(57)【要約】  本開示は、一般に、組換え遺伝子発現の分野における改良型遺伝子発現システムに関する。本発明は、改善された収率および品質のタンパク質産生を示すシステム、ならびに培養細胞、特に培養真核細胞によって産生されるタンパク質の産生を増加させるための方法に関する。【選択図】図３Ｂ
2020503021.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
変異RPL10タンパク質を発現する真核宿主細胞を提供することを含む、第２の組換えタンパク質を産生するための方法であって、野生型RPL10は発現されないか、またはその発現は前記真核細胞内で発現抑制され、および、組換えポリペプチドの発現を可能にする条件下で組換えタンパク質をコードする核酸を導入する、方法。
【請求項２】
発現されたポリペプチドを宿主細胞から回収する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
内因性RPL10 DNA配列がゲノムから除去されているものであって、内因性RPL10の発現が抑制されているか、または、内因性RPL10 DNA配列が変異RPL10をコードするように変更されている、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
変異RPL10タンパク質は、33、66、70、98、123位の１つまたは複数のアミノ酸置換または組換えタンパク質の発現増加をもたらすタンパク質における別の位置の同等の変異を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
変異RPL10タンパク質は、33、66、70、98、および123位に１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
変異RPL10タンパク質は、33Ｖａｌ、66Ｇｌｙ、70Ｍｅｔもしくは70Ｌｅｕ、98Ｓｅｒまたもしくは98Ｃｙｓ、および123Ｐｒｏからなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
変異RPL10タンパク質は、98Ｓｅｒ変異を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
細胞はNACを含む抗酸化剤を含む培地中で増殖させるものである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
宿主細胞においてＮＯＴＣＨ１シグナル伝達が活性化されている、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ＮＯＴＣＨ１シグナル伝達が、活性化細胞内ＮＯＴＣＨ１（ＮＯＴＣＨ１−ＩＣＮ）をコードするＭＳＣＶプラスミドを有するレトロウイルスベクターで形質導入されることにより活性化されている、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
組換え真核細胞宿主が哺乳動物細胞である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
哺乳動物細胞が、CHO、COS、Vero、Hela、BHK、HEK293、Hek293T、HKB-11、MEFおよびSp-2細胞株からなる群から選択される細胞株である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
変異RPL10タンパク質を発現する真核細胞の使用であって、野生型RPL10は発現されないか、またはその発現は組換えタンパク質の発現のための前記真核細胞内で発現抑制されている、使用。
【請求項１４】
野生型RPL10は、活性化ＮＯＴＣＨ１シグナル伝達によって特徴づけられ、野生型RPL10は発現されないか、またはその発現は前記真核細胞内で発現抑制されている、変異RPL10タンパク質を発現する真核細胞。
【請求項１５】
細胞内ＮＯＴＣＨ１（ＮＯＴＣＨ１−ＩＣＮ）を含む、請求項１４に記載の細胞。
【請求項１６】
野生型RPL10を含む細胞と比較されるRPL10を含む細胞において組換えタンパク質の発現の増加をもたらすRPL10変異を同定するための方法であって、
野生型RPL10が存在せず、変異RPL10の発現を可能にする条件下で、変異RPL10タンパク質をコードする第１の核酸を第１の細胞に導入し、
検出可能なタンパク質の発現を可能にする条件下で検出可能なタンパク質をコードする第２の核酸を前記第１の細胞に導入し、
変異RPL10の発現を可能にする条件下で、野生型RPL10タンパク質をコードする第３の核酸を第２の細胞に導入し、
検出可能なタンパク質の発現を可能にする条件下で、検出可能なタンパク質をコードする第２の核酸を前記第２の細胞に導入し、
第１の細胞と第２の細胞を同じ条件下で培養し、産生された検出可能なタンパク質の量を比較し、少なくとも２％（ｗ／ｗ）の検出可能なタンパク質の増加が得られるRPL10変異を有する細胞が、組換えタンパク質の発現のための宿主として選択される、方法。
【請求項１７】
請求項１に記載の方法における、請求項１６に記載の方法において選択される細胞の使用。
【請求項１８】
Ｒ98Ｓ RPL10変異を発現する非ヒト遺伝子導入動物。
【請求項１９】
ＣＲＥリコンビナーゼを介したＲ98Ｓ RPL10変異を発現するコンディショナル遺伝子導入動物である、請求項１８に記載の非ヒト遺伝子導入動物。
【請求項２０】
Ｒ98Ｓ RPL10変異が組織特異的である、請求項１８または１９に記載の非ヒト遺伝子導入動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願の開示は組換えタンパク質発現の分野における改良されたタンパク質発現系に一般に関連する。本発明はタンパク質産生の改良された収率および品質を示す系ならびに培養された細胞、特に培養された真核細胞によって産生されるタンパク質の増大される産生方法に関連する。
【背景技術】
【０００２】
組換え遺伝子発現を介してタンパク質産生を最大にするための改良された方法論は、当該分野において継続的な努力である。商業的に有用な量のこれらのタンパク質を産生するための生物学的に活性なタンパク質の組換え発現を最大にする方法論の開発は特に興味深い。原核生物、典型的には細菌性の宿主細胞系は大量の組換えタンパク質を産生することができることが証明されているが、これらの宿主は、タンパク質をグリコシル化できないこと、タンパク質からの「プレ」または「プレプロ」配列の非効率的な切断（例えば、非効率な翻訳後修飾）、ならびにタンパク質を分泌することが一般的にできないことを含む、いくつかの不都合に苦しむ。結果として、当該分野では、哺乳動物タンパク質産生のための真核宿主系、典型的には哺乳動物宿主細胞系が求められてきた。タンパク質は生物学的に活性な形態で培地に分泌され得るので、そのような系の一つの特徴は、産生されたタンパク質が天然のタンパク質種のそれに最も類似した構造を有し、そして精製がしばしばより容易であることである。
【０００３】
タンパク質は、診断用途、薬理学的用途、治療用途、栄養用途、および研究用途を含む多種多様な用途において商業的に有用である。商業的使用のためのタンパク質の大規模産生は骨が折れることでありそして高価であり得る。さらに、薬理学的用途のためのタンパク質を産生する施設は、建築および規制当局の承認を得るために多大な費用がかかる可能性がある。このように、たとえタンパク質が産生され得る効率の増加がわずかであっても、産生に利用できる施設の数が限られておりそして産生の費用がかかるために商業的に価値がある。
【０００４】
培養哺乳動物細胞は、いくつかのタンパク質、特に薬理学的使用を目的とした組換えタンパク質の産生に使用されており、培養条件の多くの調整により、産生されるタンパク質の量と質に影響を与えることが示されている。
【０００５】
非特許文献１ではQM様タンパク質（tQM）をコードするトマト（Lycopersicon esculentum）遺伝子を同定しており、tQMの安定した発現が、H2O2、パラコート、および熱による酸化的損傷に対する保護を与えることを見出した。同著者らはストレス耐性の低下により組換えタンパク質の収量を増加させるためのQM過剰発現を伴う真核生物発現系を特許文献１において開示する。QMタンパク質は酵母および脊椎動物にホモログを有する。ヒトホモログはRPL10として知られる。
非特許文献２ではT細胞性急性リンパ芽球性白血病におけるリボソーム遺伝子RPL10の変異を同定している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】US20080184384
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Chen et al. (2006) Appl Environ Microbiol.72,4001-4006
【非特許文献２】De Keersmaecker K. et al. (2013)Nat Genet.45, 186-190
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、培養真核生物、特に哺乳動物細胞からのタンパク質産生、特に組換えタンパク質産生の収率および品質が改良するように設計された新規の系を提供する。
操作されたRPL10真核細胞はリボソーム生合成欠陥を示すが、本発明は、翻訳効率および翻訳忠実度を増大させることによって関連技術の問題を解決し、それによってタンパク質産生の収率および品質が改善された系を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は以下の説明のとおりに要約される：
1.  変異RPL10タンパク質を発現する真核宿主細胞を提供することを含む、第２の組換えタンパク質を産生するための方法であって、野生型RPL10は発現されないか、またはその発現は前記真核細胞内で発現抑制され、および、組換えポリペプチドの発現を可能にする条件下で組換えタンパク質をコードする核酸を導入する、方法。
2.  発現されたポリペプチドを宿主細胞から回収する工程をさらに含む、１の説明に記載の方法。
3.  内因性RPL10 DNA配列がゲノムから除去されているものであって、内因性RPL10の発現が抑制されているか、または、内因性RPL10 DNA配列が変異RPL10をコードするように変更されている、１または２の説明に記載の方法。
4.  変異RPL10タンパク質は、33、66、70、98、123位の１つまたは複数のアミノ酸置換または組換えタンパク質の発現増加をもたらすタンパク質における別の位置の同等の変異を含む、１〜３のいずれか１の説明に記載の方法。
5.  変異RPL10タンパク質は、33、66、70、98、および123位に１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、１〜４のいずれか１の説明に記載の方法。
6.  変異RPL10タンパク質は、33Ｖａｌ、66Ｇｌｙ、70Ｍｅｔもしくは70Ｌｅｕ、98Ｓｅｒまたもしくは98Ｃｙｓ、および123Ｐｒｏからなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、１〜５のいずれか１の説明に記載の方法。
7.  変異RPL10タンパク質は、98Ｓｅｒ変異を含む、１〜６のいずれか１の説明に記載の方法。
8.  細胞は抗酸化剤を含む培地中で増殖させるものである、１〜７のいずれか１の説明に記載の方法。
9.  宿主細胞においてＮＯＴＣＨ１シグナル伝達が活性化されている、１〜８のいずれか１の説明に記載の方法。
10.  ＮＯＴＣＨ１シグナル伝達が、例えば配列番号５に示される、活性化細胞内ＮＯＴＣＨ１（ＮＯＴＣＨ１−ＩＣＮ）をコードするＭＳＣＶプラスミドを有するレトロウイルスベクターで形質導入されることにより活性化されている、９の説明に記載の方法。
11.  組換え真核細胞宿主が哺乳動物細胞である、１〜１０のいずれか１の説明に記載の方法。
12.  哺乳動物細胞が、CHO、COS、Vero、Hela、BHK、HEK293、Hek293T、HKB-11、MEFおよびSp-2細胞株からなる群から選択される細胞株である、１１の説明に記載の方法。
13.  変異RPL10タンパク質を発現する真核細胞の使用であって、野生型RPL10は発現されないか、またはその発現は組換えタンパク質の発現のための前記真核細胞内で発現抑制されている、使用。
14.  野生型RPL10は、活性化ＮＯＴＣＨ１シグナル伝達によって特徴づけられ、野生型RPL10は発現されないか、またはその発現は前記真核細胞内で発現抑制されている、変異RPL10タンパク質を発現する真核細胞。
15.  例えば、配列番号５で示される、細胞内ＮＯＴＣＨ１（ＮＯＴＣＨ１−ＩＣＮ）を含む、１４の説明に記載の細胞。
16.  野生型RPL10を含む細胞と比較されるRPL10を含む細胞において組換えタンパク質の発現の増加をもたらすRPL10変異を同定するための方法であって、
野生型RPL10が存在せず、変異RPL10の発現を可能にする条件下で、変異RPL10タンパク質をコードする第１の核酸を第１の細胞に導入し、
検出可能なタンパク質の発現を可能にする条件下で検出可能なタンパク質をコードする第２の核酸を前記第１の細胞に導入し、
変異RPL10の発現を可能にする条件下で、野生型RPL10タンパク質をコードする第３の核酸を第２の細胞に導入し、
検出可能なタンパク質の発現を可能にする条件下で、検出可能なタンパク質をコードする第２の核酸を前記第２の細胞に導入し、
第１の細胞と第２の細胞を同じ条件下で培養し、産生された検出可能なタンパク質の量を比較し、少なくとも２％（ｗ／ｗ）の検出可能なタンパク質の増加が得られるRPL10変異を有する細胞が、組換えタンパク質の発現のための宿主として選択される、方法。
17.   説明１に記載の方法における、説明１６の方法において選択される細胞の使用。
18.   Ｒ98Ｓ RPL10変異を発現する非ヒト遺伝子導入動物。
19.   ＣＲＥリコンビナーゼを介したＲ98Ｓ RPL10変異を発現するコンディショナル遺伝子導入動物である、説明１８に記載の非ヒト遺伝子導入動物。
20.  Ｒ98Ｓ RPL10変異が組織特異的である、説明１８または１９に記載の非ヒト遺伝子導入動物。
【００１０】
本発明のさらなる適用範囲は、以下に与えられる詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、本詳細な説明から、本発明の精神および範囲内の様々な変更および修正が当業者に明らかになることから、詳細な説明および特定の実施例は、本発明の好ましい態様を示すが、例示としてのみ与えられていることを理解されたい。前述の一般的な説明および以下の詳細な説明の両方は例示的および説明的なものにすぎず、特許請求の範囲に記載の本発明を限定するものではないことを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
本発明は、以下に与えられる詳細な説明および例示としてのみ与えられ、したがって本発明を限定するものではない添付の図面からより十分に理解されるであろう。
【００１２】
【図１】図１は、プログラムされた−１ リボソームフレームシフト（−１ ＰＲＦ）アッセイの概略図である。野生型および変異型Ba/F3細胞を、インフレームコントロール、アウトオブフレームコントロール、または上流のウミシイタケルシフェラーゼと下流のホタルルシフェラーゼオープンリーディングフレームの間のヒトIL7R遺伝子由来の−１ ＰＲＦシグナルを含むプラスミドでｍｏｃｋエレクトロポレーションまたはエレクトロポレーションした。
【図２】図２は、ナンセンスおよびミスセンスサプレッションアッセイの概要図である。ナンセンスサプレッションアッセイは、二重ルシフェラーゼアッセイを介して行われるものであって、ウミシイタケルシフェラーゼとホタルルシフェラーゼ遺伝子間にストップコドンが導入される。そのような構築物では、ホタルルシフェラーゼタンパク質の産生は、ストップコドンのリードスルー（read-through）現象に依存する。ミスセンスサプレッションは、ホタルルシフェラーゼ活性部位にＲ218Ｓ一塩基置換を含む構築物を用いることによってアッセイされる。そのような構築物では、ホタルルシフェラーゼの活性は、同族のセリンに代わって近同族（near-cognate）のアルギニンの取り込みに依存する。
【図３】図３は、RPL10 Ｒ98Ｓ細胞における増加した翻訳効率を示す。Ａ）Ｂａ／Ｆ３ＷＴ対Ｒ98Ｓ細胞におけるストレプトアビジン−ＨＲＰ抗体を用いて検出されたＡＨＡ−ビオチンによるデノボタンパク質標識の代表的なウエスタンブロット分析（＊：ｐ＜０．０５；Ｔ検定）。Ｂ）RPL10 Ｒ98Ｓ対ＷＴ発現細胞で発現されたＧＦＰレポーターのＭＦＩ（平均蛍光強度）の比較。左：Ba/F3 細胞、右：ジャーカット細胞 Ｃ）RPL10 ＷＴおよびＲ98Ｓ発現Ｂａ／Ｆ３細胞におけるリン酸化（phospo）−ｅＩＦ２αの代表的なウエスタンブロット検出。Ｄ）RPL10 ＷＴおよびＲ98Ｓ Ｂａ／Ｆ３発現細胞由来のポリソームプロファイルにおける示されたｍＲＮＡ分布の分析。
【図４】図４は、RPL10 Ｒ98Ｓ細胞がより高い翻訳精度を有することを示す。ＷＴまたはRPL10 Ｒ98Ｓ発現Ｂａ／Ｆ３細胞における−１ ＰＲＦレベル（フレームシフト）、ストップコドンリードスルーおよびミスセンスリードを試験する二重ルシフェラーゼレポーターアッセイの結果。＊＊：ｐ＜０．０１
【図５】図５は、RPL10 Ｒ98Ｓ細胞がキモトリプシン様およびカスパーゼ様プロテアーゼ活性の低下を示すことを説明する。ＷＴまたはＲ98Ｓ RPL10のいずれかを発現するＢａ／Ｆ３（上）細胞またはジャーカット細胞（下）のキモトリプシン様、トリプシン様、およびカスパーゼ様のプロテアソーム活性。Ｐ値はＴ検定を用いて計算された。
【図６】図６は、ＮＯＴＣＨ１−ＩＣＮシグナル伝達は、翻訳忠実度に影響を与えることなく、RPL10 Ｒ98Ｓに関連した細胞増殖欠陥を救済することを示す。Ａ）示された構築物を発現するＢａ／Ｆ３細胞の増殖曲線。Ｂ）示された構築物を発現している細胞における−１ＰＲＦレベル（フレームシフト）、ストップコドンリードスルーおよびミスセンスリードを試験する二重ルシフェラーゼレポーターアッセイの結果。
【図７】図７は、コンディショナルRpl10cKI Ｒ98Ｓマウスモデルの概略図を示す。
【図８】図８は、RPL10Ｒ98Ｓ発現マウス造血細胞が、Ｊａｋ−Ｓｔａｔシグナル伝達因子の発現およびリン酸化の増加を示すことを示す。Rpl10cKI Ｒ98Ｓ（図中ＷＴとして標識）マウスおよびMX-Cre Rpl10cKI Ｒ98Ｓ（図中Ｒ98Ｓとして標識）マウス由来の造血細胞におけるＪａｋ−Ｓｔａｔタンパク質の発現およびリン酸化の代表的免疫ブロット。
【図９】図９は、RPL10 ＷＴおよびＲ98Ｓ細胞間の差次的発現を示すタンパク質および経路の質量分析スクリーニングを示す。Ａ）３つの分析されたRPL10野生型（WT#29、WT#36およびWT#28）およびRPL10 Ｒ98Ｓ変異（R98S#13、R98S#35およびR98S#11）細胞クローンの異なるプロテオーム結果の階層的クラスター分析。Ｂ）RPL10 WTおよびＲ98Ｓサンプルを比較した定量的プロテオミクスデータのVolcanoプロット。 破線は、有意性のためのカットオフを示す（ｐ＜０．０１；Ｔ検定）。赤い点は、Ｒ98Ｓサンプルにおいて有意に上方制御されている１７８のタンパク質を表し、緑色の点は有意に下方制御されている６８のタンパク質に対応する。Ｃ）Ｒ98Ｓサンプルにおいて有意に上方（左）または下方（右）に調節される経路／プロセス。円グラフの数字は、細胞において上下する各プロセスに対応する有意な経路の数を表す。
【図１０−１】図１０は、RPL10 Ｒ98Ｓ細胞が変化したレベルのＪａｋ−Ｓｔａｔシグナル伝達因子を発現することを示す。Ａ）左：RPL10 Ｒ98Ｓ細胞において上方制御されたタンパク質中のＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路タンパク質の濃縮を示すGSEAプロット。FDR：誤発見率（false discovery rate）。右：質量分析によって同定されたＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達メディエーターのVolcanoプロット。破線は有意性のためのカットオフを示す（ｐ＜０．０５；Ｔ検定）。赤い点は、Ｒ98Ｓサンプルにおいて有意に上方制御されているタンパク質を表し、緑色の点は、Ｒ98Ｓ細胞において有意に下方制御されているタンパク質に対応する。Ｂ）左：RPL10 Ｒ98Ｓ対ＷＴ発現細胞の３つの独立したクローンにおけるＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路遺伝子の差次的発現の免疫ブロット検証。図は３つの独立した実験の代表的なブロットを示す。右：免疫ブロット検証の定量化。ＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路タンパク質のシグナルを負荷（loading）について正規化した。定量化は、３つの独立したRPL10 ＷＴ対３つの独立したＲ98Ｓ細胞クローンを比較した代表的実験の平均＋／−標準偏差を表す。Ｐ値はＴ検定を用いて計算した。Ｃ）RPL10 ＷＴ対Ｒ98Ｓ発現Ｂａ／Ｆ３細胞におけるＪＡＫ−ＳＴＡＴ ｍＲＮＡレベルの定量。結果は、３つのRPL10 ＷＴ対Ｒ98Ｓ Ｂａ／Ｆ３クローンについてのｍＲＮＡ配列決定によって得られた。表されたＲＮＡレベルは、ＷＴに対するＤＥＳｅｑ２正規化カウントである。Ｒ98ＳとＷＴとの間のＲＮＡレベルにおける有意な変化（ＦＤＲ＜０．１）は、ＤＥＳｅｑ Ｒパッケージを用いて推定された。＊ｐ ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．０１。
【図１０−２】同上
【図１０−３】同上
【図１１】図１１は、RPL10 Ｒ98ＳＴ−ＡＬＬ患者サンプルがＪＡＫ−ＳＴＡＴカスケードの発現が上昇していることを示す。Ａ）３つのRPL10 ＷＴおよび３つのRPL10 Ｒ98Ｓ変異型ヒトＴ−ＡＬＬ異種移植片サンプルにおけるＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路タンパク質発現の免疫ブロット分析。有意な変化が観察されたＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路のそれらの構成要素のみが示されている。Ｂ）パネル（Ａ）に示される免疫ブロットの定量化。バーは、３つの独立したRPL10 ＷＴ Ｔ−ＡＬＬ患者サンプル対３つのRPL10 Ｒ98Ｓ陽性患者サンプルの平均＋／−標準偏差を示す。Ｐ値はＴ検定を用いて計算した。＊ｐ ＜０．０５、＊＊ｐ ＜０．０１。
【図１２】図１２は、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路遺伝子が機能的−１ ＰＲＦシグナルを含み、そのうちのいくつかについてのフレームシフトレベルはRPL10 Ｒ98Ｓ変異によって影響されることを示す。Ａ）予測された−１ ＰＲＦシグナルを含み、そしてＰＲＦデータベース(Belew AT. et al. (2008) BMC Genomics 9, 339)から抽出された全てのヒト遺伝子内の濃縮分析の結果。分析はＧ：ｐｒｏｆｉｌｅｒ（Reimand, J. et al. (2016) Nucleic Acids Res 44, W83-W89）ソフトウェアとＫＥＧＧデータベースを用いて行い、統計的有意性はフィッシャーの片側検定を用いて計算した。Ｂ）示されたマウス遺伝子における計算上予測された−１ ＰＲＦシグナルに対して−１ ＰＲＦレベルを試験する二重ルシフェラーゼレポーターアッセイ（図１８Ａで説明される）からの結果。アウトオブフレーム（ＯＯＦ）はネガティブコントロールである。アッセイはRPL10 ＷＴまたはＲ98Ｓを発現するＢａ／Ｆ３細胞において実施した。バーは、少なくとも５つの生物学的に独立した測定値の平均＋／−標準誤差を示す。Ｃ）ＷＴ対Ｒ98Ｓ Ｂａ／Ｆ３細胞で行われた二重ルシフェラーゼレポーターアッセイによって決定された、ヒトＩＬ７ＲＡおよびＪＡＫ１のｍＲＮＡに対する−１ ＰＲＦの百分率。プロットは、少なくとも５つの生物学的に独立した測定値の平均＋／−標準誤差を示す。
【図１３−１】図１３は、RPL10 Ｒ98Ｓ発現細胞が、プロテアソーム発現および活性の変化ならびにＪａｋ１の安定性の増強を示すことを説明する。Ａ）RPL10 Ｒ98Ｓ対ＷＴ発現細胞の３つの独立したクローンにおけるＰｓｍｂ９およびＰｓｍｂ１０発現の免疫ブロット分析。Ｂ）パネル（Ａ）に示される免疫ブロット検証の定量化。Ｃ）ＷＴまたはＲ98Ｓ RPL10を発現しているＢａ／Ｆ３細胞のキモトリプシン様、カスパーゼ様およびトリプシン様プロテアソーム活性。プロットは、３つの独立したＲ98Ｓ細胞クローンに対して３つの生物学的に独立したRPL10 ＷＴを比較した３つの独立した実験の平均＋／−標準偏差を示す。Ｄ）示されたプロテアソーム阻害剤で処理されたRPL10 ＷＴおよびＲ98Ｓ細胞の相対的増殖は、ＡＴＰｌｉｔｅ発光アッセイ（パーキンエルマー）を用いて測定された。パネルは、３つの独立したＲ98Ｓ細胞クローンに対して３つの生物学的に独立したRPL10 ＷＴを比較した代表的実験の平均＋／−標準偏差を示す。Ｅ）シクロヘキシミド追跡アッセイによって評価された、ＪＡＫ１およびＣｓｆ２ｒｂ／２タンパク質の安定性を示す免疫ブロット。Ｆ）パネル（Ｅ）に示される免疫ブロットの定量化。ＣＨＸ：シクロヘキシミド。定量化は、３つの独立したＲ98Ｓ細胞クローンに対して３つの生物学的に独立したRPL10 ＷＴを比較した３つの独立した実験の平均＋／−標準偏差を表す。Ｐ値はＴ検定を用いて計算した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ ＜０．００１。
【図１３−２】同上
【図１４】図１４は、Ｂａ／Ｆ３細胞におけるRpl10 ＷＴおよびＲ98Ｓ発現を示すサンガー配列を示す。RPL10 ＷＴ（Ａ）またはＲ98Ｓ（Ｂ）を発現するＢａ／Ｆ３細胞から得られたｃＤＮＡの代表的なサンガークロマトグラム。
【図１５】図１５。二重ルシフェラーゼアッセイによる−１ ＰＲＦシグナルの検証。示されたマウスおよびヒトのＰＲＦシグナルに対して−１ ＰＲＦレベルを試験するＨｅｋ２９３Ｔ細胞における二重ルシフェラーゼレポーターアッセイの結果。エラーバーは標準誤差を表す。アウトオブフレーム（ＯＯＦ）コントロールと比較した＊＊ｐ＜０．０１（Ｔ検定）。
【図１６】図１６は、RPL10 Ｒ98Ｓマウス造血細胞が免疫プロテアソームサブユニットの上方制御を示すことを説明する。Rpl10cKI Ｒ98Ｓ（図中ではＷＴとして表示）マウスおよびMX-Cre Rpl10cKI Ｒ98Ｓ（図中ではＲ98Ｓとして表示）マウス由来の造血細胞における免疫プロテアソームの特定のサブユニットＰｓｍｂ１０およびＰｓｍｂ９のタンパク質発現レベルを示す代表的な免疫ブロット。
【図１７】図１７は、RPL10 Ｒ98Ｓ変異細胞が変化したポリユビキチン化を示さないことを示す。Ａ）RPL10 Ｒ98Ｓ対ＷＴ発現Ｂａ／Ｆ３細胞におけるポリユビキチン化タンパク質の免疫ブロット分析。図は３つの独立した実験の代表的なブロットを示す。Ｂ）パネル（Ａ）の免疫ブロットの定量化。プロットは、平均＋／−標準偏差を示す。
【図１８】図１８は、Ｓｔａｔタンパク質の安定性がＣＨＸ追跡の１５０分以内で変化しないままであることを示す。シクロヘキシミド（ＣＨＸ）追跡アッセイにより評価したタンパク質安定性を示す免疫ブロット。
【図１９】図１９は、本願において議論されている変異の指標と共に、ヒト、マウスおよび酵母のRPL10の配列比較を示す。
【図２０】図２０は、RPL10 Ｒ98Ｓ細胞が、栄養不良の過成長条件下で生存が増強されたことを示す。Ａ）培地をリフレッシュせずに５日間培養したRPL10 Ｒ98ＳおよびＷＴ発現Ｂａ／Ｆ３細胞の生細胞数。この過成長条件下で、Ｂａ／Ｆ３ RPL10 Ｒ98Ｓ変異細胞は、RPL10ＷＴ細胞と比較して延命効果を示した。Ｂ）Ｂａ／Ｆ３クローンは、それらの過成長条件が始まるまで、通常の条件下で３日間増殖させた。この時点では、培養培地は、RPL10 ＷＴ Ｂａ／Ｆ３細胞によって使い果たされた培地と交換された。使い果たした条件で2日間培養した後、RPL10 ＷＴ クローン対Ｒ98Ｓクローンを比較して生細胞数を決定した。Ｃ）培地の交換なしで５日間培養したRPL10Ｒ98ＳおよびＷＴ発現ＪＵＲＫＡＴ細胞の生細胞数。平均＋／−標準偏差がプロットされる。
【図２１】図２１は、未処理または５ｍＭ Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）で処理したＢａ／Ｆ３RPL10 ＷＴおよびＲ98Ｓクローンの細胞増殖分析を示す。ＭＴＳ増殖アッセイを用いて細胞増殖を定量し、ここで比色ホルマザン産生が光学濃度測定によって測定される。棒グラフは、比色ＭＴＳアッセイの測定された最適濃度（ＯＤ）の平均＋／−標準偏差を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本開示は、一般に、組換えタンパク質発現の分野における改善されたタンパク質発現系に関する。本発明は、培養細胞、特に培養真核細胞によって産生されるタンパク質の産生を増加させるための方法に関する。
【００１４】
最近癌においていくつかの体細胞リボソーム欠損が発見されているが、それらの根底にある発癌機序はまだよく理解されていない。ここで、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（T−ＡＬＬ）に見られる必須リボソームタンパク質Ｌ１０（RPL10）における再発性Ｒ98Ｓ変異の病原性の役割を調べた。我々のＴ−ＡＬＬ患者コホートでは、RPL10（uL16としても知られている）の98位のアルギニンからセリンへの変異（Ｒ98Ｓ）は、とびぬけた再発性のリボソーム欠損であり、小児患者の7.9％で検出された。RPL10のＲ98残基は６０Ｓサブユニットの中心に位置し、そしてリボソーム触媒コアに密接に接近する。酵母モデルによりRPL10 Ｒ98Ｓ変異がリボソーム集合、翻訳忠実度、および細胞増殖を損なうことが明らかになった。組換えRPL10真核細胞はリボソーム生合成欠陥を示すが、それらは栄養素が乏しい条件で向上した生存特性ならびにタンパク質産生の改善された収率および品質を示す。したがって、本発明は、翻訳効率および翻訳忠実度を増大させることによって関連技術の問題を解決し、それによって改善されたタンパク質産生を示す系を提供する。
【００１５】
本明細書で使用される用語「組換え」は遺伝子工学によって２つ以上の異なる供給源からの遺伝物質を組み合わせることから生じるＤＮＡまたはタンパク質のような産生物をいう。
【００１６】
「組換え発現系」は、目的の遺伝子産物または複数の遺伝子産物の発現のための任意の核酸ベースのアプローチまたは系であって、それらは遺伝子産物または複数の産物の発現に向けられた構成要素から人工的に組織された（人工の）ものをいう。これらの構成要素は、天然に存在する遺伝的供給源、合成もしくは人工、または天然および人工の遺伝的要素の何らかの組み合わせのものであり得る。一般に遺伝子産物はタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドである。
【００１７】
「組換えタンパク質」は、宿主細胞によって既に発現されているタンパク質と同一であってもよく、宿主細胞によってすでに発現されているタンパク質の突然変異型および／または断片であってもよく、あるいは別の生物由来のタンパク質（野生型の修飾）起源であってもよい。組換えタンパク質は、単離および同定のためのタグもしくは融合部分（例えば蛍光タンパク質）または他の修飾のようなさらなる要素をさらに含み得る。
【００１８】
本発明に関する特異的組換えタンパク質は、グリコシル化タンパク質、ジスルフィドタンパク質を有するタンパク質などの翻訳後修飾を有するタンパク質である。
【００１９】
変異RPL10は組換えタンパク質であることから、発現ベクター上のタンパク質は「さらなる」または第２の組換えタンパク質と呼ばれる。
【００２０】
「異種性のＤＮＡ配列」は、外来性であるか、またはそれが関連するかまたは連結している（作動可能にまたはその他の）他のＤＮＡ配列と天然で関連していないＤＮＡ配列、またはそれが導入される細胞または生物と天然で関連しないＤＮＡ配列をいう。異種性のＤＮＡ配列の例は、宿主細胞または生物における外来または異種性のタンパク質遺伝子産物の発現に使用されるものである。異種性のＤＮＡ配列はまた、インビボの宿主細胞中でまたはインビトロで、または無細胞インビトロ発現系で、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドなどの遺伝子産物の発現を指示するために設計された遺伝物質を有するベクターまたは発現構築物の一部であり得る。
【００２１】
本明細書で開示される：
変異RPL10をコードする組換えＤＮＡ配列を含む組換え真核細胞クローンであって、前記細胞は前記変異RPL10を発現するものであり、および、内因性RPL10 ＤＮＡ配列の発現はゲノムから除去されており、または、前記内因性RPL10の発現は発現抑制されており、または内因性RPL10 ＤＮＡ配列は変異RPL10をコードするように変更されている。
【００２２】
通常、変異RPL10タンパク質をコードする前記組換えＤＮＡ配列は、例えば配列番号２（ヒト）、配列番号３（マウス）、配列番号４（酵母）またはそのホモログのコンセンサスRPL10タンパク質配列と比較して、Ｉ33Ｖ、Ｅ66Ｇ、Ｉ70Ｍ、Ｉ70Ｌ、Ｒ98Ｓ、Ｒ98Ｃ、Ｈ123ＰおよびＱ123Ｐから選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。
【００２３】
特に、変異RPL10をコードする組換えＤＮＡ配列において、アミノ酸９８をコードするヌクレオチドトリプレットはセリンをコードするトリプレットに置き換えられている。
【００２４】
これらの真核細胞クローンにおいて、ＮＯＴＣＨ１シグナル伝達は、例えば配列番号５に示されるような活性化細胞なＮＯＴＣＨ１（ＮＯＴＣＨ１−ＩＣＮ）をコードするＭＳＣＶプラスミドを含むレトロウイルスベクターでの活性化細胞内ＮＯＴＣＨ１による形質導入によってさらに活性化され得る。実際、ＮＯＴＣＨ１は膜貫通タンパク質であり、それによって放出された細胞内部分はそれが転写因子として機能する核に移動することができる。配列番号６のような構築物は、ＮＯＴＣＨタンパク質分解プロセシングとは無関係であるため、それ自体活性である。
【００２５】
ＮＯＴＣＨ１の細胞内ドメインはＮＣＢＩ参照配列：NM_017617.4 (バージョン 11.12.2017)で見られるＮＯＴＣＨ１のヌクレオチド５２６０から７６６５によってコードされている。ＮＯＴＣＨ１の細胞内ドメインを含むタンパク質配列の態様は配列番号６に示され、該細胞内ドメインの配列は下線が施されている。二重下線の配列はＮＯＴＣＨ１の２２Ｎ末端アミノ酸である。
【００２６】
真核細胞株は例えば、CHO、COS、Vero、Hela、BHK、HEK293、Hek293T、Hek293S、Hek293FT、HKB-11、MEFおよびSp-2細胞株からなる群から選択される哺乳動物細胞株である。
【００２７】
本明細書では、Ｃａｓ９発現構築物またはＣａｓ９タンパク質を用いて真核細胞株を安定的または一過的にトランスフェクトし、および、Rpl10をターゲティングするｇＲＮＡおよびヒトでは配列番号２、マウスでは配列番号３、酵母では配列番号４に示される配列中の、Ｉ33Ｖ、Ｅ66Ｇ、Ｉ70Ｍ、Ｉ70Ｌ、Ｒ98Ｓ、Ｒ98Ｃ、Ｈ123ＰおよびＱ123Ｐからなる群から選択される変異をコードするドナーオリゴを用いてトランスフェクトすることを含む、ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ９システムを介した上記段落に記載の組換え真核細胞クローンを産生する方法も開示される。
【００２８】
本明細書は、変異RPL10をコードするレトロウイルスベクターでの形質導入および配列番号６に示されるRpl10をターゲティングするｓｈＲＮＡ構築物で形質導入することにより内因的に発現されるRpl10をノックダウンする、上記段落に記載の組換え真核細胞クローンを産生する方法も開示する。本明細書では、Ｃａｓ９発現構築物またはＣａｓ９タンパク質を用いて真核細胞株を安定的または一過的にトランスフェクトし、および、Rpl10をターゲティングするｇＲＮＡおよびＩ33Ｖ、Ｅ66Ｇ、Ｉ70Ｍ、Ｉ70Ｌ、Ｒ98Ｓ、Ｒ98Ｃ、Ｈ123ＰおよびＱ123Ｐからなる群から選択される変異をコードするドナーオリゴを用いてトランスフェクトすることを含むものであって、付加的にＮＯＴＣＨ１シグナル伝達はＮＯＴＣＨ１の活性化切断フォームをコードするＭＳＣＶプラスミドを有するレトロウイルスベクターで形質導入することによって活性化されるものである、ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ９システムを介した上記段落に記載の組換え真核細胞クローンを産生する方法も開示される。
【００２９】
本明細書では、Ｉ33Ｖ、Ｅ66Ｇ、Ｉ70Ｍ、Ｉ70Ｌ、Ｒ98Ｓ、Ｒ98Ｃ、Ｈ123ＰおよびＱ123Ｐからなる群から選択されるRPL10変異をコードするレトロウイルスベクターを介し、内因的に発現されるRpl10はRpl10をターゲティングする配列番号７に示されるｓｈＲＮＡ構築物での形質導入によってノックダウンされるものであり、付加的にＮＯＴＣＨ１シグナル伝達はＮＯＴＣＨ１の活性化切断フォームをコードするＭＳＣＶプラスミドを有するレトロウイルスベクターで形質導入することによって活性化されるものである、上記段落に記載の組換え真核細胞クローンを産生する方法も開示される。これらの組換え真核細胞クローンを産生する方法において、変異は通常Ｒ98Ｓである。
【００３０】
本明細書は、RPL10以外の第２の組換えタンパク質を産生する方法であって、前記方法は目的の前記第２の組換えタンパク質をコードする第２の組換えＤＮＡ配列でトランスフェクトされる上記段落に記載の組換え真核細胞クローンを培養すること、および、そのようにして産生された第２のタンパク質を回収することを含む、方法を開示する。本明細書は、真核細胞クローンのタンパク質産生効率を増大するための方法であって、前記方法は上記の方法のいずれかを用いて前記真核細胞クローンを形質転換することを含む、方法を開示する。
【００３１】
本発明は変異RPL10、典型的には、図１９に示されるヒトRPL10の番号付けに関する位置33、66、70、98、および123の１つまたは複数の変異を含む宿主細胞を使用する発現系に関する。
【００３２】
変異は、例えば変異位置33例えばＶａｌ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔへ、変異位置66例えばＧｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓへ、変異位置70例えばＶａｌ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔへ、変異位置98例えばＧｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓへの変異である。
より特異的な変異は、Ｉｌｅ33Ｖａｌ、Ｇｌｕ66Ｇｌｙ、Ｉｌｅ70ＭｅｔまたはＩｌｅ70Ｌｅｕ、Ａｒｇ98Ｓｅｒ、Ａｒｇ98Ｃｙｓ、Ｇｌｎ／Ｈｉｓ123Ｐｒｏである。
【００３３】
同等物は、組換えタンパク質の過剰発現の増加をもたらす、Ｉｌｅ33Ｖａｌ、Ｇｌｕ66Ｇｌｙ、Ｉｌｅ70ＭｅｔまたはＩｌｅ70Ｌｅｕ、Ａｒｇ98Ｓｅｒ、Ａｒｇ98Ｃｙｓ、Ｇｌｎ／Ｈｉｓ123Ｐｒｏ以外のRPL10の変異である。これは、野生型RPL10をトランスフェクトした細胞と変異RPL10をトランスフェクトした細胞との組換えタンパク質の発現を比較することによって試験することができる。点突然変異体とは別に、Ｎ末端、Ｃ末端および配列の内部のもう１つのアミノ酸の欠失は想定される。
【００３４】
宿主細胞において、内因性野生型RPL10 は１または複数の変異Ｉｌｅ33Ｖａｌ、Ｇｌｕ66Ｇｌｙ、Ｉｌｅ70ＭｅｔまたはＩｌｅ70Ｌｅｕ、Ａｒｇ98Ｓｅｒ、Ａｒｇ98Ｃｙｓ、123Ｐｒｏまたは同等物に変異される。そのかわり、野生型RPL10は、野生型RPL10遺伝子の発現抑制または野生型RPL10遺伝子の完全もしくは部分的欠失によって不活性化され、および突然変異Ｉｌｅ33Ｖａｌ、Ｇｌｕ66Ｇｌｙ、Ｉｌｅ70ＭｅｔまたはＩｌｅ70Ｌｅｕ、Ａｒｇ98Ｓｅｒ、Ａｒｇ98Ｃｙｓ、123Ｐｒｏまたは同等物を有するRPL10をコードする発現構築物が導入される。「同等物」は上記の方法で決定されるように増加した発現をもたらすそれらの突然変異である。
【００３５】
組換え発現の方法は、酵母細胞（例えば、サッカロミセス）、アスペルギルス、ピキア、昆虫細胞、藻類、植物細胞および植物、哺乳動物細胞（例えば、げっ歯類、非ヒト霊長類、ヒト）を含む様々な真核細胞において実施することができる。特定の態様は酵母以外の発現系である。市販の発現系が利用可能であり、宿主細胞は、特に新興のCrisp/Cas技術の観点から、導入遺伝子RPL10構築物のトランスフェクションおよび内因性RPL10の不活性化または変異のような修飾に適している。
【００３６】
無関係な生物間の高度に保存されたリボソームメカニズムおよびＲＰＬ１０の高い配列類似性は、例えば、ヒト細胞におけるマウスまたは酵母の変異RPL10の発現は、ヒト細胞におけるヒト変異RPL10の発現と同程度に有効であり得る、という可能性を高いものとする。通常、RPL10は宿主細胞と同じ生物に由来するであろう。変異RPL10は、上述のとおり、患者から単離された変異細胞株またはタンパク質発現に使用される細胞株（例えばＣＨＯ）であってよく、野生型RPL10が変異導入されるものである。変異RPL10が発現抑制または欠失されたRPL10を有する細胞に導入されるとき、変異RPL10はゲノムに組み込まれてもよく、またはプラスミド、ウイルスベクター、またはタンパク質発現のための任意の適切なベクター上に存在してもよい。変異RPL10は、誘導性プロモーターの制御下にあってもよく、または構成的に発現されてもよい。
【００３７】
本発明は変異RPL10をコードするヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ分子を発現する組換え真核細胞クローンの使用に関する。
【００３８】
RPL10の特異的変異は、マウス、酵母およびヒト細胞のRPL10 Ｉ33Ｖ、RPL10 Ｅ66Ｇ、RPL10 Ｉ70Ｍ、RPL10 Ｉ70Ｌ、RPL10 Ｒ98Ｃ、およびRPL10 Ｒ98Ｓからなる群のいずれか１つから選択される。
【００３９】
ある特定の態様において、組換え真核細胞クローンは、98番目がセリンをコードするトリプレットで置換されているアミノ酸をコードするヌクレオチドトリプレットを除いて配列番号１に示されるRPL10をコードするヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡ分子を発現する。
【００４０】
本発明の特定の態様において、組換えRPL10は栄養不足条件での生存特性を高め、翻訳忠実度に影響を与えることなくRPL10関連細胞増殖欠陥を救済するために機能亢進性ＮＯＴＣＨ１シグナル伝達と組み合わせられ、したがって、そのような組換え真核細胞を日常的な組換えタンパク質発現にはるかに適したものにする。さらに、RPL10 Ｒ98Ｓ関連増殖欠陥は、抗酸化剤、例えば５ｍＭ Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）の添加により救済することができる。ＮＡＣの適切な代替物は、例えばグルタチオンである。
【００４１】
本発明は、組換えRPL10 Ｒ98Ｓ細胞クローンであって、付加的にＮＯＴＣＨ１シグナル伝達が配列番号５に示されるＮＯＴＣＨ１の活性化切断フォームをコードするＭＳＣＶを有するレトロウイルスベクターで形質導入されることにより活性化されている、組換えRPL10 Ｒ98Ｓ細胞クローンを提供する。
【００４２】
真核細胞株はCHO、COS、Vero、Hela、HEK 293、HEK 293T、BHK、HKB-11、MEFおよび Sp-2細胞株からなる群から選択される、ありふれた哺乳動物細胞である。別の態様における真核細胞株は組換えRPL10を発現する、例えばLei (2013) Methods MolBiol1031:59-64によるＭＥＦ、動物モデルに由来する。
【００４３】
本発明は、ＣＲＩＳＰＲ −ＣＡＳ９システムを介して組換え真核細胞クローンを産生する方法を提供するものであり、Ｃａｓ９発現構築物またはＣａｓ９タンパク質を用いて真核細胞株を安定的または一過的にトランスフェクトすること、およびRpl10をターゲティングするｇＲＮＡおよびＲ98Ｓ修飾をコードするドナーオリゴを用いてトランスフェクトすることを含む。本発明は、Ｒ98Ｓ変異RPL10をコードするレトロウイルスベクターを用いた形質導入、およびRpl10ターゲティングする配列番号７に示されるｓｈＲＮＡ構築物での形質導入による内因的に発現されたRpl10のノックダウンを介する組換え真核細胞クローンを産生する方法を提供する。
【００４４】
本発明は、ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ９システムを介したRPL10 Ｒ98Ｓ組換え真核細胞クローンを産生するものであって、付加的にＮＯＴＣＨ１シグナル伝達がＮＯＴＣＨ１の活性化切断フォームをコードするＭＳＣＶを有するレトロウイルスベクターで形質導入されることにより活性化されている、方法を提供する。
【００４５】
本発明は、Ｒ98Ｓ変異RPL10をコードするレトロウイルスベクターおよび。Rpl10ターゲティングする配列番号７に示されるｓｈＲＮＡ構築物での形質導入による内因的に発現されたRpl10のノックダウンを介し、付加的にＮＯＴＣＨ１シグナル伝達を活性化する、組換え真核細胞クローンを産生する方法を提供する。
【００４６】
本発明は、目的のタンパク質でトランスフェクトされた組換え真核細胞クローンを増殖させ、そのようにして産生されたタンパク質を回収することを含む、組換え産物を産生する方法を提供する。
【００４７】
本発明の特定のそして好ましい態様は、添付の独立請求項および従属請求項に記載されている。従属請求項の特徴は、独立請求項の特徴および他の従属請求項の特徴と適宜組み合わせることができ、単に請求項に明示的に記載されているとおりではない。このように、詳細な説明に続く特許請求の範囲は、この詳細な説明に明白に組み込まれており、各請求項は、本発明の別々の態様としてそれ自体に基づいている。
【実施例】
【００４８】
実施例１: RPL10 Ｒ98Ｓ変異を発現する安定細胞モデルの作製
ｓｈＲＮＡ＋発現モデル
マウスリンパ系プロＢ細胞（Ｂａ／Ｆ３）を、標準的な方法に従って、ＷＴおよびＲ98Ｓ変異RPL10をコードするレトロウイルスベクターで形質導入した。これらのレトロウイルス構築物は以前に記載されていた(De Keersmaecker et al. (2013) 上記で引用)。RPL10 Ｒ98Ｓ欠損を含むＴ − ＡＬＬサンプルは変異RPL10のみを発現する (De Keersmaecker et al. (2013) 上記で引用) 。これを模倣するために、内因的に発現されたRpl10を、Rpl10ターゲティングｓｈＲＮＡ構築物での形質導入によってＢａ／Ｆ３細胞株においてノックダウンした。このｓｈＲＮＡ構築物を作製するために、マウスRpl10をターゲティングするｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ配列(AACCGACGATCCTATTGTCATC：配列番号７)を、ｐＭＳＣＶ−Ｎｅｏベクターに導入されたｍｉｒ３０カセットにクローニングした。内因性Rpl10を効率的かつ安定的にノックダウンした細胞を得るために、Ｃｌｏｎａｃｅｌｌ−ＴＣＳ培地（Stemcell technologies）中で増殖させた単一細胞コロニーから培養物を樹立した。ｑＰＣＲによって決定される、内因性Rpl10の９０％以上のノックダウンを有する培養物のみが保持された。RPL10 Ｒ98Ｓの発現および内因性Rpl10のノックダウンは、ｃＤＮＡのサンガー配列決定によって確認された（図１４）。
【００４９】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９モデル
RPL10 Ｒ98Ｓ点突然変異を発現する安定したＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ベースのモデルを作製するため、ジャーカット細胞（ＤＳＭＺ）をＪａｎＣｏｏｌｓ教授の研究室から譲受されたレンチウイルスＣａｓ９コードプラスミドであるｌｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９で形質導入した。これらのジャーカット細胞はRPL10ターゲティングｇＲＮＡ（5’-TCTTGTTGATG-CGGATGACG-3’［配列番号８］）を含むｐＸ３２１ベクター（Van der Krogt et al.(2017)Haematologica, 102, 1605-1616）およびＲ98Ｓ対立遺伝子を含む１２７ｎｔドナーオリゴならびにｇＲＮＡ−Ｃａｓ９複合体（5’-CCTGTCAGCCCCAGCACAGGACAACATCTTGTTAATGCTGATCACGTGAAAGGGGTGGAGCCGCACCCGGATATGGAAGCCATCTTTGCCACAACTTTTTACCATGTACTTATTGGCACAAATTCGGGCA-3’［配列番号９］；Integrated DNA Technologies）による再認識および切断を回避するための３つのサイレント変異でエレクトロポレーションされた（６方形波パルス、０．１ｍｓ間隔、１７５Ｖ）。エレクトロポレーション後、細胞を５００ｎＭ ＳＣＲ７（Sigma-Aldrich）の存在下で４８時間インキュベートし、続いて９６ウェルプレートに単一細胞選別（BD FACSAria I）を行った。増殖したクローンを拡大し、そしてＰＣＲ法を用いて所望の修飾についてスクリーニングした。Rpl10はＸ染色体上に位置し、そして我々のジャーカット細胞は１つのＸ染色体しか含んでいなかったので、対立遺伝子特異的プライマー(Fw_WT: 5’-CTTCCACGTCATCCGCATC-3’ ［配列番号１０］；FW_R98S:5’-CCTTTCACGTGATCAGCATT-3’［配列番号１１］；Rev_WTandR98S:5’-GCTCTGATAAAATAATGCAAGCCTA-3’ ［配列番号１２］)を用いてＰＣＲスクリーニングを行った。RPL10の状態を確認するためにサンガー配列決定を行った。
【００５０】
全く同一の戦略が他のヒト細胞株（例えばHek293細胞）にも適用可能である。
ｇＲＮＡおよびドナーオリゴの順応を条件として、マウスまたはハムスター系のＢａ／Ｆ３、ＣＨＯを作製することができる。同様に、Ｃａｓ９構築物に応じて、一過性のＣａｓ９発現またはＣａｓ９タンパク質のトランスフェクションが可能である。
【００５１】
実施例２：新たに合成されたタンパク質のレベルを決定するための代謝標識アッセイ
Ｃｌｉｃｋ−ｉＴテクノロジー(Thermo Fisher Scientific)はＢａ／Ｆ３細胞中の新たに合成されたタンパク質のレベルを測定するために用いられた。簡単に説明すると、200万個の細胞をメチオニン不含培地に1時間入れた後、35μＭ AHA (Ｌ−アジドホモアラニン)で2時間標識した。次いで細胞を溶解バッファー(Cell Signalling Technology)中で溶解し、そして、製造業者の説明書に従って、100μｇのタンパク質抽出物を使用してＣｌｉｃｋ−ｉＴビオチン結合反応を実施した。続いて、タンパク質をゲル電気泳動によって分離し、新たに合成されたタンパク質をストレプトアビジン−HRP抗体(Cell Signalling Technology)を用いた免疫ブロットによって検出した。
【００５２】
実施例３：GFP発現の解析
Ｂａ／Ｆ３ ｓｈＲＮＡ／過剰発現モデルにおいてRPL10 ＷＴまたはＲ98Ｓを発現させるために使用されるプラスミドは、ＩＲＥＳ−ＧＦＰ発現カセットを含む。このカセットの発現レベルは、ＧｕａｖａＥａｓｙｃｙｔｅＨＴ フローサイトメーター（Millipore）で平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定することによってモニターした。ジャーカット RPL10 ＷＴまたはＲ98Ｓ細胞については、GFP発現カセットをコードするプラスミドをエレクトロポレーションし、エレクトロポレーションの24時間後にＧｕａｖａ Ｅａｓｙｃｙｔｅ ＨＴ フローサイトメーター（Millipore）で平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定することによってこのカセットの発現レベルを決定した。
【００５３】
実施例４：ポリソーム解析
Ｂａ／Ｆ３細胞ペレットを氷冷100mM KCl、20 mMHepes（Life technologies）、10 mMMgCl2、1 mM DTT、1%デオキシコール酸ナトリウム、1% NP-40（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（登録商標）溶液、Sigma-Aldrich）、100μg ml-1シクロヘキシミド、1%ホスファターゼ阻害剤カクテル2（Sigma-Aldrich）、1%ホスファターゼ阻害剤カクテル3（Sigma-Aldrich）、1%プロテアーゼ阻害剤カクテル（Sigma-Aldrich）、400 U ml-1 RNasin（Promega）で溶解した。氷上で10分間インキュベートした後、溶解物を13,000 rpmで5分間遠心分離し、得られた上清を10〜60%スクロース密度勾配（100mMKCl、20 mM Hepes、10 mM MgCl2）にロードした。次いで勾配をSW40Tiローター（Beckman Coulter）中で37,000 rpmで150分間遠心分離し、BioLogic LPシステム（BIO-RAD）でのライブOD 254 nm測定、続いて12画分の収集を通してポリソーム画分をモニターした。これらの画分のそれぞれからRNAを抽出し、画分全体にわたる特定のmRNAの分布をqPCRによって分析した。
【００５４】
実施例５：翻訳忠実度アッセイ
プログラムされた−１リボソームフレームシフト（−１ ＰＲＦ：Programmed -1 ribosomal frameshifting）アッセイ
二重ルシフェラーゼアッセイ (Promega)、および統計計算は前述のとおり（Grentzmann et al. (1998) RNA 4, 479-486 ; Harger and Dinman(2003)RNA 9, 1019-1024; Jacobs and Dinman (2004) Nucleic acids Res. 32, e160）行なった。簡単に説明すると、野生型および変異型Ｂａ／Ｆ３細胞をｍｏｃｋエレクトロポレーションまたは、上流のウミシイタケと下流のホタルルシフェラーゼのオープンリーディングフレームの間のヒトIL7R遺伝子由来のインフレームコントロール、アウトオブフレームコントロール、もしくは−１ ＰＲＦシグナルを有するプラスミドを用いてエレクトロポレーションした（図１）（Belew, A.T. et al. (2014) Nature 512, 265-269）。構築物を含む−１ ＰＲＦでは、ホタルルシフェラーゼタンパク質の産生はフレームシフト事象に依存している。
指数関数的減衰プロトコル（300V、950μＦ）を用いて4 mmキュベット中の400μｌの無血清培地中の15μｇの各プラスミドで３００万個の細胞をエレクトロポレーションし、そして直ちに4ｍｌの予熱した回収培地(10% FBS、IL3、ピルビン酸ナトリウムおよびＭＥＭ非必須アミノ酸)に移した。２４時間後、細胞を100μｌの溶解バッファー中で溶解し、そして２つのインジェクターを備えたＥｎＳｐｉｒｅプレートリーダー(PerkinElmer)上の96ウェルの半分の面積の白いプレート（１回の読み取りあたり10μｌの溶解物）中でルシフェラーゼの読み取り値を収集した。フレームシフト割合は、インフレームコントロール構築物を含有する対応する細胞におけるホタル／ウミシイタケシグナル比によって、−１ＰＲＦ構築物またはアウトオブフレームコントロールを含む細胞中のホタル／ウミシイタケシグナル比を割ることによって決定された。
【００５５】
ナンセンスおよびミスセンスサプレッションアッセイ
ナンセンスサプレッションアッセイは、ストップコドンがウミシイタケとホタルルシフェラーゼ遺伝子の間に導入されることを除き上記と同じ方法で実行される。そのような構築物では、ホタルルシフェラーゼタンパク質の産生は、ストップコドンリードスルー事象に依存する（図２）。
【００５６】
ミスセンスサプレッションは、ホタルルシフェラーゼ活性部位中のＲ218Ｓ一塩基置換を含む構築物を用いることによってアッセイされる。そのような構築物では、ホタルルシフェラーゼの活性は、同族のセリンの代わりに近同族のアルギニンの取り込みに依存する（図２）。
【００５７】
実施例６：プロテアソーム活性アッセイ
プロテアソーム活性はキットに付属のマニュアルに従い、プロテアソームグロキモトリプシン様、トリプシン様およびカスパーゼ様細胞ベースアッセイ（Promega）を用いてRPL10 ＷＴまたはＲ98Ｓを発現するＢａ／Ｆ３およびジャーカット細胞で試験された（図５）。
【００５８】
実施例７： RPL10 Ｒ98Ｓ変異は翻訳効率を増大する
リボソーム機能に対するRPL10 Ｒ98Ｓの効果を特徴付けるため、我々は最初に、全ての細胞タンパク質における標識アミノ酸の取り込みを測定するアッセイを用いて、新しく合成されたタンパク質の細胞レベルを調べた。これらの実験は、RPL10 Ｒ98Ｓを発現するＢａ／Ｆ３細胞が、RPL10 ＷＴ細胞と比較した場合、25％多い新規タンパク質を産生することを示した（図３Ａ）。これと一致して、我々のRPL10発現構築物中に存在するGFPレポーターの発現は、RPL10 Ｒ98Ｓ発現細胞においてより高かった(RPL10 ＷＴ細胞において１３５８の平均MFI対RPL10 Ｒ98Ｓ細胞において２１５４；図３Ｂ、左)。同様に、GFPレポータープラスミドでエレクトロポレーションしたジャーカット細胞は、RPL10 Ｒ98Ｓ発現時にGFPMFIの上昇を示した（RPL10 ＷＴ細胞において２１７４の平均MFI対RPL10 Ｒ98Ｓ細胞において３７６４；図３Ｂ、右）。検出されたタンパク質のこの増加は、リボソームによるタンパク質翻訳の上方制御に起因し得る。これと一致して、Ｂａ／Ｆ３細胞を発現している変異体は、下方制御されたリン酸化−ｅＩＦ２αレベルを示す（図３Ｃ）。翻訳効率の上方制御は、分析されたすべての転写物がＢａ／Ｆ３細胞上でのポリソームプロファイリング実験においてより高いポリソーム画分に向かってシフトしたことによりさらに支持され、翻訳効率の一般的な増加を示した（図３Ｄ）。
【００５９】
実施例８： RPL10 Ｒ98Ｓ Ｂａ／Ｆ３細胞は増大した翻訳忠実度を示す
RPL10Ｒ98Ｓ変異がリボソームによる翻訳忠実度に影響するかどうかを確かめるため、ホタルの活性がアミノ酸の取り込みの忠実度、ストップコドンの読み取り、またはプログラムされた−１リボソームフレームシフトに依存する、二重ルシフェラーゼレポーターアッセイを実施した（上記方法の図参照）。RPL10 Ｒ98Ｓ発現細胞は、３つ全てのアッセイにおいて正規化されたホタル活性の７０〜８０％の減少を示し、より高い翻訳精度を示した（図４）。
【００６０】
実施例９： RPL10 Ｒ98Ｓ細胞は減少したタンパク質分解を示す
細胞のタンパク質の分解におけるRPL10 Ｒ98Ｓに関連したリボソーム機能の変化に影響があるかどうかを調べるために、プロテアソームの３つの主要なプロテアーゼ活性を、RPL10 ＷＴ対Ｒ98Ｓ細胞において分析した。RPL10 Ｒ98Ｓ Ｂａ／Ｆ３細胞は、ＷＴと比較して、プロテアソームのキモトリプシン様およびカスパーゼ様活性の28%および23%の減少を示した（図５、上）。同様に、RPL10 Ｒ98Ｓ発現ジャーカット細胞は、ＷＴと比較してプロテアソームキモトリプシン様およびカスパーゼ様活性の17%および25%の減少を示した（図５、下）。
【００６１】
実施例１０：機能亢進性ＮＯＴＣＨ１シグナル伝達は翻訳忠実度に影響することなくRPL10 Ｒ98Ｓ関連細胞増殖欠陥を救済する
ＮＯＴＣＨ１の活性切断型（細胞内ＮＯＴＣＨ−ＩＣＮ）（配列番号５）、それに続くＩＲＥＳ配列およびｍＣｈｅｒｒｙレポーターまたはｍＣｈｅｒｒｙ単独のいずれかをコードするＭＳＣＶプラスミドを有するレトロウイルスベクターをRPL10 ＷＴおよびＲ98Ｓ 発現Ｂａ／Ｆ３細胞に形質導入した。ｍＣｈｅｒｒｙについて選別した後、細胞を１００，０００細胞／ｍｌでプレーティングし、細胞数を２４時間毎にＧｕａｖａＥａｓｙｃｙｔｅＨＴフローサイトメーター（Millipore）で計数した。ＩＣＮ−ＩＲＥＳ−ｍＣｈｅｒｒｙまたはｍＣｈｅｒｒｙ構築物を有するRPL10 ＷＴおよびＲ98Ｓ細胞における翻訳忠実度を上記のとおりアッセイした。
【００６２】
対数増殖期において、変異RPL10 Ｒ98Ｓ Ｂａ／Ｆ３細胞は野生型細胞と比較して明らかな増殖欠陥を示す（図６Ａ）。ＮＯＴＣＨ−ＩＣＮの外因性添加は、野生型細胞の増殖速度に影響を及ぼさなかったが、変異細胞の増殖欠陥を救った（図６Ａ）。しかしながら、変異細胞の増殖欠陥がＮＯＴＣＨ−ＩＣＮで救済された一方で、それらの翻訳の変化および増大したリボソームの正確さはそのままだった。
【００６３】
実施例１１：Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）での処理はRPL10 Ｒ98Ｓ関連増殖欠陥を救済する
RPL10 ＷＴ および Ｒ98Ｓ発現Ｂａ／Ｆ３細胞を0.25x106 細胞／ｍｌでプレーティングし、５ｍＭ Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）の存在下または非存在下の対数増殖条件下で４８時間増殖させた。比色ホルマザン産生を光学濃度測定によって測定するＭＴＳ細胞増殖アッセイを細胞数の読み出しとして使用した。Ｒ98Ｓ Ｂａ／Ｆ３細胞はより低いＯＤ値を示し、ＮＡＣの非存在下でのＷＴ細胞と比較して細胞数の減少を示した（指数関数的増殖条件における増殖欠陥のため）。これらの減少した細胞数は５ｍＭのＮＡＣの添加により完全に救済された（図２１）。
実施例１０および１１はRPL10変異構築物の発現に関連する増殖欠陥は、ＮＯＴＣＨ１−ＩＣＮ対立遺伝子の発現によってまたはＮＡＣのような抗酸化剤の添加によって救済することができることを支持するものであり、これらの操作はタンパク質発現に良い影響を与えることを示唆する。
【００６４】
実施例１２：RPL10 Ｒ98Ｓコンディショナルノックインマウスモデル
コンディショナルRpl10 Ｒ98Ｓノックインマウス系統（RPL10cKI Ｒ98Ｓ）の作製は会社PolygeneAG（リュムランク、スイス )で実施された。このモデルにおいて、エクソン５から７までを包含するRpl10の野生型ゲノム領域は、loxP部位に隣接していた。このカセットの下流に、Ｒ98Ｓ変異をコードするエクソン5の変異型を配置した（図７、ターゲティング対立遺伝子RPL10cKI R98S）。この構成では、Ｃｒｅリコンビナーゼ媒介組換えの前に、Snora70を含むその野生型イントロンを含む野生型遺伝子が発現される。Ｃｒｅ組換え後、ゲノム配置は、残っているｌｏｘＰ部位、および導入されたＲ98Ｓ点突然変異を除いて、野生型と同一である（図７、Cre RPL10cKIR98S）。
【００６５】
ターゲティングベクターを作製するために、Ｃ５７Ｂｌ／６由来のＢＡＣ由来の相同性アームをサブクローニングし、３つの発現抑制変化でスパイクされたエクソン５〜７を包含するRpl10ゲノム配列を含有する合成１２９３ｂｐｌｏｘＰ隣接カセットを使用した。細胞培養における選択のために、ｌｏｘＰ部位の上流、ＦＲＴ隣接ネオマイシン選択カセットを加えた。相同アームは、2.5および3.2 kbpのサイズを有した。Ｃ５７Ｂｌ／６Ｎ由来ＥＳ細胞（PolyGene AG）のターゲティングは、３８８個のクローンのうち８個のクローンを生じ、正しい配置を有することがＰＣＲおよびサザンハイブリダイゼーションによって確認された。Ｃ５７Ｂｌ／６ｇｒｅｙ由来胚（PolyGene AG）へのこれらのクローンの胚盤胞マイクロインジェクションは、Ｃ５７Ｂｌ／６ｇｒｅｙ Ｆｌｐ欠失マウスと交配した後に生殖系列に伝達するキメラマウスをもたらした。Ｎｅｏがない（Neo-less）正しいヘテロ接合Ｆ１遺伝子型をＰＣＲによって検証した。
【００６６】
Rpl10 Ｒ98ＳコンディショナルノックインマウスはMX-Cre C57Bl/6マウス（B6.Cg-Tg(Mx1-cre)1Cgn/J系統 Jackson Laboratories）と交雑された。記載された実験に関し、系統ネガティブ細胞（lineage negative cells）を、MX-Cre対立遺伝子（MX-Cre Rpl10cKI R98S）と共にコンディショナルRpl10 Ｒ98Ｓ対立遺伝子を有する６〜８週齢のオスのマウスからおよびコンディショナルRpl10 Ｒ98Ｓコントロール（Rpl10cKIR98S）から単離した（ＥａｓｙＳｅｐマウス造血前駆細胞濃縮キット、StemcellTechnologies）。コンディショナルRPL10 Ｒ98Ｓ対立遺伝子の組換えを誘導するために、1250ユニット／ｍｌのIFNβ（R&Dsystems）を含むMethocult GFM3534培地（StemcellTechnologies）中に2000細胞／ｍｌでウェルにプレーティングされた。１０〜１５日後、細胞を収集し、5 mM Na3VO4およびプロテアーゼ阻害剤（Complete、Roche）を添加した溶解バッファー中で溶解させ、免疫ブロッティングによって分析した。Cre組換えの際のＲ98Ｓ変異の発現は、Rpl10 Ｒ98をコードする領域のｃＤＮＡのサンガー配列決定により確認された。
【００６７】
コンディショナルRpl10 Ｒ98Ｓノックインマウスモデルに由来するマウス造血細胞において、Csf2rb/2、Jak1、Stat3、Stat5、およびErkでタンパク質発現および／またはリン酸化の上昇が確認された（図８）。
【００６８】
実施例１３： 栄養不良な過成長条件下でRPL10 Ｒ98Ｓ細胞は生存の増強を示す
培地をリフレッシュせずにRPL10 ＷＴ および Ｒ98Ｓ発現Ｂａ／Ｆ３細胞を５日間培養した。この過成長条件で、Ｂａ／Ｆ３ RPL10 Ｒ98Ｓ細胞は、RPL10 ＷＴ細胞と比較して生存上の利点を示した（図２０Ａ）。対数増殖期のRPL10 Ｒ98Ｓ細胞の増殖欠陥による残存栄養分の差とは無関係に、この延命効果が独立していることを確かめるため（De Keersmaecker et al. (2013) 上記で引用）、RPL10 ＷＴおよびＲ98Ｓ Ｂａ／Ｆ３細胞を過成長させたＷＴ Ｂａ／Ｆ３細胞由来の栄養欠乏馴化培地中で培養したところ、RPL10Ｒ98Ｓ細胞の生存上の利点はさらに強化された（図２０Ｂ）。
同様に、過成長条件のRPL10 Ｒ98Ｓ発現ジャーカット細胞（５日間培地交換なし）はRPL10 ＷＴ発現ジャーカット細胞より強化された生存力を示した（図２０Ｃ）。
【００６９】
本実施例は、変異RPL10を有する細胞がストレス条件下で生存においてさらに良い可能性を有することを示す。タンパク質発現のためのRPL10変異を有する細胞の使用は、予想され得るより高いバイオマスの観点から、より高いタンパク質収量を与えると予想される。この利点は、細胞にかなりの代謝負担をかける発現構築物のタンパク質の合成などのストレス条件下でさらに顕著になると予想される。
【００７０】
実施例１４： Ｔ細胞白血病関連リボソームRPL10 Ｒ98Ｓ変異はJAK-STATシグナル伝達を増強する
【００７１】
定量的プロテオミクス
ＷＴまたはＲ９８Ｓ RPL10を発現する３つのモノクローナルＢａ／Ｆ３培養物由来の細胞を、5 mM Na3VO4およびプロテアーゼ阻害剤（Complete、Roche）を添加して溶解バッファー（Cell SignallingTechnology）中で溶解した。Ｂｒａｄｆｏｒｄ法によって測定された２０μｇのタンパク質を、補足的方法に記載されているとおり定量的プロテオミクスのために処理した。同定されたタンパク質の全リストをlog 2倍変化に従ってランク付けし、そしてMSigDB C2 KEGG遺伝子セットに対するGSEAの入力として使用した（Subramanian A. & TamayoP.(2005) Proc Natl Acad Sci USA. 103, 155545-155550、MoothaVK.et al. (2003) Nat Genet. 34, 267-273）。FDR q値＜０．２５のGSEA結果のみを考慮した。
【００７２】
プログラムされた−１ リボソームフレームシフト（−１ ＰＲＦ）アッセイ
二重ルシフェラーゼアッセイ（Promega）、および統計計算は以下のようにして行った。簡単に説明すると、Ｈｅｋ２９３Ｔ細胞またはＢａ／Ｆ３細胞はインフレームコントロール、アウトオブフレームコントロール、もしくは上流ウミシイタケと下流ホタルルシフェラーゼオープンリーディングフレーム間の−１ ＰＲＦシグナルを有するプラスミドでトランスフェクトされた（図１）。本アッセイのさらなる詳細については実施例５に記載されている。
【００７３】
定量的プロテオミクス
ＷＴまたはＲ98Ｓ RPL10のいずれかを発現する３つのモノクローナルＢａ／Ｆ３培養物由来の細胞を、5 mM Na3VO4およびプロテアーゼ阻害剤（Complete、Roche）を添加して溶解バッファー（Cell SignallingTechnology）中で溶解した。ブラッドフォード法により決定された２０μｇのタンパク質を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Bio-Rad）にかけ、そしてSimply Blue Safe Stain（Invitrogen）を用いてクマシー染色した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのレーン全体を小片にスライスし、タンパク質をＴｒｙｐｓｉｎ／ＬｙｓＣＭｉｘ（Promega）を使用して一晩消化する前に還元アルキル化した。得られたペプチドを抽出し真空乾燥した。ペプチドをC18 StageTipsで脱塩し、各サンプルをSCX StageTipsを使用して分画した。全てのフラクションを質量分析の前に再度真空乾燥した。LC MS/MS分析のために、ペプチドを再懸濁し、Orbitrap Q Exactive質量分析計（Thermo Fischer Scientific）とインライン接続したDionexUltimate3000 RSLC nanoUPLCシステムでの逆相クロマトグラフィーにより分離した。ヒトRL10Ｒ98Ｓタンパク質（Uniprot Accession:P27635）およびマウス参照プロテオーム（UniProt release 2015_04; 45182sequences）からなる自家製データベースに対してProteome Discoverer v.1.4のMascot 2.3（Matrix Science）、MS-AmandaおよびSEQUESTを使用してデータベース検索を行った。すべての検索は、トリプシン切断特異性を用いて行われ、最大２回の切断ミスが許容され、そして前駆体について１０ｐｐｍのイオン質量許容誤差およびフラグメントについて０．０５Ｄａのイオン質量許容誤差で行われた。カルバミドメチル化を固定修飾として設定し、酸化（Ｍ）、アセチル化（タンパク質Ｎ末端）、リン酸化（ＳＴＹ）は、可変修飾として考慮した。質量分析データのさらなる処理は、定量値（正規化総スペクトル）設定を使用するＳｃａｆｆｏｌｄ４ソフトウェア（Proteome Software）で行われた。教師なし平均連鎖階層的クラスタリングは、類似性計量としてユークリッド距離を用いたＩＢＭＳＰＳＳ２３．０で行われた。同定されたタンパク質の全リストをlog 2倍変化に従ってランク付けし、そしてMSigDB C2 KEGG遺伝子セットに対するGSEAの入力として使用した。FDR q値<0.25の1,2GSEA結果のみが考慮された。
【００７４】
ポリソームおよび全mRNAの配列決定
ＷＴまたはＲ98Ｓ RPL10のいずれかを発現する３つのモノクローナルＢａ／Ｆ３培養物のそれぞれについて、最大３つのポリソームおよび全ＲＮＡ配列決定ライブラリーを作製した。遠心分離（５分、１５００ｒｐｍ）によって１５×１０６個の細胞をペレット化し、そして、氷冷中１００ｍＭＫＣｌ、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（Life technologies）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ ２、１ｍＭＤＴＴ、１％デオキシコール酸ナトリウム、１％ＮＰ−４０（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ溶液、Sigma-Aldrich）、１００μｇ ｍｌ−１  シクロヘキシミド、１％ホスファターゼ阻害剤カクテル２（Sigma-Aldrich）、1％ホスファターゼ阻害剤カクテル３（Sigma-Aldrich）、１％プロテアーゼ阻害剤カクテル（Sigma-Aldrich）、１００Ｕ ｍｌ−１ ＲＮａｓｉｎ（Promega）で溶解した。氷上で１０分間インキュベートした後、溶解物を１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、得られた上清を１０〜６０％スクロース密度勾配（１００ｍＭＫＣｌ、２０ｍＭＨｅｐｅｓ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２）にロードした。次いで勾配をＳＷ４０Ｔｉローター（BeckmanCoulter）中で３７，０００ｒｐｍで１５０分間遠心分離し、ポリソーム画分をＢｉｏＬｏｇｉｃＬＰシステム（Bio-Rad）でのライブＯＤ２５４ｎｍ測定を通してモニターした。ポリソーム画分をフラクションコレクター２１１０（Bio-Rad）で収集し、続いてプロテイナーゼＫ（５０μｇ／ｍｌ）を添加し、そして３７℃で３０分間インキュベートした。ＮａＯＡｃ３Ｍ、ｐＨ５．５（１／１０容量）を加え、続いて７０％エタノールでの追加の洗浄工程を含めてフェノール／クロロホルム法を用いてＲＮＡ抽出した。TruSeqストランドmRNAサンプル調製キット（Illumina）を用いて全RNAおよびポリソームRNAから次世代シークエンシングライブラリーを作製し、50-bpシングルリードプロトコルを用いてNextSeq装置（Illumina）でシークエンスした。リボソームRNAおよびtRNAの混入を計算により除去し、残りのリードをMus_musculus GRCm38.76.6で定義されるトランスクリプトームを用いたmm10マウス参照ゲノム（GRCm38）にTophat v2.0.11により整列させた。独自にそして高品質（mapqual>10）でマッピングされたリードのみがさらなる分析のために保持された。遺伝子発現は、エクソンマップされた読み取りから推定され、それはユニオンモードでHTSeqカウントを使用してカウントされた。
【００７５】
DESeq 2 Rパッケージ8を全RNAに適用して、Ｒ98Ｓ条件とＷＴ条件の間の転写の有意差を確認した（FDR <0.1）。
【００７６】
各遺伝子についてそして各条件内で、翻訳効率（ＴＥ）を、ポリソーム関連ｍＲＮＡ数と全ｍＲＮＡ数との間の比として推定した。Ｒ98Ｓ条件とＷＴ条件との間のＴＥの差は、ＴＥ（Ｒ98Ｓ）対ＴＥ（ＷＴ）比として計算した。Babel Rパッケージ9を使用して、Ｒ98Ｓ条件とＷＴ条件の間で検出されたＴＥの差の統計的有意性を推定した。この方法は、ポリソームmRNAレベルがそれらの全mRNAレベルによって十分に説明されていない遺伝子を同定するために、ポリソームmRNA数および全mRNA数の回帰モデルを構築する。
【００７７】
結果
4％のタンパク質がRPL10 Ｒ98Ｓ細胞において有意に変化した発現レベルを示す
RPL10 Ｒ98Ｓ変異がT-ALL発生に寄与するメカニズムへの洞察を得るために、我々は、RPL10 Ｒ野生型（ＷＴ）とRPL10 Ｒ98Ｓ（Ｒ98Ｓ）発現細胞との間で差次的に発現するタンパク質についてスクリーニングした。これらの実験は、発癌研究のための確立された造血モデルであるマウスｐｒｏ−Ｂ Ｂａ／Ｆ３細胞株で行われた。無標識の定量的プロテオミクスアプローチを使用して、5557個の最も高度に発現されたタンパク質の存在量を比較し、教師なし階層的クラスタリングは、ＷＴおよびＲ98Ｓサンプルが2つの独立したクラスターに分類されることを示した（図９Ａ）。96%（5311/5557）のタンパク質がＷＴサンプルとＲ98Ｓサンプルとの間で有意に変化しなかったのに対して、3%（178）はＲ98Ｓサンプルにおいて有意に上方制御され、そして1%（68）は有意に下方制御された（図９Ｂ）。遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）は、Ｒ98Ｓ細胞中の過剰発現タンパク質の多くが細胞代謝、シグナル伝達、および免疫系の機能の経路に適合することを明らかにした。対照的に、DNA複製および修復、転写および翻訳などの必須の細胞プロセスに関連するタンパク質は、変異細胞において下方制御されていた（図９Ｃ）。したがって、RPL10 Ｒ98Ｓ細胞は、4%のタンパク質の発現変化を示し、いくつかの既知の癌関連プロセスの差次的発現を示した。
【００７８】
RPL10 Ｒ98Ｓ細胞は高レベルのJak-Statシグナル伝達メディエーターを発現する
プロテオームデータのＧＳＥＡ結果の分析は、RPL10 Ｒ98Ｓ細胞における上方制御されたタンパク質の中のJAK-STAT経路メンバーの濃縮を明らかにした（図１０Ａ、左）。T-ALLの病因および癌全般におけるJAK-STAT経路の重要性のために、これらの結果はより詳細な調査を促した。３つのＪａｋキナーゼ（Jak1、Jak3およびTyk2）が質量分析スクリーンにおいて検出され、そのうちのJak1はＲ98Ｓ細胞において有意に1.9倍の上方制御を示した（図１０Ａ、右）。検出可能な５つのStatタンパク質のうち、Stat2のみが変化しなかった。他の全てはＲ98Ｓ細胞における上方制御の傾向があり、Stat6は統計的に有意な増加を達成した。質量分析データはまた、Csf2rbおよびCsf2rb2タンパク質の2〜3倍の有意な上方制御を明らかにした。Csf2rb2はIL3、IL5、およびGM-CSFの受容体の共通のβ鎖に対応し、Csf2rb2はマウスのIL3受容体特異的なβサブユニットである（Hara T, Miyajima A. (1992) EMBOJ.11, 1875-1884）。IL3、IL5およびGM-CSFシグナル伝達は全てJAK-STATを介して媒介される。JAK-STATシグナル伝達は、Piasタンパク質、Socタンパク質、およびPtprcやPtpn2などのホスファターゼを含む負の調節因子を介して厳密に制御されている（Van Vlierberghe P. (2012) J Clin Invest. 122, 3398-3406）。質量分析データの中ではPtprcおよびPtpn2のみが検出可能であり、PtprcはＲ98Ｓ細胞において有意に下方制御されていた（図１０Ａ、右）。Jak-Statカスケードタンパク質の免疫ブロット分析は、Ｒ98Ｓ細胞において、Csf2rbおよびCsf2rb2、Jak1、Stat1、Stat3、Stat5a、Stat5b、Stat6の上方制御、Ptprcの下方制御およびPtpn2の無変化を確認した（図１０Ｂ）。免疫ブロットによってTyk2およびJak3について一貫した変化が検出されなかったので、これらはさらなる分析において考慮されなかった。Csf2rb/2、Stat5aおよびPtprcについて検出されたタンパク質変化は、mRNAレベルの対応する変化と関連していたが、他の遺伝子の転写物はＲ98Ｓ細胞において変化しなかった（図１０Ｃ）。
【００７９】
RPL10 Ｒ98Ｓ T-ALL患者サンプルはJAK-STATカスケードの発現が上昇している
異種移植T-ALL患者サンプル由来のタンパク質溶解物の免疫ブロッティングは、RPL10 Ｒ98Ｓ変異T-ALLサンプルにおけるJAK1（2.1倍）およびSTAT5（4倍）の発現の上昇を確認した（図１３Ａ〜Ｂ）。これらの患者サンプルのどれも、IL7R-JAK-STAT変異を含んでいなかった。IL3受容体はT-ALLサンプルでは発現されない。そのかわり、IL7受容体は正常なＴ細胞発生およびT-ALLにおいて重要である（Ribeiro D et al (2012). Adv. Boil. Reg. 53, 211-222）。IL7RA鎖の発現は、RPL10 ＷＴサンプルと比較して、RPL10 Ｒ98Ｓ T-ALLサンプルにおいて3.7倍上方制御された（図１１Ａ〜Ｂ）。
【００８０】
RPL10 Ｒ98Ｓは、いくつかのJAK-STAT経路mRNA上のプログラムされた−１リボソームフレームシフトを減少させる
我々は次に、特定のJAK-STAT過剰発現に寄与している可能性がある細胞メカニズムを調べた。このプロセスでは、シス作用性mRNAエレメント（−１ ＰＲＦシグナル）が翻訳リボソームにmRNAを5’方向に１塩基スリップさせるように指示し、新しいリーディングフレームを確立する。哺乳動物細胞において、このような−１ ＰＲＦ事象は、リボソームの翻訳を早すぎる終止コドンに向かわせ、−１ ＰＲＦシグナル含有ｍＲＮＡの不安定化をもたらす（Klare N. et al. (2007) J Mol Biol.373, 1-10; Advani VM & DinmanJD (2015) Bioessays. 38, 21-26）。−１ ＰＲＦはこのように遺伝子発現を微調整するメカニズムとして機能し、インシリコアルゴリズムはヒト遺伝子の約10％が−１ ＰＲＦシグナルを含むと予測する（Belew et al. (2014) 上記で引用；Advani et al. 上記で引用）。我々は最近、IL7RA鎖を含むいくつかのサイトカイン受容体が機能的な−１ ＰＲＦシグナルを含むことを示した（Belew et al. (2014) 上記で引用）。JAK-STATタンパク質発現におけるRPL10 Ｒ98Ｓ関連の差異が−１ ＰＲＦ率の変化によって影響を受ける可能性があるかどうかを試験するために、JAK-STAT経路を最初に予測−１ ＰＲＦシグナルについてインシリコでスクリーニングした。−１ ＰＲＦシグナルを含むと予測されるヒト遺伝子の１０％以内で、ＧＯ（p=0.00056）およびＫＥＧＧ（p=0.0031）の両データベースを用いたJAK-STAT経路はそのような予測シグナルについて濃縮されたことが濃縮解析で明らかになった。具体的には、他の経路における平均14.8%と比較して、JAK-STAT経路における遺伝子の３０％が−１ ＰＲＦシグナルを含むと予測される（図１２Ａ）。RPL10 Ｒ98Ｓが異なるタンパク質レベルに関連することが観察されたいくつかのヒトおよびマウスJAK-STAT経路メンバーは、そのような予測された−１ ＰＲＦシグナルを含んでいた。二重ルシフェラーゼレポーター構築物を用いてこれらのシグナルのフレームシフト促進活性を検証した（図１）（Jacobs & Dinman et al. (2004) 上記で引用）。いくつかのマウスおよびヒトの配列によって促進される−１ ＰＲＦの効果のある割合が、ヒトHek293T細胞（図１５）およびマウスＢａ／Ｆ３細胞（図１２Ｂ〜Ｃ）において確認された。
【００８１】
興味深いことに、マウスStat遺伝子におけるシグナルによって誘導されたフレームシフトレベルは、Ｒ98Ｓ細胞において３〜６倍減少した（図１２Ｂ）。これとは対照的に、マウスJak1 −１ ＰＲＦシグナルによって誘導された高レベル（15%）のフレームシフトは、Ｂａ／Ｆ３細胞におけるＲ98Ｓ変異によって影響されなかった（図１２Ｂ）。IL7RAおよびJAK1 mRNAにおけるヒト−１ ＰＲＦシグナルによって誘導されるフレームシフト率の1.5倍および2倍の減少が、Ｒ98Ｓ変異を発現する細胞において観察された（図１２Ｃ）。要約すると、我々はいくつかのマウスおよびヒトのJAK-STAT遺伝子において機能的な−１ ＰＲＦシグナルを同定し、そのうちのいくつかのフレームシフトレベルはRPL10 Ｒ98Ｓ変異によって影響された。
【００８２】
RPL10 Ｒ98Ｓ細胞は変化したプロテアソーム活性を示す
タンパク質レベルの変化にもかかわらず、フレームシフトレベルがRPL10 Ｒ98Ｓによる影響を受けない−１ ＰＲＦシグナル（Jak1）があったので、フレームシフト率の変化はJak-Statカスケードの上方制御を部分的にしか説明できない。また、我々の計算ツールは、タンパク質レベルでの変化が観察された他のタンパク質のいくつかをコードするmRNA中の−１ ＰＲＦシグナルを同定することができなかった。マウスStatタンパク質のレベルの変化もまた、−１ ＰＲＦ単独の変化によっては完全に説明されない可能性が高い。Csfr2b/2、Stat5aおよびPtprcについて検出された転写変化（図１０Ｃ）は、検出されたタンパク質変化を部分的に説明するかもしれず、我々は翻訳または翻訳後レベルで追加の潜在的な制御を検討した。Ｂａ／Ｆ３細胞モデルにおけるポリソームＲＮＡ配列解析は、Csf2rb/2、JakまたはStatmRNAの有意に変化した翻訳効率を明らかにしなかった（示さず）。興味深いことに、質量分析データは、免疫プロテアソームに特異的な触媒サブユニットであるPsmb10の上方制御を含む、Ｒ98Ｓ細胞における（p<0.05）いくつかのプロテアソームタンパク質の上方および下方制御を明らかにした（示さず）。別の免疫プロテアソーム特異的触媒サブユニットであるPsmb9および Psmb10の上方制御は、両方の利用可能なマウス造血細胞モデル由来の免疫ブロット上で確認された（図１３Ａ〜Ｂおよび図１６）。これに照らして、プロテアソーム活性をアッセイした。Ｒ98Ｓ Ｂａ／Ｆ３細胞は、プロテアソームのキモトリプシン様およびカスパーゼ様活性の28%および23%の減少を示した（図１３Ｃ）。これらの観察と一致して、Ｒ98Ｓ細胞は、プロテアソーム阻害剤ボルテゾミブ、カルフィルゾミブおよびＭＬＮ９７０８に対してより感受性であった（図１３Ｄ）。興味深いことに、この変化したプロテアソーム活性は、総タンパク質ポリユビキチン化における差異を伴わなかった（図１７）。しかしながら、翻訳阻害剤シクロヘキシミドで処理した後の追跡実験は、Ｒ98Ｓ細胞におけるJak1の安定性の増加を明らかにしたが、Csf2rb/2の安定性は示さなかった（図１３Ｅ〜Ｆ）。Statタンパク質安定性は、CHX追跡での150分以内で変化がないままだった（図１８）。全体として、我々のデータは、RPL10 Ｒ98Ｓ細胞がプロテアソーム組成および活性の変化を示すことを示しており、これはこれらの細胞におけるJak1のような特定のタンパク質の安定性の増加を説明し得る。
【００８３】
考察
我々はRPL10 Ｒ98Ｓ変異がJAK-STATカスケードの選択的上方制御を推進するかもしれない分子メカニズムを探究した。これらの効果は、少なくとも部分的には、いくつかのJAK-STAT mRNAに対する−１ ＰＲＦレベルの減少を介して媒介される可能性がある。当初ウイルスで説明されていたが、このプロセスが哺乳動物細胞にも関連があることが明らかになりつつある（Belew et al. (2014) 上記で引用）。IL7RAなどのいくつかのサイトカイン受容体におけるシグナルを含む、ほんの限られたセットの予測される哺乳動物−１ ＰＲＦシグナルのみが実験的に検証されている（Belew et al. (2014) 上記で引用）。我々は 哺乳類細胞におけるいくつかの追加の予測−１ ＰＲＦシグナルの機能性、およびサイトカイン受容体の下流のJAK-STATシグナル伝達カスケードがそのようなシグナルに富んでいることを示す。−１ ＰＲＦのレベルは、トランス作用タンパク質およびｍｉＲＮＡによって調節され得る（Belew et al. (2014) 上記で引用；Anzalone AV. etal. (2016) Nat Methods. 13, 453-458；Li Y. et al. (2014)Proc Natl Acad Sci USA. 111, E2172）。これらの−１ ＰＲＦシグナルが免疫応答の微調整および制御において機能し、RPL10 Ｒ98Ｓなどの発癌性因子がこの制御メカニズムを調節解除する可能性があることはもっともらしいことである。
【００８４】
Jak-Statシグナルによって促進される−１ ＰＲＦの比較的低い率を考慮すると、ここで検出された変化したフレームシフトレベルはタンパク質レベルで観察された変化を完全に説明できないことは明らかであり、追加のメカニズムによる寄与を示唆している。我々はＲ98Ｓが関連する−１ ＰＲＦレベルの低下を特定のタンパク質の分解の変化や転写調節のような他の潜在的なメカニズムと組み合わせることで発癌プログラムにつながるモデルを提案する。フレームシフト変化の特異性は、Jak-Stat遺伝子における独特な−１ ＰＲＦシグナルの存在によって説明することができる。しかしながら、転写および分解表現型の特異性はあまり明らかではない。我々は免疫プロテアソームの特異的触媒成分のレベルが変化していることを示す。この知見は、Ｒ98Ｓ細胞におけるプロテアソーム活性の変化と共に、異なるタイプのプロテアソームの発現を示している可能性があり、構成的および免疫サブユニットを含む以前に記載された「混合型」プロテアソームと一致している（Klare N. et al. (2007) J Mol Biol. 373, 1-10；Dahlmann B. et al. (2002) J Mol Biol. 303, 643-653）。プロテアソームの種類が異なれば、特定のエピトープの切断効率に定量的な違いが示され、ある程度のタンパク質特異性が得られる可能性がある（Mishto M. et al. (2014) Eur J Immunol. 44, 3508-3521；Huber EM. et al. (2012) Cell. 148, 727-738）。さらに、プロテオミクススクリーニングは、Ｅ３ユビキチンリガーゼ活性を有するいくつかのタンパク質がRPL10 ＷＴとＲ98Ｓ細胞との間で差次的に発現されることを明らかにし（示さず）、これは観察された分解表現型の特異性をさらに説明し得る。
【００８５】
【表１】
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2020503021.tif 000004
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【００８６】
図面の訳
in frame control インフレームコントロール
Renilla luc ウミシイタケルシフェラーゼ
frame フレーム
Firefly luc ホタルルシフェラーゼ
translation 翻訳
Out of frame (OOF) control  アウトオブフレーム（ＯＯＦ）コントロール
-1 PRF construct  −１ ＰＲＦ構築物
PRF signal  ＰＲＦシグナル
Frame-shifted translation  フレームシフトした翻訳
Stop codon read-through reporter assay  ストップコドンリードスルーレポーターアッセイ
STOP  ストップ
Missense suppression reporter assay  ミスセンスサプレッションレポーターアッセイ
Missense mutation essential AA  ミスセンス変異必須アミノ酸
Synthesized proteins  合成タンパク質
Jurkat  ジャーカット
polysomes  ポリソーム
Sedimentation  沈降
Translation efficiency  翻訳効率
Fold change 倍率変化
Frame-shifting フレームシフト
STOP read-through  ストップ リードスルー
Missense reading ミスセンスリード
Chymotrypsin-like  キモトリプシン様
Caspase-like  カスパーゼ様
Trypsin-like  トリプシン様
Viable  生存
vector  ベクター
Days  日
Wild type  野生型
Targeted allele  ターゲティング対立遺伝子
exon  エクソン
Euclidian distance  ユークリッド距離
p-value  ｐ−値
No significant change  有意でない変化
Log2 fold change  log2倍変化
Up in R98S  Ｒ98Ｓにおける増加
Carbohydrate metabolism  炭水化物代謝
Lipid metabolism  脂質代謝
Amino acid metabolism  アミノ酸代謝
Energy metabolism  エネルギー代謝
Metabolism of other amino acids  他のアミノ酸の代謝
Signal transduction  シグナル伝達
Immune system  免疫系
Infectious diseases  感染症
Transport and catabolism  輸送と異化
Other  その他
Down in R98S  Ｒ98Ｓにおける減少
DNA replication and repair  ＤＮＡ複製および修復
Transcription  転写
Translation  翻訳
Enrichment score  濃縮スコア
SIGNAL PATHWAY  シグナル経路
Relative protein expression  相対的タンパク質発現
Relative mRNA expression  相対的ｍRNA発現
ALL 297 KEGG pathways in humans containing at least one gene with a predicted -1 PRF signal  予測された-1 PRFシグナルを持つ少なくとも１つの遺伝子を含むヒトの全297 KEGG経路
JAK-STAT pathway  JAK-STAT経路
Average of other pathways  他の経路の平均
Fraction of KEGG pathway genes with predicted -1 PRF signals  -1 PRFシグナルが予測されたKEGG経路遺伝子の割合
Mouse genes  マウス遺伝子
Human genes  ヒト遺伝子
Relative proliferation  相対的増殖
Bortezomib  ボルテゾミブ
Carfilzomib  カルフィルゾミブ
Relative stability  相対的安定性
Mouse  マウス
Human  ヒト
Ubiquitinated proteins  ユビキチン化タンパク質
Ubiquitin  ユビキチン
Tublin  チューブリン
Relative poly-ubiquitin expression  相対的ポリユビキチン発現
Yeast  酵母
SEQ ID NO:  配列番号
Cell survival  細胞生存
viable counts/mL  生細胞数／ｍＬ
Control  コントロール
OD values MTS assay  OD値MTSアッセイ
【図１】
2020503021.tif 000006
【図２】
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【図３】
2020503021.tif 000008
【図４】
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【図５】
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【図６】
2020503021.tif 000011
【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2020503021.tif 000031
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