(57)【要約】  本発明の態様は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）および関節リウマチ（ＲＡ）を含む自己免疫疾患の鑑別診断を提供するための方法、装置およびシステムに関する。本発明の態様は、自己免疫疾患を互いに、他の自己免疫疾患から、ならびに自己免疫疾患に分類されないが、自己免疫疾患によく関連する症状を呈する類似する病状から鑑別診断するために提供される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己免疫疾患の鑑別診断を行う方法であって、
（ａ）対象由来のサンプルを、少なくとも１０，０００個の種々のペプチドを含むペプチドアレイと接触させること；
（ｂ）該アレイ上の少なくとも２５個のペプチドに対する該サンプルに存在する抗体の結合を検出して、結合シグナルの組合せを得ること；および
（ｃ）該結合シグナルの組合せを、１群またはそれ以上の対照結合シグナルの組合せと比較すること、
を含み、ここで、該対照結合シグナルの組合せ群の少なくとも１つは、該対象の自己免疫疾患とは異なる疾患を有することが分かっている複数の対照対象から得られて、それにより該対象の自己免疫疾患の鑑別診断が可能となり、該方法のパフォーマンスは、自己免疫疾患と各対照結合シグナルの組合せ群との間で受容動作特性（ＲＯＣ）曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）が０．６より大きいことにより特徴付けられる、方法。
【請求項２】
（ｉ）鑑別用の対照結合シグナルの組合せを識別すること、ここで、該鑑別用の対照結合シグナルは、自己免疫疾患を有することが分かっている対照対象由来のサンプルを、自己免疫疾患とは異なる疾患を有することが分かっている対照対象由来のサンプルと区別し；および
（ｉｉ）鑑別用の対照結合シグナルの組合せを請求項１に記載の工程（ｃ）に適用することにより自己免疫疾患の鑑別診断を可能にすること
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該鑑別用の対照結合シグナルの組合せのそれぞれが、請求項１に記載の工程（ａ）において、少なくとも１０，０００個の種々のペプチドを含むペプチドアレイ上の少なくとも２５個のペプチドに対する複数の対照対象のそれぞれ由来のサンプルに存在する抗体の結合を検出することにより得られる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
該結合シグナルの組合せと該対照結合シグナルの組合せとの間の該少なくとも２５個のペプチドに対する相違により該鑑別診断が決定される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
（ｄ）該結合シグナルの組合せを、自己免疫疾患を有することが分かっている複数の対照対象から得られた対照結合シグナルと比較することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
該異なる疾患が自己免疫疾患である、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
該異なる疾患が非自己免疫性の類似する症状を呈する疾患である、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
該自己免疫疾患が全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）であり、該異なる自己免疫疾患が関節リウマチ（ＲＡ）である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
該識別用ペプチドが、図７Ａに列記される１以上の配列モチーフにおいて１００％を超えて富化されている、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
該識別用ペプチドが、図７Ｂに列記される１以上のアミノ酸において１００％を超えて富化されている、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
該自己免疫疾患が全身性エリテマトーデスであり、該異なる非自己免疫疾患が変形性関節症（ＯＡ）である、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
該識別用ペプチドが、図８Ａに列記される１以上の配列モチーフにおいて１００％を超えて富化されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
該識別用ペプチドが、図８Ｂに列記される１以上のアミノ酸において１００％を超えて富化されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
該自己免疫疾患が全身性エリテマトーデスであり、該異なる非自己免疫疾患が線維筋痛症（ＦＭ）である、請求項６に記載の方法。
【請求項１５】
該識別用ペプチドが、図９Ａに列記される１以上の配列モチーフにおいて１００％を超えて富化されている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
該識別用ペプチドが、図９Ｂに列記される１以上のアミノ酸において１００％を超えて富化されている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
該自己免疫疾患が全身性エリテマトーデスであり、該異なる自己免疫疾患がシェーグレン症候群（ＳＳ）である、請求項６に記載の方法。
【請求項１８】
該識別用ペプチドが、図１０Ａに列記される１以上の配列モチーフにおいて１００％を超えて富化されている、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
該識別用ペプチドが、図１０Ｂに列記される１以上のアミノ酸において１００％を超えて富化されている、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
該自己免疫疾患が全身性エリテマトーデスであり、該異なる疾患が、自己免疫疾患および非自己免疫性の類似する症状を呈する疾患の一群である、請求項６に記載の方法。
【請求項２１】
該識別用ペプチドが、図５Ａに列記される１以上の配列モチーフにおいて１００％を超えて富化されている、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
該識別用ペプチドが、図５Ｂに列記される１以上のアミノ酸において１００％を超えて富化されている、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
該自己免疫疾患が全身性エリテマトーデスであり、該異なる疾患が、自己免疫疾患、非自己免疫性の類似する症状を呈する疾患、および健康な対照の一群である、請求項６に記載の方法。
【請求項２４】
該識別用ペプチドが、図６Ａに列記される１以上の配列モチーフにおいて１００％を超えて富化されている、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
該識別用ペプチドが、図６Ｂに列記される１以上のアミノ酸において１００％を超えて富化されている、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
全身性エリテマトーデスを有する対象からの結合シグナルを、健康な対象から得られた対照結合シグナルの組合せと比較することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
該識別用ペプチドが、図４Ａに列記される１以上の配列モチーフにおいて１００％を超えて富化されている、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
該識別用ペプチドが、図４Ｂに列記される１以上のアミノ酸において１００％を超えて富化されている、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
該自己免疫疾患が関節リウマチ（ＲＡ）であり、該異なる疾患がＯＡである、請求項６に記載の方法。
【請求項３０】
該識別用ペプチドが、図２２Ａに列記される１以上の配列モチーフにおいて１００％を超えて富化されている、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
該識別用ペプチドが、図２２Ｂに列記される１以上のアミノ酸において１００％を超えて富化されている、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
該自己免疫疾患が関節リウマチ（ＲＡ）であり、該異なる疾患がＦＭである、請求項６に記載の方法。
【請求項３３】
該識別用ペプチドが、図２３Ａに列記される１以上の配列モチーフにおいて１００％を超えて富化されている、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
該識別用ペプチドが、図２３Ｂに列記される１以上のアミノ酸において１００％を超えて富化されている、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
該自己免疫疾患が関節リウマチ（ＲＡ）であり、該異なる疾患がＳＳである、請求項６に記載の方法。
【請求項３６】
該識別用ペプチドが、図２４Ａに列記される１以上の配列モチーフにおいて１００％を超えて富化されている、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
該識別用ペプチドが、図２４Ｂに列記される１以上のアミノ酸において１００％を超えて富化されている、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
該自己免疫疾患がＲＡであり、該異なる疾患が、自己免疫疾患および非自己免疫性の類似する症状を呈する疾患の一群である、請求項６に記載の方法。
【請求項３９】
該識別用ペプチドが、図２１Ａに列記される１以上の配列モチーフにおいて１００％を超えて富化されている、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
該識別用ペプチドが、図２１Ｂに列記される１以上のアミノ酸において１００％を超えて富化されている、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
該自己免疫疾患がＲＡであり、該異なる疾患が、自己免疫疾患、非自己免疫性の類似する症状を呈する疾患、および健康な対照の一群である、請求項６に記載の方法。
【請求項４２】
該識別用ペプチドが、図２０Ａに列記される１以上の配列モチーフにおいて１００％を超えて富化されている、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
該識別用ペプチドが、図２０Ｂに列記される１以上のアミノ酸において１００％を超えて富化されている、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
ＲＡを有する対象からの結合シグナルを、健康な対象（ＨＣ）から得られた対照結合シグナルの組合せと比較することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４５】
該識別用ペプチドが、図１８Ａに列記される１以上の配列モチーフにおいて１００％を超えて富化されている、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
該識別用ペプチドが、図１８Ｂに列記される１以上のアミノ酸において１００％を超えて富化されている、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
ＳＬＥ、ＲＡ、ＦＭ、ＯＡ、ＳＳおよびＨＣの各々からのサンプルを互いに区別する結合シグナルを鑑別して、それぞれの病状を同時に区別する識別用ペプチドのマルチクラスセットを得ることをさらに組み合わせる、請求項１に記載の方法。
【請求項４８】
該識別用ペプチドが、図３０Ａに列記される１以上の配列モチーフにおいて１００％を超えて富化されている、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
該識別用ペプチドが、図３０Ｂに列記される１以上のアミノ酸において１００％を超えて富化されている、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
該方法のパフォーマンスが、０．６０から０．７０、０．７０から０．７９、０．８０から０．８９、または０．９０から１．００の範囲の受容動作特性（ＲＯＣ）曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）により特徴付けられる、請求項１に記載の方法。
【請求項５１】
自己免疫疾患の少なくとも１つの候補バイオマーカーを同定する方法であって、
（ａ）ペプチドアレイを提供し、該ペプチドアレイに対して自己免疫疾患を有することが分かっている複数の対照対象からの生物学的サンプルをインキュベートする工程；
（ｂ）該対象からの生物学的サンプルにおいて抗体に結合した識別用ペプチドのセットを同定する工程、ここで、該識別用ペプチドのセットは、健康な対象由来のサンプルから自己免疫疾患を鑑別できる結合シグナルを表示する；
（ｃ）識別用ペプチドセット内の各ペプチドを用いてプロテオームデータベースを検索する工程；
（ｄ）識別用ペプチドセット内の各ペプチドを、ヒトプロテオームデータベース内の１以上のタンパク質にアライメントさせる工程；および
（ｅ）プロテオームデータベースから特定されたタンパク質のそれぞれについて関連性スコアおよびランキングを取得する工程；
（ここで、同定されたタンパク質のそれぞれは、自己免疫疾患の候補バイオマーカーである）を含む、方法。
【請求項５２】
オーバーラップスコアを取得することをさらに含み、ここで該スコアがペプチドライブラリーのペプチド組成を補正する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
該識別用ペプチドセットを特定する工程が、
（ｉ）自己免疫疾患を有する複数の対象由来のサンプル中に存在する抗体の種々のペプチドのアレイへの結合を検出して、結合シグナルの第１の組合せを得ること；
（ｉｉ）ペプチドの同じアレイへの、対象の２以上の対照群（各群は疾患に対して血清陰性である）からのサンプルに存在している抗体の結合を検出して、結合シグナルの第２の組合せを得ること；
（ｉｉｉ）結合シグナルの該第１の組合せと該第２の組合せとを比較すること；および
（ｉｖ）自己免疫疾患を有する対象由来のサンプルにおいて健康な対象の対照群とは異なって抗体が結合する該アレイ上のペプチドを同定し、それにより該識別用ペプチドを同定すること
を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
識別用ペプチドの数が、該アレイ上のペプチドの総数の少なくとも一部に対応する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
自己免疫疾患が全身性エリテマトーデスである、請求項４１に記載の方法。
【請求項５６】
少なくとも１個の候補タンパク質バイオマーカーが、図１７Ａに記載のリストから選択される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５７】
自己免疫疾患が関節リウマチである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５８】
少なくとも１個の候補タンパク質バイオマーカーが、図２９Ａに記載のリストから選択される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５９】
サンプルが血液サンプルである、請求項１から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
血液サンプルが、全血、血漿または血清から選択される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
サンプルが血清サンプルである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
サンプルが血漿サンプルである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
サンプルが乾燥血液サンプルである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６４】
ペプチドアレイが、少なくとも５０，０００個の種々のペプチドを含む、請求項１から６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
ペプチドアレイが、少なくとも３００，０００個の種々のペプチドを含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
ペプチドアレイが、少なくとも５００，０００個の種々のペプチドを含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
ペプチドアレイが、少なくとも２，０００，０００個の種々のペプチドを含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６８】
ペプチドアレイが、少なくとも３，０００，０００個の種々のペプチドを含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６９】
ペプチドアレイ上の種々のペプチドが、少なくとも５個のアミノ酸長である、請求項１から６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
ペプチドアレイ上の種々のペプチドが、５から１３個のアミノ酸長である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
種々のペプチドが、２０個未満のアミノ酸から合成される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
アレイ上に種々のペプチドが沈積されている、請求項１から７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
アレイ上の種々のペプチドがインサイチュで合成される、請求項１から７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
自己免疫疾患の鑑別診断を行うためのキットであって、
（ａ）対象由来のサンプルを接触させるための少なくとも１０，０００個の種々のペプチドを含むペプチドアレイ；
（ｂ）該サンプルに存在する抗体の、該アレイ上の少なくとも２５個のペプチドに対する結合を検出して、結合シグナルの組合せを得るための、検出試薬；および
（ｃ)結合シグナルの該組合せを、対照結合シグナルの組合せの１以上の群と比較するための手段、ここで、対照結合シグナルの組合せの群の少なくとも１つは、対象の自己免疫疾患とは異なる疾患を有することが分かっている複数の対照対象から得られて、該対象の自己免疫疾患についての鑑別診断を可能にし、ここで、該方法のパフォーマンスは、自己免疫疾患と対照結合シグナルの組合せ群のそれぞれとの間の受容動作特性（ＲＯＣ）曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）が０．６より大きいことにより特徴付けられる、
を含む、キット。
【請求項７５】
（ｉ）鑑別用の対照結合シグナルの組合せを同定するための手段であって、ここで、該鑑別用の対照結合シグナルが、自己免疫疾患と異なる疾患を有することが分かっている対照対象由来のサンプルから、該自己免疫疾患を有することが分かっている対照対象由来のサンプルを区別すること；および
（ｉｉ）自己免疫疾患の鑑別診断を可能にするために、鑑別用の対照結合シグナルの組合せを工程１（ｃ)に適用するための手段
をさらに含む、請求項７４に記載のキット。
【請求項７６】
鑑別用の対照結合シグナルの該組合せのそれぞれが、請求項１に記載の工程（ａ）における少なくとも１０，０００個の種々のペプチドを含むペプチドアレイ上の少なくとも２５個のペプチドに対する、複数の対照対象のそれぞれ由来のサンプルに存在する抗体の結合を検出することにより得られる、請求項７５に記載のキット。
【請求項７７】
該結合シグナルの組合せと該対照結合シグナルの組合せとの間の該少なくとも２５個のペプチドに対する相違により該鑑別診断が決定される、請求項７５に記載のキット。
【請求項７８】
（ｄ）該結合シグナルの組合せを、自己免疫疾患を有することが分かっている複数の対照対象から得られる対照結合シグナルと比較するための手段
をさらに含む、請求項７４に記載のキット。
【請求項７９】
該異なる疾患が自己免疫疾患である、請求項７４から７８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項８０】
該異なる疾患が非自己免疫性の類似する症状を呈する疾患である、請求項７４から７８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項８１】
自己免疫疾患が全身性エリテマトーデスであり、該異なる自己免疫疾患が関節リウマチである、請求項７９に記載のキット。
【請求項８２】
該識別用ペプチドが、図７Ａに列挙された１以上の配列モチーフにおいて１００％を超えて富化されている、請求項８１に記載のキット。
【請求項８３】
該識別用ペプチドが、図７Ｂに列挙された１以上のアミノ酸において１００％を超えて富化されている、請求項８１に記載のキット。
【請求項８４】
該自己免疫疾患が全身性エリテマトーデスであり、該異なる非自己免疫疾患が変形性関節症である、請求項７９に記載のキット。
【請求項８５】
該識別用ペプチドが、図８Ａに列挙された１以上の配列モチーフにおいて１００％を超えて富化されている、請求項８４に記載のキット。
【請求項８６】
該識別用ペプチドが、図８Ｂに列挙された１以上のアミノ酸において１００％を超えて富化されている、請求項８４に記載のキット。
【請求項８７】
該自己免疫疾患が全身性エリテマトーデスであり、該異なる非自己免疫疾患が線維筋痛症である、請求項７９に記載のキット。
【請求項８８】
該識別用ペプチドが、図９Ａに列挙された１以上の配列モチーフにおいて１００％を超えて富化されている、請求項８７に記載のキット。
【請求項８９】
該識別用ペプチドが、図９Ｂに列挙された１以上のアミノ酸において１００％を超えて富化されている、請求項８７に記載のキット。
【請求項９０】
該自己免疫疾患が全身性エリテマトーデスであり、該異なる自己免疫疾患がシェーグレン症候群である、請求項７９に記載のキット。
【請求項９１】
該識別用ペプチドが、図１０Ａに列挙された１以上の配列モチーフにおいて１００％を超えて富化されている、請求項９０に記載のキット。
【請求項９２】
該識別用ペプチドが、図１０Ｂに列挙された１以上のアミノ酸において１００％を超えて富化されている、請求項９０に記載のキット。
【請求項９３】
自己免疫疾患が全身性エリテマトーデスであり、該異なる疾患が、自己免疫疾患および非自己免疫性の類似する症状を呈する疾患の一群である、請求項７９に記載のキット。
【請求項９４】
該識別用ペプチドが、図５Ａに列挙された１以上の配列モチーフにおいて１００％を超えて富化されている、請求項９３に記載のキット。
【請求項９５】
該識別用ペプチドが、図５Ｂに列挙された１以上のアミノ酸において１００％を超えて富化されている、請求項９３に記載のキット。
【請求項９６】
該自己免疫疾患が全身性エリテマトーデスであり、該異なる疾患が、自己免疫疾患、非自己免疫性の類似する症状を呈する疾患、および健康な対照の一群である、請求項７９に記載のキット。
【請求項９７】
該識別用ペプチドが、図６Ａに列挙された１以上の配列モチーフにおいて１００％を超えて富化されている、請求項９６に記載のキット。
【請求項９８】
該識別用ペプチドが、図６Ｂに列挙された１以上のアミノ酸において１００％を超えて富化されている、請求項９６に記載のキット。
【請求項９９】
全身性エリテマトーデスを有する対象からの結合シグナルを、健康な対象から得られた対照結合シグナルの組合せと比較するための手段をさらに含む、請求項７４に記載のキット。
【請求項１００】
該識別用ペプチドが、図４Ａに列挙された１以上の配列モチーフにおいて１００％を超えて富化されている、請求項９９に記載のキット。
【請求項１０１】
該識別用ペプチドが、図４Ｂに列挙された１以上のアミノ酸において１００％を超えて富化されている、請求項９９に記載のキット。
【請求項１０２】
該自己免疫疾患が関節リウマチ（ＲＡ）であり、該異なる疾患がＯＡである、請求項７９に記載のキット。
【請求項１０３】
該識別用ペプチドが、図２２Ａに列挙された１以上の配列モチーフにおいて１００％を超えて富化されている、請求項１０２に記載のキット。
【請求項１０４】
該識別用ペプチドが、図２２Ｂに列挙された１以上のアミノ酸において１００％を超えて富化されている、請求項１０２に記載のキット。
【請求項１０５】
該自己免疫疾患が関節リウマチ（ＲＡ）であり、該異なる疾患がＦＭである、請求項７９に記載のキット。
【請求項１０６】
該識別用ペプチドが、図２３Ａに列挙された１以上の配列モチーフにおいて１００％を超えて富化されている、請求項１０５に記載のキット。
【請求項１０７】
該識別用ペプチドが、図２３Ｂに列挙された１以上のアミノ酸において１００％を超えて富化されている、請求項１０５に記載のキット。
【請求項１０８】
該自己免疫疾患が関節リウマチであり、該異なる疾患がＳＳである、請求項７９に記載のキット。
【請求項１０９】
該識別用ペプチドが、図２４Ａに列挙された１以上の配列モチーフにおいて１００％を超えて富化されている、請求項１０８に記載のキット。
【請求項１１０】
該識別用ペプチドが、図２４Ｂに列挙された１以上のアミノ酸において１００％を超えて富化されている、請求項１０８に記載のキット。
【請求項１１１】
該自己免疫疾患がＲＡであり、該異なる疾患が、自己免疫疾患および非自己免疫性の類似する症状を呈する疾患の一群である、請求項７９に記載のキット。
【請求項１１２】
該識別用ペプチドが、図２１Ａに列挙された１以上の配列モチーフにおいて１００％を超えて富化されている、請求項１１１に記載のキット。
【請求項１１３】
該識別用ペプチドが、図２１Ｂに列挙された１以上のアミノ酸において１００％を超えて富化されている、請求項１１１に記載のキット。
【請求項１１４】
自己免疫疾患がＲＡであり、該異なる疾患が、自己免疫疾患、非自己免疫性の類似する症状を呈する疾患、および健康な対照の一群である、請求項７９に記載のキット。
【請求項１１５】
該識別用ペプチドが、図２０Ａに列挙された１以上の配列モチーフにおいて１００％を超えて富化されている、請求項１１４に記載のキット。
【請求項１１６】
該識別用ペプチドが、図２０Ｂに列挙された１以上のアミノ酸において１００％を超えて富化されている、請求項１１４に記載のキット。
【請求項１１７】
ＲＡを有する対象からの結合シグナルを、健康な対照（ＨＣ）から得られた対照結合シグナルの組合せと比較するための手段をさらに含む、請求項７４に記載のキット。
【請求項１１８】
該識別用ペプチドが、図１８Ａに列挙された１以上の配列モチーフにおいて１００％を超えて富化されている、請求項１１７に記載のキット。
【請求項１１９】
該識別用ペプチドが、図１８Ｂに列挙された１以上のアミノ酸において１００％を超えて富化されている、請求項１１７に記載のキット。
【請求項１２０】
ＳＬＥ、ＲＡ、ＦＭ、ＯＡ、ＳＳおよびＨＣの各々からのサンプルを互いから区別する差別化結合シグナルを、互いから各病状を同時に区別する識別用ペプチドのマルチクラスセットと組み合わせるための手段をさらに含む、請求項７４に記載のキット。
【請求項１２１】
該識別用ペプチドが、図３０Ａに列挙された１以上の配列モチーフにおいて１００％を超えて富化されている、請求項１２０に記載のキット。
【請求項１２２】
該識別用ペプチドが、図３０Ｂに列挙された１以上のアミノ酸において１００％を超えて富化されている、請求項１２０に記載のキット。
【請求項１２３】
該方法のパフォーマンスが、０．６０から０．７０の範囲、０．７０から０．７９の範囲、０．８０から０．８９の範囲、または０．９０から１．００の範囲の受容動作特性（ＲＯＣ）曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）により特徴付けられる、請求項７４に記載のキット。
【請求項１２４】
自己免疫疾患の少なくとも１個の候補バイオマーカーを同定するためのキットであって、
（ａ）自己免疫疾患を有することが分かっている複数の対照対象からの生物学的サンプルをインキュベートするためのペプチドアレイ；
（ｂ）健康な対象由来のサンプルから自己免疫疾患を区別できる結合シグナルを表示する識別用ペプチドのセットである、該対象からの生物学的サンプルにおいて抗体に結合した識別用ペプチドのセットを同定する手段；
（ｃ)識別用ペプチドのセットにおいて該ペプチドそれぞれでプロテオームデータベースを照会する手段;
（ｄ）識別用ペプチドのセット内の各ペプチドを、ヒトプロテオームデータベース内の１以上のタンパク質とアライメントする手段；および
（ｅ）プロテオームデータベースから同定されたタンパク質のそれぞれについて関連性スコアおよびランキングを取得する手段;
ここで、同定されたタンパク質のそれぞれは、自己免疫疾患の候補バイオマーカーである、
を含む、キット。
【請求項１２５】
オーバーラップスコアを得るための手段をさらに含み、ここで、該スコアは、ペプチドライブラリーのペプチド組成を補正する、請求項１２４に記載のキット。
【請求項１２６】
識別用ペプチドセットを同定するための手段が、
（ｉ）自己免疫疾患を有する複数の対象由来のサンプルに存在する抗体の、種々のペプチドのアレイへの結合を検出して、結合シグナルの第１の組合せを得る手段；
（ｉｉ）２以上の対照対象群（各群は該疾患に対して血清反応陰性（seronegative）である）からのサンプルに存在している抗体の、ペプチドの同じアレイへの結合を検出して、結合シグナルの；第２の組合せを得る手段；
（ｉｉｉ）結合シグナルの該第１の組合せと該第２の組合せとを比較する手段；および
（ｉｖ）健康な対象の対照群からの自己免疫疾患を有する対象由来のサンプル中の抗体により示差的に結合される、該アレイ上の該ペプチドを同定し、それにより該識別用ペプチドを同定する手段
を含む、請求項１２４に記載のキット。
【請求項１２７】
識別用ペプチドの数が、該アレイ上のペプチドの総数の少なくとも一部に相当する、請求項１２４に記載のキット。
【請求項１２８】
自己免疫疾患が全身性エリテマトーデスである、請求項１２４に記載のキット。
【請求項１２９】
該少なくとも１個の候補タンパク質バイオマーカーが、図１７Ａに記載のリストから選択される、請求項１２４に記載のキット。
【請求項１３０】
自己免疫疾患が関節リウマチである、請求項１２４に記載のキット。
【請求項１３１】
少なくとも１個の候補タンパク質バイオマーカーが、図２９Ａに記載のリストから選択される、請求項１２４に記載のキット。
【請求項１３２】
サンプルが血液サンプルである、請求項７４から１３１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１３３】
血液サンプルが、全血、血漿および血清から選択される、請求項１３２に記載のキット。
【請求項１３４】
サンプルが血清サンプルである、請求項１３２に記載のキット。
【請求項１３５】
サンプルが血漿サンプルである、請求項１３２に記載のキット。
【請求項１３６】
サンプルが乾燥血液サンプルである、請求項１３２に記載のキット。
【請求項１３７】
ペプチドのアレイが少なくとも５０，０００個の種々のペプチドを含む、請求項７４から１３６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１３８】
ペプチドアレイが、少なくとも３００，０００個の種々のペプチドを含む、請求項１３７に記載のキット。
【請求項１３９】
ペプチドアレイが少なくとも５００，０００個の種々のペプチドを含む、請求項１３７に記載のキット。
【請求項１４０】
ペプチドアレイが少なくとも２，０００，０００個の種々のペプチドを含む、請求項１３７に記載のキット。
【請求項１４１】
ペプチドアレイが、少なくとも３，０００，０００個の種々のペプチドを含む、請求項１３７に記載のキット。
【請求項１４２】
ペプチドアレイ上の種々のペプチドが、少なくとも５アミノ酸長である、請求項７４から１４１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１４３】
ペプチドアレイ上の種々のペプチドが、５アミノ酸長から１３アミノ酸長の間である、請求項１４２に記載のキット。
【請求項１４４】
種々のペプチドが、２０個未満のアミノ酸から合成されている、請求項１４２に記載のキット。
【請求項１４５】
アレイ上に種々のペプチドが沈積されている、請求項７４から１４４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１４６】
アレイ上の種々のペプチドがインサイチュウで合成される、請求項７４から１４５のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本願は、２０１７年６月１９日出願の米国仮特許出願第６２／５２２，０５２；２０１７年６月２０日出願の米国仮特許出願第６２／５２２，６３６号；および、２０１７年１１月３日出願の米国仮特許出願第６２／５８１，５８１号に基づく優先権の利益を主張し、その内容全体は、引用により本明細書中に包含される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
的確または正確な診断を受けることが時間的に困難な患者にとって、自己免疫疾患などの免疫介在疾患の発見および診断は困難である。多くの場合、患者は、これらの疾患の性質が密接に関連しているために、他の自己免疫疾患と誤診されることが少なくない。現在、自己免疫疾患または障害の発見および評価に利用できる信頼できるバイオマーカーは存在しない。
【発明の概要】
【０００３】
発明の概要
本明細書中、自己免疫疾患を有するか、または自己免疫疾患を有することが疑われる対象における自己免疫疾患の鑑別診断を提供する方法、装置およびシステムが記載される。さらに、自己免疫疾患の診断、予後予測、モニタリング、活性およびスクリーニングに有用な、そして／または自己免疫疾患の処置の治療標的として有用なタンパク質バイオマーカーを含むバイオマーカー候補を選別するための方法、装置、およびシステムが提供される。
【０００４】
いくつかの例において、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ（ＲＡ）、シェーグレン症候群（ＳＳ）、強皮症、変形性関節症（ＯＡ）および線維筋痛症（ＦＭ）を含む自己免疫疾患の鑑別診断を提供するための方法、装置、システムおよびキットが示されている。開示された態様は、自己免疫疾患を互いに、および自己免疫疾患として分類されないが、特定の自己免疫疾患によく関連する症状を呈する類似する疾患状態（mimic disease condition）から鑑別診断するために提供される。類似する症状を呈する疾患状態の限定されない例としては、変形性関節症および線維筋痛症が挙げられ、これらはＳＬＥおよびＲＡなどの自己免疫疾患と症状が重複している。さらに、他の自己免疫疾患および非自己免疫疾患を含む混合型病状集団から得られたサンプルから、ＳＬＥおよびＲＡを含む自己免疫疾患の鑑別診断を提供するための方法、装置およびシステムが提示される。いくつかの例において、混合型集団には健康な対象からのサンプルも含まれる。種々の症状を識別する候補バイオマーカーも提供される。
【０００５】
一態様において、本明細書中、自己免疫疾患の鑑別診断を実施するための方法、装置およびキットが記載され、該方法は、自己免疫疾患の鑑別診断を行う方法であって、（ａ）対象由来のサンプルを、少なくとも１０，０００個の種々のペプチドを含むペプチドアレイと接触させること；（ｂ）該アレイ上の少なくとも２５個のペプチドに対する該サンプルに存在する抗体の結合を検出して、結合シグナルの組合せを得ること；および、（ｃ）該結合シグナルの組合せを、１群またはそれ以上の対照結合シグナルの組合せと比較することを含み、ここで、該対照結合シグナルの組合せ群の少なくとも１つは、該対象の自己免疫疾患とは異なる疾患を有することが分かっている複数の対照対象から得られて、それにより該対象の自己免疫疾患の鑑別診断が可能となり、該方法のパフォーマンスは、自己免疫疾患と各対照結合シグナルの組合せ群との間で受容動作特性（Receiver operator characteristic(ＲＯＣ)）曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）が０．６より大きいことにより特徴付けられる方法を含む。いくつかの例において、本明細書に記載の方法、システムおよび装置は、（ｉ）鑑別用の対照結合シグナルの組合せを識別すること、ここで、該鑑別用の対照結合シグナルは、自己免疫疾患を有することが分かっている対照対象由来のサンプルを、自己免疫疾患とは異なる疾患を有することが分かっている対照対象由来のサンプルと区別し；そして、（ｉｉ）鑑別用の対照結合シグナルの組合せを上記の方法、システムおよび装置の工程（ｃ）に適用することにより自己免疫疾患の鑑別診断を可能にすること、をさらに含む。さらに他の例において、該鑑別用の対照結合シグナルの組合せのそれぞれが、上記の方法、システムおよび装置の工程（ａ）において、少なくとも１０，０００個の種々のペプチドを含むペプチドアレイ上の少なくとも２５個のペプチドに対する複数の対照対象のそれぞれ由来のサンプルに存在する抗体の結合を検出することにより得られる。
【０００６】
いくつかの例において、本明細書に記載の方法、装置、システムおよびキットは、該結合シグナルの組合せを、自己免疫疾患を有することが分かっている複数の対照対象から得られた対照結合シグナルと比較することをさらに含む。いくつかの例において、異なる疾患は、自己免疫疾患であり、および／または非自己免疫性である類似する症状を呈する疾患である。いくつかの例において、自己免疫疾患は全身性エリテマトーデスであり、異なる自己免疫疾患は関節リウマチであり、複数の識別用ペプチドが、図７Ａに列記される１以上の配列モチーフおよび／または図７Ｂに列記される１以上のアミノ酸において１００％を超えて富化されていることが例示される。
【０００７】
いくつかの例において、自己免疫疾患は全身性エリテマトーデスであり、異なる非自己免疫疾患は変形性関節症であり、複数の識別用ペプチドが、図８Ａに列記される１以上の配列モチーフおよび／または図８Ｂに列記される１以上のアミノ酸において１００％を超えて富化されていることが例示される。
【０００８】
いくつかの例において、自己免疫疾患は全身性エリテマトーデスであり、異なる非自己免疫疾患は線維筋痛症であり、複数の識別用ペプチドが、図９Ａに列記される１以上の配列モチーフおよび／または図９Ｂに列記される１以上のアミノ酸において１００％を超えて富化されていることが例示される。
【０００９】
いくつかの例において、自己免疫疾患は全身性エリテマトーデスであり、異なる自己免疫疾患はシェーグレン症候群であり、複数の識別用ペプチドが、図１０Ａに列記される１以上の配列モチーフおよび／または図１０Ｂに列記される１以上のアミノ酸において１００％を超えて富化されていることが例示される。
【００１０】
いくつかの例において、自己免疫疾患は全身性エリテマトーデスであり、異なる疾患は、自己免疫性および非自己免疫性の類似する症状を呈する疾患の一群であり、複数の識別用ペプチドが、図５Ａに列記される１以上の配列モチーフおよび／または図５Ｂに列記される１以上のアミノ酸において１００％を超えて富化されていることが例示される。
【００１１】
いくつかの例において、該自己免疫疾患は全身性エリテマトーデスであり、異なる疾患は、自己免疫疾患、非自己免疫性である類似する症状を呈する疾患および健康な対照の一群であり、複数の識別用ペプチドが、図６Ａに列記される１以上の配列モチーフおよび／または図６Ｂに列記される１以上のアミノ酸において１００％を超えて富化されていることが例示される。
【００１２】
いくつかの例において、該方法、システムおよび装置は、全身性エリテマトーデスを有する対象からの結合シグナルを、健康な対象から得られた対照結合シグナルの組合せと比較することをさらに含み、該複数の識別用ペプチドが、図４Ａに列記される１以上の配列モチーフおよび／または図４Ｂに列記される１以上のアミノ酸において１００％を超えて富化されていることが例示される。
【００１３】
いくつかの例において、自己免疫疾患は関節リウマチ（ＲＡ）であり、該異なる疾患はＯＡであり、複数の識別用ペプチドが、図２２Ａに列記される１以上の配列モチーフおよび／または図２２Ｂに列記される１以上のアミノ酸において１００％を超えて富化されていることが例示される。
【００１４】
いくつかの例において、自己免疫疾患は関節リウマチ（ＲＡ）であり、該異なる疾患はＦＭであり、複数の識別用ペプチドが、図２３Ａに列記される１以上の配列モチーフおよび／または図２３Ｂに列記される１以上のアミノ酸において１００％を超えて富化されていることが例示される。
【００１５】
いくつかの例において、自己免疫疾患は関節リウマチ（ＲＡ）であり、該異なる疾患はＳＳであり、複数の識別用ペプチドが、図２４Ａに列記される１以上の配列モチーフおよび／または図２４Ｂに列記される１以上のアミノ酸において１００％を超えて富化されていることが例示される。
【００１６】
いくつかの例において、自己免疫疾患はＲＡであり、該異なる疾患は、自己免疫性および非自己免疫性の類似する症状を呈する疾患の一群であり、複数の識別用ペプチドが、図２１Ａに列記される１以上の配列モチーフおよび／または図２１Ｂに列記される１以上のアミノ酸において１００％を超えて富化されていることが例示される。
【００１７】
いくつかの例において、自己免疫疾患はＲＡであり、該異なる疾患は、自己免疫疾患、非自己免疫性である類似する症状を呈する疾患、および健康な対照の一群であり、複数の識別用ペプチドが、図２０Ａに列記される１以上の配列モチーフおよび／または図２０Ｂに列記される１以上のアミノ酸において１００％を超えて富化されていることが例示される。
【００１８】
いくつかの例において、該方法、装置、システムおよびキットは、ＲＡを有する対象からの結合シグナルを、健康な対象（ＨＣ）から得られた対照結合シグナルの組合せと比較することをさらに含み、複数の識別用ペプチドが、図１８Ａに列記される１以上の配列モチーフおよび／または図１８Ｂに列記される１以上のアミノ酸において１００％を超えて富化されていることが例示される。
【００１９】
いくつかの例において、該方法、装置、システムおよびキットは、ＳＬＥ、ＲＡ、ＦＭ、ＯＡ、ＳＳおよびＨＣの各々からのサンプルを互いに区別する結合シグナルを鑑別して、それぞれの病状を同時に区別する識別用ペプチドのマルチクラスセットを得ることをさらに組み合わせて含み、ここで、複数の識別用ペプチドが図３０Ａに列記される１以上の配列モチーフおよび／または図３０Ｂに列記される１以上のアミノ酸において１００％を超えて富化されていることが例示される。
【００２０】
本明細書中、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）および関節リウマチ（ＲＡ）を含む自己免疫疾患の少なくとも１つの候補バイオマーカーを同定するための方法、装置、システムおよびキットもまた記載されている。
【００２１】
さらに、本明細書中、自己免疫疾患の少なくとも１つの候補バイオマーカーを同定する方法、装置、システムおよびキットであって、該方法が、（ａ）ペプチドアレイを提供し、該ペプチドアレイについて自己免疫疾患を有することが分かっている複数の対照対象からの生物学的サンプルをインキュベートする工程；（ｂ）該対象からの生物学的サンプルにおいて抗体に結合した識別用ペプチドのセットを同定する工程、ここで、該識別用ペプチドのセットは、健康な対象由来のサンプルから自己免疫疾患を鑑別できる結合シグナルを表示する；（ｃ）識別用ペプチドセット内の各ペプチドを用いてプロテオームデータベースを検索する工程；（ｄ）識別用ペプチドセット内の各ペプチドを、ヒトプロテオームデータベース内の１以上のタンパク質にアライメントさせる工程；および、（ｅ）プロテオームデータベースから特定されたタンパク質のそれぞれについて関連性スコアおよび順位付け（ランキング）を取得する工程（ここで、同定されたタンパク質のそれぞれは、自己免疫疾患の候補バイオマーカーである）を含む、方法、装置、システムおよびキットも開示されている。
【００２２】
本明細書の記載の方法、装置、システムおよびキットのさらに他の態様において、該サンプルは血液サンプルである。いくつかの例において、血液サンプルは、全血、血漿または血清から選択される。他の例において、サンプルは血清サンプルである。さらに他の例において、サンプルは血漿サンプルである。さらに他の例において、サンプルは、乾燥血液サンプルである。さらに他の態様において、ペプチドアレイは、少なくとも５０，０００個の種々のペプチドを含む。ある態様において、該ペプチドアレイは、少なくとも３００，０００の種々のペプチドを含む。他の態様において、該ペプチドアレイは、少なくとも５００，０００の種々のペプチドを含む。さらに他の例において、ペプチドアレイは、少なくとも２，０００，０００の種々のペプチドを含む。さらに他の態様において、ペプチドアレイは、少なくとも３，０００，０００の種々のペプチドを含む。さらに他の例において、ペプチドアレイ上の種々のペプチドは、少なくとも５アミノ酸長である。さらに他の例において、ペプチドアレイ上の種々のペプチドは、５から１３アミノ酸長である。いくつかの他の例において、種々のペプチドは、２０個未満のアミノ酸から合成される。いくつかの他の例において、アレイ上の種々のペプチドは沈積（deposit）されている。さらに他の態様において、アレイ上の種々のペプチドはインサイチュで合成される。
【００２３】
引用による包含
本明細書に記載の全ての刊行物、特許文献および特許出願はいずれも、それぞれの刊行物、特許文献または特許出願が本明細書中に包含されることが、具体的かつ個別に引用により明示される場合と同じ程度に、引用により本明細中に包含される。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
図面の簡単な説明
本特許または特許出願書類は、少なくとも１つのカラーで作成された図面を含む。カラー図面(複数可）を含む本特許または特許出願公開公報のコピーは、請求により、および必要な料金の支払いに応じて、米国特許庁により提供される。
【００２５】
本発明の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に記載されている。本発明の特徴および利点は、本発明の原理が利用される例示的な態様を記載する以下の詳細な説明、および以下の添付図面の説明を参照することにより、よりよく理解され得る。
【００２６】
【図１】図１は、免疫シグネチャー（immunosignature）の抗体結合アレイペプチドの検出を示す。
【図２】図２は、開示される態様において使用するための例示的なペプチドアレイの概略図を示す。
【図３】図３は、５分割（５-fold）クロスバリデーション（交差検証）を用いるサポートベクターマシン（ＳＶＭ）プロセスを示す。
【図４】図４Ａおよび図４Ｂは、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）サンプルと健康なドナー（ＨＣ）サンプルとを区別する、ペプチド中に富むペプチドモチーフ（図４Ａ）およびアミノ酸（図４Ｂ）を示す。
【図５】図５Ａおよび図５Ｂは、ＳＬＥサンプルと、自己免疫性および非自己免疫性の類似する症状を呈する疾患である他の疾患群（Other AI+non-AI mimic）からのサンプルとを区別する、ペプチド中の富化されたペプチドモチーフ（図５Ａ）およびアミノ酸（図５Ｂ）を示す。
【図６】図６Ａおよび図６Ｂは、ＳＬＥサンプルと、他の自己免疫疾患、非自己免疫性の類似する症状を呈する疾患および健康な対照のサンプルである“Not SLE”サンプルとを区別する、ペプチド中の富化されたペプチドモチーフ（図６Ａ）およびアミノ酸（図６Ｂ）を示す。
【００２７】
【図７】図７Ａおよび図７Ｂは、ＳＬＥサンプルと、関節リウマチ（ＲＡ）群のサンプルとを区別する、ペプチド中の富化されたペプチドモチーフ（図７Ａ）およびアミノ酸（図７Ｂ）を示す。
【図８】図８Ａおよび図８Ｂは、ＳＬＥサンプルと、変形性関節症（ＯＡ）群のサンプルとを区別する、ペプチド中の富化されたペプチドモチーフ（図８Ａ）およびアミノ酸（図８Ｂ）を示す。
【図９】図９Ａおよび図９Ｂは、ＳＬＥサンプルと、線維筋痛症（ＦＭ）群のサンプルとを区別する、ペプチド中の富化されたペプチドモチーフ（図９Ａ）およびアミノ酸（図９Ｂ）を示す。
【図１０】図１０Ａおよび図１０Ｂは、ＳＬＥサンプルと、シェーグレン症候群（ＳＳ）群のサンプルとを区別する、ペプチド中の富化されたペプチドモチーフ（図１０Ａ）およびアミノ酸（図１０Ｂ）を示す。
【図１１Ａ】図１１Ａは、ＳＬＥサンプルと、健康なドナーからのサンプルとで有意に異なる抗体−結合シグナルを提示するボルケーノプロット可視化ライブラリーペプチドを示す。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、ＳＬＥサンプルと、“Other AI+non-AI mimic”群の対象のサンプルとで有意に異なる抗体−結合シグナルを提示するボルケーノプロット可視化ライブラリーペプチドを示す。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、“Not SLE”群の対象のサンプルとで有意に異なる抗体−結合シグナルを提示するボルケーノプロット可視化ライブラリーペプチドを示す。
【００２８】
【図１２】図１２は、コントラストそれぞれのボンフェローニ・カットオフ値をパスしたペプチドおよび全てのコントラストに共通する４７８個のペプチドの分布を示すベン図を示す（ここで、コントラストは、“NOT SLE”と示される、ＳＬＥ 対 他のＡＩ＋非ＡＩである類似する症状を呈する疾患＋健康；ＳＬＥ 対 健康；および、“Other AI”と示される、ＳＬＥ 対 他のＡＩ＋非ＡＩである類似する症状を呈する疾患である）。
【図１３】図１３は、ＳＬＥ健康なドナーアッセイにおける、識別インプットペプチドの数（部分、すなわちペプチドの数；ｘ軸）の関数としての９５％信頼区間（Ｙ軸）での５分割交差検証パフォーマンスのグラフを示す。
【図１４】図１４は、ＨＣ（Healthy）、他のＡＩ＋非ＡＩである類似する症状を呈する疾患（Other AI）、および“Not SLE”群、すなわち他のＡＩ＋非ＡＩである類似する症状を呈する疾患＋ＨＣからの、識別ＳＬＥサンプルにおけるアッセイ性能として、受容動作特性曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）を示す。各群において、左側のバーは、示された病状からＳＬＥのみを識別する性能を示し、右側のバーは、混合型ＳＬＥおよび他のＡＩサンプルの混合物を識別する性能を示す。
【図１５】図１５は、ＲＡ、シェーグレン症候群、ＯＡおよび線維筋痛症からのＳＬＥの鑑別診断のアッセイ性能を示す。
【図１６】図１６は、残りの他の混合物から、各疾患を同時に識別するマルチ識別器（multiclassifier）を用いたアッセイ性能を示す。
【図１７】図１７Ａ、図１７Ｂおよび図１７Ｃは、健康な対象（図１７Ａ）、他の自己免疫疾患または自己免疫疾患に類似する症状を呈する疾患（Other AI+non-AI mimic）を有する対象群（図１７Ｂ）、および他のＡＩ＋非ＡＩである類似する症状を呈する疾患＋ＨＣからのサンプルにより表される“Not SLE”群（図１７Ｃ）から、ＳＬＥを識別するペプチドにより同定される上位の候補バイオマーカーを示す。
【図１８】図１８Ａおよび図１８Ｂは、ＲＡサンプルと健康なドナー（ＨＣ）サンプルとを区別する、ペプチド中に富むペプチドモチーフ（図１８Ａ）およびアミノ酸（図１８Ｂ）を示す。
【００２９】
【図１９】図１９Ａおよび図１９Ｂは、ＲＡサンプルと他のリウマチ性疾患からのサンプルとを区別する、ペプチド中に富むペプチドモチーフ（図１９Ａ）およびアミノ酸（図１９Ｂ）を示す。
【図２０】図２０Ａおよび図２０Ｂは、ＲＡサンプルと他のＡＩ＋非ＡＩである類似する症状を呈する疾患＋ＨＣ（Ｃ）からのサンプルで示される“Not RA”群とを区別する、ペプチド中に富むペプチドモチーフ（図２０Ａ）およびアミノ酸（図２０Ｂ）を示す。
【図２１】図２１Ａおよび図２１Ｂは、ＲＡサンプルと他のＡＩ＋非ＡＩである類似する症状を呈する疾患群とを区別する、ペプチド中に富むペプチドモチーフ（図２１Ａ）およびアミノ酸（図２１Ｂ）を示す。
【図２２】図２２Ａおよび図２２Ｂは、ＲＡサンプルとＯＡ群のサンプルとを区別する、ペプチド中に富むペプチドモチーフ（図２２Ａ）およびアミノ酸（図２２Ｂ）を示す。
【図２３】図２３Ａおよび図２３Ｂは、ＲＡサンプルとＦＭ群のサンプルとを区別する、ペプチド中に富むペプチドモチーフ（図２３Ａ）およびアミノ酸（図２３Ｂ）を示す。
【図２４】図２４Ａおよび図２４Ｂは、ＲＡサンプルとＳＳ群のサンプルとを区別する、ペプチド中に富むペプチドモチーフ（図２４Ａ）およびアミノ酸（図２４Ｂ）を示す。
【００３０】
【図２５Ａ】図２５Ａは、ＲＡサンプルと、健康なドナー由来のサンプルとで有意に異なる抗体−結合シグナルを提示するボルケーノプロット可視化ライブラリーペプチドを示す。
【図２５Ｂ】図２５Ｂは、ＲＡサンプルと、“Other AI+non-AI mimic”群の対象のサンプルとで有意に異なる抗体−結合シグナルを提示するボルケーノプロット可視化ライブラリーペプチドを示す。
【図２５Ｃ】図２５Ｃは、ＲＡサンプルと“Not RA”群の対象のサンプルとで有意に異なる抗体−結合シグナルを提示するボルケーノプロット可視化ライブラリーペプチドを示す。
【図２６】図２６は、コントラストそれぞれのボンフェローニ・カットオフ値をパスしたペプチドおよび全てのコントラストに共通する４９１個のペプチドの分布を示すベン図を示す（ここで、コントラストは、“NOT RA”と示される、ＲＡ 対 他のＡＩ＋非ＡＩである類似する症状を呈する疾患＋健康；ＲＡ 対 健康；および、“Other AI”と示される、ＲＡ 対 他のＡＩ＋非ＡＩである類似する症状を呈する疾患である）。
【図２７】図２７は、ＨＣ、他のＡＩ＋非ＡＩである類似する症状を呈する疾患、および“Not RA”群、すなわち他のＡＩ＋非ＡＩである類似する症状を呈する疾患＋ＨＣからの、ＲＡサンプルの識別におけるアッセイパフォーマンスとして、受容動作特性曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）を示す。各群において、左側のバーは、示された病状からＲＡのみを識別する性能を示し、右側のバーは、混合型ＲＡおよび他のＡＩサンプルの混合物を識別する性能を示す。
【図２８】図２８は、ＳＬＥ、シェーグレン症候群、ＯＡおよび線維筋痛症からのＲＡの鑑別診断のアッセイ性能を示す。
【図２９】図２９Ａ、図２９Ｂおよび図２９Ｃは、健康な対象（図２９Ａ）、他の自己免疫疾患（他のＡＩ＋非ＡＩである類似する症状を呈する疾患）を有する対象群（図２９Ｂ）、および他のＡＩ＋非ＡＩである類似する症状を呈する疾患＋ＨＣからのサンプルにより表される“Not RA”群（図２９Ｃ）から、ＲＡを識別するペプチドにより同定される候補バイオマーカーを示す。
【００３１】
【図３０】図３０Ａおよび図３０Ｂは、ＳＬＥ、ＲＡ、ＦＭ、ＯＡ、ＳＳおよびＨＣを互いに同時に区別する、ペプチド中に富むペプチドモチーフ（図３０Ａ）およびアミノ酸（図３０Ｂ）を示す。
【図３１】図３１は、ＳＬＥ、ＲＡ、ＦＭ、ＯＡ、ＳＳおよびＨＣクラスの割り当ての確率を可視化するヒートマップを示す。各サンプルは、０（黒）から１００％（白色）の範囲の各疾患クラスの予測されたクラスメンバーシップを有する。
【図３２】図３２は、ＳＬＥサンプルと健康な（ＨＣ）群のサンプルとを区別する、上位の有意なペプチドを示す。
【図３３】図３３は、ＳＬＥサンプルと、他の自己免疫疾患および非自己免疫性の類似する症状を呈する疾患（Other AI+non-AI）群のサンプルとを区別する、上位の有意なペプチドを示す。
【図３４】図３４は、ＳＬＥサンプルと、Not SLE（Not SLE − 他のＡＩ＋非ＡＩである類似する症状を呈する疾患＋ＨＣ）群のサンプルとを区別する、上位の有意なペプチドを示す。
【図３５】図３５は、ＲＡサンプルと、健康な（ＨＣ）群のサンプルとを区別する、上位の有意なペプチドを示す。
【図３６】図３６は、ＲＡサンプルと、他の自己免疫疾患および非自己免疫性の類似する症状を呈する疾患（Other AI+non-AI）群のサンプルとを区別する、上位の有意なペプチドを示す。
【図３７】図３７は、ＲＡサンプルと、Not RA（Not RA = 他のＡＩ＋非ＡＩである類似する症状を呈する疾患＋ＨＣ）群のサンプルとを区別する、上位の有意なペプチドモチーフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
発明の詳細な説明
的確または正確な診断を受けることが時間的に困難な患者にとって、自己免疫障害などの免疫介在障害の発見および診断は困難である。多くの場合、患者は、これらの疾患に密接に関連する特徴のために他の自己免疫疾患と誤診されることがよくある。現在、自己免疫疾患または障害の発見および評価に利用できる信頼できるバイオマーカーは存在しない。
【００３３】
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）および関節リウマチ（ＲＡ）は、炎症および組織損傷をもたらす、身体の細胞および組織を攻撃し得る、自己免疫疾患の例である。ＳＬＥおよびＲＡの発現プロセスおよびメカニズムは十分に確立されていない。症状が類似しているため、これら２つの疾患の鑑別診断および処置は困難である。さらに、ＳＬＥまたはＲＡを有する患者は、同時に複数の疾患、すなわち自己免疫疾患になり得る重複疾患または病状、または疾患の症状が類似する非自己免疫性の疾患を有し得る。その結果、そのような疾患の正しい診断を得るには、数ヶ月または数年かかる場合がある。一般的に、病歴レビュー、複数の身体検査、多数の臨床検査、およびしばしばのスキャンの組み合わせが必要とされる。臨床的には、種々の血清マーカーを用いて臨床検査を実施することがある。しかしながら、該マーカーは非特異的であり、ＳＬＥおよびＲＡの鑑別診断、予測および疾患の活性評価におけるそれらの役割はよく知られていない。
【００３４】
本明細書に記載の態様は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）および関節リウマチ（ＲＡ）を含む自己免疫疾患の鑑別診断を提供する方法、装置、システムおよびキットに関する。本明細書に記載の態様は、自己免疫疾患を互いに、および自己免疫疾患に分類されないが、自己免疫疾患にしばしば関連する症状を呈する自己免疫疾患に類似する疾患から鑑別診断するために提供される。非自己免疫性の自己免疫疾患に類似する疾患／病状の限定されない例としては、変形性関節症および線維筋痛症が挙げられる。
【００３５】
本発明では、ペプチドアレイに結合する末梢血抗体の異なるパターンを識別する単一の非侵襲的スクリーニング法を用いて自己免疫障害（ＡＩ）の鑑別診断を可能にする方法、装置、システムおよびキットが提供される。ペプチドアレイに対する患者サンプルの異なる結合は、特異的結合パターン、すなわち、患者の健康状態、例えば自己免疫疾患の指標である免疫シグネチャー（ＩＳ）をもたらす。さらに、本明細書に記載の装置およびシステムは、生物学的サンプルの抗体に対する抗原または結合パートナーの同定を可能にし、それを標的化治療介入の候補バイオマーカーとして評価することができる。
【００３６】
一般的に、病状の免疫シグネチャー特性は、対象サンプルの１以上の異なるセットから得られる１以上の対照免疫シグネチャーと比較して決定され、ここで、各セットが、対照対象の１以上の群から得られ、各群が異なる病状、例えば異なる自己免疫疾患（ＡＩ）を有する。例えば、試験対象から得られた免疫シグネチャーは、異なるＡＩを有する対照対象、検査中のＡＩの症状に類似する非ＡＩ疾患または病状を有する対象、異なるＡＩおよび／または類似する病状を含む重複疾患を有する対象の免疫シグネチャーを比較することにより、試験対象のＡＩを同定する。従って、試験対象の免疫シグネチャーと対照対象の免疫シグネチャーとの比較は、ＡＩの鑑別診断を提供する。対照群は、健康な対象の群であってよく、その状態は本明細書中、健常と称される。
【００３７】
本明細書に記載の方法、装置、システムおよびキットは、ＡＩ疾患を有すると予期されるか、またはそれを有することが知られている対象集団内の異なる個体からのサンプルにおいて、例えば血液に、異なるＡＩ疾患の数を検出し得る。ある態様において、ＩＳは、既知のプロテオーム配列を表すのではなく、２０アミノ酸未満のアミノ酸の組み合わせの少なくとも一部の無作為のサンプリングを提供するように選択されたペプチドアレイに対する抗体結合の多様であるが再現可能なパターンに基づく。対象由来のサンプルにおいて抗体が結合したペプチドは、天然の標的配列ではないかもしれないが、その代わり、同族の天然エピトープの配列または構造を模倣していてよい。ある態様において、抗体により結合されるペプチドは、既知のプロテオーム配列と少なくとも部分的に同一、類似、またはそうでなければ関連していてよい。例えば、実施例１に記載のＩＳＴライブラリーのペプチドは、既知のプロテオームデータベースの９マーの配列と一致するものはない。可能な９マーのペプチド配列の数は、プロテオームデータベースにおける連続する９マーの配列の数よりも数桁大きいため、これは驚くことではない。従って、天然配列に正確に対応する模倣ペプチドの可能性は低い。抗体によって選択的に結合される各ＩＳペプチド配列は、抗体がインビボで認識したエピトープの機能的な代替物であり得る。結果として、抗体結合アレイペプチド配列の一部または全てを含むタンパク質の配列は、治療標的として評価できる候補タンパク質バイオマーカーを識別するのに役立つ。
【００３８】
一側面において、本方法は、自己免疫疾患、例えばＳＬＥまたはＲＡの鑑別診断法であって、（ａ）対象由来のサンプルを、少なくとも１０，０００個の種々のペプチドを含むペプチドアレイと接触させること；（ｂ）該アレイ上の少なくとも２５個のペプチドに対する該サンプルに存在する抗体の結合を検出して、結合シグナルの組合せを得ること；および、（ｃ）該結合シグナルの組合せを、１群またはそれ以上の対照結合シグナルの組合せと比較すること、ここで、該対照結合シグナルの組合せ群の少なくとも１つは、該対象の自己免疫疾患とは異なる疾患を有することが分かっている複数の対照対象から得られて、それにより該対象の自己免疫疾患の鑑別診断が可能となり、該方法のパフォーマンスは、自己免疫疾患と各対照結合シグナルの組合せ群との間で受容動作特性（ＲＯＣ）曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）が０．６より大きいことにより特徴付けられる、を含む方法を提供する。いくつかの例において、該方法、システムおよび装置は、（ｉ）鑑別用の対照結合シグナルの組合せを識別すること、ここで、該鑑別用の対照結合シグナルは、自己免疫疾患を有することが分かっている対照対象由来のサンプルを、自己免疫疾患とは異なる疾患を有することが分かっている対照対象由来のサンプルと区別し；および、（ｉｉ）識別用ペプチドの組合せを同定すること、ここで、該鑑別用の対照結合シグナルの組合せが、識別用ペプチドの組合せに対応する、をさらに含む。ある態様において、対照対象としては、異なるＡＩを有する対象、検査中のＡＩの症状に類似する非ＡＩ疾患または病状を有する対象、異なるＡＩおよび／または類似する病状を含む重複疾患を有する対象が挙げられる。他の態様において、対照対象は健康な対象である。ペプチドアレイは、固体表面上に沈積されるか、またはインサイチュウで合成され得る。ある態様において、該方法のパフォーマンスは、受容動作特性（ＲＯＣ）曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）が０．６より大きいことにより特徴付けられ得る。
【００３９】
いくつかの態様において、該方法は、ＡＩサンプル、例えばＳＬＥまたはＲＡを、異なる疾患を有することが分かっている１以上の対照対象から区別する鑑別用の対照結合シグナルの組合せを同定すること、および鑑別用の結合シグナルの組合せを提示するアレイペプチドの組合せ、すなわち識別用ペプチドを同定すること、ここで、鑑別用の対照結合シグナルの組合せは、識別用ペプチドの組合せに対応する、をさらに含む。鑑別用の結合シグナルの組合せは、対照サンプルから得られた対応する結合シグナルと比べてＡＩ疾患の存在下で、増減するシグナル、新たに追加されるシグナル、および／または失われるシグナルを含み得る。鑑別用の結合シグナルの組合せを提示するアレイペプチドは、識別用ペプチドとして知られている。アレイペプチドの言及に用いるとき、用語“識別する（discriminating）”は、本明細書中、“分類する（classifying）”と互換的に用いられる。ある態様において、鑑別用の対照結合シグナルの組合せは、アレイ上の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも２０００、少なくとも３０００、少なくとも４０００、少なくとも５０００、少なくとも６０００、少なくとも７０００、少なくとも８０００、少なくとも９０００、少なくとも１００００、少なくとも２００００、またはそれ以上の識別用ペプチドに対する結合シグナルの組合せを含む。例えば、１０，０００個のペプチドのアレイ上の少なくとも２５個のペプチドが、特定の条件の識別用ペプチドとして識別される。ある態様において、各鑑別用の結合シグナルの組合せは、少なくとも１０，０００個の種々のペプチドを含むペプチドのいくつかのアレイ上の少なくとも２５個のペプチドへの、複数の対照対象のそれぞれからの対照サンプルに存在する抗体の結合を検出することにより得られる。ある態様において、ペプチドはインサイチュウで合成される。ある態様において、識別用ペプチドは、アレイ基板上の少なくとも５，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも１５，０００、少なくとも２０，０００、少なくとも２５，０００、少なくとも５０，０００、少なくとも１００，０００、少なくとも２００，０００、少なくとも３００，０００、少なくとも４００，０００、少なくとも５００，００、少なくとも１，０００，０００、少なくとも２，０００，０００、少なくとも３，０００，０００、少なくとも４，０００，０００、少なくとも５，０００，０００、少なくとも１００，０００，０００、またはそれ以上の種々のペプチドのライブラリーを含むペプチドアレイに示差的に結合する抗体から同定される。
【００４０】
キット
別の側面において、キットは、自己免疫疾患、例えばＳＬＥまたはＲＡの鑑別診断を実施するために提供され、該キットは、ペプチドアレイと、対象由来のサンプルを該ペプチドアレイ上でアッセイし、該ペプチドアレイ上でシグナルを検出するための手段とを含み、（ａ）対象由来のサンプルを少なくとも１０，０００個の種々のペプチドを含むペプチドアレイに接触させること；（ｂ）該サンプルに存在する抗体の、該アレイ上の少なくとも２５個のペプチドに対する結合を検出して、結合シグナルの組合せを得ること；および、（ｃ)結合シグナルの該組合せを、対照結合シグナルの組合せの１以上の群と比較すること、ここで、対照結合シグナルの組合せの群の少なくとも１つは、対象の自己免疫疾患とは異なる疾患を有することが分かっている複数の対照対象から得られて、それ故に該対象の自己免疫疾患についての鑑別診断を可能にし、ここで、該キットのパフォーマンスは、自己免疫疾患と対照結合シグナルの組合せ群のそれぞれとの間の受容動作特性（ＲＯＣ）曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）が０．６より大きいことにより特徴付けられる、を含む。いくつかの例において、該キットは、（ｉ）鑑別用の対照結合シグナルの組合せを同定する手段、ここで、該鑑別用の対照結合シグナルは、自己免疫疾患を有することが分かっている対照対象由来のサンプルを、自己免疫疾患とは異なる疾患を有することが分かっている対照対象由来のサンプルと区別する；および、（ｉｉ）識別用ペプチドの組合せを同定する手段、ここで、該鑑別用の対照結合シグナルの組合せが、識別用ペプチドの組合せに対応する、をさらに含む。ある態様において、対照対象としては、異なるＡＩを有する対象、検査中のＡＩの症状に類似する非ＡＩ疾患または病状を有する対象、異なるＡＩおよび／または類似する病状を含む重複疾患を有する対象が挙げられる。他の態様において、対照対象は健康な対象が挙げられる。他の態様において、対照対象は健康な対象である。ペプチドアレイは、固体表面上に沈積されるか、またはインサイチュウで合成され得る。ある態様において、該キットのパフォーマンスは、受容動作特性（ＲＯＣ）曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）が０．６より大きいことにより特徴付けられ得る。
【００４１】
ある態様において、該キットは、ＡＩサンプル、例えばＳＬＥまたはＲＡを、異なる疾患を有することが分かっている１以上の対照対象から区別する鑑別用の対照結合シグナルの組合せを同定すること、および鑑別用の結合シグナルの組合せを提示するアレイペプチドの組合せ、すなわち識別用ペプチドを同定することをさらに含み、ここで、鑑別用の対照結合シグナルの組合せは、識別用ペプチドの組合せに対応する。鑑別用の結合シグナルの組合せは、対照サンプルから得られた対応する結合シグナルと比べてＡＩ疾患の存在下で、増減するシグナル、新たに追加されるシグナル、および／または失われるシグナルを含み得る。鑑別用の結合シグナルの組合せを提示するアレイペプチドは、識別用ペプチドとして知られている。アレイペプチドの言及に用いるとき、用語“識別する（discriminating）”は、本明細書中、“分類する（classifying）”と互換的に用いられる。ある態様において、鑑別用の対照結合シグナルの組合せは、アレイ上の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも２０００、少なくとも３０００、少なくとも４０００、少なくとも５０００、少なくとも６０００、少なくとも７０００、少なくとも８０００、少なくとも９０００、少なくとも１００００、少なくとも２００００、またはそれ以上の識別用ペプチドに対する結合シグナルの組合せを含む。例えば、１０，０００個のペプチドのアレイ上の少なくとも２５個のペプチドが、特定の条件の識別用ペプチドとして識別される。ある態様において、各鑑別用の結合シグナルの組合せは、少なくとも１０，０００個の種々のペプチドを含むペプチドのいくつかのアレイ上の少なくとも２５個のペプチドへの、複数の対照対象のそれぞれからの対照サンプルに存在する抗体の結合を検出することにより得られる。ある態様において、ペプチドはインサイチュウで合成される。ある態様において、識別用ペプチドは、アレイ基板上の少なくとも５，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも１５，０００、少なくとも２０，０００、少なくとも２５，０００、少なくとも５０，０００、少なくとも１００，０００、少なくとも２００，０００、少なくとも３００，０００、少なくとも４００，０００、少なくとも５００，００、少なくとも１，０００，０００、少なくとも２，０００，０００、少なくとも３，０００，０００、少なくとも４，０００，０００、少なくとも５，０００，０００、少なくとも１００，０００，０００、またはそれ以上の種々のペプチドのライブラリーを含むペプチドアレイに示差的に結合する抗体から識別される。
【００４２】
ある態様において、アレイ上の全ペプチド数の少なくとも０．００００５％、少なくとも．０００１％、少なくとも．０００５％、少なくとも．０００１％、少なくとも．００１％、少なくとも．００３％、少なくとも．００５％、少なくとも．０１％、少なくとも．０５％、少なくとも０．１％、少なくとも０．５％、少なくとも１％、少なくとも０．５％、少なくとも１．５％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％または少なくとも９０％が、識別用ペプチドである。他の態様において、アレイ上のペプチドは全て識別用ペプチドである。
【００４３】
結合アッセイ
対象の免疫シグネチャーを、アレイペプチドに結合する抗体の結合パターンとして特定する。ペプチドアレイに固定化されたペプチドに対してサンプル中の抗体が結合するのを促進する任意の適当な条件下で、サンプル、例えば血液、血漿または血清を該ペプチドアレイに接触させ得る。したがって、本発明の方法およびキットは、特別な種類の結合条件の使用によって限定されない。条件は、用いるアレイ、基材の種類、基材上に配置されたペプチドの密度、結合相互作用の所望の強度（ストリンジェンシー）、および結合液中の競合物の性質に応じて異なっていてよい。好ましい態様においては、条件は、アドレス可能（addressable）アレイから未結合抗体を除去する工程を含む。そのような工程の必要性、およびそのような工程に適当な条件を、当業者はその能力範囲内で決定することができる。
【００４４】
本明細書に記載の方法、装置、システムおよびキットにおいて、ＡＩに起因する免疫プロファイルを作製するためにアレイ上のペプチドに対するサンプル中の抗体の結合を検出するのに、任意の適当な検出技術を用いることができる。一態様において、放射性同位元素標識、蛍光標識、発光標識および電気化学標識（すなわち、異なる中点電極電位を有するリガンド標識；ここで、検出は、該ラベルの電位を検出することを含む）を包含するがそれに限定されない、任意の種類の検出可能なラベルを用いて、アレイ上のペプチドを標識し得る。あるいは、結合した抗体を、例えば、検出可能に標識された２次抗体を用いて検出することもできる。
【００４５】
検出可能標識からのシグナル検出は、当業者は十分にその能力の範囲内で行うことができる。例えば、基材上の電位を記録する機器として、蛍光アレイリーダーが当分野でよく知られている（電気化学的検出については、例えば、J. Wang (2000) Analytical Electrochemistry, Vol., 2nd ed., Wiley--VCH, New Yorkを参照のこと）。結合相互作用は、ＳＰＲおよび質量分析などの標識を用いない他の方法によって検出することもできる。ＳＰＲは、解離定数および解離速度の測定を提供し得る。例えば、Ａ−１００ Ｂｉｏｃｏｒｅ／ＧＥ機器は、この種の解析に適当である。ＦＬＥＸチップを、同じ基材上の４００までの結合反応に使用することができる。
【００４６】
あるいは、サンプル中の抗体とアレイ上のペプチドとの間の結合相互作用は、競合フォーマットで検出することもできる。結合の競合阻害剤の存在下と不存在下とでの、サンプルに対するアレイの結合プロファイルの相違が、該サンプルの特徴付けに有用であり得る。
【００４７】
分類アルゴリズム
抗体結合シグナルデータの解析、すなわち免疫シグネチャー解析（ＩＳ）、およびそれにより導かれる鑑別診断は、一般的に、種々のコンピュータアルゴリズムおよびプログラムを用いて行われる。１次抗体に結合した標識された２次抗体によって示される抗体結合パターンが、例えばレーザースキャナの使用によりスキャンされる。スキャナによって得られた結合シグナルの画像はインポートされ、例えばGenePix Pro 8ソフトウェア（Molecular Devices, Santa Clara, CA）などのソフトウェアを用いて処理されて、各ペプチドについて表形式の情報（tabular information）が、例えば０〜６５，５３５の範囲の連続する値で提供され得る。表形式データはインポートされ、統計学的な解析が、例えば統計分析用のＲ言語および環境（R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. URL https://www.R-project.org/）などを用いて実施され得る。
【００４８】
対照対象、例えば健康な対象から得られたサンプルと、異なる疾患を有する対象から得られたサンプルとの間で、異なるシグナルパターンを示すペプチド、すなわち識別用ペプチドを、既知の統計学的検定法、例えばスチューデントのｔ検定またはＡＮＯＶＡを用いて特定することができる。統計解析を適用して、所定のストリンジェンシーレベルで異なる条件を区別する識別ペプチドを選択する。いくつかの態様において、ほとんどの識別用ペプチドのリストは、それらのｐ値のような統計的手段によりペプチドをランク付けすることにより得られる。例えば、識別用ペプチドは、０から１の間のｐ値を有するものとしてランク付けおよび識別できる。ｐ値のカットオフは、いくつかの依拠したまたは独立した統計検定が単一のデータセットで同時に実行されている場合を考慮して、さらに調整できる。たとえば、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正を用いると、単一のデータセットに対して複数のペアワイズ検定が実行される場合に、誤検知が発生する可能性を減らすことができる。修正は、アレイライブラリーのサイズに依存する。いくつかの態様において、識別を決定するためのカットオフＰ−値が、１０−２０未満、１０−１９未満、１０−１８未満、１０−１７未満、１０−１６未満、１０−１５未満、１０−１４未満、１０−１３未満、１０−１２未満、１０−１１未満、１０−１０未満、１０−９未満、１０−８未満、１０−７未満、１０−６未満、１０−５未満、１０−４未満、１０−３未満または１０−２未満に調整され得る。調整は、アレイライブラリーのサイズに依存する。あるいは、識別用ペプチドはランク付けされず、同定された識別用ペプチドのすべてまで表示された結合シグナル情報を用いて、条件、例えばサンプルの血清学的状態を分類する。
【００４９】
次いで、統計学的解析によって選択された識別用ペプチドの結合シグナル情報を機械学習アルゴリズムにインポートして、抗体プロファイルデータを精度、感度および特異度で分類する統計的または機械的モデル、すなわち識別器（classifier）を得て、サンプルの血清学的状態、および本明細書中に記載する他の適用を決定することができる。多くのコンピュータアルゴリズムのいずれか１つをその分類目的に利用することができる。
【００５０】
識別器は、ルールに基づき得るか、または演算的に有能（computationally intelligent）であり得る。さらに、演算知能分類アルゴリズムは、教師あり学習（supervised）あり、または教師あり学習なしであってよい。基礎的な分類アルゴリズムである線形判別分析（ＬＤＡ）が、２以上の疾患クラスを分類するために生物医学的データの解析に用いられ得る。例えば、ＬＤＡが、分類アルゴリズムでありうる。より複雑な分類法であるサポートベクターマシン（ＳＶＭ）は、数学的カーネルを用いて、元の予測因子をより高次元の空間に射影して、クラスに従ってサンプルを最適に分離する超平面を識別する。いくつかの一般的なカーネルは、線形、多項式、シグモイドまたは放射基底関数を含む。当技術分野で知られる一般的な識別器の比較研究が、Kukreja et al, BMC Bioinformatics. 2012; 13: 139に記載されている。抗体結合プロファイルのデータに基づくデータ解析および予測モデリングのための他のアルゴリズムとしては、Naive Bayes Classifiers、Logistic Regression、Quadratic Discriminant Analysis、K-Nearest Neighbors (KNN)、K Star、Attribute Selected Classifier (ACS)、Classification via clustering、Classification via Regression、Hyper Pipes、Voting Feature Interval Classifier、Decision Trees、Random Forest、およびディープラーニングアプローチを含むNeural Networksが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５１】
いくつかの態様において、サンプルの訓練セットから抗体結合プロファイルを得て、それを、ＳＶＭ解析に基づく削減（elimination）アルゴリズムの適用によって、識別能の高いペプチド組み合わせを識別するために用いる。統計的有意性のレベルによってランク付けされた様々な数のインプットペプチドを用いたアルゴリズムの精度を、交差検証によって決定することができる。実行可能な（feasible）数の識別用ペプチドの抗体結合プロファイルを作製および評価するために、複数の識別用ペプチドを用いて複数のモデルを構築し、最も性能の高いモデルを特定することができる。この方法はペプチドの数を制限することを除外しないが、この方法では、利用可能なペプチド結合情報、例えば結合シグナルの全てまたは実質的に全てを活用することができる。従って、この方法は、結合目的でその配列を利用できるペプチドを先験的に決定しようとするアプローチとは対照的である。いくつかの態様において、最大でアレイ上の全てのペプチドが識別ペプチドである。いくつかの態様において、ある特定の疾患分類モデルの訓練のために、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも７５０、少なくとも１０００、少なくとも１５００、少なくとも２０００、少なくとも３０００、少なくとも４０００、少なくとも５０００、少なくとも６０００、少なくとも７０００、少なくとも８０００、少なくとも９０００、少なくとも１０，０００、少なくとも１１，０００、少なくとも１２，０００、少なくとも１３，０００、少なくとも１４，０００、少なくとも１５，０００、少なくとも１６，０００、少なくとも１７，０００、少なくとも１８，０００、少なくとも１９，０００、少なくとも２０，０００、またはそれ以上の識別用ペプチドを用いる。いくつかの態様において、アレイ上のペプチド総数の少なくとも０．００００１％、少なくとも０．０００１％、少なくとも０．０００５％、少なくとも０．００１％、少なくとも０．００５％、少なくとも０．０１％、少なくとも０．０５％、少なくとも０．１％、少なくとも０．５％、少なくとも１．０％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％が識別用ペプチドであり、対応する結合シグナル情報を、ある特定の疾患分類モデルの訓練のために用いる。いくつかの態様において、アレイ上のペプチドすべてのシグナル情報を、病状特異的モデルの訓練のために用いる。
【００５２】
種々の数の識別用ペプチドを含む複数のモデルを作製することができ、各モデルのパフォーマンスを交差検証法によって評価することができる。ＳＭＶ識別器を訓練し、訓練サンプルセットの各サンプルを複数の交差検証群の１つに割り当てることにより交差検証することができる。例えば５分割交差検証のためには、各サンプルを４つの交差検証群の１つに、各群が被験および対照（すなわち参照）サンプルを含むように割り当て、交差検証群の１つ、例えば群１を抜き出し、群２〜４のサンプルを用いて、ＳＶＭ識別器モデルを訓練する（図３）。訓練群中の被験ケース（test case）および対照サンプルを識別するペプチドを解析し、例えば統計的ｐ値によってランク付けする。そして、上位κ個のペプチドをＳＶＭモデルのための予測因子として用いる。インプット予測因子の数とモデルのパフォーマンスとの関係を明らかにするため、およびオーバーフィッティングの防止のために、κ、例えば２５、５０、１００、２５０、１０００、２００、３０００またはそれ以上の上位ペプチド範囲でサブループ（sub=loop）を繰り返す。群２〜４を用いて作製されたモデルを用いて、群１のサンプルの予測、すなわち分類を行う。４群のそれぞれに対してモデルを作製し、真の疾患サンプルのシグナル結合データを用いた４モデルからのすべての予測を用いてパフォーマンス（ＡＵＣ、感度および／または特異度）を計算する。交差検証工程は、少なくとも１００回繰り返し、平均パフォーマンスを例えば９５％の信頼区間に対して計算する。例えばインプットペプチドの数に対するモデルのパフォーマンスを用いて、診断の可視化を行い得る。
【００５３】
識別インプットペプチドのセット（識別能の高いκのペプチドのリスト）に対する抗体結合の情報に基づく最適なモデル／識別器を、被験セットの疾患状態を予測するために選択し用いる。異なる識別器のパフォーマンスを、検証セットを用いて、および被験サンプルセットを用いて決定し、最もパフォーマンスの良いモデルから、パフォーマンス特性、例えば精度、感度、特異度および受容動作特性（ＲＯＣ）曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）を得る。ある態様において、異なる識別用ペプチドセットが、異なる状態の識別のために特定される。したがって、識別能の高いインプットペプチドのセットに基づく最適モデル／識別器が、各ＡＩ患者に対して鑑別診断を提供するために確立される。
【００５４】
病状の分類
ある態様において、個々の二項分類器（binary classifier）は、異なる疾患に対して相対的にＡＩを鑑別診断するために得られ得る。例えば、実施例３に示すように、識別用ペプチドの組合せに基づく最適な識別器は、異なるＡＩを有する対照対象、非ＡＩ疾患または検査中のＡＩの症状に類似する病状を有する対象、異なるＡＩおよび／またはＡＩに類似する病状を含む重複疾患を有する対象から、ＳＬＥを鑑別診断するために選択される。
【００５５】
実施例２において、識別用ペプチドを、表１に示すように、ＳＬＥを有する対象からのサンプルと異なる対象群からの対照サンプルとを区別することによりＳＬＥの鑑別診断を提供するために決定した。
【００５６】
識別用ペプチドの組合せの特徴には、１以上のアミノ酸の存在率、および／または同定された識別用ペプチドに存在する特定の配列モチーフの存在率が含まれる。アミノ酸およびモチーフの含有量の増加は、アレイライブラリーのすべてのペプチドの対応するアミノ酸およびモチーフの総量に対応する。ある態様において、ＡＩを有することが分かっているか、またはＡＩであると予期される対象と、異なる疾患を有する対照対象とを区別する免疫シグネチャー結合パターンの識別用ペプチドは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０の異なるアミノ酸が富化されていてよい。ある態様において、識別用ペプチドにおけるアミノ酸の富化は、すべてのライブラリーペプチドに存在するアミノ酸のそれぞれの総量に対して、１００％を超える、１２５％を超える、１５０％を超える、１７５％を超える、２００％を超える、２２５％を超える、２５０％を超える、２７５％を超える、３００％を超える、３５０％を超える、４００％を超える、４５０％を超える、または５００％を超える富化であり得る。
【００５７】
同様に、ある態様において、ＡＩ疾患を有する対象と、異なる疾患を有する対照対象とを区別する免疫シグネチャー結合パターンの識別用ペプチドは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０の異なる配列モチーフが富化されていてよい。配列モチーフの富化は、すべてのライブラリーペプチドに存在するモチーフのそれぞれの総量に対して、少なくとも１つのモチーフで、１００％を超える、１２５％を超える、１５０％を超える、１７５％を超える、２００％を超える、２２５％を超える、２５０％を超える、２７５％を超える、３００％を超える、３５０％を超える、４００％を超える、４５０％を超える、または５００％を超える富化であり得る。
【００５８】
富化されたモチーフを、有意なペプチドのリストから同定したが、ここで、該リストは１００ペプチド長未満のものではなく、その場合、ウェルチのｔ検定によるｐ値に基づく上位５００のペプチドを用いた。富化があるかどうかを調べるために、このペプチドリストにおける種々のｎ−ｍｅｒを、総ライブラリーにおける同サイズのｎ−ｍｅｒと比較した。該リスト中に、あるモチーフ（例えばＡＢＣＤ）が現れる回数を、該ライブラリー中に現れる該モチーフ（ＡＢＣＤ）の回数で除して決定することにより、富化比（fold enrichment）を計算する。その値を、該ライブラリーにおける該モチーフタイプ（例えば、テトラマー）出現の相対的回数（すなわち、リスト中のすべてのテトラマーの総数を、ライブラリー中のテトラマーの総数で除したもの）によって、さらに除する。富化比（Ｅ）の計算式を、次のように表すことができる：
Ｅ＝（ｍ／Ｍ）／（ｔ／Ｔ）
［式中、ｍは、識別用ペプチドリストの一部としてのモチーフの出現回数であり；Ｍは、ライブラリーにおけるモチーフ出現総回数であり；ｔは、リストにおけるモチーフタイプの出現回数であり；Ｔは、ライブラリーにおける該モチーフの出現回数である。］
富化比は、富化パーセント、すなわち「富化値」に１００を乗じた値として表すこともできる。
【００５９】
ある態様において、ＡＩ疾患はＳＬＥであり、ＳＬＥを有する対象からのサンプルと、異なる自己免疫疾患、非自己免疫疾患、健康な対象（ＨＣ）を含む状態を有する対象からのサンプル、他の自己免疫疾患を有する対象および非自己免疫性の自己免疫疾患に類似する疾患を有する対象を含む混合集団（混合群に健康な対象を含む、および除く）からのサンプルとを区別する識別用ペプチドは、図４Ａ、図５Ａ、図６Ａ、図７Ａ、図８Ａ、図９Ａおよび図１０Ａに示すように１以上のモチーフが富化されている。他の態様において、ＡＩ疾患はＲＡであり、ＲＡを有する対象からのサンプルと、異なる自己免疫疾患、非自己免疫疾患、健康な対象（ＨＣ）を含む状態を有する対象からのサンプル、他の自己免疫疾患を有する対象および非自己免疫性の自己免疫疾患に類似する疾患を有する対象を含む混合集団（混合群に健康な対象を含む、および除く）からのサンプルとを区別する識別用ペプチドは、図１８Ａ、図１９Ａ、図２０Ａ、図２１Ａ、ＦＩＧ、２２Ａ、図２３Ａおよび図２４Ａに示されるように１以上のモチーフが富化されている。１以上のアミノ酸モチーフの富化は、アレイライブラリー中の全てのペプチドの対応するモチーフの総量に対して、１００％を超える、１２５％を超える、１５０％を超える、１７５％を超える、２００％を超える、２２５％を超える、２５０％を超える、２７５％を超える、３００％を超える、３５０％を超える、４００％を超える、４５０％を超える、または５００％を超える富化であり得る。
【００６０】
ある態様において、ＡＩ疾患はＳＬＥであり、ＳＬＥを有する対象からのサンプルと、異なる自己免疫疾患、非自己免疫疾患、健康な対象（ＨＣ）を含む状態を有する対象からのサンプル、他の自己免疫疾患を有する対象および非自己免疫性の自己免疫疾患に類似する疾患を有する対象を含む混合集団（混合群に健康な対象を含む、および除く）からのサンプルとを区別する識別用ペプチドは、図４Ｂ、図５Ｂ、図６Ｂ、図７Ｂ、図８Ｂ、図９Ｂおよび図１０Ｂに示すように１以上のアミノ酸が富化されている。他の態様において、ＡＩ疾患はＲＡであり、ＲＡを有する対象からのサンプルと、異なる自己免疫疾患、非自己免疫疾患、健康な対象（ＨＣ）を含む状態を有する対象からのサンプル、他の自己免疫疾患を有する対象および非自己免疫性の自己免疫疾患に類似する疾患を有する対象を含む混合集団（混合群に健康な対象を含む、および除く）からのサンプルとを区別する識別用ペプチドは、図１８Ｂ、図１９Ｂ、図２０Ｂ、図２１Ｂ、ＦＩＧ、２２Ｂ、図２３Ｂおよび図２４Ｂに示すように１以上のアミノ酸が富化されている。１以上のアミノ酸の富化は、アレイライブラリー中の全てのペプチドの対応するアミノ酸の総量に対して、１００％を超える、１２５％を超える、１５０％を超える、１７５％を超える、２００％を超える、２２５％を超える、２５０％を超える、２７５％を超える、３００％を超える、３５０％を超える、４００％を超える、４５０％を超える、または５００％を超える富化であり得る。
【００６１】
アミノ酸およびモチーフの量の富化は、アレイライブラリーのすべてのペプチドの対応するアミノ酸およびモチーフの総量に対する。ある態様において、本明細書に記載の方法およびアレイを用いて対象のＡＩ疾患を鑑別診断または検出する際に、ＡＩ疾患を有する対象と異なる疾患を有する対象群とを区別する免疫シグネチャー結合パターンの識別用ペプチドは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０の異なるアミノ酸が富化されている。
【００６２】
アッセイパフォーマンス
ある態様において、ＡＩを鑑別診断するための得られた方法のパフォーマンスは、受容動作特性の曲線下面積によって特徴付けられる。分類の特異度、感度および精度基準が、曲線下面積によって決定され得る。健康状態が別の方法によって既に知られている複数の患者に適用される場合の方法のパフォーマンスまたは精度は、０．９０を上回る受容動作特性曲線下面積により特徴付けられる。他の態様においては、本方法のパフォーマンスは、受容動作特性曲線下面積が０．７０を上回り、０．８０を上回り、０．９０を上回り、０．９５を上回ること、受容動作特性曲線下面積が０．９７を上回ること、受容動作特性曲線下面積が０．９９を上回ることにより特徴付けられる。他の態様においては、本方法のパフォーマンスは、受容動作特性曲線下面積が０．６０〜０．６９、０．７０〜０．７９、０．８０〜０．８９、または０．９０〜１．０の範囲であることにより特徴付けられる。さらに別の態様においては、方法のパフォーマンスは、感度、特異度、および／または精度によって表される。
【００６３】
ある態様において、本方法は、少なくとも６０％、例えば６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の感度を有する。
【００６４】
他の態様において、本方法は、少なくとも６０％、例えば６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の特異度を有する。
【００６５】
ある態様において、本方法は、少なくとも６０％、例えば６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の精度を有する。
【００６６】
候補バイオマーカーの同定
本発明の方法および装置にしたがって、得られた免疫シグネチャーは、ＡＩ疾患の鑑別診断のために候補治療ターゲットを特定すること、疾患の活性をモニタリングすること、および個体のために、特定されたＡＩ疾患に対する治療法を開発することを含む複数の用途において使用され得る。ある態様において、ペプチドアレイ上に抗体レパートリーを適用し（免疫シグネチャー；ＩＳ）、ＡＩ疾患、例えばＳＬＥを有する対象由来のサンプルを、異なる疾患、例えばＲＡを有する対象由来のサンプルと比較することにより、有益な（informative）識別用ペプチドを特定して、抗体によって認識（すなわち結合）されるタンパク質を明らかにすることができる。
【００６７】
例えば、ペプチドを、インフォマティクスの方法で同定することができる。例えばエピトープが途切れている場合に、インフォマティクスによって推定マッチを同定できない場合は、情報を与えるペプチドを親和性試薬として用いることにより、反応性の抗体を精製することができる。次いで、精製された抗体を標準的な免疫学的手法に用いて、標的を同定することができる。
【００６８】
ＡＩ、例えばＳＬＥが鑑別診断されたら、サンプル中の抗体が結合した識別用ペプチドの配列を、適当な参照プロテオームに対して、クエリーにより関連付けることができる。ある態様において、識別された識別用ペプチドを用いてクエリーの対象とし得るプロテオームは、２０１６年３月１０日編集のヒトゲノムbuild GrCh38 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/)に相当する、ヒトプロテオームRefSeq release 84である。さらに、クエリーの対象とし得る他のタンパク質蓄積リスト（compilations）としては、疾患関連タンパク質のリスト、知られているか、または未知の突然変異（一塩基多形、挿入、置換および欠失を包む）を含むタンパク質のリスト、知られているか、または未知のスプライスバリアントからなるタンパク質のリスト、あるいは（天然および非天然アミノ酸を含む）コンビナトリアルライブラリー由来ペプチドまたはタンパク質のリストが挙げられるが、それらに限定されない。
【００６９】
プロテオームまたはタンパク質リストに対して単一または複数のタンパク質をアラインするためのソフトウェアとしては、BLAST、CS-BLAST、CUDAWS++、DIAMOND、FASTA、GGSEARCH (GG または GL)、Genoogle、HMMER、H-suite、IDF、KLAST、MMseqs2、USEARCH、OSWALD、Parasail、PSI-BLAST、PSI_Protein、Sequilab、SAM、SSEARCH、SWAPHI、SWIMM、およびSWIPEが挙げられるが、それらに限定されない。
【００７０】
あるいは、アレイ上のペプチドライブラリー全体中のモチーフとの対比で識別用ペプチドにおいて富化された配列モチーフを、プロテオームに対してアライメントして、ターゲットタンパク質を特定し、疾患の処置のための治療ターゲットとしての可能性を評価することができる。タンパク質ドメイン、ファミリーおよび機能部位を同定するためのオンラインデータベースおよび検索ツール、例えばExPASyのProsite、Motif Scan (MyHits, SIB, Switzerland)、Interpro 5、MOTIF (GenomeNet, Japan)、およびPfam (EMBL-EBI)が利用可能である。
【００７１】
ある態様において、アラインメント法は、クエリー配列のアミノ酸をより長いタンパク質配列上にマッピングするための任意の方法、例えばＢＬＡＳＴ(Altschul, S.F. & Gish, W. [1996] “Local alignment statistics.” Meth. Enzymol. 266:460-480)、組成の置換およびスコア行列の使用、ギャップを考慮する、および考慮しない正確なマッチング、エピトープ予測、抗原性予測、疎水性予測、表面アクセス可能性予測であり得る。各アプローチのために、標準のスコアリングシステム、またはペプチドライブラリー組成におけるバイアスを補正するのに適するように改変されたスコアリングシステムを使用し得る。いくつかの態様においては、アレイのアミノ酸組成を反映するよう改変されたスコアアトリックスBLOSUM62 (Henikoff, J.G. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10915-10919 [1992])を用いる、ギャップペナルティ４で３アミノ酸のシードを要する、改変ＢＬＡＳＴアラインメントが用いられる（States et al.、Methods 3:66-70 [1991]）。これらの改変は、類似の置換のスコアを高めること、アレイに存在しないアミノ酸に対するペナルティを除くこと、およびすべての正確なマッチに同等のスコアを与えることを含む。
【００７２】
本発明の方法に従って候補バイオマーカータンパク質を同定するために使用し得る識別用ペプチドは、２以上の異なる健康状態を区別するその能力に応じて選択される。本明細書中に記載されるように、識別用ペプチドは、２以上の状態間の識別可能性に関して、予め決定された統計学的ストリンジェンシーで、例えばｐ値によって；２以上の状態間の相対的結合シグナル強度変化の差によって；単一の状態におけるその強度順位によって；２以上の状態に対して訓練された機械学習モデルにおけるその係数、例えばＡＵＣによって；または、１以上の試験パラメーターとのその相関性、例えば決定係数（R squared）、スピアマンの相関係数（Spearman correlation）によって、選択され得る。ある態様において、１以上の候補バイオマーカーを同定するために選択される識別用ペプチドは、ｐ値がｐ＜１Ｅ−０３、ｐ＜１Ｅ−０４、またはｐ＜１Ｅ−０５を有するものとして選択される。
【００７３】
本明細書中に記載されるＡＩ疾患の鑑別診断のための識別用ペプチドのセットを特定したら、該識別用ペプチドを、１以上の病原体プロテオームにアライメントさせ、正のＢＬＡＳＴスコアを有するペプチドを特定する。識別用ペプチドがアラインされるタンパク質の各々について、アラインメントにおいてＢＬＡＳＴが正であるペプチドのスコアを、行列（matrix）、例えば、行列の各行がアラインしたペプチドに対応し、各列（カラム）がタンパク質を構成する連続するアミノ酸の１つに対応する、改変ＢＬＯＳＵＭ６２に組み込む。行列の各行は、アラインしたペプチドに対応し、各列は、タンパク質の１アミノ酸に対応し、タンパク質に対するアラインメントを可能にするためのギャップおよび欠失がペプチドの行内に含まれ得る。
【００７４】
上記の改変ＢＬＡＳＴスコア行列を用いて、行列の各位置を、その列のペプチドおよびタンパク質の対応するアミノ酸のスコアで埋める。そして、タンパク質の各アミノ酸について、対応する列を合計して、識別用ペプチドによるタンパク質における位置での該アミノ酸の包含を示すアミノ酸“オーバーラップスコア”を得る。
【００７５】
次いで、アミノ酸オーバーラップスコアは、アレイライブラリーの組成、すなわち、そのアミノ酸含量について補正される。例えば、２０個の天然アミノ酸の１つまたはそれ以上を除くライブラリーアレイペプチドを考慮して補正される。このスコアをライブラリー組成について補正するために、アミノ酸オーバーラップスコアを、すべてのアレイペプチドのリストについて同じ方法で計算する。これにより、各アミノ酸位置での識別用ペプチドに基づくペプチドオーバーラップ差分スコア「ｓｄ」が次式で計算される：
ｓｄ＝ａ−（ｂ／ｄ）＊ｃ
［式中、“ａ”は、識別用ペプチドからのオーバーラップスコアであり、“ｂ”は免疫シグネチャー識別用ペプチドの数であり、“ｃ”は、完全なペプチドアレイのオーバーラップスコアであり、そして“ｄ”は、完全なアレイ上のライブラリーペプチドの数である。］
【００７６】
次いで、識別用ペプチドのアライメントによって得たアミノ酸オーバーラップスコアを、タンパク質スコア「Ｓｄ」に変換する。アミノ酸レベルのスコア「ｓｄ」を完全タンパク質統計値「Ｓｄ」に変換するために、タンパク質内のあらゆる可能なはめ込み(tiling) n-merエピトープのスコアの合計を計算し、その最終スコアは、各タンパク質のn-mer（式中、ｎが２０である等）のこのローリングウィンドウに沿った最大値である。ある態様において、スコアは、はめ込み10-merエピトープ、15-merエピトープ、20-merエピトープ、25-merエピトープ、30 merエピトープ、35-merエピトープ、40-merエピトープ、45-merエピトープ、または50-merエピトープについて得られる。タンパク質スコア「Ｓｄ」は、ローリングウィンドウに沿って得られる最大スコアである。ある態様において、n-merは、全長タンパク質と相関し、すなわち、識別用ペプチドを、タンパク質配列全体にアライメントさせる。あるいは、スコアは、ペプチド配列をタンパク質配列全体にアライメントさせることにより得られる。
【００７７】
特定された候補バイオマーカーの順位付けを、ランダムに選択された非識別用ペプチドの順位付けに対して行う。したがって、同じプロテオームまたはタンパク質リストの１以上のタンパク質のそれぞれにアライメントした非識別用ペプチドのオーバーラップスコア（非識別ランダム‘ｓｒ’スコア）を、識別用ペプチドについて説明したようにして得る。ランダムペプチドについてアミノ酸オーバーラップスコアが計算され、続いてペプチドライブラリーのアミノ酸含有量について補正されて、非識別またはランダムｓｒスコアが得られる。非識別「ｓｒ」スコアを、次いで、ランダムに選択された複数の非識別用ペプチドのそれぞれについての非識別タンパク質‘Ｓｒ’スコアに変換する。例えば、少なくとも２５個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも１５０個、少なくとも２００個またはそれ以上のランダムに選択された非識別用ペプチドについて、非識別用タンパク質‘Ｓｒ’スコアを得ることができる。ある態様において、最終タンパク質スコアである、ランダムに選択された識別用ペプチドのＳｒスコアを、タンパク質スコアＳｄを得るために用いられる同等数の識別用ペプチドを用いて計算できる。他の態様において、Ｓｄを決定するために用いられる識別用ペプチドの数の少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％を、非識別タンパク質‘Ｓｒ’スコアを決定するために用いる。
【００７８】
ある態様において、候補タンパク質バイオマーカーは、非識別用ペプチドのアラインメントにより同定されたタンパク質のＳｒスコアに対するそれらのＳｄスコアにより順位付けされる。ある態様において、順位は、ｐ値に従って決定され得る。トップ候補バイオマーカーは、１０−３未満、１０−４未満、１０−５未満、１０−６未満、１０−７未満、１０−８未満、１０−９未満、１０−１０未満、１０−１２未満、１０−１５未満、１０−１８未満、１０−２０未満、またはそれ以下のｐ値を有するものとして選択され得る。ある態様において、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１２０、少なくとも１５０、少なくとも１８０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも５００、またはそれ以上の候補バイオマーカーが、本発明の方法により特定される。
【００７９】
他の態様において、候補バイオマーカーは、上記のn-merエピトープに複数の識別用ペプチドをはめ込んで、病原体のプロテオームの最大Ｓｄスコアを有するタンパク質のパーセントとして候補バイオマーカーの数を選択することにより得たＳｄスコアに従って選択される。ある態様において、候補バイオマーカーは、最高の順位Ｓｄスコアを有し、病原体のプロテオームの総タンパク質数の少なくとも０．０１％を含むタンパク質である。他の態様において、候補バイオマーカーは、最高の順位Ｓｄスコアを有し、病原体のプロテオームの総タンパク質数の少なくとも０．０２％、少なくとも０．０３％、少なくとも０．０４％、少なくとも０．０５％、少なくとも０．１％、少なくとも０．１５％、少なくとも０．２％、少なくとも０．２５％、少なくとも０．３％、少なくとも０．３５％、少なくとも０．４％、少なくとも０．４５％、少なくとも０．５％、少なくとも０．５５％、少なくとも０．６％、少なくとも０．６５％、少なくとも０．７％、少なくとも０．７５％、少なくとも０．８％、少なくとも０．８５％、少なくとも０．９％、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、またはそれ以上を含むタンパク質である。
【００８０】
ある態様において、方法またはキットは、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）についての少なくとも１個の候補タンパク質バイオマーカーを特定するために提供され、該方法は、（ａ）ペプチドアレイを提供し、該ペプチドアレイについて全身性エリテマトーデスを有することが分かっている複数の対照対象からの生物学的サンプルをインキュベートすること；（ｂ）該対象からの生物学的サンプルにおいて抗体に結合した識別用ペプチドのセットを同定すること、ここで、該識別用ペプチドのセットは、健康な対象由来のサンプルから全身性エリテマトーデスを鑑別できる結合シグナルを表示する；（ｃ）識別用ペプチドセット内の各ペプチドを用いてプロテオームデータベースを検索（クエリー）すること；（ｄ）識別用ペプチドセット内の各ペプチドを、ヒトプロテオームデータベース内の１以上のタンパク質にアライメントさせること；および、（ｅ）プロテオームデータベースから特定されたタンパク質のそれぞれについて関連性スコアおよびランキングを取得すること（ここで、同定されたタンパク質のそれぞれは、全身性エリテマトーデスの候補バイオマーカーである）を含む。識別用ペプチドは、統計的手段、例えばｔ検定によって、１０−３未満、１０−４未満、１０−５未満、１０−６未満、１０−７未満、１０−８未満、１０−９未満、１０−１０未満、１０−１１未満、１０−１２未満、１０−１３未満、１０−１４未満、または１０−１５未満のｐ値を有するものとして特定され得る。ある態様において、得られた候補バイオマーカーは、この方法に従ったが、非識別用ペプチドを用いて同定されたタンパク質と比較した場合、１０−３未満、１０−４未満、１０−５未満、または１０−６未満のｐ値をにしたがって順位付けされる。
【００８１】
サンプル
本発明の方法にしたがって利用するサンプルは、任意の生物学的サンプルであり得る。例えば、該生物学的サンプルは、抗体を含む生物学的液体サンプルであり得る。適当な生物学的液体サンプルとしては、血液、血漿、血清、汗、涙、喀痰、尿、便の水分、耳からの液体、リンパ液、唾液、脳脊髄液、洗浄液（ravage）、骨髄の懸濁液、膣からの液体、経頸管洗浄液、滑液、房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、脳の液体、嚢胞液、胸膜および腹腔の液体、心臓周囲の液体、腹水、乳、膵液、呼吸器、腸管および尿生殖器の分泌物、羊水、乳、ならびに白血球アフェレーシス（leukophoresis）サンプルが挙げられるが、これらに限定されない。生物学的サンプルは、胎仔または母体に由来し得る、胚盤胞腔液、臍帯血、または母体循環液でもよい。いくつかの態様において、サンプルは、非侵襲的手法で容易に入手可能なサンプル、例えば血液、血漿、血清、汗、涙、喀痰、尿、喀痰、耳からの液体、または唾液である。いくつかの態様において、サンプルは、末梢血サンプル、または末梢血サンプルの血漿もしくは血清画分である。本明細書で用いる用語“血液”、“血漿”および“血清”は、特に、その画分または加工された部分も明確に包含する。
【００８２】
臨床診療においてルーチンに測定されているヒト体液である血液は、最小限の侵襲でアクセスでき、入手が容易であることから、最も好ましく、用いられている。さらに、血液はすべての身体組織を巡っており、したがって、その組成は、個体の生理学的状態全般を示すものとして重要である。いくつかの態様において、免疫シグネチャー／抗体結合プロファイルを得るために用いる生物学的サンプルは、血液サンプルである。他の態様において、生物学的サンプルは血漿サンプルである。さらに他の態様において、生物学的サンプルは血清サンプルである。さらに別の態様において、生物学的サンプルは乾燥血液サンプルである。生物学的サンプルは、第三者、例えばその抗体結合プロファイル解析の実施者および／またはそのペプチドアレイに対する結合アッセイの実施者ではない者によって得られたものであってよい。例えば、サンプルは、臨床医、医師、またはサンプルを提供する対象に係る他のヘルスケア担当者によって得られてよい。あるいは、生物学的サンプルは、そのサンプルをペプチドアレイに対する結合アッセイに付す者、および／またはその抗体結合プロファイル／ＩＳを解析するのと同じ者によって得られてもよい。アッセイされる生物学的サンプルは、保管（例えば、凍結）するか、または他の保存条件下に保存しうる。
【００８３】
本明細書中、用語“患者サンプル”および“対象サンプル”は、互換的に用いられ、患者（すなわち医学的な注意、配慮または処置を受ける者）から得たサンプル、例えば生物学的サンプルを意味する。対象サンプルは、本明細書に記載のサンプルのいずれかであり得る。特定の態様において、対象サンプルは非侵襲的手法で得られ、例えば末梢血サンプルである。
【００８４】
サンプル中の循環抗体の抗体結合プロファイルは、本発明の方法にしたがって、少量のサンプルを用いて得ることができる。例えば、対象の健康状態を特定するのに十分な数のペプチド−タンパク質複合体の情報を含む抗体結合プロファイルを得るために、アレイ上のペプチドを少量の１ｍｌの血液と接触させることができる。
【００８５】
いくつかの態様においては、抗体結合プロファイルを得るために必要な生物学的サンプルの体積は、１０ｍｌ未満、５ｍｌ未満、３ｍｌ未満、２ｍｌ未満、１ｍｌ未満、９００μｌ未満、８００μｌ未満、７００μｌ未満、６００μｌ未満、５００μｌ未満、４００μｌ未満、３００μｌ未満、２００μｌ未満、１００μｌ未満、５０μｌ未満、４０μｌ未満、３０μｌ未満、２０μｌ未満、１０μｌ未満、１μｌ未満、９００ｎｌ未満、８００ｎｌ未満、７００ｎｌ未満、６００ｎｌ未満、５００ｎｌ未満、４００ｎｌ未満、３００ｎｌ未満、２００ｎｌ未満、１００ｎｌ未満、５０ｎｌ未満、４０ｎｌ未満、３０ｎｌ未満、２０ｎｌ未満、１０ｎｌ未満、または１ｎｌ未満である。いくつかの態様において、抗体結合プロファイルを得るために、生物学的液体サンプルを何倍か希釈し得る。例えば、対象から得た生物学的サンプルを、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、少なくとも３００倍、少なくとも４００倍、少なくとも５００倍、少なくとも６００倍、少なくとも７００倍、少なくとも８００倍、少なくとも９００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも５０００倍、または少なくとも１００００倍希釈し得る。希釈された血清サンプル中に存在する抗体は、対象の健康にとって重要であると考えられるが、これは、希釈された血清サンプル中に抗体が依然存在するならば、該抗体は該患者の血液中に比較的多量に存在するに違いないためである。
【００８６】
処置および病状（状態）
本発明の方法およびアレイは、ＡＩ疾患の鑑別診断に用いられ得る識別用ペプチドを同定するための、およびＡＩ疾患の候補バイオマーカーを同定するための、方法、アッセイおよびデバイスを提供する。本明細書に記載の態様の方法およびアレイは、例えば、ＡＩの鑑別診断のために、および／または対象におけるＡＩの１以上の候補バイオマーカーの同定のために用いられ得る。対象は、ヒト、モルモット、イヌ、ネコ、ウマ、マウス、ウサギ、およびさまざまな他の動物であり得る。対象はいずれの年齢であってもよく、例えば、対象は乳児、幼児、小児、前青年期、青年期、成人または高齢者であってよい。
【００８７】
本発明のアレイおよび方法は、ユーザーによって使用され得る。複数のユーザーが、病状を特定し、および／または病状の処置を提供するために、本発明の方法を用いることができる。ユーザーは、例えば健康状態をモニターすることを望むヒトであり得る。ユーザーは、例えばヘルスケアの提供者であり得る。ヘルスケア提供者は、例えば、医師であり得る。いくつかの態様においては、ユーザーは対象を担当するヘルスケア提供者であり得る。本発明のユーザーでありうる医師およびヘルスケア提供者の例は、以下を包含するが、それに限定されない：麻酔医、肥満外科治療専門医、血液バンク輸液医学専門家、心臓電気生理学者、心臓外科医、心臓専門医、有資格看護助手、臨床心臓電気生理学専門家、臨床神経生理学専門家、臨床専門看護師、結腸直腸外科医、救急医療専門医、救急医療専門外科医、歯科衛生士、歯科医、皮膚科医、救急救命士、救急医療医、消化器外科医、血液専門医、ホスピスケアおよび緩和医療専門医、ホメオパシー専門医、感染症専門医、内科医、顎顔面外科医、医療助手、監察医、遺伝医学者、腫瘍内科医、助産師、新生児周産期専門家、腎臓科医、神経科医、脳神経外科医、核医学専門医、看護師、ナースプラクティショナー、産科医、腫瘍医（オンコロジスト）、口腔外科医、歯科矯正医、整形外科専門医、疼痛管理の専門医、病理医、小児科医、輸液医（perfusionist）、歯周病専門医、形成外科医、ポディアトリスト、肛門科医、補綴専門医、精神科医、呼吸器専門医、放射線科医、外科医、胸部疾患専門医、移植専門医、血管専門医、血管外科医、および獣医。本発明のアレイおよび方法によって特定された診断は、対象の診療記録に組み込まれ得る。
【００８８】
アレイプラットフォーム
いくつかの態様において、向上した多様性（ダイバーシティ）および忠実度でのケミカルライブラリー合成を可能にするアレイプラットフォームを提供する方法、プロセスおよびキットが本明細書に記載される。アレイプラットフォームは、アレイ表面上に複数の個別の特徴を有する。各特徴は一般的には、要すればアレイ表面上にインサイチュウ合成された複数の個別分子、例えばペプチドを含み、ここで、該分子は、１つの特徴内では同一であるが、分子の配列または独自性は各特徴間で異なる。アレイ分子としては、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオシド、ヌクレオチド、それらの構造類似体または組み合わせを包含する）、ペプチド、ペプチド模倣体およびそれらの組み合わせ等が挙げられるが、これらに限定されず、ここで、アレイ分子は分子内に天然または非天然のモノマーを含み得る。そのようなアレイ分子は、大きな合成ペプチドアレイの合成物を含む。いくつかの態様において、アレイ中の分子は、エピトープの構造を模倣し、エピトープで誘発される抗体を結合することのできる分子であるミモトープである。いくつかの態様においては、アレイ中の分子は、抗体（またはＴ細胞受容体）の可変領域中の抗原エピトープ結合部位を含むパラトープまたはパラトープ模倣体である。いくつかの態様においては、本発明のアレイは、ランダムな、擬似ランダムな、または最大限に多様なペプチド配列を含むペプチドアレイである。
【００８９】
ペプチドアレイは、十分に特徴付けられたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）のエピトープにマッチするコントロール配列を含み得る。コントロール配列に対する結合パターンおよびライブラリーペプチドに対する結合パターンを調べることにより、アレイおよび免疫シグネチャーアッセイプロセスの品質を評価することができる。既知のエピトープを有するｍＡｂ、例えば４Ｃ１、ｐ５３Ａｂ１、ｐ５３Ａｂ８およびＬｎＫＢ２を、さまざまな用量でアッセイすることができる。さらに、異なるウェハのアレイでサンプル複製物、例えば血漿サンプルを試験し、全ライブラリーペプチドについての変動係数（ＣＶ）を計算することにより、ウェハ間のシグナル精度を決定することができる。結合シグナル測定の精度は、同じバッチのウェハ上に合成されたアレイ上で生じた、アレイ間、スライド間、ウェハ間および日間変動の集計として決定することができる（ウェハバッチ内）。さらに、異なるバッチのウェハ上のアレイについて、測定精度を決定することができる（ウェハバッチ間）。いくつかの態様において、結合シグナルの測定は、ウェハバッチ内および／またはウェハバッチ間で、変動が５％未満、１０％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満または３０％未満である精度で行うことができる。
【００９０】
本明細書に記載の技術は、半導体製造プロセスおよびコンビナトリアル化学合成を組み合わせてアレイベースのライブラリーをシリコンウェハ上に形成する、フォトリソグラフィによるアレイ合成プラットフォームを含む。フォトリソグラフィによる特徴パターン作製の凄まじい進歩を利用することにより、アレイ合成プラットフォームは高度に拡張可能であり、８インチウェハ上に４０００万の特徴を有するコンビナトリアル化学ライブラリーを形成することができる。フォトリソグラフィによるアレイ合成は、高い再現性を得るためにクラス１０，０００のクリーンルーム内で半導体ウェハ製造装置を用いて行う。ウェハが標準的顕微鏡スライドの寸法に切り分けられたとき、各スライドは３００万を超える異なる化学物質を含む。
【００９１】
ある態様において、本明細書に記載のフォトリソグラフィ技術によって製造される化学ライブラリーのアレイは、例えば免疫シグネチャーアッセイと称する、免疫ベースの診断アッセイに用いられる。アレイに対して結合する、１滴の血液に由来する患者の抗体レパートリーを用いて、結合アレイの蛍光結合プロファイルイメージから、ＡＩ疾患の鑑別診断に十分な情報が得られる。
【００９２】
ある態様において、免疫シグネチャーアッセイは、ＡＩ疾患を鑑別診断／モニターするため、および処置に対する応答を評価するための、臨床適用のために開発されている。免疫シグネチャーアッセイの態様の例が、“Compound Arrays for Sample Profiling”と題する米国特許出願公開第２０１２／０１９０５７４号、および“Immunosignaturing: A Path to Early Diagnosis and Health Monitoring”と題する米国特許出願公開第２０１４／００８７９６３号に詳細に記載されており、これら２つの文献の開示内容は引用により本明細書中に包含させる。本発明で開発されたアレイは、偏光解析法、質量分析法および蛍光法を含む検出原理が異なる分析法（orthogonal analytical method）を用いて、各合成アレイ内に分析的測定能力を組み込むものである。これらの測定は、アレイ合成パフォーマンスの長期的な定性的および定量的評価を可能にする。
【００９３】
いくつかの態様において、アレイは、コンビナトリアル配列のペプチドの計数可能な数のアレイを得るために、再使用可能なマスクおよび自動化を用いて製造したウェハベースのフォトリソグラフィで、インサイチュウでのペプチドアレイである。いくつかの態様において、ペプチドアレイは、少なくとも５，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも１５，０００、少なくとも２０，０００、少なくとも３０，０００、少なくとも４０，０００、少なくとも５０，０００、少なくとも１００，０００、少なくとも２００，０００、少なくとも３００，０００、少なくとも４００，０００、少なくとも５００，０００、少なくとも１，０００，０００、少なくとも２，０００，０００、少なくとも３，０００，０００、少なくとも４，０００，０００、少なくとも５，０００，０００、少なくとも１０，０００，０００、少なくとも１００，０００，０００またはそれ以上の異なる配列を有するペプチドを含む。異なる配列ペプチドのそれぞれの複数のコピーは、特徴として知られるアドレス可能な位置でウェハ上に配置することができる。
【００９４】
いくつかの態様において、ペプチドアレイ上の抗体結合の検出にはいくつかの課題があるが、本明細書に記載の技術はそれに対処することができる。したがって、いくつかの態様において、本明細書に記載のアレイおよび方法は、免疫シグネチャーアッセイを行うのに必要な所望の性質を調節することができるように、アレイ表面上における特殊なコーティングおよび官能基密度を利用する。例えば、ペプチドアレイ上の非特異的な抗体結合を、そのシリコン表面を、中程度に親水性の単層のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルデキストランおよびそれらの組み合わせでコーティングすることによって最小限にすることができる。いくつかの態様においては、該親水性単層は均質である。第２に、合成ペプチドをシリコン表面に連結させるのに、ペプチドが妨げられない方向で抗体に提示されるように、ペプチドを表面から遠ざけるスペーサーを用いる。
【００９５】
インサイチュウで合成されたペプチドライブラリーは、疾患にとらわれず、それらが診断しようとする疾患を先験的に認識せずに合成することができる。同一のアレイを用いて、健康状態を判断することができる。
【００９６】
本明細書で用いる用語“ペプチド”は、直鎖状または環状鎖で結合した複数のアミノ酸を意味する。本発明の目的のために、ペプチドという用語は、特定の数のアミノ酸に限定されない。しかしながら、好ましくは、それらは、最大約４００個のアミノ酸、最大約３００個のアミノ酸、最大約２５０個のアミノ酸、最大約１５０個のアミノ酸、最大約７０個のアミノ酸、最大約５０個のアミノ酸、最大約４０個のアミノ酸、最大３０個のアミノ酸、最大２０個のアミノ酸、最大１５個のアミノ酸、最大１０個のアミノ酸、または最大５個のアミノ酸を含む。いくつかの態様において、アレイのペプチドは、５〜３０個のアミノ酸、５〜２０個のアミノ酸、または５〜１５個のアミノ酸である。ペプチド分子の全部または一部を形成するアミノ酸は、２０種類の従来の天然アミノ酸、すなわちアラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、リジン（Ｋ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）、およびチロシン（Ｙ）のいずれかである。本発明のアレイを形成するペプチド中のアミノ酸のいずれかは、従来とは異なるアミノ酸で置き換えられてもよい。一般に、保存的置換が好ましい。いくつかの態様において、アレイ上のペプチドは、２０個未満のアミノ酸から合成される。いくつかの態様において、ペプチドの合成中に１以上のアミノ酸、メチオニン、システイン、イソロイシンおよびスレオニンが除去される。
【００９７】
検出器デバイス
ある態様において、本明細書に記載のシステム、プラットフォームおよび方法は、本明細書に記載のアレイフォーマット上の抗体結合を含む、本明細書に記載のペプチドアレイ上の結合を検出するための検出器デバイスを含む。いくつかの態様において、光学的検出法（ｃｃｄ、ｐｍｔ、他の光学的検出器、光学フィルターおよび他の光学的検出デバイス）と組み合わせて用いられる場合、抗体結合検出が、リアルタイムで、または時間間隔を置いて、光学的検出によって報告される。特定の例において、最終的な結合活性の定量化は、光学的検出がＡＦＵ（任意の蛍光単位）に変換されるか、またはインピーダンス測定もしくは他の電気化学的感知により電気シグナルに変換されて報告される。他の例において、抗体の結合は、ペプチドデバイスに適用されたプローブ上の、可視域の、または光学的に検出可能なラベルからの、光または電磁エネルギーの放射または吸収によって検出される。光学的に検出可能なラベルの例には、蛍光、化学発光、電気化学発光、発光、リン光、蛍光偏光、および帯電ラベルが含まれるが、それらに限定されない。いくつかの例において、蛍光標識プローブは、サンプルからの蛍光応答が標的(ターゲット）または抗体の存在を示すように、特定の標的または抗体が存在する場合にのみ活性である。
【００９８】
いくつかの例において、光学的な励起および／または放射および／または抗体結合検出を提供するために、光送達スキームを利用する。これは、特定の態様において、外部コンポーネントを用いる必要をなくすために、光導波路として、フローセル材料（熱重合体、例えばアクリル（ＰＭＭＡ）環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）等）を用いることを含む。さらに、いくつかの例においては、光源−発光ダイオード（ＬＥＤ）、垂直共振器面発光型レーザー（ＶＣＳＥＬ）、および他のライティングスキームを、該光源が内部制御され、かつ電力供給されるように、カートリッジまたは検出デバイス内に直接統合されるか、またはペプチドアレイ表面上に直接に組み込まれる。また、ＰＭＴ、ＣＣＤまたはＣＭＯＳ検出器を、検出デバイスまたはカートリッジ内に組み込むことができる。
【００９９】
デジタル処理デバイス
いくつかの態様においては、本明細書に記載のシステム、プラットフォーム、ソフトウェア、ネットワークおよび方法は、デジタル処理デバイスまたはその使用を含む。さらなる態様においては、デジタル処理デバイスは、１つまたはそれ以上のハードウェア中央処理装置（ＣＰＵ）、すなわちデバイスの機能を実行するプロセッサを含む。さらなる態様においては、デジタル処理デバイスは、実行可能な命令を実行するために構成されたオペレーティングシステムをさらに含む。いくつかの態様においては、デジタル処理デバイスは、要すればコンピュータネットワークに接続される。さらなる態様においては、デジタル処理デバイスは、要すればワールドワイドウェブにアクセスするようにインターネットに接続される。さらなる態様においては、デジタル処理デバイスは、要すれば、クラウド・コンピューティング・インフラストラクチャに接続される。他の態様においては、デジタル処理デバイスは、要すればインターネットに接続される。
【０１００】
他の態様において、デジタル処理デバイスは、要すれば、データストレージデバイスに接続される。本明細書の記載によれば、好適なデジタル処理デバイスは、例えば、以下を含むが、それに限られるわけではない：サーバコンピュータ、デスクトップコンピュータ、ラップトップコンピュータ、ノートブックコンピュータ、サブノートブックコンピュータ、ネットブックコンピュータ、ネットパッドコンピュータ、セットトップコンピュータ、ハンドヘルドコンピュータ、インターネット機器、モバイルスマートフォン、タブレットコンピュータ、携帯情報端末、ビデオゲーム機、およびビークル（vehicle）。当業者は、本明細書に記載のシステムにおいて使用するのに多くのスマートフォンが適当であることを認識し得る。当業者はまた、本明細書に記載のシステムにおいて使用するのに、オプションでコンピュータネットワーク接続機能を備えた、特殊なテレビ（select television）、ビデオプレイヤーおよびデジタル音楽プレイヤーが適当であることを認識し得る。適当なタブレットコンピュータは、当業者に知られているブックレット、スレートおよびコンバーティブル型のものを包含する。
【０１０１】
ある態様において、デジタル処理デバイスは、実行可能な命令を行うために構成されたオペレーティングシステムを含む。オペレーティングシステムは、例えば、デバイスのハードウェアを管理し、アプリケーションの実行のためのサービスを提供する、プログラムおよびデータを含むソフトウェアである。当業者は、適当なサーバオペレーティングシステムが、例えば、これに限定されないが、FreeBSD、OpenBSD、NetBSD（登録商標）、Linux、Apple（登録商標）Mac OS X Server（登録商標）、Oracle（登録商標）Solaris（登録商標）、Windows Server（登録商標）、およびNovell（登録商標）NetWare（登録商標）を包含することを認識し得る。当業者は、適当なパーソナルコンピュータオペレーティングシステムが、例えば、これに限定されないが、Microsoft（登録商標）Windows（登録商標）、Apple（登録商標）Mac OS X（登録商標）、UNIX（登録商標）、およびUNIXライク・オペレーティングシステム、例えばGNU/Linux（登録商標）を包含することを認識し得る。いくつかの態様において、オペレーティングシステムは、クラウドコンピューティングにより提供される。当業者は、適当なモバイルスマートフォンオペレーティングシステムが、例えば、それに限定されないが、Nokia（登録商標）Symbian（登録商標）OS、Apple（登録商標）iOS（登録商標）、Research In Motion（登録商標）BlackBerry OS（登録商標）、Google（登録商標）Android（登録商標）、Microsoft（登録商標）Windows Phone（登録商標）OS、Microsoft（登録商標）Windows Mobile（登録商標）OS、Linux（登録商標）、およびPalm（登録商標）WebOS（登録商標）を包含することを認識し得る。
【０１０２】
いくつかの態様において、デジタル処理デバイスは、ストレージおよび／またはメモリデバイスを含む。ストレージおよび／またはメモリデバイスは、データまたはプログラムを一時的または永久的に記憶するために用いられる１つまたはそれ以上の物理的装置である。いくつかの態様において、該デバイスは、揮発性メモリであり、記憶された情報を維持するために電力供給を必要とする。いくつかの態様において、該デバイスは、不揮発性メモリであり、電力供給が無くても記憶された情報を維持する。さらなる態様においては、不揮発性メモリはフラッシュメモリを含む。いくつかの態様において、不揮発性メモリは、ダイナミック・ランダム−アクセスメモリ（ＤＲＡＭ）を含む。いくつかの態様において、不揮発性メモリは、強誘電体ランダムアクセスメモリ（ＦＲＡＭ）を含む。いくつかの態様において、不揮発性メモリは、相変化ランダムアクセスメモリ（ＰＲＡＭ）を含む。他の態様において、該デバイスは、例えば、それに限定されないが、CD-ROM、DVD、フラッシュメモリデバイス、磁気ディスクドライブ、磁気テープドライブ、光学ディスクドライブ、およびクラウドコンピューティングベースの記憶装置を包含する記憶デバイスである。さらなる態様においては、ストレージおよび／またはメモリデバイスは、本明細書に記載のようなデバイスの組み合わせである。
【０１０３】
いくつかの態様において、デジタル処理デバイスは、視覚情報をユーザーに送るためのディスプレイを含む。いくつかの態様においては、ディスプレイはブラウン管（ＣＲＴ）である。いくつかの態様においては、ディスプレイは液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）である。さらなる態様において、ディスプレイは薄膜トランジスタ液晶ディスプレイ（ＴＦＴ−ＬＣＤ）である。いくつかの態様において、ディスプレイは有機発光ダイオード（ＯＬＥＤ）ディスプレイである。さらなるいくつかの態様においては、ＯＬＥＤディスプレイは、パッシブマトリクス型のＯＬＥＤ（ＰＭＯＬＥＤ）ディスプレイ、またはアクティブマトリクス型のＯＬＥＤ（ＡＭＯＬＥＤ）ディスプレイである。いくつかの態様において、ディスプレイはプラズマディスプレイである。他の態様において、ディスプレイはビデオプロジェクタである。さらなる態様においては、ディスプレイは、本明細書に記載のようなデバイスの組み合わせである。
【０１０４】
いくつかの態様において、デジタル処理デバイスは、ユーザーから情報を受け取るためのインプットデバイスを含む。いくつかの態様において、インプットデバイスはキーボードである。いくつかの態様において、インプットデバイスとしては、マウス、トラックボール、トラックパッド、ジョイスティック、ゲームコントローラー、またはスタイラスなどを含むが、これらに限定されない。いくつかの態様において、インプットデバイスは、タッチスクリーンまたはマルチタッチスクリーンである。他の態様においては、インプットデバイスは、音声または他の音声入力を捉えるマイクロフォンである。他の態様においては、インプットデバイスは、モーションまたは視覚的インプットを捉えるビデオカメラである。さらなる態様においては、インプットデバイスは、本明細書に記載のようなデバイスの組み合わせである。
【０１０５】
いくつかの態様において、デジタル処理デバイスは、デジタルカメラを含む。いくつかの態様において、デジタルカメラはデジタル画像を撮影する。いくつかの態様において、デジタルカメラは、オートフォーカスカメラである。いくつかの態様において、デジタルカメラは、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラである。さらなる態様において、デジタルカメラはＣＣＤビデオカメラである。他の態様においては、デジタルカメラは、相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）カメラである。いくつかの態様において、デジタルカメラは静止画像を撮影する。他の態様においては、デジタルカメラはビデオ画像を撮影する。さまざまな態様において、適当なデジタルカメラは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０メガピクセル、およびそれより高い画素数（それら数値の間の画素数を包含する）のカメラである。いくつかの態様において、デジタルカメラは、標準画質カメラである。他の態様において、デジタルカメラはＨＤビデオカメラである。さらなる態様においては、ＨＤビデオカメラは、少なくとも約１２８０×約７２０ピクセル、または少なくとも約１９２０×約１０８０ピクセルで画像を撮影する。いくつかの態様においては、デジタルカメラは、カラーでデジタル画像を撮影する。他の態様において、デジタルカメラはグレースケールでデジタル画像を撮影する。さまざまな態様において、デジタル画像は任意の適当なデジタル画像フォーマットで記憶される。適当なデジタル画像フォーマットは、例えば、それに限定されないが、Joint Photographic Experts Group (JPEG)、JPEG 2000、Exchangeable image file format (Exif)、Tagged Image File Format (TIFF)、RAW、Portable Network Graphics (PNG)、Graphics Interchange Format (GIF)、Windows（登録商標）bitmap (BMP)、portable pixmap (PPM)、portable graymap (PGM)、portable bitmap file format (PBM)、およびWebPを包含する。さまざまな態様において、デジタル画像は、任意の適当なデジタルビデオフォーマットで記憶される。適当なデジタルビデオフォーマットは、例えば、それに限定されないが、AVI、MPEG、Apple（登録商標）QuickTime（登録商標）、MP4、AVCHD（登録商標）、Windows Media（登録商標）、DivX（商標）Flash Video、Ogg Theora、WebM、およびRealMediaを包含する。
【０１０６】
非一過性のコンピュータ読み取り可能な記憶媒体
いくつかの態様において、本明細書に記載のシステム、プラットフォーム、ソフトウェア、ネットワークおよび方法は、要すればネットワーク化されたデジタル処理デバイスのオペレーティングシステムにより実行可能な命令を含むプログラムがコード化された、１以上の非一過性のコンピュータ読み取り可能な記憶媒体を含む。さらなる態様において、コンピュータ読み取り可能な記憶媒体は、デジタル処理デバイスの有形のコンポーネントである。さらなる態様においては、コンピュータ読み取り可能な記憶媒体は、要すればデジタル処理デバイスから取り外し可能である。いくつかの態様において、コンピュータ読み取り可能な記憶媒体は、例えば、それに限定されないが、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、フラッシュメモリデバイス、ソリッドステートメモリ、磁気ディスクドライブ、磁気テープドライブ、光学ディスクドライブ、クラウドコンピューティングシステムおよびサービス等を包含する。いくつかの態様において、プログラムおよび命令は該媒体に、永久的、実質的に永久的、半永久的、または非一過性にコード化される。
【０１０７】
コンピュータプログラム
いくつかの態様において、本明細書に記載のシステム、プラットフォーム、ソフトウェア、ネットワークおよび方法は、少なくとも１つのコンピュータプログラムを含む。コンピュータプログラムは、特定のタスクを行うように書かれた、デジタル処理デバイスのＣＰＵにおいて実行可能な一連の命令を含む。当業者は本明細書の記載に照らして、コンピュータプログラムがさまざまな言語のさまざまなバージョンで書かれ得ることを認識し得る。いくつかの態様において、コンピュータプログラムは、１つのシーケンスの命令を含む。いくつかの態様において、コンピュータプログラムは、複数のシーケンスの命令を含む。いくつかの態様において、コンピュータプログラムは、１つのロケーションから提供される。他の態様においては、コンピュータプログラムは、複数のロケーションから提供される。さまざまな態様において、コンピュータプログラムは、１つまたはそれ以上のソフトウェアモジュールを含む。さまざまな態様において、コンピュータプログラムは、部分的に、または全体として、１つまたはそれ以上のウェブアプリケーション、１つまたはそれ以上のモバイルアプリケーション、１つまたはそれ以上のスタンドアローンアプリケーション、１つまたはそれ以上のブラウザプラグイン、拡張機能、アドインもしくはアドオン、またはそれらの組み合わせを含む。
【０１０８】
ウェブアプリケーション
いくつかの態様において、コンピュータプログラムはウェブアプリケーションを含む。当業者は本明細書の記載に照らして、ウェブアプリケーションが、さまざまな態様において、１つまたはそれ以上のソフトウェアフレームワークおよび１つまたはそれ以上のデータベースシステムを利用することを認識し得る。いくつかの態様において、ウェブアプリケーションは、Microsoft（登録商標）.NETまたはRuby on Rails (RoR)などのソフトウェアフレームワーク上に構築される。
【０１０９】
いくつかの態様において、ウェブアプリケーションは、１つまたはそれ以上のデータベースシステム、例えば、それに限定されないが、リレーショナル（relational）、非リレーショナル、オブジェクト指向、アソシアティブ（associative）、およびXMLデータベースシステムを利用する。さらなる態様において、適当なリレーショナルデータベースシステムは、以下を含むが、それらに限定されない：Microsoft（登録商標）SQL Server、mySQL（商標）、およびOracle（登録商標）。当業者はまた、ウェブアプリケーションが、さまざまな態様において、１つまたはそれ以上の言語の１つまたはそれ以上のバージョンで書かれることを認識し得る。ウェブアプリケーションは、１つまたはそれ以上のマークアップ言語、プレゼンテーション定義言語、クライアントサイドスクリプト言語、サーバーサイドコーディング言語、データベースクエリー言語、またはそれらの組み合わせで書かれうる。いくつかの態様において、ウェブアプリケーションは、ある程度まで、マークアップ言語、例えばHypertext Markup Language (HTML)、Extensible Hypertext Markup Language (XHTML)、またはeXtensible Markup Language (XML)で書かれる。いくつかの態様において、ウェブアプリケーションは、ある程度まで、プレゼンテーション定義言語、例えばCascading Style Sheets (CSS)で書かれる。いくつかの態様において、ウェブアプリケーションは、ある程度まで、クライアントサイドスクリプト言語、例えばAsynchronous Javascript and XML (AJAX)、Flash（登録商標）Actionscript、Javascript、またはSilverlight（登録商標）で書かれる。いくつかの態様において、ウェブアプリケーションは、ある程度まで、サーバーサイドコーディング言語、例えばActive Server Pages (ASP)、ColdFusion（登録商標）、Perl、Java（商標）、JavaServer Pages (JSP)、Hypertext Preprocessor (PHP)、Python（商標）、Ruby、Tcl、Smalltalk、WebDNA（登録商標）、またはGroovyで書かれる。いくつかの態様において、ウェブアプリケーションは、ある程度まで、データベースクエリー言語、例えばStructured Query Language (SQL)で書かれる。いくつかの態様において、ウェブアプリケーションは、エンタープライズ・サーバー製品、例えばIBM（登録商標）Lotus Domino（登録商標）を統合する。いくつかの態様において、アーティストが情報およびメディアファイルをアップロードするのを可能にする、アーティストのためのキャリア開発ネットワークを提供するウェブアプリケーションは、メディアプレイヤーエレメントを含む。さらなるさまざまな態様において、メディアプレイヤーエレメントは、多くの適当なマルチメディア技術、例えば、それに限定されないが、Adobe（登録商標）Flash（登録商標）、HTML 5、Apple（登録商標）QuickTime（登録商標）、Microsoft（登録商標）Silverlight（登録商標）、Java（商標）、およびUnity（登録商標）の、１つまたはそれ以上を利用する。
【０１１０】
モバイルアプリケーション
いくつかの態様において、コンピュータプログラムは、モバイルデジタル処理デバイスに提供されるモバイルアプリケーションを含む。いくつかの態様において、モバイルアプリケーションは、モバイルデジタル処理デバイスに、その製造時点で提供される。他の態様において、モバイルアプリケーションは、モバイルデジタル処理デバイスに、本明細書に記載のコンピュータネットワークを介して提供される。
【０１１１】
本明細書の記載に照らして、モバイルアプリケーションは、当業者に知られているハードウェア、言語および開発環境を用いて、当業者に知られた技術によって構築される。当業者は、モバイルアプリケーションがいくつかの言語で書かれることを認識し得る。適当なプログラミング言語は、例えば、それに限定されないが、C、C++、C#、Objective-C、Java（商標）、Javascript、Pascal、Object Pascal、Python（商標）、Ruby、VB.NET、WML、およびCSSを適用するか、もしくは適用しないXHTML/HTML、またはそれらの組み合わせを包含する。
【０１１２】
適当なモバイルアプリケーション開発環境は、いくつかの提供元からのものが利用可能である。市販の開発環境としては、以下が挙げられるが、それに限定されない：AirplaySDK、alcheMo、Appcelerator（登録商標）、Celsius、Bedrock、Flash Lite、.NET Compact Framework、Rhomobile、およびWorkLight Mobile Platform。他の開発環境、例えば、それに限定されないが、Lazarus、MobiFlex、MoSync、およびPhonegapが無料で利用可能である。また、モバイルデバイス製造者により、ソフトウェア開発キット、例えば、それに限定されないが、iPhone and iPad (iOS) SDK、Android（商標）SDK、BlackBerry（登録商標）SDK、BREW SDK、Palm（登録商標）OS SDK、Symbian SDK、webOS SDK、およびWindows（登録商標）Mobile SDKが提供されている。
【０１１３】
当業者は、モバイルアプリケーションを配信するいくつかの商業フォーラム、例えば、それに限定されないが、Apple（登録商標）App Store、Android（商標）Market、BlackBerry（登録商標）App World、App Store for Palm devices、App Catalog for webOS、Windows（登録商標）Marketplace for Mobile、Ovi Store for Nokia（登録商標）devices、Samsung（登録商標）Apps、およびNintendo（登録商標）DSi Shopが利用可能であることを認識し得る。
【０１１４】
スタンドアローンアプリケーション
いくつかの態様において、コンピュータプログラムは、既存のプロセスへのアドオンではなく、例えばプラグインではなく、独立したコンピュータプロセスとして実行されるプログラムである、スタンドアローンアプリケーションを含む。当業者は、スタンドアローンアプリケーションはしばしばコンパイルされることを認識し得る。コンパイラは、プログラミング言語で書かれたソースコードを、バイナリのオブジェクトコード、例えばアセンブリ言語またはマシンコードに変換するコンピュータプログラムである。適当なコンパイルされるプログラミング言語は、例えば、それに限定されないが、C、C++、Objective-C、COBOL、Delphi、Eiffel、Java（商標）、Lisp、Python（商標）、Visual Basic、およびVB .NET、またはそれらの組み合わせを包含する。コンパイルはしばしば、少なくとも部分的に、実行可能なプログラムを構築するために行われる。いくつかの態様において、コンピュータプログラムは、１つまたはそれ以上の実行可能なコンパイルされたアプリケーションを含む。
【０１１５】
ソフトウェアモジュール
本明細書に記載のシステム、プラットフォーム、ソフトウェア、ネットワークおよび方法は、さまざまな態様において、ソフトウェア、サーバー、およびデータベースモジュールを含む。本明細書の記載に照らして、ソフトウェアモジュールは、当業者に知られているマシン、ソフトウェアおよび言語を用いて、当業者に知られている技術によって構築される。本明細書に記載のソフトウェアモジュールは、多くの方法でインプリメントされる。さまざまな態様において、ソフトウェアモジュールは、ファイル、コードのセクション、プログラミングオブジェクト、プログラミング構造、またはそれらの組み合わせを含む。さらなるさまざまな態様において、ソフトウェアモジュールは、複数のファイル、複数のコードのセクション、複数のプログラミングオブジェクト、複数のプログラミング構造、またはそれらの組み合わせを含む。さまざまな態様において、１つまたはそれ以上のソフトウェアモジュールは、例えば、それに限定されないが、ウェブアプリケーション、モバイルアプリケーション、およびスタンドアローンアプリケーションを含む。いくつかの態様において、ソフトウェアモジュールは、１つのコンピュータプログラムまたはアプリケーション中にある。他の態様において、ソフトウェアモジュールは、２以上のコンピュータプログラムまたはアプリケーション中にある。いくつかの態様において、ソフトウェアモジュールは、１つのマシンをホストとする。他の態様において、ソフトウェアモジュールは、２以上のマシンをホストとする。さらなる態様において、ソフトウェアモジュールは、クラウドコンピューティングプラットフォームをホストとする。いくつかの態様において、ソフトウェアモジュールは、１つのロケーションにおいて１つまたはそれ以上のマシンをホストとする。他の態様において、ソフトウェアモジュールは、２以上のロケーションにおいて１つまたはそれ以上のマシンをホストとする。
【０１１６】
本発明を以下の実施例により、さらに詳細に説明するが、実施例は本発明の特許請求の範囲を限定することを意図したものではない。添付の図面は、本発明の明細書および説明と不可分であると見なされることが意図される。以下の実施例は、説明のために供されるものであって、特許請求の範囲に係る発明を限定するものではない。
【実施例】
【０１１７】
実施例
実施例１−免疫シグネチャー法
免疫シグネチャーアッセイを用いて、自己免疫疾患（ＡＩ）：全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）および関節リウマチ（ＲＡ）を、変形性関節症（ＯＡ）、シェーグレン症候群（ＳＳ）、線維筋痛症（ＦＭ）を含む他の自己免疫性のそれと類似する疾患から区別した。
【０１１８】
ドナーサンプル。ドナー血漿サンプルを、Albert Einstein College of Medicine (Bronx、NY)から入手した。この試験のために、４００の血清サンプルの注釈付きコホート（well-annotated cohort）を前向きに集め、それはＳＬＥ（ｎ＝７５）、ＲＡ（ｎ＝９５）、シェーグレン症候群（ＳＳ）（ｎ＝２０）、骨関節炎（ＯＡ）（ｎ＝２４）、線維筋痛症（ｎ＝２２）、他の疾患（ＯＤ）（ｎ＝７６）、“全ての疾患（All Diseases）”（ＡＤ）（ｎ＝２３７）；“他のリウマチ性疾患（Other Rheumatic Diseases）”（ＯＲＤ）（ｎ＝１４４）、および健康な対照（ＨＣ）（ｎ＝５９）を含んだ。
【０１１９】
他の自己免疫疾患および非自己免疫性の自己免疫疾患に類似する疾患（ＯＤまたは他のＡＩ）（ｎ＝７６）：ＡＮＣＡ血管炎（２）、ＣＩＡ（４）、ＣＮＳの血管炎、皮膚筋炎（６）、円板状ループス（Discoid Lupus）、ＤＭＰＭ（３）、ＤＭＰＭ/ＭＣＴＤ、ＧＣＡ（２）、痛風（９）、狼瘡（４）、ＭＣＴＤ（９）、筋炎（５）、重複疾患（overlap）、多発性関節性痛風、多発性軟骨炎、多発性筋炎、偽痛風、乾癬性関節炎（１１）、強皮症（７）、Serospon（２）、および血管炎（４）。ＳＬＥについて、他のＡＩ＋非ＡＩであるＡＩと類似の症状を呈する疾患はさらに、線維筋痛症／ＲＡ、狼瘡／ＲＡ、ＯＡ/ＲＡ/serspon、ＲＡ/serspon、ＲＡ、およびＲＡＶＡＳＣを含む。ＲＡについて、他のＡＩ＋非ＡＩであるＡＩと類似の症状を呈する疾患はさらに、線維筋痛症／ＳＬＥ、ＭＣＴＤ/ＳＬＥ、ＳＬＥ/ＭＣＴＤ、ＳＬＥ/強皮症、およびＳＬＥ/ＳＳを含む。
【０１２０】
“他のリウマチ性疾患”（ＯＲＤ）（ｎ＝１４４）：ＳＬＥ、ＳＳ、ＯＡ、乾癬性関節炎（１１）、痛風（９）、血清反応陰性脊椎関節症（２）、偽痛風（１）。リウマチ性疾患を有する対象は、ＡＣＲ基準に基づいて診断された。
“非（Not）”ＳＬＥ群とは、他のＡＩ＋非ＡＩであるが類似する疾患＋ＨＣのサンプル、すなわちＳＬＥ＋ＨＣ以外のＡＩ疾患のサンプルである。
“非（Not）”ＲＡ群とは、他のＡＩ＋非ＡＩであるが類似する疾患＋ＨＣのサンプル、すなわちＲＡ＋ＨＣ以外のＡＩ疾患のサンプルである。
【０１２１】
“混合型ＳＬＥおよび他のＡＩ”および“混合型ＲＡおよび他のＡＩ”群は、図１４および図２７にそれぞれ示される、混合診断を有する対象からのサンプルと、他のＡＩおよび／または類似する症状を呈する疾患：ＣＩＡ／ＯＡ、痛風／ＯＡ、ＯＡ／ＲＡ、ＯＡ／ＲＡ、ＯＡ／ＲＡ／serospon／ＤＭＰＭ／ＦＭ／ＳＬＥ／強皮症／ＤＭＰＭ／ＳＬＥ、狼瘡／ＲＡ／ＭＣＴＤ／ＳＬＥ、ＦＭ／狼瘡、ＦＭ／ＯＡ、ＦＭ／ＲＡ、ＦＭ／ＳＬＥ，ＲＡ／serospon、ＲＡ／ＳＬＥ、ＲＡ／ＳＳ、ＲＡ／ｖａｓｃ．、ＳＬＥ／ＭＣＴＤ、ＳＬＥ／ＲＡ、ＳＬＥ／強皮症、ＳＬＥ／ＳＳ、ＡＮＣＡ血管炎、ＣＩＡ、ＣＮＳの血管炎、皮膚筋炎、円板状ループス、ＤＭＰＭ、ＤＭＰＭ／ＭＣＴＤ、ＧＣＡ、痛風、狼瘡、ＭＣＴＤ、筋炎、重複疾患、多発性関節性痛風、多発性軟骨炎、多発性筋炎、偽痛風、乾癬性関節炎、強皮症、serospon、および血管炎を有する対象からのサンプルとの組合せを表す。
【０１２２】
凍結防止剤としてサンプルとエチレングリコールとを１：１で混合し、１回の使用量に分注した。単回使用のアリコートを、必要になるまで−２０℃で貯蔵した。いずれの場合も、残りのサンプル容量は−８０℃でそのまま貯蔵した。全てのサンプルのＩＤ（identity）を２Ｄバーコード付きチューブ（Micronic、Leystad、the Netherlands）を用いて追跡した。アッセイの準備として、サンプルのアリコートを氷上で４℃に温め、一次インキュベーションバッファー（0.05％ Tween 20（PBST）および１％マンニトールを含むリン酸緩衝生理食塩水）で１：１００に希釈した。次いで、アッセイで用いるために、１：１００希釈液を含むマイクロタイタープレートを１：６２５に希釈した。
【０１２３】
アレイ。中央値９残基長で５から１３アミノ酸の範囲の１２６，００９個のペプチドのコンビナトリアルライブラリーを、１６アミノ酸（メチオニン、Ｍ；システイン、Ｃ;イソロイシン、Ｉ；および、スレオニン、Ｔを除く）のすべての可能な４マーの９９．９％およびすべての可能な５マーの４８．３％を含むように設計した。これらは、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）保護基ペプチド化学に適応した標準的な半導体用フォトリソグラフィーツールを用いて、２００ｍｍの酸化シリコンウェハ上で合成された（Legutki JB et al., Nature Communications. 2014; 5：4785）。すなわち、アミノシランで官能化されたウェハを、ＢＯＣ−グリシンでコーティングした。次に、ＵＶ光によって活性化される光酸発生剤を含むフォトレジストを、スピンコーティングによってウェハに塗布した。フォトマスクを介してウェハをＵＶ光（３６５ｎｍ）に露光すると、所定のマスクを用いてウェハ上のどの部分（features）が露光されるかを所定のとおり選択することができる。ＵＶ光への暴露後、ウェハは加熱されて、露光された部分のＢＯＣ脱保護が可能になった。その後の洗浄、それに続く活性化アミノ酸の適用により、サイクルが完了する。各サイクルで、アレイ上の特定の位置にあるペプチドのＮ末端に特定のアミノ酸が付加された。コンビナトリアルペプチドライブラリーを達成するために、これらのサイクルを繰り返し、マスクおよびアミノ酸の結合を変化させた。標準的な顕微鏡スライドの寸法を有する１３の長方形の領域を、各ウェハから切りだした。完成した各ウェハを、標準の顕微鏡スライドの寸法（２５ｍｍ Ｘ ７５ｍｍ）で１３個の長方形の領域に切りだした。これらの各スライドには、８行３列の２４アレイが含まれた。最後に、標準的なカクテルを用いて、いくつかのアミノ酸の側鎖上の保護基を除去した。完成したスライドは、必要になるまで乾燥窒素環境で保管した。詳細な品質テストを行い、各ステップでの３σ統計的制限の使用を含むプロセス仕様内でアレイが製造されていることが確認される。ＭＡＬＤＩ−ＭＳによってウェハバッチが経時的にサンプリングされ、各アミノ酸が正しいステップで結合されたことを確かめ、コンビナトリアル合成を構成する個々のステップが正しいことを確認する。ウェハの製造は、Visual Basicで記述され、ＳＱＬバックエンドを備えたアクセスフロントエンドを持つ電子カスタムリレーショナルデータベース(Relational Database)によって、最初から最後まで追跡される。フロントエンドのユーザーインターフェイスにより、オペレーターはデータベースに生産情報を簡単に入力できる。ＳＱＬバックエンドを用いると、データベースを簡単にバックアップし、必要に応じて他のコンピューターシステムと統合してデータを共有できる。通常、追跡されるデータには、化合物、レシピ、時間、および技術者実行のタスクが含まれる。ウェハが製造された後、データがレビューされ、記録がロックされて保存される。最後に、以下に説明するように、各ロットを結合アッセイで評価してパフォーマンスを確認する。
【０１２４】
アッセイ。生産品質の製造されたマイクロアレイを得て、使用前に蒸留水に１時間、ＰＢＳに３０分、一次インキュベーション緩衝液（ＰＢＳＴ、１％マンニトール）に１時間穏やかに浸して再水和した。スライドをＡｒｒａｙＩｔマイクロアレイカセット（ArrayIt、Sunnyvale、CA）にロードして、個々のマイクロアレイをマイクロタイタープレートのフットプリントに適合させた。液体ハンドラーを用いて、９０μｌの各サンプルを一次インキュベーション緩衝液（ＰＢＳＴ、１％マンニトール）で１：６２５に希釈して調製し、その後カセットに移した。この混合物をアレイ上で３７℃にて１時間インキュベートし、ＴｅｌｅＳｈａｋｅ９５（INHECO、Martinsried、ドイツ）上で混合して、抗体−ペプチド結合を駆動した。インキュベーション後、BioTek 405TS（BioTek、Winooski、VT）を用いて、カセットをＰＢＳＴで３回洗浄した。３７℃にて、TeleShake95プラットフォームミキサーで１時間、二次インキュベーション緩衝液（ＰＢＳＴ中０．５％カゼイン）中、AlexaFluor 555（Thermo-Invitrogen、Carlsbad、CA）に結合した４．０ｎＭのヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、またはDyLight 550（Novus Biologicals、Littleton、CO）に結合した４．０ｎＭのヤギ抗ヒトＩｇＡを用いて、結合抗体を検出した。二次抗体とのインキュベーション後、スライドを再度ＰＢＳＴで洗浄し、続いて蒸留水で洗浄し、カセットから取り出し、イソプロパノールを噴霧し、遠心乾燥させた。以下に説明するように、各アドレス可能なペプチドの特徴の相対蛍光値を決定することにより、定量的シグナル測定値を得た。
【０１２５】
データ収集。５３２ｎｍレーザーおよび５７２ｎｍ ＢＰ ３４フィルター（Innopsys、Carbonne、France）を取り付けたInnopsys 910ALマイクロアレイスキャナーを用いて、アッセイしたマイクロアレイを画像化した。Mapixソフトウェアアプリケーション（バージョン7.2.1）は、自動グリッディングアルゴリズムを用いて、各ペプチド部分に関連する画像の領域を特定した。各ペプチド部分のピクセル強度の中央値は、タブ区切りのテキストファイルとして記録され、分析のためにデータベースに保存された。
【０１２６】
データ解析。各部分の強度を、等分散性を向上させるために１００の一定値を加えた後に、ｌｏｇ１０変換を行った。各アレイの強度は、そのアレイのコンビナトリアルライブラリー各部分の強度の中央値を差し引き、すべてのサンプルでグランドメジアンを加算することによって正規化された。
【０１２７】
各部分への血漿抗体の結合は、蛍光シグナルを定量化することにより測定した。グループ間で異なるシグナルを示したペプチドの特徴は、不等分散のウェルチ調整を伴う平均ペプチド強度のｔ検定によって決定された。第１の病状を有する対象からのサンプル中の抗体の結合を、異なる第２の病状を有する対象からの対照サンプル中の抗体の結合と比較し、有意に異なるシグナルを示すペプチドを同定した。最初の病状を他の病状から区別するペプチドセットは、最初の病状を有する患者の平均強度を、２番目、３番目、４番目などの病状を有する対象の平均強度と比較することによって特定された。有意な識別を示すペプチド、すなわち識別用ペプチドは、多重度のボンフェローニ補正を適用した後の偽陽性の５％閾値に基づいて識別された（すなわち、ｐ＜４ｅ−７）。
【０１２８】
分類器を構築するために、識別用ペプチドの各部分を、第１の病状と第２の病状とを比較する、または複合型疾患モデルの異なる病状間で比較するウェルチのｔ検定に関連するｐ値に基づいて、第１の病状を第２の病状から区別する能力についてランク付けした。分析のために選択されるペプチドの数は、１０未満から数百または数千を超えるまでさまざまであり、選択されたペプチドの各部分は、線形カーネルおよび０．０１のコストパラメーターを用してサポートベクターマシン（Cortes CおよびVapnik V. Machine Learning. 1995; 20（3 ）：273-97）に入力さて、分類器を訓練する。５分割交差検証を１００回繰り返し、モデルの性能を定量化するために使用し、受容動作特性曲線下面積（ＡＵＣ）の誤差として推定した（図３）。
【０１２９】
最後に、固定されたＳＶＭ分類器を、それらのｔ検定のｐ値によって選択された交差検証下のパフォーマンスに基づいて機能の最適な数を用いて、コホートにおいて適合させた。プラットフォームの再現性の評価には、ＳＶＭ分類器が用いられた。
【０１３０】
すべての解析を、Ｒバージョン３．２.５を用いて行った（Team RC. R：A language and environment for statistical computing。R Foundation for Statistical Computing Vienna 2016。https://www.R-project.org/.から入手可能)。
【０１３１】
ペプチドアライメントスコア付け。ライブラリーペプチドを、２０１６年３月１０日にコンパイルされたヒトゲノムbuild GrCh38 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/)に対応するヒトプロテオームRefSeq release 84に、各独自の遺伝子ＩＤについて最も長い転写バリアントを用いてアライメントさせた。ペプチドを、プロテオーム配列の重複する２０マーの部分にアライメントさせた；重複は１０マーであった。
【０１３２】
アラインメントアルゴリズムには、３種のアミノ酸のシード、４種のアミノ酸のギャップペナルティ、およびアレイのアミノ酸組成を反映するように修正されたBLOSUM62 ［Henikoff and、Henikoff JG (1992) Proc Natl Acad Sci U S A 89: 10915-10919］のスコアリングマトリックスを要する、修正されたBLAST strategy［Altschul SF and Gish W (1996) Methods Enzymol 266: 460-480］を用いた［States DJ et al., (1991) Methods 3: 66-70］。これらの変更により、類似の置換のスコアが増加し、アレイにないアミノ酸のペナルティが除かれ、すべての完全一致が等しくスコア付けされる。
【０１３３】
識別用ライブラリーペプチドのセットについてアラインメントスコアを作成するために、正のＢＬＡＳＴスコアを有するペプチドを行列に組み入れ、ここで、行列の各行はアラインされたペプチドに対応し、各列はタンパク質の配列中のアミノ酸の１個に対応している。タンパク質とのアラインメントのために、ペプチド列内のギャップおよび欠失が許容された。このようにして、行列内の各位置は、ペプチドおよびタンパク質のアラインされるアミノ酸に関連付けられたスコアを得た。次に、タンパク質のアミノ酸に対応する各列を合計して、オーバーラップスコアを作成した。これは、ペプチドを分類することにより、そのアミノ酸位置のカバレッジ（coverage）を表す。ライブラリー組成のこのスコアを補正するために、別のオーバーラップスコアを、すべてのアレイペプチドのリストに対して同じ方法を用いて計算した。これにより、以下の式に従って、各アミノ酸位置でのペプチドオーバーラップ差分スコア「ｓ」の計算が可能になる：
ｓ＝ａ−（ｂ/ｄ）＊ｃ
［式中、ａは識別用ペプチドからのオーバーラップスコアであり、ｂは識別用ペプチドの数であり、ｃは完全なペプチドのライブラリーのオーバーラップスコアであり、そしてｄは、ライブラリー中のペプチドの数である］。
【０１３４】
これらの「ｓ」スコア（アミノ酸レベルであった）を完全タンパク質統計に変換するために、タンパク質内のあらゆる可能なはめ込み２０マーエピトープのスコアの合計を計算する。タンパク質エピトープスコアとも称される最終的なタンパク質スコア「Ｓ」は、各タンパク質の２０のローリングオーバーラップウィンドウに沿った最大値である。同様のスコアのセットが、識別用ペプチドの数に等しい数の、ライブラリーからランダムに選択された１００回の反復ラウンドに対して計算された。各スコア「Ｓ」のｐ値は、ランダムに選択されたペプチドのアライメントに基づいて識別されたタンパク質間でこのスコアが一致するか、または超過する回数に基づいて計算され、反復回数を制御する。
【０１３５】
健康な対象（ＨＣ）、他のＡＩ＋非ＡＩ模倣疾患、および非ＳＬＥ由来のサンプルから、ＳＬＥを有する対象由来のサンプルを区別するために決定された識別用ペプチドのアラインメントから特定された上位２５の候補バイオマーカーを図１７Ａ、１７Ｂおよび図１７Ｃに示し、かつ健康な対象（ＨＣ）、他のＡＩ＋非ＡＩ模倣疾患、および非ＲＡ由来のサンプルから、ＲＡを有する対象のサンプルを区別するために決定された識別用ペプチドのアライメントから特定された上位２５の候補バイオマーカーを図２９Ａ、図２９Ｂおよび図２９Ｃにそれぞれ示す。候補バイオマーカーは、アライメントスコアに従ってリストされる。
【０１３６】
実施例２−ＳＬＥの鑑別診断
ＳＬＥのみを有する対象群の対象と、健康な対照（ＨＣ）、“全ての疾患”（ＡＤ）、ＲＡを有する対象、ＯＡを有する対象、線維筋痛症（ＦＭ）を有する対象、およびシェーグレン症候群を有する対象を含む種々の対象群からの混合診断された患者においてＳＬＥを有する対象とを区別するための免疫シグネチャー。“全ての疾患”は、非ＳＬＥ ＡＩ疾患および非ＡＩであるＡＩと類似の症状を呈する疾患を含む。
【０１３７】
免疫シグネチャーアッセイを実施例１に記載の通りに行い、各部分における取得シグナル強度測定値に対してスキャンした。群間で異なるシグナルを示したペプチド部分を、不等分散のウェルチ補正を伴う平均ペプチド強度のｔ検定によって決定した。各コントラストに二項分類器が開発された。
【０１３８】
表１は、各コントラストのアッセイパフォーマンスの結果をＡＵＣ値として示す。
【表１】
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【０１３９】
各群からＳＬＥを識別する有意なペプチドは、いくつかのアミノ酸およびペプチドモチーフが豊富であることが見出された。図４から１０は、各コントラストにおける識別用の有意なペプチドの一部に富化されたモチーフ（図４Ａ−１０Ａ）およびアミノ酸（図４Ｂ−１０Ｂ）を示す。コントラストにおいて識別された有意なペプチド、すなわち識別用ペプチドの総数を、各図に示す。図４Ａ、図４Ｂ、図５Ａ、図５Ｂ、図６Ａ、図６Ｂ、図７Ａ、図７Ｂ、図８Ａ、図８Ｂ、図９Ａ、図９Ｂ、図１０Ａ、および図１０Ｂの各図の表中、“ｎ”は、モチーフが上位識別用ペプチドに出現する回数であり；n．libは、モチーフがアレイライブラリーに出現する回数であり；“enrich”は、モチーフがアレイライブラリーに出現する回数と比較した、上位識別用ペプチドにおけるモチーフの富化比（fold enrichment）であり；Ｐは、上位識別用ペプチドにおけるモチーフの出現の統計学的有意性であり；富化比（fdr）は、（リスト中あるモチーフ（例えば、ＡＢＣＤ）が現れる回数／ライブラリー中に該モチーフ（ＡＢＣＤ）が現れる回数）／（リストにおける該モチーフタイプ（例えば、テトラマー）の総出現回数／ライブラリーにおける該モチーフタイプ（例えば、テトラマー）の総出現回数）である。富化度は“enrichment”×１００である。
【０１４０】
図４Ａおよび図４Ｂは、健康なドナー（ＨＣ）サンプルからＳＬＥサンプルを区別するペプチド中に富化されているペプチドモチーフ（図４Ａ）およびアミノ酸（図４Ｂ）を示す。ＳＬＥ対象からのサンプルから得られたシグナル結合データとＨＣ群からの結合データとの比較は、ＨＣ群からＳＬＥサンプルを識別したペプチドが、ペプチドライブラリー全体での同じモチーフの出現率に対して、図４Ａに列記された１以上のモチーフにおいて４．２倍（４２０％）を超えて富化されたことを特定した。さらに、ＨＣサンプルからＳＬＥサンプルを識別するペプチドは、個々のアミノ酸において１倍（１００％）を超えて富化されることが見出された（図４Ｂ）。
【０１４１】
図５Ａおよび図５Ｂは、他のＡＩ＋非ＡＩのＡＩと類似の症状を呈する疾患からＳＬＥサンプルを識別するペプチドにおいて富化されている、ペプチドモチーフ（図５Ａ）およびアミノ酸（図５Ｂ）を示す。疾患群は、ペプチドライブラリー全体での同じモチーフの出現率に対して、図５Ａに列記された１以上のモチーフにおいて４．９倍（４９０％）を超えて富化された。さらに、ＨＣサンプルからＳＬＥサンプルを識別するペプチドは、個々のアミノ酸において１．１倍（１１０％）を超えて富化されることが見出された（図５Ｂ）。
【０１４２】
図６Ａおよび図６Ｂは、“ＳＬＥではない（Not SLE）”群のサンプルからＳＬＥサンプルを識別するペプチドにおいて富化されている、ペプチドモチーフ（図６Ａ）およびアミノ酸（図６Ｂ）を示す。ＳＬＥ対象からのサンプルから得られたシグナル結合データと“not SLE”群からの結合データとの比較は、“Not SLE”群からＳＬＥサンプルを識別したペプチドが、ペプチドライブラリー全体での同じモチーフの出現率に対して、図６Ａに列記された１以上のモチーフにおいて５倍（５００％）を超えて富化されたことを特定した。さらに、“Not SLE”サンプルからＳＬＥサンプルを識別するペプチドは、個々のアミノ酸において１．００倍（１００％）を超えて富化されることが見出された（図６Ｂ）。
【０１４３】
図７Ａおよび図７Ｂは、ＲＡ群のサンプルからＳＬＥサンプルを識別するペプチドにおいて富化されている、ペプチドモチーフ（図７Ａ）およびアミノ酸（図７Ｂ）を示す。ＳＬＥ対象からのサンプルから得られたシグナル結合データとＲＡ群からの結合データとの比較は、ＲＡ群からＳＬＥサンプルを識別したペプチドが、ペプチドライブラリー全体での同じモチーフの出現率に対して、図７Ａに列記された１以上のモチーフにおいて３．６倍（３６０％）を超えて富化されたことを特定した。さらに、ＲＡサンプルからＳＬＥサンプルを識別するペプチドは、個々のアミノ酸において１．２倍（１２０％）を超えて富化されることが見出された（図７Ｂ）。
【０１４４】
図８Ａおよび図８Ｂは、ＯＡ群のサンプルからＳＬＥサンプルを識別するペプチドにおいて富化されている、ペプチドモチーフ（図８Ａ）およびアミノ酸（図８Ｂ）を示す。ＳＬＥ対象からのサンプルから得られたシグナル結合データとＯＡ群からの結合データとの比較は、ＯＡ群からＳＬＥサンプルを識別したペプチドが、ペプチドライブラリー全体での同じモチーフの出現率に対して、図８Ａに列記された１以上のモチーフにおいて３．８倍（３８０％）を超えて富化されたことを特定した。さらに、ＯＡサンプルからＳＬＥサンプルを識別するペプチドは、個々のアミノ酸において１．２倍（１２０％）を超えて富化されることが見出された（図８Ｂ）。
【０１４５】
図９Ａおよび図９Ｂは、ＦＭ群のサンプルからＳＬＥサンプルを識別するペプチドにおいて富化されている、ペプチドモチーフ（図９Ａ）およびアミノ酸（図９Ｂ）を示す。ＳＬＥ対象からのサンプルから得られたシグナル結合データとＦＭ群からの結合データとの比較は、ＦＭ群からＳＬＥサンプルを識別したペプチドが、ペプチドライブラリー全体での同じモチーフの出現率に対して、図９Ａに列記された１以上のモチーフにおいて５倍（５００％）を超えて富化されたことを特定した。さらに、ＦＭサンプルからＳＬＥサンプルを識別するペプチドは、個々のアミノ酸において１．１倍（１１０％）を超えて富化されることが見出された（図９Ｂ）。
【０１４６】
図１０Ａおよび図１０Ｂは、ＳＳ群のサンプルからＳＬＥサンプルを識別するペプチドにおいて富化されている、ペプチドモチーフ（図１０Ａ）およびアミノ酸（図１０Ｂ）を示す。ＳＬＥ対象からのサンプルから得られたシグナル結合データとＳＳ群からの結合データとの比較は、ＳＳ群からＳＬＥサンプルを識別したペプチドが、ペプチドライブラリー全体での同じモチーフの出現率に対して、図１０Ａに列記された１以上のモチーフにおいて４．２倍（４２０％）を超えて富化されたことを特定した。さらに、ＦＭサンプルからＳＬＥサンプルを識別するペプチドは、個々のアミノ酸において１．３倍（１３０％）を超えて富化されることが見出された（図１０Ｂ）。
【０１４７】
ボルケーノプロットを用いて、シグナル強度の平均の対数差（log differences）（変化倍）に対するｔ検定 ｐ値の共散布としてサンプル間の識別を評価した。プロットされた各位置でのペプチドの密度は、ヒートスケールで示される。緑色の破線より上のペプチドは、多重性についてボンフェローニ法の調整を適用した後、９５％の信頼度で免疫シグネチャーによって各比較の２つの群を区別する識別用ペプチドとして選択された（図１１Ａ、図１１Ｂ、および図１１Ｃの緑色の線として示されている）。ボルケーノプロットは、識別用ペプチドの大部分がAll SLE群において低い結合強度を示したことを示す。図１１Ａ、図１１Ｂおよび図１１Ｃはそれぞれ、中央値で正規化されたアレイペプチド強度のボルケーノプロットを示している。
【０１４８】
ウェルチのｔ検定により、有意なペプチドが同定された。これは、ＳＬＥ対象群からのサンプルと各コントラスト群からのサンプルとの間で平均シグナルに有意差を有する個々のペプチドであった。例えば、図１１Ａ、図１１Ｂおよび図１１Ｃに示すように、ウェルチのｔ検定により、ＳＬＥ対象群からのサンプルと健康なドナー群からのサンプルとの間で平均シグナルに有意差を有する５１２１個の個々のペプチドを同定した（図１１Ａ）；ＳＬＥ対象群と他のＡＩ＋非ＡＩであるＡＩと類似の症状を呈する疾患を有する対象群との間で差異を示した６８４個の有意な部分を同定した（図１１Ｂ）；および、ＳＬＥ対象群とＳＬＥを有しない対象群（すなわち、“Not SLE”）との間の差異を示した２０４２個の有意な部分を同定した。コントラストそれぞれにおいてボンフェローニ・カットオフ値をパスしたペプチドを図１２に示す。４７８個のペプチドはすべてのコントラストに共通である。これらの４７８個のペプチドは、ＳＬＥ 対他のＡＩ＋非ＡＩであるＡＩと類似の症状を呈する疾患（“Other AI”と示す）コントラストの３分の２を構成し、同様の疾患からＳＬＥを一意に識別可能であることを示す。
【０１４９】
サポートベクターマシン（ＳＶＭ）分類器は、コントラストのそれぞれについて開発された。交差検証下、ウェルチのｔ検定でランク付けされた上位ｋ個のペプチドがモデルに入力され、ｋが２５から１０，０００の部分間で変化する場合に、最高のパフォーマンス（ＡＵＣ）が達成されたと判断された。図１３は、各コントラスト内の上位ｋ個のペプチドを用いて、５分割交差検証モデルを１００回繰り返した後のアッセイのパフォーマンスを示す。ＡＵＣ自体は広範囲のサンプルサイズで高い一貫性があるが、最適なｋはＡＵＣが最も高いｋとして選択された。コントラスト毎に二項分類器が開発された。図１３に示すグラフは、各コントラストモデルの入力ペプチドの最適サイズが大きくなる可能性がある例を示している。例えば、ＳＬＥ ｖ （ＨＣ）のコントラストの入力ペプチドのサイズは１００００であった。グラフはまた、入力ペプチドの数が増加してもＡＵＣが大きく変化しないことを示している。
【０１５０】
サポートベクターマシン（ＳＶＭ）モデルを用いて、健康な個体または他の類似の疾患に対するＳＬＥの可能性を予測できるペプチドの組み合わせを特定した。ｐ値でランク付けされた最大４０００個のペプチドを、ＳＶＭインプットとして用いた。５分割交差検証を１００回繰り返すことで、オーバーフィッティングの可能性を最小限に抑えた。図１４のヒストグラムは、ＳＬＥとリストされたサブグループ：健康なドナー（ＨＣ）、他のＡＩおよび非ＡＩであるＡＩと類似の症状を呈する疾患（“Other AI”）、およびNot SLE群（他のＡＩ＋非ＡＩであるＡＩと類似の症状を呈する疾患＋ＨＣ）を区別するための受容動作特性曲線の曲線下領域（ＡＵＣ）を示す。ＳＬＥ 対 健康の０．９のＡＵＣは、診断設定でのロバストな識別を示唆している。ＳＬＥと類似疾患との区別は、病因や症状の重複のために、より困難になり得る。
【０１５１】
図１５は、ＲＡ、シェーグレン症候群、ＯＡおよびＦＭから、ＳＬＥを区別するアッセイパフォーマンスを表すヒストグラムを示す。
【０１５２】
Ｍｕｌｔｉ＝ｃｌａｓｓモデル、すなわち、残りの関連疾患のグループからの１つの疾患の同時識別が図１６に示されており、これらの鑑別診断のためのＡＵＣおよび予測をもたらす。
【０１５３】
これらのデータは、ＳＬＥサンプルを、０．９のＡＵＣを有する健康なサンプルから識別し得ることを示す。これらのデータはまた、ＳＬＥが非自己免疫疾患（ＯＡおよび線維筋痛症）およびシェーグレン症候群から容易に区別されたことを示す。さらに、このデータまた、ＳＬＥが他のＡＩ＋非ＡＩであるＡＩと類似の症状を呈する疾患を有する患者のサンプルから区別できることも示している。
【０１５４】
従って、免疫シグネチャー（ＩＳ）技術は、健康な対照、または一般的な症状を有する疾患もしくは免疫調節不全の基礎疾患を有する対象から、ＳＬＥを有する対象を分類するために用いられ得る。
【０１５５】
実施例３−ＳＬＥ分類ペプチドをマッピングするプロテオームは、ＳＬＥの候補バイオマーカーを同定する。
実施例２に記載のコントラストにより同定された有意な識別用ペプチドを用いて、候補バイオマーカーを同定し得る。
ＳＬＥに関連する有意なペプチドをマッピングし、ＳＳＢの既知の免疫原性エピトープを含む抗原を推定した。
【０１５６】
健康な対象、他のＡＩ＋非ＡＩであるＡＩと類似の症状を呈する疾患、および“Not SLE”対象からＳＬＥを有意に識別したライブラリーペプチドを、固有の遺伝子ＩＤそれぞれについて最長の転写バリアントを用いた、２０１６年３月１０日編集のヒトゲノム build GrCh38に対応するヒトプロテオーム RefSeq release 84（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/）に、２０マー重複するスライディングウィンドウを使用する改良ＢＬＡＳＴアルゴリズムおよびスコアリングシステム（実施例１）を用いてアライメントした。ペプチドを、１０マーが重複するタンパク質の２０マーセグメントにアライメントした。結果として得られた上位２５個の候補バイオマーカータンパク質−標的領域のランク付けリストを、図１７Ａ、図１７Ｂおよび図１７Ｃに示す。遺伝子名／エピトープから〜〜アライメントスコアが供される。これらの分類ペプチドは、ライブラリーからランダムに選択された１０個の同じサイズのペプチドセットで同じ分析を実施することで得られた最大スコアを大きく上回るアライメントスコアの高い頻度を示す。
【０１５７】
ＳＬＥ分類ペプチドによりマッピングされた上位スコアの候補の中には、膜表面移行Ｌａ／ＳＳＢ抗原があった。特に、既知の臨床的に使用されているＳＬＥ自己抗原ＳＳＢは、各リストで上位にランク付けされている。具体的には、位置３４０−３６０のアミノ酸に含まれる３つの免疫優勢エピトープのうち１つが識別される。ＳＳＢ自己抗原は、細胞内ヒトＬａタンパク質の免疫優性エピトープのアミノ酸３４０−３６０にマッピングされる。これは、アポトーシス中に核局在シグナルが失われた後、核から細胞表面に再分配される[Neufing et al. (2005), Exposure and binding of selected immunodominant La/SSB epitopes on human apoptotic cells. Arthritis & Rheumatism, 52: 3934−3942. doi:10.1002/art.21486]（図１７Ａ、図１７Ｂ、および図１７Ｃ）。
【０１５８】
ＳＬＥ識別用ペプチドによりマッピングされる他の上位スコアの候補バイオマーカーには、ヒストンタンパク質が含まれた。ヒストンは核抗体の重要な標的抗原であり、抗核抗体（ＡＮＡ）および抗ヒストン抗体検査は、一般的に、ＳＬＥの診断に関連する自己抗体を検出する際に行われる［Manson and Rahman（2006）, Systemic Lupus Erythematosus. Orphanet Journal of Rare Diseases 1：6. doi 10.1186/1750-1172-1-6］（図１７Ａ、図１７Ｂ、および図１７Ｃ）。
【０１５９】
ＳＬＥ識別用ペプチドによってマッピングされた別の上位スコアの候補バイオマーカーは、ＨＭＧＮ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8318042−dopt=Abstractとして同定された。
【０１６０】
各コントラストにおける２５個の候補プロテオーム標的を合わせて、アライメントした識別用ペプチドを説明した。主要な候補バイオマーカーは、識別用ペプチドの総数の最大数まで識別することもできる。
【０１６１】
これらのデータは、ＳＬＥ自己抗原エピトープを模倣するアレイペプチドが、ＳＬＥ対象の末梢血抗体によって示差的に結合したことを示している。これらの識別用ペプチドは、ＳＬＥのいくつかの既知のマーカーにマッピングされた。リストされている他の候補標的は、ＳＬＥの新規マーカーである可能性がある。
【０１６２】
実施例４−ＲＡの鑑別診断
免疫シグネチャー（ＩＳ）を、健康な対照（ＨＣ）を含む対象、他のリウマチ性疾患（ＯＲＤ）、ＳＬＥ、ＯＡ、線維筋痛症（ＦＭ）、シェーグレン症候群（ＳＳ）を有する対象、他のＡＩ／非ＡＩであるＡＩと類似の症状を呈する疾患を有する対象群、およびNot RA対象の群から、ＲＡを有するＲＡ対象の群の対象を区別するために得た。他のリウマチ性疾患群（ＯＲＤ）（２３９）は、ＲＡ、ＳＳ、ＯＡ、乾癬性関節炎、痛風、血清反応陰性脊椎関節症、および偽痛風で構成された。リウマチ性疾患を有する対象は、ＡＣＲ基準に基づいて診断された。
【０１６３】
実施例１に記載のようにアッセイを行い、スキャンして、各部分におけるシグナル強度測定値を得た。グループ間のシグナルの差を示したペプチド部分は、上記のように、不等分散のウェルチ補正を伴う平均ペプチド強度のｔ検定によって決定された。
【０１６４】
表２は、コントラストのそれぞれについてのアッセイパフォーマンスの結果をＡＵＣ値として示す。
【表２】
2020524275.tif 000004
【０１６５】
各グループからＲＡを識別する有意なペプチドは、いくつかのアミノ酸およびペプチドモチーフが富化されていることが見出された。図１８から２４は、コントラストの各々において有意なペプチドを識別する部分において富化されているモチーフ（図１８Ａ−２４Ａ）およびアミノ酸（図１８Ｂ−２４Ｂ）を示す。有意なペプチドの総数は、各図に示されている。
【０１６６】
図１８Ａおよび図１８Ｂは、健康なドナー（ＨＣ）サンプルからＲＡサンプルを識別するペプチド中に富化されているペプチドモチーフ（図１８Ａ）およびアミノ酸（図１８Ｂを示す。ＳＬＥ対象由来のサンプルから得られたシグナル結合データとＨＣグループからの結合データとの比較により、ＨＣグループからＳＬＥサンプルを識別するペプチドが同定され、それは、ペプチドライブラリー全体での同じモチーフの出現率に対して、図１８Ａに列記された１以上のモチーフで４．６倍（４６０％）を超えて富化されていた。さらに、ＨＣサンプルからＳＬＥサンプルを区別するペプチドは、個々のアミノ酸において１（１００％）よりも多く富化されていることが見出された（図１８Ｂ）。
【０１６７】
図１９Ａおよび図１９Ｂは、“他のリウマチ性疾患”（ＯＲＤ）群のサンプルからＲＡサンプルを区別するペプチドにおいて富化されているペプチドモチーフ（図１９Ａ）およびアミノ酸（図１９Ｂ）を示す。ＲＡ対象由来のサンプルから得られたシグナル結合データとＯＲＤグループからの結合データとの比較により、ＯＲＤグループからＲＡサンプルを識別するペプチドが同定され、それは、ペプチドライブラリー全体での同じモチーフの出現率に対して、図１９Ａに列記された１以上のモチーフで４．８倍（４６０％）を超えて富化されていた。さらに、ＯＲＤサンプルからＲＡサンプルを区別するペプチドは、個々のアミノ酸において１．１（１１０％）よりも多く富化されていることが見出された（図１９Ｂ）。
【０１６８】
図２０Ａおよび図２０Ｂは、“Not RA”群のサンプルからＲＡサンプルを区別するペプチドにおいて富化されているペプチドモチーフ（図２０Ａ）およびアミノ酸（図２０Ｂ）を示す。ＲＡ対象由来のサンプルから得られたシグナル結合データと“Not RA”グループからの結合データとの比較により、“Not RA”グループからＲＡサンプルを識別するペプチドが同定され、それは、ペプチドライブラリー全体での同じモチーフの出現率に対して、図２０Ａに列記された１以上のモチーフで４．９倍（４９０％）を超えて富化されていた。さらに、“not RA”サンプルからＲＡサンプルを区別するペプチドは、個々のアミノ酸において１．１（１１０％）よりも多く富化されていることが見出された（図２０Ｂ）。
【０１６９】
図２１Ａおよび図２１Ｂは、“他のＡＩ＋非ＡＩであるＡＩと類似の症状を呈する疾患”群のサンプルからＲＡサンプルを区別するペプチドにおいて富化されているペプチドモチーフ（図２１Ａ）およびアミノ酸（図２１Ｂ）を示す。ＲＡ対象由来のサンプルから得られたシグナル結合データと“他のＡＩ＋非ＡＩであるＡＩと類似の症状を呈する疾患”グループからの結合データとの比較により、“他のＡＩ＋非ＡＩであるＡＩと類似の症状を呈する疾患”グループからＲＡサンプルを識別するペプチドが同定され、それは、ペプチドライブラリー全体での同じモチーフの出現率に対して、図２１Ａに列記された１以上のモチーフで４．８倍（４８０％）を超えて富化されていた。さらに、“他のＡＩ＋非ＡＩであるＡＩと類似の症状を呈する疾患”サンプルからＲＡサンプルを区別するペプチドは、個々のアミノ酸において１（１００％）よりも多く富化されていることが見出された（図２１Ｂ）。
【０１７０】
図２２Ａおよび図２２Ｂは、ＯＡ群のサンプルからＲＡサンプルを区別するペプチドにおいて富化されているペプチドモチーフ（図２２Ａ）およびアミノ酸（図２２Ｂ）を示す。ＲＡ対象由来のサンプルから得られたシグナル結合データとＯＡ群からの結合データとの比較により、ＯＡ群からＲＡサンプルを識別するペプチドが同定され、それは、ペプチドライブラリー全体での同じモチーフの出現率に対して、図２２Ａに列記された１以上のモチーフで３．３倍（３３０％）を超えて富化されていた。さらに、ＯＡサンプルからＲＡサンプルを区別するペプチドは、個々のアミノ酸において１．６（１６０％）よりも多く富化されていることが見出された（図２２Ｂ）。
【０１７１】
図２３Ａおよび図２３Ｂは、ＦＭ群のサンプルからＲＡサンプルを区別するペプチドにおいて富化されているペプチドモチーフ（図２３Ａ）およびアミノ酸（図２３Ｂ）を示す。ＲＡ対象由来のサンプルから得られたシグナル結合データとＦＭ群からの結合データとの比較により、ＦＭ群からＲＡサンプルを識別するペプチドが同定され、それは、ペプチドライブラリー全体での同じモチーフの出現率に対して、図２３Ａに列記された１以上のモチーフで３．９倍（３９０％）を超えて富化されていた。さらに、ＦＭサンプルからＲＡサンプルを区別するペプチドは、個々のアミノ酸において１．１（１１０％）よりも多く富化されていることが見出された（図２３Ｂ）。
【０１７２】
図２４Ａおよび図２４Ｂは、ＳＳ群のサンプルからＲＡサンプルを区別するペプチドにおいて富化されているペプチドモチーフ（図２４Ａ）およびアミノ酸（図２４Ｂ）を示す。ＲＡ対象由来のサンプルから得られたシグナル結合データとＳＳ群からの結合データとの比較により、ＳＳ群からＲＡサンプルを識別するペプチドが同定され、それは、ペプチドライブラリー全体での同じモチーフの出現率に対して、図２４Ａに列記された１以上のモチーフで４．２倍（４２０％）を超えて富化されていた。さらに、ＳＳサンプルからＲＡサンプルを区別するペプチドは、個々のアミノ酸において１．３（１３０％）よりも多く富化されていることが見出された（図２４Ｂ）。
【０１７３】
ＳＬＥコントラストについて記載のように、ボルケーノプロットを用いて、シグナル強度の平均の対数差（log differences）（変化倍）に対するｔ検定 ｐ値の共散布としてサンプル間の識別を評価した。プロットされた各位置でのペプチドの密度は、ヒートスケールで示される。緑色の破線より上のペプチドは、多重性についてボンフェローニ法の調整を適用した後、９５％の信頼度で免疫シグネチャーによって各比較の２つの群を区別する識別用ペプチドとして選択された（図２５Ａ、図２５Ｂ、および図２５Ｃの緑色の線として示されている）。図２５Ａ、図２５Ｂおよび図２５Ｃはそれぞれ、中央値で正規化されたアレイペプチド強度のボルケーノプロットを示している。
【０１７４】
ウェルチのｔ検定により、有意なペプチドが同定された。これは、ＲＡ対象群からのサンプルと各コントラスト群からのサンプルとの間で平均シグナルに有意差を有する個々のペプチドであった。例えば、図２５Ａ、図２５Ｂおよび図２５Ｃに示すように、ウェルチのｔ検定により、ＲＡ対象群からのサンプルと健康なドナー群からのサンプルとの間で平均シグナルに有意差を有する３０６２個の個々のペプチドを同定した（図２５Ａ）；ＲＡ対象群と“すべての疾患”、すなわち他のＡＩ＋非ＡＩであるＡＩと類似の症状を呈する疾患を有する対象群との間の差異を示した７４２個の有意な部分（図２５Ｂ）を同定した；および、ＲＡ対象群とＲＡを有しない対象群（すなわち、“Not RA”）との間の差異を示した１５６４個の有意な部分を同定した。コントラストそれぞれにおいてボンフェローニ・カットオフ値をパスしたペプチドを図２６に示す。４９１個のペプチドはすべてのコントラストに共通である。これらの４９１個のペプチドは、ＲＡ 対他のＡＩ＋非ＡＩであるＡＩと類似の症状を呈する疾患（“Other AI”と示す）コントラストの３分の２を構成し、同様の疾患からＲＡを一意に識別可能であることを示す。
【０１７５】
実施例２に記載のように、有意なペプチドはウェルチのｔ検定によって同定され、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）分類器はコントラストのそれぞれについて開発された。サポートベクターマシン（ＳＶＭ）モデルを用いて、健康な個体または他の類似疾患に対するＲＡの可能性を予測し得るペプチドの組合せを同定した。ｐ値でランク付けされた最大４０００個のペプチドを、ＳＶＭインプットとして用いた。５分割交差検証を１００回繰り返すことで、オーバーフィッティングの可能性を最小限に抑えた。
【０１７６】
図２７のヒストグラムは、ＲＡとリストされたサブグループ：健康なドナー（ＨＣ）、他のＡＩおよび非ＡＩであるＡＩと類似の症状を呈する疾患（“Other AI”）、およびNot SLE群（他のＡＩ＋非ＡＩである類似する症状を呈する疾患＋ＨＣ）を区別するための受容動作特性曲線の曲線下領域（ＡＵＣ）を示す。ＳＬＥ 対 健康の０．９のＡＵＣは、診断設定でのロバストな識別を示唆している。ＲＡ 対 健康の０．８のＡＵＣは、診断設定における差異を示す。
【０１７７】
ＲＡを有する対象のサンプルからのアレイ結合抗体のシグナル強度の比較は、ＲＡが他のＡＩおよび非ＡＩであるＡＩと類似の症状を呈する疾患から区別できることを示した（表２）。
【０１７８】
ＲＡサンプルをＳＬＥ、シェーグレン症候群、ＯＡおよび線維筋痛症から区別する際のアッセイパフォーマンスを示すヒストグラムを図２８に提供する。
【０１７９】
ＩＳ技術を用いて、ＲＡは、狼瘡を有する患者および健康な対照を含む、異なる状態からよく区別される。それにもかかわらず、ＲＡはまた、極わずかなｃｖＡＵＣを有するＳＳなどの密接に関連する状態からも区別され得る。結果は、ＩＳ技術が、症状の関連する種々の疾患にわたって、またはリウマチ評価と称される状態の患者において、複数の分類が可能な少量の血清サンプルを用いた単回検査を提供できることを示している。
【０１８０】
実施例５−ＲＡ分類ペプチドをマッピングするプロテオームは、ＳＬＥの候補バイオマーカーを同定する
実施例４に記載のように、健康な対象、他のＡＩ＋非ＡＩであるＡＩと類似の症状を呈する疾患、および“Not RA”対象からＲＡを有意に区別する、ｐ値によってランク付けされた、上位１０００個のライブラリーペプチドを、固有の遺伝子ＩＤそれぞれについて最長の転写バリアントを用いた、２０１６年３月１０日編集のヒトゲノム build GrCh38に対応するヒトプロテオーム RefSeq release 84（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/）に、２０マー重複するスライディングウィンドウを使用する改良ＢＬＡＳＴアルゴリズムおよびBLOSUM62ベースのスコアリングシステムを用いてアライメントした（実施例１）。ペプチドを、１０マーが重複するタンパク質の２０マーセグメントにアライメントした。結果として得られた上位２５個の候補バイオマーカータンパク質−標的領域のランク付けリストを、図２９Ａ、図２９Ｂおよび図２９Ｃに示す。遺伝子名／エピトープから〜〜アライメントスコアが供される。
【０１８１】
これらの分類ペプチドは、ライブラリーからランダムに選択された１０個の同じサイズのペプチドセットで同じ分析を実施することで得られた最大スコアを大きく上回るアライメントスコアの高い頻度を示す。
【０１８２】
ＲＡ分類ペプチドによりマッピングされた上位スコアの候補の中には、ＢｒＣＡ癌に関連するＭＮ１自己抗体があった［Wang、et al. “Plasma autoantibodies associated with basal-like breast cancers”、Cancer Epidemiol Biomaker Prev. 2015 Sep; 24(9): 1332−1340］。
【０１８３】
各コントラストの２５個の候補プロテオーム標的を合わせて、アライメントした識別用ペプチドを説明した。主要な候補バイオマーカーは、識別用ペプチドの総数の最大数まで識別することもできる。
【０１８４】
これらのデータは、ＲＡ自己抗原エピトープを模倣するアレイペプチドが、ＲＡ対象の末梢血抗体によって示差的に結合したことを示している。これらの識別用ペプチドは、ＲＡの新規マーカーである可能性があるいくつかのマーカーにマッピングされた。
【０１８５】
実施例６−種々の健康状態の同時分類
マルチ識別器分析においてＳＬＥ、ＲＡ、ＦＭ、ＯＡ、ＳＳおよびＨＣを互いに同時に識別するペプチドは、ペプチドライブラリー全体での同じモチーフの出現率に対して、図３０Ａに列記された１以上のモチーフにおいて１００％を超えて富化されていた。さらに、マルチ識別器分析においてＳＬＥ、ＲＡ、ＦＭ、ＯＡ、ＳＳおよびＨＣサンプルを互いに区別したペプチドは、図３０Ｂに列記した１以上のアミノ酸において１００％を超えて富化されていた。
【０１８６】
図３１に示すヒートマップは、６つの状態全てを含む試験コホートサンプルのそれぞれについて、バッグクロス検証モデル予測のクラスメンバーシップの平均予測確率を視覚化する。各サンプルには、０（黒色）から１００％（白色）の範囲の各結果の予測されたクラスメンバーシップがある。
【０１８７】
これらのデータは、免疫シグネチャーアッセイが、１つの健康状態を２つまたはそれ以上の他の状態から同時に区別できることを示している。
【０１８８】
実施例７−自動化アッセイおよびイメージングシステム
ペプチドマイクロアレイアッセイおよびイメージングプロセスは、自動化されたシステムである。システムには、主要な機能を自動化する２つのサブシステム：自動化されたアッセイシステムおよび自動化されたイメージングシステムがある。このプロセスには４つの工程がある。自動化されたアッセイシステムは、最初能３つの工程：サンプルの再フォーマット化、サンプルの希釈、およびアッセイの実施を行う。自動化されたイメージングシステムは、メージングプロセスの自動化を行う。サンプルの再フォーマット化およびサンプルの希釈は、アッセイの前にサンプルをセットアップするための個別の準備プロトコールとして実施されることを意図している。
【０１８９】
サンプルの再フォーマット化は、一度に１−９６サンプルで行われる。システムは、バーコード付きサンプルのマッピング出力ファイル（例えば、*.xls または *.csv 形式で）およびサンプルプレートの位置とバーコード情報を含むバーコードプレート（複数可）の再フォーマットされたそれらの位置を作成する。この情報は、サンプル追跡および管理の連鎖（chain of custody）のための下方プロトコールで用いられる。また、フォーマットされたエクセル文書などのヒトが読みやすいレポートファイルも作成する。サンプル再フォーマット化プロトコールの一例を、以下の表３に示す：
【０１９０】
【表３】
2020524275.tif 000005
【０１９１】
簡単に説明すると、サンプルの再フォーマット化は、チューブなどのその元の容器中にサンプルをロードし、検体プレート(destination plate)をロードすることを含む。サンプルをチューブからプレートに移すためのチップがシステムに提供される。バーコードを用いて、サンプルを追跡する。８つのグループでは、すべてのサンプルがプレートに移されるまで、サンプルがチューブから検体プレートのウェルに移される。
【０１９２】
サンプル希釈プロトコールの例を以下の表４に示す：
【表４】
2020524275.tif 000006
【０１９３】
簡単に説明すると、前の工程からのサンプルを、プレート中、希釈プレートおよび元のプレートから該希釈プレートに液体を移すためのチップを備えるシステムにロードする。サンプルを２段階で連続希釈する：元のプレートの一部をある量のバッファーに加えて混合し、その後、第１の希釈プレートの一部を第２の希釈プレートのある量のバッファーに加える。
【０１９４】
場合によっては、サンプルをさらに希釈する。サンプル希釈プロトコールの例を以下の表５に示す：
【表５】
2020524275.tif 000007
【０１９５】
いくつかのサンプルを、アッセイにおけるサンプルの濃度を最適化するために連続希釈する。連続希釈プロセスの例を以下の表６に示す：
【表６】
2020524275.tif 000008
【０１９６】
希釈したサンプルにアッセイを実施する。アッセイプロトコールの例を以下の表７に示す：
【表７】
2020524275.tif 000009
【０１９７】
簡単に説明すると、システムにアッセイカセットをロードし、希釈したサンプルをプレートにロードする。希釈したサンプルをカセットに適用する。カセットを密閉し、１時間振とう／インキュベートする。カセットを開封し、洗浄する。二次抗体をカセットに加え、密封し、１時間振とう／インキュベートする。カセットを洗浄し、その後、イメージングの準備をする。
【０１９８】
アッセイが実施されると、イメージングはアッセイの結果を収集する。イメージングプロトコルの例を以下の表８に示す：
【表８】
2020524275.tif 000010
【図１】
2020524275.tif 000011
【図２】
2020524275.tif 000012
【図３】
2020524275.tif 000013
【図４−１】
2020524275.tif 000014
【図４−２】
2020524275.tif 000015
【図５−１】
2020524275.tif 000016
【図５−２】
2020524275.tif 000017
【図６−１】
2020524275.tif 000018
【図６−２】
2020524275.tif 000019
【図７−１】
2020524275.tif 000020
【図７−２】
2020524275.tif 000021
【図８−１】
2020524275.tif 000022
【図８−２】
2020524275.tif 000023
【図９−１】
2020524275.tif 000024
【図９−２】
2020524275.tif 000025
【図１０−１】
2020524275.tif 000026
【図１０−２】
2020524275.tif 000027
【図１１−１】
2020524275.tif 000028
【図１１−２】
2020524275.tif 000029
【図１２】
2020524275.tif 000030
【図１３】
2020524275.tif 000031
【図１４】
2020524275.tif 000032
【図１５】
2020524275.tif 000033
【図１６】
2020524275.tif 000034
【図１７−１】
2020524275.tif 000035
【図１７−２】
2020524275.tif 000036
【図１７−３】
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【図１８−１】
2020524275.tif 000038
【図１８−２】
2020524275.tif 000039
【図１９−１】
2020524275.tif 000040
【図１９−２】
2020524275.tif 000041
【図２０−１】
2020524275.tif 000042
【図２０−２】
2020524275.tif 000043
【図２１−１】
2020524275.tif 000044
【図２１−２】
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【図２２−１】
2020524275.tif 000046
【図２２−２】
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【図２３−１】
2020524275.tif 000048
【図２３−２】
2020524275.tif 000049
【図２４−１】
2020524275.tif 000050
【図２４−２】
2020524275.tif 000051
【図２５−１】
2020524275.tif 000052
【図２５−２】
2020524275.tif 000053
【図２６】
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【図２７】
2020524275.tif 000055
【図２８】
2020524275.tif 000056
【図２９−１】
2020524275.tif 000057
【図２９−２】
2020524275.tif 000058
【図２９−３】
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【図３０−１】
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【図３０−２】
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【図３１】
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【図３２−１】
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【図３２−２】
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【図３３−１】
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【図３３−２】
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【図３４−１】
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【図３４−２】
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【図３５−１】
2020524275.tif 000069
【図３５−２】
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【図３６−１】
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【図３６−２】
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【図３７−１】
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【図３７−２】
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【配列表】
2020524275000001.app
【国際調査報告】
2020524275.tif 000075
2020524275.tif 000076
2020524275.tif 000077
2020524275.tif 000078
2020524275.tif 000079
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