(57)【要約】  本発明は、黒色腫を検出するための方法、黒色腫が安定であるか又は進行性であるか否かを決定するための方法、黒色腫を有する対象における手術切除の程度を評価するための方法、及び療法に対する黒色腫を有する対象による反応を決定するための方法を対象とする。
2020524524.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
黒色腫の検出を必要とする対象の黒色腫を検出する方法であって、テストサンプルを少なくとも２９個のバイオマーカーの発現を検出するために特異的な複数の薬剤と接触させることにより、前記対象からのテストサンプルから前記少なくとも２９個のバイオマーカーの発現レベルを決定し、ここで、前記少なくとも２９個のバイオマーカーは、ＡＴＬ１、ＡＴＰ６Ｖ０Ｄ、Ｃ１ＯＲＦ２１、ＣＦＬＡＲ、ＣＦＬＡＲ−ＡＳ１、ＣＨＰ１、ＤＤＸ５５、ＤＭＤ、ＤＮＡＪＣ９、ＥＮＯＳＦ１、ＦＡＮＣＬ、ＨＪＵＲＰ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＮＲＮＰＡ３Ｐ１、ＩＬ２３Ａ、ＩＱＧＡＰ１、ＬＯＣ４９４１２７、ＬＯＣ６４６４７１、ＬＯＨ１２ＣＲ、ＰＢＸＩＰ１、ＲＮＦ５、ＳＥＲＴＡＤ２、ＳＬＣ３５Ｇ５、ＳＰＡＴＳ２Ｌ、ＴＤＲＤ７、ＴＸＫ、ＹＹ２、及び少なくとも１つのハウスキーピング遺伝子を含み；
ＡＴＬ１、ＡＴＰ６Ｖ０Ｄ、Ｃ１ＯＲＦ２１、ＣＦＬＡＲ、ＣＦＬＡＲ−ＡＳ１、ＣＨＰ１、ＤＤＸ５５、ＤＭＤ、ＤＮＡＪＣ９、ＥＮＯＳＦ１、ＦＡＮＣＬ、ＨＪＵＲＰ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＮＲＮＰＡ３Ｐ１、ＩＬ２３Ａ、ＩＱＧＡＰ１、ＬＯＣ４９４１２７、ＬＯＣ６４６４７１、ＬＯＨ１２ＣＲ、ＰＢＸＩＰ１、ＲＮＦ５、ＳＥＲＴＡＤ２、ＳＬＣ３５Ｇ５、ＳＰＡＴＳ２Ｌ、ＴＤＲＤ７、ＴＸＫ、及びＹＹ２のそれぞれの発現レベルを少なくとも１つのハウスキーピング遺伝子に対し正規化し、それによって、ＡＴＬ１、ＡＴＰ６Ｖ０Ｄ、Ｃ１ＯＲＦ２１、ＣＦＬＡＲ、ＣＦＬＡＲ−ＡＳ１、ＣＨＰ１、ＤＤＸ５５、ＤＭＤ、ＤＮＡＪＣ９、ＥＮＯＳＦ１、ＦＡＮＣＬ、ＨＪＵＲＰ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＮＲＮＰＡ３Ｐ１、ＩＬ２３Ａ、ＩＱＧＡＰ１、ＬＯＣ４９４１２７、ＬＯＣ６４６４７１、ＬＯＨ１２ＣＲ、ＰＢＸＩＰ１、ＲＮＦ５、ＳＥＲＴＡＤ２、ＳＬＣ３５Ｇ５、ＳＰＡＴＳ２Ｌ、ＴＤＲＤ７、ＴＸＫ、及びＹＹ２のそれぞれの正規化された発現レベルを取得し；
正規化されたそれぞれの発現レベルをアルゴリズムに入力してスコアを生成し；
前記スコアを第１の所定のカットオフ値と比較し； 及び
レポートを作成し、ここで、前記レポートは、前記スコアが、前記第１の所定のカットオフ値以上の場合、前記対象における黒色腫の存在を識別し、又は前記スコアが前記第１の所定のカットオフ値未満の場合、前記対象の黒色腫の非存在を識別し、ここで、前記第１の所定のカットオフ値は、０〜１００のスケールで２０である、を含む方法。
【請求項２】
前記少なくとも１つのハウスキーピング遺伝子が、ＡＬＧ９、ＳＥＰＮ、ＹＷＨＡＱ、ＶＰＳ３７Ａ、ＰＲＲＣ２Ｂ、ＤＯＰＥＹ２、ＮＤＵＦＢ１１、ＮＤ４、ＭＲＰＬ１９、ＰＳＭＣ４、ＳＦ３Ａ１、ＰＵＭ１、ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤ、ＧＵＳＢ、ＲＰＬＰ０、ＴＦＲＣ、ＭＯＲＦ４Ｌ１、１８Ｓ、ＰＰＩＡ、ＰＧＫ１、ＲＰＬ１３Ａ、Ｂ２Ｍ、ＹＷＨＡＺ、ＳＤＨＡ、ＨＰＲＴ１、ＴＯＸ４、及びＴＰＴ１からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１つのハウスキーピング遺伝子が、ＴＯＸ４及びＴＰＴ１を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記正規化された発現レベルが、
ＡＴＬ１、ＡＴＰ６Ｖ０Ｄ、Ｃ１ＯＲＦ２１、ＣＦＬＡＲ、ＣＦＬＡＲ−ＡＳ１、ＣＨＰ１、ＤＤＸ５５、ＤＭＤ、ＤＮＡＪＣ９、ＥＮＯＳＦ１、ＦＡＮＣＬ、ＨＪＵＲＰ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＮＲＮＰＡ３Ｐ１、ＩＬ２３Ａ、ＩＱＧＡＰ１、ＬＯＣ４９４１２７、ＬＯＣ６４６４７１、ＬＯＨ１２ＣＲ、ＰＢＸＩＰ１、ＲＮＦ５、ＳＥＲＴＡＤ２、ＳＬＣ３５Ｇ５、ＳＰＡＴＳ２Ｌ、ＴＤＲＤ７、ＴＸＫ、及びＹＹ２のそれぞれの発現レベルをＴＯＸ４の発現レベルに対し正規化し、それによって、ＡＴＬ１、ＡＴＰ６Ｖ０Ｄ、Ｃ１ＯＲＦ２１、ＣＦＬＡＲ、ＣＦＬＡＲ−ＡＳ１、ＣＨＰ１、ＤＤＸ５５、ＤＭＤ、ＤＮＡＪＣ９、ＥＮＯＳＦ１、ＦＡＮＣＬ、ＨＪＵＲＰ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＮＲＮＰＡ３Ｐ１、ＩＬ２３Ａ、ＩＱＧＡＰ１、ＬＯＣ４９４１２７、ＬＯＣ６４６４７１、ＬＯＨ１２ＣＲ、ＰＢＸＩＰ１、ＲＮＦ５、ＳＥＲＴＡＤ２、ＳＬＣ３５Ｇ５、ＳＰＡＴＳ２Ｌ、ＴＤＲＤ７、ＴＸＫ、及びＹＹ２のそれぞれの第１の正規化された発現レベルを取得し；
ＡＴＬ１、ＡＴＰ６Ｖ０Ｄ、Ｃ１ＯＲＦ２１、ＣＦＬＡＲ、ＣＦＬＡＲ−ＡＳ１、ＣＨＰ１、ＤＤＸ５５、ＤＭＤ、ＤＮＡＪＣ９、ＥＮＯＳＦ１、ＦＡＮＣＬ、ＨＪＵＲＰ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＮＲＮＰＡ３Ｐ１、ＩＬ２３Ａ、ＩＱＧＡＰ１、ＬＯＣ４９４１２７、ＬＯＣ６４６４７１、ＬＯＨ１２ＣＲ、ＰＢＸＩＰ１、ＲＮＦ５、ＳＥＲＴＡＤ２、ＳＬＣ３５Ｇ５、ＳＰＡＴＳ２Ｌ、ＴＤＲＤ７、ＴＸＫ、及びＹＹ２のそれぞれの発現レベルをＴＰＴ１の発現レベルに対し正規化し、それによって、ＡＴＬ１、ＡＴＰ６Ｖ０Ｄ、Ｃ１ＯＲＦ２１、ＣＦＬＡＲ、ＣＦＬＡＲ−ＡＳ１、ＣＨＰ１、ＤＤＸ５５、ＤＭＤ、ＤＮＡＪＣ９、ＥＮＯＳＦ１、ＦＡＮＣＬ、ＨＪＵＲＰ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＮＲＮＰＡ３Ｐ１、ＩＬ２３Ａ、ＩＱＧＡＰ１、ＬＯＣ４９４１２７、ＬＯＣ６４６４７１、ＬＯＨ１２ＣＲ、ＰＢＸＩＰ１、ＲＮＦ５、ＳＥＲＴＡＤ２、ＳＬＣ３５Ｇ５、ＳＰＡＴＳ２Ｌ、ＴＤＲＤ７、ＴＸＫ、及びＹＹ２のそれぞれの第２の正規化された発現レベルを取得し；
前記第１の正規化された発現レベル及び前記第２の正規化された発現レベルを平均し、正規化された発現レベルを取得する、
ことによって取得される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
９０％超の感度を有する、請求項１〜４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
９０％超の特異度を有する、請求項１〜５の何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
黒色腫が進行性である、請求項１〜６の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも２９個のバイオマーカーの少なくとも１つが、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、又はタンパク質である、請求項１〜７の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記バイオマーカーが、ＲＮＡである場合、そのＲＮＡが逆転写されてｃＤＮＡが生成され、その生成されたｃＤＮＡ発現レベルが検出される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記バイオマーカーの発現レベルが、前記バイオマーカーと標識プローブ又はプライマーとの間で複合体を形成することによって検出される、請求項１〜９の何れか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記バイオマーカーがタンパク質である場合、前記タンパク質が、前記タンパク質と標識抗体との間で複合体を形成することによって検出される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記標識が、蛍光標識である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記バイオマーカーが、ＲＮＡ又はｃＤＮＡである場合、前記ＲＮＡ又はｃＤＮＡが、前記ＲＮＡ又はｃＤＮＡと標識核酸プローブ又はプライマーとの間で複合体を形成することによって検出される、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記標識が、蛍光標識である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＲＮＡ又はｃＤＮＡと前記標識核酸プローブ又はプライマーとの間の前記複合体が、ハイブリダイゼーション複合体である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記テストサンプルが、血液、血清、血漿、又は腫瘍性組織である、請求項１〜１５の何れか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１の所定のカットオフ値が、腫瘍性疾患のない対象から得られた複数の参照サンプルから得られる、請求項１〜１６の何れか１項に記載の方法。
【請求項１８】
参照サンプルのそれぞれが、血液、血清、血漿、又は非腫瘍性組織である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
黒色腫を有すると識別された前記対象を手術又は薬物療法で治療することをさらに含む、請求項１〜１８の何れか１項に記載の方法。
【請求項２０】
それを必要とする対象が、黒色腫を有すると診断された対象、少なくとも１つの黒色腫症状を有する対象、又は黒色腫を発症する素因又は家族歴を有する対象である、請求項１〜１９の何れか１項に記載の方法。
【請求項２１】
対象がヒトである、請求項１〜２０の何れか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記アルゴリズムが、ＸＧＢ、ＲＦ、ｇｌｍｎｅｔ、ｃｆｏｒｅｓｔ、ＣＡＲＴ、ｔｒｅｅｂａｇ、ｋｎｎ、ｎｎｅｔ、ＳＶＭ−ラジアル、ＳＶＭ−リニア、ＮＢ、ＮＮＥＴ、又はｍｌｐである、請求項１〜２１の何れか１項に記載の方法。
【請求項２３】
対象の黒色腫が、安定であるか又は進行性であるか否かを決定するための方法であって、
テストサンプルを、少なくとも２９個のバイオマーカーの発現を検出するために特異的な複数の薬剤と接触させることにより、前記対象からのテストサンプルから前記少なくとも２９個のバイオマーカーの発現レベルを決定し、ここで、前記少なくとも２９個のバイオマーカーは、ＡＴＬ１、ＡＴＰ６Ｖ０Ｄ、Ｃ１ＯＲＦ２１、ＣＦＬＡＲ、ＣＦＬＡＲ−ＡＳ１、ＣＨＰ１、ＤＤＸ５５、ＤＭＤ、ＤＮＡＪＣ９、ＥＮＯＳＦ１、ＦＡＮＣＬ、ＨＪＵＲＰ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＮＲＮＰＡ３Ｐ１、ＩＬ２３Ａ、ＩＱＧＡＰ１、ＬＯＣ４９４１２７、ＬＯＣ６４６４７１、ＬＯＨ１２ＣＲ、ＰＢＸＩＰ１、ＲＮＦ５、ＳＥＲＴＡＤ２、ＳＬＣ３５Ｇ５、ＳＰＡＴＳ２Ｌ、ＴＤＲＤ７、ＴＸＫ、ＹＹ２、及び少なくとも１つのハウスキーピング遺伝子を含み；
ＡＴＬ１、ＡＴＰ６Ｖ０Ｄ、Ｃ１ＯＲＦ２１、ＣＦＬＡＲ、ＣＦＬＡＲ−ＡＳ１、ＣＨＰ１、ＤＤＸ５５、ＤＭＤ、ＤＮＡＪＣ９、ＥＮＯＳＦ１、ＦＡＮＣＬ、ＨＪＵＲＰ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＮＲＮＰＡ３Ｐ１、ＩＬ２３Ａ、ＩＱＧＡＰ１、ＬＯＣ４９４１２７、ＬＯＣ６４６４７１、ＬＯＨ１２ＣＲ、ＰＢＸＩＰ１、ＲＮＦ５、ＳＥＲＴＡＤ２、ＳＬＣ３５Ｇ５、ＳＰＡＴＳ２Ｌ、ＴＤＲＤ７、ＴＸＫ、及びＹＹ２のそれぞれの発現レベルを前記少なくとも１つのハウスキーピング遺伝子に対して正規化し、それによって、ＡＴＬ１、ＡＴＰ６Ｖ０Ｄ、Ｃ１ＯＲＦ２１、ＣＦＬＡＲ、ＣＦＬＡＲ−ＡＳ１、ＣＨＰ１、ＤＤＸ５５、ＤＭＤ、ＤＮＡＪＣ９、ＥＮＯＳＦ１、ＦＡＮＣＬ、ＨＪＵＲＰ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＮＲＮＰＡ３Ｐ１、ＩＬ２３Ａ、ＩＱＧＡＰ１、ＬＯＣ４９４１２７、ＬＯＣ６４６４７１、ＬＯＨ１２ＣＲ、ＰＢＸＩＰ１、ＲＮＦ５、ＳＥＲＴＡＤ２、ＳＬＣ３５Ｇ５、ＳＰＡＴＳ２Ｌ、ＴＤＲＤ７、ＴＸＫ、及びＹＹ２のそれぞれの正規化された発現レベルを取得し；
正規化されたそれぞれの発現レベルをアルゴリズムに入力し、スコアを生成し；
前記スコアを第２の所定のカットオフ値と比較し； 及び
レポートを作成し、ここで、前記レポートは、前記正規化された発現レベルが、前記第２の所定のカットオフ値以上の場合、黒色腫が進行性であることを識別し、又は前記正規化された発現レベルが、前記第２の所定のカットオフ値未満の場合、黒色腫が安定であることを識別し、ここで、前記第２の所定のカットオフ値は、０〜１００のスケールで５０である、
方法。
【請求項２４】
前記少なくとも１つのハウスキーピング遺伝子が、ＡＬＧ９、ＳＥＰＮ、ＹＷＨＡＱ、ＶＰＳ３７Ａ、ＰＲＲＣ２Ｂ、ＤＯＰＥＹ２、ＮＤＵＦＢ１１、ＮＤ４、ＭＲＰＬ１９、ＰＳＭＣ４、ＳＦ３Ａ１、ＰＵＭ１、ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤ、ＧＵＳＢ、ＲＰＬＰ０、ＴＦＲＣ、ＭＯＲＦ４Ｌ１、１８Ｓ、ＰＰＩＡ、ＰＧＫ１、ＲＰＬ１３Ａ、Ｂ２Ｍ、ＹＷＨＡＺ、ＳＤＨＡ、ＨＰＲＴ１、ＴＯＸ４、及びＴＰＴ１からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記少なくとも１つのハウスキーピング遺伝子が、ＴＯＸ４及びＴＰＴ１を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
黒色腫を有する対象の外科的切除の程度を評価する方法であって、
テストサンプルを少なくとも２９個のバイオマーカーの発現を検出するために特異的な複数の薬剤と接触させることにより、前記外科的切除後の対象のテストサンプルから前記少なくとも２９個のバイオマーカーの発現レベルを決定し、ここで、前記少なくとも２９個のバイオマーカーは、ＡＴＬ１、ＡＴＰ６Ｖ０Ｄ、Ｃ１ＯＲＦ２１、ＣＦＬＡＲ、ＣＦＬＡＲ−ＡＳ１、ＣＨＰ１、ＤＤＸ５５、ＤＭＤ、ＤＮＡＪＣ９、ＥＮＯＳＦ１、ＦＡＮＣＬ、ＨＪＵＲＰ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＮＲＮＰＡ３Ｐ１、ＩＬ２３Ａ、ＩＱＧＡＰ１、ＬＯＣ４９４１２７、ＬＯＣ６４６４７１、ＬＯＨ１２ＣＲ、ＰＢＸＩＰ１、ＲＮＦ５、ＳＥＲＴＡＤ２、ＳＬＣ３５Ｇ５、ＳＰＡＴＳ２Ｌ、ＴＤＲＤ７、ＴＸＫ、ＹＹ２、及び少なくとも１つのハウスキーピング遺伝子を含み；
ＡＴＬ１、ＡＴＰ６Ｖ０Ｄ、Ｃ１ＯＲＦ２１、ＣＦＬＡＲ、ＣＦＬＡＲ−ＡＳ１、ＣＨＰ１、ＤＤＸ５５、ＤＭＤ、ＤＮＡＪＣ９、ＥＮＯＳＦ１、ＦＡＮＣＬ、ＨＪＵＲＰ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＮＲＮＰＡ３Ｐ１、ＩＬ２３Ａ、ＩＱＧＡＰ１、ＬＯＣ４９４１２７、ＬＯＣ６４６４７１、ＬＯＨ１２ＣＲ、ＰＢＸＩＰ１、ＲＮＦ５、ＳＥＲＴＡＤ２、ＳＬＣ３５Ｇ５、ＳＰＡＴＳ２Ｌ、ＴＤＲＤ７、ＴＸＫ、及びＹＹ２のそれぞれの前記発現レベルを前記少なくとも１つのハウスキーピング遺伝子に対し正規化し、それによって、ＡＴＬ１、ＡＴＰ６Ｖ０Ｄ、Ｃ１ＯＲＦ２１、ＣＦＬＡＲ、ＣＦＬＡＲ−ＡＳ１、ＣＨＰ１、ＤＤＸ５５、ＤＭＤ、ＤＮＡＪＣ９、ＥＮＯＳＦ１、ＦＡＮＣＬ、ＨＪＵＲＰ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＮＲＮＰＡ３Ｐ１、ＩＬ２３Ａ、ＩＱＧＡＰ１、ＬＯＣ４９４１２７、ＬＯＣ６４６４７１、ＬＯＨ１２ＣＲ、ＰＢＸＩＰ１、ＲＮＦ５、ＳＥＲＴＡＤ２、ＳＬＣ３５Ｇ５、ＳＰＡＴＳ２Ｌ、ＴＤＲＤ７、ＴＸＫ、及びＹＹ２のそれぞれの正規化された発現レベルを取得し；
正規化されたそれぞれの発現レベルをアルゴリズムに入力し、スコアを生成し；
前記スコアを第３の所定のカットオフ値と比較し； 及び
レポートを作成し、ここで、前記レポートは、前記正規化された発現レベルが、前記第３の所定のカットオフ値以上の場合、前記外科的切除により黒色腫全体が除去されていないことを識別し、又は前記正規化された発現レベルが、前記第３の所定のカットオフ値未満の場合、前記外科的切除により黒色腫全体が除去されていることを識別し、ここで、前記第３の所定のカットオフ値は、０〜１００のスケールで２０である、
方法。
【請求項２７】
前記レポートが、前記正規化された発現レベルが、前記第３の所定のカットオフ値以上の場合、黒色腫の再発のリスクが高いことを識別し、又は前記正規化された発現レベルが、前記第３の所定のカットオフ値未満の場合、黒色腫の再発のリスクが低いことを識別する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記少なくとも１つのハウスキーピング遺伝子が、ＡＬＧ９、ＳＥＰＮ、ＹＷＨＡＱ、ＶＰＳ３７Ａ、ＰＲＲＣ２Ｂ、ＤＯＰＥＹ２、ＮＤＵＦＢ１１、ＮＤ４、ＭＲＰＬ１９、ＰＳＭＣ４、ＳＦ３Ａ１、ＰＵＭ１、ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤ、ＧＵＳＢ、ＲＰＬＰ０、ＴＦＲＣ、ＭＯＲＦ４Ｌ１、１８Ｓ、ＰＰＩＡ、ＰＧＫ１、ＲＰＬ１３Ａ、Ｂ２Ｍ、ＹＷＨＡＺ、ＳＤＨＡ、ＨＰＲＴ１、ＴＯＸ４、及びＴＰＴ１からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記少なくとも１つのハウスキーピング遺伝子が、ＴＯＸ４及びＴＰＴ１を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
療法に対する黒色腫を有する対象による反応を決定する方法であって、第１のテストサンプルを少なくとも２８個のバイオマーカーの発現を検出するために特異的な複数の薬剤と接触させることにより、第１の時点で前記対象からの第１のテストサンプルから前記少なくとも２８個のバイオマーカーの第１の発現レベルを決定し、ここで、前記２８個のバイオマーカーは、ＡＴＬ１、ＡＴＰ６Ｖ０Ｄ、Ｃ１ＯＲＦ２１、ＣＦＬＡＲ、ＣＦＬＡＲ−ＡＳ１、ＣＨＰ１、ＤＤＸ５５、ＤＭＤ、ＤＮＡＪＣ９、ＥＮＯＳＦ１、ＦＡＮＣＬ、ＨＪＵＲＰ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＮＲＮＰＡ３Ｐ１、ＩＬ２３Ａ、ＩＱＧＡＰ１、ＬＯＣ４９４１２７、ＬＯＣ６４６４７１、ＬＯＨ１２ＣＲ、ＰＢＸＩＰ１、ＲＮＦ５、ＳＥＲＴＡＤ２、ＳＬＣ３５Ｇ５、ＳＰＡＴＳ２Ｌ、ＴＤＲＤ７、ＴＸＫ、及びＹＹ２を含み；
第２のテストサンプルを前記少なくとも２８個のバイオマーカーの発現を検出するために特異的な複数の薬剤と接触させることにより、第２の時点で前記対象からの第２のテストサンプルから前記少なくとも２８個のバイオマーカーの第２の発現レベルを決定し、ここで、前記第２の時点は、前記第１の時点の後及び前記対象への療法の実施後であり；
前記第１の発現レベルを前記第２の発現レベルと比較し； 及び
レポートを作成し、ここで、前記レポートは、前記第２の発現レベルが、前記第１の発現レベルと比較して有意に減少した場合、前記対象が療法に反応することを識別する、
方法。
【請求項３１】
前記第１の時点が、前記対象への前記療法の実施前である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記第１の時点が、前記対象への前記療法の実施後である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記療法が、免疫療法を含む、請求項３０〜３２の何れか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記療法が、標的療法を含む、請求項３０〜３２の何れか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記標的療法が、ＢＲＡＦ阻害剤を含む、請求項３４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１７年５月２５日に出願された米国仮出願第６２／５１１，０５８号の利益及び優先権を主張し、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表の参照による組み込み
２０１８年５月１２日に作成されたサイズが２６５ｋＢの「ＬＢＩＯ−００１＿００１ＷＯ ＳＥＱ ＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔ」という名称のテキストファイルの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００３】
発明の分野
本発明は、黒色腫の検出に関する。
【背景技術】
【０００４】
黒色腫は一般的であり（米国にて、〜２４〜３５／１００，０００の発生率）、非常に侵攻性の高い皮膚癌であり、発生率は上昇し続けている。最も一般的な皮膚黒色腫は、紫外線曝露と免疫調節不全に関連する。群として、黒色腫は、最も高い遺伝子変異量（ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｂｕｒｄｅｎ）（１０突然変異／Ｍｂ）を有することが知られる。主要な突然変異には、ＢＲＡＦ（〜５０％）、Ｎ−Ｒａｓ（〜２０％）及びＮＦ−１（〜５％）が含まれ、これらを合わせて全ての突然変異の７５％を占める。黒色腫は、腫瘍がこの経路のタンパク質をコードする遺伝子に突然変異を示すか否かに関係なく、ＭＡＰＫ経路の活性化に依存する。これは、この腫瘍における標的療法、例えばＢＲＡＦ ｖ６００Ｅ剤の理論的証拠を提供する。他の機能獲得及び機能喪失突然変異、例えば、ＲＡＳｏｐａｔｈｙ遺伝子及びサイクリンＤ１／ｃｄｋ４の増幅及び／又は腫瘍抑制因子ＰＴＥＮの突然変異／喪失も腫瘍を特徴づける。これにより、黒色腫は、最も侵襲的で治療抵抗性の高い癌の１つとなる。
【０００５】
５年生存率は、ステージＩに関して９５〜１００％、ステージＩＩに関して６５〜９３％、ステージＩＩＩ及びＩＶに関して、それぞれ、４１〜７１％及び９〜２８％の範囲である。手術、免疫療法、及び標的療法は、化学療法及び放射線を補助とする特殊治療の基礎を提供する。しかし、手術は、黒色腫のケア（診断、治療、緩和）において重要な役割を果たす。センチネルリンパ節生検は、予後の情報を得るために広く普及している。しかしながら、黒色腫は、臨床的に非侵襲的、例えば、疾患活動の血液ベースのバイオマーカーがなく、予測情報又は予後情報を得ることにより、患者の特殊治療の助けとなる。
【０００６】
血液ベースの因子は、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、循環腫瘍（ｃｔ）ＤＮＡの突然変異の検出、循環腫瘍（ＣＴＣ）及び循環ｍＲＮＡの測定を含む。ＬＤＨは、通常、侵襲的な腫瘍の挙動を識別して再発を予測するために使用されるが、その指標は非常に低く、例えば３０〜５０％の精度である。また、黒色腫に対して非特異的である。ＢＲＡＦのような標的遺伝子の突然変異は、血液においてｃｔＤＮＡを検出することが可能であるが、治療効果の指標としての有用性は限られている（例えば、４５〜７０％の正確性）。ＣＴＣは、黒色腫の正確なマーカーとしてではなく、ＣＴＣの臨床的有用性に関するコンセンサスはない。循環ｍｉｃｒｏＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が検出されたが、臨床的有用性の証拠は未だない。
【０００７】
黒色腫に関して、疾患再発の診断又は予後診断として機能するマルチｍＲＮＡ循環バイオマーカーはない。現在、黒色腫の手術又は薬物治療の有効性をモニターするために使用できるバイオマーカーは、不足している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Schadendorf D, Fisher DE, Garbe C, et al. Melanoma. Nat Rev Dis Primers. 2015;1:15003.: 10.1038/nrdp.2015.1033.
【非特許文献２】Mar VJ, Wong SQ, Li J, et al. BRAF/NRAS wild-type melanomas have a high mutation load correlating with histologic and molecular signatures of UV damage. Clin Cancer Res. 2013;19: 4589-4598. doi: 4510.1158/1078-0432.CCR-4513-0398. Epub 2013 Jul 4585.
【非特許文献３】Genomic Classification of Cutaneous Melanoma. Cell. 2015;161: 1681-1696. doi: 1610.1016/j.cell.2015.1605.1044.
【非特許文献４】Wan PT, Garnett MJ, Roe SM, et al. Mechanism of activation of the RAF-ERK signaling pathway by oncogenic mutations of B-RAF. Cell. 2004;116: 855-867.
【非特許文献５】Krauthammer M, Kong Y, Bacchiocchi A, et al. Exome sequencing identifies recurrent mutations in NF1 and RASopathy genes in sun-exposed melanomas. Nat Genet. 2015;47: 996-1002. doi: 1010.1038/ng.3361. Epub 2015 Jul 1027.
【非特許文献６】Svedman FC, Pillas D, Taylor A, Kaur M, Linder R, Hansson J. Stage-specific survival and recurrence in patients with cutaneous malignant melanoma in Europe - a systematic review of the literature. Clin Epidemiol. 2016;8:109-22.: 10.2147/CLEP.S99021. eCollection 92016.
【非特許文献７】Gershenwald JE, Thompson W, Mansfield PF, et al. Multi-institutional melanoma lymphatic mapping experience: the prognostic value of sentinel lymph node status in 612 stage I or II melanoma patients. J Clin Oncol. 1999;17: 976-983.
【非特許文献８】Minor DR, Moore D, Kim C, et al. Prognostic factors in metastatic melanoma patients treated with biochemotherapy and maintenance immunotherapy. Oncologist. 2009;14: 995-1002. doi: 1010.1634/theoncologist.2009-0083. Epub 2009 Sep 1023.
【非特許文献９】Kaisaki PJ, Cutts A, Popitsch N, et al. Targeted Next-Generation Sequencing of Plasma DNA from Cancer Patients: Factors Influencing Consistency with Tumour DNA and Prospective Investigation of Its Utility for Diagnosis. PLoS One. 2016;11: e0162809. doi: 0162810.0161371/journal.pone.0162809. eCollection 0162016.
【非特許文献１０】Knol AC, Vallee A, Herbreteau G, et al. Clinical significance of BRAF mutation status in circulating tumor DNA of metastatic melanoma patients at baseline. Exp Dermatol. 2016;25: 783-788. doi: 710.1111/exd.13065.
【非特許文献１１】Khoja L, Lorigan P, Dive C, Keilholz U, Fusi A. Circulating tumour cells as tumour biomarkers in melanoma: detection methods and clinical relevance. Ann Oncol. 2015;26: 33-39. doi: 10.1093/annonc/mdu1207. Epub 2014 Jun 1096.
【非特許文献１２】Stark MS, Klein K, Weide B, et al. The Prognostic and Predictive Value of Melanoma-related MicroRNAs Using Tissue and Serum: A MicroRNA Expression Analysis. EBioMedicine. 2015;2: 671-680. doi: 610.1016/j.ebiom.2015.1005.1011. eCollection 2015 Jul.
【非特許文献１３】Gerami P, Cook RW, Wilkinson J, et al. Development of a prognostic genetic signature to predict the metastatic risk associated with cutaneous melanoma. Clin Cancer Res. 2015;21: 175-183. doi: 110.1158/1078-0432.CCR-1113-3316.
【非特許文献１４】Berger AC, Davidson RS, Poitras JK, et al. Clinical impact of a 31-gene expression profile test for cutaneous melanoma in 156 prospectively and consecutively tested patients. Curr Med Res Opin. 2016;32: 1599-1604. doi: 1510.1080/03007995.03002016.01192997. Epub 03002016 Jun 03007993.
【非特許文献１５】Hanahan D, Weinberg RA. The hallmarks of cancer. Cell. 2000;100: 57-70.
【非特許文献１６】Hanahan D, Weinberg RA. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 2011;144: 646-674. doi: 610.1016/j.cell.2011.1002.1013.
【非特許文献１７】Kidd M, Drozdov I, Modlin I. Blood and tissue neuroendocrine tumor gene cluster analysis correlate, define hallmarks and predict disease status. Endocr Relat Cancer. 2015;22: 561-575. doi: 510.1530/ERC-1515-0092. Epub 2015 Jun 1532.
【非特許文献１８】Modlin I, Drozdov I, Kidd M. The Identification of gut neuroendocrine tumor disease by multiple synchronous transcript analysis in blood. Plos One. 2013;e63364.
【非特許文献１９】Li SC, Essaghir A, Martijn C, et al. Global microRNA profiling of well-differentiated small intestinal neuroendocrine tumors. Mod Pathol. 2013;26: 685-696. doi: 610.1038/modpathol.2012.1216. Epub 2013 Jan 1018.
【非特許文献２０】Modlin I, Drozdov I, Alaimo D, et al. A multianalyte PCR blood test outperforms single analyte ELISAs for neuroendocrine tumor detection Endocr Relat Cancer. 2014;21: 615-628.
【非特許文献２１】Modlin IM, Frilling A, Salem RR, et al. Blood measurement of neuroendocrine gene transcripts defines the effectiveness of operative resection and ablation strategies. Surgery. 2016;159: 336-347. doi: 310.1016/j.surg.2015.1006.1056. Epub 2015 Oct 1019.
【非特許文献２２】Cwikla JB, Bodei L, Kolasinska-Cwikla A, Sankowski A, Modlin IM, Kidd M. Circulating transcript analysis (NETest) in GEP-NETs treated with Somatostatin Analogs defines Therapy. J Clin Endocrinol Metab. 2015;100: E1437-1445.
【非特許文献２３】Bodei L, Kidd M, Modlin IM, et al. Measurement of circulating transcripts and gene cluster analysis predicts and defines therapeutic efficacy of peptide receptor radionuclide therapy (PRRT) in neuroendocrine tumors. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 2015;23: 23.
【非特許文献２４】Pavel M, Jann H, Prasad V, Drozdov I, Modlin IM, Kidd M. NET Blood Transcript Analysis defines the Crossing of the Clinical Rubicon: When Stable Disease becomes Progressive. Neuroendocrinology. 2017;104: 170-182.
【非特許文献２５】Merlino G, Herlyn M, Fisher DE, et al. The state of melanoma: challenges and opportunities. Pigment Cell Melanoma Res. 2016;29: 404-416. doi: 410.1111/pcmr.12475. Epub 12016 Apr 12417.
【非特許文献２６】Diaz-Uriarte R, Alvarez de Andres S. Gene selection and classification of microarray data using random forest. BMC Bioinformatics. 2006;7: 3.
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、病像に対する３人の寄与者のシステムとしての黒色腫スコアの可視化を示すグラフである−コントロール、反応、及び進行。各コーナーのサンプルは、各臨床群の純粋な表示を示す。中央のサンプルは、アルゴリズムと臨床の両方の不確実性の領域にある。
【図２】図２は、テストセット内のテストに関する測定基準を８７〜１００％の範囲で示すグラフである。
【図３Ａ】図３Ａは、テストセット２の循環黒色腫遺伝子テスト（Ｍｅｌａｎｏｍｘ）の評価を示す一連のグラフである。値は、コントロールよりも黒色腫のサンプルで有意に高かった。治療に反応した患者は、コントロールと同様の値を有していた。コントロールから黒色腫を識別するためのＡＵＣを特定するテストセット２の受信者操作曲線分析は、０．９５超であった（図３Ｂ）。テストの測定基準は、７８〜９２％の範囲であった（図３Ｃ）。
【図３Ｂ】図３Ｂは、テストセット２の循環黒色腫遺伝子テスト（Ｍｅｌａｎｏｍｘ）の評価を示す一連のグラフである。値は、コントロールよりも黒色腫のサンプルで有意に高かった。治療に反応した患者は、コントロールと同様の値を有していた。コントロールから黒色腫を識別するためのＡＵＣを特定するテストセット２の受信者操作曲線分析は、０．９５超であった（図３Ｂ）。テストの測定基準は、７８〜９２％の範囲であった（図３Ｃ）。
【図３Ｃ】図３Ｃは、テストセット２の循環黒色腫遺伝子テスト（Ｍｅｌａｎｏｍｘ）の評価を示す一連のグラフである。値は、コントロールよりも黒色腫のサンプルで有意に高かった。治療に反応した患者は、コントロールと同様の値を有していた。コントロールから黒色腫を識別するためのＡＵＣを特定するテストセット２の受信者操作曲線分析は、０．９５超であった（図３Ｂ）。テストの測定基準は、７８〜９２％の範囲であった（図３Ｃ）。
【図４Ａ】図４Ａは、Ｍｅｌａｎｏｍｘに対する手術の効果を示す一連のグラフである。レベルは、手術により有意に減少した（ｐ＜０．０００１）（図４Ａ）。ＮＥＤ（手術後の疾患の証拠なし）群の値は、手術後の残存疾患のあるものよりも有意に低かった（ｐ＝０．０００７）（図４Ｂ）。
【図４Ｂ】図４Ｂは、Ｍｅｌａｎｏｍｘに対する手術の効果を示す一連のグラフである。レベルは、手術により有意に減少した（ｐ＜０．０００１）（図４Ａ）。ＮＥＤ（手術後の疾患の証拠なし）群の値は、手術後の残存疾患のあるものよりも有意に低かった（ｐ＝０．０００７）（図４Ｂ）。
【図５】図５は、Ｍｅｌａｎｏｍｘスコアに対する療法の効果を示すグラフである。レベルは、免疫療法（イピリムマブ）又はＢＲＡＦ阻害剤（ベムラフェニブ）によって大幅に減少した。
【図６Ａ】図６Ａは、３つの異なる黒色腫細胞系統のＭｅｌａｎｏｍｘスコアを示すグラフのセットである。図６Ａは、細胞系統が発現の上昇を示すことを区別する−Ｍｅｌａｎｏｍｘスコアは、４０（Ａ３７５）〜９５（Ｈｓ２９４）の範囲である。図６Ｂは、黒色腫を有しない対象からこれらの細胞を血液中に皮下注射すると、検出可能な遺伝子発現及びスコアが得られたことを示す。最低１細胞／ｍｌの血液を、一貫して特定することができた。
【図６Ｂ】図６Ｂは、３つの異なる黒色腫細胞系統のＭｅｌａｎｏｍｘスコアを示すグラフのセットである。図６Ａは、細胞系統が発現の上昇を示すことを区別する−Ｍｅｌａｎｏｍｘスコアは、４０（Ａ３７５）〜９５（Ｈｓ２９４）の範囲である。図６Ｂは、黒色腫を有しない対象からこれらの細胞を血液中に皮下注射すると、検出可能な遺伝子発現及びスコアが得られたことを示す。最低１細胞／ｍｌの血液を、一貫して特定することができた。
【図７Ａ】図７Ａは、腫瘍組織における発現及び同時に収集された血液サンプルとの相関を示すグラフのセットである。図７Ａにおいて、Ｍｅｌａｎｏｍｘスコアは、黒色腫腫瘍組織で４０〜９７の範囲であった。対照的に、正常な上皮は、２０未満の値を示した。図７Ｂにおいて、腫瘍組織での遺伝子発現は、一致した血液サンプルと比較される。これは、非常によく合致する（相関関係〜０．８０）。
【図７Ｂ】図７Ｂは、腫瘍組織における発現及び同時に収集された血液サンプルとの相関を示すグラフのセットである。図７Ａにおいて、Ｍｅｌａｎｏｍｘスコアは、黒色腫腫瘍組織で４０〜９７の範囲であった。対照的に、正常な上皮は、２０未満の値を示した。図７Ｂにおいて、腫瘍組織での遺伝子発現は、一致した血液サンプルと比較される。これは、非常によく合致する（相関関係〜０．８０）。
【発明の概要】
【００１０】
特に、本明細書に開示されているのは、黒色腫の２８遺伝子発現ツールである。それは、黒色腫の検出に高い感度と特異度（９５％超）を有し、侵襲的な未治療の疾患と安定した治療済みの疾患を区別することが可能である。
【００１１】
本開示の一態様は、それを必要とする対象において黒色腫を検出する方法に関し、（１）テストサンプルを少なくとも２９個のバイオマーカーの発現を検出するために特異的な複数の薬剤と接触させることにより、対象のテストサンプルから少なくとも２９個のバイオマーカーの発現レベルを決定し、ここで、前記少なくとも２９個のバイオマーカーは、ＡＴＬ１、ＡＴＰ６Ｖ０Ｄ、Ｃ１ＯＲＦ２１、ＣＦＬＡＲ、ＣＦＬＡＲ−ＡＳ１、ＣＨＰ１、ＤＤＸ５５、ＤＭＤ、ＤＮＡＪＣ９、ＥＮＯＳＦ１、ＦＡＮＣＬ、ＨＪＵＲＰ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＮＲＮＰＡ３Ｐ１、ＩＬ２３Ａ、ＩＱＧＡＰ１、ＬＯＣ４９４１２７、ＬＯＣ６４６４７１、ＬＯＨ１２ＣＲ、ＰＢＸＩＰ１、ＲＮＦ５、ＳＥＲＴＡＤ２、ＳＬＣ３５Ｇ５、ＳＰＡＴＳ２Ｌ、ＴＤＲＤ７、ＴＸＫ、ＹＹ２、及び少なくとも１つのハウスキーピング遺伝子を含み； （２）ＡＴＬ１、ＡＴＰ６Ｖ０Ｄ、Ｃ１ＯＲＦ２１、ＣＦＬＡＲ、ＣＦＬＡＲ−ＡＳ１、ＣＨＰ１、ＤＤＸ５５、ＤＭＤ、ＤＮＡＪＣ９、ＥＮＯＳＦ１、ＦＡＮＣＬ、ＨＪＵＲＰ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＮＲＮＰＡ３Ｐ１、ＩＬ２３Ａ、ＩＱＧＡＰ１、ＬＯＣ４９４１２７、ＬＯＣ６４６４７１、ＬＯＨ１２ＣＲ、ＰＢＸＩＰ１、ＲＮＦ５、ＳＥＲＴＡＤ２、ＳＬＣ３５Ｇ５、ＳＰＡＴＳ２Ｌ、ＴＤＲＤ７、ＴＸＫ、及びＹＹ２のそれぞれの発現レベルを少なくとも１つのハウスキーピング遺伝子の発現レベルに対し正規化し、それによって、ＡＴＬ１、ＡＴＰ６Ｖ０Ｄ、Ｃ１ＯＲＦ２１、ＣＦＬＡＲ、ＣＦＬＡＲ−ＡＳ１、ＣＨＰ１、ＤＤＸ５５、ＤＭＤ、ＤＮＡＪＣ９、ＥＮＯＳＦ１、ＦＡＮＣＬ、ＨＪＵＲＰ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＮＲＮＰＡ３Ｐ１、ＩＬ２３Ａ、ＩＱＧＡＰ１、ＬＯＣ４９４１２７、ＬＯＣ６４６４７１、ＬＯＨ１２ＣＲ、ＰＢＸＩＰ１、ＲＮＦ５、ＳＥＲＴＡＤ２、ＳＬＣ３５Ｇ５、ＳＰＡＴＳ２Ｌ、ＴＤＲＤ７、ＴＸＫ、及びＹＹ２のそれぞれの正規化された発現レベルを取得し； （３）正規化されたそれぞれの発現レベルをアルゴリズムに入力しスコアを生成し； （４）スコアを第１のカットオフ値と比較し； 及び（５）レポートを作成し、ここで、レポートは、スコアが第１の所定のカットオフ値以上の場合に対象に黒色腫が存在することを識別し、又はスコアが第１の所定のカットオフ値未満の場合に対象に黒色腫が存在しないことを識別し、ここで、第１の所定のカットオフ値は、０〜１００のスケールで２０である。
【００１２】
いくつかの実施形態において、当該方法は、黒色腫を有すると特定された対象を手術又は薬物療法で治療することをさらに含む。
【００１３】
本開示の他の態様は、対象の黒色腫が安定であるか進行性であるかを判断する、（１）テストサンプルを、少なくとも２９個のバイオマーカーの発現を検出するために特異的な複数の薬剤と接触させることにより、対象からのテストサンプルから少なくとも２９個のバイオマーカーの発現レベルを決定し、ここで、前記少なくとも２９個のバイオマーカーは、ＡＴＬ１、ＡＴＰ６Ｖ０Ｄ、Ｃ１ＯＲＦ２１、ＣＦＬＡＲ、ＣＦＬＡＲ−ＡＳ１、ＣＨＰ１、ＤＤＸ５５、ＤＭＤ、ＤＮＡＪＣ９、ＥＮＯＳＦ１、ＦＡＮＣＬ、ＨＪＵＲＰ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＮＲＮＰＡ３Ｐ１、ＩＬ２３Ａ、ＩＱＧＡＰ１、ＬＯＣ４９４１２７、ＬＯＣ６４６４７１、ＬＯＨ１２ＣＲ、ＰＢＸＩＰ１、ＲＮＦ５、ＳＥＲＴＡＤ２、ＳＬＣ３５Ｇ５、ＳＰＡＴＳ２Ｌ、ＴＤＲＤ７、ＴＸＫ、ＹＹ２、及び少なくとも１つのハウスキーピング遺伝子を含み； （２）ＡＴＬ１、ＡＴＰ６Ｖ０Ｄ、Ｃ１ＯＲＦ２１、ＣＦＬＡＲ、ＣＦＬＡＲ−ＡＳ１、ＣＨＰ１、ＤＤＸ５５、ＤＭＤ、ＤＮＡＪＣ９、ＥＮＯＳＦ１、ＦＡＮＣＬ、ＨＪＵＲＰ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＮＲＮＰＡ３Ｐ１、ＩＬ２３Ａ、ＩＱＧＡＰ１、ＬＯＣ４９４１２７、ＬＯＣ６４６４７１、ＬＯＨ１２ＣＲ、ＰＢＸＩＰ１、ＲＮＦ５、ＳＥＲＴＡＤ２、ＳＬＣ３５Ｇ５、ＳＰＡＴＳ２Ｌ、ＴＤＲＤ７、ＴＸＫ、及びＹＹ２のそれぞれの発現レベルを少なくとも１つのハウスキーピング遺伝子の発現レベルに対し正規化し、それによって、ＡＴＬ１、ＡＴＰ６Ｖ０Ｄ、Ｃ１ＯＲＦ２１、ＣＦＬＡＲ、ＣＦＬＡＲ−ＡＳ１、ＣＨＰ１、ＤＤＸ５５、ＤＭＤ、ＤＮＡＪＣ９、ＥＮＯＳＦ１、ＦＡＮＣＬ、ＨＪＵＲＰ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＮＲＮＰＡ３Ｐ１、ＩＬ２３Ａ、ＩＱＧＡＰ１、ＬＯＣ４９４１２７、ＬＯＣ６４６４７１、ＬＯＨ１２ＣＲ、ＰＢＸＩＰ１、ＲＮＦ５、ＳＥＲＴＡＤ２、ＳＬＣ３５Ｇ５、ＳＰＡＴＳ２Ｌ、ＴＤＲＤ７、ＴＸＫ、及びＹＹ２のそれぞれの正規化された発現レベルを取得し； （３）正規化されたそれぞれの発現レベルをアルゴリズムに入力しスコアを生成し； （４）スコアを第２のカットオフ値と比較し； 及び（５）レポートを作成し、ここで、レポートは、スコアが第２の所定のカットオフ値以上の場合に黒色腫が進行していることを識別し、又はスコアが第２の所定のカットオフ値未満の場合に対象に黒色腫が安定していることを識別し、ここで、第２の所定のカットオフ値は、０〜１００のスケールで５０である、を含む方法に関する。
【００１４】
本開示の他の態様は、（１）テストサンプルを、少なくとも２９個のバイオマーカーの発現を検出するために特異的な複数の薬剤と接触させることにより、外科的手術後の対象からのテストサンプルから少なくとも２９個のバイオマーカーの発現レベルを決定し、ここで、前記少なくとも２９個のバイオマーカーは、ＡＴＬ１、ＡＴＰ６Ｖ０Ｄ、Ｃ１ＯＲＦ２１、ＣＦＬＡＲ、ＣＦＬＡＲ−ＡＳ１、ＣＨＰ１、ＤＤＸ５５、ＤＭＤ、ＤＮＡＪＣ９、ＥＮＯＳＦ１、ＦＡＮＣＬ、ＨＪＵＲＰ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＮＲＮＰＡ３Ｐ１、ＩＬ２３Ａ、ＩＱＧＡＰ１、ＬＯＣ４９４１２７、ＬＯＣ６４６４７１、ＬＯＨ１２ＣＲ、ＰＢＸＩＰ１、ＲＮＦ５、ＳＥＲＴＡＤ２、ＳＬＣ３５Ｇ５、ＳＰＡＴＳ２Ｌ、ＴＤＲＤ７、ＴＸＫ、ＹＹ２、及び少なくとも１つのハウスキーピング遺伝子を含み； （２）ＡＴＬ１、ＡＴＰ６Ｖ０Ｄ、Ｃ１ＯＲＦ２１、ＣＦＬＡＲ、ＣＦＬＡＲ−ＡＳ１、ＣＨＰ１、ＤＤＸ５５、ＤＭＤ、ＤＮＡＪＣ９、ＥＮＯＳＦ１、ＦＡＮＣＬ、ＨＪＵＲＰ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＮＲＮＰＡ３Ｐ１、ＩＬ２３Ａ、ＩＱＧＡＰ１、ＬＯＣ４９４１２７、ＬＯＣ６４６４７１、ＬＯＨ１２ＣＲ、ＰＢＸＩＰ１、ＲＮＦ５、ＳＥＲＴＡＤ２、ＳＬＣ３５Ｇ５、ＳＰＡＴＳ２Ｌ、ＴＤＲＤ７、ＴＸＫ、及びＹＹ２のそれぞれの発現レベルを少なくとも１つのハウスキーピング遺伝子の発現レベルに対し正規化し、それによって、ＡＴＬ１、ＡＴＰ６Ｖ０Ｄ、Ｃ１ＯＲＦ２１、ＣＦＬＡＲ、ＣＦＬＡＲ−ＡＳ１、ＣＨＰ１、ＤＤＸ５５、ＤＭＤ、ＤＮＡＪＣ９、ＥＮＯＳＦ１、ＦＡＮＣＬ、ＨＪＵＲＰ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＮＲＮＰＡ３Ｐ１、ＩＬ２３Ａ、ＩＱＧＡＰ１、ＬＯＣ４９４１２７、ＬＯＣ６４６４７１、ＬＯＨ１２ＣＲ、ＰＢＸＩＰ１、ＲＮＦ５、ＳＥＲＴＡＤ２、ＳＬＣ３５Ｇ５、ＳＰＡＴＳ２Ｌ、ＴＤＲＤ７、ＴＸＫ、及びＹＹ２のそれぞれの正規化された発現レベルを取得し； （３）正規化されたそれぞれの発現レベルをアルゴリズムに入力しスコアを生成し； （４）スコアを第３のカットオフ値と比較し；及び（５）レポートを作成し、ここで、当該レポートは、正規化された発現レベルが、第３の所定のカットオフ値以上の場合、外科的手術は、黒色腫全体を削除していないことを識別し、又は正規化された発現レベルが、第３の所定のカットオフ値未満の場合、外科的手術により黒色腫全体が除去されたことを識別し、ここで、第３の所定のカットオフ値が、０〜１００のスケールで２０である、を含む黒色腫を有する対象における外科的切除の程度を評価する方法に関する。
【００１５】
いくつかの実施形態において、当該レポートは、さらに、正規化された発現レベルが第３のカットオフ値以上の場合、黒色腫の再発のリスクが高いことを識別し、又は正規化された発現レベルが第３のカットオフ値未満の場合、黒色腫の再発のリスクが低いことを識別する。
【００１６】
本開示のさらなる他の態様は、（１）第１のテストサンプルを少なくとも２８個のバイオマーカーの発現を検出するために特異的な複数の薬剤と接触させることにより、第１の時点で対象からの第１のテストサンプルから少なくとも２８個のバイオマーカーの第１の発現レベルを決定し、ここで、前記少なくとも２８個のバイオマーカーは、ＡＴＬ１、ＡＴＰ６Ｖ０Ｄ、Ｃ１ＯＲＦ２１、ＣＦＬＡＲ、ＣＦＬＡＲ−ＡＳ１、ＣＨＰ１、ＤＤＸ５５、ＤＭＤ、ＤＮＡＪＣ９、ＥＮＯＳＦ１、ＦＡＮＣＬ、ＨＪＵＲＰ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＮＲＮＰＡ３Ｐ１、ＩＬ２３Ａ、ＩＱＧＡＰ１、ＬＯＣ４９４１２７、ＬＯＣ６４６４７１、ＬＯＨ１２ＣＲ、ＰＢＸＩＰ１、ＲＮＦ５、ＳＥＲＴＡＤ２、ＳＬＣ３５Ｇ５、ＳＰＡＴＳ２Ｌ、ＴＤＲＤ７、ＴＸＫ、及びＹＹ２を含み； （２）第２のテストサンプルを少なくとも２８個のバイオマーカーの発現を検出するために特異的な複数の薬剤と接触させることにより、第２の時点で対象の第２のテストサンプルから少なくとも２８個のバイオマーカーの第２の発現レベルを決定し、ここで、第２の時点は、第１の時点の後及び対象への療法の開始後であり； （３）第１の発現レベルと第２の発現レベルを比較し； 及び（４）レポートを作成し、ここで、当該レポートは、第１の発現レベルと比較して第２の発現レベルが大幅に減少した場合、対象が療法に対して反応することを示す、を含む療法に対する黒色腫を有する対象による反応を決定する方法に関する。
【００１７】
いくつかの実施形態において、第１の時点は、対象への療法の実施前である。いくつかの実施形態において、第１の時点は、対象への療法の実施後である。いくつかの実施形態において、両方は、免疫療法又は標的療法（例えば、ＢＲＡＦ阻害剤）を含む。
【００１８】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのハウスキーピング遺伝子は、ＡＬＧ９、ＳＥＰＮ、ＹＷＨＡＱ、ＶＰＳ３７Ａ、ＰＲＲＣ２Ｂ、ＤＯＰＥＹ２、ＮＤＵＦＢ１１、ＮＤ４、ＭＲＰＬ１９、ＰＳＭＣ４、ＳＦ３Ａ１、ＰＵＭ１、ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤ、ＧＵＳＢ、ＲＰＬＰ０、ＴＦＲＣ、ＭＯＲＦ４Ｌ１、１８Ｓ、ＰＰＩＡ、ＰＧＫ１、ＲＰＬ１３Ａ、Ｂ２Ｍ、ＹＷＨＡＺ、ＳＤＨＡ、ＨＰＲＴ１、ＴＯＸ４、及びＴＰＴ１からなる群から選択される。
【００１９】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのハウスキーピング遺伝子は、ＴＯＸ４及びＴＰＴ１を含む。
【００２０】
いくつかの実施形態において、正規化された発現レベルは、（１）ＡＴＬ１、ＡＴＰ６Ｖ０Ｄ、Ｃ１ＯＲＦ２１、ＣＦＬＡＲ、ＣＦＬＡＲ−ＡＳ１、ＣＨＰ１、ＤＤＸ５５、ＤＭＤ、ＤＮＡＪＣ９、ＥＮＯＳＦ１、ＦＡＮＣＬ、ＨＪＵＲＰ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＮＲＮＰＡ３Ｐ１、ＩＬ２３Ａ、ＩＱＧＡＰ１、ＬＯＣ４９４１２７、ＬＯＣ６４６４７１、ＬＯＨ１２ＣＲ、ＰＢＸＩＰ１、ＲＮＦ５、ＳＥＲＴＡＤ２、ＳＬＣ３５Ｇ５、ＳＰＡＴＳ２Ｌ、ＴＤＲＤ７、ＴＸＫ、及びＹＹ２のそれぞれの発現レベルをＴＯＸ４の発現レベルに対し正規化し、それによって、ＡＴＬ１、ＡＴＰ６Ｖ０Ｄ、Ｃ１ＯＲＦ２１、ＣＦＬＡＲ、ＣＦＬＡＲ−ＡＳ１、ＣＨＰ１、ＤＤＸ５５、ＤＭＤ、ＤＮＡＪＣ９、ＥＮＯＳＦ１、ＦＡＮＣＬ、ＨＪＵＲＰ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＮＲＮＰＡ３Ｐ１、ＩＬ２３Ａ、ＩＱＧＡＰ１、ＬＯＣ４９４１２７、ＬＯＣ６４６４７１、ＬＯＨ１２ＣＲ、ＰＢＸＩＰ１、ＲＮＦ５、ＳＥＲＴＡＤ２、ＳＬＣ３５Ｇ５、ＳＰＡＴＳ２Ｌ、ＴＤＲＤ７、ＴＸＫ、及びＹＹ２のそれぞれの第１の正規化された発現レベルを取得し； （２）ＡＴＬ１、ＡＴＰ６Ｖ０Ｄ、Ｃ１ＯＲＦ２１、ＣＦＬＡＲ、ＣＦＬＡＲ−ＡＳ１、ＣＨＰ１、ＤＤＸ５５、ＤＭＤ、ＤＮＡＪＣ９、ＥＮＯＳＦ１、ＦＡＮＣＬ、ＨＪＵＲＰ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＮＲＮＰＡ３Ｐ１、ＩＬ２３Ａ、ＩＱＧＡＰ１、ＬＯＣ４９４１２７、ＬＯＣ６４６４７１、ＬＯＨ１２ＣＲ、ＰＢＸＩＰ１、ＲＮＦ５、ＳＥＲＴＡＤ２、ＳＬＣ３５Ｇ５、ＳＰＡＴＳ２Ｌ、ＴＤＲＤ７、ＴＸＫ、及びＹＹ２のそれぞれの発現レベルをＴＰＴ１の発現レベルに対し正規化し、それによって、ＡＴＬ１、ＡＴＰ６Ｖ０Ｄ、Ｃ１ＯＲＦ２１、ＣＦＬＡＲ、ＣＦＬＡＲ−ＡＳ１、ＣＨＰ１、ＤＤＸ５５、ＤＭＤ、ＤＮＡＪＣ９、ＥＮＯＳＦ１、ＦＡＮＣＬ、ＨＪＵＲＰ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＮＲＮＰＡ３Ｐ１、ＩＬ２３Ａ、ＩＱＧＡＰ１、ＬＯＣ４９４１２７、ＬＯＣ６４６４７１、ＬＯＨ１２ＣＲ、ＰＢＸＩＰ１、ＲＮＦ５、ＳＥＲＴＡＤ２、ＳＬＣ３５Ｇ５、ＳＰＡＴＳ２Ｌ、ＴＤＲＤ７、ＴＸＫ、及びＹＹ２のそれぞれの第２に正規化された発現レベルを取得し； 及び（３）第１の正規化された発現レベルと第２の正規化された発現レベルを平均し、正規化された発現レベルを取得することによって得られる。
【００２１】
いくつかの実施形態において、当該方法は、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の特異度、感度、及び／又は精度を有し得る。いくつかの実施形態において、当該方法は、９０％超の感度を有する。いくつかの実施形態において、当該方法は、９０％超の特異度を有する。
【００２２】
いくつかの実施形態において、バイオマーカーは、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、又はタンパク質である。バイオマーカーが、ＲＮＡである場合、ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを生成することができ、生成されたｃＤＮＡ発現レベルが検出される。いくつかの実施形態において、バイオマーカー及び標識プローブ又はプライマーとの複合体を形成することにより、バイオマーカーの発現レベルが検出される。バイオマーカーが、ＲＮＡ又はｃＤＮＡである場合、ＲＮＡ又はｃＤＮＡは、ＲＮＡ又はｃＤＮＡ及び標識された核酸プローブ又はプライマーとの間に複合体を形成することにより検出され得る。バイオマーカーが、タンパク質の場合、タンパク質と標識抗体の間に複合体を形成することによりタンパク質が検出され得る。いくつかの実施形態において、標識は、蛍光標識である。
【００２３】
いくつかの実施形態において、テストサンプルは、血液、血清、血漿、又は腫瘍性組織である。
【００２４】
いくつかの実施形態において、第１の所定のカットオフ値は、腫瘍性疾患の無い対象から得られた複数の参照サンプルから導き出され得る。第２の所定のカットオフ値は、黒色腫が免疫療法等の療法によって適切に制御されている対象から得られた複数の参照サンプルから導き出され得る。第３の所定のカットオフ値は、手術により黒色腫が完全に除去され、「疾患が無い」とみなされる対象から得られた複数の参照サンプルから導き出され得る。いくつかの実施形態において、各参照サンプルは、血液、血清、血漿、又は非腫瘍組織であり得る。
【００２５】
いくつかの実施形態において、それを必要とする対象は、黒色腫と診断された対象、少なくとも１つの黒色腫症状を有する対象、又は黒色腫を発症する素因又は家族歴を有する対象である。いくつかの実施形態において、対象は、ヒトである。
【００２６】
いくつかの実施形態において、アルゴリズムは、ＸＧＢ、ＲＦ、ｇｌｍｎｅｔ、ｃｆｏｒｅｓｔ、ＣＡＲＴ、ｔｒｅｅｂａｇ、ｋｎｎ、ｎｎｅｔ、ＳＶＭ−ラジアル、ＳＶＭ−リニア、ＮＢ、ＮＮＥＴ、又はｍｌｐである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
発明の詳細な説明
本発明の詳細は、以下の付随する説明に記載されている。本明細書に記載されるものと類似又は同等の方法及び材料を本発明の実施又はテストに使用することができるが、例示的な方法及び材料をここで説明する。本発明の他の特徴、目的、及び利点は、明細書及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。明細書及び特許請求の範囲において、文脈がそうでないことを明確に指示しない限り、単数形又は複数形も含む。他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で引用された全ての特許及び刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００２８】
黒色腫の初期徴候には、既存のほくろの形状又は色の変化、又は結節性黒色腫の場合、皮膚の何れかに新しいしこりの出現を含む。後の段階で、ほくろは、痒み、潰瘍又は出血する場合がある。目視検査は、最も一般的な診断手法である。黒色腫は、以下のタイプに分類され得る： 悪性黒子、悪性黒子型黒色腫、表在拡大型黒色腫、末端黒子型黒色腫、粘膜性黒色腫、結節性黒色腫、ポリープ性黒色腫、線維形成性黒色腫。
【００２９】
循環黒色腫転写産物の測定−Ｍｅｌａｎｏｍｘ−は、黒色腫を特定し、Ｍｅｌａｎｏｍｘスコアの減少は、免疫療法及び標的療法等の治療的な介入の有効性と相関する。ＲＮＡの標的遺伝子発現プロファイルは、黒色腫患者の末梢血から分離され得る。この発現プロファイルは、アルゴリズムで評価され、アウトプット（予測）に変換される。標準的な臨床評価及び画像診断と組み合わせて活動性疾患の特定、治療反応の評価の提供、又は再発のリスクの予測を行うことが可能である。
【００３０】
一態様において、本開示は、（１）テストサンプルを、少なくとも２９個のバイオマーカーの発現を検出するために特異的な複数の薬剤と接触させることにより、対象からのテストサンプルから少なくとも２９個のバイオマーカーの発現レベルを決定し、ここで、前記少なくとも２９個のバイオマーカーは、ＡＴＬ１、ＡＴＰ６Ｖ０Ｄ、Ｃ１ＯＲＦ２１、ＣＦＬＡＲ、ＣＦＬＡＲ−ＡＳ１、ＣＨＰ１、ＤＤＸ５５、ＤＭＤ、ＤＮＡＪＣ９、ＥＮＯＳＦ１、ＦＡＮＣＬ、ＨＪＵＲＰ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＮＲＮＰＡ３Ｐ１、ＩＬ２３Ａ、ＩＱＧＡＰ１、ＬＯＣ４９４１２７、ＬＯＣ６４６４７１、ＬＯＨ１２ＣＲ、ＰＢＸＩＰ１、ＲＮＦ５、ＳＥＲＴＡＤ２、ＳＬＣ３５Ｇ５、ＳＰＡＴＳ２Ｌ、ＴＤＲＤ７、ＴＸＫ、ＹＹ２、及び少なくとも１つのハウスキーピング遺伝子を含み； （２）ＡＴＬ１、ＡＴＰ６Ｖ０Ｄ、Ｃ１ＯＲＦ２１、ＣＦＬＡＲ、ＣＦＬＡＲ−ＡＳ１、ＣＨＰ１、ＤＤＸ５５、ＤＭＤ、ＤＮＡＪＣ９、ＥＮＯＳＦ１、ＦＡＮＣＬ、ＨＪＵＲＰ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＮＲＮＰＡ３Ｐ１、ＩＬ２３Ａ、ＩＱＧＡＰ１、ＬＯＣ４９４１２７、ＬＯＣ６４６４７１、ＬＯＨ１２ＣＲ、ＰＢＸＩＰ１、ＲＮＦ５、ＳＥＲＴＡＤ２、ＳＬＣ３５Ｇ５、ＳＰＡＴＳ２Ｌ、ＴＤＲＤ７、ＴＸＫ、及びＹＹ２のそれぞれの発現レベルを少なくとも1つのハウスキーピング遺伝子の発現レベルに対し正規化し、それによって、ＡＴＬ１、ＡＴＰ６Ｖ０Ｄ、Ｃ１ＯＲＦ２１、ＣＦＬＡＲ、ＣＦＬＡＲ−ＡＳ１、ＣＨＰ１、ＤＤＸ５５、ＤＭＤ、ＤＮＡＪＣ９、ＥＮＯＳＦ１、ＦＡＮＣＬ、ＨＪＵＲＰ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＮＲＮＰＡ３Ｐ１、ＩＬ２３Ａ、ＩＱＧＡＰ１、ＬＯＣ４９４１２７、ＬＯＣ６４６４７１、ＬＯＨ１２ＣＲ、ＰＢＸＩＰ１、ＲＮＦ５、ＳＥＲＴＡＤ２、ＳＬＣ３５Ｇ５、ＳＰＡＴＳ２Ｌ、ＴＤＲＤ７、ＴＸＫ、及びＹＹ２のそれぞれの正規化された発現レベルを取得し； （３）正規化されたそれぞれの発現レベルをアルゴリズムに入力しスコアを生成し； （４）スコアを第１の所定のカットオフ値と比較し； 及び（５）レポートを作成し、ここで、当該レポートは、スコアが第１の所定のカットオフ値以上の場合、対象に黒色腫が存在することを識別し、又はスコアが第１の所定のカットオフ値未満の場合、対象に黒色腫が存在しないことを識別し、ここで、第１のカットオフ値が、０〜１００のスケールで２０である、を含むそれを必要とする対象において黒色腫を検出する方法を提供する。
【００３１】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのハウスキーピング遺伝子は、ＡＬＧ９、ＳＥＰＮ、ＹＷＨＡＱ、ＶＰＳ３７Ａ、ＰＲＲＣ２Ｂ、ＤＯＰＥＹ２、ＮＤＵＦＢ１１、ＮＤ４、ＭＲＰＬ１９、ＰＳＭＣ４、ＳＦ３Ａ１、ＰＵＭ１、ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤ、ＧＵＳＢ、ＲＰＬＰ０、ＴＦＲＣ、ＭＯＲＦ４Ｌ１、１８Ｓ、ＰＰＩＡ、ＰＧＫ１、ＲＰＬ１３Ａ、Ｂ２Ｍ、ＹＷＨＡＺ、ＳＤＨＡ、ＨＰＲＴ１、ＴＯＸ４、及びＴＰＴ１からなる群から選択される。
【００３２】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのハウスキーピング遺伝子は、ＴＯＸ４及びＴＰＴ１を含む。いくつかの実施形態において、正規化された発現レベルは、（１）ＡＴＬ１、ＡＴＰ６Ｖ０Ｄ、Ｃ１ＯＲＦ２１、ＣＦＬＡＲ、ＣＦＬＡＲ−ＡＳ１、ＣＨＰ１、ＤＤＸ５５、ＤＭＤ、ＤＮＡＪＣ９、ＥＮＯＳＦ１、ＦＡＮＣＬ、ＨＪＵＲＰ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＮＲＮＰＡ３Ｐ１、ＩＬ２３Ａ、ＩＱＧＡＰ１、ＬＯＣ４９４１２７、ＬＯＣ６４６４７１、ＬＯＨ１２ＣＲ、ＰＢＸＩＰ１、ＲＮＦ５、ＳＥＲＴＡＤ２、ＳＬＣ３５Ｇ５、ＳＰＡＴＳ２Ｌ、ＴＤＲＤ７、ＴＸＫ、及びＹＹ２のそれぞれの発現レベルをＴＯＸ４の発現レベルに対し正規化し、それによって、ＡＴＬ１、ＡＴＰ６Ｖ０Ｄ、Ｃ１ＯＲＦ２１、ＣＦＬＡＲ、ＣＦＬＡＲ−ＡＳ１、ＣＨＰ１、ＤＤＸ５５、ＤＭＤ、ＤＮＡＪＣ９、ＥＮＯＳＦ１、ＦＡＮＣＬ、ＨＪＵＲＰ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＮＲＮＰＡ３Ｐ１、ＩＬ２３Ａ、ＩＱＧＡＰ１、ＬＯＣ４９４１２７、ＬＯＣ６４６４７１、ＬＯＨ１２ＣＲ、ＰＢＸＩＰ１、ＲＮＦ５、ＳＥＲＴＡＤ２、ＳＬＣ３５Ｇ５、ＳＰＡＴＳ２Ｌ、ＴＤＲＤ７、ＴＸＫ、及びＹＹ２のそれぞれの第１の正規化された発現レベルを取得し； （２）ＡＴＬ１、ＡＴＰ６Ｖ０Ｄ、Ｃ１ＯＲＦ２１、ＣＦＬＡＲ、ＣＦＬＡＲ−ＡＳ１、ＣＨＰ１、ＤＤＸ５５、ＤＭＤ、ＤＮＡＪＣ９、ＥＮＯＳＦ１、ＦＡＮＣＬ、ＨＪＵＲＰ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＮＲＮＰＡ３Ｐ１、ＩＬ２３Ａ、ＩＱＧＡＰ１、ＬＯＣ４９４１２７、ＬＯＣ６４６４７１、ＬＯＨ１２ＣＲ、ＰＢＸＩＰ１、ＲＮＦ５、ＳＥＲＴＡＤ２、ＳＬＣ３５Ｇ５、ＳＰＡＴＳ２Ｌ、ＴＤＲＤ７、ＴＸＫ、及びＹＹ２のそれぞれの発現レベルをＴＰＴ１の発現レベルに対し正規化し、それによって、ＡＴＬ１、ＡＴＰ６Ｖ０Ｄ、Ｃ１ＯＲＦ２１、ＣＦＬＡＲ、ＣＦＬＡＲ−ＡＳ１、ＣＨＰ１、ＤＤＸ５５、ＤＭＤ、ＤＮＡＪＣ９、ＥＮＯＳＦ１、ＦＡＮＣＬ、ＨＪＵＲＰ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＮＲＮＰＡ３Ｐ１、ＩＬ２３Ａ、ＩＱＧＡＰ１、ＬＯＣ４９４１２７、ＬＯＣ６４６４７１、ＬＯＨ１２ＣＲ、ＰＢＸＩＰ１、ＲＮＦ５、ＳＥＲＴＡＤ２、ＳＬＣ３５Ｇ５、ＳＰＡＴＳ２Ｌ、ＴＤＲＤ７、ＴＸＫ、及びＹＹ２のそれぞれの第２の正規化された発現レベルを取得し； 及び（３）第１の正規化された発現レベルと第２の正規化された発現レベルを平均し、正規化された発現レベルを取得する、ことによって得られる。
【００３３】
提供される方法中に、黒色腫を分類又は検出することが可能な方法がある。いくつかの実施形態において、提供された方法は、ヒト血液サンプル中の黒色腫を識別又は分類することができる。いくつかの実施例において、当該方法は、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の特異度、感度及び／又は精度でそのような情報を提供することが可能である。
【００３４】
薬剤は、バイオマーカーの検出のための何れかの薬剤であり得、典型的に、単離されたポリヌクレオチド又は抗体等の単離されたポリペプチド又はタンパク質、例えば、少なくとも２９個のバイオマーカーに特異的にハイブリダイズする又は結合するものである。
【００３５】
バイオマーカーは、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、又はタンパク質であり得る。バイオマーカーが、ＲＮＡである場合、ＲＮＡを逆転写し、ｃＤＮＡを生成するこが可能であり（ＲＴ−ＰＣＲ等により）、生成されたｃＤＮＡの発現レベルが検出される。バイオマーカーの発現レベルは、バイオマーカーと標識プローブ又はプライマーとの複合体を形成することにより検出され得る。バイオマーカーが、ＲＮＡ又はｃＤＮＡである場合、ＲＮＡ又はｃＤＮＡと標識核酸プローブ又はプライマーとの複合体を形成することにより、ＲＮＡ又はｃＤＮＡが検出される。ＲＮＡ又はｃＤＮＡと標識された核酸プローブ又はプライマーとの間の複合体は、ハイブリダイゼーション複合体であり得る。
【００３６】
バイオマーカーが、タンパク質である場合、タンパク質と標識抗体との複合体を形成することにより、タンパク質が検出され得る。標識は、例えば蛍光標識、化学発光標識、放射性標識等の何れかの標識であり得る。タンパク質レベルは、限定されないが、免疫沈降、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット分析、又は遺伝子によってコードされたタンパク質を特異的に検出する薬剤、例えば抗体を使用した免疫組織化学を含む方法によって測定され得る。
【００３７】
いくつかの実施形態において、当該方法は、テストサンプルを提供された薬剤の１つ、より典型的には、複数の提供された薬剤、例えば、２９個のバイオマーカーに特異的に結合するポリヌクレオチドのセットと接触させることにより実施される。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドのセットは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又は合成オリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、当該方法は、ＲＴ−ＰＣＲ、例えばＱＰＣＲ等による検出の前にテストサンプルからＲＮＡを単離する工程を含む。従って、いくつかの実施形態において、その発現レベル等の黒色腫のバイオマーカーの検出には、ＲＮＡの有無、又は量の検出を含む。一実施例において、ＲＮＡは、ＰＣＲ又はハイブリダイゼーションによって検出される。
【００３８】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、少なくとも２９個のバイオマーカーのそれぞれに特異的なプライマーのペア等のセンス及びアンチセンスプライマーを含む。この実施形態の一態様において、少なくとも２９個のバイオマーカーの検出は、ＰＣＲ、典型的に定量的又はリアルタイムＰＣＲによって実行される。例えば、一態様において、検出は、逆転写によりテストサンプルからｃＤＮＡを生成し； 次いで、少なくとも２８個のバイオマーカーのパネルに特異的にハイブリダイズするセンスプライマーとアンチセンスプライマーのペアを使用してｃＤＮＡを増幅し、及び増幅産物を検出することによって実行される。
【００３９】
テストサンプルは、対象から得られた何れかの生体液であり得る。好ましくは、テストサンプルは、血液、血清、血漿又は腫瘍性組織である。
【００４０】
第１の所定のカットオフ値は、腫瘍性疾患の無い対象から得られた複数の参照サンプルから導き出され得る。各参照サンプルは、腫瘍性疾患を有さないか、症状を示さないか、又は腫瘍性疾患を有すると診断された対象から得られた何れかの生体液であり得る。いくつかの実施形態において、参照サンプルは、血液、血清、血漿、又は非腫瘍性組織である。
【００４１】
それを必要とする対象は、黒色腫を有すると診断された対象、少なくとも１つの黒色腫の症状を有する対象、又は黒色腫を発症する素因又は家族歴を有する対象であり得る。対象は、何れかの哺乳類であり得る。好ましくは、対象は、ヒトである。用語「対象」及び「患者」は、本明細書において互換的に使用される。
【００４２】
スコアは、Ｍｅｌａｎｏｍｘスコアであり、これは０〜１００のスケールを有する。Ｍｅｌａｎｏｍｘスコアは、例えば、ＸＧＢ、ＲＦ、ｇｌｍｎｅｔ、ｃｆｏｒｅｓｔ、ＣＡＲＴ、ｔｒｅｅｂａｇ、ｋｎｎ、ｎｎｅｔ、ＳＶＭ−ラジアル、ＳＶＭ−リニア、ＮＢ、ＮＮＥＴ、又はｍｌｐ等の予測分類アルゴリズムから構築された分類子の製品である。アルゴリズムは、データ（すなわち、発現レベル）を分析し、次いでスコアを割り当てる。
【００４３】
当該方法は、黒色腫を有すると識別された対象を、手術、薬物療法、放射線療法、又はそれらの組み合わせで治療することをさらに含み得る。薬物療法は、免疫療法、標的療法、化学療法、又はそれらの組み合わせであり得る。いくつかの実施形態において、薬物療法は、免疫療法を含む。黒色腫を治療するための免疫療法の例は、限定されないが、イムリジック（Ｉｍｌｙｇｉｃ）（Ｔ−ＶＥＣ）、オプジーボ（Ｏｐｄｉｖｏ）と組み合わせたヤーボイ（Ｙｅｒｖｏｙ）、オプジーボ（ニボルマブ（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ））、キートルーダ（ｋｅｙｔｒｕｄａ）（ペンブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ））、ヤーボイ（イピリムマブ（ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ））、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、及びインターフェロンアルファ２−ｂを含む。いくつかの実施形態において、薬物療法は、ＢＲＡＦ阻害剤等の標的療法を含む。黒色腫を治療するための標的療法の例は、限定されないが、コテリック（Ｃｏｔｅｌｌｉｃ）（コビメチニブ（ｃｏｂｉｍｅｔｉｎｉｂ））、メキニスト（Ｍｅｋｉｎｉｓｔ）と組み合わせたタフィンラー（Ｔａｆｉｎｌａｒ）、タフィンラー（ダブラフェニブ（ｄａｂｒａｆｅｎｉｂ））、メキニスト（トラメチニブ（ｔｒａｍｅｔｉｎｉｂ））、及びゼルボラフ（Ｚｅｌｂｏｒａｆ）（ベムラフェニブ（ｖｅｍｕｒａｆｅｎｉｂ））を含む。いくつかの実施形態において、薬物療法は、化学療法を含む。いくつかの実施形態において、化学療法は、ダカルバジンを含む。
【００４４】
本開示はまた、（１）テストサンプルを、少なくとも２９個のバイオマーカーの発現を検出するために特異的な複数の薬剤と接触させることにより、対象からのテストサンプルから少なくとも２９個のバイオマーカーの発現レベルを決定し、ここで、前記少なくとも２９個のバイオマーカーは、ＡＴＬ１、ＡＴＰ６Ｖ０Ｄ、Ｃ１ＯＲＦ２１、ＣＦＬＡＲ、ＣＦＬＡＲ−ＡＳ１、ＣＨＰ１、ＤＤＸ５５、ＤＭＤ、ＤＮＡＪＣ９、ＥＮＯＳＦ１、ＦＡＮＣＬ、ＨＪＵＲＰ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＮＲＮＰＡ３Ｐ１、ＩＬ２３Ａ、ＩＱＧＡＰ１、ＬＯＣ４９４１２７、ＬＯＣ６４６４７１、ＬＯＨ１２ＣＲ、ＰＢＸＩＰ１、ＲＮＦ５、ＳＥＲＴＡＤ２、ＳＬＣ３５Ｇ５、ＳＰＡＴＳ２Ｌ、ＴＤＲＤ７、ＴＸＫ、ＹＹ２、及び少なくとも１つのハウスキーピング遺伝子を含み； （２）ＡＴＬ１、ＡＴＰ６Ｖ０Ｄ、Ｃ１ＯＲＦ２１、ＣＦＬＡＲ、ＣＦＬＡＲ−ＡＳ１、ＣＨＰ１、ＤＤＸ５５、ＤＭＤ、ＤＮＡＪＣ９、ＥＮＯＳＦ１、ＦＡＮＣＬ、ＨＪＵＲＰ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＮＲＮＰＡ３Ｐ１、ＩＬ２３Ａ、ＩＱＧＡＰ１、ＬＯＣ４９４１２７、ＬＯＣ６４６４７１、ＬＯＨ１２ＣＲ、ＰＢＸＩＰ１、ＲＮＦ５、ＳＥＲＴＡＤ２、ＳＬＣ３５Ｇ５、ＳＰＡＴＳ２Ｌ、ＴＤＲＤ７、ＴＸＫ、及びＹＹ２のそれぞれの発現レベルを少なくとも１つのハウスキーピング遺伝子に対し正規化し、それによって、ＡＴＬ１、ＡＴＰ６Ｖ０Ｄ、Ｃ１ＯＲＦ２１、ＣＦＬＡＲ、ＣＦＬＡＲ−ＡＳ１、ＣＨＰ１、ＤＤＸ５５、ＤＭＤ、ＤＮＡＪＣ９、ＥＮＯＳＦ１、ＦＡＮＣＬ、ＨＪＵＲＰ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＮＲＮＰＡ３Ｐ１、ＩＬ２３Ａ、ＩＱＧＡＰ１、ＬＯＣ４９４１２７、ＬＯＣ６４６４７１、ＬＯＨ１２ＣＲ、ＰＢＸＩＰ１、ＲＮＦ５、ＳＥＲＴＡＤ２、ＳＬＣ３５Ｇ５、ＳＰＡＴＳ２Ｌ、ＴＤＲＤ７、ＴＸＫ、及びＹＹ２のそれぞれの正規化された発現レベルを取得し； （３）正規化されたそれぞれの発現レベルをアルゴリズムに入力しスコアを生成し； （４）スコアを第２のカットオフ値と比較し； 及び（５）レポートを作成し、ここで、当該レポートは、正規化された発現レベルが、第２の所定のカットオフ値以上の場合、黒色腫が進行性であることを識別し、又は正規化された発現レベルが、第２の所定のカットオフ値未満の場合、黒色腫が安定していることを識別し、ここで、第２の所定のカットオフ値は、０〜１００のスケールで５０である、を含む対象の黒色腫が安定であるか又は進行性であるかを決定する方法を提供する。
【００４５】
第２の所定のカットオフ値は、黒色腫が免疫療法等の療法によって適切に制御されている被験者から得られた複数の参照サンプルから導き出され得る。
【００４６】
外科的切除は、それを必要とする対象から黒色腫を除去する手順である。本開示はまた、（１）テストサンプルを少なくとも２９個のバイオマーカーの発現を検出するために特異的な複数の薬剤と接触させることにより、外科的切除後の対象からのテストサンプルから少なくとも２９個のバイオマーカーの発現レベルを決定し、ここで、前記少なくとも２９個のバイオマーカーは、ＡＴＬ１、ＡＴＰ６Ｖ０Ｄ、Ｃ１ＯＲＦ２１、ＣＦＬＡＲ、ＣＦＬＡＲ−ＡＳ１、ＣＨＰ１、ＤＤＸ５５、ＤＭＤ、ＤＮＡＪＣ９、ＥＮＯＳＦ１、ＦＡＮＣＬ、ＨＪＵＲＰ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＮＲＮＰＡ３Ｐ１、ＩＬ２３Ａ、ＩＱＧＡＰ１、ＬＯＣ４９４１２７、ＬＯＣ６４６４７１、ＬＯＨ１２ＣＲ、ＰＢＸＩＰ１、ＲＮＦ５、ＳＥＲＴＡＤ２、ＳＬＣ３５Ｇ５、ＳＰＡＴＳ２Ｌ、ＴＤＲＤ７、ＴＸＫ、ＹＹ２、及び少なくとも１つのハウスキーピング遺伝子を含み； （２）ＡＴＬ１、ＡＴＰ６Ｖ０Ｄ、Ｃ１ＯＲＦ２１、ＣＦＬＡＲ、ＣＦＬＡＲ−ＡＳ１、ＣＨＰ１、ＤＤＸ５５、ＤＭＤ、ＤＮＡＪＣ９、ＥＮＯＳＦ１、ＦＡＮＣＬ、ＨＪＵＲＰ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＮＲＮＰＡ３Ｐ１、ＩＬ２３Ａ、ＩＱＧＡＰ１、ＬＯＣ４９４１２７、ＬＯＣ６４６４７１、ＬＯＨ１２ＣＲ、ＰＢＸＩＰ１、ＲＮＦ５、ＳＥＲＴＡＤ２、ＳＬＣ３５Ｇ５、ＳＰＡＴＳ２Ｌ、ＴＤＲＤ７、ＴＸＫ、及びＹＹ２のそれぞれの発現レベルを少なくとも１つのハウスキーピング遺伝子に対し正規化し、それによって、ＡＴＬ１、ＡＴＰ６Ｖ０Ｄ、Ｃ１ＯＲＦ２１、ＣＦＬＡＲ、ＣＦＬＡＲ−ＡＳ１、ＣＨＰ１、ＤＤＸ５５、ＤＭＤ、ＤＮＡＪＣ９、ＥＮＯＳＦ１、ＦＡＮＣＬ、ＨＪＵＲＰ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＮＲＮＰＡ３Ｐ１、ＩＬ２３Ａ、ＩＱＧＡＰ１、ＬＯＣ４９４１２７、ＬＯＣ６４６４７１、ＬＯＨ１２ＣＲ、ＰＢＸＩＰ１、ＲＮＦ５、ＳＥＲＴＡＤ２、ＳＬＣ３５Ｇ５、ＳＰＡＴＳ２Ｌ、ＴＤＲＤ７、ＴＸＫ、及びＹＹ２のそれぞれの正規化された発現レベルを取得し； （３）正規化されたそれぞれの発現レベルをアルゴリズムに入力しスコアを生成し； （４）スコアを第３のカットオフ値と比較し； 及び（５）レポートを作成し、ここで、当該レポートは、正規化された発現レベルが、第３の所定のカットオフ値以上の場合、外科的切除により黒色腫全体が除去されていないことを識別し、又は正規化された発現レベルが、第３の所定のカットオフ値未満の場合、外科的切除により黒色腫全体が除去されていることを識別し、ここで、第３の所定のカットオフ値は、０〜１００のスケールで２０である、を含む黒色腫を有する対象における外科的切除の程度を評価する方法を提供する。
【００４７】
第３の所定のカットオフ値は、黒色腫疾患が完全に除去され、それらが「疾患を有しない」とみなされる対象から得られた複数の参照サンプルから導き出され得る。
【００４８】
外科的切除が黒色腫全体を除去していないと判断される場合、対象は、黒色腫の再発のリスクを有する。従って、いくつかの実施形態において、レポートはさらに、正規化された発現レベルが、第３の所定のカットオフ値以上の場合、黒色腫の再発のリスクが高いことを識別し、又は正規化された発現レベルが、第３の所定のカットオフ値未満の場合、黒色腫の再発のリスクが低いことを識別する。
【００４９】
本開示はまた、（１）第１のテストサンプルを少なくとも２８個のバイオマーカーの発現を検出するために特異的な複数の薬剤と接触させることにより、第１の時点で対象からの第１のテストサンプルから少なくとも２８個のバイオマーカーの第１の発現レベルを決定し、ここで、前記少なくとも２８個のバイオマーカーは、ＡＴＬ１、ＡＴＰ６Ｖ０Ｄ、Ｃ１ＯＲＦ２１、ＣＦＬＡＲ、ＣＦＬＡＲ−ＡＳ１、ＣＨＰ１、ＤＤＸ５５、ＤＭＤ、ＤＮＡＪＣ９、ＥＮＯＳＦ１、ＦＡＮＣＬ、ＨＪＵＲＰ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＮＲＮＰＡ３Ｐ１、ＩＬ２３Ａ、ＩＱＧＡＰ１、ＬＯＣ４９４１２７、ＬＯＣ６４６４７１、ＬＯＨ１２ＣＲ、ＰＢＸＩＰ１、ＲＮＦ５、ＳＥＲＴＡＤ２、ＳＬＣ３５Ｇ５、ＳＰＡＴＳ２Ｌ、ＴＤＲＤ７、ＴＸＫ、及びＹＹ２を含み； （２） 第２のテストサンプルを少なくとも２８個のバイオマーカーの発現を検出するために特異的な複数の薬剤と接触させることにより、第２の時点で対象からの第２のテストサンプルから少なくとも２８個のバイオマーカーの第２の発現レベルを決定し、ここで、第２の時点は、第１の時点の後、対象への治療の実施の後であり； （３）第１の発現レベルと第２の発現レベルを比較し； 及び（４）第２の発現レベルが、第１の発現レベルと比較して有意に減少した場合、対象が療法に対して反応することを決定する、を含む療法に対する黒色腫を有する対象による反応を決定する方法を提供する。
【００５０】
いくつかの実施形態において、当該方法は、外科的介入及び薬物療法（免疫療法又は標的療法等）等の黒色腫治療に対する治療の反応性を予測するか、又は患者が臨床的に安定したか、又は反応性若しくは非反応性であるか否かを予測することができる。いくつかの場合において、当該方法は、少なくとも７５％、8０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の特異度、感度、及び／又は精度でそのように行うことができる。いくつかの場合において、少なくとも７５％、8０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の特異度、感度、及び／又は精度で治療済黒色腫及び未治療黒色腫を区別できる。
【００５１】
いくつかの実施形態において、第１及び第２のテストサンプルは、同じタイプにすることが可能である。いくつかの実施形態において、第１及び第２のテストサンプルは、異なるタイプにすることが可能である。
【００５２】
いくつかの実施形態において、療法は、薬物療法であり得る。薬物療法は、免疫療法、標的療法、化学療法、又はそれらの組み合わせであり得る。いくつかの実施形態において、療法は、放射線療法であり得る。
【００５３】
いくつかの実施形態において、第１の時点は、対象への療法の実施前である。いくつかの実施形態において、第１の時点は、対象への療法の実施後である。第２の時点は、第１の時点から数日、数週間、又は数か月後である。例えば、第２の時点は、第１の時短から少なくとも１日、少なくとも７日、少なくとも１４日、少なくとも３０日、少なくとも６０日、又は少なくとも９０日であり得る。
【００５４】
いくつかの実施形態において、第２の発現レベルが、第１の発現レベルよりも少なくとも１０％低い場合、第２の発現レベルは、第１の発現レベルと比較して著しく減少する。いくつかの実施形態において、第２の発現レベルが、第１の発現レベルよりも少なくとも２０％低い場合、第２の発現レベルは、第１の発現レベルと比較して著しく減少する。いくつかの実施形態において、第２の発現レベルが、第１の発現レベルよりも少なくとも３０％低い場合、第２の発現レベルは、第１の発現レベルと比較して著しく減少する。いくつかの実施形態において、第２の発現レベルが、第１の発現レベルよりも少なくとも４０％低い場合、第２の発現レベルは、第１の発現レベルと比較して著しく減少する。いくつかの実施形態において、第２の発現レベルが、第１の発現レベルよりも少なくとも５０％低い場合、第２の発現レベルは、第１の発現レベルと比較して著しく減少する。いくつかの実施形態において、第２の発現レベルが、第１の発現レベルよりも少なくとも６０％低い場合、第２の発現レベルは、第１の発現レベルと比較して著しく減少する。いくつかの実施形態において、第２の発現レベルが、第１の発現レベルよりも少なくとも７０％低い場合、第２の発現レベルは、第１の発現レベルと比較して著しく減少する。いくつかの実施形態において、第２の発現レベルが、第１の発現レベルよりも少なくとも８０％低い場合、第２の発現レベルは、第１の発現レベルと比較して著しく減少する。いくつかの実施形態において、第２の発現レベルが、第１の発現レベルよりも少なくとも９０％低い場合、第２の発現レベルは、第１の発現レベルと比較して著しく減少する。
【００５５】
いくつかの実施形態において、当該方法は、少なくとも２８個のバイオマーカーの発現を検出するために特異的な複数の薬剤と第３のテストサンプルを接触させることにより、第３の時点で対象からの第３のテストサンプルから少なくとも２８個のバイオマーカーの第３の発現レベルを決定することをさらに含み、ここで、第３の時点は、第２の時点の後である。当該方法は、発現レベルの変化の傾向を示すプロットを作成することをさらに含むことができる。
【００５６】
本開示はまた、（１）黒色腫を有すると診断された患者又は黒色腫の疑いを有する対象からのテストサンプルから本質的に以下： ＡＴＬ１、ＡＴＰ６Ｖ０Ｄ、Ｃ１ＯＲＦ２１、ＣＦＬＡＲ、ＣＦＬＡＲ−ＡＳ１、ＣＨＰ１、ＤＤＸ５５、ＤＭＤ、ＤＮＡＪＣ９、ＥＮＯＳＦ１、ＦＡＮＣＬ、ＨＪＵＲＰ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＮＲＮＰＡ３Ｐ１、ＩＬ２３Ａ、ＩＱＧＡＰ１、ＬＯＣ４９４１２７、ＬＯＣ６４６４７１、ＬＯＨ１２ＣＲ、ＰＢＸＩＰ１、ＲＮＦ５、ＳＥＲＴＡＤ２、ＳＬＣ３５Ｇ５、ＳＰＡＴＳ２Ｌ、ＴＤＲＤ７、ＴＸＫ、ＹＹ２、ＴＯＸ４、及びＴＰＴ１の３０個のバイオマーカーからなるバイオマーカーの発現レベルを決定し、ここで、発現レベルが、テストサンプルを３０個のバイオマーカーの発現を検出するために特異的な複数の薬剤と接触させることにより測定され； （２）ＡＴＬ１、ＡＴＰ６Ｖ０Ｄ、Ｃ１ＯＲＦ２１、ＣＦＬＡＲ、ＣＦＬＡＲ−ＡＳ１、ＣＨＰ１、ＤＤＸ５５、ＤＭＤ、ＤＮＡＪＣ９、ＥＮＯＳＦ１、ＦＡＮＣＬ、ＨＪＵＲＰ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＮＲＮＰＡ３Ｐ１、ＩＬ２３Ａ、ＩＱＧＡＰ１、ＬＯＣ４９４１２７、ＬＯＣ６４６４７１、ＬＯＨ１２ＣＲ、ＰＢＸＩＰ１、ＲＮＦ５、ＳＥＲＴＡＤ２、ＳＬＣ３５Ｇ５、ＳＰＡＴＳ２Ｌ、ＴＤＲＤ７、ＴＸＫ、及びＹＹ２のそれぞれの発現レベルをＴＯＸ４の発現レベルに対し正規化し、それによって、ＡＴＬ１、ＡＴＰ６Ｖ０Ｄ、Ｃ１ＯＲＦ２１、ＣＦＬＡＲ、ＣＦＬＡＲ−ＡＳ１、ＣＨＰ１、ＤＤＸ５５、ＤＭＤ、ＤＮＡＪＣ９、ＥＮＯＳＦ１、ＦＡＮＣＬ、ＨＪＵＲＰ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＮＲＮＰＡ３Ｐ１、ＩＬ２３Ａ、ＩＱＧＡＰ１、ＬＯＣ４９４１２７、ＬＯＣ６４６４７１、ＬＯＨ１２ＣＲ、ＰＢＸＩＰ１、ＲＮＦ５、ＳＥＲＴＡＤ２、ＳＬＣ３５Ｇ５、ＳＰＡＴＳ２Ｌ、ＴＤＲＤ７、ＴＸＫ、及びＹＹ２のそれぞれの第１の正規化された発現レベルを取得し； （３）ＡＴＬ１、ＡＴＰ６Ｖ０Ｄ、Ｃ１ＯＲＦ２１、ＣＦＬＡＲ、ＣＦＬＡＲ−ＡＳ１、ＣＨＰ１、ＤＤＸ５５、ＤＭＤ、ＤＮＡＪＣ９、ＥＮＯＳＦ１、ＦＡＮＣＬ、ＨＪＵＲＰ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＮＲＮＰＡ３Ｐ１、ＩＬ２３Ａ、ＩＱＧＡＰ１、ＬＯＣ４９４１２７、ＬＯＣ６４６４７１、ＬＯＨ１２ＣＲ、ＰＢＸＩＰ１、ＲＮＦ５、ＳＥＲＴＡＤ２、ＳＬＣ３５Ｇ５、ＳＰＡＴＳ２Ｌ、ＴＤＲＤ７、ＴＸＫ、及びＹＹ２のそれぞれの発現レベルをＴＰＴ１の発現レベルに対し正規化し、それによって、ＡＴＬ１、ＡＴＰ６Ｖ０Ｄ、Ｃ１ＯＲＦ２１、ＣＦＬＡＲ、ＣＦＬＡＲ−ＡＳ１、ＣＨＰ１、ＤＤＸ５５、ＤＭＤ、ＤＮＡＪＣ９、ＥＮＯＳＦ１、ＦＡＮＣＬ、ＨＪＵＲＰ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＮＲＮＰＡ３Ｐ１、ＩＬ２３Ａ、ＩＱＧＡＰ１、ＬＯＣ４９４１２７、ＬＯＣ６４６４７１、ＬＯＨ１２ＣＲ、ＰＢＸＩＰ１、ＲＮＦ５、ＳＥＲＴＡＤ２、ＳＬＣ３５Ｇ５、ＳＰＡＴＳ２Ｌ、ＴＤＲＤ７、ＴＸＫ、及びＹＹ２のそれぞれの第２の正規化された発現レベルを取得し； （４）第１の正規化された発現レベルと第２の正規化された発現レベルを平均して、それぞれのバイオマーカーの正規化された発現レベルを取得し； （５）それぞれの正規化された発現レベ���をアルゴリズムに入力しスコアを生成し； （６）スコアを第１の所定のカットオフ値と比較する、を含むアッセイを提供する。
【００５７】
本開示はまた、（１）黒色腫を有すると診断された患者又は黒色腫の疑いを有する対象からのテストサンプルから以下：ＡＴＬ１、ＡＴＰ６Ｖ０Ｄ、Ｃ１ＯＲＦ２１、ＣＦＬＡＲ、ＣＦＬＡＲ−ＡＳ１、ＣＨＰ１、ＤＤＸ５５、ＤＭＤ、ＤＮＡＪＣ９、ＥＮＯＳＦ１、ＦＡＮＣＬ、ＨＪＵＲＰ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＮＲＮＰＡ３Ｐ１、ＩＬ２３Ａ、ＩＱＧＡＰ１、ＬＯＣ４９４１２７、ＬＯＣ６４６４７１、ＬＯＨ１２ＣＲ、ＰＢＸＩＰ１、ＲＮＦ５、ＳＥＲＴＡＤ２、ＳＬＣ３５Ｇ５、ＳＰＡＴＳ２Ｌ、ＴＤＲＤ７、ＴＸＫ、ＹＹ２、ＴＯＸ４、及びＴＰＴ１の３０個のバイオマーカーからなるバイオマーカーの発現レベルを決定し、ここで、発現レベルが、テストサンプルを３０個のバイオマーカーの発現を検出するために特異的な複数の薬剤と接触させることにより測定され； （２）ＡＴＬ１、ＡＴＰ６Ｖ０Ｄ、Ｃ１ＯＲＦ２１、ＣＦＬＡＲ、ＣＦＬＡＲ−ＡＳ１、ＣＨＰ１、ＤＤＸ５５、ＤＭＤ、ＤＮＡＪＣ９、ＥＮＯＳＦ１、ＦＡＮＣＬ、ＨＪＵＲＰ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＮＲＮＰＡ３Ｐ１、ＩＬ２３Ａ、ＩＱＧＡＰ１、ＬＯＣ４９４１２７、ＬＯＣ６４６４７１、ＬＯＨ１２ＣＲ、ＰＢＸＩＰ１、ＲＮＦ５、ＳＥＲＴＡＤ２、ＳＬＣ３５Ｇ５、ＳＰＡＴＳ２Ｌ、ＴＤＲＤ７、ＴＸＫ、及びＹＹ２のそれぞれの発現レベルをＴＯＸ４の発現レベルに対し正規化し、それによって、ＡＴＬ１、ＡＴＰ６Ｖ０Ｄ、Ｃ１ＯＲＦ２１、ＣＦＬＡＲ、ＣＦＬＡＲ−ＡＳ１、ＣＨＰ１、ＤＤＸ５５、ＤＭＤ、ＤＮＡＪＣ９、ＥＮＯＳＦ１、ＦＡＮＣＬ、ＨＪＵＲＰ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＮＲＮＰＡ３Ｐ１、ＩＬ２３Ａ、ＩＱＧＡＰ１、ＬＯＣ４９４１２７、ＬＯＣ６４６４７１、ＬＯＨ１２ＣＲ、ＰＢＸＩＰ１、ＲＮＦ５、ＳＥＲＴＡＤ２、ＳＬＣ３５Ｇ５、ＳＰＡＴＳ２Ｌ、ＴＤＲＤ７、ＴＸＫ、及びＹＹ２のそれぞれの第１の正規化された発現レベルを取得し； （３）ＡＴＬ１、ＡＴＰ６Ｖ０Ｄ、Ｃ１ＯＲＦ２１、ＣＦＬＡＲ、ＣＦＬＡＲ−ＡＳ１、ＣＨＰ１、ＤＤＸ５５、ＤＭＤ、ＤＮＡＪＣ９、ＥＮＯＳＦ１、ＦＡＮＣＬ、ＨＪＵＲＰ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＮＲＮＰＡ３Ｐ１、ＩＬ２３Ａ、ＩＱＧＡＰ１、ＬＯＣ４９４１２７、ＬＯＣ６４６４７１、ＬＯＨ１２ＣＲ、ＰＢＸＩＰ１、ＲＮＦ５、ＳＥＲＴＡＤ２、ＳＬＣ３５Ｇ５、ＳＰＡＴＳ２Ｌ、ＴＤＲＤ７、ＴＸＫ、及びＹＹ２のそれぞれの発現レベルをＴＰＴ１の発現レベルに対し正規化し、それによって、ＡＴＬ１、ＡＴＰ６Ｖ０Ｄ、Ｃ１ＯＲＦ２１、ＣＦＬＡＲ、ＣＦＬＡＲ−ＡＳ１、ＣＨＰ１、ＤＤＸ５５、ＤＭＤ、ＤＮＡＪＣ９、ＥＮＯＳＦ１、ＦＡＮＣＬ、ＨＪＵＲＰ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＮＲＮＰＡ３Ｐ１、ＩＬ２３Ａ、ＩＱＧＡＰ１、ＬＯＣ４９４１２７、ＬＯＣ６４６４７１、ＬＯＨ１２ＣＲ、ＰＢＸＩＰ１、ＲＮＦ５、ＳＥＲＴＡＤ２、ＳＬＣ３５Ｇ５、ＳＰＡＴＳ２Ｌ、ＴＤＲＤ７、ＴＸＫ、及びＹＹ２のそれぞれの第２の正規化された発現レベルを取得し； （４）第１の正規化された発現レベルと第２の正規化された発現レベルを平均して、それぞれのバイオマーカーの正規化された発現レベルを取得し； （５）それぞれの正規化された発現レベルをアル��リズムに入力しスコアを生成し； （６）スコアを第１の所定のカットオフ値と比較する、を含むアッセイを提供する。
【００５８】
黒色腫のバイオマーカー及びハウスキーパーの配列情報を表１に示す。
【００５９】
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【表１−７】
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【表１−８】
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【表１−９】
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【表１−１０】
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【表１−１１】
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【表１−１２】
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【表１−１３】
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【表１−１４】
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【表１−１５】
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【表１−１６】
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【表１−１７】
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【表１−１８】
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【表１−１９】
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【表１−２０】
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【表１−２１】
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【表１−２２】
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【表１−２３】
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【表１−２４】
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【表１−２５】
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【表１−２６】
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【表１−２７】
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【表１−２８】
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【表１−２９】
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【表１−３０】
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【表１−３１】
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【表１−３２】
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【表１−３３】
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【表１−３４】
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【表１−３５】
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【表１−３６】
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【表１−３７】
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【表１−３８】
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【表１−３９】
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【表１−４０】
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【表１−４１】
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【表１−４２】
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【表１−４３】
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【表１−４４】
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【表１−４５】
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【表１−４６】
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【表１−４７】
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【表１−４８】
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【表１−４９】
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【表１−５０】
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【表１−５１】
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【表１−５２】
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【表１−５３】
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【表１−５４】
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【表１−５５】
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【表１−５６】
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【表１−５７】
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【表１−５８】
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【表１−５９】
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【表１−６０】
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【表１−６１】
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【表１−６２】
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【表１−６３】
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【表１−６４】
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【表１−６５】
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【表１−６６】
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【表１−６７】
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【表１−６８】
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【表１−６９】
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【表１−７０】
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【表１−７１】
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【表１−７２】
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【表１−７３】
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【表１−７４】
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【表１−７５】
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【表１−７６】
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【表１−７７】
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【表１−７８】
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【表１−７９】
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【表１−８０】
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【表１−８１】
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【表１−８２】
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【表１−８３】
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【表１−８４】
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【表１−８５】
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【表１−８６】
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【表１−８７】
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【表１−８８】
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【表１−８９】
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【表１−９０】
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【表１−９１】
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【表１−９２】
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【表１−９３】
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【表１−９４】
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【表１−９５】
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【表１−９６】
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【表１−９７】
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【００６０】
定義
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、本開示において、冠詞の文法的対象の１つ又は複数（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。例として「要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素又は複数の要素を意味する。
【００６１】
本開示において、用語「及び／又は」は、特に明記しない限り、「及び」又は「又は」の何れかを意味するために使用される。
【００６２】
本明細書で用いられる場合、用語「ポリヌクレオチド」及び「核酸分子」は、リボヌクレオチド又はデオキシヌクレオチド、又は何れかのタイプのヌクレオチドの修飾形態の何れかで、少なくとも１０塩基又は塩基対長のヌクレオチドのポリマー形態を意味することで、及びＤＮＡの一本鎖及び二本鎖形態を含むことを意味することに交換可能に使用される。本明細書で用いられる場合、マイクロアレイ分析においてプローブとして機能する核酸分子又は核酸配列は、好ましくはヌクレオチド鎖、より好ましくはＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含む。他の実施形態において、核酸分子又は核酸配列は、例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡヘリックス、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）及び／又はリボザイム等の他の種類の核酸構造を含む。従って、本明細書で使用する用語「核酸分子」はまた、天然ヌクレオチドと同じ機能を示す非天然ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド及び／又は非ヌクレオチド構成要素を含む鎖を包含する。
【００６３】
本明細書で用いられる場合、ポリヌクレオチドの文脈で使用される用語「ハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ）」、「ハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ）」、「ハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｓ）」、及び同様の用語は、５０％ホルムアルデヒド／６ＸＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ／１００μｇ／ｍｌ ｓｓＤＮＡでの、ハイブリダイゼーションのための温度が３７℃を超え、０．１ＸＳＳＣ／０．１％ＳＤＳでの洗浄の温度が、５５℃を超えるハイブリダイゼーション等の従来のハイブリダイゼーション条件、及び好ましくは、厳しいハイブリダイゼーションの条件を指すことを意味する。
【００６４】
本明細書で用いられる場合、用語「正規化」又は「ノーマライザー（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｒ）」は、サンプル中のバイオマーカー濃度の生物学的変動ではなく、サンプルの取り扱い、サンプルの調製、及び測定方法に起因する技術的な変動から生じる影響を調整する標準値に関する微分値の表現を指す。例えば、差次的に発現されたタンパク質の発現を測定する場合、タンパク質の発現の絶対値は、発現が実質的に一定である標準タンパク質の絶対値に関して表現され得る。
【００６５】
用語「診断（ｄｉａｇｎｏｓｉｓ）」及び「診断（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）」は、それぞれ、用語「予後（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）」及び「予後（ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃｓ）」をそれぞれ包含し、並びに診断及び／又は予後を経時的にモニターする２つ以上の時点でのそのような手順の適用、及びそれに基づく統計的モデリングも包含する。さらに、用語「診断」は、ａ．予測（患者が侵襲的な疾患（過剰増殖／侵襲性）を発症する可能性が高いか否かを判断する）、ｂ．予後（将来、事前に選択された時間に患者の治療効果がより良いか悪いかを予測する）、ｃ．両方の選択、ｄ．治療薬モニタリング、及びｅ．再発モニタリングを含む。
【００６６】
生物学的サンプルに関して本明細書で使用される用語「提供する（ｐｒｏｖｉｄｉｎｇ）」は、対象から生物学的サンプルを直接又は間接的に取得することを指す。例えば、「提供する」とは、対象から生物学的サンプルを直接取得する行為を指すことができる（例えば、採血、組織生検、洗浄及び同様のものにより）。同様に、「提供する」とは、生物学的サンプルを間接的に取得する行為を指すことができる。例えば、提供とは、サンプルを直接取得した当事者からサンプルを受け取る実験室での行為、又は保存場所（ａｒｃｈｉｖｅ）からサンプルを取得する行為を指す。
【００６７】
「精度（ａｃｃｕｒａｃｙ）」は、測定又は計算された量（テストで報告された値）が実際の（又は真の）値に適合している度合いを指す。臨床的正確性は、真の治療結果（真の陽性（ＴＰ）又は真の陰性（ＴＮ）対誤分類された治療結果（擬陽性（ＦＰ）又は偽陰性（ＦＮ））の割合に関連し、他の指標の中でも、感度、特異度、陽性的中率（ＰＰＶ）又は陰性的中率（ＮＰＶ）、又は尤度、オッズ比として表される場合がある。
【００６８】
本明細書で使用される用語「生物学的サンプル」は、１つ以上のバイオマーカーを潜在的に含む生物学的供給源の何れかのサンプルを指す。生物学的サンプルの例は、組織、臓器、又は全血、血漿、血清、組織、洗液（ｌａｖａｇｅ）等の体液、又は疾患の検出に用いられるその他の検体が含まれる。
【００６９】
本明細書で使用される用語「対象」は、哺乳動物、好ましくはヒトを指す。
【００７０】
病状に関して使用される「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」又は「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、病状の予防、病状の発症又は発症速度の遅延、病状の発症リスクの低減、病状に関連する症状の発症の予防又は遅延、病状に関連する症状を軽減又は終わらせる、病状の完全又は部分的な大綱を引き起こす、又はそれらの何れかの組み合わせを指す場合がある。
【００７１】
疾患の治療により、バイオマーカーのレベルが変化し得る。本開示により、バイオマーカーのレベルの変化は測定され得る。バイオマーカーのレベルの変化は、疾患又は療法の進行をモニターするために使用される場合がある。
【００７２】
「変更された（ａｌｔｅｒｅｄ）」、「変更された（ｃｈａｎｇｅｄ）」、又は「大幅に異なる（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ）」は、合理的に比較可能な病状、プロファイル測定等からの検出可能な変更又は差異を指す。そのような変更は、全て又は全くない場合がある。それらは、増加的であり、線形である必要なない。それらは桁違いである可能性がある。変更は、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、１００％、又はそれ以上、又は０％〜１００％の間の何れかの値の増減であり得る。あるいは、変更は、１倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍以上、又は１倍〜５倍の間の何れかの値であり得る。変更は、ｐ値０．１、０．０５、０．００１、又は０．０００１で統計的に有意である場合がある。
【００７３】
用語「安定疾患」は、黒色腫の存在についての診断を指すが、黒色腫は治療されており、安定した状態、すなわち、画像データ及び／又は最良の臨床判断により決定される進行性ではない安定な状態を維持することを指す。
【００７４】
用語「進行性疾患」は、黒色腫の非常に高い活性な状態の存在に関する診断を指し、すなわち、治療されておらず、安定していない又は治療されて治療に反応しない、又は治療されて画像データ及び／又は最良の臨床診断によって決定されるように活性疾患が残存していることを指す。
【実施例】
【００７５】
本開示は、以下の実施例によってされに説明されるが、本開示の範囲又は本質において本開示を本明細書に記載の特定の手順に限定するものと解釈されるべきではない。特定の実施形態を例示するために実施例が提供され、それにより本開示の範囲に対する限定が意図されないことを理解されたい。さらに、本開示の本質及び／又は添付の特許請求の範囲から逸脱することなく、当業者にそれ自体を示唆し得る様々な他の実施形態、修正、及びそれらの均等物に頼ることができることを理解されたい。
【００７６】
実施例１
２８個のマーカー遺伝子パネルの導出
【００７７】
ｎ＝４９の全血サンプルからの生のプローブ強度（ｎ＝６，８９２，９６０の特徴）を使用して、異なるタイプの黒色腫サンプル間で最適に識別される遺伝子を特定した（例えば、治療済と未治療の同時）。合計２８個の転写産物が、黒色腫の挙動の潜在的なマーカーとして偏ることなく特定された（表２）。
【００７８】
黒色腫疾患動態の人工知能モデルは、コントロール（ｎ＝９０）、レスポンダー（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）／安定（ｎ＝６８）、及び進行的（ｎ＝６６）サンプルから全血におけるこれら２８個のマーカーの正規化遺伝子発現を使用して構築された。データセットは、モデル作成と検証のために、トレーニング（ｎ＝１６９）及びテスト（ｎ＝５５）のパーティションにランダムに分割された。トレーニングデータを最もよく予測する５つのアルゴリズム（ＸＧＢ、ＲＦ、ＴｒｅｅＢａｇ、ＳＶＭ、ＮＮＥＴ）が識別された。テストセットにおいて、各アルゴリズムがサンプルを予測した確立スコアを生成した。各確率スコアは、未知のサンプルがコントロール、レスポンダー／安定又は進行性クラスに属するアルゴリズムの「確実性」を反映する。例えば、未知のサンプルＳ１は、次の確立ベクトルを有することができる｛コントロール＝２０、レスポンダー＝５０、進行性＝３０｝。このサンプルは、スコアが５０の場合、レスポンダーとみなされるが、進行性の可能性がある場合もある（３０の確率）（図１）。
【００７９】
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【００８０】
診断： 黒色腫としてのサンプルの同定
【００８１】
テストセット１において、黒色腫をコントロールから区別するテストの有用性に関するデータは、表３に含まれる。測定基準は、図２に含まれる。これらは、感度９０％超、特異度１００％、ＰＰＶ１００％、ＮＰＶ１００％である。全体の精度は、９４％である。従って、このツールは、コントロール及び侵襲的な及び安定的な黒色腫疾患を区別できる。
【００８２】
【表３】
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【００８３】
テストは、７４人のコントロール及び９２人の黒色腫患者を含む第２のテストセット（テストセット２）で評価された。黒色腫の平均Ｍｅｌａｎｏｍｘスコアは、７３±３１対コントロール群１０±８であった（図３Ａ）。受信者操作曲線分析は、スコアが、曲線下面積（ＡＵＣ）０．９６を示し（図３Ｂ）、測定基準が、８８〜１００％であることを実証した（図３Ｃ）。
【００８４】
黒色腫の外科的除去との相関
【００８５】
一連の手術において（ｎ＝４６）、黒色腫の除去によりスコアが７４±１６から２０±１２に減少した（図４Ａ）。手術後の群の評価により、疾患の証拠がない患者１３±６（コントロール群と変わらない）と残存する疾患がある患者（３３±９）の間でスコアが、有意に異なることが確認された（図４Ｂ）。従って、Ｍｅｌａｎｏｍｘスコアは、手術の範囲を定義し、外科的治療を受けている人を特定することができる。
【００８６】
免疫療法及び標的化（ＢＲＡＦ阻害剤）療法の評価。
【００８７】
一連の治療において（ｎ＝３０）、イピリムマブ（ＣＴＬＡ４を標的とする免疫療法）、ニボルマブ（ＰＤ−１を標的とする免疫療法）又はＢＲＡＦ阻害剤（ベムラフェニブ）による５か月間の治療は、Ｍｅｌａｎｏｍｘスコアをそれぞれ、８８±１２から１５±５（ｐ＜０．０００１）、３５±１４（ｐ＜０．００１）及び３８±２１（ｐ＜０．０００１）に減少させた（図５）。治療群の全ての患者は安定していた。これは、Ｍｅｌａｎｏｍｘスコアを使用して黒色腫の免疫療法泳ぎ標的療法の両方の有効性を測定できること、及びスコアの低減が治療的介入に対する反応と相関することを示す。
【００８８】
遺伝子発現が黒色腫由来であることの確認。
【００８９】
黒色腫は、異なる黒色腫細胞系統、腫瘍組織での発現を評価し、血液中の発現を手術と同じ時点で採取した腫瘍組織と比較することにより、血液ベースの遺伝子発現アッセイの供給源であることを確認した。
【００９０】
２８個の遺伝子全てが、３つ全ての黒色腫細胞系統で高い発現を示した。スコアは、９４±６（Ｈｓ２９４Ｔ）〜８２±５（ＣＨＬ）〜４２±９（Ａ３７５）の範囲であった（図６Ａ）。
【００９１】
これら３つの細胞系統と正常な全血を使用したスパイクイン実験により、わずか１個の細胞が１ｍｌの血液にスパイクされたときに遺伝子発現スコアが検出されることが示された。単一の黒色腫細胞が検出可能であった。スコアは、２１±４（Ａ３７５）から３０±５（ＣＨＬ）から３４±２（Ｈ２２９４）の範囲であった（図６Ｂ）。スコアは、コントロール血液と比較して有意に上昇した（スパイクインなし； ｐ＜０．０００１）。
【００９２】
次に、腫瘍組織における遺伝子発現を評価した。一致した正常組織と比較して、２８個全ての遺伝子が黒色腫で高い発現を示し、スコアは、７０±２０対４±３（ｐ＜０．０００１）で有意に上昇した（図７Ａ）。
【００９３】
また、同じ時点で収集された腫瘍組織と血液の遺伝子発現を比較した。遺伝子発現は、高く一致し（ピアソンｒ：０．７４−０．８３、中央値：０．８１９）、腫瘍組織における遺伝子発現を特定し、血液では一致した（図７Ｂ）。
【００９４】
均等物
本発明は、上記の特定の実施形態に関連して説明されたが、その多くの代替、修正、及びそれらの他の変形は、当業者には明らかであろう。そのような全ての代替、修正、及び変形は、本発明の本質及び範囲に含まれることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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