(57)【要約】試料中の微生物の抗生物質耐性の迅速な検出のための方法およびシステムを本明細書中に開示する。後期遺伝子領域中に指標遺伝子を含む改変された組換えファージも開示する。感染性因子の特異性により、特定の微生物を標的にすることが可能であり、指標シグナルを増幅してアッセイ感度を最適にすることができる。いくつかの実施形態では、感染性因子は組換えファージであり、微生物は細菌である。さらなる実施形態では、指標遺伝子は、内因性シグナルを生成する前述の指標タンパク質産物または基質との反応の際にシグナルを生成する酵素をコードする。
2020526188.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の抗生物質耐性微生物を検出する方法であって、
（ａ）前記試料を抗生物質と接触させる工程、
（ｂ）前記試料を感染性因子と接触させる工程であって、ここで、前記感染性因子が指標遺伝子を含み、かつ前記微生物に特異的であり、ここで、前記指標遺伝子が、指標タンパク質産物をコードする、接触させる工程、および
（ｃ）指標タンパク質産物によって産生されたシグナルを検出する工程であって、
ここで、前記シグナルの検出を使用して抗生物質耐性を判定する、検出する工程、を含む方法。
【請求項２】
前記試料を前記抗生物質と前記感染性因子と接触前させる工程の前に一定期間接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記感染性因子が組換えファージであり、前記微生物が細菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記方法が、前記指標タンパク質を検出する工程の前に前記試料中で前記微生物を溶解させる工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記微生物を感染性因子と接触させる工程を４時間未満継続させる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記微生物を、前記抗生物質と、前記感染性因子との接触前に５分間〜２４時間インキュベートする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記微生物を、前記抗生物質と、前記感染性因子との接触前に５分間〜３時間インキュベートする、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記抗生物質が、アミノグリコシド、カルバセフェム、カルバペネム、セファロスポリン、糖ペプチド、マクロライド、モノバクタム、ペニシリン、β−ラクタム抗生物質、キノロン、バシトラシン、スルホンアミド、テトラサイクリン、ストレプトグラミン、クロラムフェニコール、クリンダマイシン、およびリンコサミド、セファマイシン、リンコマイシン、ダプトマイシン、オキサゾリジノン、および糖ペプチド抗生物質からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記組換えファージが、前記ファージゲノムの後期遺伝子領域に挿入された指標遺伝子を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
前記指標遺伝子が主要キャプシド遺伝子に隣接している、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記組換えファージが、ファージＫ、Ｔｗｏｒｔファージ、Ｔｗｏｒｔ様ファージ、ＮＣＴＣ９８５７ファージ、Ｖｉｌファージ、Ｖｉｌ様ファージ、Ｔ７ファージ、Ｔ４ファージ、Ｔ４様ファージ、またはファージＫ、Ｔｗｏｒｔファージ、Ｔｗｏｒｔ様ファージ、ＮＣＴＣ９８５７ファージ、Ｖｉｌファージ、Ｖｉｌ様ファージ、Ｔ７ファージ、Ｔ４ファージ、Ｔ４様ファージと少なくとも９０％相同性を有するゲノムを有する別の天然ファージに由来する、請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
前記細菌がＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓであり、前記組換えファージが、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに対する特異性が高い、請求項３に記載の方法。
【請求項１３】
前記指標遺伝子が、内因性シグナルを生成する前記指標タンパク質産物または基質との反応の際にシグナルを生成する酵素をコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記酵素がルシフェラーゼである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記細菌が無培養試料中に含まれる、請求項３に記載の方法。
【請求項１６】
前記細菌が試料中に含まれ、前記試料が、臨床試料、食品試料、環境試料、または水試料である、請求項３に記載の方法。
【請求項１７】
前記試料によって産生されたシグナルを実験で決定した値と比較し、前記実験で決定した値が対照試料によって産生されたシグナルである、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記実験で決定した値が平均バックグラウンドシグナルと前記平均バックグラウンドシグナルの標準偏差の１〜３倍またはそれを超える倍数の和から計算されたバックグラウンド閾値である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記試料によって産生されたバックグラウンド閾値を超えるシグナルの検出が、前記試料中の１または複数の抗生物質耐性微生物の存在を示す、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
微生物の死滅に有効な抗生物質の用量を決定する方法であって、
（ａ）１または複数の抗生物質溶液の各々を、前記微生物を含む１または複数の試料と個別にインキュベートする工程であって、ここで、前記１または複数の抗生物質溶液の濃度が異なり、かつ範囲を定義する、インキュベートする工程、
（ｂ）前記１または複数の試料中の前記微生物を、指標遺伝子を含む感染性因子とインキュベートする工程であって、ここで、前記感染性因子が目的の前記微生物に特異的である、インキュベートする工程、および
（ｃ）前記１または複数の試料中の前記感染性因子によって産生された指標タンパク質産物を検出する工程であって、ここで、前記複数の試料のうちの１または複数中の前記指標タンパク質産物の検出が、前記１または複数の試料のうちの１または複数を処置するために使用した抗生物質溶液の濃度が有効でないことを示し、前記指標タンパク質の不検出が、前記抗生物質が有効であることを示し、それにより、前記抗生物質の有効用量が決定される、検出する工程を含む方法。
【請求項２１】
前記１または複数の抗生物質溶液が２またはそれを超える抗生物質溶液であり、前記複数の抗生物質溶液中の最低濃縮溶液と最高濃縮溶液の濃度比が１：２〜１：５０の範囲である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記方法のうちのいずれか１または複数を実施するためのキットであって、指標遺伝子および抗生物質と共に組換えファージを含む、キット。
【請求項２３】
指標タンパク質を検出するための基質をさらに含む、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
試料中の微生物の抗生物質耐性を検出するためのシステムであって、
前記試料を前記抗生物質と接触させるための構成要素、
前記試料を前記感染性因子と接触させるための構成要素であって、前記感染性因子が指標部分を含み、かつ前記微生物に特異的である、構成要素、
前記感染性因子と接触した前記試料中の前記指標部分を検出するための構成要素であって、ここで、前記指標部分の陽性検出が、微生物が前記抗生物質に耐性を示すことを示す、構成要素を含む、システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年７月７日出願の米国仮出願番号第６２／５２９，６８９号の利益および優先権を主張し、この仮出願の開示は、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、感染性因子を使用した微生物の抗生物質耐性の検出のための方法およびシステムに関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
抗生物質は、微生物に原因する感染症を処置するために広く使用されている。微生物は、特定の抗生物質に天然に耐性を示すものがある一方で、抗生物質でしばらくの間処置した後にかかる耐性を獲得することができるものもある。抗生物質耐性は、望ましくない結果を引き起こし得る；微生物は、抗生物質の存在下で依然として増殖し、したがって、感染症が憎悪し、無効な抗生物質により重篤な副作用を引き起こす可能性があり、ある一定の状況に至ると、場合によっては生命を脅かし得る。さらに、これらの抗生物質耐性微生物は、ヒトおよび動物に感染する可能性があり、それにより、非耐性細菌に原因する感染症よりも典型的には処置困難な感染症を引き起こす。結果として、抗生物質耐性は、医療費の増加、入院期間の延長、および死亡率の増加に至り得る。
【０００４】
したがって、特定の抗生物質に耐性を示す微生物の検出は、非常に重要である。体内に存在する感染を担う微生物が抗生物質に耐性を示すかどうかを医療提供者が判定することができることは、的確な処置を選択する上で極めて重要である。さらに、微生物レベルが低い試料から微生物の抗生物質耐性を短時間で判定できることは、感染症が重症になる前に感染症の処置を成功させるために不可欠である。
【０００５】
さらに、低レベルの病原体を含む試料からコロニー形成参照試験を迅速に実施できることは、抗生物質耐性病原体の蔓延、特に、院内感染の蔓延を防止するのに有益である。例えば、低レベルの病原体を検出することができる迅速なコロニー形成参照試験（例：ＭＲＳＡ鼻腔スワブ）の使用を、抗生物質耐性細菌がコロニー形成している患者をスクリーニングするための予防手段として使用することができる。抗生物質耐性細菌によるコロニー形成の早期かつ迅速な検出により、予防措置を講じることが可能である（例えば、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ））。ＭＲＳＡは院内感染の主要な原因であり、重篤で生命を脅かす感染症を引き起こし得る。ＭＲＳＡ感染の米国医療制度への総費用負担は、年間２５億ドルを超えると推定されている。
【０００６】
現在の抗生物質耐性検出法は、しばしば、時間がかかり、技術的要求が厳しく、そして／または感度が十分でないアッセイを必要とする。典型的には、これらのアッセイには、ゲル電気泳動、リアルタイムＰＣＲ／多重化、および／または多遺伝子座配列タイピングを必要とする培養試料におけるイムノアッセイおよび分子ベースのアッセイが含まれる。これらの試験は、しばしば、完了に２４〜４８時間を要し、そして／または感度が十分ではない。現在利用可能な方法は、典型的には、検出前に微生物の単離および／または培養による富化が必要であり、したがって、結果を得るまでの時間が長くなる。したがって、目的の微生物、例えば、感染を引き起こした微生物が抗生物質の使用前に特定の抗生物質に耐性があるかどうかを判断するための迅速かつ高感度の試験に強い関心が示されている。本発明は、検出前に微生物を単離する必要がないことにより、微生物検出のための迅速な試験として優れている。この知識は、臨床医が適切な抗生物質を処方して感染を適時制御し、医療現場での積極的なモニタリングを通じて重篤な感染の拡大を防止する能力を高めるのに役立ち得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
概要
本発明の実施形態は、微生物の抗生物質耐性の検出のための組成物および方法を含む。本発明を、種々の方法で具体化することができる。
【０００８】
いくつかの実施形態では、本開示は、試料中の抗生物質耐性微生物を検出する方法であって、（ａ）前述の試料を抗生物質と接触させる工程、（ｂ）前述の試料を感染性因子と接触させる工程であって、ここで、前述の感染性因子が指標遺伝子を含み、かつ前述の微生物に特異的であり、ここで、前述の指標遺伝子が、指標タンパク質産物をコードする、接触させる工程、および（ｃ）指標タンパク質産物によって産生されたシグナルを検出する工程であって、ここで、前述のシグナルの検出を使用して抗生物質耐性を判定する、検出する工程、を含む方法を提供する。
【０００９】
いくつかの実施形態では、感染性因子は組換えファージであり、微生物は細菌である。さらなる実施形態では、指標遺伝子は、内因性シグナルを生成する前述の指標タンパク質産物または基質との反応の際にシグナルを生成する酵素をコードする。
【００１０】
いくつかの実施形態では、本開示は、微生物の死滅に有効な抗生物質の用量を決定する方法であって、（ａ）１または複数の抗生物質溶液の各々を、微生物を含む１または複数の試料と個別にインキュベートする工程であって、ここで、前述の１または複数の抗生物質溶液の濃度が異なり、かつ範囲を定義する、インキュベートする工程、（ｂ）前述の１または複数の試料中の微生物を、指標遺伝子を含む感染性因子とインキュベートする工程であって、ここで、前述の感染性因子が目的の微生物に特異的である、インキュベートする工程、および（ｃ）前述の１または複数の試料中の前述の感染性因子によって産生された指標タンパク質産物を検出する工程であって、ここで、前述の複数の試料のうちの１または複数中の前述の指標タンパク質産物の検出が、前述の１または複数の試料のうちの１または複数を処置するために使用した抗生物質溶液の濃度が有効でないことを示し、前述の指標タンパク質の不検出が、前述の抗生物質が有効であることを示し、それにより、前述の抗生物質の有効用量が決定される、検出する工程を含む方法を提供する。
【００１１】
いくつかの実施形態では、本開示は、指標遺伝子を有する組換えファージおよび抗生物質を含む、抗生物質耐性を検出するためのキットおよびシステムを提供する。
【００１２】
本発明のある一定の実施形態は、米国特許出願公開第２０１５／０２１８６１６号に記載の方法および構築物を使用し、前述の米国特許出願公開は、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【００１３】
本発明を、以下の非限定的な図面を参照することによって、より深く理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７がアンピシリンに対して用量応答を示し、バンコマイシンに対しては示さないことを示す、本明細書中に開示の方法の１つの実施形態を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
発明の詳細な説明
驚くべき速度および感度の微生物の抗生物質耐性の検出を実証する組成物、方法、およびシステムを本明細書中に開示する。現在利用可能な方法よりも短時間で検出することができる。この検出は、遺伝子改変された感染性因子を、単離または富化のための培養を用いないか、いくつかの実施形態では、微生物が潜在的に増殖することができる最小のインキュベーション時間を用いたアッセイで使用する。本明細書中に開示および記載されている本発明のいくつかの実施形態は、単一の微生物がファージなどの特異的認識因子に結合することができるという発見を利用している。ファージによる感染後、指標部分の産生を介してファージ複製を検出することができる。子孫ファージ、時折、１感染親ファージあたり１００またはそれを超える子孫ファージの産生により、指標部分を高レベルで発現することができ、したがって、微生物の検出能力がより高くなる。このような方法で、本発明の実施形態は、単一の感染細胞ほどの少数から甚大にシグナルを増幅することができる。したがって、抗生物質耐性を、病原性細胞が特定の抗生物質処置を生き抜いたことを判定することによって検出することができる。例えば、いくつかの実施形態では、本方法により、特定の抗生物質処置を生き抜いた細胞数を決定することが可能である。さらなる実施形態では、本方法により、特定の抗生物質処置を生き抜いた細胞の百分率を決定することが可能である。
【００１６】
本発明の組成物、方法、システム、およびキットは、かかる微生物の抗生物質耐性の検出で用いる感染性因子を含み得る。本発明の一定の実施形態では、組成物は、ファージゲノムに挿入された指標遺伝子を有する組換えファージを含むことができ、組成物は、耐性が試験される抗生物質を含む。一定の実施形態では、宿主細菌への感染後のファージ複製中の指標遺伝子の発現により、可溶性指標タンパク質産物が産生される。一定の実施形態では、指標遺伝子を、ファージの後期遺伝子（すなわち、クラスＩＩＩ）領域に挿入することができる。ファージは、Ｔ７、Ｔ４、ファージＫ（すなわち、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓファージＫ）、または他の天然ファージに由来し得る。一定の実施形態では、抗生物質は、複数の溶液中に異なる濃度で存在し得る。
【００１７】
いくつかの態様では、本発明は、微生物の抗生物質耐性を検出する方法を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、試料中の抗生物質耐性微生物を検出する方法であって、（ａ）前述の試料を抗生物質と接触させる工程、（ｂ）前述の試料を感染性因子と接触させる工程であって、ここで、前述の感染性因子が指標遺伝子を含み、かつ前述の微生物に特異的であり、ここで、前述の指標遺伝子が、指標タンパク質産物をコードする、接触させる工程、および（ｃ）指標タンパク質産物によって産生されたシグナルを検出する工程であって、ここで、前述のシグナルの検出を使用して抗生物質耐性を判定する、検出する工程、を含む方法を提供する。
【００１８】
本方法は、目的の微生物の検出のために感染性因子を使用することができる。例えば、一定の実施形態では、目的の微生物は細菌であり、感染性因子はファージである。本出願中で言及される抗生物質は、静菌性（微生物の増殖を阻害することができる）または殺菌性（微生物を死滅させることができる）の任意の薬剤であり得る。したがって、一定の実施形態では、本方法は、試料を抗生物質と接触させ、抗生物質と接触した試料を、目的の微生物に感染している感染性因子とインキュベートすることによる試料中の目的の微生物の抗生物質耐性の検出を含み得る。これは、抗生物質耐性を付与することができる遺伝子（例えば、ＰＣＲ）またはタンパク質（例えば、抗体）の存在を検出するが、その機能性を試験しないアッセイとは異なる。
【００１９】
一定の実施形態では、本方法は、試料中の目的の微生物の抗生物質に対する機能的耐性を実証するのに有利であり得る。例えば、ＰＣＲにより、抗生物質耐性遺伝子の検出が可能である；しかし、ＰＣＲは、機能性の抗生物質耐性遺伝子を有する細菌と非機能性の抗生物質耐性遺伝子を有する細菌を区別できないため、偽陽性の抗生物質耐性細菌が検出される。本発明で具体化した方法は、非機能性の抗生物質耐性遺伝子を有する細菌を陽性検出することなく、機能性の抗生物質耐性遺伝子を有する細菌を陽性検出することができる。
【００２０】
一定の実施形態では、感染性因子は指標部分を含む。他の実施形態では、感染性因子は、指標部分を発現することができる指標遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、指標部分は指標タンパク質産物であり、本方法は、指標タンパク質産物を検出する工程を含んでよく、ここで、指標タンパク質産物の陽性検出は、目的の微生物が試料中に存在すること、および微生物が抗生物質に耐性を示すことを示す。いくつかの例では、目的の微生物は、抗生物質耐性試験の前に試料から単離されない。一定の実施形態では、試料は、無培養試料または非富化試料である。場合によっては、抗生物質耐性の検出方法を、５時間以内に完了することができる。いくつかの実施形態では、本方法は、指標部分の検出前に感染性因子を感染させた微生物を溶解するための溶解緩衝液での処置を含む。
【００２１】
本発明の別の態様では、本発明は、微生物の死滅に有効な抗生物質の用量を決定する方法であって、（ａ）１または複数の抗生物質溶液の各々を、微生物を含む１または複数の試料と個別にインキュベートする工程であって、ここで、前述の１または複数の抗生物質溶液の濃度が異なり、かつ範囲を定義する、インキュベートする工程、（ｂ）前述の１または複数の試料中の微生物を、指標遺伝子を含む感染性因子とインキュベートする工程であって、ここで、前述の感染性因子が目的の微生物に特異的である、インキュベートする工程、および（ｃ）前述の１または複数の試料中の前述の感染性因子によって産生された指標タンパク質産物を検出する工程であって、ここで、前述の複数の試料のうちの１または複数中の前述の指標タンパク質産物の検出が、前述の１または複数の試料のうちの１または複数を処置するために使用した抗生物質溶液の濃度が有効でないことを示し、前述の指標タンパク質の不検出が、前述の抗生物質が有効であることを示し、それにより、前述の抗生物質の有効用量が決定される、検出する工程を含む方法を含む。
【００２２】
一定の実施形態では、本発明は、システムを含み得る。システムは、本発明の組成物のうちの少なくともいくつかを含み得る。また、システムは、方法を実施するための構成要素のうちの少なくともいくつかを含み得る。一定の実施形態では、システムを、キットとして製剤化する。したがって、一定の実施形態では、本発明は、試料中の微生物の抗生物質耐性を迅速に検出するためのシステムであって、前述の試料を前述の抗生物質と接触させるための構成要素、微生物に特異性を示し、かつ指標部分を含む感染性因子と試料をインキュベートするための構成要素；および指標部分を検出するための構成要素を含む、システムを含み得る。システムは、指標部分の検出前に微生物を溶解するための構成要素をさらに含み得る。さらに他の実施形態では、本発明は、方法またはシステムと共に使用するためのソフトウェアを含む。
【００２３】
本発明の方法およびシステムの実施形態を、種々の抗生物質（セフォキシチン、オキサシリン  アンピシリン、バンコマイシン、ペニシリン、テイコプラニン、およびメチシリンが含まれるが、これらに限定されない）に対する耐性の検出に適用することができる。
【００２４】
本発明の方法およびシステムの実施形態を、抗生物質での処置後の種々の環境における種々の微生物（例えば、細菌）の検出および定量（食品試料、水試料、臨床試料、および商業的試料由来の病原体の検出が含まれるが、これらに限定されない）に適用することができる。
定義
【００２５】
本明細書中に別段の定義がない限り、本発明に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈で別段の必要性が無い限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。一般に、本明細書中に記載の細胞および組織の培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学およびタンパク質化学および核酸化学ならびにハイブリッド形成に関連して使用される命名法およびその技術は、当該分野で周知であり、一般的に使用されるものである。別段の指示がない限り、公知の方法および技術は、一般に、当該分野で周知であり、かつ本明細書全体で考察される様々な一般的およびより具体的な参考文献に記載されている従来の方法に従って実施される。酵素反応および精製技術は、当該分野で一般的に達成されるように、または本明細書に記載されるように、製造業者の仕様に従って実施される。本明細書に記載の実験の手順および技術に関連して使用される命名法は、当該分野で周知であり、一般的に使用されているものである。
【００２６】
以下の用語は、別段の指示がない限り、以下の意味を有すると理解するものとする。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、用語「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、別段の具体的記載が無い限り、１または複数を指し得る。
【００２８】
用語「または」の使用は、代替物のみを指すように明記されていない限り、または代替物が相互に排他的でない限り、「および／または」を意味するために使用されるが、本開示は、代替物のみおよび「および／または」を指す定義を支持している。本明細書で使用される「別の」は、少なくとも第２またはそれを超えること意味し得る。
【００２９】
本出願全体を通して、用語「約」は、値がデバイスの誤差の固有の変動、値を決定するために使用される方法、または試料間に存在する変動を含むことを示すために使用される。
【００３０】
用語「固体支持体」または「支持体」は、生体分子が結合され得る基材および／または表面を提供する構造を意味する。例えば、固体支持体は、アッセイウェル（すなわち、マイクロタイタープレートまたはマルチウェルプレートなど）であり得るか、固体支持体は、フィルター、アレイ、またはビーズもしくはメンブレン（例えば、濾板または側方流動ストリップ）などの可動支持体上の位置であり得る。
【００３１】
用語「抗体」には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、合成抗体、およびキメラ抗体（例えば、組換え変異誘発およびファージディスプレイによって生成）が含まれる。用語「抗体」には、抗体の模倣物またはペプチド模倣物も含まれる。ペプチド模倣物は、ペプチドおよびタンパク質に基づくか、これらに由来する化合物である。本発明のペプチド模倣物を、典型的には、非天然アミノ酸、高次構造の制限、および等配電子置換などを使用した公知のペプチド配列の構造改変によって得ることができる。いくつかの実施形態では、抗体の断片が抗体の代わりに役立ち得る。本明細書中で使用される「表面特異的抗体」は、特定の微生物の外面に露出した分子に結合する。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、用語「遊離抗体」は、溶液中に存在し、液体中を自由に移動することができる抗体を指す；すなわち、遊離抗体は、最初に固体支持体に結合していないか、そうでなければ拘束されていない。
【００３３】
用語「検出可能な部分」または「検出可能な生体分子」または「レポーター」または「指標部分」は、定量アッセイで測定することができる分子を指す。「指標タンパク質」または「指標タンパク質産物」は、定量アッセイで測定することができるタンパク質を指す。例えば、指標部分、例えば、指標タンパク質は、基質を測定可能な生成物に変換するために使用することができる酵素を含み得る。指標部分は、生物発光（例えば、ルシフェラーゼ）、蛍光発光、または比色分析手段によって検出することができる生成物（アルカリホスファターゼまたはβ−ガラクトシダーゼなど）を生成する反応を触媒する酵素であり得る。あるいは、指標部分は、定量化することができる放射性同位体、フルオロフォア、または使用可能な他の検出可能な分子であり得る。
【００３４】
本明細書中で使用される場合、「バクテリオファージ」または「ファージ」には、複数の細菌ウイルスのうちの１または複数が含まれる。ここで、「微視的」とは、最大寸法が１ミリメートルまたはそれ未満であることを意味する。ファージは、自己複製手段として細菌を使用するように自然に進化したウイルスである。ファージは、細菌に自身を付着させ、付着した細菌にそのＤＮＡ（またはＲＮＡ）を注入し、ファージを数百または数千回も複製するように誘導することによって自己複製する。これは、ファージ増幅と呼ばれている。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、「後期遺伝子領域」は、ウイルス生活環の後期に転写されるウイルスゲノム領域を指す。後期遺伝子領域には、典型的には、最も豊富に発現される遺伝子（例えば、ファージ粒子にアセンブリされる構造タンパク質）が含まれる。後期遺伝子は、クラスＩＩＩ遺伝子と同義であり、構造およびアセンブリ機能を有する遺伝子が含まれる。例えば、後期遺伝子（クラスＩＩＩと同義）は、Ｔ７で、例えば、感染後８分から溶解までに転写され、クラスＩ（例えば、ＲＮＡポリメラーゼ）は初期の４〜８分、クラスＩＩは６〜１５分に転写されるので、ＩＩおよびＩＩＩのタイミングが重複する。後期プロモーターは、かかる後期遺伝子領域内に天然に位置し、活性であるプロモーターである。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、「富化のために培養した」、「富化のための培養（ｃｕｌｔｕｒｅ  ｆｏｒ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）」、または「富化のための培養（ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ  ｆｏｒ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）」は、微生物の増殖に好ましい培地中でのインキュベーションなどの伝統的な培養を指し、用語「富化」の他の考えられる使用（液体に含まれる微生物を濃縮するために試料の液体成分を除去することによる富化、または微生物増殖の伝統的な促進を含まない他の富化形態など）と混同すべきではない。本明細書中に記載の方法のいくつかの実施形態において、非常に短期間の富化のための培養を使用することができるが、培養する場合、富化のための伝統的な培養期間を必要とせず、伝統的な培養期間より遥かに短い期間である。本明細書中で使用される「富化のための培養」は、試験対象である抗生物質耐性を有する微生物を含む試料をインキュベートすることによって微生物を選択する選択タイプを除外する。例えば、本発明は、試料中の微生物のアンピシリン耐性を検出するために使用され、試料をアンピシリンと接触させる工程は、「富化のために培養する」工程とはみなされない。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、「無培養試料」は、富化のために培養されていない試料を指す。
【００３８】
本明細書中で使用される場合、「組換え」は、本来は見出されない遺伝子材料を集めるために実験室で通常行われる遺伝子（すなわち、核酸）改変を指す。この用語は、本明細書中で「改変された」という用語と互換的に使用される。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、「指標感染性因子」は、目的の微生物に特異的であり、かつ指標部分を含む感染性因子を指す。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、用語「結合剤」は、第２の（すなわち、異なる）目的の分子に特異的および選択的に結合することができる分子を指す。相互作用は、例えば、水素結合、ファンデルワールス相互作用、または静電相互作用もしくは疎水性相互作用の結果としての非共有結合性であり得るか、共有結合性であり得る。用語「可溶性結合剤」は、固体支持体に会合していない（すなわち、共有結合も非共有結合もしていない）結合剤を指す。
【００４１】
本明細書中で使用される場合、「融合タンパク質」は、構造ファージタンパク質をコードする遺伝子に隣接する変性遺伝子によってコードされた変性タンパク質を指す。
微生物
【００４２】
本発明の方法およびシステムによって抗生物質耐性を検出することができる微生物には、商業的、医学的、または獣医学的に懸念される病原体が含まれる。かかる病原体には、グラム陰性菌、グラム陽性菌、マイコプラズマ、真菌、および酵母が含まれる。特定の微生物に特異的な感染性因子が同定されている任意の微生物を、本発明の方法により検出することができる。当業者は、必要な特定の感染性因子／微生物の対を利用すること以外に本方法の適用に制限がないことを理解するであろう。
【００４３】
いくつかの実施形態では、目的の微生物は細菌である。本発明によって検出可能な細菌細胞には、臨床、食品、または水媒介性の病原体である細菌細胞が含まれるが、これらに限定されない。
本発明によって検出可能な細菌細胞には、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓの全ての種（Ｓ．ａｕｒｅｕｓが含まれるが、これに限定されない）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの全ての種、大腸菌の全ての株（大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７が含まれるが、これに限定されない）、Ｌｉｓｔｅｒｉａの全ての種（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓが含まれるが、これに限定されない）、およびＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒの全ての種が含まれるが、これらに限定されない。本発明によって検出可能な細菌細胞には、医学的または獣医学的に重要な病原体である細菌細胞が含まれるが、これらに限定されない。かかる病原体には、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．が含まれるが、これらに限定されない。
【００４４】
特許請求の範囲に記載のキット、システム、および方法を使用して検出することができる抗生物質耐性を有するさらなる微生物は、Ａｂｉｏｔｒｏｐｈｉａ  ａｄｉａｃｅｎｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｉｉ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、ＣｙｔｏｐｈａｇａおよびＦｌｅｘｉｂａｃｔｅｒ  ｐｈｙｌｕｍ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉおよびＣ．ｃｏｌｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｚｅｙｌａｎｏｉｄｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｃｒｙｐｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｓｐｐ．、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ群、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ−ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ−ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ群、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．、大腸菌およびＳｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ．群、Ｇｅｍｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｇｉａｒｄｉａ  ｓｐｐ．、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｓｐｐ．、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓ群、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．からなる群から選択され得る。
試料
【００４５】
試料は、環境試料、食品試料、水試料、医学的試料、または獣医学的試料であり得る。試料は、液体、固体、または半固体であり得る。試料は、固体表面のスワブであり得る。試料には、水試料などの環境材料、または空気試料由来のフィルター、またはサイクロン集塵機由来のエアロゾル試料が含まれ得る。試料を、肉、家禽類、果物、野菜、加工食品、ミルク、チーズ、または他の乳製品から採取することができる。医学的または獣医学的試料には、血液、痰、脳脊髄液、および糞便の試料、ならびに様々なタイプのスワブが含まれるが、これらに限定されない。
【００４６】
試料を、調製、濃縮、または希釈することなく、本発明の検出方法で直接使用することができる。例えば、液体試料（ミルクおよび果汁が含まれるが、これらに限定されない）を、直接アッセイすることができる。試料を、溶液（緩衝液または細菌培養培地が含まれ得るが、これらに限定されない）に希釈または懸濁することができる。固体または半固体である試料を、液体中で固体を細かく刻むか、溶解するか、混合するか、浸軟することによって液体に懸濁することができる。試料を、宿主細菌細胞へのファージの付着を促進するｐＨ範囲内で維持すべきである。試料はまた、適切な濃度の二価および一価のカチオン（Ｎａ＋、Ｍｇ２＋、およびＫ＋が含まれるが、これらに限定されない）を含むべきである。好ましくは、試料は、試料内に含まれる任意の病原体細胞の生存率を維持する温度で維持される。
【００４７】
好ましくは、検出アッセイを通して、試料は、試料中に存在する任意の病原体細胞の生存率を維持する温度に維持される。ファージが細菌細胞に付着している工程中、ファージの付着が容易になる温度に試料を維持することが好ましい。ファージが感染細菌細胞内で複製しているか、かかる感染細胞を溶解している工程中、ファージ複製および宿主の溶解を促進する温度に試料を維持することが好ましい。かかる温度は、少なくとも約セ氏２５度（℃）、より好ましくは、約４５℃以下、最も好ましくは約３７℃である。いくつかの実施形態では、試料を、ファージの付着、複製、および／または細胞溶解中に穏やかに混合または振盪することができる。いくつかの実施形態では、微生物を、抗生物質耐性の検出前に試料から単離しない。
【００４８】
アッセイは、種々の適切な対照試料を含み得る。例えば、微生物に特異的な感染性因子を含まない試料、または感染性因子を含むが微生物を含まない試料を、バックグラウンドシグナルレベルの対照としてアッセイすることができる。場合によっては、抗生物質で処置されていない微生物を含む試料を、感染性因子を使用した抗生物質耐性の判定のための対照としてアッセイする。いくつかの実施形態では、試料のシグナルを対照シグナルと比較して、抗生物質耐性微生物が試料中に存在するかどうかを判定する。
指標感染性因子
【００４９】
本明細書により詳細に記載されるように、本発明の組成物、方法、システム、およびキットは、かかる微生物の検出で用いる感染性因子を含み得る。いくつかの実施形態では、目的の微生物に特異的な指標部分を通して検出される。例えば、感染性因子は、可溶性指標をコードする遺伝子などの指標部分を含み得る。いくつかの実施形態では、指標を、バクテリオファージなどの感染性因子によってコードすることができ、バクテリオファージは指標ファージと呼ばれる。
【００５０】
種々の感染性因子を使用することができる。別の実施形態では、ファージまたはマイコバクテリオファージ（ＴＢおよびｐａｒａＴＢ用など）を使用することができる。例えば、１つの実施形態では、目的の微生物が細菌である場合、感染性因子は、ファージを含み得る。いくつかの実施形態では、ファージは、組換え指標ファージであり得る。例えば、組成物は、１または複数の野生型または遺伝子改変された感染性因子（例えば、ファージ）および１または複数の指標遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態では、組成物は、同一または異なる指標タンパク質をコードして発現することができる異なる指標ファージのカクテルを含み得る。
【００５１】
本明細書中で考察されるように、かかるファージは、細菌の内部で複製して、数百の子孫ファージを生成することができる。ファージに挿入された指標遺伝子の検出を、試料中の細菌の尺度として使用することができる。Ｓ．ａｕｒｅｕｓファージには、ファージＫ、ＳＡ１、ＳＡ２、ＳＡ３、ＳＡ１１、ＳＡ７７、ＳＡ１８７、Ｔｗｏｒｔ、ＮＣＴＣ９８５７、Ｐｈ５、Ｐｈ９、Ｐｈ１０、Ｐｈ１２、Ｐｈ１３、Ｕ４、Ｕ１４、Ｕ１６、およびＵ４６が含まれるが、これらに限定されない。大腸菌の十分に研究されたファージには、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５、Ｔ７、λが含まれ；ＡＴＣＣコレクションで利用可能な他の大腸菌ファージには、例えば、ｐｈｉＸ１７４、Ｓ１３、Ｏｘ６、ＭＳ２、ｐｈｉＶ１、ｆｄ、ＰＲ７７２、およびＺＩＫ１が含まれる。あるいは、種々の環境供給源から天然のファージを単離することができる。ファージ単離のための供給源を、目的の微生物が見出されると予想される場所に基づいて選択することができる。
【００５２】
本発明の組成物について上述したように、ファージは、上記開示のファージと少なくとも９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１  ９０、８９、８８、８７、８６、８５、８４、８３、８２、８１、８０、７９、７８、７７、７６、７５、７４、７３、７２、７１、または７０％の相同性を有するゲノムを有するＴ７、Ｔ４、Ｔ４様、ファージＫ、ＭＰ１３１、ＭＰ１１５、ＭＰ１１２、ＭＰ５０６、ＭＰ８７、Ｒａｍｂｏ、または別の天然に存在するファージに由来する。いくつかの態様では、本発明は、ファージの後期遺伝子領域に挿入された指標遺伝子を含む組換えファージを含む。いくつかの実施形態では、ファージはＴ４様ファージである。１つの実施形態では、組換えファージは、ファージＫに由来する。一定の実施形態では、組換えファージは、特定の細菌に対する特異性が高い。例えば、一定の実施形態では、組換えファージは、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７に対する特異性が高い。１つの実施形態では、組換えファージは、１００を超える他のタイプの細菌の存在下で大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７を識別することができる。
【００５３】
本発明のいくつかの実施形態では、組成物は、ファージゲノムに挿入された指標遺伝子を有する組換えファージを含み得る。一定の実施形態では、指標遺伝子を、ファージの後期遺伝子領域に挿入することができ、この遺伝子はファージの感染および複製中にのみ発現される。組換えファージでは、後期遺伝子領域は、クラスＩＩＩ遺伝子領域であり得る。後期クラスＩＩＩ遺伝子領域への指標遺伝子の挿入により、細菌内での複製時に指標遺伝子を確実に大量に発現させることができるため、アッセイの感度が向上する。以下により詳細に記載されるように、一定の実施形態では、指標遺伝子は、融合タンパク質ではない指標タンパク質産物をコードする。例えば、一定の実施形態では、宿主細胞の感染後のファージ複製中の指標遺伝子の発現により、可溶性指標タンパク質産物が得られる。
【００５４】
いくつかの実施形態では、指標ファージは、環境から単離された天然のファージ（Ｔ４様ファージなど）または実施例に記載の他のファージに由来する。いくつかの実施形態では、指標バクテリオファージは、ファージＫ、Ｔ７、Ｔ４、または別の類似のファージに由来する。指標バクテリオファージはまた、Ｔｗｏｒｔ様、ファージＫ様、Ｔ４様、Ｔ７様、ＶｉＩ、ＶｉＩ様、またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ特異的バクテリオファージに由来し得る。遺伝子改変は、野生型遺伝子の欠失を回避することができ、したがって、多数の市販のファージ（例えば、Ｔ７ＳＥＬＥＣＴ（登録商標）４１５）より野生型感染性因子との類似性をさらに保持している。かかる天然由来のファージは、市販のファージよりも環境中に見出される細菌に対してより特異的であり、そのため、市販のファージは、環境中に見出されるファージと遺伝的に異なる。
【００５５】
さらに、非必須と考えられるファージ遺伝子は、認識されていない機能を有し得る。例えば、見かけ上非必須の遺伝子は、アセンブリのわずかな切断、適合、またはトリミング機能により放出数を増加させる重要な機能を有し得る。そのため、指標を挿入するために遺伝子を欠失させることは有害であり得る。ほとんどのファージは、その天然のゲノムよりも数パーセント大きいＤＮＡをパッケージングすることができる。このことを考慮すると、ファージ、特により小さなゲノムを有するファージを改変するには、より小さな指標遺伝子がより適切な選択であり得る。ＯｐＬｕｃおよびＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）タンパク質は、わずか約２０ｋＤａ（コード領域は約５００〜６００ｂｐ）である一方で、ＦＬｕｃは約６２ｋＤａ（コード領域は約１，７００ｂｐ）である。比較のために、Ｔ７のゲノムはおよそ約４０ｋｂｐである一方で、Ｔ４ゲノムは約１７０ｋｂｐである。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的ファージであるファージＫのゲノムは、約１４８ｋｂｐである。さらに、ルシフェラーゼタンパク質は非常に発光性が高いため、より少量の指標タンパク質産物で検出を高めることができる。
【００５６】
いくつかの実施形態では、指標遺伝子を非翻訳領域に挿入して機能性遺伝子の破壊を回避することができ、それにより、野生型ファージ遺伝子をインタクトなまま残し、非実験室菌株の細菌に感染するときの適合性を高めることができる。さらに、３つすべての読み枠での終止コドンは、リーキー発現としても公知のリードスルーを減らすことにより発現を増大させるのに役立ち得る。このストラテジーはまた、ファージから分離することができないバックグラウンドシグナル（例えば、ルシフェラーゼ）として出現するかもしれない融合タンパク質が低レベルで作製される可能性を排除することができる。
【００５７】
指標遺伝子は、種々の生体分子を発現し得る。指標遺伝子は、検出可能な産物または検出可能な産物を産生する酵素を発現する遺伝子である。例えば、１つの実施形態では、指標遺伝子はルシフェラーゼ酵素をコードする。種々のタイプのルシフェラーゼを使用することができる。別の実施形態では、本明細書でより詳細に記載するように、ルシフェラーゼは、発光エビルシフェラーゼまたはホタルルシフェラーゼのうちの１つである。いくつかの実施形態では、指標遺伝子は、遺伝子改変されたルシフェラーゼ遺伝子（ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）など）である。
【００５８】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、後期（クラスＩＩＩ）遺伝子領域内に非ファージ指標遺伝子を含む改変ファージを含む。いくつかの実施形態では、変性指標遺伝子は、後期プロモーターの制御下にある。ウイルス後期遺伝子プロモーターを使用すると、レポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ）がウイルスキャプシドタンパク質のように高レベルで発現されるだけでなく、内因性の細菌遺伝子や初期のウイルス遺伝子のようにシャットダウンされない。
【００５９】
いくつかの実施形態では、後期プロモーターは、ファージＫプロモーター、Ｔ４プロモーター、Ｔ７プロモーター、もしくはＶｉＩ様プロモーター、または遺伝子改変していない天然のファージで見出されるものに類似の別のファージプロモーターである。後期遺伝子領域は、クラスＩＩＩ遺伝子領域であってよく、ファージは、ファージＫ、Ｔ７、Ｔ４、Ｔ４様ファージ、またはファージＫ、Ｔ７、Ｔ４、Ｔ４様、ＶｉＩ、ＶｉＩ様ファージと少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、または９５％の相同性を有するゲノムを有する別の天然ファージに由来し得る。好ましい実施形態では、指標遺伝子は、融合タンパク質ではない指標タンパク質産物をコードする。
【００６０】
いくつかの実施形態では、宿主細菌の感染後の子孫バクテリオファージにおける指標遺伝子の発現により、ファージ構造の一部ではない遊離の可溶性タンパク質産物が得られる。いくつかの実施形態では、変性指標遺伝子は、構造ファージタンパク質をコードする遺伝子と隣接しておらず、したがって、融合タンパク質を産生しない。キャプシドタンパク質への検出部分の融合（すなわち、融合タンパク質）を使用するシステムとは異なり、本発明のいくつかの実施形態は、可溶性指標またはレポーター（例えば、可溶性ルシフェラーゼ）を発現する。いくつかの実施形態では、指標またはレポーターは、理想的には、バクテリオファージ構造を含まない。すなわち、指標またはレポーターは、ファージ構造に付着していない。そのため、指標またはレポーターの遺伝子は、組換えファージゲノム内の他の遺伝子と融合しない。これにより、アッセイ感度を大幅に（単一の細菌に至るまで）向上させることができ、アッセイが簡素化され、それにより、いくつかの実施形態については、検出可能な融合タンパク質を産生する構築物のさらなる精製工程に数時間が必要であることと対照的に、１時間未満でアッセイを完了させることが可能である。さらに、融合タンパク質は、例えば、酵素活性部位の高次構造または基質へのアクセスを変化させ得るタンパク質折りたたみの制約により、可溶性タンパク質よりも活性が低い場合がある。
【００６１】
感染性因子に対する遺伝子改変には、核酸の小さな断片、遺伝子の実質的な部分、または遺伝子全体の挿入、欠失、または置換が含まれ得る。いくつかの実施形態では、挿入または置換された核酸は、変性配列（ｎｏｎ−ｎａｔｉｖｅ）を含む。変性指標遺伝子を、ファージプロモーターの制御下にあるようにファージゲノムに挿入することができる。いくつかの実施形態では、変性指標遺伝子は、融合タンパク質の一部ではない。すなわち、いくつかの実施形態では、指標タンパク質産物が天然のファージのポリペプチドを含まないように遺伝子改変を構成することができる。いくつかの実施形態では、指標タンパク質産物は可溶性である。いくつかの実施形態では、本発明は、試験試料をかかる改変されたファージとインキュベートする工程を含む、目的の微生物を検出する方法を含む。
【００６２】
場合によっては、指標部分は、目的の微生物の感染後のファージ複製中の指標遺伝子の発現によって可溶性指標タンパク質産物が得られるような感染性因子内の指標遺伝子によってコードされる指標タンパク質である；ここで、指標タンパク質の陽性検出は、試料中の目的の微生物が抗生物質耐性を示すことを示す。場合によっては、指標部分は、検出可能な産物を産生する酵素であり、検出可能な産物に由来するシグナルは、指標部分の量に対応する。いくつかの実施形態では、指標遺伝子は、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質など）などの内因性シグナルを発するタンパク質をコードする。指標は発光してもよく、そして／または変色によって検出可能であってもよい。いくつかの実施形態では、指標遺伝子は、基質と相互作用してシグナルを生成する酵素（例えば、ルシフェラーゼ）をコードする。一定の実施形態では、指標遺伝子は、融合タンパク質をコードしない。したがって、一定の実施形態では、宿主細菌の感染後のファージ複製中の指標遺伝子の発現により、可溶性指標タンパク質産物が得られる。場合によっては、指標部分の検出には、感染性因子に特異的な抗体は関与しない。
【００６３】
いくつかの実施形態では、指標ファージは、検出可能な酵素をコードする。指標は発光してもよく、そして／または変色によって検出可能であってもよい。アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、またはルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）などの種々の適切な酵素が市販されている。いくつかの実施形態では、これらの酵素は指標部分としての役割を果たし得る。いくつかの実施形態では、ホタルルシフェラーゼが指標部分である。いくつかの実施形態では、発光エビルシフェラーゼが指標部分である。いくつかの実施形態では、ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）が指標部分である。検出可能なシグナルを生成する他の操作されたルシフェラーゼまたは他の酵素も、適切な指標部分であり得る。
【００６４】
また、遊離の可溶性検出部分を使用すると、感染した試料細胞の溶解物から夾雑親ファージを単離する必要がなくなる。融合タンパク質システムを使用すると、試料細胞に感染させるために使用される任意のファージに検出部分が付着しており、検出部分も含む子孫ファージと識別できないであろう。試料細菌の検出は、新規に作製された（ｄｅ  ｎｏｖｏ合成された）検出部分の検出に依存しているので、融合構築物を使用するときに必要な、新規に作製された（子孫ファージ）部分から古い（親）部分を分離する追加の工程は不要である。典型的には、子孫部分からの親部分の分離は、ファージ生活環の完了前に感染細胞を複数回洗浄し、物理的または化学的手段による感染後に過剰な親ファージを不活性化し、そして／または結合部分（ビオチンなど）を使用して親ファージを化学修飾することにより達成することができ、前述の結合部分は、その後に結合および分離することができる（ストレプトアビジンでコーティングしたセファロースビーズなどによる）。しかし、これらすべての単離を試みたとしても、少数の試料細胞の感染を確実にするために高い感染多重度（ＭＯＩ）が使用されると、典型的には親ファージが残存し、したがって、バックグラウンドシグナルが生成されて感染細胞の子孫ファージからのシグナルの検出を不明瞭にする可能性がある。
【００６５】
対照的に、本発明のいくつかの実施形態で発現される遊離の可溶性検出部分は、親ファージがいかなる検出部分にも付着しないので、最終溶解物からの親ファージの精製は不要である。したがって、感染後に存在する任意の検出部分は、ｄｅ  ｎｏｖｏで作製されていたに違いなく、感染した細菌の存在を示す。この利点を活用するために、親ファージの産生および調製には、細菌培養での親ファージの産生中に産生される任意の遊離検出部分からのファージの精製が含まれ得る。スクロース密度勾配遠心分離、塩化セシウム等密度密度勾配遠心分離、ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィ、および透析、または派生テクノロジー（Ａｍｉｃｏｎブランドの濃縮器−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｉｎｃ．など）などの標準的なファージ精製技術を使用して、本発明のファージのいくつかの実施形態を精製することができる。本明細書中の実施例は、細菌ストック中のファージの増殖の際に産生される夾雑ルシフェラーゼタンパク質から親ファージ粒子を分離するための、本発明の組換えファージの調製の一部としての塩化セシウム等密度超遠心分離の使用を記載している。このようにして、本発明の組換えファージは、細菌での産生中に生成されるいかなるルシフェラーゼも実質的に含まない。ファージストックに存在する残存ルシフェラーゼを除去すると、組換えファージを試験試料とインキュベートしたときに認められるバックグラウンドシグナルを実質的に低下させることができる。
【００６６】
改変ファージのいくつかの実施形態では、後期プロモーター（例えば、ファージＫまたはＴ７またはＴ４由来のクラスＩＩＩプロモーター）は、ファージ粒子内にアセンブリされる構造タンパク質の遺伝子を転写する同一の未変性ファージ（例えば、それぞれ、ファージＫまたはＴ７またはＴ４）のＲＮＡポリメラーゼに対して高い親和性を有する。これらのタンパク質は、各ファージ粒子がこれらの分子の数十または数百のコピーを含むので、ファージによって作製される最も豊富なタンパク質である。ウイルス後期プロモーターの使用により、ルシフェラーゼ検出部分の最適な高レベルの発現を確実にすることができる。指標ファージが由来する元の野生型ファージに由来するか、特異的であるか、または活性を示す後期ウイルスプロモーター（例えば、ファージＫまたはＴ４またはＴ７に基づくシステムを用いたファージＫまたはＴ４またはＴ７後期プロモーター）の使用により、検出部分の最適な発現をさらに確実にすることができる。標準的な細菌（非ウイルス／非ファージ）プロモーターの使用は、これらのプロモーターがファージ感染中に下方制御されることが多いので（ファージが細菌からの供給源をファージタンパク質産生に優先させるため）、場合によっては、発現に有害な場合があり得る。したがって、いくつかの実施形態では、ファージは、発現をファージ構造成分のサブユニット数に限定しない可溶性（遊離）指標部分を高レベルでコードおよび発現するように操作されることが好ましい。
【００６７】
本発明の改変ファージを使用する実施形態は、特定の細菌株の迅速な検出を可能にし、総アッセイ時間は４５分〜２．０時間という速さである。必要とされる時間は、アッセイで検出されるファージの株および細菌の株に応じて、いくらか短縮または延長され得る。
【００６８】
可溶性ルシフェラーゼを産生する指標ファージを使用するストラテジーは、キャプシドタンパク質−ルシフェラーゼ融合の代わりに、複製中に可溶性ルシフェラーゼを発現するように操作されたファージ（例えば、ファージＫ）を使用する。ルシフェラーゼの発現は、ウイルスのキャプシドプロモーター（例えば、Ｔ４ファージのＳｏｃプロモーター）によって駆動され、それにより高い発現がもたらされる。親ファージにはルシフェラーゼが含まれないので、アッセイで検出される任意のルシフェラーゼは、細菌細胞から放出された子孫ファージの複製に由来するに違いない。したがって、親ファージと子孫ファージを分離する必要はない。
抗生物質および抗生物質耐性
【００６９】
本明細書中に開示の方法は、目的の微生物が抗生物質に対して感受性または耐性を示すかどうかを検出するために使用することができる。特定の抗生物質は、この抗生物質が死滅させるか阻害する微生物のタイプに特異的であり得る；抗生物質は、抗生物質に感受性を示す微生物を死滅させるか、成長を阻害し、抗生物質に耐性を示す微生物を死滅させたり、成長を阻害したりしない。場合によっては、以前に感受性を示していた微生物株が耐性を示すようになる可能性がある。微生物の抗生物質に対する耐性は、いくつかの異なる機序によって媒介され得る。例えば、いくつかの抗生物質は微生物の細胞壁合成を妨害する；かかる抗生物質に対する耐性は、抗生物質の標的、すなわち細胞壁タンパク質を変化させることにより媒介され得る。場合によっては、細菌は、細菌に到達する前に抗生物質を不活性化することができる化合物を産生することにより、抗生物質耐性を生じる。例えば、いくつかの細菌は、ペニシリンまたは／およびカルバペネムのβラクタムを切断できるベータラクタマーゼを産生し、したがってこれらの抗生物質が不活性化される。場合によっては、特定のポンプによって標的に到達する前に抗生物質が細胞から除去される。一例は、ＲＮＤ輸送体である。場合によっては、いくつかの抗生物質はリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）に結合して作用し、微生物のタンパク質生合成を阻害する。かかる抗生物質に耐性を示す微生物は、抗生物質への結合能力が低下しているが、リボソーム内で本質的に正常な機能を有する変異ｒＲＮＡを含み得る。他の場合では、細菌は耐性を付与することができる遺伝子を保有している。例えば、いくつかのＭＲＳＡはｍｅｃＡ遺伝子を保有している。ｍｅｃＡ遺伝子産物は、一定の抗生物質のリング状構造が細菌の細胞壁形成を補助する酵素に結合するのを防止する。したがって、β−ラクタムを含む抗生物質は、これらの細菌における細胞壁合成を阻害できない。いくつかの細菌は、おそらく遺伝子の変異または調節のために機能しない抗生物質耐性遺伝子を保有しており、それにより、ＰＣＲなどの従来の核酸法では抗生物質耐性として誤って検出される可能性があるが、機能的方法（抗生物質を用いたプレーティングもしくは培養または本方法など）では検出される可能性はない。
【００７０】
本発明で使用することができる抗生物質の非限定的な例には、アミノグリコシド、カルバセフェム、カルバペネム、セファロスポリン、糖ペプチド、マクロライド、モノバクタム、ペニシリン、β−ラクタム抗生物質、キノロン、バシトラシン、スルホンアミド、テトラサイクリン、ストレプトグラミン（ｓｔｒｅｐｔｏｇｒａｍｉｎｅ）、クロラムフェニコール、クリンダマイシン、およびリンコサミド、セファマイシン、リンコマイシン、ダプトマイシン、オキサゾリジノン、および糖ペプチド抗生物質が含まれる。
微生物の抗生物質耐性の検出または抗生物質耐性細菌の検出のために感染性因子を使用する方法
【００７１】
本明細書で述べるように、一定の実施形態では、本発明は、抗生物質に対する微生物の耐性を検出するため、または、言い換えれば、微生物に対する抗生物質の有効性を検出するために感染粒子を使用する方法を含み得る。別の実施形態では、本発明は、感染症の処置のために抗生物質を選択する方法を含む。さらに、本方法は、試料中の抗生物質耐性細菌を検出する方法を含み得る。本発明の方法は、種々の方法で具現化され得る。
【００７２】
本方法は、微生物を含む試料を上記の抗生物質および感染性因子と接触させる工程を含み得る。いくつかの実施形態では、本開示は、微生物の死滅または成長の阻害に有効な抗生物質の用量を決定する方法であって、（ａ）１または複数の抗生物質溶液の各々を、微生物を含む１または複数の試料と個別にインキュベートする工程であって、ここで、前述の１または複数の抗生物質溶液の濃度が異なり、かつ範囲を定義する、インキュベートする工程、（ｂ）前述の１または複数の試料中の微生物を、指標遺伝子を含む感染性因子とインキュベートする工程であって、ここで、前述の感染性因子が目的の微生物に特異的である、インキュベートする工程、および（ｃ）前述の１または複数の試料中の前述の感染性因子によって産生された指標タンパク質産物を検出する工程であって、ここで、前述の複数の試料のうちの１または複数中の前述の指標タンパク質産物の検出が、前述の１または複数の試料のうちの１または複数を処置するために使用した抗生物質溶液の濃度が有効でないことを示し、前述の指標タンパク質の不検出が、前述の抗生物質が有効であることを示し、それにより、前述の抗生物質の有効用量が決定される、検出する工程を含む方法を提供する。
【００７３】
いくつかの実施形態では、抗生物質および感染性因子は、試料が抗生物質および感染性因子の両方と接触するように同時に試料に添加される。他の実施形態では、抗生物質および感染性因子が連続的に添加され、例えば、試料が感染性因子と接触する前に試料が抗生物質と接触される。一定の実施形態では、本方法は、試料を感染性因子と接触させる前に、試料を抗生物質と一定期間インキュベートする工程を含み得る。インキュベーション時間は、例えば、微生物の倍加時間に基づいて、抗生物質および微生物の性質に応じて変動してよい。いくつかの実施形態では、インキュベーション時間は、２４時間未満、１８時間未満、１２時間未満、６時間未満、５時間未満、４時間未満、３時間未満、２時間未満、１時間未満、４５分未満、３０分未満、１５分未満、１０分未満、または５分未満である。微生物の感染性因子とのインキュベーション時間はまた、特定の感染性因子の生活環に応じて変動してよく、場合によっては、インキュベーション時間は、４時間未満、３時間未満、２時間未満、１時間未満、４５分未満、３０分未満、１５分未満、１０分未満、または５分未満である。抗生物質に耐性を示す微生物は生き残り、増殖する可能性があり、微生物に特異的な感染性因子が複製されるであろう；逆に、抗生物質に感受性を示す微生物は死滅し、したがって、感染性因子は複製しない。この方法による感染性因子は、指標部分を含み、その量は、抗生物質で処置されていた試料中に存在する微生物の量に対応する。したがって、指標部分の陽性検出は、微生物が抗生物質に耐性を示すことを示す。
【００７４】
いくつかの実施形態では、本方法を使用して、抗生物質耐性微生物が臨床試料に存在するかどうかを判定することができる。例えば、本方法を使用して、特定の抗生物質に耐性または感受性を示すＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに患者が感染しているかどうかを判定することができる。次いで、患者から得た臨床試料を、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに特異的な抗生物質と共にインキュベートすることができる。次いで、試料を、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに特異的な組換えファージと共に一定期間インキュベートすることができる。抗生物質に耐性を示すＳ．ａｕｒｅｕｓを含む試料では、組換えファージによって産生される指標タンパク質の検出は陽性であろう。抗生物質に感受性を示すＳ．ａｕｒｅｕｓの試料では、指標タンパク質の検出は陰性になるであろう。いくつかの実施形態では、抗生物質耐性の検出方法を使用して、病原性細菌が感受性を示す有効な治療薬を選択することができる。
【００７５】
一定の実施形態では、検出に必要な合計時間は、６．０時間未満、５．０時間、４．０時間、３．０時間、２．５時間、２．０時間、１．５時間、または１．０時間未満である。検出に必要な合計時間は、目的の細菌、ファージのタイプ、および試験される抗生物質に依存するであろう。
【００７６】
必要に応じて、本方法は、指標部分を検出する前に微生物を溶解する工程をさらに含む。微生物を溶解することができる任意の溶液を使用することができる。場合によっては、溶解緩衝液は、非イオン性界面活性剤、キレート剤、酵素、または種々の塩と薬剤の専有の組み合わせを含むことができる。溶解緩衝液はまた、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、またはＴｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒから市販されている。実験から、いくつかの実施形態では、ルシフェラーゼ基質の添加の際に、感染した未溶解細胞を検出できることが示唆される。おそらく、ルシフェラーゼは細胞から出て行き、そして／またはルシフェラーゼ基質は完全な細胞溶解なしで細胞に侵入し得る。したがって、溶解物に放出されたルシフェラーゼのみ（インタクトな細菌内に依然として存在するルシフェラーゼではない）が照度計で分析されるスピンフィルターシステムを利用する実施形態について、検出には溶解が必要である。しかし、インタクトで溶解した細胞を照度計で直接アッセイできる、下記の溶液または懸濁液中のファージ感染試料を含むフィルタープレートまたは９６ウェルプレートを利用する実施形態については、検出のために溶解は必要ない可能性がある。したがって、いくつかの実施形態では、抗生物質耐性を検出する方法は、微生物の溶解を伴わない。
【００７７】
アッセイの実施形態の驚くべき態様は、試料中の微生物を感染性因子とインキュベートする工程が、感染性因子（例えば、ファージ）の単一の生活環に十分な長さしか必要でないことである。ファージを使用して増幅力を得るには、以前はより多くの時間を必要とすると考えられていたので、ファージは数サイクルにわたって複製されていた。本発明のいくつかの実施形態によれば、指標ファージの単回の複製は、高感度かつ迅速な検出を容易にするのに十分であり得る。アッセイの実施形態の別の驚くべき態様は、試験試料の感染に利用される高濃度のファージ（すなわち、高ＭＯＩ）で、抗生物質で処置された非常に少数の抗生物質耐性標的微生物の検出に成功したことである。ファージの放出数が含まれる要因は、ファージの生活環の数に影響を及ぼす可能性があり、したがって、検出に必要な時間に影響を及ぼす可能性がある。放出数が大きい（約１００ＰＦＵ）ファージは検出に１サイクルしか必要としない可能性があるのに対して、放出数が小さい（１０ＰＦＵなど）ファージは検出に複数のファージサイクルを必要とする可能性がある。いくつかの実施形態では、ファージの試験試料とのインキュベーションは、単一のファージ生活環に十分な長さしか必要としない。他の実施形態では、ファージの試験試料とのインキュベーションは、単一の生活環よりも時間が長い。インキュベーション工程のためのファージ濃度は、使用するファージのタイプに応じて変動するであろう。いくつかの実施形態では、このインキュベーション工程のためのファージ濃度は、１．０×１０５ＰＦＵ／ｍＬ超、１．０×１０６ＰＦＵ／ｍＬ超、１．０×１０７ＰＦＵ／ｍＬ超、または１．０×１０８ＰＦＵ／ｍＬ超である。かかる多数のファージは、以前は、標的細胞が直ちに死滅し、それにより初期のファージアッセイ由来の有用なシグナルの生成が妨げられる「外部からの溶菌」に関連していたので、かかる高濃度のファージを用いた成功例は驚くべきことである。本明細書中に記載のファージストックの精製は、この問題（例えば、塩化セシウム等密度密度勾配超遠心分離による精製）の軽減に役立つ可能性がある。なぜなら、この精製は、ファージに関連する任意の夾雑ルシフェラーゼを除去することに加えて、ゴースト粒子（ＤＮＡを喪失した粒子）も除去することができるからである。ゴースト粒子は、「外部からの溶菌」を介して細菌細胞を溶解し、細胞を早期に死滅させ、それにより指標シグナルの生成を防止することができる。電子顕微鏡法は、粗組換えファージ溶解物（つまり、塩化セシウム精製前）のゴーストが５０％を超え得ることを実証している。これらのゴースト粒子は、細胞膜を穿刺する多くのファージ粒子の作用により、微生物の早死に寄与し得る。したがって、ゴースト粒子は、高ＰＦＵ濃度が有害であると報告されていた以前の問題に寄与していたかもしれない。
【００７８】
本開示に記載の任意の指標部分は、抗生物質処置後の微生物の生存能力を検出するために使用され、それにより抗生物質耐性を検出することができる。いくつかの実施形態では、感染性因子に関連する指標部分は、感染性因子の複製中または複製後に検出可能であり得る。例えば、上記のように、場合によっては、指標部分は、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質など）などの内因性シグナルを発するタンパク質であり得る。指標は、光を生成してもよく、そして／または変色によって検出可能であってもよい。いくつかの実施形態では、指標（例えば、ルシフェラーゼ）を検出するために照度計が使用され得る。しかし、他の装置またはデバイスも使用することができる。例えば、分光光度計、ＣＣＤカメラ、またはＣＭＯＳカメラは、変色および他の発光を検出することができる。
【００７９】
いくつかの実施形態では、抗生物質への試料の曝露は５分間またはそれを超え得て継続し、種々の時点での検出が最適な感度のために望ましいかもしれない。例えば、抗生物質で処置された一次試料のアリコートを、異なる時間間隔（例えば、５分、１０分、または１５分）で採取することができる。次いで、様々な時間間隔由来の試料にファージを感染させ、基質の添加後に指標部分を測定することができる。
【００８０】
いくつかの実施形態では、シグナルの検出を、抗生物質耐性を判定するために使用する。いくつかの実施形態では、試料によって産生されたシグナルを、実験で決定した値と比較する。さらなる実施形態では、実験で決定した値は、対照試料によって産生されたシグナルである。いくつかの実施形態では、バックグラウンド閾値を、微生物を含まない対照を使用して決定する。いくつかの実施形態では、ファージを含まないか抗生物質を含まない対照または他の対照試料を使用して、適切な閾値を決定することもできる。いくつかの実施形態では、実験で決定した値は、平均バックグラウンドシグナルと平均バックグラウンドシグナルの標準偏差の１〜３倍またはそれを超える倍数の和から計算されたバックグラウンド閾値である。いくつかの実施形態では、バックグラウンド閾値を、平均バックグラウンドシグナルと平均バックグラウンドシグナルの標準偏差の２倍の和から計算することができる。他の実施形態では、バックグラウンド閾値を、平均バックグラウンドシグナルの数倍（例えば、２または３倍）から計算することができる。バックグラウンド閾値より高い試料シグナルの検出が、試料中の１または複数の抗生物質耐性微生物の存在を示す。例えば、平均バックグラウンドシグナルは、２５０ＲＬＵであり得る。バックグラウンド閾値（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ｖａｌｕｅ）を、平均バックグラウンドシグナル（例えば、２５０）に３を掛けて計算値７５０ＲＬＵを得ることによって計算することができる。７５０ＲＬＵを超えるシグナル値を有する細菌を有する試料を、抗生物質耐性細菌の含有について陽性と判断する。
【００８１】
あるいは、実験で決定した値は、対照試料によって産生されたシグナルである。アッセイは、種々の適切な対照試料を含み得る。例えば、微生物に特異的な感染性因子を含まない試料、または感染性因子を含むが微生物を含まない試料を、バックグラウンドシグナルレベルの対照としてアッセイすることができる。場合によっては、抗生物質で処置されていない微生物を含む試料を、感染性因子を使用した抗生物質耐性の判定のための対照としてアッセイする。
【００８２】
いくつかの実施形態では、試料のシグナルを対照シグナルと比較して、抗生物質耐性微生物が試料中に存在するかどうかを判定する。感染性因子と接触しているが抗生物質と接触していない対照試料と比較して不変のシグナルが検出された場合、微生物が抗生物質に耐性であることを示し、感染性因子と接触しているが抗生物質と接触していない対照試料と比較して指標部分の検出が減少した場合、微生物が抗生物質に感受性を示すことを示す。検出の不変は、抗生物質および感染性因子で処置された試料からの検出シグナルが、抗生物質で処置されていない対照試料からのシグナルの少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％であることを指す。検出の減少は、抗生物質および感染性因子で処置された試料から検出されたシグナルが、抗生物質で処置されていない対照試料からのシグナルの８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、または少なくとも３０％であることを指す。
【００８３】
必要に応じて、目的の微生物を含む試料は、無培養試料である。必要に応じて、感染性因子はファージであり、宿主細菌の感染後のファージ複製中の指標遺伝子の発現により可溶性指標タンパク質産物が得られる、ファージの後期遺伝子領域に挿入された指標遺伝子を含む。上記の方法で使用される各組成物の特徴を、目的の微生物の抗生物質耐性を検出する方法でも利用することができる。
【００８４】
微生物の死滅に有効な抗生物質の用量を決定する方法も本明細書中に提供する。いくつかの実施形態では、抗生物質は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種の死滅に有効である。例えば、抗生物質は、ほとんどのメチシリン感受性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＳＳＡ）に対して有効なセフォキシチンであり得る。典型的には、異なる濃度の１または複数の抗生物質溶液を、異なる濃度の溶液が範囲を定義するように調製する。場合によっては、最低濃縮抗生物質溶液の最高濃縮抗生物質溶液に対する濃度比は、１：２〜１：５０（例えば、１：５〜１：３０または１：１０〜１：２０）の範囲である。場合によっては、１または複数の抗生物質溶液の最低濃度は、少なくとも１μｇ／ｍＬ（例えば、少なくとも２μｇ／ｍＬ、少なくとも５μｇ／ｍＬ  少なくとも１０μｇ／ｍＬ、少なくとも２０μｇ／ｍＬ、少なくとも４０μｇ／ｍＬ、少なくとも８０μｇ／ｍＬ、または少なくとも１００μｇ／ｍＬ）である。１または複数の抗生物質溶液の各々を、１アリコートの目的の微生物を含む試料とインキュベートする。場合によっては、微生物に特異的であり、かつ指標部分を含む感染性因子を、抗生物質溶液と同時に添加する。場合によっては、試料のアリコートを、感染性因子の添加前に抗生物質溶液と一定期間インキュベートする。指標部分を検出することができ、陽性検出は、抗生物質溶液が有効でないことを示し、陰性検出は、抗生物質溶液が有効であり、かつ抗生物質溶液の濃度が有効な用量であることを示す。したがって、いくつかの実施形態では、目的の微生物の死滅に有効な抗生物質の用量を決定する方法は、１または複数の抗生物質溶液の各々を、試料中の目的の微生物と個別にインキュベートする工程であって、ここで、１または複数の抗生物質溶液の濃度が異なり、かつ範囲を定義する、インキュベートする工程；１または複数の試料中の微生物を、指標部分を含む感染性因子とインキュベートする工程；１または複数の試料中の感染性因子の指標部分を検出する工程であって、ここで、１または複数の試料のうちの１または複数中の指標部分の陽性検出が、前述の１または複数の試料のうちの１または複数を処置するために使用した抗生物質溶液の濃度が有効でないことを示し、前述の指標タンパク質の不検出が、前述の抗生物質が有効であることを示し、それにより、前述の抗生物質の有効用量が決定される、検出する工程を含む。いくつかの実施形態では、２またはそれを超える抗生物質溶液を試験し、１または複数の抗生物質溶液中の最低濃縮溶液と最高濃縮溶液との濃度比は、１：２〜１：５０（例えば、１：５〜１：３０または１：１０〜１：２０）の範囲である。場合によっては、１または複数の抗生物質溶液の最低濃度は、少なくとも１μｇ／ｍＬ（例えば、少なくとも２μｇ／ｍＬ、少なくとも５μｇ／ｍＬ  少なくとも１０μｇ／ｍＬ、少なくとも２０μｇ／ｍＬ、少なくとも４０μｇ／ｍＬ、少なくとも８０μｇ／ｍＬ、または少なくとも１００μｇ／ｍＬ）である。
【００８５】
いくつかの実施形態では、本発明は、抗生物質感受性微生物の存在下で抗生物質耐性微生物を検出する方法を含む。一定の例では、抗生物質耐性細菌の検出を使用して、医療現場での感染の蔓延を防止することができる。いくつかの実施形態では、医療現場にある患者を、抗生物質耐性細菌の定着についてモニタリングすることができる。次いで、抗生物質耐性細菌の蔓延を防止するための予防措置を実施することができる。
【００８６】
抗生物質耐性微生物を検出する方法のいくつかの実施形態では、試料は抗生物質耐性細菌と抗生物質感受性細菌の両方を含み得る。例えば、試料は、ＭＲＳＡおよびＭＳＳＡの両方を含み得る。いくつかの実施形態では、ＭＲＳＡを、試料からＭＲＳＡを単離する必要なく、ＭＳＳＡの存在下で検出することができる。抗生物質の存在下で、ＭＳＳＡは閾値を超えるシグナルを生成しないが、試料中に存在するＭＲＳＡは閾値を超えるシグナルを生成することができる。したがって、試料内に両方が存在する場合、閾値を超えるシグナルは、抗生物質耐性株（例えは、ＭＲＳＡ）の存在を示す。
抗生物質および感染性因子とのインキュベーション前の微生物の捕捉
【００８７】
いくつかの実施形態では、本発明は、微生物を捕捉する工程を必要としない方法およびシステムを含む。他の実施形態は、抗生物質処置の前に試料から微生物を物理的に単離することが可能である。一定の実施形態では、本方法は、試料由来の微生物を抗生物質および／または感染性因子と接触させる前に、固体支持体上の試料から微生物を捕捉する工程を含み得る。いくつかの実施形態では、捕捉工程は、抗生物質との接触と同時にまたは接触後に実施することができる。いくつかの実施形態では、本方法は、固体支持体上の試料由来の微生物を捕捉する前に、試料由来の微生物を抗生物質と接触させる工程を含む。これにより、抗生物質感受性微生物の数が減少し、したがってバックグラウンドが有利に減少するであろう。場合によっては、本方法は、固体支持体上に組換えファージを固定する工程、試料および抗生物質を含む混合物を支持体上のファージと接触させる工程、および指標部分を検出する工程を含む。場合によっては、指標部分が発現され、ファージの感染および複製中にのみ検出可能である。
【００８８】
本発明の方法の種々の実施形態では、微生物の抗生物質耐性を、試料からの微生物のいかなる精製もなく検出することができる。例えば、一定の実施形態では、１または少数の目的の微生物を含む試料を、スピンカラム、マイクロタイターウェル、またはフィルターなどのアッセイ容器に直接適用することができ、前述のアッセイ容器でアッセイする。かかるアッセイの種々の実施形態が本明細書に開示されている。
【００８９】
いくつかの実施形態では、本方法は、固体支持体（例えば、磁気ビーズまたは濾過基材）に捕捉された微生物を抗生物質および複数の特定の感染性因子（例えば、指標ファージ）と接触させる工程、および感染性因子を微生物に結合および感染させる工程を含み得る。他の実施形態では、微生物の捕捉は検出に必要ではない。種々の固体支持体を使用することができる。一定の実施形態では、固体支持体は、マルチウェルプレート、フィルター、ビーズ、または側方流動ストリップ、フィルターストリップ、フィルターディスク、もしくは濾紙、または細胞を培養するために設計された薄膜（例えば、３ＭのＰＥＴＲＩＦＩＬＭ（登録商標））を含み得る。他の固体支持体も適切であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、試験試料微生物を、プレートの表面に結合することにより、または細菌学的フィルター（例えば、孔径０．４５μｍのスピンフィルターまたはプレートフィルター）を通して試料を濾過することにより捕捉することができる。いくつかの実施形態では、抗生物質をフィルターに直接添加する。さらなる実施形態では、捕捉された微生物を富化し、次いで、感染性因子と共にインキュベートする。１つの実施形態では、フィルターまたはプレートの表面上に捕捉された微生物を、引き続いて１回または複数可洗浄して過剰な未結合感染性因子を除去する。１つの実施形態では、培地（例えば、本明細書中でＬＢブロスとも呼ばれるＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）をさらなるインキュベーション時間を確保するために添加して、ファージの複製および指標部分をコードする遺伝子の高レベル発現を可能にする。
【００９０】
目的の微生物を、結合剤を使用して試料から精製することができる。必要に応じて、一定の実施形態では、捕捉工程は、目的の微生物を、微生物を認識する捕捉抗体と結合させることをさらに含む。抗体を、固体支持体と併せて使用することができる。例えば、一定の実施形態では、捕捉抗体は、微生物の固体支持体への結合を容易にする。必要に応じて、捕捉抗体は微生物の表面抗原を認識する。好ましい実施形態では、特定の微生物（例えば、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７）の微生物表面抗原を認識する表面特異的抗体は、他の類似の微生物（例えば、大腸菌Ｂ）を認識しない。いくつかの実施形態では、捕捉抗体を、固体支持体（例えば、ビーズまたはプレート表面）に付着した別の結合剤と結合する化学部分に抱合することができる。例えば、いくつかの実施形態では、捕捉抗体をビオチン化して、固体支持体に結合したストレプトアビジンへの結合を容易にすることができる。いくつかの実施形態では、固体支持体は磁気ビーズを含み、必要に応じて、これらのビーズは、捕捉抗体に結合する化学部分でコーティングされている。他の実施形態では、固体支持体は、プレート表面またはマルチウェルプレート（例えば、ＥＬＩＳＡプレート）の表面を含む。例えば、ＥＬＩＳＡプレートを、目的の微生物を特異的に認識する抗体でコーティングすることができる。多種多様な細菌または他の微生物上の表面抗原の特異的認識を示す抗体は、Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．（ＫＰＬ）またはＡｂｃａｍなどのいくつかの供給元からから市販されている。
【００９１】
いくつかの実施形態では、本発明は、微生物の物理的サイズを利用して、固体支持体上に微生物を捕捉する。いくつかの実施形態では、固体支持体はフィルターである。例えば、細菌学的フィルター（例えば、孔径０．４５μｍのスピンフィルター）で試料を濾過すると、インタクトな細菌を保持したまま、より小さい物質を通過させることが可能である。あるいは、プレートフィルターを使用して微生物を捕捉することができるか、種々の他のフィルターデバイスを使用することができる（例えば、９６ウェルフィルタープレート）。例えば、方法は、細菌学的フィルターを通して試料を濾過することなどにより、固体支持体上に微生物を収集する工程を含み得る。サイズに基づいた捕捉後、抗生物質および指標感染性因子を上記のように連続的または同時に添加して、微生物の抗生物質耐性を同定することができる。試料中の微生物を単離する他の方法（本明細書中で参考として援用される米国特許出願公開特許出願公開第２０１５／０２１８６１６号に記載されているものなど）を使用することができる。
【００９２】
あるいは、いくつかの実施形態では、捕捉工程は、サイズなどの目的の微生物の他の特徴に基づき得る。サイズベースの捕捉を利用する実施形態では、固体支持体はスピンカラムフィルターであり得る。いくつかの態様において、固体支持体は、９６ウェルフィルタープレートを含む。または、捕捉用の固体支持体は、アレイ上の場所またはビーズなどの可動支持体上の位置であり得る。
【００９３】
いくつかの実施形態では、捕捉抗体は、その後の細胞−抗体複合体の磁性ストレプトアビジンビーズへの結合を容易にするようにビオチン化されている。抗体上のビオチンは、磁気ビーズ上のストレプトアビジンに強固に結合することができる。または、捕捉抗体を、ビーズまたは別の固体支持体での捕捉を容易にする別のタンパク質または他の分子に抱合することができる。かかる実施形態は、特に初期試料体積が大きい場合、感度が向上し得る。したがって、本方法は、目的の微生物上の表面抗原に特異的に結合することができる複数の結合剤を付着させる工程を含むことができ、それにより捕捉固体支持体への結合が容易になる。
感度
【００９４】
当該分野で知られているアッセイとは対照的に、微生物の抗生物質耐性の検出は非常に感度が高く、微生物の個体群を増やす方法として試料を培養することを必要とせずに完了することができる。これは、単一の微生物が多数の特定の感染性因子（例えば、ファージ）に結合する能力に一部起因している。ファージの感染および複製後、標的微生物を、ファージ複製中に産生された指標部分を介して検出することができる。
【００９５】
したがって、一定の実施形態では、本方法は、細胞数１０個以下の微生物（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個の微生物）を含む試料中の微生物の抗生物質耐性を検出することができる。例えば、一定の実施形態では、組換えファージは、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７に対する特異性が高い。１つの実施形態では、組換えファージは、１００を超える他のタイプの細菌の存在下で大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７を識別することができる。一定の実施形態では、組換えファージを使用して、抗生物質で処置された試料中の特定のタイプの単一の細菌を検出することにより、抗生物質耐性を検出することができる。一定の実施形態では、組換えファージは、抗生物質と接触した試料中のわずか２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００個の特定の細菌の存在を検出する。
【００９６】
本明細書中に開示の抗生物質耐性を検出する方法の感度を、抗生物質とのインキュベーションの前に捕捉および感染した微生物を洗浄することによりさらに増加させることができる。さらに、溶解緩衝液および基質を添加する前に、抗生物質および感染性因子とのインキュベーション後に捕捉された微生物を洗浄することができる。これらのさらなる洗浄工程は、過剰な親ファージおよび／もしくはルシフェラーゼまたはファージ調製物を汚染する他のレポータータンパク質の除去を補助する。したがって、いくつかの実施形態では、抗生物質耐性を検出する方法は、ファージを添加する後であるがインキュベートする前に、捕捉および感染した微生物を洗浄する工程を含み得る。
【００９７】
多くの実施形態では、マルチウェルプレートを使用してアッセイを実施する。プレート（または検出を実行できる任意の他の容器）の選択は、検出工程に影響を及ぼし得る。例えば、プレートによっては、有色または白色のバックグラウンドが含まれている場合があり、これが発光の検出に影響を及ぼし得る。一般的に言えば、白色プレートは高感度であるが、バックグラウンドシグナルも高くなる。他の色のプレートは、バックグラウンドシグナルがより低くなり得るが、感度もわずかに低い。さらに、バックグラウンドシグナルの理由の１つは、あるウェルから別の隣接するウェルへの光の漏れである。ウェルは白色であるが、プレートの残部は黒色であるプレートがいくつか存在する。これにより、ウェル内で高いシグナルが得られるが、ウェル間の光漏れが防止されるため、バックグラウンドが減少し得る。したがって、プレートまたは他のアッセイ容器の選択は、アッセイの感度およびバックグラウンドシグナルに影響を及ぼし得る。
【００９８】
したがって、本発明のいくつかの実施形態は、検出可能なシグナルを増幅するための感染性因子ベースの方法を使用し、それにより微生物が抗生物質に耐性を示すかどうかを示すことによって一定の要件が解決される。本発明は、試料が富化または培養されていないにもかかわらず、使用者が試料中に存在する微生物の抗生物質耐性を検出することが可能である。一定の実施形態では、単一のバクテリアですら検出される。この原理により、微生物表面受容体の特異的認識に基づいて、１つまたは少数の細胞由来の指標シグナルを増幅可能である。例えば、微生物の単一細胞でさえ複数のファージに曝露し、その後にファージを増幅させ、複製中にコードされた指標遺伝子産物を高レベルで発現させることにより、単一微生物が検出可能なように指標シグナルが増幅される。本発明の方法は、迅速かつ伝統的な生物学的富化（例えば、富化のための培養）を必要とせずに、高い検出感度および特異性を提供する。いくつかの実施形態では、ファージまたはウイルスの１〜２複製サイクル内で検出が可能であり、これは、ファージ自体および指標部分のシグナルを増幅するファージの本来の能力を利用しないので、定説に従っていない。
【００９９】
さらなる実施形態では、本発明は、本明細書中に開示の方法を実施するための、および／または本明細書中に記載の改変された感染性因子を使用するための構成要素を含むシステム（例えば、コンピュータシステム、自動システム、またはキット）を含む。
本発明のシステムおよびキット
【０１００】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書中に開示の方法を実施するための構成要素を含むシステム（例えば、自動システムまたはキット）を含む。本発明のこれらのシステムおよびキットは、種々の構成要素を含む。本明細書中で使用される場合、用語「構成要素」は、広く定義され、列挙された方法を実施するのに適した任意の適切な装置または装置の集合物を含む。構成要素は、任意の特定の方法で一体化するように相互に接続または配置する必要はない。本発明は、相互の構成要素の任意の適切な配置を含む。例えば、構成要素は同一の空間にある必要はない。しかし、いくつかの実施形態では、構成要素は、一体型ユニット中で相互に接続されている。いくつかの実施形態では、同一の構成要素が複数の機能を実行することができる。
【０１０１】
本明細書中に記載のいくつかの実施形態は、本方法を実行するのに必要な試薬および材料の最小量であることを考慮すると、自動化またはキットに特に適している。一定の実施形態では、キットの構成要素の各々は、第１の場所から第２の場所に送達可能な自立型ユニットを含み得る。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、本発明は、試料中の目的の微生物の抗生物質に対する耐性の迅速な検出のためのシステムまたはキットを含む。システムまたはキットは、一定の実施形態では、試料を抗生物質とインキュベートするための構成要素、試料を目的の微生物に特異的な感染性因子（ここで、感染性因子は指標部分を含む）とインキュベートするための構成要素、および指標部分を検出するための構成要素を含み得る。本発明のシステムおよびキットの両方のいくつかの実施形態では、感染性因子は、目的の微生物に感染する組換えファージであり、組換えファージは、宿主細菌の感染後のファージ複製中の指標遺伝子の発現により可溶性指標タンパク質産物が得られるように、指標部分としてファージの後期遺伝子領域に挿入された指標遺伝子を含む。いくつかのシステムは、さらに、目的の微生物を固体支持体上に捕捉する構成要素および／または感染性因子とのインキュベーション後に微生物を溶解して微生物中に存在する子孫感染性因子および可溶性指標タンパク質を放出させる構成要素を含む。
【０１０３】
一定の実施形態では、システムおよび／またはキットは、捕捉された微生物試料を洗浄するための構成要素をさらに含み得る。さらにまたはあるいは、システムおよび／またはキットは、指標部分の量を決定するための構成要素をさらに含んでもよく、ここで、指標部分の検出量は、抗生物質によって処置された試料中の微生物の量に対応し、この量は、試料中の抗生物質耐性に対応する。例えば、一定の実施形態では、システムまたはキットは、ルシフェラーゼ酵素活性を測定するための照度計または他のデバイスを含み得る。いくつかの実施形態では、捕捉および／またはインキュベーションおよび／または洗浄の工程に同一の構成要素を使用することができる。いくつかの実施形態は、試料中の目的の微生物の数を決定するための構成要素をさらに含み、ここで、指標部分の検出量は、試料中の微生物数に対応する。
【０１０４】
いくつかのシステムおよび／またはキットでは、同一の構成要素を複数の工程のために使用することができる。いくつかのシステムおよび／またはキットでは、工程は、自動化されているか、コンピュータ入力を介して使用者によって制御され、そして／または液体処理ロボットが少なくとも１つの工程を実行する。いくつかの実施形態では、システムおよび／またはキットは、抗生物質と接触する前に試料中の他の構成要素から目的の微生物を単離するための構成要素を含み得る。
【０１０５】
微生物の死滅または阻害に有効な抗生物質の用量を決定するためのシステムおよび／またはキットも本明細書中に提供する。いくつかの実施形態では、キットは、例えば、異なる濃度の抗生物質溶液が範囲を定義するように、異なる濃度を有する１または複数の抗生物質溶液を調製するための感染性因子および試薬を含む。場合によっては、２またはそれを超える抗生物質溶液を試験し、１または複数の抗生物質溶液中の最低濃縮抗生物質溶液と最高濃縮抗生物質溶液の濃度比は、１：２〜１：５０（例えば、１：５〜１：３０または１：１０〜１：２０）の範囲である。場合によっては、１または複数の抗生物質溶液の最低濃度は、少なくとも１μｇ／ｍＬ（例えば、少なくとも２μｇ／ｍＬ、少なくとも５μｇ／ｍＬ、少なくとも１０μｇ／ｍＬ、少なくとも２０μｇ／ｍＬ、少なくとも４０μｇ／ｍＬ、少なくとも８０μｇ／ｍＬ、または少なくとも１００μｇ／ｍＬ）である。キットはまた、１または複数の抗生物質溶液の各々を試料中の目的の微生物とインキュベートするための構成要素を含み得る。
【０１０６】
他の実施形態では、本発明は、試料中の目的の微生物の抗生物質耐性の迅速な検出のためのキットを含むことができ、キットは、抗生物質および目的の微生物に特異的な感染性因子を含み、ここで、感染性因子は、指標部分を含む。必要に応じて、キットは、目的の微生物を捕捉するためのフィルターおよび／または捕捉抗体を含み得る。必要に応じて、キットは、捕捉された微生物試料を洗浄して非結合の感染性因子を除去するための緩衝液を含む。必要に応じて、キットは、指標部分と反応して検出可能なシグナルを生成することができる基質を含む。かかるキットは、微生物の迅速な検出方法について上述した実施形態に類似する種々の実施形態および下位の実施形態を含むことができる。１つの実施形態では、微生物は細菌であり、感染性因子はファージである。
【０１０７】
キットは、子孫感染性因子を検出するための種々の構成要素を含み得る。例えば、１つの実施形態では、子孫感染性因子（例えば、ファージ）は指標部分を含み得る。１つの実施形態では、子孫感染性因子（例えば、ファージ）中の指標部分は、可溶性ルシフェラーゼタンパク質などの複製中に発現される検出可能な部分であり得る。
コンピュータシステムおよびコンピュータ可読媒体
【０１０８】
本発明の技術またはその構成要素のいずれかに記載のシステムは、コンピュータシステムの形態で具現化され得る。コンピュータシステムの典型的な例には、汎用コンピュータ、プログラミングされたマイクロプロセッサ、マイクロコントローラ、周辺集積回路素子、および本発明の技術の方法を構成する工程を実装することができる他のデバイスまたはデバイスの配置が含まれる。本発明のシステム、方法に使用することができる例示的なコンピュータシステムおよびコンピュータ可読媒体は、米国特許出願公開第２０１５／０２１８６１６号に記載されており、関連する開示は、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【０１０９】
一定の実施形態を参照して本発明を開示してきたが、添付の特許請求の範囲で定義される本発明の範囲および意図から逸脱することなく、記載の実施形態の多くの修正、変更、および変化が可能である。したがって、本発明は、記載の実施形態に限定されないが、以下の特許請求の範囲の文言およびその均等物によって定義される全範囲を有することが意図される。
【０１１０】
本明細書中に記載のテクノロジーのいくつかの実施形態を、以下の番号付きパラグラフのうちのいずれかにしたがって定義することができる：
【０１１１】
（１）試料中の抗生物質耐性微生物を検出する方法であって、（ａ）前述の試料を抗生物質と接触させる工程、（ｂ）前述の試料を感染性因子と接触させる工程であって、ここで、前述の感染性因子が指標遺伝子を含み、かつ前述の微生物に特異的であり、ここで、前述の指標遺伝子が、指標タンパク質産物をコードする、接触させる工程、および（ｃ）指標タンパク質産物によって産生されたシグナルを検出する工程であって、ここで、前述のシグナルの検出を使用して抗生物質耐性を判定する、検出する工程、を含む方法。
【０１１２】
（２）前述の試料を抗生物質と感染性因子と接触前させる工程の前に一定期間接触させる、パラグラフ１に記載の方法。
【０１１３】
（３）前述の感染性因子が組換えファージであり、前述の微生物が細菌である、パラグラフ１に記載の方法。
【０１１４】
（４）前述の方法が、前述の指標タンパク質を検出する工程の前に前述の試料中で微生物を溶解させる工程をさらに含む、パラグラフ１に記載の方法。
【０１１５】
（５）前述の微生物を感染性因子と接触させる工程を４時間未満継続させる、パラグラフ１に記載の方法。
【０１１６】
（６）前述の微生物を、抗生物質と、感染性因子との接触前に５分間〜２４時間インキュベートする、パラグラフ１に記載の方法。
【０１１７】
（７）前述の微生物を、抗生物質と、感染性因子との接触前に５分間〜３時間インキュベートする、パラグラフ１に記載の方法。
【０１１８】
（８）前述の抗生物質が、アミノグリコシド、カルバセフェム、カルバペネム、セファロスポリン、糖ペプチド、マクロライド、モノバクタム、ペニシリン、β−ラクタム抗生物質、キノロン、バシトラシン、スルホンアミド、テトラサイクリン、ストレプトグラミン（ｓｔｒｅｐｔｏｇｒａｍｉｎｅ）、クロラムフェニコール、クリンダマイシン、およびリンコサミド、セファマイシン、リンコマイシン、ダプトマイシン、オキサゾリジノン、および糖ペプチド抗生物質からなる群から選択される、パラグラフ１に記載の方法。
【０１１９】
（９）前述の組換えファージが、前述のファージゲノムの後期遺伝子領域に挿入された指標遺伝子を含む、パラグラフ３に記載の方法。
【０１２０】
（１０）前述の指標遺伝子が主要キャプシド遺伝子に隣接している、パラグラフ１に記載の方法。
【０１２１】
（１１）前述の組換えファージが、ファージＫ、Ｔｗｏｒｔファージ、Ｔｗｏｒｔ様ファージ、ＮＣＴＣ９８５７ファージ、Ｖｉｌファージ、Ｖｉｌ様ファージ、Ｔ７ファージ、Ｔ４ファージ、Ｔ４様ファージ、またはファージＫ、Ｔｗｏｒｔファージ、Ｔｗｏｒｔ様ファージ、ＮＣＴＣ９８５７ファージ、Ｖｉｌファージ、Ｖｉｌ様ファージ、Ｔ７ファージ、Ｔ４ファージ、Ｔ４様ファージと少なくとも９０％相同性を有するゲノムを有する別の天然ファージに由来する、パラグラフ３に記載の方法。
【０１２２】
（１２）前述の細菌がＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓであり、前述の組換えファージが、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに対する特異性が高い、パラグラフ３に記載の方法。
【０１２３】
（１３）前述の指標遺伝子が、内因性シグナルを生成する前述の指標タンパク質産物または基質との反応の際にシグナルを生成する酵素をコードする、パラグラフ１に記載の方法。
【０１２４】
（１４）前述の酵素がルシフェラーゼである、パラグラフ１３に記載の方法。
【０１２５】
（１５）前述の細菌が無培養試料中に含まれる、パラグラフ３に記載の方法。
【０１２６】
（１６）前述の細菌が試料中に含まれ、前述の試料が、臨床試料、食品試料、環境試料、または水試料である、パラグラフ３に記載の方法。
【０１２７】
（１７）前述の試料によって産生されたシグナルを実験で決定した値と比較し、前述の実験で決定した値が対照試料によって産生されたシグナルである、パラグラフ１に記載の方法。
【０１２８】
（１８）前述の実験で決定した値が、平均バックグラウンドシグナルと前述の平均バックグラウンドシグナルの標準偏差の１〜３倍またはそれを超える倍数の和から計算されたバックグラウンド閾値である、パラグラフ１７に記載の方法。
【０１２９】
（１９）試料によって産生されたバックグラウンド閾値を超えるシグナルの検出が、試料中の１または複数の抗生物質耐性微生物の存在を示す、パラグラフ１８に記載の方法。
【０１３０】
（２０）微生物の死滅に有効な抗生物質の用量を決定する方法であって、（ａ）１または複数の抗生物質溶液の各々を、微生物を含む１または複数の試料と個別にインキュベートする工程であって、ここで、前述の１または複数の抗生物質溶液の濃度が異なり、かつ範囲を定義する、インキュベートする工程、（ｂ）前述の１または複数の試料中の微生物を、指標遺伝子を含む感染性因子とインキュベートする工程であって、ここで、前述の感染性因子が目的の微生物に特異的である、インキュベートする工程、および（ｃ）前述の１または複数の試料中の前述の感染性因子によって産生された指標タンパク質産物を検出する工程であって、ここで、前述の複数の試料のうちの１または複数中の前述の指標タンパク質産物の検出が、前述の１または複数の試料のうちの１または複数を処置するために使用した抗生物質溶液の濃度が有効でないことを示し、前述の指標タンパク質の不検出が、前述の抗生物質が有効であることを示し、それにより、前述の抗生物質の有効用量が決定される、検出する工程を含む方法。
【０１３１】
（２１）前述の１または複数の抗生物質溶液が２またはそれを超える抗生物質溶液であり、前述の複数の抗生物質溶液中の最低濃縮溶液と最高濃縮溶液の濃度比が１：２〜１：５０の範囲である、パラグラフ２０に記載の方法。
【０１３２】
（２２）前述の方法のうちのいずれか１または複数を実施するためのキットであって、指標遺伝子および抗生物質と共に組換えファージを含む、キット。
【０１３３】
（２３）指標タンパク質を検出するための基質をさらに含む、パラグラフ２２に記載のキット。
【０１３４】
（２４）試料中の微生物の抗生物質耐性を検出するためのシステムであって、前述の試料を前述の抗生物質と接触させるための構成要素、前述の試料を前述の感染性因子と接触させるための構成要素であって、前述の感染性因子が指標部分を含み、かつ前述の微生物に特異的である、構成要素、前述の感染性因子と接触した前述の試料中の前述の指標部分を検出するための構成要素であって、ここで、前述の指標部分の陽性検出が、微生物が前述の抗生物質に耐性を示すことを示す、構成要素を含む、システム。
【実施例】
【０１３５】
実施例
以下の実施例は説明のためのものであり、本発明を限定するものではない。
実施例１．バクテリオファージを使用した抗生物質耐性の判定
【０１３６】
約１×１０６細胞／ウェルの大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７を、１００μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに移した。アンピシリンまたはバンコマイシンの最終濃度が１０μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、または２００μｇ／ｍＬに到達するように、１０μＬのアンピシリンまたはバンコマイシン溶液をウェルに添加した。アンピシリンはグラム陰性菌とグラム陽性菌の両方を標的とし、バンコマイシンはグラム陽性菌のみを標的にする。いずれの抗生物質も含まない緩衝液も調製し、対照としての機能を果たすために細胞に添加した。試料を抗生物質またはコントロールのいずれかと共に３７℃で３０分間インキュベートし、次いで、１×１０６ファージ粒子／ｍＬのＣＢＡ１２０ＮａｎｏＬｕｃファージと３７℃で１２０分間インキュベートした。ＣＢＡ１２０ＮａｎｏＬｕｃファージはＣＢＡ１２０ファージに由来し、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７に特異的に感染することができ、宿主細胞で複製するときにルシフェラーゼを産生する。１０μＬの溶解緩衝液を各ウェルに加え、その後、５０μＬの調製済みルシフェラーゼ試薬を添加した。反応物からの発光をＧＬＯＭＡＸ（登録商標）Ｎａｖｉｇａｔｏｒで読み取り、各反応の相対発光単位（ＲＬＵ）をプロットし、分析した。細菌の感染時に産生される可溶性ルシフェラーゼによって提供されるシグナルを、Ｙ軸上にＲＬＵとして示す。
【０１３７】
図１に示す結果は、１０μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、または５０μｇ／ｍＬのアンピシリン濃度での細胞の処置により、対照と比較して、それぞれ、シグナルが約１／１００、１／１４００、または約１／２２００に低下したことを示す。他方では、１０μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、または１００μｇ／ｍＬのバンコマイシンへの曝露の際にシグナルが増加した。この結果は、細胞がバンコマイシンに耐性を示すが、アンピシリンに感受性を示すことを示す。反応物の高ＲＬＵ値は、アッセイの感度が非常に高いこと、および、いかなる富化インキュベーションを行うことなく細胞濃度がさらに低い試料について抗生物質の感受性または耐性を測定することができることを示唆している。
実施例２．バクテリオファージを使用した抗生物質耐性の判定
【０１３８】
細菌株を、およそ１×１０３ＣＦＵ／ｍＬまで連続希釈し、１３５μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに移した。最終濃度が、オキサシリン（ｏｘｉｃｉｌｌｉｎ）については１．０μｇ／ｍＬもしくは２．０μｇ／ｍＬ、またはセフォキシチンについては２．０μｇ／ｍＬ、４．０μｇ／ｍＬ、８．０μｇ／ｍＬ、もしくは１０．０μｇ／ｍＬに到達するように、１５μＬのオキサシリンまたはセフォキシチンをウェルに添加した。次いで、プレートを密封し、３７℃で２時間インキュベートした。１０μＬの組換えファージ（１．６×１０８ｐｆｕ／ｍＬ）を各ウェルに添加した。次いで、プレートを再密封し、３７℃で２時間インキュベートした。ウェルあたり１５μＬの５×溶解緩衝液、５０μＬルシフェラーゼアッセイ緩衝液、および１μＬルシフェラーゼ基質を含むマスターミックスを作製した。６５μＬのマスターミックスを各ウェルに添加した。反応物からの発光をＧＬＯＭＡＸ（登録商標）Ｎａｖｉｇａｔｏｒで読み取り、各反応の相対ルミナール単位（ＲＬＵ）を分析した。ＲＬＵ値は、ＬＢについて確立されたバックグラウンドＲＬＵレベルの３倍の値（７５０ＲＬＵ超）を陽性と見なした。表１に示す結果は、組換えファージが試験した細菌株を検出できることを示す。抗生物質で処置していない各々の試験細菌株（０ｕｇ／ｍＬ）のＲＬＵ値は陽性であり、これは、目的の細菌が試料中に存在することを示していた。
【０１３９】
さらに、オキサシリンとのインキュベーションにより、いくつかのＭＲＳＡ株およびＭＳＳＡ株は検出されなかった。セフォキシチン（２ｕｇ／ｍＬ）とのインキュベーションにより、ＭＳＳＡが選択的に不検出であり、これは、これらのＭＳＳＡ株がセフォキシチンに感受性を示すことを示している。陽性の結果を太字で示す。
【表１】
2020526188.tif 000003
実施例３．感度についてのセフォキシチン濃度の最適化
【０１４０】
細菌株を、およそ１×１０３ＣＦＵ／ｍＬまで連続希釈し、１３５μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに移した。最終濃度が１．４μｇ／ｍＬ、１．６μｇ／ｍＬ、１．８μｇ／ｍＬ、または２．０μｇ／ｍＬに到達するように、１５μＬのセフォキシチンをウェルに添加した。次いで、プレートを密封し、３７℃で２時間インキュベートした。１０μＬの組換えファージ（１．６×１０８ｐｆｕ／ｍＬ）を各ウェルに添加した。次いで、プレートを再密封し、３７℃でさらに２時間インキュベートした。ウェルあたり１５μＬの５×溶解緩衝液、５０μＬルシフェラーゼアッセイ緩衝液、および１μＬルシフェラーゼ基質を含むマスターミックスを作製した。６５μＬのマスターミックスを各ウェルに添加した。反応物からの発光をＧＬＯＭＡＸ（登録商標）Ｎａｖｉｇａｔｏｒで読み取り、各反応の相対ルミナール単位（ＲＬＵ）をプロットし、分析した。ＲＬＵ値は、ＬＢについて確立されたバックグラウンドＲＬＵレベルの３倍の値（７５０ＲＬＵ超）を陽性と見なした。表２に示す結果は、組換えファージがこれらの細菌株を検出できることを示す。抗生物質で処置していない各々の試験細菌株（０ｕｇ／ｍＬ）のＲＬＵ値は陽性であり、これは、目的の細菌が試料中に存在し、組換えファージによる感染およびルシフェラーゼ生成物の検出が可能であることを示していた。１．８ｕｇ／ｍＬセフォキシチン濃度がほとんどのＭＳＳＡ株由来の陽性シグナルを選択的に阻害することが見出された一方で、試験ＭＲＳＡ株のほとんどが陽性シグナルを生成した。陽性の結果を太字で示す。
【表２−１】
2020526188.tif 000004
【表２−２】
2020526188.tif 000005
実施例４．バクテリオファージを使用した抗生物質耐性の判定
【０１４１】
細菌株を連続希釈し、Ｃｏｐａｎ  ｅ−Ｓｗａｂｓ（商標）に、およそ１０００ＣＦＵ、５００ＣＦＵ、２５０ＣＦＵ、１２５ＣＦＵ、６３ＣＦＵ、３１ＣＦＵ、１６ＣＦＵ、または８ＣＦＵの標的数の細胞で１００μＬのＬＢを接種した。次いで、スワブを、１ｍＬの修正Ａｍｉｅｓ溶液（市販のＣｏｐａｎ  ｅ−Ｓｗａｂｓ（商標）と同梱）で溶出した。１３５μＬのこの溶液を、９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。最終濃度が１．８μｇ／ｍＬ、３．６μｇ／ｍＬ、または５．４μｇ／ｍＬに到達するように、１５μＬのセフォキシチンをウェルに添加した。次いで、プレートを密封し、３７℃で２時間インキュベートした。１０μＬの組換えファージ（１．６×１０８ｐｆｕ／ｍＬ）を各ウェルに添加した。次いで、プレートを再密封し、３７℃でさらに２時間インキュベートした。ウェルあたり１５μＬの５×溶解緩衝液、５０μＬルシフェラーゼアッセイ緩衝液、および１μＬルシフェラーゼ基質を含むマスターミックスを作製した。６５μＬのマスターミックスを各ウェルに添加した。反応物からの発光をＧＬＯＭＡＸ（登録商標）Ｎａｖｉｇａｔｏｒで読み取り、各反応の相対ルミナール単位（ＲＬＵ）をプロットし、分析した。ＲＬＵ値は、修正Ａｍｉｅｓ溶液ついて確立されたバックグラウンドＲＬＵレベルの３倍の値（１５００ＲＬＵ超）を陽性と見なした。表３に示す結果は、以前に確立されたカットオフ１．８μｇ／ｍＬを用いてインキュベートしたときのスワブ上のおよそ１２５ＣＦＵに由来するウェル中の１７ＣＦＵを、ＭＲＳＡ陽性と判定したことを示す。陽性の結果を太字で示す。
【表３】
2020526188.tif 000006
実施例５．バクテリオファージを使用した抗生物質耐性の判定
【０１４２】
細菌株を連続希釈し、ＢＤ  ＢＢＬ  ＣｕｌｔｕｒｅＳｗａｂ（商標）に、およそ１０００ＣＦＵ、５００ＣＦＵ、２５０ＣＦＵ、１２５ＣＦＵ、６３ＣＦＵ、３１ＣＦＵ、１６ＣＦＵ、または８ＣＦＵの標的数の細胞で５０μＬのＬＢを接種した。スワブを、１ｍＬの修正Ａｍｉｅｓ溶液（市販のＣｏｐａｎ  ｅ−Ｓｗａｂｓ（商標）と同梱）で溶出した。１３５μＬの溶出液を、各ウェルに添加した。最終濃度が１．８μｇ／ｍＬ、３．６μｇ／ｍＬ、または５．４μｇ／ｍＬに到達するように、１５μＬのセフォキシチンをウェルに添加した。次いで、プレートを密封し、３７℃で２時間インキュベートした。１０μＬの組換えファージ（１．６×１０８ｐｆｕ／ｍＬ）を各ウェルに添加した。次いで、プレートを再密封し、３７℃でさらに２時間インキュベートした。ウェルあたり１５μＬの５×溶解緩衝液、５０μＬルシフェラーゼアッセイ緩衝液、および１μＬルシフェラーゼ基質を含むマスターミックスを作製した。６５μＬのマスターミックスを各ウェルに添加した。反応物からの発光をＧＬＯＭＡＸ（登録商標）Ｎａｖｉｇａｔｏｒで読み取り、各反応の相対ルミナール単位（ＲＬＵ）をプロットし、分析した。ＲＬＵ値は、修正Ａｍｉｅｓ溶液ついて確立されたバックグラウンドＲＬＵレベルの３倍の値（１５００ＲＬＵ超）を陽性と見なした。表４に示す結果は、以前に確立されたカットオフ１．８μｇ／ｍＬを用いてインキュベートしたときのスワブ上のおよそ１２５ＣＦＵに由来するウェル中の２３ＣＦＵを、ＭＲＳＡ陽性と判定したことを示す。陽性の結果を太字で示す。
【表４】
2020526188.tif 000007
実施例６  ＭＳＳＡシグナルに及ぼす抗生物質およびファージの曝露時間の影響
【０１４３】
細菌株を連続希釈し、１３５μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに移した。最終濃度が１．８μｇ／ｍＬ、３．６μｇ／ｍＬ、または５．４μｇ／ｍＬに到達するように、１５μＬのセフォキシチンをウェルに添加した。次いで、プレートを密封し、３７℃で２時間または３時間インキュベートした。１０μＬの組換えファージ（１．６×１０８ｐｆｕ／ｍＬ）を各ウェルに添加した。次いで、プレートを再密封し、３７℃でさらに１時間または２時間インキュベートした。ウェルあたり１５μＬの５×溶解緩衝液、５０μＬルシフェラーゼアッセイ緩衝液、および１μＬルシフェラーゼ基質を含むマスターミックスを作製した。６５μＬのマスターミックスを各ウェルに添加した。反応物からの発光をＧＬＯＭＡＸ（登録商標）Ｎａｖｉｇａｔｏｒで読み取り、各反応の相対ルミナール単位（ＲＬＵ）をプロットし、分析した。ＲＬＵ値は、ＬＢについて確立されたバックグラウンドＲＬＵレベルの３倍の値（７５０ＲＬＵ超）を陽性と見なした。表５に示す結果は、以前に確立されたセフォキシチンのカットオフ１．８μｇ／ｍＬで偽陽性を生じたＭＳＳＡ株数が、２時間抗生物質／２時間ファージプロトコールと比較したときに３時間抗生物質／１時間ファージプロトコールを用いた場合に減少したことを示す。２時間抗生物質／２時間ファージプロトコールを用いた場合に、５４１ＣＦＵで偽陽性を生じた。それに対して、３時間抗生物質／１時間ファージプロトコールは、４３３１ＣＦＵで偽陽性を生じた。陽性の結果を太字で示す。表５では、ＣＦＵ値（５４１ＣＦＵおよび３０５ＣＦＵ）が実験で確認された。
【表５】
2020526188.tif 000008
実施例７  ＭＳＳＡとの共培養におけるＭＲＳＡの検出
【０１４４】
細菌株を連続希釈し、１３５μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに移した。最終濃度が１．８μｇ／ｍＬに到達するように、１５μＬのセフォキシチンをウェルに添加した。次いで、プレートを密封し、３７℃で２時間または３時間インキュベートした。１０μＬの組換えファージ（１．６×１０８ｐｆｕ／ｍＬ）を各ウェルに添加した。次いで、プレートを再密封し、３７℃でさらに１時間または２時間インキュベートした。ウェルあたり１５μＬの５×溶解緩衝液、５０μＬルシフェラーゼアッセイ緩衝液、および１μＬルシフェラーゼ基質を含むマスターミックスを作製した。６５μＬのマスターミックスを各ウェルに添加した。反応物からの発光をＧＬＯＭＡＸ（登録商標）Ｎａｖｉｇａｔｏｒで読み取り、各反応の相対ルミナール単位（ＲＬＵ）をプロットし、分析した。ＲＬＵ値は、ＬＢについて確立されたバックグラウンドＲＬＵレベルの３倍の値（７５０ＲＬＵ超）を陽性と見なした。表６に示す結果は、３時間抗生物質／１時間ファージインキュベーションプロトコールを使用して、ＭＲＳＡ（３８ＣＦＵ）を有する試料を、ＭＳＳＡ（５０８８ＣＦＵまで）を含む試料と識別することができることを示す。陽性の結果を太字で示す。表６では、ＣＦＵ値（３１８ＣＦＵおよび１５６ＣＦＵ）が実験で確認された。
【表６】
2020526188.tif 000009
【図１】
2020526188.tif 000010
【国際調査報告】
2020526188.tif 000011
2020526188.tif 000012
2020526188.tif 000013