(57)【要約】  大腸菌群及び大腸菌（Escherichia coli）微生物のコロニーを別個に計数するためのデバイスが提供される。本デバイスは、水不透過性の第１のシートと、第１のシートに取り付けられた水不透過性の第２のシートと、ラクトース発酵指示薬系、大腸菌中のβ−グルクロニダーゼ酵素活性を増強させる複数の化合物を含むβ−Ｄ−グルクロニダーゼ指示薬系、レドックス指示薬、及び第１のシートに接着された第１の冷水可溶性ゲル化剤を含む、乾燥した再水和可能な培養培地であって、微生物増殖ゾーン内に配置された、培養培地と、第２のシートに接着された第２の冷水可溶性ゲル化剤と、を含む。微生物増殖ゾーンは、第１のシートと第２のシートとの間に配置されている。このデバイスを使用する方法もまた提供される。
2020512832.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
大腸菌群及び大腸菌（Escherichia coli）微生物のコロニーを別個に計数するためのデバイスであって、前記デバイスが、
水不透過性の第１のシートと、
前記第１のシートに取り付けられた水不透過性の第２のシートと、
前記第１のシートに接着された乾燥した再水和可能な培養培地であって、前記培養培地が、
大腸菌群微生物の増殖を促進する有機窒素系栄養素と、
微生物増殖ゾーン内に配置され、かつＤ−ラクトース、β−ガラクトシダーゼの産生を増強する第１の誘導因子化合物、及びｐＨ指示薬を含む、ラクトース発酵指示薬系と、
前記増殖ゾーン内に配置され、かつ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド、及び大腸菌中のβ−グルクロニダーゼ酵素活性を増強する複数の化合物を含む、β−Ｄ−グルクロニダーゼ指示薬系と、
レドックス指示薬と、
非大腸菌群微生物の増殖を選択的に阻害する有効量の少なくとも１つの薬剤と、
第１の冷水可溶性ゲル化剤と、を含む培養培地と、
前記第１のシートと前記第２のシートとの間に配置された微生物増殖ゾーンであって、前記第１のシートに接着された前記培養培地の領域が、前記増殖ゾーンを画定する、微生物増殖ゾーンと、
前記第２のシートに接着された第２の冷水可溶性ゲル化剤と、を含み、
前記第１のシートは、前記培養培地が前記第２の冷水可溶性ゲル化剤に面するように、前記第２のシートに取り付けられている、デバイス。
【請求項２】
大腸菌中のβ−グルクロニダーゼ酵素活性を増強する前記複数の化合物のうちの第１の化合物が、メチル−β−Ｄ−グルクロニド及びフェニル−β−Ｄ−グルクロニドから選択される、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
前記レドックス指示薬が、ＴＴＣである、請求項１又は２に記載のデバイス。
【請求項４】
大腸菌中のβ−グルクロニダーゼ酵素活性を増強する前記複数の化合物のうちの第２の化合物が、Ｄ−グルクロン酸である、請求項１又は請求項２に記載のデバイス。
【請求項５】
前記第１のシート及び第２のシートが、それを通る二酸化炭素の通過を遅らせるように構成されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項６】
前記微生物増殖ゾーン内に配置されたＤ−グルクロン酸を更に含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項７】
前記第１のシートが、ポリエステルフィルムを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項８】
前記第２のシートが、ポリエステルフィルムを含む、請求項４〜７のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項９】
前記第２のシートが、ポリエチレンテレフタレートを含む、請求項８に記載のデバイス。
【請求項１０】
前記増殖ゾーンが、前記第１のシートに接着されたスペーサによって画定される、請求項１〜９のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１１】
前記冷水可溶性ゲル化剤が、グアーガムを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１２】
前記第１のシートに接着された前記培養培地が、約１３０ｍｇ／１００ｃｍ２〜約１９５ｍｇ／１００ｃｍ２のコーティング重量を有する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１３】
ラクトースが、前記第１のシートに接着された前記乾燥培養培地中に配置され、前記ラクトースが、前記乾燥培養培地中に、約８．５ｍｇ／１００ｃｍ２〜約２７ｍｇ／１００ｃｍ２のコーティング重量で存在する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１４】
前記培養培地が、水性液体で再構成されたときに、前記培養培地を約６．５〜約７．５のｐＨに緩衝するための試薬を更に含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１５】
前記ｐＨ指示薬が、スルホンフタレインｐＨ指示薬を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１６】
前記ｐＨ指示薬が、クロロフェノールレッド及びフェノールレッドからなる群から選択される、請求項１５に記載のデバイス。
【請求項１７】
前記有機窒素系栄養素が、酵母エキス、ブタペプトン、ゼラチンの酵素消化物、動物性ペプトンの酵素消化物、及び前述の有機窒素系栄養素のうちの任意の２つ以上の組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１８】
前記増殖ゾーンが、約１ミリリットル〜約５ミリリットルの所定の体積を有する水性液体を受容するように構成され、前記所定の体積を受容すると、大腸菌群コロニーの増殖を促進し計数を助ける水和培養培地を形成する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１９】
前記薬剤が、胆汁塩、ドデシル硫酸ナトリウム、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２０】
前記第２の冷水可溶性ゲル化剤が、乾燥粒子又は乾燥凝集粒子の形態で前記第２のシート上に配置されている、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２１】
β−ガラクトシダーゼの産生を増強する前記第１の誘導因子化合物が、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２２】
前記微生物増殖ゾーン内に配置された乾燥乳児用調整粉乳を更に含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２３】
試料中の大腸菌群及び大腸菌（Escherichia coli）微生物のコロニーを検出し、別個に計数するための方法であって、下記を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１７年４月３日に出願された米国特許仮出願第６２／４８０，６３３号の優先権を主張するものであり、その開示の全容が本明細書に参照により組み込まれる。
【０００２】
（背景技術）
食品及び飲料の安全性試験において、大腸菌群（coliform）の細菌が存在するかしないかは、重要な品質証拠であると考えられる。飲料及び特定の食品（例えば、乳製品）において許容される大腸菌群の細菌の量は、世界中の多くの国で規制されている。大腸菌群の細菌としては、大腸菌（Escherichia coli）などの糞便性大腸菌群が挙げられる。食品又は水試料中の糞便性大腸菌群の存在は、食品又は水の糞便汚染の主要な指標として、及び他の病原性微生物の存在の可能性の指標として使用される。
【０００３】
食品試料中の微生物を検出、識別、及び／又は計数する方法は、多くの場合、食品の性質、及び試料中に見られる可能性が高い微生物の種類に応じて異なる。食品試料を試験するための方法の概要としては、Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．により出版されているＳｔａｎｄａｒｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄａｉｒｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，２７．ｓｕｐ．ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、及びＵ．Ｓ．Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．により出版されているＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ（「ＢＡＭ」）が挙げられる。固形食品は、通常、水性媒体中に懸濁され、混合及び／又は粉砕されて、食品材料の液体ホモジネートを得ることができ、これは、定量的微生物分析の方法で使用することができる。
【０００４】
しかしながら、上記の方法は、一般的に比較的高価であり、複数の工程を伴い、コロニーを計測することができる前に約２４時間〜４８時間のインキュベーション時間を必要とし、かつ／又は比較的高度化された器具類及び／又は比較的高度に訓練された人材を必要とする。
【０００５】
食品及び飲料試料中の生存大腸菌群及び大腸菌（E. coli）微生物を計数するためのより速い方法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
概して、本開示は、試料中の微生物の検出及び任意選択的な計数に関する。具体的には、本開示は、半固体培養培地中で大腸菌群の細菌のコロニー形成単位（ＣＦＵ）を増殖させ、大腸菌群ＣＦＵ及び大腸菌ＣＦＵを別個に計数するために使用することができる培養デバイスに関する。本発明の培養デバイスは、大腸菌中のβ−グルクロニダーゼ活性を増強する複数の化合物を含み、β−グルクロニダーゼ陽性大腸菌Ｉ、例えば、構成的及び誘導性β−グルクロニダーゼ陽性大腸菌のコロニーを検出し、個別化させるのに特に有用であり、それによって、試料中に存在する微生物のより正確な計測を提供する。本培養培地は、典型的にはＴＴＣを含有し、これは、非βグルクロニダーゼ産生大腸菌群の細菌の個別化及び可視化を可能にし得る。加えて、デバイスで使用される培養培地は、典型的には、以前の薄膜培養デバイスよりも大腸菌群の細菌及び大腸菌（E. coli）の検出及び計数を迅速に提供する。
【０００７】
本開示はまた、培養デバイスの使用方法も提供する。本明細書に開示される本発明の方法は、大腸菌群及び大腸菌（E. coli）の細菌の増殖、検出、及び個別化を提供する。本方法は、大腸菌群及び大腸菌（E. coli）コロニーを計数するために薄膜培養デバイスを使用する先行方法よりも、複数の温度における（例えば、３５〜３７及び４２〜４４Ｃ）大腸菌群及び大腸菌（E. coli）コロニーのより迅速かつより正確な計数を可能にする。一態様では、本開示は、大腸菌群及び大腸菌（Escherichia coli）微生物のコロニーを別個に計数するためのデバイスを提供する。本デバイスは、水不透過性の第１のシートと、第１のシートに取り付けられた水不透過性の第２のシートと、第１のシートに接着された第１の冷水可溶性ゲル化剤を含む乾燥した再水和可能な培養培地と、第１のシートと第２のシートとの間に配置された微生物増殖ゾーンと、第２のシートに接着された第２の冷水可溶性ゲル化剤と、を含む。培養培地は、大腸菌群微生物の増殖を促進する有機窒素系栄養素、ラクトース発酵指示薬系、β−Ｄ−グルクロニダーゼ指示薬系と、テトラゾリウムクロリド指示薬、及び非大腸菌群微生物の増殖を選択的に阻害する有効量の少なくとも１つの薬剤を含み得る。第１のシートに接着された培養培地の領域は、増殖ゾーンを画定する。ラクトース発酵指示薬系は、Ｄ−ラクトースと、β−ガラクトシダーゼの産生を増強する第１の誘導因子化合物と、ｐＨ指示薬とを含む。β−Ｄ−グルクロニダーゼ指示薬系は、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニドと、大腸菌中のβ−グルクロニダーゼ酵素活性を増強する複数の化合物とを含む。第１のシートは、培養培地が第２の冷水可溶性ゲル化剤に面するように、第２のシートに取り付けられる。第１のシート及び第２のシートは、二酸化炭素のそれらの通過を遅らせるように構成されている。
【０００８】
上記の実施形態のいずれかにおいて、大腸菌中のβ−グルクロニダーゼ酵素活性を増強する複数の化合物のうちの少なくとも１つは、Ｄ−グルクロン酸である。上記の実施形態のいずれかにおいて、第１のシート及び／又は第２のシートは、ポリエステルフィルムを含み得る。上記の実施形態のいずれかにおいて、第２のシートは、ポリエチレンテレフタレートを含み得る。上記の実施形態のいずれかにおいて、増殖ゾーンは、第１のシートに接着されたスペーサによって画定され得る。上記の実施形態のいずれかにおいて、培養培地は、水性液体で再構成されたときに、培養培地を約６．５〜約８のｐＨに緩衝するための試薬を更に含む。上記の実施形態のいずれかにおいて、有機窒素系栄養素は、酵母エキス、ブタペプトン、ゼラチンの酵素消化物、動物性ペプトンの酵素消化物、及び前述の有機窒素系栄養素のうちの任意の２つ以上の組み合わせからなる群から選択される。上記の実施形態のいずれかにおいて、薬剤は、胆汁塩、ドデシル硫酸ナトリウム、及びこれらの組み合わせからなる群から選択され得る。
【０００９】
別の態様では、本開示は、ＴＴＣ還元と、構成的及び誘導性ベータグルクロニダーゼ発現とをそれぞれ介して、大腸菌群及び大腸菌（Escherichia coli）微生物のコロニーを別個に計数する方法を提供する。
【００１０】
「好ましい」及び「好ましくは」という語は、ある特定の状況下である特定の利益をもたらし得る本発明の実施形態を指す。しかしながら、他の実施形態もまた、同じ又は他の状況において好ましい場合がある。更にまた、１つ以上の好ましい実施形態の記載は、他の実施形態が有用でないことを含意するものではなく、他の実施形態を本発明の範囲から排除することを意図するものでもない。
【００１１】
用語「含む（comprises）」及びその変化形は、これらの用語が本明細書及び特許請求の範囲に現れる場合、限定的な意味を有するものではない。
【００１２】
本明細書で用いる場合、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、「少なくとも１つの（at least one）」、及び「１つ以上の（one or more）」は、互換的に用いられる。したがって、例えば、栄養素は、「１つ以上の」栄養素を意味するように、解釈され得る。
【００１３】
用語「及び／又は」は、列挙された要素のうちの１つ若しくは全て、又は列挙された要素のうちの任意の２つ以上の組み合わせを意味する。
【００１４】
また、本明細書において、端点による数値範囲の記載は、その範囲内に包含される全ての数を含む（例えば、１〜５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５などを含む）。
【００１５】
上記の本発明の概要は、本発明について開示される各実施形態又は全ての実施の記載を意図したものではない。以下の説明は、例示的な実施形態をより具体的に例示する。本出願を通していくつかの箇所において、例を列挙することによって指針が示されるが、それらの例は様々な組み合わせで使用することができる。いずれの場合にも、記載された列挙は、代表的な群としての役割のみを果たすものであり、排他的な列挙として解釈されるべきではない。
【００１６】
これら及び他の実施形態の更なる詳細については、添付の図面及び下記の説明において示す。他の特徴、目的及び利点は、説明及び図面から、かつ特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
本発明は、添付図面を参照して更に説明され得る。
【００１８】
【図１】本開示による好ましい微生物増殖デバイスの上面斜視図、部分的に断面図である。
【００１９】
【図２】図１のデバイスの断面図である。
【００２０】
【図３】図１のデバイスの第１のシート又は第２のシート上に印刷され得るグリッドパターンの上面図である。
【００２１】
上記で特定された図面は、本開示のいくつかの実施形態を説明するものであるが、本明細書で論議されるとおり、他の実施形態もまた企図される。全ての場合において、本開示は、限定ではなく代表例の提示によって、本発明を提示する。当業者によって多数の他の改変及び実施形態が考案され得、それらは、本発明の原理の範囲内及び趣旨内に含まれることを理解されたい。図面は、縮尺どおりに描かれていない場合がある。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本開示のいずれかの実施形態の詳細な説明に先立ち、本発明はその適用において、以下の説明に記載又は以下の図面に例示の構成の詳細及び構成要素の配置に限定されるものではないことを理解されたい。本発明は、他の実施形態も可能であり、様々な方法で実践又は実行することが可能である。また、本明細書において使用される語法及び専門用語は説明を目的としたものであり、限定するものとみなしてはならないことを理解されたい。本明細書における「含む（including）」、「含む（comprising）」、又は「有する（having）」、及びこれらの変化形の使用は、その後に列記される項目及びこれらの同等物、並びに追加的な項目を包含することを意味する。別途特定又は限定されない限り、「接続される（connected）」及び「連結される（coupled）」という用語、並びにそれらの変化形は、広い意味で使用されるものであり、直接的及び間接的な接続及び連結の両方を包含する。更に、「接続される」及び「連結される」は、物理的又は機械的な接続又は連結に制限されない。本開示の範囲から逸脱することなく、他の実施形態を利用すること、及び構造的又は論理的な変更を行うことが可能であることを理解されたい。更に、「前」、「後」、「上」、「下」などの用語は、各要素の互いに対する関係を説明するためにのみ使用されるものであり、装置の特定の向きを示すこと、装置の必要若しくは必須な向きを指示若しくは示唆すること、又は本明細書に記載される発明が使用時にどのように使用、装着、表示、若しくは配置されるかを指定することを目的とするものでは決してない。
【００２３】
本明細書では、微生物の「培養（culture）」又は「増殖（growth）」という用語は、微生物の増殖を促す条件下にある所定の培地内で微生物を繁殖させることによって微生物の数を増加させる方法を指す。より具体的には、この方法は、微生物の少なくとも１回の細胞分裂を促進するのに好適な培養培地及び条件を提供する方法である。培養培地は固体、半固体、又は液体の培地であり、微生物の増殖にとって必要な栄養成分及び必要な物理的増殖パラメータを全て含有する。
【００２４】
本明細書で使用するとき、用語「集積」は、特定の微生物の増殖に望ましい特異的態様及び既知の態様（attributes）を有する、培地及び条件を提供することによって、特定の微生物の増殖を選択的に集積する培養法を指す。集積培養環境は、選択された微生物の増殖には正に影響し、及び／又は他の微生物の増殖には負に影響する。
【００２５】
本開示は、一般的に、冷水可溶性ゲル化剤を含有する薄膜培養デバイスにおいて大腸菌群及び大腸菌（E. coli）コロニーを増殖及び検出し、かつ別個に計数するための方法に関する。
【００２６】
「大腸菌群細菌」は、まとめて、得られる酸及び気体の産生でラクトースを発酵させる能力を有する細菌のいくつかの属（例えば、シトロバクター属（Citrobacter）、エンテロバクター属（Enterobacter）、ハフニア属（Hafnia）、クレブシエラ属（Klebsiella）、セラチア属（Serratia）、及びエシェリキア属（Escherichia））の群を指す。最も多くの大腸菌群細菌は、一般的にヒトに対して非病原性であると考えられる。しかしながら、一部の大腸菌群細菌（例えば、大腸菌）は、高病原性の株を含む。大腸菌群は、哺乳動物の糞便中に見出され、食品及び／又は水の糞便汚染の指標として一般的に使用される。
【００２７】
好適な試料材料は、様々な供給源から得られるか、又は由来し得る。用語「供給源」は、一般的に、微生物について試験することが望ましい食品又は非食品を指すために使用される。供給源は、固体、液体、半固体、ゼラチン状材料、気体（例えば、空気）、及びこれらの組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、供給源は、例えば、対象の表面から又は空気から供給源を収集するために使用された捕捉要素によって提供され得る。いくつかの実施形態では、液体組成物は、供給源及び対象の任意の微生物の回収を増強するために、（例えば、撹拌又は溶解プロセス中に）更に分離することができる捕捉要素を含むことができる。対象となる表面としては、壁（ドアを含む）、床、天井、排水管、冷蔵システム、ダクト（例えば、空気ダクト）、通気口、トイレシート、ハンドル、ドアノブ、ハンドレイル、カウンタートップ、卓上、食事用面（例えば、トレイ、皿など）、作業面、機器表面、衣類など、及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない様々な表面の少なくとも一部を含み得る。供給源の全て又は一部を、本方法で使用することができる。供給源の一部が使用される場合、これは、供給源の「試料」と呼ばれ得る。しかしながら、用語「試料」は、一般的に、供給源から得られ、微生物の検出のために試験デバイスに導入される材料の体積又は質量の部分を指すために本明細書で使用される。
【００２８】
用語「食品」は、一般的に、固体、液体（例えば、溶液、分散液、エマルジョン、懸濁液など、及びこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない）及び／又は半固体の食用組成物を指すために使用される。食品の例としては、肉、鶏肉、卵、魚、魚介類、野菜、果物、加工食品（例えば、スープ、ソース、ペースト）、穀物製品（例えば、小麦粉、穀物、パン）、缶詰、ミルク、その他の乳製品（例えば、チーズ、ヨーグルト、サワークリーム）、脂肪、油、デザート、香辛料、薬味、パスタ、飲料、水、ビール、動物用飼料、他の好適な食材、及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
用語「ＴＴＣ」は、染料のトリフェニルテトラゾリウムクロリドの略称である。
【００３０】
乾燥培養培地がそれらの間に接着された２枚の隣接するシートを含む、当該技術分野において既知の薄膜培養デバイスの一種が、米国特許第４，５６５，７８３号に記載されている。これらのデバイスは、例えば、全好気性細菌又は大腸菌群細菌を含む様々な微生物を増殖、検出、及び計数するのに有用である。
【００３１】
一態様では、本開示は、デバイスを提供する。図１及び図２は、本開示によるデバイスの一実施形態を示す。微生物増殖デバイス１０は、上面及び下面を有する自己支持型の防水性の第１のシート１２を備える本体部材を含む。第１のシート１２は、好ましくは、水を吸着しないか又は他の方法で水による影響を受けない、ポリエステル、ポリプロピレン、又はポリスチレン等の材料の比較的剛性のフィルムである。約０．１ｍｍ〜０．１８ｍｍの厚さのポリエステルフィルム、約０．１ｍｍ〜０．２ｍｍの厚さのポリプロピレンフィルム、約０．３８ｍｍの厚さのポリスチレンフィルムが、良好に作用することが判明している。他の好適な第１のシートとしては、米国特許第４，５６５，７８３号に記載されているように、ポリエチレン又は他の防水コーティングを有する光印刷紙が挙げられる。第１のシート１２は、使用者が細菌のコロニーを第１のシートを介して見ることを望むか否かにより、透明又は不透明のどちらでもよい。細菌コロニーの計測を助けるために、第１のシート１２は、図３に示されるように、その上に印刷されたパターン（例えば、正方形の格子パターン）を有してもよい。
【００３２】
本明細書に記載される、第１の冷水可溶性ゲル化剤を備える培養培地１６が、第１のシート１２に接着されている。また、第２のシート２２も、デバイス１０の第１のシート１２に接着されている（直接的又は間接的のいずれかで）。第２のシート２２は、好ましくは、デバイス内の細菌コロニーの計測を助けるために透明であり、細菌及び水蒸気に対して実質的に不透過性である。本明細書及び特許請求の範囲で使用されるとき、「細菌及び水蒸気に対して実質的に不透過性である」は、デバイスの輸送、保管、及び使用中に脱水された培地の望ましくない汚染（例えば、微生物汚染）を防止し、インキュベーション時間中に微生物の増殖を支援することになる環境を提供する第２のシートを指す。
【００３３】
一般的に、第２のシート２２は、第１のシート１２と同様の特性を有するが、剛性である必要はない。第２のシート２２に好適な材料としては、例えば、ポリプロピレン（例えば、厚さ４０μｍの２軸配向ポリプロピレン（ＢＯＰＰ））及びポリエステル（例えば、厚さ約７０μｍであるポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ））が挙げられる。ＰＥＴの密度（例えば、約１．３８ｇ／ｍｍ３）は、ＢＯＰＰの密度（例えば、約０．９２ｇ／ｍｍ３）よりも高い。任意選択的に、第１のシート１２及び第２のシート２２は、二酸化炭素のそれらの通過を遅らせるように構成されている。有利には、それらを通る二酸化炭素の通過を遅らせるように構成された第１及び第２のシートで構築されたデバイスは、生物原性二酸化炭素（例えば、炭水化物の発酵によって産生された二酸化炭素）を、生物原性二酸化炭素を産生した（例えば、デバイス内に存在するラクトースの発酵によって）デバイス内のコロニーに隣接させる。
【００３４】
第１のシート１２は、任意選択的に、その主表面上で接着剤１４の層でコーティングされ、これは容易な水和のために均一な単層内に第１のシート上に乾燥した再水和可能な培養培地１６を保持する役割を果たす。あるいは、接着剤１４が第２のシート２２上にコーティングされ、培養培地が第１のシート１２上にコーティングされることができる。いずれの場合も、接着剤１４及び接着剤２４は、好ましくは、非水溶性であり、微生物の増殖に対して非阻害性である。好ましくは、接着剤は、接着剤でコーティングされたフィルムを通して細菌コロニーを見ることができるように濡れたとき十分に透明である。接着剤１４及び接着剤２４に使用するのに好適な接着剤としては、例えば、感圧接着剤が挙げられる。しかしながら、より融点の低い物質がより融点の高い基材上にコーティングされている熱活性化接着剤を用いてもよい。ゴム糊等の水活性化接着剤も有用である場合がある。接着剤１４は、好ましくはＴＴＣを含有するが、他の添加剤又は染料が使用されることもある。いくつかの以前に報告された場合とは異なり、本明細書に記載の培養デバイス及び方法は、ピルビン酸又はピルビン酸塩の添加を必要としない。多くの好ましい場合において、本明細書に記載の培養デバイス、並びにそれらが使用される方法は、ピルビン酸及びその塩を含まない。接着剤１４（通常、ＴＴＣを含有する）は、デバイス内で増殖する微生物コロニーの観察（例えば、手動によるか、又は機械的観察）を実質的に妨害しないか、又は観察を妨げない厚さで、及び／又は、微生物コロニーを観察するために使用される電磁放射線（例えば、可視光）の透過を実質的に妨害しないか、又は透過を妨げない厚さで、場合に応じて、第１のシート１２又は第２のシート２２上にコーティングされるべきである。典型的には、接着剤１４が第１のシート１２上にコーティングされると、それに細胞培養培地の第２のコーティングが続く。本開示のデバイスにおいて使用するのに好適な接着剤の非限定的な例は、イソオクチルアクリレート／アクリルアミド（９４／６のモル比）のコポリマーである。使用することができる他の感圧接着剤としては、イソオクチルアクリレート／アクリル酸（モル比９５／５又は９４／６）、及びシリコーンゴムが挙げられる。水への暴露時に白化する接着剤はあまり好ましくないが、不透明な第１のシートと組み合わせて使用してもよく、又はコロニーの視認が必要とされない場合には使用することができる。
【００３５】
任意の接着剤１４の少なくとも一部（通常、ＴＴＣを含有し、及び／又は第１のシート１２上に直接コーティングされる）にコーティングされるものは、乾燥した再水和可能な培養培地１６を含むコーティングである。乾燥培養培地１６は、実質的に水を含まない。本明細書及び特許請求の範囲で使用されるとき、「実質的に水を含まない」という表現は、コーティングを周囲環境と平衡化させると、脱水されたコーティングのおよその含水量以下の含水量を有するコーティングを指す。再水和培養培地の均一性を確保するために、乾燥培養培地１６の均一な単層が望ましい。乾燥した再水和可能な培養培地は、使用中に水和するために微生物増殖ゾーンに露出される十分な表面積を有するべきである。一般的に、約５μｍ〜約１３μｍの厚さの接着剤層が好適である。
【００３６】
図１及び２の例示的な実施形態の代替として、本開示のデバイスが、その上に配置された培養培地を有する台座を含むことができ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，６３２，６６１号に開示される培養デバイスと同様の方法で組み立てることができることが企図される。
【００３７】
図示される第２のシート２２は、接着剤２４（好ましくは、最も一般的にはＴＴＣを含有する接着剤２４）層及び粉末２６でコーティングされている。接着剤２４は、デバイス内で増殖する微生物コロニーの観察（例えば、手動によるか、又は機械的観察）を実質的に妨害しないか、又は観察を妨げない厚さで、及び／又は、微生物コロニーを観察するために使用される電磁放射線（例えば、可視光）の透過を実質的に妨害しないか、又は透過を妨げない厚さで、第２のシート２２上にコーティングされるべきである。一般的に、約５μｍ〜約１３μｍの厚さの接着剤層が好適である。
【００３８】
粉末２６は、乾燥した第２の冷水可溶性ゲル化剤を含む。第２の冷水可溶性ゲル化剤は、第１の冷水可溶性ゲル化剤と同様の特性を有し、第１の冷水可溶性ゲル化剤と同一である冷水可溶性ゲル化剤を含んでもよい。粉末２６は、第２のシート２２に接着される（例えば、第２のシート２２に接着された接着剤２４に接着される）。粉末２６は、米国特許第４，５６５，７８３号に記載されているように、接着剤２４上にコーティングされる。乾燥粉末２６の均一な単層が好ましい。粉末２６は、微生物増殖ゾーンに露出した十分な表面積を有するべきであり、乾燥培養培地１６は、デバイスの使用中に増殖ゾーンに堆積された所定の体積の水性液体を吸収する。
【００３９】
本明細書及び特許請求の範囲で使用されるとき、用語「粉末」は、４００マイクロメートル未満の平均直径を有する超微粒子状粒子物質を指す。本明細書及び特許請求の範囲で使用するとき、用語「冷水可溶性」は、室温で水中の溶液を形成する材料を指す。
【００４０】
微生物増殖ゾーンは、デバイスの接種中に試料が定置されるデバイス内の領域である。第１のシート１２及び第２のシート２２は、微生物増殖ゾーンを包囲し、培養培地１６及び粉末２６は、微生物増殖ゾーン内で互いに面している。典型的には、微生物増殖ゾーンは、試料の汚染を防止するために、及び／又はデバイスから試料が漏れるのを防ぐために、第１のシート１２及び第２のシート２２の縁部から離間している。水性液体（例えば、試験される試料を含有する）が微生物増殖ゾーン内に定置された後、微生物増殖ゾーン内の乾燥した再水和可能な培養培地１６及び粉末２６は、液体によって水和されて、大腸菌群の細菌コロニーを増殖させるための半固体培養培地を形成する。微生物増殖ゾーンは、細菌コロニーの可視化を防止するマトリックスを含まない。
【００４１】
任意の実施形態では、微生物増殖ゾーンは、任意選択的に、乾燥培養培地１６がコーティングされる第１のシート１２の表面に適用されるスペーサ要素によって画定される。スペーサ要素は、乾燥培養培地１６を露出させるために中心を貫通して切断された開口部２０（例えば、円形の開口、正方形の開口、矩形の開口）を有するスペーサ１８の片を含む。開口部２０の壁は、水和後に培地を閉じ込めるために、所定の大きさ及び形状のウェルを提供する。スペーサ１８は、所望の体積のウェル、例えば、約１ミリリットル、約２ミリリットル、約３ミリリットル、又は約５ミリリットルのウェルを形成するのに十分な厚さであるべきである。独立気泡ポリエチレン発泡体は、スペーサ１８に好適な材料の一例であるが、疎水性（非湿潤性）であり、微生物に対して不活性であり、滅菌に耐えることができる任意の材料が使用されてもよい。開口部２０は、培養デバイス内の微生物増殖ゾーンの周囲を形成する。所望の（所定の）容積を受容すると、デバイスは、大腸菌群コロニーの増殖を促進し計数を助ける水和培養培地を形成する。
【００４２】
乾燥した再水和可能な培養培地１６は、大腸菌群微生物の増殖を促進する有機窒素系栄養素と、非大腸菌群微生物の増殖を選択的に阻害する有効量の少なくとも１つの薬剤と、第１の冷水可溶性ゲル化剤と、を含む。
【００４３】
培養培地１６の有機窒素系栄養素は、（例えば、熱ストレス、ｐＨストレス、水ストレスからの）迅速な回収をもたらし、かつ大腸菌群微生物の増殖をもたらす。有機窒素系栄養素は、例えば、アミノ酸及び／又はオリゴペプチド及び／又はビタミン類を提供する。本開示によるデバイスの任意の実施形態における好適な有機窒素系栄養素の非限定的な例としては、酵母エキス、ブタペプトン、ゼラチンの酵素消化物、動物性ペプトンの酵素消化物、及び前述の有機窒素系栄養素のうちの任意の２つ以上の組み合わせが挙げられる。
【００４４】
本開示のデバイスの培養培地１６は、非大腸菌群微生物の増殖を選択的に阻害する有効量の少なくとも１つの薬剤を含む。薬剤は、本開示のデバイスにおいて、少なくとも１つの非大腸菌群微生物に対する、大腸菌群微生物の増殖に競合的な利点を提供する。例えば、抗生物質を含むこのような選択剤は、当業者に周知である。任意の実施形態では、この薬剤は、胆汁塩、ドデシル硫酸ナトリウム、又は胆汁塩とドデシル硫酸ナトリウムとの組み合わせを含む。有効量は、所定の体積の水性液体が増殖ゾーン内に堆積されるとき、再水和培養培地が、少なくとも１つの薬剤の濃度が非大腸菌群微生物の増殖を選択的に阻害するのに十分に高いが、大腸菌群微生物の増殖を実質的に阻害するほど高くないように選択される（すなわち、大腸菌群微生物は、約３７℃〜約４５℃の温度でのインキュベーションの約２４時間以内で観察可能かつ同定可能なコロニーを形成する）。
【００４５】
本開示のデバイスの培養培地１６は、冷水可溶性である。本発明のデバイスで使用される培養培地の「冷水溶解度」は、培養培地中に第１の冷水可溶性ゲル化剤を含む。培養培地１６に含めるのに好適な第１の冷水可溶性ゲル化剤は、室温で水溶液を形成する天然及び合成ゲル化剤の両方を含む。グアーガム、ポリアクリルアミド、ローカストビーンガム及び寒天などのゲル化剤は、例えば、室温で水中の溶液を形成し、本開示による「冷水可溶性」である乾燥した再水和可能な培養培地を提供するための好適な第１の冷水可溶性ゲル化剤である。培養培地１６に好ましい第１の冷水可溶性ゲル化剤としては、例えば、グアーガム及びキサンタンガムが挙げられ、これらのゲル化剤は、個々に又は互いと組み合わせて、かつ他の冷水可溶性ゲル化剤と組み合わせて有用である。大腸菌群微生物を増殖させるための有機窒素系栄養素は、室温で水中の溶液を形成する。
【００４６】
培養培地を第１のシート上にコーティングし、その上で乾燥させた後、第１のシートに接着された乾燥培養培地は、コーティング重量を有する。乾燥培養培地のコーティング重量は、増殖ゾーンが所定の体積の水性液体（例えば、大腸菌群及び大腸菌（E. coli）微生物について試験される試料を含む水性液体）で再水和されるとき、再水和培養培地は、大腸菌群及び大腸菌（E. coli）微生物の増殖を促進し別個の計数を助けるために、各成分の適切な濃度を有する。任意の実施形態では、第１のシートに接着された乾燥培養培地のコーティング重量は、約１３０ｍｇ／１００ｃｍ２〜約１９５ｍｇ／１００ｃｍ２であり得る。
【００４７】
本開示によるデバイスの乾燥した再水和可能な培養培地は、微生物増殖ゾーン内に配置されたラクトース発酵指示薬系を含む。ラクトース発酵指示薬系は、デバイスにおける大腸菌類細菌増殖のコロニーの２つの指標：ラクトースの発酵による第１の指標（酸産生）及びラクトースの発酵による第２の指標（気体産生）を提供する。ラクトースの発酵からの酸及び気体（ＣＯ２）の両方の産生は、デバイス内で増殖する大腸菌群微生物のコロニーの存在を確認する。コロニー増殖の時点でのＴＴＣ還元産物「ホルマザン」の沈殿と組み合わせた酸及び気体の存在は、誘導性及び構成的大腸菌生物からの大腸菌群細菌の個別化を提供することができる。したがって、ラクトース発酵指示薬系は、Ｄ−ラクトースと、ｐＨ指示薬とを含む。ｐＨ指示薬は、７．０周辺の変色範囲を有する。好適なｐＨ指示薬としては、例えば、フェノールレッド及びクロロフェノールレッドなどのスルホンフタレインｐＨ指示薬が挙げられる。
【００４８】
ラクトース発酵指示薬系は、ラクトースを利用するための酵素（例えば、βガラクトシダーゼ）の産生を増強する第１の誘導因子化合物を更に含む。好適な第１の誘導因子化合物の非限定的な例としては、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）及びフェニル−β−Ｄ−ガラクトシドが挙げられる。
【００４９】
ラクトース発酵指示薬系は、培養デバイスの微生物増殖ゾーン内に（例えば、乾燥した再水和可能な培養培地中に）配置される。したがって、任意の実施形態では、培養培地が第１のシート１２及び／又は第１の接着剤１４上でコーティングされる前に、ラクトース発酵指示薬系の構成成分のうちの少なくとも１つを培養培地に添加することができる。あるいは、ラクトース発酵指示薬系の少なくとも１つの構成成分は、培養培地が使用のために再水和されたときに微生物増殖ゾーン内又はその上に堆積される水性液体（例えば、水、緩衝液、及び／又は試料）に含まれ得る。ラクトースが乾燥培養培地中のデバイス内に配置される任意の実施形態では、ラクトースは、乾燥培養培地中に、約８．５ｍｇ／１００ｃｍ２〜約２７ｍｇ／１００ｃｍ２のコーティング重量で存在する。
【００５０】
本開示によるデバイスの乾燥した再水和可能な培養培地は、微生物増殖ゾーン内に配置されたβ−Ｄ−グルクロニダーゼ指示薬系を含む。β−Ｄ−グルクロニダーゼ指示薬系は、β−Ｄ−グルクロニダーゼ酵素活性を産生する大腸菌コロニーなどのコロニーの指標を提供する。したがって、β−Ｄ−グルクロニダーゼ指示薬系は、デバイス内に存在する大腸菌コロニーを、デバイス内に存在する非大腸菌の大腸菌群コロニーと区別する手段を提供する。したがって、β−Ｄ−グルクロニダーゼ指示薬系は、発色性β−Ｄ−グルクロニダーゼ酵素基質（例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド）を含む。加えて、β−Ｄ−グルクロニダーゼ指示薬系は、大腸菌中のβ−Ｄ−グルクロニダーゼ酵素活性を増強する複数の化合物を更に含む。大腸菌中のβ−グルクロニダーゼ酵素活性を増強する好適な化合物の非限定的な例としては、メチル−β−Ｄ−グルクロニド、フェニル−β−Ｄ−グルクロニド、及びＤ−グルクロン酸が挙げられる。任意の実施形態では、大腸菌中のβ−グルクロニダーゼ酵素活性を増強する第１の化合物は、メチル−β−Ｄ−グルクロニド及びフェニル−β−Ｄ−グルクロニドから選択される。任意の実施形態では、大腸菌中のβ−グルクロニダーゼ酵素活性を増強する第２の化合物は、Ｄ−グルクロン酸である。驚くべきことに、大腸菌中のβ−グルクロニダーゼ酵素活性を増強する第１及び第２の化合物の組み合わせを有するデバイスは、β−グルクロニダーゼ陽性大腸菌をより良好に検出できる。このような微生物種を検出するための化合物の組み合わせは、以前に知られていない。
【００５１】
理論に束縛されるものではないが、大腸菌中のβ−グルクロニダーゼ酵素活性を増強する複数の化合物のうちの少なくとも１つは、細胞によるより多くのβ−Ｄ−グルクロニダーゼ酵素の産生を誘導し得ると考えられる。あるいは、又はそれに加えて、大腸菌中のβ−グルクロニダーゼ酵素活性を増強する複数の化合物のうちの少なくとも１つは、発色性酵素基質（例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド）と反応したときに、β−グルクロニダーゼ酵素分子の活性を増強することができる。
【００５２】
β−Ｄ−グルクロニダーゼ指示薬系は、培養デバイスの微生物増殖ゾーン内に（例えば、乾燥した再水和可能な培養培地中に）配置される。したがって、任意の実施形態では、β−Ｄ−グルクロニダーゼ指示薬系の構成成分のうちの少なくとも１つは、培養培地が第１のシート１２、第１の接着剤１４、又は第２のシート２２上でコーティングされる前に、培養培地に添加することができる。あるいは、β−Ｄ−グルクロニダーゼ指示薬系の構成成分のうちの少なくとも１つは、培養培地が使用のために再水和されたときに微生物増殖ゾーン内又はその上に堆積される水性液体（例えば、水、緩衝液、及び／又は試料）に含まれ得る。
【００５３】
任意の実施形態では、本開示のデバイスは、培養培地が使用中に水性液体で再構成されたときに、培養培地を緩衝するための試薬を含むことができる。この試薬は、約６．５〜７．５のｐＨで培養培地（使用中水和されたとき）を緩衝することができる。培養培地を緩衝するための好適な試薬の非限定的な例は、リン酸塩（例えば、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＮａＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、又は前述の試薬のうちの任意の２つ以上の組み合わせ）である。この試薬は、培養デバイスの微生物増殖ゾーン内に配置される（例えば、乾燥した再水和可能な培養培地中に）。したがって、任意の実施形態では、培養培地が第１のシート１２及び／又は第１の接着剤１４上でコーティングされる前に、この試薬を培養培地に添加することができる。あるいは、この試薬は、培養培地が使用のために再水和されたときに微生物増殖ゾーン内又はその上に堆積される水性液体（例えば、水、緩衝液、及び／又は試料）に含まれ得る。
【００５４】
培養培地の構成成分は、例えば、米国特許第４，５６５，７８３号の実施例１２に記載されるように、水性液体中で一緒に混合され、第１のシート上にコーティングされ得る。培養培地を第１のシート上にコーティングした後、本質的に水を含まなくなるまで培養培地層を乾燥させる。任意選択的に、培養培地を第１のシート上にコーティングする前に、第１のシートは、本明細書に開示される接着剤の層でコーティングされる。次いで、培養培地を接着剤層上にコーティングし、培養培地の層が本質的に水を含まなくなるまで乾燥させる。
【００５５】
任意の実施形態では、デバイス内で増殖する微生物コロニーの存在を示すために、微生物増殖ゾーンに非特異的指示薬（例えば、染料）を組み込むことが望ましい場合がある。いくつかの実施形態では、指示薬は、培養培地１６に組み込まれてもよい。あるいは、指示薬は接着剤１４に組み込まれてもよい。好適な指示薬は、微生物を増殖させることによって代謝され、かつより容易な可視化のためにコロニーを着色させるものである。このような指示薬の例としては、トリフェニルテトラゾリウムクロリド、ｐ−トリルテトラゾリウムレッド、テトラゾリウムバイオレット、ベラトリルテトラゾリウムブルー、及び関連染料が挙げられる。
【００５６】
任意選択的に、任意の実施形態では、本開示のデバイスは、微生物増殖ゾーン内に配置された粉末状の乳児用調整粉乳を更に含む。乳児用調整粉乳は、乾燥培養培地の構成成分として増殖ゾーン内に提供されてもよく、あるいは、第２のシート上の接着剤層２４に接着された第２の冷水可溶性ゲル化剤と混合することができる。乳児用調整粉乳は、大腸菌群微生物の増殖を促進し得る複数の栄養素（例えば、タンパク質、炭水化物、ミネラル、及びビタミン）を提供する。本開示のデバイスでの使用に好適な粉末状乳児用調整粉乳の非限定的な例は、Ｎｅｓｔｌｅ  Ｉｎｆａｎｔ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ；Ｆｌｏｒｈａｍ  Ｐａｒｋ，ＮＪから入手可能なＧＥＲＢＥＲ（登録商標）ＧＯＯＤ  ＳＴＡＲＴ（登録商標）Ｇｅｎｔｌｅ（Ｓｔａｇｅ  １）乳児用調整粉乳である。
【００５７】
乳児用調整粉乳が乾燥培養培地中のデバイス内に配置される任意の実施形態では、乳児用調整粉乳は、乾燥培養培地中に、最大約２７ｍｇ／１００ｃｍ２のコーティング重量で存在する。任意の実施形態では、乳児用調整粉乳は、乾燥培養培地中に、最大約１４ｍｇ／１００ｃｍ２のコーティング重量で存在する。任意の実施形態では、乳児用調整粉乳は、乾燥培養培地中に、最大約１９ｍｇ／１００ｃｍ２のコーティング重量で存在する。
【００５８】
例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，１３７，８１２号に記載されているように、薄膜培養デバイスが、微生物のコロニー（例えば、病原性大腸菌の種）を増殖させ、計数するために使用されており、コロニーは、微生物の特定のために膜上に移動させている（例えば、「ブロットされている」）。いくつかの実施形態では、本開示による薄膜培養デバイスを使用して、微生物のコロニーを増殖させ、計数し、続いて微生物を特定するために膜上に移動させる（例えば、「ブロットさせる」）こともできる。
【００５９】
任意の実施形態では、本開示の培養デバイスは、第１のシートに接着された乾燥した再水和可能な培養培地を含むことができ、乾燥した再水和可能な培養培地は、表１に列挙される構成成分を含む。
【００６０】
表１．本開示の例示的な乾燥した再水和可能な培養培地の構成要素のリスト。
【００６１】
有機栄養素化合物：酵母エキス、ブタペプトン、ラクトース、動物組織の酵素消化物、ゼラチンの酵素消化物、乳児用調整粉乳、ｐＨ指示薬、フェノールレッド
【００６２】
塩：ＭｇＣｌ２、ＦＡＣ、胆汁塩、ＫＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４
【００６３】
誘導因子：メチルグルクロニド、Ｄ−グルクロン酸、ＩＰＴＧ
【００６４】
指示薬：ＢＣＩグルクロニド
【００６５】
ゲル化剤：グアーガム
【表１】
2020512832.tif 000003
【００６６】
別の態様では、本開示は、大腸菌群及び大腸菌（Escherichia coli）微生物のコロニーを別個に計数するための方法を提供する。本方法は、本開示の培養デバイスの任意の実施形態の微生物増殖ゾーン内の試料及び水性液体を接触させて、接種済み培養デバイスを形成することを含む。任意の実施形態では、試料は水性液体を含むことができる。一般に、ゲル化剤、指示薬剤（ＴＴＣ及びＢＣＩＧ）、並びに培養デバイスの微生物増殖ゾーン内の乾燥培養培地の量は、これらが（すなわち、ゲル化剤、指示薬剤、及び栄養素）が、所定の体積（例えば、１ミリリットル、２ミリリットル、５ミリリットル）の水性液体で再構成されたときに、大腸菌群細菌及び大腸菌のコロニーを検出し、区別するための有効濃度を提供するように選択される。任意の実施形態では、水性液体は、試料材料と共に添加することができる（例えば、試料材料は、滅菌水、水性緩衝液、又は水性栄養培地などの水性液体中に溶解、均質化、懸濁、及び／又は希釈することができる）。試料が固体（例えば、その上に又は中に保持された材料を有するメンブレンフィルター）又は半固体材料を含む任意の実施形態では、固体又は半固体試料を使用してデバイスに接種する前又は後に、所定の体積の液体（例えば、滅菌水、水性栄養培地）を使用して、培養デバイスを再構成することができる。
【００６７】
本発明のデバイスの使用を、図１及び２のデバイスを具体的に参照して論じることができる。図１及び３のデバイスを混釈平板として使用するために、第２のシート２２を引き戻し、所定量の水又は水性試験試料を、スペーサ部材１８によって画定された微生物増殖ゾーン内の第１のシート１２上に定置する。接着剤１４によって第１のシート１２に接着された乾燥培養培地１６の構成成分は、迅速に水和又は溶解され、栄養素ゲルが形成される。次いで、第２のシート２２を第１のシートの上に再び置き、重り付きプレートを上部に定置して、試料を微生物増殖ゾーン全体に完全に広げる。次いで、所定の時間デバイスをインキュベートする。
【００６８】
試料は、当該技術分野において既知の方法を使用して（例えば、液体試料を培養デバイス内に注ぐか又は分注することによって）、培養デバイスの微生物増殖ゾーンと接触させることができる。任意の実施形態では、第２のシートは、典型的には持ち上げられ（例えば、図１に示すように）、培養デバイス内の第１のシートと第２のシートとの間、好ましくは、存在する場合はスペーサの開口内への試料の堆積を可能にする。任意の実施形態では、試料及び水性液体を、微生物増殖ゾーン内のゲル化剤と接触させることにより、接種済み培養デバイスが形成される。接種済み培養デバイスを形成した後、第２のシートを下げて、インキュベーション中の水性液体の汚染及び／又は過剰な蒸発に対する保護バリアを形成する。任意の実施形態では、試料は、例えば、被覆されたデバイスの上に重り付きプレートを定置することによって、微生物増殖領域の上に均一に広げられてもよい。
【００６９】
任意の実施形態では、本方法は、接種済み培養デバイスを一定時間インキュベートすることを更に含む（例えば、温度制御された環境のチャンバ内で）。インキュベーション条件（例えば、インキュベーション温度）は、試料中に存在する大腸菌群細菌の増殖速度に影響を及ぼし得る。当業者であれば、大腸菌群細菌を検出するために好適なインキュベーション温度を認識するであろう。例えば、本開示の接種済み培養デバイスは、例えば、約３５℃〜約４５℃（両端の値を含む）の温度でインキュベートすることができる。任意の実施形態では、培養デバイスは、好気性（例えば、通常の大気）気体環境中でインキュベートすることができる。
【００７０】
接種済み培養デバイスは、大腸菌群細菌の増殖を可能にするのに十分な時間にわたってインキュベートされる。大腸菌群細菌を検出するために必要な最小インキュベーション時間は、培養デバイスがインキュベートされる温度に関連する。例えば、培養デバイスが約３５℃でインキュベートされる任意の実施形態では、インキュベーション時間は、約１２時間〜約２４時間（両端の値を含む）であり得る。培養デバイスが約４２℃でインキュベートされる任意の実施形態では、インキュベーション時間は、約８時間〜約１８時間（両端の値を含む）であり得る。培養デバイスが約４２℃でインキュベートされる任意の実施形態では、インキュベーション時間は、約８時間〜約１２時間（両端の値を含む）であり得る。
【００７１】
本開示の方法は、大腸菌群細菌のコロニーを検出すること、及び／又は培養デバイス内の大腸菌細菌のコロニーを検出すること（例えば、培養デバイス内の大腸菌群細菌を観察すること、及び／又は大腸菌細菌のコロニーを検出すること）を更に含む。任意の実施形態では、培養デバイス内の大腸菌群細菌を検出することは、指示薬系（例えば、ラクトース発酵指示薬系及びβ−Ｄ−グルクロニダーゼ指示薬系）のうちの少なくとも１つと反応したコロニーを培養デバイス内で検出することを含むことができる。大腸菌群細菌のコロニーは、ラクトースを酸及び気体状最終生成物に発酵させるその能力によって区別される。したがって、大腸菌群コロニーを検出することは、コロニー上の沈殿物としてのホルマザンの減少及びコロニーに近接する（例えば、コロニーの周辺部の約１〜２ｍｍ以内）酸のゾーン（デバイス内のｐＨ指示薬によって証明されるような、例えば、ｐＨ指示薬がフェノールレッドである場合、黄色のゾーン）の１つ又は両方を観察することと、またコロニーに近接する（例えば、コロニーの周辺部に接触するか、又はコロニーの周辺部の約１ｍｍ以内のいずれか）半固体培養培地中に捕捉された気泡を観察することも含む。
【００７２】
コロニーに近接した酸領域及び気泡を観察することに加えて、大腸菌細菌のコロニーを検出及び区別することは、β−グルクロニダーゼ酵素活性の生成物を検出することを更に含む。例えば、β−グルクロニダーゼ指示薬系がＢＣＩＧを含む場合、大腸菌コロニーは、コロニーのそれぞれを囲む小さな青色（又は青みがかった）ゾーンを有するか、又は有さない青色（又は青みがかった緑）に見えるであろう。
【００７３】
任意の実施形態では、本開示の方法は、接種済み培養デバイスをインキュベートした後に、接種済み培養デバイス内に、大腸菌群が存在する場合には大腸菌群細菌のコロニーを、大腸菌が存在する場合には大腸菌のコロニーを計数することを更に含む。したがって、大腸菌群及び大腸菌（E. coli）細菌のコロニーが本明細書に記載されるように検出された後、検出されたコロニーの数は、手動で、又は当該技術分野において既知の自動化されたプロセスを使用して（例えば、３Ｍ  Ｃｏｍｐａｎｙ；Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮから入手可能なＰＥＴＲＩＦＩＬＭ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒなどの自動コロニー計数器を使用して）決定される。
【００７４】
例示的な実施形態
実施形態Ａは、大腸菌群及び大腸菌（Escherichia coli）微生物のコロニーを別個に計数するためのデバイスであって、
水不透過性の第１のシートと、
第１のシートに取り付けられた水不透過性の第２のシートと、
第１のシートに接着された乾燥した再水和可能な培養培地であって、培養培地が、
大腸菌群微生物の増殖を促進する有機窒素系栄養素と、
微生物増殖ゾーン内に配置され、かつＤ−ラクトース、β−ガラクトシダーゼの産生を増強する第１の誘導因子化合物、及びｐＨ指示薬を含む、ラクトース発酵指示薬系と、
増殖ゾーン内に配置され、かつ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド、及び大腸菌中のβ−グルクロニダーゼ酵素活性を増強する複数の化合物を含む、β−Ｄ−グルクロニダーゼ指示薬系と、
大腸菌からの大腸菌群の個別化を可能にするレドックス指示薬系と、
非大腸菌群微生物の増殖を選択的に阻害する有効量の少なくとも１つの薬剤と、
第１の冷水可溶性ゲル化剤と、を含む培養培地と、
第１のシートと第２のシートとの間に配置された微生物増殖ゾーンであって、第１のシートに接着された培養培地の領域が、増殖ゾーンを画定する、微生物増殖ゾーンと、
第２のシートに接着された第２の冷水可溶性ゲル化剤と、を含み、
第１のシートは、培養培地が第２の冷水可溶性ゲル化剤に面するように、第２のシートに取り付けられている、デバイスである。
【００７５】
実施形態Ｂは、大腸菌中のβ−グルクロニダーゼ酵素活性を増強する複数の化合物のうちの第１の化合物が、メチル−β−Ｄ−グルクロニド及びフェニル−β−Ｄ−グルクロニドから選択される、実施形態Ａに記載のデバイスである。
【００７６】
実施形態Ｃは、大腸菌中のβ−グルクロニダーゼ酵素活性を増強する複数の化合物のうちの第２の化合物が、Ｄ−グルクロン酸である、実施形態Ａ又は実施形態Ｂに記載のデバイスである。
【００７７】
実施形態ＣＣは、レドックス指示薬が、テトラゾリウムクロリドである、先行する実施形態のいずれか１つに記載のデバイスである。
【００７８】
実施形態Ｄは、第１のシート及び第２のシートが、それを通る二酸化炭素の通過を遅らせるように構成されている、先行する実施形態のいずれか１つに記載のデバイスである。
【００７９】
実施形態Ｅは、微生物増殖ゾーン内に配置されたＤ−グルクロン酸を更に含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載のデバイスである。
【００８０】
実施形態Ｆは、第１のシートが、ポリエステルフィルムを含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載のデバイスである。
【００８１】
実施形態Ｇは、第２のシートが、ポリエステルフィルムを含む、実施形態Ｄ〜Ｆのいずれか１つに記載のデバイスである。
【００８２】
実施形態Ｈは、第２のシートが、ポリエチレンテレフタレートを含む、実施形態Ｇに記載のデバイスである。
【００８３】
実施形態Ｉは、増殖ゾーンが、第１のシートに接着されたスペーサによって画定される、先行する実施形態のいずれか１つに記載のデバイスである。
【００８４】
実施形態Ｊは、冷水可溶性ゲル化剤が、グアーガムを含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載のデバイスである。
【００８５】
実施形態Ｋは、第１のシートに接着された培養培地が、約１３０ｍｇ／１００ｃｍ２〜約１９５ｍｇ／１００ｃｍ２のコーティング重量を有する、先行する実施形態のいずれか１つに記載のデバイスである。
【００８６】
実施形態Ｌは、ラクトースが、第１のシートに接着された乾燥培養培地中に配置され、ラクトースが、乾燥培養培地中に、約８．５ｍｇ／１００ｃｍ２〜約２７ｍｇ／１００ｃｍ２のコーティング重量で存在する、先行する実施形態のいずれか１つに記載のデバイスである。
【００８７】
実施形態Ｍは、培養培地が、水性液体で再構成されたときに、培養培地を約６．５〜約８のｐＨに緩衝するための試薬を更に含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載のデバイスである。
【００８８】
実施形態Ｎは、ｐＨ指示薬が、スルホンフタレインｐＨ指示薬を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載のデバイスである。
【００８９】
実施形態Ｏは、ｐＨ指示薬が、クロロフェノールレッド及びフェノールレッドからなる群から選択される、実施形態Ｎに記載のデバイスである。
【００９０】
実施形態Ｐは、有機窒素系栄養素が、酵母エキス、ブタペプトン、ゼラチンの酵素消化物、動物性ペプトンの酵素消化物、及び前述の有機窒素系栄養素のうちの任意の２つ以上の組み合わせからなる群から選択される、先行する実施形態のいずれか１つに記載のデバイスである。
【００９１】
実施形態Ｑは、増殖ゾーンが、約１ミリリットル〜約５ミリリットルの所定の体積を有する水性液体を受容するように構成され、所定の体積を受容すると、大腸菌群コロニーの増殖を促進し計数を助ける水和培養培地を形成する、先行する実施形態のいずれか１つに記載のデバイスである。
【００９２】
実施形態Ｒは、薬剤が、胆汁塩、ドデシル硫酸ナトリウム、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、先行する実施形態のいずれか１つに記載のデバイスである。
【００９３】
実施形態Ｓは、第２の冷水可溶性ゲル化剤が、乾燥粒子又は乾燥凝集粒子の形態で第２の薄膜積層体上に配置されている、先行する実施形態のいずれか１つに記載のデバイスである。
【００９４】
実施形態Ｔは、β−ガラクトシダーゼの産生を増強する第１の誘導因子化合物が、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載のデバイスである。
【００９５】
実施形態Ｕは、微生物増殖ゾーン内に配置された乾燥乳児用調整粉乳を更に含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載のデバイスである。
【００９６】
本発明の目的及び利点は、以下の実施例によって更に例示されるが、これらの実施例に記載された特定の材料及びその量、並びに他の条件及び詳細は、本発明を不当に制限するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【００９７】
実施例１〜１３微生物検出物品の製造
【００９８】
培養培地の調製
【００９９】
表１に示す混合物を、別個の容器で調製した。混合物の液体体積を、脱イオン水で１０００ｍＬにした。
【０１００】
第１のシートの調製
【０１０１】
表２及び３に示される混合物は、まずグアーガムを水に添加し、続いて残りの構成成分を添加し、８０℃に加熱して培養培地の低温殺菌を可能にすることによって調製した。加熱工程後、混合物を周囲温度まで冷却し、使用まで４℃で保管した。
【０１０２】
液体混合物を周囲温度まで加温し、ポリエステルフィルム上にコーティングし、コーティングされた層を、米国特許第５，３８４，７６６号の実施例１に開示されるように乾燥させた。個々のフィルム上にコーティングされた各別個の培養培地の乾燥コーティング重量は、約０．２〜０．３ｇ／１５５ｃｍ２であった。コーティングされたシートを、１０．２ｃｍ×７．６ｃｍの矩形に切断した。
【０１０３】
Ａｍｅｒｉｃａｎ  ＦｕｊｉＳｅａｌ（Ｓｈａｕｍｂｅｒｇ，ＩＬ）から入手したポリスチレン発泡体（厚さ０．５１ｍｍ）を使用して、スペーサ要素を作製した。発泡体シートの片面を、接着剤（３Ｍ  ９２７  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ａｄｈｅｓｉｖｅ）を用いて、コーティングされた剥離ライナーに接着させた。円（直径約６ｃｍ）を発泡体シートからダイカットした。発泡体シートを１０．２ｃｍ×７．６ｃｍの矩形に切断し、円形穴を矩形のほぼ中央に配置させた。剥離ライナーを取り外し、スペーサ要素を（発泡体シート上の接着剤を介して）乾燥培養培地でコーティングされたシートに接着させて、これにより、培養培地を発泡体シートの円形開口部において露出させた。
【０１０４】
第２のシートの調製
【０１０５】
２軸配向ポリプロピレン（ＢＯＰＰ）を、米国特許第４，５６５，７８３号の実施例１１に記載されたトリフェニルテトラゾリウムクロリド（ＴＴＣ、パートＮｏ．１７７７９；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の５倍を含有する接着剤（３Ｍ  ９２７  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ａｄｈｅｓｉｖｅ）でコーティングした。続いて、接着剤コーティングされたＢＯＰＰフィルムを、米国特許第４，５６５，７８３号の実施例１１に記載のように、グアーガムで粉末コーティングした。第２のシートを、１０．６ｃｍ×７．６ｃｍの矩形に切断した。
【０１０６】
培養デバイスの組立。
【０１０７】
両面接着テープを、第１のシートのそれぞれの上の発泡体スペーサの縁部の１つに沿って（より狭い寸法に沿って）貼り付けた。第２のシートのコーティングされた表面が第１のシートに接着された発泡体スペーサに面し、かつシートが一緒に押圧されて、第２のシートを両面接着テープに固定させるように、第２のシートを第１のシートの上に重ね合わせた（図１に示すように）。
【０１０８】
【表２】
2020512832.tif 000004
【０１０９】
【表３】
2020512832.tif 000005
【０１１０】
実施例１．
【０１１１】
上記のように調製した第２のシートに、培地８７でコーティングされた第１のシートを接着することによって、デバイスを作製した。
【０１１２】
実施例２．
【０１１３】
上記のように調製した第２のシートに、培地８３でコーティングされた第１のシートを接着することによって、デバイスを作製した。
【０１１４】
実施例３．
【０１１５】
上記のように調製した第２のシートに、培地８４でコーティングされた第１のシートを接着することによって、デバイスを作製した。
【０１１６】
実施例４．
【０１１７】
上記のように調製した第２のシートに、培地８８でコーティングされた第１のシートを接着することによって、デバイスを作製した。
【０１１８】
実施例５．
【０１１９】
上記のように調製した第２のシートに、培地８９でコーティングされた第１のシートを接着することによって、デバイスを作製した。
【０１２０】
実施例６．
【０１２１】
上記のように調製した第２のシートに、培地７２でコーティングされた第１のシートを接着することによって、デバイスを作製した。
【０１２２】
実施例７．
【０１２３】
上記のように調製した第２のシートに、培地６６でコーティングされた第１のシートを接着することによって、デバイスを作製した。
【０１２４】
実施例８．
【０１２５】
上記のように調製した第２のシートに、培地６３でコーティングされた第１のシートを接着することによって、デバイスを作製した。
【０１２６】
実施例９．
【０１２７】
上記のように調製した第２のシートに、培地６２でコーティングされた第１のシートを接着することによって、デバイスを作製した。
【０１２８】
実施例１０．
【０１２９】
上記のように調製した第２のシートに、媒体６９でコーティングされた第１のシートを接着することによって、デバイスを作製した。
【０１３０】
実施例１１．
【０１３１】
上記のように調製した第２のシートに、培地６４でコーティングされた第１のシートを接着することによって、デバイスを作製した。
【０１３２】
実施例１２．
【０１３３】
上記のように調製した第２のシートに、培地７０でコーティングされた第１のシートを接着することによって、デバイスを作製した。
【０１３４】
実施例１３．大腸菌群又は大腸菌のコロニーを増殖及び計数するための培養デバイスの使用。
【０１３５】
大腸菌ＡＴＣＣ  ５１８１３をＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃｓ（Ｓｔ．Ｃｌｏｕｄ，ＭＮ）から入手し、続いて単離して、純粋培養凍結グリセロールストックとして保存した。誘導性ベータ−グルクロニダーゼ挙動を呈したモッツァレラチーズから単離した天然の大腸菌株のＲＥＣ１を、使用するまでグリセロール中に保存した。
【０１３６】
大腸菌ＡＴＣＣ  ５１８１３及び大腸菌ＲＥＣ１の一晩培養物を、必要に応じてＢｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄの緩衝液で連続希釈して、培養デバイス上に計測可能なコロニー（例えば、１５〜１５０  ＣＦＵ／ｍＬ）を得た。希釈した試料１ｍＬを、プロトタイププレート上に接種した。接種したプレートを２種の温度（３５℃及び４２℃）でインキュベートし、プレートを２４±６時間観察した。
【０１３７】
対照として、希釈培養物を、製造元の指示に従って３Ｍ（商標）ＰＥＴＲＩＦＩＬＭ（商標）大腸菌／大腸菌群Ｃｏｕｎｔ  Ｐｌａｔｅｓ（ＰＦＥＣ）及び３Ｍ（商標）ＰＥＴＲＩＦＩＬＭ（商標）Ｓｅｌｅｃｔ大腸菌Ｃｏｕｎｔ  Ｐｌａｔｅｓ（ＰＳＥＣ）（両方とも３Ｍ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ；Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮから入手）に接種して、２４±２時間又は４８±３時間インキュベートし、製造元の指示に従ってコロニーを計測した。
【０１３８】
インキュベーション時間後、実施例１〜１２からの培養デバイスが観察され、黄色の酸ゾーン（すなわち、ラクトース発酵コロニー）によって取り囲まれた青色に見える可視コロニー（すなわち、グルクロニダーゼ陽性、大腸菌コロニーを示す）を、１つ以上の隣接する気泡（すなわち、ラクトース発酵コロニー）と共に検出及び計数した。実施例１〜１２のそれぞれのコロニー計数は、対照ＰＥＴＲＩＦＩＬＭプレートの計数と同様であった。
【０１３９】
加えて、各プレート上のコロニーを、培養デバイスのそれぞれにおいて、β−グルクロニダーゼ活性及びラクトース発酵について定性的に分析した。結果を表４に示す。
【０１４０】
【表４】
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【０１４１】
本明細書で言及した全ての特許、特許出願、及び公報、並びに電子的に入手可能な資料の全開示内容が、参照により組み込まれる。本出願の開示内容と参照により本明細書に組み込まれたいずれかの文書の開示内容との間に何らかの矛盾が存在する場合には、本出願の開示内容が優先するものとする。上記の詳細な説明及び実施例は、理解しやすいように示したものにすぎない。これによって不必要な限定がなされるものではない。本発明は図示及び記載された細部そのものに限定されず、当業者に明白な変形形態は、特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内に含まれる。
【０１４２】
全ての見出しは読者の便宜のためのものであり、明記しない限り、見出しに続く文言の意味を限定するために用いられるものではない。
【０１４３】
本発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく、様々な変更を行うことができる。これらの実施形態及び他の実施形態は、以下の特許請求の範囲に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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