(57)【要約】  本発明は、幹細胞由来造血細胞、特にミエロイド細胞、好ましくはマクロファージ、それらの生成および使用に関する。特に、本発明は、造血細胞、好ましくはミエロイド細胞を産生する方法であって、例えば、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）などの多能性幹細胞から誘導可能である胚様体を、懸濁培養下で培養して、ミエロイド細胞形成複合体を産生し、これを懸濁培養下で更に培養して、マクロファージなどのミエロイド細胞を産生することを含む、方法に関する。これにより、例えば、産業適合性のある撹拌タンクバイオリアクターにおける、スケーラブルかつ連続的な産生が可能になる。マクロファージ、例えば、本方法を用いて産生された独特の特徴を有するマクロファージは、患者の処置のための、例えば、細菌感染などの感染の処置のための医薬組成物において使用され得る。本発明は、感染、例えば細菌感染、または創傷治癒のための患者の処置において使用するための、低減されたサイズを有し得るマクロファージなどのミエロイド細胞を含む、噴霧に好適な適用システムを更に提供する。
2020518263.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミエロイド細胞を産生する方法であって、
ａ）ＩＬ−３と、適宜、少なくとも１種の更なるサイトカインとの存在下で、ミエロイド細胞形成複合体を産生するのに十分な期間にわたり、胚様体を懸濁培養下で培養する工程と、
ｂ）ＩＬ−３と、適宜、少なくとも１種の更なるサイトカインとの存在下で、ミエロイド細胞を産生するのに十分な期間にわたり、前記ミエロイド細胞形成複合体を懸濁培養下で培養する工程と、
ｃ）前記ミエロイド細胞を単離する工程と
を含む、方法。
【請求項２】
前記胚様体が、多能性幹細胞、好ましくは誘導多能性幹細胞から誘導される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記胚様体が、胚様体を産生するのに十分な期間にわたり、多能性幹細胞を懸濁培養下で培養することを含む方法によって取得される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記懸濁培養が、撹拌タンクバイオリアクター、エルレンマイヤーフラスコ、スピナーフラスコ、ウェーブバイオリアクター、および回転壁バイオリアクターを含む群から選択される、懸濁培養を可能にするバイオリアクター、好ましくは、撹拌タンクバイオリアクターにおいて実行される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞がヒト細胞である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ａ）前記更なるサイトカインが、Ｍ−ＣＳＦであり、前記産生されるミエロイド細胞が、マクロファージであるか、または
ｂ）前記更なるサイトカインが、Ｇ−ＣＳＦであり、前記産生されるミエロイド細胞が、顆粒球であるか、または
ｃ）前記更なるサイトカインが、ＧＭ−ＣＳＦであり、前記産生されるミエロイド細胞が、マクロファージおよび顆粒球であるか、または
ｄ）前記更なるサイトカインが、ＳＣＦおよびＥＰＯであり、前記産生されるミエロイド細胞が、赤血球細胞であるか、または
ｅ）前記更なるサイトカインが、ＳＣＦおよびＴＰＯであり、前記産生されるミエロイド細胞が、巨核球および／もしくは血小板であるか、または
ｆ）前記更なるサイトカインが、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４であり、前記産生されるミエロイド細胞が、樹状細胞であるか、または
ｇ）ＩＬ−３に対する更なるサイトカインがなく、前記産生されるミエロイド細胞が、更なる分化ができる未熟細胞であり、前記方法が、
ｉ）マクロファージが取得されるまで、Ｍ−ＣＳＦの存在下で前記未熟細胞を培養すること、または
ｉｉ）顆粒球が取得されるまで、Ｇ−ＣＳＦの存在下で前記未熟細胞を培養すること、
ｉｉｉ）顆粒球およびマクロファージが取得されるまで、ＧＭ−ＣＳＦの存在下で前記未熟細胞を培養すること、
ｉｖ）赤血球細胞が取得されるまで、ＳＣＦおよびＥＰＯの存在下で前記未熟細胞を培養すること、
ｖ）巨核球および／または血小板が取得されるまで、ＳＣＦおよびＴＰＯの存在下で前記未熟細胞を培養すること
を更に含んでもよく、
好ましくは、前記更なるサイトカインが、Ｍ−ＣＳＦであり、前記産生されるミエロイド細胞が、マクロファージである、
請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記方法が、前記ミエロイド細胞の連続産生、好ましくはバッチ連続産生を可能にする、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
単離が、前記産生されるミエロイド細胞、好ましくは前記マクロファージを、少なくとも５０％の純度まで精製することを含み、
前記方法が、ステップｃの後に、
・前記ミエロイド細胞を高張液と接触させること、および凍結乾燥を含む群から選択される方法により、前記細胞のサイズを低減させること、ならびに／または
・前記ミエロイド細胞に、抗生剤、免疫調整剤、および色素を含む群から選択される治療剤または診断剤を負荷すること
を更に含んでもよい、
請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ミエロイド細胞を連続的に産生するミエロイド細胞形成複合体と、適宜、ミエロイド細胞とを含む、懸濁培養物であって、適宜、前記懸濁培養物が、請求項１ｂに記載の方法から取得可能である、懸濁培養物。
【請求項１０】
請求項１から８のいずれか一項に記載の方法によって取得可能な細胞集団であって、好ましくは、前記ミエロイド細胞のサイズが、前記細胞を高張液と接触させること、および凍結乾燥を含む群から選択される方法によって低減されており、前記細胞に、抗生剤および免疫調整剤を含む群から選択される治療剤または診断剤が負荷されていてもよい、細胞集団。
【請求項１１】
ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ１４＋／ＣＤ１６３＋／ＣＤ３４−ＴＲＡ１−６０−マクロファージを含む細胞集団であって、
好ましくは、ＤＫＫ１、ＳＥＰＰ１、ＰＩＴＸ２、ＣＯＬ３Ａ１、ＫＲＴ１９、Ａ＿３３＿Ｐ３２２１９８０、ＣＡＬＤ１、ＣＹＲ６１、Ｈ１９、ＤＤＩＴ４Ｌ、ＦＲＺＢ、ＴＭＥＭ９８、ＮＮＭＴ、ＮＰＮＴ、ＬＵＭ、ＤＣＮ、ＬＹＶＥ１、ＭＧＰ、ＩＧＦＢＰ３、およびＮＵＡＫ１からなる群から選択される少なくとも９種の遺伝子の発現が、前記マクロファージにおいて、ＰＢＭＣから誘導されるマクロファージと比較して少なくとも２０倍上方調節されており、
適宜、前記細胞集団が、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法によって取得可能である、細胞集団。
【請求項１２】
未熟ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ１４−／ＣＤ１６３−ミエロイド細胞を含む細胞集団であって、適宜、前記細胞集団が、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法によって取得可能である、細胞集団。
【請求項１３】
薬学的に許容される担体中に、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の細胞集団を含む医薬組成物であって、前記細胞集団が、好ましくは、請求項１１に記載の集団である、医薬組成物。
【請求項１４】
ａ）薬学的に許容される担体中にミエロイド細胞を含む医薬組成物と、
ｂ）前記医薬組成物を噴霧するのに好適な容器と
を備え、好ましくは、
・前記ミエロイド細胞が、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の細胞集団を含む群から選択されるマクロファージであり、かつ／または
・前記ミエロイド細胞のサイズが、前記細胞を高張液と接触させること、および凍結乾燥を含む群から選択される方法によって低減されており、かつ／または
・前記ミエロイド細胞に、抗生剤、免疫調整剤、および色素を含む群から選択される治療剤または診断剤が負荷されている、
適用システム。
【請求項１５】
薬学的に許容される担体中に細胞集団を含む医薬組成物であって、前記集団における前記細胞の平均サイズが、生理食塩水溶液中の前記細胞の集団と比較して少なくとも１０％低減されており、
前記細胞集団が、好ましくは、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の集団を含む群から選択されるミエロイド細胞の集団である、
医薬組成物。
【請求項１６】
患者における感染の処置もしくは防止において、かつ／または創傷治癒の促進のために使用するための、請求項１３または１５に記載の医薬組成物、または請求項１４に記載の適用システムであって、
前記医薬組成物が、好ましくは、細菌感染の処置または防止のため、最も好ましくは、細菌感染の処置のためのものである、医薬組成物または適用システム。
【請求項１７】
ａ）薬物スクリーニングおよび／もしくは薬物開発、
ｂ）疾患モデリング、
ｃ）組織操作、
ｄ）バイオ人工生物の調製、
ｅ）消毒、
ｆ）移植のための材料のコーティング、
ｇ）バイオマーカーの開発、または
ｈ）抗体、ホルモン、サイトカイン、薬物、培養培地、および血清を含む群から選択される生物由来物質の品質管理
のための、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の細胞集団の使用であって、
前記細胞集団が、好ましくは、請求項１１に記載の集団である、使用。
【請求項１８】
タンパク質を調製する方法であって、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法を実行することと、前記胚様体、前記ミエロイド細胞形成複合体、および／または前記ミエロイド細胞によって産生されたタンパク質を単離することとを含み、好ましくは、前記タンパク質が、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、Ｓ１００タンパク質、および組換えタンパク質を含む群から選択される、細胞培養培地中に分泌されるタンパク質である、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞由来造血細胞、特にミエロイド細胞、好ましくはマクロファージ、それらの生成および使用に関する。特に、本発明は、造血細胞、好ましくはミエロイド細胞を産生する方法であって、例えば、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）などの多能性幹細胞から誘導可能である胚様体を、懸濁培養（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ）下で培養して、ミエロイド細胞形成複合体（ｍｙｅｌｏｉｄ  ｃｅｌｌ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ）を産生し、これを懸濁培養下で更に培養して、マクロファージなどのミエロイド細胞を、好ましくは連続的様式において産生することを含む、方法に関する。これにより、例えば、産業適合性のある撹拌タンクバイオリアクターにおける、スケーラブルかつ連続的な産生が可能になる。マクロファージ、例えば、本方法を用いて産生された独特の特徴を有するマクロファージは、患者の処置のための、例えば、細菌感染などの感染の処置のための医薬組成物において使用され得る。本発明は、感染、例えば細菌感染、または創傷治癒のための患者の処置において使用するための、マクロファージなどのミエロイド細胞を含む、噴霧に好適な適用システムを更に提供する。例えば、細胞を高張液と接触させることによって取得可能な、低減されたサイズ、例えば低減された容量を有する収縮した細胞を含む医薬組成物も提供され、これは、例えばマクロファージの、噴霧適用に特に有用であり、低減された容量を有する細胞は、肺内に投与される。
【背景技術】
【０００２】
多剤耐性病原体への重度感染の数の世界的な増加は、代替治療の選択肢に対する必要性を強調している。それぞれの病原体が、多くの場合、標準的な抗生物質療法に対して不応性であるだけでなく、最終手段の薬物に対しても耐性があるという事実は、深刻な臨床的問題をもたらす。よって、細菌感染を標的とする代替的な戦略が至急必要とされている（Freire-Moran et al., 2011、Ventola, 2015、Willyard, 2017）。
【０００３】
抗生物質療法に対する１つの有望な代替物は、幹細胞由来免疫細胞、特に貪食細胞を自然免疫系の重要な構成要素として適用する、細胞に基づく処置アプローチであり得る。しかしながら、これまでのところ、治療的に必要とされる量の貪食細胞を末梢血または他の供給源から生成することは困難である。体細胞源およびより特定化された成体造血幹細胞とは対照的に、増殖および分化に関する無限の可能性をもつヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）は、この治療的シナリオを原理上は可能にし得る。この道筋に沿って、ヒトＰＳＣの血球分化は実現可能であることが証明されており（Ackermann et al., 2015）、将来の細胞に基づく処置アプローチのための有望な戦略として提唱されている。しかしながら、ｈＰＳＣ由来の造血の臨床応用は、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）の機能性に関する知識の不足および治療的に意義のある量のエフェクター細胞の欠如により、未だ阻まれている。
【０００４】
本発明者らは近年、無制限の増殖および標的を定めた分化に関するヒトの胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）および誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）の可能性が理論的特色であるだけでなく、完全に制御された撹拌タンクバイオリアクターにおけるスケーラブルかつ潜在的にＧＭＰに準拠する細胞産生プロセスを開発することによって応用され得る（Kempf et al., 2015、Kropp et al., 2016a、Zweigerdt et al., 2011）ことを示している。このアプローチの実現可能性は、ｈＰＳＣ拡大（Kropp et al., 2016b、Olmer et al., 2012）および撹拌懸濁液における心筋形成分化（Kempf et al., 2016、Kempf et al., 2015、Kempf et al., 2014）については実証されたものの、複能性または多能性の幹細胞源から造血細胞を生成するためのバイオリアクターシステムの首尾よい使用は、未だ実現困難である。ＰＳＣ由来造血細胞のインビボでの適用性についても、同様の観察がなされている。貪食細胞を含む成熟免疫細胞のヒトＰＳＣからの生成は証明されているが（Buchrieser et al., 2017、Lachmann et al., 2015、van Wilgenburg et al., 2013、Zhang et al., 2015）、それらの実際のインビボ機能性に関するデータは、これまでのところ、未だ不足している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従来技術の現状に鑑み、本発明者らは、造血細胞、特にミエロイド細胞を大量に産生する、好ましくは連続産生を可能にする方法を提供するという問題に対処した。この問題は、本発明によって、特に特許請求の範囲の主題によって解決される。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
したがって、本発明は、造血細胞、特にミエロイド細胞を産生する方法であって、
ａ）ＩＬ−３と、適宜、少なくとも１種の更なるサイトカインとの存在下で、ミエロイド細胞形成複合体を産生するのに十分な期間にわたり、胚様体を懸濁培養下で培養するステップと、
ｂ）ＩＬ−３と、適宜、少なくとも１種の更なるサイトカインとの存在下で、ミエロイド細胞を産生するのに十分な期間にわたり、ミエロイド細胞形成複合体を懸濁培養下で培養するステップと、
ｃ）ミエロイド細胞を単離するステップと
を含む、方法を提供する。
【０００７】
当該方法は、連続産生を可能にし、好ましくは、ミエロイド細胞の連続産生のために使用される。
【０００８】
胚様体（ＥＢ）は、典型的に丸みを帯びており、３つすべての胚葉の細胞型を含む、多能性幹細胞（ＰＳＣ）から誘導される立体的な凝集物である。ＰＳＣは、特殊化細胞に分化することができる未分化細胞であり、特に、好適な条件下で３つすべての胚葉の細胞に分化することができる。胚様体の誘導源となり得る多能性細胞型としては、例えば、マウス（ｍＥＳＣ）、霊長類動物、およびヒト（ｈＥＳＣ）源に由来する、胚盤胞期の胚から誘導される胚性幹細胞（ＥＳＣ）が挙げられる。
【０００９】
更に、ＥＢは、体細胞核移植または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）をもたらす体細胞の初期化を含む代替的技術によって誘導されるＰＳＣから形成され得る。ＥＢを生成するための方法は、当技術分野において周知である。
【００１０】
本発明との関連において、ＥＢは、好ましくは、生成のためにヒト胚の破壊が必要とされた幹細胞から誘導されない。好ましくは、ＥＢは、ｉＰＳＣから誘導される。
【００１１】
単層形式で分化した幹細胞と同様に、胚様体内の幹細胞は、すべての体細胞型を含む３つの生殖系列（内胚葉、外胚葉、および中胚葉）に沿った分化および細胞特定化を経る。
【００１２】
しかしながら、単層分化培養とは対照的に、ＰＳＣが凝集するときに形成される球状体の構造は、懸濁下におけるＥＢの非接着性培養を可能にする。これにより、ＥＢ培養が本質的にスケーラブルになり、これは、潜在的な臨床適用のために高い収量の細胞が産生され得るバイオプロセスアプローチのために有用である。更に、ＥＢは主に分化細胞型の不均一なパターンを呈するが、胚発生を指示するものと同様の合図に応答することができる。
【００１３】
幹細胞は単細胞として培養するとアポトーシスを受ける場合があるため、ＥＢ形成は、ｒｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）経路の阻害剤、例えば、Ｙ−２７６３２、ＨＡ−１００、Ｈ−１１５２、および／または２，４二置換チアゾール（チアゾビビン／Ｔｚｖ）、好ましくはＹ−２７６３２の、例えば、約１０μＭでの使用を必要とすることが多い。代替的に、単細胞への解離を回避するために、接着性コロニー（またはコロニーの領域）の手作業による分離により、または好ましくは、コラゲナーゼＩＶを用いた酵素処理により、ｈｉＰＳＣなどのＰＳＣからＥＢを形成し、その後、懸濁培養してもよい。懸濁下におけるＥＢの形成は、大量のＥＢの形成を可能にするが、結果として得られる凝集物のサイズはほとんど制御できず、多くの場合、大きく不規則な形状のＥＢがもたらされる。ＥＳＣがバルク懸濁液中に播種される場合、混合［または動的（ｍｏｖｅｄ）、例えば、撹拌または振盪］培養プラットフォームは、ＥＢサイズの均一性を増加させる。
【００１４】
好ましくは、本発明の胚様体は、胚様体を産生するのに十分な期間にわたり、ｉＰＳＣなどの多能性幹細胞を懸濁培養下で培養することを含む方法によって取得される。治療的使用、特に、ヒトにおける使用では、フィーダー細胞の使用は避けるべきである。これは、サイトカイン、例えばＳＣＦ、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、またはＣＨＩＲ９９０２１［（６−［［２−［［４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（５−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］−３−ピリジンカルボニトリル（ＴＯＣＲＩＳ）］およびＢＩＯ［（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−オキシム）（ＴＯＣＲＩＳ）］などのＷＮＴ経路調整剤を含む小分子を添加することによって補償され得る。好ましくは、培養条件は、ＲＯＣＫ阻害剤の使用を含むが、ｂＦＧＦの添加は必要とされない。
【００１５】
本発明の方法において使用するための好適な胚様体は、手作業で選択され得るが、好ましくは、それらの沈降特性に従って選択される。例えば、１０分以内、好ましくは５分以内に沈降する（遠心分離なし）ＥＢが使用され得る（ＷＯ２０１０／０２５７７６Ａ１）。
【００１６】
ＥＢの誘導源となり、結果的に産生されるミエロイド細胞が属する多能性幹細胞は、任意の種、例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ネコ、ウマ、イヌ、ウシ、ラクダ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、サル、または霊長類動物、例えば、ヒトに由来し得る。ヒト細胞が好ましい。細胞がヒトの処置を目的とする場合、ヒトミエロイド細胞、例えばマクロファージが好ましくは産生される。本発明の方法において、好ましくは、関連する種に由来するサイトカインが使用される。これらは、組換えサイトカインであってよく、関与する分化プロセスにおけるそれらの機能性を減少させない突然変異を含んでいてもよい。
【００１７】
本発明の懸濁培養物は、表面への、特に容器の表面への接着を防止する。懸濁培養物は、担体への接着を可能にすることもない。好ましくは、懸濁培養物は、細胞の接着または沈降を防止するために動かされる、例えば、振盪、回転、または撹拌される。培養は、懸濁プレートにおいて、例えば、オービタルシェーカー上で、または接着を防止するためにコーティングされたローラーボトルにおいて行なわれ得る。
【００１８】
好ましい一実施形態において、懸濁培養は、懸濁培養を可能にするバイオリアクター、例えばエルレンマイヤーフラスコ、スピナーフラスコ、撹拌タンクバイオリアクター、ウェーブバイオリアクター、および回転壁バイオリアクターなどにおいて、優先的には撹拌タンクバイオリアクターにおいて、最も好ましくは計装型（ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｅｄ）撹拌タンクバイオリアクター、すなわち、ｐＨ、ｐＯ２、温度、および撹拌速度などのプロセスパラメータをモニタリングし制御するための技術を備えたバイオリアクターにおいて実行される。そのようなシステムは、スケーラブルである。すなわち、培養条件を著しく変更することなく、培養物の容量を変更することができる。例えば、以下に記載するように、ＤＡＳｂｏｘ  Ｍｉｎｉバイオリアクターシステム（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）が使用され得る。
【００１９】
産業的プロセスとの適合性については、相対的線形アップスケーリングがおそらく最も重要な判断基準である。好ましいシステムは、他の目的のために当業界において既に利用されている場合があり、業界標準を満たし得る。例えばそれらは、プロセスのモニタリングおよび制御、ならびに確立された滅菌法および計器検証手順のための標準的なプローブの組込みを可能にする標準的なポートを備えていてよい。バイオリアクターは、ＧＭＰに適合するものであり得る。
【００２０】
本発明において使用されるバイオリアクター、例えば、撹拌タンクバイオリアクターは、細胞、特に単球およびマクロファージの連続的なサンプリング、モニタリング、および採取を可能にするポートを備えていてよい。それらはまた、灌流に基づく細胞供給、ならびに代謝物、例えばグルコース、乳酸、およびアンモニウムなどの培養培地成分のオンラインモニタリングを可能にする、好適な細胞保持システムを備えていてもよい。バイオリアクターは、ガラス、プラスチック、またはステンレス鋼の容器を利用した、単回使用（使い捨て）または再使用可能なバイオリアクターであり得る。
【００２１】
好ましくは、撹拌タンクバイオリアクターにおける培養は、約２１％のＯ２、約５％のＣＯ２を用いた約３Ｌ／時におけるヘッドスペースガス供給、および多翼（例えば、４〜１２翼）式の傾斜羽根車を使用した約５０回転毎分での撹拌を用いて、約３７℃で実行される。本発明との関連において、「約」は、＋／−１０％、好ましくは、＋／−５％または＋／−２％を意味する。
【００２２】
培養は、２１％のＯ２、５％のＣＯ２を用いた３Ｌ／時におけるヘッドスペースガス供給、および８翼式の傾斜した６０℃羽根車を使用した５０回転毎分での撹拌を用いて、３７℃で行なってもよく、溶存酸素、ｐＨ、温度、およびインピーダンスに基づくバイオマス評価のリアルタイムモニタリングを行なってもよい。
【００２３】
好ましくは、本発明の方法は、反復バッチ法を含む、ミエロイド細胞の連続産生を可能にする。厳密な意味での（ｓｔｒｉｃｔｕ  ｓｅｎｓｕ）連続産生も可能であり、より効果的な細胞産生を可能にし得る。例えば、灌流を可能にする細胞保持システムを連続的な培地交換と組み合わせて使用して、培養条件を最適化することができる。
【００２４】
例えば撹拌タンクバイオリアクターにおける、懸濁培養の容量は、スケーラブルであり、例えば、５０ｍＬ〜１０００Ｌ、１００ｍＬ〜５００Ｌ、２００ｍＬ〜１００Ｌ、５００ｍＬ〜５０Ｌ、または１Ｌ〜２０Ｌである。好ましくは、特に、産生された細胞の治療的適用に関して、培養に使用される培地は、ヒトにおける適用に適合する化学的に定義された培地、例えば、Ｘ−ＶＩＶＯ  １５（Ｌｏｎｚａ）またはＡＰＥＬ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、好ましくは、Ｘ−ＶＩＶＯ  １５である。好ましくはＲＯＣＫ阻害剤が補充された、Ｅ８５０またはＥ６培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、ステップａの懸濁培養のために使用してもよい。ミエロイド細胞形成複合体（ＭＣＦＣ）は、当技術分野において公知である（Lachmann et al., 2015）。それらは、ＣＤ３４＋クローン原性前駆細胞を含有する。それらは、ミエロイド細胞を連続的に産生することができる。ＩＬ−３の存在下で、ミエロイド細胞は、培養培地中に送達される。注目すべきことに、本発明の方法は、ＭＣＦＣの精製をまったく必要とせず、ステップａ）においてＭＣＦＣが形成され、これらがステップｂ）においてミエロイド細胞を産生することを必要とするのみである。ステップａ）およびｂ）［更には、適宜ｃ）］は重複してもよい。すなわち、更なるＥＢがＭＣＦＣに分化し、他のＭＣＦＣは既にミエロイド細胞（これらは既に単離されている場合がある）を産生することが可能である。
【００２５】
ＥＢからのＭＣＦＣの生成には、典型的に、約４〜８日かかる。ＭＣＦＣからの第１のミエロイド細胞の生成は、ＭＣＦＣの形成後に開始し、その後、連続生成が観察される。典型的には、ＭＣＦＣの生成から約３〜１６日後に採取が開始する。ＥＢからのＭＣＦＣの産生およびミエロイド細胞の産生にかかる好適な合計時間［すなわち、ステップａ）およびステップｂ）の合計時間］は、少なくとも約７日間、例えば、７〜２０日間である。本発明者らは、７〜１４日目以降、経時的に増加する収量を示す、撹拌バイオリアクターシステムからのマクロファージの少なくとも週１回の採取が可能であることを示すことができた。２５０ｍＬのバイオリアクター（１２０ｍＬの培養容量）において、約２〜３×１０７マクロファージ／週の安定な産生が、早ければ３週目には可能であり、これは、少なくとも５週間にわたって経時的に維持され得る。当然ながら、培養の時間および条件は、所望の細胞の表現型に応じて異なってよい。例えば、連続的または短い間隔での採取は、成熟度の低い細胞の産生をもたらし得る。採取された細胞は、次いで、後述するように、適宜更なる成熟に供され得る。
【００２６】
ＩＬ−３などのサイトカインの存在下での培養は、当該サイトカインの持続的な存在を必要としない。例えば、一定期間にわたってＩＬ−３の非存在下で細胞を培養することが可能であるが、ＭＣＦＣによるミエロイド細胞の分化、特に産生は、ＩＬ−３の存在を必要とする。ＩＬ−３の好適な量は、例えば、１０〜１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは２０〜３０ｎｇ／ｍＬ（最も好ましくは、約２５ｎｇ／ｍｌ）のＩＬ−３である。
【００２７】
ＭＣＦＣの形成のためには、分化培地Ｉ、例えば、塩基性培地、好ましくは、Ｘ−ＶＩＶＯ  １５（Ｌｏｎｚａ）またはＡＰＥＬ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（いずれも例えばヒト細胞に好適である）などの化学的に定義された培地を使用してもよく、マクロファージが産生される場合、好適な量、例えば、１０〜１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは２０〜３０ｎｇ／ｍＬ（最も好ましくは約２５ｎｇ／ｍｌ）のＩＬ−３（例えば、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈから取得可能）と、適宜、少なくとも１種の他のサイトカイン、例えば、４０〜６０ｎｇ／ｍｌ（好ましくは約５０ｎｇ／ｍｌ）のＭ−ＣＳＦ（例えば、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈから取得可能）とを更に含む、Ｘ−ＶＩＶＯ  １５が好ましい。培地は、適宜、好適な量の抗生物質、例えば、１％のペニシリン−ストレプトマイシンを含んでもよい。
【００２８】
産生される細胞がヒトにおいて使用するためのものでない場合、他の塩基性培地、例えば、マウス細胞の場合、１０％のＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、適宜、１％のペニシリン−ストレプトマイシン、および少なくとも１種のサイトカインが補充されたＲＰＭＩ１６４０を使用してもよい。
【００２９】
成熟した表現型を有するミエロイド細胞の産生のためには、本発明の方法の少なくともステップｂ）において、適宜、ステップａ）においても、更なるサイトカインを添加してもよい。
【００３０】
好ましい本発明の方法において、更なるサイトカインは、Ｍ−ＣＳＦ（好適な濃度、例えば、４０〜６０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬのＭ−ＣＳＦ）であり、産生されるミエロイド細胞は、マクロファージである。
【００３１】
代替的に、更なるサイトカインは、Ｇ−ＣＳＦ（好適な濃度、例えば、４０〜６０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬのＧ−ＣＳＦ）であり、産生されるミエロイド細胞は、顆粒球前駆体であり、これは、Ｇ−ＣＳＦのみ（好適な濃度、例えば、５０〜２００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬのＧ−ＣＳＦ）において培養して、顆粒球に更に分化させることができる。
【００３２】
代替的に、更なるサイトカインは、ＧＭ−ＣＳＦ（好適な濃度、例えば、４０〜６０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ）であり、産生されるミエロイド細胞は、マクロファージおよび顆粒球前駆体であり、これは、ＧＭ−ＣＳＦのみ（好適な濃度、例えば、５０〜２００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ）において培養して、顆粒球に更に分化させることができる。
【００３３】
更なるサイトカインがＳＣＦおよびＥＰＯ［好適な濃度、例えば、８０〜１２０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、および２〜４単位（Ｕ）、好ましくは約３ＵのＥＰＯ］である場合、産生されるミエロイド細胞は、赤血球細胞を含み、これは、ＳＣＦおよびＥＰＯのみ［好適な濃度、例えば、５０〜２００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、および２〜４単位（Ｕ）のＥＰＯ、好ましくは約３ＵのＥＰＯ］において培養して、更に分化させることができる。
【００３４】
生成される細胞型のスペクトルを樹状細胞または血小板に更に広げるため、他の系列指示性サイトカイン（ｌｉｎｅａｇｅ−ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ）を適用してもよい（Ackermann et al., 2015、Choi et al., 2009、Lachmann et al., 2015、Ma et al., 2008）。
【００３５】
代替的に、更なるサイトカインは、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦ（好適な濃度、例えば、４０〜６０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４）であり、産生されるミエロイド細胞は、樹状細胞を含み、これは、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ４のみ（好適な濃度、例えば、５０〜２００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ４）において培養して、更に分化させることができる。
【００３６】
更なるサイトカインは、ＳＣＦおよびＴＰＯ（好適な濃度、例えば、８０〜１２０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、および２〜４Ｕ、好ましくは約３ＵのＴＰＯ）であり、産生されるミエロイド細胞は、巨核球および／または血小板を含んでもよく、これは、ＳＣＦ／ＴＰＯのみ［好適な濃度、例えば、５０〜２００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、および２〜４単位（Ｕ）のＴＰＯ、好ましくは約３ＵのＴＰＯ］において培養して、更に分化させることができる。ＩＬ−３は、巨核球の成熟に対して負の効果を及ぼす可能性があるため、ステップａ）後に低減させるか、または除いてもよい。
【００３７】
本発明の方法の一実施形態において、ＩＬ−３に対する更なるサイトカインは、ステップａ）またはステップｂ）のいずれにおいても添加されず、産生されるミエロイド細胞は、更なる分化ができる未熟ミエロイド細胞である。当該事例において、当該方法は、
ｉ）マクロファージが取得されるまで、Ｍ−ＣＳＦ（好適な濃度、例えば、４０〜１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬのＭ−ＣＳＦ）の存在下で当該未熟細胞を培養すること、または
ｉｉ）顆粒球が取得されるまで、Ｇ−ＣＳＦ（好適な濃度、例えば、４０〜１２０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬのＧ−ＣＳＦ）の存在下で当該未熟細胞を培養すること、
ｉｉｉ）顆粒球およびマクロファージが取得されるまで、ＧＭ−ＣＳＦ（好適な濃度、例えば、４０〜１２０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ）の存在下で当該未熟細胞を培養すること、
ｉｖ）赤血球細胞が取得されるまで、ＳＣＦおよびＥＰＯ［好適な濃度、例えば、５０〜２００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、および２〜４単位（Ｕ）のＥＰＯ、好ましくは約３ＵのＥＰＯ］の存在下で当該未熟細胞を培養すること、
ｖ）巨核球および／または血小板が取得されるまで、ＳＣＦおよびＴＰＯ［好適な濃度、例えば、５０〜２００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、および２〜４単位（Ｕ）のＴＰＯ、好ましくは約３ＵのＴＰＯ］の存在下で当該未熟細胞を培養すること、または
ｖｉ）樹状細胞が取得されるまで、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４（好適な濃度、例えば、４０〜１２０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ、および４０〜１２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−４、好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−４）
を更に含んでもよい。
【００３８】
ＧＭＰに準拠する培地では、懸濁培養に先行する単一ｉＰＳＣの単層としての培養のための、５〜２００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含有する、ＲＯＣＫ阻害剤が補充されたＥ８培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、懸濁培養のための、ＲＯＣＫ阻害剤が補充されたＥ８５０またはＥ６培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、および、血球分化のための、適切なサイトカイン、例えば、５０ｎｇ／ｍｌのｈＶＥＧＦ、５０ｎｇ／ｍｌのｈＢＭＰ４、および２０ｎｇ／ｍｌのｈＳＣＦが補充された［この後には（例えば、中胚葉のプライミングの４日目において）、２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３の添加が続き得る］Ｘ−ＶＩＶＯ１５培地を使用し、良好な結果が見られている。プライミングされた凝集物の、例えばマクロファージ産生のための後続の血球分化は、２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３および５０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦが補充された３ｍｌのＸ−ＶＩＶＯ１５に培地を変えることによって遂行され得る。
【００３９】
本発明の方法において、産生されたミエロイド細胞を単離することは、産生されたミエロイド細胞、好ましくはマクロファージを、少なくとも５０％、または好ましくは、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の純度まで精製することを含む。本発明の方法が、マクロファージを産生するために、特に、ＩＬ−３およびＭ−ＣＳＦの存在下での培養を用いて実行される場合、ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３４−ＴＲＡ−１−６０−の発現プロファイルによって特徴付けられるミエロイド前駆体細胞の純度は、好ましくは、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％であり得る。産生される細胞のうち少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、または７０〜９０％は、ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３４−ＴＲＡ−１−６０−ＣＤ１４＋／ＣＤ１６３＋マクロファージである。一実施形態において、産生される細胞のうち少なくとも９５％は、ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３４−ＴＲＡ−１−６０−であり、産生される細胞のうち７０〜９０％は、ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３４−ＴＲＡ−１−６０−ＣＤ１４＋／ＣＤ１６３＋である。他の細胞のほとんどは、マクロファージのミエロイド前駆体である。単離が連続的である場合、または採取がより短い間隔において実施される場合、前駆体の割合はより高くてもよい。
【００４０】
本発明の方法において、産生されたミエロイド細胞（例えば、マクロファージ）を単離することは、例えば、バッチ連続法において、
ｃｉ）例えば、懸濁培養物の約５〜１２分間、好ましくは１０分間にわたる沈降により［例えば、動き（例えば、撹拌）を一時的に停止させることにより］、懸濁培養物におけるＭＣＦＣの大多数の沈降を可能にすることと、
ｃｉｉ）上清を除去することと、
ｃｉｉｉ）除去された上清を、メッシュが約７０〜１００μｍのフィルタによって濾過することと、
ｃｉｖ）適宜、残余分（主にＭＣＦＣを含む）を懸濁培養物に戻し、懸濁培養物の沈降した細胞に新しい培養培地を添加することと
を含んでもよく、
ｃｖ）産生されたミエロイド細胞は、濾液中に含まれる。産生されたミエロイド細胞は、沈降または遠心分離によって濾液から単離されてもよい。それらは次いで、患者への投与のために製剤化され、例えば、薬学的に許容される担体、例えば、ＰＢＳなどの緩衝液中に取り込まれてよい。それらは代替的に、例えば、懸濁培養下で、例えば、サイトカインまたは活性剤、例えば、ＩＬ−３、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−アルファ、ＩＦＮ−ガンマ、またはＬＰＳを含む群から選択される活性化剤および／または成熟化剤の存在下で、更に培養され、後の投与のために製剤化されてよい。
【００４１】
代替的に、単離のためには、約７０〜１００μｍのメッシュを有するフィルタを通して懸濁培養物から培地が除去されてもよく、ここで、産生されたマクロファージは、例えば遠心分離によって濾液から単離することができ、更なる成熟ありまたはなしで、投与のために製剤化してもよい。この単離手順は、産生される細胞のバッチ連続産生を可能にするように、時折、または連続的に実施されてよい。
【００４２】
産生されたミエロイド細胞の単離のための更なる代替的方法は、分画遠心分離、または例えばスクロース勾配を用いる勾配遠心分離を含む。
【００４３】
本発明の方法は、ステップｃの後に、
・細胞を高張液と接触させること、および凍結乾燥を含む群から選択される方法により、ミエロイド細胞のサイズを低減させること、ならびに／または
・ミエロイド細胞に、抗生剤、免疫調整剤、および色素を含む群から選択される治療剤または診断剤を負荷すること
を更に含んでもよい。
【００４４】
これらのステップのそれぞれ、または両方は、典型的に、マクロファージ、顆粒球、巨核球、血小板、または樹状細胞などのミエロイド細胞の単離および／または精製の後に実行される。好ましくは、ミエロイド細胞はマクロファージである。
【００４５】
本発明との関連において、細胞、例えばミエロイド細胞を、高張液と接触させることを含む方法により、細胞のサイズを低減させることは、細胞の容量が低減されるように、緩衝液および／または細胞培養培地から典型的に実質的に単離された細胞を、３００ｍｏｓｍ超、例えば３１０〜１０００ｍｏｓｍ、好ましくは３５０〜８００ｍｏｓｍ、または４００〜６００ｍｏｓｍの、例えば高張糖液（好ましくはスクロースを含むもの）を含む溶液と接触させることを意味する。ミエロイド細胞では、平均サイズ（例えば、平均容量）は典型的に、少なくとも１０％、好ましくは、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、または少なくとも７５％低減される。細胞のサイズ、例えば容量は、好ましくは、ＦＡＣＳにより、細胞の前方散乱［平均蛍光強度（ＭＦＩ）］に基づいて判定される。代替的に、平均直径の低減は、顕微鏡観察および例えばＩｍａｇｅＪを用いたコンピュータ分析によって判定されてもよい。好ましくは、本発明によるサイズが低減されたマクロファージは、１５μｍ未満、１３μｍ未満、１２μｍ未満、１０μｍ未満、好ましくは、８μｍ未満、６μｍ未満、または４μｍ未満の平均直径を有する（例えば、ヒトマクロファージの場合）。比較のため、本発明の方法によって処置されていないヒト肺胞マクロファージは、約２１μｍの平均サイズを有することが見出されている（Krombach et al., 1997. Environ Health Perspect. 105:1261-1263）。好ましくは、本発明によるサイズが低減されたマウス初代マクロファージは、１３μｍ未満、１２μｍ未満、１０μｍ未満、好ましくは８μｍ未満、６μｍ未満、または４μｍ未満の平均直径を有する。
【００４６】
接触は、所望のサイズ低減を得るのに十分な時間にわたって、例えば、３０秒間〜２４時間、１分間〜１２時間、好ましくは２分間〜１時間、５〜３０分間、１０〜２０分間、または約１５分間にわたって実行される。必要とされる時間は、細胞型、および使用される溶液のオスモル濃度に応じる。温度は、典型的には４℃〜３７℃、例えば、室温（２０〜２５℃）、好ましくは３７℃に維持される。細胞の大多数、または好ましくは少なくとも８０％の細胞の生存率が維持される。高張液との接触は、本発明の接触における細胞のサイズを低減させる好ましい方法である。代替的に、細胞のサイズは、例えば、凍結乾燥または細胞骨格（ｃｙｔｏｓｓｃｅｌｅｔｏｎ）の操作によって低減させることもできる。例えば凍結乾燥により、細胞の大多数の生存率を維持しながら細胞のサイズを低減させるための方法は、当技術分野において公知である。本発明者らは、驚くべきことに、一時的にサイズが低減された細胞、例えば、マクロファージなどのミエロイド細胞が機能的であり、医薬組成物において使用され得ることを見出した。
【００４７】
そのような医薬組成物は、新しく調製されてもよいし、または、細胞の大多数、好ましくは少なくとも８０％の細胞が生存可能である限り、保管されてもよい。高張液と接触している細胞の保管は、例えば、最長４８時間、最長２４時間、または一晩にわたってもよい。代替的に、細胞は、４℃における等張液中で最長１２時間、最長２４時間、または最長４８時間にわたって保管され、適用前に高張液と共にインキュベートされてもよい。
【００４８】
細胞、例えばミエロイド細胞、特に本発明のマクロファージを保管し、それらのサイズを低減させるためのキット、例えば、１つのチャンバに等張液中の細胞を含み、１つのチャンバに高張液を含み、２つの溶液の混合により、細胞が本明細書に定義される高張液と接触し、結果として細胞のサイズが低減されるような２チャンバシステムも、本明細書において提供される。キット内の細胞の無菌性は容易に保たれ得る。好ましくは、本キットは、細胞を噴霧するのに好適なデバイスに連結することができるか、または細胞を噴霧するためのデバイスの一部である。
【００４９】
凍結乾燥によりサイズが低減された細胞は、適切に低い温度において、高張液中の細胞よりも長い期間にわたって保管され得る。凍結乾燥された細胞は、直接、またはそれらを高張液中に取り込んだ後に投与され得る。例えば、サイズが低減されたマクロファージは、粒子または細菌、例えばＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の食作用において活性であることが見出された。低減されたサイズは、気道内へのより深い浸透、および下気道内の細胞のより良好な分布をもたらす。本発明者らは、ラットから外植された組織を用いた実験において、本発明の収縮したマクロファージが噴霧によって肺胞腔に投与され得ることを示すことができた。よって、サイズが低減された細胞は、例えば気道内への噴霧、または、低減されたサイズがより良好な浸透または分布をもたらし得る他の用途、例えば、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）の消毒用途、もしくは移植のためのデバイスのコーティングに特に好適である。
【００５０】
好ましくは、高張液と接触させるのと同時に、細胞、例えばマクロファージに、治療剤または診断剤、好ましくは治療剤であり得る薬剤を負荷してもよい。当然ながら、２つ以上の薬剤の組み合わせを使用してもよい。薬剤は、外来性因子（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  ａｇｅｎｔ）であり得る。外来性因子は、通常、本発明で使用される細胞において有意な量で見出されず、典型的に、ヒト細胞から誘導されず、ヒト細胞から誘導可能でなくてもよい。例示的な薬剤は、抗生剤または免疫調整剤である。
【００５１】
細菌感染の処置との関連において、抗生剤の負荷が特に有用である。抗生剤の例は、マクロライド系抗生物質、例えばアジスロマイシン、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、ベータ−ラクタム系抗生物質、例えばセファロスポリン、アモキシシリン、メチシリン、ペニシリン、もしくはフルクロキサシリン、クリンダマイシン、またはフルオロキノロン、例えばレボフロキサシン、モキシフロキサシン、ドキシサイクリン、もしくはテリスロマイシン、クラブラン酸、リファンピシン、またはゲンタマイシン、またはグリコペプチド系抗生物質、例えばバンコマイシンまたはテイコプラニン、好ましい親油性抗生物質である。その選択は、適応症、特に、処置され得る感染の原因である細菌に応じる。免疫調整剤、例えば、サイトカイン、ケモカイン、またはコルチコステロイドなどの免疫系の細胞を活性化もしくは阻害することができる薬剤を、例えば、炎症の場合に使用してもよい。細胞内に負荷された気管支痙攣解消剤（Ｂｒｏｎｃｈｏｓｐａｓｍｏｌｙｔｉｃｓ）は、気道を拡張する助けとなることができ、これにより、第１の用量が効力を生じるときに投与される第２の用量の細胞のより深い浸透が可能になり得る。分泌物溶解剤（Ｓｅｃｒｅｔｏｌｙｔｉｃｓ）を細胞内に負荷してもよく、これは例えば、嚢胞性線維症の処置において使用するのに特に有用であり得る。
【００５２】
細胞に対して、特にサイズが低減された細胞に対して負荷された色素は、細胞の浸透を確認するために、トレーサーとして、または診断用途のために好都合であり得る。例示的な色素は、蛍光色素、例えば、Ｄｉｌである。
【００５３】
細胞への負荷は、細胞を高張液と接触させる前に実施しても、または接触させることなく実施してもよい。低減されたサイズが大きな役割を果たさない細胞の適用、例えば、主に平面的な領域への、例えば創傷への適用については、典型的に、細胞のサイズは改変されない。
【００５４】
当然ながら、細胞に薬剤を負荷することは、マクロファージ自体が既に効果的であり得るような用途には必要とされない。
【００５５】
本発明は、造血細胞を連続的に産生するミエロイド細胞形成複合体と、適宜、ミエロイド細胞とを含む、懸濁培養物を提供する。当該懸濁培養物は、例えば、上記の本発明の方法から取得可能であり、ここで、産生されたミエロイド細胞の単離は可能だが、必須ではない。当該懸濁培養物は、好ましくは、例えば上述のような、撹拌タンクバイオリアクター内に含まれる。換言すると、本発明は、ミエロイド細胞を連続的に産生するミエロイド細胞形成複合体と、適宜、ミエロイド細胞とを含む、懸濁培養物を含む、撹拌タンクバイオリアクターを提供する。好ましくは、当該ミエロイド細胞は、マクロファージであり、培養培地は、ＩＬ−３およびＭ−ＣＳＦを含む。
【００５６】
本発明は、本発明の方法によって取得可能な、造血細胞、好ましくはミエロイド細胞の集団も提供する。
【００５７】
任意選択の実施形態において、当該ミエロイド細胞、例えばマクロファージのサイズは、細胞を高張液と接触させること、および凍結乾燥を含む群から選択される方法によって低減されている。細胞に、上述の治療剤または診断剤、例えば、抗生剤、免疫調整剤、および色素が更に負荷されていてもよい。よって、本発明は、生理学的条件下で培養された対応する細胞（特に、等張液に接触させていない細胞）と比較して細胞のサイズが低減されている、ミエロイド細胞の集団を提供する。ミエロイド細胞では、平均容量は典型的に、少なくとも１０％、好ましくは、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、または少なくとも６０％低減される。細胞のサイズまたは容量は、好ましくは、ＦＡＣＳにより、細胞の前方散乱に基づいて判定される。好ましくは、本発明によるサイズが低減されたマクロファージは、１０μｍ未満、好ましくは８μｍ未満、６μｍ未満、または４μｍ未満の平均直径を有する。これらの細胞は、治療剤または診断剤、好ましくは治療剤を更に含み得る。細胞集団は、例えば、１×１０６個超のマクロファージ、少なくとも２×１０７個のマクロファージ、少なくとも５×１０７個のマクロファージ、少なくとも１×１０８個のマクロファージ、少なくとも１×１０９個のマクロファージ、または少なくとも１×１０１０個のマクロファージを含み得る。低減されたサイズを有する細胞は、後述するマーカープロファイルのうちのいずれを有してもよい。
【００５８】
本発明の方法によって取得可能な細胞は、例えば、高張液に接触していない場合、未改変のサイズを有する場合もある。
【００５９】
本発明は、例えば、ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１４＋ＣＤ１６３＋ＣＤ３４−ＴＲＡ１−６０−マクロファージを含む細胞集団を提供し、好ましくは、当該細胞の少なくとも５０％、少なくとも６０％、または少なくとも７０％が、例えば、本発明の方法によって取得可能である。多能性および自然免疫応答の活性化に関連する遺伝子の発現の分析により、ｉＰＳＣのマクロファージ様細胞への効率的な分化が確認された。重要なことに、マクロファージ機能に関連する遺伝子、例えばｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）１および４、ＣＤ１４、またはＮＦ−κＢシグナル伝達経路の構成要素［遺伝子オントロジー（ＧＯ）自然免疫の活性化：０００２２１８］は、ｉＰＳＣと対比して、ｉＰＳＣ−ＭＡＣおよびＰＢＭＣ−ＭＡＣにおいて有意に上方調節された。接着および機能の分析（例えば、ラテックスビーズおよび細菌の食作用性取り込み）の後の形態学的分析により、産生された細胞がマクロファージであることが確認される。本発明の方法は、１×１０６個超のマクロファージ、少なくとも２×１０７個のマクロファージ、少なくとも５×１０７個のマクロファージ、少なくとも１×１０８個のマクロファージ、少なくとも１×１０９個のマクロファージ、または少なくとも１×１０１０個のマクロファージを含む細胞集団を産生することを、初めて可能にする。
【００６０】
本発明の方法から取得可能なマクロファージは、典型的に、ＰＢＭＣから取得されるマクロファージよりも有意に高いＣＤ１４およびＣ１６３の表面発現量（ＦＡＣＳにより判定される）、ならびに有意に低いＨＬＡの表面発現量を有する。実施例において産生されたマクロファージは、ＩＬ−６、ＩＬ−８、またはＴＮＦ−アルファなどの炎症促進性サイトカインを産生することが示された。したがって、それらは、抗炎症性マクロファージよりも炎症促進性マクロファージであると考えることができる。好適なサイトカイン、例えばＩＬ−１３、ＩＬ−１０、ＩＬ−４の添加により、表現型を抗炎症性マクロファージに再指向することができる。加えて、他の物質、例えばコルチコステロイドを使用して、抗炎症性表現型を誘導してもよい。
【００６１】
本発明者らは、例えば、本発明の方法から取得可能な、本発明のＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１４＋ＣＤ１６３＋ＣＤ３４−ＴＲＡ１−６０−マクロファージが、従来技術の方法に従って単離されたマクロファージと比較して独特の発現プロファイルを有することを見出した。好ましくは、本発明のマクロファージにおいて、ＤＫＫ１、ＳＥＰＰ１、ＰＩＴＸ２、ＣＯＬ３Ａ１、ＫＲＴ１９、Ａ＿３３＿Ｐ３２２１９８０、ＣＡＬＤ１、ＣＹＲ６１、Ｈ１９、ＤＤＩＴ４Ｌ、ＦＲＺＢ、ＴＭＥＭ９８、ＮＮＭＴ、ＮＰＮＴ、ＬＵＭ、ＤＣＮ、ＬＹＶＥ１、ＭＧＰ、ＩＧＦＢＰ３、およびＮＵＡＫ１からなる群から選択される少なくとも１０種の遺伝子の発現が、当該マクロファージにおいて、ＰＢＭＣから誘導されるマクロファージと比較して少なくとも２０倍、好ましくは、少なくとも５０倍、少なくとも２００倍、少なくとも４００倍、または少なくとも１０００倍上方調節されている。ＤＫＫ１、ＳＥＰＰ１、ＰＩＴＸ２、ＣＯＬ３Ａ１、ＫＲＴ１９、Ａ＿３３＿Ｐ３２２１９８０、ＣＡＬＤ１、ＣＹＲ６１、Ｈ１９、ＤＤＩＴ４Ｌ、ＦＲＺＢ、ＴＭＥＭ９８、ＮＮＭＴ、ＮＰＮＴ、ＬＵＭ、ＤＣＮ、ＬＹＶＥ１、ＭＧＰ、ＩＧＦＢＰ３、およびＮＵＡＫ１からなる群から選択される少なくとも１２種の遺伝子、好ましくは少なくとも１５種の遺伝子、またはすべての遺伝子の発現が、当該マクロファージにおいて、ＰＢＭＣから誘導されるマクロファージと比較して少なくとも１００倍、好ましくは、少なくとも２００倍、少なくとも４００倍、または少なくとも５００倍上方調節されていてもよい。ＣＹＲ６１、ＤＤＩＴ４Ｌ、ＫＲＴ１９、ＤＣＮ、ＬＵＭ、ＣＯＬ３Ａ１の発現は、当該マクロファージにおいて、ＰＢＭＣから誘導されるマクロファージと比較して、少なくとも２００倍、少なくとも５００倍、または少なくとも１０００倍上方調節されていてもよい。
【００６２】
更に、本発明のマクロファージにおいて、ＡＮＰＥＰ、ＣＤＡ、ＣＲＴＡＭ、ＥＮＳＴ０００００３９０２３７、ＦＢＰ１、ＧＢＰ１、ＧＮＬＹ、ＨＬＡ＿ＤＱＡ１、ＨＬＡ＿ＤＱＡ２、ＨＬＡ＿ＤＱＢ１、ＨＬＡ＿ＤＱＢ２、ＨＬＡ＿ＤＲＡ、ＨＬＡ＿ＤＲＢ１、ＨＬＡ＿ＤＲＢ３、ＨＬＡ＿ＤＲＢ４、ＨＬＡ＿ＤＲＢ５、ＩＬ１５、ＬＹ７５、Ｓ１ＰＲ４、ＴＮＦＡＩＰ６からなる群から選択される少なくとも１０種の遺伝子の発現が、当該マクロファージにおいて、ＰＢＭＣから誘導されるマクロファージと比較して少なくとも２０倍、好ましくは、少なくとも２００倍、少なくとも４００倍、少なくとも５００倍、または少なくとも１０００倍下方調節されていてもよい。当該群から選択される少なくとも１０種、少なくとも１２種、またはすべての遺伝子の発現が、当該マクロファージにおいて、ＰＢＭＣから誘導されるマクロファージと比較して少なくとも１００倍、好ましくは、少なくとも２００倍、少なくとも４００倍、少なくとも５００倍、または少なくとも１０００倍下方調節されていてもよい。
【００６３】
典型的な発現プロファイルは、本明細書において、例えば、表１において開示される。この比較は、比較される細胞型のうちの１つにおいて事実上発現されない遺伝子に関して、特に高い差をもたらすことが認められる。その場合、遺伝子の発現における非常に小さな差ですら、比較発現率における高い差をもたらし得る。理論に束縛されることを意図するものではないが、懸濁培養におけるせん断応力が、産生されるミエロイド細胞における遺伝子の異なる発現をもたらすと考えられる。
【００６４】
本発明は、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、または少なくとも７０％の未熟ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ１４−／ＣＤ１６３−ミエロイド細胞を含む細胞集団も提供し、適宜、当該細胞集団は、本発明の方法によって取得可能である。当該未熟細胞は、そのＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１４−／ＣＤ１６３−／ＣＤ６６ｂ−／ＣＤ３４ｄｉｍ／−の発現プロファイルのために独特である。
【００６５】
本発明は、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、または少なくとも７０％の顆粒球を含む細胞集団も提供し、適宜、当該細胞集団は、本発明の方法によって取得可能である。当該顆粒球は、その発現プロファイルのため、例えば、ＰＢＭＣから単離された顆粒球よりも有意に少ないＣＤ６６ｂをその表面上で発現するため、独特である。当該顆粒球細胞は、そのＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ６６ｂｄｉｍ、ＣＤ１６ｄｉｍの発現プロファイルのために独特である。
【００６６】
本発明は、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、または少なくとも７０％の赤血球細胞を含む細胞集団も提供し、当該細胞集団は、本発明の方法によって取得可能である。当該細胞は、赤血球前駆体であると思われる。
【００６７】
本発明は、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、または少なくとも３０％の巨核球を含む細胞集団も提供し、当該細胞集団は、本発明の方法によって取得可能である。
【００６８】
本発明は、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも１５％、または少なくとも２０％の樹状細胞を含む細胞集団も提供し、当該細胞集団は、本発明の方法によって取得可能である。
【００６９】
そのような細胞集団は、例えば、当技術分野において公知の方法に従って、凍結され得る。それらは典型的に使用前に解凍される。例えば、１つまたは複数の培養物の異なるバッチから、１つまたは複数の時点において単離された集団は、より高い細胞数が必要な場合に組み合わせることができる。特に重要なのは、最適な治療用細胞型に向けた、要求に応じた後続の分化と組み合わせて、凍結され得るミエロイド前駆細胞集団を生成するためにＩＬ３のみを用いる分化であり得る。
【００７０】
本発明は、薬学的に許容される担体中に、本発明の細胞集団、好ましくは、本発明のマクロファージまたは未熟ミエロイド細胞を含む細胞集団、最も好ましくは、本明細書において特徴付けられるマクロファージを含む、医薬組成物も提供する。細胞集団は、本明細書に記載される本発明の方法から取得可能であり得る。
【００７１】
好ましくは、細胞は、ヒト患者の処置を目的とするヒト細胞、最も好ましくは本発明のヒトマクロファージまたは未熟ミエロイド細胞、最も好ましくは、本明細書において特徴付けられるマクロファージである。
【００７２】
薬学的に許容される担体は、典型的に緩衝液、例えば、ＰＢＳ（約２０％のヒト血清アルブミンが補充されたＰＢＳ／ＥＤＴＡ）、またはクエン酸血漿、またはＰｌａｓｍａｌｙｔｅ−Ａ  ｐＨ７．４（Ｂａｘｔｅｒ、約２％のヒトアルブミンが補充されたもの）である。これは、細胞の生存に適合する。生理学的レベルのＮａＣｌを含んでもよい。
【００７３】
更なる実施形態において、本発明は、薬学的に許容される担体中に細胞集団を含む医薬組成物であって、集団における細胞の平均サイズが、生理食塩水溶液中の当該細胞の集団と比較して、例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、または少なくとも６０％低減されている、医薬組成物を提供する。当該細胞集団は、本明細書に記載されるミエロイド細胞、例えば、本明細書において特徴付けられる本発明の未熟ミエロイド細胞、マクロファージ、樹状細胞、好中球などの顆粒球、血小板、巨核球（ｍｅｇａｃａｒｙｏｃｙｔｅｓ）または赤血球細胞、好ましくは、マクロファージまたは未熟ミエロイド細胞の集団であり得る。
【００７４】
集団における細胞の平均サイズが低減されている細胞集団を含む医薬組成物との関連における薬学的に許容される担体は、例えば、糖および／または塩を含む高張液である。一実施形態において、未改変のサイズを有するマクロファージを含む本発明の医薬組成物は、医薬組成物を例えばアトマイザによって噴霧するのに好適な容器に含まれていてよい。
【００７５】
別の実施形態では、本発明の医薬組成物は、本明細書に記載されるようにサイズが低減されたマクロファージを含み、かつ、医薬組成物を例えばアトマイザによって噴霧するのに好適な容器に含まれている。
【００７６】
よって、本発明はまた、
ａ）薬学的に許容される担体中にマクロファージなどのミエロイド細胞を含む医薬組成物と、
ｂ）医薬組成物を例えばアトマイザによって噴霧するのに好適な容器と
を備える、適用システムを（例えば、キットの形態で）提供する。
【００７７】
好ましくは、当該マクロファージは、例えば、本明細書に記載される特徴を有する、本発明の方法によって取得可能なマクロファージである。しかしながら、他の方法によって生成されたミエロイド細胞、特にマクロファージを、例えば、本明細書に記載される処置のために、本発明の適用システムにおいて用いることもできる。
【００７８】
一実施形態において、適用システムのミエロイド細胞は、改変されたサイズを有せず、本明細書に記載されるマーカーを発現し得るミエロイド細胞、例えばマクロファージである。それらは、本発明の方法によって取得され得る。
【００７９】
第２の実施形態において、適用システムのミエロイド細胞は、低減されたサイズを有するミエロイド細胞、例えばマクロファージである。例えば、ミエロイド細胞のサイズは、細胞を高張液と接触させること、および凍結乾燥を含む群から選択される方法によって低減されていてよい。当該細胞は、好ましくは、本明細書に記載されるマーカーを発現する。それらは、本発明の方法によって取得され得る。第３の実施形態において、適用システムのミエロイド細胞は、抗生剤、免疫調整剤、および色素を含む群から選択される治療剤または診断剤を含むミエロイド細胞、例えばマクロファージであり、この薬剤は、細胞に対して外来性であってよい。これは、本明細書に記載されるように、細胞内に負荷されてよい。細胞は、本明細書に記載されるように、低減されたサイズを有してもよく、更に好ましくは、本発明の方法によって取得される細胞に典型的なマーカーを発現する。
【００８０】
好適な容器は、当技術分野において、例えばＥＰ２７４３３４３Ａ１から公知である。例えば、ＲｅｎｏｖａＣａｒｅのＳｋｉｎ  Ｇｕｎを使用してよく（ＲｅｎｏｖａＣａｒｅ）、これは、細胞の液体懸濁液を、例えば創傷上に噴霧することができる。細胞懸濁液を噴霧するためには、穏やかな陽圧気流を使用してよい。そのような適用システムは、例えばマクロファージを含む、本発明の細胞集団を、表面上、例えば熱傷および／または感染創などの創傷上に噴霧するのに特に有用である。それらは、肺における処置にも有用である。それらは、インビトロでの表面の処置のため、例えば、消毒のため、または病原体の数を低減させるため、特に、当該表面上の細菌の数を低減させるために使用されてもよい。
【００８１】
本発明の方法から取得可能な細胞は、代替的に、気管支鏡を用いて投与されてもよいし、または挿管患者に投与されてもよい。
【００８２】
本発明は、患者、例えばヒト患者における感染を処置または防止するのに使用するための、好ましくは、本発明の方法によって取得可能なマクロファージなどのマクロファージを含む、本発明の医薬組成物または適用システムも提供する。
【００８３】
本発明者らは、本発明の細胞が、様々な組織または臓器、例えば、脳、肺、皮膚、腸、腹膜、肝臓、脾臓、または膵臓の処置のための、特に、脳、肺、皮膚、腸、腹膜、または肝臓におけるマクロファージの機能不全の処置のための細胞治療薬として、好都合に使用され得ることを見出した。タンパク質を発現するように遺伝子操作されたマクロファージを、他の疾患の療法のために使用することもできる。例えば、インスリンを発現するマクロファージは、糖尿病の処置のために使用され得る。タンパク質の欠如または機能不全が関与する遺伝性疾患の処置も、当該タンパク質を発現するマクロファージの投与によって処置され得る。マクロファージの比較的低い回転率および組織適応のため、単回投与が、少なくとも１、２、もしくは３か月、または数年、最適には生涯にわたって効果的であり得る。反復処置が仮に必要であれば、その間隔はそれに従って長く、例えば、１、２、３、６か月毎、または１、２、３、４、５、１０、もしくは２０年毎になり得る。
【００８４】
本発明者らは、医薬組成物が、細菌感染の処置または防止のために、最も好ましくは、細菌感染の処置のために、好都合に使用され得ることを示した。細菌感染は、例えば、Ｐ．エルギノーサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｓ．ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｓ．アウレウス、およびＭ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の感染であり得る。これは肺感染であってもよい。例えばこれらの細菌の、肺感染のための処置は、例えば、挿管を介した局所細胞投与によって、肺に行なわれてよい。代替的に、エアロゾルに基づくスプレーなどの吸入に基づくシステム、または静脈内（ｉ．ｖ．）注射による全身投与を適用してもよい。局所投与を使用してもよい。吸入システムでは、気道内への深い浸透が所望される場合、本明細書に記載されるように、低減されたサイズを有する細胞の使用が好都合であり得る。
【００８５】
細菌の、例えばＰ．エルギノーサの肺感染は、嚢胞性線維症患者などの患者において特に関連性がある。特に処置または防止の関連性があり得る患者は、免疫抑制患者、例えば、移植患者、集中治療を受けている患者（例えば、人工呼吸関連肺炎患者）、新生児、高齢患者、慢性肺疾患、例えば嚢胞性線維症、ＣＧＤ（または免疫不全をもたらす他の遺伝性疾患）、慢性閉塞性肺疾患、またはｈＰＡＰを患う患者などの免疫低下患者である。
【００８６】
細菌感染の処置は、敗血症の処置でもあり得る。この関連において、マクロファージは、細菌負荷を低減させるのに役立ち得るだけでなく、炎症促進性サイトカイン、細胞および細菌の残骸、ならびに／または毒素の負荷を低減させるためのシンク（マクロファージスポンジ）として機能することもできる。
【００８７】
感染の処置または防止は、感染創の処置または創傷の感染の防止であってもよい。その場合、例えば、本発明の投与デバイスを用いて創傷に噴霧することによる局所投与が有用である。創傷は、処置前にアクセスを容易にするために、例えば、凝固した血液を除去して清浄化され得る。感染の処置または防止は、例えば、手術中、または手術部位を閉じた後に、手術部位に本発明の組成物を噴霧することによる、本発明の組成物による手術前後または手術後の処置であってもよい。
【００８８】
本発明は、患者における創傷治癒を促進するのに使用するための、好ましくはマクロファージを含む、本発明の医薬組成物または適用システムも提供する。創傷は、例えば、熱傷、特にＩＩ度またはＩＩＩ度の熱傷であり得る。創傷治癒の促進は、感染に関連していても関連していなくてもよい。マクロファージは、病原体の排除に寄与するだけでなく、組織のリモデリングの補助もする。これらの特徴は、本発明の医薬組成物を、例えば潰瘍の処置のため、または壊死組織の除去のために有用にする。更なる使用は、例えば、移植成功の促進、または歯周炎の処置におけるものであり得る。本組成物は、瘢痕形成を防止するかまたは最小限に抑えるために使用されてもよい。
【００８９】
本発明との関連において、処置とは、疾患の少なくとも１つの症状が寛解することを意味する。好ましくは、細菌感染との関連において、細菌負荷も低減され、最も好ましくは、すべての細菌が排除される。
【００９０】
防止とは、処置される患者が未だ病気ではなく、すなわち、疾患の症状を示さず、感染していない（未感染）場合があることを意味する。防止は、疾患（特に感染）の発生の可能性を低減させ、かつ／または、疾患の症状の重症度を低減させる。
【００９１】
典型的に、本発明は、処置との関連において使用されるが、例えば、多耐性細菌の激増との関連において、かつ／または、患者、例えば、そのような細菌と接触する可能性が高い、例えば集中治療を受けている免疫低下患者において、または実質臓器移植もしくは血液／骨髄輸注との関連において、防止が目的となる場合もある。
【００９２】
本発明の１つの特定の利点は、少なくとも１つの抗生剤に対する耐性がある細菌、または多耐性細菌の細菌感染を処置または防止するために使用され得るということである。
【００９３】
代替的に、本発明の細胞集団を含む（好ましくはマクロファージを含む）医薬組成物を用いた、ウイルス感染、例えばインフルエンザ（Cardani et al. 2017）の処置および／または防止、好ましくは処置が想定される。インフルエンザの処置のためには、例えば、肺内適用、例えば、本明細書に記載されるもの、または噴霧適用が実行され得る。ウイルス病原体が既知である場合、そのウイルスの表面抗原を対象とする抗体（組成物中のマクロファージによって認識され得る好適な種のもの）が、医薬組成物中に更に含まれてもよい。細菌の処置を目的とする組成物には、細菌の表面抗原を対象とする抗体を添加してもよい。
【００９４】
典型的に、医薬組成物の投与は、感染の部位において、または潜在的な感染の部位において行なわれる。例えば、肺感染に対しては、肺（肺内）投与が最適である。しかしながら、細胞が感染の部位に到達しない可能性が高く、かつ／または挿管が患者にとって高リスクとなるほど、肺疾患が重症である場合、すなわち、例えば、重度ＣＯＰＤまたは重度肺感染の場合は、他の適用形態も想定される。他の好適な投与形態としては、ｉ．ｖ．投与、吸入に基づくシステム（スプレー、例えば、喘息スプレーと同様）、局所投与、例えば、感染創もしくは感染する危険性がある創傷などの創傷に対するもの、眼投与（例えば、眼感染時）、経鼻投与、移植による臓器に対する投与、または感染側付近（例えば、移植片に関連する感染部付近）への投与が挙げられる。
【００９５】
概して、患者（例えば、ヒト患者）由来のｉＰＳＣは、ミエロイド細胞と、したがって本発明の自己ミエロイド細胞（好ましくはマクロファージ）との生成のために使用され得る。しかしながら、患者に投与された同種異系マクロファージによる細菌の排除がマクロファージの拒絶反応よりも速い場合があることから、これは必須ではない。移植されたマクロファージの長期生存が必要とされない場合、または更に言えば望ましくない場合、例えば、遺伝性疾患バックグラウンドのない急性細菌感染においては、工業規模のバイオリアクターシステムによって対費用効果の高い方法で既製の製品として産生可能な同種異系マクロファージが適用されてもよい。特に、肺投与との関連において、投与されるマクロファージの投与後の生存および機能性が示されている。
【００９６】
注目すべきことに、同種異系細胞は初めの２週間以内に免疫学的に拒絶されることが予想され得るため、本発明の同種異系ミエロイド細胞の使用は、少なくとも免疫適格性のレシピエントにおいては、腫瘍形成のリスクを最小限に抑える。とはいえ、異なるＨＬＡハプロタイプが適用される場合、即納の調製物の反復適用が可能である。免疫適格性またはＨＬＡ分子の発現の欠如のいずれかに関して選択（または操作）された、多能性幹細胞（例えば、ｉＰＳＣ）から生成されたミエロイド細胞（例えば、マクロファージ）を使用することも可能である。
【００９７】
本発明者らによって行なわれた実験に基づくと、約４×１０６個のマクロファージ（本発明の細胞集団における総細胞数に関して計算された）は、約２５ｇのマウスにおいて肺感染の処置に成功した。より低い細胞数、例えば、マウス１匹当たり約４×１０５〜約４×１０６個、またはマウス１匹当たり約１×１０６〜約２×１０６個が、処置に十分であると予想される。これは、約１，６×１０７／ｋｇ〜約１，６×１０８／ｋｇ、または約５×１０７／ｋｇ〜１×１０８／ｋｇに相当する。結果として、例えば、６０ｋｇのヒト患者は、約１×１０９〜１×１０１０個のマクロファージによって処置され得る。処置の成功に必要とされる細胞の数は、当然ながら、臨床医によって評価され得るいくつかの要因、例えば、患者の全体的健康、特に免疫状態、疾患の重症度、および細菌負荷に応じる。防止には、処置よりも著しく少ない細胞が必要であると考えられる。創傷治癒または創傷感染の場合、治療的な細胞数を解明するために、臨床医による同様の評価が実施され得る。例えば、４×１０５〜約８×１０６個のマクロファージ／ｃｍ２が処置に十分であり得る。
【００９８】
ｉＰＳＣ由来マクロファージの、例えば、感染性疾患の処置のための適用に加えて、様々な疾患を標的とするように、他のｉＰＳＣ誘導体を代替的にまたは更に適用してもよい。懸濁に基づく分化培養は、他のｉＰＳＣ由来ミエロイド細胞の生成も可能にし、撹拌タンクバイオリアクター技術も、例えば、ｉＰＳＣ由来顆粒球の生成に好適である。そのような顆粒球は、例えば上記に列挙したような、細菌感染の改善された処置のために、または真菌感染の処置のために、例えば、マクロファージと組み合わせて、かつ／または単独で使用され得る。
【００９９】
本発明の方法に従って取得可能な血小板は、例えば、血小板減少症の処置において、特に、抗がん化学療法および／または造血幹細胞移植の後に、出血エピソードにおいて予防的に（特に、頭蓋内出血を防止するため）、先制的（例えば、大手術が予期される場合）、または治療的に使用するために好適であり得る。同様に、そのような血小板は、機能的血小板欠損、例えば薬物誘導性およびここでは特にアスピリン誘導性のもの、またはグランツマン血小板無力症（ｔｈｒｏｍｂａｓｔｈｅｎｉｅ）もしくはベルナール・スーリエ症候群などの先天性のものにおいて使用され得る。
【０１００】
本発明の方法に従って取得可能な樹状細胞は、例えば、（ｉ）腫瘍および他の悪性病変、または（ｉｉ）ＥＢＶもしくはＣＭＶなどのウイルスを含む病原体に対するワクチン投与戦略において使用するのに好適であり得る。
【０１０１】
代替的に、ＩＬ３のみを用いる大規模分化を用いて、凍結保存および最適な治療用細胞型に向けた、要求に応じた後続の分化に好適な、ミエロイド前駆細胞集団を生成してもよい。
【０１０２】
好ましくはマクロファージを含む、本発明の細胞集団は、例えば、インビトロの、
ａ）薬物スクリーニングおよび薬物開発、
ｂ）疾患モデリング、
ｃ）組織操作（例えば、外傷療法のための血液産生）、
ｄ）バイオ人工生物の調製、
ｅ）消毒および／または病原体の排除（例えば、水の精製または表面の消毒のため）、
ｆ）移植のための材料、例えばステントのコーティング、
ｇ）例えば、血液細胞、好ましくはマクロファージの造血分化、発達、および成熟において、当該細胞の生理機能および病態生理をモニタリングするための、バイオマーカーの開発［ここで、例えば、患者および健康な個人に由来する細胞（または比較のための標準的細胞）の発現プロファイルがスクリーニングされ得る］、または
ｈ）抗体、ホルモン、サイトカイン、薬物、培養培地、および血清を含む群から選択される生物由来物質（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔ）の品質管理
などの用途にも有用である。
【０１０３】
これらのインビトロでの用途のうちのいくつか、例えば、消毒、または移植のための材料のコーティングに関しては、細胞の噴霧が有効であり得る。よって、本発明の細胞集団は、例えば、アトマイザに連結していてよい噴霧に好適な容器内に細胞がある、細胞を噴霧するのに好適な投与システムまたはキットの形態であってもよい。
【０１０４】
本発明は、ミエロイド細胞、例えばマクロファージを調製し、胚様体、ミエロイド細胞形成複合体、および／またはミエロイド細胞によって、好ましくはミエロイド細胞によって産生されたタンパク質を単離する本発明の方法を実行することを含む、タンパク質を調製する方法も提供する。タンパク質は、細胞内タンパク質または膜タンパク質であり得る。好ましくは、タンパク質は、細胞培養培地中に分泌されるタンパク質である。好都合なことに、これは、細胞培養培地から、例えば、本発明の懸濁培養の最後に、例えば、細胞採取のために培地から細胞を単離するときに調製され得る。タンパク質は例えば、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、Ｓ１００タンパク質、および組換えタンパク質であり得る。組換えタンパク質の発現のために、ミエロイド細胞は、例えば、安定なトランスフェクションまたは一過性トランスフェクションによって、タンパク質を発現するように遺伝子操作される。本発明者らは、例えば、本発明の方法に従って培養されたマクロファージが、例えば、新生児における敗血症の処置において、免疫調整薬として、または心臓病学的障害の処置のための医学的用途を有する、Ｓ１００アラーミンとも呼ばれるＳ１００タンパク質を高い量で産生したことを見出した。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】図１。懸濁培養におけるヒトｉＰＳＣの血球分化。（Ａ）未分化ヒトｉＰＳＣ（ＣＤ３４ｉＰＳＣ１６）の代表的な明視野画像。スケールバー、５００μｍ。（Ｂ）ｉＰＳＣ由来マクロファージ（ｉＰＳＣ−ＭＡＣ）を産生するミエロイド細胞形成複合体（ＭＣＦＣ）に向かって分化したＣＤ３４ｉＰＳＣ１６の代表的な明視野画像。スケールバー、５００μｍ。（Ｃ）ｉＰＳＣ−ＭＡＣの明視野顕微鏡観察（左）およびサイトスピン染色（右）。スケールバー、１００μｍ。（Ｄ）フローサイトメトリーによって分析されたＩＰＳＣ−ＭＡＣ（破線：それぞれのアイソタイプ対照、黒線：表面マーカー）。（Ｅ）４℃（陰性対照）または３７℃（ｎ＝２、平均±ｓ．ｅ．ｍ．）におけるｉＰＳＣ−ＭＡＣによるｐＨｒｏｄｏ標識Ｅ．Ｃｏｌｉ粒子の食作用。図Ｓ１も参照されたい。
【図２】図２。撹拌タンクバイオリアクターにおけるヒトｉＰＳＣ−ＭＡＣの連続生成。（Ａ）撹拌タンクバイオリアクター（ＤＡＳｂｏｘシステム）におけるヒトｉＰＳＣの血球分化のスキーム。（Ｂ）浮遊ＭＣＦＣを充填したＤＡＳｂｏｘバイオリアクターの代表的な写真。（Ｃ）バイオリアクターにおいて産生された生存可能なマクロファージの個々の細胞計数（ｎ＝２の独立したバイオリアクターの運転、平均±ｓ．ｅ．ｍ．）。（Ｄ）４２日間のバイオリアクターの運転のうち培養期全体にわたる、代表的なマクロファージ採取計数（上のグラフ）、および連続的プロセスモニタリングから得た対応するデータ（バイオマス、温度、ｐＨ、および溶存酸素（ＤＯ）レベル）。（Ｅ）バイオリアクターにおける培地中のヒトサイトカインの分析［技術的２回反復測定（ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｄｕｐｌｉｃａｔｅｓ）］。（Ｆ）採取１〜５において分析されたマクロファージ生成に関する代表的な光学顕微鏡観察。第１の横列は、バイオリアクターからの未濾過の培地試料の明視野画像を示す。第２の横列は、沈降によってＭＣＦＣから分離された、新鮮に採取されたマクロファージの明視野画像を示す。第３および第４の横列は、ｉＰＳＣ−ＭＡＣのサイトスピンおよびフローサイトメトリー分析を示す（破線：それぞれのアイソタイプ対照、黒線：ＣＤ４５、点線ＣＤ１４）。スケールバー、それぞれ５０、１００、および５００μｍ。図Ｓ２も参照されたい。
【図３】図３。撹拌タンクバイオリアクターから誘導されたｉＰＳＣ−ＭＡＣの特性評価。（Ａ）バイオリアクター分化から誘導されたｉＰＳＣ−ＭＡＣの代表的なフローサイトメトリー分析（破線：それぞれのアイソタイプ対照、黒線：細胞表面マーカー）。（Ｂ）バイオリアクターから誘導された最終分化型ｉＰＳＣ−ＭＡＣの明視野（左の画像）またはサイトスピン調製物（右の画像）のいずれかの代表的な写真。スケールバー、２００および１００μｍ。（Ｃ〜Ｅ）ｉＰＳＣ、バイオリアクターから誘導されたｉＰＳＣ由来マクロファージ（ｉＰＳＣ−ＭＡＣ）、およびＰＢＭＣ由来マクロファージ（ＰＢＭＣ−ＭＡＣ）のトランスクリプトーム分析［ｎ＝２、生物学的反復測定（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ）］。（Ｃ）不偏性階層的ヒートマップクラスタリング。（Ｄ）多能性関連遺伝子のヒートマップ。（Ｅ）自然免疫応答の活性化に関連する（ＧＯ：０００２２５３）差次的に調節された遺伝子（ｐ＜０．００１）のヒートマップ。（Ｆ）ｉＰＳＣ−ＭＡＣおよびＰＢＭＣ−ＭＡＣにおいて上方調節された遺伝子（上位１００種；未分化ｉＰＳＣと比較）のベン図、ならびに、一般的に共通した遺伝子セットと、ヒト遺伝子アトラス（ＥｎｒｉｃｈＲ）に従ってそれぞれｉＰＳＣ−ＭＡＣおよびＰＢＭＢＣ−Ｍａｃについて取得された遺伝子セットとに関する、上方調節された遺伝子に基づく細胞型の割り当て。（Ｇ）ｉＰＳＣ−ＭＡＣのみにおいて上方調節された遺伝子の細胞株の割り当て（ＥｎｒｉｃｈＲ）においてマッチした遺伝子を示すクラスタグラム（ｃｌｕｓｔｅｒｇｒａｍ）。
【図４】図４。撹拌タンクバイオリアクターにおいて生成されたｉＰＳＣ−ＭＡＣの抗菌活性。（Ａ）異なる時点におけるｉＰＳＣ−ＭＡＣによるラテックスビーズの食作用を示すラスター走査型電子顕微鏡観察。（Ｂ）ＧＦＰ標識Ｐ．エルギノーサ（ＰＡＯ１）と共に４または３７℃で２時間インキュベーションした後の最終分化型ｉＰＳＣ−ＭＡＣおよびＰＢＭＣ−ＭＡＣによる食作用率（ｎ＝３の生物学的反復測定、Ｓｉｄａｋの多重比較検定を用いた二元配置ＡＮＯＶＡ、ｎｓは有意差なしを意味する）。（Ｃ）炎症応答（ＧＯ：０００６９５４、１０倍超の上方調節）、自然免疫応答（ＧＯ：００４５０８７、５倍超の調節）、および自然免疫応答の活性化（ＧＯ：０００２２５３、２倍超の調節）に関連する差次的に調節された遺伝子のヒートマップ。（Ｄ）５倍を超えて上方調節された遺伝子の疾患および機能に関するＩＰＡ分析。
【図５】図５。ｈｕＰＡＰマウスにおける肺感染およびマクロファージの同時移植。（Ａ）ｈｕＰＡＰまたはＮＳＧマウスに、Ｐ．エルギノーサ（ＰＡＯ１）の肺輸送、およびｉＰＳＣ−ＭＡＣ（ＰｉＭＴ）の同時移植を行なうスキーム。（Ｂ）ｈｕＰＡＰマウスに、ＰＡＯ１の感染（感染）、または感染および移植（感染＋ＰｉＭＴ）を行なった後の、２４時間にわたる直腸温度および疾患スコアの時間経過（ｎ＝６動物／群、平均±ｓ．ｅ．ｍ）。（Ｃ）２４時間後の体重における変化。値は、感染前のそれぞれの体重に対して正規化されている（ｎ＝６動物／群、平均±ｓ．ｅ．ｍ）。（Ｄ）頭部突出型体幹プレチスモグラフィー（ｈｅａｄ−ｏｕｔ  ｂｏｄｙｐｌｅｔｈｙｓｍｏｇｒａｐｈｙ）によって測定された肺機能（ｎ＝６動物／群、平均±ｓ．ｅ．ｍ）。（Ｅ）２４時間後の肺１つ当たりのＰＡＯ１の細菌コロニー形成単位（ＣＦＵ）（ｎ＝６動物／群、平均±ｓ．ｅ．ｍ）。（Ｆ）ヘモグロビンの存在に関する尺度としての、６５０ｎｍにおける気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）試料の吸光度（ｎ＝３動物／群、平均±ｓ．ｅ．ｍ）。（Ｇ）ＢＡＬＦおよび肺のフローサイトメトリー分析。ＢＡＬＦおよび肺におけるマウス顆粒球（ＧＲ１＋細胞として判定）の割合（ｎ＝３動物／群、平均±ｓ．ｅ．ｍ）。（Ｈ）右肺の組織学的スコアリング（ｎ＝３動物／群、平均±ｓ．ｅ．ｍ）。（Ｉ）ｈＣＤ４５で染色した１群当たり１匹の動物のＢＡＬＦおよび肺の代表的な図。
【図６】図６。ｈｕＰＡＰマウスにおける肺感染およびｉＰＳＣ−ＭＡＣの治療的移植。（Ａ）ｈｕＰＡＰマウスに、Ｐ．エルギノーサ（ＰＡＯ１）の肺感染、およびバイオリアクターから誘導されたｉＰＳＣ−ＭＡＣ（ＰｉＭＴ）の治療的移植を行なうスキーム。（Ｂ）ＰＡＯ１に感染したｈｕＰＡＰマウス（感染）、感染および移植を行なったｈｕＰＡＰマウス（感染＋ＰｉＭＴ）、ならびにＰＢＳを２回受けた対照マウス（対照）に関する疾患スコアの時間経過（ｎ＝３動物／群、平均±ｓ．ｅ．ｍ）。（Ｃ）ビデオ記録および手作業による追跡によって分析されたマウスの動きによって評価された感染２４時間後の活性（ｎ＝１動物／群）。（Ｄ）感染後２４時間にわたって分析された直腸温度の時間経過（ｎ＝３動物／群、平均±ｓ．ｅ．ｍ）。（Ｅ）２４時間後の体重における変化。値は、感染前のそれぞれの体重に対して正規化されている（ｎ＝３動物／群、平均±ｓ．ｅ．ｍ）。（Ｆ）２４時間後の肺１つ当たりのＰＡＯ１の細菌コロニー形成単位（ＣＦＵ）（ｎ＝３動物／群、平均±ｓ．ｅ．ｍ）。（Ｇ）ＢＡＬＦ試料の画像。（Ｈ）感染＋ＰｉＭＴマウス（ｎ＝２マウス）のＢＡＬＦにおけるヒトサイトカインのレベル。（ｊ）感染マウス、感染＋ＰｉＭＴマウス、および対照マウスの肺組織診断画像。
【図７】図７。懸濁下における血球分化からのミエロイド細胞の誘導。（Ａ）ＩＬ３およびＧ−ＣＳＦの補充により生成され、Ｇ−ＣＳＦのみの存在下で最終的に分化した細胞の、懸濁に基づく血球分化培養物のフローサイトメトリー分析（破線：それぞれの未染色対照、黒線：細胞表面マーカー）。（Ｂ）ＩＬ３／Ｇ−ＣＳＦ培養物から生成され、Ｇ−ＣＳＦのみによって最終分化した細胞のサイトスピン。スケールバー：５０μｍおよび２０μｍ。（Ｃ）ＩＬ３およびＳＣＦ／ＥＰＯの補充によって生成され、ＳＣＦおよびＥＰＯの存在下で最終的に分化した細胞の、懸濁に基づく血球分化培養物のフローサイトメトリー分析（破線：それぞれのアイソタイプ対照、黒線：細胞表面マーカー）。（Ｄ）ＩＬ３のみを使用して懸濁培養物から誘導され、Ｍ−ＣＳＦ中で７日間より長くにわたって分化した細胞のフローサイトメトリー分析。データは、ヒストグラムのオーバーレイとして示されている（破線：それぞれの未染色対照、黒線：細胞表面マーカー）。（Ｅ）Ｍ−ＣＳＦによって最終分化したＩＬ３由来培養物に関するそれぞれのサイトスピン。スケールバー：５０μｍおよび２０μｍ。（Ｆ）ＩＬ３のみを使用して懸濁培養物から誘導され、Ｇ−ＣＳＦ中で７日間より長くにわたって分化した細胞のフローサイトメトリー分析。データは、ヒストグラムのオーバーレイとして示されている（破線：それぞれの未染色対照、黒線：細胞表面マーカー）。（Ｇ）Ｇ−ＣＳＦによって最終分化したＩＬ３由来培養物に関するそれぞれのサイトスピン。スケールバー：５０μｍおよび２０μｍ。
【図８】図８。移植マウスの肺組織診断。感染＋ＰｉＭＴ動物のみにおけるマクロファージを示す右肺組織診断（代表的な画像、ｎ＝３）。スケールバー、５０μｍ。
【図９】図９。ＮＳＧマウスモデルにおける肺感染およびマクロファージの同時移植。（Ａ）ＰＡＯ１に感染したＮＳＧマウス（感染）、または感染および移植を行なったＮＳＧマウス（感染＋ＰｉＭＴ）の、感染６時間後および２４時間後の直腸温度および（Ｂ）疾患スコア。実験前に測定した疾患スコアおよび温度を対照値とした（ｎ＝４〜５動物／群、平均±ｓ．ｅ．ｍ）。（Ｃ）感染ＮＳＧマウスおよび感染＋ＰｉＭＴ  ＮＳＧマウスにおける２４時間後の肺１つ当たりのＰＡＯ１のコロニー形成単位（ＣＦＵ）（ｎ＝４〜５動物／群、平均±ｓ．ｅ．ｍ）。
【図１０】図１０。噴霧適用および細胞サイズの低減。（Ａ）６×１０６細胞／ｍｌの濃度にて噴霧した後のヒトマクロファージ細胞株（Ｕ９３７）の生存細胞および死細胞の数。（Ｂ）パフ（噴霧）１回当たりの細胞の数は、ネブライザ（褐色ガラス、容量２０ｍｌ、噴霧容量およそ５０μｌ、Ｒｉｘｉｕｓ  ＡＧ社、Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して細胞約２＊１０５個である。
【図１１】図１１。異なるオスモル濃度の溶液中での細胞のサイズ低減（収縮）。ヒトマクロファージ細胞株Ｕ９３７を、３００、６００、８００、または１０００ｍｏｓｍのスクロース溶液において、室温で１５分間インキュベートした。対照は３００ｍｏｓｍである。それぞれのデータは、フローサイトメトリー分析から受けた。プロットは、より高いオスモル濃度の溶液中でインキュベーションした時のＦＳＣ（前方散乱、容量の指標）における減少を示す。プロットは、３００ｍｏｓｍの対照と比較して、６００ｍｏｓｍではおよそ４０％、８００ｍｏｓｍでは３２％、１０００ｏｓｍの高張液では２１％へのＦＳＣの減少を示す。
【図１２】図１２。初代マウスマクロファージの噴霧は、生存細胞の数を著しく低減させない。確立された周知の技術を使用し、マウス骨髄試料からマウス初代マクロファージを単離した。簡潔に述べると、大腿骨および脛骨を単離し、フラッシュして骨髄を受けた。総骨髄を、それぞれの培地において、最低７日間にわたり、Ｍ−ＣＳＦと共にインキュベートした。接着性のマクロファージをトリプシン処置によって採取した。それらを洗浄し、噴霧のためにＰＢＳ溶液培地（ＲＰＭＩ）に取り、噴霧後、それらを遠心分離し、フローサイトメトリー分析のためにＰＢＳに取った。分析の直前に、氷上で細胞にヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を与え、死細胞を染色した。プロットは、噴霧なしの細胞の数、および噴霧後の細胞の数を示し、白の四角は生細胞を示し、黒の四角は死細胞を示す。死細胞の割合は約５〜１０％である。
【図１３】図１３。異なるオスモル濃度の溶液中での細胞のサイズ低減（収縮）。図１２について説明したように調製されたマウス初代マクロファージを、３００、６００、８００、または１０００ｍｏｓｍのスクロース溶液において、４℃で１時間にわたってインキュベートした。対照は３００ｍｏｓｍである。それぞれのデータは、フローサイトメトリー分析から受けた。プロットは、より高いオスモル濃度の溶液中でインキュベーションした時のＦＳＣ（前方散乱、容量の指標）における減少を示す。プロットは、３００ｍｏｓｍの対照と比較して、６００ｍｏｓｍではおよそ４４％、８００ｍｏｓｍでは３６％、１０００ｏｓｍの高張液では２４％へのＦＳＣの減少を示す。
【０１０６】
参考文献
【表Ａ】
2020518263.tif 000003
【表Ｂ】
2020518263.tif 000004
【表Ｃ】
2020518263.tif 000005
【表Ｄ】
2020518263.tif 000006
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【０１０７】
実施例１
方法
細胞の培養および分化
ｉＰＳＣの培養
動員末梢血ＣＤ３４＋細胞（Lachmann et al., 2014）からヒトｉＰＳＣ（ｈＣＤ３４ｉＰＳＣ１６）を前もって生成し、ｉＰＳＣ培地（ノックアウトＤＭＥＭ、２０％のノックアウト血清代替物、１ｍＭのＬ−グルタミン、１％のＮＥＡＡ、１％のペニシリン／ストレプトマイシン、すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）、および１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）中の照射マウス胎仔線維芽細胞（ＭＥＦ）上で培養した。ＥＢ形成前の最後の４〜５日間にわたり、塩基性ＦＧＦを維持培地から除いた。
【０１０８】
接着性培養における血球分化
過去に説明されているように（Lachmann et al., 2015）、従来型の接着に基づくヒトｉＰＳＣの血球分化を実施した。簡潔に述べると、コラゲナーゼ−ＩＶを使用し、ＰＳＣコロニー（６ウェルプレートのうちの３ウェル、およそ３×１０６細胞）を破壊して断片にし、オービタルシェーカー上の６ウェル懸濁プレートにおいて、１０μＭのＲｏｃｋ阻害剤（Ｙ−２７６３２；Ｔｏｃｒｉｓ）が補充されたｉＰＳＣ培地中で５日間にわたる培養により、ＥＢ形成を誘導した。その後、双眼鏡を使用してＥＢを手作業で選択し、組織培養６ウェルプレートに移し、１％のペニシリン−ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２５ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ３、および５０ｎｇ／ｍｌのヒトＭ−ＣＳＦ（いずれもＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）が補充された分化培地Ｉ（Ｘ−ＶＩＶＯ  １５、Ｌｏｎｚａ）において培養した。１０〜１５日目以降、ｉＰＳＣ−ＭＡＣを上清から週に１回採取した。
【０１０９】
懸濁培養における血球分化
懸濁下で血球分化を達成するために、最も大きいＥＢを沈降特性（沈降１０分未満）により選択し、８５回転毎分（ｒｐｍ）におけるオービタルシェーカー（Ｃｅｌｌｔｒｏｎ、Ｉｎｆｏｒｓ  ＨＴ）上の６ウェル懸濁プレート内の分化培地Ｉに移した。１０〜１５日目以降、ｉＰＳＣ−ＭＡＣを培地から週に１回採取した。他のミエロイド細胞型への分化のためには、過去に説明されているように（Ng et al., 2008）、ＡＰＥＬ培地を使用した。顆粒球細胞および赤血球細胞への分化のためには、２５ｎｇ／ｍｌのｈＩＬ３を、それぞれ、５０ｎｇ／ｍｌのｈＧ−ＣＳＦ、または１００ｎｇ／ｍｌのｈＳＣＦと３ＵのｈＥＰＯと合わせて適用した。
【０１１０】
撹拌タンクバイオリアクターにおける血球分化
過去に説明されているように（Kempf et al., 2015）、バイオリアクター（ＤＡＳｂｏｘ  Ｍｉｎｉバイオリアクターシステム、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を設定し、較正した。簡潔に述べると、２５０ｍｌのガラス容器に、８翼式羽根車（６０°傾斜）、ならびにバイオマス（Ａｂｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、ｐＨ、ＤＯのオンラインモニタリング、および温度制御のためのプローブを備え付けた。較正は、１２０ｍｌの化学的に定義されたＸ−ＶＩＶＯ  １５（Ｌｏｎｚａ）において実施した。
【０１１１】
バイオリアクターにおける血球分化については、ｉＰＳＣを２０個の６ウェルプレートまで拡大し、ｂＦＧＦの存在下で３日間にわたって培養した。接着性培養と同様にＥＢの形成を実施した。５日後、ＥＢを沈降特性（沈降１０分未満）によって選択し、平衡化したバイオリアクターに移した。ＩＬ３およびＭ−ＣＳＦが補充されたＸ−ＶＩＶＯ  １５（分化培地Ｉ）中で、３Ｌ／時における一定のヘッドスペースガス供給（２１％のＯ２；５％のＣＯ２）、および５０ｒｐｍでの撹拌を用い、３７℃において細胞を培養した。ＭＣＦＣの完全性およびマクロファージの形成をモニタリングするため、培養プロセスを中断することなく、試料採取ポートを介して、１ｍｌの試料を週に１〜２回収集した。分化培地Ｉを、６〜７日毎に手作業で交換し、３〜４日後に２０ｍｌを適宜供給した。マクロファージを、沈降（４〜５分）、および後続の１００μｍの濾過器を通した培地の濾過を介したＭＣＦＣからの分離により、週１回採取した。保持されたＭＣＦＣをバイオリアクターに戻した。４分間の３００×ｇにおける遠心分離によって、濾過された培地からマクロファージを収集した。
【０１１２】
Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２０１６およびＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６を使用し、オンラインモニタリングからのデータを処理した。グルコースおよび乳酸の濃度についてはＹＳＩ  ２７００  ｓｅｌｅｃｔ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎａｌｙｓｅｒを使用し、オスモル濃度についてはＯｓｍｏｍａｔ  ３００（Ｇｏｎｏｔｅｃ）を使用し、乳酸デヒドロゲナーゼの濃度については製造元の説明（ＭＡＫ０６６、Ｓｉｇｍａ）に従ってマイクロプレートリーダー（Ｐａｒａｄｉｇｍ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、上清を分析した。
【０１１３】
最終分化
更なる成熟のために、ＭＣＦＣから新鮮に採取された細胞を、マクロファージについては５０ｎｇ／ｍｌのｈＭ−ＣＳＦ、顆粒球については５０ｎｇ／ｍｌのｈＧ−ＣＳＦ、赤血球分化については１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦおよび３Ｕ／ｍｌのＥＰＯを含有する、分化培地ＩＩ［１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１％のペニシリン−ストレプトマイシンが補充されたＲＰＭＩ１６４０培地］において、少なくとも７日間にわたって培養した。
【０１１４】
末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）の単離およびマクロファージへの分化
すべての健康なドナーは、Ｈａｎｎｏｖｅｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌにおける現地の倫理委員会に従って、書面によるインフォームドコンセントを提供した。Ｂｉｏｃｏｌｌ  Ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを使用した勾配遠心分離（４０分、４００×ｇ；Ｂｉｏｃｈｒｏｍｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）により、健康なボランティアの末梢血から末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。その後、１０％のウシ胎仔血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、１％のペニシリン−ストレプトマイシン（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ならびにｈＩＬ３およびｈＭ−ＣＳＦ（それぞれ５０ｎｇ／ｍｌ、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）が補充されたＲＰＭＩ１６４０培地において、１週間にわたって細胞を培養した。この後、５０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦのみを含有する分化培地において、ＰＢＭＣ−ＭＡＣを更に３〜４日間培養した。
【０１１５】
表現型および機能の特性評価
フローサイトメトリー
説明されているように（Lachmann et al., 2015、Lachmann et al., 2014）、ミエロイド細胞のフローサイトメトリー分析を実施した。マクロファージについては、非特異的結合を防止するために、１０％のＦＣＳが補充されたＰＢＳを使用した。ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒサイトメーター（Ｂｅｃｋｔｏｎ＆Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて細胞を分析し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）を用いて分析した。次の抗体：ｈＴＲＡ−１−６０−ＰＥ（カタログ番号：１２−８８６３−８０）、ｈＣＤ１１ｂ−ＡＰＣ（カタログ番号：１７−０１１８−４１）、ｈＣＤ１４−ＰＥ（カタログ番号：１２−０１４９−４２）、ｈＣＤ１６３−ＡＰＣ（カタログ番号：１７−１６３９−４１、ｈＣＤ１６−ＦＩＴＣ（カタログ番号：１１−０１６８−４１）、ｈＣＤ３４−ＦＩＴＣ（カタログ番号：１１−０３４９−４１）、ならびにアイソタイプ対照：マウスＩｇＧ１ａ−ＰＥ（カタログ番号：１２−４７１４−４１）、ＦＩＴＣ（カタログ番号：１１−４７１４−４１）またはＡＰＣ（カタログ番号：１７−４７１４−４１）、およびラットＩｇＧ２ａ−ＰＥ（カタログ番号：１２−４３２１−８１）は、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した。Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓから得た抗体：ｈＣＤ８６−ＡＰＣ（カタログ番号：３０５４１１）、ｈＣＤ６６ｂ−ＦＩＴＣ（カタログ番号：３０５１０４）、またはｈＣＤ４５−ＰＥ（カタログ番号：３０４００７）。
【０１１６】
マウスの肺およびＢＡＬＦのフローサイトメトリー分析のために、４％ＰＦＡを使用して試料を固定した。この後、非特異的結合を防止するために、試料をｆｃ受容体遮断抗体（ＣＤ１６／ＣＤ３２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号：１４−０１６１−８１）と共に２０分間インキュベートした。使用した抗体は、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓから（ｈＣＤ４５−ＰｅＣｙ７）、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから（ｍＧＲ１−ｅＦｌｕｏｒ４５０）購入した。
【０１１７】
サイトスピン調製物
２０，０００〜５０，０００個の細胞をガラススライド上で６００×ｇにおいて７分間スピンし、０．２５％のＭａｙ−Ｇｒｕｅｎｗａｌｄ中で５分間、および０，４％のＧｉｅｍｓａ染色改変溶液（Ｓｉｇｍａ）中で２０分間にわたって染色した。
【０１１８】
食作用アッセイ
懸濁培養または接着性培養から誘導され、組織培養プレート上で最終分化したｉＰＳＣ−ＭＡＣの食作用活性を、フローサイトメトリーによって評価した。したがって、１×１０５個の細胞を、ｐＨｒｏｄｏ（商標）Ｒｅｄ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢｉｏＰａｒｔｉｃｌｅｓ（登録商標）Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓｃｈｗｅｒｔｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）または培地と共に２時間にわたり、３７℃または陰性対照として４℃でインキュベートした。インキュベーション後、細胞を氷上に１０分間置いた。Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＦＣ５００フローサイトメーターを使用して分析を実施した。
【０１１９】
ＧＦＰ−ＰＡＯ１［Ｔｎ７の形質転換（Bjarnsholt et al., 2005）により緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）でタグ付けされた野生型Ｐ．エルギノーサＰＡＯ１（Ｔｈｏｍａｓ  Ｂｊａｒｎｓｈｏｌｔ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎにより親切にも提供された）］を使用して、ｉＰＳＣ−ＭＡＣおよびＰＢＭＣ−ＭＡＣが生きたＰ．エルギノーサを貪食する機能的能力を評価し、ＰＢＭＣ由来マクロファージ（ＰＢＭＣ−ＭＡＣ）と比較した。この食作用アッセイでは、１×１０５個のｉＰＳＣ−ＭＡＣを、２時間にわたり、６×１０５ＣＦＵのＧＦＰ−ＰＡＯ１と共に、３７℃または陰性対照として４℃でインキュベートした。培地対照は同様に処置した。インキュベーション後、細胞を氷上に１０分間置き、その後、２％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）溶液で３０分間にわたって固定した。Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＦＣ５００フローサイトメーターを使用して分析を実施した。
【０１２０】
電子顕微鏡観察
マクロファージを直径１ｃｍの円形カバースリップ上で成長させた。４℃においてラテックスビーズ（直径１μｍ）を細胞に添加し、５分間にわたってラテックスビーズをマクロファージの表面に接着させた。その後、試料を冷ＰＢＳで洗浄し、新鮮な培養培地と共に３７℃まで温めた。最長１時間にわたって食作用を行なわせ、１５０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．３５）において１．５％のパラホルムアルデヒド、１．５％のグルタルアルデヒドを使用し、異なる時点で試料を固定した。次いで、漸増するメタノール系を使用して試料を脱水した。製造元の説明に従ってＣＰＤ０３０臨界点乾燥機（Ｂａｌｚｅｒｓ、Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ）を使用し、臨界点乾燥を実施した。次いで、カバースリップに金（Ｓｅｍ  Ｃｏａｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｏｌａｒｉｏｎ）をスパッタリングし、Ｐｈｉｌｉｐｓ  ＳＥＭ  ５０５（Ｅｉｎｄｈｏｖｅｎ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用してＳＥＭを実行した。
【０１２１】
細菌培養
実験のために、−８０℃に保たれた保存培養物からＰ．エルギノーサ実験室株ＰＡＯ１（Klockgether et al., 2010）を取り、Ｌｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）中で一晩成長させた。滅菌ＰＢＳで洗浄した後、標準的な成長曲線から所望の感染性用量を推定した。実際の投与量の決定のためには、播種物（ｉｎｏｃｕｌａｔｅｓ）をＬＢ寒天プレート上にドロッププレート法（Herigstad et al., 2001）によって連続播種し、３７℃における１６〜１８時間のインキュベーションの後にＣＦＵを判定した。
【０１２２】
マイクロアレイ試料の収集
最終分化型ヒトｉＰＳＣ−ＭＡＣまたはヒトＰＢＭＣ−ＭＡＣを２４ウェルプレートに播種し（５００．０００細胞／ウェル）、一晩培養した。翌日、細胞をＰＢＳで３回洗浄した。その後、抗生物質を含まないＲＰＭＩ培地中のＰ．エルギノーサ実験室株ＰＡＯ１（ＭＯＩ１０）を細胞上に遠心分離し（６００×ｇ）、３７℃においてインキュベートした。培地のみの細胞を非感染対照とした。１時間後、細胞を脱離させ（ｄｅ−ａｔｔａｃｈｅｄ）、洗浄し、ＲＮＡ溶解緩衝液中に再懸濁した。ＲＮＡｅａｓｙ  ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ）を製造元の説明に従って用いて、ＲＮＡ単離を実施した。フィーダー細胞からｉＰＳＣを分離させるために、ＴＲＡ−１−６０＋についてｉＰＳＣを分取した後、ヒトｉＰＳＣ試料を取得した。
【０１２３】
マイクロアレイ実験（単色モード）
この研究において利用したマイクロアレイは、Ｈａｎｎｏｖｅｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＳｃｈｏｏｌのＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｅ  Ｕｎｉｔ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃｓ（ＲＣＵＴ）において開発された、「０５４２６１Ｏｎ１Ｍ」（デザインＩＤ  ０６６３３５）と呼ばれる、Ｗｈｏｌｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｏｌｉｇｏ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ４ｘ４４Ｋ  ｖ２（デザインＩＤ  ０２６６５２、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の洗練されたバージョンに相当する。マイクロアレイのデザインは、ｍＲＮＡ発現に関してテンプレートとして１ｘ１Ｍデザイン形式を使用し、ＡｇｉｌｅｎｔのｅＡｒｒａｙポータルにおいて作成した。デザインＩＤ  ０２６６５２の非対照プローブはすべて、合計１８１５６０フィーチャ（１７０行×１０６８列）を含む領域内で５回プリントされている。そのような領域のうちの４つを１つの１Ｍ領域内に配置し、スライド１枚当たり４つのマイクロアレイフィールドが個々にハイブリダイズされるようにした（顧客指定フィーチャレイアウト）。適切なＦｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎソフトウェア操作に必要な対照プローブは、ｅＡｒｒａｙにより、推奨されるデフォルト設定を使用して決定され、自動的に配置された。
【０１２４】
企業によって指示されるように（１ラウンドの増幅を適用し）、３０ｎｇの全ＲＮＡを使用して、アミノアリル−ＵＴＰ−修飾（ａａＵＴＰ）ｃＲＮＡを調製した［Ａｍｉｎｏ  Ａｌｌｙｌ  ＭｅｓｓａｇｅＡｍｐ（商標）ＩＩ  Ｋｉｔ、＃ＡＭ１７５３、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ］。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５  Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｄｙｅ（＃Ａ３２７５６；ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の使用により、ａａＵＴＰ−ｃＲＮＡの標識を実施した。
【０１２５】
５００ｎｇの各蛍光標識ｃＲＮＡ集団をハイブリダイゼーションのために使用したことを除いては、「Ｏｎｅ−Ｃｏｌｏｒ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ−Ｂａｓｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  Ｖ５．７」において推奨されているように、ｃＲＮＡの断片化、ハイブリダイゼーション、および洗浄ステップを実行した。
【０１２６】
Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏ  Ａｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒ  Ｇ２５６５ＣＡ（ピクセル解像度３μｍ、ビット深度２０）においてスライドをスキャンした。「Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｖｅ  ｄｅｔｒｅｎｄｉｎｇ」アルゴリズムを無効にしたことを除いては、抽出プロトコールファイル「ＧＥ１＿１０７＿Ｓｅｐ０９．ｘｍｌ」を使用し、「Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｖ１０．７．３．１」を用いて、データ抽出を実施した。
【０１２７】
緑チャネルの処理された強度値である「ｇＰｒｏｃｅｓｓｅｄＳｉｇｎａｌ」（ｇＰＳ）の幾何平均を使用し、オンチップ反復測定（ｏｎ−ｃｈｉｐ  ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ）（５回反復）の測定値を平均して、結果として得られる、独特の非対照プローブ１つ当たり１つの値を導出した。単一のフィーチャは、ｉ）手作業でフラグを付けられた場合、ｉｉ）Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅによってアウトライナとして識別された場合、ｉｉｉ）各オンチップ反復測定集団の正規化されたｇＰＳ分布に関する「１．４２×四分位範囲」の間隔の外にある場合、またはｉｖ）０．５を超えるフィーチャ毎のピクセル強度の変動係数を示した場合に、平均化から除外した。
【０１２８】
平均したｇＰＳ値を、分位正規化アプローチにより、まず正規化した。その後、値を大域的な線形スケーリングによって更に処理した。１つの試料のｇＰＳ値すべてに、アレイ固有のスケーリング因子を乗じた。この因子は、「基準７５パーセンタイル値（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ７５ｔｈ  Ｐｅｒｃｅｎｔｉｌｅ  ｖａｌｕｅ）」（シリーズ全体で１５００に設定した）を、正規化しようとする特定のマイクロアレイ（以下に示す式中「アレイＩ」）の７５パーセンタイル値によって除すことによって計算した。したがって、全試料（マイクロアレイデータセット）について正規化されたｇＰＳ値は、次式によって計算した：
正規化されたｇＰＳアレイｉ＝ｇＰＳアレイｉ×（１５００／７５パーセンタイルアレイｉ）
【０１２９】
最後に、陰性対照フィーチャの強度分布に基づいて、下位強度閾値（ｌｏｗｅｒ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）（代理値）を定義した。この値は、１５の正規化ｇＰＳ単位に固定した。この強度カットオフを下回った測定値はすべて、１５の各代理値によって置換した。
【０１３０】
Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｏｎｅ  Ｃｏｌｏｒ  ｍＲＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓに対して、あらゆる正規化オプションを非選択状態にしたことを除いてはデフォルトのインポート設定において、すべての非対照フィーチャの正規化されたマイクロアレイデータを、Ｏｍｉｃｓ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒソフトウェアｖ３．２（Ｑｌｕｃｏｒｅ）にインポートした。したがって、インポート中のデータ処理ステップは、１）ログベース２変換、２）中央値へのベースライン変換であった。
【０１３１】
ヒートマップクラスタリング分析およびＧＯに基づくヒートマップの生成を、Ｏｍｉｃｓ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒにおいて実施した。ＲＣＵＴＡＳツール（Ｖ１．７；Ｈａｎｎｏｖｅｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ）を使用して、上位１００種の上方調節された遺伝子を計算し、Ｖｅｎｎｙ  ２．１（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏｇｐ．ｃｎｂ．ｃｓｉｃ．ｅｓ／ｔｏｏｌｓ／ｖｅｎｎｙ）を使用して処理した。Ｅｎｒｉｃｈｒ（ｈｔｔｐｓ：／／ａｍｐ．ｐｈａｒｍ．ｍｓｓｍ．ｅｄｕ／Ｅｎｒｉｃｈｒ）を使用し、ヒト遺伝子アトラスに基づく細胞型分類に関する遺伝子セットのエンリッチメント分析、ならびに生物学的プロセスおよび分子機能の遺伝子オントロジー分析を行なった。Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ経路分析（Ｑｉａｇｅｎ）を使用し、疾患および機能に関する遺伝子分析を実施した。
【０１３２】
マイクロアレイデータは、受託番号Ｅ−ＭＴＡＢ−５４３６のもと、ＡｒｒａｙＥｘｐｒｅｓｓデータベース（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ａｒｒａｙｅｘｐｒｅｓｓ）に寄託された。
【０１３３】
サイトカイン分泌アッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｘ）
バイオリアクター試料またはＢＡＬＦ試料におけるヒトサイトカインの分泌を分析するために、以前に説明されているように（Lachmann et al., 2015）、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｈｕｍａｎ  １４−Ｐｌｅｘ  Ｐａｎｅｌ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いたＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）分析を実施した。Ｌｕｍｉｎｅｘ−２００  Ｓｙｓｔｅｍにおいてデータを獲得し、Ｘｐｏｎｅｎｔソフトウェアｖ．３．０（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて分析した。
【０１３４】
インビボ実験
動物の維持および感染
ＨｕＰＡＰ［１２９Ｓ４−Ｒａｇ２ｔｍ１．１ＦｌｖＣｓｆ２／Ｉｌ３ｔｍ１．１（ＣＳＦ２，ＩＬ３）ＦｌｖＩｌ２ｒｇｔｍ１．１Ｆｌｖ／Ｊ］マウス（Willinger et al., 2011）は、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから取得し、Ｈａｎｎｏｖｅｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌの中央動物施設（ｃｅｎｔｒａｌ  ａｎｉｍａｌ  ｆａｃｉｌｉｔｙ）に収容した。ＮＳＧマウス（ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪＺｔｍ）は、Ｈａｎｎｏｖｅｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌの中央動物施設から取得した。両方の免疫不全マウス系統を、個別換気ケージ（ＩＶＣ）において病原体フリー条件下で維持し、食物および水に自由にアクセスできるようにした。すべての動物実験は、Ｌｏｗｅｒ  Ｓａｘｏｎｙ  Ｓｔａｔｅの動物福祉委員会によって承認され、そのガイドラインに従って実施した。
【０１３５】
Ｐ．エルギノーサの感染またはｉＰＳＣ−ＭＡＣの肺移植のためには、麻酔した（ケタミン／ミダゾラム）マウスに、経口挿管した後に気管を介して点滴した。同時感染実験では、ｉＰＳＣ−ＭＡＣ（４×１０６／動物）およびＰＡＯ１（ＮＳＧ：５×１０５およびｈｕＰＡＰ  ０．２×１０５ＣＦＵ）をＰＢＳ中に再懸濁し、６０μｌの総容量で混合した。感染単独のマウスについては、６０μｌのＰＢＳにおいて同じＣＦＵを適用した。点滴前には、食作用を回避するため、細胞／細菌ミックスを常時氷上に保った。治療用ＰｉＭＴ実験においては、ケタミン／ミダゾラムを用いた麻酔の後、ｈｕＰＡＰ動物を０．３×１０５ＣＦＵのＰＡＯ１（３０μｌ容量のＰＢＳ中）に感染させた。対照マウスは、同じ容量のＰＢＳを受けた。４時間後、マウスをイソフルラン吸入によって麻酔し、５０μｌのＰＢＳ、または４×１０６個のｉＰＳＣ−ＭＡＣを含むＰＢＳを用いた第２の点滴を実施した。対照マウスは再び、同じ容量のＰＢＳを受けた。動物の疾患スコアを判定するため、我々は、過去に説明されているスコアリング行列（Munder et al., 2005）を使用した。２４時間後、動物を屠殺し、最終分析を実施した。
【０１３６】
マウスの肺機能
過去に説明されているように（Wolbeling et al., 2010）、１４種の肺機能パラメータを調査する非侵襲性頭部突出型スパイロメトリーを、意識のある拘束されたマウスに対して実施した。マウスをガラスインサート内に位置付けた。マウスの呼吸により、空気がニューモタコグラフを通って流れる。圧力トランスデューサーが電気的シグナルをもたらし、これがＮＯＴＯＣＯＲＤ  ＨＥＭソフトウェア（バージョン４．２．０．２４１、Ｎｏｔｏｃｏｒｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＳＡＳ、Ｃｒｏｉｓｓｙ  Ｓｕｒ  Ｓｅｉｎｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用して分析される。感染中のマウスの肺機能の特性評価を行なうため、一回換気量（ｍｌ単位で測定される）、呼気時間、吸気時間、吸気＋呼気の時間、弛緩時間、および呼気一回換気量の５０％における流量（ＥＦ５０）のパラメータを選択した。
【０１３７】
気管支肺胞（ａｌｅｖｅｏｌａｒ）洗浄（ＢＡＬ）およびヘモグロビンレベルの測定
死後のマウスの気管をカニューレ処置することにより、気管支肺胞洗浄を実施した。１ｍｌのＰＢＳを用いて右肺を３回すすいだ。新鮮なＢＡＬＦをヘモグロビンの測光分析のために使用した。この後、ＢＡＬＦ試料を遠心分離し、上清をＬｕｍｉｎｅｘ分析のために−８０℃で保管した。ペレットを固定し、フローサイトメトリーのために染色した。
【０１３８】
肺細菌数（ＣＦＵ）
安楽死させたマウスの右肺を結紮し、摘除し、組織ホモジナイザー（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ  ＰＴ  １２００、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてホモジナイズした。ドロッププレート法（Herigstad et al., 2001）を使用してＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉプレート上で培養したホモジネートの段階希釈から、総細菌数を評価した。
【０１３９】
組織診断
専用の時点において動物を屠殺した。右肺をＯＣＴ緩衝液で充填し、４℃で３日間にわたり、４％中性緩衝ＰＦＡ中で固定した。対照動物に関しては、左肺を使用した。ＲＩＴＡ−Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ（Ruehl-Fehlert et al., 2003）に従って組織をトリミングし、脱水し（Ｓｈａｎｄｏｎ  Ｈｙｐｅｒｃｅｎｔｅｒ、ＸＰ）、その後、パラフィン（ＴＥＳ、Ｍｅｄｉｔｅ）に包埋した。キシレン中で切片（２〜３μｍ厚、ミクロトームＲｅｉｃｈｅｒｔ−Ｊｕｎｇ  ２０３０）の脱パラフィンを行ない、標準的なプロトコールに従ってＨ＆Ｅ染色した。以前に説明されているように（Dutow et al., 2013）、訓練を受けた病理学者により、切片の盲検評価（Ａｘｉｏｓｋｏｐ  ４０、Ｚｅｉｓｓ顕微鏡）および組織学的スコアリングを実施した。
【０１４０】
統計
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６および７を適用して、独立スチューデントＴ検定または分散分析（ＡＮＯＶＡ）を実施した。特記なき限り、平均±ｓ．ｅ．ｍ．がプロットされている。アステリスクは、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１を意味する。
【０１４１】
結果
動的懸濁培養における複数のヒトｉＰＳＣ由来ミエロイド系列の誘導
ＰＳＣからの異なる成熟造血細胞型の生成は、従来型の二次元（２Ｄ）分化培養を使用して成功することが証明されているが（Ackermann et al., 2015、Choi et al., 2009、Dias et al., 2011、Feng et al., 2014、Sturgeon et al., 2014）、これらのシステムは、臨床的に意義のある量におけるｉＰＳＣ由来細胞の生成を可能にしない。よって、本発明者らは、産業適合性のある撹拌タンクバイオリアクターにおけるプロセスアップスケーリングに好適な、懸濁に基づく（３Ｄ）血球分化プロトコールを開発した（Kropp et al., 2016b、Zweigerdt, 2009）。従来型の明視野形態（図１Ａ）を有する十分に特性評価されたｈｉＰＳＣ株（ｈＣＤ３４ｉＰＳＣ１６）（Lachmann et al., 2014）を、本発明者らはまず、オービタルシェーカー上での小規模懸濁培養において胚様体（ＥＢ）の形成を誘導した。５日後、本発明者らは、ＩＬ３およびＭ−ＣＳＦを含有する分化培地にＥＢを移して、血球特定化およびミエロイド細胞形成複合体（ＭＣＦＣ）の形成を誘導した（図１Ｂ）。１０〜１５日間の継続的な懸濁培養の後、ＭＣＦＣは、最長３か月にわたって週１回採取することができたｉＰＳＣ由来マクロファージ（ｉＰＳＣ−ＭＡＣ）を連続的に産生した（４Ｄ分化）。生成されたｉＰＳＣ−ＭＡＣは、典型的なマクロファージ様形態を示し、ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１４＋ＣＤ１６３＋ＣＤ３４−ＴＲＡ１−６０−の高度に純粋な表面マーカープロファイルを呈し、蛍光標識されたＥ．ｃｏｌｉ粒子を効率的に貪食した（図１Ｃ〜１Ｅ）。
【０１４２】
注目すべきことに、同じ懸濁に基づくプロトコールに従ったが、単純にサイトカイン組成を変えることで、異なるミエロイドのサブセットが生成された。よって、ＩＬ３およびＧ−ＣＳＦは、ＣＤ１６＋ＣＤ６６ｂ＋ｉＰＳＣ−顆粒球の連続生成を可能にしたが（図７Ａおよび７Ｂ）、一方でＣＤ３４−ＣＤ７１＋ＣＤ２３５ａ＋ＣＤ３６＋赤血球細胞は、ＩＬ３／ＳＣＦ／ＥＰＯの使用によって誘導された（図７Ｃ）。系列指示性サイトカインと組み合わせたＩＬ３によって生成された細胞とは対照的に、ＩＬ３のみを用いると、より未熟なＣＤ４５＋／ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ１４−／ＣＤ１６３−マーカープロファイルの提示がもたらされた（データは示さない）。注目すべきことに、Ｍ−ＣＳＦまたはＧ−ＣＳＦのいずれかの存在下におけるこれらの未熟細胞の更なる分化は、ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１４＋ＣＤ６６ｂ−ＣＤ３４−マクロファージ様細胞（図７Ｄおよび７Ｅ）またはＣＤ１６＋ＣＤ６６ｂ＋顆粒球様細胞（以下ではマクロファージおよび顆粒球とも表記する）の生成をもたらした（図７Ｆおよび７Ｇ）。
【０１４３】
撹拌タンクバイオリアクターにおいてｈｉＰＳＣ−ＭＡＣの連続産生のアップスケーリングが可能になる
本発明者らは、次いで、過去にヒトｉＰＳＣの効率的な培養およびそれらの心筋細胞への分化のために適用された（Kempf et al., 2014）、産業適合性のあるシステム（ＤＡＳｂｏｘ  Ｍｉｎｉバイオリアクターシステム）（Olmer et al., 2012）を使用した撹拌タンクバイオリアクターに、懸濁に基づく分化を応用した（図２Ａ、２Ｂ）。バイオリアクターに、溶存酸素（ＤＯ）、ｐＨ、温度、およびインピーダンスに基づくバイオマス評価のリアルタイムモニタリングのためのプローブを備え付けた。プロセスパラメータは、３７℃、３Ｌ／時におけるヘッドスペースガス供給（２１％のＯ２；５％のＣＯ２）、および８翼式の傾斜した（６０°）羽根車を使用した５０回転毎分（ｒｐｍ）での撹拌に設定した（Kempf et al., 2015）。将来の臨床的スケールアップに関して、臨床治験においても適用される化学的に定義された培養培地（Ｘ−Ｖｉｖｏ１５）を使用したことは特筆すべきである。７〜１０日目以降、中断のないバイオリアクタープロセスからのｉＰＳＣ−ＭＡＣの週１回の採取は、細胞収量の経時的な増加を示し、早ければ３週目にはおよそ２〜３×１０７個のｉＰＳＣ−ＭＡＣ／週の安定な産生量に達し、これは、２回の独立したプロセス運転において５週間より長くにわたって維持された（図２Ｃ）。両方のバイオリアクター実験におけるｉＰＳＣ−ＭＡＣの効率的な生成は、特に全培地交換後の初めの数日間における、週１回のバイオマス増加に反映された。ＤＯおよびｐＨのモニタリングは、反復バッチ培養に典型的な予想されたジグザグ様パターンを明らかにした。ｐＨは、細胞の代謝活性による、特に乳酸の放出による（Kropp et al.）典型的な培地の酸性化に起因して、７．２５（新鮮培地）から６．５に及んだ。特筆すべきことに、すべてのプロセスパラメータは、１５〜２０日目辺りでマクロファージ産生の定常状態に達した後、反復性パターンの維持を示し、プロセスの全体的な安定性が確認された（図２Ｄ）。この所見は、マクロファージ採取と並行して週１回判定された、グルコース、乳酸、乳酸デヒドロゲナーゼ、および浸透圧の安定した値によって更に裏付けられる。同様に、マクロファージの活性化に関連する、ＩＬ２、ＩＬ６、ＩＬ８、ＭＣＰ１、ＴＮＦα、およびＩＦＮα２などのサイトカイン／ケモカインの分泌が、第１の採取（第２週）以降から検出され（図２Ｅ）、ＣＤ４５＋ｉＰＳＣ−ＭＡＣの出現に対応した。特筆すべきことに、バイオリアクターにおいて培養されたＭＣＦＣは、プロセス全体にわたってそれらの形態を持続し、典型的な形態とＣＤ４５＋ＣＤ１４＋表面マーカープロファイルとをもつｉＰＳＣ−ＭＡＣを連続的に生成し、その純度は経時的に増加した（図２Ｆ）。更に、オービタルシェーカー上の６ウェル懸濁プレートにおけるバイオリアクターから誘導されたＭＣＦＣの長期培養は、更に８週間にわたるｉＰＳＣ−ＭＡＣの継続的産生をもたらした（データは示さない）。
【０１４４】
バイオリアクター由来のｉＰＳＣ−ＭＡＣは、ＰＢＭＣ−ＭＡＣの表現型および転写の特性評価を再現する
バイオリアクター由来のｉＰＳＣ−ＭＡＣの詳細な特性評価は、ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１６３＋ＣＤ１４＋ＣＤ３４−ＴＲＡ１−６０−表現型、および組織培養プレートへの接着後の典型的な形態を明らかにした（図３Ａおよび３Ｂ）。全トランスクリプトームの教師なし階層的ヒートマップクラスタリングによる、未分化ｈｉＰＳＣおよび末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）由来マクロファージ（ＰＢＭＣ−ＭＡＣ）に対するｉＰＳＣ−ＭＡＣの比較は、ｉＰＳＣと比較した場合のｉＰＳＣ−ＭＡＣおよびＰＢＭＣ−ＭＡＣの近接性を明らかにした（図３Ｃ）。多能性および自然免疫応答の活性化に関連する遺伝子の分析により、ｉＰＳＣのマクロファージ様細胞への効率的な分化が確認された（図３Ｄおよび３Ｅ）。重要なことに、マクロファージ機能に関連する遺伝子、例えばｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）１および４、ＣＤ１４、またはＮＦ−κＢシグナル伝達経路の構成要素［遺伝子オントロジー（ＧＯ）自然免疫の活性化：０００２２１８］は、ｉＰＳＣと対比して、ｉＰＳＣ−ＭＡＣおよびＰＢＭＣ−ＭＡＣにおいて有意に上方調節された（図３Ｅ）。
【０１４５】
多能性ｈｉＰＳＣと対比したｉＰＳＣ−ＭＡＣ、および多能性ｈｉＰＳＣと対比したＰＢＭＣ−ＭＡＣにおける、上位１００種の上方調節された遺伝子の比較は、５４種の上方調節された遺伝子の共通する遺伝子セットを明らかにした。ＣＤ１４、ＣＤ６８、ＣＳＦＲ１、ＣＣＲ１、およびＣＹＢＢを含むこれらの転写物は、ＣＤ１４＋単球、全血、およびＣＤ３３＋ミエロイド細胞に割り当てられる（図３Ｆ）。注目すべきことに、もっぱらｉＰＳＣ−ＭＡＣにおいて上方調節されたこのセットの遺伝子（４６遺伝子）は、ＣＤ１４＋単球およびＣＤ３３＋ミエロイド細胞にも割り当てられ、ＣＤ１６３、白血球免疫グロブリン様受容体Ａ６（ＬＩＬＲＡ６）、スタビリン１（ＳＴＡＢ１）、またはホルミルペプチド受容体１（ＦＰＲ１）などの遺伝子を含んだ（図３Ｇ）。対照的に、ＰＢＭＣ−ＭＡＣのみにおいて上方調節されたこのセットの４６遺伝子は、ＣＤ５６＋ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、全血、および樹状細胞に関連する遺伝子セット［例えばヒト白血球抗原（ＨＬＡ）、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、またはグランザイム（ＧＺＭ）ＡおよびＢ］において最も高いスコアを明らかにした。この観察は、ＣＤ５６＋／ＣＤ３−ＮＫ細胞の汚染により説明され得る（データは示さない）。表１は、ＰＢＭＣから誘導されたマクロファージと直接比較した、本発明のマクロファージにおいて差次的に調節される（上方調節あるいは下方調節される）上位１００種の遺伝子を示す。
【０１４６】
バイオリアクター由来ｉＰＳＣ−ＭＡＣのインビトロ抗菌活性
次に、バイオリアクター由来ｉＰＳＣ−ＭＡＣを、それらのインビトロ抗菌活性について評価した。蛍光標識されたラテックスビーズと共にｉＰＳＣ−ＭＡＣをインキュベーションした後の異なる時点における走査型電子顕微鏡観察（ＳＥＭ）は、刺激後早期の全体的な細胞形態における典型的な変化、および経時的なビーズの効率的な食作用性取り込みを明らかにした（図４Ａ）。更により重要なことに、ｉＰＳＣ−ＭＡＣはまた、４℃では食作用が観察されなかったが、３７℃において、ＰＢＭＣ−ＭＡＣと比較可能な効率でＧＦＰ標識Ｐ．エルギノーサを貪食し、活発な食作用が確認された（図４Ｂ）。ｉＰＳＣ−ＭＡＣが活性化マクロファージの特性に向かってそれらのトランスクリプトームをリモデリングする能力に関する見識を得るために、Ｐ．エルギノーサ（ＰＡＯ１）との接触の前および後にｉＰＳＣ−ＭＡＣの全トランスクリプトーム分析を実施した。
【０１４７】
【表１】
2020518263.tif 000007
【０１４８】
炎症応答または自然免疫応答（の活性化）に関連する遺伝子オントロジー（ＧＯ）の階層的クラスター分析は、サイトカイン（例えばＩＬ２３Ａ、ＴＮＦα、ＩＬ１Ａ、ＩＬ６、ＩＮＦＧ１）、ケモカイン（例えばＣＣＬ５、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ４、ＣＸＣＬ３）、および病原体接触に応答したＮＦκＢシグナル伝達に関与する分子の著しい上方調節を示した（図４Ｃ）。同様に、病原体接触後に５倍を超えて上方調節された遺伝子の遺伝子オントロジーエンリッチメント分析は、炎症応答、リポ多糖（ＬＰＳ）に対する応答、および細菌起源の分子、ならびに創傷に対する応答を含め、生物学的プロセスに関連するＧＯについて高いスコアを明らかにした。更に、分子機能に関連するＧＯは、サイトカイン／ケモカイン活性、および受容体結合またはＧタンパク質共役型受容体結合などのＧＯ項目のエンリッチメントを明らかにした。これらの上方調節された遺伝子の疾患および機能に関するエンリッチメント分析は、炎症性疾患および応答、免疫細胞輸送、抗菌応答、ならびにフリーラジカル捕捉を含むオントロジーを明らかにした（図４Ｄ）。
【０１４９】
ｉＰＳＣ−ＭＡＣは、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）による呼吸器感染を防止する
ｉＰＳＣ−ＭＡＣのインビボの治療有効性を評価するため、肺胞マクロファージ発達障害をもつ免疫不全系統である（Willinger et al., 2011）、ヒト化マウスモデルＣ；１２９Ｓ４−Ｒａｇ２ｔｍ１．１ＦｌｖＣｓｆ２／Ｉｌ３ｔｍ１．１（ＣＳＦ２，ＩＬ３）ＦｌｖＩｌ２ｒｇｔｍ１．１Ｆｌｖ／Ｊ（ｈｕＰＡＰマウス）を利用した。ＨｕＰＡＰマウスは、肺感染に対する感受性を含め、ヒト疾患である肺胞タンパク症（ＰＡＰ）の特質を再現する。加えて、リンパ球新生障害を有するが正常な肺胞マクロファージ発達を示す、第２の免疫不全マウスモデル：ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪＺｔｍ（ＮＳＧ）において、ｉＰＳＣ−ＭＡＣを利用した。
【０１５０】
まず、ｈｕＰＡＰマウスをＰ．エルギノーサ実験室株ＰＡＯ１に感染させ、同じ点滴プロセスにおいて４×１０６個のｉＰＳＣ−ＭＡＣを共投与した（ＰＡＯ１感染単独のマウスを対照とした）。感染の経過を注意深くモニタリングし、マウスを感染の２４時間後に最終分析のために屠殺した（図５Ａ）。感染ｈｕＰＡＰマウスは、３．５±０．９の上昇した疾患スコアによって示されるように、感染後４時間で既に臨床症状を示し、疾患スコアは、２４時間後には最大６．１±０．４まで経時的に徐々に増加した。加えて、直腸温度の３５．０±０．３℃への低下、および２．６±０．５ｇの体重減少が、感染２４時間後の感染動物において観察された（すべて平均±ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝６）（図５Ｂおよび５Ｃ）。対照的に、ｉＰＳＣ−ＭＡＣの肺移植（ＰｉＭＴ）を同時に受けた動物は、軽度の感染症状しか示さなかった（図５Ｂ）。これは、感染２４時間後のＰｉＭＴ処置動物における３７．１±０．２℃の正常な直腸温度、０．６±０．２の非常に低い疾患スコア、およびほんのわずかな−０．８９±０．２ｇの体重減少と一致していた（すべて平均±ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝６）（図５Ｂおよび５Ｃ）。同様のＰｉＭＴの有益な効果は、肺機能を測定するための頭部突出型体幹プレチスモグラフィー（Wolbeling et al., 2010）によって実証された。感染動物は、一回換気量ならびに呼気および吸気時間の減少、ならびに呼吸速度の増加を示したが、感染＋ＰｉＭＴ群の動物は、分析されたすべてのパラメータについて正常な値を示した（図５Ｄ）。ＰｉＭＴの結果として、移植マウスは、感染２４時間後の肺において、それらの非移植対照と比較して有意に低減された細菌数を示した（図５Ｅ）。更に、赤血球は、ＰｉＭＴを受けなかった感染マウスの気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）のみに存在した（図５Ｆ）。更に、感染＋ＰｉＭＴマウスまたは対照マウスにはなく、感染動物のＢＡＬＦおよび肺において見られたマウスＧＲ１＋顆粒球の増加により、肺炎症が示された（図５Ｇ）。加えて、組織学的評価は、感染マウスにおける広範な顆粒球の浸潤、重度の出血、および肺胞浮腫を明らかにしたが（スコア：１３．７±０．３）、感染＋ＰｉＭＴ動物の肺は、わずかな変化しか示さなかった（スコア：２．０±１．２、いずれも平均±ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝３）（図５Ｈ）。感染＋ＰｉＭＴ動物における低減された炎症は、肺およびＢＡＬＦにおけるｈＣＤ４５＋細胞、ならびに右肺の組織切片におけるマクロファージの存在の検出と関連していた（図５Ｉおよび８）。
【０１５１】
肺胞マクロファージ発達が正常な第２の免疫不全マウス系統であるＮＳＧマウスにおいて、同様の結果が取得された。感染ＮＳＧ動物は、感染６時間後および２４時間後において、高い疾患スコアおよび直腸温度の顕著な低下といった感染の顕著な症状を現した。明らかに対照的に、ｉＰＳＣ−ＭＡＣを同時に受けた動物は、感染６時間後および２４時間後に、それぞれ、正常な体温およびごくわずかにのみ増加した疾患スコアを示した（図９Ａおよび９Ｂ）。更に、感染２４時間後の細菌数の分析は、感染＋ＰｉＭＴマウスの肺において有意に低減された細菌負荷を明らかにした（図９Ｃ）。
【０１５２】
治療用ＰｉＭＴは、重度呼吸器感染からマウスをレスキューする
同時感染実験においてｉＰＳＣ−ＭＡＣの有効性を実証した後、本発明者らは、より臨床的に意義のある治療用ＰｉＭＴ処置アプローチを評価した。これらの実験では、ｈｕＰＡＰマウス肺内にＰ．エルギノーサを感染させ、第１の疾患症状が現れるまで（疾患スコア≧５により判定した）、３〜４時間にわたって注意深くモニタリングした。その後、このモデルにおけるマウスは、感染関連症状が直ちに顕在化した後にのみ、４×１０６個のｉＰＳＣ−ＭＡＣを受けた（感染＋ＰｉＭＴ）。注目すべきことに、感染対照マウスは、ＰｉＭＴの代わりにＰＢＳのみを受けた（感染）（図６Ａ）。
【０１５３】
この感染および処置スケジュールにおいて、治療用ＰｉＭＴ処置マウスは、疾患スコアの減少、ならびに非感染動物と比較可能な程度までの直腸温度および体重の正規化を、処置後４〜８時間以内に既に示した。対照的に、ＰＢＳを受けた感染マウスは、経時的に明白な疾患進行を示した（図６Ｂ、６Ｄ、および６Ｅ）。注目すべきことに、感染の２４時間後、感染マウスは著しい疾患症状を示したが、治療用ＰｉＭＴを受けた動物は、有意に低減された疾患スコアを示した（感染動物では８．１±０．２に対して感染＋ＰｉＭＴでは１．８±０．２、平均±ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝３）。加えて、感染マウスにおける上昇した疾患スコアは、対照動物および治療用ＰｉＭＴを受けたマウスと比較すると、明らかに制限された活性と関連していた（図６Ｃ）。治療用ＰｉＭＴの効率は、感染＋ＰｉＭＴマウスにおける感染２４時間後の正規化された直腸温度および体重値、ならびに肺細菌数の顕著な低減（図６Ｂ、６Ｄ、６Ｆ）によって更に立証された。同時移植モデルにおける我々の所見を再現して、感染＋ＰｉＭＴ群における動物のＢＡＬＦは、感染した非移植対照と比較して低下した赤血球レベルを示した。この観察は、ｈＩＬ６、ｈＩＬ８、ｈＩＮＦａ２、ｈＭＣＰ−１、およびＴＮＦαなどの重要な炎症促進性ヒトサイトカイン／ケモカインの検出を伴った（図６Ｇおよび６Ｈ）。肺組織切片により、炎症を更に評価した。ここで、感染マウスは、いくつかの領域で広範な顆粒球の浸潤、重度の出血、および肺胞浮腫を示したが、これらは、バイオリアクターから得たｉＰＳＣ−ＭＡＣで処置したマウスにおいてはほとんど検出不可能であった（図６Ｉ）。
【０１５４】
考察
本研究において、本発明者らは、細菌感染のための細胞治療薬としてマクロファージを利用する処置の概念を評価してきた。臨床的に意義のある数の自家またはドナー由来マクロファージが体細胞源からはほとんど産生され得ないため、本発明者らは、相当量の機能的なマクロファージを生成するためにｈＰＳＣを利用する可能性を調査した。
【０１５５】
感染を標的とするための細胞アプローチとしてのｉＰＳＣ誘導体の使用は、これまで真剣に考えられてこなかった。これは、治療的に意義のある数における特定の子孫の産生に関するｈＰＳＣの推定される可能性が未だ実践に応用されていないという事実によって説明され得る。培養培地処方における近年の進歩を活用し、本発明者らは、ヒトＰＳＣを浮遊凝集物として培養および分化させようと試み、撹拌タンクバイオリアクター技術を幹細胞の要件に適合させて、ｉＰＳＣおよびそれらの誘導体の臨床的なスケールアップを可能にした。細菌感染に対する細胞治療薬としてのｉＰＳＣ−マクロファージの適用を発展させるために、またより具体的にはＰ．エルギノーサによって誘発された肺感染を排除するために、本発明者らはまず、設備の整ったバイオリアクターにおけるヒトｉＰＳＣのスケーラブルかつ連続的な血球分化プロセスを確立した。
【０１５６】
インビボ研究では、肺胞マクロファージが欠如している免疫不全系統であるｈｕＰＡＰマウスを用いた。このマウスモデルは、ＰＡＰ患者において典型的に観察される肺感染に対する感受性（Trapnell et al., 2003）を含め、肺胞タンパク症（ＰＡＰ）の重要な特質を再現するため（Willinger et al., 2011）、これは臨床的に意義がある。このマウスモデルにおいて、同時のＰｉＭＴ、または更により重要なことには治療用ＰｉＭＴによる、急性Ｐ．エルギノーサ感染の防止が、短い時間枠内で極めて効果的であった。これらの概念実証実験は、高い細胞用量を用いて実施した。より低い細胞数を用いても同様の治療効果が達成可能であり得る。しかしながら、この最大の細胞用量を用いても、いずれの処置シナリオにおいても明らかな有害事象は観察されず、これは、骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）を用いたマクロファージ肺移植療法研究における観察（Happle et al., 2014、Suzuki et al., 2014）と一致する。
【０１５７】
マウス１匹当たり２５ｇの体重を考えると、呼吸器感染の処置のためのｉＰＳＣ−ＭＡＣの臨床応用は、６０ｋｇの患者に対しておよそ１×１０１０個のｉＰＳＣ−ＭＡＣを必要とすることになる。更なるプロセス最適化を用いずとも、これは４０〜６０Ｌの産生規模に相当し、原理上は現在のバイオリアクター技術を用いて実現可能である（Kropp et al., 2016b）。注目すべきことに、本発明のバイオリアクターに基づく分化の連続的プロセスモニタリングは、とりわけ反復バッチ培養の初めの２〜３日間における、バイオマスの実質的増加を明らかにした。これには、培地交換前の最後の数日間における溶存酸素レベルの部分的回復およびｐＨの顕著な低下が続いた。これらの観察は、プロセス限定因子の存在を示唆し、更なるプロセス最適化の可能性を強調する。これは、ｈＰＳＣおよびそれらの子孫の細胞収量の増加を倍増させることができる（Kropp et al., 2016a）、灌流システムならびに酸素、ｐＨ、および他のプロセスパラメータのフィードバック制御の適用と組み合わせた、より高い細胞密度における培養によって達成され得る。
【０１５８】
急性感染モデルにおけるｉＰＳＣ−ＭＡＣの優れたインビボ機能性を考えると、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）（Rakhimova et al., 2009）または嚢胞性線維症（ＣＦ）（Oliver et al., 2000）を患う患者において頻繁に観察される、Ｐ．エルギノーサの慢性感染におけるＰｉＭＴの治療有効性が予想される。とりわけＣＦは、ＰｉＭＴの適用に関して興味深い疾患シナリオを表すが、それは、嚢胞性線維症コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）遺伝子における病原性突然変異はまた、プロフェッショナル貪食細胞の機能性と、したがって感染に対する宿主の防御とを妨害するためである（Bonfield et al., 2012、Bruscia et al., 2009）。単一のＰｉＭＴは急性感染に対する治療有効性を示したが、慢性疾患において確立された感染を排除するためには、反復性の治療介入または遺伝的に増強された細胞の適用（Pasula et al., 2016）が必要とされる場合がある。
【０１５９】
移植されたｉＰＳＣ−ＭＡＣＳの長期生着および持続的機能性が予想される。試験した移植シナリオにおいて、ｉＰＳＣ−ＭＡＣは２４時間時点で依然として検出されたが、それより後の時点は本研究において調査されなかった。先行研究は、１年間より長くにわたるＢＭＤＭの生着を実証した（Suzuki et al., 2014）。更に、異なる複能性前駆細胞から誘導されたマウスマクロファージの肺移植は、クロマチンリモデリング、局所組織環境への適応、および長期組込みの能力を示した（Happle et al., 2014、Lavin et al., 2014、Suzuki et al., 2014、van de Laar et al., 2016）。これに従い、本発明のｉＰＳＣ−ＭＡＣは、インビトロでの病原体接触後における炎症促進性遺伝子発現の急速な上方調節、およびインビボでの効率的な抗菌活性を実証し、移植後の肺における炎症性環境に対するそれらの応答能力を示唆している。
【０１６０】
本発明者らによって観察された強力かつ急速な抗菌効果および治療効果は、細菌感染を標的とするためのｉＰＳＣ−ＭＡＣの広い適用可能性および迅速な臨床実施に関して特に重要である。Ｐ．エルギノーサに対するｉＰＳＣ−ＭＡＣの抗菌活性を評価したが、貪食細胞に基づく細胞療法は、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）もしくはスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）などの他のグラム陰性または陽性細菌、または甚大な健康問題および経済的問題を同時にもたらす移植片感染に関連する病原体によって引き起こされる、いくつかの異なる感染シナリオにおける広範囲の用途を可能にし得る。とはいえ、標準的療法またはリザーブ抗生物質療法に対する耐性がある病原体の数の増加を考えると（Aloush et al., 2006、Falgenhauer et al., 2016、Gould, 2013、Hirsch and Tam, 2010、Liu et al., 2016、Schroeder and Stephens, 2016）、新たな形態の処置には、特定の臨床的意義がある。
【０１６１】
まとめると、本発明者らは、細菌感染の処置のためのＰＳＣ由来貪食細胞の治療的適用を提供する。本発明者らは、臨床的および産業的なスケールアップを可能にする規定の条件下における貪食細胞産生の実現可能性を実証し、例えば重度呼吸器感染を標的とする新たな処置アプローチとしてのｉＰＳＣ−ＭＡＣ移植の有効性および安全性の証拠を提供する。この技術は、プロセスアップスケーリングおよび更なる造血細胞型の生成、ならびに他の前臨床モデルにおける評価を含め、多種多様な疾患に対する革新的な細胞に基づく処置戦略を可能にする。
【０１６２】
実施例２
ＧＭＰに準拠する懸濁ｉＰＳＣ培養および血球分化
単一ｉＰＳＣの生成：
マウスフィーダー細胞上で培養したｉＰＳＣから直接、単一ｉＰＳＣを誘導した。マウスフィーダー細胞上で培養したｉＰＳＣを、３７℃における細胞培養インキュベーターにおいて最大５分間にわたり、Ａｃｃｕｔａｓｅ［細胞解離試薬、ＳｔｅｍＰｒｏ（商標）Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ］と共にインキュベートした。Ａｃｃｕｔａｓｅ反応を、ＰＢＳまたはＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のいずれかで希釈することによって停止させた。再懸濁した細胞のピペットによる吸引および吐出により、凝集塊の解離を促し、単一ｉＰＳＣを得た（３回以下および非常に低速）。細胞を計数し、規定の基質（次のステップを参照されたい）における単層培養に供した。代替的に、単一ｉＰＳＣは、以前に説明されているように細胞を処置し、基質をコーティングしたディッシュ［例えばＧｅｌＴｒｅｘ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、またはラミニン（例えばＣｅｌｌＡｄｈｅｒｅ  Ｌａｍｉｎｉｎ−５２１、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）］において培養したｉＰＳＣから誘導してもよい。
【０１６３】
単層の細胞の分割：
６ウェル組織培養プレート［例えばＮＵＮＣプレート（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）］を、少なくとも１時間にわたり、基質［例えば、ＧｅｌＴｒｅｘ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、またはラミニン（例えばＣｅｌｌＡｄｈｅｒｅ  Ｌａｍｉｎｉｎ−５２１、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）］でコーティングした。単一ｉＰＳＣを、更に拡大するため、予めコーティングされたプレートにおいて、ＲＯＣＫ阻害剤（１０μＭ）が補充されたＥ８１００またはＥ８５０培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に播種した。生成された最大２×１０５個の単一ｉＰＳＣを、６ウェルプレートの各ウェルにおいて単層として培養した。培地を２日目に変え、３日目または４日目に継代培養した。播種の翌日は培地を交換しなかった。これらの培養物を少なくとも１０継代にわたって維持した。
【０１６４】
凝集物の形成：
基質上で単一細胞として２継代より多く培養した５×１０５個の単一ｉＰＳＣを、凝集物の形成のために、懸濁培養にて、オービタルシェーカー（７０ｒｐｍ）上のＧｒｅｉｎｅｒ  ＣＥＬＬＳＴＡＲマルチウェル培養プレート（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）において、３ｍｌのＲＯＣＫ阻害剤（１０μＭ）が補充されたＥ８５０またはＥ６培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に播種した。凝集物の形成が２４時間以内に開始した。培地を２日目に交換し、２〜２，５ｍｌの培地に変えた。３日目の凝集物を分化のために移したか、あるいは懸濁下で単一細胞として継代培養した。
【０１６５】
血球分化：
中胚葉のプライミングにより、血球分化の誘導を開始させた。
【０１６６】
中胚葉のプライミングは、５０ｎｇ／ｍｌのｈＶＥＧＦ、５０ｎｇ／ｍｌのｈＢＭＰ４、および２０ｎｇ／ｍｌのｈＳＣＦが補充された３ｍｌのＸ−ＶＩＶＯ１５に、３日間にわたって約１００個の凝集物を移すことによって開始させ、これには、後に（中胚葉のプライミングの４日目において）２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ３の添加を続けた。プライミングされた凝集物の後続の血球分化を、２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３および５０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦが補充された３ｍｌのＸ−ＶＩＶＯ１５に培地を変えることによって遂行した。中胚葉のプライミング、およびその後の血球分化を、８５ｒｐｍのオービタルシェーカーにおいて行なった。
【０１６７】
結果として得られた細胞は、ヒトにおける臨床適用のために好適であった。
【０１６８】
実施例３
低減されたサイズを有する細胞の調製
当技術分野において公知の方法に従って、例えばマウスから、マクロファージを産生または単離した。代替的に、マクロファージ細胞株Ｕ９３７を使用した。
【０１６９】
細胞を洗浄し、高張液（例えば、スクロース溶液などの糖溶液）と共に１５分間〜１時間にわたり、典型的には約１５分間にわたり、４℃〜３７℃において、好ましくは３７℃においてインキュベートした。高張液は、３００ｍｏｓｍ超、好ましくは３５０ｍｏｓｍ超のオスモル濃度を有した。３００ｍｏｓｍ（対照）、６００ｍｏｓｍ、８００ｍｏｓｍ、および１０００ｍｏｓｍとのインキュベーションに関するフローサイトメトリーにおける前方散乱によって測定された、低減されたサイズが図１１および１３に示されている。
【０１７０】
マウス初代マクロファージについては、規定のオスモル濃度におけるインキュベーションの後、顕微鏡観察、および例えばＩｍａｇｅＪを用いたコンピュータ分析により、次の平均直径が判定された：
３００ｍｏｓｍ→平均面積１５５．７μｍ２、１４．０８μｍの平均直径に相当、
６００ｍｏｓｍ→平均面積１３１．６μｍ２、１２．９４μｍの平均直径に相当、
８００ｍｏｓｍ→平均面積１１３．９μｍ２、１２．０４μｍの平均直径に相当、
１０００ｍｏｓｍ→平均面積１１５．２μｍ２、１２．１１μｍの平均直径に相当。
【０１７１】
Ｕ９３７細胞については、規定のオスモル濃度におけるインキュベーションの後、顕微鏡観察、および例えばＩｍａｇｅＪを用いたコンピュータ分析により、次の平均直径が判定された：
３００ｍｏｓｍ→平均面積１１３．８μｍ２、１２．０４μｍの平均直径に相当、
６００ｍｏｓｍ→９４．３４μｍ２、１０．９６μｍの平均直径に相当、
８００ｍｏｓｍ→８２．６３μｍ２、１０．２６μｍの平均直径に相当、
１０００ｍｏｓｍ→７４．２６μｍ２、９．７２μｍの平均直径に相当。
【０１７２】
実施例４
細胞培養上清からのタンパク質の調製
実施例１に記載したように、本発明の方法に従ってマクロファージを産生した。本発明者らは、質量分析およびウェスタンブロッティングにより、細胞が、Ｓ１００Ａ７、Ｓ１００Ａ８、およびＳ１００Ｓ９変異体を含むがこれらに限定されない、高レベルのＳ１００タンパク質を懸濁培養物の培養上清中に放出することを見出した。Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９の遺伝子発現は、ｈＰＳＣと比較して５００倍超の増加、およびＰＢＭＣ由来マクロファージと比較可能な発現を示した。Ｓ１００タンパク質は、例えば、アフィニティークロマトグラフィーによって、または当技術分野において公知の他のクロマトグラフィー法、またはそれらの組み合わせによって、細胞培養上清から単離される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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