(57)【要約】  免疫コンジュゲートは、抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体またはその結合性フラグメントと、治療剤またはラベルとを含み、下記の式を有する：Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｍ（式中、ＡｂはＧｌｏｂｏ  Ｈ抗体またはその結合性フラグメントであり、Ｌはリンカーまたは直接結合であり、Ｄは治療剤またはラベルであり、ｍは１〜８の整数である）。抗体は、ヒト化抗体であり得るモノクローナル抗体である場合がある。ガンを処置するための方法は、そのような処置を必要としている対象に、Ｇｌｏｂｏ  Ｈに対する抗体またはその結合性フラグメント、および該抗体と共有結合によりコンジュゲート化される治療剤を含有する免疫コンジュゲートの医薬的に効果的な量を投与することを含む。
2020524669.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｇｌｏｂｏ  Ｈに特異的に結合する免疫コンジュゲートであって、
抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体またはその結合性フラグメント、および
治療剤またはラベルを含み、
前記免疫コンジュゲートは、式：Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｍを有する
（式中、Ａｂは抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体またはその結合性フラグメントであり、Ｌはリンカーまたは直接結合であり、Ｄは前記治療剤または前記ラベルであり、ｍは１〜８の整数である）
免疫コンジュゲート。
【請求項２】
前記抗体がモノクローナル抗体である
請求項１に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項３】
前記抗体がヒト化抗体である
請求項１に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項４】
前記治療剤が細胞傷害性薬剤である
請求項１に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項５】
前記細胞傷害性薬剤が、メイタンシノイド１（ＤＭ１）、メイタンシノイド４（ＤＭ４）、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）またはパクリタキセルである
請求項４に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項６】
Ｄが診断剤試薬または造影試薬である
請求項１に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項７】
前記抗体が、ＨＣＤＲ１（ＧＹＩＳＳＤＱＩＬＮ、配列番号１）、ＨＣＤＲ２（ＲＩＹＰＶＴＧＶＴＱＹＸＨＫＦＶＧ、配列番号２、式中、Ｘは任意のアミノ酸である）およびＨＣＤＲ３（ＧＥＴＦＤＳ、配列番号３）からなる３つの相補的領域を有する重鎖可変ドメインと、ＬＣＤＲ１（ＫＳＮＱＮＬＬＸ’ＳＧＮＲＲＹＺＬＶ、配列番号４、式中、Ｘ’は、Ｆ、ＹまたはＷであり、Ｚは、Ｃ、Ｇ、ＳまたはＴである）、ＬＣＤＲ２（ＷＡＳＤＲＳＦ、配列番号５）およびＬＣＤＲ３（ＱＱＨＬＤＩＰＹＴ、配列番号６）からなる３つの相補的領域を有する軽鎖可変ドメインとを含む
請求項１〜６のいずれか一項に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項８】
Ｇｌｏｂｏ  Ｈを発現する細胞または組織を診断するための、または画像化するための組成物であって、
請求項６に記載の免疫コンジュゲート
を含む
組成物。
【請求項９】
ガンを処置することにおいて使用されるための医薬組成物であって、
請求項１〜５のいずれか一項に記載の免疫コンジュゲート
を含む
医薬組成物。
【請求項１０】
前記抗体が、ＨＣＤＲ１（ＧＹＩＳＳＤＱＩＬＮ、配列番号１）、ＨＣＤＲ２（ＲＩＹＰＶＴＧＶＴＱＹＸＨＫＦＶＧ、配列番号２、式中、Ｘは任意のアミノ酸である）およびＨＣＤＲ３（ＧＥＴＦＤＳ、配列番号３）からなる３つの相補的領域を有する重鎖可変ドメインと、ＬＣＤＲ１（ＫＳＮＱＮＬＬＸ’ＳＧＮＲＲＹＺＬＶ、配列番号４、式中、Ｘ’は、Ｆ、ＹまたはＷであり、Ｚは、Ｃ、Ｇ、ＳまたはＴである）、ＬＣＤＲ２（ＷＡＳＤＲＳＦ、配列番号５）およびＬＣＤＲ３（ＱＱＨＬＤＩＰＹＴ、配列番号６）からなる３つの相補的領域を有する軽鎖可変ドメインとを含む
請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記ガンが上皮細胞ガンである
請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記ガンが、乳ガン、結腸ガン、卵巣ガン、膵臓ガン、肺ガン、または前立腺ガンである
請求項１１に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体を含有する抗体−薬物コンジュゲート、および治療におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、様々な疾患または状態（例えば、ガンなど）を処置するための標的化療法をもたらすことができる。ＡＤＣは、生物学的に活性な薬剤（例えば、細胞傷害性の薬剤または薬物など）に連結される抗体を含む複雑な分子である。抗体の独特の標的化を薬物の治療効果と組み合わせることによって、抗体−薬物コンジュゲートは、正常な細胞と、ガン細胞とを区別することができ、それにより、副作用を最小限に抑えることができる。
【０００３】
ＡＤＣは典型的には、マーカー（例えば、腫瘍マーカーなど）を特異的に標的とする抗体にカップリングさせられる抗ガン薬物（例えば、細胞毒）を含む。様々な抗体がこれらのタンパク質を体内で突き止め、ガン細胞の表面に結合する。抗体と標的タンパク質（抗原）との結合はシグナルを腫瘍細胞において誘発し、それにより、その後、ＡＤＣが内在化される。ＡＤＣが内在化された後、細胞傷害性薬物が放出される場合があり、ガンを殺傷する。この特異的な標的化により、薬物は副作用が低下している。
【０００４】
Ｇｌｏｂｏ  Ｈは、乳ガン、結腸ガン、卵巣ガン、膵臓ガン、肺ガンおよび前立腺ガンの細胞を含めて様々な上皮ガン細胞の表面に過剰発現される多数の腫瘍関連炭水化物抗原に属するヘキササッカリドである。したがって、Ｇｌｏｂｏ  Ｈは有望な診断／治療標的である。
【０００５】
Ｇｌｏｂｏ  Ｈに対する抗体は有用ではあるが、抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体を使用する改善された治療剤が依然として求められている。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体を含有する抗体−薬物コンジュゲート、および治療におけるその使用に関する。
【０００７】
本発明の１つの態様が免疫コンジュゲートに関する。本発明の１つの実施形態による免疫コンジュゲートは、抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体またはその結合性フラグメントと、治療剤またはラベルとを含み、下記の式を有する：Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｍ（式中、ＡｂはＧｌｏｂｏ  Ｈ抗体またはその結合性フラグメントであり、Ｌはリンカーまたは直接結合であり、Ｄは治療剤またはラベルであり、ｍは１〜８の整数である）。
【０００８】
本発明のいずれかの実施形態によれば、Ａｂは、ＨＣＤＲ１（ＧＹＩＳＳＤＱＩＬＮ、配列番号１）、ＨＣＤＲ２（ＲＩＹＰＶＴＧＶＴＱＹＸＨＫＦＶＧ、配列番号２、式中、Ｘは任意のアミノ酸である）およびＨＣＤＲ３（ＧＥＴＦＤＳ、配列番号３）からなる３つの相補的領域を有する重鎖可変ドメインと、ＬＣＤＲ１（ＫＳＮＱＮＬＬＸ’ＳＧＮＲＲＹＺＬＶ、配列番号４、式中、Ｘ’は、Ｆ、ＹまたはＷであり、Ｚは、Ｃ、Ｇ、ＳまたはＴである）、ＬＣＤＲ２（ＷＡＳＤＲＳＦ、配列番号５）およびＬＣＤＲ３（ＱＱＨＬＤＩＰＹＴ、配列番号６）からなる３つの相補的領域を有する軽鎖可変ドメインとを含む場合がある。
【０００９】
リンカーであるＬは、直接結合であることが可能であり、この場合、ペイロード成分であるＤは抗体またはその結合性フラグメントと直接に連結される（コンジュゲート化される）。リンカーは、タンパク質の修飾またはコンジュゲート化において一般に使用されるどのようなリンカーも可能であり、例えば、短いペプチド（例えば、ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ）、または短い有機分子リンカー（例えば、ＳＭＣＣ、スクシンイミジル−４（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１カルボキシラート）などが可能である。
【００１０】
ペイロード成分であるＤは、治療剤であることが可能であり、例えば、細胞傷害性薬剤などが可能である。本発明の様々な実施形態とともに使用され得る細胞傷害性薬剤の例には、メイタンシノイド（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）またはパクリタキセルなどが含まれる場合がある。
【００１１】
ペイロード成分であるＤは、診断または画像化のためのラベルまたは薬剤であることが可能である。造影剤の例には、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）またはＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸）が含まれる場合がある。
【００１２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、抗体は、ヒト化抗体であり得るモノクローナル抗体である場合がある。
【００１３】
本発明の１つの態様が、Ｇｌｏｂｏ  Ｈを発現する細胞または組織を診断するための、または画像化するための方法に関する。本発明の１つの実施形態による方法は、対象に上記の免疫コンジュゲートを投与することを含む場合がある。
【００１４】
本発明の１つの態様が、ガンを処置するための方法に関する。本発明の１つの実施形態による方法は、ガン処置を必要としている対象に、医薬的に効果的な量の上記の免疫コンジュゲートを投与することを含む場合がある。ガンは上皮細胞ガンであり、例えば、乳ガン、結腸ガン、卵巣ガン、膵臓ガン、肺ガンまたは前立腺ガンなどである。
【００１５】
当業者は、医薬的に効果的な量が、多くの要因（例えば、患者の状態、年齢、疾患状体、投与経路など）に依存すること、そして、そのような効果的な量が、過度な実験を伴うことなく、日常の業務においてこれらの要因に基づいて決定され得ることを理解するであろう。
【００１６】
本発明の他の局面が下記の説明により明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の１つの実施形態によるＡＤＣ（ＤＣＢ１６００１）のＳＤＳ−ＰＧＡＥゲル分析を示す。結果は、ＡＤＣが、適切な抗体構造、すなわち、非還元条件および還元条件のもとでの適切な分子量を保持することを示す。
【００１８】
【図２】Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体とＳＭＣＣ−ＤＭ１との間でのコンジュゲート化反応が実質的に完了し、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体およびＳＭＣＣ−ＤＭ１の残存量のみが残留したことを示しているＨＰＬＣプロフィルを示す。
【００１９】
【図３】本発明のＡＤＣ（ＤＣＢ１６００１）のＭＳ分析の一例を例示する。抗体に結合する薬物の様々な数の分布、そして、最も多い種は、１個〜８個の薬物が１つの抗体に結合していることが示されている。このサンプルにおける平均薬物対抗体比（ＤＡＲ）が４．０７である。
【００２０】
【図４Ａ】ＡＤＣ内在化の蛍光画像化から得られる結果を示す。
【図４Ｂ】ＡＤＣ内在化の蛍光画像化から得られる結果を示す。結果は、本発明のＡＤＣが、Ｇｌｏｂ  Ｈを発現する細胞（例えば、ＭＣＦ−７細胞（図４Ｂ）およびＨＣＣ−１４２８細胞（図４Ａ））によって内在化され得ることを示している。
【００２１】
【図５】総抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体およびコンジュゲート型抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体をＤＣＢＤ１６００１のインビボ薬物動態学研究のために測定するためのＭｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）電気化学発光アッセイを例示する概略図を示す。
【００２２】
【図６】ＤＣＢＤ１６００１のインビボ薬物動態学研究から得られる結果を示す。
【００２３】
【図７】本発明のＡＤＣを使用するガン異種移植モデルにおける処置プロトコルを示す。
【００２４】
【図８】ＨＣＣ−１４２８異種移植モデルにおける腫瘍成長阻害を示す。
【００２５】
【図９】図８の実験における処置期間中のマウスの体重を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明の様々な実施形態が、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体を含有する抗体−薬物コンジュゲート、および治療におけるその使用に関する。Ｇｌｏｂｏ  Ｈは、乳ガン、結腸ガン、卵巣ガン、膵臓ガン、肺ガンおよび前立腺ガンの細胞を含めて様々な上皮ガン細胞の表面に過剰発現される多数の腫瘍関連炭水化物抗原に属するヘキササッカリドである。したがって、Ｇｌｏｂ  Ｈに対する抗体に基づくＡＤＣは、有用な診断剤および／または処置剤となり得る。
【００２７】
しかしながら、治療用抗体の速い内在化または欠けているＡＤＣＣ活性は、抵抗性と同様に、効果のない抗体をもたらすかもしれないであろう。したがって、抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈに基づく治療薬の治療効力を高める必要がある。１つの取り組みが、ペイロード成分を抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体とコンジュゲート化すること（すなわち、抗体−薬物コンジュゲート）である。抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体をペイロード成分にコンジュゲート化すること（すなわち、ＡＤＣ）によって、本発明の実施形態はネイキッド抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体よりも強力であり、それにより、より少ない抗体を使用することを可能にする。
【００２８】
本発明の実施形態によれば、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体またはその結合性フラグメントは、薬物、診断剤または治療剤にカップリングさせられる場合がある。したがって、本明細書中で使用されるような用語「抗体−薬物コンジュゲート」（ＡＤＣ）は、ペイロード成分（これは、薬物、診断剤または治療剤が可能である）にカップリングさせられる抗体部分（これは、完全な抗体またはその結合性フラグメントが可能である）を示す場合がある。
【００２９】
本発明のＡＤＣは、治療用途または診断用途のために設計されるペイロード成分を含有する。これらのＡＤＣは、ネイキッドＧｌｏｂｏ  Ｈ抗体と比較して、より良好な生物学的活性を有しており、より少ない量を、所望の効果を達成するために必要とすることになるであろう。
【００３０】
本発明の様々な実施形態が下記の具体的な実施例により例示されるであろう。当業者は、これらの実施例が例示のみのためであること、そして、他の改変および変化が、本発明の範囲から逸脱することなく可能であることを理解するであろう。
【実施例】
【００３１】
別途示されている場合を除き、それぞれの１Ｈ  ＮＭＲデータを５００ＭＨｚで得た。本明細書中で使用される略語は、別途明記される場合を除き、下記の通りである：
Ｂｕ：ブチル；Ｂｎ：ベンジル；ＢＯＣ：ｔ−ブチルオキシカルボニル；ＢＯＰ：ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリ／ジメチルアミノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスファート；ＤＣＣ：ジシクロヘキシルカルボジイミド；ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド；ＤＭＡＰ：４−ジメチルアミノピリジン；ＥＤＣ：１−（３−ジメチルアミノプロピル）３−エチルカルボジイミド塩酸塩；ＥｔＯＡｃ：酢酸エチル；Ｅｑ．：当量；ＨＯＢｔ：ヒドロキシベンズトリアゾール；ＬＡＨ：水素化アルミニウムリチウム；ＭｅＯＨ：メタノール；ＭＨｚ：メガヘルツ；ＭＳ（ＥＳ）：質量分光光度計−エレクトロンスプレー；ＮＭＰ：Ｎ−メチルピロリジノン；Ｐｈ：フェニル；Ｐｒ：プロピル；ＴＥＡ：トリエチルアミン；ＴＨＦ：テトラヒドロフラン；ＴＬＣ：薄層クロマトグラフィー；Ｔｅｔｒａｋｉｓ：テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム。
【実施例１】
【００３２】
抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体の調製
本発明の実施形態によれば、抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体を生成させるための一般的な方法は、Ｇｌｏｂｏ  Ｈに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることを含む。モノクローナル抗体を産生させるための様々な方法がこの技術分野では知られており、ここでは詳しく述べられないであろう。簡単に記載すると、マウスに、抗原（Ｇｌｏｂｏ  Ｈ）が、適切なアジュバントとともに投与される。その後、免疫化マウスの脾臓細胞を採取し、ハイブリドーマと融合させた。陽性クローンが、いずれかの公知の方法（例えば、ＥＬＩＳＡなど）を使用して、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗原と結合するその能力のために確認される場合がある。
【００３３】
本発明の抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、Ｇｌｏｂｏ  Ｈを特異的に標的とすることができる。これらのＡＤＣでは、Ｇｌｏｂ  Ｈに特異的に結合する抗体をどのようなものであれ使用することができる。例えば、本発明のＡＤＣでは、マウス抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体またはヒト化抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体あるいはそれらのｓｃＦｖフラグメントまたはＦａｂフラグメントが使用される場合がある。例示的な抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体は、ＨＣＤＲ１（ＧＹＩＳＳＤＱＩＬＮ、配列番号１）、ＨＣＤＲ２（ＲＩＹＰＶＴＧＶＴＱＹＸＨＫＦＶＧ、配列番号２、式中、Ｘは任意のアミノ酸である）およびＨＣＤＲ３（ＧＥＴＦＤＳ、配列番号３）からなる３つの相補的領域を有する重鎖可変ドメインと、ＬＣＤＲ１（ＫＳＮＱＮＬＬＸ’ＳＧＮＲＲＹＺＬＶ、配列番号４、式中、Ｘ’は、Ｆ、ＹまたはＷであり、Ｚは、Ｃ、Ｇ、ＳまたはＴである）、ＬＣＤＲ２（ＷＡＳＤＲＳＦ、配列番号５）およびＬＣＤＲ３（ＱＱＨＬＤＩＰＹＴ、配列番号６）からなる３つの相補的領域を有する軽鎖可変ドメインとを含む場合がある。
【００３４】
本発明の実施形態によれば、抗体はマウス抗体である場合がある。代替において、抗体は、キメラ抗体（例えば、マウスの可変領域にカップリングさせられるヒト定常領域）またはヒト化抗体（例えば、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域に継がれるマウスＣＤＲ）または完全ヒト抗体である場合がある。
【００３５】
モノクローナル抗体は、ＣＤＲ配列をハイブリドーマから取得し、ＣＤＲ配列を、ヒト化抗体を産生させるためのヒトフレームワーク配列にクローニングすることによってヒト化される場合がある。ＣＤＲ配列を特定するためにこの技術分野において知られている一般的な方法はどれも使用され得る。本発明におけるＣＤＲ領域はＫａｂａｔ番号スキームにより特定される。最初に、抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈのハイブリドーマ（例えば、マウスＧＢＨハイブリドーマなど）を生成させた。そのようなハイブリドーマは、モノクローナル抗体の産生のための標準的なプロトコルを用いて生成させられる場合がある。その後、ハイブリドーマの総ＲＮＡを、例えば、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬を使用して単離した。その後、ｃＤＮＡを、例えば、第一鎖ｃＤＮＡ合成キット（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ）およびオリゴ（ｄＴ２０）プライマーまたはＩｇ−３’定常領域プライマーを使用して総ＲＮＡから合成した。
【００３６】
その後、免疫グロブリン遺伝子の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をｃＤＮＡからクローニングした。例えば、抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ  ｍＡｂのＶＨ可変領域およびＶＬ可変領域を、マウスＩｇ−５’プライマーセット（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用してＰＣＲによってマウスＧＢＨハイブリドーマｃＤＮＡから増幅した。ＰＣＲ産物は、ＣｌｏｎｅＪｅｔ（商標）ＰＣＲクローニングキット（Ｆｅｒｍｅｎｔｓ）を使用して好適なベクター（例えば、ｐＪＥＴ１．２ベクター）に直接にクローニングされる場合がある。ｐＪＥＴ１．２ベクターは、致死的挿入が含まれており、所望の遺伝子がこの致死的領域の中にクローニングされたときにだけ、選択条件を耐え抜くことになるであろう。これにより、組換えコロニーの選択が容易になる。最後に、組換えコロニーを所望のクローンについてスクリーニングし、それらのクローンのＤＮＡを単離し、配列決定した。免疫グロブリン（ＩＧ）ヌクレオチド配列は国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ情報システム（ＩＧＭＴ）ウェブサイトにおいて分析される場合がある。
【００３７】
抗体の発現および精製
抗体産生のために、単離されたクローンはいずれかの好適な細胞において発現され得る。一例として、Ｆ２９３細胞（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を、抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ  ｍＡｂ発現プラスミドを用いてトランスフェクションし、７日間培養した。抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体を、プロテインＡ親和性カラム（ＧＥ）を使用して培地から精製した。この技術分野において知られている手順を使用して、または製造者の説明書に従って、タンパク質濃度がＢｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイキットにより決定され、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析され得る。
【００３８】
本発明の実施形態によれば、これらの抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体のいずれもが、下記の実施例において例示されるように、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を調製するために使用され得る。
【実施例２】
【００３９】
抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体−ビオチンコンジュゲートの調製
【化１】
2020524669.tif 000003
薬物を抗体にカップリングさせるための例として、ビオチン−アビジン系が、反応条件を調べるために、また、ＡＤＣ戦略の実行可能性を例示するために使用される場合がある。この特定の実施例において、ビオチンの類似体（すなわち、ビオチン−Ｎ−スクシンイミドエステル）が、抗体表面のアミノ基と反応するためのカップリング試薬として使用される。アミノ基は抗体表面のリジン残基の側鎖である場合がある。
【００４０】
簡単に記載すると、緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウム、５０ｍＭ塩化ナトリウム、２ｍＭ  ＥＤＴＡ；ｐＨ６．５）における抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈモノクローナル抗体の溶液の４３０μＬ（２．７ｍｇ／ｍＬ）に、３．８μＬのＯｓｕ−ビオチン（ビオチン−Ｏ−スクシンイミド；ＤＭＳＯにおいて２０ｍＭ）をゆっくり加えた。反応混合物をアルゴン下、室温で撹拌し、２時間、４時間、１６時間それぞれ撹拌した。抗体調製物を、３０ｋＤａのＮＭＷＬを有するＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５遠心フィルターデバイスをｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液において使用して脱塩し、濃縮して、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ−ビオチンＡＤＣ２−１を得る。
【化２】
2020524669.tif 000004
【００４１】
代替となる取り組みにおいて、このビオチン類似体は抗体表面のシステイン残基のＳＨ基にカップリングさせられる場合がある。上記の反応スキームにおいて示されるように、抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈモノクローナル抗体の溶液の１８０μＬ（ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液において５．０ｍｇ／ｍＬ）にＴＣＥＰ（５．０ｅｑ）をゆっくり加え、３７℃で１．０時間撹拌した。その後、反応混合物にビオチン−マレイミド（１２ｅｑ）を加え、反応混合物をアルゴン下、室温で２０時間撹拌した。抗体調製物を、３０ｋＤａのＮＭＷＬを有するＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５遠心フィルターデバイスをｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液において使用して脱塩し、濃縮して、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ−ビオチンＡＤＣ２−２を得る。
【実施例３】
【００４２】
抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体−ＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートの調製
【化３】
2020524669.tif 000005
本実施例において、ＡＤＣは、ガン治療のために開発されたメイタンシノイドであるＤＭ１を含有する。ベンゾアンサマクロライド（ｂｅｎｚｏａｎｓａｍａｃｒｏｌｉｄｅ）であるメイタンシンは、サブナノモル濃度で有糸分裂の停止を誘発し、腫瘍細胞を殺傷する非常に強力な微小管標的化合物である。ＤＭ１は微小管の先端において結合して、微小管の動力学性（ｄｙｎａｍｉｃｉｔｙ）を抑制し、すなわち、微小管の組立てを阻害する。ＤＭ１は、全身毒性がメイタンシンよりも少ないメイタンシノイドである。本実施例では、ＳＭＣＣ−ＤＭ１（これは、反応性リンカーＳＭＣＣを有するＤＭ１である）が、抗体と反応させて抗体−薬物コンジュゲートを作製するために使用される。ＳＭＣＣ−ＤＭ１は様々な市販元から、例えば、ＭｅｄＫｏｏ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．およびＡＬＢ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙなどから入手可能である。
【００４３】
例えば、緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウム、５０ｍＭ塩化ナトリウム、２ｍＭ  ＥＤＴＡ；ｐＨ６．５）における抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈモノクローナル抗体の溶液の５００μＬ（２．９ｍｇ／ｍＬ）に、５８μＬのＳＭＣＣ−ＤＭ１（ＤＭＳＯにおいて５ｍＭ）をゆっくり加えた。反応混合物をアルゴン下、３７℃で撹拌し、２０時間撹拌した。抗体調製物を、３０ｋＤａのＮＭＷＬを有するＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５遠心フィルターデバイスをｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液において使用して脱塩し、濃縮して、抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１  ＡＤＣ３（ＤＣＢＤ１６００１）を得る。
【実施例４】
【００４４】
抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体−ＳＭＣＣ−ＤＭ４コンジュゲートの調製
【化４】
2020524669.tif 000006
ＤＭ４は別のメイタンシン類似体である。ＤＭ４もまた、有糸分裂の状態にある細胞の増殖を阻害する強力な微小管標的化合物である。本発明のいくつかの実施形態では、ＤＭ４が使用される場合がある。本実施例では、緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウム、５０ｍＭ塩化ナトリウム、２ｍＭ  ＥＤＴＡ；ｐＨ６．５）における抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈモノクローナル抗体の溶液の５００μＬ（２．９ｍｇ／ｍＬ）に、５８μＬのＳＭＣＣ−ＤＭ４（ＤＭＳＯにおいて５ｍＭ）をゆっくり加えた。反応混合物をアルゴン下、３７℃で撹拌し、２０時間撹拌した。抗体調製物を、３０ｋＤａのＮＭＷＬを有するＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５遠心フィルターデバイスをｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液において使用して脱塩し、濃縮して、抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ−ＳＭＣＣ−ＤＭ４  ＡＤＣ４を得る。
【実施例５】
【００４５】
抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体−ＭＭＡＥコンジュゲートの調製
【化５】
2020524669.tif 000007
モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）は抗腫瘍剤であり、チューブリンの重合を阻止することによって細胞分裂を阻害する。モノメチルアウリスタチンＥは、海洋性の無殻軟体動物に存在するペプチド（ドラスタチン）に由来する。ＭＭＡＥは、ＡＤＣのための有用なペイロード成分であることが示されている。
【００４６】
本実施例では、緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウム、５０ｍＭ塩化ナトリウム、２ｍＭ  ＥＤＴＡ；ｐＨ６．５）における抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈモノクローナル抗体の溶液の４００μＬ（５．０ｍｇ／ｍＬ）に、４０μＬのＯＳｕ−ＭＭＡＥ（ＤＭＳＯにおいて５ｍＭ）をゆっくり加えた。反応混合物をアルゴン下、３７℃で撹拌し、２０時間撹拌した。抗体調製物を、３０ｋＤａのＮＭＷＬを有するＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５遠心フィルターデバイスをｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液において使用して脱塩し、濃縮して、抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ−ＭＭＡＥ  ＡＤＣ５を得る。
【実施例６】
【００４７】
抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体−ｖｃ−ＭＭＡＥコンジュゲートの調製
【化６】
2020524669.tif 000008
ＡＤＣにおけるリンカーは、生物学的活性に対する著しい影響を有する場合がある。例えば、インビボ研究では、様々なペプチド結合コンジュゲートが、確立された腫瘍異種移植片の退行および治癒を６０倍もの高い治療指数で誘発することが明らかにされた。これらのコンジュゲートは、ガン治療のための安全かつ有効なｍＡｂ−薬物コンジュゲートを開発する際のリンカー技術、薬物効能およびコンジュゲート化方法論の重要性を例示している。
【００４８】
本発明のいくつかの実施形態が、バリン−シトルリン（ｖｃ）（リソソームで切断可能なジペプチド）を介して抗体に連結されるＭＭＡＥに関連しており、これらは、ＡＤＣ効力を改善することが示されている。本実施例では、緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウム、５０ｍＭ塩化ナトリウム、２ｍＭ  ＥＤＴＡ；ｐＨ６．５）における抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈモノクローナル抗体の溶液（４００μＬ（５．０ｍｇ／ｍＬ）に、４０μＬのＯＳｕ−ｖｃ−ＭＭＡＥ（ＤＭＳＯにおいて５ｍＭ）をゆっくり加えた。反応混合物をアルゴン下、３７℃で撹拌し、２０時間撹拌した。抗体調製物を、３０ｋＤａのＮＭＷＬを有するＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５遠心フィルターデバイスをｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液において使用して脱塩し、濃縮して、抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ−ｖｃ−ＭＭＡＥ  ＡＤＣ６を得る。
【実施例７】
【００４９】
抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体−ＭＭＡＦコンジュゲートの調製
【化７】
2020524669.tif 000009
本発明のいくつかの実施形態が、ＭＭＡＥの類似体であるモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）を含有するＡＤＣに関する。緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウム、５０ｍＭ塩化ナトリウム、２ｍＭ  ＥＤＴＡ；ｐＨ６．５）における抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈモノクローナル抗体の溶液（４００μＬ（５．０ｍｇ／ｍＬ）に、４０μＬのＯＳｕ−ＭＭＡＦ（ＤＭＳＯにおいて５ｍＭ）をゆっくり加えた。反応混合物をアルゴン下、３７℃で撹拌し、２０時間撹拌した。抗体調製物を、３０ｋＤａのＮＭＷＬを有するＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５遠心フィルターデバイスをｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液において使用して脱塩し、濃縮して、抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣ７を得る。
【実施例８】
【００５０】
抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体−４−イソチオシアナト−フェニル−ＤＴＰＡコンジュゲートの調製
【化８】
2020524669.tif 000010
処置に加えて、ＡＤＣはまた、診断および／または画像化のために使用することができる。本発明のいくつかの実施形態が、標的分子に特異的に結合することができる画像化試薬に関する。例えば、ＡＤＣのペイロード成分は、画像化のための選択された金属（例えば、放射性遷移金属など）と結合するために使用することができるキレート化官能基を含有する場合がある。診断用途および／または画像化用途のための多くのキレート化官能基がこの技術分野では知られている（例えば、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）またはＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸）など）。ＤＴＰＡは、ジエチレントリアミン骨格と、５つのカルボキシル基とを有するアミノポリカルボン酸である。ＤＴＰＡはＥＤＴＡの拡張型と見なすことができる。ここでは、ＤＴＰＡを例として使用する。当業者は、他のキレート化剤もまた、本発明の範囲から逸脱することなく使用され得ることを理解するであろう。
【００５１】
本実施例では、緩衝液（１０ｍＭリン酸ナトリウム；ｐＨ８．０）における抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈモノクローナル抗体の溶液の４００μＬ（５．０ｍｇ／ｍＬ）に、４０μＬの４−イソチオシアナト−フェニル−ＤＴＰＡ（ＤＭＳＯにおいて５ｍＭ）をゆっくり加えた。反応混合物をアルゴン下、３７℃で撹拌し、２０時間撹拌した。抗体調製物を、３０ｋＤａのＮＭＷＬを有するＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５遠心フィルターデバイスをｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液において使用して脱塩し、濃縮して、抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ−チオウレア−４−フェニル−ＤＴＰＡ  ＡＤＣ８を得る。
【実施例９】
【００５２】
抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体−Ｎ−フェニルアジパミド−ＤＴＰＡコンジュゲートの調製
【化９】
2020524669.tif 000011
本実施例では、ＤＰＴＡが、リンカーを介して、すなわち、アジプアミンド（ａｄｉｐａｍｉｎｄｅ）を介して抗体に連結される。緩衝液（１０ｍＭリン酸ナトリウム；ｐＨ８．０）における抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈモノクローナル抗体の溶液の４００μＬ（５．０ｍｇ／ｍＬ）に、４０μＬの６−Ｏｓｕ−Ｎ−フェニルヘキサンアミド−ＤＴＰＡ（ＤＭＳＯにおいて５ｍＭ）をゆっくり加えた。反応混合物をアルゴン下、３７℃で撹拌し、２０時間撹拌した。抗体調製物を、３０ｋＤａのＮＭＷＬを有するＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５遠心フィルターデバイスをｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液において使用して脱塩し、濃縮して、抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ−Ｎ−フェニルヘキサンアミド−ＤＴＰＡ  ＡＤＣ９を得る。
【実施例１０】
【００５３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
本発明の様々なＡＤＣは、この技術分野において知られている技術を用いて、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＨＰＬＣなどを用いて分析される場合がある。例えば、実施例１および実施例３から得られる抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ  ｍＡｂおよび抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ  ＡＤＣ３（ＤＣＢＤ１６００１）の溶液を、４〜１２％の非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよび還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを使用し、その後、クーマシーブリリアントブルー染色することによって分析した。図１は、ＡＤＣ（ＤＣＢ１６００１）が、適切な抗体構造、すなわち、非還元条件および還元条件のもとでの適切な分子量を保持することを示す。
【実施例１１】
【００５４】
ＰＬＲＰ−ＨＰＬＣ
本発明の様々なＡＤＣはまた、ＨＰＬＣを用いて分析される場合がある。図２は、コンジュゲート化反応が実質的に完了し、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体およびＳＭＣＣ−ＤＭ１の残存量のみが残留したことを示す。
【実施例１２】
【００５５】
ペイロード成分カップリングアッセイ
薬物対抗体比（ＤＡＲ）を評価することは、標的抗体に対するペイロード成分コンジュゲート化効率をモニターリングするために重要である。薬物対抗体比率は、抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ  ＡＤＣ製造物の治療効力に影響を及ぼし得る。液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）は、リジン連結の抗体−薬物結合体（ＡＤＣ）についての薬物対抗体比（ＤＡＲ）および薬物負荷分布を決定するための最適な方法である。ピークの面積割合により、特定の薬物負荷ＡＤＣ種の相対的分布が表される。その後、加重平均ＤＡＲが、ピーク面積比情報および薬物負荷数を使用して計算される。
【００５６】
図３は本発明のＡＤＣ（抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１  ＡＤＣ３（ＤＣＢＤ１６００１））のＭＳ分析の一例を例示する。抗体に結合する薬物の様々な数の分布、そして、最も多い種は、１個〜８個の薬物が抗体に結合していることが示されている。このサンプルにおける平均薬物対抗体比（ＤＡＲ）が４．０７である。多数個の薬物が１つの抗体に結合していることにより、細胞内への薬物のより効率的な送達が保証されるであろう。
【実施例１３】
【００５７】
結合親和性
本発明のＡＤＣの結合親和性が、この技術分野において知られているいずれかの好適な方法を用いて、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅまたはＥＬＩＳＡなどを用いて評価される場合がある。本実施例では、ＢＩＡｃｏｒｅが、本発明のＡＤＣの親和性を測定するために使用される。
【００５８】
簡単に記載すると、抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ  ＡＤＣのフロー溶液を結合速度論研究のために調製した。リガンドのＧｌｏｂｏ  ＨをＣＭ５チップに固定化した。最初に、リガンド（Ｇｌｏｂｏ  Ｈ−アミン）を固定化緩衝液（１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５）において６ｍｇ／ｍＬに希釈する。５μＬ／分の流速を使用する２５℃での一般的な固定化。固定用試薬がアミンカップリングキットで提供される。活性化：ＥＤＣ／ＮＨＳ、７分。固定化：フロー時間、７２０秒。失活化：１．０Ｍエタノールアミン（ｐＨ８．５）、７分。この手順により、センサーチップＣＭ５での約２００ＲＵの応答限界レベルがもたらされるはずである。
【００５９】
その後、１サイクルだけの速度論アッセイを下記のように行った：速度論データを得るためのソフトウェアとともに提供されるＢｉａｃｏｒｅでの１サイクル速度論（ＳＣＫ）方法。Ｒｕｎ：Ｍｅｔｈｏｄを選ぶ。パラメーターを下記のように設定する。データ収集速度：１Ｈｚ、検出モード：デュアル、温度：２５℃、濃度単位：ｎＭ、緩衝液Ａ：ＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液。Ｓｔａｒｔ  ｕｐを選択し、反復数を３に変更する。Ｓｔａｒｔｕｐサイクルを選択し、パラメーターを下記のように設定する：タイプ：低サンプル消費、接触時間：１５０秒、解離時間：４２０秒、流速：５０μＬ／分、流路：両方。Ｓａｍｐｌｅサイクルを選択し、パラメーターを下記のように設定する：タイプ：１サイクル速度論、サイクルあたりの濃縮：５、接触時間：１５０秒、解離時間：４２０秒、流速：５０μｌ／分、流路：両方。Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎを選択し、パラメーターを下記のように設定する：再生溶液：１０ｍＭグリシンｐＨ２．０／１．５（ｖ／ｖ＝１）、接触時間：４５秒、流速：３０μＬ／ｍｉｎ、流路：両方。Ｃｏｐｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓａｍｐｌｅを選択し、パラメーターを上記のように設定する。サンプルを調製する：検体抗体ＤＣＢＰＲ１１０１を移動緩衝液で２００ｎＭに希釈する。濃度系列を２００ｎＭのサンプルから調製する：２００μＬの２００ｎＭ溶液を２００μＬの移動緩衝液を混合して、１００ｎＭの溶液を得る。希釈系列を続けて、２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭおよび１２．５ｎＭを得る。サンプルを準備し、ラック位置に従って配置する。すべてが、Ｐｒｅｐａｒｅ  Ｒｕｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌに従って正しいことを確認し、Ｓｔａｒｔをクリックして、実験を開始する。Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００評価ソフトウェア２．０によって提供される定義済みのモデル（１：１の結合）を使用する親和性結合曲線適合。
【００６０】
表１には、本発明の１つのＡＤＣ（ＤＣＢＤ１６００１）についてのＢＩＡｃｏｒｅアッセイの結果がまとめられる。これらの結果は、本発明のＡＤＣは依然として抗原（Ｇｌｏｂｏ  Ｈ）に特異的に結合することができることを示す。
【表１】
2020524669.tif 000012
【実施例１４】
【００６１】
細胞傷害性アッセイ
細胞傷害性のペイロード成分を含有する本発明のＡＤＣは、ガン細胞を殺傷するなど、標的細胞を殺傷するために使用される場合がある。本アッセイのために、ＭＣＦ−７、ＨＣＣ−１４２８、ＢＴ−４７４をＡＴＣＣから得た。すべての細胞株を５％ＣＯ２の加湿インキュベーター雰囲気において、３７℃で好適な培地において培養した。すべての細胞株を少なくとも３代にわたって継代培養し、細胞を９６ウエルの黒色平底プレートに置床し（すべての細胞株について１０，０００細胞／１００μｌ／ウエル）、５％ＣＯ２の加湿雰囲気において３７℃で一晩接着させた。
【００６２】
ＡＤＣを１ｕｇ／ｕｌのストック溶液から調製し、細胞播種の２４時間後に適切な作業用濃度に希釈した。２０ｍＭの試験品を最初に、ＰＢＳにより最大作業用濃度物に希釈した。この最大作業用濃度物から、８点のための連続三倍希釈を、ＤＭＳＯを用いて行い、その後、さらに培養培地を用いて１００倍に希釈した。８個の濃度物が検出される。最終濃度が、１００ｎＭ〜０．０４６ｎＭの範囲（ＤＭ−１）、または６６．６７ｎＭ〜０．０３０ｎＭの範囲（ＤＢＣＤ１６００１、ＤＣＢＰＲ１１０１）であった。最終ＰＢＳ濃度が１％であった。その後、培地を除き、異なる濃度の遊離型ＤＭ１、ＤＢＣＤ１６００１、ＤＣＢＰＲ１１０１および２００μｌ／ウエルを含有する新鮮な培地によって置き換え、細胞を７２時間インキュベーションした。Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬を室温で４８時間にわたって事前に解凍する。この時点の後、培地を除き、１００μｌ／ウエルのＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｇ７５７１、ロット：００００１８２８７２）を室温で１０分間、ウエルに加え、発光シグナルを、ＣＬＡＲＩＯｓｔａｒ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｍｏｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｒマルチモードマイクロプレートリーダーを使用して測定した。すべての細胞アッセイについて、用量応答曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６による３パラメーター曲線適合化を使用して得た。
【００６３】
これらのアッセイからの結果が下記の表２に示される。本発明のＡＤＣ（すなわち、ＤＣＢＤ１６００１）は、抗原陰性細胞（すなわち、ＢＴ−４７４）と比較して、抗原（Ｇｌｏｂｏ  Ｈ）発現細胞（ＭＣＦ−７およびＨＣＣ−１４２８）を殺傷することにおいて効果的であることが明らかである。
【表２】
2020524669.tif 000013
【実施例１５】
【００６４】
内在化アッセイ
抗体の受容体介内在化は細胞特異的な薬物送達をもたらすことができる。内在化は、ＡＤＣを使用する一部の標的化療法のために必要である。ＡＤＣの内在化は抗体依存的およびペイロード成分依存的の両方であることがこの技術分野では知られている。すなわち、すべての抗体がＡＤＣのための送達機構を提供することができるとは限らない。同様に、同じ抗体におけるペイロード成分が異なると、内在化効率が劇的に異なることがある。
【００６５】
抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ  ＡＤＣおよび抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体の内在化および分解をフローサイトメトリーによって測定することができる。２つの方法を本研究では使用した：抗体に対して直接に蛍光ラベルされる、または蛍光コンジュゲート化二次抗体を使用して、内在化後の細胞表面に残される一次抗体を検出する。
【００６６】
簡単に記載すると、ＭＣＦ７乳ガン細胞またはＨＣＣ１４２８乳ガン細胞を１×１０５細胞／ウエルで播種した。次に、０．５ｍｇ〜１ｍｇの蛍光ラベルされた抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体または抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ  ＡＤＣをＦＡＣＳ緩衝液における１００μｌの標的細胞（細胞密度、１×１０６／ｍｌ）において４℃で１時間供して、抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体または抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ  ＡＤＣが細胞表面の標的に特異的に結合することを可能にした。インキュベーション後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液により３回洗浄して、結合しなかった抗体を除いた。その後、細胞を抗体の内在化のために５％ＣＯ２とともに３７℃でインキュベーションした。
【００６７】
異なる時点で、細胞をトリプシンにより解離させ、蛍光コンジュゲート化抗ヒトＩｇＧ二次抗体により５分間染色し、その後、Ｂｅｃｋｍａｎフローサイトメトリーシステムを使用して分析した。間接的にラベルされた抗体または間接的に蛍光ラベルされた二次抗体の内在化および分解を、（抗体の内在化バックグラウンドとしての）４℃でのコントロール群と比較して測定するために、それぞれの時点での蛍光強度および細胞結合割合をＢｅｃｋｍａｎサイトメトリーソフトウェアによって分析した。それぞれの実験を三連で行った。
【００６８】
抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ  ＡＤＣおよび抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体の内在化を蛍光画像化によって調べるために、細胞を、標準的なフィルター構成を使用するＤｅｌｔａＶｉｓｉｏｎ（登録商標）Ｃｏｒｅ顕微鏡で画像化した。簡単に記載すると、ＭＣＦ−７標的細胞またはＨＣＣ１４２８標的細胞を８ウエルのガラス製カバースリップ底ディッシュ（Ｎｕｎｃ）でウエルあたり約２×１０５個の細胞で継代培養した。付着後、細胞を、Ａｌｅｘａ−４８８にコンジュゲート化された１０ｎＭの抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体または抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ  ＡＤＣと３７℃で一晩インキュベーションした。内在化に先立って、細胞を、蛍光マーカーＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒによるエンドソームおよびリソソームのラベル化のために、Ｒａｂ５−ｍＣｈｅｒｒｙプラスミドまたはＬＡＭＰ１−ｍＡｐｐｌｅプラスミドによりトランスフェクションした。細胞を洗浄し、Ｄｅｌｔａｖｉｓｉｏｎデコンボリューション顕微鏡で画像化して、Ａｌｅｘａ  ４８８およびＡｌｅｘａ５９４の共局在化を求めた。
【００６９】
図４Ａおよび図４Ｂはこれらの研究からの結果を示す。結果は、本発明のＡＤＣが、Ｇｌｏｂ  Ｈを発現する細胞（例えば、ＭＣＦ−７細胞（図４Ｂ）およびＨＣＣ−１４２８細胞（図４Ａ））によって内在化され得ることを示している。
【実施例１６】
【００７０】
インビボＰＫ
本研究では、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）電気化学発光（ＥＣＬ）方法をＢＡＬＢ／ｃマウスサンプルにおけるＤＣＢＤ１６００１の薬物動態学分析のために使用した。抗体ＭＳＤアッセイでは、図５に例示されるように、コンジュゲート型抗体および非コンジュゲート型抗体の両方を測定することができる。本実施例において、または総抗体アッセイにおいて例示されるように、プレートがヤギ抗ヒトＩｇＧにより被覆され、これにより、すべてのヒト化抗体（コンジュゲート型および非コンジュゲート型）を捕捉することができる。コンジュゲート型抗体アッセイのために、プレートが、ペイロード成分（薬物）に対する抗体により、例えば、図５に示される抗マイタシン（Ｍａｙｔａｓｉｎｅ）抗体などにより被覆される。
【００７１】
ＢＡＬＢ／ｃマウスに、尾静脈を介した１ｍｇ／ｋｇの用量レベルでの投与を行った。その後、血液サンプルを、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＤＣＢＤ１６００１の濃度をＭＥＳＯ  ＱｕｉｃｋＰｌｅｘ  ＳＱ１２０法によって求めるために種々の時点で得た。ＤＣＢＤ１６００１の薬物動態学パラメーターを、Ｐｈｏｅｎｉｘ（商標）ｆｏｒ  ＷｉｎＮｏｎｌｉｎプログラム（バージョン６．３）を使用して非コンパートメント分析によって分析した。
【００７２】
図６はインビボ薬物動態学研究からの結果を示し、下記の表３には、このＰＫ研究についての結果がまとめられる。総抗体ＭＳＤアッセイ：コンジュゲート型抗体および非コンジュゲート型抗体の両方を測定する。コンジュゲート型抗体ＭＳＤアッセイ：コンジュゲート型抗体のみを測定する。ＤＣＢＤ１６００１のインビボ半減期が、知られている治療用抗体の半減期よりも比較的短い１２７時間前後であり、このことは、重篤な副作用が生じるならば、ＤＣＢＤ１６００１の方が早く洗い流され得ることを示唆している。
【表３】
2020524669.tif 000014
【実施例１７】
【００７３】
抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ  ＡＤＣの異種移植片モデル
本発明のいくつかの実施形態が、ＡＤＣにおける抗体をホーミング剤／標的化剤として使用する、疾患の診断、画像化および処置のための方法に関する。抗体部分がその標的抗原に特異的に結合することになり、一方、ペイロード成分が診断／画像化試薬または処置試薬を提供することになる。可能な診断／画像化試薬には、例えば、蛍光成分または放射性プローブが含まれる場合があり、一方、処置試薬には、例えば、細胞傷害性薬剤または免疫調節物質（例えば、ＣＤ３）が含まれる場合がある。
【００７４】
この特定の実施例では、ガンを処置する本発明のＡＤＣの能力が評価される。簡単に記載すると、６週齢〜７週齢のオスのＣＢ．１７  ＳＣＩＤマウスをＢｉｏＬａｓｃｏ  Ｔａｉｗａｎ  Ｃｏ．，ＬＴＤから購入し、１週間隔離した。実験期間中、５匹のマウスが１つのケージに収容される。すべての動物がＤａ−Ｈｕ動物施設において１２時間照明／１２時間消灯サイクルで、１９℃〜２５℃で飼育される。動物はげっ歯類用ペレット餌および水を自由に摂取することができる。動物研究の実験プロトコルは施設内動物管理使用委員会（ＤＣＢ）によって審査され、承認された。
【００７５】
マウスに、１７−β−エストラジオールペレット（０．１８ｍｇ／ペレット、６０日間放出；Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ（合衆国））を腫瘍細胞注射の７日前に接種した。移植のために使用されるＨＣＣ１４２８乳ガン細胞を対数期成長の期間中に採取し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁した。それぞれのマウスに、０．１５ｍＬの５０％マトリゲル溶液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＭＡ、合衆国））における１×１０７細胞のＨＣＣ１４２８を脇腹に皮下（ｓ．ｃ．）注射した。平均腫瘍体積が２５０ｍｍ３に達したとき、マウスをランダムに８つの群に分けた。群１にはＰＢＳが投与され、この群は、腫瘍成長阻害率を計算するためのコントロール群として役立つ。群２〜群５には、ＤＣＢＤ１６００１が３ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ）で週に２回、１０ｍｐｋで週に２回、２０ｍｐｋで週に１回、そして１日目および１１日目にそれぞれ３０ｍｇ／ｋｇで、それぞれ投与される。群６には、（ペイロード成分を伴わない）ネイキッド抗体ＰＲ１１０１が１０ｍｐｋで週に２回投与される。群７におけるマウスには、イソタイプ抗体が１０ｍｐｋで週に２回投与され、この群は陰性コントロール群として役立つ。群８におけるマウスには、パクリタキセルが１０ｍｐｋで週に１回投与され、この群は陽性処置コントロール群として役立つ。ビヒクル、ＤＣＢＤ１６００１、ネイキッド抗体およびイソタイプ抗体により処置されるマウスはｉｖ注射によってであり、一方、パクリタキセルはｉｐ注射によって与えられた。
【００７６】
腫瘍体積を、カリパスを使用して週に３回測定し、下記の式を使用して推定した：腫瘍体積＝（ｗ２×ｌ）／２、式中、ｗ＝腫瘍の幅、ｌ＝腫瘍の直径での長さ（ｍｍ）。腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）の割合を、下記式を使用して計算した：％ＴＧＩ＝［１−（Ｔ／Ｃ）］×１００％、式中、ＴおよびＣは処置群およびコントロール群の平均腫瘍体積をそれぞれ表す。
【００７７】
動物の重量を、研究が完了するまで週に３回測定した。体重変化を、初期体重と比較した場合の体重における増加率として計算した。
【００７８】
図７は実験プロトコルおよび処置スキームを例示する。本実験では、乳ガン細胞株であるＨＣＣ１４２８細胞が使用される。この細胞はその表面にＧｌｏｂ  Ｈを発現する。
【００７９】
図８はインビボ異種移植腫瘍処置研究の結果を示す。示されるように、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇでの本発明のＡＤＣ（ＤＣＢＤ１６００１）は、ネイキッド抗体（抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗体）よりも有意に効果的である。この結果は本発明のＡＤＣの有効性を示している。有意に改善された効力は、細胞傷害性の強化および／または薬物動態学の改善をもたらし得るカップリングされたペイロード成分に起因するものである。
【００８０】
興味深いことに、（６０ｍｇ／ｋｇの総用量のための）１日目および１１日目における３０ｍｐｇでのＤＣＢＤ１６００１による処置は最も効果的であり、週に２回の１０ｍｇ／ｋｇの場合（６０ｍｇ／ｋｇの総用量）よりも有意に効果的である。この結果は、単回注射用量がより大きく、投与間隔がより長い場合（１０日）、ＡＤＣの方が効果的であることを示している。同じ総用量のもとにおいて、より長い投与間隔（例えば、１０日）がより良好な結果をもたらしたという事実は、予想外である。このことは、抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈ  ＡＤＣについては、より高いＣｍａｘが、より大きいＡＵＣよりも重要であり得ることを示唆しているかもしれない。
【００８１】
腫瘍成長抑制が、高まった腫瘍細胞の殺傷または腫瘍細胞成長の阻害から生じていることが、マウスの体重が、図９に示されるように、異なる処置群の間での感知できるほどの変化を有していないという事実によって裏付けられる。
【００８２】
上記実施例は、本発明のＡＤＣを得るための、そして特徴づけるための様々な方法、同様にまた、ガンを処置することにおける本発明のＡＤＣの有効性を明確に例示している。本発明の様々な実施形態が限られた数の実施例により例示されているが、当業者は、他の変化および改変が、本発明の範囲から逸脱することなく可能であることを理解するであろう。したがって、本発明の保護の範囲は、添付された請求項のみによって限定されなければならない。
【図１】
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【図２】
2020524669.tif 000016
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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