(57)【要約】  ヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）ムテインまたはそのバリアントが提供される。特に、癌治療のための抗ＰＤ−１抗体との併用療法で使用するための、野生型ＩＬ−２と比較してＩＬ−２Ｒｐ受容体に対する増加した結合能力を有する、ＩＬ−２ムテインが提供される。そのような抗ＰＤ−１抗体と、開示されるＩＬ−２ムテインと、を含む、薬学的組成物もまた、提供される。【選択図】図１
2020524174.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌を治療する方法であって、
（ｉ）抗ＰＤ−１抗体もしくは阻害剤、または抗ＰＤ−Ｌ１抗体もしくは阻害剤と、
（ｉｉ）以下のアミノ酸置換、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含むＩＬ−２ムテインであって、その番号付けが、配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従う、ＩＬ−２ムテインと、を含む、併用治療を投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記抗ＰＤ−１抗体もしくは阻害剤が、ニボルマブ、ＢＭＳ−９３６５５８、ＭＤＸ−１１０６、ＯＮＯ−４５３８、ＡＭＰ２２４、ＣＴ−０１１、およびＭＫ−３４７５（ペンブロリズマブ）、セミプリマブ（ＲＥＧＮ２８１０）、ＳＨＲ−１２１０（ＣＴＲ２０１６０１７５およびＣＴＲ２０１７００９０）、ＳＨＲ−１２１０（ＣＴＲ２０１７０２９９およびＣＴＲ２０１７０３２２）、ＪＳ−００１（ＣＴＲ２０１６０２７４）、ＩＢＩ３０８（ＣＴＲ２０１６０７３５）、ＢＧＢ−Ａ３１７（ＣＴＲ２０１６０８７２）、ならびに米国特許公開第２０１７／００８１４０９号で列挙されているＰＤ−１抗体からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体もしくは阻害剤が、アテゾリズマブ、アベルマブ、およびデュルバルマブからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＩＬ−２ムテインが、Ｆ４２Ａ置換をさらに含み、その番号付けが、配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従う、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＩＬ−２ムテインが、Ｋ４３Ｎ置換をさらに含み、その番号付けが、配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従う、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＩＬ−２ムテインが、Ｆ４２Ａ置換をさらに含み、その番号付けが、配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従う、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＩＬ−２ムテインが、Ｙ４５Ａ置換をさらに含み、その番号付けが、配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従う、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＩＬ−２ムテインが、Ｅ６２Ａ置換をさらに含み、その番号付けが、配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従う、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＩＬ−２ムテインが、融合タンパク質である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記融合タンパク質が、Ｆｃ抗体断片に連結された前記ＩＬ−２を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｆｃ抗体断片が、ヒトＦｃ抗体断片である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｆｃ抗体断片が、Ｎ２９７Ａ置換を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記融合タンパク質が、アルブミンに連結された前記ＩＬ−２を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記癌が、前立腺癌、卵巣癌、乳癌、子宮内膜癌、多発性骨髄腫、黒色腫、リンパ腫、小細胞肺癌を含む肺癌、腎臓癌、肝臓癌、結腸癌、結腸直腸癌、膵臓癌、胃癌、および脳癌からなる群から選択される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記癌が、結腸癌である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＩＬ−２ムテインが、野生型ヒトＩＬ−２と比較して、ＩＬ−２Ｒβに対して増加した結合能力を示す、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＩＬ−２ムテインが、野生型ヒトＩＬ−２と比較して、ＩＬ−２Ｒβに対してより高い結合親和性を示す、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＩＬ−２ムテインが、野生型ヒトＩＬ−２と比較して、ＣＤ２５に対して減少した結合親和性を示す、請求項４〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
抗ＰＤ−１抗体または阻害剤と、請求項１〜１３または１６〜１８のいずれかに記載のＩＬ−２ムテインと、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づいて、２０１７年６月１９日に出願された米国特許出願第６２／５２１，９５７号および２０１８年６月１日に出願された第６２／６７９，６８７号に対する優先権を主張するものであり、そのすべては参照により本明細書へそのすべてが明白に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
インターロイキン２（ＩＬ−２）は、活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞によって主に産生される多能性サイトカインであり、正常な免疫応答の産生に重要な役割を果たす。ＩＬ−２は、活性化Ｔリンパ球の増殖および拡大を促進し、Ｂ細胞の成長を増強し、単球およびナチュラルキラー細胞を活性化する。これらの活性のおかげで、ＩＬ−２が試験され、認可された癌治療として使用されている（アルデスロイキン、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標））。真核細胞では、ヒトＩＬ−２は１５３アミノ酸の前駆体ポリペプチドとして合成され、そこから２０アミノ酸が除去されて、成熟分泌型ＩＬ−２が生成される（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ  １９８３）。組換えヒトＩＬ−２は、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  １９８４）、昆虫細胞（Ｓｍｉｔｈ  １９８５）、および哺乳類ＣＯＳ細胞（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ  １９８３）において産生されてきた。
【０００３】
インターロイキン−２（ＩＬ−２）は、Ｔ細胞成長因子として最初に同定された４つのαらせん状束Ｉ型サイトカインである（Ｍｏｒｇａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９３：１００７（１９７６））が、その後、幅広い作用があることが示されている。ＩＬ−２はＴヘルパー分化を促進し（Ｚｈｕら、Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２８：４４５（２０１０）；Ｌｉａｏら、Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：１２８８（２００８）；およびＬｉａｏら、Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １２：５５１（２０１１））、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の発達を促進し（Ｃｈｅｎｇら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  ２４１：６３（２０１１））、ナチュラルキラーおよびリンホカイン活性化キラー活性を誘導し（Ｌｉａｏら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３８：１３（２０１３））、活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）を仲介する（Ｌｅｎａｒｄｏら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５３：８５８（１９９１））。
【０００４】
ＩＬ−２は、３つの異なる受容体、インターロイキン２受容体アルファ（ＩＬ−２Ｒα；ＣＤ２５）、インターロイキン２受容体ベータ（ＩＬ−２Ｒβ；ＣＤ１２２）、およびインターロイキン２受容体ガンマ（ＩＬ−２Ｒγ；ＣＤ１３２；一般的なガンマ鎖）と相互作用することにより作用する。同定された最初の受容体はＩＬ−２Ｒαであり、これはＴ細胞活性化時に現れる５５ｋＤのポリペプチド（ｐ５５）であり、元々Ｔａｃ（Ｔ活性化）抗原と呼ばれていた。ＩＬ−２Ｒαは約１０−８ＭのＫｄでＩＬ−２に結合し、「低親和性」ＩＬ−２受容体としても知られている。ＩＬ−２Ｒαのみを発現する細胞へのＩＬ−２の結合は、検出可能な生物学的応答を引き起さない。ほとんどの場合、ＩＬ−２は、３つの異なる受容体、ＩＬ−２Ｒα、ＩＬ−２Ｒβ、およびＩＬ−２Ｒγを介して作用する。休止Ｔ細胞などのほとんどの細胞は、それらがＩＬ−２に対する親和性が低いＩＬ−２ＲβおよびＩＬ−２Ｒγのみを発現するため、ＩＬ−２に応答しない。刺激すると、休止Ｔ細胞は比較的親和性の高いＩＬ−２受容体ＩＬ−２Ｒαを発現する。ＩＬ−２のＩＬ−２Ｒαへの結合により、この受容体は順次ＩＬ−２ＲβおよびＩＬ−２Ｒγの係合を引き起こし、Ｔ細胞活性化をもたらす。ＩＬ−２Ｒβに対する結合親和性が強化されたために作用が増強されたＩＬ−２「スーパーカイン」が以前に開発された（Ｌｅｖｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ４８４：５２９（２０１２））。
【０００５】
ＩＬ−２スーパーアゴニストを含むＩＬ−２に関する豊富な知識にもかかわらず、抗ＰＤ−１抗体との併用療法および腫瘍溶解性ウイルスまたはＣＡＲ−Ｔ細胞との併用療法を含む、癌の治療のためのより良い併用療法のための技術が、依然として必要とされている。本発明はこの必要性を満たし、癌の治療のためのＩＬ−２スーパーアゴニストまたはアゴニストの併用療法、特に、野生型ＩＬ−２に従って番号付された置換Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６ＶおよびＩ９２Ｆを含むＩＬ−２ムテインと抗ＰＤ−１抗体との併用を提供する。
【発明の概要】
【０００６】
ＩＬ−２は免疫系に幅広い影響を及ぼし、免疫活性化と恒常性維持の両方の調節に重要な役割を果たす。免疫系刺激剤として、本発明のＩＬ−２ムテインは、癌の治療のために抗ＰＤ−１抗体と組み合わせて使用されることが見出された。
【０００７】
別の態様では、抗ＰＤ−１抗体または阻害剤と組み合わせてＩＬ−２ムテインを投与することを含む、癌を有する対象を治療する方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、本方法は、本明細書に開示されるＩＬ−２ムテインのいずれか１つを含む薬学的組成物の治療的有効量を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、アミノ酸置換、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを有するＩＬ−２ムテインを含む。
【０００８】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、（ｉ）抗ＰＤ−１抗体または阻害剤と、（ｉｉ）以下のアミノ酸置換、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６ＶおよびＩ９２Ｆを含むＩＬ−２ムテインであって、その番号付けは配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従うものであるＩＬ−２ムテインと、を含む併用治療を投与することを含む、癌を治療する方法を提供する。
【０００９】
いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体または阻害剤は、ニボルマブ、ＢＭＳ−９３６５５８、ＭＤＸ−１１０６、ＯＮＯ−４５３８、ＡＭＰ２２４、ＣＴ−０１１、およびＭＫ−３４７５（ペンブロリズマブ）、セミプリマブ（ＲＥＧＮ２８１０）、ＳＨＲ−１２１０（ＣＴＲ２０１６０１７５およびＣＴＲ２０１７００９０）、ＳＨＲ−１２１０（ＣＴＲ２０１７０２９９およびＣＴＲ２０１７０３２２）、ＪＳ−００１（ＣＴＲ２０１６０２７４）、ＩＢＩ３０８（ＣＴＲ２０１６０７３５）、ＢＧＢ−Ａ３１７（ＣＴＲ２０１６０８７２）、ならびに米国特許公開第２０１７／００８１４０９号で列挙されているＰＤ−１抗体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体または阻害剤は、アテゾリズマブ、アベルマブ、およびデュルバルマブからなる群から選択される。
【００１０】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインはＦ４２Ａ置換をさらに含み、その番号付けは配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従う。いくつかの実施形態では、Ｆ４２Ａ置換をさらに含むＩＬ−２ムテインは、野生型ヒトＩＬ−２と比較してＣＤ２５に対して低下した結合親和性を示す。
【００１１】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインはＫ４３Ｎ置換をさらに含み、その番号付けは配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従う。いくつかの実施形態では、Ｋ４３Ｎ置換をさらに含むＩＬ−２ムテインは、野生型ヒトＩＬ−２と比較してＣＤ２５に対して低下した結合親和性を示す。
【００１２】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインはＹ４５Ａ置換をさらに含み、その番号付けは配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従う。いくつかの実施形態では、Ｙ４５Ａ置換をさらに含むＩＬ−２ムテインは、野生型ヒトＩＬ−２と比較してＣＤ２５に対して低下した結合親和性を示す。
【００１３】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインはＥ６２Ａ置換をさらに含み、その番号付けは配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従う。いくつかの実施形態では、Ｅ６２Ａ置換をさらに含むＩＬ−２ムテインは、野生型ヒトＩＬ−２と比較してＣＤ２５に対して低下した結合親和性を示す。
【００１４】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインは融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、アルブミンに連結した前述のＩＬ−２を含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、Ｆｃ抗体断片に連結した前述のＩＬ−２を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ抗体断片はヒトＦｃ抗体断片である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ抗体断片はＮ２９７Ａ置換を含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、癌は、前立腺癌、卵巣癌、乳癌、子宮内膜癌、多発性骨髄腫、黒色腫、リンパ腫、小細胞肺癌を含む肺癌、腎臓癌、肝臓癌、結腸癌、結腸直腸癌、膵臓癌、胃癌、および脳癌からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、癌は結腸癌である。
【００１６】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、野生型ヒトＩＬ−２と比較してＩＬ−２Ｒβに対して増加した結合能力を示す。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、野生型ヒトＩＬ−２と比較してＩＬ−２Ｒβに対してより高い結合親和性を示す。
【００１７】
前記ＩＬ−２ムテインが、野生型ヒトＩＬ−２と比較してＣＤ２５に対して減少した結合親和性を示す、請求項３〜７のいずれか１項に記載の方法。
【００１８】
別の態様では、本明細書に記載のＩＬ−２ムテインまたはＩＬ−２ムテイン融合タンパク質のいずれか１つおよび薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、アミノ酸置換、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを有するＩＬ−２ムテインを含む。
【００１９】
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、抗ＰＤ−１抗体または阻害剤、本明細書に記載のＩＬ−２ムテインのいずれか、および薬学的に許容される担体を含む。
【００２０】
本発明はまた、インターロイキン−２受容体β（ＩＬ−２Ｒβ）結合タンパク質を含む免疫細胞標的化または発現構築物を提供し、ここで、前述の結合タンパク質のＩＬ−２Ｒβの平衡解離定数は野生型ヒトＩＬ−２（ｈＩＬ−２）のものよりも小さく；少なくとも１つの他の標的化部分を含む免疫細胞標的化または発現構築物に連結されている。
【００２１】
いくつかの実施形態では、免疫細胞標的化または発現構築物は、Ｔ細胞、例えばＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞に対して細胞傷害性効果を示す。
【００２２】
いくつかの実施形態では、構築物はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であり、ＩＬ−２ムテインは膜貫通ドメインに融合され、細胞内シグナル伝達領域に連結されている。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達領域はＣＤ３シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達領域は、ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン、ＣＤ１３７シグナル伝達ドメイン、ＯＸ−４０シグナル伝達ドメイン、ＩＣＯＳシグナル伝達ドメイン、ＤＡＰ１０シグナル伝達ドメインのうちの１つ以上を含む。
【００２３】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインまたは他の標的化部分は、ＴＣＲ複合体に関連するタンパク質に結合するリガンドに融合され、Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインポリペプチドに融合される。
【００２４】
いくつかの実施形態では、ＴＣＲ複合体に関連するタンパク質はＣＤ３である。
【００２５】
いくつかの態様において、Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインポリペプチドは、ＣＤ４細胞質ゾルドメインおよびＣＤ４膜貫通ドメインを含む。
【００２６】
いくつかの実施形態では、構築物は、ＩＬ−２または他の標的化部分のムテインに高親和性で結合するキメラ抗原受容体成分を含む抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）である。
【００２７】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲ成分はＣＤ１６を含み、ＩＬ−２ムテインまたは他の標的化部分はＦｃ配列に融合している。
【００２８】
いくつかの実施形態では、構築物は、Ｔ細胞受容体の成分に結合する抗体の可変領域に融合したＩＬ−２ムテインを含む二重特異性Ｔ細胞交換体（ＢｉＴＥ）である。
【００２９】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞受容体のＢｉＴＥ成分はＣＤ３である。
【００３０】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、野生型ｈＩＬ−２に従って番号付けされた、以下のアミノ酸置換、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含む。
【００３１】
いくつかの実施形態では、上記の構築物をコードする（ｅｎｄｏｃｄｉｎｇ）核酸が提供される。
【００３２】
いくつかの実施形態では、核酸を含むベクターが提供される。
【００３３】
いくつかの実施形態では、上記の構築物またはベクターを含むＴ細胞が提供される。いくつかの態様では、Ｔ細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞である。いくつかの態様では、Ｔ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【００３４】
いくつかの実施形態では、上記の構築物またはベクターを含むＮＫ細胞が提供される。
【００３５】
上記の免疫細胞の単離された集団も提供される。
【００３６】
上記の免疫細胞集団を含む薬学的製剤も提供される。
【００３７】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２受容体を発現する細胞を含むＩＬ−２受容体を発現する細胞を標的とする方法が提供され、その方法は、細胞を上記の免疫細胞集団を含む製剤と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、接触はインビトロである。いくつかの実施形態では、接触はインビボである。
【００３８】
本発明はまた、癌を治療する方法を提供し、この方法は、癌を有する個体を上記の免疫細胞集団を含む製剤の有効用量と接触させることを含む。
【００３９】
いくつかの実施形態では、癌は、白血病、リンパ腫、膠芽腫、髄芽腫、乳癌、頭頸部癌、腎臓癌、卵巣癌、カポジ肉腫、急性骨髄性白血病、Ｂ系列悪性腫瘍、結腸直腸、膵臓、腎臓、または中皮腫である。
【００４０】
本発明はまた、癌細胞をＩＬ−２ムテイン腫瘍溶解性ウイルスの組み合わせと接触させることを含む、ＩＬ−２ムテインタンパク質を癌細胞に対して標的化するための方法を提供し、その組み合わせは、腫瘍溶解性ウイルスによりコンジュゲートまたは発現されるＩＬ−２ムテインを含み、その腫瘍溶解性ウイルスは、癌細胞を標的化することができる。
【００４１】
いくつかの実施形態では、接触はインビトロで起こる。いくつかの実施形態では、接触はインビボで起こる。
【００４２】
いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、アデノウイルス、自己複製アルファウイルス、ワクシニアウイルス、セネカバレー（Ｓｅｎｅｃａ  Ｖａｌｌｅｙ）ウイルス、ニューカッスル（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ）病ウイルス、マラバ（Ｍａｒａｂａ）ウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２を含む）、麻疹ウイルス、ポリオウイルス、レオウイルス、コクサッキー（ｃｏｘｓａｃｋｉｅ）ウイルス、レンチウイルス、モルビリウイルス、インフルエンザウイルス、シンビス（Ｓｉｎｂｉｓ）ウイルス、粘液腫ウイルス、およびレトロウイルスからなる群から選択される。
【００４３】
いくつかの実施形態では、ワクシニアウイルスゲノムは、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子における置換および／または部分的に欠失したチミジンキナーゼ遺伝子を提供する少なくとも１つのヌクレオチドの欠失を切除するオープンリーディングフレームによって不活性化されるチミジンキナーゼ遺伝子を含み、ワクシニア成長因子遺伝子は欠失しており、改変されたワクシニアウイルスベクターは、本明細書に記載のＩＬ−２ムテインをコードする少なくとも１つの核酸配列を含む。
【００４４】
いくつかの実施形態では、インビボ接触により、腫瘍溶解性ウイルスにコンジュゲートしていないＩＬ−２ムテインタンパク質の濃度と比較して、腫瘍微小環境におけるＩＬ−２ムテインタンパク質の濃度の増加が生じる。
【００４５】
いくつかの実施形態では、改変された腫瘍溶解性ウイルスは、治療上の利点を改善するために、ＩＬ−２ムテインを、腫瘍関連マクロファージおよびＭＤＳＣ（骨髄由来サプレッサー細胞）などの腫瘍微小環境（ＴＭＥ）の免疫抑制細胞に対して標的化する。
【００４６】
いくつかの実施形態では、改変腫瘍溶解性ウイルスは、ＩＬ−２ムテインを、１つ以上の腫瘍抗原を発現する１つ以上の免疫抑制細胞に標的化する。
【００４７】
いくつかの実施形態では、改変腫瘍溶解性ウイルスは、ＩＬ−２ムテインをＴＭＥに標的化する。
【００４８】
いくつかの態様では、ＩＬ−２ムテインタンパク質はエフェクターＴ細胞および／またはＮＫ細胞を増強する。
【００４９】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインはＴｒｅｇ活性を抑制する。
【００５０】
いくつかの態様では、ＩＬ−２は、以下のアミノ酸置換、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含み、その番号付けは配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従う。
【００５１】
本発明によれば、ベクターがワクシニアウイルスゲノムを含み、そのチミジンキナーゼ遺伝子が、チミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ）遺伝子における置換および／または部分的に欠失したチミジンキナーゼ遺伝子を提供する少なくとも１つのヌクレオチドの欠失を切除するオープンリーディングフレームによって不活性化され、ワクシニア成長因子遺伝子が欠失しており、改変されたワクシニアウイルスベクターが、本明細書に記載のＩＬ−２ムテインをコードする少なくとも１つの核酸配列を含む、という点を特徴とする、改変されたワクシニアウイルスベクターも提供される。
【００５２】
本発明によれば、（ｉ）コードされたＥ１Ａポリペプチドのアミノ酸１２２〜１２９をコードするヌクレオチドが場合により欠失された改変された核酸と、（ｉｉ）本明細書に記載のＩＬ−２ムテインをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットと、を含む改変された腫瘍溶解性アデノウイルスも提供される。
【００５３】
いくつかの実施形態では、治療上の利点を改善するために、ＩＬ−２ムテインは、改変された腫瘍溶解性ウイルスを、腫瘍関連マクロファージおよびＭＤＳＣ（骨髄由来サプレッサー細胞）などの腫瘍微小環境（ＴＭＥ）の免疫抑制細胞に指向させる。
【００５４】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインタンパク質は、改変された腫瘍溶解性ウイルスを１つ以上の腫瘍抗原に指向させる。
【００５５】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインタンパク質は、改変された腫瘍溶解性ウイルスをＴＭＥに指向させる。
【００５６】
いくつかの態様では、ＩＬ−２ムテインタンパク質はエフェクターＴ細胞およびＮＫ細胞を増強する。
【００５７】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインはＴｒｅｇ活性を抑制する。
【００５８】
本発明はまた、ＩＬ−２ムテインを発現することができるおよび腫瘍溶解性ウイルスを、それらを必要とする対象に投与することを含む、癌を治療する方法を提供する。いくつかの態様では、ＩＬ−２ムテインは、以下のアミノ酸置換、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含み、その番号付けは配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従う。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２腫瘍溶解性ウイルスは、アデノウイルス、自己複製アルファウイルス、ワクシニアウイルス、セネカバレー（Ｓｅｎｅｃａ  Ｖａｌｌｅｙ）ウイルス、ニューカッスル（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ）病ウイルス、マラバ（Ｍａｒａｂａ）ウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２を含む）、麻疹ウイルス、ポリオウイルス、レオウイルス、コクサッキー（ｃｏｘｓａｃｋｉｅ）ウイルス、レンチウイルス、モルビリウイルス、インフルエンザウイルス、シンビス（Ｓｉｎｂｉｓ）ウイルス、粘液腫ウイルス、およびレトロウイルスからなる群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】Ｈ９は抗ＰＤ−１免疫療法と相乗作用する。併用療法は、用量依存的な様式で強固な応答を生み出す。抗ＰＤ−１抗体を１０ｍｇ／ｋｇで、４日ごとに３回（１０ｍｇ／ｋｇ  ＩＶ  ｑ４ｄｘ３）、静脈内投与した。Ｈ９（アミノ酸置換、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを有するＩＬ−２ムテイン、その番号付けは配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従う）を、５μｇｑ．ｄ．または２５μｇｑ．ｄ．の示された投与量（投与量はμｇ／マウス）で、同じ投与レジメンに従って、投与した。次に、ＭＣ３８結腸癌モデルマウスを腫瘍移植後最大４０日間監視した。抗ＰＤ−１抗体とＨ９の組み合わせにより、低投与量と高投与量の両方で治癒の数が増加し、Ｈ９の２５ｕｇｑ．ｄの投与量で実質的に増加した。
【図２】ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４配列の例を提供する。
【図３】例示的なＨ９−Ｆｃ融合配列を提供する。
【図４】ＩＬ−１３Ｒα１−およびＩＬ−１３Ｒα２−特異的ＩＬ−１３バリアントの比較分析。ヒトＩＬ−１３およびＩＬ−１３Ｒα１およびＩＬ−１３Ｒα２選択的バリアント配列は、示された残基番号について示される。速度論的および親和性パラメータは、表面プラズモン共鳴により決定された。
【図５】Ｈ９−Ｆｃは、主要な免疫細胞に対する効力を改善し、Ｈ９およびＨ９−Ｆｃは、腫瘍細胞殺傷に関与する主要なエフェクターＴ細胞、特にＣＤ８＋Ｔ細胞に対する効力を大いに改善した。Ｈ９およびそのＦｃバリアントは、Ｔｒｅｇに対する効力を失わないが、抗腫瘍エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞の相対的な活性化を大幅に増加させることができる。
【図６】Ｈ９−Ｆｃは同様のインビボ効力を有し、Ｈ９に対してＰＫプロファイルが拡張されている。Ｈ９の拡張されたＰＫバリアントについての最適化された用量とスケジュールが同定された。Ｈ９−Ｆｃは、マウスで使用される抗ＰＤ−１抗体と同様のスケジュールである隔週のスケジュールで効果的なＢ１６Ｆ１０腫瘍制御を可能とする。したがって、本発明者らは、毎週または２週間に１回のＨ９−Ｆｃ投与を予測する。皮下投与：皮下Ｈ９−Ｆｃは、将来の免疫療法薬のために有利な投与アプローチである。チェックポイント阻害剤、プロロイキンおよび競合ＩＬ−２療法（ＮＫＴＲ−２１４、ＡＬＫＳ  ４２３０）はすべて、ＩＶ点滴を必要とし、診療所での長時間の投与と監視時間が必要である。皮下投与は、一般的な標的の癌治療のために患者が一般的に好む迅速で便利な投与を提供する。
【図７】本発明の組み合わせで使用するための例示的な抗ＰＤ−１抗体。
【図８】本発明の組み合わせで使用するための例示的な抗ＰＤ−Ｌ１抗体。
【図９】例示的な腫瘍溶解性ウイルス。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
本開示をより容易に理解するために、特定の用語および語句が、本明細書全体を通して以下で定義される。
【００６１】
定義
本明細書で引用されたすべての参考文献は、完全に記載されているかのようにその全体が参照により組み込まれる。別に定義されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３ｒｄ  ｅｄ．、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ  ２００１）；Ｍａｒｃｈ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ、Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５ｔｈ  ｅｄ．、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ  ２００１）；ならびにＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｒｄ  ｅｄ．、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ  ２００１）は、本開示で使用される多くの用語に対する一般的なガイドを当業者に提供する。必要に応じて、市販のキットと試薬の使用を伴う手順は、特に明記されていない限り、一般的に、製造元が定義したプロトコルおよび／またはパラメータに従って実施される。
【００６２】
本明細書で使用する場合、「ＩＬ−２」は、天然または組換えに関わらず、野生型ＩＬ−２を意味する。成熟ヒトＩＬ−２は、Ｆｕｊｉｔａら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、８０、７４３７−７４４１（１９８３）に記載されているように、１３３個のアミノ酸配列（追加の２０個のＮ末端アミノ酸からなるシグナルペプチドより少ない）として生じる。ヒトＩＬ−２のアミノ酸配列（配列番号１、全長）はＧｅｎｂａｎｋアクセッションロケーターＮＰ＿０００５７７．２において見出される。成熟ヒトＩＬ−２のアミノ酸配列は、配列番号２に示されている（ヒト野生型成熟；置換の位置番号付けはこの配列に基づく）。マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＩＬ−２アミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッションロケーター（配列番号３）において見出される。成熟マウスＩＬ−２のアミノ酸配列は、配列番号４に示される。
配列番号１  ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＱＳＩＩＳＴＬＴ
配列番号２
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＱＳＩＩＳＴＬＴ
配列番号３
ＭＹＳＭＱＬＡＳＣＶＴＬＴＬＶＬＬＶＮＳＡＰＴＳＳＳＴＳＳＳＴＡＥＡＱＱＱＱＱＱＱＱＱＱＱＱＨＬＥＱＬＬＭＤＬＱＥＬＬＳＲＭＥＮＹＲＮＬＫＬＰＲＭＬＴＦＫＦＹＬＰＫＱＡＴＥＬＫＤＬＱＣＬＥＤＥＬＧＰＬＲＨＶＬＤＬＴＱＳＫＳＦＱＬＥＤＡＥＮＦＩＳＮＩＲＶＴＶＶＫＬＫＧＳＤＮＴＦＥＣＱＦＤＤＥＳＡＴＶＶＤＦＬＲＲＷＩＡＦＣＱＳＩＩＳＴＳＰＱ
配列番号４
ＡＰＴＳＳＳＴＳＳＳＴＡＥＡＱＱＱＱＱＱＱＱＱＱＱＱＨＬＥＱＬＬＭＤＬＱＥＬＬＳＲＭＥＮＹＲＮＬＫＬＰＲＭＬＴＦＫＦＹＬＰＫＱＡＴＥＬＫＤＬＱＣＬＥＤＥＬＧＰＬＲＨＶＬＤＬＴＱＳＫＳＦＱＬＥＤＡＥＮＦＩＳＮＩＲＶＴＶＶＫＬＫＧＳＤＮＴＦＥＣＱＦＤＤＥＳＡＴＶＶＤＦＬＲＲＷＩＡＦＣＱＳＩＩＳＴＳＰＱ
【００６３】
本明細書で使用される場合、「ＩＬ−２ムテイン」は、インターロイキン−２タンパク質に対する特異的置換がなされたＩＬ−２ポリペプチドを意味する。ＩＬ−２ムテインは、天然のＩＬ−２ポリペプチド鎖の１つ以上の部位または他の残基におけるアミノ酸の挿入、欠失、置換、および改変によって特徴付けられる。本開示によれば、そのような挿入、欠失、置換および改変はいずれも、ＩＬ−２Ｒβ結合活性を保持するＩＬ−２ムテインをもたらす。例示的なムテインは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のアミノ酸の置換を含むことができる。
【００６４】
ムテインには、ＩＬ−２の他の位置（すなわち、ムテインの二次または三次構造に対する影響が最小限であるもの）における保存的改変および置換も含まれる。そのような保存的置換には、Ｔｈｅ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５（１９７８）においてＤａｙｈｏｆｆにより、およびＥＭＢＯ  Ｊ．、８：７７９−７８５（１９８９）においてＡｒｇｏｓにより記載されているものが含まれる。例えば、次のグループの１つに属するアミノ酸は保存的変更を表す：群Ｉ：ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；群ＩＩ：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；群ＩＩＩ：ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；群ＩＶ：ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ；Ｇｒｏｕｐ  Ｖ：ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓ；ａｎｄ  Ｇｒｏｕｐ  ＶＩ：ａｓｐ、ｇｌｕ。
【００６５】
「ＩＬ−２に従って番号付けされた」とは、野生型ＩＬ−２の成熟配列においてそのアミノ酸が通常存在する位置を参照して選択されたアミノ酸を同定することを意味し、例えば、Ｒ８１は、配列番号２に存在する８１番目のアミノ酸であるアルギニンを指す。Ｌ８０は、配列番号２に存在する８０番目のアミノ酸であるロイシンを指す。Ｌ８５は、配列番号２に存在する８５番目のアミノ酸であるロイシンを指す。Ｉ８６は、配列番号２に存在する８６番目のアミノ酸であるイソロイシンを指す。Ｉ９２は、配列番号２に存在する９２番目のアミノ酸であるイソロイシンを指す。Ｆ４２は、配列番号２に存在する４２番目のアミノ酸であるフェニルアラニンを指す。Ｋ４３は、配列番号２に存在する４３番目のアミノ酸であるリジンを指す。
【００６６】
本明細書で使用される場合、本開示方法で使用される遺伝的にコードされたＬ−鏡像異性アミノ酸についての省略形は従来のものであり、表１において以下の通りである。
【表１】
2020524174.tif 000003
【００６７】
「親水性アミノ酸」とは、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら、１９８４、Ｊ．Ｍｏｌ。Ｂｉｏｌ．１７９：１２５−１４２の正規化されたコンセンサス疎水性スケールに従ってゼロ未満の疎水性を示すアミノ酸を指す。遺伝的にコードされた親水性アミノ酸には、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、およびＡｒｇ（Ｒ）が含まれる。
【００６８】
用語「ＩＬ−２Ｒαβγ受容体を有する細胞型」は、この受容体型を有することが知られている細胞、すなわち、Ｔ細胞、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、活性化単球、活性化ＮＫ細胞を意味する。用語「ＩＬ−２Ｒβγ受容体を有する細胞型」は、その受容体型を有することが知られている細胞、すなわち、Ｂ細胞、休止単球、および休止ＮＫ細胞を意味する。
【００６９】
本明細書でポリペプチドまたはＤＮＡ配列に関して使用される「同一性」という用語は、２つの分子間のサブユニット配列同一性を指す。両方の分子のサブユニット位置が同じ単量体サブユニット（すなわち、同じアミノ酸残基またはヌクレオチド）によって占められている場合、分子はその位置で同一である。２つのアミノ酸または２つのヌクレオチド配列間の類似性は、同一の位置の数の直接的な関数である。一般に、配列は、最高次の一致が得られるように整列される。必要に応じて、公開された手法と、ＧＣＳプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：３８７、１９８４）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌ．２１５：４０３、１９９０）などの広く利用可能なコンピュータプログラムとを用いて、同一性を算出することができる。配列同一性は、ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ（１７１０  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．５３７０５）のｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐの配列分析ソフトウェアパッケージなどの配列分析ソフトウェアをそのデフォルトパラメータとともに使用して測定することができる。
【００７０】
用語「ポリペプチド」、「タンパク質」または「ペプチド」は、その長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）に関係なく、アミノ酸残基の任意の鎖を指す。
【００７１】
本開示の変異体ＩＬ−２ポリペプチドが「実質的に純粋」である場合、それらは目的のポリペプチド、例えば変異体ＩＬ−２アミノ酸配列を含有するポリペプチドの少なくとも約６０重量％（乾燥重量）であり得る。例えば、ポリペプチドは、目的のポリペプチドの少なくとも約７５重量％、約８０重量％、約８５重量％、約９０重量％、約９５重量％または約９９重量％であり得る。純度は、任意の適切な標準法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはＨＰＬＣ分析によって測定できる。
【００７２】
「アゴニスト」は、標的と相互作用して、標的の活性化の増加を引き起こすかまたはそれを促進する化合物である。
【００７３】
「部分アゴニスト」は、アゴニストと同じ標的と相互作用するが、部分アゴニストの投与量を増やしても、アゴニストほど大きな生化学的および／または生理学的効果をもたらさない化合物である。
【００７４】
「スーパーアゴニスト」（「スーパーカイン」とも呼ばれる）は、標的受容体の内因性アゴニストよりも大きな最大の応答を生み出すことができるアゴニストの一種であり、したがって１００％を超える効力を有する。
【００７５】
「作動可能に連結された」とは、目的のヌクレオチド配列（すなわち、ＩＬ−２ムテインをコードする配列）が、ヌクレオチド配列の発現を可能にする（例えば、インビトロ転写／翻訳系、またはベクターが宿主細胞に導入された場合の宿主細胞において）方法で調節配列（複数可）に連結されることを意味することを意図する。「調節配列」には、プロモーター、エンハンサー、および他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）が含まれる。例えば、Ｇｅｎｅｄｅｌ（１９９０）ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）を参照されたい。調節配列には、多くのタイプの宿主細胞でヌクレオチド配列の構成的発現を指示するもの、および特定の宿主細胞でのみヌクレオチド配列の発現を指示するもの（例えば、組織特異的調節配列）が含まれる。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどの要因に依存し得ることを当業者は理解するであろう。本発明の発現構築物を宿主細胞に導入して、それにより、本明細書に開示されるヒトＩＬ−２ムテインを産生するか、またはその生物学的に活性なバリアントを産生することができる。
【００７６】
用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書で互換的に使用される。そのような用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫または潜在的な子孫も指すことが理解される。突然変異または環境の影響により、特定の改変が後続の世代で発生する可能性があるため、そのような子孫は実際には親細胞と同一ではないかもしれないが、本明細書で使用される用語の範囲内になお含まれる。
【００７７】
本明細書で使用される場合、「形質転換」および「トランスフェクション」という用語は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、パーティクルガン、または電気穿孔を含む、外来核酸（例えばＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための様々な技術的に認められた技術を指す。
【００７８】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語には、薬学的投与に相容性のある、生理食塩水、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれるが、これらに限定されない。補助的な活性化合物（例えば、抗生物質）も組成物に組み込むことができる。
【００７９】
本明細書で使用される場合、「抗ＰＤ−１抗体」という用語は、阻害性抗体を含む、ＰＤ−１に結合する任意の抗体を指す。「抗ＰＤ−１阻害剤」とは、ＰＤ−１に結合してそれを阻害する阻害剤を指す。そのような抗ＰＤ−１抗体および／または阻害剤には、とりわけ、ニボルマブ、ＢＭＳ−９３６５５８、ＭＤＸ−１１０６、ＯＮＯ−４５３８、ＡＭＰ２２４、ＣＴ−０１１、およびＭＫ−３４７５が含まれるが、これらに限定されない。
【００８０】
本明細書で使用される場合、「癌」（または「癌性」）、「過剰増殖性」、および「新生物の」という用語は、自律成長（すなわち、急速に増殖する細胞成長を特徴とする異常な様子または状態）を有する細胞を指す。過剰増殖性および新生物の疾患状態は、病的として分類されてもよく（すなわち、疾患状態を特徴付けるまたは構成する）、またはそれらは非病的として分類されてもよい（すなわち、正常からの逸脱であるが疾患状態に関連しない）。この用語は、組織病理学的型または侵襲性の段階に関係なく、すべての型の癌性成長または発癌プロセス、転移組織または悪性形質転換細胞、組織、または臓器を含むことを意味する。「病的過剰増殖性」細胞は、悪性腫瘍の成長を特徴とする疾患状態で生じる。非病理学的過剰増殖性細胞の例には、創傷修復に関連する細胞の増殖が含まれる。「癌」または「新生物」という用語は、肺、乳房、甲状腺、リンパ腺およびリンパ組織、生殖系、胃腸器官、および泌尿生殖路に影響を及ぼすものを含む様々な臓器系の悪性腫瘍、ならびにほとんどの結腸癌、腎細胞癌、前立腺癌および／または精巣腫瘍、非小細胞肺癌、小腸の癌および食道の癌などの悪性腫瘍を含むと一般に考えられている腺癌を指すために使用される。癌は一般に、前立腺癌、卵巣癌、乳癌、子宮内膜癌、多発性骨髄腫、黒色腫、リンパ腫、小細胞肺癌を含む肺癌、腎臓癌、結腸直腸癌、膵臓癌、胃癌、および脳癌を含むことができる。
【００８１】
「癌」という用語は、技術的に認識されており、呼吸器系癌腫、胃腸系癌腫、泌尿生殖器系癌腫、精巣癌腫、乳癌腫、前立腺癌腫、内分泌系癌腫、および黒色腫を含む上皮または内分泌組織の悪性腫瘍を指す。「腺癌」は、腺組織に由来するか、腫瘍細胞が認識可能な腺構造を形成する癌腫を指す。
【００８２】
本明細書で使用される場合、「造血性新生物障害」という用語は、例えば骨髄、リンパ系または赤血球系、またはそれらの前駆細胞から生じる造血起源の過形成／新生物細胞を含む疾患を指す。好ましくは、疾患は低分化急性白血病（例えば、赤芽球性白血病および急性巨核芽球性白血病）から生じる。追加の例示的な骨髄障害には、急性前骨髄性白血病（ＡＰＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）が含まれるが、これらに限定されない（Ｖａｉｃｋｕｓ、Ｌ．（１９９１）Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ．ｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．／Ｈｅｍｏｔｏｌ１１：２６７−９７において評論されている）；リンパ系悪性腫瘍には、Ｂ系統ＡＬＬおよびＴ系統ＡＬＬを含む急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ球性白血病（ＰＬＬ）、毛様細胞白血病（ＨＬＬ）およびワルデンストロームマクログロブリン血症（ＷＭ）が含まれるが、これらに限定されない。悪性リンパ腫の追加の形態には、非ホジキンリンパ腫およびそれらの変異形、末梢Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＦ）、ホジキン病およびリード・ステムバーグ病が含まれるが、これらに限定されない。
【００８３】
本明細書で使用される「治療」、「治療する」などの用語は、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを指す。その効果は、疾患またはその症状を完全にまたは部分的に予防するという点で予防的であり、かつ／または疾患および／または疾患に起因する副作用の部分的または完全な治癒という点で治療的であり得る。本明細書で使用される「治療」は、哺乳動物、特にヒトにおける疾患のあらゆる治療を包含し、以下：（ａ）疾患または疾患を獲得する危険性があると前診断されたが、まだ疾患を有すると診断されていない対象において疾患が生じるのを予防すること、（ｂ）疾患を抑制すること、すなわち、疾患の発達を阻止すること、および（ｃ）疾患を緩和すること、すなわち、疾患の退行を引き起こすこと、を含む。治療的有効量は、腫瘍数、腫瘍サイズを減少させる、および／または生存を増加させる量であり得る。
【００８４】
「個体」、「対象」、および「患者」という用語は、本明細書では互換的に使用され、サルおよびヒト、スポーツ用哺乳動物（例えば、ウマ）、家畜用哺乳動物（例えば、ヒツジ、ヤギなど）、ペット用哺乳動物（イヌ、ネコなど）、およびげっ歯類（例えば、マウス、ラットなど）を含むヒトおよび非ヒト霊長類を含むがこれらに限定されない哺乳類を指す。
【００８５】
「薬学的に許容される」および「生理学的に許容される」という用語は、１つ以上の投与経路、インビボ送達または接触に適した生物学的に許容される製剤、気体、液体または固体、またはそれらの混合物を意味する。「薬学的に許容される」または「生理学的に許容される」組成物は、生物学的またはその他の点で望ましくない材料ではなく、例えば、材料は、実質的に望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく対象へ投与することができる。したがって、そのような薬学的組成物は、例えば、ＩＬ−２ムテインを対象に投与する際に使用することができる。特に、置換Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含むＩＬ−２ムテインは、抗ＰＤ−１と組み合わせて癌を有する対象に投与される。いくつかの実施形態では、投与されるＩＬ−２ムテインは、位置Ｆ４２Ａに置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、投与されるＩＬ−２ムテインは、位置Ｋ４３Ｎに置換をさらに含む。
【００８６】
本明細書で使用される場合、「単位剤形」という語句は、治療される対象についての単位用量として適した物理的に別個の単位を指し、各単位は、１つ以上の用量で投与された場合に、所望の効果（例えば、予防または治療効果）を生み出す薬学的担体（賦形剤、希釈剤、ビヒクルまたは充填剤）と任意で関連する所定量を含む。いくつかの実施形態では、治療効果は腫瘍の数を軽減することである。いくつかの実施形態では、治療効果は腫瘍の大きさを縮小することである。いくつかの実施形態では、治療効果は生存率を高めることである。
【００８７】
いくつかの実施形態では、単位剤形は、例えば、液体組成物、または凍結乾燥または凍結乾燥状態の組成物を含むアンプルおよびバイアル内にあってもよく、例えば、滅菌液体担体は、インビボでの投与または送達の前に添加され得る。個々の単位剤形は、複数回投与キットまたは容器に含めることができる。抗ＰＤ−１抗体と組み合わせたＩＬ−２ムテイン、およびその薬学的組成物は、投与の容易さおよび投与量の均一性のために単一または複数の単位剤形に包装することができる。
【００８８】
「治療的有効量」は、実験および／または臨床試験を通じて決定可能な比較的広い範囲に収まる。例えば、インビボ注射の場合、例えば、対象の組織または脈管構造（例えば、肝臓組織または静脈）への直接注射。他の有効な投与量は、用量反応曲線を確立する日常的な試行を通じて、当業者によって容易に確立され得る。
【００８９】
「有効量」または「十分な量」とは、単回投与または複数回投与で、単独または組み合わせて、１つ以上の他の組成物（薬物などの治療薬）、治療、プロトコル、または治療レジメン薬（例えば、ワクチンレジメンを含む）を用いて、任意の期間（長期または短期）の検出可能な応答、測定可能なまたは検出可能な程度の、または任意の期間（例えば、数分、数時間、数日、数ヶ月、数年、または治癒までの間）の対象の期待されるまたは望ましい結果または利益を提供する量を指す。
【００９０】
治療のための「有効量」または「十分な量」の用量（例えば、改善または治療的利益または改良を提供するための）は、疾患の進行または悪化の減少、軽減、阻害、抑止、制限または制御も満足な結果ではあるが、典型的には、疾患の１つ、複数またはすべての有害症状、結果または合併症、例えば、疾患により引き起こされるかまたはそれに関連する１つ以上の有害症状、障害、病気、病理、または合併症に対して測定可能な程度の応答を提供するのに有効である。いくつかの実施形態では、有効量は、腫瘍の数を軽減するのに十分な量である。いくつかの実施形態では、有効量は、腫瘍の大きさを縮小するのに十分な量である。いくつかの実施形態では、有効量は、生存率を高めるのに十分な量である。
【００９１】
「予防」およびその文法的変形は、対象への接触、投与またはインビボ送達が疾患に先立つものである方法を意味する。対象への投与またはインビボ送達は、疾患により引き起こされるかまたはそれに関連する有害症状、状態、合併症などの発症前に実施することができる。例えば、スクリーニング（例えば、遺伝的）を使用して、そのような対象を記載の方法および使用の候補として特定することができるが、対象は疾患を発現しない場合がある。したがって、そのような対象が疾患の症状を発現しないとしても、そのような対象には、疾患に至る機能性遺伝子産物（タンパク質）の量の不足または欠損について、または異常な部分的機能性または非機能性遺伝子産物（蛋白質）の産生について、陽性とスクリーニングされた者、ならびに疾患に至る異常な、または欠陥のある（突然変異）遺伝子産物（タンパク質）について陽性とスクリーニングされた対象を含む。
【００９２】
Ｉ．詳細な説明
本明細書では、ＩＬ−２Ｒβ受容体に対する結合能が増加し、抗ＰＤ−１抗体との併用治療での使用が見出されている、置換Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含むＩＬ−２ムテインが記載される。いくつかの実施形態では、野生型ヒトＩＬ−２（配列番号２；野生型ｈＩＬ−２）に従って番号付けされたＬ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６ＶおよびＩ９２Ｆを含むＩＬ−２ムテインはＨ９と呼ばれる。そのようなＩＬ−２ムテインは、例えば、癌の治療のために抗ＰＤ−１抗体と組み合わせた場合に用途が見出される。また、そのようなＩＬ−２ムテインをコードする核酸、そのようなＩＬ−２ムテインの作製方法、そのようなＩＬ−２ムテインを含む薬学的組成物、およびそのようなＩＬ−２ムテインを使用する治療方法も提供される。
【００９３】
Ａ．ＩＬ−２ムテイン
置換されたアミノ酸残基（複数可）は、必ずしもそうではないが、典型的には以下の群：グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；フェニルアラニン、チロシン内に置換を含む保存的置換であり得る。これらの突然変異は、ＩＬ−２Ｒβおよび／またはＩＬ−２Ｒγと接触するアミノ酸残基で起こり得る。
【００９４】
より具体的には、１つ以上の位置で突然変異（保存的または非保存的、付加（複数可）または欠失（複数可）による）を行うことができる。例えば、突然変異は、Ｉ２４Ｖ、Ｐ６５Ｈ、Ｑ７４Ｒ、Ｑ７４  Ｈ、Ｑ７４Ｎ、Ｑ７４Ｓ、Ｌ８０Ｆ、Ｌ８０Ｖ、Ｒ８１Ｉ、Ｒ８１Ｔ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、Ｉ８９Ｖ、Ｉ９２Ｆ、Ｖ９３Ｉであり得る。例示的なＩＬ−２ムテインの配列は以下の通りである：５−１配列番号５；５−２配列番号６；６−６配列番号７；Ａ２配列番号８；Ｂ１配列番号９；Ｂ１１配列番号１０；Ｃ５配列番号１１；Ｄ１０配列番号１２；Ｅ１０配列番号１３；Ｇ８配列番号１４；Ｈ４配列番号１５；およびＨ９配列番号１６。
【００９５】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインにおける置換は、配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従って番号付けされたＬ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインはＦ４２Ａ置換をさらに含み、その番号付けは配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従う。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインはＹ４５Ａ置換をさらに含み、その番号付けは配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従う。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインはＥ６２Ａ置換をさらに含み、その番号付けは配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従う。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインにおける置換は、配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従って番号付けされたＦ４２Ａ、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインにおける置換は、配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従って番号付けされたＦ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインにおける置換は、配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従って番号付けされたＦ４２Ａ、Ｅ６２Ａ、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインにおける置換は、配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従って番号付けされたＦ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｅ６２Ａ、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインにおける置換は、配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従って番号付けされたＥ６２Ａ、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインにおける置換は、配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従って番号付けされたＹ４５Ａ、Ｅ６２Ａ、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインにおける置換は、配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従って番号付けされたＹ４５ＡおよびＥ６２Ａを含む。
【００９６】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２Ｒβ結合の増加および／または増強をもたらすＩＬ−２ムテイン中の置換には、配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従って番号付けされたＬ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆが含まれる。いくつかの実施形態では、本発明で使用するためのＩＬ−２ムテインは、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含み、ＩＬ−２Ｒβ結合の増加を示す。いくつかの実施形態では、本発明で使用するためのＩＬ−２ムテインは、位置Ｆ４２Ａに置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、本発明で使用するためのＩＬ−２ムテインは、位置Ｋ４３Ｎに置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、ムテインは、置換Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆ、ならびにＦ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、およびＥ６２Ａからなる群から選択される１つ以上の置換を含み、これらのすべては野生型ヒトＩＬ−２（配列番号２）と比較される。
【００９７】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２Ｒβ結合親和性を増加しているアミノ酸置換には、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆが含まれる。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２Ｒβ結合親和性を増加させるアミノ酸置換には、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆが含まれる。
【００９８】
いくつかの実施形態では、野生型ヒトＩＬ−２と比較してＩＬ−２Ｒβに対してより高い結合親和性を有する対象ＩＬ−２ムテインは、アミノ酸置換Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインは次のアミノ酸配列を有する：
2020524174.tif 000004
【００９９】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、ＩＬ−２Ｒβ／ＩＬ−２Ｒγｃヘテロ二量体化に依存している１つ以上のシグナル伝達経路を刺激する能力を増加した。いくつかの実施形態では、対象ＩＬ−２ムテインは、野生型ヒトＩＬ−２と比較して、ＩＬ−２Ｒβ＋細胞においてＳＴＡＴ５リン酸化を刺激する能力が増強されている。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、ＩＬ−２Ｒβ＋細胞におけるＳＴＡＴ５リン酸化を、野生型ＩＬ−２が同細胞におけるＳＴＡＴ５リン酸化を刺激するレベルの１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上のレベルで刺激する。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、ＩＬ−２Ｒβ＋細胞におけるＳＴＡＴ５リン酸化を、野生型ＩＬ−２が同細胞におけるＳＴＡＴ５リン酸化を刺激するレベルと比較して、１０５％、１１０％、１１５％、１２０％、１２５％、１３０％、１３５％、１４０％、１４５％、１５０％、１５５％、１６０％、１６５％、１７０％、１７５％、１８０％、１８５％、１９０％、１９５％、またはそれ以上のレベルで刺激する。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２Ｒβ＋細胞はＴ細胞である。特定の実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞は新たに単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞である。他の実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞Ｔ細胞は、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞である。他の実施形態では、ＩＬ−２Ｒβ＋細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。いくつかの態様では、ＩＬ−２ムテインは、野生型ヒトＩＬ−２（配列番号２）と比較して、置換Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含む。
【０１００】
いくつかの実施形態では、ムテインは、野生型ヒトＩＬ−２と比較して、ＩＬ−２Ｒβ＋細胞においてＥＲＫ１／ＥＲＫ２シグナル伝達を刺激する能力が増強されている。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、ＩＬ−２Ｒβ＋細胞におけるｐＥＲＫ１／ＥＲＫ２シグナル伝達を、野生型ＩＬ−２が同細胞におけるｐＥＲＫ１／ＥＲＫ２シグナル伝達を刺激するレベルの１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上のレベルで刺激する。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、ＩＬ−２Ｒβ＋細胞におけるｐＥＲＫ１／ＥＲＫ２リン酸化を、野生型ＩＬ−２が同細胞におけるｐＥＲＫ１／ＥＲＫ２リン酸化を刺激するレベルと比較して、１０５％、１１０％、１１５％、１２０％、１２５％、１３０％、１３５％、１４０％、１４５％、１５０％、１５５％、１６０％、１６５％、１７０％、１７５％、１８０％、１８５％、１９０％、１９５％、またはそれ以上のレベルで刺激する。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２Ｒβ＋細胞はＴ細胞である。特定の実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞である。いくつかの態様では、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、新たに単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞である。他の実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞Ｔ細胞は、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞である。他の実施形態では、ＩＬ−２Ｒβ＋細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。いくつかの態様では、ＩＬ−２ムテインは、野生型ヒトＩＬ−２（配列番号２）と比較して、置換Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含む。
【０１０１】
ＳＴＡＴ５およびＥＲＫ１／２シグナル伝達は、例えば、当該分野で公知の任意の適切な方法を使用して、ＳＴＡＴ５およびＥＲＫ１／２のリン酸化により測定することができる。例えば、ＳＴＡＴ５およびＥＲＫ１／２リン酸化は、本明細書に記載のフローサイトメトリー分析と組み合わせて、これらの分子のリン酸化バージョンに特異的な抗体を使用して測定することができる。いくつかの実施形態では、ムテインは、野生型ヒトＩＬ−２と比較して、ＩＬ−２Ｒβ＋細胞においてＰＩ  ３−キナーゼシグナル伝達を刺激する能力が増強されている。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、ＩＬ−２Ｒβ＋細胞におけるＰＩ  ３−キナーゼシグナル伝達を、野生型ＩＬ−２が同細胞におけるＰＩ  ３−キナーゼシグナル伝達を刺激するレベルの１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上のレベルで刺激する。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、ＩＬ−２Ｒβ＋細胞におけるＰＩ  ３−キナーゼシグナル伝達を、野生型ＩＬ−２が同細胞におけるＰＩ  ３−キナーゼシグナル伝達を刺激するレベルと比較して、１０５％、１１０％、１１５％、１２０％、１２５％、１３０％、１３５％、１４０％、１４５％、１５０％、１５５％、１６０％、１６５％、１７０％、１７５％、１８０％、１８５％、１９０％、１９５％、またはそれ以上のレベルで刺激する。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２Ｒβ＋細胞はＴ細胞である。特定の実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞である。いくつかの態様では、ＣＤ８＋Ｔ細胞Ｔ細胞は、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞である。他の実施形態では、ＩＬ−２Ｒβ＋細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。いくつかの態様では、ＩＬ−２ムテインは、野生型ヒトＩＬ−２（配列番号２）と比較して、置換Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含む。ＰＩ３−キナーゼシグナル伝達は、当該分野で公知の任意の適切な方法を使用して測定することができる。例えば、ＰＩ  ３−キナーゼシグナル伝達は、本明細書に記載のフローサイトメトリー分析と併せて、ホスホ−Ｓ６リボソームタンパク質に特異的な抗体を使用して測定することができる。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインはＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＩＬ−２および／またはＩＬ−１５  ＳＴＡＴ５リン酸化の刺激因子である。いくつかの実施形態では、ムテインは、ＩＬ−２および／またはＩＬ−１５により誘導されるＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖のプロモーターである。いくつかの実施形態では、ムテインは、ＩＬ−２依存性のＴＣＲ誘導細胞増殖の刺激因子である。いくつかの態様では、ＩＬ−２ムテインは、野生型ヒトＩＬ−２（配列番号２）と比較して、置換Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含む。
【０１０３】
ＩＬ−２は、Ｔｈ１、Ｔｈ９、およびＴｒｅｇ  Ｔ細胞の分化を促進し、Ｔｈ１７の分化を阻害する。したがって、特定の動作理論に縛られることはないが、ＩＬ−２スーパーアゴニストとして機能するＩＬ−２ムテインは、Ｔｈ１、Ｔｈ９、および／またはＴｒｅｇ細胞分化を促進するか、Ｔｈ１７細胞分化を阻害することができると考えられる。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインはＩＬ−２依存性Ｔｈ１、Ｔｈ９および／またはＴｒｅｇ分化のプロモーターである。いくつかの実施形態では、ムテインはＴｈ１７分化の阻害剤である。いくつかの態様では、ＩＬ−２ムテインは、野生型ヒトＩＬ−２（配列番号２）と比較して、置換Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含む。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、野生型ヒトＩＬ−２と比較して、ＣＤ２５より少ないおよび／または独立してシグナル伝達する（例えば、ＣＤ２５結合が減少または除去されている）。いくつかの実施形態では、ＣＤ２５に関する低減されたおよび／または独立したシグナル伝達は、Ｔｒｅｇの刺激を制限しながらエフェクターＴ細胞の優先的活性化を可能にする。いくつかの実施形態では、ＣＤ２５に関する低減されたおよび／または独立したシグナル伝達は、毒性の低減を可能にする。いくつかの実施形態では、ムテインは、置換Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆ、ならびにＦ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、およびＥ６２Ａからなる群から選択される１つ以上の置換を含み、これらのすべては野生型ヒトＩＬ−２（配列番号２）と比較される。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、アネルギー性ＮＫ細胞に対する応答性を増加および／または回復させることができる。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、腫瘍微小環境内のアネルギー性ＮＫ細胞に対する応答性を増加および／または回復させることができる。いくつかの態様では、ＩＬ−２ムテインは、野生型ヒトＩＬ−２（配列番号２）と比較して、置換Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含む。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、ムテインは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のＩＬ−２依存性活性化の阻害剤阻害剤である。ＮＫ細胞のＩＬ−２活性化は、当技術分野で知られている任意の適切な方法、例えば、本明細書に記載のＩＬ−２誘導ＣＤ６９発現および／または細胞毒性を測定することにより測定することができる。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２Ｒβ結合親和性における増加は、ＩＬ−２Ｒβに対する野生型ヒトＩＬ−２結合親和性よりも大きい、ＩＬ−２Ｒβに対する任意の結合親和性である。いくつかの実施形態では、結合親和性は、ＩＬ−２Ｒβに対する野生型ヒトＩＬ−２結合親和性と比較して、ＩＬ−２Ｒβに対する結合親和性において、２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１２０倍、１５０倍、１７０倍、１９０倍、２００倍、２２０倍、２４０倍、またはそれ以上の増加である。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２Ｒβに対する結合能力の増加は、ＩＬ−２Ｒβに対する野生型ヒトＩＬ−２結合能力よりも大きい、ＩＬ−２Ｒβに対する任意の結合能力である。いくつかの実施形態では、結合能力は、ＩＬ−２Ｒβに対する野生型ヒトＩＬ−２結合能力と比較して、ＩＬ−２Ｒβに対する結合能力において、２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１２０倍、１５０倍、１７０倍、１９０倍、２００倍、２２０倍、２４０倍、またはそれ以上の増加である。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、野生型ヒトＩＬ−２と比較してＩＬ−２Ｒβに対してより高い結合親和性を有する対象ＩＬ−２ムテインはまた、ＣＤ２５への低下した結合を示し、アミノ酸置換Ｆ４２Ａ、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含む。いくつかの実施形態では、結合親和性の低下は、約２２０倍、すなわち、野生型ヒトＩＬ−２についての約６．６ｎＭのＫｄから、Ｆ４２Ａ、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含むムテインについての約１．４μＭまでである。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインは次のアミノ酸配列を有する：
2020524174.tif 000005
【０１１０】
いくつかの実施形態では、野生型ヒトＩＬ−２と比較してＩＬ−２Ｒβに対してより高い結合親和性を有する対象ＩＬ−２ムテインはまた、ＣＤ２５への低下した結合を示し、アミノ酸置換Ｋ４３Ｎ、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含む。いくつかの実施形態では、結合親和性の低下は、位置４３においてＫ４３Ｎ置換を伴うグリコシル化が可能となるためである。アスパラギンをリジンに置き換えることにより（Ｋ４３Ｎ）、Ｋ４３Ｎ、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆのアミノ酸置換を含むＩＬ−２ムテインにおけるＣＤ２５結合が減少および／または除去される。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインは次のアミノ酸配列を有する：
2020524174.tif 000006
【０１１１】
いくつかの態様では、ＣＤ２５に対する結合親和性の低下は、野生型ヒトＩＬ−２結合親和性よりも低い、ＣＤ２５に対する任意の結合親和性である。いくつかの実施形態では、結合親和性は、ＣＤ２５に対する野生型ヒトＩＬ−２結合親和性と比較して、ＣＤ２５に対する結合親和性において、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１２０倍、１５０倍、１７０倍、１９０倍、２００倍、２２０倍、２４０倍、またはそれ以上の減少である。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、野生型ヒトＩＬ−２と比較してＩＬ−２Ｒβに対してより高い結合親和性およびＣＤ２５に対してより低い結合親和性を有する対象ＩＬ−２ムテインは、アミノ酸置換Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ  Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインは次のアミノ酸配列を有する：
2020524174.tif 000007
【０１１３】
いくつかの実施形態では、野生型ヒトＩＬ−２と比較してＩＬ−２Ｒβに対してより高い結合親和性およびＣＤ２５に対してより低い結合親和性を有する対象ＩＬ−２ムテインは、アミノ酸置換Ｆ４２Ａ、Ｅ６２Ａ  Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインは次のアミノ酸配列を有する：
2020524174.tif 000008
【０１１４】
いくつかの実施形態では、野生型ヒトＩＬ−２と比較してＩＬ−２Ｒβに対してより高い結合親和性およびＣＤ２５に対してより低い結合親和性を有する対象ＩＬ−２ムテインは、アミノ酸置換Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｅ６２Ａ  Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインは次のアミノ酸配列を有する：
2020524174.tif 000009
【０１１５】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテイン配列は、配列番号２または配列番号６〜配列番号１０または配列番号１６のいずれか１つと９０％同一である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテイン配列は、配列番号２または配列番号６〜配列番号１０のいずれか１つと９５％同一である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテイン配列は、配列番号２または配列番号６〜配列番号１０のいずれか１つと９８％同一である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテイン配列は、配列番号２または配列番号６〜配列番号１０のいずれか１つと９９％同一である。
【０１１６】
さらなる例示的なＩＬ−２配列を以下の表に提供する。
【表２】
2020524174.tif 000010
2020524174.tif 000011
2020524174.tif 000012
【０１１７】
Ｂ．ＩＬ−２ムテイン融合タンパク質
ＩＬ−２ムテインは、対象ＩＬ−２ムテインおよび異種ポリペプチド（すなわち、ＩＬ−２またはその変異体ではないポリペプチド）を含む融合またはキメラポリペプチドとして調製することができる（例えば、米国特許第６，４５１，３０８を参照されたい）。例示的な異種ポリペプチドは、インビボでキメラポリペプチドの循環半減期を増加することができ、したがって、変異体ＩＬ−２ポリペプチドの特性をさらに高めることができる。様々な実施形態では、循環半減期を増加させるポリペプチドは、ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミン、ＰＥＧ、ＰＥＧ誘導体、またはＩｇＧ重鎖可変領域を欠く抗体のＩｇＧサブクラスのＦｃ領域であり得る。例示的なＦｃ領域は、補体固定およびＦｃ受容体結合を阻害する変異を含むことができ、または溶解性であってもよく、すなわち抗体依存性補体溶解（ＡＤＣＣ；ＵＳＳＮ  ０８／３５５，５０２、１９９４年１２月１２日出願）などの別の機序を介して補体に結合または細胞を溶解することができる。
【０１１８】
「Ｆｃ領域」は、ＩｇＧをパパインで消化することにより生成されるＩｇＧのＣ末端ドメインに相同である天然に生じるまたは合成のポリペプチドであり得る。ＩｇＧ  Ｆｃは、約５０ｋＤａの分子量を有する。変異体ＩＬ−２ポリペプチドは、Ｆｃ領域全体、またはそれが一部であるキメラポリペプチドの循環半減期を延長する能力を保持するより小さな部分を含むことができる。さらに、全長または断片化されたＦｃ領域は、野生型分子のバリアントであり得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテイン融合タンパク質（例えば、本明細書に記載のＩＬ−２ムテイン）は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４  Ｆｃ領域を含む（例えば、図２Ａ〜２Ｂの配列を参照されたい）。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は置換Ｎ２９７Ａを含む。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、異種融合ポリペプチドに直接または間接的に連結している。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインはＦｃ領域に直接連結している。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、ＧＧＧＧＳなどのリンカーペプチドを介してＦｃ領域に連結している。いくつかの実施形態では、リンカーは（ＧＧＧＧＳ）ｎであり、ｎは１〜１０の整数である。いくつかの実施形態では、リンカーはＧＧＧＧＳである。いくつかの実施形態では、リンカーはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１６）である。いくつかの実施形態では、リンカーはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１７）である。いくつかの実施形態では、リンカーはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１８）である。いくつかの実施形態では、リンカーはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１９）である。
【０１２１】
Ｆｃ領域は「溶解性」または「非溶解性」であり得るが、典型的には非溶解性である。非溶解性Ｆｃ領域は、通常、高親和性Ｆｃ受容体結合部位およびＣ´１ｑ結合部位を欠いている。マウスＩｇＧ  Ｆｃの高親和性Ｆｃ受容体結合部位は、ＩｇＧ  Ｆｃの２３５位にＬｅｕ残基を含む。したがって、Ｆｃ受容体結合部位は、Ｌｅｕ  ２３５を変異または欠失させることにより破壊できる。例えば、Ｌｅｕ  ２３５をＧｌｕで置換することにより、Ｆｃ領域が高親和性Ｆｃ受容体に結合する能力が阻害される。マウスのＣ´１ｑ結合部位は、ＩｇＧのＧｌｕ  ３１８、Ｌｙｓ  ３２０、およびＬｙｓ  ３２２残基を変異または欠失させることにより、機能的に破壊することができる。例えば、Ｇｌｕ  ３１８、Ｌｙｓ  ３２０、およびＬｙｓ  ３２２をＡｌａ残基で置換することにより、ＩｇＧ１  Ｆｃは抗体依存性補体溶解を指示できなくなる。対照的に、溶解性ＩｇＧ  Ｆｃ領域は、高親和性Ｆｃ受容体結合部位およびＣ´１ｑ結合部位を有する。高親和性Ｆｃ受容体結合部位はＩｇＧ  Ｆｃの２３５位のＬｅｕ残基を含み、Ｃ´１ｑ結合部位はＩｇＧ１のＧｌｕ  ３１８、Ｌｙｓ  ３２０、およびＬｙｓ  ３２２残基を含む。溶解性ＩｇＧ  Ｆｃは、これらの部位に野生型残基または保存的アミノ酸置換を有する。溶解性ＩｇＧ  Ｆｃは、抗体依存性細胞傷害性または補体指向性細胞溶解（ＣＤＣ）のために細胞を標的にすることができる。ヒトＩｇＧについての適切な変異も知られている（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ  ２：１１９−１２４、１９９４；およびＢｒｅｋｋｅら、Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ  ２：１２５、１９９４を参照されたい）。
【０１２２】
他の実施形態では、キメラポリペプチドは、対象のＩＬ−２ムテインと、ＦＬＡＧ配列などの抗原タグとして機能するポリペプチドとを含むことができる。ＦＬＡＧ配列は、本明細書に記載されているように、ビオチン化された高度に特異的な抗ＦＬＡＧ抗体によって認識される（Ｂｌａｎａｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１０１４、１９９２；ＬｅＣｌａｉｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：８１４５、１９９２も参照されたい）。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、Ｃ末端ｃ−ｍｙｃエピトープタグをさらに含む。
【０１２３】
他の実施形態では、キメラポリペプチドは、変異体ＩＬ−２ポリペプチドと、Ａｇａ２ｐアグルチニンサブユニットなどの変異体ＩＬ−２ポリペプチドの発現を増強するかまたはそれらの細胞局在化を指示するように機能する異種ポリペプチドとを含む（例えば、ＢｏｄｅｒおよびＷｉｔｔｒｕｐ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ。１５：５５３−７、１９９７）。
【０１２４】
他の実施形態では、変異体ＩＬ−２および抗体またはその抗原結合部分を含むキメラポリペプチドを生成することができる。キメラタンパク質の抗体または抗原結合成分は、標的化部分として役立ち得る。例えば、キメラタンパク質を特定の細胞サブセットまたは標的分子に局在化させるために使用できる。サイトカイン抗体キメラポリペプチドを産生する方法は、例えば、米国特許第６，６１７，１３５号に記載されている。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、ＰＤ−１受容体とそのリガンド、ＰＤ−Ｌ１との間の相互作用を破壊する抗体またはその抗原結合部分への融合を含み、および／またはＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達経路の成分に対する抗体である。ＰＤ−１に結合し、ＰＤ−１とそのリガンドであるＰＤ−Ｌ１との相互作用を破壊し、抗腫瘍免疫応答を刺激する当技術分野で公知の抗体は、本明細書に開示されるキメラポリペプチドでの使用に適している。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、ＰＤ−１に特異的に結合する。例えば、ＰＤ−１を標的とし、本発明で使用できる抗体には、例えば、ニボルマブ（ＢＭＳ−９３６５５８、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、ペンブロリズマブ（ランブロリズマブ、ＭＫ０３４７５またはＭＫ−３４７５、Ｍｅｒｃｋ）、ヒト化抗ＰＤ−１抗体ＪＳ００１（ＳｈａｎｇＨａｉ  ＪｕｎＳｈｉ）、モノクローナル抗ＰＤ−１抗体ＴＳＲ−０４２（Ｔｅｓａｒｏ、Ｉｎｃ．）、ピジリズマブ（抗ＰＤ−１  ｍＡｂ  ＣＴ−０１１、Ｍｅｄｉｖａｔｉｏｎ）、抗ＰＤ−１モノクローナル抗体ＢＧＢ−Ａ３１７（ＢｅｉＧｅｎｅ）、および／または抗ＰＤ−１抗体ＳＨＲ−１２１０（ＳｈａｎｇＨａｉ  ＨｅｎｇＲｕｉ）、ヒトモノクローナル抗体ＲＥＧＮ２８１０（セミプリマブ、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）、ヒトモノクローナル抗体ＭＤＸ−１１０６（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、および／またはヒト化抗ＰＤ−１  ＩｇＧ４抗体ＰＤＲ００１（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１抗体はクローン：ＲＭＰ１−１４（ラットＩｇＧ）−ＢｉｏＸｃｅｌｌカタログ番号ＢＰ０１４６に由来する。他の適切な抗体には、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第８，００８，４４９号に開示されている抗ＰＤ−１抗体が含まれる。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合し、ＰＤ−１との相互作用を阻害し、それにより免疫活性を増加させる。ＰＤ−Ｌ１に結合し、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用を破壊し、抗腫瘍免疫応答を刺激する当技術分野で公知の任意の抗体は、本明細書に開示されるキメラポリペプチドでの使用に適している。例えば、ＰＤ−Ｌ１を標的とし、臨床試験中の抗体には、ＢＭＳ−９３６５５９（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）およびＭＰＤＬ３２８０Ａ（Ｇｅｎｅｔｅｃｈ）が含まれる。ＰＤ−Ｌ１を標的とする他の適切な抗体は、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第７，９４３，７４３号に開示されている。ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１に結合し、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用を破壊し、抗腫瘍免疫応答を刺激する任意の抗体が本明細書に開示されるキメラでの使用に適していることは、当業者には理解されるであろう。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、抗ＰＤ−１抗体への融合を含む。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体への融合を含む。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、ＣＴＬＡ−４を標的とし、そのＣＤ８０およびＣＤ８６との相互作用を破壊する抗体またはその抗原結合部分への融合を含む。ＣＴＬＡ−４を標的とする例示的な抗体には、ＦＤＡ承認済みのイピリムマブ（ＭＤＸ−０１０、ＭＤＸ−１０１、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、および現在ヒト試験中のトレメリムマブ（チシリムマブ、ＣＰ−６７５、２０６、Ｐｆｉｚｅｒ）が含まれる。ＣＴＬＡ−４を標的とする他の適切な抗体は、参照により本明細書に組み入れられるＷＯ  ２０１２／１２０１２５、米国特許第６，９８４７２０号、第６，６８２，７３６８号、および米国特許出願第２００２／００３９５８１号、第２００２／００８６０１４号、および第２００５／０２０１９９４号に開示されている。ＣＴＬＡ−４に結合し、そのＣＤ８０およびＣＤ８６との相互作用を破壊し、抗腫瘍免疫応答を刺激する任意の抗体が本明細書に開示されるキメラポリペプチドでの使用に適していることは、当業者には理解されよう。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、抗ＣＴＬＡ−４抗体への融合を含む。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、ＬＡＧ−３を標的とし、そのＭＨＣクラスＩＩ分子との相互作用を破壊する抗体またはその抗原結合部分への融合を含む。ＬＡＧ−３を標的とする例示的な抗体は、現在ヒト試験中のＩＭＰ３２１（Ｉｍｍｕｔｅｐ）である。ＬＡＧ−３を標的とする他の適切な抗体は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第２０１１／０１５０８９２号に開示されている。ＬＡＧ−３に結合し、そのＭＨＣクラスＩＩ分子との相互作用を破壊し、抗腫瘍免疫応答を刺激する任意の抗体が本明細書に開示されるキメラポリペプチドでの使用に適していることは、当業者には理解されよう。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、抗ＬＡＧ−３抗体への融合を含む。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、Ｂ７−Ｈ３またはＢ７−Ｈ４を標的とする抗体またはその抗原結合部分への融合を含む。Ｂ７ファミリーには任意の定義された受容体はないが、これらのリガンドは腫瘍細胞または腫瘍浸潤細胞にて上方制御される。Ｂ７−Ｈ３を標的とする例示的な抗体は、現在ヒト試験中のＭＧＡ２７１（Ｍａｃｒｏｇｅｎｉｃｓ）である。Ｂ７ファミリーメンバーを標的とする他の適切な抗体は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第２０１３／０１４９２３６号に開示されている。Ｂ７−Ｈ３またはＨ４に結合し、抗腫瘍免疫応答を刺激する任意の抗体が本明細書に開示されるキメラでの使用に適していることは、当業者には理解されるであろう。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、抗Ｂ７−Ｈ３またはＢ７−Ｈ４抗体への融合を含む。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、ＴＩＭ−３を標的とし、そのガレクチン９との相互作用を破壊する抗体またはその抗原結合部分への融合を含む。ＴＩＭ−３を標的とする適切な抗体は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第２０１３／００２２６２３号に開示されている。ＴＩＭ−３に結合し、そのガレクチン９との相互作用を破壊し、抗腫瘍免疫応答を刺激する任意の抗体が本明細書に開示されるキメラポリペプチドでの使用に適していることは、当業者には理解されよう。いくつかの態様では、キメラポリペプチドは、抗ＴＩＭ−３抗体への融合を含む。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７を標的とし、そのＣＤ１３７Ｌとの相互作用を破壊する抗体またはその抗原結合部分への融合を含む。４−１ＢＢ／ＣＤ１３７に結合し、そのＣＤ１３７Ｌまたは別のリガンドとの相互作用を破壊し、全体として抗腫瘍活性をもたらす抗腫瘍免疫応答または免疫刺激応答を刺激する抗体が本明細書に開示されるキメラポリペプチドでの使用に適していることは、当業者には理解されよう。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、抗４−１ＢＢ／ＣＤ１３７抗体への融合を含む。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、ＧＩＴＲを標的とし、そのリガンドとの相互作用を破壊する抗体またはその抗原結合部分への融合を含む。ＧＩＴＲに結合し、そのＧＩＴＲＬまたは別のリガンドとの相互作用を破壊し、全体として抗腫瘍活性をもたらす抗腫瘍免疫応答または免疫刺激応答を刺激する抗体が本明細書に開示されるキメラポリペプチドでの使用に適していることは、当業者には理解されよう。いくつかの態様では、キメラポリペプチドは、抗ＧＩＴＲ抗体への融合を含む。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、ＯＸ４０を標的とし、そのリガンドとの相互作用を破壊する抗体またはその抗原結合部分への融合を含む。ＯＸ４０に結合し、そのＯＸ４０Ｌまたは別リガンドとの相互作用を破壊し、全体として抗腫瘍活性をもたらす抗腫瘍免疫応答または免疫刺激応答を刺激する抗体が本明細書に開示されるキメラポリペプチドでの使用に適していることは、当業者には理解されよう。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、抗ＯＸ４０抗体への融合を含む。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、ＣＤ４０を標的とし、そのリガンドとの相互作用を破壊する抗体またはその抗原結合部分への融合を含む。ＣＤ４０に結合し、そのリガンドとの相互作用を破壊し、全体として抗腫瘍活性をもたらす抗腫瘍免疫応答または免疫刺激応答を刺激する抗体が本明細書に開示されるキメラポリペプチドでの使用に適していることは、当業者には理解されよう。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、抗ＣＤ４０抗体への融合を含む
【０１３４】
いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、ＩＣＯＳを標的とし、そのリガンドとの相互作用を破壊する抗体またはその抗原結合部分への融合を含む。ＩＣＯＳに結合し、そのリガンドとの相互作用を破壊し、全体として抗腫瘍活性をもたらす抗腫瘍免疫応答または免疫刺激応答を刺激する抗体が本明細書に開示されるキメラポリペプチドでの使用に適していることは、当業者には理解されよう。いくつかの態様では、キメラポリペプチドは、抗ＩＣＯＳ抗体への融合を含む。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、ＣＤ２８を標的とし、そのリガンドとの相互作用を破壊する抗体またはその抗原結合部分への融合を含む。ＣＤ２８に結合し、そのリガンドとの相互作用を破壊し、全体として抗腫瘍活性をもたらす抗腫瘍免疫応答または免疫刺激応答を刺激する抗体が本明細書に開示されるキメラポリペプチドでの使用に適していることは、当業者には理解されよう。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、抗ＣＤ２８抗体への融合を含む。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、ＩＦＮαを標的とし、そのリガンドとの相互作用を破壊する抗体またはその抗原結合部分への融合を含む。ＩＦＮαに結合し、そのリガンドとの相互作用を破壊し、全体として抗腫瘍活性をもたらす抗腫瘍免疫応答または免疫刺激応答を刺激する抗体が本明細書に開示されるキメラポリペプチドでの使用に適していることは、当業者には理解されよう。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、抗ＩＦＮα抗体への融合を含む。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、腫瘍抗原または腫瘍抗原を標的とするポリペプチドへの融合を含む。一般に、腫瘍抗原は、腫瘍細胞をそれらの正常な細胞対応物から区別することを可能にし、例えば、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）および腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を含み得る。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、癌原遺伝子および／または腫瘍抑制因子、ならびに過剰発現または異常発現した細胞タンパク質、発癌性ウイルスによって産生される腫瘍抗原、癌胎児性抗原、細胞表面糖脂質および糖タンパク質の変化、および／または細胞型特異的分化抗原である。そのような腫瘍抗原には、黒色腫抗原、癌精巣抗原、上皮腫瘍抗原、細胞周期調節タンパク質、前立腺特異的抗原（例えば、米国特許第５，５３８，８６６号に開示されているような前立腺癌腫抗原を含む）、リンパ腫（米国特許第４，８１６，２４９号；第５，０６８，１７７号；および第５，２２７，１５９号）が含まれ得る。腫瘍抗原には、例えば、２Ｇ３および３６９Ｆ１０に結合したＨＭＷムチン、ｃ−ｅｒｂＢ−２関連腫瘍抗原（およそ４２ｋＤまたは５５ｋＤの糖タンパク質）、およそ１１３Ｆ１に結合した４０、６０、１００および２００ｋＤの抗原、９−Ｏ−アセチルＧＤ３、ｐ９７、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）（例えば、胚細胞腫瘍および／または肝細胞癌についての）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）（例えば、腸癌、時に肺癌または乳癌についての）、ＣＡ−１２５（例えば、卵巣癌についての）、ＭＵＣ−１（例えば、乳癌についての）、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）（例えば、乳癌についての）、チロシナーゼ（例えば、悪性黒色腫についての）、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）（例えば、悪性黒色腫についての）、癌／精巣抗原１（ＣＴＡＧ１Ｂ）、黒色腫関連抗原１（ＭＡＧＥＡ１）、異常なＲａｓ産物、異常なｐ５３産物、サイクリンの過剰発現（例えば、サイクリンＢ１を含む）、フィブロネクチンの突然変異、ＭＵＣ１糖タンパク質の翻訳後変化、分泌腫瘍抗原（例えば、ガングリオシドを含む）が含まれ得るが、これらに限定されない。
【０１３８】
他の融合は、アポトーシス促進性ペイロードとの融合を含み得る。そのような例示的な配列は、以下の表に提供される。いくつかの実施形態では、および本明細書に記載のＩＬ−２ムテインは、アポトーシス促進性ペイロード、例えばＢＡＤ、ＢＡＸ、ＢＡＫ、ＢＩＫ、および／またはＢＩＤ配列に融合される。いくつかの実施形態では、アポトーシス促進性ペイロードは、Ｂｃｌ−２ドメイン含有ペプチドおよび／またはＢＡＤ、ＢＡＸ、ＢＡＫ、ＢＩＫ、および／またはＢＩＤ配列の配列である。例示的なアポトーシス促進性融合を以下の表３に提供する。
【表３】
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いくつかの特定の実施形態では、ＩＬ−２アンタゴニストは、癌の治療のためにアポトーシス促進性ペイロードに融合され得る。「アンタゴニスト」とは、例えばアゴニストの活性を予防、低減、阻害、または中和することにより、アゴニストの作用に対抗する化合物である。「アンタゴニスト」は、同定されたアゴニストが存在しない場合でも、標的、例えば標的受容体の構成的活性を予防、阻害、または減少させることもできる。典型的には、野生型ＩＬ−２と比較された場合にアゴニストまたはスーパーアゴニスト活性を有するＩＬ−２ムテインが本発明の癌治療方法で使用されるが、そのようなアンタゴニストがアポトーシス促進性ペイロードに融合される場合、アンタゴニスト特性を有するＩＬ−２ムテインを使用することができる。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２アンタゴニストは、配列番号２の野生型ＩＬ−２と比較して、以下のアミノ酸置換Ｌ１８Ｒ、Ｑ２２Ｅ、Ｑ１２６Ｔ、およびＳ１３０Ｒを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２アンタゴニストは、配列番号２の野生型ＩＬ−２と比較して、以下のアミノ酸置換Ｌ１８Ｒ、Ｑ２２Ｅ、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＱ１２６Ｔを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２アンタゴニストは、配列番号２の野生型ＩＬ−２と比較して、以下のアミノ酸置換Ｌ１８Ｒ、Ｑ２２Ｅ、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、Ｑ１２６Ｔ、およびＳ１３０Ｒを含む。上記で提供されたものなどのアポトーシス促進性ペイロードと融合することができる例示的なアンタゴニストは、以下の表４で提供される。
【表４Ａ】
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【０１３９】
他の融合は、ＣＤ８細胞、ＮＫ細胞およびアネルギー性ＮＫ細胞の活性化の延長に使用するための抗アポトーシス性ペイロードとの融合も含むことができ、そのような例示的な配列を以下の表に示す。Ｔ細胞のこのような活性化の延長は、癌治療の治療法においての有益性を証明することができる。
【表４Ｂ】
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【０１４０】
他の例示的なＩＬ−２融合には、以下の表に列挙されたものを含む。
【表５】
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【０１４１】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテイン−Ｆｃ融合物は、以下の配列の１つを含む：
【表６】
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【０１４２】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテイン配列は、配列番号１２〜配列番号１５および／または配列番号２０〜配列番号８０のいずれか１つ（例えば、本明細書で提供されるＩＬ−２配列のいずれか）と９０％同一である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテイン配列は、配列番号１２〜配列番号１５および／または配列番号２０〜配列番号８０のいずれか１つ（例えば、本明細書で提供されるＩＬ−２配列のいずれか）と９５％同一である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテイン配列は、配列番号１２〜配列番号１５および／または配列番号２０〜配列番号８０のいずれか１つ（例えば、本明細書で提供されるＩＬ−２配列のいずれか）と９８％同一である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテイン配列は、配列番号１２〜配列番号１５および／または配列番号２０〜配列番号８０のいずれか１つ（例えば、本明細書で提供されるＩＬ−２配列のいずれか）と９９％同一である。
【０１４３】
Ｃ．ＩＬ−２との融合のためのＩＬ−４、ＩＬ−１３  ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ１５、およびＩＬ−１８
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、本明細書に記載されるようなＩＬ−４ムテインに融合させることができる。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、本明細書に記載されるようなＩＬ−１３ムテインに融合させることができる。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインをＩＬ−１０に融合させることができる。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインをＩＬ−１２に融合させることができる。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインをＩＬ−１５に融合させることができる。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインをＩＬ−１８に融合させることができる。いくつかの実施形態では、そのような融合は、癌細胞および／または癌幹細胞を特異的に標的とし、癌幹細胞成長を低減または阻害するとともに、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）内の免疫抑制細胞を標的とするように機能する。
【０１４４】
任意のＩＬ−１３配列またはそのバリアントが、本明細書に記載のＩＬ−２ムテインとの融合において使用され得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、５−１配列番号５；５−２配列番号６；６−６配列番号７；Ａ２配列番号８；Ｂ１配列番号９；Ｂ１１配列番号１０；Ｃ５配列番号１１；Ｄ１０配列番号１２；Ｅ１０配列番号１３；Ｇ８配列番号１４；Ｈ４配列番号１５；およびＨ９配列番号１６のいずれか１つを含む。例示的なＩＬ−１３ポリペプチド配列は、配列番号８１〜配列番号１２８、ならびに以下の表に提供されている。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１３ポリペプチド配列は、配列番号８１〜配列番号１２８のいずれか１つで提供される通りである。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１３ポリペプチド配列は配列番号８１である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１３ポリペプチド配列は配列番号８２である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１３ポリペプチド配列は配列番号８３である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１３ポリペプチド配列は配列番号８４である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１３ポリペプチド配列は配列番号８５である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１３ポリペプチド配列は配列番号８６である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１３ポリペプチド配列は配列番号８７である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１３ポリペプチド配列は配列番号８８である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１３ポリペプチド配列は配列番号８９である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１３ポリペプチド配列は配列番号９０である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１３ポリペプチド配列は配列番号９１である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１３ポリペプチド配列は配列番号９２である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１３ポリペプチド配列は配列番号９３である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１３ポリペプチド配列は配列番号９４である。いくつかの実施形態では、ポリペプチド配列は配列番号９５である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１３ポリペプチド配列は配列番号９６である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１３ポリペプチド配列は配列番号９７である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１３ポリペプチド配列は配列番号９８である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１３ポリペプチド配列は配列番号９９である。いくつかの実施形態では、ポリペプチド配列は配列番号１００である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１３ポリペプチド配列は配列番号１０１である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１３ポリペプチド配列は配列番号１０２である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１３ポリペプチド配列は配列番号１０３である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１３ポリペプチド配列は配列番号１０４である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１３ポリペプチド配列は配列番号１０５である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１３ポリペプチド配列は配列番号１０６である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１３ポリペプチド配列は配列番号１０７である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１３ポリペプチド配列は配列番号１０８である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１３ポリペプチド配列は配列番号１０９である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１３ポリペプチド配列は配列番号１１０である。いくつかの実施形態では、ポリペプチド配列は配列番号１１１である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１３ポリペプチド配列は配列番号１１２である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１３ポリペプチド配列は配列番号１１３である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１３ポリペプチド配列は配列番号１１４である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１３ポリペプチド配列は配列番号１１５である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１３ポリペプチド配列は配列番号１１６である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１３ポリペプチド配列は配列番号１１７である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１３ポリペプチド配列は配列番号１１８である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１３ポリペプチド配列は配列番号１１９である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１３ポリペプチド配列は配列番号１２０である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１３ポリペプチド配列は配列番号１２１である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１３ポリペプチド配列は配列番号１２２である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１３ポリペプチド配列は配列番号１２３である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１３ポリペプチド配列は配列番号１２４である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１３ポリペプチド配列は配列番号１２５である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１３ポリペプチド配列は配列番号１２６である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１３ポリペプチド配列は配列番号１２７である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１３ポリペプチド配列は配列番号１２８である。ＩＬ−１３  いくつかの実施形態では、ＩＬ−１３ポリペプチド配列は、配列番号８１〜配列番号１２８のいずれか１つと９０％同一である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１３ポリペプチド配列は、配列番号８１〜配列番号１２８のいずれか１つと９５％同一である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１３ポリペプチド配列は、配列番号８１〜配列番号１２８のいずれか１つと９８％同一である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１３ポリペプチド配列は、配列番号８１〜配列番号１２８のいずれか１つと９９％同一である。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、配列番号８１〜配列番号１２８のいずれか１つが、本明細書に記載のＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインに連結される。いくつかの実施形態では、配列番号８１は、本明細書に記載のＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインに結合している。いくつかの実施形態では、配列番号８２は、本明細書に記載のＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインに結合している。いくつかの実施形態では、配列番号８３は、本明細書に記載のＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインに結合している。いくつかの実施形態では、配列番号８４は、本明細書に記載のＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインに結合している。いくつかの実施形態では、配列番号８５は、本明細書に記載のＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインに結合している。いくつかの実施形態では、配列番号８６は、本明細書に記載のＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインに結合している。いくつかの実施形態では、配列番号８７は、本明細書に記載のＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインに結合している。いくつかの実施形態では、配列番号８８は、本明細書に記載のＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインに結合している。いくつかの実施形態では、配列番号８９は、本明細書に記載のＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインに結合している。いくつかの実施形態では、配列番号９０は、本明細書に記載のＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインに結合している。いくつかの実施形態では、配列番号９１は、本明細書に記載のＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインに結合している。いくつかの実施形態では、配列番号９２は、本明細書に記載のＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインに結合している。いくつかの実施形態では、配列番号９３は、本明細書に記載のＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインに結合している。いくつかの実施形態では、配列番号９４は、本明細書に記載のＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインに結合している。いくつかの実施形態では、配列番号９４は、本明細書に記載のＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインに結合している。いくつかの実施形態では、配列番号９６は、本明細書に記載のＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインに結合している。いくつかの実施形態では、配列番号９７は、本明細書に記載のＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインに結合している。いくつかの実施形態では、配列番号９８は、本明細書に記載のＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインに結合している。いくつかの実施形態では、配列番号９９は、本明細書に記載のＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインに結合している。いくつかの実施形態では、配列番号１００は、本明細書に記載のＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインに結合している。いくつかの実施形態では、配列番号１０１は、本明細書に記載のＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインに結合している。いくつかの実施形態では、配列番号１０２は、本明細書に記載のＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインに結合している。いくつかの実施形態では、配列番号１０３は、本明細書に記載のＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインに結合している。いくつかの実施形態では、配列番号１０４は、本明細書に記載のＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインに結合している。いくつかの実施形態では、配列番号１０５は、本明細書に記載のＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインに結合している。いくつかの実施形態では、配列番号１０６は、本明細書に記載のＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインに結合している。いくつかの実施形態では、配列番号１０７は、本明細書に記載のＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインに結合している。いくつかの実施形態では、配列番号１０８は、本明細書に記載のＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインに結合している。いくつかの実施形態では、配列番号１０９は、本明細書に記載のＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインに結合している。いくつかの実施形態では、配列番号１１０は、本明細書に記載のＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインに結合している。いくつかの実施形態では、配列番号１１１は、本明細書に記載のＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインに結合している。いくつかの実施形態では、配列番号１１２は、本明細書に記載のＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインに結合している。いくつかの実施形態では、配列番号１１３は、本明細書に記載のＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインに結合している。いくつかの実施形態では、配列番号１１４は、本明細書に記載のＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインに結合している。いくつかの実施形態では、配列番号１１５は、本明細書に記載のＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインに結合している。いくつかの実施形態では、配列番号１１６は、本明細書に記載のＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインに結合している。いくつかの実施形態では、配列番号１１７は、本明細書に記載のＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインに結合している。いくつかの実施形態では、配列番号１１８は、本明細書に記載のＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインに結合している。いくつかの実施形態では、配列番号１１９は、本明細書に記載のＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインに結合している。いくつかの実施形態では、配列番号１２０は、本明細書に記載のＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインに結合している。いくつかの実施形態では、配列番号１２１は、本明細書に記載のＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインに結合している。いくつかの実施形態では、配列番号１２２は、本明細書に記載のＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインに結合している。いくつかの実施形態では、配列番号１２３は、本明細書に記載のＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインに結合している。いくつかの実施形態では、配列番号１２４は、本明細書に記載のＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインに結合している。いくつかの実施形態では、配列番号１２５は、本明細書に記載のＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインに結合している。いくつかの実施形態では、配列番号１２６は、本明細書に記載のＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインに結合している。いくつかの実施形態では、配列番号１２７は、本明細書に記載のＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインに結合している。いくつかの実施形態では、配列番号１２８は、本明細書に記載のＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインに結合している。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、５−１配列番号５；５−２配列番号６；６−６配列番号７；Ａ２配列番号８；Ｂ１配列番号９；Ｂ１１配列番号１０；Ｃ５配列番号１１；Ｄ１０配列番号１２；Ｅ１０配列番号１３；Ｇ８配列番号１４；Ｈ４配列番号１５；およびＨ９配列番号１６のいずれか１つを含む。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、本発明のＩＬ−１３ペプチドは、アミノ酸置換：（１）Ｌ１０Ｆ、Ｌ１０Ｉ、Ｌ１０Ｖ、Ｌ１０Ａ、Ｌ１０Ｄ、Ｌ１０Ｔ、Ｌ１０Ｈ；（２）Ｒ１１Ｓ、Ｒ１１Ｎ、Ｒ１１Ｈ、Ｒ１１Ｌ、Ｒ１１Ｉ；（３）Ｉ１４Ｌ、Ｉ１４Ｆ、１１４Ｖ、Ｉ１４Ｍ；（４）Ｖ１８Ｌ、Ｖ１８Ｆ、Ｖ１８Ｉ；（５）Ｅ１２Ａ、（６）Ｒ６５Ｄ、（７）Ｒ８６Ｋ、Ｒ８６Ｔ、Ｒ８６Ｍ；（８）Ｄ８７Ｅ、Ｄ８７Ｋ、Ｄ８７Ｒ、Ｄ８７Ｇ、Ｄ８７Ｓ；（９）Ｔ８８Ｉ、Ｔ８８Ｋ、Ｔ８８Ｒ；（１０）Ｋ８９Ｒ、Ｋ８９Ｔ、Ｋ８９Ｍ；（１１）Ｌ１０１  Ｆ、Ｌ１０１Ｉ、Ｌ１０１Ｙ、Ｌ１０１Ｈ、Ｌ１０１Ｎ；（１２）Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０４Ｔ、Ｋ１０４Ｍ；（１３）Ｋ１０５Ｔ、Ｋ１０５Ａ、Ｋ１０５Ｒ、Ｋ１０５Ｅ；（１４）Ｆ１０７Ｌ、Ｆ１０７Ｉ、Ｆ１０７Ｖ、Ｆ１０７Ｍ；および（１５）Ｒ１０８Ｋ、Ｒ１０８Ｔ、Ｒ１０８Ｍの１つ以上を含み、これらの置換は、ＩＬ−１３Ｒα１とＩＬ−１３Ｒα２の一方または両方の親和性の変化を引き起こす。他の実施形態では、改変された残基は、上記で定義された接触残基の組み合わせセット内の２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上であるが、１４以下のアミノ酸にある。国際特許公開第ＷＯ２０１３／１１２８７１号に記載されており、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換には、図４に提供されるものが含まれるがこれらに限定されない。
【０１４７】
改変のセットには、以下の特定の変更：（１）Ｌ１０Ｈ；Ｌ１０Ａ；（２）Ｒ１１Ｌ；（４）Ｖ１８Ｉ；（７）Ｒ８６Ｍ；Ｒ８６Ｋ；Ｒ８６Ｔ；（８）Ｄ８７Ｋ；Ｄ８７Ｇ；（９）Ｔ８８Ｒ、Ｔ８８Ｓ；Ｔ８８Ｋ；（１０）Ｋ８９Ｒ；（１１）Ｌ１０１Ｎ；（１２）Ｋ１０４Ｒ；（１３）Ｋ１０５Ａ；Ｋ１０５Ｅ；（１４）Ｒ１０８Ｋ．が含まれ得る。いくつかの実施形態では、改変は、列挙された特定の変更のいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ１０Ｈを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ１０Ａを含む。いくつかの実施形態では、改変はＲ１１Ｌを含む。いくつかの実施形態では、改変はＶ１８Ｉを含む。いくつかの実施形態では、改変はＲ８６Ｍを含む。いくつかの実施形態では、改変はＲ８６Ｋを含む。いくつかの実施形態では、改変はＲ８６Ｔを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ８７Ｋを含む。いくつかの実施形態では、改変はＤ８７Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変はＴ８８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＴ８８Ｓを含む。いくつかの実施形態では、改変はＴ８８Ｋを含む。いくつかの実施形態では、改変はＫ８９Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＬ１０１Ｎを含む。いくつかの実施形態では、改変はＫ１０４Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変はＫ１０５Ａを含む。いくつかの実施形態では、改変はＫ１０５Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変はＲ１０８Ｋを含む。いくつかの態様では、１つ以上の改変を含むポリペプチドは、本明細書に記載のＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインに結合している。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換には、図４に提供されるものが含まれるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、５−１配列番号５；５−２配列番号６；６−６配列番号７；Ａ２配列番号８；Ｂ１配列番号９；Ｂ１１配列番号１０；Ｃ５配列番号１１；Ｄ１０配列番号１２；Ｅ１０配列番号１３；Ｇ８配列番号１４；Ｈ４配列番号１５；およびＨ９配列番号１６のいずれか１つを含む。
【０１４８】
天然のＩＬ−１３配列と比較してＩＬ−１３Ｒα１に対するＩＬ−１３Ｒα２への結合の選択性を高める特定の改変のセットには、以下が含まれるがこれらに限定されない：
●［Ｌ１０Ｄ、Ｒ１１Ｉ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｋ、ｋ８９Ｒ、Ｒ１０８Ｋ］（例えば、Ｃ２、例えば、配列番号３１または配列番号４９）
●［Ｌ１０Ａ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｋ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｎ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、Ｒ１０８Ｋ］（例えば、Ｃ３、例えば、配列番号３２または配列番号５０）
●［Ｌ１０Ｖ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｎ、Ｋ１０５Ｅ、Ｒ１０８Ｔ］（例えば、Ｃ４、例えば、配列番号３３または配列番号３１）
●［Ｒ１１Ｓ、Ｉ１４Ｍ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｎ、Ｋ１０５Ａ、Ｒ１０８Ｋ］（例えば、Ｃ７、例えば、配列番号３４または配列番号５２）
●［Ｌ１０Ｈ、Ｒ１１Ｌ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｅ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｎ、Ｋ１０５Ｔ、Ｒ１０８Ｋ］（Ｃ９、例えば、配列番号５３）
●［Ｌ１０Ｈ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｒ、Ｒ１０８Ｋ］（Ｃ１１、例えば、配列番号３８または配列番号５５）
●［Ｌ１０Ａ、Ｖ１８Ｆ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｋ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｉ、Ｋ１０４Ｒ、Ｒ１０８Ｋ］（Ｄ７、例えば、配列番号４０または配列番号５７）
●［Ｌ１０Ｔ／Ｄ；Ｒ１１Ｉ；Ｖ１８Ｉ；Ｒ８６Ｋ；Ｄ８７Ｋ／Ｇ；Ｔ８８Ｓ；Ｋ８９Ｒ；Ｌ１０１Ｙ；Ｋ１０４Ｒ；Ｋ１０５Ｔ；Ｒ１０８Ｋ］
●［Ｌ１０Ａ／Ｖ；Ｒ８６Ｔ；Ｄ８７Ｇ；Ｔ８８Ｋ；Ｋ８９Ｒ；Ｌ１０１Ｎ；Ｋ１０４Ｒ；Ｋ１０５Ａ／Ｅ；Ｒ１０８Ｋ／Ｔ］
【０１４９】
いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｖ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｎ、Ｋ１０５Ｅ、Ｒ１０８Ｔを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｒ１１Ｓ、Ｉ１４Ｍ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｎ、Ｋ１０５Ａ、およびＲ１０８Ｋ（Ｃ７、例えば配列番号３５または配列番号５２）を含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｈ、Ｒ１１Ｌ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｅ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｎ、Ｋ１０５Ｔ、およびＲ１０８Ｋ（Ｃ９、例えば配列番号３６または配列番号５３）を含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｈ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｒ、およびＲ１０８Ｋ（Ｃ１１、例えば配列番号３８または配列番号５５）を含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ａ、Ｖ１８Ｆ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｋ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｉ、Ｋ１０４Ｒ、およびＲ１０８Ｋ（Ｄ７、例えば、配列番号４０または配列番号５７）を含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｔ／Ｄ、Ｒ１１Ｉ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｋ／Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｙ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、およびＲ１０８Ｋを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｔ、Ｒ１１Ｉ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｋ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｙ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、およびＲ１０８Ｋを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｔ、Ｒ１１Ｉ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｙ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、およびＲ１０８Ｋを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｄ、Ｒ１１Ｉ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｋ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｙ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、およびＲ１０８Ｋを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｄ、Ｒ１１Ｉ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｙ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｒ１０８Ｋを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ａ／Ｖ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｋ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｎ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ／Ｅ、およびＲ１０８Ｋ／Ｔを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ａ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｋ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｎ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、およびＲ１０８Ｋを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ａ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｋ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｎ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｅ、およびＲ１０８Ｋを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ａ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｋ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｎ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、およびＲ１０８Ｔを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ａ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｋ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｎ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｅ、およびＲ１０８Ｔを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｖ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｋ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｎ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、およびＲ１０８Ｋを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｖ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｋ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｎ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｅ、およびＲ１０８Ｋを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｖ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｋ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｎ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、ｄＲ１０８Ｔを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｖ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｋ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｎ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｅ、およびＲ１０８Ｔを含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は９０％同一である。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は９５％同一である。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は９８％同一である。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は９９％同一である。いくつかの実施形態では、１つ以上の改変を含むポリペプチドは、本明細書に記載のＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインに連結している。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換には、図４に提供されるものが含まれるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、５−１配列番号５；５−２配列番号６；６−６配列番号７；Ａ２配列番号８；Ｂ１配列番号９；Ｂ１１配列番号１０；Ｃ５配列番号１１；Ｄ１０配列番号１２；Ｅ１０配列番号１３；Ｇ８配列番号１４；Ｈ４配列番号１５；およびＨ９配列番号１６のいずれか１つを含む。
【０１５０】
天然のＩＬ−１３配列と比較してＩＬ−１３Ｒα２に対するＩＬ−１３Ｒα１への結合の選択性を高める特定の改変のセットには、以下が含まれるがこれらに限定されない：
●［Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｄ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ］
●［Ｒ１１Ｓ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｍ、Ｌ１０１Ｙ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ］
●［Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ］
●［Ｌ１０Ｖ／Ｉ；Ｄ８７Ｓ；Ｔ８８Ｓ；Ｋ８９Ｒ；Ｌ１０１Ｈ／Ｆ；Ｋ１０４Ｒ；Ｋ１０５Ｔ］
●［Ｌ１０Ｉ；Ｖ１８Ｉ；Ｒ８６Ｔ；Ｄ８７Ｇ；Ｔ８８Ｓ；Ｋ８９Ｒ；Ｌ１０１Ｙ／Ｈ；Ｋ１０４Ｒ；Ｋ１０５Ａ］
●［Ｌ１０Ｖ；Ｖ１８Ｉ；Ｄ８７Ｓ；Ｔ８８Ｓ；Ｌ１０１Ｆ；Ｋ１０４Ｒ；Ｋ１０５Ｔ］
●［Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｙ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ］
●［Ｒ１１Ｉ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｈ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、Ｆ１０７Ｍ］
これらの置換は、場合により、置換［Ｅ１２Ａ／Ｇ／Ｓ、Ｒ６５Ｄ／Ｅ］と組み合わされる。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｄ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、およびＫ１０５Ｔを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｒ１１Ｓ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｍ、Ｌ１０１Ｙ、Ｋ１０４Ｒ、およびＫ１０５Ｔを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、およびＫ１０５Ｔを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｖ／Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｈ／Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、およびＫ１０５Ｔを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｉ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｙ／Ｈ、Ｋ１０４Ｒ、およびＫ１０５Ａを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、およびＫ１０５Ｔを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｙ、Ｋ１０４Ｒ、およびＫ１０５Ａを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｒ１１Ｉ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｈ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、およびＦ１０７Ｍを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｄ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ａ／Ｇ／Ｓ、およびＲ６５Ｄ／Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｒ１１Ｓ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｍ、Ｌ１０１Ｙ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ａ／Ｇ／Ｓ、およびＲ６５Ｄ／Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ａ／Ｇ／Ｓ、およびＲ６５Ｄ／Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｖ／Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｈ／Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ａ／Ｇ／Ｓ、およびＲ６５Ｄ／Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｉ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｙ／Ｈ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、Ｅ１２Ａ／Ｇ／Ｓ、およびＲ６５Ｄ／Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ａ／Ｇ／Ｓ、およびＲ６５Ｄ／Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｙ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、Ｅ１２Ａ／Ｇ／Ｓ、およびＲ６５Ｄ／Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｒ１１Ｉ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｈ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、Ｆ１０７Ｍ、Ｅ１２Ａ／Ｇ／Ｓ、およびＲ６５Ｄ／Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｄ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ａ、およびＲ６５Ｄ／Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｒ１１Ｓ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｍ、Ｌ１０１Ｙ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ａ、およびＲ６５Ｄ／Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ａ、およびＲ６５Ｄ／Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｖ／Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｈ／Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ａ、およびＲ６５Ｄ／Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｉ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｙ／Ｈ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、Ｅ１２Ａ、およびＲ６５Ｄ／Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ａ、およびＲ６５Ｄ／Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｙ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、Ｅ１２Ａ、およびＲ６５Ｄ／Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｒ１１Ｉ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｈ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、Ｆ１０７Ｍ、Ｅ１２Ａ、およびＲ６５Ｄ／Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｄ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ｇ、およびＲ６５Ｄ／Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｒ１１Ｓ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｍ、Ｌ１０１Ｙ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ｇ、およびＲ６５Ｄ／Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ａ／Ｇ／Ｓ、およびＲ６５Ｄ／Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｖ／Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｈ／Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ｇ、およびＲ６５Ｄ／Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｉ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｙ／Ｈ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、Ｅ１２Ｇ、およびＲ６５Ｄ／Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ｇ、およびＲ６５Ｄ／Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｙ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、Ｅ１２Ｇ、およびＲ６５Ｄ／Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｒ１１Ｉ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｈ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、Ｆ１０７Ｍ、Ｅ１２Ｇ、およびＲ６５Ｄ／Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｄ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ｓ、およびＲ６５Ｄ／Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｒ１１Ｓ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｍ、Ｌ１０１Ｙ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ａ／Ｇ／Ｓ、およびＲ６５Ｄ／Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ｓ、およびＲ６５Ｄ／Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｖ／Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｈ／Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ｓ、およびＲ６５Ｄ／Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｉ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｙ／Ｈ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、Ｅ１２Ｓ、およびＲ６５Ｄ／Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ｓ、およびＲ６５Ｄ／Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｙ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、Ｅ１２Ｓ、およびＲ６５Ｄ／Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｒ１１Ｉ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｈ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、Ｆ１０７Ｍ、Ｅ１２Ｓ、およびＲ６５Ｄ／Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｄ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ａ、およびＲ６５Ｄを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｒ１１Ｓ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｍ、Ｌ１０１Ｙ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ａ、およびＲ６５Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ａ、およびＲ６５Ｄを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｖ／Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｈ／Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ａ、およびＲ６５Ｄを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｉ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｙ／Ｈ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、Ｅ１２Ａ、およびＲ６５Ｄを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ａ、およびＲ６５Ｄを含む。
いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｙ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、Ｅ１２Ａ、およびＲ６５Ｄを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｒ１１Ｉ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｈ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、Ｆ１０７Ｍ、Ｅ１２Ａ、およびＲ６５Ｄを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｄ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ｇ、およびＲ６５Ｄを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｒ１１Ｓ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｍ、Ｌ１０１Ｙ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ｇ、およびＲ６５Ｄを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ａ／Ｇ／Ｓ、およびＲ６５Ｄを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｖ／Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｈ／Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ｇ、およびＲ６５Ｄを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｉ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｙ／Ｈ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、Ｅ１２Ｇ、およびＲ６５Ｄを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ｇ、およびＲ６５Ｄを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｙ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、Ｅ１２Ｇ、およびＲ６５Ｄを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｒ１１Ｉ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｈ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、Ｆ１０７Ｍ、Ｅ１２Ｇ、およびＲ６５Ｄを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｄ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ｓ、およびＲ６５Ｄを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｒ１１Ｓ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｍ、Ｌ１０１Ｙ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ｓ、およびＲ６５Ｄを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ｓ、およびＲ６５Ｄを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｖ／Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｈ／Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ｓ、およびＲ６５Ｄを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｉ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｙ／Ｈ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、Ｅ１２Ｓ、およびＲ６５Ｄを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ｓ、およびＲ６５Ｄを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｙ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、Ｅ１２Ｓ、およびＲ６５Ｄを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｒ１１Ｉ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｈ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、Ｆ１０７Ｍ、Ｅ１２Ｓ、およびＲ６５Ｄを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｄ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ａ、およびＲ６５Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｒ１１Ｓ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｍ、Ｌ１０１Ｙ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ａ、およびＲ６５Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ａ、およびＲ６５Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｖ／Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｈ／Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ａ、およびＲ６５Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｉ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｙ／Ｈ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、Ｅ１２Ａ、およびＲ６５Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ａ、およびＲ６５Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｙ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、Ｅ１２Ａ、およびＲ６５Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｒ１１Ｉ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｈ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、Ｆ１０７Ｍ、Ｅ１２Ａ、およびＲ６５Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｄ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ｇ、およびＲ６５Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｒ１１Ｓ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｍ、Ｌ１０１Ｙ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ｇ、およびＲ６５Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ａ／Ｇ／Ｓ、およびＲ６５Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｖ／Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｈ／Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ｇ、およびＲ６５Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｉ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｙ／Ｈ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、Ｅ１２Ｇ、およびＲ６５Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ｇ、およびＲ６５Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｙ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、Ｅ１２Ｇ、およびＲ６５Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｒ１１Ｉ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｈ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、Ｆ１０７Ｍ、Ｅ１２Ｇ、およびＲ６５Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｄ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ｓ、およびＲ６５Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｒ１１Ｓ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｍ、Ｌ１０１Ｙ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ａ／Ｇ／Ｓ、およびＲ６５Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ｓ、およびＲ６５Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｖ／Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｈ／Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ｓ、およびＲ６５Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｉ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｙ／Ｈ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、Ｅ１２Ｓ、およびＲ６５Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ｓ、およびＲ６５Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｙ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、Ｅ１２Ｓ、およびＲ６５Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｒ１１Ｉ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｈ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、Ｆ１０７Ｍ、Ｅ１２Ｓ、およびＲ６５Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変のセットは、Ｌ１０Ｖ、Ｅ１２Ａ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ６５Ｄ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、およびＫ１０５Ｔを含む（例えば、ＩＬ−１３ｄｎ；配列番号３８を参照されたい）。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は９０％同一である。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は９５％同一である。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は９８％同一である。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は９９％同一である。いくつかの実施形態では、１つ以上の改変を含むポリペプチドは、本明細書に記載のＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインに連結している。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換には、図４に提供されるものが含まれるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、５−１配列番号５；５−２配列番号６；６−６配列番号７；Ａ２配列番号８；Ｂ１配列番号９；Ｂ１１配列番号１０；Ｃ５配列番号１１；Ｄ１０配列番号１２；Ｅ１０配列番号１３；Ｇ８配列番号１４；Ｈ４配列番号１５；およびＨ９配列番号１６のいずれか１つを含む。
【０１５２】
ＩＬ−１３配列の表を以下に示す。
【表７】
2020524174.tif 000029
2020524174.tif 000030
2020524174.tif 000031
2020524174.tif 000032
2020524174.tif 000033
2020524174.tif 000034
2020524174.tif 000035
2020524174.tif 000036
2020524174.tif 000037
【０１５３】
任意のＩＬ−４配列またはそのバリアントが、本明細書に記載のものを含むＩＬ−２ムテインまたはバリアントとの融合において使用され得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、５−１配列番号５；５−２配列番号６；６−６配列番号７；Ａ２配列番号８；Ｂ１配列番号９；Ｂ１１配列番号１０；Ｃ５配列番号１１；Ｄ１０配列番号１２；Ｅ１０配列番号１３；Ｇ８配列番号１４；Ｈ４配列番号１５；およびＨ９配列番号１６のいずれか１つを含む。例示的なポリペプチド配列は、本明細書で提供されるものいずれかを含む配列番号１３０〜配列番号１３５において提供される。いくつかの実施形態では、ＩＬ−４ポリペプチド配列は、配列番号１３０〜配列番号１３５のいずれか１つで提供される通りである。いくつかの実施形態では、ＩＬ−４ポリペプチド配列は配列番号１３０である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−４ポリペプチド配列は配列番号１３１である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−４ポリペプチド配列は配列番号１３２である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−４ポリペプチド配列は配列番号１３３である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−４ポリペプチド配列は配列番号１３４である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−４ポリペプチド配列は配列番号１３５である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−４ポリペプチド配列は、配列番号１３０〜配列番号１３５のいずれか１つと９８％同一である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−４ポリペプチド配列は、配列番号１３０〜配列番号１３５のいずれか１つと９９％同一である。いくつかの実施形態では、配列番号１３０〜配列番号１３５のいずれか１つが、本明細書に記載のＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインに連結される。いくつかの実施形態では、配列番号１３０は、本明細書に記載のＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインに結合している。いくつかの実施形態では、配列番号１３１は、本明細書に記載のＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインに結合している。いくつかの実施形態では、配列番号１３２は、本明細書に記載のＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインに結合している。いくつかの実施形態では、配列番号１３３は、本明細書に記載のＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインに結合している。いくつかの実施形態では、配列番号１３４は、本明細書に記載のＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインに結合している。いくつかの実施形態では、配列番号１３５は、本明細書に記載のＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインに結合している。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、５−１配列番号５；５−２配列番号６；６−６配列番号７；Ａ２配列番号８；Ｂ１配列番号９；Ｂ１１配列番号１０；Ｃ５配列番号１１；Ｄ１０配列番号１２；Ｅ１０配列番号１３；Ｇ８配列番号１４；Ｈ４配列番号１５；およびＨ９配列番号１６のいずれか１つを含む。
【０１５４】
ＩＬ−４配列の表を以下に示す。
【表８】
2020524174.tif 000038
2020524174.tif 000039
【０１５５】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインをＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、および／またはＩＬ−１８配列に融合させることができる。いくつかの実施形態では、このような融合は、融合構築物をＮＫ細胞および／またはＣＤ８＋細胞に特異的に標的させるように機能する。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、５−１配列番号５；５−２配列番号６；６−６配列番号７；Ａ２配列番号８；Ｂ１配列番号９；Ｂ１１配列番号１０；Ｃ５配列番号１１；Ｄ１０配列番号１２；Ｅ１０配列番号１３；Ｇ８配列番号１４；Ｈ４配列番号１５；およびＨ９配列番号１６のいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、配列番号１３６は、本明細書に記載のＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインに結合している。いくつかの実施形態では、配列番号１３７は、本明細書に記載のＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインに結合している。いくつかの実施形態では、配列番号１３８は、本明細書に記載のＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインに結合している。いくつかの実施形態では、配列番号１３９は、本明細書に記載のＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインに結合している。いくつかの実施形態では、配列番号１４０は、本明細書に記載のＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインに結合している。いくつかの実施形態では、配列番号１４１は、本明細書に記載のＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインに結合している。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、以下の表の配列番号１３６〜１４１に提供されるようなＩＬ−ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、および／またはＩＬ−１８配列に融合することができる。
【表９】
2020524174.tif 000040
2020524174.tif 000041
【０１５６】
例示的なＩＬ−２ムテインの配列は、５−１配列番号５；５−２配列番号６；６−６配列番号７；Ａ２配列番号８；Ｂ１配列番号９；Ｂ１１配列番号１０；Ｃ５配列番号１１；Ｄ１０配列番号１２；Ｅ１０配列番号１３；Ｇ８配列番号１４；Ｈ４配列番号１５；およびＨ９配列番号１６のいずれか１つを含む。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、サイトカイン−サイトカイン融合体は、以下の表に含まれるものの１つである。
【表１０】
2020524174.tif 000042
【０１５８】
Ｄ．ＩＬ−２ムテインの組換え発現、発現ベクター、および宿主細胞
種々の実施形態では、本発明の実施において使用されるポリペプチドは合成であるか、または組換え核酸分子の発現により産生される。ポリペプチドがキメラ（例えば、少なくとも１つの変異ＩＬ−２ポリペプチドおよび異種ポリペプチドを含む融合タンパク質）である場合、それは、ＩＬ−２ムテインのすべてまたは一部をコードする１つの配列と、異種ポリペプチドのすべてまたは一部をコードする第２の配列とを含むハイブリッド核酸分子によってコードされ得る。例えば、本明細書に記載の対象ＩＬ−２ムテインは、細菌で発現したタンパク質の精製を促進するヘキサヒスチジンタグ、または真核細胞で発現したタンパク質の精製を促進するヘマグルチニンタグに融合され得る。
【０１５９】
ＩＬ−２ムテインをコードするＤＮＡ配列を構築し、適切に形質転換された宿主でそれらの配列を発現させる方法には、ＰＣＲ支援突然変異誘発技術の使用が含まれるが、これに限定されない。ＩＬ−２ポリペプチドに対するアミノ酸残基の欠失または付加からなる突然変異も、標準的な組換え技術を使用して行うことができる。欠失または付加の場合、ＩＬ−２をコードする核酸分子は、適切な制限エンドヌクレアーゼで任意に消化される。得られた断片は、直接発現させるか、例えば、第２の断片にそれを連結することによりさらに操作することができる。核酸分子の２つの末端が互いに重なり合う相補的ヌクレオチドを含む場合、連結は促進され得るが、平滑末端断片も連結され得る。ＰＣＲで生成された核酸を使用して、様々な変異配列を産生することもできる。
【０１６０】
完全なアミノ酸配列を使用して、逆翻訳遺伝子を構築できる。ＩＬ−２ムテインをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡオリゴマーを合成することができる。例えば、所望のポリペプチドの部分をコードするいくつかの小さなオリゴヌクレオチドを合成し、次に連結することができる。個々のオリゴヌクレオチドは、通常、相補的なアセンブリのために５´または３’突出部分を含有する。
【０１６１】
組換え分子生物学的技術によって変更された核酸分子の発現を介して変異体ポリペプチドを生成することに加えて、対象ＩＬ−２ムテインを化学的に合成することができる。化学合成ポリペプチドは、当業者によって日常的に産生される。
【０１６２】
（合成、部位特異的突然変異誘発、または別の方法により）組み立てられると、ＩＬ−２ムテインをコードするＤＮＡ配列が発現ベクターに挿入され、所望の形質転換された宿主においてＩＬ−２ムテインの発現に適した発現制御配列に作動可能に連結され得る。適切なアセンブリは、ヌクレオチド配列決定、制限マッピング、および適切な宿主における生物学的に活性なポリペプチドの発現によって確認することができる。当該分野で周知のように、宿主においてトランスフェクトされた遺伝子の高い発現レベルを得るために、遺伝子は、選択された発現宿主において機能する転写および翻訳発現制御配列に作動可能に連結される必要がある。
【０１６３】
ＩＬ−２ムテインをコードするＤＮＡ配列は、部位特異的突然変異誘発、化学合成または他の方法のいずれによって調製されたものであるかに関わらず、シグナル配列をコードするＤＮＡ配列を含むこともできる。そのようなシグナル配列は、存在する場合、ＩＬ−２ムテインの発現のために選択された細胞によって認識されるものでなければならない。それは、原核生物、真核生物、またはその２つの組み合わせであり得る。それは、また、天然のＩＬ−２のシグナル配列でもあり得る。シグナル配列の包含は、ＩＬ−２ムテインをそれが作られた組換え細胞から分泌することが望ましいかどうかに依存する。選択された細胞が原核細胞である場合、ＤＮＡ配列はシグナル配列をコードしないことが一般に好ましい。選択された細胞が真核細胞である場合、一般的にシグナル配列をコードすることが好ましく、野生型ＩＬ−２シグナル配列を使用することが最も好ましい。
【０１６４】
Ｅ．腫瘍溶解性ウイルス標的化部位
いくつかの例では、本明細書に記載のＩＬ−２ムテインを利用して、腫瘍溶解性ウイルスを標的化することができる（例えば、Ａｌｌｅｎら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ。１６：１５５６−６４、２００８を参照されたい）。いくつかの例では、腫瘍溶解性ウイルスを使用して、ＩＬ−２ムテインを腫瘍またはＴＭＥに標的化することができる。アデノウイルスおよび自己複製アルファウイルス、ならびに腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを含む多数のウイルスを腫瘍溶解性ウイルスとして使用することができる（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１３０３８０６６、特に図１７を参照されたい）。他の腫瘍溶解性ウイルスには、セネカバレーウイルス、ニューカッスル病ウイルス（ニューカッスルウイルスとも呼ばれる）、マラバウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１を含む）、麻疹ウイルス、ポリオウイルス、レオウイルス、コクサッキーウイルス、レンチウイルス、モルビリウイルス、インフルエンザウイルス、シンビスウイルス、粘液腫ウイルスおよび／またはレトロウイルス（例えば、Ｔｗｕｍａｓｉ−Ｂｏａｔｅｎｇら、「Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｓ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｐｌａｔｆｏｒｍｓ  ｆｏｒ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ、２０１８およびＫａｕｆｍａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ、１４：６４２−６６２（２０１５）を参照されたい、これらはすべて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）が含まれる。いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、アデノウイルス、自己複製アルファウイルス、ワクシニアウイルス、セネカバレーウイルス、ニューカッスル病ウイルス、マラバウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２を含む）、麻疹ウイルス、ポリオウイルス、レオウイルス、コクサッキーウイルス、レンチウイルス、モルビリウイルス、インフルエンザウイルス、シンビスウイルス、粘液腫ウイルス、およびレトロウイルスを含むが、これらに限定されない。ＩＬ−２スーパーカイン（本明細書に記載のＨ９およびＩＬ−２バリアント）はまた、Ｔ細胞／ＯＶをＴＭＥに指向させるために使用することができる。ＩＬ−２バリアント（Ｈ９など）はエフェクターＴ細胞およびＮＫ細胞を増強できるが、ＩＬ−２バリアントはＴ  ｒｅｇ活性を抑制できる。他の腫瘍溶解性ウイルスには、例えば、癌細胞に優先的に感染する複製条件付き単純ヘルペスウイルスの腫瘍内注射を伴うｏｎｃｏＶｅｘ／Ｔ−ＶＥＣが含まれ得る。また、ＧＭ−ＣＳＦを発現するように設計されたウイルスは、癌細胞内で複製してその溶解を引き起こし、新しいウイルスと一連の腫瘍抗原を放出し、その過程でＧＭ−ＣＳＦを分泌する。そのような腫瘍溶解性ウイルスワクチンは、腫瘍微小環境におけるＤＣの機能を強化して、抗腫瘍免疫応答を刺激する。これらの腫瘍溶解性ウイルスを使用して、本明細書に記載のＩＬ−２ムテインを腫瘍に標的化または送達することができる。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、本明細書に開示される任意のＩＬ−２ムテインまた��バリアントである。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテイン配列は、配列番号２または配列番号６〜配列番号１０または配列番号１６のいずれか１つと９０％同一である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、５−１配列番号５；５−２配列番号６；６−６配列番号７；Ａ２配列番号８；Ｂ１配列番号９；Ｂ１１配列番号１０；Ｃ５配列番号１１；Ｄ１０配列番号１２；Ｅ１０配列番号１３；Ｇ８配列番号１４；Ｈ４配列番号１５；およびＨ９配列番号１６のいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインにおける置換は、配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従って番号付けされたＬ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含む。いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、本明細書に記載のＩＬ−２ムテインを発現することができる導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従って番号付けされた以下のアミノ酸置換、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含むＩＬ−２ムテインを発現することができる導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従って番号付けされた以下のアミノ酸置換、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含むＩＬ−２ムテインをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、治療用ペイロードとして発現される導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、治療用ペイロードは、本明細書に記載のＩｌ−２である。いくつかの実施形態では、治療用ペイロードは、配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従って番号付けされた以下のアミノ酸置換、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含むＩＬ−２ムテインである。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスである。いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスベクターは、ウイルス粒子が細胞内成熟ウイルス（ＩＭＶ）、細胞内エンベロープウイルス（ＩＥＶ）、細胞関連エンベロープウイルス（ＣＥＶ）、または細胞外エンベロープウイルス（ＥＥＶ）型であることを特徴とする。いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ワクシニアウイルス粒子は、ＥＥＶまたはＩＭＶ型である。いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ワクシニアウイルス粒子は、ＥＥＶ型である。
【０１６６】
一般的に、腫瘍細胞で優先的に複製し、少なくとも１つの導入遺伝子（例えば、本明細書に記載のＩＬ−２ムテイン）を発現し、抗腫瘍効果およびアポトーシス誘導を促進し、対象の宿主免疫応答を調節する前述のベクターを含む腫瘍溶解性ワクシニアウイルス組換え体および細胞および薬学的組成物の構築。本発明によれば、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスまたは腫瘍溶解性アデノウイルスを標的とし、および／またはＩＬ−２ムテインを発現させるために、腫瘍溶解性アデノウイルスおよび腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを本明細書に記載のＩＬ−２発現または標的化部分と組み合わせることができる。腫瘍溶解は腫瘍抗原を放出し、共刺激の危険信号を提供する。ただし、ウイルスを武装することにより、有効性をさらに向上させることができる。例えば、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１５４）は、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導することが知られており、それは、いくつかの免疫機構も引き起こす。これらの１つは、細胞傷害性Ｔ細胞の活性化と免疫抑制の低下につながるＴヘルパー１型（Ｔｈｌ）応答である。本発明は、本発明のＩＬ−２ムテインを発現する腫瘍溶解性ウイルスを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、本発明のＩＬ−２標的化部分で標的化された（例えば、「武装された」）腫瘍溶解性ウイルスを提供する。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、ワクシニアウイルスゲノムを含む改変されたワクシニアウイルスベクター、ウイルス粒子、宿主細胞、薬学的組成物、およびキットであり、ここで、そのチミジンキナーゼ遺伝子は、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子における置換および／または部分的に欠失したチミジンキナーゼ遺伝子を提供する少なくとも１つのヌクレオチドの欠失を切除するオープンリーディングフレームのいずれかによって不活性化され、ワクシニア成長因子遺伝子は欠失しており、改変されたワクシニアウイルスベクターは、非ウイルスタンパク質（例えば、発現させることができる本明細書に記載のＩＬ−２ムテイン）をコードする少なくとも１つの核酸配列を含む。別の態様では、対象における免疫応答の誘発のため、哺乳動物の悪性細胞増殖の阻害方法にて使用するため、癌の治療または予防における使用のため、対象における改変されたワクシニアウイルスの存在の検出のため、および場合によりアデノウイルスと組み合わせたｉｎ  ｓｉｔｕ癌ワクチンとして、癌治療のために使用することができる、改変されたワクシニアウイルスベクター、ウイルス粒子、薬学的組成物またはキットが提供される。いくつかの実施形態では、本発明は、ワクシニアウイルスゲノムを含む改変されたワクシニアウイルスを生成する方法であって、そのチミジンキナーゼ遺伝子が、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子における置換および／または部分的に欠失したチミジンキナーゼ遺伝子を提供する少なくとも１つのヌクレオチドの欠失を切除するオープンリーディングフレームによって不活性化され、そのワクシニア成長因子遺伝子が欠失しており、その改変されたワクシニアウイルスベクターが、非ウイルスタンパク質（例えば、本明細書に記載のＩＬ−２ムテイン）をコードする少なくとも１つの核酸配列を含む方法であり、ワクシニアウイルス粒子の産生を維持し、改変されたワクシニアベクターを運搬することができるプロデューサー細胞を提供する工程と、ウイルスの複製および生成に適した条件下でプロデューサー細胞を培養する工程と、ウイルス粒子を収集する工程とを含む方法を提供する。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載のＩＬ−２ムテインをコードする核酸を伴うかまたはそれを含む腫瘍溶解性ウイルスを投与する方法を提供し、ここで、そのＩＬ−２ムテインは、腫瘍位置で発現されるか、対象において全身的に発現される。いくつかの実施形態では、本発明はまた、本明細書に記載のＩＬ−２ムテインで「武装」または標的化された腫瘍溶解性ウイルスを投与する方法を提供する。投与経路は、当然、腫瘍の位置および性質により異なり、例えば、皮内、経皮、非経口、静脈内、筋肉内、鼻腔内、皮下、局所的（例えば、腫瘍に近接して、特に、血管系または隣接する血管系を用いて）、経皮、気管内、腹腔内、動脈内、膀胱内、腫瘍内、吸入、灌流、洗浄、および経口投与を含む。組成物は、特定の投与経路に対して製剤化される。
【０１６９】
１．腫瘍溶解性ワクシニアウイルス
ワクシニアウイルスは、ポックスウイルス科（Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ）のオルソポックスウイルス属の一員である。それは、大きな二本鎖ＤＮＡゲノム（約２００ｋｂ、約２００遺伝子）を有し、複雑な形態形成経路により、各感染細胞から異なる形態の感染性ビリオンが生成される。ウイルス粒子は、コアの周りに脂質膜（複数可）を含有する。ウイルスコアは、ウイルス構造タンパク質、密に圧縮されたウイルスＤＮＡゲノム、および転写酵素を含有する。ワクシニアウイルスの寸法は、約３６０ｘ２７０ｘ２５０ｎｍであり、重量は約５−１０ｆｇである。遺伝子は、小さな非コーディングＤＮＡで密に詰まっており、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）はイントロンを欠失している。３つのクラスの遺伝子（初期、中間、後期）が存在する。初期遺伝子（約１００遺伝子；即時および遅延型）は、主に免疫調節およびウイルスＤＮＡ複製に関連するタンパク質をコードする。中間遺伝子は、後期遺伝子（例えば、転写因子）の発現に必要な調節タンパク質をコードし、後期遺伝子は、次の感染を開始するために新しいビリオン内にパッケージ化されるウイルス粒子と酵素を作るのに必要なタンパク質をコードする。ワクシニアウイルスは細胞の細胞質内で複製する。
【０１７０】
ワクシニアウイルスの様々な株が同定されている（一例として、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｖｉｒｕｓ  Ａｎｋａｒａ（ＭＶＡ）、Ｌｉｓｔｅｒ、Ｔｉａｎ  Ｔａｎ、Ｗｙｅｔｈ（＝  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｃｉｔｙ  Ｂｏａｒｄ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ（ＷＲ））。ＷＲワクシニアのゲノム配列が決定されている（アクセッション番号ＡＹ２４３３１２）。いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、コペンハーゲン、改変ウイルスアンカラ（ＭＶＡ）、リスター（Ｌｉｓｔｅｒ）、ティアンタン（Ｔｉａｎ  Ｔａｎ）、ワイス（Ｗｙｅｔｈ）、またはウェスタンリザーブ（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ）（ＷＲ）ワクシニアウイルスである。
【０１７１】
異なる形態のウイルス粒子は、ウイルス生活環において異なる役割を有する。いくつかの形態のウイルス粒子が存在する：細胞内成熟ウイルス（ＩＭＶ）、細胞内エンベロープウイルス（ＩＥＶ）、細胞関連エンベロープウイルス（ＣＥＶ）、細胞外エンベロープウイルス（ＥＥＶ）。ＥＥＶ粒子には、トランスゴルジネットワークに由来する余分な膜がある。この外膜には２つの重要な役割がある：ａ）それは、内部ＩＭＶを免疫攻撃から保護し、ｂ）ウイルスの細胞表面への結合を仲介する。
【０１７２】
ＣＥＶおよびＥＥＶは、宿主由来の膜に包まれることにより、ウイルスが宿主抗体および補体を回避するのに役立つ。ＩＭＶおよびＥＥＶ粒子は、生物学的特性にいくつかの違いがあり、ウイルスの生活環で異なる役割を果たす。ＥＥＶおよびＩＭＶは異なる（未知の）受容体に結合し（１）、それらは異なる機序で細胞に入る。ＥＥＶ粒子はエンドサイトーシスを介して細胞に入り、プロセスはｐＨ感受性である。内部移行後、ＥＥＶの外膜は酸性化されたエンドソーム内で破裂し、露出したＩＭＶはエンドソーム膜と融合し、ウイルスコアは細胞質に放出される。一方、ＩＭＶは細胞膜とウイルス膜の融合により細胞に入り、このプロセスはｐＨに依存しない。これに加えて、ＣＥＶは細胞表面からアクチン尾部の形成を誘導し、これはビリオンを未感染の隣接細胞に向かって駆動させる。
【０１７３】
さらに、ＥＥＶは抗体（ＮＡｂ）による中和と補体毒性に対して耐性があるが、ＩＭＶは耐性がない。したがって、ＥＥＶはインビトロおよびインビボでの長距離伝播を仲介する。コメット阻害試験は、遊離ＥＥＶがＥＥＶ  ＮＡｂで中和できない場合でも、感染細胞からのＥＥＶの放出がＥＥＶ  ＮＡｂによって阻止され、コメット形状のプラークが見られないため、ＥＥＶ特異抗体を測定する１つの方法となった。ＥＥＶはＩＭＶ粒子と比較して特異的感染率がより高く（粒子／ｐｆｕ比がより低い）、このため、ＥＥＶは治療用途の興味深い候補となる。しかし、ＥＥＶの外膜は非常に壊れやすい構造であり、ＥＥＶ粒子の取り扱いには注意が必要であり、治療用途に必要な量のＥＥＶ粒子を入手することは困難である。ＥＥＶ外膜は低ｐＨ（ｐＨ約６）で破裂する。ＥＥＶの外膜が破裂すると、エンベロープ内のウイルス粒子はＩＭＶとして完全な感染力を保持する。
【０１７４】
一部の宿主細胞由来タンパク質は、ＥＥＶ調製物と共局在するが、ＩＭＶとは共局在せず、細胞由来タンパク質の量は、宿主細胞株とウイルス株に依存する。例えば、ＷＲ  ＥＥＶはＶＶ  ＩＨＤ−Ｊ株と比較してより多くの細胞由来タンパク質を含む。宿主細胞由来のタンパク質は、ＥＥＶ粒子の生物学的効果を改変することができる。一例として、ＥＥＶの表面に宿主膜タンパク質ＣＤ５５を組み込むと、補体毒性に対する耐性が得られる。本発明において、ＥＥＶ粒子の表面のヒトＡ５４９細胞由来タンパク質は、ウイルスをヒト癌細胞に標的化できることが示されている。同様の現象は、ヒト免疫不全ウイルス１型を用いた研究で実証されており、そこでは、宿主由来のＩＣＡＭ−１糖タンパク質がウイルス感染性を増加させた。ＩＥＶ膜には少なくとも９つのタンパク質が含まれ、そのうち２つはＣＥＶ／ＥＥＶには存在しない。Ｆ１２ＬおよびＡ３６Ｒタンパク質は、細胞表面へのＩＥＶ輸送に関与し、それらは後に残され、ＣＥＶ／ＥＥＶ（９、１１）の一部ではない。（ＩＥＶ）／ＣＥＶ／ＥＥＶでは７つのタンパク質Ｆ１３Ｌ、Ａ３３Ｒ、Ａ３４Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｅ２、（Ｋ２Ｌ）が共通である。ワクシニアウイルスのウェスタンリザーブ株の場合、通常、ウイルス粒子の最大１％がＥＥＶであり、プロデューサー細胞の腫瘍溶解の前に培養上清に放出される。５０倍以上のＥＥＶ粒子がワクシニアの国際保健部門（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ）（ＩＨＤ）−Ｊ株から放出される。ただし、ＩＨＤはヒトの癌治療での使用については研究されていない。ＩＨＤ−Ｗ表現型は、主にＡ３４Ｒ  ＥＥＶレクチン様タンパク質内の点突然変異に起因した。また、Ａ３４Ｒの欠失は、放出されるＥＥＶの数を増加させる。ＥＥＶ粒子は、感染６時間後に細胞表面で最初に検出でき（ＣＥＶとして）、５時間後に上清で検出できる（ＩＨＤ−Ｊ株）。低い感染多重度（ＭＯＩ）を伴う感染は、高ウイルス量と比較してより高い比率のＥＥＶをもたらす。ＣＥＶとＥＥＶのバランスは、宿主細胞とウイルス株の影響を受ける。
【０１７５】
ワクシニアは天然痘の撲滅のために使用され、その後、外来遺伝子の発現ベクターとして、および感染症や癌の組換え生ワクチンとして使用されてきた。ワクシニアウイルスは、ヒトで最も広く使用されているポックスウイルスであるため、ヒトで使用するための安全性データは広範囲にわたる。世界中の天然痘ワクチン接種プログラムの間に、何十万人もが改変ワクシニアウイルス株で安全にワクチン接種されており、非常にまれに重篤な有害事象が報告されている。それらは、全身性ワクシニア（体内でのワクシニアの全身性の広がり）、多形性紅斑（毒性／アレルギー反応）、ワクシニア性湿疹（皮膚の広範囲の感染）、進行性ワクシニア（組織破壊）、およびワクシニア後脳炎である。
【０１７６】
１９６０年代から１９９０年代にかけて、４４人の黒色腫患者全員が野生型ワクシニアウイルスの初期臨床試験において治療を受け、注射された腫瘍の全体的な客観的反応率は５０％だった。また、いくつかの有益な免疫学的反応が見られた（３６）。野生型ワクシニアウイルスは、膀胱癌、肺癌、腎臓癌、および骨髄腫の治療のためにも使用されており、軽度の有害事象のみが見られた。ＧＭ−ＣＳＦをコードする腫瘍溶解性ワイエス株ワクシニアウイルスであるＪＸ−５９４は、３つの第Ｉ相試験で首尾よく評価され、無作為化第ＩＩ相試験の予備的な結果が科学会議で発表された。
【０１７７】
ワクシニアウイルスは、いくつかの特徴のために、癌遺伝子治療にとって魅力的である。それは、癌細胞に向かう天然の向性を持ち、ウイルス遺伝子の一部を欠失することで選択性を有意に高めることができる。本発明は、２つのウイルス遺伝子、ウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）およびワクシニア成長因子（ＶＧＦ）が少なくとも部分的に欠失している二重欠失ワクシニアウイルス（ｖｖｄｄ）の使用に関する。ＴＫおよびＶＧＦ遺伝子は、ウイルスが正常細胞で複製するために必要とされるが、癌細胞では必要とされない。部分的なＴＫ欠失は、活動を付与するＴＫ領域において設計することができる。
【０１７８】
ＴＫ欠失ワクシニアウイルスは、ＤＮＡ合成および複製のために分裂細胞に存在する細胞ヌクレオチドプールに依存する。いくつかの実施形態では、ＴＫ欠失は休止細胞におけるウイルス複製を有意に制限し、活発に分裂する細胞（例えば、癌細胞）においてのみ効率的なウイルス複製が起こることを可能にする。ＶＧＦは感染細胞から分泌され、分裂促進因子として作用することにより、周囲の細胞に対してパラクリンプライミング効果を有する。ＶＧＦ欠失ワクシニアウイルスの複製は、休止（非癌）細胞で高度に弱毒化されている。ＴＫおよびＶＧＦの欠失の効果は相乗的であることが示されている。
【０１７９】
２．腫瘍溶解性アデノウイルス
一般に、アデノウイルスは、３６ｋｂの直線状、二本鎖ＤＮＡウイルスである（ＧｒｕｎｈａｕｓおよびＨｏｒｗｉｔｚ、１９９２）。「アデノウイルス」または「ＡＡＶ」という用語は、ＡＡＶ１型（ＡＡＶ１）、ＡＡＶ２型（ＡＡＶ２）、ＡＡＶ３型（ＡＡＶ３）、ＡＡＶ４型（ＡＡＶ４）、ＡＡＶ５型（ＡＡＶ５）、ＡＡＶ６型（ＡＡＶ６）、ＡＡＶ７型（ＡＡＶ７）、ＡＡＶ８型（ＡＡＶ８）、ＡＡＶ９型（ＡＡＶ９）、ＡＡＶ９＿ｈｕ１４、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、およびヒツジＡＡＶを含む。「霊長類ＡＡＶ」は霊長類に感染できるＡＡＶを指し、「非霊長類ＡＡＶ」は非霊長類哺乳類に感染できるＡＡＶを指し、「ウシＡＡＶ」はウシ哺乳類に感染できるＡＡＶを指す。
【０１８０】
宿主細胞のアデノウイルス感染により、アデノウイルスＤＮＡがエピソーム的に維持され、それにより、ベクターの組み込みに伴う潜在的な遺伝毒性が低下する。また、アデノウイルスは構造的に安定しており、大規模な増幅後にゲノムの再配列は検出されていない。アデノウイルスは、細胞周期の段階に関係なく、事実上すべての上皮細胞に感染することができる。（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＵＳ２００６／０１４７４２０を参照されたい。）さらに、アデノウイルスのＥ１ａおよびＥ４領域は、ヒト細胞の効率的かつ生産的な感染に不可欠である。Ｅ１ａ遺伝子は、増殖性感染において転写される第１のウイルス遺伝子であり、その転写は他の任意のウイルス遺伝子産物の作用に依存しない。ただし、残りの初期ウイルス遺伝子の転写には、Ｅ１ａ遺伝子の発現が必要である。Ｅ１ａプロモーターは、Ｅ１ａ遺伝子の発現の調節に加えて、ウイルスＤＮＡの複製の開始に必要な部位だけでなく、ウイルスゲノムのパッケージングのためのシグナルも統合している。Ｓｃｈｍｉｄ、Ｓ．Ｉ．、およびＨｅａｒｉｎｇ、Ｐ．ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ。１９９：ｐａｇｅｓ  ６７−８０（１９９５）を参照されたい。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは腫瘍溶解性アデノウイルスである。天然に生じるウイルスを操作して腫瘍細胞における腫瘍溶解効果をもたらすことが確立されている（Ｗｉｌｄｎｅｒ、２００１；Ｊａｃｏｔａｔ、１９６７；Ｋｉｍ、２００１；Ｇｅｏｅｒｇｅｒら、２００２；Ｙａｎら、２００３；Ｖｉｌｅら、２００２、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる）。アデノウイルスの場合、アデノウイルスゲノム内の特定の欠失は、正常な静止細胞内で複製する能力を弱めることができるが、腫瘍細胞で複製する能力は保持する。そのような条件付き複製アデノウイルスの１つであるΔ２４は、Ｆｕｅｙｏら（２０００）によって記載されており、米国特許出願第２００３／０１３８４０５号でも参照され、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。Δ２４アデノウイルスは、アデノウイルス５型（Ａｄ−５）に由来し、Ｅ１Ａ遺伝子のＣＲ２部分に２４塩基対の欠失を含有する。例えば、ＷＯ２００１／０３６６５０Ａ２（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【０１８２】
腫瘍溶解性アデノウイルスは、デルタ２４などの条件付き複製アデノウイルス（ＣＲＡＤ）を含み、それは、生物療法薬としての使用のための候補となるためのいくつかの特性を有する。そのような特性の１つは、許容細胞または組織で複製する能力であり、それは、腫瘍溶解性ウイルスの元の投入量を増幅し、直接的な抗腫瘍効果をもたらす隣接する腫瘍細胞に薬剤が広がるのを補助する。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、デルタ２４の腫瘍溶解性成分は、武装したデルタ２４を生成するための導入遺伝子発現アプローチを伴う。武装したデルタ２４アデノウイルスは、腫瘍内でのバイスタンダー効果の生成または強化、ならびに／または患者または腫瘍関連組織および／もしくは細胞における腫瘍溶解性アデノウイルスの検出／イメージングの生成または強化に使用できる。いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性アデノウイルスと様々な導入遺伝子戦略（例えば、およびＩＬ−２ムテインの発現）との組み合わせは、例えば、様々な難治性腫瘍に対する潜在的能力を含む潜在的な治療能力を改善し、画像化能力の改善をもたらす。特定の実施形態では、腫瘍溶解性アデノウイルスは、複製欠損アデノウイルス、別の腫瘍溶解性ウイルス、複製コンピテントアデノウイルス、および／または野生型アデノウイルスとともに投与され得る。その各々を、他のアデノウイルスと同時に、その前または後に、投与することができる。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、Ｅ１ａアデノウイルスベクターは、ＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、および転写開始のための開始部位を含む塩基性アデノウイルスＥ１ａプロモーターを、腫瘍特異性を示し、好ましくはＥ２Ｆ応答性である、より好ましくはは、ヒトＥ２Ｆ−１プロモーターである塩基性プロモーターで置換することを含む。したがって、このウイルスは、Ｅ２Ｆ応答性プロモーターからの転写を活性化する分子を欠失しているか、またはそのような分子が機能しない細胞で抑制される。転写因子Ｅ２Ｆとしてこのクラスに分類される正常な非分裂細胞または静止細胞は、ｐＲｂまたは網膜芽細胞腫タンパク質に結合し、そのため、Ｅ２ＦはＥ２Ｆ応答性プロモーターに結合して活性化するために利用できなくなる。対照的に、遊離Ｅ２Ｆを含有する細胞は、Ｅ２Ｆに基づく転写を支持するはずである。そのような細胞の一例は、生産的なウイルス感染の発生を可能にするｐＲｂ機能を欠く腫瘍細胞である。いくつかの実施形態では、Ｅ１ａアデノウイルスベクターは、本明細書に記載のＩＬ−２部分を使用して標的化される。
【０１８５】
Ｅ１ａプロモーターにあるエンハンサー配列、パッケージングシグナル、およびＤＮＡ複製開始部位の保持により、ｐＲｂ機能を欠く新生細胞でアデノウイルス感染が野生型レベルに進行することが確実となる。本質的に、改変されたＥ１ａプロモーターは、腫瘍特異的な転写活性化を付与し、実質的な腫瘍特異的な殺傷をもたらすが、正常細胞での安全性を高める。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、Ｅ１ａアデノウイルスベクターは、内因性Ｅ１ａプロモーターをＥ２Ｆ応答性プロモーターで置き換えることにより調製され、アデノウイルス５ゲノムのヌクレオチド３７５の上流の要素はインタクトなままである。ヌクレオチド番号付けは、例えば、Ｓｃｈｍｉｄ、Ｓ．Ｉ．、およびＨｅａｒｉｎｇ、Ｐ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ。１９９：ｐａｇｅｓ  ６７−８０（１９９５）により記載されている通りである。これには、ウイルスゲノムのパッケージングのために同定された７つのＡリピートモチーフのすべてが含まれる。ヌクレオチド３７５からヌクレオチド５３６までの配列は、ＢｓａＡＩからＢｓｒＢＩ制限開始部位によって欠失されるが、Ｅ１Ａタンパク質の翻訳開始コドンの上流の２３塩基対をなお保持する。既知の材料および方法を使用して、欠失された内因性Ｅ１ａプロモーター配列の代わりに、Ｅ２Ｆ応答性プロモーター、好ましくはヒトＥ２Ｆ−１が使用される。Ｅ２Ｆ−１プロモーターは、実施例１に記載されるように単離され得る。
【０１８７】
Ｅ４領域は、アデノウイルス感染の後期に起こる多くの事象に関与しており、効率的なウイルスＤＮＡ複製、後期ｍＲＮＡ蓄積およびタンパク質合成、スプライシング、および宿主細胞のタンパク質合成のシャットオフのために必要とされる。Ｅ４転写ユニットのほとんどが欠損しているアデノウイルスは、深刻な複製欠陥があり、一般に、高力価を達成するにはＥ４補完細胞株において増殖させる必要がある。Ｅ４プロモーターはウイルスゲノムの右端近くに位置し、複数のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の転写を支配している。このプロモーターでは、最大転写活性の媒介に重要な多くの調節要素が特徴づけられている。これらの配列に加えて、Ｅ４プロモーター領域は、ウイルスＤＮＡ複製に必要な調節配列を含有する。Ｅ４プロモーターおよびこれらの調節配列の位置の描写は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，００１，５９６号の図２および３に見ることができる。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、腫瘍特異性を示すことが実証されているもの、好ましくはＥ２Ｆ応答性プロモーター、より好ましくはヒトＥ２Ｆ−１プロモーターで置換されたＥ４塩基性プロモーターを有するアデノウイルスベクター。Ｅ４発現を駆動するためにＥ２Ｆ応答性プロモーターが好ましい理由は、Ｅ１ａプロモーターがＥ２Ｆ応答性プロモーターで置換されたＥ１ａアデノウイルスベクターの文脈で上記で議論されたものと同じである。ｐＲｂの腫瘍抑制機能は、Ｅ２Ｆ−１プロモーターなどのＥ２Ｆ応答性プロモーターを抑制する能力と相関している（Ａｄａｍｓ、Ｐ．Ｄ．、およびＷ．Ｇ．Ｋａｅｌｉｎ、Ｊｒ．１９９５、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．６：９９−１０８；Ｓｅｌｌｅｒｓ、Ｗ．Ｒ．、およびＷ．Ｇ．Ｋａｅｌｉｎ．１９９６、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １９９６  Ｄｅｃ．９；１２８８（３）：Ｅ−１内で公開された正誤表、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１２８８：Ｍ１−５．Ｓｅｌｌｅｒｓ、Ｗ．Ｒ．，Ｊ．Ｗ．Ｒｏｄｇｅｒｓ、およびＷ．Ｇ．Ｋａｅｌｉｎ、Ｊｒ．１９９５、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９２：１１５４４−８．）。ヒトＥ２Ｆ−１プロモーターは、広範囲にわたって特徴付けられており、ｐＲｂ／ｐ１０７、Ｅ２Ｆ−１／−２／−３、およびＧ１サイクリン／ｃｄｋ複合体、およびＥ１Ａを含むｐＲｂシグナル伝達回路に対して応答性があることが示されている（Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｄ．Ｇ．、Ｋ．Ｏｈｔａｎｉ、およびＪ．Ｒ．Ｎｅｖｉｎｓ．１９９４、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．８：１５１４−２５；Ｎｅｕｍａｎ、Ｅ．、Ｅ．Ｋ．Ｆｌｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｗ．Ｒ．Ｓｅｌｌｅｒｓ，およびＷ．Ｇ．Ｋａｅｌｉｎ、Ｊｒ．１９９５．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５：４６６０；Ｎｅｕｍａｎ、Ｅ．、Ｗ．Ｒ．Ｓｅｌｌｅｒｓ，Ｊ．Ａ．ＭｃＮｅｉｌ，Ｊ．Ｂ．Ｌａｗｒｅｎｃｅ、およびＷ．Ｇ．Ｋａｅｌｉｎ、Ｊｒ．１９９６、Ｇｅｎｅ．１７３：１６３−９．）。この調節のすべてではないにしても、ほとんどは、Ｅ２Ｆ−１プロモーター内に存在する複数のＥ２Ｆ部位の存在に起因する。したがって、この（これらの）改変（複数可）を運ぶウイルスは、インタクトな（野生型）ｐＲｂ経路を含有する正常細胞では弱毒化されるが、ｐＲｂの抑制機能を欠く細胞では正常な感染／複製プロファイルを示すと予想される。この変異ウイルスの正常な感染／複製プロファイルを維持するために、本発明者らは、Ｅ４プロモーターの遠位端で逆方向末端反復（ＩＴＲ）を保持したが、これは、ウイルスＤＮＡ複製に必要なすべての調節要素が含まれているためである（Ｈａｔｆｉｅｌｄ、Ｌ．およびＰ．Ｈｅａｒｉｎｇ．１９９３、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：３９３１−９；Ｒａｗｌｉｎｓ、Ｄ．Ｒ．、Ｐ．Ｊ．Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ、Ｒ．Ｊ．Ｗｉｄｅｓ、Ｍ．Ｄ．Ｃｈａｌｌｂｅｒｇ、およびＴ．Ｊ．Ｋｅｌｌｙ、Ｊｒ．１９８４、Ｃｅｌｌ．３７：３０９−１９；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ、Ｐ．Ｊ．、Ｅ．Ａ．Ｏ´Ｎｅｉｌｌ、Ｒ．Ｊ．Ｗｉｄｅｓ、およびＴ．Ｊ．Ｋｅｌｌｙ．１９８７、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７：８７５−８６；Ｗｉｄｅｓ、Ｒ．Ｊ．、Ｍ．Ｄ．Ｃｈａｌｌｂｅｒｇ、Ｄ．Ｒ．Ｒａｗｌｉｎｓ、およびＴ．��．Ｋｅｌｌｙ．１９８７、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７：８６４−７４）。これにより、このウイルスに感染したｐＲｂ経路欠損腫瘍細胞で野生型レベルのウイルスの獲得が容易となる。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、Ｅ４プロモーターはウイルスゲノムの右端近くに位置し、それは、複数のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の転写を支配している（Ｆｒｅｙｅｒ、Ｇ．Ａ．、Ｙ．Ｋａｔｏｈ、および１９８４、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：３５０３−１９；Ｔｉｇｇｅｓ、Ｍ．Ａ．、およびＨ．Ｊ．Ｒａｓｋａｓ．１９８４。アデノウイルス２初期領域４  ｍＲＮＡのスプライスジャンクション：複数のスプライス部位が１８〜２４のＲＮＡを生成する。Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５０：１０６−１７；Ｖｉｒｔａｎｅｎ、Ａ．Ｐ．Ｇｉｌａｒｄｉ、Ａ．Ｎａｓｌｕｎｄ、Ｊ．Ｍ．ＬｅＭｏｕｌｌｅｃ、Ｕ．Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ、およびＭ．Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ．１９８４、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１：８２２−３１．）。転写活性を媒介する多くの調節要素がこのプロモーターにおいて特徴づけられた（Ｂｅｒｋ、Ａ．Ｊ．１９８６、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ．２０：４５−７９；Ｇｉｌａｒｄｉ、Ｐ．、およびＭ．Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ．１９８６、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：９０３５−４９；Ｇｉｌａｒｄｉ、Ｐ．、およびＭ．Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ．１９８４、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：７８７７−８８；Ｈａｎａｋａ、Ｓ．、Ｔ．Ｎｉｓｈｉｇａｋｉ、Ｐ．Ａ．Ｓｈａｒｐ、およびＨ．Ｈａｎｄａ．１９８７、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７：２５７８−８７；Ｊｏｎｅｓ、Ｃ．、およびＫ．Ａ．Ｌｅｅ．１９９１、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１：４２９７−３０５；Ｌｅｅ、Ｋ．Ａ．、およびＭ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎ．１９８７、ＥｍｂｏＪ．６：１３４５−５３）。これらの配列に加えて、Ｅ４プロモーター領域には、ウイルスＤＮＡ複製に関与する要素が含まれている（Ｈａｔｆｉｅｌｄ、Ｌ．、およびＰ．Ｈｅａｒｉｎｇ．１９９３、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．６７：３９３１−９；Ｒａｗｌｉｎｓ、Ｄ．Ｒ．、Ｐ．Ｊ．Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ、Ｒ．Ｊ．Ｗｉｄｅｓ、Ｍ．Ｄ．Ｃｈａｌｌｂｅｒｇ、およびＴ．Ｊ．Ｋｅｌｌｙ、Ｊｒ．１９８４、Ｃｅｌｌ．３７：３０９−１９；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ、Ｐ．Ｊ．、Ｅ．Ａ．Ｏ´Ｎｅｉｌｌ、Ｒ．Ｊ．Ｗｉｄｅｓ、およびＴ．Ｊ．Ｋｅｌｌｙ．１９８７、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７：８７５−８６；Ｗｉｄｅｓ、Ｒ．Ｊ．、Ｍ．Ｄ．Ｃｈａｌｌｂｅｒｇ、Ｄ．Ｒ．Ｒａｗｌｉｎｓ、およびＴ．Ｊ．Ｋｅｌｌｙ．１９８７、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７：８６４−７４）。Ｅ４プロモーターとこれらの調節配列の位置の描写は、図１および２で参照され得る。また、Ｊｏｎｅｓ、Ｃ．、およびＫ．Ａ．Ｌｅｅ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１：４２９７−３０５（１９９１）も参照されたい。これらの考慮事項を念頭に置いて、Ｅ４プロモーターシャトルは、ヌクレオチド３５，５７６のＸｈｏＩ部位とヌクレオチド３５，８１５のＳｐｅＩ部位の２つの新規制限エンドヌクレアーゼ部位を作成することにより設計された（図３を参照されたい）。ＸｈｏＩとＳｐｅＩの両方で消化すると、３５，５８１から３５，８１７のヌクレオチドが除去される。これにより、Ｅ４転写に対して最大の影響を与えることが示されているすべての配列を含む、Ｅ４転写開始部位に対して−２０８〜＋２９の塩基が効果的に除去される。特に、これは、プロモーター活性化に対して最も有意な効果があることが実証されているＥ４Ｆ結合部位の２つの逆方向反復を包含する。ただし、３つのＳｐ１結合部位すべて、５つのＡＴＦ結合部位のうち２つ、およびウイルスＤＮＡ複製に重要なＮＦ１およびＮＦＩＩＩ／Ｏｃｔ−１結合部位の両方が保持される。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、Ｅ２Ｆ応答性プロモーターはヒトＥ２Ｆ−１プロモーターである。ｐＲｂ経路への応答を媒介するＥ２Ｆ−１プロモーター中の主要な調節要素は、インビトロおよびインビボの両方でマッピングされている（Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｄ．Ｇ．、Ｋ．Ｏｈｔａｎｉ、およびＪ．Ｒ．Ｎｅｖｉｎｓ．１９９４、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．８：１５１４−２５；Ｎｅｕｍａｎ、Ｅ．、Ｅ．Ｋ．Ｆｌｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｗ．Ｒ．Ｓｅｌｌｅｒｓ、およびＷ．Ｇ．Ｋａｅｌｉｎ、Ｊｒ．１９９５、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５：４６６０；Ｐａｒｒ、Ｍ．Ｊ．、Ｙ．Ｍａｎｏｍｅ、Ｔ．Ｔａｎａｋａ、Ｐ．Ｗｅｎ、Ｄ．Ｗ．Ｋｕｆｅ、Ｗ．Ｇ．Ｋａｅｌｉｎ、Ｊｒ．、およびＨ．Ａ．Ｆｉｎｅ．１９９７、Ｎａｔ  Ｍｅｄ．３：１１４５−９）。したがって、本発明者らは、転写開始部位に対して塩基対−２１８〜＋５１に由来するヒトＥ２Ｆ−１プロモーター断片を、ＳｐｅＩおよびＸｈｏＩ部位をそれらに組み込むプライマーを用いるＰＣＲにより単離した。これにより、Ｅ４プロモーターシャトル内に存在する同じ部位が作成され、Ｅ４プロモーターをＥ２Ｆ−１プロモーターで直接置換可能となる。
【０１９１】
Ｆ．変異体ＩＬ−２をコードする核酸分子
いくつかの実施形態では、単独または上記のようなキメラポリペプチドの一部としての対象ＩＬ−２ムテインは、核酸分子の発現により得ることができる。ＩＬ−２ムテインが野生型ＩＬ−２ポリペプチドとの同一性という点で説明できるように、それらをコードする核酸分子は必然的に野生型ＩＬ−２をコードする核酸分子と特定の同一性を有する。例えば、対象ＩＬ−２ムテインをコードする核酸分子は、野生型ＩＬ−２（例えば、配列番号２）をコードする核酸と少なくとも５０％、少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９５％（例えば、９９％）同一であり得る。
【０１９２】
提供される核酸分子は、天然に生じる配列か、または天然に生じるものとは異なるが、遺伝暗号の縮重のために、同じポリペプチドをコードする配列を含むことができる。これらの核酸分子は、ＲＮＡまたはＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはホスホロアミダイトに基づく合成によって生成されるような合成ＤＮＡ）、またはこれらの種の核酸内のヌクレオチドの組み合わせまたは改変からなり得る。さらに、核酸分子は、二本鎖または一本鎖（すなわち、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれか）であり得る。
【０１９３】
核酸分子は、ポリペプチドをコードする配列に限定されず、コード配列（例えば、ＩＬ−２のコード配列）の上流または下流にある非コード配列の一部またはすべても含めることができる。分子生物学の当業者は、核酸分子を単離するための日常的な手順に精通している。それらは、例えば、制限エンドヌクレアーゼによるゲノムＤＮＡの処理により、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の実行により生成され得る。核酸分子がリボ核酸（ＲＮＡ）である場合、分子は、例えば、インビトロ転写により生成され得る。
【０１９４】
本開示の例示的な単離された核酸分子は、天然状態ではそのようなものとして見出されない断片を含み得る。したがって、本開示は、核酸配列（例えば、変異体ＩＬ−２をコードする配列）がベクター（例えば、プラスミドもしくはウイルスベクター）または異種細胞のゲノム（もしくは天然の染色体位置以外の位置にある相同細胞のゲノム）に組み込まれているものなどの組換え分子を包含する。
【０１９５】
上記のように、対象ＩＬ−２ムテインはキメラポリペプチドの一部として存在し得る。上記の異種ポリペプチドに加えて、またはその代わりに、対象の核酸分子は、「マーカー」または「レポーター」をコードする配列を含有することができる。マーカーまたはレポーター遺伝子の例には、β−ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ネオｒ、Ｇ４１８ｒ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシンＢ−ホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＨ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ｌａｃｚ（β−ガラクトシダーゼをコードする）、およびキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）が含まれる。当業者は、追加の有用な試薬、例えば、マーカーまたはレポーターの機能を果たすことができる追加の配列を認識するであろう。
【０１９６】
対象の核酸分子は、哺乳動物の細胞などの任意の生物細胞から得られたＩＬ−２をコードするＤＮＡに突然変異を導入することにより得ることができる。したがって、対象核酸（およびそれらがコードするポリペプチド）は、マウス、ラット、モルモット、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ウサギ、サル、ヒヒ、イヌ、またはネコのものであり得る。一実施形態では、核酸分子はヒトのものである。
【０１９７】
Ｇ．キメラ抗原受容体（ＣＡＲＳ）
標的免疫療法は、悪性腫瘍の治療における有望な研究分野として浮上しており、近年大きな関心を集めている。確かに、ＣＤ１９悪性細胞を標的とする組み換えまたは遺伝子改変されたＴ細胞を用いる、リンパ腫患者の治療法が報告されている。これにより、遺伝子療法および免疫療法の標的として癌細胞に存在する抗原への注目が高まっている。これらのＣＡＲＳは、本明細書に記載のＩＬ−２ムテインを腫瘍に標的化または送達するために使用することができ、または全身ＩＬ−２ムテイン発現さえ可能にすることができる。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、本明細書に開示される任意のＩＬ−２ムテインまたはバリアントである。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテイン配列は、配列番号２または配列番号６〜配列番号１０または配列番号１６のいずれか１つと９０％同一である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、５−１配列番号５；５−２配列番号６；６−６配列番号７；Ａ２配列番号８；Ｂ１配列番号９；Ｂ１１配列番号１０；Ｃ５配列番号１１；Ｄ１０配列番号１２；Ｅ１０配列番号１３；Ｇ８配列番号１４；Ｈ４配列番号１５；およびＨ９配列番号１６のいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインにおける置換は、配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従って番号付けされたＬ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含む。
【０１９８】
特定の腫瘍抗原を特異的に標的とするための自己または同種Ｔ細胞またはＮＫ細胞の遺伝子操作は、ほとんどの腫瘍細胞による細胞傷害性免疫応答誘導の失敗を回避する戦略を提供する。いくつかの実施形態では、これらの遺伝子操作されたＴ細胞またはＮＫ細胞を使用して、例えばＩＬ−２ムテインが腫瘍位置で発現されるように、本明細書に記載のＩＬ−２ムテインを腫瘍に標的化することができる。これらの技術は、ヒト免疫細胞の遺伝的改変に基づいており、細胞は白血球アフェレーシスによって患者またはドナーから抽出することができる。特定の細胞、通常はＴ細胞は精製され、目的の癌抗原を標的とする受容体を発現するように操作される。操作は、レトロウイルス、レンチウイルス、トランスポゾン、ｍＲＮＡ電気穿孔などによる形質導入を利用してもよい。免疫細胞は、所望の用量まで拡大され、患者に導入され得る。操作された細胞は、細胞媒介性毒性（細胞傷害性Ｔ細胞）を介して、および／または腫瘍の免疫認識、サイトカイン放出、免疫細胞動員により癌細胞に対する免疫応答を誘発することにより、癌細胞を特異的に殺傷することができる。
【０１９９】
例えば、悪性腫瘍の免疫遺伝子療法へのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の適用は、抗体またはリガンド結合ドメインがＴ細胞受容体のゼータシグナル伝達鎖と融合する有望な戦略である。結果として生じるＣＡＲ免疫細胞は、遺伝子改変Ｔ細胞受容体によって認識される表面抗原または受容体（複数可）を発現する腫瘍を攻撃する新特異性によってリダイレクトされ、高度に調節された方法で正常な宿主免疫応答を介して腫瘍を攻撃する細胞療法を提供する。これらの細胞は脳および全身循環中を自由に循環し、共局在化およびバイオアベイラビリティの必要性を問題としない。
【０２００】
多世代のＣＡＲ免疫細胞が開発されている。ＣＡＲは、腫瘍特異的ｓｃＦｖ抗体または他の細胞外リガンド結合ドメインと、ＴＣＲ関連ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインまたは共刺激タンパク質受容体からの別の細胞内シグナル伝達ドメインとの融合によって作成される。この構造により、ＣＡＲはＢ細胞抗原受容体の腫瘍特異性を持ち、ＭＨＣ結合とは無関係にＴ細胞抗原受容体を介してＴ細胞を活性化することができる。第１世代のＣＡＲには１つの細胞内シグナル伝達ドメインが含まれ、通常はＴＣＲシグナル伝達を可能にするＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを伴う。第２世代ＣＡＲは、２つの細胞内シグナル伝達ドメイン：ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインと結合したＣＤ２８または４−１ＢＢシグナル伝達ドメインのいずれかを含む共刺激ドメインを有する。この配置により、ＣＡＲのｓｃＦｖ領域による抗原認識時にＴ細胞の活性化と増殖が可能となる。第３世代ＣＡＲは、２つの共刺激ドメインと１つのＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを有する。第１の共刺激ドメインはＣＤ２８または４−１ＢＢドメインのいずれかであり、第２の共刺激ドメインはＣＤ２８、４−１ＢＢまたはＯＸ４０ドメインのいずれかからなる。第４世代の「武装したＣＡＲ  Ｔ細胞」は、第２世代のＣＡＲとサイトカインおよび共刺激リガンドを含む様々な遺伝子の追加を組み合わせて、ＣＡＲ  Ｔ細胞の殺腫瘍効果を高める。例えば、Ｂａｔｌｅｖｉら（２０１６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １３：２５−４０を参照されたい。米国特許第７，７４１，４６５号および国際特許公開第ＷＯ２０１４／１２７２６１号も参照されたい。これらはすべて、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２０１】
Ｔ細胞標的化への代替アプローチには、参照により本明細書に具体的に組み込まれる「Ｔｒｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  Ｃｏｕｐｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  ｔｈｅｒｅｏｆ」と題する国際出願第ＷＯ２０１５／１１７２２９号に記載のＴ細胞抗原連結体（ｃｏｕｐｌｅｒ）が含まれる。Ｔ細胞抗原連結体系は、３つの連結ドメイン：標的特異的ポリペプチドリガンド；ＴＣＲ複合体に関連するタンパク質に結合するリガンド、例えば、Ｔ細胞活性化を刺激するＣＤ３（ＴＣＲ、Ｔ細胞受容体）に対するｓｃＦｖ結合；およびＴ細胞受容体シグナル伝達ドメイン、例えば、Ｔ細胞活性化を増幅するＣＤ４膜貫通および細胞内ドメイン、を含む。ＴＣＲを介してＴ細胞の活性化を刺激することにより、ＴＡＣはＴ細胞の重要な分子機構と連携するように操作された。
【０２０２】
抗体連結Ｔ細胞受容体は、Ｔ細胞標的化への別のアプローチである。ＡＣＴＲは、ＣＡＲおよび確立されたモノクローナル抗体腫瘍治療薬に対するハイブリッドアプローチである。ＡＣＴＲは、Ｆｃ受容体ＣＤ１６の高親和性バリアントを介して抗体の重鎖に結合できる典型的なＣＡＲ構築物から構成されている。ＡＣＴＲ−Ｔ細胞は、特定の癌抗原を標的とするリガンドを結合することにより、腫瘍を標的化することができる。Ｔ細胞の活性化はＣＡＲモジュールによって実行される。
【０２０３】
二重特異性Ｔ細胞交換体（ＢｉＴＥ）は、Ｔ細胞のＴＣＲに結合でき、２つのモジュール：癌標的化リガンド；およびＴ細胞を腫瘍に橋渡しするＣＤ３結合ｓｃＦｖドメインを介して腫瘍細胞を標的化できる、二重特異性抗体である。
【０２０４】
ＩＬ１３にコンジュゲートした細菌毒素、ナノ粒子、腫瘍溶解性ウイルスを含むＩＬ１３Ｒα２に対する標的化療法、ならびにモノクローナル抗体、ＩＬ１３Ｒα２パルス樹状細胞、ＩＬ１３Ｒα２標的化キメラ抗原受容体を使用する免疫療法が開発されている（Ｋａｈｌｏｎら（２００４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．６４（２４）：９１６０−９１６６；Ｋｏｎｇら（２０１２）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．１８（２１）：５９４９−５９６０；Ｔｈａｃｉら（２０１４）Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ；およびｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ  ＮＣＴ０２２０８３６２、ＮＣＴ００７３０６１３およびＮＣＴ０１０８２９２６を参照されたい）。いくつかの実施形態では、これらの標的化療法を使用して、ＩＬ−２ムテインを腫瘍に送達することができる。
【０２０５】
ＩＬ−１３活性の選択的変化を提供する生物学的性質は、Ｔ細胞特異性の操作による特定の癌の治療を含む多くの治療目的にとって興味深い。本発明はこの問題に対処するものである。
【０２０６】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）；Ｔ細胞抗原連結体（ＴＡＣ）；抗体共役Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）；およびＩＬ−１３またはＩＬ−４スーパーカインが標的特異的リガンドを提供する二重特異性Ｔ細胞交換体（ＢｉＴＥ）を含むがこれらに限定されない標的組成物を用いて、抗腫瘍免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞、ＮＫ細胞などを増強するための方法および組成物が提供される。さらなる実施形態では、免疫エフェクター細胞はＩＬ−２ムテインを発現する。
【０２０７】
ＩＬ−２スーパーカイン配列を含む免疫細胞標的化または発現構築物が提供され、本明細書に記載の任意のＩＬ−２配列を含むことができる。スーパーカインは、免疫細胞を少なくとも１つの受容体を発現する細胞、例えば腫瘍細胞に標的化するのに有用である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、本明細書に開示される任意のＩＬ−２ムテインまたはバリアントである。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテイン配列は、配列番号２または配列番号６〜配列番号１０または配列番号１６のいずれか１つと９０％同一である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、５−１配列番号５；５−２配列番号６；６−６配列番号７；Ａ２配列番号８；Ｂ１配列番号９；Ｂ１１配列番号１０；Ｃ５配列番号１１；Ｄ１０配列番号１２；Ｅ１０配列番号１３；Ｇ８配列番号１４；Ｈ４配列番号１５；およびＨ９配列番号１６のいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインにおける置換は、配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従って番号付けされたＬ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含む。
【０２０８】
構築物のＩＬ−２スーパーカインまたはムテイン成分は、少なくとも約５０のアミノ酸の長さ、少なくとも約７５、少なくとも約１００、少なくとも約１１０、少なくとも約１１５のアミノ酸の長さ、最大で膜貫通ドメインにある野生型タンパク質の全長、すなわち約１１６のアミノ酸の長さであり得る。例えば、スーパーカインまたはムテインは、ＣＡＲのヒンジ、膜貫通またはシグナル伝達ドメインに融合され得る。例示的なポリペプチド配列が提供される。
【０２０９】
スーパーカインまたはムテインとして含まれるのは、これらの配列と９０％、９５％、９８％または９９％同一であるアミノ酸および核酸コード配列、これらの配列を含むが３´または５´末端に追加のヌクレオチドを含む、例えば、３、６、９、１２以上のヌクレオチドなどの任意の数の追加のヌクレオチドまたはコドン、または最大約１２、２０、５０または１００の追加のヌクレオチドを含むより長い配列、および遺伝暗号の縮重に起因してこれらの核酸と同じアミノ酸配列をコードする任意の配列である。特に、所望の宿主による発現のためにコドン最適化された（ＣＯ）配列は、本発明の一部として企図される。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は９０％同一である。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は９５％同一である。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は９８％同一である。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は９９％同一である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＩＬ−２スーパーカイン免疫細胞標的化または発現構築物に連結されている。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２スーパーカイン免疫細胞標的化または発現構築物は、ＣＤ３−ζ、ＣＤ２８、ＤＡＰ１０、ＯＸ−４０、ＩＣＯＳおよびＣＤ１３７に由来する１つ以上のシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２スーパーカイン免疫細胞標的化または発現構築物または発現は、ＣＤ３−ζに由来する１つ以上のシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２スーパーカイン免疫細胞標的化または発現構築物は、ＣＤ２８に由来する１つ以上のシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２スーパーカイン免疫細胞標的化または発現構築物は、ＤＡＰ１０に由来する１つ以上のシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２スーパーカイン免疫細胞標的化または発現構築物は、ＯＸ−４０に由来する１つ以上のシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２スーパーカイン免疫細胞標的化または発現構築物は、ＣＤ１３７に由来する１つ以上のシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２スーパーカイン免疫細胞標的化または発現構築物は、本明細書で提供されるものを含むＩＬ−２バリアント／ＩＬ−２スーパーカインを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２スーパーカイン免疫細胞標的化または発現構築物は、配列番号２から配列番号３８で提供されるものを含むＩＬ−２バリアント／ＩＬ−２スーパーカインを含む。
【０２１０】
１．ＮＫ細胞
いくつかの実施形態では、免疫細胞はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。ＮＫ細胞は、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１６、および自然細胞傷害性受容体（ＮＣＲ）、例えば、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０を含む複数の細胞表面受容体を介して、感染または形質転換された細胞を認識する。これらの受容体は、パーフォリンおよびグランザイムを含有する細胞溶解性顆粒の放出を開始する免疫チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有し、ならびにＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αなどのサイトカインおよびケモカインの産生および放出を媒介する、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ３ζなどのシグナル伝達アダプタータンパク質を活性化する。重要なことは、ＮＫ細胞媒介細胞毒性は自己ＨＬＡの提示に依存しないことである。したがって、ＮＫ細胞は、同種環境で使用でき、市販の細胞製品を潜在的に提供できるその能力のために、細胞に基づく癌治療法として著しい臨床的関心を保持している。
【０２１１】
ナチュラルキラー細胞は、ＨＬＡマッチングを必要としないため、養子免疫療法についてＴ細胞の使用の代替となり、同種エフェクター細胞として使用することができる。養子移入された同種ＮＫ細胞の臨床試験は、これらの細胞が数週間から数ヶ月間患者で生存できることを示している。さらに、ＮＫ細胞でのＣＡＲの発現により、これらの細胞は、通常ＮＫ細胞感受性がより高い血液悪性腫瘍（特に、急性骨髄性白血病）と比較して、ＮＫ細胞媒介活性に抵抗することが多い固形腫瘍をより効果的に殺傷することができる。ＮＫ細胞標的化に有用なＣＡＲには、例えば、ＣＤ３ζを唯一のシグナル伝達ドメインとして含有する第１世代のＣＡＲ構築物が含まれる。第２および第３世代のＣＡＲもＮＫ細胞で有用である。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞活性化受容体であるＮＫＧ２Ｄの外部ドメインは、ＣＤ３ζに直接連結している。
【０２１２】
改変用のＮＫ細胞には、細胞株または末梢血ＮＫ細胞が含まれ、これらは、単純な採血またはより多くの細胞が必要な場合はアフェレーシスによってドナーから単離できる。活性化されたＰＢ−ＮＫ細胞は、ＣＤ１６、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６などのより広い範囲の活性化受容体、およびＮＫ細胞ライセンシングに重要な役割を果たすＫＩＲを発現する。さらに、ＰＢ−ＮＫ細胞は細胞に照射することなく投与できるため、インビボで拡大する能力を有する。ＣＡＲ発現に適したＮＫ細胞の別の源は、ヒト多能性幹細胞（人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）またはヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）の両方）に由来するＮＫ細胞である。これらのＮＫ細胞はＰＢ−ＮＫ細胞と同様の表現型を示し、ｈＥＳＣ／ｉＰＳＣ−ＮＫ細胞は臨床スケールで増殖させることができる。
【０２１３】
２．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
スーパーカイン配列に加えて、ＣＡＲは、ＣＤ３ζについてのシグナル伝達ドメインと、ＣＡＲを発現する免疫細胞のリサイクル、生存、および／または拡大をさらに促進する１つ以上の共刺激受容体のシグナル伝達ドメインとを含有している。共刺激受容体のシグナル伝達ドメインは、細胞内で活性化シグナルを生成する各受容体タンパク質の細胞内部分である。例としては、天然ＣＤ２８分子のアミノ酸１８０〜２２０および天然４−１ＢＢ分子のアミノ酸２１４〜２５５が挙げられる。
【０２１４】
スーパーカインをシグナル伝達領域に連結するための適切なヒンジおよび膜貫通領域の例には、免疫グロブリンの定常（Ｆｃ）領域、ヒトＣＤ８ａ、および標的細胞への接近および結合を改善するために標的化部位を細胞表面から遠ざけるように働く人工リンカーが含まれ得るが、これらに限定されない。適切な膜貫通ドメインの例には、白血球ＣＤマーカー、好ましくはＣＤ４またはＣＤ２８の膜貫通ドメインが含まれる。細胞内受容体シグナル伝達ドメインの例には、Ｔ細胞抗原受容体複合体、好ましくはＣＤ３のゼータ鎖が含まれるが、膜中にＣＡＲを固定するのに十分な任意の膜貫通領域を使用することができる。当業者は、多数の膜タンパク質において膜貫通ドメインを生成する多数の膜貫通領域および構造要素（親油性アミノ酸領域など）を認識しており、したがって、任意の都合の良い配列で代用することができる。ＣＡＲ発現細胞の機能および活性を改善するのに適したＴ細胞共刺激シグナル伝達受容体には、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、およびＯＸ−４０が含まれるが、これらに限定されない。
【０２１５】
ＣＤ２８を介したシグナル伝達は、ＩＬ２の産生および増殖に必要であるが、Ｔ細胞の機能および活性を維持する上で主要な役割を果たしていない。ＣＤ１３７（ＣＤ２８の活性化後に発現する腫瘍壊死因子受容体ファミリーのメンバー）およびＯＸ−４０は、Ｔ細胞の長期生存およびＴ細胞の蓄積を駆動するのに関与している。これらの受容体のリガンドは通常、樹状細胞や活性化マクロファージなどの専門的な抗原提示細胞上で発現されるが、腫瘍細胞では発現されない。ＣＤ４＋Ｔ細胞中にＣＤ２８および／または４−１ＢＢシグナル伝達ドメインを組み込んだＣＡＲを発現させると、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインのみを含有するＣＡＲを発現するものと比較して、これらの細胞の活性および抗腫瘍効力が増強され、この構築物は、第２または第３世代ＣＡＲと称することができる。
【０２１６】
目的のＣＡＲ構築物として含まれているのは、タンデムＣＡＲであり、例えば、Ｈｅｇｄｅら（２０１６）Ｊ．ＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ  １２６（８）：３０３６−３０５２を参照されたく、これは参照により本明細書に具体的に組み込まれる。そのような構築物では、腫瘍特異的抗原の結合部分がＩＬ−１３スーパーカインと縦列に組み合わされる。結合部分は、例えば、当技術分野で公知のＨＥＲ−２、ＥＧＦＲ、ＣＤ２０などを含むがこれらに限定されない腫瘍細胞抗原に特異的なｓｃＦｖであってもよい。
【０２１７】
様々な実施形態では、抗原結合ドメインは、標的細胞、例えば癌細胞上の抗原に結合する。抗原結合ドメインは、腫瘍標的抗原などであるがこれに限定されない抗原に結合することができる。場合によっては、抗原結合ドメインは１つ以上の抗原に結合する。例示的な抗原結合ドメインは、Ｄ１９；ＣＤ１２３；ＣＤ２２；ＣＤ３０；ＣＤ１７１；ＣＳ−１（ＣＤ２サブセット１、ＣＲＡＣＣ、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３１９、および１９Ａ２４とも呼ばれる）；Ｃ型レクチン様分子−１（ＣＬＬ−１またはＣＬＥＣＬ１）；ＣＤ３３；上皮成長因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）；ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）；ガングリオシドＧＤ３；ＴＮＦ受容体ファミリーＢ細胞成熟（ＢＣＭＡ）；Ｔｎ抗原（（Ｔｎ  Ａｇ）または（ＧａｌＮＡｃα  Ｓｅｒ／Ｔｈｒ））；前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）；受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）；Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）；腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）；ＣＤ３８；ＣＤ４４ｖ６；癌胎児性抗原（ＣＥＡ）；上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）；Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６）；ＫＩＴ（ＣＤ１１７）；インターロイキン−１３受容体サブユニットアルファ−２（ＩＬ−１３Ｒα２またはＣＤ２１３Ａ２）；；メソセリン；インターロイキン１１受容体アルファ（ＩＬ−１１Ｒａ）；前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）；プロテアーゼセリン２１（ＴｅｓｔｉｓｉｎまたはＰＲＳＳ２１）；血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）；Ｌｅｗｉｓ（Ｙ）抗原；ＣＤ２４；血小板由来成長因子受容体ベータ（ＰＤＧＦＲ−ベータ）；ステージ特異的胚抗原−４（ＳＳＥＡ−４）；ＣＤ２０；葉酸受容体アルファ；受容体チロシンプロテインキナーゼＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）；ムチン１，細胞表面関連（ＭＵＣ１）；上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）；神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）；プロスターゼ（Ｐｒｏｓｔａｓｅ）；前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）；伸長因子２変異（ＥＬＦ２Ｍ）；エフリンＢ２；線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰ）；インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ−Ｉ受容体）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）；プロテアソーム（プロソーム、マクロパイン）サブユニット，ベータ型９（ＬＭＰ２）；糖タンパク質１００（ｇｐ１００）；ブレークポイントクラスター領域（ＢＣＲ）およびＡｂｅｌｓｏｎマウス白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ１（Ａｂｌ）（ｂｃｒ−ａｂｌ）からなる癌遺伝子融合タンパク質；チロシナーゼ；エフリン型−Ａ受容体２（ＥｐｈＡ２）；フコシルＧＭ１；シアリルルイス接着分子（ｓＬｅ）；ガングリオシドＧＭ３（ａＮｅｕ５Ａｃ（２−３）ｂＤＧａｌｐ（１−４）ｂＤＧｌｃｐ（１−１）Ｃｅｒ）；トランスグルタミナーゼ５（ＴＧＳ５）；高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷＭＡＡ）；ｏ−アセチル−ＧＤ２ガングリオシド（ＯＡｃＧＤ２）；葉酸受容体ベータ；腫瘍内皮マーカー１（ＴＥＭ１／ＣＤ２４８）；腫瘍内皮マーカー７関連（ＴＥＭ７Ｒ）；クローディン６（ＣＬＤＮ６）；甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）；Ｇタンパク質共役受容体クラスＣグループ５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）；染色体Ｘオープンリーディングフレーム６１（���ＸＯＲＦ６１）；ＣＤ９７；ＣＤ１７９ａ；未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）；ポリシアル酸；胎盤特異的１（ＰＬＡＣ１）；ｇｌｏｂｏＨグリコセラミド（ＧｌｏｂｏＨ）の六糖部分；乳腺分化抗原（ＮＹ−ＢＲ−１）；ウロプラキン２（ＵＰＫ２）；Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体１（ＨＡＶＣＲ１）；アドレナリン受容体ベータ３（ＡＤＲＢ３）；パネキシン３（ＰＡＮＸ３）；Ｇタンパク質共役受容体２０（ＧＰＲ２０）；リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｋ９（ＬＹ６Ｋ）；嗅覚受容体５１Ｅ２（ＯＲ５１Ｅ２）；ＴＣＲガンマ代替リーディングフレームタンパク質（ＴＡＲＰ）；ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）；癌／精巣抗原１（ＮＹ−ＥＳＯ−１）；癌／精巣抗原２（ＬＡＧＥ−１ａ）；黒色腫関連抗原１（ＭＡＧＥ−Ａ１）；１２番染色体１２ｐ上に位置するＥＴＳ転座バリアント遺伝子６（ＥＴＶ６−ＡＭＬ）；精子タンパク質１７（ＳＰＡ１７）；Ｘ抗原ファミリー、メンバー１Ａ（ＸＡＧＥ１）；アンジオポエチン結合細胞表面受容体２（Ｔｉｅ２）；黒色腫癌精巣抗原−１（ＭＡＤ−ＣＴ−１）；黒色腫癌精巣抗原−２（ＭＡＤ−ＣＴ−２）；Ｆｏｓ関連抗原１；腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）；ｐ５３変異体；プロスタイン；生存（ｓｕｒｖｉｖｉｎｇ）；テロメラーゼ；前立腺癌腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１またはＧａｌｅｃｔｉｎ８）、Ｔ細胞１によって認識される黒色腫抗原（ＭｅｌａｎＡまたはＭＡＲＴ１）；ラット肉腫（Ｒａｓ）変異体；ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）；肉腫転座ブレークポイント；アポトーシスの黒色腫阻害剤（ＭＬ−ＩＡＰ）；ＥＲＧ（膜貫通プロテアーゼ、セリン２（ＴＭＰＲＳＳ２）ＥＴＳ融合遺伝子）；Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ（ＮＡ１７）；ペアボックスタンパク質Ｐａｘ−３（ＰＡＸ３）；アンドロゲン受容体；サイクリンＢ１；ｖ−ｍｙｃ鳥類骨髄細胞腫ウイルス腫瘍遺伝子神経芽細胞腫由来ホモログ（ＭＹＣＮ）；ＲａｓホモログファミリーメンバーＣ（ＲｈｏＣ）；チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ−２）；シトクロムＰ４５０１Ｂ１（ＣＹＰ１Ｂ１）；ＣＣＣＴＣ−結合因子（ジンクフィンガータンパク質）様（ＢＯＲＩＳまたは刷り込み部位の調節因子の同胞、Ｔ細胞３により認識される扁平細胞癌腫抗原（ＳＡＲＴ３）；ペアボックスタンパク質Ｐａｘ−５（ＰＡＸ５）；プロアクロシン結合タンパク質ｓｐ３２（ＯＹ−ＴＥＳ１）；リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ（ＬＣＫ）；Ａキナーゼアンカータンパク質４（ＡＫＡＰ−４）；滑膜肉腫、Ｘブレークポイント２（ＳＳＸ２）；高度糖化エンドポイントのための受容体（ＲＡＧＥ−１）；腎遍在１（ＲＵ１）；腎遍在２（ＲＵ２）；レグマイン；ヒトパピローマウイルスＥ６（ＨＰＶＥ６）；ヒトパピローマウイルスＥ７（ＨＰＶ  Ｅ７）；腸のカルボキシルエステラーゼ；熱ショックタンパク質７０−２変異（ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２）；ＣＤ７９ａ；ＣＤ７９ｂ；ＣＤ７２；白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）；ＩｇＡ受容体のＦｃ断片（ＦＣＡＲまたはＣＤ８９）；白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＡメンバー２（ＬＩＬＲＡ２）；ＣＤ３００分子様ファミリーメンバーｆ（ＣＤ３００ＬＦ）；Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡ（ＣＬＥＣ１２Ａ）；骨髄間質細胞抗原２（ＢＳＴ２）；ＥＧＦ様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様２（ＥＭＲ２）；リンパ球抗原７５（ＬＹ７５）；グリピカン−３（ＧＰＣ３）；Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５）；ならびに免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド１（ＩＧＬＬ１）を含むがこれに限定されない抗原に結合できる。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、合成抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、非ヒト抗体、ナノボディ、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ´）２、Ｆａｂ´、Ｆａｂ、Ｆｖなどを含む。抗原結合ドメインは、ＣＡＲの膜貫通ドメイン結合され得る。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインをコードする核酸は、ＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸に作動可能に連結される。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、膜結合または膜貫通タンパク質に由来し得る。特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、膜結合または膜貫通タンパク質の膜貫通ドメインの野生型アミノ酸配列と比較して、１つ以上、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、またはそれ以上のアミノ酸改変（例えば、置換、挿入、および欠失）を含む。ＣＡＲの膜貫通ドメインの非限定的な例は、Ｔ細胞受容体、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン（ＣＤ３ξ）、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、またはエリスロポエチン受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖の少なくとも膜貫通領域（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）ヒンジ領域、例えば、ＩｇＧ４Ｆｃヒンジを含む。他の実施形態では、膜貫通ドメインは、疎水性アミノ酸残基（例えば、ロイシンおよびバリン）を含む組換えまたは合成ドメインである。場合によっては、膜貫通ドメインは、ドメインの片端または両端にフェニルアラニン、トリプトファン、およびバリンを含む。
【０２２０】
膜貫通ドメインは、抗原結合ドメインをＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインに連結する。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインをコードする核酸は、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸に作動可能に連結される膜貫通ドメインをコードする核酸に作動可能に連結される。
【０２２１】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、シグナル活性化またはシグナル伝達ドメインを含む。そのようなものとして、細胞内シグナル伝達ドメインは、シグナル、例えば、活性化シグナルを変換もしくは伝達するか、または細胞内の細胞応答を媒介するのに十分なタンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインの任意の部分を含む。非限定的な例には、ＴＣＲ、ＣＤ２、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ８６、一般的なＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＦｃガンマＲＩＩａ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３，ＣＤ８３に特異的に結合するリガンド、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＣＤ１２７、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（触覚）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、それらの任意の誘導体、バリアント、または断片が含まれる。特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１２７、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＰＤ−１、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、それらの任意の誘導体、またはそれらの任意のバリアントなどからの共刺激分子の細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（触覚）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ，およびＣＤ８３に特異的に結合するリガンドからなる群から選択される。
【０２２２】
３．ＢｉＴＥＳ
二重特異性Ｔ細胞係合体（Ｂｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｎｇａｇｅｒ）（ＢｉＴＥ）は、ＣＤ３に特異的に結合する抗体可変領域に融合したＩＬ−１３スーパーカインを含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の抗体可変領域。スーパーカインは、リンカーを介して可変領域に融合され得る。場合によりＦｃ領域が提供される。
【０２２３】
４．ＴＡＣ
ＴＡＣ構築物は、ＴＣＲ複合体に関連するタンパク質に結合するリガンドに融合され、Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインポリペプチドに融合される、ＩＬ−２スーパーカインを含む。ドメインはリンカーで区切られてもよい。ＴＣＲ複合体に関連するタンパク質はＣＤ３であり得る。ＴＣＲ複合体に関連するタンパク質に結合するリガンドは、単鎖抗体であり得る。ＴＣＲ複合体に関連するタンパク質に結合するリガンドは、ＵＣＨＴ１またはそのバリアントであり得る。Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインポリペプチドは、細胞質ゾルドメインおよび膜貫通ドメインを含み得る。細胞質ゾルドメインは、ＣＤ４細胞質ゾルドメインであり、膜貫通ドメインは、ＣＤ４膜貫通ドメインであり得る。
【０２２４】
５．ＡＣＴＲ
ＡＣＴＲは、ＣＡＲおよび確立されたモノクローナル抗体腫瘍治療薬に対するハイブリッドアプローチである。ＡＣＴＲは、Ｆｃ受容体ＣＤ１６の高親和性バリアントを介して抗体の重鎖に結合できる典型的なＣＡＲ構築物から構成されている。スーパーカインは、ＣＡＲによって認識される部分に融合され、これには、ＣＤ１６に対して高い親和性を持つ抗体のＦｃ領域が含まれるが、これに限定されない。
【０２２５】
免疫細胞標的化または発現構築物コード配列は、組換えＤＮＡ技術を含む、当技術分野で知られている任意の手段によって生成することができる。キメラ受容体のいくつかの領域をコードする核酸は、当技術分野で知られている分子クローニングの標準的な手法（ゲノムライブラリースクリーニング、ＰＣＲ、プライマー支援ライゲーション、部位特異的突然変異誘発など）により都合よく調製し、完全なコード配列に組み立てることができる。得られたコード領域を発現ベクターに挿入し、適切な発現宿主細胞株、例えば、初代培養、細胞株、ｉＰＳＣ由来細胞などを含む同種または自己Ｔリンパ球、同種または自己ＮＫ細胞の集団を形質転換するために使用できる。この方法は、インビトロ（例えば、無細胞系）、培養中、例えばインビトロまたはエクスビボの細胞において使用することができる。例えば、ＩＬ−２スーパーカインＣＡＲ発現細胞は、培養培地中、インビトロで培養し、増殖させることができる。
【０２２６】
非ＩＬ−２スーパーカイン免疫細胞標的化または発現構築物は、特定の腫瘍細胞を標的とするように免疫細胞に特異的に指向させるように使用できる。ＣＤ４＋またはＣＤ８＋  エフェクターＴ細胞などの抗腫瘍エフェクター細胞は、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、ＤＡＰ１０、ＯＸ−４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ１３７に由来する１つ以上のシグナル伝達ドメインを含むスーパーカイン免疫細胞標的化または発現構築物をＴ細胞に導入することにより、そのような腫瘍細胞を認識するようにリダイレクトされるように生成される。いくつかの実施形態では、細胞は、本明細書に記載のＩＬ−２ムテインを発現することができる導入遺伝子をさらに含むことができる。ＩＬ−２スーパーカイン免疫細胞標的化または発現構築物は、腫瘍細胞を含むＩＬ−２Ｒ発現細胞を標的化するように免疫細胞を特異的に指向させることができる。ＣＤ４＋またはＣＤ８＋エフェクターＴ細胞などの抗腫瘍エフェクター細胞は、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、ＤＡＰ１０、ＯＸ−４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ１３７に由来する１つ以上のシグナル伝達ドメインを含むＩＬ−２スーパーカイン免疫細胞標的化または発現構築物をＴ細胞に導入することにより、そのような腫瘍細胞を認識するようにリダイレクトされるように生成される。
【０２２７】
ＩＬ−２スーパーカイン免疫細胞標的化または発現構築物は、例えば、当該分野で公知のような非ウイルスプラスミドベクターおよび電気穿孔法；ウイルスベクターおよび感染方法などを使用して、ヒト免疫細胞に感染またはトランスフェクトされる。共刺激シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲは、養子療法プロトコルの臨床的有効性を大幅に改善できる方法で、抗腫瘍活性の持続時間および／または保持を強化し得る。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞エフェクター機能、ならびにＮＫ細胞機能は、これらの受容体を介して駆動されることができ、したがって、これらの細胞型は本発明での使用が想定される。本発明のＩＬ１３スーパーカインＣＡＲを発現するＣＤ８＋Ｔ細胞は、これらの細胞の他の機能の中でも、標的細胞の溶解および標的細胞の存在下でＩＬ−２を産生するために使用され得る。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかまたは両方での適切な共刺激ＣＡＲの発現は、養子免疫療法のため、したがって、強化されたおよび／または長い生存期間および抗腫瘍活性を示す専門的なヘルパーおよびキラーＴ細胞のいずれかまたは両方からなる、最も効果的な細胞集団を提供するために使用される。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２スーパーカイン免疫細胞標的化または発現構築物は、図２で提供されるものを含むＩＬ−２バリアント／ＩＬ−２スーパーカインを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２スーパーカイン免疫細胞標的化または発現構築物は、本明細書で提供される任意のものを含むＩＬ−２バリアント／ＩＬ−２スーパーカインを含む。
【０２２８】
本発明のポリペプチドは、さらに改変することができ、例えば、様々な目的のために多種多様な他のオリゴペプチドまたはタンパク質に結合させることができる。例えば、プレニル化、アセチル化、アミド化、カルボキシル化、グリコシル化、ペグ化などにより翻訳後修飾される。このような修飾には、グリコシル化の修飾、例えば、その合成およびプロセシングまたはさらなるプロセシング工程中にポリペプチドのグリコシル化パターンを修飾することにより作成されるもの、例えば、哺乳類のグリコシル化または脱グリコシル化酵素などのグリコシル化に影響する酵素にポリペプチドを曝露させることにより作成されるものも含み得る。
【０２２９】
当業者に周知の方法を使用して、コード配列および適切な転写／翻訳制御シグナルを含有するＴ細胞標的化構築物発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、例えば、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ組換え／遺伝子組換えが含まれる。あるいは、目的のポリペプチドをコードできるＲＮＡを化学的に合成してもよい。当業者は、本発明のポリペプチドのいずれかに適したコード配列を提供するために、周知のコドン使用表および合成方法を容易に利用することができる。核酸は、実質的な純度で単離および取得され得る。通常、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかとしての核酸は、他の天然に生じる核酸配列を実質的に含むことなく得られてもよく、一般に少なくとも約５０％であり、通常は少なくとも約９０％純粋であり、典型的には、例えば、天然に生じる染色体上では通常関連付けられない１つ以上のヌクレオチドが隣接している「組換え」型である。本発明の核酸は、線状分子として、または環状分子内に提供することができ、自律的に複製する分子（ベクター）内または複製配列のない分子内に提供することができる。核酸の発現は、それ自体または当該分野で公知の他の調節配列によって調節され得る。本発明の核酸は、当該分野で利用可能な種々の技術を使用して適切な宿主細胞に導入され得る。
【０２３０】
本発明によれば、免疫細胞標的化または発現構築物ベクターおよび免疫細胞標的化または発現構築物改変細胞は、例えばヒトの治療などの治療用途に適した薬学的組成物で提供することができる。いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物は、本発明の１つ以上の治療物質またはその薬学的に許容される塩、エステルもしくは溶媒和物を含む。いくつかの他の実施形態では、本発明の薬学的組成物は、別の治療薬、例えば別の抗腫瘍薬と組み合わせた、本発明の１つ以上の治療物質を含む。
【０２３１】
本発明の治療物質は、しばしば、活性治療薬および別の薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物として投与される。そのような製剤は、１つ以上の非毒性の薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、および／またはアジュバントを含むことができる。好ましい形態は、意図される投与様式および治療用途に依存する。組成物は、所望の製剤に応じて、動物またはヒト投与用の薬学的組成物を製剤化するために一般的に使用されるビヒクルとして定義される、薬学的的に許容される非毒性担体または希釈剤も含み得る。希釈剤は、組み合わせの生物活性に影響を与えないように選択される。そのような希釈剤の例は、蒸留水、生理的リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、およびハンクス液である。さらに、薬学的組成物または製剤は、他の担体、アジュバント、または非毒性、非治療的、非免疫原性の安定剤などを含んでもよい。
【０２３２】
さらに他のいくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物は、タンパク質などの大きくゆっくりと代謝される高分子、キトサンなどの多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸およびコポリマー（例えば、ラテックス官能化セファロースＴＭ、アガロース、セルロースなど）、高分子アミノ酸、アミノ酸コポリマー、および脂質凝集体（油滴またはリポソームなど）も含むことができる。
【０２３３】
ＣＡＲ免疫細胞の最大耐量（ＭＴＤ）は、臨床試験の開発中に決定されてもよく、例えば、経験的に決定されるように、最大約１０４Ｔ細胞／ｋｇ体重、最大約１０５細胞／ｋｇ体重、最大約１０６細胞／ｋｇ体重、最大約５×１０６細胞／ｋｇ体重、最大約１０７細胞／ｋｇ体重、最大約５×１０７  細胞／ｋｇ体重、またはそれ以上である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ免疫細胞の最大耐量（ＭＴＤ）は、最大約１０４Ｔ細胞／体重ｋｇである。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ免疫細胞の最大耐量（ＭＴＤ）は、最大約１０５Ｔ細胞／体重ｋｇである。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ免疫細胞の最大耐量（ＭＴＤ）は、最大約１０６Ｔ細胞／体重ｋｇである。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ免疫細胞の最大耐量（ＭＴＤ）は、最大約１０７Ｔ細胞／体重ｋｇである。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ免疫細胞の最大耐量（ＭＴＤ）は、最大約５×１０６Ｔ細胞／体重ｋｇである。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ免疫細胞の最大耐量（ＭＴＤ）は、最大約５×１０７Ｔ細胞／体重ｋｇである。
【０２３４】
本明細書に記載の細胞の毒性は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手法により、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％致死量）またはＬＤ１００（集団の１００％致死量）を決定することにより、決定することができる。毒性効果と治療効果との用量比が治療指数である。これらの細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトでの使用において毒性でない投与量範囲を策定する際に使用することができる。本明細書に記載の投与量は、毒性がほとんどまたは全くない有効量を含む循環濃度の範囲内にあることが好ましい。投与量は、用いられる投与剤形および利用される投与経路に応じて、この範囲内で変化し得る。正確な製剤、投与経路、および用量は、患者の状態を考慮して個々の医師が選択することができる。
【０２３５】
用量漸増試験の後、拡大コホートの患者はＭＴＤの免疫細胞で治療される。例示的な治療レジメンは、２週間に１回、または１か月に１回、または３〜６か月に１回の投与を伴う。本発明の治療物質は通常、複数の機会に投与される。単回投与の間隔は、毎週、毎月、または毎年である。患者中の治療物質の血中濃度を測定することにより示されるように、間隔は不規則であり得る。
【０２３６】
予防的用途では、例えば、患者の寛解を維持するために、比較的低い投与量が、長期間にわたって比較的まれな間隔で投与され得る。一部の患者は、生涯にわたって治療を受け続ける。他の治療用途では、疾患の進行が軽減または終了するまで、好ましくは、患者が疾患の症状の部分的または完全な改善を示すまで、比較的短い間隔で比較的高い投与量が必要になる場合がある。その後、患者に予防レジメンを実施することができる。
【０２３７】
免疫細胞標的化または発現構築物とともに投与および／またはともに製剤化できる追加の治療薬の例には、宿主中の腫瘍細胞および他の望ましくない細胞を排除するために治療的に使用され、電離放射線の送達および化学療法剤の投与などの治療の使用を含む、抗増殖療法、または細胞減少療法が含まれる。化学療法剤は、当技術分野で周知であり、従来の用量およびレジメンで、または低い用量もしくはレジメンで、使用され、例えば、化合物ダウノルビシン、アドリアマイシン（ドキソルビシン）、エピルビシン、イダルビシン、アナマイシン、ＭＥＮ１０７５５を含む、アントラサイクリンなどのトポイソメラーゼ阻害剤を含む。他のトポイソメラーゼ阻害剤には、ポドフィロトキシン類似体であるエトポシドおよびテニポシド、およびアントラセンジオン、ミトキサントロンおよびアムサクリンが含まれる。他の抗増殖剤は、微小管の集合を妨害し、例えば、ビンカアルカロイドのファミリーである。ビンカアルカロイドの例には、ビンブラスチン、ビンクリスチン；ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ）；ビンデシン；ビンドリン；ビンカミンなどが含まれる。ＤＮＡ損傷剤には、ヌクレオチド類似体、アルキル化剤などが含まれる。アルキル化剤には、ナイトロジェンマスタード、例えば、メクロレタミン、シクロホスファミド、メルファラン（Ｌ−サルコリシン）など；およびニトロ源、例えば、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、セムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）、ストレプトゾシン、クロロゾトシンなどが含まれる。ヌクレオチド類似体には、ピリミジン、例えば、シタラビン（ＣＹＴＯＳＡＲ−Ｕ）、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル（５−ＦＵ），フロクスウリジン（ＦＵｄＲ）など；プリン、例えば、チオグアニン（６−チオグアニン），メルカプトプリン（６−ＭＰ）、ペントスタチン，フルオロウラシル（５−ＦＵ）など；および葉酸類似体，例えば、メトトレキサート、１０−プロパルギル−５，８−ジデアザフォレート（ＰＤＤＦ、ＣＢ３７１７）、５，８−ジデアザテトラヒドロ葉酸（ＤＤＡＴＨＦ），ロイコボリンなどが含まれる。他の目的の化学療法剤には、金属複合体、例えば、シスプラチン（ｃｉｓ−ＤＤＰ）、カルボプラチン，オキサリプラチンなど；尿素、例えば、ヒドロキシ尿素およびヒドラジン、例えば、Ｎ−メチルヒドラジンが含まれる。
【０２３８】
例えば、電離放射線（ＩＲ）は、治療される領域の細胞を損傷または破壊するエネルギーを蓄積することにより、癌患者の約６０％を治療するために使用され、本発明の目的のために、従来の用量およびレジメン、または低い用量で送達され得る。細胞への放射線損傷は非特異的であり、ＤＮＡに複雑な影響を及ぼす。治療の有効性は、正常細胞に対してよりも大きな癌細胞に対する細胞傷害に依存する。放射線療法は、あらゆる種類の癌の治療に使用できる。放射線療法の種類によっては、Ｘ線やガンマ線などの光子が含まれる。癌細胞に放射線を照射するための別の技法は、内部放射線療法であり、これは、放射性インプラントを腫瘍または体腔に直接配置することにより、放射線量を小さな領域に集中させる。電離放射線の適切な線量は、少なくとも約２Ｇｙ〜約１０Ｇｙ以下の範囲、通常は約５Ｇｙであり得る。紫外線照射の適切な線量は、少なくとも約５Ｊ／ｍ２〜約５０Ｊ／ｍ２以下の範囲、通常は約１０Ｊ／ｍ２であり得る。試料は、紫外線照射後少なくとも約４時間〜約７２時間以内、通常は約４時間で収集され得る。
【０２３９】
治療は、例えばＣＤ４０、ＯＸ４０などの免疫共刺激分子を刺激する薬剤、および／または（ｉｉｉ）例えばＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１などの免疫抑制分子を拮抗する薬剤を含む免疫調節性調節剤と組み合わせてもよい。活性薬剤は、宿主内の癌細胞の枯渇に対して相加的または相乗的効果をもたらすために一定期間内に投与される。投与方法には、全身投与、腫瘍内投与などが含まれるが、これらに限定されない。
【０２４０】
いくつかの実施形態では、癌はチェックポイント阻害剤、例えば、ＰＤ−１アンタゴニスト、ＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト、ＣＴＬＡ４アンタゴニスト、ＴＩＭ−３アンタゴニスト、ＢＴＬＡアンタゴニスト、ＶＩＳＴＡアンタゴニスト、ＬＡＧ３アンタゴニストなどに反応する癌タイプであるため、個々の癌が、併用療法による治療のために選択される。いくつかの実施形態では、そのような免疫調節剤は、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ１またはＰＤＬ１アンタゴニスト、例えば、アベルマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、イピリムマブなどである。いくつかのそのような実施形態では、癌は、黒色腫または小細胞肺癌であるが、これらに限定されない。いくつかのそのような実施形態では、癌は、高い新抗原、または突然変異誘発の負荷を有するタイプである（参照により本明細書に具体的に組み込まれるＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎら（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９（６１２７）：１５４６−１５５８を参照されたい）。
【０２４１】
いくつかの実施形態では、癌は免疫応答アゴニスト、例えば、ＣＤ２８アゴニスト、ＯＸ４０アゴニスト、ＧＩＴＲアゴニスト、ＣＤ１３７アゴニスト、ＣＤ２７アゴニスト、ＨＶＥＭアゴニストなどに応答する癌タイプであるため、個々の癌が、本発明の併用療法による治療のために選択される。いくつかの実施形態では、そのような免疫調節剤は、ＯＸ４０、ＣＤ１３７、またはＧＩＴＲアゴニスト、例えば、トレメリムマブなどである。いくつかのそのような実施形態では、癌は、黒色腫または小細胞肺癌であるが、これらに限定されない。いくつかのそのような実施形態では、癌は、高い新抗原、または突然変異誘発の負荷を有するタイプである。
【０２４２】
いくつかの実施形態では、併用療法には、ＰＤ−１に結合し、ＰＤ−１およびそのリガンドＰＤ−Ｌ１との相互作用を破壊して、抗腫瘍免疫応答を刺激する、当技術分野で公知の抗体が含まれる。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、ＰＤ−１に特異的に結合する。例えば、ＰＤ−１を標的とし、本発明で使用できる抗体には、例えば、ニボルマブ（ＢＭＳ−９３６５５８、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、ペンブロリズマブ（ランブロリズマブ、ＭＫ０３４７５またはＭＫ−３４７５、Ｍｅｒｃｋ）、ヒト化抗ＰＤ−１抗体ＪＳ００１（ＳｈａｎｇＨａｉ  ＪｕｎＳｈｉ）、モノクローナル抗ＰＤ−１抗体ＴＳＲ−０４２（Ｔｅｓａｒｏ、Ｉｎｃ．）、ピジリズマブ（抗ＰＤ−１  ｍＡｂ  ＣＴ−０１１、Ｍｅｄｉｖａｔｉｏｎ）、抗ＰＤ−１モノクローナル抗体ＢＧＢ−Ａ３１７（ＢｅｉＧｅｎｅ）、および／または抗ＰＤ−１抗体ＳＨＲ−１２１０（ＳｈａｎｇＨａｉ  ＨｅｎｇＲｕｉ）、ヒトモノクローナル抗体ＲＥＧＮ２８１０（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）、ヒトモノクローナル抗体ＭＤＸ−１１０６（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、および／またはヒト化抗ＰＤ−１  ＩｇＧ４抗体ＰＤＲ００１（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１抗体はクローン：ＲＭＰ１−１４（ラットＩｇＧ）−ＢｉｏＸｃｅｌｌカタログ番号ＢＰ０１４６に由来する。他の適切な抗体には、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第８，００８，４４９号に開示されている抗ＰＤ−１抗体が含まれる。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合し、ＰＤ−１との相互作用を阻害し、それにより免疫活性を増加させる。ＰＤ−Ｌ１に結合し、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用を破壊し、抗腫瘍免疫応答を刺激する当技術分野で公知の任意の抗体は、本明細書に開示される併用治療法における使用に適している。例えば、ＰＤ−Ｌ１を標的とし、臨床試験中の抗体には、ＢＭＳ−９３６５５９（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）およびＭＰＤＬ３２８０Ａ（Ｇｅｎｅｔｅｃｈ）が含まれる。ＰＤ−Ｌ１を標的とする他の適切な抗体は、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第７，９４３，７４３号に開示されている。ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１に結合し、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用を破壊し、抗腫瘍免疫応答を刺激する任意の抗体が本明細書に開示される併用治療法における使用に適していることは、当業者には理解されるであろう。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、併用療法には、ＣＴＬＡ−４に結合し、そのＣＤ８０およびＣＤ８６との相互作用を破壊する、当技術分野で公知の抗体が含まれる。ＣＴＬＡ−４を標的とする例示的な抗体には、ＦＤＡ承認済みのイピリムマブ（ＭＤＸ−０１０、ＭＤＸ−１０１、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、および現在ヒト試験中のトレメリムマブ（チシリムマブ、ＣＰ−６７５、２０６、Ｐｆｉｚｅｒ）が含まれる。ＣＴＬＡ−４を標的とする他の適切な抗体は、参照により本明細書に組み入れられるＷＯ  ２０１２／１２０１２５、米国特許第６，９８４７２０号、第６，６８２，７３６８号、および米国特許出願第２００２／００３９５８１号、第２００２／００８６０１４号、および第２００５／０２０１９９４号に開示されている。ＣＴＬＡ−４に結合し、そのＣＤ８０およびＣＤ８６との相互作用を破壊し、抗腫瘍免疫応答を刺激する任意の抗体が本明細書に開示される併用治療法における使用に適していることは、当業者には理解されよう。いくつかの実施形態では、併用療法には、ＬＡＧ−３に結合し、そのＭＨＣクラスＩＩ分子との相互作用を破壊する、当技術分野で公知の抗体が含まれる。ＬＡＧ−３を標的とする例示的な抗体は、現在ヒト試験中のＩＭＰ３２１（Ｉｍｍｕｔｅｐ）である。ＬＡＧ−３を標的とする他の適切な抗体は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第２０１１／０１５０８９２号に開示されている。ＬＡＧ−３に結合し、そのＭＨＣクラスＩＩ分子との相互作用を破壊し、抗腫瘍免疫応答を刺激する任意の抗体が本明細書に開示される併用治療法における使用に適していることは、当業者には理解されよう。
【０２４４】
いくつかの実施形態では、併用療法には、ＴＩＭ−３に結合し、そのガレクチン９との相互作用を破壊する、当技術分野で公知の抗体が含まれる。ＴＩＭ−３を標的とする適切な抗体は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第２０１３／００２２６２３号に開示されている。ＴＩＭ−３に結合し、そのガレクチン９との相互作用を破壊し、抗腫瘍免疫応答を刺激する任意の抗体が本明細書に開示される併用治療法における使用に適していることは、当業者には理解されよう。
【０２４５】
いくつかの実施形態では、併用療法には、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７に結合し、そのＣＤ１３７Ｌとの相互作用を破壊する、当技術分野で公知の抗体が含まれる。４−１ＢＢ／ＣＤ１３７に結合し、そのＣＤ１３７Ｌまたは別のリガンドとの相互作用を破壊し、全体として抗腫瘍活性をもたらす抗腫瘍免疫応答または免疫刺激応答を刺激する抗体が本明細書に開示される併用治療法における使用に適していることは、当業者には理解されよう。
【０２４６】
いくつかの実施形態では、併用療法には、ＧＩＴＲに結合し、そのリガンドとの相互作用を破壊する、当技術分野で公知の抗体が含まれる。ＧＩＴＲに結合し、そのＧＩＴＲＬまたは別のリガンドとの相互作用を破壊し、全体として抗腫瘍活性をもたらす抗腫瘍免疫応答または免疫刺激応答を刺激する抗体が本明細書に開示される併用治療法における使用に適していることは、当業者には理解されよう。
【０２４７】
いくつかの実施形態では、併用療法には、ＯＸ４０に結合し、そのリガンドとの相互作用を破壊する、当技術分野で公知の抗体が含まれる。ＯＸ４０に結合し、そのＯＸ４０Ｌまたは別のリガンドとの相互作用を破壊し、全体として抗腫瘍活性をもたらす抗腫瘍免疫応答または免疫刺激応答を刺激する抗体が本明細書に開示される併用治療法における使用に適していることは、当業者には理解されよう。
【０２４８】
いくつかの実施形態では、併用療法には、ＣＤ４０に結合し、そのリガンドとの相互作用を破壊する、当技術分野で公知の抗体が含まれる。ＣＤ４０に結合し、そのリガンドとの相互作用を破壊し、全体として抗腫瘍活性をもたらす抗腫瘍免疫応答または免疫刺激応答を刺激する抗体が本明細書に開示される併用治療法における使用に適していることは、当業者には理解されよう。
【０２４９】
いくつかの実施形態では、併用療法には、ＩＣＯＳに結合し、そのリガンドとの相互作用を破壊する、当技術分野で公知の抗体が含まれる。ＩＣＯＳに結合し、そのリガンドとの相互作用を破壊し、全体として抗腫瘍活性をもたらす抗腫瘍免疫応答または免疫刺激応答を刺激する抗体が本明細書に開示される併用治療法における使用に適していることは、当業者には理解されよう。
【０２５０】
いくつかの実施形態では、併用療法には、ＣＤ２８に結合し、そのリガンドとの相互作用を破壊する、当技術分野で公知の抗体が含まれる。ＣＤ２８に結合し、そのリガンドとの相互作用を破壊し、全体として抗腫瘍活性をもたらす抗腫瘍免疫応答または免疫刺激応答を刺激する抗体が本明細書に開示される併用治療法における使用に適していることは、当業者には理解されよう。
【０２５１】
いくつかの実施形態では、併用療法には、ＩＦＮαに結合し、そのリガンドとの相互作用を破壊する、当技術分野で公知の抗体が含まれる。ＩＦＮαに結合し、そのリガンドとの相互作用を破壊し、全体として抗腫瘍活性をもたらす抗腫瘍免疫応答または免疫刺激応答を刺激する抗体が本明細書に開示される併用治療法における使用に適していることは、当業者には理解されよう。
【０２５２】
「抗癌治療薬」とは、癌細胞の増殖および／または転移を予防または遅延させる化合物、組成物、または治療（手術など）である。そのような抗癌治療には、手術（例えば、腫瘍の全部または一部の除去）、化学療法薬の治療、放射線、遺伝子治療、ホルモン操作、免疫療法（（例えば、治療抗体および癌ワクチン）、およびアンチセンスまたはＲＮＡｉオリゴヌクレオチド療法が含まれるが、これらに限定されない。有用な化学療法薬の例には、ヒドロキシ尿素、ブスルファン、シスプラチン、カルボプラチン、クロラムブシル、メルファラン、シクロホスファミド、イホスファミド、ダノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ナベルビンＲＴＭ。（ビノレルビン）、エトポシド、テニポシド、パクリタキセル、ドセタキセル、ゲムシタビン、シトシン、アラビノシド、ブレオマイシン、ネオカルシノスタチン、スラミン、タキソール、マイトマイシンＣ、アバスチン、ハーセプチン、ＲＴＭ、フルロウラシル、およびテモゾラミドなどが含まれるが、これらに限定されない。化合物は、２つ以上の化学療法剤を使用する標準的な併用療法での使用にも適している。抗癌治療には、将来開発される新規化合物または治療が含まれることを理解されたい。
【０２５３】
上記の薬学的組成物および／または製剤は、意図する目的を達成するのに有効な量の１つ以上の治療物質を含む。したがって、「治療的有効量」という用語は、癌の症状を改善する治療物質の量を指す。化合物の治療的有効な用量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。例えば、治療的有効量は、本明細書に記載されているような細胞培養アッセイまたは動物モデルのいずれかで最初に推定することができる。動物モデルを使用して、適切な濃度範囲および投与経路を決定することもできる。次いで、そのような情報を使用して、当業者に公知の標準的な方法を使用して、ヒトを含む他の動物における投与のための有用な用量および経路を決定することができる。
【０２５４】
本発明の組成物および使用説明書を含むキットも本発明の範囲内である。キットは、少なくとも１つの追加試薬、例えば、化学療法薬、抗腫瘍抗体などをさらに含んでもよい。キットは通常、キットの内容物の使用目的を示すラベルを含む。ラベルという用語には、キット上またはキットに付属する任意の書面または記録材料、または他の方法でキットに付属するものが含まれる。
【０２５５】
本発明を十分に説明してきたが、本発明の精神または範囲から逸脱することなく様々な変更および修正を行うことができることは当業者には明らかであろう。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載のＩＬ−２バリアント／ＩＬ−２スーパーカインを含むＩＬ−２スーパーカイン免疫細胞標的化または発現構築物を含む。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書で提供されるものを含むＩＬ−２バリアント／ＩＬ−２スーパーカインを含むＩＬ−２スーパーカイン免疫細胞標的化または発現構築物を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２スーパーカイン免疫細胞標的化または発現構築物は、本明細書で提供されるものを含むＩＬ−２バリアント／ＩＬ−２スーパーカインを含む。
【０２５６】
６．例示的な免疫細胞標的化または発現構築物の実施形態
免疫細胞標的化または発現構築物は、インターロイキン−２受容体β（ＩＬ−２Ｒβ）結合タンパク質を含み、ここで、前述の結合タンパク質のＩＬ−２Ｒβの平衡解離定数は、野生型ヒトＩＬ−２（ｈＩＬ−２）のものよりも小さく；免疫細胞標的化または発現構築物に連結されている。
【０２５７】
いくつかの実施形態では、免疫細胞標的化または発現構築物は、Ｔ細胞、例えばＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞に対して細胞傷害性効果を示す。
【０２５８】
いくつかの実施形態では、構築物はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であり、ＩＬ−２スーパーカインは膜貫通ドメインに融合され、細胞内シグナル伝達領域に連結されている。
【０２５９】
いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達領域はＣＤ３シグナル伝達ドメインを含む。
【０２６０】
いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達領域は、ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン、ＣＤ１３７シグナル伝達ドメイン、ＯＸ−４０シグナル伝達ドメイン、ＩＣＯＳシグナル伝達ドメイン、ＤＡＰ１０シグナル伝達ドメインのうちの１つ以上を含む。
【０２６１】
いくつかの実施形態では、構築物はＴ細胞抗原連結体（ＴＡＣ）であり、ＩＬ−２スーパーカインは、ＴＣＲ複合体に関連するタンパク質に結合するリガンドに融合され；Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインポリペプチドに融合されている。
【０２６２】
いくつかの実施形態では、ＴＣＲ複合体に関連するタンパク質はＣＤ３である。
【０２６３】
いくつかの態様において、Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインポリペプチドは、ＣＤ４細胞質ゾルドメインおよびＣＤ４膜貫通ドメインを含む。
【０２６４】
いくつかの実施形態では、構築物は、ＩＬ−２スーパーカインに高親和性で結合するキメラ抗原受容体成分を含む抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）である。
【０２６５】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲ成分はＣＤ１６を含み、ＩＬ−２スーパーカインはＦｃ配列に融合している。
【０２６６】
いくつかの実施形態では、構築物は、Ｔ細胞受容体の成分に結合する抗体の可変領域に融合したＩＬ−２スーパーカインを含む二重特異性Ｔ細胞交換体（ＢｉＴＥ）である。
【０２６７】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞受容体のＢｉＴＥ成分はＣＤ３である。
【０２６８】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２Ｒβ結合タンパク質は、野生型ｈＩＬ−２に従って番号付けされた以下のアミノ酸置換：Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含む。
【０２６９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のおよびＩＬ−２をコードする核酸が提供される。いくつかの実施形態では、核酸を含むベクターが提供される。
【０２７０】
いくつかの実施形態では、上記のいずれかによる構築物を含むＴ細胞が提供される。いくつかの実施形態では、上記のいずれかによる構築物を含むＮＫ細胞が提供される。いくつかの態様では、Ｔ細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞である。いくつかの態様では、Ｔ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【０２７１】
上記の免疫細胞の単離された集団も提供される。上記の免疫細胞集団を含む薬学的製剤も提供される。
【０２７２】
Ｈ．変異ＩＬ−２遺伝子産物の発現
上記の核酸分子は、例えば、ベクターで形質導入された細胞においてそれらの発現を指示することができるベクター内に含まれ得る。したがって、対象ＩＬ−２ムテインに加えて、対象ＩＬ−２ムテインをコードする核酸分子を含有する発現ベクターおよびこれらのベクターでトランスフェクトされた細胞は、好ましい実施形態に含まれる。
【０２７３】
もちろん、すべてのベクターおよび発現制御配列が、本明細書に記載のＤＮＡ配列を発現するために同等に首尾よく機能するとは限らないことを理解されたい。また、すべての宿主が同じ発現系で同等に首尾よく機能するとは限らない。しかしながら、当業者は、過度の実験を行うことなく、これらのベクター、発現制御配列および宿主の中から選択することができる。例えば、ベクターを選択する場合、ベクターは宿主中で複製する必要があるため、宿主を考慮する必要がある。ベクターのコピー数、そのコピー数を制御する能力、および抗生物質マーカーなど、ベクターによってコードされた他のタンパク質の発現も考慮する必要がある。例えば、使用できるベクターには、ＩＬ−２ムテインをコードするＤＮＡをコピー数で増幅できるものが含まれる。そのような増幅可能なベクターは、当技術分野で周知である。それらには、例えば、ＤＨＦＲ増幅（例えば、Ｋａｕｆｍａｎ、米国特許第４，４７０，４６１号、ＫａｕｆｍａｎおよびＳｈａｒｐ、「Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｍｏｄｕｌａｒ  Ｄｉｈｙｄｒａｆｏｌａｔｅ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｃＤＮＡ  Ｇｅｎｅ：Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｉｇｎａｌｓ  Ｕｔｉｌｉｚｅｄ  ｆｏｒ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、２、ｐｐ．１３０４−１９（１９８２）を参照されたい）またはグルタミンシンテターゼ（「ＧＳ」）増幅（例えば、米国特許第５，１２２，４６４号および欧州公開出願第３３８，８４１号を参照されたい）により増幅できるベクターが含まれる。
【０２７４】
いくつかの実施形態では、本開示のヒトＩＬ−２ムテインは、ベクター、好ましくは発現ベクターから発現されるであろう。ベクターは、宿主細胞における自律複製に有用であるか、または宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより宿主ゲノムとともに複製される（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）ことができる。発現ベクターは、作動可能に連結されているコーディング配列の発現を指示することができる。一般的に、組換えＤＮＡ技術で有用な発現ベクターは、多くの場合、プラスミド（ベクター）の形態である。しかしながら、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）などの他の形態の発現ベクターも含まれる。
【０２７５】
例示的な組換え発現ベクターは、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択され、発現される核酸配列に作動可能に連結された、１つ以上の調節配列を含むことができる。
【０２７６】
発現構築物またはベクターは、原核生物または真核生物の宿主細胞におけるＩＬ−２ムテインまたはそのバリアントの発現のために設計することができる。
【０２７７】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換またはトランスフェクション技術により、原核細胞または真核細胞に導入できる。宿主細胞の形質転換またはトランスフェクションに適した方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｄ  ｅｄ．、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎ．Ｙ．）および他の標準的な分子生物学実験マニュアルにおいて見出され得る。
【０２７８】
原核生物におけるタンパク質の発現は、構成的または誘導可能なプロモーターを含有するベクターを用いて大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）で最も頻繁に実施される。Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換えタンパク質発現を最大化するための戦略は、例えば、Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ（１９９０）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）、ｐｐ．１１９−１２８およびＷａｄａら（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：２１１１−２１１８において見出され得る。ＩＬ−２ムテインまたはそのバリアントを細胞から成長、収穫、破壊、または抽出するプロセスは、例えば、米国特許第４，６０４，３７７号；第４，７３８，９２７号；第４，６５６，１３２号；第４，５６９，７９０号；第４，７４８，２３４号；第４，５３０，７８７号；第４，５７２，７９８号；第４，７４８，２３４号；第４，９３１，５４３号に実質的に記載されておおり、これらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２７９】
いくつかの実施形態では、組換えＩＬ−２ムテインまたはその生物学的に活性なバリアントは、酵母またはヒト細胞などの真核生物で作製することもできる。適切な真核生物宿主細胞には、昆虫細胞（（培養昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）でタンパク質の発現に利用できるバキュロウイルスベクターの例には、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈら（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５）およびｐＶＬシリーズ（ＬｕｃｋｌｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７０：３１−３９）が含まれる）；酵母細胞（酵母Ｓ．ｃｅｒｅｎｖｉｓｉａｅでの発現用ベクターの例には、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら（１９８７）ＥＭＢＯＪ．６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（ＫｕｒｊａｎおよびＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ（１９８２）Ｃｅｌｌ  ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら（１９８７）Ｇｅｎｅ  ５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）、およびｐＰｉｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）が含まれる）；または哺乳動物細胞（哺乳動物発現ベクターには、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら（１９８７）ＥＭＢＯＪ．６：１８７：１９５）が含まれる）が含まれる。適切な哺乳動物細胞には、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞が含まれる。哺乳動物細胞では、発現ベクターの制御機能は多くの場合ウイルス調節要素によって提供される。例えば、一般的に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、およびシミアンウイルス４０に由来する。原核細胞および真核細胞の両方に適した他の発現系については、Ｃｈａｐｔｅｒｓ  １６および１７、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄ．、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎ．Ｙ．）を参照されたい。Ｇｏｅｄｄｅｌ（１９９０）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）を参照されたい。
【０２８０】
本開示のヒトＩＬ−２ムテインをコードする配列は、目的の宿主細胞における発現のために最適化され得る。配列のＧＣ含有量は、宿主細胞で発現している既知の遺伝子を参照して計算されるような、特定の細胞宿主の平均レベルに調整できる。コドン最適化の方法は、当技術分野で周知である。ＩＬ−２ムテインコード配列内のコドンは、宿主細胞での発現を高めるように最適化することができ、結果として、コード配列内のコドンの約１％、約５％、約１０％、約２５％、約５０％、約７５％、または最大１００％が、特定の宿主細胞での発現のために最適化される。
【０２８１】
使用に適したベクターには、細菌用のＴ７に基づくベクター（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｇｅｎｅ  ５６：１２５、１９８７を参照されたい）、哺乳動物細胞用のｐＭＳＸＮＤ発現ベクター（ＬｅｅおよびＮａｔｈａｎｓ、Ｊ．Ｂｉｏｌ。Ｃｈｅｍ。２６３：３５２１、１９８８）、および昆虫細胞用のバキュロウイルス由来のベクター（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆ．からの発現ベクターｐＢａｃＰＡＫ９）が含まれる。
【０２８２】
いくつかの実施形態では、そのようなベクター中の対象ＩＬ−２ムテインをコードする核酸挿入物は、例えば、発現が求められる細胞型に基づいて選択されるプロモーターに作動可能に連結することができる。
【０２８３】
発現制御配列を選択する際には、様々な要因も考慮する必要がある。これらには、例えば、特に潜在的な二次構造に関して、配列の相対的強度、その制御性、および対象ＩＬ−２ムテインをコードする実際のＤＮＡ配列との適合性が含まれる。宿主は、選択されたベクターとの適合性、本発明のＤＮＡ配列によってコードされる産物の毒性、分泌特性、ポリペプチドを正しく折りたたむ能力、発酵または培養要件、およびＤＮＡ配列によってコード化された産物の精製容易さを考慮して選択されるべきである。
【０２８４】
これらのパラメータ内で、当業者は、例えばＣＨＯ細胞またはＣＯＳ７細胞を使用して、発酵または大規模動物培養で所望のＤＮＡ配列を発現する様々なベクター／発現制御配列／宿主の組み合わせを選択することができる。
【０２８５】
いくつかの実施形態では、発現制御配列および発現ベクターの選択は、宿主の選択に依存し得る。多種多様な発現宿主／ベクターの組み合わせを使用することができる。真核生物宿主に有用な発現ベクターには、例えば、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス、アデノウイルス、およびサイトメガロウイルス由来の発現制御配列を含むベクターが含まれる。細菌宿主に有用な発現ベクターには、ｃｏｌ  Ｅｌ、ｐＣＲＩ、ｐＥＲ３２ｚ、ｐＭＢ９、およびそれらの誘導体を含むＥ．ｃｏｌｉ由来のプラスミドなどの細菌プラスミド、より広範な宿主プラスミド、例えば、ＲＰ４、ｐｈａｇｅ  ＤＮＡ、例えば、ファージラムダの多数の誘導体、例えば、ＮＭ９８９、および他のＤＮＡファージ、例えば、Ｍ１３および糸状一本鎖ＤＮＡファージが含まれる。酵母細胞に有用な発現ベクターには、２μプラスミドおよびその誘導体が含まれる。昆虫細胞に有用なベクターには、ｐＶＬ  ９４１およびｐＦａｓｔＢａｃ（商標）１（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍｄ）Ｃａｔｅら、「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｓ  Ｆｏｒ  Ｍｕｌｌｅｒｉａｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｉｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ」、Ｃｅｌｌ、４５、ｐｐ．６８５−９８（１９８６）が含まれる。
【０２８６】
さらに、これらのベクターでは、様々な任意の発現制御配列を使用できる。そのような有用な発現制御配列には、前述の発現ベクターの構造遺伝子に関連する発現制御配列が含まれる。有用な発現制御配列の例には、例えば、ＳＶ４０またはアデノウイルスの初期および後期プロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣまたはＴＲＣ系、ファージラムダの主要なオペレーターおよびプロモーター領域、例えば、ＰＬ、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖酵素のプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター、例えば、ＰｈｏＡ、酵母のα−交配系のプロモーター、バキュロウイルスの多面体プロモーター、および原核細胞または真核細胞またはそれらのウイルスの遺伝子の発現を制御するために知られている他の配列、ならびにそれらの様々な組み合わせが含まれる。
【０２８７】
Ｔ７プロモーターは細菌で使用でき、ポリヘドリンプロモーターは昆虫細胞で使用でき、サイトメガロウイルスまたはメタロチオネインプロモーターは哺乳類細胞で使用できる。また、高等真核生物の場合、組織特異的および細胞型特異的プロモーターが広く利用可能である。これらのプロモーターは、体内の所定の組織または細胞型で核酸分子の発現を指示する能力からそのように名付けられている。当業者は、核酸の発現を指示するために使用できる多くのプロモーターおよび他の調節要素を熟知しているだろう。
【０２８８】
挿入された核酸分子の転写を促進する配列に加えて、ベクターは複製起点、および選択マーカーをコードする他の遺伝子を含むことができる。例えば、ネオマイシン耐性（ｎｅｏｒ）遺伝子は、それが発現される細胞にＧ４１８耐性を付与し、トランスフェクトされた細胞の表現型選択を可能にする。当業者は、所定の調節要素または選択可能マーカーが特定の実験状況での使用に適しているかどうかを容易に決定することができる。
【０２８９】
本発明で使用できるウイルスベクターには、例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ベクター、ヘルペスウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、およびウシパピローマウイルスベクター（例えば、Ｇｌｕｚｍａｎ（Ｅｄ．）、Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ、ＣＳＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．を参照されたい）が含まれる。
【０２９０】
本明細書に開示される対象ＩＬ−２ムテインをコードする核酸分子を含有および発現する原核細胞または真核細胞も本発明の特徴である。本発明の細胞は、トランスフェクトされた細胞、すなわち核酸分子、例えば、変異体ＩＬ−２ポリペプチドをコードする核酸分子が組換えＤＮＡ技術によって導入された細胞である。そのような細胞の子孫も本発明の範囲内であると見なされる。
【０２９１】
発現系の正確な成分は重要ではない。例えば、ＩＬ−２ムテインは、細菌Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核生物宿主において、または昆虫細胞（例えば、Ｓｆ２１細胞）もしくは哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞、もしくはＨｅＬａ細胞）などの真核生物宿主において、産生させることができる。これらの細胞は、ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．）を含む多くの供給元から入手できる。発現系を選択する際に重要なのは、成分が相互に適合性があるかということのみである。専門家または当業者は、そのような決定を下すことができる。さらに、発現系の選択にガイダンスが必要な場合、当業者は、Ａｕｓｕｂｅｌら（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、１９９３）およびＰｏｕｗｅｌｓら（Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、１９８５  Ｓｕｐｐｌ．１９８７）を参考にしてもよい。
【０２９２】
発現されたポリペプチドは、通常の生化学的手順を使用して発現系から精製することができ、例えば、本明細書に記載の治療薬として使用することができる。
【０２９３】
いくつかの実施形態では、得られたＩＬ−２ムテインは、ムテインを産生するために使用される宿主生物に応じてグリコシル化または非グリコシル化される。細菌が宿主として選択される場合、産生されるＩＬ−２ムテインはグリコシル化されない。一方、真核細胞はＩＬ−２ムテインをグリコシル化するが、おそらく天然ＩＬ−２がグリコシル化されるのと同じ方法ではない。形質転換された宿主によって産生されたＩＬ−２ムテインは、任意の適切な方法に従って精製することができる。ＩＬ−２を精製するために様々な方法が知られている。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｖｏｌ  ２．Ｅｄｓ：Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ、Ｂｅｎ  Ｍ．Ｄｕｎｎ、Ｈｉｄｄｅ  Ｌ．Ｐｌｏｅｈｇ、Ｄａｖｉｄ  Ｗ．Ｓｐｅｉｃｈｅｒ、Ｐａｕｌ  Ｔ．Ｗｉｎｇｆｉｅｌｄ、Ｕｎｉｔ  ６．５（Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ  １９９７、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．を参照されたい。ＩＬ−２ムテインは、陽イオン交換、ゲルろ過、および／または逆相液体クロマトグラフィーを使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ中で産生された封入体から分離可能であり、または所定のムテインを産生する哺乳動物または酵母の培養液のいずれかからの馴化培地から分離可能である。
【０２９４】
ＩＬ−２ムテインをコードするＤＮＡ配列を構築する別の例示的な方法は、化学合成によるものである。これには、記載された特性を示すＩＬ−２ムテインをコードするタンパク質配列の化学的手段によるペプチドの直接合成が含まれる。この方法は、ＩＬ−２Ｒα、ＩＬ−２Ｒβおよび／またはＩＬ−２ＲγとＩＬ−２との相互作用に影響を与える位置に天然および非天然アミノ酸の両方を組み込むことができる。あるいは、所望のＩＬ−２ムテインをコードする遺伝子は、オリゴヌクレオチド合成機を使用する化学的手段により合成することができる。そのようなオリゴヌクレオチドは、所望のＩＬ−２ムテインのアミノ酸配列に基づいて設計され、好ましくは、組換えムテインが産生される宿主細胞で好まれるコドンを選択する。これに関して、遺伝暗号が縮重していること、つまりアミノ酸が２つ以上のコドンによってコードされている可能性があることはよく認識されている。例えば、Ｐｈｅ（Ｆ）は、ＴＩＣまたはＴＴＴの２つのコドンによってコード化され、Ｔｙｒ（Ｙ）は、ＴＡＣまたはＴＡＴによってコード化され、ｈｉｓ（Ｈ）は、ＣＡＣまたはＣＡＴによってコード化される。Ｔｒｐ（Ｗ）は、単一のコドンＴＧＧによってコード化される。したがって、特定のＩＬ−２ムテインをコードする所与のＤＮＡ配列について、そのＩＬ−２ムテインをコードする多くのＤＮＡ縮重配列が存在することが理解されよう。例えば、ムテインＨ９の好ましいＤＮＡ配列に加えて、示されているＩＬ−２ムテインをコードする多くの縮重ＤＮＡ配列が存在することが理解されよう。これらの縮重ＤＮＡ配列は、本開示の範囲内であると見なされる。したがって、本発明の文脈における「その縮重バリアント」とは、特定のムテインをコードし、それにより発現を可能にするすべてのＤＮＡ配列を意味する。
【０２９５】
ＩＬ−２ムテインの生物学的活性は、当該分野で公知の任意の適切な方法によってアッセイされ得る。そのようなアッセイには、ＰＨＡ芽球増殖およびＮＫ細胞増殖が含まれる。
【０２９６】
Ｉ．抗ＰＤ−１抗体および組み合わせ
本明細書に記載される発明および方法に従って使用するための抗ＰＤ−１抗体には、ニボルマブ、ＢＭＳ−９３６５５８、ＭＤＸ−１１０６、ＯＮＯ−４５３８、ＡＭＰ２２４、ＣＴ−０１１、およびＭＫ−３４７５（ペンブロリズマブ）、セミプリマブ（ＲＥＧＮ２８１０）、ＳＨＲ−１２１０（ＣＴＲ２０１６０１７５およびＣＴＲ２０１７００９０）、ＳＨＲ−１２１０（ＣＴＲ２０１７０２９９およびＣＴＲ２０１７０３２２）、ＪＳ−００１（ＣＴＲ２０１６０２７４）、ＩＢＩ３０８（ＣＴＲ２０１６０７３５）、ＢＧＢ−Ａ３１７（ＣＴＲ２０１６０８７２）、ならびに米国特許公開第２０１７／００８１４０９号で列挙されているＰＤ−１抗体を含むが、これらに限定されない。承認された２つの抗ＰＤ−１抗体、ペンブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標）；ＭＫ−３４７５−０３３）、およびニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標）；ＣｈｅｃｋＭａｔｅ０７８）、ならびに開発中のさらに多くのものが存在し、これらは本明細書に記載の組み合わせにおいて使用できる。例示的な抗ＰＤ−１抗体配列は図１０に示されており、これらのうちのいずれもが、本明細書に記載のＩＬ−２との併用方法において使用することができる。
【０２９７】
いくつかの実施形態では、ヒト野生型ＩＬ−２（配列番号２）に従って番号付けされた置換Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含むＩＬ−２ムテインは、抗ＰＤ−１抗体または阻害剤と組み合わせて使用される。いくつかの実施形態では、ヒト野生型ＩＬ−２（配列番号２）に従って番号付けされた置換Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含むＩＬ−２ムテインは、ニボルマブと組み合わせて使用される。いくつかの実施形態では、ヒト野生型ＩＬ−２（配列番号２）に従って番号付けされた置換Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含むＩＬ−２ムテインは、ペンブロリズマブと組み合わせて使用される。いくつかの態様では、ヒト野生型ＩＬ−２（配列番号２）に従って番号付けされた置換Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含むＩＬ−２ムテインは、セミプリマブと組み合わせて使用される。いくつかの実施形態では、ヒト野生型ＩＬ−２（配列番号２）に従って番号付けされた置換Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含むＩＬ−２ムテインは、ＢＭＳ−９３６５５８と組み合わせて使用される。いくつかの実施形態では、ヒト野生型ＩＬ−２（配列番号２）に従って番号付けされた置換Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含むＩＬ−２ムテインは、ＭＤＸ−１１０６と組み合わせて使用される。いくつかの実施形態では、ヒト野生型ＩＬ−２（配列番号２）に従って番号付けされた置換Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含むＩＬ−２ムテインは、ＯＮＯ−４５３８と組み合わせて使用される。いくつかの実施形態では、ヒト野生型ＩＬ−２（配列番号２）に従って番号付けされた置換Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含むＩＬ−２ムテインは、ＡＭＰ２２４と組み合わせて使用される。いくつかの実施形態では、ヒト野生型ＩＬ−２（配列番号２）に従って番号付けされた置換Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含むＩＬ−２ムテインは、ＣＴ−０１１と組み合わせて使用される。いくつかの実施形態では、ヒト野生型ＩＬ−２（配列番号２）に従って番号付けされた置換Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含むＩＬ−２ムテインは、ＭＫ−３４７５と組み合わせて使用される。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインはＦ４２Ａ置換をさらに含み、その番号付けは配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従う。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインはＹ４５Ａ置換をさらに含み、その番号付けは配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従う。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインはＥ６２Ａ置換をさらに含み、その番号付けは配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従う。
【０２９８】
いくつかの実施形態では、ヒト野生型ＩＬ−２（配列番号２）に従って番号付けされた置換Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含むＩＬ−２ムテインは、参照した抗体のいずれかと組み合わせて使用される。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインはＦ４２Ａ置換をさらに含み、その番号付けは配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従う。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインはＹ４５Ａ置換をさらに含み、その番号付けは配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従う。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインはさらにＥ６２Ａ置換を含み、その番号付けは配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従う。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインはＥ６２Ａ置換をさらに含み、その番号付けは配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従う。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、本明細書に開示される任意のＩＬ−２ムテインまたはバリアントである。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテイン配列は、配列番号２または配列番号６〜配列番号１０または配列番号１６のいずれか１つと９０％同一である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、５−１配列番号５；５−２配列番号６；６−６配列番号７；Ａ２配列番号８；Ｂ１配列番号９；Ｂ１１配列番号１０；Ｃ５配列番号１１；Ｄ１０配列番号１２；Ｅ１０配列番号１３；Ｇ８配列番号１４；Ｈ４配列番号１５；およびＨ９配列番号１６のいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体と組み合わせて使用されるＩＬ−２ムテインは、本明細書に記載の融合ムテインである。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体と組み合わせて使用されるＩＬ−２ムテインは、本明細書に記載の融合ムテインである。
【０２９９】
Ｊ．抗ＰＤ−Ｌ１抗体および組み合わせ
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＩＬ−２ムテインのいずれかを抗ＰＤ−１抗体と組み合わせて使用することができる。３つの承認された抗ＰＤ−Ｌ１抗体、アテゾリズマブ（ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ（登録商標）；ＭＰＤＬ３２８０Ａ）、アベルマブ（ＢＡＶＥＮＣＩＯ（登録商標）；ＭＳＢ００１０７１  ８Ｃ）、およびデュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）、ならびに開発中の他の抗ＰＤ−Ｌ１抗体が存在する。多数の抗ＰＤ−Ｌ１抗体が利用可能であり、またさらに多くのものが開発中であり、これらは本明細書に記載の抗ＩＬ−２ムテインと組み合わせて使用することができる。いくつかの実施形態において、ＰＤ−Ｌ１抗体は、米国特許公開第２０１７／０２８１７６４号、ならびに国際特許公開第ＷＯ２０１３／０７９１７４（アベルマブ）、およびＷＯ２０１０／０７７６３４（または米国特許出願第２０１６０２２２１１７号、もしくは米国特許第８，２１７，１４９号；アテゾリズマブ）に記載されるものである。いくつかの実施形態において、ＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号３４の重鎖配列、および配列番号３６の軽鎖配列（ＵＳ２０１７／２８１７６４から）を含む。いくつかの実施形態において、ＰＤ−Ｌ１抗体はアテゾリズマブ（ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ（登録商標）；ＭＰＤＬ３２８０Ａ；ＩＭｐｏｗｅｒ１１０）である。いくつかの実施形態において、ＰＤ−Ｌ１抗体はアベルマブ（ＢＡＶＥＮＣＩＯ（登録商標）；ＭＳＢ００１０７１  ８Ｃ）である。いくつかの実施形態において、ＰＤ−Ｌ１抗体はデュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）である。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１抗体は、例えば、アテゾリズマブ（ＩＭｐｏｗｅｒ１３３）、ＢＭＳ−９３６５５９／ＭＤＸ−１１０５、および／またはＲＧ−７４４６／ＭＰＤＬ３２８０Ａ、および／またはＹＷ２４３．５５．Ｓ７０、ならびに本明細書の図１１に提供される例示的な抗ＰＤ−Ｌ１抗体のいずれかを含む。いくつかの実施形態では、ヒト野生型ＩＬ−２（配列番号２）に従って番号付けされた置換Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含むＩＬ−２ムテインは、参照した抗体のいずれかと組み合わせて使用される。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインはＦ４２Ａ置換をさらに含み、その番号付けは配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従う。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインはＹ４５Ａ置換をさらに含み、その番号付けは配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従う。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインはさらにＥ６２Ａ置換を含み、その番号付けは配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従う。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインはＥ６２Ａ置換をさらに含み、その番号付けは配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従う。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、本明細書に開示される任意のＩＬ−２ムテインまたはバリアントである。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテイン配列は、配列番号２または配列番号６〜配列番号１０または配列番号１６のいずれか１つと９０％同一である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、５−１配列番号５；５−２配列番号６；６−６配列番号７；Ａ２配列番号８；Ｂ１配列番号９；Ｂ１１配列番号１０；Ｃ５配��番号１１；Ｄ１０配列番号１２；Ｅ１０配列番号１３；Ｇ８配列番号１４；Ｈ４配列番号１５；およびＨ９配列番号１６のいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わせて使用されるＩＬ−２ムテインは、本明細書に記載の融合ムテインである。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わせて使用されるＩＬ−２ムテインは、本明細書に記載の融合ムテインである。
【０３００】
Ｋ．他の免疫療法の組み合わせ
本発明の方法に従って使用するための他の抗体および／または免疫療法には、イピリムマブ、トレメリムマブなどの抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂ；ＢＭＳ−９３６５５９／ＭＤＸ−１１０５、ＭＥＤＩ４７３６、ＲＧ−７４４６／ＭＰＤＬ３２８０Ａなどの抗ＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト抗体；ＩＭＰ−３２１などの抗ＬＡＧ−３；ＣＰ−８７０，８９３、ルカツムマブ、ダセツズマブなどの抗ＣＤ４０  ｍＡｂを含む免疫刺激タンパク質を標的とするアゴニスト抗体；ＢＭＳ−６６３５１３ウレウマブ（抗４−１ＢＢ抗体；例えば、米国特許第７，２８８，６３８号および第８，９６２，８０４号を参照されたい。それらの全体は参照により本明細書に組み込まれる）などの抗ＣＤ１３７ｍＡｂ（抗４−１−ＢＢ抗体）；リリルマブ（抗ＫＩＲ  ｍＡＢ；ＩＰＨ２１０２／ＢＭＳ−９８６０１５；ＮＫ細胞阻害性受容体を阻止する）およびＰＦ−０５０８２５６６（ウトミルマブ；例えば、米国特許第８，８２１，８６７号；第８，３３７，８５０号；および第９，４６８，６７８号、ならびに国際特許出願公開第ＷＯ  ２０１２／０３２４３３号を参照されたい。それらの全体は参照により本明細書に組み込まれる）；抗ＯＸ４０  ｍＡｂ（例えば、ＷＯ２００６／０２９８７９またはＷＯ２０１０／０９６４１８を参照されたい。それらの全体は参照により本明細書に組み込まれる）；ＴＲＸ５１８などの抗ＧＩＴＲ  ｍＡｂ（例えば、米国特許第７，８１２，１３５号を参照されたい。その全体は参照により本明細書に組み込まれる）；ベリルマブＣＤＸ−１１２７などの抗ＣＤ２７  ｍＡｂ（例えば、ＷＯ２０１６／１４５０８５および米国特許公開第ＵＳ２０１１／０２７４６８５号および第ＵＳ２０１２／０２１３７７１号を参照されたい。それらの全体は参照により本明細書に組み込まれる）抗ＩＣＯＳ  ｍＡｂ（例えば、ＭＥＤＩ−５７０、ＪＴＸ−２０１１，および抗ＴＩＭ−３抗体（例えば、ＷＯ２０１３／００６４９０または米国特許公開第２０１６／０２５７７５８号を参照されたい。それらの全体は参照により本明細書に組み込まれる）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ヒト野生型ＩＬ−２（配列番号２）に従って番号付けされた置換Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含むＩＬ−２ムテインは、参照した抗体のいずれかと組み合わせて使用される。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインはＦ４２Ａ置換をさらに含み、その番号付けは配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従う。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインはＹ４５Ａ置換をさらに含み、その番号付けは配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従う。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインはさらにＥ６２Ａ置換を含み、その番号付けは配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従う。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインはＥ６２Ａ置換をさらに含み、その番号付けは配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従う。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、本明細書に開示される任意のＩＬ−２ムテインまたはバリアントである。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテイン配列は、配列番号２または配列番号６〜配列番号１０または配列番号１６のいずれか１つと９０％同一であ��。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、５−１配列番号５；５−２配列番号６；６−６配列番号７；Ａ２配列番号８；Ｂ１配列番号９；Ｂ１１配列番号１０；Ｃ５配列番号１１；Ｄ１０配列番号１２；Ｅ１０配列番号１３；Ｇ８配列番号１４；Ｈ４配列番号１５；およびＨ９配列番号１６のいずれか１つを含む。
【０３０１】
他の抗体には、前立腺癌、卵巣癌、乳癌、子宮内膜癌、多発性骨髄腫、黒色腫、リンパ腫、小細胞肺癌を含む肺癌、腎臓癌、結腸直腸癌、膵臓癌、胃癌、および脳癌に対するモノクローナル抗体も含まれる（一般的にｗｗｗ．ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖを参照されたい）。いくつかの実施形態では、ヒト野生型ＩＬ−２（配列番号２）に従って番号付けされた置換Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含むＩＬ−２ムテインは、参照した抗体のいずれかと組み合わせて使用される。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインはＦ４２Ａ置換をさらに含み、その番号付けは配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従う。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインはＹ４５Ａ置換をさらに含み、その番号付けは配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従う。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインはＥ６２Ａ置換をさらに含み、その番号付けは配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従う。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、本明細書に開示される任意のＩＬ−２ムテインまたはバリアントである。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテイン配列は、配列番号２または配列番号６〜配列番号１０または配列番号１６のいずれか１つと９０％同一である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、５−１配列番号５；５−２配列番号６；６−６配列番号７；Ａ２配列番号８；Ｂ１配列番号９；Ｂ１１配列番号１０；Ｃ５配列番号１１；Ｄ１０配列番号１２；Ｅ１０配列番号１３；Ｇ８配列番号１４；Ｈ４配列番号１５；およびＨ９配列番号１６のいずれか１つを含む。
【０３０２】
抗体には、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）用の抗体も含まれる。いくつかの実施形態では、ヒト野生型ＩＬ−２（配列番号２）に従って番号付けされた置換、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含むＩＬ−２ムテインは、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）のための抗体と組み合わせて使用される。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインはＦ４２Ａ置換をさらに含み、その番号付けは配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従う。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインはＹ４５Ａ置換をさらに含み、その番号付けは配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従う。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインはＥ６２Ａ置換をさらに含み、その番号付けは配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従う。
【０３０３】
Ｌ．治療方法
いくつかの実施形態では、対象ＩＬ−２ムテイン、および／またはそれらを発現する核酸を対象に投与して、異常アポトーシスまたは分化プロセスに関連する障害（例えば、能動免疫または受動免疫を生じることによる、例えば、癌などの細胞増殖性障害または細胞分化障害）を治療することができる。そのような疾患の治療において、開示されたＩＬ−２ムテインは、血管漏出症候群の減少などの有利な特性を有し得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、本明細書に開示される任意のＩＬ−２ムテインまたはバリアントである。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテイン配列は、配列番号２または配列番号６〜配列番号１０または配列番号１６のいずれか１つと９０％同一である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、５−１配列番号５；５−２配列番号６；６−６配列番号７；Ａ２配列番号８；Ｂ１配列番号９；Ｂ１１配列番号１０；Ｃ５配列番号１１；Ｄ１０配列番号１２；Ｅ１０配列番号１３；Ｇ８配列番号１４；Ｈ４配列番号１５；およびＨ９配列番号１６のいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインにおける置換は、配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従って番号付けされたＬ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインは融合タンパク質である。いくつかの態様では、ＩＬ−２ムテインはＣＡＲ−Ｔ構築物により関連付けられる、および／または発現される。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、腫瘍溶解性ウイルスによって発現され、および／または腫瘍溶解性ウイルスと関連している。
【０３０４】
細胞増殖および／または分化障害の例には、癌（例えば、癌腫、肉腫、転移性障害、または造血性腫瘍性障害、例えば、血病）が含まれる。転移性腫瘍は、前立腺癌、卵巣癌、乳癌、子宮内膜癌、多発性骨髄腫、黒色腫、リンパ腫、小細胞肺癌を含む肺癌、腎臓癌、肝臓癌、結腸癌、結腸直腸癌、膵臓癌、胃癌、および脳癌のものを含むがこれらに限定されない多数の原発腫瘍型から生じる可能性がある。
【０３０５】
変異体ＩＬ−２ポリペプチドを使用して、腎癌腫または黒色腫を含むあらゆる種類の癌、またはあらゆるウイルス性疾患を発症している、その発症が疑われる、または発症する危険性が高い患者を治療することができる。例示的な癌腫には、子宮頸部、肺、前立腺、乳房、頭頸部、結腸および卵巣の組織から形成されるものが含まれる。この用語には癌肉腫も含まれ、これには癌性および肉腫性組織で構成される悪性腫瘍が含まれる。
【０３０６】
増殖性疾患の追加の例には、造血性腫瘍性疾患が含まれる。
【０３０７】
あるいは、または患者への直接投与の方法に加えて、いくつかの実施形態では、変異体ＩＬ−２ポリペプチドをエクスビボ法で使用することができる。例えば、細胞（例えば、末梢血リンパ球、または患者から単離され、培養中に置かれたまたは維持されたリンパ球の精製された集団）を培養培地でインビトロで培養することができ、接触工程は、ＩＬ−２変異体を培養培地へ添加することにより影響を受ける。培養工程は、例えば、目的の抗原（例えば、癌抗原またはウイルス抗原）に反応する細胞集団の増殖を刺激するか、またはそれを拡大するために、細胞を他の薬剤で刺激または処理するさらなる工程を含むことができる。次に、細胞は処理後に患者に投与される。
【０３０８】
治療方法について本明細書で開示されるＩＬ−２ムテインと組み合わせて使用するための抗ＰＤ−１抗体には、ニボルマブ、ＢＭＳ−９３６５５８、ＭＤＸ−１１０６、ＯＮＯ−４５３８、ＡＭＰ２２４、ＣＴ−０１１、およびＭＫ−３４７５が含まれるが、これらに限定されない。
【０３０９】
いくつかの実施形態では、ヒト野生型ＩＬ−２（配列番号２）に従って番号付けされた置換Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含むＩＬ−２ムテインは、癌の治療のために抗ＰＤ−１抗体または阻害剤と組み合わせて使用される。いくつかの実施形態では、ヒト野生型ＩＬ−２（配列番号２）に従って番号付けされた置換Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含むＩＬ−２ムテインは、癌の治療のためにニボルマブと組み合わせて使用される。いくつかの実施形態では、ヒト野生型ＩＬ−２（配列番号２）に従って番号付けされた置換Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含むＩＬ−２ムテインは、癌の治療のためにＢＭＳ−９３６５５８と組み合わせて使用される。いくつかの実施形態では、ヒト野生型ＩＬ−２（配列番号２）に従って番号付けされた置換Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含むＩＬ−２ムテインは、癌の治療のためにＭＤＸ−１１０６と組み合わせて使用される。いくつかの実施形態では、ヒト野生型ＩＬ−２（配列番号２）に従って番号付けされた置換Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含むＩＬ−２ムテインは、癌の治療のためにＯＮＯ−４５３８と組み合わせて使用される。いくつかの実施形態では、ヒト野生型ＩＬ−２（配列番号２）に従って番号付けされた置換Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含むＩＬ−２ムテインは、癌の治療のためにＡＭＰ２２４と組み合わせて使用される。いくつかの実施形態では、ヒト野生型ＩＬ−２（配列番号２）に従って番号付けされた置換Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含むＩＬ−２ムテインは、癌の治療のためにＣＴ−０１１と組み合わせて使用される。いくつかの実施形態では、ヒト野生型ＩＬ−２（配列番号２）に従って番号付けされた置換Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含むＩＬ−２ムテインは、癌の治療のためにＭＫ−３４７５と組み合わせて使用される。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインはＦ４２Ａ置換をさらに含み、その番号付けは配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従う。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインはＫ４３Ｎ置換をさらに含み、その番号付けは配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従う。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインはさらにＦ４２Ａ置換を含み、その番号付けは、配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従う。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインはＹ４５Ａ置換をさらに含み、その番号付けは配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従う。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインはＥ６２Ａ置換をさらに含み、その番号付けは配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従う。
【０３１０】
いくつかの実施形態では、ヒト野生型ＩＬ−２（配列番号２）に従って番号付けされた置換Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含むＩＬ−２ムテインは、癌の治療のために、イピリムマブ、トレメリムマブなどの抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂ；ＢＭＳ−９３６５５９／ＭＤＸ−１１０５、ＭＥＤＩ４７３６、ＲＧ−７４４６／ＭＰＤＬ３２８０Ａなどの抗ＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト抗体；ＩＭＰ−３２１などの抗ＬＡＧ−３；ＣＰ−８７０，８９３、ルカツムマブ、ダセツズマブなどの抗ＣＤ４０  ｍＡｂを含む免疫刺激タンパク質を標的とするアゴニスト抗体；ＢＭＳ−６６３５１３ウレウマブ（抗４−１ＢＢ抗体；例えば、米国特許第７，２８８，６３８号および第８，９６２，８０４号を参照されたい。それらの全体は参照により本明細書に組み込まれる）などの抗ＣＤ１３７ｍＡｂ（抗４−１−ＢＢ抗体）；リリルマブ（抗ＫＩＲ  ｍＡＢ；ＩＰＨ２１０２／ＢＭＳ−９８６０１５；ＮＫ細胞阻害性受容体を阻止する）およびＰＦ−０５０８２５６６（ウトミルマブ；例えば、米国特許第８，８２１，８６７号；第８，３３７，８５０号；および第９，４６８，６７８号、ならびに国際特許出願公開第ＷＯ２０１２／０３２４３３号を参照されたい。それらの全体は参照により本明細書に組み込まれる）；抗ＯＸ４０  ｍＡｂ（例えば、ＷＯ  ２００６／０２９８７９またはＷＯ２０１０／０９６４１８を参照されたい。それらの全体は参照により本明細書に組み込まれる）；ＴＲＸ５１８などの抗ＧＩＴＲ  ｍＡｂ（例えば、米国特許第７，８１２，１３５号を参照されたい。その全体は参照により本明細書に組み込まれる）；ベリルマブＣＤＸ−１１２７などの抗ＣＤ２７  ｍＡｂ（例えば、ＷＯ２０１６／１４５０８５および米国特許公開第ＵＳ  ２０１１／０２７４６８５号および第ＵＳ２０１２／０２１３７７１号を参照されたい。それらの全体は参照により本明細書に組み込まれる）抗ＩＣＯＳ  ｍＡｂ（例えば、ＭＥＤＩ−５７０、ＪＴＸ−２０１１，および抗ＴＩＭ−３抗体（例えば、ＷＯ２０１３／００６４９０または米国特許公開第２０１６／０２５７７５８号を参照されたい。それらの全体は参照により本明細書に組み込まれる）を含むがこれらに限定されない、抗体および／または免疫療法と組み合わせて使用される。
【０３１１】
いくつかの実施形態では、ヒト野生型ＩＬ−２（配列番号２）に従って番号付けされた置換Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含むＩＬ−２ムテインは、癌の治療のために、前立腺癌、卵巣癌、乳癌、子宮内膜癌、多発性骨髄腫、黒色腫、リンパ腫、小細胞肺癌を含む肺癌、腎癌、結腸直腸癌、膵臓癌、胃癌、脳癌（一般的にｗｗｗ．ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖを参照されたい）に対するモノクローナル抗体を含むことができる別の抗体と組み合わせて使用される。
【０３１２】
いくつかの実施形態では、ヒト野生型ＩＬ−２（配列番号２）に従って番号付けされた置換、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含むＩＬ−２ムテインは、癌の治療のために、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）のための抗体（複数可）と組み合わせて使用される。
【０３１３】
Ｍ．薬学的組成物および投与方法
いくつかの実施形態では、対象ＩＬ−２ムテインおよび核酸は、薬学的組成物を含む組成物に組み込むことができる。そのような組成物は、典型的には、ポリペプチドまたは核酸分子および薬学的に許容される担体を含む。そのような組成物は、抗ＰＤ−１抗体も含むことができる。いくつかの実施形態では、組成物は、融合タンパク質である、および／またはＣＡＲ−Ｔ構築物と関連する、および／または腫瘍溶解性ウイルスによって発現されるか、もしくはそれに関連する、ＩＬ−２ムテインを含む。
【０３１４】
抗ＰＤ−１抗体およびＩＬ−２ムテインは、単一の組成物として、２つの別個の組成物として同時に、および／または２つの別個の組成物として連続的に投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体または阻害剤およびＩＬ−２ムテインは、単一の共組成物（すなわち、ともに製剤化される）として一緒に投与される。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体または阻害剤およびＩＬ−２ムテインは、２つの別個の組成物（すなわち、別個の製剤）として同時に投与される。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体または阻害剤およびＩＬ−２ムテインは、別個の組成物（すなわち、別個の製剤）として連続的に投与される。いくつかの態様では、抗ＰＤ−１抗体または阻害剤およびＩＬ−２ムテインが別個の組成物として連続的に投与される場合、抗ＰＤ−１抗体または阻害剤はＩＬ−２ムテインの前に投与される。いくつかの態様では、抗ＰＤ−１抗体または阻害剤およびＩＬ−２ムテインが別々の組成物として連続的に投与される場合、ＩＬ−２ムテインは抗ＰＤ−１抗体または阻害剤の前に投与される。いくつかの態様では、抗ＰＤ−１抗体には、ニボルマブ、ＢＭＳ−９３６５５８、ＭＤＸ−１１０６、ＯＮＯ−４５３８、ＡＭＰ２２４、ＣＴ−０１１、およびＭＫ−３４７５が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様では、ＩＬ−２ムテインは、ヒト野生型ＩＬ−２（配列番号２）に従って番号付けされた置換Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含むＩＬ−２ムテインである。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインはＦ４２Ａ置換をさらに含み、その番号付けは配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従う。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインはＫ４３Ｎ置換をさらに含み、その番号付けは配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従う。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインはＦ４２Ａ置換をさらに含み、その番号付けは配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従う。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインはＹ４５Ａ置換をさらに含み、その番号付けは配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従う。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインはＥ６２Ａ置換をさらに含み、その番号付けは配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従う。
【０３１５】
記載されている他の免疫療法薬およびＩＬ−２ムテインは、単一の組成物として、２つの別個の組成物として同時に、および／または２つの別個の組成物として連続的に投与することができる。いくつかの実施形態では、他の免疫療法薬およびＩＬ−２ムテインは、単一の共組成物（すなわち、ともに製剤化される）として一緒に投与される。いくつかの実施形態では、他の免疫療法薬およびＩＬ−２ムテインは、２つの別個の組成物（すなわち、別個の製剤）として同時に投与される。いくつかの実施形態では、他の免疫療法薬およびＩＬ−２ムテインは、別個の組成物（すなわち、別個の製剤）として連続的に投与される。いくつかの態様では、他の免疫療法薬およびＩＬ−２ムテインが別個の組成物として連続的に投与される場合、抗ＰＤ−１抗体または阻害剤はＩＬ−２ムテインの前に投与される。いくつかの態様では、他の免疫療法薬およびＩＬ−２ムテインが別々の組成物として連続的に投与される場合、ＩＬ−２ムテインは他の免疫療法薬の前に投与される。いくつかの態様では、ＩＬ−２ムテインは、ヒト野生型ＩＬ−２（配列番号２）に従って番号付けされた置換Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含むＩＬ−２ムテインである。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインはＦ４２Ａ置換をさらに含み、その番号付けは配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従う。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインはＫ４３Ｎ置換をさらに含み、その番号付けは配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従う。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインはＦ４２Ａ置換をさらに含み、その番号付けは配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従う。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインはＹ４５Ａ置換をさらに含み、その番号付けは配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従う。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインはＥ６２Ａ置換をさらに含み、その番号付けは配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従う。
【０３１６】
薬学的組成物は、その意図された投与経路に適合するように製剤化される。本発明の抗ＰＤ−１抗体および／または変異体ＩＬ−２ポリペプチドは経口投与されてもよいが、例えば、静脈内投与を含む非経口経路で投与される可能性が高い。非経口投与経路の例には、例えば、静脈内、皮内、皮下、経皮（局所）、経粘膜、および直腸投与が含まれる。非経口用途に使用される溶液または懸濁液には、次の成分：注射用水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたはその他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコールやメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの酸化防止剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などの緩衝液、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張度調整剤が含まれる。ｐＨは、一塩基性および／または二塩基性リン酸ナトリウム、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整することができる（例えば、約７．２〜７．８、例えば、７．５のｐＨに）。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ、または複数回投与用バイアルに封入できる。
【０３１７】
注射用途に適した薬学的組成物には、滅菌水溶液（水溶性の場合）、または滅菌注射溶液もしくは分散液の即時調製用の分散液および滅菌粉末が含まれる。静脈内投与の場合、適切な担体には、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。すべての場合において、組成物は無菌でなければならず、注射を容易に可能とする程度に流動性である必要がある。それは、製造および貯蔵の条件下で安定している必要があり、細菌や真菌などの微生物の汚染作用から保護する必要がある。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合は必要とされる粒子サイズの維持、および界面活性剤、例えばドデシル硫酸ナトリウムの使用により、維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。多くの場合、等張剤、例えば糖、多価アルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましいだろう。注射可能な組成物の長期吸収は、組成物中に吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることによりもたらすことができる。
【０３１８】
滅菌注射液は、必要な量の活性化合物を、必要に応じて上記に列挙した成分の１つまたは組み合わせとともに適切な溶媒に組み込み、その後ろ過滅菌することにより調製することができる。一般に、分散液は、活性化合物を滅菌ビヒクルに組み込むことにより調製され、滅菌ビヒクルは、基本的な分散媒および上に列挙したものからの必要な他の成分を含む。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより、以前に滅菌濾過されたその溶液から、活性成分および任意の追加の所望の成分の粉末が得られる。
【０３１９】
経口組成物は、使用される場合、一般に不活性希釈剤または食用担体を含む。経口治療投与の目的のために、活性化合物を賦形剤と混合し、錠剤、トローチ、またはカプセル、例えばゼラチンカプセルの形態で使用することができる。経口用組成物は、うがい薬として使用するために液体担体を使用して調製することもできる。薬学的に適合する結合剤、および／またはアジュバント材料を組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸剤、カプセル、トローチなどは、以下の成分、または類似の性質の化合物：微結晶セルロース、トラガカントゴム、ゼラチンなどの結合剤；デンプンまたはラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ（商標）、またはコーンスターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓ（商標）などの潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤；ショ糖やサッカリンなどの甘味料；ペパーミント、サリチル酸メチル、オレンジ風味などの香味料のいずれかを含むことができる。
【０３２０】
吸入による投与の場合、抗ＰＤ−１抗体および／またはＩＬ−２ムテイン、またはそれらをコードする核酸は、適切な噴射剤、例えば、二酸化炭素などの気体を含む加圧容器またはディスペンサー、またはネブライザーからエアゾールスプレーの形態で送達される。そのような方法には、米国特許第６，４６８，７９８号に記載されているものが含まれる。
【０３２１】
抗ＰＤ−１抗体および／またはＩＬ−２ムテインまたは核酸の全身投与は、経粘膜または経皮手段によるものであってもよい。経粘膜または経皮投与の場合、浸透するバリアに適した浸透剤が製剤に使用される。そのような浸透剤は一般に当技術分野で知られており、例えば、経粘膜投与の場合、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与は、鼻スプレーまたは坐剤の使用により達成することができる。経皮投与の場合、活性化合物は、当技術分野で一般的に知られているような軟膏、薬用軟膏、ゲル、またはクリームに製剤化される。
【０３２２】
いくつかの実施形態では、化合物（抗ＰＤ−１抗体および／または変異体ＩＬ−２ポリペプチドまたは核酸）は、直腸送達のために、坐薬（例えば、カカオバターおよび他のグリセリドなどの従来の坐薬基剤を伴う）または保留浣腸の形態で調製することもできる。
【０３２３】
いくつかの実施形態では、化合物（対象ＩＬ−２ムテインまたは核酸）は、ＭｃＣａｆｆｒｅｙら（Ｎａｔｕｒｅ  ４１８：６８９３，２００２），Ｘｉａら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１００６−１０１０，２００２），またはＰｕｔｎａｍ（Ａｍ．Ｊ．Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｙｓｔ．Ｐｈａｒｍ．５３：１５１−１６０，１９９６，ｅｒｒａｔｕｍ  ａｔ  Ａｍ．Ｊ．Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｙｓｔ．Ｐｈａｒｍ．５３：３２５，１９９６）に記載されている方法を含むがこれらに限定されない、当該分野において知られている方法を用いるトランスフェクションまたは感染により投与することもできる。
【０３２４】
一実施形態では、抗ＰＤ−１抗体および／またはＩＬ−２ムテインまたは核酸は、例えば、インプラントおよびマイクロカプセル化送達系を含む放出制御製剤などのように、抗ＰＤ−１抗体および／または変異体ＩＬ−２ポリペプチドが身体から迅速に排出されないように保護する担体とともに調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸などの生分解性の生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような製剤は、標準的な技術を使用して調製することができる。材料は、Ａｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｉｎｃから商業的にも入手可能である。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を用いて感染細胞に標的化されたリポソームを含む）も薬学的に許容される担体として使用可能である。これらは、例えば米国特許第４，５２２，８１１号に記載されているように、当業者に知られている方法に従って調製することができる。
【０３２５】
このような抗ＰＤ−１抗体、ＩＬ−２ムテイン、または核酸化合物の用量、毒性、および治療効果は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手法により、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％致死量）またはＥＤ５０（集団の５０％に治療効果のある用量）を決定するために、決定することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比が治療指数であり、これは、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表すことができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。有毒な副作用を示す化合物を使用してもよいが、感染していない細胞への潜在的な損傷を最小限に抑え、それにより副作用を減らすために、そのような化合物を罹患組織の部位に標的化する送達系を設計するように注意する必要がある。
【０３２６】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトでの使用のための投与量範囲を策定する際に使用することができる。かかる化合物の用量は、毒性がほとんどまたは全くないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にあることが好ましい。投与量は、用いられる投与剤形および利用される投与経路に応じて、この範囲内で変化し得る。本発明の方法において使用される任意の化合物について、治療的有効量は、最初に細胞培養アッセイから推定することができる。細胞培養において決定されるような  ＩＣ５０（すなわち、症状の最大半量の阻害に到達する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように、用量を動物モデルで策定することができる。かかる情報を使用して、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定され得る。
【０３２７】
本明細書で定義されるように、対象ＩＬ−２ムテインの治療的有効量（すなわち、有効用量）および／または抗ＰＤ−１抗体または阻害剤は、選択されたポリペプチドまたは抗体に依存する。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ムテインの単回投与量は、投与され得る患者の体重１ｋｇあたり約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜０．１ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体または阻害剤の単回投与量は、投与され得る患者の体重１ｋｇあたり約１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、または約５ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇ、または約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。いくつかの実施形態では、約０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０２５ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ、１０．０ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ−１抗体または阻害剤および／またはＩＬ−２ムテインの用量が投与できる。いくつかの実施形態では、６００，０００ＩＵ／ｋｇが投与される（ＩＵは、リンパ球増殖バイオアッセイによって決定でき、インターロイキン−２（ヒト）について世界保健機構の第１の国際標準によって確立された国際単位（ＩＵ）で表される）。投与量は、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）について処方された量と同等であり得るが、それよりも少ないことが予想される。組成物は、１日おきに１回を含む、１日に１回以上〜週に１回以上投与することができる。当業者は、疾患または障害の重症度、以前の治療、対象の一般的な健康および／または年齢、および存在する他の疾患を含むがこれらに限定されない、特定の因子が対象を効果的に治療するために必要な用量およびタイミングに影響を及ぼし得ることを理解するであろう。さらに、治療的有効量の対象ＩＬ−２ムテインによる対象の治療は、単一の治療を含むことができ、または一連の治療を含むことができる。一実施形態では、組成物は８時間ごとに５日間投与され、その後２〜１４日間、例えば９日間の休薬期間が続き、その後８時間ごとにさらに５日間の投与が続く。いくつかの実施形態では、投与は４日ごとに３回投与される。
【０３２８】
薬学的組成物は、投与のための説明書とともに容器、パック、またはディスペンサー内に含めることができる。
【０３２９】
以下の実施例は、本明細書で提供される本発明の特定の実施形態を説明するために提供され、限定するものとして解釈されるべきではない。
例示的な実施形態
１．癌を治療する方法であって、
（ｉ）抗ＰＤ−１抗体もしくは阻害剤、または抗ＰＤ−Ｌ１抗体もしくは阻害剤と、
（ｉｉ）以下のアミノ酸置換、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含むＩＬ−２ムテインであって、その番号付けが、配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従う、ＩＬ−２ムテインと、を含む、併用治療を投与することを含む、方法。
２．前記抗ＰＤ−１抗体もしくは阻害剤が、ニボルマブ、ＢＭＳ−９３６５５８、ＭＤＸ−１１０６、ＯＮＯ−４５３８、ＡＭＰ２２４、ＣＴ−０１１、およびＭＫ−３４７５（ペンブロリズマブ）、セミプリマブ（ＲＥＧＮ２８１０）、ＳＨＲ−１２１０（ＣＴＲ２０１６０１７５およびＣＴＲ２０１７００９０）、ＳＨＲ−１２１０（ＣＴＲ２０１７０２９９およびＣＴＲ２０１７０３２２）、ＪＳ−００１（ＣＴＲ２０１６０２７４）、ＩＢＩ３０８（ＣＴＲ２０１６０７３５）、ＢＧＢ−Ａ３１７（ＣＴＲ２０１６０８７２）、および米国特許公開第２０１７／００８１４０９号で列挙されているＰＤ−１抗体からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
３．前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体もしくは阻害剤が、アテゾリズマブ、アベルマブ、およびデュルバルマブからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
４．前記ＩＬ−２ムテインが、Ｆ４２Ａ置換をさらに含み、その番号付けが、配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従う、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
５．前記ＩＬ−２ムテインが、Ｋ４３Ｎ置換をさらに含み、その番号付けが、配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従う、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
６．前記ＩＬ−２ムテインが、Ｆ４２Ａ置換をさらに含み、その番号付けが、配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従う、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
７．前記ＩＬ−２ムテインが、Ｙ４５Ａ置換をさらに含み、その番号付けが、配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従う、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
８．前記ＩＬ−２ムテインが、Ｅ６２Ａ置換をさらに含み、その番号付けが、配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従う、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
９．前記ＩＬ−２ムテインが融合タンパク質である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
１０．前記融合タンパク質が、Ｆｃ抗体断片に連結された前記ＩＬ−２を含む、請求項９に記載の方法。
１１．前記Ｆｃ抗体断片が、ヒトＦｃ抗体断片である、請求項１０に記載の方法。
１２．前記Ｆｃ抗体断片が、Ｎ２９７Ａ置換を含む、請求項１０に記載の方法。
１３．前記融合タンパク質が、アルブミンに連結された前記ＩＬ−２を含む、請求項９に記載の方法。
１４．前記癌が、前立腺癌、卵巣癌、乳癌、子宮内膜癌、多発性骨髄腫、黒色腫、リンパ腫、小細胞肺癌を含む肺癌、腎臓癌、肝臓癌、結腸癌、結腸直腸癌、膵臓癌、胃癌、および脳癌からなる群から選択される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
１５．前記癌が、結腸癌である、請求項１４に記載の方法。
１６．前記ＩＬ−２ムテインが、野生型ヒトＩＬ−２と比較して、ＩＬ−２Ｒβに対して増加した結合能力を示す、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
１７．前記ＩＬ−２ムテインが、野生型ヒトＩＬ−２と比較して、ＩＬ−２Ｒβに対してより高い結合親和性を示す、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
１８．前記ＩＬ−２ムテインが、野生型ヒトＩＬ−２と比較して、ＣＤ２５に対して減少した結合親和性を示す、請求項４〜８のいずれか１項に記載の方法。
１９．抗ＰＤ−１抗体または阻害剤と、請求項１〜１３または１６〜１８のいずれかに記載のＩＬ−２ムテインと、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物。
２０．インターロイキン−２受容体β（ＩＬ−２Ｒβ）結合タンパク質を含む免疫細胞標的化または発現構築物であって、前述の結合タンパク質のＩＬ−２Ｒβの平衡解離定数が、野生型ヒトＩＬ−２（ｈＩＬ−２）のものよりも小さく、少なくとも１つの他の標的化部分を含む免疫細胞標的化または発現構築物に連結されている、免疫細胞標的化または発現構築物。
２１．前記免疫細胞標的化または発現構築物が、Ｔ細胞、例えばＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞に対して細胞傷害性効果を示す、請求項２０に記載の構築物。
２２．前記構築物が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であり、前記ＩＬ−２ムテインが、膜貫通ドメインに融合され、細胞内シグナル伝達領域に連結されている、請求項２０〜２１のいずれか１項に記載の構築物。
２３．前記細胞内シグナル伝達領域がＣＤ３シグナル伝達ドメインを含む、請求項２２に記載の構築物。
２４．前記細胞内シグナル伝達領域が、ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン、ＣＤ１３７シグナル伝達ドメイン、ＯＸ−４０シグナル伝達ドメイン、ＩＣＯＳシグナル伝達ドメイン、ＤＡＰ１０シグナル伝達ドメインのうちの１つ以上を含む、請求項２３に記載の構築物。
２５．前記構築物が、Ｔ細胞抗原連結体（ＴＡＣ）であり、前記ＩＬ−２ムテインまたは他の標的化部分が、ＴＣＲ複合体に関連するタンパク質に結合するリガンドに融合され；Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインポリペプチドに融合されている、請求項２１に記載の構築物。
２６．前記ＴＣＲ複合体に関連する前記タンパク質が、ＣＤ３である、請求項２５に記載の構築物。
２７．前記Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインポリペプチドが、ＣＤ４細胞質ゾルドメインおよびＣＤ４膜貫通ドメインを含む、請求項２６に記載の構築物。
２８．前記構築物が、ＩＬ−２ムテインまたは他の標的化部分に高親和性で結合するキメラ抗原受容体成分を含む、抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）である、請求項２０に記載の構築物。
２９．前記ＣＡＲ成分が、ＣＤ１６を含み、前記ＩＬ−２ムテインが、Ｆｃ配列に融合している、請求項２０に記載の構築物。
３０．前記構築物が、Ｔ細胞受容体の成分に結合する抗体の可変領域に融合したＩＬ−２ムテインまたは他の標的化部分を含む、二重特異性Ｔ細胞交換体（ＢｉＴＥ）である、請求項２０に記載の構築物。
３１．前記Ｔ細胞受容体のＢｉＴＥ成分が、ＣＤ３である、請求項３０に記載の構築物。
３２．ＩＬ−２Ｒβ結合タンパク質が、野生型ｈＩＬ−２に従って番号付けされた以下のアミノ酸置換：Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含む、請求項３１に記載の構築物。
３３．請求項２０〜３２のいずれか１項に記載の構築物をコードする、核酸。
３４．請求項３３に記載の核酸構築物を含む、ベクター。
３５．請求項３３に記載の構築物または請求項３４に記載のベクターを含む、Ｔ細胞。
３６．請求項３３に記載の構築物または請求項３４に記載のベクターを含む、ＮＫ細胞。
３７．Ｔ細胞がＣＤ４＋Ｔ細胞である、請求項３５に記載のＴ細胞。
３８．Ｔ細胞がＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項３５に記載のＴ細胞。
３９．請求項３５または請求項３６に記載の免疫細胞の単離された集団。
４０．請求項３９に記載の免疫細胞集団を含む薬学的製剤。
４１．ＩＬ−２受容体を発現する細胞を含む癌細胞を標的化する方法であって、細胞を請求項４０に記載の製剤と接触させることを含む、方法。
４２．前記接触がインビトロである、請求項４１に記載の方法。
４３．前記接触がインビボである、請求項４１に記載の方法。
４４．癌を治療する方法であって、癌を有する個体を請求項４０に記載の製剤の有効量と接触させることを含む、方法。
４５．前記癌が、白血病、リンパ腫、膠芽腫、髄芽腫、乳癌、頭頸部癌、腎臓癌、卵巣癌、カポジ肉腫、急性骨髄性白血病、Ｂ系列悪性腫瘍、結腸直腸、膵臓、腎臓、または中皮腫である、請求項４４に記載の方法。
４６．癌細胞をＩＬ−２ムテイン腫瘍溶解性ウイルスの組み合わせと接触させることを含む、ＩＬ−２ムテインタンパク質を癌細胞に対して標的化するための方法であって、その組み合わせが、腫瘍溶解性ウイルスにコンジュゲートされるか、またはそれにより発現されるＩＬ−２ムテインを含み、その腫瘍溶解性ウイルスが、癌細胞を標的化することができる、方法。
４７．前記接触がインビトロで起こる、請求項４６に記載の方法。
４８．前記接触がインビボで起こる、請求項４６に記載の方法。
４９．前記腫瘍溶解性ウイルスが、アデノウイルス、自己複製アルファウイルス、ワクシニアウイルス、セネカバレー（Ｓｅｎｅｃａ  Ｖａｌｌｅｙ）ウイルス、ニューカッスル（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ）病ウイルス、マラバ（Ｍａｒａｂａ）ウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２を含む）、麻疹ウイルス、ポリオウイルス、レオウイルス、コクサッキー（ｃｏｘｓａｃｋｉｅ）ウイルス、レンチウイルス、モルビリウイルス、インフルエンザウイルス、シンビス（Ｓｉｎｂｉｓ）ウイルス、粘液腫ウイルス、およびレトロウイルスからなる群から選択される、請求項４６〜４８のいずれか１項に記載の方法。
５０．前記ワクシニアウイルスゲノムが、チミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ）遺伝子における置換および／または部分的に欠失したチミジンキナーゼ遺伝子を提供する少なくとも１つのヌクレオチドの欠失を切除するオープンリーディングフレームによって不活性化されるチミジンキナーゼ遺伝子を含み、ワクシニア成長因子遺伝子は欠失しており、改変されたワクシニアウイルスベクターは、本明細書に記載のＩＬ−２ムテインをコードする少なくとも１つの核酸配列を含む、請求項４７に記載の方法。
５１．前記インビボ接触により、腫瘍溶解性ウイルスにコンジュゲートしていないＩＬ−２ムテインタンパク質の濃度と比較して、腫瘍微小環境におけるＩＬ−２ムテインタンパク質の濃度の増大が生じる、請求項４８に記載の方法。
５２．前記改変された腫瘍溶解性ウイルスが、治療上の利点を改善するために、ＩＬ−２ムテインを、腫瘍関連マクロファージおよびＭＤＳＣ（骨髄由来サプレッサー細胞）などの腫瘍微小環境（ＴＭＥ）の免疫抑制細胞に対して標的化する、請求項４６または４８〜５１のいずれか１項に記載の方法。
５３．前記改変された腫瘍溶解性ウイルスが、ＩＬ−２ムテインを１つ以上の腫瘍抗原を発現する１つ以上の免疫抑制細胞に対して標的化する、請求項４６または４８〜５２のいずれか１項に記載の方法。
５４．前記改変された腫瘍溶解性ウイルスが、ＩＬ−２ムテインをＴＭＥに対して標的化する、請求項４６または４８〜５３のいずれか１項に記載の方法。
５５．前記ＩＬ−２ムテインタンパク質がエフェクターＴ細胞および／またはＮＫ細胞を増強する、請求項４６または４８〜５４のいずれか１項に記載の方法。
５６．前記ＩＬ−２ムテインがＴｒｅｇ活性を抑制する、請求項４６または４８〜５５のいずれか１項に記載の方法。
５７．前記ＩＬ−２が、以下のアミノ酸置換、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含み、その番号付けは配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従う、請求項４６または４８〜５６のいずれか１項に記載の方法。
５８．ベクターがワクシニアウイルスゲノムを含み、そのチミジンキナーゼ遺伝子が、チミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ）遺伝子における置換および／または部分的に欠失したチミジンキナーゼ遺伝子を提供する少なくとも１つのヌクレオチドの欠失を切除するオープンリーディングフレームによって不活性化され、ワクシニア成長因子遺伝子が欠失しており、改変されたワクシニアウイルスベクターが、本明細書に記載のＩＬ−２ムテインをコードする少なくとも１つの核酸配列を含む、という点を特徴とする、改変されたワクシニアウイルスベクター。
５９．（ｉ）コードされたＥ１Ａポリペプチドのアミノ酸１２２〜１２９をコードするヌクレオチドが場合により欠失された改変された核酸と、（ｉｉ）本明細書に記載のＩＬ−２ムテインをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットと、を含む、改変された腫瘍溶解性アデノウイルス。
６０．前記ＩＬ−２ムテインが、治療上の利点を改善するために、改変された腫瘍溶解性ウイルスを、腫瘍関連マクロファージおよびＭＤＳＣ（骨髄由来サプレッサー細胞）などの腫瘍微小環境（ＴＭＥ）の免疫抑制細胞に指向させる、請求項５８または請求項５９に記載の改変されたウイルス。
６１．前記ＩＬ−２ムテインタンパク質が、改変された腫瘍溶解性ウイルスを１つ以上の腫瘍抗原に指向させる、請求項５８または請求項５９に記載の改変されたウイルス。
６２．前記ＩＬ−２ムテインタンパク質が、改変された腫瘍溶解性ウイルスをＴＭＥに指向させる、請求項５８または請求項５９に記載の改変されたウイルス。
６３．前記ＩＬ−２ムテインタンパク質が、エフェクターＴ細胞およびＮＫ細胞を増強する、請求項５８または請求項５９に記載の改変されたウイルス。
６４．前記ＩＬ−２ムテインが、Ｔｒｅｇ活性を抑制する、請求項５８または請求項５９に記載の改変されたウイルス。
６５．ＩＬ−２ムテインを発現することができるおよび腫瘍溶解性ウイルスを、それらを必要とする対象に投与することを含む、癌を治療する方法。
６６．前記ＩＬ−２ムテインが、以下のアミノ酸置換、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを含み、その番号付けが配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従う、請求項６５に記載の方法。
６７．前記腫瘍溶解性ウイルスが、アデノウイルス、自己複製アルファウイルス、ワクシニアウイルス、セネカバレーウイルス、ニューカッスル病ウイルス、マラバウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２を含む）、麻疹ウイルス、ポリオウイルス、レオウイルス、コクサッキーウイルス、レンチウイルス、モルビリウイルス、インフルエンザウイルス、シンビスウイルス、粘液腫ウイルス、およびレトロウイルスからなる群より選択される、請求項６５〜６６のいずれか１項に記載の方法。
【実施例】
【０３３０】
実施例１：Ｈ９は、マウスＭＣ３８結腸癌モデルにおいて抗ＰＤ−１免疫療法と相乗作用する。
この実施例は、併用療法が用量依存的に強固な応答もたらすことを示すデータを提供する。
【０３３１】
以下の表１１は、この実施例で使用されるＨ９  ＩＬ−２ムテインについての置換マトリックスを示す。
【表１１】
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【０３３２】
抗ＰＤ−１抗体を１０ｍｇ／ｋｇで、４日ごとに３回（１０ｍｇ／ｋｇ  ＩＶ  ｑ４ｄｘ３）、静脈内投与した。Ｈ９（アミノ酸置換、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、およびＩ９２Ｆを有するＩＬ−２ムテイン、その番号付けは配列番号２の野生型ヒトＩＬ−２に従う）を、５μｇｑ．ｄ．または２５μｇｑ．ｄ．の示された投与量（投与量はμｇ／マウス）で、同じ投与レジメンに従って、投与した。次に、ＭＣ３８結腸癌モデルマウスを腫瘍移植後最大４０日間監視した。抗ＰＤ−１抗体とＨ９の組み合わせにより、低投与量と高投与量の両方で治癒マウスの数が増加し、Ｈ９の２５ｕｇｑ．ｄの投与量で実質的に増加した。
【０３３３】
図１のデータで提供されているように、Ｈ９および抗ＰＤ−１は限られた効能のみをもたらす。しかし、併用療法は、ほとんどのマウスを十分に寛容性のあるＨ９用量で治癒するのに十分である。組み合わせの効能の増加は、新たな毒性または毒性の増加をもたらさなかった。
【０３３４】
上記の実施例は、当業者に本発明の組成物、システム、および方法の実施形態をどのように作製および使用するかについての完全な開示および説明を与えるために提供されており、そして本発明者らが自分たちの発明とみなすものの範囲を限定することは意図されていない。当業者に明らかである本発明を実施するための上記の様式の修正は、添付の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。本明細書中で言及されている全ての特許および刊行物は、本発明が関係する当業者の技術水準を示している。本開示において引用された全ての参考文献は、あたかも各参考文献が参照によりその全体が個別に組み込まれているのと同程度に参照により組み込まれる。
【０３３５】
全ての見出しおよびセクションの指定は、明確さおよび参照目的のためだけに使用されているにすぎず、決して限定的であるとみなされるべきではない。例えば、当業者は、本明細書に記載の本発明の趣旨および範囲に従って、必要に応じて異なる見出しおよびセクションからの様々な態様を組み合わせることの有用性を認識するであろう。
【０３３６】
本明細書に引用された全ての参考文献は、あたかも各個々の刊行物または特許または特許出願が全ての目的のためにその全体が参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されるのと同程度にそれらの全体が全ての目的のために本明細書に参照により組み込まれる。
【０３３７】
当業者には明らかなように、本出願の趣旨および範囲から逸脱することなく、本出願の多くの修正および変形をなすことができる。本明細書に記載された特定の実施形態および実施例は例としてのみ提供され、特許請求の範囲が権利を与えられる同等物の全範囲とともに、添付の特許請求の範囲の用語によってのみ限定されるべきである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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