(57)【要約】本発明は、５−エチル−２−フルオロ−４−（３−（５−（１−メチルピペリジン−４−イル）−４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イル）フェノールのシュウ酸塩およびコハク酸塩の結晶性水和物を提供する。本発明はまた、そのような結晶性水和物を含む医薬組成物、呼吸器疾患およびその他の疾患を処置するためにそのような結晶性水和物を使用する方法、ならびにそのような結晶性シュウ酸塩およびコハク酸塩水和物を調製するのに有用なプロセスも提供する。2020518582.tif 000015
2020518582.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
５−エチル−２−フルオロ−４−（３−（５−（１−メチルピペリジン−４−イル）−４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イル）フェノールのシュウ酸塩の結晶性水和物。
【請求項２】
前記結晶性シュウ酸塩水和物が、６．７７±０．２０、１２．１３±０．２０、１３．５４±０．２０、１７．２３±０．２０、および１８．００±０．２０の２θ値における回折ピークを含む粉末Ｘ線回折パターンを特徴とする、請求項１に記載の結晶性シュウ酸塩水和物。
【請求項３】
前記粉末Ｘ線回折パターンが、１１．５６±０．２０、１４．２９±０．２０、１９．５１±０．２０、２１．３８±０．２０、および２３．６３±０．２０から選択される、２θ値における２つまたはそれより多くのさらなる回折ピークを有することをさらに特徴とする、請求項２に記載の結晶性シュウ酸塩水和物。
【請求項４】
前記結晶性シュウ酸塩水和物は、前記ピーク位置が図１に示されるパターンのピーク位置と実質的に一致する粉末Ｘ線回折パターンを特徴とする、請求項１に記載の結晶性シュウ酸塩水和物。
【請求項５】
前記結晶性シュウ酸塩水和物が、２６６℃〜２７６℃の温度で吸熱熱流の最大値を示す、１０℃／分の加熱速度で記録された示差走査熱量測定トレースを特徴とする、請求項１に記載の結晶性シュウ酸塩水和物。
【請求項６】
前記結晶性シュウ酸塩水和物が、図２に示される示差走査熱量測定トレースと実質的に一致する示差走査熱量測定トレースを特徴とする、請求項１に記載の結晶性シュウ酸塩水和物。
【請求項７】
５−エチル−２−フルオロ−４−（３−（５−（１−メチルピペリジン−４−イル）−４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イル）フェノールのコハク酸塩の結晶性水和物。
【請求項８】
前記結晶性コハク酸塩水和物が、４．８１±０．２０、９．６６±０．２０、１４．９３±０．２０、および１６．７８±０．２０の２θ値における回折ピークを含む粉末Ｘ線回折パターンを特徴とする、請求項７に記載の結晶性コハク酸塩水和物。
【請求項９】
前記粉末Ｘ線回折パターンが、１０．４６±０．２０、１６．２１±０．２０、１７．４５±０．２０、２２．８７±０．２０、および２４．７７±０．２０から選択される、２θ値における２つまたはそれより多くのさらなる回折ピークを有することをさらに特徴とする、請求項８に記載の結晶性コハク酸塩水和物。
【請求項１０】
前記結晶性コハク酸塩水和物は、前記ピーク位置が図５に示されるパターンのピーク位置と実質的に一致する粉末Ｘ線回折パターンを特徴とする、請求項７に記載の結晶性コハク酸塩水和物。
【請求項１１】
前記結晶性コハク酸塩水和物が、１８０℃〜１９０℃の温度で吸熱熱流の最大値を示す、１０℃／分の加熱速度で記録された示差走査熱量測定トレースを特徴とする、請求項７に記載の結晶性コハク酸塩水和物。
【請求項１２】
前記結晶性コハク酸塩水和物が、図６に示される示差走査熱量測定トレースと実質的に一致する示差走査熱量測定トレースを特徴とする、請求項７に記載の結晶性コハク酸塩水和物。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の結晶性シュウ酸塩水和物または請求項７〜１２のいずれか一項に記載の結晶性コハク酸塩水和物と薬学的に許容され得る担体とを含む、医薬組成物。
【請求項１４】
５−エチル−２−フルオロ−４−（３−（５−（１−メチルピペリジン−４−イル）−４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イル）フェノールのシュウ酸塩の結晶性水和物を調製する方法であって、前記方法が、
（ａ）５−エチル−２−フルオロ−４−（３−（５−（１−メチルピペリジン−４−イル）−４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イル）フェノール：シュウ酸の１：１混合物をテトラヒドロフラン：水の１：１混合物に室温で溶解させることと、
（ｂ）テトラヒドロフラン：水：アセトニトリルの１：１：２混合物を添加して懸濁液を生成することと、
（ｃ）前記懸濁液を約１日間撹拌することと、
（ｄ）前記懸濁液から前記シュウ酸塩の前記結晶性水和物を単離すること
を含む、方法。
【請求項１５】
哺乳動物において呼吸器疾患を処置する方法であって、前記方法が、請求項１〜６のいずれか一項に記載の結晶性シュウ酸塩水和物または請求項７〜１２のいずれか一項に記載の結晶性コハク酸塩水和物と薬学的に許容され得る担体とを含む医薬組成物を前記哺乳動物に投与することを含む、方法。
【請求項１６】
前記呼吸器疾患が、喘息、慢性閉塞性肺疾患、嚢胞性線維症、間質性肺炎、特発性肺線維症、急性肺傷害、急性呼吸窮迫症状群、気管支炎、気腫または閉塞性細気管支炎である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記呼吸器疾患が閉塞性細気管支炎である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記呼吸器疾患が喘息または慢性閉塞性肺疾患である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記呼吸器疾患が喘息である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記医薬組成物が吸入によって投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記呼吸器疾患が、肺感染症、蠕虫感染症、肺動脈性肺高血圧症、サルコイドーシス、リンパ脈管筋腫症、気管支拡張症、または浸潤性肺疾患である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
前記呼吸器疾患が、薬物誘導性間質性肺炎、真菌誘導性間質性肺炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、過敏性肺炎、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症、特発性急性好酸球性肺炎、特発性慢性好酸球性肺炎、好酸球増加症状群、レフレル症状群、閉塞性細気管支炎性器質化肺炎、または免疫チェックポイント阻害剤誘発性間質性肺炎である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
哺乳動物における呼吸器疾患の処置において使用するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の結晶性シュウ酸塩水和物または請求項７〜１２のいずれか一項に記載の結晶性コハク酸塩水和物。
【請求項２４】
哺乳動物における呼吸器疾患の処置のための医薬の製造における、請求項１〜６のいずれか一項に記載の結晶性シュウ酸塩水和物または請求項７〜１２のいずれか一項に記載の結晶性コハク酸塩水和物の使用。
【請求項２５】
哺乳動物において眼疾患を処置する方法であって、前記方法が、請求項１〜６のいずれか一項に記載の結晶性シュウ酸塩水和物または請求項７〜１２のいずれか一項に記載の結晶性コハク酸塩水和物と薬学的に許容され得る担体とを含む医薬組成物を前記哺乳動物の眼に投与することを含む、方法。
【請求項２６】
哺乳動物における眼疾患の処置において使用するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の結晶性シュウ酸塩水和物または請求項７〜１２のいずれか一項に記載の結晶性コハク酸塩水和物。
【請求項２７】
哺乳動物における眼疾患の処置のための医薬の製造における、請求項１〜６のいずれか一項に記載の結晶性シュウ酸塩水和物または請求項７〜１２のいずれか一項に記載の結晶性コハク酸塩水和物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、呼吸器疾患およびその他の疾患を処置するために有用なＪＡＫ阻害剤化合物の結晶塩形態に向けられる。本発明はまた、そのような化合物を含む医薬組成物、該塩形態を例えば呼吸器疾患および眼疾患を処置するために使用する方法、ならびにそのような結晶塩形態を調製するために有用なプロセスおよび中間体にも関する。
【背景技術】
【０００２】
技術水準
サイトカインは、細胞間シグナル伝達分子であり、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイン、および腫瘍壊死因子がそれに含まれる。サイトカインは正常な細胞増殖および免疫調節に非常に重要であるが、免疫介在性疾患を促進し、悪性細胞の成長の一因にもなる。多くのサイトカインのレベルの上昇は、多数の疾患または状態、特に炎症を特徴とする疾患の病理に関係づけられてきた。疾患に関わるサイトカインの多くは、チロシンキナーゼのヤヌスファミリー（ＪＡＫ）に依存するシグナル伝達経路によって作用し、それはシグナル伝達性転写因子（ＳＴＡＴ）ファミリーの転写因子を通じてシグナルを伝達する。
【０００３】
ＪＡＫファミリーは、４つのメンバー、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、およびチロシンキナーゼ２（ＴＹＫ２）を含む。サイトカインとＪＡＫ依存性サイトカイン受容体の結合は受容体二量体化を誘導し、それによりＪＡＫキナーゼのチロシン残基がリン酸化され、ＪＡＫ活性化がもたらされる。次に、リン酸化されたＪＡＫは、様々なＳＴＡＴタンパク質に結合してリン酸化し、そのタンパク質が二量体化し、細胞核内に取り込まれ、遺伝子転写を直接調節し、他の作用の中でも、炎症性疾患に関連する下流の作用をもたらす。ＪＡＫは通常、ホモ二量体またはヘテロ二量体としてサイトカイン受容体と対で会合する。特定のサイトカインは特定のＪＡＫ対形成に関連している。ＪＡＫファミリーの４つのメンバーの各々が、炎症に関連するサイトカインの少なくとも１つのシグナル伝達に関わっている。
【０００４】
喘息は、予防法または治療法が存在しない気道の慢性疾患である。この疾患は、その全てが気流制限の一因である、気道の炎症、線維症、応答性亢進およびリモデリングを特徴とする。世界中で推定３億人が喘息に罹患しており、喘息を有する人の数は、２０２５年までに１億人超増加すると推定されている。ほとんどの患者は、ロイコトリエン修飾因子および／また長時間作用型βアゴニストと併用され得る吸入コルチコステロイドの使用によって喘息症状の制御を達成することができるが、その疾患が従来の治療法によって制御されない、重度の喘息を有する患者のサブセットがまだある。ＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路を通じてシグナルを伝達する、喘息炎症に関わるサイトカインには、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３、ＩＬ−２３、ＩＬ−３１、ＩＬ−２７、胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）、インターフェロン−γ（ＩＦＮγ）および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）が含まれる。気道の炎症は、喘息に加えてその他の呼吸器疾患の特徴である。慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症（ＣＦ）、間質性肺炎、間質性肺疾患（特発性肺線維症を含む）、急性肺傷害、急性呼吸窮迫症状群、気管支炎、気腫、および閉塞性細気管支炎も気道疾患であり、その病態生理学は、ＪＡＫシグナル伝達サイトカインに関係していると考えられている。
【０００５】
炎症は、ブドウ膜炎、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、ドライアイ病、加齢性黄斑変性、アトピー性角結膜炎をはじめとする多くの眼疾患で顕著な役割を果たす。ブドウ膜炎は複数の眼内炎症状態を包含し、多くの場合、自己免疫性であり、既知の感染性の引き金がなくても生じる。この状態は、米国で約２００万人の患者に発症すると推定されている。一部の患者では、ブドウ膜炎に関連する慢性炎症が組織破壊を引き起こし、米国ではこれは失明の主な原因の第５位である。ＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路を通じてシグナルを伝達するブドウ膜炎患者の目において増加したサイトカインには、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−２３、およびＩＦＮ−γが含まれる。（Ｈｏｒａｉ  ａｎｄ  Ｃａｓｐｉ，Ｊ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ，２０１１，３１，７３３−７４４；Ｏｏｉら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００６，４，２９４−３０９）。ブドウ膜炎の既存の治療法は最適でない場合が多く、多くの患者は十分に制御されていない。ステロイドは、効果的な場合もあるが、白内障および眼圧上昇／緑内障に関連している。
【０００６】
糖尿病性網膜症（ＤＲ）は、網膜内の血管への損傷によって起こる。それは糖尿病を持つ人の中で視力喪失の最も一般的な原因である。血管新生および炎症経路は、疾患において重要な役割を果たす。多くの場合、ＤＲは糖尿病の患者の失明の最もよくある原因である糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）に進行する。この状態は、米国だけで約１５０万人の患者に発症し、そのうち約２０％が両目に影響を及ぼす疾患を有すると推定されている。ＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路を通じてシグナルを伝達するサイトカイン、例えばＩＬ−６など、ならびにその産生がＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路シグナル伝達によって一部促進されるその他のサイトカイン、例えばＩＰ−１０およびＭＣＰ−１（またはＣＣＬ２と呼ばれる）などは、ＤＲ／ＤＭＥに関連する炎症において役割を果たすと考えられている（Ａｂｃｏｕｗｅｒ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１３，Ｓｕｐｐｌ  １，１−１２；Ｓｏｈｎら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｐｔｈａｍｏｌｏｇｙ，２０１１，１５２，６８６−６９４；Ｏｗｅｎ  ａｎｄ  Ｈａｒｔｎｅｔｔ，Ｃｕｒｒ  Ｄｉａｂ  Ｒｅｐ，２０１３，１３，４７６−４８０；Ｃｈｅｕｎｇら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｖｉｓｉｏｎ，２０１２，１８，８３０−８３７；Ｄｏｎｇら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｖｉｓｉｏｎ，２０１３，１９，１７３４−１７４６；Ｆｕｎａｔｓｕら、Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，２００９，１１６，７３−７９）。ＤＭＥの既存の治療法はしばしば最適ではない：硝子体内抗ＶＥＧＦ処置が一部の患者で唯一有効であり、ステロイドは白内障および眼圧上昇に関連している。
【０００７】
ドライアイ疾患（ＤＥＤ）は、米国で約５百万人の患者に発症する多因子障害である。眼表面の炎症は、この疾患の発症および伝播に重要な役割を果たすと考えられている。ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、およびＩＦＮ−γなどのサイトカインのレベルの上昇は、ＤＥＤの患者の眼液に認められている。（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、Ａｒｃｈ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ，２０１２，１３０，９０−１００）、そしてこれらのレベルは疾患の重傷度と相関する場合が多い。加齢黄斑変性およびアトピー性角結膜炎も、ＪＡＫ依存性サイトカインに関連していると考えられている。
【０００８】
２０１６年１１月０２日に出願された、本発明の譲受人に譲渡された米国特許出願第１５／３４１，２２６号は、ＪＡＫ阻害剤として有用なジアミノ化合物を開示している。特に、化合物５−エチル−２−フルオロ−４−（３−（５−（１−メチルピペリジン−４−イル）−４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イル）フェノール（化合物１）
【化１】
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は、当該出願において強力な汎ＪＡＫ阻害剤として具体的に開示されている。
【０００９】
この化合物を治療薬として効果的に使用するために、結晶性の固体塩形態を有することが望ましいであろう。例えば、適度に高い温度で熱的に安定し、それにより材料の処理と保存を容易にする物理的形態を有することが非常に望ましいであろう。製造された製品の純度および安定性を高めるために、結晶性固体は一般に非晶形よりも好ましい。しかし、有機化合物の結晶形態の形成は、全く予測不能である。もしあるならば、有機化合物のどの形態が結晶性になるかを予測するための信頼できる方法は存在しない。さらに、もしあるならば、どの結晶形態が医薬品としての使用に望ましい物理的特性を有するかを予測する方法も存在しない。
【００１０】
化合物１の結晶塩形態は以前に報告されていない。したがって、化合物１の結晶塩形態が必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ａｂｃｏｕｗｅｒ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１３，Ｓｕｐｐｌ  １，１−１２
【非特許文献２】Ｓｏｈｎら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｐｔｈａｍｏｌｏｇｙ，２０１１，１５２，６８６−６９４
【非特許文献３】Ｏｗｅｎ  ａｎｄ  Ｈａｒｔｎｅｔｔ，Ｃｕｒｒ  Ｄｉａｂ  Ｒｅｐ，２０１３，１３，４７６−４８０
【非特許文献４】Ｃｈｅｕｎｇら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｖｉｓｉｏｎ，２０１２，１８，８３０−８３７
【非特許文献５】Ｄｏｎｇら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｖｉｓｉｏｎ，２０１３，１９，１７３４−１７４６
【非特許文献６】Ｆｕｎａｔｓｕら、Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，２００９，１１６，７３−７９
【非特許文献７】Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、Ａｒｃｈ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ，２０１２，１３０，９０−１００
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、５−エチル−２−フルオロ−４−（３−（５−（１−メチルピペリジン−４−イル）−４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イル）フェノール（１）のシュウ酸塩およびコハク酸塩の結晶性水和物を提供する。
【００１３】
５−エチル−２−フルオロ−４−（３−（５−（１−メチルピペリジン−４−イル）−４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イル）フェノールのシュウ酸塩の結晶性水和物は、室温で約３０％〜約９０％の範囲の相対湿度にさらされた場合に、約２６６℃〜約２７６℃の範囲の融解温度を有し、約１％の総吸湿を示すことが見出された。
【００１４】
５−エチル−２−フルオロ−４−（３−（５−（１−メチルピペリジン−４−イル）−４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イル）フェノールのコハク酸塩の結晶性水和物は、室温で約５％〜約９０％の範囲の相対湿度にさらされた場合に、約１８０℃〜約１９０℃の範囲の融解温度を有し、約２％の総吸湿を示すことが見出された。
【００１５】
他の用途の中でも、本発明の結晶性固体形態は、ＪＡＫ阻害剤による処置に適した疾患、特に呼吸器疾患を処置または改善するための医薬組成物の調製に有用であると予期される。したがって、その組成物のもう一つの態様において、本発明は、薬学的に許容され得る担体と、５−エチル−２−フルオロ−４−（３−（５−（１−メチルピペリジン−４−イル）−４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イル）フェノールのシュウ酸塩の結晶性水和物および５−エチル−２−フルオロ−４−（３−（５−（１−メチルピペリジン−４−イル）−４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イル）フェノールのコハク酸塩の結晶性水和物から選択される活性剤とを含む医薬組成物を提供する。
【００１６】
本発明はまた、哺乳動物において呼吸器疾患、特に喘息を処置する方法も提供し、この方法は、哺乳動物に本発明の結晶性固体形態または医薬組成物を投与することを含む。別個の異なる態様では、本発明は、本発明の結晶形態を調製するために有用な合成プロセスも提供する。
【００１７】
本発明はさらに、哺乳動物において眼炎症性疾患を処置する方法を提供し、この方法は、哺乳動物の目に本発明の結晶性固体形態または医薬組成物を投与することを含む。
【００１８】
本発明はまた、医学療法で使用するための本明細書に記載の本発明の結晶性固体形態、ならびに哺乳動物において呼吸器疾患を処置するための製剤または医薬の製造における本発明の結晶性固体形態の使用も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
本発明の様々な態様は、添付の図面を参照して例示される。
【００２０】
【図１】図１は、５−エチル−２−フルオロ−４−（３−（５−（１−メチルピペリジン−４−イル）−４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イル）フェノールのシュウ酸塩の結晶性水和物（以降「シュウ酸塩水和物」）の粉末Ｘ線回折（ＰＸＲＤ）パターンを示す。
【００２１】
【図２】図２は、本発明のシュウ酸塩水和物の示差走査熱量測定（ＤＳＣ）サーモグラムを示す。
【００２２】
【図３】図３は、本発明のシュウ酸塩水和物の熱重量分析（ＴＧＡ）プロットを示す。
【００２３】
【図４】図４は、約２５℃の温度で観察された本発明のシュウ酸塩水和物の動的水分吸着（ＤＭＳ）等温線を示す。
【００２４】
【図５】図５は、５−エチル−２−フルオロ−４−（３−（５−（１−メチルピペリジン−４−イル）−４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イル）フェノールの結晶性コハク酸塩水和物（以降「コハク酸塩水和物」）の粉末Ｘ線回折（ＰＸＲＤ）パターンを示す。
【００２５】
【図６】図６は、本発明のコハク酸塩水和物の示差走査熱量測定（ＤＳＣ）サーモグラムを示す。
【００２６】
【図７】図７は、本発明のコハク酸塩水和物の熱重量分析（ＴＧＡ）プロットを示す。
【００２７】
【図８】図８は、約２５℃の温度で観察された本発明のコハク酸塩水和物の動的水分吸着（ＤＭＳ）等温線を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
発明の詳細な説明
定義
様々な態様および実施形態を含む本発明を説明する際、特に明記しない限り、以下の用語は以下の意味を有する。
【００２９】
用語「治療上有効な量」とは、処置を必要とする患者に投与されると処置を達成するのに十分な量を意味する。
【００３０】
用語「処置すること」または「処置」とは、患者（特にヒト）において処置される医学的状態、疾患または障害（例えば、呼吸器疾患）を予防、改善または抑制すること；あるいは、医学的状態、疾患または障害の症状を緩和することを意味する。
【００３１】
用語「水和物」とは、水の分子と本発明の化合物とによって形成される、一般に結晶形態の複合体または凝集体を意味し、水分子と化合物分子の比は１：１またはそれ未満であってもよいし１：１またはそれを超えてもよい。
【００３２】
用語「約」とは、規定値の±５パーセントを意味する。
【００３３】
本明細書および添付される特許請求の範囲において使用される、単数形の「ａ」、「ａｎ」、「ｏｎｅ」および「ｔｈｅ」は、内容が明らかに別のものを示している場合を除いて、複数の指示対象を含むことに留意が必要である。
【００３４】
命名規則
化合物１は、ＣｈｅｍＤｒａｗソフトウェア（パーキンエルマー社、マサチューセッツ州ケンブリッジ）で実行されているＩＵＰＡＣ規則に従って５−エチル−２−フルオロ−４−（３−（５−（１−メチルピペリジン−４−イル）−４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イル）フェノールと命名される。
【００３５】
さらに、化合物１の構造のテトラヒドロイミダゾピリジン部分のイミダゾ部分は互変異性型で存在し、実施例１の化合物の断片について下に例示されている。
【化２】
2020518582.tif 000004
【００３６】
ＩＵＰＡＣ規則によれば、これらの表現は、イミダゾール部分の原子の異なる番号付けを生じる：２−（１Ｈ−インダゾール−３−イル）−４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン（構造Ａ）に対して２−（１Ｈ−インダゾール−３−イル）−４，５，６，７−テトラヒドロ−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン（構造Ｂ）。構造が特定の形態で示されているか、または命名されているとしても、本発明がその互変異性体も含むことは当然理解される。
【００３７】
本発明の結晶形態
一態様では、本発明は、５−エチル−２−フルオロ−４−（３−（５−（１−メチルピペリジン−４−イル）−４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イル）フェノール（１）のシュウ酸塩の結晶性水和物を提供する。
【００３８】
一態様では、結晶性シュウ酸塩水和物は、いくつかあるピークのうちで、６．７７±０．２０、１２．１３±０．２０、１３．５４±０．２０、１７．２３±０．２０、および１８．００±０．２０の２θ値における重要な回折ピークを有する粉末Ｘ線回折（ＰＸＲＤ）パターンを特徴とする。結晶性シュウ酸塩水和物は、１１．５６±０．２０、１４．２９±０．２０、１９．５１±０．２０、２１．３８±０．２０、および２３．６３±０．２０から選択される２θ値において３またはそれ以上のさらなる回折ピークを含む、２つまたはそれより多くのさらなる回折ピークを有するＰＸＲＤパターンをさらに特徴とすることがある。もう一つの態様では、結晶性シュウ酸塩水和物は、６．７７±０．２０、１１．５６±０．２０、１２．１３±０．２０、１３．５４±０．２０、１４．２９±０．２０、１７．２３±０．２０、１８．００±０．２０、１９．５１±０．２０、２１．３８±０．２０、および２３．６３±０．２０の２θ値における回折ピークを有するＰＸＲＤパターンを特徴とする。
【００３９】
粉末Ｘ線回折の分野で周知のように、ＰＸＲＤスペクトルのピーク位置は、相対ピーク高さよりも、実験の詳細、例えば試料調製および装置のジオメトリの詳細などに対する感受性が比較的低い。したがって、一態様では、結晶性シュウ酸塩水和物は、ピーク位置が図１に示される位置と実質的に一致する粉末Ｘ線回折パターンを特徴とする。
【００４０】
もう一つの態様では、結晶性シュウ酸塩水和物は、高温にさらされた際の挙動によって特徴付けられる。図２に実証されるように、１０℃／分の加熱速度で記録された示差走査熱量測定（ＤＳＣ）トレースは、約５９℃の開始と約９７℃のピークを有する脱溶媒和吸熱と、約２６８℃〜約２７３℃を含む約２６６℃〜約２７６℃の範囲内の融解転移として特定される、吸熱熱流のピークを示す。図３の熱重量分析（ＴＧＡ）トレースは、約２６℃の温度で脱溶媒和開始および約２５０℃の温度で分解開始を示す。総合すると、ＤＳＣおよびＴＧＡのトレースは、融解転移が分解を伴うことを示唆している。ＴＧＡプロファイルは、約２５℃〜約７５℃で約５．５％の重量減少を示す。
【００４１】
本発明の結晶性シュウ酸塩水和物は、わずかに吸湿性の傾向のある可逆的な吸着／脱着プロファイルを有することが実証された。シュウ酸塩水和物は、図４に示されるように、室温で約３０％〜約９０％の範囲の相対湿度にさらされた場合に、約１％の総吸湿を示した。可逆的な水和／脱水転移は約０％〜１５％の相対湿度で観察された。ヒステリシスは、２サイクルの吸着および脱着において観察されなかった。
【００４２】
もう一つの態様では、本発明は、５−エチル−２−フルオロ−４−（３−（５−（１−メチルピペリジン−４−イル）−４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イル）フェノールのコハク酸塩の結晶性水和物（１）を提供する。
【００４３】
一態様では、結晶性コハク酸塩水和物は、いくつかあるピークのうちで、４．８１±０．２０、９．６６±０．２０、１４．９３±０．２０、および１６．７８±０．２０の２θ値における重要な回折ピークを有する粉末Ｘ線回折（ＰＸＲＤ）パターンを特徴とする。結晶性コハク酸塩水和物は、１０．４６±０．２０、１６．２１±０．２０、１７．４５±０．２０、２２．８７±０．２０、および２４．７７±０．２０から選択される２θ値において３またはそれ以上のさらなる回折ピークを含む、２つまたはそれより多くのさらなる回折ピークを有するＰＸＲＤパターンをさらに特徴とすることがある。もう一つの態様では、結晶性シュウ酸塩水和物は、４．８１±０．２０、９．６６±０．２０、１０．４６±０．２０、１４．９３±０．２０、１６．２１±０．２０、１６．７８±０．２０、１７．４５±０．２０、２２．８７±０．２０、および２４．７７±０．２０の２θ値における回折ピークを有するＰＸＲＤパターンを特徴とする。さらにもう一つの態様では、結晶性コハク酸塩水和物は、ピーク位置が図５に示される位置と実質的に一致する粉末Ｘ線回折パターンを特徴とする。
【００４４】
結晶性コハク酸塩水和物も、高温にさらされた際の挙動によって特徴付けられる。図６に実証されるように、１０℃／分の加熱速度で記録された示差走査熱量測定（ＤＳＣ）トレースは、２つの脱溶媒和吸熱を示し、１つ目は約２０℃の開始と約５０℃のピークを有し、２つ目の脱溶媒和吸熱は約１０３℃の開始と約１２９℃のピークを有する。ＤＳＣトレースは、約１８３℃〜約１８８℃を含む約１８０℃〜約１９０℃の範囲内の融解転移として特定される吸熱熱流のピークをさらに示す。図７の熱重量分析（ＴＧＡ）トレースは、約２００℃の温度で分解開始を示す。
【００４５】
結晶性コハク酸塩水和物は、わずかに吸湿性の傾向のある可逆的な吸着／脱着プロファイルを有することが実証された。コハク酸塩水和物は、図８に示されるように、室温で約５％〜約９０％の範囲の相対湿度にさらされた場合に、約２％の総吸湿を示した。ヒステリシスは、２サイクルの吸着および脱着において観察されなかった。
【００４６】
合成手順
化合物１は、以下の実施例に記載の手順を使用して、または本出願の背景の項に列挙される本発明の譲受人に譲渡された米国出願に記載の手順を使用して、容易に入手可能な出発物質から調製することができる。
【００４７】
本発明の結晶性シュウ酸塩水和物は、化合物１とシュウ酸の等モル混合物をテトラヒドロフランおよび水の１：１混合物に室温で溶解させ、続いてテトラヒドロフラン：水：アセトニトリルの１：１：２混合物を逆溶剤として添加して懸濁液を生成することによって便宜に調製される。得られる反応混合物を室温で約１日間撹拌し、アセトニトリルで洗浄し、乾燥させて結晶性水和物形態が得られる。
【００４８】
本発明の結晶性コハク酸塩水和物は、３段階のプロセスによって調製されてよい。第１に、化合物１とコハク酸の等モル混合物をイソプロパノール中に懸濁させ、室温で約１日間撹拌する。得られる固体を濾過し、イソプロパノールで洗浄し、乾燥させて第１の中間体結晶性固体が得られる。第２に、単離した第１の中間体結晶性固体を約１５０℃で約３０分間乾燥させると第２の中間体結晶性固体が得られる。第３に、第２の中間体固体を約８０％〜９０％の相対湿度下、室温で約１日間平衡させると結晶性コハク酸塩水和物形態が得られる。
【００４９】
一つの方法態様によれば、本発明は、５−エチル−２−フルオロ−４−（３−（５−（１−メチルピペリジン−４−イル）−４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イル）フェノールのシュウ酸塩の結晶性水和物を調製する方法を提供し、該方法は、（ａ）５−エチル−２−フルオロ−４−（３−（５−（１−メチルピペリジン−４−イル）−４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イル）フェノール：シュウ酸の１：１混合物をテトラヒドロフラン：水の１：１混合物に室温で溶解させること、（ｂ）テトラヒドロフラン：水：アセトニトリルの１：１：２混合物を添加して懸濁液を生成すること、（ｃ）懸濁液を約１日間撹拌すること、および（ｄ）結晶性シュウ酸塩水和物を懸濁液から単離することを含む。
【００５０】
医薬組成物
本発明の結晶性固体形態は、一般に医薬組成物または製剤の形態で使用される。そのような医薬組成物は、吸入によって患者に有利に投与され得る。さらに、医薬組成物は、以下に限定されるものではないが、経口、局所（経皮を含む）、直腸、経鼻、および非経口投与様式を含む、任意の許容可能な投与経路によって投与され得る。
【００５１】
したがって、その組成物の態様の一つにおいて、本発明は、薬学的に許容され得る担体または賦形剤と、化合物１の結晶性シュウ酸塩水和物または結晶性コハク酸塩水和物とを含む医薬組成物に向けられる。必要に応じて、そのような医薬組成物は、所望により、他の治療薬および／または配合剤を含んでもよい。組成物およびその使用を考察する際、本発明の結晶性固体形態は、本明細書において「活性剤」と呼ばれることもある。
【００５２】
本発明の医薬組成物は、一般に治療上有効な量の本発明の結晶形態を含有する。しかし、当業者は、医薬組成物が治療上有効な量より多い量を含有する（すなわちバルク組成物）か、または治療上有効な量よりも少ない量を含有する（すなわち治療上有効な量を達成するために複数回投与用に設計された個々の単位用量）ことができることを理解するであろう。
【００５３】
一般に、そのような医薬組成物は、約０．０１〜約９５重量％の活性剤を含む；それには、例えば約０．０５〜約３０重量％；および約０．１％〜約１０重量％の活性剤が含まれる。
【００５４】
任意の従来の担体または賦形剤を本発明の医薬組成物に使用することができる。特定の担体または賦形剤、あるいは担体または賦形剤の組合せの選択は、特定の患者を処置するために使用される投与様式あるいは医学的状態または疾患状態の種類に依存することになる。この点について、特定の投与様式に適した医薬組成物の調製は、十分に製薬分野の当業者の範囲内である。その上、本発明の医薬組成物に使用される担体または賦形剤は、商業的に入手可能である。さらなる例として、従来の製剤技法が、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｈｉｔｅ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ  （２０００）；およびＨ．Ｃ．Ａｎｓｅｌら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，７ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｈｉｔｅ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ  （１９９９）に記載されている。
【００５５】
薬学的に許容され得る担体として役立ち得る材料の代表的な例としては、以下に限定されるものではないが、以下が挙げられる：糖、例えばラクトース、グルコースおよびスクロースなど；デンプン、例えばトウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなど；セルロース、例えば微結晶性セルロース、およびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなど；トラガント末；麦芽；ゼラチン；タルク；賦形剤、例えばカカオバターおよび坐剤ワックスなど；油、例えばピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油など；グリコール、例えばプロピレングリコールなど；ポリオール、例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなど；エステル、例えばオレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなど；寒天；緩衝剤、例えば水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなど；アルギン酸；パイロジェンフリー水；等張性生理食塩水；リンゲル液；エチルアルコール；リン酸緩衝液；ならびに医薬組成物中で用いられるその他の無毒の適合物質。
【００５６】
医薬組成物は、一般に活性剤を薬学的に許容され得る担体および１または複数の随意の構成成分と完全にかつ均質に混合またはブレンドすることによって調製される。結果として得られる均一にブレンドされた混合物は、次に従来の手順および機器を使用して錠剤、カプセル剤、丸剤などに成形または充填されることができる。
【００５７】
一態様では、医薬組成物は吸入投与に適している。吸入投与のための医薬組成物は、一般にエアゾールまたは粉末の形態である。そのような組成物は、通常、吸入器送達装置、例えばドライパウダー式吸入器（ＤＰＩ）、定量吸入器（ＭＤＩ）、ネブライザー吸入器、または同様の送達装置などを使用して投与される。
【００５８】
特定の実施形態では、医薬組成物は、ドライパウダー式吸入器を使用して吸入によって投与される。そのようなドライパウダー式吸入器は、一般に、吸気の間に患者の気流に分散する流動性粉末として医薬組成物を投与する。流動性粉末組成物を実現するために、治療薬は一般にラクトース、デンプン、マンニトール、デキストロース、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリラクチド−コ−グリコリド（ＰＬＧＡ）またはその組合せなどの適した賦形剤とともに配合される。一般に、治療薬は、吸入に適した組成物を形成するために微粒子化され、適した担体と組み合わされる。
【００５９】
ドライパウダー式吸入器で用いる代表的な医薬組成物は、ラクトースと、微粉化形態の本発明の結晶性固体形態を含む。そのような乾燥粉末組成物は、例えば、乾式粉砕ラクトースを治療薬と組み合わせた後、成分をドライブレンドすることによって作製することができる。次に、組成物は、一般に、乾燥粉末ディスペンサー、または乾燥粉末送達装置で使用するための吸入カートリッジまたはカプセルに充填される。
【００６０】
吸入による治療薬の送達に適したドライパウダー式吸入器送達装置は、当技術分野において記載されており、そのような装置の例は商業的に入手可能である。例えば、代表的なドライパウダー式吸入器送達装置または製品としては、Ａｅｏｌｉｚｅｒ（ノバルティス）；Ａｉｒｍａｘ（ＩＶＡＸ）；ＣｌｉｃｋＨａｌｅｒ（Ｉｎｎｏｖａｔａ  Ｂｉｏｍｅｄ）；Ｄｉｓｋｈａｌｅｒ（グラクソスミスクライン）；Ｄｉｓｋｕｓ／Ａｃｃｕｈａｌｅｒ（グラクソスミスクライン）；Ｅｌｌｉｐｔａ（グラクソスミスクライン）；Ｅａｓｙｈａｌｅｒ（Ｏｒｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａ）；Ｅｃｌｉｐｓｅ（アベンティス）；ＦｌｏｗＣａｐｓ（Ｈｏｖｉｏｎｅ）；Ｈａｎｄｉｈａｌｅｒ（ベーリンガーインゲルハイム）；Ｐｕｌｖｉｎａｌ（Ｃｈｉｅｓｉ）；Ｒｏｔａｈａｌｅｒ（グラクソスミスクライン）；ＳｋｙｅＨａｌｅｒ／Ｃｅｒｔｉｈａｌｅｒ（ＳｋｙｅＰｈａｒｍａ）；Ｔｗｉｓｔｈａｌｅｒ（シェリング・プラウ）；Ｔｕｒｂｕｈａｌｅｒ（アストラゼネカ）；Ｕｌｔｒａｈａｌｅｒ（アベンティス）；などが挙げられる。
【００６１】
もう一つの特定の実施形態では、医薬組成物は、定量吸入器を使用して吸入によって投与される。そのような定量吸入器は、一般に、圧縮された高圧ガスを用いて、測定された量の治療薬を放出する。したがって、定量吸入器を使用して投与される医薬組成物は、一般に、治療薬の溶液または懸濁液を液化高圧ガス中に含む。任意の適した液化高圧ガスが用いられてよく、それにはヒドロフルオロアルカン（ＨＦＡ）、例えば１，１，１，２−テトラフルオロエタン（ＨＦＡ  １３４ａ）および１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロ−ｎ−プロパン、（ＨＦＡ  ２２７）など；ならびにクロロフルオロカーボン、例えばＣＣｌ３Ｆなどが含まれる。特定の実施形態では、高圧ガスはヒドロフルオロアルカンである。一部の実施形態では、ヒドロフルオロアルカン製剤は、共溶媒、例えばエタノールまたはペンタンなど、および／または界面活性剤、例えばソルビタントリオレエート、オレイン酸、レシチン、およびグリセリンなどを含む。
【００６２】
定量吸入器で用いる代表的な医薬組成物は、約０．０１％〜約５重量％の本発明化合物；約０％〜約２０重量％のエタノール；および約０％〜約５重量％の界面活性剤を含み；残りはＨＦＡ高圧ガスである。そのような組成物は、一般に、冷却したかまたは加圧したヒドロフルオロアルカンを、治療薬、エタノール（存在する場合）および界面活性剤（存在する場合）を含有する、適した容器に添加することによって調製される。懸濁液を調製するには、治療薬を微粉化した後、高圧ガスと組み合わせる。次に、一般に定量吸入装置の一部を形成するエアゾール缶に組成物を充填する。
【００６３】
吸入による治療薬の送達に適した定量吸入装置は、当技術分野において記載されており、そのような装置の例は商業的に入手可能である。例えば、代表的な定量吸入器または製品としては、ＡｅｒｏＢｉｄ  Ｉｎｈａｌｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｆｏｒｅｓｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；Ａｔｒｏｖｅｎｔ  Ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ  Ａｅｒｏｓｏｌ（ベーリンガーインゲルハイム）；Ｆｌｏｖｅｎｔ（グラクソスミスクライン）；Ｍａｘａｉｒ  Ｉｎｈａｌｅｒ（３Ｍ）；Ｐｒｏｖｅｎｔｉｌ  Ｉｎｈａｌｅｒ（シェリング）；Ｓｅｒｅｖｅｎｔ  Ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ  Ａｅｒｏｓｏｌ（グラクソスミスクライン）；などが挙げられる。
【００６４】
もう一つの特定の態様では、医薬組成物は、ネブライザー吸入器を使用する吸入によって投与される。そのようなネブライザー装置は、一般に、患者の気道に運ばれるミストとして医薬組成物を噴霧させる高速の空気の流れを生成する。したがって、ネブライザー吸入器で用いるために配合される場合、治療薬は、溶液を形成するために適した担体に溶解させることができる。あるいは、治療薬を微粉化するかまたはナノ粉砕し、適した担体と組み合わせて懸濁液を形成することができる。
【００６５】
ネブライザー吸入器で用いる代表的な医薬組成物は、約０．０５μｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬの本発明の化合物と、噴霧製剤に適合する賦形剤を含む溶液または懸濁液を含む。一実施形態では、溶液のｐＨは約３〜約８である。
【００６６】
吸入による治療薬の送達に適したネブライザー装置は、当技術分野において記載されており、そのような装置の例は商業的に入手可能である。例えば、代表的なネブライザー装置または製品としては、Ｒｅｓｐｉｍａｔ  Ｓｏｆｔｍｉｓｔ  Ｉｎｈａｌｅｒ（ベーリンガーインゲルハイム）；ｔｈｅ  ＡＥＲｘ  Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｒａｄｉｇｍ  Ｃｏｒｐ．）；ｔｈｅ  ＰＡＲＩ  ＬＣ  Ｐｌｕｓ  Ｒｅｕｓａｂｌｅ  Ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ（Ｐａｒｉ  ＧｍｂＨ）；などが挙げられる。
【００６７】
さらにもう一つの態様では、本発明の医薬組成物は、その代わりに、経口投与を意図した剤形に調製されてよい。経口投与に適した医薬組成物は、カプセル剤、錠剤、丸剤、ロゼンジ、カシェ、糖衣錠、粉末、顆粒剤の形態であるか；あるいは、水性または非水性液体の溶液または懸濁液として；あるいは水中油型または油中水型液体エマルジョンとして；あるいはエリキシル剤またはシロップ剤として；などであってよく；それぞれ、所定量の本発明の化合物を有効成分として含有する。
【００６８】
固体剤形での経口投与を目的とする場合、本発明の医薬組成物は、一般に、活性剤と、１または複数の薬学的に許容され得る担体、例えばクエン酸ナトリウムまたは第二リン酸カルシウムなどを含むことになる。必要に応じて、またはその代わりに、そのような固体剤形は、賦形剤または増量剤、結合剤、保水剤、溶解遅延剤、吸収促進剤、湿潤剤、吸収剤、潤滑剤、着色剤、および緩衝剤を含むこともある。離型剤、湿潤剤、コーティング剤、甘味料、香味料および芳香剤、防腐剤および酸化防止剤も、本発明の医薬組成物に存在し得る。
【００６９】
結晶性固体形態は、眼注射用の滅菌水性懸濁液または溶液として配合されてもよい。そのような水性製剤に含めてよい有用な賦形剤としては、ポリソルベート８０、カルボキシメチルセルロース、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ヒスチジン、α−α−トレハロース二水和物、スクロース、ポリソルベート２０、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、およびリン酸ナトリウムが挙げられる。ベンジルアルコールは、防腐剤として役立ち得、塩化ナトリウムは張性を調整するために含まれることがある。さらに、塩酸および／または水酸化ナトリウムが、ｐＨ調整のために溶液に添加されてよい。眼注射用の水性製剤は、防腐剤無添加で調製されてよい。
【００７０】
代替製剤には、制御放出製剤、経口投与用の液体剤形、経皮パッチ、および非経口製剤が含まれてもよい。そのような代替製剤の従来の賦形剤および調製方法は、例えば、上記のＲｅｍｉｎｇｔｏｎによる参考文献に記載されている。
【００７１】
以下の限定されない例は、本発明の代表的な医薬組成物を示す。
ドライパウダー組成物
【００７２】
本発明の微粉化された固体形態（１ｇ）を、粉砕されたラクトース（２５ｇ）とブレンドする。次に、このブレンドした混合物を、用量あたり約０．１ｍｇ〜約４ｍｇの式Ｉの化合物を提供するために十分な量で、剥離可能なブリスター包装の個々のブリスターに充填する。ブリスターの内容物を、ドライパウダー式吸入器を使用して投与する。
【００７３】
ドライパウダー組成物
本発明の微粉化された固体形態（１ｇ）を、粉砕されたラクトース（２０ｇ）とブレンドして、化合物対粉砕されたラクトースの重量比が１：２０のバルク組成物を形成する。ブレンドされた組成物を、用量あたり約０．１ｍｇ〜約４ｍｇの式Ｉの化合物を送達可能なドライパウダー吸入装置に詰め込む。
【００７４】
定量吸入器用組成物
本発明の微粉化された固体形態（１０ｇ）を、レシチン（０．２ｇ）を脱塩水（２００ｍＬ）に溶解させることによって調製した溶液に分散させる。得られる懸濁液を噴霧乾燥させた後、微粉化して、平均直径が約１．５μｍ未満の粒子を含む微粉化された組成物を形成する。次に、加圧した１，１，１，２−テトラフルオロエタンを、定量噴霧式吸入器によって投与された場合に、用量あたり約０．１ｍｇ〜約４ｍｇの式Ｉの化合物を提供するために十分な量で含有する定量吸入器のカートリッジに微粉化された組成物を充填する。
【００７５】
ネブライザー組成物
本発明の固体形態（２５ｍｇ）を１．５〜２．５当量の塩酸を含む溶液に溶解させ、続いて水酸化ナトリウムを添加してｐＨを３．５〜５．５およびグリセロールの３重量％に調整する。全ての成分が溶解するまで溶液をよく撹拌する。用量あたり約０．１ｍｇ〜約４ｍｇの式Ｉの化合物を提供するネブライザー装置を使用して溶液を投与する。
【００７６】
眼注射用の水性製剤
滅菌水性懸濁液の各１ｍＬには、５ｍｇ〜５０ｍｇの本発明の固体形態、張性のための塩化ナトリウム、防腐剤としての０．９９％（ｗ／ｖ）ベンジルアルコール、０．７５％カルボキシメチルセルロースナトリウム、および０．０４％ポリソルベートが含まれる。水酸化ナトリウムまたは塩酸を含めてｐＨを５〜７．５に調整してもよい。
【００７７】
眼注射用の水性製剤
滅菌防腐剤無添加水性懸濁液には、５ｍｇ／ｍＬ〜５０ｍｇ／ｍＬの本発明の固体形態が、１０ｍＭリン酸ナトリウム、４０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０３％ポリソルベート２０、および５％スクロースに含まれる。
有用性
【００７８】
本発明の化合物、５−エチル−２−フルオロ−４−（３−（５−（１−メチルピペリジン−４−イル）−４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イル）フェノール、（化合物１）は、酵素のＪＡＫファミリー：ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、およびＴＹＫ２の強力な阻害剤であることが示された。
【００７９】
呼吸器疾患
その上、下のアッセイに記載されるように、化合物１は、喘息およびその他の呼吸器疾患に関わる炎症促進性および線維化促進性サイトカインの強力な阻害を実証した。この化合物の吸収および分布は、前臨床アッセイでプロファイルされている。マウスにおいて、この化合物は、肺での曝露が血漿での曝露の約５５倍大きいことを示した。重要なことに、マウス肺における化合物１の濃度はＪＡＫ酵素阻害の予測される薬力学的効果と相関することが示された。特に、この化合物は、マウス肺組織において炎症促進性サイトカインＩＬ−１３の作用を阻害することが示されている。具体的には、この化合物は、生体内での局所肺ＪＡＫ標的結合の証拠をもたらし、肺組織におけるＳＴＡＴ６のＩＬ−１３誘導性リン酸化の阻害を実証した。この作用は、炎症促進性サイトカインＩＬ−１３を試験化合物の投与の４時間後に投与した場合に観察されており、肺における著しい保持のさらなる証拠を提供する。
【００８０】
ＪＡＫ阻害剤の抗炎症活性は、喘息の前臨床モデルにおいて強く実証されている（Ｍａｌａｖｉｙａら、Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ，２０１０，１０，８２９，−８３６；Ｍａｔｓｕｎａｇａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，２０１１，４０４，２６１−２６７；Ｋｕｄｌａｃｚら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２００８，５８２，１５４−１６１）。したがって、本発明の化合物は、炎症性呼吸器疾患、特に喘息の処置に有用であることが予期される。肺の炎症および線維症は、喘息に加えてその他の呼吸器疾患、例えば慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症（ＣＦ）、間質性肺炎、間質性肺疾患（特発性肺線維症を含む）、急性肺傷害、急性呼吸窮迫症状群、気管支炎、気腫、および閉塞性細気管支炎などの特徴である。そのため、本発明の化合物は、慢性閉塞性肺疾患、嚢胞性線維症、間質性肺炎、間質性肺疾患（特発性肺線維症を含む）、急性肺傷害、急性呼吸窮迫症状群、気管支炎、気腫、および閉塞性細気管支炎の処置にも有用であると予期される。上記のように、呼吸器疾患の処置のために、固体形態は吸入による投与に特に有用である。
【００８１】
そのため、一態様では、本発明は、哺乳動物（例えば、ヒト）において呼吸器疾患を処置する方法を提供し、該方法は、哺乳動物に、治療有効量の本発明の化合物または薬学的に許容され得る担体と本発明の固体形態とを含む医薬組成物を投与することを含む。
【００８２】
一態様では、呼吸器疾患は、喘息、慢性閉塞性肺疾患、嚢胞性線維症、間質性肺炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症（ＣＦ）、間質性肺炎、間質性肺疾患（特発性肺線維症を含む）、急性肺傷害、急性呼吸窮迫症状群、気管支炎、気腫または閉塞性細気管支炎である。もう一つの態様では、呼吸器疾患は喘息または慢性閉塞性肺疾患である。もう一つの態様では、本発明の固体形態は、吸入によって投与される。
【００８３】
本発明はさらに、哺乳動物において喘息を処置する方法を提供し、該方法は、哺乳動物に、本発明の固体形態または薬学的に許容され得る担体と本発明の固体形態とを含む医薬組成物を投与することを含む。
【００８４】
喘息を処置するために使用される場合、本発明の化合物は、一般に、１日１回または１日複数回投与されるが、その他の投与形態を使用してもよい。活性剤の用量あたりに投与される量または一日に投与される総量は、一般に、処置される状態、選択された投与経路、投与された実際の化合物とその相対的活性、個々の患者の年齢、体重、および応答、患者の症状の重症度などを含む関連する状況を考慮して、医師が決定する。
【００８５】
炎症に関連するサイトカインの強力な阻害が実証されたことに加えて、化合物１は、げっ歯類肺好酸球増加症および好中球増加症アッセイにおいてＴ細胞活性化の阻害および活性が実証された。そのため、本発明の固体形態は、さらなる呼吸器の状態の処置に有用であると考えられる。
【００８６】
さらなる呼吸器の状態としては、肺感染症、蠕虫感染症、肺動脈性肺高血圧症、サルコイドーシス、リンパ脈管筋腫症、気管支拡張症、および浸潤性肺疾患が挙げられる。固体形態は、薬物誘導性間質性肺炎、真菌誘導性間質性肺炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、過敏性肺炎、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症、特発性急性好酸球性肺炎、特発性慢性好酸球性肺炎、好酸球増加症状群、レフレル症状群、閉塞性細気管支炎性器質化肺炎、および免疫チェックポイント阻害剤誘発性間質性肺炎の処置にも有用であると考えられている。
【００８７】
ＪＡＫ−シグナル伝達サイトカインも、多くの免疫プロセスの中心となる免疫細胞のサブタイプであるＴ細胞の活性化において主要な役割を果たす。病理学的Ｔ細胞の活性化は、複数の呼吸器疾患の病因において重要である。自己反応性Ｔ細胞は、閉塞性細気管支炎性器質化肺炎（ＣＯＳとも呼ばれる）において役割を果たす。ＣＯＳと同様に、肺移植拒絶の病因は、移植されたドナー肺によるレシピエントＴ細胞の異常なＴ細胞活性化に関連している。肺移植拒絶は、原発性移植片機能不全（ＰＧＤ）、器質化肺炎（ＯＰ）、急性拒絶反応（ＡＲ）またはリンパ球性細気管支炎（ＬＢ）として早期に発生するか、または肺移植の数年後に慢性肺同種移植片機能不全（ＣＬＡＤ）として発生することがある。ＣＬＡＤは以前には閉塞性細気管支炎（ＢＯ）として知られていたが、現在は、ＢＯ、拘束型ＣＬＡＤ（ｒＣＬＡＤまたはＲＡＳ）および好中球性同種移植片機能不全をはじめとする様々な病理学的徴候を有する可能性のある症候群とみなされている。慢性肺同種移植片機能不全（ＣＬＡＤ）は、移植された肺の機能を徐々に失わせるので、肺移植レシピエントの長期管理に大きな課題がある（Ｇａｕｔｈｉｅｒら、Ｃｕｒｒ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｒｅｐ．，２０１６，３（３），１８５−１９１）。ＣＬＡＤは処置に対する反応性が低く、そのため、この状態を予防または処置することのできる効果的な化合物がなお必要とされている。数種のＪＡＫ依存性サイトカイン、例えばＩＦＮγおよびＩＬ−５などは、ＣＬＡＤおよび肺移植拒絶において増加する（Ｂｅｒａｓｔｅｇｕｉら、Ｃｌｉｎ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２０１７，３１，ｅ１２８９８）。さらに、ＪＡＫ依存性ＩＦＮシグナル伝達の下流にあるＣＸＣＬ９およびＣＸＣＬ１０などのＣＸＣＲ３ケモカインの肺レベルが高いことは、肺移植患者の転帰の悪化と関連している（Ｓｈｉｎｏら、ＰＬＯＳ  Ｏｎｅ，２０１７，１２（７），ｅ０１８０２８１）。全身のＪＡＫ阻害は、腎臓移植拒絶において効果的であることが示された（Ｖｉｃｅｎｔｉら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，２０１２，１２，２４４６−５６）。そのため、ＪＡＫ阻害剤は、肺移植拒絶およびＣＬＡＤを処置または予防するのに効果的である可能性がある。肺移植拒絶の基準として記載されている同様のＴ細胞活性化イベントも、造血幹細胞移植後に生じ得る肺移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の主な促進剤と考えられている。ＣＬＡＤと同様に、肺ＧＶＨＤは、慢性的な進行性の状態であり、結果は極めて悪く、現在承認されている処置はない。サルベージ療法として全身ＪＡＫ阻害剤ルキソリチニブを投与されたステロイド抵抗性の急性または慢性ＧＶＨＤ患者９５名のレトロスペクティブな多施設調査研究により、肺ＧＶＨＤ患者を含む第多数の患者においてルキソリチニブに対する完全または部分的応答が実証された（Ｚｅｉｓｅｒら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ，２０１５，２９，１０，２０６２−６８）。全身性ＪＡＫ阻害は重大な有害イベントおよび小さい治療係数に関連しているので、肺移植拒絶または肺ＧＶＨＤを予防および／または処置するための吸入肺指向性の非全身性ＪＡＫ阻害剤に対する必要性がまだある。
【００８８】
したがって、本発明は、哺乳動物において、上記のさらなる呼吸器の状態を処置する方法をさらに提供し、該方法は、哺乳動物に、本発明の固体形態または薬学的に許容され得る担体と本発明の固体形態とを含む医薬組成物を投与することを含む。
【００８９】
眼疾患
多くの眼疾患は、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路に頼る炎症性サイトカインの上昇と関連していることが示されている。本発明の化合物は４つ全てのＪＡＫ酵素で強力な阻害を示すため、ＪＡＫを通じてシグナルを伝達する多数のサイトカイン（例えばＩＬ−６、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γなど）のシグナル伝達および病原性効果を強力に阻害すること、ならびにその産生がＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路シグナル伝達によって促進されるその他のサイトカイン（例えばＭＣＰ−１およびＩＰ−１０など）の増加を防ぐことが予期される。
【００９０】
特に、化合物１は、サイトカイン上昇の下流効果の阻害を記録するアッセイを含むアッセイ３〜７に記載される細胞アッセイにおいて、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、およびＩＦＮγシグナル伝達の阻害について６．７またはそれ以上のｐＩＣ５０値（２００ｎＭまたはそれ以下のＩＣ５０値）を示した。
【００９１】
アッセイ１２の薬物動態研究は、実施例２の結晶性化合物１の懸濁液の単回硝子体内注射後のウサギの目での持続的曝露、および硝子体組織で観察される濃度より少なくとも３桁低い血漿中濃度を実証した。アッセイ１３および１４は、ラットおよびウサギにおける化合物の薬力学的効果を実証した。
【００９２】
そのため、本発明の固体形態は、以下に限定されるものではないが、ブドウ膜炎、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、ドライアイ病、加齢性黄斑変性、およびアトピー性角結膜炎を含む多数の眼疾患において有用であることが予期される。
【００９３】
特に、ブドウ膜炎（Ｈｏｒａｉ  ａｎｄ  Ｃａｓｐｉ，Ｊ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ，２０１１，３１，７３３−７４４）、糖尿病性網膜症（Ａｂｃｏｕｗｅｒ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１３，Ｓｕｐｐｌ  １，１−１２）、糖尿病性黄斑浮腫（Ｓｏｈｎら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｐｔｈａｍｏｌｏｇｙ，２０１１，１５２，６８６−６９４）、ドライアイ病（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、Ａｒｃｈ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ，２０１２，１３０，９０−１００）、および加齢性黄斑変性（Ｋｎｉｃｋｅｌｂｅｉｎら、Ｉｎｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｃｌｉｎ，２０１５，５５（３），６３−７８）は、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路を介してシグナルを伝達する特定の炎症性サイトカインの上昇を特徴とする。したがって、本発明の固体形態は、関連する眼の炎症を緩和し、疾患の進行を逆転させるか、症状の緩和をもたらすことが可能であり得る。
【００９４】
網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）は、非常に一般的な視覚障害性疾患である。網膜血流の閉塞は、網膜脈管構造の損傷、出血、および組織虚血を導く可能性がある。ＲＶＯの原因は多因子性であるが、血管と炎症の両方のメディエーターが重要であることが示されている（Ｄｅｏｂｈａｋｔａら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，２０１３，ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ４３８４１２）。ＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路を通じてシグナルを伝達するサイトカイン、例えばＩＬ−６およびＩＬ−１３など、ならびにその産生がＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路シグナル伝達によって促進されるその他のサイトカイン、例えばＭＣＰ−１などが、ＲＶＯの患者の眼組織において高いレベルで検出されている（Ｓｈｃｈｕｋｏら、Ｉｎｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，２０１５，６３（１２），９０５−９１１）。したがって、本発明の固体形態は、関連する眼の炎症を緩和し、疾患の進行を逆転させるか、この疾患の症状の緩和をもたらすことが可能であり得る。多くのＲＶＯ患者が光凝固によって処置されているが、これは本質的に破壊的な治療法である。抗ＶＥＧＦ剤も使用されているが、それらは一部の患者にしか効果的ではない。目の炎症レベルを低下させるステロイド投薬（トリアムシノロンアセトニドおよびデキサメタゾンインプラント）も特定の型のＲＶＯの患者に有益な結果をもたらすことが示されているが、それらが白内障および眼圧上昇／緑内障を引き起こすことも示されている。
【００９５】
そのため、一態様では、本発明は、哺乳動物において眼疾患を処置する方法を提供し、該方法は、本発明の固体形態を哺乳動物の目に投与することを含む。一態様では、眼疾患は、ブドウ膜炎、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、ドライアイ病、加齢性黄斑変性、またはアトピー性角結膜炎である。一態様では、眼疾患は網膜静脈閉塞症である。
【実施例】
【００９６】
以下の合成および生物学的実施例は、本発明を説明するために提供され、決して本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。下の実施例において、以下の略語は、特に明記しない限り以下の意味を有する。以下に定義されていない略語は、一般に受け入れられている意味を有する。
ＡＣＮ＝アセトニトリル
ＣＰＭＥ＝シクロペンチルメチルエーテル
ＤＣＭ＝ジクロロメタン
ＤＩＰＥＡ＝Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＡｃ＝ジメチルアセトアミド
ＤＭＦ＝Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＥｔＯＡｃ＝酢酸エチル
ｈ＝時間
ＩＰＡｃ＝イソプロピルアセテート
ＫＯＡｃ＝酢酸カリウム
ＭｅＯＨ＝メタノール
ＭｅＴＨＦ＝２−メチルテトラヒドロフラン
ｍｉｎ＝分
ＭＴＢＥ＝ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル
ＮＭＰ＝Ｎ−メチル−２−ピロリドン
Ｐｄ（ａｍｐｈｏｓ）２Ｃｌ２＝ビス（ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（４−ジメチルアミノフェニル）−ホスフィン）ジクロロパラジウム（ＩＩ）
Ｐｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２＝ジクロロ（１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）−フェロセン）ジパラジウム（ＩＩ）
Ｐｄ（ＰＰｈ３）４＝テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）
Ｐｄ（ｔ−Ｂｕ３Ｐ）２＝ビス（トリ−ｔｅｒｔ−ブチルホスフィン）パラジウム（０）
ＲＴ＝室温
ＴＥＡ＝トリエチルアミン
ＴＦＡ＝トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ＝テトラヒドロフラン
ビス（ピナコラート）ジボロン＝４，４，５，５，４’，４’，５’，５’−オクタメチル−［２，２’］ビ［［１，３，２］ジオキサボロラニル］
【００９７】
試薬および溶媒は商業的供給業者（アルドリッチ、Ｆｌｕｋａ、シグマ等）から購入し、さらなる精製を行わずに使用した。反応混合物の進行は、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、分析用高速液体クロマトグラフィー（ａｎａｌ．ＨＰＬＣ）、および質量分析によってモニターした。  各反応において具体的に記載されているように、反応混合物を後処理した。一般に、それらは抽出、ならびにその他の精製方法、例えば温度依存性結晶化、溶媒依存性結晶化、および沈殿などによって精製された。さらに、反応混合物は、通常はＣ１８またはＢＤＳカラムパッキングと従来の溶出剤を使用して、カラムクロマトグラフィーによるか、または分取ＨＰＬＣによって常套的に精製された。典型的な分取ＨＰＬＣ条件が下に記載される。
【００９８】
反応生成物の特性決定は、質量分析および１Ｈ−ＮＭＲ分光分析によって常套的に実行された。ＮＭＲ分析のために、試料を重水素化溶媒（例えばＣＤ３ＯＤ、ＣＤＣｌ３、またはｄ６−ＤＭＳＯなど）に溶解させ、標準的な観察条件下、Ｖａｒｉａｎ  Ｇｅｍｉｎｉ  ２０００装置（４００ＭＨｚ）で１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを取得した。化合物の質量分析同定は、自動精製システムを組み合わせた、アプライドバイオシステムズ（カリフォルニア州フォスターシティ）モデルＡＰＩ  １５０  ＥＸ装置またはウォーターズ（マサチューセッツ州ミルフォード）３１００装置を用いるエレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＭＳ）によって実行した。
分取ＨＰＬＣ条件
カラム    ：Ｃ１８、５μｍ。２１．２×１５０ｍｍまたはＣ１８、５μｍ  ２１×２５０
またはＣ１４、５μｍ  ２１×１５０ｍｍ
カラム温度：室温
流量      ：２０．０ｍＬ／分
移動相    ：Ａ＝水＋０．０５％  ＴＦＡ
Ｂ＝ＡＣＮ＋０．０５％  ＴＦＡ、
注入量    ：（１００〜１５００μＬ）
検出器波長：２１４ｎｍ
【００９９】
粗化合物を、１：１  水：酢酸に約５０ｍｇ／ｍＬで溶解させた。２．１×５０ｍｍのＣ１８カラムを使用して４分の分析規模試験を実行し、それに続いて、実施した分析規模試験のＢ保持％に基づく勾配で１００μＬの注入を用いて１５または２０分の分取規模を実行した。正確な勾配は試料に依存した。最適な分離のために、近接して流れる不純物を含む試料を２１×２５０ｍｍ  Ｃ１８カラムおよび／または２１×１５０ｍｍ  Ｃ１４カラムでチェックした。目的生成物を含有する画分を質量分析によって特定した。
分析ＨＰＬＣ条件
方法Ａ
カラム：アジレント・Ｚｏｒｂａｘ  Ｂｏｎｕｓ−ＲＰ  Ｃ１８、１５０×４．６０ｎｍ、３．５ミクロン
カラム温度：４０℃
流量      ：１．５ｍＬ／分
注入量    ：５μＬ
試料の調製：１：１  ＡＣＮ：１Ｍ  ＨＣｌに溶解
移動相    ：Ａ＝水：ＴＦＡ（９９．９５：０．０５）
Ｂ＝ＡＣＮ：ＴＦＡ（９９．９５：０．０５）
検出器波長：２５４ｎｍおよび２１４ｎｍ
勾配      ：合計２６分（時間（分）／％Ｂ）：０／５、１８／９０、２２／９０、２２．５／９０、２６／５
方法Ｂ
カラム：アジレントＰｏｒｏｓｈｅｌｌ  １２０  Ｂｏｎｕｓ−ＲＰ、４．６×１５０ｍｍ、２．７μｍ
カラム温度：３０℃
流量      ：１．５ｍＬ／分
注入量    ：１０μＬ
移動相    ：Ａ＝ＡＣＮ：水：ＴＦＡ（２：９８：０．１）
Ｂ＝ＡＣＮ：水：ＴＦＡ（９０：１０：０．１）
試料の調製：移動相Ｂに溶解
検出器波長：２５４ｎｍおよび２１４ｎｍ
勾配      ：合計６０分（時間（分）／％Ｂ）：０／０、５０／１００、５５／１００、５５．１／０、６０／０
方法Ｃ
カラム    ：アジレントＰｏｒｏｓｈｅｌｌ  １２０  Ｂｏｎｕｓ−ＲＰ、４．６×１５０ｍｍ、２．７μｍ
カラム温度：３０℃
流量      ：１．５ｍＬ／分
注入量    ：１０μＬ
移動相    ：Ａ＝ＡＣＮ：水：ＴＦＡ（２：９８：０．１）
Ｂ＝ＡＣＮ：水：ＴＦＡ（９０：１０：０．１）
試料の調製：移動相Ｂ（０．１５ｍＬ）に溶解させた後、移動相Ａ（０．８５ｍＬ）で希釈
検出器波長：２４５ｎｍ
勾配      ：合計４６分（時間（分）／％Ｂ）：０／０、２５／５０、３５／１００，４０／１００、４０．１／０、４６／０
【０１００】
調製１：１−ベンジル−４−イミノ−１，４−ジヒドロピリジン−３−アミン
【化３】
2020518582.tif 000005
【０１０１】
ピリジン−３，４−ジアミン（４４５ｇ、４．０７８ｍｏｌ）とＡＣＮ（１１．０Ｌ）の混合物を、２５℃から１５℃まで８０分間撹拌した。臭化ベンジル（４８５ｍＬ、４．０７８ｍｏｌ）を２０分にわたり添加し、反応混合物を２０℃で一晩撹拌した。反応混合物を１０℃に冷却し、濾過した。反応器にＡＣＮ（３Ｌ）を添加し、これを１０℃に冷却した。ケーキを反応器のすすぎ液で洗浄し、２５℃に温めたＡＣＮ（３Ｌ）で再び洗浄した。固体をフィルター上で、窒素下で２４時間、真空下５５℃で２時間、次に室温で一晩および４日間乾燥させて、表題化合物のＨＢｒ塩を得た（１１０２．２ｇ、３．９３４ｍｏｌ、収率９６％）。ＨＰＬＣ方法Ａ保持時間４．１２分。
【０１０２】
調製２：５−ベンジル−２−（６−ブロモ−１Ｈ−インダゾール−３−イル）−５Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン
【化４】
2020518582.tif 000006
（ａ）５−ベンジル−２−（６−ブロモ−１Ｈ−インダゾール−３−イル）−５Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン
【０１０３】
６−ブロモ−１Ｈ−インダゾール−３−カルバルデヒド（５５０ｇ、２．４４４ｍｏｌ）、１−ベンジル−４−イミノ−１，４−ジヒドロピリジン−３−アミンＨＢｒ（７２１ｇ、２．３３３ｍｏｌ）およびＤＭＡｃ（２．６５Ｌ）の溶液を６０分間撹拌し、重亜硫酸ナトリウム（２５７ｇ、２．４６８ｍｏｌ）  を添加した。反応混合物を１３５℃に加熱し、３時間保持し、２０℃まで冷却させて２０℃で一晩保持した。アセトニトリル（８Ｌ）を添加し、反応混合物を１５℃で４時間撹拌した。スラリーを圧力フィルターで中程度の濾過速度で濾過した。反応器にＡＣＮを添加した（１Ｌ）ケーキをＡＣＮ反応器の洗液で洗浄し、窒素下で一晩、次に真空下５０℃で２４時間乾燥させて、表題化合物のＨＢｒ塩（１２６４ｇ、２．４４４ｍｏｌ、収率１００％、純度９４％）を、高密度の湿ったベージュ色／茶色の固体として得た。ＨＰＬＣ方法Ａ保持時間８．７７分。
【０１０４】
前のステップの生成物（１２６４ｇ、２．４４４ｍｏｌ）、ＭｅＴＨＦ（６Ｌ）および水（２．７５Ｌ）の混合物を６５℃に加熱し、５０重量％の水酸化ナトリウム（２５４ｇ、３．１７７ｍｏｌ）を５分にわたって添加し、反応混合物を６５℃で１時間撹拌し、室温に冷却し、次に５℃冷却して２時間保持した。スラリーを濾過し、反応器およびケーキをＭｅＴＨＦ（１Ｌ）で洗浄した。得られたベージュ色から黄色の固体をフィルター上で窒素下３日間乾燥させて、表題化合物（４７５ｇ、１．１７５ｍｍｏｌ、収率４８％）をベージュ色／黄色の固体として得た。母液（約８Ｌ）を約２Ｌに濃縮するとすぐ、固体が砕け始めた。スラリーを５０℃に加熱し、２時間保持し、２時間にわたって５℃に冷却し、一晩撹拌し、濾過した。ケーキをＭｅＴＨＦ（１００ｍＬ）で洗浄し、真空下４０℃で一晩乾燥させて、さらなる表題化合物を得た（１４０ｇ、０．３４６ｍｏｌ、収率１４％）。
【０１０５】
同じ規模の第２のバッチの生成物と組み合わせた前のステップの総生成物（１５００ｇ、３．７１０ｍｏｌ）とＭｅＴＨＦ（４Ｌ）の混合物を２０℃で２時間撹拌し、濾過した。反応器およびケーキをＭｅＴＨＦ（１．５Ｌ）で洗浄した。得られたベージュ色から黄色の固体を窒素下３日間乾燥させて、表題化合物をベージュイエローの固体として得た（１３２５ｇ、３．１８４ｍｏｌ、収率８６％（全体で収率６８％）、純度９７％）。ＨＰＬＣ方法Ａ保持時間８．７７分
【０１０６】
調製３：５−ベンジル−２−（６−ブロモ−１Ｈ−インダゾール−３−イル）−４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン
【化５】
2020518582.tif 000007
【０１０７】
１５Ｌフラスコに、５−ベンジル−２−（６−ブロモ−１Ｈ−インダゾール−３−イル）−５Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン（４４０ｇ、１．０８８ｍｏｌ）、続いてＭｅＴＨＦ（４．５Ｌ）、メタノール（２．２５Ｌ）および水（１．１２５Ｌ）を添加した。スラリーを２０℃に冷却し、１時間撹拌し、ＮａＢＨ４（２４７ｇ、６．５３０ｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２５℃で１８時間撹拌した。水（１．１２５Ｌ）と、それに続いて２０重量％の塩化ナトリウム溶液（１．１２５Ｌ）を添加し、混合物を３０分間撹拌し、層を分離させた。水層を排出した。ＮａＯＨ（５２２ｇ）と水（５Ｌ）の予備混合溶液を添加し、反応混合物を６０分間撹拌した；層を分離させ、水層を排出した。同じ規模の２つの追加のバッチを調製した。
【０１０８】
１つのバッチから有機層を、ジャケットを５０℃、内部温度を２０℃に設定した１５Ｌジャケット付き反応器内で減圧下で濃縮した。追加のバッチを反応器に添加し、一度に１つ濃縮して、体積が約６Ｌのスラリーを得た。スラリーを５０℃に加熱し、ＩＰＡｃ（６Ｌ）を添加し、混合物を６０℃で１．５時間保持し、２０℃に１０時間冷却し、６０℃に５０時間加熱し、５時間で２０℃に冷却し、次に５℃に冷却し、３時間保持した。混合物を濾過し、反応器およびケーキをＩＰＡｃ（１Ｌ）とＭｅＴＨＦ（１Ｌ）の予備混合溶液で洗浄し、５℃に予備冷却した。固体をフィルター上で窒素下４０℃で３日間乾燥させて、表題化合物（１０５９ｇ、２．５８９ｍｏｌ、収率７９％）を灰白色固体として得た。この材料を５０〜６０℃の真空炉内で８時間および２７℃で２日間さらに乾燥させて、表題化合物を得た（１０４３ｇ、２．５２６ｍｏｌ、収率７７％、純度９９％）。ＨＰＬＣ方法Ａ保持時間６．７３分
【０１０９】
調製４：（４−（ベンジルオキシ）−２−エチル−５−フルオロフェニル）トリフルオロボレート、カリウム
【化６】
2020518582.tif 000008
【０１１０】
（ａ）２−（４−（ベンジルオキシ）−２−エチル−５−フルオロフェニル）−４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン
１−（ベンジルオキシ）−４−ブロモ−５−エチル−２−フルオロベンゼン（５２０ｇ、１６８２ｍｍｏｌ）とジオキサン（５１９３ｍＬ）の混合物を窒素でパージし、次にビス（ピナコラート）ジボロン（６４１ｇ、２５２３ｍｍｏｌ）を添加し、続いて酢酸カリウム（４９５ｇ、５０４６ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を窒素でパージし；Ｐｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２（４１．２ｇ、５０．５ｍｍｏｌ）を添加し；反応混合物を窒素でパージし、窒素下１０３℃で５時間加熱し；室温に冷却した。反応混合物を減圧蒸留により濃縮し、酢酸エチル（５２０４ｍＬ）と水（５２１２ｍＬ）とに分液した。反応混合物をセライトで濾過し；有機層をブライン（２６０６ｍＬ）で洗浄し、続いて減圧蒸留により溶媒を除去して粗生成物を濃厚な黒色の油として得た（約８００ｇ）。
【０１１１】
粗生成物をＤＣＭ（１２８９ｍＬ）に溶解させ、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製した（ヘキサン中に予備スラリー化した（ｐｒｅｓｌｕｒｒｉｅｄ）シリカ２６２７ｇ、ヘキサン中２０％酢酸エチルで溶出（１０．３５Ｌ））。溶媒を減圧蒸留によって除去して、淡黄色の油を得た（６００ｇ）。ＨＰＬＣ方法Ｂ保持時間３３．７４分。
【０１１２】
（ｂ）（４−（ベンジルオキシ）−２−エチル−５−フルオロフェニル）トリフルオロボレート、カリウム
前のステップの生成物（２００ｇ、５６１ｍｍｏｌ）をアセトン（１０１１ｍＬ）と完全に溶解するまで混合し、メタノール（９９９ｍＬ）を添加し、水（１３１０ｍＬ）に溶解させた３Ｍ二フッ化水素カリウム（３０７ｇ、３９３０ｍｍｏｌ）を続いて添加した。反応混合物を３．５時間撹拌した。有機溶媒の大部分を減圧蒸留によって除去した。水（７５９ｍＬ）を添加し、得られる濃厚なスラリーを３０分間撹拌し、濾過した。ケーキを水（５０６ｍＬ）で洗浄し、固体をフィルター上で３０分間乾燥させた。固体をアセトン（１２３７ｍＬ）中でスラリー化し、１時間撹拌した。  得られるスラリーを濾過し、固体をアセトン（２４７ｍＬ）で洗浄した。アセトン溶液を減圧蒸留によって濃縮し、すべてのアセトンおよび水が蒸留されるまで、トルエン（２９８３ｍＬ）をゆっくりと添加することにより、一定体積（２Ｌ）を維持した。トルエン溶液を回転蒸発により濃厚な黄色スラリーに蒸留し、その間に生成物が白色固体として沈殿した。トルエンの追加部分（４７７ｍＬ）を混合物に添加し、１時間撹拌した。次に、混合物を濾過し、トルエン（１７９ｍＬ）ですすぎ、真空下５０℃で２４時間乾燥させて表題化合物（１０４ｇ、３１０ｍｍｏｌ、収率５５％）を流動性のある、ふわふわした、わずかに灰白色の固体として得た。ＨＰＬＣ方法Ｂ保持時間２７．７１分。
【０１１３】
調製５：５−ベンジル−２−（６−（４−（ベンジルオキシ）−２−エチル−５−フルオロフェニル）−１Ｈ−インダゾール−３−イル）−４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン
【化７】
2020518582.tif 000009
【０１１４】
（ａ）５−ベンジル−２−（６−（４−（ベンジルオキシ）−２−エチル−５−フルオロフェニル）−１Ｈ−インダゾール−３−イル）−４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン
ビス（ピナコラート）ジボロン（２５０ｇ、９８４ｍｍｏｌ）とＩＰＡ（１．８８Ｌ）の混合物を撹拌して溶解させ、次に二フッ化水素カリウム（５３８ｇ、６．８９１ｍｏｌ）の水溶液（２．３１Ｌ）を少量ずつ１０分にわたり添加した。反応混合物を１時間撹拌し、濾過した。ゲル状の固体を、混合物が透明なヒドロゲルを形成するまで水（１．３３Ｌ）でスラリー化し、次にさらに４５分間行った。得られる固体／ゲルを濾過し、次にアセトン（１．０８Ｌ）で再びスラリー化し、濾過し、フィルター上で３０分間風乾させ、一晩乾燥させてふわふわした白色の固体を得た（１９６．７ｇ）。
【０１１５】
５Ｌフラスコに、５−ベンジル−２−（６−ブロモ−１Ｈ−インダゾール−３−イル）−４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン（１３５ｇ、３３１ｍｍｏｌ）、（４−（ベンジルオキシ）−２−エチル−５−フルオロフェニル）−トリフルオロボレート、カリウム（１３３ｇ、３９７ｍｍｏｌ）、および前のステップの白色固体生成物（４０．５ｇ）を添加し、続いてＭｅＴＨＦ（１．２３Ｌ）およびＭｅＯＨ（１．７５Ｌ）を添加した。得られるスラリーを窒素で３回脱気した。このスラリーに、脱気した炭酸セシウム（４３１ｇ、１．３２３ｍｏｌ）の水（１．３５Ｌ）中溶液を添加した。スラリーを２回脱気し、Ｐｄ（ａｍｐｈｏｓ）２Ｃｌ２（１１．７１ｇ、１６．５３ｍｍｏｌ）を添加し、スラリーを再び２回脱気し、反応混合物を６７℃で一晩撹拌し、２０℃に冷却した。層を分離し、ＭｅＴＨＦ（５５０ｍＬ）で逆抽出した。有機層を合し、回転蒸発によって固体が沈殿するまで濃縮した。ＭｅＴＨＦ（７００ｍＬ）を添加し、反応混合物を６５℃で撹拌した。層を分離し、水相をＭｅＴＨＦ（１３５ｍＬ）で逆抽出した。有機相を合し、約３００ｍＬに濃縮し、濃厚な橙色のスラリーを得た。このスラリーに、ＭｅＯＨ（２７０ｍＬ）を添加し、続いて１Ｍ  ＨＣｌ（１．３２５Ｌ）を２０℃で急速に撹拌しながら添加した。反応混合物を５分間撹拌し、水（１Ｌ）を添加し、得られるスラリーを１時間撹拌した。固体を濾過し、水（１５０ｍＬ）で洗浄し、フィルター上で１０分間および窒素下４５℃で１６時間乾燥させて、表題化合物の２ＨＣｌ塩（２２１．１ｇ、３５１ｍｍｏｌ、純度９２．２％）を淡黄色の固体として得た。  ＨＰＬＣ方法Ｂ保持時間２３．４１分。
【０１１６】
調製６：５−エチル−２−フルオロ−４−（３−（４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イル）フェノール
【化８】
2020518582.tif 000010
【０１１７】
１Ｌフラスコに、エタノール（３４８ｍＬ）中のスラリーとしての５−ベンジル−２−（６−（４−（ベンジルオキシ）−２−エチル−５−フルオロフェニル）−１Ｈ−インダゾール−３−イル）−４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン、２ＨＣｌ（４０ｇ、６３．４ｍｍｏｌ）と、ＭｅＯＨ（１０１ｍＬ）および水（１７．１４ｍＬ）中１．２５Ｍ  ＨＣｌを添加した。反応混合物を窒素で５分間脱気し、１０重量％のＰｄ／Ｃ、５０重量％のＨ２Ｏ（４．０５ｇ、１．９０３ｍｍｏｌ）を添加した。反応器を密閉し、Ｈ２でパージし、１〜２ｐｓｉに加圧し、５０℃に加温し、反応混合物を一晩撹拌し、セライトで濾過した。反応器およびフィルターをメタノール（１００ｍＬ）で洗浄した。
【０１１８】
濾過溶液を９８ｍｍｏｌスケールの第２のバッチの生成物と合し、３９０ｇに濃縮した。ＥｔＯＡｃ（２．０４Ｌ）を撹拌しながらゆっくり添加し、次に溶液を撹拌しながら５℃に冷却した。固体を濾過し、ＥｔＯＡｃ（５１０ｍＬ）で洗浄し、窒素下４５℃で一晩乾燥させて、表題化合物の２ＨＣｌ塩（５８ｇ、収率８０％）を灰白色固体として得た。ＨＰＬＣ方法Ｂ保持時間１２．８３分。
【０１１９】
実施例１：５−エチル−２−フルオロ−４−（３−（５−（１−メチルピペリジン−４−イル）−４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イル）フェノール水和物
【化９】
2020518582.tif 000011
【０１２０】
１２５ｍＬフラスコに、ＮＭＰ（１９．２３ｍＬ）および５−エチル−２−フルオロ−４−（３−（４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イル）フェノール、２ＨＣｌ（６ｇ、１３．３２ｍｍｏｌ）を撹拌しながら添加し、続いてＮＭＰ（１９．２３ｍＬ）を添加した。酢酸（２．５２ｍＬ）を添加し、次に１−メチルピペリジン−４−オン（３．２８ｍＬ、２６．６ｍｍｏｌ）を一度に添加し、反応混合物を２５℃で３０分間撹拌し、１５℃に冷却した。トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（７．９１ｇ、３７．３ｍｍｏｌ）を添加し、２０分後に外部ジャケットを２０℃に設定した。３．５時間後、総溶液量は３５ｍＬであった。反応器をメタノール（５ｍＬ）で洗浄した。温度を５℃未満に維持しながら、溶液の半量（１７．５ｍＬ）と、それに続いてメタノール洗液の半量（２．５ｍＬ）を、メタノール（２８ｍＬ）、水酸化アンモニウム（１７ｍＬ、２７０ｍｍｏｌ）および水（９ｍＬ）の予備混合溶液に添加した。１０分後に固体が沈殿した。スラリーを３０分間撹拌し、ＡＣＮ（６０ｍＬ）を３０分にわたりゆっくりと添加し、スラリーを０℃で２時間撹拌し、濾過し、ＡＣＮですすいだ。固体を５０℃で１２時間乾燥させて、表題化合物（２．９５ｇ、収率９３．２％、（含水量を補正した収率８５．２％））を灰白色固体として得た。ＨＰＬＣ方法Ｃ保持時間１２．１１分。
【０１２１】
実施例２：５−エチル−２−フルオロ−４−（３−（５−（１−メチルピペリジン−４−イル）−４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イル）フェノールの結晶性水和物
【０１２２】
実施例Ａで調製した５−エチル−２−フルオロ−４−（３−（５−（１−メチルピペリジン−４−イル）−４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イル）フェノール（１０ｇ、２１．０７ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ（１９．９９ｍＬ）中溶液に、エタノール（１９．９３ｍＬ）を添加した。溶解しなかった固体を濾過によって除去し、ＤＭＳＯ溶液の半量をメタノール（３０ｍＬ）中２０％水の撹拌溶液に添加した。スラリーは１０分後に生じ、これを室温で４時間撹拌し、濾過した。得られる黄色の固体を窒素下５０℃で３時間乾燥させた。固体をアセトン中２０％水（１１０ｍＬ）に４５℃で撹拌しながら３５時間スラリー化し、濾過し、アセトン中１５％水で洗浄し、一晩乾燥させて、表題化合物（４．４０ｇ、収率８８％）を淡黄色の固体として得た。
【０１２３】
実施例３：５−エチル−２−フルオロ−４−（３−（５−（１−メチルピペリジン−４−イル）−４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イル）フェノールの結晶性シュウ酸塩水和物
【０１２４】
２０ｍＬガラスバイアル中で、実施例２の生成物である化合物１の結晶性水和物（２４８．５ｍｇ）、およびシュウ酸無水物（４８．０ｍｇ）を、１：１テトラヒドロフラン：水（５ｍＬ）に溶解させた。アセトニトリル（５ｍＬ）を添加して懸濁液を生成した。得られる反応混合物を１日間室温で撹拌し、濾過し、アセトニトリル（２ｍＬ）で洗浄し、周囲条件下で一晩乾燥させて、表題化合物を得た。
【０１２５】
実施例４：５−エチル−２−フルオロ−４−（３−（５−（１−メチルピペリジン−４−イル）−４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イル）フェノールの結晶性コハク酸塩水和物
【０１２６】
４ｍＬガラスバイアル中で、化合物１の結晶性水和物（４０ｍｇ）およびコハク酸（１０ｍｇ）をイソプロパノール（１ｍＬ）中に懸濁させた。反応混合物懸濁液を７日間室温で撹拌した。固体を濾過し、イソプロパノール（０．５ｍＬ）で洗浄し、周囲条件下で一晩乾燥させて、結晶性コハク酸塩溶媒和物を得た。単離したコハク酸塩溶媒和物固体を１５０℃で３０分間真空炉で乾燥させて、第２の固体形態を得、これを８０％〜９０％の相対湿度で１日間室温で平衡化させて、表題化合物を得た。
【０１２７】
実施例５〜７：本発明の固体形態の特性
実施例３の５−エチル−２−フルオロ−４−（３−（５−（１−メチルピペリジン−４−イル）−４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イル）フェノールのシュウ酸塩の結晶性水和物および実施例４の５−エチル−２−フルオロ−４−（３−（５−（１−メチルピペリジン−４−イル）−４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イル）フェノールのコハク酸塩の結晶性水和物の試料を、粉末Ｘ線回折（ＰＸＲＤ）、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、熱重量分析（ＴＧＡ）、および動的水分吸着（ＤＭＳ）によって分析した。
【０１２８】
実施例５  粉末Ｘ線回折
図１の粉末Ｘ線回折パターンは、４５ｋＶの出力電圧および４０ｍＡの電流でＣｕ−Ｋα放射線（λ＝１．５４０５１Å）を使用するＢｒｕｋｅｒ  Ｄ８−ＡｄｖａｎｃｅＸ線回折計で得られた。  この装置は、試料で強度を最大化するように設定された入射、発散、および散乱スリットを備えるＢｒａｇｇ−Ｂｒｅｎｔａｎｏ配置で動作した。測定のために、少量の粉末（５〜２５ｍｇ）を試料ホルダーに静かに押し付けて滑らかな表面を形成させ、Ｘ線照射にさらした。試料は、０．０２°のステップサイズおよび１ステップあたり０．３０°秒の走査速度で２θで２°から４０°まで２θ−２θモードで走査された。データの取得はＢｒｕｋｅｒ  ＤｉｆｆｒａｃＳｕｉｔｅ測定ソフトウェアによって制御され、Ｊａｄｅソフトウェア（バージョン７．５．１）によって分析された。装置は、コランダム標準を用いて、±０．０２°の２シータ角以内に較正された。本発明の結晶性シュウ酸塩水和物および結晶性コハク酸塩水和物についてそれぞれ観察されたＰＸＲＤ  ２θピーク位置およびｄ間隔を表１および２に示す。
【表１】
2020518582.tif 000012
【０１２９】
【表２−１】
2020518582.tif 000013
【０１３０】
実施例６：熱分析
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を、Ｔｈｅｒｍａｌ  Ａｎａｌｙｓｔコントローラーを備えるＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｍｏｄｅｌ  Ｑ−１００モジュールを使用して実施した。データを収集し、ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを用いて解析した。各結晶形態の試料を、蓋付きのアルミニウムパンに正確に秤量した。５℃で５分の等温平衡期間の後、試料を１０℃／分の線形加熱勾配で０℃から２５０℃に加熱した。本発明の結晶性シュウ酸塩水和物および結晶性コハク酸塩水和物の代表的なＤＳＣサーモグラムを、それぞれ図２および６に示す。
【０１３１】
熱重量分析（ＴＧＡ）測定は、高分解能を備えるＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｍｏｄｅｌ  Ｑ−５０モジュールを使用して実施した。ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ａｎａｌｙｓｔコントローラーを使用してデータを収集し、ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを用いて解析した。秤量した試料を白金パンの上に載せ、周囲温度から３００℃まで１０℃の加熱速度で走査した。使用中、天秤および炉室に窒素流をパージした。本発明の結晶性シュウ酸塩水和物および結晶性コハク酸塩水和物の代表的なＴＧＡトレースを、それぞれ図３および７に示す。
実施例７：動的水分吸着の評価
【０１３２】
動的水分吸着（ＤＭＳ）測定を、ＶＴＩ大気微量天秤、ＳＧＡ−１００システム（ＶＴＩ  Ｃｏｒｐ．，Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ  ３３０１６）を使用して実施した。秤量した試料を使用し、解析の開始時の湿度は、可能な限り最低の値（０％ＲＨに近い値）であった。ＤＭＳ解析は、１２０分間の最初の乾燥ステップ（約０％ＲＨ）と、それに続く２サイクルの吸着および脱着からなり、走査速度は５％ＲＨ〜９０％ＲＨの湿度範囲で５％ＲＨ／ステップであった。ＤＭＳの実行は、２５℃で等温的に実施した。本発明の結晶性シュウ酸塩水和物および結晶性コハク酸塩水和物の代表的なＤＭＳトレースを、それぞれ図４および８に示す。
生物学的アッセイ
【０１３３】
５−エチル−２−フルオロ−４−（３−（５−（１−メチルピペリジン−４−イル）−４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イル）フェノール（化合物１）は、以下の生物学的アッセイにおいて特徴付けられている。
【０１３４】
アッセイ１：生化学的ＪＡＫキナーゼアッセイ
４つのＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎＪＡＫ生化学的アッセイのパネル（ＪＡＫ１、２、３およびＴｙｋ２）は、一般的なキナーゼ反応緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５、０．０１％Ｂｒｉｊ−３５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１ｍＭ  ＥＧＴＡ）に含められた。組換えＧＳＴタグ付きＪＡＫ酵素およびＧＦＰタグ付きＳＴＡＴ１ペプチド基質をライフテクノロジーズより入手した。
【０１３５】
段階希釈した化合物を、白色の３８４ウェルマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で４つのＪＡＫ酵素の各々および基質とともに周囲温度で１時間プレインキュベートした。その後、ＡＴＰを添加して１％ＤＭＳＯを含む１０μＬの総体積でキナーゼ反応を開始させた。ＪＡＫ１、２、３およびＴｙｋ２の最終酵素濃度はそれぞれ４．２ｎＭ、０．１ｎＭ、１ｎＭ、および０．２５ｎＭであり；使用した対応するＫｍ  ＡＴＰ濃度は、２５μＭ、３μＭ、１．６μＭ、および１０μＭであり；一方、４つのアッセイすべての基質濃度は２００ｎＭである。キナーゼ反応を周囲温度で１時間進めた後、ＴＲ−ＦＲＥＴ希釈緩衝液（ライフテクノロジーズ）中のＥＤＴＡ（最終濃度１０ｍＭ）およびＴｂ−抗ｐＳＴＡＴ１（ｐＴｙｒ７０１）抗体（ライフテクノロジーズ、最終濃度２ｎＭ）の１０μＬ調製物を添加した。プレートを周囲温度で１時間インキュベートさせた後、ＥｎＶｉｓｉｏｎリーダー（パーキンエルマー）で読み取った。発光比シグナル（５２０ｎｍ／４９５ｎｍ）を記録し、それを用いて、ＤＭＳＯおよびバックグラウンド対照に基づいて阻害パーセントの値を計算した。
【０１３６】
用量反応解析には、阻害パーセントのデータを化合物濃度に対してプロットし、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）による４パラメータのロバストなフィットモデルからＩＣ５０値を決定した。結果をｐＩＣ５０（ＩＣ５０の負の対数）として表し、その後Ｃｈｅｎｇ−Ｐｒｕｓｏｆｆ式を用いてｐＫｉ（解離定数の負の対数、Ｋｉ）に変換した。
【０１３７】
化合物１は、以下の酵素能力を示した。
【表２−２】
2020518582.tif 000014
【０１３８】
アッセイ２：細胞ＪＡＫ効力アッセイ：ＩＬ−１３の阻害
ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ  ＪＡＫＩ細胞効力アッセイを、ＢＥＡＳ−２Ｂヒト肺上皮細胞（ＡＴＣＣ）においてインターロイキン−１３（ＩＬ−１３、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）誘導性のＳＴＡＴ６リン酸化を測定することによって行った。抗ＳＴＡＴ６抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアクセプタービーズ（パーキンエルマー）に結合させ、抗ｐＳＴＡＴ６（ｐＴｙｒ６４１）抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてビオチン化した。
【０１３９】
ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞を、５％ＣＯ２加湿インキュベーターにおいて、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（ライフテクノロジーズ）、および２ｍＭＧｌｕｔａＭＡＸ（ライフテクノロジーズ）を補充した５０％ＤＭＥＭ／５０％Ｆ−１２培地（ライフテクノロジーズ）中、３７℃で増殖させた。アッセイの１日目に、２５μＬの培地を有する白色のポリ−Ｄ−リジンでコーティングした３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に７，５００細胞／ウェルの密度で細胞を播種し、恒温器内で一晩接着させた。アッセイの２日目に、培地を除去し、試験化合物の用量反応物を含有する１２μＬのアッセイ緩衝液（ハンクス平衡塩類溶液／ＨＢＳＳ、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン／ＢＳＡ）と交換した。化合物をＤＭＳＯで段階希釈し、次いで、最終ＤＭＳＯ濃度が０．１％になるようにさらに培地で１０００倍希釈した。細胞を３７℃で１時間試験化合物とともにインキュベートし、続いて、刺激のために、１２μＬの予め温めたＩＬ−１３（アッセイ緩衝液中８０ｎｇ／ｍＬ）を添加した。３７℃で３０分間インキュベートした後、アッセイ緩衝液（化合物およびＩＬ−１３を含有）を除去し、１０μＬの細胞溶解緩衝液（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．１％ＳＤＳ、１％ＮＰ−４０、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．３ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、ならびにＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ製のＣｏｍｐｌｅｔｅ  Ｕｌｔｒａミニプロテアーゼ阻害剤およびＰｈｏｓＳＴＯＰによる補充）。プレートを周囲温度で３０分間振盪した後、検出試薬を添加した。ビオチン−抗ｐＳＴＡＴ６および抗ＳＴＡＴ６結合アクセプタービーズの混合物を最初に添加し、周囲温度で２時間インキュベートし、続いてストレプトアビジン結合ドナービーズ（パーキンエルマー）を添加した。最低２時間のインキュベーションの後、アッセイプレートをＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダーで読み取った。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎルミネセンスシグナルを記録し、それを用いて、ＤＭＳＯおよびバックグラウンド対照に基づいて阻害パーセントの値を計算した。
【０１４０】
用量反応解析には、阻害パーセントのデータを化合物濃度に対してプロットし、Ｐｒｉｓｍソフトウェアによる４パラメータのロバストなフィットモデルからＩＣ５０値を決定した。結果は、ＩＣ５０の負の対数である、ｐＩＣ５０として表してもよい。化合物１はこのアッセイで８．２のｐＩＣ５０値を示した。
【０１４１】
アッセイ３：細胞ＪＡＫ効力アッセイ：ヒトＰＢＭＣにおけるＩＬ−２／抗ＣＤ３刺激ＩＦＮγの阻害
インターロイキン−２（ＩＬ−２）／抗ＣＤ３で刺激したインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）の阻害についての試験化合物の効力を、ヒト全血（Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｎｔｅｒ）から単離したヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）において測定した。ＩＬ−２はＪＡＫを通じてシグナルを伝達するので、このアッセイはＪＡＫの細胞効力の尺度を提供する。
【０１４２】
（１）ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、フィコール密度勾配を用いて健康なドナーのヒト全血から単離した。細胞を、５％ＣＯ２加湿インキュベーターにおいて、１０％熱失活ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、ライフテクノロジーズ）、２ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ（ライフテクノロジーズ）、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ライフテクノロジーズ）および１Ｘ  Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（ライフテクノロジーズ）を補充したＲＰＭＩ（ライフテクノロジーズ）、３７℃で培養した。細胞を２００，０００細胞／ウェルで培地（５０μＬ）に播種し、１時間培養した。化合物をＤＭＳＯで段階希釈し、次に培地でさらに５００倍（最終アッセイ濃度の２倍）に希釈した。試験化合物（１００μＬ／ウェル）を細胞に添加し、３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートし、続いて２４時間予め温めた培地（５０μＬ）にＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；最終濃度１００ｎｇ／ｍＬ）および抗ＣＤ３（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；最終濃度１μｇ／ｍＬ）を添加した。
【０１４３】
（２）サイトカイン刺激後、細胞を５００ｇで５分間遠心分離し、上清を除去し、−８０℃で凍結させた。ＩＬ−２／抗ＣＤ３に応答する試験化合物の阻害効力を決定するために、上清のＩＦＮγ濃度をＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって測定した。ＩＣ５０値は、化合物濃度に対するＩＦＮγの濃度の阻害曲線の解析から決定した。データはｐＩＣ５０（１０を底とする負の対数ＩＣ５０）値として表される。化合物１は、このアッセイで約７．３のｐＩＣ５０値を示した。
【０１４４】
アッセイ４：細胞ＪＡＫ効力アッセイ：ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＩＬ−２刺激ｐＳＴＡＴ５の阻害
インターロイキン−２（ＩＬ−２）／抗ＣＤ３で刺激したＳＴＡＴ５のリン酸化の阻害についての試験化合物の効力を、フローサイトメトリーを用いてヒト全血（Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｎｔｅｒ）から単離したヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のＣＤ４陽性（ＣＤ４＋）Ｔ細胞において測定した。ＩＬ−２はＪＡＫを通じてシグナルを伝達するので、このアッセイはＪＡＫの細胞効力の尺度を提供する。
【０１４５】
ＣＤ４＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ４抗体（Ｃｌｏｎｅ  ＲＰＡ−Ｔ４、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と結合したフィコエリスロビリン（ＰＥ）を使用して特定し、一方、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７結合抗ｐＳＴＡＴ５抗体（ｐＹ６９４、Ｃｌｏｎｅ４７、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してＳＴＡＴ５リン酸化を検出した。
【０１４６】
（１）抗ＣＤ３によるサイトカイン刺激を２４時間の代わりに３０分間実施したことを除いて、アッセイ３の段落（１）のプロトコールに従った。
【０１４７】
（２）サイトカイン刺激の後、細胞を予め温めた固定液（２００μＬ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で３７℃、５％ＣＯ２で１０分間固定し、ＤＰＢＳ緩衝液（１ｍＬ、ライフテクノロジーズ）で２回洗浄し、氷冷Ｐｅｒｍ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩＩ（１０００μＬ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に４℃で３０分間再度懸濁させた。細胞をＤＰＢＳ（ＦＡＣＳ緩衝液）中２％ＦＢＳで２回洗浄し、次に抗ＣＤ４  ＰＥ（１：５０希釈）および抗ＣＤ３  抗ＣＤ３Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７（１：５希釈）を含有するＦＡＣＳ緩衝液（１００μＬ）中に暗所で室温で６０分間再度懸濁させた。インキュベーション後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後に、ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。ＩＬ−２／抗ＣＤ３に応答する試験化合物の阻害効力を決定するために、ｐＳＴＡＴ５の蛍光強度中央値（ＭＦＩ）をＣＤ４＋Ｔ細胞で測定した。ＩＣ５０値は、化合物濃度に対するＭＦＩの阻害曲線の解析から決定した。データはｐＩＣ５０（１０を底とする負の対数ＩＣ５０）値として表される。化合物１は、このアッセイで約７．７のｐＩＣ５０値を示した。
【０１４８】
アッセイ５：細胞ＪＡＫ効力アッセイ：ＣＤ３＋Ｔ細胞におけるＩＬ−４刺激ｐＳＴＡＴ６の阻害
インターロイキン−４（ＩＬ−４）で刺激したＳＴＡＴ６のリン酸化の阻害についての試験化合物の効力を、フローサイトメトリーを用いてヒト全血（Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｎｔｅｒ）から単離したヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のＣＤ３陽性（ＣＤ３＋）Ｔ細胞において測定した。ＩＬ−４はＪＡＫを通じてシグナルを伝達するので、このアッセイはＪＡＫの細胞効力の尺度を提供する。
【０１４９】
ＣＤ３＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３抗体（Ｃｌｏｎｅ  ＵＣＨＴ１、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と結合したフィコエリスロビリン（ＰＥ）を使用して特定し、一方、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７結合抗ｐＳＴＡＴ６抗体（ｐＹ６４１、Ｃｌｏｎｅ１８／Ｐ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してＳＴＡＴ６リン酸化を検出した。
【０１５０】
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、アッセイ３および４と同様に健康なドナーのヒト全血から単離した。細胞を２５０，０００細胞／ウェルで培地（２００μＬ）に播種し、１時間培養し、次に、様々な濃度の試験化合物を含有するアッセイ培地（５０μＬ）（０．１％ウシ血清アルブミン（シグマ）、２ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび１Ｘ  Ｐｅｎｓｔｒｅｐを補充したＲＰＭＩ）中に再度懸濁させた。化合物をＤＭＳＯで段階希釈し、次にアッセイ培地でさらに５００倍（最終アッセイ濃度の２倍）に希釈した。試験化合物（５０μＬ）を細胞とともに３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートし、続いて３０分間予め温めたアッセイ培地にＩＬ−４（５０μＬ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；最終濃度２０ｎｇ／ｍＬ）を添加した。サイトカイン刺激の後、細胞を予め温めた固定液（１００μＬ）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で３７℃、５％ＣＯ２で１０分間固定し、ＦＡＣＳ緩衝液（１ｍＬ）（ＤＰＢＳ中２％ＦＢＳ）で２回洗浄し、氷冷Ｐｅｒｍ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩＩ（１０００μＬ）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に４℃で３０分間再度懸濁させた。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、次に抗ＣＤ３  ＰＥ（１：５０希釈）および抗ｐＳＴＡＴ６  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７（１：５希釈）を含有するＦＡＣＳ緩衝液（１００μＬ）中に暗所で室温で６０分間再度懸濁させた。インキュベーション後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後に、ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。
【０１５１】
ＩＬ−４に応答する試験化合物の阻害効力を決定するために、ｐＳＴＡＴ６の蛍光強度中央値（ＭＦＩ）をＣＤ３＋Ｔ細胞で測定した。ＩＣ５０値は、化合物濃度に対するＭＦＩの阻害曲線の解析から決定した。データはｐＩＣ５０（１０を底とする負の対数ＩＣ５０）として表される。化合物１はこのアッセイで８．１のｐＩＣ５０値を示した。
【０１５２】
アッセイ６：細胞ＪＡＫ効力アッセイ：ＣＤ３＋Ｔ細胞におけるＩＬ−６刺激ｐＳＴＡＴ３の阻害
アッセイ５のプロトコールに類似したプロトコールを使用して、インターロイケン−６（ＩＬ−６）で刺激したＳＴＡＴ３のリン酸化の阻害についての試験化合物の効力を決定した。抗ｐＳＴＡＴ３抗体（ｐＹ７０５、Ｃｌｏｎｅ４／Ｐ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と結合したＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７を使用してＳＴＡＴ３リン酸化を検出した。
【０１５３】
化合物１はこのアッセイで７．４のｐＩＣ５０値を示した。
【０１５４】
アッセイ７：細胞ＪＡＫ効力アッセイ：ＩＦＮγ誘導性ｐＳＴＡＴ１の阻害
インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）で刺激したＳＴＡＴ１のリン酸化の阻害についての試験化合物の効力を、フローサイトメトリーを用いてヒト全血（Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｎｔｅｒ）から単離したＣＤ１４陽性（ＣＤ１４＋）単球において測定した。ＩＦＮγはＪＡＫを通じてシグナルを伝達するので、このアッセイはＪＡＫの細胞効力の尺度を提供する。
【０１５５】
単球を、抗ＣＤ１４抗体（Ｃｌｏｎｅ  ＲＭ０５２、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）と結合したフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を使用して特定し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７結合抗ｐＳＴＡＴ１抗体（ｐＹ７０１、Ｃｌｏｎｅ４ａ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してＳＴＡＴ１リン酸化を検出した。
【０１５６】
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、フィコール密度勾配を用いて健康なドナーのヒト全血から単離した。細胞を、５％ＣＯ２加湿インキュベーターにおいて、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、ライフテクノロジーズ）、２ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ（ライフテクノロジーズ）、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ライフテクノロジーズ）および１Ｘ  Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（ライフテクノロジーズ）を補充したＲＰＭＩ（ライフテクノロジーズ）、３７℃で培養した。細胞を２５０，０００細胞／ウェルで培地（２００μＬ）に播種し、２時間培養し、様々な濃度の試験化合物を含有するアッセイ培地（５０μＬ）（０．１％ウシ血清アルブミン（シグマ）、２ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび１Ｘ  Ｐｅｎｓｔｒｅｐを補充したＲＰＭＩ）中に再度懸濁させた。化合物をＤＭＳＯで段階希釈し、次いで、最終ＤＭＳＯ濃度が０．１％になるようにさらに培地で１０００倍希釈した。試験化合物の希釈液を細胞とともに３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートし、続いて最終濃度０．６ｎｇ／ｍＬでアッセイ培地（５０μＬ）に３０分間予め温めたＩＦＮγ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加した。サイトカイン刺激の後、細胞を予め温めた固定液（１００μＬ）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で３７℃、５％ＣＯ２で１０分間固定し、ＦＡＣＳ緩衝液（１ｍＬ）（ＰＢＳ中１％ＢＳＡ）で２回洗浄し、１：１０  抗ＣＤ１４  ＦＩＴＣ：ＦＡＣＳ緩衝液（１００μＬ）中に再度懸濁させ、４℃で１５分間インキュベートした。細胞を１回洗浄し、次に氷冷Ｐｅｒｍ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（１００μＬ）中に４℃で３０分間再度懸濁させた。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、次に１：１０  抗ｐＳＴＡＴ１  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７：ＦＡＣＳ緩衝液（１００μＬ）中に暗所で室温で３０分間再度懸濁させ、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。
【０１５７】
試験化合物の阻害効力を決定するために、ｐＳＴＡＴ１の蛍光強度中央値（ＭＦＩ）をＣＤ１４＋単球で測定した。ＩＣ５０値は、化合物濃度に対するＭＦＩの阻害曲線の解析から決定した。データはｐＩＣ５０（１０を底とする負の対数ＩＣ５０）値として表される。化合物１は、このアッセイで約７．５のｐＩＣ５０値を示した。
【０１５８】
アッセイ８：マウスの血漿および肺における薬物動態
試験化合物の血漿および肺レベルならびにその比率は、以下の方法で決定された。チャールズ・リバー・ラボラトリーズから入手したＢＡＬＢ／ｃマウスをアッセイに使用した。試験化合物を、０．２ｍｇ／ｍＬの濃度でｐＨ４クエン酸緩衝液中の２０％プロピレングリコールに個別に配合し、５０ｕＬの投与溶液を経口吸引によりマウスの気管に導入した。投与後の様々な時点（一般に０．１６７、２、６、２４時間）に、血液試料を心臓穿刺により取り出し、無傷の肺をマウスから切除した。血液試料を４℃にて約１２，０００ｒｐｍで４分間遠心分離（エッペンドルフ遠心分離機、５８０４Ｒ）して血漿を収集した。肺をパッドで乾燥させ、秤量し、滅菌水に１：３に希釈してホモジナイズした。試験化合物の血漿および肺のレベルは、試験マトリックスの標準曲線に構築された分析標準に対するＬＣ−ＭＳ解析によって決定された。肺対血漿比は、肺ＡＵＣ（μｇｈｒ／ｇ）と血漿ＡＵＣ（μｇｈｒ／ｍＬ）の比として決定された。このＡＵＣは、慣習的に時間に対する試験化合物濃度の曲線下面積として定義されている。
【０１５９】
化合物１は、マウスにおいて、肺での曝露が血漿での曝露の約５５倍大きいことを示した。
【０１６０】
アッセイ９：肺組織におけるＩＬ−１３誘導性ｐＳＴＡＴ６誘導のネズミ（マウス）モデル
ＩＬ−１３は喘息の病態生理学の基礎となる重要なサイトカインである（Ｋｕｄｌａｃｚら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２００８，５８２，１５４−１６１）。ＩＬ−１３は、キナーゼのヤヌスファミリー（ＪＡＫ）のメンバーを活性化する細胞表面受容体に結合し、それは次にＳＴＡＴ６をリン酸化し、その後転写経路をさらに活性化する。記載されるモデルでは、ＩＬ−１３の用量をマウスの肺に局所送達してＳＴＡＴ６のリン酸化（ｐＳＴＡＴ６）を誘導し、次にこれをエンドポイントとして測定した。
【０１６１】
ハーランから入手した成体ＢＡＬＢ／ｃマウスをアッセイに使用した。試験当日、動物をイソフルランで軽く麻酔し、ビヒクルまたは試験化合物（０．５ｍｇ／ｍＬ、数回の呼吸で総体積５０μＬ）を経口吸引で投与した。動物を投与後横臥位に置き、麻酔から完全に回復するのをモニターした後、ホームケージに戻した。数時間後、動物を再度短時間麻酔し、経口吸引によりビヒクルまたはＩＬ−１３のいずれか（送達された総用量０．０３μｇ、総体積５０μＬ）を負荷した後、麻酔から完全に回復するのをモニターしてホームケージに戻した。ビヒクルまたはＩＬ−１３投与の１時間後、抗ｐＳＴＡＴ６  ＥＬＩＳＡ（ウサギｍＡｂ捕捉／コーティング抗体；マウスｍＡｂ検出／レポート抗体：抗ｐＳＴＡＴ６−ｐＹ６４１；二次抗体：抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ）を使用する両方のｐＳＴＡＴ６検出のために胚を収集し、上記のアッセイ１２で記載されるように、総薬物濃度について分析した。
【０１６２】
モデルの活性は、ビヒクルで処置されてＩＬ−１３を負荷された対照動物と比較した、５時間で処置動物の肺に存在するｐＳＴＡＴ６のレベルの低下によって証明される。ビヒクルで処置されてＩＬ−１３を負荷された対照動物と、ビヒクルで処置されてビヒクルを負荷された対照動物の違いは、任意の所与実験においてそれぞれ０％および１００％の阻害効果となった。化合物１は、ＩＬ−１３負荷後４時間でＳＴＡＴ６リン酸化を約６０％阻害した。
【０１６３】
アッセイ１０：肺のアルテルナリア・アルテナータ誘導性好酸球性炎症のネズミモデル
気道好酸球増加症は、ヒトの喘息の特徴である。アルテルナリア・アルテナータは、ヒトにおいて喘息を悪化させ、マウスの肺において好酸球性炎症を誘発する真菌のエアロアレルゲンである。（Ｈａｖａｕｘら、Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５，１３９（２）：１７９−８８）。マウスにおいて、アルテルナリアが肺において組織常在性２型自然リンパ球系細胞を間接的に活性化し、この細胞がＪＡＫ依存性サイトカインに応答し（例えば、ＩＬ−２およびＩＬ−７）、放出し（例えば、ＩＬ−５およびＩＬ−１３）、好酸球性炎症を調整することが実証されている（Ｂａｒｔｅｍｅｓら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２０１２，１８８（３）：１５０３−１３）。
【０１６４】
Ｔａｃｏｎｉｃより入手した７〜９週齢の雄Ｃ５７マウスを試験に使用した。試験当日、動物をイソフルランで軽く麻酔し、ビヒクルまたは試験化合物（０．１〜１．０ｍｇ／ｍＬ、数回の呼吸で総体積５０μＬ）を中咽頭吸引で投与した。動物を投与後横臥位に置き、麻酔から完全に回復するのをモニターした後、ホームケージに戻した。１時間後、動物を再度短時間麻酔し、ビヒクルまたはアルテルナリア抽出物（送達された総抽出物２００ｕｇ、総体積５０μＬ）を中咽頭吸引で負荷した後、麻酔から完全に回復するのをモニターしてホームケージに戻した。アルテルナリア投与の４８時間後、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）を回収し、Ａｄｖｉａ  １２０  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｉｅｍｅｎｓ）を使用してＢＡＬＦ中の好酸球を計数した。
【０１６５】
モデルの活性は、ビヒクルで処置されてアルテナリアを負荷された対照動物と比較し、４８時間の時点で処置動物のＢＡＬＦに存在する好酸球のレベルの低下によって証明される。データは、ビヒクルで処置されてアルテルナリアを負荷されたＢＡＬＦ好酸球の応答の阻害パーセントとして表される。阻害パーセントを計算するため、各条件のＢＡＬＦ好酸球の数を、平均ビヒクル処置アルテルナリア負荷ＢＡＬＦ好酸球のパーセントに変換し、１００パーセントから引いた。化合物１は、アルテルナリア負荷の４８時間後にＢＡＬＦ好酸球数の約８８％の阻害を示した。
【０１６６】
アッセイ１１：肺モデルのＬＰＳ／Ｇ−ＣＳＦ／ＩＬ−６／ＩＦＮγカクテル誘導性気道好中球性炎症のネズミモデル
気道の好中球増加は、ヒトの一連の呼吸器疾患の特徴である。気道の好中球増加症を誘導するためにＬＰＳ／Ｇ−ＣＳＦ／ＩＬ−６／ＩＦＮγカクテルを使用して好中球性気道炎症のモデルで化合物１を試験した。
【０１６７】
ジャクソン研究所から入手した７〜９週齢の雄Ｂａｌｂ／Ｃ（野生型）マウスを試験に使用した。試験当日、動物をイソフルランで軽く麻酔し、ビヒクルまたは試験化合物（１．０ｍｇ／ｍＬ、数回の呼吸で総体積５０μＬ）を中咽頭吸引で投与した。動物を投与後横臥位に置き、麻酔から完全に回復するのをモニターした後、ホームケージに戻した。１時間後、動物を再度短時間麻酔し、ビヒクルまたはＬＰＳ；０．０１ｍｇ／ｋｇ／Ｇ−ＣＳＦ；５μｇ／ＩＬ−６；５μｇ／ＩＦＮγ；５μｇ（総体積１００μＬ）を中咽頭吸引（ＯＡ）によって負荷した。ＬＰＳ／Ｇ−ＣＳＦ／ＩＬ−６／ＩＦＮｇカクテル投与の２４時間後、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）を回収し、好中球を計数した。
【０１６８】
化合物１によるＯＡ処置で、気道好中球の統計学的に有意な減少が見られ（ビヒクル処置マウスに対して８４％）、ＪＡＫ依存性シグナル伝達の遮断が好中球性気道炎症に効果があることが実証された。
【０１６９】
アッセイ１２：ウサギの目における眼内薬物動態
このアッセイの目的は、ウサギ眼組織における化合物１の薬物動態を決定することであった。
【０１７０】
溶液製剤
本発明の化合物、５−エチル−２−フルオロ−４−（３−（５−（１−メチルピペリジン−４−イル）−４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−６−イル）フェノール（１）を、４ｍｇ／ｍＬの標的濃度を達成するように１０％  ２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンに溶解させるか、または１ｍｇ／ｍＬの標的濃度を達成するように精製水に溶解させた。試験化合物溶液の両眼硝子体内注射（５０μＬ／目）を、シクロデキストリンおよび水ビヒクル製剤のそれぞれについて、２用量群（それぞれ２００μｇ／目および５０μｇ／目）のニュージーランド白色ウサギに投与した。試験化合物濃度は、注射後の所定の時点（３０分、４時間、１日、３日、７日、１４日）に眼組織：硝子体、房水、網膜／脈絡膜および虹彩−毛様体で測定した。２匹のウサギ（４個の目）に各時点で投与した。硝子体組織において、化合物１は、約１２時間の半減期の初期濃度低下と最後に約３．６日の終末相半減期を特徴とする２相の濃度の低下を示した。この化合物は、網膜および脈絡膜領域にも迅速に分配されることが見出され、硝子体組織と同様の薬物動態プロファイルを示す。
【０１７１】
懸濁液製剤
懸濁液製剤は、１０ｍｇ／ｍＬの標的濃度を達成するように、実施例２の結晶性化合物１と０．５％ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ  Ｅ５）＋０．０２％  Ｔｗｅｅｎ  ８０を組み合わせることによって調製した。試験化合物の懸濁液の両眼硝子体内注射（５０μＬ／目）を、ニュージーランド白色ウサギに投与した（５００μｇ／目）。試験化合物濃度は、注射後３０分、２週間、４週間、６週間、および８週間に懸濁液製剤アッセイと同様に眼組織で測定した。化合物は、約３μｇ／ｍＬ／日のクリアランス速度で、３０分から６週間まで硝子体の薬物濃度の直線的な低下を示した。この挙動は、化合物１のビヒクルへの溶解度および溶液製剤における眼の薬物動態挙動と一致している。血漿中の薬物濃度を測定し、この濃度が硝子体組織の濃度よりも少なくとも３桁低いことが見出された。
【０１７２】
アッセイ１３：薬力学的アッセイ：ラットにおけるＩＬ−６誘導性ｐＳＴＡＴ３の阻害
ＩＬ−６誘導性ｐＳＴＡＴ３を阻害する試験化合物の単回硝子体内投与の能力を、ラット網膜／脈絡膜ホモジネートにおいて測定した。
【０１７３】
懸濁液製剤は、３ｍｇ／ｍＬおよび１０ｍｇ／ｍＬの標的濃度を達成するように、実施例２の結晶性化合物１と０．５％ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ  Ｅ５  ＬＶ）、０．０２％  Ｔｗｅｅｎ  ８０、および０．９％塩化ナトリウムを精製水中で組み合わせることによって調製した。
【０１７４】
雌Ｌｅｗｉｓラットに懸濁液製剤または薬物ビヒクルを硝子体内（ＩＶＴ）投与した（５μＬ／目）。３日後、ＩＬ−６（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ；０．１ｍｇ／ｍＬ；５μＬ／目）またはビヒクルを硝子体内投与してｐＳＴＡＴ３を誘導した。眼組織を、ＩＬ−６を用いる２回目のＩＶＴ注射の１時間後に解剖した。網膜／脈絡膜組織をホモジナイズし、ＥＬＩＳＡ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いてｐＳＴＡＴ３レベルを測定した。ＩＬ−６誘導性ｐＳＴＡＴ３の阻害パーセントを、ビヒクル／ビヒクルおよびビヒクル／ＩＬ−６群と比較して計算した。１００％を超える阻害は、ビヒクル／ビヒクル群で観察されたレベルを下回るｐＳＴＡＴ３レベルの低下を反映している。
【０１７５】
ＩＬ−６負荷の前の３日の前処置により、懸濁液製剤によって投与された１５μｇ用量と５０μｇ用量の本発明の化合物は、ＩＬ−６誘導性ｐＳＴＡＴ３を、網膜／脈絡膜組織においてそれぞれ３３％および１０９％阻害した。
【０１７６】
アッセイ１４：薬力学的アッセイ：ウサギにおけるＩＦＮγ誘導性ＩＰ−１０の阻害
インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮγ）誘導性ＩＰ−１０タンパク質レベルを阻害する単回硝子体内投与の能力を、ウサギ硝子体および網膜／脈絡膜組織において測定した。
【０１７７】
実施例２の化合物１の１ｍｇ／ｍＬおよび４ｍｇ／ｍＬの濃度の溶液製剤を、アッセイ１２と同様に調製した。懸濁液製剤は、２０ｍｇ／ｍＬの標的濃度を達成するように、実施例２の結晶性化合物１と０．５％ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ  Ｅ５）、０．０２％  Ｔｗｅｅｎ  ８０、および９ｍｇ／ｍＬ塩化ナトリウムを精製水中で組み合わせることによって調製した。
【０１７８】
雄のニュージーランド白色ウサギ（Ｌｉｖｅｏｎ  Ｂｉｏｌａｂｓ、インド）を試験に使用した。動物を、研究施設（Ｊｕｂｉｌａｎｔ  Ｂｉｏｓｙｓ  Ｌｔｄ．インド）に到着後に順応させた。各ウサギに、５０μＬ／目の総投与量で合計２回の硝子体内（ＩＶＴ）注射を投与した。最初のＩＶＴ注射（４５μＬ／目）は、規定の時点（すなわち溶液製剤には２４時間、懸濁液製剤には１週間）に試験化合物またはビヒクルを送達した。２回目のＩＶＴ注射（５μＬ／目）は、ＩＰ−１０の誘導のためにＩＦＮγ（１μｇ／目；保存溶液１ｍｇ／ｍＬ；Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）またはビヒクルを送達した。手短に言えば、注射当日に、ウサギをケタミン（３５ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）の筋肉注射によって麻酔した。深く麻酔がかかったら、それぞれの目を滅菌生理食塩水ですすぎ、Ｂｒａｕｎｓｔｅｉｎ固定キャリパー（２  ３／４”）で直筋から３．５ｍｍ、縁から４ｍｍの位置にマークを付けることによって両目の鼻上側に、３１ゲージ針を有する０．５ｍＬインスリンシリンジ（５０単位＝０．５ｍＬ）を使用してＩＶＴ注射を行った。
【０１７９】
組織を、ＩＦＮγを用いる２回目のＩＶＴ注射の２４時間に回収した。硝子体液（ＶＨ）および網膜／脈絡膜組織（Ｒ／Ｃ）を回収し、ホモジナイズし、ウサギ  ＣＸＣＬ１０（ＩＰ−１０）ＥＬＩＳＡキット（Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用してＩＰ−１０タンパク質レベルを測定した。ＩＦＮγ誘導性ＩＰ−１０の阻害パーセントを、ビヒクル／ビヒクルおよびビヒクル／ＩＦＮγ群と比較して計算した。
【０１８０】
溶液として投与した場合、ＩＦＮγ負荷の前の２４時間の前処置で、４５μｇの化合物１は、ＩＦＮγ誘導性ＩＰ−１０を硝子体液および網膜／脈絡膜  組織においてそれぞれ７０％および８６％阻害し、一方、１８０μｇの化合物は、ＩＦＮγ誘導性ＩＰ−１０を硝子体液および網膜／脈絡膜組織においてそれぞれ９１％および１００％阻害した。
【０１８１】
ＩＦＮγ負荷の前の１週間の前処置により、化合物１の結晶性懸濁液製剤は、ＩＦＮγ誘導性ＩＰ−１０を硝子体液および網膜／脈絡膜組織の両方で１００％阻害した。
【０１８２】
アッセイ１５：ヒト３Ｄ気道培養におけるＩＦＮγおよびＩＬ−２７誘導性ケモカインＣＸＣＬ９およびＣＸＣＬ１０の阻害
ＥｐｉＡｉｒｗａｙ組織培養をＭａｔｔｅｋから入手した（ＡＩＲ−１００）。培養物は喘息ドナーから得られたものであった。細胞培養インサートにおいて、ヒト由来気管／気管支上皮細胞を多孔質膜支持体上で増殖および分化させ、細胞の下の温められた培地と上の気体の試験雰囲気を有する気液界面を可能にした。組織を３７℃、５％ＣＯ２加湿インキュベーター内の維持培地（Ｍａｔｔｅｋ、ＡＩＲ−１００−ＭＭ）で培養した。４つのドナーを試験した。０日目に、組織培養を１０μＭ、１μＭおよび／または０．１μＭの試験化合物で処理した。化合物をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、シグマ）に希釈して最終濃度０．１％とした。０．１％のＤＭＳＯをビヒクル対照として使用した。試験化合物を培養物とともに５％ＣＯ２、３７℃で１時間インキュベートした、続いて最終濃度１００ｎｇ／ｍｌのＩＦＮγ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）またはＩＬ−２７（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含有する、予め温めた培地を添加した。組織培養を８日間維持した。培地は２日おきに化合物およびＩＦＮγまたはＩＬ−２７を含有する新鮮な培地と交換した。８日目に、組織培養および上清を分析のために回収した。上清試料を、ＣＸＣＬ１０（ＩＰ−１０）およびＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）についてｌｕｍｉｎｅｘ  分析（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してアッセイした。データは阻害％＋／−標準偏差（±ＳＴＤＶ）として表される。阻害パーセントは、ビヒクル処理細胞と比較した、ＩＦＮγまたはＩＬ−２７誘導性ＣＸＣＬ１０またはＣＸＣＬ９分泌に対する化合物阻害効力によって決定した。データは３または４つのドナーの平均である。化合物１は、ビヒクル対照と比較した場合に、ＩＦＮγ誘導性ＣＸＣＬ１０分泌を９９％±２．０（１０μＭで）、７１％±１９（μＭで）および１７％±１２（０．１μＭで）阻害できた。化合物１は、ビヒクル対照と比較した場合に、ＩＦＮγ誘導性ＣＸＣＬ９分泌を１００％±０．３（１０μＭで）、９９％±０．９（１μＭで）および７４％±１７（０．１μＭで）阻害できた。化合物１は、ビヒクル対照と比較した場合に、ＩＬ−２７誘導性ＣＸＣＬ１０分泌を１０８％±１１（１０μＭで）、９８％±１０（１μＭで）および７３％±８．５（０．１μＭで）阻害できた。化合物１は、ビヒクル対照と比較した場合に、ＩＬ−２７誘導性ＣＸＣＬ９分泌を１００％±０（１０μＭで）、９５％±３．７（１μＭで）および７５％±３．５（０．１μＭで）阻害できた。
【０１８３】
アッセイ１６：ＩＬ−５媒介性好酸球生存アッセイ
ＩＬ−５媒介性好酸球の生存に対する試験化合物の効力を、ヒト全血から単離したヒト好酸球（ＡｌｌＣｅｌｌｓ）で測定した。ＩＬ−５はＪＡＫを通じてシグナルを伝達するので、このアッセイはＪＡＫの細胞効力の尺度を提供する。
【０１８４】
ヒト好酸球を、健康なドナーの新鮮なヒト全血（ＡｌｌＣｅｌｌｓ）から単離した。血液を０．９％塩化ナトリウム溶液（シグマ−アルドリッチ）中４．５％デキストラン（シグマ−アルドリッチ）と混合した。赤血球を３５分間沈降させた。白血球に富む上層を取り出し、フィコール−Ｐａｑｕｅ（ＧＥヘルスケア）の上で層状にし、６００ｇで３０分間遠心分離した。血漿および単核細胞層を取り出した後、顆粒球層を水で溶解させ、混入している赤血球を取り出した。ヒト好酸球単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して好酸球をさらに精製した。精製された好酸球の一部を抗ＣＤ１６  ＦＩＴＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）とともに暗所で４℃で１０分間とともにインキュベートした。ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して純度を分析した。
【０１８５】
細胞を、５％ＣＯ２加湿インキュベーターにおいて、１０％熱失活ウシ胎仔血清１６４０（ＦＢＳ、ライフテクノロジーズ）、２ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ（ライフテクノロジーズ）、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ライフテクノロジーズ）および１Ｘ  Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（ライフテクノロジーズ）を補充したＲＰＭＩ（ライフテクノロジーズ）、３７℃で培養した。細胞を１０，０００細胞／ウェルで培地（５０μＬ）に播種した。プレートを３００ｇで５分間遠心分離し、上清を除去した。化合物をＤＭＳＯで段階希釈し、次に培地でさらに５００倍に希釈して最終アッセイ濃度の２倍とした。試験化合物（５０μＬ／ウェル）を細胞に添加し、３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートし、続いて７２時間予め温めた培地（５０μＬ）にＩＬ−５（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；最終濃度１ｎｇ／ｍＬおよび１０ｐｇ／ｍｌ）を添加した。
【０１８６】
サイトカイン刺激後、細胞を３００ｇで５分間遠心分離し、冷ＤＰＢＳ（ライフテクノロジーズ）で２回洗浄した。生存力およびアポトーシスを評価するために、細胞をヨウ化プロピジウム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＡＰＣ  Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とともにインキュベートし、ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して分析した。ＩＣ５０値は、化合物濃度に対する細胞生存率パーセントの生存率曲線の解析から決定した。データはｐＩＣ５０（１０を底とする負の対数ＩＣ５０）値として表される。化合物１は、１０ｐｇ／ｍｌのＩＬ−５の存在下で７．９±０．５のｐＩＣ５０値、および１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−５の存在下で６．５±０．２のｐＩＣ５０値を示した。
【０１８７】
本発明はその特定の態様または実施形態を参照して説明されたが、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更を行うことができ、または等価物を置き換えることができることを当業者は理解するであろう。さらに、適用され得る特許法および規制によって許可される範囲内で、本明細書に引用される全ての刊行物、特許および特許出願は、それぞれの文書が参照によって個別に本明細書に組み込まれるのと同程度に、その全文が参照によって本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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