(57)【要約】  本発明は、ＨＬＡ−Ｇ分子およびそれらの治療的使用の分野に関する。本発明は、新規のＨＬＡ−Ｇアイソフォーム、つまり新規ＲＮＡ転写物およびＨＬＡ−Ｇ遺伝子由来のタンパク質、それを含む医薬組成物ならびにこれらの転写物に特異的なプライマーおよびこれらのタンパク質に特異的な抗体に関する。本発明は、さらに、これらの分子の診断的使用または治療的使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離ＨＬＡ−Ｇタンパク質であって、配列が次の特性：
−そのＮ末端部分において、５個のアミノ酸残基ＭＫＴＰＲ、つまり配列番号１を含むこと、および／または；
−α１ドメインを欠く、つまり配列番号３の配列を欠くこと、および／または；
−膜貫通／細胞質ドメインを欠く、つまり配列番号６を欠き、前記タンパク質が、配列番号９０、９１および９２の配列の何れかからなること、および／または；
−１個のイントロンの少なくとも一部の保持の結果得られるアミノ酸を含み、ただし前記イントロンがイントロン２またはイントロン４ではないこと
のうち少なくとも１つを有する、単離ＨＬＡ−Ｇタンパク質。
【請求項２】
その配列が、配列番号７〜配列番号３１からなる群から選択される配列を含むかまたはそれらのみからなる、請求項１に記載の単離ＨＬＡ−Ｇタンパク質。
【請求項３】
そのＮ末端部分に５個のアミノ酸残基ＭＫＴＰＲを含む、請求項１に記載の単離ＨＬＡ−Ｇタンパク質。
【請求項４】
その配列が、配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６からなる群から選択される配列を含むかまたはそれらのみからなる、請求項１に記載の単離ＨＬＡ−Ｇタンパク質。
【請求項５】
その配列が、配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２９、３０、３１からなる群から選択される配列を含むかまたはそれらのみからなる、請求項１に記載の単離ＨＬＡ−Ｇタンパク質。
【請求項６】
その配列が、配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２１、２３、２５、２７、２８、３０からなる群から選択される配列を含むかまたはそれらからなる、請求項１に記載の単離ＨＬＡ−Ｇタンパク質。
【請求項７】
請求項１〜６の何れかで定義されるタンパク質をコードする、単離ポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項７で定義されるポリヌクレオチドを含む、組み換えベクター。
【請求項９】
薬剤としての使用のための、好ましくは自己免疫および／または炎症性疾患の処置での、または同種異系移植片拒絶の予防および／または処置での使用のための、請求項１〜６の何れかで定義されるようなタンパク質、請求項７で定義されるようなポリヌクレオチドおよび／または請求項８で定義されるようなベクター。
【請求項１０】
虚血、好ましくは心血管系疾患、末梢動脈疾患または脳卒中に付随する虚血の予防および／または処置における使用のための、請求項１〜６の何れかで定義されるようなタンパク質、請求項７で定義されるようなポリヌクレオチドおよび／または請求項８で定義されるようなベクター。
【請求項１１】
血管網膜症の予防および／または処置での使用のための、請求項１〜６の何れかで定義されるようなタンパク質、請求項７で定義されるようなポリヌクレオチドおよび／または請求項８で定義されるようなベクター。
【請求項１２】
−配列番号３２；
−配列番号３３または；
−配列番号３４
の少なくとも一部に相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
配列番号３５、３６または３７の配列のペプチドのうち少なくとも１つに特異的な抗体。
【請求項１４】
対象の生体試料中で、少なくとも、配列番号３８〜７４の配列および／または請求項１〜６の何れかで定義されるようなタンパク質のうち少なくとも１つからなるリストにおいて選択される配列を有するＲＮＡ転写物の検出を含み、好ましくは前記検出が、少なくとも配列番号７５〜７９からなるリストにおいて選択される配列を有するプライマーを使用して行われる、癌の診断のためのインビトロの方法。
【請求項１５】
配列番号７８〜８４からなるリストにおいて選択される配列を有する少なくとも２つのプライマーを含む、好ましくは少なくとも次のもの：
−配列番号７６の配列のプライマーＥｘ１Ｆまたは配列番号７７の配列のプライマーＰｒＰｒＦおよび配列番号８０の配列のプライマーＧ５２６Ｒ；
−配列番号７５の配列のプライマーｉｎｔ４Ｒおよび配列番号７８の配列のプライマーＩｎｔ３Ｆ；
−配列番号７８の配列のプライマープライマーＩｎｔ３Ｆおよび配列番号７９の配列のプライマーＩｎｔ５Ｒ
からなるリストにおいて選択されるプライマーの組み合わせを含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＬＡ−Ｇ分子およびそれらの治療的使用の分野に関する。本発明は、新規のＨＬＡ−Ｇアイソフォーム、つまり新規ＲＮＡ転写物およびＨＬＡ−Ｇ遺伝子由来のタンパク質、それを含む医薬組成物ならびにこれらの転写物に特異的なプライマーおよびこれらのタンパク質に特異的な抗体に関する。本発明は、さらに、これらの分子の診断的使用または治療的使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＬＡ−Ｇは、強力な免疫調整活性があるＨＬＡ−クラスＩｂ分子であり、これは、同種移植認識（すなわち母胎胎児間の境界または移植を受けた患者）を回避するために免疫応答の調整が必要とされる生理的条件で発現される。ＨＬＡ−Ｇは、最初、妊娠の維持において重要な役割を果たすことが記載され［１］、絨毛外栄養膜細胞層において胎児母体境界で構成的に発現されることが分かった。
【０００３】
ＨＬＡ−Ｇは免疫寛容誘発効果があり、ＴまたはＢリンパ球およびＮＫ細胞または多形核細胞と相互作用することによって適応および自然免疫を調整する。この効果には、α３ドメインを介した抑制性受容体への完全可溶性および膜結合アイソフォーム両方の直接的な結合が介在する。実際に、骨髄細胞系列のＢおよびＴリンパ球、ＮＫ細胞および単球は、免疫グロブリン様転写物ＩＬＴ２（ＣＤ８５ｊ、ＩＬＩＲＢ１）を発現し［１５］；単球、マクロファージおよび樹状細胞は、ＩＬＴ−４（ＣＤ８５ｄ、ＬＩＬＲＢ２）を発現する［１６］。キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ２ＤＬ４／ｐ４９）は、ＨＬＡ−Ｇに特異的であり、脱落膜ＮＫ細胞によって発現される。他の抑制性受容体とは異なり、これは活性化にも介在し得る［１７、１８］。さらに、可溶性ＨＬＡ−Ｇは、ＣＤ８様古典的クラスＩ可溶性分子を介してＴおよびＮＫ細胞のアポトーシスを誘発する［１９］。
【０００４】
ＨＬＡ−Ｇ発現は、正常な状態では一部の組織に制限されるが、病的状態では大きく増加する。実際に、ＨＬＡ−Ｇは、固形および血液腫瘍を含め、いくつかの病的状態において高レベルでデノボ発現される。膜結合型および可溶性ＨＬＡ−Ｇの過剰発現は、様々なヒト固形および血液腫瘍において検出されており、ＮＫおよびＴ細胞介在性の溶解を阻害することにより、免疫系の制御から逃れるために腫瘍細胞により行われる機序に相当し得る。特に、最も一般的なヒト腎臓悪性腫瘍の１つである腎明細胞癌（ｃｃＲＣＣ）［２、３］においてＨＬＡ−Ｇ発現の発生率が高いことが報告されている［４］。さらに、腫瘍エスケープを可能にする免疫チェックポイントとしてのＨＬＡ−Ｇの役割がマウスモデルにおいて明らかになっている［５、６］。
【０００５】
一方で、免疫反応のＨＬＡ−Ｇ介在性制御の喪失は、免疫エフェクター細胞の無制御活性化により引き起こされる自己免疫／炎症性疾患の発症につながり得る。過去数年のいくつかの研究から、ＨＬＡ−Ｇは、自己免疫／炎症性疾患、例えば多発性硬化症（ＭＳ）、クローン病（ＣＤ）、乾癬、天疱瘡、セリアック病、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、喘息、若年性特発性関節炎および関節リウマチ（ＲＡ）の制御において重要な役割を果たすことが明らかになっている［２３］。
【０００６】
ＨＬＡ−Ｇの７個のアイソフォームが同定されており、その中でも４個は膜結合型（ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３およびＨＬＡ−Ｇ４）であり、３個は可溶性（ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６およびＨＬＡ−Ｇ７）である。これらのＨＬＡ−Ｇの全てがそのＮ末端にペプチドシグナルを含む。
【０００７】
ＨＬＡ−Ｇ１タンパク質アイソフォームは、３個の外部ドメイン（α１、α２およびα３）、膜貫通領域および細胞質ドメインを含む。ＨＬＡ−Ｇ２タンパク質アイソフォームはα２ドメインを含まず、すなわちα１およびα３ドメインが直接連結され、続いて膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインが連結される。ＨＬＡ−Ｇ３タンパク質アイソフォームはα２およびα３ドメインの両方を欠き、すなわちこれは、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに直接連結されるα１ドメインを含む。ＨＬＡ−Ｇ４タンパク質アイソフォームはα３ドメインを欠き、すなわちこれはα１ドメイン、α２ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。
【０００８】
可溶性ＨＬＡ−Ｇアイソフォームは全て膜貫通および細胞質ドメインを欠く。興味深いことに、全てのこれらの可溶性ＨＬＡ−Ｇタンパク質は、膜結合型ＨＬＡ−Ｇの何れにも存在しないさらなるアミノ酸を含有し、これは、１個のイントロンの保持によるものである。より具体的には、
−（転写物スプライシングおよびＲＮＡ成熟後のイントロン４保持の結果として）ＨＬＡ−Ｇ５タンパク質アイソフォームは、α１、α２およびα３ドメイン、ならびにイントロン４によりコードされる２１個のアミノ酸残基の余分なＣ末端ペプチド配列を含有し；
−（転写物スプライシングおよびＲＮＡ成熟後のイントロン４保持の結果として）ＨＬＡ−Ｇ６タンパク質アイソフォームは、α２内のＨＬＡ−Ｇ５に対応し、すなわちＨＬＡ−Ｇ６は、α１およびα３ドメインならびにイントロン４によりコードされる２１個のアミノ酸残基の余分なＣ末端ペプチド配列を含有し；
−（転写物スプライシングおよびＲＮＡ成熟後のイントロン２保持の結果として）ＨＬＡ−Ｇ７タンパク質アイソフォームは、α１ドメインのみ、ならびにイントロン２によりコードされる２個のさらなるＣ末端アミノ酸残基を含有する。
【０００９】
報告されている７個の全てのＨＬＡ−Ｇアイソフォームは、１つの主要な転写物のオルタナティブスプライシングによるものであり、同様の翻訳開始部位を有し、明確に異なる機能的役割はまだ提案されていない。
【００１０】
今までのところ、ＨＬＡ−Ｇ遺伝子のエクソンのナンバリングは、ＩＭＧＴ／ＨＬＡデータベース（本明細書中でＩＭＧＴ／ＨＬＡ命名法とも呼ばれる。）に基づき、８個のエクソン、７個のイントロンおよび３’非翻訳末端を含み、次のドメイン：エクソン１：シグナル配列、エクソン２：α１細胞外ドメイン、エクソン３：α２、細胞外ドメイン、エクソン４：α３細胞外ドメイン、エクソン５：膜貫通ドメイン、エクソン６：細胞質ドメインＩ、エクソン７：細胞質ドメインＩＩ（非翻訳）、エクソン８：細胞質ドメインＩＩＩ（非翻訳）および３’非翻訳領域にそれぞれ対応するものとして記載された。
【００１１】
しかし、Ｅｎｓｅｍｂｌデータベースによると、ＨＬＡ−Ｇ遺伝子は、ＩＭＧＴ／ＨＬＡデータベースにない５’末端の補足的エクソンを保持し得る。さらに、エクソン７が非翻訳ドメインに対応するので、それをエクソンそれ自体としてみなすことが適切であるか否かという疑問が残る。
【００１２】
したがって、この補足的エクソンの存在は、５’−非翻訳領域（ＵＴＲ）のサイズおよびプロモーターの位置を変化させる。これは、制御タンパク質および／またはｍｉＲＮＡの結合を修飾することによって、遺伝子の制御を変化させ得る。
【００１３】
マウスモデルにおいて合成ＨＬＡ−Ｇ由来タンパク質または抗体に基づく治療アプローチが出現してきており、これらの新規治療ツールは、癌、感染疾患、自己免疫／炎症性疾患および同種異系移植片拒絶の処置に有用であることを証明し得る。さらに、ＨＬＡ−Ｇ１の可溶性型（ＨＬＡ−Ｇ５とも呼ばれる。）が血管形成を阻害し、病的な血管新生を予防するための治療標的としてのその使用が示唆されていることが示されている［２８］。
【００１４】
したがって、これに関連して、ＨＬＡ−Ｇ分子に基づく新規治療アプローチが必要とされている。
【発明の概要】
【００１５】
発明者らは、オルタナティブスプライシングゆえである可能性が最も高い、ＨＬＡ−Ｇ遺伝子の新規転写物を発見した。
【００１６】
発明者らは、エクソン１（ＩＭＧＴ／ＨＬＡ命名法による。）の上流の領域に対応する、５’末端に補足的配列を有するＨＬＡ−Ｇ転写物の存在を明らかにした。興味深いことに、本明細書中で長いＨＬＡ−Ｇ転写物と呼ばれるこれらの転写物は、既知のＨＬＡ−Ｇ転写物と比較して１０６ｂｐ欠失もあり、翻訳開始の出発点として使用され得るＡＴＧを保持する（［２９］）。
【００１７】
これらの結果により、Ｅｎｓｅｍｂｌデータベースに基づく新しい命名法の使用が適切であるという仮説が確認される。したがって、具体的な指示がない限り、Ｅｎｓｅｍｂｌ命名法を本明細書中で以後使用する。図１で例示されるこの新しい命名法において、第１のエクソンは、５’末端の補足的配列内に位置し、前のエクソン７が抑えられる。したがって、エクソンナンバリングがその結果変更される：エクソン１：新たに発見した配列に対応；エクソン２：シグナル配列；エクソン３：α１細胞外ドメイン；エクソン４：α２細胞外ドメイン；エクソン５：α３細胞外ドメイン；エクソン６：膜貫通ドメイン；エクソン７：細胞質ドメインＩ；エクソン８：細胞質ドメインＩＩＩ（非翻訳）および３’非翻訳領域（ＩＭＧＴ／ＨＬＡ命名法と比較して、エクソン１はエクソン２に再ナンバリングされ、エクソン２はエクソン３に再ナンバリングされるなど）。
【００１８】
発明者らは、イントロン１、４、６または７の何れかを保持する新しいＨＬＡ−Ｇ転写物、ならびに２個のイントロンを同時に、特にイントロン３および４またはイントロン３および５を保持する転写物をさらに発見したが、これらは前に報告されたことがない。
【００１９】
発明者らは、オルタナティブスプライシングの結果、新しい翻訳開始コドンの可能性がエクソン２に位置する翻訳開始コドンとは異なり、今までのところ、ＨＬＡ−Ｇタンパク質の唯一の可能な翻訳開始コドンとしてみなされていることをさらに示した。新しい転写物において、可能な翻訳開始コドンは、エクソン１において、およびエクソン４において見出された。
【００２０】
言い換えると、この新規転写物は新規ＨＬＡ−Ｇタンパク質をコードし、この個々の構造は、今まで開示されたＨＬＡ−Ｇアイソフォームとは異なる。
【００２１】
これらの新規転写物内で、発明者らは、以前にＨＬＡ−Ｇタンパク質と関連して開示されたことがない、いくつかの主要な特性を同定した。
【００２２】
第１の特性は、同定される新規ＨＬＡ−Ｇタンパク質のうち一部における、Ｎ末端での５個のアミノ酸残基ＭＫＴＰＲ、つまりエクソン１（ＩＭＧＴ／ＨＬＡ命名法による。）の上流の存在である。この特性は、エクソン１における翻訳開始によるものである。便宜上、および単に明確化するために、およびそれらのアミノ酸配列の実際の長さとは独立に、この特性を有するＨＬＡ−Ｇタンパク質は、このさらなるアミノ酸残基の存在を強調するために、本明細書中で「長いＨＬＡ−Ｇ」と呼ばれる。
【００２３】
第２の特性は、同定される新規ＨＬＡ−Ｇタンパク質のうち一部においてα１ドメインがないことである。
【００２４】
第３の特性は、同定される新規ＨＬＡ−Ｇタンパク質のうち一部において膜貫通ドメインがないことであり、このタンパク質は、既知の可溶性ＨＬＡ−Ｇタンパク質ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６およびＨＬＡ−Ｇ７とは異なるペプチド配列を有する。便宜上、および単に明確化するために、これらの特性を有するＨＬＡ−Ｇタンパク質は、本明細書中で「可溶性ＨＬＡ−Ｇ」と呼ばれる。
【００２５】
第４の特性は、同定される新規ＨＬＡ−Ｇタンパク質のうち一部において、イントロン２または４とは異なるイントロンの少なくとも一部の保持であり、この保持はＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６およびＨＬＡ−Ｇ７で観察される。一貫して既知のＨＬＡ−Ｇタンパク質の報告された機能とともに、新たに同定されたＨＬＡ−Ｇタンパク質の全てが免疫寛容誘発性の特性を有することが予測される。したがって、これらのタンパク質は、自己免疫／炎症性疾患、例えば多発性硬化症（ＭＳ）、クローン病（ＣＤ）、乾癬、天疱瘡、セリアック病、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、喘息、若年性特発性関節炎および関節リウマチ（ＲＡ）などの処置において、ならびに同種異系移植片拒絶の予防において有用であり得る。
【００２６】
さらに、当技術分野での知識に基づき、新たに発見されたＨＬＡ−Ｇ転写物および対応するタンパク質は、癌細胞が免疫チェックポイントを逃れる能力に関与し、したがって重要な治療標的を構成することが予想される。この文脈において、発明者らは、癌の処置、特に腎明細胞癌（ｃｃＲＣＣ）において使用され得る、新規ＲＮＡ転写物またはそれらがコードするタンパク質の何れかを標的とする分子ならびにこのような分子を含む組成物を設計した。
【００２７】
発明者らは、実験パートで詳述されるように、新たに同定したＨＬＡ−Ｇタンパク質がインビボで驚くべき血管新生効果を有することを明らかにした。この効果は、文献で報告されたＨＬＡ−Ｇ５／可溶性ＨＬＡ−Ｇ１の効果と際立って対照的である。このように、一方で、新たに同定したＨＬＡ−Ｇタンパク質は、例えば心血管系疾患、末梢動脈疾患および脳卒中において見られる症状である虚血など、このような血管新生効果が所望される病態の処置における治療的な血管形成として有用であり得る。
【００２８】
さらに、発明者らは、これらの転写物およびそれらがコードするタンパク質の検出において有用なプライマーおよび抗体を設計し、したがってこれらは癌の診断において使用され得る。
【００２９】
したがって、本発明の第１の態様は、配列が次の特性：
−そのＮ末端部分において、５個のアミノ酸残基ＭＫＴＰＲ、つまり配列番号１を含むこと、および／または；
−α１ドメインを欠く、つまり配列番号３の配列を欠くこと、および／または；
−膜貫通／細胞質ドメインを欠く、つまり配列番号６を欠くこと；および
−１個のイントロンの少なくとも一部の保持の結果得られるアミノ酸を含み、ただし前記イントロンはイントロン２またはイントロン４ではないこと
のうち少なくとも１つを有する単離ＨＬＡ−Ｇタンパク質である。
【００３０】
「ＨＬＡ−Ｇタンパク質」という用語は、ＨＬＡ−Ｇ遺伝子、好ましくは遺伝子ＩＤ３１３５（ゲノム参照番号ＧＲＣｈ３８．ｐ１０に基づくＧｅｎｅＢａｎｋデータベースにおいて言及される場合）のヒトＨＬＡ−Ｇ遺伝子、の発現の結果得られる何らかのタンパク質またはポリペプチドを包含する。好ましくは、「ＨＬＡ−Ｇタンパク質」は、少なくとも、Ｅｎｓｅｍｂｌ命名法による、ヒトＨＬＡ−Ｇ遺伝子のエクソン１〜８の何れかの翻訳に対応する配列を含むタンパク質またはポリペプチドである。言い換えると、「ＨＬＡ−Ｇタンパク質」は、好ましくは次のドメイン：そのＮ末端部分における５個のアミノ酸残基ＭＫＴＰＲ、ペプチドシグナル、α１ドメイン、α２ドメイン、α３ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン、のうち少なくとも１つを含む。
【００３１】
本発明の文脈において、「ペプチドシグナル」は、配列番号２の配列を有する。
【００３２】
本発明の文脈において、「α１ドメイン」は、配列番号３の配列を有する。
【００３３】
本発明の文脈において、「α２ドメイン」は、配列番号４の配列を有する。
【００３４】
本発明の文脈において、「α３ドメイン」は、配列番号５の配列を有する。
【００３５】
本発明の文脈において、「膜貫通／細胞質ドメイン」は配列番号６の配列を有する。
【００３６】
「イントロン保持の結果得られるアミノ酸」という用語は、当技術分野で一般的に理解されるように解釈するべきである。本発明の文脈において、当業者は、タンパク質の配列を、例えばＨＬＡ−Ｇ遺伝子のエクソン全ての翻訳に存する参照配列など、イントロン保持の結果得られる何らかのアミノ酸を欠く参照配列と比較することによって、このようなアミノ酸を容易に同定し得る。このような比較に適切な参照配列は配列番号７であり、これは、ＨＬＡ−Ｇ遺伝子のエクソンの全てを有し、イントロンがない、つまりそれらのＮ末端部分の５個のアミノ酸残基ＭＫＴＰＲ、ペプチドシグナル、α１、α２およびα３ドメイン、膜貫通／細胞質ドメインを有するＨＬＡ−Ｇタンパク質のペプチド配列に対応する。本発明によれば、配列番号７との比較において付加を構成する何らかのアミノ酸残基はイントロン保持によるものである。
【００３７】
好ましくは、本発明の文脈において、「配列が膜貫通／細胞質ドメインを欠く、つまり配列が配列番号６の配列を欠くＨＬＡ−Ｇタンパク質」は、配列が：
−配列番号１の少なくとも一部；および／または；
−配列番号２の少なくとも一部；および／または；
−配列番号３の少なくとも一部；および／または；
−配列番号４の少なくとも一部；および／または；
−配列番号５の少なくとも一部
からなるタンパク質であり、
−ただし、このタンパク質は、ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６またはＨＬＡ−Ｇ７の配列がなく、つまり、それぞれ配列番号９０、９１および９２の配列の何れかからなるものとする。
【００３８】
発明者らは特に、本発明によるいくつかの新規ＨＬＡ−Ｇタンパク質を同定した。本発明による単離ＨＬＡ−Ｇタンパク質は、好ましくは、配列が、配列番号７〜配列番号３１からなる群から選択される配列を含むかまたはそれらのみからなるタンパク質である。
【００３９】
好ましくは、配列がそのＮ末端部分に５個のアミノ酸残基ＭＫＴＰＲを含む本発明によるＨＬＡ−Ｇタンパク質は、配列が、配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６からなる群から選択される配列を含むかまたはそれらのみからなるタンパク質である。
【００４０】
好ましくは、配列がα１ドメインを欠く本発明によるＨＬＡ−Ｇタンパク質は、配列が配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２９、３０、３１からなる群から選択される配列を含むかまたはそれらからなるタンパク質である。
【００４１】
好ましくは、配列が膜貫通／細胞質ドメインを欠く本発明によるＨＬＡ−Ｇタンパク質は、配列が配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２１、２３、２５、２７、２８、３０からなる群から選択される配列を含むかまたはそれらのみからなるタンパク質である。
【００４２】
本発明によるＨＬＡ−Ｇタンパク質は精製タンパク質または合成タンパク質であり得、これらは当業者にとって公知の従来技術により得ることができる。
【００４３】
好ましくは、本発明は、上記タンパク質の変異体も包含し、つまり、配列が、上記タンパク質のうち少なくとも１つと少なくとも８０、８５、９０または９５％同一性を有するタンパク質である。
【００４４】
本発明の意味において、核酸またはアミノ酸の２つの配列間の「パーセンテージ同一性」または「％同一性」は、最適アライメント後に得られる、比較しようとする２つの配列間の同一であるヌクレオチドまたはアミノ酸残基のパーセンテージを意味し、このパーセンテージは純粋に統計学的なものであり、この２つの配列間の相違はそれらの長さに沿って無作為に分布する。２つの核酸またはアミノ酸配列の比較は、それらを最適にアラインした後に配列を比較することによって従来から行われ、この比較は、セグメントにより、または「アライメントウィンドウ」を使用することにより行うことが可能である。手作業による比較に加えて、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムにより、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）の類似性検索方法により、またはこれらのアルゴリズムを使用したコンピュータソフトウェアにより（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおける、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡまたは比較ソフトウェアＢＬＡＳＴ  ＮＲまたはＢＬＡＳＴ  Ｐによる。）、比較のための配列の最適アライメントを行い得る。
【００４５】
２つの核酸またはアミノ酸配列間のパーセンテージ同一性は、２つの最適にアライメントされた配列を比較することによって決定され、比較するための核酸またはアミノ酸配列は２つの配列間の最適アライメントのために参照配列と比較して付加または欠失を有し得る。２つの配列間で、好ましくは２つの完全配列間でアミノ酸、ヌクレオチドまたは残基が同一である位置の数を決定し、アライメントウィンドウ中の位置の総数により同一である位置の数を除して、その結果に１００をかけて２つの配列間のパーセンテージ同一性を得ることによって、パーセンテージ同一性を計算する。
【００４６】
例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｂｌ２．ｈｔｍｌのサイトで利用可能なＢＬＡＳＴプログラム、「ＢＬＡＳ  Ｔ２  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」［２７］は、初期設定パラメーターとともに使用し得（とりわけパラメーター「オープン・ギャップ・ペナルティー」：５および「伸長ギャップペナルティー」：２；選択されるマトリクスは、例えばプログラムにより提案される「ＢＬＯＳＵＭ  ６２」マトリクスである。）；
比較するための２つの配列間のパーセンテージ同一性はプログラムによって直接計算される。
【００４７】
好ましくは、本発明は、本発明によるＨＬＡ−Ｇタンパク質の機能的変異体をさらに包含し、この場合、アミノ酸残基は、同様の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基に対して置換され、したがって分子の機能的特性を変化させない。
【００４８】
好ましくは、本発明は、修飾されたタンパク質が機能的なままである限り、タンパク質の安定性、バイオアベイラビリティまたは生体反応性を向上させることを目的とした、タンパク質の１つ以上のアミノ酸残基、ペプチド結合、Ｎ−および／またはＣ末端への何らかの化学的修飾の導入による上記タンパク質由来の修飾タンパク質も包含する。
【００４９】
当技術分野で周知のように、単離タンパク質のインビボでの使用に対する代替法は、発現可能な形態でそのタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはそのポリヌクレオチドを含む組み換えベクターの使用であり得る。このようなベクターは、タンパク質の産生またはインビボでの治療的使用に有用である。
【００５０】
本発明の別の態様は、本発明のタンパク質をコードする単離ポリヌクレオチドに関する。合成または組み換えポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの組み合わせ、１本鎖および／または２本鎖の何れかであり得る。好ましくは、本ポリヌクレオチドは、タンパク質が発現される宿主に対して最適化されるコード配列を含む。
【００５１】
本発明の別の態様は、このポリヌクレオチドを含む組み換えベクターに関する。好ましくは、この組み換えベクターは、宿主細胞に遺伝子移入されるかまたは形質転換されたときにこのポリヌクレオチドを発現可能である発現ベクターである。本ポリヌクレオチドは、発現に対して正しい方向で、および正しい読み枠で発現ベクターに挿入される。好ましくは、本ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの転写調節配列に、および場合によっては少なくとも１つの翻訳調節配列に操作可能に連結される。組み換えベクターとしては、例えばプラスミドおよびウイルスベクターを含め、遺伝子操作および遺伝子治療において使用される通常のベクターが挙げられる。
【００５２】
本発明のさらなる態様は、このポリヌクレオチドまたは組み換えベクターを用いて形質転換される宿主細胞を提供する。
【００５３】
本発明のポリヌクレオチド、ベクターおよび／または細胞は、周知の組み換えＤＮＡ技術を使用して調製され得る。
【００５４】
特に本明細書中で開示される新たに発見されたＨＬＡ−Ｇタンパク質の全てがα３ドメインを有するので、本発明のタンパク質が、当技術分野で既知であるＨＬＡ−Ｇタンパク質と同様の免疫寛容誘発特性を有することが予想される。
【００５５】
本発明の別の態様は、本発明の少なくとも１つのタンパク質、ポリヌクレオチドおよび／またはベクターおよび好ましくは薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物に関する。
【００５６】
適切なビヒクルまたは担体としては、何れかの薬学的に許容可能なビヒクル、例えば緩衝剤、安定化剤、希釈剤、塩、保存剤、乳化剤、甘味料などが挙げられる。ビヒクルは一般的に等張性の水性または非水性溶液を含み、これらは既知の技術に従い調製され得る。適切な溶液としては、緩衝化された溶質、例えばリン酸緩衝溶液、塩化物溶液、リンゲル液などが挙げられる。
【００５７】
本発明のさらなる態様は、薬剤としての使用のための本発明のタンパク質、ポリヌクレオチドおよび／またはベクターに関する。
【００５８】
好ましくは、本発明の上記のタンパク質、ポリヌクレオチドおよび／またはベクターは、自己免疫および／または炎症性疾患の処置における、または同種異系移植片拒絶の予防および／または処置における使用のための、虚血、好ましくは心血管系疾患、末梢動脈疾患または脳卒中に付随する虚血の予防および／または処置における使用のための、または血管網膜症の予防および／または処置における使用のためのものである。
【００５９】
本発明の文脈において、血管網膜症という用語は、フォンヒッペルの血管腫症、海綿状網膜血管腫、コーツ病、特発性黄斑毛細血管拡張症（リース病）、網膜の中心動脈の閉塞、動脈枝の閉塞、毛様体網膜動脈の閉塞、眼動脈の閉塞、網膜静脈閉塞を包含する。
【００６０】
医学的用途の文脈において、当業者は、好ましくは本発明のＨＬＡ−Ｇタンパク質の中でも、α−３ドメインを有するもの、例えば配列番号７、８、９、１０、１３、１４、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２６、２７、３１の配列のタンパク質の何れかを選択し得る。
【００６１】
有利に、薬剤としての使用のため、好ましくは上記の処置での使用のためのＨＬＡ−Ｇタンパク質は、配列が、配列番号７、８、９、１０、１３、１４、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２６、２７および３１からなるリストにおいて選択される配列を含むかまたはそれらのみからなるタンパク質である。
【００６２】
本発明の文脈において、自己免疫／炎症性疾患は好ましくは、多発性硬化症（ＭＳ）、クローン病（ＣＤ）、乾癬、天疱瘡、セリアック病、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、喘息、若年性特発性関節炎および関節リウマチ（ＲＡ）、また好ましくは乾癬を指す。
【００６３】
本発明は、自己免疫／炎症性疾患の処置のための、または同種異系移植片拒絶の予防および処置のための、虚血、好ましくは心血管系疾患、末梢動脈疾患または脳卒中に付随する虚血の予防および／または処置での使用のための、または血管網膜症の予防および／または処置での使用のための方法も提供し、この方法は、本発明の少なくとも１つのタンパク質、ポリヌクレオチドおよび／またはベクターまたは上記のような組成物の治療的有効量を個体に投与することを含む。
【００６４】
「治療的有効量」とは、本明細書により、疾患進行を少なくとも軽減するかまたは予防するのに経時的に十分である量を指す。一般的には、この量は、病的状態、対象、処置の持続期間、他の活性成分の存在などに依存して、当業者により調整され得る。
【００６５】
既に述べられたように、新たに発見したＨＬＡ−Ｇ転写物および対応するタンパク質は、特に癌の処置に対して重要な治療標的である。一般的には、治療目的のために、アンチセンスオリゴヌクレオチドによりＲＮＡ転写物が標的とされ得、一方でタンパク質は特異的な抗体により標的とされ得る。
【００６６】
例えば、配列がα１ドメインをコードする配列を欠くが、シグナルペプチドおよびα２およびα３ドメインをコードする配列を含有するＲＮＡ転写物は、シグナルペプチドをコードする配列とα２ドメインをコードする配列との間に連結部を有し、これは配列番号３２の配列に対応し、他のＨＬＡ−Ｇタンパク質では見られない。同様に、α３ドメインおよびシグナルペプチドをコードする配列からなるが、α１およびα２ドメインを欠くＲＮＡ転写物は、α３ドメインをコードする配列とシグナルペプチドとの間の連結部に対応する配列番号３３の配列を含む。可溶性ＨＬＡ−ＧをコードするＲＮＡ転写物は、配列番号３４の配列を含む。
【００６７】
本発明の別の目的は、
−配列番号３２；
−配列番号３３または；
−配列番号３４
の少なくとも一部に相補的である配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００６８】
本発明はさらに、本発明の少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを含む組み換えベクターに関する。
【００６９】
本発明の新規ＨＬＡ−Ｇタンパク質は、それぞれ配列番号３２、３３および３４の連結配列によりコードされる特異的なペプチド配列、配列番号３５、３６および３７を有し、これはこのようなタンパク質に特異的な抗体、つまりある種のＨＬＡ−Ｇタンパク質に特異的な抗ＨＬＡ−Ｇ抗体、を作製するために抗原として使用され得る。
【００７０】
本発明の別の目的は、配列番号３５、３６または３７の配列のペプチドのうち少なくとも１つに特異的な抗体である。
【００７１】
本発明の目的のために、「抗体」という用語は、別の分子に特異的に結合し、それにより別の分子の特定の空間および極性機構と相補的なものとして定義される免疫グロブリンを指す。抗体はモノクローナルまたはポリクローナルであり得、宿主の免疫付与および血清（ポリクローナル）の回収などの技術分野において周知である技術により、または連続的ハイブリッド細胞株を調製し、分泌型タンパク質（モノクローナル）を回収することにより、または少なくとも天然抗体の特異的な結合に必要とされるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列もしくはその突然変異型をクローニングし、発現させることによって、調製され得る。抗体は完全な免疫グロブリンまたはそれらの断片を含み得、この免疫グロブリンとしては、様々なクラスおよびアイソタイプ、例えばＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３、ＩｇＭなどが挙げられる。機能的抗体断片は、全長抗体と同様の親和性で結合を保持可能な抗体の一部を含み得る（例えば、Ｆａｂ、ＦｖおよびＦ（ａｂ’）２またはＦａｂ’）。さらに、特定の分子に対する結合親和性が実質的に維持される限り、適切な場合は、免疫グロブリンまたはそれらの断片の凝集体、ポリマーおよびコンジュゲートが使用され得る。
【００７２】
「少なくとも１つのペプチドに特異的な抗体」という用語は、当技術分野で一般に理解されるものと解釈されるべき、すなわち、この少なくとも１つのペプチドに対する実質的な親和性、好ましくは約１０−５Ｍ（ＫＤ）以上の強い親和性をこの抗体が示すことが示されるように、解釈されるべきである。親和性は、当業者にとって周知である様々な方法により決定され得、これには、Ｂｉａｃｏｒｅ分析、Ｂｌｉｔｚ分析およびスキャッチャードプロットが含まれるが限定されない。
【００７３】
本発明の別の目的は、本発明による、抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび／またはそれをコードするベクターおよび好ましくは薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物である。
【００７４】
本発明のさらなる態様は、薬剤としての使用のための本発明の、抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび／またはそれをコードするベクターに関する。
【００７５】
好ましくは、本発明の、上記の抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび／またはそれをコードするベクターは、癌の処置において使用される。
【００７６】
癌の非限定例としては、食道、胃、結腸、膵臓、メラノーマ、甲状腺、肺、乳房、腎臓、膀胱、子宮、卵巣および前立腺の癌；肝細胞癌腫、骨肉腫、シリンドロマトース（ｃｙｌｉｎｄｒｏｍａｔｏｓｅ）、神経芽細胞腫、神経膠芽腫、星状細胞腫、大腸炎付随癌、多発性骨髄腫および様々なタイプの白血病およびリンパ腫、例えばびまん性大細胞型Ｂ−細胞リンパ腫、縦隔原発Ｂ−細胞リンパ腫（ＰＭＢＬ）、ホジキンリンパ腫およびＭＡＬＴリンパ腫などが挙げられる。好ましい実施形態において、この癌は腎明細胞癌（ｃｃＲＣＣ）である。
【００７７】
本発明は、本発明の、抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび／またはそれをコードするベクターまたは上記のような組成物の治療的有効量を個体に投与することを含む、癌の処置のための方法も提供する。
【００７８】
既に示されるように、発明者らは、癌細胞の試料が特異的なＨＬＡ−Ｇ転写物、つまりヒトＨＬＡ−Ｇ遺伝子の発現に対応するＲＮＡ分子を含むことを同定し、これらのＲＮＡ転写物は、配列番号３８〜７４の配列に対応する。したがって、発明者らは、生体試料中でのこのようなＲＮＡ転写物の存在に基づく癌の診断のためのインビトロの方法を開発した。
【００７９】
本発明はさらに、対象の生体試料中で、配列番号３８〜７４の配列および／または上記で開示されるような本発明のタンパク質のうち少なくとも１つからなるリストにおいて選択される配列を有する少なくとも少なくともＲＮＡ転写物の検出を含む、癌の診断のためのインビトロの方法に関する。
【００８０】
「生体試料」という用語は、生体組織または体液由来の試料を含む、対象から得られる試料を指す。このような試料は、ヒトを含む哺乳動物から単離される体液（例えば血液、血漿、血清または尿）、臓器、組織、分画および細胞であり得るが限定されない。生体試料はまた、組織（例えば臓器または組織の切片部分を含む生体試料の切片）も含み得る。
【００８１】
生体試料はまた、生体試料からの抽出物、例えば体液（例えば血液または尿）由来の抗原も含み得る。好ましくは、対象は哺乳動物、また好ましくはヒトである。
【００８２】
本発明の文脈において、少なくとも、配列番号３８〜７４の配列および／または本発明のタンパク質のうち少なくとも１つからなるリストにおいて選択される配列を有するＲＮＡ転写物の検出は、対象が癌を有することを示す。
【００８３】
癌の非限定例としては、食道、胃、結腸、膵臓、メラノーマ、甲状腺、肺、乳房、腎臓、膀胱、子宮、卵巣および前立腺の癌；肝細胞癌腫、骨肉腫、シリンドロマトース（ｃｙｌｉｎｄｒｏｍａｔｏｓｅ）、神経芽細胞腫、神経膠芽腫、星状細胞腫、大腸炎付随癌、多発性骨髄腫および様々なタイプの白血病およびリンパ腫、例えばびまん性大細胞型Ｂ−細胞リンパ腫、縦隔原発Ｂ−細胞リンパ腫（ＰＭＢＬ）、ホジキンリンパ腫およびＭＡＬＴリンパ腫などが挙げられる。好ましい実施形態において、この癌は腎明細胞癌（ｃｃＲＣＣ）である。
【００８４】
本発明のタンパク質の少なくとも１つの検出は、上記で開示されるように、そのタンパク質に特異的な少なくとも１つの抗体によって、適切な免疫学的方法（例えばＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、免疫蛍光、免疫組織化学）を実行することにより行われ得る。
【００８５】
ＲＮＡ転写物の検出は、ハイブリッド形成により、そのＲＮＡに特異的なヌクレオチドプローブ（例えばバイオチップに付着）により、または増幅（例えばＲＴ−ＰＣＲによる。）により、そのＲＮＡ転写物に特異的なヌクレオチドプライマーにより、行われ得る。
【００８６】
発明者らは、特に本発明のＲＮＡ転写物の少なくとも１つを検出するために適切なヌクレオチドプライマーを開発した：
−イントロン４の開始部とハイブリッド形成するように設計され、したがってこのイントロンを保持したＨＬＡ−Ｇ転写物を検出するために使用され得る、配列番号７５の配列のプライマーｉｎｔ４Ｒ；
−エクソン１に対して相補的な領域とハイブリッド形成するように設計され、したがって長いＨＬＡ−Ｇタンパク質をコードする転写物を検出するために使用され得る、配列番号７６の配列のプライマーＥｘ１Ｆ；
−プロモーター領域として報告される遺伝子の５’−転写物末端としてアノテートされる領域のさらに上流に位置する領域とハイブリッド形成するように設計され、したがって長いＨＬＡ−Ｇタンパク質をコードする転写物を検出するために使用し得る、配列番号７７の配列のプライマーＰｒＰｒＦ；
−イントロン３に位置する領域とハイブリッド形成するように設計され、このイントロンを保持したＨＬＡ−Ｇ転写物を検出するために使用され得る、配列番号７８の配列のプライマーＩｎｔ３Ｆ；
−イントロン５に位置する領域とハイブリッド形成するように設計され、このイントロンを保持したＨＬＡ−Ｇ転写物を検出するために使用され得る、配列番号７９の配列のプライマーＩｎｔ５Ｒ。
【００８７】
これらのプライマーは、本発明の診断方法を実行するために特に有用である。したがって、本発明の方法における一実施形態において、少なくとも本発明のＲＮＡ転写物の検出は、少なくとも配列番号７５〜７９からなるリストにおいて選択される配列を有するプライマーを使用して行われる。
【００８８】
これらの特異的なプライマーは、互いにまたは、当技術分野で開示されているＨＬＡ−Ｇ転写物に特異的な他の既知のプライマー、例えば配列番号８０の配列のプライマーＧ５２６Ｒなどと組み合わせて使用され得る。２つのイントロン（イントロン３および４またはイントロン３および５）を保持した転写物を検出するために、プライマーＩｎｔ３ＦおよびプライマーＩｎｔ５Ｒまたはプライマーｉｎｔ４Ｒの何れかの組み合わせのさらなる何れかを使用し得る。
【００８９】
好ましい実施形態において、本発明の診断の方法で、本発明の少なくともＲＮＡ転写物の検出は、次の組み合わせの少なくとも１つ：
−配列番号７６の配列のプライマーＥｘ１Ｆまたは配列番号７７の配列のプライマーＰｒＰｒＦおよび配列番号８０の配列のプライマーＧ５２６Ｒ；
−配列番号７５の配列のプライマーｉｎｔ４Ｒおよび配列番号７８の配列のプライマーＩｎｔ３Ｆ；
−配列番号７８の配列のプライマープライマーＩｎｔ３Ｆおよび配列番号７９の配列のプライマーＩｎｔ５Ｒを使用して行われ；
したがって、本発明の別の目的は、配列番号７５〜７９からなるリストにおいて選択される配列を有するプライマーである。
【００９０】
本発明はさらに、配列番号７５〜８０からなるリストにおいて選択される配列を有する少なくとも２つのプライマーを含むキットに関する。
【００９１】
好ましくは、本キットは、少なくとも、次のもの：
−配列番号７６の配列のプライマーＥｘ１Ｆまたは配列番号７７の配列のプライマーＰｒＰｒＦおよび配列番号８０の配列のプライマーＧ５２６Ｒ；
−配列番号７５の配列のプライマーｉｎｔ４Ｒおよび配列番号７８の配列のプライマーＩｎｔ３Ｆ；
−配列番号７８の配列のプライマーＩｎｔ３Ｆおよび配列番号７９の配列のプライマーＩｎｔ５Ｒ
からなるリストにおいて選択されるプライマーの組み合わせを含み；
本発明は、次の実施の例から出現する他の規定も含み、これは本発明の範囲を限定するように解釈され得ない。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】ＨＬＡ−Ｇ遺伝子の構造の略図。Ａ．ＩＭＧＴ／ＨＬＡ命名法（上）およびＥｎｓｅｍｂｌデータベース（下）。番号はＨＬＡ−Ｇタンパク質のエクソンおよびドメインを表し、下に示す。ＴＭ：膜貫通；ＣＴ：細胞質尾部。Ｂ．異なるＲＴ−ＰＣＲストラテジーのために使用されるプライマーの位置。特異的なアンプリコンに対するｂｐ単位でのサイズおよび翻訳開始コドンを示す。
【図２】この実験に含まれる８個のｃｃＲＣＣの差次的な形態およびＨＬＡ−Ｇ染色パターン。免疫組織化学実験のために陽性対照として栄養膜組織を使用した（Ｈ＆Ｅおよび免疫ペルオキシダーゼ染色）。
【図３】ｃｃＲＣＣ患者におけるＨＬＡ−Ｇ１の発現。ＨＬＡ−Ｇ１に特異的なプライマーＧ２５７ＦおよびＧ５２６Ｒ（上のパネル）および対照としてのＡＣＴＢプライマー（下のパネル）を使用して、ＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲに供した。レーン１：患者６および８の腫瘍を除く、隣接する非腫瘍領域。レーン２、３および４：異なる腫瘍領域。部分的腎摘出が行われ、隣接する腫瘍領域が入手可能でなかったので、患者６および８に対しては、示される全ての領域が腫瘍領域に対応する。Ｍ：１００ｂｐサイズマーカー。
【図４】ＨＬＡ−Ｇ転写物で見られるイントロン保持事象。イントロン−エクソン連結部に広がるリードのみを考慮した。イントロン配列に排他的に対応するリードを廃棄した。
【図５】主要なイントロン保持事象の分子検証。Ａ：保持されるイントロンを増幅するために開発されたＲＴ−ＰＣＲストラテジーの図表示。Ｂ：ゲノムＤＮＡ（左）がないことに対する対照としてアクチンプライマーおよびイントロン１（右）の存在を検出するためのＩｎｔ１およびＧ２５７Ｒプライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲ分析の結果。５２３ｂｐのバンドはイントロン２がないことを明らかにし、６４９ｂｐのバンドを生成させる。Ｃ：イントロン４（左パネル）のみを保持するＨＬＡ−Ｇ転写物またはいくつかのイントロンを同時に保持するＨＬＡ−Ｇ転写物（中央および右パネル）。
【図６】５’−伸長転写物ＨＬＡ−Ｇ１の同定。Ａ．２つのＡＴＧ間の距離の短縮を示すＤＮＡ配列の詳細。Ｇ５２６ＲプライマーＢを用いて前向きに配列決定を行った。１０６ｂｐ−欠失の略図；２つのＡＴＧに下線を付す。
【図７】Ａ：注入後第３８日に撮影した、長いＨＬＡ−Ｇ１をコードするウイルスベクターに感染したＲＣＣ７細胞を異種移植されたＮＳＧマウスの写真。Ｂ：注入後第３８日に撮影した、長いＨＬＡ−Ｇ１Ｌをコードするウイルスベクターに感染したＲＣＣ７細胞を異種移植されたＮＳＧマウスの写真。
【図８】Ａ：皮内注入後第２５日の、ＧＦＰ、ＨＬＡ−Ｇ１またはＨＬＡ−Ｇ１Ｌの何れかを発現するＲＣＣ７細胞を異種移植されたヌードマウスの写真。Ｂ：皮内注入後第２５日の、マトリゲル上で増殖させ、ＧＦＰ、ＨＬＡ−Ｇ１またはＨＬＡ−Ｇ１Ｌの何れかを発現するＲＣＣ７細胞を異種移植されたヌードマウスの写真。
【図９】左耳での対照ＲＣＣ７細胞（ＧＦＰを発現）および右耳でのＨＬＡ−Ｇ１Ｌを発現するＲＣＣ７細胞の注入から８日後のＮＳＧ免疫不全マウスの写真（ＡおよびＢ）。
【図１０】左耳での対照ＲＣＣ７細胞および右耳でのＨＬＡ−Ｇ１を発現するＲＣＣ７細胞の注入から８日後のＮＳＧ免疫不全マウスの写真（ＡおよびＢ）。
【発明の詳細な説明】
【００９３】
【実施例】
【００９４】
Ａ．新規ＨＬＡ−Ｇアイソフォームの検出および分析
【００９５】
１．材料および方法
１．１  腫瘍および患者
２０１４年１１月から２０１５年４月まで、サン・ルイ病院（パリ、フランス）の泌尿器科で、この試験の全ての患者に第１の治療介入としてｃｃＲＣＣに対する根治的腎摘出術を行った。腫瘍サイズの中央値は５０ｍｍ（３５〜１７５の範囲）であった。２０１０原発腫瘍ＴＮＭ分類に従い、これらの腫瘍をｐＴ１ａ（患者６）、ｐＴ１ｂ（患者１、３および８）およびｐＴ３ａ（患者２、４、５および７）として分類した。２名の患者（患者２および４）は診察時に内臓転移があった。腎臓腫瘍のＷＨＯ分類［８］に従い、経験のある泌尿器の病理学者が全てのこれらの腎臓腫瘍をｃｃＲＣＣとして分類した。この試験に参加した全患者は、自由意志により、十分な情報を与えられた上で同意書を提出した。この試験は、パリのサン・ルイ病院の施設内倫理委員会により承認された。
【００９６】
１．２  腫瘍検体処理
各腫瘍に対して、および腫瘍サイズに従い、発明者らは、１０×５×５ｍｍの３〜１０試料の間で単離し、これは空間広がりおよび肉眼で見える腫瘍内不均一性を表す。各試料の半分を腎臓動脈のクランプから１時間以内に液体窒素中で瞬間凍結し、他方の半分を使用して組織学的分析を行い、写真により示した。組織病理学検査において腫瘍細胞を含有しなかった領域も対照として単離した。
【００９７】
１．３  免疫組織化学
４μｍの厚さのホルマリン固定およびパラフィン包埋腫瘍組織切片において各腫瘍に対して免疫組織化学試験を行った。次のマウス抗体：全てのＨＬＡ−Ｇアイソフォームに共通するアルファ１ドメインに位置するエピトープを認識する４Ｈ８４、ＩｇＧ１（希釈１／２００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）および可溶性ＨＬＡ−Ｇ５および−Ｇ６アイソフォーム中に存在する保持されるイントロン５（Ｅｎｓｅｍｂｌデータベース）によりコードされるエピトープを認識する２つの抗体５Ａ６Ｇ７および２Ａ１２（希釈１／１００、Ｅｘｂｉｏ抗体、Ｅｘｂｉｏ  Ｃｏ．，ＣＲ）、を使用した。ＯｐｔｉＶｉｅｗ  ＤＡＢ  ＩＨＣ検出キット（Ｒｏｃｈｅ）、細胞コンディショニング１（ＣＣ１）短いかまたは標準的な抗原回収、３７℃で３２分間の抗体温置時間、ｕｌｔｒａＷａｓｈ手順、ヘマトキシリンＩＩで４分間および青み剤で８分間での対比染色を使用して、Ｒｏｃｈｅからの自動スライド染色装置（ＢｅｎｃｈＭａｒｋ  ＵＬＴＲＡ  ｓｙｓｔｅｍ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）で染色を行った。陽性および陰性対照は各手順に対して適切な結果をもたらした。
【００９８】
ＢＸ５１顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｆｒａｎｃｅ  Ｓ．Ａ．Ｓ，Ｒｕｎｇｉｓ）を使用して、泌尿器の病理学者が免疫組織化学分析を行った。陰性、弱、中または強としての染色強度および陰性（腫瘍面積の０％）、最少（腫瘍面積の０〜１０％）、局限的（腫瘍面積の＜５０％）または広汎性（腫瘍面積の＞５０％）としての染色の分布の両方により膜および／または細胞質染色に基づいて各免疫染色をスコア化した。各操作とともに、栄養膜組織を陽性対照として使用し、陰性対照としてアイソタイプ特異的な免疫グロブリンを使用した。
【００９９】
１．４  栄養膜試料調製
流産（妊娠３か月未満）から栄養膜組織を得た。機械的な解離後、下記のプロトコールを使用したＲＮＡ抽出まで、試料をＴｒｉｚｏｌ（商標）試薬（ＬｉｆｅＴｅｃｈ，ｒｅｆ．１５５９６−０２６）中、−８０℃で保存した。
【０１００】
１．５  ＲＮＡ抽出
Ｔｒｉｚｏｌ（商標）試薬（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ，ｒｅｆ．１５５９６０２６）中で手作業により破壊した組織切片からトータルＲＮＡを単離した。クロロホルム分離後、製造者の説明書に従い、ＤＮａｓｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｅｘｔｒａ  ｓｔｅｐ（Ｑｉａｇｅｎ，ｒｅｆ．７９２５４）を用い、ｍｉＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，ｒｅｆ．２１７００４）を使用してＲＮＡを精製した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計およびＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して、ＲＮＡ純度および濃度を評価した。ＲＩＮ（ＲＮＡ  Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  Ｎｕｍｂｅｒ）値は殆ど＞８であった。
【０１０１】
１．６ＲＴ−ＰＣＲ
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆのサーモサイクラー（ＭａｓｔｅｒＣｙｃｌｅｒ，Ｐｒｏ  Ｓ）を用い、ＧｏＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素キット（Ｐｒｏｍｅｇａ，ｒｅｆ．Ａ５００１）を使用して、ｃＤＮＡへのＲＮＡの逆転写を行った。ＬｉｆｅＴｅｃｈからのａｍｐｌｉＴａｑポリメラーゼ（Ｒｅｆ．Ｎ８０８００１６６）を使用して、２μＬのｃＤＮＡ鋳型を含有する１０μＬの最終体積でＰＣＲ反応を行った。増幅のために、４０サイクル（９４℃で３０秒、５５または６０℃で３０秒および７２℃で３０秒）を行った。ＨＬＡ−Ｇおよびアクチン（ＡＴＣＢ）プライマーを表１に記載する。実験全てにおいて対照としてＡＴＣＢ増幅を行った。ＰＣＲ増幅産物を６Ｘローディング色素（Ｐｒｏｍｅｇａ，ｒｅｆ．Ｇ１８８１）と混合し、アガロースゲル１００ｍＬに対して１ｍｇ／ｍＬの２μＬの臭化エチジウムで染色した２％アガロースゲル上で分析した。使用した分子量マーカーはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからの１Ｋｂ＋ＤＮＡラダー（Ｒｅｆ．１０７８７０１８）であった。ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＸＲＳ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏｒａｄ）を使用してイメージングを行い、ＩｍａｇｅＬａｂソフトウェア（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して解釈を行った。
【０１０２】
【表１】
2020530978.tif 000002
【０１０３】
１．７  ＲＮＡシーケンシング
Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＴＲＵＳＥＱプロトコールに従い、１μｇのトータルＲＮＡから指標付きの相補的ＤＮＡライブラリを調製した。ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）精製ＰＣＲ産物の平均サイズは２７５ｂｐであった。ＮｅｘｔＳｅｑ  ５００（ＩＬＬＵＭＩＮＡ）において４つのｃＤＮＡライブラリの等モル濃度プールでトランスクリプトームのペアドエンド１５０ｂｐリードシーケンシングを行った。
【０１０４】
１．８  ＨＬＡ−Ｇアイソフォームのハイスループット分析
テキストを通じてＥｎｓｅｍｂｌ命名法を使用する。ＢＷＡアライナー（ＢＷＡ  ＭＥＭオプション）を使用して、ＮＧＳシーケンシングからの短いリードをヒト参照ゲノムＮＣＢＩ  Ｈｇ１９にマッピングした［２０］。低品質のマッピングリードをアライメントファイルから除去し、ｓａｍｔｏｏｌｓ（Ｌｉら、２００９）を使用してＨＬＡ−Ｇ遺伝子座に対するリードマッピングを抽出した。イントロンおよび周囲のエクソンの１つと重複するリードを選択することによって、イントロン保持検出を行い、発明者らが、５’および３’フランキングエクソン両方と重複するリードを検出したときのみイントロンに対する保持を評価した。スプリットマッピングを与えるリードを分析し、マッピングしたエクソンの順序の不連続を検索することによって、エクソンスキッピング検出を行い、例えば：エクソンの４の末端およびエクソン６の開始部にマッピングされるが、エクソン５にマッピングされないリードは、エクソン５のスキップを示す。各リードサブセットをＩＧＶで視覚的に検証した［２２］。イントロンｎの保持について、この事象を裏付けるリード（連結部エクソンｎ／イントロンｎにおけるリード、イントロンｎにおける内部イントロンリードおよび連結部イントロンｎ／エクソンｎ＋１におけるリード）と事象が起こる領域にわたるリードの総数（エクソンｎとイントロンｎとの間の連結部から開始し、イントロンｎとエクソンｎ＋１との間の連結部までの領域）との間の比として、この事象を裏付けるリードｐｎｉのパーセンテージを計算する：Ｌｅｔ  Ｒ（ｉ）は厳密に領域ｉにおけるリードの数であり（リードは領域ｉのみにあり、他の領域と重複しない。）およびＲ（ｉ，ｊ）は領域ｉおよびｊ両方に重複するリードの数である。Ｌｅｔ  Ｓ（ｉ）はエクソンｉ（エクソンｎおよびエクソンｍ（ｍ＞ｎ＋１）と重複するリード）のスキップを裏付けるリードの数である。したがって、イントロンｎの保持を裏付けるリード数はＩＲｎ＝Ｒ（エクソンｎ，イントロンｎ）＋Ｒ（イントロンｎ）＋Ｒ（イントロンｎ，エクソンｎ＋１）である。イントロンｎの保持の領域におけるリードの総数は、Ｔｎ＝ＩＲｎ＋Ｒ（エクソンｎ，エクソンｎ＋１）＋Ｓ（ｎ）であり；したがってｐｎｉはｐｎｉ＝ＩＲｎ／Ｔｎにより与えられる。
エクソンｎのスキップに対して、この事象を裏付けるリードｐｎｅのパーセンテージは、ｐｎｅ＝Ｓ（ｎ）／Ｔｎにより与えられる。ＴｏｐＨａｔ２アライナを使用することによって、潜在的なバイアスの分析を評価した［２４］。
【０１０５】
２．結果
２．１  ｃｃＲＣＣにおけるＨＬＡ−Ｇアイソフォーム分布の顕著な細胞内不均一性
ＨＬＡ−Ｇを癌治療に対する有望な標的とみなすために、ｃｃＲＣＣの患者由来の腫瘍細胞におけるＨＬＡ−Ｇの発現を評価した。この目的のために、腫瘍サイズに従い、各腫瘍に対して３〜１０個の薄片を分離した。ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色スライドで行った顕微鏡分析によって、古典的にｃｃＲＣＣに関連付けられた形態学的な不均一性が確認された（図２、左パネル）［８］。発明者らは、全ての７つの報告されたＨＬＡ−Ｇアイソフォームに共通するアルファ１ドメインに位置するエピトープを認識する、ＨＬＡ−Ｇに対する特異的抗体：４Ｈ８４および可溶性ＨＬＡ−Ｇ５およびＨＬＡ−Ｇ６アイソフォームのみを認識する抗体５Ａ６Ｇ７で免疫染色することによって、この不均一性をさらに精査した。この抗体は、（ＩＭＧＴ／ＨＬＡ命名法によりイントロン４として以前知られていた）保持されるイントロン５によりコードされるアミノ酸を標的とする。ＨＬＡ−Ｇを高レベルで発現する栄養膜細胞を陽性対照として使用した。
【０１０６】
少なくとも１つの領域で全ての腫瘍がＨＬＡ−Ｇを発現したにしても、この発現は、腫瘍間および腫瘍内部で明確に異なっていた。患者１および２の腫瘍は、全領域で４Ｈ８４抗体での強い免疫染色を示した。染色は膜および細胞質であった（図２）。注目すべきこととして、腫瘍細胞の細胞質にある硝子様小球のさらなる非常に強い染色も検出された。これらの硝子様小球は、Ｈ＆Ｅスライド上でよく見ることができ、腫瘍の非常に珍しい状況に相当する［９］。一方で、５Ａ６Ｇ７抗体を使用して、細胞において弱いかまたは中程度の顆粒状の細胞質免疫染色が認められたが硝子様小球では認められなかった。他の患者からの腫瘍におけるＨＬＡ−Ｇの発現は非常に異なっていた：患者６および７の腫瘍は、４Ｈ８４抗体による拡散しているが中程度の膜免疫染色を呈した。これらの２つの腫瘍は、５Ａ６Ｇ７で顆粒状の細胞質内免疫染色がない（患者６）かまたは弱く、局限的（患者７）であり、これは可溶性タンパク質ＨＬＡ−Ｇ５およびＨＬＡ−Ｇ６の欠如を示す。２つの他の腫瘍（患者４および５）において、４Ｈ８４抗体により評価したＨＬＡ−Ｇの発現は、１つの腫瘍領域のみの小さな顕微鏡的領域で示された。注目すべきは、患者４の腫瘍のＨＬＡ−Ｇ陽性領域のみが細胞質内の硝子様小球に的確に対応することである。腫瘍の何れの他の領域でも染色は観察されなかった。
【０１０７】
患者３および８の腫瘍細胞の免疫染色プロファイルは予想外であった。報告されたＨＬＡ−Ｇアイソフォーム全てを標識する４Ｈ８４抗体で免疫染色は検出されなかった。この抗体での腫瘍切片の標識の欠如は通常、ＨＬＡ−Ｇ発現の欠如に相当する。しかし、拡散し、強い顆粒状の細胞質内５Ａ６Ｇ７免疫染色および拡散し、薄く、顆粒状の細胞質内免疫染色が、それぞれ患者３および８の腫瘍細胞で観察された。７つの報告されているＨＬＡ−Ｇアイソフォームは全て、４Ｈ８４抗体により認識されるアルファ１ドメインを含有するので、この構造に対する発明者らの現在の知識を考慮するとこれは予想できないものであった。これらの差異をよりよく理解しようとするために、発明者らは、２Ａ１２と呼ばれる、可溶性ＨＬＡ−Ｇ５および−Ｇ６アイソフォームに存在する保持されるイントロン５（Ｅｎｓｅｍｂｌデータベース）によりコードされるエピトープも認識する抗体を使用して同様の分析を行った。その結果から、異なり、予想されなかった免疫染色パターン、とりわけ患者１および２における硝子様小球の標識が明らかになった。
【０１０８】
まとめると、免疫組織化学試験の結果から、ｃｃＲＣＣ腫瘍におけるＨＬＡ−Ｇ発現の内部および相互不均一性が明らかに示される。しかし、ＨＬＡ−Ｇアイソフォームの構造における発明者らの一般的知識の区域内では、一部の免疫染色パターンは予想外であった。
【０１０９】
２．２  ｃｃＲＣＣで発現されるＨＬＡ−Ｇ１転写物の調査
ｃｃＲＣＣで発現されるＨＬＡ−Ｇアイソフォームへのより良好な洞察を得て、免疫組織化学分析の結果を明確にするために、ＲＴ−ＰＣＲによってＨＬＡ−Ｇアイソフォームの多様性の調査をさらに評価した。図１Ｂで図示される周知のＧ２５７ＦおよびＧ５２６Ｒプライマー［１０］を用いて上記で試験した８名の患者の腫瘍切片に対して増幅を行った。これらのプライマーは、４Ｈ８４抗体により認識されるエピトープを含有する領域を増幅する。対照として各試料に対してアクチンｍＲＮＡの増幅を行った。患者１、２および６に対する全腫瘍切片でＨＬＡ−Ｇ１転写物の増幅に特異的な２９０ｂｐの予想されるバンドが見られ、一方でこのバンドは、他の患者の腫瘍の１つまたは２つの領域でしか検出されなかった（図３）。非腫瘍性の隣接組織において増幅産物は検出されなかった。異なるアイソフォームの配列は類似性が高く、これらのＲＴ−ＰＣＲ条件によって、プライマーＧ５２６の標的であるエクソン４を欠くＨＬＡ−Ｇ２、−Ｇ３、−Ｇ６または−Ｇ７のような他のアイソフォームの同定ができないので、発明者らは、ｃｃＲＣＣで発現されるアイソフォームの包括的な実体を提供するために、ＲＮＡｓｅｑによって大規模試験を行った。
【０１１０】
２．３  ＲＮＡ−Ｓｅｑは、非アノテーションＨＬＡ−Ｇ転写物を明らかにする。
ＲＮＡ−Ｓｅｑ技術は、発現されるアイソフォームを分析するための最も強力な方法をもたらし、種における発生および疾患機序を理解するために必須であるオルタナティブスプライシング事象および非アノテーション転写物を検出するための機会が得られる［２５］。
【０１１１】
最初に、発明者らは、非常に高いカバレッジ範囲（深度＞３００ｘ）で４つの代表的な試料のシーケンシングを行った。材料および方法に記載のように、Ｅｎｓｅｍｂｌ  ７０（ＧＲＣｈ３７．ｐ８）参照アノテーションに従ってリードをアラインし、定量した。オルタナティブスプライシングされたアイソフォームは、主に２つの主要な群：エクソンスキップおよびイントロン保持に分類され、単一のエクソンまたはイントロンが、成熟メッセージから、オルタナティブスプライシングされるかまたは含まれる。
【０１１２】
上記のｃｃＲＣＣ患者のＨＬＡ−Ｇ発現パターンがｃｃＲＣＣ患者で見られる一般的プロファイルの代表的サブセットを構成するか否かを検証するために、発明者らは、欧州の異なる４か国（チェコ共和国、英国、ルーマニアおよびロシア）で処置された１００名のｃｃＲＣＣ患者を含む「Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｋｉｄｎｅｙ」（ＣＡＧＥＫＩＤ）コホートに対して得られるものと発明者らの結果を比較した。生成されたデータは、高い精度でオルタナティブスプライシング事象を検出可能にした高品質リソースを構成する（Ｓｃｅｌｏら、２０１４）。さらに、発明者らは、ＲＮＡｓｅｑデータに対するアライナの選択またはＨＬＡ−Ｇを試験するための参照配列などの一般的な要因が、２つの異なるアライナ、ＢＷＡ  ＭＥＭおよびＴｏｐＨａｔ２を使用することによって、発明者らの分析を偏らせる可能性があり得るか否かを詳しく評価した。その結果から、ＢＷＡ  ＭＥＭまたはＴｏｐＨａｔ２を用いてアラインしたデータが同様の結果を生成させることが確認された（補足データ）。さらに、個々のレベルでのリード数は、発明者らの小規模ｃｃＲＣＣ患者コホートで見られるＨＬＡ−Ｇ転写物の発現プロファイルとＣａｇｅｋｉｄのプロファイルとの間で大きな類似性を示した。これらの結果を表２および３でまとめ、次のセクションでより詳しく論じる。
【０１１３】
２．４  発現されるＨＬＡ−Ｇ転写物における記載されないイントロン保持事象
イントロン保持は、哺乳動物におけるオルタナティブスプライシングの最もまれなタイプであり、代替転写物のおよそ３％のみを占める［１２］。これまでのところ、ＨＬＡ−Ｇ転写物に対する文献において、イントロン３またはイントロン５（ＩＭＧＴ／ＨＬＡ命名法に従い、以前はイントロン２およびイントロン４として知られる。）の保持のみが報告された。イントロン３を保持する転写物はＨＬＡ−Ｇ７をコードし［１３］、イントロン５を保持するものはＨＬＡ−Ｇ５およびＨＬＡ−Ｇ６をコードする［７］。
【０１１４】
発明者らのＲＮＡｓｅｑ分析において、エクソンにより包含されるイントロンを、保持されるものとして標識した。図４で図示され、表２で要約される結果から、イントロン３および５の保持を表すリードが最も大量にあることが示された。さらに、このデータは、４つのさらなるイントロン：１、４、６および７の保持に由来する全体的な新しい多くの知見を裏付ける。イントロン保持転写物の発現を検証するために、発明者らは、最初に、イントロン１を含有する転写物の存在について探索した。この目的のために、発明者らは、図５に記載のストラテジーを使用してＲＴ−ＰＣＲ増幅を行った。最初に、Ｇ２５７Ｒ、Ｇ２５７Ｆのリバースプライマーと組み合わせてイントロン１を標的とするプライマー（Ｉｎｔ１Ｆ）を使用した［１３］。イントロンの存在は内因性ゲノムＤＮＡの混入ゆえであり得るので、２つの異なるエクソンに位置するアクチン特異的なプライマーと平行して全ての試料を増幅させた。ｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡの増幅に対する予想サイズは３２０ｂｐであり、一方でゲノムＤＮＡのサイズは５６０ｂｐである。この結果から、全ての試料において３２０ｂｐ−断片の増幅のみが示され、このことから、ゲノム混入がないことが明らかになる（図５Ｂ、左パネル）。この結果を考慮して、発明者らは、プライマーＩｎｔ１ＦおよびＧ２５７Ｒを使用して腫瘍試料をさらに増幅した。予想サイズ（５２１ｂｐ）の増幅バンドを得たが、これはＨＬＡ−Ｇ転写物におけるイントロン１の存在と一致する（図５−Ｂ、右パネル）。ＨＬＡ−Ｇの転写の開始がエクソン２にしか割り当てられなかったので、この事象は文献で以前に報告されなかった［２６］。発明者らは、イントロン２の同時保持に対応する６４９ｂｐのＰＣＲ増幅バンドを検出しなかった。これは、イントロン２が保持されるのがまれであることを示すＲＮＡｓｅｑ分析の結果と一致する。
【０１１５】
【表２】
2020530978.tif 000003
【０１１６】
イントロン４の保持を検証するために、さらなる分析を行った（図５Ｃ）。この目的のために、イントロン４を特異的に標的とする（ｉｎｔ４Ｒと呼ばれる）プライマーと組み合わせてプライマーＧ２５７Ｆを使用してＲＴ−ＰＣＲを行った。これらのプライマーでの増幅によって、４３０ｂｐのＤＮＡ断片が生じ（図５Ｃ、左パネル）、このことから、ＨＬＡ−Ｇ転写物にイントロン４が存在することが明らかになった。増幅バンドのサイズもイントロン３の同時保持の存在と一致する。同じ転写物がいくつかのイントロンを同時に保持し得るか否かをさらに評価するために、発明者らは、プライマーｉｎｔ４Ｒと組み合わせてプライマーｉｎｔ３Ｆ（その配列はイントロン３の領域と相補的）を使用してＲＴ−ＰＣＲ増幅を行った。この結果から、同じ転写物におけるイントロン３および４の保持について予想されるように、３８０ｂｐのＤＮＡ断片が明らかになる（図５Ｃ、中央パネル）。さらに、Ｉｎｔ３ＦおよびＩｎｔ５Ｒプライマーでの増幅によって７２５ｐｂの増幅バンドが生じた（図５Ｃ、右パネル）。注目すべきことに、このバンドのサイズは、イントロン４を除くイントロン３および５の保持に対応する。これらの結果から、腫瘍試料が、単一のイントロンを保持する転写物および、１つの転写物から他の転写物へ変動し得るいくつかの異なるイントロンを保持する他のものを発現し得ることが明らかに示される。発明者らの知る限り、これらの事象は以前に記載されなかった。
【０１１７】
２．５  ５’−伸長末端がある新規ＨＬＡ−Ｇ転写物
ＲＮＡｓｅｑデータから、リードのいくつかがエクソン１の何れかの側でアラインされたことがさらに明らかになった（図４）。この領域に由来する転写物は以前に報告されなかった。実際に、Ｅｎｓｅｍｂｌデータベースに含有される情報からＨＬＡ−Ｇ転写物がこのエクソンで開始され得、これがＩＭＧＴ／ＨＬＡ命名法により定義されるエクソン１の５’に位置することが示唆されるので、この領域の構造は依然として議論の余地がある（図１Ａ）。このエクソンの有無により、プロモーターの位置、５’−非翻訳領域の長さおよび転写／翻訳開始部位を含む主要な修飾が起こり得る。発明者らは、ＲＴ−ＰＣＲ増幅により、このエクソンで、または上流でさえもＨＬＡ−Ｇ転写物が開始され得るか否かを評価する。２つの特異的プライマーを設計した。配列がエクソン１（Ｅｎｓｅｍｂｌデータベース）に位置する領域と相補的であるプライマーＥｘ１Ｆおよび配列が現在プロモーター領域と考えられているさらに上流に位置する領域と相補的であるプライマーＰｒＰｒ（図１Ｂで図示）。Ｇ５２６Ｒと組み合わせてこれらの２つの上流プライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲによって、それぞれ予想サイズ：６９０ｂｐ（Ｅｘ１Ｆ−Ｇ５２６Ｒに対する）および７２５ｂｐ（ＰｒＰｒ−Ｇ５２６Ｒに対する）の２本のバンドが生じた（データは示さない。）。これらの断片の特異性を検証するために、増幅ＤＮＡ試料をシーケンシングし、ＢＬＡＳＴを使用して公開データベースでヌクレオチド類似性を調べた。この結果から、１０６ｂｐ断片の欠失を除き、ＨＬＡ−Ｇとの高い類似度が明らかになった。この欠失の結果、エクソン１の末端に位置するＡＴＧとエクソン２に位置するものとの間の距離が１１８ｂｐから１２ｂｐに短縮した（図６Ａ）。結果として、１０６−ｂｐの欠失はインフレームで両ＡＴＧをもたらす。これは、現在、第１のエクソンに位置するＡＴＧでの翻訳開始を可能にし、５個のさらなるアミノ酸（ＭＫＴＰＲ）の５’−伸長末端を有するタンパク質を生成させ得る。現在、唯一の翻訳開始の開始部位は、（ＩＭＧＴ／ＨＬＡ命名法により定められるエクソン１に対応する）エクソン２に位置するＡＴＧに起因した。この転写物は、試験した栄養膜試料の一部でも見られたが、全てではなかった。これは、その発現を調節する要因が依然として不明であることを示す。
【０１１８】
まとめると、これらの結果は、以前に報告されたＨＬＡ−Ｇアイソフォームとともに栄養膜およびｃｃＲＣＣ腫瘍細胞において同時発現され得る、ＨＬＡ−Ｇ１Ｌと呼ばれる、伸長５’−末端を有する新規ＨＬＡ−Ｇ転写物の存在と一致する。
【０１１９】
２．６  オルタナティブスプライシングされたエクソンは、新規の可溶性ＨＬＡ−Ｇアイソフォームを生成させる可能性がある。
エクソンスキップは、オルタナティブスプライシングの主要な形態の１つであり、それらのエクソン配列の正確な組み合わせにより、異なる複数のｍＲＮＡアイソフォームが生成する。ここで、発明者らは、同じエクソンで、および同じ隣接イントロンとともに生じる、エクソン含有形態とエクソン除外形態との間の対合としてエクソンスキップ事象を定義する。同じエクソンが複数のエクソンスキップ事象に関与し得る。
【０１２０】
ＨＬＡ−Ｇについては、エクソン４（ＨＬＡ−Ｇ２）、エクソン５（ＨＬＡ−Ｇ４）または両方同時（ＨＬＡ−Ｇ３）のスキップのみが文献で報告された。この研究において、ＢＷＡ  ｍｅｍでアラインされたリードから、以前は明らかにされなかったエクソンのスキップが明らかになる。主なスキップ事象を表２で報告する。発明者らはまた、ＴｏｐＨａｔ２を使用することによってこれらの結果を確認した。
【０１２１】
最大リードカバレッジは、タンパク質の停止コドンを含有する、エクソン７のみのスキップと一致した。しかし、エクソン８の最初に補足的なインフレーム停止コドンが見られるので、このエクソンを欠くコードタンパク質には大きな修飾は予想されない。最も重要なこととして、膜貫通ドメインをコードするエクソン６と同時のエクソン７のスキップは、それらの欠如が膜貫通ドメインおよび細胞質尾部を欠くアイソフォームを生成し得、したがって未報告の可溶性タンパク質に依然として相当するため、非常に重要である。
【０１２２】
配列がエクソン６の領域に相補的であるプライマーＧ９６３Ｒを用いてＲＴ−ＰＣＲを行ったとき、フォワードプライマーＧ２５７Ｆ（エクソン３）またはＧ２５６Ｆ（エクソン４）と組み合わせて増幅産物を得ることができなかった。しかし、プライマーＧ２５７ＦをＧ５２６Ｒと組み合わせて使用した場合、予想される２９０ｂｐの増幅断片が生じた。まとめると、これらの結果は、エクソン３および４を保有するがエクソン６を欠くＨＬＡ−Ｇ転写物と一致する。さらに、これらのプライマーを使用して患者１からの試料を分析した場合、Ｇ５２６Ｆ−Ｇ９６３Ｒのプライマーの組み合わせを使用して増幅バンドが得られ、一方で、Ｇ２５７Ｆ−Ｇ９６３Ｒを使用して増幅は検出されず、これはエクソン３を欠く転写物の発現と一致した。
【０１２３】
２．７  オルタナティブスプライシングされたＨＬＡ−Ｇアイソフォームはアルファ−１ドメインを欠く。
ＲＮＡｓｅｑデータをさらに分析すると、エクソン４でリードの一部が開始され得ることが明らかになる。これは、エクソンアクセプター部位の２０ｂｐ上流以内のリードの生カウント値を定量することによって決定された。予測されるＮ末端短縮型タンパク質は、ペプチドシグナルおよびアルファ１ドメインを欠く。タンパク質への翻訳がこの領域で開始され得るか否かを評価するために、発明者らはエクソン４のヌクレオチド配列を調べた。この分析により、翻訳開始コドンとして機能し得るインフレームＡＴＧの存在が明らかになった。発明者らの予備的な結果（示さない。）から、アルファ−１ドメインを欠く転写物がアルファ−２ドメインも欠き、したがってアルファ−３ドメインのみをコードし得ることが明らかになる。
【０１２４】
特に、これらのアイソフォームの発現は現在、いくつかの腫瘍試料を４Ｈ８４および可溶性アイソフォームに対して生じた抗体で標識した後に生成される免疫染色パターンの相違における仮説を提供し得るが、これはＨＬＡ−Ｇアイソフォームの構造に関する広範な知識の区域内では以前に説明され得なかった。
【０１２５】
【表３】
2020530978.tif 000004
【０１２６】
Ｂ．ＨＬＡ−Ｇアイソフォームの腫瘍促進効果
【０１２７】
１．材料および方法
１．１  ＨＬＡ−Ｇアイソフォームを発現するレンチウイルスの作製
プラスミドｐＷＰＸＬ（１０５１０ｂｐ）に対して、２つのアイソフォームＨＬＡ−Ｇの発現を支配するＥＦ−１αプロモーターのちょうど３’である、ＢａｍＨ１（３４９９）部位とＮｄｅＩ（４３３４）部位との間にＨＬＡ−Ｇ１およびＨＬＡ−Ｇ１Ｌアイソフォームを導入した。
【０１２８】
ＨＬＡ−Ｇ１の場合：
３４３８ｂｐの挿入断片は、配列番号９３ＡＧＴＧＴＧＧＴＡＣＴＴＴ配列で始まり、配列番号９４ＴＧＧＡＡＧＡＣＡＴＧＡＧＡＡＣＴＴＴＣＣＡ配列を有する３’で終わるＨＬＡ−Ｇ１  ｃＤＮＡを含む。この断片には、ＣＭＶプロモーターの制御下に置かれているＮｅｐｔｕｎｅと名付けられたＧＦＰの「ｒｅｄ」変異体（アクオレア・ビクトリア（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）緑色蛍光タンパク質クラゲ）が続く。最後に、３’末端で、組み込みマーカーとして、および転移のインビボでの監視のために、分子バーコードを導入した（Ｇｒｏｓｓｅｌｉｎら，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，１０：２１６２−７１，２０１３）。
【０１２９】
ＨＬＡ−Ｇ１Ｌの場合：
３２７９ｂｐの挿入断片は、配列番号９５ＡＴＡＴＡＧＴＡＡＣＡＴＡＧＴＧＴ配列で始まり、配列番号９４ＴＧＧＡＡＧＡＣＡＴＧＡＧＡＡＣＴＴＴＣＣＡ配列を有する３’で終わるＨＬＡ−Ｇ１Ｌ  ｃＤＮＡを含む。この断片にはＧＦＰの「ｂｌｕｅ」（シアン）変異体、４３３／４４５ｎｍおよび４７５／５０３ｎｍの二峰性の励起および発光スペクトルを有し、光沢がある蛍光色素および光安定性の向上につながるＥＣＦＰが続く。ＥＣＦＰをＣＭＶプロモーター制御下に置いた。最後に、３’末端で、組み込みマーカーとして、および転移のインビボでの監視のために、分子バーコードを導入した（Ｇｒｏｓｓｅｌｉｎら，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，１０：２１６２−７１，２０１３）。
【０１３０】
これらの２つのプラスミドを使用して、１．２０Ｅ＋０８ＴＵ（形質導入単位）／ｍＬでレンチウイルスＷＰＸＬ  ΔＵ３  ＳＩＮ、エンベロープＶＳＶ−Ｇ、ＯＧＭグループＩＩ、クラス２を作製した。
【０１３１】
２．結果
各レンチウイルスは、異なるＨＬＡ−Ｇアイソフォームを含有する。ＨＬＡ−Ｇを発現しない、完全に特徴が明らかになっている腎細胞癌の明細胞（細胞ＲＣＣ７）系列の株においてレンチウイルスを形質導入した。各アイソフォームについて、発明者らの結果の信頼性とロバスト性を高めるために、２つの独立した形質導入を行った。
【０１３２】
条件ごとに５匹のＮＳＧマウスに、形質導入を行った各ＲＣＣ７細胞株の皮内注射を行った。非形質導入ＲＣＣ７細胞を対照として使用する。
【０１３３】
細胞の皮内注射後、腫瘍／転移増殖を定期的に評価した。
【０１３４】
マウスの屠殺時に、免疫組織化学的および発現（ＲＮＡ）分析のために、腫瘍転移および異なる組織を取り出した。各アイソフォームはバーコードに関連付けられており、それにより、得られた腫瘍および転移が注入細胞に由来することを確実にすることが可能になる。
【０１３５】
図７に見られるように、長いＨＬＡ−Ｇ１Ｌアイソフォームを持つＲＣＣ７株からの細胞由来の異種移植マウスは、Ｊ３８でより顕著な腫瘍成長を示し、少なくとも部分的に、より発達した腫瘍内および腫瘍周囲の血管新生に至った。これらの腫瘍では、ＨＬＡ−Ｇ１アイソフォームを保有するＲＣＣ７株から得られるものとは異なり、腫瘍内壊死の再構成は観察されない。
【０１３６】
ヌードマウスで同様の実験を行った。図８Ａは、注射後第２５日の、ＧＦＰ、ＨＬＡ−Ｇ１またはＨＬＡ−Ｇ１Ｌの何れかを発現するＲＣＣ７細胞を異種移植したヌードマウスの写真を示す。図８Ｂは、注射後第２５日の、マトリゲル上で増殖させ、ＧＦＰ、ＨＬＡ−Ｇ１またはＨＬＡ−Ｇ１Ｌの何れかを発現するＲＣＣ７細胞を異種移植したヌードマウスの写真を示す。
【０１３７】
Ｃ．ＨＬＡ−Ｇアイソフォームの血管新生促進効果
【０１３８】
上記で開示されるようにＧＦＰ、ＨＬＡ−Ｇ１またはＨＬＡ−Ｇ１Ｌの何れかを発現するＲＣＣ７細胞を調製した（点Ｂ）。
【０１３９】
ＮＳＧマウスの左耳に対照（ＧＦＰを発現するＲＣＣ７細胞）を注射し、一方でＨＬＡ−Ｇ１またはＨＬＡ−Ｇ１Ｌの何れかを発現するＲＣＣ７細胞をその右耳に注射した。写真を第８日に撮影した。結果を図９（対照ＲＣＣ７細胞対ＨＬＡ−Ｇ１Ｌ）および図１０（対照ＲＣＣ７細胞対ＨＬＡ−Ｇ１）で示す。
【０１４０】
結果から、ＨＬＡ−Ｇ１Ｌの発現の血管新生促進効果が示され、これはＨＬＡ−Ｇ１の発現により再現されない。
【０１４１】
参考文献
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2020530978.tif 000006
2020530978.tif 000007
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2020530978.tif 000019
2020530978.tif 000020
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