(57)【要約】  本発明は、脳由来神経栄養因子前駆体タンパク質ｐｒｏ−ＢＤＮＦに特異的に結合される抗体および結合エピトープに関する。前記抗体およびタンパク質は、自己免疫疾患を治療するために使用される。ｐｒｏ−ＢＤＮＦ媒介活性を阻害して、関節リウマチ、乾癬、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、慢性閉塞性肺疾患、喘息または嚢胞性線維症、多発性硬化症および他の自己免疫性と炎症性病症などを治療することができる。【選択図】図１
2020531041.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドであって、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１に示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、前記ポリペプチド。
【請求項２】
ポリペプチドであって、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４に示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、前記ポリペプチド。
【請求項３】
ポリペプチドであって、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７に示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、前記ポリペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項のポリペプチドに特異的に結合するタンパク質。
【請求項５】
前記タンパク質とヒトｐｒｏ−ＢＤＮＦの結合親和性は、＜１０ ｎＭであることを特徴とする
請求項４に記載のタンパク質。
【請求項６】
前記タンパク質は、抗体であることを特徴とする
請求項４または５に記載のタンパク質。
【請求項７】
前記抗体の軽鎖可変領域は、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４に示されるＣＤＲ１と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５に示されるＣＤＲ２と、および
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６に示されるＣＤＲ３とを有することを特徴とする
請求項６に記載のタンパク質。
【請求項８】
前記抗体の軽鎖可変領域は、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示されるＣＤＲ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に示されるＣＤＲ３、または
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５に示されるＣＤＲ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６に示されるＣＤＲ３を有することを特徴とする
請求項７に記載のタンパク質。
【請求項９】
前記抗体の重鎖可変領域は、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に示される  ＣＤＲ１と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２に示されるＣＤＲ２と、および
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に示されるＣＤＲ３とを有することを特徴とする
請求項６に記載のタンパク質。
【請求項１０】
前記抗体の重鎖可変領域は、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるＣＤＲ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示されるＣＤＲ３、または
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２に示されるＣＤＲ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３  に示されるＣＤＲ３を有することを特徴とする
請求項９に記載のタンパク質。
【請求項１１】
前記抗体は、
重鎖可変領域はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示される配列を含み、軽鎖可変領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に示される配列を含む抗体（ａ）、
重鎖可変領域はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に示される配列を含み、軽鎖可変領域はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６に示される配列を含む抗体（ｂ）、
抗体（ａ）または抗体（ｂ）の変異体であり、抗体（ａ）または抗体（ｂ）の活性を有するか、基本的に有する抗体（ｃ）から選択されることを特徴とする
請求項６〜１０のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１２】
前記抗体は、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に示される重鎖可変領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に示される軽鎖可変領域を有する抗体（ｄ）、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７に示される重鎖可変領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８に示される軽鎖可変領域を有する抗体（ｅ）、
抗体（ｄ）または抗体（ｅ）の変異体であり、抗体（ｄ）または抗体（ｅ）の活性を有するか、基本的に有する抗体（ｆ）から選択されることを特徴とする
請求項６に記載のタンパク質。
【請求項１３】
前記タンパク質は、請求項１〜３のいずれか一項のポリペプチドで動物を免疫させて得るか、または請求項１〜３のいずれか一項のポリペプチドでファージライブラリーのスクリーニングして得ることを特徴とする
請求項４または５に記載のタンパク質。
【請求項１４】
薬学的組成物であって、
前記薬学的組成物は、請求項４〜１３のいずれか一項のタンパク質および任意の１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体を含むことを特徴とする、前記薬学的組成物。
【請求項１５】
自己免疫疾患の予防、治療または診断用の薬物を製造するための請求項４〜１３のいずれか一項のタンパク質の用途。
【請求項１６】
ｐｒｏ−ＢＤＮＦ媒介疾患の予防、治療または診断用の薬物を製造するための請求項４〜１３のいずれか一項のタンパク質の用途。
【請求項１７】
前記疾患は、関節炎、関節リウマチ、強直性脊椎炎、再生不良性貧血、乾癬、インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症、クリオグロブリン血症、慢性閉塞性肺疾患、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎、喘息、多発性硬化症または嚢胞性線維症であることを特徴とする
請求項１６に記載の用途。
【請求項１８】
ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、ＩＬ−６またはＩＬ−４の分泌を阻害することにより、疾患を予防、治療または診断する薬物を製造するための請求項４〜１３のいずれか一項のタンパク質の用途。
【請求項１９】
疼痛を緩和する薬物を製造するための請求項４〜１３のいずれか一項のタンパク質の用途。
【請求項２０】
請求項４〜１３のいずれか一項のタンパク質をコードする核酸。
【請求項２１】
抗体のスクリーニング方法であって、請求項１〜３のいずれか一項のポリペプチドで動物を免疫させるか、請求項１〜３のいずれか一項のポリペプチドでファージライブラリーをスクリーニングするステップを含むことを特徴とする、前記抗体のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物医学の分野に属し、具体的に、ｐｒｏ−ＢＤＮＦのポリペプチド断片およびポリペプチド断片に結合されるタンパク質に関し、さらにｐｒｏ−ＢＤＮＦのポリペプチド断片の用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
自己免疫疾患（ＡＩＤ）は、自己免疫性が破壊され、免疫システムが有効になって自己抗原を攻撃することにより、組織や臓器の損傷を与える一種の疾患である。その病因と発症メカニズムは明らかにされなかったが、現在は自己抗体、自己反応性Ｔリンパ球またはこの両方による自己抗原に対する過敏性反応性疾患とみなされている。臨床的な根治的薬物がなく、従来のグルココルチコイド（ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ）と免疫抑制剤を、適時に適用すると、症状を抑制することができ、患者の生存率を向上させることができるが、長期的に使用すると、一連の副作用が発生し、深刻な場合、生活の質に影響を及ぼしたり、生命を脅かすこともあり、一部の患者はグルココルチコイドと免疫抑制剤の治療に敏感ではない。
【０００３】
近年、ＡＩＤ分子メカニズムの深い理解と、遺伝子療法、エピジェネティックな介入、小分子Ｔｏｌｌ−様受容体抑制剤、抗炎症因子抗体、幹細胞および調節性Ｔ細胞自己注入、樹状細胞ワクチンなどを含む新たな治療戦略が提案された。これらの薬物または方法のいくつかは、臨床に既に使用され、一部は臨床研究ステップ（例えば、幹細胞自己注入治療など）、さらには動物実験のステップ（例えば、エピジェネティックな調節など）にある。
【０００４】
しかし、これらの薬物は、グルココルチコイド代わり、第一の薬物にすることができないので、臨床適用のために新しい安全で効果的な治療薬物と方法が早急に必要である。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の目的は、ポリペプチドを提供することであり、前記ポリペプチドを利用して、それに特異的に結合される抗体を得ることができ、前記抗体は、自己免疫疾患の治療に有効に利用できる。
【０００６】
第１の態様において、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。
好ましい実施形態において、前記ポリペプチドのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１に示される。
【０００７】
第２の態様において、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。
好ましい実施形態において、前記ポリペプチドのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４に示される。
【０００８】
第３の態様において、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７に示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、前記ポリペプチドを提供する。
好ましい実施形態において、前記ポリペプチドのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７に示される。
【０００９】
具体的な実施形態において、本発明は、本発明の第１の態様〜第３の態様のいずれか一項のポリペプチドのコーディングポリヌクレオチドを提供する。
具体的な実施形態において、本発明は、本発明のコーディングポリヌクレオチドを含む発現担体を提供する。
具体的な実施形態において、本発明は、本発明の第１の態様〜第３の態様のいずれか一項のポリペプチドのスクリーニングまたはその特異的抗体の製造での用途を提供する。
【００１０】
第４の態様において、本発明は、本発明の第１の態様〜第３の態様のいずれか一項のポリペプチドに特異的に結合するタンパク質を提供する。
具体的な実施形態において、前記タンパク質とヒトｐｒｏ−ＢＤＮＦの結合親和性は、＜ １０ ｎＭである。
具体的な実施形態において、前記タンパク質は、抗体である。
好ましい実施形態において、前記抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、または抗体断片である。
好ましい実施形態において、前記抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体または完全なヒト抗体から選択されることができる。
【００１１】
具体的な実施形態において、前記抗体の軽鎖可変領域は、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４に示されるＣＤＲ１と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５に示されるＣＤＲ２と、および
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６に示されるＣＤＲ３とを有する。
【００１２】
具体的な実施形態において、前記抗体の軽鎖可変領域は、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示されるＣＤＲ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に示されるＣＤＲ３、または
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５に示されるＣＤＲ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６に示されるＣＤＲ３を有する。
【００１３】
具体的な実施形態において、前記抗体の重鎖可変領域は、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に示される  ＣＤＲ１と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２に示されるＣＤＲ２と、および
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に示されるＣＤＲ３とを有する。
【００１４】
具体的な実施形態において、前記抗体の重鎖可変領域は、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるＣＤＲ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示されるＣＤＲ３、または
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２に示されるＣＤＲ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３  に示されるＣＤＲ３を有する。
【００１５】
具体的な実施形態において、前記抗体は、
重鎖可変領域はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示される配列を含み、軽鎖可変領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に示される配列を含む抗体（ａ）、
重鎖可変領域はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に示される配列を含み、軽鎖可変領域はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６に示される配列を含む抗体（ｂ）、
抗体（ａ）または抗体（ｂ）の変異体であり、抗体（ａ）または抗体（ｂ）の活性を有するか、基本的に有する抗体（ｃ）から選択される。
好ましい実施形態において、前記抗体（ｃ）は、抗体（ａ）のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に示される配列中の１〜３個、好ましくは、１つなどの１つまたは複数のアミノ酸の添加、欠失または置換（好ましくは、置換）によって得、抗体（ａ）の活性を有するか、基本的に有し、または
前記抗体（ｃ）は、抗体（ｂ）のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６に示される配列中の１〜３個、好ましくは、１つなどの１つまたは複数のアミノ酸の添加、欠失または置換（好ましくは、置換）によって得、抗体（ｂ）の活性を有するか、基本的に有する。
好ましい実施形態において、前記アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。
【００１６】
具体的な実施形態において、前記抗体は、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に示される重鎖可変領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に示される軽鎖可変領域を有する抗体（ｄ）、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７に示される重鎖可変領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８に示される軽鎖可変領域を有する抗体（ｅ）、
抗体（ｄ）または抗体（ｅ）の変異体であり、抗体（ｄ）または抗体（ｅ）の活性を有するか、基本的に有する抗体（ｆ）から選択される。
好ましい実施形態において、前記抗体（ｆ）は、抗体（ｄ）のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に示される配列中の１〜１０個、好ましくは、１〜６個、より好ましくは、１〜３個、最も好ましくは、１つなどの１つまたは複数のアミノ酸の添加、欠失または置換（好ましくは、置換）によって得、抗体（ｆ）の活性を有するか、基本的に有し、または
前記抗体（ｆ）は、抗体（ｅ）のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８に示される配列中の１個〜１０個、好ましくは、１〜６個、より好ましくは、１〜３個、最も好ましくは、１つなどの１つまたは複数のアミノ酸の添加、欠失または置換（好ましくは、置換）によって得、抗体（ｆ）の活性を有するか、基本的に有する。
【００１７】
好ましい実施形態において、前記抗体は、
ｉ）１０ ｎＭまたはさらに低いＫＤでｐｒｏ−ＢＤＮＦポリペプチドに結合される特徴と、
ｉｉ）ｐｒｏ−ＢＤＮＦとｐ７５の結合を競合的に阻害する特徴と、および
ｉｉｉ）ｐｒｏ−ＢＤＮＦ依存的活性特徴中の１つまたは複数を有する。
【００１８】
具体的な実施形態において、前記タンパク質は、本発明の第１の態様〜第３の態様のいずれか一項のポリペプチドで動物を免疫させて得るか、本発明の第１の態様〜第３の態様のいずれか一項のポリペプチドでファージライブラリーをスクリーニングして得る。
【００１９】
第５の態様において、本発明は、本発明の第４の態様のタンパク質および任意の１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体を含む薬学的組成物を提供する。
【００２０】
第６の態様において、本発明は、自己免疫疾患の予防、治療または診断用の薬物を製造するための本発明の第４の態様のタンパク質の用途を提供する。
好ましい実施形態において、前記自己免疫疾患は、ｐｒｏ−ＢＤＮＦ媒介自己免疫疾患である。
【００２１】
第７の態様において、本発明は、ｐｒｏ−ＢＤＮＦ媒介疾患の予防、治療または診断用薬物を製造するための本発明の第４の態様のタンパク質の用途を提供する。
【００２２】
具体的な実施形態において、前記疾患は、関節炎、関節リウマチ、強直性脊椎炎、再生不良性貧血、乾癬、インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症、クリオグロブリン血症、慢性閉塞性肺疾患、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎、喘息、多発性硬化症または嚢胞性線維症である。
【００２３】
第８の態様において、本発明は、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、ＩＬ−６またはＩＬ−４の分泌を阻害することにより、疾患を予防、治療または診断する薬物を製造するための本発明の第４の態様のタンパク質の用途を提供する。
【００２４】
第９の態様において、本発明は、疼痛を緩和する薬物を製造するための本発明の第４の態様のタンパク質の用途を提供する。
【００２５】
第１０の態様において、本発明は、本発明の第４の態様のタンパク質をコードする核酸を提供する。
【００２６】
第１１の態様において、本発明は、本発明の第１の態様〜第３の態様のいずれか一項のポリペプチドで動物を免疫させるか、本発明の第１の態様〜第３の態様のいずれか一項のポリペプチドでファージライブラリーをスクリーニングするステップを含む抗体のスクリーニング方法を提供する。
【００２７】
本発明の範囲内で、本発明の上記の技術的特徴および以下（例えば、実施例）に具体的に説明する各技術的特徴を互いに組み合わせて、新規または好ましい技術的解決手段を形成することができることを理解されたい。スペースの制限のため、ここでは繰り返しない。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】ヒトｐｒｏＢＤＮＦ前駆体タンパク質への１Ｄ３と２Ｈ８の結合能力のＥＬＩＳＡ結合図を示す。
【図２】精製された組換えモノクローナル抗体１Ｄ３と２Ｈ８（ヒトＩｇＧ１形態）を示す。
【図３】Ｂｉａｃｏｒｅ親和性測定実験における１Ｄ３の動態曲線を示す。
【図４】Ｂｉａｃｏｒｅ親和性測定実験における２Ｈ８の動態曲線を示す。
【図５】図５Ａは、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の２Ｈ８治療実験を示し、図５Ｂは、ＥＡＥの２Ｈ８治療の累積治療スコアを示す。
【図６】図６Ａは、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の１Ｄ３治療実験を示し、図６Ｂは、ＥＡＥの１Ｄ３治療の累積治療スコアを示す。
【図７】図７Ａは、炎症因子ＴＮＦ−α遺伝子発現状況を示し、図７Ｂは、ＥＡＥマウス脾臓インターロイキン（ＩＬ）−６に対するＡｂ−ｐｒｏＢの作用を示し、図７Ｃは、ＥＡＥマウス脾臓ＩＬ−２に対するＡｂ−ｐｒｏＢの作用を示し、図７Ｄは、ＥＡＥマウス脾臓ＩＬ−４に対するＡｂ−ｐｒｏＢの作用を示す。
【図８】１Ｄ３および２Ｈ８とポリペプチドＥ２およびポリペプチドＥ５のＥＬＩＳＡ結果を示す。
【図９】１Ｄ３および２Ｈ８とポリペプチドＤＨのＥＬＩＳＡ結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明者らは、範囲にわたる綿密な研究により、予想外にｐｒｏ−ＢＤＮＦに特異的に結合される抗体を発見し、これらの抗体は体内実験自己免疫性脳脊髄炎モデルでＴＮＦ−α、ＩＬ−２、ＩＬ−６、またはＩＬ−４の分泌を減少させることができ、同時に、これらの抗体の結合エピトープを分析し、これを基礎として、本発明を完成した。
【００３０】
用語
本明細書で使用される科学技術用語は、当業者に一般的に理解されるものと同一または類似の意味を有する。本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語を以下のように定義する。
【００３１】
用語「ｐｒｏＢＤＮＦ」（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｆｏｒ  ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）は、  「脳由来神経栄養因子の前駆体」であり、是ＢＤＮＦ遺伝子の前駆体産物である。他に説明しない限り、用語「ｐｒｏ−ＢＤＮＦ」は、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７に示されるヒトｐｒｏ−ＢＤＮＦを指す。ｐｒｏＢＤＮＦの分子アミノ酸配列第１〜１８番の部位は、信号ペプチド配列であり、分泌過程において、この部位で２つの断片が生成されるが、そのうち１つの断片は、配列第１９〜１２９番アミノ酸、すなわち、前駆体ドメインを含むポリペプチド断片であり、前駆体ドメイン（ｐｒｏＢＤＮＦ  ｐｒｏ−ｄｏｍａｉｎ）とよばれ、他の１つの断片は、アミノ酸配列第１３０〜２４７番、すなわち、成熟ドメインによってコードされる断片であり、加工後に生物活性が形成された成熟ＢＤＮＦである。
用語「ｐ７５」は、神経栄養因子受容体（Ｐ７５ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｐ７５ＮＴＲ）であり、ＣＤ２７１とも呼ばれ、ｐｒｏＢＤＮＦのリガンドである。
【００３２】
本明細書で使用される用語「本発明のタンパク質」または「本発明タンパク質」は、本発明のポリペプチドに結合されたタンパク質を示す。本発明のポリペプチドは、具体的にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１に示されるアミノ酸配列またはアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１に示されるものを含むポリペプチド、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４に示されるアミノ酸配列またはアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４に示されるものを含むポリペプチド、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７に示されるアミノ酸配列またはアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７に示されるものを含むポリペプチドを指す。したがって、具体的な実施形態において、本発明のタンパク質は、抗体またはその抗原結合部分であることができ、本発明のタンパク質は、抗体またはその抗原結合部分を含む融合タンパク質であることもできる。
【００３３】
用語「抗体」は、本明細書で完全な抗体と任意の抗原結合断片を含む。天然に存在する「抗体」は、ジスルフィド結合によって連結された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖と２つの軽（Ｌ）鎖の糖タンパク質である。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（本明細書でＶＨと略される）と重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３からなる。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書でＶＬと略される）と軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬからなる。ＶＨ領域とＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＥＲ）を呼ばれるより保存的な領域によって離隔された相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる可変性の高い領域によりより細分されることができる。それぞれのＶＨとＶＬは、アミノ基末端からカルボキシル基末端までＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順で配列された３つのＣＤＲと４つのＦＲからなる。重鎖と軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、宿主組織または因子（免疫システムの様々な細胞（例えば、効果細胞）と古典的補体システムの最１の成分（Ｃ１ｑ）を含む）に対する免疫グロブリンの結合を媒介することができる。
【００３４】
用語「相補性決定領域」と「ＣＤＲ」は、抗体可変領域内の抗原特異性と結合親和力を付与するアミノ酸の配列を指す。一般的に、それぞれの重鎖可変領域には、３つのＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）が存在し、軽鎖可変領域には、３つのＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）が存在する。
【００３５】
指定されたＣＤＲのアミノ酸配列の境界は、Ｋａｂａｔら（１９９１），「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，」第５版を含む多数の既知の手段の任意の手段によって決定することができる。Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（「Ｋａｂａｔ」番手段）、Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉら；（１９９７）  ＪＭＢ  ２７３，９２７−９４８（「Ｃｈｏｔｈｉａ」番手段）に説明されたような手段である。
【００３６】
本明細書で使用されるように、用語「抗体」は、抗原（例えば、ｐｒｏ−ＢＤＮＦ的部分）に特異的に結合される能力を維持する抗体の全長または１つまたは複数の断片、または他の類似の抗体結合活性を有するポリペプチドを指す。抗体の抗原結合機能は、全長抗体の断片によって実行されることができることが示されている。抗体という用語に含まれる「抗原結合断片」の実例は、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる１価断片を含むＦａｂ断片、ヒンジ領域のジスルフィドブリッジ（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｒｉｄｇｅ）によって連結される２つのＦａｂ断片を含む２価断片を含むＦ（ａｂ）２断片、ＶＨとＣＨ１ドメインからなＦｄ断片、抗体の単一アームのＶＬとＶＨドメインからなるＦｖ断片、ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら，１９８９，  Ｎａｔｕｒｅ３４１：５４４−５４６）、および分離された相補性決定領域（ＣＤＲ）またはこれらの抗原結合部分を含む任意の融合タンパク質を含む。
【００３７】
本明細書で使用されるように、「類似の抗体結合活性を有するポリペプチド」は、単一のドメイン抗体、マイクロ抗体、二量体、三量体のような抗体−抗原結合部位を有するタンパク質であることができ、非抗体構造を有する親和性タンパク質であることもできる。
【００３８】
Ｆｖ断片の２つのドメインＶＬとＶＨは、別々の遺伝子によってコードされたが、ＶＬとＶＨ領域が一対になっている単一鎖タンパク質（ｓｃＦｖ）として生成できるようにするリンカーを合成することにより、組換え法を使用して結合することができる（例えば、Ｂｉｒｄら，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；およびＨｕｓｔｏｎら，１９８８，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ８５：５８７９−５８８３を参照）。これらの単一鎖抗体は、抗体という用語の「抗原結合断片」内に含まれることを意図される。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来の技術を使用して得られ、完全な抗体に使用されたのと同じ方法で、前記断片の機能をスクリーニングすることができる。
【００３９】
本明細書で使用されるように、「分離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を大体的に含まない抗体  （例えば、ヒトｐｒｏ−ＢＤＮＦのようなｐｒｏ−ＢＤＮＦに特異的に結合される分離された抗体、ｐｒｏ−ＢＤＮＦ以外の他の抗原に特異的に結合される抗体を大体的に含まない）を指す。しかし、ｐｒｏ−ＢＤＮＦに特異的に結合される分離された抗体は、他の抗原（例えば、他の種類のｐｒｏ−ＢＤＮＦ分子から由来される）と交差反応性を有することができる。なお、分離された抗体は、他の細胞材料および／または化学医薬品を大体的に含まないことができる。
【００４０】
用語「エピトープ」は、抗体に特異的に結合することができるタンパク質決定因子を意味する。エピトープは通常、アミノ酸または糖側鎖のような分子の化学活性表面成分からなり、通常、特定の構造の特徴と電荷の特徴を有する。
【００４１】
用語「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によって提供される抗体の種類を指す（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＥ、およびＩｇＧ１またはＩｇＧ４のようなＩｇＧ）。アイソタイプは、これらのタイプのいずれかの修飾された形式をさらに含むが、ここでのエフェクター機能またはＦｃ受容体への結合を増加させたり減少させるように修飾されることによりＦｃ機能を変更させる。
【００４２】
本明細書で使用されるように、用語「完全なヒト抗体」とは、フレームワーク領域とＣＤＲ領域の両方がヒト由来の配列から由来された可変領域を有する抗体を意味する。なお、抗体が定常領域を含む場合、前記定常領域もこのようなヒト配列から由来され、例えば、ヒト生殖系列配列、またはヒト生殖系列配列またはヒトフレームワークに由来するか、またはヒトフレームワーク配列分析を含む（例えば、Ｋｎａｐｐｉｋら、２０００，  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９６：５７−８６に記載されているような）コンセンサスフレームワークシーケンスの抗体の変異型。本開示内容の完全なヒト抗体は、ヒト配列によってコーディングされていないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムまたは部位指定突然変異誘発またはインビボでの体細胞突然変異によって導入された変異体）を含むことができる。しかし、本明細書で使用されるように、用語「完全なヒト抗体」は、マウスのような他の哺乳動物種の生殖系列由来のＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植された抗体を含むように意図されない。
【００４３】
本明細書で使用されるように、用語「組換えヒト抗体」は、組換え手段によって製造、発現、生成または分離されたすべてのヒト抗体を含む。例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子の遺伝子組み換えまたは染色体ジェニック動物（例えば、マウス）またはこれから製造された雑種腫瘍で分離された抗体は、例えば、形質感染腫瘍から分離された抗体、組換え組み合わせヒト抗体ライブラリーから分離された抗体、およびヒト免疫グロブリン遺伝子配列の全部または一部を他のＤＮＡ配列とスプライシン（ｓｐｌｉｃｉｎｇ）することを含む任意の他の手段によって製造、発現、生成または分離された抗体のような形質転換されて、人間の抗体を発現する宿主細胞を含む。これらの組換えヒト抗体は、フレームワーク領域とＣＤＲ領域の両方がヒト生殖系列免疫グロブリン配列から由来した可変領域を有する。しかし、いくつかの実施形態では、このような組換えヒト抗体は、インビトロでの突然変異誘発されることがあり（または、ヒトＩｇ配列を有する遺伝子組み換え動物を使用する場合は、インビボでの体細胞突然変異誘発）、組換え抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列から由来されるか、これと関連しているが、インビボでヒト抗体生殖系列ライブラリー内の配列に自然に存在しないことができる。
【００４４】
本明細書で使用されるように、「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によって提供される抗体タイプ（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４のようなＩｇＧ）を指す。
【００４５】
フレーズ「抗原を識別する抗体」と「抗原に特異的な抗体」は、本明細書において、用語「抗原に特異的に結合される抗体」と相互交換して使用される。
【００４６】
本明細書で使用されるように、「ｐｒｏ−ＢＤＮＦポリペプチドに特異的に結合」する抗体またはタンパク質は、１００ ｎＭまたはそれ以下、１０ ｎＭまたはそれ以下、５ ｎＭまたはそれ以下のＫＤでヒトｐｒｏ−ＢＤＮＦポリペプチドに結合する抗体またはタンパク質を意味する。「ｐｒｏ−ＢＤＮＦ以外の抗原と交差反応」の抗体は、１０ ｎＭまたはそれ以下、５ ｎＭまたはそれ以下のＫＤで前記抗原に結合する抗体を意味する。「特定の抗原と交差反応しない」の抗体は、２００ ｎＭまたはそれ以上のＫＤまたは１ μＭまたはそれ以上のＫＤまたは１０ μＭまたはそれ以上のＫＤで前記抗原に結合抗体を指す。いくつかの解決手段において、抗原と交差反応しないこれらの抗体の抗体の標準結合測定で、基本的に検出することができないこれらのタンパク質の結合を示す。
【００４７】
本明細書で使用されるように、用語「ＫＤ」は、Ｋｄ対Ｋａの比率（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される解離定数を意味する。抗体のＫＤ値は、当該技術分野で良好に確立された方法で測定することができる。抗体のＫＤを測定するための方法は、当業者に公知された実施例の操作に応じた表面プラズモン共鳴を使用したり、ＢｉａｃｏｒｅＴＭシステムなどのバイオセンサーシステムを使用した。
【００４８】
本明細書で使用されるように、用語「親和性」または「親和活性」は、単一の抗原性部位（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｓｉｔｅ）における抗体と抗原との間の総合作用の強さを指す。本明細書で使用されるように、用語ＩｇＧ抗体またはその断片（例えば、Ｆａｂ断片）に対する「高親和性」は、標的抗原に対して１０−８Ｍまたはそれ以下、１０−９Ｍまたはそれ以下のＫＤを有する抗体を指す。しかし、高親和性は、他の抗体アイソタイプに応じて変わることができる。
【００４９】
本明細書で使用されるように、用語本開示内容の抗体またはタンパク質「選択的に」は、いくつかの標的ポリペプチドに結合するが、密接に関連するポリペプチドに結合しない抗体またはタンパク質を指す。フレーズ「抗原を識別する抗体」と「抗原に特異的な抗体」は、本明細書において用語「抗原に特異的に結合される抗体」と相互交換して使用される。
【００５０】
用語「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）およびその単一鎖または二本鎖形態のポリマーを指す。明確的に限定されない限り、用語は参照核酸と同様の結合性を持って、天然的に存在するヌクレオチドと同様の方法で代謝される、すでに知られている天然ヌクレオチドの類似体を含有する核酸を含む。特に断りのない限り、特定の核酸配列は、その保存的に修飾された変異体（例えば、縮退コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰと相補配列及び明示的に示された配列を暗黙的に含む。具体的に、縮退コドン置換は、１つまたは複数の選択された（または全部）コドンの第３位置が混合された塩基および／またはデオキシイノシン（ｄｅｏｘｙｉｎｏｓｉｎｅ）残基に置換される配列を生成することで実現することができる（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）。
【００５１】
本明細書で使用されるように、用語「疾患」（例えば、関節リウマチ）の「治療」は、１つの解決手段では疾患または病症（すなわち、疾患の進行をまたはその臨床症状の少なくとも一つを緩和、抑制または減少させる）を改善することを指す。別の解決手段において、「治療」は、患者が識別できない物理的なパラメータを含む少なくとも１つの物理的パラメータを緩和または改善することを指す。別の解決手段において、「治療」は、疾患または病症を物理的（例えば、識別可能な症状の安定）、生理学的（例えば、物理的パラメータの安定）またはその両方を調節することを指す。本明細書に明確的に記載されていない限り、疾患の治療および／または予防を評価するための方法は、当該技術分野で知られている。
【００５２】
２つのヌクレオチド配列の間の同一性パーセントは、例えば、核酸配列のＢＬＡＳＴＮプログラムなどアルゴリズムを使用することもでき、１１の単語の語長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ ＝ ５、Ｎ ＝ ４と二本鎖の比較用語「クロスブロッキング」、「クロスブロッキング」、および「クロスブロッキング」に本明細書で相互交換的に使用されることができ、標準的な競争結合の測定中に抗体または他の結合剤のｐｒｏ−ＢＤＮＦの結合を干渉する能力を指す。
【００５３】
抗体の抗原結合部分を含むタンパク質のような抗体または他の結合剤は、他の抗体または結合分子がｐｒｏ−ＢＤＮＦに結合する能力、または程度を干渉することができ、したがって、本開示内容に応じたクロスブロックとみなされることができるかかどうかは、標準的な競争結合分析を利用して測定することができる。１つの適切な測定は、表面プラズモン共鳴技術を使用して、相互作用の程度を測定することができるＢｉａｃｏｒｅＴＭ技術（例えば、ＢｉａｃｏｒｅＴＭ３０００機器（ＢｉａｃｏｒｅＴＭ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ））を使用することを含む。
【００５４】
用語「変異体」は、ヌクレオチド欠失、挿入、または置換によって変異されたが、本明細書に開示されたＣＤＲ、ＶＬ、ＶＨ、または軽鎖、または重鎖、またはｓｃＦｖなどに対応するコーディング核酸配列と少なくとも６０ ％、７０ ％、８０％、９０ ％、９１ ％、９２ ％、９３％、９４ ％、９５ ％、９６ ％、９７％、９８ ％、９９ ％または１００ ％の同一性を有する核酸を含む本開示内容の抗体をコードする他の核酸を指す。
【００５５】
いくつかの解決手段において、これは突然変異核酸を含み、前記突然変異核酸では、本明細書に記述されたＣＤＲコーディング領域に比べて、ＣＤＲコーディング領域でヌクレオチド欠失、挿入、または置換によって変更されたヌクレオチドは、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つを超えていない。
【００５６】
同じエピトープに結合する抗体の場合、ＶＨ、ＶＬ、全長軽鎖および全長重鎖配列（ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列）は、「混合およびマッチング」され、本開示内容の他の抗ｐｒｏ−ＢＤＮＦ結合分子を生成することができる。これらの「混合およびマッチング」された抗体のｐｒｏ−ＢＤＮＦ結合は前記結合測定および他の通常の結合の測定（例えば、ＥＬＩＳＡ）によって測定することができる。これらの鎖は、混合およびマッチングされるとき、特定のＶＨ／ＶＬペアからのＶＨ配列は構造的に類似したＶＨ配列に置き換えなければならない。同様に、構造的に類似した全長重鎖配列は、特定の全長重鎖／全長軽鎖のペアからの完全長重鎖配列の代替的に使用する必要がある。同様に、構造的に類似したＶＬ配列は、特定のＶＨ／ＶＬペアからのＶＬ配列に置き換える必要がある。同様に、構造的に類似した全長軽鎖配列は、特定の全長重鎖／全長軽鎖のペアからの全長軽鎖配列の代替的に使用する必要がある。
【００５７】
これらの抗体のそれぞれがｐｒｏ−ＢＤＮＦに結合することができ、抗原結合特異性がＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域によって主に提供されることを考慮すると、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３配列はＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３配列と「混合およびマッチング」することができる（すなわち、異なる抗体からのＣＤＲを混合およびマッチングすることができ、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３とＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３を含有する各抗体は、本開示内容の他の抗ｐｒｏ−ＢＤＮＦ結合分子を生成する）。上述した実施例での結合の測定または他の通常の測定（例えば、ＥＬＩＳＡ）を使用して、これらの「混合およびマッチング」抗体のｐｒｏ−ＢＤＮＦ結合を測定した。ＶＨ  ＣＤＲ配列を混合およびマッチングさせるとき、特定のＶＨ配列からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列は構造的に類似したＣＤＲ配列で代替的に使用する必要がある。同様に、ＶＬ  ＣＤＲ配列を混合およびマッチングさせるとき、特定のＶＬ配列からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列は構造構造的に類似ＣＤＲの配列に代替的に使用する必要がある。１つまたは複数のＶＨおよび／またはＶＬ  ＣＤＲ領域配列を、本明細書に開示された内容のモノクローナル抗体のＣＤＲ配列からの構造的に類似した配列に置換することにより、新規なＶＨおよびＶＨを生成することができることが当業者には明らかであろう。
【００５８】
本明細書で使用されるように、抗体の可変領域鎖または全長鎖がヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子を使用するシステムから得られる場合には、ヒト抗体は、特定の生殖系列配列「の産物」または「これから誘導された」重鎖または軽鎖可変領域または全長重鎖または軽鎖を含む。これらのシステムは、標的抗原でヒト免疫グロブリン遺伝子を有する組み換えマウスを免疫すること、または標的抗原でファージディスプレイされたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることを含む。ヒト抗体のアミノ酸配列をヒト生殖系列免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較して、配列で、ヒト抗体の配列と最も近い（すなわち、最大のパーセント同一性）ヒト生殖系列免疫グロブリン配列を選択することで、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列の「の産物」または「これから誘導された」ヒト抗体に検定ことができる。特定のヒト生殖系列免疫グロブリン配列の「の産物」または「これから誘導された」ヒト抗体は、天然に存在する体細胞突然変異または部位指定突然変異の意図的な導入により、生殖系列配列と異なるアミノ酸を含有することができる。しかし、選択されたヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされたアミノ酸配列と通常アミノ酸配列の少なくとも９０ ％の同一性を有し、他の種の生殖系列免疫グロブリンとアミノ酸配列（例えば、マウス生殖細胞系列）と比較すると、ヒトアミノ酸残基として検定されるヒト抗体も含む。いくつかの場合、ヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされたアミノ酸配列とアミノ酸配列の少なくとも６０ ％、７０ ％、８０％、９０ ％、または少なくとも９５ ％、または少なくとも９６ ％、９７ ％、９８％、または９９ ％の同一性を有することができる。通常、特定のヒト生殖系列配列から誘導されたヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされたアミノ酸配列と１０個以下のアミノ酸の違いを示す。いくつかの場合、ヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされたアミノ酸配列と５個以下、またはさらに４個、３個、２個または１個のアミノ酸の違いを示すことができる。
【００５９】
保存的に修飾された抗体
いくつかの実施形態において、本開示内容の抗体（またはその抗原結合断片を含む）は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列（またはＨＣＤＲ１’、ＨＣＤＲ２’およびＨＣＤＲ３’）を含む重鎖可変領域と、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列（またはＬＣＤＲ１’、ＬＣＤＲ２’およびＬＣＤＲ３’）を含む軽鎖可変領域とを有し、ここでこれらのＣＤＲ配列の１つまたは複数の本明細書に記載の抗体１Ｄ３または２Ｈ８に基づいて指定されたアミノ酸配列またはその保存的修飾を有し、ここで前記抗体またはタンパク質は、本開示内容の抗ｐｒｏ−ＢＤＮＦ抗体の所望の機能特性を保持する。
【００６０】
本明細書で使用されるように、用語「保存的配列修飾」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で大体されたアミノ酸によって置換されることを意味する。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、帯電していない極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β−分岐鎖側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。したがって、本開示内容の抗体のＣＤＲ領域内の１つまたは複数のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基に代替することができ、本明細書に記述された機能の測定を利用して、変更された抗体が保有している機能を測定することができる。
【００６１】
部位指定突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発のような当該技術分野で公知の標準的な技術により、本明細書に開示された抗体に修飾を導入することができる。
【００６２】
また、本発明の組換え抗体１Ｄ３と２Ｈ８以外に、本発明は、１Ｄ３と２Ｈ８抗体の理想的な機能的性質を保持している相同抗体またはタンパク質をさらに含む。
【００６３】
特に、前記本発明による相同抗体またはタンパク質は、ｐｒｏ−ＢＤＮＦポリペプチドに対する抗体の抗原結合部分を含む抗体またはタンパク質であり、前記抗体またはタンパク質は、
ｉ）例えば、実施例に係るＢｉａｃｏｒｅＴＭ測定で測定されたように、１０ｎＭまたはそれ以下のＫＤでｐｒｏ−ＢＤＮＦポリペプチドを結合し、
（ｉｉ）ｐ７５の結合に対するｐｒｏ−ＢＤＮＦの競争阻害し、および
（ｉｉｉ）ｐｒｏ−ＢＤＮＦ活性に依存することを特徴とする。
【００６４】
本明細書に係る「ｐｒｏ−ＢＤＮＦ活性に依存」とは、本発明の抗体またはタンパク質がｐｒｏ−ＢＤＮＦ関連する活性を有することを指す。例えば、ｐｒｏＢＤＮＦがそのリガンドに結合して生物学的プロセスを促進する場合には、本発明の抗体またはタンパク質は、前記生物学的プロセスの抑制剤または拮抗薬であり、ｐｒｏＢＤＮＦがそのリガンドに結合して特定の生物学的プロセスを阻害する場合には、本発明の抗体またはタンパク質は、前記生物学的プロセスの促進剤またはアゴニストである。
【００６５】
本発明の抗体をコードする核酸分子
本発明の別の態様は、本発明の抗体またはタンパク質をコードする核酸分子に関する。
【００６６】
本発明はさらに、ＣＨＯ細胞系のような哺乳動物細胞でのタンパク質の発現に最適化され、後者の配列から由来された核酸分子に関するものである。前記核酸は、完全な細胞、細胞分解物に存在することができたり、部分的に精製されるか大体的に純粋な形態の核酸であることができる。標準的な技術（塩基性／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング（ｂａｎｄｉｎｇ）、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動およびその技術分野に公知された他の技術を含む）によって、他の細胞成分または他の汚染物質（例えば、他の細胞核酸またはタンパク質）から精製される場合、核酸は「分離された」または「大体的に純粋な」ものである。Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌら，１９８７，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照する。
【００６７】
本発明の核酸は、標準的な分子生物学技術を使用して得ることができる。例えば、ＶＨおよびＶＬセグメントをコードするＤＮＡ断片を得ると、可変領域遺伝子を全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂ断片遺伝子またはｓｃＦｖ遺伝子に転換させるように標準的な組換えＤＮＡ技術によって、これらのＤＮＡ断片をさらに操作することができる。これらの操作では、ＶＬ−またはＶＨ−コーディングＤＮＡ断片は、他の１つのＤＮＡ分子または他の１種類のタンパク質（例えば、抗体定常領域または可撓性リンカー）をコードする断片に効果的に連結される。本明細書で使用されるように、用語「効果的連結された」とは、２つのＤＮＡ断片によってコードされたアミノ酸配列がフレーム内に維持されるか、所望のプロモーターの制御下でタンパク質を発現するように、２つのＤＮＡ断片の機能的結合を意味する。
【００６８】
ＶＨ−コーディングＤＮＡを重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）をコードする他の一つのＤＮＡ分子に効果的に連結することにより、ＶＨ領域をコードする分離されたＤＮＡを全長重鎖遺伝子に転換させることができる。人重鎖定常領域遺伝子の配列は当該技術分野で知られている（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら，１９９１，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，米国保健社会福祉省，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２を参照）。それに、これらの領域をコードするＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。重鎖定常領域はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域であることができる。いくつかの解決手段において、重鎖定常領域は、ＩｇＧ１アイソタイプから選択される。Ｆａｂ断片の重鎖遺伝子について、ＶＨ−コーディングＤＮＡは重鎖ＣＨ１定常領域のみコーディングする他の１つのＤＮＡ分子に効果的に連結されることができる。
【００６９】
ＶＬ−コーディングＤＮＡを軽鎖定常領域ＣＬをコードする他の１つのＤＮＡ分子に効果的に連結させることにより、ＶＬ領域をコードする分離されたを全長軽鎖遺伝子（およびＦａｂ軽鎖遺伝子）に転換させることができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当該技術分野で知られている（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら，１９９１，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，米国保健社会福祉省，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２を参照）。それに、これらの領域を含むるＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。前記軽鎖定常領域は、κまたはλ定常領域であることができる。
【００７０】
ｓｃＦｖ遺伝子を生成するために、ＶＨ−およびＶＬ−コーディングＤＮＡ断片は、ＶＨおよびＶＬ配列が連続単一鎖タンパク質として発現されるようにアミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３のような可撓性リンカーをコードする他の１つの断片に効果的に連結され、ＶＬとＶＨ領域は、前記可撓性リンカーによって接続される（例えば、Ｂｉｒｄら，１９８８，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；Ｈｕｓｔｏｎら，１９８８，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ等，１９９０，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４を参照）。
【００７１】
本発明の組換え抗体の分離
抗体とその抗原結合部分を含むタンパク質をスクリーニングする様々な方法が当該技術分野で記述されている。これらの方法は、抗原の免疫後、全長ヒト抗体を生成することができるトランスジェニックマウスなどのインビボ系、抗体ＤＮＡコーティングライブラリーを生成するインビトロ系に分割することができる。これらのインビトロでの技術は、ディスプレイ技術と呼ばれて、ファージディスプレイ、ＲＮＡまたはＤＮＡディスプレイ、リボソームディスプレイ、酵母または哺乳動物細胞ディスプレイを含むがこれらに限定されない。これらは、本技術分野で詳細に説明された（総論については、例えば、Ｎｅｌｓｏｎら，２０１０，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｔｒｅｎｄｓ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」を参照）。１つの具体的な解決手段では、ヒト太線抗体ライブラリーをスクリーニングするためのライブラリーを使用して、例えば、ライブラリーのファージディスプレイ方法を使用して、本開示内容のヒト組換え抗体を分離する。
【００７２】
ＶＨおよびＶＬ遺伝子または関連するＣＤＲ領域のライブラリーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって別々にクローニングされたり、ＤＮＡシンセサイザーによって合成されることができ、ファージライブラリーからランダムに組み換えた後、その抗原結合クローンをスクリーニングすることができる。
【００７３】
ヒト抗体を分離するためのこれらのファージディスプレイ方法は、当該技術分野で確立されているか、下記の実施例に記載されている。例えば、ＵＳ  ５２２３４０９、ＵＳ  ５４０３４８４、ＵＳ  ５４２７９０８、ＵＳ  ５５８０７１７、ＵＳ  ６５２１４０４などを参照することができる。
【００７４】
モノクローナル抗体を生成するトランスフェクトされた腫瘍の製造
本開示内容の抗体は、例えば、当該分野で公知の組換えＤＮＡ技術および遺伝子トランスフェクション法の組み合わせ（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．  １９８５，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２）を使用して、宿主細胞がトランスフェクトされた腫瘍で生成されることができる。
【００７５】
例えば、抗体またはその抗体断片を発現するために、コーディング部分または全長軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡは、標準的な分子生物学または生物化学技術（例えば、ＤＮＡの化学合成、ＰＣＲ増幅、または標的抗体を発現する雑種腫瘍を使用したｃＤＮＡクローン）によって得ることができ、前記遺伝子が転写および翻訳制御配列に効果的連結されるように、前記ＤＮＡを発現担体に挿入することができる。本明細書では、用語「効果的連結された」とは、担体内で転写および翻訳制御配列が抗体遺伝子の転写および翻訳を調節する意図されて機能を実行するように抗体遺伝子が担体内に連結されていることを意味する。使用された発現宿主細胞と適合する発現担体と発現制御配列を選択する。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子を異なる担体に挿入するか、または典型的に２つの遺伝子を同じ発現担体に挿入することができる。標準的な方法により抗体遺伝子を発現担体に挿入する（例えば、抗体遺伝子断片と担体の相補的な制限部位を連結するか、制限部位が存在しない場合は、平滑末端を連結する）。本明細書による抗体の軽鎖と重鎖可変領域によって、任意の抗体アイソタイプの全長抗体遺伝子を生成することができ、これを所望のアイソタイプの重鎖定常領域および軽鎖定常領域をコードした発現担体に挿入することで、ＶＨセグメントが担体中のＣＨセグメントに効率的に連結され、ＶＬセグメントが担体中のＣＬセグメントに効率的に連結される。
【００７６】
軽鎖および重鎖を発現させるためには、標準的な技術を応用して軽鎖と重鎖をコードする発現担体を宿主細胞にトランスフェクトする。さまざまな形式の用語「トランスフェクト」とは、外来ＤＮＡの原核生物または真核宿主細胞に導入するための電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなどのような技術を含むことを意味する。理論的には原核または真核宿主細胞の両方で、本開示内容の抗体を発現することがである。哺乳動物宿主細胞、酵母、または糸状真菌のような真核細胞での抗体の発現について論述すると、これらの真核細胞（特に、哺乳動物細胞）は、原核細胞よりも、正しく折りたたまれ、免疫学的に活性のある抗体を組み立てて分泌する可能性が高いからである。
【００７７】
二重特異的分子
別の態様において、本発明は、本開示内容の抗ｐｒｏＢＤＮＦを含む抗体またはその抗原結合部分を含むタンパク質の二重特異的または多重特異的分子を特徴とする。本発明の抗体またはタンパク質は、他の機能性分子、例えば、他のペプチドまたはタンパク質（例えば、受容体の他の抗体またはリガンド）に誘導されたり、連結されて、少なくとも２つの異なる結合部位または標的分子に結合する二重特異的分子を生成することができる。本発明の抗体またはタンパク質は、実際には複数の他の機能性分子に誘導したり、連結され、２つ以上の異なる結合部位および／または標的分子に結合する複数の特異的分子を生成することができる。これらの複数の特異的分子は、本明細書に使用される用語「二重特異的分子」に含まれるものと意図される。本発明の二重特異的分子を生成するために、本発明の抗体またはタンパク質は、他の抗体、抗体断片、ペプチド、または結合類似物などの１つまたは複数の他の結合分子に機能的に連結（例えば、化学的カップリング（ｃｏｕｐｌｉｎｇ、遺伝子融合、非共有結合またはその他の方法）されて、二重特異的分子を生成することができる。
【００７８】
したがって、本発明は、ｐｒｏ−ＢＤＮＦまたはその断片（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１、４４、または４７）の少なくとも一つの二重特異的分子を含んむ。例えば、第２の標的エピトープは、第１の標的エピトープと他のｐｒｏ−ＢＤＮＦのもう１つのエピトープである。別の実施例では、ｐｒｏ−ＢＤＮＦの第１結合特異的部分（例えば、１Ｄ３または２Ｈ８のいずれかの抗原結合部分）とｐｒｏ−ＢＤＮＦ内の別の場所または他の標的抗原のエピトープの第２結合特異的部分を含む二重特異的分子である。
【００７９】
多価抗体
別の態様において、本発明は、ｐｒｏ−ＢＤＮＦに結合する本発明の抗体の少なくとも２つの同一または異なる抗原結合部分（例えば、１Ｄ３または２Ｈ８から選択される抗原結合部分）を含む多価抗体を提供する。１つの解決手段において、多価抗体は、少なくとも２つ、３つ、または４つの抗体の抗原結合部分を提供する。タンパク質融合または共有または非共有の連結によって抗原結合部分を互いに連結することができる。または、二重特異的分子の連結方法を説明した。例えば、本発明の抗体をＦｃまたはヒンジ領域のような、本発明の抗体の定常領域に結合する抗体を架橋させて、４価化合物を得ることができる。
【００８０】
薬学的組成物
別の態様において、本発明は、組成物を提供し、例えば、薬学的組成物は、薬学的に許容される担体と一緒に製剤化された１つまたは一連の本開示内容の抗体またはその抗原結合部分を含むタンパク質（１Ｄ３または２Ｈ８から選択される抗体）を含む。これらの組成物は、１つまたは一連（例えば、２つまたは複数）の本発明の抗体を含むことができる。例えば、本発明の薬学的組成物は、一連の標的抗原に結合する異なるエピトープまたは相補的な活性を有する抗体またはタンパク質を含むことができる。
【００８１】
本発明の薬学的組成物は、併用療法（すなわち、他の薬物との組み合わせ）で投与することもできる。例えば、併用療法は、少なくとも１つの他の抗炎症剤または他の化学療法剤（例えば、免疫抑制剤）と組み合わせた本発明の抗ｐｒｏ−ＢＤＮＦ抗体またはタンパク質（例えば、１Ｄ３または２Ｈ８から選択される抗体）を含むことができる。
【００８２】
本明細書で使用されるように、「薬学的に許容される担体」は、生理学的に適合性のある任意及びすべての溶媒、分散媒質、コーティング剤、抗菌剤と抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮投与（例えば、注射または注入による）に適合しなければならない。１つの解決手段において、担体は、皮下経路に適合しなければならない。投与経路に応じて、活性化合物、すなわち抗体、免疫複合体または二重特異的分子は、酸及び前記化合物を不活性化させることができる他の自然条件作用から化合物を保護するために１つの物質でコーティングされることができる。
【００８３】
本発明の薬学的組成物は、１つまたは複数の薬学的に許容される塩を含むことができる。「薬学的に許容される塩」は、任意の有害な毒性効果を生成することなく、親化合物の所望の生物学的活性を保持する塩を指す（例えば、Ｂｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．ら，１９７７，  Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．  ６６：１−１９を参照）。これらの塩の例として酸付加塩および塩基付加塩を含む。
【００８４】
酸付加塩は、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素、ヨウ化水素酸、亜リン酸などの非毒性の無機酸から誘導された塩、脂肪族モノカルボン酸とジカルボン酸、フェニル置換されたアルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などのような非毒性の有機酸から誘導された塩を含む。塩基付加塩は、アルカリ土類金属（例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなど）から誘導された塩、およびＮ、Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン（Ｎ、Ｎ’−ｄｉｂｅｎｚｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）、Ｎ−メチルグルカミン（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｃａｍｉｎｅ）、クロロプロカイン（ｃｈｌｏｒｏｐｒｏｃａｉｎｅ）、コリン（ｃｈｏｌｉｎｅ）、ジエタノールアミン（ｄｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、エチレンジアミン（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）、プロカイン（ｐｒｏｃａｉｎｅ）などの非毒性の有機アミンから誘導された塩を含む。
【００８５】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容されるな抗酸化剤をさらに含むことができる。薬学的に許容される抗酸化剤の例として、アスコルビン酸（ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ）、システイン塩酸塩（ｃｙｓｔｅｉｎｅ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、重硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）、メタ重亜硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｏｓｕｌｆｉｔｅ）、亜硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｓｕｌｆｉｔｅ）など水溶性抗酸化剤と、パルミチン酸アスコルビル（ａｓｃｏｒｂｙｌ  ｐａｌｍｉｔａｔｅ）、ブチル化ヒドロキシアニソール（ｂｕｔｙｌａｔｅｄ  ｈｙｄｒｏｘｙａｎｉｓｏｌｅ，ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ｂｕｔｙｌａｔｅｄ  ｈｙｄｒｏｘｙｔｏｌｕｅｎｅ，ＢＨＴ）、レシチン（ｌｅｃｉｔｈｉｎ）、没食子酸プロピル（ｐｒｏｐｙｌ  ｇａｌｌａｔｅ）、α−トコフェロール（α−ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ）など脂溶性抗酸化剤と、クエン酸（ｃｉｔｒｉｃ  ａｃｉｄ）、エチレンジアミン四酢酸（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ，ＥＤＴＡ）、ソルビトール（ｓｏｒｂｉｔｏｌ）、酒石酸（ｔａｒｔａｒｉｃ  ａｃｉｄ）、リン酸などのような金属キレート剤を含む。
【００８６】
本発明の薬学的組成物に使用することができる適切な水性および非水性担体の例として、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）など）およびこれらの適切な混合物、オリーブオイルなどの植物油、およびエチルオレエート（Ｅｔｈｙｌ  ｏｌｅａｔｅ）のような注射可能な有機エステルを含む。例えば、レシチンのようなコーティング材料を使用すると、分散時に所望の粒子サイズを維持して、界面活性剤を使用して、適切な流動性を維持することができる。
【００８７】
これらの組成物は、防腐剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤のようなアジュバントをさらに含むことができる。滅菌方法およびパラベン系（Ｐａｒａｂｅｎｓ）、クロロブタノール（Ｃｈｌｏｒｏｂｕｔａｎｏｌ）、フェノール（ｐｈｅｎｏｌ）、ソルビン酸（Ｓｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ）など、さまざまな抗菌剤および抗真菌剤を含むことにより、微生物の存在を防ぐことができる。組成物に糖類、塩化ナトリウムなどの等張剤を添加することが望ましいことがある。なお、モノステアレート、ゼラチンのような吸収を遅延させる薬剤の添加により、注射可能な薬物形式の吸収を遅延させることができる。
【００８８】
薬学的に許容される担体は、無菌注射溶液または分散体と、無菌注射溶液または分散体の即時製造のための無菌粉末を含む。薬物活性物質に使用するためのこれらの媒質と薬物の使用は、当該技術分野で知られている。任意の通常の媒質または薬物が活性化合物と適合しない場合のほかに、本発明の薬学的組成物でのその用途を想像した。組成物に補充的な活性化合物をさらに混入することができる。
【００８９】
治療的組成物は、製造および保管条件下で、一般的に無菌で、安定しなければならない。組成物を、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、または高い薬物濃度に適した他の配置構造で製造することができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびこれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒質であることができる。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングを使用するか、分散体の場合は、所望の粒子サイズを維持することにより、および界面活性剤を使用することにより、維持することができる。多くの場合、糖類、マンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムのようなポリオールのような等張剤が組成物に含まれることができる。モノステアレート、ゼラチンのような吸収遅延剤を組成物に含めることにより、注射可能な組成物の吸収を遅延させることができる。
【００９０】
安定的なタンパク質（例えば、抗体）製剤の開発に関する総論はＣｌｅｌａｎｄら，１９９３，  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  １０（４）：３０７−３７７およびＷｅｉ  Ｗａｎｇ  １９９９，  Ｉｎｔ．  Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｃｓ  １８５：１２９−８８を参照することができる。抗体の他の配合に関する議論は、例えばＤａｕｇｈｅｒｔｙとＭｒｓｎｙ  ２００６，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５８：６８６−７０６；ＵＳ  ６，１７１，５８６および他の公知の文献を参照することができる。
【００９１】
皮内または皮下投与用の溶液または懸濁液は、通常、注射用水、塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）、グリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）、または他の合成溶媒のような無菌希釈剤、ベンジルアルコール（ｂｅｎｚｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ）またはメチルパラベン（ｍｅｔｈｙｌ  ｐａｒａｂｅｎ）などの抗菌剤、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムのような抗酸化剤、エチレンジアミン四酢酸のようなキレート剤、アセテート、クエン酸塩またはリン酸塩のような緩衝剤、および塩化ナトリウムまたはブドウ糖のような張力調整試薬のいずれかまたは複数のを含む。ｐＨは塩酸または水酸化ナトリウムのような酸または塩基で調節することができる。これらの製剤を、ガラスまたはプラスチックで製造されたアンプル、使い捨て注射器または多容量バイアルに密封包装することができる。
【００９２】
必要な量の前記活性化合物を必要とされる１つまたは一連の上記に列挙された成分と一緒に、適切な溶媒に混入させた後、微量で濾過滅菌し、無菌注射液を製造することができる。一般的に、本開示内容の抗体またはタンパク質を、基本的な分散媒質と、上記に列挙されたような成分に必要な他の成分を含有した無菌媒質に混入させて分散剤を製造する。無菌注射液を製造するための無菌粉末の場合、製造方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、前記方法は、以前に濾過された滅菌溶液の活性成分の任意の別の必要な成分を追加した粉末剤によるものである。
担体材料と組み合わせて単一の調製量形態を生成することができる活性成分の量は、治療される被験者との具体的な投与方法に応じて異なる場合がある。担体材料と組み合わせて単一の調製量形式を生成することができる活性成分の量は、一般的に治療効果を生成する組成物の量である。
【００９３】
「治療有効量」の本開示内容の抗ｐｒｏ−ＢＤＮＦ抗体またはタンパク質は、疾患の症状の重症度を低減、無疾患の症状期間の頻度と持続時間の増加、または疾患によって引き起こされる損傷または障害の予防することができる。
【００９４】
当該技術分野で公知の様々な方法の１つまたは複数のを利用して、１つまたは複数の投与経路によって、本開示内容の組成物を投与することができる。当業者が理解するように、投与経路および／または投与方式は、目的の結果に応じて異なる。本開示内容の抗体の投与経路は、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または注射または注入のような他の非経口投与経路を含む。本明細書で使用されるように、フレーズ「非経口投与」は、腸と局所投与以外の投与方式を意味し、一般的に注射を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、脊髄内、被膜内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外、および胸骨内（ｉｎｔｒａｓｔｅｍａｌ）注射と注入を含むが、これらに限定されない。
【００９５】
または、本開示内容の抗体またはタンパク質は、局所、表皮または粘膜投与経路のような非経口経路によって投与されることができ、例えば、鼻腔内、経口、経膣、直腸、舌下または局所に投与される。
【００９６】
担体を使用して、本開示内容の抗体またはタンパク質を製造することができ、前記担体は、インプラント、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化された配信システムを含む制御放出製剤のような迅速な放出から抗体を保護する。エチレン酢酸ビニル（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｖｉｎｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ）、ポリ無水物系（ｐｏｌｙａｎｈｙｄｒｉｄｅｓ）、ポリグリコール酸（ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）、ポリ−ｎ−エステル（ｐｏｌｙ−ｎ−ｅｓｔｅｒｓ）とポリ乳酸（ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ）のようなセンブンセソン、生体適合性ポリマーを使用することができる。これらの製剤を製造するための多くの方法は特許を受けたり、当業者に公知されている。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編集、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９７８を参照することができる。
【００９７】
当該技術分野で公知の医学的手段を使用して、治療的組成物を投与することができる。例えば、１つの解決手段において、本開示内容の治療的組成物は、ＵＳ５，３９９，１６３、ＵＳ５，３８３，８５１、ＵＳ５，３１２，３３５などに開示された手段のような針のない皮下注射手段によって投与することができる。
【００９８】
本開示内容に使用することができる公知のインプラントおよびモジュールの実装例として、調節された速度で薬物を分配するための移植可能な微細注入ポンプを開示したＵＳ４，４８７，６０３、皮膚を通して薬物を投与するための治療用装置を開示したＵＳ４，４８６，１９４、正確な注入速度で薬物を提供するための薬物注入ポンプを開示したＵＳ４，４４７，２３３、継続的な薬物送達のための可変流量移植型注入装置を開示したＵＳ４，４４７，２２４、複数の区画を有する浸透薬物送達システムを開示したＵＳ４，４３９，１９６、浸透薬物送達システムを開示したＵＳ４，４７５，１９６を含む。他の多くのこのようなインプラント、送達システム、およびモジュールは、当業者に知られている。
【００９９】
いくつかの実施形態において、本開示内容の抗体またはタンパク質は、体内で適切に分布されるように製造することができる。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は、多くの高親水性化合物を排除した。本開示内容の治療化合物がＢＢＢ（必要な場合）を通過するように、これらはリポソームに製剤化することができる。リポソームを製造する方法については、例えば、ＵＳ４，５２２，８１１、ＵＳ５，３７４，５４８、および５，３９９，３３１を参照することができる。前記リポソームは、特定の細胞または臓器に選択的に輸送され、標的化薬物送達を向上させる１つまたは複数の部分を含むことができる（例えば、Ｖ．Ｖ．Ｒａｎａｄｅ  １９８９，  Ｊ．Ｃｌｉｎｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ２９：６８５を参照）。例示的な標的部分は、葉酸またはビオチン（例えば、Ｌｏｗらの米国特許５，４１６，０１６を参照）、マンノシド（ｍａｎｎｏｓｉｄｅ）（Ｕｍｅｚａｗａら，１９８８，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．  １５３：１０３８）、抗体（Ｐ．Ｇ．Ｂｌｏｅｍａｎら，１９９５，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ３５７：１４０；Ｍ．Ｏｗａｉｓら，１９９５，  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｒｎｏｔｈｅｒ．  ３９：１８０）、界面活性剤Ａタンパク質受容体（Ｂｒｉｓｃｏｅら，１９９５，  Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １２３３：１３４）、ｐ１２０（Ｓｃｈｒｅｉｅｒら，１９９４，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２６９：９０９０）を含み、また、ＫｅｉｎａｎｅｎとＬａｕｋｋａｎｅｎ，１９９４，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ３４６：１２３、ＫｉｌｌｉｏｎとＦｉｄｌｅｒ，１９９４，  Ｉｍｍｕｎｏ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２７３を参照することができる。
【０１００】
本発明の用途と方法
本発明の抗体またはタンパク質は、インビトロおよびインビボで診断と治療機能がある。例えば、これらの分子は、培養中（例えば、インビトロまたはインビボ）または被験者のうち（例えば、インビボ）の細胞に投与して、様々な病症を治療、予防または診断することができる。
【０１０１】
前記の方法は、ｐｒｏ−ＢＤＮＦ関連疾患および／または自己免疫および炎症性疾患、例えば多発性硬化症、関節リウマチ、または乾癬の治療、予防または診断、または鎮痛に特に適している。
【０１０２】
具体的、本発明は、ｐｒｏ−ＢＤＮＦ関連疾患および／または自己免疫および炎症性疾患の治療、または鎮痛方法を提供する。いくつかの解決手段において、前記方法は、本発明の分離された抗体またはその抗原結合部分を含むタンパク質を、これを必要とする被験者に投与するステップを含む。
【０１０３】
本発明は、細胞を治療有効量の本開示内容の抗体を含む組成物と接触させて標的細胞または組織のｐｒｏ−ＢＤＮＦまたはｐｒｏ−ＢＤＮＦによって誘導されたシグナル伝達応答を減少させたり阻害するステップを含む方法より提供した。
【０１０４】
本明細書において、フレーズ「ｐｒｏ−ＢＤＮＦ媒介疾患」または「ｐｒｏ−ＢＤＮＦ関連疾患」は、ｐｒｏ−ＢＤＮＦまたはｐｒｏ−ＢＤＮＦが疾患または医学的状態の（直接または間接的に）作用を起こす、疾患または病状の原因、発症、進行、持続、または病理学を含むすべての疾患や病状を含む。したがって、これらの用語は、異常なｐｒｏ−ＢＤＮＦレベルに関連または異常なｐｒｏ−ＢＤＮＦレベルを特徴とする病状および／または標的細胞または組織のｐｒｏ−ＢＤＮＦが誘導する活性（例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、ＩＬ−６またはＩＬ−４の生成）を減少または阻害することにより治療できる疾患または病状を含む。これらの疾患または病状は、炎症性病状と自己免疫疾患、例えば、多発性硬化症、喘息、関節炎、関節リウマチまたは乾癬を含む。これらの疾患は、アレルギーおよびアレルギー性の病状、過敏症、慢性閉塞性肺疾患、嚢胞性線維症および臓器または組織移植拒絶反応を含む。
【０１０５】
本発明の抗体またはタンパク質は、自己免疫疾患または炎症の症状を治療、予防または改善することができ（しかし、これに限定されない）、特に病因学は自己免疫成分の炎症症状を含み、例えば、関節炎（例えば、関節リウマチ、慢性進行性関節炎（ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｃｈｒｏｎｉｃａ  ｐｒｏｇｒｅｄｉｅｎｔｅ）と奇形関節炎）とリウマチ性疾患を含み、骨損失、炎症性の痛みのリウマチ性疾患、脊椎関節症（強直性脊椎炎を含む）、光症候群、反応性関節炎、乾癬関節炎、小児特発性関節炎および腸関節炎、開始および終了点の炎症、過敏症（気道過敏症と皮膚過敏症を含む）およびアレルギーを含む。本開示内容の抗体が使用されることができる特定の自己免疫疾患は、自己免疫血液疾患（例えば、溶血性貧血、再生不良性貧血、純粋な赤血球貧血と特発性血小板減少症を含む）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎、炎症性筋疾患（皮膚筋炎）、歯肉炎、多発性軟骨炎、硬皮症、ウェゲナー肉芽腫症、皮膚筋肉炎、慢性活動性肝炎、重症筋無力症、乾癬、スティーブンジョンソン症候群、自発的な口腔炎症性下痢、自己免疫炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病、および過敏性腸症候群を含む）、内分泌眼疾患、グレーブス病、サルコイドーシス、多発性硬化症、全身性硬化症、繊維性疾患、原発性胆汁性肝硬変、若年性糖尿病（Ｉ型糖尿病）、ブドウ膜炎、乾燥角膜結膜炎と春角膜結膜炎、間質性肺線維症、人工関節周囲骨溶解症、糸球体腎炎（特発性症候群または微小症性腎臓病を含むネフローゼ症候群の有無にかかわらず）、多発性骨髄腫、他のタイプの腫瘍、皮膚および角膜の炎症性疾患、筋炎、骨インプラントの緩み、代謝障害（例えば、肥満、アテローム性動脈動脈硬化症と拡張性心筋症、ＩＩ型糖尿病および脂質異常症を含む他の心血管疾患）と自己免疫甲状腺疾患（橋本甲状腺炎を含む）、中小血管原発性血管炎、巨細胞動脈炎を含む大型血管血管炎、化膿性汗腺炎、視神経骨髄炎、シェーグレン症候群、ベーチェット病、アトピー性および接触性皮膚炎、細気管支炎、炎症性筋疾患、自己免疫性末梢神経障害、免疫腎臓、肝臓、甲状腺疾患、炎症およびアテローム性動脈硬化症、自己炎症発熱症候群、免疫血液疾患、および皮膚、粘膜の水疱性疾患を含む。解剖学的にブドウ膜炎は、前ブドウ膜炎、中ブドウ膜炎、後ブドウ膜炎または汎ブドウ膜炎であることができる。それは慢性または急性であることができる。ブドウ膜炎の病因は自己免疫または非感染性、伝染性であることができ、全身性と関連されるか、または白点症候群である。
【０１０６】
本開示内容の抗体またはタンパク質は、喘息、気管支炎、細気管支炎、特発性間質性肺炎、塵肺症、肺気腫と気道の他の閉塞性または炎症性疾患を治療、予防または改善することもできる。
【０１０７】
本開示内容の抗体またはタンパク質は、骨関節炎、骨粗しょう症およびその他の炎症性関節炎をはじめとする骨代謝疾患と年齢関連骨損失、特に歯周病を含む一般的な骨損失に使用することもできる。
【０１０８】
多発性硬化症、乾癬、喘息、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）とループス腎炎は、本発明の抗体またはその抗原結合部分を含むタンパク質を用いて治療されている特に好ましい標的を含む。
【０１０９】
本発明の抗体またはタンパク質を唯一の活性成分として投与するか、免疫抑制剤または免疫調節剤または他の抗炎症薬または他の細胞毒性製又は抗癌剤のような他の薬剤と一緒に（例えば、そのアジュバントまたはその組み合わせ）投与して、前記疾患を治療または予防することができる。例えば、本発明の抗体を金塩、スルファサラジン（ｓｕｌｆａｓａｌａｚｉｎｅ）、抗マラリア薬、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、Ｄ−ペニシラミン（Ｄ−ｐｅｎｉｃｉｌｌａｍｉｎｅ）、アザチオプリン（ａｚａｔｈｉｏｐｒｉｎｅ）、ミコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、タクロリムス（ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ）、シロリムス（ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ）、ミノサイクリン（ｍｉｎｏｃｙｃｌｉｎｅ）、レフルノミド（ｌｅｆｌｕｎｏｍｉｄｅ）、グルココルチコイドのようなＤＭＡＲＤと、シクロスポリンＡ（Ｃｉｃｌｏｓｐｏｒｉｎ  Ａ）またはＦＫ  ５０６のようなカルシニュリン（ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ）抑制剤と、ＦＴＹ７２０とＦＴＹ７２０類似体のようなリンパ球再循環調節剤と、ラパマイシン（ｒａｐａｍｙｃｉｎ）、４０−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−ラパマイシン（４０−Ｏ−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−ｒａｐａｍｙｃｉｎ）、ＣＣＩ７７９、ＡＢＴ５７８、ＡＰ２３５７３またはＴＡＦＡ−９３のようなｍＴＯＲ抑制剤と、ＡＢＴ−２８１、ＡＳＭ９８１などの免疫抑制性質を持つアスコマイシン（ａｓｃｏｍｙｃｉｎ）と、コルチコステロイド（ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄｓ）と、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）と、アザチオプリンと、レインフルエンザノーマグレードと、ミゾリビン（ｍｉｚｏｒｉｂｉｎｅ）と、ミコフェノール酸モフェチル（Ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌａｔｅ  Ｍｏｆｅｔｉｌ）と、１５−デオキシスポグリング（１５−ｄｅｏｘｙｓｐｅｒｇｕａｌｉｎ）またはそれらの免疫抑制類似体、類似体または誘導体と、ＭＨＣ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ５８、ＣＤ８０、ＣＤ８６またはそのリガンドのような白血球受容体に関するモノクローナル抗体のような免疫抑制モノクローナル抗体と、他の免疫調節化合物、例えば、ＣＴＬＡ４またはその突然変異体を有する細胞外ドメインの少なくとも一部、例えば、ＣＴＬＡ４タンパク質配列のＣＴＬＡ４またはその突然変異体の細胞外ドメインの少なくとも一部に接続された組換え結合分子、例えば、ＣＴＬＡ４Ｉｇ（例えば、ＡＴＣＣ  ６８６２で指定）またはその突然変異体、例えばＬＥＡ２９Ｙと、ＬＦＡ−１アンタゴニスト、ＩＣＡＭ−１または−３アンタゴニスト、ＶＣＡＭ−４拮抗薬またはＶＬＡ−４拮抗薬のような接着分子抑制剤と、またはテクソル（ｔａｘｏｌ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、アドリアマイシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）または５−フルオロウラシル（５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）などの化学療法剤と、インフルリシマップ（Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）、アダリムマブ（ａｄａｌｉｍｕｍａｂ）、ＣＤＰ８７０のようなＴＮＦのモノクローナル抗体またはエタノセプトゥ（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）、ＰＥ��−ＴＮＦ−ＲＩのようなＴＮＦ−ＲＩまたはＴＮＦ−ＲＩＩ受容体構造のような抗ＴＮＦ薬と、前炎症性サイトカイン遮断薬、ＩＬ１のブロッカー、例えばアナキンと（Ａｎａｋｉｎｒａ）またはＩＬ１トラップ（ｔｒａｐ）、カナスヌーズマップ（Ｋａｎａｎｕｚｕｍａｂ）、ＩＬ１３ブロッカー、ＩＬ４ブロッカー、ＩＬ６ブロッカー、ＩＬ１７ブロッカー（例えば、三クッキーヌマプ（ｓｅｃｕｋｉｎｕｍａｂ）、ブロアペダルマップ（ｂｒｏａｄａｌｕｍａｂ）、もうきぬマップ（ｉｘｅｋｉｚｕｍａｂ））と、メタロプロテアーゼ（ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ）のようなプロテアーゼ抑制剤または活性化剤、抗−ＩＬ１５抗体、抗−ＩＬ６抗体、抗−ＩＬ４抗体、抗−ＩＬ１３抗体、抗−ＣＤ２０抗体、アスピリン（ａｓｐｉｒｉｎ）または抗感染剤と同じＮＳＡＩＤのようなケモカインブロッカーと組み合わせて使用することができる（記載されて試薬に限定されない）。
【０１１０】
以下、具体的な実施例に結びつけて、本発明をさらに説明する。これらの実施例は、単に本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲はこれに限定されないことを理解されたい。下記の実施例では、具体的な条件を明示していない実験方法はＪ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋらが編集した分子クローニング実験ガイド、第３版、科学出版社、２００２に記載の通条件、またはメーカーが提案する条件に従う。
【０１１１】
実施例１．ヒトｐｒｏＢＤＮＦ前駆体ドメインタンパク質の発現と精製
（１）ｐＥＴ２２ｂ−ｐｒｏＢＤＮＦ担体の構築と検証
ヒト腫瘍細胞Ｕ８７ＭＧのｃＤＮＡを鋳型にして（ＲＡＹＧＥＮＥ会社から購入）、プライマーＰＲＯＢＤＮＦ−Ｆ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２５）とＰＲＯＢＤＮＦ−Ｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２６）でＰＣＲ増幅して、両端に制限酵素部位ＥＣＯＲＩ／ＸｈｏＩがあるｐｒｏＢＤＮＦ遺伝子断片（７０３ｂｐ）を得、ＥＣＯＲＩ／ＸｈｏＩ二重消化（ＮＥＢ社から購入）で目的の遺伝子断片ｐｒｏＢＤＮＦを得た。担体プラスミドはｐＥＴ２２ｂ（Ｎｏｖｏｇｅｎ会社から購入）ＥＣＯＲＩ／ＸｈｏＩ二重消化し、アガロースゲル電気泳動後、担体断片を回収し、Ｔ４リガーゼ（ＮＥＢ社から購入）作用の下で、前述した目的遺伝子断片ｐｒｏＢＤＮＦと連結した後、大腸菌ＴＯＰ１０（ＬＩＦＥ会社から購入）に形質転換し、アンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）耐性によりスクリーニングし、ＥＣＯＲＩ／ＸｈｏＩ切断酵素で挿入された断片を含有した陽性クローンを検証し、シーケンスチェックを使用して正確なヒトｐｒｏＢＤＮＦ遺伝子配列の原核発現プラスミドｐＥＴ２２ｂ−ｐｒｏＢＤＮＦを得た。
【０１１２】
（２）ヒトｐｒｏＢＤＮＦタンパク質の発現と精製
ｐＥＴ２２ｂ−ｐｒｏＢＤＮＦプラスミドを発現宿主菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社から購入）に形質転換させ、アンピシリン耐性のプレートに平らに伸ばし、３７ ℃の温度下で裏返し一晩培養し、単一のクルロウルを選択して誘導発現させ、モノクローナルを選択した後、ＯＤ６００が０.６ないし０.８になるまで振とう培養し、最終濃度が１ ｍＭのＩＰＴＧを入れて、３０ ℃の温度下で４時間誘導して菌液を収集した。遠心分離してペレットを得て、１０分の１体積の緩衝液Ａ（５０ ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、３００ ｍＭのＮａＣｌ、１０ ｍＭのイミダゾール、ｐＨ  ８.０）を入れて再懸濁し、ＰＭＳＦ（最終濃度は１ ｍＭである）を入れ、氷で超音波処理し、１５分間遠心分離（４ ℃、１２０００  ｇ）であり、遠心分離して上清を収集し、Ｎｉ−ＮＴＡ  Ａｇａｒｏｓｅ（ＱＩＡＧＥＮ社から購入）親和カラムクロマトグラフィーで精製して、目的発現タンパク質を得た後、ＰＢＳ溶液を透析し、１２ ％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで透析した後、精製されたタンパク質の純度を分析し、Ａ２８０でその含有量を測定し、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ電気泳動でその分子量を測定した結果、目的バンドの分子量の３０  ｋＤ近くであり、前記分子量は、ｐｒｏＢＤＮＦ分子の理論分子量２７.８ ｋＤと基本的に一致した。
【０１１３】
（３）ヒトｐｒｏＢＤＮＦ前駆体ドメイン発現担体Ｖ５Ｆ−ｐｒｏ−ｄｏｍａｉｎの構築
上記で得られたプラスミドｐＥＴ２２ｂ−ｐｒｏＢＤＮＦを鋳型として、プライマーＢＤＮＦｐｒｏＶＦ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）とＢＤＮＦｐｒｏＶＲ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）でＰＣＲ増幅して、両端に制限酵素部位ＮｈｅＩ／ＸｈｏＩがあるヒトｐｒｏＢＤＮＦ前駆体ドメイン遺伝子断片（３５０ｂｐ）を得た。前記ＰＣＲ断片を制限酵素ＮｈｅＩ／ＸｈｏＩ（ＮＥＢ社から購入）で二重消化して、得られた前駆体ドメイン遺伝子断片と同じＮｈｅＩ／ＸｈｏＩ（ＮＥＢ社から購入）二重消化して得られた担体Ｖ５Ｆ（ＲＡＹＧＥＮＥ会社から購入）をＴ４  ＤＮＡリガーゼにより連結した後、宿主菌ＴＯＰ１０（ＬＩＦＥ会社から購入）に形質転換させ、陽性クローンを選択してＰＣＲ検証し、シーケンスを使用して精度を確認して、Ｖ５Ｆ−ｐｒｏ−ｄｏｍａｉｎプラスミド正常に構築した。
【０１１４】
（４）ヒトｐｒｏＢＤＮＦ前駆体ドメインタンパク質の発現と精製
成長のよいＨＥＫ２９３Ｆ細胞（ＨＥＫ２９３Ｆ、ＬＩＦＥ会社から購入）を１×１０６ 細胞／ｍｌの密度で細胞三角形培養フラスコに接種し、３７ ℃、５ ％のＣＯ２と１２０ ｒｐｍの条件の下で一晩培養し、上記のステップで得られたＶ５Ｆ−ｐｒｏ−ｄｏｍａｉｎプラスミドとリポソーム（２９３Ｆｅｃｔｉｎ、ＬＩＦＥ会社から購入）をそれぞれＤＭＥＭで希釈して穏やかに混合し、室温下で２０分間インキュベーション（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）し、インキュベーションされたＤＮＡ−リポソーム複合体をＨＥＫ２９３Ｆ細胞に入れて、３７ ℃、５ ％のＣＯ２と１２０ ｒｐｍの条件下で７２時間の培養した。細胞培養液を収集し、４５００ ｇで１５分間遠心分離して上清を除去した。１ ｍｌのＦＬＡＧ抗体親和性充填材（ＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ  Ａｇａｒｏｓｅ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｇｅｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入）をとり、カラムに入れて、ＦＬＡＧ親和性カラムを溶解緩衝液（５０ ｍＭのＰＢ、０.３ ＭのＮａＣｌ、５ ％のグリセロール）で５〜１０個のカラム体積ので平衡化させた。遠心分離された細胞培養液上清をＦＬＡＧ親和性カラムを使用して、１ ｍｌ／ｍｉｎに流れ通る溶液を収集し、４ ℃の温度下で保管した。洗浄緩衝液１（５０ ｍＭのＰＢ、ｐＨ  ７.８、０.３ ＭのＮａＣｌ、５ ％のグリセロール）で５〜１０個のカラム体積を洗浄し、洗浄液１を収集し、４ ℃の温度に保持した。洗浄緩衝液２（５０ ｍＭのＰＢ、ｐＨ  ７.８、０.３ ＭのＮａＣｌ、５ ％のグリセロール）で４〜５つのカラム体積を洗浄し、洗浄液２を収集し、４℃の温度に保持した。洗浄緩衝液（５０ ｍＭのＧｌｙｃｉｎｅ．ＨＣｌ、ｐＨ  ３.０、０.３ ＭのＮａＣｌ、５ ％のグリセロール）で４〜５つのカラム体積を洗浄し、洗浄液を収集し、中和緩衝液（１Ｍ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ  ｐＨ８.０）を入れ、透析液（５０ ｍＭのＰＢ、ｐＨ  ７.８、０.３ ＭのＮａＣｌ、５％のグリセロール）で４ ℃の温度で一晩透析し、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ電気泳動によって目的のバンドの分子量は、ヒトｐｒｏＢＤＮＦ前駆体ドメインタンパク質の理論分子量１３ ｋＤに該当することが分かった。
【０１１５】
実施例２．ヒトｐｒｏＢＤＮＦ前駆体の単一鎖抗体スクリーニング
２．１  ファージディスプレイによるヒトｐｒｏＢＤＮＦ前駆体タンパク質に特異的に結合する抗体のスクリーニング
ファージディスプレイ技術を用いて、ヒトｐｒｏＢＤＮＦ前駆体タンパク質特異的抗体を、完全にヒトの天然抗体ライブラリーからスクリーニングした。このため、当該技術分野の通常のファージディスプレイ方法を使用してファージディスプレイライブラリーを製造し、ビオチン標識されたヒトｐｒｏＢＤＮＦ前駆体組換えタンパク質に対して４ラウンドクローブスクリーニングを行い、ファージディスプレイライブラリーの製造方法とディスプレイの方法は、ＰＣＴ／ＣＮ２０１６／０９６２９２、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ（ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｒｏｂｅｒｔ  Ａｉｔｋｅｎ）に開示され方法のような当該技術分野の操作によって行われる。
【０１１６】
２．２  ヒトｐｒｏＢＤＮＦ前駆体特異的結合抗体の検証
第４ラウンドのスクリーニングで得られたクローンからランダムに９６個を選択して、単一のファージＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着分析）により、ヒトｐｒｏＢＤＮＦ前駆体との結合能力を分析した。このため、９６ウェルディプウェプ培養プレートの各単一コロニーに３００μｌの２×ＹＴ／アンピシリン培地を（２ ％のグルコース含有）を接種して、３７ ℃および２５０ ｒｐｍの条件下で１６時間振とう培養した。２０ μｌの培養物を５００μｌの２×ＹＴ／アンピシリン培地（０.１ ％のグルコース含有）に接種し、３７ ℃と２５０ ｒｐｍの条件下で１.５時間振とう培養した。ヘルパーファージ（ｈｅｌｐｅｒ  ｐｈａｇｅ）溶液を用意し、７５ μｌのＭ１３ＫＯ７（滴度は３×１０１２ ｐｆｕ／ｍｌ）をとり、１５ ｍｌの２×ＹＴ培地に混合して、５０ μｌ／ウェル培養プレートに添加した。３７ ℃と１５０ ｒｐｍの条件下で３０分間培養した後、用意されたカナマイシン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）溶液を５０ μｌ／ウェル（１８０μｌの５０ ｍｇ／ｍｌのカナマイシンをとり、１５ ｍｌの２×ＹＴ培地に入れる）とり、３７ ℃と２５０ ｒｐｍの条件下で１６時間振とう培養した。最後に、細胞を遠心分離して（３０分、５０００×ｇ、４ ℃）、上清を新しい９６ウェルディプウェル培養プレートに移した。
【０１１７】
単一ファージＥＬＩＳＡを行うために、１００ ｎｇ／ウェルの抗原ヒトｐｒｏＢＤＮＦ前駆体および陰性対照タンパク質（ＢＳＡ  １００ μｌ／ウェル）を使用して、４ ℃の温度下で９６ウェルのＭｅｄｉＳｏｒｐ  ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃから購入する）に一晩コーディングした。それぞれのウェルを２ ％のＢＳＡ（ｗ／ｖ）を含有したＰＢＳＴでブロックした。この後、ＰＢＳＴでウェルを３回洗浄してきれいに除去した。その後、プレート上の各ウェルに、上記で調製した各ファージ溶液を１００ μｌ／ウェルに加えた。３７ ℃で２ 時間インキュベートした後、ＰＢＳＴで３回洗浄した。結合したファージを検出するために、抗Ｍ１３抗体ペルオキシダーゼジスムターゼ複合体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入）をＰＢＳＴで１：５０００に希釈し、１００ μｌを各ウェルに加えた。３７ ℃で１ 時間インキュベートした後、ウェルをＰＢＳＴで３回、次にＰＢＳで３回すすいだ。最後に、５０ μｌのＴＭＢ基質をとり、各ウェルに入れて、室温下で１０分間発色し、各ウェルに５０μｌの２ ＭのＨ２ＳＯ４を入れて発色反応を停止させた。酵素結合免疫分析装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して４５０ ｎＭで消光値を測定した。
【０１１８】
シーケンス解析に結合して、単一鎖抗体１Ｄ３（ヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２を参照、アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１を参照）と２Ｈ８（ヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４を参照、アミノ酸配列は２３を参照）を観察し、ＥＬＩＳＡ実験では、ヒトｐｒｏＢＤＮＦ前駆体タンパク質の結合信号は強いが、ＢＳＡは、結合はない（図１）。この２つの抗体に対応するプラスミドは、ｐＣａｎｔａｂ−１Ｄ３とｐＣａｎｔａｂ−２Ｈ８である。
【０１１９】
実施例３．ヒトｐｒｏＢＤＮＦ前駆体タンパク質モノクローナル抗体の製造
本実施例において、モノクローナル抗体の発現は、二重プラスミドシステムを使用し、それぞれの抗体重鎖可変領域遺伝子をヒトＩｇＧ１  ＣＨ遺伝子を含むｐＩＨプラスミドに構築しなければならず、抗体軽鎖可変領域遺伝子をヒトＩｇＧ  ＣＬ遺伝子含有ｐＩＫプラスミドに構築しなければならない（プラスミドは上海鋭勁バイオテック有限会社から購入）。
【０１２０】
プライマーペア１Ｄ３−ＨＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）と１Ｄ３−ＨＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１）を使用して鋳型プラスミドｐＣａｎｔａｂ−１Ｄ３からＶＨ−１Ｄ３断片を増幅させた。プライマーペアＨＦ１Ｆ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２）とＨＦ１Ｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）を使用して鋳型プラスミドｐＩＨからＨＦ１断片を増幅させた。プライマーペアＨＦ３Ｆ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）とＨＦ３Ｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５）を使用して鋳型プラスミドｐＩＨからＨＦ３断片を増幅させた。３つの断片を等モル比で混合した後、スフライシング（ｓｐｌｉｃｉｎｇ）ＰＣＲを行い、断片を回収した後、制限酵素ＮｈｅＩ／ＮｏｔＩで二重消化し、同様にＮｈｅＩ／ＮｏｔＩで二重消化された担体プラスミドｐＩＨをＴ４  ＤＮＡリーゼロ宿主菌ＴＯＰ１０に形質転換させ、クローンを選択してＰＣＲを介して陽性クローンを検証し、シーケンシングで確認して、ｐＩＨ−１Ｄ３真核発現プラスミドを得た。同じ方法でｐＩＨ−２Ｈ８真核発現プラスミドを得た。
【０１２１】
ｐＩＫ−１Ｄ３真核発現プラスミドを得るために、プライマーペア１Ｄ３−ＬＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）と１Ｄ３−ＬＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７）を使用して鋳型プラスミドｐＣａｎｔａｂ−２Ｈ８からＶＬ−２Ｈ８断片を増幅させて、プライマーペアＬＦ１Ｆ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）とＬＦ１Ｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）を使用して鋳型プラスミドｐＩＫからＬＦ１断片を増幅させた。２つの断片を等モル比で混合した後、スフライシングＰＣＲを行い、断片を回収した後、制限酵素ＥｃｏＲＶ／ＢｓｉＷＩ二重切断で二重消化し、同様にＥｃｏＲＶ／ＢｓｉＷＩで二重消化された担体プラスミドｐＩＫをＴ４  ＤＮＡリガゼロ宿主菌ＴＯＰ１０に形質転換させ、クローンを選択してＰＣＲを介して陽性クローンを検証し、シーケンシングで確認した。同じ方法でｐＩＫ−２Ｈ８真核発現プラスミドを得た。
【０１２２】
発現プラスミドｐＩＨ−１Ｄ３とｐＩＫ−１Ｄ３を等モル比で混合し、ｐＩＨ−２Ｈ８とｐＩＫ−２Ｈ８を等モル比で混合して、それぞれによく成長したＨＥＫ−２９３Ｆ細胞に形質感染させ、３７ ℃、５ ％のＣＯ２、１２５ ｒｐｍの条件の下で７日間シェーカーで連続培養し、４０００ ｒｐｍで１０分間遠心分離して、沈殿物を除去し、上清を収集し、０.４５μｍのろ過膜でろ過して、処理されたサンプルをｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ（ＧＥから購入）親和性カラムに優しい精製し、最終的に精製された組換えモノクローナル抗体１Ｄ３と２Ｈ８を得ており、検証結果は、図２に示された通りである。
【０１２３】
実施例４．ヒトｐｒｏＢＤＮＦ前駆体タンパク質モノクローナル抗体の親和性
Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００システム（ＧＥから購入）を使用してキャプチャ法により、それぞれ１Ｄ３と２Ｈ８モノクローナル抗体の親和性と動力学パラメータを測定した。操作は、明細書を参照することができ、ヒトｐｒｏＢＤＮＦ前駆体タンパク質の濃度は、それぞれ０.２５ ｎＭ、０.５ ｎＭ、１ ｎＭ、２ ｎＭ、４ｎＭおよび８ ｎＭである。Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅによって得られた作用曲線を評価し、親和性のＫＤ値を測定した。図３および図４は、それぞれＢｉａｃｏｒｅ親和性の測定実験でのモノクローナル抗体１Ｄ３と２Ｈ８の動力学曲線を示す。
【０１２４】
それぞれのヒトｐｒｏＢＤＮＦ前駆体タンパク質に対する１Ｄ３と２Ｈ８のモノクローナル抗体の結合データは、表１に要約されている。
表１．ヒトｐｒｏＢＤＮＦ前駆体タンパク質に対する１Ｄ３と２Ｈ８のモノクローナル抗体の親和性パラメータ
2020531041.tif 000003
【０１２５】
実施例５．２Ｈ８および１Ｄ３治療実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の実験
本実験は、ＳＰＦ級６〜８週間雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスを使用し、体重は１８〜２０  ｇである。
【０１２６】
ＥＡＥモデルの製造：ＭＯＧ３５−５５（３ ｍｇ／ｍｌ）／ＩＦＡ（Ｈ３７ＲＡ  ４ ｍｇ／ｍｌ）を完全に乳化させた後、１５０ μｌ／マウスの用量で、マウスの上背の左右両側と左側尾部に皮下注射した。同時に、百日咳菌毒素（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  ｔｏｘｉｎ）ＰＴＸ（０.５ μｇ／１００ μｌ）を５０ μｌ／マウスの用量で腹腔注射し、４８時間後に再び同じ用量のＰＴＸを注射した。７日目に、ＭＯＧ３５−５５（３ ｍｇ／ｍｌ）／ＩＦＡ（Ｈ３７ＲＡ  ２ ｍｇ／ｍｌ）を免疫化されたマウスの下背の左右両側および右尾部に１５０μｌ／マウスの用量で皮下注射した。
【０１２７】
２０匹のマウスをランダムに完全ヒト由来ＩｇＧ対照抗体群と２Ｈ８モノクローナル抗体関与群に分けた。相同ＩｇＧ対照抗体群は、ＥＡＥモデリング後１７日目、１９日目、および２３日目に完全ヒト由来ＩｇＧ対照抗体群を０.２ ｍｌ／回に腹腔注射した。２Ｈ８モノクローナル抗体関与群は、モデリングした後、１７日目、１９日目、および２３日目に２Ｈ８モノクローナル抗体を５ ｍｇ／ｋｇずつ２００ μＬを腹腔注射した。
【０１２８】
ブランク（Ｂｌａｎｋ）対照群と実験群のマウスを毎日ＥＡＥモデルで臨床的に評価して、評価基準は下記の通りである。臨床症状がない場合、０点、尾に力がない場合、０.５点、尾が麻痺された場合、１点、協調運動が消えた場合、２点、一側の後肢が麻痺された場合、２.５点、両側後肢が麻痺された場合、３点、両側後肢が麻痺して前足半分が力がない場合、３.５点、前足が麻痺された場合、４点、瀕死または死亡した場合、５点である。死んだマウスは、死んだ日に５点を得て、次の日からスコアを記録しない。
【０１２９】
結果は、図５Ａおよび図５Ｂに示された通りであり、相同対照抗体が提供されるＥＡＥマウスは、モデリング後、１７日に臨床評点で著しく増加し、臨床スコアは２点を超えており、モデリング後４９日まで維持され、２Ｈ８モノクローナル抗体が提供されるＥＡＥマウスは、モデリング後１７日から４９日に臨床評価がすべて１.５点より低かった。臨床累積スコアは、相同対照群抗体が関与したＥＡＥマウスの臨床治療の累積評価（４３.４５±５.００９点）は、２Ｈ８クローンで治療されたＥＡＥマウスの臨床評価（２４.６５±１.２８２点）より著しく高いことを示し、結果として２Ｈ８クローンはこのＥＡＥマウスでの臨床症状が改善されたことを示唆する。
【０１３０】
本実施例の上記操作を参照すると、抗体１Ｄ３に対してＥＡＥモデル臨床評価を実行した結果、図６Ａ及び６Ｂに示された通りであり、１Ｄ３クローン関与群ＥＡＥマウスの臨床評価は、相同ＩｇＧ対照抗体関与群より著しく減少され、臨床累積治療評価群１Ｄ３治療群は２１.６５±１.７３４点で、相同対照群ＩｇＧ抗体群は４３.４５±５.００９点で、１Ｄ３がＥＡＥマウスの進行を著しく減少させることを示唆している。
【０１３１】
実施例６．ＥＡＥマウス発病初期の炎症因子の発現に対するｐｒｏＢＤＮＦ抗体の影響
実施例５の操作を参照して、ＥＡＥモデルを実行して、実験群を、（１）正常対照（ｃｏｎ）群、（２）単にＡｂ−ｐｒｏＢＤＮＦモノクローナル抗体（Ａｂ−ｐｒｏＢ）投与群：モデリング１日前の５ ｍｇ／ｋｇのＡｂ−ｐｒｏＢＤＮＦ（１Ｄ３）モノクローナル抗体の投与群、（３）ＥＡＥモデル＋相同ＩｇＧ抗体投与対照（ＥＡＥ）群、（４）ＥＡＥモデル ＋ Ａｂ−ｐｒｏＢＤＮＦモノクローナル抗体投与（ＥＡＥ ＋ Ａｂ−ｐｒｏＢ）群に分ける。ＱＰＣＲの方法で、各群からの脊髄や脾臓の疾患関連遺伝子発現を検出し、その結果は、図７に示された通りである。
【０１３２】
図７Ａは、炎症因子ＴＮＦ−α遺伝子発現状況を示す。Ａｂ−ｐｒｏＢ群は正常対照群に比べ、ＴＮＦ−αの発現が、基本的に類似するが、ＥＡＥ群のＴＮＦ−αの発現が正常対照群よりも著しく増加され、ｐｒｏＢＤＮＦ抗体が早期炎症に対して干渉と予防作用があることを示す。ＥＡＥ ＋ Ａｂ−ｐｒｏＢ群はＥＡＥ群に比べ、ＴＮＦ−αｍＲＮＡレベルが顕著に減少し、正常対照群に比べ顕著な差がなく、１Ｄ３モノクローナル抗体の投与が、ＴＮＦ−αのレベルを著しく減少させることができることを示して、すなわち、ｐｒｏＢＤＮＦ抗体が抗炎症作用があることを示す。
【０１３３】
図７Ｂ、図７Ｃ、図７Ｄは、それぞれＥＡＥマウス脾臓ＩＬ−６、ＩＬ−２、ＩＬ−４に対するＡｂ−ｐｒｏＢの作用を示す。結果、正常対照群に比べ、Ａｂ−ｐｒｏＢ群のＩＬ−６、ＩＬ−２、ＩＬ−４遺伝子発現は、顕著な違いがないが、ＥＡＥ群のＴＮＦ−α発現は、正常対照群よりも著しく増加され、ｐｒｏＢＤＮＦ抗体が早期炎症に対して干渉と予防作用があることを示し、ＥＡＥ群脾臓ＩＬ−６、ＩＬ−２、ＩＬ−４遺伝子は、対照群に比べ、発現が著しく上方調節され、１Ｄ３関与後（ＥＡＥ ＋ Ａｂ−ｐｒｏＢ群）、ＩＬ−６、ＩＬ−２およびＩＬ−４遺伝子レベルがＥＡＥ群より著しく減少した。これらの結果は、ｐｒｏＢＤＮＦ抗体の投与がＥＡＥの早期脾臓から上方調節されたＩＬ−６、ＩＬ−２、ＩＬ−４ ｍＲＮＡレベルを阻害することができることを示し、すなわち、ｐｒｏＢＤＮＦ抗体が抗炎症作用があることを示す。
【０１３４】
実施例７．抗体のエピトープ結合実験
Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ結果は、抗体１Ｄ３、２Ｈ８が変性されたｈｕＢＤＮＦｐｒｏに結合することができることを示し、２つの抗体の結合エピトープが線形である可能性があることを示唆している。ｈｕＢＤＮＦｐｒｏを２つのペプチドセグメント（Ｅ１、Ｅ２）、または３つのペプチドセグメント（Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５）で平均的に分割し、アミノ酸配列は、下記の通りである。
Ｅ１：ｐｍｋｅａｎｉｒｇｑｇｇｌａｙｐｇｖｒｔｈｇｔｌｅｓｖｎｇｐｋａｇｓｒｇｌｔｓｌａｄｔｆｅｈｍｉｅｅｌｌｄｅｄｑ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）
Ｅ２：ｋｖｒｐｎｅｅｎｎｋｄａｄｌｙｔｓｒｖｍｌｓｓｑｖｐｌｅｐｐｌｌｆｌｌｅｅｙｋｎｙｌｄａａｎｍｓｍｒｖｒｒｈ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）
Ｅ３：ｐｍｋｅａｎｉｒｇｑｇｇｌａｙｐｇｖｒｔｈｇｔｌｅｓｖｎｇｐｋａｇｓｒｇｌ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）
Ｅ４：ｔｓｌａｄｔｆｅｈｍｉｅｅｌｌｄｅｄｑｋｖｒｐｎｅｅｎｎｋｄａｄｌｙｔｓｒ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）
Ｅ５：ｖｍｌｓｓｑｖｐｌｅｐｐｌｌｆｌｌｅｅｙｋｎｙｌｄａａｎｍｓｍｒｖｒｒｈ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）
５つのペプチドセグメントとＧＳＴ融合発現させた後、精製した。ＥＬＩＳＡによって抗体１Ｄ３と２Ｈ８の結合を検出した。図８に示すように、抗体１Ｄ３および２Ｈ８とＧＳＴ−ｈｕＢＤＮＦｐｒｏ全長、ＧＳＴ−ｈｕＢＤＮＦｐｒｏ−Ｅ２ペプチドセグメントは、ＧＳＴ−ｈｕＢＤＮＦｐｒｏ−Ｅ５ペプチドセグメントがすべて結合され、この２つの抗体の結合エピトープがＥ５ペプチドセグメントのこれらの３６個のアミノ酸内に位置することを示唆している。
【０１３５】
実施例８．抗体のエピトープ結合実験
Ｅ５ペプチドセグメントを１２個のアミノ酸を含有する３つの三等分ペプチドのセグメントに分割し、それぞれＶＰペプチドセグメント（ＶＭＬＳＳＱＶＰＬＥＰＰ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）、ＬＬペプチドセグメント（ＬＬＦＬＬＥＥＹＫＮＹＬ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）、ＤＨペプチドセグメント（ＤＡＡ ｎＭＳＭＲＶＲＲＨ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）である。ＧＬ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（上海）有限会社によってインビトロで合成されたビオチン化ＶＰペプチドセグメント、ＬＬペプチドセグメントとＤＨペプチドセグメントをＥＬＩＳＡによって抗体の結合を検出した。結果は、図９に示された通りであり、抗体１Ｄ３とＤＨペプチドセグメントの結合が比較的強く、２Ｈ８とＤＨペプチドセグメントの結合が比較的弱く、他の２つのペプチドセグメントは結合せず、抗体１Ｄ３のエピトープがＤＨペプチドセグメントの近くにあり、２Ｈ８のエピトープがＤＨペプチドセグメントの近くにあることを示唆している。
【０１３６】
本発明に記載する配列は、下記の表のように総括される。
2020531041.tif 000004
2020531041.tif 000005
2020531041.tif 000006
2020531041.tif 000007
2020531041.tif 000008
2020531041.tif 000009
2020531041.tif 000010
2020531041.tif 000011
2020531041.tif 000012
2020531041.tif 000013
本発明で言及されるすべての文書は、あたかも各文書が個々に参照により組み込まれたかのように、本出願に参照により組み込まれている。さらに、本発明の上記の教示内容を読んだ後、当業者は本発明に様々な変更または修正を加えることができ、これらの同等の形態も本願に添付された特許請求の範囲によって定義される範囲内にあることを理解されたい。
【図１】
2020531041.tif 000014
【図２】
2020531041.tif 000015
【図３】
2020531041.tif 000016
【図４】
2020531041.tif 000017
【図５】
2020531041.tif 000018
【図６】
2020531041.tif 000019
【図７】
2020531041.tif 000020
【図８】
2020531041.tif 000021
【図９】
2020531041.tif 000022
【配列表】
2020531041000001.app
【国際調査報告】
2020531041.tif 000023
2020531041.tif 000024
2020531041.tif 000025
2020531041.tif 000026
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2020531041.tif 000029
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2020531041.tif 000031