(57)【要約】ＣＤ３８標的に結合するＩｇＧ抗体を有し、ＩｇＧ抗体のヒンジ領域のＣｙｓ部位でコンジュゲートしている、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を開示する。多発性骨髄腫を治療するための方法であって、有効量のＣＤ３８  ＡＤＣを提供することを含む方法をさらに開示する。本開示は、ＣＤ３８に結合するＩｇＧ抗体、重鎖ヒンジ領域が、２つではなく１つのＣｙｓ残基のみを含むように、ヒンジ領域が突然変異していてもよいＩｇＧ抗体のヒンジ領域の単一のＣｙｓ残基へ結合しているコンジュゲーションリンカー部分、ならびにアントラサイクリンおよびドラスタチンの誘導体からなる群から選択される毒素部分を含む抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）組成物を提供する。
2020524675.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ３８に結合するＩｇＧ抗体、１つのＣｙｓ残基のみを有するように突然変異したＩｇＧ抗体のヒンジ領域の１つのＣｙｓ残基にコンジュゲートしているリンカー部分、および前記リンカー部分にコンジュゲートしている毒素部分を含む、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）組成物。
【請求項２】
（ａ）抗ＣＤ３８  ＩｇＧ抗体Ｃ３８Ａ２−ＳＶ（本明細書における重／軽鎖可変領域に関する配列番号１／３）またはＣ３８Ａ２（本明細書における重／軽鎖可変領域に関する配列番号１／２）；
（ｂ）チューブリン阻害剤またはドキソルビシン類似体である薬物または毒素部分；および
（ｃ）コンジュゲーションリンカーが、リンカーと、ＩｇＧ抗体のヒンジ領域の単一のＣｙｓ残基に共有結合しているコンジュゲーション部分とを含み、ＩｇＧ抗体の重鎖ヒンジ領域が１つのＣｙｓ残基のみを含むように、前記重鎖ヒンジ領域が突然変異していてもよい、コンジュゲーションリンカー部分
を含む、抗ＣＤ３８  ＡＤＣ組成物。
【請求項３】
前記薬物または毒素部分が、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５、およびこれらの組合せからなる群から選択され、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４およびＤ５の構造が
【化４０】
2020524675.tif 000048
である、請求項２に記載の抗ＣＤ３８  ＡＤＣ組成物。
【請求項４】
リンカーが、
【化４１】
2020524675.tif 000049
からなる群から選択され、式中、波線は、前記コンジュゲーション部分および前記薬物または毒素部分への結合点を示す、請求項２に記載の抗ＣＤ３８  ＡＤＣ組成物。
【請求項５】
前記コンジュゲーション部分が、
【化４２】
2020524675.tif 000050
であり、式中、波線は前記リンカーへの結合点を示す、請求項２に記載の抗ＣＤ３８  ＡＤＣ組成物。
【請求項６】
多発性骨髄腫を治療するための方法であって、
（ａ）抗ＣＤ３８  ＩｇＧ抗体Ｃ３８Ａ２−ＳＶ（本明細書における重／軽鎖可変領域に関する配列番号１／３）またはＣ３８Ａ２野生型（本明細書における重／軽鎖可変領域に関する配列番号１／２）；
（ｂ）チューブリン阻害剤またはドキソルビシン類似体である薬物または毒素部分；および
（ｃ）リンカーと、ＩｇＧ抗体のヒンジ領域の単一のＣｙｓ残基に共有結合しているコンジュゲーション部分とを含むコンジュゲーションリンカー部分であって、ＩｇＧ抗体の重鎖ヒンジ領域が１つのＣｙｓ残基のみを含むように、前記重鎖ヒンジ領域が突然変異していてもよい、コンジュゲーションリンカー部分
を含む、抗ＣＤ３８  ＡＤＣ組成物の治療有効量を供することを含む方法。
【請求項７】
前記薬物または毒素部分が、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５、およびこれらの組合せからなる群から選択され、構造が
【化４３】
2020524675.tif 000051
である、請求項６に記載の多発性骨髄腫を治療するための方法。
【請求項８】
前記リンカーが、
【化４４】
2020524675.tif 000052
からなる群から選択され、式中、波線は、前記コンジュゲーション部分および前記薬物または毒素部分への結合点を示す、請求項６に記載の多発性骨髄腫を治療するための方法。
【請求項９】
前記コンジュゲーション部分が
【化４５】
2020524675.tif 000053
であり、式中、波線は、前記リンカーへの結合点を示す、請求項６に記載の多発性骨髄腫を治療するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本特許出願は、２０１７年６月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／５２２，５１６号および２０１７年９月１日に出願された米国仮特許出願第６２／５５３，４３８号からの優先権を主張する。
【０００２】
本開示は、ＣＤ３８標的に結合するＩｇＧ抗体を有し、ＩｇＧ抗体のヒンジ領域のＣｙｓ部位でコンジュゲートしている、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を提供する。本開示は、多発性骨髄腫を治療するための方法であって、有効量のＣＤ３８  ＡＤＣを供することを含む方法をさらに提供する。
【背景技術】
【０００３】
ＣＤ３８は、長いＣ末端細胞外ドメインおよび短いＮ末端細胞質ドメインを有する４５ｋＤのＩＩ型膜貫通糖タンパク質である。ＣＤ３８タンパク質は、ＮＡＤ＋の環式ＡＤＰ−リボース（ｃＡＤＰＲ）への変換、またｃＡＤＰＲのＡＤＰ−リボースへの加水分解を触媒することができる二機能性エクト酵素である。個体発生の間、ＣＤ３８は、ＣＤ３４＋委託幹細胞、ならびにリンパ球細胞、赤血球および骨髄性細胞の系列委託前駆細胞上に出現する。ＣＤ３８発現は大部分が、Ｔ細胞およびＢ細胞発生のさまざまな段階で、さまざまな発現レベルでリンパ球系列において持続される。
【０００４】
ＣＤ３８は、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、Ｂ慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）、ＢおよびＴ急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、Ｔ細胞リンパ腫（ＴＣＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、ヘアリー細胞白血病（ＨＣＬ）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を含む、多くの造血器悪性腫瘍においてかつさまざまな造血器悪性腫瘍由来の細胞株において上方制御される。その一方で、造血系の大部分の原始多能性幹細胞はＣＤ３８−である。造血器悪性腫瘍におけるＣＤ３８発現、および疾患進行とのその相関によって、ＣＤ３８は、抗ＣＤ３８抗体療法のための魅力的な標的となる。
【０００５】
ＣＤ３８は、Ｃａ２＋動員に（Morra  et  al.,  1998,  FASEB  J.,  12:  581-592；Zilber  et  al.,  2000,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA,  97:  2840-2845）、かつリンパ球および骨髄性細胞または細胞株における、ホスホリパーゼＣ−γ、ＺＡＰ−７０、ｓｙｋ、およびｃ−ｃｂｌを含む多くのシグナル伝達分子のチロシンリン酸化を介したシグナル伝達に（Funaro  et  al.,  1993,  Eur.  J.  Immunol.,  23:  2407-2411；Morra  et  al.,  1998,  FASEB  J.,  12:  581-592；Funaro  et  al.,  1990,  J  Immunol,  145:  2390-2396；Zubiaur  et  al.,  1997,  J  Immunol,  159:  193-205；Deaglio  et  al.,  2003,  Blood  102:  2146-2155；Todisco  et  al.,  2000,  Blood,  95:  535-542；Konopleva  et  al.,  1998,  J.  Immunol.,  161:  4702-4708；Zilber  et  al.,  2000,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA,  97:  2840-2845；Kitanaka  et  al.,  1997,  J.  Immunol.,  159:  184-192；Kitanaka  et  al.,  1999,  J.  Immunol.,  162:  1952-1958；Mallone  et  al.,  2001,  Int.  Immunol.,  13:  397-409）関与することが報告されている。ＣＤ３８は、リンパ球および骨髄性細胞の成熟および活性化におけるそれらの正常な発生の間の重要なシグナル伝達分子であることが提言された。
【０００６】
ＣＤ３８の機能に関する根拠は、それらの先天性免疫における欠損、および樹状細胞遊走における欠損に起因するＴ細胞依存性体液応答の低下を伴うＣＤ３８−／−ノックアウトマウスに由来する（Partida-Sanchez  et  al.,  2004,  Immunity,  20:  279-291；Partida-Sanchez  et  al.,  2001,  Nat.  Med.,  7:  1209-1216）。それにもかかわらず、造血中のＣＤ３８発現パターンは、ヒトとマウスとの間で大いに異なるために、すなわちａ）ヒトにおける未成熟前駆幹細胞とは異なり、マウスにおける同様の前駆幹細胞は高レベルのＣＤ３８を発現する（Randall  et  al.,  1996,  Blood,  87:4057-4067；Dagher  et  al.,  1998,  Biol.  Blood  Marrow  Transplant,  4:69-74）ために、ｂ）ヒトＢ細胞発生中は、高レベルのＣＤ３８発現が胚中心Ｂ細胞および形質細胞において認められるが（Uckun,  1990,  Blood,  76:1908-1923；Kumagai  et  al.,  1995,  J.  Exp.  Med.,  181:1101-1110）、マウスでは、それに対応する細胞におけるＣＤ３８発現レベルは低い（Oliver  et  al.,  1997,  J.  Immunol.,  158:  108-1115；Ridderstad  and  Tarlinton  1998,  J.  Immunol.,  160:4688-4695）ために、マウスにおけるＣＤ３８機能がヒトにおけるものと同一であるかどうかは明白ではない。
【０００７】
さまざまな腫瘍細胞および細胞株に対してさまざまな増殖特性を有するいくつかの抗ヒトＣＤ３８抗体が文献に記載されてきた。例えば、マウスＦａｂおよびヒトＩｇＧ１Ｆｃを有するキメラＯＫＴ１０抗体は、抗体依存性細胞介在性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を、ＭＭ患者または健常個体のいずれかに由来する末梢血液単核エフェクター細胞の存在下で、リンパ腫細胞に対して非常に効率的に介在する（Stevenson  et  al.,  1991,  Blood,  77:1071-1079）。抗ＣＤ３８抗体のＣＤＲ−グラフトヒト化異形ＡＴ１３／５は、ＣＤ３８陽性細胞株に対して強力なＡＤＣＣ活性を有することが示されている。ヒトモノクローナル抗ＣＤ３８抗体は、ＡＤＣＣおよび／または補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）によってＣＤ３８陽性細胞株のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの殺傷を媒介し、ＭＭ細胞株ＲＰＭＩ−８２２６を有するＳＣＩＤマウスにおいて腫瘍成長を遅延させることが示されている（ＷＯ２００５／１０３０８３Ａ２）。その一方で、ＩＢ６、ＡＴ１、ＡＴ２を除くいくつかの抗ＣＤ３８抗体、ＩＢ４、ＳＵＮ−４Ｂ７、およびＯＫＴ１０は、健常個体から末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）の増殖を誘導した（Ausiello  et  al.  2000,  Tissue  Antigens,  56:539-547）。
先行技術の抗体の一部は、ＣＤ３８＋Ｂ細胞においてアポトーシスを誘発できることが示されている。しかし、それらは間質細胞または間質由来サイトカインの存在下でのみ、誘発を行うことができる。作動性抗ＣＤ３８抗体（ＩＢ４）は、ヒト胚中心（ＧＣ）Ｂ細胞のアポトーシスを阻止し（Zupo  et  al.  1994,  Eur.  J.  Immunol.,  24:1218-1222）、かつＫＧ−１およびＨＬ−６０ＡＭＬ細胞の増殖を誘導するが（Konopleva  et  al.  1998,  J.  Immunol.,  161:4702-4708）、ジャーカットＴリンパ芽球性細胞においてアポトーシスを誘導する（Morra  et  al.  1998,  FASEB  J.,  12:581-592）ことが報告されている。別の抗ＣＤ３８抗体Ｔ１６は、ＡＬＬ患者由来の未成熟リンパ球細胞および白血病リンパ芽球細胞（Kumagai  et  al.  1995,  J.  Exp.  Med.,  181:1101-1110）、およびＡＭＬ患者由来の白血病骨髄芽球細胞（Todisco  et  al.  2000,  Blood,  95:535-542）のアポトーシスを誘導したが、Ｔ１６は、間質細胞または間質由来サイトカイン（ＩＬ−７、ＩＬ−３、幹細胞因子）の存在下でのみアポトーシスを誘導した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Morra  et  al.,  1998,  FASEB  J.,  12:  581-592
【非特許文献２】Zilber  et  al.,  2000,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA,  97:  2840-2845
【非特許文献３】Funaro  et  al.,  1993,  Eur.  J.  Immunol.,  23:  2407-2411
【非特許文献４】Funaro  et  al.,  1990,  J  Immunol,  145:  2390-2396
【非特許文献５】Zubiaur  et  al.,  1997,  J  Immunol,  159:  193-205
【非特許文献６】Deaglio  et  al.,  2003,  Blood  102:  2146-2155
【非特許文献７】Todisco  et  al.,  2000,  Blood,  95:  535-542
【非特許文献８】Konopleva  et  al.,  1998,  J.  Immunol.,  161:  4702-4708
【非特許文献９】Kitanaka  et  al.,  1997,  J.  Immunol.,  159:  184-192
【非特許文献１０】Kitanaka  et  al.,  1999,  J.  Immunol.,  162:  1952-1958
【非特許文献１１】Mallone  et  al.,  2001,  Int.  Immunol.,  13:  397-409
【非特許文献１２】Partida-Sanchez  et  al.,  2004,  Immunity,  20:  279-291
【非特許文献１３】Partida-Sanchez  et  al.,  2001,  Nat.  Med.,  7:  1209-1216
【非特許文献１４】Randall  et  al.,  1996,  Blood,  87:4057-4067
【非特許文献１５】Dagher  et  al.,  1998,  Biol.  Blood  Marrow  Transplant,  4:69-74
【非特許文献１６】Uckun,  1990,  Blood,  76:1908-1923
【非特許文献１７】Kumagai  et  al.,  1995,  J.  Exp.  Med.,  181:1101-1110
【非特許文献１８】Oliver  et  al.,  1997,  J.  Immunol.,  158:  108-1115
【非特許文献１９】Ridderstad  and  Tarlinton  1998,  J.  Immunol.,  160:4688-4695
【非特許文献２０】Stevenson  et  al.,  1991,  Blood,  77:1071-1079
【非特許文献２１】Ausiello  et  al.  2000,  Tissue  Antigens,  56:539-547
【非特許文献２２】Zupo  et  al.  1994,  Eur.  J.  Immunol.,  24:1218-1222
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
したがって、抗ＣＤ３８抗体を用いて標的化された抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、低減された副作用という利点と共に、強力な抗腫瘍活性を達成する有望性および可能性をもたらすことが考えられる。
【００１０】
本開示は、ＣＤ３８標的に結合するＩｇＧ抗体を有し、ＩｇＧ抗体のヒンジ領域のＣｙｓ部位でコンジュゲートしているＩｇＧ抗体を有する抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を提供する。本開示は、多発性骨髄腫を治療するための方法であって、有効量のＣＤ３８  ＡＤＣを供することを含む方法をさらに提供する。
【００１１】
より詳細には、本開示は、
（ａ）抗ＣＤ３８  ＩｇＧ抗体Ｃ３８Ａ２（本明細書における重／軽鎖可変領域に関する配列番号１／２）またはＣ３８Ｄ８（本明細書における重／軽鎖可変領域に関する配列番号３／４）；
（ｂ）チューブリン阻害剤またはドキソルビシン類似体である薬物または毒素部分；および
（ｃ）ＩｇＧ抗体のヒンジ領域の単一のＣｙｓ残基へ結合しているコンジュゲーションリンカー部分であって、ＩｇＧ抗体の重鎖ヒンジ領域が１つのＣｙｓ残基のみを含むように、重鎖ヒンジ領域が突然変異していてもよい、コンジュゲーションリンカー部分
を含む、抗ＣＤ３８  ＡＤＣ組成物を提供する。
【００１２】
好ましくは、薬物または毒素部分は、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５、およびこれらの組合せからなる群から選択され、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４およびＤ５の構造は
【化１】
2020524675.tif 000003
である。
【００１３】
一部の実施形態では、コンジュゲーションリンカー部分は、リンカー部分およびコンジュゲーション部分を含む。一部の実施形態では、コンジュゲーションリンカー部分は、構造：
【化２】
2020524675.tif 000004
のうちの１つまたは複数を含み、式中、波線は薬物または毒素部分およびコンジュゲーション部分への結合点を示す。一部の実施形態では、コンジュゲーション部分は
【化３】
2020524675.tif 000005
であり、式中、波線はコンジュゲーションリンカー部分への結合点を示す。
【００１４】
好ましくは、コンジュゲーションリンカー部分は、
【化４】
2020524675.tif 000006
からなる群から選択され、式中、波線は結合点を示す。
【００１５】
好ましくは、コンジュゲーション部分は
【化５】
2020524675.tif 000007
であり、式中、波線は結合点を示す。
【００１６】
別の態様では、ＣＤ３８に結合するＩｇＧ抗体、１つのＣｙｓ残基のみを有するように突然変異したＩｇＧ抗体のヒンジ領域の１つのＣｙｓ残基にコンジュゲートしているリンカー部分、およびリンカー部分にコンジュゲートしている毒素部分を含む、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）組成物を提供する。
【００１７】
別の態様では、
（ａ）抗ＣＤ３８  ＩｇＧ抗体Ｃ３８Ａ２−ＳＶ（本明細書における重／軽鎖可変領域に関する配列番号１／３）またはＣ３８Ａ２（本明細書における重／軽鎖可変領域に関する配列番号１／２）；
（ｂ）チューブリン阻害剤またはドキソルビシン類似体である、薬物または毒素部分；および
（ｃ）コンジュゲーションリンカーが、リンカーと、ＩｇＧ抗体のヒンジ領域の単一のＣｙｓ残基に共有結合しているコンジュゲーション部分とを含み、ＩｇＧ抗体の重鎖ヒンジ領域が１つのＣｙｓ残基のみを含むように、重鎖ヒンジ領域が突然変異していてもよい、コンジュゲーションリンカー部分
を含む、抗ＣＤ３８  ＡＤＣ組成物が提供される。
【００１８】
一部の実施形態では、薬物または毒素部分は、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５、およびこれらの組合せからなる群から選択され、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４およびＤ５の構造は：
【化６】
2020524675.tif 000008
である。
【００１９】
一部の実施形態では、リンカーは、
【化７】
2020524675.tif 000009
からなる群から選択され、式中、波線は、コンジュゲーション部分および薬物または毒素部分への結合点を示す。
【００２０】
一部の実施形態では、コンジュゲーション部分は、
【化８】
2020524675.tif 000010
であり、式中、波線はリンカーへの結合点を示す。
【００２１】
本開示は、多発性骨髄腫を治療するための方法であって、
（ａ）抗ＣＤ３８  ＩｇＧ抗体Ｃ３８Ａ２（本明細書における重／軽鎖可変領域に関する配列番号１／２）またはＣ３８Ｄ８（本明細書における重／軽鎖可変領域に関する配列番号３／４）；
（ｂ）チューブリン阻害剤またはドキソルビシン類似体である薬物または毒素部分；および
（ｃ）ＩｇＧ抗体のヒンジ領域の単一のＣｙｓ残基へ結合しているコンジュゲーションリンカー部分であって、ＩｇＧ抗体の重鎖ヒンジ領域が１つのＣｙｓ残基のみを含むように、重鎖ヒンジ領域が突然変異していてもよい、コンジュゲーションリンカー部分
を含む、抗ＣＤ３８  ＡＤＣ組成物の有効量を投与することを含む方法をさらに提供する。
【００２２】
好ましくは、薬物または毒素部分は、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５、およびこれらの組合せからなる群から選択され、構造は、
【化９】
2020524675.tif 000011
である。
【００２３】
一部の実施形態では、コンジュゲーションリンカー部分は、リンカー部分およびコンジュゲーション部分を含む。一部の実施形態では、コンジュゲーションリンカー部分は、構造：
【化１０】
2020524675.tif 000012
のうちの１つまたは複数を含み、式中、波線は、薬物または毒素部分およびコンジュゲーション部分への結合点を示す。一部の実施形態では、コンジュゲーション部分は
【化１１】
2020524675.tif 000013
であり、式中、波線はコンジュゲーションリンカー部分への結合点を示す。
好ましくは、コンジュゲーションリンカー部分のリンカー部分は、
【化１２】
2020524675.tif 000014
からなる群から選択され、式中、波線は結合点を示す。
【００２４】
好ましくは、コンジュゲーション部分は
【化１３】
2020524675.tif 000015
であり、式中、波線は結合点を示す。
【００２５】
別の態様では、多発性骨髄腫を治療するための方法であって、
（ａ）抗ＣＤ３８  ＩｇＧ抗体Ｃ３８Ａ２−ＳＶ（本明細書における重／軽鎖可変領域に関する配列番号１／３）またはＣ３８Ａ２野生型（本明細書における重／軽鎖可変領域に関する配列番号１／２）；
（ｂ）チューブリン阻害剤またはドキソルビシン類似体である薬物または毒素部分；および
（ｃ）コンジュゲーションリンカーが、リンカーと、ＩｇＧ抗体のヒンジ領域の単一のＣｙｓ残基に共有結合しているコンジュゲーション部分とを含み、ＩｇＧ抗体の重鎖ヒンジ領域が１つのＣｙｓ残基のみを含むように、重鎖ヒンジ領域が突然変異していてもよい、コンジュゲーションリンカー部分
を含む抗ＣＤ３８  ＡＤＣ組成物の治療有効量を供することを含む方法が提供される。
【００２６】
一部の実施形態では、薬物または毒素部分は、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５、およびこれらの組合せからなる群から選択され、構造は、
【化１４】
2020524675.tif 000016
である。
【００２７】
一部の実施形態では、リンカーは、
【化１５】
2020524675.tif 000017
からなる群から選択され、式中、波線は、コンジュゲーション部分および薬物または毒素部分への結合点を示す。
【００２８】
一部の実施形態では、コンジュゲーション部分は、
【化１６】
2020524675.tif 000018
であり、式中、波線はリンカーへの結合点を示す。
【００２９】
好ましくは、抗体部分は、２０１６年４月８日に出願された米国シリアル番号第１５／０９４，３８４号で開示されかつ特許請求されたＣＤ３８Ａ２野生型抗体のバリアントであり、その開示は、本明細書において参照により組み込まれるものとする。ＣＤ３８Ａ２野生型可変領域配列は、重鎖配列番号１および軽鎖配列番号２として本明細書において開示する。より詳細には、バリアント配列は、軽鎖可変領域のＮ末端から２番目および３番目のアミノ酸が変化している。好ましくは、抗体部分は、重鎖配列番号１および軽鎖配列番号３を有するＣＤ３８Ａ２−ＳＶ（ＳＶバリアント）を含む。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１Ａ】図１Ａは、バーキットリンパ腫モデルに対する抗ＣＤ３８  ＡＤＣのｉｎ  ｖｉｖｏ研究を示す。研究では、１０００万個のＤａｕｄｉ細胞をＮｕ  Ｎｕマウスへｓ．ｃ．注射した。ＡＤＣ＃４５を、平均腫瘍体積が２００ｍｍ３に到達した後に担腫瘍マウスへｉｖ注射した。
【図１Ｂ】図１Ｂは、表示された３つの異なる用量でＡＤＣ＃４５で処置されたマウスの体重測定値を示す。
【００３１】
【図２Ａ】図２Ａは、バーキットリンパ腫モデルに対する抗ＣＤ３８  ＡＤＣのｉｎ  ｖｉｖｏ研究を示す。研究では、１０００万個のＲａｍｏｓ細胞をＮｕ  Ｎｕマウスへｓ．ｃ注射した。ＡＤＣ＃４５を、平均腫瘍体積が２００ｍｍ３に到達した後に、担腫瘍マウスへ表示された投薬量でｉｖ注射した。
【図２Ｂ】図２Ｂは、抗ＣＤ３８−ＡＤＣで処置されたマウスの体重測定値を示す。
【００３２】
【図３】図３は、バーキットリンパ腫モデルに対する抗ＣＤ３８  ＡＤＣのｉｎ  ｖｉｖｏ研究を示す。研究では、１０００万個のＤａｕｄｉ−ｌｕｃ細胞をＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスへｉｖ注射した。抗ＣＤ３８抗体（Ａ２）および同一のＡ２抗体を用いて作製した２つの抗ＣＤ３８  ＡＤＣを、腫瘍を注射してから１４日後に担腫瘍マウスへｉｖ注射した。
【００３３】
【図４】図４は、バーキットリンパ腫モデルに対する抗ＣＤ３８  ＡＤＣのｉｎ  ｖｉｖｏ研究を示す。研究では、１０００万個のＤａｕｄｉ−ｌｕｃ細胞をＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスへｉｖ注射した。ＡＤＣ＃４５およびＡＤＣ＃４１を、腫瘍を注射してから１４日後に担腫瘍マウスへｉｖ注射した。
【００３４】
【図５】図５は、バーキットリンパ腫モデルに対する抗ＣＤ３８  ＡＤＣのｉｎ  ｖｉｖｏ研究を示す。研究では、１０００万個のＤａｕｄｉ−ｌｕｃ細胞をＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスへｉｖ注射した。抗ＣＤ３８抗体および抗ＣＤ３８−ＡＤＣを、腫瘍を注射してから１４日後に担腫瘍マウスへｉｖ注射した。マウス画像を１週間に１回撮影した。
【００３５】
【図６】図６は、バーキットリンパ腫モデルに対する抗ＣＤ３８  ＡＤＣのｉｎ  ｖｉｖｏ研究を示す。研究では、１０００万個のＤａｕｄｉ−ｌｕｃ細胞をＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスへｉｖ注射した。ＡＤＣ＃４５およびＡＤＣ＃４１を、腫瘍を注射してから１４日後に担腫瘍マウスへｉｖ注射した。マウスの画像を１週間に１回撮影した。
【００３６】
【図７】図７は、ＣＤ３８発現がん細胞株、Ｒａｍｏｓ、ＲａｊｉおよびＲＰＭＩ  ８２２６、ならびにＣＤ３８陰性細胞株、ＰＣ−３を９６ウェルプレートに播種し、１００ｎＭで開始し、段階希釈したＡＤＣ＃４５、ＡＤＣ＃４１、およびＡＤＣ＃４６で処置したことを示す。細胞を、コンジュゲートしているペイロードの性質に応じて、３〜５日間処置した。処置の最後に、細胞を、Ｐｒｏｍｅｇａ製のＣｅｌｌｔｉｔｒｅＧｌｏ（商標）発光キットを用いて染色し、シグナルを発光プレートリーダーによって記録した。腫瘍細胞成長阻害に対するＡＤＣの活性を、５０％細胞成長阻害に必要な濃度、いわゆるＥＣ５０（ｎＭ）として示した。ＡＤＣ＃４５、ＡＤＣ＃４１、およびＡＤＣ＃４６は、ＣＤ３８をそれらの表面上に発現した細胞に対して選択的な阻害を示したことが、データによって示された。
【００３７】
【図８】図８は、出発抗ＣＤ３８抗体および精製したＡＤＣ４６コンジュゲートの、２８０ｎｍ検出におけるＨＩＣ−ＨＰＬＣオーバーレイを示す。
【００３８】
【図９】図９は、出発抗ＣＤ３８抗体および精製したＡＤＣ４１コンジュゲートの、２８０ｎｍ検出におけるＨＩＣ−ＨＰＬＣオーバーレイを示す。
【００３９】
【図１０Ａ】図１０Ａは、バーキットリンパ腫モデルに対する抗ＣＤ３８  ＡＤＣ４６のｉｎ  ｖｉｖｏ研究を示す。研究では、１０００万個のＤａｕｄｉ細胞をＮｕ  Ｎｕマウスへｓ．ｃ．注射した。ＡＤＣ４６を、平均腫瘍体積が２００ｍｍ３に到達した後に担腫瘍マウスへｉｖ注射した。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、表示された３つの異なる用量でＡＤＣ４６で処置されたマウスの体重測定値を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本開示は、新規なヒト抗ＣＤ３８抗体（Ａ２）（２０１６年４月８日に出願された米国特許出願公開第２０１６／０２９７８８８号明細書、シリアル番号１５／０９４，３８４に記載されており、その開示は、本明細書において参照により組み込まれるものとする）と、チューブリン阻害剤またはドキソルビシン類似体などのＤＮＡ損傷剤を含む、本明細書において記載する毒素部分とを含む抗体薬物コンジュゲートを提供する。ＡＤＣコンジュゲートは、結合親和性を保持し、さまざまなＣＤ３８陽性細胞株およびｉｎ  ｖｉｖｏにおいて強力な細胞殺傷を示した。
【００４１】
本開示は、ＣＤ３８に結合するＩｇＧ抗体、重鎖ヒンジ領域が、２つではなく１つのＣｙｓ残基のみを含むように、ヒンジ領域が突然変異していてもよいＩｇＧ抗体のヒンジ領域の単一のＣｙｓ残基へ結合しているコンジュゲーションリンカー部分、ならびにアントラサイクリンおよびドラスタチンの誘導体からなる群から選択される毒素部分を含む抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）組成物を提供する。好ましくは、毒素部分は、チューブリン阻害剤またはドキソルビシン類似体である。好ましくは、抗体は、ヒトＣ３８Ａ２（米国特許出願第２０１６／０２９７８８８号において重／軽配列番号３／４または本明細書における重／軽鎖可変領域に関する配列番号１／２）ファミリーと称されるＩｇＧ抗体であり、またはＣ３８Ｄ８（米国特許出願２０１６／０２９７８８８号において重／軽配列番号２１／２２または本明細書における重／軽鎖可変領域に関する配列番号３／４）である。好ましくは、リンカー構造とコンジュゲートしている毒素は、
【化１７】
2020524675.tif 000019
【化１８】
2020524675.tif 000020
からなる群から選択される。
【００４２】
本開示は、多発性骨髄腫を治療するための方法であって、ＣＤ３８に結合するＩｇＧ抗体、ＩｇＧ抗体のヒンジ領域のＣｙｓ残基および毒素部分へ結合しているコンジュゲーションリンカー部分を含む、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）組成物の有効量を投与することを含む方法を提供する。「Ｃｙｓ残基に結合している」は、コンジュゲーションリンカー部分が、ＩｇＧ抗体のヒンジ領域のＣｙｓ残基の硫黄原子に共有結合している場合があることを意味する。好ましくは、毒素部分は、チューブリン阻害剤またはドキソルビシン類似体である。好ましくは、抗体は、ヒトＣ３８Ａ２（米国特許出願第２０１６／０２９７８８８号において重／軽配列番号３／４または本明細書における重／軽鎖可変領域に関する配列番号１／２）ファミリーと称されるＩｇＧ抗体であり、またはＣ３８Ｄ８（米国特許出願第２０１６／０２９７８８８号において重／軽配列番号２１／２２または本明細書における重／軽鎖可変領域に関する配列番号３／４）である。当業者であれば、本明細書において開示するリンカーおよびコンジュゲーション部分にコンジュゲートしている本明細書において開示する毒素部分は、毒素リンカーコンジュゲート中間体を表し、本明細書において開示するＩｇＧ抗体に共有結合している（コンジュゲートしている）場合、これは本明細書において開示するＡＤＣであることを認識するであろう。好ましくは、リンカー構造とコンジュゲートしている毒素は（表示する各化合物番号と共に）、
【化１９】
2020524675.tif 000021
【化２０】
2020524675.tif 000022
からなる群から選択される。
【表１−１】
2020524675.tif 000023
【表１−２】
2020524675.tif 000024
【００４３】
毒素部分（Ｄ）：Ｄ１およびＤ２はアントラサイクリン誘導体である。Ｄ３、Ｄ４、およびＤ５はチューブリン阻害剤である。
【化２１】
2020524675.tif 000025
【００４４】
リンカー部分（Ｌ２）：
【化２２】
2020524675.tif 000026
【００４５】
コンジュゲーション方法（Ｌ１）
【化２３】
2020524675.tif 000027
【００４６】
波線はリンカーへの結合点を示す。
【００４７】
一部の実施形態では、薬物リンカーコンジュゲートは、リンカーＬ２およびコンジュゲーション部分を含み、リンカーＬ２はコンジュゲーション部分に共有結合しており；コンジュゲーション部分は、ＩｇＧ抗体のヒンジ領域の遊離システインチオール基と反応することができる。一部の実施形態では、コンジュゲーション部分は、構造
【化２４】
2020524675.tif 000028
を有する（「コンジュゲーション方法Ｌ１」）。
【００４８】
薬物リンカーコンジュゲートの例：
【化２５】
2020524675.tif 000029
【化２６】
2020524675.tif 000030
【００４９】
抗ＣＤ３８  ＡＤＣの例
【化２７】
2020524675.tif 000031
【化２８】
2020524675.tif 000032
【００５０】
定義
本明細書において使用する一般的な有機物質の略語を以下のとおりに定義する：
【表２−１】
2020524675.tif 000033
【表２−２】
2020524675.tif 000034
【００５１】
薬物リンカーコンジュゲートの例：
【化２９】
2020524675.tif 000035
【化３０】
2020524675.tif 000036
【００５２】
抗ＣＤ３８  ＡＤＣの例（抗体構成成分は「Ａｂ」と称される）：
【化３１】
2020524675.tif 000037
【化３２】
2020524675.tif 000038
【実施例】
【００５３】
合成例１
化合物１８の合成：
【化３３】
2020524675.tif 000039
化合物１１の合成：
【００５４】
化合物１０（３０ｍｇ、４６．８μｍｏｌ）を、無水ＤＣＭ  ３ｍＬ中に窒素下で溶解した。次いで、ＤＩＥＡ（２４μＬ、１４０μｍｏｌ）を添加し、反応混合物を、氷浴を用いて冷却した。次いで、メタンスルホニルクロリド（７．２μＬ、９３．６μｍｏｌ）を添加し、混合物を３０分間撹拌した。反応物をＤＣＭ  ３ｍＬで希釈し、水４ｍＬで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、蒸発させ、化合物１１を赤色固体として得た（３３ｍｇ、９８％）。ＭＳ  ｍ／ｚ＝７２０．５（Ｍ＋Ｈ）
化合物１３の合成：
【００５５】
化合物１１（２０ｍｇ、２７．８μｍｏｌ）を、無水エタノール３ｍＬ中に窒素下で溶解した。次いで、チオアミド１２（４５ｍｇ、１３９μｍｏｌ）を添加し、混合物を４０℃で２４時間加熱した。混合物をＨＰＬＣで精製し、化合物１３を赤色固体として得た（１５ｍｇ、５９％）。ＭＳ  ｍ／ｚ＝９３２．６（Ｍ＋Ｈ）
化合物１４の合成：
【００５６】
化合物１３（１５ｍｇ、１６．１μｍｏｌ）を、無水ＤＭＦ  ２ｍＬ中に窒素下で溶解した。次いで、ピペリジン６０μＬを添加し、混合物を周囲温度で１０分間撹拌した。混合物をＨＰＬＣで精製し、化合物１４を赤色固体として得た（６．９ｍｇ、６０％）。ＭＳ  ｍ／ｚ＝７１０．４（Ｍ＋Ｈ）
化合物１６の合成：
【００５７】
化合物１５（８．９ｍｇ、１６．９μｍｏｌ）をＤＭＦ  ２ｍＬ中に溶解し、次いでＨＡＴＵ（６．４ｍｇ、１６．８μｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（９μＬ、５１．８μｍｏｌ）を添加した。２分後、化合物１４（１０ｍｇ、１４．１μｍｏｌ）を添加し、混合物を周囲温度で１時間撹拌した。混合物へＤＢＵ４０μＬを添加し、１０分間撹拌した。次いで、混合物をＨＰＬＣで精製し、化合物１６を赤色固体として得た（１２．２ｍｇ、８７％）。ＭＳ  ｍ／ｚ＝９９５．４（Ｍ＋Ｈ）
化合物１８の合成：
【００５８】
化合物１７（１２．５ｍｇ、２４．２μｍｏｌ）をＤＣＭ  ２ｍＬ中に溶解し、次いでＤＩＣ（１．６ｍｇ、１２．７μｍｏｌ）を添加した。１０分後、ＤＭＦ  ０．５ｍＬ中に溶解した化合物１６（１２ｍｇ、１２．１μｍｏｌ）を添加し、混合物を周囲温度で１０分間撹拌した。次いで、混合物をＨＰＬＣで精製し、化合物１８を赤色固体として得た（１２．８ｍｇ、７１％）。ＭＳ  ｍ／ｚ＝１４９４．４（Ｍ＋Ｈ）
化合物２２の合成：
【化３４】
2020524675.tif 000040
化合物２１の合成：
【００５９】
ＤＣＭ  ６ｍＬ中の酸１９（５１ｍｇ、８１μｍｏｌ）の溶液へ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（４６ｍｇ、４００μｍｏｌ）、およびＥＤＣ（１００ｍｇ、５２３μｍｏｌ）を添加する。３０分後、混合物を水（２×６ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、蒸発させた。残渣をＤＭＦ  ２ｍＬ中に溶解した。次いで、アミン２０（５５ｍｇ、８１μｍｏｌ、ＴＦＡ塩として）、続いてＤＩＥＡ（５０μＬ）を添加した。混合物を１時間撹拌した。次いで、ピペリジン（４０μＬ）を添加し、２０分間撹拌した。混合物をＨＰＬＣで精製し、化合物２１を赤色固体として得た（３４ｍｇ、４４％）；ＭＳ  ｍ／ｚ９５５．２（Ｍ＋Ｈ）。
化合物２２の合成：
【００６０】
化合物１７（１２．５ｍｇ、２４．２μｍｏｌ）をＤＣＭ  ２ｍＬ中に溶解し、次いでＤＩＣ（１．６ｍｇ、１２．７μｍｏｌ）を添加した。１０分後、ＤＭＦ  ０．５ｍＬ中に溶解した化合物２１（１１．５ｍｇ、１２．１μｍｏｌ）を添加し、混合物を周囲温度で１０分間撹拌した。次いで、混合物をＨＰＬＣで精製し、化合物２２を赤色固体として得た（７．０ｍｇ、４２％）。ＭＳ  ｍ／ｚ＝１４５３．６（Ｍ＋Ｈ）
化合物２７の合成：
【化３５】
2020524675.tif 000041
化合物２６の合成：
【００６１】
ＤＭＦ  ２ｍＬ中の、ＴＦＡ塩としての化合物２３（８４．２ｍｇ、９６．３μｍｏｌ）の溶液へ、化合物２４（１２０．６ｍｇ、９６．２μｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（５０μＬ）、ＨＯＢｔ（１３ｍｇ、９６．３μｍｏｌ）を添加した。２４時間後、反応を完了させ、次いでピペリジン（６０μＬ）を添加し、１０分間撹拌した。混合物をＨＰＬＣで精製し、化合物２６を白色固体として得た（１３４ｍｇ、８０％）；ＭＳ  ｍ／ｚ１６３５．３（Ｍ＋Ｈ）。
化合物２７の合成：
【００６２】
化合物１７（２５ｍｇ、４８．４μｍｏｌ）を、ＤＣＭ  ２ｍＬ中に溶解し、次いでＤＩＣ（３．２ｍｇ、２５．４μｍｏｌ）を添加した。１０分後、ＤＭＦ  ０．５ｍＬ中に溶解した化合物２６（３９．５ｍｇ、２４．２μｍｏｌ）を添加し、混合物を周囲温度で１０分間撹拌した。次いで、混合物をＨＰＬＣで精製し、化合物２７を白色固体として得た（３２．０ｍｇ、６２％）。ＭＳ  ｍ／ｚ＝２１３４．１（Ｍ＋Ｈ）
化合物３１の合成：
【化３６】
2020524675.tif 000042
化合物３０の合成：
【００６３】
ＤＭＦ  １ｍＬ中の、ＴＦＡ塩としての化合物２８（３０ｍｇ、３６μｍｏｌ）の溶液へ、化合物２４（４５ｍｇ、３６μｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（２０μＬ）、ＨＯＢｔ（５ｍｇ、３７μｍｏｌ）を添加した。２４時間後、反応を完了させ、次いでピペリジン（２０μＬ）を添加し、３０分間撹拌した。混合物をＨＰＬＣで精製し、化合物３０を白色固体として得た（４６ｍｇ、７９％）；ＭＳ  ｍ／ｚ１６３５．３（Ｍ＋Ｈ）。
化合物３１の合成：
【００６４】
化合物１７（３０ｍｇ、５７．１μｍｏｌ）を、ＤＣＭ  ２ｍＬ中に溶解し、次いでＤＩＣ（３．６ｍｇ、２８．６μｍｏｌ）を添加した。１０分後、ＤＭＦ  ０．５ｍＬ中に溶解した化合物３０（４６ｍｇ、２８．６μｍｏｌ）を添加し、混合物を周囲温度で１０分間撹拌した。次いで、混合物をＨＰＬＣで精製し、化合物３１を白色固体として得た（４４．８ｍｇ、５９％）。ＭＳ  ｍ／ｚ＝２１０９．２（Ｍ＋Ｈ）。
化合物３４の合成：
【化３７】
2020524675.tif 000043
化合物３３の合成：
【００６５】
化合物１５（１７ｍｇ、３３μｍｏｌ）をＤＭＦ  ２ｍＬ中に溶解し、次いでＨＡＴＵ（１２．５ｍｇ、３２．９μｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（２３μＬ）を添加した。２分後、ＴＦＡ塩としての化合物３２（２４ｍｇ、２７．６μｍｏｌ）を添加し、混合物を周囲温度で１時間撹拌した。ＤＢＵ４０μＬを混合物へ添加し、１０分間撹拌した。次いで、混合物をＨＰＬＣで精製し、化合物３３を白色固体として得た（３０．２ｍｇ、８５％）。ＭＳ  ｍ／ｚ＝１０５７．８（Ｍ＋Ｈ）
化合物３４の合成：
【００６６】
化合物１７（１２．５ｍｇ、２４．２μｍｏｌ）を、ＤＣＭ  ２ｍＬ中に溶解し、次いでＤＩＣ（１．６ｍｇ、１２．７μｍｏｌ）を添加した。１０分後、ＤＭＦ  ０．５ｍＬ中に溶解した化合物３３（１２．８ｍｇ、１２．１μｍｏｌ）を添加し、混合物を周囲温度で１０分間撹拌した。次いで、混合物をＨＰＬＣで精製し、化合物３４を白色固体として得た（１４．５ｍｇ、７７％）。ＭＳ  ｍ／ｚ＝１５５６．８（Ｍ＋Ｈ）。
化合物３９の合成：
【化３８】
2020524675.tif 000044
化合物３６の合成：
【００６７】
丸底フラスコへ、ＴＦＡ塩としての化合物３３（８８．６ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）、化合物３５（８４ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）、ＨＯＡｔ（４１ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）、ＤＣＭ（５ｍＬ）、ＤＩＥＡ（１０４μＬ）、およびＤＩＣ（２５ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）を添加する。撹拌してから１６時間後に、反応混合物を、ＤＣＭ  ５ｍＬを用いて希釈し、次いでそれを水５ｍＬで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、溶媒を真空下で蒸発させ、粗製ガラス状固体を得、それを次のステップにおいて使用した。ＤＣＭ  ２ｍＬ、ＴＦＡ２ｍＬおよびトリイソプロピルシラン０．２ｍＬからなる混合物中に得られた固体を溶解し、１時間撹拌する。溶媒を真空下で蒸発させ、ＨＰＬＣで精製し、化合物３６を得る（８１ｍｇ、６０％）、ＭＳ  ｍ／ｚ１３５１．５（Ｍ＋Ｈ）。
化合物３７の合成：
【００６８】
丸底フラスコへ、化合物３６（８１ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）、ＡＣＮ  ２ｍＬ、水１ｍＬおよび飽和ＮａＨＣＯ３水溶液１ｍＬを添加する。次いで、Ｎａ２Ｓ２Ｏ４（４２ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）を添加し、撹拌を２０分間継続する。混合物をＨＰＬＣで精製し、化合物３７を得る（５５ｍｇ、７０％）、ＭＳ  ｍ／ｚ１３２１．７（Ｍ＋Ｈ）。
化合物３９の合成：
【００６９】
化合物３７（５３ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）をＡＣＮ  ２ｍＬ中に溶解し、１，４−ジブロモ−２，３−ブタンジオン（３８）（２９ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を添加した。２０分間撹拌した後に、反応物をＨＰＬＣで精製し、化合物３９を得た（４０ｍｇ、６５％）、ＭＳ  ｍ／ｚ１５２７．６（Ｍ＋Ｈ）。
化合物５２の合成：
【化３９】
2020524675.tif 000045
化合物５１の合成：
【００７０】
ＤＭＦ  １０ｍＬ中の、アミン３２（８７５ｍｇ、１．１３ｍｍｏｌ）および酸５０（１０００ｍｇ、１．１３ｍｍｏｌ）の溶液へ、Ｏｘｉｍａ−ｐｕｒｅ（１６０ｍｇ、１．１３ｍｍｏｌ）、続いてＤＩＣ（４２８ｍｇ、２．７４ｍｍｏｌ）を添加した。２時間後、カップリングを完了させ、次いでピペリジン１ｍＬを添加し、２０分間撹拌した。混合物をＨＰＬＣで精製し、化合物５１  ＴＦＡ塩を白色固体として得た（１０２０ｍｇ、６９％）；ＭＳ  ｍ／ｚ１１９１．７（Ｍ＋Ｈ）。
化合物５２の合成：
【００７１】
化合物５１  ＴＦＡ塩（２００ｍｇ、１４１ｕｍｏｌ）を、ＡＣＮ  ２ｍＬおよび水１ｍＬ中に溶解した。次いで、ＡＣＮ  １ｍＬ中の１，４−ジブロモ−２，３−ブタンジオン３８（６９ｍｇ、２８２μｍｏｌ）の溶液を添加した。１５分間撹拌した後に、反応物をＨＰＬＣで精製し、化合物５２を白色固体として得た（１６６ｍｇ、８４％）。ＭＳ  ｍ／ｚ＝１３９７．６（Ｍ＋Ｈ）
ＡＤＣ調製例１
ＡＤＣ４６の調製
【００７２】
アフィニティー精製した抗ＣＤ３８抗体を、５〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度で４ｍＭ  ＥＤＴＡを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０〜７．２へ緩衝液交換した。この抗体ストック液の一部へ、新たに調製した１０ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）（ＴＣＥＰ）の水溶液を、最大２０倍モル過剰で添加した。得られた混合物を４〜８℃で一晩インキュベートした。ゲル濾過クロマトグラフィーでまたは遠心濾過を数回行うことにより、過剰なＴＣＥＰを除去した。回収し、還元した抗体材料のＵＶ−Ｖｉｓ定量を行い、続いて十分な遊離チオール対抗体の比を確認した。簡潔には、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０〜７．２、４ｍＭ  ＥＤＴＡ中の、新たに調製した１ｍＭ  （５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）のアリコートを、等体積の精製した抗体溶液と混合した。４１２ｎｍで得られた吸光度を測定し、吸光係数１４，１５０Ｍ−１ｃｍ−１を使用して、還元したシステイン含有量を判定した。
【００７３】
化合物５２の抗ＣＤ３８抗体へのコンジュゲーションを開始するために、まず、Ｌ０１４−０７７を３：２アセトニトリル／水混合物中に５ｍＭの濃度で溶解した。次いで、この新たに調製した毒素−リンカー溶液のアリコートを、還元し精製した抗ＣＤ３８抗体中間体の一部へ４．５〜５倍のモル過剰で添加した。完全に混合し、周囲温度で１時間以上インキュベートした後に、粗製コンジュゲーション反応物をＨＩＣ−ＨＰＬＣクロマトグラフィーによって分析し、２８０ｎｍの波長において検出し、反応が完了したこと（出発抗体ピークが消失したこと）を確認した。次いで、ＡＤＣ４６の精製を、ＰＢＳを用いて平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｐｇカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を備えたＡＫＴＡシステムを使用したゲル濾過クロマトグラフィーで行った。薬物対抗体の比（ＤＡＲ）を、ＵＶ−ＶＩＳおよびＨＩＣ−ＨＰＬＣに基づいて算出した。図８は、出発抗ＣＤ３８抗体および精製したＡＤＣ４６の代表的なＨＩＣ−ＨＰＬＣ比較を示す。得られたＡＤＣ４６に関する低い百分率（５％未満）の高分子量（ＨＭＷ）凝集体の確認を、分析ＳＥＣ−ＨＰＬＣを使用して判定した。
ＡＤＣ４１の調製
【００７４】
ＡＤＣ４１に関する抗ＣＤ３８抗体の還元および分析を、ＡＤＣ４６を生成するために使用した手順と同一の方法で実施した。抗体への最終的な薬物−リンカーコンジュゲーションを開始するために、まず化合物２２を、２：３アセトニトリル／水混合物中に５ｍＭの濃度で溶解した。次いで、プロピレングリコール（ＰＧ）を、還元し精製した抗ＣＤ３８抗体のアリコートへ添加し、最終濃度を１０〜３０％（ｖ／ｖ）ＰＧとしてから、新たに調製した化合物２２溶液を４．５〜５倍モル過剰で添加した。その後、ＡＤＣ４１の分析および精製を、ＡＤＣ４６に関する手順と同一の方法で行った。図９は、出発抗ＣＤ３８抗体および精製したＡＤＣ４１の代表的なＨＩＣ−ＨＰＬＣ比較を示す。
アッセイ例１
【００７５】
受入時に、制御された環境の室内で１ケージ当たり５匹のマウスで動物を収容した。動物には、齧歯動物用固形飼料および水を適宜与えた。実験室条件にマウスを少なくとも７２時間順化させてから、細胞投与および投薬を開始した。順化期間の間、動物の健康状態を判定した。研究開始前に健常であることが観察された動物のみを使用した。
【００７６】
この例は、対照（ＰＢＳ）、抗ＣＤ３８  ＩｇＧ１抗体（ＳＴＩ−０６０２およびＳＴＩ−０６０７）および両抗体のＡＤＣバリアントを用いた、マウスの処置を比較する、ｉｎ  ｖｉｖｏ実験を提供する。手順ではまず、腫瘍細胞接種および腫瘍の確立を行った：
ａ．Ｕ８７細胞を、１０％ＦＢＳ  Ｕ８７培地（ＥＭＥＭ）を用いて培養し、０．０５％トリプシンを用いて採取した。細胞を無血清ＥＭＥＭで２回洗浄し、計数し、０．２ｍＬ中５×１０６細胞、または無血清ＥＭＥＭおよびマトリゲルの１：１の混合物中２５×１０６細胞／ｍＬで再懸濁し、各マウスの右上側腹部へ皮下注射した。
ｂ．デジタルキャリパーを使用して、接種してから６〜９日目に開始し、その後１週間に２回および研究が終了する前に腫瘍体積を測定することによって腫瘍成長をモニターした。
ｃ．デジタルキャリパーを用いて腫瘍を測定した。長さ（最も長い寸法）および幅（長さに対して垂直なかつ同一の平面内の距離）を測定した。腫瘍体積を算出するための式は、ＴＶ（ｍｍ３）＝１／２×Ｌ×Ｗ２であった。
【００７７】
処置：
ａ．腫瘍を所望の体積（平均２００〜３００ｍｍ３）へ分類し、動物を無作為化し、非常に大きいまたは小さい腫瘍を有するマウスを処分した。マウスを、腫瘍体積によって無作為化された、各１０匹のマウスの８つの群に分けた。
ｂ．マウスを、図４に従ってビヒクルまたは被験物品のいずれかで処置した。マウスには、合計５回の用量が与えられた。
ｃ．明確な処置傾向が確立されたら、および／またはビヒクル処置マウスに負荷された腫瘍がＩＡＣＵＣプロトコール限界（２０００ｍｍ３）に達したときに、腫瘍応答をモニターし、研究を終了した。
アッセイ例２
【００７８】
この例は、開示される２つのＣＤ３８  ＡＤＣを、マウスを用いてｉｎ  ｖｉｖｏで比較するｉｎ  ｖｉｖｏ実験である。ｉｎ  ｖｉｖｏ研究において、１０００万個のＤａｕｄｉ−ｆｌｕｃ細胞をＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにｉｖ注射した。マウスにおいて腫瘍が確立されてから４日後に、抗ＣＤ３８抗体およびＡＤＣをマウスにＩＶによって注射した。抗体またはＡＤＣによる腫瘍成長の阻害を、腫瘍の発光強度変化によってモニターした（図３、図４、図５および図６）。
【００７９】
ＡＤＣ＃４５およびＡＤＣ＃４１の試験を行った。両ＡＤＣは、同一のＡ２抗体を使用する。ＤａｕｄｉおよびＲａｍｏｓ細胞株をＡＴＣＣから得た。細胞を、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ  １６４０  １Ｘ培地で、５％二酸化炭素加湿環境において３７℃で培養した。細胞を２週間の期間培養し、３継代培養してから採取した。注射する前に、ＤａｕｄｉまたはＲａｍｏｓ細胞を、１：１の比のＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩溶液）およびマトリゲル中に再懸濁し、０．２ｍｌ当たり１０００万個の細胞を、各マウスの右上側腹部に皮下注射した。
【００８０】
Ｄａｕｄｉ−ｌｕｃ細胞を、１０％ＦＢＳおよび０．２ｕｇ／ｍｌピューロマイシンを含むＲＰＭＩ  １６４０  １Ｘ培地中で、５％二酸化炭素加湿環境において３７℃で培養した。細胞を２週間の期間培養し、３継代培養してから採取した。注射する前に、Ｄａｕｄｉ−ｌｕｃ細胞をＨＢＳＳ中に再懸濁した。０．２ｍｌ当たり１０００万個の細胞を各マウスの尾静脈に静脈内注射した。
【００８１】
６週齢の雌ＮＯＤ  ＳＣＩＤマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）を使用して、Ｄａｕｄｉ皮下異種移植およびＤａｕｄｉ−ｌｕｃ静脈内異種移植を行った。研究において、６週齢の雌Ｎｕ／Ｎｕマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）を使用して、Ｒａｍｏｓ皮下異種移植を行った。受入時に、マウスを、制御された環境の室内で１ケージ当たり５匹のマウスで飼育した。齧歯動物用固形飼料および水を適宜与えた。実験室条件にマウスを７２時間順化させてから、投薬を開始した。動物の健康状態を、順化期間の間モニターした。各ケージは群番号および研究番号で識別し、マウスはイヤータグで個々に識別した。
研究デザインおよび投薬レジメンを以下の表に示す。
【表３】
2020524675.tif 000046
【００８２】
デジタルキャリパーを使用して、接種してから５〜７日目に開始し、その後１週間に２回、腫瘍体積が約１００〜２５０ｍｍ３に到達するまで腫瘍幅および長さを測定することによって腫瘍成長をモニターした。腫瘍体積を、式：体積（ｍｍ３）＝［長さ（ｍｍ）×幅（ｍｍ）２］／２を使用して算出した。
【００８３】
腫瘍を所望の体積へ分類したら、動物を無作為化し、非常に大きいまたは小さい腫瘍を有するマウスを処分した。マウスを、１群当たり研究デザインで示すとおりの動物数で群に分けた。次いでマウスを、ＰＢＳ、Ａｂ、ＡＤＣ＃４５、またはＡＤＣ＃４１のいずれかで静脈内処置（０．２ｍｌ／動物）した。処置した後に、腫瘍成長、動物の健康および体重をモニターした。群に関する平均皮下腫瘍負荷が２０００ｍｍ３を超えたときに、動物の体重減少が２０％を超えたときに、または研究の最後に、被験動物を屠殺した。
【００８４】
腫瘍体積を、実験期間を通して１週間に２回測定した。ＴＧＩ（腫瘍成長阻害％）を、式：ＴＧＩ＝［（ＰＢＳ群の最後の体積測定値−ＰＢＳ対照として同日の処置群の体積）／（ＰＢＳ群の最後の体積測定値）］×１００を使用して計算した。各マウスの体重を電子はかりで１週間に２回測定した。
【００８５】
個々の体重および腫瘍体積の生データを算出した。群平均および標準偏差を算出し、統計分析（一元ＡＮＯＶＡおよびダネットの多重比較検定；ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６．０）を行った。全ての処置群をＰＢＳ群と比較した。Ｐ＜０．０５は統計的に有意とみなした。
【００８６】
ＡＤＣ＃４５は１０ｍｇ／ｋｇで、ＰＢＳ処置対照群と比較して、Ｄａｕｄｉ腫瘍の成長を有意に阻害した。腫瘍は３週間後に再び成長したが、１０ｍｇ／ｋｇの単回処置は、腫瘍成長を有意に遅延させた。この場合、複数回処置を、持続的な腫瘍阻害を達成するために試験してもよい。一方、３ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇの単回用量のＡＤＣ＃４５は、腫瘍成長を有意に阻害しなかった。しかし、差は顕著ではなかったが、単回用量のＡＤＣ＃４５は、ＰＢＳ処置対照群と比較して腫瘍成長にわずかな阻害を示した。この研究では、用量応答が観察され、高用量ではより優れた腫瘍成長阻害を示した（図１Ａ）。ＡＤＣ＃４５を１０ｍｇ／ｋｇまたはそれ未満の用量の単回用量で静脈内投与された被験動物では、体重減少は認められなかった（図１Ｂ）。
【００８７】
同様に、ＡＤＣ＃４５は１０ｍｇ／ｋｇで、ＰＢＳ処置対照群と比較してＲａｍｏｓ腫瘍の成長を有意に阻害し、かつ持続的な腫瘍阻害効果を最大６０日間有した。３ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇの単回用量のＡＤＣ＃４５は、腫瘍成長を有意に阻害しなかった。しかし、差は顕著ではなかったが、３ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇの単回用量のＡＤＣ＃４５は、ＰＢＳ処置対照群と比較して腫瘍成長にわずかな阻害を示した。この研究では、用量応答が観察され、高用量ではより優れた腫瘍成長阻害を示した（図２Ａ）。ＡＤＣ＃４５を１０ｍｇ／ｋｇまたはそれ未満の用量の単回用量で静脈内投与された被験動物では、体重減少は認められなかった（図２Ｂ）。
【００８８】
３ｍｇ／ｋｇの単回用量のＡＤＣ＃４５は、処置してから最大４８日目に生存率１００％で腫瘍成長を完全に阻害した。３ｍｇ／ｋｇの単回用量のＡＤＣ＃４１は、ＰＢＳ対照群と比較して腫瘍成長を有意に阻害し、かつマウスの生存率を有意に延長した（図３および図４）。
【００８９】
ＡＤＣ＃４５およびＡＤＣ＃４１は１０ｍｇ／ｋｇの単回用量で、腫瘍成長を有意に阻害したが、３ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇは両方とも、マウスのＤａｕｄｉおよびＲａｍｏｓ皮下注射異種移植腫瘍モデルにおいて有意な腫瘍阻害を示さなかった。ＡＤＣ＃４５は３ｍｇ／ｋｇの単回用量で、雌ＮＯＤ  ＳＣＩＤマウスのＤａｕｄｉ−ｌｕｃ静脈内注射腫瘍モデルにおいて腫瘍成長を生存率１００％で最大４８日完全に阻害した。ＡＤＣ＃４１は３ｍｇ／ｋｇの単回用量で、腫瘍成長を有意に阻害し、かつ雌ＮＯＤ  ＳＣＩＤマウスのＤａｕｄｉ−ｌｕｃ静脈内注射腫瘍モデルにおいて生存率を延長した。この研究では、ＡＤＣ＃４５およびＡＤＣ＃４１に関して用量応答が観察された。ＡＤＣ＃４５は、同一（１０ｍｇ／ｋｇ、または３ｍｇ／ｋｇ）の用量レジメンでＡＤＣ＃４１よりも優れた腫瘍成長阻害効果を示した。全ての処置群について、処置に関連する体重減少は研究の間観察されなかった。
【表４】
2020524675.tif 000047
【図１Ａ】
2020524675.tif 000054
【図１Ｂ】
2020524675.tif 000055
【図２Ａ】
2020524675.tif 000056
【図２Ｂ】
2020524675.tif 000057
【図３】
2020524675.tif 000058
【図４】
2020524675.tif 000059
【図５】
2020524675.tif 000060
【図６】
2020524675.tif 000061
【図７】
2020524675.tif 000062
【図８】
2020524675.tif 000063
【図９】
2020524675.tif 000064
【図１０Ａ】
2020524675.tif 000065
【図１０Ｂ】
2020524675.tif 000066
【配列表】
2020524675000001.app
【国際調査報告】
2020524675.tif 000067
2020524675.tif 000068
2020524675.tif 000069