい。
【０２５６】
ペプチドワクチン
改善されたＬＡＭＰ構築物によってコードされるペプチドワクチンも本発明の範囲内である。好ましくは、抗原は区画／オルガネラ（またはそれが送達される後続の区画／オルガネラ）内で処理され、免疫応答を調節することができるＭＨＣクラスＩＩ分子に結合したエピトープを生成する。
【０２５７】
改善されたＬＡＭＰ構築物によりコードされるペプチドワクチンはまた、膜構造に結合されて、生物の身体への投与を促進することができる。例えば、改善されたＬＡＭＰ構築物によりコードされたペプチドワクチンは、米国特許第４，４４８，７６５号に記載されているように、リポソームに組み込まれてもよい。
【０２５８】
タンパク質またはポリペプチドを免疫原として使用する場合、本明細書に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物のいずれか１つまたは複数を組換え細胞で発現させることにより生成するか、化学合成により調製することができる。例えば、メリフィールド法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、ｖｏｌ．８５、ｐｐ．２１４９−２１５４、１９６８）を使用できる。
【０２５９】
ＬＡＭＰ構築物を使用して抗体を産生する方法
ポリヌクレオチドとしての改善されたＬＡＭＰ構築物、改善されたＬＡＭＰ構築物のコード化タンパク質、および／または細胞（本明細書に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物を発現する抗原提示細胞など）は、例えば当技術分野で説明されている方法など、当業者に周知の方法により抗体を生成するために使用できる。例えば、前出のＳｕｔｃｌｉｆｆｅら；前出のＷｉｌｓｏｎら；Ｃｈｏｗら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：９１０−９１４（１９８５）；およびＢｉｔｔｌｅら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３４７−２３５４（１９８５）を参照。インビボ免疫化を使用する場合、改善されたＬＡＭＰ構築物によってコードされたタンパク質および／または本明細書に記載したような抗原を含む改善されたＬＡＭＰ構築物を含むポリヌクレオチドで動物を免疫化してもよい。本発明の好ましい一実施形態は、ポリヌクレオチドとしての改善されたＬＡＭＰ構築物でのプライミング、改善されたＬＡＭＰ構築物のコード化タンパク質、および／または細胞（本明細書に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物を発現する抗原提示細胞など）に続く抗原でのブースティングである。さらなる好ましい実施形態では、特に抗体レパートリーの多様性および力価を考慮すると、本明細書に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物でのプライミングとそれに続く抗原でのブースティングが特に考えられ、さらに強い免疫応答を生み出すために使用できる。
【０２６０】
抗原を含む改善されたＬＡＭＰ構築物は、抗体を産生するために非ヒト脊椎動物に注入してもよい。非ヒト脊椎動物へのＬＡＭＰ構築物の調製および注入は、当業者に周知の動物の免疫化の原理に従って達成され得る。
【０２６１】
改善されたＬＡＭＰ構築物を使用して抗原を効果的に提示することは、一態様では、エンドサイトーシス、およびエンドソームとリソソームとの融合後に抗原提示細胞でＬＡＭＰによって抗原を処理することを含む。次に、エンドソームは、クラスＩＩ  ＭＨＣ分子を含むゴルジ体からのエキソサイトーシス小胞と結合し、結果として生じるペプチドがそれに結合する。次に、ＭＨＣ−ペプチド複合体は原形質膜に輸送され、ここで抗原をＣＤ４＋Ｔ細胞への表示に利用できる。
【０２６２】
ウサギ、ラット、マウス、ラマ、ラクダ、および／またはウシなどの動物は、抗原および／または抗原を含む改善されたＬＡＭＰ構築物をコードするポリヌクレオチドを含む改善されたＬＡＭＰ構築物で免疫化することができる。免疫化に適した追加の動物には、非ヒト哺乳動物、例えばげっ歯類（例えばモルモット、ハムスター、ラット、マウス）、ネズミ科動物（例えばマウス）、イヌ科動物（例えばイヌ）、ネコ科動物（例えばネコ）、ウマ科動物（例えばウマ）、霊長類、類人猿（例えばサルまたはエイプ）、サル（例えばマーモセット、ヒヒ、アカゲザル）、エイプ（例えばゴリラ、チンパンジー、オランウータン、テナガザル）が含まれる。
【０２６３】
例えば、抗原または担体タンパク質およびフロイントアジュバントまたは免疫応答を刺激することが知られている任意の他のアジュバントを含む約１００マイクログラムの改善されたＬＡＭＰ構築物を含む乳濁液の腹腔内および／または皮内注射を使用してもよい。例えばＥＬＩＳＡアッセイで、直接または間接的に（例えば、ビオチン化ＡｖｉＴａｇを介して）固体表面に吸着した遊離抗原を使用して検出することができる抗抗原抗体の有用な力価を得るために、例えば約２週間の間隔で、何度かのブースター注射（組換え抗原タンパク質など）が必要になる場合がある。免疫動物の血清中の抗抗原抗体の力価は、抗抗体の選択によって、例えば、固体支持体上の抗原への吸着および当技術分野で周知の方法による選択された抗体の溶出によって増加し得る。
【０２６４】
あるいは、抗原を含む改善されたＬＡＭＰ構築物をコードするポリヌクレオチドを動物に直接導入することもできる。例えば、米国特許第５，６７６，９５４号；第６，８７５，７４８号；第５，６６１，１３３号；Ｓａｈｉｎら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ、２０１４  Ｏｃｔ；１３（１０）：７５９−８０；Ｋａｒｉｋｏら、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ、２００８  Ｎｏｖ；１６（１１）：１８３３−４０；Ｋａｒｉｋｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ、２０１１、Ｎｏｖ；３９（２１）：ｅ１４２；米国特許第６，５１１，８３２号を参照。一例では、抗原を含む改善されたＬＡＭＰ構築物は、非ヒト脊椎動物に直接注射される。動物への注射は、筋肉内、皮内、鼻腔内、皮下、静脈内、気管内、およびくも膜下腔内の送達を介して行うことができる。組換え抗原による後続のブースティングも、抗体の生成に含めることができる。
【０２６５】
さらに、開示の方法によって生成された抗体は、例えばファージディスプレイ、酵母ディスプレイまたはリボソームディスプレイなどのディスプレイ技術を使用して親和性成熟させることができる。一例では、ファージ粒子の表面に表示される単鎖抗体分子（「ｓｃＦｖ」）をスクリーニングして、抗原および／または出発タンパク質に免疫特異的に結合するｓｃＦｖを特定する。本発明は、抗原および／または出発タンパク質に免疫特異的に結合することが特定されたｓｃＦｖおよびその部分の両方を包含する。そのようなｓｃＦｖは、例えば、ｓｃＦｖのＶＨおよび／またはＶＬドメインをコードするヌクレオチド配列を、定常ドメイン配列を含む発現ベクターに挿入し、免疫グロブリン分子の発現を指示するように操作することにより、免疫グロブリン分子に日常的に「変換」することができる。
【０２６６】
抗原を含む改善されたＬＡＭＰ構築物および／または本発明の抗原を含む改善されたＬＡＭＰ構築物をコードするポリヌクレオチドを使用する、産生された抗体（ｓｃＦｖ、および抗体断片またはその変異体を含むかそれらからなる他の分子を含む（例えば、本発明の抗体の重鎖または軽鎖、またはその一部、または本発明の単鎖抗体））の組換え発現には、抗体またはその断片または変異体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの構築が必要である。本発明の抗体分子（例えば、抗体全体、抗体の重鎖または軽鎖、またはその変異体または部分（重鎖または軽鎖可変ドメインを含むことが好ましいが必ずしもそうではない））をコードするポリヌクレオチドが得られた後、抗体分子を産生するためのベクターは、当技術分野で周知の技術を使用する組換えＤＮＡ技術により生成され得る。このように、ヌクレオチド配列をコードする抗体を含むポリヌクレオチドを発現させることにより抗体を調製する方法が本明細書に記載されている。当業者に周知の方法を使用して、抗体コード配列と適切な転写および翻訳制御シグナルとを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、例えば、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組換えが含まれ、本明細書に記載されている。したがって、本発明は、プロモーターに作動可能に連結されている本明細書に記載されるように得られ単離された抗抗原抗体（例えば、抗体全体、抗体の重鎖または軽鎖、抗体の重鎖または軽鎖可変ドメイン、またはその一部、または重鎖もしくは軽鎖のＣＤＲ、単鎖Ｆｖ、またはその断片もしくは変異体）をコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。そのようなベクターは、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含み（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ８６／０５８０７；ＰＣＴ公開ＷＯ８９／０１０３６；および米国特許第５，１２２，４６４号を参照）、抗体の可変ドメインは、重鎖全体、軽鎖全体、または重鎖および軽鎖両方の全体の発現のためにそのようなベクターにクローニングされる。
【０２６７】
発現ベクターは従来の技術によって宿主細胞に移入することができ、その後、トランスフェクトされた細胞は従来の技術によって培養されていずれかの抗抗原抗体を産生する。したがって、本発明は、異種プロモーターに機能的に連結された抗抗原抗体（例えば、抗体全体、その重鎖または軽鎖、またはその一部、または本発明の一本鎖抗体、またはその断片もしくは変異体）をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を含む。好ましい実施形態では、抗体分子全体の発現のために、以下に詳述するように、免疫グロブリン分子全体の発現のために、重鎖と軽鎖の両方をコードするベクターを宿主細胞で共発現させることができる。
【０２６８】
様々な宿主発現ベクター系を利用して、抗抗原抗体を発現させることができる。そのような宿主発現系には、目的のコード配列を産生することができ、かつその後精製することができる媒体が挙げられるが、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェクトすると抗抗原抗体を発現する細胞も挙げられる。これらには、限定ではないが、組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、または配列を含むコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、大腸菌、枯草菌）などの微生物；コード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、サッカロミセス、ピキア属）；コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染しているか、またはコード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；または哺乳動物細胞のゲノム（例えば、メタロチオネインプロモーター）もしくは哺乳動物ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）に由来するプロモーターを含む組換え発現構築物を有する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３細胞）が含まれる。好ましくは大腸菌などの細菌細胞、より好ましくは真核細胞が、抗抗原抗体の発現に使用される。例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）などの哺乳動物細胞は、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要な中間初期遺伝子プロモーター要素などのベクターと組み合わせると有効な発現システムである（Ｆｏｅｃｋｉｎｇら、Ｇｅｎｅ  ４５：１０１（１９８６）；Ｃｏｃｋｅｔｔら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：２（１９９０））。
【０２６９】
細菌系では、意図する用途に応じて多くの発現ベクターを有利に選択することができる。例えば、（抗体産生または改善されたＬＡＭＰ構築物のコード化ポリペプチドのいずれかで）大量のタンパク質を生成する場合、容易に精製される高レベルの融合タンパク質生成物の発現を指示するベクターが望ましい場合がある。そのようなベクターには、限定ではないが、大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら、ＥＭＢＯ  １．２：１７９１（１９８３））、コード配列は、融合タンパク質が生成されるようにｌａｃ  Ｚコード領域を含むフレーム内のベクターに個別に連結される；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ＆Ｉｎｏｕｙｅ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９（１９８５）；Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ＆Ｓｃｈｕｓｔｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３−５５０９（１９８９））などが含まれる。ｐＧＥＸベクターは、外来ポリペプチドをグルタチオン５−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現させるためにも使用できる。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、マトリックスグルタチオンアガロースビーズへの吸着および結合とそれに続く遊離グルタチオンの存在下での溶出により、溶解細胞から容易に精製することができる。ｐＧＥＸベクターは、クローニングされた標的遺伝子産物がＧＳＴ部分から放出されるように、トロンビンまたはＸａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計されている。
【０２７０】
昆虫系では、オウトグラファカリフォルニア（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多汗症ウイルス（ＡｃＮＰＶ）をベクターとして使用して、抗抗原抗体または改善されたＬＡＭＰ構築物のコード化ポリペプチドを発現させることができる。ウイルスはスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞で増殖する。コード配列は、ウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）に個別にクローニングし、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に置く。
【０２７１】
哺乳動物宿主細胞では、多くのウイルスベースの発現系を利用して、抗抗原抗体または改善されたＬＡＭＰ構築物のコード化ポリペプチドを発現させることができる。発現ベクターとしてアデノウイルスを使用する場合、目的のコード配列は、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーターおよび三者間リーダー配列に連結することができる。次に、このキメラ遺伝子を、インビトロまたはインビボ組換えによりアデノウイルスゲノムに挿入してもよい。
【０２７２】
ウイルスゲノムの非必須領域（例えば領域Ｅ１またはＥ３）に挿入すると、感染宿主で抗抗原抗体または改善されたＬＡＭＰ構築物のコード化ポリペプチドを発現できる、生存能力のある組換えウイルスが得られる（例えば、Ｌｏｇａｎ＆Ｓｈｅｎｋ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８  １：３５５−３５９（１９８４）を参照）。
【０２７３】
挿入されたコード配列の効率的な翻訳には、特定の開始シグナルも必要になる場合がある。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドンと隣接配列が含まれる。さらに、開始コドンは、インサート全体の翻訳を確実にするために、所望のコード配列のリーディングフレームと同相でなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成の両方の様々な起源のものであり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサー要素、転写ターミネーターなどを含めることにより高めることができる（例えばＢｉｔｔｎｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１−５４４（１９８７）を参照）。
【０２７４】
加えて、挿入された配列の発現を調節するか、または遺伝子産物を所望の特定の様式で修飾および処理する宿主細胞株を選択することができる。タンパク質産物のそのような修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、切断）は、タンパク質の機能にとって重要であり得る。様々な宿主細胞には、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび修飾のための特徴的かつ特定のメカニズムがある。発現した外来タンパク質の正しい修飾とプロセシングを確実に行うために適切な細胞株または宿主系を選択することができ、このために、一次転写産物、グリコシル化、遺伝子産物のリン酸化の適切なプロセシングのための細胞機構を有する真核宿主細胞を使用してもよい。そのような哺乳動物宿主細胞には、限定ではないがＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＣＯＳ、ＮＳＯ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、Ｗ１３８、および特に乳癌細胞株、例えばＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２ＯおよびＴ４７Ｄ、ならびに通常の乳腺細胞株、例えばＣＲＬ７Ｏ３ＯおよびＨｓＳ７８Ｂｓｔなどが含まれる。
【０２７５】
組換えタンパク質の長期にわたる高収量の産生には、安定した発現が好ましい。例えば、抗抗原抗体の発現または改善されたＬＡＭＰ構築物のコード化ポリペプチドを安定して発現する細胞株は、操作することができる。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを使用するのではなく、適切な発現制御要素（プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）および選択可能なマーカーによって制御されるポリヌクレオチドで宿主細胞を形質転換することができる。外来ポリヌクレオチドの導入に続いて、操作された細胞を濃縮培地で１〜２日間増殖させることが可能であり得、その後、選択培地に切り替える。組換えプラスミドの選択マーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞がプラスミドを染色体に安定して組み込み、増殖して病巣を形成することを可能にし、それをクローニングして細胞株内に拡大させることができる。この方法は、抗抗原抗体または改善されたＬＡＭＰ構築物のコード化ポリペプチドを発現する細胞株を操作するために有利に使用され得る。
【０２７６】
多くの選択系を使用することができ、限定ではないが単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ  １１：２２３（１９７７））、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ＆Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ４８：２０２（１９９２））、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら、Ｃｅｌｌ  ２２：８  １７（１９８０））遺伝子を含み、これらはそれぞれｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−、またはａｐｒｔ−細胞で使用できる。また、代謝拮抗薬耐性は、以下の遺伝子、すなわち、メトトレキサートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：３５７（１９８０）；Ｏ’Ｈａｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：１５２７（１９８１））；
ミコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ＆Ｂｅｒｇ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：２０７２（１９８１））；アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ（Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、１２：４８８−５０５（１９９３）；Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２（１９９３）；およびＭｏｒｇａｎ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；ＴＩＢ  ＴＥＣＨ  １１（５）：１５５−２  １５（Ｍａｙ；１９９３））；およびハイグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、Ｇｅｎｅ  ３０：１４７（１９８４））の選択の基礎として使用できる。組換えＤＮＡ技術の分野で一般的に知られている方法は、所望の組換えクローンを選択するために日常的に適用することができ、そのような方法は、例えばＡｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９３）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９０）；Ｄｒａｃｏｐｏｌｉら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第１２章および第１３章、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９４）；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１（１９８１）に記載されている。
【０２７７】
抗抗原抗体または改善されたＬＡＭＰ構築物のコード化ポリペプチドの発現レベルは、ベクター増幅によって増加させることができる（レビューについては、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ、Ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｇｅｎｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｆｏｒ  Ｔｈｅ  Ｃｌｏｎｅｄ  Ｇｅｎｅｓ  Ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ  Ｉｎ  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｖｏｌ．３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８７）を参照）。抗抗原抗体または改善されたＬＡＭＰ構築物のコード化ポリペプチドを発現するベクター系のマーカーが増幅可能である場合、宿主細胞培養に存在する阻害剤のレベルの増加はマーカー遺伝子のコピー数を増加させる。増幅された領域はコード配列に関連付けられているため、抗抗原抗体発現または改善されたＬＡＭＰ構築物のコード化ポリペプチドの産生も増加する（Ｃｒｏｕｓｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２５７（１９８３））。
【０２７８】
ベクター配列に含めることができる他の要素には、異種シグナルペプチド（分泌シグナル）、膜固定配列、イントロン、代替スプライス部位、翻訳開始および停止シグナル、インテイン、ビオチン化部位、および翻訳後修飾を促進する他の部位、精製タグ、他のタンパク質またはペプチドへの融合をコードする配列、内部リボソーム再入部位により分離された別個のコード領域、例えば選択性（例えば、抗生物質耐性）または選別性（例えば、蛍光）、修飾ヌクレオチドを付与する「マーカー」タンパク質をコードする配列、およびこれらの例に限定されない他の既知のポリヌクレオチドシス作用特徴が含まれる。
【０２７９】
宿主細胞は、本発明の２つの発現ベクター、例えば、重鎖由来ポリペプチドをコードする第１のベクターおよび軽鎖由来ポリペプチドをコードする第２のベクターで同時にトランスフェクトされ得る。２つのベクターは、重鎖および軽鎖ポリペプチドの同等の発現を可能にする同一の選択可能マーカーを含んでもよい。あるいは、重鎖および軽鎖ポリペプチドの両方をコードし、発現できる単一のベクターを使用してもよい。このような状況では、重鎖の前に軽鎖を配置して、毒性のない過剰な重鎖を避けることが好ましい（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ、Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：５２（１９８６）；Ｋｏｈｌｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：２  １９７（１９８０））。重鎖および軽鎖のコード配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡ配列を含んでもよい。
【０２８０】
抗抗原抗体または改善されたＬＡＭＰ構築物のコード化ポリペプチドを組換え発現によって生成した後、タンパク質の精製のための当技術分野で公知の任意の方法、例えばクロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性（特にプロテインＡの親和性と特定の抗原に対する免疫親和性による）、およびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度の違い、またはタンパク質精製のためのその他の標準技術によって精製してもよい。さらに、抗抗原抗体または改善されたＬＡＭＰ構築物のコード化ポリペプチドを、本明細書に記載のまたは当技術分野で知られている異種ポリペプチド配列に融合して、精製を促進してもよい。
【０２８１】
一例では、抗抗原抗体または改善されたＬＡＭＰ構築物のコード化ポリペプチドを、免疫グロブリンの定常ドメイン（ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）またはその一部（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、またはこれらの任意の組み合わせまたはこれらの一部）、またはアルブミン（組換えヒトアルブミンまたはその断片または変異体を含むが、これらに限定されない）と融合して、キメラポリペプチドを得てもよい（例えば、１９９９年３月２日発行の米国特許第５，８７６，９６９号、欧州特許第０  ４１３  ６２２号、および１９９８年６月１６日発行の米国特許第５，７６６，８８３を参照）。そのような融合タンパク質は、精製を促進し、インビボでの半減期を延長し得る。これは、ヒトＣＤ４−ポリペプチドの最初の２つのドメインと哺乳動物免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の様々なドメインからなるキメラタンパク質で示されている。例えば、欧州特許第３９４，８２７号、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、３３１：８４−８６（１９８８）を参照。免疫系への上皮バリアを通過する抗原の増強された送達は、ＩｇＧまたはＦｅ断片などのＦｃＲｎ結合パートナーに結合した抗原（例えば、インスリン）について実証されている（例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ９６／２２０２４およびＷＯ９９／０４８１３を参照）。ＩｇＧ部分のジスルフィド結合によるジスルフィド結合二量体構造を有するＩｇＧ融合タンパク質は、単量体ポリペプチドまたはその断片単独よりも他の分子の結合および中和においてより効率的であることがわかっている。例えば、Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ、２７０：３９５８−３９６４（１９９５）を参照。本明細書に記載の抗抗原抗体または改善されたＬＡＭＰ構築物のコード化ポリペプチドをコードする核酸を、エピトープタグ（例えば、血球凝集素（「ＨＡ」）タグまたはフラグタグ）としての目的の遺伝子と組換えて、発現したポリペプチドの検出および精製を補助することもできる。例えば、Ｊａｎｋｎｅｃｈｔらによって説明されたシステムによりヒト細胞株で発現した非変性融合タンパク質の容易な精製が可能になる（Ｊａｎｋｎｅｃｈｔら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８９７２−８９７）。このシステムでは、遺伝子のオープンリーディングフレームが６つのヒスチジン残基からなるアミノ末端タグに翻訳融合されるように、目的の遺伝子をワクシニア組換えプラスミドにサブクローニングする。タグは、融合タンパク質のマトリックス結合ドメインとして機能する。組換えワクシニアウイルスに感染した細胞からの抽出物をＮｉ２＋ニトリロ酢酸−アガロースカラムにロードし、ヒスチジンタグ付きタンパク質をイミダゾール含有緩衝液で選択的に溶出することができる。
【０２８２】
投与
本発明によるワクチン材料は、本明細書に記載の免疫刺激性が改善されたＬＡＭＰ構築物を含んでもよく、または組換え微生物、または免疫刺激性が改善されたＬＡＭＰ構築物を発現する抗原提示細胞であってもよい。本発明によるワクチン材料を含む改善されたＬＡＭＰ構築物の調製および個体の免疫化のためのそのような改善されたＬＡＭＰ構築物の投与は、当業者に周知の免疫化の原理に従って達成される。
【０２８３】
本明細書に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物を発現するレプリコンを含む組換え細胞または形質転換細胞を培養することにより、これらの材料を大量に得ることができる。培養方法は、当業者に周知であり、上記で引用した１または複数の文書で教示されている。改善されたＬＡＭＰ構築物ワクチンは一般に、組換え細胞または形質転換細胞の培養によって生成され、通常生理学的に適合性のある水溶液である薬理学的に許容される溶液または懸濁液、または例えば参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，４４６，１２８号に記載されるようなコーティング錠、錠剤、カプセル、坐剤またはアンプルに製剤化される。投与は、経口、直腸、鼻腔内または注射による任意の適切な経路であり得、注射は、例えば経皮、皮下、筋肉内または静脈内であり得る。
【０２８４】
改善されたＬＡＭＰ構築物は、哺乳動物に免疫応答を誘発するのに十分な量で哺乳動物に投与される。投与のための最小の好ましい量は、投与前に存在した濃度の少なくとも４倍の濃度まで抗体形成を誘発するのに必要な量である。投与の一般的な初期用量は、静脈内、筋肉内または皮下投与の場合１０〜５０００マイクログラム、または組換えベクターの１０５〜１０１１プラーク形成単位であるが、この量はワクチンや免疫応答を誘発する他の薬剤の投与で一般的に行われるように、投与を行う臨床医によって調整される場合がある。通常、免疫を誘発するには単回投与で十分であり得るが、反応を確実にしたりブースティングしたりするために、複数回投与を行う場合がある。
【０２８５】
改善されたＬＡＭＰ構築物ワクチンは、最初に非ヒト哺乳動物（例えば、マウスまたは霊長類）で試験することがある。例えば、接種したマウスの免疫応答のアッセイを使用して、野生型抗原に対するよりも改善されたＬＡＭＰ構築物に対するより強い抗体、Ｔ細胞増殖、および細胞傷害性Ｔ細胞応答を実証することができる。改善されたＬＡＭＰ構築物をアカゲザルで評価して、マウスで非常に効果的なワクチン製剤が適切なサルの免疫応答を誘発するかどうかを判断できる。一態様において、各サルに、免疫化ごとに合計５ｍｇのＤＮＡを投与し、筋肉内送達し、２施設に分け、０日目および４、８、および２０週目に免疫化し、追加の用量は任意とする。抗体反応、ＡＤＣＣ、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞サイトカイン産生、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞抗原特異的サイトカイン染色を測定して、ワクチンに対する免疫応答をモニターすることができる。
【０２８６】
本発明による製剤化および投与の適切な方法のさらなる説明は、米国特許第４，４５４，１１６号（構築物）、米国特許第４，６８１，７６２号（組換え細菌）、および米国特許第４，５９２，００２号および第４，９２０，２０９号（組換えウイルス）に見出すことができる。
【０２８７】
癌免疫療法：予防と治療のための候補
表１に記載の少なくとも１つの癌抗原を含む本明細書に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物を使用して、癌および／または過剰増殖性障害を有する患者を治療することができる。例には、エプスタイン−バーウイルス関連リンパ腫が記録されている患者、ＨＰＶ関連子宮頸癌患者、慢性ＨＣＶ患者、または癌遺伝子もしくは腫瘍抑制遺伝子に明確な再配列もしくは変異がある患者が含まれる。さらに好ましい実施形態は、ＣＭＶ感染に起因する癌を含む過剰増殖性障害を有する患者を含む。
【０２８８】
好ましい実施形態では、本明細書に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物を使用して治療できる癌には、腺癌、肉腫、皮膚癌、黒色腫、膀胱癌、脳癌（多形性膠芽腫を含む）、乳癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌（ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、扁平上皮癌を含むがこれらに限定されない）、結腸直腸癌、肛門癌、直腸癌、子宮頸癌、肝臓癌、頭頸部癌、口腔癌、唾液腺癌、食道癌、膵臓癌、膵管腺癌（ＰＤＡ）、腎癌、胃癌、腎臓癌、多発性骨髄腫または脳癌の過形成を含む進行のすべてのステージが含まれるが、これらに限定されない。
【０２８９】
改善されたＬＡＭＰ構築物を含むワクチン組成物の場合など、改善されたＬＡＭＰ構築物による治療は、癌が特定されると、個人の癌の経過中の任意の期間で利用できると想定される。リスクの高い患者では、その後の癌の発生を防ぐためのワクチン接種も可能である。タンパク質ベースのＬＡＭＰ構築物ワクチンおよび細胞療法（例えば、ＬＡＭＰ構築物を含む樹状細胞療法）も想定される。
【０２９０】
治療の手順
一実施形態では、改善されたＬＡＭＰ構築物は、悪性腫瘍の経過中の任意の適切な時間に患者に注入され得る。例えば、表１に記載の少なくとも１つの癌抗原を含む改善されたＬＡＭＰ構築物は、腫瘍負荷が低い段階で注入されるであろう。改善されたＬＡＭＰ構築物が個体の抗原提示細胞（例えば、樹状細胞など）に導入される代替実施形態では、抗原提示細胞または成熟抗原提示細胞の前駆体は、個体の骨髄または末梢血から静脈穿刺によって採取される。これらの細胞は培養で確立され、続いて改善されたＬＡＭＰ構築物で形質導入される。形質導入が行われた後、これらの抗原提示細胞は患者に注入される。
【０２９１】
特に好ましい実施形態では、本発明は、疾患の初期、新生物腫瘍の切除後、または腫瘍細胞の負荷が減少しているときなど、腫瘍負荷が低い癌患者の治療方法を提供する。この方法では、ＭＨＣクラスＩＩ分子を発現する抗原提示細胞に分化することができる自己幹細胞を含む細胞集団が患者から得られる。これらの細胞は、改善されたＬＡＭＰ構築物を導入することにより培養および形質転換され、癌抗原を区画／オルガネラ内または抗原が送達される別の区画／オルガネラ内のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合して送達される。
【０２９２】
次に、トランスフェクトされた幹細胞集団を患者に再導入し、そこで幹細胞は抗原提示細胞に分化し、抗原からのＴｈエピトープと複合体化したＭＨＣクラスＩＩ分子を発現する。抗原に対する免疫応答は、ヘルパーＴ細胞集団の刺激を強化することにより強化される。
【０２９３】
より一般的には、一実施形態において、本発明は、抗原に対する哺乳動物の免疫応答を調節する（すなわち、そのような応答を刺激、増強、または低減する）ための改善されたＬＡＭＰ構築物を含むワクチン組成物を提供する。
【０２９４】
キット
本発明はさらに、本明細書に記載された方法の実施を促進するキットを含む。一態様では、キットは、本明細書に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物と、改善されたＬＡＭＰ構築物を受け取るための細胞とを含む。キットは、細胞をプロフェッショナルＡＰＣ内に設計するための１または複数の核酸をさらに含み得る。ただし、一態様では細胞はプロフェッショナルＡＰＣである。細胞は共刺激分子を発現してもしなくてもよい。好ましい態様では、細胞が共刺激分子を発現しない場合、改善されたＬＡＭＰ構築物によりコードされる抗原は自己抗原である。別の態様では、異なるＭＨＣ分子（例えば、ヒトで発現されることが知られている）を発現する細胞のパネルが提供される。さらなる態様では、キットは、細胞（例えば、脂質ベースの製剤、ウイルスパッケージング材料、細胞など）への改善されたＬＡＭＰ構築物の進入を促進する試薬を含む。なおさらなる態様では、改善されたＬＡＭＰ構築物によってコードされる抗原に特異的な１つ以上のＴ細胞株が提供され、改善されたＬＡＭＰ構築物が免疫応答を誘発、調節または増強する能力を検証する。
【０２９５】
実施例
ここで、以下の実施例を参照して本発明をさらに説明する。以下の実施例は単なる例に過ぎず、本発明の範囲内にある限り詳細を変更することができることを理解されたい。
【実施例１】
【０２９６】
ＬＡＭＰ構築物の構築
図１に示す改善されたＬＡＭＰ構築物は、当業者に周知の標準的な分子生物学技術を使用して構築することができる。例えば、ポリヌクレオチドを含むプラスミドは、図１に示すＩＬＣ−１〜ＩＬＣ−６の異なる構造を生じるように設計できる。図１に示すＬＡＭＰドメインは、図３〜図１０に示すアミノ酸配列に由来することができる。好ましくは、ＬＡＭＰドメインは、図３〜図１０に示すヒトＬＡＭＰタンパク質に由来する。各ドメインの境界は、図２Ａおよび図２Ｂから導出できる。ヒト配列と比較した場合に同等のドメインを識別することにより、対応するドメインはオーソロガス配列からもクローニングできることが想定される。癌抗原は、表１に記載されているように、個別に、または組み合わせて、記載されているＬＡＭＰ構築物にクローニングできる。
【実施例２】
【０２９７】
ＬＡＭＰ構築物に対するマウスの免疫応答評価
免疫応答を調節する能力について、実施例１に記載の改善されたＬＡＭＰ構築物の能力を試験することができる。例えば、雌のＢＡＬＢ／ｃマウスを０、１４、２８日目にナノパスを使用して、ＰＢＳ１００ｕｌ中の改善されたＬＡＭＰ構築物５０ｕｇおよびＧＭＣＳＦ５ｕｇの投与量で免疫化することができる。実験は、最後の投与の４週間後に終了する。
【０２９８】
脾細胞（３ｘ１０５／ウェル）をＴ細胞培地（１０％熱不活性化ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１Ｘ２−ＭＥを含むＲＰＭＩ）の抗原タンパク質（１０ｕｇ／ｍｌ）で刺激し、７２時間後に上清を収集する。上清を希釈し（上清４００ｕｌ＋Ｔ細胞培地２００ｕｌ）、サイトカインをＥＬＩＳＡで評価する。ＩＬ−１０またはＩＬ−４の産生をＥＬＩＳＰＯＴアッセイで測定できる。
【実施例３】
【０２９９】
ＬＡＭＰ構築物を使用した抗原提示の改善
サバイビンは、タンパク質のアポトーシス阻害剤（ＩＡＰ）ファミリーの最小メンバーであり、アポトーシスの阻害と細胞周期の調節に関与する。これらの機能的属性により、サバイビンは、多様な機能、すなわち細胞増殖と細胞死の調節を示す独自のタンパク質になる。腫瘍におけるサバイビンの発現は、アポトーシスの阻害および細胞死の減少率と相関するだけでなく、化学療法への抵抗性および腫瘍の攻撃性とも相関する［１−６］。したがって、サバイビンは癌ワクチンおよび治療薬の重要な標的である［７−９］。サバイビンは、ヒトおよび胚性幹細胞と多くの体性幹細胞タイプの両方で顕著に発現されることもわかっており、幹細胞の発生と維持における未だ未解明の役割を示している。
【０３００】
癌は、他の身体部分に侵入する可能性のある異常な細胞増殖が正常な恒常性を制御し、適時かつ適切に治療されなければ致命的になる異種の疾患群である。免疫療法は特に腫瘍細胞を標的とし、それにより非腫瘍細胞への付随的損傷を回避し、抗腫瘍応答を誘導する。この抗腫瘍応答は、外科的切除では不可能な場合がある体内の遠隔部位で腫瘍を根絶する可能性もある。腫瘍細胞は複数の回避戦略を使用し、免疫細胞による検出または排除を避けるため、抗腫瘍免疫応答の誘導または強化は、癌にとって手ごわい挑戦である。
【０３０１】
このプロジェクトの目的は、ＢＡＬＢ／ｃマウスに皮内投与で注入されるすべての新世代のＬＡＭＰ構築物のインビボ免疫応答を評価することである。具体的には、図１の凡例に定義されている試験構築物５０μｇで皮内注射によりマウスを免疫化した。この実験ではアジュバントは添加しなかった。各群６匹のマウスにワクチンを７日ごとに投与し、１か月に合計３回投与した。免疫応答は、最後の免疫化の１４日後にモニターした。
【０３０２】
試験したＬＡＭＰ構築物は、本明細書に記載したように生成し、試験した各構築物の配列は図１９に示されている。サバイビンタンパク質は、ＭｙＢｉｏｓｏｕｒｃｅ（カリフォルニア州サンディエゴ）から購入した。サバイビンペプチドはＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（ニュージャージー州ピスカタウェイ）から入手した。抗サバイビンおよびｍ−ＩｇＧｋ−ＢＰ−ＨＲＰはＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（テキサス州ダラス）から購入し、マウスモノクローナル抗ＬＡＭＰ−１／ＣＤ１０７ａはＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（メリーランド州ロックビル）から購入した。ＩＦＮγのＥＬＩＳＰＯＴ抗体ペアはＢｉｏｌｅｇｅｎｄから入手した。蛍光結合ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌ、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、グランザイムＢ、ＣＤ６９モノクローナル抗体およびＺｏｍｂｉｅ  ａｑｕａ  ｆｉｘａｂｌｅ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ｋｉｔはＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（カリフォルニア州サンディエゴ）から購入した。ヤギ抗マウスＩｇＧ２ａ−ＨＲＰおよびヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰは、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（アラバマ州バーミンガム）から購入した。ストレプトアビジン−ＨＲＰは、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ（マサチューセッツ州ウォルサム）から購入した。ＳｕｒｅＢｌｕｅ  ＴＭＢマイクロウェルペルオキシダーゼ基質およびＴＭＢ停止液は、ＫＰＬ（メリーランド州ゲーサーズバーグ）から購入した。
【０３０３】
Ｐｈａｒｍａｊｅｔで各構築物５０μｇを１００ｕｌ／マウス／用量の総量で使用した。０、７、１４日目に皮内送達によりマウスをワクチンで免疫化した。２８日目に血清収集のためマウスから採血した。血清を採取し、−３０℃で保存した。２８日目の実験終了時に脾臓を収集し、ＥＬＩＳＰＯＴおよびＦＡＣＳで処理して、サバイビン特異的Ｔ細胞応答を評価した。
【０３０４】
ＥＬＩＳＡによる血漿サバイビン特異的総ＩｇＧの測定。サバイビンに対するマウス抗体反応は、間接ＥＬＩＳＡによって評価した。ＥＬＩＳＡプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ）を炭酸水素塩−重炭酸塩緩衝液中の２μｇ／ｍｌサバイビン（１−１４２）タンパク質で一晩コーティングし、その後、ＰＢＳ中の２％ＢＳＡでブロックした。血漿試料をブロッキング緩衝液で１：１００に希釈した。試料をヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、アラバマ州バーミンガム）で検出した。反応はＳｕｒｅＢｌｕｅ  ＴＭＢ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅで発生させ、ＫＰＬ（メリーランド州ゲーサーズバーグ）のＴＭＢ  Ｓｔｏｐ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで停止させた。Ｅｐｏｃｈ  ＥＬＩＳＡリーダー（ＢｉｏＴｅｋ、バーモント州ウィヌースキー）を使用して、プレートを読み取った（ＯＤ４５０）。
【０３０５】
抗原特異的Ｔ細胞応答の評価  ワクチン接種マウスの抗原特異的Ｔ細胞応答を評価するために、ワクチン接種マウスの脾細胞を、酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）による抗原特異的ＩＦＮγ産生について評価した。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの場合、９６ウェルニトロセルロースプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、ＰＢＳ中の１００μｌ／ウェルの捕捉モノクローナル抗体で４℃で一晩コーティングした。プレートを２００μｌ／ウェルのＰＢＳで３回洗浄し、２００μｌ／ウェルのＴ細胞培地で室温で少なくとも２時間ブロックした。脾細胞を３ｘ１０５細胞／ウェルで播種し、３ｘ１０５細胞／ウェル、総量２００μｌ／ウェルのＴ細胞培地（Ｌ−グルタミンおよびＨＥＰＥＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０（ＡＴＣＣ）、１％ペニシリン、１％ストレプトマイシン、および５ｘ１０−５Ｍβ−ＭＥ）中、サバイビンのペプチドプール２μｇ／ｍｌ（表２）またはコンカバリンＡ（０．１２５μｇ／ｍｌ）または培地のみを５％ＣＯ２、３７°Ｃで４８時間共培養した。プレートを２００μｌ／ウェルのＰＢＳで２回、２００μｌ／ウェルのＰＢＳ−Ｔ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳ）で２回洗浄した。希釈した検出抗体（ＰＢＳ−Ｔ／０．５％ＢＳＡ中５０μｌ／ウェル）を添加し、室温で振とうしながらプレートを２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳで４回洗浄した。ＰＢＳで希釈したストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（５０μｌ／ウェル）を添加し、２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳで４回洗浄し、５０μｌ／ウェルの３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）基質で１０分間発色させた。水道水の流水で洗浄することにより発色を停止させた。暗所で室温で７２時間乾燥させた後、ＡＩＤ  ＥＬＩＳＰＯＴ高解像度リーダーシステムおよびＡＩＤ  ＥＬＩＳＰＯＴソフトウェアバージョン３．５（Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ  ＧｍｂＨ）を使用して、着色スポットをカウントした。
【０３０６】
表２  Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔから入手したペプチドプール
【０３０７】
【表２】
2020518613.tif 000019
【０３０８】
ウエスタンブロット  リポフェクタミン２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、試験した構築物を２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞をＰＢＳで洗浄し、停止プロテイナーゼ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州ウォルサム）を含む２００μｌのＲＩＰＡ溶解緩衝液に懸濁した。ライセートを遠心分離機にかけ（７００ｇを４°Ｃで１５分間）、続いてＰｉｅｒｃｅ  ＢＣＡタンパク質アッセイキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州ウォルサム）を使用して、清澄化された上清のタンパク質濃度を測定した。１０μｇのタンパク質をプレキャスト（４−２０％）ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ＢｉｏＲａｄ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）で電気泳動し、ニトロセルロース膜（ＢｉｏＲａｄ）に移入し、ｍＡｂでｈＬＡＭＰに免疫ブロットした。膜をＤｅｔｅｃｔｉｏｎ（商標）ブロック緩衝液（ＫＰＬ）でブロックし、ウサギ抗ヒトＬＡＭＰ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．、中国、北京）または抗サバイビン抗体とヤギ抗ウサギＨＲＰ抗体でプローブし、ＴＭＢ（ＫＰＬ）で発色させた。
【０３０９】
フローサイトメトリー  最初に細胞をＰＢＳ中のＺｏｍｂｉｅ  ａｑｕａ  ｆｉｘａｂｌｅ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ染料（１：５００希釈）で標識し、続いて染色緩衝液中の表面抗体（１：１００希釈）（ＰＢＳ中４％ＦＢＳ、２％ラット血清、２％マウス血清）で標識した。細胞内染色の場合、細胞をＺｏｍｂｉｅ  ａｑｕａで染色した後、表面染色し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、透過処理緩衝液（１％ＦＣＳ、０．１％サポニンを含むＰＢＳ）中の細胞内抗体で染色した。試料をＣｙｔｏＦｌｅｘフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）で分析し、Ｋａｌｕｚａソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して分析した。
【０３１０】
統計  統計的有意性を評価するために、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６．０ソフトウェアまたはＲファイルを使用して、２因子ＡＮＯＶＡ試験を実施した。各マウスのＲＰＭＩ結果を抗原活性化の結果から差し引いた。
【０３１１】
ワクチンおよび免疫化  コントロール、サバイビン＋完全なＬＡＭＰ、サバイビン−ＩＬＣ−１構築物、サバイビン−ＩＬＣ−２、サバイビン−ＩＬＣ−３、およびサバイビン−ＩＬＣ−４構築物ワクチンを２５μｌ／マウス／用量の総量で使用した。０、７、および１４日目に皮内送達によりマウスをワクチンで免疫化した。１３、２８日目に血清採取のためマウスから採血した。血清を採取し、−３０℃で保存した。２８日目に脾臓を採取し、ＥＬＩＳＰＯＴ／ＥＬＩＳＡアッセイ用に処理した。
【０３１２】
図１４：プラスミドの検証：２９３Ｔ細胞にプラスミドを３日間トランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を溶解し、次にプレキャストＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動した。タンパク質をニトロセルロース膜に移入し、ヒトＬＡＭＰ（ＯｒｉＧｅｎｅ、＃ＴＡ３３７１０８）またはサバイビン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ＃１７７７９）に対するｍＡｂで免疫ブロットした。ＬＡＭＰの分子量＝１００ＫＤ、サバイビン＝１６ＫＤ。図１３は、試験したすべてのＬＡＭＰ構築物が適切なサイズのタンパク質を産生したことを示す。
【０３１３】
図１５および図１６：試験したＬＡＭＰ構築物は、ＩＦＮγを産生するＴｈ１エフェクターＴ細胞を誘導する。雌のＢＡＬＢ／ｃマウスを、０、７、および１４日目にＰｈａｒｍａｊｅｔデバイスを介してＰＢＳ１００μｌ中の示された構築物５０μｇの皮内投与で免疫化した。実験は、最後の投与の１４日後に終了した。脾細胞（３ｘ１０５／ウェル）を、Ｔ細胞培地（１０％熱不活性化ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１Ｘβ−ＭＥを含むＲＰＭＩ）のサバイビンプールペプチド（４μｇ／ｍｌ）で４８時間刺激した。Ａ．スポットによるＩＦＮγの産生Ｂ．すべてのペプチドプールによって誘導されたＩＦＮγの産生（Ａの棒グラフ）。ｎ＝６／群。統計分析には、２因子ＡＮＯＶＡ（Ｒファイル）を使用した。図１４は、ＩＦＮγ産生によって示されるように、試験したすべてのＬＡＭＰ構築物が強いＴ細胞応答を誘導したことを示す。
【０３１４】
本発明者らは意外にも、改善されたＬＡＭＰ構築物３回（１週間間隔）の後、試験したＬＡＭＰ構築物、特にヒンジ配列がサバイビン遺伝子で置き換えられたＩＬＣ−４によって、Ｔｈ１タイプの強い反応が誘発されることを見出した。さらに興味深いことに、改善されたＬＡＭＰ構築物ＩＬＣ−４は、Ｎ末端からＣ末端までのサバイビンエピトープを認識し、マウスと１００％同一のヒトサバイビンペプチド配列に対するＴ細胞応答を誘導するように見える。また、サバイビンペプチドによる凍結融解脾細胞のより長い（７２時間）刺激を見出し、ＩＬＣ−４は、第１世代のＬＡＭＰ−サバイビンよりも有意に高いＩＦＮγ産生を示した（図１９を参照）。具体的には、図１６は、試験したすべての改善されたＬＡＭＰ構築物がＩＬＣ−４でより高いＴ細胞応答を示し、この構築物はすべてのサバイビンペプチドプールに対して有意に高いＴ細胞応答を誘発したため最高の活性を有することを示している。さらに、当技術分野で知られていることとは反対に、管腔ドメインの２番目の相同ドメインの除去は、完全なＬＡＭＰ構築物と比較してより強い免疫応答を誘発する改善されたＬＡＭＰ構築物を作り出した（ＩＬＣ−２およびＩＬＣ−３の結果を参照）。凍結脾細胞（４ｘ１０５／ウェル）を、Ｔ細胞培地（１０％熱不活性化ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１Ｘβ−ＭＥを含むＲＰＭＩ）のペプチドプール４（４μｇ／ｍｌ）で４８時間刺激した（ｎ＝６／群）。統計分析には２因子ＡＮＯＶＡを使用した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【０３１５】
図１７：ＣＤ４  Ｔ細胞はＩＦＮγ産生細胞の主要な供給源である。雌のＢＡＬＢ／ｃマウスを、０、７、および１４日目にＰｈａｒｍａｊｅｔデバイスを介してＰＢＳ１００μｌ中の示されたワクチン５０μｇの皮内投与で免疫化した。実験は、最後の投与の１４日後に終了した。脾細胞（１ｘ１０６／ウェル）を、Ｔ細胞培地（１０％熱不活性化ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１Ｘβ−ＭＥを含むＲＰＭＩ）のペプチドプール１（４μｇ／ｍｌ）で一晩刺激し、続いてモネシンおよびブレフェルディンＡを添加し、さらに５時間培養した。細胞を採取し、ＩＴＩ染色プロトコルに従ってＺｏｍｂｉｅ、表面マーカー、および細胞内染色で染色した。細胞は、記憶ＣＤ４  Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ−）またはＣＤ８  Ｔ細胞（ＣＤ８＋ＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ−）でゲート制御する。データは、各グループ１匹のマウスを代表する。様々な構築物を接種したワクチン接種マウスでＣＤ８エフェクター記憶細胞が増加しているが、ＣＤ４  Ｔ細胞集団ではＩＦＮγの産生がより顕著である。
【０３１６】
図１８：改善されたＬＡＭＰ構築物は、ＢＡＬＢ／ｃマウスでより強いサバイビン特異的総ＩｇＧ応答を生じた。雌のＢＡＬＢ／ｃマウスを、０、７、および１４日目にＰｈａｒｍａｊｅｔデバイスを介してＰＢＳ１００μｌ中の示されたワクチン５０μｇの皮内投与で免疫化した。実験は、最後の投与の１４日後に終了した。２８日目にマウスから採血した。血清を分離し、−３０℃で保存した。ＥＬＩＳＡで血清中の総ＩｇＧおよびＩｇＧ２ａを測定した。簡単に説明すると、ＥＬＩＳＡプレートを２μｇ／ｍｌサバイビン（１−１４２ａａ）でコーティングし、ＰＢＳ／２％ＢＳＡでブロックし、血清（ブロッキング緩衝液で１：１００希釈）をＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（１：６０００）およびＩｇＧ２ａ（１：１１０００）で評価した。ｎ＝マウス６匹／群。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。重要なことに、また当技術分野で知られていることとは反対に、図１８は、管腔ドメインの断片が完全な管腔ドメインを使用した場合よりもうまく機能したことを示す（すなわち、完全なＬＡＭＰ構築物を構築物ＩＬＣ−２およびＩＬ−３と比較する）。意外にも、管腔ドメインの２つの相同ドメイン間に抗原を挿入すると、最も強い抗体反応が生じた（ＩＬＣ−４を参照）。
【０３１７】
このセクションが依拠する参照
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３．Ｚｈａｎｇ  Ｘ、Ｚｈｏｎｇ  Ｌ、Ｈｕ  Ｋ、Ｌｉ  Ｑ、［Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ］、Ｚｈｏｎｇｇｕｏ  Ｆｅｉ  Ａｉ  Ｚａ  Ｚｈｉ．２００４；７（２）：１３８−４１．ｄｏｉ  ：１０．３７７９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００９−３４１９．２００４．０２．１４．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２１２１５００９。
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５．Ａｓａｎｕｍａ  Ｋ、Ｔｓｕｊｉ  Ｎ、Ｅｎｄｏｈ  Ｔ、Ｙａｇｉｈａｓｈｉ  Ａ、Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｎ．Ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  Ｆａｓ  ｌｉｇａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｉａ  ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４；１７２（６）：３９２２−９．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１５００４２００。
６．Ｍｉｙａｃｈｉ  Ｋ，Ｓａｓａｋｉ  Ｋ，Ｏｎｏｄｅｒａ  Ｓ，Ｔａｇｕｃｈｉ  Ｔ，Ｎａｇａｍａｃｈｉ  Ｍ，Ｋａｎｅｋｏ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｍＲＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｉｎ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ．Ｇａｓｔｒｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ．２００３；６（４）：２１７−２４、ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１０１２０−００３−０２５５−２．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１４７１６５１５。
７．Ｂａｄａｎａ  ＡＫ，Ｃｈｉｎｔａｌａ  Ｍ，Ｇａｖａｒａ  ＭＭ，Ｎａｉｋ  Ｓ，Ｋｕｍａｒｉ  Ｓ，Ｋａｐｐａｌａ  ＶＲら、Ｌｉｐｉｄ  ｒａｆｔｓ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｂｙ  ａｔｔｅｎｕａｔｉｎｇ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＬＲＰ６  ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｉｎ  ｔｒｉｐｌｅ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．Ｂｉｏｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．２０１７；９７：３５９−６８．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｉｏｐｈａ．２０１７．１０．０４５．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２９０９１８８５。
８．Ｃａｉ  ＪＰ、Ｗａｎｇ  ＹＤ、Ｚｈａｎｇ  Ｘ、Ｘｕｅ  ＨＺ、［Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｐ１６  ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｉｎ  ｌｉｖｅｒ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ］、ＺｈｏｎｇｈｕａＧａｎ  Ｚａｎｇ  Ｂｉｎｇ  Ｚａ  Ｚｈｉ．２０１７；２５（１０）：７７８−８０．ｄｏｉ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１００７−３４１８．２０１７．１０．０１３．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２９１０８２１０。
９．Ｃｈｏ  ＨＪ、Ｋｉｍ  ＨＲ、Ｐａｒｋ  ＹＳ、Ｋｉｍ  ＹＨ、Ｋｉｍ  ＤＫ、Ｐａｒｋ  ＳＩ、Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｖａｌｕｅ  ｏｆ  ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｓｔａｇｅ  ＩＩＩ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｌａｔｉｎｕｍ−ｂａｓｅｄ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｓｕｒｇ  Ｏｎｃｏｌ．２０１５；２４（４）：３２９−３４．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｕｒｏｎｃ．２０１５．０９．００１．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２６６９０８２２。
１０．Ｇｏｄｉｎｈｏ  ＲＭ、Ｍａｔａｓｓｏｌｉ  ＦＬ、Ｌｕｃａｓ  ＣＧ、Ｒｉｇａｔｏ  ＰＯ、Ｇｏｎｃａｌｖｅｓ  ＪＬ、Ｓａｔｏ  ＭＮら、Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＩＶ−Ｇａｇ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｅｎｄｏｌｙｓｏｓｏｍａｌ／ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｐａｔｈｗａｙ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｌｕｍｉｎａｌ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｌｙｓｏｓｏｍａｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＬＡＭＰ−１）ｅｎｈａｎｃｅ  Ｇａｇ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１４；９（６）：ｅ９９８８７．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００９９８８７．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２４９３２６９２；ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣＰＭＣ４０５９６４７。
【実施例４】
【０３１８】
ＬＡＭＰ構築物の治療的処置
０日目に、雌のＢＡＬＢ／ｃマウスに同系の７０００  ４Ｔ１乳癌細胞を皮下接種することができる。腫瘍が触知可能になったら、ナノパスを使用して、ＰＢＳ１００ｕｌ中のワクチン５０ｕｇおよびＧＭＣＳＦ５ｕｇを皮内投与する。原発腫瘍をノギスで測定し、腫瘍体積を式ｐ／６（長さｘ幅）３／２を使用して計算する。腫瘍接種後の日数の関数としての平均腫瘍体積を測定できる。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットを使用して、終了時点での全生存率を表示できる。
【実施例５】
【０３１９】
プライム／ブーストプロトコル
腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１４（ＴＮＦＲＳＦ１４）またはＣＤ２７０としても知られるヘルペスウイルス侵入メディエーター（ＨＶＥＭ）は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのヒト細胞表面受容体である。近年、ＨＶＥＭは、造血細胞、様々な実質細胞（乳癌、黒色腫、結腸直腸、卵巣癌細胞など）、および腸上皮に高度に発現していることが見出されている。ＨＶＥＭは、ＢＴＬＡまたはＬＩＧＨＴ（ＴＮＦＳＦ１４）への結合を介して、Ｔ細胞を阻害または刺激する双方向タンパク質である。
【０３２０】
本発明者らはＨＶＥＭ−ＬＡＭＰをコードするＤＮＡワクチンを生成して、腫瘍治療用途でＨＶＥＭの阻害機能をブロックできる抗体を生成した。本発明者らは、ＬＡＭＰがＨＶＥＭ特異的抗体の親和性を高める、および／またはＨＶＥＭタンパク質のＢ細胞エピトープのレパートリーを拡大することにより、抗体応答を促進するという仮説を立てた。この研究では、ＨＶＥＭをコードするプラスミドの免疫原性を、ＬＡＭＰ（配列番号１５８および配列番号１５９）の有無で比較した。ＨＶＥＭ−ＬＡＭＰおよびＨＶＥＭおよび組換えＨＶＥＭタンパク質をコードするプラスミドは、本明細書に記載されるように設計した。
【０３２１】
ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰは、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（アラバマ州バーミンガム）から購入した。ＳｕｒｅＢｌｕｅ  ＴＭＢマイクロウェルペルオキシダーゼ基質およびＴＭＢ停止液は、ＫＰＬ（メリーランド州ゲーサーズバーグ）から購入した。ＥＬＩＳＰＯＴプレートは、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（マサチューセッツ州ビレリカ、カタログ番号ＭＡＩＰＳ４５１０）に注文した。ＥＬＩＳＰＯＴで使用したＩＦＮ−γ抗体ペアはＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（カリフォルニア州サンディエゴ）から購入し、クローンＡＮ１８およびＲ４６Ａ２はそれぞれコーティングおよび検出に使用した。ストレプトアビジン−ＨＲＰおよびＡＥＣ基質はＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（カリフォルニア州サンホゼ）から購入した。
【０３２２】
６〜８週齢の雌のＢａｌｂ／ｃマウスをＨａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（マサチューセッツ州フレデリック）から購入し、Ｉｍｍｕｎｏｍｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｉｎｃ．（マサチューセッツ州ロックビル）の動物施設で飼育した。０、７、および１４日目に、エレクトロポレーションによる筋肉内送達により１０μｇ／用量のＨＶＥＭ−ＬＡＭＰ、ＨＶＥＭ、またはＬＡＭＰベクターコントロールでマウス（ｎ＝６）を処置した。３５日目に、ミョウバンの存在下、５μｇのＨＶＥＭタンパク質の腹腔内注射でマウスをブーストした。２８日目と４９日目に、マウスから採血し、抗体検出のために血清を単離した。５６日目にマウスを屠殺し、ＩＦＮ−γ産生についてＥＬＩＳＰＯＴで脾細胞を試験した。
【０３２３】
ＥＬＩＳＡ手順はＳｕら、Ｊ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ；（１０）：１−１５（２０１６）に従った。プレートを５μｇ／ｍｌのＨＶＥＭタンパク質でコーティングした。データはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＥｘｃｅｌおよびＰｒｉｓｍ  ６ソフトウェアを使用して分析した。
【０３２４】
この研究の主な目的は、ＨＶＥＭ−ＬＡＭＰとＨＶＥＭの抗体プロファイルを比較することであった。２８日目に、ＨＶＥＭ−ＬＡＭＰワクチン接種マウスは、ＨＶＥＭ群よりも有意に高いレベルのＨＶＥＭ特異的ＩｇＧ抗体を産生した（図１１）。タンパク質ブースト後、ＨＶＥＭ特異的抗体はＨＶＥＭ免疫マウスで約１０００倍増加し、平均力価は１００から１０８０００に変化した。この結果は、ＨＶＥＭ  ＤＮＡプラスミドによって免疫記憶が誘導されたことを示す。ＨＶＥＭ  ＤＮＡ単独では最小限の抗体反応しか誘発しなかったが、タンパク質ブーストは免疫記憶を急速に呼び戻した。一方、ＨＶＥＭ−ＬＡＭＰ群はＨＶＥＭ群およびＬＡＭＰ群よりも有意に高い力価を再び示し、平均力価はＨＶＥＭ群の５倍であり、ＬＡＭＰが抗体応答を高める力を示している（図１２）。
【０３２５】
さらに、ＨＶＥＭ＋ＬＡＭＰまたはＨＶＥＭ単独免疫／ＨＶＥＭタンパク質ブーストマウスからの血清試料（４９日目）をプールし、ペプチドマッピングについて試験した。１２個のペプチドが血清プールに結合していることがわかり（マウスＩｇＧ反応）、１２個のペプチドのうち７個が強い結合親和性を示した。ＨＶＥＭ＋ＬＡＭＰは、図１３に示すように、ＨＶＥＭ単独と比較して、ペプチド１７、２４、２５、２８の結合親和性を変化させる。これらの変化は、腫瘍の成長を保護する生理学的効果をもたらす可能性がある。
【０３２６】
結論として、この研究のデータは、２つの構築物がインビボで発現され、ＬＡＭＰが液性免疫応答を大幅に改善したことを示唆する。
【実施例６】
【０３２７】
ポリペプチドからの抗体産生
抗抗原抗体は、動物への注射を用いて抗体を産生する様々な標準的な方法で調製できる。（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２を参照。）例えば、本明細書に記載の癌抗原を含む改善されたＬＡＭＰ構築物を発現する細胞を非ヒト脊椎動物に投与して、ポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導する。好ましい方法では、ＬＡＭＰ／抗原タンパク質の調製物を調製および精製して、天然汚染物質を実質的に含まないようにする。次に、そのような調製物を非ヒト脊椎動物に導入して、より高い比活性のポリクローナル抗血清を産生する。
【０３２８】
最も好ましい方法では、本発明の抗抗原抗体はモノクローナル抗体（またはそのタンパク質結合断片）である。そのようなモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術を使用して調製することができる（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）；Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１（１９７６）；Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２９２（１９７６）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、ＮＹ、ｐｐ．５６３−６８１（１９８１））。一般に、そのような手順は、抗原を含む改善されたＬＡＭＰ構築物、抗原を含む改善されたＬＡＭＰ構築物のコード化ポリペプチド、またはより好ましくは、改善されたＬＡＭＰ構築物発現細胞と共に、非ヒト脊椎動物（好ましくはウサギ、マウス、ウシ、ラクダ、ラマ）を免疫化することを含む。そのような細胞は、任意の適切な組織培養培地で培養され得るが、好ましくは、１０％ウシ胎児血清（約５６°Ｃで不活性化）を追加し、約１０ｇ／ｌの非必須アミノ酸、約１，０００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および約１００ｕｇ／ｍｌのストレプトマイシンを追加したＥａｒｌｅの改変イーグル培地で細胞を培養する。
【０３２９】
そのような非ヒト脊椎動物宿主（例えば、マウス）の脾細胞を抽出し、適切な骨髄腫細胞株と融合する。本発明に従って、任意の適切な骨髄腫細胞株を使用することができるが、好ましくは、ＡＴＣＣ（商標）から入手可能な親骨髄腫細胞株（ＳＰ２０）を使用する。融合後、得られたハイブリドーマ細胞をＨＡＴ培地で選択的に維持し、その後、Ｗａｎｄｓら（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ８０：２２５−２３２（１９８１）に記載されるように限界希釈によってクローニングする。次に、そのような選択により得られたハイブリドーマ細胞をアッセイして、抗原に結合できる抗体を分泌するクローンを特定する。
【０３３０】
ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２および抗抗原抗体の他の断片が、本明細書に開示される方法に従って使用され得ることが理解されるであろう。そのような断片は、典型的には、パパイン（Ｆａｂ断片を生成する）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片を生成する）などの酵素を使用して、タンパク質分解開裂により生成される。あるいは、分泌されたタンパク質結合断片は、組換えＤＮＡ技術の適用または合成化学により生成され得る。
【０３３１】
ヒトにおける抗体のインビボ使用のために、「ヒト化」キメラモノクローナル抗体を使用することが好ましい場合がある。そのような抗体は、上記のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞に由来する遺伝子構築物を使用して産生され得る。キメラ抗体を産生する方法は、当技術分野で知られている。（レビューについては、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４（１９８６）；Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；谷口ら、欧州特許第１７１４９６号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、欧州特許第１７３４９４号；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、ＷＯ８６０１５３３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、ＷＯ８７０２６７１；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６４３（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：２６８（１９８５）を参照。）
【実施例７】
【０３３２】
ポリヌクレオチドの使用によるポリクローナルおよびモノクローナル抗体の生成
動物にポリヌクレオチドを直接注入する方法は、当技術分野で十分に説明されている。例えば、米国特許第５，６７６，９５４号；第６，８７５，７４８号；第５，６６１，１３３号を参照。例えば、抗原を含む改善されたＬＡＭＰ構築物をコードするポリヌクレオチドを、拘束された覚醒マウス（雌の６−１２週齢ＢＡＬＢ／ｃまたはヌード、ｎｕ／ｎｕ、Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ（インディアナ州インディアナポリス）から入手）の四頭筋に注射することができる。一実施形態では、５０μｌ溶液中の５０μｇのポリヌクレオチドを、使い捨ての滅菌プラスチックインスリン注射器およびマイクロピペット先端部から切り取ったプラスチックカラーを備えた２８Ｇ  １／２針（ニュージャージー州フランクリンレイクスのＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ．３２９４３０）を使用して、Ｈａｒｔｉｋｋａ、Ｊら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：１２０５−１２１７（１９９６）に記載されているようにマウスに注射することができる。
【０３３３】
または、６週齢の雌のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙマウス（体重２０〜２５グラム）に、注射の２４時間前から飲料水中５０００ｐｐｍのＺｎＯＳＯ４を与えることができる。この量の亜鉛は、メタロチオネインプロモーターを活性化できることが示されている。次に、各マウスに、リポソーム１５０μｇ（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ  ＴＭ）と複合体を形成した抗原を含む改善されたＬＡＭＰ構築物をコードするポリヌクレオチド３０μｇを総量３０μｌで２５ゲージ針を用いて尾静脈穿刺により静脈内注射する。動物の世話は研究を通して維持されるべきであり、「実験動物の使用と管理に関する指針（Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｒｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ）」、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  Ｐｒｅｓｓに従って実施すべきである。
【０３３４】
抗原を含む改善されたＬＡＭＰ構築物をコードするポリヌクレオチドが注入され動物の細胞に送達された後、抗原はエンドソーム／リソソームに送達され、処理され、免疫系に提示される。次に、抗原を含む改善されたＬＡＭＰ構築物は、抗原に特異的な抗体の産生を刺激することができる。これらの抗体は、単離してポリクローナル混合物として使用することも、単一種またはモノクローナルにさらに単離することもできる。免疫応答のプロセスおよびインビボでの外来抗原に対する抗体の産生は、当技術分野で周知である。
【０３３５】
第３の動物モデルでは、Ｂａｌｂ／ｃ  ３Ｔ３  Ａ３１細胞に、抗原を含む改善されたＬＡＭＰ構築物をコードするポリヌクレオチドをエレクトロポレーションによりトランスフェクトする。抗原を含むＬＡＭＰ構築物を発現するＧ４１８耐性クローンは、ヒトＲＢＣに結合する能力により特定される。ポリクローナル抗体を生成するために、Ｂａｌｂ／ｃマウスを１４日間の間隔で２回腹腔内に免疫し、１０７個の細胞が抗原を含む改善されたＬＡＭＰ構築物を含むようにする。最後のブーストの後、免疫血清を収集し、ＩｇＧをプロテインＧセファロースで精製し、臭化シアンで活性化したセファロースＣＬ−４Ｂに精製抗原１．０ｍｇをカップリングして調製した抗原カラムに通す。結合したＩｇＧは、０．１Ｍグリシン緩衝液ｐＨ２．５で溶出し、０．１容量の０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０で中和することができる。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を生成するには、Ｂａｌｂ／ｃマウスを抗原を含むＬＡＭＰ構築物で免疫化し、標準的な方法に従ってＳＰ２骨髄腫と免疫脾細胞を融合することによりハイブリドーマを生成する（２８）。抗原と特異的に反応する陽性ウェルは、当技術分野で説明されている酵素結合免疫吸着検定法によって特定できる。ハイブリドーマを限界希釈により３回クローニングして抗体を生成する。
【実施例８】
【０３３６】
抗原を含む改善されたＬＡＭＰ構築物の免疫化
哺乳動物で抗体を産生する方法は、当技術分野で周知である。一例では、抗原を含むＬＡＭＰ構築物に対するポリクローナル抗血清は、抗原を含む合計５００μｇの改善されたＬＡＭＰ構築物で病原体を含まないウサギを免疫化することによって２か月間にわたって産生される。例えば、抗原を含む改善されたＬＡＭＰ構築物をＰＢＳに溶解し、等量のフロイントアジュバントで乳化することができる。最後のブースターの後、ウサギの血清を分離して、ポリクローナル抗血清の力価を決定することができる。
【０３３７】
追加の動物モデルでは、ミョウバンに乳化した抗原を含む内毒素を含まないＬＡＭＰ構築物５μｇで、各群５匹のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ；Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ）を皮下免疫することができる。３週間後、マウスから採血し、ＥＬＩＳＡで血清を滴定することによって抗抗原特異的抗体の存在を確認することができる（ウェル上に直接または間接的に（ビオチン化タグおよびストレプトアビジンを介して）コーティングした野生型ＢＰＴＩまたはＡＰＰ−ＫＩに血清中の抗体を直接結合させる）。
【０３３８】
モノクローナル抗体を得るには、４〜６週齢のＢａｌｂ／ｃマウスを、抗原を含む改善されたＬＡＭＰ構築物で免疫することができる（例えば、１０〜１００μｇ／注射を最初の注射ではフロイントの完全なアジュバントに溶解し、その後の免疫化ではフロイントの不完全なアジュバントに溶解し、２週間間隔で４回）。脾細胞を単離し、Ｓｐ２／０骨髄腫細胞などの融合細胞株と融合させた後、限界希釈を行う。成長中のクローンは、例えば酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用してスクリーニングする。９６細胞プレートを、抗原またはコントロールタンパク質を含む改善されたＬＡＭＰ構築物でコーティングする。培養上清を加えた後、洗浄し、検出用の標識抗マウス抗体を加える。限界希釈後、安定したハイブリドーマを産生する抗抗原抗体のクローニングが得られる。各細胞から上清を回収し、プロテインＡセファロースカラムを使用したアフィニティークロマトグラフィーによりモノクローナル抗体を精製できる。
【実施例９】
【０３３９】
ＩＧＦＢＰ−２を使用したＬＡＭＰ構築物
癌ワクチンの開発は４０年以上にわたって追求されてきた。しかし、様々な癌ワクチン製剤の多数の臨床研究にもかかわらず、治療用癌ワクチン接種の全体的な臨床的利益は約２０％である１、２、３、４、５。有効性を改善するための障害には、ａ）癌関連抗原である自己タンパク質の免疫原性の低さ、ｂ）制御性Ｔ細胞の誘導６、およびｃ）ワクチン接種により得られる低い免疫応答が含まれる。最近の報告は、多くの腫瘍における臨床反応の改善と腫瘍微小環境におけるワクチン誘発性Ｔｈ１免疫浸潤との相関を示唆している７、８、９、１０、１１。
【０３４０】
インスリン様成長因子結合タンパク質２（ＩＧＦＢＰ−２）は、多くのヒト腫瘍の進行中に上昇する自己タンパク質である。ＩＧＦＢＰ−２の過剰発現は、予後不良の高悪性度神経膠腫と相関しており１２、乳癌患者の悪性腫瘍の独立した指標である１３。ＩＧＦＢＰ２は、肺癌患者の転移と生存率低下に関連している１４。ＩＧＦＢＰ２の過剰発現は、副腎癌１５、膀胱癌１６、胃癌１７、卵巣癌１８、１９、および前立腺癌２０、２１の進行疾患とも相関している。
【０３４１】
材料および方法
マウス  ６〜８週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６アルビノマウスをＥｎｖｉｇｏから購入し、Ｉｍｍｕｎｏｍｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｉｎｃ．（マサチューセッツ州ロックビル）の動物施設で飼育した。
【０３４２】
試薬および抗体  コントロールベクター対照、ＩＧＦＢＰ２（１−３２８）−ＬＡＭＰなし、およびＩＧＦＢＰ２（３９−３２８）−ＩＬＣ−１構築物を、標準プロトコルを使用して本明細書に記載のように作製した。抗マウスウサギＩＧＦＢＰ２  ＰｏＡｂはＭｙＢｉｏｓｏｕｒｃｅ（カリフォルニア州サンディエゴ）から、ヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＦＩＴＣはｅ−ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（カリフォルニア州サンディエゴ）から、ウサギ抗ヒトＬＡＭＰはＳｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ（中国、北京）から入手した。ヤギ抗ウサギＨＲＰ、ヤギ抗マウスＩｇＧ１−ＨＲＰおよびヤギ抗マウスＩｇＧ２ａ−ＨＲＰは、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（アラバマ州バーミンガム）から購入した。ストレプトアビジン−ＨＲＰは、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ（マサチューセッツ州ウォルサム）から購入した。ＳｕｒｅＢｌｕｅ  ＴＭＢマイクロウェルペルオキシダーゼ基質およびＴＭＢ停止液は、ＫＰＬ（メリーランド州ゲーサーズバーグ）から購入した。ＩＦＮγのＥＬＩＳＰＯＴ抗体ペアとＩＬ−１０はＢｉｏＬｅｇｅｎｄから入手した。サイトカインＥＬＩＳＡキットはＲ＆Ｄシステムから入手した。
【０３４３】
ワクチンおよび免疫化  コントロール、ＩＧＦＢＰ２（３９−３２８）−ＩＬＣ−１構築物、およびＩＧＦＢＰ２（１−３２８）−ＬＡＭＰなしワクチンを２０μｌ／マウス／用量の総量で使用した。０、７、および１４日目にエレクトロポレーションを介した筋肉内送達によりマウスをワクチンで免疫化した。１３、２８日目に血清採取のためマウスから採血した。血清を採取し、−３０℃で保存した。２８日目に脾臓を採取し、ＥＬＩＳＰＯＴ／ＥＬＩＳＡアッセイ用に処理した。
【０３４４】
ＥＬＩＳＡによる血清ＩＧＦＢＰ−２特異的ＩｇＧの測定。ＩＧＦＢＰ−２に対するマウス抗体反応は、間接ＥＬＩＳＡによって評価した。ＥＬＩＳＡプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ）を炭酸‐重炭酸塩緩衝液中の５ｕｇ／ｍｌのＩＧＦＢＰ２（３９−３２８）タンパク質で一晩コーティングし、次にＰＢＳ中の２％ＢＳＡでブロックした。血清試料をＰＢＳ−Ｔで希釈した（１：１００、１：３００、１：９００、１：２７００、１：８１００、１：２４３００、１：７２９００、１：２１８７００）。試料を１：６０００ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、アラバマ州バーミンガム）で検出し、続いてストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、イリノイ州ロックフォード）で検出した。反応はＳｕｒｅＢｌｕｅ  ＴＭＢ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅで発生させ、ＫＰＬ（メリーランド州ゲーサーズバーグ）のＴＭＢ  Ｓｔｏｐ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで停止させた。Ｅｐｏｃｈ  ＥＬＩＳＡリーダー（ＢｉｏＴｅｋ、バーモント州ウィヌースキー）を使用して、プレートを読み取った（ＯＤ４５０）。平均バックグラウンド（ＰＢＳのみ）を計算し、平均バックグラウンド２＊を超えるＯＤ４５０値を有する試料を陽性と見なした。そのような試料の希釈を終点力価として測定する。
【０３４５】
抗原特異的Ｔ細胞応答の評価  ワクチン接種マウスの抗原特異的Ｔ細胞応答を評価するために、ワクチン接種マウスの脾細胞の抗原特異的ＩＦＮγおよびＩＬ−１０を酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）により評価した。
【０３４６】
脾細胞からＲＢＣを除去し、平底９６ウェルプレートで、２００μｌ／ウェルのＴ細胞培地（Ｌ−グルタミンおよびＨＥＰＥＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０（ＡＴＣＣ）、１％ペニシリン、１％ストレプトマイシン、および５ｘ１０−５Ｍ  ２−ＭＥ）４ｘ１０５細胞／ウェル、および１０μｇ／ｍｌ  ＩＧＦＢＰ２（３９−３２８）タンパク質またはコンカバリンＡ（０．２５μｇ／ｍｌ）または培地のみを３７％、５％ＣＯ２で７２時間共培養した。プレートを１６００  ｒｐｍで６分間遠心分離し、上清を収集して−３０℃で保存した。
【０３４７】
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイについては、本明細書に記載のとおりに実施した。簡単に説明すると、９６ウェルニトロセルロースプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を３０ｕｌの３５％エタノールで１分間活性化し、ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ中のキャプチャーモノクローナル抗体５０μｌ／ウェルで４℃で一晩コーティングした。プレートを２００μｌ／ウェルのＰＢＳで３回洗浄し、２００μｌ／ウェルのＴ細胞培地で室温で少なくとも２時間ブロックした。脾細胞を４ｘ１０５細胞／ウェルで播種し、総量２００μｌ／ウェルのＴ細胞培地中、１０μｇ／ｍｌ  ＩＧＦＢＰ２（３９−３２８）タンパク質または１０ｕｇ／ｍｌペプチドプールまたはコンカバリンＡ（０．２５μｇ／ｍｌ）または培地のみを５％ＣＯ２、３７℃で４８時間共培養した。プレートを洗浄し、希釈した検出抗体（５０μｌ／ウェル）を加え、プレートをシェーカー上で室温で２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳで４回洗浄した。ＰＢＳで希釈したストレプトアビジン−ＨＲＰ（５０μｌ／ウェル）を添加し、１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳで洗浄し、５０μｌ／ウェルのＡＥＣ発色液で最大３０分間発色させた。水道水の流水で洗浄することにより発色を停止させた。暗所の室温で２４〜７２時間乾燥させた後、ＡＩＤ  ＥＬＩＳＰＯＴ高解像度リーダーシステムおよびＡＩＤ  ＥＬＩＳＰＯＴソフトウェアバージョン３．５（Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ  ＧｍｂＨ）を使用して、着色スポットをカウントした。
【０３４８】
細胞内サイトカインの評価  サイトカインの産生に関与する細胞を決定するために、細胞内染色を実施した。ＲＢＣを除去した脾臓細胞を冷蔵庫に２４時間保管した。翌日、脾細胞を、平底９６ウェルプレートで２００ｕｌ／ウェルのＴ細胞培地（Ｌ−グルタミンおよびＨＥＰＥＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０（ＡＴＣＣ）、１％ペニシリン、１％ストレプトマイシン、および５ｘ１０−５Ｍ  ２−ＭＥ）３ｘ１０６細胞／ウェル、および２０ｕｇ／ｍｌ  ＩＧＦＢＰ２（３９−３２８）タンパク質またはペプチドプールまたは培地のみを共培養した。１時間後にブラフェルジンＡとモネンシン（Ｘ１０００）の混合物を各ウェルに２０ｕｌの容量で加えた（２０ｕｌの容量に対して各ウェル０．２２ｕｌ、すべてのウェルについてストックを準備）。ＰＭＡ／イオノマイシン活性化カクテルをＢＦＡおよびモネンシンと共に陽性対照ウェルに加えた（２つのウェルを設定し、１つはＩｇＧコントロール用、もう１つはサイトカイン染色用であった）。細胞を５％ＣＯ２、３７°Ｃで合計６時間インキュベートした。
【０３４９】
細胞を２００μｌのＰＢＳで洗浄した。細胞を５０ｕｌの希釈したｚｏｍｂｉｅ  ａｑｕａ色素（ｚｏｍｂｉｅ  ａｑｕａをＰＢＳで１：５００希釈）で染色し、遮光し室温で２０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳ中の２％血清で１回洗浄した。２０ｕｌの精製抗マウスＣＤ１６／３２ｍＡｂ（クローン２．４Ｇ２；１ｕｇ／２０ｕｌ）を細胞に加え、細胞を４℃で１０分間インキュベートした。細胞を遠心分離し（２０００ｒｐｍ、６分）、上清をデカントし、２％血清を添加したＰＢＳに細胞外抗体を加えた。抗体は各０．３ｕｌ／ウェルであった。Ａｂｓを５０μｌ／ウェルの量で加え、４℃で３０分間インキュベートした（ＣＤ３クローン１７Ａ２はＴ細胞を活性化できるため、４℃の温度が重要である）。
【０３５０】
細胞をＰＢＳ＋タンパク質（２％ＦＣＳ）で洗浄し、１００μｌのＣｙｔｏＦｉｘ／ＣｙｔｏＰｅｒｍ溶液で４℃で３０分間固定し、透過処理した（固定緩衝液を加えるときにマルチチャネルと完全に混合し、凝集体とダブレットの形成を減らした）。細胞を２００μｌのＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液（１Ｘ）で２回（２０００ｒｐｍ、６分）洗浄した。細胞をＰｅｒｍ緩衝液中０．５μｌ  Ａｂ／ウェルの細胞内染色Ａｂで染色した。ＰＭＡ／イオノマイシンウェルの１つをアイソタイプコントロールで染色した。１時間（または一晩）インキュベーション後、細胞をＰｅｒｍ緩衝液で２回洗浄し、フローサイトメーターで細胞を取得した。取得中のイベント／秒は８０００未満であった。試料あたり１０６個を超える細胞を取得した。取得したデータは、Ｋａｌｕｚａ分析ソフトウェアを使用して分析した。死細胞とダブレットはゲートアウトした。
【０３５１】
統計  統計分析は、Ｐｒｉｓｍ  ６ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、カリフォルニア州ラホーヤ）を使用して実行した。データは、１因子ＡＮＯＶＡの後、多重比較のためテューキー検定で分析した。０．０５未満のρ値が統計的に有意な差を示すと見なした。
【０３５２】
結果図２１：ＩＧＦＢＰ２（３９−３２８）−ＩＬＣ−１構築物は、１０ｕｇ  ＩＭ／ＥＰ免疫化の用量で有意に高いＩＦＮγ産生エフェクターＴ細胞を誘導した。ペプチドプール１は、ＩＧＦＢＰ−２全長タンパク質と同様のＩＦＮγ応答を誘導し、ペプチドプール１の優性エピトープを示している。脾細胞（４ｘ１０５／ウェル）を、Ｔ細胞培地（１０％熱不活性化ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、および１Ｘ２−ＭＥを含むＲＰＭＩ）中のＩＧＦＢＰ−２タンパク質（１０ｕｇ／ｍｌ）またはペプチドプール（１０ｕｇ／ｍｌ）で４８時間刺激した。ドットプロットの値は実験的なもので、各マウスの培地である。Ｎ＝マウス７匹／群。図２１Ａ：ＩＧＦＢＰ２全長（１０ｕｇ／ｍｌ）でのリコールを示すドットプロットである。図２１Ｂ：ペプチドプール１（１０ｕｇ／ｍｌ）でのリコールを示すドットプロットである。＊はｐ＜０．０５を示す。
【０３５３】
図２２：ＩＧＦＢＰ２（３９−３２８）−ＩＬＣ−１構築物は、１０ｕｇ  ＩＭ／ＥＰ免疫化の用量で、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋エフェクター記憶Ｔ細胞を産生するＩＦＮγおよび／またはＴＮＦαを誘導した。脾細胞（４ｘ１０５／ウェル）を、Ｔ細胞培地（１０％熱不活性化ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、および１Ｘ２−ＭＥを含むＲＰＭＩ）中のＩＧＦＢＰ−２タンパク質（１０ｕｇ／ｍｌ）またはペプチドプール１（５ｕｇ／ｍｌ）で６時間刺激した。細胞を、説明したように細胞内サイトカインについて染色し、以下に示すように分析した。各グループの代表的なデータを示す。
【０３５４】
図２３：ＩＭ／ＥＰによるＩＧＦＢＰ２（３９−３２８）−ＩＬＣ−１構築物で免疫化したＣ５７ＢＬ／６アルビノマウスにおけるＩＧＦＢＰ−２特異的ＩｇＧ産生。０、７、および１４日目に、雌のＣ５７ＢＬ／６アルビノマウスをＰＢＳ２０μｌ中の示されたワクチン１０ｕｇでＩＭ／ＥＰで免疫化した。６、２８日目にマウスから採血した。血清を分離し、−３０℃で保存した。ＩｇＧは、血漿中のＥＬＩＳＡによって測定した。簡単に説明すると、ＥＬＩＳＡプレートを炭酸‐重炭酸塩緩衝液中の５μｇ／ｍｌ  ＩＧＦＢＰ−２（３９−３２８）でコーティングし、２％ＢＳＡでブロックし、血清（ＰＢＳ−Ｔで１：１００希釈）をＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧで評価した（１：６０００）。平均バックグラウンド（ＰＢＳのみ）を計算し、平均バックグラウンド２＊を超えるＯＤ４５０値を有する試料を陽性と見なした。そのような試料の希釈を終点力価として測定する。
【０３５５】
この実施例が依拠する参照。
１．Ｍｅｌｅｒｏ、Ｉら、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ：ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ．ＮａｔＲｅｖ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １１、５０９−５２４（２０１４）。
２．Ｏｂｅｉｄ、Ｊ．、Ｈｕ、Ｙ．＆Ｓｌｉｎｇｌｕｆｆ、Ｃ．Ｌ．、Ｊｒ．Ｖａｃｃｉｎｅｓ、Ａｄｊｕｖａｎｔｓ、ａｎｄ  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ−−Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｓｔａｔｕｓ  ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ４２、５４９−５６１（２０１５）。
３．Ｐｏｌ、Ｊら、Ｔｒｉａｌ  Ｗａｔｃｈ：Ｐｅｐｔｉｄｅ−ｂａｓｅｄ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４、ｅ９７４４１１（２０１５）。
４．Ｓｐｅｉｓｅｒ、Ｄ．Ｅ。＆Ｒｏｍｅｒｏ、Ｐ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｓｅｍｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２２、１４４−１５４（２０１０）。
５．Ｔｈｏｍａｓ、Ａ．＆Ｇｉａｃｃｏｎｅ、Ｇ．Ｗｈｙ  ｈａｓ  ａｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｎｏｔ  ｗｏｒｋｅｄ  ｉｎ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ？Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２６、２２１３−２２２０（２０１５）。
６．Ｅｂｅｒｔ、Ｌ．Ｍら、Ａ  ｃａｎｃｅｒ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ＮＹ−ＥＳＯ−１−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｍｅｌａｎｏｍａ．ＰＬｏＳＯｎｅ  ７、ｅ４８４２４（２０１２）。
７．Ｇａｌｏｎ、Ｊら、Ｔｙｐｅ，ｄｅｎｓｉｔｙ，ａｎｄ  ｌｏｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｔｕｍｏｒｓ  ｐｒｅｄｉｃｔ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｕｔｃｏｍｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ３１３、１９６０−１９６４（２００６）。
８．Ｆｒｉｄｍａｎ、Ｗ．Ｈ．、Ｐａｇｅｓ、Ｆ．、Ｓａｕｔｅｓ−Ｆｒｉｄｍａｎ、Ｃ．＆Ｇａｌｏｎ、Ｊ．Ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｏｎｔｅｘｔｕｒｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｕｒｓ：ｉｍｐａｃｔ  ｏｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｕｔｃｏｍｅ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  １２、２９８−３０６（２０１２）。
９．Ｋｅｎｔｅｒ、Ｇ．Ｇら、Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ＨＰＶ−１６  ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  ｖｕｌｖａｒ  ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｎｅｏｐｌａｓｉａ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６１、１８３８−１８４７（２００９）。
１０．Ｍａｄａｎ、Ｒ．Ａ．、Ｂｉｌｕｓｉｃ、Ｍ．、Ｈｅｅｒｙ、Ｃ．、Ｓｃｈｌｏｍ、Ｊ．＆Ｇｕｌｌｅｙ、Ｊ．Ｌ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＴＲＩＣＯＭ  ｖｅｃｔｏｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ３９、２９６−３０４（２０１２）。
１１．Ｄｉｓｉｓ、Ｍ．Ｌら、Ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ  ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ａｎｄ  ＨＥＲ２／ｎｅｕ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２７、４６８５−４６９２（２００９）。
１２．Ｍｏｏｒｅ、Ｌ．Ｍら、ＩＧＦＢＰ２  ｉｓ  ａ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  Ｉｎｋ４ａ−Ａｒｆ  ｓｔａｔｕｓ  ａｎｄ  ａ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｇｒａｄｅ  ｇｌｉｏｍａｓ．ＰｒｏｃＮａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０６、１６６７５−１６６７９（２００９）。
１３．Ｂｕｓｕｎｄ、Ｌ．Ｔら、Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＩＧＦＢＰ２  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｏｍｐａｒｅｄ  ｗｉｔｈ  ｂｅｎｉｇｎ  ｌｅｓｉｏｎｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ  ５８、３６１−３６６（２００５）。
１４．Ｈｕ、Ｑら、Ｉｓ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｉｎ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ？Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ３１、５３５−５４１（２０１４）。
１５．Ｂｏｕｌｌｅ、Ｎ．、Ｌｏｇｉｅ、Ａ．、Ｇｉｃｑｕｅｌ、Ｃ．、Ｐｅｒｉｎ、Ｌ．＆Ｌｅ  Ｂｏｕｃ、Ｙ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）ａｎｄ  ＩＧＦ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−２  ａｒｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ  ｉｎ  ｓｐｏｒａｄｉｃ  ａｄｒｅｎｏｃｏｒｔｉｃａｌ  ｔｕｍｏｒｓ．ＪＣｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ８３、１７１３−１７２０（１９９８）。
１６．Ｍｉｙａｋｅ，Ｈ．，Ｈａｒａ，Ｉ．，Ｙａｍａｎａｋａ，Ｋ．，Ｍｕｒａｍａｋｉ，Ｍ．＆  Ｅｔｏ，Ｈ．Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＩＧＦ）ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−２  ｔｏ  ＩＧＦ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−３  ｒａｔｉｏ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｕｎｄｅｒｇｏｉｎｇ  ｒａｄｉｃａｌ  ｃｙｓｔｅｃｔｏｍｙ  ｆｏｒ  ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｌａｄｄｅｒ．ＢＪＵ  Ｉｎｔ  ９５，９８７−９９１（２００５）。
１７．Ｓｈｉ、Ｌ．Ｈ．、Ｚｈｕ、Ｘ．Ｑ．、Ｚｈａｏ、Ｇ．Ｈ．、Ｘｉａ、Ｙ．Ｂ．＆Ｚｈａｎｇ、Ｙ．Ｓ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−２  ｉｎ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｗｉｔｈ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．ＷｏｒｌｄＪ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  １２、６２８５−６２８９（２００６）。
１８．Ｌｅｅ、Ｅ．Ｊら、Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｉｎｖａｓｉｏｎ．ＭｏｌＣａｎｃｅｒ  ４、７（２００５）。
１９．Ｌｕｋａｎｏｖａ、Ａら、Ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｐｒｅｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ，ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ−１  ａｎｄ−２（ＵＳＡ，Ｓｗｅｄｅｎ，Ｉｔａｌｙ）．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃａｕｓｅｓ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  １４、２８５−２９２（２００３）。
２０．Ｄｅｇｒａｆｆ、Ｄ．Ｊ．、Ａｇｕｉａｒ、Ａ．Ａ．＆Ｓｉｋｅｓ、Ｒ．Ａ．Ｄｉｓｅａｓｅ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ＩＧＦＢＰ−２  ａｓ  ａ  ｋｅｙ  ｐｌａｙｅｒ  ｉｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  ｌｅｓｉｏｎｓ．ＡｍＪ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｒｅｓ  １、１１５−１３０（２００９）。
２１．Ｓｈａｒｉａｔ、Ｓ．Ｆ．ら、Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｅｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｐｌａｓｍａ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  Ｉ  ａｎｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ−２  ａｎｄ−３  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎｖａｓｉｏｎ，ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ，ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２０、８３３−８４１（２００２）。
【実施例１０】
【０３５６】
ＣＭＶ  ｐｐ６５およびｇＢを含むＬＡＭＰ構築物
多形性膠芽腫（ＧＢＭ）脳癌は、５年生存率が１０％未満の攻撃的なヒト脳癌である（Ｓｃｈｕｅｓｓｌｅｒ  Ａら、２０１４）。現在の治療には腫瘍の外科的切除と放射線療法が含まれるが、治療の成功で延長される生存期間中央値は約１５か月に過ぎない。現在、ＧＢＭについて免疫療法を含むいくつかの臨床試験が評価されている。興味深いことに、ＧＢＭ腫瘍は抗原ｐｐ６５を含むＣＭＶ抗原を発現することが最近発見された。ＣＭＶは発癌性ウイルスではないため、ＧＢＭでのＣＭＶの役割は不明であるが、治療の観点から、ＣＭＶ抗原の存在は、免疫ベースのＧＢＭ治療に既存の抗ウイルス免疫を活用する独自の機会を提供する。最近の報告では、独自のプロトコルでＬＡＭＰ−ｐｐ６５  ｍＲＮＡをトランスフェクトしたＤＣを使用した自己免疫療法により、ＧＢＭ患者の生存率が大幅に改善されることが示された。具体的には、フロリダ大学のＤｒ．Ｄｕａｎｅ  Ａ．Ｍｉｔｃｈｅｌｌは、エクスビボで自己ＤＣを生成し、ＬＡＭＰ−ｐｐ６５  ｍＲＮＡでパルスし、ＧＢＭ患者に注射して、ＧＢＭ患者の生存率を大幅に改善したことを示した。ｐｐ６５をトランスフェクトしたＤＣのプロトコルでは、ＤＣ注射の２４時間前に破傷風／ジフテリアワクチンを注射して注射部位を事前調整する必要もあった（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  ＤＡら、２０１５）。
【０３５７】
ここでは、ＰｈａｒｍａＪｅｔとＩＤ／ＥＰを使用して、ｐｐ６５＋ＩＬＣ−１  ＬＡＭＰ構築物とｇＢ＋ＩＬＣ−１  ＬＡＭＰワクチンを比較する。
【０３５８】
材料および方法
【０３５９】
試薬  プラスミド構築物コントロール、ｐｐ６５＋ＩＬＣ−１  ＬＡＭＰ構築物、およびｇＢ＋ＩＬＣ−１  ＬＡＭＰは本明細書に記載するように構築した。ＥＬＩＳＰＯＴのｐｐ６５およびｇＢペプチドはＪＰＴから購入した（純度７０％）。ＲＢＣ溶解緩衝液はＴｏｎｂｏＢｉｏから購入し、０．２２μｍフィルターで濾過した。ＣｏｎＡ（Ｓｉｇｍａ）を２．５ｕｇ／ｍｌで使用した。ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴの抗体は、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅまたはＢｉｏｌｅｇｅｎｄから購入した。ＩＬ−１０  ＥＬＩＳＰＴＯ試薬、ＳＡ−ＡＬＰおよびＢＣＩＰ／ＮＢＴ  ｐｌｕｓはＭａｂＴｅｃｈから購入した。Ａｂ抗体価は、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ＢｉｏｔｅｃｈのＨＲＰ抗マウス抗体を使用して評価した。ＣＭＶに感染した細胞のライセートはＶｉｒｕｓｙｓから購入した。ライセートは製造会社により非感染性であることが確認された。
【０３６０】
免疫化および血漿採取  ６〜８週齢の雄のＢＡＬＢ／ＣマウスをＩｍｍｕｎｏｍｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｉｎｃ．の動物施設で繁殖させ飼育した。０、７、および１４日目に、ＩＤ（Ｐｈａｒｍａｊｅｔ）またはエレクトロポレーションを介した皮内投与によりマウスをワクチンで免疫化した。２６日目にマウスを屠殺した。
【０３６１】
ＥＬＩＳＰＯＴ。ＥＬＩＳＰＯＴは、細胞数を除いて、本明細書に記載するように実行した：細胞はウェルあたり２×１０５個の脾細胞を播種した。屠殺したマウスの脾臓を培地で洗い流し、赤血球を溶解し、セルメーターを使用して細胞をカウントした。ＥＬＩＳＰＯＴのウェルごとに２×１０５個の脾細胞を播種し、培地（ＨＥＰＥＳ＋１０％ＨＩ同量のＦｅｔａｌ＋ＮａＰ＋βＭＥ＋Ｐ／Ｓを含むＲＰＭＩ）、ＰＰ６５およびｇＢペプチド（各ペプチド１μｇ／ｍｌ）またはＣｏｎＡ（２．５ｕｇ／ｍｌ）の複製でインキュベートした。結果は、各マウスの複製を平均化し、ＲＰＭＩからの値を適切に減らした後に表示されている。
【０３６２】
抗体価  ＣＭＶに感染した細胞のライセートを使用して抗体価を評価した。総ＩｇＧおよびＩｇＧ２ａを評価した。結果は総ＩｇＧについてのみ計算し、１：１００  ＯＤの結果のみを比較した。
【０３６３】
結果  図２４は、ＩＦＮγがｐｐ６５およびｇＢペプチドの両方で誘導されたことを示す。さらに、最後の採血から血清Ａｂを試験した。ＣＭＶトランスフェクト細胞のライセートを使用した場合、両方の免疫化で同様のＩｇＧ力価が見られる。具体的には、図２５は、ＣＭＶトランスフェクト細胞ライセートに対する免疫マウスの血清中の総ＩｇＧ（左）およびＩｇＧ２ａ（右）抗体の力価を示す。統計分析は、Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙの検定を使用して、ＧｒａｐｈＰａｄプリズムで行った。ＩｇＧ２ａ  ＣＭＶライセートＡｇ−Ｐ＝０．０４１
【実施例１１】
【０３６４】
ＰＳＭＡを含むＬＡＭＰ構築物
前立腺癌は、男性で最も頻繁に診断される癌であり、米国では男性の癌による死亡の２番目に多い原因である１。局在性疾患の場合、手術と放射線療法は治癒的な治療法であり続けるが、尿路症状や性機能障害などの悪影響があり、生活の質に悪影響を及ぼす可能性がある。転移性疾患の場合、初期治療としての化学療法は現在、アンドロゲン除去療法単独（ＡＤＴ）２と比較して生存期間を延長するように見える。ＡＤＴは、ａ）骨ミネラル密度の減少と骨粗鬆症による脆弱性骨折のリスク増加、ｂ）去勢抵抗性前立腺癌（ＣＲＰＣ）の発生に関連する。免疫系を利用して前立腺癌細胞を認識し殺す方法が開発されている。そのような試みの１つは、無症候性または最小症候性の転移性ＣＲＰＣ（ｍＣＲＰＣ）３の治療のために前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）を標的とするＦＤＡ承認の自己細胞免疫療法であるＳｉｐｕｌｅｕｃｅｌ−Ｔにつながっている。前立腺癌に対するさらなる免疫療法は、多くのワクチン候補、および標的モノクローナル抗体を使用するアプローチを含めて開発中である４，５。
【０３６５】
Ｔ細胞または抗体ベースの免疫療法の有望な標的を表すいくつかの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）が特定されている。正常および悪性の前立腺組織で優先的に発現される分子群は、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＰＲＯＳＴＥＩＮ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、Ｔ細胞受容体γ代替リーディングフレームタンパク質（ＴＡＲＰ）、一過性受容体電位（ｔｒｐ）−ｐ８および前立腺１の６回膜貫通上皮抗原（ＳＴＥＡＰ１）を含む。
【０３６６】
葉酸ヒドロラーゼＩ（ＦＯＬＨ１）としても知られるヒト前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）は、７５０アミノ酸のＩＩ型膜糖タンパク質であり、主に正常なヒト前立腺上皮で発現し、転移性疾患を含む前立腺癌で上方制御される。ＰＳＭＡのマウス相同体（Ｆｏｌｈ１）は、マウスの前立腺では発現しないが、主に脳と腎臓で発現する。マウスＦｏｌｈ１は、ヒトＰＳＭＡのアミノ酸配列と８６％の同一性と９１％の類似性を有する７５２アミノ酸のタンパク質をコードする６。ＰＳＭＡは、前立腺細胞で他の組織の細胞よりもはるかに多く発現するため、前立腺の重要な臨床バイオマーカーと考えられている７、８、９。ＰＳＭＡ発現の増加と前立腺癌の進行との間に強い相関関係が示されている１０。ＰＳＭＡ発現の上昇は、腎臓癌および膀胱癌を含む他の悪性腫瘍とも関連している１１。ＰＳＭＡ発現の上昇は腫瘍の新生血管で観察されているが、正常な血管では観察されず血管新生におけるＰＳＭＡの役割を示唆している１２。膜タンパク質であるＰＭＳＡは、診断および治療目的でそれに対する抗体を開発するための魅力的な標的である１３。いくつかの治療用抗ＰＳＭＡ  ｍＡｂが開発されており、これらの多くは細胞傷害性放射性ヌクレオチド、特にＰＳＭＡ発現細胞を標的とする放射免疫療法に使用されている１４。いくつかの抗ＰＳＭＡ  ｍＡｂｓは、前立腺癌細胞を殺す抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）効果を促進することにより、治療効果を媒介することが実証されている４、１４、１５
【０３６７】
材料および方法
【０３６８】
マウス  ６〜８週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６アルビノマウスをＥｎｖｉｇｏから購入し、Ｉｍｍｕｎｏｍｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｉｎｃ．（マサチューセッツ州ロックビル）の動物施設で飼育した。
【０３６９】
試薬および抗体  コントロールおよびＰＳＭＡ−ＩＬＣ−１  ＬＡＭＰ構築物は、本明細書に記載するように作製した。ヒトＰＳＭＡ  ＰｅｐＭｉｘ（１８５ペプチド、１１ａａオーバーラップを有する１５マー）はＪＰＴ（マサチューセッツ州アクトン）から入手した。マウス抗ヒトＰＳＭＡ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ  ４８８、ヤギ（Ｆａｂ）２抗マウスＩｇＧ−Ｆｃ  ＰＥはａｂｃａｍ（マサチューセッツ州ケンブリッジ）から、ウサギ抗ヒトＬＡＭＰはＳｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ（中国、北京）から入手した。ヤギ抗ウサギＨＲＰ、ヤギ抗マウスＩｇＧ１−ＨＲＰおよびヤギ抗マウスＩｇＧ２ａ−ＨＲＰは、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（アラバマ州バーミンガム）から購入した。ストレプトアビジン−ＨＲＰは、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ（マサチューセッツ州ウォルサム）から購入した。ＳｕｒｅＢｌｕｅ  ＴＭＢマイクロウェルペルオキシダーゼ基質およびＴＭＢ停止液は、ＫＰＬ（メリーランド州ゲーサーズバーグ）から購入した。ＩＦＮｇのＥＬＩＳＰＯＴ抗体ペアはＢｉｏＬｅｇｅｎｄから入手した。
【０３７０】
ワクチンおよび免疫化  コントロールベクターであるＰＳＭＡ−ＩＬＣ−１  ＬＡＭＰ構築物は、２０μｌ／マウス／用量の総量で使用した。０日目および２１日目にエレクトロポレーションを介した皮内投与によりマウスをワクチンで免疫化した。血清を採取し、−３０ｏＣで保存した。３４日目にＥＬＩＳＰＯＴ／ＥＬＩＳＡアッセイのために脾臓を採取した。
【０３７１】
抗原特異的Ｔ細胞応答の評価  ワクチン接種マウスの抗原特異的Ｔ細胞応答を評価するために、ワクチン接種マウスの脾細胞を酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）により抗原特異的ＩＦＮγおよびＩＬ−１０について評価した。脾細胞からＲＢＣを除去し、平底９６ウェルプレートで２００μｌ／ウェルのＴ細胞培地（Ｌ−グルタミンおよびＨＥＰＥＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０（ＡＴＣＣ）、１％ペニシリン、１％ストレプトマイシン、および５ｘ１０−５Ｍ  ２−ＭＥ）４ｘ１０５細胞／ウェル、および１０μｇ／ｍｌ  ＩＧＦＢＰ２（３９−３２８）タンパク質またはコンカバリンＡ（０．２５μｇ／ｍｌ）、または培地のみを３７ｏＣ％、５％ＣＯ２で７２時間共培養した。プレートを１６００  ｒｐｍで６分間遠心分離し、上清を収集して−３０ｏＣで保存した。
【０３７２】
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイについては、本明細書に記載のとおりに実施した。簡単に説明すると、９６ウェルニトロセルロースプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を３０ｕｌの３５％エタノールで１分間活性化し、ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ中のキャプチャーモノクローナル抗体５０μｌ／ウェルで４ｏＣで一晩コーティングした。プレートを２００μｌ／ウェルのＰＢＳで３回洗浄し、２００μｌ／ウェルのＴ細胞培地で室温で少なくとも２時間ブロックした。脾細胞を３ｘ１０５細胞／ウェルで播種し、総量２００μｌ／ウェルのＴ細胞培地中、ＰＳＭＡ用の１０、５、２、１、０．１、０．０１μｇ／ｍｌ  ＰＳＭＡ  ＪＰＴペプチド混合物またはコンカバリンＡ（０．２５μｇ／ｍｌ）または培地単独で５％ＣＯ２、３７ｏＣで４８時間共培養した。プレートを洗浄し、希釈した検出抗体（５０μｌ／ウェル）を加え、プレートをシェーカー上で室温で２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳで４回洗浄した。ＰＢＳで希釈したストレプトアビジン−ＨＲＰ（５０μｌ／ウェル）を添加し、１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳで洗浄し、５０μｌ／ウェルのＡＥＣ発色液で最大３０分間発色させた。水道水の流水で洗浄することにより発色を停止させた。暗所の室温で２４〜７２時間乾燥させた後、ＡＩＤ  ＥＬＩＳＰＯＴ高解像度リーダーシステムおよびＡＩＤ  ＥＬＩＳＰＯＴソフトウェアバージョン３．５（Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ  ＧｍｂＨ）を使用して、着色スポットをカウントした。
【０３７３】
ＥＬＩＳＡによる血清ＰＳＭＡ特異的ＩｇＧ／ＩｇＧ２ａおよびＰｒｏｓｔｅｉｎ特異的ＩｇＧ／ＩｇＧ２ａの測定。ＰＳＭＡに対するマウス抗体応答を間接ＥＬＩＳＡによって評価した。ＥＬＩＳＡプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ）を炭酸‐重炭酸塩緩衝液中の５ｕｇ／ｍｌのＰＳＭＡタンパク質で一晩コーティングし、次にＰＢＳ中の２％ＢＳＡでブロックした。血清試料をＰＢＳ−Ｔで希釈した（１：１００、１：３００、１：９００、１：２７００、１：８１００、１：２４３００、１：７２９００、１：２１８７００）。試料を１：６０００ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰまたは１：１１０００ヤギ抗マウスＩｇＧ２ａ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、アラバマ州バーミンガム）で検出し、続いてストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、イリノイ州ロックフォード）で検出した。反応はＳｕｒｅＢｌｕｅ  ＴＭＢ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅで発生させ、ＫＰＬ（メリーランド州ゲーサーズバーグ）のＴＭＢ  Ｓｔｏｐ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで停止させた。Ｅｐｏｃｈ  ＥＬＩＳＡリーダー（ＢｉｏＴｅｋ、バーモント州ウィヌースキー）を使用して、プレートを読み取った（ＯＤ４５０）。平均バックグラウンド（ＰＢＳのみ）を計算し、平均バックグラウンド２＊を超えるＯＤ４５０値を有する試料を陽性と見なした。そのような試料の希釈を終点力価として測定する。
【０３７４】
細胞内サイトカインの評価  サイトカインの産生に関与する細胞を決定するために、細胞内染色を実施した。ＲＢＣを除去した脾臓細胞を冷蔵庫に２４時間保管した。翌日、脾細胞を平底９６ウェルプレートで、２００ｕｌ／ウェルのＴ細胞培地（Ｌ−グルタミンおよびＨＥＰＥＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０（ＡＴＣＣ）、１％ペニシリン、１％ストレプトマイシン、および５ｘ１０−５Ｍ  ２−ＭＥ）３ｘ１０６細胞／ウェル、および２ｕｇ／ｍｌ  ＰＳＭＡ（ＪＰＴペプチドミックス）、または培地のみを共培養した。１時間後にブラフェルジンＡとモネンシン（Ｘ１０００）の混合物を各ウェルに２０ｕｌの容量で加えた（２０ｕｌの容量に対して各ウェル０．２２ｕｌ、すべてのウェルについてストックを準備）。ＰＭＡ／イオノマイシン活性化カクテルをＢＦＡおよびモネンシンと共に陽性対照ウェルに加えた（２つのウェルを設定し、１つはＩｇＧコントロール用、もう１つはサイトカイン染色用であった）。細胞を５％ＣＯ２で３７ｏＣで合計６時間インキュベートした。
【０３７５】
Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ染色（このステップではタンパク質なし）：細胞を２００μｌのＰＢＳで洗浄した（この洗浄にはタンパク質なし）。細胞を５０ｕｌの希釈したｚｏｍｂｉｅ  ａｑｕａ染料（ｚｏｍｂｉｅ  ａｑｕａをＰＢＳで１：５００希釈）で染色し、遮光し室温で２０分間インキュベートした（このステップではタンパク質なし）。細胞をＰＢＳ中の２％血清で１回洗浄した。
【０３７６】
Ｆｃブロック：２０ｕｌの精製抗マウスＣＤ１６／３２ｍＡｂ（クローン２．４Ｇ２；１ｕｇ／２０ｕｌ）を細胞に加え、細胞を４ｏＣで１０分間インキュベートした。
【０３７７】
表面染色：細胞を遠心分離し（２０００ｒｐｍ、６分）、上清をデカントし、２％血清を添加したＰＢＳに細胞外抗体を加えた。抗体は各０．３ｕｌ／ウェルであった。Ａｂｓを５０μｌ／ウェルｌの量で加え、４ｏＣで３０分間インキュベートした
（ＣＤ３クローン１７Ａ２はＴ細胞を活性化できるため、４ｏＣの温度が重要である）。
【０３７８】
固定および透過処理：細胞をＰＢＳ＋タンパク質（２％ＦＣＳ）で洗浄し、１００μｌのＣｙｔｏＦｉｘ／ＣｙｔｏＰｅｒｍ溶液で４ｏＣで３０分間固定および透過処理した（固定緩衝液を加えるときにマルチチャネルと完全に混合し、凝集体とダブレットの形成を減らした）。細胞を２００μｌのＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液（１Ｘ）で２回洗浄した（２０００ｒｐｍ、６分）。
【０３７９】
細胞内染色：細胞をＰｅｒｍ緩衝液中０．５μｌ  Ａｂ／ウェルの細胞内染色Ａｂで染色した。ＰＭＡ／イオノマイシンウェルの１つをアイソタイプコントロールで染色した。１時間（または一晩）インキュベーション後、細胞をＰｅｒｍ緩衝液で２回洗浄し、フローサイトメーターで細胞を取得した。取得中のイベント／秒は８０００未満であった。試料あたり１０６個を超える細胞を取得した。
【０３８０】
取得したデータは、Ｋａｌｕｚａ分析ソフトウェアを使用して分析した。死細胞とダブレットはゲートアウトした。
【０３８１】
統計  統計分析は、Ｐｒｉｓｍ  ６ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、カリフォルニア州ラホーヤ）を使用して実行した。データは、１因子ＡＮＯＶＡの後、多重比較のためテューキー検定で分析した。０．０５未満のρ値が統計的に有意な差を示すと見なした。
【０３８２】
図２６は、ＰＳＭＡ−ＩＬＣ−１  ＬＡＭＰ構築物が、２０μｇ  ＩＤ／ＥＰ免疫化の用量で有意に高いＩＦＮγ産生エフェクターＴ細胞を誘導したことを示す。脾細胞（３ｘ１０５／ウェル）を、Ｔ細胞培地（１０％熱不活性化ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、および１Ｘ２−ＭＥを含むＲＰＭＩ）中のＪＰＴ製ＰＳＭＡペプチドミックス（２、１、０．１、０．０１、０．００１ｕｇ／ｍｌ）で４８時間刺激した。ドットプロットの値は実験的なもので、各マウスの培地である。Ｎ＝マウス７匹／群。ドットプロットはＰＳＭＡでのリコールを示す。
【０３８３】
図２７は、ＰＳＭＡ−ＩＬＣ−１  ＬＡＭＰ構築物が、２０ｕｇ  ＩＤ／ＥＰ免疫化の用量でＣＤ４＋およびＣＤ８＋エフェクター記憶Ｔ細胞を産生するＩＦＮγを誘導したことを示す。脾細胞（３ｘ１０５／ウェル）を、Ｔ細胞培地（１０％熱不活性化ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、および１Ｘ２−ＭＥを含むＲＰＭＩ）中のＰＳＭＡペプチド（ＪＰＴ、２ｕｇ／ｍｌ）で６時間刺激した。細胞を、説明したように細胞内サイトカインについて染色し、以下に示すように分析した。個々のマウスからのデータを示す。
【０３８４】
図２８は、ＩＤ／ＥＰを介した免疫化によりＰＳＭＡ−ＩＬＣ−１  ＬＡＭＰ構築物で免疫したＣ５７ＢＬ／６マウスの総ＩｇＧおよびＩｇＧ２Ａ産生を示す。ＩｇＧは、血漿中のＥＬＩＳＡによって測定した。簡単に説明すると、ＥＬＩＳＡプレートを炭酸‐重炭酸塩緩衝液中の５μｇ／ｍｌのＰＳＭＡでコーティングし、２％ＢＳＡでブロックし、ＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（１：６０００）で血清（ＰＢＳ−Ｔで１：１００希釈）を評価した。
【０３８５】
本明細書に記載されているものの変形、修正、および他の実装は、本発明および特許請求の範囲の趣旨および範囲から逸脱することなく、当業者に思い浮かぶであろう。特定されたすべての特許、特許出願、国際出願、および参考文献は、参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれる。
【図１】
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【図２Ａ−１】
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【図２Ａ−２】
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【図２Ｂ】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図４−６】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２０−３】
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【図２０−４】
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【図２０−５】
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【図２０−６】
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【図２０−７】
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【図２０−８】
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【図２０−９】
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【図２０−１０】
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【図２０−１１】
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【図２０−１２】
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【図２０−１３】
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【図２０−１４】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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