(57)【要約】  向上した効率をもって腫瘍細胞のような標的細胞中の後期エンドソーム及び／又はリソソームに細胞傷害性薬物又は画像化標識のようなカーゴ分子を送達するように改変されたエンドリソソーム標的化コンジュゲートを説明する。該エンドリソソーム標的化コンジュゲートは標的化成分及カーゴ成分を含む。前記標的化成分は標的細胞の細胞表面分子に結合するように構成され、前記カーゴ成分はカーゴ分子を含む。前記標的化成分及びカーゴ成分は共有結合により融合しているか、あるいは、非共有結合により会合している場合がある。前記標的化成分は、標的細胞のエンドリソソーム区画におけるより高い親和性で細胞外空間において細胞表面分子又はカーゴ成分に結合する場合がある。【選択図】図１
2020518240.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンドリソソーム標的化コンジュゲートであって、
抗体、抗体フラグメント、抗体ドメイン、ナノボディー、タンパク質、タンパク質フラグメント又はタンパク質ドメインを含む標的化成分であって、ここで該標的化成分は標的細胞のエンドリソソーム区画内より低い解離定数で細胞外空間において標的細胞の細胞表面分子に結合するように構成されている、標的化成分と、
抗体、抗体フラグメント、抗体ドメイン、ナノボディー、タンパク質、タンパク質フラグメント又はタンパク質ドメインにコンジュゲート化されたカーゴ分子を含む、カーゴ成分と
を含み、
ここで前記標的化成分は前記カーゴ成分に直接又は間接的に融合しており、
前記標的化成分は、エンドリソソーム区画に進入すると細胞表面分子から解離するように構成されており、そして
前記エンドリソソーム標的化コンジュゲートは、前記標的細胞のエンドリソソーム区画に前記カーゴ分子を送達するように構成されている、エンドリソソーム標的化複合体。
【請求項２】
前記標的化成分は、５００ｎＭ未満の解離定数で細胞外空間において細胞表面分子に結合するように構成される、抗体、抗体フラグメント、抗体ドメイン又はナノボディーを含む、請求項１に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項３】
前記標的化成分は、酸性エンドリソソームｐＨにおけるより低い解離定数で中性近辺のｐＨにおいて細胞表面分子に結合するように構成される、抗体、抗体フラグメント、抗体ドメイン又はナノボディーを含む、請求項１に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項４】
前記中性近辺のｐＨは約ｐＨ６．８から約ｐＨ７．５までであり、前記酸性エンドリソソームｐＨが約ｐＨ５．０から約ｐＨ６．５までである、請求項３に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項５】
前記標的化成分は、エンドリソソームＣａ２＋濃度におけるより低い解離定数で細胞外Ｃａ２＋濃度において細胞表面分子に結合するように構成される、抗体、抗体フラグメント、抗体ドメイン又はナノボディーを含む、請求項１に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項６】
前記細胞外Ｃａ２＋濃度は約２ｍＭであり、前記エンドリソソームＣａ２＋濃度は約２μＭである、請求項５に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項７】
前記標的化成分は５００ｎＭ未満の解離定数で細胞外空間において細胞表面分子に結合するように構成される、タンパク質、タンパク質フラグメント又はタンパク質ドメインを含む、請求項１に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項８】
前記標的化成分は、酸性エンドリソソームｐＨにおけるより低い解離定数で中性近辺のｐＨにおいて細胞表面分子に結合するように構成される、タンパク質、タンパク質フラグメント又はタンパク質ドメインである、請求項１に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項９】
前記中性近辺のｐＨは約ｐＨ６．８から約ｐＨ７．５までであり、前記酸性エンドリソソームｐＨは約ｐＨ５．０から約ｐＨ６．５までである、請求項８に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項１０】
前記標的化成分は、エンドリソソームＣａ２＋濃度におけるより低い解離定数で細胞外Ｃａ２＋濃度において細胞表面分子に結合するように構成される、タンパク質、タンパク質フラグメント又はタンパク質ドメインを含む、請求項１に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項１１】
前記細胞外Ｃａ２＋濃度は約２ｍＭであり、前記エンドリソソームＣａ２＋濃度は約２μＭである、請求項１０に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項１２】
前記カーゴ成分は、抗体Ｆｃ領域又は抗体Ｆｃフラグメントのドメインを含む、抗体、抗体フラグメント又は抗体ドメインを含む、請求項１に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項１３】
前記抗体Ｆｃ領域又は抗体ＦｃフラグメントのドメインはヒトＩｇＧ１に由来する、請求項１２に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項１４】
前記カーゴ成分はアルブミン分子又はアルブミンのドメインを含む、請求項１に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項１５】
前記標的化成分はＨＥＲ２特異的抗体のＦａｂフラグメント又はｓｃＦｖフラグメントを含み、ここで該Ｆａｂフラグメント又はｓｃＦｖフラグメントの重鎖可変ドメインは、Ｓｅｒ５５のヒスチジンへの突然変異及びＧｌｙ５７のグルタミン酸への突然変異を有する、請求項３に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項１６】
前記標的化成分はＨＥＲ２特異的抗体のＦａｂフラグメント又はｓｃＦｖフラグメントを含み、ここで該Ｆａｂフラグメント又はｓｃＦｖフラグメントにおいて重鎖可変ドメインはＳｅｒ１０３のヒスチジンへの突然変異を有し、軽鎖可変ドメインはＴｙｒ５５のヒスチジンへの突然変異を有する、請求項３に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項１７】
少なくとも第１標的化成分及び第２標的化成分を含み、ここで第１標的化成分は第２標的化成分と異なる細胞表面分子に結合するように構成されている、請求項１に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項１８】
第１及び第２標的化成分は２本の免疫グロブリンＦｃフラグメントのヘテロダイマーに融合している、請求項１７に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項１９】
前記標的化成分はホスファチジルセリン結合タンパク質を含み、前記標的細胞は細胞表面上にホスファチジルセリンを有する細胞である、請求項１に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項２０】
前記ホスファチジルセリン結合タンパク質は、ＡｎｘＡ１のコアドメイン、Ｓｙｔ１のＣ２Ａドメイン及びＰＫＣαのＣ２ドメインからなる群より選ばれる、請求項１９に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項２１】
前記ホスファチジルセリン結合タンパク質はＳｙｔ１のＣ２Ａドメインである、請求項２０に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項２２】
前記標的化成分は２個のＳｙｔ１のＣ２Ａドメインを含む、請求項２１に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項２３】
前記標的化成分は４個のＳｙｔ１のＣ２Ａドメインを含む、請求項２１に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項２４】
前記標的化成分は４個より多いＳｙｔ１のＣ２Ａドメインを含む、請求項２１に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項２５】
前記標的化成分はホスファチジルセリン結合タンパク質を含み、
前記カーゴ成分はヒトＩｇＧ１のＦｃ部分を含み、そして
前記標的化成分はリンカータンパク質によりカーゴ成分に共有結合的に融合している、請求項１９に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項２６】
前記リンカータンパク質はＧｌｙ４Ｓｅｒリンカーである、請求項２５に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項２７】
前記カーゴ分子は細胞傷害性薬物である請求項１に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項２８】
前記細胞傷害性薬物はＭＭＡＥである、請求項２７に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項２９】
前記カーゴ分子は画像化標識である、請求項１に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項３０】
エンドリソソーム標的化コンジュゲートであって、
抗体、抗体フラグメント、抗体ドメイン、ナノボディー、タンパク質、タンパク質フラグメント又はタンパク質ドメインを含む標的化成分であって、ここで該標的化成分は標的細胞の細胞表面分子に結合するように構成されている標的化成分と、
抗体、抗体フラグメント、抗体ドメイン、ナノボディー、タンパク質、タンパク質フラグメント又はタンパク質ドメインにコンジュゲート化されたカーゴ分子を含むカーゴ成分と
を含み、
ここで前記標的化成分は標的細胞のエンドリソソーム区画内におけるより低い解離定数で細胞外空間においてカーゴ成分に結合するように構成されており、
前記標的化成分は、エンドリソソーム区画に進入すると細胞表面分子から解離するように構成されており、そして
前記エンドリソソーム標的化コンジュゲートは、標的細胞のエンドリソソーム区画にカーゴ分子を送達するように構成されている、エンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項３１】
前記標的化成分は酸性エンドソームｐＨにおけるより低い解離定数で中性近辺のｐＨにおいてカーゴ区画に結合するように構成されている、請求項３０に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項３２】
前記中性近辺のｐＨは約ｐＨ６．８から約ｐＨ７．５までであり、前記酸性エンドリソソームｐＨは約ｐＨ５．０から約ｐＨ６．５までである、請求項３１に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項３３】
前記標的化成分はエンドリソソームＣａ２＋濃度におけるより低い解離定数で細胞外Ｃａ２＋濃度においてカーゴ成分に結合するように構成されている、請求項３０に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項３４】
前記細胞外Ｃａ２＋濃度は約２ｍＭであり、前記エンドリソソームＣａ２＋濃度は約２μＭである、請求項３３に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項３５】
前記標的化成分はカルビンジンＤ９Ｋドメイン２を含み、前記カーゴ成分はカルビンジンＤ９Ｋドメイン１を含む、請求項３３に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項３６】
カルビンジンＤ９Ｋドメイン１がリンカーペプチドによりカーゴ成分に融合している、及び／又は、カルビンジンＤ９Ｋドメイン２がリンカーペプチドにより標的化成分に融合している、請求項３５に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項３７】
前記カーゴ分子は細胞傷害性薬物である、請求項３０に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項３８】
前記細胞傷害性薬物はＭＭＡＥである、請求項３７に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項３９】
前記カーゴ分子は画像化標識である、請求項３０に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項４０】
請求項１又は請求項３０に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲートと、医薬上許容され得るビヒクルとを含む、組成物。
【請求項４１】
癌の処置方法であって、
有効用量の請求項４０の組成物を患者に投与することを含み、
ここで
カーゴ分子は細胞傷害性薬物であり、そして
前記組成物の投与は患者における腫瘍の成長を抑制する、
癌の処置方法。
【請求項４２】
前記組成物は、１つ以上のタイプの標的細胞を含む腫瘍を標的とするように構成される、少なくとも１種のエンドリソソーム標的化コンジュゲートを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
患者における腫瘍の画像化方法であって、
有効用量の請求項４０の組成物を患者に投与する段階であって、ここでカーゴ分子は画像化標識である、段階と、
前記患者において前記画像化標識を検出するのに適した画像化方法を実施する段階と
を含み、ここで
前記組成物の投与は、前記画像化方法により検出可能な画像化標識の十分な濃度を与える、
患者における腫瘍の画像化方法。
【請求項４４】
癌の処置のためのエンドリソソーム標的化コンジュゲートを与える方法であって、
請求項１の標的化成分を選択する段階であって、ここで該標的化成分は、選ばれたタイプの腫瘍標的細胞上の細胞表面分子に選択的に結合するように構成される、抗体、抗体フラグメント、抗体ドメイン、ナノボディー、タンパク質、タンパク質フラグメント又はタンパク質ドメインを含み、ここで前記標的化成分は、エンドリソソーム区画におけるより低い解離定数で細胞外空間において細胞表面分子に結合するように構成されている、段階
と、
請求項１のカーゴ成分を選択する段階であって、ここでカーゴ分子は、選ばれたタイプの腫瘍標的細胞の成長を抑制するための薬効を有する、細胞傷害性薬物を含む、段階と、
前記カーゴ成分に直接又は間接的に融合した前記標的化成分を含む、エンドリソソーム標的化コンジュゲートを与える段階と
を含む、方法。
【請求項４５】
癌の処置のためのエンドリソソーム標的化コンジュゲートを与える方法であって、
請求項３０の標的化成分を選択する段階であって、ここで該標的化成分は、選ばれたタイプの腫瘍標的細胞上の細胞表面分子に選択的に結合するように構成される、抗体、抗体フラグメント、ナノボディー、タンパク質、タンパク質フラグメント又はタンパク質ドメインを含む、段階と、
請求項３０のカーゴ成分を選択する段階であって、ここでカーゴ分子は、選ばれたタイプの腫瘍標的細胞の成長を抑制するための薬効を有する、細胞傷害性薬物を含む、段階とを含み、ここで
前記標的化成分は第１のタンパク質ドメインをさらに含むように改変され、
前記カーゴ成分は第２のタンパク質ドメインをさらに含むように改変され、そして
第１のタンパク質ドメインは、エンドリソソーム区画におけるより低い解離定数で細胞外空間において第２のドメインに結合するように構成されている、
方法。
【請求項４６】
前記カーゴ成分は２本の免疫グロブリンＦｃフラグメントのダイマーを含む、請求項１又は３０に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項４７】
前記カーゴ分子は、ペプチドリンカーにより、又は、化学的コンジュゲート化反応を介して、抗体フラグメント、抗体ドメイン、ナノボディー、タンパク質、タンパク質フラグメント又はタンパク質ドメインにコンジュゲート化されている、請求項１又は３０に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項４８】
前記画像化標識は、放射性標識か、蛍光又は近赤外標識かである、請求項１又は３０に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項４９】
前記標的化成分のＮ末端がカーゴ成分のＣ末端に融合している、請求項１又は３０に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項５０】
前記標的化成分のＣ末端がカーゴ成分のＮ末端に融合している、請求項１又は３０に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項５１】
前記標的化成分がカーゴ成分の非末端位置においてカーゴ成分に融合している、請求項１又は３０に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項５２】
前記カーゴ成分は免疫グロブリンＦｃフラグメントを含み、そして
前記標的化成分はカーゴ成分の免疫グロブリンＦｃフラグメントに、免疫グロブリンＦｃフラグメントのヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインのＮ末端又はＣ末端において融合している、
請求項１又は３０に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項５３】
前記標的化成分は、ヒト表皮成長因子受容体２に結合するように構成される、抗体、抗体フラグメント、抗体ドメイン又はナノボディーを含む、請求項１又は３０に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項５４】
前記標的化成分は、前立腺特異的膜抗原に結合するように構成される、抗体、抗体フラグメント、抗体ドメイン又はナノボディーを含む、請求項１又は３０に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項５５】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８又はそれらの相同体の少なくとも１つのアミノ酸配列を有する、１個以上のタンパク質を含む、請求項１又は３０に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項５６】
配列番号２及び配列番号４か、配列番号６及び配列８か、配列番号４２及び配列番号４４か、配列番号４６及び配列番号４８か、それらの相同体かのアミノ酸配列を有するタンパク質のヘテロダイマーを含む、請求項１又は３０に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項５７】
配列番号１８及び配列番号２０及び配列番号２２か、配列番号２２及び配列番号２４及び配列番号２６か、それらの相同体かのアミノ酸配列を有するタンパク質のヘテロトリマーを含む、請求項１又は３０に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項５８】
前記標的化成分は、酸性ｐＨにおいて１．５μＭより高い解離定数で細胞表面分子に結合するように構成される、抗体、抗体フラグメント、抗体ドメイン又はナノボディーを含む、請求項１に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項５９】
前記酸性ｐＨは約５．８である、請求項５８に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項６０】
前記標的化成分は、酸性ｐＨにおいて１．５μＭより高い解離定数で細胞表面分子に結合するように構成される、タンパク質、タンパク質フラグメント又はタンパク質ドメインを含む、請求項１に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項６１】
前記酸性ｐＨは約５．８である、請求項６０に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項６２】
前記標的化成分は、約５．０から約６．５までのｐＨにおけるより低い解離定数で約６．８から約７．５までのｐＨにおいて細胞表面分子に結合するように構成される、抗体、抗体フラグメント、抗体ドメイン又はナノボディーを含む、請求項１に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項６３】
前記標的化成分は、約２μＭのＣａ２＋濃度におけるより低い解離定数で約２ｍＭのＣａ２＋濃度において細胞表面分子に結合するように構成される、抗体、抗体フラグメント、抗体ドメイン又はナノボディーを含む、請求項１に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項６４】
前記標的化成分は、約５．０から約６．５までのｐＨにおけるより低い解離定数で約６．８から約７．５までのｐＨにおいて細胞表面分子に結合するように構成される、タンパク質、タンパク質フラグメント又はタンパク質ドメインを含む、請求項１に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項６５】
前記標的化成分は、約２μＭのＣａ２＋濃度におけるより低い解離定数で約２ｍＭのＣａ２＋濃度において細胞表面分子に結合するように構成される、タンパク質、タンパク質フラグメント又はタンパク質ドメインを含む、請求項１に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項６６】
前記標的化成分は、約５．０から約６．５までのｐＨにおけるより低い解離定数で約６．８から約７．５までのｐＨにおいてカーゴ区画に結合するように構成される、請求項３０に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項６７】
前記標的化成分は、約２μＭのＣａ２＋濃度におけるより低い解離定数で約２ｍＭのＣａ２＋濃度においてカーゴ成分に結合するように構成される、請求項３０に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項６８】
前記カーゴ分子は細胞傷害性放射性標識である、請求項１又は３０に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項６９】
前記カーゴ分子は標的細胞の挙動を改変する薬物その他の薬剤である、請求項１又は３０に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書に開示される本発明は一般的に、腫瘍細胞のような標的細胞への細胞傷害性薬物、画像化標識その他のカーゴ分子の送達のためのプラットフォームとして用いられ得る改変タンパク質の作製に関する。これらのタンパク質は、標的細胞中の後期エンドソーム及びリソソームにカーゴ分子をより有効に送達するように改変される。
【背景技術】
【０００２】
抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣｓ）又はタンパク質−薬物コンジュゲート（ＰＤＣｓ）は、癌細胞あるいは炎症細胞又はウイルス感染細胞のような他の望ましくない細胞に結合する抗体、抗体フラグメントその他のタンパク質の高い特異性を高度に毒性の薬物の送達と組み合わせる種類の治療薬を代表する。現在のＡＤＣｓ又はＰＤＣｓに伴う問題は、それらが用量を制限し得る毒性を有することである。しかしながら、腫瘍細胞への細胞傷害性薬物のより有効な送達を可能にするＡＤＣｓ及びＰＤＣｓの開発は、困難だがやりがいのあるまま残っている（ｒｅｍａｉｎｓ  ｃｈａｌｌｅｎｇｉｎｇ）。
【０００３】
さらに、診断用画像化における標識コンジュゲート（ＬＣｓ）として用いられるべく、抗体、抗体フラグメントその他の標的化タンパク質を放射性標識、蛍光標識又は近赤外標識で標識することができる。しかしながら背景組織へのより高いコントラストをもって腫瘍をより有効に標識することを可能にするＬＣｓの開発も困難であるがやりがいのあるまま残っている。
【発明の概要】
【０００４】
本開示は、本明細書でエンドリソソーム標的化コンジュゲートと呼ばれる改変タンパク質に関し、それは癌細胞その他の細胞タイプのような標的細胞におけるエンドリソソーム経路への細胞傷害性薬物（例えばＡＤＣｓ又はＰＤＣｓにおける）あるいは画像化標識（例えばＬＣｓにおける）のようなカーゴ分子の送達の向上を可能にするように構成される。
【０００５】
第１の側面に従い、エンドリソソーム標的化コンジュゲートを説明する。エンドリソソーム標的化コンジュゲートは、抗体、抗体フラグメント、抗体ドメイン、ナノボディー、タンパク質、タンパク質フラグメント又はタンパク質ドメインを含む標的化成分を有し、ここで標的化成分は標的細胞のエンドリソソーム区画内におけるより低い解離定数で細胞外空間において標的細胞の細胞表面分子に結合するように構成されている。エンドリソソーム標的化コンジュゲートはカーゴ成分も有し、それは抗体、抗体フラグメント、抗体ドメイン、ナノボディー、タンパク質、タンパク質フラグメント又はタンパク質ドメインにコンジュゲート化したカーゴ分子を含む。標的化成分はカーゴ成分に直接又は間接的に融合している。標的化成分は、エンドリソソーム区画に進入すると細胞表面分子から解離するように構成されている。エンドリソソーム標的化コンジュゲートは、標的細胞のエンドリソソーム区画にカーゴ分子を送達するように構成されている。
【０００６】
第２の側面に従い、エンドリソソーム標的化コンジュゲートを説明する。エンドリソソーム標的化コンジュゲートは抗体、抗体フラグメント、抗体ドメイン、ナノボディー、タンパク質、タンパク質フラグメント又はタンパク質ドメインを含む標的化成分を有し、ここで標的化成分は標的細胞の細胞表面分子に結合するように構成されている。エンドリソソーム標的化コンジュゲートはカーゴ成分も有し、それは抗体、抗体フラグメント、抗体ドメイン、ナノボディー、タンパク質、タンパク質フラグメント又はタンパク質ドメイン
にコンジュゲート化したカーゴ分子を含む。標的化成分は標的細胞のエンドリソソーム区画におけるより低い解離定数で細胞外空間においてカーゴ成分に結合するように構成されている。標的化成分は、エンドリソソーム区画に進入するとカーゴ成分から解離するように構成されている。エンドリソソーム標的化コンジュゲートは標的細胞のエンドリソソーム区画にカーゴ分子を送達するように構成されている。
【０００７】
第３の側面に従い、組成物を説明する。組成物はエンドリソソーム標的化コンジュゲート及び医薬上許容され得るビヒクルを含む。
【０００８】
第４の側面に従い、癌の処置方法を説明する。前記方法は有効用量のエンドリソソーム標的化コンジュゲート組成物を患者に投与することを含み、ここでカーゴ分子は細胞傷害性薬物であり、組成物の投与は患者における腫瘍の成長を抑制する。
【０００９】
第５の側面に従い、患者における腫瘍の画像化方法を説明する。前記方法は、（１）有効用量のエンドリソソーム標的化コンジュゲート組成物を患者に投与する段階であって、ここでカーゴ分子は画像化標識である、段階と、（２）患者において画像化標識を検出するのに適した画像化方法を実施する段階とを含む。組成物の投与は、画像化方法により検出可能な画像化標識の十分な濃度を与える。
【００１０】
第６の側面に従い、癌の処置のためのエンドリソソーム標的化コンジュゲートを与える方法を説明する。前記方法は、（１）標的化成分を選択する段階であって、ここで標的化成分は選ばれたタイプの腫瘍標的細胞上の細胞表面分子に選択的に結合するように構成される、抗体、抗体フラグメント、抗体ドメイン、ナノボディー、タンパク質、タンパク質フラグメント又はタンパク質ドメインを含み、ここで標的化成分はエンドリソソーム区画におけるより低い解離定数で細胞外空間において細胞表面分子に結合するように構成されている、段階と、（２）カーゴ成分を選択する段階であって、ここでカーゴ成分はカーゴ分子にコンジュゲート化した抗体、抗体フラグメント、抗体ドメイン、ナノボディー、タンパク質、タンパク質フラグメント又はタンパク質ドメインを含み、ここでカーゴ分子は選ばれたタイプの腫瘍標的細胞の成長を抑制するための薬効を有する細胞傷害性薬物である段階と、（３）カーゴ成分に直接又は間接的に融合した標的化成分を含むエンドリソソーム標的化コンジュゲートを与える段階とを含む。
【００１１】
第７の側面に従い、癌の処置のためのエンドリソソーム標的化コンジュゲートを与える方法を説明する。前記方法は、（１）標的化成分を選択する段階であって、ここで標的化成分は選ばれたタイプの腫瘍標的細胞上の細胞表面分子に選択的に結合するように構成される、抗体、抗体フラグメント、ナノボディー、タンパク質、タンパク質フラグメント又はタンパク質ドメインを含む、段階と、（２）カーゴ成分を選択する段階とを含み、ここでカーゴ成分はカーゴ分子にコンジュゲート化した抗体、抗体フラグメント、抗体ドメイン、ナノボディー、タンパク質、タンパク質フラグメント又はタンパク質ドメインを含み、ここでカーゴ分子は選ばれたタイプの腫瘍標的細胞の成長を抑制するための薬効を有する細胞傷害性薬物である。前記方法において、標的化成分は第１のタンパク質ドメインをさらに含むように改変され、カーゴ成分は第２のタンパク質ドメインをさらに含むように改変され、そして第１のタンパク質ドメインはエンドリソソーム区画におけるより低い解離定数で細胞外空間において第２のドメインに結合するように構成されている。
【００１２】
上記のエンドリソソーム標的化コンジュゲート及び方法はさらに以下の詳細を含む場合があり、それらは明らかに互いに排他的でなければ互いと組み合わされる場合がある。ｉ）標的化成分は、５００ｎＭ未満の解離定数で細胞外空間において細胞表面分子に結合するように構成される、抗体、抗体フラグメント又はナノボディーを含む場合がある、（ｉｉ）標的化成分は、酸性エンドリソソームｐＨにおけるより低い解離定数で中性近辺のｐ
Ｈにおいて細胞表面分子に結合するように構成される、抗体、抗体フラグメント又はナノボディーを含む場合がある、ｉｉｉ）中性近辺のｐＨは約ｐＨ６．８より高く且つ約ｐＨ７．５未満の場合があり、酸性エンドリソソームｐＨは約ｐＨ５．０より高く且つ約ｐＨ６．５未満の場合がある、ｉｖ）標的化成分は、エンドリソソームＣａ２＋濃度におけるより低い解離定数で細胞外Ｃａ２＋濃度において細胞表面分子に結合するように構成される、抗体、抗体フラグメント又はナノボディーを含む場合がある、ｖ）細胞外Ｃａ２＋濃度は約２ｍＭの場合があり、エンドリソソームＣａ２＋濃度は約２μＭの場合がある、ｖｉ）標的化成分は、５００ｎＭ未満の解離定数で細胞外空間において細胞表面分子に結合するように構成される、タンパク質、タンパク質フラグメント又はタンパク質ドメインを含む場合がある、ｖｉｉ）標的化成分は、酸性エンドリソソームｐＨにおけるより低い解離定数で中性近辺のｐＨにおいて細胞表面分子に結合するように構成される、タンパク質、タンパク質フラグメント又はタンパク質ドメインを含む場合がある、ｖｉｉｉ）標的化成分は、エンドソームＣａ２＋濃度におけるより低い解離定数で細胞外Ｃａ２＋濃度において細胞表面分子に結合するように構成される、タンパク質、タンパク質フラグメント又はタンパク質ドメインを含む場合がある、ｉｘ）カーゴ成分は抗体Ｆｃ領域又は抗体Ｆｃフラグメントのドメインの場合がある抗体、抗体フラグメントを含む場合がある、ｘ）抗体Ｆｃ領域又は抗体ＦｃフラグメントのドメインはヒトＩｇＧ１に由来する場合がある、ｘｉ）カーゴ成分はアルブミン分子又はアルブミンのドメインを含む場合がある、ｘｉｉ）標的化成分はＨＥＲ２特異的抗体のＦａｂフラグメント又はｓｃＦｖフラグメントを含む場合があり、ここでＦａｂフラグメント又はｓｃＦｖフラグメントの重鎖可変ドメインはＳｅｒ５５のヒスチジンへの突然変異及びＧｌｙ５７のグルタミン酸への突然変異を有する、ｘｉｉｉ）標的化成分はＨＥＲ２特異的抗体のＦａｂフラグメント又はｓｃＦｖフラグメントを含む場合があり、ここでＦａｂフラグメント又はｓｃＦｖフラグメントにおいて重鎖可変ドメインはＳｅｒ１０３のヒスチジンへの突然変異を有し、軽鎖可変ドメインはＴｙｒ５５のヒスチジンへの突然変異を有する、ｘｉｖ）エンドリソソーム標的化コンジュゲートは少なくともの第１標的化成分及びの第２標的化成分を含み、ここで第１標的化成分は第２標的化成分と異なる細胞表面分子に結合するように構成されている場合がある、ｘｖ）少なくとも第１及び第２標的化成分は２本の免疫グロブリンＦｃフラグメントのヘテロダイマーに融合している場合がある、ｘｖｉ）標的化成分はホスファチジルセリン結合タンパク質を含む場合があり、標的細胞は細胞表面上にホスファチジルセリンを有する細胞の場合がある、ｘｖｉｉ）ホスファチジルセリン結合タンパク質はＡｎｘＡ１のコアドメイン、Ｓｙｔ１のＣ２Ａドメイン及びＰＫＣαのＣ２ドメインからなる群より選ばれる場合がある、ｘｖｉｉｉ）ホスファチジルセリン結合タンパク質はＳｙｔ１のＣ２Ａドメインの場合がある、ｘｉｘ）標的化成分は２個のＳｙｔ１のＣ２Ａドメインを含む場合があ��、ｘｘ）標的化成分は４個のＳｙｔ１のＣ２Ａドメインを含む場合がある、ｘｘｉ）標的化成分は４個より多いＳｙｔ１のＣ２Ａドメインを含む場合がある、ｘｘｉｉ）標的化成分はホスファチジルセリン結合タンパク質を含む場合があり、カーゴ成分はヒトＩｇＧ１のＦｃ部分を含み、標的化成分はリンカータンパク質によりカーゴ成分に共有結合的に融合している場合がある、ｘｘｉｉｉ）リンカータンパク質はＧｌｙ４Ｓｅｒリンカーの場合がある、ｘｘｉｖ）カーゴ分子は細胞傷害性薬物の場合がある、ｘｘｖ）細胞傷害性薬物はモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）の場合がある、ｘｘｖｉ）カーゴ分子は画像化標識の場合がある、ｘｘｖｉｉ）標的化成分は、酸性エンドソームｐＨにおけるより低い解離定数で中性近辺のｐＨにおいてカーゴ区画に結合するように構成される場合がある、ｘｘｖｉｉｉ）標的化成分は、エンドソームＣａ２＋濃度におけるより低い解離定数で細胞外Ｃａ２＋濃度においてカーゴ成分に結合するように構成される場合がある、ｘｘｉｘ）標的化成分はカルビンジンＤ９Ｋドメイン２を含む場合があり、カーゴ成分はカルビンジンＤ９Ｋドメイン１を含む場合がある、ｘｘｘ）カルビンジンドメイン１Ｄ９Ｋはリンカーペプチドによりカーゴ成分に融合している場合があるか、及び／又はカルビンジンＤ９Ｋドメイン２はリンカーペプチドにより標的化成分に融合している場合がある、ｘｘｘｉ）組成物は、１つ以上のタイプの標的細胞の腫瘍を標的とするように
構成される、少なくとも１種のエンドリソソーム標的化コンジュゲートを含む場合がある、ｘｘｘｉｉ）カーゴ分子はペプチドリンカーにより又は化学的コンジュゲート化反応（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を介して抗体フラグメント、抗体ドメイン、ナノボディー、タンパク質、タンパク質フラグメント又はタンパク質ドメインにコンジュゲート化している場合がある、ｘｘｘｉｉｉ）画像化標識は放射性標識、蛍光又は近赤外標識の場合がある、ｘｘｘｉｖ）標的化成分のＮ末端をカーゴ成分のＣ末端に融合させる場合がある、ｘｘｘｖ）標的化成分のＣ末端をカーゴ成分のＮ末端に融合させる場合がある、ｘｘｘｖｉ）標的化成分をカーゴ成分の非末端位置においてカーゴ成分に融合させる場合がある、ｘｘｘｖｉｉ）カーゴ成分は免疫グロブリンＦｃフラグメントを含む場合があり、標的化成分はカーゴ成分の免疫グロブリンＦｃフラグメントに、免疫グロブリンＦｃフラグメントのヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインのＮ末端又はＣ末端において融合している場合がある、ｘｘｘｖｉｉｉ）標的化成分は、ヒト表皮成長因子受容体２に結合するように構成される、抗体、抗体フラグメント、抗体ドメイン又はナノボディーを含む場合がある、ｘｘｘｉｘ）標的化成分は、前立腺特異的膜抗原に結合するように構成される、抗体、抗体フラグメント、抗体ドメイン又はナノボディーを含む場合がある、ｘｌ）エンドリソソーム標的化コンジュゲートは配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８又はそれらの相同体の少なくとも１つのアミノ酸配列を有する１個以上のタンパク質を含む場合がある、ｘｌｉ）エンドリソソーム標的化コンジュゲートは配列番号２プラス配列番号４、配列番号６プラス配列８、配列番号４２プラス配列番号４４又は配列番号４６プラス配列番号４８或いはそれらの相同体のアミノ酸配列を有するタンパク質のヘテロダイマーを含む場合がある、ｘｌｉｉ）エンドリソソーム標的化コンジュゲートは配列番号１８プラス配列番号２０プラス配列番号２２、配列番号２２プラス配列番号２４プラス配列番号２６又はそれらの相同体のアミノ酸配列を有するタンパク質のヘテロトリマーを含む場合がある、ｘｌｉｉｉ）標的化成分は、酸性ｐＨにおいて１．５μＭより高い解離定数で細胞表面分子に結合するように構成される、抗体、抗体フラグメント、抗体ドメイン又はナノボディーを含む場合がある、ｘｌｉｖ）標的化成分は、酸性ｐＨにおいて１．５μＭより高い解離定数で細胞表面分子に結合するように構成される、タンパク質、タンパク質フラグメント又はタンパク質ドメインを含む場合がある、ｘｌｖ）酸性ｐＨは約５．８の場合がある、ｘｌｖｉ）標的化成分は、約５．０から約６．５までのｐＨにおけるより低い解離定数で約６．８から約７．５までのｐＨにおいて細胞表面分子に結合するように構成される、抗体、抗体フラグメント、抗体ドメイン又はナノボディーを含む場合がある、ｘｌｖｉｉ）標的化成分は、約２μＭのＣａ２＋濃度におけるより低い解離定数で約２ｍＭのＣａ２＋濃度において細胞表面分子に結合するように構成される、抗体、抗体フラグメント、抗体ドメイン又はナノボディーを含む場合がある、ｘｌｖｉｉｉ）標的化成分は、約５．０から約６．５までのｐＨにおけるより低い解離定数で約６．８から約７．５までのｐＨにおいて細胞表面分子に結合するように構成される、タンパク質、タンパク質フラグメント又はタンパク質ドメインを含む場合がある、ｘｌｉｘ）標的化成分は、約２μＭのＣａ２＋濃度におけるより低い解離定数で約２ｍＭのＣａ２＋濃度において細胞表面分子に結合するように構成される、タンパク質、タンパク質フラグメント又はタンパク質ドメインを含む場合がある、ｘｌｘ）標的化成分は、約５．０から約６．５までのｐＨにおけるより低い解離定数で約６．８から約７．５までのｐＨにおいてカーゴ区画に結合するように構成される場合がある、ｘｌｘｉ）標的化成分は、約２μＭのＣａ２＋濃度におけるより低い解離定数で約２ｍＭのＣａ２＋濃度においてカーゴ成分に結合するように構成される場合がある、ｘｌｘｉｉ）カーゴ分子は細胞傷害性放射性標識の場合がある、ｘｌｘｉｉｉ）カーゴ分子は標的細胞の挙動を改変する薬物その他の薬剤の場合がある。
【００１３】
本発明ならびにその特徴及び利点をさらに完全に理解するために、ここで添付の図面と一緒に理解される以下の説明に言及し、図面は一定の比率で拡大縮小されておらず（ｎｏｔ  ｔｏ  ｓｃａｌｅ）、図面中で同じ数字は同じ特徴を指す。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】エンドリソソーム標的化コンジュゲートによるカーゴ分子の後期エンドソーム及びリソソーム中への送達に導く選ばれた細胞事象（ｃｅｌｌｕａｒ  ｅｖｅｎｔｓ）の代表的な略図である。
【図２】エンドソーム中におけるエンドリソソーム標的化コンジュゲートのカーゴ成分と標的化成分の解離及びそれに続くカーゴ成分の後期エンドソーム及びリソソーム中への送達に導く選ばれた細胞事象の代表的な略図である。
【図３Ａ】酸性エンドソームｐＨにおける（又はより低いエンドソームＣａ２＋濃度における）より高い親和性（より低い解離定数）で中性近辺のｐＨにおいて（又は細胞外Ｃａ２＋濃度において）細胞表面タンパク質又は細胞表面受容体に結合する抗体を含む代表的なエンドリソソーム標的化コンジュゲートの略図である。
【図３Ｂ】酸性エンドソームｐＨにおける（又はより低いエンドソームＣａ２＋濃度における）より高い親和性（より低い解離定数）で中性近辺のｐＨにおいて（又は細胞外Ｃａ２＋濃度において）細胞表面タンパク質又は細胞表面受容体に結合する抗体ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質を含む代表的なエンドリソソーム標的化コンジュゲートの略図である。
【図３Ｃ】酸性エンドソームｐＨにおける（又はより低いエンドソームＣａ２＋濃度における）より高い親和性（より低い解離定数）で中性近辺のｐＨにおいて（又は細胞外Ｃａ２＋濃度において）細胞表面タンパク質又は細胞表面受容体に結合する抗体可変ドメイン／抗体可変ドメインフラグメント−Ｆｃ融合タンパク質を含む代表的なエンドリソソーム標的化コンジュゲートの略図である。
【図３Ｄ】酸性エンドソームｐＨにおける（又はより低いエンドソームＣａ２＋濃度における）より高い親和性（より低い解離定数）で中性近辺のｐＨにおいて（又は細胞外Ｃａ２＋濃度において）細胞表面タンパク質又は細胞表面受容体に結合する免疫グロブリンヒンジ及びＣＨ３ドメインのＮ末端位置に融合したＦａｂフラグメントを含む代表的なエンドリソソーム標的化コンジュゲートの略図である。
【図３Ｅ】酸性エンドソームｐＨにおける（又はより低いエンドソームＣａ２＋濃度における）より高い親和性（より低い解離定数）で中性近辺のｐＨにおいて（又は細胞外Ｃａ２＋濃度において）細胞表面タンパク質又は細胞表面受容体に結合する免疫グロブリンヒンジ及びＣＨ３ドメインのＮ末端位置に融合したｓｃＦｖフラグメントを含む代表的なエンドリソソーム標的化コンジュゲートの略図である。
【図３Ｆ】酸性エンドソームｐＨにおける（又はより低いエンドソームＣａ２＋濃度における）より高い親和性（より低い解離定数）で中性近辺のｐＨにおいて（又は細胞外Ｃａ２＋濃度において）細胞表面タンパク質又は細胞表面受容体に結合する免疫グロブリンヒンジ及びＣＨ３ドメインのＮ末端位置に融合した抗体可変ドメイン／抗体可変ドメインフラグメントを含む代表的なエンドリソソーム標的化コンジュゲートの略図である。
【図３Ｇ】酸性エンドソームｐＨにおける（又はより低いエンドソームＣａ２＋濃度における）より高い親和性（より低い解離定数）で中性近辺のｐＨにおいて（又は細胞外Ｃａ２＋濃度において）細胞表面タンパク質又は細胞表面受容体に結合するアルブミンに融合した抗体可変ドメイン／抗体可変ドメインフラグメントを含む代表的なエンドリソソーム標的化コンジュゲートの略図である。
【図３Ｈ】酸性エンドソームｐＨにおける（又はより低いエンドソームＣａ２＋濃度における）より高い親和性（より低い解離定数）で中性近辺のｐＨにおいて（又は細胞外Ｃａ２＋濃度において）細胞表面タンパク質又は細胞表面受容体に結合するアルブミンに融合した抗体Ｆａｂフラグメントを含む代表的なエンドリソソーム標的化コンジュゲートの略図である。
【図３Ｉ】酸性エンドソームｐＨにおける（又はより低いエンドソームＣａ２＋濃度における）より高い親和性（より低い解離定数）で中性近辺のｐＨにおいて（又は細胞外Ｃａ２＋濃度において）細胞表面タンパク質又は細胞表面受容体に結合するアルブミンに融合した抗体ｓｃＦｖフラグメントを含む代表的なエンドリソソーム標的化コンジュゲートの略図である。
【図３Ｊ】ＦｃフラグメントのＮ末端位置に融合したタンパク質、タンパク質ドメイン又はフラグメントを含む代表的なエンドリソソーム標的化コンジュゲートの略図である。タンパク質、タンパク質ドメイン又はタンパク質フラグメントは、酸性エンドソームｐＨにおける（又はより低いエンドソームＣａ２＋濃度における）より高い親和性（より低い解離定数）で中性近辺のｐＨにおいて（又は細胞外Ｃａ２＋濃度において）細胞表面タンパク質又は細胞表面受容体に結合する。
【図３Ｋ】ＦｃフラグメントのＣ末端位置に融合したタンパク質、タンパク質ドメイン又はフラグメントを含む代表的なエンドリソソーム標的化コンジュゲートの略図である。タンパク質、タンパク質ドメイン又はタンパク質フラグメントは、酸性エンドソームｐＨにおける（又はより低いエンドソームＣａ２＋濃度における）より高い親和性（より低い解離定数）で中性近辺のｐＨにおいて（又は細胞外Ｃａ２＋濃度において）細胞表面タンパク質又は細胞表面受容体に結合する。
【図３Ｌ】ＦｃフラグメントのＮ末端及びＣ末端の両方の位置に融合したタンパク質、タンパク質ドメイン又はフラグメントを含む代表的なエンドリソソーム標的化コンジュゲートの略図である。タンパク質、タンパク質ドメイン又はタンパク質フラグメントは、酸性エンドソームｐＨにおける（又はより低いエンドソームＣａ２＋濃度における）より高い親和性（より低い解離定数）で中性近辺のｐＨにおいて（又は細胞外Ｃａ２＋濃度において）細胞表面タンパク質又は細胞表面受容体に結合する。
【図３Ｍ】ＦｃフラグメントのＮ末端及びＣ末端の両方の位置に融合したタンパク質、タンパク質ドメイン又はタンパク質フラグメントを含み、Ｆｃフラグメント当たりに２個のタンパク質ドメイン又はフラグメント分子を有するヘテロダイマーを形成する代表的なエンドリソソーム標的化コンジュゲートの略図である。タンパク質、タンパク質ドメイン又はタンパク質フラグメントは、酸性エンドソームｐＨにおける（又はより低いエンドソームＣａ２＋濃度における）より高い親和性（より低い解離定数）で中性近辺のｐＨにおいて（又は細胞外Ｃａ２＋濃度において）細胞表面タンパク質又は細胞表面受容体に結合する。
【図３Ｎ】ＦｃフラグメントのＣ末端位置に融合したタンパク質、タンパク質ドメイン又はタンパク質フラグメントを含み、Ｆｃフラグメント当たりに１個のタンパク質、タンパク質ドメイン又はフラグメント分子を有するヘテロダイマーを形成する代表的なエンドリソソーム標的化コンジュゲートの略図である。タンパク質、タンパク質ドメイン又はタンパク質フラグメントは、酸性エンドソームｐＨにおける（又はより低いエンドソームＣａ２＋濃度における）より高い親和性（より低い解離定数）で中性近辺のｐＨにおいて（又は細胞外Ｃａ２＋濃度において）細胞表面タンパク質又は細胞表面受容体に結合する。
【図３Ｏ】酸性エンドソームｐＨにおける（又はより低いエンドソームＣａ２＋濃度における）より高い親和性（より低い解離定数）で中性近辺のｐＨにおいて（又は細胞外Ｃａ２＋濃度において）互いに会合するように設計されたＦａｂ−タンパク質（ドメイン）及びタンパク質（ドメイン）−Ｆｃ融合体を含む代表的なエンドリソソーム標的化コンジュゲートの略図である。
【図３Ｐ】酸性エンドソームｐＨにおける（又はより低いエンドソームＣａ２＋濃度における）より高い親和性（より低い解離定数）で中性近辺のｐＨにおいて（又は細胞外Ｃａ２＋濃度において）互いに会合するように設計されたｓｃＦｖフラグメント−タンパク質（ドメイン）及びタンパク質（ドメイン）−Ｆｃ融合体を含む代表的なエンドリソソーム標的化コンジュゲートの略図である。
【図３Ｑ】酸性エンドソームｐＨにおける（又はより低いエンドソームＣａ２＋濃度における）より高い親和性（より低い解離定数）で中性近辺のｐＨにおいて（又は細胞外Ｃａ２＋濃度において）互いに会合するように設計された抗体可変ドメイン−タンパク質（ドメイン）及びタンパク質（ドメイン）−Ｆｃ融合体を含む代表的なエンドリソソーム標的化コンジュゲートの略図である。
【図３Ｒ】酸性エンドソームｐＨにおける（又はより低いエンドソームＣａ２＋濃度における）より高い親和性（より低い解離定数）で中性近辺のｐＨにおいて（又は細胞外Ｃａ２＋濃度において）２種以上の細胞表面受容体又は細胞表面分子に結合する２種のＦａｂフラグメントを含む抗体を含む代表的なエンドリソソーム標的化コンジュゲートの略図である。
【図３Ｓ】酸性エンドソームｐＨにおける（又はより低いエンドソームＣａ２＋濃度における）より高い親和性（より低い解離定数）で中性近辺のｐＨにおいて（又は細胞外Ｃａ２＋濃度において）２種以上の細胞表面受容体又は細胞表面分子に結合する２種のｓｃＦｖフラグメントを含む抗体を含む代表的なエンドリソソーム標的化コンジュゲートの略図である。
【図４Ａ】代表的なＨＥＲ２標的化エンドリソソーム標的化薬剤（コンジュゲート化薬物なし）の種々のｐＨ値におけるＨＥＲ２への結合分析に関する代表的なデータを示す。
【図４Ｂ】代表的なＨＥＲ２標的化エンドリソソーム標的化薬剤（コンジュゲート化薬物なし）の種々のｐＨ値におけるＨＥＲ２への解離定数に関する代表的なデータを示す。
【図５Ａ】種々の腫瘍細胞系上のＨＥＲ２の発現レベルのフローサイトメトリー分析に関する代表的なデータのグラフを示す。
【図５Ｂ】種々の腫瘍細胞系における代表的なＨＥＲ２標的化エンドリソソーム標的化コンジュゲートの内在化及び蓄積のフローサイトメトリー分析に関する代表的なデータのグラフを示す。
【図５Ｃ】デキストラン陽性リソソームにおける代表的なＨＥＲ２標的化エンドリソソーム標的化コンジュゲートの局在化を比較する一系列の代表的な顕微鏡画像を示す。
【図６】腫瘍細胞の生存率へのＨＥＲ２標的化エンドリソソーム標的化コンジュゲート及び対照ＭＭＡＥコンジュゲートの効果に関する代表的なデータを報告するグラフを示す。
【図７Ａ】マウスにおける代表的なＨＥＲ２標的化エンドリソソーム標的化コンジュゲートに関して時間に対する代表的な全身カウント及び血液カウントを報告するグラフを示す。
【図７Ｂ】マウスにおける腫瘍成長（ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞）への代表的なＨＥＲ２標的化エンドリソソーム標的化コンジュゲート及び対照タンパク質の効果に関する代表的なデータを報告するグラフを示す。
【図８Ａ】それぞれ抗体Ｆａｂ（ＨＥＲ２特異的）及びＦｃフラグメントに融合したカルビンジンドメイン２及び１を含む代表的なＨＥＲ２標的化融合タンパク質の相互作用に関する代表的な結合データを示す。
【図８Ｂ】それぞれ抗体Ｆａｂ（０２６，ＰＳＭＡ特異的）及びＦｃフラグメントに融合したカルビンジンドメイン２及び１を含む代表的な前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）標的化抗体の、前立腺癌細胞における内在化及び蓄積のフローサイトメトリー分析に関する代表的なデータのグラフを示す。
【図９】代表的なＰＳ標的化Ｆｃ融合タンパク質の代表的なゲルろ過クロマトグラフィー分析を報告するグラフを示す。
【図１０Ａ】代表的なＰＳ標的化薬剤（ＰＳ標的化タンパク質、ＡｎｘＡ１、シナプトタグミン１（Ｓｙｔ１）のＣ２Ａドメイン及びＰＫＣαに連結したヒトＩｇＧ１由来Ｆｃを含むＦｃ融合体）の略図及び分析である。黒丸（ｆｉｌｌｅｄ  ｃｉｒｃｌｅｓ）及び長方形はそれぞれＰＳ標的化ドメイン及びＩｇＧ１ヒンジ領域を示す。右のパネルはエンドリソソーム標的化薬剤のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示し、分子量（ＭＷ）が左にｋＤａで示されている。
【図１０Ｂ】脂質がコーティングされたニトロセルロース膜を用いる代表的なＰＳ標的化薬剤の代表的な脂質結合分布を示す。
【図１０Ｃ】フローサイトメトリー分析を用い、代表的なＰＳ標的化薬剤のＰＳ陽性２Ｈ１１及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞への代表的な結合を報告するグラフを示す。
【図１０Ｄ】代表的なＰＳ標的化薬剤の代表的な時間に対する全身カウントを報告するグラフを示す。
【図１０Ｅ】代表的なＰＳ標的化薬剤に関して図１０Ｄに示されたデータに関する代表的な曲線下面積を報告するグラフを示す。
【図１０Ｆ】近赤外染料（ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ）で標識された代表的なＰＳ標的化薬剤が注入された腫瘍保有マウスの代表的な全身画像を示す。
【図１０Ｇ】図１０Ｆに示された画像に関し、近赤外染料（ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ）で標識された代表的なＰＳ標的化薬剤に関する代表的な腫瘍関連蛍光を報告するグラフを示す。
【図１０Ｈ】腫瘍保有マウス中への４８時間の注入に続く代表的な腫瘍の画像及び近赤外染料（ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ）で標識された代表的なＰＳ標的化薬剤に関する平均染料強度を報告するグラフを示す。
【図１１Ａ】代表的な２価及び４価のＰＳ標的化薬剤の略図及び分析であり、黒丸はＳｙｔ１  Ｃ２Ａドメインを示す（左のパネル）。右のパネルはＳｙｔ１−Ｆｃ融合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示し、分子量（ＭＷ）が右にｋＤａで示されている。
【図１１Ｂ】Ｆｃフラグメント当たりに４個のＳｙｔ１分子を含有する代表的なＰＳ標的化Ｆｃ融合タンパク質の代表的なゲルろ過クロマトグラフィー分析を示す。
【図１１Ｃ】代表的なＰＳ標的化薬剤のＰＳがコーティングされたニトロセルロース膜上のＰＳ及び脂質がコーティングされたニトロセルロース膜への代表的な結合を示す。
【図１１Ｄ】ＰＳが露出されている細胞への代表的なＰＳ標的化薬剤及び対照タンパク質の代表的な結合を報告するグラフを示す。
【図１１Ｅ】ＰＳが露出されている細胞中への代表的なＰＳ標的化薬剤の代表的な内在化を報告するグラフを示す。
【図１１Ｆ】内皮細胞（２Ｈ１１）中の代表的なＰＳ標的化薬剤及び対照タンパク質の一系列の代表的な顕微鏡画像を示し、細胞中のリソソームはＬＡＭＰ−１特異的抗体で標識されている。
【図１１Ｇ】腫瘍細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）中の代表的なＰＳ標的化薬剤及び対照タンパク質の別の系列の代表的な顕微鏡画像を示し、細胞中のリソソームはＬＡＭＰ−１特異的抗体で標識されている。
【図１２Ａ】ＭＭＡＥ（小さい黒丸）とコンジュゲート化したカーゴ成分を有する代表的なＰＳ標的化エンドリソソーム標的化コンジュゲートの略図及び分析を示す（左のパネル）。右のパネルは非コンジュゲート化又はＭＭＡＥコンジュゲート化ＰＳ標的化薬剤のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示し、分子量（ＭＷ）が左にｋＤａで示されている。
【図１２Ｂ】代表的なＭＭＡＥコンジュゲート化ＰＳ標的化エンドリソソーム標的化コンジュゲートの代表的な質量分析を示す。
【図１２Ｃ】代表的なＰＳ標的化エンドリソソーム標的化コンジュゲートの代表的なゲルろ過クロマトグラフィー分析を示す。
【図１２Ｄ】示されるＣａ２＋濃度（左のパネル）又はｐＨレベル（右のパネル）の存在下における代表的なＰＳ標的化エンドリソソーム標的化コンジュゲートのＰＳへの結合の代表的な分析を示す。イムノブロット法を用いてビーズ会合（ｂｅａｄ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）タンパク質を分析した。
【図１３Ａ】腫瘍細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）中の代表的なＰＳ標的化エンドリソソーム標的化コンジュゲート及び対照ＭＭＡＥコンジュゲートの代表的な一系列の顕微鏡画像を示し、細胞中の初期エンドソームがＥＥＡ−１特異的抗体で標識されている。特定のエンドソームを収穫し（ｃｒｏｐｐｅｄ）拡大する（ａ及びｂと標識する）。
【図１３Ｂ】腫瘍細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）中の代表的なＰＳ標的化エンドリソソーム標的化コンジュゲート及び対照ＭＭＡＥコンジュゲートの代表的な一系列の顕微鏡画像を示し、細胞中のリソソームがＬＡＭＰ−１特異的抗体で標識されている。
【図１３Ｃ】内皮細胞（２Ｈ１１）中及び腫瘍細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）中のチューブリンへの代表的なＰＳ標的化エンドリソソーム標的化コンジュゲート及び対照ＭＭＡＥコンジュゲートの効果の代表的な一系列の顕微鏡画像を示す。
【図１４Ａ】腫瘍細胞上に露出されたＰＳのレベルを示す代表的なフローサイトメトリーデータのグラフを示す。
【図１４Ｂ】腫瘍細胞の生存率への代表的なＰＳ標的化エンドリソソーム標的化コンジュゲート及び対照ＭＭＡＥコンジュゲートの効果に関する代表的なデータを報告するグラフを示す。
【図１４Ｃ】２時間のインキュベーションの後に腫瘍細胞中に内在化した代表的なＰＳ標的化エンドリソソーム標的化コンジュゲートのレベルを示す代表的なフローサイトメトリーデータのグラフを示す。
【図１４Ｄ】代表的なＰＳ標的化Ｆｃ融合体（コンジュゲート化薬物なし）が細胞生存率に影響しないことを示す代表的なデータのグラフを示す。
【図１５Ａ】代表的なＰＳ標的化エンドリソソーム標的化コンジュゲートの代表的な時間に対する全身カウントを報告するグラフを示す。
【図１５Ｂ】代表的なＰＳ標的化エンドリソソーム標的化コンジュゲートに関して図１５Ａで示されたデータに関する曲線下面積を報告する代表的なグラフを示す。
【図１５Ｃ】マウスにおける腫瘍成長（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞）への代表的なＰＳ標的化エンドリソソーム標的化コンジュゲート及び対照タンパク質の効果に関する代表的なデータを報告するグラフを示す。
【図１５Ｄ】腫瘍保有マウスの体重への代表的なＰＳ標的化エンドリソソーム標的化コンジュゲート及び対照タンパク質の効果に関する代表的なデータを報告するグラフを示す。
【図１５Ｅ】マウスにおける腫瘍成長（ＬＮＣａＰ細胞）への代表的なＰＳ標的化エンドリソソーム標的化コンジュゲート及び対照タンパク質の効果に関する代表的なデータを報告するグラフを示す。
【図１６Ａ】ＭＭＡＥにコンジュゲート化した及びしない、ＰＳ結合活性が低下するように改変された（ＤＮ突然変異を用いて）対照エンドリソソーム標的化コンジュゲート及び対照タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図１６Ｂ】ＰＳに結合する代表的なＰＳ標的化エンドリソソーム標的化コンジュゲート又はＰＳに低い親和性で結合するように改変されている（ＤＮ）対照エンドリソソーム標的化コンジュゲートの脂質がコーティングされたニトロセルロース膜への代表的な脂質結合分布を示す。
【図１６Ｃ】ＰＳに結合するか、あるいは、低い親和性で結合するように改変された（ＤＮ）代表的なＰＳ標的化エンドリソソーム標的化コンジュゲートのＰＳ陽性２Ｈ１１細胞への代表的な結合を、フローサイトメトリー分析を用いて報告するグラフを示す。
【図１６Ｄ】マウスにおける腫瘍成長（ＬＮＣａＰ細胞）への代表的なＰＳ標的化エンドリソソーム標的化コンジュゲート及び対照タンパク質の効果に関する代表的なデータを報告するグラフを示す。
【図１６Ｅ】代表的なＰＳ標的化エンドリソソーム標的化コンジュゲート及び対照タンパク質で処置されたマウスから単離された腫瘍（ＬＮＣａＰ細胞）の代表的な画像を示す。
【図１７Ａ】腫瘍組織中のＣＤ３１陽性内皮細胞に関する代表的なＰＳ標的化エンドリソソーム標的化コンジュゲート及び対照（ＰＢＳビヒクル）の位置を示す代表的な一系列の顕微鏡画像を示す。そして
【図１７Ｂ】腫瘍組織中のＦ４／８０陽性マクロファージに関する代表的なＰＳ標的化エンドリソソーム標的化コンジュゲート及び対照（ＰＢＳビヒクル）の位置を示す代表的な一系列の顕微鏡画像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本開示は、標的細胞中の後期エンドソーム及びリソソームへの細胞傷害性薬物又は画像
化標識のようなカーゴ分子の送達の向上を可能にするように構成される、改変された抗体又は融合タンパク質に関する。本明細書で用いられる「エンドリソソーム」及び「エンドリソソーム区画」という用語は、細胞の初期エンドソーム、後期エンドソーム、リソソーム及び関連する管状小胞輸送担体（ｔｕｂｕｌｏｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｃａｒｒｉｅｒ）を指す。従って本明細書で用いられる「エンドリソソーム標的化コンジュゲート」という用語は、標的細胞のエンドリソソーム区画へのカーゴ分子の送達の向上のために構成される、改変された抗体又は融合タンパク質を指す。
【００１６】
本明細書に説明される抗体又は融合タンパク質は標的化成分及びカーゴ成分を含む。標的化成分は抗体、抗体フラグメント、抗体ドメイン、ナノボディー、タンパク質、タンパク質フラグメント又はタンパク質ドメインを含む場合があり、それらは細胞の原形質膜の細胞外表面上に存在する場合がある細胞表面受容体その他の細胞表面分子のような細胞表面分子に結合するように構成され、ここで分子は少なくとも部分的に細胞外空間に露出している。カーゴ成分は、細胞傷害性薬物又は画像化標識のようなカーゴ分子にコンジュゲート化した抗体、抗体フラグメント、抗体ドメイン、ナノボディー、タンパク質、タンパク質フラグメント又はタンパク質ドメインを含む場合がある。
【００１７】
本明細書で用いられる「抗体−薬物コンジュゲート」又は「ＡＤＣ」という用語は、薬物を細胞に送達するように構成される、抗体に基づくコンジュゲートを指す。特に「抗体−薬物コンジュゲート」又は「ＡＤＣ」という用語は、本明細書で用いられる場合、標的化成分及びカーゴ成分を含む抗体を指す。標的化成分は抗体Ｆａｂフラグメント、抗体可変ドメイン又はナノボディーを含む場合がある。標的化成分はカーゴ成分に連結され、それは抗体定常領域（Ｆｃフラグメント）又は定常領域のドメインを含む場合がある。１個以上の細胞傷害性薬物分子がＡＤＣのカーゴ成分の抗体定常領域（Ｆｃフラグメント）又は定常領域のドメインにコンジュゲート化される場合がある。
【００１８】
本明細書で用いられる「タンパク質−薬物コンジュゲート」又は「ＰＤＣ」という用語は、薬物を細胞に送達するように構成される、タンパク質に基づくコンジュゲートを指す。特に「タンパク質−薬物コンジュゲート」又は「ＰＤＣ」という用語は、本明細書で用いられる場合、標的化成分及びカーゴ成分を含むタンパク質を指す。標的化成分は、細胞表面受容体又は細胞表面分子に結合するタンパク質或いはＦａｂフラグメント、抗体可変ドメイン又はナノボディーを含む場合がある。標的化成分はカーゴ成分に連結され、それは抗体定常領域（Ｆｃフラグメント）、定常領域のドメイン又はアルブミンのようなタンパク質を含む場合がある。１個以上の細胞傷害性薬物分子がＰＤＣのカーゴ成分の抗体定常領域（Ｆｃフラグメント）、定常領域のドメイン又はアルブミンのようなタンパク質にコンジュゲート化される場合がある。
【００１９】
本明細書で用いられる「標識コンジュゲート」又は「ＬＣ」という用語は、カーゴ成分に連結した標的化成分を含む抗体又はタンパク質を指す。従って標的化成分は細胞表面受容体又は細胞表面分子に結合する抗体Ｆａｂフラグメント、抗体可変ドメイン、ナノボディー又はタンパク質を含む場合がある。カーゴ成分は抗体定常領域（Ｆｃフラグメント）又は定常領域のドメイン或いはアルブミンのようなタンパク質を含む場合がある。カーゴ成分の抗体定常領域（Ｆｃフラグメント）又は定常領域のドメインあるいはタンパク質は、放射性標識、蛍光分子その他の標識分子のような１個以上の画像化標識にコンジュゲート化される場合がある。
【００２０】
一般にＡＤＣｓ又はＰＤＣｓが有効に薬物を細胞に送達するために、それらは標的細胞に選択的に結合しなければならず、細胞中に内在化しなければならず、且つ後期エンドソーム及びリソソームと呼ばれる分解区画（ｄｅｇｒａｄａｔｉｖｅ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ）に進入しなければならない。リソソームに進入する前に、ＡＤＣｓ又はＰＤＣｓ
は初期エンドソームに進入し、そこで再循環への選別又はリソソーム経路が起こる。後期エンドソーム及びリソソームへの送達（エンドリソソーム経路）の向上はより有力なＡＤＣｓ又はＰＤＣｓを生じ、より低い用量の使用を可能にする。
【００２１】
さらに、標的細胞中の後期エンドソーム及びリソソームへの画像化標識の送達の向上を可能にするＬＣｓは、標的とされない細胞又は組織の背景に対する標的細胞の画像化に関するより高いコントラストを生ずるであろう。
【００２２】
従って、本発明は一般的に標的細胞のエンドリソソーム区画にカーゴ分子をより有効に送達するように改変されるエンドリソソーム標的化コンジュゲートに関し、本明細書に説明される改変されたコンジュゲートはエンドソーム又は後期エンドソーム内と細胞外環境中の化学的組成における相違に反応し、それにより標的細胞への細胞傷害性薬物又は画像化標識のようなカーゴ分子のより有効な送達を達成するように構成される。本明細書に説明されるエンドリソソーム標的化コンジュゲートの例には、標的細胞のエンドリソソーム区画への薬物又は画像化標識のようなコンジュゲート化カーゴ分子の標的化の向上のために構成され、それによってより有力なＡＤＣｓ又はＰＤＣｓ或いはよりコントラストの高いＬＣｓを生ずる改良されたＡＤＣｓ、ＰＤＣｓ及びＬＣｓが含まれる。
【００２３】
本明細書に説明されるカーゴ分子には、標的細胞において効果を引き起こすのに有用な機能を有するいずれの分子も含まれ得る。例えば細胞傷害性薬物又は画像化標識の他に、追加のカーゴ分子は放射線損傷を介して細胞を殺す、すなわち画像化のためではなくて治療用に用いることができる放射性標識であることができる。そのような放射性標識の例はイットリウム（Ｙ）−９０及びヨウ素（Ｉ）−１３１である。追加のタイプのカーゴ分子は本開示を読んで当業者により同定可能である。
【００２４】
腫瘍細胞の他に、本開示の意味における標的細胞には、本開示を読んで当業者に同定可能な他のものの中でも炎症細胞又はウイルス感染細胞のような他のタイプの望ましくない細胞が含まれる場合がある。
【００２５】
本明細書で用いられる「細胞表面分子」という用語は、少なくとも部分的に細胞の原形質膜の細胞外表面上に露出しているタンパク質その他の生体分子（例えばリン脂質、炭水化物）を指す。
【００２６】
図１及び２は、本開示のエンドリソソーム標的化コンジュゲートによるカーゴ分子の送達の向上の代表的な機構の略図を示す。標的化成分が細胞表面分子に結合すると、エンドリソソーム標的化コンジュゲートは細胞中に内在化する（図１及び２）。
【００２７】
図１における代表的な略様式（ｓｃｈｅｍａｔｉｃ  ｆｏｒｍ）に示される通り、エンドリソソーム標的化コンジュゲートは、より低い（酸性の）ｐＨ、より低いＣａ２＋濃度、より低いＣｌ−又はＮａ＋濃度、より高いＫ＋濃度或いはエンドソームを細胞外空間と区別する他の環境条件の故に、初期又は後期エンドソーム中で受容体又は細胞表面分子から解離する場合がある（例えばＳｃｏｔｔ，Ｃ．Ｃ．，Ｇｒｕｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．（２０１０）  Ｉｏｎ  ｆｌｕｘ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｄｏｓｏｍｅｓ  ａｎｄ  ｌｙｓｏｓｏｍｅｓ：ｐＨ  ｉｓ  ｊｕｓｔ  ｔｈｅ  ｓｔａｒｔ．Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ  ３３，１０３−１１０に説明されている通り）。従って本明細書に説明されるエンドリソソーム標的化コンジュゲートのいくつかの例において、細胞表面分子に関する標的化成分の親和性は細胞外空間においてエンドリソソーム区画内におけるより高い。かくして標的化成分と細胞表面分子は細胞外空間において、より低い解離定数で結合する場合がある。エンドリソソーム標的化コンジュゲートは後期エンドソーム又はリソソームに送達され、結果としてその薬物又は標識を放出する。
【００２８】
別の例において、図２における代表的な略様式に示される通り、エンドリソソーム標的化コンジュゲートの標的化成分とカーゴ成分は非共有結合的相互作用により互いに会合している場合があり、それは中性近辺のｐＨ又は細胞外Ｃａ２＋濃度において安定であるが、エンドソーム（酸性）ｐＨ又はエンドソームＣａ２＋濃度或いはエンドソームを細胞外空間と区別する他の環境条件においては安定でない。カーゴ成分は初期又は後期エンドソーム内で放出され、リソソームに進入するが、標的化成分は再循環されてカーゴ成分を再負荷されることができる。従って本明細書に説明されるエンドリソソーム標的化コンジュゲートのいくつかの例において、カーゴ成分に関する標的化成分の親和性は細胞外空間においてエンドリソソーム区画におけるより高い。かくして標的化成分は細胞外空間において、より低い解離定数でカーゴ成分に結合する場合がある。
【００２９】
標的化成分とカーゴ成分は共有結合により連結している場合があるか、又は非共有結合的に互いに会合している場合がある。
【００３０】
本明細書に説明されるエンドリソソーム標的化コンジュゲートの例は、ＨＥＲ２又は前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）のような細胞表面分子に結合するように構成される、標的化成分を含む。特に代表的なエンドリソソーム標的化コンジュゲートは中性近辺のｐＨにおいて５００ｎＭ未満の親和性でＨＥＲ２又はＰＳＭＡのような細胞表面分子に結合する場合がある。
【００３１】
本明細書に説明されるエンドリソソーム標的化コンジュゲートの例は、ＰＳのような細胞表面分子に結合するように構成される、標的化成分を含む。特に代表的なＰＤＣｓは中性近辺のｐＨにおいて５００ｎＭ未満の親和性でＰＳのような細胞表面分子に結合する場合がある。
【００３２】
ＨＥＲ２及びＰＳＭＡは、腫瘍上で過剰発現される細胞表面受容体であり、従って十分に特性化された腫瘍標的である。本開示のこのエンドリソソーム標的化コンジュゲートは、前立腺幹細胞関連抗原のようなこれらの受容体又は細胞表面分子を標的化することに制限されず、ＥｐＣＡＭ、ｃ−ＭＥＴ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、グリピカン−２、ＣＤ５６、インスリン様成長因子受容体１、腫瘍内皮マーカー８（ＴＥＭ−８）、ＣＤ４６及び他の多くの標的が本開示を読んで当業者により同定可能である。
【００３３】
ＰＳは、正常細胞の原形質膜の内葉内に存在するが、腫瘍微小環境における酸化ストレス及び炎症因子に反応して癌内皮細胞の膜の外葉上に露出されるようになる。ネズミのモデルにおける研究に基づき、ＰＳの露出は腫瘍血管系に関する「普遍的な」マーカーであると思われる。典型的に、腫瘍血管の半分未満がＰＳ陽性であり、放射線及び化学療法により露出は増加し得る。腫瘍内皮の他に、ＰＳは黒色腫、乳癌、前立腺癌及び腎癌を含む多くの非アポトーシス性癌細胞上にも露出することが報告されている。
【００３４】
従って、標的化成分は細胞表面受容体その他の細胞表面分子に特異的に結合するように構成される、いずれのタイプの分子も含むことができる。そのような分子にはタンパク質、タンパク質フラグメント、リボ核酸又はデオキシリボ核酸のようなポリヌクレオチド、ポリペプチド、多糖類、脂質、アミノ酸、ペプチド、糖類及び／或いは本開示を読んで当業者により同定可能な他の小分子又は大分子及び／或いはポリマーが含まれることができる。
【００３５】
図１に示される通り、エンドリソソーム標的化コンジュゲート２０は標的化成分２０Ｔ及びカーゴ成分２０Ｃを含む。カーゴ成分に黒丸により示される薬物又は標識が結合して
いる。は細胞１０の表面上の細胞表面受容体その他の分子３０に可逆的に結合する場合がある。この結合は典型的に約６．８より高く且つ約７．５未満のｐＨのような中性近辺のｐＨにおいて起こり、それはそれが細胞外空間４０の典型的なｐＨだからである。細胞表面受容体又は細胞表面分子への結合は、典型的な細胞外Ｃａ２＋濃度（約２ｍＭ）においても起こり得る。エンドリソソーム標的化コンジュゲート２０が結合した細胞表面受容体又は分子３０は、エンドソーム５０中への受容体媒介吸収を介して細胞１０内に内在化する。エンドリソソーム標的化コンジュゲート２０と細胞表面受容体その他の分子３０の複合体は初期又は後期エンドソーム内で、これらの区画内の酸性のｐＨ（約ｐＨ５．０から約ｐＨ６．５まで）又は低いＣａ２＋濃度（約２μＭ）の故に受容体その他の分子３０から解離する。従って、受容体又は細胞表面分子３０は再循環エンドソーム６０内で細胞表面に再循環して戻され、エンドリソソーム標的化コンジュゲート２０が再負荷される場合があるが、エンドソームにより（ｅｎｄｏｓｏｍａｌｌｙ）解離したエンドリソソーム標的化コンジュゲート２０はリソソームに進入し、フラグメントに分解する（７０）。エンドリソソーム標的化コンジュゲートは細胞外空間内の条件下で細胞表面受容体その他の分子に結合するように構成され、細胞中に内在化したエンドリソソーム標的化コンジュゲートの少なくとも１０％がエンドソーム又は後期エンドソーム中で解離する。
【００３６】
図２に示される通り、標的化成分８０及びカーゴ成分９０（黒丸により示される薬物その他の標識が結合した）を含むエンドリソソーム標的化コンジュゲートは、細胞１０の表面上の細胞表面受容体その他の分子３０に可逆的に結合する場合がある。標的化成分８０とカーゴ成分９０の会合は、典型的に６．８より高く且つ７．５未満のｐＨのような中性近辺のｐＨにおいて起こり、それはそれが細胞外空間４０の典型的なｐＨだからである。標的化成分８０とカーゴ成分９０の会合は、細胞外Ｃａ２＋濃度（約２ｍＭ）においても起こり得る。エンドリソソーム標的化コンジュゲートが結合した細胞表面受容体又は分子８０は、エンドソーム５０中への受容体媒介吸収を介して細胞１０内に内在化する。標的化成分８０とカーゴ成分９０は初期又は後期エンドソーム内で、これらの区画内の酸性のｐＨ（典型的にｐＨ６．８未満）又は低いＣａ２＋濃度（約２μＭ）の故に解離する。従って、受容体又は細胞表面分子に結合した標的化成分８０は再循環エンドソーム６０内で細胞表面に再循環して戻され、カーゴ成分９０が再負荷される場合があるが、エンドソームにより解離したカーゴ成分９０はリソソームに進入し、フラグメントに分解する（７０）。エンドリソソーム標的化コンジュゲートは細胞外空間内の条件下で細胞表面受容体その他の分子に結合するように構成され、細胞中に内在化したカーゴ成分の少なくとも１０％がエンドソーム又は後期エンドソーム中で解離する。
【００３７】
本開示に従うエンドリソソーム標的化コンジュゲートは、中性近辺のｐＨ又は細胞外Ｃａ２＋濃度において標的化成分を介して細胞表面受容体／分子に特異的に結合するように構成される。本明細書で用いられる「特異的に結合する」という用語は、標的化成分と細胞表面受容体／分子の間の検出可能な選択的分子間相互作用を指す。例えば特異的に結合するために、標的化成分は標的とされている細胞表面受容体又は細胞表面分子との検出可能な相互作用を示す必要があり、一方で他の細胞表面受容体又は細胞表面分子との検出可能な相互作用を示さないか、あるいは、ずっと低い親和性相互作用を示すことが必要である。特異的な結合の検出法は、ＥＬＩＳＡ及び当業者により同定され得る他の方法のように当該技術分野内で既知である。
【００３８】
従ってエンドリソソーム標的化コンジュゲートは、連結したカーゴ成分が標的とされる細胞表面受容体その他の標的とされる細胞表面分子を発現する細胞中に内在化し、その後細胞内で分解することを可能にする。
【００３９】
エンドリソソーム標的化コンジュゲートは少なくとも第１標的化成分及び第２標的化成分を含むことができ、ここで第１標的化成分の抗体Ｆａｂフラグメント、一本鎖Ｆｖ（ｓ
ｃＦｖ）、ナノボディー、タンパク質又はタンパク質フラグメントは第２標的化成分の抗体Ｆａｂフラグメント、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ナノボディー、タンパク質又はタンパク質フラグメントと異なる。従って少なくとも第１標的化成分及び第２標的化成分を含むエンドリソソーム標的化コンジュゲートは２種類の細胞表面受容体又は細胞表面分子に結合することができる。
【００４０】
さらにエンドリソソーム標的化コンジュゲートは、ヒトに投与される場合にエンドリソソーム標的化コンジュゲートへの免疫反応の可能性を避けるか、あるいは、低下させるために、ヒト又はヒト化タンパク質又はタンパク質フラグメントを含有する場合がある。標的化成分及びカーゴ成分は、ヒトへのエンドリソソーム標的化コンジュゲートの投与のために、好ましくはヒトタンパク質又はタンパク質フラグメントである。標的化成分及びカーゴ成分は、ヒトへのエンドリソソーム標的化コンジュゲートの投与のために、好ましくはヒト抗体、抗体フラグメント又はヒトアルブミン若しくはアルブミンフラグメントのようなヒトタンパク質又はタンパク質フラグメント或いはヒト化抗体又はヒト化抗体フラグメントである。エンドリソソーム標的化コンジュゲートをヒト以外の動物における使用のために開発する場合、その動物に由来するか、あるいは、それと免疫学的に適合性であるように改変されたタンパク質又はタンパク質フラグメントを代わりに用いる場合がある。
【００４１】
図３Ａは、酸性エンドソームｐＨにおける（又はエンドソームＣａ２＋濃度における）より高い親和性で中性近辺のｐＨにおいて（又は細胞外Ｃａ２＋濃度において）細胞表面タンパク質又は細胞表面分子に結合するように構成される、抗体のＦａｂフラグメント（１００）を含む代表的なエンドリソソーム標的化コンジュゲート（２０ａ）の略図である。Ｆｃフラグメント（１１０）はホモダイマー（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒｉｃ）である。当業者が理解する通り、ＩｇＧのＦｃフラグメントは抗体のＹ形の基部の全部であり、それはスルフヒドリル架橋ヒンジ領域ならびにＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。この例では、カーゴ分子（１２０）がシステイン残基への化学的コンジュゲート化を介してヒンジ領域に結合している。
【００４２】
図３Ｂは、酸性エンドソームｐＨにおける（又はエンドソームＣａ２＋濃度における）より高い親和性で中性近辺のｐＨにおいて（又は細胞外Ｃａ２＋濃度において）細胞表面タンパク質又は細胞表面分子に結合するように構成される、抗体のｓｃＦｖフラグメント（２６０）を含む代表的なエンドリソソーム標的化コンジュゲート（２０ｂ）の略図である。Ｆｃフラグメント（１１０）はホモダイマー性である。この例では、カーゴ分子（１２０）がシステイン残基への化学的コンジュゲート化を介してヒンジ領域に結合している。
【００４３】
図３Ｃは、酸性エンドソームｐＨにおける（又はエンドソームＣａ２＋濃度における）より高い親和性で中性近辺のｐＨにおいて（又は細胞外Ｃａ２＋濃度において）細胞表面タンパク質又は細胞表面分子に結合するように構成される、抗体可変ドメイン又はフラグメント（１３０）を含む代表的なエンドリソソーム標的化コンジュゲート（２０ｃ）の略図である。Ｆｃフラグメント（１１０）はホモダイマー性である。この例では、カーゴ分子（１２０）がシステイン残基への化学的コンジュゲート化を介してヒンジ領域に結合している。
【００４４】
抗体可変領域１３０は、細胞表面受容体又は細胞表面分子に結合するように構成される、抗体の非可変領域の部分を含む場合がある。例えば抗体可変領域１３０はシングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）又はラクダ由来ＶＨＨドメイン（通常ナノボディーとも呼ばれる）の場合がある。そのような可変領域は２個の逆平行βシートを含む免疫グロブリンドメインの折り畳み全体（ｏｖｅｒａｌｌ  ｆｏｌｄ）を有し、且つ当業者が同定可能な他のものの中でもＴ細胞受容体可変ドメイン、抗体の定常領域ドメイン又は補助受容体、ＣＤ４
のドメインのような免疫グロブリンスーパーファミリー（ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）の他のメンバーからのドメインも含むことができる。抗体可変領域は、ペプチドリンカーにより軽鎖可変（ＶＬ）ドメインに連結されてｓｃＦｖフラグメント（２６０）を形成する重鎖可変（ＶＨ）ドメインのヘテロダイマーを含むこともできる。ＶＨ及びＶＬドメインを連結するために用いられるリンカー配列は当業者に周知であり、ＶＨドメインのＣ末端をＶＬドメインのＮ末端に連結するＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ［（Ｇ４Ｓ）３］配列を含む。類似のリンカー配列を用いてＶＬドメインのＣ末端をＶＨドメインのＮ末端に連結することができる。ｐＨ依存性、Ｃａ２＋依存性などを以て細胞表面受容体その他の細胞表面分子に結合するｓｃＦｖｓは、ファージディスプレー、酵母ディスプレーその他の抗体ディスプレー法を用いてｓｃＦｖｓのライブラリから単離され得る。エンドリソソーム標的化コンジュゲートの標的化成分は当業者に既知の他の方法の中でもファージディスプレー又は酵母ディスプレーを用いてＦａｂフラグメントのライブラリから単離され得る抗体のＦａｂフラグメントを含む場合がある。ナノボディー、ｓｃＦｖｓ及びＦａｂフラグメントに関し、相補性決定領域（ＣＤＲｓ）中の残基を無作為に突然変異させるか、あるいは、エラープローンポリメラーゼ連鎖反応を用い、突然変異したナノボディー又は可変ドメインのライブラリを形成し、続いて選択することにより、標的とされる細胞表面受容体又は細胞表面分子に関する所望の結合性（ｐＨ依存性、Ｃａ２＋依存性）をさらに向上させることができる。標的とされる代表的なＣＤＲ残基は軽鎖可変ドメインのＣＤＲ３（残基８９−９７、Ｋａｂａｔナンバリング）及び重鎖可変ドメインのＣＤＲ３（残基９５−１０２、Ｋａｂａｔナンバリング）中のものである。これらのライブラリをファージ又は酵母上にディスプレーし（ｄｉｓｐｌａｙｅｄ）、当業者に既知の方法を用いて所望の結合挙動を有する変異体を選択することができる。
【００４５】
図３Ｄは、酸性エンドソームｐＨにおける（又はエンドソームＣａ２＋濃度における）より高い親和性で中性近辺のｐＨにおいて（又は細胞外Ｃａ２＋濃度において）細胞表面タンパク質又は細胞表面分子に結合するように構成される、抗体のＦａｂフラグメント（１００）を含む代表的なエンドリソソーム標的化コンジュゲート（２０ｄ）の略図である。Ｆａｂフラグメントは免疫グロブリンＣＨ３ドメイン（１４０）に連結してホモダイマーを形成する。この例では、カーゴ分子（１２０）がシステイン残基への化学的コンジュゲート化を介してヒンジ領域に結合している。
【００４６】
図３Ｅは、酸性エンドソームｐＨにおける（又はエンドソームＣａ２＋濃度における）より高い親和性で中性近辺のｐＨにおいて（又は細胞外Ｃａ２＋濃度において）細胞表面タンパク質又は細胞表面分子に結合するように構成される、抗体のｓｃＦｖフラグメント（２６０）を含む代表的なエンドリソソーム標的化コンジュゲート（２０ｅ）の略図である。ｓｃＦｖフラグメントは免疫グロブリンＣＨ３ドメイン（１４０）に連結してホモダイマーを形成する。この例では、カーゴ分子（１２０）がシステイン残基への化学的コンジュゲート化を介してヒンジ領域に結合している。
【００４７】
図３Ｆは、酸性エンドソームｐＨにおける（又はエンドソームＣａ２＋濃度における）より高い親和性で中性近辺のｐＨにおいて（又は細胞外Ｃａ２＋濃度において）細胞表面タンパク質又は細胞表面分子に結合するように構成される、抗体可変ドメイン又はフラグメント（１３０）を含む代表的なエンドリソソーム標的化コンジュゲート（２０ｆ）の略図である。タンパク質フラグメント又はドメインは免疫グロブリンＣＨ３ドメイン（１４０）に連結してホモダイマーを形成する。この例では、カーゴ分子（１２０）がシステイン残基への化学的コンジュゲート化を介してヒンジ領域に結合している。
【００４８】
図３Ｇは、酸性エンドソームｐＨにおける（又はエンドソームＣａ２＋濃度における）より高い親和性で中性近辺のｐＨにおいて（又は細胞外Ｃａ２＋濃度において）細胞表面タンパク質又は細胞表面分子に結合するように構成される、抗体可変ドメイン又はフラグ
メント（１３０）を含む代表的なエンドリソソーム標的化コンジュゲート（２０ｇ）の略図である。抗体可変ドメイン又はフラグメントはアルブミン又はアルブミンフラグメント（１５０）に連結し、それはそれが向上した親和性で新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合するように突然変異するか、あるいは、修飾される場合がある。例えばエラープローンＰＣＲならびにそれに続く酵母又はファージ上における突然変異アルブミン変異体のライブラリのディスプレー及び親和性がより高い変異体の選択を用い、（ヒト血清）アルブミンのＦｃＲｎ結合ドメイン（ＤＩＩＩ）中に突然変異を挿入することができる。あるいはまた、アルブミン：ＦｃＲｎ境界面におけるか、あるいは、その近辺の残基を突然変異させ、結合親和性が向上したアルブミン変異体を選択するか、あるいは、それに関してスクリーニングすることにより、親和性がより高い変異体を生むことができる。図３Ｇはアルブミン又はアルブミンフラグメント１５０の末端位置における抗体可変ドメイン又はフラグメント（１３０）を示しているが、それは代わりに非末端位置にある場合もある。抗体可変ドメイン又はフラグメントは、化学反応を介する結合又はペプチドリンカーを介する結合を含むいずれかの適した方法でアルブミン又はアルブミンフラグメント１５０に融合する場合がある。この例では、カーゴ分子（１２０）がシステイン又はリシンのような露出アミノ酸に化学的コンジュゲート化を介して結合している。
【００４９】
図３Ｈ及び図３Ｉに示される代表的な略図において、図３Ｇに示される抗体可変ドメイン又はフラグメント１３０はＦａｂフラグメント１００（図３Ｈ）又はｓｃＦｖフラグメント２６０（図３Ｉ）により置き換えられ、それらは酸性エンドソームｐＨにおける（又はエンドソームＣａ２＋濃度における）より高い親和性で中性近辺のｐＨにおいて（又は細胞外Ｃａ２＋濃度において）細胞表面タンパク質又は細胞表面分子に結合するように構成されている。この例では、カーゴ分子（１２０）がシステイン又はリシンのような露出アミノ酸に化学的コンジュゲート化を介して結合している。
【００５０】
図３Ｊは、酸性エンドソームｐＨにおける（又はエンドソームＣａ２＋濃度における）より高い親和性で中性近辺のｐＨにおいて（又は細胞外Ｃａ２＋濃度において）細胞表面タンパク質又は細胞表面分子に結合するように構成される、タンパク質フラグメント又はドメイン（１６０）を含む代表的なエンドリソソーム標的化コンジュゲート（２０ｊ）の略図である。タンパク質フラグメント又はドメインはＦｃフラグメント１１０のＮ末端に連結してホモダイマーを形成する。この例では、カーゴ分子（１２０）がシステイン残基への化学的コンジュゲート化を介してヒンジ領域に結合している。
【００５１】
図３Ｋ及び図３Ｌに示される代表的な略図において、タンパク質フラグメント又はドメイン（１６０）はＦｃフラグメント（１１０）のＣ末端に連結してホモダイマーを形成する（図３Ｋ）か、あるいは、Ｆｃフラグメント（１１０）のＮ及びＣ末端の両方に連結してホモダイマーを形成する（図３Ｌ）。この例では、カーゴ分子（１２０）がシステイン残基への化学的コンジュゲート化を介してヒンジ領域に結合している。
【００５２】
図３Ｍは、酸性エンドソームｐＨにおける（又はエンドソームＣａ２＋濃度における）より高い親和性で中性近辺のｐＨにおいて（又は細胞外Ｃａ２＋濃度において）細胞表面タンパク質又は細胞表面分子に結合するように構成される、タンパク質フラグメント又はドメイン（１６０）を含む代表的なエンドリソソーム標的化コンジュゲート（２０ｍ）の略図である。タンパク質フラグメント又はドメインはＦｃフラグメント（１７０）のＮ及びＣ末端に連結し、それはタンパク質フラグメント又はドメインのない別のＦｃフラグメント１８０とヘテロ二量化するように構成され、図３Ｍに示されるヘテロダイマー性エンドリソソーム標的化コンジュゲート２０ｍを生ずる。図３Ｎは、タンパク質フラグメント又はドメイン（１６０）がＦｃフラグメント（１７０）のＣ末端に融合している代表的なＰＤＣ又はＬＣ２０ｎの略図を示す。図３Ｍ及び３Ｎに示される例では、カーゴ分子（１２０）がシステイン残基への化学的コンジュゲート化を介してヒンジ領域に結合している
。両方のＦｃフラグメントが融合タンパク質フラグメント又はドメイン（１６０）を有するか或いは融合タンパク質又はタンパク質ドメインを有していないＦｃフラグメントホモダイマーを避けるために、ノブズイントゥーホールズ突然変異（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）（例えばＭｏｏｒｅ，Ｇ．Ｌ．，Ｂａｕｔｉｓｔａ，Ｃ．，Ｐｏｎｇ，Ｅ．，Ｎｇｕｙｅｎ，Ｄ．Ｈ．，Ｊａｃｉｎｔｏ，Ｊ．，Ｅｉｖａｚｉ，Ａ．，Ｍｕｃｈｈａｌ，Ｕ．Ｓ．，Ｋａｒｋｉ，Ｓ．，Ｃｈｕ，Ｓ．Ｙ．，Ｌａｚａｒ，Ｇ．Ａ．，（２０１１）．Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ
ｆｏｒｍａｔ  ｅｎａｂｌｅｓ  ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｂｉｖａｌｅｎｔ  ａｎｄ  ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ  ｃｏ−ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｔａｒｇｅｔ  ａｎｔｉｇｅｎｓ．ＭＡｂｓ  ３，５４６−５５７に説明されているような）及び／又は静電ステアリング突然変異（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ｓｔｅｅｒｉｎｇ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）（例えばＧｕｎａｓｅｋａｒａｎ，Ｋ．，Ｐｅｎｔｏｎｙ，Ｍ．，Ｓｈｅｎ，Ｍ．，Ｇａｒｒｅｔｔ，Ｌ．，Ｆｏｒｔｅ，Ｃ．，Ｗｏｏｄｗａｒｄ，Ａ．，Ｎｇ，Ｓ．Ｂ．，Ｂｏｒｎ，Ｔ．，Ｒｅｔｔｅｒ，Ｍ．，Ｍａｎｃｈｕｌｅｎｋｏ，Ｋ．，Ｓｗｅｅｔ，Ｈ．，Ｆｏｌｔｚ，Ｉ．Ｎ．，Ｗｉｔｔｅｋｉｎｄ，Ｍ．，Ｙａｎ，Ｗ．（２０１０）  Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｃ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ｓｔｅｅｒｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｎｄ  ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ  ＩｇＧ．Ｊ．ＢｉｏｌＣｈｅｍ．２８５，１９６３７−１９６４６に説明されているような）を用い、ヘテロダイマー形成を促進するようにエンドリソソーム標的化コンジュゲートを設計することができる。ヘテロダイマーの形成のために、（例えばＺｈｏｕ，Ｌ．，Ｗａｎｇ，Ｈ−Ｙ．，Ｔｏｎｇ，Ｓ．，Ｏｋａｍｏｎｏ，Ｃ．Ｔ．，Ｓｈｅｎ，Ｗ−Ｃ．，Ｚａｒｏ，Ｊ．Ｌ．（２０１６）
Ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｃ−ｄｉｍｅｒ−ｈｕｍａｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｒ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，１１７，２４−３１に説明されているような）抗原−Ｆｃ融合体のＣ末端と第２のＦｃフラグメントのＮ末端の間における（Ｇ４Ｓ）１３リンカーペプチドの挿入のような他の方法を用いることもできる。ノブズイントウホールズ突然変異、静電ステアリング突然変異及び／その他の突然変異を含むエンドリソソーム標的化コンジュゲートの例のＤＮＡ配列及びタンパク質配列を実施例１４に記載する。
【００５３】
ノブズイントウホールズ突然変異の例には、当業者が同定可能な他のものの中でも（例えばＭｏｏｒｅ，Ｇ．Ｌ．，Ｂａｕｔｉｓｔａ，Ｃ．，Ｐｏｎｇ，Ｅ．，Ｎｇｕｙｅｎ，Ｄ．Ｈ．，Ｊａｃｉｎｔｏ，Ｊ．，Ｅｉｖａｚｉ，Ａ．，Ｍｕｃｈｈａｌ，Ｕ．Ｓ．，Ｋａｒｋｉ，Ｓ．，Ｃｈｕ，Ｓ．Ｙ．，Ｌａｚａｒ，Ｇ．Ａ．，（２０１１）  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒｍａｔ  ｅｎａｂｌｅｓ  ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｂｉｖａｌｅｎｔ  ａｎｄ  ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ  ｃｏ−ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｔａｒｇｅｔ  ａｎａｔｉｇｅｎｓ．ＭＡｂｓ  ３，５４６−５５７に説明されているような）Ｙ３４９Ｔ／Ｔ３９４Ｆ：Ｓ３６４Ｈ／Ｆ４０５Ａ及びＹ３４９Ｔ／Ｆ４０５Ｆ：Ｓ３６４Ｈ／Ｔ３９４Ｆならびに（例えばＡｔｗｅｌｌ，Ｓ．，Ｒｉｄｇｗａｙ，Ｊ．Ｂ．Ｂ．，Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．，Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ（１９９７）  Ｓｔａｂｌｅ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｓ  ｆｒｏｍ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｔｈｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  ｏｆ  ａ  ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂａｒｙ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７０，２６−３５に説明されているような）Ｔ３６６Ｗ：Ｔ３６６Ｓ：Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖが含まれる。これらの代表的なノブズイントウホールズ突然変異の残基のナンバリング（ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）は、当業者が理解する通り、ＥＵ抗体ナンバリングシステムを指す。
【００５４】
静電ステアリング突然変異の例には、当業者が同定可能な他のものの中でも（例えばＧ
ｕｎａｓｅｋａｒａｎ，Ｋ．，Ｐｅｎｔｏｎｙ，Ｍ．，Ｓｈｅｎ，Ｍ．，Ｇａｒｒｅｔｔ，Ｌ．，Ｆｏｒｔｅ，Ｃ．，Ｗｏｏｄｗａｒｄ，Ａ．，Ｎｇ，Ｓ．Ｂ．，Ｂｏｒｎ，Ｔ．，Ｒｅｔｔｅｒ，Ｍ．，Ｍａｎｃｈｕｌｅｎｋｏ，Ｋ．，Ｓｗｅｅｔ，Ｈ．，Ｆｏｌｔｚ，Ｉ．Ｎ．，Ｗｉｔｔｅｋｉｎｄ，Ｍ．，Ｙａｎ，Ｗ．（２０１０）  Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｃ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ｓｔｅｅｒｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｎｄ  ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ  ＩｇＧ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８５，１９６３７−１９６４６に説明されているような）Ｅ３５６Ｋ／Ｄ３９９Ｋ：Ｋ３９２Ｄ／Ｋ４０９Ｄ及びＫ４０９Ｄ／Ｋ３７０Ｄ：Ｄ３５７Ｋ／Ｄ３９９Ｋが含まれる。これらの代表的な静電ステアリング突然変異の残基のナンバリングは、当業者が理解する通り、ＥＵ抗体ナンバリングシステムを指す。
【００５５】
図３Ｏは、カルビンジンのドメイン２（ＣａｌＤ２、１９０）に融合した抗体のＦａｂフラグメント（２１０）を含む代表的なエンドリソソーム標的化コンジュゲート（２０ｏ）の略図である。Ｆｃフラグメント（１１０）はカルビンジンのドメイン１（ＣａｌＤ１、２００）に融合している。ＣａｌＤ１（２００）とＣａｌＤ２（１９０）とは、細胞外Ｃａ２＋濃度においてそれより低いエンドソームＣａ２＋濃度におけるより高い親和性で互いに会合する。他の例にはＦａｂフラグメント（２１０）又はＦｃ（１１０）に融合し、Ｃａ２＋又はｐＨ依存的やり方で互いに会合するタンパク質又はタンパク質フラグメント（１９０、２００）が含まれる場合がある。Ｃａ２＋依存的やり方で相互作用するタンパク質の他の例は、（例えばＭｉｙａｗａｋｉ，Ａ．，Ｌｌｏｐｉｓ，Ｊ．，Ｈｅｉｍ，Ｒ．，ＭｃＣａｆｆｅｒｙ，Ｊ．Ｍ．，Ａｄａｍｓ，Ｊ．Ａ．，Ｉｋｕｒａ，Ｍ．，Ｔｓｉｅｎ，Ｒ．Ｙ．  （１９９７）  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｃａ２＋  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ．  Ｎａｔｕｒｅ，３８８，８８２−８８７に説明されているような）カルモジュリン及びカルモジュリン結合ペプチドＭ１３、（例えばＳｅｅｍａｎ，Ｊ．，Ｗｅｂｅｒ，Ｋ．，Ｇｅｒｋｅ，Ｖ．  （１９９６）  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ａｎｎｅｘｉｎ  Ｉ−Ｓ１００Ｃ  ｃｏｍｐｌｅｘ−ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３１９，１２３−１２９、Ｍａｌｌｉａｒｄ，Ｗ．Ｓ．，Ｈａｉｇｌｅｒ，Ｈ．Ｔ．，Ｓｃｈｌａｅｐｆｅｒ，Ｄ．Ｄ．  （１９９５）  Ｃａｌｃｉｕｍ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  Ｓ１００Ｃ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｉ．  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２，７１９−７２５に説明されているような）Ｓ１００Ｃ及びアネキシンＩのＮ末端の１３個の残基、（例えばＭａｕｒｅｒ，Ｐ．，Ｈｏｈｅｎａｄｌ，Ｃ．，Ｈｏｈｅｎｅｓｔｅｒ，Ｅ．，Ｇｏｈｒｉｎｇ，Ｗ．，Ｔｉｍｐｌ，Ｒ．，Ｅｎｇｅｌ，Ｊ．  （１９９５）  Ｔｈｅ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ＢＭ−４０（ＳＰＡＲＣ／Ｏｓｔｅｏｎｅｃｔｉｎ）ｉｓ  ａｎ  ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓｌｙ  ｆｏｌｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｔｈａｔ  ｂｉｎｄｓ  ｃａｌｃｉｕｍ  ａｎｄ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ＩＶ．  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５３，３４７−３５７に説明されているような）オステオネクチン及びコラーゲンＩＶである。エンドリソソーム標的化コンジュゲートの他の例において、図３Ｏに示されるＦａｂフラグメントは、図３Ｐにおいて示される通りｓｃＦｖフラグメント（２２０）により又は図３Ｑに示される通り抗体可変ドメイン、フラグメント若しくはナノボディー（２３０）により置き換えられる。図３Ｏ、３Ｐ及び３Ｑに示される例において、カーゴ分子（１２０）はシステイン残基への化学的コンジュゲート化を介してヒンジ領域に結合している。
【００５６】
図３Ｒは、酸性エンドソームｐＨにおける（又はエンドソームＣａ２＋濃度における）より高い親和性で中性近辺のｐＨにおいて（又は細胞外Ｃａ２＋濃度において）２種の細
胞表面タンパク質又は細胞表面分子に結合するように構成される、２個の抗体のＦａｂフラグメント（１００、２４０）を含む代表的なエンドリソソーム標的化コンジュゲート（２０ａ）の略図である。Ｆｃフラグメント（１７０、１８０）はそれぞれ異なるＦａｂフラグメント（１００、２４０）に融合してヘテロダイマーを形成する。ヘテロダイマー形成は（例えばＭｏｏｒｅ，Ｇ．Ｌ．，Ｂａｕｔｉｓｔａ，Ｃ．，Ｐｏｎｇ，Ｅ．，Ｎｇｕｙｅｎ，Ｄ．Ｈ．，Ｊａｃｉｎｔｏ，Ｊ．，Ｅｉｖａｚｉ，Ａ．，Ｍｕｃｈｈａｌ，Ｕ．Ｓ．，Ｋａｒｋｉ，Ｓ．，Ｃｈｕ，Ｓ．Ｙ．，Ｌａｚａｒ，Ｇ．Ａ．，（２０１１）．Ａ
ｎｏｖｅｌ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒｍａｔ  ｅｎａｂｌｅｓ  ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｂｉｖａｌｅｎｔ  ａｎｄ  ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ  ｃｏ−ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｔａｒｇｅｔ  ａｎｔｉｇｅｎｓ．ＭＡｂｓ  ３，５４６−５５７に説明されているような）ノブズイントゥーホールズ突然変異及び／又は（例えばＧｕｎａｓｅｋａｒａｎ，Ｋ．，Ｐｅｎｔｏｎｙ，Ｍ．，Ｓｈｅｎ，Ｍ．，Ｇａｒｒｅｔｔ，Ｌ．，Ｆｏｒｔｅ，Ｃ．，Ｗｏｏｄｗａｒｄ，Ａ．，Ｎｇ，Ｓ．Ｂ．，Ｂｏｒｎ，Ｔ．，Ｒｅｔｔｅｒ，Ｍ．，Ｍａｎｃｈｕｌｅｎｋｏ，Ｋ．，Ｓｗｅｅｔ，Ｈ．，Ｆｏｌｔｚ，Ｉ．Ｎ．，Ｗｉｔｔｅｋｉｎｄ，Ｍ．，Ｙａｎ，Ｗ．（２０１０）  Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｃ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ｓｔｅｅｒｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｎｄ  ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ  ＩｇＧ．Ｊ．ＢｉｏｌＣｈｅｍ．２８５，１９６３７−１９６４６に説明されているような）静電ステアリング突然変異により駆動される（ｂｅ  ｄｒｉｖｅｎ）場合がある。図３Ｓに示される別の例において、図３Ｒに示されるＦａｂフラグメントは２個のｓｃＦｖフラグメント（２５０、２６０）により置き換えられ、それらは酸性エンドソームｐＨにおける（又はエンドソームＣａ２＋濃度における）より高い親和性で中性近辺のｐＨにおいて（又は細胞外Ｃａ２＋濃度において）２種の細胞表面タンパク質又は細胞表面分子に結合するように構成される。図３Ｒ及び３Ｓに示される例では、カーゴ分子（１２０）がシステイン残基への化学的コンジュゲート化を介してヒンジ領域に結合している。
【００５７】
図３Ａ−図３Ｓに示される例において、エンドリソソーム標的化コンジュゲートはＦａｂフラグメント、ｓｃＦｖｓ又はナノボディーを含む標的化成分及び細胞傷害性薬物又は放射性標識若しくは蛍光標識のような画像化標識のようなカーゴ分子に連結したＦｃフラグメント、Ｆｃのサブフラグメント（例えばＣＨ２ドメイン）又はアルブミンを含むカーゴ成分を有する。図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ、３Ｅ、３Ｆ、３Ｊ、３Ｋ、３Ｌ、３Ｍ、３Ｎ、３Ｏ、３Ｐ、３Ｑ、３Ｒ及び３Ｓ中に示されるカーゴ分子は、１個以上のシステイン残基を介してヒンジ領域に結合している。他の例において１個以上のカーゴ分子が、当業者により同定可能な他の方法の中でもアミンからアミン（ａｍｉｎｅ−ｔｏ−ａｍｉｎｅ）（ＮＨＳエステル）、スルフヒドリルからスルフヒドリル（マレイミド）、アミンからスルフヒドリル（ＮＨＳエステル／マレイミド）、スルフヒドリルから炭水化物（マレイミド／ヒドラジド）又は所望の化学反応性を有する非天然アミノ酸を介する結合のような当業者に既知の種々の化学を介してカーゴ成分に結合することができる。非天然アミノ酸を標的化成分の組換え体生産の際に挿入する場合がある。図３Ｒ及び図３Ｓに示される例のような他の例において、標的化成分は２種以上の標的に結合する場合がある。標的化成分のそれぞれは、ヘテロダイマー形成を駆動するためにノブズイントゥーホールズ突然変異及び／又は静電ステアリング突然変異を有するＦｃフラグメントに融合する場合がある。
【００５８】
図３Ｊ、３Ｋ、３Ｌ、３Ｍ及び３Ｎに示される例において、エンドリソソーム標的化コンジュゲートは例えばＰＳ結合ドメインをヒトＩｇＧ１のＦｃフラグメントその他のＦｃフラグメントに融合させることにより作られるＰＳ標的化薬剤を含む場合がある。例えば標的化成分を、細胞傷害性薬物を含むカーゴ成分にコンジュゲート化し、エンドリソソー
ム標的化コンジュゲートＰＤＣｓを作製する場合があるか、あるいは、標的化成分を、放射性標識、蛍光標識又は近赤外標識のような画像化標識を含むカーゴ成分にコンジュゲート化させてエンドリソソーム標的化コンジュゲートＬＣｓを作製する場合がある。従って本明細書に説明されるエンドリソソーム標的化コンジュゲートは、例えばＣａ２＋依存的やり方でＰＳと相互作用するＰＳ結合ドメインを用いることにより、エンドソーム内のＣａ２＋レベルにおける有意な低下に暴露されると標的細胞表面分子から解離するように構成される、タンパク質或いはタンパク質フラグメント又はドメインを含む場合がある。例えばエンドリソソーム標的化コンジュゲートＰＤＣ又はＬＣはＦｃ−Ｓｙｔ１のような標的化成分を含むことができる。Ｆｃ−Ｓｙｔ１を含むエンドリソソーム標的化コンジュゲートＰＤＣは例えば図３Ｊ、３Ｋに示されるように２価又は図３Ｌに示されるように４価の場合がある。
【００５９】
エンドリソソーム標的化コンジュゲートは、融合タンパク質を有していないＦｃフラグメントとヘテロダイマーを形成するＦｃフラグメントに融合した１個の標的化ドメインを含む場合がある。ヘテロダイマー形成を促進するために、図３Ｍ及び３Ｎにおける例に示される通り、ノブズイントゥーホールズ突然変異及び／又は静電ステアリング突然変異を用いてＦｃフラグメントを改変する場合がある。
【００６０】
本明細書に説明されるいくつかの例において、標的化成分とカーゴ成分は共有結合的に連結しておらず、代わりに非共有結合的に互いに会合する改変されたドメインへの連結を介して互いに会合するように構成される。特に非共有結合的会合は、細胞外空間における化学的環境と接触する場合にエンドリソソーム区画における場合より強い親和性を有する場合がある。例えば改変されたドメインはカルビンジンドメイン１（ＣａｌＤ１）及びカルビンジンドメイン２（ＣａｌＤ２）のようなものを含む場合がある。ＣａｌＤ１とＣａｌＤ２は細胞外Ｃａ２＋濃度で互いに結合するがエンドソームＣａ２＋濃度で結合しない（実施例６を参照されたい）。Ｃａ２＋依存的やり方で相互作用するタンパク質の他の例は、（例えばＭｉｙａｗａｋｉ，Ａ．，Ｌｌｏｐｉｓ，Ｊ．，Ｈｅｉｍ，Ｒ．，ＭｃＣａｆｆｅｒｙ，Ｊ．Ｍ．，Ａｄａｍｓ，Ｊ．Ａ．，Ｉｋｕｒａ，Ｍ．，Ｔｓｉｅｎ，Ｒ．Ｙ．  （１９９７）  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｃａ２＋
ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ
ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ．  Ｎａｔｕｒｅ，３８８，８８２−８８７に説明されているような）カルモジュリン及びカルモジュリン結合ペプチドＭ１３、（例えばＳｅｅｍａｎ，Ｊ．，Ｗｅｂｅｒ，Ｋ．，Ｇｅｒｋｅ，Ｖ．  （１９９６）  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ａｎｎｅｘｉｎ  Ｉ−Ｓ１００Ｃ  ｃｏｍｐｌｅｘ−ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３１９，１２３−１２９、Ｍａｌｌｉａｒｄ，Ｗ．Ｓ．，Ｈａｉｇｌｅｒ，Ｈ．Ｔ．，Ｓｃｈｌａｅｐｆｅｒ，Ｄ．Ｄ．（１９９５）  Ｃａｌｃｉｕｍ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  Ｓ１００Ｃ  ｔｏ
ｔｈｅ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｉ．  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２，７１９−７２５に説明されているような）Ｓ１００Ｃ及びアネキシンＩのＮ末端の１３個の残基、（例えばＭａｕｒｅｒ，Ｐ．，Ｈｏｈｅｎａｄｌ，Ｃ．，Ｈｏｈｅｎｅｓｔｅｒ，Ｅ．，Ｇｏｈｒｉｎｇ，Ｗ．，Ｔｉｍｐｌ，Ｒ．，Ｅｎｇｅｌ，Ｊ．  （１９９５）  Ｔｈｅ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ＢＭ−４０（ＳＰＡＲＣ／Ｏｓｔｅｏｎｅｃｔｉｎ）ｉｓ  ａｎ  ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓｌｙ
ｆｏｌｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｔｈａｔ  ｂｉｎｄｓ  ｃａｌｃｉｕｍ  ａｎｄ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ＩＶ．  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５３，３４７−３５７に説明されているような）オステオネクチン及びコラーゲンＩＶである。そのようなドメインを含有するいくつかの形状の例を図３Ｏ、３Ｐ及び３Ｑに示すが、他の形状が可能である。
【００６１】
エンドリソソーム標的化コンジュゲートは異なる数の標的化成分及びカーゴ成分を含む
場合がある。本開示を読んで複数の他の形状が当業者により同定可能であるので、図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ、３Ｅ、３Ｆ、３Ｇ、３Ｈ、３Ｉ、３Ｊ、３Ｋ、３Ｌ、３Ｍ、３Ｎ、３Ｏ、３Ｐ、３Ｑ、３Ｒ及び３Ｓに示される形状は例であり、制限ではない。
【００６２】
本明細書に説明されるいくつかの例において、エンドリソソーム標的化コンジュゲートはバリン−シトルリン−ＰＡＢリンカーを介してコンジュゲート化したモノメチルアウリスタチン（ＭＭＡＥ）のような毒素を含む場合がある。エンドリソソーム標的化コンジュゲートは、例えば中性近辺のｐＨにおいて酸性エンドソームｐＨにおけるより高い親和性でＨＥＲ２のような細胞表面分子に結合する抗体を含む場合がある（ＨＥＲ２−ＡＤＣｓ、実施例２−５を参照されたい）。本明細書に説明される改変された抗体及びタンパク質を哺乳類細胞により高い収率で発現させ、高い効率で薬物とコンジュゲート化させることができる。ＨＥＲ２陽性細胞に結合すると、代表的なＨＥＲ２−ＡＤＣｓは初期エンドソーム内に内在化し、そこでｐＨは中性近辺から約ｐＨ５．５−６．５に低下する。このｐＨにおける低下はＨＥＲ２−ＡＤＣｓを初期／選別エンドソーム膜から解離させ、ＭＭＡＥ薬物の有効なリソソーム送達に導く。特に例えば（例えば図４Ｂを参照されたい）ペルツズマブ変異体ＳＧ及びＹＳはｐＨ５．８において１．５μＭより高い解離定数を有するが、ＷＴペルツズマブは同じｐＨにおいてもっとずっと低い解離定数を有する。従ってＨＥＲ２−ＡＤＣｓは有効にＨＥＲ２陽性細胞を全滅させることができ、ＨＥＲ２発現乳癌のマウスモデルにおいてＨＥＲ２−ＡＤＣｓを用いる処置は不利な影響の徴候なく腫瘍成長を有効に抑制することができる。
【００６３】
本明細書に説明される別の例において、エンドリソソーム標的化コンジュゲートは、マレイミドカプロイルバリン−シトルリン−ＰＡＢリンカーを介してＭＭＡＥにコンジュゲート化した抗体のＦｃ領域のようなカーゴ成分に融合したシナプトタグミン１（Ｓｙｔ１）のＣ２ＡドメインのようなＰＳ結合ドメインを含む標的化成分を有する（ＰＳ−ＰＤＣｓ、実施例７−１３を参照されたい）。ＰＳ標的化タンパク質も哺乳類細胞により高い収率で発現させ、高い効率で薬物とコンジュゲート化させることができる。代表的なＰＳ−ＰＤＣｓはカルシウム依存的やり方で特異的にＰＳに結合するように構成される。ＰＳ陽性細胞に結合すると、ＰＳ−ＰＤＣｓは初期エンドソーム内に有効に内在化し、そこでカルシウムレベルは２ｍＭから２μＭ未満に低下する。このカルシウム濃度の低下はＰＳ−ＰＤＣｓを初期／選別エンドソーム膜から解離させ、ＭＭＡＥ薬物の有効なリソソーム送達に導く。ＰＳ−ＰＤＣｓは、腫瘍内皮細胞、乳癌及び前立腺癌細胞を含むがこれらに限られないＰＳ陽性細胞を有効に全滅させることができる。ＰＳ−ＰＤＣｓを用いる処置は、ヒトトリプルネガティブ乳癌ならびに前立腺癌のマウスモデルにおいて、不利な影響の徴候なく腫瘍成長を有効に抑制することができるが、非コンジュゲート化タンパク質は薬効を有していない。ＰＳは癌内皮細胞ならびにストレスが加えられた（ｓｔｒｅｓｓｅｄ）腫瘍細胞に関する普遍的なマーカーであるので、ＰＤＣｓをほとんどの充実性腫瘍の処置に適用することができる。
【００６４】
ｐＨ依存的又はＣａ２＋依存的やり方で標的細胞表面分子に結合する本明細書に説明されるエンドリソソーム標的化コンジュゲートの標的化成分を、免疫グロブリン可変ドメイン、ｓｃＦｖｓ（ＶＨ及びＶＬドメインがＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳのようなリンカーペプチドにより互いに連結されているＶＨ：ＶＬヘテロダイマー）又はＦａｂフラグメントのライブラリから、ファージディスプレー、酵母ディスプレー又は当業者により同定可能な他の方法を用いて単離することができる。これらのライブラリは天然に存在する抗体可変遺伝子に由来することができるか、相補性決定領域（ＣＤＲｓ）がランダム化オリゴヌクレオチド配列を用いて作られる「半合成」ライブラリを生ずる方法を用いて作成され得るか、又は現存する抗体のＶＨ及びＶＬドメイン遺伝子からＣＤＲｓ中へのランダム突然変異の挿入により誘導されることができる。エラープローンＰＣＲを用いて又はヒスチジン残基に向かう傾向（ｂｉａｓｅｓ）を用いて（ｐＨ依存性のため）ＣＤＲｓにお
いてランダム突然変異を挿入し、続いてファージディスプレー又は酵母ディスプレーを用いて選択することができる。標的とされる代表的なＣＤＲ残基は軽鎖可変ドメインのＣＤＲ３（残基８９−９７、Ｋａｂａｔナンバリング）及び重鎖可変ドメインのＣＤＲ３（残基９５−１０２、Ｋａｂａｔナンバリング）中のものである。所望のｐＨ依存性又はＣａ２＋依存性を有するｓｃＦｖｓ又はＦａｂフラグメントの選択は、当業者に既知の方法を用いて行われ得る。さらに、ｐＨ依存性結合剤の単離のために、ＣＤＲ残基を系統的にヒスチジンに突然変異させ、得られるＦａｂ又はｓｃＦｖフラグメントを過剰発現させ、例えば表面プラスモン共鳴又はＥＬＩＳＡｓを用いて標的への結合に関して分析することができる。
【００６５】
本明細書に説明されるエンドリソソーム標的化コンジュゲートは標的化成分（例えばＦａｂフラグメント又はｓｃＦｖフラグメント）の数における変動を有する場合があり、それは１−４個の標的化成分の範囲である（図３）。これらの標的化成分は免疫グロブリンＦｃフラグメント又はアルブミンのような他のタンパク質に連結されている場合があり、融合タンパク質、ドメイン又はフラグメントの間に、長さ及び組成において様々であるリンカー配列、例えば当業者により同定可能な他のリンカー配列の中でもＧＧＧＧＳ又はそのリンカーの２−３回の繰り返しを含む。ＣａｌＤ１又はＣａｌＤ２のようなドメインを類似のリンカーを用いて標的化成分及びカーゴ成分に連結することもできる。エンドリソソーム標的化コンジュゲートのＦｃフラグメントは、標的化成分が連結している及び連結していないＦｃフラグメントのヘテロダイマーが形成されるように、ノブズイントゥーホールズ及び／又は静電ステアリング突然変異のような突然変異を有する場合もある。
【００６６】
タンパク質の寸法を減少させながらＦｃ領域が引き出す治療的機能及び生体内持続性（ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ）を保持している抗体のＦｃ領域に標的化成分を融合させる場合がある。他の例において、アルブミン（又はＤＩＩＩ）と再循環受容体ＦｃＲｎとの相互作用の故に長期間生体内持続性を有するアルブミン又はアルブミンのドメインＩＩＩによりＦｃ領域を置き換える場合がある。
【００６７】
本明細書に説明される代表的なエンドリソソーム標的化コンジュゲートＡＤＣｓ及びＰＤＣｓは、毒素の細胞内放出の向上を介して癌細胞の殺害における薬効の向上を示す（実施例３−５、９−１３を参照されたい）。代表的な細胞傷害性薬物、ＭＭＡＥの他に、当業者が同定可能な薬物の中でもマイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）、ツブリシン（ｔｕｂｕｌｙｓｉｎ）、ベンゾジアゼピン、デュオカルマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ）のような他の細胞傷害性薬物を用いる場合がある。化学的コンジュゲート化を介して薬物をカーゴ成分の抗体フラグメント、抗体ドメイン、ナノボディー、タンパク質、タンパク質フラグンメント又はタンパク質ドメインにコンジュゲート化させる場合がある。用いられる場合がある化学的カップリングの例は当業者により同定可能な他の方法の中でもアミンからアミン（ＮＨＳエステル）、スルフヒドリルからスルフヒドリル（マレイミド）、アミンからスルフヒドリル（ＮＨＳエステル／マレイミド）、スルフヒドリルから炭水化物（マレイミド／ヒドラジド）又は所望の化学反応性を有する非天然アミノ酸を介する結合である。非天然アミノ酸を標的化成分の組換え体生産の間に挿入する場合がある。化学的にコンジュゲート化されたタンパク質、タンパク質フラグメントその他の分子の間にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）スペーサーを挿入する場合がある。カテプシンのようなレジデントプロテアーゼ（ｒｅｓｉｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅａｓｅ）による後期エンドソーム又はリソソーム内における細胞傷害性薬物の放出を可能にするために、バリン−シトルリンのようなリンカーは開裂可能な場合がある。トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）−ＤＭ１の場合のように連結が開裂可能でない場合、薬物を放出するために抗体をタンパク質分解させる場合がある。連結の化学、連結の部位及びペプチドの選択を分子モデリングにより導くことができ、当業者が理解する通り、細胞表面受容体その他の細胞表面分子に関するＡＤＣ又はＰＤＣの結合活性の損失を最小にするように設計する
ことができる。
【００６８】
当業者が同定可能な画像化標識をカーゴ成分の抗体フラグメント、抗体ドメイン、タンパク質、タンパク質フラグメント又はタンパク質ドメインにコンジュゲート化させることにより、エンドリソソーム標的化コンジュゲートＬＣｓのカーゴ成分を作製することができる。画像化標識の制限ではない例にはＩＲＤｙｅ８００ＣＷのような近赤外染料或いはＩ−１２４、Ｃｕ−６４又はＺｒ−８９のような放射性標識が含まれる。Ｃｕ−６４又はＺｒ−８９へのコンジュゲート化は、当業者が同定可能な他の方法の中でもこれらの放射性標識をキレート化する１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）へのキレート化を介して達成され得る。
【００６９】
さらなる例において、エンドリソソーム標的化コンジュゲートのカーゴ成分は細胞傷害性放射性標識（例えばイットリウム−９０、Ｙ−９０又はヨウ素−１３１、Ｉ−１３１）或いは標的とされる細胞の挙動を改変する薬物その他の薬剤の場合がある。例えば薬物はアンドロゲン受容体（ＡＲ）に関する拮抗性リガンド（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ  ｌｉｇａｎｄ）の場合があり、ＡＲ活性を下方調節するために用いられ得る。
【００７０】
標的細胞その他の細胞に関連する「挙動」という用語は、標的細胞その他の細胞の表現型又は遺伝子型に関する活性、機能、出力或いは他の属性又は作用を指す場合がある。本開示を読んで当業者が理解する通り、一般に特定の標的細胞に関する治療効果、細胞傷害効果などのような効果を生むために薬物その他の薬剤を用いることができる。
【００７１】
本明細書に説明されるいくつかの例において、エンドリソソーム標的化コンジュゲートは、配列番号２プラス配列番号４、配列番号６プラス配列８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８プラス配列番号２０プラス配列番号２２、配列番号２２プラス配列番号２４プラス配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２プラス配列番号４４、配列番号４６プラス配列番号４８又はそれらの相同体のアミノ酸配列を含む場合がある。
【００７２】
エンドリソソーム標的化コンジュゲートは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８と少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む場合がある。
【００７３】
本明細書で用いられる場合、２本の核酸又はポリペプチド配列の状況における「配列同一性」又は「同一性」は、特定される比較ウィンドウにわたって最大対応（ｍａｘｉｍｕｍ  ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ）に関して並べられると同じである２本の配列におけるヌクレオチド塩基又は残基を指す。タンパク質への言及において配列同一性又は類似性のパーセンテージが用いられる場合、同一でない残基の位置は多くの場合に同類アミノ酸置換により異なることが認識され、同類アミノ酸置換ではアミノ酸残基が類似の物理化学的性質を有するアミノ酸残基の機能的に同等の残基で置換され、従って分子の機能的性質を変化させない。
【００７４】
本明細書で用いられるアミノ酸の機能的に同等の残基は、典型的には最初のアミノ酸に実質的に類似の物理化学的及び立体化学的特性を有する他のアミノ酸残基を指す。物理化学的性質には水溶性（疎水性又は親水性）、誘電的及び電気化学的性質、生理学的ｐＨ、側鎖の部分的電荷（正、負又は中性）及び当業者が同定可能な他の性質が含まれる。立体
化学的特性には、アミノ酸の空間的及びコンフォーメーション的配置ならびにそれらのキラリティーが含まれる。例えばグルタミン酸は、本開示の意味においてアスパラギン酸に機能的に同等の残基であると考えられる。チロシン及びトリプトファンは、フェニルアラニンに機能的に同等の残基と考えられる。アルギニンはリシンに機能的に同等の残基と考えられる。
【００７５】
当業者は、典型的に２本のポリペプチド又はポリヌクレオチド配列を並べて整列配列を形成し、次いで２本の整列配列の間で一致する文字、すなわち類似又は同一の文字の数を検出し、一致する文字の合計数を、ギャップを含む各ポリペプチド又はポリヌクレオチド配列中の整列文字の合計数で割って計算する段階を含む方法により、配列間の類似性が測定されることを理解するであろう。類似性の結果は同一性のパーセンテージとして表される。
【００７６】
本明細書で用いられる場合、「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウにわたる２本の最適整列配列の比較により決定される値を意味し、ここでポリヌクレオチド配列の比較ウィンドウ中の部分は２本の配列の最適整列のための参照配列（付加又は欠失を含まない）と比較して付加又は欠失（ギャップ）を含む場合がある。パーセンテージは、両配列中に同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が存在する位置の数を決定して一致する位置の数を与え、一致する位置の数を比較のウィンドウ中の位置の合計数で割り、結果を１００倍して配列同一性のパーセンテージを与えることにより計算される。
【００７７】
本明細書で用いられる場合、「参照配列」は配列比較のための基礎として用いられる定義された（ｄｅｆｉｎｅｄ）配列である。参照配列は、例えば全長タンパク質又はタンパク質フラグメントの切片として特定される配列のサブセット又は全体の場合がある。参照配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ及びＵｎｉｐｒｏｔ及び当業者が同定可能な他のようなデータベースにおいて同定され得る配列であることができる。
【００７８】
当業者が理解する通り、いずれの２本の配列間のパーセント同一性の決定も、数学的アルゴリズムを用いて行うことができる。配列同一性の決定のための配列の比較のために、適した数学的アルゴリズムのコンピューターインプリメンテーションを用いることができる。そのようなインプリメンテーションには、当業者が同定可能な他のものの中でもＣＬＵＳＴＡＬ、ＡＬＩＧＮ、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡが含まれるがこれらに限られない。
【００７９】
例えば本開示に従うエンドリソソーム標的化コンジュゲートは、配列番号２、配列番号４、配列番号６又は配列番号８又は配列番号１０又は配列番号１２又は配列番号１４又は配列番号１６又は配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２又は配列番号３４又は配列番号３６又は配列番号３８又は配列番号４０又は配列番号４２又は配列番号４４又は配列番号４６又は配列番号４８と比較して少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む場合がある。
【００８０】
本明細書に説明されるエンドリソソーム標的化コンジュゲートは組成物中において与えられる場合があり、それはエンドリソソーム標的化コンジュゲート及び医薬上許容され得るビヒクルを含む。
【００８１】
本明細書に説明されるエンドリソソーム標的化コンジュゲート又はその組成物を、当業者が同定可能な他の方法の中でも注入（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、特に静脈内、皮下又は筋肉内注射を介するような１個の細胞、複数の細胞又は多細胞生物、特に動物又はヒトそし
て特に１個以上の腫瘍を有する場合がある動物又はヒトのような対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）にそれらを送達するための適した方法を用いて投与する場合がある。
【００８２】
本明細書に説明されるエンドリソソーム標的化コンジュゲート又はその組成物を癌の処置方法において用いる場合がある。前記方法は、有効用量のエンドリソソーム標的化コンジュゲート又はその組成物を患者に投与することを含み、ここでカーゴ分子は細胞傷害性薬物であり、組成物の投与は患者における腫瘍の成長を抑制する。
【００８３】
本明細書に説明されるエンドリソソーム標的化コンジュゲート又はその組成物を患者における腫瘍の画像化方法において用いる場合がある。前記方法は、カーゴ分子が画像化標識である有効用量のエンドリソソーム標的化コンジュゲート組成物を患者に投与する段階と、患者における画像化標識の検出に適した画像化方法を行う段階を含む。前記方法において組成物の投与は、当業者が同定可能である通り、画像化方法により検出可能な画像化標識の十分な濃度を与えるのに有効な用量で行われる。
【００８４】
本明細書に説明されるエンドリソソーム標的化コンジュゲート又はその組成物を適した時間間隔で、例えば毎週、毎月又は例えば患者の５０％が腫瘍退縮を示したと予想されるときにいつでも投与する場合がある。
【００８５】
診断用／セラノスティック画像化において、放射性標識、近赤外標識又は蛍光標識のような画像標識を含むエンドリソソーム標的化コンジュゲートＬＣの患者への投与に、患者における標的細胞の局在化、例えば患者における腫瘍局在化を許すための１−７日間が続く場合があると思われる。この期間に続き、ポジトロン放射断層撮影あるいは局部（ｌｏｃａｌｉｚｅｄ）又は全身画像化のような他の適した画像化様式を用いて患者を画像化し、腫瘍のような標的細胞の位置の検出を可能にする場合がある。
【００８６】
本明細書に説明されるエンドリソソーム標的化コンジュゲートを、特定の細胞タイプを選択的に標的とし、それにより選ばれた標的細胞にカーゴ分子を送達するように設計する場合がある。特に本明細書に説明されるエンドリソソーム標的化コンジュゲートを、患者中の特定のタイプの腫瘍細胞を標的とするように設計する場合がある。従って本明細書に説明されるエンドリソソーム標的化コンジュゲートを与える方法は、（１）標的化成分を選択する段階であって、ここで標的化成分は腫瘍標的細胞のような選ばれたタイプの細胞上の細胞表面分子に選択的に結合するように構成される、抗体、抗体フラグメント、抗体ドメイン、ナノボディー、タンパク質、タンパク質フラグメント又はタンパク質ドメインを含み、ここで標的化成分はエンドリソソーム区画におけるより高い親和性で細胞外空間において標的細胞上に発現される細胞表面分子に結合するように構成される、段階と、（２）カーゴ成分を選択する段階であって、ここでカーゴ成分はカーゴ分子にコンジュゲート化した抗体、抗体フラグメント、抗体ドメイン、ナノボディー、タンパク質、タンパク質フラグメント又はタンパク質ドメインを含み、ここでカーゴ分子は例えば選ばれたタイプの腫瘍標的細胞の成長を抑制するための薬効を有する細胞傷害性薬物又は選ばれた腫瘍細胞の画像化に適した画像化標識の場合がある、段階と、（３）カーゴ成分に直接又は間接的に融合した標的化成分を含むエンドリソソーム標的化コンジュゲートを与える段階とを含む場合がある。
【００８７】
あるいはまた、患者における癌の処置及び／又は腫瘍の画像化のためのエンドリソソーム標的化コンジュゲートを与える方法は、（１）標的化成分を選択する段階であって、ここで標的化成分は選ばれたタイプの腫瘍標的細胞上の細胞表面分子に選択的に結合するように構成される、抗体、抗体フラグメント、ナノボディー、タンパク質、タンパク質フラグメント又はタンパク質ドメインを含む、段階と、（２）カーゴ成分を選択する段階とを含む場合があり、ここでカーゴ成分はカーゴ分子にコンジュゲート化した抗体、抗体フラ
グメント、抗体ドメイン、ナノボディー、タンパク質、タンパク質フラグメント又はタンパク質ドメインを含み、ここでカーゴ分子は例えば選ばれたタイプの腫瘍標的細胞の成長を抑制するための薬効を有する細胞傷害性薬物又は選ばれた腫瘍細胞の画像化に適した画像化標識である。特に前記方法において、本明細書に説明される通り、標的化成分はさらに第１タンパク質ドメインを含むように改変され、カーゴ成分はさらに第２タンパク質ドメインを含むように改変され、第１タンパク質ドメインはエンドリソソーム区画におけるより高い親和性で細胞外空間において第２ドメインに結合するように構成される。
【実施例】
【００８８】
以下の制限ではない実施例は、本明細書に開示されるエンドリソソーム標的化コンジュゲート及び方法をさらに例示するために与えられる。以下の実施例において開示される方法は本発明の実施において十分に機能することが見出された方法を代表し、かくしてその実施のための様式の例を構成すると考えられ得ることが当業者により認識されるべきである。しかしながら当業者は本開示を見て、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、開示される特定の実施例内で多くの変更を成し、それでも同様又は類似の結果を得ることができることを認識するべきである。
【実施例１】
【００８９】
材料及び方法
細胞系及び培養条件。マウス内皮細胞系２Ｈ１１（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ−２１６３）を、５％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）が補足されたＤｕｌｂｅｃｃｏの修正Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。ヒト乳癌細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＡＴＣＣ，ＨＴＢ−２６）を１０％ＦＢＳが補足されたＤＭＥＭ中で培養した。ヒト乳癌細胞系Ｔ−４７Ｄ（ＡＴＣＣ，ＨＴＢ−１３３）、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３（ＡＴＣＣ，ＨＴＢ−１３１）及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＡＴＣＣ，ＨＴＢ−１３２）を１０％ＦＢＳが補足されたＲＰＭＩ  １６４０培地中で培養した。ヒト乳癌細胞系ＳＫ−ＢＲ−３（ＡＴＣＣ，ＨＴＢ−３０）及びヒト卵巣癌細胞系ＳＫ−ＯＶ−３（ＡＴＣＣ，ＨＴＢ−７７）を１０％ＦＢＳが補足されたＭｃＣｏｙの５Ａ培地中で培養した。ヒト前立腺癌細胞系ＬＮＣａＰ及び２２Ｒｖ１（ＡＴＣＣ，それぞれＣＲＬ−１７４０及びＣＲＬ−２５０５）を１０％ＦＢＳが補足されたＲＰＭＩ  １６４０培地中で培養した。ヒト乳癌細胞系ＨＣＣ１９５４（Ｇａｚｄａｒ，Ａ．Ｆ．，Ｋｕｒｖａｒｉ，Ｖ．，Ｖｉｒｍａｎｉ，Ａ．，Ｇｏｌｌａｈｏｎ，Ｌ．，Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，Ｍ．，Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ，Ｍ．，Ｋｏｄａｇｏｄａ，Ｄ．，Ｓｔａｓｎｙ，Ｖ．，Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｈ．Ｔ．，Ｗｉｓｔｕｂａ，Ｉ．Ｉ．，Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｇ．，Ｔｏｎｋ．，Ｖ，Ａｓｈｆａｑ．，Ｒ．，Ｌｅｉｔｃｈ，Ａ．Ｍ．，Ｍｉｎｎａ，Ｊ．Ｄ．，Ｓｈａｙ，Ｊ．Ｗ．  （１９９８）  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｉｒｅｄ  ｔｕｍｏｒ  ａｎｄ  ｎｏｎ−ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  ｆｒｏｍ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．７８，７６６−７７４）を１０％ＦＢＳが補足されたＲＰＭＩ  １６４０培地中で培養した。すべての癌細胞系はＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａｒｉｚｏｎａ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｅ（ＵＡＧＣ）によりＤＮＡ指紋法（ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ）を用いて認証された。細胞を３７℃において５％ＣＯ２を用いて培養した。タンパク質発現のために用いられるＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号Ａ１４６３５）をＥｘｐｉ２９３発現培地中で３７℃において８％ＣＯ２及び８０％湿度を用いて培養した。
【００９０】
抗体、抗体−薬物コンジュゲート及びデキストラン。この研究において以下の抗体を用いた、ラット抗マウスＬＡＭＰ１、マウス抗ヒトＬＡＭＰ１及びマウス抗ベータチューブリン抗体（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ，クローン番号（ｃｌｏｎｅ＃）１Ｄ４Ｂ、Ｈ４Ａ３及びＥ７）、マウス抗ヒトＥＥＡ１
及びラット抗マウスＣＤ３１抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，カタログ番号６１０４５６及び５５７３５５）、ＨＲＰとコンジュゲート化したヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８とコンジュゲート化したロバ抗ラット（Ｈ＋Ｌ）抗体及びＣｙ３とコンジュゲート化したロバ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，カタログ番号１０９−０３５−００３、７１２−５４５−１５３及び７０９−１６５−１４９）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５とコンジュゲート化したヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８とコンジュゲート化したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７とコンジュゲート化したヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号Ａ２１４３３、Ａ１１０２９及びＡ２１４４５）、ウサギ抗ヒトＫｉ−６７抗体（Ａｂｃａｍ，カタログ番号９２７４２）。トラスツズマブ−ＤＭ１（Ｔ−ＤＭ１，Ｋａｄｃｙｌａ（登録商標））をＵＴ  Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ｄａｌｌａｓ）から得た。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７−標識デキストラン、１０ｋＤａ分子量をＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した（カタログ番号Ｄ２２９１４）。
【００９１】
タンパク質−薬物コンジュゲートの生産のための発現構築物の作製。対照として用いるために、鶏卵リゾチーム特異的ヒトＩｇＧ１、ＨｕＬｙｓ１０（Ｆｏｏｔｅ，Ｊ．，Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．  （１９９２）  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｏｏｐｓ．  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４，４８７−４９９）のヒンジ領域（重鎖の残基２１５−４４７、ＥＵナンバリング）を含むＦｃ領域を、マウスＩｇＧ重鎖に由来するＮ末端リーダーペプチドを有するｐｃＤＮＡ３．４ベクター中にクローニングした（Ｆｏｏｔｅ，Ｊ．，Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．  （１９９２）  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｏｏｐｓ．  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４，４８７−４９９、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．  （１９８３）  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  ｉｎｔｏ
ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ．  ＥＭＢＯ  Ｊ．２：１３７３−１３７８）。類似して、ＨｕＬｙｓ１０抗体の重鎖及び軽鎖遺伝子（ｃＤＮＡ）をコードする遺伝子をｐｃＤＮＡ３．４中にクローニングした。ＩｇＧ重鎖及び軽鎖構築物の調節のために、ＨｕＬｙｓ１０の重鎖中のＣｙｓ２２０（ＥＵナンバリング）とスルフヒドリル架橋を形成する軽鎖中のＣｙｓ２１４（ＥＵナンバリング）の両方を、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号２００５２３）を用いてセリン残基に突然変異させた。
【００９２】
ヒトアネキシンＡ１（ＡｎｘＡ１）、ヒトシナプトタグミン１（Ｓｙｔ１）及びヒトＰＫＣαに関するｃＤＮＡクローンをＯｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入した（それぞれクローンＩＤ：３４５９６１５、クローンＩＤ：６１８７９０２及びクローンＩＤ：４００２８３０５）。ＡｎｘＡ１  ＰＳ結合コアドメイン（アミノ酸４１−３４６）、Ｓｙｔ１  ＰＳ結合Ｃ２Ａドメイン（アミノ酸１４１−２６６）及びＰＫＣα  ＰＳ結合Ｃ２ドメイン（アミノ酸１５７−２８８）をコードする遺伝子を、マウスＩｇＧ重鎖に由来するリーダーペプチドを有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域のＣＨ３ドメイン（残基２１５−４４７、ＥＵナンバリング）にＧｌｙ４Ｓｅｒリンカー配列を介して融合させた（Ｆｏｏｔｅ，Ｊ．，Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．（１９９２）  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋ
ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｏｏｐｓ．  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４，４８７−４９９、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．  （１９８３）  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｈｅａｖｙ  
ｃｈａｉｎ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  ｉｎｔｏ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ．  ＥＭＢＯ  Ｊ．２：１３７３−１３７８）。すべてのＦｃ融合構築物においてヒンジ領域中のＣｙｓ２２０（ＥＵナンバリング）を突然変異させ、ヒンジ当たりに２個のシステイン残基があるようにした。Ｆｃ融合体をコードする遺伝子をｐｃＤＮＡ３．４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号１４３０８）中にクローニングした。
【００９３】
Ｓｙｔ１−Ｆｃ−Ｓｙｔ１の作製のために、Ｓｙｔ１  ＰＳ結合Ｃ２Ａドメイン（アミノ酸１４１−２６６）をＦｃ−Ｓｙｔ１構築物のヒンジ領域のＮ末端にＧｌｙ４Ｓｅｒリンカー配列を介して連結した。マウスＩｇＧ重鎖に由来するリーダーペプチド（Ｆｏｏｔｅ，  Ｊ．，Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．  （１９９２）  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ
ｔｈｅ  ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｏｏｐｓ．  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４，４８７−４９９、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．  （１９８３）  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｈｅａｖｙ
ｃｈａｉｎ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  ｉｎｔｏ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ．  ＥＭＢＯ  Ｊ．２：１３７３−１３７８）をヒンジ連結Ｓｙｔ１  ＰＳ結合Ｃ２ＡドメインのＮ末端に付加し、得られるＦｃ融合体をｐｃＤＮＡ３．４ベクター中にクローニングした。Ｓｙｔ１  Ｃ２ＡドメインのＰＳ結合を低下させる突然変異（Ｄ１７３Ｎ、Ｄ１７９Ｎ、Ｄ２３１Ｎ、Ｄ２３３Ｎ及びＤ２３９Ｎ）（Ｓｔｒｉｅｇｅｌ，Ａ．Ｒ．，Ｂｉｅｌａ，Ｌ．Ｍ．，Ｅｖａｎｓ，Ｃ．Ｓ．，Ｗａｎｇ，Ｚ．，Ｄｅｌｅｈｏｙ，Ｊ．Ｂ．，Ｓｕｔｔｏｎ，Ｒ．Ｂ．，Ｃｈａｐｍａｎ，Ｅ．Ｒ．  ａｎｄ  Ｒｅｉｓｔ，Ｎ．Ｅ．  ２０１２．  Ｃａｌｃｉｕｍ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｙ  ｓｙｎａｐｔｏｔａｇｍｉｎ’ｓ  Ｃ２Ａ  ｄｏｍａｉｎ  ｉｓ  ａｎ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｅｌｅｍｅｎｔ
ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ｓｗｉｔｃｈ  ｔｈａｔ  ｔｒｉｇｇｅｒｓ  ｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ．  Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ３２，１２５３−１２６０）をＳｙｔ１−Ｆｃ構築物中に挿入し、Ｆｃ−Ｓｙｔ１（ＤＮ）を作製し、ｐｃＤＮＡ３．４ベクター中にクローニングした。すべての構築物は分子生物学の標準的な方法及び設計されたオリゴヌクレオチドを用いて作製された。
【００９４】
抗体−薬物コンジュゲートのための発現構築物の作製。ＨＥＲ２特異的抗体、ペルツズマブの重鎖可変ドメイン及びペルツズマブ軽鎖可変ドメインをコードする合成遺伝子（Ｆｒａｎｋｌｉｎ，Ｍ．Ｃ．，Ｃａｒｅｙ，Ｋ．Ｄ．，Ｖａｊｄｏｓ，Ｆ．Ｆ．，Ｌｅａｈｙ，Ｄ．Ｊ．，ｄｅ  Ｖｏｓ，Ａ．Ｍ．，Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ，Ｍ．Ｘ．  （２００４）
Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ＥｒｂＢ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＥｒｂＢ２−ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ  ｃｏｍｐｌｅｘ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，４，３１７−３２８）をＧｅｎｅｓｃｒｉｐｔから購入し、ヒト重鎖定常領域ドメイン１（ＣＨ１）及びヒト軽鎖定常ドメイン（カッパ鎖、Ｃκ）を含有するＦａｂフラグメント生産のための発現ベクター中にクローニングした。ヒスチジンスキャンニング（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ  ｓｃａｎｎｉｎｇ）のための標的とするべき（ｔｏ  ｔａｒｇｅｔ）ペルツズマブ重鎖及び軽鎖可変ドメイン中の残基を同定するために、抗原、ＨＥＲ２との複合体におけるペルツズマブの結晶構造（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｃｏｄｅ  １Ｎ８Ｚ）をＰｙＭＯＬにおいて分析した。ＨＥＲ２のドメインＩＩ中の残基（Ｆｒａｎｋｌｉｎ，Ｍ．Ｃ．，Ｃａｒｅｙ，Ｋ．Ｄ．，Ｖａｊｄｏｓ，Ｆ．Ｆ．，Ｌｅａｈｙ，Ｄ．Ｊ．，ｄｅ  Ｖｏｓ，Ａ．Ｍ．，Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ，Ｍ．Ｘ．  （２００４）  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ＥｒｂＢ
ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＥｒｂＢ２−ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ  ｃｏｍｐｌｅｘ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，４，３１７−３２８に説明されているＨｉｓ２４５、Ｖａｌ２８６、Ｓｅｒ２８８、Ｌｅｕ２９５、Ｈｉｓ２９６及びＬｙｓ３１１）と相互作用するペルツズマブのＣＤＲｓ中に位置する残
基（ＶＨドメイン：Ａｓｐ３１、Ｔｙｒ３２、Ａｓｎ５４、Ｔｙｒ６０、Ｌｅｕ１００、Ｇｌｙ１０１、Ｐｒｏ１０２、Ｓｅｒ１０３、Ｔｙｒ１０５、Ａｓｐ１０７、ＶＬドメイン：Ｔｙｒ５５、言及されるアミノ酸番号はペルツズマブ重鎖及び軽鎖可変ドメインのタンパク質配列中のものであり、他のナンバリング協定を指していない）を、オーバーラップ伸長（ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）によるスプライシング（Ｈｏｒｔｏｎ，Ｒ．Ｍ．，Ｈｕｎｔ，Ｈ．Ｄ．，Ｈｏ，Ｓ．Ｎ．，Ｐｕｌｌｅｎ，Ｊ．Ｋ．，Ｐｅａｓｅ，Ｌ．Ｒ．  （１９８９）  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｈｙｂｒｉｄ  ｇｅｎｅｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅｓ：  ｇｅｎｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｂｙ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ．  Ｇｅｎｅ  ７７，６１−６８）を用いて系統的にヒスチジンにより置き換えた。得られる遺伝子をクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ中において細胞周辺に（ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃａｌｌｙ）分泌されるＦａｂフラグメントとして発現させた。
【００９５】
ファージディスプレーベクター、ｐＨＥＮ１（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．，Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ａ．Ｄ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．，Ｃｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄ．Ｊ．，Ｈｕｄｓｏｎ，Ｐ．，Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．  （１９９１）  Ｍｕｌｔｉ−ｓｕｂｕｎｉｔ
ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｏｆ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｐｈａｇｅ：  ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  （Ｆａｂ）  ｈｅａｖｙ  ａｎｄ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎｓ．  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９，４１３３−４１３７）中でペルツズマブｓｃＦｖ遺伝子を作製するために、標準的な分子生物学の方法を用いてペルツズマブのためのＦａｂフラグメント発現ベクターを修飾し、重鎖及び軽鎖可変ドメイン遺伝子の間にリンカーペプチド［（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３］を挿入し、続いてｓｃＦｖ遺伝子をｐＨＥＮ１中に再クローニングした。ＣＤＲｓ中にランダムに突然変異した残基を有する突然変異ペルツズマブｓｃＦｖｓのライブラリを作成するために、以下のオリゴヌクレオチドを用いた。各オリゴヌクレオチドに関し、ＤＮＡ配列を５’から３’への方向で示す、ＣＤＲＨ１Ｂａｃｋ，  ＧＣＴＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＡＴＴＣＡＣＡＮＮＢＮＮＢＮＮＢＡＴＧＧＡＴＴＧＧＧＴＧＡＧＡＣＡＧＧＣＴ  （配列番号４９）、ＣＤＲＨ１Ｆｏｒ，  ＴＧＴＧＡＡＴＧＴＧＡＡＴＣＣＡＧＡＡＧＣ  （配列番号５０）、ＣＤＲＨ２Ｂａｃｋ，  ＴＧＧＧＴＧＧＣＴＧＡＴＧＴＧＡＡＴＣＣＴＮＮＢＮＮＢＮＮＢＮＮＢＴＣＴＡＴＣＴＡＣＡＡＴＣＡＧＡＧＡＴＴＣ  （配列番号５１）、ＣＤＲＨ２Ｆｏｒ，  ＡＧＧＡＴＴＣＡＣＡＴＣＡＧＣＣＡＣＣＣＡ  （配列番号５２）、ＣＤＲＨ３Ｂａｃｋ，  ＴＡＣＴＡＣＴＧＴＧＣＴＡＧＡＡＡＴＣＴＧＮＮＢＣＣＴＮＮＢＴＴＣＮＮＢＴＴＣＧＡＴＮＮＢＴＧＧＧＧＡＣＡＧＧＧＡＡＣＡＣＴＧ  （配列番号５３）、  ＣＤＲＨ３Ｆｏｒ，  ＣＡＧＡＴＴＴＣＴＡＧＣＡＣＡＧＴＡＧＴＡ  （配列番号５４）、  ＣＤＲＬ２−１Ｂａｃｋ，  ＣＣＴＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＴＣＴＮＮＢＴＣＴＮＮＢＡＧＡＮＮＢＡＣＡＧＧＡＧＴＧＣＣＴＴＣＴＡＧＡ  （配列番号５５）、ＣＤＲＬ２−１Ｆｏｒ，  ＡＧＡＧＴＡＧＡＴＣＡＧＣＡＧＣＴＴＡＧＧ  （配列番号５６）、ＣＤＲＬ２−２Ｂａｃｋ，  ＧＧＡＡＡＧＧＣＴＣＣＴＡＡＧＣＴＧＣＴＧＮＮＢＮＮＢＮＮＢＧＣＴＴＣＴＴＡＣＡＧＡＴＡＣＡＣＡＧＧＡ  （配列番号５７）、及びＣＤＲＬ２−２Ｆｏｒ５，  ＣＡＧＣＡＧＣＴＴＡＧＧＡＧＣＣＴＴＴＣＣ  （配列番号５８）。当業者に既知の分子生物学法を用い、ｓｃＦｖｓ遺伝子のライブラリを作成し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１（Ｌｕｃｉｇｅｎ，カタログ番号６０５０２）のエレクトロポレーションを用いてそれぞれの標的とされるＣＤＲに関する約５ｘ１０７個の突然変異体のライブラリを作成した。
【００９６】
ライブラリからのコロニーをプールし（ｐｏｏｌｅｄ）、Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージ（ＮＥＢ，カタログ番号Ｎ０３１５Ｓ）、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）及び５０μｇ／ｍＬのカナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）が補足された培養物に３０℃において終夜接種するのに用いた。押し出された（ｅｘｔｒｕｄｅｄ）ファージを、４％ポリエチレングリコール８０００、３％ＮａＣｌを用いる沈殿により上澄
み液から収穫した。ファージ（２ｘ１０１２ｐｆｕ／ｍＬの１００μＬ）を、４％スキムミルク／リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）がコーティングされたＭａｘｉｓｏｒｐ  ９６ウェルミクロタイタープレート（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ，カタログ番号４４−２４０４−２１）を用いて予備パンニング（ｐｒｅ−ｐａｎｎｅｄ）してから、２μｇ／ｍＬの組換えヒトＨＥＲ２（細胞外ドメイン）−Ｆｃ融合タンパク質（ＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｆｃ、Ｒ＆Ｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，カタログ番号１１２９−ＥＲ−０５０）がコーティングされたＭａｘｉｓｏｒｐ  ９６細胞プレートを用いてパンニングした（ｐａｎｎｉｎｇ）。ファージを４％スキムミルクｐＨ７．４と一緒に９６ウェルプレート中で２時間インキュベーションした。０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０が補足されたＰＢＳ  ｐＨ７．４（ＰＢＳＴ）を用いてプレートを強力に洗浄し、続いてＰＢＳ  ｐＨ７．４で洗浄した。２０ｍＭ  ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）ｐＨ５．８を用い、ｐＨ依存的結合を有するファージを室温で１０分間選択的に溶離させた。溶離したファージを用いて指数関数的に成長しているＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１に感染させた。４巡（ｆｏｕｒ  ｒｏｕｎｄｓ）のパンニングを行い、単離されたファージをｐＨ５．８におけるより高い親和性でのｐＨ７．０におけるＨＥＲ２への結合に関してスクリーニングした。選ばれたファージによりコードされる組換えｓｃＦｖｓをＥＬＩＳＡ及び／又は表面プラスモン共鳴によりＨＥＲ２への結合に関して分析した。
【００９７】
ｐＨ７．０においてｐＨ５．８におけるより高い親和性を有するペルツズマブｓｃＦｖ又はＦａｂフラグメントに関する重鎖及び軽鎖可変ドメイン遺伝子を、バックボーンベクター（ｂａｃｋｂｏｎｅ  ｖｅｃｔｏｒ）としてｐｃＤＮＡ４．３を用い、それぞれヒトＩｇＧ１重鎖及び軽鎖（Ｃκ）配列の発現のためのカセットベクター中にクローニングした。Ｃκドメインをヒンジ領域に連結するヒンジジスルフィド結合及び２本の重鎖を互いに連結する１個のヒンジジスルフィドを、軽鎖システイン（Ｃｙｓ２１４、ＥＵナンバリング）及び２個の重鎖システイン（Ｃｙｓ２２０、Ｃｙｓ２２９、ＥＵナンバリング）をセリンに突然変異させることにより重鎖及び軽鎖から除去した。
【００９８】
カルビンジンＤ９Ｋドメイン２（ＣａｌＤ２）に融合したトラスツズマブのＨＥＲ２特異的Ｆａｂフラグメントをコードする発現構築物を作製するために、トラスツズマブ重鎖及び軽鎖可変ドメインをコードする遺伝子（Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．，Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．，Ｇｏｒｍａｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｒｉｄｇｗａｙ，Ｊ．Ｂ．，Ｈｅｎｎｅｒ，Ｄ．，Ｗｏｎｇ，Ｗ．Ｌ．，Ｒｏｗｌａｎｄ，Ａ．Ｍ．，Ｋｏｔｔｓ，Ｃ．，Ｃａｒｖｅｒ，Ｍ．Ｅ．，Ｓｈｅｐａｒｄ，Ｈ．Ｍ．  （１９９２）  Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉ−ｐ１８５ＨＥＲ２  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８９，４２８５−４２８９）をＧｅｎｅｓｃｒｉｐｔにより合成した。カルビンジンＤ９Ｋ遺伝子（Ｂｅｒｇｇａｒｄ，Ｔ．，Ｊｕｌｅｎｉｕｓ，Ｋ．，Ｏｇａｒｄ，Ａ．，Ｄｒａｋｅｎｂｅｒｇ，Ｔ．，Ｌｉｎｓｅ，Ｓ．  （２００１）  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｃｏｒｅ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５，１２５７−１２６４）をＧｅｎｅｓｃｒｉｐｔにより合成し、トラスツズマブＦａｂ重鎖（ヒンジの一部を含むＶＨ−ＣＨ１−リンカー）とＣａｌＤ２ドメイン遺伝子を、オーバーラップ伸長によるスプライシングを用い、Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙリンカーで一緒に融合させた（Ｈｏｒｔｏｎ，Ｒ．Ｍ．，Ｈｕｎｔ，Ｈ．Ｄ．，Ｈｏ，Ｓ．Ｎ．，Ｐｕｌｌｅｎ，Ｊ．Ｋ．，Ｐｅａｓｅ，Ｌ．Ｒ．  （１９８９）  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｈｙｂｒｉｄ  ｇｅｎｅｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅｓ：  ｇｅｎｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｂｙ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ．  Ｇｅｎｅ  ７７，６１−６８）。ＶＨ−ＣＨ１−ＣａｌＤ２融合タンパク質遺伝子及びトラスツズマブ軽鎖（Ｃ末端ポリヒスチジンタグを有する）をコードする遺伝子をｐｃＤＮＡ３．４ベクター中に別々にクローニングした。
【００９９】
類似の方法を用いて、ＣａｌＤ２ドメインに融合したＰＳＭＡ特異的（０２６）ＶＨ−ＣＨ１−リンカーペプチドをコードする発現構築物を作製した。０２６重鎖及び軽鎖可変ドメインをコードする遺伝子（米国特許第７８５０９７１Ｂ２号明細書）をＧｅｎｅｓｃｒｉｐｔにより合成した。オーバーラップ伸長によるスプライシングにより、ＣａｌＤ２ドメイン遺伝子及び０２６  ＶＨ−ＣＨ１−リンカーを一緒に融合させ、得られる融合タンパク質遺伝子をｐｃＤＮＡ３．４中にクローニングした。Ｃ末端ポリヒスチジンタグを有する０２６軽鎖をコードする遺伝子を別のｐｃＤＮＡ３．４ベクター中にクローニングした。
【０１００】
ヒトＩｇＧ１由来Ｆｃフラグメントに融合したカルビンジンＤ９Ｋドメイン１（ＣａｌＤ１）をコードする発現構築物の作製のために、オーバーラップ伸長によるスプライシング（Ｈｏｒｔｏｎ，Ｒ．Ｍ．，Ｈｕｎｔ，Ｈ．Ｄ．，Ｈｏ，Ｓ．Ｎ．，Ｐｕｌｌｅｎ，Ｊ．Ｋ．，Ｐｅａｓｅ，Ｌ．Ｒ．  （１９８９）  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｈｙｂｒｉｄ
ｇｅｎｅｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅｓ：  ｇｅｎｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｂｙ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ．  Ｇｅｎｅ  ７７，６１−６８）を介し、Ｆｃドメイン（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３、ヒトＩｇＧ１由来）遺伝子をＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒリンカーを介してカルビンジンＤ９Ｋドメイン１遺伝子に融合させ、ｐｃＤＮＡ３．４ベクター中にクローニングした。
【０１０１】
タンパク質発現及び精製。Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＥｘｐｉ２９３発現系を用い、製造者の指示に従って組換え抗体及びＦｃ融合タンパク質を生産した。要するに、発現構築物（上記）を用いて細胞を６−７日間トランスフェクションし、タンパク質Ｇ−セファロースを用いて組換えＰＤＣｓ又はＡＤＣｓを培養上澄み液から精製した。１５０ｍＭのＮａＣｌを有する５０ｍＭのジエチルアミンを用いて結合タンパク質を溶離させた。溶離したタンパク質を２Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．０により中和し、ＰＢＳに対して透析し、濃縮し、Ｈｉｌｏａｄ  １６／６００  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ゲルろ過カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に負荷した。モノマー形態のタンパク質を分離し、濃縮し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ５／１５０ゲルろ過カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）又はＹａｒｒａ  ３μｍ  ＳＥＣ−３０００カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を用いて分析した。
【０１０２】
上記のＥｘｐｉ２９３発現系を用いてトラスツズマブＦａｂ−ＣａｌＤ２、０２６Ｆａｂ−ＣａｌＤ２及びＣａｌＤ１−Ｆｃ融合タンパク質を生産し、Ｎｉ２＋−ＮＴＡ−アガロースを用いて組換えタンパク質を培養上澄み液から精製した。
【０１０３】
Ｅ．ｃｏｌｉを宿主として用い、ペルツズマブｓｃＦｖ及びＦａｂフラグメントを組換えタンパク質として発現させた。ｓｃＦｖ及びＦａｂフラグメントを細胞周辺中に分泌させ、Ｎｉ２＋−ＮＴＡ−アガロースを用いて浸透圧刺激を与えられた（ｏｓｍｏｔｉｃａｌｌｙ  ｓｈｏｃｋｅｄ）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞から精製した。
【０１０４】
マレイミドカプロイル−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥとのタンパク質コンジュゲート化。１６モル当量（８モル当量ｘヒンジジスルフィドの数）のＴＣＥＰを室温で３時間加えてヒンジジスルフィド結合を還元することにより、ＰＢＳ中のＦｃ融合体又は対照抗体を還元した。次いで還元されたＦｃ融合体にマレイミドカプロイル−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ（ＭＣ−ＶＣ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、Ｌｅｖｅｎａ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａ，カタログ番号ＳＥＴ０２０１）を８モル当量（４モル当量ｘ遊離のシステインの数）において加え、室温で３時間インキュベーションした。コンジュゲート化反応に続き、タンパク質をＰＢＳに対して強力に透析することにより、遊離のＭＭＡＥを除去した。コンジュゲート化したＦｃ融合体又は対照抗体を４℃で保存した。
【０１０５】
ＡＤＣｓの作製のために、ヒンジジスルフィドが１個だけ存在するので８モル当量のＴＣＥＰ及び４モル当量のＭＣ−ＶＣ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥを用いる以外は類似の方法を用いた。さらに、抗体を３７℃で２時間還元した。
【０１０６】
表面プラスモン共鳴分析。ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて結合分析を行った。アミンカップリング化学を用い、ＣＭ５センサーチップのフローセルを組換えＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｆｃ（免疫グロブリンＦｃフラグメントへのＨＥＲ２細胞外ドメインの融合体）、野生型（ＷＴ）ペルツズマブ、突然変異したペルツズマブ変異体又は対照としてのカップリング緩衝液（１０ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ４．８）とカップリングさせた。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）プラス０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０及び０．０５％（ｖ／ｖ）ＮａＮ３（ｐＨ７．４、７．０、６．５及び５．８）中で２５℃において５又は１０μＬ／分の流量で、固定化されたＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｆｃ上に抗体を又は固定化された抗体上にＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｆｃを注入した。各注入の後に０．１５Ｍ  ＮａＣｌ／０．１Ｍ  グリシン（ｐＨ２．８）緩衝液を用いてフローセルを再生させた。平衡解離定数の決定のために、固定化されたＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｆｃ上に抗体を注入し、特注のソフトウェア（ｃｕｓｔｏｍ  ｗｒｉｔｔｅｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて相互作用を１：１相互作用としてモデル化し（Ｏｂｅｒ，Ｒ．Ｊ．，Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．  （２００２）  Ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．  Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３０６，２２８−２３６）、見掛けの（固定化されたＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｆｃへの抗体の２価の結合の故に）解離定数を与えた。
【０１０７】
Ｆａｂ−ＣａｌＤ２融合タンパク質とＣａｌＤ１−Ｆｃ融合タンパク質の相互作用のカルシウム依存性を調べるために、Ｆａｂ−ＣａｌＤ２を注入し、続いて種々のカルシウム濃度を含有する緩衝液中のＣａｌＤ１−Ｆｃを共注入した。特定的に、１００ｎＭのトラスツズマブＦａｂ−ＣａｌＤ２融合体を固定化されたＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｆｃ上に、ＰＢＳ，０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０，０．０５％（ｖ／ｖ）ＮａＮ３  ｐＨ７．４（ＰＢＳ＋）プラス２ｍＭ  ＣａＣｌ２中で２５℃において１０μＬ／分の流量で注入し、続いて１００ｎＭのＣａｌＤ１−Ｆｃ融合体をＰＢＳ＋プラス２ｍＭ  ＣａＣｌ２中で２５℃において１０μＬ／分の流量で注入した。解離段階の間に種々の濃度のＣａＣｌ２又はＥＤＴＡ２Ｎａを有するＰＢＳ＋を注入した。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ及び特注のソフトウェアを用いてデータを処理した。
【０１０８】
ＰＳ標的化タンパク質に関する膜脂質ストリップ結合アッセイ。脂質がコーティングされた膜ストリップ（Ｅｃｈｅｌｏｎ，カタログ番号Ｐ−６００２）を最初にＴＢＳＴ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１％Ｔｗｅｅｎ２０，ｐＨ７．５）を用いて水和させ、次いで遮断溶液（ＴＢＳＴ中に溶解された４％脂肪酸非含有ＢＳＡ）と一緒に室温で１時間インキュベーションした。タンパク質を遮断緩衝液中で２μｇ／ｍｌにおいて希釈し、膜と一緒に室温で２時間インキュベーションした。次いで脂質ストリップをＴＢＳＴで洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート化ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体を用いて結合タンパク質を検出した。
【０１０９】
抗体−薬物コンジュゲートの内在化のフローサイトメトリー分析。癌細胞を４８ウェルプレート中で平板培養し、３７℃において終夜インキュベーションした。細胞を１０ｎＭ  Ａｌｅｘａ  ４８８標識ＡＤＣｓで０．５、４及び２０時間処理した。処理された細胞を氷上で冷却し、５μｇ／ｍＬのウサギ抗Ａｌｅｘａ  ４８８抗体を用いてＡｌｅｘａ  ４８８の表面信号を４℃において３０分間クエンチングした。試料を洗浄し、トリプシン処理により収穫し、ＰＢＳ中に再懸濁させ、ＦＡＣＳ−Ａｃｃｕｒｉを用いて分析し、Ｆｌ
ｏｗＪｏ（ＦＬＯＷＪＯ，ＬＬＣ）を用いてデータを処理した。
【０１１０】
細胞内におけるＣａｌＤ１−Ｆｃの蓄積を分析するために、ＬＮＣａＰ細胞を４８ウェルプレート中で平板培養し、接着させた。次いでＬＮＣａＰ細胞を１００ｎＭ  Ａｌｅｘａ  ６４７標識ＣａｌＤ１−Ｆｃ又は１００ｎＭ  Ａｌｅｘａ  ６４７標識ＣａｌＤ１−Ｆｃプラス１００ｎＭ  ０２６  Ｆａｂ−ＣａｌＤ２の混合物で１又は２時間パルスした（ｐｕｌｓｅｄ）。細胞を洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ  カタログ番号２５２０００５６）を用いてトリプシン処理して細胞を剥がし（ｄｅｔａｃｈｅｄ）、Ａｌｅｘａ  ６４７標識ＣａｌＤ１−Ｆｃを細胞表面結合０２６  Ｆａｂ−ＣａｌＤ２から解離させた。細胞を収穫し、洗浄し、ＢＤ  Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメーターを用いて分析した。
【０１１１】
ＰＳ及びＨＥＲ２標的化薬剤の蛍光顕微鏡分析。ＰＳ標的化薬剤の細胞内局在化の研究のために、２Ｈ１１又はＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をカバーガラス（Ｚｅｉｓｓ，参照番号０１０９０３００９１）上で成長させ、成長培地中で希釈された５０ｎＭの対照ＩｇＧ（ＨｕＬｙｓ１０）又は５０ｎＭのＰＳ標的化薬剤と一緒に３時間インキュベーションした。次いで細胞をＰＢＳで洗浄し、氷冷４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を用いて室温で２０分間固定した。固定に続き、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いて細胞を透過処理し（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅｄ）、遮断緩衝液（ＰＢＳ，５％血清及び０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）と一緒に室温で３０分間インキュベーションした。マウスＬＡＭＰ−１（クローン１Ｄ４Ｂ）、ヒトＬＡＭＰ−１（クローンＨ４Ａ３）又はマウスＥＥＡ１に関して特異的な一次抗体を遮断緩衝液中で希釈し、細胞と一緒に室温で２時間インキュベーションした。次いで細胞をＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を有するＰＢＳ）で洗浄し、遮断緩衝液中で希釈された蛍光標識された二次抗体と一緒に室温で１時間インキュベーションした。内在化したＰＳ標的化薬剤の検出のために、蛍光標識されたヤギ又はロバ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体を用いた。インキュベーションに続き、細胞をＰＢＳＴで洗浄し、ＰｒｏＬｏｎｇ  Ｇｏｌｄ退色防止用封入剤（ａｎｔｉｆａｄｅ  ｍｏｕｎｔａｎｔ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号Ｐ３６９３０）を載せた（ｍｏｕｎｔｅｄ）。６３Ｘ，１．４ＮＡプランアポクロマート対物レンズ（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）及び１．６Ｘインターナルオプトバー（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｏｐｔｏｖａｒ）を有するＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍ倒立蛍光顕微鏡を用いて蛍光画像を取得した。取得したデータを、顕微鏡画像分析ツール（ＭＩＡＴｏｏｌ）ソフトウェア（ｗｗｗ４．ｕｔｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ．ｅｄｕ／ｗａｒｄｌａｂ／ｍｉａｔｏｏｌ．ａｓｐ）を用いて処理した。
【０１１２】
内在化したＨＥＲ２標的化ＡＤＣｓの細胞内運命を研究するために、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞をＭａｔｔｅｋ皿上で平板培養した。細胞を５μＭのＡｌｅｘａ  ６４７標識デキストランで予備処理し（２時間パルスし、３時間追跡した）、続いてＭＭＡＥ（ＳＧ−ＭＭＡＥ、ＹＳ−ＭＭＡＥ）又はＴ−ＤＭ１にコンジュゲート化したペルツズマブのＡｌｅｘａ  ４８８標識された突然変異体の１０ｎＭで２０時間処理した。ＭＭＡＥにコンジュゲート化した野生型（ＷＴ）ペルツズマブを対照として用いた。試料を氷上で３３．３ｎＭのウサギ抗Ａｌｅｘａ  ４８８抗体（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ，カタログ番号Ａ１１０９４）で３０分間処理し、表面蛍光をクエンチングした。０．０２５％のグルタルアルデヒドが補足された１．７％（ｗ／ｖ）のパラホルムアルデヒドを用いて室温で１０分間細胞を固定した。試料を画像化し、データを上記の通りに処理した。
【０１１３】
ＰＳ標的化薬剤に関するＰＳプルダウンアッセイ。ＰＳ標的化Ｆｃ融合体のＰＳへの結合のＣａ２＋依存性の研究のために、タンパク質を結合緩衝液（２ｍＭ又は２μＭのＣａ２＋を有する１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４及び１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中で１００ｎＭにおいて希釈した。５０μｌのＰＳがコーティングされたビーズ（Ｅｃｈｅｌｏｎ，カ
タログ番号Ｐ−Ｂ０ＰＳ）を加え、室温で２時間インキュベーションした。次いでビーズを結合緩衝液で洗浄し、ＨＲＰコンジュゲート化ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体を用いるイムノブロット法により結合タンパク質を検出した。ＰＳへのｐＨ依存的結合を調べるために、タンパク質をＰＢＳ  ｐＨ７．４又は６．０中で１００ｎＭにおいて希釈した。５０μｌ（ベッドボリューム）のＰＳがコーティングされたビーズを加え、室温で２時間インキュベーションした。次いでビーズをＰＢＳで洗浄し、ＨＲＰコンジュゲート化ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体を用いるイムノブロット法により結合タンパク質を検出した。
【０１１４】
細胞上の露出ＰＳのレベルを分析するためのアネキシンＶ結合アッセイ。１００万個の細胞をアネキシンＶ結合溶液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２を有する１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４）中に懸濁させた。Ａｌｅｘａ  ４８８  Ｆｌｕｏｒとコンジュゲート化したアネキシンＶ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号Ａ１３２０１）を細胞懸濁液に１：１００希釈において加え、細胞と一緒に室温で１０分間インキュベーションした。次いで細胞をアネキシンＶ結合溶液で１回洗浄し、フローサイトメトリー（ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ）により分析した。ＦｌｏｗＪｏ（ＦＬＯＷＪＯ，ＬＬＣ）を用いてフローサイトメトリーデータを処理した。
【０１１５】
ＰＳ標的化薬剤のフローサイトメトリー分析。細胞をトリプシン処理し、フローサイトメトリー緩衝液（ＰＢＳｗ／Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋及び１％ＢＳＡ）を用いて再懸濁させた。５０ｎＭのＰＳ標的化Ｆｃ融合体を細胞と一緒に、アッセイに依存して室温で又は氷上で３０分間インキュベーションした。細胞をフローサイトメトリー緩衝液で洗浄し、フルオロフォアコンジュゲート化二次抗体と一緒に氷上で３０分間インキュベーションした。次いで細胞を洗浄し、フローサイトメトリー（ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ）により分析した。ＦｌｏｗＪｏ（ＦＬＯＷＪＯ，ＬＬＣ）を用いてフローサイトメトリーデータを処理した。
【０１１６】
細胞成長及び生存アッセイ。癌細胞系（２Ｈ１１、ＭＣＦ−７、ＳＫ−ＢＲ−３、ＳＫ−ＯＶ−３、ＬＮＣａＰ、２２Ｒｖ１、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８及びＨＣＣ１９５４）を９６ウェルプレートにおいて平板培養した。細胞を終夜成長させ、続いてＰＳ標的化ＰＤＣｓ又はＨＥＲ２標的化ＡＤＣｓを加えた。３−５日のインキュベーションの後にＣｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ＡＱ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，カタログ番号Ｇ３５８１）を用いて細胞成長及び生存を測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて用量反応曲線をプロットした。
【０１１７】
マウスにおける全身画像化、薬物動態学及び治療研究。すべてのマウス研究において用いられる動物取扱手順（ａｎｉｍａｌ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）はＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ  Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ及びＴｅｘａｓ  Ａ＆Ｍ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認された。ＢＡＬＢ／ｃ  ＳＣＩＤマウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入し（ストック番号００１８０３）、組織内で（ｉｎ  ｈｏｕｓｅ）飼育した。薬物動態学的研究を前に説明した通りに行った（１９）。要するに、実験から９６時間前にルゴール液を飲料水に加えた。酸素中の２％イソフルランを用いてＳＣＩＤ  ＢＡＬＢ／ｃ雌マウス（８週齢、体重１８−２２ｇ）を麻酔し、１２５Ｉ標識タンパク質（１００−１２０μＣｉ，１０−１２μｇ／マウス）を注入した（静脈内）。種々の時点に用量キャリブレーター（ｄｏｓｅ  ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ）（Ｃａｐｉｎｔｅｃ  Ｉｎｃ．）を用いて全身カウンティングを行った。
【０１１８】
ＰＳ標的化薬剤を用いる全身近赤外画像化（ＮＩＲ）のために、雌のヌードマウス（６
−７週齢、Ｅｎｖｉｇｏから購入した，カタログ番号６９０３Ｆ）又はＢＡＬＢ／ｃ  ＳＣＩＤマウス（６−８週齢）を用いた。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍の移植のために、酸素中の２％イソフルランを用いてマウスを麻酔し、小さい外科的切開を行って乳房脂肪体を露出した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳ中に分散させて単細胞懸濁液とした（ｄｉｓｐｅｒｓｅｄ  ｉｎｔｏ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ）。マウス当たりに５ｘ１０６個の細胞を２５Ｇの針を用いて１００μｌにおいて乳房脂肪体中に注入し、次いで創傷クリップを用いて創傷を閉じた。外科手術の直後及び１２時間後にブプレノルフィン（ｂｕｐｒｅｎｏｒｐｈｉｎｅ）を５０μｇ／ｋｇで投与した（皮下）。マウスを毎日監視し、外科手術から１週間後に創傷クリップを除去した。ヌードマウスの画像化のために、腫瘍が約１５０ｍｍ３の寸法に達した時にマウスを３グループに分け（ｎ＝グループ当たり３匹のマウス）、酸素中の２％のイソフルランを用いて麻酔した。麻酔されたマウスにＰＢＳ中の１ｎモルのＩＲＤｙｅ８００ＣＷ標識ＰＳ特異的薬剤を注入した（静脈内）。０時間（注入前）ならびに注入から３、２４及び４８時間後にＣａｌｉｐｅｒ  Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）生体内画像化システムを用いて蛍光画像化（ＦＬＩ）を行った。７４５ｎｍ励起、８００ｎｍ発光、ビニング（ｂｉｎｎｉｎｇ）  ８、ＦＯＶ  １２．９ｃｍ、ｆストップ  ２及びオート露出を用いてＦＬＩを行った。腫瘍のＦＬＩシグナルを概述するために手動で書かれるＲＯＩにおける絶対放射効率（光子／秒）を用い、データをＬｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｉｎｇソフトウェアで数値化し（ｑｕａｎｔｉｔａｔｅｄ）、腫瘍体積に基準化した（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ）。ＢＡＬＢ／ｃ  ＳＣＩＤマウスにおける画像化のために、腫瘍が約３００ｍｍ３の寸法に達した時にマウスを３グループに分け（ｎ＝グループ当たり３匹のマウス）、ＰＢＳ中の１ｎモルのＩＲＤｙｅ８００ＣＷ標識ＰＳ特異的薬剤を注入した（静脈内）。注入から４８時間後、腫瘍を切断し、上記の通りに画像化した。腫瘍のＦＬＩシグナルを概述するために手動で書かれるＲＯＩにおける蛍光を数値化し、腫瘍重量に基準化した。
【０１１９】
ＰＳ標的化ＰＤＣｓを用いる腫瘍処置研究のために、全身画像化実験に関して説明した通りにＢＡＬＢ／ｃ  ＳＣＩＤマウスにおけるＭＤＡ−ＭＢＡ−２３１腫瘍異種移植片の移植を行った。ＬＮＣａＰ腫瘍の移植のために、７−８週齢の雄のＢＡＬＢ／ｃ  ＳＣＩＤマウス（体重１８−２２ｇ）を酸素中の２％イソフルランを用いて麻酔し、５０％ＲＰＭＩ及び５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に懸濁された５ｘ１０６個のＬＮＣａＰ細胞を注入した（皮下）。ＭＤＡ−ＭＢＡ−２３１又はＬＮＣａＰ腫瘍が約１００ｍｍの寸法に達したら、処置から７２及び４８時間前にマウスに５ｍｇ／ｋｇのドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）を注入した（腹腔内）。次いでマウスに１ｎモルの非コンジュゲート化タンパク質、ＰＤＣｓ又はＰＢＳビヒクルを１週間に２回注入した（静脈内）。１週間に２回、腫瘍重量及び体重を測定した。Ｆｃ−Ｓｙｔ１（ＤＮ）
ＭＭＡＥを用いる処置実験のために（図１６Ｄ）、マウスを４週間処置し、さらに２．５週間監視した。腫瘍寸法がいずれの寸法（ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）においても２ｃｍに達したら実験を停止した。
【０１２０】
ＨＥＲ２特異的ＡＤＣｓを用いる治療のために、６−８週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃ  ＳＣＩＤマウスに、全身画像化実験に関して説明した方法を用い、４−５ｘ１０６個のＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞を移植した。腫瘍が約６０−１００ｍｍ３の寸法に達したら、マウスに２ｍｇ／ｋｇのＡＤＣ、Ｔ−ＤＭ１、非コンジュゲート化タンパク質又はＰＢＳビヒクルを３週間毎に１回（合計で２回の投薬）注入した（静脈内）。
【０１２１】
免疫組織化学的分析。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍を保有する雌のＢＡＬＢ／ｃ  ＳＣＩＤマウスを、ＰＢＳ又はＭＭＡＥとコンジュゲート化した１ｎモルのＦｃ−Ｓｙｔ１のいずれかの送達（静脈内）から７２及び４８時間前に５ｍｇ／ｋｇのドセタキセルを用いて処置した（腹腔内）。種々の時点にマウスにＰＢＳ及び続いて４％ＰＦＡを灌流した。次い
で腫瘍を切断し、ＯＣＴ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，カタログ番号２３−７３０−５７１）中に埋め込み、−８０℃で保存した。１０μｍの組織切片を切断し、ＰＢＳを用いて室温で水和させてから４％ＰＦＡを用いて３０分間固定した。次いで腫瘍切片をＰＢＳで洗浄し、透過処理／遮断溶液（ＰＢＳ＋０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及び３％ＢＳＡ）と一緒に室温で１時間インキュベーションした。ヒトＫｉ−６７及びマウスＣＤ３１に関する一次抗体を遮断緩衝液（ＰＢＳ＋０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０＋５％血清）中で希釈し、組織切片と一緒に４℃で終夜インキュベーションした。翌日、組織切片をＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄し、遮断緩衝液中で希釈されたフルオロフォアコンジュゲート化二次抗体と一緒に室温で２時間インキュベーションした。ＰＢＳＴで洗浄した後、組織切片にＰｒｏＬｏｎｇ  Ｇｏｌｄ退色防止用封入剤（ａｎｔｉｆａｄｅ  ｍｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ）を載せた。４０Ｘ，１．３ＮＡプランフルオール対物レンズを有するＮｉｋｏｎ  Ａ１Ｒ共焦点顕微鏡を用いて共焦点画像を取得し、ＮＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎｔｓソフトウェア（Ｎｉｋｏｎ）を用いて処理した。
【実施例２】
【０１２２】
ＨＥＲ２へのｐＨ依存的結合を有するＨＥＲ２標的化薬剤の作製
図４Ａ及び４Ｂは、ＨＥＲ２を標的とするペルツズマブの２個の突然変異した変異体の結合の分析を示す。ＳＧ突然変異体、重鎖可変ドメイン中でＳｅｒ５５がヒスチジンに突然変異し、Ｇｌｙ５７がグルタミン酸に突然変異している（配列番号４）、ＹＳ突然変異体，軽鎖可変ドメイン中でＴｙｒ５５がヒスチジンに突然変異し、重鎖可変ドメイン中でＳｅｒ１０３がヒスチジンに突然変異している（配列番号６，８）。表面プラスモン共鳴を用いてデータを得た。図４Ａは１μＭ  ＨＥＲ−細胞外ドメイン（ＥＣＤ）−Ｆｃ融合体と突然変異した変異体及び野生型（ＷＴ）ペルツズマブの相互作用に関するｐＨ７．０及び５．８における代表的なセンサーグラムを示す。図４Ａに示される分析のために、抗体をフローセル上に固定化した。図４Ｂは、固定化されたＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｆｃ上に抗体を注入することにより得られたＷＴペルツズマブ、ＳＧ及びＹＳに関する平衡解離定数（ｎＭ）を示す。データは、ペルツズマブのＳＧ及びＹＳ変異体の両方がＨＥＲ２への結合に関してＷＴペルツズマブより大きなｐＨ依存性を有することを示す。
【実施例３】
【０１２３】
ＨＥＲ２発現細胞におけるＨＥＲ２標的化薬剤の内在化及び蓄積
ペルツズマブ（ＷＴ）及び突然変異した変異体ＳＧ及びＹＳを２個のヒンジシステイン残基を介してマレイミドカプロイル−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ（ＭＣ−ＶＣ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ）に、抗体当たりに２個の薬物の薬物対抗体比（ＤＡＲ）においてコンジュゲート化させ、続いて種々のＨＥＲ２発現細胞系のパネル内でＨＥＲ２標的化ＡＤＣｓ（ＨＥＲ２−ＡＤＣｓ）の結合及び蓄積の分析を行った。図５Ａは、Ａｌｅｘａ  ６４７標識ペルツズマブ（実線）又はＡｌｅｘａ  ６４７標識対照抗体（点線）及びフローサイトメトリーを用いて検出された種々の癌細胞系上におけるＨＥＲ２の発現レベルを示す。図５Ｂは、０．５、４及び２０時間のインキュベーションに続く内在化したＡｌｅｘａ
４８８標識ＷＴペルツズマブ−ＭＭＡＥ（ＷＴ−ＭＭＡＥ）、ＳＧ−ＭＭＡＥ、ＹＳ−ＭＭＡＥ、対照抗体−ＭＭＡＥ（Ｃ−ＭＭＡＥ）又はトラスツズマブ−ＤＭ１（Ｔ−ＤＭ１）のレベルを示す。Ａｌｅｘａ  ４８８特異的抗体を用いて細胞表面結合ＡＤＣをクエンチングした。エラーバーは標準偏差を示し、＊は統計的に有意な差を示す（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ−検定，ｐ＜０．０５）。データは、調べられたすべての癌細胞系に関し、ＳＧ−ＭＭＡＥ及びＹＳ−ＭＭＡＥがＷＴ−ＭＭＡＥ及びＴ−ＤＭ１より高いレベルまで蓄積することを示す。中程度のレベルのＨＥＲ２を発現するＭＤＡ−ＭＢ−４５３癌細胞（図５Ａ）におけるリソソームへのＡＤＣｓの送達も、蛍光顕微鏡検査を用いて調べた（図５Ｃ）。ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞中のリソソームをＡｌｅｘａ  ６４７標識デキストランを用いるパルス追跡（ｐｕｌｓｅ  ｃｈａｓｉｎｇ）により標識した。続いて細胞を１０ｎＭ  Ａｌｅｘａ  ４８８標識ＡＤＣｓと一緒に２０時間インキュベーションし、洗浄し
、表面信号をＡｌｅｘａ−４８８特異的抗体を用いてクエンチングした。顕微鏡画像（サイズバー（ｓｉｚｅ  ｂａｒ）＝３μｍ）は、ＷＴ−ＭＭＡＥ又はＴ−ＤＭ１と比較して実質的により高いレベルのＳＧ−ＭＭＡＥ及びＹＳ−ＭＭＡＥのリソソームにおける蓄積を示す。
【実施例４】
【０１２４】
ＨＥＲ２−ＡＤＣｓによるＨＥＲ２陽性細胞の成長及び生存の抑制
ＨＥＲ２＋乳癌細胞の生存率へのＨＥＲ２−ＡＤＣｓの効果の分析は、ＭＤＡ−ＭＢＡ−ＭＢ−４５３、ＳＫ−ＯＶ−３及びＪＩＭＴ−１細胞の生存率の低下において、ＳＧ−ＭＭＡＥ及びＹＳ−ＭＭＡＥがＭＭＡＥにコンジュゲート化したＷＴペルツズマブ（ＷＴ−ＭＭＡＥ）又はＴ−ＤＭ１より有効であることを示す（図６）。エラーバーは標準偏差を示し、＊は統計的に有意な差を示す（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ−検定，ｐ＜０．０５）。
【実施例５】
【０１２５】
マウス異種移植片モデルにおけるＨＥＲ２−ＡＤＣｓによる腫瘍成長の抑制
ＨＥＲ２−ＡＤＣｓ（ＷＴ−ＭＭＡＥ、ＳＧ−ＭＭＡＥ及びＹＳ−ＭＭＡＥ）の薬物動態学の分析は、ＢＡＬＢ／ｃ  ＳＣＩＤマウスにおけるＳＧ−ＭＭＡＥ及びＹＳ−ＭＭＡＥの生体内持続性がＷＴ−ＭＭＡＥのものに類似であることを示す（図７Ａ、ｎ＝グループ当たり５匹のマウス）。ＡＤＣｓを１２５−Ｉで放射性標識し、マウス中に注入し（グループ当たり５匹のマウス）、示される時点に血液中及び全身レベルにおける残留放射能を決定した。ＭＤＡ−ＭＢ−４５３異種移植片（中程度のＨＥＲ２発現レベル）を保有するＢＡＬＢ／ｃ  ＳＣＩＤマウスにおけるＡＤＣｓを用いる治療研究は、処置においてＳＧ−ＭＭＡＥ及びＹＳ−ＭＭＡＥがＷＴ−ＭＭＡＥ又はＴ−ＤＭ１より有効であることを示す（図７Ｂ）。１７日及び３８日（実験１、矢印により示す）又は２４日及び４５日（実験２、矢印により示す）における２回の２ｍｇ／ｋｇのＡＤＣの投薬を用いて、マウスを処置した。エラーバーは標準偏差を示し、処置の終了点における統計的に有意な差（ＳＧ−ＭＭＡＥ対ＷＴ−ＭＭＡＥ又はＴ−ＤＭ１、ＹＳ−ＭＭＡＥ対ＷＴ−ＭＭＡＥ又はＴ−ＤＭ１）を＊により示す（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ−検定、ｐ＜０．０５、ｎ＝グループ当たりに５−８匹のマウス）。まとめて、データはＳＧ−ＭＭＡＥ及びＹＳ−ＭＭＡＥが好ましい薬物動態学を有し、且つ腫瘍成長の低下においてそれらの親であるＷＴペルツズマブ及び臨床的に承認されたＨＥＲ２特異的ＡＤＣであるＴ−ＤＭ１より有効でもあることを示す。
【実施例６】
【０１２６】
カルシウム依存的会合を有するＡＤＣｓの作製及び特性化
ＣＨ１ドメインのＣ末端においてヒンジ−ＳＧＧリンカーを介してカルビンジンＤ９Ｋのドメイン２（ＣａｌＤ２）に融合したＨＥＲ２特異的Ｆａｂフラグメント（トラスツズマブに由来する）（トラスツズマブＦａｂ−ＣａｌＤ２、トラスツズマブ軽鎖、配列番号２０と会合した配列番号１８）とカルビンジンＤ９Ｋのドメイン１と融合したヒト−ＩｇＧ由来Ｆｃフラグメント（ＣａｌＤ１−Ｆｃ、配列番号２２）の表面プラスモン共鳴を用いる相互作用は、Ｃａ２＋依存的会合を示す（図８Ａ）。センサーグラムは、固定化ＨＥＲ２−ＥＣＤへの１００ｎＭのトラスツズマブＦａｂ−ＣａｌＤ２の結合、それに続く１００ｎＭのＣａｌＤ１−Ｆｃ及び次いで０−２ｍＭの範囲の種々のＣａ２＋の濃度を有する緩衝液（右のパネルに拡大して示される四角形で囲まれた領域）の注入を示す。データは代表的なセンサーグラムを示し、それはＣａ２＋濃度の低下と共にＦａｂ−ＣａｌＤ２とＣａｌＤ１−Ｆｃの解離が増加することを示す。追加の実験において、Ｃ末端においてヒンジ−ＳＧＧリンカーを介してＣａｌＤ２に融合したＰＳＭＡ特異的ＶＨ−ＣＨ１ドメイン（ＰＲＧＸ１−ＸＧ１−０２９、０２６と省略される、Ｓｃｈｕｅｌｋｅ，Ｎ．，Ｖａｒｌａｍｏｖａ，Ｏ．Ａ．，Ｄｏｎｏｖａｎ，Ｇ．Ｐ．，Ｍａ．，Ｄ．，Ｇａｒｄｎｅｒ，Ｊ．Ｐ．，Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，Ｄ．Ｍ．，Ａｒｒｉｇａｌｅ，Ｒ．Ｒ．，Ｚｈａｎ
，Ｃ．，Ｃｈｏｄｅｒａ，Ａ．Ｊ．，Ｓｕｒｏｗｉｔｚ，Ｋ．Ｇ．，Ｍａｄｄｏｎ，Ｐ．Ｊ．，Ｈｅｓｔｏｎ，Ｗ．Ｄ．Ｗ．，Ｏｌｓｏｎ，Ｗ．Ｃ．  （２００３）  Ｔｈｅ  ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｓ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ
ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，１００，１２５９−１２５９５）を含む融合タンパク質（０２６−ＣａｌＤ２、配列番号２４）も作製した。０２６軽鎖（配列番号２６）と会合して、このＣａｌＤ２融合体はＦａｂ−ＣａｌＤ２を形成する。フローサイトメトリー分析は、ＰＳＭＡ発現ＬＮＣａＰ細胞内における蛍光標識されたＣａｌＤ１−Ｆｃ（配列番号２２）の蓄積が、０２６−ＣａｌＤ２が加えられない（「Ｆａｂなし」）１００ｎＭ  Ａｌｅｘａ  ６４７標識ＣａｌＤ１−Ｆｃを用いる処理と比較して（それぞれ１００ｎＭの）０２６−ＣａｌＤ２及びＡｌｅｘａ  ６４７標識ＣａｌＤ１−Ｆｃの混合物を用いて細胞を処理した時に増強されることを示した（図８Ｂ）。
【実施例７】
【０１２７】
ＰＳ標的化薬剤の作製及び特性化
ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域を以下のＰＳ結合ドメインと融合させることによりＰＳ標的化薬剤のパネルを作成した、アネキシンＡ１（ＡｎｘＡ１）のコアドメイン、シナプトタグミン１（Ｓｙｔ１）のＣ２Ａドメイン及びＰＫＣαのＣ２ドメイン。得られる融合タンパク質をそれぞれＦｃ−ＡｎｘＡ１、Ｆｃ−Ｓｙｔ１及びＦｃ−ＰＫＣαと呼ぶ。ＰＳ標的化薬剤をホモダイマーとして精製し（図９、図１０Ａ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＨＰＬＣを用いて評価した）、脂質ストリップを用いる脂質結合アッセイにおいてＰＳに結合させた（図１０Ｂ）。それらはカルジオリピンにも結合し、それは真核細胞の内部ミトコンドリア膜上に位置し、従って標的化に関連しない。Ｆｃ−ＡｎｘＡ１は広い脂質結合分布を示し、中性及び負に帯電した脂質の両方に結合する（図１０Ｂ）。重要なことに、ＰＳ結合薬剤のいずれも、原形質膜外葉に存在する脂質であるホスファチジルコリン（ＰＣ）及びスフィンゴミエリンに結合しなかった。
【０１２８】
腫瘍内皮細胞系２Ｈ１１を用い、ＰＳ結合薬剤が細胞表面上の脂質と相互作用する能力を調べた。蛍光性アネキシンＶの結合は、これらの細胞がＰＳを露出していること及びドセタキセル処置の後にＰＳ露出が増すことを示した。フローサイトメトリー分析は、すべてのＰＳ結合薬剤がＰＳ陽性細胞と相互作用し、Ｆｃ−Ｓｙｔ１が比較的低いレベルの結合を示すことを示した（図１０Ｃ、２ｎｄ  ｏｎｌｙは二次抗体対照を示し、ＦｃはＰＳ標的化タンパク質又はドメインのないＦｃフラグメントを示す）。
【０１２９】
マウスにおける３個のＰＳ結合薬剤の薬物動態学的挙動及び腫瘍局在化を評価し、タンパク質−薬物コンジュゲート（ＰＤＣｓ）としてさらに開発するのにどの組換えタンパク質が適しているか決定した。ＰＳ結合薬剤の薬物動態学的研究は、Ｆｃ−Ｓｙｔ１がマウスにおいて有意により長い半減期を有することを明らかにした（図１０Ｄ、Ｅ）。マウス中への放射性ヨウ素化ＰＳ標的化融合タンパク質の注入に続く全身カウント（ｎ＝グループ当たり５匹のマウス）を図１０Ｄ中のグラフに示し、１０Ｅはそれぞれの放射性標識タンパク質に関する対応する曲線下面積を示す。さらに、タンパク質を残留性染料（ｒｅｓｉｄｕａｌｉｚｉｎｇ  ｄｙｅ）、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷで標識し、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植片を保有する雌のヌードマウス中に注入し（静脈内）（ｎ＝グループ当たり３匹のマウス）、示された時点に画像化し（図１０Ｆ）、注入から４８時間後に抽出した腫瘍において腫瘍蛍光を定量した（図１０Ｇ）。類似の実験を腫瘍保有ＢＡＬＢ／ｃ  ＳＣＩＤマウスにおいて行い（ｎ＝グループ当たり３匹のマウス）、４８時間後に腫瘍を切除し、染料レベルを決定した（図１０Ｈ）。３個のＰＳ特異的薬剤の中で、Ｆｃ−Ｓｙｔ１は最高レベルの腫瘍局在化を示した。図１０Ｅ、１０Ｇ及び１０Ｈに関する統計的に有意な差を、一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）及び続くテューキーポストホ
ックテスト（Ｔｕｋｅｙ  ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  ｔｅｓｔ）を用いて分析し（＊＊，ｐ＜０．０１、＊＊＊，ｐ＜０．００１、＊＊＊＊，ｐ＜０．０００１）、エラーバーはＳＥＭを示す。
【実施例８】
【０１３０】
ＰＳ標的化薬剤の４価は結合及び標的細胞内への内在化を向上させる
いくつかの受容体系において、多価リガンド又は抗体のような架橋リガンドの混合物が受容体内在化及び分解を促進することが示された。ＰＳ標的化ＰＤＣｓの挙動におけるアビディティー（ａｖｉｄｉｔｙ）の役割の研究のために、４個のＳｙｔ１  Ｃ２Ａドメインを含有する４価Ｓｙｔ１−Ｆｃ−Ｓｙｔ１を作製した（図１１Ａにおいて略図に示される）。４価のタンパク質はホモダイマーとして精製された（図１１Ａ、Ｂ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＨＰＬＣを用いて評価された）。ニトロセルロース上に固定化された脂質を用いる結合分析は、Ｓｙｔ１−Ｆｃ−Ｓｙｔ１がその２価の親であるＦｃ−Ｓｙｔ１より高いＰＳに関する親和性／アビディティーを有し、それと同じ脂質選択性を有することを示した（図１１Ｃ）。図１１Ｃに示される結合データと一致して、フローサイトメトリーを用いて分析すると、４価Ｓｙｔ１−Ｆｃ−Ｓｙｔ１は有意により高いレベルで２Ｈ１１細胞に結合した（図１１Ｄ）。
【０１３１】
Ａｌｅｘａ  ６４７標識タンパク質を用いてＦｃ−Ｓｙｔ１及びＳｙｔ１−Ｆｃ−Ｓｙｔ１の内在化も研究した。２Ｈ１１細胞を種々の濃度において標識Ｆｃ−Ｓｙｔ１及びＳｙｔ１−Ｆｃ−Ｓｙｔ１と一緒に氷上でインキュベーションし、類似の表面結合を達成し、続いて３７℃で種々の時間にわたってインキュベーションして内在化させた。ＥＤＴＡを用いて表面結合タンパク質を剥脱させ（結合のＣａ２＋依存性の故に）、内在化したレベル（剥脱（ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ）に抵抗性）をフローサイトメトリーにより決定した。これらの研究は、両方のタンパク質が有効に細胞内に蓄積するが、４価Ｓｙｔ１−Ｆｃ−Ｓｙｔ１はより迅速に内在化することを示した（図１１Ｅ）。図１１Ｄ及び１１Ｅに関し、統計的に有意な差を、二元配置分散分析及び続くテューキーポストホックテスト（Ｔｕｋｅｙ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  ｔｅｓｔ）を用いて分析した（＊，ｐ＜０．０５、＊＊，ｐ＜０．０１、＊＊＊，ｐ＜０．００１、＊＊＊＊，ｐ＜０．０００１）。図１１Ｄ及び１１Ｅ中のエラーバーはＳＥＭを示す。
【０１３２】
Ｓｙｔ１−Ｆｃ融合タンパク質の細胞内輸送（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）挙動を研究するために蛍光顕微鏡検査も用いた。２Ｈ１１及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を５０ｎＭのＰＳ標的化薬剤又は対照ＩｇＧと一緒に４時間インキュベーションし、続いて洗浄し、固定し、Ｃｙ３／Ａｌｅｘａ  ５５５標識抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を用いて染色した。ＬＡＭＰ−１特異的抗体及び続いてＡｌｅｘａ  ４８８標識二次コンジュゲートを用いてリソソームマーカー、ＬＡＭＰ−１を検出した。Ｆｃ−Ｓｙｔ１及びＳｙｔ１−Ｆｃ−Ｓｙｔ１は２Ｈ１１（図１１Ｆ）及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１（図１１Ｇ）細胞において内在化し、ＬＡＭＰ−１陽性リソソーム中に送達された。スケールバー（ｓｃａｌｅ  ｂａｒｓ）は１０μｍ（Ｆ）及び５μｍ（Ｇ）である。
【実施例９】
【０１３３】
ＰＳ−ＰＤＣｓのカルシウム感知及びエンドソーム放出
Ｆｃ−Ｓｙｔ１及びＳｙｔ１−Ｆｃ−Ｓｙｔ１のリソソーム輸送及び内在化挙動は、それらがコンジュゲート化薬物のための送達ビヒクルとして有効であり得ることを示した。マレイミドカプロイル−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥをヒンジシステインにコンジュゲート化させた（図１２Ａ、左のパネル）。負の対照として用いるために、マレイミドカプロイル−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥを重／軽鎖相互作用システイン残基がセリンに突然変異している鶏卵リゾチーム特異的ヒトＩｇＧ１にコンジュゲート化させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、コンジュゲート化が完了し、４の薬物対抗体比（ＤＡＲ）を生
じたことを示した（図１２Ａ、右のパネル）。これはＦｃ−Ｓｙｔ１ ＭＭＡＥに関してＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により確かめられた。完全なコンジュゲート化はヒンジ領域における２個のジスルフィド結合を分裂させるので、質量分析を用いて４３．６ｋＤａの分子量が得られた（図１２Ｂ）。これは、それぞれ２個又は１個のジスルフィド結合を保持し、約８２ｋＤａの見掛けの分子量を生ずる非コンジュゲート化又は部分的コンジュゲート化タンパク質と対照的である（図１２Ｂ）。重要なことにＨＰＬＣ分析は、コンジュゲート化プロセスがタンパク質凝集に導かないことを示した（図１２Ｃ）。
【０１３４】
Ｓｙｔ１  Ｃ２ＡドメインはＰＳ結合のためにＣａ２＋を必要とする。細胞外Ｃａ２＋レベル（１−２ｍＭ）と比較してより低い初期／選別エンドソーム中のＣａ２＋濃度（約２μＭ）は、内在化に続いてＰＳ標的化ＰＤＣｓ（ＰＳ−ＰＤＣｓ）がこれらのエンドソームの境界膜から解離するであろうことを示唆している。この解離は、リソソーム送達の向上に導くと思われる。Ｓｙｔ１ドメインを含有する両方のＰＳ−ＰＤＣｓは２ｍＭ  Ｃａ２＋を含有する緩衝液中でＰＳビーズに結合したが、Ｃａ２＋濃度が２μＭに低下すると検出可能な相互作用は観察されなかった（図１２Ｄ）。さらに、選別エンドソーム内のｐＨは酸性（ｐＨ６．０−６．５）なので、ＰＤＣ：ＰＳ相互作用へのｐＨの効果を分析した。両方のＰＤＣｓはｐＨ範囲６．０−７．４において類似のレベルでＰＳに結合した（図１２Ｄ）。図１２Ｄに関し、イムノブロット法及びホースラディッシュペルオキシダーゼとコンジュゲート化したヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を用いる検出を用い、ビーズ会合タンパク質を分析した。
【０１３５】
Ｃａ２＋依存的結合を示す試験管内結合分析と一致して、１００ｎＭ  ＰＳ−ＰＤＣ又はＭＭＡＥコンジュゲート化対照と一緒にＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞を３０分間インキュベーションし、続いて洗浄し、初期エンドソーム抗原１（ＥＥＡ１）特異的抗体を用いて初期エンドソームを染色した後の蛍光顕微鏡分析は、細胞内への内在化に続く選別エンドソームの境界膜ではなくて内腔におけるＰＳ−ＰＤＣｓの存在を示した（図１３Ａ）。これらの実験においてＡｌｅｘａ  ５５５標識抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体を用いてＰＳ−ＰＤＣｓを検出し、収穫されて拡大された初期エンドソーム（ａ及びｂと標識）の強度分析を図のパネルの右側に示す。さらに、送達の４時間以内にＦｃ−Ｓｙｔ１ ＭＭＡＥ及びＳｙｔ１−Ｆｃ−Ｓｙｔ１ ＭＭＡＥをリソソーム中で検出することができた（ＬＡＭＰ−１特異的抗体を用いて検出した）（図１３Ｂ）。両方のＰＳ−ＰＤＣｓは、２Ｈ１１又はＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞を１００ｎＭ又は５０ｎＭのＰＳ−ＰＤＣｓと一緒にそれぞれ１０又は２０時間インキュベーションした後に２Ｈ１１及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞中の微小管ネットワークを分裂させた（図１３Ｃ）。スケールバー＝５μｍ（図１３Ａ）、１０μｍ（図１３Ｂ）、１５μｍ（図１３Ｃ、上のパネル）及び１０μｍ（図１３Ｃ、下のパネル）。
【実施例１０】
【０１３６】
ＰＳ−ＰＤＣｓによるＰＳ陽性細胞の成長及び生存の抑制
腫瘍内皮（２Ｈ１１）、ＥＲ陽性乳癌（Ｔ−４７Ｄ）、ＨＥＲ２陽性乳癌（ＳＫ−ＢＲ−３）、トリプルネガティブ乳癌（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）、アンドロゲン感受性前立腺癌（ＬＮＣａＰ）及びアンドロゲン非感受性前立腺癌（２２Ｒｖ１）を含む複数の細胞系の成長へのＰＳ特異的ＰＤＣｓの効果を調べた。蛍光標識されたアネキシンＶを用いる細胞の染色及びそれに続くフローサイトメトリー分析は、これらの細胞系のすべてがＰＳ陽性であることを示した（図１４Ａ）。ＰＳ−ＰＤＣｓと一緒の細胞のインキュベーションは、用量依存的やり方で細胞の成長及び生存を有効に抑制した（図１４Ｂ）。７２時間（２Ｈ１１）、９６時間（ＳＫ−ＢＲ−３、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及び２２Ｒｖ１）又は１２０時間（Ｔ−４７Ｄ）のインキュベーションに続く細胞生存率を示す。４価Ｓｙｔ１−Ｆｃ−Ｓｙｔ１ ＭＭＡＥはＴ−４７Ｄ細胞成長の抑制において２価Ｆｃ−Ｓｙｔ１ ＭＭＡＥより有力であったが、２個のＰＤＣｓは他の細胞系に類似の効果を示した。対照し
て、ＭＭＡＥとコンジュゲート化した比較的高濃度の対照ＩｇＧ（鶏卵リゾチーム特異的ヒトＩｇＧ１）は、おそらく非特異的な薬物の流体相吸収の故に、細胞成長の抑制を生じた（図１４Ｂ）。ＰＳ−ＰＤＣｓの成長抑制効果と一致して、２つのＰＤＣｓのそれらの対応するＩＣ５０ｓに近い濃度における内在化のフローサイトメトリー分析は、Ｓｙｔ１−Ｆｃ−Ｓｙｔ１ ＭＭＡＥがＴ−４７Ｄ細胞において比較的高いレベルで内在化したことを除いて、２時間のインキュベーションの後にすべての他の細胞系に関して類似の挙動を示した（図１４Ｃ）。図１４Ｃに関し、統計的に有意な差を、二元配置分散分析及び続くボンフェローニポストホックテストを用いて分析した（ｎ．ｓ．，有意な差なし、＊，ｐ＜０．０５、＊＊＊，ｐ＜０．００１、そしてエラーバーはＳＥＭを示す）。さらに、非コンジュゲート化ＰＳ標的化タンパク質は、１μＭの濃度で９６時間細胞に加えられた時に、細胞生存率アッセイにおいて細胞成長に効果を示さなかった（図１４Ｄ）。かくしてデータは、Ｓｙｔ１に基づくＰＤＣｓが試験管内における腫瘍内皮及び癌細胞成長の有力な抑制剤であることを示す。
【実施例１１】
【０１３７】
マウス異種移植片モデルにおけるＰＳ−ＰＤＣｓによる腫瘍成長の抑制
ＢＡＬＢ／ｃ  ＳＣＩＤマウスにおける腫瘍異種移植片に対するＰＳ−ＰＤＣｓの治療効果を調べた。治療の前に、ＰＳ−ＰＤＣｓの薬物動態学的研究は、４価Ｓｙｔ１−Ｆｃ−Ｓｙｔ１ ＭＭＡＥが、おそらく標的媒介吸収の増加の故に、２価Ｆｃ−Ｓｙｔ１ ＭＭＡＥより短い半減期を有することを示した（図１５Ａ、Ｂ）。図１５Ａは、放射性ヨウ素化ＰＳ−ＰＤＣの注入に続くＢＡＬＢ／ｃ  ＳＣＩＤマウス（ｎ＝グループ当たり５匹のマウス）における全身カウントを示す。図１５Ｂは、図１５Ａに示されるクリアランス曲線に関する曲線下面積を示し、統計的に有意な差は独立Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ−検定を用いて分析された（＊＊＊＊，ｐ＜０．０００１）。ＰＤＣｓの治療効果を調べるために、それらを同所性（ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳房腫瘍を保有する雌のＢＡＬＢ／ｃ  ＳＣＩＤマウス（ｎ＝グループ当たり５−６匹のマウス）中に送達した。腫瘍保有マウスをドセタキセルで予備処置し、以下の用量（１ｎモルのタンパク質と同等）のＰＤＣｓ又は対照非コンジュゲート化タンパク質を週に２回送達した。Ｆｃ−Ｓｙｔ１又はＦｃ−Ｓｙｔ１ ＭＭＡＥの場合４．１ｍｇ／ｋｇ、Ｓｙｔ１−Ｆｃ−Ｓｙｔ１又はＳｙｔ１−Ｆｃ−Ｓｙｔ１ ＭＭＡＥの場合５．６ｍｇ／ｋｇ。これらの実験において、２価Ｆｃ−Ｓｙｔ１ ＭＭＡＥは乳房腫瘍成長を有力に妨げた（図１５Ｃ）。４価Ｓｙｔ１−Ｆｃ−Ｓｙｔ１ ＭＭＡＥも腫瘍成長を抑制したが、２価Ｆｃ−Ｓｙｔ１ ＭＭＡＥより効果が低かった。非コンジュゲート化Ｆｃ−Ｓｙｔ１及びＳｙｔ１−Ｆｃ−Ｓｙｔ１の処置は腫瘍成長に効果がなかった（図１５Ｃ）。重要なことに、処置グループのいずれにおいても衰弱又は体重減少が観察されず（図１５Ｄ）、ＰＳ特異的ＰＤＣｓが生体内で十分に忍容されることを示している。
【０１３８】
乳房腫瘍モデルにおける薬効と類似して、２価Ｆｃ−Ｓｙｔ１ ＭＭＡＥは、ドセタキセルで予備処置された前立腺癌ＬＮＣａＰ異種移植片を保有する雄のＢＡＬＢ／ｃ  ＳＣＩＤマウスにおける腫瘍成長を完全に妨げた（図１５Ｅ）。腫瘍保有マウスにＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植片実験（上記）の場合と同様に投薬した。試験管内データ（図１４Ｄ）と一致して、非コンジュゲート化ＰＳ標的化融合タンパク質は効果がなかった。しかしながら、４価Ｓｙｔ１−Ｆｃ−Ｓｙｔ１ ＭＭＡＥはＬＮＣａＰモデルにおいて腫瘍成長を有意に抑制しなかった。この差に関する最もありそうな説明は、４価ＰＤＣの比較的短い生体内持続性である。図１５Ｃ及び１５Ｅの両方に関し、処置の終了点における統計的分析を一元配置分散分析及び続くボンフェローニポストホックテストを用いて分析した（＊，ｐ＜０．０５、＊＊＊，ｐ＜０．００１、＊＊＊＊，ｐ＜０．０００１）。図１５Ａ、１５Ｃ及び１５Ｅ中のエラーバーはＳＥＭを示す。
【実施例１２】
【０１３９】
Ｆｃ−Ｓｙｔ１  ＭＭＡＥによる腫瘍成長の抑制はＰＳ結合に依存性である
薬物が高められた透過性及び保持（ＥＰＲ）効果のような非特異的な機構を介して腫瘍中に蓄積した可能性を排除するため、及び生体内薬効がＰＳ結合に依存性であったことを示すために、ＰＳに関する親和性が低下したシナプトタグミン１  Ｃ２Ａドメインの突然変異した変異体を作製した。シナプトタグミン１のＣ２Ａドメインは、ドメインループＩ及びＩＩＩ中の５個のアスパラギン酸（Ｄ）によりキレート化された３個のＣａ２＋イオンを介してＰＳと相互作用する（Ｓｔｒｉｅｇｅｌ，Ａ．Ｒ．，Ｂｉｅｌａ，Ｌ．Ｍ．，Ｅｖａｎｓ，Ｃ．Ｓ．，Ｗａｎｇ，Ｚ．，Ｄｅｌｅｈｏｙ，Ｊ．Ｂ．，Ｓｕｔｔｏｎ，Ｒ．Ｂ．，Ｃｈａｐｍａｎ，Ｅ．Ｒ．  ａｎｄ  Ｒｅｉｓｔ，Ｎ．Ｅ．  ２０１２．  Ｃａｌｃｉｕｍ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｙ  ｓｙｎａｐｔｏｔａｇｍｉｎ’ｓ  Ｃ２Ａ  ｄｏｍａｉｎ  ｉｓ  ａｎ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ｓｗｉｔｃｈ  ｔｈａｔ  ｔｒｉｇｇｅｒｓ  ｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ．  Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３２，１２５３−１２６０）。Ｃａ２＋結合を切断するために、５個のアスパラギン酸残基すべて（Ｄ１７３Ｎ、Ｄ１７９Ｎ、Ｄ２３１Ｎ、Ｄ２３３Ｎ及びＤ２３９Ｎ）をアスパラギン（Ｎ）に突然変異させ、Ｆｃ−Ｓｙｔ１（ＤＮ）を作製した。Ｆｃ−Ｓｙｔ１（ＤＮ）を精製し、４のＤＡＲでＭＭＡＥにコンジュゲート化し（図１６Ａ）、それは脂質がコーティングされたニトロセルロースストリップを用いるタンパク質−脂質オーバーレイ（ｐｒｏｔｅｉｎ−ｌｉｐｉｄ  ｏｖｅｒｌａｙ）アッセイにおいて本質的に背景レベルでＰＳと相互作用した（図１６Ｂ）。さらにフローサイトメトリー分析は、Ｆｃ−Ｓｙｔ１（ＤＮ）がその野生型の相手と比較して有意に低下したＰＳ陽性細胞への結合を有することを示した（図１６Ｃ）。図１６Ｃにおいて、統計的に有意な差を、二元配置分散分析及び続くテューキーポストホックテストを用いて分析し（＊＊＊，ｐ＜０．００１、＊＊＊＊，ｐ＜０．０００１）、エラーバーはＳＥＭを示す。
【０１４０】
同所性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍を保有するＢＡＬＢ／ｃ  ＳＣＩＤマウス（ｎ＝グループ当たり６匹のマウス）をドセタキセルで予備処置してからＰＳ−ＰＤＣｓ又は対照を用いて４週間、対照（ＰＢＳ）グループ中のマウスをそれらの大きな腫瘍寸法の故に安楽死させるまで処置した。マウスを週に２回、４週間（２８−５６日）以下の用量（１ｎモルのタンパク質に同等）で処置した。Ｆｃ−Ｓｙｔ１ ＭＭＡＥ又はＦｃ−Ｓｙｔ１（ＤＮ） ＭＭＡＥの場合４．１ｍｇ／ｋｇ、Ｆｃ ＭＭＡＥの場合２．６ｍｇ／ｋｇ。Ｆｃ−Ｓｙｔ１ ＭＭＡＥを用いるＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍の処置は有力な成長抑制に導いた（図１６Ｄ）。さらに重要なことに、Ｆｃ−Ｓｙｔ１ ＭＭＡＥの送達を４週間において停止した後に腫瘍成長は抑制されたままであった。処置の終了点におけるＦｃ−Ｓｙｔ１ ＭＭＡＥ及びＦｃ−Ｓｙｔ１（ＤＮ） ＭＭＡＥ処置グループの間の統計的に有意な差を一元配置分散分析及び続くボンフェローニポストホックテストを用いて分析し（＊＊＊，ｐ＜０．００１）、エラーバーはＳＥＭを示す。実験の最後に各グループ内のマウスから腫瘍を単離し、Ｆｃ−Ｓｙｔ１ ＭＭＡＥ処置グループ内の６匹のマウス中３匹から腫瘍を単離することはできなかった（図１６Ｅ）。Ｆｃ ＭＭＡＥ又はＦｃ−Ｓｙｔ１（ＤＮ） ＭＭＡＥの送達は最初に腫瘍成長を遅くしたが、処置の終了に続いて急速な増殖が観察された（図１６Ｄ）。まとめると、データはＰＳ結合がＦｃ−Ｓｙｔ１ ＭＭＡＥの活性に必須であることを示している。
【実施例１３】
【０１４１】
Ｆｃ−Ｓｙｔ１  ＭＭＡＥは腫瘍組織における腫瘍内皮及び癌細胞の両方を含む複数の細胞タイプを標的とする
ドセタキセル処置の後にＦｃ−Ｓｙｔ１ ＭＭＡＥが腫瘍組織におけるＰＳ陽性細胞に結合することをさらに実証するために、腫瘍保有マウス中へのこのＰＤＣの送達から１時間（図１７Ａ）又は２４時間（図１７Ｂ）後に免疫組織化学を行った。ビヒクル対照としてＰＢＳを注入し、Ａｌｅｘａ  ５５５標識抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を用いてＦｃ−Ｓｙ
ｔ１ ＭＭＡＥを検出した。Ｆｃ−Ｓｙｔ１ ＭＭＡＥはＰＳを露出し得るＣＤ３１陽性血管（図１７Ａ）、腫瘍細胞及び腫瘍浸潤Ｆ４／８０陽性マクロファージ（図１７Ｂ）に局在した。データは、癌細胞が試験管内でＰＳを露出するのみでなく（図１４Ａ）、生体内でこのＰＳ不斉の喪失（ｌｏｓｓ  ｏｆ  ＰＳ  ａｓｙｍｍｅｔｒｙ）を保持していることを示す。
【実施例１４】
【０１４２】
代表的な抗体−薬物コンジュゲート、タンパク質−薬物コンジュゲートのＤＮＡ及びタンパク質配列
表１は本明細書に説明される代表的なタンパク質をコードするポリヌクレオチドのＤＮＡ配列を示し、表２は表１に示されるポリヌクレオチドによりコードされる代表的なタンパク質のアミノ酸配列を示し、表において、配列番号１のＤＮＡ配列は配列番号２のタンパク質をコードし、配列番号３のＤＮＡ配列は配列番号４のタンパク質をコードし、配列番号５のＤＮＡ配列は配列番号６のタンパク質をコードし、配列番号７のＤＮＡ配列は配列番号８のタンパク質をコードし、配列番号９のＤＮＡ配列は配列番号１０のタンパク質をコードし、配列番号１１のＤＮＡ配列は配列番号１２のタンパク質をコードし、配列番号１３のＤＮＡ配列は配列番号１４のタンパク質をコードし、配列番号１５のＤＮＡ配列は配列番号１６のタンパク質をコードし、配列番号１７のＤＮＡ配列は配列番号１８のタンパク質をコードし、配列番号１９のＤＮＡ配列は配列番号２０のタンパク質をコードし、配列番号２１のＤＮＡ配列は配列番号２２のタンパク質をコードし、配列番号２３のＤＮＡ配列は配列番号２４のタンパク質をコードし、配列番号２５のＤＮＡ配列は配列番号２６のタンパク質をコードし、配列番号２７のＤＮＡ配列は配列番号２８のタンパク質をコードし、配列番号２９のＤＮＡ配列は配列番号３０のタンパク質をコードし、配列番号３１のＤＮＡ配列は配列番号３２のタンパク質をコードし、配列番号３３のＤＮＡ配列は配列番号３４のタンパク質をコードし、配列番号３５のＤＮＡ配列は配列番号３６のタンパク質をコードし、配列番号３７のＤＮＡ配列は配列番号３８のタンパク質をコードし、配列番号３９のＤＮＡ配列は配列番号４０のタンパク質をコードし、配列番号４１のＤＮＡ配列は配列番号４２のタンパク質をコードし、配列番号４３のＤＮＡ配列は配列番号４４のタンパク質をコードし、配列番号４５のＤＮＡ配列は配列番号４６のタンパク質をコードし、配列番号４７のＤＮＡ配列は配列番号４８のタンパク質をコードする。
【表１−１】
2020518240.tif 000003
【表１−２】
2020518240.tif 000004
【表１−３】
2020518240.tif 000005
【表１−４】
2020518240.tif 000006
【表１−５】
2020518240.tif 000007
【表１−６】
2020518240.tif 000008
【表１−７】
2020518240.tif 000009
【表１−８】
2020518240.tif 000010
【表１−９】
2020518240.tif 000011
【表１−１０】
2020518240.tif 000012
【表１−１１】
2020518240.tif 000013
【表１−１２】
2020518240.tif 000014
【表１−１３】
2020518240.tif 000015
【表１−１４】
2020518240.tif 000016
【表１−１５】
2020518240.tif 000017
【表２−１】
2020518240.tif 000018
【表２−２】
2020518240.tif 000019
【表２−３】
2020518240.tif 000020
【表２−４】
2020518240.tif 000021
【表２−５】
2020518240.tif 000022
【０１４３】
配列番号１のＤＮＡ配列は、Ｃｙｓ２１４のセリンへの突然変異を有する代表的なＨＥＲ２特異的抗体ペルツズマブの軽鎖（配列番号２）をコードするポリヌクレオチドのものであり、例えばペルツズマブのＳＧ重鎖変異体（配列番号４）とのヘテロダイマー形成のために構成される。
【０１４４】
特に、代表的なＨＥＲ２特異的抗体ペルツズマブの軽鎖（配列番号２）のアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端への順序で残基１−１０８にＨＥＲ２特異的ＶＬドメイン及び残基１０９−２１４に免疫グロブリンＣＬドメイン（ヒトＣκ）を有する。通常免疫グロブリン重鎖と対になるシステイン残基（２１４）はセリンに突然変異している。配列番号２において言及されているアミノ酸残基の番号は、タンパク質配列のものであり、ＥＵナンバリング協定を指していない。
【０１４５】
配列番号３のＤＮＡ配列は、Ｃｙｓ２２２及びＣｙｓ２３１のセリンへの突然変異及び
ＳＧ突然変異を有する代表的なＨＥＲ２特異的抗体ペルツズマブの重鎖（配列番号４）をコードするポリヌクレオチドのものである。コードされる重鎖（配列番号４）は、例えばペルツズマブの軽鎖変異体（配列番号２）とヘテロダイマーを形成し、ペルツズマブのＳＧ変異体を形成するように構成されている。
【０１４６】
特に、配列番号４の代表的な抗体重鎖のアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端への順序で残基１−１１９にＨＥＲ２特異的ＶＨドメイン、残基１２０−２１６に免疫グロブリンＣＨ１ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）、残基２１７−２３２に免疫グロブリンヒンジ（ヒトＩｇＧ１由来）、残基２３３−３４２に免疫グロブリンＣＨ２ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）、残基３４３−４４９に免疫グロブリンＣＨ３ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）を有する。配列番号４の代表的なＨＥＲ２特異的抗体重鎖は、Ｓｅｒ５５及びＧｌｙ５７のそれぞれヒスチジン及びグルタミン酸への突然変異（ＳＧ突然変異）を有する。通常免疫グロブリン軽鎖と対になり、ヒンジスルフヒドリル架橋を形成するシステイン残基（２２２及び２３１）はセリンに突然変異している。配列番号４において言及されているアミノ酸残基の番号は、タンパク質配列のものであり、ＥＵナンバリング協定を指していない。
【０１４７】
配列番号５のＤＮＡ配列は、Ｃｙｓ２１４のセリンへの突然変異及びＴｙｒ５５のヒスチジンへの突然変異を有する代表的なＨＥＲ２特異的抗体ペルツズマブの軽鎖（配列番号６）をコードするポリヌクレオチドのものである。コードされる軽鎖（配列番号６）は、例えばペルツズマブのＹＳ重鎖変異体（配列番号８）とのヘテロダイマー形成のために構成されている。
【０１４８】
特に、代表的なＨＥＲ２特異的抗体ペルツズマブの軽鎖のアミノ酸配列（配列番号６）は、Ｎ末端からＣ末端への順序で残基１−１０８にＨＥＲ２特異的ＶＬドメイン及び残基１０９−２１４に免疫グロブリンＣＬドメイン（ヒトＣκ）を有する。配列番号６の代表的なＨＥＲ２特異的抗体軽鎖は、残基５５のヒスチジンへの突然変異を有する。通常免疫グロブリン重鎖と対になるシステイン残基（２１４）はセリンに突然変異している。配列番号６において言及されているアミノ酸残基の番号は、タンパク質配列のものであり、ＥＵナンバリング協定を指していない。
【０１４９】
配列番号７のＤＮＡ配列は、Ｃｙｓ２２２及びＣｙｓ２３１のセリンへの突然変異及びＳｅｒ１０３のヒスチジンへの突然変異を有する代表的なＨＥＲ２特異的抗体ペルツズマブの重鎖（配列番号８）をコードするポリヌクレオチドのものである。コードされる重鎖（配列番号８）は、例えばペルツズマブの軽鎖変異体（配列番号６）とヘテロダイマーを形成してペルツズマブのＹＳ変異体を作製するために構成されている。
【０１５０】
特に、配列番号８の代表的な抗体重鎖のアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端への順序で残基１−１１９にＨＥＲ２特異的ＶＨドメイン、残基１２０−２１６に免疫グロブリンＣＨ１ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）、残基２１７−２３２に免疫グロブリンヒンジ（ヒトＩｇＧ１由来）、残基２３３−３４２に免疫グロブリンＣＨ２ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）、残基３４３−４４９に免疫グロブリンＣＨ３ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）を有する。配列番号８の代表的なＨＥＲ２特異的抗体重鎖は残基１０３のヒスチジンへの突然変異を有する。通常免疫グロブリン軽鎖と対になり、ヒンジスルフヒドリル架橋を形成するシステイン残基（２２２及び２３１）はセリンに突然変異している。配列番号８において言及されているアミノ酸残基の番号は、タンパク質配列のものであり、ＥＵナンバリング協定を指していない。
【０１５１】
配列番号９のＤＮＡ配列は、Ｃｙｓ２５１及びＣｙｓ２６０のセリンへの突然変異及びＳＧ突然変異を有する免疫グロブリンＦｃフラグメントのＮ末端に融合した代表的なＨＥＲ２特異的抗体ペルツズマブの一本鎖Ｆｖ（配列番号１０）をコードするポリヌクレオチ
ドのものである。コードされる融合タンパク質（配列番号１０）はホモダイマーを形成するように構成されている。
【０１５２】
特に配列番号１０の代表的な抗体重鎖のアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端への順序で残基１−１１９にＨＥＲ２特異的ＶＨドメイン、残基１２０−１３４に（Ｇ４Ｓ）３リンカーペプチド、残基１３５−２４２にＨＥＲ２特異的ＶＬドメイン、残基２４３−２４５にＧＧＳリンカーペプチド、残基２４６−２６１に免疫グロブリンヒンジ（ヒトＩｇＧ１由来）、残基２６２−３７１に免疫グロブリンＣＨ２ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）、残基３７２−４７８に免疫グロブリンＣＨ３（ヒトＩｇＧ１由来）を有する。配列番号１０の代表的なＨＥＲ２特異的抗体ｓｃＦｖ−重鎖融合体は、Ｓｅｒ５５及びＧｌｙ５７のそれぞれヒスチジン及びグルタミン酸への突然変異（ＳＧ突然変異）を有する。通常免疫グロブリン軽鎖と対になり、ヒンジスルフヒドリル架橋を形成するシステイン残基（２５１及び２６０）はセリンに突然変異している。配列番号１０において言及されているアミノ酸残基の番号は、タンパク質配列のものであり、ＥＵナンバリング協定を指していない。
【０１５３】
配列番号１１のＤＮＡ配列は、Ｃｙｓ２５１及びＣｙｓ２６０のセリンへの突然変異及びＹＳ突然変異を有する免疫グロブリンＦｃフラグメントのＮ末端に融合した代表的なＨＥＲ２特異的抗体ペルツズマブの一本鎖Ｆｖ（配列番号１２）をコードするポリヌクレオチドのものである。コードされる融合タンパク質（配列番号１２）はホモダイマーを形成するように構成されている。
【０１５４】
特に配列番号１２の代表的な抗体重鎖のアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端への順序で残基１−１１９にＨＥＲ２特異的ＶＨドメイン、残基１２０−１３４に（Ｇ４Ｓ）３リンカーペプチド、残基１３５−２４２にＨＥＲ２特異的ＶＬドメイン、残基２４３−２４５にＧＧＳリンカーペプチド、残基２４６−２６１に免疫グロブリンヒンジ（ヒトＩｇＧ１由来）、残基２６２−３７１に免疫グロブリンＣＨ２ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）、残基３７２−４７８に免疫グロブリンＣＨ３（ヒトＩｇＧ１由来）を有する。配列番号１２の代表的なＨＥＲ２特異的抗体ｓｃＦｖ−重鎖融合体は、Ｓｅｒ１０３及びＴｙｒ１８９のヒスチジンへの突然変異（ＹＳ突然変異）を有する。通常免疫グロブリン軽鎖と対になり、ヒンジスルフヒドリル架橋を形成するシステイン残基（２５１及び２６０）はセリンに突然変異している。配列番号１２において言及されているアミノ酸残基の番号は、タンパク質配列のものであり、ＥＵナンバリング協定を指していない。
【０１５５】
配列番号１３のＤＮＡ配列は、Ｃｙｓ６及びＣｙｓ１５のセリンへの突然変異及びＳＧ突然変異を有する免疫グロブリンＦｃフラグメントのＣ末端に融合した代表的なＨＥＲ２特異的抗体ペルツズマブの一本鎖Ｆｖ（配列番号１４）をコードするポリヌクレオチドのものである。コードされる融合タンパク質（配列番号１４）はホモダイマーを形成するように構成されている。
【０１５６】
特に配列番号１４の代表的な抗体重鎖のアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端への順序で残基１−１６に免疫グロブリンヒンジ（ヒトＩｇＧ１由来）、残基１７−１２６に免疫グロブリンＣＨ２ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）、残基１２７−２３３に免疫グロブリンＣＨ３ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）、残基２３４−２３６にＧＧＳリンカーペプチド、残基２３７−３５５にＨＥＲ２特異的ＶＨドメイン、残基３５６−３７０に（Ｇ４Ｓ）３リンカーペプチド、残基３７１−４７８にＨＥＲ２特異的ＶＬドメインを有する。配列番号１４の代表的なＨＥＲ２特異的抗体ｓｃＦｖ−重鎖融合体は、Ｓｅｒ２９１及びＧｌｙ２９３のそれぞれヒスチジン及びグルタミン酸への突然変異（ＳＧ突然変異）を有する。通常免疫グロブリン軽鎖と対になり、ヒンジスルフヒドリル架橋を形成するシステイン残基（６及び１５）はセリンに突然変異している。配列番号１４において言及されているアミノ酸残基の番号は、タンパク質配列のものであり、ＥＵナンバリング協定を指していない
。
【０１５７】
配列番号１５のＤＮＡ配列は、Ｃｙｓ６及びＣｙｓ１５のセリンへの突然変異及びＹＳ突然変異を有する免疫グロブリンＦｃフラグメントのＣ末端に融合した代表的なＨＥＲ２特異的抗体ペルツズマブの一本鎖Ｆｖ（配列番号１６）をコードするポリヌクレオチドのものである。コードされる融合タンパク質（配列番号１６）はホモダイマーを形成するように構成されている。
【０１５８】
特に配列番号１６の代表的な抗体重鎖のアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端への順序で残基１−１６に免疫グロブリンヒンジ（ヒトＩｇＧ１由来）、残基１７−１２６に免疫グロブリンＣＨ２ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）、残基１２７−２３３に免疫グロブリンＣＨ３ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）、残基２３４−２３６にＧＧＳリンカーペプチド、残基２３７−３５５にＨＥＲ２特異的ＶＨドメイン、残基３５６−３７０に（Ｇ４Ｓ）３リンカーペプチド、残基３７１−４７８にＨＥＲ２特異的ＶＬドメインを有する。配列番号１６の代表的なＨＥＲ２特異的抗体ｓｃＦｖ−重鎖融合体は、Ｓｅｒ３３９及びＴｙｒ４２５のヒスチジンへの突然変異（ＹＳ突然変異）を有する。通常免疫グロブリン軽鎖と対になり、ヒンジスルフヒドリル架橋を形成するシステイン残基（６及び１５）はセリンに突然変異している。配列番号１６において言及されているアミノ酸残基の番号は、タンパク質配列のものであり、ＥＵナンバリング協定を指していない。
【０１５９】
配列番号１７のＤＮＡ配列は、免疫グロブリンヒンジの一部（Ｃｙｓ２２３のセリンへの突然変異を有する）及びＳＧＧを含むリンカーペプチドを介してカルビンジンドメイン２（ＣａｌＤ２）のＮ末端に融合したＨＥＲ２特異的抗体トラスツズマブのＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインを含む代表的なＣａｌＤ２融合タンパク質（配列番号１８）をコードするポリヌクレオチドのものである。コードされる融合タンパク質（配列番号１８）は、例えばトラスツズマブの軽鎖（配列番号２０）とヘテロダイマーを形成し、Ｃａ２＋依存的やり方で配列番号２２と会合するように構成されている。
【０１６０】
特に配列番号１８の代表的なＣａｌＤ２融合タンパク質のアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端への順序で残基１−１２０にＨＥＲ２特異的ＶＨドメイン、残基１２１−２１７に免疫グロブリンＣＨ１ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）、残基２１８−２２８に重鎖ヒンジ領域の一部を含むリンカー配列及び続いて残基２２９−２３１にＳＧＧ配列ならびに残基２３２−２６３にＣａｌＤ２ドメインを有する。通常免疫グロブリン軽鎖と対になるシステイン残基（２２３）はセリンに突然変異している。配列番号１８において言及されているアミノ酸残基の番号は、タンパク質配列のものであり、ＥＵナンバリング協定を指していない。
【０１６１】
配列番号１９のＤＮＡ配列は、Ｃｙｓ２１４のセリンへの突然変異を有する代表的なＨＥＲ２特異的抗体トラスツズマブの軽鎖（配列番号２０）をコードするポリヌクレオチドのものである。コードされる軽鎖（配列番号２０）は、例えばトラスツズマブＶＨ−ＣＨ１：ＣａｌＤ２融合タンパク質（配列番号１８）とのヘテロダイマー形成のために構成されている。
【０１６２】
特に、代表的なＨＥＲ２特異的抗体トラスツズマブの軽鎖（配列番号２０）のアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端への順序で残基１−１０８にＨＥＲ２特異的ＶＬドメイン及び残基１０９−２１４に免疫グロブリンＣＬドメイン（ヒトＣκ）、続いて残基２１５−２２０にヘキサヒスチジンペプチドタグを有する。通常免疫グロブリン重鎖と対になるシステイン残基（２１４）はセリンに突然変異している。配列番号２０において言及されているアミノ酸残基の番号は、タンパク質配列のものであり、ＥＵナンバリング協定を指していない。
【０１６３】
配列番号２１のＤＮＡ配列は、Ｃｙｓ５２のセリンへの突然変異を有する免疫グロブリンＦｃフラグメントのＮ末端に融合したカルビンジンドメイン１（ＣａｌＤ１）を含む代表的なＣａｌＤ１融合タンパク質（配列番号２２）をコードするポリヌクレオチドのものである。コードされる融合タンパク質（配列番号２２）は、例えばトラスツズマブＶＨ−ＣＨ１：ＣａｌＤ２融合タンパク質（配列番号１８）又は０２６  ＶＨ−ＣＨ１：ＣａｌＤ２融合タンパク質（配列番号２４）とＣａ２＋依存的やり方で会合するように構成されている。
【０１６４】
特に、配列番号２２の代表的なＣａｌＤ１融合タンパク質のアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端への順序で残基１−４３にＣａｌＤ１ドメイン、残基４４−４６にＧＳＳリンカーペプチド、残基４７−６２に免疫グロブリンヒンジ（ヒトＩｇＧ１由来）、残基６３−１７２に免疫グロブリンＣＨ２ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）、残基１７３−２７９に免疫グロブリンＣＨ３ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）を有する。通常免疫グロブリン軽鎖と対になるシステイン残基（５２）はセリンに突然変異している。配列番号２２において言及されているアミノ酸残基の番号は、タンパク質配列のものであり、ＥＵナンバリング協定を指していない。
【０１６５】
配列番号２３のＤＮＡ配列は、免疫グロブリンヒンジの一部（Ｃｙｓ２２７のセリンへの突然変異を有する）及びＳＧＧを含むリンカーペプチドを介してカルビンジンドメイン２（ＣａｌＤ２）のＮ末端に融合したＰＳＭＡ特異的抗体０２６のＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインを含む代表的なＣａＬＤ２融合タンパク質（配列番号２４）をコードするポリヌクレオチドのものである。コードされる融合タンパク質（配列番号２４）は、例えば０２６の軽鎖（配列番号２６）とヘテロダイマーを形成して配列番号２２とＣａ２＋依存的やり方で会合するように構成されている。
【０１６６】
特に、配列番号２４の代表的なＣａｌＤ２融合タンパク質のアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端への順序で残基１−１２４にＰＳＭＡ特異的ＶＨドメイン、残基１２５−２２１に免疫グロブリンＣＨ１ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）、残基２２２−２３２に重鎖ヒンジ領域の一部を含むリンカー配列、続いて残基２３３−２３５にＳＧＧ配列及び残基２３６−２６７にＣａｌＤ２ドメインを有する。通常免疫グロブリン軽鎖と対になるシステイン残基（２２７）はセリンに突然変異している。配列番号２４において言及されているアミノ酸残基の番号は、タンパク質配列のものであり、ＥＵナンバリング協定を指していない。
【０１６７】
配列番号２５のＤＮＡ配列は、Ｃｙｓ２１４のセリンへの突然変異を有する代表的なＰＳＭＡ特異的抗体０２６の軽鎖（配列番号２６）をコードするポリヌクレオチドのものである。コードされる軽鎖（配列番号２６）は、例えば０２６ＶＨ−ＣＨ１：ＣａｌＤ２融合タンパク質（配列番号２４）とのヘテロダイマー形成のために構成されている。
【０１６８】
特に、代表的なＰＳＭＡ特異的抗体０２６の軽鎖（配列番号２６）のアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端への順序で残基１−１０８にＨＥＲ２特異的ＶＬドメイン及び残基１０９−２１４に免疫グロブリンＣＬドメイン（ヒトＣκ）、続いて残基２１５−２２０にヘキサヒスチジンペプチドタグを有する。通常免疫グロブリン重鎖と対になるシステイン残基（２１４）はセリンに突然変異している。配列番号２６において言及されているアミノ酸残基の番号は、タンパク質配列のものであり、ＥＵナンバリング協定を指していない。
【０１６９】
配列番号２７のＤＮＡ配列は、Ｃｙｓ６のセリンへの突然変異を有する免疫グロブリンＦｃフラグメントのＣ末端に融合したシナプトタグミンのＳｙｔ１  Ｃ２Ａドメインを含む代表的なＦｃ融合タンパク質（配列番号２８）をコードするポリヌクレオチドのもので
ある。コードされる融合タンパク質（配列番号２８）はホモダイマーを形成するように構成されている。
【０１７０】
特に、配列番号２８の代表的なＦｃ−Ｓｙｔ１のアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端への順序で残基１−１６に免疫グロブリンヒンジ（ヒトＩｇＧ１由来）、残基１７−１２６に免疫グロブリンＣＨ２ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）、残基１２７−２３３に免疫グロブリンＣＨ３ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）を有する。シナプトタグミン（Ｓｙｔ１）のＣ２Ａ  ＰＳ結合ドメインの残基１４１−２６６がＧＧＧＧＳリンカーペプチド（残基２３４−２３８）を介してＣＨ３ドメインのＣ末端に残基２３９−３６４として融合している。免疫グロブリン軽鎖と対になるシステイン残基（６）はセリンに突然変異している。配列番号２８において言及されているアミノ酸残基の番号は、タンパク質配列のものであり、ＥＵナンバリング協定を指していない。
【０１７１】
配列番号２９のＤＮＡ配列は、Ｃｙｓ１３７のセリンへの突然変異を有する免疫グロブリンＦｃフラグメントのＮ及びＣ末端の両方に融合したシナプトタグミンのＳｙｔ１  Ｃ２Ａドメインを含む代表的なＦｃ融合タンパク質（配列番号３０）をコードするポリヌクレオチドのものである。コードされる融合タンパク質（配列番号３０）はホモダイマーを形成するように構成されている。
【０１７２】
特に、配列番号３０の代表的なＳｙｔ１−Ｆｃ−Ｓｙｔ１のアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端への順序で残基１３２−１４７に免疫グロブリンヒンジ（ヒトＩｇＧ１由来）、残基１４８−２５７に免疫グロブリンＣＨ２ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）、残基２５８−３６４に免疫グロブリンＣＨ３ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）を有する。シナプトタグミン（Ｓｙｔ１）のＣ２Ａ  ＰＳ結合ドメインの残基１４１−２６６がＧＧＧＧＳリンカーペプチド（残基１２７−１３１及び３６５−３６９）を介してヒンジ及びＣＨ３ドメインのＮ及びＣ末端にそれぞれ残基１−１２６及び３７０−４９５として融合している。免疫グロブリン軽鎖と対になるシステイン残基（１３７）はセリンに突然変異している。配列番号３０において言及されているアミノ酸残基の番号は、タンパク質配列のものであり、ＥＵナンバリング協定を指していない。
【０１７３】
配列番号３１のＤＮＡ配列は、Ｃｙｓ６のセリンへの突然変異を有する免疫グロブリンＦｃフラグメントのＣ末端に融合したＰＫＣαのＣ２ドメインを含む代表的なＦｃ融合タンパク質（配列番号３２）をコードするポリヌクレオチドのものである。コードされる融合タンパク質（配列番号３２）はホモダイマーを形成するように構成されている。
【０１７４】
特に、配列番号３２の代表的なＦｃ−ＰＫＣαのアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端への順序で残基１−１６に免疫グロブリンヒンジ（ヒトＩｇＧ１由来）、残基１７−１２６に免疫グロブリンＣＨ２ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）、残基１２７−２３３に免疫グロブリンＣＨ３ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）を有する。ＰＫＣαのＣ２ドメインの残基１５７−２８８がＧＧＧＧＳリンカーペプチド（残基２３４−２３８）を介してＣＨ３ドメインのＣ末端に残基２３９−３７０として融合している。免疫グロブリン軽鎖と対になるシステイン残基（６）はセリンに突然変異している。配列番号３２において言及されているアミノ酸残基の番号は、タンパク質配列のものであり、ＥＵナンバリング協定を指していない。
【０１７５】
配列番号３３のＤＮＡ配列は、Ｃｙｓ６のセリンへの突然変異を有する免疫グロブリンＦｃフラグメントのＣ末端に融合したＡｎｘＡ１  ＰＳ結合コアドメインを含む代表的なＦｃ融合タンパク質（配列番号３４）をコードするポリヌクレオチドのものである。コードされる融合タンパク質（配列番号３４）はホモダイマーを形成するように構成されている。
【０１７６】
特に、配列番号３４の代表的なＦｃ−ＡｎｘＡ１のアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端への順序で残基１−１６に免疫グロブリンヒンジ（ヒトＩｇＧ１由来）、残基１７−１２６に免疫グロブリンＣＨ２ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）、残基１２７−２３３に免疫グロブリンＣＨ３ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）を有する。ＡｎｘＡ１コアドメインの残基４１−３４６がＧＧＧＧＳリンカーペプチド（残基２３４−２３８）を介してＣＨ３ドメインのＣ末端に残基２３９−５４４として融合している。免疫グロブリン軽鎖と対になるシステイン残基（６）はセリンに突然変異している。配列番号３４において言及されているアミノ酸残基の番号は、タンパク質配列のものであり、ＥＵナンバリング協定を指していない。
【０１７７】
配列番号３５のＤＮＡ配列は、Ｃｙｓ１３７のセリンへの突然変異を有する免疫グロブリンＦｃフラグメントのＮ末端に融合したシナプトタグミンのＳｙｔ１  Ｃ２Ａドメインを含む代表的なＦｃ融合タンパク質（配列番号３６）をコードするポリヌクレオチドのものである。コードされる融合タンパク質（配列番号３６）はホモダイマーを形成するように構成されている。
【０１７８】
特に、配列番号３６の代表的なＳｙｔ１−Ｆｃのアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端への順序でシナプトタグミン（Ｓｙｔ１）のＣ２Ａ  ＰＳ結合ドメインの残基１４１−２６６を残基１−１２６として、残基１２７−１３１にＧＧＧＧＳリンカーペプチド、残基１３２−１４７に免疫グロブリンヒンジ（ヒトＩｇＧ１由来）、残基１４８−２５７に免疫グロブリンＣＨ２ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）、残基２５８−３６４に免疫グロブリンＣＨ３ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）を有する。免疫グロブリン軽鎖と対になるシステイン残基（１３７）はセリンに突然変異している。配列番号３６において言及されているアミノ酸残基の番号は、タンパク質配列のものであり、ＥＵナンバリング協定を指していない。
【０１７９】
配列番号３７のＤＮＡ配列は、Ｃｙｓ１４３のセリンへの突然変異を有する免疫グロブリンＦｃフラグメントのＮ末端に融合したＰＫＣαのＣ２ドメインを含む代表的なＦｃ融合タンパク質（配列番号３８）をコードするポリヌクレオチドのものである。コードされる融合タンパク質（配列番号３８）はホモダイマーを形成するように構成されている。
【０１８０】
特に、配列番号３８の代表的なＰＫＣα−Ｆｃのアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端への順序でＰＫＣαのＣ２ドメインの残基１５７−２８８を残基１−１３２として、残基１３３−１３７にＧＧＧＧＳリンカーペプチド、残基１３８−１５３に免疫グロブリンヒンジ（ヒトＩｇＧ１由来）、残基１５４−２６３に免疫グロブリンＣＨ２ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）、残基２６４−３７０に免疫グロブリンＣＨ３ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）を有する。免疫グロブリン軽鎖と対になるシステイン残基（１４３）はセリンに突然変異している。配列番号３８において言及されているアミノ酸残基の番号は、タンパク質配列のものであり、ＥＵナンバリング協定を指していない。
【０１８１】
配列番号３９のＤＮＡ配列は、Ｃｙｓ３１７のセリンへの突然変異を有する免疫グロブリンＦｃフラグメントのＮ末端に融合したＡｎｘＡ１  ＰＳ結合コアドメインを含む代表的なＦｃ融合タンパク質（配列番号４０）をコードするポリヌクレオチドのものである。コードされる融合タンパク質（配列番号４０）はホモダイマーを形成するように構成されている。
【０１８２】
特に、配列番号４０の代表的なＡｎｘＡ１−Ｆｃのアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端への順序でＡｎｘＡ１コアドメインの残基４１−３４６を残基１−３０６として、残基３０７−３１１にＧＧＧＧＳリンカーペプチド、残基３１２−３２７に免疫グロブリンヒン
ジ（ヒトＩｇＧ１由来）、残基３２８−４３７に免疫グロブリンＣＨ２ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）、残基４３８−５４４に免疫グロブリンＣＨ３ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）を有する。免疫グロブリン軽鎖と対になるシステイン残基（３１７）はセリンに突然変異している。配列番号４０において言及されているアミノ酸残基の番号は、タンパク質配列のものであり、ＥＵナンバリング協定を指していない。
【０１８３】
配列番号４１のＤＮＡ配列は、ノブズイントゥーホールズ突然変異及びＣｙｓ１３７のセリンへの突然変異を有する免疫グロブリンＦｃフラグメントのＮ及びＣ末端に融合したシナプトタグミンのＳｙｔ１  Ｃ２Ａドメインを含む代表的なＦｃ融合タンパク質（配列番号４２）をコードするポリヌクレオチドのものである。コードされる融合タンパク質（配列番号４２）は例えば代表的なＦｃフラグメント（配列番号４４）とヘテロダイマーを形成するように構成されている。
【０１８４】
特に、配列番号４２の代表的なＳｙｔ１−Ｆｃ−Ｓｙｔ１のアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端への順序で残基１３２−１４７に免疫グロブリンヒンジ（ヒトＩｇＧ１由来）、残基１４８−２５７に免疫グロブリンＣＨ２ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）、残基２５８−３６４に免疫グロブリンＣＨ３ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）を有する。シナプトタグミン（Ｓｙｔ１）のＣ２Ａ  ＰＳ結合ドメインの残基１４１−２６６がＧＧＧＧＳリンカーペプチド（残基１２７−１３１及び３６５−３６９）を介してヒンジ及びＣＨ３ドメインのＮ及びＣ末端にそれぞれ残基１−１２６及び３７０−４９５として融合している。配列番号４２の代表的なＳｙｔ１−Ｆｃ−Ｓｙｔ１は残基２６６及び３１１に「ノブズイントゥーホールズ」突然変異を有する。免疫グロブリン軽鎖と対になるシステイン残基（１３７）はセリンに突然変異している。配列番号４２において言及されているアミノ酸残基の番号は、タンパク質配列のものであり、ＥＵナンバリング協定を指していない。
【０１８５】
配列番号４３のＤＮＡ配列は、ノブズイントゥーホールズ突然変異及びＣｙｓ６のセリンへの突然変異を有する代表的なＦｃフラグメント（配列番号４４）をコードするポリヌクレオチドのものである。配列番号４４のＦｃフラグメントは、例えば代表的なＳｙｔ１−Ｆｃ−Ｓｙｔ１融合体（配列番号４２）とヘテロダイマーを形成するように構成されている。
【０１８６】
特に、配列番号４４の代表的なＦｃフラグメントのアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端への順序で残基１−１６に免疫グロブリンヒンジ（ヒトＩｇＧ１由来）、残基１７−１２６に免疫グロブリンＣＨ２ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）、残基１２７−２３３に免疫グロブリンＣＨ３ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）を有する。配列番号４４の代表的なＦｃフラグメントは残基１５０及び１９１にノブズイントゥーホールズ突然変異を有する。通常免疫グロブリン軽鎖と対になるシステイン残基（６）はセリンに突然変異している。配列番号４４において言及されているアミノ酸残基の番号は、タンパク質配列のものであり、ＥＵナンバリング協定を指していない。
【０１８７】
配列番号４５のＤＮＡ配列は、ノブズイントゥーホールズ突然変異、静電ステアリング突然変異及びＣｙｓ１３７のセリンへの突然変異を有する免疫グロブリンＦｃフラグメントのＮ及びＣ末端の両方に融合したシナプトタグミンのＳｙｔ１  Ｃ２Ａドメインを含む代表的なＦｃ融合タンパク質（配列番号４６）をコードするポリヌクレオチドのものである。コードされる融合タンパク質（配列番号４６）は例えば代表的なＦｃフラグメント（配列番号４８）とヘテロダイマーを形成するように構成されている。
【０１８８】
特に、配列番号４６の代表的なＳｙｔ１−Ｆｃ−Ｓｙｔ１のアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端への順序で残基１３２−１４７に免疫グロブリンヒンジ（ヒトＩｇＧ１由来）、残基１４８−２５７に免疫グロブリンＣＨ２ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）、残基２５８
−３６４に免疫グロブリンＣＨ３ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）を有する。シナプトタグミン（Ｓｙｔ１）のＣ２Ａ  ＰＳ結合ドメインの残基１４１−２６６がＧＧＧＧＳリンカーペプチド（残基１２７−１３１及び３６５−３６９）を介してヒンジ及びＣＨ３ドメインのＮ及びＣ末端にそれぞれ残基１−１２６及び３７０−４９５として融合している。配列番号４６の代表的なＳｙｔ１−Ｆｃ−Ｓｙｔ１は残基２６６及び３１１に「ノブズイントゥーホールズ」突然変異ならびに残基３０９及び３２６に静電ステアリング突然変異を有する。免疫グロブリン軽鎖と対になるシステイン残基（１３７）はセリンに突然変異している。配列番号４６において言及されているアミノ酸残基の番号は、タンパク質配列のものであり、ＥＵナンバリング協定を指していない。
【０１８９】
配列番号４７のＤＮＡ配列は、ノブズイントゥーホールズ突然変異、静電ステアリング突然変異及びＣｙｓ６のセリンへの突然変異を有する代表的なＦｃフラグメント（配列番号４８）をコードするポリヌクレオチドのものである。配列番号４８のＦｃフラグメントは、例えば代表的なＳｙｔ１−Ｆｃ−Ｓｙｔ１融合体（配列番号４６）とヘテロダイマーを形成するように構成されている。
【０１９０】
特に、配列番号４８の代表的なＦｃフラグメントのアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端への順序で残基１−１６に免疫グロブリンヒンジ（ヒトＩｇＧ１由来）、残基１７−１２６に免疫グロブリンＣＨ２ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）、残基１２７−２３３に免疫グロブリンＣＨ３ドメイン（ヒトＩｇＧ１由来）を有する。配列番号４８の代表的なＦｃフラグメントは残基１５０及び１９１にノブズイントゥーホールズ突然変異ならびに残基１４３及び１８５に静電ステアリング突然変異を有する。通常免疫グロブリン軽鎖と対になるシステイン残基（６）はセリンに突然変異している。配列番号４８において言及されているアミノ酸残基の番号は、タンパク質配列のものであり、ＥＵナンバリング協定を指していない。
【０１９１】
上記で開示した主題は例であって制限的ではないと考えられるべきであり、添付の請求項は本開示の真の精神及び範囲内に含まれる修正、強調及び他の態様のすべてを網羅することを意図している。かくして法律が許す最大の程度まで、本開示の範囲は以下の請求項及びそれらの同等事項の許される最も広い解釈により決定されるべきであり、前記の詳細な説明により限定又は制限されるべきではない。
【０１９２】
上記の種々の方法及び技術は出願を実施するための複数のやり方を与えている。もちろん説明されている必ずしもすべての目的又は利点を本明細書に説明の特定の態様に従って達成できるわけではないと理解されるべきである。かくして例えば当業者は、本明細書に説明又は示唆されている他の目的又は利点を必ずしも達成せずに、本明細書に説明されている１つの利点又は利点の群を達成するか、あるいは、最適化するやり方で前記方法を行うことができることを認識するであろう。多様な代替案が本明細書に挙げられる。いくつかの好ましい態様は特定的に１つの、別の又はいくつかの特徴を含むが他は特定的に１つの、別の又はいくつかの特徴を排除し、さらに他は１つの、別の又はいくつかの有利な特徴を含むことにより特定の特徴を軽減することが理解されるべきである。
【０１９３】
さらに当業者は、種々の態様からの種々の特徴の応用性（ａｐｐｌｉｃａｂｉｌｉｔｙ）を認識するであろう。類似して、上記で議論された種々の要素、特徴及び段階ならびにそのような要素、特徴又は段階のそれぞれに関する他の既知の同等事項を、当業者が種々の組み合わせにおいて用い、本明細書に説明された原理に従って方法を実施することができる。種々の要素、特徴及び段階の中でいくつかは多様な態様において特定的に含まれ、他は特定的に排除されるであろう。
【０１９４】
ある態様及び実施例の面で本出願を開示してきたが、本出願の態様は特定的に開示され
た態様を超えて他の別の態様及び／又は使用ならびにその修正及び同等事項に広がることが当業者により理解されるであろう。
【０１９５】
いくつかの態様において、本出願のある態様を説明し、主張するために用いられる分子量、反応条件などのような成分の量、性質を表す数字は、ある場合に「約」という用語で修飾されることが理解されるべきである。従っていくつかの態様において、明細書及び添付の請求項に示される数的パラメーターは近似であり、それは特定の態様が得ようとしている所望の性質に依存して変わり得る。いくつかの態様において、数的パラメーターは報告される有意な数字を見て、且つ通常の丸め法（ｒｏｕｎｄｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）の適用により解釈されるべきである。本出願のいくつかの態様の広い範囲を示す数的範囲及びパラメーターが近似であるのにかかわらず、特定の実施例において示される数値は実行可能な限り正確に報告される。
【０１９６】
いくつかの態様において、本出願の特定の態様を説明する状況で（特に以下の請求項のあるものの状況で）用いられる“ａ”及び“ａｎ”及び“ｔｈｅ”という用語ならびに類似の言及は、単数及び複数の両方を包含すると解釈され得る。本明細書における値の範囲の説明は、単に範囲内に含まれる各個別の値を個々に言及することの簡略表記法（ｓｈｏｒｔｈａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄ）として役立たせることが意図されている。本明細書で他にことわらなければ、各個々の値はそれが本明細書に個々に説明されているかのように明細書中に導入される。本明細書に説明されるすべての方法は、本明細書で他にことわるか、あるいは、そうでなければ明らかに文脈により矛盾しなければ、いずれの適した順序でも実施され得る。本明細書のある態様に関して与えられるあらゆる例又は代表的な言葉（ｅｘｅｍｐｌａｒｙ  ｌａｎｇｕａｇｅ）（例えば「のような」）の使用は、単に本出願をより明らかにすることを意図しており、他のように特許請求される本出願の範囲に制限を提示しない。明細書中のいずれの言葉も本出願の実施に必須な特許請求されていない要素を示すと解釈されるべきではない。
【０１９７】
本出願を実施するために発明者らに既知の最良の様式を含む本出願の好ましい態様を本明細書に説明する。それらの好ましい態様への変型は、前記の説明を読むと当業者に明らかになるであろう。当業者がそのような変型を適宜用いることができること及び本明細書に特定的に説明されている以外に本出願を実施できることが意図されている。従って本出願の多くの態様は、適用可能な法律により許される通り本明細書に添付の請求項に説明される主題のすべての修正及び同等事項を含む。さらに、上記の要素のすべての可能な変型におけるそれらのいずれの組み合わせも、本明細書で他にことわるか、あるいは、そうでなければ明らかに文脈により矛盾しなければ、本出願に包含される。
【０１９８】
本明細書において引用されるすべての特許、特許出願、特許出願の公報及び論文、本、明細書、公報、文書、物などのような他の材料は、それらと、本文書と一致しないか、あるいは、矛盾するそれらのいずれかとあるいは本文書と現在又は後に関連する請求項の最も広い範囲に関して制限的影響を有する場合があるそれらのいずれかと関連する審査出願経過（ｐｒｏｓｅｃｕｔｉｏｎ  ｆｉｌｅ  ｈｉｓｔｏｒｙ）を除いて、本引用によりそれらの全体がすべての目的のために本明細書の内容となる。例えば本明細書の内容となる材料のいずれかと関連する用語の説明、定義及び／又は使用及び本文書と関連するものとの間に不一致又は矛盾があったら（ｓｈｏｕｌｄ  ｔｈｅｒｅ  ｂｅ）、本文書における用語の説明、定義及び／又は使用が支配する（ｐｒｅｖａｉｌ）べきである。
【０１９９】
本明細書に開示される本出願の態様は、本出願の態様の原理の例であると理解されるべきである。用いられ得る他の修正は本出願の範囲内であることができる。かくして例として、しかし制限ではなく、本出願の態様の別の形状を本明細書の説明に従って用いることができる。従って本出願の態様は、示され、説明される態様に厳格に制限されるものでは
ない。
【図１】
2020518240.tif 000023
【図２】
2020518240.tif 000024
【図３Ａ−３Ｌ】
2020518240.tif 000025
【図３Ｍ−３Ｓ】
2020518240.tif 000026
【図４Ａ】
2020518240.tif 000027
【図４Ｂ】
2020518240.tif 000028
【図５Ａ】
2020518240.tif 000029
【図５Ｂ】
2020518240.tif 000030
【図５Ｃ】
2020518240.tif 000031
【図６】
2020518240.tif 000032
【図７Ａ】
2020518240.tif 000033
【図７Ｂ】
2020518240.tif 000034
【図８Ａ】
2020518240.tif 000035
【図８Ｂ】
2020518240.tif 000036
【図９】
2020518240.tif 000037
【図１０Ａ】
2020518240.tif 000038
【図１０Ｂ】
2020518240.tif 000039
【図１０Ｃ】
2020518240.tif 000040
【図１０Ｄ】
2020518240.tif 000041
【図１０Ｅ】
2020518240.tif 000042
【図１０Ｆ】
2020518240.tif 000043
【図１０Ｇ】
2020518240.tif 000044
【図１０Ｈ】
2020518240.tif 000045
【図１１Ａ】
2020518240.tif 000046
【図１１Ｂ】
2020518240.tif 000047
【図１１Ｃ】
2020518240.tif 000048
【図１１Ｄ】
2020518240.tif 000049
【図１１Ｅ】
2020518240.tif 000050
【図１１Ｆ】
2020518240.tif 000051
【図１１Ｇ】
2020518240.tif 000052
【図１２Ａ】
2020518240.tif 000053
【図１２Ｂ】
2020518240.tif 000054
【図１２Ｃ】
2020518240.tif 000055
【図１２Ｄ】
2020518240.tif 000056
【図１３Ａ】
2020518240.tif 000057
【図１３Ｂ】
2020518240.tif 000058
【図１３Ｃ】
2020518240.tif 000059
【図１４Ａ】
2020518240.tif 000060
【図１４Ｂ】
2020518240.tif 000061
【図１４Ｃ】
2020518240.tif 000062
【図１４Ｄ】
2020518240.tif 000063
【図１５Ａ】
2020518240.tif 000064
【図１５Ｂ】
2020518240.tif 000065
【図１５Ｃ】
2020518240.tif 000066
【図１５Ｄ】
2020518240.tif 000067
【図１５Ｅ】
2020518240.tif 000068
【図１６Ａ】
2020518240.tif 000069
【図１６Ｂ】
2020518240.tif 000070
【図１６Ｃ】
2020518240.tif 000071
【図１６Ｄ】
2020518240.tif 000072
【図１６Ｅ】
2020518240.tif 000073
【図１７Ａ】
2020518240.tif 000074
【図１７Ｂ】
2020518240.tif 000075
【配列表】
2020518240000001.app
【国際調査報告】
2020518240.tif 000076
2020518240.tif 000077
2020518240.tif 000078
2020518240.tif 000079
2020518240.tif 000080
2020518240.tif 000081
2020518240.tif 000082
2020518240.tif 000083
2020518240.tif 000084
2020518240.tif 000085
2020518240.tif 000086
2020518240.tif 000087
2020518240.tif 000088
2020518240.tif 000089