(57)【要約】  本発明は、医療分野、特に、神経障害の処置に関する。より具体的には、本発明は、ナノ粒子又はナノ粒子凝集体が電場に曝された場合に、対象における神経疾患又はその少なくとも１つの症状の予防又は治療における使用のためのナノ粒子又はナノ粒子凝集体であって、ナノ粒子又はナノ粒子凝集体の材料が、導体材料、半導体材料、２００以上の誘電率εｉｊｋを有する絶縁体材料及び１００以下の誘電率εｉｊｋを有する絶縁体材料から選択される、ナノ粒子又はナノ粒子凝集体に関する。更に、本発明は、このようなナノ粒子及び／又はナノ粒子凝集体を含む組成物及びキット並びにそれらの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノ粒子又はナノ粒子凝集体が電場に曝された場合に、対象における神経疾患又はその少なくとも１つの症状の予防又は治療における使用のためのナノ粒子又はナノ粒子凝集体であって、
ナノ粒子又はナノ粒子凝集体の材料は、導体材料、半導体材料、２００以上の誘電率εｉｊｋを有する絶縁体材料及び１００以下の誘電率εｉｊｋを有する絶縁体材料から選択される、ナノ粒子又はナノ粒子凝集体。
【請求項２】
電場が、脳深部刺激、経頭蓋電気刺激又は経頭蓋磁気刺激により印加される、請求項１記載の使用のためのナノ粒子又はナノ粒子凝集体。
【請求項３】
ナノ粒子又はナノ粒子凝集体の材料が、０．２超の標準還元電位Ｅ°を有する金属及び構造中に隣接するｓｐ２混成炭素中心を有する有機材料から選択される導体材料である、請求項１又は２記載の使用のためのナノ粒子又はナノ粒子凝集体。
【請求項４】
ナノ粒子又はナノ粒子凝集体の材料が、金属元素がＩｒ、Ｐｄ、Ｐｔ、Ａｕである金属ナノ粒子又はそれらの混合物並びにポリアニリン、ポリピロール、ポリアセチレン、ポリチオフェン、ポリカルバゾール及び／もしくはポリピレン（polypyrene）からなる有機ナノ粒子から選択される、請求項３記載の使用のためのナノ粒子又はナノ粒子凝集体。
【請求項５】
ナノ粒子又はナノ粒子凝集体の材料が、３．０eV未満のバンドギャップＥｇを有する半導体材料である、請求項１又は２記載の使用のためのナノ粒子又はナノ粒子凝集体。
【請求項６】
ナノ粒子又はナノ粒子凝集体の材料が、メンデレーエフ周期表のＩＶＡ族からの元素又はメンデレーエフ周期表のＩＩＩ族及びＶ族からの元素の混合組成又はメンデレーエフ周期表のＩＩ族及びＶＩ族からの元素の混合組成からなる、請求項５記載の使用のためのナノ粒子又はナノ粒子凝集体。
【請求項７】
ナノ粒子又はナノ粒子凝集体の材料が、メンデレーエフ周期表のＩＶＡ族からの元素からなり、Ａｌ、Ｂ、Ｇａ、Ｉｎ及びＰから選択される電荷キャリアによりドーピングされている、請求項６記載の使用のためのナノ粒子又はナノ粒子凝集体。
【請求項８】
材料が、３．０eV以上のバンドギャップＥｇを有する絶縁体材料であり、比誘電率εｉｊｋが、２０℃〜３０℃、１０２Hz〜赤外周波数までの間で測定される、請求項１又は２記載の使用のためのナノ粒子又はナノ粒子凝集体。
【請求項９】
材料が、３．０eV以上のバンドギャップＥｇを有する絶縁体材料であり、比誘電率εｉｊｋが、２００以上であり、ナノ粒子又はナノ粒子凝集体の材料が、ＢａＴｉＯ３、ＫＴａＮｂＯ３、ＫＴａＯ３、ＳｒＴｉＯ３及びＢａＳｒＴｉＯ３から選択される混合金属酸化物である誘電体材料である、請求項８記載の使用のためのナノ粒子又はナノ粒子凝集体。
【請求項１０】
材料が、３．０eV以上のバンドギャップＥｇを有する絶縁体材料であり、比誘電率εｉｊｋが、１００以下であり、ナノ粒子又はナノ粒子凝集体の材料が、金属元素がメンデレーエフ周期表の周期３、５もしくは６からの金属元素又はランタニドである金属酸化物、混合金属酸化物、及び炭素材料から選択される誘電体材料である、請求項８記載の使用のためのナノ粒子又はナノ粒子凝集体。
【請求項１１】
神経疾患が、パーキンソン病、アルツハイマー病、てんかん、強迫性障害、自閉症スペクトラム障害、抑うつ障害、ジストニア、トゥレット症候群、統合失調症、脳卒中、失語症、認知症、耳鳴り、ハンチントン病、本態性振戦、双極性障害、不安障害、中毒障害、意識植物状態（consciousness vegetative state）及びそれらの少なくとも１つの症状から選択される、請求項１〜１０のいずれか一項記載の使用のためのナノ粒子。
【請求項１２】
電場に曝された対象における神経疾患又はその少なくとも１つの症状の予防又は治療における使用のための組成物であって、
組成物は、ナノ粒子及び／又はナノ粒子凝集体と、薬学的に許容し得る支持体とを含み、ここで、ナノ粒子又はナノ粒子凝集体の材料は、導体材料、半導体材料、２００以上の誘電率εｉｊｋを有する絶縁体材料及び１００以下の誘電率εｉｊｋを有する絶縁体材料から選択される、組成物。
【請求項１３】
組成物が、少なくとも２種の別個のナノ粒子及び／又はナノ粒子凝集体を含み、各ナノ粒子又はナノ粒子凝集体が、導体材料、半導体材料、２００以上の誘電率εｉｊｋを有する絶縁体材料及び１００以下の誘電率εｉｊｋを有する絶縁体材料から選択される別個の材料からなる、請求項１２記載の使用のための組成物。
【請求項１４】
少なくとも２種の別個のナノ粒子及び／又はナノ粒子凝集体を含み、各ナノ粒子又はナノ粒子凝集体は、導体材料、半導体材料、２００以上の誘電率εｉｊｋを有する絶縁体材料及び１００以下の誘電率εｉｊｋを有する絶縁体材料から選択される別個の材料からなる、キット。
【請求項１５】
対象における神経疾患又はその少なくとも１つの症状の予防又は治療における使用のための、請求項１４記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療分野、特に、神経障害の処置に関する。より具体的には、本発明は、ナノ粒子又はナノ粒子凝集体が電場／電気刺激に曝された場合に、対象における神経疾患又はその少なくとも１つの症状の予防又は治療における使用のためのナノ粒子又はナノ粒子凝集体であって、ナノ粒子又はナノ粒子凝集体の材料が、導体材料、半導体材料、２００以上の誘電率εｉｊｋを有する絶縁体材料及び１００以下の誘電率εｉｊｋを有する絶縁体材料から選択される、ナノ粒子又はナノ粒子凝集体に関する。更に、本発明は、このようなナノ粒子及び／又はナノ粒子凝集体を含む組成物及びキット並びにそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
神経障害は、主要な健康上の懸念事項である（Neurological disorders public health challenges. WHO, 2006）。ニューラルネットワーク機能の障害は、異なる起源を有し得る。パーキンソン病は、中脳に位置する黒質におけるドーパミンニューロンの死により引き起こされる運動障害である。脳卒中は、脳の血液供給の遮断に対応する。酸素無しには、冒された領域のニューロンは死滅し、これらの細胞により制御される身体の部分は機能することができなくなる。ハンチントン病は、遺伝性障害である。てんかんは、種々の脳領域におけるニューロンの大きな群の異常な興奮により引き起こされる障害である。アルツハイマー病は、海馬、大脳皮質及び他の脳領域におけるニューロンの死を特徴とする神経変性障害である。自閉症スペクトラム障害の原因は、遺伝的、環境的等の多因子性である。
【０００３】
神経障害は、患者に影響を及ぼす主要な症状に応じて分類することができる。本明細書において以下で更に説明されるように、運動障害、精神（気分／社会）障害及び認知障害の３つの主要なタイプの症状が観察される。
【０００４】
運動障害は、振戦、運動機能低下、例えば、運動緩徐又はジスキネジア、筋捻転、硬直、姿勢不安定性、すくみ足等を包含する。運動障害を呈する疾患は、典型的には、パーキンソン病、ジストニア、てんかん、ハンチントン病及びトゥレット症候群を含む。
【０００５】
精神障害は、気分／社会障害の症状を呈する各種の疾患を構成する。非網羅的なリストは、自閉症スペクトラム障害、統合失調症障害、双極性障害、抑うつ障害、不安障害、強迫性障害、物質関連及び／又は中毒障害を含む（the Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 2013, 第５版, the American Psychiatric Associationからの定義）。運動障害、例えば、パーキンソン病及びジストニアを患う患者の中には、疾患の後期に精神障害を発症する場合がある。
【０００６】
認知障害は、すべてではないにしても多くの精神障害（例えば、統合失調症、双極性障害）に存在する。中心になる特徴が認知性である障害のみが、認知障害カテゴリーに含まれる。認知障害は、患者の日常生活に影響を及ぼし、単純な仕事を達成することが困難である。認知症は、代表的な認知障害であり、日常生活に支障をきたすほど重度の精神能力の低下の総称である。アルツハイマー病は、神経変性局面を伴う特有なタイプの認知症である。
【０００７】
神経障害は、可能な場合、脳における神経伝達物質レベルのレギュレーション及びそれらの特定の神経伝達物質レセプターとの相互作用の制御において役割を果たす薬物により処置される。関与する主な神経伝達物質は：グルタマート、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、ドーパミン及びアセチルコリンである。グルタマート及びＧＡＢＡ神経伝達物質は、特に興味深い。それらは、神経細胞の興奮性の増大（Platt et al., The Veterinary Journal, 2007, 173, 278-286: The role of glutamate in central nervous system health and disease - a review）及び低下（Holmes et al., Mental Retardation and Developmental Disabilities, 1995, 1, 208-219: Role of glutamate and GABA in the pathophysiology of epilepsy）のそれぞれにおいて主要な役割を果たすためである。ドーパミンは、いくつかの脳機能：基底核を介した運動の制御（基底核におけるドーパミンの不適切なレベルは、制御されていない運動をもたらす）、快楽報酬を求める行動（障害により、機能不全中毒がもたらされ得る）、認知（前頭葉におけるドーパミンの障害により、神経認知機能の低下がもたらされ得る）等に関与する（Alcaro et al., Brain Res. Rev., 2007, 56(2), 283-321: Behavioral functions of the mesolimbic dopaminergic system: an affective neuroethological perspective）。アセチルコリンは、中枢神経系レベルにおける学習及び記憶に関与する神経伝達物質である（Hasselmo et al., Curr Opin Neurobiol, 2006, 16(6), 710-715: The role of acetylcholine in learning and memory）。
【０００８】
パーキンソン病の運動症状を軽減するための一般的な薬剤は、レボドパであり、レボドパは、脳内でドーパミンに変換され、このようにして、ドーパミンの欠乏のバランスをとるのに役立つ。レボドパは、カルビドパに関連しており、カルビドパは、レボドパが全身においてドーパミンに変換されるのを回避するのに役立つ。レボドパ処置の１つの問題は、「オン−オフ」現象であり、同現象により、高揚緩和（jubilant thaw）と交互に起こる抑うつに関連する不動及び無能の段階がもたらされる（Lees et al., J Neurology Neurosurgery Psychiatry, Special Supplement, 1989, 29-37: The on-off phenomenon）。この処置に対する後期パーキンソン病患者の無反応性は、問題である（Fabbri et al., Parkinsonism and related disorders, 2016: Do patients with late-stage Parkinson’s disease still respond to levodopa?）。統合失調症における「陽性」症状、妄想及び幻覚等の神経精神障害の症状を処置するための他の一般的な薬剤は、抗精神病薬である。
【０００９】
しかしながら、薬物による神経障害の症状の治療的処置は、非特異的であるため、重篤な有害事象を誘発し得る。加えて、使用された薬物に対する治療抵抗性が現れ得る。
【００１０】
神経科学の理解が進むにつれて、脳は、その電線であるニューロンを介して情報を符号化し、伝達する電気ネットワークと考えることができる。ニューロン間の接続性は、単純であると同時に複雑である。単純であるのは、ニューロン内でのイオンの流入／流出により、その結果、活動電位（又は電気活動の「スパイク」）が生じるためである。複雑であるのは、脳ネットワークが種々の空間的及び時間的スケールで、協調した相互作用を示すノード、ハブ及びモジュールを形成する、数千億のニューロンから構成されるためである（Fornito et al., Nature Reviews Neuroscience, 2015, 16, 159-172: The connectomics of brain disorders）。神経伝達は、個々のニューロンを接続する解剖学的構成要素（構造）と、情報を伝達するプロセス（機能）とにより決まる。両方の側面は、神経系の性能全体に影響を及ぼす。神経相互作用は、脳電気活動パターンの振動により引き起こされる（traduced）。この振動は、典型的には、脳波（ＥＥＧ）により測定可能である。異なる周波数帯域：デルタ、シータ、アルファ、ベータ、ガンマの振動が観察される（Ward et al., Trends in Cognitive Sciences, 2003, 7(12), 553-559: Synchronous neural oscillations and cognitive processes）。構造的には、脳の最も顕著な神経解剖学的特徴は、ニューロン間の豊富な接続性であり、これは、神経伝達の重要性を反映している。１つの脳領域と別の脳領域との間の振動の同期化（「同期」）により、時空間協調をもたらすことによる情報符号化の最後のレベル［第１のレベル（ニューロン）：活動電位；第２のレベル（ニューロンネットワーク）：ニューロン振動］が構成されると考えられる（Engel et al., Nature Reviews Neuroscience, 2001, 2, 704-716: Dynamic predictions: oscillations and synchrony in top-down processing）。重要なことに、空間及び時間における同期化及び非同期化の微妙にバランスのとれたパターンが、神経系の機能的性能にとっての基礎である証拠が出現している（Schnitzler et al., Nature Reviews Neuroscience, 2005, 6, 285-296: Normal and pathological oscillatory communication in the brain）。
【００１１】
異常な同期化プロセス（高すぎる及び／もしくは長すぎる同期（すなわち、過同期とも呼ばれる）又は低すぎる同期（すなわち、同期障害とも呼ばれる））は、幾つかの脳障害、例えば、てんかん、統合失調症、認知症及びパーキンソン病に関連している（Schnitzler et al., Nature Reviews Neuroscience, 2005, 6, 285-296: Normal and pathological oscillatory communication in the brain）。
【００１２】
現在、ニューロンの電気活動パターンのモデュレーション（ニューロモデュレーション）は、電気刺激により誘発することができる。脳内に電気刺激を生成するための現在の技術は、直接電気刺激、又は磁気コイルを通る電流の印加による電場の誘導のいずれかを利用する。特定の神経障害は、脳深部の領域に影響を及ぼし、電場の浸透深さが弱いため、電気刺激を連続的に送達するために脳内に電極を外科的に埋め込むことが実施されており、「脳深部刺激」（ＤＢＳ）技術を構成する。その有効性は、刺激に使用されるパラメータ、特に、周波数により決まる。１９８７年に、埋め込まれた電極による腹側部中間（ventralis intermedius）（ＶＩＭ）の高周波刺激（≧１００Hz）により、パーキンソン病を患う患者の振戦症状が軽減されることが見出された（Benabid et al., Applied Neurophysiology, 1987, 50, 344-346: Combined (thalamotomy and stimulation) stereotactic surgery of the VIM thalamic nucleus for bilateral Parkinson disease）。また、サルでは、高周波刺激（＞１００Hz）により、低周波刺激（＜５０Hz）と比較して、淡蒼球外節（ＧＰｅ）及び淡蒼球内節（ＧＰｉ）におけるニューロンの時間的発火パターンの変化（刺激に同期した規則的な発火パターン）が可能となり、この変化により、基底核における神経活動の変化したパターンの、視床及び脳幹におけるそのターゲット構造への伝達が遮断されるため、運動緩徐及び硬直症状が軽減されることが示されている（Hashimoto et al., The Journal of Neuroscience, 2003, 23(5), 1916-1923: Stimulation of the subthalamic nucleus changes the firing pattern of pallidal neurons）。ＤＢＳは、現在、幾つかの運動障害（パーキンソン病、ジストニア、本態性振戦、てんかん）及び精神障害（強迫性障害、抑うつ）を処置するために承認されている。
【００１３】
しかしながら、幾つかの欠点が、ＤＢＳに関連している場合があり、第１の欠点は、技術の侵襲性、及び種々の合併症、例えば、出血、てんかん発作、感染、鉛移行、鉛破損等のリスクである（Fenoy et al., J Neurosurg, 2014, 120, 132-139: Risks of common complications in DBS surgery: management and avoidance）。
【００１４】
ターゲット内に生成された電場の焦点性（すなわち、空間解像能）は、別の懸念事項である。電気刺激の広がりは、抑うつ等の副作用にも関連している。多くの研究では、刺激を特定の領域内にシフトさせ、閉じ込めることができる新たなタイプの電極を設計することに専念してきた（Luan et al., Frontiers in Neuroengineering, 2014, 7(27), 1-9: Neuromodulation: present and emerging methods）。他の技術的側面：電極（又はリード）、そのサイズ、ＤＢＳ装置の侵襲性、リードを構成する材料、（磁気共鳴）画像技術との適合性、連続刺激の必要性に関連する内部パルス発生器（ＩＰＧ）のバッテリー寿命は、評価中である。
【００１５】
他の主要な既存のタイプの電気刺激、すなわち、経頭蓋電気刺激又は経頭蓋磁気刺激は、侵襲性ではないという利点を有するが、電場の浸透深さが弱い。したがって、それらの用途は、大脳皮質の刺激に限定される（脳深部には到達できない）。更に、空間解像能は低いままである。
【００１６】
脳の電気刺激は、神経障害を処置するのに関連する方法のままである。しかしながら、副作用、例えば、精神医学的副作用を回避し、最終的には、処置の利益／リスク比を向上させるために、電気刺激のより局所的な送達及び周囲の脳領域に影響を及ぼすことなく浸透深さを増大させる必要がある。
【００１７】
近年、非侵襲的な神経刺激技術、例えば、ニューロンを直接刺激するための光又は超音波の使用が想定されている。しかしながら、これらの技術には、空間解像能が低いという欠点がある。
【００１８】
興味深いことに、固有の特性を有するナノ材料が、ナノ材料−ニューロン界面において、無線で伝達された一次刺激を、局所化された二次刺激、主に電場又は熱に変換するためのメディエーターとして探求されてきた（Wang Y. & Guo L. Frontiers in Neuroscience. 2016; vol. 10, Article 69, Nanomaterial-enabled neural stimulation）。このため、量子ドットを使用する光電変換、金ナノ材料を使用する光熱変換、磁気電気ナノ粒子を使用する磁気電気変換、超常磁性ナノ粒子を使用する磁気熱変換及び圧電ナノ材料を使用する音響電気変換が示されている。
【００１９】
ナノ材料を使用するこれらの新興技術の大部分では、神経刺激を提供するためのエネルギー源の同時開発が必要である。更に、入ってくるエネルギーを、十分に画定されたナノ粒子の構造及び組成並びにナノ粒子の構造及び組成の経時的な持続性を必要とする効率的な二次刺激に変換する必要がある。
【００２０】
例えば、磁気電気（ＭＥ）ナノ粒子は、圧電特性及び磁歪特性を示す複合ナノ粒子である。具体的には、例えば、ＣｏＦｅ２Ｏ４−ＢａＴｉＯ３ナノ粒子により可能となるＭＥ作用は、２つの別個の材料、すなわち、磁歪（ＣｏＦｅ２Ｏ４）材料と圧電（ＢａＴｉＯ３）材料との組合せ作用により生じる。より正確には、ＣｏＦｅ２Ｏ４−ＢａＴｉＯ３ナノ粒子が磁場に曝されると、第一に、磁歪材料は、その長さ（体積）が変化することにより、局所応力を生じさせ、第二に、圧電材料は、この局所応力に対する反応として分極（荷電）を生成する。磁歪材料又は圧電材料はいずれも、Grossinger R. et al.（Grossinger R.  et al., Journal of Magnetism and Magnetic Materials, 2008, 320, 1972-1977: The physics of magnetoelectric composites）により説明されているように、磁場に曝された場合に、ＭＥ作用又は分極のいずれもそれ自体で発生させることができない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明は、ナノ粒子又はナノ粒子凝集体が電場に曝された場合に、神経疾患（典型的には、ニューロンネットワークの障害）又はその少なくとも１つの症状を予防し又は治療するための使用／これらの予防又は治療における使用のためのナノ粒子及び／又はナノ粒子凝集体（ナノ粒子の凝集体）を扱う。電場は、典型的には、脳深部刺激（ＤＢＳ）、経頭蓋電気刺激（ＴＥＳ）又は経頭蓋磁気刺激（ＴＭＳ）により印加される。
【００２２】
ナノ粒子又はナノ粒子凝集体により、ニューロンネットワーク内及び／又はニューロンネットワーク間並びに脳の別個の領域内及び／又は同領域間のニューロン振動の同期化が正常化され（同期が改善され）、標準的な電気刺激技術を使用しながら、電気刺激の空間解像能（焦点性）が高まる。このため、本発明者らにより本明細書に記載されたナノ粒子又はナノ粒子凝集体は、対象／患者が健康な状態に戻るのに役立つ。
【００２３】
更に、本発明のナノ粒子又はナノ粒子凝集体により、印加される電流、電圧、パルス幅及び／又は周波数の低減が可能であるため、印加／誘導電流に関連する公知の潜在的毒性が低減される。
【００２４】
簡単な説明
本明細書において、ナノ粒子又はナノ粒子凝集体が電場／電気刺激に曝される、電場／電気刺激により励起され又は活性化される場合に、予防又は治療を必要とする対象における神経疾患又はその少なくとも１つの症状を予防し又は治療するための使用／これらの予防又は治療における使用のためのナノ粒子又はナノ粒子凝集体が、初めて有利に記載される。ナノ粒子又はナノ粒子凝集体の材料は、典型的には、導体材料、半導体材料、２００以上の誘電率εｉｊｋを有する絶縁体材料及び１００以下の誘電率εｉｊｋを有する絶縁体材料から選択される。
【００２５】
また、本明細書において、予防又は治療を必要とする対象における本明細書に記載された神経疾患又はその少なくとも１つの症状を予防し又は治療するための組成物を調製するための、ナノ粒子又はナノ粒子凝集体の使用も記載される。
【００２６】
また、本明細書において、電場に曝された対象における神経疾患又はその少なくとも１つの症状を予防し又は治療するための使用／これらの予防又は治療における使用のための組成物であって、組成物は、ナノ粒子及び／又はナノ粒子凝集体と、薬学的に許容し得る支持体とを含み又はこれらからなり、ここで、ナノ粒子又はナノ粒子凝集体の材料は、典型的には、導体材料、半導体材料、２００以上の誘電率εｉｊｋを有する絶縁体材料及び１００以下の誘電率εｉｊｋを有する絶縁体材料から選択される、組成物も記載される。
【００２７】
更に、本明細書において、少なくとも２種の別個のナノ粒子及び／又はナノ粒子凝集体を含み、各ナノ粒子又はナノ粒子凝集体は、導体材料、半導体材料、２００以上の誘電率εｉｊｋを有する絶縁体材料及び１００以下の誘電率εｉｊｋを有する絶縁体材料から典型的に選択される別個の材料からなる、キット及び、典型的には、対象における神経疾患又はその少なくとも１つの症状の予防又は治療における／これらを予防し又は治療する方法における、その使用が記載される。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
詳細な説明
ヒト神経系は、およそ８００〜１２００億個の神経細胞からなると推定される（Herculano-Houzel S. Frontier in Human Neuroscience (2009), 3(31): 1-11, The human brain in numbers: a linearly scaled-up primate brain）。ニューロン（又は神経細胞）を定義する特性は、活動電位の形態で電気信号を伝達するその能力である。
【００２９】
ニューロン／神経細胞は、脳の基本ノードを構成する。神経細胞は、高度に構造化された様式で互いに伝達して、ニューロンネットワークを形成することができる。ニューロンは、シナプス結合を介して伝達する。ニューロン内では、ナノ回路が、重要なニューロン特性、例えば、学習及び記憶並びにニューロンリズムの発生を媒介するための基礎となる生化学的機構を構成する。
【００３０】
マイクロ回路は、ほんの少数の相互接続されたニューロンにより形成することができ、高度なタスク、例えば、媒介反射、プロセス感覚情報、移動の開始並びに学習及び記憶の媒介を行うことができる。マクロ回路は、複数の埋め込みマイクロ回路からなるより複雑なネットワークである。マクロ回路は、より高い脳機能、例えば、物体認識及び認識を媒介する。したがって、複数のレベルのネットワークが神経系を占めている。
【００３１】
ニューラルネットワークの興奮性
ニューロンは、電気化学的にメッセージを送信する（すなわち、化学物質／イオンにより、電気信号が生じる）。神経系における重要なイオンは、ナトリウム及びカリウム、カルシウム及び塩化物である。ニューロンが信号を送信していない時は、「静止状態」である。ニューロンが静止状態である時は、ニューロンの内部は、外部に対して負である。種々のイオンの濃度により、膜の両側でバランスをとろうと試みられるが、バランスをとることはできない。細胞膜により、一部のイオンのみがチャネル（イオンチャネル）を通過することができるためである。これらの選択的イオンチャネルに加えて、エネルギーを使用して、ニューロンが入れる２つのカリウムイオン毎にニューロンから３つのナトリウムイオンを移動させるポンプが存在する。最後に、これらの力が全てバランスされ、ニューロンの内部と外部との間の電圧の差が測定された場合、ニューロンの静止膜電位（また「静止電位」）は、約−７０mVである。これは、ニューロンの内部が外部よりも７０mV低いことを意味する。静止状態では、ニューロンの外部には、比較的多くのナトリウムイオンが存在し、そのニューロンの内部には、より多くのカリウムイオンが存在する。活動電位（「スパイク」又は「インパルス」としても特定される）は、ニューロンが細胞体から離れて軸索を下って情報を送信する時に生じる。これは、何らかの事象（刺激）が静止電位を０mVに向かって移動させることを意味する。脱分極が約−５５mVに達すると、ニューロンは、活動電位を発火させる。脱分極がこの臨界閾値レベルに達しない場合には、活動電位は発火しない（オン／オフ機構）。また、閾値レベルに達すると、固定振幅の活動電位は、常に発火する。したがって、脱分極が閾値に達しないか又は完全な活動電位が生成されるかのいずれかである。
【００３２】
活動電位の伝播速度には、大きな変動性が見られる。実際に、神経における活動電位の伝播速度は、毎秒１００メートルから毎秒１０分の１メートル未満まで変化することができる。時定数は、膜が刺激に対して時間的にどのくらい迅速に応答するであろうかの指標であるが、空間定数（長さ定数とも言う）は、電位が距離の関数として軸索に沿ってどのくらい良好に広がるであろうかの指標である。
【００３３】
ニューロンネットワーク内及びニューロンネットワーク間の接続性
脳内及び脳を横切る伝達を調査するために使用される３つの接続性ネットワークタイプが存在する。構造的接続性は、脳の領域を物理的に接続する繊維トラックの検出に基づいている。これらは、信号が脳内を移動することができる可能性のある経路を示す解剖学的ネットワークマップである。機能的接続性は、相関する活動の類似の周波数、位相及び／又は振幅を有する脳領域における活動を特定する。効果的な接続性は、機能的な接続性情報を使用し、更に１工程進み、１つの神経系が別の神経系に対して有することができる直接的又は間接的な影響、より具体的には脳内の動的な情報フローの方向を決定する（Bowyer et al., Neuropsychiatric Electrophysiology, 2016, 2(1), 1-12: Coherence a measure of the brain networks: past and present）。
【００３４】
ニューロンネットワーク内の同期された活動は、脳磁図（ＭＥＧ）、脳波（ＥＥＧ）、機能的磁気共鳴画像（ＦＭＲＩ）又はポジトロン放射断層撮影（ＰＥＴ）、ついで、ネットワーク接続性分析を使用する画像により検出することができる。ＭＥＧ（脳磁図）又はＥＥＧ（脳波）が好ましい。情報の動的なフローを解像するのに高い時間解像能を有するためである。脳の接続性分析は、脳が機能するのに必要な伝達ネットワークをマッピングするために行われる。脳内の特定の領域は、特定のタイプの情報を処理するために特化している。画像化技術は、これらの領域が脳内のネットワークを横切って他の特化した領域と接続され、伝達することを明らかにした。「コヒーレンス」（Bowyer et al., Neuropsychiatric Electrophysiology, 2016, 2(1), 1-12: Coherence a measure of the brain networks: past and present.）は、振動する脳の活動のニューロンパターンの同期性（同期している状態又は同期される状態）の周波数及び振幅を定量化する数学的技術である。ニューロンの同期性活動の検出は、ヒトの脳における機能的接続性の健全性又は完全性を決定するために使用することができる。機能的接続性マップを構造的接続性画像上に重ね合わせ、有効な接続性から導出された情報フローの方向を使用することにより、脳がどのように機能するかの包括的な理解が提供される。これらの技術は、処置前後の脳接続性画像化に基づいて治療を評価するのに役立つ。
【００３５】
インタクトな脳は、遅いデルタリズム（０．５〜４Hz）からシータ（４〜８Hz）、アルファ（８〜１２Hz）、ベータ（１５〜３０Hz）及びガンマ（３０〜７０Hz）振動までの、生物の異なる「状態」に関連する同期性活動の複雑なパターンを表す。興味深いことに、皮質構造の分離された培養物は、緻密に相互接続されたニューロンの集団におけるネットワーク発火（スパイク）及びバースト（スパイクのクラスター）の出現、発生及び広がりを制御する規則の試験のための便利なシステムを提供する。ネットワーク活動は、非侵襲的な様式で、多電極アレイを使用して有限の時間解像能により、長期間記録することができる。二次元的に分離された培養物は、脳におけるネットワーク活動の形成及び維持を制御する規則を研究するための実行可能な試験システムとして使用することができ、このシステムにより、インタクトな脳において対処することができない仮説の試験が可能となる（Cohen E. et al., Brain Research, 2008, 1235, 21-30: Determinants of spontaneous activity in networks of cultured hippocampus）。
【００３６】
本明細書において、ナノ粒子又はナノ粒子凝集体が電場に曝された場合に、予防又は治療を必要とする対象における神経疾患又はその少なくとも１つの症状を予防し又は治療するための使用／これらの予防又は治療における使用のための、ナノ粒子又はナノ粒子凝集体が、初めて有利に記載される。ナノ粒子又はナノ粒子凝集体の材料は、典型的には、導体材料、半導体材料、２００以上の誘電率εｉｊｋを有する絶縁体材料及び１００以下の誘電率εｉｊｋを有する絶縁体材料から選択される。
【００３７】
「処置」という用語は、本明細書に記載された疾患、障害又は機能不全状態を予防し、軽減し又は治癒することができる治療的処置又は手段を指す。このような処置は、同処置を必要とするほ乳類の対象、好ましくは、ヒトの対象に対して意図される。このように、本明細書に記載された疾患、障害もしくは機能不全状態を患っている既に特定されている（診断されている）対象又は処置が予防的（preventive）もしくは予防的（prophylactic）な処置であるこのような疾患、障害もしくは機能不全状態を「発症するリスクがある」と考えられる対象が考えられる。
【００３８】
ニューロン間の振動伝達の異常なモデュレーションは、実際には、異なるタイプの神経疾患又は障害（本明細書では、「神経（neural）疾患又は障害」としても特定される）に存在する（Uhlhaas et al., Neuron, 2006, 52, 155-168: Neural synchrony in brain disorders: relevance for cognitive dysfunctions and pathophysiology；Basar E. et al. International Journal of Psychophysiology 103 (2016) 135-148, What does the broken brain say to the neuroscientist? Oscillations and connectivity in schizophrenia, Alzheimer’s disease, and bipolar disorder）。
【００３９】
ヒトの神経系は、中枢神経系（ＣＮＳ）と末梢神経系（ＰＮＳ）とに分けられる。次に、ＣＮＳは、脳と脊髄に分けられ、それぞれ、頭蓋の頭蓋腔と脊柱管に存在する。ＣＮＳ及びＰＮＳは協調して動作し、感覚情報を統合し、運動及び認知機能を制御する。図１は、脳構造の簡略図を示す。
【００４０】
脳の別個の領域内及び／又は脳の別個の領域間におけるニューロンネットワーク内及び／又はニューロンネットワーク間の同期（又は同期化）は、ニューロン振動の協調を通じて時間的に行われる（Buzsaki et al., Science, 2004, 304, 1926-1929: Neuronal oscillations in cortical networks）。運動障害は、典型的には、過同期によるものであり、過同期は、脳の別個の領域内及び／又は脳の別個の領域間におけるニューロンネットワーク内及び／又はニューロンネットワーク間の振動の同期化が高すぎる及び／又は長すぎることを意味する。精神障害及び認知障害は、典型的には、同期障害によるものであり、同期障害は、脳の別個の領域内及び／又は脳の別個の領域間におけるニューロンネットワーク内及び／又はニューロンネットワーク間の振動の同期化が低下し（典型的には、活性の低下を示し）又は更に消失することを意味する（参照．表１：神経障害における異常な神経同期（Uhlhaas et al., Neuron, 2006, 52, 155-168: Neural synchrony in brain disorders: relevance for cognitive dysfunctions and pathophysiologyから採用））。
【００４１】
【表１】
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【００４２】
「コヒーレンス」は、振動する脳の活動のニューロンパターンの同期性（同期している状態又は同期される状態）の周波数及び振幅を定量化する数学的技術であるため、高すぎるコヒーレンス及び低すぎるコヒーレンスはそれぞれ、運動障害及び精神／認知障害に関与すると考えることができる（Bowyer et al., Neuropsychiatric Electrophysiology, 2016, 2(1), 1-12: Coherence a measure of the brain networks: past and present）（参照．図２）。
【００４３】
特定の態様では、本発明の文脈においてターゲットとされる神経疾患又は障害は、パーキンソン病、アルツハイマー病、てんかん、強迫性障害、自閉症スペクトラム障害、抑うつ障害、ジストニア、トゥレット症候群、統合失調症、脳卒中、失語症、認知症、耳鳴り、ハンチントン病、本態性振戦、双極性障害、不安障害、中毒障害、意識植物状態（consciousness vegetative state）から選択され、例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、てんかん、強迫性障害、自閉症スペクトラム障害、抑うつ障害、ジストニア、トゥレット症候群、統合失調症、脳卒中、失語症、認知症、耳鳴り、ハンチントン病、本態性振戦、双極性障害、中毒障害、意識植物状態及びそれらの少なくとも１つの症状から選択される。
【００４４】
本明細書において上記で既に説明されたように、神経疾患又は障害は、本明細書において以下で更に詳述されるように、運動障害、精神（気分／社会）障害及び認知障害である患者に影響を及ぼす主要な症状に応じて分類することができる。
【００４５】
運動障害の例
パーキンソン病
パーキンソン病（ＰＤ）は、世界中で約７００〜１，０００万人が罹患し、振戦、ジスキネジア、運動緩徐、すくみ足等を特徴とする。ＰＤは、脳のゆっくり進行する変性疾患である。ＰＤは、基底核及び黒質と呼ばれる脳の領域の神経細胞に影響を及ぼす。黒質における神経細胞は、身体運動を計画し、制御するのに重要な脳回路内の化学的メッセンジャーとして作用する神経伝達物質であるドーパミンを産生する。ＰＤでは、黒質のドーパミン産生神経細胞は、一部の個体において早期に死滅する（Corti et al., Physiol Rev, 2011, 91, 1161-1218: What genetics tells us about the causes and mechanisms of Parkinson’s disease）。線条体におけるドーパミンレセプターが十分に刺激されない場合、基底核の一部は、過少刺激又は過剰刺激のいずれかがされる。特に、視床下核（ＳＴＮ）は過剰活性になり、淡蒼球内節（ＧＰｉ）上の促進体として作用する。ＧＰｉの過剰刺激は、視床に対して過剰阻害効果を有し、この効果により、次に、その出力が低下し、運動の減速及び硬直が生じる（Guo et al., Frontiers in Computational Neuroscience, 2013, 7, 124, 1-11: Basal ganglia modulation of thalamocortical relay in Parkinson’s disease and dystonia）。
【００４６】
ＰＤにおけるドーパミンの欠如は、皮質−基底核運動ネットワーク全体にわたるベータ周波数における過剰な振動同期化に関連している。実際に、基底核におけるドーパミンレベルは、β同期を抑制すると予測され、この抑制は、次に、運動予想に必要なドーパミン作動性関与を媒介する（Jenkinson et al., Trends in Neuroscience, 2011, 34(12), 611-618: New insights into the relationship between dopamine, beta oscillations and motor function）。基底核におけるドーパミンレベルが十分に高くない場合には、ベータ振動の同期がもはや制御されず、運動の遅さが現れ得る。パーキンソン病患者における別の観察から、ベータバンドにおける皮質振動が基底核における皮質振動をもたらし、駆動するという結論が導かれる（Lalo et al., The Journal of Neuroscience, 2008, 28(12), 3008-3016: Patterns of bidirectional communication between cortex and basal ganglia during movement in patients with Parkinson disease）。
【００４７】
脳深部刺激（ＤＢＳ）は、振戦及び硬直の症状を処置するために使用することができる（Eusebio et al., J Neurol Neurosurg Psychiatry, 2011, 82, 569-573: Deep brain stimulation can suppress pathological synchronization in parkinsonian patients）。ＤＢＳによるＰＤ症状の処置は、２００２年から（本態性振戦については１９９７年から）ＦＤＡにより承認されている。本明細書に記載されたナノ粒子と組み合わせて、本発明の文脈において使用可能な最も一般的に使用される刺激パラメータは、周波数１３０〜１８５Hz、パルス幅６０〜２１０μs及び電圧振幅１〜３．５Vである（Kuncel et al., Clinical Neurophysiology, 2004, 115, 2431-2441: Selection of stimulus parameters for DBS）。電気刺激は、典型的には、基底核、ＳＴＮ及びＧＰｉにおいて行われる。上記言及されたように、皮質ベータ振動も、疾患の病態生理に関与するため、皮質の経頭蓋刺激（例えば、経頭蓋磁気刺激−ＴＭＳ）を使用して、パーキンソン病の症状を処置することもできる（Cantello et al., Brain Research Reviews, 2002, 38, 309-327: Transcranial magnetic stimulation and Parkinson’s disease）。
【００４８】
ジストニア
ジストニアは、運動系機能の障害を反映する異常な、不随意の捻転及び回転運動を特徴とする神経障害である。症状に冒された身体の部分、それらの遺伝的起源、関与する神経伝達物質のタイプ等に応じて、幾つかの形態のジストニアが存在する。ジストニアの中枢神経系（ＣＮＳ）は、不完全な阻害を示し、これにより、対向する筋肉間の相互脊椎阻害の喪失が引き起こされる。例えば、上部ジストニアの場合、入力信号を前腕拮抗筋に与えるニューロン／神経の異常な同期化により、これらの拮抗筋の共収縮（ジストニアの症状）がもたらされる（Farmer et al., Brain, 1998, 121, 801-814: Abnormal motor unit synchronization of antagonist muscles underlies pathological co-contraction in upper limb dystonia）。
【００４９】
興味深い抗ジストニア効果を示すＤＢＳターゲットポイントは、淡蒼球内節である（ＧＰｉ−ＤＢＳ）。ＧＰｉ−ＤＢＳは、慢性の医学的に難治性ジストニアを有する患者に対して２００３年にＦＤＡにより承認された（Hu et al., Translational Neurodegeneration, 2014, 3(2), 1-5: Deep brain stimulation for dystonia）。視床の腹側部中間（ＶＩＭ）核の刺激（ＶＩＭ−ＤＢＳ）の効果は、はるかに弱い。視床下核を使用する刺激（ＳＴＮ−ＤＢＳ）は、実験的であった。ＧＰｉ−ＤＢＳにより、ジストニアの主な症状の軽減が提供されるが、治療効果が完全に発現するのには、数週間から数ヶ月かかり得る（Dressler et al., J Neural Transm, 2015, DOI 10.1007/s00702-015-1453-x: Strategies for treatment of dystonia）。本明細書に記載されたナノ粒子と組み合わせて、本発明の文脈において使用可能な最も一般的に使用される刺激パラメータは、周波数１３０〜１８０Hz、パルス幅６０〜２１０μs、振幅２〜５ボルトである。
【００５０】
てんかん
てんかんは、世界中で約５０００万人が罹患する脳障害であり、てんかん発作と呼ばれる、正常な脳機能の再発性かつ予測不能な中断により主に特徴付けられる。てんかんは、単独の疾患実体ではなく、多くの異なる原因（遺伝的突然変異、脳腫瘍、頭部外傷、脳卒中、アルコール中毒、脳の炎症；髄膜炎、ＨＩＶ又はウイルス性脳炎等の感染症）に起因し得る基礎脳機能不全を反映する各種の障害である（Fisher et al., Neurology, 2015, 28(2), 130-135: Redefining epilepsy）。てんかん発作は、脳における過剰な同期性ニューロン活動による徴候及び／又は症状の一過性の発生として定義される（Fisher et al., Epilepsia, 2005, 46(4), 470-472: Epileptic seizures and epilepsy: definitions proposed by the International League Against Epilepsy (ILAE) and the International Bureau for Epilepsy (IBE)）。大脳皮質は、てんかん発作の発生における主要な要素であり、多くの人々は、焦点性前頭葉発作又は内側側頭葉発作と診断される（National Institute of Neurological Disorders and Stroke: http://www.ninds.nih.gov/disorders/epilepsy/detail_epilepsy.htm#3109_7）。皮質における上昇した局所同期領域又は「過同期」領域の特定から、局所過同期が発作発生領域のマーカーであり得ることが示唆される（Schevon et al., Neuroimage, 2007, 35(1), 140-148: Cortical abnormalities in epilepsy revealed by local EEG synchrony）。
【００５１】
てんかんの処置のための神経刺激は、末梢神経刺激、例えば、迷走神経刺激（ＶＮＳ）、脊髄刺激、経頭蓋脳刺激（ＴＥＳ又はＴＭＳ）又は脳深部刺激（ＤＢＳ）の形態をとることができる。応答性神経刺激は、別の戦略である。この場合、刺激は、発作開始が検出された場合にのみ送達される。２００４年には、３名のてんかん患者での応答性神経刺激の原理証明研究が発表され、その内の２名の患者は、皮質グリッド又はストリップ電極により、１名は、海馬深部電極により処置された。個々の発作を刺激の開始時に打ち切ることができ、全発作頻度を５０〜７５％減少させた（Kossoff et al., Epilepsia, 2004, 45, 1560-1567: Effect of an external responsive neurostimulator on seizures and electromagnetic discharges during subdural electrode monitoring）。ＶＮＳ及び応答性神経刺激は両方とも、米国において特定のタイプのてんかんの処置について、ＦＤＡにより承認されている。視床前核（ＡＮＴ）のＤＢＳは、欧州連合の国で承認されている（Fisher et al., Nature Reviews Neurology, 2014, 10, 261-270: Electrical brain stimulation for epilepsy）。てんかんについての視床前核の両側刺激（ＳＡＮＴＥ）の多施設ランダム化比較対照試験が、二次性全般化を伴う又は伴わない部分発作が月に少なくとも６回、ただし、１日に１０回以下であった１１０名の成人患者に行われた。ベースライン発作頻度が３ヶ月間記録され、続けて、ＤＢＳリード埋込み、１ヶ月の回復、ついで、活動刺激又は刺激なし（プラセボ）のいずれかの３ヶ月の盲検期間が記録された。オン刺激パラメータは、１４５Hzで５Vの９０μsパルスを１分、続けて、刺激なしで５分であった。発作頻度は、１ヶ月の回復期間中にベースラインから中央値２０％減少した。その後、２つの処置群における発作頻度は、明らかに分かれ、中央値の改善は、アクティブ群で４０．４％、プラセボ群で１４．５％であった。アクティブ群では、複雑部分発作が明らかに少なく、患者により「最も重症」と予め指定されたタイプの発作が明らかに少なかった（Fisher et al., Epilepsia, 2010, 51, 899-908: Electrical stimulation of the anterior nucleus of thalamus for treatment of refractory epilepsy）。本明細書に記載された電気刺激／処置の条件は、本明細書に記載されたナノ粒子と組み合わせて、本発明の文脈において使用することができる。
【００５２】
精神障害（気分・社会障害）の例
強迫性障害（ＯＣＤ）
強迫性障害（ＯＣＤ）は、多くの場合、慢性的で、重度で、極端に衰弱する一般的な精神障害である。また、強迫性障害は、通常、処置に対して難治性であり、かなりの割合の患者が、応答しないか又は部分的な軽減を得るのみである。
【００５３】
機能的神経画像処理研究により、眼窩前頭皮質、基底核及び線条体における機能不全が実証されている。
【００５４】
ある研究により、急性ＯＣＤ症状が視床下核（ＳＴＮ）、特に、左半球及びデルタ−アルファ（１〜１２Hz）周波数範囲における異常な高振動活動に関連し得ることが示された（Bastin et al., Cortex, 2014, 60, 145-150: Changes of oscillatory activity in the subthalamic nucleus during obsessive-compulsive disorder symptoms: two case reports）。更に、一部の視床下ニューロンは、確認作業の間に疑いが生じた場合に、それらの発火速度を特異的に向上させた（Burbaud et al., brain, 2013, 136(1), 304-317: Neuronal activity correlated with checking behavior in the subthalamic nucleus of patients with obsessive-compulsive disorder）。
【００５５】
内包の腹側前肢（ＶＣ）及び隣接する腹側線条体（ＶＳ）のＤＢＳは、重症かつ高度処置抵抗性ＯＣＤ（ＶＣ／ＶＳ−ＤＢＳ）の処置についてＥＵにおいて承認された。この手法の治療見込みを実証するために、４つの臨床施設が、小規模研究において、８年間にわたって最も密接に協力し、それらのデータが分析された（Greenberg et al., Molecular Psychiatry, 2010, 15, 64-79: Deep brain stimulation of the ventral internal capsule/ventral striatum for obsessive-compulsive disorder: worldwide experience）。ＤＢＳリードが、前嚢の背側−腹側の範囲を刺激するために、両側に埋め込まれた。電気刺激周波数は、１００〜１３０Hzであり、パルス幅は、９０〜最大４５０μsの範囲であった。ＤＢＳ強度は、一般的には、２〜８Vの範囲であり、電極インピーダンス（一般的には、５００〜１０００Ω）に応じて、約２〜１５mAの範囲の電流をもたらした。これらの組み合わせデータの結論として、臨床的に顕著な症状の減少及び機能的改善が、高度に処置抵抗性の患者の約３分の２（合計２６名の患者）で見られ、このことは、ＶＣ／ＶＳ−ＤＢＳ後の治療効果に希望を与えることを示している。本明細書に記載された電気刺激／処置の条件は、本明細書に記載されたナノ粒子と組み合わせて、本発明の文脈において使用することができる。
【００５６】
自閉症スペクトラム障害
自閉症は、社会的相互関係及びコミュニケーションの欠損並びに異常に制限された反復行動により定義される神経発達症候群である。自閉症は、通常、乳児期、遅くとも生後３年以内に始まる障害である。自閉症は、不均一な状態であり（自閉症の２名の小児又は成人が同様のプロフィールを有することはない）、この状態から、「自閉症スペクトラム障害」の概念がもたらされ、言語欠損の程度又は全体的な認知遅延に及び社会的又は行動的症状の重症度に従って、疾患のいくつかのレベルに分類される（Lord et al., Neuron, 2000, 28, 355-363: Autism spectrum disorders）。このスペクトラムの一端では、自閉症を有する固体は高機能であり、自分自身で生活し、雇用を維持することが可能である。低機能として特徴付けられる個体は、より重篤な症状：言語（又は非言語でさえも）の困難、貧弱な社会的コミュニケーション、自傷行動（ＳＩＢ）、かんしゃく、及び潜在的に生命を脅かすおそれがある攻撃を示す。自閉症における脳の構造的及び機能的研究における重要な傾向は、社会情緒的な処理のためのネットワーク：辺縁系、顔面処理系及びミラーニューロンネットワークの関与である。ガンマバンド振動の同期化の欠損は、症状の出現に関与することが示されている（Sinha et al., Neurosurgery Focus, 2015, 38(6), E3: Deep brain stimulation for severe autism: from pathophysiology to procedure）。
【００５７】
重度の自閉症において処置を必要とし得る２つの主要な症状ドメインは、会話に対して非言語性及び非応答性であること並びに生命を脅かすおそれがあるＳＩＢを含む、社会的欠損である。扁桃体は、これらの異常の病態生理学において重要な役割を果たしていると考えられる。興奮性又は抑制性の制御の変化は、自閉症の病態生理学の異常に関係している。ＤＢＳによる扁桃体をターゲットとするニューロモデュレーションは、重度の自閉症患者に対する治療的介在を表すことができる。３例のＤＢＳ処置が文献に報告された。処置の目的は、主に、疾患に関連する運動障害、例えば、常同症（反復運動パターン）及び自傷行動（ＳＩＢ）を軽減することであった（Sinha et al., Neurosurgery Focus, 2015, 38(6), E3: Deep brain stimulation for severe autism: from pathophysiology to procedure；Stocco et al., Parkinsonism and related disorders, 2014, 20, 1035-1036: Deep brain stimulation for severe secondary stereotypies）。本明細書に記載されたナノ粒子と組み合わせて、本発明の文脈において使用することができるＤＢＳパラメータは、周波数８０〜１３０Hz、パルス幅１２０〜２１０μs及び電圧振幅２．５〜６．５Vである（Sinha et al., Neurosurgery Focus, 2015, 38(6), E3: Deep brain stimulation for severe autism: from pathophysiology to procedure）。３例のうち１例では、基底外側核におけるＤＢＳにより、自閉症関連症状、例えば、社会的接触の顕著な改善がもたらされ、モデュレーション及び夜間睡眠に影響を及ぼすことが報告された（Sturm et al., Frontiers in Human Neuroscience, 2013, 6, 341, 1-10）。
【００５８】
統合失調症
統合失調症は、中でも、下記症状：異常な精神活動を反映する陽性症状（幻覚及び妄想）；通常存在する精神機能の欠損に対応する陰性症状（思考障害、情動の鈍化、会話の貧困）により特徴付けられる慢性精神疾患である。生涯にわたる障害の原因については、統合失調症は、上位１０位以内に位置する。
【００５９】
脳表面の顕著な脳室拡大及び脳脊髄液の増加から、脳が萎縮していることが示唆される。この灰白質の喪失及びニューロン上のシナプス構造数の減少から、統合失調症が神経発達障害であることが示唆され、このことは、脳の異常が（神経変性障害とは対照的に）初発患者に既に存在することを意味する。
【００６０】
統合失調症患者において、観察された神経回路の障害は、ガンマバンド同期化の失敗に起因することが実証されている（Spencer et al., The Journal of Neuroscience, 2003, 23(19), 7407-7411: Abnormal neural synchrony in schizophrenia；Gallinat et al., Clinical Neurophysiology, 2004, 115, 1863-1874: Reduced oscillatory gamma-band responses in unmedicated schizophrenic patients indicate impaired frontal network processing）。
【００６１】
電気痙攣療法（ＥＣＴ）、すなわちショック処置は、統合失調症における最も成功した非薬理学的処置の１つであることが実証されており（Payne et al., J. Psychiatr. Pract., 2009, 15(5), 346-368: Electroconvulsive therapy part I: a perspective on the evolution and current practice of ECT）、本明細書において、本明細書に記載されたナノ粒子と組み合わせて、本発明の文脈において使用可能である。電気痙攣療法（ＥＣＴ）は、脳への電流の連続的な印加を含み、この印可により、てんかん発作に匹敵する発作が引き起こされる。
【００６２】
統合失調症の対症療法のための電気刺激も、ＤＢＳにより可能である。例えば、抑うつにおける側坐核（ＮＡｃｃ）のＤＢＳ（周波数１４５Hz、パルス幅９０μs、電圧振幅４V）により、無快感の寛解、すなわち、快楽の回復がもたらされ（Schlaepfer et al., Neuropsychopharmacology, 2008, 33, 368-377: Deep brain stimulation to reward circuitry alleviates anhedonia in refractory major depression）、本明細書に記載されたナノ粒子と組み合わせて、本発明の文脈において使用可能である。
【００６３】
認知障害の例
アルツハイマー病
アルツハイマー病（ＡＤ）は、神経変性障害であり、精神的、行動的、機能的低下及び学習能力の進行性喪失をもたらす。ＡＤを有する６５歳未満の約２００，０００人が、より若い発症ＡＤ集団を構成し、５００万人が、６５歳以上である。
【００６４】
近年の証拠から、アルツハイマー病に見られる認知障害が神経−認知ネットワークの機能的切断に関連することが示されている。グローバルＥＥＧ同期化の分析から、デルタバンド同期化の増加に付随して、アルファバンド、ベータバンド及びガンマバンド同期化の広範な減少が明らかとなっている。軽度のアルツハイマー病の患者において、ベータバンド同期化の喪失は、認知障害と相関することが示されている（Schnitzler et al., Nature Reviews Neuroscience, 2005, 6, 285-296: Normal and pathological oscillatory communication in the brain）。アルツハイマー病の処置のためのＤＢＳの可能性を評価するために、臨床研究が進行中である。本明細書に記載されたナノ粒子と組み合わせて、本発明の文脈において典型的に使用可能な刺激パラメータは、周波数１３０Hz、パルス幅６０又は９０μs、振幅電圧３〜５Vである（Laxton et al., World Neurosurgery, 2013, 80, S28.E1-S28.E8: Deep brain stimulation for the treatment of Alzheimer disease and dementias）。
【００６５】
電気刺激
本発明の文脈において、電場は、好ましくは、脳深部刺激、経頭蓋電気刺激又は経頭蓋磁気刺激により印加される。また、迷走神経刺激（ＶＮＳ）及び脊髄刺激も、本発明の文脈、例えば、てんかんの文脈において適用することができる。任意の他の公知の別個の電気刺激法、例えば、時間的に干渉する電場を介して行われる非侵襲的な脳深部刺激であるGrossman N. et al.（Cell, 2017, 169, 1029-1041: Noninvasive deep brain stimulation via temporally interfering electric fields）に記載されている方法を、本発明の文脈において使用することができる。
【００６６】
本発明の文脈において、電気刺激のための２つの主な脳領域は、脳深部及び大脳皮質である。
【００６７】
電気刺激は、電極の外科的埋込みにより、脳深部に到達することができる［皮膚表面下の電極の侵入深さは、１０ｃｍ以上であり、電極により生成される電場の浸透範囲は、数ミリメートルである：脳深部刺激（ＤＢＳ）］。
【００６８】
大脳皮質に到達させた場合、電気刺激は、表面上で行われる（電場の浸透深さは、通常、皮膚表面下２ｃｍ以下である；特定の技術−経頭蓋磁気刺激用の特定のコイルによれば、電場は、深さ５ｃｍに達することができる）。このような電場を提供する技術は、典型的には、経頭蓋磁気刺激（ＴＭＳ）、反復経頭蓋磁気刺激（ｒＴＭＳ）、経頭蓋直流刺激（ｔＤＣＳ）、高精細経頭蓋直流刺激（ＨＤ−ｔＤＣＳ）、経頭蓋電気刺激（ＴＥＳ）、経頭蓋交流刺激（ｔＡＣＳ）、経頭蓋パルス電流刺激（ｔＰＣＳ）及び経頭蓋ランダムノイズ刺激（ｔＲＮＳ；ランダム振幅及び周波数を伴う交流）を含む。臨床試験において最も広く使用され、本発明の文脈において好ましいものは、ＴＭＳ及びｔＤＣＳである。
【００６９】
脳深部刺激
ＤＢＳ装置は、３つの重要な構成要素：刺激電極（リードとも呼ばれる）、延長ケーブル及び心臓ペースメーカに似たプログラマブルパルス発生器（ＰＧ）を含む。この装置は、２段階で埋め込まれる。第１の段階の間に、片側又は両側リードが、脳深部の特定の治療ターゲットに定位的に埋め込まれる。同日又はそれ以降に行われ得る第２の段階の間に、パルス発生器が前胸壁（鎖骨の下）又は腹部の皮膚の下に埋め込まれ、皮下トンネル延長ケーブルを介してリードワイヤに接続される。リードは、一般的には、長さ４０cm、直径１．２７mmであり、適応症に応じて、幅１．５mm又は３mmであり、リード上に０．５〜４mmの間隔を置いて配置された複数の接触電極（ほとんどの場合、リード上に４つの接触電極、すなわち、四極電極）を提供する。１つ又は２つの接触電極を刺激することができる（２つの電極が使用される場合、一方はアノードであり、他方はカソードである）。接触電極を介して、電気刺激は、脳深部の領域、とりわけ、基底核に直接適用される。本発明の文脈において使用可能な典型的な電流は、高周波数［１００〜２００Hz、１３０Hzが最も頻繁に使用される）、パルス幅６０〜１２０μs、低電圧（４V未満）及び低電流（２mA未満）］でパルス化される。
【００７０】
基底核への高周波電気刺激の適用は、典型的には、（少なくとも米国及び／又は欧州連合において）承認されており、いくつかの運動（movement）／運動（motor）障害、例えば、パーキンソン病、ジストニア、てんかん、強迫性障害（ＯＣＤ）及びトゥレット症候群に、本発明の文脈において使用可能である。
【００７１】
経頭蓋磁気刺激（ＴＭＳ）
経頭蓋磁気刺激（ＴＭＳ）は、正常及び病理学的な脳機能並びに神経障害の処置の研究を含む、多くの調査及び治療用途のために使用され又は調査され、かつ、本発明の文脈において使用可能な非侵襲的技術である。ＴＭＳは、電磁誘導を介して脳内に電場を生成するために、対象の頭部に配置されたコイルに送達される電流の短く強いパルスを使用する。誘導された電場により、神経膜貫通電位がモデュレーションされることにより、神経活動がモデュレーションされる。脳における活性化の位置はおおよそ、誘導された電場が最大である領域であり、次に、この位置は、刺激コイルの幾何学的形状及び配置により決まる。目的の２つの電場空間的特徴は、浸透の深さ及び焦点性であり、これらは両方とも、コイルの幾何学的形状により決まり、当業者により容易に決定可能である。反復ＴＭＳ（ｒＴＭＳ）は、典型的には、抑うつ、疼痛、脳卒中等に使用される。
【００７２】
経頭蓋直流刺激（ｔＤＣＳ）
経頭蓋直流刺激（ｔＤＣＳ）は、非侵襲的技術であり、本発明の文脈において使用可能である。この場合、脳刺激は、直流により行われ、皮質興奮性の変化がもたらされる。ｔＤＣＳは、典型的には、２０〜３５cm2の２つの電極（アノード／カソード）を介して、頭部に直接的に印加される低強度（０．５〜２mA）定電流を使用する。設計に応じて、一方の電極（参照電極）は、額の上（眼窩上隆起の上）に配置することができ、他方の電極（活性電極）は、対側性半球上、一般的には、運動皮質（Ｍ１）又は背外側前頭前皮質の上に配置することができる。刺激の持続時間は、最も多くの場合、２０〜４０分の範囲である。電流の一部は、脳に浸透し、印加された１mAあたりに約０．３V/mのピーク電場を生成する。ｔＤＣＳ中に生成される持続電場は、膜貫通ニューロン電位を修飾し、興奮性のレベル及びシナプス入力に対する応答性に影響を及ぼすことができ、個々のニューロンの発火速度をモデュレーションする。興奮性の向上は、陽極刺激により起こり、一方で、興奮性の低下は、典型的には、陰極刺激により起こる。
【００７３】
ｔＤＣＳは、自閉症（Chi et al., Medical Hypotheses, 2014, 83, 614-618: Treating autism by targeting the temporal lobes）、脳卒中後の運動リハビリテーション（Gillick et al., Frontiers in Human Neuroscience, 2014, 8(739), 1-9: Pediatric stroke and tDCS: method for rational individualized dose optimization）、大うつ病性障害（Croarkin et al., Frontiers in Human Neuroscience, 2014, 8(669), 1-9: Developmental aspects of cortical excitability and inhibition in depressed and healthy youth: an exploratory study）の処置に使用可能である。
【００７４】
ナノ粒子
本明細書において、ナノ粒子又はナノ粒子凝集体が電場に曝された場合に、対象における神経疾患又はその少なくとも１つの症状を予防し又は治療するための／これらの予防又は治療における使用のための、本発明の使用のためのナノ粒子又はナノ粒子凝集体が記載される。ここで、ナノ粒子又はナノ粒子凝集体の材料は、典型的には、導体材料、半導体材料、２００以上の誘電率εｉｊｋを有する絶縁体材料及び１００以下の誘電率εｉｊｋを有する絶縁体材料から選択される。
【００７５】
ナノ粒子の組成
導体材料から調製されるナノ粒子
導体材料から調製されるナノ粒子は、有機ナノ粒子又は無機ナノ粒子である。
【００７６】
導体材料から調製される無機ナノ粒子は、典型的には、標準水素電極に対して２５℃及び１atmの圧力で典型的に測定された場合（「reduction reactions having E° values more positive than that of the standard hydrogen electrode」, 8-25, Handbook of chemistry and physics; David R. Lide; 88thEditionの表２を参照のこと）、約０．０１以上、より好ましくは、約０．１、０．２、０．４又は０．５以上の標準還元電位Ｅ°値を有する金属元素により調製される。ナノ粒子を調製するのに使用される典型的な金属元素は、Ｔｌ、Ｐｏ、Ａｇ、Ｐｄ、Ｉｒ、Ｐｔ、Ａｕ及びそれらの混合物から選択することができる。好ましくは、ナノ粒子を調製するための導体材料として使用可能な金属元素は、Ｉｒ、Ｐｄ、Ｐｔ、Ａｕ及びそれらの混合物から選択される。
【００７７】
導体材料から調製される有機ナノ粒子は、典型的には、その構造中に隣接するｓｐ２混成炭素中心（すなわち、炭素二重結合又は芳香環内もしくは芳香環外に、ヘテロ原子、典型的には、ＮもしくはＳを含む芳香環）を有する有機材料により調製される。好ましい有機材料は、ポリアニリン、ポリピロール、ポリアセチレン、ポリチオフェン、ポリカルバゾール、ポリピレン、ポリ（３，４−エチレンジオキシチオフェン）及び／又はポリ（３，４−エチレンジオキシチオフェン）ポリスチレンスルホナートから選択される。
【００７８】
半導体材料から調製されるナノ粒子
半導体材料から調製されるナノ粒子は、典型的には、無機ナノ粒子である。
【００７９】
無機ナノ粒子は、典型的には、その価電子帯と伝導帯との間に比較的小さいエネルギーバンドギャップ（Ｅｇ）を示す半導体材料により調製される。典型的には、半導体材料は、室温（２５℃）で典型的に測定した場合、３．０eV未満のバンドギャップＥｇを有する。特定の態様では、材料は、本明細書において以下で更に説明されるように、真性半導体材料又は外因性半導体材料である。
【００８０】
真性半導体材料は、典型的には、メンデレーエフ周期表のＩＶＡ族からの元素、例えば、ケイ素（Ｓｉ）又はゲルマニウム（Ｇｅ）、メンデレーエフ周期表のＩＩＩ族及びＶ族からの元素の混合組成、例えば、ＡｌＳｂ、ＡｌＮ、ＧａＰ、ＧａＮ、ＩｎＰ、ＩｎＮ等又はメンデレーエフ周期表のＩＩ族及びＶＩ族からの元素の混合組成、例えば、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＴｅ等からなる。
【００８１】
外因性半導体材料は、典型的には、高度の化学純度で調製された真性半導体を含み又はそれからなり、ここで、真性半導体材料は、ドーパントを含む。特定の態様では、ナノ粒子又はナノ粒子凝集体の外因性半導体材料は、メンデレーエフ周期表のＩＶＡ族からの元素からなる場合、Ａｌ、Ｂ、Ｇａ、Ｉｎ及びＰから選択される電荷キャリアによりドーピングされる。このような外因性半導体材料は、負の電荷キャリアが優勢であるｎ型又は正の電荷キャリアが優勢であるｐ型のいずれかであることができる。典型的な外因性ｐ型半導体材料は、アルミニウム（Ａｌ）、ホウ素（Ｂ）、ガリウム（Ｇａ）及びインジウム（Ｉｎ）から選択される荷電キャリアによりドーピングされたケイ素（Ｓｉ）又はゲルマニウム（Ｇｅ）からなる。典型的な外因性ｐ型半導体材料は、リン（Ｐ）により典型的にドーピングされたケイ素（Ｓｉ）又はゲルマニウム（Ｇｅ）からなる。
【００８２】
高い比誘電率（比誘電率（relative permittivity））、すなわち、２００以上の比誘電率を有する絶縁体材料から調製されるナノ粒子
高い比誘電率εｉｊｋ（比誘電率とも呼ばれる）を有する絶縁体材料から調製され又はそれからなるナノ粒子は、典型的には、室温（２５℃）で典型的に測定した場合、３．０eV以上のバンドギャップＥｇと、２０℃〜３０℃及び１０２Hz〜赤外周波数で典型的に測定された（例えば、「Permittivity (dielectric constant) of inorganic solid」; Handbook of chemistry and physics; David R. Lide; 88th Edition; Compilation of the static dielectric constant of inorganic solid. K.F. Young and H.P.R. Frederikse. J. Phys. Chem. Ref. Data, Vol. 2, No. 2, 1973の表１２〜４５を参照のこと）２００以上の比誘電率εｉｊｋとを有する材料により調製される。
【００８３】
このようなナノ粒子は、典型的には、ＢａＴｉＯ３、ＫＴａＮｂＯ３、ＫＴａＯ３、ＳｒＴｉＯ３、ＢａＳｒＴｉＯ３等から好ましく選択される混合金属酸化物である誘電体材料により調製される。
【００８４】
低い比誘電率（比誘電率）、すなわち、１００以下の比誘電率を有する絶縁体材料から調製されるナノ粒子
低い比誘電率を有する絶縁体材料から調製されるか又はそれからなるナノ粒子は、典型的には、室温（２５℃）で典型的に測定した場合、３．０eV以上のバンドギャップＥｇと、２０℃〜３０℃及び１０２Hz〜赤外周波数で典型的に測定された（例えば、「Permittivity (dielectric constant) of inorganic solid」; Handbook of chemistry and physics; David R. Lide; 88th Edition; Compilation of the static dielectric constant of inorganic solid. K.F. Young and H.P.R. Frederikse. J. Phys. Chem. Ref. Data, Vol. 2, No. 2, 1973の表１２〜４５を参照のこと）１００以下、好ましくは、５０以下又は２０以下の比誘電率εｉｊｋとを有する材料により調製される。
【００８５】
このようなナノ粒子は、典型的には、金属元素がメンデレーエフ周期表の周期３、５もしくは６からの金属元素又はランタニドである金属酸化物、混合金属酸化物、及び炭素材料から選択される誘電体材料により調製される。誘電体材料は、好ましくは、Ａｌ２Ｏ３、ＬａＡｌＯ３、Ｌａ２Ｏ３、ＣｅＯ２、ＳｉＯ２、ＳｎＯ２、Ｔａ２Ｏ５、ＺｒＯ２、ＨｆＯ２、Ｙ２Ｏ３及びカーボンダイヤモンドから選択される。
【００８６】
ナノ粒子又はナノ粒子凝集体の形状
粒子又は凝集体の形状は、その「生体適合性」に影響を及ぼし得るため、極めて均質な形状を有する粒子又は凝集体が好ましい。このため、薬物動態学的理由から、形状が本質的に球形、丸み状又は卵形であるナノ粒子又は凝集体が好ましい。このような形状は、ナノ粒子又は凝集体の細胞との相互作用又は細胞による取り込みにも有利である。球形又は丸み状が特に好ましい。
【００８７】
ナノ粒子又はナノ粒子凝集体の形状は、典型的には、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を使用して評価される。
【００８８】
ナノ粒子又はナノ粒子凝集体の寸法又はサイズ
本発明の趣旨において、「ナノ粒子」又は「ナノ粒子凝集体」という用語は、ナノメートル範囲、典型的には、１nm〜５００nmのサイズを有する生成物、特に、合成生成物を指す。
【００８９】
「ナノ粒子凝集体（aggregate of nanoparticles）」又は「ナノ粒子凝集体（nanoparticles’ aggregate）」という用語は、互いに強く結合、典型的には、共有結合したナノ粒子の集合体を指す。
【００９０】
透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を使用して、ナノ粒子又はナノ粒子凝集体のサイズを測定することができる。同様に、動的光散乱（ＤＬＳ）を使用して、溶液中のナノ粒子又はナノ粒子凝集体の流体力学的直径を測定することができる。これら２つの方法は、サイズ測定値を比較し、前記サイズを確認するために、次々と更に使用することができる。好ましい方法は、ＤＬＳであり（参照．International Standard ISO22412 Particle Size Analysis- Dynamic Light Scattering, International Organisation for Standardisation (ISO) 2008）、一方、溶液中のナノ粒子又はナノ粒子凝集体の平均流体力学的直径は、強度で与えられる。
【００９１】
典型的には、最大の寸法又はサイズは、丸み状もしくは球形のナノ粒子の直径又は卵形もしくは楕円形のナノ粒子の最長の長さである。
【００９２】
本明細書で定義されたナノ粒子又は凝集体の最大寸法は、典型的には、約２nm〜約２５０nm、好ましくは、約４nm又は１０nm〜約１００nm又は約２００nm、更により好ましくは、約１０nm〜約１５０nmである。
【００９３】
ナノ粒子又はナノ粒子凝集体の生体適合性コーティング
好ましい実施態様では、目的の組成物を調製するために本発明の文脈において使用されるナノ粒子又はナノ粒子凝集体は、ステルス特性を示す薬剤から選択される生体適合性材料によりコーティングすることができる。ステルス特性を示す薬剤は、立体基を示す薬剤であることができる。このような基は、例えば、ポリアクリラート；ポリアクリルアミド（ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド））；ポリカルバミド；生体高分子；多糖類、例えば、デキストラン又はキシラン；及びコラーゲンから選択することができる。別の好ましい実施態様では、ナノ粒子又はナノ粒子凝集体は、生物学的ターゲットとの相互作用を可能にする薬剤から選択される生体適合性材料によりコーティングすることができる。このような薬剤は、典型的には、ナノ粒子又はナノ粒子凝集体の表面上に正又は負の電荷をもたらすことができる。ナノ粒子又はナノ粒子凝集体の表面上に正電荷を形成する薬剤は、例えば、アミノプロピルトリエトキシシラン又はポリリシンであることができる。ナノ粒子又はナノ粒子凝集体の表面上に負電荷を形成する薬剤は、例えば、ホスファート（例えば、ポリホスファート、メタホスファート、ピロホスファート等）、カルボキシラート（例えば、クエン酸塩又はジカルボン酸、特に、コハク酸）又はスルファートであることができる。
【００９４】
好ましい実施態様では、本発明の文脈において使用されるナノ粒子又はナノ粒子凝集体は、親水性中性表面電荷を提示し又はナノ粒子に中性表面電荷を付与する親水性剤から選択される生体適合性材料（すなわち、コーティング剤）によりコーティングされる。実際に、本発明のナノ粒子が対象に投与される場合、親水性中性表面電荷を提示するナノ粒子又はナノ粒子に中性表面電荷を付与する親水性剤から選択される生体適合性剤によりコーティングされたナノ粒子は、電気刺激／電場に曝された場合に、神経疾患又はその少なくとも１つの症状を処置するためのナノ粒子の使用を最適化するのに特に有利である。
【００９５】
ナノ粒子又はナノ粒子凝集体に中性の表面電荷を付与する親水性剤は、アルコール（Ｒ−ＯＨ）、アルデヒド（Ｒ−ＣＯＨ）、ケトン（Ｒ−ＣＯ−Ｒ）、エステル（Ｒ−ＣＯＯＲ）、酸（Ｒ−ＣＯＯＨ）、チオール（Ｒ−ＳＨ）、糖（例えば、グルコース、フルクトース、リボース）、酸無水物（ＲＣＯＯＯＣ−Ｒ）及びピロールから選択される官能基を提示する薬剤であることができる。ナノ粒子又はナノ粒子凝集体に中性表面電荷を付与する親水性剤は、モノマー、ダイマー、オリゴマー、ポリマー又はコポリマーであることができる。薬剤がオリゴマーである場合、オリゴマーは、オリゴ糖、例えば、シクロデキストリンであることができる。薬剤がポリマーである場合、ポリマーは、ポリエステル（例えば、ポリ（乳酸）又はポリヒドロキシアルカン酸）、ポリエーテル、ポリエチレンオキシド、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリカプロラクトン、ポリビニルピロリドン、多糖類、例えば、セルロース、ポリピロール等であることができる。
【００９６】
加えて、ナノ粒子又はナノ粒子凝集体に中性表面電荷を付与する親水性剤は、ナノ粒子又はナノ粒子凝集体の表面と相互作用可能な特定の基（Ｒ−）を提示する薬剤であることができる。Ｒは、典型的には、チオール、シラン、カルボン酸及びリン酸基から選択される。
【００９７】
ナノ粒子又はナノ粒子凝集体が導体又は半導体及び金属ナノ粒子である場合、Ｒは、好ましくは、チオール、チオエーテル、チオエステル、ジチオラン又はカルボン酸基である。好ましくは、親水性中性コーティング剤は、チオグルコース、２−メルカプトエタノール、１−チオグリセロール、チオジグリコール及びヒドロキシ酪酸から選択される。
【００９８】
ナノ粒子又はナノ粒子凝集体が絶縁体及び酸化物又は混合酸化物ナノ粒子である場合、Ｒは、好ましくは、シラン又はリン酸基である。好ましくは、親水性中性コーティング剤は、ヒドロキシメチルトリエトキシシラン、フルクトース ６−ホスファート又はグルコース ６−ホスファート化合物である。
【００９９】
ナノ粒子又はナノ粒子凝集体に中性表面電荷を付与する親水性剤は、双性イオン化合物、例えば、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、ビタミン又はリン脂質であることができる。
【０１００】
ナノ粒子又はナノ粒子凝集体の表面電荷は、典型的には、当業者に周知のように、ｐＨ６〜８について、０．２〜１０g/Lのナノ粒子濃度について、典型的に水中でのゼータ電位測定により、及び、０．００１〜０．２M、例えば、０．０１M又は０．１５Mの水中濃度で電解質を典型的に加えることにより決定される。上記定義された条件下で、ナノ粒子又はナノ粒子凝集体の表面電荷は、典型的には、−１０mV〜＋１０mV（中性表面電荷に対応する）、−２０mV〜＋２０mV又は−３５mV〜＋３５mVに含まれる。
【０１０１】
ナノ粒子又は凝集体の完全な生体適合性コーティングは、ナノ粒子が親水性中性表面電荷を提示する場合、ナノ粒子の表面上のいかなる電荷をも回避するために、本発明の文脈において有利であることができる。「完全なコーティング」は、粒子の表面上に少なくとも完全な単層を形成可能な生体適合性分子の非常に高い密度／緊密さの存在を意味する。
【０１０２】
生体適合性コーティングにより、特に、生理学的流体（血液、血漿、血清等）等の流体又は医薬品投与に必要な任意の等張性媒体もしくは生理学的媒体中でのナノ粒子の安定性が可能となる。
【０１０３】
安定性は、乾燥オーブンを使用する乾燥抽出物定量化により確認することができ、典型的には、０．４５μmフィルターでのろ過前後のナノ粒子懸濁液において測定することができる。
【０１０４】
有利には、コーティングにより、インビボでの粒子の完全性が保存され、その生体適合性が確実なものとなり又は改善され、その任意の官能化（例えば、スペーサー分子、生体適合性ポリマー、ターゲット化剤、タンパク質等による）が容易になる。
【０１０５】
本発明の生体適合性のナノ粒子又はナノ粒子凝集体は、インビボ投与（すなわち、生理学的ｐＨでの）後に、毒性種を溶解し、放出すべきではなく、電気刺激の非存在下で酸化還元挙動を示すべきでもない。
【０１０６】
本明細書に記載される別の特定の目的は、好ましくは、薬学的に許容し得る担体又は媒体と共に、上記定義されたナノ粒子及び／又はナノ粒子凝集体を含む組成物、特に、医薬組成物に関する。
【０１０７】
特に、本明細書において、電場に曝された対象における本明細書に記載された神経疾患又はその少なくとも１つの症状を予防し又は治療するための使用／これらの予防又は治療における使用のための組成物が記載される。ここで、該組成物は、ナノ粒子及び／又はナノ粒子凝集体と、薬学的に許容し得る支持体とを含み又はこれらからなり、ここで、ナノ粒子又はナノ粒子凝集体の材料は、典型的には、本明細書で上記説明された、導体材料、半導体材料、２００以上の誘電率εｉｊｋを有する絶縁体材料及び１００以下の誘電率εｉｊｋを有する絶縁体材料から選択される。
【０１０８】
好ましい態様では、該組成物は、少なくとも２種の別個のナノ粒子及び／又はナノ粒子凝集体を含み又はこれらからなり、別個の材料からなる各ナノ粒子又はナノ粒子凝集体は、典型的には、導体材料、半導体材料、２００以上の誘電率εｉｊｋを有する絶縁体材料及び１００以下の誘電率εｉｊｋを有する絶縁体材料から選択される。
【０１０９】
特定の態様では、該組成物は、治療剤と共に、本発明のナノ粒子又はナノ粒子凝集体を含むことができる。治療剤は、神経障害処置に使用される任意の薬物から選択することができる。治療剤は、典型的には、抗精神病剤、抗ドーパミン作動剤、ドーパミン作動剤、抗コリン作動剤、コリン作動剤、抗グルタミン酸作動剤、グルタミン酸作動剤、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、Ｎ−メチル  Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）レセプターアンタゴニスト、ガンマ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）アゴニスト、ボツリヌス毒素、抗ジストニア薬、抗てんかん薬、抗痙攣剤、気分安定剤、抗うつ剤及び鎮静剤から選択される。
【０１１０】
該組成物は、固体、液体（懸濁液中の粒子）、エアロゾル、ゲル、ペースト等の形態にあることができる。好ましい組成物は、液体又はゲルの形態にある。特に好ましい組成物は、液体形態にある。
【０１１１】
利用される薬学的に許容し得る支持体又は担体は、当業者のための任意の古典的な支持体、例えば、生理食塩水、等張性で、無菌で、緩衝された溶液、非水性媒体溶液等であることができる。
【０１１２】
また、該組成物は、安定剤、甘味料、界面活性剤、ポリマー等も含むことができる。
【０１１３】
該組成物は、例えば、アンプル、エアロゾル、ボトル、錠剤、カプセル剤として、当業者に公知の医薬製剤の技術を使用して製剤化することができる。
【０１１４】
本発明のナノ粒子又はナノ粒子凝集体は、種々の可能な経路、例えば、頭蓋内、静脈内（ＩＶ）、気道（吸入）、髄腔内、眼内又は経口経路（経口）を使用して、好ましくは、頭蓋内又は髄腔内を使用して、対象に投与することができる。
【０１１５】
必要に応じて、ナノ粒子の反復注入又は投与を行うことができる。
【０１１６】
本明細書に記載されたナノ粒子又はナノ粒子凝集体及びこのようなナノ粒子又はナノ粒子凝集体を含む組成物は、対象において、典型的には、動物において、好ましくは、ほ乳類において、更により好ましくは、ヒトにおいて、典型的には、ヒトの患者において、その年齢又は性別にかかわらず、使用するためのものである。
【０１１７】
対象の大脳皮質に投与されるナノ粒子又はナノ粒子凝集体の典型的な量は、１０５〜１０１５個、好ましくは、１０７〜１０１４個、より好ましくは、１０９〜１０１２個である。また、対象の大脳皮質に投与されるナノ粒子又はナノ粒子凝集体の典型的な量は、１cm3あたり１０２〜１０１２個のナノ粒子又はナノ粒子凝集体である。
【０１１８】
対象の脳深部に投与されるナノ粒子又はナノ粒子凝集体の典型的な量は、１０４〜１０１４個、好ましくは、１０６〜１０１２個、より好ましくは、１０８〜１０１１個である。また、対象の脳深部に投与されるナノ粒子又はナノ粒子凝集体の典型的な量は、１cm3あたり１０１〜１０１１個のナノ粒子又はナノ粒子凝集体である。
【０１１９】
本発明の文脈において、ナノ粒子又はナノ粒子凝集体を電場／電気刺激に曝すことは、ナノ粒子又はナノ粒子凝集体を投与された対象を電場／電気刺激に曝すことと同等である。
【０１２０】
また、本明細書において、対象における神経疾患又はその少なくとも１つの症状を予防し又は治療するための方法であって、本明細書に記載されるナノ粒子又はナノ粒子凝集体のいずれかを対象に投与する工程と、前記対象を電場／電気刺激に曝す工程とを含む、方法が記載される。
【０１２１】
本明細書に記載された更なる目的は、本明細書に記載された少なくとも２種の別個のナノ粒子及び／又は少なくとも２種の別個のナノ粒子凝集体を含み、別個の材料からなる各ナノ粒子又はナノ粒子凝集体は、典型的には、本明細書に記載された、導体材料、半導体材料、２００以上の誘電率εｉｊｋを有する絶縁体材料及び１００以下の誘電率εｉｊｋを有する絶縁体材料から選択される、キットに関する。
【０１２２】
特定の実施態様では、キットは、別個の容器内に、本明細書に記載された別個のナノ粒子及び／又はナノ粒子凝集体（これらは、接触する、典型的には、インサイチュ、すなわち、ターゲット部位で、又はターゲット部位での混合物の堆積前にインビトロもしくはエクスビボのいずれかで混合されることが意図される）を含む。
【０１２３】
更なる目的は、本明細書に記載されたナノ粒子又はナノ粒子凝集体とは異なり、当業者であればターゲット疾患の性質に応じて選択することができるであろう、少なくとも１つの更なる治療剤、例えば、抗精神病剤、抗ドーパミン作動剤、ドーパミン作動剤、抗コリン作動剤、コリン作動剤、抗グルタミン酸作動剤、グルタミン酸作動剤、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、Ｎ−メチル Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）レセプターアンタゴニスト、ガンマ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）アゴニスト、ボツリヌス毒素、抗ジストニア薬、抗てんかん薬、抗痙攣剤、気分安定剤、抗うつ剤及び鎮静剤を更に含むキットに関する。
【０１２４】
また、本明細書において、対象における本明細書に記載された神経疾患又はその少なくとも１つの症状を予防し又は治療するための方法におけるこのようなキットのインビボ、インビトロ又はエクスビボでの使用が記載される。また、本明細書において、対象における神経疾患又はその少なくとも１つの症状の予防又は治療における使用のための、本明細書に記載されたキットが開示される。
【０１２５】
本発明は、電気刺激／電場に曝されたナノ粒子又はナノ粒子凝集体の使用により、神経疾患又はその少なくとも１つの症状を処置することを目的とする。
【０１２６】
ニューロンレベルでは、ナノ粒子は、ニューロンの電気的興奮性を向上させ又は阻害するように記載されている。例えば、酸化亜鉛、カーボンナノチューブ及び金ナノ粒子は、ニューロンの電気的興奮性を向上させることが見出され、一方、酸化銅、銀、カーボンブラック、酸化鉄及び酸化チタンは、ニューロンの電気的興奮性を阻害することが見出された（Polak P & Shefi O. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine 11 (2015) 1467-1479, Nanometric agents in the service of neuroscience: MAnipulation of neuronal growth and activity using nanoparticles）。
【０１２７】
コーティングされた銀ナノ粒子（ｃＡｇＮＰ）−両親媒性ポリマーであるポリエチレングリコールを使用−［純水中での流体力学的直径１３nm±２nm（動的光散乱技術）及びゼータ電位−６９mV（Zetasizer Nano）を有するｃＡｇＮＰ］のニューロン系での全身影響研究から、ナノ粒子が興奮性に影響する機構の変化を誘発することが示された。その上、ニューロンネットワークシミュレーションから、局所的にｃＡｇＮＰ誘発された変化により、ネットワーク全体のネットワーク活動の変化がもたらされることが示され、このことは、ｃＡｇＮＰの局所適用がネットワーク全体の活動に影響を及ぼし得ることを示している（Busse M. et al. International Journal of Nanomedicine 2013:8 3559-3572, Estimating the modulatory effects of nanoparticles on neuronal circuits using computational upscaling）。
【０１２８】
また、細胞内金ナノ粒子に関連するニューロンの興奮性の向上は、病理学的状態、例えば、発作下でニューロンに対して有害な効果を潜在的に有することが記載されている（Jung S, et al. PLOS ONE 2014, 9(3) e91360, Intracellular gold nanoparticles increase neuronal excitability and aggravate seizure activity in the mouse brain）。
【０１２９】
本発明のナノ粒子又はナノ粒子凝集体は、電場／電気刺激に曝された場合、脳の別個の領域内及び／又は脳の別個の領域間におけるニューロンネットワーク内及び／又はニューロンネットワーク間での振動の同期化を正常化することにより、神経疾患又はその少なくとも１つの症状を予防し又は治療するための使用／これらの予防又は治療における使用のためのものである。
【０１３０】
図２及び図３に説明されるたように、脳の別個の領域内及び／又は脳の別個の領域間の伝達は、神経疾患において影響を受ける。神経障害及び関連症状によれば、本発明のナノ粒子への脳の特定領域の曝露（表２を参照のこと）により、電気刺激と組み合わせると、脳の別個の領域内及び／又は脳の別個の領域間におけるニューロンネットワーク内及び／又はニューロンネットワーク間での振動の同期化の正常化（すなわち、コヒーレンスの正常化）により、伝達が改善されるであろう（図４及び図５並びに表２）。
【０１３１】
【表２】
2020503306.tif 000003
【０１３２】
当業者であれば容易に理解できるように、ニューラルネットワークに対する電気刺激の効果は、ターゲット脳領域内の電場の浸透深さ及び空間解像能に関連する。低空間解像能及び浸透深さは、電気刺激の重要な欠点である。本発明のナノ粒子又はナノ粒子凝集体の存在により、ナノ粒子が局在化される電場の空間解像能（焦点性）の向上及び電流の浸透深さの向上（その治療効果の向上）が、まさに有利に可能となる。
【０１３３】
また、ターゲット組織におけるナノ粒子又はナノ粒子凝集体の存在により、ニューロン刺激に必要とされる印加／誘導電気刺激閾値の減少も可能となる、すなわち、印加パラメータ、例えば、電流、電圧、パルス幅及び／又は周波数の値を減少させる。加えて、この効果により、印加／誘導電流に関連する潜在的な毒性が低減される。また、このことは、内部パルス発生器（ＩＰＧ）バッテリーの有効期限を延長させること又はＤＢＳ電極のサイズ及び幾何学的形状を修正する（小さくする）こと等の技術的影響を有することができる。
【０１３４】
下記実施例及びそれらの対応する図面は、本発明の範囲を限定することなく、本発明を説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１】脳の模式図（矢状面）。
【図２】２つのニューロンネットワーク間の過同期及び同期障害。
【図３】種々の神経疾患に関与する脳領域。
【図４】ナノ粒子（ＮＰ１）が電場（Ｅ）に曝された場合の、過同期（運動障害）の正常化についての効果。
【図５】ナノ粒子（ＮＰ２）が電場（Ｅ）に曝された場合の、同期障害（精神障害及び認知障害）の正常化についての効果。
【図６】ＭＰＰ＋処理及び電気活動記録を伴うパーキンソン病誘発の実験スキーム。マウス腹側中脳／皮質の共培養物をＥ１４．５ ＮＭＲＩマウスから調製し、４８ウェルのＭＥＡにおいて３週間培養した（培養期間）。この培養物を培養７日後（７日目）、ナノ粒子懸濁液（「ナノ粒子」群）又は水（「対照」群及び「ＭＰＰ＋」群）で処理し、８日目に、ＭＰＰ＋（２０μM）（「ナノ粒子」群及び「ＭＰＰ＋」群）又は水（「対照」群）で処理した。自発活動を２１日目に記録した。２１日目での記録後、培養物を１つの電極上で電気的に刺激し、活動の記録を非刺激電極上で行った。
【図７】電気活動記録から抽出することができる幾つかのパラメータを概説する２つの単純化されたバーストのスキーム。全体的な活動（スパイク、バースト、バースト間の間隔（inter burst interval）（ＩＢＩ）及びバースト期間）及びバースト構造（バースト持続時間、バーストプラトー、バースト振幅、バーストのスパイク間の間隔（burst inter spike interval）（ＩＳＩ）及びバースト面積）を説明するパラメータを示す。これらのパラメータの標準偏差（ＳＤ）はそれぞれ、全体的な活動及びバースト構造の規則性の尺度である。時間の変動係数（ＣＶｔｉｍｅ）は、各単位の活動パターンの時間的規則性を反映する。ＣＶｔｉｍｅは、パラメータの標準偏差と平均との比により計算される。ネットワーク間の変動係数（ＣＶｎｅｔ）は、ネットワーク内のニューロン間の同期化を反映する。ＣＶｎｅｔは、ネットワークにわたるパラメータの標準偏差と平均との比により計算される。大きなＣＶｎｅｔ値は、ネットワーク全体にわたる活動の広範囲の変動を意味し、より少ない同期化を意味する。
【図８】電気刺激下の「ナノ粒子」群において観察された機能的効果を、中脳／皮質ネットワーク活動について「対照」群（電気刺激下）及び「ＭＰＰ＋」群（電気刺激下）と比較した。試験したナノ粒子の存在下又は非存在下における電気刺激下でのネットワーク活動におけるＭＰＰ＋誘発機能的効果の全て並びに「対照」群（電気刺激下）を、「刺激前」活動、すなわち、各実験について１００％に設定した２１日目に測定された活動に対して正規化した。データから、電気刺激下でのＭＰＰ＋誘発機能的効果が示され、電気刺激下での本発明のナノ粒子の予防／救済効力（すなわち、「対照」群の効果と同様のレベルまで機能的効果を予防／救済する能力）が実証される。
【図９】「ナノ粒子」群、「対照」群（効果スコア＝０）及び「ＭＰＰ＋」群（効果スコア＝１）についての効果スコア分析。
【図１０】アミロイドベータ１−４２（Ａベータ１−４２）を伴うアルツハイマー病の誘発、処置及び電気活動記録の実験スキーム。４週間の培養（培養期間）後、Ａベータ１−４２（１００nM）（「ナノ粒子」群及び「Ａベータ」群）又は水（「対照」群）（Ｔ０）をニューロンネットワークに加えた。４時間後、ナノ粒子懸濁液（「ナノ粒子」群）又は水（「対照」群及び「Ａベータ」群）を加えた。自発活動を下記のように記録した：    −Ｔ０（Ａベータ１−４２の添加前）において    −Ｔ０＋１ｈ、Ｔ０＋２ｈ、Ｔ０＋３ｈ、Ｔ０＋４ｈ（ナノ粒子又は水の添加前）、Ｔ０＋５ｈ及びＴ０＋６ｈにおいて。
【図１１】電気刺激下での「ナノ粒子」群において観察された機能的効果を、皮質ネットワーク活動について「対照」群（電気刺激下）及び「Ａベータ１−４２」群（電気刺激下）と比較した。試験したナノ粒子の存在下又は非存在下における電気刺激下でのネットワーク活動におけるＡベータ１−４２誘発機能的効果の全て並びに「対照」群（電気刺激下）を、「刺激前」活動、すなわち、各実験について１００％に設定したＴ０＋６時間に測定された活動に対して正規化した。データから、電気刺激下でのＡベータ１−４２機能的効果が示され、電気刺激下での本発明のナノ粒子により可能となる救済効力（すなわち、「対照」群の効果と同様のレベルまで機能的効果を救済する能力）が実証される。
【図１２】「ナノ粒子」群、「対照」群（効果スコア＝０）及び「Ａベータ」群（効果スコア＝１）についての効果スコア分析。
【実施例】
【０１３６】
シミュレーション
シミュレーションを使用して、電気刺激（電場）に曝されたナノ粒子のニューロンネットワークにおける効果を評価することができる。
【０１３７】
ニューロンのインビトロ研究
ニューロンレベルでは、パッチクランプ技術は、ニューロンの膜電位の直接測定及び制御を同時に行うことができるため、活動電位を検出するのに非常に有用である。
【０１３８】
この技術を使用して、単一のニューロンにおけるナノ粒子の効果を評価する。
【０１３９】
ニューロンネットワークのインビトロ研究
多電極アレイ（ＭＥＡ）により、多数のニューロン（ニューロンネットワーク）の刺激及び記録が可能となる。ＭＥＡ上の分離されたニューロン培養物により、ネットワーク活動をアレイの複数の電極を通して電気刺激シーケンスにより操作することができる簡略化されたモデルが提供される。この技術は、脳機能及び機能不全のより良好な理解につながる、ネットワーク及び細胞レベルでの生理学的に関連する問題を評価するのに非常に有用である。
【０１４０】
実際に、ＭＥＡに結合した分離されたニューロン培養物は、脳ネットワークの複雑さをより良好に理解するのに広く使用されている。加えて、分離されたニューロンアセンブリの使用により、ネットワークの接続性の操作及び制御が可能となる。ＭＥＡに結合した分離されたニューロン培養物の使用により、装置の同じ電極を通して送達される電気パルスによりニューロンを細胞外で刺激することができる実験の設計が可能となる。このようにして、出現するニューロン動力学を電気刺激によりどのようにモデュレーションすることができ、その結果として、基礎となる機能的接続性が修飾されるか否かを調査することが合理的になる（Poli D. et al, Frontiers in Neural Circuits, 2015, 9 (article 57), 1-14: Functional connectivity in in vitro neuronal assemblies）。
【０１４１】
ＭＥＡシステムにより、リアルタイムでのニューロンネットワークにおける複数の部位からの非侵襲的で、長期間持続する同時の細胞外記録が可能となり、空間解像能が向上することにより、ネットワーク活動の堅牢な測定が提供される。長期間にわたる活動電位及び電場電位データの同時収集により、時空間パターン生成を担う全ての細胞機構の相互作用から生じるネットワーク機能のモニタリングが可能となる（Johnstone A. F. M. et al., Neurotoxicology (2010), 31: 331-350, Microelectrode arrays: a physicologically based neurotoxicity testing platform for the 21st century）。パッチクランプ及び他の単一電極記録技術と比較して、ＭＥＡにより、ネットワーク全体の応答が測定され、ネットワークに存在する全てのレセプター、シナプス及びニューロンタイプの相互作用に関する全体的な情報が統合される（Novellino A. et al., Frontiers in Neuroengineering. (2011), 4(4), 1-14, DeVelopment of micro-electrode array based tests for neurotoxicity: assessment of interlaboratory reproducibility with neuroactive chemicals.）。したがって、ＭＥＡ記録は、ニューロン伝達、情報符号化、伝播、及びニューロン培養における処理を理解するために利用されてきた（Taketani,M., and Baudry,M.(2006). Advances in Network Electrophysiology. New York, NY: Springer; Obien et al., Frontiers in Neurosciences, 2015, 8(423): Revealing neuronal functions through microelectrode array recordings）。ＭＥＡ技術は、電気的に活性な細胞培養物におけるネットワーク活動の機能的変化を特徴付けるための高度な表現型高含量スクリーニング法であり、神経発生並びに神経再生及び神経変性の局面に対して非常に感受性である。更に、ＭＥＡ上で増殖したニューロンネットワークは、インタクトなほ乳類の神経系の機能を変化させるのとほぼ同じ濃度範囲で、神経活性化合物又は神経毒性化合物に応答可能であることが公知である（Xia et al., Alcohol, 2003, 30, 167-174: Histiotypic electrophysiological responses of cultured neuronal networks to ethanol; Gramowski et al., European Journal of Neuroscience, 2006, 24, 455-465: Functional screening of traditional antidepressants with primary cortical neuronal networks grown on multielectrode neurochips; Gramowski et al., Frontiers in Neurology, 2015, 6(158): Enhancement of cortical network activity in vitro and promotion of GABAergic neurogenesis by stimulation with an electromagnetic field with 150MHz carrier wave pulsed with an alternating 10 and 16 Hz modulation）。
【０１４２】
この技術を使用して、ニューロンネットワークにおけるナノ粒子の効果を評価する。
【０１４３】
ニューロンネットワークのインビボ研究
電気刺激に曝された場合に、本発明のナノ粒子の動物のニューロンネットワークにおける効果を評価するために、適切な動物モデルが考慮される。
【０１４４】
例えば、パーキンソン病のマウスモデルを使用して、行動障害（運動障害）の軽減において、ｔＤＣＳ（経頭蓋直流刺激）により刺激されたナノ粒子の効果を評価する。また、アルツハイマー病のラットモデルを使用して、動物の空間学習及び記憶機能不全（認知障害）において、ｔＤＣＳにより刺激されたナノ粒子の効果を評価する。
【０１４５】
実施例１．導体材料により調製されたナノ粒子：中性表面電荷を有する生体適合性コーティングでコーティングされた金ナノ粒子の合成
金ナノ粒子を、塩化金塩（ＨＡｕＣｌ４）をキャッピング剤（クエン酸ナトリウム）で還元することにより合成した（プロトコールは、G. Frens Nature Physical Science 241 (1973) 21から採用した）。典型的な実験では、ＨＡｕＣｌ４溶液を加熱して沸騰させた。続けて、クエン酸ナトリウム溶液を加えた。得られた溶液を沸騰下で更に５分間維持した。ナノ粒子懸濁液の０．２２μmろ過（フィルターメンブレン：ポリ（エーテルスルホン）（ＰＥＳ））を行い、懸濁液中での金濃度を５３０nmでのＵＶ−可視分光分析アッセイにより決定した。
【０１４６】
表面コーティングを、α−メトキシ−ω−メルカプトポリ（エチレングリコール）２０kDa（「チオール-PEG 20kDa」）を使用して行った。充分な量の「チオール-PEG 20kDa」をナノ粒子懸濁液に加えて、金ナノ粒子表面上の単層被覆の少なくとも半分に達した（２．５分子／nm2）。ｐＨを７〜７．２に調節し、ナノ粒子懸濁液を一晩撹拌した。
【０１４７】
流体力学的直径（強度で測定）を、ナノ粒子懸濁液を水中で希釈する（最終濃度：０．１g/L）ことにより、６３３nmで発光するレーザーによる１７３°の散乱角でのNano-Zetasizer（Malvern）を用いて動的光散乱（ＤＬＳ）により決定した。このようにして得られた生体適合性金ナノ粒子の懸濁液中での流体力学的直径は、１１８nmに等しく、多分散性指数（サイズにおけるナノ粒子の集団の分散）は、０．１３であることが見出された。
【０１４８】
ゼータ電位を、ｐＨ７において１mM ＮａＣｌ溶液中でナノ粒子懸濁液を希釈する（最終濃度：０．１g/L）ことによって、ナノ粒子の電気泳動移動度（Nano-Zetasizer, Malvern）を測定することにより決定した。ｐＨ７でのゼータ電位は、−１mVに等しいことが見出された。
【０１４９】
実施例２．導体材料により調製されたナノ粒子：負の表面電荷を有する生体適合性コーティングでコーティングされた金ナノ粒子の合成
金ナノ粒子を実施例１に記載されたように調製した（同じ金無機コア）。
【０１５０】
ＰＥＳメンブレンフィルターでの０．２２μmろ過を行い、懸濁液中での金濃度を５３０nmでのＵＶ−可視分光分析アッセイにより決定した。
【０１５１】
生体適合性表面コーティングを、メソ−２，３−ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）を使用して行った。充分な量のＤＭＳＡをナノ粒子懸濁液に加えて、表面上の単層被覆の少なくとも半分に達した（２．５分子／nm2）。ｐＨを７〜７．２に調節し、ナノ粒子懸濁液を一晩撹拌した。
【０１５２】
流体力学的直径（強度で測定）を、ナノ粒子懸濁液を水中で希釈する（最終濃度：０．１g/L）ことにより、６３３nmで発光するレーザーによる１７３°の散乱角でのNano-Zetasizer（Malvern）を用いて動的光散乱（ＤＬＳ）により決定した。このようにして得られたナノ粒子の懸濁液中での流体力学的直径は、７６nmに等しく、多分散性指数（サイズにおけるナノ粒子の集団の分散）は、０．４６であった。
【０１５３】
ゼータ電位を、ｐＨ７において１mM ＮａＣｌ溶液中でナノ粒子懸濁液を希釈する（最終濃度：０．１g/L）ことによって、ナノ粒子の電気泳動移動度（Nano-Zetasizer, Malvern）を測定することにより決定した。ｐＨ７でのゼータ電位は、−２３mVに等しいことが見出された。
【０１５４】
実施例３．１００以下の低い比誘電率を有する絶縁体材料により調製されたナノ粒子：中性表面電荷を有する生体適合性コーティングでコーティングされた酸化ジルコニウムナノ粒子の合成
酸化ジルコニウム（ＺｒＯ２）ナノ粒子を、塩基性ｐＨにおいて、塩化ジルコニウム（ＺｒＣｌ４）を水酸化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＯＨ）と共に沈殿させることにより合成した。得られた懸濁液をオートクレーブに移し、１１０℃超の温度で加熱した。冷却後、懸濁液を脱イオン水で洗浄し、酸性にした。
【０１５５】
ＰＥＳメンブレンフィルターでの０．２２μmろ過を行い、水溶液を粉末に乾燥させ、かつ、得られたままの質量を秤量することにより、（ＺｒＯ２）ナノ粒子濃度を決定した。
【０１５６】
生体適合性コーティングをシラン−ポリ（エチレン）グリコール ２kDa（「Si-PEG 2kDa」）を使用して調製した。充分な量の「Si-PEG 2kDa」をナノ粒子懸濁液に加えて、表面上の単層被覆の少なくとも半分に達した（２．５分子／nm2）。ナノ粒子懸濁液を一晩撹拌し、続けて、ｐＨを７に調節した。
【０１５７】
流体力学的直径（強度で測定）を、ナノ粒子懸濁液を水中で希釈する（最終濃度：０．１g/L）ことにより、６３３nmで発光するレーザーによる１７３°の散乱角でのNano-Zetasizer（Malvern）を用いて動的光散乱（ＤＬＳ）により決定した。ナノ粒子の流体力学的直径は、５５nmに等しく、多分散性指数（サイズにおけるナノ粒子の集団の分散）は、０．１であることが見出された。
【０１５８】
ゼータ電位を、ｐＨ７において１mM ＮａＣｌ溶液中でナノ粒子懸濁液を希釈する（最終濃度：０．１g/L）ことによって、ナノ粒子の電気泳動移動度（Nano-Zetasizer, Malvern）を測定することにより決定した。ｐＨ７でのゼータ電位は、−１mVに等しいことが見出された。
【０１５９】
実施例４．１００以下の低い比誘電率を有する絶縁体材料により調製されたナノ粒子：負の表面電荷を有する生体適合性コーティングでコーティングされた酸化ジルコニウムナノ粒子の合成
酸化ジルコニウムナノ粒子を実施例３に記載されたように調製した（同じ無機コア）。
【０１６０】
ＰＥＳメンブレンフィルターでの０．２２μmろ過を行い、水性懸濁液を粉末に乾燥させ、かつ、得られたままの質量を秤量することにより、（ＺｒＯ２）ナノ粒子濃度を決定した。
【０１６１】
表面官能化を、ヘキサメタリン酸ナトリウムを使用して行った。充分な質量のヘキサメタリン酸ナトリウムをナノ粒子懸濁液に加えて、表面上の単層被覆の少なくとも半分に達した（２．５分子／nm2）。ナノ粒子懸濁液を一晩撹拌し、続けて、ｐＨを７に調節した。
【０１６２】
流体力学的直径（強度で測定）を、ナノ粒子懸濁液を水中で希釈する（最終濃度：０．１g/L）ことにより、６３３nmで発光するレーザーによる１７３°の散乱角でのNano-Zetasizer（Malvern）を用いて動的光散乱（ＤＬＳ）により決定した。ナノ粒子の流体力学的直径は、７０nmに等しく、多分散性指数（サイズにおけるナノ粒子の集団の分散）は、０．１１であることが見出された。
【０１６３】
ゼータ電位を、ｐＨ７において１mM ＮａＣｌ溶液中でナノ粒子懸濁液を希釈する（最終濃度：０．１g/L）ことによって、ナノ粒子の電気泳動移動度（Nano-Zetasizer, Malvern）を測定することにより決定した。ｐＨ７でのゼータ電位は、−３３mVに等しいことが見出された。
【０１６４】
実施例５．半導体材料により調製されたナノ粒子：負の表面電荷を有する生体適合性コーティングでコーティングされたケイ素ナノ粒子
ケイ素（Ｓｉ）ナノ粒子（粉末）をUS Research Nanomaterials Inc.から入手した。それらを（プローブによる）超音波処理下、３０g/Lで水中に分散させた。
【０１６５】
ＰＥＳメンブレンフィルターでの０．２２μmろ過を行い、懸濁液を粉末に乾燥させ、かつ、得られたままの質量を秤量することにより、（Ｓｉ）ナノ粒子濃度を決定した。
【０１６６】
流体力学的直径（強度で測定）を、ナノ粒子懸濁液を水中で希釈する（最終濃度：０．１g/L）ことにより、６３３nmで発光するレーザーによる１７３°の散乱角でのNano-Zetasizer（Malvern）を用いて動的光散乱（ＤＬＳ）により決定した。ナノ粒子の流体力学的直径は、１６４nmに等しく、多分散性指数（サイズにおけるナノ粒子の集団の分散）は、０．１６であることが見出された。
【０１６７】
ゼータ電位を、ｐＨ７において１mM ＮａＣｌ溶液中でナノ粒子懸濁液を希釈する（最終濃度：０．１g/L）ことによって、ナノ粒子の電気泳動移動度（Nano-Zetasizer, Malvern）を測定することにより決定した。ｐＨ７でのゼータ電位は、−１９mVに等しいことが見出された。
【０１６８】
実施例６．２００以上の高い比誘電率を有する絶縁体材料により調製されたナノ粒子：負の表面電荷を有する生体適合性コーティングでコーティングされたチタン酸バリウムナノ粒子
チタン酸バリウム（ＢａＴｉＯ３）ナノ粒子の懸濁液（水中の２０wt％）をUS Research Materials Inc.（US3835）から入手した。
【０１６９】
表面官能化を、シラン−ポリ（エチレン）グリコール １０kDa（「Si-PEG 10kDa」）を使用して行った。簡潔に言うと、まず、「Si-PEG 10kDa」をエタノール／水の溶液（１／３ v/v）に溶解させ、ＢａＴｉＯ３懸濁液（水中の２０wt％）に加え、ナノ粒子の表面上に完全な単層被覆を達成した。この懸濁液を超音波処理し、続けて、一晩撹拌した。０．２２μmろ過（フィルターメンブレン：ポリ（エーテルスルホン））後、未反応の「Si-PEG 10kDa」ポリマーを除去するために、洗浄工程を行った。
【０１７０】
流体力学的直径（強度で測定）を、ナノ粒子懸濁液を水中で希釈する（最終濃度：０．１g/L）ことにより、６３３nmで発光するレーザーによる１７３°の散乱角でのNano-Zetasizer（Malvern）を用いて動的光散乱（ＤＬＳ）により決定した。ナノ粒子の流体力学的直径は、１６４nmに等しく、多分散性指数（サイズにおけるナノ粒子の集団の分散）は、０．１６であることが見出された。
【０１７１】
ゼータ電位を、ｐＨ７において１mM ＮａＣｌ溶液中でナノ粒子懸濁液を希釈する（最終濃度：０．１g/L）ことによって、ナノ粒子の電気泳動移動度（Nano-Zetasizer, Malvern）を測定することにより決定した。ｐＨ７でのゼータ電位は、−１１mVであることが見出された。
【０１７２】
実施例７．表現型ＭＥＡスクリーニング技術を使用する、ＭＰＰ＋誘発ニューロンネットワークにおける、電気刺激に曝された実施例１、２、５及び６からのナノ粒子の予防／救済効力の評価
本発明のナノ粒子の予防／救済効力を、４８ウェルＭＥＡ上で３週間培養した、ＭＰＰ＋処理マウスの腹側中脳／皮質の共培養物で試験した。このモデルは、ＭＥＡ上で増殖している障害を有する中脳／皮質の培養物を使用したドーパミン作動性ニューロンの機能的救済に基づいて、化合物をスクリーニングするためのインビトロのパーキンソンモデルを表わす。中脳は、基底核の一部であり、ドーパミン作動性ニューロンの大部分を含有する黒質を含む脳の領域である。ナノ粒子の予防／救済効果の評価を微小電極アレイ（ＭＥＡ）チップ上に播種したニューロンの共培養物の細胞外電気活動の測定により行った。
【０１７３】
マウスニューロンにおけるパーキンソン表現型のインビトロ誘発を１−メチル−４−フェニルピリジニウムヨウ化物（ＭＰＰ＋）により行った。ミトコンドリア障害がパーキンソン病（ＰＤ）の病因において役割を果たすという強力な証拠が存在する。ＭＰＰ＋は、電子伝達酵素複合体Ｉ（ＮＡＤＨ：ユビキノンオキシドレダクターゼ）の遮断を介して細胞呼吸を阻害するミトコンドリア毒であることが見出された。幾つかの研究室から、ＰＤ患者の死後組織の黒質にミトコンドリア電子伝達鎖の複合体Ｉに選択的欠損が存在し、初期ＰＤ患者の血小板でも複合体Ｉ活性が低下していることが報告されている（Peng J. et al., Journal of Biomolecular screening, 2013, 18(5), 522-533: Using human pluripotent stem cell-derived dopaminergic neurons to evaluate candidate Parkinson’s disease therapeutic agents in MPP+ and rotenone models.）。
【０１７４】
材料及び方法
初代細胞培養、処理条件及び電気刺激
中脳組織を胚性１４．５日目のｃｈｒ：ＮＭＲＩマウス（Charles River）から採取した。マウスを頸椎脱臼により殺処分した。組織を酵素消化（１３３，３Kunitz単位/ml ＤＮａｓｅ；１０単位/ml Ｐａｐａｉｎ）及び機械的粉砕により分離し、計数し、生命力を制御し、ラミニン（１０μg/ml）、１０％ ウシ胎児血清及び１０％ ウマ血清を含有するＤＭＥＭの２０μl滴中において、ＭＥＡ上に播種した。ＭＥＡ上での培養物を使用の準備ができるまで、１０％ ＣＯ２雰囲気中、３７℃でインキュベーションした。１０％ ウマ血清を含有するＤＭＥＭを培養培地に週２回補充した。
【０１７５】
「ナノ粒子」群において、ウェルを７日目に、実施例１、２、５からのナノ粒子懸濁液（８００μM）及び実施例６からのナノ粒子懸濁液（２０００μM）で、続けて８日目に、２０μM ＭＰＰ＋で処理した。「対照」群では、７日目に、水をウェルに加え、続けて、８日目に水を加えた。「ＭＰＰ＋」群では、７日目に水をウェルに加え、続けて、８日目に２０μM ＭＰＰ＋を加えた。ＭＰＰ＋（又は「対照」群については水）添加の２４（２４）時間後に、培地を交換して、ＭＰＰ＋の洗浄を達成した。その後、培地を週２回交換した。
【０１７６】
２１日目に、１２０分のニューロン活動を記録し、３０分の安定活動を分析した。２１日目の記録後、全てのウェルを電気刺激により能動的にスパイクする電極の１つで活性化した。刺激を３０分間行った（４８ウェルのＭＥＡにおいてウェルあたりに１つの電極の刺激、最小刺激持続時間＝１００μs、パルス後２msのアーチファクト除去、パルス１０×二相性＋／−５００mV）。非刺激電極の応答を平均化し、刺激前活動に対して正規化した（図６）。
【０１７７】
微小電極アレイニューロチップ
４８ウェルの微小電極アレイニューロチップをAxion Biosystems Inc.から購入した。これらのチップは、ウェルあたりに１６個の受動電極を有する。表面をポリエチレンイミン（ＰＥＩ、ホウ酸バッファー中の５０％）により１時間コーティングし、洗浄し、風乾した。
【０１７８】
マルチチャネル記録及びマルチパラメトリックデータ分析
記録には、Axion Biosystems（USA）によるマルチチャネルMAESTRO記録システムを使用した。細胞外記録には、４８ウェルのＭＥＡをMAESTRO記録ステーションに入れ、３７℃に維持した。記録をＤＭＥＭ／１０％ 熱不活化ウマ血清中で行った。１０％ＣＯ２を含むろ過され、加湿された気流の継続的な流れにより、ｐＨを７．４に維持した。
【０１７９】
各単位は、１つの電極で記録された１つのニューロンから生じる活動を表す。単位を記録の開始時に分離する。各単位について、活動電位（すなわち、スパイク）をスパイク列として記録し、これをいわゆる「バースト」にクラスタリングする。バーストを、プログラムSpike Wrangler及びNPWaveX（両方ともNeuroProof GmbH, Rostock, Germany）を使用する直接スパイク列分析により定量的に記述した。バーストを短いスパイク事象の開始及び終了により定義した（図７）。
【０１８０】
ネットワーク活動パターンのマルチパラメトリック高含量分析により、２０４個の活動記述スパイク列パラメータを抽出した。これらのパラメータにより、以下の４つのカテゴリー：全体的な活動、バースト構造、振動挙動及び同期性における活動変化の正確な記述を得ることが可能となる。
−「全体的な活動パラメータ」の変化は、活動電位発火速度（スパイク速度）、バースト速度及びバースト間の時間としてのバースト期間における効果を記述する。
−「バースト構造パラメータ」は、高周波スパイク位相（「バースト」）内のスパイクの内部構造、例えば、バースト内のスパイク周波数、バースト内のスパイク速度及びバーストスパイク密度だけでなく、バーストの全体構造、例えば、持続時間、面積及びプラトーも定義する。
−「振動パラメータ」は、バーストの発生又は構造の規則性を定量化し、この規則性は、実験エピソード内のパラメータ（全体的な活動、バースト構造）の変動性を記述する主要な活動パラメータの変動係数により計算される（Gramowski A. et al., Eur. J. Neurosci., 2004, 19, 2815-2825: Substance identification by quantitative characterization of oscillator activity in murine spinal cord networks on microelectrode arrays）。より高い値は、より規則的でないバースト構造又はより規則的でない全体的な活動（例えば、スパイク、バースト）を示す。
−スパイク列における同期性の尺度として、「ＣＶｎｅｔパラメータ」は、ネットワーク内のニューロン間の「同期化」を反映する（Gramowski A. et al., Eur. J. Neurosci., 2004, 19, 2815-2825: Substance identification by quantitative characterization of oscillator activity in murine spinal cord networks on microelectrode arrays）。ＣＶｎｅｔは、ネットワークにわたる変動係数である。大きなＣＶｎｅｔ値は、ネットワーク全体にわたる活動の広範囲の変動を意味し、より少ない同期化を意味する（Gramowski A. et al., Frontiers in Neurology, 2015, 6(158): Enhancement of cortical network activity in vitro and promotion of GABAergic neurogenesis by stimulation with an electromagnetic field with 150MHz carrier wave pulsed with an alternating 10 and 16 Hz modulation）。
【０１８１】
電気刺激下でのニューロンネットワークにＭＰＰ＋により誘発される機能的効果及び電気刺激下での本発明のナノ粒子の予防／救済効力を、上記パラメータを通して評価した（また、それらのいくつかについては、以下の表３に要約する）。
【０１８２】
【表３】
2020503306.tif 000004
【０１８３】
試験したナノ粒子の存在下又は非存在下での電気刺激下でのネットワーク活動におけるＭＰＰ＋誘発機能的効果を「刺激前」活動、すなわち、各実験について１００％に設定した２１日目に測定された活動に対して正規化した。自発的なネイティブ活動に関連する値を活動の３０分安定化後の３０分の期間から得られた６０秒のビンデータから得た。結果（パラメータ値）を独立したネットワークの平均±ＳＥＭとして表わした。各「ナノ粒子」群については、少なくとも８個のアクティブウェル、「対照」群については、少なくとも３０個のアクティブウェル、「ＭＰＰ＋」群については、少なくとも２６個のアクティブウェル（「アクティブ」は、電気活動を測定するのに十分な数の電極を有するウェルを意味する）を分析に含めた。絶対パラメータ分布を正規性について試験し、群間の統計的有意差を一方向ＡＮＯＶＡにより評価した。
【０１８４】
図８に、下記カテゴリー：振動挙動及び同期性からのいくつかの代表的なパラメータを示す。これらのパラメータにより、電気刺激下でのＭＰＰ＋誘発機能的効果及び電気刺激下での本発明のナノ粒子により可能となる予防／救済効力（すなわち、「対照」群の効果と同様のレベルまで機能的効果を予防／救済する能力）が特徴付けられる。
【０１８５】
化合物の効果を評価するために、２０４個のパラメータの選択のマルチパラメトリック結果を「効果スコア」と呼ばれる単一パラメータに表現した。これは、選択された特徴の線形結合であり、データセットを「０」の平均値で電場に曝された「対照」群と、「１」の平均値で電場に曝された「ＭＰＰ＋」群とを有するベクトルに変換する。効果スコアのＺ因子の計算は、「対照」群と「ＭＰＰ＋」群との間の最良の区別を見出すように測定され、最適化された２０４個のパラメータのうち１８個の特徴選択を通して行った（Kummel A, et al. J Biomol Screen., 2010, 15(1),95-101: Integration of multiple readouts into the z' factor for assay quality assessment）。効果スコア分析を図９に示す。
【０１８６】
電気刺激に曝された本発明のナノ粒子の予防／救済効力を表４に示す。
【０１８７】
【表４】
2020503306.tif 000005
【０１８８】
ＤＢＳによるパーキンソン病症状の処置は、２００２年からＦＤＡにより承認されている。本明細書に記載されたナノ粒子と組み合わせて、本発明の文脈において使用可能な最も一般的に使用される刺激パラメータは、周波数１３０〜１８５Hz、パルス幅６０〜２１０μs及び電圧振幅１〜３．５Vである。本明細書に記載された実験では、刺激をニューロンネットワーク共培養物に３０分間行った。刺激＝１０の二相パルス（パルス持続時間＝１００μs）、パルス振幅＝＋／−５００mV、パルス周波数＝２０Hz及びパルス列期間＝０．２Hz。
【０１８９】
図１２、１３及び表４は、本発明のナノ粒子によるニューロンネットワークの前処理及び電場への曝露により、電場下において、ニューロンネットワークにおけるＭＰＰ＋誘発機能的効果が予防／救済されることを示す。興味深いことに、予防／救助効力は、振動挙動及び同期性に関連するカテゴリーのパラメータについて観察され、「対照」群で観察されるレベルまで達することができる。これらの振動挙動及び同期化のパラメータを、典型的には、変更されたネットワーク発達の尺度としてモニタリングする。これらのパラメータを、有利には、電気刺激に曝された本発明のナノ粒子の存在下で救済することができる。
【０１９０】
これらの結果から、電場に曝された場合、電場下において、ニューロンネットワークにおけるＭＰＰ＋誘発機能的効果を救済する際の、本願に記載されたナノ粒子の有利な性能が強調される。
【０１９１】
実施例８．表現型ＭＥＡスクリーニング技術を使用する、初代マウスニューロンネットワークにおけるアミロイドベータ１−４２誘発機能的効果における、電気刺激に曝された実施例２、３、４及び５からのナノ粒子の効果の評価
電気刺激に曝された本発明のナノ粒子の救済効力を、マウスニューロンの前頭皮質培養物におけるアルツハイマー病のアミロイドベータ１−４２（Ａベータ１−４２）誘発モデルにおいて、ＭＥＡを介してインビトロで試験した。
【０１９２】
アルツハイマー関連機能表現型を誘発するために、合成ＨＦＩＰ（ヘキサフルオロイソプロパノール）処理Ａベータ１−４２ペプチド（ＨＦＩＰ処理によりアミロイドベータのモノマーが生成される）を亜毒性用量（１００nM）で使用する。高レベルのアミロイドベータ（Ａベータ）により、グルタミン酸作動性シナプス伝達が低下し、シナプス損失が引き起こされる（Palop et al., Nat Neurosci., 2010, 13(7), 812-818: Amyloid-beta induced neuronal dysfunction in Alzheimer’s disease: from synapses toward neural networks; Hsia et al., Proc.Natl. Acad. Sci., 1999, 96, 3228-3233: Plaque-independent disruption of neural circuits in Alzheimer’s disease mouse models）。Ａベータの産生及び細胞外空間へのその分泌は、インビトロ及びインビボにおいて、ニューロン活動により厳密にレギュレーションされる。ニューロン活動の向上により、Ａベータ産生が増強され、そしてニューロン活動の遮断は、反対の効果を有する。Ａベータのこのシナプスレギュレーションは、少なくとも部分的に、シナプス前末端における表面アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のクラスリン依存性エンドサイトーシス、ＡＰＰのエンドソームタンパク質分解性開裂及びシナプス末端におけるＡベータ放出により媒介される（Cirrito et al., Neuron, 2005, 48, 913-922: Synaptic activity regulates interstitial fluid amyloid-beta levels in vivo）。
【０１９３】
材料及び方法
初代細胞培養
前頭皮質組織を胚性１５／１６日目のｃｈｒ：ＮＭＲＩマウス（Charles River）から採取した。マウスを頸椎脱臼により殺処分した。組織を酵素消化（１３３，３Kunitz単位/ml ＤＮａｓｅ；１０単位/ml Ｐａｐａｉｎ）及び機械的粉砕により分離し、計数し、生命力を制御し、ラミニン（１０μg/ml）、１０％ ウシ胎児血清及び１０％ ウマ血清を含有するＤＭＥＭの２０μl滴中において、ＭＥＡ上に播種した。ＭＥＡ上での培養物を使用の準備ができるまで、１０％ ＣＯ２雰囲気中、３７℃でインキュベーションした。１０％ ウマ血清を含有するＤＭＥＭを培養培地に週２回補充した。発生中の共培養物を播種後５日目に有糸分裂阻害剤である５−フルオロ−２’−デオキシウリジン（２５μM）及びウリジン（６３μM）により処理して、更なるグリア増殖を防止した。
【０１９４】
「ナノ粒子」群において、まず、ウェルをＡベータ１−４２（合成ＨＦＩＰ処理アミロイド−ベータ１−４２ペプチド）により、Ｔ０（Ｔ０は、２８日間のインビトロ培養期間の最後である）で処理した。ついで、ウェルを実施例２、３、４及び５からのナノ粒子懸濁液（各懸濁液は、濃度８００μMである）により、独立及び平行実験において、Ｔ０＋４時間で処理した。「対照」群では、Ｔ０、ついで、Ｔ０＋４時間で、水をウェルに加えた。「Ａベータ」群では、Ａベータ１−４２をウェルにＴ０で加え、ついで、水をウェルにＴ０＋４時間で加えた。
【０１９５】
ニューロン活動を下記のように記録した：
−Ｔ０、Ａベータ１−４２（又は「対照」群においては水）の添加前において
−Ｔ０＋１ｈ、Ｔ０＋２ｈ、Ｔ０＋３ｈ、Ｔ０＋４ｈ（＜＜ナノ粒子＞＞群ではナノ粒子、又は対照群では「水」の添加前）、Ｔ０＋５ｈ及びＴ０＋６ｈにおいて。
【０１９６】
値を活動の３０分安定化後の３０分の期間から得られた６０秒のビンデータから得た。
【０１９７】
Ｔ０＋６ｈでの記録後に、全てのウェルを電気刺激により能動的にスパイクする電極の１つで活性化した。刺激を３０分間行った（４８ウェルのＭＥＡにおいてウェルあたりに１つの電極の刺激、最小刺激持続時間＝１００μs、パルス後２msのアーチファクト除去、パルス１０×二相性＋／−５００mV）。非刺激電極の応答を平均化し、刺激前活動に対して正規化した（図１０）。
【０１９８】
微小電極アレイニューロチップ
４８ウェルの微小電極アレイニューロチップをAxion Biosystems Inc.から購入した。これらのチップは、ウェルあたりに１６個の受動電極を有する。表面をポリエチレンイミン（ＰＥＩ、ホウ酸バッファー中の５０％）により１時間コーティングし、洗浄し、風乾した。
【０１９９】
マルチチャネル記録及びマルチパラメトリックデータ分析
記録には、Axion Biosystems（USA）からのマルチチャネルMAESTRO記録システムを使用した。細胞外記録には、４８ウェルのＭＥＡをMAESTRO記録ステーションに入れ、３７℃に維持した。記録をＤＭＥＭ／１０％ 熱不活化ウマ血清中で行った。１０％ＣＯ２を含むろ過され、加湿された気流の継続的な流れにより、ｐＨを７．４に維持した。活動電位又は「スパイク」をスパイク列で記録し、いわゆる「バースト」にクラスタリングした。バーストを、プログラムSpike Wrangler及びNPWaveX（両方ともNeuroProof GmbH, Rostock, Germany）を使用する直接スパイク列分析により定量的に記述した。バーストを短いスパイク事象の開始及び終了により定義した。
【０２００】
ネットワーク活動パターンのマルチパラメトリック高含量分析により、２０４個の活動記述スパイク列パラメータを抽出した。これらのパラメータにより、以下の４つのカテゴリー：全体的な活動、バースト構造、振動挙動及び同期性における活動変化の正確な記述を得ることが可能となる。
【０２０１】
電気刺激に曝されたニューロンネットワークにおけるアミロイドベータ１−４２の機能的効果、及び電気刺激に曝された本発明のナノ粒子によるニューロンネットワークの機能的効果の救済効力を、上記パラメータを通して評価した（また、それらのいくつかについては、以下の表５に要約する）。
【０２０２】
【表５】
2020503306.tif 000006
【０２０３】
刺激下でのネットワーク活動を各実験について１００％に設定した関連する自発的なネイティブ活動（Ｔ０＋６時間での記録）に正規化した。自発的なネイティブ活動に関連する値を活動の３０分安定化後の３０分の期間から得られた６０秒のビンデータから得た。結果（パラメータ値）を独立したネットワークの平均±ＳＥＭとして表わした。各「ナノ粒子」群については、少なくとも９個のアクティブウェル、「対照」群については、少なくとも１８個のアクティブウェル、「Ａベータ」群については、少なくとも１８個のアクティブウェル（「アクティブ」は、電気活動を測定するのに十分な数の電極を有するウェルを意味する）を分析に含めた。絶対パラメータ分布を正規性について試験し、群間の統計的有意差を一方向ＡＮＯＶＡにより評価した。
【０２０４】
図１１に、下記カテゴリー：全体的な活動、バースト構造、振動挙動及び同期性からのいくつかの代表的なパラメータを示す。
【０２０５】
これらのパラメータにより、電気刺激下でのＡベータ１−４２誘発機能的効果及び電気刺激下での本発明のナノ粒子により可能となる救済効力（すなわち、「対照」群の効果と同様のレベルまで機能的効果を予防／救済する能力）が特徴付けられる。
【０２０６】
化合物の効果を評価するために、２０４個のパラメータの選択のマルチパラメトリック結果を「効果スコア」と呼ばれる単一パラメータに表現した。これは、選択された特徴の線形結合であり、データセットを「０」の平均値で電場に曝された「対照」群と、「１」の平均値で電場に曝された「Ａベータ」群とを有するベクトルに変換する。効果スコアのＺ因子の計算は、「対照」群と「Ａベータ」群との間の最良の区別を見出すように測定され、最適化された２０４個のパラメータのうち１５個の特徴選択を通して行った（Kummel A, et al. J Biomol Screen., 2010, 15(1),95-10: Integration of multiple readouts into the z' factor for assay quality assessment）。効果スコア分析を図１２に示す。
【０２０７】
電気刺激に曝された本発明のナノ粒子の救済効力を表６に示す。
【０２０８】
【表６】
2020503306.tif 000007
【０２０９】
アルツハイマー病の処置のためのＤＢＳの可能性を評価するために、臨床研究が進行中である。本明細書に記載されたナノ粒子と組み合わせて、本発明の文脈において典型的に使用可能な刺激パラメータは、周波数１３０Hz、パルス幅６０又は９０μs及び振幅電圧３〜５Vである。本明細書に記載された実験では、刺激をニューロンネットワーク共培養物に３０分間行った。刺激＝１０の二相パルス、最小パルス持続時間＝１００μs、パルス振幅＝＋／−５００mV、パルス周波数＝２０Hz及びパルス列期間＝０．２Hz。
【０２１０】
図１１及び１２並びに表６は、本発明のナノ粒子によるニューロンネットワークの処理により、電場に曝露された場合、電場下でのニューロンネットワークのＡベータ１−４２誘発機能的効果が救済されることを示す。興味深いことに、救済効力は、振動挙動及び同期性に関連するカテゴリーのパラメータについて観察され、「対照」群で観察されるレベルまで達することができる。
【０２１１】
これらの振動挙動及び同期化のパラメータを、典型的には、変更されたネットワーク発達の尺度としてモニタリングする。これらのパラメータを、有利には、電気刺激に曝された本発明のナノ粒子の存在下で救済することができる。
【０２１２】
これらの結果から、電場に曝された場合、電場下において、ニューロンネットワークにおけるＡベータ１−４２誘発機能的効果を救済する際の、本願に記載されたナノ粒子の有利な性能が強調される。
【図１】
2020503306.tif 000008
【図２】
2020503306.tif 000009
【図３】
2020503306.tif 000010
【図４】
2020503306.tif 000011
【図５】
2020503306.tif 000012
【図６】
2020503306.tif 000013
【図７】
2020503306.tif 000014
【図８】
2020503306.tif 000015
【図９】
2020503306.tif 000016
【図１０】
2020503306.tif 000017
【図１１】
2020503306.tif 000018
【図１２】
2020503306.tif 000019
【国際調査報告】
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