(57)【要約】単離されたウェルシュ菌線毛ポリペプチド、線毛ポリペプチドのバリアント；線毛ポリペプチドのフラグメント；およびバリアントのフラグメントから選択される免疫原性ポリペプチドは、家禽における腸壊疽の処置または予防のためのワクチンの調製に有用である。単離されたウェルシュ菌線毛ポリペプチドは、組み立てられた線毛または線毛サブユニットＣｎａＡ、ＦｉｍＡおよび／またはＦｉｍＢを含む。
2020527051.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたウェルシュ菌線毛ポリペプチド。
【請求項２】
ＣｎａＡポリペプチドである、請求項１に記載の単離されたウェルシュ菌線毛ポリペプチド。
【請求項３】
ＣｎａＡポリペプチドが、配列番号１０および配列番号１３から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；配列番号１、配列番号４、および配列番号７から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；および、配列番号１、配列番号４、および配列番号７から選択される配列を有するポリヌクレオチドに対して、少なくとも穏やかにストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドから選択される、請求項２に記載の単離されたウェルシュ菌線毛ポリペプチド。
【請求項４】
ＦｉｍＡポリペプチドである、請求項１に記載の単離されたウェルシュ菌線毛ポリペプチド。
【請求項５】
ＦｉｍＡポリペプチドが、配列番号１１および配列番号１４から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；配列番号２、配列番号５、および配列番号８から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；および、配列番号２、配列番号５、および配列番号８から選択される配列を有するポリヌクレオチドに対して、少なくとも穏やかにストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドから選択される、請求項４に記載の単離されたウェルシュ菌線毛ポリペプチド。
【請求項６】
ＦｉｍＢポリペプチドである、請求項１に記載の単離されたウェルシュ菌線毛ポリペプチド。
【請求項７】
ＦｉｍＢポリペプチドが、配列番号１２および配列番号１５から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；配列番号３、配列番号６、および配列番号９から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；および、配列番号３、配列番号６、および配列番号９から選択される配列を有するポリヌクレオチドに対して、少なくとも穏やかにストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドから選択される、請求項６に記載の単離されたウェルシュ菌線毛ポリペプチド。
【請求項８】
組み立てられた線毛である、請求項１に記載の単離されたウェルシュ菌線毛ポリペプチド。
【請求項９】
組み立てられた線毛が、ＣｎａＡポリペプチド、ＦｉｍＡポリペプチド、およびＦｉｍＢポリペプチドから互いに個別に選択された１以上のサブユニットを備える、請求項９に記載の単離されたウェルシュ菌線毛ポリペプチド。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の単離されたウェルシュ菌線毛ポリペプチド、線毛ポリペプチドのバリアント；線毛ポリペプチドのフラグメント；およびバリアントのフラグメントから選択される免疫原性ポリペプチドであって、ここで、線毛ポリペプチド、バリアント、ポリペプチドのフラグメント、およびバリアントのフラグメントは、家禽において免疫原性である、前記免疫原性ポリペプチド。
【請求項１１】
バリアントが、線毛ポリペプチドに対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．９％の配列同一性を有する、請求項１０に記載の免疫原性ポリペプチド。
【請求項１２】
請求項１０または１１に記載の免疫原性ポリペプチドをコードする配列を備えるポリヌクレオチド。
【請求項１３】
宿主細胞の免疫原性ポリペプチドの発現のために構成される、請求項１２に記載のポリヌクレオチドを備えるベクター。
【請求項１４】
少なくとも１の請求項１０または１１に記載の免疫原性ポリペプチドを備える、家禽における壊疽性腸炎の処置または予防のためのワクチン。
【請求項１５】
少なくとも１の請求項１０または１１に記載の免疫原性ポリペプチドを備える、家禽におけるウェルシュ菌感染の処置または予防のためのワクチン。
【請求項１６】
家禽における壊疽性腸炎の処置または予防のための医薬の調製における、請求項１０または１１に記載の免疫原性ポリペプチドの使用。
【請求項１７】
家禽におけるウェルシュ菌感染の処置または予防のための医薬の調製における、請求項１０または１１に記載の免疫原性ポリペプチドの使用。
【請求項１８】
家禽に有効量の請求項１０または１１に記載の免疫原性ポリペプチド、または有効量の請求項１４に記載のワクチンを投与することを備える、家禽における壊疽性腸炎の処置または予防の方法。
【請求項１９】
家禽に有効量の請求項１０または１１に記載の免疫原性ポリペプチド、または有効量の請求項１５に記載のワクチンを投与することを備える、家禽におけるウェルシュ菌感染の処置または予防の方法。
【請求項２０】
家禽における壊疽性腸炎の処置または予防のためのワクチンとしての、請求項１０または１１に記載の免疫原性ポリペプチドの使用。
【請求項２１】
家禽におけるウェルシュ菌感染の処置または予防のためのワクチンとしての、請求項１０または１１に記載の免疫原性ポリペプチドの使用。
【請求項２２】
請求項１０または１１に記載の免疫原性ポリペプチドに選択的に結合する抗体。
【請求項２３】
家禽から生体試料を得て、生体試料において請求項２２に記載の抗体の存在を検出することによって、家禽におけるウェルシュ菌感染を検出する方法。
【請求項２４】
請求項２２に記載の抗体に、免疫原性ポリペプチドを暴露して、抗体への免疫原性ポリペプチドの結合を検出することを備える、請求項１０または１１に記載の免疫原性ポリペプチドを検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
背景
本出願は、家禽における壊疽性腸炎に対するワクチンを調製するのに有用なポリペプチドに関する。より具体的に言うと、本出願は、家禽におけるウェルシュ菌感染に関連する壊疽性腸炎に対するワクチンを調製するのに有用なウェルシュ菌線毛ポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
壊疽性腸炎は、ブロイラーニワトリ等家禽の腸疾患であり、それは２０１５年において家禽産業に６，０００，０００，０００ＵＳドルの喪失の代償を与えたと算定された。壊疽性腸炎は、孔形成毒素を生成するウェルシュ菌の、あるＴｙｐｅＡ株によってまず引き起こされ、それは、過剰成長し、腸粘膜に接着し、最終的にその疾患特徴的病変を引き起こす。ウェルシュ菌は、腸管の正常な生息菌であり、および典型的にはＮｅｔＢ毒素を運搬するこれらの株のみが、壊疽性腸炎を引き起こすことができる。壊疽性腸炎は、送り込まれる抗生物質の適用によってまず制御され、抗菌耐性の潜在的な広がりのために、診療は次第に阻止され、そして、現在いくつかの国の生産から段階的に廃止されつつある。それゆえ、ワクチンの開発などの、壊疽性腸炎を制御するための代替アプローチを発見することは、財政および大衆の健康の観点から、重要である。
【０００３】
ウェルシュ菌接着遺伝子座（ＶＲ−１０Ｂ）は、最近ＮｅｔＢ陽性株とのその関連によって同定された。（Lepp D, Gong J, Songer JG, Boerlin P, Parreira VR, Prescott JF. 2013.Identification of Accessory Genome Regions in Poultry Clostridium perfringens Isolates Carrying the netB Plasmid. Journal of Bacteriology 195: 1152-1166.）同定された遺伝子座が、調査された５４の家禽単離株のうち、ｎｅｔＢ陽性単離株の８７％およびｎｅｔＢ陰性単離株の４２％に存在することがわかった。この遺伝子座（続いてコラーゲン接着（ＣＡ）遺伝子座に名前が変更された）は、後でコラーゲン結合に関わることが示され、壊疽性腸炎の病因として要求された。（Wade B, Keyburn AL, Haring V, Ford M, Rood JI, Moore RJ: The adherent abilities of Clostridium perfringens strains are critical for the pathogenesis of avian necrotic enteritis. Vet Microbiol 2016, 197: 53-61; Wade B, Keyburn AL, Seemann T, Rood JI, Moore RJ: Binding of Clostridium perfringens to collagen correlates with the ability to cause necrotic enteritis in chickens. Vet Microbiol 2015, 180: 299-303.）
【０００４】
数多のウェルシュ菌タンパク質は、これまでにワクチンの候補として評価されてきた。しかしながら、これらのタンパク質は、壊疽性腸炎に対して最良の部分保護を提供する。加えて、多くのこれらのタンパク質は、壊疽性腸炎を引き起こす株に特異的でなく、そして壊疽性腸炎の病因に役割を果たすことが公知でない。したがって、壊疽性腸炎に対するワクチンを生成するための候補であり得る、代替のウェルシュ菌ポリペプチドを同定することが望ましい。
【発明の概要】
【０００５】
概要
本発明の一側面は、単離されたウェルシュ菌線毛ポリペプチドを提供する。別の側面において、本発明は、単離されたウェルシュ菌線毛ポリペプチド（線毛ポリペプチドのバリアント）から選択される免疫原性ポリペプチドを提供する；線毛ポリペプチドのフラグメント；および、バリアントのフラグメント、ここで線毛ポリペプチド、バリアント、ポリペプチドのフラグメント、およびバリアントのフラグメントは、家禽において免疫原性である。少なくとも一態様において、線毛ポリペプチドは、ＣｎａＡポリペプチドである。少なくとも一態様において、線毛ポリペプチドは、ＦｉｍＡポリペプチドである。少なくとも一態様において、線毛ポリペプチドは、ＦｉｍＢポリペプチドである。少なくとも一態様において、線毛ポリペプチドは、組み立てられた線毛である。
【０００６】
本発明の別の側面は、本明細書に記載の様に、単離されたウェルシュ菌線毛ポリペプチドまたは免疫原性ポリペプチドをコードする配列を備えるポリヌレオチドを提供する。別の側面において、本出願は、本明細書に記載の単離されたウェルシュ菌線毛ポリペプチドまたは免疫原性ポリペプチドをコードする配列を有するポリヌクレオチドを備えるベクターを提供し、ここでベクターは、単離されたウェルシュ菌線毛ポリペプチドまたは宿主細胞の免疫原性ポリペプチドの発現のために構成される。
【０００７】
別の側面において、本発明は、家禽の壊疽性腸炎の処置または予防のためのワクチンを提供し、ここで本明細書に記載のワクチンは、免疫原性ポリペプチドを備える。別の側面において、本出願は、家禽のウェルシュ菌感染の処置または予防のためのワクチンを提供し、ここで本明細書に記載のワクチンは、免疫原性ポリペプチドを備える。
【０００８】
別の側面において、本発明は、家禽の壊疽性腸炎の処置または予防のための、または、家禽のウェルシュ菌感染の処置または予防のための医薬の調製における、本明細書に記載の免疫原性ポリペプチドの使用を、提供する。
【０００９】
別の側面において、本発明は、家禽の壊疽性腸炎の処置または予防の、または、家禽のウェルシュ菌感染の処置または予防のための方法、本明細書に記載の免疫原性ポリペプチド、またはそれらのワクチンの有効量を、家禽に投与することを備える方法を提供する。
【００１０】
別の側面において、本発明は、家禽の壊疽性腸炎の処置または予防のためのワクチンとしての、または、家禽のウェルシュ菌感染の処置または予防のための、本明細書に記載の免疫原性ポリペプチドの使用を、提供する。
【００１１】
本発明の更なる側面は、本明細書に記載の免疫原性ポリペプチドに、選択的に結合する抗体を提供する。別の側面において、本発明は、家禽から生体試料を得ることによって、家禽のウェルシュ菌感染を検出し、生体試料において、本明細書に記載の免疫原性ポリペプチドに選択的に結合する抗体の存在を検出する方法を、提供する。本発明のまた別の側面は、選択的に免疫原性ポリペプチドに結合する抗体に免疫原性ポリペプチドを暴露して、抗体への免疫原性ポリペプチドの結合を検出することを備える、本明細書に記載の免疫原性ポリペプチドを検出する方法を、提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
図面の簡単な記載
本発明の更なる特色は、以下の記載および添付の図から明らかになるだろう、すなわち：
【００１３】
【図１】図１は、染色体５．２キロベースペアウェルシュ菌ＶＲ−１０Ｂ遺伝子座の線図表現である；
【００１４】
【図２Ａ】図２Ａは、クーマシー染色によって視覚化されたドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によってヒスチジンで標識された組み換え線毛サブユニットポリペプチドＣｎａＡの分離を図示するフォトグラフである；
【００１５】
【図２Ｂ】図２Ｂは、クーマシー染色によって視覚化されたＳＤＳ−ＰＡＧＥによる、組み換え線毛サブユニットポリペプチドＦｉｍＡの分離を、図示するフォトグラフである；
【００１６】
【図２Ｃ】図２Ｃは、クーマシー染色によって視覚化されたＳＤＳ−ＰＡＧＥによる、組み換え線毛サブユニットポリペプチドＦｉｍＢの分離を、図示するフォトグラフである；
【００１７】
【図２Ｄ】図２Ｄは、濃縮および脱塩に続く、ＣｎａＡ、ＦｉｍＡ、およびＦｉｍＢのプールされた分画の、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシー染色による可視化を、図示するフォトグラフである；
【００１８】
【図３Ａ】図３Ａは、ＣｎａＡ組み換えポリペプチドに対して、アジュバント単独によって、または、最初のワクチン接種実験のＣｎａＡによって免疫化されたニワトリからの、血清ＩｇＹ抗体応答（４０５ｎｍの吸光度）を、図示するグラフである。各点は、個々を表し、および水平線は、平均値を表す。チューキー検定で測定される場合（Tukey, J. "Comparing Individual Means in the Analysis of Variance". Biometrics (1949) 5(2): 99-114）、＊は、各群からの免疫前の試料（ｄ８）からの、ｐ＜０．０５のレベルの有意差を指し、＊＊は、ｐ＜０．０１のレベルでの有意差を指し、そして、＊＊＊はｐ＜０．００１のレベルでの有意差を指す；
【００１９】
【図３Ｂ】図３Ｂは、アジュバント単独によって、または、図３Ａの実験のＦｉｍＡによって免疫化されたトリからのＦｉｍＡ組み換えポリペプチドに対する、血清ＩｇＹ抗体応答（４０５ｎｍの吸光度）を、図示するグラフである。各点は、個々を表し、および水平線は、平均値を表す。チューキー検定で測定される場合、＊は、各群からの免疫前の試料（ｄ８）からの、ｐ＜０．０５のレベルでの有意差を指し、＊＊は、ｐ＜０．０１のレベルでの有意差を指し、そして、＊＊＊はｐ＜０．００１のレベルでの有意差を指す；
【００２０】
【図４】図４は、アジュバント単独によって、または、図３Ａの実験のＣｎａＡまたはＦｉｍＡによって免疫化され、ウェルシュ菌株ＣＰ１により送り込まれるチャレンジが続く、ニワトリの群からの壊疽性腸炎（Ｎｅ）病変スコアを図示するグラフである。各点は、個々を表し、および水平線は、平均の壊疽性腸炎病変スコアを表す。
【００２１】
【図５Ａ】図５Ａは、第２のワクチン接種実験において、アジュバント単独、ＣｎａＡ、またはＣｎａＡ、ＦｉｍＡ、およびＦｉｍＢの組合せ（Ｃｏｍｂ）によって免疫化された、ニワトリからのＣｎａＡ組み換えポリペプチドに対する、血清ＩｇＹ抗体応答（４０５ｎｍの吸光度）を図示する、グラフである。各点は、個々を表し、および水平線は、平均値を表す。チューキー検定で測定される場合、＊は、各群からの免疫前の試料（ｄ７）からの、ｐ＜０．０５のレベルでの有意差を指し、＊＊は、ｐ＜０．０１のレベルでの有意差を指し、そして、＊＊＊はｐ＜０．００１のレベルでの有意差を指す；
【００２２】
【図５Ｂ】図５Ｂは、図５Ａの実験において、アジュバント単独、またはＣｎａＡ、ＦｉｍＡ、およびＦｉｍＢの組合せ（Ｃｏｍｂ）によって免疫化された、ニワトリからのＦｉｍＡ組み換えポリペプチドに対する、血清ＩｇＹ抗体応答（４０５ｎｍの吸光度）を図示する、グラフである。各点は、個々を表し、および水平線は、平均値を表す。チューキー検定で測定される場合、＊は、各群からの免疫前の試料（ｄ７）からの、ｐ＜０．０５のレベルでの有意差を指し、＊＊は、ｐ＜０．０１のレベルでの有意差を指し、そして、＊＊＊はｐ＜０．００１のレベルでの有意差を指す；
【００２３】
【図５Ｃ】図５Ｃは、図５Ａの実験において、アジュバント単独、ＦｉｍＢ、またはＣｎａＡ、ＦｉｍＡ、およびＦｉｍＢの組合せ（Ｃｏｍｂ）によって免疫化された、ニワトリからのＦｉｍＢ組み換えポリペプチドに対する、血清ＩｇＹ抗体応答（４０５ｎｍの吸光度）を図示する、グラフである。各点は、個々を表し、および水平線は、平均値を表す。チューキー検定で測定される場合、＊は、各群からの免疫前の試料（ｄ７）からの、ｐ＜０．０５のレベルでの有意差を指し、＊＊は、ｐ＜０．０１のレベルでの有意差を指し、そして、＊＊＊はｐ＜０．００１のレベルでの有意差を指す；
【００２４】
【図６】図６は、図５Ａの実験において、アジュバント単独、ＣｎａＡ、ＦｉｍＢ、またはＣｎａＡ、ＦｉｍＡ、およびＦｉｍＢの組合せ（Ｃｏｍｂ）で免疫化され、ウェルシュ菌ＣＰ１により送り込まれたチャレンジが続く、ニワトリの群からの壊疽性腸炎（Ｎｅ）病変スコアを図示する、グラフである。各点は、個々を表し、および水平線は、平均の壊疽性腸炎病変スコアを表す。文字（ａ、ｂ）は、有意差がある群を示す（チューキーで；ｐ＜０．０１）；
【００２５】
【図７】図７は、線毛サブユニット遺伝子ｆｉｍＡおよびｆｉｍＢ（ＣＰ１ΔｆｉｍＡおよびＣＰ１ΔｆｉｍＢ）のウェルシュ菌株ＣＰ１またはＣＰ１ヌル変異体を送り込まれるチャレンジを追跡する、ニワトリの群からの壊疽性腸炎（Ｎｅ）病変スコアを図示する、グラフである。線は、平均の壊疽性腸炎病変スコアを、表す；
【００２６】
【図８Ａ】図８Ａは、クーマシー染色によって視覚化された、ウェルシュ菌株ＣＰ１、または線毛サブユニットｃｎａＡ、ｆｉｍＡ、およびｆｉｍＢのそれぞれのための遺伝子のＣＰ１ヌル変異体（ＣＰ１ΔｃｎａＡ、ＣＰ１ΔｆｉｍＡ、およびＣＰ１ΔｆｉｍＢ）から抽出された表層ポリペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離を図示する、フォトグラフである。
【００２７】
【図８Ｂ】図８Ｂは、一次抗体としてのニワトリ血清から得られた抗ＦｉｍＡ抗体を使用して検出された、ウェルシュ菌株ＣＰ１、または線毛サブユニットｃｎａＡ、ｆｉｍＡ、およびｆｉｍＢのそれぞれのための遺伝子のＣＰ１ヌル変異体（ＣＰ１ΔｃｎａＡ、ＣＰ１ΔｆｉｍＡ、およびＣＰ１ΔｆｉｍＢ）から抽出されたＳＤＳページで分離された、表層ポリペプチドのウエスタンブロット分析を図示する、フォトグラフである；
【００２８】
【図８Ｃ】図８Ｃは、一次抗体としてのウサギ中で増加した抗ＦｉｍＡ抗体を使用して検出された、ウェルシュ菌株ＣＰ１、または線毛サブユニットｃｎａＡ、ｆｉｍＡ、およびｆｉｍＢのそれぞれのための遺伝子のＣＰ１ヌル変異体（ＣＰ１ΔｃｎａＡ、ＣＰ１ΔｆｉｍＡ、およびＣＰ１ΔｆｉｍＢ）から抽出されたＳＤＳページで分離された、表層ポリペプチドのウエスタンブロット分析を図示する、フォトグラフである；
【００２９】
【図９Ａ】図９Ａは、クーマシー染色によって視覚化された、様々なウェルシュ菌株から抽出された表層ポリペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離を図示する、フォトグラフである；
【００３０】
【図９Ｂ】図９Ｂは、一次抗体としてのニワトリ血清から得られる抗ＦｉｍＡ抗体によって視覚化された、様々なウェルシュ菌株から抽出されるＳＤＳページで分離された表層ポリペプチドのウエスタンブロット分析を、図示するフォトグラフである；および
【００３１】
【図１０】図１０は、一次抗体としてのウサギ抗ＦｉｍＡ抗体、および二次抗体としての６ｎｍ免疫金標識化ヤギ抗ウサギＩｇＧにより標識化された、ウェルシュ菌株ＣＰ１、または、ＣＰ１ヌル変異体ＣＰ１ΔｆｉｍＡ、およびＣＰ１ΔｆｉｍＢの細胞のトランスミッション電子顕微鏡法によって得られた、一連のフォトグラフである。
【００３２】
詳細な記載
家禽における壊疽性腸炎と関連するウェルシュ菌の株において同定されたＶＲ−１０Ｂ遺伝子座が（Lepp D et al, Journal of Bacteriology (2013) 195: 1152-1166）、粘着性の線毛をコードすることがわかった６つの推定遺伝子を含有することが、本願出願人によってわかった：構造線毛サブユニットをコードする３つの遺伝子（ｃｎａＡ、ｆｉｍＡ、およびｆｉｍＢ）、およびおそらく線毛アセンブリに関わる２つのソルターゼおよびシグナルペプチダーゼをコードする遺伝子。ＶＲ−１０Ｂ遺伝子座の線図表現は、図１中に示される。
【００３３】
線毛は、多くの細菌の表面に存在し、そしてしばしば毒性に関わる毛髪状構造である。この種の線毛は、おおよそ１μｍの長さを有する細胞表面構造を形成する、共有結合した主なおよび需要でないポリペプチドサブユニットで、構成される。線毛は、グラム陰性菌において広範囲にわたって研究されたが、ジフテリア菌、肺炎連鎖球菌、および化膿連鎖球菌を含むいくつかのグラム陽性種が、ソルターゼ酵素によって組み立てられた特殊なタイプの線毛を生成することが、より最近になって示された。この種の粘着性のグラム陽性線毛は、細胞表面で線毛サブユニットの共有結合を介してハウスキーピングおよび線毛特異的なソルターゼ酵素によって組み立てられ、最終的に細胞壁ペプチドグリカンに共有結合されて、組み立てられた線毛を形成する。
【００３４】
理論によって拘束されずに、本明細書に記載されたウェルシュ菌線毛ポリペプチドが、多くの理由により、壊疽性腸炎に対するワクチンの開発のための現実的および有望な標的であり得ることが、想定される。遺伝子座は、主にウェルシュ菌の壊疽性腸炎を引き起こす株中に存在する。したがって、免疫原性線毛タンパク質によって引き出される免疫応答は、疾患を引き起こすウェルシュ菌の株を特異的に標的とすると、予想される。加えて、線毛は、細菌細胞の表面に存在し、細菌感染症の病因である間に、しばしば宿主への付着に関わり、それは宿主免疫系に線毛を暴露することができる。さらにその上、多分疾患でのそれらの役割および細菌細胞表面のそれらの場所のために、線毛は、多数の他の感染症のためのワクチンを開発するために、うまく使用された。
【００３５】
このように、本出願の一側面は、単離されたウェルシュ菌線毛ポリペプチド、線毛ポリペプチドのバリアント；線毛ポリペプチドのフラグメント；そしてバリアントのフラグメントから選択される免疫原性ポリペプチドを提供し；ここで、線毛ポリペプチド、バリアント、ポリペプチドのフラグメント、およびバリアントのフラグメントは、家禽において免疫原性である。
【００３６】
本明細書に使用されているように、用語「家禽」は、食肉、卵、および羽毛を含むがこれに限定されない生成物のために農業上育てられた、トリまたは家禽の種を指すために、使用される。家禽は、ニワトリ、シチメンチョウ、カモ、ガチョウ、ウズラ、ダチョウ、キジ、およびその他の農業上関連のあるトリまたは家禽を含むが、これに限定されない。ウェルシュ菌感染によって引き起こされる壊疽性腸炎に影響されやすい家禽が、特に含まれる。少なくとも一態様において、家禽は、食肉生産のために育てられるブロイラーまたはニワトリである。
【００３７】
本明細書に使用されているように、用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって一緒に連結した２以上のアミノ酸残基を含有する化合物を意味することを、意図する。ポリペプチドは、２以上のアミノ酸残基が、共有ペプチド結合によって連続して一緒に連結され、単一のポリペプチド鎖、および、非共有結合で互いに結合するか、または、ジスルフィド結合およびイソペプチド結合を含むがこれに限定されない、ペプチド結合以外の共有結合で互いに連結する２以上のポリペプチド鎖を備えるタンパク質を形成する、オリゴペプチドまたはポリペプチドを含むがこれに限定されない。本明細書に使用されているように、用語「イソペプチド結合」は、アミド結合が、１つのアミノ酸のアミノ基と、第２のアミノ酸のカルボキシル基の間に形成し、ここで、アミノ基の少なくとも１つとカルボキシル基が、それぞれのアミノ酸の側鎖に位置することを意味することを、意図する。
【００３８】
本明細書に使用されているように、用語「ウェルシュ菌線毛ポリペプチド」は、線毛または線毛サブユニットの機能を有し、そして、ウェルシュ菌の株中で見つかる１以上の遺伝子によってコードされ、家禽の壊疽性腸炎に関連するポリペプチドを意味することを、意図する。少なくとも一態様において、遺伝子は、図１において概略的にあらわされるように、Lepp D et al, Journal of Bacteriology (2013) 195: 1152-1166中で同定されたＶＲ−１０Ｂ遺伝子座中で見つかった、ｃｎａＡ遺伝子、ｆｉｍＡ遺伝子、または、ｆｉｍＢ遺伝子である：
【００３９】
本明細書に使用されているように、ポリペプチドに使用される場合に用語「バリアント」は、バリアントが、１以上のアミノ酸残基によって比較されている参照ポリペプチドの配列と、そのアミノ酸配列において異なるポリペプチドを指すことを、意図する。バリアントの配列と参照ポリペプチドの配列の間の違いは、種々のアミノ酸残基を有する１以上のアミノ酸残基の置換、追加のアミノ酸残基の挿入、またはアミノ酸残基の欠失を含むことができる。ある態様において、バリアントは、１以上のアミノ酸残基の、同様の特性を有してもよい置換アミノ酸残基への保存的置換により、参照ポリペプチドと異なることができ、新しい残基が置き替わったアミノ酸残基に対する、電荷、寸法、および親水性を含むがこれに限定されない。ある態様において、バリアントは、参照ポリペプチドの１以上の生物学的機能を完全に、または、部分的に保持してもよく、免疫原性を含むがこれに限定されない。少なくとも一態様において、参照ポリペプチドは、本明細書に記載された、単離されたウェルシュ菌線毛ポリペプチドである。
【００４０】
少なくとも一態様において、バリアントの配列は、参照ポリペプチドの配列に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．９％の同一性を有することができる。本明細書に使用されているように、用語「パーセント同一性」または「％同一性」は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの配列の参照で使用される場合に、参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列の対応する位置のそれらと同一である配列における、アミノ酸またはヌクレオチド残基のそれぞれの総数の割合を意味することを、意図する。少なくとも一態様において、バリアント配列の長さおよび参照配列の長さが同一でない場合に、パーセント同一性は、バリアント配列の残基の総数に基づくか、または参照配列の残基の総数基づいて、算出することができる。パーセント同一性は、当該技術分野において周知の様々な局所または全体の配列アルゴリズムで測定することができ、Ｓｍｉｔｈ−ＷａｔｅｒｍａｎアルゴリズムおよびＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを含むがこれに限定されない。これらまたは他の好適なアルゴリズムを用いたツールは、ＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool）および当該技術分野において周知のその他のこのようなツールに含むがこれに限定されない。
【００４１】
本明細書に使用されているように、用語「フラグメント」は、ポリペプチドまたはバリアントとの関係で使用される場合に、ポリペプチドまたはバリアントより少ないアミノ酸残基を含有し、そしてポリペプチドまたはバリアントの配列の一部分と同一である配列を有する、より小さいポリペプチドを指すことを、意図する。少なくとも一態様において、フラグメントは、ポリペプチドまたはバリアントの１以上の生物活性を保持し、免疫原性を含むがこれに限定されない。少なくとも一態様において、フラグメントは、ポリペプチドまたはバリアントのエピトープを備える。少なくとも１態様において、フラグメントは、少なくとも６アミノ酸長、または少なくとも７アミノ酸長、または少なくとも８アミノ酸長、または少なくとも９アミノ酸長、または少なくとも１０アミノ酸長である。
【００４２】
本明細書に使用されているように、用語「免疫原性の」は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドまたはそれらのフラグメントを含むがこれに限定されず、免疫原性剤が投与される対象における免疫防御応答を引き出す剤を指すことを、意図する。本明細書に使用されているように、用語「免疫保護応答」は、感染した対象の疾患の症状の一つ以上を防御するか、緩和するか、または除去する免疫応答を指すことを、意図する。
【００４３】
本発明の単離されたウェルシュ菌線毛ポリペプチド、線毛ポリペプチドのバリアント、線毛ポリペプチドのフラグメントおよびバリアントのフラグメントを含む本発明の免疫原性ポリペプチドは、家禽において免疫原性である。このように、少なくとも一態様において、本発明の単離されたウェルシュ菌線毛ポリペプチド、線毛ポリペプチドのバリアント、線毛ポリペプチドのフラグメント、およびバリアントのフラグメントのいずれか１以上によって免疫化された家禽は、ウェルシュ菌細胞、組み立てられたウェルシュ菌線毛、ウェルシュ菌線毛ポリペプチド、ウェルシュ菌線毛ポリペプチドのフラグメント、またはウェルシュ菌細胞の１部分（細胞壁またはその部分を含むがこれに限定されない）によるチャレンジにたいして免疫防御応答を示すだろうし、それらは、組み立てられたウェルシュ菌線毛、ウェルシュ菌線毛ポリペプチド、またはウェルシュ菌線毛ポリペプチドのフラグメントの１以上を担持する。
【００４４】
本出願の別の側面は、本明細書に記載の様に、単離されたウェルシュ菌線毛ポリペプチドまたは免疫原性ポリペプチドをコードする配列を備えるポリヌレオチドを提供する。少なくとも一態様において、ポリヌクレオチドは、単離されたウェルシュ菌線毛ポリペプチドまたは免疫原性ポリペプチドを発生させるために翻訳されることができる配列を有する、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。少なくとも１態様において、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであり、それの少なくとも１つの鎖は、転写され、次々に翻訳されて単離されたウェルシュ菌線毛ポリペプチドまたは免疫原性ポリペプチドを発生させることができるｍＲＮＡを、生成することができる。少なくとも一態様において、ＤＮＡは、単離されたウェルシュ菌線毛ポリペプチドまたは免疫原性ポリペプチドを生成する生化学系（細胞を含むがこれに限定されない）によって発現されることができる。このような少なくとも一態様において、当該技術分野において周知である様に、ＤＮＡは、宿主細胞のＤＮＡの発現のために構成されるベクターに、組み込まれることができる。
【００４５】
少なくとも一態様において、ポリヌクレオチドは、少なくとも穏やかにストリンジェントな条件の下で、本明細書に記載されているような単離されたウェルシュ菌線毛ポリペプチドまたは免疫原性ポリペプチドをコードする配列を備えるポリヌクレオチドにハイブリダイズするバリアントポリヌクレオチド配列を含むことができる。少なくとも穏やかにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件によって、溶液中の２つの相補核酸分子の間で選択的なハイブリダイゼーションを促進する条件が、選択されることが、意味される。ハイブリダイゼーションは、核酸一次構造分子の全部または１部分に生じてもよい。ハイブリダイズする部分は、典型的には、少なくとも１５（例えば２０、２５、３０、４０、または５０）ヌクレオチド長さである。当業者は、核酸二重鎖またはハイブリッドの安定性が、ナトリウム含有緩衝液中で、ナトリウムイオン濃度（［Ｎａ＋］）と温度の関数または類似の方程式である融解温度（Ｔｍ）によって決定されることを（Ｔｍ＝８１．５℃−１６．６（Ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％（Ｇ＋Ｃ）−６００／Ｉ、ここで、％Ｇ＋Ｃが、核酸中のシトシンおよびグアニンヌクレオチドの割合であり、ｌが、塩基対の核酸の長さである）、認識するだろう。したがって、ハイブリッドの安定性を決定する洗浄条件のパラメーターは、ナトリウムイオン濃度および温度である。公知の核酸分子と類似するが、同一でない分子を同定するために、１％の誤った組合せが、Ｔｍの約１℃の減少に、結果としてなることが想定されてもよい。たとえば、＞９５％の同一性を有する核酸分子が求められる場合、最終的な洗浄温度は、約５℃減少してもよい。これらの考慮点に基づいて、当業者は、適切なハイブリダイゼーション条件を、容易に選択することができる。
【００４６】
いくつかの態様において、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が、選択される。例証として、以下の条件は、ストリンジェントなハイブリダイゼーションを達成するために用いられてもよい：上記の等式に基づく、Ｔｍ−５℃、５×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）／５×デンハート溶液／１．０％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）でのハイブリダイゼーション、続く６０℃、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳでの洗浄。穏やかにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、４２℃、３×ＳＳＣでの洗浄ステップを含む。しかしながら、代替の緩衝液、塩、および温度を使用して同等のストリンジェンシーが達成されてもよいことが理解される。ハイブリダイゼーション条件に関する追加の指針は、以下で見つかってもよい：Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 2002, and in: Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.
【００４７】
少なくとも一態様において、単離されたウェルシュ菌線毛ポリペプチドは、ＣｎａＡポリペプチドである。少なくとも一態様において、ＣｎａＡポリペプチドは、配列番号１０および配列番号１３から選択されるアミノ酸配列を有する。少なくとも一態様において、ＣｎａＡポリペプチドは、配列番号１、配列番号４、および配列番号７から選択される配列を有するポリヌクレオチドによって、コードされる。少なくとも一態様において、ＣｎａＡポリペプチドは、配列番号１、配列番号４、および配列番号７から選択される配列を有するポリヌクレオチドに、少なくとも穏やかにストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによって、コードされる。少なくとも一態様において、線毛ポリペプチドがＣｎａＡポリペプチドである場合に、そのバリアントは、配列番号１０および配列番号１３から選択されるアミノ酸配列に少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または９９．９％の配列同一性を有する。
【００４８】
少なくとも一態様において、単離されたウェルシュ菌線毛ポリペプチドは、ＦｉｍＡポリペプチドである。少なくとも一態様において、ＦｉｍＡポリペプチドは、配列番号１１および配列番号１４から選択されるアミノ酸配列を有する。少なくとも一態様において、ＦｉｍＡポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号５、および配列番号８から選択される配列を有するポリヌクレオチドによって、コードされる。少なくとも一態様において、ＦｉｍＡポリペプチドは、配列番号２、配列番号５、および配列番号８から選択される配列を有するポリヌクレオチドに、少なくとも穏やかにストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによって、コードされる。少なくとも一態様において、線毛ポリペプチドがＦｉｍＡポリペプチドである場合に、そのバリアントは、配列番号１１および配列番号１４から選択されるアミノ酸配列に少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または９９．９％の配列同一性を有する。
【００４９】
少なくとも一態様において、単離されたウェルシュ菌線毛ポリペプチドは、ＦｉｍＢポリペプチドである。少なくとも一態様において、ＦｉｍＢポリペプチドは、配列番号１２および配列番号１５から選択されるアミノ酸配列を有する。少なくとも一態様において、ＦｉｍＢポリペプチドは、配列番号１、配列番号３、配列番号６、および配列番号９から選択される配列を有するポリヌクレオチドによって、コードされる。少なくとも一態様において、ＦｉｍＢポリペプチドは、配列番号３、配列番号６、および配列番号９から選択される配列を有するポリヌクレオチドに、少なくとも穏やかにストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによって、コードされる。少なくとも一態様において、線毛ポリペプチドがＦｉｍＢポリペプチドである場合に、そのバリアントは、配列番号１２および配列番号１５から選択されるアミノ酸配列に少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または９９．９％の配列同一性を有する。
【００５０】
少なくとも一態様において、単離されたウェルシュ菌線毛ポリペプチドは、組み立てられた線毛である。少なくとも一態様において、組み立てられた線毛は１または２以上のサブユニットを備え、それぞれがＣｎａＡポリペプチド、ＦｉｍＡポリペプチド、およびＦｉｍＢポリペプチドから個別に選択される。少なくとも一態様において、１以上のサブユニットは、互いに共有結合している。少なくとも一態様において、組み立てられた線毛は、ウェルシュ菌細胞から単離された線毛であるか、またはそれらの１部分であり、細胞膜またはそれらの１部分または細胞壁またはそれらの１部分を含むが、これらに限定されない。少なくとも一態様において、組み立てられた線毛は、ウェルシュ菌細胞から単離された線毛のフラグメントであるか、またはそれらの１部分であり、細胞膜またはそれらの位１部分または細胞壁またはそれらの１部分を含むが、これらに限定されず、ここで、該フラグメントは、１以上のサブユニットを備え、それぞれが、ＣｎａＡポリペプチド、ＦｉｍＡポリペプチド、およびＦｉｍＢポリペプチドから個別に選択される。
【００５１】
少なくとも一態様において、単離されたウェルシュ菌線毛ポリペプチドは、ウェルシュ菌の培養から単離されることができる。このように、少なくとも一態様において、単離されたウェルシュ菌線毛ポリペプチドは、ウェルシュ菌細胞の１以上の部分を含有する調製物の部分であることができ、細胞膜またはそれらの１部分または細胞壁またはそれらの１部分を含むがこれらに限定されず、それは、本明細書に記載の線毛ポリペプチドまたはそれらのフラグメントを担持する。少なくとも一態様において、線毛ポリペプチドをコードする配列を有するポリヌクレオチドを備えるベクターの好適な宿主細胞の発現によって、単離されたウェルシュ菌線毛ポリペプチドは、組み換えによって生成されることができる。少なくとも一態様において、線毛ポリペプチドが、組み立てられた線毛である場合に、該組み立てられた線毛は、遺伝子、および組み立てられた線毛の組立てのために要求される他の核酸配列をコードする配列を有するポリヌクレオチドを備えるベクターの好適な宿主細胞の発現およびによって、組み換えによって生成されることができる。加えて、単離されたウェルシュ菌線毛ポリペプチドは、単離または組み換え生産の後、少なくとも部分的に精製されることができる。原核生物および真核生物宿主細胞を含むがこれに限定されない、組み換えポリペプチドの生産のために適応した好適なベクターおよび宿主細胞、および、このようなポリペプチドの少なくとも部分的な精製の方法を含むがこれに限定されない、このようなポリペプチドを単離するかまたは組み換えによって生成する方法は、当該技術分野において周知であるか、またはルーチンの実験努力だけによる当業者によって、容易に同定され選択されることができる。
【００５２】
別の側面において、本出願は、家禽における壊疽性腸炎の処置または予防のために、または、家禽におけるウェルシュ菌感染の処置または予防のために、ワクチンを提供し、ここで、ワクチンは、本明細書に記載の少なくとも１の免疫原性ポリペプチドを、備える。本明細書に使用されているように、用語「ワクチン」は、ウェルシュ菌による感染の効果を防御するか、処置するか、または減少させるための使用される免疫原性調製物を指すことを、意図する。ワクチン製剤は、典型的には免疫原性剤の免疫学的に有効な量を含有し、そしてアジュバントを含有してもよいか、またはアジュバントフリーでもよい。本発明のワクチンの場合、免疫原性剤は、本明細書に記載の免疫原性ポリペプチドであることができる。
【００５３】
本明細書に使用されているように、用語「アジュバント」は、免疫原性剤を備えるワクチンで、ワクチン接種をされた対象の免疫原性剤に対する、免疫応答を増強するために有効である剤を指すことを、意図する。好適なアジュバントは、以下のように当該技術分野において周知であり、そして、無機の化合物を含むがこれに限定されず、ミョウバン、水酸化アルミニウム、および他のアルミニウム含有化合物を含むが、これに限定されない；Ｑｕｉｌ−Ａ（商標）を含むがこれに限定されないサポニン；完全なおよび不完全なフロイントアジュバント；水中油エマルジョンを含むがこれに限定されない脂質または鉱油含有アジュバント；多糖類アジュバント；タンパク質アジュバント；免疫モジュレーター；殺されたか弱毒化された細菌細胞から得られたアジュバント；そして、当該技術分野において公知な他の好適なアジュバント。
【００５４】
ワクチンは、１以上の薬理学的に許容しうる担体中で、製剤化されることができる。本明細書に使用されているように、用語「薬理学的に許容しうる」は、動物またはヒトに投与される場合に、生理学的に許容でき、そして典型的には厄介な反応を生成しない分子本体および組成物を指すことを、意図する。好ましくは、本明細書で使用されているように、用語「薬理学的に許容しうる」は、連邦または州政府の監督機関の承認を得るか、または米国薬局方または動物またはヒトに使用するために一般に認識されたその他の薬局方にリストされたことを、意味する。本明細書に使用されているように、用語「担体」は、希釈液、アジュバント、添加剤、または化合物が投与される媒体を指すことを、意図する。好適な担体は、当該技術分野において周知であり、少なくとも一態様において、"Remington's Pharmaceutical Sciences" by E. W. Martin, 18th Edition, or other editionsに記載されている。
【００５５】
ワクチンは、当該技術分野において公知の都合がいい、いずれかのルートによる投与のために製剤化されることができ、経口的に、直腸に、鼻に、経粘膜的に、経皮的に、非経口的に、静脈内に、筋肉内に、皮下に、胚内に、または、他の公知のルートを含むが、これらに限定されない。少なくとも一態様において、ワクチンが、経口的に投与されることができることが、想定される。理論によって拘束されずに、経口ワクチン接種が、ウェルシュ菌の壊疽性腸炎関連株による感染の部位で、腸関連リンパ系組織を直接標的とすることができることが、想定される。少なくとも一態様において、子孫が、母のワクチン接種、および母子免疫のその後の転送によって免疫化されることができることが想定され、子孫への移行抗体を含むがこれに限定されない。
【００５６】
別の側面において、本発明は、家禽の壊疽性腸炎の処置または予防のための、または、家禽のウェルシュ菌感染の処置または予防のための医薬の調製における、本明細書に記載の免疫原性ポリペプチドの使用を、提供する。医薬は、本明細書に記載のワクチンであることができる。
【００５７】
別の側面において、本発明は、家禽の壊疽性腸炎の処置または予防の、または、家禽のウェルシュ菌感染の処置または予防のための方法、本明細書に記載の免疫原性ポリペプチド、または本明細書に記載のワクチンの有効量を、家禽に投与することを備える方法を提供する。投与は、当該技術分野において周知のルートであることができ、経口的に、直腸に、鼻に、非経口的に、静脈内に、筋肉内に、皮下に、または、他のルートを含むが、これらに限定されない。少なくとも一態様において、投与は、皮下注射によってであることができる。少なくとも一態様において、投与は、経口的であることができる。少なくとも一態様において、当該技術分野において理解されるように、初期免疫に続く１以上の追加免疫を提供するために、ワクチンは、家禽に、二回以上投与されることができる。少なくとも一態様において、初期免疫および１以上の追加免疫の１以上は、家禽の移行抗体の消失の後、家禽に投与される。少なくともこのような一態様において、初期免疫および１以上の追加免疫の１以上は、ふ化の後の約１０日より、家禽に投与される。
【００５８】
別の側面において、本発明は、家禽の壊疽性腸炎の処置または予防のためのワクチンとしての、または、家禽のウェルシュ菌感染の処置または予防のための、本明細書に記載の免疫原性ポリペプチドの使用を、提供する。
【００５９】
本発明の更なる側面は、本明細書に記載の免疫原性ポリペプチドに、選択的に結合する抗体を提供する。少なくとも一態様において、抗体は、家禽抗体である。少なくとも一態様において、抗体は、本明細書に記載の免疫原性ポリペプチドへの選択的結合特性を保持する、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、または抗体フラグメントであることができる。本明細書に使用されているような用語「抗体フラグメント」は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、ダイマー、ミニボディ、ダイアボディ、およびそれらのマルチマー、および二重特異的抗体フラグメントを含むことを、意図するが、これらに限定されない。抗体は、従来の技法を使用して、断片化されることができる。例えば、Ｆ（ａｂ’）フラグメントは、抗体をペプシンで処理して生成できる。得られたＦ（ａｂ'）２フラグメントは、ジスルフィド架橋を還元するために処理され、Ｆａｂ'フラグメントを生成することができる。パパイン消化は、Ｆａｂフラグメントの形成につながることができる。Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、ダイマー、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異的抗体フラグメント、および他のフラグメントは、組み換え技法によって合成されることもできる。
【００６０】
このような抗体およびそれらのフラグメントを調製して、特徴づける方法は、当該技術分野において周知であり、過度の努力をせずに、当業者によって容易に実行されることができる。たとえば、ポリクローナル抗血清またはモノクローナル抗体は、標準的な方法を使用してなされることができる。哺乳動物（例として、マウス、ハムスター、またはラビット）、トリ（例として家禽）、または他の動物は、哺乳動物の抗体応答を引き出す本発明の免疫原性ポリペプチドの免疫原性形によって、免疫化されることができる。ペプチドに免疫原性を授けるための技法は、担体、または当該技術分野において周知の他の技法への結合を含む。たとえば、ペプチドは、アジュバントの存在下で投与されることができる。免疫化の過程は、プラズマ又は血清中の抗体滴定量の検出で観察できる。標準的なＥＬＩＳＡまたは他のイムノアッセイの手順は、抗体のレベルを評価するために、抗原としての免疫原性剤とともに使用されることができる。免疫化に続いて、抗血清が得られ、所望により、血清から単離されたポリクローナル抗体であることができる。
【００６１】
モノクローナル抗体を生成するために、抗体産生細胞（リンパ球）は、免疫化された動物から収穫されることができ、このように、これらの細胞を不死化し、ハイブリドーマ細胞を産生する標準的な体性細胞融合手順によって、骨髄腫細胞と融合することができる。このような技法は、当該技術分野において周知である。ハイブリドーマ細胞は、本明細書に記載の免疫原性ポリペプチドに特異的に反応性が高い抗体の作成のために、免疫化学的にスクリーニングされることができ、そして、モノクローナル抗体は、単離されることができる。したがって、本開示も、本明細書に記載の免疫原性ポリペプチドに関する特異性を有するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を、想定する。
【００６２】
特異的抗体、または本明細書に記載の免疫原性ポリペプチドに対して反応性の抗体フラグメントは、本明細書に記載の核酸分子から生成されるペプチドを有する細菌に発現する免疫グロブリン遺伝子またはそれらの部分をコードするスクリーニング発現ライブラリによって、発生されてもよい。たとえば、完全なＦａｂフラグメント、ＶＨ領域、およびＦＶ領域は、ファージ発現ライブラリを使用して、細菌に発現されることができる。
【００６３】
別の側面において、本発明は、壊疽性腸炎と関連するウェルシュ菌の株によって家禽の感染を検出する方法を提供し、ここで、該方法は、家禽から生体試料を得、そして、該生体試料において、本明細書に記載の免疫原性ポリペプチドに選択的に結合する抗体の存在を検出することを含む。少なくとも一態様において、生体試料は、血液試料である。少なくとも一態様において、試料は、糞試料である。少なくとも一態様において、該検出は、当業者に周知の方法を使用して、生体試料中に存在する抗体の量および濃度の測定を含む。
【００６４】
本発明のまた別の側面は、選択的に免疫原性ポリペプチドに結合する抗体に免疫原性ポリペプチドを暴露して、抗体への免疫原性ポリペプチドの結合を検出することを備える、本明細書に記載の免疫原性ポリペプチドを検出する方法を、提供する。少なくとも一態様において、免疫原性ポリペプチドは、本明細書に記載の単離されたウェルシュ菌線毛ポリペプチドであることができる。少なくとも一態様において、免疫原性ポリペプチドは、ウェルシュ菌細菌細胞の表面に付随する組み立てられた線毛であることができる。該方法のこのような態様は、家禽の壊疽性腸炎を生成することができるウェルシュ菌の株を同定し、検出するために有用であることができる。
【００６５】
本明細書において使用されるように、数値または値の範囲に適用される場合、用語「約」または「ほぼ」は、変動が当該技術分野において引用される値に同等であるとして考えられ、および同じ機能または結果を提供するように、引用された値が、測定の性質または精度を考慮して、測定された量の許容される程度の誤差の中で変動し得ることを意味することを意図する。例としては、当該技術分野において理解されるように、誤差の程度は、測定のために提供される有意な数値の数によって指し示され得、限定されないが、および測定について報告されている最も正確な有効数字における±１の変動を包含する。誤差の典型的な例示の程度は、与えられる値または範囲の２０パーセント（％）、好ましくは１０％、およびより好ましくは５％の中である。代わりに、および特に生物学的システムにおいて、用語「約」および「およそ」は、桁の中にある範囲、与えられる値の好ましくは５倍の中におよびより好ましくは２倍の中である値を意味し得る。記載されていないかぎり、本明細書において与えられる数の量はおよそであり、特別に述べられないとき、用語「約」または「およそ」は、推認され得ることを意味する。
【００６６】
本明細書において使用されるように、用語「実質上」は、完全なまたはほぼ完全な範囲または程度の作用、特徴、特性、状態、構造、品目、または結果を指す。たとえば、「実質的に」同じ特性を有する２つの物質は、完全に同一の特性を有するか、または、違いが測定できないか有意でないほど完全に同一にきわめて近い特性を有するだろう。絶対的な完全からちょうど許される程度の偏差は、いくつかの場合において特異的な文脈に依ってもよい。しかしながら、一般的に言って、まるで絶対的および総体的な完成が得られたかのように同じ全体の結果を有するように完成の類似が得られるだろう。「実質上」の使用は、消極的な含意において、作用、特色、特性、状態、構造、品目または結果の完全なまたは完全に近い欠乏を指すことに使用されるとき、同等に適用できる。
【００６７】
例
本発明の他の特徴は、発明の原理を例という方法によって説明する以下の非限定的例から、明白になるだろう。
【００６８】
例１：ウェルシュ菌から精製された組み換え線毛関連ポリペプチドの生産
３つの線毛サブユニット（ｃｎａＡ、ｆｉｍＡ、およびｆｉｍＢ）のためのコード領域は、コドンを最適化し、予測されたＮ末端シグナルペプチドおよびＣ末端細胞壁局在化シグナルＬＰＸＴＧ膜貫通ドメインを除去するために、トランケートした。Ｃ末端ドメインは、線毛アセンブリの間、取り除かれると予測される疎水性領域である。トランケートされたコドンを最適化されたコード領域を、合成し（Integrated DNA Technologies, Coralville, USA）、製造業者（Takara Bio USA, Mountain View, California, USA）の説明書に従うＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（商標）クローニングによってｐＥＴ２８ａ発現ベクター（MilliporeSigma, Etobicoke, Ontario, Canada）にクローニングし、配列を確認し、その後大腸菌ＢＬ２１細胞に形質転換した。形質転換されたコロニーを、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンおよび１ｍＭのＩＰＴＧで補充された１ＬのＬＢブロス中で、振盪によって、３７℃で１８ｈの間、増殖させた。培養物を、ペレット化し、結合用緩衝液２０ｍｌ（２０ｍＭのＮａＰＯ４、０．５ＭのＮａＣｌ、３０ｍＭのイミダゾール）中に再懸濁し、氷上での１０分間の超音波処理によって溶解した。（１０ｓパルス、２０ｓ停止）。細胞可溶化物を、ＡＥＫＴＡ（商標）ｐｒｉｍｅ  ｐｌｕｓシステム上で、５０〜５００ｍＭのイミダゾールのグラディエントを使用して、ＨｉｓＴｒａｐ（商標）ＦＦＣｒｕｄｅカラム（GE Healthcare, Montreal, Canada）上で、固有の条件のもとで精製した。１ｍｌの分画を収集し、そして、２８０ｎｍのピークを提示する分画を、プールし、そして、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒｓ（９Ｋ分子量カットオフ）（Fisher Scientific, Unionville, Ontario, Canada）で濃縮し、そして、Ｚｅｂａ（商標）Ｓｐｉｎ  ７Ｋ分子量カットオッフ脱塩カラム（Fisher Scientific）を使用して、脱塩した。精製されたタンパク質の定量化を、製造業者の説明書に従って、ＢＣＡ（ビシンコニン酸）タンパク質アッセイキット（Fisher）を使用して、遂行した。ポリペプチドを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシー染色によって視覚化した。
【００６９】
図２Ａ（ＣｎａＡ）、２Ｂ（ＦｉｍＡ）、２Ｃ（ＦｉｍＢ）、および２Ｄ（濃縮および脱塩につづくＣｎａＡ、ＦｉｍＡ、およびＦｉｍＢのプールされた分画）に示されるＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって証明されているように、トランケートされた配列は、ヒスチジンタグを付けられたポリペプチドのハイレベルの発現に結びついた。これらの発現の増大したレベルは、得られたポリペプチドの溶解性の増大によるかもしれない。
【００７０】
表１は、全長のサブユニットポリペプチド、および発現されトランケートされそしてヒスチジンタグを付けられたサブユニットポリペプチドの配列とともに、全長の、コドンを最適化されそしてトランケートされた遺伝子配列を示す。
【表１−１】
2020527051.tif 000003
【表１−２】
2020527051.tif 000004
【表１−３】
2020527051.tif 000005
【表１−４】
2020527051.tif 000006
【００７１】
例２：ウェルシュ菌株ＣＰ１線毛サブユニットヌル変異体の調製
以前本質的に記載されているように（Yu, Q., Lepp, D., Mehdizadeh Gohari, I., Wu, T., Zhou, H., Yin, X., Yu, H., Prescott, J.F., Nie, S.P., Xie, M.Y., Gong, J., 2017. The Agr-like quorum sensing system is required for necrotic enteritis pathogenesis in poultry caused by Clostridium perfringens. Infection and Immunity 85(6): e00975-16）、３つの線毛サブユニット遺伝子（ｃｎａＡ、ｆｉｍＡ、およびｆｉｍＢ）を、ＣｌｏｓＴｒｏｎ突然変異誘発による有毒なウェルシュ菌株ＣＰ１において、それぞれ挿入して不活化し（Heap, J.T., et al, Methods Mol. Biol. (2010), 646: 165-182)、線毛サブユニット遺伝子（ＣＰ１ΔｃｎａＡ、ＣＰ１ΔｆｉｍＡ、およびＣＰ１ΔｆｉｍＢ）のそれぞれに関してＣＰ１ヌル変異体を発生させた。簡潔には、ＣｌｏｓＴｒｏｎイントロン−ターゲティング領域を、以下の位置に挿入するために、www.clostron.comで実施されるＰｅｒｕｔｋａアルゴリズム：ｃｎａＡセンス鎖の塩基対（ｂｐ）１８３、ｆｉｍＡセンス鎖のｂｐ２３１、およびｆｉｍＢセンス鎖のｂｐ２７３を使用して、設計した。イントロン−ターゲッティング領域は、ＣｌｏｓＴｒｏｎプラスミドｐＭＴＬ００７Ｃ−Ｅ２に、ＤＮＡ２．０（Menlo Park, CA, USA）によって合成され、クローニングされた。その結果としてのプラスミドを、以前に軽微な修飾とともに記載のＣＰ１中に個別に電気穿孔した（イメージ１）。簡潔には、５ｍｌのＴＧＹブロス（３％のトリプトン、２％のグルコース、１％の酵母抽出物）中での、３７℃で嫌気的にオーバーナイトでの増殖の後、ＣＰ１を、５０ｍｌのＴＧＹに継代培養し、指数増殖期（６００ｎｍ［ＯＤ６００］（０．８）の光学密度）へと増殖させた。該細胞を、２０℃で１０分間、６，０００ｇの遠心分離によって収穫し、１０ｍｌのスクロースエレクトロポレーション緩衝液（ＳＥＢ）（２７２ｍＭのスクロース、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．４）で洗浄し、その後５ｍｌのＳＥＢ中で再懸濁した。アリコート（０．２ｍｌ）を、前冷却されたキュベット（０．２−ｃｍｇａｐ）中で２μｇの濃縮されたプラスミドＤＮＡを混合し、そして、プラスミドＤＮＡを、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌ装置（Bio-Rad, Hercules, CA, USA）を使用したエレクトロポレーション（１，０００Ｖ、２５Ｆ）によって、細胞に導入した。形質転換の直後に、混合物を、１ｍｌのＴＧＹブロスへ転送し、そして、嫌気的にオーバーナイトで３７℃３ｈの間インキュベートし、続いて、形質転換体を選択するために、１５μｇ／ｍｌのチアンフェニコールを含有するＴＧＹ寒天上へプレーティングした。得られたコロニーを、成分を選択するために、１０μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを含有するＴＧＹ寒天上へ継代培養し、その後シャトルベクターをキュアリングするために１０日連続で継代した。エリスロマイシン耐性であるが、チアンフェニコールに感受性であるそれらのクローンは、更なる分析のために選択された。
【００７２】
例３：動物実験
２つのワクチン接種実験を、ニワトリのチャレンジモデルにおける壊疽性腸炎（Ｎｅ）から防御するための、３つの精製されたヒスチジンタグを付けられた組み換え線毛サブユニットの能力を評価するために、実行した。市販の日令雄ホワイトプリマスロックのブロイラーニワトリを、ランダムに実験群（ｎ＝１５−１７）に分けて、単離ユニットの中で別々の部屋に収容した。実験設計の概要を、表２に示す。加えて、ＣＰ１ΔｆｉｍＡおよびＣＰ１ΔｆｉｍＢ変異体を、同じモデルにおいて、毒性評価した。
【表２−１】
2020527051.tif 000007
【表２−２】
2020527051.tif 000008
【００７３】
実験１：
最初の実験に、アジュバントのみのコントロール、ＣｎａＡ、またはＦｉｍＡのいずれかのワクチン接種をされた１８羽のトリの３つの群を含めた。８日目および２０日目に、Ｑｕｉｌ−Ａ（商標）アジュバント（５０μｇ）を含有する２００μｌのリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）および組み換え線毛ポリペプチド（５０μｇ）を、各トリの胸筋の筋肉内（ｉ．ｍ．）に注射し、そして、トリを３１日目に安楽死させた。
【００７４】
血清を、８日目（免疫化の前）に、および、２０および３１日目（免疫化の後）に、各群からの５羽のトリから収集した。ＣｎａＡ、およびＦｉｍＡに対する血清ＩｇＹ力価を、ＥＬＩＳＡ（酵素結合抗体免疫吸着アッセイ）によって決定した。ウェルシュ菌組み換え線毛ポリペプチドを、ｐＨ９．６で、５０ｍＭの炭酸塩／重炭酸塩コーティング緩衝液中で、１０μｇ／ｍｌまで希釈し、そして、１００μｌを、９６ウェルＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）イムノプレート（Fisher Scientific）のそれぞれのウェルに加えた。ウェルは、３７℃で１ｈの間、続いて４℃で終夜コートし、洗浄緩衝液（０．０５％のトゥイーン２０を含有するＰＢＳ）で３回洗浄し、その後３７℃で２ｈの間、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Sigma）を含有する洗浄緩衝液中でブロックした。１％のＢＳＡ（１／６４〜１／６５，５３６）を含有する洗浄緩衝液中で希釈された各血清試料の二倍階段希釈物を、３７℃で２ｈの間別々のウェル中でインキュベートし、その後３回、洗浄緩衝液で洗浄した。ウェルを、ヤギ抗ニワトリＩｇＹホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）複合ポリクローナル抗体とともにインキュベートし、室温で、１ｈの間洗浄緩衝液中で１：５，０００に希釈し、そして、３回洗浄緩衝液で洗浄した。基質溶液（０．２ｍｇ／ｍｌの１×ＡＢＴＳ緩衝液（Sigma）中の２、２´−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ）（Sigma））を、よくそれぞれとウェルに加え、室温で３０分間、インキュベートした。反応を０．５％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で停止したあと、吸光度を、ＢｉｏＴｅｋ（商標）プレートリーダーにおいて、４０５ｎｍで測定した。力価を、バックグラウンドのウェルのそれの２倍超の吸光度によって、最も低い血清希釈のｌｏｇ２値として算出し、そこにおいて、１％のＢＳＡを含有するＰＢＳを、血清の代わりに使用した。一方向ＡＮＯＶＡに続くチューキーのポストホックテストによって、異なるワクチン接種群の中で、各抗原に関する免疫前および免疫後の力価の間の統計的差異を、決定した。
【００７５】
結果を、図３ＡおよびＢにおいて、それぞれ示す。ＣｎａＡを免疫化された群におけるＣｎａＡに対する平均血清応答は、ｄ３１で免疫前のトリ（ｄ８）と比較して、有意により高かったが、しかしながら、全体の増大は、小さかった。ＦｉｍＡを免疫化された群において、ＦｉｍＡに対する平均応答は、免疫化の後有意に増加しなかった。しかしながら、２羽のトリは、ｄ３１によって高い力価を呈した。
【００７６】
トリに、壊疽性腸炎（Ｎｅ）の実験的誘発まで、２０％のタンパク質を含有する抗生物質フリーなスターター飼料を、与えた。２７日目に、トリを、２４ｈの間絶食し、その後、３１日目での安楽死の前の２８および２９日目に、ウェルシュ菌ＣＰ１培養物を含有する抗生物質フリーなシチメンチョウスターター飼料（２８％のタンパク質）へ切り替えた。感染した飼料を、ウェルシュ菌ＣＰ１培養物（流体チオグリコール酸塩（ＦＴＧ）（Ｄｉｆｃｏ）培地中で、３７℃で１５ｈまたは２４ｈの間増殖した）と、それぞれ２：１（ｖ／ｗ）の比率で混合することによって、毎日朝および午後に調製した。安楽死に続いて、トリの小腸（十二指腸から回腸へ）を、壊疽性腸炎病変に関して大雑把に調査し、以下の通り、盲検的に、１から６までＫｅｙｂｕｒｎら（Keyburn AL, Boyce JD, Vaz P, Bannam TL, Ford ME, Parker D, Di Rubbo A, Rood JI, Moore RJ. 2008. NetB, a new toxin that is associated with avian necrotic enteritis caused by Clostridium perfringens. PLoS Pathog. 4:e26）に記載のシステムを使用してスコア化した：
０、肉眼的病変なし；
１、薄いかまたはもろい壁；
２、局所の壊疽または潰瘍（１〜５の病巣）；
３、局所の壊疽または潰瘍（６〜１５の病巣）；
４、局所の壊疽または潰瘍（１６以上の病巣）；
５、長さ２〜３ｃｍの壊疽の斑；
６、分野の症例に典型的な瀰漫した壊疽。
【００７７】
一方向ＡＮＯＶＡ（分散分析）、続くチューキーのポストホックテストによって、群の中の壊疽性腸炎（Ｎｅ）スコアの間の統計的差異を、決定した。結果（図４において示される）は、すべての群が、同様に高い平均病変スコアを有したことを指す。｛アジュバントのみのコントロール、ＣｎａＡを免疫化されたおよびＦｉｍＡを免疫化された群に関する平均壊疽性腸炎スコアは、それぞれ３．１、３．０、および３．３であった。
【００７８】
理論によって拘束されずに、８日目での免疫化が、移行抗体からの干渉に対する対象であったかもしれないことが、そして、２０日目での免疫化がウェルシュ菌ＣＰ１によるチャレンジの前に、充分な免疫応答を引き出す時間がなかったかもしれないことが、想定される。したがって、追加の免疫化を含む第２のワクチン接種実験を、ウェルシュ菌ＣＰ１によるチャレンジの前に、実行した。
【００７９】
実験２：
第２の実験は、アジュバントのみのコントロール、ＣｎａＡ、ＦｉｍＢ、またはＣｎａＡ、ＦｉｍＡ、およびＦｉｍＢの組み合わせのいずれかによるワクチン接種を皮下（ｓ．ｃ．）にされた、１８羽のトリの４つの群から、成った。この実験において、各トリを、７、１４、および１９日目に、５０μｇのＱｕｉｌ−Ａ（商標）アジュバントと組み合わせた５０μｇの組み換えポリペプチドによって、皮下に免疫化し、そして、血清を、抗体力価の測定のために、７、１９、および２９日目に収集した。
トリに、２６および２７日目に、実験１で記載のウェルシュ菌株ＣＰ１により送り込みでチャレンジし、そして２９日目に、トリを安楽死させ、そして、腸の病変をスコア化した。
【００８０】
免疫前のコントロール（ＦｉｍＢによって１９日目に免疫化された群を除いた）と比較して、有意な（ｐ＜０．００１）血清抗体（ＩｇＹ）応答を、すべての免疫化された群において１９および２９日目の両方で観察し、そして、応答の規模は、実験１においてよりも非常に大きかった。結果を、図５Ａ（抗ＣｎａＡ血清応答）、５Ｂ（抗ＦｉｍＡ血清応答）、および５Ｃ（抗ＦｉｍＢ血清応答）に示す。
【００８１】
加えて、図６に示されるように、実験１のように測定し、スコア化した場合、ＣｎａＡおよびＦｉｍＢを免疫化された両方の群は，アジュバントコントロール（３．７５）と比較して、有意に低い壊疽性腸炎スコア（それぞれ２および２．０６）を有し、壊疽性腸炎に対する少なくとも部分保護を与えられたこれらの抗原を指す。ＦｉｍＢ抗原に関して、重篤な疾患（壊疽性腸炎スコア＞２）をもつトリの数は、コントロールにおける９３．７％と比較して、３３．３％であった。図５Ａ−Ｃに示されるように、組み合わせたサブユニットによる免疫化は、すべての３つのサブユニットに対して強い血清応答を引き出すにもかかわらず、疾患の重症度を減少するように見えなかった（平均壊疽性腸炎スコア＝３．７）。
【００８２】
ウェルシュ菌株ＣＰ１線毛サブユニットヌル変異体によるニワトリのチャレンジ
免疫化されなかった実験２における１８羽のトリの３つの群に、２６および２７日目の１日２回、例２に記載のように調製されたＣＰ１、ＣＰ１ΔｆｉｍＡ、またはＣＰ１ΔｆｉｍＢによる送込みにより、チャレンジした。２９日目に、トリを安楽死させ、そして、壊疽性腸炎病変を、例３に記載のようにスコア化した。図７において表された結果から示されるように、ＣＰ１ΔｆｉｍＡまたはＣＰ１ΔｆｉｍＢ変異体株も、チャレンジされたトリの疾患を引き起こさず、機能的な線毛が、壊疽性腸炎の病因のために要求されるように見えることを示した。
【００８３】
例４：ウェルシュ菌線毛表面ポリペプチドのキャラクタリゼーション
ウェルシュ菌株ＣＰ１およびＣＰ１線毛サブユニット変異体：
表面ポリペプチドを、Chang, C., Huang, I.-H., Hendrickx, A.P.A., Ton-That, H. 2013. Visualization of Gram-positive Bacterial Pili, In: Delcour, H.A. (Ed.) Bacterial Cell Surfaces: Methods and Protocols. Humana Press, Totowa, NJ, 77-95の方法を使用して、ウェルシュ菌株ＣＰ１、および、例３に記載の線毛サブユニット変異体ＣＰ１ΔｃｎａＡ、ＣＰ１ΔｆｉｍＡ、およびＣＰ１ΔｆｉｍＢから抽出した。株を、３７℃で、嫌気的にＴＧＹ培地（３％のトリプトン、２％のグルコース、１％の酵母抽出物）中で終夜増殖させ、１０ｍｌのＴＧＹ培地へ１：１００で継代培養し、ＯＤ６００〜１に増殖させた。細胞を、６，０００×ｇで５分間ペレット化し、ＳＭＭ緩衝液、ｐＨ６．８（０．５Ｍのスクロース、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのマレアート）中で、一回洗浄した。細菌ペレットを、１ｍｌのＳＭＭ緩衝液に再懸濁し、ムラミダーゼ緩衝液（２ｍＭの酢酸、４８ｍＭの酢酸ナトリウム）中の５ｕ／μｌムタノリシン（Sigma）の６０μｌ、および０．１Ｍフェニルメチルスルホニルフッ化物（ＰＭＳＦ）（Sigma）の１０μｌをそれに加えた。一定の回転による３７℃での少なくとも４ｈの間のインキュベーションの後、プロトプラストを、２０，０００×ｇで５分間ペレット化し、そして、細胞壁タンパク質を含有する上清分画を取り除いた。タンパク質を、１ｍｌにつき８１μｌの１００％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）（Sigma）の添加、および４℃での終夜インキュベーションによって、沈殿させた。４℃で２０分間の２０，０００×ｇの遠心分離に続いて、タンパク質ペレットを、アセトンによって洗浄し、５０μｌの試料負荷緩衝液（６２．５ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、２％ＳＤＳ、２０％グリセロール、４％のβメルカプトエタノール、３Ｍ尿素、０．０１％ブロモフェノールブルー）中に、室温で少なくとも１５分間ゆっくり再懸濁した。
【００８４】
表面タンパク質抽出物（５μｌ）を、Ｎｏｖｅｘ（商標）ＮｕＰＡＧＥ（商標）３〜８％トリス−アセタートゲル（Fisher Scientific）上へ負荷し、１５０Ｖで１ｈの間、電気泳動にかけた。ゲルを、Ｂｉｏ−Ｓａｆｅ（商標）クーマシー染色（ＢｉｏＲａｄ）で染色するか、または、１×転送緩衝液（４８ｍＭトリス、３９ｍＭグリシン、２０％メタノール、０．１％ＳＤＳ）中で、３５０Ｖで１ｈの間、ポリビニレン二フッ化物（ＰＶＤＦ）膜上へ転送した。化学発光検出を、一次抗体としてニワトリ抗ＦｉｍＡ血清（１：２００）、およびヤギ抗ニワトリＩｇＹアルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）結合二次抗体（１：２，０００）を使用して、製造業者の説明書に従ってＷｅｓｔｅｒｎＢｒｅｅｚｅ（商標）化学発光キット（Life Technologies）によって遂行した。一次Ａｂとして使用した血清を、ＦｉｍＡを免疫化させ、その結果高い抗ＦｉｍＡ力価を呈した実験１（例３）からのニワトリのサクリファイスで、または例１に記載の組み換え線毛ポリペプチドに対してラビット中で上昇させたポリクローナル抗体で得た。結果を、図８Ａ〜Ｃに示す。
【００８５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離されたソルターゼ依存的線毛のウエスタンブロット分析が、種々のポリマー長さを反映し、該線毛が、細胞表面で組み立てられる機構を反映する高分子量（ＨＭＷ）はしご状パターンを生成することができることが、知られている。線毛サブユニットは、ハウスキーピングおよび線毛特異的なソルターゼ酵素によって共有結合され、それは、増殖するヘテロポリマーの構造に結びつき、最終的に、細胞壁ペプチドグリカンに共有結合される。組み立ての終結、および、よってポリマー長さは可変であり、これらの線毛がウエスタンブロッティングによって視覚化される場合に、特徴的な高分子量のはしご状のパターンが生じる。図８ＢおよびＣに示されるように、ニワトリ血清から得られた抗体によって視覚化しても、またはラビットにおいて上昇させても、突然変異株から抽出される表面ポリペプチドの対応するウエスタンブロットにおいてではなく、ウェルシュ菌株ＣＰ１から抽出される表面ポリペプチドのウエスタンブロットにおいて、線毛構造を表すはしご状のパターンを、観察した。
【００８６】
様々なウェルシュ菌株：
家禽（ＣＰ１、ＪＧＳ４１４１およびＪＧＳ４１２０）または、非家禽（株１３、ＡＴＣＣ１３１２４）を源とする、５つのウェルシュ菌単離物からの表面ポリペプチドの抽出を、上記のとおり遂行した。表面タンパク質抽出物（５μｌ）を、２つのＮｏｖｅｘ（商標）ＮｕＰＡＧＥ（商標）３〜８％トリス−アセタートゲル（Fisher Scientific）上へ負荷し、１５０Ｖで１ｈの間、電気泳動にかけた。１つのゲルを、Ｂｉｏ−Ｓａｆｅ（商標）クーマシー染色（BioRad）で染色するために使用し、そして、第２のゲルを、１×転送緩衝液（４８ｍＭトリス、３９ｍＭグリシン、２０％メタノール、０．１％ＳＤＳ）中で、３５０Ｖで１ｈの間、ポリビニレン二フッ化物（ＰＶＤＦ）膜上へ転送した。化学発光検出を、一次抗体としてニワトリ抗ＦｉｍＡ血清（１：２００）、およびヤギ抗ニワトリＩｇＹアルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）結合二次抗体（１：２，０００）を使用して、製造業者の説明書に従ってＷｅｓｔｅｒｎＢｒｅｅｚｅ（商標）化学発光キット（Life Technologies）によって遂行した。一次Ａｂとして使用した血清を、ＦｉｍＡを免疫化されその結果高い抗ＦｉｍＡ力価を提示したニワトリからのサクリファイスで得た。
【００８７】
結果を、図９Ａ〜Ｂに示す。それぞれのウェルシュ菌株における線毛サブユニット遺伝子ｃｎａＡ、ｆｉｍＡ、およびｆｉｍＢに関する遺伝子座（ＶＲ−１０Ｂ（Ｃａ）遺伝子座）の存在（＋）または不在（−）を、マイクロアレイ分析およびポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）方法論（Lepp D et al, Journal of Bacteriology (2013) 195: 1152-1166）によってあらかじめ決定しておいた。図９Ａ〜Ｂに示されるように、ウエスタンブロットを、ニワトリ抗ＦｉｍＡ抗体によって視覚化した場合、それらのゲノム（ＪＧＳ４１４１およびＣＰ１）中の線毛遺伝子座を運搬する株は、抽出された表面ポリペプチド（図９Ｂにおけるゲル画像の右側に垂直線によって示されている）における線毛構造の特徴的なはしご状のパターンを示し、一方で、それらのゲノム中の線毛遺伝子座を運搬しない他の株はこのパターンを示さない。抽出物中のより小さい分子量バンドの可視化は、粗ニワトリ血清に存在する無関係な抗体による可能性がある。抽出物のいずれも、ＦｉｍＡポリペプチド自体に対応するバンドを示さず、その予想された場所を、図９Ｂのゲル画像の右側の矢印で、示す。表面関連タンパク質が、ＦｉｍＡモノマー（それは細胞中で見いだされるのみである）を含むと予想されないので、これは驚くべきことではない。
【００８８】
ウェルシュ菌株ＣＰ１およびＣＰ１線毛サブユニット変異体の中で免疫金標識化：
ウェルシュ菌株ＣＰ１の、または、ＣＰ１ヌル変異体ＣＰ１ΔｆｉｍＡおよびＣＰ１ΔｆｉｍＢの細胞を、一次抗体としてのラビット抗ＦｉｍＡと二次抗体としての６ｎｍのＣｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｇｏｌｄ−ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ（商標）ヤギ抗ラビットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（min X Hu,Ms,Rat Sr Prot）（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）を含む免疫金技法を使用して、金粒子で標識化し、そして、基本的に以前記載のように（Chang, C., Huang, I.-H., Hendrickx, A.P.A., Ton-That, H. 2013. Visualization of Gram-positive Bacterial Pili, In: Delcour, H.A. (Ed.) Bacterial Cell Surfaces: Methods and Protocols. Humana Press, Totowa, NJ, 77-95）、透過型電子顕微鏡によって、調査した。図１０に示されるように、天然のＣＰ１株の細胞は、細胞表面上の線毛構造の存在を示し、一方で、ＣＰ１ΔｆｉｍＡおよびＣＰ１ΔｆｉｍＢ変異体の細胞は、このような構造が欠如している。
【００８９】
本明細書に記載の態様は、本発明の組成物および方法を図示することを意図され、本発明の範囲を制限することを意図されない。全体として、そして、当業者に容易に明白である記載と一致する様々な変更態様と改変が、含まれることが意図される。添付クレームは、例に規定された具体的な態様に限定されるべきでなく、全体としての記載と一致する最も広い解釈を与えられるべきである。
【図１】
2020527051.tif 000009
【図２Ａ】
2020527051.tif 000010
【図２Ｂ】
2020527051.tif 000011
【図２Ｃ】
2020527051.tif 000012
【図２Ｄ】
2020527051.tif 000013
【図３Ａ】
2020527051.tif 000014
【図３Ｂ】
2020527051.tif 000015
【図４】
2020527051.tif 000016
【図５Ａ】
2020527051.tif 000017
【図５Ｂ】
2020527051.tif 000018
【図５Ｃ】
2020527051.tif 000019
【図６】
2020527051.tif 000020
【図７】
2020527051.tif 000021
【図８Ａ−Ｃ】
2020527051.tif 000022
【図９Ａ−Ｂ】
2020527051.tif 000023
【図１０】
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【配列表】
2020527051000001.app
【国際調査報告】
2020527051.tif 000025
2020527051.tif 000026
2020527051.tif 000027
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