(57)【要約】トレーサー分析論による複雑な不均一コミュニティの微生物株の解析、その機能的関連性及び相互作用の決定、ならびに微生物アンサンブル（投与される微生物アンサンブル及び接種される微生物アンサンブルを含む）の合成、のための方法、装置、及びシステムが開示される。【選択図】図１０
2020503048.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的生物学的環境における現存微生物を構成、圧倒、及び／または置換するように構成された活性微生物株のバイオアンサンブルの形成方法であって、前記方法が、
少なくとも２つの試料セットを取得すること（各試料セットは、複数の試料を含み、各試料セットは、少なくとも１つの共通環境パラメータを共有する）、
各試料における複数の微生物型を検出し、前記複数の微生物型のうちで検出されたそれぞれの微生物型の絶対細胞数を決定すること、
各試料における特有の第１のマーカー及びその量を測定すること（特有の第１のマーカーはそれぞれ、被検出微生物型の微生物株のマーカーである）、
各試料に存在するそれぞれの微生物株の絶対細胞数を、前記試料における前記検出されたそれぞれの微生物型の絶対数と、前記試料における前記特有の第１のマーカーの数及びその量と、に基づいて決定すること、
それぞれの微生物株に対する少なくとも１つの特有の第２のマーカーを測定して各試料における活性微生物株を決定すること、
前記少なくとも２つの試料セットの各試料についての活性微生物株のリスト及びそのそれぞれの絶対細胞数を得ること、
前記少なくとも２つの試料セットのそれぞれについての少なくとも１つの測定メタデータと共に、前記少なくとも２つの試料セットの各試料についての前記活性微生物株及びそれぞれの絶対細胞数を、ネットワーク解析を使用して解析することで、それぞれの活性微生物株と他のあらゆる活性微生物株と間の連結度、ならびにそれぞれの活性微生物株と前記少なくとも１つの測定メタデータとの間の連結度、を測定すること、
前記解析に基づいて前記活性微生物株のセットから複数の活性微生物株を選択すること（前記選択される活性微生物株は、標的生物学的環境における現存微生物の構成、圧倒、及び／または置換のうちの少なくとも１つを生じさせるように選択される）、ならびに
前記選択された複数の活性微生物株を、それぞれの株の標的絶対細胞数に基づく用量で担体媒体と組み合わせることで、標的生物学的環境における現存微生物を構成、圧倒、及び／または置換するように構成された活性微生物のバイオアンサンブルを形成させること、
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記解析が、ノンパラメトリックネットワーク解析を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
標的生物学的環境の特性を変えるように構築された活性微生物株の活性微生物バイオアンサンブルの形成方法であって、前記方法が、
閉鎖／隔離された生物学的環境に特定量のトレーサーを導入すること、
前記生物学的環境から少なくとも２つの試料を取得すること、
各試料について、トレーサーの存在量を決定すること、
各試料について、１つまたは複数の微生物型の存在を検出し、前記１つまたは複数の微生物型のうちで検出されたそれぞれの微生物型の絶対数を決定すること、
各試料における複数の特有の第１のマーカー及びその相対量を測定すること（特有の第１のマーカーはそれぞれ、被検出微生物型の微生物株のマーカーである）、
各試料について、前記検出されたそれぞれの微生物型の絶対数に対してトレーサー希釈係数及び前記特有の第１のマーカーの相対量を乗じることで、各試料に存在するそれぞれの微生物株の補正絶対細胞数を得ること、
それぞれの微生物株に対する少なくとも１つの特有の第２のマーカーを特定の閾値に基づいて測定して各試料における前記微生物株の活性レベルを決定すること、
前記決定された活性によって前記それぞれの微生物株の補正絶対細胞数をフィルタリングすることで、前記少なくとも２つの試料のそれぞれについての活性微生物株のリスト及びそのそれぞれの補正絶対細胞数を得ること、
前記少なくとも２つの試料のそれぞれについての少なくとも１つの測定メタデータと共に、前記少なくとも２つの試料のそれぞれについての前記活性微生物株のフィルタリングされた補正絶対細胞数を解析すること（前記解析は、活性微生物株の機能及び／または化学を予測することを含む）、
前記解析に基づいて１つまたは複数の微生物株を選択すること、ならびに
前記選択された１つまたは複数の微生物株を担体媒体と組み合わせることで、活性微生物バイオアンサンブルが前記標的生物学的環境に導入されると、前記少なくとも１つの測定メタデータに対応する特性を変えるように構成された前記活性微生物バイオアンサンブルを形成させること、
を含む、前記方法。
【請求項４】
前記解析が、各試料における前記補正活性微生物株と、前記少なくとも１つの測定メタデータと、の共出現を決定することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
各試料における、前記活性微生物株と、前記少なくとも１つの測定メタデータと、の共出現の決定が、メタデータと微生物株との関連性を示すリンケージならびに前記活性微生物株の補正絶対細胞数がまとまったマトリックスを創出して１つまたは複数の不均一微生物コミュニティネットワークを示すことを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記解析が、活性な不均一微生物コミュニティネットワーク内のそれぞれの補正活性微生物株と測定メタデータとの連結度を明らかにするノンパラメトリックネットワーク解析及びクラスター解析のうちの少なくとも１つを含む、請求項３、請求項４、または請求項５のうちの１項に記載の方法。
【請求項７】
標的生物学的環境の特性を変えるように構築された活性微生物株の活性微生物バイオアンサンブルの形成方法であって、前記方法が、
少なくとも１つの共通環境パラメータ特徴を共有する少なくとも２つの試料を取得すること、
各試料について、各試料における１つまたは複数の微生物型の存在を検出し、検出されたそれぞれの微生物型の絶対数を得ること、
各試料における特有の第１のマーカーの数を測定すること（特有の第１のマーカーはそれぞれ、被検出微生物型の微生物株のマーカーである）、
前記それぞれの微生物型の絶対数に対して、前記微生物型に対する前記特有の第１のマーカーの比例数を乗じることで、各試料に存在するそれぞれの微生物株の絶対細胞数を得ること、
それぞれの微生物株に対する少なくとも１つの特有の第２のマーカーを測定することで、各試料における前記微生物株の活性レベルを決定すること、
前記決定された活性によって前記それぞれの微生物株の絶対細胞数をフィルタリングすることで、前記少なくとも２つの試料のそれぞれについての活性微生物株のセット及びそのそれぞれの絶対細胞数を得ること、
前記少なくとも２つの試料と関連する少なくとも１つの測定メタデータと共に、前記少なくとも２つの試料のそれぞれについての前記活性微生物株のフィルタリングされた絶対細胞数を解析すること、
前記解析に基づいて１つまたは複数の微生物株を選択すること、
前記１つまたは複数の選択された微生物株のそれぞれの初期量を、前記少なくとも２つの試料のうちの少なくとも１つに由来する対応絶対細胞数に基づいて決定すること、
前記１つまたは複数の選択された微生物株をそれぞれの初期量で担体媒体と組み合わせることで、第１の活性微生物バイオアンサンブルが標的生物学的環境に導入されると、前記標的生物学的環境の特性を変えるように構成された前記第１の活性微生物バイオアンサンブルを形成させること（前記特性は、前記少なくとも１つの測定メタデータに対応する）、
前記第１の活性微生物バイオアンサンブルを前記標的生物学的環境に導入すること、
前記標的生物学的環境から追加の試料を取得すること、
前記追加の試料について、
前記追加の試料における１つまたは複数の微生物型の存在を検出し、検出されたそれぞれの微生物型の絶対数を得ること、
前記追加の試料における特有の第１のマーカーの数を測定すること（特有の第１のマーカーはそれぞれ、被検出微生物型の微生物株のマーカーである）、
前記それぞれの微生物型の絶対数及び前記特有の第１のマーカーの比例数から前記追加の試料におけるそれぞれの微生物株の絶対細胞数を決定すること、
それぞれの微生物株に対する少なくとも１つの特有の第２のマーカーを測定することで、前記追加の試料における前記微生物株の活性レベルを決定すること、
前記決定された活性によって前記それぞれの微生物株の絶対細胞数をフィルタリングすることで、前記追加の試料ついての活性微生物株のリスト及びそのそれぞれの絶対細胞数を得ること、
前記追加の試料の前記活性微生物株のセット及びそのそれぞれの絶対細胞数と、前記第１の活性微生物バイオアンサンブルの前記１つまたは複数の選択された微生物株のそれぞれの初期量と、を比較すること、
前記第１の活性微生物バイオアンサンブルの前記１つまたは複数の活性微生物株のうちの少なくとも１つの活性微生物株に対する補正量を前記比較に基づいて決定すること、ならびに
前記少なくとも１つの活性微生物株に対する補正量を含む前記１つまたは複数の選択された微生物株と、担体媒体とを組み合わせることで、活性微生物の第２のバイオアンサンブルを形成させること、
を含む、前記方法。
【請求項８】
前記解析が、各試料における前記活性微生物株と、前記少なくとも１つの測定メタデータと、の共出現を決定することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
各試料における、前記活性微生物株と、前記少なくとも１つの測定メタデータと、の共出現の決定が、メタデータと微生物株との関連性を示すリンケージならびに前記活性微生物株の絶対細胞数がまとまったマトリックスを創出して１つまたは複数の不均一微生物コミュニティネットワークを示すことを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記解析が、活性な不均一微生物コミュニティネットワーク内のそれぞれの活性微生物株と測定メタデータとの連結度を明らかにすることを含む、請求項７、請求項８、または請求項９うちの１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記解析が、活性な不均一微生物コミュニティネットワーク内のそれぞれの活性微生物株の間の連結度を明らかにすることを含む、請求項７、請求項８、請求項９、または請求項１０のうちの１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記解析が、ノンパラメトリックネットワーク解析を含む、請求項７、請求項８、請求項９、請求項１０、または請求項１１のうちの１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記解析が、クラスター解析を含む、請求項７、請求項８、請求項９、請求項１０、または請求項１１のうちの１項に記載の方法。
【請求項１４】
標的生物学的環境における現存微生物を構成、圧倒、及び／または置換するように構成された活性微生物株のバイオアンサンブルを形成させることを含む方法であって、前記形成が、
少なくとも２つの試料セットを取得すること（各試料セットは、少なくとも１つの試料を含み、各試料は、少なくとも１つの共通環境パラメータを共有する）、
各試料における複数の微生物型を検出すること、
前記複数の微生物型のうちで各試料において検出されたそれぞれの微生物型の絶対細胞数を決定すること、
各試料における特有の第１のマーカー及びその量を測定すること（特有の第１のマーカーはそれぞれ、被検出微生物型の微生物株のマーカーである）、
各試料に存在するそれぞれの微生物株の絶対細胞数を、前記試料における前記検出されたそれぞれの微生物型の絶対数と、前記試料における前記特有の第１のマーカーの数及びその量と、に基づいて決定すること、
それぞれの微生物株に対する少なくとも１つの特有の第２のマーカーを測定して各試料における活性微生物株を決定すること、
前記少なくとも２つの試料のそれぞれについての活性微生物株のセット及びそのそれぞれの絶対細胞数を得ること、
前記少なくとも２つの試料セットのそれぞれについての少なくとも１つの測定メタデータと共に、前記少なくとも２つの試料セットの各試料についての前記活性微生物株及びそれぞれの絶対細胞数を解析してそれぞれの活性微生物株と測定メタデータとの間の関連性を明らかにすること、
前記解析に基づいて前記活性微生物株のセットから複数の活性微生物株を選択すること（前記選択される活性微生物株は、標的生物学的環境における現存微生物の構成、圧倒、及び／または置換のうちの少なくとも１つを生じさせるように選択される）、ならびに
前記選択された複数の活性微生物株を、それぞれの株の標的絶対細胞数に基づく用量で担体媒体と組み合わせることで、標的生物学的環境における現存微生物を構成、圧倒、及び／または置換するように構成された活性微生物のバイオアンサンブルを形成させること、
を含む、前記方法。
【請求項１５】
特有の第１のマーカー及びその量の測定が、各試料に由来するゲノムＤＮＡをハイスループットシークエンシング反応に供すこと、及び／または各試料に由来するゲノムＤＮＡをメタゲノムシークエンシングに供すこと、のうちの少なくとも１つを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記特有の第１のマーカーが、ｍＲＮＡマーカー、ｓｉＲＮＡマーカー、及び／またはリボソームＲＮＡマーカー、のうちの少なくとも１つを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記特有の第１のマーカーが、シグマ因子、転写因子、ヌクレオシド関連タンパク質、及び／または代謝酵素、のうちの少なくとも１つを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
特有の第１のマーカーの測定が、各試料における特有のゲノムＤＮＡマーカーを測定すること、各試料における特有のＲＮＡマーカーを測定すること、及び／または各試料における特有のタンパク質マーカーを測定すること、のうちの少なくとも１つを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
それぞれの微生物株に対する少なくとも１つの特有の第２のマーカーの測定が、前記少なくとも１つの特有の第２のマーカーの発現レベルを測定することを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記少なくとも１つの特有の第２のマーカーの発現レベルの測定が、試料ｍＲＮＡを遺伝子発現解析に供すことを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記少なくとも１つの特有の第２のマーカーの発現レベルの測定が、各試料またはその一部を質量分析に供すことを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
前記少なくとも１つの特有の第２のマーカーの発現レベルの測定が、各試料またはその一部をメタリボソームプロファイリングまたはリボソームプロファイリングに供すことを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
少なくとも１つの測定メタデータと共に、前記少なくとも２つの試料セットの各試料についての前記活性微生物株及びそれぞれの絶対細胞数を解析することが、ネットワーク内のそれぞれの活性微生物株と前記少なくとも１つの測定メタデータとの連結度を測定するための最大情報係数ネットワーク解析に基づくものである、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１６年１２月２８日出願の米国仮特許出願第６２／４３９，８６７号の優先権及び利益を主張すると共に、本出願は、２０１７年９月１８日出願の米国仮特許出願第６２／５６０，１７４号の優先権及び利益も主張し、前述の出願（複数可）は、参照によってその全体が本明細書に明確に組み込まれる。
【０００２】
本出願は、著作権、マスクワーク、及び／または他の知的財産保護の対象となる材料を含み得る。そのような知的財産のそれぞれの所有者は、本開示が特許庁のファイル／記録に公開される通りに任意の者が本開示を複製する分には意義は唱えないが、その他の場合は、すべての権利を保有する。
【背景技術】
【０００３】
微生物は、コミュニティとして天然に共存しており、さまざまな相互作用に関与する結果、個々のコミュニティメンバーの間では協働も競合も生じる。微生物生態学が進歩したことで、ほとんどのコミュニティには種の多様性及び複雑性が高いレベルで存在することが明らかとなっている。微生物は、環境中の至る所に存在し、生物圏内の多様な生態系に生息している。個々の微生物及びそのそれぞれのコミュニティは、海洋部（深海と海洋表層との両方）、土壌、ならびに動物組織（ヒト組織を含む）などの環境において特有の役割を担っている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本開示は、トレーサー分析論による複雑な不均一コミュニティの微生物株の解析、その機能的関連性及び相互作用の決定、ならびに微生物アンサンブル（投与される微生物アンサンブル及び接種される微生物アンサンブルを含む）の合成、のための方法、装置、及びシステムに関する。
【０００５】
本開示による方法は、トレーサーによる補正及びトレーサーの適用を含む。例えば、いくつかの実施形態は、標的生物学的環境の特性を変えるように構成された活性微生物株の活性微生物バイオアンサンブルを形成するための方法を含み、この方法は、特定量のトレーサーを閉鎖／隔離された環境（例えば、飼料、家畜領域など）に導入すること、及び（例えば、その環境中にトレーサーが分布した後に）その環境から少なくとも２つの試料を取得すること、を含む。各試料について、各試料におけるトレーサーの存在量が決定され、各試料における１つまたは複数の微生物型の存在が検出され、同時に、１つまたは複数の微生物型のうちで各試料において検出されたそれぞれの微生物型の量が検出される。各試料における特有の第１のマーカー及びその量が決定され、特有の第１のマーカーはそれぞれ、被検出微生物型の微生物株のマーカーである。それぞれの微生物型の数に対してトレーサー希釈係数（例えば、投与されたトレーサー量を測定されたトレーサー量で除したもの）及び特有の第１のマーカーの数を乗じることで、各試料に存在するそれぞれの微生物株の補正（体積補正）絶対細胞数が得られる。それぞれの微生物株に対する少なくとも１つの特有の第２のマーカーが特定の閾値に基づいて測定されることで各試料におけるその微生物株の活性レベルが決定された後、決定された活性によってそれぞれの微生物株の補正絶対細胞数をフィルタリングすることで、少なくとも２つの試料のそれぞれついての活性微生物株のリストまたはセット及びそのそれぞれの補正絶対細胞数が得られる。少なくとも２つの試料のそれぞれについての活性微生物株のフィルタリングされた補正絶対細胞数と、少なくとも２つの試料のそれぞれについての少なくとも１つの測定メタデータと、が比較／解析される。活性微生物株は、予測される機能及び／または化学に従って少なくとも２つの群に分類または群化される。少なくとも２つの群のそれぞれから少なくとも１つの微生物株が選択され、選択された微生物株が組み合わせられ、担体媒体と一緒になることで、そのバイオアンサンブルが標的生物学的環境に導入されるとその標的生物学的環境の少なくとも１つのメタデータに対応する特性を変えるように構成された活性微生物のバイオアンサンブルが形成される。
【０００６】
本開示の他の態様は、投与及び投与量の決定を含み、この決定は、トレーサー及び関連方法と共に利用されることも、それらを用いずに利用されることもあり得る。いくつかの実施形態では、投与方法は、少なくとも１つの共通環境パラメータ特徴を共有する少なくとも２つの試料を取得すること、各試料における１つまたは複数の微生物型の存在を検出すること、及び１つまたは複数の微生物型のうちで各試料において検出されたそれぞれの微生物型の数を決定すること、を含む。各試料における特有の第１のマーカー及びその量が測定され、特有の第１のマーカーはそれぞれ、被検出微生物型の微生物株のマーカーである。次に、それぞれの微生物型の数が特有の第１のマーカーの比例数と統合されるか、またはそれぞれの微生物型の数に対して特有の第１のマーカーの比例数が乗じられることで、各試料に存在するそれぞれの微生物株の絶対細胞数が得られる。それぞれの微生物株に対する少なくとも１つの特有の第２のマーカーが特定の閾値に基づいて測定されることで各試料におけるその微生物株の活性レベルが決定された後、決定された活性によってそれぞれの微生物株の絶対細胞数がフィルタリングされることで、少なくとも２つの試料のそれぞれについての活性微生物株のセットまたはリスト及びそのそれぞれの絶対細胞数が得られる。少なくとも２つの試料のそれぞれについての活性微生物株のフィルタリングされた絶対細胞数と、少なくとも２つの試料のそれぞれについての少なくとも１つの測定メタデータと、が比較または解析され、活性微生物株は、予測される機能及び／または化学に従って少なくとも２つの群に分類または群化される。少なくとも２つの群のそれぞれから少なくとも１つの微生物株が選択され、それぞれの選択された微生物株の初期量が、試料の少なくとも１つに由来する対応絶対細胞数に基づいて（またはいくつかの実施形態では、環境に導入されたトレーサーにも基づいて）決定される。選択された微生物株が、それぞれの量で担体媒体と組み合わせられることで、そのバイオアンサンブルが標的生物学的環境に導入されると、その標的生物学的環境の少なくとも１つのメタデータに対応する特性を変えるように構成された活性微生物の第１のバイオアンサンブルが形成される。次に、第１のバイオアンサンブルは、標的生物学的環境に導入される。その後、標的生物学的環境から追加の試料が取得され、追加の試料について、１つまたは複数の微生物型の存在及びその数が決定され、追加の試料における特有の第１のマーカー及びその量が測定され、特有の第１のマーカーはそれぞれ、被検出微生物型の微生物株のマーカーであり、追加の試料におけるそれぞれの微生物株の絶対細胞数が、それぞれの微生物型の数及び特有の第１のマーカーの数から決定された後、それぞれの微生物株に対する少なくとも１つの特有の第２のマーカーが特定の閾値に基づいて測定されることで、試料におけるその微生物株の活性レベルが決定され、決定された活性によってそれぞれの微生物株の絶対細胞数がフィルタリングされることで、追加の試料についての活性微生物株のリストまたはセット及びそのそれぞれの絶対細胞数が得られ、追加の試料についての活性微生物株のリストまたはセット及びそのそれぞれの絶対細胞数と、それぞれの選択された微生物株の初期量と、が比較される。次に、選択された微生物株のうちの少なくとも１つに対する補正量が比較に基づいて決定され、選択された微生物株が、選択された微生物株のうちの少なくとも１つに対する補正量（複数可）を加味して担体媒体と組み合わせられることで、活性微生物の第２のバイオアンサンブルが形成される。
【０００７】
本開示の他の態様は、投与されると、微生物にナイーブな環境に生息するように構成され、及び／または標的生物学的環境における現存微生物を圧倒及び／または置換するように構成されたアンサンブルを製剤化することを含む。例えば、開示の方法は、病的またはナイーブな動物（ヒヨコなど）に投与されるとその動物のＧＩ系に生息するように構成されたアンサンブルを合成するために使用することができ、アンサンブルの微生物／株は、現存微生物を構成／圧倒／置換するように構成される。そのような実施形態は、アンサンブルの再投与が必要ないように構成するか、または定期的な再投与（例えば、１日に１回、１週間に１回、２週間に１回、１ヶ月に１回、３ヶ月に１回、季節ごとに１回、１年に１回など）のみが必要となるように構成することができる。そのような方法は、少なくとも２つの試料または試料セット（各試料セットは、少なくとも１つの試料を含む）を取得すること、各試料における複数の微生物型を検出すること、複数の微生物型のうちで各試料において検出されたそれぞれの微生物型の絶対細胞数を決定すること、各試料における特有の第１のマーカー及びその量を測定すること（特有の第１のマーカーはそれぞれ、被検出微生物型の微生物株のマーカーである）、次に、各試料に存在するそれぞれの微生物株の絶対細胞数を、その試料における検出されたそれぞれの微生物型の数と、その試料における特有の第１のマーカーの数及びその量と、に基づいて決定すること、それぞれの微生物株に対する少なくとも１つの特有の第２のマーカーを測定して各試料における活性微生物株を決定すること、少なくとも２つの試料のそれぞれについての活性微生物株のセット及びそのそれぞれの絶対細胞数を得ること、少なくとも２つの試料セットのそれぞれについての少なくとも１つの測定メタデータと共に、少なくとも２つの試料セットの各試料についての活性微生物株及びそれぞれの絶対細胞数を解析してそれぞれの活性微生物株と測定メタデータとの間の関連性を明らかにすること、を含み得る。次に、解析に基づいて活性微生物株のセットから複数の活性微生物株が選択され、選択される活性微生物株は、標的生物学的環境における現存微生物の構成、圧倒、及び／または置換のうちの少なくとも１つを生じさせるように選択される（例えば、それが導入されると特定の期間にわたって活性を維持し、及び／または他の株と比較して増殖する株が選択される）。選択された複数の活性微生物株は、担体媒体と組み合わせられることで、標的生物学的環境における現存微生物を構成、圧倒、及び／または置換するように構成された活性微生物のバイオアンサンブルが形成される。
【０００８】
本開示の１つの態様では、複数の試料から活性微生物を同定し、同定された微生物を少なくとも１つのメタデータと共に解析し、解析に基づいて微生物のアンサンブルを創出するための方法が開示される。方法の実施形態は、試料における１つまたは複数の活性微生物株の絶対細胞数を決定することを含み、１つまたは複数の活性微生物株は、試料における微生物コミュニティに存在する。１つまたは複数の微生物株は、微生物型の亜分類群（ｓｕｂｔａｘｏｎ）である。本明細書で提供される方法において使用される試料は、任意の環境起源のものであり得る。例えば、１つの実施形態では、試料は、動物、土壌（例えば、バルク土壌もしくは根圏）、空気、塩水、淡水、廃水汚泥、堆積物、油、植物、農産物、植物、または極限環境に由来する。別の実施形態では、動物試料は、血液、組織、歯、汗、爪、皮膚、毛髪、糞便、尿、精液、粘液、唾液、消化管、ルーメン、筋肉、脳、組織、または器官の試料である。追加の用途には、食品、特に発酵食品及び微生物食品（例えば、パン、チーズ、ワイン、ビール、キムチなど）における使用が含まれる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の活性微生物株の絶対細胞数を決定するための方法が提供される。
【０００９】
いくつかの実施形態によれば、標的生物学的環境の特性を変えるように構成された生物反応性の改変剤（ｂｉｏｒｅａｃｔｉｖｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｏｒ）（活性微生物株のバイオアンサンブルなど）の形成方法が提供される。そのような方法は、少なくとも１つの共通環境パラメータ（試料型、試料時期、試料位置、試料源型など）を共有する少なくとも２つの試料（または試料セット）を取得すること、及び各試料における複数の微生物型の存在を検出すること、を含み得る。次に、複数の微生物型のうちで各試料において検出されたそれぞれの微生物型の絶対細胞数が決定され（例えば、非限定的な例として、本明細書で議論される染色手順、細胞選別／ＦＡＣＳなど）、各試料における特有の第１のマーカーの数及びその量が測定され、特有の第１のマーカーはそれぞれ、被検出微生物型の微生物株のマーカーである。ある特定の検出微生物／株は、例えば効率の理由で、実施形態に応じて追加の処理／解析から除外することができる。各試料に存在するいくつかまたはそれぞれの微生物株の絶対細胞数は、その試料における検出されたそれぞれの微生物型の数と、その試料における特有の第１のマーカーの数及びその量と、に基づいて決定される。少なくとも１つの特有の第２のマーカーは、活性（例えば、代謝活性）の指標であり、それぞれの微生物株について測定されることで各試料における活性微生物株が決定され、少なくとも２つの試料のそれぞれについての活性微生物株のセットまたはリスト及びそのそれぞれの絶対細胞数が得られる。少なくとも２つの試料のそれぞれについての少なくとも１つの測定メタデータと共に、少なくとも２つの試料のそれぞれについての活性微生物株及びそれぞれの絶対細胞数が解析されることで、それぞれの活性微生物株と、少なくとも１つの測定メタデータ、各試料の測定メタデータ、及び／または試料セット（複数可）の測定メタデータと、の関連性が明らかにされる。解析に基づいて複数の活性微生物株が選択され、担体媒体と組み合わせられることで、活性微生物のバイオアンサンブルが形成され、この活性微生物のバイオアンサンブルは、このバイオアンサンブルが標的生物学的環境に導入されると、その標的生物学的環境の少なくとも１つの特性（少なくとも１つのメタデータに対応するもの）を変えるように構成されている。実施形態に応じて、メタデータは、１つまたは複数の環境パラメータ（複数可）であり得、試料もしくは試料セットにわたって同一もしくは比較的類似したものであり、及び／または異なる試料もしくは試料セットにわたって異なる値を有し得る。例えば、乳牛のメタデータは、摂食及び乳産生量を含み得、摂食メタデータ値は同一であり得る（すなわち、乳牛には、同一の飼料が与えられる）一方で、乳産生量は異なり得る（すなわち、１頭の乳牛に由来する試料または特定の乳牛群に由来する試料セットは、第２の乳牛に由来する試料または別の乳牛群の試料セットに対応する乳産生量とは異なる平均乳産生量を有する）。
【００１０】
本開示のいくつかの実施形態によれば、微生物コミュニティを解析するための方法が提供される。そのような方法は、少なくとも２つの試料（または少なくとも２つの試料のデータ）を取得すること（各試料は、不均一微生物コミュニティを含む）、及び各試料における複数の微生物型の存在を検出すること、を含み得る。次に、複数の微生物型のうちで各試料において検出されたそれぞれの微生物型の絶対細胞数が決定される（例えば、本明細書で議論されるＦＡＣＳまたは他の方法を介して決定される）。各試料における特有の第１のマーカーの数及びその量が測定され、特有の第１のマーカーはそれぞれ、被検出微生物型の微生物株のマーカーである。１つまたは複数の特有の第２のマーカーの値（活性、濃度、発現など）が測定され（特有の第２のマーカーは、被検出微生物型の特定の微生物株の活性（例えば、代謝活性）の指標である）、１つまたは複数の特有の第２のマーカーの測定値に基づいて（例えば、特定のセット閾値を上回る値に基づいて）それぞれの検出微生物株の活性が決定される。それぞれの活性な検出微生物株の存在比率及び／またはそれぞれの比率が決定される（例えば、それぞれの微生物型についての株の相対量、それぞれの微生物型の数／型当たりのそれぞれの絶対細胞数、それぞれの活性な検出微生物株の絶対細胞数、特有の第１のマーカーの値、特有の第２のマーカーの値などに基づいて決定される）。次に、少なくとも２つの試料の活性な検出微生物株（またはそのサブセット）のそれぞれが解析されることで、それぞれの活性な検出微生物株とその他の活性な検出微生物株との間、ならびにそれぞれの活性な検出微生物株と少なくとも１つの測定メタデータとの間、の関連性及びその強度が明らかにされる。次に、明らかにされた関連性は、表示またはその他の形で出力され、バイオアンサンブルの生成に利用することができる。いくつかの実施形態では、ある特定の強度または重みを上回る関連性のみが表示される。本開示を通じて詳細に示されるように、バイオアンサンブルは、標的環境に導入されると、バイオアンサンブルが標的環境の特性（及び特に、測定メタデータと関連する特性）を変更または変えることができるように構成することができる。
【００１１】
本開示のいくつかの実施形態によれば、方法は、複数の試料における複数の微生物型の存在を検出すること、及び各試料における検出された微生物型のそれぞれの絶対細胞数を決定すること、を含む。各試料における特有の第１のマーカーの数及びその量を測定することができ、特有の第１のマーカーは、微生物株のマーカーである。１つまたは複数の特有の第２のマーカーの値またはレベルが測定され、特有の第２のマーカーは、特定の微生物株の代謝活性の指標である。測定値または測定レベルに基づいて、各試料について検出された微生物株のそれぞれの活性が決定または定義される（例えば、特定の閾値を上回る測定値または測定レベルに基づいて決定または定義される）。試料における検出されたそれぞれの活性微生物株の加重値または細胞補正値が決定される（この加重値または細胞補正値は、相対存在量ではない）。いくつかの実施態様では、加重値または細胞補正値は、すべての株のすべての絶対細胞数の総和に対する１つの株の絶対細胞数である。
【００１２】
各試料（または試料セット）の活性な検出微生物株のそれぞれが解析される。解析は、加重値を有するそれぞれの活性な検出微生物株と加重値を有する他のあらゆる活性微生物株との間、ならびに加重値を有するそれぞれの活性微生物株と１つまたは複数の測定メタデータとの間、の関連性及びその強度を明らかにすることを含み得る。
【００１３】
次に、明らかにされた関連性（ならびにいくつかの実施形態では、加重値及び強度などの関連データ）は、表示またはその他の形で出力することができ、合成アンサンブルの生成に利用することができる。いくつかの実施形態では、それぞれのメタデータについて明らかにされた関連性が表示または出力される。いくつかの実施形態では、表示または出力された関連性によって、疾患の原因となる１つもしくは複数の微生物株が同定されるか、またはその同定が容易になるように当該関連性が構成される。いくつかの実施形態では、表示または出力された関連性によって、疾患または障害を治療するために、１つもしくは複数の微生物株が同定されるか、またはその同定が容易になるように当該関連性が構成される。
【００１４】
いくつかの実施形態では、ある特定の強度または重みを上回る関連性（例えば、特定の閾値または基準値を上回るもの）のみが表示または出力される。本開示を通じて詳細に示されるように、合成アンサンブルは、標的環境に導入されると、合成アンサンブルが標的環境の特性（及び特に、測定メタデータと関連する特性）を変更または変えることができるように構成することができる。いくつかの実施態様では、上記の方法を使用することで、生物学的環境の特性を変えるように構成された活性微生物株の合成アンサンブルを形成させることができ、当該方法は、複数の環境パラメータをそれぞれが有する２つ以上の試料セットに基づいており、複数の環境パラメータの少なくとも１つのパラメータは、２つ以上の試料セットの間で同様の共通環境パラメータであり、少なくとも１つの環境パラメータは、２つ以上の試料セットのそれぞれの間で異なる別の環境パラメータである。いくつかの実施態様では、各試料セットは、生物学的試料源から取得された不均一微生物コミュニティを含む少なくとも１つの試料を含む。いくつかの実施態様では、活性微生物株の少なくとも１つは、１つまたは複数の微生物型の亜分類群である。
【００１５】
本開示のいくつかの実施形態では、１つまたは複数の微生物型は、１つまたは複数の細菌（例えば、マイコプラズマ、球菌、桿菌、リケッチア、スピリルム）、真菌（例えば、糸状菌、酵母）、線形動物、原生動物、古細菌、藻類、渦鞭毛藻類、ウイルス（例えば、バクテリオファージ）、ウイロイド、及び／またはそれらの組み合わせである。１つの実施形態では、１つまたは複数の微生物株は、１つまたは複数の細菌（例えば、マイコプラズマ、球菌、桿菌、リケッチア、スピリルム）、真菌（例えば、糸状菌、酵母）、線形動物、原生動物、古細菌、藻類、渦鞭毛藻類、ウイルス（例えば、バクテリオファージ）、ウイロイド、及び／またはそれらの組み合わせである。別の実施形態では、１つまたは複数の微生物株は、１つまたは複数の真菌種または真菌亜種である。別の実施形態では、１つまたは複数の微生物株は、１つまたは複数の細菌種または細菌亜種である。さらに別の実施形態では、試料は、ルーメン試料である。いくつかの実施形態では、ルーメン試料は、ウシに由来する。さらに別の実施形態では、試料は、消化管試料である。いくつかの実施形態では、消化管試料は、ブタまたはニワトリに由来する。
【００１６】
いくつかの実施形態では、方法は、試料における１つまたは複数の活性微生物株の絶対細胞数を決定することを含み、試料における１つまたは複数の微生物型の存在が検出され、試料における１つまたは複数の微生物型のそれぞれの絶対数が決定される。特有の第１のマーカーの数が、特有の第１のマーカーのそれぞれの量または存在量と共に測定される。本明細書に記載のように、特有の第１のマーカーは、特有の微生物株のマーカーである。次に、１つまたは複数の特有の第２のマーカーの発現のレベルを測定することによってタンパク質レベルまたはＲＮＡレベルで活性が評価される。特有の第２のマーカーは、特有の第１のマーカーと同一または異なり、生物株の活性のマーカーである。特有の第２のマーカーの１つまたは複数の発現レベルに基づいて、（存在するのであれば）どの１つまたは複数の微生物株が活性であるかが決定される。１つの実施形態では、微生物株は、特有の第２のマーカーを、閾値レベルで発現するか、または閾値レベルを上回る割合で発現するのであれば、活性であると見なされる。１つまたは複数の活性微生物株の絶対細胞数は、１つまたは複数の活性微生物株の１つまたは複数の第１のマーカーの量と、１つまたは複数の微生物株が亜分類群となる由来元の微生物型の絶対数と、に基づいて決定される。
【００１７】
１つの実施形態では、試料における１つまたは複数の生物型のそれぞれの数の決定は、核酸シークエンシング、遠心分離、光学顕微鏡法、蛍光顕微鏡法、染色、質量分析、マイクロフルイディクス、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、またはフローサイトメトリーに、試料またはその一部を供すことを含む。
【００１８】
１つの実施形態では、試料における特有の第１のマーカーの数の測定は、特有のゲノムＤＮＡマーカーの数の測定を含む。別の実施形態では、試料における特有の第１のマーカーの数の測定は、特有のＲＮＡマーカーの数の測定を含む。別の実施形態では、試料における特有の第１のマーカーの数の測定は、特有のタンパク質マーカーの数の測定を含む。別の実施形態では、試料における特有の第１のマーカーの数の測定は、特有の代謝物マーカーの数の測定を含む。別の実施形態では、試料における特有の代謝物マーカーの数の測定は、特有の糖質マーカー、特有の脂質マーカー、またはそれらの組み合わせ、の数の測定を含む。
【００１９】
別の実施形態では、特有の第１のマーカーの数及びその量の測定は、試料に由来するゲノムＤＮＡをハイスループットシークエンシング反応に供すことを含む。特有の第１のマーカーの測定は、１つの実施形態では、マーカーに特異的な反応を含み、この反応は、例えば、特有の第１のマーカーに特異的なプライマーを用いて実施される。別の実施形態では、メタゲノム手法が採られる。
【００２０】
１つの実施形態では、１つまたは複数の特有の第２のマーカーの発現レベルの測定は、試料におけるＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、及び／またはｍＲＮＡ）を発現解析に供すことを含む。別の実施形態では、遺伝子発現解析は、シークエンシング反応を含む。さらに別の実施形態では、ＲＮＡ発現解析は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、メタトランスクリプトームシークエンシング、及び／またはトランスクリプトームシークエンシングを含む。
【００２１】
いくつかの実施形態では、試料における特有の第２のマーカーの数の測定は、特有のタンパク質マーカーの数の測定を含む。いくつかの実施形態では、試料における特有の第２のマーカーの数の測定は、特有の代謝物マーカーの数の測定を含む。いくつかの実施形態では、試料における特有の代謝物マーカーの数の測定は、特有の糖質マーカーの数の測定を含む。いくつかの実施形態では、試料における特有の代謝物マーカーの数の測定は、特有の脂質マーカーの数の測定を含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の微生物株の絶対細胞数は、複数の試料において測定される。別の実施形態では、複数の試料は、同一の環境または同様の環境から取得される。いくつかの実施形態では、複数の試料は、複数の時点で取得される。
【００２２】
いくつかの実施形態では、１つまたは複数の特有の第２のマーカーのレベルの測定は、試料またはその一部を質量分析に供すことを含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の特有の第２のマーカーの発現レベルの測定は、試料またはその一部をメタリボソームプロファイリング及び／またはリボソームプロファイリングに供すことを含む。
【００２３】
本開示の別の態様では、１つまたは複数の活性微生物株の絶対細胞数を決定するための方法では、複数の試料で決定がなされ、絶対細胞数レベルは、１つまたは複数のメタデータ（例えば、環境）パラメータに関連付けられる。１つまたは複数のメタデータパラメータに絶対細胞数レベルを関連付けることは、１つの実施形態では、共出現測定、相互情報量測定、連鎖解析、及び／または同様のものを含む。１つの実施形態では、１つまたは複数のメタデータパラメータは、第２の活性微生物株の存在である。したがって、この方法の実施形態の１つでは、微生物コミュニティにおける１つまたは複数の活性微生物株と環境パラメータとの共出現を決定するために絶対細胞数値が使用される。別の実施形態では、１つまたは複数の活性微生物株の絶対細胞数レベルは、微生物コミュニティの取得源である環境の環境パラメータ（摂食条件、ｐＨ、栄養素、または温度など）に関連付けられる。
【００２４】
この態様では、１つまたは複数の活性微生物株の絶対細胞数は、１つまたは複数の環境パラメータに関連付けられる。環境パラメータは、試料自体のパラメータであり得、例えば、ｐＨ、温度、試料におけるタンパク質量、コミュニティにおける他の微生物の存在である。１つの実施形態では、パラメータは、試料の取得源である宿主の特定のゲノム配列（例えば、特定の遺伝子変異）である。あるいは、環境パラメータは、微生物コミュニティの独自性の変化に影響を与えるパラメータであるか（すなわち、微生物コミュニティの「独自性」は、コミュニティにおける微生物株の型及び／または特定の微生物株の数によって特徴付けられる）、あるいは微生物コミュニティの独自性の変化によって影響を受けるパラメータである。例えば、１つの実施形態では、環境パラメータは、動物の食物摂取量であるか、あるいは泌乳反芻動物によって産生する乳汁の量（または乳汁のタンパク質もしくは脂肪の含量）である。本明細書に記載の実施形態のいくつかでは、環境パラメータは、メタデータパラメータと称される。
【００２５】
１つの実施形態では、試料における１つまたは複数の活性微生物株の共出現の決定は、１つまたは複数の環境パラメータと活性微生物株との関連性を示すリンケージがまとまったマトリックスを創出することを含む。
【００２６】
１つの実施形態では、１つまたは複数の活性生物株とメタデータパラメータとの共出現の決定は、ネットワーク内の株の連結度を測定するためのネットワーク解析方法及び／またはクラスター解析方法を含み、ネットワークは、共通または同様の環境パラメータを共有する２つ以上の試料がまとまったものである。いくつかの実施形態では、ネットワーク解析及び／またはネットワーク解析方法は、グラフ理論、種コミュニティルール、固有ベクトル／モジュラリティマトリックス、ガンビット・オブ・ザ・グループ（Ｇａｍｂｉｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｒｏｕｐ）、及び／またはネットワーク測定、のうちの１つまたは複数を含む。いくつかの実施態様では、ネットワーク測定は、観測マトリックス、時間集合（ｔｉｍｅ−ａｇｇｒｅｇａｔｅｄ）ネットワーク、階層的クラスター解析、ノード−レベル特徴量、及び／またはネットワークレベル特徴量、のうちの１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、ノード−レベル特徴量は、次数、強度、媒介中心性、固有ベクトル中心性、ページランク、及び／または到達性（ｒｅａｃｈ）、のうちの１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、ネットワークレベル特徴量は、密度、同類性／次数相関、及び／または推移性、のうちの１つまたは複数を含む。
【００２７】
いくつかの実施形態では、ネットワーク解析は、連鎖解析、モジュラリティ解析、頑健性測定、媒介性測定、連結度測定、推移性測定、中心性測定、またはそれらの組み合わせを含む。別の実施形態では、クラスター解析方法は、連結度モデル、部分空間モデル、分布モデル、密度モデル、または重心モデルを構築することを含む。別の実施形態では、ネットワーク解析は、リンクのマイニング及び予測、集団分類、リンクに基づくクラスタリング、関連類似度、またはそれらの組み合わせを介するネットワークの予測モデリングを含む。別の実施形態では、ネットワーク解析は、連結度を確立するための、変数間の相互情報量、最大情報係数計算、または他のノンパラメトリック法を含む。別の実施形態では、ネットワーク解析は、微分方程式に基づく集団のモデリングを含む。別の実施形態では、ネットワーク解析は、Ｌｏｔｋａ−Ｖｏｌｔｅｒｒａモデリングを含む。
【００２８】
解析に基づいて、株関連性を表示もしくはその他の形で出力することができ、及び／または微生物アンサンブルに含めるための１つもしくは複数の活性な関連株が同定される。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】いくつかの実施形態のうちの、トレーサーに基づく実施態様に関する高レベル処理フローの例を示す。
【図１−１】いくつかの実施形態による、実験動物における株の存在量及び活性を示す。
【図１−２】いくつかの実施形態による、対照動物における株の存在量及び活性を示す。
【図１−３】いくつかの実施形態による、有効性試験の間に産生した平均エネルギー補正乳量を示す。
【図１Ａ】複雑な不均一コミュニティに由来する微生物株をスクリーニング及び解析し、その機能的関連性及び相互作用を予測し、それに基づいて微生物アンサンブルを選択及び合成するための高レベル処理フローの、いくつかの実施形態による例を示す。
【図１Ｂ】１つまたは複数の活性微生物株の絶対細胞数を決定するための、いくつかの実施形態による一般的な処理フローを示す。
【図１Ｃ】微生物コミュニティを解析し、型／株−メタデータの関連性を決定し、表示し、バイオアンサンブルを生成するための、いくつかの実施形態による処理フローを示す。
【図１Ｄ】解析された株及び関連性を視覚的に出力した、いくつかの実施形態による例を示す。
【図１Ｅ】いくつかの実施形態による、ルーメン細菌及び乳脂肪効率に対するＭＩＣスコアの分布を示す。
【図１Ｆ】いくつかの実施形態による、ルーメン真菌及び乳脂肪効率に対するＭＩＣスコアの分布を示す。
【図１Ｇ】いくつかの実施形態による、ルーメン細菌及び乳効率（Ｄａｉｒｙ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）に対するＭＩＣスコアの分布を示す。
【図１Ｈ】いくつかの実施形態による、ルーメン真菌及び乳効率に対するＭＩＣスコアの分布を示す。
【図２】試料（複数可）における１つまたは複数の活性微生物株と、１つまたは複数のメタデータ（環境）パラメータと、の共出現を決定する、いくつかの実施形態による一般的な処理フローを示す。
【図３Ａ】図３Ａは、微生物の相互作用解析及び選択を行うシステム３００の、いくつかの実施形態による例を示す模式図である。図３Ｂは、そのようなシステムで使用するための処理フローの例である。天然の微生物コミュニティ内の多次元の種間相互作用及び依存度を決定し、活性微生物を同定し、複数の活性微生物を選択することで、特定のパラメータ（複数可）及び／または関連指標を変えることになる微生物のアンサンブル、集合物、または他の合成集団を形成するためのシステム及び処理が、図３Ａ及び図３Ｂと関連して記載される。
【図３Ｂ】図３Ａは、微生物の相互作用解析及び選択を行うシステム３００の、いくつかの実施形態による例を示す模式図である。図３Ｂは、そのようなシステムで使用するための処理フローの例である。天然の微生物コミュニティ内の多次元の種間相互作用及び依存度を決定し、活性微生物を同定し、複数の活性微生物を選択することで、特定のパラメータ（複数可）及び／または関連指標を変えることになる微生物のアンサンブル、集合物、または他の合成集団を形成するためのシステム及び処理が、図３Ａ及び図３Ｂと関連して記載される。
【図３Ｃ】本開示のいくつかの態様を示すデータの例を示す。
【図３Ｄ】本開示のいくつかの態様を示すデータの例を示す。
【図４】乳牛における乳脂肪の産生に影響を与えるルーメン微生物コミュニティ構成要素を決定するための実験の過程にわたって産生した乳脂肪のポンドが非線形性を有することを示す。
【図５】標的株Ａｓｃｕｓ＿７１３の、活性でフィルタリングした絶対細胞数と、産生した乳脂肪のポンド（ｌｂ）と、の相関を示す。
【図６】標的株Ａｓｃｕｓ＿７の、活性でフィルタリングした絶対細胞数と、実験過程にわたって産生した乳脂肪のポンド（ｌｂ）と、を示す。
【図７】標的株Ａｓｃｕｓ＿３０３８の、活性でフィルタリングしていない相対存在量と、産生した乳脂肪のポンド（ｌｂ）と、の相関を示す。
【図８】開示の方法に従って調製した微生物アンサンブルを乳牛に投与した実地試験の結果を示す。図８Ａは、産生した乳脂肪の平均ポンド数を経時的に示す。図８Ｂは、産生した乳タンパク質の平均ポンド数を経時的に示す。図８Ｃは、産生したエネルギー補正乳量（ＥＣＭ）の平均ポンド数を経時的に示す。
【図９】本開示のいくつかの実施形態の実施態様についての追加詳細を示す。
【図１０】本開示のいくつかの実施形態の実施態様についての追加詳細を示す。
【図１１】本開示のいくつかの実施形態の実施態様についての追加詳細を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
多くの異なる型の生態系ならびに地球の生物地球化学における環境プロセス（例えば、栄養素の循環及び炭素の固定によるもの）にとって微生物コミュニティは中心をなすものである（Ｆａｌｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１，ｐｐ．２３７−２４０（あらゆる目的のために参照によってその全体が本明細書に組み込まれる））。しかしながら、コミュニティが複雑であり、いずれの所与の微生物コミュニティも、そのメンバーのほとんどが培養不可能であるという理由で、こうしたプロセスの分子的及び生態学的な詳細ならびに影響因子に関する理解は依然として不十分なままである。
【００３１】
微生物コミュニティは、定性的及び定量的に組成が異なることから、それぞれの微生物コミュニティは特有のものであり、その組成は、それが存在する所与の生態系及び／または環境に依存する。微生物コミュニティメンバーの絶対細胞数は、コミュニティが存在する環境の変化、ならびに微生物によって引き起こされる生理学的及び代謝的な変化（例えば、細胞分裂、タンパク質発現など）によって影響を受ける。環境パラメータ及び／またはコミュニティ内の１つの活性微生物の量が変化すると、コミュニティのその他の微生物、ならびにコミュニティが見られる生態系及び／または環境に対して広範囲に影響が及び得る。こうした微生物コミュニティにおける変化を理解し、予測し、それに対処するには、試料における活性微生物及びそれぞれのコミュニティにおける活性微生物の数を同定することが必要である。しかしながら、これまでのところ、微生物コミュニティメンバーの試験は、絶対細胞数ではなく、特定の微生物コミュニティにおける微生物の比率に焦点を当てているものが圧倒的多数を占めている（Ｓｅｇａｔａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ９，ｐ．６６６（あらゆる目的のために参照によってその全体が本明細書に組み込まれる））。
【００３２】
例えばハイスループットシークエンシング手法を使用すれば、微生物コミュニティの組成を容易に決定できるものの、それぞれのコミュニティがどのように構築されて維持されるかということの理解を深めることが必要である。
【００３３】
微生物コミュニティは、生物地球化学的な必須要素の循環（例えば、炭素、酸素、窒素、硫黄、リン、及びさまざまな金属の循環）などの非常に重要なプロセスに関与しており、それぞれのコミュニティの構造、相互作用、及び動態は、生物圏の存在にとって非常に重要である（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）．ｍＢｉｏ  ６（１）：ｅ０２２８８−１４．Ｄｏｉ：１０．１１２８／ｍＢｉｏ．０２２８８−１４（あらゆる目的のために参照によってその全体が本明細書に組み込まれる））。そのようなコミュニティは、高度に不均一であり、細菌、ウイルス、古細菌、及び他のマイクロ真核生物（真菌など）の複雑な混合物を含むことがほとんど常である。ヒト環境（腸及び膣など）における微生物コミュニティの不均一性レベルは、疾患（炎症性腸疾患及び細菌性膣炎など）と関連している（Ｎａｔｕｒｅ（２０１２）．Ｖｏ．４８６，ｐ．２０７（あらゆる目的のために参照によってその全体が本明細書に組み込まれる））。しかしながら、注目すべきことに、健康な個体でさえ、そのような環境において組織を占める微生物が顕著に異なるのである（Ｎａｔｕｒｅ（２０１２）．Ｖｏ．４８６，ｐ．２０７）。
【００３４】
微生物の多くが、培養不可能であるか、あるいは培養に困難／費用が伴い得るものであるため、培養に依存しない手法（核酸シークエンシングなど）によって、さまざまな微生物コミュニティの多様性に関する理解が進んできた。コミュニティの微生物多様性の研究に対する基礎的な手法といえば、小サブユニットリボソームＲＮＡ（ＳＳＵ  ｒＲＮＡまたは１６ｓ  ｒＲＮＡ）遺伝子を増幅及びシークエンシングするものであった。こうした手法は、この遺伝子が普遍的に存在し、進化速度が比較的一定であることに部分的には基づくものである。ハイスループット法が進歩したことで、メタゲノミクス解析がもたらされており、この解析では、微生物の全ゲノムがシークエンシングされる。そのような方法では、コミュニティの事前知識は必要なく、新たな微生物株を発見することが可能となる。メタゲノミクス、メタトランスクリプトミクス、メタプロテオミクス、及びメタボロミクスはすべて、コミュニティを探索して構造及び機能を識別することを可能にするものである。
【００３５】
コミュニティにおける微生物を分類するだけでなく、どのメンバーが活性であるかということ、そうした生物の数、ならびに微生物コミュニティメンバー（複数可）が互いに共出現すること、及び微生物コミュニティメンバー（複数可）と環境パラメータ（複数可）とが共出現すること（例えば、コミュニティの環境のある特定の変化に応じてコミュニティに２つの微生物が共出現すること）も読み解く能力があれば、微生物コミュニティ内の微生物の独自性（及びそのそれぞれの数）に対するそれぞれの環境因子（例えば、気候、栄養素の存在、環境ｐＨ）の重要性、ならびにコミュニティが存在する環境に対するある特定のコミュニティメンバーの重要性を理解することが可能になると想定される。本開示は、こうしたもの及び他のニーズに対処するものである。
【００３６】
本明細書で使用される「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という単数形は、別に文脈上明確に示されない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「生物型」という用語は、単一の生物型または複数の生物型を意味することが意図される。別の例では、「環境パラメータ」という用語は、単一の環境パラメータまたは複数の環境パラメータを意味し得、その結果、「ａ」または「ａｎ」という不定冠詞は、存在する環境パラメータが１つまたは１つのみであるという解釈が文脈上必要にならない限り、複数の環境パラメータが存在する可能性を除外するものではない。
【００３７】
本明細書を通じて、「１つの実施形態」、「実施形態」、「１つの態様」、または「態様」、「１つの実施態様」、または「実施態様」に対する言及は、その実施形態と関連して記載される特定の特性、構造、または特徴が本開示の実施形態の少なくとも１つに含まれることを意味する。したがって、「１つの実施形態では」または「実施形態では」という語句が本明細書を通じてさまざまな箇所で登場するが、こうしたもののうちの必ずしもすべてが、同一の実施形態に言及しているというわけではない。さらに、特定の特性、構造、または特徴は、１つまたは複数の実施形態において任意の適切な様式で組み合わせることができる。
【００３８】
特定の実施形態では、本明細書で使用される「約（ａｂｏｕｔ）」または「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という用語は、それが数値を修飾するとき、その値±１０％の範囲を意味する。値の範囲が与えられる場合、別に文脈上明確に示されない限り、その範囲の上限値と下限値との間に存在する、下限値の１０分の１の単位までの各介在値と、その記載範囲の任意の他の記載値または介在値と、が本開示に包含されると理解される。こうしたより小さな範囲の上限値及び下限値は、そのより小さな範囲に独立して含まれ得るものであり、こうした上限値及び下限値もまた、本開示に包含され、記載範囲において具体的に除外される任意の限界値の対象にもなる。記載範囲が限界値の一方または両方を含む場合、そうした含まれる限界値のどちらか一方または両方を除外した範囲もまた、本開示に含まれる。
【００３９】
本明細書で使用される「単離する」、「単離された」、「単離された微生物」、及び同様の用語は、１つまたは複数の微生物が、特定の環境（例えば、土壌、水、動物組織）においてそれと関連する材料の少なくとも１つから分離されていることを意味することが意図される。したがって、「単離された微生物」は、それが天然に生じる環境に存在するのではなく、本明細書に記載のさまざまな手法が適用されることで、その微生物がその天然の環境から取り出されており、天然には生じない存在状態とされている。したがって、単離された株は、例えば、生物学的に純粋な培養物として存在するか、または許容可能な担体と結び付いた胞子（もしくはその株の他の形態）として存在し得る。
【００４０】
本明細書で使用される「生物反応性の改変剤（ｂｉｏｒｅａｃｔｉｖｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｏｒ）」は、本開示の方法、システム、及び／または装置によって明らかにされる組成物（１つまたは複数の活性微生物を含む微生物アンサンブルなど）であって、天然に生じる環境には天然に存在せず、及び／または天然には一貫して見られず、及び／または天然物には存在しない比率、割合、及び／または量を有する組成物を指す。例えば、生物反応性の改変剤（微生物アンサンブル（合成アンサンブルもしくはバイオアンサンブルとも称される）など）または生物反応性の改変剤の集合物は、同定もしくは生成された化合物／組成物、及び／または１つもしくは複数の単離された微生物株から、適切な媒体または担体と共に形成させることが可能である。生物反応性の改変剤（微生物アンサンブルなど）は、標的に適用または投与することができ、こうした標的は、標的環境、標的集団、標的個体、標的動物、及び／または同様のものなどである。
【００４１】
本開示による微生物アンサンブルは、相互に関連する個々の活性微生物種または種の活性株、のセット、サブセット、及び／または群から選択される。関連性及びネットワークは、本開示の方法によって明らかにされ、１つまたは複数の共通機能の実施に基づいて群化及び／または関連付けられるものであるか、あるいは認識可能なパラメータ（目的の表現型形質（例えば、反芻動物における乳産生の増加）など）に関与するか、またはそれを導くか、またはそれと関連するものであると説明できる。微生物アンサンブルの選択元の群、及び／または微生物アンサンブル自体は、微生物の種、微生物の種の株、または微生物の異なる種の株を２つ以上含み得る。場合によっては、微生物は、群及び／または微生物アンサンブル内で共生的に共存することができる。
【００４２】
本開示のある特定の態様では、微生物アンサンブルは、単離された生物学的に純粋な培養物として存在する１つもしくは複数の単離された微生物であるか、またはそれに基づくものである。特定の微生物の単離された生物学的に純粋な培養物は、当該培養物が（科学的に理にかなうように）他の生物を実質的に含まず、問題の個々の微生物のみを含むことを意味することを当業者なら理解するであろう。培養物は、異なる濃度の当該微生物を含み得る。本開示では、単離された生物学的に純粋な微生物は、「必然的に、低純度または不純な材料とは異なる」ことが多いことに留意されたい。例えば、Ｉｎ  ｒｅ  Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ，４２７  Ｆ．２ｄ  １３９４，（ＣＣＰＡ１９７０）（精製プロスタグランジンについて議論されている）を参照のこと。Ｉｎ  ｒｅ  Ｂｅｒｇｙ，５９６  Ｆ．２ｄ  ９５２（ＣＣＰＡ１９７９）（精製微生物について議論されている）も併せて参照のこと。Ｐａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓ  ＆  Ｃｏ．ｖ．Ｈ．Ｋ．Ｍｕｌｆｏｒｄ  ＆  Ｃｏ．，１８９  Ｆ．９５（Ｓ．Ｄ．Ｎ．Ｙ．１９１１）（Ｌｅａｒｎｅｄ  Ｈａｎｄにより精製アドレナリンについて議論されている），ａｆｆ’ｄ  ｉｎ  ｐａｒｔ，ｒｅｖ’ｄ  ｉｎ  ｐａｒｔ，１９６  Ｆ．４９６（２ｄ  Ｃｉｒ．１９１２）も併せて参照のこと。これらの文献はそれぞれ、参照によって本明細書に組み込まれる。さらに、いくつかの態様では、開示の微生物アンサンブルにおいて使用されるべき単離された生物学的に純粋な微生物培養物で達成されなくてはならないある特定の定量的な濃度指標または純度限界が本開示の実施の際に必要となり得る。こうした純度値の存在は、ある特定の実施形態では、本明細書に開示される方法によって同定される微生物が、天然の状態で存在するそうした微生物と区別される追加属性である。例えば、Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．ｖ．Ｏｌｉｎ  Ｍａｔｈｉｅｓｏｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．，２５３  Ｆ．２ｄ  １５６（４ｔｈ  Ｃｉｒ．１９５８）（微生物によって産生するビタミンＢ１２の純度限界値について議論されている）を参照のこと。当該文献は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００４３】
本明細書で使用される「担体」、「許容可能な担体」、または「医薬担体」は、微生物アンサンブルと共に使用されるか、または微生物アンサンブルにおいて使用される希釈剤、補助剤、賦形剤、または媒体を指す。そのような担体は、水及び油（石油起源、動物起源、植物起源、または合成起源のものを含む）などの無菌の液体であり得、こうしたものは、ピーナッツ油、ダイズ油、ミネラル油、ゴマ油、及び同様のものなどである。好ましくは、水または水溶液、生理食塩水、ならびにデキストロース水溶液及びグリセロール水溶液が担体として利用され、いくつかの実施形態では、注射用液として利用される。あるいは、担体は、固体の剤形担体であり得、こうした固体の剤形担体には、限定はされないが、結合剤（圧縮丸剤用）、流動促進剤、封入剤、風味剤、及び着色剤のうちの１つまたは複数が含まれる。担体の選択は、意図される投与経路及び標準的な薬務に照らして実施することができる。Ｈａｒｄｅｅ  ａｎｄ  Ｂａｇｇｏ（１９９８．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ．２ｎｄ  Ｅｄ．ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ．５０４  ｐｇ．）、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ（１９７０．Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．１７ｔｈ  Ｅｄ．Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．）、及びＢｌａｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（米国公開ＵＳ２０１１０２８０８４０Ａ１）を参照のこと。これらの文献はそれぞれ、参照によってその全体が本明細書に明確に組み込まれる。
【００４４】
「微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）」及び「微生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）」という用語は、本明細書で互換的に使用され、真正細菌ドメイン、真核生物ドメイン、または古細菌ドメインのものである任意の微生物を指す。微生物型には、限定はされないが、細菌（例えば、マイコプラズマ、球菌、桿菌、リケッチア、スピリルム）、真菌（例えば、糸状菌、酵母）、線形動物、原生動物、古細菌、藻類、渦鞭毛藻類、ウイルス（例えば、バクテリオファージ）、ウイロイド、及び／またはそれらの組み合わせが含まれる。生物株は、生物型の亜分類群であり、例えば、特定の微生物の種、亜種、亜型、遺伝子変異体、病原型、または血清型であり得る。
【００４５】
本明細書で使用される「マーカー」または「特有のマーカー」という用語は、特有の微生物型、微生物株、または微生物株の活性の指標である。生物学的な試料においてマーカーを測定することができ、こうしたマーカーには、限定はされないが、核酸に基づくマーカー（リボソームＲＮＡ遺伝子など）、ペプチドもしくはタンパク質に基づくマーカー、及び／または代謝物もしくは他の小分子マーカーが含まれる。
【００４６】
本明細書で使用される「代謝物」という用語は、代謝中間体または代謝産物である。１つの実施形態では、代謝物は、小分子である。代謝物は、さまざまな機能を有しており、こうした機能には、燃料機能、構造機能、シグナル伝達機能、酵素に刺激作用及び阻害作用を及ぼす機能、酵素に対する補因子としての機能、防御機能、ならびに他の生物との相互作用機能（色素、匂い物質、及びフェロモンなど）が含まれる。一次代謝物は、正常な発育、発生、及び生殖に直接的に関与する。二次代謝物は、こうしたプロセスに直接的には関与しないが、通常、重要な生態学的機能を有する。代謝物の例には、限定はされないが、抗生物質及び色素（樹脂及びテルペンなど）などが含まれる。いくつかの抗生物質では、前駆物質として一次代謝物が使用され、例えば、アクチノマイシンは、一次代謝物であるトリプトファンから創出される。本明細書で使用される代謝物には、小さな親水性糖質、大きな疎水性脂質、及び複雑な天然化合物が含まれる。
【００４７】
本開示による方法は、トレーサーによる補正及びトレーサーの適用を含む。例えば、図１に示されるように、いくつかの実施形態は、標的生物学的環境の特性を変えるように構成された活性微生物株の活性微生物バイオアンサンブルを形成するための方法を含み、この方法は、特定量のトレーサーを閉鎖／隔離された環境（例えば、飼料、家畜領域など）に導入すること（００１）、及び（例えば、その環境中にトレーサーが分布した後に）その環境から少なくとも２つの試料を取得すること（００３）、を含む。各試料について、各試料におけるトレーサーの存在量が決定され（００５）、各試料における１つまたは複数の微生物型の存在が検出され、同時に、１つまたは複数の微生物型のうちで各試料において検出されたそれぞれの微生物型の量が検出される（００７）。各試料における特有の第１のマーカー及びその量が決定され（００９）、特有の第１のマーカーはそれぞれ、被検出微生物型の微生物株のマーカーである。トレーサー希釈係数（例えば、投与されたトレーサー量を測定されたトレーサー量で除したもの）及び特有の第１のマーカーの数でそれぞれの微生物型の数を補正／乗じることで、各試料に存在するそれぞれの微生物株の補正（体積補正）絶対細胞数が得られる（０１１）。それぞれの微生物株に対する少なくとも１つの特有の第２のマーカーが特定の閾値に基づいて測定されることで各試料におけるその微生物株の活性レベルが決定された後（０１３）、決定された活性によってそれぞれの微生物株の補正絶対細胞数をフィルタリングすることで、少なくとも２つの試料のそれぞれついての活性微生物株のリストまたはセット及びそのそれぞれの補正絶対細胞数が得られる（０１５）。少なくとも２つの試料のそれぞれについての活性微生物株のフィルタリングされた補正絶対細胞数と、少なくとも２つの試料のそれぞれについての少なくとも１つの測定メタデータと、が比較／解析される（０１７）。活性微生物株は、予測される機能及び／または化学に従って少なくとも２つの群に分類または群化される（０１９）。少なくとも２つの群のそれぞれから少なくとも１つの微生物株が選択され（０２１）、選択された微生物株が組み合わせられ、担体媒体と一緒になることで、そのバイオアンサンブルが標的生物学的環境に導入されるとその標的生物学的環境の少なくとも１つのメタデータに対応する特性を変えるように構成された活性微生物のバイオアンサンブルが形成される（０２３）。
【００４８】
開示の方法の用途は、多種多様である。例えば、開示の方法及びトレーサーを利用することで、動物（ブタなど）の腸管おける微生物集団（アンサンブル微生物集団を含む）に対してさまざまな食物組成物が与え得る影響、ならびに特定の食物（高繊維食など）を与えることが腸管における微生物及び微生物株の総量及び特定量にどのように影響し得るかということ、を決定できる。
【００４９】
いくつかの実施形態では、特定の環境における化学物質の濃度、微生物、体積などを定量化するために難消化性マーカーまたは難消化性トレーサーが使用される。外部難消化性マーカーには、二酸化チタン、酸化クロム、Ｃｒ媒染繊維、コバルト−エチレンジアミン四酢酸（Ｃｏ−ＥＤＴＡ）、酸化鉄、放射線不透過性マーカー／トレーサー、ジスプロシウム、及び／または同様のものが含まれ得る。内部難消化性マーカー／トレーサーには、酸性デタージェントリグニン、酸不溶性灰分、アルカン、難消化性セルロース、難消化性中性デタージェント繊維、リグニン、及び／または同様のものが含まれ得る。
【００５０】
難消化性マーカーまたは難消化性トレーサーの利用においては、濃度が既知の難消化性マーカー／トレーサー（例えば、０．４％の二酸化チタン）を測定対象の環境に含めることが必要であり得る。動物試験及び消化性試験の場合、難消化性マーカーを飼料に含め、実験全体を通じて使用することができる。一例として、さまざまな食物が与えられたブタの回腸におけるアミノ酸、デンプン、ＡＤＦ、及びＮＤＦの見かけの消化性を決定するために、難消化性マーカーが与えられた動物に由来する試料が経時的に取得され、−２０℃で保管されることで、天然の生息微生物による代謝作用の継続が最小化される。実験後、すべての試料について難消化性マーカーの濃度が定量化される。いくつかの実施形態では、二酸化チタンについては、試料をすべて凍結乾燥し、分析可能状態となるまで粉砕機を使用して篩にかけて粉砕することができる。実験の完了後、例えばＩＣＰ手順（Ｍｅｔｈｏｄ  ９９０．０８；ＡＯＡＣ  Ｉｎｔ．，２００７（参照によって本明細書に明確に組み込まれる））を使用して、二酸化チタン濃度が決定される。
【００５１】
データを得た後、アミノ酸、デンプン、ＡＤＦ、及びＮＤＦの見かけの回腸消化性を下記の式を使用して計算することができる：
ＡＩＤ（％）＝１００−［栄養素消化管内容物／栄養素食物）×（チタン食物／チタン消化管内容物）］
式中、ＡＩＤは、栄養素の見かけの回腸消化性（％）であり、栄養素消化管内容物は、回腸内容物の乾燥物におけるその栄養素の濃度であり、栄養素食物は、食物の乾燥物におけるその栄養素の濃度であり、チタン食物は、食物の乾燥物におけるチタン濃度であり、チタン消化管内容物は、回腸内容物の乾燥物におけるチタン濃度である。Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（“Ｉｎｖｉｔｅｄ  ｒｅｖｉｅｗ：Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｄｉｇｅｓｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｐｉｇ  ｆｅｅｄ  ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ：Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ８５．１（２００７）：１７２−１８０）の教示内容及び方法を適切に適用するができ、当該文献は、あらゆる目的のために参照によってその全体が本明細書に明確に組み込まれる。
【００５２】
本開示の他の態様は、投与及び投与量の決定を含み、この決定は、トレーサー及び関連方法と共に利用されることも、それらを用いずに利用されることもあり得る。いくつかの実施形態では、投与方法は、少なくとも１つの共通環境パラメータ特徴を共有する少なくとも２つの試料を取得すること、各試料における１つまたは複数の微生物型の存在を検出すること、及び１つまたは複数の微生物型のうちで各試料において検出されたそれぞれの微生物型の数を決定すること、を含む。各試料における特有の第１のマーカー及びその量が測定され、特有の第１のマーカーはそれぞれ、被検出微生物型の微生物株のマーカーである。次に、それぞれの微生物型の数が特有の第１のマーカーの比例数と統合されるか、またはそれぞれの微生物型の数に対して特有の第１のマーカーの比例数が乗じられることで、各試料に存在するそれぞれの微生物株の絶対細胞数が得られる。それぞれの微生物株に対する少なくとも１つの特有の第２のマーカーが特定の閾値に基づいて測定されることで各試料におけるその微生物株の活性レベルが決定された後、決定された活性によってそれぞれの微生物株の絶対細胞数がフィルタリングされることで、少なくとも２つの試料のそれぞれについての活性微生物株のセットまたはリスト及びそのそれぞれの絶対細胞数が得られる。少なくとも２つの試料のそれぞれについての活性微生物株のフィルタリングされた絶対細胞数と、少なくとも２つの試料のそれぞれについての少なくとも１つの測定メタデータと、が比較または解析され、活性微生物株は、予測される機能及び／または化学に従って少なくとも２つの群に分類または群化される。少なくとも２つの群のそれぞれから少なくとも１つの微生物株が選択され、それぞれの選択された微生物株の初期量が、試料の少なくとも１つに由来する対応絶対細胞数に基づいて（またはいくつかの実施形態では、環境に導入されたトレーサーにも基づいて）決定される。選択された微生物株が、それぞれの量で担体媒体と組み合わせられることで、そのバイオアンサンブルが標的生物学的環境に導入されると、その標的生物学的環境の少なくとも１つのメタデータに対応する特性を変えるように構成された活性微生物の第１のバイオアンサンブルが形成される。次に、第１のバイオアンサンブルは、標的生物学的環境に導入される。その後、標的生物学的環境から追加の試料が取得され、追加の試料について、１つまたは複数の微生物型の存在及びその数が決定され、追加の試料における特有の第１のマーカー及びその量が測定され、特有の第１のマーカーはそれぞれ、被検出微生物型の微生物株のマーカーであり、追加の試料におけるそれぞれの微生物株の絶対細胞数が、それぞれの微生物型の数及び特有の第１のマーカーの数から決定された後、それぞれの微生物株に対する少なくとも１つの特有の第２のマーカーが特定の閾値に基づいて測定されることで、試料におけるその微生物株の活性レベルが決定され、決定された活性によってそれぞれの微生物株の絶対細胞数がフィルタリングされることで、追加の試料についての活性微生物株のリストまたはセット及びそのそれぞれの絶対細胞数が得られ、追加の試料についての活性微生物株のリストまたはセット及びそのそれぞれの絶対細胞数と、それぞれの選択された微生物株の初期量と、が比較される。次に、選択された微生物株のうちの少なくとも１つに対する補正量が比較に基づいて決定され、選択された微生物株が、選択された微生物株のうちの少なくとも１つに対する補正量（複数可）を加味して担体媒体と組み合わせられることで、活性微生物の第２のバイオアンサンブルが形成される。
【００５３】
本開示の方法の実施プラットフォームは、任意の環境における特定の株及び種の活性細胞の数を測定するように構成することができる。そのため、環境における微生物株のコロニー形成を経時的に観測することによって微生物アンサンブルの有効サイズ及び投与頻度を知ることができる。
【００５４】
本開示の方法のいくつかを下記の例において実施されるように使用することで、泌乳反芻動物によって産生する乳脂肪及び乳タンパク質の総量、ならびに計算ＥＣＭを増加させることができる。本明細書に示される方法論は、開示の単離された微生物、アンサンブル、及びそれを含む組成物を利用することに基づいており、泌乳反芻動物によって産生する乳脂肪及び乳タンパク質の総量が増加することを実証している。こうした増加は、ホルモンを別に与えることを必要とせずに実現した。
【００５５】
この例では、２つの単離された微生物、１つの細菌、１つの真菌を含む微生物アンサンブルを、授乳の中期のホルスタイン乳牛に５週間にわたって投与した。
【００５６】
８頭の群２つに乳牛を無作為に割り付け、これらの群の一方は、微生物アンサンブルを含まない緩衝液を投与する対照群とした。第２の群（実験群）には、微生物アンサンブルを５週間、１日に１回投与した。乳牛はそれぞれ、個別の飼育領域に収容し、飼料及び水を自由に摂取できるようにした。食物は、乳量が多くなる食物とした。乳牛には自由に摂食させ、日々の終わりに飼料の重量を測定し、前日の拒食分は、重量を測定し、廃棄した。体重測定は、Ｓａｌｔｅｒ  Ｂｒｅｃｋｎｅｌｌ（Ｆａｉｒｍｏｎｔ，ＭＮ）のＰＳ−２０００スケールで実施した。
【００５７】
乳牛のルーメンにカニューレが到達するように乳牛にカニューレを装着した。乳牛には、カニューレ挿入の後、少なくとも１０日間の回復期間をさらに与えてから、対照用量または実験用量を投与した。
【００５８】
２０ｍｌの中性緩衝生理食塩水でそれぞれの投与を行うものと、当該生理食塩水に約１０９個細胞を懸濁したものでそれぞれの投与を行うものと、にした。対照群には、２０ｍｌの当該生理食塩水を１日に１回投与し、実験群には、１０９個の微生物細胞の記載の微生物アンサンブルをさらに含む２０ｍｌの当該生理食塩水を投与した。
【００５９】
それぞれのルーメン試料の一部を染色し、フローサイトメーターに供すことで、各試料におけるそれぞれの微生物型の細胞数を定量化した。同一のルーメン試料の別の部分をビーズ破砕でホモジナイズすることで微生物を溶解させた。各試料からＤＮＡ及びＲＮＡを抽出及び精製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｍｉｓｅｑでのシークエンシング用として調製した。ペアエンド化学を使用して試料をシークエンシングし、ライブラリーの両末端に対して３００塩基対のシークエンシングを実施した。シークエンシングリードを使用することで、対照群及び実験群の動物ルーメンのそれぞれに存在するそれぞれの活性微生物メンバーの細胞数を実験過程にわたって定量化した。
【００６０】
細菌についてのルーメンコロニー形成分析の結果は、図１−１及び図１−２に示され、動物におけるエネルギー補正乳量（ＥＣＭ）の対応する変化は、図１−３に示される。微生物アンサンブルを投与した実験群ではコロニー形成が観測されたが、対照群では観測されなかった。細菌と真菌との両方がルーメンにコロニーを形成し、動物によっては、連日投与の約３〜５日後にルーメンにおいて細菌と真菌との両方が痕跡量の活性を有していた。真菌のコロニー形成（掲載なし）は、細菌と同様であり、２０日目辺りにピークに達した。１０日目直前には、すべての動物において顕著な測定可能なコロニー形成が生じた。このコロニー形成シフトは、すべての動物にわたって測定された平均ＥＣＭの増加と同時に生じた。
【００６１】
このコロニー形成パターンに基づくと、適切な投与を確保するために、適切な投与レジメンを逆算及び最適化することができる。１０日目辺りに能力の改善が観測され、これは、集団の約０．２％がコロニーを形成したことに相当するものである。この値は、集団の約１．５％まで増加した後、そこで減少し始めた。集団の絶対細胞数は分かるため、こうした値を実際の細胞数に変換することができる。ルーメンを介する食物物質の代謝回転及び流れの推定値ならびにインビトロとインビボとの両方での生物の増殖率に基づくと、適切な投与細胞数及び投与頻度を決定することができる。
【００６２】
本開示の他の態様は、投与されると、微生物にナイーブな環境に生息するように構成され、及び／または標的生物学的環境における現存微生物を圧倒及び／または置換するように構成されたアンサンブルを製剤化することを含む。例えば、開示の方法は、病的またはナイーブな動物（ヒヨコなど）に投与されるとその動物のＧＩ系に生息するように構成されたアンサンブルを合成するために使用することができ、アンサンブルの微生物／株は、現存微生物を構成／圧倒／置換するように構成される。そのような実施形態は、アンサンブルの再投与が必要ないように構成するか、または定期的な再投与（例えば、１日に１回、１週間に１回、２週間に１回、１ヶ月に１回、３ヶ月に１回、季節ごとに１回、１年に１回など）のみが必要となるように構成することができる。そのような方法は、少なくとも２つの試料または試料セット（各試料セットは、少なくとも１つの試料を含む）を取得すること、各試料における複数の微生物型を検出すること、複数の微生物型のうちで各試料において検出されたそれぞれの微生物型の絶対細胞数を決定すること、各試料における特有の第１のマーカー及びその量を測定すること（特有の第１のマーカーはそれぞれ、被検出微生物型の微生物株のマーカーである）、次に、各試料に存在するそれぞれの微生物株の絶対細胞数を、その試料における検出されたそれぞれの微生物型の数と、その試料における特有の第１のマーカーの数及びその量と、に基づいて決定すること、それぞれの微生物株に対する少なくとも１つの特有の第２のマーカーを測定して各試料における活性微生物株を決定すること、少なくとも２つの試料のそれぞれについての活性微生物株のセット及びそのそれぞれの絶対細胞数を得ること、少なくとも２つの試料セットのそれぞれについての少なくとも１つの測定メタデータと共に、少なくとも２つの試料セットの各試料についての活性微生物株及びそれぞれの絶対細胞数を解析してそれぞれの活性微生物株と測定メタデータとの間の関連性を明らかにすること、を含み得る。次に、解析に基づいて活性微生物株のセットから複数の活性微生物株が選択され、選択される活性微生物株は、標的生物学的環境における現存微生物の構成、圧倒、及び／または置換のうちの少なくとも１つを生じさせるように選択される（例えば、それが導入されると特定の期間にわたって活性を維持し、及び／または他の株と比較して増殖する株が選択される）。選択された複数の活性微生物株は、担体媒体と組み合わせられることで、標的生物学的環境における現存微生物を構成、圧倒、及び／または置換するように構成された活性微生物のバイオアンサンブルが形成される。
【００６３】
１つの実施形態では、組成物は、本開示の微生物アンサンブル及び許容可能な担体を含む。別の実施形態では、微生物アンサンブルは、封入される。別の実施形態では、封入された微生物アンサンブルは、ポリマーを含む。
【００６４】
いくつかの実施形態では、許容可能な担体は、食用の飼料グレードの材料、ミネラル混合物、水、グリコール、糖蜜、単糖、多糖、コーン油、及び／または同様のものから選択される。いくつかの実施形態では、微生物アンサンブルを形成する少なくとも２つ微生物株の、組成物における存在細胞数は、当該組成物のグラム当たり１０２〜１０１５個である。
【００６５】
いくつかの他の実施形態では、本開示の固体または液体の微生物組成物は、機能性物質をさらに含み、こうした機能性物質は、例えば、活性炭、ミネラル、ビタミン、及び当該生成物の品質を改善することが可能な他の物質、またはそれらの組み合わせである。
【００６６】
いくつかの実施形態では、本開示の微生物は、組み合わせて合成微生物組成物またはアンサンブルとされる。いくつかの実施形態では、微生物組成物は、反芻動物飼料を含み、こうした反芻動物飼料は、穀類（オオムギ、トウモロコシ、カラスムギ、及び同様のもの）、デンプン（タピオカ及び同様のもの）、油糧種子ケーキ、ならびに植物廃棄物などである。いくつかの実施形態では、微生物組成物は、ビタミン、ミネラル、微量元素、乳化剤、芳香剤、結合剤、着色剤、付臭剤、増粘剤、及び同様のものを含む。
【００６７】
いくつかの実施形態では、本開示の微生物組成物は、固体である。固体組成物が使用される場合、固体組成物は、１つまたは複数の担体材料を含むことが望まれることがあり得、こうした担体材料には、限定はされないが、土類鉱物（シリカ、タルク、カオリン、石灰石、チョーク、クレイ、ドロマイト、珪藻土など）、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、酸化マグネシウム、炭酸カルシウム、二酸化ケイ素、植物起源の産物（穀類ミール、樹皮ミール、木質ミール、及び木の実の殻ミールなど）、及び／または同様のもの、のうちの１つまたは複数が含まれる。
【００６８】
いくつかの実施形態では、本開示の微生物組成物は、液体である。別の実施形態では、液体は、水またはアルコールを含み得る溶媒、及び動物に安全な他の溶媒を含む。いくつかの実施形態では、本開示の微生物組成物は、結合剤を含み、こうした結合剤は、動物に安全なポリマー、カルボキシメチルセルロース、デンプン、ポリビニルアルコール、及び同様のものなどである。
【００６９】
いくつかの実施形態では、本開示の微生物組成物は、増粘剤を含み、こうした増粘剤は、シリカ、クレイ、種子または海藻の天然抽出物、セルロースの合成誘導体、グアーガム、ローカストビーンガム、アルギン酸、及びメチルセルロースなどである。いくつかの実施形態では、微生物組成物は、沈降防止剤を含み、こうした沈降防止剤は、加工デンプン、ポリビニルアルコール、キサンタンガム、及び同様のものなどである。
【００７０】
いくつかの実施形態では、本開示の微生物組成物は、着色剤を含み、こうした着色剤には、ニトロソ、ニトロ、アゾ（モノアゾ、ビスアゾ、及びポリアゾを含む）、アクリジン、アントラキノン、アジン、ジフェニルメタン、インダミン、インドフェノール、メチン、オキサジン、フタロシアニン、チアジン、チアゾール、トリアリールメタン、キサンテンとして分類される有機発色団が含まれる。いくつかの実施形態では、本開示の微生物組成物は、微量栄養素を含み、こうした微量栄養素は、鉄、マンガン、ホウ素、銅、コバルト、モリブデン、及び亜鉛、の塩などである。
【００７１】
いくつかの実施形態では、本開示の微生物組成物は、動物に安全な抗ウイルス剤または殺線虫剤を含む。いくつかの実施形態では、本開示の微生物組成物は、糖類（例えば、単糖、二糖、三糖、多糖、オリゴ糖、及び同様のもの）、高分子糖類、脂質、高分子脂質、リポ多糖、タンパク質、高分子タンパク質、リポタンパク質、核酸、核酸ポリマー、シリカ、無機塩、及びそれらの組み合わせを含む。別の実施形態では、微生物組成物は、寒天、アガロース、ゲルライト（ｇｅｌｒｉｔｅ）、ゲランガム、及び同様のもの、のポリマーを含む。いくつかの実施形態では、微生物組成物は、プラスチックカプセル、エマルション（例えば、水及び油）、膜、及び人工膜を含む。いくつかの実施形態では、エマルションまたは架橋型ポリマー溶液に本開示の微生物組成物が含められ得る。例えば、Ｈａｒｅｌ  ａｎｄ  Ｂｅｎｎｅｔｔ  米国特許第８，４６０，７２６Ｂ２号を参照のこと。当該文献は、あらゆる目的のために参照によってその全体が本明細書に明確に組み込まれる。
【００７２】
いくつかの実施形態では、本開示の合成微生物組成物は、固体形態（例えば、凍結乾燥胞子が分散したもの）または液体形態（微生物が保存媒体に散在するもの）で構成される。
【００７３】
いくつかの実施形態では、本開示の合成微生物組成物は、１つまたは複数の保存剤を含む。保存剤は、液体製剤または気体製剤であり得る。保存剤は、単糖、二糖、三糖、多糖、酢酸、アスコルビン酸、アスコルビン酸カルシウム、エリソルビン酸、イソ−アスコルビン酸、エリソロビン酸（ｅｒｙｔｈｒｏｂｉｃ  ａｃｉｄ）、硝酸カリウム、アスコルビン酸ナトリウム、エリソルビン酸ナトリウム、イソ−アスコルビン酸ナトリウム、硝酸ナトリウム、亜硝酸ナトリウム、窒素、安息香酸、ソルビン酸カルシウム、ラウロイルアルギニンエチル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル、メチルパラベン、酢酸カリウム、安息香酸カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｂｅｎｚｏｉａｔｅ）、亜硫酸水素カリウム、二酢酸カリウム、乳酸カリウム、メタ重亜硫酸カリウム、ソルビン酸カリウム、ｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピル、プロピルパラベン、酢酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、亜硝酸ナトリウム、二酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、メチル−ｐ−ヒドロキシ安息香酸のナトリウム塩、プロピル−ｐ−ヒドロキシ安息香酸のナトリウム塩、硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、亜ジチオン酸ナトリウム、亜硫酸、プロピオン酸カルシウム、二炭酸ジメチル、ナタマイシン、ソルビン酸カリウム、亜硫酸水素カリウム、メタ重亜硫酸カリウム、プロピオン酸、二酢酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、ソルビン酸ナトリウム、ソルビン酸、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、ステアリン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、ブチル化ヒドロキシルアニソール（ＢＨＡ）、クエン酸、モノグリセリド及び／またはジグリセリドのクエン酸エステル、Ｌ−システイン、Ｌ−システイン塩酸塩、グアヤクガム（ｇｕｍ  ｇｕａｉａｃｕｍ）、グアヤクガム（ｇｕｍ  ｇｕａｉａｃ）、レシチン、クエン酸レシチン（ｌｅｃｉｔｈｉｎ  ｃｉｔｒａｔｅ）、クエン酸モノグリセリド、クエン酸モノイソプロピル、没食子酸プロピル、メタ重亜硫酸ナトリウム、酒石酸、ターシャリーブチルヒドロキノン、塩化スズ、チオジプロピオン酸、チオジプロピオン酸ジラウリル、チオジプロピオン酸ジステアリル、エトキシキン、二酸化硫黄、ギ酸、あるいはトコフェロール（複数可）、のうちの１つまたは複数から選択され得る。
【００７４】
いくつかの実施形態では、本開示の微生物組成物は、胞子形態、栄養細胞形態、及び／または溶解細胞形態の細菌細胞及び／または真菌細胞を含む。１つの実施形態では、溶解細胞形態は、マイコトキシン結合剤として働き、例えば、死細胞にマイコトキシンが結合する。
【００７５】
合成アンサンブル組成物
【００７６】
いくつかの実施形態では、本開示のアンサンブル（例えば、微生物及び／または合成微生物組成物）は、封入組成物に封入される。封入組成物は、微生物が有蹄動物の消化管に入る前に、外的ストレス要因から微生物を保護する。封入組成物は、好気性環境による嫌気性微生物に対する酸化ストレスを最小化するなどして、微生物に有利となり得る環境をさらに創出する。微生物の封入組成物及び微生物の封入方法については、Ｋａｌｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．（ＵＳ５，１０４，６６２Ａ）、Ｆｏｒｄ（ＵＳ５，７３３，５６８Ａ）、及びＭｏｓｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｎｉｌｓｓｏｎ（ＵＳ４，６４７，５３６Ａ）を参照のこと。
【００７７】
１つの実施形態では、封入組成物は、固体シェル材料に封入された多数の液体コアを有するマイクロカプセルを含む。本開示の目的では、「多数」のコアは、２つ以上と定義される。
【００７８】
有用な可溶性シェル材料の第１のカテゴリーは、通常は固体の脂肪のカテゴリーであり、こうした脂肪には、既に硬度が適切な脂肪、ならびにその融点が本開示の目的を果たす上で十分に高くなるまで水素化された、動物または植物の脂肪及び油が含まれる。所望の処理及び保管温度及び特定の選択材料に応じて、特定の脂肪は、通常は固体または通常は液体の材料であり得る。本明細書で使用される「通常は固体」及び「通常は液体」という用語は、得られるマイクロカプセルを保管するための所望の温度における材料の状態を指す。厳密に言えば、脂肪及び水素化油は融点を有さないため、「融点」という用語は、乳化し、スプレー冷却に成功する上で十分なほどに可溶性材料が軟化または液体化する最小温度を説明するために本明細書で使用されるものであり、したがって、この用語は、大ざっぱに言えば、コリンコアの放出を阻止する上で十分なほどにシェル材料が完全性を有する最大温度に相当するものである。「融点」は、鋭い融点を有さない他の材料についても、本明細書では同様に定義される。
【００７９】
本明細書で有用な脂肪及び油の特定の例は、以下のものである（これらのいくつかは硬化が必要になる）：動物の油及び脂肪（牛脂、羊脂、子羊脂、ラードまたは豚脂、魚油、及びマッコウクジラ油など）、植物油（キャノーラ油、綿実油、ピーナッツ油、コーン油、オリーブ油、ダイズ油、サンフラワー油、ベニバナ油、ヤシ油、パーム油、アマニ油、キリ油、及びヒマシ油など）、脂肪酸モノグリセリド及びジグリセリド、遊離脂肪酸（ステアリン酸、パルミチン酸、及びオレイン酸など）、ならびにそれらの混合物。上に列挙されている油及び脂肪は、包括的なものであるということは意図されず、単なる例示にすぎない。脂肪酸の特定の例には、リノール酸、γ−リノール酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、ドコサテトラエン酸、バクセン酸、ネルボン酸、ミード酸、エルカ酸、ゴンド酸（ｇｏｎｄｏｉｃ  ａｃｉｄ）、エライジン酸、オレイン酸、パリトレイン酸（ｐａｌｉｔｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、ステアリドン酸、エイコサペンタエン酸、吉草酸、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ウンデシル酸、ラウリン酸、トリデシル酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、パルミチン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、ノナデシル酸（ｎｏｎａｄｅｃｙｃｌｉｃ  ａｃｉｄ）、アラキジン酸、ヘンイコシル酸、ベヘン酸、トリコシル酸、リグノセリン酸、ペンタコシル酸、セロチン酸、ヘプタコシル酸、モンタン酸、ノナコシル酸、メリシン酸、ヘナトリアコンチル酸（ｈｅｎａｔｒｉａｃｏｎｔｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ラッセロ酸（ｌａｃｃｅｒｏｉｃ  ａｃｉｄ）、プシリン酸（ｐｓｙｌｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ゲダ酸（ｇｅｄｄｉｃ  ａｃｉｄ）、セロプラスチン酸、ヘキサトリアコンチル酸（ｈｅｘａｔｒｉａｃｏｎｔｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ヘプタトリアコンタン酸（ｈｅｐｔａｔｒｉａｃｏｎｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、及びオクタトリアコンタン酸（ｏｃｔａｔｒｉａｃｏｎｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）が含まれる。
【００８０】
封入シェル材料として有用な可溶性材料の別のカテゴリーは、ワックスのカテゴリーである。本明細書での使用が企図される代表的なワックスは下記のものである：動物ワックス（ミツロウ、ラノリン、シェルワックス（ｓｈｅｌｌ  ｗａｘ）、及びイボタロウ（Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｉｎｓｅｃｔ  ｗａｘ）など）、植物ワックス（カルナウバロウ、カンデリラロウ、ヤマモモ、及びサトウキビなど）、ミネラルワックス（パラフィン、微結晶石油、オゾケライト、セレシン、及びモンタンなど）、合成ワックス（低分子量ポリオレフィン（例えば、ＣＡＲＢＯＷＡＸ）、及びポリオールエーテル−エステル（例えば、ソルビトール）など）、フィッシャー・トロプシュプロセス合成ワックス、ならびにそれらの混合物。水溶性ワックス（ＣＡＲＢＯＷＡＸ及びソルビトールなど）は、コアが水性であるならば、本明細書では企図されない。
【００８１】
本明細書で有用な可溶性化合物でさらに他のものは、ロジン、バルサム、セラック、及びそれらの混合物などの、可溶性の天然樹脂である。本開示に従ってさまざまな補助材料を可溶性材料に組み込むことが企図される。例えば、抗酸化物質、光安定剤、色素及びレーキ、風味剤、精油、固化防止剤、フィラー、ｐＨ安定剤、糖（単糖、二糖、三糖、及び多糖）、ならびに同様のものを、本開示のためのその有用性を低減しない量で可溶性材料に組み込むことができる。本明細書のいくつかの実施形態に従って企図されるコア材料がマイクロカプセルを構成する重量割合は、約０．１％〜約５０％、約１％〜約３５％、または約５％〜約３０％である。いくつかの実施形態では、本明細書で企図されるコア材料がマイクロカプセルを構成する重量割合は、約３０％以下である。いくつかの実施形態では、本明細書で企図されるコア材料がマイクロカプセルを構成する重量割合は、約５％である。実施態様に応じて、コア材料は、マイクロカプセルの企図される保管温度で液体または固体であり得る。
【００８２】
コアは、他の添加物を含み得、こうした他の添加物には、食用糖（スクロース、グルコース、マルトース、フルクトース、ラクトース、セロビオース、単糖、二糖、三糖、多糖、及びそれらの混合物など）、人工甘味料（アスパルテーム、サッカリン、シクラミン酸塩、及びそれらの混合物など）、食用酸（酢酸（酢）、クエン酸、アスコルビン酸、酒石酸、及びそれらの混合物など）、食用デンプン（コーンスターチなど）、加水分解植物タンパク質、水溶性ビタミン（ビタミンＣなど）、水溶性薬剤、水溶性栄養材料（硫酸第一鉄など）、風味剤、塩、グルタミン酸ナトリウム、抗微生物剤（ソルビン酸など）、抗真菌剤（ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、安息香酸ナトリウム、及び安息香酸など）、食物グレードの色素（ｐｉｇｍｅｎｔ）及び色素（ｄｙｅ）、ならびにそれらの混合物が含まれる。有用となる可能性のある他の補助コア材料もまた、実施態様に応じて企図される。
【００８３】
安定なエマルションの形成を支援するために、いくつかの実施形態では乳化剤を利用することができる。代表的な乳化剤には、モノステアリン酸グリセリン、ポリソルベートエステル、エトキシ化モノジグリセリド及びエトキシ化ジグリセリド、ならびにそれらの混合物が含まれる。
【００８４】
処理を容易化するために、加えて具体的には、適度に安定なエマルションの形成が達成可能となるように、コア材料の粘度とシェル材料の粘度とは、エマルションが形成される温度で同様のものであるべきである。いくつかの実施形態では、シェルの粘度とコアの粘度と（センチポアズまたは同等の単位で表現され、両方がエマルションの温度で測定される）の比は、約２２：１〜約１：１、約８：１〜約１：１、または約３：１〜約１：１であり得る。いくつかの実施形態では、１：１の比を利用することができ、記載の範囲内の粘度比が有用な場合は、さまざまな用途向けに他の粘度を用いることができる。
【００８５】
封入組成物は、上に開示されるマイクロカプセル組成物に限定されるものではない。いくつかの実施形態では、毒性作用を有さない天然または合成のものであり得る接着性ポリマーの中に微生物組成物が封入組成物によって封入される。いくつかの実施形態では、封入組成物は、糖マトリックス、ゼラチンマトリックス、ポリマーマトリックス、シリカマトリックス、デンプンマトリックス、泡沫マトリックスなどから選択されるマトリックスであり得る。いくつかの実施形態では、封入組成物は、ポリ酢酸ビニル、ポリ酢酸ビニルコポリマー、エチレン酢酸ビニル（ＥＶＡ）コポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルコールコポリマー、セルロース（エチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、及びカルボキシメチルセルロースを含む）、ポリビニルピロリドン、多糖（デンプン、加工デンプン、デキストリン、マルトデキストリン、アルギン酸、及びキトサンを含む）、単糖、脂肪、脂肪酸（油を含む）、タンパク質（ゼラチン及びゼインを含む）、アラビアガム、セラック、塩化ビニリデン及び塩化ビニリデンコポリマー、リグニンスルホン酸カルシウム、アクリルコポリマー、ポリビニルアクリレート、ポリエチレンオキシド、アクリルアミドのポリマー及びコポリマー、ポリヒドロキシエチルアクリレート、メチルアクリルアミドモノマー、ならびにポリクロロプレンから選択され得る。
【００８６】
合成アンサンブルの追加の方法及び製剤には、下記の米国特許のうちの１つまたは複数に開示される製剤及び方法が含まれ得る：６５３７６６６、６３０６３４５、５７６６５２０、６５０９１４６、６８８４８６６、７１５３４７２、６６９２６９５、６８７２３５７、７０７４４３１、及び／または６５３４０８７。これらの文献はそれぞれ、参照によってその全体が本明細書に明確に組み込まれる。
【００８７】
いくつかの実施形態では、アンサンブルは、動物飼料と混合することができる。別の実施形態では、動物飼料は、家禽飼料である。
【００８８】
いくつかの実施形態では、動物の形質を少なくとも１つ改善する方法は、アンサンブルを動物に投与することを含む。別の実施形態では、動物は、ブロイラーまたは産卵するニワトリなどの鳥類である。
【００８９】
いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも１日に１回投与される。別の実施形態では、組成物は、少なくとも１週間に１回投与される。別の実施形態では、組成物は、少なくとも１ヶ月に１回投与される。
【００９０】
いくつかの実施形態では、投与は、動物の素嚢、砂嚢、盲腸、小腸、または大腸のうちの１つまたは複数に組成物を注射することを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、排泄腔を介して投与される。別の実施形態では、経排泄腔投与は、坐剤を直腸に挿入することを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、経口投与される。いくつかの態様では、経口投与は、ゲルまたは粘性溶液に含めた組成物を動物の体の一部に塗布することを含み、動物は、組成物を経口摂取する。いくつかの実施形態では、動物が摂食するたびに投与が行われる。いくつかの実施形態では、経口投与は、組成物を動物飼料と組み合わせて投与することを含む。
【００９１】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの形質の改善は、体重の増加、産卵の増加、筋肉組織の増加、卵におけるビタミンの増加、消化管における脂肪酸濃度の増加、及び卵の体積の増加、飼料利用効率及び消化効率の改善、多糖及びリグニンの分解の増加、脂肪、デンプン、及び／またはタンパク質の消化の増加、ビタミン利用能の増加、ミネラル利用能の増加、アミノ酸利用能の増加、消化管におけるｐＨのバランス、メタン及び／または亜酸化窒素の放出の減少、糞尿産生の減少、窒素利用効率の改善、リン利用効率の改善、ニワトリにコロニー形成する病原性微生物のコロニー形成に対する抵抗性の増加、死亡率の減少、抗微生物物質の産生の増加、病原性微生物の排出能の増加、ニワトリにコロニー形成する病原性微生物のコロニー形成に対する抵抗性の増加、ヒトに感染する病原性微生物のコロニー形成に対する抵抗性の増加、のうちの１つまたは複数であり、上記の増加または減少は、当該組成物が投与されたことのない動物に対する比較によって決定される。
【００９２】
いくつかの実施形態では、体重の増加は、当該組成物が投与されたことのない動物に対する比較によって決定される少なくとも１％の増加である。いくつかの実施形態では、糞尿産生の減少は、当該組成物が投与されたことのない動物に対する比較によって決定される少なくとも１％の減少である。
【００９３】
いくつかの実施形態では、多糖分解の増加は、リグニン、セルロース、及び／またはヘミセルロースの分解の増加である。いくつかの実施形態では、脂肪酸濃度の増加は、酢酸、プロピオン酸、及び／またはブタン酸の増加である。
【００９４】
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または共同体に存在する少なくとも２つ微生物株は、当該株が単独で生じるとき、または天然に生じる濃度で当該株が存在するときには示さない有用性の増加を示す。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、本明細書で教示される微生物株を少なくとも２つ含み、動物の形質を少なくとも１つ改善することに対する相乗効果を示す。
【００９５】
１つの実施形態では、本開示は、家禽の所望の表現型形質を増加させることが可能な家禽飼料サプリメントを提供する。特定の実施形態では、家禽飼料サプリメントは、家禽には天然に生じない濃度の本開示の微生物アンサンブルと、許容可能な担体とを含む。
【００９６】
本開示の１つの態様では、複数の微生物株と、１つまたは複数のメタデータ及び／またはパラメータと、の間の関連性を明らかにするための方法が開示される。図１Ａに示されるように、試料及び／または少なくとも２つの試料の試料データが少なくとも２つの試料源から入手され（１０１）、各試料について、１つまたは複数の微生物型の存在が決定され（１０３）、１つまたは複数の微生物型のうちで各試料において検出されたそれぞれの微生物型の数（細胞数）が決定され（１０５）、各試料における特有の第１のマーカーの数及びその量が決定され（１０７）、特有の第１のマーカーはそれぞれ、微生物株のマーカーである。それぞれの微生物型の数と第１のマーカーの数とが統合されることで、各試料に存在するそれぞれの微生物株の絶対細胞数が得られ（１０９）、それぞれの微生物株に対する少なくとも１つの特有の第２のマーカーの特定の閾値を上回る測定値に基づいて各試料におけるそれぞれの微生物株の活性レベルが決定され（１１１）、微生物株は、その株に対する少なくとも１つの特有の第２のマーカーの測定値が対応閾値を上回るであれば、活性であると見なされる。次に、決定された活性によってそれぞれの微生物株の絶対細胞数がフィルタリングされることで、少なくとも２つの試料のそれぞれについての活性微生物株のセットまたはリスト及びそのそれぞれの絶対細胞数が得られる（１１３）。少なくとも１つの測定メタデータまたは追加の活性微生物株と共に、少なくとも２つの試料のそれぞれについての活性微生物株のフィルタリングされた絶対細胞数のセットまたはリストのネットワーク解析が実施され（１１５）、ネットワーク解析は、それぞれの活性微生物株と他のあらゆる活性微生物株との間の最大情報係数スコアの決定、ならびにそれぞれの活性微生物株と少なくとも１つの測定メタデータまたは追加の活性微生物株との間の最大情報係数スコアの決定、を含む。次に、機能、予測される機能、及び／または化学に基づいて活性微生物株を分類することができ（１１７）、分類に基づいて複数の活性微生物株が同定及び出力される（１１９）。いくつかの実施形態では、方法は、同定された複数の微生物株から活性微生物アンサンブルを構築することをさらに含み（１２１）、微生物アンサンブルは、標的に適用されると、少なくとも１つの測定メタデータに対応する特性を変えるように構成される。方法は、出力された複数の同定活性微生物株に基づいて少なくとも１つの病原体を同定することをさらに含み得る（追加詳細については実施例４を参照のこと）。いくつかの実施形態では、複数の活性微生物株を利用することで、それが標的に適用されると、少なくとも１つの同定病原体に対処し、及び／または少なくとも１つの同定病原体と関連する症状を治療するように構成された活性微生物アンサンブルを構築することができる。
【００９７】
本開示の１つの態様では、１つまたは複数の試料における１つまたは複数の活性微生物株の絶対細胞数を決定するための方法が提供され、１つまたは複数の活性微生物株は、試料における微生物コミュニティに存在する。１つまたは複数の微生物株は、１つまたは複数の生物型の亜分類群である（図１Ｂの方法１０００を参照のこと）。各試料について、試料における１つまたは複数の微生物型の存在が検出される（１００１）。試料における１つまたは複数の生物型のそれぞれの絶対数が決定される（１００２）。特有の第１のマーカーの数が、特有の第１のマーカーのそれぞれの量と共に測定される（１００３）。本明細書に記載のように、特有の第１のマーカーは、特有の微生物株のマーカーである。次に、１つまたは複数の特有の第２のマーカーの発現レベルを測定することによってタンパク質レベル及び／またはＲＮＡレベルで活性が評価される（１００４）。特有の第２のマーカーは、特有の第１のマーカーと同一または異なり得るものであり、生物株の活性のマーカーである。特有の第２のマーカーの１つまたは複数の発現レベルに基づいて、（存在するのであれば）どの微生物株が活性であるかが決定される（１００５）。微生物株は、特有の第２のマーカーを特定のレベルで発現するか、または閾値レベルを上回って（例えば、閾値レベルを少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、もしくは少なくとも約４０％上回って）発現するのであれば、活性であると見なされる（１００５）（特定の用途及び／または実施態様に基づいてさまざまな閾値を決定することができ、例えば、試料源（複数可）（特定の種など）、試料起源の位置、目的メタデータ、環境などによって閾値は異なり得ることを理解されよう）。１つまたは複数の活性微生物株の絶対細胞数は、１つまたは複数の活性微生物株の１つまたは複数の第１のマーカーの量と、１つまたは複数の微生物株が亜分類群となる由来元の生物型の絶対数と、に基づいて決定することができる。
【００９８】
本開示のいくつかの実施形態は、微生物コミュニティの解析向けに構成することができる。図１Ｃによって示されるように、２つ以上の試料（及び／または試料セット）のデータが取得され（１０５１）（各試料は、不均一微生物コミュニティを含む）、各試料における複数の微生物型が検出される（１０５３）。次に、複数の微生物型のうちで各試料において検出されたそれぞれの微生物型の絶対細胞数が、例えば本明細書で議論されるＦＡＣＳまたは他の方法を介して、決定される（１０５５）。各試料における特有の第１のマーカー及びその量が測定され（１０５７）、特有の第１のマーカーはそれぞれ、被検出微生物型の微生物株のマーカーである。１つまたは複数の特有の第２のマーカーの値（活性、濃度、発現など）が測定され（１０５９）（特有の第２のマーカーは、被検出微生物型の特定の微生物株の活性（例えば、代謝活性）の指標である）、１つまたは複数の特有の第２のマーカーの測定値に基づいて（例えば、特定のセット閾値を上回る値に基づいて）それぞれの検出微生物株の活性が決定される（１０６１）。各試料における検出されたそれぞれの活性微生物株のそれぞれの比率が、例えばそれぞれの絶対細胞数、値などに基づいて、決定される（１０６３）。例えば、例示の実施態様では、ウマの糞便試料に由来する細胞を染色し、その数を数えた。次に、各試料から全核酸を単離した。この溶出液を２つの部分に分け、酵素的に精製することで、精製ＤＮＡまたは精製ＲＮＡを得た。精製ＲＮＡは、ＲＮＡからｃＤＮＡへと酵素的に変換することで安定化させた。ＰＣＲを使用してＤＮＡとｃＤＮＡとの両方についてＩｌｌｕｍｉｎａシークエンシングライブラリーを調製することで、適切なバーコード及びアダプター領域を付加し、マーカー領域を増幅した。シークエンシングの後、生のシークエンシングリードのクオリティトリミング及びマージを実施し、微生物株の全集団を同定した。どの株が各試料に存在するかを同定し、各試料におけるそれぞれの株に対するリードの数を定量化するために、ＤＮＡ試料から得られたシークエンシングライブラリーを微生物株の全集団にマッピングし戻した。次に、定量化したリードリストを絶対細胞数データと統合することで、それぞれの株の絶対細胞数を決定した。細胞数データを統合した後、各試料においてどの株が活性であるかを決定するために、ｃＤＮＡライブラリーに由来するリードを各試料における株にマッピングし戻した。出力結果から不活性株を除外し、各試料における検出されたそれぞれの活性微生物株のそれぞれの比率のリストを得た。
【００９９】
次に、少なくとも２つの試料の活性な検出微生物株（またはそのサブセット）のそれぞれが解析されることで、それぞれの活性な検出微生物株とその他の活性な検出微生物株との間、ならびにそれぞれの活性な検出微生物株と少なくとも１つの測定メタデータとの間、の関連性及びその強度が明らかにされる（１０６５）。次に、明らかにされた関連性は、表示またはその他の形で出力され（１０６７）（例えば、グラフィカルディスプレイ／グラフィカルインターフェースで行われる）（例えば、図１Ｄを参照のこと）、バイオアンサンブルの生成に利用することができる（１０６９）。いくつかの実施形態では、関連性の表示／出力は、ある特定の強度または重みを上回る関連性のみが表示されるように限定することができる（１０６６ａ、１０６６ｂ）。
【０１００】
本開示による微生物アンサンブルは、相互に関連する個々の活性微生物種または種の活性株、のセット、サブセット、及び／または群から選択することができる。関連性及びネットワークは、本開示の方法によって明らかにされ、１つまたは複数の共通機能の実施に基づいて群化及び／または関連付けられるものであるか、あるいは認識可能なパラメータ（目的の表現型形質（例えば、反芻動物における乳産生の増加）など）に関与するか、またはそれを導くか、またはそれと関連するものであると説明できる。図１Ｄでは、Ｌｏｕｖａｉｎコミュニティ検出法を使用することで、乳牛関連のメタデータパラメータと関連する群を同定した。それぞれのノードは、特定のルーメン微生物株またはメタデータパラメータを示す。ノード間のリンクは、有意な関連性を示す。連結されていないノードは、関連しない微生物である。着色された「バブル」はそれぞれ、Ｌｏｕｖａｉｎ解析によって検出された群を示す。この群化によって、株の分類先である群に基づいて株の機能性を予測することが可能になる。
【０１０１】
本開示のいくつかの実施形態は、相互情報量を活用することで、動物の消化管に生息する天然の微生物株の、特定の動物形質に対する重要性を順位付けするように構成される。すべての微生物及び所望の動物形質について最大情報係数（ＭＩＣ）が計算される。０〜１の段階で関連性がスコア付けされ、１は、微生物株と動物形質との間に強い関連性があることを示し、０は、関連性がないことを示す。このスコアに基づくカットオフを使用することで、特定の形質の改善に関して有用な微生物及び有用ではない微生物が定義される。図１Ｅ及び図１Ｆは、乳脂肪効率との関連性を共有するルーメン微生物株のＭＩＣスコア分布の例を示す。ここでは、指数関数から直線へと曲線がシフトする点（細菌については約０．４５〜０．５、真菌については約０．３）が、有用な微生物株と有用ではない微生物株との間のカットオフとなる。図１Ｇ及び図１Ｈは、乳効率との関連性を共有するルーメン微生物株のＭＩＣスコア分布の例を示す。指数関数から直線へと曲線がシフトする点（細菌については約０．４５〜０．５、真菌については約０．２５）が、有用な微生物株と有用ではない微生物株との間のカットオフとなる。
【０１０２】
図２に示されるように、本開示の別の態様では、１つまたは複数の活性微生物の絶対細胞数が複数の試料において決定され、絶対細胞数は、メタデータ（環境パラメータ）に関連付けられる（２００１〜２００８）。１つまたは複数の活性微生物株の絶対細胞数の解析に複数の試料が供され、１つまたは複数の活性微生物株は、複数の試料の少なくとも１つにおいて活性測定値が閾値レベルであるか、または閾値レベルを上回るのであれば、活性であると見なされる（２００１〜２００６）。次に、１つまたは複数の活性微生物株の絶対細胞数は、特定の実施態様及び／または用途のメタデータパラメータに関連付けられる（２００８）。
【０１０３】
１つの実施形態では、複数の試料は、同一の環境源から経時的に取得される（例えば、同一の動物から経時的に取得される）。別の実施形態では、複数の試料は、複数の環境源（例えば、異なる動物）に由来する。１つの実施形態では、環境パラメータは、第２の活性微生物株の絶対細胞数である。別の実施形態では、１つまたは複数の活性微生物株の絶対細胞数値を使用することで、１つまたは複数の活性微生物株と微生物コミュニティの第２の活性微生物株との共出現が決定される。別の実施形態では、１つまたは複数の活性微生物株の絶対細胞数及び／または第２の環境株の絶対細胞数に対して第２の環境パラメータが関連付けられる。
【０１０４】
開示の実施形態の態様は、本開示を通じて議論される。
【０１０５】
重要なことであるが、本明細書で提供される方法で使用するための試料は、微生物コミュニティを含む任意の型のものであり得る。例えば、本明細書で提供される方法で使用するための試料には、限定はされないが、動物試料（例えば、哺乳類、爬虫類、トリ）、土壌、空気、水（例えば、海洋、淡水、廃水汚泥）、堆積物、油、植物、農産物、植物、土壌（例えば、根圏）、及び極限環境試料（例えば、酸性鉱山排水、熱水系）が含まれる。海洋試料または淡水試料の場合、試料は、水体の表面または水体の任意の深度に由来し得る（例えば、深海試料）。水試料は、１つの実施形態では、海洋、河川、または湖の試料である。
【０１０６】
１つの実施形態は、動物試料は、体液である。別の実施形態では、動物試料は、組織試料である。動物試料には、限定はされないが、歯、汗、爪、皮膚、毛髪、糞便、尿、精液、粘液、唾液、消化管が含まれる。動物試料は、例えば、ヒト、霊長類、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、げっ歯類（例えば、マウスもしくはラット）、またはトリの試料であり得る。１つの実施形態では、トリ試料は、１羽または複数羽のニワトリに由来する試料を含む。別の実施形態では、試料は、ヒト試料である。ヒトマイクロバイオームは、皮膚の表面及び深層、乳腺、唾液、口腔粘膜、結膜、ならびに消化管に見られる微生物の集合体を含む。マイクロバイオームに見られる微生物には、細菌、真菌、原生動物、ウイルス、及び古細菌が含まれる。体の部分が異なると、微生物の多様性が異なる。微生物の量及び型は、個体の健康状態または病的状態を知らせ得るものである。細菌分類群の数は数千に上り、ウイルスも同じくらい大量に存在し得る。体表の所与の部位の細菌組成は、人によって異なるものであり、型だけでなく、存在量または量も異なる。追加の用途には、食品、特に発酵食品及び微生物食品（例えば、パン、チーズ、ワイン、ビール、キムチなど）における使用が含まれる。
【０１０７】
別の実施形態では、試料は、ルーメン試料である。ウシなどの反芻動物は、その飼料を消化する上で多様な微生物コミュニティに依存している。こうした動物は、変化した上部消化管（反芻胃またはルーメン）を有することによって栄養価の乏しい飼料を使用するように進化を遂げており、飼料は、それが嫌気性微生物のコミュニティによって発酵を受ける間、当該上部消化管に保持される。ルーメン微生物コミュニティは、非常に高密度なものであり、ミリリットル当たり約３×１０１０個の微生物細胞を含む。ルーメンでは嫌気発酵微生物が大半を占めている。ルーメン微生物コミュニティは、生命の３つすべてのドメイン（細菌、古細菌、及び真核生物）のメンバーを含む。ルーメン発酵産物は、体の維持、成長、ならびに乳産生のためにそのそれぞれの宿主によって必要とされるものである（ｖａｎ  Ｈｏｕｔｅｒｔ（１９９３）．Ａｎｉｍ．Ｆｅｅｄ  Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．４３，ｐｐ．１８９−２２５、Ｂａｕｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｕｔｒ．３１，ｐｐ．２９９−３１９（これらの文献はそれぞれ、あらゆる目的のために参照によってその全体が組み込まれる））。さらに、乳汁の収量及び組成は、ルーメン微生物コミュニティと関連することが報告されている（Ｓａｎｄｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．Ａｎｉｍａｌ  ８，ｐｐ．５７２−５７９、Ｐａｌｍｏｎａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）．Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．９３，ｐｐ．２７９−２８７（これらの文献はそれぞれ、あらゆる目的のために参照によってその全体が組み込まれる））。１つの実施形態では、Ｊｅｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８１，ｐｐ．４６９７−４７１０（あらゆる目的のために参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）に記載の処理を介してルーメン試料が取得される。
【０１０８】
別の実施形態では、試料は、土壌試料（例えば、バルク土壌または根圏の試料）である。１グラムの土壌は、数万の細菌分類群、及び最大で１０億個の細菌細胞、ならびに約２億の菌糸体を含むと推定されている（Ｗａｇｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １１１，ｐｐ．５２６６−５２７０（あらゆる目的のために参照によってその全体が組み込まれる））。細菌、放線菌、真菌、藻類、原生動物、及びウイルスはすべて、土壌に見られるものである。土壌微生物コミュニティの多様性は、土壌微小環境の構造及び肥沃度、植物による栄養素獲得、植物の多様性及び成長、ならびに地上コミュニティと地下コミュニティとの間の資源の循環と関連付けられている。したがって、土壌試料の微生物含量の経時変化ならびに活性微生物の共出現（及び活性微生物の数）を評価することで、環境メタデータパラメータ（栄養素獲得及び／または植物多様性など）と関連する微生物への洞察が得られる。
【０１０９】
１つの実施形態では、土壌試料は、根圏試料であり、根圏は、すなわち、根の分泌物及び関連土壌微生物によって直接的に影響を受ける狭い土壌領域である。根圏は、微生物活性の上昇が観測され、栄養素及び成長因子の交換を介して植物の根が土壌微生物と相互作用する、生息密度の高い領域である（Ｓａｎ  Ｍｉｇｕｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．ＤＯＩ  １０．１００７／ｓ００２５３−０１４−５５４５−６（あらゆる目的のために参照によってその全体が組み込まれる））。植物は、多くの化合物を根圏に分泌するため、根圏における生物型の解析は、そこで成長する植物の特徴を決定する上で有用であり得る。
【０１１０】
別の実施形態では、試料は、海洋試料または淡水試料である。海洋水は、ミリリットル当たり最大で１００万の微生物及び数千の微生物型を含む。こうした数は、沿岸水では有機物及び栄養素の生産性も取り込み量も高まることから桁違いに大きくなり得る。海洋微生物は、海洋生態系の機能、二酸化炭素の生産と固定とのバランス維持、海洋光合成微生物（シアノバクテリア、珪藻、ならびにピコ植物プランクトン及びナノ植物プランクトンなど）を介する地球上の酸素の５０％超の生産、新規の生理活性化合物及び代謝経路の提供、海洋食物網において非常に重要な最下位栄養レベルを占めることによる持続可能な海産物供給の確保、にとって極めて重要である。海洋環境に見られる生物には、ウイルス、細菌、古細菌、及びいくつかの真核生物が含まれる。海洋ウイルスは、ウイルスによる溶解を介して海洋細菌集団を制御する上で重要な役割を担い得る。海洋細菌は、他の小微生物にとっての食物源としても、有機物の生産者としても重要である。海洋において水柱を通じて見られる古細菌は遠洋古細菌であり、その存在量は海洋細菌の存在量に匹敵する。
【０１１１】
別の実施形態では、試料は、極限環境に由来する試料を含み、極限環境は、すなわち、地球上のほとんどの生命に有害な条件を伴う環境である。極限環境で増殖する生物は、極限環境微生物と呼ばれる。古細菌ドメインは、極限環境微生物のよく知られる例を含むが、真正細菌ドメインもまた、こうした微生物の代表的なものを有し得る。極限環境微生物には、３以下のｐＨレベルで増殖する好酸性微生物、９以上のｐＨレベルで増殖する好アルカリ微生物、増殖に酸素を必要としない嫌気性生物（Ｓｐｉｎｏｌｏｒｉｃｕｓ  Ｃｉｎｚｉａなど）、深部地下において地下水で満たされた岩石、亀裂、帯水層、及び断層の中の微小空間に生息する岩石内生物（ｃｒｙｐｔｏｅｎｄｏｌｉｔｈ）、少なくとも約０．２Ｍの塩濃度で増殖する好塩性生物、高温（約８０〜１２２℃）で生息する超好熱性生物（熱水系に見られるものなど）、寒冷砂漠において岩石下に生息する岩石下生物（ｈｙｐｏｌｉｔｈ）、黄鉄鉱のような還元ミネラル化合物からエネルギーを引き出し、地球化学的な循環において活性な独立栄養生物（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ  ｅｕｒｏｐａｅａなど）、高レベルの溶解重金属（銅、カドミウム、ヒ素、及び亜鉛など）に耐性を示す金属耐性生物、栄養的に限られた環境で増殖する低栄養生物、糖濃度が高い環境で増殖する高濃性生物（ｏｓｍｏｐｈｉｌｅ）、高圧で生息する好圧性生物（ｐｉｅｚｏｐｈｉｌｅ）（または好圧性生物（ｂａｒｏｐｈｉｌｅ））（海洋または地下の深い位置に見られるものなど）、約−１５℃以下の温度で生存、増殖、及び／または繁殖する好冷性生物（ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｅ）／好冷性生物（ｃｒｙｏｐｈｉｌｅ）、高レベルの電離放射線に抵抗性を示す放射線抵抗性生物、４５〜１２２℃の温度で生息する好熱性生物、極度に乾燥した条件で増殖することができる好乾性生物が含まれる。多重極限環境微生物は、複数のカテゴリーに入る極限環境微生物であると見なされる生物であり、多重極限環境微生物には、好熱好酸性微生物（７０〜８０℃の温度及びｐＨ２〜３を好む）が含まれる。古細菌のクレン古細菌門群は、好熱好酸性微生物を含む。
【０１１２】
試料は、１つまたは複数のドメインに由来する微生物を含み得る。例えば、１つの実施形態では、試料は、細菌及び／または真菌（本明細書では細菌株または真菌株とも称される）の不均一集団を含む。
【０１１３】
試料における１つまたは複数の微生物の存在及び絶対細胞数（例えば、同一または異なる環境から、及び／または複数の時点にわたって取得された複数の試料における１つまたは複数の微生物の絶対細胞数）を決定するための、本明細書で提供される方法では、１つまたは複数の微生物は、任意の型のものであり得る。例えば、１つまたは複数の微生物は、真正細菌ドメイン、古細菌ドメイン、真核生物ドメイン、またはそれらの組み合わせに由来し得る。細菌及び古細菌は、原核生物であり、内部オルガネラを有さない非常に単純な細胞構造を有する。細菌は、グラム陽性／外膜なし、グラム陰性／外膜あり、及び未分類の門に分類することができる。古細菌は、単細胞微生物のドメインまたは界を構成している。視覚的には細菌と同様ではあるものの、古細菌は、真核生物のもの（注目すべきは、転写及び翻訳に関与する酵素）とより密接に関連する遺伝子及びいくつかの代謝経路を有している。古細菌生化学の他の側面は、その細胞膜にエーテル脂質が存在するなど、特有のものである。古細菌は、タウム古細菌門、アイグ古細菌門、クレン古細菌門、及びコル古細菌門という４つの認知された門に分けられる。
【０１１４】
真核生物のドメインは、真核生物を含んでおり、真核生物は、膜結合型オルガネラ（核など）によって定義される。原生動物は、単細胞真核生物である。動物、植物、及び真菌を含めて、多細胞生物はすべて真核生物である。真核生物は、原生生物界、植物界、菌界、及び動物界という４つの界に分類されている。しかしながら、いくつかの代替分類が存在する。別の分類では、真核生物は、エクスカバータ界（さまざまな鞭毛原生動物）、アメーバ動物界（葉状アメーバ類（ｌｏｂｏｓｅ  ａｍｏｅｂｏｉｄ）及び粘液糸状菌）、オピストコンタ界（動物、真菌、襟鞭毛虫）、リザリア界（有孔虫、放散虫、及びさまざまな他のアメーバ様原生動物）、クロムアルベオラータ界（黄色植物（褐藻、珪藻）、ハプト植物、クリプト植物（またはクリプト藻類）、及びアルベオラータ）、アーケプラスチダ界／一次植物（陸上植物、緑藻、紅藻、及び灰色藻）という６つの界に分けられる。
【０１１５】
真核生物のドメイン内では、真菌が微生物コミュニティにおける主たる微生物である。真菌には、微生物（酵母及び糸状菌など）ならびによく知られたキノコが含まれる。真菌細胞は、グルカン及びキチンを含む細胞壁を有しており、このことは、こうした生物に特有の特徴である。真菌は、共通の祖先を共有する関連生物の単一群を形成しており、この群は、真菌類（Ｅｕｍｙｃｏｔａ）と呼ばれる。真菌界は、１５０万種〜５００万種と推定されており、これらのうちで正式に分類されているものは約５％である。ほとんどの真菌の細胞は、複数の核を含み得る菌糸と呼ばれる管状の伸長した糸状構造として増殖する。いくつかの種は、出芽または二分裂によって繁殖する単細胞酵母として増殖する。真菌の主要な門（ｐｈｙｌａ）（門（ｄｉｖｉｓｉｏｎ）と呼ばれることもある）は、その有性生殖構造の特徴に主に基づいて分類されている。現在、微胞子虫門、ツボカビ門、コウマクキン門、ネオカリマスティクス門、グロムス門、子嚢菌門、及び担子菌門という７つの門が提唱されている。
【０１１６】
本明細書に記載の方法による検出及び定量化の対象となる微生物は、ウイルスでもあり得る。ウイルスは、他の生物の生細胞の内部でのみ複製する小さな感染性病原体である。ウイルスは、真核生物、細菌、及び古細菌のドメインにおけるすべての型の生命体に感染することができる。ウイルス粒子（ビリオンとして知られる）は、（ｉ）ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る遺伝物質、（ｉｉ）こうした遺伝子を保護するタンパク質コート、ならびに場合によっては（ｉｉｉ）それが細胞外に存在するときにタンパク質コートを囲む脂質外被、という２つまたは３つの部分からなる。ウイルスについては、カウドウイルス目、ヘルペスウイルス目、リガメンウイルス目（Ｌｉｇａｍｅｎｖｉｒａｌｅ）、モノネガウイルス目、ニドウイルス目、ピコルナウイルス目、及びティモウイルス目という７つの目が確立されている。ウイルスゲノムは、一本鎖（ｓｓ）または二本鎖（ｄｓ）、ＲＮＡまたはＤＮＡであり得、ウイルスゲノムにおいては、逆転写酵素（ＲＴ）が使用されることも使用されないこともあり得る。さらに、ｓｓＲＮＡウイルスは、センス（＋）またはアンチセンス（−）であり得る。この分類では、ウイルスは、Ｉ：ｄｓＤＮＡウイルス（アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルスなど）、ＩＩ：（＋）ｓｓＤＮＡウイルス（パルボウイルスなど）、ＩＩＩ：ｄｓＲＮＡウイルス（レオウイルスなど）、ＩＶ：（＋）ｓｓＲＮＡウイルス（ピコルナウイルス、トガウイルスなど）、Ｖ：（−）ｓｓＲＮＡウイルス（オルソミクソウイルス、ラブドウイルスなど）、ＶＩ：生活環においてＤＮＡ中間体を伴う（＋）ｓｓＲＮＡ−ＲＴウイルス（レトロウイルスなど）、ＶＩＩ：ｄｓＤＮＡ−ＲＴウイルス（ヘパドナウイルスなど）という７つの群に分けられる。
【０１１７】
本明細書に記載の方法による検出及び定量化の対象となる微生物は、ウイロイドでもあり得る。ウイロイドは、知られる中で最小の感染性病原体であり、タンパク質コートなしの一本鎖ＲＮＡである環状短鎖のみからなる。ウイロイドは、ほとんどが植物病原体であり、そのいくつかは、経済観点から重要なものである。ウイロイドゲノムは、サイズが極端に小さく、約２４６〜約４６７の範囲の核酸塩基を有する。
【０１１８】
本明細書で提供される方法によれば、試料は、試料における１つまたは複数の微生物型の存在が検出されるように処理される（図１Ｂ、１００１；図２、２００１）。試料における１つまたは複数の微生物生物型の絶対数が決定される（図１Ｂ、１００２；図２、２００２）。１つまたは複数の生物型の存在の決定と、少なくとも１つの生物型の絶対数の決定と、は平行して実施するか、または連続して実施することができる。例えば、細菌（すなわち、１つの微生物型）及び真菌（すなわち、第２の微生物型）を含む微生物コミュニティを含む試料の場合、１つの実施形態では、試料におけるこれらの生物型のうちの一方または両方の存在がユーザーによって検出される（図１Ｂ、１００１；図２、２００１）。別の実施形態では、試料における少なくとも１つの生物型の絶対数（この例の場合、試料における細菌、真菌、またはそれらの組み合わせの数）がユーザーによって決定される（図１Ｂ、１００２；図２、２００２）。
【０１１９】
１つの実施形態では、試料またはその一部がフローサイトメトリー（ＦＣ）分析に供されることで、１つまたは複数の微生物型の存在及び／または数が検出される（図１Ｂ、１００１、１００２；図２、２００１、２００２）。フローサイトメーターによる１つの実施形態では、個々の微生物細胞は、少なくとも約３００個／秒、または少なくとも約５００個／秒、または少なくとも約１０００個／秒の速度でイルミネーションゾーンを通過する。しかしながら、この速度は、利用機器の型に応じて異なり得ることを当業者なら認識するであろう。電子的にゲートされる検出器によって、散乱光の程度を示すパルスの大きさが測定される。こうしたパルスの大きさが「ビン」または「チャネル」へと電子的に選別されることで、ある特定の定量的な特性（例えば、細胞の染色特性、直径、細胞膜）を有する細胞の数を、チャネル番号に対してヒストグラム表示することが可能になる。そのような分析によって、それぞれの「ビン」における細胞数を決定することが可能になり、こうした「ビン」は、本明細書に記載の実施形態では、「微生物型」ビン（例えば、細菌、真菌、線形動物、原生動物、古細菌、藻類、渦鞭毛藻類、ウイルス、ウイロイドなど）である。
【０１２０】
１つの実施形態では、試料は、１つまたは複数の蛍光色素で染色され（蛍光色素は、特定の微生物型に特異的である）、この染色によって、フローサイトメーターまたは蛍光を利用する何らかの他の検出方法及び定量化方法（蛍光顕微鏡法など）を介して検出することが可能になる。この方法によって、試料における所与の生物型の細胞数及び／または細胞体積を定量化することができる。別の実施形態では、本明細書に記載のように、フローサイトメトリーを利用することで、生物型の特有の第１のマーカー及び／または特有の第２のマーカー（酵素の発現、細胞表面タンパク質の発現など）の存在及び量が決定される。変数が２つまたは３つのヒストグラムまたは等高線図（例えば、光散乱と細胞膜染色に由来する蛍光と（タンパク質染色またはＤＮＡ染色に由来する蛍光と）を対比したもの）を生成することもできるため、集団全体における細胞間のさまざまな目的特性の分布の印象を得ることができる。そのような多パラメータのフローサイトメトリーデータを多く表示することは、一般的に行われることであり、本明細書に記載の方法での使用に適している。
【０１２１】
１つまたは複数の微生物型の存在及び数を検出するために試料を処理する実施形態の１つでは、顕微鏡法が利用される（図１Ｂ、１００１、１００２）。１つの実施形態では、顕微鏡法は、光学顕微鏡法であり、小さな試料の画像を拡大するために可視光及びレンズ系が使用される。デジタル画像は、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラによって記録することができる。他の顕微鏡手法には、限定はされないが、走査型電子顕微鏡法及び透過型電子顕微鏡法が含まれる。微生物型は、本明細書で提供される態様に従って可視化及び定量化される。
【０１２２】
本開示の別の実施形態では、１つまたは複数の微生物型の存在及び数を検出するために、各試料またはその一部が蛍光顕微鏡法に供される。異なる蛍光色素を使用することで、試料における細胞を直接的に染色し、落射蛍光顕微鏡ならびに上記のフローサイトメトリーを使用して細胞総数を定量化することができる。微生物の定量化に有用な色素には、限定はされないが、アクリジンオレンジ（ＡＯ）、４，６−ジ−アミノ−２フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、及び５−シアノ−２，３ジトリルテトラゾリウムクロリド（ＣＴＣ）が含まれる。生細胞は、生死判定染色方法によって推定することができ、こうした生死判定染色方法は、緑色蛍光のＳＹＴＯ９（商標）色素（すべての膜を透過する）及び赤色蛍光のヨウ化プロピジウム（ＰＩ）色素（損傷膜を有する細胞を透過する）という２つの核酸染色剤を含むＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）細菌生死判定キット（Ｂａｃ−Ｌｉｇｈｔ（商標））などである。したがって、膜に損傷がある細胞は赤色に染まることになり、一方、膜に損傷のない細胞は緑色に染まることになる。蛍光インサイチュハイブリダイゼーション法（ＦＩＳＨ）は、落射蛍光顕微鏡法を進展させたものであり、特定生物の迅速な検出及び計数を可能にするものである。ＦＩＳＨでは、試料における生物ＤＮＡに特異的に結合する蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブ（通常１５〜２５塩基対）が使用され、落射蛍光顕微鏡または共焦点レーザー走査型顕微鏡（ＣＬＳＭ）を使用して細胞を可視化することが可能になる。レポーター沈着触媒蛍光インサイチュハイブリダイゼーション法（Ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）（ＣＡＲＤ−ＦＩＳＨ）では、試験対象微生物から得られるシグナルの強度を増幅するために西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを使用することによってＦＩＳＨ法が改良されている。ＦＩＳＨを他の手法と組み合わせることで微生物コミュニティを特徴付けることができる。１つの複合手法は、高親和性ペプチド核酸（ＰＮＡ）−ＦＩＳＨであり、この手法では、プローブが細胞外高分子物質（ＥＰＳ）マトリックスを透過する能力が増強されている。別の例は、細胞生死判定キットとＦＩＳＨとが組み合わさったＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ−ＦＩＳＨであり、この手法は、飲料水配水系における消毒効率の評価に使用されている。
【０１２３】
別の実施形態では、各試料またはその一部は、微生物型の存在及び少なくとも１つの微生物型の絶対数を決定するために顕微ラマン分光法に供される（図１Ｂ、１００１〜１００２；図２、２００１〜２００２）。顕微ラマン分光法は、単一細胞ラマンスペクトル（ＳＣＲＳ）を検出及び測定することを可能にする非破壊かつ無標識の技術である。典型的なＳＣＲＳでは、単一細胞の固有の生化学的「フィンガープリント」が得られる。ＳＣＲＳは、その中に生体分子（核酸、タンパク質、糖質、及び脂質を含む）の情報を豊富に含んでおり、これによって、異なる細胞種、生理学的変化、及び細胞表現型を特徴付けることが可能になる。ラマン顕微鏡法では、異なる細胞バイオマーカーの化学結合によるレーザー光の散乱が調べられる。ＳＣＲＳは、１つの単一細胞におけるすべての生体分子のスペクトルの総和であり、細胞の表現型プロファイルを示す。細胞表現型は、遺伝子発現の結果としてのものであり、通常は遺伝子型を反映する。したがって、同一の増殖条件の下では、異なる微生物型からは、その遺伝子型の差異に対応する明確に異なるＳＣＲＳが得られるため、異なる微生物型をそのラマンスペクトルによって同定することができる。
【０１２４】
さらに別の実施形態では、試料またはその一部は、微生物型の存在及び少なくとも１つの微生物型の数を決定するために遠心分離に供される（図１Ｂ、１００１〜１００２；図２、２００１〜２００２）。この処理は、遠心分離機によって創出される遠心力を使用することによって不均一混合物を沈降させるものである。混合物の高密度成分は遠心分離機の軸から遠ざかって移動する一方で、混合物の低密度成分は軸に向かって移動する。遠心分離によって、細胞質部分、膜部分、及び細胞外部分へと試料を分画することが可能になる。目的の生物学的分子の局在情報を決定するためにも遠心分離を使用できる。さらに、全微生物コミュニティＤＮＡの分画にも遠心分離を使用することができる。異なる原核生物群は、ＤＮＡにおけるそのグアニン＋シトシン（Ｇ＋Ｃ）含量が異なるため、Ｇ＋Ｃ含量に基づく密度勾配遠心分離は、生物型、及びそれぞれの型と関連する細胞の数を識別するための方法である。この手法では、全コミュニティＤＮＡの分画プロファイルが得られ、Ｇ＋Ｃ含量の関数としてＤＮＡの存在量が示される。全コミュニティＤＮＡは、高度に精製された画分へと物理的に分離され、それぞれの画分は、Ｇ＋Ｃ含量が異なることを示しており、当該画分を、追加の分子手法（変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）／増幅リボソームＤＮＡ制限酵素分析（ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＤＮＡ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＡＲＤＲＡ）（本明細書の議論を参照のこと）など）によって分析することで、全微生物コミュニティの多様性及び１つまたは複数の微生物型の存在／量を評価することができる。
【０１２５】
別の実施形態では、試料またはその一部は、微生物型の存在及び少なくとも１つの微生物型の数を決定するために染色に供される（図１Ｂ、１００１〜１００２；図２、２００１〜２００２）。染色剤及び色素を使用することで、生物学的組織、細胞、または細胞内オルガネラを可視化することができる。染色を顕微鏡法、フローサイトメトリー、またはゲル電気泳動と併用することで、異なる微生物型に特有の細胞または生物学的分子を可視化またはマークすることができる。インビボ染色は、生存組織の染色処理である一方で、インビトロ染色では、その生物学的状況から取り出された細胞または構造が染色される。本明細書に記載の方法で使用するための特定の染色手法の例には、限定はされないが、細菌のグラム状態を決定するためのグラム染色、内生胞子の存在を同定するための内生胞子染色、チール・ネールゼン染色、組織の薄切片を調べるためのヘマトキシリン及びエオシン染色、体のさまざまな分泌液に由来する細胞試料を調べるためのパパニコロウ染色、糖質の過ヨウ素酸・シッフ染色、細胞を周囲結合組織と区別するために三色染色プロトコールを利用するマッソントリクローム、血液または骨髄試料を調べるためのロマノフスキー染色（またはライト染色、ジェンナー染色、メイ・グリュンワルド溶液、リーシュマン染色、及びギムザ染色を含む一般的な変法）、タンパク質及びＤＮＡを明らかにするための銀染色、脂質のためのズダン染色、ならびに真の内生胞子を検出するためのコンクリン染色（Ｃｏｎｋｌｉｎ’ｓ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）が含まれる。一般的な生物学的染色剤には、細胞周期を決定するためのアクリジンオレンジ、酸性ムチンのためのビスマルクブラウン、グリコーゲンのためのカルミン、核のためのカルミンアルミニウム、タンパク質のためのクマシーブルー、神経細胞質の酸性成分のためのクレシルバイオレット、細胞壁のためのクリスタルバイオレット、核のためのＤＡＰＩ、細胞質物質、細胞膜、いくつかの細胞外構造、及び赤血球のためのエオシン、ＤＮＡのための臭化エチジウム、コラーゲン、平滑筋、またはミトコンドリアのための酸性フクシン、核のためのヘマトキシリン、ＤＮＡのためのヘキスト染色剤、デンプンのためのヨウ素、細菌（ヒメネス染色手法の場合）及び胞子のためのマラカイトグリーン、クロマチンのためのメチルグリーン、動物細胞のためのメチレンブルー、ニッスル物質のためのニュートラルレッド、核のためのナイルブルー、親油性物質のためのナイルレッド、脂質のための四酸化オスミウム、蛍光顕微鏡法において使用されるローダミン、核のためのサフラニンが含まれる。染色剤は、コントラストを強調するために透過型電子顕微鏡法においても使用され、こうした染色剤には、リンタングステン酸、四酸化オスミウム、四酸化ルテニウム、モリブデン酸アンモニウム、ヨウ化カドミウム、カルボヒドラジド、塩化第二鉄、ヘキサミン、三塩化インジウム、硝酸ランタン、酢酸鉛、クエン酸鉛、硝酸鉛（ＩＩ）、過ヨウ素酸、リンモリブデン酸、フェリシアン化カリウム、フェロシアン化カリウム、ルテニウムレッド、硝酸銀、タンパク銀、塩化金酸ナトリウム、硝酸タリウム、チオセミカルバジド、酢酸ウラニル、硝酸ウラニル、及び硫���バナジルが含まれる。
【０１２６】
別の実施形態では、試料またはその一部は、微生物型の存在及び少なくとも１つの微生物型の数を決定するために質量分析（ＭＳ）に供される（図１Ｂ、１００１〜１００２；図２、２００１〜２００２）。ＭＳは、以下に議論されるように、試料における１つまたは複数の特有のマーカーの存在及び発現を検出するためにも使用することができる（図１Ｂ、１００３〜１００４；図２、２００３〜２００４）。ＭＳを使用することで、例えば、微生物型に特有のタンパク質及び／またはペプチドマーカーの存在及び量が検出されるため、試料におけるそれぞれの微生物型の数が評価される。定量化は、安定同位体標識を用いて実施するか、または標識を用いずに実施することができる。ペプチドのデノボシークエンシングは、ＭＳ／ＭＳスペクトルから直接的に実施するか、または配列タグ付け（データベースに対して一致し得る短いタグを得る）を行っても実施することができる。ＭＳは、タンパク質の翻訳後修飾を明らかにし、代謝物を同定することもできる。ＭＳをクロマトグラフィー手法及び他の分離手法（ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、イオン移動度など）と併用することで、質量の分解能及び決定能を高めることができる。
【０１２７】
別の実施形態では、試料またはその一部は、微生物型の存在及び少なくとも１つの微生物型の数を決定するために脂質分析に供される（図１Ｂ、１００１〜１００２；図２、２００１〜２００２）。脂肪酸は、細胞バイオマスに比較的一定の比率で存在しており、コミュニティ内の微生物型を区別することができるシグネチャー脂肪酸が微生物細胞には存在する。１つの実施形態では、脂肪酸は、鹸化した後、誘導体化してそれぞれの脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）を得ることによって抽出され、その後、ＦＡＭＥは、ガスクロマトグラフィーによって分析される。次に、１つの実施形態では、ＦＡＭＥプロファイルが参照ＦＡＭＥデータベースと比較されることで、多変量統計解析によって脂肪酸及びその対応微生物シグネチャーが同定される。
【０１２８】
本明細書で提供される方法の態様では、試料またはその一部（例えば、試料の一定分量）における特有の第１のマーカーの数、ならびに特有の第１のマーカーのそれぞれの量が測定される（図１Ｂ、１００３；図２、２００３）。特有のマーカーは、微生物株のマーカーである。探索及び測定の対象となる特有のマーカーによっては試料全体を分析する必要はないことを当業者なら理解するであろう。例えば、特有のマーカーが細菌株に特有のものであれば、試料の真菌部分を分析する必要はない。上記のように、いくつかの実施形態では、試料における１つまたは複数の生物型の絶対細胞数の測定は、生物型によって試料を分離すること（例えば、フローサイトメトリーを介して実施される）を含む。
【０１２９】
本明細書では、生物株に特有の任意のマーカーを利用することができる。例えば、マーカーには、限定はされないが、小サブユニットリボソームＲＮＡ遺伝子（１６Ｓ／１８Ｓ  ｒＤＮＡ）、大サブユニットリボソームＲＮＡ遺伝子（２３Ｓ／２５Ｓ／２８Ｓ  ｒＤＮＡ）、介在５．８Ｓ遺伝子、チトクロムｃ酸化酵素、ベータ−チューブリン、伸長因子、ＲＮＡポリメラーゼ、及び内部転写スペーサー（ＩＴＳ）が含まれ得る。
【０１３０】
リボソームＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）、特に小サブユニットリボソームＲＮＡ遺伝子（すなわち、真核生物の場合は１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子（１８Ｓ  ｒＤＮＡ）であり、原核生物の場合は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ（１６Ｓ  ｒＤＮＡ）である）は、微生物コミュニティにおける生物型及び株を評価する上で主たる標的となっている。しかしながら、大サブユニットリボソームＲＮＡ遺伝子（２８Ｓ  ｒＤＮＡ）もまた、標的とされている。ｒＤＮＡは、分類学的な同定に適したものであり、この理由は、（ｉ）既知生物のすべてにｒＤＮＡが普遍的に存在すること、（ｉｉ）保存領域と可変領域との両方をｒＤＮＡが有すること、（ｉｉｉ）比較に利用可能なｒＤＮＡ配列のデータベースが指数関数的に充実してきていること、によるものである。試料のコミュニティ解析では、保存領域は、対応するユニバーサルＰＣＲプライマー及び／またはシークエンシングプライマーのためのアニーリング部位として役立ち、一方、可変領域は、系統発生学的な差異を明らかにするために使用することができる。さらに、細胞におけるｒＤＮＡのコピー数が多いことも、環境試料からの検出を容易にしている。
【０１３１】
内部転写スペーサー（ＩＴＳ）は、１８Ｓ  ｒＤＮＡと２８Ｓ  ｒＤＮＡとの間に位置するものであり、ＩＴＳもまた、標的とされている。ＩＴＳは、転写はされるものの、リボソームの構築前にスプライシングを受けて除去される。ＩＴＳ領域は、ＩＴＳ１及びＩＴＳ２という２つの高度に可変なスペーサーと、介在５．８Ｓ遺伝子と、から構成される。ゲノムには、このｒＤＮＡオペロンのコピーが複数存在する。ＩＴＳ領域は、リボソームの構成要素をコードしないため、高度に可変である。
【０１３２】
１つの実施形態では、特有のＲＮＡマーカーは、ｍＲＮＡマーカー、ｓｉＲＮＡマーカー、またはリボソームＲＮＡマーカーであり得る。
【０１３３】
タンパク質をコードする機能遺伝子もまた、特有の第１のマーカーとして本明細書で使用することができる。そのようなマーカーには、限定はされないが、リコンビナーゼＡ遺伝子ファミリー（細菌のＲｅｃＡ、古細菌のＲａｄＡ及びＲａｄＢ、真核生物のＲａｄ５１及びＲａｄ５７、ファージのＵｖｓＸ）、ＲＮＡポリメラーゼβサブユニット（ＲｐｏＢ）遺伝子（転写の開始及び伸長を担う）、シャペロニンが含まれる。候補マーカー遺伝子もまた、細菌＋古細菌に対するものが同定されている：リボソームタンパク質Ｓ２（ｒｐｓＢ）、リボソームタンパク質Ｓ１０（ｒｐｓＪ）、リボソームタンパク質Ｌ１（ｒｐｌＡ）、翻訳伸長因子ＥＦ−２、翻訳開始因子ＩＦ−２、メタロエンドペプチダーゼ、リボソームタンパク質Ｌ２２、ｆｆｈ  シグナル認識粒子タンパク質、リボソームタンパク質Ｌ４／Ｌ１ｅ（ｒｐｌＤ）、リボソームタンパク質Ｌ２（ｒｐｌＢ）、リボソームタンパク質Ｓ９（ｒｐｓＩ）、リボソームタンパク質Ｌ３（ｒｐｌＣ）、フェニルアラニルｔＲＮＡシンテターゼベータサブユニット、リボソームタンパク質Ｌ１４ｂ／Ｌ２３ｅ（ｒｐｌＮ）、リボソームタンパク質Ｓ５、リボソームタンパク質Ｓ１９（ｒｐｓＳ）、リボソームタンパク質Ｓ７、リボソームタンパク質Ｌ１６／Ｌ１０Ｅ（ｒｐｌＰ）、リボソームタンパク質Ｓ１３（ｒｐｓＭ）、フェニルアラニルｔＲＮＡシンテターゼαサブユニット、リボソームタンパク質Ｌ１５、リボソームタンパク質Ｌ２５／Ｌ２３、リボソームタンパク質Ｌ６（ｒｐｌＦ）、リボソームタンパク質Ｌ１１（ｒｐｌＫ）、リボソームタンパク質Ｌ５（ｒｐｌＥ）、リボソームタンパク質Ｓ１２／Ｓ２３、リボソームタンパク質Ｌ２９、リボソームタンパク質Ｓ３（ｒｐｓＣ）、リボソームタンパク質Ｓ１１（ｒｐｓＫ）、リボソームタンパク質Ｌ１０、リボソームタンパク質Ｓ８、ｔＲＮＡプソイドウリジンシンターゼＢ、リボソームタンパク質Ｌ１８Ｐ／Ｌ５Ｅ、リボソームタンパク質Ｓ１５Ｐ／Ｓ１３ｅ、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ、リボソームタンパク質Ｓ１７、リボソームタンパク質Ｌ１３（ｒｐｌＭ）、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシクロ−リガーゼ（ｒｐｓＥ）、リボヌクレアーゼＨＩＩ、及びリボソームタンパク質Ｌ２４。細菌に対する他の候補マーカー遺伝子には、転写伸長タンパク質ＮｕｓＡ（ｎｕｓＡ）、ｒｐｏＢ  ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼサブユニットベータ（ｒｐｏＢ）、ＧＴＰ結合タンパク質ＥｎｇＡ、ｒｐｏＣ  ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼサブユニットベータ’、ｐｒｉＡ  プライモソーム集合タンパク質、転写共役修復因子、ＣＴＰシンターゼ（ｐｙｒＧ）、ｓｅｃＹ  タンパク質前駆体トランスロカーゼサブユニットＳｅｃＹ、ＧＴＰ結合タンパク質Ｏｂｇ／ＣｇｔＡ、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ｒｐｓＦ  ３０Ｓリボソームタンパク質Ｓ６、ｐｏＡ  ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼサブユニットアルファ、ペプチド鎖終結因子１、ｒｐｌＩ  ５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ９、ポリリボヌクレオチドヌクレオチジルトランスフェラーゼ、ｔｓｆ  伸長因子Ｔｓ（ｔｓｆ）、ｒｐｌＱ  ５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ１７、ｔＲＮＡ（グアニン−Ｎ（１）−）−メチルトランスフェラーゼ（ｒｐｌＳ）、ｒｐｌＹ  推定５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ２５、ＤＮＡ修復タンパク質ＲａｄＡ、グルコース阻害分裂タンパク質Ａ、リボソーム結合因子Ａ、ＤＮＡミスマッチ修復タンパク質ＭｕｔＬ、ｓｍｐＢ  ＳｓｒＡ−結合タンパク質（ｓｍｐＢ）、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、Ｓ−アデノシル−メチルトランスフェラーゼＭｒａＷ、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルムラモイルアラニン−−Ｄ−グルタミン酸リガーゼ、ｒｐｌＳ  ５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ１９、ｒｐｌＴ  ５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ２０（ｒｐｌＴ）、ｒｕｖＡ  ホリデイジャンクションＤＮＡヘリカーゼ、ｒｕｖＢ  ホリデイジャンクションＤＮＡヘリカーゼＢ、ｓｅｒＳ  セリルｔＲＮＡシンテターゼ、ｒｐｌＵ  ５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ２１、ｒｐｓＲ  ３０Ｓリボソームタンパク質Ｓ１８、ＤＮＡミスマッチ修復タンパク質ＭｕｔＳ、ｒｐｓＴ  ３０Ｓリボソームタンパク質Ｓ２０、ＤＮＡ修復タンパク質ＲｅｃＮ、ｆｒｒ  リボソームリサイクリング因子（ｆｒｒ）、組換えタンパク質ＲｅｃＲ、機能未知タンパク質ＵＰＦ００５４、ｍｉａＡ  ｔＲＮＡイソペンテニルトランスフェラーゼ、ＧＴＰ結合タンパク質ＹｃｈＦ、染色体複製開始タンパク質ＤｎａＡ、デホスホＣｏＡキナーゼ、１６Ｓ  ｒＲＮＡプロセシングタンパク質ＲｉｍＭ、ＡＴＰ−コーン（ｃｏｎｅ）ドメインタンパク質、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼ、２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸シンターゼ、脂肪酸／リン脂質合成タンパク質ＰｌｓＸ、ｔＲＮＡ（Ｉｌｅ）−ライシジンシンテターゼ、ｄｎａＧ  ＤＮＡプライマーゼ（ｄｎａＧ）、ｒｕｖＣ  ホリデイジャンクションリゾルバーゼ、ｒｐｓＰ  ３０Ｓリボソームタンパク質Ｓ１６、リコンビナーゼＡ  ｒｅｃＡ、リボフラビン生合成タンパク質ＲｉｂＦ、グリシルｔＲＮＡシンテターゼベータサブユニット、ｔｒｍＵ  ｔＲＮＡ（５−メチルアミノメチル−２−チオウリジレート）−メチルトランスフェラーゼ、ｒｐｍＩ  ５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３５、ｈｅｍＥウロポルフィリノーゲン脱炭酸酵素、桿状決定タンパク質、ｒｐｍＡ  ５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ２７（ｒｐｍＡ）、ペプチジルｔＲＮＡヒドロラーゼ、翻訳開始因子ＩＦ−３（ｉｎｆＣ）、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルムラミル−トリペプチドシンテターゼ、ｒｐｍＦ  ５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３２、ｒｐＩＬ  ５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２（ｒｐＩＬ）、ｌｅｕＳ  ロイシルｔＲＮＡシンテターゼ、ｌｉｇＡ  ＮＡＤ依存性ＤＮＡリガーゼ、細胞分裂タンパク質ＦｔｓＡ、ＧＴＰ結合タンパク質ＴｙｐＡ、ＡＴＰ依存性Ｃｌｐプロテアーゼ、ＡＴＰ結合サブユニットＣｌｐＸ、ＤＮＡ複製及び修復タンパク質ＲｅｃＦ、ならびにＵＤＰ−Ｎ−アセチルエノールピルボイルグルコサミンレダクターゼが含まれる。
【０１３４】
リン脂質脂肪酸（ＰＬＦＡ）もまた、本明細書に記載の方法による特有の第１のマーカーとして使用することができる。ＰＬＦＡは、微生物が増殖する間に急速に合成され、貯蔵分子には見られず、細胞死の間に急速に分解されるため、現在の生存コミュニティの構成メンバー数をＰＬＦＡによって正確に調べることができる。すべての細胞は、抽出及びエステル化して脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）を形成させることができる脂肪酸（ＦＡ）を含んでいる。ガスクロマトグラフィー−質量分析を使用してＦＡＭＥが分析されると、得られるプロファイルは、試料における微生物の「フィンガープリント」となる。真正細菌ドメイン及び真核生物ドメインにおける生物の膜の化学組成物は、エステル型結合によってグリセロールに連結された脂肪酸（リン脂質脂肪酸（ＰＬＦＡ））から構成される。一方、古細菌の膜脂質は、エーテル型結合によってグリセロールに連結された長鎖の分岐炭化水素（リン脂質エーテル脂質（ＰＬＥＬ））から構成される。これは、これら３つのドメインを区別するために最も広く使用される非遺伝子的な基準の１つである。この意味においては、微生物細胞膜に由来するリン脂質（異なるアシル鎖によって特徴付けられる）は優れたシグネチャー分子であり、この理由は、そのような脂質構造多様性を特定の微生物分類群と関連付けできることによるものである。
【０１３５】
本明細書に示されるように、生物株が活性であるかを決定するために、１つまたは複数の特有の第２のマーカー（第１のマーカーと同一または異なり得る）の発現レベルが測定される（図１Ｂ、１００４；図２、２００４）。特有の第１のマーカーは、上記のものである。特有の第２のマーカーは、微生物活性のマーカーである。例えば、１つの実施形態では、上記の第１のマーカーのいずれかのｍＲＮＡまたはタンパク質の発現は、本開示の目的のための特有の第２のマーカーであると見なされる。
【０１３６】
１つの実施形態では、第２のマーカーの発現レベルが閾値レベル（例えば、対照レベル）以上であるならば、微生物は、活性であると見なされる（図１Ｂ、１００５；図２、２００５）。１つの実施形態では、第２のマーカーの発現レベルが、閾値レベル（いくつかの実施形態では対照レベル）と比較して少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、または少なくとも約３０％変化するのであれば、活性であると判定される。
【０１３７】
特有の第２のマーカーは、１つの実施形態では、タンパク質レベル、ＲＮＡレベル、または代謝物レベルで測定される。特有の第２のマーカーは、特有の第１のマーカーと同一または異なる。
【０１３８】
上に示されるように、本明細書に記載の方法に従って、複数の特有の第１のマーカー及び特有の第２のマーカーを検出することができる。さらに、特有の第１のマーカーの検出及び定量化は、当業者に知られる方法に従って実施される（図１Ｂ、１００３〜１００４、図２、２００３〜２００４）。
【０１３９】
１つの実施形態では、核酸シークエンシング（例えば、ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ）を使用することで、特有の第１のマーカー及び／または特有の第２のマーカーの絶対細胞数が決定される。シークエンシングプラットフォームには、限定はされないが、Ｒｏｃｈｅ／４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ／Ｓｏｌｅｘａ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ、及びＮａｎｏｐｏｒｅから利用可能なサンガーシークエンシング法及びハイスループットシークエンシング法が含まれる。シークエンシングは、特定のＤＮＡ配列もしくはＲＮＡ配列のアンプリコンシークエンシング、または全メタゲノム／トランスクリプトームのショットガンシークエンシングであり得る。
【０１４０】
従来のサンガーシークエンシング（Ｓａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｃｈａｉｎ−ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，ｐｐ．５４６３−５４６７（参照によってその全体が本明細書に組み込まれる））は、インビトロのＤＮＡ複製の間に、鎖伸長を停止するジデオキシヌクレオチドがＤＮＡポリメラーゼによって選択的に取り込まれることに依存するものであり、本明細書に記載の方法での使用に適している。
【０１４１】
別の実施形態では、試料またはその一部は、核酸の抽出、適切なプライマーを用いた目的ＤＮＡ（ｒＲＮＡ遺伝子など）の増幅、及びシークエンシングベクターを使用するクローンライブラリーの構築に供される。次に、選択されたクローンがサンガーシークエンシングによってシークエンシングされ、目的ＤＮＡのヌクレオチド配列が検索されることで、試料における特有の微生物株の数を計算することが可能になる。
【０１４２】
Ｒｏｃｈｅ／４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓの４５４パイロシークエンシングは、長いリードを生成するものであり、本明細書に記載の方法において利用することができる（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ，４３７，ｐｐ．３７６−３８０、米国特許第６，２７４，３２０号、同６，２５８，５６８号、同６，２１０，８９１号（これらの文献はそれぞれ、あらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる））。シークエンシング対象の核酸（例えば、アンプリコンまたはネブライザーによって断片化したゲノムＤＮＡ／メタゲノムＤＮＡ）は、ＰＣＲまたはライゲーションによって特異的なアダプターが両末端に付加される。アダプターを有するＤＮＡは、小さなビーズに固定化され（理想的には、１つのビーズが１つのＤＮＡ断片を有することになる）、このビーズは、油中水型エマルションに懸濁される。次に、エマルションＰＣＲ段階が実施されることで、それぞれのＤＮＡ断片の複数のコピーが調製され、その結果、同一のＤＮＡ断片がクローン化された多くのコピーをそれぞれのビーズが含むビーズのセットが得られる。次に、ビーズはそれぞれ、光ファイバーチップのウェルに入れられ、当該ウェルは、合成によるシークエンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）反応に必要な酵素も含む。塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴ）が付加されるとピロリン酸が放出され、この放出によって閃光が生じ、この閃光が記録されることで各ウェルにおけるＤＮＡ断片の配列判定が行われる。最大１，０００塩基のリード長でラン当たり約１００万のリード数を達成することができる。ペアエンドシークエンシングを行うことができ、これによってリードのペアが得られ、得られたリードはそれぞれ、所与のＤＮＡ断片の一方の末端から始まるものである。マルチプレックス反応では、分子バーコードを創出し、アダプター配列と目的配列との間に設置することができ、これによって、それぞれの配列を生物情報学的に試料に割り当てることが可能になる。
【０１４３】
Ｉｌｌｕｍｉｎａ／Ｓｏｌｅｘａシークエンシングでは、約２５塩基対（ｂｐ）〜約３００ｂｐの平均リード長が得られる（Ｂｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ，６：３７３−３８２、Ｌａｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １５，ｐ．６３、Ｆａｄｒｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ  ２，ｐ．６、Ｃａｐｏｒａｓｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）ＩＳＭＥ  Ｊ，６，ｐ．１６２１−１６２４、Ｂｅｎｔｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ａｃｃｕｒａｔｅ  ｗｈｏｌｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｎａｔｕｒｅ，４５６：５３−５９）。このシークエンシング技術もまた、合成によるシークエンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）であるが、このシークエンシング技術では、可逆的色素ターミネーターと、オリゴが付加された領域を有するフローセルと、が利用される。シークエンシング対象のＤＮＡ断片は、特異的なアダプターを両末端に有しており、断片の末端にハイブリダイズする特異的なオリゴヌクレオチドが多数配置されたフローセル上に流される。次に、断片はそれぞれ、複製されて同一断片のクラスターが調製される。次に、可逆的色素−ターミネーターヌクレオチドがフローセル上に流され、結合する時間が取られる。過剰のヌクレオチドは洗浄除去され、フローセルが画像化される。可逆的ターミネーターは除去することができ、その結果、処理を繰り返すことができ、その後のサイクルにおいてヌクレオチドを続けて添加することができる。それぞれの長さが３００塩基のペアエンドリードを達成することができる。Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォームでは、それぞれのリードにつき１２５塩基を有するペアエンド様式で４０億の断片を１回のランで生成することができる。試料のマルチプレックス解析については、バーコードを使用することもできるが、インデックスプライマーが使用される。
【０１４４】
ＳＯＬｉＤ（オリゴヌクレオチドのライゲーション及び検出によるシークエンシング（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））処理は、「ライゲーションによるシークエンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｌｉｇａｔｉｏｎ）」手法であり、第１のマーカー及び／または第２のマーカーの存在及び量を検出するために本明細書に記載の方法で使用することができる（図１Ｂ、１００３〜１００４；図２、２００３〜２００４）（Ｐｅｃｋｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．ＳＯＬｉＤ（商標）Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  ２−Ｂａｓｅ  Ｅｎｃｏｄｉｎｇ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００７、Ｍｉｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ  ｕｓｉｎｇ  ＳＯＬｉＤ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ  ｇｅｎｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  ＳＯＬｉＤ  ｓｈｏｔｇｕｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１４（Ｓｕｐｐｌ５）：Ｓ１６、Ｍａｒｄｉｓ（２００８）Ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄｓ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ，９：３８７−４０２（これらの文献はそれぞれ、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる））。ＤＮＡ断片のライブラリーは、シークエンシング対象の試料から調製され、クローンビーズ集団を調製するために使用され、この場合、それぞれの磁気ビーズの表面に１種類のみの断片が存在することになる。磁気ビーズに結合した断片は、ユニバーサルＰ１アダプター配列を有することになり、その結果、あらゆる断片の開始配列が既知かつ同一のものとなる。プライマーは、ライブラリーテンプレート内のＰ１アダプター配列にハイブリダイズする。４種類の蛍光で標識された二塩基プローブのセットがシークエンシングプライマーへのライゲーションにおいて競合する。１つ目の塩基及び２つ目の塩基がすべて、各ライゲーション反応において確実に確かめられることによって二塩基プローブの特異性が達成される。ライゲーション、検出、及び切断のサイクルが複数回実施され、サイクル数によって最終的なリード長が決定される。ＳＯＬｉＤプラットフォームでは、長さが７５塩基のリードをラン当たり最大で３０億リード生成することができる。ペアエンドシークエンシングが利用可能であり、本明細書で使用することができるが、ペアにおける第２のリードの長さは３５塩基にすぎない。別々のインデックスを付けたランを行えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａによって使用されるものと類似のシステムを介して試料のマルチプレックス解析を行うことが可能である。
【０１４５】
Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔシステムは、４５４シークエンシングと同様のものであり、第１のマーカー及び／または第２のマーカーの存在及び量を検出するための本明細書に記載の方法での使用に適している（図１Ｂ、１００３〜１００４；図２、２００３〜２００４）。Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔシステムでは、ＤＮＡ断片が結合したビーズを含むマイクロウェルのプレートが使用される。しかしながら、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔシステムは、塩基の取り込みが検出される様式がその他のシステムのすべてと異なる。伸長中のＤＮＡ鎖に塩基が付加されるとプロトンが放出され、このプロトンによって周辺のｐＨが僅かに変化する。ｐＨを検知する微量測定器がプレート上のウェルと結び付いており、こうした変化が生じると当該微量測定器によって記録される。異なる塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）がウェルを通って順次流れることで、各ウェルに由来する配列を推定することが可能になる。Ｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｎプラットフォームは、２００塩基のリード長を有するリードをラン当たり最大で５０００万リード生成することができる。Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍａｃｈｉｎｅプラットフォームでは、４００塩基という、より長いリードが生成される。双方向シークエンシングが利用可能である。マルチプレックス解析は、標準的なインライン分子バーコードシークエンシングを介して行うことが可能である。
【０１４６】
Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＰａｃＢｉｏ）ＳＭＲＴシークエンシングは、一分子リアルタイムシークエンシング手法を使用するものであり、１つの実施形態では、第１のマーカー及び／または第２のマーカーの存在及び量を検出するための本明細書に記載の方法で使用される（図１Ｂ、１００３〜１００４；図２、２００３〜２００４）。ＰａｃＢｉｏシークエンシングシステムは、増幅段階を必要としないことから、他の主要な次世代シークエンシングシステムとは一線を画するものとなっている。１つの実施形態では、このシークエンシングは、多くのゼロモード導波路（ＺＭＷ）検出器を含むチップ上で実施される。ＺＭＷ検出器にはＤＮＡポリメラーゼが結合されており、リン酸を介して連結された色素で標識されたヌクレオチドの取り込みがＤＮＡ鎖の合成と並行してリアルタイムで画像化される。ＰａｃＢｉｏシステムでは、非常に長いリード長（平均約４，６００塩基）が得られ、ラン当たりに得られるリード数も非常に多い（約４７，０００）。リードは、典型的には、両末端からの独立したシークエンシングを必要とすることなくＣＣＳを介して断片を複数回カバーできるほど十分な長さを有するため、典型的な「ペアエンド」手法はＰａｃＢｉｏでは使用されない。ＰａｃＢｉｏでのマルチプレックス解析は、独立したリードを必要とするものではなく、標準的な「インライン」バーコード付加モデルに従って行われる。
【０１４７】
１つの実施形態では、特有の第１のマーカーがＩＴＳゲノム領域の場合、試料における微生物株の数及び独自性を決定するために、１つの実施形態では、リボソーム遺伝子間スペーサー自動解析（ＡＲＩＳＡ）が使用される（図１Ｂ、１００３、図２、２００３）（Ｒａｎｊａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）．Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５，ｐｐ．１１１１−１１２０（あらゆる目的のために参照によってその全体が本明細書に組み込まれる））。ＩＴＳ領域は、長さとヌクレオチド配列との両方において顕著な不均一性を有する。蛍光標識されたフォワードプライマー及び自動ＤＮＡシークエンサーを使用することで、高い分離分解能及びハイスループットを得ることが可能である。各試料に内部標準を含めることで、包括的断片のサイズ分類における精度が得られる。
【０１４８】
別の実施形態では、試料における特有の第１のマーカー及びその量を特徴付けるために、ＰＣＲによって増幅されたｒＤＮＡ断片の断片長多型（ＲＦＬＰ）（増幅リボソームＤＮＡ制限酵素分析（ＡＲＤＲＡ）としても知られる）が使用される（図１Ｂ、１００３、図２、２００３）（追加詳細については、Ｍａｓｓｏｌ−Ｄｅｙａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｅｃｏｌ．Ｍａｎｕａｌ．３．３．２，ｐｐ．１−１８（あらゆる目的のために参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。共通プライマーを使用するＰＣＲによってｒＤＮＡ断片が生成され、生成したｒＤＮＡ断片は、制限酵素で消化され、アガロースゲルまたはアクリルアミドゲルにおいて電気泳動され、臭化エチジウムまたは硝酸銀で染色される。
【０１４９】
特有の第１のマーカーの存在及び存在量の検出において使用されるフィンガープリンティング手法の１つは、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）である（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６２，ｐｐ．３１１２−３１２０、Ｓｃｈｅｉｎｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２６，ｐｐ．１０３−１１７、Ｓｃｈｗｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｔｅｂｂｅ（１９９８）．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４，ｐｐ．４８７０−４８７６（これらの文献はそれぞれ、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。この手法では、ＤＮＡ断片（１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に特異的なプライマーを用いて得られたＰＣＲ産物など）が変性され、非変性ゲルで直接的に電気泳動される。分離は、サイズ差異と、一本鎖ＤＮＡの折り畳まれた高次構造と、に基づいており、こうしたものによって電気泳動移動度が影響を受ける。電気泳動の間にＤＮＡ鎖が再アニーリングすることは、いくつかの方針によって阻止することができ、こうした方針には、ＰＣＲにおいて１つのリン酸化プライマーを使用した後、ラムダエキソヌクレアーゼでリン酸化鎖を特異的に消化すること、及び１つのビオチン化プライマーを使用して変性後の１つの一本鎖を磁気で分離すること、が含まれる。所与の微生物コミュニティにおける主たる集団の独自性を評価するために、１つの実施形態では、バンドが切り出され、シークエンシングされるか、または特異的なプローブがＳＳＣＰパターンにハイブリダイズされ得る。電気泳動条件（ゲルマトリックス、温度、及びゲルへのグリセロールの添加など）によって、分離に影響が及び得る。
【０１５０】
シークエンシングに基づく方法に加えて、第２のマーカーの発現（例えば、遺伝子発現、タンパク質発現）を定量化するための他の方法もまた、１つまたは複数の第２のマーカーの発現レベルを決定するための本明細書で提供される方法での使用に適している（図１Ｂ、１００４；図２、２００４）。例えば、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイ解析、線形増幅手法（核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）など）はすべて、本明細書に記載の方法での使用に適しており、当業者に知られる方法に従って実施することができる。
【０１５１】
別の実施形態では、試料またはその一部は、第１のマーカー及び／または第２のマーカーの存在及び量を検出するための定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供される（図１Ｂ、１００３〜１００４；図２、２００３〜２００４）。転写されたリボソームＲＮＡ及び／またはメッセンジャーＲＮＡ（ｒＲＮＡ及びｍＲＮＡ）を相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）へと逆転写した後、ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を実施することによって、特定の微生物株の活性が測定される。
【０１５２】
別の実施形態では、試料またはその一部は、第１のマーカー及び／または第２のマーカーの存在及び量を検出するために、ＰＣＲに基づくフィンガープリンティング手法に供される（図１Ｂ、１００３〜１００４；図２、２００３〜２００４）。ＰＣＲ産物は、ヌクレオチド組成に基づいて電気泳動によって分離することができる。異なるＤＮＡ分子の間の配列差異は、融解挙動に影響を与えるため、異なる配列を有する分子は、ゲル中の異なる位置で移動を停止することになる。したがって、異なるバンドまたはピークの位置及び相対強度によって電気泳動プロファイルを定義することができ、この電気泳動プロファイルを、多様性インデックスを計算するための数値データに変換することができる。ゲルからバンドを切り出した後、シークエンシングすることで、コミュニティメンバーの系統発生学的な所属を明らかにすることもできる。電気泳動方法には、限定はされないが、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）、温度勾配ゲル電気泳動（ＴＧＧＥ）、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）、制限酵素断片長多型分析（ＲＦＬＰ）または増幅リボソームＤＮＡ制限酵素分析（ＡＲＤＲＡ）、末端標識制限酵素断片多型分析（Ｔ−ＲＦＬＰ）、リボソーム遺伝子間スペーサー自動解析（ＡＲＩＳＡ）、無作為増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）、ＤＮＡ増幅フィンガープリンティング（ＤＡＦ）、及びＢｂ−ＰＥＧ電気泳動が含まれ得る。
【０１５３】
別の実施形態では、試料またはその一部は、特有の第１のマーカーの量及び／または特有の第２のマーカーの存在／量を決定するために、チップに基づくプラットフォーム（マイクロアレイまたはマイクロフルイディクスなど）に供される（図１Ｂ、１００３〜１００４、図２、２００３〜２００４）。試料における全ＤＮＡからＰＣＲ産物が増幅され、マイクロアレイに固定された既知の分子プローブに対して当該ＰＣＲ産物が直接的にハイブリダイズされる。この蛍光標識ＰＣＲアンプリコンが当該プローブにハイブリダイズした後、共焦点レーザー走査型顕微鏡法を使用することによって陽性シグナルがスコア付けされる。マイクロアレイ手法では、複製に関して試料を迅速に評価することが可能になり、このことは、微生物コミュニティの分析においては重要な利点である。マイクロアレイ上でのハイブリダイゼーションシグナル強度は、標的生物の量に直接的に比例し得る。ユニバーサル高密度１６Ｓマイクロアレイ（例えば、ＰＨＹＬＯＣＨＩＰ）は、いくつかの培養微生物種及び「候補の門（ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ）」を標的とする１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のプローブを約３０，０００個含む。こうしたプローブによって、１２１の区分された原核生物目のすべてが標的となり、８，７４１の細菌分類群及び古細菌分類群を同時に検出することが可能になる。微生物コミュニティのプロファイリングのために使用される別のマイクロアレイは、機能遺伝子アレイ（ＦＧＡ）である。ＰＨＹＬＯＣＨＰとは異なり、ＦＧＡは、細菌の特定の代謝群を検出することを第一に設計される。したがって、ＦＧＡは、コミュニティ構造を明らかにするだけでなく、インサイチュのコミュニティ代謝能も解明するものである。ＦＧＡは、生物学的機能が既知の遺伝子に由来するプローブを含んでいるため、微生物コミュニティ組成を生態系機能と関連付ける上で有用である。ＧＥＯＣＨＩＰと呼ばれるＦＧＡは、さまざまな生物地球化学的プロセス、生態学的プロセス、及び環境プロセス（アンモニア酸化、メタン酸化、及び窒素固定など）に関与するすべての既知代謝遺伝子に由来する＞２４，０００個のプローブを含む。
【０１５４】
１つの実施形態では、１つまたは複数の第２のマーカーの発現レベルを決定するための本明細書に記載の方法でタンパク質発現アッセイが使用される（図１Ｂ、１００４；図２、２００４）。例えば、１つの実施形態では、１つまたは複数の特有の第２のマーカーの発現レベルを定量化するために、質量分析または免疫アッセイ（酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）など）が利用され、１つまたは複数の特有の第２のマーカーは、タンパク質である。
【０１５５】
１つの実施形態では、試料またはその一部は、特有の第２のマーカーのレベルを決定するために、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）取り込みに供される（図１Ｂ、１００４；図２、２００４）。ＢｒｄＵは、チミジンの合成ヌクレオシド類似体であり、複製中の細胞において新たに合成されるＤＮＡに取り込ませることができる。次に、ＢＲｄＵを検出するために、この塩基類似体に特異的な抗体を使用することができる。したがって、ＢｒｄＵが取り込まれることで同定される細胞は、そのＤＮＡを活発に複製している細胞であり、このことは、本明細書に記載の方法の１つの実施形態による微生物の活性の尺度である。ＢｒｄＵ取り込みをＦＩＳＨと併用することで、標的細胞の独自性及び活性を把握することができる。
【０１５６】
１つの実施形態では、試料またはその一部は、特有の第２のマーカーのレベルを決定するために、ＦＩＳＨと組み合わさったマイクロオートラジオグラフィー（ＭＡＲ）に供される（図１Ｂ、１００４；図２、２００４）。ＭＡＲ−ＦＩＳＨは、放射性基質が細胞に取り込まれることに基づいており、活性細胞の検出にはオートラジオグラフィーが使用され、細胞の同定にはＦＩＳＨが使用される。単一細胞の解像度での活性細胞の検出及び同定が、顕微鏡を用いて実施される。ＭＡＲ−ＦＩＳＨでは、全細胞、プローブの標的となる細胞、及び所与の放射標識物質を取り込む細胞の割合に関する情報が得られる。この方法は、標的微生物のインサイチュ機能の評価を与えるものであり、微生物のインビボ生理学を試験する上で有効な手法である。細胞特異的な基質取り込みをＭＡＲ−ＦＩＳＨと組み合わせて定量化するために開発された手法は、定量的ＭＡＲ（ＱＭＡＲ）として知られる。
【０１５７】
１つの実施形態では、試料またはその一部は、特有の第２のマーカーのレベルを決定するために、ＦＩＳＨと組み合わさった安定同位体ラマン分光法（ラマン−ＦＩＳＨ）に供される（図１Ｂ、１００４；図２、２００４）。この手法では、安定同位体プロービング、ラマン分光法、及びＦＩＳＨが組み合わせられることで、代謝プロセスが特定の生物と関連付けられる。細胞による安定同位体の取り込み比率が光散乱に影響を与える結果、標識された細胞成分（タンパク質成分及びｍＲＮＡ成分を含む）についてのピークシフトが測定可能となる。ラマン分光法を使用することで、細胞が化合物を合成するかどうかを明らかにすることができ、こうした化合物には、限定はされないが、油（アルカンなど）、脂質（トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）など）、特定のタンパク質（ヘムタンパク質、金属タンパク質など）、チトクロム（Ｐ４５０、チトクロムｃなど）、クロロフィル、発色団（集光性カロテノイド及びロドプシンのための色素など）、有機ポリマー（ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）など）、ホパノイド、ステロイド、デンプン、硫化物、サルフェート、及び二次代謝物（ビタミンＢ１２など）が含まれる。
【０１５８】
１つの実施形態では、試料またはその一部は、特有の第２のマーカーのレベルを決定するために、ＤＮＡ／ＲＮＡ安定同位体プロービング（ＳＩＰ）に供される（図１Ｂ、１００４；図２、２００４）。ＳＩＰは、特定の代謝経路と関連する微生物多様性を決定することを可能にするものであり、一般に、炭素化合物及び窒素化合物の利用に関与する微生物を試験するために適用されている。目的基質は、安定同位体（１３Ｃまたは１５Ｎなど）で標識され、試料に添加される。当該基質を代謝することができる微生物のみがその細胞に当該基質を取り込むことになる。その後、密度勾配遠心分離によって１３Ｃ−ＤＮＡ及び１５Ｎ−ＤＮＡを単離し、メタゲノム解析に使用することができる。ＲＮＡに基づくＳＩＰは、ＲＮＡ自体が細胞活性を反映するものであるため、ＳＩＰ試験において使用するための応答性バイオマーカーとなり得る。
【０１５９】
１つの実施形態では、試料またはその一部は、特有の第２のマーカーのレベルを決定するために、同位体アレイに供される（図１Ｂ、１００４；図２、２００４）。同位体アレイでは、活性微生物コミュニティを機能的及び系統発生学的にハイスループット様式でスクリーニングすることが可能になる。この手法では、基質の取り込みプロファイルを監視するためのＳＩＰと、活性微生物コミュニティの分類学的独自性を決定するためのマイクロアレイ技術と、が併用される。１４Ｃで標識された基質と共に試料がインキュベートされ、この基質は、増殖過程の間に微生物バイオマスに取り込まれる。１４Ｃで標識されたｒＲＮＡは、非標識ｒＲＮＡと分離された後、蛍光色素で標識される。蛍光標識されたｒＲＮＡは、系統発生学的マイクロアレイにハイブリダイズされた後、放射シグナル及び蛍光シグナルが走査される。したがって、この手法では、微生物コミュニティの組成と、複雑な微生物コミュニティの代謝的に活性な微生物による特定基質の消費と、を同時に試験することが可能になる。
【０１６０】
１つの実施形態では、試料またはその一部は、特有の第２のマーカーのレベルを決定するために、メタボロミクスアッセイに供される（図１Ｂ、１００４；図２、２００４）。メタボロミクスでは、生物学的な細胞、組織、器官、または生物におけるすべての代謝物（細胞プロセスの最終代謝産物）の収集物に相当するメタボロームが試験される。この方法論を使用することで、特定の代謝物プロファイルを異なる微生物と関連付けることが可能になるため、微生物の存在及び／または微生物介在性のプロセスを監視することができる。微生物活性と関連する細胞内代謝物及び細胞外代謝物のプロファイルは、ガスクロマトグラフィー−質量分析（ＧＣ−ＭＳ）などの手法を使用して得ることができる。メタボローム試料の複雑な混合物は、ガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、及びキャピラリー電気泳動などの手法によって分離することができる。代謝物の検出は、質量分析、核磁気共鳴分（ＮＭＲ）分光法、イオンモビリティ質量分析、電気化学検出（ＨＰＬＣと組み合わせたもの）、及び放射標識（薄層クロマトグラフィーと組み合わせたときのもの）によって実施することができる。
【０１６１】
本明細書に記載の実施形態によれば、試料における１つまたは複数の活性微生物株の存在及びそれぞれの数が決定される（図１Ｂ、１００６；図２、２００６）。例えば、第１のマーカーの数及び存在をアッセイすることで得られる株独自性情報が解析されることで、特有の第１のマーカーがどのくらい多く出現するかが決定され、それによって特有の微生物株が示される（例えば、シークエンシングアッセイにおける配列リードの数を数えることによって行われる）。この値は、１つの実施形態では、第１のマーカーの全配列リードに占める割合として示すことで、特定の微生物型に占める特有の微生物株の割合を得ることができる。別の実施形態では、この割合に対して微生物型の数（段階１００２または段階２００２で得られるもの。図１Ｂ及び図２を参照のこと）が乗じられることで、試料及び所与の体積における１つまたは複数の微生物株の絶対細胞数が得られる。
【０１６２】
１つまたは複数の微生物株は、特有の第２のマーカーの発現レベルが、閾値レベルであるか、閾値より高い（例えば、対照レベルと比較して少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％高い）のであれば、上記のように、活性であると見なされる。
【０１６３】
本開示の別の態様では、１つまたは複数の微生物株の絶対細胞数を決定するための方法は、複数の試料において決定が実施される（図２、具体的には２００７を参照のこと）。活性であると分類されるべき微生物株については、試料のうちの１つにおいて活性であるだけでよい。試料は、同一の取得源から複数の時点にわたって取得され得るか、または異なる環境源（例えば、異なる動物）から取得され得る。
【０１６４】
１つの実施形態では、試料にまたがる絶対細胞数値が使用されることで、１つまたは複数の活性微生物株が環境パラメータと関連付けられる（図２、２００８）。１つの実施形態では、環境パラメータは、第２の活性微生物株の存在である。環境パラメータに対する１つまたは複数の活性微生物株の関連付けは、１つの実施形態では、ネットワーク解析及び／またはグラフ理論によって株とパラメータとの共出現を決定することによって実施される。
【０１６５】
１つの実施形態では、１つまたは複数の活性微生物株と環境パラメータとの共出現の決定は、ネットワーク内の株（複数可）と環境パラメータとの連結度を測定するためのネットワーク解析方法及び／またはクラスター解析方法を含み、ネットワークは、共通または同様の環境パラメータを共有する２つ以上の試料がまとまったものである。独立性の測定例は、本明細書で提供及び議論されており、追加詳細については、Ｂｌｏｍｑｖｉｓｔ“Ｏｎ  ａ  ｍｅａｓｕｒｅ  ｏｆ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｗｏ  ｒａｎｄｏｍ  ｖａｒｉａｂｌｅｓ”Ｔｈｅ  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ（１９５０）：５９３−６００、Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．“Ｎｏｎｐａｒａｍｅｔｒｉｃ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ−Ｗｉｌｅｙ  ｓｅｒｉｅｓ  ｉｎ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  Ｔｅｘｔｓ  ａｎｄ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｓｅｃｔｉｏｎ”（１９９９）、及び／またはＢｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．“Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｆｒｅｅ  ｔｅｓｔｓ  ｏｆ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓａｍｐｌｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ”Ｔｈｅ  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ（１９６１）：４８５−４９８の教示内容及び方法を調整利用することによって理解できる（前述の刊行物はそれぞれ、あらゆる目的のために参照によってその全体が本明細書に明確に組み込まれる）。
【０１６６】
別の実施形態では、変数間の連結度を確立するために、相関解析方法（ピアソン相関、スピアマン相関、ケンドール相関、正準相関解析、尤度比検定（例えば、Ｗｉｌｋｓ，Ｓ．Ｓ．“Ｏｎ  ｔｈｅ  Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｋ  Ｓｅｔｓ  ｏｆ  Ｎｏｒｍａｌｌｙ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｖａｒｉａｂｌｅｓ”Ｅｃｏｎｏｍｅｔｒｉｃａ，Ｖｏｌ．３，Ｎｏ．３，Ｊｕｌｙ  １９３５，ｐｐ３０９−３２６（あらゆる目的のために参照によってその全体が本明細書に明確に組み込まれる）に詳細が記載される教示内容及び方法を適用することによるもの）を含む）及び正準相関解析が使用される。こうした方法の多変数拡張、最大相関（例えば、Ａｌｆｒｅｄ  Ｒｅｎｙｉ“Ｏｎ  ｍｅａｓｕｒｅｓ  ｏｆ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ”Ａｃｔａ  ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａ  ｈｕｎｇａｒｉｃａ  １０．３−４（１９５９）：４４１−４５１（参照によってその全体が本明細書に明確に組み込まれる）を参照のこと）、または両方（ＭＡＣ）を、比較対象の変数の数に応じて、適切なときに使用することができる。いくつかの実施形態では、多次元パターンを発見するように構成される最大相関解析及び／または他の多変量相関測定（例えば、“Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  Ｍａｘｉｍａｌ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，”Ｎｇｕｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ３１ｓｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｍａｃｈｉｎｅ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ，Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ，２０１４（当該文献は、あらゆる目的のために参照によってその全体が本明細書に明確に組み込まれる）の方法及び教示内容を適用することによるもの）が利用される。いくつかの実施形態では、ネットワークの特徴量及び解析（Ｆａｒｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ，ｉｎ“Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ，Ｃｏｎｄｕｃｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔｉｎｇ  Ａｎｉｍａｌ  Ｓｏｃｉａｌ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  Ａｎａｌｙｓｉｓ”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｃｏｌｏｇｙ，２０１５，８４，ｐｐ．１１４４−１１６３．ｄｏｉ：１０．１１１１／１３６５−２６５６．１２４１８（あらゆる目的のために参照によってその全体が本明細書に明確に組み込まれる）によって議論されるものなど）を本開示のために利用及び調整することができる。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、ネットワーク解析は、ノンパラメトリック手法（例えば、Ｔａｓｋｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．“Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  ｎｏｎｐａｒａｍｅｔｒｉｃ  ｔｅｓｔｓ  ｏｆ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ．”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  １００．４７１（２００５）：９１６−９２５、及びＧｉｅｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．“Ａ  Ｎｏｎｐａｒａｍｅｔｒｉｃ  Ｔｅｓｔ  ｏｆ  Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  Ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｔｗｏ  Ｖｅｃｔｏｒｓ．”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．９２，Ｎｏ．４３８，Ｊｕｎｅ，１９７７，ｐｐ５６１−５６７（あらゆる目的のために参照によってそれぞれの全体が本明細書に明確に組み込まれる）に詳細が記載される教示内容及び方法を適用することによるもの）を含み、こうしたノンパラメトリック手法には、相互情報量最大情報係数、最大情報エントロピー（ＭＩＥ；例えば、Ｚｈａｎｇ  Ｙａ−ｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．“Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｂｌｅ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｍａｘｉｍａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｅｎｔｒｏｐｙ［Ｊ］”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  ＆  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１５−０１（３７（１）：１２３−１２９）（あらゆる目的のために参照によってその全体が本明細書に明確に組み込まれる）の教示内容及び方法を適用することによるもの）、カーネル正準相関解析（ＫＣＣＡ；例えば、Ｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．“Ｋｅｒｎｅｌ  Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍａｃｈｉｎｅ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３（２００２）１−４８（あらゆる目的のために参照によってその全体が本明細書に明確に組み込まれる）に詳細が記載される教示内容及び方法を適用することによるもの）、交替条件付き期待値またはバックフィッティングアルゴリズム（ＡＣＥ；例えば、Ｂｒｅｉｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．“Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ  Ｏｐｔｉｍａｌ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ：  Ｒｅｊｏｉｎｄｅｒ．”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ８０，ｎｏ．３９１（１９８５）：６１４−１９，ｄｏｉ：１０．２３０７／２２８８４７７（あらゆる目的のために参照によってその全体が本明細書に明確に組み込まれる）に詳細が記載される教示内容及び方法を適用することによるもの）、相関距離測定（ｄｃｏｒ；例えば、Ｓｚｅｋｅｌｙ  ｅｔ  ａｌ．“Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｂｙ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｉｓｔａｎｃｅｓ”Ｔｈｅ  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，２００７，Ｖｏｌ．３５，Ｎｏ．６，２７６９−２７９４，ｄｏｉ：１０．１２１４／００９０５３６０７００００００５０５（あらゆる目的のために参照によってその全体が本明細書に明確に組み込まれる）に詳細が記載される教示内容及び方法を適用することによるもの）、ブラウン距離共分散（Ｂｒｏｗｎｉａｎ  ｄｉｓｔａｎｃｅ  ｃｏｖａｒｉａｎｃｅ）（ｄｃｏｖ；例えば、Ｓｚｅｋｅｌｙ  ｅｔ  ａｌ．“Ｂｒｏｗｎｉａｎ  Ｄｉｓｔａｎｃｅ  Ｃｏｖａｒｉａｎｃｅ”Ｔｈｅ  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，２００９，Ｖｏｌ．３，Ｎｏ．４，１２３６−１２６５，Ｄｏｉ：１０．１２１４／０９−ＡＯＡＳ３１２（あらゆる目的のために参照によってその全体が本明細書に明確に組み込まれる）に詳細が記載される教示内容及び方法を適用することによるもの）、ヒルベルト・シュミット独立性基準（ＨＳＣＩ／ＣＨＳＩ；例えば、Ｇｒｅｔｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．“Ａ  Ｋｅｒｎａｌ  Ｔｗｏ−Ｓａｍｐｌｅ  Ｔｅｓｔ”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍａｃｈｉｎｅ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １３（２０１２）７２３−７７３、及びＰｏｃｚｏｓ  ｅｔ  ａｌ．“Ｃｏｐｕｌａ−ｂａｓｅｄ  Ｋｅｒｎｅｌ  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｙ  Ｍｅａｓｕｒｅｓ”Ｃａｒｎｅｇｉｅ  Ｍｅｌｌｏｗ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｈｏｗｃａｓｅ＠ＣＭＵ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ２９ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｍａｃｈｉｎｅ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ（これらの文献はそれぞれ、あらゆる目的のため参照によってその全体が本明細書に明確に組み込まれる）に詳細が記載される教示内容及び方法を適用することによるもの）、乱択従属係数（ＲＤＣ；例えば、Ｌｏｐｅｚ−Ｐａｚ  ｅｔ  ａｌ．“Ｔｈｅ  Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ”Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（２０１３）（あらゆる目的のために参照によってその全体が本明細書に明確に組み込まれる）に詳細が記載される教示内容及び方法を適用することによるもの）が含まれ、こうした手法によって変数の連結度が確立される。いくつかの実施形態では、こうした方法の１つまたは複数を、バギング法もしくはブースティング法またはｋ最近傍推定法（例えば、Ｂｒｅｉｍａｎ，“Ａｒｃｉｎｇ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒｓ”Ｔｈｅ  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，１９９８，Ｖｏｌ．２６，Ｎｏ．３，８０１−８４９、Ｌｉｕ，“Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｂａｇｇｉｎｇ  ｏｆ  Ｍａｘｉｍａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ”Ｉｎｔ．Ｊ．Ｄａｔａ  Ｍｉｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１４，Ｎｏ．３，２０１６，ｐｐ．２２９−２５７、及び／またはＧａｏ  ｅｔ  ａｌ．“Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｕｔｕａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｓｔｒｏｎｇｌｙ  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｖａｒｉａｂｌｅｓ”Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  １８ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ（ＡＩＳＴＡＴＳ），２０１５，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＪＭＬＲ：Ｗ＆ＣＰ  Ｖｏｌｕｍｅ  ３８（これらの文献はそれぞれ、あらゆる目的のために参照によってその全体が本明細書に明確に組み込まれる）に詳細が記載される教示内容及び方法を適用することによるもの）と組み合わせることができる。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、ネットワーク解析は、ノードレベル解析を含み、こうしたノードレベル解析には、次数、強度、媒介中心性、固有ベクトル中心性、ページランク、及び到達性（ｒｅａｃｈ）が含まれる。別の実施形態では、ネットワーク解析は、ネットワークレベル特徴量を含み、こうしたネットワークレベル特徴量には、密度、同類性または次数相関、推移性、連鎖解析、モジュラリティ解析、頑健性測定、媒介性測定、連結度測定、推移性測定、中心性測定、またはそれらの組み合わせが含まれる。他の実施形態では、種コミュニティルール（例えば、Ｃｏｎｎｏｒ  ｅｔ  ａｌ．“Ｔｈｅ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  Ｓｐｅｃｉｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ：Ｃｈａｎｃｅ  ｏｒ  Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ？”Ｅｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６０，Ｎｏ．６（Ｄｅｃ．，１９７９），ｐｐ．１１３２−１１４０（あらゆる目的のために参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと）がネットワークに適用され、これは、ガンビット・オブ・ザ・グループ（Ｇａｍｂｉｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｒｏｕｐ）仮定（例えば、Ｆｒａｎｋｓ  ｅｔ  ａｌ．“Ｓａｍｐｌｉｎｇ  Ａｎｉｍａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｇａｍｂｉｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｒｏｕｐ”Ｂｅｈａｖ  Ｅｃｏｌ  Ｓｏｃｉｏｂｉｏｌ（２０１０）６４：４９３，ｄｏｉ：１０．１００７／ｘ００２６５−００９８−０８６５−８（あらゆる目的のために参照によってその全体が本明細書に明確に組み込まれる）の方法及び教示内容を適用することによるもの）を活用することを含み得る。いくつかの実施形態では、固有ベクトル／モジュラリティマトリックス解析方法は、例えば、Ｍａｒｋ  ＥＪ  Ｎｅｗｍａｎ  ｉｎ“Ｆｉｎｄｉｎｇ  ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｉｎ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｉｇｅｎｖｅｃｔｏｒｓ  ｏｆ  ｍａｔｒｉｃｅｓ”Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｅ  ７４．３（２００６）：０３６１０４（あらゆる目的のために参照によってその全体が本明細書に明確に組み込まれる）によって議論される教示内容及び方法を調整利用することによって使用することができる。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、時間集合ネットワークまたは時間順序ネットワークが利用される。別の実施形態では、クラスター解析方法は、グラフにおけるコミュニティ検出の使用、及び／またはコミュニティ検出アルゴリズム（非限定的な例として、Ｌｏｕｖａｉｎアルゴリズム、Ｂｒｏｎ−Ｋｅｒｂｏｓｃｈアルゴリズム、Ｇｉｒｖａｎ−Ｎｅｗｍａｎアルゴリズム、Ｃｌａｕｓｅｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｍｏｏｒｅアルゴリズム、Ｐｏｎｓ−Ｌａｔａｐｙアルゴリズム、及びＷａｋｉｔａ−Ｔｓｕｒｕｍｉアルゴリズムなど）の使用による、観測マトリックス、連結度モデル、部分空間モデル、分布モデル、密度モデル、または重心モデルの構築（ｂｕｉｌｄｉｎｇ）または構築（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ）を含む。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、クラスター解析方法は、モジュラリティの最適化に基づくヒューリスティックな方法である。別の実施形態では、クラスター解析方法は、Ｌｏｕｖａｉｎ法（例えば、Ｂｌｏｎｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｆａｓｔ  ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ  ｏｆ  ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ｌａｒｇｅ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｍｅｃｈａｎｉｃｓ：Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２００８，Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２００８（あらゆる目的のために参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）によって記載される方法を参照のこと。この方法を、本明細書に開示の方法における使用に適用することができる）である。
【０１７１】
他の実施形態では、ネットワーク解析は、リンクのマイニング及び予測、集団分類、リンクに基づくクラスタリング、階層的クラスター解析、関連類似度、またはそれらの組み合わせを介するネットワークの予測モデリングを含む。別の実施形態では、ネットワーク解析は、微分方程式に基づく集団のモデリングを含む。別の実施形態では、ネットワーク解析は、Ｌｏｔｋａ−Ｖｏｌｔｅｒｒａモデリングを含む。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、試料における環境パラメータに対する１つまたは複数の活性微生物株の関連付け（例えば、共出現の決定）は、環境パラメータと微生物株との関連性を示すリンケージがまとまったマトリックスを創出することを含む。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、段階２００７で得られる複数の試料データ（例えば、２つ以上の時点で取得され得る２つ以上の試料にわたって得られるものであり、それぞれの時点は、個々の試料に対応する）が集計される。別の実施形態では、各試料における１つまたは複数の微生物株のそれぞれの細胞の数が関連性マトリックス（いくつかの実施形態では、量マトリックスであり得る）に蓄積される。１つの実施形態では、関連性マトリックスは、関連性（例えば、量）データで重み付けされるルールマイニング手法を使用して特定時点試料における活性微生物株間の関連性を明らかにするために使用される。１つの実施形態では、有意ではないルールを除外するためにフィルターが適用される。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、１つもしくは複数の活性微生物株または２つ以上の活性微生物株の絶対細胞数が、例えば共出現の決定を介して、１つまたは複数の環境パラメータに関連付けられる（図２、２００８）。環境パラメータは、解析対象の試料（複数可）に応じて選択することができ、本明細書に記載の方法による制限を受けない。環境パラメータは、試料自体のパラメータであり得、例えば、試料におけるｐＨ、温度、タンパク質量である。あるいは、環境パラメータは、微生物コミュニティの独自性の変化に影響を与えるパラメータであるか（すなわち、微生物コミュニティの「独自性」は、コミュニティにおける微生物株の型及び／または特定の微生物株の数によって特徴付けられる）、あるいは微生物コミュニティの独自性の変化によって影響を受けるパラメータである。例えば、１つの実施形態では、環境パラメータは、動物の食物摂取量であるか、あるいは泌乳反芻動物によって産生する乳汁の量（または乳汁のタンパク質もしくは脂肪の含量）である。１つの実施形態では、環境パラメータは、同一の試料に存在する、微生物コミュニティの第２の微生物株の存在、活性、及び／または量である。本明細書に記載の実施形態のいくつかでは、環境パラメータは、メタデータパラメータと称され、逆もまた同様である。
【０１７５】
メタデータパラメータの他の例には、限定はされないが、試料の取得元である宿主に由来する遺伝情報（例えば、ＤＮＡ変異情報）、試料ｐＨ、試料温度、特定のタンパク質またはｍＲＮＡの発現、周辺環境／生態系の栄養素条件（例えば、１つまたは複数の栄養素のレベル及び／または独自性）、疾患に対する感受性または抵抗性、疾患の発症または進行、毒素に対する試料の感受性または抵抗性、生体異物化合物の有効性（医薬的な薬物）、天然物の生合成、あるいはそれらの組み合わせが含まれる。
【０１７６】
例えば、１つの実施形態によれば、図２の方法（すなわち、２００１〜２００７）に従って、複数の試料にまたがって微生物株数変化が計算される。１つまたは複数の活性株（例えば、段階２００６に従って活性であると最初に同定された１つまたは複数の株）の経時的な株数変化が集計されると共に、変化の方向性が加味される（すなわち、負の値は減少を示し、正の値は増加を示す）。経時的な細胞数はネットワークとして示され、微生物株はノードを示し、量で重み付けされたルールはエッジを示す。マルコフ連鎖及びランダムウォークを活用することで、ノード間の連結度が決定され、クラスターが定義される。１つの実施形態では、クラスターは、所望のメタデータと関連するクラスターを同定するために、メタデータを使用してフィルタリングされる（図２、２００８）。
【０１７７】
別の実施形態では、経時的な細胞数変化と標的クラスターに存在する株とを統合することによる重要度に従って微生物株が順位付けされ、細胞数変化が最も大きいものが最上位に順位付けされる。
【０１７８】
１つの実施形態では、ネットワーク解析方法及び／またはクラスター解析方法は、ネットワーク内の１つまたは複数の株の連結度を測定するために使用され、ネットワークは、共通または同様の環境パラメータを共有する２つ以上の試料がまとまったものである。１つの実施形態では、ネットワーク解析は、連鎖解析、モジュラリティ解析、頑健性測定、媒介性測定、連結度測定、推移性測定、中心性測定、またはそれらの組み合わせを含む。別の実施形態では、ネットワーク解析は、リンクのマイニング及び予測、社会的ネットワーク理論、集団分類、リンクに基づくクラスタリング、関連類似度、またはそれらの組み合わせを介するネットワークの予測モデリングを含む。別の実施形態では、ネットワーク解析は、連結度を確立するための、変数間の相互情報量、最大情報係数計算、または他のノンパラメトリック法を含む。別の実施形態では、ネットワーク解析は、微分方程式に基づく集団のモデリングを含む。さらに別の実施形態では、ネットワーク解析は、Ｌｏｔｋａ−Ｖｏｌｔｅｒｒａモデリングを含む。
【０１７９】
クラスター解析方法は、連結度モデル、部分空間モデル、分布モデル、密度モデル、または重心モデルを構築することを含む。
【０１８０】
ネットワーク及びクラスターに基づく解析（例えば、図２の方法段階２００８を実施するためのもの）は、プロセッサ、コンポーネント、及び／またはモジュールを介して実施することができる。本明細書で使用されるコンポーネント及び／またはモジュールは、例えば、任意の組立物、命令、及び／または動作可能なように連結された電気コンポーネントのセットとなり得るものであり、こうしたコンポーネント及び／またはモジュールには、例えば、メモリ、プロセッサ、電気トレース、光コネクタ、ソフトウェア（ハードウェアで実行されるもの）及び／または同様のものが含まれ得る。
【０１８１】
図３Ａは、１つの実施形態による、微生物の解析、スクリーニング、及び選択を行うプラットフォーム及びシステム３００を示す模式図である。本開示によるプラットフォームは、天然の微生物コミュニティ内の多次元の種間相互作用及び依存度を決定するためのシステム及び処理を含み得るものであり、図３Ａと関連して一例が示される。図３Ａは、構造的な図であるため、説明の明瞭性を向上させるために、ある特定の態様は割愛されているが、こうした態様は、本開示の文脈に鑑みれば、当業者には明らかであろう。
【０１８２】
図３Ａに示されるように、微生物のスクリーニング及び選択を行うプラットフォーム及びシステム３００は、１つまたは複数のプロセッサ３１０、データベース３１９、メモリ３２０、通信インターフェース３９０、ユーザー入力デバイス３９６及び周辺デバイス３９７（限定はされないが、データの収集及び解析を行うデバイス（ＦＡＣｓなど）、選択／インキュベート／製剤化デバイス、及び／または追加のデータベース／データソース、遠隔データ収集デバイス（例えば、メタデータ環境データ（試料特徴、温度、天候など）を収集することができるデバイス（そのような情報を収集するためのアプリを実行するモバイルスマートフォンならびに他のモバイルデバイスまたは固定式デバイスを含む））を含む）と相互通信するように構成された入力／出力インターフェース、クライアント３９３ｂ（ユーザーインターフェース及び／またはディスプレイ（グラフィカルディスプレイなど）を含み得る）ならびにユーザー３９３ａに対して通信ネットワーク３９２（例えば、ＬＡＮ、ＷＡＮ、及び／またはインターネット）を介してデータを送受信するように構成されたネットワークインターフェース、データ収集コンポーネント３３０、絶対数計数コンポーネント３３５、試料関連付けコンポーネント３４０、活性コンポーネント３４５、ネットワーク解析コンポーネント３５０、ならびに株選択／微生物アンサンブル生成コンポーネント３５５を含み得る。いくつかの実施形態では、微生物スクリーニングシステム３００は、単一の物理的デバイスであり得る。他の実施形態では、微生物スクリーニングシステム３００は、複数の物理的デバイス（例えば、動作可能なようにネットワークによって結ばれたもの）を含み得、こうした物理的デバイスはそれぞれ、図３Ａに示されるコンポーネント及び／またはモジュールを１つまたは複数含み得る。
【０１８３】
微生物スクリーニングシステム３００におけるコンポーネントまたはモジュールはそれぞれ、残りのコンポーネント及び／またはモジュールのそれぞれに動作可能なように連結することができる。微生物スクリーニングシステム３００におけるコンポーネント及び／またはモジュールはそれぞれ、そのコンポーネント及び／またはモジュールと関連する１つまたは複数の特定の機能を実行することが可能なハードウェア及び／またはソフトウェア（ハードウェアに保存されたもの及び／またはハードウェアで実行されるもの）との任意の組み合わせで使用することができる。
【０１８４】
メモリ３２０は、例えば、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）（例えば、ダイナミックＲＡＭ、スタティックＲＡＭ）、フラッシュメモリ、着脱式メモリ、ハードドライブ、データベース、及び／または同様のものであり得る。いくつかの実施形態では、メモリ３２０は、例えば、データベース（例えば、３１９に示されるようなもの）、処理、アプリケーション、仮想マシン、及び／または他の何らかのソフトウェアコンポーネント、ソフトウェアプログラム、及び／またはソフトウェアモジュール（ハードウェアに保存されたもの及び／またはハードウェアで実行されるもの）、あるいはハードウェアコンポーネント／ハードウェアモジュールを含み得るものであり、こうしたものは、微生物スクリーニング処理及び／または微生物スクリーニング及びアンサンブル生成のための１つもしくは複数の関連方法を実行するように構成される（例えば、データ収集コンポーネント３３０、絶対数計数コンポーネント３３５、試料関連付けコンポーネント３４０、活性コンポーネント３４５、ネットワーク解析コンポーネント３５０、株選択／微生物アンサンブル生成コンポーネント３５５、（及び／または同様のモジュール）を介して実行するように構成される）。そのような実施形態では、微生物スクリーニング及び／またはアンサンブル生成処理及び／または関連方法を実行する命令は、メモリ３２０内に保存し、プロセッサ３１０で実行することができる。いくつかの実施形態では、データ収集コンポーネント３３０を介して収集されたデータは、データベース３１９及び／またはメモリ３２０に保存することができる。
【０１８５】
プロセッサ３１０は、例えば、通信インターフェース３９０の操作の制御と、メモリ３２０へのデータの書き込み及びメモリ３２０からのデータの読み込みと、メモリ３２０内に保存された命令の実行と、を行うよう構成することができる。プロセッサ３１０は、例えば、データ収集コンポーネント３３０、絶対数計数コンポーネント３３５、試料関連付けコンポーネント３４０、活性コンポーネント、及びネットワーク解析コンポーネント３５０（本明細書にさらに詳細に記載される）の操作を実行及び／または制御するように構成することもできる。いくつかの実施形態では、データ収集コンポーネント３３０、絶対数計数コンポーネント３３５、試料関連付けコンポーネント３４０、活性コンポーネント３４５、ネットワーク解析コンポーネント３５０、及び株選択／アンサンブル生成コンポーネント３５５は、プロセッサ（複数可）３１０の制御下で、メモリ３２０内に保存された方法または処理に基づいて微生物スクリーニング、選択、及び合成アンサンブル生成処理（本明細書にさらに詳細に記載される）を実行するように構成することができる。
【０１８６】
通信インターフェース３９０は、微生物スクリーニングシステム３００の１つまたは複数のポートを含み、及び／またはそれを管理（例えば、入出力インターフェース（複数可）３９５を介して管理）するように構成することができる。場合によっては、例えば、通信インターフェース３９０（例えば、ネットワークインターフェースカード（ＮＩＣ））は、１つまたは複数のラインカード（ｌｉｎｅ  ｃａｒｄ）を含み得、こうしたラインカードはそれぞれ、デバイス（例えば、周辺デバイス３９７及び／またはユーザー入力デバイス３９６）に（動作可能なように）連結された１つまたは複数のポートを含み得る。通信インターフェース３９０に含められるポートは、連結されたデバイスとの活発な通信またはネットワーク３９２を介した活発な通信（例えば、エンドユーザーデバイス３９３ｂ、ホストデバイス、サーバーなどとの通信）を行うことができる任意の実体であり得る。いくつかの実施形態では、そのようなポートは、必ずしもハードウェアポートである必要はなく、仮想ポートまたはソフトウェアによって定義されるポートでもあり得る。通信ネットワーク３９２は、情報（例えば、データ及び／または信号）を送信することが可能な任意のネットワークまたはネットワークの組み合わせであり得、通信ネットワーク３９２には、例えば、電話ネットワーク、イーサネット（登録商標）ネットワーク、光ファイバーネットワーク、無線ネットワーク、及び／またはセルラーネットワークが含まれ得る。通信は、ネットワークを介するものであり得、こうしたネットワークは、例えば、Ｗｉ−Ｆｉまたは無線ローカルエリアネットワーク（「ＷＬＡＮ」）接続、無線ワイドエリアネットワーク（「ＷＷＡＮ」）接続、及び／またはセルラー接続などである。ネットワーク接続は、有線接続であり得、こうした有線接続は、例えば、イーサネット（登録商標）接続、デジタル加入回線（「ＤＳＬ」）接続、広帯域同軸接続、及び／または光ファイバー接続などである。例えば、微生物スクリーニングシステム３００は、ネットワーク３９２を介して１つまたは複数の計算デバイス３９３ｂによってアクセスされるように構成されたホストデバイスであり得る。そのような様式では、計算デバイスは、ネットワーク３９２を介して、微生物スクリーニングシステム３００に情報を送信し、及び／または微生物スクリーニングシステム３００から情報を受信することができる。そのような情報は、例えば、微生物スクリーニングシステム３００が収集し、関連付け、決定し、解析し、及び／またはネットワーク解析された微生物のうちで活性なもののアンサンブルを生成する情報であり得え、このことは、本明細書にさらに詳細に記載される。同様に、計算デバイスは、微生物スクリーニングシステム３００からの決定情報を検索及び／または要求するように構成することができる。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、通信インターフェース３９０は、入力／出力インターフェース３９５を含み、及び／またはそれを含むように構成することができる。入力／出力インターフェースは、ユーザー入力デバイス、周辺デバイス、暗号プロセッサデバイス、及び／または同様のものを受容、それと通信、及び／またはそれに接続することができる。場合によっては、１つの出力デバイスは、ビデオディスプレイであり得、こうしたビデオディスプレイには、例えば、ビデオインターフェースからの信号を受信するインターフェース（例えば、デジタルビジュアルインターフェース（ＤＶＩ）の電気回路及びケーブル）を備えた陰極線管（ＣＲＴ）もしくは液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）、ＬＥＤ、またはプラズマを基礎とするモニタが含まれ得る。そのような実施形態では、通信インターフェース３９０は、他の機能の中でも特に、データ及び／または情報を受信し、微生物スクリーニングの修正、指令、及び／または命令を送信するように構成することができる。
【０１８８】
データ収集コンポーネント３３０は、天然の微生物コミュニティ内の多次元の種間相互作用及び依存度に関する解析のためのデータを収集、処理、及び／または正規化するように構成された任意のハードウェア及び／またはソフトウェアのコンポーネント及び／またはモジュール（メモリ（メモリ３２０など）に保存されたもの及び／またはハードウェア（プロセッサ３１０など）で実行されるもの）であり得、上記の解析は、絶対数計数コンポーネント３３５、試料関連付けコンポーネント３４０、活性コンポーネント３４５、ネットワーク解析コンポーネント３５０、及び／または株選択／アンサンブル生成コンポーネント３５５によって実施される。いくつかの実施形態では、データ収集コンポーネント３３０は、試料の所与の体積における１つまたは複数の活性生物株の絶対細胞数を決定するように構成することができる。データ収集コンポーネント３３０は、１つまたは複数の活性微生物株の絶対細胞数に基づき、マーカー配列を使用して絶対細胞数データセット内の活性株を同定することができる。データ収集コンポーネント３３０は、試料中の微生物集団の動態を示すために、ある一定期間、継続的にデータを収集することができる。データ収集コンポーネント３３０は、時間的なデータを集計し、メモリ（メモリ３２０など）に存在する量マトリックスにそれぞれの活性生物株の細胞数を蓄積することができる。
【０１８９】
試料関連付けコンポーネント３４０及びネットワーク解析コンポーネント３５０は、天然の微生物コミュニティ内の多次元の種間相互作用及び依存度をまとめて決定するように構成することができる。試料関連付けコンポーネント３４０は、メタデータパラメータを（環境パラメータを、例えば、共出現したことをもって）１つまたは複数の活性微生物株の存在に関連付けるように構成された任意のハードウェアコンポーネント及び／またはソフトウェアコンポーネント（メモリ（メモリ３２０など）に保存されたもの及び／またはハードウェア（プロセッサ３１０など）で実行されるもの）であり得る。いくつかの実施形態では、試料関連付けコンポーネント３４０は、１つまたは複数の活性生物株を１つまたは複数の環境パラメータに関連付けることができる。
【０１９０】
ネットワーク解析コンポーネント３５０は、環境（メタデータ）パラメータに対して試料における１つまたは複数の活性微生物株が共出現することを決定するように構成された任意のハードウェアコンポーネント及び／またはソフトウェアコンポーネント（メモリ（メモリ３２０など）に保存されたもの及び／またはハードウェア（プロセッサ３１０など）で実行されるもの）であり得る。いくつかの実施形態では、データ収集コンポーネント３３０によって収集されたデータと、試料関連付けコンポーネント３４０によって決定された１つまたは複数の活性微生物株と１つまたは複数の環境パラメータとの間の関連性と、に基づいて、ネットワーク解析コンポーネント３５０は、環境パラメータと微生物株との関連性を示すリンケージ、１つまたは複数の活性微生物株の絶対細胞数、ならびに１つまたは複数の特有の第２のマーカーの発現レベルがまとまったマトリックスを創出することで、微生物株の不均一集団の１つまたは複数のネットワークを示すことができる。例えば、ネットワーク解析では、量データで重み付けされるルールマイニング手法を使用して試料における活性微生物株とメタデータパラメータとの間の関連性（例えば、２つ以上の活性微生物株の関連性）を明らかにするために関連性（量及び／または存在量）マトリックスを使用することができる。いくつかの実施形態では、ネットワーク解析コンポーネント３５０は、ルールを選択及び／または除外するためのフィルターを適用することができる。ネットワーク解析コンポーネント３５０は、変化の方向性を加味した上で（すなわち、負の値は減少を示し、正の値は増加を示す）、活性株の経時的な細胞数変化を計算することができる。ネットワーク解析コンポーネント３５０は、ネットワークとしてマトリックスを示すことができ、微生物株はノードを示し、量で重み付けされたルールはエッジを示す。ネットワーク解析コンポーネント３５０は、マルコフ連鎖及びランダムウォークを活用して、ノード間の連結度を決定し、クラスターを定義することができる。いくつかの実施形態では、ネットワーク解析コンポーネント３５０は、所望のメタデータと関連するクラスターを同定するために、メタデータを使用してクラスターをフィルタリングすることができる。いくつかの実施形態では、ネットワーク解析コンポーネント３５０は、経時的な細胞数変化と標的クラスターに存在する株とを統合することによって標的微生物株を順位付けすることができ、細胞数変化が最も大きいものが最上位に順位付けされる。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、ネットワーク解析は、連鎖解析、モジュラリティ解析、頑健性測定、媒介性測定、連結度測定、推移性測定、中心性測定、またはそれらの組み合わせを含む。別の実施形態では、クラスター解析方法を使用することができ、このクラスター解析方法は、連結度モデル、部分空間モデル、分布モデル、密度モデル、または重心モデルを構築することを含む。別の実施形態では、ネットワーク解析は、リンクのマイニング及び予測、集団分類、リンクに基づくクラスタリング、関連類似度、またはそれらの組み合わせを介するネットワークの予測モデリングを含む。別の実施形態では、ネットワーク解析は、連結度を確立するための、変数間の相互情報量、最大情報係数計算、または他のノンパラメトリック法を含む。別の実施形態では、ネットワーク解析は、微分方程式に基づく集団のモデリングを含む。別の実施形態では、ネットワーク解析は、Ｌｏｔｋａ−Ｖｏｌｔｅｒｒａモデリングを含む。
【０１９２】
図３Ｂは、本開示の実施形態の１つによる論理フローの例を示す。最初に、複数の試料及び／または試料セットが取得及び／または入手される（３００１）。本明細書で使用される「試料」は、１つまたは複数の試料、試料セット、複数の試料（例えば、特定の集団に由来するもの）を指し得るが、これは理解を容易にするためのものであり、結果的に、２つ以上の異なる試料について議論されるとき、各試料は、複数の副試料を含み得ることを理解されよう（例えば、第１の試料及び第２の試料について議論されるとき、第１の試料は、第１の集団から取得された副試料を２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれを上回る数含み得、第２の試料は、第２の集団から取得された副試料、あるいは、第１の集団から取得されるが、異なる時点（第１の副試料の取得から１週間後または１ヶ月後の時点など）で取得された副試料を２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれを上回る数含み得る）。副試料が取得されると、それぞれの副試料についての個々の取得識別指標及びパラメータを管理し、蓄積することができ、こうしたものには、環境パラメータ、定性的及び／または定量的な知見、集団メンバー独自性が含まれる（したがって、例えば、２つ以上の異なる時点で同一の集団から試料が取得されるとき、こうした副試料は独自性によって対にされるため、時間１の時点で動物１から取得される副試料は、時間２の時点で同一の動物から取得される副試料と結び付けられるなどする）。
【０１９３】
各試料、試料セット、及び／または副試料について、標的生物型に基づいて細胞が染色され（３００２）、各試料／副試料またはその一部が重量測定され、段階希釈され（３００３）、処理される（３００４）ことで、各試料／副試料におけるそれぞれの微生物型の細胞数が決定される。１つの例示の実施態様では、細胞選別機を使用することで、試料に由来する個々の細菌細胞及び真菌細胞（環境試料に由来するものなど）を数えることができる。本開示の一環として、特異的な色素を開発したことで、従来の方法では以前は数えることができなかった微生物を数えることが可能になった。本開示の方法に従って特異的な色素を使用すると、細胞壁（例えば、細菌及び／または真菌のもの）が染色されることで、レーザーを使用して細胞特徴に基づいて、より大きな集団から標的細胞の個別集団を数えることができる。１つの特定の例では、環境試料が調製され、等張緩衝液で希釈され、下記の色素で染色される：（ａ）細菌については、下記の色素を染色に使用することができる−ＤＮＡ：Ｓｙｂｒグリーン、呼吸：５−シアノ−２，３−ジトリルテトラゾリウムクロリド及び／またはＣＴＣ、細胞壁：マラカイトグリーン及び／またはクリスタルバイオレット、（ｂ）真菌については、下記の色素を染色に使用することができる−細胞壁：カルコフロールホワイト、コンゴーレッド、トリパンブルー、ダイレクトイエロー９６、ダイレクトイエロー１１、ダイレクトブラック１９、ダイレクトオレンジ１０、ダイレクトレッド２３、ダイレクトレッド８１、ダイレクトグリーン１、ダイレクトバイオレット５１、コムギ胚芽凝集素−ＷＧＡ、リアクティブイエロー２、リアクティブイエロー４２、リアクティブブラック５、リアクティブオレンジ１６、リアクティブレッド２３、リアクティブグリーン１９、及び／またはリアクティブバイオレット５。
【０１９４】
直接的色素及び反応性色素は、典型的には、セルロースに基づく材料（すなわち、綿、亜麻、及びビスコースレーヨン）の染色を連想させるものであるが、本開示の開発においては、こうした色素をキチン及びキトサンの染色にも使用できることが有利に発見された。当該色素をキチン及びキトサンの染色に利用できる理由は、キチン及びキトサンには、それぞれアセチルグルコサミンがβ−（１→４）結合で連結された鎖、ならびにＤ−グルコサミン及びＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンがβ−（１→４）結合で連結された鎖が存在することによるものである。こうしたサブユニットから鎖が構築されると、セルロース鎖と非常に類似した平らな繊維様構造が形成される。キチン分子及び／またはキトサン分子への直接的な色素の付着は、色素と当該繊維分子と間のファンデルワールス力を介して生じる。これら２つ分子の間の接触表面積が広ければ広いほど、相互作用が強くなる。一方、反応性色素は、キチン及び／またはキトサンに対して共有結合を形成する。
【０１９５】
染色された試料はそれぞれ、計数のためにＦＡＣｓにロードされる（３００４）。個々の液滴（例えば、マイクロリットルの約１／１０のもの（０．１μＬ））の流れを生じさせる特定サイズのノズル（例えば、１００μｍ（実施態様及び用途に応じて選択される））を備えたマイクロ流体チップを介して試料を分析にかけることができる。こうした変数（ノズルサイズ、液滴形成）は、それぞれの標的微生物型に最適化することができる。理想的には、それぞれの液滴には１つの細胞、すなわち「事象（ｅｖｅｎｔ）」が封入され、それぞれの液滴にレーザーが当たると、染色物はすべて励起され、異なる波長の光を放出する。ＦＡＣｓは、それぞれの放出を光学的に検出し、それを事象としてプロットすることができる（例えば、２Ｄグラフにプロットすることができる）。典型的なグラフは、事象のサイズ（「前方散乱」によって決定される）に対応する１つの軸と、蛍光の強度に対応するもう１つの軸と、からなるものである。こうしたグラフ上の個別の集団の周りに「ゲート」をかけることができ、こうしたゲート内の事象を数えることができる。
【０１９６】
図３Ｃは、ダイレクトイエローで染色された真菌に由来するデータの例を示しており、酵母の単培養物（３００５ａ）（正の対照、左）、Ｅ．ｃｏｌｉ（３００５ｂ）（負の対照、中央）、及び環境試料（３００５ｃ）（実験、右）を含む。この図では、「後方散乱」（ＢＳＣ−Ａ）によって事象の複雑性が測定されており、ＦＩＴＣによってダイレクトイエローからの蛍光放出強度が測定されている。ドットはそれぞれ、１つの事象を示しており、事象の密度は、緑色から赤色への色変化によって示される。ゲートＢは、標的となる事象（この場合は、ダイレクトイエローで染色された真菌）が見られることが予測される通常領域を示す。
【０１９７】
図３Ｂに説明を戻すと、１つまたは複数の取得源から２つ以上の試料（個々の動物もしくは単一の地理的位置から経時的に取得される試料、地理的位置、品種、能力、食物、疾患などが異なる２つ以上の群から取得される試料、生理学的な撹乱もしくは事象を経験する１つもしくは複数の群から取得される試料、及び／または同様のものを含む）を取得すること（３００１）から始まり、フローサイトメトリー（上記の染色（３００２）を含む）を使用して試料が解析されることで絶対数が確立され得る。試料は、重量測定され、段階希釈され（３００３）、ＦＡＣｓを使用して処理される（３００４）。次に、ＦＡＣｓの結果が処理されることで、各試料における所望の生物型の絶対数が決定される（３００５）。下記のコード断片は、１つの実施形態による、そのような処理の方法論の例を示すものである：
【数１】
2020503048.tif 000003
【数２】
2020503048.tif 000004
【０１９８】
各試料から全核酸が単離される（３００６）。核酸試料溶出液は、２つの部分に分割され（典型的には２等分される）、それぞれの部分が酵素的に精製されることで、精製ＤＮＡが得られるか（３００６ａ）、または精製ＲＮＡが得られる（３００６ｂ）。精製ＲＮＡは、酵素的にｃＤＮＡに変換されることによって安定化される（３００６ｃ）。ＰＣＲを使用して精製ＤＮＡと精製ｃＤＮＡとの両方についてシークエンシングライブラリー（例えば、ＩＬＬＵＭＩＮＡシークエンシングライブラリー）が調製されることで、適切なバーコード及びアダプター領域が付加され、所望の生物型の測定に適したマーカー領域が増幅される（３００７）。ライブラリーのクオリティを評価及び定量化することができ、次に、すべてのライブラリーをプールしてシークエンシングすることができる。
【０１９９】
生のシークエンシングリードに対してクオリティトリミング及びマージが実施される（３００８）。処理されたリードが重複除去され、クラスター化されることで、複数の試料に存在する特有の株のすべてのセットまたはリストが得られる（３００９）。このセットまたはリストは、複数の試料に存在するそれぞれの株を分類学的に同定するために使用することができる（３０１０）。ＤＮＡ試料に由来するシークエンシングライブラリーを同定することができ、同定されたＤＮＡライブラリーに由来するシークエンシングリードは、各試料にどの株が存在するかを同定し、各試料におけるそれぞれの株のリード数を定量化するために、重複除去された株のセットまたはリストにマッピングし戻される（３０１１）。次に、定量化されたリードリストは、それぞれの株の絶対数または細胞数を決定するために、標的微生物型の絶対細胞数と統合される（３０１３）。下記のコード断片は、１つの実施形態による、そのような処理の方法論の例を示すものである：
【数３】
2020503048.tif 000005
【０２００】
ｃＤＮＡ試料から得られたシークエンシングライブラリーが同定される（３０１４）。次に、同定されたｃＤＮＡライブラリーに由来するシークエンシングリードは、各試料においてどの株が活性であるかを決定するために、重複除去された株のリストにマッピングし戻される。リード数が特定または指定の閾値を下回るのであれば（３０１５）、その株は、不活性であると見なされるか、または同定され、その後の解析から除外される（３０１５ａ）。リード数が閾値を上回るのであれば（３０１５）、その株は、活性であると見なされるか、または同定され、解析に残される（３０１５ｂ）。次に、不活性株は、結果からフィルタリングされることで（３０１３）、各試料についての活性株のセットまたはリスト及びそれぞれの絶対数／細胞数が得られる（３０１６）。下記のコード断片は、１つの実施形態による、そのような処理の方法論の例を示すものである：
【数４】
2020503048.tif 000006
【０２０１】
各試料（試料のセット、副試料など）についての定性的メタデータ及び定量的メタデータ（例えば、環境パラメータなど）が同定、検索、及び／または取得され（３０１７）、データベース（例えば、３１９）に保存される（３０１８）。適切なメタデータを特定することができ、用途／実施態様に応じてデータベースにクエリーが投げられることで、解析対象の各試料についての特定メタデータ及び／または関連メタデータが引き出される（３０１９）。次に、メタデータのサブセットが活性株のセットまたはリスト及びその対応する絶対数／細胞数とマージされることで、試料マトリックスによって１つの大きな種及びメタデータが創出される（３０２０）。
【０２０２】
次に、最大情報係数（ＭＩＣ）が株とメタデータとの間（３０２１ａ）ならびに株間（３０２１ｂ）で計算される。結果がプールされることで、すべての関連性のセットまたはリスト及びその対応するＭＩＣスコアが創出される（３０２２）。関連性が所与の閾値を下回るのであれば（３０２３）、関連性がないものと見なされる／特定される（３０２３ｂ）。関連性が所与の閾値を上回るのであれば（３０２３）、関連性があるものと見なされ／特定され（３０２３ａ）、ネットワーク解析にさらに供される（３０２４）。下記のコード断片は、１つの実施形態による、そのような解析の方法論の例を示すものである：
【数５】
2020503048.tif 000007
【０２０３】
ネットワーク解析の結果に基づいて活性株が選択され（３０２５）、この選択は、選択された株を含む製造物（例えば、アンサンブル、集合物、及び／または他の合成集団）を調製するために実施される。ネットワーク解析の結果を使用することで、追加の製造物組成試験を行うための株の選択情報を得ることもできる。
【０２０４】
閾値の使用については、解析及び決定に関して上に議論されている。閾値は、統計学な閾値（すなわち、有意性検定）に加えて、実施態様及び用途に応じて、（１）経験的に決定されるものであり（例えば、リードレベルが低い特定の部分または有意な部分を除去する数となるようにカットオフ値が設定され、分布レベルに基づいて決定される）、（２）任意の非ゼロ値であり、（３）割合／パーセンタイルに基づくものであり、（４）第２のマーカー（すなわち、活性）の正規化リード数が第１のマーカー（細胞数）の正規化リード数を上回る株のみとするものであり、（５）活性と量または細胞数との間のｌｏｇ２倍率変化であり、（６）第２のマーカー（活性）の正規化リード数が、試料（及び／または試料セット）全体についての第２のマーカー（活性）の平均リード数を上回るものとするものであり、及び／または任意の大きさの上記の閾値であり得る。以下には、１つの実施形態に従って、ＤＮＡに基づく第１のマーカーの測定値と関連してＲＮＡに基づく第２のマーカーの測定値の分布に対して閾値を設定する例が詳細に示される。
【０２０５】
１羽の雄性Ｃｏｂｂ５００の小腸内容物を取得し、本開示による分析に供した。簡潔に記載すると、試料における細菌細胞の総数を、ＦＡＣｓを使用して決定した（例えば、３００４）。固定した小腸試料から全核酸を単離した（例えば、３００６）。ＤＮＡ（第１のマーカー）シークエンシングライブラリー及びｃＤＮＡ（第２のマーカー）シークエンシングライブラリーを調製し（例えば、３００７）、ＩＬＬＵＭＩＮＡ  ＭＩＳＥＱにロードした。それぞれのライブラリーに由来する生のシークエンシングリードに対して、クオリティフィルタリング、重複除去、クラスター化、及び定量化を実施した（例えば、３００８）。ＤＮＡに基づくライブラリーとｃＤＮＡに基づくライブラリーとの両方に由来する定量化株のリストを細胞数データと統合することで、試料中のそれぞれの株の絶対細胞数を確立した（例えば、３０１３）。ｃＤＮＡは、必ずしも株量の直接的な測定値を与えるものではないものの（すなわち、高度に活性な株は、同一のＲＮＡ分子のコピーを多く有し得る）、この例では、ｃＤＮＡに基づくライブラリーを細胞計数データと統合することで、ＤＮＡライブラリーに使用したものと同一の正規化手順を維持した。
【０２０６】
分析の後、ｃＤＮＡに基づくライブラリーでは７０２株（４６株は特有のもの）を同定し、ＤＮＡに基づくライブラリーでは１１４０株を同定した。活性閾値として０を使用すると（すなわち、任意の非ゼロ値を残すと）、この試料中でＤＮＡに基づく第１のマーカーを有していた株の５７％が、ｃＤＮＡに基づく第２のマーカーとも関連していた。こうした株は、微生物コミュニティのうちの活性部分であると同定／見なされ、こうした株のみ、その後の解析が継続される。閾値の厳密性を上げ、その第２のマーカー値が第１のマーカー値を上回る株のみを活性であると見なすのであれば、２８９株（２５％）のみが閾値を満たす。この閾値を満たす株は、図３ＤのＤＮＡ（第１のマーカー）線を上回るものに対応する。
【０２０７】
本開示は、互いに影響し合う複数の活性微生物株ならびに１つまたは複数のパラメータまたはメタデータを同定し、同定された微生物を微生物アンサンブルにおいて使用するために選択するさまざまな方法を含み、当該微生物アンサンブルは、共通機能の実施と関連するか、もしくは共通機能に影響を与えるか、または認識可能なパラメータ（目的の表現型形質（例えば、反芻動物における乳産生の増加）など）に関与するか、もしくはそれを導くか、もしくはそれと関連するものであると説明できる、個々の微生物種または種の株の微生物コミュニティの選択サブセットを含む。本開示は、こうした方法を実施及び／または促進するさまざまなシステム及び装置も含む。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、方法は、少なくとも１つの共通の特徴（試料地理的位置、試料型、試料源、試料源個体、試料標的動物、試料時期、品種、食物、温度など）を共有し、かつ少なくとも１つの異なる特徴（共通の特徴とは異なる試料地理的位置／時間的位置、試料型、試料源、試料源個体、試料標的動物、試料時期、品種、食物、温度など）を有する少なくとも２つの試料を取得することを含む。各試料について、１つまたは複数の微生物型の存在が検出され、１つまたは複数の微生物型のうちで各試料において検出されたそれぞれの微生物型の数が決定され、各試料における特有の第１のマーカーの数及びその量が測定され、特有の第１のマーカーはそれぞれ、微生物株のマーカーである。この後、それぞれの微生物型の数と第１のマーカーの数とが統合されることで、各試料に存在するそれぞれの微生物株の絶対細胞数が得られ、それぞれの微生物株に対する少なくとも１つの特有の第２のマーカーが特定の閾値に基づいて測定されることで各試料におけるその微生物株の活性レベルが決定され、決定された活性によって絶対細胞数がフィルタリングされることで、少なくとも２つの試料のそれぞれについての活性微生物株のセットまたはリスト及びそのそれぞれの絶対細胞数が得られ、少なくとも２つの試料のそれぞれについての活性微生物株のフィルタリングされた絶対細胞数が互いに比較されるか、または少なくとも２つの試料のそれぞれについての少なくとも１つの測定メタデータと比較され、予測される機能及び／または化学に基づいて、少なくとも２つの群、少なくとも３つの群、少なくとも４つの群、少なくとも５つの群、少なくとも６つの群、少なくとも７つの群、少なくとも８つの群、少なくとも９つの群、少なくとも１０の群、少なくとも１５の群、少なくとも２０の群、少なくとも２５の群、少なくとも５０の群、少なくとも７５の群、または少なくとも１００の群のうちの１つへと活性微生物株が分類される。例えば、比較は、それぞれの微生物株の間の結び付き、それぞれの微生物株とメタデータとの間の結び付き、及び／またはメタデータと微生物株との間の結び付き、を明らかにするネットワーク解析であり得る。少なくとも１つの微生物を、少なくとも２つの群から選択し、組み合わせることで、少なくとも１つのメタデータに対応する特性（例えば、標的の特性（乳牛または乳牛集団の乳産生など））を変えるように構成された微生物のアンサンブルを形成させることができる。アンサンブルの形成は、微生物株またはそれぞれの微生物株を単離すること、あらかじめ単離された微生物株を解析に基づいて選択すること、及び／または解析に基づいて特定の微生物株をインキュベート／増殖させること、ならびに用途に基づいて特定の量／数及び／または比率及び／または媒体／担体（複数可）で株を含むように株を組み合わせて微生物アンサンブルを形成させること、を含み得る。アンサンブルは、それがレシピエントに影響を与える（例えば、乳産生を増加させる）ことができるような方法でそのアンサンブル中の微生物を送達することが可能になる適切な媒体、担体、及び／または医薬担体を含み得る。
【０２０９】
特有の第１のマーカーの数の測定は、各試料における特有のゲノムＤＮＡマーカーの数を測定すること、各試料における特有のＲＮＡマーカーの数を測定すること、各試料における特有のタンパク質マーカーの数を測定すること、及び／または各試料における特有の代謝物マーカーの数を測定すること（各試料における特有の脂質マーカーの数を測定すること、及び／または各試料における特有の糖質マーカーの数を測定することを含む）を含み得る。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、特有の第１のマーカーの数及びその量の測定は、各試料に由来するゲノムＤＮＡをハイスループットシークエンシング反応に供すこと、及び／または各試料に由来するゲノムＤＮＡをメタゲノムシークエンシングに供すこと、を含む。特有の第１のマーカーは、ｍＲＮＡマーカー、ｓｉＲＮＡマーカー、及び／またはリボソームＲＮＡマーカー、のうちの少なくとも１つを含み得る。特有の第１のマーカーは、シグマ因子、転写因子、ヌクレオシド関連タンパク質、及び／または代謝酵素、のうちの少なくとも１つを付加的または代替的に含み得る。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの特有の第２のマーカーの測定は、各試料における少なくとも１つの特有の第２のマーカーの発現レベルを測定することを含むと共に、試料におけるｍＲＮＡを遺伝子発現解析に供すことを含み得る。遺伝子発現解析は、シークエンシング反応、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、メタトランスクリプトームシークエンシング、及び／またはトランスクリプトームシークエンシングを含み得る。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの特有の第２のマーカーの発現レベルの測定は、各試料またはその一部を質量分析に供すこと、及び／または各試料またはその一部をメタリボソームプロファイリングもしくはリボソームプロファイリングに供すこと、を含む。１つまたは複数の微生物型には、細菌、古細菌、真菌、原生動物、植物、他の真核生物、ウイルス、ウイロイド、またはそれらの組み合わせが含まれ、１つまたは複数の微生物株には、１つまたは複数の細菌株、古細菌株、真菌株、原生動物株、植物株、他の真核生物株、ウイルス株、ウイロイド株、またはそれらの組み合わせが含まれる。１つまたは複数の微生物株は、１つもしくは複数の真菌種もしくは真菌亜種であり得、及び／または１つもしくは複数の微生物株は、１つもしくは複数の細菌種もしくは細菌亜種であり得る。
【０２１３】
いくつかの実施形態では、各試料における１つまたは複数の微生物型のそれぞれの数の決定は、各試料またはその一部をシークエンシング、遠心分離、光学顕微鏡法、蛍光顕微鏡法、染色、質量分析、マイクロフルイディクス、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、ゲル電気泳動、及び／またはフローサイトメトリーに供すことを含む。
【０２１４】
特有の第１のマーカーは、５Ｓリボソームサブユニット遺伝子、１６Ｓリボソームサブユニット遺伝子、２３Ｓリボソームサブユニット遺伝子、５．８Ｓリボソームサブユニット遺伝子、１８Ｓリボソームサブユニット遺伝子、２８Ｓリボソームサブユニット遺伝子、チトクロムｃ酸化酵素サブユニット遺伝子、β−チューブリン遺伝子、伸長因子遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼサブユニット遺伝子、内部転写スペーサー（ＩＴＳ）、またはそれらの組み合わせを含む系統発生学的マーカーを含み得る。特有のマーカーの数及びその量の測定は、各試料に由来するゲノムＤＮＡをハイスループットシークエンシング反応に供すこと、ゲノムＤＮＡをゲノムシークエンシングに供すこと、及び／またはゲノムＤＮＡをアンプリコンシークエンシングに供すこと、を含み得る。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異なる特徴は、第１の試料の取得時間と第２の試料の取得時間とが異なるように少なくとも２つの試料のそれぞれが取得された取得時間と、第１の試料の取得位置と第２の試料の取得位置とが異なるように少なくとも２つの試料のそれぞれが取得された取得位置（地理的な位置差異及び／または個々の試料標的／動物取得差異）と、を含む。少なくとも１つの共通の特徴は、第１の試料の試料源型と第２の試料の試料源型とが同一である試料源型を含み得る。試料源型は、動物型、器官型、土壌型、水型、堆積物型、油型、植物型、農産物型、バルク土壌型、土壌根圏型、植物部分型、及び／または同様のもの、のうちの１つであり得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの共通の特徴は、少なくとも２つの試料のそれぞれが消化管試料であることを含み、こうした消化管試料は、いくつかの実施態様では、ルーメン試料であり得る。いくつかの実施態様では、本明細書で提供される共通／異なる特徴は、代替として、ある特定の試料の間の異なる／共通の特徴であり得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの共通の特徴は、動物試料源型を含むと共に、各試料は、追加の共通の特徴を含み、その結果、各試料は、組織試料、血液試料、歯試料、汗試料、爪試料、皮膚試料、毛髪試料、糞便試料、尿試料、精液試料、粘液試料、唾液試料、筋肉試料、脳試料、または器官試料である。
【０２１６】
いくつかの実施形態では、上記の方法は、少なくとも１つの測定メタデータに基づいて標的から少なくとも１つの追加の試料を取得することをさらに含み得、標的に由来する少なくとも１つの追加の試料は、少なくとも２つの試料と少なくとも１つの共通の特徴を共有する。次に、標的に由来する少なくとも１つの追加の試料について、１つまたは複数の微生物型の存在が検出され、１つまたは複数の微生物型のうちで検出されたそれぞれの微生物型の数が決定され、特有の第１のマーカーの数及びその量が測定され、それぞれの微生物型の数と第１のマーカーの数とが統合されることで、存在するそれぞれの微生物株の絶対細胞数が得られ、それぞれの微生物株に対する少なくとも１つの特有の第２のマーカーが測定されることでその微生物株の活性レベルが決定され、決定された活性によって絶対細胞数がフィルタリングされることで、標的に由来する少なくとも１つの追加の試料ついての活性微生物株のセットまたはリスト及びそのそれぞれの絶対細胞数が得られる。そのような実施形態では、少なくとも２つの群からの少なくとも１つの微生物株の選択は、標的に由来する少なくとも１つの追加の試料についての活性微生物株（複数可）のセットまたはリスト及びそのそれぞれの絶対細胞数に基づくものであり、その結果、形成されるアンサンブルは、少なくとも１つのメタデータに対応する標的の特性を変えるように構成される。例えば、そのような実施態様が使用されるのであれば、ホルスタイン乳牛から取得された試料と、ジャージー乳牛または水牛から取得された標的試料と、から微生物アンサンブルを明らかにすることができ、元の試料及び標的試料（複数可）に由来する同一または同様の微生物株の間の同一、実質的に同様、または同様のネットワーク関連性が解析によって明らかにされる。
【０２１７】
いくつかの実施形態では、少なくとも２つの試料のそれぞれについての活性微生物株のフィルタリングされた絶対細胞数と、少なくとも２つの試料のそれぞれについての少なくとも１つの測定メタデータまたは追加の活性微生物株と、の比較は、各試料における１つまたは複数の活性微生物株と、少なくとも１つの測定メタデータまたは追加の活性微生物株と、の共出現を決定することを含む。少なくとも１つの測定メタデータは、１つまたは複数のパラメータを含み得、１つまたは複数のパラメータは、試料ｐＨ、試料温度、脂肪の存在量、タンパク質の存在量、糖質の存在量、ミネラルの存在量、ビタミンの存在量、天然物の存在量、特定の化合物の存在量、試料源の体重、試料源の飼料摂取量、試料源の体重増加、試料源の飼料効率、１つもしくは複数の病原体の存在もしくは不在、試料源の物理的な特徴（複数可）もしくは測定値（複数可）、試料源の産生特徴、またはそれらの組み合わせ、のうちの少なくとも１つである。パラメータは、試料源によって産生する乳汁における乳清タンパク質の存在量、カゼインタンパク質の存在量、及び／または脂肪の存在量も含み得る。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、各試料における、１つまたは複数の活性微生物株と、少なくとも１つの測定メタデータまたは追加の活性微生物株と、の共出現の決定は、２つ以上の試料セットにおけるメタデータと微生物株との関連性を示すリンケージ、１つまたは複数の活性微生物株の絶対細胞数、ならびに１つまたは複数の特有の第２のマーカーの測定値、がまとまったマトリックスを創出して不均一微生物コミュニティ（複数可）の１つまたは複数のネットワークを示すことを含み得る。１つまたは複数の活性微生物株と、少なくとも１つの測定メタデータまたは追加の活性微生物株と、の共出現を決定し、活性微生物株を分類することは、ネットワーク内のそれぞれの微生物株の連結度を測定するためのネットワーク解析及び／またはクラスター解析を含み得、ネットワークは、共通の特徴、測定メタデータ、及び／または関連環境パラメータを共有する少なくとも２つの試料がまとまったものを示す。ネットワーク解析及び／またはクラスター解析は、連鎖解析、モジュラリティ解析、頑健性測定、媒介性測定、連結度測定、推移性測定、中心性測定、またはそれらの組み合わせを含み得る。クラスター解析は、連結度モデル、部分空間モデル、分布モデル、密度モデル、及び／または重心モデルを構築することを含み得る。ネットワーク解析は、いくつかの実施態様では、リンクのマイニング及び予測、集団分類、リンクに基づくクラスタリング、関連類似度、それらの組み合わせ、及び／または同様のものを介するネットワーク（複数可）の予測モデリングを含み得る。ネットワーク解析は、微分方程式に基づく集団のモデリング及び／またはＬｏｔｋａ−Ｖｏｌｔｅｒｒａモデリングを含み得る。解析は、ヒューリスティックな方法であり得る。いくつかの実施形態では、解析は、Ｌｏｕｖａｉｎ法であり得る。ネットワーク解析は、変数間の連結度を確立するためのノンパラメトリック法、及び／または連結度を確立するための、変数間の相互情報量及び／または最大情報係数の計算を含み得る。
【０２１９】
いくつかの実施形態については、環境の特性または特徴を変えるように構築された活性微生物株のアンサンブルを２つ以上の試料セットに基づいて形成するための方法であって、当該２つ以上の試料セットが、当該２つ以上の試料セットの間で少なくとも１つの共通または関連する環境パラメータを共有し、かつ当該２つ以上の試料セットの間で少なくとも１つの異なる環境パラメータを有するものであり、各試料セットが、不均一微生物コミュニティを含む少なくとも１つの試料を含み、１つまたは複数の微生物株が、１つまたは複数の生物型の亜分類群である方法は、各試料における複数の微生物型の存在を検出すること、各試料において検出された微生物型のそれぞれの絶対細胞数を決定すること、及び各試料における特有の第１のマーカーの数及びその量を測定すること、を含み、特有の第１のマーカーは、微生物株のマーカーである。次に、１つまたは複数の特有の第２のマーカーの発現レベルがタンパク質レベルまたはＲＮＡレベルで測定され、特有の第２のマーカーは、微生物株の活性のマーカーであり、１つまたは複数の特有の第２のマーカーの特定の閾値を上回る発現レベルに基づいて各試料について検出された微生物株の活性が決定され、１つまたは複数の第１のマーカーの量と、１つまたは複数の微生物株が亜分類群となる由来元の微生物型の絶対細胞数と、に基づいて、各試料における検出されたそれぞれの活性微生物株の絶対細胞数が計算され、１つまたは複数の活性微生物株は、特定の閾値を上回って特有の第２のマーカーを発現する。次に、試料における活性微生物株と少なくとも１つの環境パラメータとの共出現が、ネットワーク内のそれぞれの微生物株の連結度を測定するための最大情報係数ネットワーク解析に基づいて決定され、ネットワークは、少なくとも２つ以上の試料セットが少なくとも１つの共通または関連する環境パラメータと共にまとまったものである。ネットワーク解析に基づいて１つまたは複数の活性微生物株から複数の活性微生物株が選択され、選択された複数の活性微生物株から活性微生物株のアンサンブルが形成され、活性微生物株のアンサンブルは、その活性微生物株のアンサンブルが環境に導入されたときにその環境の特性または特徴を選択的に変えるように構成される。いくつかの実施態様については、第１の試料セットについての少なくとも１つの共通または関連する環境因子の少なくとも１つの測定識別指標は、第２の試料セットについての少なくとも１つの共通または関連する環境因子の測定識別指標とは異なる。例えば、試料／試料セットが乳牛に由来するのであれば、第１の試料セットは、牧草食が与えられた乳牛に由来し得、一方、第２の試料セットは、トウモロコシ食が与えられた乳牛に由来し得る。１つの試料セットは、単一の試料であり得るが、代替的に、複数の試料でもあり得、試料セット内の各試料についての少なくとも１つの共通または関連する環境因子の測定識別指標は、実質的に同様であり（例えば、１つのセット中の試料はすべて、牧草飼料を摂取する群れから取得されたものである）、１つの試料セットについての平均測定識別指標は、別の試料セットに由来する平均測定識別指標と異なる（第１の試料セットは、牧草飼料を摂取する群れに由来し、第２の試料セットは、トウモロコシ飼料を摂取する群れに由来する試料である）。解析において考慮される差異及び類似性が追加で存在し得、こうした差異及び類似性は、品種の差異、食物の差異、能力の差異、年齢の差異、飼料添加物の差異、成長段階の差異、生理学的特徴の差異、健康状態の差異、標高（ｅｌｅｖａｔｉｏｎ）の差異、環境温度の差異、季節の差異、抗生物質の差異などである。いくつかの実施形態では、各試料セットは、複数の試料を含み、第１の試料セットは、第１の集団から取得され、第２の試料セットは、第２の集団から取得され、一方、追加または代替の実施形態では、各試料セットは、複数の試料を含み、第１の試料セットは、第１の時点で第１の集団から取得され、第２の試料セットは、第１の時点とは異なる第２の時点で第１の集団から取得される。例えば、第１の試料セットは、牧草飼料を摂取中のウシの群れから第１の時点で取得することができ、第２の試料セットは、第１の試料セットが取得された直後から群れの飼料がトウモロコシに切り替わっている第２の時点（例えば、２ヶ月後）に取得することができる。そのような実施形態では、試料を取得し、集団に対する解析を実施することができ、及び／または個々の動物に対する固有の照会情報を試料に含めることができ、その結果、ある一定期間にわたって個々の動物に生じた変化を特定できるようになり、粒度レベルが高まったデータが得られる。いくつかの実施形態では、生物学的環境の特性を変えるように構成された活性微生物株の合成アンサンブルを２つ以上の試料（または試料セット（それぞれのセットは、少なくとも１つの試料を含む））に基づいて形成するための方法であって、それぞれが複数の環境パラメータ（及び／またはメタデータ）を有し、複数の環境パラメータの少なくとも１つのパラメータが、２つ以上の試料または試料セットの間で同様の共通環境パラメータであり、少なくとも１つの環境パラメータが、２つ以上の試料または試料セットのそれぞれの間で異なる別の環境パラメータであり、各試料セットが、生物学的試料源から取得された不均一微生物コミュニティを含む少なくとも１つの試料を含み、活性微生物株の少なくとも１つが、１つまたは複数の生物型の亜分類群である方法は、各試料における複数の微生物型の存在を検出すること、各試料において検出された微生物型のそれぞれの絶対細胞数を決定すること、各試料における特有の第１のマーカーの数及びその量を測定すること（特有の第１のマーカーは、微生物株のマーカーである）、１つまたは複数の特有の第２のマーカーのレベル（例えば、発現レベル）を測定すること（特有の第２のマーカーは、微生物株の活性のマーカーである）、１つまたは複数の特有の第２のマーカーの特定の閾値を上回るレベル（例えば、発現レベル）に基づいて、各試料について検出された微生物株のそれぞれの活性を決定して１つまたは複数の活性微生物株を同定すること、１つまたは複数の特有の第１のマーカーのそれぞれの量（相対量、比例数、比例量、割合量など）と、１つまたは複数の微生物株が亜分類群となる由来元のそれぞれまたは対応する微生物型の絶対細胞数と、から、各試料における検出されたそれぞれの活性微生物株の絶対細胞数を計算すること（計算は、乗算、ドット演算子、及び／または他の操作などの数値演算である）（１つまたは複数の活性微生物株は、特定の閾値を上回って１つまたは複数の特有の第２のマーカーを有するか、または発現する）、２つ以上の試料セットの活性微生物株を解析すること（解析は、２つ以上の試料セットのそれぞれの活性微生物株のそれぞれと、少なくとも１つの共通環境パラメータと、少なくとも１つの異なる環境パラメータと、のノンパラメトリックネットワーク解析を実施することを含み、ノンパラメトリックネットワーク解析は、それぞれの活性微生物株と他のあらゆる活性微生物株との間の最大情報係数スコアを決定すること、及びそれぞれの活性微生物株と少なくとも１つの異なる環境パラメータとの間の最大情報係数スコアを決定すること、を含む）、ノンパラメトリックネットワーク解析に基づいて１つまたは複数の活性微生物株から複数の活性微生物株を選択すること、ならびに選択された複数の活性微生物株及び微生物担体媒体を含む活性微生物株の合成アンサンブルを形成させること（活性微生物株のアンサンブルは、その活性微生物株の合成アンサンブルが生物学的環境に導入されると、その生物学的環境の特性を選択的に変えるように構成される）、を含む。実施形態または実施態様に応じて、少なくとも２つの試料または試料セットは、３つの試料、４つの試料、５つの試料、６つの試料、７つの試料、８つの試料、９つの試料、１０の試料、１１の試料、１２の試料、１３の試料、１４の試料、１５の試料、１６の試料、１７の試料、１８の試料、１９の試料、２０の試料、２１の試料、２２の試料、２３の試料、２４の試料、２５の試料、２６の試料、２７の試料、２８の試料、２９の試料、３０の試料、３５の試料、４０の試料、４５の試料、５０の試料、６０の試料、７０の試料、８０の試料、９０の試料、１００の試料、１５０の試料、２００の試料、３００の試料、４００の試料、５００の試料、６００の試料、及び／または同様のものを含み得る。試料の総数は、実施形態／実施態様に応じ得るものであり、５未満、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、１００未満、１００超、２００未満、２００超、３００未満、３００超、４００未満、４００超、５００未満、５００超、１０００未満、１０００超、５０００未満、１００００未満、２００００未満などであり得る。
【０２２０】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの共通または関連する環境因子には、栄養素情報、食物情報、動物特徴、感染情報、健康状態、及び／または同様のものを含む。
【０２２１】
少なくとも１つの測定識別指標は、試料ｐＨ、試料温度、脂肪の存在量、タンパク質の存在量、糖質の存在量、ミネラルの存在量、ビタミンの存在量、天然物の存在量、特定の化合物の存在量、試料源の体重、試料源の飼料摂取量、試料源の体重増加、試料源の飼料効率、１つもしくは複数の病原体の存在もしくは不在、試料源の物理的な特徴（複数可）もしくは測定値（複数可）、試料源の産生特徴、試料源によって産生する乳汁における乳清タンパク質の存在量、試料源によって産生するカゼインタンパク質の存在量、及び／または試料源によって産生する乳汁における脂肪の存在量、あるいはそれらの組み合わせを含み得る。
【０２２２】
各試料における特有の第１のマーカーの数の測定は、実施形態に応じて、特有のゲノムＤＮＡマーカーの数を測定すること、特有のＲＮＡマーカーの数を測定すること、及び／または特有のタンパク質マーカーの数を測定すること、を含み得る。複数の微生物型は、１つまたは複数の細菌、古細菌、真菌、原生動物、植物、他の真核生物、ウイルス、ウイロイド、またはそれらの組み合わせを含み得る。
【０２２３】
いくつかの実施形態では、各試料における微生物型のそれぞれの絶対数の決定は、シークエンシング、遠心分離、光学顕微鏡法、蛍光顕微鏡法、染色、質量分析、マイクロフルイディクス、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、ゲル電気泳動及び／またはフローサイトメトリーに、試料またはその一部を供すことを含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の活性微生物株は、１つまたは複数の細菌、古細菌、真菌、原生動物、植物、他の真核生物、ウイルス、ウイロイド、またはそれらの組み合わせから選択される１つまたは複数の微生物型の亜分類群である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の活性微生物株は、１つまたは複数の細菌株、古細菌株、真菌株、原生動物株、植物株、他の真核生物株、ウイルス株、ウイロイド株、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の活性微生物株は、１つまたは複数の細菌種または細菌亜種である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の活性微生物株は、１つまたは複数の真菌種または真菌亜種である。
【０２２４】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの特有の第１のマーカーは、５Ｓリボソームサブユニット遺伝子、１６Ｓリボソームサブユニット遺伝子、２３Ｓリボソームサブユニット遺伝子、５．８Ｓリボソームサブユニット遺伝子、１８Ｓリボソームサブユニット遺伝子、２８Ｓリボソームサブユニット遺伝子、チトクロムｃ酸化酵素サブユニット遺伝子、ベータ−チューブリン遺伝子、伸長因子遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼサブユニット遺伝子、内部転写スペーサー（ＩＴＳ）、またはそれらの組み合わせを含む系統発生学的マーカーを含む。
【０２２５】
いくつかの実施形態では、特有の第１のマーカーの数及びその量の測定は、各試料に由来するゲノムＤＮＡをハイスループットシークエンシング反応に供すこと、及び／または各試料に由来するゲノムＤＮＡをメタゲノムシークエンシングに供すこと、を含む。いくつかの実施態様では、特有の第１のマーカーは、ｍＲＮＡマーカー、ｓｉＲＮＡマーカー、及び／またはリボソームＲＮＡマーカーを含み得る。いくつかの実施態様では、特有の第１のマーカーは、シグマ因子、転写因子、ヌクレオシド関連タンパク質、代謝酵素、またはそれらの組み合わせを含み得る。
【０２２６】
いくつかの実施形態では、１つまたは複数の特有の第２のマーカーの発現レベルの測定は、各試料におけるｍＲＮＡを遺伝子発現解析に供すことを含み、いくつかの実施態様では、遺伝子発現解析は、シークエンシング反応を含む。いくつかの実施態様では、遺伝子発現解析は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、メタトランスクリプトームシークエンシング、及び／またはトランスクリプトームシークエンシングを含む。
【０２２７】
いくつかの実施形態では、１つまたは複数の特有の第２のマーカーの発現レベルの測定は、質量分析、メタリボソームプロファイリング、及び／またはリボソームプロファイリングに、各試料またはその一部を供すことを含む。
【０２２８】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つまたは複数の特有の第２のマーカーの発現レベルの測定は、各試料またはその一部をメタリボソームプロファイリングまたはリボソームプロファイリング（Ｒｉｂｏ−Ｓｅｑ）に供すことを含む（例えば、Ｉｎｇｏｌｉａ，Ｎ．Ｔ．，Ｓ．Ｇｈａｅｍｍａｇｈａｍｉ，Ｊ．Ｒ．Ｎｅｗｍａｎ，ａｎｄ  Ｊ．Ｓ．Ｗｅｉｓｓｍａｎ，２００９，“Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ”Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２４：２１８−２２３、Ｉｎｇｏｌｉａ，Ｎ．Ｔ．，２０１４，“Ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ：ｎｅｗ  ｖｉｅｗｓ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，ｆｒｏｍ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｏｄｏｎｓ  ｔｏ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｃａｌｅ”Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１５：２０５−２１３を参照のこと（これらの文献はそれぞれ、あらゆる目的のための参照によってその全体が組み込まれる））。Ｒｉｂｏ−ｓｅｑは、ゲノムスケールでインビボのタンパク質合成を決定するために使用することができる分子手法である。この方法では、フットプリントリボソームによるｍＲＮＡとの結合及び相互作用に伴ってそれを介してどの転写物が活発に転写中であるかが直接的に測定される。次に、ｍＲＮＡの被結合領域が処理され、ハイスループットシークエンシング反応に供される。Ｒｉｂｏ−ｓｅｑは、定量的プロテオミクスと強い相関を有することが示されている（例えば、Ｌｉ，Ｇ．Ｗ．，Ｄ．Ｂｕｒｋｈａｒｄｔ，Ｃ．Ｇｒｏｓｓ，ａｎｄ  Ｊ．Ｓ．Ｗｅｉｓｓｍａｎ．２０１４“Ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ  ａｂｓｏｌｕｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｒａｔｅｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ  ａｌｌｏｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ”Ｃｅｌｌ  １５７：６２４−６３５を参照のこと（参照によってその全体が本明細書に明確に組み込まれる））。
【０２２９】
試料の取得源の型は、動物、土壌、空気、塩水、淡水、廃水汚泥、堆積物、油、植物、農産物、食物試料（特に、発酵食品及び微生物食品（例えば、パン、チーズ、ワイン、ビール、キムチなど））、バルク土壌、土壌根圏、植物部分、野菜、極限環境、またはそれらの組み合わせ、のうちの１つであり得る。いくつかの実施態様では、各試料は、消化管試料及び／またはルーメン試料である。いくつかの実施態様では、試料は、組織試料、血液試料、歯試料、汗試料、爪試料、皮膚試料、毛髪試料、糞便試料、尿試料、精液試料、粘液試料、唾液試料、筋肉試料、脳試料、組織試料、及び／または器官試料であり得る。
【０２３０】
実施態様に応じて、本開示の微生物アンサンブルは、２つ以上の実質的に純粋な微生物または微生物株（所望の微生物／微生物株の混合物）を含み得、標的に投与（例えば、マイクロバイオータを回復させるために動物に投与）することができる任意の追加の成分も含み得る。本開示に従って調製される微生物アンサンブルは、微生物が標的環境（例えば、動物の消化管であり、この場合、アンサンブルは、低ｐＨに抵抗性であり、消化管環境において増殖するように構成される）で生き延びることを可能にする物質と共に投与することができる。いくつかの実施形態では、微生物アンサンブルは、１つまたは複数の所望の微生物または微生物株の数及び／または活性を増加させる１つまたは複数の物質を含み得、当該株は、アンサンブルに含められる微生物／株の中に存在する株であるか、またはそこに存在しない株である。そのような物質の例には、限定はされないが、フルクトオリゴ糖（例えば、オリゴフルクトース、イヌリン、イヌリン型フルクタン）、ガラクトオリゴ糖、アミノ酸、アルコール、及びそれらの混合物が含まれる（Ｒａｍｉｒｅｚ−Ｆａｒｉａｓ  ｅｔ  ａｌ．２００８．Ｂｒ．Ｊ．Ｎｕｔｒ．４：１−１０、及びＰｏｏｌ−Ｚｏｂｅｌ  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ  ２００７．Ｊ．Ｎｕｔｒ．１３７：２５８０−２５８４  ａｎｄ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌを参照のこと（これらの文献はそれぞれ、あらゆる目的のために参照によってその全体が本明細書に組み込まれる））。いくつかの実施形態では、こうした物質には、１つまたは複数の所望の微生物または微生物株の数及び／または活性を増加させることになる栄養物質が含まれ得、こうした栄養物質は、ビタミン、ミネラル、糖類、及び／または他のプレバイオティクスなどである。
【０２３１】
本開示の方法によって同定される微生物株は、培養／増殖させてからアンサンブルに含めることができる。そのような増殖のために培地を使用することができ、こうした培地には、微生物の増殖を支援する上で適した任意の培地が含まれ得、その例には、限定はされないが、ガストリン添加寒天、ＬＢ培地、血清、及び／または組織培養ゲルを含めて、天然または人工のものが含まれる。培地は、単独で使用するか、または１つもしくは複数の他の培地と併用できることを理解されよう。培地は、外来栄養素を添加して使用するか、または外来栄養素を添加せずに使用することもできる。培地は、追加の化合物または成分で改変するか、または濃度を高めることができ、こうした化合物または成分は、例えば、微生物及び／またはその株の特定の群の相互作用及び／または選択を支援し得る成分である。例えば、抗生物質（ペニシリンなど）または滅菌剤（例えば、第四級アンモニウム塩及び酸化剤）が含められ得、及び／または物理的条件（塩分、栄養素（例えば、有機ミネラル及び無機ミネラル（リン、窒素塩、アンモニア、カリウム、及び微量栄養素（コバルト及びマグネシウムなど）など）、ｐＨ、及び／または温度など）が改変され得る。
【０２３２】
上で議論されるように、本開示に従ってシステム及び装置を構成することができ、いくつかの実施形態では、こうしたシステム及び装置は、プロセッサ及びメモリを含み得、このメモリにプロセッサ可読命令／発行可能命令を保存することで方法（複数可）が実施される。１つの実施形態では、システム及び／または装置は、方法を実施するように構成される。方法のプロセッサの実施態様もまた開示され、このことは、図３Ａを参照して議論される。例えば、プロセッサによって実施される方法は、少なくとも１つの共通の特徴を共有し、かつ少なくとも１つの異なる特徴を有する少なくとも２つの試料から試料データを入手すること、各試料について各試料における１つまたは複数の微生物型の存在を決定すること、１つまたは複数の微生物型のうちで各試料において検出されたそれぞれの微生物型の細胞数を決定すること、各試料における特有の第１のマーカーの数及びその量を決定すること（特有の第１のマーカーはそれぞれ、微生物株のマーカーである）、それぞれの微生物型の数と第１のマーカーの数とを、１つまたは複数のプロセッサを介して統合して各試料に存在するそれぞれの微生物株の絶対細胞数を得ること、それぞれの微生物株に対する少なくとも１つの特有の第２のマーカーの特定の閾値を上回る測定値に基づいて各試料におけるそれぞれの微生物株の活性レベルを決定すること（微生物株は、その株に対する少なくとも１つの特有の第２のマーカーの測定値が対応閾値を上回るであれば、活性であると同定する）、決定された活性によってそれぞれの微生物株の絶対細胞数をフィルタリングすることで、少なくとも２つの試料のそれぞれについての活性微生物株のリスト及びそのそれぞれの絶対細胞数を得ること、少なくとも２つの試料のそれぞれについての少なくとも１つの測定メタデータまたは追加の活性微生物株と共に、少なくとも２つの試料のそれぞれについての活性微生物株のフィルタリングされた絶対数を１つまたは複数のプロセッサを介して解析し、機能、予測機能、及び／または化学に基づいて活性微生物株を分類すること、分類に基づいて複数の活性微生物株を同定すること、ならびに同定された複数の活性微生物株を出力すること（当該同定された複数の活性微生物株は、標的に適用されると少なくとも１つの測定メタデータに対応する標的の特性を変えるように構成された活性微生物を構築するためのものである）、を含み得る。いくつかの実施形態では、出力は、合成及び／またはトランスジェニックの微生物及び微生物株の生成、合成、評価、及び／または試験において利用することができる。いくつかの実施形態は、方法（複数可）の実行を実現及び／または促進するための命令が保存されたプロセッサ可読かつ非一過性のコンピュータ可読媒体を含み得る。いくつかの実施形態では、本開示による解析方法及びスクリーニング方法、装置、及びシステムは、問題の微生物及び株（病原体など）の同定に使用することができ、このことは、後述の実施例４において議論される。そのような状況では、試料のネットワーク解析において既知の症状メタデータ（病変スコアなど）が使用されることが想定される。
【０２３３】
本明細書に記載のシステム及び方法は、ソフトウェア（メモリに保存されたもの及び／またはハードウェアで実行されるもの）、ハードウェア、あるいはそれらの組み合わせによって実施できることが意図される。ハードウェアコンポーネント及び／またはハードウェアモジュールには、例えば、汎用プロセッサ、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、及び／または特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）が含まれ得る。ソフトウェアコンポーネント及び／またはソフトウェアモジュール（ハードウェアで実行されるもの）は、さまざまなソフトウェア言語（例えば、コンピュータコード）において表すことができ、こうしたソフトウェア言語には、Ｕｎｉｘ（登録商標）ユーティリティ、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｊａｖａ（商標）、ＪａｖａＳｃｒｉｐｔ（登録商標）（例えば、ＥＣＭＡＳｃｒｉｐｔ６）、Ｒｕｂｙ、ＳＱＬ、ＳＡＳ（登録商標）、Ｒプログラミング言語／ソフトウェア環境、Ｖｉｓｕａｌ  Ｂａｓｉｃ（商標）、ならびに他のオブジェクト指向型、手続き型、または他の型のプログラミング言語及び開発ツールが含まれる。コンピュータコードの例には、限定はされないが、マイクロコードまたはマイクロ命令、マシン命令（コンパイラによって生成されるものなど）、ウェブサービスを生成するために使用されるコード、及びインタプリタを使用するコンピュータによって実行される高レベルの命令を含むファイルが含まれる。コンピュータコードの追加の例には、限定はされないが、制御信号、暗号化コード、及び圧縮コードが含まれる。
【０２３４】
本明細書に記載の実施形態のいくつかは、非一過性のコンピュータ可読媒体（非一過性のプロセッサ可読媒体またはプロセッサ可読メモリとも称され得る）を備えたデバイスに関し、こうした非一過性のコンピュータ可読媒体は、コンピュータによって実行されるさまざまな操作を実施するための命令またはコンピュータコードがそこに存在するものである。コンピュータ可読媒体（またはプロセッサ可読媒体）は、一過性に伝搬する信号（例えば、送信媒体（空間またはケーブルなど）上で情報を運ぶ伝搬性の電磁波）自体をそれが含まないという意味において非一過性である。媒体及びコンピュータコード（コードとも称され得る）は、特定の目的（複数可）のために設計及び構築されるものであり得る。非一過性のコンピュータ可読媒体の例には、限定はされないが、磁気記憶媒体（ハードディスク、フロッピーディスク（登録商標）、及び磁気テープなど）、光記憶媒体（コンパクトディスク／デジタルビデオディスク（ＣＤ／ＤＶＤ）、コンパクトディスク−読み取り専用メモリ（ＣＤ−ＲＯＭ）、及びホログラフィックデバイスなど）、磁気光学記憶媒体（光ディスクなど）、搬送波信号処理コンポーネント及び／または搬送波信号処理モジュール、ならびにプログラムコードを保存及び実行するように特別に構成されたハードウェアデバイス（特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、プログラマブル論理デバイス（ＰＬＤ）、読み取り専用メモリ（ＲＯＭ）、及びランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）デバイスなど）が含まれる。本明細書に記載の他の実施形態は、コンピュータプログラム製品に関し、こうしたコンピュータプログラム製品は、例えば、本明細書で議論される命令及び／またはコンピュータコードを含み得る。
【０２３５】
図３Ａのさまざまな実施形態が上に説明されているが、こうした実施形態は、例として示されているものにすぎず、限定ではないことを理解されよう。上記の方法及び段階が、ある特定の順序で生じるある特定の事象を示す場合、ある特定の段階の順序を改変することができる。さらに、ある特定の段階を、可能なときは並行処理で同時に実施することも、上記のように連続的に実施することもできる。特定の特徴及び／または構成要素の組み合わせを有するものとしてさまざまな実施形態が記載されているが、本明細書に記載の実施形態のいずれかに由来する任意の特徴及び／または構成要素の任意の組み合わせまたは部分的組み合わせを有する他の実施形態も可能である。さらに、特定の計算デバイスと関連する特定の実体を有するものとしてさまざまな実施形態が記載されるが、他の実施形態では、他の計算デバイス及び／または異なる計算デバイスと関連する実体は異なり得る。
【実施例】
【０２３６】
実験データ及び実施例
本開示は、下記の実験データ及び実施例を参照することによってさらに示される。しかしながら、こうした実験データ及び実施例は、上記の実施形態のように、例示的なものであり、いかなる様式においても本開示の範囲の限定であると解釈してはならないことに留意されたい。
【０２３７】
実施例１
図２に示される段階を参照する。
【０２３８】
２０００：乳牛のルーメン試料に由来する細胞をマトリックスから剥離する。この処理は、超音波処理またはボルテックス処理を介して試料を激しくブレンドまたは混合した後、細胞からマトリックスを除去するために分画遠心分離法に供すことによって実施できる。遠心分離は、ＮｙｃｏｄｅｎｚまたはＰｅｒｃｏｌｌを使用する勾配遠心分離段階を含み得る。
【０２３９】
２００１：特定の生物型を標的とする蛍光色素を使用して生物を染色する。フローサイトメトリーを使用することによって、染色特性及びサイズに基づいて異なる集団を判別する。
【０２４０】
２００２：試料における生物の絶対数を、例えばフローサイトメトリーによって、決定する。この段階では、所与の体積中にどのくらい多くの生物型（細菌、古細菌、真菌、ウイルス、または原生生物など）が存在するかについての情報が得られる。
【０２４１】
２００３：乳牛のルーメン試料を取得し、マトリックスに接着した細胞を、ビーズ破砕を介して直接的に溶解させる。全核酸を精製する。全精製核酸をＲＮＡｓｅで処理して精製ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を得る。ｑＰＣＲを使用することで、バルクのｇＤＮＡから特定のマーカーを増幅すると同時に、それぞれのマーカーにシークエンシングアダプター及びバーコードを付加する。指数関数的な増幅の初期にｑＰＣＲ反応を停止することで、ＰＣＲと関連する偏りを最小化する。試料をプールし、プールした試料に対してＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｍｉｓｅｑを使用してマルチプレックスシークエンシングを実施する。
【０２４２】
２００４：マトリックスに接着した乳牛ルーメン試料から、ビーズ破砕を介して細胞を直接的に溶解させる。カラムに基づく手法を使用して全核酸を精製する。全精製核酸をＤＮＡｓｅで処理して精製ＲＮＡを得る。逆転写酵素を使用して全ＲＮＡをｃＤＮＡに変換する。ｑＰＣＲを使用することで、バルクのｃＤＮＡから特定のマーカーを増幅すると同時に、それぞれのマーカーにシークエンシングアダプター及びバーコードを付加する。指数関数的な増幅の初期にｑＰＣＲ反応を停止することで、ＰＣＲと関連する偏りを最小化する。試料をプールし、プールした試料に対してＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｍｉｓｅｑを使用してマルチプレックスシークエンシングを実施する。
【０２４３】
２００５：クオリティの低い塩基対及び切断型リードを除外することによってシークエンシング結果（ｆａｓｔｑファイル）を処理する。カスタマイズしたＵＰＡＲＳＥパイプラインを使用してＤＮＡに基づくデータセットを解析し、現存データベースエントリーに対するシークエンシングリードのマッチングを行うことで、集団内の株を同定する。特有の配列は、データベースに追加する。カスタマイズしたＵＰＡＲＳＥパイプラインを使用してＲＮＡに基づくデータセットを解析する。最新データベースを使用して活性株を同定する。
【０２４４】
２００６：前の段階（２００５）で得た株独自性データを使用して、それぞれの株を示すリードの数を決定し、全リードに占める割合として示す。この割合に対して細胞数（２００２）を乗じることで、試料及び所与の体積におけるそれぞれの生物型の絶対細胞数を決定する。ＲＮＡに基づくデータセットに存在するマーカー配列を適切な閾値と共に使用して絶対細胞数データセット内において活性株を同定する。閾値を満たさない株は、解析から除外する。
【０２４５】
２００７：２００３〜２００６を繰り返すことで、複数の乳牛ルーメン内の微生物集団の動態を示す経時変化を確立する。時間的なデータを集計し、各試料についてのそれぞれの活性生物株の細胞数及びメタデータを量マトリックスまたは存在量マトリックスに保存する。量マトリックスを使用することで、量データで重み付けされるルールマイニング手法を使用して特定時点の試料における活性株間の関連性を明らかにする。フィルターを適用して、有意ではないルールを除外する。
【０２４６】
２００８：変化の方向性を加味した上で（すなわち、負の値は減少を示し、正の値は増加を示す）、活性株の経時的な細胞数変化を計算する。マトリックスをネットワークとして示し、ネットワーク中、生物株はノードを示し、量で重み付けされたルールはエッジを示す。マルコフ連鎖及びランダムウォークを活用して、ノード間の連結度を決定し、クラスターを定義する。所望のメタデータ（環境パラメータ（複数可））と関連するクラスターを同定するために、メタデータを使用してクラスターをフィルタリングする。経時的な細胞数変化と標的クラスターに存在する株とを統合することによって標的生物株を順位付けし、細胞数変化が最も大きいものを最上位に順位付けする。
【０２４７】
実施例２
実験の設計及び材料及び方法
目的：乳牛における乳脂肪の産生に影響を与えるルーメン微生物コミュニティの構成要素を決定すること。
【０２４８】
動物：ルーメンにカニューレを挿入した泌乳ホルスタイン乳牛８頭を、実験で使用するための個別のタイストールに収容した。乳牛には、１日に２回の給餌及び１日に２回搾乳を実施し、乳牛が新鮮な水を自由に摂取できる状態を保った。１頭の乳牛（乳牛１）については、実験前の流産に起因して合併症が生じたため、食物起因性の乳脂肪量低下を最初に誘導した後に試験から除外した。
【０２４９】
実験の設計及び処理：実験では、２群及び１実験期間とするクロスオーバー設計を使用した。実験期間は３８日間に及ぶものとし、１０日間は共変動期間／ウォッシュアウト期間とし、２８日間はデータ収集及び試料取得のためのものとした。データ収集期間は、食物起因性の乳脂肪量低下（ＭＦＤ）の誘導期間が１０日間、回復期間が１８日間となる構成とした。第１の実験期間の後に、１０日間のウォッシュアウト期間をすべての乳牛に取らせてから期間２を開始した。
【０２５０】
デンプン分解性が高く（７０％が分解可能）、多価不飽和脂肪酸のレベルが高い（ＰＵＦＡ、３．７％）、低繊維含量（ＮＤＦ２９％）の完全混合飼料（ＴＭＲ）を用いて食物起因性のＭＦＤを誘導した。回復期間には、デンプン分解性が異なる２つの食物を使用した。繊維含量が高く（ＮＤＦ３７％）、ＰＵＦＡ含量が低く（２．６％）、デンプン分解性が高い（７０％が分解可能）回復用食物に対して４頭の乳牛を無作為に割り付けた。残りの４頭の乳牛には、繊維含量が高く（ＮＤＦ３７％）、ＰＵＦＡ含量が低い（２．６％）が、デンプン分解性が低い（３５％）回復用食物を与えた。
【０２５１】
１０日間の共変動期間中及び１０日間のウォッシュアウト期間中は、繊維含量が高く、ＰＵＦＡ含量が低く、デンプン分解性が低い食物を乳牛に与えた。
【０２５２】
試料及び測定：共変動期間、ウォッシュアウト期間、及び試料取得期間を通じて、乳産生量、乾物摂取量、及び飼料効率をそれぞれの動物について毎日測定した。ＴＭＲ試料については、栄養素組成の測定を実施した。取得期間中は、乳試料を取得し、３日ごとに分析した。試料の分析は、乳成分濃度（乳脂肪、乳タンパク質、ラクトース、乳中尿素窒素、体細胞数、及び固形分）ならびに脂肪酸組成について実施した。
【０２５３】
取得期間中は、ルーメン試料を取得し、微生物コミュニティの組成及び活性について３日ごとに分析した。食物起因性のＭＦＤから０日目、７日目、及び１０日目には、その日の給餌から０時間後、２時間後、４時間後、６時間後、８時間後、１０時間後、１２時間後、１４時間後、１６時間後、１８時間後、２０時間後、及び２２時間後に、ルーメンから集中的に試料を取得した。同様に、回復期間中は、１６日目及び２８日目に、その日の給餌から０時間後、２時間後、４時間後、６時間後、８時間後、１０時間後、１２時間後、１４時間後、１６時間後、１８時間後、２０時間後、及び２２時間後に、ルーメンから集中的に試料を取得した。ルーメン内容物の分析は、ｐＨ、酢酸濃度、酪酸濃度、プロピオン酸濃度、イソ酸濃度、ならびに長鎖及びＣＬＡ異性体の濃度について実施した。
【０２５４】
ルーメン試料の調製及びシークエンシング：ルーメン試料を取得後、スイングバケット型の遠心分離機においてルーメン試料の遠心分離（４，０００ｒｐｍ）を４℃で２０分間実施した。上清をデカントし、０．１ｍｍのガラスビーズを事前に充填した１．７ｍＬ滅菌チューブに一定分量のルーメン内容物試料（１〜２ｍｇ）をそれぞれ添加した。第２の一定分量を取得し、細胞計数用として空の１．７ｍＬ滅菌チューブに入れて保管した。
【０２５５】
ガラスビーズを含めたルーメン試料（第１の一定分量）を、ビーズ破砕を用いてホモジナイズして微生物を溶解させた。各試料からＤＮＡ及びＲＮＡを抽出及び精製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｍｉｓｅｑでのシークエンシング用として調製した。ペアエンド化学を使用して試料をシークエンシングし、ライブラリーの両末端に対して３００塩基対のシークエンシングを実施した。空のチューブに入れたルーメン試料（第２の一定分量）を染色し、フローサイトメーターにかけることで、各試料におけるそれぞれの微生物型の細胞数を定量化した。
【０２５６】
シークエンシングリードの処理及びデータ解析：シークエンシングリードのクオリティトリミング及び処理を実施することで、ルーメンに存在する細菌種をマーカー遺伝子に基づいて同定した。計数データセット及び活性データセットをシークエンシングリードと統合することで、ルーメン微生物コミュニティ内の活性微生物種の絶対細胞数を決定した。相互情報量を使用することによって、乳牛の産生特徴（産生した乳汁のポンドを含む）の経時変化を、実験過程にわたって各試料内の活性微生物の分布に関連付けた。産生した乳脂肪のポンドとそれぞれの活性微生物の絶対細胞数との間で最大情報係数（ＭＩＣ）スコアを計算した。ＭＩＣスコアによって微生物を順位付けし、ＭＩＣスコアが最も高い微生物を、産生した乳汁のポンドとの関連性が最も高い標的種として選択した。
【０２５７】
計数データ、活性データ、ならびに数及び活性が最終結果に与える影響を決定するための試験ケースを、シークエンシング解析から適切なデータセットを除外することによって実施した。ＭＩＣではなく線形相関を使用することが標的の選択に与える影響を評価するために、すべての微生物の相対存在量及び活性微生物の絶対細胞数に対する産生した乳脂肪のポンドのピアソン係数も計算した。
【０２５８】
結果及び考察
相対存在量と絶対細胞数との対比
【０２５９】
細胞数データを含めたデータセットについての上位１５の標的種（絶対細胞数、表２）及び細胞数データを含めないデータセットについての上位１５の標的種（相対存在量、表１）をＭＩＣスコアに基づいて同定した。標的の最終的な選択に対する細胞数データの影響を浮き彫りにするため、この解析では活性データは使用しなかった。最終的に、上位８つの標的は、２つのデータセットの間で同一であった。残りの７つのうちの５つの株は両方のリストに存在したが、その順序は異なった。これら５つの株は順位に差異が存在したにもかかわらず、それぞれの株に対して計算されたＭＩＣスコアは、２つのリストの間で同一であった。絶対細胞数リストには存在するが、相対存在量リストには存在しない２つの株（ａｓｃｕｓ＿１１１及びａｓｃｕｓ＿２８８）は、相対存在量リストではそれぞれ９１位及び１６位であった。相対存在量リストには存在するが、絶対細胞数リストには存在しない２つの株（ａｓｃｕｓ＿１０２及びａｓｃｕｓ＿２５２）は、絶対細胞数リストではそれぞれ５０位及び１９位であった。これら４つの株は、それぞれのリストでのＭＩＣスコアが実際に異なっており、したがってこのことは、それらの順位がシフトし、それに伴ってリスト中のその他の株に影響が及んだことの説明を与えるものである。
【０２６０】
【表１−１】
2020503048.tif 000008
【表１−２】
2020503048.tif 000009
【０２６１】
【表２−１】
2020503048.tif 000010
【表２−２】
2020503048.tif 000011
【０２６２】
細胞数データを統合することは、それぞれの株に割り当てられる最終的なＭＩＣスコアに常に影響を与えるものではなかった。このことは、微生物集団は、実際に、ルーメン内で毎日変化し、３８日間の実験期間にわたって変化してはいたものの、その変化は常に１０７〜１０８個細胞／ミリリットルの範囲内であったという事実に起因するものであり得る。集団の数の変化が増大すれば、最終的なＭＩＣスコアに影響が及ぶ範囲が拡大することは明らかであると想定される。
【０２６３】
不活性種と活性種との対比
【０２６４】
活性データに基づいて株をフィルタリングすることの影響を評価するために、活性データと共に相対存在量を活用したデータセット（表３）、及び活性データなしで相対存在量を活用したデータセット（表１）、ならびに活性データと共に絶対細胞数を活用したデータセット（表４）、及び活性データなしで絶対細胞数を活用したデータセット（表２）、から標的種を同定した。
【０２６５】
相対存在量の場合については、ａｓｃｕｓ＿１２６、ａｓｃｕｓ＿１３６６、ａｓｃｕｓ＿１７８０、ａｓｃｕｓ＿２９９、ａｓｃｕｓ＿１１３９、ａｓｃｕｓ＿１２７、ａｓｃｕｓ＿３４１、及びａｓｃｕｓ＿２５２は、活性データの適用前は、標的株であると見なされていた。これら８つの株（最初の上位１５の標的のうちの５３％）は、活性データの統合後は、上位１５から外れて下位に落ちた。同様の傾向が絶対細胞数の場合についても観測された。Ａｓｃｕｓ＿１２６、ａｓｃｕｓ＿１３６６、ａｓｃｕｓ＿１７８０、ａｓｃｕｓ＿２９９、ａｓｃｕｓ＿１１３９、ａｓｃｕｓ＿１２７、及びａｓｃｕｓ＿３４１（最初の上位１５の標的うちの４６％）は、活性データセットの統合後は、上位１５から外れて下位に落ちた。
【０２６６】
細胞数データセットと比較すると、活性データセットは、標的の順位及び選択に対してはるかに重大な影響を有していた。こうしたデータセットを共に統合するとき、試料が不活性であることが明らかになれば、その試料は本質的に「０」に変えられ、解析の一部とは見なされなくなる。この理由から、試料内の点の分布は、統合後に重度に改変または歪められた状態となり得、このことは、次に、最終的なＭＩＣスコア、ひいては標的微生物の順序に大きな影響を与える。
【０２６７】
【表３−１】
2020503048.tif 000012
【表３−２】
2020503048.tif 000013
【０２６８】
【表４−１】
2020503048.tif 000014
【表４−２】
2020503048.tif 000015
【表４−３】
2020503048.tif 000016
【０２６９】
相対存在量かつ活性なしと、絶対細胞数かつ活性ありとの対比
【０２７０】
最終的には、本明細書で定義される方法は、細胞数データと活性データとの両方を活用することで、関連するメタデータ特徴に高度に関連付けられる微生物を同定するものである。両方の方法（表４、表１）を使用して選択した上位１５の標的のうちで、両方のリストに見られたものは７株にすぎなかった。８つの株（５３％）は、絶対細胞数及び活性を含むリストに特有のものであった。両方のリストに存在する上位３つの標的は、株と順位との両方において一致した。しかしながら、３つのうちの２つは、両方のリストでＭＩＣスコアが異なっており、このことは、それらが活性データセットの統合によって影響を受けたものの、その影響は、それらの順位を覆すには十分ではなかったことを示唆している。
【０２７１】
線形相関手法とノンパラメトリック手法との対比
【０２７２】
産生した乳脂肪のポンドと各試料内の活性微生物の絶対細胞数との間でピアソン係数及びＭＩＣスコアを計算した（表５）。ＭＩＣ（表５ａ）またはピアソン係数（表５ｂ）のいずれかによって株を順位付けすることで、乳脂肪産生との関連性が最も高い標的株を選択した。ＭＩＣスコアとピアソン係数との両方が、それぞれの場合において報告される。両方のリストに見られた株は６つであり、このことは、ＭＩＣ手法を使用することで特有の株が９つ（６０％）同定されたことを意味する。リスト間での株の順序は異なっており、それぞれの方法によって同定された上位３つの標的株もまた特有のものであった。
【０２７３】
ピアソン係数と同様に、ＭＩＣスコアは、０〜１の範囲にわたって報告されるものであり、１は、２つの変数の間で関連性が非常に強いことを示唆する。ここでは、上位１５の標的は、０．９７〜０．７４の範囲のＭＩＣスコアを示した。一方、この相関試験ケースに対するピアソン係数は、０．５３〜０．４５の範囲となり、相互情報量の試験ケースと比較すると実質的に低かった。この相違は、それぞれの解析方法に固有の差異に起因するものであり得る。相関は、直線の周りの点の分散を測定する線形推定である一方で、相互情報量では、確率分布が活用され、２つの分布の間の類似性が測定される。実験過程にわたって、産生した乳脂肪のポンドは、非線形的に変化した（図４）。この特定の関数については、相互情報量によって示され、近似が取られる方が、相関と比較して適している可能性がある。このことについて調べるために、相関及び相互情報量を使用して同定した上位の標的株（それぞれＡｓｃｕｓ＿７１３（図５）及びＡｓｃｕｓ＿７（図６））をプロットすることで、株と乳脂肪量との関連性をそれぞれの方法がどのくらい精度よく予測したかを決定した。２つの変数が強い相関を示すのであれば、互いに対してプロットすると点の分散がほとんどないか、または全くない１つの線によってそれら２つの変数が示される。図５では、Ａｓｃｕｓ＿７１３と乳脂肪量との相関は弱く、このことは、点が広範に拡散していることによって示される。重ねて記載すると、相互情報量は、２つの点分布がどのくらい類似するかを測定するものである。Ａｓｃｕｓ＿７を乳脂肪量と共にプロットすると（図６）、これら２つの点の分布が非常に類似していることが明らかである。
【０２７４】
全体としての本発明の方法と従来の手法との対比
【０２７５】
微生物コミュニティを解析する従来の手法は、活性情報を取り込むことなく相対存在量データを使用することに依存しており、最終的に、メタデータに対する微生物種の単純な相関を得て終わるものである（例えば、米国特許第９，２０６，６８０号（当該文献は、あらゆる目的のために参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。本明細書では、我々は、それぞれのデータセットを取り込むことが標的の最終リストにどの程度の影響を付加的に及ぼすかを示している。本明細書に記載の方法が、その全体として適用されると、従来の方法と比較して完全に異なる標的セットが本明細書に記載の方法によって選択された（表５ａ及び表５ｃ）。従来の手法を使用すると標的株として最上位に選択されたＡｓｃｕｓ＿３０３８を、乳脂肪量に対してプロットして相関の強度を可視化した（図７）。前述の例のように、乳脂肪量に対してＡｓｃｕｓ＿３０３８が示した相関もまた弱いものであった。
【０２７６】
表５：相互情報量または相関を使用したときの上位１５の標的株
【０２７７】
【表５ａ−１】
2020503048.tif 000017
【表５ａ−２】
2020503048.tif 000018
【表５ａ−３】
2020503048.tif 000019
【０２７８】
【表５ｂ−１】
2020503048.tif 000020
【表５ｂ−２】
2020503048.tif 000021
【表５ｂ−３】
2020503048.tif 000022
【０２７９】
【表５ｃ−１】
2020503048.tif 000023
【表５ｃ−２】
2020503048.tif 000024
【０２８０】
実施例３
乳牛における総乳脂肪量、総乳タンパク質量、及びエネルギー補正乳量（ＥＣＭ）の増加
実施例３では、泌乳反芻動物によって産生する乳脂肪及び乳タンパク質の総量、ならびに計算ＥＣＭを増加させることを目的とする特定の実施態様が示される。本明細書で使用されるように、ＥＣＭは、乳体積、乳脂肪、及び乳タンパク質に基づく乳汁中のエネルギー量を示す。ＥＣＭでは、乳成分が脂肪３．５％及びタンパク質３．２％に補正されることによって動物の能力が等しくなり、個々の動物及び群れのレベルで経時的に産生を比較することが可能になる。本開示と関連してＥＣＭの計算に使用される式は、以下のものである。
ＥＣＭ＝（０．３２７ｘ乳汁のポンド）＋（１２．９５ｘ脂肪のポンド）＋（７．２ｘタンパク質のポンド）
【０２８１】
開示の方法を利用して活性な相互関連微生物／微生物株を同定し、そこから微生物アンサンブルを生成して本明細書に示される方法論を適用すると、泌乳反芻動物によって産生する乳脂肪及び乳タンパク質の総量が増加することが実証されている。こうした増加は、ホルモンを別に与えることを必要とせずに実現した。
【０２８２】
この実施例では、上記の開示に従って同定及び生成された２つの単離された微生物（Ａｓｃｕｓｂ＿Ｘ及びＡｓｃｕｓｆ＿Ｙ）を含む微生物アンサンブルを、授乳の中期のホルスタイン乳牛に５週間にわたって投与した。８頭の群２つに乳牛を無作為に割り付け、これらの群の一方は、微生物アンサンブルを含まない緩衝液を投与する対照群とした。第２の群（実験群）には、Ａｓｃｕｓｂ＿Ｘ及びＡｓｃｕｓｆ＿Ｙを含む微生物アンサンブルを１日に１回、５週間投与した。乳牛はそれぞれ、個別の飼育領域に収容し、飼料及び水を自由に摂取できるようにした。食物は、乳量が多くなる食物とした。乳牛には自由に摂食させ、１日の終わりに飼料の重量を測定し、前日の拒食分は、重量を測定し、廃棄した。体重測定は、Ｓａｌｔｅｒ  Ｂｒｅｃｋｎｅｌｌ（Ｆａｉｒｍｏｎｔ，ＭＮ）のＰＳ−２０００スケールで実施した。
【０２８３】
乳牛のルーメンにカニューレが到達するように乳牛にカニューレを装着した。乳牛には、カニューレ挿入の後、少なくとも１０日間の回復期間をさらに与えてから、対照用量または実験用量を投与した。
【０２８４】
対照群への投与は、２０ｍｌの中性緩衝生理食塩水を用いるものとし、実験群への投与は、２０ｍＬの中性緩衝生理食塩水に約１０９個の細胞を懸濁したもの用いるものとした。対照群には、２０ｍｌの当該生理食塩水を１日に１回投与し、実験群には、１０９個の微生物細胞の記載の微生物アンサンブルをさらに含む２０ｍｌの当該生理食塩水を投与した。
【０２８５】
０日目、７日目、１４日目、２１日目、及び３５日目にあらゆる乳牛のルーメンから試料を取得し、ここでは微生物投与の前日を０日目とした。実験投与及び対照投与は、その日にルーメンから試料を取得した後に実施したことに留意されたい。ルーメンからの毎日の試料取得は０日目に開始し、取得したルーメン液にＨａｎｎａ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｗｏｏｎｓｏｃｋｅｔ，ＲＩ）のｐＨメーターを挿入して記録を取った。ルーメン試料の取得においては、ルーメンの中心領域、背側領域、腹側領域、前側領域、及び後側領域からカニューレを介して微粒子と液体との両方を取得するようにし、５つの試料すべてを、１．５ｍｌの停止液（エタノール９５％、フェノール５％）を含む１５ｍｌのコニカルバイアルにプールした。それぞれの試料取得日に糞便試料も取得し、糞便は、触診用スリーブを使用して直腸から取得した。それぞれの試料取得時に乳牛の体重を測定した。
【０２８６】
糞便試料を２オンスバイアルに入れ、凍結保管し、分析することで、見かけの中性デタージェント繊維（ＮＤＦ）消化性の値、見かけのデンプン消化性の値、及び見かけのタンパク質消化性の値を決定した。ルーメン試料の取得においては、ルーメンの液体部分と微粒子部分との両方を取得するようにし、それらのそれぞれを１５ｍｌのコニカルチューブに保管した。１０％の停止液（フェノール５％／エタノール９５％の混合物）で細胞を固定し、４℃に保ち、氷上に留めてＡｓｃｕｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に送付した。
【０２８７】
乳産生量を１日に２回（朝に１回及び夜に１回）測定した。乳組成（脂肪％及びタンパク質％など）を１日に２回（朝に１回及び夜に１回）測定した。タンパク質脂肪、固形分については近赤外線分光法で分析し、乳中尿素窒素（ＭＵＮ）及び体細胞数（ＳＣＣ）についてはＴｕｌａｒｅ  Ｄａｉｒｙ  Ｈｅｒｄ  Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＤＨＩＡ）（Ｔｕｌａｒｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で分析して、乳試料をさらに分析した。個々の乳牛の飼料摂取量及びルーメンのｐＨを１日に１回決定した。
【０２８８】
完全混合飼料（ＴＭＲ）の試料を適用期間の最終日に取得し、その後は１週間に１回の取得を続けた。試料取得は四分法を用いて実施し、試料は真空密封バッグに保管し、この真空密封バッグをＣｕｍｂｅｒｌａｎｄ  Ｖａｌｌｅｙ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（Ｈａｇｅｒｓｔｏｗｎ，ＭＤ）に送付し、ＮＩＲ１パッケージによる分析を実施した。緩衝液及び／または微生物バイオアンサンブルの最終投与日は３５日目としたが、他の測定及び試料取得はすべて、４６日目まで記載のように継続した。
【０２８９】
図８Ａは、開示の方法に基づいて微生物アンサンブルを投与した乳牛では、緩衝液単独物を投与した乳牛と比較して平均乳脂肪産生量が２０．９％増加したことを示す。図８Ｂは、微生物アンサンブルを投与した乳牛では、緩衝液単独物を投与した乳牛と比較して平均乳タンパク質産生量が２０．７％増加したことを示す。図８Ｃは、微生物アンサンブルを投与した乳牛では、平均エネルギー補正乳産生量が１９．４％増加したことを示す。図８Ａ〜Ｃに見られる増加は、アンサンブルの投与を停止（データ点を横切る垂直線によって示される）した後は、顕著さが低下した。
【０２９０】
実施例４
ブロイラーにおける病変形成の原因病原体としてのＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの検出
さまざまなレベルのＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓを１６０羽の雄性Ｃｏｂｂ５００に投与した（表６ａ）。これらの雄性Ｃｏｂｂ５００を２１日間飼育し、屠殺し、病変スコアを付けることで、壊死性腸炎の進行及びＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの影響を定量化した。
【０２９１】
【表６ａ−１】
2020503048.tif 000025
【表６ａ−２】
2020503048.tif 000026
【０２９２】
実験設計
【０２９３】
環境的に制御された施設内にトリを収容し、木の床の飼育領域（約４フィート×４フィートからフィーダースペース用の２．２５平方フィートを引いた領域）にトリを入れ、この飼育領域では、床スペース及びトリの密度を［約０．６９平方フィート／トリ］とし、温度、照明、フィーダー、及び水を供給した。木くずを適切な深さで含めた清潔な飼育領域にトリを入れ、当該ヒヨコにとって快適な環境を与えた。試験中に、試験用のトリにとっての快適な条件としては木くずが湿気を帯びすぎた状態となった場合は、追加の木くずを飼育領域に加えた。照明は、白色光を介するものとし、市販の照明プログラムを下記のように使用した。
【０２９４】
【表６ｂ】
2020503048.tif 000027
【０２９５】
トリに対する環境条件（すなわち、トリ密度、温度、照明、フィーダー、及び水のスペース）は、すべての処理群で同様となるようにした。飼育領域間のトリの移動及び細菌拡散を防ぐために、飼育領域の間に約２４インチの高さの頑丈な（プラスチックの）仕切りを各飼育領域に設けた。
【０２９６】
ワクチン接種及び治療薬投与：
【０２９７】
マレック病を防ぐために、孵化場でトリにワクチン接種を行った。受け入れ時（試験の０日目）に、ニューカッスル病及び感染性気管支炎を防ぐために、噴霧適用によってトリにワクチン接種を行った。ワクチン製造業者、ロット番号、及び有効期限を文書化し、最終報告書と共に提出した。
【０２９８】
水：
【０２９９】
飼育領域当たりに１つのＰｌａｓｓｏｎ給水器を介して、試験を通じて水を不断供給した。給水器は、１日に２回点検し、必要に応じて洗浄することで、清潔な水が一定して確実にトリに供給されるようにした。
【０３００】
給餌：
【０３０１】
飼育領域当たりに１つの直径約１７インチの吊り下げ式チューブフィーダーを介して、試験を通じて不断給餌を行った。最初の約４日間は、各飼育領域にヒヨコ用のフィーダートレイを置いた。受け入れ時（０日目）に、実験設計に従ってトリをそのそれぞれの処理食物の摂取過程下に置いた。０日目から試験終了までの間に飼育領域に追加した飼料及び飼育領域から除去した飼料については、重量を測定し、記録した。
【０３０２】
毎日の観察：
【０３０３】
全体的な群れの状態、照明、水、飼料、換気、及び不測の事象について、試験施設、飼育領域、及びトリを少なくとも１日に２回観察した。１日に２回の観察のいずれかにおいて異常な状態また異常な挙動が確認されれば、それを文書化し、それを試験記録の付属文書とした。試験施設の最低温度及び最高温度を１日に１回記録した。
【０３０４】
飼育領域のカード：
【０３０５】
各飼育領域に２つのカードを取り付けた。一方のカードによって飼育領域番号を識別し、第２のカードによって処理番号を示した。
【０３０６】
動物の取り扱い：
【０３０７】
動物は、理想的な飼育適合条件の下で保持した。損傷及び不要なストレスを低減するような様式で動物を取り扱った。人道的な手段を厳格に実行した。
【０３０８】
獣医学的な管理、介入、及び安楽死：
【０３０９】
試験手順とは無関係な臨床的に顕著な併発疾患を発症したトリは、試験責任者または被任命者の裁量で試験から除外し、現場のＳＯＰに従って安楽死させた。さらに、瀕死または損傷したトリもまた、現場の獣医師または有資格技術者の権限で安楽死させた。いずれの除外理由も文書化した。動物が死亡するか、または除外し、人道的理由で安楽死させたのであれば、そのことを飼育領域の死亡率シートに記録し、剖検を実施し、提出して除外理由を文書化した。
【０３１０】
試験責任者によって安楽死が必要であると判断されれば、頸椎脱臼によって動物を安楽死させた。
【０３１１】
死亡率及び選別：
【０３１２】
死亡が明らかになったトリまたは除外及び屠殺したトリはいずれも、体重を測定し、剖検した。このことは、試験の０日目から開始した。飼料または水を得ることができなくなった選別トリは、屠殺し、体重を測定し、文書化した。体重及び推定死亡原因及び剖検知見を飼育領域の死亡率記録に記録した。
【０３１３】
体重及び飼料摂取量：
【０３１４】
およそ１４日目及び２１日目にトリの体重を飼育領域別かつ個別に測定した。各飼育領域に残った飼料は、試験の１４日目及び２１日目に重量を測定し、記録した。１４〜２１日目の間の飼料摂取量を計算した。
【０３１５】
体重増加及び飼料要求率：
【０３１６】
飼育領域かつ個体ベースのトリの平均体重を各体重測定日にまとめた。生存するトリの総体重によって飼育領域の総飼料消費量を割ったものを使用して、試験の２１日目に平均飼料要求率を計算した（すなわち、０〜２１日目のもの）。生存するトリの総体重に死亡または飼育領域から除外したトリの体重を加えたものによってその飼育領域の総飼料消費量を割ったものを使用して補正飼料要求率を計算した。
【０３１７】
ＣＬＯＳＴＲＩＤＩＵＭ  ＰＥＲＦＲＩＮＧＥＮＳの投与
【０３１８】
投与方法：
【０３１９】
この試験では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ（ＣＬ−１５、Ａ型、α毒素及びβ２毒素）の培養物を、飼料を介して投与した。培養物との混合には、各飼育領域のフィーダー由来の飼料を使用した。飼育領域に培養物を置く前に、約４〜８時間、処理飼料を取り出し、トリから遠ざけた。トリの各飼育領域について、約２．０〜９．０Ｘ１０８ｃｆｕ／ｍｌの濃度のブロス培養物を、試験設計に基づく固定量で、固定量の飼料（約２５ｇ／トリ）とフィーダートレイ中で混合した。投与を行う飼育領域はすべて、同一に処理した。培養物−飼料のほとんどが１〜２時間以内に消費された。すべての処理においてトリが同様に処理されるように、非投与群もまた、投与群と同一の時間、飼料を取り出した。
【０３２０】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍの投与：
【０３２１】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ（ＣＬ−１５）の培養増殖は、デンプンを含む液体チオグリコール酸培地において約３７℃で約５時間実施した。ＣＬ−１５は、コロラド州においてブロイラーの間で大流行したものに由来するＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの野外株である。新鮮なブロス培養物を調製し、それぞれの日に使用した。トリの各飼育領域について、一晩培養したブロス培養物を固定量で、固定量の処理飼料とフィーダートレイ中で混合した（投与の項を参照のこと）。飼料の量、接種培養物の体積及び定量化、ならびに投与日数を最終報告書に記入した。飼育領域はすべて、同一に処理するようにする。Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの培養物のトリへの投与は、１日間（試験の１７日目）実施した。
【０３２２】
収集データ：
−本開示によるＡｓｃｕｓプラットフォーム法で解析するための腸内容物。
−飼育領域別かつ個別のトリの体重及び飼育領域別の飼料効率（およそ１４日目及び２１日目）。
−各飼育領域に追加した飼料量及び各飼育領域から除去した飼料量（０日目〜試験終了）。
−死亡率：性別、体重、及び推定死亡原因（０日目〜試験終了）。
−除外したトリ：選別理由、性別、及び体重（０日目〜試験終了）。
−施設及びトリの毎日の観察、毎日の施設温度。
−トリ５羽／飼育領域の病変スコア（およそ２１日目）。
【０３２３】
病変のスコア付け：
【０３２４】
Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ培養物の最後の投与から４日後、最初に捕獲されたトリを選択することによって、各飼育領域から５羽のトリを無作為に選択し、屠殺し、壊死性腸炎について腸の病変をスコア付けした。病変は、下記のようにスコア付けした：
−０＝正常：ＮＥ病変がなく、小腸は、正常な弾性を有する（開いた後に、丸まって正常位置に戻る）。
−１＝軽度：小腸壁が薄く、弛緩性であり（開いたときに平らなままであり、開いた後に、丸まって正常な位置に戻らない）、粘膜を覆う粘液が過剰である。
−２＝中等度：腸壁が顕著に発赤し、膨化しており、腸膜に少数の潰瘍及び壊死が存在し、粘液が過剰である。
−３＝重度：小腸膜の壊死及び潰瘍が多発する領域（複数可）が存在し、顕著な出血が見られ、フィブリン及び壊死片の層が粘膜上に存在する（トルコタオルの外観を有する）。
−４＝死亡または瀕死：２４時間以内に死亡し得る可能性があり、かつ２以上のＮＥ病変スコアを有するトリ。
【０３２５】
結果
【０３２６】
上に開示される方法（例えば、図１Ａ、図１Ｂ、及び図２を参照して議論されるもの、ならびに本明細書を通じて議論されるもの）ならびに従来の相関手法（上に議論されるもの）を使用して結果を解析した。各トリの小腸内容物について株レベルの微生物の存在量及び活性を決定し、こうしたプロファイルを、２つの異なるトリ特徴（個々の病変スコア及び飼育領域の平均病変スコア）に関して解析した。
【０３２７】
個々の病変スコアの解析では、３７羽のトリを使用した。この解析に関しては、４０羽のトリのスコア付けを実施したものの、解析に十分な腸材料が存在したのは３７羽のみであった。本開示のＡｓｃｕｓ手法と従来の手法との両方について、同一のシークエンシングリード及び同一のシークエンシング解析パイプラインを使用した。しかしながら、Ａｓｃｕｓ手法では、詳細を前述したように、各試料の細胞数情報に加えて、活性情報も統合した。
【０３２８】
Ａｓｃｕｓ相互情報量手法を使用することで、活性株の存在量と３７羽のブロイラーの個々の病変スコアとの間の関連性をスコア付けした。従来の手法については、３７羽のブロイラーの株と個々の病変スコアとの間でピアソン相関を計算した。原因株であるＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの確認は、試料のプールから同定した生物のリストに対する網羅的アライメント検索を介して実施した。次に、この特定の株の順位を、それぞれの解析方法の結果で確認した。Ａｓｃｕｓ手法では、実験において投与したＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓが、個々の病変スコアと関連する最上位の株として同定された。この株は、従来の方法では、個々の病変スコアと関連する上位２６番目の株として同定された。
【０３２９】
平均病変スコアの解析では、１０２羽のトリを使用した。前述の場合と同様に、Ａｓｃｕｓ手法と従来の手法との両方について、同一のシークエンシングリード及び同一のシークエンシング解析パイプラインを使用した。この場合もまた、Ａｓｃｕｓ手法では、各試料の細胞数情報に加えて、活性情報も統合した。
【０３３０】
Ａｓｃｕｓ相互情報量手法を使用することで、活性株の存在量と各飼育領域の平均病変スコアとの間の関連性をスコア付けした。従来の手法については、各飼育領域の株と平均病変スコアとの間でピアソン相関を計算した。原因株であるＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの確認は、試料のプールから同定した生物のリストに対する網羅的アライメント検索を介して実施した。次に、この特定の株の順位を、それぞれの解析方法の結果で確認した。Ａｓｃｕｓ手法では、実験において投与したＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓが、飼育領域の平均病変スコアと関連する上位４番目の株として同定された。従来の手法では、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓは、飼育領域の平均病変スコアと関連する上位１５番目の株として同定された。バルク／平均を測定することによってＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの感染レベルの変動が隠れてしまうため、飼育領域の平均病変スコアの測定精度は、個々の病変スコアと比較して低いものとなる。個々の病変スコアの解析を平均飼育領域病変スコア解析と比較すると、こうして順位が下がることは、予測したとおりのことであった。以下には、収集したメタデータが示される。
【０３３１】
【表７】
2020503048.tif 000028
【０３３２】
実施例５
相互情報量に基づく手法を使用して複雑な微生物コミュニティにおける関連性を検出する能力と、相関に基づく手法を使用して当該関連性を検出する能力と、の比較
授乳の中期のホルスタイン乳牛３頭から、乳脂肪量低下エピソード期間中に、カニューレを介して一連のルーメン試料を取得した。ルーメン試料は、０日目、７日目、１０日目、１６日目、及び２８日目の午前４時に取得した。ルーメン内容物から精製したＤＮＡからシークエンシングライブラリーを調製し、シークエンシングした。
【０３３３】
生のシークエンシングリードを使用することで、試料のプールに存在するすべての微生物株を同定した。これにより、試料のプールにおいて特有の株を４，７２９株同定した。次に、それぞれの微生物株の相対存在量を計算し、その後の解析に使用した。
【０３３４】
【表８ａ】
2020503048.tif 000029
【０３３５】
表８ａでは、それぞれの時点でそれぞれの動物によって産生した乳脂肪の測定ポンドが示される。これらの乳脂肪値を利用し、そこから１を差し引くことによって、この解析において使用するためにモック株を創出し、結果的に、モック株と乳脂肪値とが一緒に完全に同じように経時的に動く傾向を確実に示すようにした。すなわち、このモック株と乳脂肪値との間には、既知の線形傾向／関連性が存在するということである。次に、このモック株を、コミュニティにおけるすべての事前同定株を含むマトリックスに追加した。マトリックス内の産生乳脂肪のポンドとすべての株との間で、ＭＩＣ値及びピアソン係数をさまざまな条件（以下に記載される）で同時に計算することで、こうした尺度の関連性予測変数としての感度及び頑健性を証明した。
【０３３６】
開示の方法が関連性を検出する能力を従来の方法と比較して試験するために、モック株に対するデータ点を１つずつ除外した（相対存在量を０に設定した）。それぞれのデータ点を除外した後にＭＩＣ及びピアソン係数を再計算し、モック株の順位を記録した（表８ｂ）。示されるように、ＭＩＣは、ピアソン係数と比較してはるかに頑健性の高い尺度であった。点を全く除外しないときは、産生乳脂肪のポンドと関連する最上位株としてモック株を両方の方法が同定することができた。しかしながら、点を１つ除外すると、相関解析方法ではモック株は５５位まで順位を下げ、次に、さらに点を除外すると、２１４２位まで順位を下げた。ＭＩＣでは、点を６つ除外するまで、モック株が最上位株であるとの予測が継続した。
【０３３７】
【表８ｂ】
2020503048.tif 000030
【０３３８】
感度を試験するために点を除外する論理的根拠の１つは、一群の標的（例えば、動物）のマイクロバイオームを眺めると、標的のすべてに共通する特定の株が存在するということにあり、こうした特定の株は、コアマイクロバイオームと称され得る。この群は、特定の標的（例えば、特定の動物）の微生物集団のごく一部に相当し得るものであると共に、標的／動物のサブセット／ごく一部のみに見られる株の全く別の集団が存在し得る。いくつかの実施形態では、より特有の株（すなわち、動物のすべてには見られない株）が、特定の関連性を有し得る。開示の方法の実施形態のいくつかは、データセットにおけるそのような「ギャップ」に対処するように開発されたものであり、したがって、特に関連性を有する微生物及び株を標的とするように開発されたものである。
【０３３９】
実施例６
ブロイラーの飼料効率を改善するための活性微生物株のアンサンブルの選択
９６羽の雄性Ｃｏｂｂ５００を２１日間飼育した。個々のトリについて体重及び飼料摂取量を決定し、屠殺後に、盲腸剥離物を取得した。この盲腸試料を、本開示の方法を使用して処理することで、生産状況においてブロイラーに投与すると飼料効率を高めることになる微生物のアンサンブルを明らかにした。
【０３４０】
実験設計
【０３４１】
１２０羽のＣｏｂｂ５００のヒヨコを分け、食物処理に基づいて飼育領域に入れた。０〜１４日目の処理別にトリを床の飼育領域に入れた。２つの飼育領域を含む１つのブロックと、２つの個別のケージをそれぞれが含む４８のブロックと、に試験施設を分けた。完全乱塊法を使用して処理を飼育領域／ケージに割り付け、試験を通じて飼育領域／ケージの処理はそのままとした。処理は、数字コードによって識別した。トリは、ケージ／飼育領域に無作為に割り付けた。特定の処理群は、表９に以下に示されるとおりである。
【０３４２】
【表９】
2020503048.tif 000031
【０３４３】
収容：
【０３４４】
ケージ／飼育領域に対する処理の割り付けは、コンピュータプログラムを使用して実施した。コンピュータによって生成した割り付けは、下記のとおりである：
【０３４５】
環境的に制御された施設にトリを収容し、頑丈なプラスチック（高さ４フィート）から構成される広いコンクリート床の飼育領域（４フィートｘ８フィート）に、清潔な藁くずと共にトリを入れた。１４日目に、環境的に制御された同一施設内のケージに９６羽のトリを移した。各ケージは、２４インチｘ１８インチｘ２４インチとした。
【０３４６】
照明は、白色光を介するものとし、市販の照明プログラムを使用した。２４時間ごとの連続光の時間は、表１０に以下に示されるとおりである。
【０３４７】
【表１０】
2020503048.tif 000032
【０３４８】
トリに対する環境条件（すなわち、０．５３平方フィート）、温度、照明、フィーダー、及び水のスペース）は、すべての処理群で同様となるようにした。
【０３４９】
トリの移動を防ぐために、各飼育領域を点検して、飼育領域間の高さ約１４インチの仕切りに１インチを超える開口が存在しないことを確かめた。
【０３５０】
ワクチン接種：
【０３５１】
マレック病を防ぐために、孵化場でトリにワクチン接種を行った。受け入れ時（試験の０日目）に、ニューカッスル病及び感染性気管支炎を防ぐために、噴霧適用によってトリにワクチン接種を行った。ワクチン製造業者、ロット番号、及び有効期限を文書化し、最終報告書と共に提出した。
【０３５２】
水：
【０３５３】
試験を通じて水を不断供給した。床の飼育領域では、自動のベル型給水器を介して水を供給した。バタリーケージでは、１つのニップル式給水器を介して水を供給した。給水器は、１日に２回点検し、必要に応じて洗浄して、清潔な水が確実にトリに常に供給されるようにした。
【０３５４】
給餌：
【０３５５】
試験を通じて飼料を不断供給した。床の飼育領域では、直径約１７インチの吊り下げ式チューブフィーダーを介して飼料を供給した。バタリーケージでは、１つのフィーダートラフ（９インチｘ４インチ）を介して供給した。最初の約４日間は、床の各飼育領域にヒヨコ用のフィーダートレイを置いた。
【０３５６】
毎日の観察：
【０３５７】
全体的な群れの状態、照明、水、飼料、換気、及び不測の事象について、試験施設、飼育領域、及びトリを少なくとも１日に２回観察した。試験施設の最低温度及び最高温度を１日に１回記録した。
【０３５８】
死亡率及び選別：
【０３５９】
死亡が明らかになったトリまたは除外及び屠殺したトリはいずれも剖検した。このことは、試験の０日目から開始した。飼料または水を得ることができなくなった選別トリは、屠殺し、剖検した。推定死亡原因及び剖検知見を飼育領域の死亡率記録に記録した。
【０３６０】
体重及び飼料摂取量：
【０３６１】
約９６羽のトリの体重測定を個別に毎日実施した。各ケージに残った飼料は、１４〜２１日目に、重量を毎日測定し、記録した。各ケージの飼料摂取量を毎日決定した。
【０３６２】
体重増加及び飼料要求率：
【０３６３】
１４〜２１日目のケージベースの体重増加及び処理ベースの平均体重増加を決定した。トリの体重によってケージの総飼料消費量を割ったものを使用して、１４〜２１日目の期間の日々及び全期間の飼料要求率を計算した。１４〜２１日目の期間の平均処理飼料要求率を、その処理を行った各ケージに由来する個々の飼料要求率を平均化することによって決定した。
【０３６４】
獣医学的な管理、介入、及び安楽死：
【０３６５】
顕著な併発疾患を発症しており、損傷し、その状態が試験の結果に影響を与え得る動物は、試験から除外し、決定が下った時点で安楽死させた。投与から６日後、ケージにいるすべてのトリを取り出し、病変のスコア付けを実施した。
【０３６６】
収集データ：
【０３６７】
トリの体重及び飼料要求率（１４〜２１日目の間、個別に毎日実施）。
【０３６８】
床の飼育領域及びケージに追加した飼料量ならびに床の飼育領域及びケージから除去した飼料量（０日目〜試験終了）。
【０３６９】
死亡率：推定死亡原因（０日目〜試験終了）。
【０３７０】
除外したトリ：選別理由（０日目〜試験終了）。
【０３７１】
施設及びトリの毎日の観察、毎日の施設温度。
【０３７２】
各トリに由来する盲腸内容物（２１日目）。
【０３７３】
結果
【０３７４】
上に開示される方法（例えば、図１Ａ、図１Ｂ、及び図２を参照して議論されるもの、ならびに本明細書を通じて議論されるもの）を使用して結果を解析した。各トリの盲腸内容物について株レベルの微生物の存在量及び活性を決定した。９６のブロイラー盲腸試料のすべてにまたがって、特有の株が全部で２２，４６１株検出された。活性閾値によってそれぞれの株の絶対細胞数をフィルタリングすることで、活性微生物株のリスト及びそのそれぞれの絶対細胞数を創出した。上記の株のうち、屠殺の時点のそれぞれのブロイラーにおいて活性であると見なされた株は、平均で４８．３％にすぎなかった。フィルタリングの後、各トリの活性微生物のプロファイルを、さまざまなトリメタデータ（飼料効率、最終的な体重、及び食物におけるサリノマイシンの存在／不在を含む）と統合することで、こうした形質のすべての能力を改善するアンサンブルを選択した。
【０３７５】
本開示の相互情報量手法を使用することで、活性株の絶対細胞数と能力測定値との間の関連性、ならびに２つの異なる活性株の間の関連性を、９６羽すべてのトリについてスコア付けした。閾値の適用後、４０３９のメタデータ−株関連性が有意であると見なされ、８８４２の株−株関連性が有意であると見なされた。次に、こうしたリンク（ＭＩＣスコアによって重み付けされたもの）をエッジとして使用する（メタデータ及び株はノードとする）ことで、その後のコミュニティ検出解析のためのネットワークを創出した。このネットワークに対してＬｏｕｖａｉｎ法によるコミュニティ検出アルゴリズムを適用して、ノードを亜群に分類した。
【０３７６】
Ｌｏｕｖａｉｎ法では、ノードをその現在の亜群から最初に除外し、隣接する亜群へと移入することによってネットワークモジュラリティが最適化される。そのノードの隣接ノードのモジュラリティが改善するのであれば、その新たな亜群へのそのノードの再割り付けが行われる。複数の群のモジュラリティが改善するのであれば、最も有効な変化を伴う亜群が選択される。この段階が、新たな割り付けが行われなくなるまで、ネットワークにおけるあらゆるノードに対して繰り返される。次の段階では、あらたな粗視化ネットワークが創出され、すなわち、発見された亜群が新たなノードとなる。ノード間のエッジは、それぞれの亜群内の低レベルのノードのすべての総和によって定義される。ここから、モジュラリティが最適化する変化がもはや生じ得なくなくなるまで、第１の段階及び第２の段階が繰り返される。極大値（すなわち、反復段階で生じる群）と最大値（すなわち、最終的な群化）との両方を調べることで、全微生物コミュニティ内に生じる亜群を分離すると共に、存在し得る可能性のある階層を明らかにすることができる。
【０３７７】
モジュラリティ：
【数６】
2020503048.tif 000033
【０３７８】
式中、Ａは、メタデータ−株関連性及び株−株関連性のマトリックスであり、ｋｉ＝ΣｊＡｉｊは、ノードｉに付加される総リンク重であり、ｍ＝１／２ΣｉｊＡｉｊである。ノードｉ及びノードｊが同一のコミュニティに割り付けられると、クロネッカーのデルタδ（ｃｉ，ｃｊ）は１となり、その他の場合は０となる。
【０３７９】
ノードの移動時におけるモジュラリティの変化の算出：
【数７】
2020503048.tif 000034
【０３８０】
ΔＱは、亜群Ｃのモジュラリティの増分である。Σｉｎは、Ｃにおけるリンクの重みの総和であり、Σｔｏｔは、Ｃにおけるノードに付随するリンクの重みの総和であり、ｋｉは、ノードｉに付随するリンクの重みの総和であり、ｋｉ，ｉｎは、ＣにおけるノードにＩから繋がるリンクの重みの総和であり、ｍは、ネットワークにおけるすべてのリンクの重みの総和である。
【０３８１】
Ｌｏｕｖａｉｎコミュニティ検出法を使用することで、ニワトリ微生物コミュニティにおいて５つの異なる亜群を検出した。天然には膨大な量の微生物多様性が存在するものの、存在する機能的多様性ははるかに少ない。代謝能力には類似性及び重複性が存在することにより、冗長性が生じる。同一の環境刺激または栄養素に応答する微生物株は、類似傾向を有する可能性があり（このことが本開示の方法によって捕捉される）、こうした微生物は、最終的に一緒に群化されることになる。得られる分類及び階層によって株の機能性予測を明らかにし、この機能性予測は、コミュニティ検出解析後にこうした株が分類される先の群に基づいて行う。
【０３８２】
株の分類が完了した後、試料に由来する微生物株を培養する。不均一微生物コミュニティから純粋培養物を単離し、増殖させることには技術的な困難が伴うため、実験室においては、本開示の方法の活性閾値と関連性閾値との両方を通過する株のごく一部のみが純粋に増殖することになる。培養が完了した後、純粋培養物が存在するか否かということ、及び株がどの亜群に分類されるかということ、に基づいて微生物株のアンサンブルを選択する。可能な限り機能的多様性に富むものとなるようにアンサンブルを創出し、すなわち、アンサンブルにおいて多様な亜群となるように株を選択する。次に、こうしたアンサンブルを有効性試験及び実地試験において試験することで、製品としての株のアンサンブルの有効性を決定し、株のアンサンブルが生産に寄与することが実証されれば、株のアンサンブルを製造し、製品として流通させることができる。
【０３８３】
実施例７
サイズの小さな試料を使用することによる活性微生物株の同定
以下に詳細に示されるように、活性微生物株の同定に有効な試料の数は、僅か２つであり得る。具体的には、２つの試料の比較を含めて、すべての比較について、腸の病変及び壊死性腸炎の活性微生物株かつ原因病原体としてＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓが本開示の方法によって正しく同定されることが以下の実験によって示される。
【０３８４】
実験設計
【０３８５】
環境的に制御された施設内にトリを収容し、コンクリート床の飼育領域（約４フィート×４フィートからフィーダースペース用の２．２５平方フィートを引いた領域）に入れ、この飼育領域では、床スペース及びトリの密度を［約０．５５平方フィート／トリ（０日目）、約０．６９平方フィート／トリ（２１日目（病変のスコア付け後））］とし、温度、湿度、照明、フィーダー、及び水のスペースをすべての試験群で同様となるように供給した。清潔な木くずを適切な深さで含めた清潔な飼育領域にトリを入れることで、当該ヒヨコにとって快適な環境を与えた。トリを快適な状態で維持するために、追加の木くずを飼育領域に加えた。白色光を介する照明及び市販の照明プログラムは、以下のように使用した。
【０３８６】
【表１１】
2020503048.tif 000035
【０３８７】
トリに対する環境条件（すなわち、トリ密度、温度、照明、フィーダー、及び水のスペース）は、すべての処理群で同様となるようにした。飼育領域間のトリの移動及び細菌拡散を防ぐために、飼育領域の間に約２４インチの高さの頑丈な（プラスチックの）仕切りを各飼育領域に設けた。
【０３８８】
ワクチン接種及び治療薬投与：
【０３８９】
マレック病を防ぐために、孵化場でトリにワクチン接種を行った。受け入れ時（試験の０日目）に、ニューカッスル病及び感染性気管支炎を防ぐために、噴霧適用によってトリにワクチン接種を行った。ワクチン製造業者、ロット番号、及び有効期限を文書化し、最終報告書と共に提出した。
【０３９０】
水：
【０３９１】
飼育領域当たりに１つのＰｌａｓｓｏｎ給水器を介して、試験を通じて水を不断供給した。給水器は、１日に２回点検し、必要に応じて洗浄することで、清潔な水が一定して確実にトリに供給されるようにした。
【０３９２】
給餌：
【０３９３】
飼育領域当たりに１つの直径約１７インチの吊り下げ式チューブフィーダーを介して、試験を通じて不断給餌を行った。最初の約４日間は、各飼育領域にヒヨコ用のフィーダートレイを置いた。受け入れ時（０日目）に、実験設計に従ってトリをそのそれぞれの処理食物の摂取過程下に置いた。０日目から試験終了までの間に飼育領域に追加した飼料及び飼育領域から除去した飼料については、重量を測定し、記録した。
【０３９４】
毎日の観察：
【０３９５】
全体的な群れの状態、照明、水、飼料、換気、及び不測の事象について、試験施設、飼育領域、及びトリを少なくとも１日に２回観察した。１日に２回の観察のいずれかにおいて異常な状態また異常な挙動が確認されれば、それを文書化し、文書化したものを試験記録と共に含めた。試験施設の最低温度及び最高温度を１日に１回記録した。
【０３９６】
飼育領域のカード：
【０３９７】
各飼育領域に２つのカードを取り付けた。一方のカードによって飼育領域番号を識別し、第２のカードによって処理番号を示した。
【０３９８】
動物の取り扱い：
【０３９９】
動物は、理想的な飼育適合条件の下で保持した。損傷及び不要なストレスを低減するような様式で動物を取り扱った。人道的な手段を厳格に実行した。
【０４００】
獣医学的な管理、介入、及び安楽死：
【０４０１】
試験手順とは無関係な臨床的に顕著な併発疾患を発症したトリは、試験責任者または被任命者の裁量で試験から除外し、現場のＳＯＰに従って安楽死させてよい。さらに、瀕死または損傷したトリもまた、現場の獣医師または有資格技術者の権限で安楽死させてよい。除外理由は、文書化した。動物が死亡するか、または除外し、人道的理由で安楽死させたのであれば、そのことを飼育領域の死亡率シートに記録し、剖検を実施し、提出して除外理由を文書化した。
【０４０２】
試験責任者によって安楽死が必要であると判断されれば、頸椎脱臼によって動物を安楽死させた。
【０４０３】
死亡率及び選別：
【０４０４】
死亡が明らかになったトリまたは除外及び屠殺したトリはいずれも、体重を測定し、剖検した。このことは、試験の０日目から開始した。飼料または水を得ることができなくなった選別トリは、屠殺し、体重を測定し、文書化した。体重及び推定死亡原因及び剖検知見を飼育領域の死亡率記録に記録した。
【０４０５】
ＣＬＯＳＴＲＩＤＩＵＭ  ＰＥＲＦＲＩＮＧＥＮＳの投与
【０４０６】
投与方法：
【０４０７】
この試験では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ（ＣＬ−１５、Ａ型、α毒素及びβ２毒素）の培養物を、飼料を介して投与した。培養物との混合には、各飼育領域のフィーダー由来の飼料を使用した。飼育領域に培養物を置く前に、約４〜８時間、処理飼料を取り出し、トリから遠ざけた。トリの各飼育領域について、約２．０〜９．０Ｘ１０８ｃｆｕ／ｍｌの濃度のブロス培養物を、試験設計に基づく固定量で、固定量の飼料（約２５ｇ／トリ）とフィーダートレイ中で混合した。投与を行う飼育領域はすべて、同一に処理した。培養物−飼料のほとんどが１〜２時間以内に消費された。すべての処理においてトリが同様に処理されるように、非投与群もまた、投与群と同一の時間、飼料を取り出した。
【０４０８】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍの投与：
【０４０９】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ（ＣＬ−１５）の培養増殖は、デンプンを含む液体チオグリコール酸培地において約３７℃で約５時間実施した。ＣＬ−１５は、コロラド州においてブロイラーの間で大流行したものに由来するＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの野外株である。新鮮なブロス培養物を調製し、それぞれの日に使用した。トリの各飼育領域について、一晩培養したブロス培養物を固定量で、固定量の処理飼料とフィーダートレイ中で混合した。飼料の量、接種培養物の体積及び定量化、ならびに投与日数を最終報告書に記入した。飼育領域はすべて、同一に処理するようにする。Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの培養物のトリへの投与は、１日間（試験の１７日目）実施するようにする。
【０４１０】
収集データ
【０４１１】
本出願の方法で解析するための腸内容物。
【０４１２】
飼育領域別かつ個別のトリの体重及び飼育領域別の飼料効率（およそ１４日目及び２１日目）。
【０４１３】
各飼育領域に追加した飼料量及び各飼育領域から除去した飼料量（０日目〜試験終了）。
【０４１４】
死亡率：性別、体重、及び推定死亡原因（０日目〜試験終了）。
【０４１５】
除外したトリ：選別理由、性別、及び体重（０日目〜試験終了）。
【０４１６】
施設及びトリの毎日の観察、毎日の施設温度。
【０４１７】
トリ５羽／飼育領域の病変スコア（およそ２１日目）。
【０４１８】
病変のスコア付けをした４８羽のトリから取得した試料。
【０４１９】
病変のスコア付け：
【０４２０】
Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ培養物の最後の投与から４日後、最初に捕獲されたトリを選択することによって、各飼育領域から５羽のトリを無作為に選択し、屠殺し、壊死性腸炎について腸の病変をスコア付けした。病変は、下記のようにスコア付けした：
【０４２１】
０＝正常：ＮＥ病変がなく、小腸は、正常な弾性を有する（開いた後に、丸まって正常位置に戻る）。
【０４２２】
１＝軽度：小腸壁が薄く、弛緩性であり（開いたときに平らなままであり、開いた後に、丸まって正常な位置に戻らない）、粘膜を覆う粘液が過剰である。
【０４２３】
２＝中等度：腸壁が顕著に発赤し、膨化しており、腸膜に少数の潰瘍及び壊死が存在し、粘液が過剰である。
【０４２４】
３＝重度：小腸膜の壊死及び潰瘍が多発する領域（複数可）が存在し、顕著な出血が見られ、フィブリン及び壊死片の層が粘膜上に存在する（トルコタオルの外観を有する）。
【０４２５】
４＝死亡または瀕死：２４時間以内に死亡し得る可能性があり、かつ２以上のＮＥ病変スコアを有するトリ。
【０４２６】
結果
【０４２７】
本出願の方法を使用して結果を解析した。４８羽のトリすべての小腸内容物について株レベルの微生物の絶対細胞数及び活性を決定した。本出願の方法によって、各試料の絶対細胞数情報だけでなく、活性情報も統合した。
【０４２８】
本出願の相互情報量手法を使用することで、活性株の絶対細胞数と、無作為に選択した１０羽のブロイラーの個々の病変スコアと、の間の関連性をスコア付けした。データセットから１つの試料を無作為に除外し、解析を繰り返した。これを、比較するブロイラー試料が２つのみとなるまで繰り返した。
【０４２９】
原因株であるＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの確認は、試料のプールから同定した生物のリストに対する網羅的アライメント検索を介して実施した。表１２には、解析したすべての株に対するＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの順位（順位が１位であることは、その株が病変スコアの誘起に最も関与しているということである）が示される：
【表１２】
2020503048.tif 000036
【０４３０】
表１２は、開示の方法を使用することで、２つの試料の比較を含めて、すべての比較について、病変スコアの活性微生物株かつ原因病原体としてＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓが正しく同定されたことを示す。試料数を減らすにつれて、偽陽性（すなわち、他の株もまた、原因病原体として同定される）の数が増加し、この増加は、７つの試料を比較した時点で始まった。この７つの試料の比較時点では、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓを含む２つの株が１位タイとなった。この傾向は、比較試料の数を２つに減らすまで続き、２つの試料の比較では、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓを含む３１の株が最上位タイとなった。
【０４３１】
一般に、追加の試料を使用するとノイズ／偽陽性数を減らすことができる一方で、合計３１の同定株に由来するものを含めて、残りの株をさらに分析及び処理することでもＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓを原因株として同定するができる。本開示の方法は、実施形態、構成、及び用途に応じて、少数の試料で実施することができ、試料源、試料型、メタデータ、標的マイクロバイオームの複雑性などに応じて、利用する試料の数を変えることができる。
【０４３２】
実施例８
【０４３３】
乳牛における総乳脂肪量、総乳タンパク質量、及びエネルギー補正乳量（ＥＣＭ）を増加させるために乳牛に毎日投与される微生物組成物の用量当たりの細胞数の決定
【０４３４】
この実施例では、泌乳反芻動物によって産生する乳脂肪及び乳タンパク質の総量、ならびに計算エネルギー補正乳量（ＥＣＭ）を増加させることを目的とする特定の実施態様が示される。本明細書で使用されるように、ＥＣＭは、乳体積、乳脂肪、及び乳タンパク質に基づく乳汁中のエネルギー量を示す。ＥＣＭでは、乳成分が脂肪３．５％及びタンパク質３．２％に補正されることによって動物の能力が等しくなり、個々の動物及び群れのレベルで経時的に産生を比較することが可能になる。本開示と関連してＥＣＭの計算に使用される式の例は、以下のものである：
【０４３５】
ＥＣＭ＝（０．３２７ｘ乳汁のポンド）＋（１２．９５ｘ脂肪のポンド）＋（７．２ｘタンパク質のポンド）
【０４３６】
開示の方法を利用して活性な相互関連微生物／微生物株を同定し、そこから微生物アンサンブルを生成して本明細書に示される方法論を適用すると、そのアンサンブルをルーメンに直接的に投与したときに泌乳反芻動物によって産生する乳脂肪及び乳タンパク質の総量が増加することが実証されている。こうした増加は、ホルモンを別に与えることを必要とせずに実現した。
【０４３７】
この実施例では、上記の開示に従って同定及び生成された２つの単離された微生物（Ａｓｃｕｓｂ＿Ｘ及びＡｓｃｕｓｆ＿Ｙ）を含む微生物アンサンブルを、授乳の中期のホルスタイン乳牛に５週間にわたって投与した。８頭の群２つに乳牛を無作為に割り付け、これらの群の一方は、微生物アンサンブルを含まない緩衝液を投与する対照群とした。第２の群（実験群）には、Ａｓｃｕｓｂ＿Ｘ及びＡｓｃｕｓｆ＿Ｙを含む微生物アンサンブルを１日に１回、５週間投与した。乳牛はそれぞれ、個別の飼育領域に収容し、飼料及び水を自由に摂取できるようにした。食物は、乳量が多くなる食物とした。乳牛には自由に摂食させ、１日の終わりに飼料の重量を測定し、前日の拒食分は、重量を測定し、廃棄した。体重測定は、Ｓａｌｔｅｒ  Ｂｒｅｃｋｎｅｌｌ（Ｆａｉｒｍｏｎｔ，ＭＮ）のＰＳ−２０００スケールで実施した。
【０４３８】
乳牛のルーメンにカニューレが到達するように乳牛にカニューレを装着した。乳牛には、カニューレ挿入の後、少なくとも１０日間の回復期間をさらに与えてから、対照用量または実験用量を投与した。
【０４３９】
対照群への投与は、２０ｍｌの中性緩衝生理食塩水を用いるものとし、実験群への投与は、２０ｍＬの中性緩衝生理食塩水に約１０９個の細胞を懸濁したもの用いるものとした。対照群には、２０ｍｌの当該生理食塩水を１日に１回投与し、実験群には、１０９個の微生物細胞の記載の微生物アンサンブルをさらに含む２０ｍｌの当該生理食塩水を投与した。
【０４４０】
０日目、７日目、１４日目、２１日目、及び３５日目にあらゆる乳牛のルーメンから試料を取得し、ここでは微生物投与の前日を０日目とした。実験投与及び対照投与は、その日にルーメンから試料を取得した後に実施したことに留意されたい。ルーメンからの毎日の試料取得は０日目に開始し、取得したルーメン液にＨａｎｎａ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｗｏｏｎｓｏｃｋｅｔ，ＲＩ）のｐＨメーターを挿入して記録を取った。ルーメン試料の取得においては、ルーメンの中心領域、背側領域、腹側領域、前側領域、及び後側領域からカニューレを介して微粒子と液体との両方を取得するようにし、５つの試料すべてを、１．５ｍｌの停止液（エタノール９５％、フェノール５％）を含む１５ｍｌのコニカルバイアルにプールした。それぞれの試料取得日に糞便試料も取得し、糞便は、触診用スリーブを使用して直腸から取得した。それぞれの試料取得時に乳牛の体重を測定した。
【０４４１】
糞便試料を２オンスバイアルに入れ、凍結保管し、分析することで、見かけの中性デタージェント繊維（ＮＤＦ）消化性の値、見かけのデンプン消化性の値、及び見かけのタンパク質消化性の値を決定した。ルーメン試料の取得においては、ルーメンの液体部分と微粒子部分との両方を取得するようにし、それらのそれぞれを１５ｍｌのコニカルチューブに保管した。１０％の停止液（フェノール５％／エタノール９５％の混合物）で細胞を固定し、４℃に保ち、氷上に留めてＡｓｃｕｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に送付した。
【０４４２】
乳産生量を１日に２回（朝に１回及び夜に１回）測定した。乳組成（脂肪％及びタンパク質％など）を１日に２回（朝に１回及び夜に１回）測定した。タンパク質脂肪、固形分については近赤外線分光法で分析し、乳中尿素窒素（ＭＵＮ）及び体細胞数（ＳＣＣ）についてはＴｕｌａｒｅ  Ｄａｉｒｙ  Ｈｅｒｄ  Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＤＨＩＡ）（Ｔｕｌａｒｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で分析して、乳試料をさらに分析した。個々の乳牛の飼料摂取量及びルーメンのｐＨを１日に１回決定した。
【０４４３】
完全混合飼料（ＴＭＲ）の試料を適用期間の最終日に取得し、その後は１週間に１回の取得を続けた。試料取得は四分法を用いて実施し、試料は真空密封バッグに保管し、この真空密封バッグをＣｕｍｂｅｒｌａｎｄ  Ｖａｌｌｅｙ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（Ｈａｇｅｒｓｔｏｗｎ，ＭＤ）に送付し、ＮＩＲ１パッケージによる分析を実施した。緩衝液及び／または微生物バイオアンサンブルの最終投与日は３５日目としたが、他の測定及び試料取得はすべて、４６日目まで記載のように継続した。
【０４４４】
図９Ａは、開示の方法に基づいて微生物アンサンブルを投与した乳牛では、緩衝液単独物を投与した乳牛と比較して平均乳脂肪産生量が２０．９％増加したことを示す。図９Ｂは、微生物アンサンブルを投与した乳牛では、緩衝液単独物を投与した乳牛と比較して平均乳タンパク質産生量が２０．７％増加したことを示す。図９Ｃは、微生物アンサンブルを投与した乳牛では、平均エネルギー補正乳産生量が１９．４％増加したことを示す。図９Ａ〜９Ｃに見られる増加は、アンサンブルの投与を停止（データ点を横切る垂直線によって示される）した後は、顕著さが低下した。
【０４４５】
本明細書に示される方法論を使用して、ルーメン試料をシークエンシングし、解析することで、各試料における活性微生物株の絶対存在量を決定した。図１０Ａ及び図１０Ｂならびに図１１Ａ及び図１１Ｂは、実験過程を通じてＡｓｃｕｓｂ＿Ｘ株及びＡｓｃｕｓｆ＿Ｙ株の相対存在量が増加したことを示す。これらの図では、相対存在量が報告されており、これによって、対照群と実験群とを直接的に比較することが可能であり、動物間の絶対存在量の可変性が正規化されている。但し、計算はすべて、株の絶対細胞量を使用して実施した。
【０４４６】
０日目は、対照群及び実験群において両方の株の開始レベルは低く、基底のものであった。Ａｓｃｕｓｂ＿Ｘの存在量及び活性は、実験の１３日目までに顕著に増加し始め、１９日目あたりにピークを付けた。１９日目より後は、Ａｓｃｕｓｂ＿Ｘの存在量は減少し始めた。Ａｓｃｕｓｆ＿Ｙについても同様の傾向が観測された。Ａｓｃｕｓｆ＿Ｙの存在量及び活性は、実験の１０日までに顕著に増加し始め、１９日目あたりにピークを付けた。１９日目より後は、存在量及び活性は減少し始めた。こうして観測された両方の株の増減は、動物の能力とよく相関している。
【０４４７】
動物の能力に影響与える上で必要な負荷率（１０９個細胞／動物／日）と、１０９個の細胞がルーメン内で複製及び存続することができる比率（それぞれの株の絶対細胞数情報に由来する）と、存在量の最初の増加が観測されるまでの遅延時間と、がこの時点で明らかになるため、精度を高めた製品用量を決定して、それぞれの動物に有効数の細胞を日々確実に送達することができる。試料への製品の混合、動物への飼料の送達、及び環境曝露、に起因する消失は、実験室での実験によるシミュレーションを介して推定することができる。動物の飼料摂取量の差異に起因する可変性も考慮に入れることで、最終的な投与がさらに微調整される。
【０４４８】
実施例９
【０４４９】
乳牛に毎週〜毎日投与される微生物組成物の用量当たりの細胞数の決定
【０４５０】
この実施例では、泌乳反芻動物によって産生する乳脂肪及び乳タンパク質の総量、ならびに計算エネルギー補正乳量（ＥＣＭ）を増加させることを目的とする特定の実施態様が示される。本明細書に示される方法論は、開示の単離された微生物、アンサンブル、及びそれを含む組成物を利用することに基づいており、泌乳反芻動物によって産生する乳脂肪及び乳タンパク質の総量が増加することを実証している。こうした増加は、ホルモンを別に与えることを必要とせずに実現した。
【０４５１】
この実施例では、２つの単離された微生物（Ａｓｃｕｓｂ＿３１３８（配列番号２８）及びＡｓｃｕｓｆ＿１５（配列番号３２））を含む微生物アンサンブルを、授乳の中期のホルスタイン乳牛に５週間にわたって投与した。
【０４５２】
８頭の群２つに乳牛を無作為に割り付け、これらの群の一方は、微生物アンサンブルを含まない緩衝液を投与する対照群とした。第２の群（実験群）には、Ａｓｃｕｓｂ＿３１３８（配列番号２８）及びＡｓｃｕｓｆ＿１５（配列番号３２）を含む微生物アンサンブルを１日に１回、５週間投与した。乳牛はそれぞれ、個別の飼育領域に収容し、飼料及び水を自由に摂取できるようにした。食物は、乳量が多くなる食物とした。乳牛には自由に摂食させ、日々の終わりに飼料の重量を測定し、前日の拒食分は、重量を測定し、廃棄した。体重測定は、Ｓａｌｔｅｒ  Ｂｒｅｃｋｎｅｌｌ（Ｆａｉｒｍｏｎｔ，ＭＮ）のＰＳ−２０００スケールで実施した。
【０４５３】
乳牛のルーメンにカニューレが到達するように乳牛にカニューレを装着した。乳牛には、カニューレ挿入の後、少なくとも１０日間の回復期間をさらに与えてから、対照用量または実験用量を投与した。
【０４５４】
２０ｍｌの中性緩衝生理食塩水でそれぞれの投与を行うものと、当該生理食塩水に約１０９個の細胞を懸濁したものでそれぞれの投与を行うものと、にした。対照群には、２０ｍｌの当該生理食塩水を１日に１回投与し、実験群には、１０９個の微生物細胞の記載の微生物アンサンブルをさらに含む２０ｍｌの当該生理食塩水を投与した。
【０４５５】
０日目、７日目、１４日目、２１日目、及び３５日目にあらゆる乳牛のルーメンから試料を取得し、ここでは微生物投与の前日を０日目とした。実験投与及び対照投与は、その日にルーメンから試料を取得した後に実施したことに留意されたい。ルーメンからの毎日の試料取得は０日目に開始し、取得したルーメン液にＨａｎｎａ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｗｏｏｎｓｏｃｋｅｔ，ＲＩ）のｐＨメーターを挿入して記録を取った。ルーメン試料の取得においては、ルーメンの中心領域、背側領域、腹側領域、前側領域、及び後側領域からカニューレを介して微粒子と液体との両方を取得するようにし、５つの試料すべてを、１．５ｍｌの停止液（エタノール９５％、フェノール５％）を含む１５ｍｌのコニカルバイアルにプールし、４℃で保管し、氷上に留めてＡｓｃｕｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に送付した。
【０４５６】
それぞれのルーメン試料の一部を染色し、フローサイトメーターに供すことで、各試料におけるそれぞれの微生物型の細胞数を定量化した。同一のルーメン試料の別の部分をビーズ破砕でホモジナイズすることで微生物を溶解させた。各試料からＤＮＡ及びＲＮＡを抽出及び精製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｍｉｓｅｑでのシークエンシング用として調製した。ペアエンド化学を使用して試料をシークエンシングし、ライブラリーの両末端に対して３００塩基対のシークエンシングを実施した。シークエンシングリードを使用することで、対照群及び実験群の動物ルーメンのそれぞれに存在するそれぞれの活性微生物メンバーの細胞数を実験過程にわたって定量化した。
【０４５７】
Ａｓｃｕｓｂ＿３１３８とＡｓｃｕｓｆ＿１５との両方がコロニーを形成し、動物によっては、約３〜５日の連日投与の後にルーメンにおいて最初に活性を有した。このコロニー形成は、実験群では観測されたが、対照群では観測されなかった。こうした株は、毎日投与したものであるが、細胞の絶対量及び必要な有効閾値は分かるため、毎週投与するレジメンをデータから推定することができる。ここでは、生産に対する影響が観測される上で必要なＡｓｃｕｓｂ＿３１３８の量は約１０７個細胞／ｍＬであり、生産に対する影響が観測される上で必要なＡｓｃｕｓｆ＿１５の量は約１０６細胞／ｍＬであった。毎日の細胞用量を１０９個とすると、存在量の最初の増加は、一般に、５日目までに観測され、１０日目までには、より顕著な増加が生じた。このパターンを、既知の増殖率及びこうした株の他の生理学的特徴に加えることで、微生物株の毎週の投与に適した細胞数の計算に必要な変数が設定される。定常状態系に適用される単純な指数関数増殖式を使用することで、生産を改善するための閾値レベルを達成する上で必要な細胞数を決定することができる。栄養素の枯渇、競合などをモデル化するためには、より複雑な式を使用することもできる。いくつかの実施形態では、生理学的な実験及びインビトロの実験から初期値が近似される。以下のコード断片例は、いくつかの実施形態の態様を示す：
【数８】
2020503048.tif 000037
【数９】
2020503048.tif 000038
【０４５８】
実施例１０
【０４５９】
ペレット化飼料を介してブロイラーに投与される微生物組成物のためのそれぞれの株の用量当たりの細胞数の決定
【０４６０】
この試験の目的は、２つの異なる微生物バイオアンサンブルがＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの感染に起因する死亡率を低減する能力を評価することとした。
【０４６１】
実験設計
【０４６２】
基本食及び実験食
【０４６３】
飼料粉砕機を使用して開始食、成長食、及び基本食を製造し、バルクで保管した。５００ポンド容量の縦型混合機、４０００ポンド容量の縦型混合機、及び／または１４，０００ポンド容量の水平混合機及びカリフォルニアペレットミルを使用して、最終的な実験食の混合、ペレット化、及び粉砕を実施した。処理コード標識を付けた５０ポンド容量の飼料ずだ袋及び／またはバルク保管ビンに飼料を保管した。実験を通じて、すべての食品にフィターゼを含めた。
【０４６４】
【表１３−１】
2020503048.tif 000039
【表１３−２】
2020503048.tif 000040
【０４６５】
試験群
【０４６６】
完全乱塊法を使用して飼育領域に処理を割り付けた。試験０日目の開始時点で飼育領域に対して処理を実施した。処理は、数字コードによって識別するようにする。特定の処理群は、以下のとおりである。
【表１４】
2020503048.tif 000041
【０４６７】
収容及び管理
【０４６８】
収容
【０４６９】
データマネージャーによるＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌの乱数発生機能を使用して、処理を各飼育領域に無作為に割り付けた。トリを飼育領域に無作為に割り付けた。環境的に制御された場所にトリを収容し、コンクリート床の飼育領域に入れ、この飼育領域では、床スペース及びトリの密度を［約０．５５平方フィート／トリ（０日目）、約０．６９平方フィート／トリ（２１日目（病変のスコア付け後））］とし、温度、湿度、照明、フィーダー、及び水のスペースをすべての試験群で同様となるように供給した。清潔な木くずを適切な深さで含めた清潔な飼育領域にトリを入れることで、当該ヒヨコにとって快適な環境を与えた。トリを快適な状態で維持するために、追加の木くずを飼育領域に加えた。照明は、白色光を介するものとし、市販の照明プログラムを下記のように使用した。
【表１５】
2020503048.tif 000042
【０４７０】
トリに対する環境条件（すなわち、トリ密度、温度、照明、フィーダー、及び水のスペース）は、すべての処理群で同様となるようにした。飼育領域間のトリの移動及び細菌拡散を防ぐために、飼育領域の間に約２４インチの高さの木またはプラスチックの頑丈な仕切りを各飼育領域に設けるようにする。
【０４７１】
ワクチン接種及び治療薬投与
【０４７２】
マレック病を防ぐために、孵化場でトリにワクチン接種を行った。受け入れ時（試験の０日目）に、ニューカッスル病及び感染性気管支炎を防ぐためのワクチン接種、ならびにＣｏｃｃｉｖａｃによるワクチン接種を、噴霧キャビネットを使用して噴霧適用によってトリに実施した。ワクチン製造業者、ロット番号、及び有効期限を文書化し、最終報告書と共に提出した。
【０４７３】
水
【０４７４】
飼育領域当たりに１つの自動ニップル式給水器（給水器当たりのニップル数４）を介して、試験を通じて水を不断供給した。給水器は、１日に２回点検し、必要に応じて洗浄することで、清潔な水が一定して確実にトリに供給されるようにした。
【０４７５】
飼料
【０４７６】
飼育領域当たりに１つの直径約１７インチの吊り下げ式チューブフィーダーを介して、試験を通じて不断給餌を行った。最初の約４日間は、各飼育領域にヒヨコ用のフィーダートレイを置いた。受け入れ時（０日目）に、実験設計に従ってトリをそのそれぞれの処理食物の摂取過程下に置いた。０日目から試験終了までの間に飼育領域に追加した飼料及び飼育領域から除去した飼料については、重量を測定し、記録した。
【０４７７】
毎日の観察
【０４７８】
全体的な群れの状態、照明、水、飼料、換気、及び不測の事象について、試験施設、飼育領域、及びトリを少なくとも１日に２回観察した。１日に２回の観察のいずれかにおいて異常な状態また異常な挙動が確認されれば、それを文書化し、試験記録と共に含めた。試験施設の最低温度及び最高温度を１日に１回記録した。
【０４７９】
飼育領域カード
【０４８０】
各飼育領域に２つのカードを取り付けた。一方のカードによって飼育領域番号を識別し、第２のカードでは処理番号を示すようにする。
【０４８１】
動物の取り扱い
【０４８２】
動物は、理想的な飼育適合条件の下で保持した。損傷及び不要なストレスを低減するような様式で動物を取り扱った。人道的な手段を厳格に実行した。
【０４８３】
獣医学的な管理、介入、及び安楽死
【０４８４】
試験手順とは無関係な臨床的に顕著な併発疾患を発症したトリは、試験責任者または被任命者の裁量で試験から除外し、現場のＳＯＰに従って安楽死させてよい。さらに、瀕死または損傷したトリもまた、現場の獣医師または有資格技術者の権限で安楽死させてよい。除外理由は、文書化した。動物が死亡するか、または除外し、人道的理由で安楽死させたのであれば、そのことを飼育領域の死亡率シートに記録し、剖検を実施し、提出して除外理由を文書化した。安楽死が必要であると判断されれば、頸椎脱臼によって動物を安楽死させた。
【０４８５】
死亡率及び選別
【０４８６】
０日目から試験終了までの間、死亡が明らかになったトリまたは屠殺したトリはいずれも、体重を測定し、剖検した。体重及び推定死亡原因及び剖検知見を死亡率記録に記録した。試験中の任意の時点で性別の誤りが認められれば、当該トリを除外し、体重を測定し、剖検して性別を確認し、飼育領域の死亡率記録に記録した。
【０４８７】
体重及び飼料摂取量
【０４８８】
およそ０日目、１７日目、２８日目、及び３５日目にトリの体重を飼育領域別に測定した。試験の１７日目、２８日目、及び３５日目に各飼育領域に残った飼料の重量を測定し、記録した。０〜１７日目、１７〜２８日目、及び０〜３５日目の間の飼料摂取量を計算した。
【０４８９】
体重増加及び飼料要求率
【０４９０】
各体重測定日に飼育領域ベースのトリの平均体重をまとめた。１７〜２８日目の間のトリの体重増加を飼育領域別に計算した。生存するトリの総体重によって飼育領域の総飼料消費量を割ったものを使用して試験の１７日目及び２８日目に平均飼料要求率を計算した（すなわち、０〜１７日目、１７〜３５日目、及び０〜３５日目のものを計算した）。生存するトリの総体重に死亡または飼育領域から除外したトリの体重を加えたものによってその飼育領域の総飼料消費量を割ったものを使用して補正飼料要求率を計算した。
【０４９１】
コクシジウム症（ＣＯＣＣＩＤＩＯＳＩＳ）への曝露
【０４９２】
投与材料の投与
【０４９３】
試験のおよそ０日目に噴霧キャビネットによって１ｘ用量のＣｏｃｃｉｖａｃを、すべてのトリのそれぞれに投与した。
【０４９４】
ＣＬＯＳＴＲＩＤＩＵＭ  ＰＥＲＦＲＩＮＧＥＮＳの投与
【０４９５】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍの投与：
【０４９６】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ（ＣＬ−１５）の培養増殖は、デンプンを含む液体チオグリコール酸培地において約３７℃で約５時間実施した。ＣＬ−１５は、コロラド州においてブロイラーの間で大流行したものに由来するＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの野外株である。トリの各飼育領域について、固定量のブロス培養物（約２〜３ｍｌ／トリ）を、固定量の処理飼料（約２５ｇ／トリ）とフィーダートレイ中で混合した。飼料の量、接種培養物の体積及び定量化、ならびに投与日数を最終報告書に記入し、飼育領域はすべて、同一に処理した。Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの培養物のトリへの投与は、１日間（試験の１７日目）実施するようにする。投与ありかつ薬剤なしの群における死亡率目標は１０％であり、最低でも５％である。
【０４９７】
投与方法：
【０４９８】
この試験では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ（ＣＬ−１５、Ａ型、α毒素及びβ２毒素）の培養物を、飼料を介して投与した。培養物との混合には、各飼育領域のフィーダー由来の飼料を使用した。飼育領域に培養物を置く前に、約４〜８時間、処理飼料を取り出し、トリから遠ざけた。トリの各飼育領域について、約２．０〜９．０Ｘ１０８ｃｆｕ／ｍｌの濃度のブロス培養物を固定量（約２．５ｍｌ／トリ）で、固定量の飼料（約２５ｇ／トリ）とフィーダートレイ中で混合し、投与を行う飼育領域はすべて、同一に処理した。培養物−飼料のほとんどが１〜２時間以内に消費された。すべての処理においてトリが同様に処理されるように、非投与群もまた、投与群と同一の時間、飼料を取り出すようにする。
【０４９９】
病変のスコア付け
【０５００】
試験の２１日目に、各飼育領域から５羽のトリを無作為に選択し（最初に捕獲されたトリを選択することによるもの）、屠殺し、壊死性腸炎について腸の病変をスコア付けして評価した。病変は、下記のようにスコア付けした：
【０５０１】
０＝正常：ＮＥ病変がなく、小腸は、正常な弾性を有する（開いた後に、丸まって正常位置に戻る）。
【０５０２】
１＝軽度：小腸壁が薄く、弛緩性であり（開いたときに平らなままであり、開いた後に、丸まって正常な位置に戻らない）、粘膜を覆う粘液が過剰であった。
【０５０３】
２＝中等度：腸壁が顕著に発赤し、膨化しており、腸膜に少数の潰瘍及び壊死が存在し、粘液が過剰である。
【０５０４】
３＝重度：小腸膜の壊死及び潰瘍が多発する領域（複数可）が存在し、顕著な出血が見られ、フィブリン及び壊死片の層が粘膜上に存在する（トルコタオルの外観を有する）。
【０５０５】
４＝死亡または瀕死：２４時間以内に死亡し得る可能性があり、かつ２以上のＮＥ病変スコアを有するトリ、または壊死性腸炎に起因して死亡したトリ。
【０５０６】
消化管内容物の取得
【０５０７】
２１日目に、頸椎脱臼によって各トリを安楽死させて、記載の手順を使用して下記のものを取得し、手袋は、各トリ間で交換した。
１．停止液を事前に充填した１．５ｍｌチューブに１つの盲腸の内容物を直ちに入れる。
２．停止液を事前に充填した１．５ｍｌチューブに小腸の内容物を直ちに入れる。
３．ＧＩ管から砂嚢を切除し、内容物を鉗子で取り出し、停止液を事前に充填した１．５ｍｌチューブに入れる。
４．ＧＩ管から素嚢を切除し、鉗子／スクレーパーで内容物を粘膜内層から剥がし取り、停止液を事前に充填した１．５ｍｌチューブに入れる。
５．送付するまで、すべての試料を４℃で保管する。
【０５０８】
ＧＩ試料の調製及びシークエンシング
【０５０９】
消化管（ＧＩ）試料を取得後、スイングバケット型の遠心分離機においてＧＩ試料の遠心分離（４，０００ｒｐｍ）を４℃で２０分間実施した。上清をデカントし、０．１ｍｍのガラスビーズを事前に充填した１．７ｍＬ滅菌チューブに一定分量の消化管内容物試料（１〜２ｍｇ）をそれぞれ添加した。第２の一定分量を取得し、細胞計数用として空の１．７ｍＬ滅菌チューブに入れて保管した。
【０５１０】
空のチューブに入れたＧＩ試料を染色し、フローサイトメーターにかけることで、各試料におけるそれぞれの微生物型の細胞数を定量化した。ガラスビーズを含めたＧＩ試料をビーズ破砕でホモジナイズすることで微生物を溶解させた。各試料からＤＮＡ及びＲＮＡを抽出及び精製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｍｉｓｅｑでのシークエンシング用として調製した。ペアエンド化学を使用して試料をシークエンシングし、ライブラリーの両末端に対して３００塩基対のシークエンシングを実施した。
【０５１１】
シークエンシングリードの処理及びデータ解析
【０５１２】
シークエンシングリードのクオリティトリミング及び処理を実施することで、ＧＩ管に存在する細菌種をマーカー遺伝子（１６Ｓ  ｒＤＮＡあるいはＩＴＳ１及び／またはＩＴＳ２）に基づいて同定した。計数データセット及び活性データセットをシークエンシングリードと統合することで、消化管微生物コミュニティ内の活性微生物種の絶対細胞数を決定した。微生物バイオアンサンブルにおいて使用した微生物株をシークエンシングデータセットから同定することで、試験を通じて当該株のコロニー形成及び活性を決定した。
【０５１３】
【表１６】
2020503048.tif 000043
【０５１４】
ブロイラーに微生物アンサンブルを給餌することで、薬剤なしの対照群と比較して死亡率及び病変スコアが実際に低下した。それぞれの群に補充した株がコロニーを形成し、活性を有することが確認された。当該微生物が有効であることが示されたため、適切な投与レジメンをこの実験データから決定することができる。
【０５１５】
この実験では、それぞれのバイオアンサンブルにおいて３つの異なる微生物株を利用した。同一の細胞濃度で投与したにもかかわらず、６つの株すべてが、異なるコロニー形成を示した。このことから、こうした実験結果を使用することで、製品において使用するための株の適切な比率の選択指針を得ることができる。他のものよりも遅延する傾向を有する株、またはすべてのトリで効率的にコロニーを形成しなかった株は、濃度を高めて補充することで、動物への送達を確保することができる。動物の能力に影響を与える上で必要な負荷率（１０６個細胞／動物／日）と、存在量の最初の増加が観測されるまでの遅延時間と、がこの時点で明らかになることから、製品用量の精度を高めて、それぞれの動物に有効数の細胞を日々確実に送達することが可能となる。
【０５１６】
実施例１１
【０５１７】
ブタにおける希釈係数を決定するための難消化性トレーサーの使用
【０５１８】
この実施例では、難消化性マーカーを使用することで、栄養素の濃度及び微生物の存在量の変化を計算した。取得及び解析する消化管内容物は一部にすぎないため、難消化性マーカーを使用して濃度及び存在量を正規化することで、解析前に体積の差異を把握することができる。
【０５１９】
動物及び収容
【０５２０】
この実験では、Ｃ−４６雌性ブタに交配させたＬ−３５９雄性ブタの子孫である去勢した雄性ブタ３０匹（Ｐｉｇ  Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎｖｉｌｌｅ，ＴＮ）（初期平均体重２９．３±１．９ｋｇ）を使用した。Ｔ−カニューレをブタに外科的に装着させて、このＴ−カニューレが回腸遠位部に設置されるようにすると共に、盲腸結腸接合部から遠位となる結腸近位部に第２のＴ−カニューレを設置した。手術の後、１．２×１．５ｍの飼育領域にそれぞれのブタを収容し、８日間の回復期間を与えた。各飼育領域は、全体にスラットのある三角棒の床を有したものであり、フィーダー及びニップル式給水器を各飼育領域に備え付けた。
【０５２１】
食物及び給餌
【０５２２】
３つの食物を調製した。第１の食物は、トウモロコシ及びダイズミール（基礎物）を含む低繊維食とし、第２の食物は、トウモロコシ、ダイズミール、及び蒸留時残留物を乾燥させた穀物粕（ＤＤＧＳ）（３０％）を含む高繊維食とした。第３の食物も高繊維食としたが、この食物には、トウモロコシ、ダイズミール、ＤＤＧＳ（１５％）、及びダイズ外皮（ＳＢＨ）（１５％）を含めた。現在の推定必要値を満たすか、または上回るようにビタミン及びミネラルをすべての食物に含めた。難消化性マーカーとして二酸化チタンを含有率が０．４％となるようにすべての食物に含め、食物はすべて、食事として提供した。
【０５２３】
これら３つの食物にブタを無作為に割り付けた。３回の連続１４日の期間、ブタに食物を与えた。それぞれの期間中は、それぞれの群のブタに与える食物は１つとし、実験中、３つすべての群に３つすべての食物を与えた。実験の初日及びそれぞれの期間の最終日に個々のブタの体重を記録した。実験を通じてブタが飼料及び水を自由に摂取できるようにしたが、毎日の飼料の配分量は記録した。それぞれの期間の終了時にすべてのフィーダーを空にし、飼料の消失分を計算した。
【０５２４】
試料の取得
【０５２５】
回腸内容物の３つの別々の試料及び結腸内容物の３つの試料を、第１の期間の１日目ならびに期間１、期間２、及び期間３の１４日目に取得した。これらの試料のうちの２つは、追加の分析のために会社に送付した。第３の試料を２ＮのＨＣｌと１：１の比で混合し、ＶＦＡの濃度を分析するまで−２０℃で保管した。それぞれの期間の８日目及び９日目に糞便試料を取得し、それぞれの期間の１０日目及び１１日目に結腸内容物試料を取得し、それぞれの期間の１２日目及び１３日目に回腸内容物試料を取得した。カニューレバレルにプラスチックを取り付け、消化管内容物を当該バッグに流し入れることによって回腸内容物及び結腸内容物を８時間（０７００〜１５００時間）取得した。消化管内容物でバッグが満たされたときはすぐにバックを外し、または少なくとも３０分ごとに１回はバックを外し、直ちに−２０℃で凍結させることで、消化管内容物中のアミノ酸及びデンプンが細菌によって分解されるのを防いだ。１つの実験期間の完了時には、動物が飼料を一晩摂取できないようにし、翌日の朝に、新たな実験食を与えた。
【０５２６】
それぞれの期間の終結時点で、試料をブタ内で混合し、副試料を取得した。実験の終了時点で、すべての副試料を凍結乾燥し、粉砕して目開き１ｍｍの篩に通してから化学分析に供した。
【０５２７】
化学分析
【０５２８】
食物試料、糞便試料、結腸試料、及び回腸試料は、ＤＭ（Ｍｅｔｈｏｄ  ９３０．１５；ＡＯＡＣ  Ｉｎｔ．，２００７）、及びＧＥ（較正用標準物質として安息香酸を用いて等周温ボンベ熱量計を使用する分析（Ｍｏｄｅｌ  ６３００，Ｐａｒｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｍｏｌｉｎｅ，ＩＬ））、ならびにＡＤＦ、ＮＤＦ、及びリグニン（それぞれＡｎｋｏｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ法１２、同法１３、及び同法９を使用する分析（Ａｎｋｏｍ２０００  Ｆｉｂｅｒ  Ａｎａｌｙｚｅｒ，ＤａｉｓｙＩＩ  Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ  Ａｎｋｏｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍａｃｅｄｏｎ，ＮＹ））を分析した。食物試料及び回腸内容物試料については、アミノ酸（ポストカラム誘導体化用にニンヒドリン、及び内部標準物質としてノルロイシンを使用してＨｉｔａｃｈｉアミノ酸分析機モデル番号Ｌ８８００（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｈｉｇｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．，Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，ＣＡ）で行う分析［Ｍｅｔｈｏｄ  ９８２．３０  Ｅ（ａ，ｂ，ｃ）；ＡＯＡＣ  Ｉｎｔ．，２００７］）ならびにデンプン（グルコアミラーゼ手順を使用する分析（Ｍｅｔｈｏｄ  ９７９．１０；ＡＯＡＣ  Ｉｎｔ．，２００７））も分析した。ＩＣＰ手順（Ｍｅｔｈｏｄ  ９９０．０８；ＡＯＡＣ  Ｉｎｔ．，２００７）を使用して、チタンの濃度もまた、すべての試料において分析した。試料は、硝酸−過塩素酸（Ｍｅｔｈｏｄ  ９６８．０８  Ｄ（ｂ）；ＡＯＡＣ  Ｉｎｔ．，２００７）を使用して調製した。２ＮのＨＣｌにおいて安定化させた回腸内容物試料及び盲腸内容物試料はすべて、ガスクロマトグラフ（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ５８９０Ａ  Ｓｅｒｉｅｓ  ＩＩ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）及び８０／１００＋メッシュＣｈｏｍｏｓｏｒｂ  ＷＡＷ（Ｓｕｐｅｌｃｏ  Ｉｎｃ．，Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ，ＰＡ）を１０％のＳＰ−１２００／１％のＨ３ＰＯ４  ９６でパッキングしたガラスカラム（１８０ｃｍ×内径４ｍｍ）を使用して、Ｅｒｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９６１）に従ってガスクロマトグラフィーによってＶＦＡの濃度を分析した。窒素をキャリアガスとし、流速を７５ｍＬ／分とした。オーブン、検出器、及びインジェクタの温度は、それぞれ１２５℃、１７５℃、及び１８０℃とした。
【０５２９】
計算
【０５３０】
個々のブタの体重（ＢＷ）のデータをまとめ、１日当たりの平均体重増加（ＡＤＧ）、１日当たりの平均飼料摂取量（ＡＤＦＩ）、及び平均の体重増加と飼料との比（Ｇ：Ｆ）を、実験の終結時点でそれぞれの食物について計算した。アミノ酸、デンプン、ＡＤＦ、及びＮＤＦの見かけの回腸消化性を下記の式を使用して計算した：
ＡＩＤ（％）＝１００−［（栄養素消化管内容物／栄養素食物）×（チタン食物／チタン消化管内容物）］
【０５３１】
式中、ＡＩＤは、栄養素の見かけの回腸消化性（％）であり、栄養素消化管内容物は、回腸内容物のＤＭにおけるその栄養素の濃度であり、栄養素食物は、食物のＤＭにおけるその栄養素の濃度であり、チタン食物は、食物のＤＭにおけるチタン濃度であり、チタン消化管内容物は、回腸内容物のＤＭにおけるチタン濃度である。同一の式を使用してＡＤＦ及びＮＤＦのＡＣＤ及びＡＴＴＤを計算した。
【０５３２】
個々の微生物株の総細胞数は、以下の式を使用して計算した：
微生物株の補正絶対細胞数＝
［（測定細胞数／ｍＬ）／（試料の質量）×（チタン食物／チタン消化管内容物）］＊微生物株の特有の第１のマーカーの比率
【０５３３】
次に、開示の方法を利用して活性な相互関連微生物／微生物株を同定し、そこから微生物アンサンブルを生成して本明細書に示される方法論を適用することを、ブタにおける飼料の消化性を改善する株を同定するために、正規化されたデータセットに適用した。それぞれの回腸試料及び結腸試料の一部を染色し、フローサイトメーターにかけることで、各試料におけるそれぞれの微生物型の細胞数を定量化した。同一のルーメン試料の別の部分をビーズ破砕でホモジナイズすることで微生物を溶解させた。各試料からＤＮＡ及びＲＮＡを抽出及び精製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｍｉｓｅｑでのシークエンシング用として調製した。ペアエンド化学を使用して試料をシークエンシングし、ライブラリーの両末端に対して３００塩基対のシークエンシングを実施した。シークエンシングリード及び計算した細胞存在量（上記の式を参照のこと）を使用することで、それぞれの動物に存在するそれぞれの活性微生物メンバーの細胞数を実験過程にわたって定量化した。試料のそれぞれについての活性微生物株のフィルタリングされた絶対細胞数、及び正規化されたメタデータを解析し、ネットワーク解析を使用して、予測される機能及び／または化学に従って活性微生物株を分類する。
【０５３４】
追加の実施形態例
【０５３５】
実施形態Ｔ１
標的生物学的環境の特性を変えるように構成された活性微生物株の活性微生物バイオアンサンブルの形成方法であって、前記方法が、特定量のトレーサーを閉鎖／隔離された環境に導入すること、前記環境から少なくとも２つの試料（またはそれぞれのセットが複数の試料を含む試料セット）を取得すること（前記少なくとも２つの試料は、少なくとも１つの共通環境パラメータ特徴を共有する）、各試料について、各試料におけるトレーサーの存在量を決定すること、各試料について、各試料における１つまたは複数の微生物型の存在を検出すること、前記１つまたは複数の微生物型のうちで各試料において検出されたそれぞれの微生物型の数を決定すること、各試料における特有の第１のマーカーの数及びその量を測定すること（特有の第１のマーカーはそれぞれ、被検出微生物型の微生物株のマーカーである）、前記それぞれの微生物型の数に対してトレーサー希釈係数及び前記特有の第１のマーカーの数を乗じて、各試料に存在するそれぞれの微生物株の補正絶対細胞数を得ること、それぞれの微生物株に対する少なくとも１つの特有の第２のマーカーを特定の閾値に基づいて測定して各試料における前記微生物株の活性レベルを決定すること、前記決定された活性によって前記それぞれの微生物株の補正絶対細胞数をフィルタリングすることで、前記少なくとも２つの試料のそれぞれについての活性微生物株のリスト及びそのそれぞれの補正絶対細胞数を得ること、前記少なくとも２つの試料のそれぞれについての前記活性微生物株のフィルタリングされた補正絶対細胞数と、前記少なくとも２つの試料のそれぞれについての少なくとも１つの測定メタデータと、を比較すること、予測される機能及び／または化学に従って前記活性微生物株を少なくとも２つの群に群化すること、前記少なくとも２つの群に基づいて少なくとも１つの微生物株を選択すること（及び／またはそれぞれの群から、またはそれぞれの群に基づいて、少なくとも１つの微生物株を選択すること）、ならびに前記選択された微生物株（複数可）を組み合わせ、担体媒体と一緒にして活性微生物のバイオアンサンブルを形成させること（前記バイオアンサンブルは、前記バイオアンサンブルが標的生物学的環境に導入されると、前記標的生物学的環境の少なくとも１つのメタデータと関連及び／またはそれに対応する特性を変えるように構成される）、を含む、前記方法。
【０５３６】
実施形態Ｔ２
前記比較が、各試料における前記活性微生物株と、前記少なくとも１つの測定メタデータと、の共出現を決定することを含む、実施形態Ｔ１に記載の方法。
実施形態Ｔ３
各試料における、前記活性微生物株と、前記少なくとも１つの測定メタデータと、の共出現の決定が、メタデータと微生物株との関連性を示すリンケージならびに前記活性微生物株の絶対細胞数がまとまったマトリックスを創出して１つまたは複数の不均一微生物コミュニティネットワークを示すことを含む、実施形態Ｔ２に記載の方法。
実施形態Ｔ４
前記群化が、活性な不均一微生物コミュニティネットワーク内のそれぞれの活性微生物株と測定メタデータとの連結度を明らかにするノンパラメトリックネットワーク解析及びクラスター解析のうちの少なくとも１つに基づくものである、実施形態Ｔ１、実施形態Ｔ２、または実施形態Ｔ３のいずれか１つに記載の方法。
【０５３７】
実施形態Ｄ１
標的生物学的環境の特性を変えるように構成された活性微生物株の活性微生物バイオアンサンブルの形成方法であって、前記方法が、少なくとも１つの共通環境パラメータ特徴を共有する少なくとも２つの試料を取得すること、各試料について、各試料における１つまたは複数の微生物型の存在を検出すること、前記１つまたは複数の微生物型のうちで各試料において検出されたそれぞれの微生物型の数を決定すること、各試料における特有の第１のマーカーの数及びその量を測定すること（特有の第１のマーカーはそれぞれ、被検出微生物型の微生物株のマーカーである）、前記それぞれの微生物型の数に対して前記特有の第１のマーカーの比例数を乗じて、各試料に存在するそれぞれの微生物株の絶対細胞数を得ること、それぞれの微生物株に対する少なくとも１つの特有の第２のマーカーを特定の閾値に基づいて測定して各試料における前記微生物株の活性レベルを決定すること、前記決定された活性によって前記それぞれの微生物株の絶対細胞数をフィルタリングすることで、前記少なくとも２つの試料のそれぞれについての活性微生物株のリスト及びそのそれぞれの絶対細胞数を得ること、前記少なくとも２つの試料のそれぞれについての前記活性微生物株のフィルタリングされた絶対細胞数と、前記少なくとも２つの試料のそれぞれについての少なくとも１つの測定メタデータと、を比較すること、予測される機能及び／または化学に従って前記活性微生物株を少なくとも２つの群に群化すること、前記群化に基づいて少なくとも１つの微生物株を選択すること及び／または前記少なくとも２つの群のそれぞれから少なくとも１つの株を選択すること、それぞれの選択された微生物株の初期量を、前記試料の少なくとも１つに由来する対応絶対細胞数に基づいて決定すること、前記選択された微生物株をそれぞれの量で組み合わせ、担体媒体と一緒にして活性微生物の第１のバイオアンサンブルを形成させること（前記第１のバイオアンサンブルは、前記バイオアンサンブルが標的生物学的環境に導入されると、前記標的生物学的環境の少なくとも１つのメタデータに対応する特性を変えるように構成される）、前記第１のバイオアンサンブルを前記標的生物学的環境に導入すること、前記標的生物学的環境から追加の試料を取得すること、前記追加の試料について、前記試料における１つまたは複数の微生物型の存在を検出すること、前記１つまたは複数の微生物型のうちで前記試料において検出されたそれぞれの微生物型の数を決定すること、前記試料における特有の第１のマーカーの数及びその量を測定すること（特有の第１のマーカーはそれぞれ、被検出微生物型の微生物株のマーカーである）、前記それぞれの微生物型の数及び前記特有の第１のマーカーの数から、前記試料におけるそれぞれの微生物株の絶対細胞数を決定すること、それぞれの微生物株に対する少なくとも１つの特有の第２のマーカーを特定の閾値に基づいて測定して前記試料における前記微生物株の活性レベルを決定すること、前記決定された活性によって前記それぞれの微生物株の絶対細胞数をフィルタリングすることで、前記追加の試料についての活性微生物株のリスト及びそのそれぞれの絶対細胞数を得ること、前記追加の試料についての活性微生物株のリスト及びそのそれぞれの絶対細胞数と、それぞれの選択された微生物株の初期量と、を比較すること、前記比較に基づいて、前記選択された微生物株のうちの少なくとも１つに対する補正量を決定すること、ならびに前記選択された微生物株をそれぞれの量（前記選択された微生物株のうちの少なくとも１つに対する補正量を含む）で組み合わせ、担体媒体と一緒にして活性微生物の第２のバイオアンサンブルを形成させること、を含む、前記方法。
【０５３８】
実施形態Ｄ２
前記比較が、各試料における前記活性微生物株と、前記少なくとも１つの測定メタデータと、の共出現を決定することを含む、実施形態Ｄ１に記載の方法。
実施形態Ｄ３
各試料における、前記活性微生物株と、前記少なくとも１つの測定メタデータと、の共出現の決定が、メタデータと微生物株との関連性を示すリンケージならびに前記活性微生物株の絶対細胞数がまとまったマトリックスを創出して１つまたは複数の不均一微生物コミュニティネットワークを示すことを含む、実施形態Ｄ２に記載の方法。
実施形態Ｄ４
前記群化が、活性な不均一微生物コミュニティネットワーク内のそれぞれの活性微生物株と測定メタデータとの連結度を明らかにするノンパラメトリックネットワーク解析及びクラスター解析のうちの少なくとも１つに基づくものである、実施形態Ｄ１、実施形態Ｄ２、または実施形態Ｄ３のいずれか１つに記載の方法。
【０５３９】
実施形態Ｖ１
標的生物学的環境における現存微生物を構成、圧倒、及び／または置換するように構成された活性微生物株のバイオアンサンブルを形成させることを含む方法であって、前記形成が、少なくとも２つの試料セットを取得すること（各試料セットは、少なくとも１つの試料を含み、各試料は、少なくとも１つの共通環境パラメータを共有する）、各試料における複数の微生物型を検出すること、前記複数の微生物型のうちで各試料において検出されたそれぞれの微生物型の絶対細胞数を決定すること、各試料における特有の第１のマーカー及びその量を測定すること（特有の第１のマーカーはそれぞれ、被検出微生物型の微生物株のマーカーである）、各試料に存在するそれぞれの微生物株の絶対細胞数を、前記試料における前記検出されたそれぞれの微生物型の数と、前記試料における前記特有の第１のマーカーの数及びその量と、に基づいて決定すること、それぞれの微生物株に対する少なくとも１つの特有の第２のマーカーを測定して各試料における活性微生物株を決定すること、前記少なくとも２つの試料のそれぞれについての活性微生物株のセット及びそのそれぞれの絶対細胞数を得ること、前記少なくとも２つの試料セットのそれぞれについての少なくとも１つの測定メタデータと共に、前記少なくとも２つの試料セットの各試料についての前記活性微生物株及びそれぞれの絶対細胞数を解析してそれぞれの活性微生物株と測定メタデータとの間の関連性を明らかにすること、前記解析に基づいて前記活性微生物株のセットから複数の活性微生物株を選択すること（前記選択される活性微生物株は、標的生物学的環境における現存微生物の構成、圧倒、及び／または置換のうちの少なくとも１つを生じさせるように選択される）、ならびに前記選択された複数の活性微生物株を、それぞれの株の標的絶対細胞数に基づく用量、前記標的絶対細胞数によって決定される用量、前記標的絶対細胞数から得られる用量、及び／または前記標的絶対細胞数によって判明する用量で、担体媒体と組み合わせることで、標的生物学的環境における現存微生物を構成、圧倒、及び／または置換するように構成された活性微生物のバイオアンサンブルを形成させること、を含む、前記方法。
【０５４０】
実施形態Ｖ２
少なくとも１つの測定メタデータと共に、前記少なくとも２つの試料セットの各試料についての前記活性微生物株及びそれぞれの絶対細胞数を解析することが、ネットワーク内のそれぞれの活性微生物株と前記少なくとも１つの測定メタデータとの連結度を測定するための最大情報係数ネットワーク解析に基づくものである、実施形態Ｖ１に記載の方法。
【０５４１】
実施形態Ｖ３
特有の第１のマーカー及びその量の測定が、各試料に由来するゲノムＤＮＡをハイスループットシークエンシング反応に供すこと、及び／または各試料に由来するゲノムＤＮＡをメタゲノムシークエンシングに供すこと、のうちの少なくとも１つを含む、実施形態Ｖ１に記載の方法。
実施形態Ｖ４
前記特有の第１のマーカーが、ｍＲＮＡマーカー、ｓｉＲＮＡマーカー、及び／またはリボソームＲＮＡマーカー、のうちの少なくとも１つを含む、実施形態Ｖ１に記載の方法。
実施形態Ｖ５
前記特有の第１のマーカーが、シグマ因子、転写因子、ヌクレオシド関連タンパク質、及び／または代謝酵素、のうちの少なくとも１つを含む、実施形態Ｖ１に記載の方法。
実施形態Ｖ６
特有の第１のマーカーの測定が、各試料における特有のゲノムＤＮＡマーカーを測定すること、各試料における特有のＲＮＡマーカーを測定すること、及び／または各試料における特有のタンパク質マーカーを測定すること、のうちの少なくとも１つを含む、Ｖ１に記載の方法。
実施形態Ｖ７
それぞれの微生物株に対する少なくとも１つの特有の第２のマーカーの測定が、前記少なくとも１つの特有の第２のマーカーの発現レベルを測定することを含む、実施形態Ｖ１に記載の方法。
実施形態Ｖ８
前記少なくとも１つの特有の第２のマーカーの発現レベルの測定が、試料ｍＲＮＡを遺伝子発現解析に供すこと、各試料もしくはその一部を質量分析に供すこと、及び／または各試料もしくはその一部をメタリボソームプロファイリングもしくはリボソームプロファイリングに供すこと、のうちの少なくとも１つを含む、実施形態Ｖ１に記載の方法。
【０５４２】
実施形態Ａ１
少なくとも１つの共通の特徴を共有し、かつ少なくとも１つの異なる特徴を有する少なくとも２つの試料を取得すること、各試料について、各試料における１つまたは複数の微生物型の存在を検出すること、前記１つまたは複数の微生物型のうちで各試料において検出されたそれぞれの微生物型の数を決定すること、各試料における特有の第１のマーカーの数及びその量を測定すること（特有の第１のマーカーはそれぞれ、微生物株のマーカーである）、前記それぞれの微生物型の数と前記第１のマーカーの数とを統合して、各試料に存在するそれぞれの微生物株の絶対細胞数を得ること、それぞれの微生物株に対する少なくとも１つの特有の第２のマーカーを特定の閾値に基づいて測定して各試料における前記微生物株の活性レベルを決定すること、前記決定された活性によって前記絶対細胞数をフィルタリングすることで、前記少なくとも２つの試料のそれぞれについての活性微生物株のリスト及びそのそれぞれの絶対細胞数を得ること、前記少なくとも２つの試料のそれぞれについての前記活性微生物株のフィルタリングされた絶対細胞数と、前記少なくとも２つの試料のそれぞれについての少なくとも１つの測定メタデータまたは追加の活性微生物株と、を比較し、前記活性微生物株を、予測される機能及び／または化学に基づいて少なくとも２つの群に分類すること、前記少なくとも２つの群から、少なくとも１つの微生物株を選択すること、ならびに前記少なくとも２つの群に由来する前記選択された少なくとも１つの微生物株を組み合わせることで、前記少なくとも１つのメタデータに対応する特性を変えるように構成された微生物のアンサンブルを形成させること、を含む、方法。
【０５４３】
実施形態Ａ２
前記特有の第１のマーカーの数の測定が、各試料における特有のゲノムＤＮＡマーカーの数を測定することを含む、実施形態Ａ１に記載の方法。
実施形態Ａ３
前記特有の第１のマーカーの数の測定が、各試料における特有のＲＮＡマーカーの数を測定することを含む、実施形態Ａ１に記載の方法。
実施形態Ａ４
前記特有の第１のマーカーの数の測定が、各試料における特有のタンパク質マーカーの数を測定することを含む、実施形態Ａ１に記載の方法。
実施形態Ａ５
前記特有の第１のマーカーの数の測定が、各試料における特有の代謝物マーカーの数を測定することを含む、実施形態Ａ１に記載の方法。
実施形態Ａ６
前記特有の代謝物マーカーの数の測定が、各試料における特有の脂質マーカーの数を測定することを含む、実施形態Ａ５に記載の方法。
実施形態Ａ７
前記特有の代謝物マーカーの数の測定が、各試料における特有の糖質マーカーの数を測定することを含む、実施形態Ａ５に記載の方法。
実施形態Ａ８
前記特有の第１のマーカーの数及びその量の測定が、各試料に由来するゲノムＤＮＡをハイスループットシークエンシング反応に供すことを含む、実施形態Ａ１に記載の方法。
実施形態Ａ９
前記特有の第１のマーカーの数及びその量の測定が、各試料に由来するゲノムＤＮＡをメタゲノムシークエンシングに供すことを含む、実施形態Ａ１に記載の方法。
実施形態Ａ１０
前記特有の第１のマーカーが、ｍＲＮＡマーカー、ｓｉＲＮＡマーカー、及び／またはリボソームＲＮＡマーカー、のうちの少なくとも１つを含む、実施形態Ａ１に記載の方法。
実施形態Ａ１１
前記特有の第１のマーカーが、シグマ因子、転写因子、ヌクレオシド関連タンパク質、及び／または代謝酵素、のうちの少なくとも１つを含む、実施形態Ａ１に記載の方法。
【０５４４】
実施形態Ａ１２
前記少なくとも１つの特有の第２のマーカーの測定が、各試料における前記少なくとも１つの特有の第２のマーカーの発現レベルを測定することを含む、実施形態Ａ１〜Ａ１１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ａ１３
前記少なくとも１つの特有の第２のマーカーの発現レベルの測定が、前記試料におけるｍＲＮＡを遺伝子発現解析に供すことを含む、実施形態Ａ１２に記載の方法。
実施形態Ａ１４
前記遺伝子発現解析が、シークエンシング反応を含む、実施形態Ａ１３に記載の方法。
実施形態Ａ１５
前記遺伝子発現解析が、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、メタトランスクリプトームシークエンシング、及び／またはトランスクリプトームシークエンシングを含む、実施形態Ａ１３に記載の方法。
実施形態Ａ１６
前記少なくとも１つの特有の第２のマーカーの発現レベルの測定が、各試料またはその一部を質量分析に供すことを含む、実施形態Ａ１２に記載の方法。
実施形態Ａ１７
前記少なくとも１つの特有の第２のマーカーの発現レベルの測定が、各試料またはその一部をメタリボソームプロファイリングまたはリボソームプロファイリングに供すことを含む、実施形態Ａ１２に記載の方法。
【０５４５】
実施形態Ａ１８
前記１つまたは複数の微生物型が、細菌、古細菌、真菌、原生動物、植物、他の真核生物、ウイルス、ウイロイド、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態Ａ１〜Ａ１７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ａ１９
前記１つまたは複数の微生物株が、１つまたは複数の細菌株、古細菌株、真菌株、原生動物株、植物株、他の真核生物株、ウイルス株、ウイロイド株、またはそれらの組み合わせである、実施形態Ａ１〜Ａ１８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ａ２０
前記１つもしくは複数の微生物株が、１つもしくは複数の真菌種もしくは真菌亜種であり、及び／または前記１つもしくは複数の微生物株が、１つもしくは複数の細菌種もしくは細菌亜種である、実施形態Ａ１９に記載の方法。
【０５４６】
実施形態Ａ２１
各試料における前記１つまたは複数の微生物型のそれぞれの数の決定が、各試料またはその一部をシークエンシング、遠心分離、光学顕微鏡法、蛍光顕微鏡法、染色、質量分析、マイクロフルイディクス、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、ゲル電気泳動、及び／またはフローサイトメトリーに供すことを含む、実施形態Ａ１〜Ａ２０のいずれか１つに記載の方法。
【０５４７】
実施形態Ａ２２
前記特有の第１のマーカーが、５Ｓリボソームサブユニット遺伝子、１６Ｓリボソームサブユニット遺伝子、２３Ｓリボソームサブユニット遺伝子、５．８Ｓリボソームサブユニット遺伝子、１８Ｓリボソームサブユニット遺伝子、２８Ｓリボソームサブユニット遺伝子、チトクロムｃ酸化酵素サブユニット遺伝子、β−チューブリン遺伝子、伸長因子遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼサブユニット遺伝子、内部転写スペーサー（ＩＴＳ）、またはそれらの組み合わせを含む系統発生学的マーカーを含む、実施形態Ａ１に記載の方法。
【０５４８】
実施形態Ａ２２ａ
前記特有の第１のマーカーが、系統発生学的マーカーを含まない、実施形態Ａ１に記載の方法。
実施形態Ａ２２ｂ
前記特有の第１のマーカーが、５Ｓリボソームサブユニット遺伝子を含む系統発生学的マーカーを含まない、実施形態Ａ１に記載の方法。
実施形態Ａ２２ｃ
前記特有の第１のマーカーが、１６Ｓリボソームサブユニット遺伝子を含む系統発生学的マーカーを含まない、実施形態Ａ１に記載の方法。
実施形態Ａ２２ｄ
前記特有の第１のマーカーが、２３Ｓリボソームサブユニット遺伝子を含む系統発生学的マーカーを含まない、実施形態Ａ１に記載の方法。
実施形態Ａ２２ｅ
前記特有の第１のマーカーが、５．８Ｓリボソームサブユニット遺伝子を含む系統発生学的マーカーを含まない、実施形態Ａ１に記載の方法。
実施形態Ａ２２ｆ
前記特有の第１のマーカーが、１８Ｓリボソームサブユニット遺伝子を含む系統発生学的マーカーを含まない、実施形態Ａ１に記載の方法。
実施形態Ａ２２ｇ
前記特有の第１のマーカーが、２８Ｓリボソームサブユニット遺伝子を含む系統発生学的マーカーを含まない、実施形態Ａ１に記載の方法。
実施形態Ａ２２ｈ
前記特有の第１のマーカーが、チトクロムｃ酸化酵素サブユニット遺伝子を含む系統発生学的マーカーを含まない、実施形態Ａ１に記載の方法。
実施形態Ａ２２ｉ
前記特有の第１のマーカーが、β−チューブリン遺伝子を含む系統発生学的マーカーを含まない、実施形態Ａ１に記載の方法。
実施形態Ａ２２ｊ
前記特有の第１のマーカーが、伸長因子遺伝子を含む系統発生学的マーカーを含まない、実施形態Ａ１に記載の方法。
実施形態Ａ２２ｋ
前記特有の第１のマーカーが、ＲＮＡポリメラーゼサブユニット遺伝子を含む系統発生学的マーカーを含まない、実施形態Ａ１に記載の方法。
実施形態Ａ２２ｌ
前記特有の第１のマーカーが、内部転写スペーサー（ＩＴＳ）を含む系統発生学的マーカーを含まない、実施形態Ａ１に記載の方法。
【０５４９】
実施形態Ａ２３
前記特有のマーカーの数及びその量の測定が、各試料に由来するゲノムＤＮＡをハイスループットシークエンシング反応に供すことを含む、実施形態Ａ２２に記載の方法。
実施形態Ａ２４
前記特有のマーカーの数及びその量の測定が、ゲノムＤＮＡをゲノムシークエンシングに供すことを含む、実施形態Ａ２２に記載の方法。
実施形態Ａ２５
前記特有のマーカーの数及びその量の測定が、ゲノムＤＮＡをアンプリコンシークエンシングに供すことを含む、実施形態Ａ２２に記載の方法。
【０５５０】
実施形態Ａ２６
前記少なくとも１つの異なる特徴が、第１の試料の取得時間と第２の試料の取得時間とが異なるように前記少なくとも２つの試料のそれぞれが取得された取得時間を含む、実施形態Ａ１〜Ａ２５のいずれか１つに記載の方法。
【０５５１】
実施形態Ａ２７
前記少なくとも１つの異なる特徴が、第１の試料の取得位置と第２の試料の取得位置とが異なるように前記少なくとも２つの試料のそれぞれが取得された取得位置を含む、実施形態Ａ１〜Ａ２５のいずれか１つに記載の方法。
【０５５２】
実施形態Ａ２８
前記少なくとも１つの共通の特徴が、第１の試料の試料源型と第２の試料の試料源型とが同一である試料源型を含む、実施形態Ａ１〜Ａ２７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ａ２９
前記試料源型が、動物型、器官型、土壌型、水型、堆積物型、油型、植物型、農産物型、バルク土壌型、土壌根圏型、または植物部分型のうちの１つである、実施形態Ａ２８に記載の方法。
【０５５３】
実施形態Ａ３０
前記少なくとも１つの共通の特徴が、前記少なくとも２つの試料のそれぞれが消化管  試料であることを含む、実施形態Ａ１〜Ａ２７のいずれか１つに記載の方法。
【０５５４】
実施形態Ａ３１
前記少なくとも１つの共通の特徴が、動物試料源型を含むと共に、各試料が、追加の共通の特徴を有し、その結果、各試料が、組織試料、血液試料、歯試料、汗試料、爪試料、皮膚試料、毛髪試料、糞便試料、尿試料、精液試料、粘液試料、唾液試料、筋肉試料、脳試料、または器官試料である、実施形態Ａ１〜Ａ２７のいずれか１つに記載の方法。
【０５５５】
実施形態Ａ３２
前記少なくとも１つの測定メタデータに基づいて標的から少なくとも１つの追加の試料を取得すること（前記標的に由来する前記少なくとも１つの追加の試料は、前記少なくとも２つの試料と少なくとも１つの共通の特徴を共有する）、ならびに前記標的に由来する前記少なくとも１つの追加の試料について、１つまたは複数の微生物型の存在を検出すること、前記１つまたは複数の微生物型のうちで検出されたそれぞれの微生物型の数を決定すること、特有の第１のマーカーの数及びその量を測定すること、前記それぞれの微生物型の数と前記第１のマーカーの数とを統合して、存在するそれぞれの微生物株の絶対細胞数を得ること、それぞれの微生物株に対する少なくとも１つの特有の第２のマーカーを測定して前記微生物株の活性レベルを決定すること、前記決定された活性によって前記絶対細胞数をフィルタリングすることで、前記標的に由来する前記少なくとも１つの追加の試料についての活性微生物株のリスト及びそのそれぞれの絶対細胞数を得ること、をさらに含む、実施形態Ａ１〜Ａ３１のいずれか１つに記載の方法であって、前記少なくとも２つの群のそれぞれからの前記少なくとも１つの微生物株の選択が、前記標的に由来する前記少なくとも１つの追加の試料についての前記活性微生物株のリスト及びそのそれぞれの絶対細胞数に基づくものであり、その結果、前記形成されるアンサンブルが、前記少なくとも１つのメタデータに対応する前記標的の特性を変えるように構成される、前記方法。
【０５５６】
実施形態Ａ３３
前記少なくとも２つの試料のそれぞれについての前記活性微生物株のフィルタリングされた絶対細胞数と、前記少なくとも２つの試料のそれぞれについての少なくとも１つの測定メタデータまたは追加の活性微生物株と、の比較が、各試料における前記１つまたは複数の活性微生物株と、前記少なくとも１つの測定メタデータまたは追加の活性微生物株と、の共出現を決定することを含む、実施形態Ａ１〜Ａ３２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ａ３４
前記少なくとも１つの測定メタデータが、１つまたは複数のパラメータを含み、前記１つまたは複数のパラメータが、試料ｐＨ、試料温度、脂肪の存在量、タンパク質の存在量、糖質の存在量、ミネラルの存在量、ビタミンの存在量、天然物の存在量、特定の化合物の存在量、前記試料源の体重、前記試料源の飼料摂取量、前記試料源の体重増加、前記試料源の飼料効率、１つもしくは複数の病原体の存在もしくは不在、前記試料源の物理的な特徴（複数可）もしくは測定値（複数可）、前記試料源の産生特徴、またはそれらの組み合わせ、のうちの少なくとも１つである、実施形態Ａ３３に記載の方法。
実施形態Ａ３５
前記１つまたは複数のパラメータが、乳汁における乳清タンパク質の存在量、カゼインタンパク質の存在量、及び／または脂肪の存在量、のうちの少なくとも１つである、実施形態Ａ３４に記載の方法。
【０５５７】
実施形態Ａ３６
各試料における、前記１つまたは複数の活性微生物株と、前記少なくとも１つの測定メタデータと、の共出現の決定が、メタデータと微生物株との関連性を示すリンケージ、前記１つまたは複数の活性微生物株の絶対細胞数、ならびに前記１つまたは複数の特有の第２のマーカーの測定値、がまとまったマトリックスを創出して不均一微生物コミュニティ（複数可）の１つまたは複数のネットワークを示すことを含む、実施形態Ａ３３〜Ａ３５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ａ３７
前記少なくとも１つの測定メタデータが、第２の微生物株の存在、活性、及び／または量を含む、実施形態Ａ３６に記載の方法。
【０５５８】
実施形態Ａ３８
前記１つまたは複数の活性微生物株と、前記少なくとも１つの測定メタデータと、の共出現を決定し、前記活性微生物株を分類することが、ネットワーク内のそれぞれの微生物株の連結度を測定するためのネットワーク解析及び／またはクラスター解析を含み、前記ネットワークが、共通の特徴、測定メタデータ、及び／または関連環境パラメータを共有する前記少なくとも２つの試料がまとまったものを示す、実施形態Ａ３３〜Ａ３７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ａ３９
前記少なくとも１つの測定メタデータが、第２の微生物株の存在、活性、及び／または量を含む、実施形態Ａ３８に記載の方法。
実施形態Ａ４０
前記ネットワーク解析及び／またはクラスター解析が、連鎖解析、モジュラリティ解析、頑健性測定、媒介性測定、連結度測定、推移性測定、中心性測定、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態Ａ３８または実施形態Ａ３９に記載の方法。
実施形態Ａ４１
前記クラスター解析が、連結度モデル、部分空間モデル、分布モデル、密度モデル、または重心モデルを構築するものを含む、実施形態Ａ３８〜Ａ４０のいずれか１つに記載の方法。
【０５５９】
実施形態Ａ４２
前記ネットワーク解析が、リンクのマイニング及び予測、集団分類、リンクに基づくクラスタリング、関連類似度、またはそれらの組み合わせを介するネットワークの予測モデリングを含む、実施形態Ａ３８または実施形態Ａ３９に記載の方法。
実施形態Ａ４３
前記ネットワーク解析が、微分方程式に基づく集団のモデリングを含む、実施形態Ａ３８または実施形態３Ａ９に記載の方法。
実施形態Ａ４４
前記ネットワーク解析が、Ｌｏｔｋａ−Ｖｏｌｔｅｒｒａモデリングを含む、実施形態Ａ４３に記載の方法。
実施形態Ａ４５
前記クラスター解析が、ヒューリスティックな方法である、実施形態Ａ３８または実施形態Ａ３９に記載の方法。
実施形態Ａ４６
前記ヒューリスティックな方法が、Ｌｏｕｖａｉｎ法である、実施形態Ａ４５に記載の方法。
【０５６０】
実施形態Ａ４７
前記ネットワーク解析が、変数間の連結度を確立するためのノンパラメトリック法を含む、実施形態Ａ３８または実施形態Ａ３９に記載の方法。
実施形態Ａ４８
前記ネットワーク解析が、連結度を確立するための、変数間の相互情報量及び／または最大情報係数の計算を含む、実施形態Ａ３８または実施形態Ａ３９に記載の方法。
【０５６１】
実施形態Ａ４９
環境の特性または特徴を変えるように構成された活性微生物株のアンサンブルを２つ以上の試料セットに基づいて形成するための方法であって、前記２つ以上の試料セットが、前記２つ以上の試料セットの間で少なくとも１つの共通または関連する環境パラメータを共有し、かつ前記２つ以上の試料セットの間で少なくとも１つの異なる環境パラメータを有するものであり、各試料セットが、不均一微生物コミュニティを含む少なくとも１つの試料を含み、前記１つまたは複数の微生物株が、１つまたは複数の生物型の亜分類群であり、前記方法が、各試料における複数の微生物型の存在を検出すること、各試料において検出された微生物型のそれぞれの絶対細胞数を決定すること、各試料における特有の第１のマーカーの数及びその量を測定すること（特有の第１のマーカーは、微生物株のマーカーである）、タンパク質レベルまたはＲＮＡレベルで１つまたは複数の特有の第２のマーカーの発現レベルを測定すること（特有の第２のマーカーは、微生物株の活性のマーカーである）、前記１つまたは複数の特有の第２のマーカーの特定の閾値を上回る発現レベルに基づいて、各試料について前記検出された微生物株の活性を決定すること、前記１つまたは複数の第１のマーカーの量と、前記１つまたは複数の微生物株が亜分類群となる由来元の前記微生物型の絶対細胞数と、に基づいて、各試料における検出されたそれぞれの活性微生物株の絶対細胞数を計算すること（前記１つまたは複数の活性微生物株は、前記特有の第２のマーカーを前記特定の閾値を上回って発現する）、前記試料における前記活性微生物株と、少なくとも１つの環境パラメータまたは追加の活性微生物株と、の共出現を、ネットワーク内のそれぞれの微生物株の連結度を測定するための最大情報係数ネットワーク解析に基づいて決定すること（前記ネットワークは、前記少なくとも２つ以上の試料セットが少なくとも１つの共通または関連する環境パラメータと共にまとまったものである）、前記ネットワーク解析に基づいて前記１つまたは複数の活性微生物株から複数の活性微生物株を選択すること、ならびに前記選択された複数の活性微生物株から活性微生物株のアンサンブルを形成させること（前記活性微生物株のアンサンブルは、前記活性微生物株のアンサンブルが環境に導入されたときに前記環境の特性または特徴を選択的に変えるように構成される）、を含む、前記方法。
【０５６２】
実施形態Ａ５０
前記少なくとも１つの環境パラメータが、第２の微生物株の存在、活性、及び／または量を含む、実施形態Ａ４９に記載の方法。
実施形態Ａ５１
第１の試料セットについての少なくとも１つの共通または関連する環境因子の少なくとも１つの測定識別指標が、第２の試料セットについての前記少なくとも１つの共通または関連する環境因子の測定識別指標とは異なる、実施形態Ａ４９または実施形態Ａ５０に記載の方法。
【０５６３】
実施形態Ａ５２
各試料セットが、複数の試料を含み、試料セット内の各試料についての少なくとも１つの共通または関連する環境因子の測定識別指標が、実質的に同様であり、１つの試料セットについての平均測定識別指標が、別の試料セットに由来する前記平均測定識別指標と異なる、実施形態Ａ４９または実施形態Ａ５０に記載の方法。
実施形態Ａ５３
各試料セットが、複数の試料を含み、第１の試料セットが、第１の集団から取得され、第２の試料セットが、第２の集団から取得される、実施形態Ａ４９または実施形態Ａ５０に記載の方法。
実施形態Ａ５４
各試料セットが、複数の試料を含み、第１の試料セットが、第１の時点で第１の集団から取得され、第２の試料セットが、前記第１の時点とは異なる第２の時点で前記第１の集団から取得される、実施形態Ａ４９または実施形態Ａ５０に記載の方法。
実施形態Ａ５５
少なくとも１つの共通または関連する環境因子が、栄養素情報を含む、実施形態Ａ４９〜Ａ５４のいずれか１つに記載の方法。
【０５６４】
実施形態Ａ５６
少なくとも１つの共通または関連する環境因子が、食物情報を含む、実施形態Ａ４９〜Ａ５４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ａ５７
少なくとも１つの共通または関連する環境因子が、動物特徴を含む、実施形態Ａ４９〜Ａ５４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ａ５８
少なくとも１つの共通または関連する環境因子が、感染情報または健康状態を含む、実施形態Ａ４９〜Ａ５４のいずれか１つに記載の方法。
【０５６５】
実施形態Ａ５９
少なくとも１つの測定識別指標が、試料ｐＨ、試料温度、脂肪の存在量、タンパク質の存在量、糖質の存在量、ミネラルの存在量、ビタミンの存在量、天然物の存在量、特定の化合物の存在量、前記試料源の体重、前記試料源の飼料摂取量、前記試料源の体重増加、前記試料源の飼料効率、１つもしくは複数の病原体の存在もしくは不在、前記試料源の物理的な特徴（複数可）もしくは測定値（複数可）、前記試料源の産生特徴、またはそれらの組み合わせである、実施形態Ａ５１に記載の方法。
【０５６６】
実施形態Ａ６０
前記少なくとも１つのパラメータが、乳汁における乳清タンパク質の存在量、カゼインタンパク質の存在量、及び／または脂肪の存在量、のうちの少なくとも１つである、実施形態Ａ４９または実施形態Ａ５０に記載の方法。
実施形態Ａ６１
各試料における前記特有の第１のマーカーの数の測定が、特有のゲノムＤＮＡマーカーの数を測定することを含む、実施形態Ａ４９〜Ａ６０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ａ６２
前記試料における前記特有の第１のマーカーの数の測定が、特有のＲＮＡマーカーの数を測定することを含む、実施形態Ａ４９〜Ａ６０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ａ６３
前記試料における前記特有の第１のマーカーの数の測定が、特有のタンパク質マーカーの数を測定することを含む、実施形態Ａ４９〜Ａ６０のいずれか１つに記載の方法。
【０５６７】
実施形態Ａ６４
前記複数の微生物型が、１つまたは複数の細菌、古細菌、真菌、原生動物、植物、他の真核生物、ウイルス、ウイロイド、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態Ａ４９〜Ａ６３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ａ６５
各試料における前記微生物型のそれぞれの絶対細胞数の決定が、前記試料またはその一部をシークエンシング、遠心分離、光学顕微鏡法、蛍光顕微鏡法、染色、質量分析、マイクロフルイディクス、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、ゲル電気泳動、及び／またはフローサイトメトリーに供すことを含む、実施形態Ａ４９〜Ａ６４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ａ６６
１つまたは複数の活性微生物株が、１つまたは複数の細菌、古細菌、真菌、原生動物、植物、他の真核生物、ウイルス、ウイロイド、またはそれらの組み合わせから選択される１つまたは複数の微生物型の亜分類群である、実施形態Ａ４９〜Ａ６５のいずれか１つに記載の方法。
【０５６８】
実施形態Ａ６７
１つまたは複数の活性微生物株が、１つまたは複数の細菌株、古細菌株、真菌株、原生動物株、植物株、他の真核生物株、ウイルス株、ウイロイド株、またはそれらの組み合わせである、実施形態Ａ４９〜Ａ６５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ａ６８
１つまたは複数の活性微生物株が、１つまたは複数の真菌種、真菌亜種、細菌種、及び／または細菌亜種である、実施形態Ａ４９〜Ａ６７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ａ６９
少なくとも１つの特有の第１のマーカーが、５Ｓリボソームサブユニット遺伝子、１６Ｓリボソームサブユニット遺伝子、２３Ｓリボソームサブユニット遺伝子、５．８Ｓリボソームサブユニット遺伝子、１８Ｓリボソームサブユニット遺伝子、２８Ｓリボソームサブユニット遺伝子、チトクロムｃ酸化酵素サブユニット遺伝子、ベータ−チューブリン遺伝子、伸長因子遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼサブユニット遺伝子、内部転写スペーサー（ＩＴＳ）、またはそれらの組み合わせを含む系統発生学的マーカーを含む、実施形態Ａ４９〜Ａ６８のいずれか１つに記載の方法。
【０５６９】
実施形態Ａ７０
前記特有の第１のマーカーの数及びその量の測定が、各試料に由来するゲノムＤＮＡをハイスループットシークエンシング反応に供すことを含む、実施形態Ａ４９または実施形態Ａ５０に記載の方法。
実施形態Ａ７１
前記特有の第１のマーカーの数及びその量の測定が、各試料に由来するゲノムＤＮＡをメタゲノムシークエンシングに供すことを含む、実施形態Ａ４９または実施形態Ａ５０に記載の方法。
実施形態Ａ７２
特有の第１のマーカーが、ｍＲＮＡマーカー、ｓｉＲＮＡマーカー、またはリボソームＲＮＡマーカーを含む、実施形態Ａ４９または実施形態Ａ５０に記載の方法。
実施形態Ａ７３
特有の第１のマーカーが、シグマ因子、転写因子、ヌクレオシド関連タンパク質、代謝酵素、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態Ａ４９または実施形態Ａ５０に記載の方法。
【０５７０】
実施形態Ａ７４
前記１つまたは複数の特有の第２のマーカーの発現レベルの測定が、前記試料におけるｍＲＮＡを遺伝子発現解析に供すことを含む、実施形態Ａ４９〜Ａ７３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ａ７５
前記遺伝子発現解析が、シークエンシング反応を含む、実施形態Ａ７４に記載の方法。
実施形態Ａ７６
前記遺伝子発現解析が、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、メタトランスクリプトームシークエンシング、及び／またはトランスクリプトームシークエンシングを含む、実施形態Ａ７４に記載の方法。
【０５７１】
実施形態Ａ７７
前記１つまたは複数の特有の第２のマーカーの発現レベルの測定が、各試料またはその一部を質量分析に供すことを含む、実施形態Ａ４９〜Ａ６８及び実施形態Ａ７４〜Ａ７６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ａ７８
前記１つまたは複数の特有の第２のマーカーの発現レベルの測定が、前記試料またはその一部をメタリボソームプロファイリング及び／またはリボソームプロファイリングに供すことを含む、実施形態Ａ４９〜Ａ６８及び実施形態Ａ７４〜Ａ７６のいずれか１つに記載の方法。
【０５７２】
実施形態Ａ７９
前記試料の取得源の型が、動物、土壌、空気、塩水、淡水、廃水汚泥、堆積物、油、植物、農産物、バルク土壌、土壌根圏、植物部分、野菜、極限環境、またはそれらの組み合わせ、のうちの１つである、実施形態Ａ４９〜Ａ７８のいずれか１つに記載の方法。
【０５７３】
実施形態Ａ８０
各試料が、消化管試料である、実施形態Ａ４９〜Ａ７８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ａ８１
各試料が、組織試料、血液試料、歯試料、汗試料、爪試料、皮膚試料、毛髪試料、糞便試料、尿試料、精液試料、粘液試料、唾液試料、筋肉試料、脳試料、または器官試料のうちの１つである、実施形態Ａ４９〜Ａ７８のいずれか１つに記載の方法。
【０５７４】
実施形態Ａ８２
プロセッサによって実施される方法であって、前記方法が、少なくとも１つの共通の特徴を共有し、かつ少なくとも１つの異なる特徴を有する少なくとも２つの試料から試料データを入手すること、各試料について各試料における１つまたは複数の微生物型の存在を決定すること、前記１つまたは複数の微生物型のうちで各試料において検出されたそれぞれの微生物型の数を決定すること、各試料における特有の第１のマーカーの数及びその量を決定すること（特有の第１のマーカーはそれぞれ、微生物株のマーカーである）、前記それぞれの微生物型の数と前記第１のマーカーの数とを、プロセッサを介して統合して、各試料に存在するそれぞれの微生物株の絶対細胞数を得ること、それぞれの微生物株に対する少なくとも１つの特有の第２のマーカーの特定の閾値を上回る測定値に基づいて各試料におけるそれぞれの微生物株の活性レベルを決定すること（微生物株は、前記株に対する少なくとも１つの特有の第２のマーカーの測定値が対応閾値を上回るであれば、活性であると同定する）、前記決定された活性によって前記それぞれの微生物株の絶対細胞数をフィルタリングすることで、前記少なくとも２つの試料のそれぞれについての活性微生物株のリスト及びそのそれぞれの絶対細胞数を得ること、前記少なくとも２つの試料のそれぞれについての少なくとも１つの測定メタデータまたは追加の活性微生物株と共に、前記少なくとも２つの試料のそれぞれについての前記活性微生物株のフィルタリングされた絶対細胞数のネットワーク解析を、少なくとも１つのプロセッサを介して実施すること（前記ネットワーク解析は、それぞれの活性微生物株と他のあらゆる活性微生物株との間の最大情報係数スコアを決定すること、及びそれぞれの活性微生物株とそれぞれの少なくとも１つの測定メタデータまたは追加の活性微生物株の間の最大情報係数スコアを決定することを含む）、予測される機能及び／または化学に基づいて前記活性微生物株を分類すること、前記分類に基づいて複数の活性微生物株を同定すること、ならびに前記同定された複数の活性微生物株を出力すること、を含む、前記方法。
【０５７５】
実施形態Ａ８３
標的に適用されると、前記少なくとも１つの測定メタデータに対応する特性を変えるように構成された活性微生物アンサンブルを構築することをさらに含む、実施形態Ａ８２に記載の、プロセッサによって実施される方法。
実施形態Ａ８４
前記出力された複数の活性微生物株が、活性微生物アンサンブルの構築に使用され、前記活性微生物アンサンブルが、標的に適用されると、前記少なくとも１つの測定メタデータに対応する特性を変えるように構成される、実施形態Ａ８２に記載の、プロセッサによって実施される方法。
実施形態Ａ８５
前記出力された複数の同定活性微生物株に基づいて少なくとも１つの病原体を同定することをさらに含む、実施形態Ａ８２に記載の、プロセッサによって実施される方法。
実施形態Ａ８６
前記出力された複数の活性微生物株が、活性微生物アンサンブルの構築にさらに使用され、前記活性微生物アンサンブルが、標的に適用されると、前記少なくとも１つの同定病原体を標的とし、前記少なくとも１つの同定病原体と関連する症状を治療及び／または予防するように構成される、実施形態Ａ８２〜Ａ８５のいずれか１つに記載の、プロセッサによって実施される方法。
【０５７６】
実施形態Ａ８７
標的生物学的環境の特性を変えるように構成された活性微生物株の活性微生物バイオアンサンブルの形成方法であって、前記方法が、少なくとも１つの共通の特徴を共有し、かつ少なくとも１つの異なる特徴を有する少なくとも２つの試料を取得すること、各試料について、各試料における１つまたは複数の微生物型の存在を検出すること、前記１つまたは複数の微生物型のうちで各試料において検出されたそれぞれの微生物型の数を決定すること、各試料における特有の第１のマーカーの数及びその量を測定すること（特有の第１のマーカーはそれぞれ、微生物株のマーカーである）、前記それぞれの微生物型の数と前記第１のマーカーの数とを統合して、各試料に存在するそれぞれの微生物株の絶対細胞数を得ること、それぞれの微生物株に対する少なくとも１つの特有の第２のマーカーを特定の閾値に基づいて測定して各試料における前記微生物株の活性レベルを決定すること、前記決定された活性によって前記絶対細胞数をフィルタリングすることで、前記少なくとも２つの試料のそれぞれについての活性微生物株のリスト及びそのそれぞれの絶対細胞数を得ること、前記少なくとも２つの試料のそれぞれについての前記活性微生物株のフィルタリングされた絶対細胞数と、前記少なくとも２つの試料のそれぞれについての少なくとも１つの測定メタデータと、を比較すること（前記比較は、各試料における前記活性微生物株と、前記少なくとも１つの測定メタデータと、の共出現を決定することを含み、各試料における、前記活性微生物株と、前記少なくとも１つの測定メタデータと、の共出現の決定は、メタデータと微生物株との関連性を示すリンケージ、前記活性微生物株の絶対細胞数、ならびに前記特有の第２のマーカーの測定値、がまとまったマトリックスを創出して１つまたは複数の不均一微生物コミュニティネットワークを示すことを含む）、活性な不均一微生物コミュニティネットワーク内のそれぞれの活性微生物株と測定メタデータとの連結度を明らかにするノンパラメトリックネットワーク解析及びクラスター解析のうちの少なくとも１つに基づいて予測される機能及び／または化学に従って前記活性微生物株を少なくとも２つの群に群化すること、前記少なくとも２つの群のそれぞれから少なくとも１つの微生物株を選択すること、ならびに前記選択された微生物株を組み合わせ、担体媒体と一緒にして活性微生物のバイオアンサンブルを形成させること（前記バイオアンサンブルは、前記バイオアンサンブルが標的生物学的環境に導入されると前記標的生物学的環境の前記少なくとも１つのメタデータに対応する特性を変えるように構成される）、を含む、前記方法。
【０５７７】
実施形態Ａ８８
前記少なくとも１つの測定メタデータに基づいて少なくとも１つの追加の試料を取得すること（前記少なくとも１つの追加の試料は、前記少なくとも２つの試料と少なくとも１つの特徴を共有する）、ならびに前記少なくとも１つの追加の試料について、１つまたは複数の微生物型の存在を検出すること、前記１つまたは複数の微生物型のうちで検出されたそれぞれの微生物型の数を決定すること、特有の第１のマーカーの数及びその量を測定すること、前記それぞれの微生物型の数と前記第１のマーカーの数とを統合して、存在するそれぞれの微生物株の絶対細胞数を得ること、それぞれの微生物株に対する少なくとも１つの特有の第２のマーカーを測定して前記微生物株の活性レベルを決定すること、前記決定された活性によって前記絶対細胞数をフィルタリングすることで、前記少なくとも１つの追加の試料についての活性微生物株のリスト及びそのそれぞれの絶対細胞数を得ること、をさらに含む、実施形態Ａ８７に記載の方法であって、前記活性微生物株のフィルタリングされた絶対細胞数の比較が、前記少なくとも１つの測定メタデータと共に、前記少なくとも２つの試料のそれぞれについての前記活性微生物株のフィルタリングされた絶対細胞数と、前記少なくとも１つの追加の試料についての前記活性微生物株のフィルタリングされた絶対細胞数と、を比較することを含み、その結果、前記活性微生物株の選択が、前記少なくとも１つの追加の試料についての前記活性微生物株のリスト及びそのそれぞれの絶対細胞数に少なくとも部分的に基づくものとなる、前記方法。
【０５７８】
実施形態Ａ８９
生物学的環境の特性を変えるように構成された活性微生物株の合成アンサンブルを形成するための方法であって、前記方法が、複数の環境パラメータをそれぞれが有する２つ以上の試料セットに基づいており、前記複数の環境パラメータの少なくとも１つのパラメータが、前記２つ以上の試料セットの間で同様の共通環境パラメータであり、少なくとも１つの環境パラメータが、前記２つ以上の試料セットのそれぞれの間で異なる別の環境パラメータであり、各試料セットが、生物学的試料源から取得された不均一微生物コミュニティを含む少なくとも１つの試料を含み、前記活性微生物株の少なくとも１つが、１つまたは複数の生物型の亜分類群であり、前記方法が、各試料における複数の微生物型の存在を検出すること、各試料において検出された微生物型のそれぞれの絶対細胞数を決定すること、各試料における特有の第１のマーカーの数及びその量を測定すること（特有の第１のマーカーは、微生物株のマーカーである）、１つまたは複数の特有のＲＮＡマーカーの発現レベルを測定すること（特有のＲＮＡマーカーは、微生物株の活性のマーカーである）、前記１つまたは複数の特有のＲＮＡマーカーの特定の閾値を上回る発現レベルに基づいて、各試料について前記検出された微生物株のそれぞれの活性を決定すること、前記１つまたは複数の第１のマーカーの量と、前記１つまたは複数の微生物株が亜分類群となる由来元の前記微生物型の絶対細胞数と、に基づいて、各試料における検出されたそれぞれの活性微生物株の絶対細胞数を計算すること（前記１つまたは複数の活性微生物株は、１つまたは複数の特有のＲＮＡマーカーを前記特定の閾値を上回って発現する）、前記２つ以上の試料セットの前記活性微生物株を解析すること（前記解析は、前記２つ以上の試料セットのそれぞれの前記活性微生物株のそれぞれと、前記少なくとも１つの共通環境パラメータと、前記少なくとも１つの異なる環境パラメータと、のノンパラメトリックネットワーク解析を実施することを含み、前記ノンパラメトリックネットワーク解析は、（１）それぞれの活性微生物株と他のあらゆる活性微生物株との間の最大情報係数スコアを決定すること、ならびに（２）それぞれの活性微生物株と前記少なくとも１つの異なる環境パラメータとの間の最大情報係数スコアを決定することを含む）、前記ノンパラメトリックネットワーク解析に基づいて前記１つまたは複数の活性微生物株から複数の活性微生物株を選択すること、ならびに前記選択された複数の活性微生物株及び微生物担体媒体を含む活性微生物株の合成アンサンブルを形成させること（前記活性微生物株のアンサンブルは、前記活性微生物株の合成アンサンブルが生物学的環境に導入されると、前記生物学的環境の特性を選択的に変えるように構成される）、を含む、前記方法。
【０５７９】
実施形態Ａ９０
標的生物学的環境の特性を変えるように構成された活性微生物バイオアンサンブルの形成方法であって、前記方法が、少なくとも１つの共通環境パラメータを共有し、かつ少なくとも１つの異なる環境パラメータを有する少なくとも２つの試料を取得すること、各試料について、各試料における１つまたは複数の微生物型の存在を検出すること、前記１つまたは複数の微生物型のうちで各試料において検出されたそれぞれの微生物型の数を決定すること、各試料における特有の第１のマーカーの数及びその量を測定すること（特有の第１のマーカーはそれぞれ、被検出微生物型の微生物株のマーカーである）、前記検出されたそれぞれの微生物型の数と、前記微生物型に対応または関連する特有の第１のマーカーの比例数／相対数と、に基づいて、各試料に存在するそれぞれの微生物株の絶対細胞数を決定すること、それぞれの微生物株に対する少なくとも１つの特有の第２のマーカーを特定の閾値に基づいて測定して各試料における前記微生物株の活性レベルを決定すること、前記決定された活性によって前記それぞれの微生物株の絶対細胞数をフィルタリングすることで、前記少なくとも２つの試料のそれぞれについての活性微生物株のリストまたはセット及びそのそれぞれの絶対細胞数を得ること、前記少なくとも２つの試料のそれぞれについての前記活性微生物株のフィルタリングされた絶対細胞数と、前記少なくとも２つの試料のそれぞれについての少なくとも１つの測定メタデータと、を比較すること（前記比較は、各試料における前記活性微生物株と、前記少なくとも１つの測定メタデータと、の共出現を決定することを含み、各試料における、前記活性微生物株と、前記少なくとも１つの測定メタデータと、の共出現の決定は、メタデータと微生物株との関連性を示すリンケージ、前記活性微生物株の絶対細胞数、ならびに前記特有の第２のマーカーの測定値、がまとまったマトリックスを創出して１つまたは複数の不均一微生物コミュニティネットワークを示すことを含む）、活性な不均一微生物コミュニティネットワーク内のそれぞれの活性微生物株と測定メタデータとの連結度を明らかにするノンパラメトリックネットワーク解析及びクラスター解析のうちの少なくとも１つに基づいて予測される機能及び／または化学に従って前記活性微生物株を少なくとも２つの群に群化すること、前記少なくとも２つの群のそれぞれから少なくとも１つの微生物株を選択すること、前記選択された微生物株を組み合わせ、担体媒体と一緒にして活性微生物の合成バイオアンサンブルを形成させること（前記合成バイオアンサンブルは、前記バイオアンサンブルを標的生物学的環境に導入すると、前記標的生物学的環境の前記少なくとも１つのメタデータに対応する特性を変えるように構成される）、を含む、前記方法。
【０５８０】
追加の実施形態には、１つまたは複数の生物反応性の改変剤が含まれ、こうした生物反応性の改変剤には、限定はされないが、１つまたは複数の活性微生物株及び担体を含む微生物アンサンブルを含む生物反応性の改変剤が含まれ、生物反応性の改変剤は、開示の方法の１つまたは複数に基づいて開示の方法を介して同定／選択された１つまたは複数の微生物株を含み得、開示の方法１つまたは複数を介して同定された経路を標的とするなどする。
【０５８１】
本開示は、その特定の実施形態を参照して明らかにされているが、本開示の真の趣旨及び範囲を逸脱することなく、さまざまな変更を実施できると共に、同等形態での置き換えもできることを当業者なら理解するであろう。さらに、記載の実施形態及び開示の目的の趣旨及び範囲に特定の状況、材料、組成物、プロセス、またはプロセス段階（複数可）が適合するように、多くの改変を実施することができる。そのような改変はすべて、本開示の範囲に含まれることが意図される。本明細書で参照される特許、特許出願、特許出願刊行物、学術論文、及びプロトコールは、あらゆる目的のために参照によってその全体が組み込まれる。こうした文献には、下記のＰＣＴ出願刊行物が含まれる：ＷＯ／２０１６／２１０２５１、ＷＯ／２０１７／１２０４９５、及びＷＯ／２０１７／１８１２０３。
【０５８２】
さまざまな実施形態が本明細書に記載及び例示されているが、本明細書に記載の機能の実施、及び／または本明細書に記載の結果の獲得、及び／または本明細書に記載の利点の１つもしくは複数、を達成するためのさまざまな他の方法及び／または構造を当業者なら容易に思い付くであろう。そのような変形形態及び／または改変形態はそれぞれ、本開示の範囲に含まれるものと見なされる。より一般的には、本明細書に記載のパラメータ、寸法、材料、及び構成は、例示のものとして提供されており、実際のパラメータ、寸法、材料、及び／または構成は、開示の教示内容が使用される特定の用途（複数可）または実施態様（複数可）に依存することになることを当業者なら容易に理解するであろう。当業者なら日常的な実験手法を使用するだけで、本明細書に記載の特定の実施形態に対する同等形態を認識するか、または確認可能であろう。したがって、前述の実施形態は、例として示されるものにすぎず、添付の特許請求の範囲及びそこに記載のものの同等形態の範囲内で、具体的に記載及び請求されるもの以外の形で実施形態を実施できると理解されたい。本開示の実施形態は、本明細書に記載のそれぞれの個々の特徴、システム、物品、材料、キット、及び／または方法を対象とする。さらに、そのような特徴、システム、物品、材料、キット、及び／または方法を２つ以上組み合わせたものはいずれも、そのような特徴、システム、物品、材料、キット、及び／または方法が相互に矛盾しないのであれば、本開示の範囲に含まれる。
【０５８３】
上記の実施形態は、多数の方法のいずれでも実施することができる。例えば、実施形態は、ハードウェア、ソフトウェア、またはそれらの組み合わせを使用して実施することができる。ソフトウェアにおいて実施されるとき、ソフトウェアコードは、任意の適切なプロセッサまたはプロセッサの集合物で実行することができ、こうしたプロセッサまたはプロセッサの集合物が、単一のコンピュータにおいて提供されるか、または複数のコンピュータにまたがって分散しているものであるかは問われない。
【０５８４】
さらに、開示の方法をコンピュータと組み合わせて使用できることを理解されよう。こうしたコンピュータは、ラックマウント型コンピュータ、デスクトップコンピュータ、ラップトップコンピュータ、またはタブレットコンピュータなどの、いくつかの形態のいずれにおいても具体化することができる。さらに、コンピュータとは一般に見なされないが、適切な処理能力を有するデバイスにコンピュータを組み込むことができ、こうしたデバイスには、タブレット、携帯情報端末（ＰＤＡ）、スマートフォン、または任意の他の適切な携帯式または固定式の電子デバイスが含まれる。
【０５８５】
また、コンピュータは、１つまたは複数のディスプレイを含めて、１つまたは複数の入力デバイス及び出力デバイスを有し得る。こうしたデバイスは、数ある中でも特に、ユーザーインターフェースを提供するために使用することができる。ユーザーインターフェースを提供するために使用することができる出力デバイスの例には、出力結果を視覚的に表示するためのプリンターまたは表示画面、及び出力結果を音で示すためのスピーカーまたは他の音発生デバイスが含まれる。ユーザーインターフェースのために使用することができる入力デバイスの例には、キーボード、ならびにポインティングデバイス（マウス、タッチパッド、及びデジタイズタブレットなど）が含まれる。別の例として、コンピュータは、音声認識を介すか、または他の音形式で、入力情報を受信することができる。
【０５８６】
そのようなコンピュータは、任意の適切な形式で１つまたは複数のネットワークによって相互接続することができ、こうしたネットワークには、ローカルエリアネットワークまたはワイドエリアネットワーク（企業ネットワークなど）、及びインテリジェントネットワーク（ＩＮ）またはインターネットが含まれる。そのようなネットワークは、任意の適切な技術に基づくものであり得、任意の適切なプロトコールに従って運用することができ、無線ネットワーク、有線ネットワーク、または光ファイバーネットワークを含み得る。
【０５８７】
本明細書に概要が記載されるさまざまな方法及びプロセス（及び／またはその一部）は、さまざまなオペレーティングシステムまたはプラットフォームのいずれか１つを利用する１つまたは複数のプロセッサで実行可能なソフトウェアとしてコード化することができる。さらに、そのようなソフトウェアは、いくつかの適切なプログラミング言語及び／またはプログラミングツールもしくはスクリプト作成ツールのいずれかを使用して記述することができると共に、実行可能なマシン語コードまたはフレームワークもしくは仮想マシンで実行される中間コードとしてコンパイルすることもできる。
【０５８８】
この点において、１つまたは複数のプログラムがコード化されたコンピュータ可読記憶媒体（または複数のコンピュータ可読記憶媒体）（例えば、コンピュータメモリ、１つもしくは複数のフロッピーディスク（登録商標）、コンパクトディスク、光ディスク、磁気テープ、フラッシュメモリ、フィールドプログラマブルゲートアレイの回路構成もしくは他の半導体デバイス、または他の非一過性の媒体もしくは有形のコンピュータ記憶媒体）として開示のさまざまな概念を具体化することができ、こうした１つまたは複数のプログラムは、１つまたは複数のコンピュータまたは他のプロセッサで実行されると、上記の本開示のさまざまな実施形態を実施する方法を実行することができる。コンピュータ可読媒体（複数可）は、可搬型のものであり得、その結果、そこに保存されたプログラム（複数可）を１つまたは複数の異なるコンピュータまたは他のプロセッサにロードして、上に議論される本開示のさまざまな態様を実施することができる。
【０５８９】
「プログラム」または「ソフトウェア」という用語は、コンピュータまたは他のプロセッサをプログラムして上に議論される実施形態のさまざまな態様を実施するために利用することができる、コンピュータによって実行可能な命令の任意の型のコンピュータコードまたはセットを指すために包括的な意味において本明細書で使用される。さらに、１つの態様によれば、実行時に本開示の方法を実施する１つまたは複数のコンピュータプログラムは、単一のコンピュータまたはプロセッサに存在する必要はなく、本開示のさまざまな態様を実施するためのいくつかの異なるコンピュータまたはプロセッサにまたがってモジュラー様式で分散して存在し得ることを理解されよう。
【０５９０】
コンピュータによって実行可能な命令は、１つまたは複数のコンピュータまたは他のデバイスによって実行される多くの形態（プログラムモジュールなど）をとり得る。一般に、プログラムモジュールは、特定のタスクを実施するか、または特定の抽象データ型を実施するルーチン、プログラム、オブジェクト、コンポーネント、データ構造などを含む。典型的には、プログラムモジュールの機能性を、必要に応じて、さまざまな実施形態において統合または分配することができる。
【０５９１】
また、データ構造は、任意の適切な形式でコンピュータ可読媒体に保存することができる。説明を簡単にするために、データ構造は、そのデータ構造における位置で関連付けられたフィールドを有するように示すことができる。同様に、そのような関連性は、コンピュータ可読媒体における位置がフィールド間の関連性を示すようにフィールドの保存割り当てを行うことによっても達成できる。しかしながら、データ構造のフィールドにおける情報の間の関連性を確立するために任意の適切な機構を使用することができ、こうした機構には、ポインター、タグ、またはデータ要素間の関連性を確立する他の機構を使用するものが含まれる。
【０５９２】
また、開示のさまざまな概念を１つまたは複数の方法として具体化することができ、こうした方法の例は示されている。方法の一部として実施される行為は、任意の適切な方法で順序付けすることができる。したがって、実施形態は、例示のものとは異なる順序で行為を実施するものとして構成され得るものであり、こうした順序には、実施形態の例において行為が連続的なものとして示されていたとしても、いくつかの行為を同時に実施するものが含まれ得る。
【０５９３】
本明細書で定義及び使用される定義はすべて、辞書の定義、参照によって組み込まれる文書の定義、及び／または定義される用語の通常の意味より優先されることを理解されよう。
【０５９４】
本明細書ではフロー図が使用されている。フロー図の使用は、実施される操作の順序に関する限定を意図するものではない。本明細書に記載される対象物では、異なるコンポーネントが他の異なるコンポーネントに含められたもの、または異なるコンポーネントが他の異なるコンポーネントと連結されたものが示されることがある。そのような記載の構築様式は単に例示にすぎず、実際は、同一の機能性を達成する他の多くの構築様式を利用できることを理解されよう。概念的な意味では、同一の機能性を達成するための任意の配置のコンポーネントが、所望の機能性を達成するように効率的に「結合」される。したがって、特定の機能性を達成するために組み合わせられた本明細書の任意の２つのコンポーネントは、構築様式または中間コンポーネントとは無関係に、所望の機能性を達成するように互いに「結合」されたものと見なすことができる。同様に、そのように結合した任意の２つのコンポーネントは、所望の機能性を達成するために互いに「機能可能なように連結」または「機能可能ように結合」したものと見なすこともでき、そのように結合することが可能な任意の２つのコンポーネントは、所望の機能性を達成するために互いに「機能可能なように結合可能」なものと見なすこともできる。機能可能なように結合可能なものの特定の例には、限定はされないが、物理的に対形成することが可能であり、及び／または物理的に相互作用するコンポーネント、及び／または無線で相互作用することが可能であり、及び／または無線で相互作用するコンポーネント、及び／または論理的に相互作用し、及び／または論理的に相互作用することが可能なコンポーネントが含まれる。
【０５９５】
本明細書及び特許請求の範囲で使用される「ａ」及び「ａｎ」という不定冠詞は、異なる定義が明確に示されない限り、「少なくとも１つ」を意味することを理解されよう。本明細書及び特許請求の範囲で使用される「及び／または」という語句は、まとまった要素、すなわち、離接的に存在する場合もあり、連接的に存在する場合もある要素の「いずれかまたは両方」を意味することを理解されよう。「及び／または」を用いて列挙される複数の要素もまた、同一の様式、すなわち、そのようにまとまった当該要素の「１つまたは複数」であると解釈されるべきである。「及び／または」節によって具体的に特定される要素以外にも、具体的に特定されるそうした要素と関連するか否かとは無関係に、他の要素が任意選択で存在し得る。したがって、非限定的な例として、「Ａ及び／またはＢ」に対する参照は、非限定型の言葉（「含む」など）と併用されるとき、１つの実施形態では、Ａのみ（Ｂ以外の要素を任意選択で含む）を指し、別の実施形態では、Ｂのみ（Ａ以外の要素を任意選択で含む）を指し、さらに別の実施形態では、ＡとＢとの両方（他の要素を任意選択で含む）を指すなどし得る。
【０５９６】
本明細書及び特許請求の範囲で使用される「または」は、上に定義される「及び／または」と同一の意味を有することを理解されよう。例えば、「または」あるいは「及び／または」によってリスト中の項目が分かれているとき、「または」あるいは「及び／または」は、包含的であり、すなわち、いくつかの要素または一連の要素のうちの少なくとも１つを含むだけなく、そのうちの複数も含むことに加えて、任意選択で、リストにない項目も追加で含むと解釈されるものとする。これと異なることが明確に示される用語（「のうちの１つのみ」もしくは「のうちの厳密に１つ」、または特許請求の範囲で使用されるときは、「からなる」など）のみが、いくつかの要素または一連の要素のうちの厳密に１つの要素を含むことを指すことになる。一般に、本明細書で使用される「または」という用語は、排他性の用語（「いずれか」、「のうちの１つ」、「のうちの１つのみ」、または「のうちの厳密に１つ」など）が先行するとき、排他的選択肢を指すもの（すなわち、「一方またはもう一方であるが、両方ではない」）としてのみ解釈されるものとする。「から本質的になる」は、特許請求の範囲で使用されるとき、特許法の分野において使用されるその通常の意味を有するものとする。
【０５９７】
１つまたは複数の要素のリストに関して本明細書及び特許請求の範囲で使用される「少なくとも１つ」という語句は、要素のリストに存在する要素のうちの任意の１つまたは複数から選択される少なくとも１つの要素を意味するが、要素のリスト内に具体的に列挙されるありとあらゆる要素のうちの少なくとも１つを必ず含むというわけではなく、要素のリストに存在する要素の任意の組み合わせを除外しないことを理解されよう。この定義では、「少なくとも１つ」という語句が指す要素のリスト内で具体的に特定される要素以外の要素が、具体的に特定される要素と関連するか否かとは無関係に、任意選択で存在し得ることも許容される。したがって、非限定的な例として、「Ａ及びＢのうちの少なくとも１つ」（あるいは同等の「ＡまたはＢのうちの少なくとも１つ」、あるいは同等の「Ａ及び／またはＢのうちの少なくとも１つ」）は、１つの実施形態では、Ｂが存在しない少なくとも１つのＡ（任意選択で複数のＡを含む）（加えて任意選択でＢ以外の要素を含む）を指し、別の実施形態では、Ａが存在しない少なくとも１つのＢ（任意選択で複数のＢを含む）（加えて任意選択でＡ以外の要素を含む）を指し、さらに別の実施形態では、少なくとも１つのＡ（任意選択で複数のＡを含む）及び少なくとも１つのＢ（任意選択で複数のＢを含む）（加えて任意選択で他の要素を含む）を指すなどし得る。
【０５９８】
特許請求の範囲ならびに上記の本明細書では、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「保有する（ｃａｒｒｙｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、「保持する（ｈｏｌｄｉｎｇ）」、「から構成される（ｃｏｍｐｏｓｅｄ  ｏｆ）」、及び同様のものなどの移行句はすべて、非限定的であり、すなわち、含むが、限定はされないという意味を有することを理解されよう。「からなる」及び「から本質的になる」という移行句のみが、それぞれ限定的または半限定的な移行句となるものとし、このことは、米国特許庁特許審査便覧のセクション２１１１．０３に記載される。
【図１】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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