(57)【要約】本発明は、ある個体（P）において既往性免疫反応がないかまたは少ないCAR-T細胞の連続用量を用いた免疫療法によって、ヒトにおいて癌を処置するための組成物キットおよび方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
操作された細胞と薬学的に許容されるビヒクルとを含むn個の薬学的単位用量のセットまたはキットを調製するための方法であって、
（i）患者PのHLA分子および/またはHLAアレルをジェノタイピングおよび/またはフェノタイピングする工程、
（ii)(a）Pの細胞に由来するHLA分子および/またはHLAアレルに完全にマッチする細胞の試料、あるいは
（a'）Pと比較した時に可能な限り少ない数のミスマッチを有する細胞の試料であって、任意で、該細胞が、Pの細胞に由来するHLA分子および/もしくはHLAアレルにマッチするようにさらに遺伝子組換えされているか、または該細胞が任意の潜在的に既往性の分子を発現しないようにさらに遺伝子組換えされている、試料
を選択することによって、ヒトドナーからの細胞の少なくとも5つの試料を選択および/または準備する工程、
（iii）少なくとも1種類のキメラ抗原受容体（CAR）もしくは1種類のT細胞受容体（TCR）を導入することによって、および/またはTCR遺伝子の少なくとも1種類の成分を不活化することによって、細胞を改変する工程
を含む、方法。
【請求項２】
HLA分子が、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DR、およびその組み合わせから選択される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
（a'）の試料のHLAがPのHLAの80％超にマッチする、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
細胞の試料を選択する工程が、HLA-A、HLA-B、およびHLA-DR遺伝子におけるトリプルホモ接合体を選択することを含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
細胞の試料を選択する工程が、HLA-A、HLA-B、およびHLA-DR遺伝子のうちの2つにおけるダブルホモ接合体を選択することを含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
ドナーが、
（i）データベースにおける自身のHLAタイピングの頻度、
（ii）他のドナーと比較した時の自身のHLAタイピング、ならびに
任意で、（iii）少なくとも6/6、好ましくは10/10のHLAアレルマッチングで分析および選択するコンピュータソフトウェアまたはプログラムを用いたPとのマッチングのレベル
に基づいて選択される、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
既往反応および移植片対宿主病のリスクを下げることを目標として、患者において、異なるドナーから生じた同種異系末梢血細胞の連続（N=移植片の数）処置を実施する使用のための連続注射用量のセットを調製するための方法であって、
（a）ドナーバンクに含まれる5人のドナーからなるいくつかの群をランダムにサンプリングする工程、
（b）HLA-A、HLA-B、およびHLA-DRアレルについて該群内の5人のドナーの遺伝子型を比較する工程、
（c）共通するHLA-A、HLA-B、およびHLA-DRアレルを示さない5人のドナーからなる群を選択する工程、
（d）工程（c）から得られた群において、該患者の民族集団の少なくとも80％（fmin）、好ましくは90％超、さらにより優先的には95％超の遺伝子型との、HLA-A、HLA-B、およびHLA-DR対立遺伝子の少なくとも50％マッチを示したものを選択する工程、
（e）工程（d）から選択されたドナーのそれぞれに由来する同種異系末梢血細胞を操作して、該末梢血細胞におけるTCRの発現を低減させるかまたは損なう工程、
（f）任意で、血液試料から、操作された末梢血細胞を増大する工程、ならびに
（g）異なるドナーに由来する操作された末梢血細胞を別々に前処置する工程
を含む、方法。
【請求項８】
末梢血細胞が免疫細胞、好ましくはT細胞である、請求項7記載の方法。
【請求項９】
請求項1〜6のいずれか一項記載の方法によって入手可能なn個の薬学的単位用量のセットまたはキット。
【請求項１０】
表1に記載されたもののいずれか1つとしてのn個の薬学的単位用量のセットまたはキット。
【請求項１１】
請求項7または8記載の方法によって入手可能な連続用量のキット。
【請求項１２】
既往反応および移植片対宿主病のリスクが低い患者に連続注射するための異なる同種異系末梢血細胞を含む、少なくとも2つ、好ましくは少なくとも3つ、より好ましくは少なくとも4つ、さらにより好ましくは少なくとも5つの組成物を含むキットであって、該同種異系末梢血細胞が、それぞれ、HLA-A、HLA-B、およびHLA-DRアレルについてホモ接合性のドナーから選択され、該ドナーが、共通するHLA-A、HLA-B、およびHLA-DRアレルを共有しない、キット。
【請求項１３】
末梢血細胞がT細胞である、請求項12記載のキット。
【請求項１４】
末梢血細胞がT細胞受容体を不活化するように遺伝子操作されている、請求項12または13記載のキット。
【請求項１５】
末梢血細胞にはキメラ抗原受容体が付与されている、請求項12〜14のいずれか一項記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、既往反応を誘導しないか、またはわずかな既往反応を誘導する、細胞免疫療法に適した、操作された細胞と、薬学的に許容されるビヒクルとを含む、n個の薬学的単位用量のセットに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
養子免疫療法は、ウイルス感染または癌などの疾患を処置するための有望な戦略の1つである。養子免疫療法に用いられる細胞は、免疫細胞前駆体の分化、抗原特異的T細胞の増大、または遺伝子工学によるT細胞もしくは分化した免疫細胞前駆体のリダイレクション(redirection)によって作製することができる(Park, Rosenberg et al. 2011)。
【０００３】
細胞を特定の病理学的細胞に向けるために、内因性TCRの非存在下でもトランスジェニックT細胞受容体(TCR)またはキメラ抗原受容体(CAR)を細胞表面で首尾良く発現させることができる。これらの合成受容体は、1つの融合分子の形で1つまたは複数のシグナル伝達ドメインと結合したターゲティング部分を含むか、または(WO2014039523A1)に記載のように、いくつかの非共有結合的に連結された膜貫通ドメインにある。
【０００４】
非常に多くの研究において、CARの結合部分は、それを発現する免疫細胞の活性を特定の分子、好ましくは、腫瘍または病理学的細胞の表面で発現している特定の分子にリダイレクトすることができる。従って、モノクローナル抗体の軽鎖可変断片および重鎖可変断片が可動性リンカーでつながっている単鎖抗体(scFv)は非常に効率的な場合がある。受容体またはリガンドドメインに基づく結合部分も首尾良く用いられてきた。このような細胞外ドメインは、当初はCD28、CD3ζ、4-1BBの細胞質領域から導き出されたシグナル伝達ドメインに連結されたか、または第一世代、第二世代、および第三世代のCARではFc受容体γ鎖から導き出されたシグナル伝達ドメインに連結された。CARが病理学的細胞に結合するとシグナル伝達が生じ、脱顆粒、サイトカイン放出を含む事象のカスケードが誘発され、最終的には標的細胞が破壊される。
【０００５】
従って、CARを用いると、細胞傷害性T細胞を、リンパ腫(Jena, Dotti et al. 2010)を含む腫瘍細胞の表面に発現している特定の抗原にリダイレクトし、これらの標的細胞を破壊することが可能になる。
【０００６】
養子免疫療法を用いて患者を処置する現行のプロトコールは自己細胞移入に基づいている。このアプローチでは、ある特定の患者から回収されたTリンパ球がエクスビボで遺伝子組換えされるかまたは選択され、細胞数を増やすためにインビトロで培養され、最終的には患者に再注入される。
【０００７】
操作された免疫細胞の自己移入は、サイトカインストーム、GVHD(自己免疫疾患の場合がある)、または、マウス抗体断片を含む時がある編集された分子に対する免疫反応を含む、望ましくない免疫反応を誘導すると報告された(Villa NY, Rahman MM, McFadden G, Cogle CR. Therapeutics for Graft-versus-Host Disease: From Conventional Therapies to Novel Virotherapeutic Strategies. Lamfers MLM, Chiocca EA, eds. Viruses. 2016;8(3):85. doi:10.3390/v8030085)。
【０００８】
さらに、自家療法は、実際に適用するのには、かなりの技術的障害およびロジスティックな障害に直面する。自家療法を作製するには高価な専用の設備と専門職員が必要であり、患者の診断後に短時間で作製しなければならず、多くの場合、患者の前処置は免疫機能の劣化をもたらし、そのため患者のリンパ球が少数で存在する場合があり、十分に機能しないかまたは機能不全にさえなることがある。これらの障害があるために、それぞれの患者の自己細胞調製物は、実質上、新しい製品であり、そのため効力と安全性にはかなりのばらつきがある。
【０００９】
宿主に対する望ましくない免疫反応が少なく、患者全員において使用することができる操作された細胞を提供する必要に応えるために、癌細胞を破壊するように操作された、健常個体に由来する細胞が用いられる場合がある。しかしながら、ある個体に由来するT細胞が別の個体に移入された時に宿主にとって有害な場合があり、そのため移植片対宿主病(GvHD)の原因となり、潜在的に重大な組織損傷と死亡につながる。急性GVHDまたは慢性GVHDを担う分子機構が少なくとも部分的に突き止められている。同種異系細胞のレシピエントにおけるT細胞増殖とGvHDの発症につながり得る特定のTCRによるMHC認識は、ドナーとレシピエントとの間で一致しない。この問題を克服する目的で、内因性TCRの様々なサブユニットをコードするTCR遺伝子の発現を低減するために新たな遺伝子編集法が用いられてきた(Domain-swapped T cell receptors improve the safety of TCR gene therapy.(Bethune MT, Gee MH, Bunse M, et al. Domain-swapped T cell receptors improve the safety of TCR gene therapy. Rath S, ed. eLife. 2016;5:e19095. doi:10.7554/eLife.19095)。
【００１０】
従って、いわゆる「同種異系TCR KO治療用細胞」または「既製の、すぐ使用できる(off the shelve-ready to use-)CART細胞」は、病理学的細胞、癌にリダイレクトされるか、または感染し、GVHDを誘導しないか、もしくは低減したGVHDを誘導するように操作されている。このようなTCR-KO細胞を患者に注入すると、少なくとも2人の小児患者における難治性AMLに罹患している患者ではGVHDが大幅に低減したか、またはGVHDのリスクが大幅に低下し、生存率が上昇した(Gray N, 2016. http://www.biopharmadive.com/news/cellectis-t-cell-therapy-clears-leukemia-in-second-baby/418862/)。
【００１１】
同種異系細胞療法もしくは臓器移植を用いた時に遭遇する、または異所性抗原を発現する自己細胞療法もしくは移植片を用いた時でも遭遇する問題の1つは、個体が、(細胞に由来する)移植片に存在する1種類または複数種の抗原に以前に曝露されており、免疫系によって寛容されない時の、移植された細胞、組織、または臓器(「移植片」)の起こり得る免疫学的反応および拒絶反応にある。万一、前記抗原に再曝露された場合は、「既往反応」が移植片を効率的および/または迅速に拒絶する可能性が高い。
【００１２】
このような状況は特に、移植片が、移植された個体に存在しない(または個体の免疫系によって寛容されない)高分子特徴(例えば、タンパク質、糖、脂質、またはその組み合わせ)を有する時に起こることが知られている。
【００１３】
この事例は、移植片が、過去に個体に曝露されている場合、個体の分子とは異なる分子、例えば、HLAアレル産物を有する時に観察される。
【００１４】
既往反応による移植片拒絶反応は免疫系の様々な区画が関与する。従って、拒絶された抗原は、抗体によっておよび/またはTリンパ球の特定の受容体(TCR)によって、認識される。
【００１５】
しかし、特に固形癌を処置するためには、2回以上の連続移植を行い、既往反応(繰り返し曝露されたことに起因する、あらゆる免疫応答)を最小限にすることが望ましい場合がある。
【００１６】
従って、操作されたT細胞養子免疫療法を用いて、癌細胞に由来する抗原を標的とする時に、同じ癌マーカーの同じ抗原または異なる抗原を標的とする反復処置および連続処置を行うことが有用な場合がある。新たな癌、または再発癌の場合に、または難治性癌の場合でさえ、異なる抗原を標的とする連続処置を行うことも有用な場合がある。全ての場合において既往反応を回避し、副作用を最小限にしなければならない。
【００１７】
従って、「同種異系」免疫療法を用いるか「自己」免疫療法を用いるかに関係なく、連続免疫療法の副作用を低減し、このような処置の効率と安全性を改善するために、これらの問題の解決策を突き止めることが強く必要とされている。
【００１８】
本発明における提案された技術的解決策は既往反応を最小限することに関し、また、免疫療法の間に、特に、CAR発現細胞を用いた同種異系免疫療法または自己免疫療法の間に、腫瘍量を実際に、かつかなり減らし、管理しながら、免疫療法に関係する重大な副作用、例えば、一用量または連続用量のT細胞を移植した時の宿主対移植片反応である移植片対宿主病の非存在下で、既往反応を最小限にするかまたは阻害することにも関する。
【発明の概要】
【００１９】
以下の方法が提供される：
1．
本発明は概して、操作された細胞と薬学的に許容されるビヒクルとを含むn個の薬学的単位用量のセットまたはキットを調製するための方法を提供し、本方法は、
（i）患者PのHLA分子および/またはHLAアレルをジェノタイピングおよび/またはフェノタイピングする工程、
（ii)(a）Pの細胞に由来するHLA分子および/またはHLAアレルに完全にマッチする細胞の試料、あるいは
（a'）Pと比較した時に可能な限り少ない数のミスマッチを有する細胞の試料であって、任意で、該細胞が、Pの細胞に由来するHLA分子および/もしくはHLAアレルにマッチするようにさらに遺伝子組換えされているか、または該細胞が任意の潜在的に既往性の分子を発現しないようにさらに遺伝子組換えされている、試料
を選択することによって、ヒトドナーからの細胞の少なくとも5つの試料を選択および/または準備する工程、
（iii）少なくとも1種類のキメラ抗原受容体（CAR）もしくは1種類のT細胞受容体（TCR）を導入することによって、および/またはTCR遺伝子の少なくとも1種類の成分を不活化することによって、細胞を改変する工程
を含む。
2．
HLA分子が、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DR、およびその組み合わせから選択される、1に記載の方法が提供され、かつ好ましい。
3．
（a'）の試料のHLAがPのHLAの80％超にマッチする、1または2に記載の方法もまた提供される。
4．
細胞の試料を選択する工程が、HLA-A、HLA-B、およびHLA-DR遺伝子におけるトリプルホモ接合体を選択することを含む、1〜3のいずれか一つに記載の方法が提供される。
5．
細胞の試料を選択する工程が、HLA-A、HLA-B、およびHLA-DR遺伝子のうちの2つにおけるダブルホモ接合体を選択することを含む、1〜3のいずれか一つに記載の方法が提供される。
6．
ドナーが、
（i）データベースにおける自身のHLAタイピングの頻度、
（ii）他のドナーと比較した時の自身のHLAタイピング、ならびに
任意で、（iii）少なくとも6/6、好ましくは10/10のHLAアレルマッチングで分析および選択するコンピュータソフトウェアまたはプログラムを用いたPとのマッチングのレベル
に基づいて選択される、1〜5のいずれか一つに記載の方法が提供される。
7．
別の概略的な局面として、本発明は、既往反応および移植片対宿主病のリスクを下げることを目標として、患者において、異なるドナーから生じた同種異系末梢血細胞の連続（N=移植片の数）処置を実施する使用のための連続注射用量のセットを調製するための方法を提供し、本方法は、
（a）ドナーバンクに含まれる5人のドナーからなるいくつかの群をランダムにサンプリングする工程、
（b）HLA-A、HLA-B、およびHLA-DRアレルについて該群内の5人のドナーの遺伝子型を比較する工程、
（c）共通するHLA-A、HLA-B、およびHLA-DRアレルを示さない5人のドナーからなる群を選択する工程、
（d）工程（c）から得られた群において、該患者の民族集団の少なくとも80％（fmin）、好ましくは90％超、さらにより優先的には95％超の遺伝子型との、HLA-A、HLA-B、およびHLA-DR対立遺伝子の少なくとも50％マッチを示したものを選択する工程、
（e）工程（d）から選択されたドナーのそれぞれに由来する同種異系末梢血細胞を操作して、該末梢血細胞におけるTCRの発現を低減させるかまたは損なう工程、
（f）任意で、血液試料から、操作された末梢血細胞を増大する工程、ならびに
（g）異なるドナーに由来する操作された末梢血細胞を別々に前処置する工程
を含む。
8．
末梢血細胞が免疫細胞、好ましくはT細胞である、7に記載の方法が提供される。
9．
別の概略的な局面として、本発明は、上記1〜6のいずれか一つに記載の方法によって入手可能なn個の薬学的単位用量のセットまたはキットを提供する。
10．
表1に記載されたもののいずれか1つとしてのn個の薬学的単位用量のセットまたはキットは、本発明の一部である。
11．
別の概略的な局面として、本発明は、7または8に記載の方法によって入手可能な連続用量のキットを提供する。
12．
別の概略的な局面として、本発明は、
既往反応および移植片対宿主病のリスクが低い患者に連続注射するための異なる同種異系末梢血細胞を含む、少なくとも2つ、好ましくは少なくとも3つ、より好ましくは少なくとも4つ、さらにより好ましくは少なくとも5つの組成物を含むキットであって、該同種異系末梢血細胞が、それぞれ、HLA-A、HLA-B、およびHLA-DRアレルについてホモ接合性のドナーから選択され、該ドナーが、共通するHLA-A、HLA-B、およびHLA-DRアレルを共有しない、キット
を提供する。
13．
別の概略的な局面として、本発明は、末梢血細胞がT細胞である、12に記載のキットを提供する。
14．
別の概略的な局面として、本発明は、末梢血細胞がT細胞受容体を不活化するように遺伝子操作されている、12または13に記載のキットを提供する。
15．
末梢血細胞にはキメラ抗原受容体が付与されている、12〜14のいずれか一つに記載のキットが提供される。
16．
別の概略的な局面として、本発明は、操作された細胞と、薬学的に許容されるビヒクルとを含む、n個の薬学的単位用量のセットまたはキットを調製するための方法を提供し、本方法は、
（a）互いに、共通するHLAアレルがない免疫細胞の少なくとも5つの試料を選択する工程、または
（a）互いに、Pで以前に免疫された人と共通するHLAアレルがない免疫細胞の少なくとも5つの試料を選択する工程、または
（a）互いに、Pで以前に免疫された人と共通するHLA-A、HLA-B、HLA-C、およびHLA-DRアレルがない免疫細胞の少なくとも5つの試料を選択する工程、または
（a）互いに、Pで以前に免疫された人と共通するHLA-A、HLA-B、HLA-C、およびHLA-DRアレルがない免疫細胞の少なくとも5つの試料を選択する工程であって、これらのアレルが一般集団において表される頻度が0.6％より大きく、かつ0.1％以上である、工程、または
（a）互いに、Pで以前に免疫された人と共通するHLA-A、HLA-B、HLA-C、およびHLA-DRアレルがない免疫細胞の少なくとも5つの試料を選択する工程であって、これらのアレルが一般集団において表される頻度が5e-5より大きい、工程
を含む。
【００２０】
別の局面として、本発明は、患者Pの免疫療法のためのn個の薬学的単位用量のセットまたはキットを調製するための方法を提供し、本方法は、
バンクに由来する少なくとも2つのドナー細胞試料から、好ましくは、本発明に従って選択された5人のドナーn=5、T1、T2、T3、T4、T5から、および/もしくはP自身から、標的細胞(T)を準備する工程、または
バンクに由来する少なくとも2つのドナー細胞試料から、好ましくは、5人のドナーn=5、T1、T2、T3、T4、T5から、および/もしくはP自身から、標的細胞(T)を準備する工程、
T、もしくはT1、T2、T3、T4、T5を放射線照射する工程、
Pが、任意の免疫細胞(例えば、妊娠中、輸血された血小板、もしくはドナー細胞試料の操作された免疫細胞)に曝露される前および/もしくは曝露された後に、(T)もしくはT1、T2、T3、T4、T5を、処置することが意図される患者Pの免疫細胞(E)と、少なくとも1回接触させる工程、
1：10000〜10000：1、好ましくは100：1〜1：100、さらにより好ましくは20：1、10：1、5：1、1：1、1：5、1：15、1：30、さらにより好ましくは5：1の異なるE：T比で、1日、2日、3日、4日、もしくは5日にわたってエフェクターと接触した標的生細胞の数を、同じ時間の長さにわたって増殖させたエフェクターの非存在下での標的生細胞の数で割ったものを算出することによって、放射線照射済みドナー細胞試料T(Tは、対照として、もしくは抗CART細胞活性を測定する場合、Pの細胞でもよい)に対するEの細胞溶解活性を測定する工程、
Tに対するEの細胞溶解活性を、自身の放射線照射済み免疫細胞(自己系-図5)および別の個体Yに由来する放射線照射済み免疫細胞(T)に対する個体Xのものと比較する工程であって、Xの細胞がYのハプロタイプ一致の細胞、マッチする細胞、もしくはミスマッチする細胞でもよく、XがYの細胞で免疫されていても免疫されていなくてもよく、Xの細胞がYの細胞に3回曝露された後に、Yに対するXのCTL活性が測定される、工程
を含む。
【００２１】
EがCD3/CD28抗体を用いて活性化される、および/またはEが放射線照射済みTと1：10000〜10000：1、好ましくは100：1〜1：100、さらにより好ましくは20：1、10：1、5：1、1：1、1：5、1：15、1：30の異なるE：T比で1回、2回、または3回接触された後に細胞溶解活性が測定される、前記方法が提供される。
【００２２】
標的生細胞は、Eの非存在下での標的細胞の生存率と比べて確かめられる(正規化される)。
【００２３】
前記方法は、比E：T 1：1で、1日、2日、3日、4日にわたってエフェクターと接触した、または5日目の標的生細胞の数を、同じ時間の長さにわたって増殖させたエフェクターの非存在下での標的生細胞の数で割ったものを測定することによって求めた時に、Eが前記標的細胞で3回活性化された時に、0.2超および0.2〜1、好ましくは0.5、さらにより好ましくは1または0.9の細胞溶解活性を有すれば、免疫療法のためにドナー細胞試料Tのオリジナルの細胞を操作するさらなる工程を含む。
【００２４】
本発明は、第2、第3などの処置として、操作されたT1の後に注射されることが意図されるUCARTに対する潜在的なCTL活性を検出するために、E(Pの免疫細胞)を放射線照射済みT2、T3、T4、T5と接触させる工程であって、Eが、操作されたT1で処理された後のPに由来する細胞を含む、工程をさらに含む方法を提供し、
Eの細胞溶解活性は、放射線照射済みT2(Eの非存在下での生細胞T2の数と比べた、E：T2 1：1混合物中の生細胞の数)に対して検出され、対照と比較した時に1未満または0.5未満であれば、T2は破棄され、Pの処置に用いられない場合がある。
【００２５】
本発明は概して、ある個体(P)における既往性反応と比較した時に、前記個体Pにおいて既往性免疫反応を誘導しないか、またはわずかな既往性免疫反応を誘導する、操作された細胞と薬学的に許容されるビヒクルとを含むn個の薬学的単位用量のセットまたはキットを提供し、細胞に由来する免疫原性抗原に以前に曝露され、免疫原性抗原(好ましくは、T細胞依存性抗原)に対してPに獲得免疫があれば、その後に、Pに獲得免疫がある前記細胞に由来する免疫原性抗原を含む、操作された細胞の単位用量が移植される。
【００２６】
本発明は、Pから得られた薬学的単位用量を含む、上記に従う、操作された細胞と、薬学的に許容されるビヒクルとを含む、n個の薬学的単位用量のセットまたはキットを提供する。
【００２７】
Pとは異なるドナーから得られた薬学的単位用量を含む、上記に従う、操作された細胞と、薬学的に許容されるビヒクルとを含む、n個の薬学的単位用量のセットまたはキット。
【００２８】
nが少なくとも5である、上記のいずれか1つに従うn個の薬学的組成物のセットまたはキット。
【００２９】
本発明は概して、それぞれの薬学的単位用量の中にある細胞が少なくとも1種類のCARまたはTCRを含み、前記CARまたはTCRがn個の連続用量において同じである、および/または異なる、上記に従うn個の薬学的単位用量のセットまたはキットを提供する。
【００３０】
本発明は概して、薬学的単位用量の中にある細胞に由来する免疫原性抗原が、少なくとも、http://hla.alleles.org/nomenclature/updates/201606.htmlに記載のようにHLAアレルの少なくとも1つによってコードされる産物を含む、上記のいずれか1つに従うn個の薬学的単位用量のセットまたはキットを提供する。
【００３１】
本発明は、最初に、操作された細胞に由来する免疫原性抗原が患者のものにマッチする薬学的単位用量が用いられ、次いで、ドナーの操作されていない細胞または操作された細胞に由来する免疫原性抗原がドナーPのものとミスマッチする薬学的単位用量が用いられるように、薬学的単位用量が好みの順序で連続的に用いられる、上記のいずれか1つに従う、n個の薬学的単位用量のセットを提供する。
【００３２】
本発明は、癌を予防または処置するための免疫療法における薬として使用するための上記のいずれか1つに従うn個の薬学的単位用量のセットまたはキットを提供する。
【００３３】
前記癌が、再発性難治性の癌または癌合併症、例えば、転移である、上記に従う使用のためのn個の薬学的単位用量のセットまたはキットも提供される。
【００３４】
一局面において、本発明は、それぞれの薬学的単位用量が少なくとも1種類の免疫抑制薬と組み合わされる、上記に従う使用のための、操作された細胞と、薬学的に許容されるビヒクルとを含む、n個の薬学的単位用量のセットまたはキットを提供する。
【００３５】
本発明は、上記に従う使用のための、操作された細胞と、薬学的に許容されるビヒクルとを含む、n個の薬学的単位用量のセットまたはキットであって、それぞれの薬学的単位用量が、X線、γ線、荷電粒子、コルチコステロイド、生物製剤、抗体、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ(IMDH)阻害剤、mtor阻害剤、およびその組み合わせから選択される以下の処置の少なくとも1つと組み合わせられる、セットまたはキットを提供する。
【００３６】
本発明は、上記に従う使用のための、操作された細胞と、薬学的に許容されるビヒクルとを含む、n個の薬学的単位用量のセットまたはキットであって、それぞれの薬学的単位用量がフルダラビンおよびシクロホスファミドと組み合わせられる、セットまたはキットを提供する。
【００３７】
それぞれの薬学的単位用量が、45日ごとに、ならびにフルダラビンおよびシクロホスファミドが3〜5日間投与された日の次の日に投与される、上記に従う使用のための、操作された細胞と、薬学的に許容されるビヒクルとを含む、n個の薬学的単位用量のセットまたはキット。
【００３８】
本発明は、CLL、ALL、MMに罹患している患者の連続処置において使用するための、上記に従う使用のための、操作された細胞と、薬学的に許容されるビヒクルとを含む、n個の薬学的単位用量のセットまたはキットを提供する。
【００３９】
本発明は、1〜14のいずれか1つに従う、n個の薬学的単位用量のセットまたはキットを調製するための少なくとも230人のドナーのバンクを提供する。
【００４０】
本発明は、上記のいずれか1つに従う、n個の薬学的単位用量のセットまたはキットを調製するための少なくとも230人のドナーのバンクを提供する。
【００４１】
本発明は、表1に記載のもののいずれか1つとしての、n個の薬学的単位用量のセットまたはキットを提供する。
【００４２】
この態様では、TCRを不活化し、キメラ抗原受容体をコードする遺伝子を各試料に導入するように、表1に記載の細胞試料を操作した。
【００４３】
本発明は、操作された細胞と、薬学的に許容されるビヒクルとを含む、n個の薬学的単位用量のセットまたはキットを調製するための方法を提供し、本方法は、
(a)患者PのHLA分子および/またはHLAアレルをジェノタイピングおよび/またはフェノタイピングする工程、
(b)前記患者Pの既存の抗体および/またはCTL応答を測定および定量する工程、
(c)(i)Pの細胞に由来する免疫原性抗原に完全にマッチするドナー(ドナー細胞試料)を選択することによって、
(ii)Pと比較した時に可能な限り少ない数のミスマッチを有するドナー(ドナー細胞試料)を選択することによって、好ましくは、ペアのドナー間で共通抗原がない試料を選択し、任意で、Pにマッチするように細胞を改変することによって、
ドナーのバンクに由来する細胞の少なくとも5つの試料を選択および/または準備する工程、
(d)少なくとも1種類のCARもしくはTCRを導入することによって、および/またはTCR遺伝子の少なくとも1つの成分を不活化することによって細胞を改変する工程
を含む。
【００４４】
本発明は、操作された細胞と、薬学的に許容されるビヒクルとを含む、n個の薬学的単位用量のセットまたはキットを調製するための方法を提供し、本方法は、
(a)患者PのHLA分子および/またはHLAアレルをジェノタイピングおよび/またはフェノタイピングする工程、
(b)任意で、前記患者Pの既存の抗体および/またはCTL応答を測定および定量する工程、
(c)(iii)Pの細胞に由来する免疫原性抗原に完全にマッチするドナー(ドナー細胞試料)を選択することによって、および/または
(iv)Pと比較した時に可能な限り少ない数のミスマッチを有するドナー(ドナー細胞試料)を選択することによって、好ましくは、ペアのドナー間で共通抗原がない試料を選択することによって、
(v)任意で、Pにマッチするように細胞を改変することによって、
ドナーのバンクに由来する細胞の少なくとも5つの試料を選択および/または準備する工程、
(d)少なくとも1種類のCARもしくはTCRを導入することによって、および/またはTCR遺伝子の少なくとも1つの成分を不活化することによって細胞を改変する工程
を含む。
【００４５】
一局面において、本発明は、操作された細胞と、薬学的に許容されるビヒクルとを含む、n個の薬学的単位用量のセットまたはキットを調製するための方法を提供し、本方法は、
-コンピュータソフトウェアを用いて、
ペアのドナー間で共通抗原がないドナー(ドナー細胞試料)であって、好ましくは、前記抗原が、MHC分子クラスIおよび/もしくはクラスII、より好ましくは、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA DR、さらにより好ましくは、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOBである、ドナー(ドナー細胞試料)、または
ペアのドナー間で共通抗原がないドナー(ドナー細胞試料)であって、好ましくは、前記抗原が、MHC分子クラスIおよび/もしくはクラスII、より好ましくは、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLADR、さらにより好ましくは、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOBである、ドナー(ドナー細胞試料)
を選択することによって、ドナーのバンクに由来する細胞を選択および/または準備する工程であって、前記MHC分子の前記アレルが検出される頻度が一般集団において0.1％の間で観察される、工程、
少なくとも1種類のCARもしくはTCRを導入することによって、および/またはTCR遺伝子の少なくとも1つの成分を不活化することによって、細胞を改変する工程
を含む。
【００４６】
本発明は、操作された細胞と、薬学的に許容されるビヒクルとを含む、n個の薬学的単位用量のセットまたはキットを調製するための方法を提供し、本方法は、
(e)任意で、患者PのHLA分子および/またはHLAアレルをジェノタイピングおよび/またはフェノタイピングする工程、
(f)任意で、前記患者Pの既存の抗体および/またはCTL応答を測定および定量する工程、
(g)(vi)Pと比較した時に可能な限り少ない数のミスマッチを有するドナー(ドナー細胞試料)を選択し、好ましくは、ペアのドナー間で共通抗原がない試料を選択し、
(vii)Pにマッチするように細胞を改変することによって
ドナーのバンクに由来する細胞の少なくとも5つの試料を選択および/または準備する工程、
(e)少なくとも1種類のCARもしくはTCRを導入することによって、および/またはTCR遺伝子の少なくとも1つの成分を不活化することによって細胞を改変する工程
を含む。
【００４７】
本発明は概して、ある個体(P)における既往性反応と比較した時に、前記個体Pにおいて既往性免疫反応を誘導しないか、またはわずかな既往性免疫反応を誘導する連続療法として使用するための、操作された細胞と、薬学的に許容されるビヒクルとを含む、n個の薬学的単位用量のセットまたはキットであって、細胞に由来する免疫原性抗原に以前に曝露され、免疫原性抗原(好ましくは、T細胞依存性抗原)に対してPに獲得免疫があれば、次いで、その後に、Pに獲得免疫がある、前記細胞に由来する免疫原性抗原を含む、操作された細胞の単位用量が移植される、セットまたはキットを提供する。
【００４８】
本発明はまた、単独で、または少なくとも1種類の免疫抑制薬と組み合わせて使用するための、操作された細胞と、薬学的に許容されるビヒクルとを含む、n個の薬学的単位用量のセットまたはキットも提供する。
【００４９】
別の局面において、本発明はまた、同じ細胞試料または同じ操作された細胞の連続用量が連続療法または再投薬(redosing)として用いられる、上記のような、少なくとも1種類の免疫抑制薬と組み合わせて使用するための、操作された細胞と、薬学的に許容されるビヒクルとを含む、n個の薬学的単位用量のセットまたはキットも提供する。
【００５０】
別の局面において、本発明はまた、X線、γ線、荷電粒子、コルチコステロイド、生物製剤、抗体、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ(IMDH)阻害剤、mtor阻害剤、およびその組み合わせから選択される処置の少なくとも1つと組み合わせた、上記のいずれか1つに従う、操作された細胞と、薬学的に許容されるビヒクルとを含む、n個の薬学的単位用量のセットまたはキットも提供する。
【００５１】
別の局面において、本発明はまた、コルチコステロイド、生物製剤、抗体、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ(IMDH)阻害剤、mtor阻害剤、およびその組み合わせから選択される処置の少なくとも1つと組み合わせた、上記のいずれか1つに従う、操作された細胞と、薬学的に許容されるビヒクルとを含む、n個の薬学的単位用量のセットまたはキットも提供する。
【００５２】
別の局面において、本発明はまた、少なくとも2種類の免疫抑制薬物と組み合わされた状態で使用するための、操作された細胞と、薬学的に許容されるビヒクルとを含む、上記に従う、操作された細胞と、薬学的に許容されるビヒクルとを含む、n個の薬学的単位用量のセットまたはキットも提供する。
【００５３】
別の局面において、本発明はまた、フルダラビンおよびシクロホスファミドと組み合わせて使用するための、またはフルダラビンおよびシクロホスファミドと組み合わされる、上記に従う、操作された細胞と、薬学的に許容されるビヒクルとを含む、n個の薬学的単位用量のセットまたはキットも提供する。
【００５４】
さらに別の局面において、本発明はまた、フルダラビンおよびシクロホスファミドと組み合わせて使用するための、上記のいずれか1つに従う、操作された細胞と、薬学的に許容されるビヒクルとを含む、n個の薬学的単位用量のセットまたはキットであって、前記単位用量が、45日ごとに、フルダラビンおよびシクロホスファミドが3〜5日間投与された日の次の日に投与される、セットまたはキットも提供する。
【００５５】
別の局面において、本発明はまた、CLLに罹患している患者において使用するための、上記に従う、操作された細胞と、薬学的に許容されるビヒクルとを含む、n個の薬学的単位用量のセットまたはキットも提供する。
【００５６】
別の局面において、本発明はまた、n個の用量のそれぞれがPから得られた、上記に従う、操作された細胞と、薬学的に許容されるビヒクルとを含む、n個の薬学的単位用量のセットまたはキットも提供する。
【００５７】
一局面において、本発明はまた、n個の用量のそれぞれがドナーから得られた、上記に従うn個の薬学的単位用量のセットまたはキットも提供する。
【００５８】
一局面において、本発明はまた、n個の用量のそれぞれが、異なるドナーから得られ、Pとは異なる、上記に従うn個の薬学的単位用量のセットまたはキットも提供する。
【００５９】
一局面において、本発明はまた、nが少なくとも5である、上記のn個の薬学的組成物のセットまたはキットも提供する。
【００６０】
一局面において、本発明はまた、上記のいずれか1つに従うn個の薬学的単位用量のセットまたはキットも提供し、それぞれの薬学的単位用量の細胞は、少なくとも1種類のCARまたはTCRを含み、n個の連続用量において前記CARまたはTCRが同じおよび/または異なる。
【００６１】
一局面において、本発明はまた、HLA系因子のWHO命名委員会(WHO Nomenclature Committee for Factors of the HLA System)のSteven G. E. Marsh により編集され、
HLA (2016) 88:142-51. Human Immunology (2016) 77:1309-17. International Journal of Immunogenetics (2016) 43:320-9において公開された、http://hla.alleles.org/nomenclature/updates/201606.htmlに記載のように、特定日と、修正されているのであれば修正日と共に、Nomenclature | How an allele is named | Nomenclature Reports | Nomenclature Updates | Nomenclature Committee | HLA WorkshopsNomenclature for Factors of the HLA System- June 2016において公開されたように、細胞に由来する免疫原性抗原が、少なくとも、HLA アレルの少なくとも1つによってコードされる産物を含む、上記のいずれか1つに従うn個の薬学的単位用量のセットまたはキットも提供する。
【００６２】
これらのアレルが最初に特定された日はデータベースにおいて示される。
【００６３】
さらに、同封されているAnnex Iは、2018年6月29日に、http://hla.alleles.org/nomenclature/updates/201606.htmlにおいて特定されたアレルを複写したものである。
【００６４】
本発明は、Annex Iでも報告され、2017年6月30日以前および2017年6月30日付の、http://hla.alleles.org/nomenclature/updates/201606.htmlに記載のような完成した(finished)数のアレルを含む。
【００６５】
操作された細胞に由来する免疫原性抗原は、MHCの分子と、キメラ抗原受容体を含む他の分子を含む。
【００６６】
一局面において、本発明はまた、n個の用量のセットまたはキットが連続療法として使用するためのものである、上記のいずれか1つに従うn個の薬学的単位用量のセットまたはキットも提供する。
【００６７】
本発明によるn個の薬学的単位用量のセットまたはキットの各用量が、これを必要とする患者Pに順次投与され、2つの投与の時間間隔が1時間〜20年である。
【００６８】
一局面において、本発明はまた、n個の用量のセットまたはキットが、連続療法として使用するために提供される、上記のいずれか1つに従うn個の薬学的単位用量のセットまたはキットを提供し、前記連続療法は、最初に、患者Pのものと完全にマッチする、操作された細胞に由来する免疫原性抗原を含む用量、次に、元々マッチするドナーに由来し、操作された、Pのものにマッチする細胞、または癌を標的とするだけでなく、Pの細胞に由来する免疫原性抗原と可能な限りマッチするように操作された細胞を投与する工程を含む。
【００６９】
Pに完全にマッチする細胞の場合(操作された細胞に由来する免疫原性抗原が、Pの細胞に由来する免疫原性抗原に完全にマッチする)、細胞は最も好ましくは、元々Pに由来し、好ましくは、Pが健康だった時に得られたものである。
【００７０】
本発明に従って、マッチするとは、最も好ましくは、細胞がPに由来しない時に、2つのAマーカー、2つのBマーカー、2つのCマーカー、2つのDRB1マーカー、および2つのDQの10個のうち少なくとも10のHLAマーカー(アレル)が、Pにマッチする10(10/10)ことを意味する。
【００７１】
これより少ないマッチングが許容されることがあり、ミスマッチの限界は10個のうち2個のミスマッチと設定され、いくらかのミスマッチが、下記で定義されるように回避しなければならない。
【００７２】
例えば、成人ドナーは、8つのHLAマーカー(2つのAマーカー、2つのBマーカー、2つのCマーカー、2つのDRB1マーカー)のうち少なくとも6つに、好ましくは、8つのうち少なくとも7つにマッチしなければならない。
【００７３】
最初の材料として臍帯血細胞を用いるのであれば、臍帯血ユニットは、HLA-A、HLA-B、およびHLA-DRB1で6つのマーカーのうち少なくとも4つ(4/6)にマッチしなければならず、ミスマッチは2個以下でなければならない。
【００７４】
マッチするドナーの場合、細胞は、最も好ましいものから、あまり好ましくないものの順序で10/10、9/9、8/8、7/7、6/6個のHLAマッチングがある、マッチする双生児、同胞、ドナーに由来してもよく、Pにマッチするように操作された、このような任意の細胞に由来してもよい。操作された細胞の第3のカテゴリーは、2つのHLAミスマッチがある細胞を含む、本発明によるn個の薬学的単位用量のセットまたはキットに存在してもよい。もっと後の場合では、Pが、細胞に由来する同じ抗原に2回曝露されないように、セットまたはキットの細胞は、そのセットまたはキットの他のどの細胞試料とも同じミスマッチを有してはならない。
【００７５】
Pが移植片、細胞組織、または臓器から既に利益を得ていたら、セットまたはキット内の細胞は、そのセットまたはキット内の他のどの細胞試料とも同じミスマッチを有してはならず、もしあれば以前の移植片にあるものとも同じミスマッチを有してはならない。
【００７６】
本発明は、Pと2個以下のミスマッチを有する細胞からなるn個の薬学的単位用量のセットまたはキットを意図し、前記2個のミスマッチは全てのn個の薬学的単位用量において異なり、任意で、Pが骨髄移植を受けていない限り、ミスマッチは、Pに移植された以前の移植片から発現される。もっと後の場合では、n個の薬学的単位用量のセットまたはキットは、n個の薬学的単位用量において、これらの間で2個以下のミスマッチを有し、移植片のHLAを有する細胞からならなければならない。
【００７７】
全ての場合において、操作された細胞に由来する免疫原性抗原は、個体が既に免疫されている、あらゆる免疫原性抗原を発現すること、または有することを、回避しなければならない。これは、Pにおける既存の免疫応答を特定することによって成し遂げられる。
【００７８】
HLA(またはHLAタイピング)の検出レベルは、少なくとも、血清学によるものであり、例えば、微量リンパ球傷害性試験(microlymphocytotoxicity test)を用いてPに存在するAbを分析することによるものであり、良くても、当技術分野において公知の分子的方法によるものである。
【００７９】
Pには、連続処置として、最初に、患者Pのものに完全にマッチする、操作された細胞に由来する免疫原性抗原を含む用量が与えられ、次いで、患者のものにマッチしないn個の用量の、ドナーの操作された細胞に由来する免疫原性抗原を含む用量が与えられてもよい。
【００８０】
言い換えると、(HLA分子の点で)Pに完全にマッチするCAR-T細胞が、好ましくは、最初にPに投与され(自己移入、マッチする個体、双生児、同胞、ハプロタイプ一致の細胞、MHC分子を有さないように操作された同種異系細胞、またはPにマッチするように操作された同種異系細胞)、次いで、これが入手できなければ、Pを同じ抗原に二回曝露することを回避するために、ペアで共通抗原がない同種異系細胞が投与される。さらに、特定のミスマッチが回避され、特定の有害な連続注射が回避される(回避すべき連続用量の特定の組み合わせについては以下を参照されたい)。
【００８１】
一局面において、本発明はまた、癌を予防または処置するための免疫療法における薬として使用するための、上記のいずれか1つに従うn個の薬学的単位用量のセットまたはキットも提供する。
【００８２】
一局面において、本発明はまた、再発性難治性の癌または癌合併症、例えば、転移を処置するための、上記に従うn個の薬学的単位用量のセットまたはキットも提供する。
【００８３】
一局面において、本発明はまた、表1に記載のもののいずれか1つとしてのn個の薬学的単位用量のセットまたはキットも提供する。
【００８４】
一局面において、本発明はまた、上記のいずれか1つに従うn個の薬学的単位用量のセットまたはキットを調製するための少なくとも230人のドナーのバンクも提供する。
【００８５】
一局面において、本発明はまた、操作された細胞と、薬学的に許容されるビヒクルとを含む、n個の薬学的単位用量のセットまたはキットを調製するための方法を提供し、本方法は、
（i）患者PのHLA分子および/またはHLAアレルをジェノタイピングおよび/またはフェノタイピングする工程(任意)、
（ii）前記患者Pの既存の抗体および/またはCTL応答を測定および定量する工程(任意)、
（iii)(a）Pの細胞に由来する免疫原性抗原に完全にマッチする細胞の試料を選択することによって、または
（a'）Pと比較した時に可能な限り少ない数のミスマッチを有する細胞の試料を選択し、
細胞がPにマッチするように細胞を改変するか、もしくは
既往反応を潜在的に誘導する、細胞に由来する抗原を細胞が発現しないように細胞を改変することによって、または
（a''）互いに共通抗原の可能性が少なく、Pが以前に免疫されたものと共通抗原の可能性が少ない試料を選択することによって、
ヒトドナーからの細胞の少なくとも5つの試料を選択および/または準備する工程、
（iv）少なくとも1種類のCARもしくは1種類のTCRを導入することによって、および/またはTCR遺伝子の少なくとも1つの成分を不活化することによって、細胞を改変する工程
を含む。
【００８６】
一局面において、本発明は、操作された細胞と、薬学的に許容されるビヒクルとを含む、n個の薬学的単位用量のセットまたはキットを調製するための方法を提供し、本方法は、
患者PのHLA分子および/もしくはHLAアレルをジェノタイピングおよび/もしくはフェノタイピングする工程(任意)、
前記患者Pの既存の抗体および/もしくはCTL応答を測定および定量する工程(任意)、
- Pの細胞に由来する免疫原性抗原に完全にマッチする細胞の試料、もしくは
- Pと比較した時に可能な限り少ない数のミスマッチを有する細胞の試料
を選択することによって、または
- PのHLAアレルに細胞がマッチするように細胞を改変する、もしくは
- 既往反応を潜在的に誘導する、細胞に由来する抗原を細胞が発現しないように細胞を改変することによって、または
- 互いに共通抗原がなく、かつPが以前に免疫されたものと共通抗原がない試料を選択することによって、
ヒトドナーからの細胞の少なくとも5つの試料を選択および/もしくは準備する工程、
（v）少なくとも1種類のCARもしくは1種類のTCRを導入することによって、および/またはTCR遺伝子の少なくとも1つの成分を不活化することによって細胞を改変する工程
を含む。
【００８７】
一局面において、本発明は、操作された細胞と、薬学的に許容されるビヒクルとを含む、n個の薬学的単位用量のセットまたはキットを調製するための方法を提供し、本方法は、
互いに共通抗原がなく、かつPが以前に免疫されたものと共通抗原がない試料を選択することによって、ヒトドナーからの細胞の少なくとも5つの試料を選択および/または準備する工程、
（vi）少なくとも1種類のCARもしくは1種類のTCRを導入することによって、および/またはTCR遺伝子の少なくとも1つの成分を不活化することによって、細胞を改変する工程
を含む。
【００８８】
n個の用量がそれぞれPから得られている、本発明の操作された細胞と、薬学的に許容されるビヒクルとを含む、n個の薬学的単位用量のセットまたはキット。
【００８９】
n個の用量がそれぞれドナーから得られており、ドナーの少なくとも1つがPである、上記に従うn個の薬学的単位用量のセットまたはキット。
【００９０】
n個の用量がそれぞれ異なるドナーから得られており、Pとは異なる、上記に従うn個の薬学的単位用量のセットまたはキット。
【００９１】
nが少なくとも5である、上記に従うn個の薬学的組成物のセットまたはキット。
【００９２】
それぞれの薬学的単位用量の細胞が少なくとも1種類のCARまたは1つのTCRを含み、前記CARまたはTCRがn個の連続用量において同じ、および/または異なる、上記に従うn個の薬学的単位用量のセットまたはキット。
【００９３】
細胞に由来する免疫原性抗原が、http://hla.alleles.org/nomenclature/updates/201606.htmlに記載のように、少なくとも、HLAアレルの少なくとも1つによってコードされる産物を含む、上記に従うn個の薬学的単位用量のセットまたはキット。
【００９４】
細胞に由来する免疫原性抗原が、以下の遺伝子座:HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ、およびHLA-DR、またはその組み合わせによってコードされる産物の変種アレルである、上記に従うn個の薬学的単位用量のセットまたはキット。
【００９５】
Pの細胞にマッチする操作された細胞が、7/7、好ましくは8/8、より好ましくは9/9、理想的には10/10のスコアで、Pの細胞のHLAタイピングを用いたHLAタイピング、好ましくは(分子HLAタイピング)、より好ましくは高精度分子タイピング]と一致する、上記に従うn個の薬学的単位用量のセットまたはキット。
【００９６】
n個の用量の少なくとも1つのHLAタイピング、好ましくは、n個の用量全てのHLAタイピングが、HLA-A、HLA-B、HLA-C、DRB1、およびDQB1遺伝子座において10/10の高精度マッチであることを特徴とする、上記のいずれか1つに従うn個の薬学的単位用量のセットまたはキット。
【００９７】
n個の用量の少なくとも1つのHLAタイピングが、患者PのHLAタイピングに（6/6または7/7、好ましくは8/8、より好ましくは9/9または10/10のスコアで）マッチし、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、またはDQB1遺伝子座から選択される遺伝子座において、多くても1個のミスマッチ、好ましくは、HLA-A、HLA-B、HLA-DRB1、またはDQB1遺伝子座から選択される遺伝子座、より好ましくはHLA-DQ、あまり好ましくないがHLA-Cにおいて1個のミスマッチを含むことを特徴とする、上記に従うn個の薬学的用量のセットまたはキット。
【００９８】
上記のいずれか1つに従うn個の薬学的単位用量のセットまたはキットであり、
n個の用量のドナーの操作されていない細胞または操作された細胞に由来する免疫原性抗原が患者ものにマッチし、
Pのものにマッチする操作されていない細胞または操作された細胞に由来する免疫原性抗原が最初に用いられ、ミスマッチがあれば、Pが同じ抗原に二度曝露されないように、操作されていない細胞または操作された細胞に由来するミスマッチする免疫原性抗原が、(他方の後に)使用される単位用量のそれぞれにおいて異ならなければならない
ように、用量が連続療法において好みの順序で用いられる。Pにおいて免疫反応が生じた場合でさえ、Pが免疫反応を生じた抗原に、Pは再度曝露される。
【００９９】
従って、n個の用量のうちのn-m(n≧m≧2)のドナーの操作されていない細胞または操作された細胞に由来する免疫原性抗原が全て患者のものにマッチし、Mkが、m個の連続したマッチしない用量のk番目に存在する、Pにマッチしない免疫原性抗原のセットであれば、これらのm個の投与される用量のk番目(k≧2)は、M1、M2、…、M(k-1)の和集合(union)に存在する免疫原性抗原を有してはならない。さらに、M1は、個体が既に免疫されている、あらゆる免疫原性抗原を回避してもよい。
【０１００】
免疫原性抗原の全てが患者のものに完全にマッチする操作された細胞を含む用量が他の用量の前に投与され、その後に、ミスマッチレベルが増えて他の用量が投与される、上記に従うn個の薬学的単位用量のセットまたはキット。
【０１０１】
免疫原性抗原が患者の免疫原性抗原に完全にマッチしない操作された細胞の用量が、患者とのミスマッチが増加する順序で投与され、同じ数の前記ミスマッチを有する場合は、好ましい順序は以下の通りである:
- (Aのミスマッチに既に曝露されていれば)、(Bのミスマッチ)を使用した後に(DQB1のミスマッチ)を使用する、
- (Aのミスマッチに既に曝露されていれば)、(Cのミスマッチ)を使用した後に(DQB1のミスマッチ)を使用する、
- (Cのミスマッチに既に曝露されていれば)、(Aのミスマッチ)を使用した後に(Bのミスマッチ)を使用する、
- (Cのミスマッチに既に曝露されていれば)、(Aのミスマッチ)を使用した後に(DRB1のミスマッチ)を使用する、
- (Cのミスマッチに既に曝露されていれば)、(DQB1のミスマッチ)を使用した後に(DRB1のミスマッチ)を使用する、
- (DPB1のミスマッチに既に曝露されていれば)、(DQB1のミスマッチ)を使用した後に(DRB1のミスマッチ)を使用する、
- (DQB1のミスマッチに既に曝露されていれば)、(Aのミスマッチ)を使用した後に(Bのミスマッチ)を使用する、
- (DQB1のミスマッチに既に曝露されていれば)、(Aのミスマッチ)を使用する、
- (DQB1のミスマッチに既に曝露されていれば)、(Cのミスマッチ)を使用した後に(Aのミスマッチ)を使用する、
- (DPB1のミスマッチに既に曝露されていれば)、(DRB3,4,5のミスマッチ)を使用した後に(Cのミスマッチ)を使用する、
- (DQB1のミスマッチに既に曝露されていれば)、(Aのミスマッチ)を使用した後に(DRB3,4,5のミスマッチ)を使用する、
- (DPB1、DRB3,4,5のミスマッチに既に曝露されていれば)、(DQB1のミスマッチ)を使用した後に(Cのミスマッチ)を使用する、
- (C、DRB3,4,5、DQB1、DPB1のミスマッチに既に曝露されていれば)、(Aのミスマッチ)を使用した後に(B,DRB1のミスマッチ)を使用する、
n個の薬学的単位用量のセットまたはキット。
【０１０２】
体重1キログラムあたりの操作された細胞の用量について、以下のマッチ:
体重1キログラムあたり＞3x107個の操作された細胞以上を含む用量の場合は少なくとも6/6 HLAのマッチ、
体重1キログラムあたり＞4x107個の操作された細胞以上を含む用量の場合は少なくとも5/6 HLAのマッチ、
体重1キログラムあたり＞5x107個の操作された細胞以上を含む用量の場合は少なくとも4/6 HLAのマッチ
が推奨されることを特徴とする、上記のいずれか1つに従うn個の薬学的用量のセットまたはキット。
【０１０３】
ヒト集団におけるPにマッチしないHLAアレルのそれぞれの頻度が6％未満であるが、0.1％超であることを特徴とする、上記のいずれか1つに従うn個の薬学的単位用量のセットまたはキット。
【０１０４】
ハプロタイプA/DRB1の点でPとミスマッチするHLAアレルを有する操作された細胞に続いて、ハプロタイプB/Cの点でPとミスマッチするHLAアレルを有する操作された細胞に続いて、ハプロタイプDQの点でPとミスマッチするHLAアレルを有する操作された細胞の連続投与を回避すべきことを特徴とする、上記のいずれか1つに従うn個の薬学的単位用量のセットまたはキット。
【０１０５】
前記操作された初代細胞がPとHLAハプロタイプ一致であることを特徴とする、上記のいずれか1つに従うn個の薬学的単位用量のセットまたはキット。
【０１０６】
各用量にある前記操作された細胞が、健常細胞と比較した時に病理学的細胞上で構成的もしくは一時的に過剰発現している分子、または病理学的細胞上でしか発現していない分子を標的とする少なくとも1種類のCARおよび/またはTCRを発現する、上記のいずれか1つに従うn個の薬学的単位用量のセットまたはキット。
【０１０７】
前記少なくとも1種類のCARまたはTCRが、DR4、CD19、CD123、CD20、CD22、CD38、CD30、CS-1、CLL-1、HSP70、BCMA、VEGF、DR4、GD2、癌精巣(CT)抗原、MUC1、GD2、oアセチルGD2、HM1.24(CD317)、CYP1B1、SP17、PRAME、ウィルムス腫瘍1(WT1)、熱ショックタンパク質gp96、甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)；CD171；CS-1(CD2サブセット1、CRACC、SLAMF7、CD319、および19A24)；C型レクチン様分子-1(CLL-1)；ガングリオシドGD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(]-4)bDGlcp(l-l)Cer)；Tn抗原(TnAg)；Fms様チロシンキナーゼ3(FLT3)；CD38；CD44v6；B7H3(CD276)；KIT(CD117)；インターロイキン-13受容体サブユニットα-2(IL-13Ra2)；インターロイキン11受容体α(IL-llRa)；前立腺幹細胞抗原(PSCA)；プロテアーゼセリン21(PRSS21)；血管内皮増殖因子受容体2(VEGFR2)；ルイス(Y)抗原；CD24；血小板由来増殖因子受容体β(PDGFR-β)；stage-specific embryonic antigen-4(SSEA-4)；Mucin 1, cell surface associated (MUC1)；上皮増殖因子受容体(EGFR)；神経細胞接着分子(NCAM)；炭酸脱水酵素IX(CAIX)；Proteasome(Prosome, Macropain)サブユニット、β型、9(LMP2)；エフリンA型受容体2(EphA2)；フコシルGM1；シアリルルイス接着分子(sLe)；ガングリオシドGM3(aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer；TGS5；高分子量-黒色腫関連抗原(HMWMAA)；o-アセチル-GD2ガングリオシド(OAcGD2)；葉酸受容体β；腫瘍内皮マーカー1(TEM1/CD248)；tumor endothelial marker 7-related(TEM7R)；クローディン6(CLDN6)；G protein-coupled receptor class C group 5, member D(GPRC5D)；chromosome X open reading frame 61(CXORF61)；CD97；CD179a；未分化リンパ腫キナーゼ(ALK)；ポリシアル酸；胎盤特異的1(PLAC1)；hexasaccharide portion of globoH glycoceramide (GloboH)；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；ウロプラキン2(UPK2)；A型肝炎ウイルス細胞受容体1(HAVCR1)；アドレノセプターβ3(ADRB3)；パンネキシン(pannexin)3(PANX3)；Gタンパク質共役受容体20(GPR20)；リンパ球抗原6複合体、遺伝子座K9(LY6K)；嗅覚受容体51E2(OR51E2)；TCR Gamma Alternate Reading Frame Protein(TARP)；ウィルムス腫瘍タンパク質(WT1)；ETS translocation-variant gene 6, located on chromosome 12p(ETV6-AML)；精子タンパク質17(SPA17)；X Antigen Family, Member 1A(XAGE1)；アンジオポエチン結合細胞表面受容体2(Tie2)；黒色腫癌精巣抗原-1(MAD-CT-1)；黒色腫癌精巣抗原-2(MAD-CT-2)；Fos関連抗原1；p53変異体；ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)；sarcoma translocation breakpoints；melanoma inhibitor of apoptosis(ML-IAP)；ERG(transmembrane protease, serine 2(TMPRSS2)ETS融合遺伝子)；N-アセチルグルコサミニル-トランスフェラーゼV(NA17)；ペアードボックスタンパク質Pax-3(PAX3)；アンドロゲン受容体；サイクリンB1；v-myc avian myelocytomatosis viral oncogene neuroblastoma derived homolog(MYCN)；RasホモログファミリーメンバーC(RhoC)；チトクロムP450 1B1(CYP1B1)；CCCTC結合因子(ジンクフィンガータンパク質)様(BORIS)；Squamous Cell Carcinoma Antigen Recognized By T Cells 3(SART3)；ペアードボックスタンパク質Pax-5(PAX5)；プロアクロシン結合タンパク質sp32(OY-TES1)；リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ(LCK)；A kinase anchor protein 4(AKAP-4)；synovial sarcoma, X breakpoint 2 (SSX2)；CD79a；CD79b；CD72；白血球関連免疫グロブリン様受容体1(LAIR1)；Fc fragment of IgA receptor(FCAR)；白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーAメンバー2(LILRA2)；CD300分子様ファミリーf(CD300LF)；C型レクチンドメインファミリー12メンバーA(CLEC12A)；骨髄ストローマ細胞抗原2(BST2)；EGF様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様2(EMR2)；リンパ球抗原75(LY75)；グリピカン-3(GPC3)；Fc受容体様5(FCRL5)；および免疫グロブリンλ様ポリペ���チド1(IGLL1)、ならびに、好ましくは、DR4、CD19、CD123、CD20、CD22、CD38、CD30、CS-1、CLL-1、HSP70、BCMA、VEGF、DR4、GD2、O-アセチルGD2、癌精巣(CT)抗原、MUC1、MUC16、HM1.24(CD317)、CYP1B1、SP17、PRAME、ウィルムス腫瘍1(WT1)、熱ショックタンパク質gp96、クローディン18.2、およびその組み合わせより選択される、その組み合わせからなる群より選択される分子に特異的である、上記のいずれか1つに従うn個の薬学的単位用量のセットまたはキット。
【０１０８】
免疫療法における薬として使用するための、上記のいずれか1つに従うn個の薬学的単位用量のセットまたはキット。
【０１０９】
癌を予防または処置するための免疫療法における薬として使用するための、上記のいずれか1つに従うn個の薬学的単位用量のセットまたはキット。
【０１１０】
慢性ウイルス感染を除去するための、感染症を予防または処置するための免疫療法における薬として使用するための上記のいずれか1つに従うn個の薬学的単位用量のセットまたはキット。
【０１１１】
再発性難治性の癌または癌合併症、例えば、転移を処置するための上記のいずれか1つに従うn個の薬学的単位用量のセットまたはキット。
【０１１２】
表1に記載のように、上記のいずれか1つに従うn個の薬学的単位用量のセットまたはキット。
【０１１３】
血液癌、固形癌、または血液癌および固形癌を処置するための上記のいずれか1つに従うn個の薬学的単位用量のセットまたはキット。
【０１１４】
連続的癌、連続的血液癌、連続的固形癌、または連続的血液癌および固形癌を処置するための上記のいずれか1つに従うn個の薬学的単位用量のセットまたはキット。
【０１１５】
血液癌または血液悪性腫瘍とは、血液およびリンパ系に影響を及ぼす癌を意味する。癌は造血組織(例えば、骨髄)において発生する場合もあり、免疫系の細胞において発生する場合もある。血液悪性腫瘍のいくつかのタイプには、白血病、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫が含まれる。血液癌には、組織において発生したリンパ節の血液中にある任意の細胞、および血液中を循環する任意の細胞が含まれる。
【０１１６】
各用量が、別の抗癌薬、抗GVHD薬物と組み合わせて別の薬物と併用され、前記用量中の操作された細胞が前記薬物に対して耐性になるように操作されている、上記のいずれか1つに従うn個の薬学的単位用量のセットまたはキット。
【０１１７】
操作された細胞が、TCRαサブユニットをコードする少なくとも1つの不活化された遺伝子を含み、操作された細胞が、TCRαサブユニットアレルをコードする少なくとも1つの不活化された遺伝子を含む、上記のいずれか1つに従うn個の薬学的単位用量のセットまたはキット。
【０１１８】
操作された細胞が、不活化されたβ2ミクログロブリン遺伝子、不活化されたCTIIA遺伝子、またはPのものにマッチするMHC分子の遺伝子改変を含む、上記のいずれか1つに従うn個の薬学的単位用量のセットまたはキット。
【０１１９】
操作された細胞が、TCRサブユニットをコードする少なくとも1つの不活化された遺伝子と、不活化されたβ2ミクログロブリン遺伝子を含む、上記に従う、操作された細胞と、薬学的に許容されるビヒクルとを含む、n個の薬学的単位用量のセットまたはキット。
【０１２０】
操作された細胞が、TCRαサブユニットをコードする少なくとも1つの不活化された遺伝子と、不活化されたCTIIA遺伝子を含む、上記に従う、操作された細胞と、薬学的に許容されるビヒクルとを含む、n個の薬学的単位用量のセットまたはキット。
【０１２１】
操作された細胞が、TCRαサブユニットをコードする少なくとも1つの不活化された遺伝子と、PのものにマッチするMHC分子の遺伝子改変を含む、上記に従う、操作された細胞と、薬学的に許容されるビヒクルとを含む、n個の薬学的単位用量のセットまたはキット。
【０１２２】
操作された細胞が、TCRαサブユニットをコードする少なくとも1つの不活化された遺伝子と、不活化されたCTIIA遺伝子と、PのものにマッチするMHC分子の遺伝子改変を含む、上記に従う、操作された細胞と、薬学的に許容されるビヒクルとを含む、n個の薬学的単位用量のセットまたはキット。
【０１２３】
少なくとも1つの用量における操作された細胞が、抗癌薬に対する耐性を付与する欠失、挿入、または変異を含む、上記のいずれか1つに従うn個の薬学的単位用量のセットまたはキット。
【０１２４】
少なくとも1つの用量における操作された細胞が、CAR-T細胞の活性に影響を及ぼす、抗癌薬に対する耐性を付与する欠失、挿入、または変異を含む、上記のいずれか1つに従うn個の薬学的単位用量のセットまたはキット。
【０１２５】
少なくとも1つの用量における操作された細胞が、抗癌薬に対する耐性を付与する欠失、挿入、または変異を含み、抗癌活性を有する用量の前記抗癌薬がCART-T細胞の効率および/またはT細胞の生存を変える、上記のいずれか1つに従うn個の薬学的単位用量のセットまたはキット。
【０１２６】
少なくとも1つの用量における操作された細胞が、PNAに対する耐性を付与する欠失、挿入、または変異を含む、上記のいずれか1つに従うn個の薬学的単位用量のセットまたはキット。
【０１２７】
PNAとはプリンヌクレオシド類似体を意味する。
【０１２８】
少なくとも1つの用量における操作された細胞が、以下の分子、CD52、デオキシシチジンキナーゼ(dCK)、グルココルチコイド受容体(GR)、およびその組み合わせの1つをコードする不活化された遺伝子を含む、上記のいずれか1つに従うn個の薬学的単位用量のセットまたはキット。
【０１２９】
デオキシシチジンキナーゼ(dCK)は、ヒトにおいてDCK遺伝子によってコードされる酵素である。
【０１３０】
少なくとも1つの用量の細胞が腫瘍誘導性低酸素、腫瘍誘導性アデノシン、サイトカインおよび/またはケモカインによる抗癌細胞活性の腫瘍誘導性阻害に対して耐性になるように操作されている、上記のいずれか1つに従うn個の薬学的単位用量のセットまたはキット。
【０１３１】
nが少なくとも2であり、nが、少なくとも3、または3、少なくとも4、または4、少なくとも5、または5、少なくとも6、または6、少なくとも7、または7、少なくとも8、または8、少なくとも9、または9、少なくとも10または10、好ましくは5である、上記のいずれか1つに従うn個の薬学的単位用量のセットまたはキット。
【０１３２】
上記のいずれか1つに従うn個の薬学的単位用量のセットを調製するための少なくとも230人のドナーのバンク。
【０１３３】
操作された細胞を含めてnが少なくとも5であるか、または5である、n個の薬学的単位用量のセットを調製するための上記に従うバンク。
【０１３４】
免疫療法用の薬を必要とする、ある1人の患者Pにおける免疫療法用の薬として、請求項1〜33のいずれか一項に記載のn個の薬学的単位用量のセットを調製するために使用するための上記に従うバンク。
【０１３５】
免疫療法用の薬を必要とする、ある1人の患者Pにおける免疫療法用の薬として、上記のいずれか1つに従うn個の薬学的単位用量のセットを調製するために使用するための上記に従うバンク。
【０１３６】
免疫療法用の薬を必要とする、ある1人の患者Pにおける免疫療法用の薬として、上記のいずれか1つに従うn個の薬学的単位用量のセットを調製するために使用するための上記に従うバンク。
【０１３７】
操作された細胞のn個の薬学的単位用量のセットを調製するために用いられるドナーがPでなければ、Pにおける細胞、臓器、または組織の以前のドナーを除外する、上記に従うバンク。
【０１３８】
前記ドナーがPでなければ、Pにおける細胞、臓器、または組織の以前のドナーが除外される、上記に従うバンク。
【０１３９】
共通アレルがPのものにマッチしなければ、ドナーが、ペアの2人のドナー間で共通アレルを有さない、上記のいずれか1つに従うバンク。
【０１４０】
ドナーが、ペアの2人のドナー間で共通アレルを有さず、
前記ペアの2人のドナー間の非共通アレルが、既往反応に関与する少なくとも1つの遺伝子座を含むか、もしくは前記ペアの2人のドナー間の非共通アレルが、以下の遺伝子座HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ、およびHLA-DRの1つ、好ましくは、HLA-C、より好ましくは、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ、およびHLA-DRを含むか、または
前記ペアの2人のドナー間の非共通アレルが、既往反応に関与する少なくとも1つの遺伝子座を含み、前記ペアの2人のドナー間の非共通アレルが、以下の遺伝子座HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ、およびHLA-DR、好ましくはHLA-C、より好ましくは、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ、およびHLA-DRを含む、
上記のいずれか1つに従うバンク。
【０１４１】
本発明は、ドナーが、ペアの2人のドナー間で共通アレルを有さず、
前記ペアの2人のドナー間の非共通アレルが、既往反応に関与する少なくとも1つの遺伝子座を含む、ならびに/もしくは前記ペアの2人のドナー間の非共通アレルが、以下の遺伝子座HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ、およびHLA-DRの1つを含むか、または
前記ペアの2人のドナー間の非共通アレルが、既往反応に関与する少なくとも1つの遺伝子座を含み、前記ペアの2人のドナー間の非共通アレルが、以下の遺伝子座HLA-A、HLA-B、HLA-C、およびHLA-DRを含む、
上記のいずれか1つに従うバンクを提供する。
【０１４２】
操作された細胞がβ2ミクログロブリン欠損および/またはCTIIA欠損であり、前記ペアの2人のドナー間の非共通アレルが以下の分子HLA-DP、HLA-DQ、およびHLA-DRを含む、上記のいずれか1つに従うバンク。
【０１４３】
操作された細胞がβ2ミクログロブリン欠損および/またはCTIIA欠損であり、前記ペアの2人のドナー間の非共通アレルが、発現がβ2ミクログロブリンまたはCTIIAによって調節されないMHC分子を含む、上記のいずれか1つに従うバンク。
【０１４４】
本発明はまた、ある個体(P)における既往性反応と比較した時に、前記個体Pにおいて既往性免疫反応を誘導しないか、またはわずかな既往性免疫反応を誘導する、操作された細胞と、薬学的に許容されるビヒクルとを含む、n個の薬学的単位用量のセットまたはキットも提供し、細胞に由来する免疫原性抗原に以前に曝露され、免疫原性抗原(好ましくは、T細胞依存性抗原)に対してPに獲得免疫があれば、次いで、その後に、Pに獲得免疫がある前記細胞に由来する免疫原性抗原を含む、操作された細胞の単位用量が移植され、操作された細胞がPの細胞と少なくとも2つのHLAミスマッチを示し、前記細胞が宿主によって寛容されるのを可能にする処置と組み合わせて投与され、少なくとも45日間、抗癌活性を有し、45日、90日、135日、180日、225日、または270日、315日にわたって45日ごとに(投与される)。
【０１４５】
細胞のそれぞれの薬理学的単位用量が、半日、1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、15日、16日、17日、18日、19日、20日、30日、40日、45日、50日、60日、90日、120日、180日、225日、270日、315日、8ヶ月、12ヶ月、1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、11年、12年、13年、14年、15年、16年、17年、18年、19年、20年、30年、40年、50年、60年、70年〜90年、好ましくは6ヶ月、または半日〜80年の任意の時間に及ぶ2回の投与間の時間間隔で、ある個体Pに投与される、上記のいずれか1つに従うバンク。
【０１４６】
キメラ抗原受容体(CAR)またはTCRを発現する操作された初代細胞の5個の連続した薬学的単位用量からなるセットを調製するための、多くても230人の異なるドナーを含む、上記のいずれか1つに従うバンク。
【０１４７】
キメラ抗原受容体(CAR)またはTCRを発現する操作された初代細胞のn個の連続した薬学的単位用量、n＞5からなるセットを調製するための、少なくとも230人の異なるドナーを含む、上記のいずれか1つに従うバンク。
【０１４８】
宿主対移植片拒絶反応を阻止するために、少なくとも1つのドナーのHLAが以前の移植片(骨髄)のものにマッチし、Pのものと完全にマッチしないことがある(処置と以前の移植片の間でマッチする)、上記のいずれか1つに従うバンク。
【０１４９】
前記操作された初代細胞が少なくとも1つの不活化されたTCR遺伝子アレルを含む、上記に従う操作された初代細胞の5つの用量のセット。
【０１５０】
少なくとも1種類のCARまたはT細胞受容体(TCR)が付与された、表1のような操作された初代細胞の5つの用量のセット。
【０１５１】
以下のハプロタイプ(A-B-DRB1):
29-58-0807
68-75-0413
32-42-0302
2-70-1322
69-35-1305
のうちの1つを含む、上記のような5つの用量の操作された初代細胞のセットまたはキット。
【０１５２】
細胞が、以下のハプロタイプ(A-B-DRB1):
29-58-0807
68-75-0413
32-42-0302
2-70-1322
69-35-1305
のうちの1つを含む、上記のような5つの用量の操作された初代細胞のセットまたはキット。
【０１５３】
操作された細胞と、薬学的に許容されるビヒクルとを含む、n個の薬学的単位用量のセットを調製するための方法であって、
- WO0161043(A2)、またはWO0161043(A3)、またはWO0161043(A9)において行われるように、患者PのHLA分子および/またはHLAアレルをジェノタイピングおよび/またはフェノタイピングする工程、
- 前記患者の既存の抗体および/またはCTL応答を測定および定量する工程、
- 好みの順序で、
- Pが既に免疫されている免疫原性抗原を含まない、Pの細胞に由来する免疫原性抗原に完全にマッチする細胞の試料、または
- Pのものと比較した時に可能な限り少ない数の、ミスマッチする、細胞に由来する免疫原性抗原(Pが既に免疫されている免疫原性抗原を含む)を有する細胞の試料
を選択することによって、5人の異なるヒトドナーから少なくとも5つの細胞試料(移植片)を選択および/または準備する工程、ならびに
Pが既に免疫されている、前記細胞に由来する免疫原性抗原がもしあれば、その発現を変えるように細胞を改変する工程、および前記細胞に由来する免疫原性抗原を、Pの細胞に由来する免疫原性抗原にマッチするように細胞を改変する工程、または
(既往性応答を誘導する)任意の潜在的に既往性(anamnestogenic)の分子を発現しないように細胞を改変する工程、あるいは
免疫原性抗原がPのものにマッチしなければ、互いに共通抗原の可能性が少ない、Pが以前に免疫されたものと共通抗原の可能性が少ない試料を選択する工程、
免疫原性抗原がPのものにマッチしなければ、互いに共通抗原がなく、かつPが以前に免疫されたものと共通抗原がない試料を選択する工程、
各試料において異なる少なくとも1種類のCARまたはTCRを導入することによって、および/またはTCR遺伝子の少なくとも1つの成分を不活化することによって細胞を改変する工程
を含む、方法。
【０１５４】
操作された細胞と、薬学的に許容されるビヒクルとを含む、n個の薬学的単位用量のセットを調製するための方法であって、
- WO0161043(A2)、またはWO0161043(A3)、またはWO0161043(A9)において行われるような、患者PのHLA分子および/またはHLAアレルをジェノタイピングおよび/またはフェノタイピングする工程、
- 前記患者の既存の抗体および/またはCTL応答を測定および定量する工程、
- 好みの順序で、
- Pが既に免疫されている免疫原性抗原を含まない、Pの細胞に由来する免疫原性抗原に完全にマッチする細胞の試料を選択し、各試料において異なる少なくとも1種類のCARもしくはTCRを導入することによって、および/またはTCR遺伝子の少なくとも1つの成分を不活化することによって細胞を改変することによって、あるいは
- Pのものと比較した時に可能な限り少ない数の、ミスマッチする、細胞に由来する免疫原性抗原(Pが既に免疫されている免疫原性抗原を含む)を有する細胞の試料
を選択し、
Pが既に免疫されている、前記細胞に由来する免疫原性抗原がもしあれば、その発現を変えるように細胞を改変する、ならびに前記細胞に由来する免疫原性抗原を、Pの細胞に由来する免疫原性抗原にマッチさせるように細胞を改変する、ならびに各試料において異なる少なくとも1種類のCARもしくはTCRを導入することによって、および/もしくはTCR遺伝子の少なくとも1つの成分を不活化することによって細胞を改変することによって、または
(既往性応答を誘導する)任意の潜在的に既往性の分子を発現しないように細胞を改変する工程、ならびに各試料において異なる少なくとも1種類のCARもしくはTCRを導入することによって、および/もしくはTCR遺伝子の少なくとも1つの成分を不活化することによって細胞を改変することによって、あるいは
免疫原性抗原がPのものにマッチしなければ、互いに共通抗原がない(好ましくは共通抗原がなく)、Pが以前に免疫されたものと共通抗原がない試料を選択し、各試料において異なる少なくとも1種類のCARもしくはTCRを導入することによって、および/またはTCR遺伝子の少なくとも1つの成分を不活化することによって細胞を改変することによって、
5人の異なるヒトドナーから少なくとも5つの細胞試料(移植片)を選択および/または準備する工程
を含む、方法。
【０１５５】
特定の態様では、操作された細胞と、薬学的に許容されるビヒクルとを含む、n個の薬学的単位用量のセットを調製するための方法が提供され、本方法は、
（a）患者PのHLA分子をジェノタイピングする工程
（b）前記患者の既存の抗体および/またはCTL応答を測定および定量する工程、
（c）Pの細胞に由来する免疫原性抗原にマッチする細胞の試料を選択することによって細胞の試料を選択および/または準備する工程、
（d）各試料において異なる少なくとも1種類のCARもしくはTCRを導入することによって、および/またはTCR遺伝子の少なくとも1つの成分を不活化することによって細胞を改変する工程
を含む。工程（c）では、n個の薬学的単位用量の細胞はPの細胞に天然でマッチするか、またはPの細胞にマッチするように操作されている。
【０１５６】
特定の態様では、提供される本発明の方法において、選択および操作が終わった時に得られた、n個の用量のうちのn-m(n≧m≧2)のドナーの操作された細胞に由来する免疫原性抗原が全て患者のものにマッチし、Mkが、m個の連続したマッチしない用量のk番目に存在する、Pにマッチしない免疫原性抗原のセットであれば、これらのm個の投与される用量のk番目(k≧2)は、M1、M2、…、M(k-1)の和集合に存在する免疫原性抗原を有してはならない。さらに、M1は、個体が既に免疫されている、あらゆる免疫原性抗原を回避し得る。
【０１５７】
細胞を改変する工程が、
外因性ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列を含む少なくとも1つの核酸と、
ゲノムにある選択された内因性遺伝子座を特異的な標的とする少なくとも1種類の配列特異的試薬と
を、前記細胞に同じ時間で導入する工程であって、好ましくは、前記内因性遺伝子座が、TCR遺伝子AまたはB、をコードする内因性遺伝子座である、工程
を含む、上記に従う、操作された細胞と、薬学的に許容されるビヒクルとを含む、n個の薬学的単位用量のセットを調製するための方法。
【０１５８】
「同じ時間で」とは、同時、またはもう一方の直後(数時間の間隔の中で)を意味する。
【０１５９】
細胞を操作するための方法は、その全体が参照により本明細書に組み入れられるPCT/EP2017/076798に記載されている。一態様では、
外因性ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列を含む少なくとも1つの核酸と、
ゲノムにある選択された内因性遺伝子座を特異的な標的とする少なくとも1種類の配列特異的試薬と
を、前記細胞に同じ時間で導入する工程であって、好ましくは、前記内因性遺伝子座が、TCR遺伝子AまたはBをコードする内因性遺伝子座である工程が、アデノ随伴ウイルス粒子を用いて行われる。
【０１６０】
細胞に由来する免疫原性抗原が、http://hla.alleles.org/nomenclature/updates/201606.htmlに記載のもののいずれか1つから選択されるHLA分子の1つを含む、上記に従う方法。実際に、今や、MHC分子が、外来抗原に対する免疫応答に関与することは十分に確立している。
【０１６１】
HLAクラスII(HLA-II)分子またはタンパク質は、細胞表面において、細胞外病原体のタンパク質を含む細胞外タンパク質に由来するペプチド抗原を提示するのに対して、HLAクラスIタンパク質は、細胞内タンパク質または病原体に由来するペプチドを提示することが認められている。糖も提示されることがある。細胞表面に詰め込まれたHLAクラスIIタンパク質はCD4+ヘルパーT細胞と相互作用する。相互作用が起こると、白血球の動員、炎症、および/またはB細胞を介した体液応答が起こる。現在までに、HLA-DM(HLA-DM a鎖をコードするHLA-DMAおよびHLA-DMβ鎖をコードするHLA-DMB)、HLA-DO(HLA-DOα鎖をコードするHLA-DOAおよびHLA-DOβ鎖をコードするHLA-DOB)、HLA-DP(HLA-DPαをコードするHLA-DPAおよびHLA-DPβ鎖をコードするHLA-DPB)、HLA-DQ(HLA-DQα鎖をコードするHLA-DQAおよびHLA-DQβ鎖をコードするHLA-DQB)、ならびにHLA-DR(HLA-DRα鎖をコードするHLA-DRAおよびHLA-DRβ鎖をコードするHLA-DRB)を含む、いくつかのHLAクラスII遺伝子座が特定されている。
【０１６２】
細胞に由来する免疫原性抗原が、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DR、およびその組み合わせから選択されるHLA分子の少なくとも1つを含む、上記のいずれか1つに従う方法。
【０１６３】
試料のHLAがPのHLAと80％超マッチする、上記のいずれか1つに従う方法。
【０１６４】
少なくとも1つの免疫チェックポイントを不活化するように細胞を遺伝子操作する工程を含む、上記のいずれか1つに従う方法。
【０１６５】
薬物に対する耐性を付与するように細胞を遺伝子操作する工程を含む、上記のいずれか1つに従う方法。
【０１６６】
細胞に由来する免疫原性抗原をPのものにマッチするように細胞を遺伝子操作する工程を含む、上記のいずれか1つに従う方法。
【０１６７】
細胞に由来する免疫原性抗原をPの以前の移植片のものにマッチするように細胞を遺伝子操作する工程を含む、上記のいずれか1つに従う方法。
【０１６８】
細胞を遺伝子操作する工程が特異的レアカット（rare-cutting）エンドヌクレアーゼを用いることによって行われる、上記のいずれか1つに従う方法。
【０１６９】
前記レアカットエンドヌクレアーゼがTALE-ヌクレアーゼまたはCRISPR/Casヌクレアーゼである、上記のいずれか1つに従う方法。
【０１７０】
細胞を遺伝子操作する工程が、WO2016183345(A1)に記載の技術を用いて特異的レアカットエンドヌクレアーゼを用いることによって行われる、上記のいずれか1つに従う方法。
【０１７１】
細胞を遺伝子操作する工程が、PCT/EP2017/076798、またはZnフィンガーエンドヌクレアーゼを用いるWO2014153470A2、またはWO2014204729A1に記載のように相同組換えを介した遺伝子ターゲティングを用いることによって行われる、上記のいずれか1つに従う方法。
【０１７２】
細胞の試料を選択する工程が、HLA-A、HLA-B、およびHLA-DR遺伝子のトリプルホモ接合体を選択する工程を含む、上記のいずれか1つに従う方法。
【０１７３】
細胞の試料を選択する工程が、HLA-A、HLA-B、およびHLA-DR遺伝子のうち2つのダブルホモ接合体を選択する工程を含む、上記のいずれか1つに従う方法。
【０１７４】
細胞の試料を選択する工程が、データベースにおいて利用可能なドナーを選択する工程を含む、上記のいずれか1つに従う方法。
【０１７５】
細胞の試料を選択する工程が、ヒト集団におけるHLAアレル遺伝子型の頻度が6％未満であるが、0.1％より大きい、データベースにおいて利用可能なドナーを選択する工程を含む、上記のいずれか1つに従う方法。
【０１７６】
細胞の試料を選択する工程が、ヒト集団におけるHLA A、B、C、およびDRアレル遺伝子型の頻度が6％未満であるが、0.1％より大きい、データベースにおいて利用可能なドナーを選択する工程を含む、上記のいずれか1つに従う方法。
【０１７７】
ドナーが、白人、アフリカ人、アジア人から選択される部分母集団に属すると定義される、上記のいずれか1つに従う前記方法。
【０１７８】
ドナーが、約1000万の共通DNA変種を含む、Human Genome Project1、SNP Consortium2、および/またはInternational HapMap Project3に従って少なくとも1つの遺伝子マーカーによって定義される、上記のいずれか1つの請求項に従う前記方法。
【０１７９】
さらに別の局面において、本発明者らは、それぞれの単位用量が少なくとも2種類の免疫抑制薬物と組み合わされる、操作された細胞と、薬学的に許容されるビヒクルとを含む、n個の薬学的単位用量のキットを提供する。
【０１８０】
さらに別の局面において、本発明者らは、それぞれの単位用量がフルダラビンおよびシクロホスファミドと組み合わされる、操作された細胞と、薬学的に許容されるビヒクルとを含む、n個の薬学的単位用量のキットを提供する。
【０１８１】
さらに別の局面において、本発明者らは、上記のような、操作された細胞と、薬学的に許容されるビヒクルとを含む、n個の薬学的単位用量のキットであって、前記キットまたはセットがフルダラビンおよびシクロホスファミドと組み合わされ、定期的に投与され、前記期間が45日ごと、または20日ごと〜50日ごとである、キットを提供する。
【０１８２】
さらに別の局面において、本発明者らは、フルダラビンおよびシクロホスファミドが45日ごとに3〜5日間投与された直後に使用するための、操作された細胞と、薬学的に許容されるビヒクルとを含む、n個の薬学的単位用量のキットを提供する。
【０１８３】
さらに別の局面において、本発明者らは、CLLに罹患している患者において使用するための、フルダラビンおよびシクロホスファミドが45日ごとに3〜5日間投与された直後に使用するための、操作された細胞と、薬学的に許容されるビヒクルとを含む、n個の薬学的単位用量のキットを提供する。
【０１８４】
さらに別の局面において、本発明者らは、AMLに罹患している患者において使用するための、フルダラビンおよびシクロホスファミドが45日ごとに3〜5日間投与された直後に使用するための、CD123に特異的なCARを発現する操作された細胞と、薬学的に許容されるビヒクルとを含む、n個の薬学的単位用量のキットを提供する。
【０１８５】
さらに別の局面において、本発明者らは、フルダラビンおよびシクロホスファミドが14日ごとに、30日ごとに、45日ごとに3〜5日間投与された直後に使用するための、または患者において使用するための、CD22および/またはCD19に特異的なCARを発現する操作された細胞と、薬学的に許容されるビヒクルとを含む、n個の薬学的単位用量のキットを提供する。
【０１８６】
本発明のn個の薬学的単位用量のキットを調製するための方法が提供され、特定の態様では、細胞に
（i）少なくとも1つのNK細胞阻害剤をコードするように、選択された内因性遺伝子座に組み込まれた外因性ポリヌクレオチド配列を含む少なくとも1種類の核酸、
（ii）前記選択された内因性遺伝子座を特異的な標的とする少なくとも1種類の配列特異的試薬
を導入する工程を含み、前記外因性ポリヌクレオチド配列は、標的遺伝子組込みによって前記内因性遺伝子座に挿入される。
【０１８７】
すぐ下に提供される方法において、前記配列特異的試薬は、ヌクレアーゼ、好ましくは、特異的エンドヌクレアーゼ試薬、より好ましくは、TAL-ヌクレアーゼを含み、前記特異的エンドヌクレアーゼ試薬は、RNAガイドエンドヌクレアーゼもしくはDNAガイドエンドヌクレアーゼ、例えば、Cas9もしくはCpf1、RNAガイドもしくはDNAガイド、TAL-エンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、またはその任意の組み合わせから選択されてもよい。
【０１８８】
提供される方法において、前記標的遺伝子組込みは前記免疫細胞への相同組換えまたはNHEJによって操作される。
【０１８９】
提供される方法において、外因性ポリヌクレオチド配列は、前記遺伝子座に存在する内因性プロモーターの転写制御下で組み込まれてもよい。
【０１９０】
提供される方法は、外因性ポリヌクレオチド配列が組み込まれ得る前記内因性遺伝子座が、β2mなどのMHC I成分を発現する遺伝子座である方法でもよい。
【０１９１】
提供される方法は、外因性配列のうちの1つを挿入することで遺伝子発現、好ましくは、前記遺伝子によってコードされるタンパク質の細胞表面発現が不活化される方法でもよい。
【０１９２】
提供される方法は、前記内因性プロモーターが免疫細胞活性化の間に活性があるように選択される方法でもよい。
【０１９３】
前記内因性遺伝子座に、例えば、表6から選択される内因性遺伝子座にある前記内因性プロモーターがT細胞活性化に対して応答する方法。
【０１９４】
好ましい態様では、前記方法は、外因性配列を、TCR、PD1、CD25、B2Mから選択される遺伝子に組み込む工程を含み、前記外因性配列はNK阻害剤をコードする、好ましくは、前記NK阻害剤をコードする外因性配列は、非多型クラスI分子、例えば、HLA-F、HLA-G、もしくはHLA-E、またはその重鎖エピトープを含む、その断片をコードする配列を含み、より好ましくは、前記外因性配列はβ2m内因性遺伝子座に組み込まれた時に、HLA-EもしくはHLA-Gまたはその断片とβ2mとの融合をもたらす。さらにより好ましくは、HLA-EもしくはHLA-Gまたはその断片とβ2m断片との融合は、HLA-EまたはHLA-Gの二量体または三量体の発現をもたらす。
【０１９５】
特定の態様では、前記NK阻害剤をコードする外因性配列は、例えば、UL16(いわゆる、ULBP1-Uniprot ref.:#Q9BZM6)に由来するウイルスアエバシン(aevasin)、またはそのエピトープを含む断片をコードする配列を含む。
【０１９６】
すぐ下にある方法によって入手可能な操作されたT細胞、および本発明の操作された細胞のキットまたはセットの一部が提供される。好ましい態様では、操作されたT細胞は少なくとも1つのキメラ抗原受容体を含む。さらに好ましい態様では、操作されたT細胞は、[TCR]neg[β2m]negとして2種類の不活化された遺伝子がある遺伝子型を含む。
【０１９７】
セットまたはキット内の薬学的用量のそれぞれについて、操作されたT細胞の少なくとも30％、好ましくは50％、より好ましくは80％を構成する、操作された免疫細胞の治療に有効な集団が提供される。
【０１９８】
前記細胞を調製するための前記方法は本明細書において提供され、その全体が参照により本明細書に組み入れられるPCT/EP2018/055957に記載されている。
【０１９９】
ある病態を処置するための、好ましくは、数回の処置または持続的な処置(同じ処置を数回、連続して投与する)を必要とする癌を処置するためのキットが意図される。
【０２００】
連続する病態、好ましくは、複数の癌を処置するためのセットがPにおいて用いられてもよい。
【０２０１】
連続する病態、好ましくは、1つの癌を処置するためのセットがPにおいて用いられてもよい。
【図面の簡単な説明】
【０２０２】
【図１】4つの異なる集団における本発明による薬学的用量単位のキットまたはセットを含む試料サイズ。
【図２】頻度の大きい順に並べられたCAUにおけるハプロタイプの頻度。
【図３】バンクにおけるHLA A(遺伝子A)、HLA B(遺伝子B)、およびHLA DRB1(遺伝子DRB1)の特定のアレルの頻度(パーセント)。
【図４】ランダムに選択されたハプロタイプのスコア。
【図５】患者におけるCTLを介した既往反応を明らかにするためのインビトロアッセイ。
【図６】同種異系細胞の細胞傷害活性はHLA I依存性である。
【０２０３】
表1：本発明によるセットまたはキットの例。
表1の細胞は少なくとも1種類のCARを発現し、TCR分子のaサブユニットをコードする遺伝子の少なくとも1つが不活化されている。
表2：12〜15のミスマッチ数(m)について行った4つの操作の患者カバレッジ(coverage)(1=100％)。
表3：2種類のミスマッチ値(m=20およびm=22)についての、5人のドナーからなる各群および個々の操作(合計30の操作)のカバレッジ(1=100％)の頻度。
表4：最良のハプロタイプセット
表5：HLAA-BおよびDRB1を用いた、最大化された移植可能性を有する5人のドナー(ホモ接合性)のセットの例
表6：T細胞活性化に対して応答する好ましいヒト内因性遺伝子座。
【発明を実施するための形態】
【０２０４】
発明の詳細な説明
本明細書において特に定義のない限り、本明細書において使用される技術用語および科学用語は全て、遺伝子療法、生化学、遺伝学、および分子生物学の分野の当業者に一般的に理解されているものと同じ意味を有する。
【０２０５】
本明細書に記載のものと類似または同等の全ての方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができ、適切な方法および材料を本明細書において説明する。本明細書において言及された全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献が、その全体が参照により組み入れられる。矛盾する場合は、定義を含む本明細書が優先される。さらに、材料、方法、および実施例は例示にすぎず、特に定めのない限り限定することが意図されない。
【０２０６】
本開示の実施では、特に定めのない限り、当技術分野の技術の範囲内である細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えDNA、および免疫学の従来技法が用いられる。このような技法は文献内で十分に説明されている。例えば、Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, (Sambrook et al, 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al. 米国特許第4,683,195号; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Harries & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984);シリーズ物のMethods In ENZYMOLOGY (J. Abelson and M. Simon, 編集長, Academic Press, Inc., New York)、特に、第154巻および155 巻(Wu et al. eds.) and Vol. 185, 「Gene Expression Technology」(D. Goeddel, ed.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986);ならびにManipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986)を参照されたい。
【０２０７】
本発明は、ある個体(P)において既往性免疫反応を誘導しないか、またはわずかな既往性免疫反応を誘導する免疫療法のための、操作された細胞のセットまたはキットに向けられる。
【０２０８】
HLA系の因子の命名法
HLAアレルの命名法
2020530277.tif 000002
【０２０９】
それぞれのHLAアレルの名前には、コロンで分けられた4つまでの数字の集まりに対応する固有の数字がある。アレルの名称の長さはアレルの配列と、その最も近い関係物の配列によって決まる。全てのアレルには、最初の2つの数字の集まりに対応する、少なくとも4桁の名前が与えられる。これより長い名前は必要な時にしか割り当てられない。
【０２１０】
1番目のコロンの前の数字はタイプについて説明し、このタイプは、アロタイプによって運ばれる血清学的抗原に対応することが多い。次の数字の集まりはサブタイプを列挙するために用いられ、DNA配列が決定された順序で数字が割り当てられている。2つの数字の集まりにおいて数字が異なるアレルは、コードされているタンパク質のアミノ酸配列を変える1つまたは複数のヌクレオチド置換の点で差がなければならない。コード配列内で同義ヌクレオチド置換(サイレント置換またはノンコーディング置換とも呼ばれる)しか差がないアレルは、3番目の数字の集まりを用いることで区別される。イントロン、またはエキソンおよびイントロンに隣接する5'非翻訳領域もしくは3'非翻訳領域において配列多型しか差がないアレルは、4番目の数字の集まりを用いることで区別される。
【０２１１】
ユニークなアレルの数字に加えて、アレルの発現状況を示すためにアレルに加えられることがある、さらなる任意の接尾語がある。発現しないことが示されているアレルである「ヌル」アレルには接尾語「N」が与えられている。選択的に発現することが示されているアレルには、接尾語「L」、「S」、「C」、「A」、または「Q」がある場合がある。
【０２１２】
接尾語「L」は、正常レベルと比較した時に「低」細胞表面発現を有することが示されているアレルを示すために用いられる。「S」接尾語は、可溶性の「分泌型」分子として発現し、細胞表面に存在しないタンパク質を指定するアレルを示すために用いられる。「C」接尾語は、「細胞質」に存在し、細胞表面には存在しないタンパク質を産生するアレルに割り当てられる。「A」接尾語は、タンパク質が実際に発現しているかどうかに関して、いくらか疑問がある「異常」発現を示す。「Q」接尾語は、アレルに見られる変異が、他のアレルの正常発現レベルに影響を及ぼすことが示されているのであれば、アレルの発現が「疑わしい」時に用いられる。
【０２１３】
2016年6月時点で、「C」または「A」接尾語を付けて命名されているアレルはない。
【０２１４】
アレルは遺伝子の変種型である。さらに詳細に説明すると、それぞれの遺伝子は、特定の遺伝子座(染色体上の場所)に2コピーで存在し、片親から1コピーの遺伝子が受け継がれる。しかしながら、コピーは必ず同じであるとは限らない。遺伝子のコピーが互いに異なる時には、アレルとして知られる。ある特定の遺伝子には、複数の異なるアレルがある場合があるが、あらゆる個体において遺伝子の遺伝子座に存在するアレルは2つしかない。
【０２１５】
いくつかの局面によれば、免疫療法のための、操作された細胞のセットまたはキットは、ある個体(P)において既往性免疫反応を誘導しないか、またはわずかな既往性免疫反応を誘導する免疫抑制薬の組み合わせと共に用いられる。
【０２１６】
本発明は、細胞、任意で操作された細胞に由来する免疫原性抗原に以前に曝露されるか、または操作された細胞を含み、前記Pの既往性分子、もしくはPに獲得免疫がある抗原(好ましくは、T細胞依存性抗原)を発現する単位用量に以前に曝露され、次いで、その後に、前記既往性分子またはPに獲得免疫がある抗原を含む、操作された細胞または組織の単位用量が移植された場合に、ある個体(P)における既往性反応と比較した時に、前記個体Pにおいて既往性免疫反応を誘導しないか、またはわずかな既往性免疫反応を誘導する連続療法として使用するための、操作された細胞と、薬学的に許容されるビヒクルとを含む、n個の薬学的単位用量のセットまたはキットを提供する。
【０２１７】
本発明によれば、ある個体(P)において既往性免疫反応がないこと、またはわずかな既往性免疫反応があるとは、Pに獲得免疫がある既往性分子である、細胞に由来する免疫原性抗原および/または操作された細胞に由来する免疫原性抗原に再曝露されたPにおける既往性免疫反応と比較した時に既往性免疫反応がないこと、またはわずかな既往性免疫反応があることを意味する。
【０２１８】
連続とは、少なくとも2つ、好ましくは少なくとも3つ、より好ましくは少なくとも4つ、さらにより好ましくは少なくとも5つの連続した用量を連続して(順次)投与することを意味する。
【０２１９】
これは、操作された細胞と、薬学的に許容されるビヒクルとを含む、n個の薬学的単位用量がそれぞれ個々に、または一緒に薬として用いられることを意味した。
【０２２０】
既往性反応は、同じ抗原既往反応に2回目に(後で)遭遇した時の新たな、迅速な抗体産生でもよく、抗原、例えば、ウイルス抗原または菌類抗原または細菌抗原または移植された臓器もしくは細胞にある抗原を認識し、その抗原に特異的な抗体を産生する免疫反応、免疫応答、免疫学的応答、すなわち、身体防御反応である。
【０２２１】
提供されるn個の薬学的単位用量またはn個の薬学的組成物のセットまたはキットは、あるユニークな個体Pを処置するためのものであり、血液製剤、例えば、操作された免疫細胞の骨髄移植または養子移入を含む、Pにおける以前の移植片、例えば、Pにおける以前の自己移植片または以前の同種異系移植片に左右される。
【０２２２】
本発明によるドナーは、ドナー細胞、あるドナーに由来する試料または細胞である。
【０２２３】
概して、ドナー、すなわちドナー細胞は、異なるドナー細胞に由来してもよく、異なるドナー細胞に由来しなくてもよく、細胞は、本発明の目的のためにPにおいて既往反応を担っている可能性がある抗原を発現しないように操作されてもよい。
【０２２４】
本発明は、連続処置として、または患者Pに投与された潜在的な以前の移植片を考慮して既往性免疫反応を阻止するための処置として連続用量の操作された細胞を提供すること含む。
【０２２５】
特定の態様では、本発明は、既往性免疫反応に関与する抗原にPを再曝露した時に、既往反応を誘導しないか、またはわずかな既往反応を誘導する、n個の薬学的単位用量またはn個の薬学的組成物のセットを含む。これは、2つの注射間の時間を管理することによって、および/または(前記既往性免疫反応を変えるか、阻害するか、もしくは阻止するために、操作された免疫細胞の投与の前、それと同じ時間で/その後で)薬物もしくは薬物の組み合わせを投与することによって成し遂げられる。
【０２２６】
これは、例えば、抗アジュバント作用を有する化合物を投与することにより、このような免疫反応に関与する任意の免疫細胞を一時的に(癌細胞および/または転移を破壊するための時間)破壊することによって行われてもよい。
【０２２７】
従って、一態様では、操作された免疫細胞の、あらゆる注射には、薬物の投与、または免疫系の活性に一時的または決定的に影響(免疫抑制)を及ぼす可能性がある処置(デバルキング、光線)、例えば、リンパ球枯渇薬物、Tリンパ球および/またはBリンパ球を枯渇させる薬物、特定の免疫細胞サブセットの活性を低減する薬物が先行する。
【０２２８】
免疫抑制性薬物
最終的に既往反応を誘導しないか、またはわずかな既往反応を誘導する本発明のセットの単位用量を用いた免疫療法の前および/または間に、以下の薬物:
コルチコステロイド
・  プレドニゾン(Deltasone, Orasone)
・  ブデソニド(Entocort EC)
・  プレドニゾロン(Millipred)
カルシニューリン阻害剤
・  シクロスポリン(Neoral, Sandimmune,SangCya)
・  タクロリムス(Astagraf XL, Envarsus XR,Prograf)
mTOR阻害剤
・  シロリムス(Rapamune)
・  エベロリムス(Afinitor, Zortress)
IMDH阻害剤
・  アザチオプリン(Azasan, Imuran)
・  レフルノミド(Arava)
・  ミコフェノール酸(CellCept, Myfortic)
生物製剤
・  アバタセプト(Orencia)
・  アダリムマブ(Humira)
・  アナキンラ(Kineret)
・  セルトリズマブ(Cimzia)
・  エタネルセプト(Enbrel)
・  ゴリムマブ(Simponi)
・  インフリキシマブ(Remicade)
・  イキセキズマブ(Taltz)
・  ナタリズマブ(Tysabri)
・  リツキシマブ(リツキサン)
・  セクキヌマブ(Cosentyx)
・  トシリズマブ(Actemra)
・  ウステキヌマブ(Stelara)
・  ベドリズマブ(Entyvio)
・  QBEN10
抗体
・  バシリキシマブ(Simulect)
・  ダクリズマブ(Zinbryta)
・  ムロモナブ(Orthoclone OKT3)
・  アレムツズマブ
・  リツキシマブ
・  QBEN10
またはその組み合わせのいずれか1つが用いられてもよい。
【０２２９】
免疫療法と交互に用いられる、これらの任意の免疫抑制薬物の有効用量は、二療法(bi-therapy)または三療法(tri-therapy)、例えば、二療法シクロホスファミド、フルダラビン、あるいは三療法、例えば、シクロホスファミド、フルダラビン、リツキシマブ、もしくはシクロホスファミド、フルダラビン、またはミトキサントロンから利益を得る患者に通常与えられるものである。
【０２３０】
従って、本発明はまた、デバルキング、光線、X線、γ線、荷電粒子、コルチコステロイド、生物製剤、抗体、imdh阻害剤、mtor阻害剤、およびその組み合わせから選択される以下の処置の少なくとも1つ、好ましくは2つと組み合わされたn個の薬学的単位用量のセットも提供する。
【０２３１】
従って、本発明はまた、処置された患者において既往反応を誘導しない、デバルキング、光線、X線、γ線、荷電粒子、コルチコステロイド、生物製剤、抗体、imdh阻害剤、mtor阻害剤、およびその組み合わせから選択される以下の処置の少なくとも1つ、好ましくは4つと組み合わされたn個の薬学的単位用量のセットも提供する。
【０２３２】
本発明は、デバルキング、コルチコステロイド、生物製剤、抗体、imdh阻害剤、mtor阻害剤、およびその組み合わせから選択される以下の処置の少なくとも1つと組み合わされた、同種異系細胞、好ましくは、操作された同種異系細胞、より好ましくは、Pとは異なる1人のドナーに由来する操作された同種異系細胞を含むn個の薬学的単位用量のセットを提供する。
【０２３３】
mTOR阻害剤は、ホスファチジルイノシトール-3キナーゼ(PI3K)関連キナーゼ(PIKK)のファミリーに属するセリン/スレオニン特異的プロテインキナーゼであるラパマイシン標的タンパク質(mTOR)を阻害する薬物のクラスである。mTORは、2種類のタンパク質複合体mTORC1およびmTORC2を介した形成およびシグナル伝達によって細胞代謝、成長、および増殖を調節する。好ましくは、mTOR阻害剤は、シロリムス、テムシロリムス、エベロリムス、またはリダフォロリムスから選択されるラパログ(rapalog)(ラパマイシンおよびその類似体)である。
【０２３４】
本発明は、デバルキング、光線、X線、γ線、荷電粒子、およびその組み合わせから選択される以下の処置の少なくとも1つと組み合わされた、同種異系細胞、好ましくは、操作された同種異系細胞、より好ましくは、Pとは異なる1人のドナーに由来する操作された同種異系細胞を含むn個の薬学的単位用量のセットを提供する。
【０２３５】
本発明はまた、デバルキング、光線、X線、γ線、荷電粒子、コルチコステロイド、生物製剤、抗体、imdh阻害剤、mtor阻害剤、およびその組み合わせから選択される以下の処置の少なくとも1つと組み合わされた、Pにおける連続免疫療法、すなわち、再投薬のための同じ細胞試料または同じ操作された細胞の連続用量も含む。
【０２３６】
本発明はまた、以下のスケジュールに従って使用するための、デバルキング、光線、X線、γ線、荷電粒子、コルチコステロイド、生物製剤、抗体、imdh阻害剤、mtor阻害剤、およびその組み合わせから選択される以下の処置の少なくとも1つと組み合わされた、Pにおける連続免疫療法、すなわち、再投薬のための同じ細胞試料または同じ操作された細胞の連続用量も含む。
【０２３７】
同じ抗原(細胞、例えば、UCART123細胞の同じバッチに由来する異なる細胞試料)がそれぞれ、免疫反応を阻害または抑制または減弱する処置(例えば、フルダラビン/シクロホスファミド)、特に（免疫細胞を阻害することによって）既往性免疫反応を阻害または抑制する処置と組み合わされて、(任意で、デバルキング処置、好ましくは、7+3処置を受けた)ある個体において数回(少なくとも2回、好ましくは少なくとも3回)、一定の時間間隔で、例えば、45日ごとに注射される。
【０２３８】
特定の態様では、Pは、最初に、1回目の免疫療法注射の前に、免疫系に影響を及ぶことが意図されるレジメン、例えば、「7+3レジメン」を使用し、次に、再度、好ましくは、1回目の注射の45日後に、癌細胞がなくなるまで、リンパ球枯渇処置および第2の用量の操作された免疫細胞の連続注射を使用して処置(デバルキング)される。
【０２３９】
化学療法の文脈において「7+3」とは、ATRAおよび/または三酸化ヒ素で良好に処置され、化学療法をあまり必要としない(化学療法を必要とする場合。いつも当てはまるというわけではない)急性前骨髄球性白血病型を除いて、急性骨髄性白血病において(軽快を誘導するための)第一選択導入療法として今日(2014年現在)、最もよく用いられている化学療法レジメンの頭字語である。
【０２４０】
「7+3」という名前は、7日間の標準用量シタラビンと、3日間のアントラサイクリン抗生物質またはアントラセンジオン、ほとんどの場合、(ドキソルビシンまたはイダルビシンまたはミトキサントロンの代わりに使用することができる)ダウノルビシンからなる化学療法コースの期間から来ている。
【０２４１】
投与計画
標準用量シタラビン+ダウノルビシン(DAまたはDAC化学療法)
2020530277.tif 000003
標準用量シタラビン+イダルビシン(IAまたはIAC化学療法)
2020530277.tif 000004
標準用量シタラビン+ミトキサントロン(MAまたはMAC化学療法)
2020530277.tif 000005
【０２４２】
強化バージョン
効力を改善することを目的とする「7+3」レジメンの強化はコースを延長することによって成し遂げられる(シタラビンの場合は7日ではなく10日、またはダウノルビシン/イダルビシンの場合は3日ではなく4〜5日)。
【０２４３】
本発明によれば、ビンカアルカロイド(ビンクリスチンまたはビンブラスチン)は、AMLを処置するために用いられる時には、「7+3」レジメンに関連するグルココルチコイド(プレドニゾロンに似ている)またはメトトレキサテノト(methotrexatenot)である。
【０２４４】
本発明の目的では、操作された細胞の各用量は繰り返し、または異なる時間間隔で患者に投与され、前記時間間隔は1日〜70年である。
【０２４５】
連続用量を調製するための試料は、良くても患者のMHCにマッチするように、主要組織適合遺伝子複合体の分子の「内容(content)」に基づいて選択されてもよく、Pにマッチしなければ、MHCの内容は、投与しようとする、または既に投与されている、またはその両方の他の試料用量の他のどんなMHCアレルとも異ならなければならない。
【０２４６】
概略的な局面において、本発明者らは、Pに獲得免疫がある、細胞に由来する免疫原性抗原(好ましくは、T細胞依存性抗原)に以前に曝露され、次いで、その後に、Pに獲得免疫がある、前記細胞に由来する免疫原性抗原に再曝露された場合に、前記個体Pにおける既往性反応と比較した時に、ある個体(P)において既往性免疫反応を誘導しないか、またはわずかな既往性免疫反応を誘導する連続療法として、単独で使用するか、または少なくとも1種類の免疫抑制薬と組み合わせて使用するための、操作された細胞と、薬学的に許容されるビヒクルとを含む、n個の薬学的単位用量のセットを提供する。
【０２４７】
本発明者らは、細胞、任意で、操作された細胞に由来する免疫原性抗原に以前に曝露されるか、または操作された細胞を含み、前記Pの既往性分子、もしくはPに獲得免疫がある抗原(好ましくは、T細胞依存性抗原)を発現する単位用量に以前に曝露され、次いで、その後に、前記既往性分子またはPに獲得免疫がある抗原を含む、操作された細胞または組織の単位用量が移植された場合に、前記個体Pにおける既往性反応と比較した時に、ある個体(P)において既往性免疫反応を誘導しないか、またはわずかな既往性免疫反応を誘導する連続療法として使用するための、単独で使用するか、または少なくとも1種類の免疫抑制薬と組み合わせて使用するための、操作された細胞と、薬学的に許容されるビヒクルとを含む、n個の薬学的単位用量のセットを特定した。
【０２４８】
特定の態様では、n個の用量のそれぞれがPから得られた、本発明によるn個の薬学的単位用量のセットが提供される。
【０２４９】
特定の態様では、n個の用量のそれぞれがPから得られ、同じバッチ(全く同じ抗原を有する)に由来するか、または同じ抗原を標的とするが、異なって操作されているn個の薬学的単位用量のセットが提供される。この場合、既往反応が開始しないように2回の使用間の時間が決定され、任意で免疫抑制性薬物が投与される。
【０２５０】
特定の態様では、本発明は、n個の用量のそれぞれが、好ましくは、Pに由来し、Pの細胞に由来する抗原とマッチする、P以外のドナーに由来してもよい、薬学的単位用量のセットを提供する。
【０２５１】
特定の態様では、本発明は、n個の用量のそれぞれが異なるドナーから得られ、Pとは異なるn個の薬学的単位用量のセットを提供する。
【０２５２】
特定の態様では、本発明は、nが少なくとも5であるn個の薬学的単位用量のセットを提供する。
【０２５３】
特定の態様では、本発明はn個の薬学的単位用量のセットを提供し、ここでそれぞれの薬学的単位用量の細胞は少なくとも1種類のCARまたは1つのTCRを含み、前記CARまたはTCRは、n個の連続用量において、同じであり、同じ抗原特異性を有するか、または異なり、異なる抗原特異性を有する。
【０２５４】
本発明による細胞は免疫療法に適している。細胞は、例えば、初代細胞、初代T細胞、初代CD4 T細胞、初代CD4 T調節細胞、初代CD8 T細胞、初代NKT細胞でもよい。
【０２５５】
一部の態様では、前記細胞はT細胞である。一部の態様では、前記細胞はT細胞前駆体である。
【０２５６】
特定の態様では、本発明による細胞は免疫療法に適しており、幹細胞、細胞傷害性細胞に分化するように操作およびプログラムされた細胞でもよい。
【０２５７】
本発明によれば、細胞は、初代細胞、例えば、初代免疫細胞、または初代幹細胞、初代T細胞、初代T細胞に由来する初代IPS、初代CD4 T細胞、初代CD4 Treg細胞、初代CD8 T細胞、初代NKT細胞でもよい。
【０２５８】
本発明は、細胞に由来する免疫原性抗原が、http://hla.alleles.org/nomenclature/updates/201606.htmlに記載のように、少なくとも、HLAアレルの少なくとも1つによってコードされる産物を含む、n個の薬学的単位用量のセットを提供する。最初のリストは、HLA (2016) 88:142-51. Human Immunology (2016) 77:1309-17. International Journal of Immunogenetics (2016)43:320-9に公開された。全て2017年6月30日以前の日付である、http://hla.alleles.org/nomenclature/updates/201606.htmlにあるHLAアレルが本発明の一部である。
【０２５９】
本発明は、細胞に由来する免疫原性抗原が全てPのものにマッチするか、またはPに投与されたら、および/またはPに2回投与された時に免疫反応を全く誘導しないn個の薬学的単位用量のセットを提供する。
【０２６０】
他の態様では、上記に従うn個の薬学的単位用量のセットは、細胞に由来する免疫原性抗原が、少なくとも、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ、およびHLA-DR、またはその組み合わせから選択されるHLAアレルの少なくとも1つによってコードされる産物を含むセットである。
【０２６１】
特定の態様では、細胞に由来する免疫原性抗原は、以下の遺伝子座:HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ、およびHLA-DR、またはその組み合わせによってコードされる産物の変種アレルを含み、好ましくは、細胞に由来する免疫原性抗原は、HLA-DP、HLA-DQ、およびHLA-DRによってコードされる産物の変種アレルであり、細胞は、不活化されたβ2ミクログロブリンを有し(もはやMHCクラスIがない)、より好ましくは、細胞は、さらに、CTIIA遺伝子の不活化によりHLA-DP、HLA-DQ、およびHLA-DRアレルを含まないか、または限られたHLA-DP、HLA-DQ、およびHLA-DRアレルを含む。
【０２６２】
HLA系
HLA遺伝子ファミリーは、ヒト白血球抗原(HLA)複合体として知られる関連タンパク質のグループを作るための指示を与える。HLA複合体は、免疫系が身体のタンパク質と、外来侵入者、例えば、ウイルス、細菌、または組織移植もしくは臓器移植の場合は同種異系によって作られるタンパク質を区別するのを助ける。ヒトでは、MHC複合体は、6番染色体上ですぐ近くに配置されている200超の遺伝子からなる。ヒトには6つの主なMHCクラスII遺伝子:HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DRA、およびHLA-DRB1がある。MHCクラスII遺伝子は、ほぼ、ある特定の免疫系細胞の表面にしか存在しないタンパク質を作るための指示を与える。MHCクラスIタンパク質と同様に、これらのタンパク質はペプチドを免疫系に提示する。HLA遺伝子には、起こり得る多くのバリエーションがあり、このため、一人一人の免疫系は広範にわたる外来侵入者に反応することができる。HLA遺伝子の中には数百種類もの特定されたバージョン(アレル)があり、それぞれに、ある特定の数(例えば、HLA-B27)が与えられている。密接に関連しているアレルは一緒に分類され、例えば、少なくとも40種類の非常に似たアレルはHLA-B27サブタイプである。これらのサブタイプはHLA-B*2701〜HLA-B*2743と呼ばれる。
【０２６３】
HLAの精度
HLAタイピングを報告するためのガイドラインによれば、2011年3月17日〜18日、アテネでのHLA-NETミーティングにおいて定義されたように、アレルの精度は、WHO HLA Nomenclature Reportのある特定のバージョンにおいて定義された1つのアレルと一致する、DNAに基づくタイピング結果である。
【０２６４】
高精度は、HLA分子のペプチド結合領域の同じタンパク質配列を指定し、かつコードし、細胞表面タンパク質として発現していないアレルを除外するアレルセットと定義される。これは、2番目のフィールド(以前は4桁の数字)の精度レベルまたはそれより大きなレベルでHLAアレルを特定し、少なくとも、クラスI遺伝子座のエキソン2および3ならびにクラスII遺伝子座のエキソン2の中にある多型に起因する全ての曖昧さを解決する。
【０２６５】
中間精度は、アレル名の1番目のフィールドにある数字を共有するアレルサブセットを含み、このフィールドを共有する、いくつかのアレルを除外する、DNAに基づくタイピング結果と定義される。
【０２６６】
低精度は、DNAに基づく命名法における1番目のフィールド(以前は2桁の数字)のレベルでの、DNAに基づくタイピング結果である。上記の精度のどれにも達することができなかったら、DNAに基づく低精度タイピングが受け入れられる。
【０２６７】
本発明によるn個の薬学的単位用量のセットまたはキットは、特定の態様では、Pのものにマッチする、細胞に由来する免疫原性抗原を含む。マッチングは、Pの細胞のHLAタイピングと、HLAタイピング、好ましくは(分子HLAタイピング)、より好ましくは高精度分子タイピング]、7/7、好ましくは8/8、より好ましくは9/9、理想的には10/10のスコアで一致する。
【０２６８】
一態様では、単位用量の1つまたはいくつかにある細胞はPのものとハプロタイプ一致し得る。
【０２６９】
好ましくは、ドナーとレシピエントPがぴったりとマッチする細胞タイプを有するようにドナーは選択される。タイプは、身体の細胞の表面にあるタンパク質であるヒト白血球抗原(HLA)によって決められる。ヒト白血球抗原(HLA)により、免疫系は、細胞が宿主に属し、放置できるか、または異物か、もしくは病気にかかっており、排除すべきかどうか確かめることが可能になる。移植により正常な健常組織が攻撃されるリスクを小さくするために、好ましくは、HLAタイプがレシピエントのものとできる限り近いドナーが選択される。
【０２７０】
本発明は、健常な第1度近親者である親、同胞、または子供がドナーとして役立つハプロタイプ一致移植片を含む。ほぼ完全にHLAマッチするのではなく、ハプロタイプ一致移植片用のドナーはレシピエントに50パーセントマッチすることしか必要としない。
【０２７１】
もっと後の場合では、移植して数日経った後、Pには非常に高い用量の化学療法薬物シトキサン(シクロホスファミド)が与えられる。これにより、提供された免疫系細胞が身体への攻撃を開始する潜在的な移植副作用である移植片対宿主病(GVHD)の重要な一因である活性T細胞が激減する。
【０２７２】
シクロホスファミドの標準用量は、1〜14日間、100〜200mg/m2/日(2,5〜5mg/kg/日)であり、2〜4週間ごとに繰り返される。標準(450〜1000mg/m2)、高用量は500〜1000mg/m2または500〜1000mg/m2IV毎月6用量または＞1000mg/m2とみなされる。
【０２７３】
特定の態様では、本発明によるn個の薬学的単位用量のセットは、n個の用量の少なくとも1つのHLAタイピング、好ましくは、n個の用量全てのHLAタイピングが、HLA-A、HLA-B、HLA-C、DRB1、およびDQB1遺伝子座においてPと10/10の高精度マッチであることを特徴とする。
【０２７４】
特定の態様では、本発明によるn個の薬学的単位用量のセットは、n個の用量の少なくとも1つのHLAタイピングが患者PのHLAタイピングに(6/6または7/7、好ましくは8/8、より好ましくは9/9または10/10で)マッチし、HLA-A、HLA-B、HLA-C、-DRB1、またはDQB1遺伝子座から選択される遺伝子座において多くても1個のミスマッチ、好ましくは、HLA-A、HLA-B、HLA-DRB1、またはDQB1遺伝子座から選択される遺伝子座、より好ましくはHLA-DQ、あまり好ましくなくはHLA-Cにおいて1個のミスマッチを含むことを特徴とする。
【０２７５】
本発明によれば、n個の薬学的単位用量のセットにおいて、細胞はPと比べて1個のミスマッチを示してもよく、前記ミスマッチは、それぞれの単位用量において異なってもよい。
【０２７６】
本発明によれば、連続療法において好みの順序で最初に用いられるn個の薬学的単位用量のセットにおける用量は、102〜1010個の細胞、102、103、104、105、106、107、108、109、1010個の細胞、好ましくは、CAR発現細胞、または必須の精製された(3％未満のTCR陽性の操作されたTCR陰性細胞である。好ましい態様では、細胞の用量は、104〜108個の細胞/用量/kg、より好ましくは105、106、107/用量/kg、さらにより好ましくは1.25×105細胞/kg〜5.05×106細胞/kgである。
【０２７７】
概して、本発明の全ての試料中の細胞は、PにおいてGVHDを誘導しないTCR陰性T細胞である。
【０２７８】
本発明によれば、連続療法において好みの順序で最初に用いられるn個の薬学的単位用量のセットにおける用量は、
- 操作されていない細胞または操作された細胞に由来する免疫原性抗原が患者のものに完全にマッチする用量(例えば、少なくとも3回連続した用量の連続した自己移入)、
- 細胞がHLAに基づいて選択されていても(双生児)、患者のものにマッチするように操作されていても、armful HLAがなく、細胞に由来する主要な免疫原性抗原を有さないように操作されていても(参照により本明細書に組み入れられるWO2016183041A3のようにハプロタイプ一致ドナーまたはユニバーサルドナー)、操作されていない細胞または操作された細胞に由来する免疫原性抗原が患者のものにマッチする用量
である。
【０２７９】
細胞は、参照により本明細書に組み入れられるWO2017081288A1の方法および発明に従って得られてもよく、参照により本明細書に組み入れられるPCT/US2014/024660もしくはWO/2014/165177に記載の方法および発明に従って得られてもよい。
- 細胞は、Pとの少ないミスマッチを有し、それぞれのミスマッチはそれぞれの単位用量において異なり、従って、以下の場合：
n個の用量のドナーの操作されていない細胞または操作された細胞に由来する免疫原性抗原は患者のものにマッチする、
n個の用量のうちのn-1のドナーの操作されていない細胞または操作された細胞に由来する免疫原性抗原は全て患者のものにマッチする
ことが意図され、本発明の一部である。
n個の用量のうちのn-m(n≧m≧2)のドナーの操作されていない細胞または操作された細胞に由来する免疫原性抗原は全て患者のものにマッチし、
Mkが、m個の連続したマッチしない用量のk番目に存在する、Pにマッチしない免疫原性抗原のセットであれば、これらのm個の投与される用量のk番目(k≧2)は、M1、M2、…、M(k-1)の和集合に存在する免疫原性抗原を有してはならない。さらに、M1は、個体が既に免疫されている、あらゆる免疫原性抗原を回避してもよい。
【０２８０】
特定の態様によれば、本発明によるn個の薬学的単位用量のセットは、患者の免疫原性抗原に完全にマッチしない免疫原性抗原が、患者とのミスマッチが増加する順序で、かつ以下：
- (Aのミスマッチに既に曝露されていれば)、(Bのミスマッチ)を使用した後に(DQB1のミスマッチ)を使用する、
- (Aのミスマッチに既に曝露されていれば)、(Cのミスマッチ)を使用した後に(DQB1のミスマッチ)を使用する、
- (Cのミスマッチに既に曝露されていれば)、(Aのミスマッチ)を使用した後に(Bのミスマッチ)を使用する、
- (Cのミスマッチに既に曝露されていれば)、(Aのミスマッチ)を使用した後に(DRB1のミスマッチ)を使用する、
- (Cのミスマッチに既に曝露されていれば)、(DQB1のミスマッチ)を使用した後に(DRB1のミスマッチ)を使用する、
- (DPB1のミスマッチに既に曝露されていれば)、(DQB1のミスマッチ)を使用した後に(DRB1のミスマッチ)を使用する、
- (DQB1のミスマッチに既に曝露されていれば)、(Aのミスマッチ)を使用した後に(Bのミスマッチ)を使用する、
- (DQB1のミスマッチに既に曝露されていれば)、(Aのミスマッチ)を使用する、
- (DQB1のミスマッチに既に曝露されていれば)、(Cのミスマッチ)を使用した後に(Aのミスマッチ)を使用する、
- (DPB1のミスマッチに既に曝露されていれば)、(DRB3,4,5のミスマッチ)を使用した後に(Cのミスマッチ)を使用する、
- (DQB1のミスマッチに既に曝露されていれば)、(Aのミスマッチ)を使用した後に(DRB3,4,5のミスマッチ)を使用する、
- (DPB1、DRB3,4,5のミスマッチに既に曝露されていれば)、(DQB1のミスマッチ)を使用した後に(Cのミスマッチ)を使用する、
- (C、DRB3,4,5、DQB1、DPB1のミスマッチに既に曝露されていれば)、(Aのミスマッチ)を使用した後に(B、DRB1のミスマッチ)を使用する
から選択される順序の1つで投与されることを特徴とする。
【０２８１】
さらに、本発明は、体重1キログラムあたりの操作された細胞の用量について、以下のマッチ；
体重1キログラムあたり＞3x107個またはそれより多い操作された細胞を含む用量の場合は、少なくとも6/6 HLAのマッチ、
体重1キログラムあたり＞4x107個またはそれより多い操作された細胞を含む用量の場合は、少なくとも5/6 HLAのマッチ、
体重1キログラムあたり＞5x107個またはそれより多い操作された細胞を含む用量の場合は、少なくとも4/6 HLAのマッチ
が推奨されることを特徴とする、n個の薬学的用量のセットを提供する。
【０２８２】
さらに、本発明は、ヒト集団におけるPにマッチしないHLAアレルのそれぞれの頻度が6％未満であるが、0.1％超であることを特徴とするn個の薬学的単位用量のセットを提供する。
【０２８３】
さらに、本発明は、ハプロタイプA/DRB1の点でPとミスマッチするHLAアレルを有する操作された細胞に続いて、ハプロタイプB/Cの点でPとミスマッチするHLAアレルを有する操作された細胞に続いて、ハプロタイプDQの点でPとミスマッチするHLAアレルを有する操作された細胞の連続投与を回避しなければならないことを特徴する、n個の薬学的単位用量のセットを提供する。
【０２８４】
さらに、本発明は、前記操作された初代細胞がPとHLAハプロタイプ一致であることを特徴とする、n個の薬学的単位用量のセットを提供する。
【０２８５】
さらに、本発明は、各用量にある前記操作された細胞が、健常細胞と比較した時に病理学的細胞上で構成的もしくは一時的に発現している分子、または病理学的細胞上でしか発現していない分子を標的とする少なくとも1種類のCARおよび/またはTCRを発現することを特徴する、n個の薬学的単位用量のセットを提供する。
【０２８６】
さらに、本発明は、前記少なくとも1種類のCARが、DR4、CD19、CD123、CD20、CD22、CD38、CD30、CS-1、CLL-1、HSP70、BCMA、VEGF、DR4、GD2、癌精巣(CT)抗原、MUC1、GD2、oアセチルGD2、HM1.24(CD317)、CYP1B1、SP17、PRAME、ウィルムス腫瘍1(WT1)、熱ショックタンパク質gp96、甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)；CD171；CS-1(CD2サブセット1、CRACC、SLAMF7、CD319、および19A24)；C型レクチン様分子-1(CLL-1)；ガングリオシドGD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(]-4)bDGlcp(l-l)Cer)；Tn抗原(TnAg)；Fms様チロシンキナーゼ3(FLT3)；CD38；CD44v6；B7H3(CD276)；KIT(CD117)；インターロイキン-13受容体サブユニットα-2(IL-13Ra2)；インターロイキン11受容体α(IL-llRa)；前立腺幹細胞抗原(PSCA)；プロテアーゼセリン21(PRSS21)；血管内皮増殖因子受容体2(VEGFR2)；ルイス(Y)抗原；CD24；血小板由来増殖因子受容体β(PDGFR-β)；stage-specific embryonic antigen-4(SSEA-4)；Mucin 1, cell surface associated(MUC1)；上皮増殖因子受容体(EGFR)；神経細胞接着分子(NCAM)；炭酸脱水酵素IX(CAIX)；Proteasome(Prosome, Macropain)サブユニット、β型、9(LMP2)；エフリンA型受容体2(EphA2)；フコシルGM1；シアリルルイス接着分子(sLe)；ガングリオシドGM3(aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer；TGS5；高分子量-黒色腫関連抗原(HMWMAA)；o-アセチル-GD2ガングリオシド(OAcGD2)；葉酸受容体β；腫瘍内皮マーカー1(TEM1/CD248)；腫瘍内皮マーカー7関連(TEM7R)；クローディン6(CLDN6)；G protein-coupled receptor class C group 5, member D(GPRC5D)；chromosome X open reading frame 61(CXORF61)；CD97；CD179a；未分化リンパ腫キナーゼ(ALK)；ポリシアル酸；胎盤特異的1(PLAC1)；hexasaccharide portion of globoH glycoceramide(GloboH)；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；ウロプラキン2(UPK2)；A型肝炎ウイルス細胞受容体1(HAVCR1)；アドレノセプターβ3(ADRB3)；パンネキシン3(PANX3)；Gタンパク質共役受容体20(GPR20)；リンパ球抗原6複合体、遺伝子座K9(LY6K)；嗅覚受容体51E2(OR51E2)；TCR Gamma Alternate Reading Frame Protein(TARP)；ウィルムス腫瘍タンパク質(WT1)；ETS translocation-variant gene 6, located on chromosome 12p(ETV6-AML)；精子タンパク質17(SPA17)；X Antigen Family, Member 1A(XAGE1)；アンジオポエチン-結合細胞表面受容体2(Tie2)；黒色腫癌精巣抗原-1(MAD-CT-1)；黒色腫癌精巣抗原-2(MAD-CT-2)；Fos関連抗原1；p53変異体；ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)；sarcoma translocation breakpoints；melanoma inhibitor of apoptosis(ML-IAP)；ERG(transmembrane protease, serine 2(TMPRSS2)ETS融合遺伝子)；N-アセチルグルコサミニル-トランスフェラーゼV(NA17)；ペアードボックスタンパク質Pax-3(PAX3)；アンドロゲン受容体；サイクリンB1；v-myc avian myelocytomatosis viral oncogene neuroblastoma derived homolog(MYCN)；RasホモログファミリーC(RhoC)；チトクロムP450 1B1(CYP1B1)；CCCTC結合因子(ジンクフィンガータンパク質)様(BORIS)；Squamous Cell Carcinoma Antigen Recognized By T Cells 3(SART3)；ペアードボックスタンパク質Pax-5(PAX5)；プロアクロシン結合タンパク質sp32(OY-TES1)；リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ(LCK)；A kinase anchor protein 4(AKAP-4)；synovial sarcoma, X breakpoint 2(SSX2)；CD79a；CD79b；CD72；白血球関連免疫グロブリン様受容体1(LAIR1)；Fc fragment of IgA receptor(FCAR)；白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーAメンバー2(LILRA2)；CD300分子様ファミリーf(CD300LF)；C型レクチンドメインファミリー12メンバーA(CLEC12A)；骨髄ストローマ細胞抗原2(BST2)；EGF様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様2(EMR2)；リンパ球抗原75(LY75)；グリピカン-3(GPC3)；Fc受容体様5(FCRL5)；および免疫グロブリンλ様ポリペプチド1(IGLL1)、ならびにその組み合わせからなる群より選択される分子に特異的であることを特徴とする、n個の薬学的単位用量のセットまたはキットを提供する。
【０２８７】
CARは、好ましくは、DR4、CD19、CD123、CD20、CD22、CD38、CD30、CS-1、CLL-1、HSP70、BCMA、VEGF、DR4、GD2、O-アセチルGD2、癌精巣(CT)抗原、MUC1、MUC16、HM1.24(CD317)、CYP1B1、SP17、PRAME、ウィルムス腫瘍1(WT1)、熱ショックタンパク質gp96、クローディン18.2、およびその組み合わせから選択されてもよい。
【０２８８】
好ましい態様では、CARは、以下の標的:メソテリンFRα、L1-CAM、CAIX、GD2、O-アセチルGD2、FAP、ルイスY、EGFRvIII、HER2、CD20、PSMA、kLC、CD30、CEAのうちの1つに対して向けられる。
【０２８９】
別の好ましい態様では、CARは、以下の標的:α-葉酸受容体(FRα)；L1-細胞接着分子(L1-CAM)；カルボキシ-アンヒドラーゼ-IX(CAIX)；線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)、ヒト上皮増殖因子受容体2(HER2)；癌胎児抗原(CEA)；前立腺特異的膜抗原(PSMA)；CD79aまたはCD79b、CD20またはCD268、C型レクチンドメインファミリー14メンバーA；EGFR5(CLEC14a)、上皮細胞接着分子(EPCAM)、Liv-1、または亜鉛輸送体LIV-1(SLC39A6)、Cholinergic Receptor Nicotinic Alpha 2 サブユニット(CHRNA2)、A Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 10(ADAM10)またはCDw156またはCD156cADAM10、Delta-like 3(DLL3)、C型レクチンドメインファミリー14メンバーA；EGFR5(CLEC14a)の1つに対して向けられる。
【０２９０】
CLEC14aは、タンパク質のC型レクチンドメインファミリーの51kDa(予測)メンバーである。これは、明らかに脳において発現しており、ほとんど知られていない型膜貫通タンパク質である。成熟ヒトCLEC14Aは長さが469アミノ酸である。
【０２９１】
CAR分子は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、ならびに補助刺激ドメインおよび/または一次シグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメインを含み、前記抗原結合ドメインは、疾患に関連する腫瘍抗原に結合し、前記腫瘍抗原は、CD19分子(CD19)；membrane spanning 4-domains A1(CD20とも知られるMS4A1)；CD22分子(CD22)；CD24分子(CD24)；CD248分子(CD248)；CD276分子(CD276またはB7H3)；CD33分子(CD33)；CD38分子(CD38)；CD44v6；CD70分子(CD70)；CD72；CD79a；CD79b；インターロイキン3受容体サブユニットα(CD123とも知られるIL3RA)；TNF受容体スーパーファミリーメンバー8(CD30とも知られるTNFRSF8)；KIT癌原遺伝子受容体型チロシンキナーゼ(CD117)；V-set pre-B cell surrogate light chain 1(VPREB1またはCD179a)；接着Gタンパク質共役受容体E5(ADGRE5またはCD97)；TNF受容体スーパーファミリーメンバー17(BCMAとも知られるTNFRSF17)；SLAMファミリーメンバー7(CS1とも知られるSLAMF7)；L1細胞接着分子(L1CAM)；C型レクチンドメインファミリー12メンバーA(CLL-1とも知られるCLEC12A)；tumor-specific variant of the epidermal growth factor receptor(EGFRvIII)；甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)；Fms関連チロシンキナーゼ3(FLT3)；ガングリオシドGD3(GD3)；Tn抗原(Tn Ag)；リンパ球抗原6ファミリーG6D(LY6G6D)；Delta like canonical Notch ligand 3(DLL3)；インターロイキン-13受容体サブユニットα-2(IL-13RA2)；インターロイキン11受容体サブユニットα(IL11RA)；メソテリン(MSLN)；受容体型チロシンキナーゼ様オーファン受容体1(ROR1)；前立腺幹細胞抗原(PSCA)；erb-b2受容体型チロシンキナーゼ2(ERBB2またはHer2/neu)；プロテアーゼセリン21(PRSS21)；キナーゼインサートドメイン受容体(VEGFR2とも知られるKDR)；ルイスy抗原(ルイスY)；溶質輸送体ファミリー39メンバー6(SLC39A6)；線維芽細胞活性化タンパク質α(FAP)；Hsp70ファミリー シャペロン(HSP70)；血小板由来増殖因子受容体β(PDGFR-β)；Cholinergic receptor nicotinic alpha 2サブユニット(CHRNA2)；Stage-Specific Embryonic Antigen-4(SSEA-4)；Mucin 1, cell surface associated(MUC1)；mucin 16, cell surface associated(MUC16)；クローディン18(CLDN18)；クローディン6(CLDN6)；上皮増殖因子受容体(EGFR)；Preferentially expressed antigen in melanoma(PRAME)；神経細胞接着分子(NCAM)；ADAMメタロペプチダーゼドメイン10(ADAM10)；葉酸受容体1(FOLR1)；葉酸受容体β(FOLR2)；炭酸脱水酵素IX(CA9)；プロテアソームサブユニットβ9(PSMB9またはLMP2)；エフリン受容体A2(EphA2)；テトラスパニン10(TSPAN10)；フコシルGM1(Fuc-GM1)；シアリルルイス接着分子(sLe)；TGS5；高分子量-黒色腫関連抗原(HMWMAA)；o-アセチル-GD2ガングリオシド(OAcGD2)；tumor endothelial marker 7-related(TEM7R)；G protein-coupled receptor class C group 5, member D(GPRC5D)；chromosome X open reading frame 61(CXORF61)；ALK受容体型チロシンキナーゼ(ALK)；ポリシアル酸；胎盤特異的1(PLAC1)；hexasaccharide portion of globoH glycoceramide(GloboH)；NY-BR-1抗原；ウロプラキン2(UPK2)；A型肝炎ウイルス細胞受容体1(HAVCR1)；アドレノセプターβ3(ADRB3)；パンネキシン3(PANX3)；Gタンパク質共役受容体20(GPR20)；リンパ球抗原6ファミリーメンバーK(LY6K)；嗅覚受容体ファミリー51サブファミリーEメンバー2(OR51E2)；TCR Gamma Alternate Reading Frame Protein(TARP)；ウィルムス腫瘍タンパク質(WT1)；ETV6-AML1 fusion protein due to 12；21 chromosomal translocation(ETV6-AML1)；精子自己抗原タンパク質17(SPA17)；X Antigen Family, Member 1E(XAGE1E)；TEK受容体型チロシンキナーゼ(Tie2)；黒色腫癌精巣抗原-1(MAD-CT-1)；黒色腫癌精巣抗原-2(MAD-CT-2)；Fos関連抗原1；p53変異体；ヒトテロ���ラーゼ逆転写酵素(hTERT)；sarcoma translocation breakpoints；melanoma inhibitor of apoptosis(ML-IAP)；ERG (transmembrane protease, serine 2(TMPRSS2)ETS融合遺伝子)；N-アセチルグルコサミニル-トランスフェラーゼV(NA17)；ペアードボックスタンパク質Pax-3(PAX3)；アンドロゲン受容体；サイクリンB1；v-myc avian myelocytomatosis viral oncogene neuroblastoma derived homolog(MYCN)；RasホモログファミリーメンバーC(RhoC)；チトクロムP450 1B1(CYP1B1)；CCCTC結合因子(ジンクフィンガータンパク質)様(BORIS)；Squamous Cell Carcinoma Antigen Recognized By T Cells 3(SART3)；ペアードボックスタンパク質Pax-5(PAX5)；プロアクロシン結合タンパク質sp32(OY-TES1)；リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ(LCK)；A kinase anchor protein 4(AKAP-4)；synovial sarcoma, X breakpoint 2(SSX2)；白血球関連免疫グロブリン様受容体1(LAIR1)；Fc fragment of IgA receptor(FCAR)；白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーAメンバー2(LILRA2)；CD300分子様ファミリーメンバーf(CD300LF)；；骨髄ストローマ細胞抗原2(BST2)；EGF様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様2(EMR2)；リンパ球抗原75(LY75)；グリピカン-3(GPC3)；Fc受容体様5(FCRL5)；免疫グロブリンλ様ポリペプチド1(IGLL1)、ならびに熱ショックタンパク質70(HSP70)からなる群より選択される。
【０２９２】
TCR分子は抗原結合ドメインを含み、前記抗原結合ドメインは、疾患に関連する腫瘍抗原に結合し、前記腫瘍抗原は、PCTA-l/ガレクチン8、CD171、TAG72、CEA、EPCAM、PSCA、PRSS21、PDGFR-β、プロスターゼ、PAP、ELF2M、エフリンB2、IGF-I受容体、CAIX、gp100、bcr-abl、チロシナーゼ、GM3、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-A1、レグマイン、HPVE6,E7、MAGEAl、プロステイン(prostein)、サバイビンおよびテロメラーゼ、PCTA-l/ガレクチン8、メランA/MARTl、Ras変異体、TRP-2、RAGE-1、RU1、RU2、ならびに腸カルボキシルエステラーゼからなる群より選択される。
【０２９３】
免疫療法における薬として使用するための、n個の薬学的単位用量のこれらのセットのいずれか1つが提供される。
【０２９４】
連続免疫療法における薬として使用するための、n個の薬学的単位用量のこれらのセットのいずれか1つが提供される。
【０２９５】
連続した、かつ一定の標的化が必要とされる特定の腫瘍に対する薬として使用するための、n個の薬学的単位用量のこれらのセットのいずれか1つが提供される。ここでは、高速で成長する腫瘍が関係する。
【０２９６】
癌を予防または処置するための免疫療法における薬として使用するための、n個の薬学的単位用量のこれらのセットのいずれか1つが提供される。
【０２９７】
慢性ウイルス感染を除去するための、感染症を予防または処置するための免疫療法における薬として使用するための、n個の薬学的単位用量のこれらのセットのいずれか1つが提供される。
【０２９８】
再発性難治性の癌または癌合併症、例えば、転移を処置するための、n個の薬学的単位用量のこれらのセットのいずれか1つが提供される。
【０２９９】
血液癌、固形癌、または血液癌および固形癌を処置するための、n個の薬学的単位用量のこれらのセットのいずれか1つが提供される。
【０３００】
連続的癌(successive cancer)、連続的血液癌、連続的固形癌、または連続的血液癌および固形癌を処置するための、n個の薬学的単位用量のこれらのセットのいずれか1つが提供される。
【０３０１】
各用量が別の抗癌薬、抗GVHD薬と組み合わせて別の薬物と併用される、n個の薬学的単位用量のこれらのセットのいずれか1つが提供される。
【０３０２】
従って、前記薬物は、単位用量の前または後で同じ時間に与えられてもよく、前記用量中の操作された細胞は必要に応じて前記薬物に対して耐性になるように操作されている。
【０３０３】
従って、本発明は、各用量が、既に注射されている先の単位用量を阻害する、および/またはその生存もしくは効果に影響を及ぼす処置の後に用いられる、n個の薬学的単位用量のセットを提供する。
【０３０４】
本発明は、操作された細胞が、TCRαサブユニットをコードする少なくとも1つの不活化された遺伝子を含む、上記のn個の薬学的単位用量のセットを提供する。
【０３０５】
n個の薬学的単位用量を構成する全ての試料において、細胞にはCARまたはTCRが付与され、CARまたはTCRの細胞表面発現は活性化されてもよく、構成的でもよく、条件付きでもよい。
【０３０６】
好ましくは、本発明は、操作された細胞が、TCRαサブユニットをコードする少なくとも1つの不活化された遺伝子を含む、上記のn個の薬学的単位用量のセットを提供する。
【０３０７】
好ましくは、本発明は、操作された細胞が、TCRαサブユニットアレルをコードする少なくとも1つの不活化された遺伝子アレルを含む、上記のn個の薬学的単位用量のセットを提供する。
【０３０８】
本発明は、操作された細胞が、以下:不活化されたβ2ミクログロブリン遺伝子、不活化されたCTIIA遺伝子、PのものにマッチするMHC分子の遺伝子改変の少なくとも1つを含む、上記のn個の薬学的単位用量のセットを提供する。
【０３０９】
本発明は、操作された細胞が、不活化されたβ2ミクログロブリン遺伝子と、不活化されたCTIIA遺伝子を含む、上記のn個の薬学的単位用量のセットを提供する。
【０３１０】
本発明は、操作された細胞が、MHC分子発現を変える(ダウンレギュレートする)、および/またはMHCをPのものとマッチさせる遺伝子改変を含む、上記のn個の薬学的単位用量のセットを提供する。
【０３１１】
本発明は、操作された細胞が、TCRサブユニットをコードする少なくとも1つの不活化された遺伝子と、不活化されたβ2ミクログロブリン遺伝子を含む、上記のn個の薬学的単位用量のセットを提供する。
【０３１２】
本発明は、操作された細胞が、TCRαサブユニットをコードする少なくとも1つの不活化された遺伝子と、不活化されたCTIIA遺伝子を含む、上記のn個の薬学的単位用量のセットを提供する。
【０３１３】
本発明は、操作された細胞が、TCRαサブユニットをコードする少なくとも1つの不活化された遺伝子と、PのものにマッチするMHC分子の遺伝子改変を含む、上記のn個の薬学的単位用量のセットを提供する。
【０３１４】
本発明は、操作された細胞が、TCRαサブユニットをコードする少なくとも1つの不活化された遺伝子と、不活化されたCTIIA遺伝子と、PのものにマッチするMHC分子の遺伝子改変を含む、上記のn個の薬学的単位用量のセットを提供する。
【０３１５】
本発明は、少なくとも1つの用量における操作された細胞が、薬物、好ましくは抗癌薬に対する耐性を付与する、欠失、挿入、または変異を含む、上記のn個の薬学的単位用量のセットを提供する。
【０３１６】
好ましくは、前記抗癌薬は、薬物に対する耐性を付与する、任意の欠失、挿入、または変異がないCAR-T細胞の生存および/または活性に影響を及ぼす。
【０３１７】
本発明者らは、薬物、好ましくは、免疫抑制薬、または数種類の免疫抑制薬、より好ましくは、1つの薬学的単位用量の前に2〜5日間用いられる1種類の免疫抑制薬または数種類の免疫抑制薬に対する耐性を付与する欠失も挿入も変異も全くないTCR陰性のCAR発現操作細胞を処置として使用することができる、上記のようなn個の薬学的単位用量のセットを特定した。
【０３１８】
本発明は、操作された細胞が、抗癌活性に効率的な用量の抗癌薬と共に用いられる、上記のn個の薬学的単位用量のセットを提供する。
【０３１９】
3〜4サイクルにわたって10〜50日間隔の連続用量は、再発性難治性の癌を処置するための本発明の特定の態様の必須な特徴の1つである。
【０３２０】
本発明は、少なくとも1つの用量における操作された細胞が、PNAに対する耐性を付与する欠失、挿入、または変異を含む、n個の薬学的単位用量のセットを提供する。
【０３２１】
本発明は、少なくとも1つの用量における操作された細胞が、以下の分子、CD52、dCK、GR、およびその組み合わせのうちの1つをコードする不活化された遺伝子を含む、上記のn個の薬学的単位用量のセットを提供する。好ましくは、以下の分子、CD52、dCK、GRのうちの1つをコードする前記不活化された遺伝子は、前記で列挙されたCARまたはTCRの挿入を含む。
【０３２２】
さらに、細胞は、アルギニンもしくはトリプトファンに対する耐性については、参照により本明細書に組み入れられるWO2015155341に記載のように、または全てが参照により本明細書に組み入れられるWO2015075195もしくはPCT/EP2017/058922もしくはPCT/EP2017/058923に記載のように操作されてもよい。
【０３２３】
免疫チェックポイント
本発明は、CARまたはTCR、特に上記のCARのいずれかを発現する同種異系T細胞(アロ反応性が少ないか、またはアロ反応性がない)であって、参照により本明細書に組み入れられるWO2014/184741において言及されるように、T細胞受容体(TCR)の1つまたは複数の成分を発現する少なくとも1つの遺伝子が不活化される、および/または遺伝子CTLA4、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、LAG3、HAVCR2、BTLA、CD160、TIGIT、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、TGFBRII、TGFBRI、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3から選択される1種類の遺伝子が不活化される、同種異系T細胞を提供する。
【０３２４】
細胞は、WO2015121454A1に記載のように産物の発現を阻害する、さらなる遺伝子不活化を行ってもよい。
【０３２５】
本発明は、少なくとも1つの用量における操作された細胞が、以下の分子、CD52、dCK、GR、およびその組み合わせのうちの1つをコードする不活化された遺伝子を含む、上記のようなn個の薬学的単位用量のセットまたはキットを提供する。好ましくは、以下の分子、CD52、dCK、GRのうちの1つをコードする不活化された遺伝子は、以下の抗原:BCMA、CD33、EGFRVIII、Flt3、WT1、CD70、MUC1、PRAME、TSPAN10、クローディン18.2、DLL3、LY6G6D、CD38、HSP70、CD30、CD123、CS1、CD22、CLL-1、MUC1、GD2、CD19、CD123、CD20、CD22、CD38、CD30、CS-1、CLL-1、HSP70、BCMA、VEGF、DR4、GD2、癌精巣(CT)抗原、MUC1、GD2、oアセチルGD2、HM1.24(CD317)、CYP1B1、SP17、PRAME、ウィルムス腫瘍1(WT1)、熱ショックタンパク質gp96、甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)；CD171；CS-1(CD2サブセット1、CRACC、SLAMF7、CD319、および19A24)；C型レクチン様分子-1(CLL-1)；ガングリオシドGD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(]-4)bDGlcp(l-l)Cer)；Tn抗原(TnAg)；Fms様チロシンキナーゼ3(FLT3)；CD38；CD44v6；B7H3(CD276)；KIT(CD117)；インターロイキン-13受容体サブユニットα-2(IL-13Ra2)；インターロイキン11受容体α(IL-llRa)；前立腺幹細胞抗原(PSCA)；プロテアーゼセリン21(PRSS21)；血管内皮増殖因子受容体2(VEGFR2)；ルイス(Y)抗原；CD24；血小板由来増殖因子受容体β(PDGFR-β)；stage-specific embryonic antigen-4 (SSEA-4)；Mucin 1, cell surface associated(MUC1)；上皮増殖因子受容体(EGFR)；神経細胞接着分子(NCAM)；炭酸脱水酵素IX(CAIX)；Proteasome(Prosome, Macropain)サブユニット、β型、9(LMP2)；エフリンA型受容体2(EphA2)；フコシルGM1；シアリルルイス接着分子(sLe)；ガングリオシドGM3(aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer；TGS5；高分子量-黒色腫関連抗原(HMWMAA)；o-アセチル-GD2ガングリオシド(OAcGD2)；葉酸受容体β；腫瘍内皮マーカー1(TEM1/CD248)；tumor endothelial marker 7-related(TEM7R)；クローディン6(CLDN6)；G protein-coupled receptor class C group 5, member D(GPRC5D)；chromosome X open reading frame 61(CXORF61)；CD97；CD179a；未分化リンパ腫キナーゼ(ALK)；ポリシアル酸；胎盤特異的1(PLAC1)；hexasaccharide portion of globoH glycoceramide(GloboH)；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；ウロプラキン2(UPK2)；A型肝炎ウイルス細胞受容体1(HAVCR1)；アドレノセプターβ3(ADRB3)；パンネキシン3(PANX3)；Gタンパク質共役受容体20(GPR20)；リンパ球抗原6複合体、遺伝子座K9(LY6K)；嗅覚受容体51E2(OR51E2)；TCR Gamma Alternate Reading Frame Protein(TARP)；ウィルムス腫瘍タンパク質(WT1)；ETS translocation-variant gene 6, located on chromosome 12p(ETV6-AML)；精子タンパク質17(SPA17)；X Antigen Family, Member 1A(XAGE1)；アンジオポエチン結合細胞表面受容体2(Tie2)；黒色腫癌精巣抗原-1(MAD-CT-1)；黒色腫癌精巣抗原-2(MAD-CT-2)；Fos関連抗原1；p53変異体；ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)；sarcoma translocation breakpoints；melanoma inhibitor of apoptosis(ML-IAP)；ERG (transmembrane protease, serine 2(TMPRSS2)ETS融合遺伝子)；N-アセチルグルコサミニル-トランスフェラーゼV(NA17)；ペアードボックスタンパク質Pax-3(PAX3)；アンドロゲン受容体；サイクリンB1；v-myc avian myelocytomatosis viral oncogene neuroblastoma derived homolog(MYCN)；RasホモログファミリーメンバーC(RhoC)；チトクロムP450 1B1(CYP1B1)；CCCTC結合因子(ジンクフィンガータンパク質)様(BORIS)；Squamous Cell Carcinoma Antigen Recognized By T Cells 3(SART3)；ペアードボックスタンパク質Pax-5(PAX5)；プロアクロシン結合タンパク質sp32(OY-TES1)；リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ(LCK)；A kinase anchor protein 4(AKAP-4)；synovial sarcoma, X breakpoint 2(SSX2)；CD79a；CD79b；CD72；白血球関連免疫グロブリン様受容体1(LAIR1)；Fc fragment of IgA receptor(FCAR)；白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーAメンバー2(LILRA2)；CD300分子様ファミリーメンバーf(CD300LF)；C型レクチンドメインファミリー12メンバーA(CLEC12A)；骨髄ストローマ細胞抗原2(BST2)；EGF様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様2(EMR2)；リンパ球抗原75(LY75)；グリピカン-3(GPC3)；Fc受容体様5(FCRL5)；および免疫グロブリンλ様ポリペプチド1(IGLL1)、ならびに、好ましくは、DR4、CD19、CD123、CD20、CD22、CD38、CD30、CS-1、CLL-1、HSP70、BCMA、VEGF、DR4、GD2、O-アセチルGD2、癌精巣(CT)抗原、MUC1、MUC16、HM1.24(CD317)、CYP1B1、SP17、PRAME、ウィルムス腫瘍1(WT1)、熱ショックタンパク質gp96、クローディン18.2、およびその組み合わせより選択される、その組み合わせ、のいずれか1つに特異的なCARの挿入を含む。
【０３２６】
好ましい態様では、CARは、以下の標的:メソテリン、FRα、L1-CAM、CAIX、GD2、O-アセチルGD2、FAP、ルイスY、EGFRvIII、HER2、CD20、PSMA、kLC、CD30、CEA、FRα、α-葉酸受容体；L1-CAM、L1-細胞接着分子；CAIX、カルボキシ-アンヒドラーゼ-IX；FAP、線維芽細胞活性化タンパク質；HER2、ヒト上皮増殖因子受容体2；CEA、癌胎児抗原；PSMA、前立腺特異的膜抗原；CEA、癌胎児抗原、FAP、HER2、CD79aまたはCD79b、CD20またはCD268、CLEC14a、(EPCAM)、Liv-1、または亜鉛輸送体LIV-1(SLC39A6)、Cholinergic Receptor Nicotinic Alpha 2 サブユニット(CHRNA2)、A Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 10(ADAM10)またはCDw156またはCD156cADAM10、Delta-like 3(DLL3)の1つに対して向けられる。
【０３２７】
より好ましくは、前記CARは、以下の標的:CD123、CD38、CS1、CD19、HSP70、CLL-1、CD22、CD30、Oアセチル-GD2、BCMA、FLT3、MUC-16、MUC-1、DLL3、EGFRV-III、FAP、HER2、CD79a、CD79b、Liv-1、CHRNA2、ADAM10の1つに特異的なCARから選択される。
【０３２８】
発現されたCARはどれも、参照により本明細書に組み入れられるPCT/EP2016/051467に記載のように、精製および/または選択的インビボ欠失を可能にする、さらなるエピトープまたはミメトープを有してもよい。
【０３２９】
本発明は、少なくとも1つの用量における細胞が、腫瘍誘導性低酸素、腫瘍誘導性アデノシン分泌、サイトカインおよび/またはケモカインによる抗癌細胞活性の腫瘍誘導性阻害に対して耐性になるように操作されている、n個の薬学的単位用量のセットを提供する。
【０３３０】
本発明は、nが少なくとも2であり、nが、少なくとも3、または3、少なくとも4、または4、少なくとも5、または5、少なくとも6、または6、少なくとも7、または7、少なくとも8、または8、少なくとも9、または9、少なくとも10または10、好ましくは5である、n個の薬学的単位用量のセットを提供する。
【０３３１】
本発明は、細胞に由来する免疫原性抗原に以前に曝露されるか、または操作された細胞を含み、前記Pの既往性分子、もしくはPに獲得免疫がある抗原(好ましくは、T細胞依存性抗原)を発現する単位用量に以前に曝露され、次いで、その後に、前記既往性分子またはPに獲得免疫がある抗原を含む、操作された細胞または組織の単位用量が移植された場合、ある個体(P)における既往性反応と比較した時に、前記個体Pにおいて既往性免疫反応を誘導しないか、またはわずかな既往性免疫反応を誘導する、癌に対する連続療法として使用するためのn個の薬学的単位用量のセットを提供する。
【０３３２】
本発明は、血液癌に対する連続療法として使用するための、上記のようなn個の薬学的単位用量のセットを提供する。
【０３３３】
本発明は、骨髄増殖性癌、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍(BPDCN)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)、非ホジキンリンパ腫(NHL)、多発性骨髄腫(MM)、急性リンパ球性白血病(ALL)、および慢性リンパ性白血病(CLL)からなる群より選択される血液癌に対する連続療法として使用するための、上記のようなn個の薬学的単位用量のセットを提供する。
【０３３４】
本発明は、骨髄増殖性癌、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍(BPDCN)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)、非ホジキンリンパ腫(NHL)、多発性骨髄腫(MM)、急性リンパ球性白血病(ALL)、慢性リンパ性白血病(CLL)からなる群より選択される再発性および/または難治性の血液癌に対する連続療法として使用するための、上記のようなn個の薬学的単位用量のセットを提供する。
【０３３５】
本発明は、固形癌、肉腫、癌腫、芽腫、または生殖細胞腫瘍に対する連続療法として使用するための、上記のようなn個の薬学的単位用量のセットを提供する。
【０３３６】
本発明は、神経組織、腸組織、肝臓、胃、食道、頭頚部、軟部組織、膵臓、腸、結腸、乳房、眼、膀胱、胆嚢、前立腺、卵巣、子宮、肺、または精巣に罹患する固形癌に対する連続療法として使用するための、上記のようなn個の薬学的単位用量のセットを提供する。
【０３３７】
本発明は、骨に罹患する固形癌に対する連続療法として使用するための、上記のようなn個の薬学的単位用量のセットを提供する。
【０３３８】
一態様では、本発明は、デバルキングされた患者において本発明による免疫抑制薬または免疫抑制薬の組み合わせと組み合わせて(好ましくは、直後に)、すなわち、望ましくない免疫既往性反応を誘導せずに、単位用量を45日ごとに使用することができる、上記のn個の薬学的単位用量のセットを提供する。従って、本発明者らは、Pにおいて既往反応を得ないように設計されたプロトコールに従って投与または使用することができる、自己または同種異系の操作された免疫細胞を含むn個の薬学的単位用量のセットを提供した。
【０３３９】
従って、本発明者らは、Pにおいて既往反応を得ないように設計されたプロトコールに従って用いられた時にMHCバックグラウンドに関係なく投与することができる操作された免疫細胞を含む、n個の薬学的単位用量のセットを提供した。好ましくは、細胞はTCR陰性細胞である。
【０３４０】
単位用量が少なくとも7日間隔、少なくとも20日間隔、少なくとも45日間隔、好ましくは少なくとも45日間隔で順次用いられ、免疫抑制薬または免疫抑制薬の組み合わせを用いた処置が先行する、操作された免疫細胞を含むn個の薬学的単位用量のセットまたはキット。
【０３４１】
mTOR阻害剤は、ホスファチジルイノシトール-3キナーゼ(PI3K)関連キナーゼ(PIKK)のファミリーに属するセリン/スレオニン特異的プロテインキナーゼであるラパマイシン標的タンパク質(mTOR)を阻害する薬物のクラスである。mTORは、2種類のタンパク質複合体、mTORC1およびmTORC2を介した形成およびシグナル伝達によって細胞代謝、成長、および増殖を調節する。好ましくは、mTOR阻害剤は、シロリムス、テムシロリムス、エベロリムス、またはリダフォロリムスから選択されるラパログ(rapalog)(ラパマイシンおよびその類似体)である。
【０３４２】
本発明によれば、提供される物体は、患者、好ましくは、リンパ球枯渇された(lymphodepleted)患者において、30〜60日ごと、好ましくは45日ごとに連続使用(すなわち、抑制性薬物または連続的薬物の組み合わせ、次いで、操作された免疫細胞の単位用量)するための、操作された免疫細胞と、免疫抑制薬または免疫抑制薬の組み合わせのn個の薬学的単位用量のセットを含むキットである。
【０３４３】
本発明によれば、最初に、患者は前処置され、次いで、免疫抑制薬で2〜5日間(好ましくは3〜4日間)処置され、次いで、すぐ後で、単位用量が与えられ、次いで、40〜45日後に患者は前記免疫抑制薬で再処置され、次いで、別の単位用量(別のサイクル)などで、少なくとも2サイクル、3サイクル、4サイクル、5サイクル、6サイクル、7サイクル、8サイクル、9サイクル、10サイクルにわたって、好ましくは、2サイクルより多く処置される。
【０３４４】
これらの条件下で、かつ本発明の定義に従って、処置された患者において既往反応は測定されない。
【０３４５】
好ましくは、細胞は、不活化されたTCRα遺伝子、β2ミクログロブリン遺伝子、および前記で説明されたCARを含む。
【０３４６】
本発明は、患者の初期免疫系が自己再生し、癌細胞が除去される可能性を残すという利点を示す。この処置は反復することにより、最後には癌細胞を除去することになる。
【０３４７】
本発明によれば、1サイクルごと、好ましくは45日ごとの注射の連続サイクルのために、同じバッチに由来するCAR発現が操作された免疫細胞を使用することができ、(免疫抑制薬が先行して)組み合わされた時に既往性反応は生じない。
【０３４８】
1サイクルは、10日、20日、30日、40日、50日、または60日、好ましくは45日ごとに投与されてもよい。
【０３４９】
1サイクルは、上記の少なくとも2種類の免疫抑制薬を用いた2〜5日間の処置と、それに続く10〜109個の操作された細胞の注射である。
【０３５０】
好ましい態様では、癌細胞複製速度が算出され、再発性難治性の細胞を阻止するために、および/またはPにおける副作用を減弱するために2つのサイクル間の時間は短縮または延長される。1サイクルは3〜4日間のフルダラビン/シクロホスファミド、次いで、操作された細胞の単位用量でもよい。
【０３５１】
好ましい態様では、患者Pには最初に7+3デバルキング処置が与えられ、次いで、フルダラビンとシクロホスファミドの組み合わせを用いて3〜4日間処置した後に、6.25 106個のCARを発現する操作された細胞/kg、好ましくは、CD123 CAR T(癌細胞上のCD123抗原を認識する)が注射される。
【０３５２】
一態様では、本発明は、フルダラビンおよびシクロホスファミドを用いて4〜5日間処置した直後に、前処置された患者において単位用量が45日ごとに用いられる、上記のn個の薬学的単位用量のセットを提供する。第1のCARはCD19発現細胞に特異的であり、第2のCARはCD22もしくはC79aまたはCD79bに特異的である。
【０３５３】
本発明による特定の態様では、フルダラビンとシクロホスファミド、任意でリツキシマブを用いて3〜4日間または4〜5日間処置した後に、本発明による同じCAR発現T細胞が注射され、これらの患者において既往反応は測定されない。
【０３５４】
本発明による特定の態様では、フルダラビンとシクロホスファミド、任意でリツキシマブを用いて3〜4日間または4〜5日間処置した後に、本発明による同じTCR陰性CAR発現T細胞が注射され、これらの患者において既往反応は測定されない。
【０３５５】
一態様では、本発明は、単位用量が、フルダラビンおよびシクロホスファミドで3〜4日間処置した直後に45日毎に用いられる、上記のn個の薬学的単位用量のセットを提供する。
【０３５６】
一態様では、本発明は、CLLに罹患している患者におけるフルダラビン、シクロホスファミド、およびリツキシマブなどの免疫抑制薬を用いた処置後に用いられる同種異系CART細胞のn個の薬学的単位用量のセットを提供する。
【０３５７】
一態様では、本発明は、ALLに罹患している患者におけるフルダラビン、シクロホスファミド、およびリツキシマブなどの免疫抑制薬を用いた処置後に用いられる同種異系CART細胞のn個の薬学的単位用量のセットを提供する。
【０３５８】
一態様では、本発明は、AMLに罹患している患者におけるフルダラビン、シクロホスファミド、およびリツキシマブなどの免疫抑制薬を用いた処置後に用いられる同種異系CART細胞のn個の薬学的単位用量のセットを提供する。
【０３５９】
一態様では、本発明は、NHLに罹患している患者におけるフルダラビン、シクロホスファミド、およびリツキシマブなどの免疫抑制薬を用いた処置後に用いられる同種異系CART細胞のn個の薬学的単位用量のセットを提供する。
【０３６０】
一態様では、本発明は、MMに罹患している患者におけるフルダラビン、シクロホスファミド、およびリツキシマブなどの免疫抑制薬を用いた処置後に用いられる同種異系CART細胞のn個の薬学的単位用量のセットを提供する。
【０３６１】
一態様では、本発明は、BPDCNに罹患している患者におけるフルダラビン、シクロホスファミド、およびリツキシマブなどの免疫抑制薬を用いた処置後に用いられる同種異系CART細胞のn個の薬学的単位用量のセットを提供する。
【０３６２】
一態様では、本発明は、固形癌に罹患している患者における免疫抑制薬を用いた処置後に用いられる同種異系CART細胞のn個の薬学的単位用量のセットを提供する。
【０３６３】
一態様では、本発明は、固形癌に罹患している患者における抗癌薬を用いた処置後に用いられる同種異系CART細胞のn個の薬学的単位用量のセットを提供する。
【０３６４】
抗癌剤は以下のいずれか1つでよく、処置される病態の機能に応じて、医師による処方および用量に従って適切に投与される。
酢酸アビラテロン
アビトレキセート(メトトレキセート)
アブラキサン(パクリタキセルアルブミン安定化ナノ粒子処方物)
ABVD
ABVE
ABVE-PC
AC
AC-T
アドセトリス(ブレンツキシマブベドチン)
ADE
アドトラスツズマブエムタンシン
アドリアマイシン(塩酸ドキソルビシン)
ジマレイン酸アファチニブ
アフィニトール(エベロリムス)
アキンゼオ(Akynzeo)(ネツピタントおよび塩酸パロノセトロン)
アルダラ(イミキモド)
アルデスロイキン
アレセンサ(アレクチニブ)
アレクチニブ
アレムツズマブ
アルケラン静注用(Alkeran for Injection)(塩酸メルファラン)
アルケラン錠剤(メルファラン)
アリムタ(ペメトレキセド二ナトリウム)
アロキシ(塩酸パロノセトロン)
アルンブリグ(Alunbrig)(ブリガチニブ(Brigatinib))
アムボクロリン(Ambochlorin)(クロランブシル)
アムボクロリン(Amboclorin)(クロランブシル)
アミホスチン
アミノレブリン酸
アナストロゾール
アプレピタント
アレディア(パミドロン酸二ナトリウム)
アリミデックス(アナストロゾール)
アロマシン(エキセメスタン)
アラノン(ネララビン)
三酸化ヒ素
アーゼラ(オファツムマブ)
アスパラギナーゼ黒脚病菌(Erwinia chrysanthemi)
アテゾリズマブ
アバスチン(ベバシズマブ)
アベルマブ
アキシチニブ
アザシチジン
B
バベンチオ(アベルマブ)
BEACOPP
ベセナム(Becenum)(カルムスチン)
ベレオダク(Beleodaq)(ベリノスタット)
ベリノスタット
塩酸ベンダムスチン
BEP
ベバシズマブ
ベキサロテン
ベキサール(トシツモマブおよびヨウ素I131トシツモマブ)
ビカルタミド
BiCNU(カルムスチン)
ブレオマイシン
ブリナツモマブ
ブリンサイト(Blincyto)(ブリナツモマブ)
ボルテゾミブ
ボシュリフ(ボスチニブ)
ボスチニブ
ブレンツキシマブベドチン
ブリガチニブ(Brigatinib)
BuMel
ブスルファン
ブスルフェクス(ブスルファン)
C
カバジタキセル
カルボメティクス(Cabometyx)(カボザンチニブ-S-リンゴ酸塩)
カボザンチニブ-S-リンゴ酸塩
CAF
キャンパス(アレムツズマブ)
カンプトサル(Camptosar)(塩酸イリノテカン)
カペシタビン
CAPOX
カラック(Carac)(フルオロウラシル--局所用)
カルボプラチン
カルボプラチン-タキソール
カーフィルゾミブ
カルムブリス(Carmubris)(カルムスチン)
カルムスチン
カルムスチンインプラント
カソデックス(Casodex)(ビカルタミド)
CEM
セリチニブ
セルビジン(Cerubidine)(塩酸ダウノルビシン)
サーバリックス(組換えHPV二価ワクチン)
セツキシマブ
CEV
クロランブシル
クロランブシル-プレドニゾン
CHOP
シスプラチン
クラドリビン
クラフェン(Clafen)(シクロホスファミド)
クロファラビン
クロファレックス(Clofarex)(クロファラビン)
クロラール(Clolar)(クロファラビン)
CMF
コビメチニブ
コメトリク(Cometriq)(カボザンチニブ-S-リンゴ酸塩)
COPDAC
COPP
COPP-ABV
コスメゲン(ダクチノマイシン)
コテリック(Cotellic)(コビメチニブ)
クリゾチニブ
CVP
シクロホスファミド
サイフォス(Cyfos)(イホスファミド)
サイラムザ(ラムシルマブ)
シタラビン
シタラビンリポソーム
サイトサル(Cytosar)-U(シタラビン)
シトキサン(シクロホスファミド)
D
ダブラフェニブ
ダカルバジン
ダコジェン(Dacogen)(デシタビン)
ダクチノマイシン
ダラツムマブ
ダラザレックス(ダラツムマブ)
ダサチニブ
塩酸ダウノルビシン
デシタビン
デフィブロチドナトリウム
デフィテリオ(Defitelio)(デフィブロチドナトリウム)
デガレリクス
デニロイキンジフチトクス
デノスマブ
DepoCyt(シタラビンリポソーム)
デキサメタゾン
塩酸デクスラゾキサン
ジヌツキシマブ
ドセタキセル
ドキシル(塩酸ドキソルビシンリポソーム)
塩酸ドキソルビシン
塩酸ドキソルビシンリポソーム
Dox-SL(塩酸ドキソルビシンリポソーム)
DTIC-Dome(ダカルバジン)
デュルバルマブ
E
エフデックス(Efudex)(フルオロウラシル--局所用)
エリテック(Elitek)(ラスブリカーゼ)
エレンス(Ellence)(塩酸エピルビシン)
エロツズマブ(Elotuzumab)
エロキサチン(Eloxatin)(オキサリプラチン)
エルトロンボパグオラミン
イメンド(アプレピタント)
エムプリシティ(エロツズマブ)
エンザルタミド
塩酸エピルビシン
EPOCH
エルビタックス(セツキシマブ)
メシル酸エリブリン
エリベッジ(ビスモデギブ)
塩酸エルロチニブ
エルウィナゼ(Erwinaze)(アスパラギナーゼ黒脚病菌)
エチヨル(Ethyol)(アミホスチン)
エトポフォス(Etopophos)(リン酸エトポシド)
エトポシド
リン酸エトポシド
エバセト(Evacet)(塩酸ドキソルビシンリポソーム)
エベロリムス
エビスタ(塩酸ラロキシフェン)
エボメラ(Evomela)(塩酸メルファラン)
エキセメスタン
F
5-FU(フルオロウラシル注射液)
5-FU(フルオロウラシル--局所用)
フェアストン(トレミフェン)
ファリーダック(パノビノスタット)
ファスロデックス(フルベストラント)
FEC
フェマーラ(レトロゾール)
フィルグラスチム
フルダラ(リン酸フルダラビン)
リン酸フルダラビン
フルロプレックス(Fluoroplex)(フルオロウラシル--局所用)
フルオロウラシル注射液
フルオロウラシル--局所用
フルタミド
フォレックス(Folex)(メトトレキセート)
フォレックスPFS(メトトレキセート)
フォルフィリ(FOLFIRI)
フォルフィリ-ベバシズマブ
フォルフィリ-セツキシマブ
フォルフィリノックス(FOLFIRINOX)
フォルフォックス(FOLFOX)
フォロチン(プララトレキサート)
FU-LV
フルベストラント
G
ガーダシル(組換えHPV四価ワクチン)
ガーダシル9(組換えHPV無価(Nonavalent)ワクチン)
ガジヴァ(Gazyva)(オビヌツズマブ)
ゲフィチニブ
塩酸ゲムシタビン
ゲムシタビン-シスプラチン
ゲムシタビン-オキサリプラチン
ゲムツズマブオゾガマイシン
ジェムザール(塩酸ゲムシタビン)
ギロトリフ(Gilotrif)(ジマレイン酸アファチニブ)
グリベック(メシル酸イマチニブ)
グリアデル(カルムスチンインプラント)
グリアデルウエハー(カルムスチンインプラント)
グルカルピダーゼ
酢酸ゴセレリン
H
ハラベン(メシル酸エリブリン)
ヘマンゲオール(Hemangeol)(塩酸プロプラノロール)
ハーセプチン(トラスツズマブ)
HPV二価ワクチン、組換え
HPV無価ワクチン、組換え
HPV四価ワクチン、組換え
ハイカムチン(塩酸トポテカン)
ハイドレア(ヒドロキシウレア)
ヒドロキシウレア
Hyper-CVAD
I
イブランス(パルボシクリブ)
イブリツモマブチウキセタン
イブルチニブ
ICE
アイクルシグ(塩酸ポナチニブ)
イダマイシン(塩酸イダルビシン)
塩酸イダルビシン
イデラリシブ
イフェックス(Ifex)(イホスファミド)
イホスファミド
イフォスファミダム(Ifosfamidum)(イホスファミド)
IL-2(アルデスロイキン)
メシル酸イマチニブ
イムブルビカ(イブルチニブ)
イムフィンジ(Imfinzi)(デュルバルマブ)
イミキモド
イムリジク(Imlygic)(タリモジーン・ラハーパレプベック)
インライタ(アキシチニブ)
インターフェロンα-2b,組換え
インターロイキン-2(アルデスロイキン)
イントロンA(組換えインターフェロンα-2b)
ヨウ素I131トシツモマブおよびトシツモマブ
イピリムマブ
イレッサ(ゲフィチニブ)
塩酸イリノテカン
塩酸イリノテカンリポソーム
イストダックス(ロミデプシン)
イクサベピロン
クエン酸イキサゾミブ
イグゼンプラ(イクサベピロン)
J
ジャカフィ(Jakafi)(リン酸ルキソリチニブ)
JEB
ジェブタナ(カバジタキセル)
K
カドサイラ(アドトラスツズマブエムタンシン)
ケオキシフェン(塩酸ラロキシフェン)
ケピバンス(パリフェルミン)
キイトルーダ(ペンブロリズマブ)
キスカリ(Kisqali)(リボシクリブ)
カイプロリス(カーフィルゾミブ)
L
酢酸ランレオチド
ラパチニブジトシレート
ラルトルボ(Lartruvo)(オララツマブ)
レナリドマイド
メシル酸レンバチニブ
レンビマ(メシル酸レンバチニブ)
レトロゾール
ロイコボリンカルシウム
リューケラン(クロランブシル)
酢酸リュープロリド
ロイスタチン(クラドリビン)
レブラン(アミノレブリン酸)
リンフォリジン(Linfolizin)(クロランブシル)
リポドックス(LipoDox)(塩酸ドキソルビシンリポソーム)
ロムスチン
ロンサーフ(トリフルリジンおよび塩酸チピラシル)
リュープロン(酢酸リュープロリド)
リュープロンデポー(酢酸リュープロリド)
リュープロンデポー-Ped(酢酸リュープロリド)
リムパーザ(オラパリブ)
M
マルキボ(Marqibo)(硫酸ビンクリスチンリポソーム)
マツラン(Matulane)(塩酸プロカルバジン)
塩酸メクロレタミン
酢酸メゲストロール
メキニスト(トラメチニブ)
メルファラン
塩酸メルファラン
メルカプトプリン
メスナ
メスネックス(Mesnex)(メスナ)
メタゾラストン(Methazolastone)(テモゾロミド)
メトトレキセート
メトトレキセートLPF(メトトレキセート)
臭化メチルナルトレキソン
メキサート(Mexate)(メトトレキセート)
メキサート-AQ(メトトレキセート)
ミドスタウリン
マイトマイシンC
塩酸ミトキサントロン
ミトジトレックス(Mitozytrex)(マイトマイシンC)
MOPP
モゾビル(プレリキサホル)
ムスタルゲン(Mustargen)(塩酸メクロレタミン)
ムタマイシン(Mutamycin)(マイトマイシンC)
ミレラン(ブスルファン)
マイロザール(Mylosar)(アザシチジン)
マイロターグ(ゲムツズマブオゾガマイシン)
N
ナノ粒子パクリタキセル(パクリタキセルアルブミン安定化ナノ粒子処方物)
ナベルビン(酒石酸ビノレルビン)
ネシツムマブ
ネララビン
ネオザール(Neosar)(シクロホスファミド)
ネツピタントおよび塩酸パロノセトロン
ニューラスタ(Neulasta)(ペグフィルグラスチム)
ニューポジェン(フィルグラスチム)
ネクサバール(ソラフェニブトシレート)
ニランドロン(Nilandron)(ニルタミド)
ニロチニブ
ニルタミド
ニンラーロ(クエン酸イキサゾミブ)
トシル酸ニラパリブ一水和物
ニボルマブ
ノルバデックス(クエン酸タモキシフェン)
ニプラート(Nplate)(ロミプロスチム)
O
オビヌツズマブ
オドムゾ(Odomzo)(ソニデギブ)
OEPA
オファツムマブ
OFF
オラパリブ
オララツマブ
オマセタキシン・メペサクシネート
オンカスパー(Oncaspar)(ペグアスパルガーゼ)
塩酸オンダンセトロン
オニビデ(Onivyde)(塩酸イリノテカンリポソーム)
オンダク(Ontak)(デニロイキンジフチトクス)
オプジーボ(ニボルマブ)
OPPA
オシメルチニブ
オキサリプラチン
P
パクリタキセル
パクリタキセルアルブミン安定化ナノ粒子処方物
PAD
パルボシクリブ
パリフェルミン
塩酸パロノセトロン
塩酸パロノセトロンおよびネツピタント
パミドロン酸二ナトリウム
パニツムマブ
パノビノスタット
パラプラット(Paraplat)(カルボプラチン)
パラプラチン(カルボプラチン)
塩酸パゾパニブ
PCV
PEB
ペグアスパルガーゼ
ペグフィルグラスチム
ペグインターフェロンα-2b
PEG-イントロン(ペグインターフェロンα-2b)
ペンブロリズマブ
ペメトレキセド二ナトリウム
パージェタ(ペルツズマブ)
ペルツズマブ
プラチノール(シスプラチン)
プラチノール-AQ(シスプラチン)
プレリキサホル
ポマリドミド
ポマリスト(ポマリドミド)
塩酸ポナチニブ
ポルタラッツァ(Portrazza)(ネシツムマブ)
プララトレキサート
プレドニゾン
塩酸プロカルバジン
プロロイキン(Proleukin)(アルデスロイキン)
プロリア(デノスマブ)
プロマクタ(エルトロンボパグオラミン)
塩酸プロプラノロール
プロベンジ(シプロイセル-T)
プリネトール(メルカプトプリン)
プリキサン(Purixan)(メルカプトプリン)
Q
R
二塩化ラジウム223
塩酸ラロキシフェン
ラムシルマブ
ラスブリカーゼ
R-CHOP
R-CVP
組換えヒトパピローマウイルス(HPV)二価ワクチン
組換えヒトパピローマウイルス(HPV)無価ワクチン
組換えヒトパピローマウイルス(HPV)四価ワクチン
組換えインターフェロンα-2b
レゴラフェニブ
レリストール(臭化メチルナルトレキソン)
R-EPOCH
レブリミド(レナリドマイド)
リウマトレックス(メトトレキセート)
リボシクリブ
R-ICE
リツキサン(リツキシマブ)
リツキシマブ
塩酸ロラピタント
ロミデプシン
ロミプロスチム
ルビドマイシン(塩酸ダウノルビシン)
ルブラカ(Rubraca)(カンシル酸ルカパリブ)
カンシル酸ルカパリブ
リン酸ルキソリチニブ
リダプト(Rydapt)(ミドスタウリン)
S
スクレロゾール胸膜内(Sclerosol Intrapleural)エアロゾル(タルク)
シルツキシマブ
シプロイセル-T
ソマチュリンデポー(酢酸ランレオチド)
ソニデギブ
ソラフェニブトシレート
スプリセル(ダサチニブ)
スタンフォード(STANFORD)V
滅菌タルク粉末(Sterile Talc Powder)(タルク)
ステリタルク(Steritalc)(タルク)
スチバーガ(レゴラフェニブ)
リンゴ酸スニチニブ
スーテント(リンゴ酸スニチニブ)
シラトロン(Sylatron)(ペグインターフェロンα-2b)
スチルバント(Sylvant)(シルツキシマブ)
シンリボ(Synribo)(オマセタキシン・メペサクシネート)
T
タブロイド(Tabloid)(チオグアニン)
TAC
タフィンラー(ダブラフェニブ)
タグリッソ(オシメルチニブ)
タルク
タリモジーン・ラハーパレプベック
クエン酸タモキシフェン
タラビン(Tarabine)PFS(シタラビン)
タルセバ(塩酸エルロチニブ)
タルグレチン(ベキサロテン)
タシグナ(ニロチニブ)
タキソール(パクリタキセル)
タキソテール(ドセタキセル)
テセントリク(アテゾリズマブ)
テモダール(Temodar)(テモゾロミド)
テモゾロミド
テムシロリムス
サリドマイド
タロミド(Thalomid)(サリドマイド)
チオグアニン
チオテパ
トラック(Tolak)(フルオロウラシル--局所用)
塩酸トポテカン
トレミフェン
トーリセル(テムシロリムス)
トシツモマブおよびヨウ素I131トシツモマブ
トテクト(Totect)(塩酸デクスラゾキサン)
TPF
トラベクテジン
トラメチニブ
トラスツズマブ
トレアンダ(塩酸ベンダムスチン)
トリフルリジンおよび塩酸チピラシル
トリセノックス(三酸化ヒ素)
タイケルブ(ラパチニブジトシレート)
U
ユニツキシン(Unituxin)(ジヌツキシマブ)
三酢酸ウリジン
V
VAC
バンデタニブ
VAMP
バルビ(Varubi)(塩酸ロラピタント)
ベクティビックス(パニツムマブ)
VeIP
ベルバン(Velban)(硫酸ビンブラスチン)
ベルケイド(ボルテゾミブ)
ベルサール(Velsar)(硫酸ビンブラスチン)
ベムラフェニブ
ベンクレキスタ(Venclexta)(ベネトクラクス)
ベネトクラクス
ビアドゥール(Viadur)(酢酸リュープロリド)
ビダーザ(Vidaza)(アザシチジン)
硫酸ビンブラスチン
ビンカサール(Vincasar)PFS(硫酸ビンクリスチン)
硫酸ビンクリスチン
硫酸ビンクリスチンリポソーム
酒石酸ビノレルビン
VIP
ビスモデギブ
ビストガード(Vistogard)(三酢酸ウリジン)
ボラキサゼ(Voraxaze)(グルカルピダーゼ)
ボリノスタット
ヴォトリエント(塩酸パゾパニブ)
W
ウェルコボリン(Wellcovorin)(ロイコボリンカルシウム)
X
ザーコリ(クリゾチニブ)
ゼローダ(カペシタビン)
ゼリーリ(XELIRI)
ゼロックス(XELOX)
ザイゲバ(Xgeva)(デノスマブ)
ゾーフィゴ(二塩化ラジウム223)
イクスタンジ(エンザルタミド)
Y
ヤーボイ(イピリムマブ)
ヨンデリス(トラベクテジン)
Z
ザルトラップ(Ziv-アフリベルセプト(Aflibercept))
ザルキシオ(Zarxio)(フィルグラスチム)
ジェジュラ(Zejula)(ニラパリブトシレート一水和物)
ゼルボラフ(ベムラフェニブ)
ゼヴァリン(イブリツモマブチウキセタン)
ジネカード(Zinecard)(塩酸デクスラゾキサン)
ジブ・アフリベルセプト(Ziv-Aflibercept)
ゾフラン(塩酸オンダンセトロン)
ゾラデックス(酢酸ゴセレリン)
ゾレドロン酸
ゾリンザ(ボリノスタット)
ゾメタ(ゾレドロン酸)
ジデリグ(Zydelig)(イデラリシブ)
ジカディア(セリチニブ)
ザイティガ(酢酸アビラテロン)
【０３６５】
バンク
別の概略的な局面において、本発明は、上記のいずれか1つに従うn個の薬学的単位用量のセットまたはキットを調製するための、少なくとも230人のドナーのバンクを提供する。
【０３６６】
本発明は、nが少なくとも5である、n個の薬学的単位用量のセットを調製するための上記のバンクを提供する。
【０３６７】
本発明は、nが5である、n個の薬学的単位用量のセットを調製するための上記のバンクを提供する。
【０３６８】
本発明は、それを必要とする、ある患者Pにおける免疫療法のための薬として使用するための、n個の薬学的単位用量のセットを調製するための上記のバンクを提供する。
【０３６９】
それを必要とする、ある患者Pにおける免疫療法のための薬として使用するための、5つの薬学的単位用量のセットを調製するための上記のバンク。
【０３７０】
操作された細胞のn個の薬学的単位用量のセットを調製するために用いられるドナーがPでなければ、Pにおける細胞、臓器、または組織の以前のドナーを除く、上記のバンク。
【０３７１】
共通アレルがPのものにマッチしなければ、ドナーがペアの2人のドナー間で共通アレルを有さない、上記のいずれか1つに従うバンク。
【０３７２】
ドナーが、ペアの2人のドナー間で共通アレルを有さず、
前記ペアの2人のドナー間の非共通アレルが、既往反応に関与する少なくとも1つの遺伝子座をコードするか、または
前記ペアの2人のドナー間の非共通アレルが、以下の遺伝子座HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ、およびHLA-DRの1つ、好ましくはHLA-C、より好ましくはHLA-C、HLA-DP、HLA-DQ、およびHLA-DRを含むか、または
前記ペアの2人のドナー間の非共通アレルが、既往反応に関与する少なくとも1つの遺伝子座を含み、前記ペアの2人のドナー間の非共通アレルが、以下の遺伝子座HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ、およびHLA-DRの1つ、ならびにその組み合わせ、好ましくはHLA-C、より好ましくはHLA-C、HLA-DP、HLA-DQ、およびHLA-DRを含む、
上記のいずれか1つに従うバンク。
【０３７３】
本発明は、操作された細胞がβ2ミクログロブリン欠損および/またはCTIIA欠損であり、前記ペアの2人のドナー間の非共通アレルが、以下の分子、HLA-DP、HLA-DQ、およびHLA-DRを含む、上記のバンクを提供する。
【０３７４】
本発明は、細胞のそれぞれの薬理学的単位用量が、半日、1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、15日、16日、17日、18日、19日、20日、30日、40日、45日、50日、60日、90日、120日、180日、8ヶ月、12ヶ月、1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、11年、12年、13年、14年、15年、16年、17年、18年、19年、20年、30年、40年、50年、60年、70年〜90年、好ましくは6ヶ月、または半日〜80年の任意の時間に及ぶ2回の投与間の時間間隔で、ある個体Pに投与される、上記のバンクを提供する。
【０３７５】
本発明は、キメラ抗原受容体(CAR)またはTCRを発現する操作された初代細胞の5つの連続した薬学的単位用量のセットを調製するための、多くても230人の異なるドナーを含む、上記のバンクを提供する。
【０３７６】
本発明は、宿主対移植片拒絶反応を阻止するために、少なくとも1つのドナーのHLAが以前の移植片(骨髄)のものにマッチし、Pのものと完全にマッチしないことがある、上記のバンクを提供する。
【０３７７】
本発明は、前記操作された初代細胞が、少なくとも1つの不活化されたTCR遺伝子アレルを含む、上記のいずれか1つとしてのバンクを提供する。
【０３７８】
本発明は、少なくとも1種類のCARまたはT細胞受容体(TCR)が付与された上記のいずれか1つとしてのバンクを提供する。
【０３７９】
上記のものに従う、5つの用量の操作された初代細胞のセットであって、それぞれが、以下のハプロタイプ(A-B-DRB1)ハプロタイプ:29-58-0807、68-75-0413、32-42-0302、2-70-1322、69-35-1305を有する。他の例は表1にある。
【０３８０】
本発明はまた、操作された細胞と、薬学的に許容されるビヒクルとを含む、n個の薬学的単位用量のセットを調製するための方法に関し、本方法は、
（i）患者PのHLA分子および/またはHLAアレルをジェノタイピングおよび/またはフェノタイピングする工程、
（ii）前記患者の既存の抗体および/またはCTL応答を測定および定量する工程、
（iii）好みの順序で、
（a）Pの細胞に由来する免疫原性抗原に完全にマッチするドナーもしくは細胞試料、
（a'）Pが既に免疫されている免疫原性抗原を含まないドナーもしくは細胞試料
を選択することによって、または
（a''）Pと比較した時に可能な限り少ない数の、細胞に由来するミスマッチ免疫原性抗原(Pが既に免疫されている免疫原性抗原を含む)を有するドナーもしくは細胞試料
を選択することによって、230人のドナー間で少なくとも5つの細胞試料(移植片)を選択および/または準備する工程、ならびに
（iv）Pが既に免疫されている、前記細胞に由来する免疫原性抗原がもしあれば、その発現を変えるように細胞を改変する工程、および前記細胞に由来する免疫原性抗原を、Pの細胞に由来する免疫原性抗原にマッチするように細胞を改変する工程
を含む。
【０３８１】
最初の2つの工程は、参照により本明細書に組み入れられる、説明された方法によって行われてもよい。
【０３８２】
本発明は、
Pのものにマッチしなければ、互いに共通抗原の可能性が少ない、およびPが以前に免疫されたものと共通抗原の可能性が少ない、ドナーまたは細胞試料を選択する工程、
各試料において異なる少なくとも1種類のCARもしくはTCRを導入することによって、および/またはTCR遺伝子の少なくとも1つの成分を不活化することによって細胞を改変する工程
を含む、n個の薬学的単位用量のセットを調製するための方法を提供する。
【０３８３】
本発明は、上記に従う、操作された細胞と、薬学的に許容されるビヒクルとを含む、n個の薬学的単位用量のセットを調製するための方法を提供し、
細胞を改変する工程は、
外因性ヌクレオチドまたは外因性ポリヌクレオチド配列を含む少なくとも1つの核酸と、
ゲノムにある選択された内因性遺伝子座を特異的な標的とする少なくとも1種類の配列特異的試薬を、
同じ時間で前記細胞に導入する工程であって、好ましくは、前記内因性遺伝子座が、TCR遺伝子AまたはBをコードする内因性遺伝子座である、工程
を含む。
【０３８４】
好ましい態様では、前記外因性ポリヌクレオチドはCARをコードする。
【０３８５】
好ましい態様では、前記配列特異的試薬は、TALEN、CRISPR、Znフィンガー、megaTAL…から選択されるレアカットエンドヌクレアーゼである。
【０３８６】
本発明は、細胞に由来する免疫原性抗原が、http://hla.alleles.org/nomenclature/updates/201606.htmlに記載のHLA分子のいずれか1つから選択されるHLA分子の1つを含む、上記に記載の方法を提供する。
【０３８７】
本発明は、細胞に由来する免疫原性抗原が、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DR、およびその組み合わせから選択されるHLA分子の少なくとも1つを含む、上記に記載の方法を提供する。
【０３８８】
本発明は、試料のHLAがPのHLAと80％超マッチする、上記に記載の方法を提供する。
【０３８９】
本発明は、少なくとも1つの免疫チェックポイントを不活化するように細胞を遺伝子操作する工程を含む、上記に従う方法を提供する。
【０３９０】
本発明は、薬物に対する耐性を付与するように細胞を遺伝子操作する工程を含む、上記に従う方法を提供する。
【０３９１】
本発明は、細胞に由来する免疫原性抗原をPのものにマッチするように細胞を遺伝子操作する工程を含む、上記に従う方法を提供する。
【０３９２】
本発明は、細胞に由来する免疫原性抗原をPの以前の移植片にマッチするように細胞を遺伝子操作する工程を含む、上記に従う方法を提供する。
【０３９３】
本発明は、細胞を遺伝子操作する工程が特異的レアカットを使用する工程を含む、上記に記載の方法を提供する。
【０３９４】
本発明は、前記レアカットエンドヌクレアーゼがTALE-ヌクレアーゼまたはCRISPR/Casヌクレアーゼである、上記に記載の方法を提供する。
【０３９５】
本発明は、細胞を遺伝子操作する工程が相同組換えを介した遺伝子ターゲティングによって行われる、上記に記載の方法を提供する。
【０３９６】
本発明は、細胞試料を選択する工程が、HLA-A、HLA-B、およびHLA-DR遺伝子におけるトリプルホモ接合体を選択する工程を含む、上記に記載の方法を提供する。
【０３９７】
本発明は、細胞試料を選択する工程が、HLA-A、HLA-B、およびHLA-DR遺伝子のうちの2つにおけるダブルホモ接合体を選択する工程を含む、上記に記載の方法を提供する。
【０３９８】
本発明は、細胞の試料を選択する工程が、データベースにおいて利用可能なドナーを選択する工程を含む、上記に記載の方法を提供する。
【０３９９】
本発明によるデータベースは、潜在的なドナーを対象にした、特に、臓器移植または細胞移植を対象にした既存のデータベースのいずれか1つでもよい。
【０４００】
本発明は、ドナーが、白人、アフリカ人、アジア人から選択される部分母集団に属すると定義される、上記に記載の方法を提供する。
【０４０１】
本発明は、ドナーが、約1000万の共通DNA変種を含む、Human Genome Project1、SNP Consortium2、および/またはInternational HapMap Project3に従って少なくとも1つの遺伝子マーカーによって定義される、上記に記載の方法を提供する。
【０４０２】
本発明は、ドナーが、（i）データベースにおける自身のHLAタイピングの頻度、（ii）セットの他のドナーと比較した時の自身のHLAタイピングに基づいて選択される(自身のドナーの細胞が、本発明によるセットのn-1単位用量において用いられる)、上記に記載の方法を提供する。任意で、ドナーは、（iii）少なくとも6/6、好ましくは10/10 HLAアレルマッチングを分析および選択するコンピュータソフトウェアまたはプログラムを用いたPとのマッチングのレベルに基づいて選択される。
【０４０３】
本発明者らは、驚くべきことに、免疫療法用の細胞を提供するといった現在の技術問題の解決策が、免疫療法に起因する特定の副作用も最小限にすることを発見した。
【０４０４】
本発明は、サイトカインストームなどの免疫療法に起因する他の副作用を回避するのに特に有用である。
【０４０５】
一態様では、本発明は、操作された細胞と、薬学的に許容されるビヒクルとを含む、n個の薬学的単位用量のセットであって、操作された免疫細胞を投与する前に免疫調節性または免疫抑制性の医療レジメンを投与することによって拒絶反応が軽減および/または遅延し、移植片が所期の目的を果たすための時間が得られる(例えば、癌に対する免疫療法において癌細胞を破壊する)セットを提供する。
【０４０６】
特定の態様では、本発明は、操作された細胞と、薬学的に許容されるビヒクルとを含む、n個の薬学的単位用量のセットであって、操作された免疫細胞を投与する前に免疫調節性または免疫抑制性の医療レジメンを投与することによって、それに続く既往反応を全く誘導することなく同じ抗原への再曝露が行われる、セットを提供する。
【０４０７】
このようなレジメンは、患者において、ここで特徴付けられた様々な免疫系区画に様々な影響を及ぼし、他のレジメンよりも、これらの免疫系区画のいくつかに対する高い効力の原因であり得る。
【０４０８】
例えば、リンパ球枯渇(lymphodepletion)(例えば、シクロホスファミドおよびフルダラビンを用いた処置による)は循環抗体の作用よりもT細胞の活性に大きな影響を及ぼし得る。
【０４０９】
T非依存性B細胞応答は皮膚(GVHD)および/または消化管において発生し、皮膚(GVHD)および/または消化管における免疫反応に関与し得る。従って、組織特異的な免疫細胞または腸にある粘膜免疫細胞を阻害する特定の免疫抑制薬物は、関連するGVHD(皮膚対消化管)を阻止し得る。
【０４１０】
従って、移植片の拒絶反応、特に、前記移植片に存在する1種類または複数種の抗原に対して既に免疫された個体における移植片の拒絶反応は医療レジメンだけでは管理しにくい場合がある。
【０４１１】
従って、本発明は、以下の判断基準：
処置を予定している宿主と共有する既往性分子および共有しない既往性分子の細胞表面発現、
処置を予定している宿主と共有せず、ペアのドナーと共有する既往性分子の発現、
処置を予定している宿主と共有せず、ペアのドナーと共有する既往性分子の発現と、前記分子のうち弱い既往反応を誘導するものの選択
の1つ、またはいくつかに基づいて、TCRを発現しないか、またはわずかなTCRを発現し、既往反応を誘導しないか、またはわずかな既往反応を誘導する、免疫療法用の免疫細胞の連続的な単位または用量を調製するためにドナーまたは細胞を選択するための方法を提供する。
【０４１２】
本発明は、連続的な抗原発現細胞を調製するためのドナーを選択するための方法であって、Pと移植片をマッチするように、または以前の同種異系幹細胞移植および/もしくは骨髄移植があった場合は、Pに投与された以前の移植片と移植片をマッチするように(Pにある抗体の分析)、移植片対宿主病および/または既往反応に関与する遺伝子を改変する工程を含む、方法を提供する。
【０４１３】
本発明は、前記操作された細胞において前記既往反応を阻害する分子を発現させることによって、連続的な抗原発現細胞を調製するためのドナーを選択するための方法を提供する。
【０４１４】
本発明は、抗原認識受容体(例えば、キメラ抗原受容体)に加えて、受け取る個体に存在しない表面タンパク質、例えば、MHC分子を有する操作されたT細胞のセットを含む。
【０４１５】
任意で、n個の薬学的単位用量のセットの単位用量にある細胞は、MHC分子にマッチし、癌細胞によって阻害されないように、さらに操作されてもよく、前記細胞は、免疫抑制薬物を用いた処置において用いられてもよい。
【０４１６】
本発明は、操作された細胞のn個の薬学的単位用量のセットまたはキットであって、それぞれ個々の用量が、Pのものと同一か、またはマッチする、細胞に由来する免疫原性抗原と、n-1個の他の用量のそれぞれにある、操作された細胞のものと共通エピトープを有さない、操作された細胞に由来する免疫原性抗原を含む、セットまたはキットを提供する。
【０４１７】
これにより、Pの免疫系は同種異系抗原に2回曝露されず、既往性反応の開始が回避される。
【０４１８】
本発明は、細胞が共通抗原を有し得る単位用量のセットを提供する。本発明は、細胞が共通MHC分子を有し得る単位用量のセットを提供する。
【０４１９】
本発明によれば、特定の態様では、Pにおいて用いられる第2の用量は、例えば、CARによって運ばれる同じ免疫原性抗原を有さなければならない(かつPに投与される次の用量はどれも有してはならない)。従って、前記CARは、同じ抗原に結合するのであっても、それぞれの単位用量において異なっていなければならない。
【０４２０】
特定の態様では、Pにおいて用いられる第2の用量(とPに投与される次の用量の全て)は、例えば、CARによって運ばれる同じ免疫原性抗原を有してもよい。従って、各用量が少なくとも1種類の免疫抑制薬、好ましくは、フルダラビン、シクロホスファミド、任意でリツキシマブの組み合わせの直後に連続投与のために用いられる時に、前記CARは、それぞれの単位用量において同一であってもよい。
【０４２１】
本発明によれば、特定の態様では、(これらの抗原が免疫応答を全く生じない場合を除いて)Pにおいて投与される第2の用量(と次の用量)は、第1の用量または以前に移植片によって運ばれる免疫原性抗原を有してはならない。
【０４２２】
例示として、
1回目の注射：Pから単離されたT細胞を用いて調製され、操作され、次いで、Pに再注射される、抗CD123 CAR T細胞
2回目の注射：別の抗CD123抗原結合ドメインと、Pから単離されたT細胞を用いて作製され、Pに再注射される抗CD123 CAR。
【０４２３】
本発明によれば、特定の態様では、ある個体(P)において既往性免疫反応を誘導しないか、またはわずかな既往性免疫反応を誘導する連続療法として使用するための操作された細胞のn個の薬学的単位用量のセットまたはキットは、好みの順序で、例えば、
最初に、Pの構成している免疫細胞、好ましくは、PとHLA同一の自己由来の免疫細胞が発現しているものと同一の、細胞に由来する免疫原性抗原を有するもの、
次いで、MHCクラスIおよびクラスIIがPのものにマッチするように細胞が操作された用量、
次いで、細胞に由来する免疫原性抗原がPのものにマッチするもの(スコア6/6、7/7、8/8、9/9、10/10)(細胞は、一卵性双生児(同系、HLA同一)に由来するか、同胞、親類(同種異系。HLA同一でもよく、ハプロタイプ一致でもよく、ミスマッチがあってもよい)に由来する)
次いで、操作された細胞に由来する免疫原性抗原が、ミスマッチレベルが増えて患者のものに完全にマッチせず、Mが、m個の連続した完全にマッチしない用量のk番目に存在する、Pにマッチしない免疫原性抗原のセットであれば、これらのm個の投与される用量のk番目(k≧2)が、M1、M2、…、M(k-1)の和集合に存在する免疫原性抗原を有してはならない用量
で投与すべきである。さらに、Mは、個体が既に免疫されている、あらゆる免疫原性抗原を回避してもよい。
【０４２４】
一態様では、操作されたCAR発現細胞は、持続的な生着および移植片対宿主病のリスク低下を誘導するものとしてPCT/US2013/032129に記載の方法に従って投与されてもよい。
【０４２５】
通常、ある個体(P)において既往性免疫反応を誘導しないか、またはわずかな既往性免疫反応を誘導する連続療法として使用するための操作された細胞のn個の薬学的単位用量のセットの中で最初に投与するために選択される用量は、好みの順序で、操作された細胞の免疫原性抗原がPの最も可能性があるものにマッチするように(自己移入を用いた連続療法の場合、Pの細胞はTCRの異なるCARを用いて操作される)、あるいはMHCクラスI分子およびクラスII分子がPのものと完全にマッチするか(6:6、好ましくは8:8、より好ましくは10:10のスコア)、またはPと適合するように(β2ミクログロブリンおよびCTIIA遺伝子を欠失させ、細胞を操作することによってクラスIがなく、クラスII分子がない操作された細胞)、もしくはPと適合するMHC分子の特定の組み合わせと適合するように(既往性免疫反応を誘導しないか、またはわずかな既往性免疫反応を誘導する)操作された細胞が改変されるように選択される。
【０４２６】
細胞は、Pの造血細胞上で発現している免疫原性抗原と、できる限り少ない程度のミスマッチ(5/8以下のミスマッチ、好ましくは1個以下のミスマッチ)を示さなければならない。
【０４２７】
ここで用いられる細胞は、特に方法について、例えば、全てが参照により組み入れられるWO2014/184143またはWO2014191128またはWO2016160620A3において説明された以前の方法のいずれかに従って操作された免疫細胞でもよい。
【０４２８】
本発明の細胞を用いた連続処置は、移植片として同種異系T細胞に対して既往反応を誘導しないか、または極めて穏やかな既往反応を誘導し、少なくとも、移植片対宿主および宿主対移植片反応の非存在下で、前記移植された細胞が個体の病理組織を攻撃するのに十分な時間帯を空ける。
【０４２９】
本発明の別の局面は、ある個体(P)において既往性免疫反応を誘導しないか、またはわずかな既往性免疫反応を誘導する連続療法として使用するための操作された細胞のn個の薬学的単位用量のセットを調製するための方法であり、本方法は、
（v）nをある特定の値、例えば、n=5に固定する工程、
（vi）少なくとも230人のドナーからなる、ある特定の集団からn人のドナーをランダムに選択する工程、
（vii）n人の既往性の適合性ドナーを選択する工程；
（viii）好ましくは、TALEN(登録商標)レアカットエンドヌクレアーゼを用いて前記CARをTCR遺伝子座に挿入することによって、各ドナーに由来する細胞にCAR、または多機能性CAR、または必要に応じて、適切なscfvもしくは結合ドメインに(共有結合的もしくは非共有結合的に)連結可能なCARの一部を付与する工程、
（ix）任意で、TCRA遺伝子(TCRα遺伝子)、β2ミクログロブリン遺伝子、およびCTIIA遺伝子を不活化することによって、それぞれの細胞試料を別々に操作する工程、
（x）前記試料を凍結する工程
を含む。
【０４３０】
試料または薬学的単位用量の中にある細胞は、細胞集団、(例えば、末梢血単球(PBMC)、T細胞集団、実質的に精製されたT細胞の集団でもよい。
【０４３１】
本発明の別の局面は、ある個体(P)において既往性免疫反応を誘導しないか、またはわずかな既往性免疫反応を誘導する連続療法として、操作された細胞のn個の薬学的単位用量のキットまたはセットを用いて患者を処置するための方法である。
【０４３２】
このような方法の態様は、ある個体(P)において既往性免疫反応を誘導しないか、またはわずかな既往性免疫反応を誘導する連続療法として使用するための操作された細胞のn個の薬学的単位用量の任意のキットまたはセットから導き出すことができる。
【０４３３】
概略的方法
移植片に対する既往反応の非存在を容易にするために、以前の移植片にある免疫原性抗原の数を最小限にすることができる。
【０４３４】
これは、
受け取る個体に密接に関連する移植片(例えば、自己由来、ハプロタイプマッチなど)を選択もしくは操作する工程、または
アレルが免疫化に関与する可変遺伝子についてホモ接合性またはたった1つの機能的アレルの存在によって、限られた数の免疫原性抗原がある移植片を選択もしくは操作する工程
によって成し遂げることができる。
【０４３５】
前記免疫原性抗原がHLA分子であれば、移植片の表面上で6つではなく、変化することが知られている、3つの(トリプルホモ接合性、すなわち、3つ全てのHLA-A、HLA-B、およびHLA-DR遺伝子)、4つの(ダブルホモ接合性、すなわち、HLA-A、HLA-B、もしくはHLA-DR遺伝子のうちの2つ)、または5つの(シングルホモ接合性、すなわち、HLA-A、HLA-B、もしくはHLA-DR遺伝子のうちの1つ)異なるHLA抗原の存在につながる、HLA-A、HLA-B、HLA-C、および/またはHLA-DRホモ接合性があると、前記移植片が与えられた時に、個体が免疫される免疫原性抗原が少なくなる。
【０４３６】
同様に、天然であっても操作されていても、移植片の表面にHLA-A、または-B、またはC、または-DRが存在しなければ、前記移植片が与えられた時に、個体が潜在的に免疫され得る免疫原性抗原が少なくなる。このような少数のHLA発現遺伝子を実現するための方法の工程は、(例えば、ヌクレアーゼベースの遺伝子編集、もしくは相同組換えを介した遺伝子ターゲティングを用いる)遺伝子破壊でもよく、アンチセンスまたは干渉分子、例えば、前記発現をブロックするRNAの異所性発現でもよい。好ましくは、PA201670840に記載のような方法が実行される。
【０４３７】
代わりに、1つまたは複数のHLA分子の1つまたは複数のアレルと、移植された個体に存在するアレルが交換することで、前記移植片が与えられた時に、個体が潜在的に免疫され得る免疫原性抗原が少なくなる。
【０４３８】
本発明は、相同組換えを介した標的DNA配列置換によって、移植された細胞のゲノムにおいて、このようなHLAコード遺伝子交換を実現するための方法を提供する。
【０４３９】
代わりに、本発明は、移植された個体に存在するHLAアレルの異所性発現と、(例えば、ヌクレアーゼベースの遺伝子編集、もしくは相同組換えを介した遺伝子ターゲティングを用いる)遺伝子破壊、またはアンチセンスまたは干渉分子、例えば、前記発現をブロックするRNAの免疫原性HLA異所性発現(但し、その作用は、発現を軽減しようとするHLAに特異的である)を組み合わせることで実現することができる。
【０４４０】
前記免疫原性抗原が血液型抗原であれば、本発明に従ってセットを調製する予備工程として、個体の赤血球型:AB、O、Rhesus、KEL、Duffyなどを確かめることは本発明の一部である。
【０４４１】
移植された細胞またはその子孫の表面にある免疫原性抗原の存在を制限するために他の戦略が推し進められてもよい。
【０４４２】
本発明は、1つまたは複数の前記免疫原性赤血球型抗原においてホモ接合性のドナーを選択する工程；赤血球上で発現している前記免疫原性赤血球型抗原の数を制限するために有核赤血球または細胞前駆体のゲノムを操作する工程；あるいは(標的相同組換えによって、または移植された個体に存在するアレルの異所性発現と、望ましくないアレルをコードする遺伝子の不活化または発現のブロックを組み合わせることによって)抗原を置換する工程を含む、方法を含む。
【０４４３】
前記処置が、免疫原性変種アレルが現れる頻度が偏っている特定の集団を対象としていれば(すなわち、変種アレルの中には他の変種アレルより頻度が高いものもある)、連続移植が行われる順番も最適化することができる。集団において異なることが知られている免疫原性抗原の一連の選択された連続するセットを設計することが本発明の一部である。
【０４４４】
患者が異物の細胞または組織に曝露されている可能性が高ければ(例えば、患者の状態のために輸血、血小板が与えられたことがあるか、または移植されたことがあれば)、ある特定の免疫原性抗原に曝露されたことがある可能性は前記免疫原性抗原の存在量と関連付けられる。従って、最も小さいセット、または頻度が最も低い免疫原性抗原のセットを有する細胞または組織を最初に使用すべきである。その後に、連続移植のために、患者が以前に曝露されたものとは異なる、頻度がもっと高い免疫原性抗原のセットを有する細胞または組織などを移植することができる。最初の移植の場合、既往性反応を誘導しないようにするために、各患者について免疫原性抗原の第1のセットに対して既存の免疫が存在しないことを試験することができる。
【０４４５】
（3）CAR T細胞養子免疫療法のための方法
養子CAR T細胞養子免疫療法の場合、時とともに反復投薬することで製品を患者に再投与することが望ましい場合がある。CAR分子もしくは他の任意の異所的に発現している抗原が免疫原性抗原であれば、および/または製品が同種異系であり、他の免疫原性抗原、例えば、MHC分子(例えば、HLA-C)の表面タンパク質コード遺伝子の変種アレルを有するのであれば、このようなアプローチは既往反応につながることがある。
【０４４６】
第1の場合、CAR分子の免疫原性エピトープの変更は連続投薬によって依然として腫瘍を標的とするが、アプローチの1つであり得る。しかしながら、これには再処置ごとに異なる製品が必要となる。
【０４４７】
第2の場合、既往反応を回避するために、それぞれの移植片に、先の移植片に存在する免疫原性抗原がないように、異なるドナーに由来する同種異系細胞を使用することができる。しかしながら、移植片はT細胞を含むので、急速な拒絶反応がなくなると、前記移植されたT細胞が個体の組織を移植片対宿主病によって攻撃するのに十分な時間帯が空く場合がある。
【０４４８】
反復投薬ごとに急速な拒絶反応につながる可能性がある既往反応が存在せず、移植片対宿主病も存在しない同種異系T細胞に基づく処置を繰り返し行う手段の1つは、(例えば、1本の機能的TCR鎖をコードする遺伝子を破壊することによって)移植片にあるT細胞表面にT細胞受容体が存在しないようにするか、またはこれらのT細胞においてTCRを介した活性化を非効率的にし、前記方法の1つに従って、連続的に移植された細胞を選択することである。
【０４４９】
既往反応がないか、または少なく、あるドナーに由来する細胞を2回以上用いて別のドナーに投与することが以下の概略的原理に則って本発明に従って成し遂げられる。
【０４５０】
潜在的な既往反応の発生を最小限にするために、Mnが、個体の免疫化につながる、n番目の連続した移植片にある抗原(「免疫原性抗原」)のセットであれば、M1、M2、…、M(i-1)の和集合に存在する免疫原性抗原を有さないように、すなわち、同じ抗原に2回曝露されないように移植片の数i(i≧2)を設計すべきである。
【０４５１】
さらに、第1の移植片は、初めから個体が既に免疫されている、あらゆる抗原を有することを回避してもよい。
【０４５２】
これを実現するために、以下の技術的手段が本明細書において提供される。
ドナーのバンク:世界中から利用可能な、あらゆるバンクを使用することができる。
5人のドナー細胞のセット(表1)
【０４５３】
(表１)本発明によるn個の薬学的単位用量セットの例
2020530277.tif 000006
2020530277.tif 000007
2020530277.tif 000008
2020530277.tif 000009
2020530277.tif 000010
2020530277.tif 000011
2020530277.tif 000012
2020530277.tif 000013
2020530277.tif 000014
2020530277.tif 000015
2020530277.tif 000016
2020530277.tif 000017
2020530277.tif 000018
2020530277.tif 000019
2020530277.tif 000020
2020530277.tif 000021
2020530277.tif 000022
freq_all1：アレル1頻度
freq_all2：アレル2頻度
【０４５４】
本発明による方法は、血液バンクのデータベースを用いて5人のドナーの最良のセットを発見するために提供され、
各ドナーのHLAアレルの遺伝子型を分析する工程、
2人のドナー間で共通アレルを有さない5人のドナーを選択する工程であって、
ヒト集団またはこれらのドナーの集団の試料における遺伝子型の頻度が、(このようなドナーを実現可能に発見するために)ある特定の閾値「fmin」より低くなく、多くても「m」個のミスマッチを有する、処置することができる患者のパーセントが可能な限り高く、mが1〜10、好ましくは2以下である、工程
(副作用なく、患者が移植片を有する最大の可能性を保つために)ヒト集団における最低頻度から最高頻度までドナーを順序付ける工程
を含む。
【０４５５】
本発明は、免疫療法のための5つの用量の操作された細胞のキットまたはセットを調製するための方法を提供し、本方法は、本発明の5人のドナーの最良のセットを発見するための方法の工程を含み、かつ
適合性を予測するために、前記5人のドナーの細胞に対する患者Pの既存の免疫応答を分析する工程、
TCRおよびまたはMHCの細胞表面発現に関与する遺伝子または遺伝子領域を操作することによって少なくとも1人のドナー、好ましくは、5人のドナーの細胞を操作する工程、
PCT/EP2014/078876またはJuillerat et al., 2017 http://www.nature.com/articles/srep39833に記載のように、操作された細胞、HLA分子、例えば、NK細胞活性を阻害するHLA、固形腫瘍環境に対して耐性を付与する分子、例えば、低酸素に対する耐性を付与する分子に対する癌細胞の親和性および走化活性を高めるために、コード配列、例えば、キメラ抗原受容体をコードする配列を導入する工程
をさらに含む。
【０４５６】
表1に記載の5人のドナーの各セットが本発明の目的である。
【０４５７】
本発明による薬学的単位用量のセットにおいて提供される操作された細胞はWO2015075195に従って調製されてもよい。
【０４５８】
特定の態様では、マッチしたドナーが利用できなければ、以下のミスマッチを回避しなければならない。HLA DP、特に、HLADP βに関連するミスマッチ、より好ましくは、HLA-DPb1*0901に関連するミスマッチを回避しなければならない。
【０４５９】
ヒト白血球抗原(HLA)およびABO血液型についてドナー-レシピエント適合性を評価するために移植前に組織/細胞タイピングまたはクロスマッチングが行われる。これらの試験には、以下の少なくとも1つが含まれる：
・  ABO血液型間の不適合性が急速な拒絶反応につながるので、最初にABO血液の型適合性を試験する。
・  リンパ球傷害性アッセイでは、ドナーリンパ球との反応性があるかどうか患者血清を試験する。正のクロスマッチは超急性拒絶反応のリスクがあるために移植の禁忌になる可能性がある。この場合、移植しようとする細胞は、患者の抗血清によって認識される抗原を発現するものを選択的に標的とするように操作される。
・  パネル反応性抗体(PRA)は、ランダム細胞パネルに対してリンパ球性抗体があるかどうか患者の血清をスクリーニングする。以前に輸血されたことがある、移植されたことがある、または妊娠したことがある患者は高度の感作を有する可能性があり、ドナーと負のクロスマッチを有する可能性は低い。感作されていない初代腎臓または腎臓/膵臓移植患者に対して、もっと強力な免疫抑制とウサギ抗胸腺細胞グロブリン、タクロリムス、およびミコフェノール酸モフェチル/ナトリウムを使用した時に、2回目の移植時の感作リスクが低いことが観察されている。
・  主要組織適合遺伝子複合体(MHC)クラスIおよびクラスII適合性の程度を評価するために混合リンパ球反応(MLR)を使用することができる。しかしながら、これは迅速な試験ではなく、生きている血縁ドナーが関与する場合にのみ使用することができる。これは既知の方法の代案である。
【０４６０】
6番染色体の短腕にある主要組織適合遺伝子複合体(MHC)に位置するHLA遺伝子は組織適合性を規定し、移植片の寛容を決定する。35を超えるHLAクラスIおよびII遺伝子ならびに684を超えるアレルがあるが、幹細胞移植のためのドナーおよびレシピエントの組織適合性を決定する際にはHLA-A、HLA-B(クラスI)、およびHLA-DRB1(クラスII)遺伝子が主に用いられる。6つのうち6つがマッチするとは、それぞれに2つのアレルがある、これらの3つの遺伝子がマッチすることを指す。6つのアレルのうちどれもマッチしない時には、これはミスマッチと呼ばれ、様々な程度のミスマッチは、1抗原ミスマッチ、2抗原ミスマッチなどと呼ばれる。6つのうち3つのアレルがミスマッチしない時、この用語はハプロタイプ一致である。移植拒絶反応および移植片対宿主病(GVHD)は、HLA不一致と関連する、免疫を介した主要な合併症である。HLA不一致が大きければ大きいほど、これらのリスクは高くなる。患者の25〜50％にしかHLA同一の同胞がない。従って、最近、大きなドナー登録所(donor registry)が、表現型的にマッチする非血縁ドナーを特定することに成功した。米国ではNational Marrow Donor Programは、ほぼ400万人のボランティアドナーを分類しており、40,000人の潜在的な新たなドナーを毎月、加えるために118のドナーセンターと57を超える移植センターを使用する。
【０４６１】
一態様では、移植された細胞は、血管内皮が発現する受容体を含む以下の非HLA抗原、例えば、Gタンパク質共役受容体(GPCR)、主要組織適合遺伝子複合体クラスI鎖関連遺伝子A(MICA)、およびストレスが加えられた内皮細胞の表面に発現する抗原、例えば、ミオシン、ビメンチン、コラーゲンV、およびKα1チューブリンを発現しない。
【０４６２】
これらの抗原のうち、商業的に配布されている試薬は、ATR、ETR、およびMICAに対する非HLA特異的抗体を検出することにしか利用できない。
【０４６３】
さらに、これらのアッセイには精度管理試験(proficiency testing)プログラムも利用することができ、そのため、臨床移植のための試験において精度管理試験プログラムを適用することができる。
【０４６４】
薬学的単位用量は、病理学的な細胞または組織を標的とするように任意でリダイレクトされ、あるドナーに由来する同種異系の細胞または組織が連続して移植された患者と比較した時に既往反応を誘導しないか、またはわずかな既往反応を誘導する、ある個体(P)において連続処置として用いられる初代「同種異系」(非アロ反応性細胞)細胞を含む。
【０４６５】
特に、本発明は、既往反応および移植片対宿主病のリスクを激減させるために操作されたHLA抗原発現細胞の選ばれた特定の組み合わせを決定することに頼る。本発明の目的は、操作された免疫細胞を用いた連続処置を必要とする患者、例えば、急速に成長する癌、固形および/または再発性/難治性の腫瘍、連続的癌において特に有用な場合があり、既に移植された個体において免疫療法による安全かつ効率的な処置を提供する。
【０４６６】
特に、本発明は、前記HLA抗原の特定の連続的な組み合わせをヒト集団における頻度に基づいて決定することに頼る。前記HLA抗原のマッチした組み合わせが好ましい。利用可能なHLAデータベースにおいて発見されなければ、ミスマッチのある組み合わせが用いられる。
【０４６７】
後の連続用量注射のために、最低頻度から、もっと高い頻度にかけてHLA A、HLA B、およびHLA DR抗原から開始してミスマッチプロセスが適用される。この方法は、(危険をはらんでいる既往反応をもたらす)患者が免疫されるアレルを最小にすることによって患者における将来の移植のために最大の可能性を保つことが可能になる。
【０４６８】
別の局面によれば、本発明は、既往反応および移植片対宿主病のリスクが低い、患者における処置として連続使用するための異なる同種異系細胞を含む少なくとも2つであり、5つまでの組成物を含むキットを開示する。前記組成物は、HLA A、HLA BおよびHLA DRアレルについてホモ接合性ドナーから選択され、共通して前記アレルを共有しない。
【０４６９】
一局面によれば、これは、完全ミスマッチを成し遂げるために、少なくとも1つのHLAアレルを不活化することによって成し遂げることができる。遺伝子不活化はまた、他の遺伝子、例えば、同種異系性(allogeneicity)、免疫チェックポイント、自殺遺伝子…に関与する遺伝子においても想定される。
【０４７０】
別の局面によれば、このような同種異系免疫細胞は、腫瘍特異的抗原を特異的な標的とするキメラ抗原受容体を付与するように操作することができる。
【０４７１】
この方法およびそのキットは、固形腫瘍および/または再発性/難治性の腫瘍などの数回の用量の注射を必要とする患者において特に有用である。
【０４７２】
キメラ抗原受容体(CAR)
本発明によるCARは単鎖CARでもよく、多鎖CARでもよい。
【０４７３】
概して、本発明によるCARは、
（a）少なくとも、結合ドメインおよび/もしくはscfvに連結可能なヒンジ、または結合ドメインおよび/もしくはscfvに既に連結されているヒンジ、
（b）膜貫通ドメイン、
（c）少なくとも、シグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメイン
を含む。
【０４７４】
本発明によるCARは、
（c）少なくとも、シグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメイン
に連結された
（b）膜貫通ドメイン
に連結された
（a）少なくとも、結合ドメインに連結可能なヒンジ
を含む。
【０４７５】
特定の態様では、セットまたはキットに由来する単位用量が提供され、Pが罹患している癌細胞が発現する抗原に特異的な結合ドメインまたはscfvと組み合わされる。癌細胞Pが発現する抗原に特異的な結合ドメインまたはscfvは、そのヒンジによってCARに結合し、それによって、操作された細胞は、Pが罹患している癌細胞が発現する抗原に特異的になる。
【０４７６】
従って、本発明は、操作された細胞、および前記の任意の癌抗原に特異的な結合ドメインまたはscfvと、薬学的に許容されるビヒクルを含むn個の薬学的単位用量のセットまたはキットであって、前記結合ドメインまたはscfvが前記の任意の癌抗原に特異的でもよく、操作された細胞が発現したCARヒンジに連結するための手段を含む、セットまたはキットを提供する。
【０４７７】
本発明によるCARは、ヒンジ、好ましくは、IgG1ヒンジ、CD8αヒンジ、FcγRIIIαヒンジ、および腫瘍壊死因子(TNF)スーパーファミリーデスレセプターの膜貫通受容体の細胞外ドメインから導き出されたEpoR-D2ヒンジからなる群より選択されるヒンジ、例えば、CD95の細胞外ドメインから導き出されたヒンジを含み、ヒトCD95のヒンジと少なくとも80％配列同一性を有してもよい。
【０４７８】
本発明によるCARは、好ましくは、CD95(Fas)膜貫通ドメイン、DR4膜貫通ドメイン、DR5膜貫通ドメイン、TNFR1膜貫通ドメイン、DR3膜貫通ドメイン、CD8α膜貫通ドメイン、4-1BB膜貫通ドメイン、DAP10膜貫通ドメイン、およびCD28膜貫通ドメインからなる群より選択される、少なくとも1つの膜貫通ドメインを含んでもよい。
【０４７９】
本発明によるCARは、FcεRIα、β、およびγ鎖の膜貫通ドメインからなる群より選択される少なくとも1つの膜貫通ドメインを含んでもよい。
【０４８０】
任意で、本発明によるCARは、病理学的細胞または病理学的組織の表面で発現している標的抗原に特異的な外部ドメインまたは細胞外結合ドメインを含む。前記CARを用いると、操作された細胞は病理学的細胞または病理学的組織を標的とし、最終的には、その機能に影響を及ぼすことが可能になる。前記の特異的標的抗原に対する標的抗原に特異的な結合ドメインに結合すると、CAR発現細胞においてシグナルが発生して様々な細胞効果が生じる。
【０４８１】
本発明によるCARのシグナル伝達ドメインまたは「細胞質シグナル伝達ドメイン」(またはエンドドメイン)は、免疫細胞および免疫応答の活性化または阻害をもたらす、細胞外リガンド結合ドメインが標的に結合した後の細胞内シグナル伝達を担う。言い換えると、シグナル伝達ドメインは、CARが発現している免疫細胞の正常エフェクター機能のうちの少なくとも1つの活性化または不活化を担う。例えば、T細胞のエフェクター機能は、サイトカイン分泌を含む細胞溶解活性またはヘルパー活性でもよい。従って、「細胞質シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクターシグナル機能シグナルを伝達し、細胞が特化した機能を果たすように誘導するタンパク質部分を指す。
【０４８２】
細胞質シグナル伝達ドメイン、例えば、ヒト免疫阻害受容体CTLA-4およびPD-1のシグナル伝達ドメインは、好ましくは、シグナル伝達経路に関与するヒトタンパク質に由来し、細胞免疫活性を低減する作用を有している場合がある(Federov et al., Sci Transl Med. 2013 Dec 11; 5 (215): 215ra172)。CARにおいて使用するためのシグナル伝達ドメインの好ましい例は、抗原受容体結合後にシグナル伝達を開始するように協調して作用するT細胞受容体および補助受容体の細胞質配列、ならびにこれらの配列の任意の誘導体(derivate)または変種および同じ機能的能力を有する任意の合成配列でもよい。シグナル伝達ドメインは、2つの別個の細胞質シグナル伝達配列クラスである、抗原依存性一次活性化を開始する細胞質シグナル伝達配列と、二次シグナルまたは補助刺激シグナルを生じるように抗原非依存的に働く細胞質シグナル伝達配列を含む。一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容活性化チロシンモチーフITAMとして知られるシグナル伝達モチーフを含んでもよい。ITAMは、syk/zap70クラスチロシンキナーゼの結合部位として役立つ、様々な受容体の細胞質内テールにおいて見出される詳細に明らかにされたシグナル伝達モチーフである。本発明において用いられるITAMの例には、非限定的な例として、TCRζ、FcRγ、FcRβ、FcRε、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、およびCD66dに由来するITAMが含まれ得る。好ましい態様では、CARのシグナル伝達ドメインは、ヒトCD3ζのアミノ酸配列と少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％、95％、97％または99％または100％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するCD3ζシグナル伝達ドメインを含んでもよい。
【０４８３】
特定の態様では、本発明のCARのシグナル伝達ドメインは補助刺激シグナル分子を含む。補助刺激分子は、効率的な免疫応答に必要とされる、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。「補助刺激リガンド」とは、T細胞上のコグネイト補助刺激分子に特異的に結合し、それによって、例えば、TCR/CD3複合体と、ペプチドが装填されたMHC分子が結合することで生じる一次シグナルに加えて、増殖活性化、分化などを含むが、これに限定されないT細胞応答を媒介するシグナルを生じる、抗原提示細胞上の分子を指す。補助刺激リガンドには、CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、誘導性補助刺激リガンド(ICOS-L)、細胞間接着分子(ICAM、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、M1CB、HVEM、リンホトキシンβ受容体、3/TR6、ILT3、ILT4、Tollリガンド受容体に結合するアゴニストまたは抗体、およびB7-H3に特異的に結合するリガンドが含まれ得るが、これに限定されない。補助刺激リガンドはまた、特に、CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LTGHT、NKG2C、B7-H3、CD83に特異的に結合するリガンドなどがあるが、これに限定されない、T細胞上に存在する補助刺激分子に特異的に結合する抗体も含む。「補助刺激分子」とは、補助刺激リガンドと一緒に特異的に結合し、それによって、増殖などがあるが、これに限定されないT細胞による補助刺激応答を媒介する、T細胞上にあるコグネイト結合パートナーを指す。補助刺激分子には、MHCクラスI分子、BTLAおよびTollリガンド受容体が含まれるが、これに限定されない。補助刺激分子の例には、CD27、CD28、CD8、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、およびCD83に特異的に結合するリガンドなどが含まれる。
【０４８４】
好ましい態様では、本発明のCARのシグナル伝達ドメインは、ヒト4-1BB（GenBank：AAA53133.）および/またはヒトCD28（NP_006130.1）の断片からなる群より選択される補助刺激シグナル分子の一部を含む。
【０４８５】
本発明の操作された細胞は、少なくとも結合ドメインに連結可能なヒンジまたは少なくともscfvに連結可能なヒンジ、膜貫通ドメイン、細胞内ドメインを含む、本発明によるCARを発現することがある。
【０４８６】
本発明の操作された細胞は、少なくとも結合ドメインに連結可能なヒンジまたは少なくともscfvに連結可能なヒンジ、膜貫通ドメイン、細胞内ドメインを含む、本発明によるCARを発現することがある。
【０４８７】
本発明によれば、特定の抗原への結合およびシグナル伝達の際にCAR発現細胞において誘導される細胞効果は、例えば、脱顆粒、薬物に対する耐性、薬物に対する感受性、サイトカイン放出、標的細胞または組織の溶解、CAR発現細胞の成熟、CAR発現細胞の死でもよい。
【０４８８】
本発明によるCARは、(任意で)細胞外リガンド結合ドメインを含むか、あるいはCD19分子(CD19)；membrane spanning 4-domains A1(CD20とも知られるMS4A1)；CD22分子(CD22)；CD24分子(CD24)；CD248分子(CD248)；CD276分子(CD276またはB7H3)；CD33分子(CD33)；CD38分子(CD38)；CD44v6；CD70分子(CD70)；CD72；CD79a；CD79b；インターロイキン3受容体サブユニットα(CD123とも知られるIL3RA)；TNF受容体スーパーファミリーメンバー8(CD30とも知られるTNFRSF8)；KIT癌原遺伝子受容体型チロシンキナーゼ(CD117)；V-set pre-B cell surrogate light chain 1(VPREB1またはCD179a)；接着Gタンパク質共役受容体E5(ADGRE5またはCD97)；TNF受容体スーパーファミリーメンバー17(BCMAとも知られるTNFRSF17)；SLAMファミリーメンバー7(CS1とも知られるSLAMF7)；L1細胞接着分子(L1CAM)；C型レクチンドメインファミリー12メンバーA(CLL-1とも知られるCLEC12A)；tumor-specific variant of the epidermal growth factor receptor(EGFRvIII)；甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)；Fms関連チロシンキナーゼ3(FLT3)；ガングリオシドGD3(GD3)；Tn抗原(Tn Ag)；リンパ球抗原6ファミリーメンバーG6D(LY6G6D)；Delta like canonical Notch ligand 3(DLL3)；インターロイキン-13受容体サブユニットα-2(IL-13RA2)；インターロイキン11受容体サブユニットα(IL11RA)；メソテリン(MSLN)；Receptor tyrosine kinase like orphan receptor 1(ROR1)；前立腺幹細胞抗原(PSCA)；erb-b2受容体型チロシンキナーゼ2(ERBB2またはHer2/neu)；プロテアーゼセリン21(PRSS21)；キナーゼインサートドメイン受容体(VEGFR2とも知られるKDR)；ルイスy抗原(ルイスY)；溶質輸送体ファミリー39メンバー6(SLC39A6)；線維芽細胞活性化タンパク質α(FAP)；Hsp70ファミリーシャペロン(HSP70)；血小板由来増殖因子受容体β(PDGFR-β)；Cholinergic receptor nicotinic alpha 2 サブユニット(CHRNA2)；Stage-Specific Embryonic Antigen-4(SSEA-4)；Mucin 1, cell surface associated(MUC1)；mucin 16, cell surface associated(MUC16)；クローディン18(CLDN18)；クローディン6(CLDN6)；上皮増殖因子受容体(EGFR)；Preferentially expressed antigen in melanoma(PRAME)；神経細胞接着分子(NCAM)；ADAMメタロペプチダーゼドメイン10(ADAM10)；葉酸受容体1(FOLR1)；葉酸受容体β(FOLR2)；炭酸脱水酵素IX(CA9)；プロテアソームサブユニットβ9(PSMB9またはLMP2)；エフリン受容体A2(EphA2)；テトラスパニン10(TSPAN10)；フコシルGM1(Fuc-GM1)；シアリルルイス接着分子(sLe)；TGS5；高分子量-黒色腫関連抗原(HMWMAA)；o-アセチル-GD2ガングリオシド(OAcGD2)；tumor endothelial marker 7-related(TEM7R)；G protein-coupled receptor class C group 5, member D(GPRC5D)；chromosome X open reading frame 61(CXORF61)；ALK受容体型チロシンキナーゼ(ALK)；ポリシアル酸；胎盤特異的1(PLAC1)；hexasaccharide portion of globoH glycoceramide(GloboH)；NY-BR-1抗原；ウロプラキン2(UPK2)；A型肝炎ウイルス細胞受容体1(HAVCR1)；アドレノセプターβ3(ADRB3)；パンネキシン3(PANX3)；Gタンパク質共役受容体20(GPR20)；リンパ球抗原6ファミリーメンバーK(LY6K)；嗅覚受容体ファミリー51サブファミリーEメンバー2(OR51E2)；TCR Gamma Alternate Reading Frame Protein(TARP)；ウィルムス腫瘍タンパク質(WT1)；ETV6-AML1 fusion protein due to 12；21 chromosomal translocation(ETV6-AML1)；精子自己抗原タンパク質17(SPA17)；X Antigen Family, Member 1E(XAGE1E)；TEK受容体型チロシンキナーゼ(Tie2)；黒色腫癌精巣抗原-1(MAD-CT-1)；黒色腫癌精巣抗原-2(MAD-CT-2)；Fos関連抗原1；p53変異体；ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)；sarcoma translocation breakpoints；melanoma inhibitor of apoptosis(ML-IAP)；ERG(transmembrane protease, serine 2(TMPRSS2)ETS融合遺伝子)；N-アセチルグルコサ���ニル-トランスフェラーゼV(NA17)；ペアードボックスタンパク質Pax-3(PAX3)；アンドロゲン受容体；サイクリンB1；v-myc avian myelocytomatosis viral oncogene neuroblastoma derived homolog(MYCN)；RasホモログファミリーメンバーC(RhoC)；チトクロムP450 1B1(CYP1B1)；CCCTC結合因子(ジンクフィンガータンパク質)様(BORIS)；Squamous Cell Carcinoma Antigen Recognized By T Cells 3(SART3)；ペアードボックスタンパク質Pax-5(PAX5)；プロアクロシン結合タンパク質sp32(OY-TES1)；リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ(LCK)；A kinase anchor protein 4(AKAP-4)；synovial sarcoma, X breakpoint 2(SSX2)；白血球関連免疫グロブリン様受容体1(LAIR1)；Fc fragment of IgA receptor(FCAR)；白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーAメンバー2(LILRA2)；CD300分子様ファミリーf(CD300LF)；骨髄ストローマ細胞抗原2(BST2)；EGF様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様2(EMR2)；リンパ球抗原75(LY75)；グリピカン-3(GPC3)；Fc受容体様5(FCRL5)；および免疫グロブリンλ様ポリペプチド1(IGLL1)；PCTA-l/ガレクチン8、CD171、TAG72、CEA、EPCAM、PSCA、PRSS21、PDGFR-β、プロスターゼ、PAP、ELF2M、エフリンB2、IGF-I受容体、CAIX、gp100、bcr-abl、チロシナーゼ、GM3、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-A1、レグマイン、HPVE6,E7、MAGEAl、プロステイン、サバイビンおよびテロメラーゼ、PCTA-l/ガレクチン8、メランA/MARTl、Ras変異体、TRP-2、RAGE-1、RU1、RU2、腸カルボキシルエステラーゼ、ならびに熱ショックタンパク質70からなる群より選択される抗原に特異的な結合ドメインに連結可能である。
【０４８９】
本発明のCARは、TCR、特に、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-A1、レグマイン、HPVE6,E7、MAGEAl、プロステイン、サバイビンおよびテロメラーゼ、PCTA-l/ガレクチン8、メランA/MARTl、Ras変異体、TRP-2、RAGE-1、RU1、RU2に特異的な任意のTCRでもよい。
【０４９０】
本発明のCARは固形腫瘍抗原に特異的でもよい。
【０４９１】
一部の態様では、本発明によるCARは単鎖CARである。
【０４９２】
一部の態様では、本発明によるCARは多鎖CARである。
【０４９３】
一部の態様では、本発明の操作された細胞は細胞表面に少なくとも1種類のCARを発現し、操作されたMHCクラスI分子に加えて、CARの2つ、3つを発現してもよい。
【０４９４】
一部の態様では、本発明によるCARは、前記CARの少なくとも1つの外部ドメインおよび少なくとも1つのエンドドメインが同じポリペプチド鎖に由来せず、それぞれが膜貫通ドメインを含み、相互作用して二量体CARまたは多量体CARを形成する少なくとも2つの異なるポリペプチド鎖に由来するCARでもよい。
【０４９５】
一部の態様では、本発明によるCARは、前記少なくとも2つの異なるポリペプチド鎖が、FcεRIα鎖、FcεRIβ鎖、および/またはFcεRIγ鎖の一部を含むCARでもよい。
【０４９６】
一部の態様では、本発明によるCARは、外部ドメインを含むポリペプチド鎖が、FcεRIのα鎖に由来する膜貫通ドメインを含むCARでもよい。
【０４９７】
一部の態様では、本発明によるCARは、デスドメインを含むエンドドメインを含むポリペプチド鎖が、FcεRIのγ鎖またはβ鎖に由来する膜貫通ドメインを含むCARでもよい。
【０４９８】
一部の態様では、本発明によるn個の薬学的単位用量のセットまたはキットは、好ましくは、TCRA遺伝子に挿入された、CARをコードする核酸配列を含む少なくとも1つのポリヌクレオチドを含む、操作された細胞を含んでもよい。
【０４９９】
一部の態様では、操作された細胞が、活性プロモーター、好ましくは、TCRAプロモーターに機能的に連結された少なくとも1つのポリヌクレオチドを含む、本発明によるn個の薬学的単位用量のセット。
【０５００】
一部の態様では、活性プロモーターとは、免疫療法に用いられる細胞において活性があるプロモーターを意味する。
【０５０１】
一部の態様では、本発明による細胞は、免疫細胞、初代免疫細胞、炎症性Tリンパ球、細胞傷害性Tリンパ球、調節性Tリンパ球、またはヘルパーTリンパ球に由来する免疫細胞でもよい。
【０５０２】
一部の態様では、β2-ミクログロブリン(B2M)および/またはクラスII主要組織適合遺伝子複合体トランスアクチベーター(CIITA)をコードする遺伝子が不活化されている、本発明による細胞。
【０５０３】
HLAクラスII(HLA-II)分子またはタンパク質HLAクラスII関連遺伝子をコードする他の遺伝子が破壊されてもよく、WO2013158292に開示されるような制御因子X関連アンキリン含有タンパク質(RFXANK)、制御因子5(RFX5)、制御因子X関連タンパク質(RFXAP)、クラスIIトランスアクチベーター(CIITA)、HLA-DPA(α鎖)、HLA-DPB(β鎖)、HLA-DQA、HLA-DQB、HLA-DRA、HLA-DRB、HLA-DMA、HLA-DMB、HLA-DOA、およびHLA-DOBからなる群より選択される。
【０５０４】
キット内の本発明の操作された細胞の用量は、モノクローナル抗体、好ましくは、リツキシマブおよび/またはQBEND-10Inを用いてCAR発現細胞をなくすために、その全体が参照により本明細書に組み入れられるWO2016120216A1に開示されるようにTRAC遺伝子座に挿入された、CARをコードする外因性遺伝子を含む。態様では、本発明のキット内の各用量の操作された細胞は、不活化された、β2-ミクログロブリン(B2M)および/またはクラスII主要組織適合遺伝子複合体(例えば、トランスアクチベーター(CIITA))をコードする遺伝子と、リンパ球枯渇に対する耐性を付与する少なくとも1種類の遺伝子を含む。リンパ球枯渇に対する耐性を付与する遺伝子は、dCK、CD52、CS1、CD38、CD70をコードする遺伝子から選択される遺伝子のいずれか1つでよい。
【０５０５】
一部の態様では、T細胞受容体(TCR)の成分をコードする少なくとも1つの遺伝子が不活化されている、本発明による細胞。
【０５０６】
一部の態様では、少なくとも1種類の免疫抑制性薬物、化学療法薬物、または抗癌薬に耐性を付与するように改変されている、本発明による細胞。
【０５０７】
一局面によれば、本発明は、既往反応および移植片対宿主病のリスクを下げることを目標として、患者において連続(N=移植片の数)処置を実施するために使用するための、異なるドナーから生じた連続注射用量のセットを調製するための方法に関し、本方法は、
（a）ドナーバンクに含まれる5人のドナーからなる、いくつかの群をランダムにサンプリングする工程、
（b）HLA-A、HLA-B、およびHLA-DRアレルについて前記群の中にある5人のドナーの遺伝子型を比較する工程、
（c）共通してHLA-A、HLA-B、およびHLA-DRアレルを示さない5人のドナーからなる群を選択する工程、
（d）工程（c）から得られた群において、前記患者の民族集団の少なくとも80％(fmin)、好ましくは90％超、さらにより優先的には95％超の遺伝子型と、HLA-A、HLA-B、およびHLA-DRアレルの少なくとも50％マッチを示すものを選択する工程、
（e）同種異系末梢血細胞におけるTCR発現を低減するか、または損なうように、工程(d)から選択されたドナーのそれぞれに由来する前記末梢血細胞を操作する工程、
（f）任意で、血液試料から、操作された末梢血細胞を増大する工程、
異なるドナーに由来する操作された末梢血細胞を別々に前処置する工程
を含む。
【０５０８】
一局面によれば、本発明は、既往反応および移植片対宿主病のリスクを下げることを目標として、患者において連続(N=移植片の数)処置を実施するために使用するための、異なるドナーから生じた同種異系末梢血細胞の連続注射用量のセットを調製するための方法に関し、本方法は、
（a）ドナーバンクに含まれる5人のドナーからなる、いくつかの群をランダムにサンプリングする工程、
（b）HLA-A、HLA-B、HLA-C、およびHLA-DRアレルについて前記群の中にある5人のドナーの遺伝子型を比較する工程、
（c）共通してHLA-A、HLA-B、HLA-C、およびHLA-DRアレルを示さない5人のドナーからなる群を選択する工程、
（d）工程（c）から得られた群において、一般集団の少なくとも80％(fmin)、好ましくは90％超、さらにより優先的には95％超の遺伝子型と、HLA-A、HLA-B、HLAC、およびHLA-DRアレルの少なくとも50％マッチを示すものを選択する工程、
（e）同種異系末梢血細胞の細胞表面でのTCR発現を低減するかまたは損なうように、工程（d）から選択されたドナーのそれぞれに由来する前記末梢血細胞を操作する工程、
（f）血液試料から、操作された末梢血細胞を増大する工程、
（g）異なるドナーに由来する操作された末梢血細胞を別々に前処置する工程
を含む。
【０５０９】
別の局面によれば、本発明は、既往反応および移植片対宿主病のリスクを下げることを目標として、患者において、連続(N=移植片の数)処置を実施するために使用するための、異なるドナーから生じた同種異系末梢血細胞の連続注射用量のセットを調製するための方法に関し、本方法は、
（a）ドナーのバンクにおいて、一般集団の少なくとも80％(fmin)、好ましくは90％超、さらにより優先的には95％超の遺伝子型と、HLA-A、HLA-B、HLAC、およびHLA-DRアレルの少なくとも50％マッチを示すドナーを選択する工程、
（b）HLA-A、HLA-B、HLA-C、およびHLA-DR、HLA-DQアレルについて、(a)において選択されたドナーの細胞の遺伝子型を比較する工程、
（c）共通してHLA-A、HLA-B、HLA-C、およびHLA-DRアレルを示さない少なくとも5人のドナーからなる群を選択する工程、または前記アレルが、免疫療法によって処置されることが意図される患者のHLAアレルにマッチしなければ、互いに、共通してHLA-A、HLA-B、HLA-C、およびHLA-DRアレルを示さない少なくとも5人のドナーからなる群を選択する工程、
（d）末梢血細胞の細胞表面でのTCR発現を低減するかまたは損なうように、工程（c）から選択されたドナーのそれぞれに由来する前記末梢血細胞を操作する工程、
（e）末梢血細胞の細胞表面でのMHCクラスIおよび/またはMHCクラスIIの発現が制御可能になるように、工程（c）または（d）から選択されたドナーのそれぞれに由来する前記末梢血細胞を操作する工程、
（e）細胞表面においてNK細胞を阻害するHLA、好ましくはHLA-Eを発現するように、工程（c）または（d）または（e）から選択されたドナーのそれぞれに由来する末梢血細胞を操作する工程であって、前記発現が制御可能である、工程、
（f）血液試料から、操作された末梢血細胞を増大する工程、
（g）異なるドナーに由来する操作された末梢血細胞を別々に前処置する工程
を含む。
【０５１０】
「制御可能な発現」とは、操作された細胞が、改変されたサイトカイン、抗生物質などの薬物と接触した時に阻害され得るか、または誘導され得る発現を意味する。
【０５１１】
特に、本発明の態様および一部が提供される。
【０５１２】
定義:
「同種異系」とは、細胞が、遺伝的に異なるレシピエントに移植されることを意味する。
【０５１３】
「既往反応」とは、本発明の中で、移植された免疫細胞を認識し、その抗原に対して特異的な抗体を産生する身体防御反応を意味する。
【０５１４】
「移植片対宿主病(GvHD)」とは、本発明の中では、レシピエント(宿主)を「異物」として認識する免疫細胞が同種異系移植された後の、よくある合併症を意味する。次いで、移植された免疫細胞は宿主の身体細胞を攻撃する。
【０５１５】
好ましい態様によれば、末梢血細胞(「移植片」とも呼ばれる)は初代白血球(免疫細胞)、より好ましくは、T細胞である。初代細胞は対象から直接培養されている。初代細胞は、本発明の範囲で意図されない樹立細胞株から分化される。造血細胞は、リンパ系細胞、例えば、T細胞、B細胞、NK細胞、ならびに骨髄系細胞、例えば、単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球/血小板、および樹状細胞に対応する。
【０５１６】
本発明の中で考慮される「免疫原性抗原」は、レシピエントに移植される末梢血細胞のタイプに依存する。
【０５１７】
好ましい態様によれば、免疫原性抗原はHLA系の一部である。
【０５１８】
最も好ましい態様によれば、本発明の中で考慮される免疫原性抗原は、HLA-A、HLA-B、およびHLA-DR遺伝子型の組み合わせである。「HLA-A、HLA-B、およびHLA-DR遺伝子型」とは、これらの3種類の特定のHLA抗原について2つのハプロタイプセットである。これらはホモ接合性でもよく、類似するアレルでもよく、ヘテロ接合性でもよい。
【０５１９】
「ホモ接合体」は特定の遺伝子に適用される。
【０５２０】
可能性のあるHLA組織型の何千もの異なる組み合わせがある。このため、特に本発明の方法が遺伝子型、すなわち、両親から受け継がれるHLA抗原に適用される時には、完全にマッチするものを見つけることは難しい場合がある。従って、本発明の中では、HLA-AおよびHLA-Bの血清型(アレルの群)が考慮され、HLA-DRのアレルが考慮される。Prasad VK et al.(1999)では、83のHLA-Aと186のHLA-Bアレルは28のHLA-Aと59のHLA-B血清型にしか分解しないと報告された。
【０５２１】
HLA-DRアレル
定義については、Prasad VK, Kernan NA, Heller G, O'Reilly RJ, Yang SY, (1999) 「DNA typing for HLA-A and HLA-B identifies disparities between patients and unrelated donors matched by HLA-A and HLA-B serology and HLA-DRB1」, Blood. 93(1):399-409.)を参照されたい。
【０５２２】
本発明によれば、「参照集団」は世界中に及んでもよく、部分母集団、例えば、アフリカ人、白人、アジア人、ヒスパニック、および北米原住民は1つの国に限定されない。「ドナーの利用可能なパネル」とは、集団または集団のサブセットにおいてランダムに選ばれた数百ものドナーまたは数千ものドナーのセットを意味する。
【０５２３】
従って、前記集団は、世界規模での、遺伝的に類似し、かつ少数の個体で構成される部分母集団である。
【０５２４】
一態様によれば、前記患者(または「レシピエント」)および前記参照集団は白人である。
【０５２５】
別の態様によれば、前記患者(または「レシピエント」)および前記参照集団はアフリカ系アメリカ人である。
【０５２６】
別の態様によれば、前記患者(または「レシピエント」)および前記参照集団はアジア人/太平洋諸島の住民(Pacific Islander)である。
【０５２７】
別の態様によれば、前記患者(または「レシピエント」)および前記参照集団はヒスパニックである。
【０５２８】
別の態様によれば、前記患者(または「レシピエント」)および前記参照集団はネイティブアメリカンである。
【０５２９】
実際には、様々な集団が、出身国に従って生まれを示す個体群に対応する。この分離は、Chew A, Han JH, et al. Haplotype variation and linkage disequilibrium in 313 human genes. Science. 2001;293:489-493、またはRisch N, Burchard E, Ziv E, Tang H. Categorization of humans in biomedical research: genes, race and disease. Genome Biology. 2002; 3(7):comment 2007.1-comment2007.12において以前に定義された判断基準と一致する。
【０５３０】
本発明の方法によれば、1回目の注射については、マッチしたHLA遺伝子型または可能な限り近いHLA遺伝子型を選択することが好ましい。これが可能でなければ、移植片のためにミスマッチのあるHLA遺伝子型を選択すべきである。
【０５３１】
HLAマッチング
多くのHLAマーカーがある。それぞれのHLAマーカーには名前がある。名前は文字または文字の組み合わせと数字である。本発明では、少なくとも6つのHLAマーカー、好ましくは少なくとも8つのマーカー、さらにより好ましくは10のマーカー、すなわち、2つのAマーカー、2つのBマーカー、2つのCマーカー、2つのDRB1、および2つのDQマーカーがマッチすることが「マッチ」するための最低必要条件である。
【０５３２】
成人ドナーは、これらの8つのHLAマーカーのうち少なくとも6にマッチしなければならない。多くの移植センターは8つのマッチのうち少なくとも7つにマッチすることを要求する。臍帯血細胞は成人ドナー細胞よりも成熟していないので、そのマッチング基準はあまり厳しくない。臍帯血ユニットはHLA-A、HLA-B、およびHLA-DRB1において少なくとも6つのマーカーのうち4つにマッチしなければならない。これらのガイドラインは移植結果の科学研究に基づいている。
【０５３３】
「HLAマッチング」とは、ドナーのHLA組織型とレシピエントのHLA組織型との間で最良のマッチを探索するプロセスを意味する。本発明の中で、HLA-A、HLA-B、およびHLA-DR抗原が同じである時に最良のマッチが得られる。
【０５３４】
ある好ましい態様によれば、受け取るレシピエントに密接に関連する移植片の選択肢はHLA-A、HLA-B、およびHLA-DR遺伝子のうちの1つにおけるシングルホモ接合体である。
【０５３５】
「ホモ接合体」とは、2つのハプロタイプ(一方が片親に由来する)が同一であることを意味する。
【０５３６】
ある好ましい態様によれば、受け取るレシピエントに密接に関連する移植片の選択肢は、HLA-A、HLA-B、およびHLA-DR遺伝子のうちの2つにおけるダブルホモ接合体である。
【０５３７】
ある好ましい態様によれば、受け取るレシピエントに密接に関連する移植片の選択肢は、HLA-A、HLA-B、およびHLA-DR遺伝子におけるトリプルホモ接合体である。
【０５３８】
「ミスマッチング」とは、本発明の中で、レシピエントによって共有されないドナーHLA-A、HLA-B、およびHLA-DRアレルの存在として定義された。
【０５３９】
「免疫原性抗原アレルが、患者においてジェノタイピングされたものと同一性が最も高い」とは、前記ミスマッチのあるHLA抗原が次の注射バッチにおいて絶対に再使用されないという条件で、1つのミスマッチが許容され得ることを意味する。実際には、可能であれば、ドナーの探索は、通常、患者と同じ親をもつ患者の兄弟姉妹(同胞)から始まる。同胞のいずれか一人が完璧にマッチする(すなわち、両親の片方から同じHLA抗原セットを受け取る)確率は1/4である。同胞が良好にマッチしなければ、探索は、良好にマッチする可能性が低い親類-両親、片親が同じきょうだい(half siblings)、および拡大家族、例えば、おば、おじ、またはいとこに移ることがある(血縁関係にない他人よりも、配偶者は良好にマッチする可能性が低い)。親類がぴったりとマッチすると見出されなかったら、移植チームは探索を一般に人々に広げる。他人と良好にマッチすることが見出される可能性がある。このプロセスを助けるために、チームは移植登録所(transplant registry)を利用する。登録所は患者とボランティアドナーとの間の仲介役として働く。登録所は、何百万人もの可能性のあるドナーと何十万もの臍帯血ユニットを探索し、これらにアクセスすることができる。組織タイピングに応じて、他のいくつかの国際登録所も利用することができる。類似した人種背景または民族背景を有する人々において最良のマッチが見出されることもある。たった1つのマッチでも、何百万人もの記録に目を通す必要がある場合がある。
【０５４０】
1回目の注射の(あまり好ましくない)第2の選択肢によれば、ドナーのHLA遺伝子型は、レシピエントのHLA遺伝子型、特に、HLA-A、HLA-B、およびHLA-DR抗原と異なる。
【０５４１】
一態様によれば、HLA-A、HLA-B、およびHLA-DR遺伝子型の完全ミスマッチを得ることができなければ、HLA-DR抗原にあるという条件で部分的なミスマッチが許容され得る。
【０５４２】
HLAデータベース
本発明によれば、HLAマッチング/ミスマッチングに最良のドナーを決定するために、臓器移植において現在用いられているHLAデータベースを通じて処理することが適している。なぜなら、HLAデータベースは何百万もの国際記録にアクセスでき、従って、何千人もの首尾良くマッチしたドナーとレシピエントを最適化できるからである。
【０５４３】
このようなHLAデータベースは、米国において最大の登録所(registry)である「Be the Match」(以前はNational Marrow Donor Programと呼ばれていた)またはヒト主要組織適合遺伝子複合体(HLA)配列にスペシャリストデータベースを提供するIMGT/HLAデータベースであり、WHO Nomenclature Committee For Factors of the HLA Systemの公式の配列を含む。
【０５４４】
別の態様によれば、HLAミスマッチの工程(b)(i)が非常に低い頻度の集団から作られる、前記方法が行われる。
【０５４５】
まれなアレル(すなわち、0.001未満の頻度)が好ましい。しかしながら、その希少性のために発見されないことがあるので、共通アレル(0.001より大きな遺伝子頻度)を使用することが可能である。集団内で非常に低い頻度から、免疫原性抗原を有する移植片を選択するこの工程は、共通アレル頻度データベースから利用可能なデータを編集することによって実現される。
【０５４６】
HLAジェノタイピング
本発明の方法の一部として、潜在的なドナーの参照集団が既に確かめられている場合、第1の工程は、移植片がレシピエント(または「患者」)に移植される前にその人をジェノタイピングすることからなる。
【０５４７】
この目的のために、本発明の中で用いられるジェノタイピング法は、好ましくは、現行の国際標準であるHLAジェノタイピング法であるいずれか1つ、例えば、サンガー配列決定法に基づくPCR配列決定法(SBT)である(Bentley. G., Higuchi, R., Hoglund, B., Goodridge, D., Sayer, D., Trachtenberg, E.A., and Erlich H.A. (2009)「High-resolution, high-throughput HLA genotyping by next-generation sequencing」, Tissue Antigens. 74(5): 393-403)。その代わりに、他の十分に確立したHLAタイピング検査法、例えば、群特異的PCRまたは群特異的配列決定プライマーによるアレル分離を使用することができる(Danzer M., Niklas N., Stabentheiner S., Hofer K., Proll, J., Stuckler C., Raml E., Polin H. and Gabriel C. (2013)「Rapid, scalable and highly automated HLA genotyping using next-generation sequencing: a transition from research to diagnostics」, BMC Genomics, 14:221)。US20090035776において述べられたように、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法によるHLAジェノタイピングが、診療において広く用いられる血清学的方法の代案になってきた。最も一般的に用いられる、PCRベースのタイピング法は、配列特異的プライマーを用いるPCR(PCR-SSP)および配列特異的オリゴヌクレオチドを用いるPCR(PCR-SSO)である。PCR-SSP法では、HLA抗原の型を決定するために、標的HLA抗原の超可変領域を増幅することによって遺伝子配列が決定される(例えば、M. Bunce et al.,「Phototyping: comprehensive DNA typing for HLA-A, B, C, DRB1, DRB3, DRB4, DRB5 & DQB1 by PCR with 144 primer mixes utilizing sequence-specific primers (PCR-SSP)」, Tissue Antigens 1995, vol. 46, pp.355-67を参照されたい)。PCR-SSO法では、(HLA遺伝子特異的プライマーによって増幅したDNAを固定化した)膜を調製し、それぞれのHLA型に特異的なオリゴヌクレオチドプローブをタイピングのためにハイブリダイズする(例えば、R. K. Saiki et al.,「Analysis of enzymatically amplified beta-globin and HLA-DQ alpha DNA with allele-specific oligonucleotide probes」, Nature 1986, vol. 324, pp.163-6を参照されたい)。市場において現在入手可能なHLA-Bジェノタイピングキットは、これらの2つの方法であるPCR-SSPおよびPCR-SSOに基づいている。
【０５４８】
レシピエントのHLAセロタイピング
一態様によれば、実施された循環している抗HLA抗体の検出工程は第1の用量投与の前に行われる。
【０５４９】
別の態様によれば、前記検出は、実施された循環している抗HLA-A、抗HLA-B、および抗HLA-DR抗体に対して行われる。
【０５５０】
妊娠、輸血、失敗に終わった移植、または他の手段により同種異系HLA抗原に感作されたことがある患者は、移植または血小板輸血を必要とする時に難題となる。前もって形成された抗HLA抗体が移植の超急性拒絶反応と関連付けられる。患者血清中の抗HLA抗体が、数人または多くの個体に由来する細胞と反応することがある。感作は、患者血清によって死滅した潜在的な試験ドナー細胞のパーセントであるパネル反応性抗体(PRA)のパーセントとして報告される。PRAからまた、適切なドナーを発見する可能性も見積もられる。下記で示されるような、感度および精度が異なる、いくつかのアプローチを用いて、これらの抗体を特定し、特徴付けることができる。これらのアプローチの全てが本発明の中で意図される。補体依存性リンパ球傷害性(CDC)は、補体の存在下で、ドナーの免疫細胞と既存の患者の抗HLA抗体の間で交差反応(クロスマッチ)を検出するのに用いられることがある。また、抗HLAクラスIおよびクラスII抗体が存在するか、もしくは存在しないか患者をモニタリングするために、または抗体が出現したか、もしくは消失したかを経時的にモニタリングするために移植前後にLuminexが用いられることがある。その後に、抗体のHLA特異性を確かめるために、陽性の血清をLuminexクラスIおよびクラスII特定アッセイによって試験する。フローサイトメトリーは、細胞傷害性などの感度の高くない方法では通常検出されない抗HLA抗体の特異性を評価するための別の技法である。高PRA含有血清中の特異的HLA抗体を確かめるために1種類のHLA抗原ビーズが用いられる。
【０５５１】
免疫細胞の操作
本発明は免疫療法用の免疫細胞を調製する方法であって、エクスビボで、ある特異的エンドヌクレアーゼおよび/または下記のキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドまたはベクターを前記免疫細胞に導入する工程を含む、方法を含む。
【０５５２】
好ましい態様では、前記ポリヌクレオチドは免疫細胞において安定発現されることを考慮してレンチウイルスベクターに含まれる。
【０５５３】
遺伝子を不活化するとは、関心対象の遺伝子が機能的なタンパク質の形で発現されないことと意図される。特定の態様では、前記方法の遺伝子組換えは、あるレアカットエンドヌクレアーゼが、ある標的遺伝子における切断を特異的に触媒し、それによって前記標的遺伝子を不活化するように、操作する提供された細胞において、このレアカットエンドヌクレアーゼを発現させることに頼る。レアカットエンドヌクレアーゼによって引き起こされる核酸鎖切断は概して、相同組換えまたは非相同末端結合(NHEJ)の別々の機構によって修復される。しかしながら、NHEJは、切断部位でDNA配列に変化を加えることが多い不完全な修復プロセスである。機構は、2つのDNA末端のうち残っているものが直接的な再連結(Critchlow and Jackson 1998)によって、またはいわゆるマイクロ相同性媒介末端結合(Ma, Kim et al. 2003)によって再結合することを伴う。非相同末端結合(NHEJ)を介した修復は小さな挿入または欠失をもたらすことが多く、特異的な遺伝子ノックアウトの作製に使用することができる。前記改変は少なくとも1つのヌクレオチドの置換、欠失、または付加でもよい。切断によって誘導される変異誘発事象、すなわち、NHEJ事象に引き続いて起こる変異誘発事象が起こった細胞は、当技術分野において周知の方法によって特定および/または選択することができる。
【０５５４】
一態様によれば、不活化の工程は、相同組換えを介した遺伝子ターゲティングによって行われる。ヌクレオチド鎖切断は相同組換え速度を刺激することが知られている。従って、別の態様では、前記方法の遺伝子組換え工程は、相同組換えが標的核酸配列と外因性核酸との間で行われるように、少なくとも、標的核酸配列の一部と相同な配列を含む外因性核酸を細胞に導入する工程をさらに含む。特定の態様では、前記外因性核酸は、標的核酸配列の5'側にある領域と相同な第1の部分と、標的核酸配列の3'側にある領域と相同な第2の部分を含む。これらの態様における前記外因性核酸はまた、標的核酸配列の5'側にある領域と3'側にある領域との相同性を含まない、第1の部分と第2の部分の間に配置された第3の部分も含む。標的核酸配列が切断された後に、標的核酸配列と外因性核酸との間で相同組換え事象が刺激される。好ましくは、前記ドナーマトリックス内に、少なくとも50bp、好ましくは100bp超、より好ましくは200bp超の相同配列が用いられる。従って、外因性核酸は、好ましくは200bp〜6000bp、より好ましくは1000bp〜2000bpである。実際には、切断部位の上流および下流に隣接する領域に、共通の核酸相同性が配置され、導入される核酸配列は2本のアームの間に配置しなければならない。
【０５５５】
好ましい態様では、免疫細胞をさらに操作する前記方法は、下記のように、DNA切断によって遺伝子を選択的に不活化するために、前記免疫細胞、例えば、T細胞に、特異的レアカットをコードするポリヌクレオチド、特に、mRNAを導入する工程を含む。さらに好ましい態様では、前記レアカットエンドヌクレアーゼはTALE-ヌクレアーゼまたはCas9エンドヌクレアーゼである。TAL-ヌクレアーゼは、今までに、他のタイプのレアカットエンドヌクレアーゼと比べて特異性および切断効率が高いと判明しており、そのため、一定の代謝回転(turn-over)で、操作された免疫細胞を大規模に産生するのに最適なエンドヌクレアーゼとなっている。
【０５５６】
好ましい態様によれば、遺伝子不活化は、好ましくは、TAL-ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、またはRNA/DNAガイドエンドヌクレアーゼ、例えば、Cas9またはアルゴノート(Argonaute)を用いることによって行われる。
【０５５７】
さらに好ましい態様によれば、免疫原性抗原をコードする前記アレル、好ましくは、HLA-A、HLA-B、および/またはHLA-DRアレルの不活化はTALE-ヌクレアーゼを用いて行われる。これは、特異的TALE-ヌクレアーゼによって標的とされる正確なゲノム位置で成し遂げることができ、前記特異的TALE-ヌクレアーゼは切断を触媒し、前記外因性核酸は、少なくとも、相同性領域と、以前に引用された群より選択される1つの標的遺伝子を不活化するための配列を連続して含む。いくつかの遺伝子は、それぞれ、数種類のTALE-ヌクレアーゼを使用し、1つの規定された遺伝子と、いくつかの特異的な遺伝子を特異的に標的とすることによって連続して不活化されてもよく、同じ時間で不活化されてもよい。TALE-ヌクレアーゼとは、転写活性化因子様エフェクター(TALE)に由来するDNA結合ドメインと、核酸標的配列を切断するための1つのヌクレアーゼ触媒ドメインからなる融合タンパク質だと意図される(Boch, Scholze et al. 2009; Moscou and Bogdanove 2009; Christian, Cermak et al. 2010; Cermak, Doyle et al. 2011; Geissler, Scholze et al. 2011; Huang, Xiao et al. 2011; Li, Huang et al. 2011; Mahfouz, Li et al. 2011; Miller, Tan et al. 2011; Morbitzer, Romer et al. 2011; Mussolino, Morbitzer et al. 2011; Sander, Cade et al. 2011; Tesson, Usal et al. 2011; Weber, Gruetzner et al. 2011; Zhang, Cong et al. 2011; Deng, Yan et al. 2012; Li, Piatek et al. 2012; Mahfouz, Li et al. 2012; Mak, Bradley et al. 2012)。
【０５５８】
免疫原性抗原アレルの不活化
一局面では、本発明は、ミスマッチプロセスの間に、すなわち、第1のバッチに適用される工程（c)(ii）において、またはレシピエントに注射される後のバッチに適用される工程（d）において少なくとも1つの免疫原性抗原アレルを不活化することが有用であり得る方法をさらに提供する。
【０５５９】
好ましい態様によれば、不活化しようとする免疫原性抗原アレルは、HLA-A、HLA-B、および/またはHLA-DRアレルである。
【０５６０】
別の好ましい態様によれば、免疫原性抗原、好ましくは、HLA-A、HLA-B、および/またはHLA-DRアレルをコードする前記アレルの不活化は、RNAガイドエンドヌクレアーゼ、例えば、Cas9またはDNAガイドエンドヌクレアーゼ、例えば、WO2014189628に記載のようなアルゴノートに基づく技法によって行われる。
【０５６１】
さらなる態様によれば、前記方法は、前記細胞が同種移植に適するように前記細胞を遺伝子組換えする工程をさらに含む。
【０５６２】
第1の局面によれば、免疫細胞は、例えば、WO2013/176915に記載のようにT細胞受容体(TCR)の1つまたは複数の成分を発現する少なくとも1つの遺伝子を不活化することによって同種異系にされてもよく、HLAまたはβ2mタンパク質発現をコードするか、または調節する遺伝子の不活化と組み合わせることができる。従って、移植片対宿主症候群および移植片拒絶反応のリスクは大幅に小さくなる。
【０５６３】
別の局面によれば、免疫細胞は、陽性悪性細胞を処置するための標準治療として用いられる免疫抑制薬または化学療法処置に対する耐性を改善するように、さらに遺伝子操作することができる。例えば、キャンパス(アレムツズマブ)およびグルココルチコイド処置の薬物標的であるCD52およびグルココルチコイド受容体(GR)は、これらの処置に対して細胞が耐性になるように不活化され、患者自身のT細胞よりも他に負けない優位点を与える。CD3遺伝子の発現もまた、別の免疫抑制性薬物であるテプリズマブに対する耐性を付与するために抑制または低減することができる。HPRT発現もまた、化学療法においてよく用いられる、特に、急性リンパ芽球性白血病を処置するための細胞分裂阻害剤である6-チオグアニンに対する耐性を付与するために本発明に従って抑制または低減することができる。
【０５６４】
本発明のさらなる局面によれば、免疫細胞は、T細胞活性化の制御因子として働く「免疫チェックポイント」として働くタンパク質、例えばPDCD1またはCTLA-4をコードする遺伝子を不活化することによって、免疫細胞の活性をさらに高めるか、または消耗を制限するように、さらに操作することができる。発現を低減または抑制することができる遺伝子の例を、出願WO2014/184744の表1に示した。
【０５６５】
キメラ抗原受容体(CAR)を付与する細胞
本発明の重要な局面によれば、レシピエントに移植される白血球は、キメラ受容体抗原(CAR)を発現するように遺伝子操作される。
【０５６６】
これらの人工(操作された)T細胞受容体は、養子細胞移入と呼ばれる技法を用いた癌の療法として研究中である。T細胞は患者から除去され、特定の型の癌に特異的な受容体を発現するようにモノクローナル抗体の特異性を移植することによって改変される。この免疫細胞(すなわち、T細胞)は、癌細胞を認識し、死滅させることができ、患者に再導入される。
【０５６７】
CARは、1つの融合分子の中に、1つまたは複数のシグナル伝達ドメインに関連するターゲティング部分からなる合成受容体である。概してCARの結合部分は、可動性リンカーによってつながったモノクローナル抗体の軽鎖可変断片を含む、単鎖抗体(scFv)の抗原結合ドメインからなる。受容体またはリガンドドメインに基づく結合部分もまた首尾良く用いられてきた。本発明は、シグナル伝達ドメインがCD3ζまたはFc受容体γ鎖の細胞質領域に由来する第一世代CARを含む。本発明はまた、インビボでの増大および抗腫瘍活性の延長を可能にする第二世代および第三世代も含む。これらのCARについて、CARを形成するために、補助刺激分子に由来するシグナル伝達ドメインならびに膜貫通ドメインおよびヒンジドメインが付加されてきた。
【０５６８】
一態様によれば、前記CARは単鎖CARである。
【０５６９】
これらは、US7446190、WO2008/121420、US8252592、US20140024809、WO2012/079000、WO2014153270、WO2012/099973、WO2014/011988、WO2014/011987、WO2013/067492、WO2013/070468、WO2013/040557、WO2013/126712、WO2013/126729、WO2013/126726、WO2013/126733、US8399645、US20130266551、US20140023674、WO2014039523、US7514537、US8324353、WO2010/025177、US7446179、WO2010/025177、WO2012/031744、WO2012/136231A1、WO2012/050374A2、WO2013074916、WO/2009/091826A3、WO2013/176915、またはWO/2013/059593などの先行技術において十分に明らかにされている単鎖に従って設計されてもよい。
【０５７０】
別の態様によれば、前記CARは多鎖CARである。CARの多鎖構造の例は、WO2014039523において、さらに詳細に開示される。
【０５７１】
別の態様によれば、前記CARは、少なくとも、CD3ζシグナル伝達ドメインと4-1BB補助刺激ドメインを含む。
【０５７２】
別の態様によれば、前記CARは、C38、CD123、またはCS1から選択される細胞表面抗原に特異的である。
【０５７３】
別の態様によれば、前記CARは、固形腫瘍または転移性細胞の表面で発現または過剰発現している癌細胞表面抗原に特異的である。前記癌細胞表面抗原は、結腸直腸癌、乳癌、または肝臓転移の場合はCEA、神経膠腫-グリア芽細胞腫の場合はEGFRvIII、神経膠腫-NSCL癌を処置する場合はEGFR、神経膠腫の場合はEphA2またはIL13-Rα2、癌腫の場合はEpCAM、中皮腫の場合はFAP、卵巣癌の場合はFR-α、神経芽細胞腫の場合はO-アセチル-GD2、肺扁平上皮癌または肝細胞癌を処置する場合はGPC3、癌、例えば、肺癌、胸膜中皮腫、膵臓癌、乳癌、肺癌、または転移癌、例えば、転移性結腸癌、転移性乳癌、転移性肺癌を処置する場合はメソテリン、癌腫の場合はMUC1、卵巣癌の場合はMUC16、前立腺癌の場合はPSMA、乳房肺癌を処置する場合はROR1の中から選択され得る。
【０５７４】
好ましい態様では、前記操作された細胞は、HtrA1に特異的なCARを含む(Altobelli E, Angeletti PM, Morroni M, Profeta VF. HtrA1 as a promising tissue marker in cancer: a meta-analysis. BMC Cancer. 2018;18:143. doi:10.1186/s12885-018-4041-2)。
【０５７５】
さらに好ましい態様では、前記操作された細胞は、HtrA1に特異的なCARと、CD123；CD19；CD22；CD30；CD79b、CD70；CD171；CS-1(CD2サブセット1、CRACC、SLAMF7、CD319、および19A24とも呼ばれる)；DLL3；TSPAN10；PRAME；C型レクチン様分子-1(CLL-1またはCLECL1)；CD33；上皮増殖因子受容体バリアントIII(EGFRvIII)；ガングリオシドG2(GD2)；ガングリオシドGD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer)；TNF受容体ファミリーメンバーB細胞成熟(BCMA)；Tn抗原((TnAg)または(GalNAca-Ser/Thr))；前立腺特異的膜抗原(PSMA)；受容体型チロシンキナーゼ様オーファン受容体1(ROR1)；Fms様チロシンキナーゼ3(FLT3)；腫瘍関連糖タンパク質72(TAG72)；CD38；CD44v6；癌胎児抗原(CEA)；上皮細胞接着分子(EPCAM)；B7H3(CD276)；KIT(CD117)；インターロイキン-13受容体サブユニットα-2(IL-13Ra2またはCD213A2)；メソテリン；インターロイキン11受容体α(IL-llRa)；前立腺幹細胞抗原(PSCA)；プロテアーゼセリン21(テスチチン(Testisin)またはPRSS21)；血管内皮増殖因子受容体2(VEGFR2)；ルイス(Y)抗原；CD24；血小板由来増殖因子受容体β(PDGFR-β)；Stage-specific embryonic antigen-4(SSEA-4)；CD20；葉酸受容体α；受容体チロシン-プロテインキナーゼERBB2(Her2/neu)；ムチン1(MUC1)；ムチン16(MUC16)；ムチン17(MUC17)；上皮増殖因子受容体(EGFR)；神経細胞接着分子(NCAM)；プロスターゼ；前立腺酸性ホスファターゼ(PAP)；elongation factor 2 mutated(ELF2M)；エフリンB2；線維芽細胞活性化タンパク質α(FAP)；インシュリン様増殖因子1受容体(IGF-I受容体)、炭酸脱水酵素IX(CAFX)；Proteasome (Prosome, Macropain)サブユニット、β型、 9(LMP2)；糖タンパク質100(gplOO)；ブレイクポイントクラスター領域(BCR)およびアベルソンマウス白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ1(Abl)(bcr-abl)からなる癌遺伝子融合タンパク質；チロシナーゼ；エフリンA型受容体2(EphA2)；フコシルGM1；シアリルルイス接着分子(sLe)；ガングリオシドGM3(aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer)；トランスグルタミナーゼ5(TGS5)；高分子量-黒色腫関連抗原(HMWMAA)；o-アセチル-GD2(OAcGD2)；葉酸受容体β；腫瘍内皮マーカー1(TEM1/CD248)；tumor endothelial marker 7-related(TEM7R)；クローディン6(CLDN6)；スプライスバリアント2(クローディン18.2)を含むクローディン18(CLDN18)；甲状腺刺激ホルモン受容体 (TSHR)；G protein-coupled receptor class C group 5, member D(GPRC5D)；chromosome X open reading frame 61(CXORF61)；CD97；CD179a；未分化リンパ腫キナーゼ(ALK)；ポリシアル酸；胎盤特異的1(PLAC1)；hexasaccharide portion of globoH glycoceramide(GloboH)；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；ウロプラキン2(UPK2)；A型肝炎ウイルス細胞受容体1(HAVCRl)；アドレノセプターβ3(ADRB3)；パンネキシン3(PANX3)；Gタンパク質共役受容体20(GPR20)；lymphocyte antigen 6 complex, locus K 9(LY6K)；リンパ球抗原6複合体遺伝子座タンパク質G6d(LY6G6D)；嗅覚受容体51 E2(OR51E2)；TCR Gamma Alternate Reading Frame Protein (TARP)；ウィルムス腫瘍タンパク質(WT1)；癌/精巣抗原1(NY-ESO-1)；癌/精巣抗原2(LAGE-la)；黒色腫関連抗原1(MAGE-A1)；ETS translocation-variant gene 6, located on chromosome 12p(ETV6-AML)；精子タンパク質17(SPA17)；X Antigen Family, Member 1A(XAGE1)；アンジオポエチン結合細胞表面受容体2(Tie2)；黒色腫癌精巣抗原-1(MAD-CT-1)；黒色腫癌精巣抗原-2(MAD-CT-2)；Fos関連抗原1；腫瘍タンパク質p53(p53)；p53変異体；プロステイン；サバイビン(surviving)；テロメラーゼ；前立腺癌腫瘍抗原-1(PCTA-1またはガレクチン8)、melanoma antigen recognized by T cells 1(メランAまたはMARTI)；Rat sarcoma(Ras)変異体；ヒトテロメラーゼ逆転���酵素(hTERT)；sarcoma translocation breakpoints；melanoma inhibitor of apoptosis(ML-IAP)；ERG(transmembrane protease, serine 2(TMPRSS2)ETS融合遺伝子)；Nアセチルグルコサミニル-トランスフェラーゼV(NA17)；ペアードボックスタンパク質Pax-3(PAX3)；アンドロゲン受容体；サイクリンBl；v-myc avian myelocytomatosis viral oncogene neuroblastoma derived homolog(MYCN)；RasホモログファミリーメンバーC(RhoC)；チロシナーゼ関連タンパク質2(TRP-2)；チトクロムP450 1B1(CYP1B1)；CCCTC結合因子(ジンクフィンガータンパク質)様(BORISまたはBrother of the Regulator of Imprinted Sites)、Squamous Cell Carcinoma Antigen Recognized By T Cells 3(SART3)；ペアードボックスタンパク質Pax-5(PAX5)；プロアクロシン結合タンパク質sp32(OY-TES1)；リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ(LCK)；A kinase anchor protein 4(AKAP-4)；synovial sarcoma, X breakpoint 2(SSX2)；Receptor for Advanced Glycation Endproducts (RAGE-1)；renal ubiquitous1 (RU1)；renal ubiquitous2(RU2)；レグマイン；ヒトパピローマウイルスE6(HPV E6)；ヒトパピローマウイルスE7(HPVE7)；腸カルボキシルエステラーゼ；熱ショックタンパク質70(HSP70)；熱ショックタンパク質70-2変異型(mut hsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白血球関連免疫グロブリン様受容体1(LAIR1)；IgA 受容体のFc35断片(FCARまたはCD89)；白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーAメンバー2(LILRA2)；CD300分子様ファミリーメンバーf(CD300LF)；C型レクチンドメインファミリー12メンバーA(CLEC12A)；骨髄ストローマ細胞抗原2(BST2)；EGF様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様2(EMR2)；リンパ球抗原75(LY75)；グリピカン-3(GPC3)；Fc受容体様5(FCRL5)；および免疫グロブリンλ様ポリペプチド1(IGLL1)からなる癌マーカーの群より選択される癌マーカーに特異的なCARを含む。
【０５７６】
好ましい態様では、前記操作された細胞は、HtrA1に特異的なCARと、CD123、ROR1、BCMA、PSMA、CD33、CD38、CD22、CD79aまたはb、CS1、CLL-1、HSP70、EGFRVIII、FLT3、WT1、CD30、CD70、MUC1、MUC16、MUC17、PRAME、TSPAN10、クローディン18.2、DLL3、LY6G6D、およびo-アセチル-GD2(OAcGD2)からなる群より選択される標的抗原の少なくとも1つに特異的なCARを含む。
【０５７７】
さらに好ましい態様では、前記操作された細胞は、HtrA1に特異的なCARと、CD123、CD38、CD22、CS1、CLL-1、HSP70、CD30、MUC1、およびo-アセチル-GD2(OAcGD2)からなる群より選択される標的抗原に特異的なCARを含む。
【０５７８】
別の態様によれば、前記CARは固形腫瘍抗原に対して向けられる。
【０５７９】
上記の様々な方法はCARを細胞に導入する工程を含む。非限定的な例として、前記CARは、1つのプラスミドベクターによってコードされる複数のトランスジーンとして導入することができる。前記プラスミドベクターはまた、前記ベクターを受け入れた細胞を特定および/または選択する選択マーカーも含有することができる。
【０５８０】
ポリペプチドは、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを細胞に導入した結果としてインサイチュで細胞において合成されてもよい。代わりに、前記ポリペプチドを細胞外で産生し、次いで、細胞に導入することができるかもしれない。ポリヌクレオチド構築物を細胞に導入するための方法は当技術分野において公知であり、非限定的な例として、ポリヌクレオチド構築物が細胞ゲノムに組み込まれる安定形質転換法、ポリヌクレオチド構築物が細胞ゲノムに組み込まれない一過的形質転換法、およびウイルスを介した方法を含む。前記ポリヌクレオチドは、例えば、組換えウイルスベクター(例えば、レトロウイルス、アデノウイルス)、リポソームなどによって細胞に導入されてもよい。例えば、一過的形質転換法には、例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションまたはパーティクルボンバードメントが含まれる。前記ポリヌクレオチドは細胞内で発現されることを考慮して、ベクター、さらに詳細にはプラスミドまたはウイルスに含まれてもよい。
【０５８１】
治療用途
開示される方法およびキットと共に使用することができる細胞は前のセクションに記載されている。前記処置は、WO2015142675(combo)またはWO2016201047に記載のように、癌、ウイルス感染、自己免疫性障害、または移植片対宿主病(GvHD)と診断された患者を処置するのに使用することができる。治療され得る癌には、血管形成していない腫瘍またはまだ大幅に血管形成していない腫瘍、ならびに血管形成した腫瘍が含まれる。癌は非固形腫瘍(例えば、血液腫瘍、例えば、白血病およびリンパ腫)を含んでもよく、固形腫瘍を含んでもよい。抗原特異的CARが付与された免疫細胞を用いて処置される癌のタイプには、癌腫、芽腫、および肉腫、ならびにある特定の白血病またはリンパ系腫瘍、良性腫瘍および悪性腫瘍、ならびに新生物、例えば、肉腫、癌腫、および黒色腫が含まれるが、これに限定されない。成人腫瘍/癌および小児腫瘍/癌も含まれる。
【０５８２】
処置
本発明による細胞または細胞集団の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸血、移植(implantation)、または移植(transplantation)を含む任意の便利なやり方で行うことができる。本明細書に記載の組成物は患者に皮下に、皮内に、腫瘍内に、結節内に、髄内に、筋肉内に、静脈内注射もしくはリンパ内注射によって、または腹腔内に投与されてもよい。一態様では、本発明の細胞組成物は好ましくは静脈内注射によって投与される。
【０５８３】
細胞または細胞集団の投与は、範囲内にある全ての整数値を含む、104〜109細胞/kg体重、好ましくは、105〜106細胞/kg体重の投与からなってもよい。細胞または細胞集団は1つまたは複数の用量で投与することができる。別の態様では、前記有効量の細胞が単一用量として投与される。別の態様では、前記有効量の細胞は、ある期間にわたって複数の用量として投与される。投与のタイミングは、管理を行っている医師によって判断され、患者の臨床状態に左右される。前記の細胞または細胞集団は、血液バンクまたはドナーなどの任意の供給源から得ることができる。個々のニーズは異なるが、特定の疾患または状態に対する特定の細胞タイプの有効量の最適範囲の決定は当技術分野の技術の範囲内にある。有効量とは、治療的利益または予防的利益をもたらす量を意味する。投与される投与量は、レシピエントの年齢、健康状態、および体重、併用処置がもしあれば、その種類、処置の頻度、ならびに望ましい効果がどういったものかに左右される。
【０５８４】
別の態様では、前記有効量の細胞またはこの細胞を含む組成物が非経口投与される。前記投与は静脈内投与でもよい。前記投与は腫瘍内注射によって直接行われてもよい。
【０５８５】
本発明によれば、レシピエントに注射される連続用量の数は2より多いか、または2に等しい。
【０５８６】
好ましい態様では、この数は2〜5である。前記の数は、処置しようとする主要のタイプに依存する。固形腫瘍ならびに再発性または難治性の癌の症例は、もっと多くの注射を必要とする場合がある。
【０５８７】
別の好ましい態様では、前記連続投与は45日ごとに行われる。
【０５８８】
別のさらに好ましい態様では、前記連続投与は14日ごとに行われる。
【０５８９】
一局面によれば、リンパ球枯渇されたレシピエントに連続注射用量が注射される本発明の方法が実施される。この任意のリンパ球枯渇工程は前記投与の前に行われる。免疫療法において日常的に行われる前記リンパ球枯渇は、1種類の薬物または組み合わされた複数種の薬物、例えば、アルキル化剤(例えば、シクロホスファミド…)、代謝拮抗物質、例えば、シクロホスファミド、メトトレキセート、またはプリン類似体(例えば、フルダラビン)、ピリミジン類似体(例えば、フルオロウラシル)またはタンパク質合成阻害剤の投与にある。細胞傷害性薬物、例えば、アザチオプリンまたは細胞傷害性抗生物質、例えば、ダクチノマイシン、アントラサイクリン、マイトマイシンCまたはブレオマイシン、ミトラマイシンも用いられてよい。好ましくは、リンパ球枯渇レジメンはフルダラビンおよびシクロホスファミドである。
【０５９０】
より好ましくは、リンパ球枯渇レジメンはフルダラビン30mg/m2/日IVと、シクロホスファミド750mg/m2/日IVである。
【０５９１】
さらにより好ましくは、リンパ球枯渇レジメンは、4日間のフルダラビン30mg/m2/日IVと、3日間のシクロホスファミド750mg/m2/日IVである。
【０５９２】
さらにより好ましくは、リンパ球枯渇レジメンは、4日間、-5日目〜-2日目に15〜30分にわたるフルダラビン30mg/m2/日IVと、3日間、-4日目〜-2日目に1時間にわたるシクロホスファミド750mg/m2/日IVである。
【０５９３】
その後に、用量漸増期は、4用量の、1.25×105細胞/kg〜5.05×106細胞/kgのUCARTを注射する工程からなった。
【０５９４】
最も好ましい態様の1つは、フルダラビン30mg/m2/日IVを4日間、-5日目〜-2日目に15〜30分にわたって投与し、シクロホスファミド750mg/m2/日IVを3日間、-4日目〜-2日目に1時間にわたって投与し、その後に、2用量の1.25×104細胞/kg〜5.05×107細胞/kgのUCARTを注射する工程を含む。
【０５９５】
最も好ましい態様の1つは、フルダラビン30mg/m2/日IVを4日間、-5日目〜-2日目に15〜30分にわたって投与し、シクロホスファミド750mg/m2/日IVを3日間、-4日目〜-2日目に1時間にわたって投与し、その後に、2用量の1.25×105細胞/kg〜5.05×106細胞/kgのUCARTを注射する工程を含む。
【０５９６】
最も好ましい態様の1つは、フルダラビン30mg/m2/日IVを4日間、-5日目〜-2日目に15〜30分にわたって投与し、シクロホスファミド750mg/m2/日IVを3日間、-4日目〜-2日目に1時間にわたって投与し、その後に、2用量の1.25×105細胞/kg〜5.05×106細胞/kgのUCART123を注射する工程を含む。
【０５９７】
本発明のある特定の態様では、細胞は、MS患者の場合は、薬剤を用いた処置、例えば、抗ウイルス療法、シドホビルおよびインターロイキン-2、シタラビン(ARA-Cとも知られる)、もしくはナタリズマブ処置、または乾癬患者の場合はエファリズマブ処置、またはPML患者の場合は他の処置を含むが、これに限定されない任意の数の関連する治療モダリティーと一緒に(例えば、これの前に、これと同時に、またはこれの後に)患者に投与される。さらなる態様では、本発明のT細胞は、化学療法、放射線、免疫抑制剤、例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキセート、ミコフェノール酸、およびFK506、抗体、または他の免疫除去(immunoablative)剤、例えば、キャンパス、抗CD3抗体または他の抗体療法、サイトキシン(cytoxin)、フルダラビン、シクロスポリン、FK506、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、FR901228、サイトカイン、および放射線照射と併用されてもよい。これらの薬物はカルシウム依存性ホスファターゼカルシニューリンを阻害するか(シクロスポリンおよびFK506)、または増殖因子誘導性シグナル伝達に重要なp70S6キナーゼを阻害する(ラパマイシン)(Henderson, Naya et al. 1991; Liu, Albers et al. 1992; Bierer, Hollander et al. 1993)。さらなる態様では、本発明の細胞組成物は、骨髄移植、化学療法剤、例えば、フルダラビン、外部ビーム放射線療法(XRT)、シクロホスファミド、または抗体、例えば、OKT3もしくはキャンパスのいずれかを用いたT細胞除去療法と一緒に(例えば、これの前に、これと同時に、またはこれの後に)患者に投与される。別の態様では、本発明の細胞組成物は、B細胞除去療法、例えば、CD20と反応する薬剤、例えば、リツキサンの後に投与される。例えば、一態様では、対象は、高用量化学療法を用いた標準的な処置の後に末梢血幹細胞移植を受けてもよい。ある特定の態様では、移植後に、対象は、増大された本発明の免疫細胞が注入される。さらなる態様では、増大された細胞は外科手術の前または後に投与される。
【０５９８】
本発明のキット
前記用量を調製する方法、例えば、前記の方法に従って入手可能な連続用量のキットも提供される。
【０５９９】
別の局面では、本発明は、既往反応および移植片対宿主病のリスクが低い、患者に連続注射される異なる同種異系末梢血細胞(移植片)を含む、少なくとも2種類、好ましくは少なくとも3種類、より好ましくは少なくとも4種類、さらにより好ましくは少なくとも5種類の組成物を含むキットを提供し、ここで前記同種異系末梢血細胞は、それぞれ、HLA-A、HLA-B、HLA-DRアレルについてホモ接合性であり、前記ドナーが共通してHLA-A、HLA-B、HLA-DRアレルを共有しないドナーから選択される。
【０６００】
さらに別の局面では、本発明は、同種異系ヒト末梢血細胞組成物のキットであって、
（a）少なくとも、患者の免疫原性抗原にぴったりとマッチする移植片を含む第1の末梢血細胞組成物(マッチする組成物)、
（b）少なくとも、前記患者の免疫原性抗原にマッチしない移植片を含むその後の末梢血細胞組成物(ミスマッチのある組成物)
を含む、キットを提供する。
【０６０１】
さらに別の局面では、本発明は、同種異系ヒト末梢血細胞組成物のキットであって、
（a）少なくとも、患者の免疫原性抗原にマッチしない移植片を含む第1の末梢血細胞組成物(第1のミスマッチのある組成物)、
（b）患者の免疫原性抗原にマッチせず(第2のミスマッチのある組成物)、かつ第1のミスマッチのある組成物にマッチしない移植片を含む、その後の末梢血細胞組成物
を含む、キットを提供する。
【０６０２】
好ましい態様では、前記末梢血細胞はT細胞である。
【０６０３】
好ましい態様では、前記末梢血細胞、好ましくは、T細胞は、HLAミスマッチを増やす少なくとも1種類の免疫原性抗原を不活化するように遺伝子操作されている。
【０６０４】
好ましい態様では、前記末梢血細胞、好ましくはT細胞には、例えば、以前に示されたようなキメラ受容体抗原(CAR)が付与されている。
【０６０５】
好ましい態様では、前記CARは固形腫瘍抗原に対して向けられる。
【０６０６】
好ましい態様では、前記T細胞は、TCR受容体を不活化するように遺伝子操作されている。
【０６０７】
好ましい態様では、不活化の工程は特異的レアカットを用いることによって行われる。さらに好ましい態様では、前記エンドヌクレアーゼはTALE-ヌクレアーゼまたはCRISPR/Casヌクレアーゼである。
【０６０８】
別の好ましい態様では、不活化の工程は、相同組換えを介した遺伝子ターゲティングによって行われる。
【０６０９】
好ましい態様では、受け取るレシピエントに密接に関連する移植片は、HLA-A、HLA-B、およびHLA-DRアレルのうちの1つにおいてシングルホモ接合体である。
【０６１０】
さらに好ましい態様では、受け取るレシピエントに密接に関連する移植片は、HLA-A、HLA-B、およびHLA-DR遺伝子のうちの2つにおいてダブルホモ接合体である。
【０６１１】
さらにより好ましい態様では、受け取るレシピエントに密接に関連する移植片は、HLA-A、HLA-B、およびHLA-DR遺伝子においてトリプルホモ接合体である。
【０６１２】
好ましい態様では、前記連続投与は45日ごとに行われる。
【０６１３】
好ましい態様では、リンパ球枯渇の工程は前記投与前に行われる。前記リンパ球枯渇は、少なくとも1種類の免疫抑制薬(単独で、または組み合わせて)、例えば、前記で示された免疫抑制薬を投与することによって行われる。
【０６１４】
好ましい態様では、前記移植片の数は2〜5である。
【０６１５】
好ましい態様では、前記キットは免疫療法において用いられる。
【０６１６】
さらに好ましい態様では、前記キットは腫瘍の処置において用いられる。
【０６１７】
さらにより好ましい態様では、前記キットは、固形腫瘍および/または難治性もしくは再発性の癌の処置において用いられる。
【０６１８】
さらなる局面では、本発明は、キット、例えば、前記で示されたキットに含まれる同種異系末梢血細胞(移植片)を含む前記組成物を連続注射することによって、処置を必要とする患者を処置するための方法に関する。
【０６１９】
好ましい態様では、少なくとも2つの、かつ5つまでの前記組成物が患者に連続して注射される。
【０６２０】
好ましい態様では、2回の注射の間隔は少なくとも45日である。
【０６２１】
好ましい態様では、患者の血清は、注射しようとする前記組成物の次のもののハプロタイプに属するHLA-A、HLA-B、HLA-DRアレルによってコードされる免疫原性ポリペプチドに対して作られた抗体についてアッセイされる。
【０６２２】
ポリヌクレオチド、ベクター：
本発明はまた、本発明による上記のCARをコードするポリヌクレオチド、ベクターにも関する。
【０６２３】
前記ポリヌクレオチドは、発現カセットまたは発現ベクター(例えば、細菌宿主細胞に導入するためのプラスミド、または昆虫宿主細胞をトランスフェクトするためのウイルスベクター、例えば、バキュロウイルスベクター、またはプラスミドまたはウイルスベクター、例えば、哺乳動物宿主細胞をトランスフェクトするためのレンチウイルス)にあってもよい。
【０６２４】
あるポリヌクレオチドまたはベクターには、リボソームスキップ配列をコードする核酸配列、例えば、2Aペプチドをコードする配列を含む様々な核酸配列を含めることができる。ピコルナウイルスのアフトウイルスサブグループにおいて特定された2Aペプチドは、あるコドンと次のコドンによってコードされる2つのアミノ酸間でペプチド結合を形成せずに、あるコドンから次のコドンへのリボソーム「スキップ(skip)」を引き起こす((Donnelly and Elliott 2001; Atkins, Wills et al. 2007; Doronina, Wu et al. 2008)を参照されたい)。「コドン」とは、あるアミノ酸残基にリボソームによって翻訳される、mRNAの(またはDNA分子のセンス鎖上にある)3つのヌクレオチドを意味する。従って、2つのポリペプチドはインフレームの2Aオリゴペプチド配列によって隔てられている時に、mRNA内にある1つの連続したオープンリーディングフレームから合成することができる。このようなリボソームスキップ機構は当技術分野において周知であり、1本のメッセンジャーRNAによってコードされる数種類のタンパク質を発現させるために数種類のベクターによって用いられることが知られている。
【０６２５】
膜貫通ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に向けるために、ポリヌクレオチド配列またはベクター配列の中に分泌シグナル配列(リーダー配列、プレプロ配列、またはプレ配列とも知られる)が設けられる。分泌シグナル配列は膜貫通核酸配列に機能的に連結される。すなわち、2つの配列は正しい読み枠で連結され、新たに合成されたポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に向けるように配置される。分泌シグナル配列は概して、関心対象のポリペプチドをコードする核酸配列の5'側に配置されるが、ある特定の分泌シグナル配列は、関心対象の核酸配列の他の場所に配置されてもよい(例えば、Welch et al.,米国特許第5,037,743号; Holland et al.,米国特許第5,143,830号を参照されたい)。
【０６２６】
当業者は、遺伝暗号の縮重を考慮して、これらのポリヌクレオチド分子間で、かなりの配列のばらつきが起こり得ると認識する。好ましくは、本発明の核酸配列は、哺乳動物細胞において発現するように、好ましくは、ヒト細胞において発現するようにコドン最適化されている。コドン最適化とは、ある特定の種の高発現遺伝子において概してまれな、コドンの関心対象の配列を、このような種の高発現遺伝子において概してよくあるコドンと交換することを指し、このようなコドンは、交換されるコドンとしてアミノ酸をコードする。
【０６２７】
免疫細胞の活性化および増大
T細胞などの免疫細胞の遺伝子組換えの前でも後でも、本発明の遺伝子組換えされた免疫細胞が抗原結合機構とは独立して活性化および増殖されるが、本発明の免疫細胞、特にT細胞は、概して、例えば、米国特許第6,352,694号;同第6,534,055号;同第6,905,680号;同第6,692,964号;同第5,858,358号;同第6,887,466号;同第6,905,681号;同第7,144,575号;同第7,067,318号;同第7,172,869号;同第7,232,566号;同第7,175,843号;同第5,883,223号;同第6,905,874号;同第6,797,514号;同第6,867,041号;および米国特許出願公開第20060121005号に記載の方法を用いてさらに活性化および増大することができる。T細胞をインビトロまたはインビボで増大することができる。
【０６２８】
概して、本発明のT細胞は、T細胞に対する活性化シグナルを発生するために、CD3 TCR複合体を刺激する薬剤およびT細胞表面にある補助刺激分子と接触することによって増大される。例えば、カルシウムイオノフォアA23187、ホルボール12-ミリステート13-アセテート(PMA)、またはフィトヘマグルチニン(PHA)のような分裂促進性レクチンなどの化学物質を用いてT細胞に対する活性化シグナルを発生することができる。
【０６２９】
非限定的な例として、T細胞集団は、インビトロで、例えば、抗CD3抗体、またはその抗原結合断片、もしくは表面に固定化された抗CD2抗体と接触させることによって刺激されてもよく、カルシウムイオノフォアと一緒にプロテインキナーゼCアクチベーター(例えば、ブリオスタチン)と接触させることによって刺激されてもよい。T細胞の表面にあるアクセサリー分子を同時刺激するために、アクセサリー分子に結合するリガンドが用いられる。例えば、T細胞の増殖を刺激するのに適した条件下で、T細胞集団を抗CD3抗体および抗CD28抗体と接触させることができる。T細胞培養に適した条件には、血清(例えば、ウシまたはヒトの胎児血清)、インターロイキン-2(IL-2)、インシュリン、IFN-g、1L-4、1L-7、GM-CSF、-10、-2、1L-15、TGFp、およびTNF-、または当業者に公知の細胞増殖のための他の任意の添加物を含む、増殖および生存に必要な因子を含有することがある適切な培地(例えば、最小必須培地またはRPMI培地1640または、X-vivo5、(Lonza))が含まれる。細胞増殖のための他の添加物には、界面活性剤、プラズマネート(plasmanate)、および還元剤、例えば、N-アセチル-システインおよび2-メルカプトエタノールが含まれるが、これに限定されない。培地には、無血清の、あるいは適量の血清(または血漿)もしくは規定された一組のホルモン、ならびに/またはT細胞の増殖および増大に十分な量のサイトカインを加えた、添加されたアミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、およびビタミンを含む、RPMI1640、A1M-V、DMEM、MEM、a-MEM、F-12、X-Vivo1、およびX-Vivo20、Optimizerが含まれ得る。抗生物質、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンは実験培養でしか含まれず、対象に注入される細胞の培養には含まれない。標的細胞は、増殖を支持するのに必要な条件下で、例えば、適切な温度(例えば、37℃)および雰囲気(例えば、空気+5％C02)で維持される。様々な刺激時間に曝露されたT細胞は異なる特徴を示すことがある。
【０６３０】
前記細胞は組織または細胞と共培養することによって増大することができる。前記細胞はまた、インビボで、例えば、対象に投与された後に対象の血液中で増大することもできる。
【０６３１】
他の定義
適応免疫応答または適応免疫は、免疫記憶の発生を含む、抗原に対する抗原特異的リンパ球の応答である。
【０６３２】
アジュバント
アジュバントは、アジュバントと混合されている抗原に対する免疫応答を強化する任意の物質である。
【０６３３】
親和性
1つの部位における、ある分子と別の分子との結合の強度
【０６３４】
既往反応
既往反応は、以前に対象が一次免疫応答を生じたことがある抗原が導入された後、血中に抗体が急速に再出現することである。
【０６３５】
抗体
抗体とは、特定の物質-抗原に特異的に結合するタンパク質である。各抗体分子は、その対応する抗原に特異的に結合することを可能にするユニークな構造を有するが、全ての抗体が同じ全体構造を有し、免疫グロブリンまたはIgと総称される。抗体は感染または免疫化に応答して形質細胞によって産生され、病原体に結合し、それを中和するか、または取り込んで、食細胞が破壊するために病原体を準備する。
【０６３６】
抗体、定常領域
アミノ酸配列において比較的安定している分子部分
【０６３７】
抗体、可変領域
分子の抗原結合部位および最も変わりやすい分子部分
【０６３８】
抗原
抗原とは、抗体に特異的に結合することができる任意の分子である。この名前は、抗体を生じる能力から来ている。しかしながら、抗原の中には、それ自身では抗体産生を誘発しないものもある。抗体産生を誘導することができる抗原は免疫原と呼ばれる。
【０６３９】
ポリペプチド配列中のアミノ酸残基は本明細書では一文字表記に従って指定される。例えば、QはGlnまたはグルタミン残基を意味し、RはArgまたはアルギニン残基を意味し、DはAspまたはアスパラギン酸残基を意味する。
【０６４０】
アミノ酸置換とは、あるアミノ酸残基と別のアミノ酸残基を交換することを意味し、例えば、ペプチド配列中でのアルギニン残基とグルタミン残基の交換はアミノ酸置換である。
【０６４１】
ヌクレオチドは以下の通りに命名される。すなわち、一文字表記はヌクレオシドの塩基を指定するのに用いられる。aはアデニンであり、tはチミンであり、cはシトシンであり、gはグアニンである。縮重(degenerated)ヌクレオチドの場合、rはgまたはa(プリンヌクレオチド)を表し、kはgまたはtを表し、sはgまたはcを表し、wはaまたはtを表し、mはaまたはcを表し、yはtまたはc(ピリミジンヌクレオチド)を表し、dはg、a、またはtを表し、vはg、a、またはcを表し、bはg、t、またはcを表し、hはa、t、またはcを表し、nはg、a、t、またはcを表す。
【０６４２】
本明細書で使用する「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチドおよび/またはポリヌクレオチド、例えば、デオキシリボ核酸(DNA)またはリボ核酸(RNA)、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって生じた断片、ならびに連結、切断、エンドヌクレアーゼ作用、およびエキソヌクレアーゼ作用のいずれかによって生じた断片を指す。核酸分子は、天然ヌクレオチド(例えば、DNAおよびRNA)の単量体、または天然ヌクレオチドの類似体(例えば、天然ヌクレオチドのエナンチオマー型)、またはその両方の組み合わせで構成されてもよい。修飾されたヌクレオチドは糖部分および/またはピリミジンもしくはプリン塩基部分に変化を有することがある。糖修飾には、例えば、1つまたは複数のヒドロキシル基とハロゲン、アルキル基、アミン、およびアジド基との交換が含まれるか、または糖にエーテルもしくはエステルで官能基を持たせることができる。さらに、糖部分全体を、立体的および電子工学的に類似する構造、例えば、アザ-糖および炭素環式糖類似体と交換することができる。塩基部分における修飾の例には、アルキル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンもしくはピリミジン、または他の周知の複素環式置換基が含まれる。核酸単量体はホスホジエステル結合またはこのような結合の類似体によって連結することができる。核酸は一本鎖でもよく二本鎖でもよい。
【０６４３】
キメラ抗原受容体(CAR)は、特異的な抗標的細胞免疫活性を示すキメラタンパク質を作製するために、標的細胞に存在する成分に対する結合ドメイン、例えば、望ましい抗原(例えば、腫瘍抗原)に対する抗体ベース特異性と、T細胞受容体活性化細胞内ドメインを組み合わせた分子と意図される。概して、CARは、T細胞抗原受容体複合体ζ鎖(scFvFc:ζ)の細胞内シグナル伝達ドメインと融合した細胞外単鎖抗体(scFvFc)からなり、T細胞において発現された時に、モノクローナル抗体の特異性に基づいて抗原認識をリダイレクトする能力を有する。CARは、時として、WO2014039523に記載のように複数の膜貫通ポリペプチド(多鎖CAR)を含むことがある。本発明において用いられるCARの一例は、5T4抗原に対するCARであり、非限定的な例としてアミノ酸配列:SEQ ID NO:19〜42を含んでもよい。
【０６４４】
「エンドヌクレアーゼ」という用語は、DNA分子またはRNA分子、好ましくは、DNA分子の中にある核酸間の結合の加水分解(切断)を触媒することができる任意の野生型または変種酵素を指す。エンドヌクレアーゼは配列に関係なくDNA分子またはRNA分子を切断しないが、DNA分子またはRNA分子の特定のポリヌクレオチド配列を認識および切断する。この特定のポリヌクレオチド配列は、さらに「標的配列」または「標的部位」と呼ばれる。エンドヌクレアーゼは、典型的には、長さが12塩基対(bp)より長い、より好ましくは14〜55bpのポリヌクレオチド認識部位を有する時にレアカットエンドヌクレアーゼとして分類することができる。レアカットエンドヌクレアーゼは、規定された遺伝子座においてDNA二本鎖切断(DSB)を誘導することによってHRを大幅に増やす(Perrin, Buckle et al. 1993; Rouet, Smih et al. 1994; Choulika, Perrin et al. 1995; Pingoud and Silva 2007)。レアカットエンドヌクレアーゼは、例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼ(Paques and Duchateau 2007)、操作されたジンクフィンガードメインと、制限酵素、例えば、FokI(Porteus and Carroll 2005)の触媒ドメインとの融合に起因するキメラジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、CRISPR系に由来するCas9エンドヌクレアーゼ(Gasiunas, Barrangou et al. 2012; Jinek, Chylinski et al. 2012; Cong, Ran et al. 2013; Mali, Yang et al. 2013)、または化学エンドヌクレアーゼ (Eisenschmidt, Lanio et al. 2005; Arimondo, Thomas et al. 2006)でもよい。化学エンドヌクレアーゼでは、化学的切断因子またはペプチド切断因子が核酸ポリマーまたは特定の標的配列を認識する別のDNAに結合体化され、それによって、切断活性が特定の配列にターゲティングされる。化学エンドヌクレアーゼはまた、オルトフェンナントロリン(orthophenanthroline)、DNA切断分子、および特定のDNA配列に結合することが知られている三重鎖形成オリゴヌクレオチド(TFO)の合成ヌクレアーゼ様結合体も含む(Kalish and Glazer 2005)。このような化学エンドヌクレアーゼは、本発明による「エンドヌクレアーゼ」という用語に含まれる。
【０６４５】
「TALE-ヌクレアーゼ」(TALEN)は、典型的には転写活性化因子様エフェクター(TALE)に由来する核酸結合ドメインと、核酸標的配列を切断する1ヌクレアーゼ触媒ドメインからなる融合タンパク質と意図される。触媒ドメインは、好ましくはヌクレアーゼドメインであり、より好ましくはエンドヌクレアーゼ活性を有するドメイン、例えば、I-TevI、ColE7、NucA、およびFok-Iである。特定の態様では、TALEドメインはメガヌクレアーゼ、例えば、I-CreIおよびI-OnuIまたはその機能的変種と融合することができる。さらに好ましい態様では、前記ヌクレアーゼは単量体TALE-ヌクレアーゼである。単量体TALE-ヌクレアーゼは、特異的な認識および切断のために二量体化を必要としないTALE-ヌクレアーゼ、例えば、操作されたTAL反復と、WO2012138927に記載のI-TevIの触媒ドメインとの融合である。転写活性化因子様エフェクター(TALE)は、複数の反復配列を含む、細菌種ザントモナス属(Xanthomonas)に由来するタンパク質であり、それぞれの反復は、位置12および13に、核酸標的配列のそれぞれのヌクレオチド塩基に特異的な二残基(RVD)を含む。同様のモジュラー塩基対塩基核酸結合特性(MBBBD)を有する結合ドメインはまた、出願人が異なる細菌種において最近発見した新たなモジュラータンパク質からも得ることができる。この新たなモジュラータンパク質には、TAL反復よりも大きな配列可変性を示すという利点がある。好ましくは、異なるヌクレオチドの認識に関連するRVDは、Cを認識する場合はHD、Tを認識する場合はNG、Aを認識する場合はNI、GまたはAを認識する場合はNN、A、C、G、もしくはTを認識する場合はNS、Tを認識する場合はHG、Tを認識する場合はIG、Gを認識する場合はNK、Cを認識する場合はHA、Cを認識する場合はND、Cを認識する場合はHI、Gを認識する場合はHN、Gを認識する場合はNA、GまたはAを認識する場合はSNおよびTを認識する場合はYG、Aを認識する場合はTL、AまたはGを認識する場合はVT、ならびにAを認識する場合はSWである。別の態様では、ヌクレオチドA、T、C、およびGに対する特異性を調節するために、特に、この特異性を強化するために、重要なアミノ酸12および13を他のアミノ酸残基に変異させることができる。TALE-ヌクレアーゼは既に説明されており、遺伝子ターゲティングおよび遺伝子改変を刺激するのに用いられている(Boch, Scholze et al. 2009; Moscou and Bogdanove 2009; Christian, Cermak et al. 2010; Li, Huang et al. 2011)。オーダーメイドの TAL-ヌクレアーゼが商品名TALEN(商標)で市販されている(Cellectis, 8 rue de la Croix Jarry, 75013 Paris, France)。
【０６４６】
本発明によるレアカットエンドヌクレアーゼはまたCas9エンドヌクレアーゼでもよい。最近、II型原核生物CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short palindromic Repeats)適応免疫系に由来するRNAガイドCas9ヌクレアーゼ(Gasiunas, Barrangou et al. 2012; Jinek, Chylinski et al. 2012; Cong, Ran et al. 2013; Mali, Yang et al. 2013)に基づいて新たなゲノム操作ツールが開発された(総説については(Sorek, Lawrence et al. 2013)を参照されたい)。CRISPR関連 (Cas)系は細菌において最初に発見され、ウイルスまたはプラスミドのいずれかの外来DNAに対する防御として機能する。CRISPRを介したゲノム操作は、最初に、プロトスペーサー隣接モチーフ(proto-spacer adjacent motif)(PAM)と呼ばれる短い配列モチーフが隣接することが多い標的配列を選択することによって進行する。標的配列を選択した後に、この標的配列に相補的な特定のcrRNAを操作する。CRISPR II型系において必要とされるトランス活性化crRNA(tracrRNA)はcrRNAと対になり、提供されたCas9タンパク質に結合した。Cas9は、tracRNAとcRNA(Deltcheva, Chylinski et al. 2011)との塩基対合を容易にする分子アンカーとして働く。この三元複合体において、二重tracrRNA：crRNA構造は、エンドヌクレアーゼCas9をコグネイト標的配列に向けるガイドRNAとして働く。Cas9-tracrRNA:crRNA複合体による標的認識は、標的配列とcrRNAとの間に相同性があるかどうか標的配列をスキャンすることによって開始する。標的配列-crRNA相補性に加えて、DNAターゲティングには、プロトスペーサー(プロトスペーサー隣接モチーフ-PAM)に隣接する短いモチーフの存在が必要である。二重-RNAと標的配列との間に対形成が生じた後、それに続いて、Cas9は、PAMモチーフの3塩基上流に平滑末端(blunt)の二本鎖切断を導入する(Garneau, Dupuis et al. 2010)。
【０６４７】
レアカットエンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼの名前でも知られているホーミングエンドヌクレアーゼでもよい。このようなホーミングエンドヌクレアーゼは当技術分野において周知である(Stoddard 2005)。ホーミングエンドヌクレアーゼはDNA標的配列を認識し、一本鎖切断または二本鎖切断を生じる。ホーミングエンドヌクレアーゼは高度に特異的であり、長さが12〜45塩基対(bp)、通常、長さが14〜40bpのDNA標的部位を認識する。本発明によるホーミングエンドヌクレアーゼは、例えば、LAGLIDADGエンドヌクレアーゼに対応してもよく、HNHエンドヌクレアーゼに対応してもよく、GIY-YIGエンドヌクレアーゼに対応してもよい。本発明による好ましいホーミングエンドヌクレアーゼはI-CreI変種でもよい。
【０６４８】
「送達ベクター」は、本発明において必要とされる薬剤/化学物質および分子(タンパク質または核酸)を細胞と接触させる(put into cell contact)(すなわち、「接触させる(contacting)」)か、または細胞もしくは細胞下区画の内部に送達する(すなわち、「導入する」)ために本発明において使用することができる任意の送達ベクターだと意図される。これには、リポソーム送達ベクター、ウイルス送達ベクター、薬物送達ベクター、化学担体、ポリマー担体、リポプレックス、ポリプレックス、デンドリマー、マイクロバブル(超音波造影剤)、ナノ粒子、エマルジョン、または他の適切なトランスファーベクターが含まれるが、これに限定されない。これらの送達ベクターは、分子、化学物質、高分子(遺伝子、タンパク質)、または他のベクター、例えば、プラスミド、Diatosによって開発されたペプチドの送達を可能にする。これらの場合、送達ベクターは分子担体である。「送達ベクター」はまたトランスフェクションを行うための送達方法だと意図される。
【０６４９】
「ベクター」という用語は、連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。本発明における「ベクター」には、ウイルスベクター、プラスミド、RNAベクター、または染色体核酸、非染色体核酸、半合成核酸、もしくは合成核酸からなってもよい直鎖もしくは環状のDNA分子もしくはRNA分子が含まれるが、これに限定されない。好ましいベクターは、自己複製可能なベクター(エピソームベクター)および/または連結された核酸の発現が可能なベクター(発現ベクター)である。多数の適切なベクターが当業者に公知であり、市販されている。
【０６５０】
ウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス(例えば、アデノ随伴ウイルス)、コロナウイルス、マイナス鎖RNAウイルス、例えば、オルトミクソウイルス(例えば、インフルエンザウイルス)、ラブドウイルス(例えば、狂犬病ウイルスおよび水疱性口内炎ウイルス)、パラミクソウイルス(例えば、麻疹およびセンダイ)、プラス鎖RNAウイルス、例えば、ピコルナウイルスおよびアルファウイルス、ならびにアデノウイルス、ヘルペスウイルス(例えば、単純ヘルペスウイルス1型および2型、エプスタイン-バーウイルス、サイトメガロウイルス)、ならびにポックスウイルス(例えば、ワクシニア、鶏痘、およびカナリアポックス)を含む二本鎖DNAウイルスが含まれる。他のウイルスには、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルス、および肝炎ウイルスが含まれる。レトロウイルスの例には、トリ白血病肉腫ウイルス、哺乳動物C型、B型ウイルス、D型ウイルス、HTLV-BLV群、レンチウイルス、スプーマウイルスが含まれる(Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, In Fundamental Virology, Third Edition, B. N. Fields, et al., Eds., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996)。
【０６５１】
「レンチウイルスベクター」とは、パッケージング能力が比較的大きく、免疫原性が低く、広範囲の異なる細胞タイプを高効率で安定に形質導入する能力があるために遺伝子送達に極めて有望な、HIVベースのレンチウイルスベクターを意味する。レンチウイルスベクターは、通常、3種類(パッケージング、エンベロープ、およびトランスファー)の、またはそれより多いプラスミドでプロデューサー細胞(producer cell)を一過的にトランスフェクトした後に作製される。HIVのように、レンチウイルスベクターはウイルス表面糖タンパク質と細胞表面にある受容体との相互作用を介して標的細胞に侵入する。侵入すると、ウイルスRNAは逆転写される。逆転写はウイルス逆転写酵素複合体によって媒介される。逆転写産物は、感染細胞のDNAにおけるウイルス組込みの基質である二本鎖直鎖ウイルスDNAである。「組込み型レンチウイルスベクター(integrative lentiviral vector)(またはLV)」とは、非限定的な意味として、標的細胞ゲノムを組込むことができる、このようなベクターを意味する。反対に、「非組込み型レンチウイルスベクター(non-integrative lentiviral vector)(またはNILV)」とは、ウイルスインテグラーゼの働きで標的細胞ゲノムを組込まない効率的な遺伝子送達ベクターを意味する。
【０６５２】
送達ベクターおよびベクターは、任意の細胞透過処理技法、例えば、ソノポレーションまたはエレクトロポレーションまたはこれらの技法の派生物と関連付けられてもよく、組み合わせられてもよい。
【０６５３】
細胞とは、インビトロ培養のための、任意の真核生物の生細胞、これらの生物に由来する初代細胞および細胞株が意図される。
【０６５４】
「初代細胞」は、ごくわずかな集団倍加しか経ておらず、従って、連続的な腫瘍形成性の、または人工的に不死化された細胞株と比較して、初代細胞の元となった組織の主要な機能的成分および特徴をよく表している、生体組織(すなわち、生検材料)から直接採取され、インビトロ増殖のために樹立された細胞と意図される。
【０６５５】
これらの細胞株は全て、関心対象の遺伝子またはタンパク質を産生、発現、定量、検出、研究する目的で細胞株モデルを提供するために本発明の前記方法によって改変することができる。これらのモデルはまた、研究および生産において、ならびに非限定的な例として化学物質、バイオ燃料、治療学、および農学などの様々な分野において関心対象の生物学的に活性な分子をスクリーニングするのに使用することもできる。
【０６５６】
「変異」は、ポリヌクレオチド(cDNA、遺伝子)配列中またはポリペプチド配列中での1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、20個、25個、30個、40個、50個まで、またはそれより多くのヌクレオチド/アミノ酸の置換、欠失、挿入と意図される。変異は遺伝子のコード配列またはその制御配列に影響を及ぼすことがある。変異はまた、ゲノム配列の構造またはコードされているmRNAの構造/安定性にも影響を及ぼすことがある。
【０６５７】
「変種」は、親分子のアミノ酸配列中にある少なくとも1つの残基の変異または交換によって得られた、反復変種、変種、DNA結合変種、TALE-ヌクレアーゼ変種、ポリペプチド変種だと意図される。
【０６５８】
「機能的変種」は、タンパク質またはタンパク質ドメインの触媒活性のある変異体だと意図される。このような変異体は、その親タンパク質もしくはタンパク質ドメインと比較して同じ活性を有してもよく、さらなる特性、またはさらに高いもしくは低い活性を有してもよい。
【０６５９】
「同一性」とは、2つの核酸分子間または2つのポリペプチド間の配列同一性を指す。同一性は、比較目的で並べられ得る各配列中の位置を比較することによって決定することができる。比較された配列中での位置が同じ塩基によって占められれば、これらの分子はその位置で同一である。核酸配列間またはアミノ酸配列間の類似性または同一性の程度は、核酸配列が共有する位置において同一のヌクレオチドまたはマッチするヌクレオチドの数の関数である。2つの配列間の同一性を算出するのに、FASTA、またはGCG配列解析パッケージ(University of Wisconsin, Madison, Wis.)の一部として利用可能なBLASTを含む様々なアラインメントアルゴリズムおよび/またはプログラムが用いられることがあり、例えば、デフォルト設定を用いて使用することができる。例えば、本明細書に記載の特定のポリペプチドに対して少なくとも70％、85％、90％、95％、98％または99％同一性を有し、好ましくは、実質的に同じ機能を示すポリペプチド、ならびにこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが意図される。特別の定めのない限り、類似性スコアはBLOSUM62の使用に基づいている。BLASTPが用いられる場合、パーセント類似性はBLASTPポジティブスコアに基づいており、パーセント配列同一性はBLASTP同一性スコアに基づいている。BLASTP「同一性」は、高スコアリング配列ペアにおいて同一の全残基の数および割合を示す。BLASTP「ポジティブ」とは、アラインメントスコアが正の値を有し、互いに類似している残基の数および割合を示す。本明細書において開示されるアミノ酸配列に対して、これらの程度の同一性または類似性または任意の中間の程度の同一性または類似性を有するアミノ酸配列が意図され、本開示に含まれる。類似するポリペプチドのポリヌクレオチド配列が遺伝暗号を用いて推定され、従来手段によって、特に、遺伝暗号を用いて、そのアミノ酸配列を逆翻訳することによって得られることがある。
【０６６０】
「シグナル伝達ドメイン」または「補助刺激リガンド」とは、T細胞上のコグネイト補助刺激分子に特異的に結合し、それによって、例えば、TCR/CD3複合体と、ペプチドが装填されたMHC分子が結合することで生じる一次シグナルに加えて、増殖活性化、分化などを含むが、これに限定されないT細胞応答を媒介するシグナルを生じる、抗原提示細胞上の分子を指す。補助刺激リガンドには、CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、誘導性補助刺激リガンド(inducible costimulatory ligand)(ICOS-L)、細胞間接着分子(ICAM、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、M1CB、HVEM、リンホトキシンβ受容体、3/TR6、ILT3、ILT4、Tollリガンド受容体に結合するアゴニストまたは抗体、およびB7-H3に特異的に結合するリガンドが含まれ得るが、これに限定されない。補助刺激リガンドはまた、特に、CD27、CD28、4-IBB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LTGHT、NKG2C、B7-H3、CD83に特異的に結合するリガンドなどがあるが、これに限定されない、T細胞に存在する補助刺激分子に特異的に結合する抗体も含む。好ましい補助刺激ドメインには、4-1BBなどのTCRの補助刺激ドメインおよび/またはMHC分子に由来する補助刺激ドメイン(結合によって細胞が活性化される)が含まれる。
【０６６１】
「補助刺激分子」とは、補助刺激リガンドに特異的に結合し、それによって、増殖などがあるが、これに限定されない、T細胞による補助刺激応答を媒介する、T細胞上にあるコグネイト結合パートナーを指す。補助刺激分子には、MHCクラスI分子、BTLA、およびTollリガンド受容体が含まれるが、これに限定されない。
【０６６２】
本明細書で使用する「補助刺激シグナル」とは、TCR/CD3連結などの一次シグナルと組み合わされると、T細胞増殖および/または重要な分子のアップレギュレーションもしくはダウンレギュレーションにつながるシグナルを指す。
【０６６３】
本明細書で使用する「細胞外リガンド結合ドメイン」という用語は、リガンドに結合することができるオリゴペプチドまたはポリペプチドと定義される。好ましくは、前記ドメインは細胞表面分子と相互作用することができる。例えば、細胞外リガンド結合ドメインは、特定の疾患状態に関連する標的細胞上で細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するように選択されてもよい。従って、リガンドとして作用し得る細胞表面マーカーの例には、ウイルス、細菌、および寄生生物の感染、自己免疫疾患、ならびに癌細胞に関連する細胞表面マーカーが含まれる。
【０６６４】
本明細書で使用する「対象」または「患者」という用語は、非ヒト霊長類およびヒトを含む動物界の全てのメンバーを含む。
【０６６５】
上記の書面での本発明の説明は、当業者が本発明と同じものを作製および使用できるように、本発明を作製および使用するやり方およびプロセスを提供し、この実施可能性は、特に、原文の一部を構成する、最後にある特許請求の範囲の主題に向けて提供される。
【０６６６】
数値の限界または範囲が本明細書において述べられている場合、終点が含まれる。数値の限界または範囲の中にある全ての値および部分範囲も、明瞭に書かれているように明確に含まれる。
【０６６７】
上記の説明は、当業者が本発明を作製および使用できるようにするために示され、特定の応用例の状況およびその要件において提供される。好ましい態様に対する様々な変更が当業者に容易に明らかであり、本明細書において定義される一般原理が、本発明の精神および範囲から逸脱することなく他の態様および応用例に適用され得る。従って、本発明は、示された態様に限定されることが意図されないが、本明細書において開示される原理および特徴と一致する最も広い範囲が与えられる。
【０６６８】
本発明を大まかに説明したが、ある特定の実施例を参照することによって理解を深めることができる。実施例は例示のためだけに本明細書で示され、特に定めのない限り、限定することが意図されない。
【実施例】
【０６６９】
臨床試験のために患者一人一人について以下の判断基準が考慮される。
・  年齢
・  性別
・  血液型
・  身体サイズ
・  女性ドナーが妊娠した回数
・  自己免疫疾患の病歴
【０６７０】
既往反応の測定;
細胞療法から利益を得た患者の免疫応答は、通常、組織が移植された個体において観察される免疫応答よりも重要でない。本研究では、体液性応答および/またはT細胞応答の任意の部門(arm)、好ましくは、アロ抗体応答を測定することができる。
【０６７１】
ヒトでは、アロ抗体応答は、例えば、Hickey MJ, Valenzuela NM, Reed EF. Alloantibody Generation and Effector Function Following Sensitization to Human Leukocyte Antigen. Frontiers in Immunology. 2016;7:30. doi:10.3389/fimmu.2016.00030、および引用された参考文献34に記載のように測定することができる：
34.  Scornik JC, Meier-Kriesche HU. Blood transfusions in organ transplant patients: mechanisms of sensitization and implications for prevention. Am J Trancplant (2011) 11 (9): 1785-91. doi:10.1111/j.1600-6143.2011.03705.x。
【０６７２】
さらに、免疫細胞によるIL-4、IFN-γ、およびIL-17放出は、任意の古典的なヒトサイトカイン検出方法を用いて測定することができる。
【０６７３】
抗体産生、特に、IgG1およびIgG2の増加は、任意の公知の方法を用いて測定される。
【０６７４】
ヒトでは、既知の抗原に対するCTL応答は、第1の試料(または第2、第3、第4、および第5の試料)を注射した直後に循環細胞を使用し、フローサイトメトリーによって特異的四量体を用いてTCR発現を測定して検出することができる。
【０６７５】
使用データベース
使用データベースは、https://bioinformatics.bethematchclinical.org/HLA-Resources/Haplotype-Frequencies/A-B-DRB1-224-Haplotype-Frequenciesから自由に入手可能なNational Marrow Donor Program、別名「Be the Match」プログラムから入手したものである(Maiers, M., Gragert, L., Klitz, W. High resolution HLA alleles and haplotypes in the US population. Human Immunology (2007) 68, 779-788)。これらのデータは2007年からのものであり、組織適合性に最も重要な遺伝子だと思われるMHCクラスIAおよびB遺伝子+MHCクラスII DRB1遺伝子のハプロタイプ頻度の統計値を含む。もっと正確に言うと、これらのデータは、4つのUS部分母集団(American Census Bureau):白人(ヨーロッパ系アメリカ人)、ヒスパニック、アフリカ人、アメリカ人、およびアジア人/太平洋諸島の住民の中での各ハプロタイプの頻度を示す。アレルの精度は、遺伝子AおよびBについては最初の2桁、遺伝子DRB1については最初の4桁に関する。
【０６７６】
これらの頻度の測定に関与する人の数は、ヒスパニック、アフリカ人、およびアジア人/太平洋集団の場合は200,000〜300,000人から、白色集団の場合は100万人超とかなり多い。
【０６７７】
(本発明の一部でない)頻度に関する記述データ
頻度を把握するために、図1(対数スケールでy軸)に、白人部分母集団における降順の頻度によって分類したハプロタイプ頻度をプロットした。最も高い頻度は約6％であり、次に、他のハプロタイプについては急減する。白人集団については12723のハプロタイプが発見され、Aについては21アレル、Bについては40アレル、DRB1については166アレルに対応する(従って、可能性のあるハプロタイプのうち9％が本当に観察された)。
【０６７８】
全HLAバンクに基づいた、処置可能な患者のパーセントを最大にするドナー遺伝子型セットの決定の例
使用した方法
最良のドナー遺伝子型セットを発見するための基本原理は、以下のパラメータに基づいた。
・  これらの遺伝子型に存在するアレルは共通の要素をもたない(disjoint)(2人のドナー間に共通アレルはない)。
・  ドナー数は前もって設定され、ここでは5人のドナーに固定した。
・  これらのドナーに由来する遺伝子型の頻度は、(このようなドナーを実現可能に発見するために)ある特定の閾値「fmin」より低くない。
・  これらのドナーを用いると、多くても「m」個のミスマッチを有する処置可能な患者のパーセントは可能な限り高い。
・  最後に、ある特定の解のために見出された5人のドナーを系統的に最低頻度から最高頻度まで順序付けた(これは、副作用なく、患者が移植片を有する最大の可能性を保つことである)。
【０６７９】
以下の段落は本発明の一部ではなく、検討中の仮説の基本原理を説明する。
【０６８０】
注：  本発明者らは、各患者について5人のドナーが抽出されたドナーライブラリーから開始し、これらの5人のドナーを各患者に適合させる場合に、このドナーライブラリーを最適化するという問題に対処することができなかった。この問題はアルゴリズムで手に負えるものではなかった。ドナーライブラリーを、共通の要素をもたないドナーに制約することができなかった。なぜなら、例えば、(遺伝子Aには21のアレルしかないので)比較的高い頻度で15人の共通の要素をもたないドナーを発見することは非常に難しいからである。他方で、この制約を持たないことで、共通の要素をもたないドナーサブセットの探索は非常に困難で、かつかなり悪くなり、ライブラリーの大部分では、共通の要素をもたないドナーサブセットの全てにおいて解が得られなかった。結果として、パラメータmおよびfminがもっと許容されるものでない限り、0にとどまっている全てにおいてライブラリー最適化は機能しなかったということになった。
【０６８１】
従って、本発明は、
・  遺伝子型の頻度が、両方のハプロタイプの頻度の積(product)であるという仮説が立てられ、
・  実際には、正確な遺伝子型そのものを研究することに関心はなく、むしろアレル内容を研究することに関心があった、
方法を開示する。実のところ、例えば、以下の遺伝子型A1-B1-D1/A2-B2-D2(ハプロタイプを「/」で分けた)を有するドナーと、A1-B2-D1/A2-B1-D2である別のドナーの場合、彼らは、ここで示された問題にとっては厳密には同じである。従って、彼らの頻度を合計し、1つのユニークな「遺伝子型」として彼らを処理することが決定された。
【０６８２】
白人集団に由来するN=12723のハプロタイプから開始すると、N(N+1)=80,943,726の遺伝子型を演算することができる。関心はアレル内容にしかないので、このセットをユニークなアレル内容まで減らした。49,803,456のユニークな「遺伝子型」(アレル組み合わせ)がある。
【０６８３】
次に、fminの最高値およびmの最低値を得ようとして、fmin(ドナー遺伝子型の最小頻度)およびm(患者と5人のドナーの間で許容されるミスマッチの総数の最大値)について多数の異なる値を試した。fmin=1e-4では、524の可能性のあるユニークな「遺伝子型」しかなく、大きなm値でも解を生じる、共通の要素をもたないドナーセットを発見することは不可能であった。fmin=5e-5では、1415の可能性のあるユニークな「遺伝子型」があり、共通の要素をもたないドナーセットを発見することは可能であった。下記においてfminの後者の値を残した。
【０６８４】
患者(ドナー)のカバレッジの良好なパーセントが得られた最低値を発見するために、mの様々な値について多数の操作を行った。それぞれの操作は、ランダム変数を用いるアルゴリズム(遺伝的アルゴリズム)を使用するので、操作ごとに変数品質(variable quality)の解を得ることができる。mの様々なきちんと選択された値について一組4回の操作を行った。規定された(m)値について、最良の解(1=100％)を目指して、患者カバレッジの最大パーセントの結果を記録した。結果を以下の表2に示した。
【０６８５】
(表２)12〜15のミスマッチ数(m)について行った4つの操作の患者カバレッジ(1=100％)
2020530277.tif 000023
【０６８６】
ランダムに抽出されたドナーのセットにおける、処置可能な患者のパーセントを最大にするドナー遺伝子型セットの決定の例
ここでは、最良の5人のドナーを決定するプロセスが、多数のドナーではなく、例えば、ランダムに抽出された100人のドナーからなる限られた集団において行われたと仮説を立てた。結果は、抽出された100人の候補ドナーからなる試料に左右され、最適化操作にも左右されるので、結果の統計上の意見を持つために、いくつかの操作を行った。何回か試行した後に、m、20および22という2つの値に焦点を合わせた。
【０６８７】
結果を以下の表3に示した(注:m=20およびm=22の操作は完全に独立している)。m=20のm=22カバレッジの操作カバレッジ。
【０６８８】
(表３)2種類のミスマッチ値(m=20およびm=22)についての、5人のドナーからなる各群および個々の操作(合計30の操作)のカバレッジ(1=100％)の頻度
2020530277.tif 000024
【０６８９】
これらの値の分布を以下に示した。従って、m=20では、患者全員をカバーしないことが多いのに対して、m=22では、概して、(失敗した、30のうちの1つの事例を除いて)良好〜非常に良好なカバレッジがある。
【０６９０】
頻度が最も高いドナーハプロタイプのセットの決定の例
ここでの問題は、共通の要素をもたず、かつ最小頻度が可能な限り高いN個のハプロタイプ(Nは一定である)のセットを決定することである。なぜなら、これらのドナーを発見する確率を最大にすることが望ましいからである。ここでは、ホモ接合性であり、従って、可能な限り頻度が高いハプロタイプを発見することができるドナーを選択することが考慮された。
【０６９１】
最良の解は、必ずしも、貪欲アルゴリズムによって得られる、交差がない(intersection-free)最も頻度の高いハプロタイプの第1の解ではない。このアルゴリズムは分枝限定探索(branch and bound exploration)であり、頻度を減らすことによってハプロタイプを選別し、次いで、次のハプロタイプを包含するか、または包含しないことで全ての選択肢を繰り返し調べ、包含は、前のものと共通の要素をもたないハプロタイプにしか調べられない。従って、ハプロタイプリストのリストが漸進的に組み立てられ、最低頻度が、調べようとする次のハプロタイプよりも高い、N個の共通の要素をもたないハプロタイプのリストを含む時に、この手順は止まる。この解は、最高値で最低頻度を有するハプロタイプリストである。
【０６９２】
以下の表4には最良のハプロタイプセットを示す。
【０６９３】
(表４)最良のハプロタイプセット
2020530277.tif 000025
【０６９４】
将来、患者に移植される可能性が最も高いドナーハプロタイプのセットの決定の例
使用した概略的な方法
同種異系T細胞の反復注射を行う時には、これらのT細胞に由来する全てのMHCアレルを、後のT細胞注射において、または移植のために再使用してはならない。従って、患者が免疫されるアレルを最小限にすることは関心が高い。本発明者らは、患者には、異なるハプロタイプに由来するT細胞の5つの注射液を与え、次いで、おそらく1つのアレル以外は患者のMHCと適合しなければならず、T細胞注射からのどんなMHCも含んではならない移植片(例えば、腎臓)が与えられるべきだと仮説を立てた。この問題は、平均的な患者に対する移植ドナーの頻度を最大にするために、5人のT細胞ユニバーサルドナー(患者全員に用いられるドナー)がどのように選択しなければならないかを発見することであった。
【０６９５】
演算を妥当なものにするために、ドナーおよび患者には両者ともハプロタイプが1つしかない(ホモ接合性)とみなされた。次いで、本発明者らは、平均的な患者では、おそらく1つのアレル以外で適合する、移植ドナーの頻度を最大にする5つのドナーハプロタイプのリストを検索した(加重頻度(weighted frequency))。さらなる制約は、T細胞ドナーハプロタイプの頻度が0.1％以上にならなければならないことであった(本発明者らはドナーを発見できることが必要である)。白人集団の場合、最適なハプロタイプのリストが、0.011468のスコア(頻度)で下記のものになることが発見された。
【０６９６】
演算を患者xドナーの行列で表すことができ、それぞれの細胞が、ある特定のドナーハプロタイプに対する、ある特定のドナーハプロタイプの適合性を表す。約12,000のハプロタイプがあるので、この行列には約1億個の細胞があるが、まだ妥当に扱うことができる。次に、この原理はブール行列によって連続T細胞注射を表し(ドナーが使用できれば1、使用できなければ0)、適合ドナーの頻度を評価するために行列をスコア付けすることであり、結局、ベクトル演算になる。本発明者らは、各工程で可能な限り高いスコアを与える最良のハプロタイプリストを系統的に調査した。
【０６９７】
結果
結果を以下の表5に示した。
【０６９８】
(表５)HLAA-BおよびDRB1を用いる、最大化された移植可能性を有する5人のドナー(ホモ接合性)からなるセットの例
2020530277.tif 000026
【０６９９】
次の工程は、この解を、ランダムに求められた解と比較して評価することである(「本発明者らはどれだけ最適化したのか」)。このために、0.1％またはそれより高い頻度を有する5つの重複しないハプロタイプからなるランダムに選択されたリストを選び、平均的な患者に対する移植ドナーの同等の頻度を演算した。図3にスコア分布を示した。最適化されたスコアは、本発明者らがランダムドナーから入手した全ての値よりも高いが、差はかなり小さいことが分かる(実際、ドナーセット間の差は既に小さい。すなわち、この分布には、極めて小さな分散がある)。注:最も頻度が高い(が、まれな)ハプロタイプを選ぶことで、かなり低いスコアがほぼ確実に得られるだろう。実施例1からドナーセットを選ぶことによって試行を行い、0.010934のスコアが得られた。
【０７００】
(表６)T細胞活性化に応答する好ましいヒト内因性遺伝子座
2020530277.tif 000027
2020530277.tif 000028
2020530277.tif 000029
2020530277.tif 000030
2020530277.tif 000031
2020530277.tif 000032
2020530277.tif 000033
2020530277.tif 000034
2020530277.tif 000035
2020530277.tif 000036
2020530277.tif 000037
2020530277.tif 000038
2020530277.tif 000039
【０７０１】
方法
定義：
全ての定義および基準は、特に、Nunes E, Heslop H, Fernandez-Vina M, Taves C, Wagenknecht DR, Eisenbrey AB, Fischer G, Poulton K, Wacker K, Hurley CK, Noreen H, Sacchi N. Human Immunology. 2011 72:1214-6 Blood. 2011 118:e180-3、およびHollenbach JA, Mack SJ, Gourraud PA, Single RM, Maiers M, Middleton D, Thomson G, Marsh SGE, Varney MD. for the Immunogenomics Data Analysis Working Group Tissue Antigens. 2011 78:333-44を参考にし、かつこれらに重点を置いて、当業者に公知であり、例えば、http://hla.alleles.org/definitions/index.htmlに公開されたような定義および基準である。
【０７０２】
本発明は、あらゆる新しいアレルを含んでもよく、前記方法は基本的に同じである。ここでの新しい名称へのデータの移行を助けるために、変換表、およびImmunogenetics Data Analysis Working Groupによって述べられたような変換ツールが提供されている。これにより、HLAアレル名を入力することが可能になり、大きなデータセットを扱うための変換ツールを用いて現バージョンおよび新バージョンのアレル名が提供される。
【０７０３】
従って、インターネットでダウンロードまたは使用するためにAllele Name Translationアプリケーションを利用することができる。
【０７０４】
変換ツールの2つの例をここで説明する。「Allele Name Translation Tool (ANTT)」は、全データセットにあるアレル名を翻訳するダウンロード可能なアプリケーションであり、任意の一対の命名規則(ユーザーによって定義された命名規則を含む)間でアレル名を翻訳するためにカスタマイズすることができ、「Update NomenCLature(UNCL)」は、全データセットにあるアレル名を翻訳するRスクリプトのウエブベースインプリメンテーションである。UNCLは、インターネット接続と最新のウエブブラウザを用いて、だれでも使用することができる。
【０７０５】
これらのツールは、以下の論文:Mack SJ, Hollenbach JA. Allele Name Translation Tool and Update NomenCLature: Software tools for the automated translation of HLA allele names between successive nomenclatures. Tissue Antigens 2010: 75:457-461に記載されている。
【０７０６】
使用データ
本研究の目的は、既往反応のリスクが低い免疫療法によって1人の個体を処置するために免疫細胞が操作される任意の「集団」にいる少なくとも5人の既知ドナーのセットを提供することである。
【０７０７】
ここでは、本発明の目的と、大きな集団試料から得られたデータを用いて本発明を生産するための方法を構成するのに必要なドナー数が提供される。
【０７０８】
任意の細胞ドナープログラムから入手可能なデータを使用することができ、例えば、検索可能なデータベース、例えば、Bone Marrow Donors Worldwide (BMDW)、Netcord Foundation、National Marrow Donor Program(NMDP)、他の国の登録所(national registry)、Eurocord、Center for International Blood and Marrow Transplant Research(CIBMTR)にある、日本さい帯血バンクネットワーク(Japan cord blood bank network)(JCBBN)、Chinese Stem Cell Donor Database Management Center (2010年8月31日にChina Marrow Donor Program (CMDP)には1,149,189件のデータがある)、オーストラリアにあるABMDRから、「Be the Match」プログラムと呼ばれるNational Marrow Donor Program(NMDP)のデータを使用することができる。
【０７０９】
ハプロタイプ頻度の統計値が有意であるためには、データ数は少なくとも230でなければならない。
【０７１０】
データセットは、A-B-DRB1遺伝子のハプロタイプ、および6つの遺伝子座ハプロタイプとA-C-B-DRB3/4/5-DRB1-DQB1遺伝子を含むデータセットを含む(Maiers et al, High-resolution HLA alleles and haplotypes in the United States population, Hum. Immunol., 2007, 68, 779-788と、もっと新しい論文であるGragert et al, Six-locus high resolution HLA haplotype frequencies derived from mixed-resolution DNA typing for the entire US donor registry., Hum. Immunol., 2013, 74, 1313-1320も参照されたい)。
・  第1のデータセットA-B-DRB1遺伝子は、412,861人のアフリカ系アメリカ人、359,423人のアジア人/太平洋諸島の住民、および2,361,208人の白人に対応する(https://bioinformatics.bethematchclinical.org/hla-resources/haplotype-frequencies/a-b-drb1-224-haplotype-frequencies/を参照されたい)。
・  6つの遺伝子座を含む他の新たなデータセットは、505,250人のアフリカ系アメリカ人、568,597人のアジア人/太平洋諸島の住民、3,912,440人の白人、および712,764人のヒスパニックに対応する(上記で引用されたGragert et al 2013を参照されたい)。
【０７１１】
これらのデータセットは、主に、異なる集団において測定された異なるハプロタイプの頻度からなる(すなわち、遺伝子の異なるアレルのジョイント頻度(joint frequency)が考慮される)。
【０７１２】
第1のデータセットとA-B-DRB1を用いた研究
最初に、このデータセットを、以下：
・  アフリカ系アメリカ人：AFA
・  アジア人および太平洋諸島の住民：API
・  ヨーロッパ系アメリカ人(白人)：CAU
・  ヒスパニック：HIS
のような民族群に属するという、それぞれの個々の認識に基づいて表した4つの「集団」または群を用いて決定した。
【０７１３】
これらのカテゴリーは、HLAの検査を受けている人そのものによって定義される。
【０７１４】
アレル頻度
データセットは、ハプロタイプ頻度をもたらす、集団試料において発見された3つの遺伝子のアレルの全組み合わせの頻度にある。これから、本発明者らは、3つの遺伝子について各集団における各アレルの頻度を演算した。各集団において、および各遺伝子について、アレルを降順の頻度によって分類し、表1に記載した。遺伝子Aについては21のアレル、遺伝子Bについては41のアレル、遺伝子DRB1については236のアレルがあった。
【０７１５】
ドナーの最小数
結果
考慮されている遺伝子(ここではHLA-A、B、およびDRB1)の共通アレルを持たない確率が95％(または確率が99％)にならなければならない5人の既往性適合性ドナーのセットを得るために、ドナーの最小数nはどんなものであるかという以下の問題を解決する(但し、患者は、これらの5人の新ドナーに存在するアレルを有するドナーを用いて以前に一度も処置/移植されたことがない)。
【０７１６】
この問題を解決するために、使用した戦略は、nを5という特定の値に固定し、ある特定の集団から5人のドナーをランダムに選択し、5人の既往性適合性ドナーの解を発見できるかどうか確かめることであった。5人の既往性適合性ドナーが発見される頻度を評価するために様々なランダム抽出を用いて、この手順を数回繰り返した。次いで、本発明者らは、様々な集団に対して、およびnの様々な値を用いて手順全体を繰り返した。さらなる詳細は「方法」の段落において見出すことができる。
【０７１７】
結果は4つの集団の結果である。これは、5人の既往性適合性ドナーを発見する95％信頼度(または99％信頼度)を有するためにAFAまたはHIS集団において必要とされる試料サイズがAPIまたはCAU集団のものより小さいことを示す。
【０７１８】
グラフを作成するのに使用した値から、本発明者らは、5人の既往性適合性ドナーを発見できる確率が95％または99％になるのに必要な最小試料サイズを求めた。結果は、この表にある。
【０７１９】
本発明者らはまた、(50および1000の反復のドナープールサイズから)選択されたドナーについて、選択されたドナーのハプロタイプの頻度を評価した。これらの頻度の分布を図2に示した。
【０７２０】
方法
各集団について、および異なるドナー試料サイズnについて、nは20〜75であり、5刻みで増え、本発明者らは、n人のドナーの抽出において5人の既往性適合性ドナーを発見する確率を調査した(ここでは既往性適合性とは、3つの遺伝子について任意のドナーペア間で共通アレルがないことを意味する)。このために、本発明者らは、集団の分布確率に従って、2つの独立したハプロタイプを有するn人のドナーを抽出した。次いで、これらのn人のドナーが5人の既往性適合性ドナーのサブセットを含むかどうか発見するために試験した。これを評価するために、本発明者らは以下を行った。
【０７２１】
1．  本発明者らは、ドナーペアについて、彼らの適合性を演算した(共通アレルがなければ1、そうでなければ0となる)。これによりドナー間の適合性のグラフが得られた。それぞれの頂点(vertex)はドナーを表し、2人のドナーが既往性適合性であれば、2人のドナー間の辺(edge)が存在する。
2．  次いで、本発明者らは、標準的なグラフ探索ライブラリーを用いて、このグラフの中で、少なくとも5つのノードを含むクリーク(clique)を探した。このようなクリークが発見されたら、このドナーセットは成功したとみなされる。すなわち、本発明者らは、それから、5人の既往性適合性ドナーからなる少なくとも1つのセットを抽出することができる。そうでなければ失敗である。
【０７２２】
本発明者らは、10,000回の独立した抽出において、このプロセスを繰り返し、本発明者らが5人の既往性適合性ドナーからなる群を分離できる確率を評価する成功(success)のパーセントを数えた。次いで、本発明者らが、本発明者らの推定値の平均および標準偏差を演算することができる3つの異なるパーセントを有するために、本発明者らは演算を3回繰り返した。最後に、様々な集団に対して、およびnの様々な値を用いて手順全体を繰り返した。
【０７２３】
データセットとA-C-Bを用いた研究
このデータセットは22の部分母集団を含んだが、これらは、上記のように4つの集団:
・  アフリカ系アメリカ人：AFA
・  アジア人および太平洋諸島の住民：API
・  ヨーロッパ系アメリカ人(白人)：CAU
・  ヒスパニック：HIS
にグループ分けすることができた。
【０７２４】
アレル頻度
もう一度、利用可能なハプロタイプ表から、本発明者らは、3つの遺伝子について各集団にある各アレルの頻度を演算した。A遺伝子については21アレル、遺伝子Cについては14アレル、遺伝子Bについては36アレルがある。遺伝子Bのアレルは以前のデータセットよりも少ない。おそらく、第1のデータセットにおいて新たなアレルが特定されたからである(第1のデータセットにあるアレルは全て、60を超える大きな数を有する)。頻度を添付の表に示した。
【０７２５】
ドナーの最小数
結果
本発明者らは、A-B-DRB1を用いた以前の研究と同じ問題を解いた。
【０７２６】
本発明者らは、5人の既往性適合性ドナー(上記の意味では既往性適合性)を発見できる確率が95％または99％になるのに必要な最小試料サイズを求めた。
【０７２７】
データセットとA-C-B-DRB1を用いた研究
次に、本発明者らは、同じ4つの集団に対して4つ全ての遺伝子A、C、BおよびDRB1を用いる同じ戦略を使おうと試みた。開始ハプロタイプの数は特に多くないが(20036のハプロタイプ)、共通アレルを全く持たない5人のドナーを発見するのに必要なドナーの数は大幅に増加する。組み合わせの数はドナー数と共に指数関数的に増加するので、演算時間も増加する。最新のグラフは以下のものである(演算は99％確率に達するように終了していない):図1を参照されたい。
【０７２８】
グラフを作製するために使用した値から、本発明者らは、5人の既往性適合性ドナー(上記の意味では既往性適合性)を発見できる確率が95％または99％になるのに必要な最小試料サイズを求めた。最小試料サイズは230である。
【０７２９】
細胞工学
CAR
それぞれの薬学的単位用量の細胞は少なくとも1種類のキメラ受容体(CAR)を含む。本発明のCARは、病理学的細胞の細胞表面に発現している抗原を標的とするために適合された構造を有する。本発明によるCARの例は、全てが参照により本明細書に組み入れられる、WO2015140268、WO2014039523、WO2016166268A1、WO2015136001、WO2014184741、WO2013176916、WO2013176915、WO2016201047、WO2015/092024に記載されている。
【０７３０】
遺伝子編集
それぞれの薬学的単位用量の細胞は、例えば、WO2016064929に記載のように少なくとも1種類の編集された遺伝子を含む。
【０７３１】
細胞外リガンド結合ドメインを、CD123；CD19；CD22；CD30；CD79b、CD70；CD171；CS-1(CD2サブセット1、CRACC、SLAMF7、CD319、および19A24とも呼ばれる)；DLL3；TSPAN10；PRAME；C型レクチン様分子-1(CLL-1またはCLECL1)；CD33；上皮増殖因子受容体バリアントIII(EGFRvIII)；ガングリオシドG2(GD2)；ガングリオシドGD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(l-l)Cer)；TNF受容体ファミリーメンバーB細胞成熟(BCMA)；Tn抗原((TnAg)または(GalNAca-Ser/Thr))；前立腺特異的膜抗原(PSMA)；受容体型チロシンキナーゼ様オーファン受容体1(ROR1)；Fms様チロシンキナーゼ3(FLT3)；腫瘍関連糖タンパク質72(TAG72)；CD38；CD44v6；癌胎児抗原(CEA)；上皮細胞接着分子(EPCAM)；B7H3(CD276)；KIT(CD117)；インターロイキン-13受容体サブユニットα-2(IL-13Ra2またはCD213A2)；メソテリン；インターロイキン11受容体α(IL-IIRa)；前立腺幹細胞抗原(PSCA)；プロテアーゼセリン21(テスチチンまたはPRSS21)；血管内皮増殖因子受容体2(VEGFR2)；ルイス(Y)抗原；CD24；血小板由来増殖因子受容体β(PDGFRβ)；ステージ特異的胎児抗原(SSEA-4)；CD20；葉酸受容体α；受容体チロシン-プロテインキナーゼERBB2(Her2/neu)；ムチン1(MUC1)；ムチン16(MUC16)；ムチン17(MUC17)；上皮増殖因子受容体(EGFR)；神経細胞接着分子(NCAM)；プロスターゼ(Prostase)；前立腺酸性ホスファターゼ(PAP)；伸長因子2変異(ELF2M)；エフリンB2；線維芽細胞活性化タンパク質α(FAP)；インシュリン様増殖因子1受容体(IGF-I受容体)、炭酸脱水酵素IX(CAFX)； Proteasome(Prosome, Macropain)サブユニット,β型,9(LMP2)；糖タンパク質100(gp100)；ブレイクポイントクラスター領域(BCR)およびエーベルソンマウス白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ1(Abl)(bcr-abl)からなる癌遺伝子融合タンパク質；チロシナーゼ；エフリンA型受容体2(EphA2)；フコシルGM1；シアリルルイス接着分子(sLe)；ガングリオシドGM3(aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer)；トランスグルタミナーゼ5(TGS5)；高分子量-黒色腫関連抗原(HMWMAA)；o-アセチル-GD2(OAcGD2)；葉酸受容体β；腫瘍内皮マーカー1(TEM1/CD248)；腫瘍内皮マーカー7関連(TEM7R)；クローディン6(CLDN6)；スプライスバリアント2(クローディン18.2)を含むクローディン18(CLDN18)；甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)；G protein-coupled receptor class C group 5, member D(GPRC5D)；chromosome X open reading frame 61(CXORF61)；CD97；CD179a；未分化リンパ腫キナーゼ(ALK)；ポリシアル酸；胎盤特異的1(PLAC1)；hexasaccharide portion of globoH glycoceramide(GloboH)；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；ウロプラキン2(UPK2)；A型肝炎ウイルス細胞受容体1(HAVCRl)；アドレノセプターβ3(ADRB3)；パンネキシン3(PANX3)；Gタンパク質共役受容体20(GPR20)；lymphocyte antigen 6 complex, locus K 9(LY6K)； Lymphocyte antigen 6 complex locus protein G6d(LY6G6D)；嗅覚受容体51 E2(OR51E2)；TCR Gamma Alternate Reading Frame Protein(TARP)；ウィルムス腫瘍タンパク質(WT1)；癌/精巣抗原1(NY-ESO-1)；癌/精巣抗原2(LAGE-la)；黒色腫関連抗原1(MAGE-A1)；ETS translocation-variant gene 6, located on chromosome 12p(ETV6-AML)；精子タンパク質17(SPA17)；X Antigen Family, Member 1A(XAGE1)；アンジオポエチン結合細胞表面受容体2(Tie 2)；黒色腫癌精巣抗原-1(MAD-CT-1)；黒色腫癌精巣抗原-2(MAD-CT-2)；Fos関連抗原1；腫瘍タンパク質p53(p53)；p53変異体；プロステイン；サバイビン；テロメラーゼ；前立腺癌腫瘍抗原-1(PCTA-1またはガレクチン8)、melanoma antigen recognized by T cells 1(メランAまたはMARTI)；Rat sarcoma(Ras)変異体；ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)；sarcoma translocation breakpoints； melanoma inhibitor of apoptosis(ML-IAP)；ERG(transmembrane protease, serine 2(TMPRSS2)ETS融合遺伝子)；Nアセチルグルコサミニル-トランスフェラーゼV(NA17)；ペアードボックスタンパク質Pax-3(PAX3)；アンドロゲン受容体；サイクリンBl；v-myc avian myelocytomatosis viral oncogene neuroblastoma derived homolog(MYCN)；RasホモログファミリーメンバーC(RhoC)；チロシナーゼ関連タンパク質2(TRP-2)；チトクロムP450 1B1(CYP1B1)；CCCTC結合因子(ジンクフィンガータンパク質)様(BORISまたはBrother of the Regulator of Imprinted Sites)、Squamous Cell Carcinoma Antigen Recognized By T Cells 3(SART3)；ペアードボックスタンパク質Pax-5(PAX5)；プロアクロシン結合タンパク質sp32(OY-TES1)；リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ(LCK)；A kinase anchor protein 4(AKAP-4)；synovial sarcoma, X breakpoint 2(SSX2)；Receptor for Advanced Glycation Endproducts(RAGE-1)；renal ubiquitous1(RU1)；renal ubiquitous 2(RU2)；レグマイン；ヒトパピローマウイルスE6(HPV E6)；ヒトパピローマウイルスE7(HPV E7)；腸カルボキシルエステラーゼ；熱ショックタンパク質70(HSP70)；熱ショックタンパク質70-2変異型(mut hsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白血球関連免疫グロブリン様受容体1(LAIR1)；IgA受容体のFc35断片(FCARまたはCD89)；白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーAメンバー2(LILRA2)；CD300分子様ファミリーメンバーf(CD300LF)；C型レクチンドメインファミリー12メンバーA(CLEC12A)；骨髄ストローマ細胞抗原2(BST2)；EGF様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様2(EMR2)；リンパ球抗原75(LY75)；グリピカン-3(GPC3)；Fc受容体様5(FCRL5)；および免疫グロブリンλ様ポリペプチド1(IGLL1)からなる群より選択される標的抗原(例えば、細胞表面抗原)に対する特異性をもたせた。
【０７３２】
他の実験において、細胞外リガンド結合ドメインは、CD123、ROR1、BCMA、PSMA、CD33、CD38、CD22、CD79aまたはb、CS1、CLL-1、HSP70、EGFRVIII、FLT3、WT1、CD30、CD70、MUC1、MUC16、MUC17、PRAME、TSPAN10、クローディン18.2、DLL3、LY6G6D、およびo-アセチル-GD2(OAcGD2)からなる群より選択される標的抗原の少なくとも1つに特異的である。ある特定の態様によれば、細胞外リガンド結合ドメインは、CD123、CD38、CD22、CS1、CLL-1、HSP70、CD30、MUC1、およびo-アセチル-GD2(OAcGD2)からなる群より選択される標的抗原に特異的である。
【０７３３】
ある特定の態様によれば、細胞外リガンド結合ドメインはCD123に特異的である。このような細胞外リガンド結合ドメインは、モノクローナルCD123抗体に由来するscFV、例えば、ヒトモノクローナルCD123抗体またはヒト化モノクローナルCD123抗体に由来するscFVでもよい。
【０７３４】
本発明の免疫細胞は、患者において、または本発明の免疫細胞と組み合わせられる処置の一部としてT細胞を枯渇させるために用いられる薬物に対して耐性になるように、さらに操作される。薬物耐性細胞を得るための遺伝子編集の例は、例えば、その全体が本明細書に参照により組み入れられる、PA201670232、PA201670233、PA201770038に記載されている。
【０７３５】
特定の態様では、前記薬物耐性は、(全体が参照により組み入れられる、PA201670840に記載のように)少なくとも1つの遺伝子(薬物耐性遺伝子)の遺伝子もしくは変異遺伝子の発現、遺伝子の欠失もしくは変異、または遺伝子もしくは変異遺伝子の挿入によってT細胞に付与することができる。前記薬物耐性遺伝子は、化学療法剤(例えば、メトトレキセート)などの薬剤に対して「耐性」を付与する、タンパク質をコードする核酸配列、または化学療法剤(例えば、メトトレキセート)などの薬剤に対して「耐性」を付与するレベルのタンパク質を指す。言い換えると、細胞において薬物耐性遺伝子を発現させると、薬剤の存在下で、薬物耐性遺伝子がない対応する細胞の増殖よりも大きな程度で細胞の生存および増殖が可能になる。本発明の薬物耐性遺伝子は、代謝拮抗物質、メトトレキセート、ビンブラスチン、シスプラチン、アルキル化剤、プリンヌクレオチド類似体(PNA)、プロテアソーム阻害剤アントラサイクリン、細胞傷害性抗生物質、抗イムノフィリン、その類似体または誘導体などに対する耐性をコードしてもよい。
【０７３６】
標的細胞に薬物耐性を付与するために潜在的に使用することができる、いくつかの薬物耐性遺伝子が特定されている(Takebe, Zhao et al. 2001; Sugimoto, Tsukahara et al. 2003; Zielske, Reese et al. 2003; Nivens, Felder et al. 2004; Bardenheuer, Lehmberg et al. 2005; Kushman, Kabler et al. 2007)。
【０７３７】
薬物耐性遺伝子の一例はまたジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)の変異型または改変型でもよい。DHFRは、細胞におけるテトラヒドロ葉酸量の調節に関与する酵素であり、DNA合成に必要不可欠である。メトトレキセート(MTX)などの葉酸類似体はDHFRを阻害し、従って、診療所において抗悪性腫瘍剤として用いられる。療法において用いられる葉酸代謝拮抗剤による阻害に対する耐性が高い様々なDHFR変異型が述べられている。特定の態様では、本発明による薬物耐性遺伝子は、葉酸代謝拮抗剤処置、例えば、メトトレキセートに対する耐性を付与する少なくとも1つの変異を含む、ヒト野生型DHFRの変異型をコードする核酸配列(GenBank:AAH71996.1)でもよい。特定の態様では、DHFR変異型は、位置G15、L22、F31、またはF34、好ましくは、位置L22またはF31に少なくとも1つの変異アミノ酸を含む((Schweitzer, Dicker et al.1990);国際出願WO94/24277; 米国特許第6,642,043号)。特定の態様では、前記DHFR変異型は位置L22およびF31に2つの変異アミノ酸を含む。本明細書に記載のアミノ酸位置の対応は野生型DHFRポリペプチドの型のアミノ酸位置によって表されることが多い。特定の態様では、位置15にあるセリン残基は好ましくはトリプトファン残基と交換される。別の特定の態様では、位置22にあるロイシン残基は、好ましくは、変異体DHFRと葉酸代謝拮抗剤との結合を破壊するアミノ酸、好ましくは、無電荷アミノ酸残基、例えば、フェニルアラニンまたはチロシンと交換される。別の特定の態様では、位置31または34にあるフェニルアラニン残基は、好ましくは、小さな親水性アミノ酸、例えば、アラニン、セリン、またはグリシンと交換される。
【０７３８】
本明細書で使用する「葉酸代謝拮抗剤」または「葉酸類似体」は、あるレベルで葉酸代謝経路を妨害するように向けられた分子を指す。葉酸代謝拮抗剤の例には、例えば、メトトレキセート(MTX); アミノプテリン; トリメトレキセート(Neutrexin(商標)); エダトレキセート; N10-プロパルギル-5,8-ジデアザ葉酸(CB3717); ZD1694(Tumodex)、5,8-ジデアザイソ葉酸(dideazaisofolic acid)(IAHQ);5,10-ジデアザテトラヒドロ葉酸(DDATHF);5-デアザ葉酸;PT523(Nα-(4-アミノ-4-デオキシプテロイル)-Nδ-ヘミフタロイル-L-オルニチン); 10-エチル-10-デアザアミノプテリン(DDATHF、ロマトレキソール(lomatrexol)); ピリトレキシム; 10-EDAM; ZD1694; GW1843; ペメトレキセート(Pemetrexate); およびPDX(10-プロパルギル-10-デアザアミノプテリン)が含まれる。
【０７３９】
薬物耐性遺伝子の別の例はまた、グアノシンヌクレオチドの新規合成における律速酵素であるイノシン-5'一リン酸デヒドロゲナーゼII(IMPDH2)の変異体または改変型でもよい。IMPDH2の変異型または改変型はIMPDH阻害剤耐性遺伝子である。IMPDH阻害剤はミコフェノール酸(MPA)またはそのプロドラッグであるミコフェノール酸モフェチル(MMF)でもよい。変異体IMPDH2はIMPDH阻害剤に対して大幅に高い耐性をもたらす、野生型ヒトIMPDH2(NP_000875.2)のMAP結合部位における少なくとも1つ、好ましくは2つの変異を含んでもよい。これらの変異は、好ましくは、位置T333および/または5351にある(Yam, Jensen et al. 2006; Sangiolo, Lesnikova et al. 2007; Jonnalagadda, Brown et al. 2013)。特定の態様では、位置333にあるスレオニン残基はイソロイシン残基と交換され、位置351にあるセリン残基はチロシン残基と交換される。本明細書に記載のアミノ酸位置の対応は、野生型ヒトIMPDH2の型のアミノ酸位置によって表されることが多い。
【０７４０】
別の薬物耐性遺伝子はカルシニューリンの変異型である。カルシニューリン(PP2B)は、多くの生物学的プロセスに関与し、T細胞活性化にとって重要な偏在して発現しているセリン/スレオニンプロテインホスファターゼである。カルシニューリンは、触媒サブユニット(CnA;3種類のアイソフォーム)および調節サブユニット(CnB;2種類のアイソフォーム)で構成されるヘテロ二量体である。T細胞受容体が結合した後に、カルシニューリンは転写因子NFATを脱リン酸し、それにより、転写因子NFATは核と、活性のある重要な標的遺伝子、例えば、IL2に移動できるようになる。FKBP12と複合体化したFK506、またはCyPAと複合体化したシクロスポリンA(CsA)はNFATがカルシニューリン活性部位に接近するのをブロックし、それにより、NFATの脱リン酸が阻止され、それにより、T細胞活性化が阻害される(Brewin, Mancao et al. 2009)。本発明の薬物耐性遺伝子は、カルシニューリン阻害剤、例えば、FK506および/またはCsAに対して耐性のあるカルシニューリン変異型をコードする核酸配列でもよい。特定の態様では、前記変異型は、位置:V314、Y341、M347、T351、W352、L354、K360に野生型カルシニューリンヘテロ二量体aの少なくとも1つの変異アミノ酸、好ましくは、位置T351とL354またはV314とY341に二重変異を含んでもよい。特定の態様では、位置341にあるバリン残基はリジンまたはアルギニン残基と交換されてもよく、位置341にあるチロシン残基はフェニルアラニン残基と交換されてもよく、位置347にあるメチオニンはグルタミン酸、アルギニン、またはトリプトファン残基と交換されてもよく、位置351にあるスレオニンはグルタミン酸残基と交換されてもよく、位置352にあるトリプトファン残基はシステイン、グルタミン酸、またはアラニン残基と交換されてもよく、位置353にあるセリンはヒスチジンまたはアスパラギン残基と交換されてもよく、位置354にあるロイシンはアラニン残基と交換されてもよく、位置360にあるリジンはGenBank:ACX34092.1のアラニンまたはフェニルアラニン残基と交換されてもよい。本明細書に記載のアミノ酸位置の対応は、GenBank:ACX34092.1に示された野生型ヒトカルシニューリンヘテロ二量体aポリペプチドの型のアミノ酸位置によって表されることが多い。
【０７４１】
別の特定の態様では、前記変異型は、位置:V120、N123、L124、またはK125にある野生型カルシニューリンヘテロ二量体bの少なくとも1つの変異アミノ酸、好ましくは、位置L124およびK125における二重変異を含んでもよい。特定の態様では、位置120にあるバリンは、セリン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、またはロイシン残基と交換されてもよい。位置123にあるアスパラギンは、トリプトファン、リジン、フェニルアラニン、アルギニン、ヒスチジン、またはセリンと交換されてもよい。位置124にあるロイシンはスレオニン残基と交換されてもよい。位置125にあるリジンは、アラニン、グルタミン酸、トリプトファンと交換されてもよく、または、アミノ酸配列GenBank: ACX34095.1の位置125にあるリジンの後ろに、2つの残基、例えば、ロイシン-アルギニンもしくはイソロイシン-グルタミン酸が付加されてもよい。本明細書に記載のアミノ酸位置の対応は、GenBank:ACX34095.1に示された野生型ヒトカルシニューリンヘテロ二量体bポリペプチドの型のアミノ酸位置によって表されることが多い。
【０７４２】
別の薬物耐性遺伝子は、ヒトアルキルグアニントランスフェラーゼ(hAGT)をコードする0(6)-メチルグアニンメチルトランスフェラーゼ(MGMT)である。AGTは、アルキル化剤、例えば、ニトロソ尿素およびテモゾロミド(TMZ)の細胞傷害作用に対する耐性を付与するDNA修復タンパク質である。6-ベンジルグアニン(6-BG)は、ニトロソ尿素毒性を増強するAGTの阻害剤であり、この薬剤の細胞傷害作用を増強するためにTMZと一緒に同時投与される。AGT変種をコードする、いくつかのMGMT変異型が6-BGによる不活化に対して高い耐性を示すが、DNA損傷を修復する能力を保持している(Maze, Kurpad et al. 1999)。特定の態様では、AGT変異型は、アミノ酸配列UniProtKB:P16455において野生型AGT位置P140の変異アミノ酸を含むことがある。好ましい態様では、位置140にある前記プロリンはリジン残基と交換される。
【０７４３】
別の薬物耐性遺伝子は多剤耐性タンパク質1(MDR1)遺伝子でもよい。この遺伝子は、細胞膜を通過する代謝副産物の輸送に関与するP-糖タンパク質(P-GP)として知られる膜糖タンパク質をコードする。P-Gpタンパク質は、数種類の構造的に関連しない化学療法剤に対して広範囲の特異性を示す。従って、薬物耐性は、MDR-1(NP_000918)をコードする核酸配列を発現させることによって細胞に付与することができる。
【０７４４】
薬物耐性遺伝子はまた、ble遺伝子またはmcrA遺伝子などの細胞傷害性抗生物質でもよい。免疫細胞におけるble遺伝子またはmcrAの異所性発現は、それぞれ、化学療法剤であるブレオマイシンまたはマイトマイシンCに曝露された時に選択上の利点となる。
【０７４５】
遺伝子療法の最も現実的なアプローチは、T細胞を操作するために、効率的な遺伝子送達とベクター、好ましくはウイルスベクターを用いることによって遺伝子を添加することである。従って、特定の態様では、トランスジーン、好ましくは、少なくとも1つのベクターによってコードされるトランスジーンを細胞に導入することによって、前記薬物耐性遺伝子を前記細胞において発現させることができる。
【０７４６】
遺伝子がゲノムにランダム挿入されると、挿入された遺伝子または挿入部位の近くにある遺伝子が不適切に発現する可能性がある。ゲノム内の特定の部位に遺伝子を標的とするために内因性配列を含む外因性核酸の相同組換えを用いた特異的な遺伝子療法が起こると、しっかりした(secure)T細胞を操作することが可能になる。前記のように、前記方法の遺伝子組換え工程は、相同組換えが内因性遺伝子と外因性核酸との間で起こるように、少なくとも、薬物耐性遺伝子をコードする配列と内因性遺伝子の一部を含む外因性核酸を細胞に導入する工程を含んでもよい。特定の態様では、前記内因性遺伝子は、相同組換え後に野生型遺伝子が、薬物に対する耐性を付与する遺伝子の変異型と交換されるような野生型「薬物耐性」遺伝子でもよい。
【０７４７】
ヌクレオチド鎖切断は相同組換え速度を刺激することが知られている。従って、特定の態様では、本発明の方法は、前記細胞において、内因性遺伝子内の標的配列を切断することができるレアカットエンドヌクレアーゼを発現させる工程をさらに含む。前記内因性遺伝子は、例えば、DHFR、IMPDH2、カルシニューリン、またはAGTをコードしてもよい。前記レアカットエンドヌクレアーゼは、TALE-ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、CRISPR/Cas9エンドヌクレアーゼ、MBBBD-ヌクレアーゼ、またはメガヌクレアーゼでもよい。
【０７４８】
薬物増感遺伝子の不活化
別の特定の態様では、薬物増感遺伝子を不活化することによって前記薬物耐性をT細胞に付与することができる。初めて、本発明者は、免疫療法のためにT細胞を操作する目的で潜在的な薬物増感遺伝子を不活化しようと試みた。
【０７４９】
遺伝子不活化によって、関心対象の遺伝子は機能的タンパク質型で発現されないと考えられている。特定の態様では、前記方法の遺伝子組換えは、レアカットエンドヌクレアーゼが、ある標的とされた遺伝子において切断を特異的に触媒し、それによって、前記標的遺伝子を不活化するように、操作する提供された細胞において、このレアカットエンドヌクレアーゼを発現させることに頼る。特定の態様では、少なくとも1つの薬物増感遺伝子を不活化する工程は、少なくとも1つの薬物増感遺伝子を破壊することができるレアカットエンドヌクレアーゼを細胞に導入する工程を含む。さらに特定の態様では、前記細胞は、薬物増感遺伝子を破壊することができるレアカットエンドヌクレアーゼをコードする核酸で形質転換され、前記レアカットエンドヌクレアーゼは前記細胞内で発現される。前記レアカットエンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、CRISPR/Cas9ヌクレアーゼ、MBBBD-ヌクレアーゼ、またはTALE-ヌクレアーゼでもよい。好ましい態様では、前記レアカットエンドヌクレアーゼはTALE-ヌクレアーゼである。
【０７５０】
好ましい態様では、T細胞に対して薬物耐性を付与するために不活化することが薬物増感遺伝子はヒトデオキシシチジンキナーゼ(dCK)遺伝子である。この酵素は、デオキシリボヌクレオシドデオキシシチジン(dC)、デオキシグアノシン(dG)、およびデオキシアデノシン(dA)のリン酸化に必要とされる。プリンヌクレオチド類似体(PNA)はdCKによって一リン酸PNA、二リン酸PNA、および三リン酸PNAに代謝される。これらの三リン酸型、特にクロファラビン三リン酸はDNA合成においてATPと競合し、アポトーシス促進剤として作用し、トリヌクレオチド産生に関与するリボヌクレオチド還元酵素(RNR)の強力な阻害剤である。
【０７５１】
好ましくは、T細胞におけるdCKの不活化はTALEヌクレアーゼによって媒介される。この目的を実現するために、いくつかのdCK TALE-ヌクレアーゼペアが設計され、ポリヌクレオチドレベルで組み立てられ、配列決定によって検証されている。従って、T細胞におけるdCK不活化は、プリンヌクレオシド類似体(PNA)、例えば、クロファラビンおよびフルダラビンに対する耐性を付与する。
【０７５２】
別の好ましい態様では、T細胞におけるdCK不活化は、これらの二重ノックアウト(KO)T細胞をクロファラビンなどの薬物に対して耐性にし、かつ同種異系にするTRAC遺伝子の不活化と組み合わされる。この二重特性は治療目的に特に有用であり、免疫療法のための「既成の」同種異系細胞が化学療法と一緒に癌患者を処置することを可能にする。この二重KO不活化dCK/TRACは同時に、または連続して行うことができる。
【０７５３】
不活化することができる酵素の別の例は、ヒトヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT)遺伝子(Genbank:M26434.1)である。特に、HPRTによって細胞傷害性チオグアニンヌクレオチドに変換され、癌、特に、白血病をもつ患者を処置するのに現在用いられている細胞分裂停止性代謝産物6-チオグアニン(6TG)に対する耐性を付与するために、操作されたT細胞においてHPRTを不活化することができる(Hacke, Treger et al. 2013)。グアニン類似体は、ホスホリボシル部分の付加を触媒し、TGMP形成を可能にするHPRTトランスフェラーゼによって代謝される(図2)。6メルカプトプリン(6MP)および6チオグアニン(6TG)を含むグアニン類似体は、通常、ALLを処置するためのリンパ球枯渇薬物として用いられる。これらは、HPRT(ホスホリボシル部分の付加を触媒し、TGMPの形成を可能にするヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ)によって代謝される。この後のリン酸化によって三リン酸化型が形成され、最終的にDNAに組み込まれる。DNAに組み込まれたら、チオGTPはチオレート基を介してDNA複製の忠実度を損ない、細胞完全性に極めて有害なランダム点変異を発生させる。
【０７５４】
別の態様では、T細胞表面に通常発現しているCD3の不活化はテプリズマブなどの抗CD3抗体に対する耐性を付与することができる。
【０７５５】
薬物耐性同種異系CAR T細胞の細胞傷害性を試験するためのCD19+/Luc+薬物耐性Daudi細胞
本発明はまた、CAR T細胞に特異的な表面受容体と、耐性遺伝子を発現する標的細胞を製造するための方法も含む。これらの標的細胞は、CAR T細胞の細胞傷害性(cytoxicity)を試験するのに特に有用である。これらの細胞は、臨床的に関連する用量のクロファラビンに対して簡単に耐性を示し、ルシフェラーゼ活性を有する。この特徴組み合わせがあるために、これらの細胞をマウスモデルにおいてインビボで追跡することができる。さらに詳細には、これらの細胞は、マウスにおいてクロファラビンまたは他のPNAの存在下で薬物耐性T細胞の細胞傷害特性を評価するのに使用することができる。クロファラビン耐性Daudi細胞は、薬物耐性B細胞新生物を有する、導入療法から再発した急性リンパ芽球性白血病(ALL)患者の生理学的状態を模倣する。従って、薬物耐性CAR T細胞の信頼性および細胞傷害性を評価するために、これらの細胞は関心が高い。好ましくは、これらの標的細胞はCD19 + ルシフェラーゼ + Daudi細胞である。
【０７５６】
単離された細胞
特に、本発明は、T細胞受容体成分をコードする少なくとも1種類の破壊された遺伝子を含む、薬物耐性のある単離されたT細胞に関する。特定の態様では、前記T細胞は、少なくとも1種類の薬物耐性遺伝子、好ましくは、ble遺伝子もしくはmcrA遺伝子、または変異DHFR、変異IMPDH2、変異AGT、もしくは変異カルシニューリンをコードする遺伝子を発現する。別の特定の態様では、前記T細胞は、少なくとも1種類の破壊された薬物増感遺伝子、例えば、dCKまたはHPRT遺伝子を含む。さらに特定の態様では、前記単離されたT細胞は、破壊されたHPRT遺伝子を含み、DHFR変異体を含む。前記単離されたT細胞は、破壊されたHPRT遺伝子を含み、IMPDH2変異体を発現する。前記単離されたT細胞は、破壊されたHPRT遺伝子を含み、カルシニューリン変異体を発現する。前記単離されたT細胞は、破壊されたHPRT遺伝子を含み、AGT変異体を発現する。
【０７５７】
薬物耐性のある同種異系T細胞
特に、本発明は、免疫療法に特に適した、薬物耐性のある同種異系T細胞に関する。薬物耐性は、薬物増感遺伝子の不活化によって、または薬物耐性遺伝子、例えば、以前に説明された薬物耐性遺伝子の発現によって獲得することができる。本発明に合う薬物のいくつかの例は、プリンヌクレオシド類似体(PNA)、例えば、クロファラビンもしくはフルダラビン、または他の薬物、例えば、6-メルカプトプリン(6MP)および6チオ-グアニン(6TG)である。
【０７５８】
本発明による細胞は、自然免疫応答および/または適応免疫応答の開始および/または実行に機能的に関与する造血由来細胞を指す。本発明による細胞は、好ましくは、ドナーから得られたT細胞またはT細胞集団である。
【０７５９】
本発明による前記T細胞は幹細胞から得ることができる。幹細胞は、成人幹細胞、胚性幹細胞、さらに詳細には、非ヒト幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、全能性幹細胞、または造血幹細胞でもよい。代表的なヒト幹細胞はCD34+細胞である。前記細胞はまた、樹状細胞、キラー樹状細胞、マスト細胞、NK細胞、B細胞、または炎症性Tリンパ球、細胞傷害性Tリンパ球、調節性Tリンパ球、もしくはヘルパーTリンパ球からなる群より選択されるT細胞でもよい。別の態様では、前記細胞は、CD4+Tリンパ球およびCD8+Tリンパ球からなる群から導き出すことができる。本発明の細胞の増大および遺伝子組換えの前に、細胞の供給源を、様々な非限定的な方法によって対象から得ることができる。細胞は、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位に由来する組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含む多数の非限定的な供給源から得ることができる。本発明のある特定の態様では、当業者に利用可能な、かつ公知の任意の数のT細胞株を使用することができる。別の態様では、前記細胞は、好ましくは、健常ドナーから導き出される。別の態様では、前記細胞は、異なる表現型特徴を示す混合細胞集団の一部である。
【０７６０】
多剤耐性
別の特定の態様では、本発明者らは、患者が異なる薬物で処置された時に、操作されたT細胞の選択を媒介する複数種の薬物に対して耐性のある同種異系T細胞を用いて「既成の」の免疫療法戦略を開発しようと試みた。多剤耐性同種異系T細胞を遺伝子操作することによって治療効率を大幅に上げることができる。このような戦略は、相乗効果を示す薬物組み合わせに応答する腫瘍を処置する際に特に有効な場合がある。さらに、複数の操作された耐性T細胞を増大し、最小用量の薬物薬剤を用いて選択することができる。従って、本発明による方法は、前記T細胞に多剤耐性を付与するためにT細胞を改変する工程を含んでもよい。前記多剤耐性は、複数種の薬物耐性遺伝子を発現させることによって、または複数種の薬物増感遺伝子を不活化することによって付与することができる。別の特定の態様では、多剤耐性は、少なくとも1種類の薬物耐性遺伝子を発現させることによって、または少なくとも1種類の薬物増感遺伝子を不活化することによって前記T細胞に付与することができる。特に、多剤耐性は、少なくとも1種類の薬物耐性遺伝子、例えば、DHFRの変異型、IMPDH2の変異型、カルシニューリンの変異型、MGMTの変異型、ble遺伝子、およびmcrA遺伝子を発現させることによって、ならびに少なくとも1種類の薬物増感遺伝子、例えば、HPRT遺伝子を不活化することによって前記T細胞に付与することができる。好ましい態様では、多剤耐性は、HPRT遺伝子を不活化し、DHFRの変異型を発現させることによって；HPRT遺伝子を不活化し、IMPDH2の変異型を発現させることによって；HPRT遺伝子を不活化し、カルシニューリンの変異型を発現させることによって；またはHPRT遺伝子を不活化し、MGMTの変異型を発現させることによって；HPRT遺伝子を不活化し、ble遺伝子を発現させることによって；HPRT遺伝子を不活化し、mcrA遺伝子を発現させることによって付与することができる。
【０７６１】
薬物耐性同種異系T細胞を操作する方法：
癌療法および同種異系T細胞の選択的生着を改善することを目的として、化学療法剤の毒性副作用から前記細胞を保護するために前記細胞に薬物耐性が付与される。薬剤感受性細胞と比べて薬物耐性遺伝子を発現するT細胞が生き残り、増加するので、T細胞の薬物耐性はインビボまたはエクスビボでの前記細胞の濃縮も可能にする。特に、本発明は、免疫療法に耐性がある同種異系かつ薬物耐性のT細胞を操作する方法でに関し、本方法は、
（a）T細胞を準備する工程；
（b）少なくとも1種類の薬物を選択する工程；
（c）T細胞受容体(TCR)成分をコードする少なくとも1つの遺伝子を不活化することによって前記T細胞を改変する工程；
（d）前記T細胞に薬物耐性を付与するようにT細胞を改変する工程；
（e）前記薬物の存在下で前記操作されたT細胞を増大する工程
を含む。
【０７６２】
少なくとも5つの用量の本発明の操作された免疫細胞を含む試料が薬物耐性になるように操作されてもよい。
【０７６３】
臨床試験
以下の臨床試験に向けられた、それぞれの態様は本発明の一部であり、そのようなものとして請求され得る。フルダラビン、シクロホスファミドを3〜4日間投与した4つの臨床研究からの液体癌(liquid cancer)(CLL、NHL、AML)患者データを、本発明によるn個の薬学的単位用量のセットまたはキットと組み合わせ、再発性または難治性の癌(CLL)および低悪性度非ホジキンリンパ腫(NHL)をもつ患者を処置するのに使用した。
【０７６４】
使用した用量およびタイミング：
患者をフルダラビン25mg/m2 i.v.で3日間または24mg/m2経口で5日間、シクロホスファミド250mg/m2 i.vで3日間または150mg/m2経口で5日間処置した。
【０７６５】
別の例として：
処置は、2〜4日目でのフルダラビン(F)25mg/m(2)/日、2〜4日目でのシクロホスファミド(著作権) 250mg/m(2)/日、2日目でのミトキサントロン(M)6mg/m(2)、および1日目でのリツキシマブ375mg/m(2)にあった。サイクル2〜6については、FCMは1日目にR 500mg/m(2)と共に開始した。ペグフィルグラスチム(組換えヒトG-CSF)を各サイクルと共に投与する。サイクルを4〜6週間ごとに繰り返し、それぞれのサイクルの後に、操作された細胞の単位用量を投与する。細胞(6.25x106細胞/kg)は、同種異系TCR陰性(3％TCR+未満)CD123 CAR陽性、CD52またはdcK欠損であり、3〜4回投与した。
【０７６６】
CTLおよび抗体応答を測定した。操作された免疫細胞に由来する抗原によって運ばれる同じ抗原に反復曝露されたのにもかかわらず、これらの患者では既往反応は測定されなかった。
【０７６７】
以前の報告書では、数用量のCART T(自己状況)を注入した患者において、抗CAR応答だと突き止められた免疫応答を生じたと開示された(Hege et al.,2017)。
【０７６８】
ここでのデータから、本研究に従って選択および操作されたUCARTは、有害な免疫応答を誘導することなく同じリンパ球枯渇患者Pに数回投与できることが証明された。実際に、(同じ最終用量2x1.105)の単回細胞注射と比較した時に再投薬によって同種異系T細胞が良好に生着した。これは、少なくとも部分的には、細胞に由来する抗原の内容、細胞表面での、これらの抗原の量、およびリンパ球枯渇下では宿主免疫/系/応答が相対的に非効率であることが原因である可能性が高い。実際、ここで使用した細胞を、免疫原性を最小限にするか、または妨害さえするように操作し(TRAC遺伝子およびβ2ミクログロブリン遺伝子のTALEN不活化後には検出可能なレベルのTCRおよびMHC-1は無かった)、(HLAクラスIIについて)免疫応答を低減するように選択した。
【０７６９】
UCART123で処置したAML患者
UCART123は、AML患者に静脈内投与された、UCART123の第1相、ファースト・イン・ヒューマン、非盲検、用量設定試験である(詳細については、AML123(急性骨髄性白血病におけるUCART123-ClinicalTrials.gov Identifier:NCT03190278を参照されたい)。
【０７７０】
この研究は、2つの期、再発性または難治性のAML患者における用量漸増期と、再発性/難治性のAMLまたは新たに診断されたAMLの患者および予後不良における用量展開(dose-expansion)期からなる(Dohner et al.,2010; Rollig et al.,2011)。
【０７７１】
用量
活性が観察される用量レベルで用いられるUCART123用量を用量展開期で使用した。
【０７７２】
用量レベルの増加:1つの試料UCARTを用いた(DL)
DL1を6.25x104〜2.5x105個のUCART123細胞/kgへと増やした。DL2&DL3は、それぞれ、6.25x105個および5.05x106個であった。
【０７７３】
次いで、処置間隔を42日から28日に、次に14日へと短縮することができた。
【０７７４】
処置はUCARTの注射である。
【０７７５】
リンパ球枯渇レジメン：
患者をリンパ球枯渇レジメンによって、フルダラビン30mg/m2/日IVを用いて-5日目〜-2日目で4日にわたって15〜30分間、シクロホスファミド750mg/m2/日IVを用いて-4日目〜-2日目で3日にわたって1時間処置した。その後に、用量漸増期は、1.25×105細胞/kg〜5.05×106細胞/kgに及ぶ4用量のUCART123を注射することからなった。
【０７７６】
検出不可能まで和らげられた、CARおよび/またはCART細胞の副作用(神経毒性)、免疫原性を許容するレベルにリンパ球枯渇を維持するために、組成、安全性、生物学的活性、および/または臨床活性の観察時の用量に応じてリンパ球枯渇レジメン(用量、注射間の時間)を変更することができた。
【０７７７】
用量制限毒性定義：
用量制限毒性(DLT)は、試験責任者によって白血病、介入疾患、または併用薬と無関係だと評価され、UCART123に関連するとみなされ、かつ予め決められた特定の判断基準を満たす、DLT観察期間中(例えば、0日目から28日、もしくは骨髄化生を28日目に患者が経験していれば0日目から42日)に観察された(食欲不振および疲労を除く)有害事象、または異常検査値である。試験責任者またはDSMBの見解ではDLTとして適格である、他の任意の容認できない毒性に遭遇した。
【０７７８】
DLT観察期間：
残存AMLの非存在下で<5％の細胞充実性によって定義される無形成性骨髄をもつ患者を除いて、DLT観察期間は初回UCART123投与の0日目から28日間である。無形成性骨髄をもつ患者の場合、DLT観察期間は、骨髄を再評価するために42日目まで延長される。
【０７７９】
UCART123連続投与：
いくつかのUCART細胞バッチを本発明に従って調製し、UCART1、UCART2、UCART3、UCART4、およびUCART5と名付けた。本発明の方法に従って共通HLAアレルをもたないようにドナーバンクにおいて選択された5つのUCART細胞試料は5つの異なるバッチに対応した。
【０７８０】
患者を登録し、および患者のMHCが分かったら、患者のHLA IおよびIIにマッチするHLA IおよびIIを有する試料を調製した。
【０７８１】
（i）第1のUCART123投与後、完全寛解しているがフローサイトメトリーによってMRD≧0.1％であるか、部分寛解しているか、または安定病態を有するか、あるいは（ii）完全寛解に達し、フローサイトメトリーによってMRD<0.1％であったが、その後に再発したかに応じて、UCART1注射後のDLT観察期間中にDLTを経験しなかった患者には、試験責任者が推奨し、治験依頼者(Sponsor)が同意したら、UCART123(UCART1 DL2&DL3またはUCART2)の第2の投与が考慮された。
【０７８２】
第2のUCART123用量(UCART2)を与えた患者には、必要であれば新たなリンパ球枯渇後に、(第1の投与と同じモダリティーに従って)第1の投与と同じ用量レベルのUCART123(UCART1)を与える。注目すべきことに、全試験期間の間に安全性および効力のデータを分析したが、MTDの決定は、初回UCART123投与後のDLT観察期間の結果にしか基づいていない。
【０７８３】
第1の研究では、UCART1およびUCART2は両方とも同じドナーに由来する同種異系細胞である。継続中の異なる研究の部門は、注射(再投薬、2つの異なる用量(異なる数の細胞)の注射、ならびに同じ試料UCART1、または2つの試料UCART1およびUCART2を用いた2つの同一の連続用量の注射)を繰り返すことに対応した。
【０７８４】
UCARTのHLA：
UCART細胞のGMP生産のためにUSおよびEP規制要件に従って、健常ボランティアドナーからの新鮮な、または凍結した単核細胞(MNC)を提供する、カリフォルニア州の血液バンクであるHEMACAREによる、それぞれの細胞ドナーを対象にしてHLAクラスIおよびクラスIIアレルの高精度DNAタイピングを行った。
【０７８５】
HLAタイピングは、HLAクラスI(-A、-B、-C)およびHLAクラスII(-DR、-DQおよび-DP)遺伝子座に対して行ったタイピング分析に基づいて、配列特異的プライマーを用いたゲノムDNA増幅によって、および/または配列決定によって行った。
【０７８６】
患者の既存の免疫 - 同種異系の操作されたUCART免疫細胞を1回または数回注射した後に免疫が生じた
免疫細胞で一度も処置されたことのない患者(同種異系の細胞、血小板または移植片に一度も曝露されたことのない患者、すなわち、ナイーブ患者)ではUCART単回注射によって既往反応が誘導された可能性は低かった。実際に、既往反応を誘発するためには、患者は、抗原に対する免疫応答を開始し、次いで、同じ抗原に再曝露されなければならない。
【０７８７】
従って、このようなナイーブ個体におけるMHCに対する既存のAbの測定は任意の場合があるが、対照として、およびバックグラウンド免疫の測定のために行われた。
【０７８８】
従って、あらゆる処置の前に、患者に抗HLA抗体が存在するかどうか、特に、患者が免疫細胞(血小板、T細胞、骨髄移植片…)による処置から既に利益を得ているかどうか評価した。従って、以前に免疫細胞または血小板の輸血から利益を得た、それぞれの登録患者の血清(1：2〜1：20000の段階希釈)を、抗HLA抗体が存在するかどうか分析した。
【０７８９】
対照として、以前に免疫細胞または血小板の輸血から利益を得なかった、それぞれの登録患者の血清を分析した。
【０７９０】
抗HLA Abが存在するかどうか、処置前に1回、処置後には様々な時間で、UCART2後の82日目まで連続処置を行うたびに血清を分析した。
【０７９１】
抗体スクリーニングおよび特異性を、半定量固相蛍光ビーズアッセイ、例えば、Lab Screen Single Antigen Assay(One Lambda, Thermo Fisher)を用いて分析した。
【０７９２】
このフローサイトメトリー方法では、組換え単一抗原HLA分子でコーティングしたマイクロビーズを使用した。
【０７９３】
患者から得られた血清を蛍光ビーズとインキュベートした。ビーズ上の抗原と結合した、試験血清中に存在する、あらゆるHLA抗体をフィコエリトリン(PE)結合ヤギ抗ヒトIgGで標識した。
【０７９４】
次いで、フローサイトメトリーを用いて、各ビーズからのPEおよび色素シグネチャーの蛍光発光を同時検出した。HLA特異性を割り当てるために、試験血清の反応パターンを各抗原の色素シグネチャーのリストと比較した。抗体反応性の強度の近似値を平均蛍光強度(MFI)から導き出した。予め規定されたMFI閾値を超える値を陽性とみなした。
【０７９５】
インビトロCTL
患者が、HLA分子に対して、および/または1回目のUCART注射後ではUCART産物に対して免疫応答(CTL、Ab)を生じた可能性を評価するために、IFNγ、自己状況と比較する時には同種異系状況下のCTL活性を測定する試験を開発した。
【０７９６】
UCART1のHLAアレルが患者のHLA分子にマッチしなければ、UCART2がUCART1と共通アレルをもたないので、患者はUCART1に対して免疫応答を生じるが、患者がUCART2に対する既往反応を生じないという仮説を試験するために、これらの試験を適合させた。数回の試験。
【０７９７】
UCARTに対するT細胞性免疫応答を、UCART細胞に応答した増殖によって測定した。このようなアッセイでは、UCART療法の前後に得られた患者由来リンパ球を、プレート結合抗原を用いて活性化したUCART細胞と共培養し、共培養を準備する前に放射線照射する。5日間の共培養後に、細胞増殖を3H-チミジンの取り込みによって測定した。対照として、UCART細胞の存在下での増殖を、UCART細胞の非存在下での増殖と比較することができる、または(TRAC、B2-ミクログロブリン、もしくはCIITA遺伝子の不活化により)TCRもしくはMHCクラスI/IIを発現しないUCART細胞と同じドナーに由来するT細胞と比較することができる。
【０７９８】
インターフェロンγ(IFNγ)活性
UCARTに対するT細胞性免疫応答の可能性も、MLR-エリスポットアッセイを用いて評価した。このアッセイでは、UCART細胞を、UCART療法の前後に得られた患者に由来するPBMCと共培養した。
【０７９９】
利用したUCART細胞をプレート結合抗原によって活性化し、放射線照射した。共培養後、患者の細胞を、精製された抗インターフェロン-γモノクローナル抗体でコーティングした96ウェルエリスポットプレート中でインキュベートした。次いで、プレートをストレプトアビジンアルカリホスファターゼおよび比色基質を用いて発色させた。次いで、可視化したスポットを計数した。これはインターフェロン-γ陽性細胞を示した。
【０８００】
対照は、単独で培養した患者PBMC、(TRAC、B2-ミクログロブリン、もしくはCIITA遺伝子のTALEN不活化のために)TCRもしくはMHCクラスI/IIを発現しないUCART細胞と同じドナーに由来するT細胞と共培養したPBMC、またはスティミュレーター(stimulator)細胞と共培養したPBMCを含んだ。
【０８０１】
患者に由来するPBMCも、UCART細胞による処置前に、ならびにUCART投与後のいくつかの時点で(すなわち、D28、D56、D84、およびその後、3〜6ヶ月ごとに)分析した。UCART投与後の、またはTCRもしくはMHCクラスI/IIを発現しないT細胞を含有する対照反応と比較したIFNγ産生細胞数の増加を測定して、患者におけるアロ抗原特異的T細胞の存在を評価することができる。
【０８０２】
この方法を、UCARTの連続用量(利用可能なドナーのバンクにおいて選択された5つの用量の試料)によって処置した患者における免疫応答を検出するために使用した。
【０８０３】
CTL活性
CFSE標識：
標的細胞(UCART1〜5)を室温、107細胞/mlでPBSに再懸濁した。PBMC 1mlごとに2μlの10mM CFSE溶液を添加し、5秒ボルテックスすることによって混合した。光から保護した状態で37℃で10分間インキュベートした後に、細胞を、同じ体積の胎仔ウシ血清を用いてオリジナルの標識から1回洗浄した。細胞を遠心分離(5分、300g)によってペレット化し、2回目に新鮮な培養培地を用いて洗浄した。さらなる遠心分離の後に、機能アッセイのために細胞を106細胞/mlで完全培養培地に再懸濁した。
【０８０４】
インビトロアロ反応性：
ある特定の個体A(例えば、患者)が、別の個体B(例えば、UCAR T細胞を産生するためのドナー)に由来する細胞に対してアロ反応性を発生したかどうか確かめるために、各個体に由来するT細胞をインビトロ細胞傷害性アッセイにおいて使用した。エフェクターとして使用した細胞(個体Aに由来する)が標識されないままであった場合、標的として使用した細胞(個体Bに由来する)をCFSE標識した。次いで、2つの細胞集団を混合し、様々なエフェクター:標的(E:T)比で完全培養培地中でコインキュベートした。37℃で5時間後に、Bに対するAの細胞傷害性を、fixable viability dye eFluor780(eBioscience)で細胞を標識し、CFSE標識集団の生存をフローサイトメトリーによって測定し、それと並行して、Aからのエフェクター細胞が存在せずにインキュベートしたCFSE標識細胞の生存と比較することによって評価した。
【０８０５】
細胞への放射線照射：
全ての標的細胞放射線照射をFlaxitronのCellRad計器において製造業者の推奨に従って20ラドで行った。
【０８０６】
ドナー特異的アロ反応性細胞集団の作製：正の対照
ドナー特異的アロ反応性T細胞集団を作製するために、個体Aに由来する106個のPBMC(エフェクター)を、1mlの完全培養培地中で、同種異系ドナーBに由来する106個のCFSE標識した放射線照射済みPBMC(標的)と7日間共培養した(プライミング反応)。1週目の後に、プライミング反応から106個のエフェクター細胞を計数し、同じ同種異系ドナーBに由来する106個のCFSE標識した放射線照射済みPBMC標的を用いて7日間再曝露した(二次曝露)。2週目の後に、二次曝露から106個のエフェクター細胞を計数し、同じ同種異系ドナーに由来する106個のCFSE標識した放射線照射済みPBMC標的を用いて7日間再曝露した。
【０８０７】
CTL活性を測定するための試験を準備するために、抗HLA抗体を示した1人の患者の血清および免疫細胞ならびに該患者に輸血された細胞も使用した。
【０８０８】
この試験を連続用量のUCART(UCART1、UCART2、UCART3、UCART4、UCART5)で処置した患者においてCTL活性を測定する目的で適合し、使用した。
【０８０９】
参考文献：
2020530277.tif 000040
2020530277.tif 000041
【０８１０】
結果
各細胞ドナーに対して行ったHLAクラスIおよびクラスIIアレルの高精度DNAタイピングの結果の一例をここに記載する。
【０８１１】
HLAタイピングを、配列特異的プライマーを用いたゲノムDNAの増幅によって、ならびに/またはHLAクラスI(-A、-B、-C)ならびにHLAクラスII(-DR、-DQ、および-DP)遺伝子座に対して行った、配列決定に基づくタイピング分析によって行った。
【０８１２】
2020530277.tif 000042
【０８１３】
HLAタイピングを、配列特異的プライマーを用いたゲノムDNAの増幅によって、および/またはDNA配列に基づくタイピングによって行った。
【０８１４】
ドナー特定および結果を無関係の2人によって分析および確認した。
【０８１５】
抗体価
UCART123を連続注射した患者から得られた血清において、前の処置と反応した抗UCART抗体は検出できず、以前の処置に対するCTL活性は検出未満のままであった(Eは活性化されず、E：T=1で0.25超である)。
【０８１６】
本発明者らは、既往反応が検出されなかったと結論づけた。
【０８１７】
CTL活性を測定するための試験
最初に、自身の放射線照射済み細胞(A：A)(自己由来)または別のドナーBに由来する放射線照射済み細胞(A：B) (同種異系)を用いて1回、2回、または3回刺激した免疫細胞の細胞傷害性を測定した。この目的のために、これらの「選択された」エフェクター細胞(刺激される細胞)を、自身のCFSE標識した標的細胞(A：A+A)または曝露されたドナーに由来するCFSE標識した標的細胞(A：B+B)との様々なエフェクター：標的比(5、10、15、20、25、30)とインキュベートした。
【０８１８】
標的生細胞の100％を求めるために、CFSE標識した標的細胞を単独でもインキュベートした。
【０８１９】
少なくとも24時間〜5日インキュベートした後に、生細胞をフローサイトメトリーによって分析した。
【０８２０】
図5は、エフェクターの存在下での1ウェルあたりの標的生細胞数を、エフェクターの非存在下での標的生細胞数で割ったものの比を示す。
【０８２１】
図5の結果から、ドナーBに由来する放射線照射済み細胞を用いた連続曝露によって得られたドナーAに由来するエフェクター細胞は、ドナーBに由来する細胞に対して特異的な細胞傷害性を示し、自身の細胞(自己)に対して特異的な細胞傷害性を示さないことが証明された。HLAクラスI陰性およびTCR陰性のT細胞を得るために、B2M遺伝子を標的とするTALENとTRAC遺伝子を標的とするTALENを用いてトランスフェクトした標的細胞を用いて類似実験を行った。フローサイトメトリー分析前に、HLA ABC特異的抗体およびTCRαβ特異的抗体も用いて細胞を染色した。図6は、HLA ABC-TCR陽性細胞がアロ反応性エフェクター細胞に対して感受性があるのに対して、HLA ABC-TCR陰性であるB2M-TRAC KO細胞は、アロ反応性エフェクター細胞による細胞傷害性に対して耐性があることを示す。
【０８２２】
これにより、この試験において観察された細胞傷害性は、標的とエフェクターの間での同種異系TCR-MHC相互作用によって媒介されることが裏付けられる。さらに、この試験によって、CTLを作製できるかどうか、どのHLAが関与するかを特定することができた。
【０８２３】
これらのデータによって、様々なUCART細胞試料を用いて処置した個体において既存のCTL活性または獲得されたCTL活性を測定するための閾値が得られた。
【０８２４】
従って、この試験を用いて、UCARTで連続的に処置した患者においてCTL活性を特定して、（i）自身(自己)、（ii）患者のHLAにマッチする異なるドナー、（iii）患者のHLAにミスマッチし、共通アレル(HLA-A、B、C、およびDR)をもたない異なるドナーからの連続用量のUCARTを用いて処置した時に既往反応を個体が生じ得るかどうか示す/予測した。
【０８２５】
抗CAR T免疫
血小板を輸血した患者の血清を用いて得られた結果から、免疫細胞が輸血された患者は、本発明者らの試験において検出することができる輸血細胞に対して免疫(抗HLA Ab)を生じる可能性があると示唆された。
【０８２６】
（i）放射線照射済みUCARTとエフェクター細胞の共培養物中のCTL活性、および（ii）2用量のUCART1または2つのUCART1、次にUCART2を注入した患者の血清中の抗HLA抗体を測定することによって得られた結果から、免疫細胞を輸血した免疫枯渇患者は、第1の輸血細胞に対しても第2の輸血細胞に対しても免疫(抗HLA Ab、CTL)を全く生じない可能性があることが示唆された。
【０８２７】
実際に、結果から、同種異系UCART1で処置した患者では、1：2に希釈した血清中に、および循環免疫細胞において、UCART1移植片に対する免疫(抗HLA Ab、CTL)が検出されないことが分かった。
【０８２８】
UCART細胞のレベルが10日目〜30日目に急落し、次いで崩壊するという観察は、免疫枯渇宿主においてCARTが増殖し、少なくとも一時的に移植できるという事実と合致する。このことは、注射後、様々な時間で血中のUCART1量の減少(d10〜15に急落し、次いで、d42、d56およびd84で検出不可能になるまで減少する)を測定し、(同じUCARTと、患者のHLAにマッチするHLAを用いて)UCART2を注射した際の、注射後、同じレベルまたはさらに大きなUCART2レベルの第2の急落を検出することによってインビボで再確認された。
【０８２９】
UCART1と共通のHLA A B CおよびDRアレルがないUCART2を注射すると、UCART1に対するAbレベルは血清中ではバックグラウンドレベルのままであり、UCART1の検出可能な抗HLA Abレベルは測定されなかった。これらの患者では、UCART1に対するCTL 活性もUCART2に対するCTL活性も検出されなかった。最後に、5つの放射線照射済みUCART細胞の連続的試料(Cellectisによって開発された方法に従って選択した)のそれぞれに対するCTL活性を、それぞれのUCART細胞注射前、および注入して14日後または45日後に収集し、2用量のUCART1 5.05x106)で処置した患者の免疫細胞を用いて測定した。収集した細胞を活性化しないか、または抗CD3/CD28 Abを用いて1回活性化し、次いで、放射線照射済みUCARTに曝露した。
【０８３０】
予想通り、UCART1およびUCART2を用いて処置した2人の患者は、投与したUCART1に対して(比0.2：1および1：1のE：Tで)検出可能なCTL活性を生じなかった。
【０８３１】
(標的として使用した)放射線照射済みUCART2、UCART3、UCART4、またはUCART5に対して試験した時に、UCART1に対するCTL活性は、比E：T=1およびE：T=5では検出することができなかった。
【０８３２】
まとめると、これらのデータから、5つのUCART用量の本発明の同種異系細胞からなる試料は、既往反応を誘導することなく患者に連続投与され得ることが示唆された。
【０８３３】
まとめると、これらのデータから、インビトロでCTL活性を検出して、UCART細胞で処置した患者において生じたCTL活性を測定できることが分かった。適切に、かつ本発明に従って選択された時に、さらに操作された細胞を安全に用いて、連続注射を必要とする病態を処置することができる。
【０８３４】
従って、本発明は、以下を提供する：
細胞のMHCが患者のものであるか、もしくはこれにマッチする免疫療法用の操作された細胞を連続投与用のリンパ球枯渇レジメンと組み合わせて含む、少なくとも5つの試料のキット、
細胞のMHCが互いに共通アレルをもたない免疫療法用の操作された細胞を連続投与用のリンパ球枯渇レジメンと組み合わせて含む、少なくとも5つの試料のキット、
連続免疫療法用の前記試料を調製するための方法、または
連続免疫療法を対象にしたキット内の複数の用量の細胞に対する交差CTL活性を分析するためのインビトロ方法であって、
連続免疫療法を対象にしたキット内の細胞のMHCが患者Pに由来するものであるか、もしくは患者Pのものにマッチするか、または共通アレルがPのものにマッチしなければ、連続免疫療法を対象にしたキット内の細胞のMHCが互いに共通アレルをもたない、連続免疫療法を対象にしたキット内の複数の用量の細胞を準備する工程、
任意の処置の前に、および1用量のCART細胞、好ましくはUCART細胞を用いた処置の後に(処置が終了して少なくとも3ヶ月後に)Pから単離した免疫細胞を、連続免疫療法を対象にしたキット内の連続用量の細胞中の細胞に対して細胞溶解活性があるかどうか分析する工程、
それぞれの処置の後に、および使用したUCARTのそれぞれに対して分析を繰り返す工程、
任意で、任意の処置の前に、および1用量のCART細胞、好ましくはUCART細胞を用いた処置の後に(処置が終了して少なくとも3ヶ月後に)Pから単離した免疫細胞を、任意の処置の前に、および1用量のCART細胞、好ましくはUCART細胞を用いた処置の後に(処置が終了して少なくとも3ヶ月後に)Pの血清中にある抗体の存在下で、連続免疫療法を対象にしたキット内の連続用量の細胞中の細胞に対して細胞溶解活性があるかどうか分析する工程((図5に記載のような試験において)1：1のE：Tで3〜5日間インキュベートした後に、細胞溶解活性(E+Tの中にある生細胞/生細胞のみの比)が0.5未満、好ましくは約0.25である場合)
を含む、方法。
【０８３５】
付属書類1
HLA系因子の命名法
2016年6月
HLA系因子のWHO命名委員会のSteven G. E. Marshにより編集された
・  HLA(2016) 88:142-51.
・  Human Immunology (2016) 77:1309-17.
・  International Journal of Immunogenetics (2016) 43:320-9.
において公開された
【０８３６】
以下の配列は、2016年5月の命名更新から命名委員会に提出されており、ポリシー同意後、公式のアレル名称が割り当てられた(1)。全配列の全詳細が、この次の報告書において報告される。
【０８３７】
新たに割り当てられた配列(表A1)および以前に報告された配列の確認(表A2)を下記に列挙する。各配列のアクセッション番号が与えられ、これらをEMBL、GenBank、またはDDBJデータライブラリーから配列ファイルを検索するのに使用することができる。アクセッション番号がデータライブラリーによって割り当てられており、既にほとんどの配列を利用することができるが、著者が配列の公表をまだ許可していない可能性がある。このような場合、投稿著者に直接連絡を取らなければならない。新配列に関するさらなる情報は、これらのアレルについて述べた刊行物に収録されることが多い。新たなHLA配列について述べた最近の刊行物のリストを表A3に示した。
【０８３８】
現在、全ての新たな配列および確認配列は、提供された配列提出ツールを用いてIMGT/HLA データベース経由でHLA系因子のWHO命名委員会に直接提出しなければならない(2)。IMGT/HLA データベースへは、ワールドワイドウェブhttp://ww.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/経由でアクセスすることができる。
【０８３９】
(表Ａ１)新たな配列
2020530277.tif 000043
2020530277.tif 000044
2020530277.tif 000045
2020530277.tif 000046
2020530277.tif 000047
2020530277.tif 000048
2020530277.tif 000049
2020530277.tif 000050
2020530277.tif 000051
2020530277.tif 000052
2020530277.tif 000053
2020530277.tif 000054
2020530277.tif 000055
【０８４０】
(表Ａ２)確認配列
2020530277.tif 000056
2020530277.tif 000057
2020530277.tif 000058
2020530277.tif 000059
2020530277.tif 000060
2020530277.tif 000061
2020530277.tif 000062
2020530277.tif 000063
2020530277.tif 000064
2020530277.tif 000065
2020530277.tif 000066
2020530277.tif 000067
2020530277.tif 000068
2020530277.tif 000069
2020530277.tif 000070
2020530277.tif 000071
2020530277.tif 000072
2020530277.tif 000073
2020530277.tif 000074
【０８４１】
(表Ａ３)最近発表された配列
2020530277.tif 000075
【０８４２】
参考文献:
2020530277.tif 000076
【図１】
2020530277.tif 000077
【図２】
2020530277.tif 000078
【図３】
2020530277.tif 000079
【図４】
2020530277.tif 000080
【図５】
2020530277.tif 000081
【図６】
2020530277.tif 000082
【手続補正書】
【提出日】令和2年3月9日(2020.3.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
操作された細胞と薬学的に許容されるビヒクルとを含むn個の薬学的単位用量のセットまたはキットを調製するための方法であって、
（i）患者PのHLA分子および/またはHLAアレルをジェノタイピングおよび/またはフェノタイピングする工程、
（ii)(a）Pの細胞に由来するHLA分子および/またはHLAアレルに完全にマッチする細胞の試料、あるいは
（a'）Pと比較した時に可能な限り少ない数のミスマッチを有する細胞の試料であって、任意で、該細胞が、Pの細胞に由来するHLA分子および/もしくはHLAアレルにマッチするようにさらに遺伝子組換えされているか、または該細胞が任意の潜在的に既往性の分子を発現しないようにさらに遺伝子組換えされている、試料
を選択することによって、ヒトドナーからの細胞の少なくとも5つの試料を選択および/または準備する工程、
（iii）少なくとも1種類のキメラ抗原受容体（CAR）もしくは1種類のT細胞受容体（TCR）を導入することによって、および/またはTCR遺伝子の少なくとも1種類の成分を不活化することによって、細胞を改変する工程
を含む、方法。
【請求項２】
HLA分子が、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DR、およびその組み合わせから選択される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
（a'）の試料のHLAがPのHLAの80％超にマッチする、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
細胞の試料を選択する工程が、HLA-A、HLA-B、およびHLA-DR遺伝子におけるトリプルホモ接合体を選択することを含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
細胞の試料を選択する工程が、HLA-A、HLA-B、およびHLA-DR遺伝子のうちの2つにおけるダブルホモ接合体を選択することを含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
ドナーが、
（i）データベースにおける自身のHLAタイピングの頻度、
（ii）他のドナーと比較した時の自身のHLAタイピング、ならびに
任意で、（iii）少なくとも6/6、好ましくは10/10のHLAアレルマッチングで分析および選択するコンピュータソフトウェアまたはプログラムを用いたPとのマッチングのレベル
に基づいて選択される、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
既往反応および移植片対宿主病のリスクを下げることを目標として、患者において、異なるドナーから生じた同種異系末梢血細胞の連続（N=移植片の数）処置を実施する使用のための連続注射用量のセットを調製するための方法であって、
（a）ドナーバンクに含まれる5人のドナーからなるいくつかの群をランダムにサンプリングする工程、
（b）HLA-A、HLA-B、およびHLA-DRアレルについて該群内の5人のドナーの遺伝子型を比較する工程、
（c）共通するHLA-A、HLA-B、およびHLA-DRアレルを示さない5人のドナーからなる群を選択する工程、
（d）工程（c）から得られた群において、該患者の民族集団の少なくとも80％（fmin）、好ましくは90％超、さらにより優先的には95％超の遺伝子型との、HLA-A、HLA-B、およびHLA-DR対立遺伝子の少なくとも50％マッチを示したものを選択する工程、
（e）工程（d）から選択されたドナーのそれぞれに由来する同種異系末梢血細胞を操作して、該末梢血細胞におけるTCRの発現を低減させるかまたは損なう工程、
（f）任意で、血液試料から、操作された末梢血細胞を増大する工程、ならびに
（g）異なるドナーに由来する操作された末梢血細胞を別々に前処置する工程
を含む、方法。
【請求項８】
末梢血細胞が免疫細胞、好ましくはT細胞である、請求項7記載の方法。
【請求項９】
請求項1〜6のいずれか一項記載の方法によって入手可能なn個の薬学的単位用量のセットまたはキット。
【請求項１０】
表1に記載されたもののいずれか1つとしてのn個の薬学的単位用量のセットまたはキット。
【請求項１１】
請求項7または8記載の方法によって入手可能な連続用量のキット。
【請求項１２】
既往反応および移植片対宿主病のリスクが低い患者に連続注射するための異なる同種異系末梢血細胞を含む、少なくとも2つ、好ましくは少なくとも3つ、より好ましくは少なくとも4つ、さらにより好ましくは少なくとも5つの組成物を含むキットであって、該同種異系末梢血細胞が、それぞれ、HLA-A、HLA-B、およびHLA-DRアレルについてホモ接合性のドナーから選択され、該ドナーが、共通するHLA-A、HLA-B、およびHLA-DRアレルを共有しない、キット。
【請求項１３】
末梢血細胞がT細胞である、請求項12記載のキット。
【請求項１４】
末梢血細胞がT細胞受容体を不活化するように遺伝子操作されている、請求項12または13記載のキット。
【請求項１５】
末梢血細胞にはキメラ抗原受容体が付与されている、請求項12〜14のいずれか一項記載のキット。
【請求項１６】
癌を予防または処置するための免疫療法における医薬として使用するための、請求項9〜11のいずれか一項記載のn個の薬学的単位用量のセットまたはキット、または請求項12〜15のいずれか一項記載のキット。
【国際調査報告】
2020530277.tif 000083
2020530277.tif 000084
2020530277.tif 000085