(57)【要約】本発明は、ＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１Ｒの調節制御およびＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１Ｒの関連疾患の治療におけるプラスミノーゲンの使用を開示している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、ＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１Ｒを調節制御することによって疾患を治療する方法。
【請求項２】
前記疾患は、糖質代謝障害に関連する疾患、脂肪代謝障害に関連する疾患、またはＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１Ｒに関連する神経系疾患である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記疾患は、糖尿病、糖尿病性腎症、糖尿病性神経痛、糖尿病性網膜症、高脂血症、アテローム性動脈硬化症、高血圧、冠状動脈性心臓病、心筋梗塞、脳血栓症、脳出血、脳塞栓症、肥満、脂肪肝、肝硬変、骨粗鬆症、認知障害、パーキンソン症候群、脊髄側柱硬化症、アルツハイマー病、炎症性腸疾患、消化不良、および胃腸潰瘍からなる群より選ばれる一つ以上の疾患である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、ＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１Ｒの機能を調節制御する方法。
【請求項５】
前記プラスミノーゲンはＧＬＰ−１および／またはＧＬＰ−１Ｒの発現を促進する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、ＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１Ｒの関連疾患を治療する方法。
【請求項７】
前記ＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１Ｒの関連疾患は、血糖値の上昇、耐糖能異常、血中脂質上昇、肥満、脂肪肝、および認知障害からなる群より選ばれる一つ以上を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１Ｒの関連疾患は、糖尿病、糖尿病合併症、高脂血症、アテローム性動脈硬化症、高血圧、冠状動脈性心臓病、心筋梗塞、脳血栓症、脳出血、脳塞栓症、肥満、脂肪肝、肝硬変、骨粗鬆症、認知障害、パーキンソン症候群、側柱硬化症、アルツハイマー病、炎症性腸疾患、消化不良、および胃腸潰瘍からなる群より選ばれる一つ以上を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記プラスミノーゲンは配列２、６、８、１０または１２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するタンパク質である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記プラスミノーゲンは、プラスミノーゲン活性フラグメントを含み、且つ依然としてプラスミノーゲン活性を有するタンパク質である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記プラスミノーゲンは、Ｇｌｕ−プラスミノーゲン、Ｌｙｓ−プラスミノーゲン、ミニプラスミノーゲン、マイクロプラスミノーゲン、δ−プラスミノーゲンまたはそれらのプラスミノーゲン活性を保持した変異体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記プラスミノーゲンは一種以上のその他の薬剤または治療方法と併用することができる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記プラスミノーゲンは、糖尿病を治療するための薬剤または治療方法、アテローム性動脈硬化症を治療するための薬剤または治療方法、心脳血管疾患を治療するための薬剤または治療方法、血栓を治療するための薬剤または治療方法、高血圧を治療するための薬剤または治療方法、血脂を低下させるための薬剤または治療方法、脂肪肝を治療するための薬剤または治療方法、パーキンソン病を治療するための薬剤または治療方法、アルツハイマー病を治療するための薬剤または治療方法、および抗感染薬または治療方法からなる群より選ばれる一つ以上の薬剤または治療方法と併用することができる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
有効量のプラスミノーゲンを含む、ＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１Ｒの関連疾患を治療するための薬剤。
【請求項１５】
有効量のプラスミノーゲンを収容する容器と、ＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１Ｒの関連疾患を治療するためにプラスミノーゲンを使用することを説明するプロトコルとを含む、ＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１Ｒの関連疾患を治療するための製品またはキット。
【請求項１６】
前記ＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１Ｒの関連疾患は、血糖値の上昇、耐糖能異常、血中脂質上昇、肥満、脂肪肝、および認知障害からなる群より選ばれる一つ以上を含む、請求項１４または１５に記載の薬剤、製品またはキット。
【請求項１７】
前記ＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１Ｒの関連疾患は、糖尿病、糖尿病合併症、高脂血症、アテローム性動脈硬化症、高血圧、冠状動脈性心臓病、心筋梗塞、脳血栓症、脳出血、脳塞栓症、肥満、脂肪肝、肝硬変、骨粗鬆症、認知障害、パーキンソン症候群、側柱硬化症、アルツハイマー病、炎症性腸疾患、消化不良、および胃腸潰瘍からなる群より選ばれる一つ以上を含む、請求項１４または１５に記載の薬剤、製品またはキット。
【請求項１８】
ＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１Ｒを調節制御することによって疾患を治療するための薬剤の製造におけるプラスミノーゲンの使用。
【請求項１９】
前記疾患は、糖質代謝障害に関連する疾患、脂肪代謝障害に関連する疾患、またはＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１Ｒに関連する神経系疾患である、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
前記疾患は、糖尿病、糖尿病性腎症、糖尿病性神経痛、糖尿病性網膜症、高脂血症、アテローム性動脈硬化症、高血圧、冠状動脈性心臓病、心筋梗塞、脳血栓症、脳出血、脳塞栓症、肥満、脂肪肝、肝硬変、骨粗鬆症、認知障害、パーキンソン症候群、側柱硬化症、アルツハイマー病、炎症性腸疾患、消化不良、および胃腸潰瘍からなる群より選ばれる一つ以上の疾患である、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
ＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１Ｒの機能を調節制御するための薬剤の製造におけるプラスミノーゲンの使用。
【請求項２２】
前記プラスミノーゲンはＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１Ｒの発現を促進する、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
ＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１Ｒの関連疾患を治療するための薬剤の製造におけるプラスミノーゲンの使用。
【請求項２４】
前記ＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１Ｒの関連疾患は、血糖値の上昇、耐糖能異常、血中脂質上昇、肥満、脂肪肝、および認知障害からなる群より選ばれる一つ以上を含む、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
前記ＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１Ｒの関連疾患は、糖尿病、糖尿病合併症、高脂血症、アテローム性動脈硬化症、高血圧、冠状動脈性心臓病、心筋梗塞、脳血栓症、脳出血、脳塞栓症、肥満、脂肪肝、肝硬変、骨粗鬆症、認知障害、パーキンソン症候群、側柱硬化症、アルツハイマー病、炎症性腸疾患、消化不良、および胃腸潰瘍からなる群より選ばれる一つ以上を含む、請求項２３に記載の使用。
【請求項２６】
前記プラスミノーゲンは配列２、６、８、１０または１２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するタンパク質である、請求項１８〜２５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２７】
前記プラスミノーゲンは、プラスミノーゲン活性フラグメントを含み、且つ依然としてプラスミノーゲン活性を有するタンパク質である、請求項１８〜２６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２８】
前記プラスミノーゲンは、Ｇｌｕ−プラスミノーゲン、Ｌｙｓ−プラスミノーゲン、ミニプラスミノーゲン、マイクロプラスミノーゲン、δ−プラスミノーゲンまたはそれらのプラスミノーゲン活性を保持した変異体である、請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
前記プラスミノーゲンは一種以上のその他の薬剤または治療方法と併用することができる、請求項１８〜２８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３０】
前記プラスミノーゲンは、糖尿病を治療するための薬剤または治療方法、アテローム性動脈硬化症を治療するための薬剤または治療方法、心脳血管疾患を治療するための薬剤または治療方法、血栓を治療するための薬剤または治療方法、高血圧を治療するための薬剤または治療方法、血脂を低下させるための薬剤または治療方法、脂肪肝を治療するための薬剤または治療方法、パーキンソン病を治療するための薬剤または治療方法、アルツハイマー病を治療するための薬剤または治療方法、および抗感染薬または治療方法からなる群より選ばれる一つ以上の薬剤または治療方法と併用することができる、請求項２９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１Ｒを調節制御することによってＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１Ｒに関連する疾患の治療におけるプラスミノーゲンの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＧＬＰ−１は、インスリン分泌を促進する内因性ホルモンであり、主に腸内のＬ−細胞から分泌される。小腸Ｌ細胞のプログルカゴン遺伝子の発現は、プログルカゴン（ｐｒｏｇｌｕｃａｇｏｎ，ＰＧ）を生成し、プロホルモンコンバーターゼ１／３（ｐｒｏｈｏｒｍｏｎｅｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ，ＰＣ１／３）で処理した後、ＧＬＰ−１ペプチド前駆体を放出する。エンドペプチダーゼは、ＧＬＰ−１（１−３７）が二つのペプチドフラグメントに分解することを触媒し、ＧＬＰ−１（７−３７）はアミダーゼで処理されてからＧＬＰ−１（７−３６）アミドを形成する。α細胞内のグルカゴン遺伝子の発現はＰＧを生成することもできるが、α細胞におけるプロホルモンコンバーターゼ２（ＰＣ２）は、ＰＧをグルカゴンに優先的に転化するため、α細胞は正常な状況下でＧＬＰ−１を合成することができない。但し、ストレスまたは病理生理学的条件下（例えば、２型糖尿病）で、α細胞はＧＬＰ−１を適応的に生成することができる。
【０００３】
ＧＬＰ−１は、低血糖を起こさずに膵島β細胞のインスリン分泌と血糖の正常化を促進し、α細胞によるグルカゴンの生成を抑制し、胃内容排出を遅らせ、食欲を抑え、体重を減らし、β細胞の増殖を促進し、アポトーシスを抑制することができ、膵島細胞の機能の調節において重要な役割を果たしている［１］。
【０００４】
糖尿病は肥満と並行して発症する傾向があり、患者の体重を２型糖尿病の治療ガイドラインに含むことも臨床的に認められている。糖尿病の進行中にＧＬＰ−１とインスリンの分泌の間に負のフィードバック調節があり、２型糖尿病の患者には腸−膵島軸（ｅｎｔｅｒｏｉｎｓｕｌａｒ  ａｘｉｓ）の損傷があり、しかも食後の循環血中の脂質の上昇が伴われることは、研究によって発見された［２］。実験性糖尿病マウスモデルでは、β細胞の脂肪毒性損傷によりＧＬＰ−１の機能が影響され、高脂血症の治療が、ＧＬＰ−１によるインスリンの分泌の誘導を促進することができることは発見された［３］。現在、実証済みの治療スキームの中で、グルカゴン様ペプチド‐１受容体作動剤（ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｇｏｎｉｓｔｓ，ＧＬＰ−１  ＲＡｓ）しか、患者の体重と血糖値の同時調節制御を実現することができない。ＧＬＰ−１は、ＧＬＰ−１受容体作動剤についての研究の基礎として、血糖依存的にインスリン分泌を促進する役割を果たし、食欲を抑え、胃内容排出を遅らせることで体重を減らす役割を果たすことができる［４］。
【０００５】
ＧＬＰ−１は、末梢の血糖値を低下させて膵島細胞を保護し、症状を改善するだけではなく、中枢神経系において神経伝達物質として、細胞増殖、神経新生および細胞アポトーシスに対して栄養的役割を果たす。ＧＬＰ−１Ｒは、げっ歯類動物およびヒトの脳に広く分布しており［５］、視床、小脳、脳幹、脳弓、視床下部後域、外側横隔核、尾状核被殻、海馬、および大脳皮質にいずれも発現している。ＧＬＰ−１は、血液脳関門を介して対応する脳領域でその受容体に結合して役割を果たすことができる。ＧＬＰ−１は、神経細胞の複数の生理学的プロセスを調節することができ、例えば、細胞の生存とニューロンの軸索の成長を調節し、インビトロで培養した神経細胞の興奮性、酸化的損傷および死亡に抵抗し、ニューロンβ前駆体タンパク質（βＡＰＰ）を低下させ、内因性Ａβレベルを低下させ、複数のアポトーシス刺激に抵抗し、インビトロでの培養神経細胞の分化を誘導するニューロンの機能を保護することができる［６］。Ａβ毒性損傷に関する動物実験研究から、Ａβが重度の長期増強（ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｐｏｔｅｎｔｉｏｎ，ＬＴＰ）阻害を誘発する可能性があり、この損傷はＧＬＰ−１の類似体によって逆転でき［７］、げっ歯類動物の脳室にＡβを注射した後、Ｍｏｒｒｉｓ水迷路を介して評価すると、空間学習能力と記憶能力が不十分であることが示されるが、ＧＬＰ−１類似体で処理すると、空間学習能力と記憶能力での動物のパフォーマンスを改善することができることは発見された［８］。また、ＧＬＰ−１およびその類似体が、記憶と、脳内シナプス可塑性を改善することができると科学者は発見した［９］。
【０００６】
ＧＬＰ−１受容体の機能の調節は非常に複雑であり、様々な内因性および外因性のポリペプチドと相互作用し、複数の下流シグナル経路のカスケード活性化を起こす。ＧＬＰ−１受容体遺伝子多型はずっと前から発見されており、肥満および糖尿病の発生に関連している可能性がある［１０］。
【０００７】
本発明は、ＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１受容体経路の調節制御、およびＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１受容体経路に関連する疾患の治療におけるプラスミノーゲンの使用を見出した。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は下記項に係る。
【０００９】
１．被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、ＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１Ｒを調節制御することによって疾患を治療する方法。
【００１０】
２．前記疾患は、糖質代謝障害に関連する疾患、脂肪代謝障害に関連する疾患、またはＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１Ｒに関連する神経系疾患である、項１に記載の方法。
【００１１】
３．前記疾患は、糖尿病、糖尿病性腎症、糖尿病性神経痛、糖尿病性網膜症、高脂血症、アテローム性動脈硬化症、高血圧、冠状動脈性心臓病、心筋梗塞、脳血栓症、脳出血、脳塞栓症、肥満、脂肪肝、肝硬変、骨粗鬆症、認知障害、パーキンソン症候群、脊髄側柱硬化症、アルツハイマー病、炎症性腸疾患、消化不良、および胃腸潰瘍からなる群より選ばれる一つ以上の疾患である、項２に記載の方法。
【００１２】
４．被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、ＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１Ｒの機能を調節制御する方法。
【００１３】
５．前記プラスミノーゲンはＧＬＰ−１および／またはＧＬＰ−１Ｒの発現を促進する、項４に記載の方法。
【００１４】
６．被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、ＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１Ｒの関連疾患を治療する方法。
【００１５】
７．前記ＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１Ｒの関連疾患は、血糖値の上昇、耐糖能異常、血中脂質上昇、肥満、脂肪肝、および認知障害からなる群より選ばれる一つ以上を含む、項６に記載の方法。
【００１６】
８．前記ＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１Ｒの関連疾患は、糖尿病、糖尿病合併症、高脂血症、アテローム性動脈硬化症、高血圧、冠状動脈性心臓病、心筋梗塞、脳血栓症、脳出血、脳塞栓症、肥満、脂肪肝、肝硬変、骨粗鬆症、認知障害、パーキンソン症候群、側柱硬化症、アルツハイマー病、炎症性腸疾患、消化不良、および胃腸潰瘍からなる群より選ばれる一つ以上を含む、項６に記載の方法。
【００１７】
９．前記プラスミノーゲンは配列２、６、８、１０または１２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するタンパク質である、項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【００１８】
１０．前記プラスミノーゲンは、プラスミノーゲン活性フラグメントを含み、且つ依然としてプラスミノーゲン活性を有するタンパク質である、項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【００１９】
１１．前記プラスミノーゲンは、Ｇｌｕ−プラスミノーゲン、Ｌｙｓ−プラスミノーゲン、ミニプラスミノーゲン、マイクロプラスミノーゲン、艨|プラスミノーゲンまたはそれらのプラスミノーゲン活性を保持した変異体である、項１０に記載の方法。
【００２０】
１２．前記プラスミノーゲンは一種以上のその他の薬剤または治療方法と併用することができる、項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【００２１】
１３．前記プラスミノーゲンは、糖尿病を治療するための薬剤または治療方法、アテローム性動脈硬化症を治療するための薬剤または治療方法、心脳血管疾患を治療するための薬剤または治療方法、血栓を治療するための薬剤または治療方法、高血圧を治療するための薬剤または治療方法、血脂を低下させるための薬剤または治療方法、脂肪肝を治療するための薬剤または治療方法、パーキンソン病を治療するための薬剤または治療方法、アルツハイマー病を治療するための薬剤または治療方法、および抗感染薬または治療方法からなる群より選ばれる一つ以上の薬剤または治療方法と併用することができる、項１２に記載の方法。
【００２２】
１４．有効量のプラスミノーゲンを含む、ＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１Ｒの関連疾患を治療するための薬剤。
【００２３】
１５．有効量のプラスミノーゲンを収容する容器と、ＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１Ｒの関連疾患を治療するためにプラスミノーゲンを使用することを説明するプロトコルとを含む、ＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１Ｒの関連疾患を治療するための製品またはキット。
【００２４】
１６．前記ＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１Ｒの関連疾患は、血糖値の上昇、耐糖能異常、血中脂質上昇、肥満、脂肪肝、および認知障害からなる群より選ばれる一つ以上を含む、項１４または１５に記載の薬剤、製品またはキット。
【００２５】
１７．前記ＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１Ｒの関連疾患は、糖尿病、糖尿病合併症、高脂血症、アテローム性動脈硬化症、高血圧、冠状動脈性心臓病、心筋梗塞、脳血栓症、脳出血、脳塞栓症、肥満、脂肪肝、肝硬変、骨粗鬆症、認知障害、パーキンソン症候群、側柱硬化症、アルツハイマー病、炎症性腸疾患、消化不良、および胃腸潰瘍からなる群より選ばれる一つ以上を含む、項１４または１５に記載の薬剤、製品またはキット。
【００２６】
１８．ＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１Ｒを調節制御することによって疾患を治療するための薬剤の製造におけるプラスミノーゲンの使用。
【００２７】
１９．前記疾患は、糖質代謝障害に関連する疾患、脂肪代謝障害に関連する疾患、またはＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１Ｒに関連する神経系疾患である、項１８に記載の使用。
【００２８】
２０．前記疾患は、糖尿病、糖尿病性腎症、糖尿病性神経痛、糖尿病性網膜症、高脂血症、アテローム性動脈硬化症、高血圧、冠状動脈性心臓病、心筋梗塞、脳血栓症、脳出血、脳塞栓症、肥満、脂肪肝、肝硬変、骨粗鬆症、認知障害、パーキンソン症候群、側柱硬化症、アルツハイマー病、炎症性腸疾患、消化不良、および胃腸潰瘍からなる群より選ばれる一つ以上の疾患である、項１９に記載の使用。
【００２９】
２１．ＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１Ｒの機能を調節制御するための薬剤の製造におけるプラスミノーゲンの使用。
【００３０】
２２．前記プラスミノーゲンはＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１Ｒの発現を促進する、項２１に記載の使用。
【００３１】
２３．ＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１Ｒの関連疾患を治療するための薬剤の製造におけるプラスミノーゲンの使用。
【００３２】
２４．前記ＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１Ｒの関連疾患は、血糖値の上昇、耐糖能異常、血中脂質上昇、肥満、脂肪肝、および認知障害からなる群より選ばれる一つ以上を含む、項２３に記載の使用。
【００３３】
２５．前記ＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１Ｒの関連疾患は、糖尿病、糖尿病合併症、高脂血症、アテローム性動脈硬化症、高血圧、冠状動脈性心臓病、心筋梗塞、脳血栓症、脳出血、脳塞栓症、肥満、脂肪肝、肝硬変、骨粗鬆症、認知障害、パーキンソン症候群、側柱硬化症、アルツハイマー病、炎症性腸疾患、消化不良、および胃腸潰瘍からなる群より選ばれる一つ以上を含む、項２３に記載の使用。
【００３４】
２６．前記プラスミノーゲンは配列２、６、８、１０または１２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するタンパク質である、項１８〜２５のいずれか１項に記載の使用。
【００３５】
２７．前記プラスミノーゲンは、プラスミノーゲン活性フラグメントを含み、且つ依然としてプラスミノーゲン活性を有するタンパク質である、項１８〜２６のいずれか１項に記載の使用。
【００３６】
２８．前記プラスミノーゲンは、Ｇｌｕ−プラスミノーゲン、Ｌｙｓ−プラスミノーゲン、ミニプラスミノーゲン、マイクロプラスミノーゲン、艨|プラスミノーゲンまたはそれらのプラスミノーゲン活性を保持した変異体である、項２７に記載の使用。
【００３７】
２９．前記プラスミノーゲンは一種以上のその他の薬剤または治療方法と併用することができる、項１８〜２８のいずれか１項に記載の使用。
【００３８】
３０．前記プラスミノーゲンは、糖尿病を治療するための薬剤または治療方法、アテローム性動脈硬化症を治療するための薬剤または治療方法、心脳血管疾患を治療するための薬剤または治療方法、血栓を治療するための薬剤または治療方法、高血圧を治療するための薬剤または治療方法、血脂を低下させるための薬剤または治療方法、脂肪肝を治療するための薬剤または治療方法、パーキンソン病を治療するための薬剤または治療方法、アルツハイマー病を治療するための薬剤または治療方法、および抗感染薬または治療方法からなる群より選ばれる一つ以上の薬剤または治療方法と併用することができる、項２９に記載の使用。
【００３９】
定義：
「糖尿病」は遺伝的要素、免疫機能の乱れ、微生物感染及びその毒素、フリーラジカル毒素、精神要因などの各種病気誘発因子が生体に作用することによる、インスリン減退、インスリン抵抗などによって引き起こされる糖、タンパク質、脂肪、水及び電解質等の一連の代謝に乱れが生じる症候群であり、臨床的には高血糖を主な特徴とする。
【００４０】
「糖尿病合併症」は糖尿病プロセスにおける血糖の制御不良によって引き起こされる身体のその他の臓器または組織のダメージまたは機能障害であり、肝臓、腎臓、心臓、網膜、神経系のダメージまたは機能障害等を含む。世界保健機関（ＷＨＯ）の統計によれば、糖尿病合併症は１００種類以上あり、現在における合併症が最も多い疾患である。
【００４１】
「プラスミン」は血液中に存在する非常に重要な酵素であり、フィブリン多量体を分解することができる。
【００４２】
「プラスミノーゲン（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ，ｐｌｇ）」はプラスミンの酵素前駆体の形であり、ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔ中の配列に基づいて、シグナルペプチドの天然ヒト由来プラスミノーゲンのアミノ酸配列（配列４）として計算によれば８１０個のアミノ酸からなり、分子量は約９０ｋＤであり、主に肝臓において合成され且つ血液中で循環できる糖タンパク質であり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列３に示される通りである。フルサイズのＰＬＧ（プラスミノーゲン）は七つのドメインを含む：Ｃ末端に位置するセリンプロテアーゼドメイン、Ｎ末端に位置するＰａｎ  Ａｐｐｌｅ（ＰＡｐ）ドメイン及び５つのＫｒｉｎｇｌｅドメイン（Ｋｒｉｎｇｌｅ１−５）を含む。ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔ中の配列を参照すれば、そのシグナルペプチドは残基Ｍｅｔ１−Ｇｌｙ１９を含み、Ｐａｐは残基Ｇｌｕ２０−Ｖａｌ９８を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ１は残基Ｃｙｓ１０３−Ｃｙｓ１８１を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ２は残基Ｇｌｕ１８４−Ｃｙｓ２６２を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ３は残基Ｃｙｓ２７５−Ｃｙｓ３５２を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ４は残基Ｃｙｓ３７７−Ｃｙｓ４５４を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ５は残基Ｃｙｓ４８１−Ｃｙｓ５６０を含む。ＮＣＢＩデータによれば、セリンプロテアーゼドメインは残基Ｖａｌ５８１−Ａｒｇ８０４を含む。
【００４３】
Ｇｌｕ−プラスミノーゲンは天然のフルサイズのプラスミノーゲンであり、７９１個のアミノ酸からなる（１９個のアミノ酸からなるシグナルペプチドを含まない）。該配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列１に示される通りであり、そのアミノ酸配列は配列２に示される通りである。体内において、さらにＧｌｕ−プラスミノーゲンの第７６−７７位のアミノ酸の位置で加水分解することにより形成されたＬｙｓ−プラスミノーゲンが存在し、例えば配列６に示されるものであり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列５が示す通りである。δ−プラスミノーゲン（δ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）はフルサイズのプラスミノーゲンにＫｒｉｎｇｌｅ２−Ｋｒｉｎｇｌｅ５構造が欠損したフラグメントであり、Ｋｒｉｎｇｌｅ１及びセリンプロテアーゼドメインしか含有せず［１１、１２］、δ−プラスミノーゲンのアミノ酸配列（配列８）を報告している文献があり［１２］、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は例えば配列７である。ミニプラスミノーゲン（Ｍｉｎｉ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）はＫｒｉｎｇｌｅ５及びセリンプロテアーゼドメインからなり、残基Ｖａｌ４４３−Ａｓｎ７９１（シグナルペプチドＧｌｕ−プラスミノーゲン配列を含まないＧｌｕ残基を開始アミノ酸とする）について文献が報告しており［１３］、そのアミノ酸配列は配列１０に示される通りであり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列９が示す通りである。しかしマイクロプラスミノーゲン（Ｍｉｃｒｏ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）はセリンプロテアーゼドメインのみ含有し、そのアミノ酸配列は残基Ａｌａ５４３−Ａｓｎ７９１（シグナルペプチドを含まないＧｌｕ−プラスミノーゲン配列のＧｌｕ残基は開始アミノ酸である）と文献が報告し［１４］、特許文献ＣＮ１０２１５４２５３Ａはその配列が残基Ｌｙｓ５３１−Ａｓｎ７９１を含むと開示し（シグナルペプチドを含まないＧｌｕ−プラスミノーゲン配列のＧｌｕ残基を開始アミノ酸とする）、本特許の配列は特許文献ＣＮ１０２１５４２５３Ａを参照でき、そのアミノ酸配列は配列１２に示される通りであり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列１１に示される通りである。
【００４４】
本発明の「プラスミン」と「フィブリンプラスミン」、「繊維タンパクプラスミン」は互いに置き換えて使用でき、その意味は同じである。「プラスミノーゲン」と「フィブリンプラスミノーゲン」、「繊維タンパクプラスミノーゲン」は互いに置き換えて使用でき、その意味は同じである。
【００４５】
当業者は以下のように理解できる。本発明のプラスミノーゲンのすべての技術構成はプラスミンに適用でき、そのため、本発明に記載の技術構成はプラスミノーゲン及びプラスミンをカバーするものである。
【００４６】
循環プロセスにおいて、プラスミノーゲンは閉鎖した非活性コンフォメーションであるが、血栓または細胞表面に結合した際、プラスミノーゲン活性化剤（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ，ＰＡ）の介在下において、開放性のコンフォメーションを有する活性プラスミンとなる。活性を有するプラスミンはさらにフィブリン凝塊をフィブリン分解生成物及びＤ−二量体に加水分解させ、これにより血栓を溶解させる。そのうちプラスミノーゲンのＰＡｐドメインはプラスミノーゲンを非活性閉鎖コンフォメーションにする重要なエピトープであり、しかしＫＲドメインは受容体及び基質上のリジン残基と結合できるものである。プラスミノーゲン活性化剤としての酵素は、既に複数種類知られ、組織プラスミノーゲン活性化剤（ｔＰＡ）、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化剤（ｕＰＡ）、カリクレイン及び凝結因子ＸＩＩ（ハーゲマン因子）などを含む。
【００４７】
「プラスミノーゲン活性フラグメント」とはプラスミノーゲンタンパク質において、基質中のターゲット配列と結合してタンパク質加水分解機能を発揮できる活性フラグメントである。本発明のプラスミノーゲンに係る技術構成が、プラスミノーゲン活性フラグメントでプラスミノーゲンの代替とする技術構成を含む。本発明に記載のプラスミノーゲン活性フラグメントはプラスミノーゲンのセリンプロテアーゼドメインを含むタンパク質であり、好ましくは、本発明に記載のプラスミノーゲン活性フラグメントは配列１４、配列１４と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性のアミノ酸配列を含有するタンパク質を含むものである。そのため、本発明に記載のプラスミノーゲンは該プラスミノーゲン活性フラグメントを含み、且つ依然として該プラスミノーゲン活性を有するタンパク質を含む。
【００４８】
現在、血液中のフィブリンプラスミノーゲン及びその活性測定方法は以下を含む：組織フィブリンプラスミノーゲン活性化剤の活性に対する測定（ｔ−ＰＡＡ）、血漿組織フィブリンプラスミノーゲン活性化剤抗原に対する測定（ｔ−ＰＡＡｇ）、血漿組織プラスミノーゲン活性に対する測定（ｐｌｇＡ）、血漿組織プラスミノーゲン抗原に対する測定（ｐｌｇＡｇ）、血漿組織フィブリンプラスミノーゲン活性化剤の阻害物活性に対する測定、血漿組織フィブリンプラスミノーゲン活性化剤の阻害物抗原に対する測定、血漿フィブリンプラスミン−抗プラスミン複合物に対する測定（ＰＡＰ）。最もよく見られる測定方法は発色基質法である：測定対象（被験者）の血漿中にストレプトキナーゼ（ＳＫ）と発色基質を添加し、測定対象の血漿中のＰＬＧはＳＫの作用下においてプラスミンとなり、後者は発色基質に作用し、それから分光光度計で測定し、吸光度の増加はフィブリンプラスミノーゲンの活性と正比例の関係となる。この他にも免疫化学法、ゲル電気泳動法、免疫比濁法、放射免疫拡散法などを用いて血液中のフィブリンプラスミノーゲン活性に対して測定を行うことができる。
【００４９】
「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とは異なる種どうしのホモログであり、タンパク質の相同物もＤＮＡの相同物も含む。それは具体的に異なる種どうしの同じ祖先の遺伝子から進化して得られるタンパク質または遺伝子を言う。本発明のプラスミノーゲンはヒト天然プラスミノーゲンを含み、さらには異なる種に由来する、プラスミノーゲン活性を有するプラスミノーゲンオルソログを含む。
【００５０】
「保存的置換バリアント」とはそのうちの一つの指定されたアミノ酸残基が改変されたがタンパク質または酵素の全体のコンフォメーション及び機能を変えないものであり、これはペアレントタンパク質中のアミノ酸配列中のアミノ酸を類似の特性（例えば酸性、塩基性、疎水性など）のアミノ酸で置換するものを含むがこれらに限られない。類似の性質を有するアミノ酸は知られている通りである。例えば、アルギニン、ヒスチジン及びリジンは親水性の塩基性アミノ酸であり且つ互いに置き換えることができる。同じように、イソロイシンは疎水アミノ酸であり、ロイシン、メチオニンまたはバリンによって置換されることができる。そのため、機能の類似する二つのタンパク質またはアミノ酸配列の類似性は異なる可能性もある。例えば、ＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づいて７０％〜９９％の類似性（同一性）を有する。「保存的置換バリアント」はさらにＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡアルゴリズムに基づいて６０％以上のアミノ酸同一性を有するポリペプチドまたは酵素を含み、７５％以上に達すればさらによく、最も好ましくは８５％以上に達し、さらには９０％以上に達するのが最も好ましく、さらに天然またはペアレントタンパク質または酵素と比較して同じまたは基本的に類似する性質または機能を有する。
【００５１】
「分離された」プラスミノーゲンとは天然環境から分離及び／または回収されたプラスミノーゲンタンパク質である。いくつかの実施形態において、前記プラスミノーゲンは（１）９０％を超える、９５％を超える、または９８％を超える純度（重量で計算した場合）になるまで精製し、例えばＬｏｗｒｙ法によって決まるもので、例えば９９％（重量で計算した場合）を超えるまで精製する、（２）少なくともスピニングカップ配列分析装置によりＮ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５個の残基が得られる程度になる精製する、または（３）同質性になるまで精製する。該同質性はクマシーブリリアントブルーまたは銀染色により還元性または非還元性条件下のドデシル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミノゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって決まるものである。分離されたプラスミノーゲンはバイオエンジニアリング技術により組み換え細胞から製造することができ、さらに少なくとも一つの精製ステップで分離されたプラスミノーゲンを含む。
【００５２】
用語の「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は本明細書において互いに置き換えて使用でき、いかなる長さのアミノ酸の重合体を指し、遺伝的にコードされた及び非遺伝的にコードされたアミノ酸、化学的または生化学的に修飾されまたは派生したアミノ酸、及び修飾されたペプチド主鎖を有するポリペプチドを含む。該用語は融合タンパク質を含み、異種性アミノ酸配列を有する融合タンパク質を含むがこれに限られず、異種性と同種性由来のリーダー配列（Ｎ端メチオニン残基を有するか有しない）を含む融合物；等々である。
【００５３】
参照ペプチド配列の「アミノ酸配列同一性パーセンテージ（％）」の定義は、必要に応じてギャップを導入することで最大のパーセンテージ配列の同一性を実現した後、如何なる保存的な置換も配列同一性の一部として見なさない場合、候補配列中における参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同じアミノ酸残基のパーセンテージである。パーセンテージのアミノ酸配列の同一性を測定することを目的とした比較は本分野の技術範囲における複数種類の手段によって実現でき、例えば公衆が入手できるコンピュータソフトウエア、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアによって実現できる。当業者は配列をアライメントするための適切なパラメータを決めることができ、該パラメータが比較対象の配列のフルサイズに対して最大比較の要求を実現するための如何なるアルゴリズムも含む。しかし、本発明の目的のために、アミノ酸配列の同一性パーセンテージは配列比較コンピュータソフトウエアＡＬＩＧＮ−２により得られるものである。
【００５４】
ＡＬＩＧＮ−２を用いることによりアミノ酸配列を比較する場合、所定のアミノ酸配列Ａの所定のアミノ酸配列Ｂに対するアミノ酸配列同一性％（または所定のアミノ酸配列Ｂに対して、と、またはについてのあるアミノ酸配列と同一性を有するまたは含む所定のアミノ酸配列Ａともいう）は以下のように計算される：
分数Ｘ／Ｙ×１００
【００５５】
そのうちＸは配列アライメントプログラムＡＬＩＧＮ−２において該プログラムのＡ及びＢのアライメントにおいて同一でマッチングすると評価したアミノ酸残基の数であり、且つそのうちＹはＢにおけるアミノ酸残基の総数である。以下のように理解するべきである：アミノ酸配列Ａの長さとアミノ酸配列Ｂの長さが等しくない場合、ＡのＢに対するアミノ酸配列の同一性％は、ＢのＡに対するアミノ酸配列同一性％とは異なる。特に断りのない限り、本文中において使用するすべてのアミノ酸配列同一性値％は前記の段落に記載の通りであり、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムによって得られるものである。
【００５６】
本文において使用されているように、用語の「治療」及び「予防」は期待される薬理及び／または生理的効果が得られることを言う。前記効果は疾患またはその症状を完全または一部予防すること、及び／または疾患及び／またはその症状を一部または完全に治癒するものとすることができる。さらに以下を含む：（ａ）疾患が被験者の体内で発生することを予防し、前記被験者は疾患の要因を持っているが、該疾患を有すると診断されていない状況であること；（ｂ）疾患を抑制し、その形成を阻害すること；及び（ｃ）疾患及び／またはその症状を減軽し、即ち疾患及び／またはその症状を減退させること。
【００５７】
用語の「個体」、「被験者」及び「患者」は本明細書中において互いに置き換えて使用でき、哺乳動物を指し、ネズミ（ラット、マウス）、ヒト以外の霊長類、ヒト、イヌ、ネコ、有蹄動物（例えばウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ）などを含むがこれらに限られない。
【００５８】
「治療上有効量」または「有効量」とは、哺乳動物またはその他の被験者に投与して疾患の治療に用いられる際に疾患の前記予防及び／または治療を実現できるプラスミノーゲンの量である。「治療上有効量」は使用するプラスミノーゲン、治療しようとする被験者の疾患及び／または症状の重症度及び年齢、体重などに従って変化するものである。
【００５９】
２．本発明のプラスミノーゲンの調製
プラスミノーゲンは治療の使用に用いられるために、自然界から分離及び精製されるものでもよく、標準的な化学ペプチド合成技術によって合成するものでもよい。化学的手法によりポリペプチドを合成する際、液相または固相で合成を行うことができる。固相ポリペプチド合成（ＳＰＰＳ）（配列のＣ末端アミノ酸を不溶性支持体に附着させ、順番に配列中の残りのアミノ酸を添加する）はプラスミノーゲンの化学的合成に適したものである。各種形式のＳＰＰＳ、例えばＦｍｏｃ及びＢｏｃは、プラスミノーゲンの合成に用いることができる。固相合成に用いられる技術は以下に記載されている：Ｂａｒａｎｙ及びＳｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；３−２８４ページ、Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ．第二巻：Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐａｒｔ  Ａ．，Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，ｔら  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９−２１５６（１９６３）；Ｓｔｅｗａｒｔら，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ  ｅｄ．Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．（１９８４）；及びＧａｎｅｓａｎ  Ａ．２００６Ｍｉｎｉ  Ｒｅｖ．Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．６：３−１０及びＣａｍａｒｅｒｏ  ＪＡら  ２００５Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｅｐｔ  Ｌｅｔｔ．１２：７２３−８。簡単に言えば、その上にペプチド鎖が構築されている機能性ユニットにより不溶性の多孔ビーズを処理する。カップリング／脱保護の繰り返し循環後に、附着した固相の遊離Ｎ末端アミンと単一のＮ保護を受けているアミノ酸ユニットをカップリングさせる。それから、該ユニットを脱保護し、他のアミノ酸と連結する新しいＮ末端アミンを露出させる。ペプチドを固相上に固定したままにし、それからそれを切除する。
【００６０】
標準的な組み換え方法により本発明のプラスミノーゲンを生産する。例えば、プラスミノーゲンをコードする核酸を発現ベクター中に挿入し、それと発現ベクター中の制御配列を操作可能に連結させる。発現制御配列はプロモーター（例えば天然に関連されているプロモーター、または異種由来のプロモーター）、シグナル配列、エンハンサーエレメント及び転写終了配列を含むが、これらに限られない。発現の制御はベクター中の真核プロモーターシステムとすることができ、前記ベクターは真核宿主細胞（例えばＣＯＳまたはＣＨＯ細胞）を形質転換またはトランスフェクションさせる。一旦ベクターを適切な宿主に導入すれば、ヌクレオチド配列の高レベル発現及びプラスミノーゲンの収集及び精製に適した条件下において宿主を維持する。
【００６１】
適切な発現ベクターは通常宿主体内においてエピソームまたは宿主染色体ＤＮＡの組み換え部分として複製される。通常、発現ベクターは選択マーカー（例えばアンピシリン耐性、ハイグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性、カナマイシン耐性またはネオマイシン耐性）を含み、インビトロで所望のＤＮＡ配列によって形質転換されたそれらの細胞に対して測定を行うことに有用である。
【００６２】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）は本発明のプラスミノーゲンタンパク質をコードするポリヌクレオチドをクローンすることに用いられる原核宿主細胞の例である。その他の使用に適した微生物宿主は桿菌を含み、例えばバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びその他の腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、例えばサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、及び各種シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種である。これらの原核宿主において、発現ベクターを生成でき、通常は宿主細胞と相容する発現制御配列（例えば複製開始点）を含むものである。また、多くの公知のプロモーターが存在し、例えば乳糖プロモーターシステム、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム、β−ラクタマーゼプロモーターシステム、またはファージλ由来のプロモーターシステムである。プロモーターは一般的に発現を制御し、必要に応じて遺伝子配列を制御する場合に、転写及び翻訳を起動するために、さらにリボソームの結合位置配列を有してもよい。
【００６３】
その他の微生物、例えば酵母も発現に用いることができる。酵母（例えばサッカロミセス（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））及びピキア（Ｐｉｃｈｉａ）が適した酵母宿主細胞の例であり、そのうちの適切な担体は必要に応じて発現制御配列（例えばプロモーター）、複製開始点、終止配列など含む。典型的なプロモーターは３−ホスホグリセリン酸キナーゼ及びその他の糖分解酵素を含む。誘導型酵母プロモーターにはアルコール脱水素酵素、イソチトクロムＣ、及びマルトースとガラクトースの利用のための酵素のプロモーターを含む。
【００６４】
微生物以外に、哺乳動物細胞（例えば体外細胞培養物中において培養された哺乳動物細胞）も本発明のプラスミノーゲンの発現に用いることができる。例えばＷｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎ．Ｙ．，Ｎ．Ｙ．（１９８７）参照。適した哺乳動物宿主細胞はＣＨＯ細胞系、各種Ｃｏｓ細胞系、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞系、及び形質転換されたＢ細胞またはハイブリドーマを含む。これらの細胞に用いられる発現ベクターは発現制御配列、例えば複製開始点、プロモーター、及びエンハンサー（Ｑｕｅｅｎら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：４９（１９８６））、及び必要とされる加工情報サイト、例えばリボソームの結合サイト、ＲＮＡの切断サイト、ポリアデノシン酸化サイト、及び転写ターミネーター配列を含むことができる。適切な発現制御配列の例はウサギ免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウィルス、サイトメガロウイルスなどの派生のプロモーターである。Ｃｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９（１９９２）を参照すること。
【００６５】
一旦合成（化学または組み換え的に）されれば、本分野の標準的な手順、例えば硫酸アンモニウム沈殿、アフィニテイカラム、カラムクロマトグラフィー、高速液相クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ゲル電気泳動などにより本発明に記載のプラスミノーゲンを精製することができる。該プラスミノーゲンは基本的に純粋なものであり、例えば少なくとも約８０％から８５％の純度で、少なくとも約８５％〜９０％の純度で、少なくとも約９０％〜９５％の純度で、または９８％〜９９％の純度またはさらに純度が高いものであり、例えば汚染物を含まず、前記汚染物は例えば細胞砕片、本発明のプラスミノーゲン以外の大分子などである。
【００６６】
３．薬物配合剤
所望の純度のプラスミノーゲンと必要に応じた薬用担体、賦形剤、または安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．ｅｄ．（１９８０））を混合して凍結乾燥製剤または水溶液を形成して治療用の配合剤を得る。許容可能な担体、賦形剤、安定化剤は所要の用量及び濃度下において被験者に対して毒性がなく、さらに例えばリン酸塩、クエン酸塩及びその他の有機酸などの緩衝剤を含む。抗酸化剤はアスコルビン酸和メチオニンを含む；防腐剤（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメチレンジアミン；塩化ベンザルコニウム（ｂｅｎｚａｌｋｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブタノールまたはベンジルアルコール；アルキルパラヒドロキシ安息香酸エステル、例えばメチルまたはプロピルのパラヒドロキシ安息香酸エステル；ピロカテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；ｍ−クレゾール）；低分子量ポリペプチド（少なくとも１０個の残基を有するもの）；タンパク質例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性重合体、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン酸、ヒスチジン、アルギニンまたはリシンである；単糖、二糖及びその他の炭水化物はグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む；キレート剤は例えばＥＤＴＡである；糖類は例えばショ糖、マンニトール、フコースまたはソルビトールである；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属複合体（例えば亜鉛−タンパク複合体）；及び／または非イオン界面活性剤を含む。
【００６７】
本発明の配合剤は治療を必要とする具体的な症状の必要とする一種類以上の活性化合物を含有してもよく、好ましくは活性が相補的で互いに副作用を有しないものである。例えば、糖尿病、糖尿病合併症、高脂血症、アテローム性動脈硬化症、高血圧、冠状動脈性心臓病、心筋梗塞、脳血栓症、脳出血、脳塞栓症、肥満、脂肪肝、肝硬変、骨粗鬆症、認知障害、パーキンソン症候群、側柱硬化症、アルツハイマー病、炎症性腸疾患、消化不良、および胃腸潰瘍からなる群より選ばれる一つ以上の疾患を治療するための薬剤である。
【００６８】
本発明のプラスミノーゲンは例えば凝集技術または界面重合によって作られるマイクロカプセル中に内包ことができ、例えば、膠質薬物輸送系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン剤、ナノ粒子及びナノカプセル）中に入れまたは粗エマルジョン状液中のヒドロキシメチルセルロースまたはゲルーマイクロカプセル及びポリ―（メタアクリル酸メチル）マイクロカプセル中に入れることができる。これらの技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
【００６９】
体内に投与することに用いられる本発明のプラスミノーゲンは必ず無菌である必要がある。これは凍結乾燥及び再度配合する前または後に除菌濾過膜で濾過することで容易に実現できる。
【００７０】
本発明のプラスミノーゲンは緩衝製剤を調製できる。緩衝製剤の適切な実例は一定の形状を有し且つ糖タンパクを含む固体の疎水性重合体の半透過マトリックスを含み、例えば膜またはマイクロカプセルである。緩衝基質の実例はポリエステル、水性ゲル（例えばポリ（２−ヒドロキシエチル−メタアクリル酸エステル）（Ｌａｎｇｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５：１６７−２７７（１９８１）；Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８−１０５（１９８２））またはポリ（ビニールアルコール）、ポリラクチド（米国特許３７７３９１９，ＥＰ  ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸とエチル−Ｌ−グルタミン酸の共重合体（Ｓｉｄｍａｎ，ら，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７（１９８３）），分解できないエチレン−ビニルアセテート（ｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｖｉｎｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ）（Ｌａｎｇｅｒ，ら，出所は前記と同じ）、または分解可能な乳酸−ヒドロキシ酢酸共重合体、例えばＬｕｐｒｏｎ  ＤｅｐｏｔＴＭ（乳酸−ヒドロキシ酢酸共重合体及びリュープロレリン（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ）酢酸エステルからなる注射可能なミクロスフェア体）、及びポリＤ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を含む。重合体、例えばエチレン−酢酸エチル及び乳酸−ヒドロキシ酢酸は、持続的に分子を１００日間以上放出することができ、しかしいくつかの水性ゲルがタンパク質を放出する時間は比較的短い。関連のメカニズムに応じてタンパク質を安定化させる合理的なストラテジーにより設計できる。例えば、凝集のメカニズムが硫化ジスルフィド結合の交換によって分子間Ｓ−Ｓ結合を形成するであれば、メルカプト基残基を修飾することにより、酸性溶液中から凍結乾燥させ、湿度を制御し、適切な添加剤を用いて、及び特定の重合体基質組成物を開発することで安定化を実現できる。
【００７１】
４．投与及び使用量
異なる方式、例えば静脈内、腹膜内、皮下、頭蓋骨内、髄腔内、動脈内（例えば頸動脈）、筋肉内、鼻内、体表または皮内投与または脊髄または脳内輸送により本発明の薬物組成物の投与を実現できる。エアロゾル製剤例えば鼻噴霧製剤は活性化剤を含有する精製した水性またはその他の溶液及び防腐剤と等張剤を含有する。このような製剤を鼻粘膜と相容し得るｐＨ及び等張状態に調整する。
【００７２】
一部の場合において、以下の方式により本発明のプラスミノーゲン薬物組成物を修飾または配合することができ、これにより血液脳関門を通過できる能力を提供する。
【００７３】
胃腸外での投与に用いられる製造物は無菌水性または非水性溶液、懸濁液及び乳剤を含む。非水性溶媒の例はプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、例えばオリーブオイルのような植物油、及び注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。水性担体は水、アルコール性／水性溶液、乳剤または懸濁液を含み、食塩水及び緩衝媒介を含む。胃腸外媒介物は塩化ナトリウム溶液、リンガ―デキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、または固定油である。静脈内媒介物は液体及び栄養補充物、電気分解補充物などを含む。されには防腐剤及びその他の添加剤、例えば抗微生物製剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなども存在してもよい。
【００７４】
いくつかの実施形態において、本発明のプラスミノーゲンは血液脳関門の通過を促進する薬剤と配合されている。いくつかの場合において、本発明のプラスミノーゲンは直接またはリンカーにより血液脳関門の通過を促進する担体分子、ペプチドまたはタンパク質と融合する。一部の実施形態において、本発明のプラスミノーゲンは内在性血液脳関門（ＢＢＢ）受容体に結合するポリペプチドと融合する。プラスミノーゲンと内在性血液脳関門受容体に結合するポリペプチドは、ＢＢＢの通過を促進する。内在性血液脳関門（ＢＢＢ）受容体に結合するポリペプチドは抗体、例えばモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメントを含み、それは特異的に内在性ＢＢＢ受容体に結合する。一部の場合において、抗体はリポソームに内包されたものである。例えば米国特許公開書類Ｎｏ．２００９／０１５６４９８を参照すること。
【００７５】
医療関係者は各種臨床的要素により用量案を決めることができる。例えば医学分野で公知のように、任意の患者の用量は複数の要素によって決められ、これらの要素は患者の体型、体表面積、年齢、投与される具体的な化合物、性別、投与回数及び経路、全体の健康度、及び同時に投与するその他の薬物を含む。本発明が含有するプラスミノーゲンの薬物組成物の用量の範囲は例えば被験者体重に対して毎日約０．０００１〜２０００ｍｇ／ｋｇであり、または約０．００１〜５００ｍｇ／ｋｇ（例えば０．０２ｍｇ／ｋｇ，０．２５ｍｇ／ｋｇ，０．５ｍｇ／ｋｇ，０．７５ｍｇ／ｋｇ，１０ｍｇ／ｋｇ，５０ｍｇ／ｋｇなど）とすることができる。例えば、用量は１ｍｇ／ｋｇ体重または５０ｍｇ／ｋｇ体重または１−５０ｍｇ／ｋｇの範囲とすることができ、または少なくとも１ｍｇ／ｋｇである。この例示性の範囲より高いまたは低い用量もカバーされ、特に前記の要素を考慮した場合である。前記範囲中の中間用量も本発明の範囲内に含まれるものである。被験者は毎日、隔日、毎週または経験分析によって決められた任意のスケジュール表に従ってに従ってこのような用量を投与できる。例示的な用量のスケジュール表は連続数日１−１０ｍｇ／ｋｇ投与することである。本発明の薬物の投与過程において治療効果及び安全性はリアルタイムに評価、定期的に評価すべきである。
【００７６】
５．製品または薬物キット
本発明の一つの実施形態は製品または薬物キットに係るものであり、本発明のプラスミノーゲンを含有する。前記製品は好ましくは一つの容器、ラベルまたはプロトコルを含む。適切な容器はボトル、バイアル、注射器などである。容器は各種材料例えばガラスまたはプラスチックから作られることができる。前記容器は組成物を含有し、前記組成物は本発明の疾患または症状を有効に治療し且つ無菌の入口を有する（例えば前記容器は静脈輸液用パックまたはバイアルであり、皮下注射針によって貫通される栓を含む）。前記組成物中の少なくとも一種類の活性化剤がプラスミノーゲンである。前記容器上にあるまたは添付されているラベルは前記組成物を本発明の前記疾患の治療に用いられると説明するものである。前記製品はさらに薬用緩衝液を含有する第二容器を含み、前記薬用緩衝液は例えばリン酸塩緩衝の食塩水、リンガー溶液及びグルコース溶液を含む。さらには商業及び使用者の観点から見ると必要とされるその他の物質、即ちその他の緩衝液、希釈剤、濾過物、針及び注射器を含むことができる。また、前記製品は使用説明を有するプロトコルを含み、これは例えば前記組成物の使用者にプラスミノーゲン組成物及び疾患の治療に伴うその他の薬物を患者に投与することを指示するものである。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】図１Ａ〜Ｃは、１４〜１５週齢のｄｂ／ｄｂマウスにプラスミノーゲンを２８日投与した後の膵臓ＧＬＰ−１免疫染色の観察結果を示したものである。Ａは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｂはプラスミノーゲン投与群であり、Ｃは定量分析の結果である。その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群のマウスの膵島ＧＬＰ−１の発現（矢印に表記される）はプラスミノーゲン投与群より明らかに少なく、しかもその差が統計学的に有意である（＊は、Ｐ＜０．０５を表す）ことは示されている。この結果は、プラスミノーゲンが比較的に若い糖尿病マウスの膵島ＧＬＰ−１の発現を促進できることを示している。
【図２】図２Ａ〜Ｂは２３〜２５週齢のｄｂ／ｄｂマウスにプラスミノーゲンを２８日投与した後の膵臓ＧＬＰ−１免疫染色の代表的な写真を示すものである。Ａは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｂはプラスミノーゲン投与群である。その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群のマウスの膵島ＧＬＰ−１の発現（矢印に表記される）はプラスミノーゲン投与群より明らかに少ないことは示されている。この結果は、プラスミノーゲンが比較的に老齢の糖尿病マウスの膵島ＧＬＰ−１の発現を促進できることを示している。
【図３】図３Ａ〜Ｃは、Ｔ１ＤＭモデルにおけるＰＬＧ＋／＋マウスにプラスミノーゲンを２８日投与した後の膵島ＧＬＰ−１染色の観察結果を示したものである。Ａは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｂはプラスミノーゲン投与群であり、Ｃは定量分析の結果である。その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群のマウスの膵島ＧＬＰ−１の発現（矢印に表記される）はプラスミノーゲン投与群より明らかに少なく、しかもその差が統計学的に有意である（＊＊は、Ｐ＜０．０１を表す）ことは示されている。この結果は、プラスミノーゲンがＩ型糖尿病マウスの膵島ＧＬＰ−１の発現を促進できることを示している。
【図４】図４Ａ〜Ｃは２４〜２５週齢の糖尿病マウスにプラスミノーゲンを３５日投与した後の膵島グルカゴン免疫組織化学的観察結果を示すものである。Ａは正常対照群であり、Ｂは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｃはプラスミノーゲン投与群である。その結果、グルカゴンは正常対照群マウスにおいて膵島周辺のα細胞の区域に発現されている。プラスミノーゲン投与群と比べ、溶媒ＰＢＳ投与対照群のグルカゴンの陽性細胞（矢印に表記される）は明らかに増え、陽性細胞は膵島の中央に浸潤している；プラスミノーゲン投与群のグルカゴンの陽性細胞は膵島周辺に散在的に分布し、ＰＢＳ投与対照群と比べ、プラスミノーゲン投与群の膵島形態は正常マウスにより近い。これは、プラスミノーゲンが膵島α細胞の増殖およびグルカゴンの分泌を顕著に抑制でき、膵島α細胞の分布の乱れを修正でき、膵島損傷の修復を促進できることを示している。
【図５】図５Ａ〜Ｄは２７週齢の糖尿病マウスにプラスミノーゲンを３５日投与した後の膵島グルカゴン免疫組織化学的観察結果を示すものである。Ａは正常対照群であり、Ｂは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｃはプラスミノーゲン投与群であり、Ｄは定量分析の結果である。その結果、グルカゴンは正常対照群マウスにおいて膵島周辺のα細胞の区域に発現されている。プラスミノーゲン投与群と比べ、溶媒ＰＢＳ投与対照群のグルカゴンの陽性細胞（矢印に表記される）は明らかに増え、陽性細胞は膵島の中央に浸潤し、しかも平均光学密度の定量分析の結果には統計学的な差がある（＊は、Ｐ＜０．０５を表す）；プラスミノーゲン投与群のグルカゴンの陽性細胞は膵島周辺に散在的に分布し、ＰＢＳ投与対照群と比べ、プラスミノーゲン投与群の膵島形態は正常マウスにより近い。これは、プラスミノーゲンが膵島α細胞の増殖およびグルカゴンの分泌を顕著に抑制でき、膵島α細胞の分布の乱れを修正でき、膵島損傷の修復を促進できることを示している。
【図６】図６Ａ〜Ｄはプラスミノーゲンを２８日投与した後のＰＬＧ＋／＋マウスがＴ１ＤＭモデルにおける膵島グルカゴン免疫組織化学的観察結果を示すものである。Ａはブランク対照群であり、Ｂは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｃはプラスミノーゲン投与群であり、Ｄは定量分析の結果である。その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群のグルカゴンの陽性発現はプラスミノーゲン投与群より明らかに多く、しかも平均光学密度の定量分析の結果のその差が統計学的に有意である（＊は、Ｐ＜０．０５を表す）ことは示されている。これは、プラスミノーゲンが糖尿病マウスの膵島α細胞のグルカゴン分泌を顕著に減少させることができ、膵島損傷の修復を促進できることを示している。
【図７】図７は２４〜２５週齢の糖尿病マウスにプラスミノーゲンを投与してから第１１日、第３２日の血糖測定結果を示したものである。その結果、プラスミノーゲン投与群マウスの血糖は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに低く、しかもその差が統計学的に有意である（＊は、Ｐ＜０．０５を表し、＊＊は、Ｐ＜０．０１を表す）ことは示されている。また、投与時間が長くなるにつれて、溶媒ＰＢＳ投与対照群マウスの血糖は上昇する傾向があるに対して、プラスミノーゲン投与群の血糖は徐々に低下する。これは、プラスミノーゲンが血糖を降下する作用があることを示している。
【図８】図８はプラスミノーゲンが糖尿病マウスの血清フルクトサミンの濃度に対する影響を示したものである。測定した結果、プラスミノーゲン投与後の血清フルクトサミンの濃度は明らかに低下し、投与前と比べ、その差が統計学的に極めて有意である（＊＊は、Ｐ＜０．０１を表す）ことは示されている。これは、プラスミノーゲンが糖尿病マウスの血清フルクトサミンのレベルを顕著に降下することができることを示している。
【図９】図９は２７週齢の糖尿病マウスにプラスミノーゲンを３５日投与した後の血清フルクトサミンの測定結果を示すものである。測定結果によると、プラスミノーゲン投与群の血清フルクトサミンの濃度は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに低く、その差が統計学的に有意に近い（Ｐ＝０．０６）。これは、プラスミノーゲンが糖尿病マウスの血清フルクトサミンのレベルを顕著に低下させることができることを示している。
【図１０】図１０は２７週齢の糖尿病マウスにプラスミノーゲンを３５日投与した後の血漿糖化ヘモグロビンの測定結果を示したものである。その結果、プラスミノーゲン投与群マウスの糖化ヘモグロビンのＯＤ値は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに低く、しかもその差が統計学的に極めて有意である（＊＊は、Ｐ＜０．０１を表す）ことは示されている。これは、プラスミノーゲンが糖尿病マウスの血漿糖化ヘモグロビンを降下する作用があることを示している。
【図１１】図１１は２７週齢の糖尿病マウスにプラスミノーゲンを１０日投与した後のＩＰＧＴＴ測定結果を示したものである。その結果、グルコースを腹腔に注射した後、プラスミノーゲン投与群マウスの血糖レベルは溶媒ＰＢＳ投与対照群より低く、しかも溶媒ＰＢＳ投与対照群と比べてプラスミノーゲン投与群の糖耐性曲線は正常なマウスにより近いことは示されている。これは、プラスミノーゲンが糖尿病マウスの糖耐性能力を明らかに改善できることを示している。
【図１２】図１２はＴ１ＤＭモデルＰＬＧ＋／＋マウスにプラスミノーゲンを１０日投与してから禁食後の血糖測定結果を示したものである。その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群マウスの血糖はプラスミノーゲン投与群より明らかに高く、しかもその差が統計学的に極めて有意である（＊＊＊は、Ｐ＜０．００１を表す）ことは示されている。これは、プラスミノーゲンが、Ｔ１ＤＭモデルにおけるＰＬＧ＋／＋マウスの血糖レベルを顕著に低下させることができることを示している。
【図１３】図１３はＴ１ＤＭモデルＰＬＧ＋／＋マウスにプラスミノーゲンを２８日投与した後のＩＰＧＴＴ測定結果を示したものである。その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群マウスのグルコース注射後の血糖濃度はプラスミノーゲン投与群より明らかに高く、しかも溶媒ＰＢＳ投与対照群と比べ、プラスミノーゲン投与群の糖耐性曲線は正常なマウスにより近いことは示されている。これは、プラスミノーゲンが、Ｔ１ＤＭモデルにおけるＰＬＧ＋／＋マウスの糖耐性能力を高めることができることを示している。
【図１４】図１４はＴ１ＤＭモデルマウスにプラスミノーゲンを２０日投与した後の血糖測定結果を示すものである。その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群マウスの血糖はプラスミノーゲン投与群マウスより明らかに高く、しかもその差が統計学的に有意である（Ｐ＝０．０４）ことは示されている。これは、プラスミノーゲンがＴ１ＤＭマウスのグルコース分解能力を促進でき、血糖を降下することができることを示している。
【図１５】図１５は２７週齢の糖尿病マウスにプラスミノーゲンを３５日投与した後の血清インスリンの測定結果を示したものである。その結果、プラスミノーゲン投与群の血清インスリンレベルは溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに高く、しかもその差が統計学的に有意である（＊は、Ｐ＜０．０５を表す）ことは示されている。これは、プラスミノーゲンがインスリンの分泌を効果的に促進できることを示している。
【図１６】図１６Ａ〜Ｅは２４〜２５週齢の糖尿病マウスにプラスミノーゲンを３１日投与した後の膵臓のＨＥ染色の写真および膵島面積比の統計分析結果を示したものである。Ａ、Ｂは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、ＣとＤはプラスミノーゲン投与群であり、Ｅは膵島面積の定量分析結果である。その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群の大部分の膵島が委縮し、委縮した膵島細胞は腺房（矢印に表記される）に置き換えられ、膵島のヘリの腺房が増殖して膵島と腺房との境目があいまいになっている；プラスミノーゲン投与群の大部分の膵島は対照群より面積が大きく、しかも膵島内には腺房増殖がなく、ただ僅かの膵島内に僅かの腺房が残存しており、膵島と腺房との境目がはっきりしていることは示されている。プラスミノーゲン投与群と対照群の、膵島と膵臓との面積比を比較すると、プラスミノーゲン投与群は対照群の倍近くになっていることが分かる。これは、プラスミノーゲンが２４〜２５週齢の糖尿病マウスの膵島損傷の修復を促進でき、損傷した膵島を修復することにより糖尿病を治療することができることを示している。
【図１７】図１７Ａ〜Ｃは２４〜２５週齢の糖尿病マウスにプラスミノーゲンを３１日投与した後の膵島シリウスレッド染色の観察結果を示したものである。Ａは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｂはプラスミノーゲン投与群であり、Ｃは定量分析の結果である。その結果、プラスミノーゲン投与群マウスの膵島コラーゲン沈着（矢印に標記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに少なく、しかもその差が統計学的に有意である（＊は、Ｐ＜０．０５を表す）ことは示されている。これは、プラスミノーゲンが糖尿病動物の膵島の繊維化を改善できることを示している。
【図１８】図１８Ａ〜Ｂは２４〜２５週齢の糖尿病マウスにプラスミノーゲンを３１日投与した後の膵島Ｃａｓｐａｓｅ−３免疫組織化学的染色の観察結果を示したものである。Ａは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｂはプラスミノーゲン投与群である。その結果、プラスミノーゲン投与群のＣａｓｐａｓｅ−３の発現（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに低いことは示されている。これは、プラスミノーゲンが膵島細胞のアポトーシスを減少させ、糖尿病マウスの膵臓組織を保護できることを示している。
【図１９】図１９Ａ〜Ｃは１７〜１８週齢の糖尿病マウスにプラスミノーゲンを３５日投与した後の膵島インスリン免疫組織化学的染色結果を示すものである。Ａは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｂはプラスミノーゲン投与群であり、Ｃは定量分析の結果である。その結果、プラスミノーゲン投与群のインスリンの発現（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに高く、しかもその差が統計学的に有意に近い（Ｐ＝０．１５を表す）ことは示されている。これは、プラスミノーゲンが膵島の機能修復を促進でき、インスリンの生成と分泌を促進できることを示している。
【図２０】図２０Ａ〜Ｃは２４〜２５週齢の糖尿病マウスにプラスミノーゲンを３１日投与した後のインスリン免疫組織化学的染色の観察結果を示すものである。Ａは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｂはプラスミノーゲン投与群であり、Ｃは定量分析結果である。その結果、プラスミノーゲン投与群のインスリンの発現（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに高く、しかもその差が統計学的に有意である（＊は、Ｐ＜０．０５を表す）ことは示されている。これは、プラスミノーゲンが膵島の機能修復を促進でき、インスリンの生成と分泌を促進できることを示している。
【図２１】図２１Ａ〜Ｃは２７週齢の糖尿病マウスにプラスミノーゲンを３５日投与した後のインスリン免疫組織化学的染色の観察結果を示すものである。Ａは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｂはプラスミノーゲン投与群であり、Ｃは定量分析結果である。その結果、プラスミノーゲン投与群のインスリンの発現（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに高く、しかもその差が統計学的に極めて有意である（＊＊は、Ｐ＜０．０１を表す）ことは示されている。これは、プラスミノーゲンが膵島の機能修復を効果的に促進でき、インスリンの生成と分泌を促進できることを示している。
【図２２】図２２Ａ〜Ｄは２４〜２５週齢の糖尿病マウスにプラスミノーゲンを３１日投与した後の膵臓組織ＮＦ−ｋＢ免疫組織化学的染色の観察結果を示すものである。Ａは正常対照群であり、Ｂは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｃはプラスミノーゲン投与群であり、Ｄは定量分析結果である。その結果、プラスミノーゲン投与群のＮＦ−ｋＢの発現（矢印に表記される）は正常対照マウスに近く、溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに高く、しかもその差が統計学的に有意である（＊は、Ｐ＜０．０５を表す）ことは示されている。これは、プラスミノーゲンが多方向核転写因子ＮＦ−ｋＢの発現を促進でき、２４〜２５週齢の糖尿病マウスの膵島炎症の修復を促進できることを示している。
【図２３】図２３Ａ〜Ｄは１７〜１８週齢の糖尿病マウスにプラスミノーゲンを３５日投与した後の膵島グルカゴン免疫組織化学的染色の観察結果を示すものである。Ａは正常対照群であり、Ｂは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｃはプラスミノーゲン投与群であり、Ｄは定量分析の結果である。その結果、グルカゴンは正常対照群マウスにおいて膵島周辺のα細胞の区域に発現されている。プラスミノーゲン投与群と比べ、溶媒ＰＢＳ投与対照群のグルカゴンの陽性細胞（矢印に表記される）は明らかに増え、グルカゴンの陽性細胞は膵島の中央に浸潤し、しかも平均光学密度の定量分析の結果にはその差が統計学的に極めて有意である（＊＊は、Ｐ＜０．０１を表す）；プラスミノーゲン投与群のグルカゴンの陽性細胞は膵島周辺に散在的に分布し、ＰＢＳ投与対照群と比べ、プラスミノーゲン投与群の膵島形態は正常マウスにより近い。これは、プラスミノーゲンが膵島α細胞の増殖およびグルカゴンの分泌を顕著に抑制でき、膵島α細胞の分布の乱れを修正でき、膵島損傷の修復を促進できることを示している。
【図２４】図２４Ａ〜Ｄは１７〜１８週齢の糖尿病マウスにプラスミノーゲンを３５日投与した後の膵島ＩＲＳ−２免疫組織化学的染色の観察結果を示すものである。Ａは正常対照群であり、Ｂは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｃはプラスミノーゲン投与群であり、Ｄは定量分析の結果である。その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群マウスの膵島ＩＲＳ−２陽性発現（矢印に表記される）はプラスミノーゲン投与群より明らかに少なく、しかもその差が統計学的に極めて有意である（＊＊は、Ｐ＜０．０１を表す）；プラスミノーゲン投与群のＩＲＳ−２発現レベルは溶媒ＰＢＳ投与対照群より正常対照群マウスにより近い。これは、プラスミノーゲンが膵島細胞ＩＲＳ−２の発現を効果的に増加させ、インスリン信号伝達を改善し、１７〜１８週齢の糖尿病マウスの膵島β細胞損傷を減少させることができることを示している。
【図２５】図２５Ａ〜Ｄは２４〜２５週齢の糖尿病マウスにプラスミノーゲンを３１日投与した後の膵島ＩＲＳ−２免疫組織化学的観察結果を示すものである。Ａは正常対照群であり、Ｂは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｃはプラスミノーゲン投与群であり、Ｄは定量分析の結果である。その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群マウスの膵島ＩＲＳ−２陽性発現（矢印に表記される）はプラスミノーゲン投与群より明らかに少なく、しかもその差が統計学的に有意である（＊は、Ｐ＜０．０５を表す）；プラスミノーゲン投与群のＩＲＳ−２発現レベルは溶媒ＰＢＳ投与対照群より正常対照群マウスにより近い。これは、プラスミノーゲンが膵島細胞ＩＲＳ−２の発現を効果的に増加させ、インスリン信号伝達を改善し、糖尿病マウスの膵島β細胞損傷を減少させることができることを示している。
【図２６】図２６Ａ〜Ｃは２７週齢の糖尿病マウスにプラスミノーゲンを３５日投与した後の膵島ＩＲＳ−２免疫組織化学的観察結果を示すものである。Ａは正常対照群であり、Ｂは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｃはプラスミノーゲン投与群である。その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群マウスの膵島ＩＲＳ−２陽性発現（矢印に表記される）はプラスミノーゲン投与群より明らかに少ない；プラスミノーゲン投与群のＩＲＳ−２発現レベルは溶媒ＰＢＳ投与対照群より正常対照群マウスにより近い。これは、プラスミノーゲンが膵島細胞ＩＲＳ−２の発現を効果的に増加させ、インスリン信号伝達を改善し、糖尿病マウスの膵島β細胞損傷を減少させることができることを示している。
【図２７】図２７Ａ〜Ｃはプラスミノーゲンを２８日投与した後のＰＬＧ＋／＋Ｔ１ＤＭマウスの膵島ＩＲＳ−２免疫組織化学的観察結果を示すものである。Ａは正常対照群であり、Ｂは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｃはプラスミノーゲン投与群である。その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群マウスの膵島ＩＲＳ−２陽性発現（矢印に表記される）はプラスミノーゲン投与群より明らかに少ない；プラスミノーゲン投与群のＩＲＳ−２発現レベルは溶媒ＰＢＳ投与対照群より正常対照群マウスにより近い。これは、プラスミノーゲンが膵島細胞ＩＲＳ−２の発現を効果的に増加させ、インスリン信号伝達を改善し、ＰＬＧ＋／＋Ｔ１ＤＭマウスの膵島β細胞損傷を減少させることができることを示している。
【図２８】図２８Ａ〜Ｃは２７週齢の糖尿病マウスにプラスミノーゲンを３５日投与した後の膵島好中球の免疫組織化学的染色の観察結果を示すものである。Ａは正常対照群であり、Ｂは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｃはプラスミノーゲン投与群である。その結果、プラスミノーゲン投与群の陽性発現の細胞（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群より少なく、しかもプラスミノーゲン投与群は溶媒ＰＢＳ投与対照群より正常対照群により近い。これは、プラスミノーゲンが好中球の浸潤を減少させることができることを示している。
【図２９】図２９Ａ〜ＣはＴ１ＤＭモデルにおけるＰＬＧ−／−マウスにプラスミノーゲンを２８日投与した後の膵島好中球の免疫組織化学的染色の観察結果を示すものである。Ａはブランク対照群であり、Ｂは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｃはプラスミノーゲン投与群である。その結果、プラスミノーゲン投与群の陽性発現の細胞（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群より少なく、しかもプラスミノーゲン投与群は溶媒ＰＢＳ投与対照群よりブランク対照群により近い。これは、プラスミノーゲンがＰＬＧ−／−マウスのＴ１ＤＭモデルにおける膵島好中球の浸潤を減少させることができることを示している。
【図３０】図３０Ａ〜ＣはＴ１ＤＭモデルにおけるＰＬＧ＋／＋マウスにプラスミノーゲンを２８日投与した後の膵島好中球の免疫組織化学的染色の観察結果を示すものである。Ａはブランク対照群であり、Ｂは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｃはプラスミノーゲン投与群である。その結果、プラスミノーゲン投与群の陽性発現の細胞（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群より少なく、しかもプラスミノーゲン投与群は溶媒ＰＢＳ投与対照群よりブランク対照群により近い。これは、プラスミノーゲンがＰＬＧ＋／＋マウスのＴ１ＤＭモデルにおける膵島好中球の浸潤を促進できることを示している。
【図３１】図３１Ａ〜ＣはＴ１ＤＭモデルにおけるＰＬＧ−／−マウスにプラスミノーゲンを２８日投与した後の膵島インスリンの免疫組織化学的染色の観察結果を示すものである。Ａはブランク対照群であり、Ｂは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｃはプラスミノーゲン投与群である。免疫組織化学的結果は、プラスミノーゲン投与群のインスリンの陽性発現（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに多く、しかもプラスミノーゲン投与群は溶媒ＰＢＳ投与対照群よりブランク対照群により近いことを示している。これは、プラスミノーゲンがＰＬＧ−／−マウスのＴ１ＤＭモデルにおけるインスリンの合成と分泌を促進できることを示している。
【図３２】図３２Ａ〜ＣはＴ１ＤＭモデルにおけるＰＬＧ＋／＋マウスにプラスミノーゲンを２８日投与した後の膵島インスリンの免疫組織化学的染色の観察結果を示すものである。Ａはブランク対照群であり、Ｂは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｃはプラスミノーゲン投与群である。免疫組織化学的結果によると、プラスミノーゲン投与群のインスリン陽性発現（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに多く、しかもプラスミノーゲン投与群は溶媒ＰＢＳ投与対照群よりブランク対照群により近い。これは、プラスミノーゲンがＰＬＧ＋／＋マウスのＴ１ＤＭモデルにおけるインスリンの合成と発現を促進できることを示している。
【図３３】図３３Ａ〜ＣはＴ１ＤＭモデルにおけるＰＬＧ−／−マウスにプラスミノーゲンを２８日投与した後の膵島ＮＦ−ｋＢの免疫組織化学的染色の観察結果を示すものである。Ａはブランク対照群であり、Ｂは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｃはプラスミノーゲン投与群である。その結果、プラスミノーゲン投与群のＮＦ−ｋＢ発現（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに多いことは示されている。これは、プラスミノーゲンが炎症修復因子ＮＦ−ｋＢの発現を促進することができ、膵島炎症の修復を促進することができることを示している。
【図３４】図３４Ａ〜Ｂは１７〜１８週齢の糖尿病マウスにプラスミノーゲンを３５日投与した後の膵島ＮＦ−ｋＢの免疫組織化学的染色の観察結果を示すものである。Ａは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｂはプラスミノーゲン投与群である。その結果、プラスミノーゲン投与群のＮＦ−ｋＢ発現（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに高いことは示されている。これは、プラスミノーゲンが多方向核転写因子ＮＦ−ｋＢの発現を促進することができ、比較的に若い（１７〜１８週齢）糖尿病マウスの膵島炎症の修復を促進することができることを示している。
【図３５】図３５Ａ〜Ｃは２７週齢の糖尿病マウスにプラスミノーゲンを３５日投与した後の膵島ＮＦ−ｋＢの免疫組織化学的観察結果を示すものである。Ａは正常対照群であり、Ｂは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｃはプラスミノーゲン投与群である。本発明の実験結果によると、プラスミノーゲン投与群のＮＦ−ｋＢ発現（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに高いことは示されている。これは、プラスミノーゲンが多方向核転写因子ＮＦ−ｋＢの発現を促進することができ、比較的に老齢（２７週齢）の糖尿病マウスの膵島炎症の修復を促進することができることを示している。
【図３６】図３６Ａ〜Ｃは２４〜２５週齢の糖尿病マウスにプラスミノーゲンを３１日投与した後の膵島ＴＮＦ−αの免疫組織化学的観察結果を示すものである。Ａは正常対照群であり、Ｂは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｃはプラスミノーゲン投与群である。研究結果によると、プラスミノーゲン投与群のＴＮＦ−αの陽性発現（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに高く、しかもプラスミノーゲン投与群は溶媒ＰＢＳ投与対照群より正常対照群により近いことは示されている。これは、プラスミノーゲンがＴＮＦ−αの発現を促進することができ、２４〜２５週齢の糖尿病マウスの膵島損傷の修復を促進することができることを示している。
【図３７】図３７Ａ〜Ｃは２７週齢の糖尿病マウスにプラスミノーゲンを３５日投与した後の膵島ＴＮＦ−αの免疫組織化学的染色の観察結果を示すものである。Ａは正常対照群であり、Ｂは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｃはプラスミノーゲン投与群である。研究結果によると、プラスミノーゲン投与群のＴＮＦ−αの陽性発現（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに高く、しかもプラスミノーゲン投与群は溶媒ＰＢＳ投与対照群より正常対照群により近いことは示されている。これは、プラスミノーゲンがＴＮＦ−αの発現を促進することができ、２７週齢の糖尿病マウスの膵島損傷の修復を促進することができることを示している。
【図３８】図３８Ａ〜ＢはＴ１ＤＭモデルにおけるＰＬＧ−／−マウスにプラスミノーゲンを２８日投与した後の膵島ＴＮＦ−αの免疫組織化学的染色の観察結果を示すものである。Ａは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｂはプラスミノーゲン投与群である。研究結果によると、プラスミノーゲン投与群のＴＮＦ−αの陽性発現（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに高い。これは、プラスミノーゲンがＴＮＦ−αの発現を促進することができ、Ｔ１ＤＭモデルにおけるＰＬＧ−／−マウスの膵島損傷の修復を促進することができることを示している。
【図３９】図３９Ａ〜ＣはＴ１ＤＭモデルにおけるＰＬＧ−／−マウスにプラスミノーゲンを２８日投与した後の膵島ＩｇＭの免疫組織化学的観察結果を示すものである。Ａはブランク対照群であり、Ｂは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｃはプラスミノーゲン投与群である。本実験研究の結果によると、プラスミノーゲン投与群のＩｇＭの陽性発現（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに低く、しかもプラスミノーゲン投与群は溶媒ＰＢＳ投与対照群より正常対照群により近い。これは、プラスミノーゲンがＩｇＭの発現を低下させることができ、Ｔ１ＤＭモデルにおけるＰＬＧ−／−マウスの膵島損傷を減少させることができることを示している。
【図４０】図４０Ａ〜Ｃは２４〜２５週齢の糖尿病マウスにプラスミノーゲンを３１日投与した後の膵島ＴＵＮＥＬ染色の観察結果を示すものである。Ａは正常対照群であり、Ｂは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｃはプラスミノーゲン投与群である。本実験研究の結果によると、正常対照群のＴＵＮＥＬ陽性染色は極めて低い。プラスミノーゲン投与群の陽性細胞数（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに少ない。正常対照群のアポトーシス率は約８％であり、溶媒ＰＢＳ投与対照群のアポトーシス率は約９３％であり、プラスミノーゲン投与群のアポトーシス率は約１６％である。これは、プラスミノーゲンが糖尿病マウスの膵島細胞のアポトーシスを顕著に減少させることができることを示している。
【図４１】図４１はＴ１ＤＭモデルマウスにプラスミノーゲンを２０日投与した後の血清インスリンの測定結果を示すものである。その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群マウスの血清インスリン濃度はプラスミノーゲン投与群マウスより明らかに低く、しかもその差が統計学的に有意に近い（Ｐ＝０．０８）。これは、プラスミノーゲンがＴ１ＤＭマウスのインスリン分泌を促進することができることを示している。
【図４２】図４２Ａ〜Ｄは、２４〜２５週齢の糖尿病マウスにプラスミノーゲンを３１日投与した後の膵島ＧＬＰ−１Ｒ染色の観察結果を示したものである。Ａは正常対照群であり、Ｂは溶媒ＰＢＳ対照群であり、Ｃはプラスミノーゲン投与群であり、Ｄは定量分析の結果である。その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群のマウスの膵島ＧＬＰ−１Ｒの発現（矢印に表記される）は正常対照群マウスより明らかに少なく、プラスミノーゲン投与群マウスの膵島ＧＬＰ−１Ｒの発現は正常対照群よりも少ないが、溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに多く、しかもその差が統計学的に極めて有意である（＊は、Ｐ＜０．０５を表し、＊＊は、Ｐ＜０．０１表す）ことは示されている。この結果は、プラスミノーゲンが糖尿病マウスの膵島ＧＬＰ−１Ｒの発現を促進できることを示している。
【図４３】図４３Ａ〜Ｄは、高脂血症モデルマウスにプラスミノーゲンを３０日投与した後の膵臓ＧＬＰ−１Ｒ免疫染色の観察結果を示したものである。Ａはブランク対照群であり、Ｂは溶媒ＰＢＳ対照群であり、Ｃはプラスミノーゲン投与群であり、Ｄは定量分析の結果である。その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群のマウスの膵島ＧＬＰ−１Ｒの発現（矢印に表記される）は正常対照マウスより明らかに少なく、プラスミノーゲン投与群マウスの膵島ＧＬＰ−１Ｒの発現はブランク対照群よりも少ないが、溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに多く、しかもその差が統計学的に極めて有意である（＊＊は、Ｐ＜０．０１表す）ことは示されている。この結果は、プラスミノーゲンが高脂血症モデルマウスの膵島ＧＬＰ−１Ｒの発現を促進できることを示している。
【図４４】図４４Ａ〜Ｃは、１４〜１５週齢のｄｂ／ｄｂマウスにプラスミノーゲンを２８日投与した後の膵臓ＧＬＰ−１Ｒ免疫染色の観察結果を示したものである。Ａは溶媒ＰＢＳ対照群であり、Ｂはプラスミノーゲン投与群であり、Ｃは定量分析の結果である。その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群のマウスの膵島ＧＬＰ−１Ｒの発現（矢印に表記される）はプラスミノーゲン投与群より明らかに少なく、しかもその差が統計学的に有意に近い（Ｐ＝０．０９）ことは示されている。この結果は、プラスミノーゲンが比較的に若い（１４〜１５週齢）糖尿病マウスの膵島ＧＬＰ−１Ｒの発現を促進できることを示している。
【図４５】図４５Ａ〜Ｃはアテローム性動脈硬化モデルマウスにプラスミノーゲンを３０日投与した後の肝臓ＧＬＰ−１Ｒ免疫組織化学的染色の観察結果を示したものである。Ａは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｂはプラスミノーゲン投与群であり、Ｃは定量分析の結果である。その結果、プラスミノーゲン投与群マウスの肝臓ＧＬＰ−１Ｒの発現（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに多く、しかもその差が統計学的に極めて有意である（＊＊＊は、Ｐ＜０．００１を表す）ことは示されている。この結果は、プラスミノーゲンがアテローム性動脈硬化モデルマウスの肝臓ＧＬＰ−１Ｒの発現を促進でき、肝臓脂肪の合成、分泌、吸収または酸化を促進し、血中脂質レベルを低下させ、高脂血症を改善する可能性があることを示している。
【図４６】図４６Ａ〜Ｃは高脂血症モデルマウスにプラスミノーゲンを３０日投与した後の肝臓ＧＬＰ−１Ｒ免疫染色の代表的写真を示したものである。Ａは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｂはプラスミノーゲン投与群であり、Ｃは定量分析の結果である。その結果、プラスミノーゲン投与群マウスの肝臓ＧＬＰ−１Ｒの発現（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに多く、しかもその差が統計学的に有意に近い（Ｐ＝０．０９）ことは示されている。この結果は、プラスミノーゲンが高脂血症モデルマウスの肝臓ＧＬＰ−１Ｒの発現を促進でき、肝臓脂肪の合成、分泌、吸収または酸化を促進し、血中脂質レベルを低下させ、高脂血症を改善する可能性があることを示している。
【図４７】図４７Ａ〜Ｃは、ＭＰＴＰ誘発パーキンソンモデルマウスにプラスミノーゲンを１４日投与した後の黒質ＧＬＰ−１Ｒ免疫染色の観察結果を示したものである。Ａは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｂはプラスミノーゲン投与群であり、Ｃは定量分析の結果である。その結果、プラスミノーゲン投与群マウスの黒質ＧＬＰ−１Ｒの発現（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに多く、しかもその差が統計学的に有意である（＊は、Ｐ＜０．０５を表す）ことは示されている。この結果は、プラスミノーゲンがパーキンソンモデルマウスの黒質ＧＬＰ−１Ｒの発現を促進できることを示している。
【図４８】図４８は高カロリー食により誘発された肥満モデルマウスにプラスミノーゲンを２８日投与した後の体重変化の計算結果を示すものである。２９日目の体重から１日目の体重を差し引いた数値が結果として示されている。その結果、ブランク対照群の体重変化は明らかではなく、プラスミノーゲン投与群の体重は明らかに低下し、溶媒ＰＢＳ投与対照群と比べ、その差が統計学的に有意である（＊は、Ｐ＜０．０５を表す）。これは、プラスミノーゲンが肥満モデルマウスの体重の軽減を促進することができることを示している。
【図４９】図４９は高カロリー食により誘発された肥満モデルマウスにプラスミノーゲンを２８日投与した後の体重指数の統計結果を示すものである。その結果、プラスミノーゲン投与群マウスの体重指数は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに低く、しかもその差が統計学的に有意であり（＊は、Ｐ＜０．０５を表し、＊＊は、Ｐ＜０．０１を表す）、しかも溶媒ＰＢＳ投与対照群と比べ、プラスミノーゲン投与群マウスの体重指数はブランク対照群により近い。これは、プラスミノーゲンが肥満モデルマウスの体重指数を有意に低め、肥満を軽減することができることを示している。
【図５０】図５０は高カロリー食により誘発された肥満モデルマウスにプラスミノーゲンを２８日投与した後のＬｅｅ’ｓ指数の統計結果を示すものである。その結果、プラスミノーゲン投与群マウスのＬｅｅ’ｓ指数は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに低く、しかもその差が統計学的に有意であり（＊は、Ｐ＜０．０５を表す）、しかも溶媒ＰＢＳ投与対照群と比べ、プラスミノーゲン投与群マウスのＬｅｅ’ｓ指数はブランク対照群により近い。これは、プラスミノーゲンが肥満モデルマウスのＬｅｅ’ｓ指数を有意に低め、肥満を軽減することができることを示している。
【図５１】図５１は高カロリー食により誘発された肥満モデルマウスにプラスミノーゲンを２８日投与した後の腹腔脂肪係数の統計結果を示すものである。その結果、プラスミノーゲン投与群マウスの腹腔脂肪係数は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに低く、しかもその差が統計学的に有意であり（＊は、Ｐ＜０．０５を表す）、しかも溶媒ＰＢＳ投与対照群と比べ、プラスミノーゲン投与群マウスの腹腔脂肪含有量はブランク対照群により近い。これは、プラスミノーゲンが肥満モデルマウスの腹腔脂肪の沈着を有意に低めることができることを示している。
【図５２】図５２Ａ〜Ｄは高カロリー食により誘発された肥満モデルマウスにプラスミノーゲンを２８日投与した後の腹腔脂肪のＨ＆Ｅ染色の脂肪空胞面積の統計結果を示すものである。Ａはブランク対照群であり、Ｂは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｃはプラスミノーゲン投与群であり、Ｄは定量分析結果である。その結果、プラスミノーゲン投与群の平均脂肪空胞の面積は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに小さく、その差が統計学的にとても有意であり（＊＊は、Ｐ＜０．０１を表す）、しかも溶媒ＰＢＳ投与対照群と比べ、プラスミノーゲン投与群の脂肪空胞面積はブランク対照群マウスにより近い。これは、プラスミノーゲンが肥満モデルマウスの脂肪細胞の大きさを有意低め、腹腔脂肪の沈着を減少させることができることを示している。
【図５３】図５３Ａ〜Ｃは２４〜２５週齢の糖尿病マウスにプラスミノーゲンを３５日投与した後の肝臓のオイルレッドＯ染色写真である。Ａは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｂはプラスミノーゲン投与群であり、Ｃは定量分析結果である。その結果、プラスミノーゲン投与群マウスの肝臓における脂質沈着面積は溶媒ＰＢＳ投与対照群より有意に小さく、しかもその差が統計学的に有意である（＊は、Ｐ＜０．０５を表す）。これは、プラスミノーゲンが糖尿病マウスの肝臓における脂肪沈着を減少させることができることを示している。
【図５４】図５４Ａ〜ＣはＡｐｏＥアテローム性動脈硬化モデルマウスにプラスミノーゲンを３０日投与した後の肝臓のオイルレッドＯ染色の代表的写真を示すものである。Ａは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｂはプラスミノーゲン投与群であり、Ｃは定量分析結果である。その結果、プラスミノーゲン投与群マウスの肝臓における脂肪沈着は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに少なく、しかも定量分析した結果、その差が統計学的に有意である（＊は、Ｐ＜０．０５を表す）。これは、プラスミノーゲンがアテローム性動脈硬化モデルマウスの肝臓における脂肪沈着を減少させることができることを示している。
【図５５】図５５Ａ〜Ｃは１６週齢の高脂血症モデルマウスにプラスミノーゲンを３０日投与した後の肝臓のオイルレッドＯ染色の観察結果を示すものである。Ａは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｂはプラスミノーゲン投与群であり、Ｃは定量分析結果である。その結果、プラスミノーゲン投与群マウスの肝臓における脂肪沈着は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに少なく、しかも定量分析した結果、その差が統計学的に有意である（＊は、Ｐ＜０．０５を表す）。これは、プラスミノーゲンが高脂血症モデルマウスの肝臓における脂肪沈着を改善できることを示している。
【図５６】図５６Ａ〜Ｄは、Ｃｕｐｒｉｚｏｎｅ誘発性脱ミエリンモデルマウスにプラスミノーゲンを１４日投与した後の脳梁ＬＦＢ染色の結果を示すものである。Ａはブランク対照群であり、Ｂは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｃはプラスミノーゲン投与群であり、Ｄは定量分析結果である。その結果、ブランク対照群の脳梁ミエリンの形態は基本的に正常であり、プラスミノーゲン投与群の脳梁ミエリンの陽性着色（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに多く、しかもその差が統計学的に有意である（＊は、Ｐ＜０．０５を表す）。これは、プラスミノーゲンがｃｕｐｒｉｚｏｎｅ誘発性脱ミエリンモデルマウスの脳梁ミエリンの再生を促進できることを示している。
【図５７】図５７Ａ〜Ｄは、Ｃｕｐｒｉｚｏｎｅ誘発性脱ミエリンモデルマウスにプラスミノーゲンを１４日投与した後のニューロフィラメントタンパク質（ＮＦＰ）の免疫染色の観察結果を示すものである。Ａはブランク対照群であり、Ｂは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｃはプラスミノーゲン投与群であり、Ｄは定量分析結果である。その結果、プラスミノーゲン投与群マウスの脳梁ＮＦＰの発現（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに多く、その差が統計学的に有意であり（＊は、Ｐ＜０．０５を表す）、しかも溶媒ＰＢＳ投与対照群と比べ、プラスミノーゲン投与群の脳梁ＮＦＰの発現はブランク対照群により近い。これは、プラスミノーゲンがＮＦＰの発現を促進でき、これによって神経線維の再生を促進できることを示している。
【図５８】図５８Ａ〜Ｃは、糖尿病性熱傷モデルマウスにプラスミノーゲンを投与した後の熱傷した皮膚のタンパク質遺伝子産物９．５（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ９．５，ＰＧＰ  ９．５）の免疫染色の結果を示すものである。ＡはＰＧＰ９．５染色の代表的写真である。Ａのａ〜ｃはそれぞれ、溶媒ＰＢＳ投与対照群の４、８、１５日目の代表的写真であり、ｄ〜ｆはプラスミノーゲン投与群の４、８、１５日目の代表的写真である。Ｂは投与の４日目および８日目の免疫染色の定量分析結果である。Ｃは投与１５日目の定量分析結果である。その結果、プラスミノーゲン投与群マウスの熱傷した皮膚のＰＧＰ９．５の陽性発現は、溶媒ＰＢＳ投与対照群より高く、しかも二つの群のマウスのＰＧＰ９．５の発現は、８日目にその差が統計学的に有意に近く、１５日目にその差が統計学的に有意である（＊は、Ｐ＜０．０５を表す）。これは、プラスミノーゲンが糖尿病熱傷の皮膚の神経再生を促進できることを示している。
【実施例】
【００７８】
下記の実施例で使用されたヒトプラスミノーゲンは、ドナーの血漿に由来し、文献［１５−１７］に記載されている方法に基づいてプロセスを最適化し、血漿から精製して得られたものである。プラスミノーゲンモノマーの純度は９５％を超える。
【実施例１】
【００７９】
実施例１は、プラスミノーゲンが１４〜１５週齢の糖尿病マウスの膵島ＧＬＰ−１の発現を促進することに関するものである。
１４〜１５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを１２匹取り、実験開始当日を０日目とし、体重を計ってｄｂ／ｄｂマウスの体重によってランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群と溶媒ＰＢＳ投与対照群で各群で６匹ずつとした。一日目からプラスミノーゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、プラスミノーゲン投与群に２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して２８日投与した。２９日目にマウスを殺処分して膵臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。固定後の膵臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水して１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ウサギ抗マウスＧＬＰ−１抗体（Ｗｕｈａｎ  Ｂｏｓｔｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＰＢ０７４２）を滴加して４℃で終夜インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒対比染色をして、流水で５分間流した。アルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させた後、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
グルカゴン様ペプチド‐１（ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ−１，ＧＬＰ−１）は、インクレチンのホルモンであり、正常状況下で発現の量が低く、その発現は、インスリンの分泌を促進し、グルカゴンの分泌を阻害することができる［１８］。
その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群（図１Ａ）のマウスの膵島ＧＬＰ−１の発現（矢印に表記される）はプラスミノーゲン投与群（図１Ｂ）より明らかに少なく、しかもその差が統計学的に有意である（図１Ｃ）（＊は、Ｐ＜０．０５を表す）ことは示されている。この結果は、プラスミノーゲンが比較的に若い（１４〜１５週齢）糖尿病マウスの膵島ＧＬＰ−１の発現を促進できることを示している。
【実施例２】
【００８０】
実施例２は、プラスミノーゲンが２３〜２５週齢の糖尿病マウスの膵島ＧＬＰ−１の発現を促進することに関するものである。
２３〜２５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを１３匹取り、実験開始当日を０日目とし、体重を計ってｄｂ／ｄｂマウスの体重によってランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群（７匹）と溶媒ＰＢＳ投与対照群（６匹）とした。一日目からプラスミノーゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、プラスミノーゲン投与群に２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して２８日投与した。２９日目にマウスを殺処分して膵臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。固定後の膵臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水して１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ウサギ抗マウスＧＬＰ−１抗体（Ｗｕｈａｎ  Ｂｏｓｔｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＰＢ０７４２）を滴加して４℃で終夜インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒対比染色をして、流水で５分間流した。アルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させた後、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群（図２Ａ）のマウスの膵島ＧＬＰ−１の発現（矢印に表記される）はプラスミノーゲン投与群（図２Ｂ）より明らかに少ないことは示されている。この結果は、プラスミノーゲンが比較的に老齢（２３〜２５週齢）糖尿病マウスの膵島ＧＬＰ−１の発現を促進できることを示している。
【実施例３】
【００８１】
実施例３は、プラスミノーゲンが、Ｔ１ＤＭモデルにおけるＰＬＧ＋／＋マウスの膵島ＧＬＰ−１の発現を促進することに関するものである。
９〜１０週齢のＰＬＧ＋／＋オスマウスを８匹取り、ランダムに二つの群に分け、溶媒ＰＢＳ投与対照群とプラスミノーゲン投与群で各群４匹である。この二つの群のマウスを４時間禁食した後、一回経腹腔で２００ｍｇ／ｋｇのＳＴＺ（Ｓｉｇｍａ  Ｓ０１３０）を注射してＩ型糖尿病を誘導した［１９］。注射して１２日後から投薬し始め、投薬開始当日を１日目とし、プラスミノーゲン投与群に１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して２８日投与した。２９日目にマウスを殺処分して膵臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。固定後の膵臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水して１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ウサギ抗マウスＧＬＰ−１抗体（Ｗｕｈａｎ  Ｂｏｓｔｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＰＢ０７４２）を滴加して４℃で終夜インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒対比染色をして、流水で５分間流した。アルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群（図３Ａ）のマウスの膵島ＧＬＰ−１の発現はプラスミノーゲン投与群（図３Ｂ）より明らかに少なく、しかもその差が統計学的に有意である（＊＊は、Ｐ＜０．０１を表す）ことは示されている。この結果は、プラスミノーゲンがＴ１ＤＭマウスの膵島ＧＬＰ−１の発現を促進できることを示している。
【実施例４】
【００８２】
実施例４は、プラスミノーゲンが２４〜２５週齢の糖尿病マウスの膵島α細胞の増殖を減少させ、膵島α細胞の正常な分布を回復し、グルカゴン分泌を低下させることに関するものである。
２４〜２５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを１１匹、ｄｂ／ｍオスマウスを５匹取り、ｄｂ／ｄｂマウスの体重を計ってからランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群に５匹、溶媒ＰＢＳ投与対照群に６匹であり、ｄｂ／ｍマウスを正常対照群とした。投与開始当日を一日目とし、その日からプラスミノーゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、プラスミノーゲン投与群に２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与するか何ら液体も注射せずに、連続して３１日投与した。正常対照群マウスに投与処置をしなかった。３２日目にマウスを殺処分して膵臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。固定後の膵臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水して１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ウサギ抗マウスグルカゴン抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ９２５１７）を滴加して４℃で終夜インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒対比染色をして、流水で５分間流した。アルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
膵島α細胞はグルカゴンを合成、分泌し、主に膵島の周辺区域に分布されている。
その結果、プラスミノーゲン投与群（図４Ｃ）と比べ、溶媒ＰＢＳ投与対照群（図４Ｂ）のグルカゴンの陽性細胞（矢印に表記される）は明らかに増え、陽性細胞は膵島の中央に浸潤する；プラスミノーゲン投与群のグルカゴンの陽性細胞は膵島周辺に散在的に分布し、ＰＢＳ投与対照群と比べ、プラスミノーゲン投与群の膵島形態は正常対照群（４Ａ）により近い。これは、プラスミノーゲンが２４〜２５週齢の糖尿病マウスの膵島α細胞の増殖およびグルカゴンの分泌を顕著に抑制でき、膵島α細胞の分布の乱れを修正できることを示し、プラスミノーゲンが膵島損傷の修復を促進できることを示唆している。
【実施例５】
【００８３】
実施例５は、プラスミノーゲンが２７週齢の糖尿病マウスの膵島α細胞の増殖を抑制させ、膵島α細胞の正常な分布を回復し、グルカゴン分泌を低下させることに関するものである。
２７週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを９匹、ｄｂ／ｍオスマウスを３匹取り、ｄｂ／ｄｂマウスの体重を計ってからランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群に４匹、溶媒ＰＢＳ投与対照群に５匹であり、ｄｂ／ｍマウスを正常対照群とした。投与開始当日を一日目とし、プラスミノーゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、プラスミノーゲン投与群に２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して３５日投与した。正常対照群マウスに投与処置をしなかった。３６日目にマウスを殺処分して膵臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。固定後の膵臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水して１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ウサギ抗マウスグルカゴン抗体（Ａｂｃａｍ）を滴加して４℃で終夜インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒対比染色をして、流水で５分間流した。アルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
膵島α細胞はグルカゴンを合成分泌し、主に膵島の周辺区域に分布されている。
その結果、プラスミノーゲン投与群（図５Ｃ）と比べ、溶媒ＰＢＳ投与対照群（図５Ｂ）のグルカゴンの陽性細胞（矢印に表記される）は明らかに増え、陽性細胞は膵島の中央に浸潤し、しかも平均光学密度定量分析の結果の統計学的差異がある（＊は、Ｐ＜０．０５を表す）（図５Ｄ）；プラスミノーゲン投与群のグルカゴンの陽性細胞は膵島周辺に散在的に分布し、ＰＢＳ投与対照群と比べ、プラスミノーゲン投与群の膵島形態は正常対照群（５Ａ）により近い。これは、プラスミノーゲンが２７週齢の糖尿病マウスの膵島α細胞の増殖およびグルカゴンの分泌を顕著に抑制でき、膵島α細胞の分布の乱れを修正できることを示し、プラスミノーゲンが膵島損傷の修復を促進できることを示唆している。
【実施例６】
【００８４】
実施例６は、プラスミノーゲンがＴ１ＤＭモデルにおけるＰＬＧ＋／＋マウスのグルカゴン分泌を減少させることに関するものである。
９〜１０週齢のＰＬＧ＋／＋オスマウスを１５匹取り、体重によってランダムに二つの群に分け、ブランク対照群（５匹）とモデル群（１０匹）である。モデル群マウスを４時間禁食した後、一回経腹腔で２００ｍｇ／ｋｇ体重でＳＴＺ（Ｓｉｇｍａ，Ｓ０１３０）を注射してＩ型糖尿病を誘導し［１９］、ブランク対照群に対して一回経腹腔で０．２５ｍｌのクエン酸ナトリウム溶液（ｐＨ４．５）を注射した。ＳＴＺ注射して１２日後、血糖値を血糖計で測定し、モデル群マウスを血糖に基づいてランダムに二つの群に分け、溶媒ＰＢＳ投与対照群とプラスミノーゲン投与群で各群５匹ずつとした。群分けしてから投薬し始め、投薬開始当日を一日目とし、プラスミノーゲン投与群に１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して２８日投与した。ブランク対照群マウスに対して投与処置はしなかった。２９日目にマウスを殺処分して膵臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。固定後の膵臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水して１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ウサギ抗マウスグルカゴン抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ９２５１７）を滴加して４℃で終夜インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒対比染色をして、流水で５分間流した。アルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
膵島α細胞はグルカゴンを合成分泌し、主に膵島の周辺区域に分布されている。
その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群（図６Ｂ）のグルカゴンの陽性発現（矢印に表記される）はプラスミノーゲン投与群（図６Ｃ）より明らかに多く、しかも平均光学密度の定量分析の結果として、その差が統計学的に有意であり（＊は、Ｐ＜０．０５を表す）（図６Ｄ）、しかも溶媒ＰＢＳ投与対照群と比べ、プラスミノーゲン投与群はブランク対照群（図６Ａ）により近い。これは、プラスミノーゲンが、ＳＴＺに誘導されたＴ１ＤＭマウスの膵島α細胞のグルカゴンの分泌を顕著に減少させることができることを示している。
【実施例７】
【００８５】
実施例７は、プラスミノーゲンが糖尿病マウスの血糖を降下することに関するものである。
２４〜２５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを８匹取り、ランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群に５匹と溶媒ＰＢＳ投与対照群に３匹である。実験開始当日を０日目として体重を測ってから群分けし、一日目からプラスミノーゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、プラスミノーゲン投与群に２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して３１日投与した。１０、３１日目に１６時間禁食した後、１１、３２日目に血糖試験紙（Ｒｏｃｈｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で血糖検出をした。
その結果、プラスミノーゲン投与群マウスの血糖は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに低く、しかもその差が統計学的に有意である（＊は、Ｐ＜０．０５を表し、＊＊は、Ｐ＜０．０１を表す）。また、投与時間が長くなるにつれて、溶媒ＰＢＳ投与対照群マウスの血糖は上昇する傾向があるに対して、プラスミノーゲン投与群の血糖は徐々に低下する（図７）。これは、プラスミノーゲンが糖尿病動物の血糖を降下する作用があることを示している。
【実施例８】
【００８６】
実施例８は、プラスミノーゲンが糖尿病マウスのフルクトサミンレベルを低下させることに関するものである。
２４〜２５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを５匹取り、血清フルクトサミン濃度の測定のために投薬する前日にマウス１匹ずつ眼球静脈叢から５０μｌ採血し、採血当日を０日目として、１日目にプラスミノーゲンを投与し始め、２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、連続して３１日投与した。３２日目に眼球を摘出して採血し、血清フルクトサミンの濃度を測定した。フルクトサミン濃度について、フルクトサミン測定キット（南京建成、Ａ０３７−２）で測定した。
フルクトサミン濃度は１〜３週間以内の血糖の平均レベルを反映する。その結果、プラスミノーゲン投与後の血清フルクトサミンの濃度は明らかに低下し、投薬前と比べてその差が統計学的に極めて有意である（＊＊は、Ｐ＜０．０１を表す）（図８）。これは、プラスミノーゲンが糖尿病動物の血清フルクトサミンレベルを効果的に降下できることを示している。
【実施例９】
【００８７】
実施例９は、プラスミノーゲンが２７週齢の糖尿病マウスの血清フルクトサミンレベルを低下させることに関するものである。
２７週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを９匹取り、実験開始当日を０日目として体重を測ってから体重によってランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群に４匹と溶媒ＰＢＳ投与対照群に５匹である。プラスミノーゲン投与群に２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与した。一日目からプラスミノーゲンまたはＰＢＳを投与し、連続して３５日投与した。３６日目にマウスを殺処分し、血清フルクトサミンの濃度を測定した。フルクトサミンの濃度をフルクトサミン測定キット（南京建成、Ａ０３７−２）で測定した。
測定の結果、プラスミノーゲン投与群の血清フルクトサミンの濃度は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに低く、その差が統計学的に有意に近いことは示されている（Ｐ＝０．０６）（図９）。これは、プラスミノーゲンが２７週齢の糖尿病マウスの血糖フルクトサミンの濃度を降下できることを示している。
【実施例１０】
【００８８】
実施例１０は、プラスミノーゲンが糖尿病マウスの糖化ヘモグロビンレベルを低下させることに関するものである。
２７週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを９匹取り、体重を計って体重によってランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群に４匹、溶媒ＰＢＳ投与対照群に５匹である。群分けして投与開始当日を一日目とし、その日からプラスミノーゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、プラスミノーゲン投与群に２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して３５日投与した。３５日目にマウスを１６時間禁食し、３６日目に眼球を摘出して採血し、血漿糖化ヘモグロビンの濃度を測定した。
糖化ヘモグロビンの含有量は通常患者の最近８〜１２週間内の血糖コントロール状況を反映することができる。
その結果、プラスミノーゲン投与群マウスの糖化ヘモグロビンのＯＤ値は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに低く、しかもその差が統計学的に有意である（＊＊は、Ｐ＜０．０１を表す）（図１０）。これは、プラスミノーゲンが糖尿病マウスの血漿糖化ヘモグロビンを降下する作用を有することを示している。
【実施例１１】
【００８９】
実施例１１は、プラスミノーゲンが糖尿病マウスの糖耐性能力を改善することに関するものである。
２７週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを９匹、及びｄｂ／ｍマウスを３匹取った。ｄｂ／ｄｂマウスの体重を計って体重によってランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群に４匹、溶媒ＰＢＳ投与対照群に５匹とし、ｄｂ／ｍマウスを正常対照群とした。投与開始当日を一日目とし、その日からプラスミノーゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、プラスミノーゲン投与群に２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して１０日投与した。正常対照群マウスに投与処置をしなかった。１１日目にマウスを１６時間禁食した後、マウス１匹ずつ５ｇ／ｋｇ体重で５％グルコース溶液を腹腔注射により投与し、０、３０、６０、９０、１２０、１８０分に血糖試験紙（Ｒｏｃｈｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で血糖濃度を測定した。
腹腔内ブドウ糖負荷試験（Ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｔｅｓｔ，ＩＰＧＴＴ）は、生体がグルコースに対する耐性能力をテストすることができる。従来技術では、糖尿病患者の耐糖能が低下することが知られている。
実験の結果、グルコースを腹腔に注射した後、プラスミノーゲン投与群マウスの血糖レベルは溶媒ＰＢＳ投与対照群より低く、しかも溶媒ＰＢＳ投与対照群と比べてプラスミノーゲン投与群の糖耐性曲線は正常マウス群により近いことは示されている（図１１）。これは、プラスミノーゲンが糖尿病マウスの耐糖能を明らかに改善できることを示している。
【実施例１２】
【００９０】
実施例１２は、プラスミノーゲンがＴ１ＤＭモデルにおけるＰＬＧ＋／＋マウスの血糖レベルを低下させることに関するものである。
９〜１０週齢のＰＬＧ＋／＋オスマウスを１０匹取り、ランダムに二つの群に分け、溶媒ＰＢＳ投与対照群とプラスミノーゲン投与群で５匹ずつである。二つの群のマウスを４時間禁食した後、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）（ｓｉｇｍａ  Ｓ０１３０）２００ｍｇ／ｋｇを腹腔注射により一回投与してＴ１ＤＭを誘導した［１９］。ＳＴＺ注射して１２日後に投薬し始め、投薬開始当日を一日目とし、プラスミノーゲン投与群に１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して１０日投与した。１１日目にマウスを１６時間禁食した後、血糖試験紙（Ｒｏｃｈｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で血糖を測定した。
その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群マウスの血糖はプラスミノーゲン投与群マウスより明らかに高く、しかもその差が統計学的に極めて有意である（＊＊＊は、Ｐ＜０．００１を表す）（図１２）。これは、プラスミノーゲンがＴ１ＤＭモデルにおけるＰＬＧ＋／＋マウスの血糖レベルを顕著に低下させることができることを示している。
【実施例１３】
【００９１】
実施例１３は、プラスミノーゲンがＴ１ＤＭモデルマウスの糖耐性能力を改善することに関するものである。
９〜１０週齢のＰＬＧ＋／＋オスマウスを１５匹取り、体重によってランダムに二つの群に分け、ブランク対照群（５匹）とモデル群（１０匹）である。モデル群マウスを４時間禁食した後、一回経腹腔で２００ｍｇ／ｋｇでＳＴＺ（Ｓｉｇｍａ，Ｓ０１３０）を注射してＩ型糖尿病を誘導し［１９］、ブランク対照群に対して一回経腹腔で０．２５ｍｌのクエン酸ナトリウム溶液（ｐＨ４．５）を注射した。ＳＴＺ注射して１２日後、血糖値を血糖計で測定し、モデル群マウスを血糖に基づいてランダムに二つの群に分け、溶媒ＰＢＳ投与対照群とプラスミノーゲン投与群で各群５匹ずつとした。群分けしてから投薬し始め、投薬開始当日を一日目とし、プラスミノーゲン投与群に１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して２８日投与した。ブランク対照群マウスに投与処置はしなかった。２８日目にマウスを６時間禁食した後、５ｇ／ｋｇ体重で５％グルコース溶液を腹腔注射により投与し、注射後０、１５、３０、６０、９０分に血糖試験紙（Ｒｏｃｈｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で血糖濃度を測定した。
腹腔内ブドウ糖負荷試験（Ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｔｅｓｔ，ＩＰＧＴＴ）は、生体がグルコースに対する耐性能力をテストすることができる。従来技術では、糖尿病患者の耐糖能が低下することが知られている。
その結果、グルコース注射後、溶媒ＰＢＳ投与対照群マウスの血糖濃度はプラスミノーゲン投与群より明らかに高く、しかも溶媒ＰＢＳ投与対照群と比べてプラスミノーゲン投与群の糖耐性曲線は正常マウス群により近いことは示されている（図１３）。これは、プラスミノーゲンが、ＰＬＧ＋／＋マウスのＴ１ＤＭモデルにおける糖耐性能力を向上させることができることを示している。
【実施例１４】
【００９２】
実施例１４は、プラスミノーゲンがＴ１ＤＭモデルにおけるマウスのグルコース分解能力を向上させることに関するものである。
９〜１０週齢のＣ５７オスマウスを８匹取り、ランダムに二つの群に分け、溶媒ＰＢＳ投与対照群とプラスミノーゲン投与群で４匹ずつである。溶媒ＰＢＳ投与対照群とプラスミノーゲン投与群マウスを４時間禁食した後、２００ｍｇ／ｋｇ体重でストレプトゾトシン（ＳＴＺ）（ｓｉｇｍａ  Ｓ０１３０）を腹腔注射により一回投与してＴ１ＤＭを誘導した［１９］。ＳＴＺ注射して１２日後に投薬し始め、投薬開始当日を一日目とし、プラスミノーゲン投与群に１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して１９日投与した。２０日目にマウスを６時間禁食した後、２ｇ／ｋｇ体重で２０％のグルコースを胃管栄養法により投与し、６０分間後、眼窩静脈叢から採血して遠心分離して上澄み液を取り、グルコース測定キット（上海栄盛３６１５００）により血糖を測定した。
その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群マウスの血糖はプラスミノーゲン投与群マウスの血糖より明らかに高く、しかもその差が統計学的に有意である（Ｐ＝０．０４）（図１４）。これは、プラスミノーゲンがＴ１ＤＭモデルにおけるマウスのグルコース分解能力を向上させることができ、血糖を低下させることができることを示している。
【実施例１５】
【００９３】
実施例１５は、プラスミノーゲンが糖尿病マウスのインスリンの分泌を促進することに関するものである。
２７週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを９匹取り、実験開始当日を０日目とし、体重を計って体重によってランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群に４匹、溶媒ＰＢＳ投与対照群に５匹である。一日目からプラスミノーゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、プラスミノーゲン投与群に２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して３５日投与した。３５日目にマウスを１６時間禁食し、３６日目に眼球を摘出して採血し、遠心分離して上澄み液を取り、インスリン測定キット（Ｍｅｒｃｏｄｉａ  ＡＢ）で取扱説明書に従って血清インスリンレベルを測定した。
測定した結果、プラスミノーゲン投与群の血清インスリンレベルは溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに高く、しかもその差が統計学的に有意である（＊は、Ｐ＜０．０５を表す）（図１５）。これは、プラスミノーゲンが糖尿病マウスのインスリン分泌を顕著に促進することができることを示している。
【実施例１６】
【００９４】
実施例１６は、プラスミノーゲンが糖尿病マウスの膵臓に対する保護作用に関するものである。
２４〜２５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを７匹取り、体重によってランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群に４匹、溶媒ＰＢＳ投与対照群に３匹である。投与開始当日を一日目とし、その日からプラスミノーゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、プラスミノーゲン投与群に２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して３１日投与した。３２日目にマウスを殺処分して膵臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。固定後の膵臓組織をアルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にした後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせさらに浸水してヘマトキシリン及びエオシンで染色（ＨＥ染色）させ、１％塩酸エタノールで分別させ、アンモニア水でブルーイングさせ、さらにアルコールで段階的に脱水させて封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍と４００倍にて観察した。
その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群（図１６Ａ、１６Ｂ）の大部分の膵島が委縮し、委縮した膵島細胞は腺房（矢印に表記される）に置き換えられ、膵島のヘリの腺房が増殖して膵島と腺房との境目があいまいになっている；プラスミノーゲン投与群（図１６Ｃ、１６Ｄ）の大部分の膵島は対照群より面積が大きく、しかも膵島内には腺房増殖がなく、ただ僅かの膵島内に僅かの腺房が残存しており、膵島と腺房との境目がはっきりしていることは示されている。プラスミノーゲン投与群と対照群の、膵島と膵臓との面積比を比較すると、プラスミノーゲン投与群は対照群の倍近くになっていることが分かる（図１６Ｅ）。これは、プラスミノーゲンが糖尿病マウスの膵島損傷の修復を促進できることを示している。
【実施例１７】
【００９５】
実施例１７は、プラスミノーゲンが糖尿病マウスの膵島コラーゲンの沈着を減少させることに関するものである。
２４〜２５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを１６匹取り、体重によってランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群に１０匹、溶媒ＰＢＳ投与対照群に６匹である。投与開始当日を一日目とし、その日からプラスミノーゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、プラスミノーゲン投与群に２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して３１日投与した。３２日目にマウスを殺処分して膵臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。固定後の膵臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水して１回水で洗い、０．１％シリウスレッドで６０分間染色した後、流水で流し、ヘマトキシリンで１分間染色してから流水で流し、１％塩酸エタノールとアンモニア水で分別させてブルーイングさせ、流水で流した。乾燥した後に封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
シリウスレッド染色はコラーゲンを持続的に染色することができ、病理学的切片の特殊の染色方法として、シリウスレッド染色はコラーゲン組織を特異的に示すことができる。
染色の結果、プラスミノーゲン投与群マウス（図１７Ｂ）の膵島コラーゲンの沈着（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図１７Ａ）より明らかに低く、しかもその差が統計学的に有意である（＊は、Ｐ＜０．０５を表す）（図１７Ｃ）ことは示されている。これは、プラスミノーゲンが糖尿病動物の膵島の繊維化を低下させることができることを示している。
【実施例１８】
【００９６】
実施例１８は、プラスミノーゲンが糖尿病マウスの膵島細胞のアポトーシスを減少させることに関するものである。
２４〜２５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを６匹取り、体重によってランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群に４匹、溶媒ＰＢＳ投与対照群に２匹である。投与開始当日を一日目とし、その日からプラスミノーゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、プラスミノーゲン投与群に２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して３１日投与した。３２日目にマウスを殺処分して膵臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。固定後の膵臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水して１回水で洗った。３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、水で２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で１時間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、ウサギ抗マウスＣａｓｐａｓｅ−３抗体（Ｗｕｈａｎ  Ｂｏｓｔｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＢＡ２１４２）を滴加して４℃で終夜インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒対比染色をして、流水で５分間流した。段階的に脱水させて透徹にし、封入させた後、切片を光学顕微鏡下で４００倍にて観察した。
Ｃａｓｐａｓｅ−３は細胞アポトーシス過程において最も主要な末端切断酵素であり、その発現は多ければ多いほど、アポトーシス状態にある細胞が多いことは示される［２０］。
本発明の実験の結果、プラスミノーゲン投与群（図１８Ｂ）のＣａｓｐａｓｅ−３の発現（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図１８Ａ）より明らかに低いことは示されている。これは、プラスミノーゲンが膵島細胞のアポトーシスを減少させることができることを示している。
【実施例１９】
【００９７】
実施例１９は、プラスミノーゲンが１７〜１８週齢の糖尿病マウスのインスリンの発現と分泌を促進することに関するものである。
１７〜１８週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを８匹取り、体重によってランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群と溶媒ＰＢＳ投与対照群で４匹ずつである。投与開始当日を一日目とし、その日からプラスミノーゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、プラスミノーゲン投与群に２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して３５日投与した。３６日目にマウスを殺処分して膵臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。固定後の膵臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水して１回水で洗った。３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、水で２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で１時間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、ウサギ抗マウスインスリン抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ６３８２０）を滴加して４℃で終夜インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒対比染色をして、流水で５分間流した。段階的に脱水させて透徹にし、封入させた後、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
その結果、プラスミノーゲン投与群（図１９Ｂ）のインスリンの発現（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図１９Ａ）より明らかに高く、しかもその差が統計学的に有意に近い（Ｐ＝０．１５）（図１９Ｃ）ことは示されている。これは、プラスミノーゲンが膵島の機能修復を促進でき、インスリンの発現と分泌を促進できることを示している。
【実施例２０】
【００９８】
実施例２０は、プラスミノーゲンが２４〜２５週齢の糖尿病マウスのインスリンの発現と分泌を促進することに関するものである。
２４〜２５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを８匹取り、体重によってランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群に５匹、溶媒ＰＢＳ投与対照群に３匹である。投与開始当日を一日目とし、その日からプラスミノーゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、プラスミノーゲン投与群に２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して３１日投与した。３２日目にマウスを殺処分して膵臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。固定後の膵臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水して１回水で洗った。３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、水で２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で１時間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、ウサギ抗マウスインスリン抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ６３８２０）を滴加して４℃で終夜インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒対比染色をして、流水で５分間流した。段階的に脱水させて透徹にし、封入させた後、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
その結果、プラスミノーゲン投与群（図２０Ｂ）のインスリンの発現（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図２０Ａ）より明らかに高く、しかもその差が統計学的に有意である（Ｐ＝０．０２）（図２０Ｃ）ことは示されている。これは、プラスミノーゲンが膵島の機能を効果的に修復でき、インスリンの発現と分泌を促進できることを示している。
【実施例２１】
【００９９】
実施例２１は、プラスミノーゲンが糖尿病マウスのインスリン合成分泌機能の修復を促進することに関するものである。
２７週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを９匹取り、体重によってランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群に４匹、溶媒ＰＢＳ投与対照群に５匹である。投与開始当日を一日目とし、その日からプラスミノーゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、プラスミノーゲン投与群に２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して３５日投与した。３５日目にマウスを１６時間禁食した後、３６日目にマウスを殺処分して膵臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。固定後の膵臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水して１回水で洗った。３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、水で２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で１時間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、ウサギ抗マウスインスリン抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ６３８２０）を滴加して４℃で終夜インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒対比染色をして、流水で５分間流した。段階的に脱水させて透徹にし、封入させた後、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
その結果、プラスミノーゲン投与群（図２１Ｂ）のインスリンの発現（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図２１Ａ）より明らかに高く、しかもその差が統計学的に極めて有意である（Ｐ＝０．００５）（図２１Ｃ）ことは示されている。これは、プラスミノーゲンが糖尿病マウスの膵島の機能を効果的に修復でき、インスリンの発現と分泌を促進できることを示している。
【実施例２２】
【０１００】
実施例２２は、プラスミノーゲンが２４〜２５週齢の糖尿病マウスの膵島多方向核転写因子ＮＦ−ｋＢの発現を促進することに関するものである。
２４〜２５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを１０匹取り、体重によってランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群に４匹、溶媒ＰＢＳ投与対照群に６匹である。また、ｄｂ／ｍを４匹取って正常対照群とし、正常対照群に対して処置しなかった。投与開始当日を一日目とし、その日からプラスミノーゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、プラスミノーゲン投与群に２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して３１日投与した。３２日目にマウスを殺処分して膵臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。固定後の膵臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水して１回水で洗った。３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、水で２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で１時間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、ウサギ抗マウスＮＦ−ｋＢ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，８２４２）を滴加して４℃で終夜インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒対比染色をして、流水で５分間流した。段階的に脱水させて透徹にし、封入させた後、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
ＮＦ−ｋＢは転写因子タンパクの家族メンバーであり、炎症修復の過程において重要な役割を果たしている［２１］。
本発明の実験の結果、プラスミノーゲン投与群（図２２Ｃ）のＮＦ−ｋＢの発現（矢印に表記される）は正常対照マウス（図２２Ａ）に近く、溶媒ＰＢＳ投与対照群（図２２Ｂ）より明らかに高く、しかもその差が統計学的に有意である（＊は、Ｐ＜０．０５を表す）（図２２Ｄ）ことは示されている。これは、プラスミノーゲンが多方向核転写因子ＮＦ−ｋＢの発現を促進でき、これによって２４〜２５週齢の糖尿病マウスの膵島炎症の修復を促進できることを示している。
【実施例２３】
【０１０１】
実施例２３は、プラスミノーゲンが１７〜１８週齢の糖尿病マウスの膵島α細胞の増殖を減少させ、膵島α細胞の正常な分布を回復し、グルカゴン分泌を低下させることに関するものである。
１７〜１８週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを８匹、ｄｂ／ｍオスマウスを３匹取り、体重によってｄｂ／ｄｂマウスをランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群と溶媒ＰＢＳ投与対照群で４匹ずつであり、ｄｂ／ｍマウスを正常対照群とした。投与開始当日を一日目として、その日からプラスミノーゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、プラスミノーゲン投与群に２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して３５日投与した。正常対照マウスに対しては投与処置はしなかった。３６日目にマウスを殺処分して膵臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。固定後の膵臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水して１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ウサギ抗マウスグルカゴン抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ９２５１７）を滴加して４℃で終夜インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒対比染色をして、流水で５分間流した。アルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
膵島α細胞はグルカゴンを合成、分泌し、主に膵島の周辺区域に散在している。
その結果、プラスミノーゲン投与群（図２３Ｃ）と比べ、溶媒ＰＢＳ投与対照群（図２３Ｂ）のグルカゴンの陽性細胞（矢印に表記される）は明らかに増え、陽性細胞は膵島の中央に浸潤し、しかも平均光学密度の定量分析の結果の統計学的差異がある（＊＊は、Ｐ＜０．０１を表す）（図２３Ｄ）；プラスミノーゲン投与群のグルカゴンの陽性細胞は膵島周辺に散在的に分布し、ＰＢＳ投与対照群と比べ、プラスミノーゲン投与群の膵島形態は正常対照群（図２３Ａ）により近い。これは、プラスミノーゲンが１７〜１８週齢の糖尿病マウスの膵島α細胞の増殖およびグルカゴンの分泌を顕著に抑制でき、膵島α細胞の分布の乱れを修正できることを示し、プラスミノーゲンが膵島損傷の修復を促進できることを示唆している。
【実施例２４】
【０１０２】
実施例２４は、プラスミノーゲンが１７〜１８週齢の糖尿病マウスの膵島インスリン受容体基質２（ＩＲＳ−２）の発現を促進することに関するものである。
１７〜１８週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを７匹、ｄｂ／ｍオスマウスを３匹取り、体重によってｄｂ／ｄｂマウスをランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群に３匹、溶媒ＰＢＳ投与対照群に４匹であり、ｄｂ／ｍマウスを正常対照群とした。投与開始当日を一日目とし、その日からプラスミノーゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、プラスミノーゲン投与群に２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して３５日投与した。正常対照マウスに対して投与処置はしなかった。３６日目にマウスを殺処分して膵臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。固定後の膵臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水して１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ウサギ抗マウスＩＲＳ−２抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ１３４１０１）を滴加して４℃で終夜インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒対比染色をして、流水で５分間流した。アルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
インスリン受容体基質２（Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−２，ＩＲＳ−２）は活性化され得るインスリン受容体チロシンキナーゼに作用される基質であり、インスリン信号伝達経路における重要な分子であり、しかも膵島β細胞の生存に対して極めて重要である。ＩＲＳ−２は膵島β細胞の発現の増加時に保護作用があり、機能性膵島β細胞の維持に対して極めて重要である［２２−２３］。
ＩＲＳ−２免疫組織化学的結果によると、溶媒ＰＢＳ投与対照群マウス（図２４Ｂ）の膵島ＩＲＳ−２の陽性発現（矢印に表記される）はプラスミノーゲン投与群（図２４Ｃ）より明らかに少なく、しかもその差が統計学的に極めて有意であり（＊＊は、ｐ＜０．０１を表す）（図２４Ｄ）、しかも溶媒ＰＢＳ投与対照群と比べ、プラスミノーゲン投与群はブランク対照群（図２４Ａ）により近い。これは、プラスミノーゲンが、１７〜１８週齢の糖尿病マウスの膵島細胞ＩＲＳ−２の発現を効果的に増加させることができることを示している。
【実施例２５】
【０１０３】
実施例２５は、プラスミノーゲンが２４〜２５週齢の糖尿病マウスの膵島ＩＲＳ−２の発現を促進することに関するものである。
２４〜２５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを１１匹、ｄｂ／ｍオスマウスを５匹取り、体重によってｄｂ／ｄｂマウスをランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群に５匹、溶媒ＰＢＳ投与対照群に６匹であり、ｄｂ／ｍマウスを正常対照群とした。投与開始当日を一日目とし、その日からプラスミノーゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、プラスミノーゲン投与群に２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して３１日投与した。正常対照マウスに対して投与処置はしなかった。３２日目にマウスを殺処分して膵臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。固定後の膵臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水して１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ウサギ抗マウスＩＲＳ−２抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ１３４１０１）を滴加して４℃で終夜インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒対比染色をして、流水で５分間流した。アルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
ＩＲＳ−２免疫組織化学的結果によると、溶媒ＰＢＳ投与対照群マウス（図２５Ｂ）の膵島ＩＲＳ−２の陽性発現（矢印に表記される）はプラスミノーゲン投与群（図２５Ｃ）より明らかに少なく、しかもその差が統計学的に有意であり（＊は、Ｐ＜０．０５を表す）（図２５Ｄ）、しかも溶媒ＰＢＳ投与対照群と比べ、プラスミノーゲン投与群は正常対照群（図２５Ａ）により近い。これは、プラスミノーゲンが、２４〜２５週齢の糖尿病マウスの膵島細胞ＩＲＳ−２の発現を効果的に増加させることができることを示している。
【実施例２６】
【０１０４】
実施例２６は、プラスミノーゲンが２７週齢の糖尿病マウスの膵島ＩＲＳ−２の発現を促進することに関するものである。
２７週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを９匹、ｄｂ／ｍオスマウスを３匹取り、体重によってｄｂ／ｄｂマウスをランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群に４匹、溶媒ＰＢＳ投与対照群に５匹であり、ｄｂ／ｍマウスを正常対照群とした。投与開始当日を一日目とし、その日からプラスミノーゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、プラスミノーゲン投与群に２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して３５日投与した。正常対照マウスに対して投与処置はしなかった。３６日目にマウスを殺処分して膵臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。固定後の膵臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水して１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ウサギ抗マウスＩＲＳ−２抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ１３４１０１）を滴加して４℃で終夜インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒対比染色をして、流水で５分間流した。アルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
ＩＲＳ−２免疫組織化学的結果によると、溶媒ＰＢＳ投与対照群マウス（図２６Ｂ）の膵島ＩＲＳ−２の陽性発現（矢印に表記される）はプラスミノーゲン投与群（図２６Ｃ）より明らかに少ない；プラスミノーゲン投与群のＩＲＳ−２発現レベルは正常対照群マウス（図２６Ａ）に近い。これは、プラスミノーゲンが、２７週齢の糖尿病マウスの膵島細胞ＩＲＳ−２の発現を効果的に増加させることができることを示している。
【実施例２７】
【０１０５】
実施例２７は、プラスミノーゲンが、ＰＬＧ＋／＋Ｔ１ＤＭマウスの膵島ＩＲＳ−２の発現を促進することに関するものである。
９〜１０週齢のＰＬＧ＋／＋オスマウスを１５匹取り、体重によってランダムに二つの群に分け、ブランク対照群（５匹）とモデル群（１０匹）である。モデル群マウスを４時間禁食した後、一回経腹腔で２００ｍｇ／ｋｇ体重でＳＴＺ（Ｓｉｇｍａ，Ｓ０１３０）を注射してＩ型糖尿病を誘導し［１９］、ブランク対照群に対して一回経腹腔で０．２５ｍｌのクエン酸ナトリウム溶液（ｐＨ４．５）を注射した。ＳＴＺ注射して１２日後、血糖値を血糖計で測定し、モデル群マウスを血糖に基づいてランダムに二つの群に分け、溶媒ＰＢＳ投与対照群とプラスミノーゲン投与群で各群５匹ずつとした。群分けしてから投薬し始め、投薬開始当日を一日目とし、プラスミノーゲン投与群に１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して２８日投与した。ブランク対照群マウスに投与処置はしなかった。２９日目にマウスを殺処分して膵臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。固定後の膵臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水して１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ウサギ抗マウスＩＲＳ−２抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ１３４１０１）を滴加して４℃で終夜インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒対比染色をして、流水で５分間流した。アルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
ＩＲＳ−２免疫組織化学的結果によると、溶媒ＰＢＳ投与対照群マウス（図２７Ｂ）の膵島ＩＲＳ−２の陽性発現（矢印に表記される）はプラスミノーゲン投与群（図２７Ｃ）より明らかに少なく、しかも溶媒ＰＢＳ投与対照群と比べ、プラスミノーゲン投与群はブランク対照群（図２７Ａ）により近い。これは、プラスミノーゲンが膵島細胞ＩＲＳ−２の発現を効果的に増加させ、インスリン信号伝達を改善し、ＰＬＧ＋／＋Ｔ１ＤＭマウスの膵島β細胞の損傷を減少させることができることを示している。
【実施例２８】
【０１０６】
実施例２８は、プラスミノーゲンが２４〜２６週齢の糖尿病マウスの膵島好中球の浸潤を減少させることに関するものである。
２４〜２６週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを９匹、ｄｂ／ｍオスマウスを３匹取り、ｄｂ／ｄｂオスマウスをランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群に４匹、溶媒ＰＢＳ投与対照群に５匹であり、ｄｂ／ｍマウスを正常対照群とした。実験開始当日を０日目とし、体重を計って群分けをし、実験の２日目からプラスミノーゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、その日を１日目とした。プラスミノーゲン投与群に２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して３５日投与した。３６日目にマウスを殺処分して膵臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。固定後の膵臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水して１回水で洗った。ＥＤＴＡで３０分間修復し、室温で１０分間冷却してから水で柔らかく濯いだ。３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ラット抗マウス好中球抗体（ｃｅｄａｒｌａｎｅ，ＣＬ８９９３ＡＰ）を滴加して４℃で終夜インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ラットＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ９７０５７）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒対比染色をして、流水で５分間流した。アルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で４００倍にて観察した。
好中球は非特異的な細胞性免疫系における重要なメンバーであり、炎症が発生する時、好中球は走化性物質により炎症部位に吸引される。
好中球の免疫組織化学的結果によると、プラスミノーゲン投与群（図２８Ｃ）の陽性発現細胞は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図２８Ｂ）より少なく、しかも溶媒ＰＢＳ投与対照群と比べ、プラスミノーゲン投与群は正常対照群（図２８Ａ）により近い。これは、プラスミノーゲンが糖尿病マウスの膵島好中球の浸潤を減少させることができることを示している。
【実施例２９】
【０１０７】
実施例２９は、プラスミノーゲンが、ＰＬＧ−／−マウスのＴ１ＤＭモデルにおける膵島好中球の浸潤を減少させることに関するものである。
９〜１０週齢のＰＬＧ−／−オスマウスを１０匹取り、体重によってランダムに二つの群に分け、ブランク対照群（３匹）とモデル群（７匹）である。モデル群マウスを４時間禁食した後、一回経腹腔で２００ｍｇ／ｋｇ体重でＳＴＺ（Ｓｉｇｍａ，Ｓ０１３０）を注射してＩ型糖尿病を誘導し［１９］、ブランク対照群に対して一回経腹腔で０．２５ｍｌのクエン酸ナトリウム溶液（ｐＨ４．５）を注射した。ＳＴＺ注射して１２日後、血糖値を血糖計で測定し、モデル群マウスを血糖に基づいてランダムに二つの群に分け、溶媒ＰＢＳ投与対照群（３匹）とプラスミノーゲン投与群（４匹）とした。群分けしてから投薬し始め、投薬開始当日を一日目とし、プラスミノーゲン投与群に１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して２８日投与した。ブランク対照群マウスに投与処置はしなかった。２９日目にマウスを殺処分して膵臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。固定後の膵臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水して１回水で洗った。ＥＤＴＡで３０分間修復し、室温で１０分間冷却してから水で柔らかく濯いだ。３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ラット抗マウス好中球抗体（ｃｅｄａｒｌａｎｅ，ＣＬ８９９３Ａ）を滴加して４℃で終夜インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ラットＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ９７０５７）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒対比染色をして、流水で５分間流した。アルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で４００倍にて観察した。
好中球の免疫組織化学的結果によると、プラスミノーゲン投与群（図２９Ｃ）の陽性発現細胞（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図２９Ｂ）より少なく、しかも溶媒ＰＢＳ投与対照群と比べ、プラスミノーゲン投与群はブランク対照群（図２９Ａ）により近い。これは、プラスミノーゲンが、ＰＬＧ−／−マウスのＴ１ＤＭモデルにおける膵島好中球の浸潤を減少させることができることを示している。
【実施例３０】
【０１０８】
実施例３０は、プラスミノーゲンが、ＰＬＧ＋／＋マウスのＴ１ＤＭモデルにおける膵島好中球の浸潤を減少させることに関するものである。
９〜１０週齢のＰＬＧ＋／＋オスマウスを１５匹取り、体重によってランダムに二つの群に分け、ブランク対照群（５匹）とモデル群（１０匹）である。モデル群マウスを４時間禁食した後、一回経腹腔で２００ｍｇ／ｋｇ体重でＳＴＺ（Ｓｉｇｍａ，Ｓ０１３０）を注射してＩ型糖尿病を誘導し［１９］、ブランク対照群に対して一回経腹腔で０．２５ｍｌのクエン酸ナトリウム溶液（ｐＨ４．５）を注射した。ＳＴＺを注射して１２日後、血糖値を血糖計で測定し、モデル群マウスを血糖に基づいてランダムに二つの群に分け、溶媒ＰＢＳ投与対照群とプラスミノーゲン投与群で各群５匹ずつとした。群分けしてから投薬し始め、投薬開始当日を一日目とし、プラスミノーゲン投与群に１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して２８日投与した。ブランク対照群マウスに対して投与処置はしなかった。２９日目にマウスを殺処分して膵臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。固定後の膵臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水して１回水で洗った。ＥＤＴＡで３０分間修復し、室温で１０分間冷却してから水で柔らかく濯いだ。３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ラット抗マウス好中球抗体（ｃｅｄａｒｌａｎｅ，ＣＬ８９９３Ａ）を滴加して４℃で終夜インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ラットＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ９７０５７）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒対比染色をして、流水で５分間流した。アルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で４００倍にて観察した。
好中球の免疫組織化学的結果によると、プラスミノーゲン投与群（図３０Ｃ）の陽性発現細胞（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図３０Ｂ）より少なく、しかも溶媒ＰＢＳ投与対照群と比べ、プラスミノーゲン投与群はブランク対照群（図３０Ａ）により近い。これは、プラスミノーゲンが、ＰＬＧ＋／＋マウスのＴ１ＤＭモデルにおける膵島好中球の浸潤を減少させることができることを示している。
【実施例３１】
【０１０９】
実施例３１は、プラスミノーゲンが、Ｔ１ＤＭモデルにおけるＰＬＧ−／−マウスのインスリンの合成と分泌を促進することに関するものである。
９〜１０週齢のＰＬＧ−／−オスマウスを１０匹取り、体重によってランダムに二つの群に分け、ブランク対照群（３匹）とモデル群（７匹）である。モデル群マウスを４時間禁食した後、一回経腹腔で２００ｍｇ／ｋｇ体重でＳＴＺ（Ｓｉｇｍａ，Ｓ０１３０）を注射してＩ型糖尿病を誘導し［１９］、ブランク対照群に対して一回経腹腔で０．２５ｍｌのクエン酸ナトリウム溶液（ｐＨ４．５）を注射した。ＳＴＺ注射して１２日後、血糖値を血糖計で測定し、モデル群マウスを血糖に基づいてランダムに二つの群に分け、溶媒ＰＢＳ投与対照群（３匹）とプラスミノーゲン投与群（４匹）とした。群分けしてから投薬し始め、投薬開始当日を一日目とし、プラスミノーゲン投与群に１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して２８日投与した。ブランク対照群マウスに投与処置はしなかった。２９日目にマウスを殺処分して膵臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。固定後の膵臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水して１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ウサギ抗マウスインスリン抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ６３８２０）を滴加して４℃で終夜インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒対比染色をして、流水で５分間流した。アルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
免疫組織化学的結果によると、プラスミノーゲン投与群（図３１Ｃ）のインスリンの陽性発現（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図３１Ｂ）より明らかに多く、しかも溶媒ＰＢＳ投与対照群と比べ、プラスミノーゲン投与群はブランク対照群（図３１Ａ）により近い。これは、プラスミノーゲンが、Ｔ１ＤＭモデルにおけるＰＬＧ−／−マウスのインスリンの合成と分泌を促進できることを示している。
【実施例３２】
【０１１０】
実施例３２は、プラスミノーゲンが、Ｔ１ＤＭモデルにおけるＰＬＧ＋／＋マウスのインスリンの合成と発現を促進することに関するものである。
９〜１０週齢のＰＬＧ＋／＋オスマウスを１５匹取り、体重によってランダムに二つの群に分け、ブランク対照群（５匹）とモデル群（１０匹）である。モデル群マウスを４時間禁食した後、一回経腹腔で２００ｍｇ／ｋｇ体重でＳＴＺ（Ｓｉｇｍａ，Ｓ０１３０）を注射してＩ型糖尿病を誘導し［１９］、ブランク対照群に対して一回経腹腔で０．２５ｍｌのクエン酸ナトリウム溶液（ｐＨ４．５）を注射した。ＳＴＺを注射して１２日後、血糖値を血糖計で測定し、モデル群マウスを血糖に基づいてランダムに二つの群に分け、溶媒ＰＢＳ投与対照群とプラスミノーゲン投与群で各群５匹ずつとした。群分けしてから投薬し始め、投薬開始当日を一日目とし、プラスミノーゲン投与群に１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して２８日投与した。ブランク対照群マウスに対して投与処置はしなかった。２９日目にマウスを殺処分して膵臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。固定後の膵臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水して１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ウサギ抗マウスインスリン抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ６３８２０）を滴加して４℃で終夜インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒対比染色をして、流水で５分間流した。アルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
免疫組織化学的結果によると、プラスミノーゲン投与群（図３２Ｃ）のインスリンの陽性発現（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図３２Ｂ）より明らかに多く、しかも溶媒ＰＢＳ投与対照群と比べ、プラスミノーゲン投与群はブランク対照群（図３２Ａ）により近い。これは、プラスミノーゲンが、Ｔ１ＤＭモデルにおけるＰＬＧ＋／＋マウスのインスリンの合成と発現を促進できることを示している。
【実施例３３】
【０１１１】
実施例３３は、プラスミノーゲンが、ＰＬＧ−／−マウスのＴ１ＤＭモデルにおける膵島多方向核転写因子ＮＦ−ｋＢの発現を促進することに関するものである。
９〜１０週齢のＰＬＧ−／−オスマウスを１０匹取り、体重によってランダムに二つの群に分け、ブランク対照群（３匹）とモデル群（７匹）である。モデル群マウスを４時間禁食した後、一回経腹腔で２００ｍｇ／ｋｇ体重でＳＴＺ（Ｓｉｇｍａ，Ｓ０１３０）を注射してＩ型糖尿病を誘導し［１９］、ブランク対照群に対して一回経腹腔で０．２５ｍｌのクエン酸ナトリウム溶液（ｐＨ４．５）を注射した。ＳＴＺ注射して１２日後、血糖値を血糖計で測定し、モデル群マウスを血糖に基づいてランダムに二つの群に分け、溶媒ＰＢＳ投与対照群（３匹）とプラスミノーゲン投与群（４匹）とした。群分けしてから投薬し始め、投薬開始当日を一日目とし、プラスミノーゲン投与群に１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して２８日投与した。ブランク対照群マウスに投与処置はしなかった。２９日目にマウスを殺処分して膵臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。固定後の膵臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水して１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ウサギ抗マウスＮＦ−ｋＢ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ、８２４２）を滴加して４℃で終夜インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒対比染色をして、流水で５分間流した。アルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
実験の結果、プラスミノーゲン投与群（図３３Ｃ）のＮＦ−ｋＢの発現（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図３３Ｂ）より明らかに高いことは示されている。これは、プラスミノーゲンが多方向核転写因子ＮＦ−ｋＢの発現を促進でき、これによって膵島炎症の修復を促進できることを示している。
【実施例３４】
【０１１２】
実施例３４は、プラスミノーゲンが１７〜１８週齢の糖尿病マウスの膵島多方向核転写因子ＮＦ−ｋＢの発現を促進することに関するものである。
１７〜１８週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを７匹取り、体重によってランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群に３匹、溶媒ＰＢＳ投与対照群に４匹である。投与開始当日を一日目とし、その日からプラスミノーゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、プラスミノーゲン投与群に２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して３５日投与した。３６日目にマウスを殺処分して膵臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。固定後の膵臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水して１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ウサギ抗マウスＮＦ−ｋＢ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ、８２４２）を滴加して４℃で終夜インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒対比染色をして、流水で５分間流した。アルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
本発明の実験の結果、プラスミノーゲン投与群（図３４Ｂ）のＮＦ−ｋＢの発現（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図３４Ａ）より明らかに高いことは示されている。これは、プラスミノーゲンが多方向核転写因子ＮＦ−ｋＢの発現を促進でき、これによって比較的に若い（１７〜１８週齢）糖尿病マウスの膵島炎症の修復を促進できることを示している。
【実施例３５】
【０１１３】
実施例３５は、プラスミノーゲンが２７週齢の糖尿病マウスの多方向核転写因子ＮＦ−ｋＢの発現を促進することに関するものである。
２７週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを９匹、ｄｂ／ｍオスマウスを３匹取り、体重によってｄｂ／ｄｂマウスをランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群に４匹、溶媒ＰＢＳ投与対照群に５匹であり、ｄｂ／ｍマウスを正常対照群とした。投与開始当日を一日目とし、その日からプラスミノーゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、プラスミノーゲン投与群に２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して３５日投与した。正常対照マウスに対して投与処置はしなかった。３６日目にマウスを殺処分して膵臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。固定後の膵臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水して１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ウサギ抗マウスＮＦ−ｋＢ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ、８２４２）を滴加して４℃で終夜インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒対比染色をして、流水で５分間流した。アルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
実験の結果、プラスミノーゲン投与群（図３５Ｃ）のＮＦ−ｋＢの発現（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図３５Ｂ）より明らかに高く、しかも溶媒ＰＢＳ投与対照群と比べ、プラスミノーゲン投与群は正常対照群（図３５Ａ）により近いことは示されている。これは、プラスミノーゲンが比較的に老齢（２７週齢）の糖尿病マウスの多方向核転写因子ＮＦ−ｋＢの発現を促進でき、これによってその膵島炎症の修復を促進できることを示している。
【実施例３６】
【０１１４】
実施例３６は、プラスミノーゲンが２４〜２５週齢の糖尿病マウスの膵島ＴＮＦ−αの発現を促進することに関するものである。
２４〜２５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを１１匹、ｄｂ／ｍオスマウスを５匹取り、体重によってｄｂ／ｄｂマウスをランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群に５匹、溶媒ＰＢＳ投与対照群に６匹であり、ｄｂ／ｍマウスを正常対照群とした。投与開始当日を一日目とし、その日からプラスミノーゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、プラスミノーゲン投与群に２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与するか何ら液体も注射せずに、連続して３１日投与した。正常対照マウスに対して投与処置はしなかった。３２日目にマウスを殺処分して膵臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。固定後の膵臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水して１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ウサギ抗マウスＴＮＦ−α抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ３４６７４）を滴加して４℃で終夜インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒対比染色をして、流水で５分間流した。アルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
腫瘍壊死因子α（Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ−α、ＴＮＦ−α）は主に活性化した単核／マクロファージにより発生し、炎症を促進する重要な因子である［２４］。
本実験研究の結果、プラスミノーゲン投与群（図３６Ｃ）のＴＮＦ−αの陽性発現は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図３６Ｂ）より明らかに高く、しかも溶媒ＰＢＳ投与対照群と比べ、プラスミノーゲン投与群は正常対照群（図３６Ａ）により近いことは示されている。これは、プラスミノーゲンが２４〜２５週齢の糖尿病マウスのＴＮＦ−αの発現を促進でき、膵島損傷の修復を促進できることを示している。
【実施例３７】
【０１１５】
実施例３７は、プラスミノーゲンが２７週齢の糖尿病マウスの膵島ＴＮＦ−αの発現を促進することに関するものである。
２７週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを９匹、ｄｂ／ｍオスマウスを３匹取り、体重によってｄｂ／ｄｂマウスをランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群に４匹、溶媒ＰＢＳ投与対照群に５匹であり、ｄｂ／ｍマウスを正常対照群とした。投与開始当日を一日目とし、その日からプラスミノーゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、プラスミノーゲン投与群に２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して３５日投与した。正常対照マウスに対して投与処置はしなかった。３６日目にマウスを殺処分して膵臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。固定後の膵臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水して１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ウサギ抗マウスＴＮＦ−α抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ３４６７４）を滴加して４℃で終夜インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒対比染色をして、流水で５分間流した。アルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
研究の結果、プラスミノーゲン投与群（図３７Ｃ）のＴＮＦ−αの陽性発現は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図３７Ｂ）より明らかに高く、しかも溶媒ＰＢＳ投与対照群と比べ、プラスミノーゲン投与群は正常対照群（図３７Ａ）により近いことは示されている。これは、プラスミノーゲンが２７週齢の糖尿病マウスのＴＮＦ−αの発現を促進でき、膵島損傷の修復を促進できることを示している。
【実施例３８】
【０１１６】
実施例３８は、プラスミノーゲンが、ＰＬＧ−／−マウスのＴ１ＤＭモデルにおける膵島ＴＮＦ−αの発現を促進することに関するものである。
９〜１０週齢のＰＬＧ−／−オスマウスを１０匹取り、体重によってランダムに二つの群に分け、ブランク対照群（３匹）とモデル群（７匹）である。モデル群マウスを４時間禁食した後、一回経腹腔で２００ｍｇ／ｋｇ体重でＳＴＺ（Ｓｉｇｍａ，Ｓ０１３０）を注射してＩ型糖尿病を誘導し［１９］、ブランク対照群に対して一回経腹腔で０．２５ｍｌのクエン酸ナトリウム溶液（ｐＨ４．５）を注射した。ＳＴＺを注射して１２日後、血糖値を血糖計で測定し、モデル群マウスを血糖に基づいてランダムに二つの群に分け、溶媒ＰＢＳ投与対照群（３匹）とプラスミノーゲン投与群（４匹）とした。群分けしてから投薬し始め、投薬開始当日を一日目とし、プラスミノーゲン投与群に１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して２８日投与した。ブランク対照群マウスに投与処置はしなかった。２９日目にマウスを殺処分して膵臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。固定後の膵臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水して１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ウサギ抗マウスＴＮＦ−α抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ３４６７４）を滴加して４℃で終夜インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒対比染色をして、流水で５分間流した。アルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
本実験研究の結果、プラスミノーゲン投与群（図３８Ｂ）のＴＮＦ−αの陽性発現は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図３８Ａ）より明らかに高いことは示されている。これは、プラスミノーゲンが、ＰＬＧ−／−マウスのＴ１ＤＭモデルにおけるＴＮＦ−αの発現を促進でき、膵島損傷の修復を促進できることを示している。
【実施例３９】
【０１１７】
実施例３９は、プラスミノーゲンが、ＰＬＧ−／−マウスのＴ１ＤＭモデルにおける膵島の損傷を軽減することに関するものである。
９〜１０週齢のＰＬＧ−／−オスマウスを１０匹取り、体重によってランダムに二つの群に分け、ブランク対照群（３匹）とモデル群（７匹）である。モデル群マウスを４時間禁食した後、一回経腹腔で２００ｍｇ／ｋｇ体重でＳＴＺ（Ｓｉｇｍａ，Ｓ０１３０）を注射してＩ型糖尿病を誘導し［１９］、ブランク対照群に対して一回経腹腔で０．２５ｍｌのクエン酸ナトリウム溶液（ｐＨ４．５）を注射した。ＳＴＺを注射して１２日後、血糖値を血糖計で測定し、モデル群マウスを血糖に基づいてランダムに二つの群に分け、溶媒ＰＢＳ投与対照群３匹とプラスミノーゲン投与群４匹とした。群分けしてから投薬し始め、投薬開始当日を一日目とし、プラスミノーゲン投与群に１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して２８日投与した。ブランク対照群マウスに投与処置はしなかった。２９日目にマウスを殺処分して膵臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。固定後の膵臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水して１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ヤギ抗マウスＩｇＭ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ９７２３０）を滴加して室温で１時間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒対比染色をして、流水で５分間流した。アルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
ＩｇＭ抗体はアポトーシスと壊死した細胞の除去過程において重要な役割を果たし、組織器官の損傷局所のＩｇＭ抗体のレベルは、損傷程度と正相関している［２５−２６］。よって、組織器官局所のＩｇＭ抗体のレベルは、該組織器官の損傷状況を反映できる。
研究の結果、プラスミノーゲン投与群（図３９Ｃ）のＩｇＭの陽性発現は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図３９Ｂ）より明らかに低く、溶媒ＰＢＳ投与対照群と比べ、プラスミノーゲン投与群はブランク対照群（図３９Ａ）により近いことは示されている。これは、プラスミノーゲンがＩｇＭの発現を低下させることができることを示し、プラスミノーゲンが、ＰＬＧ−／−マウスのＴ１ＤＭモデルにおける膵島の損傷を軽減できることを示唆している。
【実施例４０】
【０１１８】
実施例４０は、プラスミノーゲンが２４〜２５週齢の糖尿病マウスの膵島細胞のアポトーシスを減少させることに関するものである。
２４〜２５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを１１匹、ｄｂ／ｍオスマウスを５匹取り、体重によってｄｂ／ｄｂマウスをランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群に５匹、溶媒ＰＢＳ投与対照群に６匹であり、ｄｂ／ｍマウスを正常対照群とした。投与開始当日を一日目とし、その日からプラスミノーゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、プラスミノーゲン投与群に２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与するか何ら液体も注射せずに、連続して３１日投与した。正常対照マウスに対して投与処置はしなかった。３２日目にマウスを殺処分して膵臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。固定後の膵臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水して１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、プロテアーゼＫ使用液を滴加して組織を覆い、室温で７分間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで３回洗い、毎回３分間であった。ＴＵＮＥＬキット（Ｒｏｃｈｅ）の試薬１と試薬２との混合液体（５：４５）を滴加し、３７℃恒温で４０分間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで３回洗い、毎回３分間であった。メタノールで調製した３％過酸化水素水（過酸化水素：メタノール＝１：９）を滴加して室温で遮光して２０分間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで３回洗い、毎回３分間であった。ＴＵＮＥＬキットの試薬３を滴加し、３７℃恒温で３０分間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで３回洗い、ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒対比染色をして、流水で５分間流した。アルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で４００倍にて観察した。
ＴＵＮＥＬ染色は、組織細胞がアポトーシスの末期における細胞核ＤＮＡの破断状況を検出するために用いることができる。
本実験研究の結果、正常対照群のＴＵＮＥＬ陽性染色は極めて低い（図４０Ａ）。プラスミノーゲン投与群（図４０Ｃ）の陽性細胞数（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図４０Ｂ）より明らかに少ない。正常対照群のアポトーシス率は約８％であり、溶媒ＰＢＳ投与対照群のアポトーシス率は約９３％であり、プラスミノーゲン投与群のアポトーシス率は約１６％である。これは、プラスミノーゲンが糖尿病マウスの膵島細胞のアポトーシスを顕著に減少させることができることを示している。
【実施例４１】
【０１１９】
実施例４１は、プラスミノーゲンがＴ１ＤＭモデルにおけるマウスのインスリン分泌を改善できることに関するものである。
９〜１０週齢のＣ５７オスマウスを１３匹取り、マウスを４時間禁食した後、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）を（ｓｉｇｍａ  Ｓ０１３０）２００ｍｇ／ｋｇ体重で腹腔注射により一回投与してＴ１ＤＭを誘導した［１９］。ＳＴＺを注射して１２日後に血糖を測定し、血糖によってランダムに二つの群に分け、溶媒ＰＢＳ投与対照群（６匹）とプラスミノーゲン投与群（７匹）とした。群分けしてから投薬し始め、投薬開始当日を一日目とし、プラスミノーゲン投与群に１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して２０日投与した。２１日目にマウスを６時間禁食した後、眼球静脈叢から採血して遠心分離して上澄み液を取り、インスリン測定キット（Ｍｅｒｃｏｄｉａ  ＡＢ）を用いて取扱説明書に従って血清インスリン濃度を測定した。
その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群マウスのインスリン濃度はプラスミノーゲン投与群マウスより明らかに低く、しかもその差が統計学的に有意に近い（Ｐ＝０．０８）（図４１）ことは示されている。これは、プラスミノーゲンがＴ１ＤＭモデルにおけるマウスのインスリン分泌を促進できることを示している。
【実施例４２】
【０１２０】
実施例４２は、プラスミノーゲンが２４〜２５週齢の糖尿病マウスの膵臓ＧＬＰ−１Ｒの発現を促進することに関するものである。
２４〜２５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを１１匹取り、ｄｂ／ｍオスマウスを５匹取り、ｄｂ／ｄｂマウスの体重によってランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群で５匹と溶媒ＰＢＳ投与対照群で６匹とした。ｄｂ／ｍマウスを正常対照群とした。投与開始当日を一日目とし、その日からプラスミノーゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、プラスミノーゲン投与群に２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与するか何ら液体も注射せずに、連続して３１日投与した。正常対照群マウスに対して投与処置はしなかった。３２日目にマウスを殺処分して膵臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。固定後の膵臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水して１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ウサギ抗マウスＧＬＰ−１Ｒ抗体（ＮＯＶＵＳ，ＮＢＰ１−９７３０８）を滴加して４℃で終夜インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒対比染色をして、流水で５分間流した。アルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させた後、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
グルカゴン様ペプチド‐１受容体（ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＧＬＰ−１Ｒ）は、グルカゴン受容体ファミリーメンバーの一つであり、Ｇタンパク質共役受容体であり、インスリン分泌を促進することにより血糖レベルを調節することができる［２７−２８］。
その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群（図４２Ｂ）のマウスの膵島ＧＬＰ−１Ｒの発現（矢印に表記される）は正常対照群マウス（図４２Ａ）より明らかに少なく、プラスミノーゲン投与群（図４２Ｃ）マウスの膵島ＧＬＰ−１Ｒの発現は正常対照群よりも少ないが、溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに多く、しかもその差が統計学的に極めて有意である（＊は、Ｐ＜０．０５を表し、＊＊は、Ｐ＜０．０１表す）（図４２Ｄ）ことは示されている。この結果は、プラスミノーゲンが糖尿病マウスの膵島ＧＬＰ−１Ｒの発現を促進できることを示している。
【実施例４３】
【０１２１】
実施例４３は、プラスミノーゲンが高脂血症モデルマウスの膵臓ＧＬＰ−１Ｒの発現を促進することに関するものである。
９週齢のオスＣ５７マウス１７匹に３％コレストロール高脂肪食（南通トロフィー飼料科技有限公司）を４週間給餌して高脂血症を誘発し［２９−３０］、このモデルを３％コレストロール高脂血症モデルとした。モデル化後のマウスに引き続き３％コレストロール高脂肪食を与えた。また、同じ週齢のオス野生型マウス５匹を取ってブランク対照群とし、実験期間中に通常の維持食を与えた。投薬の３日前に各マウスから５０μＬの血液を採取して総コレステロールを測定し、マウスを総コレステロール濃度と体重によってランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群（９匹）と溶媒ＰＢＳ投与対照群（８匹）とした。投与開始当日を１日目とし、プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して３０日間投与した。ブランク対照群マウスに対して投与処置はしなかった。３１日目にマウスを殺処分して膵臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を２４〜４８時間行った。固定後の組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水して１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ウサギ抗マウスＧＬＰ−１Ｒ抗体（ＮＯＶＵＳ，ＮＢＰ１−９７３０８）を滴加して４℃で終夜インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒対比染色をして、流水で５分間流した。アルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させた後、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群（図４３Ｂ）のマウスの膵島ＧＬＰ−１Ｒの発現（矢印に表記される）は正常対照群マウス（図４３Ａ）より明らかに少なく、プラスミノーゲン投与群（図４３Ｃ）マウスの膵島ＧＬＰ−１Ｒの発現はブランク対照群よりも少ないが、溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに多く、しかもその差が統計学的に極めて有意である（＊＊は、Ｐ＜０．０１表す）（図４３Ｄ）ことは示されている。この結果は、プラスミノーゲンが高脂血症モデルマウスの膵島ＧＬＰ−１Ｒの発現を促進できることを示している。
【実施例４４】
【０１２２】
実施例４４は、プラスミノーゲンが１４〜１５週齢の糖尿病マウスの膵島ＧＬＰ−１Ｒの発現を促進することに関するものである。
１４〜１５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを１２匹取り、実験開始当日を０日目とし、体重を計ってｄｂ／ｄｂマウスの体重によってランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群と溶媒ＰＢＳ投与対照群で各群で６匹ずつとした。一日目からプラスミノーゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、プラスミノーゲン投与群に２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して２８日投与した。２９日目にマウスを殺処分して膵臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。固定後の膵臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水して１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ウサギ抗マウスＧＬＰ−１Ｒ抗体（ＮＯＶＵＳ，ＮＢＰ１−９７３０８）を滴加して４℃で終夜インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒対比染色をして、流水で５分間流した。アルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させた後、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群（図４４Ａ）のマウスの膵島ＧＬＰ−１Ｒの発現（矢印に表記される）はプラスミノーゲン投与群（図４４Ｂ）より明らかに少なく、しかもその差が統計学的に有意に近い（図４４Ｃ）（Ｐ＝０．０９）ことは示されている。この結果は、プラスミノーゲンが比較的に若い（１４〜１５週齢）糖尿病マウスの膵島ＧＬＰ−１Ｒの発現を促進できることを示している。
【実施例４５】
【０１２３】
実施例４５は、プラスミノーゲンがアテローム性動脈硬化モデルマウスの肝臓ＧＬＰ−１Ｒの発現を促進することに関するものである。
６週齢の１８〜２２ｇのオスＡＰＯＥマウス１９匹に高脂肪モデル食（ＴＰ２０３１、南通トロフィー飼料科技有限公司）を１６週間給餌してアテローム性動脈硬化モデルを構築した［３１−３２］。投与の３日前に、すべてのマウスの体重を測って眼球の静脈叢から５０μＬの血液を採取し、血漿ＴＣおよびＨＤＬを測定し、アテローム性動脈硬化指数を計算した。１匹のマウスをランダムに選択し、アテローム性動脈硬化指数によって残りのマウスをランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群と溶媒ＰＢＳ投与対照群で各群９匹ずつとした。群分けしてから投与し始め、投与開始当日を１日目とし、プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して３０日間投与した。３１日目にマウスを殺処分して肝臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を２４〜４８時間行った。固定後の組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水して１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ウサギ抗マウスＧＬＰ−１Ｒ抗体（ＮＯＶＵＳ，ＮＢＰ１−９７３０８）を滴加して４℃で終夜インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒対比染色をして、流水で５分間流した。アルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させた後、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
その結果、プラスミノーゲン投与群（図４５Ｂ）のマウスの肝臓ＧＬＰ−１Ｒの発現（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図４５Ａ）より明らかに多く、しかもその差が統計学的に極めて有意である（図４５Ｃ）（＊＊＊は、Ｐ＜０．００１を表す）ことは示されている。この結果は、プラスミノーゲンがアテローム性動脈硬化モデルマウスの肝臓ＧＬＰ−１Ｒの発現を促進でき、肝臓脂肪の合成、分泌、吸収または酸化を促進し、血中脂質レベルを低下させ、高脂血症を改善する可能性があることを示している。
【実施例４６】
【０１２４】
実施例４６は、プラスミノーゲンが高脂血症モデルマウスの肝臓ＧＬＰ−１Ｒの発現を促進することに関するものである。
９週齢のオスＣ５７マウス１７匹に３％コレストロール高脂肪食（南通トロフィー飼料科技有限公司）を４週間給餌して高脂血症を誘発し［２９−３０］、このモデルを３％コレストロール高脂血症モデルとした。モデル化後のマウスに引き続き３％コレストロール高脂肪食を与えた。投薬の３日前に各マウスから５０μＬの血液を採取して総コレステロールを測定し、マウスを総コレステロール濃度と体重によってランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群（９匹）と溶媒ＰＢＳ投与対照群（８匹）とした。群分けしてから投与し始め、投与開始当日を１日目とし、プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して３０日間投与した。３１日目にマウスを殺処分して肝臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を２４〜４８時間行った。固定後の組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水して１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ウサギ抗マウスＧＬＰ−１Ｒ抗体（ＮＯＶＵＳ，ＮＢＰ１−９７３０８）を滴加して４℃で終夜インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒対比染色をして、流水で５分間流した。アルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させた後、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
その結果、プラスミノーゲン投与群（図４６Ｂ）マウスの肝臓ＧＬＰ−１Ｒの発現（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図４６Ａ）より明らかに多く、しかもその差が統計学的に有意に近い（Ｐ＝０．０９）（図４６Ｃ）ことは示されている。この結果は、プラスミノーゲンが高脂血症モデルマウスの肝臓ＧＬＰ−１Ｒの発現を促進でき、肝臓脂肪の合成、分泌、吸収または酸化を促進し、血中脂質レベルを低下させ、高脂血症を改善する可能性があることを示している。
【実施例４７】
【０１２５】
実施例４７は、プラスミノーゲンがパーキンソンモデルマウスの黒質ＧＬＰ−１Ｒの発現を促進することに関するものである。
９週齢のＣ５７オスマウスを１２匹取り、モデルを構築する１日前に体重を測り、マウスに３０ｍｇ／ｋｇ体重で毎日５ｍｇ／ｍｌ  ＭＰＴＰ溶液を腹腔内注射により投与し、連続して５日間注射してパーキンソンモデルを構築した［３３−３４］。ＭＰＴＰ溶液の調製：１０ｍｌの脱イオン水をシリンジで吸引して、１００ｍｇのＭＰＴＰ粉末（ｓｉｇｍａ、Ｍ０８９６）に加えて１０ｍｇ／ｍｌの母液を作り、そして１ｍｌの母液を吸い取ってアンプルに入れ、１ｍｌの脱イオン水を加え、最終濃度は５ｍｇ／ｍｌである。モデル構築後、マウスをランダムに二つの群に分け、溶媒ＰＢＳ投与対照群とプラスミノーゲン投与群で各群６匹ずつとし、投与し始め、投与開始当日を１日目とし、プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して１４日間投与した。１５日目にマウスを殺処分して迅速に脳を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を２４〜４８時間行った。固定後の脳組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。黒質を決まった位置で切片し、切片の厚みは４μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水して１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ウサギ抗マウスＧＬＰ−１Ｒ抗体（ＮＯＶＵＳ，ＮＢＰ１−９７３０８）を滴加して４℃で終夜インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒対比染色をして、流水で５分間流した。アルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させた後、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
パーキンソン病は、黒質線条体ニューロンのドーパミン作動性シグナルの喪失を特徴とし、黒質線条体もＧＬＰ−１Ｒを発現する［３５］。
その結果、プラスミノーゲン投与群（図４７Ｂ）マウスの黒質ＧＬＰ−１Ｒの発現（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図４７Ａ）より明らかに多く、しかもその差が統計学的に有意である（図４７Ｃ）（＊は、Ｐ＜０．０５を表す）ことは示されている。この結果は、プラスミノーゲンがパーキンソンモデルマウスの黒質ＧＬＰ−１Ｒの発現を促進できることを示している。
【実施例４８】
【０１２６】
実施例４８は、プラスミノーゲンが肥満マウスの体重および脂肪含有量に対する影響に関するものである。
マウスモデルと群分け
８週齢のＣ５７オスマウス１４匹を取って体重によってランダムに二つの群に分け、ブランク対照群で４匹とモデル群で１０匹とした。ブランク対照群マウスに通常の維持食を与え、モデル群マウスに４５％脂肪カロリー高脂肪食（ＴＰ２３０００、南通トロフィー飼料科技有限公司）を１２週間給餌して肥満モデルを建築した［３６］。本文において、４５％脂肪カロリー高脂肪食は高カロリー食と略称される。１２週間後、モデル群マウスの体重を測って体重によってさらにランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群と溶媒ＰＢＳ投与対照群で各群５匹ずつとした。ヒトプラスミノーゲンをＰＢＳに溶けた。プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、ブランク対照群に対しては何の処置もしなかった。上記実験動物に連続して２８日間投与し（投与開始当日を１日目とし）、２９日目に下記処置および測定を行った。
測定と結果
体重測定
上記実験動物に対して１日目、２９日目に体重を測って体重の変化を計算した。２９日目の体重から１日目の体重を差し引いた数値が結果として示されている。
その結果、ブランク対照群の体重変化は明らかではなく、プラスミノーゲン投与群の体重が溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに軽減されて、その差が統計学的に有意である（＊は、Ｐ＜０．０５を表す）（図４８）。これは、プラスミノーゲンが肥満モデルマウスの体重を有意に低めることができることを示している。
体重指数の測定
２９日目に上記マウスに対して体重を測ってマウスの体長を量り、体重指数を計算した。体重指数＝体重（ｋｇ）／体長２（ｍ）。
体重指数は、現在国際的によく使用されている、人体の太り具合および健康であるか否かを量る基準である。体重指数は肥満モデル動物の太り具合の指標とすることもできる［３７−３８］。その結果、プラスミノーゲン投与群マウスの体重指数は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに低く、しかもその差が統計学的に有意であり（＊は、Ｐ＜０．０５を表し、＊＊は、Ｐ＜０．０１を表す）、しかも溶媒ＰＢＳ投与対照群と比べ、プラスミノーゲン投与群マウスの体重指数はブランク対照群により近い（図４９）。これは、プラスミノーゲンが肥満モデルマウスの体重指数を有意に低め、肥満を軽減することができることを示している。
Ｌｅｅ’ｓ指数の測定
上記マウスに対して２９日目に体重を測ってからマウスの体長を量り、Ｌｅｅ’ｓ指数を計算した。Ｌｅｅ’ｓ指数＝３￣体重（ｇ）／体長（ｃｍ）。
Ｌｅｅ’ｓ指数は肥満程度を反映するための有効な指数である［３９−４０］。その結果、プラスミノーゲン投与群マウスのＬｅｅ’ｓ指数は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに低く、しかもその差が統計学的に有意であり（＊は、Ｐ＜０．０５を表す）、しかも溶媒ＰＢＳ投与対照群と比べ、プラスミノーゲン投与群マウスのＬｅｅ’ｓ指数はブランク対照群により近い（図５０）。これは、プラスミノーゲンが肥満モデルマウスのＬｅｅ’ｓ指数を有意に低め、肥満を軽減することができることを示している。
腹腔内脂肪量の検出
上記マウスに対して２９日目に体重を測ってから殺処分し、腹腔脂肪を取って重量を量った。腹腔脂肪係数（％）＝（腹腔脂肪重量／体重）＊１００。
その結果、プラスミノーゲン投与群マウスの腹腔脂肪係数は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに低く、しかもその差が統計学的に有意であり（＊は、Ｐ＜０．０５を表す）、しかもブランク対照群マウスの脂肪係数により近い（図５１）。これは、プラスミノーゲンが肥満モデルマウスの腹腔脂肪の沈着を有意に低めることができることを示している。
腹腔皮下脂肪の空胞面積の検出
２９日目に上記マウスを殺処分し、腹腔脂肪を取って４％パラホルムアルデヒド固定液において２４〜４８時間固定を行った。固定後の組織サンプルをアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは４μｍであり、切片を脱パラフィンさせ、さらに浸水してヘマトキシリン及びエオシンで染色（ＨＥ染色）させ、１％塩酸エタノールで分別させ、アンモニア水でブルーイングさせ、さらにアルコールで段階的に脱水させて封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。Ｉｍａｇｅ−ｐｒｏ  ｐｌｕｓ画像処理ソフトを使って脂肪空胞の面積を分析した。
肥満体のエネルギー摂取がエネルギー消耗を超えると、大量の脂質が脂肪細胞に蓄積して脂肪組織の拡張、すなわち脂肪細胞の増大を引き起こし、脂肪空胞の面積が増えることになる［４１］。
その結果、プラスミノーゲン投与群（図５２Ｃ）の脂肪空胞の面積は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図５２Ｂ）より明らかに小さく、その差が統計学的に極めて有意であり（＊＊は、Ｐ＜０．０１を表す）（図５２Ｄ）、しかも溶媒ＰＢＳ投与対照群と比べ、プラスミノーゲン投与群の脂肪空胞面積はブランク対照群マウスにより近い（図５２Ａ）。これは、プラスミノーゲンが肥満モデルマウスの脂肪細胞の大きさを有意低め、腹腔脂肪の沈着を減少させることができることを示している。
【実施例４９】
【０１２７】
実施例４９は、プラスミノーゲンが肝臓における脂質沈着を低減することに関する研究の一である。
２４〜２５週齢のオスｄｂ／ｄｂマウス１０匹を取り、実験開始当日を０日目として体重を測り、体重によってランダムに二つの群に分け、それぞれ溶媒ＰＢＳ投与対照群とプラスミノーゲン投与群で、各群５匹ずつとした。１日目からプラスミノーゲンまたはＰＢＳを投与し始めた。プラスミノーゲン投与群マウスに２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、３５日間投与した。３６日目にマウスを殺処分して肝臓組織を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において２４〜４８時間固定を行った。それぞれ１５％、３０％スクロース中において４℃で終夜沈めさせ、ＯＣＴで包埋処理を行い、凍結切片の厚みは８μｍであり、オイルレッドＯで１５分間染色し、７５％アルコールで５秒間分別し、そしてヘマトキシリンで３０秒間核を染色し、グリセリンゼラチンに封入させた。切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
オイルレッドＯ染色は、脂質沈着を表し、脂質沈着の程度を反映することができる［４２］。
染色の結果、プラスミノーゲン投与群（図５３Ｂ）のマウスの肝臓における脂肪沈着面積は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図５３Ａ）より明らかに小さく、しかもその差が統計学的に有意である（Ｐ＝０．０２）（図５３Ｃ）。これは、プラスミノーゲンが糖尿病マウスの肝臓における脂肪の沈着を低減できることを示している。
【実施例５０】
【０１２８】
実施例５０は、プラスミノーゲンが肝臓における脂質沈着を低減することに関する研究の二である。
６週齢のオスＡｐｏＥマウス１３匹に高脂肪高コレステロール食（南通トロフィー、ＴＰ２０３１）を１６週間給餌してアテローム性動脈硬化症を誘発した［３１−３２］。モデル化後のマウスに引き続き高脂肪高コレステロール食を与えた。投薬の３日前に各マウスから５０μＬの血液を採取して総コレステロール（Ｔ−ＣＨＯ）含有量を測定し、モデルマウスをＴ−ＣＨＯ含有量によってランダムに二つの群に分け、溶媒ＰＢＳ投与対照群で７匹とプラスミノーゲン投与群で６匹とした。投薬し始めた日を１日目とし、プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、３０日間投与した。投与期間中に引き続きモデル食をマウスに与えた。３１日目にマウスを殺処分して肝臓組織を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において２４〜４８時間固定を行った。それぞれ１５％、３０％スクロース中において４℃で終夜沈めさせ、ＯＣＴで包埋処理を行い、凍結切片の厚みは８μｍであり、オイルレッドＯで１５分間染色し、７５％アルコールで５秒間分別し、そしてヘマトキシリンで３０秒間核を染色し、グリセリンゼラチンに封入させた。切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
染色の結果、プラスミノーゲン投与群（図５４Ｂ）マウスの肝臓における脂肪沈着は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図５４Ａ）より明らかに少なく、しかもその定量分析の差が統計学的に有意である（Ｐ＝０．０２）（図５４Ｃ）。これは、プラスミノーゲンがアテローム性動脈硬化症モデルマウスの肝臓における脂肪の沈着を低減できることを示している。
【実施例５１】
【０１２９】
実施例５１は、プラスミノーゲンが肝臓における脂質沈着を低減することに関する研究の三である。
６週齢のオスＣ５７マウス１１匹に高脂肪高コレステロール食（南通トロフィー、ＴＰ２０３１）を１６週間給餌して高脂血症のモデルを誘発し［２９−３０］、このモデルを１６週齢高脂血症モデルとした。モデル化後のマウスに引き続き高脂肪高コレステロール食を与えた。投薬の３日前に各マウスから５０μＬの血液を採取して総コレステロール（Ｔ−ＣＨＯ）含有量を測定し、モデルマウスをＴ−ＣＨＯ含有量によってランダムに二つの群に分け、溶媒ＰＢＳ投与対照群で６匹とプラスミノーゲン投与群で５匹とした。投薬し始めた日を１日目とし、プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与した。投与期間中にモデル食を引き続きマウスに与えた。３０日間投与し、３１日目にマウスを殺処分して肝臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において２４〜４８時間固定を行った。それぞれ１５％、３０％スクロース中において４℃で終夜沈めさせ、ＯＣＴで包埋処理を行い、凍結切片の厚みは８μｍであり、オイルレッドＯで１５分間染色し、７５％アルコールで５秒間分別し、そしてヘマトキシリンで３０秒間核を染色し、グリセリンゼラチンに封入させた。切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
その結果、プラスミノーゲン投与群（図５５Ｂ）マウスの肝臓における脂肪沈着は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図５５Ａ）より明らかに少なく、しかもその定量分析の差が統計学的に有意である（＊は、Ｐ＜０．０５を表す）（図５５Ｃ）。これは、プラスミノーゲンが高脂血症モデルマウスの肝臓における脂肪の沈着を低減できることを示している。
【実施例５２】
【０１３０】
実施例５２は、プラスミノーゲンがｃｕｐｒｉｚｏｎｅ誘発性脱ミエリンモデルマウスの脳梁ミエリンの再生を促進することに関するものである。
８週齢のＣ５７オスマウスを２０匹取り、ランダムに二つの群に分け、ブランク対照群６匹とモデル群１４匹とした。ブランク対照群マウスに通常の維持食を与え、モデル群マウスに０．２％ｃｕｐｒｉｚｏｎｅモデル食（南通トロフィー飼料科技有限公司）を６週間給餌してマウスミエリン脱落モデルを誘発した［４３］。６週間後、モデル群マウスを体重によってさらにランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群と溶媒ＰＢＳ投与対照群で各群７匹とした。プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、ブランク対照群マウスに対して注射の処置はしなかった。連続して１４日間投与した。投与期間中にすべてのマウスに通常の維持食を与えた。投薬開始当日を１日目とし、１５日目にマウスを解剖して脳を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行い、脱水して包埋した。固定後の組織サンプルをアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。脳組織の冠状切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水した後、ミエリン染色液でＬＦＢ染色を行った。アルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、光学顕微鏡下で観察して写真を撮った。
ＬＦＢ（ｌｕｘｏｌ  ｆａｓｔ  ｂｌｕｅ）染色は、ルクソール‐ファスト‐ブルー染色法を使用してミエリンを染色し、皮質脊髄路の位置決め、ミエリン病変、損傷及び再生修復の形態観察を研究するための効果的な方法である［４４−４５］。
その結果、ブランク対照群（図５６Ａ）の脳梁ミエリンの形態は基本的に正常であり、プラスミノーゲン投与群（図５６Ｃ）の脳梁ミエリンの陽性着色（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図５６Ｂ）より明らかに多く、しかもその差が統計学的に有意である（図５６Ｄ）（＊は、Ｐ＜０．０５を表す）。これは、プラスミノーゲンがｃｕｐｒｉｚｏｎｅ誘発性脱ミエリンモデルマウスの脳梁ミエリンの再生を促進できることを示している。
【実施例５３】
【０１３１】
実施例５３は、プラスミノーゲンが損傷した神経におけるニューロフィラメントタンパク質の発現を促進することに関するものである。
８週齢のＣ５７オスマウスを２０匹取り、ランダムに二つの群に分け、ブランク対照群６匹とモデル群１４匹とした。ブランク対照群マウスに通常の維持食を与え、モデル群マウスに０．２％ｃｕｐｒｉｚｏｎｅモデル食（南通トロフィー飼料科技有限公司）を６週間給餌してマウスミエリン脱落モデルを誘発した［４３］。６週間後、モデル群マウスを体重によってさらにランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群と溶媒ＰＢＳ投与対照群で各群７匹とした。プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、ブランク対照群マウスに対して注射の処置はしなかった。連続して１４日間投与した。投与期間中にすべてのマウスに通常の維持食を与えた。投薬開始当日を１日目とし、１５日目にマウスを解剖して脳を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行い、脱水して包埋した。固定後の組織サンプルをアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。脳組織の冠状切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水して１回水で洗った。クエン酸で３０分間修復し、室温で１０分間冷却してから水で柔らかく濯いだ。３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲んだ。１０％のヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で１時間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ウサギ抗ＮＦＰ抗体（Ａｂｃａｍ，ａｂ２０７１７６）を滴加して４℃で終夜インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒対比染色をして、流水で５分間ブルーイングし、そしてＰＢＳで１回洗った。段階的に脱水させて透徹にして封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
ニューロフィラメントタンパク質（Ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ＮＦＰ）は、神経細胞の軸索の中間フィラメントを形成するタンパク質である。その機能は、弾力性を与えて神経線維を引き伸ばしやすくし、破損を防ぐことであり、細胞骨格の維持、細胞形態の安定化、および軸索輸送において非常に重要である［４６］。
その結果、プラスミノーゲン投与群（図５７Ｃ）マウスの脳梁ＮＦＰの発現（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図５７Ｂ）より明らかに多く、その差が統計学的に有意であり（＊は、Ｐ＜０．０５を表す）、しかも溶媒ＰＢＳ投与対照群と比べ、プラスミノーゲン投与群の脳梁ＮＦＰの発現はブランク対照群（図５７Ａ）により近い。これは、プラスミノーゲンがＮＦＰの発現を促進でき、これによって神経線維の再生を促進できることを示している。
【実施例５４】
【０１３２】
実施例５４は、プラスミノーゲンが皮膚の神経再生を促進することに関するものである。
メスｄｂ／ｄｂマウスを３０匹取り、実験前に、非空腹時血糖（血糖は１５ｍＭ以上である）を測定して体重を測り、マウスを血糖および体重によって二つの群に分け、溶媒ＰＢＳ投与対照群とプラスミノーゲン投与群で各群１５匹ずつとした。すべてのマウスに５０ｍｇ／ｋｇ体重でペントバルビタールナトリウムを腹腔内注射してマウスを麻酔した。マウスを麻酔した後、背中の毛の一部を取り除いた。銅ブロックを沸騰した水で９５〜１００℃に加熱し、取り出した直後にマウスの脱毛部分に垂直して６秒間軽く触れた。接触する際に余分な圧力がかからないようにし、皮膚熱傷モデルを構築した［４７］。モデルを構築して５分後に投与し、プラスミノーゲン投与群マウスに２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与した。投薬開始当日を１日目とし、４、８日目に二つの群のマウスから５匹ずつを取り、殺処分して熱傷した皮膚を取った。１５日目に残りのマウスを殺処分して熱傷した皮膚を取った。皮膚を４％パラホルムアルデヒド固定液において２４〜４８時間固定を行い、パラフィンで包埋処理を行った。切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水して１回水で洗った。クエン酸で３０分間修復し、室温で１０分間冷却してから水で柔らかく濯いだ。３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲んだ。１０％のヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で１時間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ウサギ抗ＰＧＰ９．５抗体（Ａｂｃａｍ，ａｂ１０４０４）を滴加して４℃で終夜インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒対比染色をして、流水で５分間ブルーイングし、そしてＰＢＳで１回洗った。段階的に脱水させて透徹にして封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
タンパク質遺伝子産物９．５（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ９．５，ＰＧＰ  ９．５）は、神経線維における特異的なユビキチンヒドロキシヒドロラーゼである。神経軸索のマーカーとして、抗ＰＧＰ９．５抗体は、ミエリンのないまたはミエリンを有するあらゆる神経線維と結合することができる［４８−４９］。
その結果、プラスミノーゲン投与群マウスの熱傷した皮膚のＰＧＰ９．５の陽性発現は、溶媒ＰＢＳ投与対照群より高く、しかも二つの群のマウスのＰＧＰ９．５の発現は、８日目にその差が統計学的に有意に近く、１５日目にその差が統計学的に有意である（＊は、Ｐ＜０．０５を表す）（図５８）。これは、プラスミノーゲンが糖尿病熱傷の皮膚の神経再生を促進できることを示している。ＡはＰＧＰ９．５染色の代表的写真であり、ａ〜ｃはそれぞれ、溶媒ＰＢＳ投与対照群の４、８、１５日目の代表的写真であり、ｄ〜ｆはプラスミノーゲン投与群の４、８、１５日目の代表的写真である。Ｂは投与の４日目および８日目の免疫染色の定量分析結果である。Ｃは投与１５日目の定量分析結果である。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図５８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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