(57)【要約】  本発明は、化学及び製薬産業に関する。特異的クラスリン阻害剤としての合成ペプチドの使用が提案される。また、特異的クラスリン阻害剤として、有効量のペプチド又はプロドラッグ又は生理学的に許容される塩又は上記ペプチドの溶媒和物、又は上記のペプチドを含む医薬組成物を投与することを含む、動物の疾患又は状態の予防又は治療方法も提案される。ペプチドは、医学、獣医学、薬理学において、特異的クラスリン阻害剤である新薬を開発するために使用できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（I）（配列番号１）の合成ペプチド、
XDL-XDL1-XDL2-L-Lys-L-Leu-XDL3-L-Thr-R2（I）、
ここで：
XDLはアミノ酸の欠如又はL-Tyrであり、
XDL1はL-Leu、L-Ala又はD-Alaのいずれか１つのアミノ酸であり、
XDL2はL-His、D-His、L-Ala又はD-Alaのいずれか１つのアミノ酸であり、
XDL3はL-Gln、L-Ala又はD-Alaのいずれか１つのアミノ酸であり、
R2はOMe又はNH2である、
又は一般式（II）（配列番号２）に示す式（I）の、L型アミノ酸がD型に、D型アミノ酸がL型に置換された逆のアミノ酸配列を有するレトロ反転ペプチド、
D-Thr-XDL4-D-Leu-D-Lys-XDL5-XDL6-XDL7-R2（II）
ここで：
XDL4はD-Gln、D-Ala又はL-Alaのいずれか１つのアミノ酸であり、
XDL5はD-His、L-His、D-Ala又はL-Alaのいずれか１つのアミノ酸であり、
XDL6はD-Leu、D-Ala又はL-Alaのいずれか１つのアミノ酸であり、
XDL7はアミノ酸の欠如又はD-Tyrであり、
R2はOMe又はNH2である、
のクラスリンの特異的阻害剤としての使用。
【請求項２】
有効量の一般式（I）（配列番号１）若しくは一般式（II）（配列番号２）の合成ペプチド、又はそのプロドラッグ、又は前述のペプチドの生理学的に許容される塩又は溶媒和物、又はクラスリンの特異的阻害剤として上記ペプチドを含む医薬組成物、を投与することを含む、動物の疾患又は状態を予防又は治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生化学に関し、より具体的には、クラスリンの特異的阻害剤であり、及びクラスリンの阻害に応答する又はクラスリンの阻害が必要とされる様々な疾患及び生理学的状態の予防又は治療のための薬物としての医学的又は薬理学的な用途を見出すことができる生理活性ペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書で使用される「クラスリン」という用語は、細胞内タンパク質を意味し、これは、受容体介在性エンドサイトーシス中に形成されるシェルによって境界のある小胞の膜の主成分である（McMahon, Boucrot, 2011）。
【０００３】
古典的には、クラスリンは3つのクラスリン重鎖（〜190kDa）で構成され、それぞれが軽鎖（〜25kDa）に密接に結合している。重鎖は、17番染色体（重鎖C17）と22番染色体（重鎖C22）上の2つの遺伝子によってエンコードされる。後者は主に筋肉に発現するが、C17は全ての細胞の全てのクラスリンに発現する。しかし、2つの重鎖は高度な相同性（95％のアミノ酸配列の重複）を有し、機能的に同等である（Hood, Royle, 2009）。
【０００４】
重合の結果、クラスリンは球体に似た閉じた3次元ネットワークを形成し、約100nmのサイズの被覆小胞を形成する。小胞の形成及び小胞の膜からの分離（GTP分解酵素ダイナミンの影響により）の後、クラスリン膜は急速に解離し、クラスリンはエンドサイトーシス及びエキソサイトーシスに再利用される。このプロセスは、リガンドの特異的レセプターとの相互作用によって促進される（McMahon, Boucrot, 2011）。重鎖のクラスリン活性の停止が、クラスリン複合体の活性の低下を伴うため基本的に重要である（Haar ter, Harrison, Kirchhausen, 2000）。
【０００５】
クラスリンのエンドサイトーシスの結果、受容体だけでなく、他の代謝産物、即ちホルモン、神経伝達物質、様々なタンパク質が細胞に入る（Most et al., 2003）。また、クラスリンのエンドサイトーシスの結果、様々な病原体、即ちウイルス、毒素、共生微生物などが細胞内に入る。例えば、ボツリヌス神経毒と破傷風神経毒は、破傷風とボツリヌス中毒の2つの深刻な病気を引き起こす細菌タンパク質である。それらの作用は、神経毒の神経終末へのエンドサイトーシスによる内在化に依存する（Pellett et al., 2015）。
【０００６】
クラスリンの阻害剤である様々な医薬がある。それらの全ては、医療での使用の可能性を制限するいくつかの欠陥がある。
【０００７】
特に、クラスリンの末端ドメインの一つ以上のアミノ酸、例えば、Ile52、Ile62、Ile80、Phe91及び／又はIle93に結合する合成製剤が知られている(国際公開第2013/010218号; Robertson et al., 2014)。それらの化合物の大きな欠点は特異性の欠如である（Willox, Sahraoui, Royle, 2014）。
【０００８】
また、クラスリンペプチドの阻害剤として、Thr-Pro-Val-Leu-Glu-Thr-Pro-Lys-Leu-Leu-Leu-Trp（特開2009‐250552号公報）も知られている。しかし、この場合、この提案された12の構成要素を含む阻害剤配列は、直接作用する阻害剤ではなく、クラスリンと結合しない特性を持つGRP78タンパク質を阻害するものである。従って、特異性の欠如がこの化合物にとっても問題になる。さらに、これらの提案されたアミノ酸は天然のL型アミノ酸のみで構成され、それ故、エンドペプチダーゼに感受性であり、生体内での使用の可能性が制限される。
【０００９】
このような欠陥を実験により解消するために、非麻薬性鎮痛作用を有する合成ペプチド（過去にはロシア特許（RF patent）第2508295号、米国特許第9260482号 (国際公開第2013/141750, 2013),で保護されていた）が様々な処方（後頭下、筋肉内、鼻腔内及び静脈注射）で、急性及び持続性疼痛の様々なモデルに効果的であり、特異的クラスリン阻害剤であることが発見された。
【００１０】
この開発されたペプチド配列が、テトラサイクリン結合試験によるカルシウム代謝に影響を与えないこと、免疫効果を持たないこと、溶液中で小繊維を形成しないこと、保存の間安定なこと、安価に製造できることを、我々は以前にも示している（ロシア特許第2508295号）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第2013/010218号、Inhibition of clathrin / Volker H., Robinson P., Mccluskey A. (公開日：01.24.2013)
【特許文献２】特開2011-093825号公報、Clathrin-bonding peptide derivative / Kitahara H. et al.（公開日：05.12.2011）
【特許文献３】国際公開第2013/141750号、Synthetic peptides with a non-narcotic type of analgesic effect, 2013
【特許文献４】ロシア特許（RF patent）第2508295号公報、synthetic peptides with non-narcotic type analgesic action / Vlasov GP, Kotin AM / Bull., 2013, No.27.
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】McMahon NT, Boucrot E., "Molecular mechanism and physiological functions of clathrin-mediated endocytosis", Nat Rev Mol Cell Biol. 2011. V. 12. No.8. pp. 517-533.
【非特許文献２】Hood FE, Royle SJ., "Functional equivalence of the clathrin heavy chains CHC17 and CHC22 in endocytosis and mitosis", J. Cell Sci. 2009. V. 122. No.13. pp. 2185-2190.
【非特許文献３】McMahon HT, Boucrot E., "Molecular mechanism and physiological functions of clathrin-mediated endocytosis", Nat Rev Mol Cell Biol. 2011. V. 12. No.8. pp. 517-533.
【非特許文献４】Haar E. ter, Harrison SC, Kirchhausen T., "Peptide-in-groove interactions link target proteins to the beta-propeller of clathrin.", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000. V. 97. No.3. pp. 1096-1100.
【非特許文献５】Most P. et al., "Extracellular S100A1 Protein Inhibits Apoptosis in Ventricular Cardiomyocytes via Activation of the Extracellular Signal-regulated Protein Kinase 1/2 (ERK1/2)", J. Biol. Chem. 2003. V. 278. No.48. pp. 48404-48412.
【非特許文献６】Pellett S. et al., "Botulinum neurotoxins can enter cultured neurons independent of synaptic vesicle recycling", PLoS One. 2015. V. 10. No.7. pp. 1-17.
【非特許文献７】Robertson MJ et al., "Synthesis of the Pitstop family of clathrin inhibitors.", Nat. Protoc. 2014. V9. pp. 1592.
【非特許文献８】Willox AK, Sahraoui YME, Royle SJ., "Non-specificity of Pitstop 2 in clathrin-mediated endocytosis.", Biol. Open. 2014. V. 3. No.5. pp. 326-31.
【非特許文献９】Aridor M., Hannan L. a., "Traffic jams II: an update of diseases of intracellular transport.", Traffic. 2002. V. 3. No.11. pp. 781-790.
【非特許文献１０】Aridor M., Hannan LA., "Traffic Jam: A Compendium of Human Diseases that Affect Intracellular Transport Processes", Traffic. 2000. V. 1. No.11. pp. 836-851.
【非特許文献１１】Harold D. et al., "Genome- Wide Association Study Identifies Variants at CLU and PICALM Associated with Alzheimer's Disease, and Shows Evidence for Additional Susceptibility Genes", Nat. Genet. 2009. V. 41. No.10. pp. 1088-1093.
【非特許文献１２】Edvardson S. et al., "A deleterious mutation in DNAJC6 encoding the neuronal- specific clathrin-uncoating Co-chaperone auxilin, is associated with juvenile parkinsonism", PLoS One. 2012. V. 7. No.5. pp. 4-8.
【非特許文献１３】Casillas-Espinosa PM, Powell KL, O'Brien TJ., "Regulators of synaptic transmission: roles in the pathogenesis and treatment of epilepsy.", Epilepsia. 2012. V. 53 Suppl 9. pp. 41-58.
【非特許文献１４】Nowack A. et al., "Levetiracetam reverses synaptic deficits produced by overexpression of sV2A", PLoS One. 2011. V. 6. No.12. pp. 1-8.
【非特許文献１５】Richards BL, Whittle SL, Buchbinder R., "Neuromodulators for pain management in rheumatoid arthritis.", Cochrane database Syst. Rev. V. 1. No.1. pp. CD008921.
【非特許文献１６】Nahorski MS et al., "A novel disorder reveals clathrin heavy chain-22 is essential for human pain and touch development", Brain. 2015. 138. V. 138. No.8. pp. 2147-2160.
【非特許文献１７】Escobar GA et al., "Clathrin heavy chain is required for TNF-induced inflammatory signaling", Surgery. 2006. V. 140. No.2. pp. 268-272.
【非特許文献１８】Kim ML, Sorg I., Arrieumerlou C., "Endocytosis-independent function of clathrin heavy chain in the control of basal NF-κΒ activation", PLoS One. 2011. V. 6. No.2.
【非特許文献１９】Booth DG et al., " A TACC3/ch-TOG/clathrin complex stabilises kinetochore fibres by inter-microtubule bridging.", EMBO J. 2011. V. 30. No.5. pp. 906-19.
【非特許文献２０】Smith SM. et al., "Inhibition of clathrin by pitstop 2 activates the spindle assembly checkpoint and induces cell death in dividing HeLa cancer cells.", Mol. Cancer. 2013. V.12. pp. 4.
【非特許文献２１】Anantpadma M. et al., "Large-Scale Screening and Identification of Novel Ebola Virus and Marburg Virus Entry Inhibitors", 2016. V. 60. No.8. pp. 4471-4481.
【非特許文献２２】Aleksandrowicz P. et al., "Ebola virus enters host cells by macropinocytosis and clathrin-mediated endocytosis", J. Infect. Dis. 2011. V. 204. No. SUPPL. 3. pp. 957-967.
【非特許文献２３】Piccini LE, Castilla V., Damonte EB., "Dengue-3 virus entry into vero cells: Role of clathrin-mediated endocytosis in the outcome of infection", PLoS One. 2015. V. 10. No.10. pp. 1-17.
【非特許文献２４】Day ED, Hashim GA., "Affinity purification of two populations of antibodies against format determinants of synthetic myelin basic protein peptide S82 from S82-AH- and S82-CH-Sepharose 4B columns.", Neurochem. Res. 1984. V. 9. No.10. pp. 1453-65.
【非特許文献２５】Lowe CR., "Immobilised lipoamide dehydrogenase. 2. Properties of the enzyme immobilised to agarose through spacer molecules of various lengths.", Eur. J. Biochem. 1977. V. 76. No.2. pp. 401-9.
【非特許文献２６】Martinez-Ceron MC et al., "Recombinant protein purification using complementary peptides as affinity tags", N. Biotechnol. 2012. V. 29. No.2. pp. 206-210.
【非特許文献２７】サーモフィッシャーサイエンティフィック社の公式ウェブサイト／[電子リソース]アクセス：URL：https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26634、参照日：03.17.2017
【非特許文献２８】Riddelle-Spencer KS, O'Halloran TJ., "Purification of clathrin heavy and light chain from Dictyostelium discoideum.", Protein Expr. Purif. 1997. V. 11. No.3. pp. 250-6.
【非特許文献２９】Santos T. dos et al., "Effects of transport inhibitors on the cellular uptake of carboxylated polystyrene nanoparticles in different cell lines.", PLoS One. 2011. V. 6. No.9. pp. e24438.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明が解決しようとする課題は、副作用がなく、容易に合成することができるクラスリンの特異的阻害剤の種類の範囲を拡大することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
課題は以下の事実によって解決される。
この結果を得るために、一般式（I）（配列番号１）の合成ペプチド、
XDL-XDL1-XDL2-L-Lys-L-Leu-XDL3-L-Thr-R2（I）、
ここで：
XDLはアミノ酸の欠如又はL-Tyrであり、
XDL1はL-Leu、L-Ala又はD-Alaのいずれか１つのアミノ酸であり、
XDL2はL-His、D-His、L-Ala又はD-Alaのいずれか１つのアミノ酸であり、
XDL3はL-Gln、L-Ala又はD-Alaのいずれか１つのアミノ酸であり、
R2はOMe又はNH2であり、
又は一般式（II）（配列番号２）に示す式（I）の、L型アミノ酸がD型に、D型アミノ酸がL型に置換された逆のアミノ酸配列を有するレトロ反転ペプチド、
D-Thr-XDL4-D-Leu-D-Lys-XDL5-XDL6-XDL7-R2（II）
ここで：
XDL4はD-Gln、D-Ala又はL-Alaのいずれか１つのアミノ酸であり、
XDL5はD-His、L-His、D-Ala又はL-Alaのいずれか１つのアミノ酸であり、
XDL6はD-Leu、D-Ala又はL-Alaのいずれか１つのアミノ酸であり、
XDL7はアミノ酸の欠如又はD-Tyrであり、
R2はOMe又はNH2である、
のクラスリンの特異的阻害剤としての使用が提案される。
【００１５】
また、一般式（I）（配列番号１）若しくは一般式（II）（配列番号２）の合成ペプチド、又はそれらのプロドラッグの有効量、又は前述のペプチドの生理学的に許容される塩又は溶媒和物、又はクラスリンの特異的阻害剤として上記ペプチドを含む医薬組成物、を投与することを含む、動物の疾患又は状態を予防又は治療する方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ペプチドのクロマトグラム（6つのアミノ酸からなる配列）。
【図２】タンパク質画分の溶出。
【図３】主要タンパク質化合物。
【図４】ゲル電気泳動中の概算質量を決定するための多色タンパク質プロファイル（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）（サーモフィッシャーサイエンティフィック社の公式ウェブサイトから取得）／[電子リソース]。アクセスモード：URL：https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26634、アクセス日：03.17.2017）。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
クラスリンの機能の阻害が重要な役割を果たす疾患が以下の表1にリストされる。
【表１−１】
2020512996.tif 000002
【表１−２】
2020512996.tif 000003
【表１−３】
2020512996.tif 000004
【表１−４】
2020512996.tif 000005
【表１−５】
2020512996.tif 000006
【表１−６】
2020512996.tif 000007
【表１−７】
2020512996.tif 000008
【表１−８】
2020512996.tif 000009
【表１−９】
2020512996.tif 000010
【表１−１０】
2020512996.tif 000011
【００１８】
本発明の本質は、単純な構造を有する特許請求されたペプチド（それは化学的手段による調製を容易にする）がクラスリンの特異的阻害剤であることを実験的に確立したという事実からなる。
【００１９】
本明細書で使用される「クラスリンの阻害剤」という用語及びその変形は、クラスリンと相互作用し、クラスリン介在性エンドサイトーシス（CME）におけるクラスリン活性の機能を少なくとも部分的に阻害し、細胞におけるCME及び／又はCMEのレベルを減少させることができる化合物を意味する。従って、本発明によるクラスリンの阻害は、クラスリンの機能的活性の完全な阻害又は部分的な阻害であり得る。
【００２０】
クラスリンを介したエンドサイトーシス（CME）は、細胞内の代謝産物の移動だけでなく、細胞の伝達シグナルにとっても重要であり、クラスリンの機能の阻害は、さまざまな疾患又は状態の予防又は処置に応用されている。クラスリン機能の阻害が重要な役割を果たす疾患のリストは、以前に文献に公開されており（Aridor, Hannan, 2002; Aridor, Hannan, 2000）、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００２１】
特に、クラスリン機能の阻害剤は、アルツハイマー病（Harold et al, 2009）、パーキンソン病（Edvardson et al, 2012）、癲癇（Casillas-Espinosa, Powell, O'Brien, 2012）を含む中枢神経系の多くの疾患に適用できる。クラスリンに関連するプロセスの阻害メカニズムに作用する新しい抗癲癇薬の例は、レベチラセタム（Keppra（登録商標））（Nowack et al., 2011）である。クラスリンの遮断によるクラスリン介在性エンドサイトーシスの阻害により、シナプス伝達が減少し、痛みの予防処置に使用されるシナプス小胞が低下する。例えば、フェニトインやガバペンチンなどの抗痙攣薬は、神経因性疼痛の治療に非常に効果的である（Richards, Whittle, Buchbinder, 2012）。
【００２２】
これらの薬物は、シナプス小胞の伝達プロセスを変化させることによって作用する、即ち、CMEクラスリンを遮断することによる阻害は、痛み信号の伝達を停止又は制限し、それによって痛みの感覚を改善又は軽減することができる。また、特に興味深いのは、クラスリンの重鎖の突然変異の1つが、人々の稀な病気（痛みと触覚感度の喪失（Nahorski et al., 2015.））を引き起こすということ、並びに炎症の強度、及びその結果、疼痛反応はクラスリン重鎖に依存している(Escobar et al., 2006; Kim, Sorg, Arrieumerlou, 2011)という証拠である。
【００２３】
実際、本明細書に記載されるように、CMEを阻害することにより影響を受ける可能性のある生理学的障害の予防又は処置は、本発明によって直接カバーされる。
【００２４】
また、非常に重要なのは、がんにおける過剰な細胞増殖に影響するクラスリンを阻害する能力である。有糸分裂タンパク質と相互作用するいくつかの現在知られている阻害剤は、現在、がんの治療薬として前臨床試験又は臨床試験中である。これらの阻害剤の抗有糸分裂効果は、クラスリンの有糸分裂機能を間接的に遮断することに一部起因している可能性がある（Booth et al., 2011）。その結果、クラスリン阻害剤は、有糸分裂周期におけるクラスリンの役割を解明するための有用な分子ツールであるだけでなく、少なくともいくつかの実施形態では、がん及び細胞増殖性障害の治療のための抗有糸分裂化合物として使用できる。これに関連して、多くの成長因子受容体（例えばEGF-R）も内在化及び細胞活性の維持のためにクラスリン介在性エンドサイトーシス（CME）を必要とすることに留意すべきである。CMEを遮断すると、これらの場合の細胞増殖が防止され、そしてそれはクラスリン阻害剤の抗がん活性と抗増殖活性のさらなる証拠となっている（Smith et al., 2013）。
【００２５】
また、本発明の１つ以上の実施形態によるCMEの阻害は、エンドサイトーシスにより脳を含む細胞に侵入する、多数の病原性ウイルス、ペプチドを含むあらゆる種類の毒素などの細胞への侵入を防止するための手段を開発するために重要である。これらのウイルス及び毒素としては、限定されないが、ジフテリア、ロイコトキシン（LKT）、クラミジア、炭疽毒素、黄色ブドウ球菌、カンジダ、歯周炎、アデノウイルス、アフリカ豚コレラウイルス、熱ウイルス、デング、ザイールエボラウイルス（エボラ出血熱）、B型肝炎ウイルス、カポジ肉腫ヘルペスウイルス関連C型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、インフルエンザウイルスなどが挙げられる。例えば、エボラウイルスの感染を防ぐための最も活性な化合物の作用メカニズムは、エボラウイルスの細胞表面への付着の遮断、又は細胞へのエンドサイトーシスの抑制に関連する（Anantpadma et al., 2016.; Aleksandrowicz et al., 2011.; Piccini, Castilla, Damonte, 2015）。
【００２６】
従って、本発明が予防又は処置に適用される特定の疾患及び状態の例としては、細胞増殖性疾患又は状態に限定されないが、多巣性白質脳症、多発性嚢胞腎疾患、アミロイドβに関連する疾患（アルツハイマー病のような）、神経変性障害、神経精神障害、精神病性障害、精神病、双極性障害、統合失調症、ニューロンの異常な無秩序な興奮、発作、神経因性疼痛、片頭痛、及びCMEの関与するシナプスシグナル伝達プロセスによって介在されるか、そうでなければ関連する全ての疾患又は状態（癲癇など）、細胞小胞のリサイクル障害が挙げられる。また、上記のように、本発明の1つ又は複数の実施形態によるCMEの阻害は、多くの細胞における病原体の侵入を防止するのにも有用な場合があり、従ってそれに関連する疾患又は状態を予防又は処置するのに有用であり得る。
【００２７】
特許請求されたファミリーの全てのペプチドは以前に鎮痛効果を示しており（PCT 国際公開第2013/141750号を参照）、クラスリンの特異的阻害剤である。
【００２８】
ペプチドの合成は、L及びDアミノ酸を使用した固相法によるペプチド化学の方法によって行われた。
【実施例１】
【００２９】
ペプチドL-Leu-D-His-L-Lys-L-Leu-L-Gln-L-Thr-NH2の合成（ペプチド番号７（配列番号１））。
ペプチドL-Leu-D-His-L-Lys-L-Leu-L-Gln-L-Thr-NH2は、ポリマー上のFmocスキームを用いてRinkポリマー(Rinkアミド樹脂, １gの樹脂当たりアミノ基0.6mmol)上でDCC/HOBt(N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド／1-ヒドロキシベンゾトリアゾール)によるアミノ酸活性化法を用いた自動固相合成によって調製された。ピペリジン／DMF溶液（ピペリジン／N,N-ジメチルホルムアミド）（1：4）で7分間処理することにより、脱保護された。側鎖の基は、チロシン、スレオニンに対してはtBu（tert-ブチルエーテル）、グルタミン及びヒスチジンに対してはTrt（トリチル又はトリフェニルメチル）、リジンに対してはBoc（t-ブチルオキシカルボニル）グループで保護された。ペプチドは樹脂から切断され、TFA/H2O/EDT（トリフルオロ酢酸／水／1,2-エタンジチオール）の混合物（90：5：5）で脱保護された。ペプチドの精製は、溶離液に6：4の比率のアセトニトリル-水（0.1Mリン酸二水素カリウムを含む）を用いた逆相HPLC（C18カラム）で行われた。ペプチドは質量分析計を用いて特定された。ペプチドの精製度は、ウォーターズ社製 DeltaPak C18 3.9×150mm 5μm 100Aを用いたHPLCで確認された；溶液A：0.1％TFAを含む100％水／アセトニトリル；流速1mL／min；検出波長230nm（図1）。
【実施例２】
【００３０】
合成ペプチドのクラスリン特異的阻害剤としての活性の試験。
実験の基本はアフィニティクロマトグラフィーの実験法に基づき、固定相は特別のマトリックスに接着されたペプチド分子が使用された。移動相は、ラットの脳抽出物として機能する。ペプチド分子に特異的に結合したタンパク質画分は、その後電気泳動により分画され、個々のタンパク質分子が直接検出される。
【００３１】
親和性吸着剤は以下のように調整された：1mM塩酸（HCl）に溶解した臭化シアン活性化セファロース4B（シグマアルドリッチ社製）が吸着剤のマトリックスとして使用された。クラスリン結合ペプチドの可能性に関する研究を行うために、ペプチドが担体（セファロース）に捕獲するためにスペーサーを導入する必要があった。スペーサーの役割は、担体（セファロース）とペプチドを空間的に分割し、実際のペプチド分子が、試験ペプチドと脳抽出物のタンパク質が相互作用する条件を作成することである。この「スペーサー」の使用は、親和性収着に非常に一般的である。天然の「スペーサー」は非常に多様である（Day, Hashim, 1984; Lowe, 1977; Martinez-Ceron et al., 2012）。2つのアミノ酸残基（Asp-Asp）で構成される「スペーサー」が使用された。ジペプチドはリン酸緩衝液（pH7.8〜8.0）に導入された。
【００３２】
試験ペプチドを再蒸留水に溶解し、厳密なpH制御下で親和性樹脂に添加され、吸着剤1mLあたり5mgのペプチドが採取された。「架橋」が、4℃の温度で12時間実施された。「架橋」プロセスの終了時に、pH5.0の酢酸緩衝液とpH9.0の重炭酸緩衝液により結合物が慎重に繰り返し洗浄された。
【００３３】
ラットの大脳皮質の検体を得るために動物が飼育された（ウィスターラット、雄性、体重約300g)。動物は断頭され、大脳皮質が低温状態で分離された。得られたサンプルが液体窒素中に置かれ、微粉末になるまで粉砕された。次にサンプルは、0.3Mスクロース（Helicon社製）、1mM CaCl2（シグマアルドリッチ社製）及び10mM MgCl2（シグマアルドリッチ社製）を含む10mM トリス緩衝液pH7.6に移された。次に、得られたホモジネートは15,000回転／分の条件で20分間低温で遠心分離された。
【００３４】
遠心分離後に得られた皮質検体の上清を用いて、親和性吸着がシェーカー上で4℃で24時間実施された。さらに、吸着剤はカラム（バイオラッド社製）に移され、非特異的に結合したタンパク質が洗浄された。洗浄は、ショ糖を含まないpH7.6のトリス緩衝液を用いて行われた。タンパク質の洗浄は、GC BioRad NGC Discoveryによってモニターされた。流出はλ＝280nmにより観察された。次に、タンパク質はNaClを含むpH7.6のトリス緩衝液を用いて洗浄された。塩の量の勾配は、0.05M〜0.5Mで用いられた。検出は280nm、流速0.1mL／分で行われた。図2には、32〜34分の2つのピークの存在が示され、これは、ペプチド分子に特異的に結合したタンパク質画分の存在を示している。
【００３５】
ペプチド分子に特異的に結合したタンパク質画分は、その後電気泳動により分画され、個々のタンパク質分子が直接検出された。電気泳動はPAAG-ゲルで行われた。濃縮画分が、1、5、及び10μLの量で使用された。スペクトル適用マーカー（Spectra（登録商標）Multicolor Broad Range Protein Ladder）が使用された。図3は、2つの主要なタンパク質化合物が明確に示され、マーカーが右側に、研究される画分が左側に3つの濃度で示されている。260、50、及び10kDaのマーカーに対応する質量の一片が特定のため切り取られた。分子量を決定するために、生産者のマニュアルの参照図（図４）が使用された。
【００３６】
泳動スポットの特定は質量分析によって行われた。切り出されたゲルのトリプシン処理後（triptinization）のトリプシン分解ペプチドを用いてクロマトグラフィー／質量分析による分析が行われた。次に、このペプチド溶液のクロマト質量分析とデータベースによるペプチド配列の特定が実施された。結果の特定の後、自動バリデーション手順を用いてバリデーションが行われた。トリプシンペプチドの配列が検証する（veryfy）ために供された。スポットの特定を検証する（verify）ために、哺乳類データベースで検索が実行された。140kDa〜260kDaの通路（aisle）重量に対応する上部スポットは、13ペプチド配列のクラスリン重鎖として特定された。
【００３７】
試験ペプチドの鎮痛効果が既に確立及び実証され、クラスリンを遮断することによるCME阻害が疼痛シグナルの伝達を停止又は制限できるため、研究したペプチドはクラスリン重鎖の特異的阻害剤であると結論付けられた。
【００３８】
クラスリン重鎖のペプチドからの溶出（分離）は勾配における高い値で発生し、ペプチドのクラスリン重鎖に対する親和性が顕著に高いことを示していることに留意すべきである。従って、本発明は、クラスリン重鎖を分取する方法としても使用することができる。
【００３９】
さらに、この単離方法は、従来の方法（Riddelle-Spencer, O'Halloran, 1997）より実質的に簡便である。従って、提案された方法は、分子生物学研究及びナノテクノロジー研究（Santos dos et al., 2011）におけるクラスリン重鎖の分取に使用できる。従って、本発明の技術的結果は、クラスリンの特異的阻害剤である提案されたペプチドの合成の簡便性と低コストであり、加えて望ましくない免疫学的活性及び他の副作用がないため、それらをクラスリンの特異的阻害剤であって簡便な合成により得ることができる安全な医薬の基盤として考慮することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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