(57)【要約】  デングウイルス、および随意に、腫瘍抗原を認識する刺激された樹状細胞を用いて、疾患、特に黒色腫を処置するための組成物および方法が本明細書に記載される。細胞表面に埋め込まれた状態で維持される細胞表面分子を提供するために、溶解が、細胞の完全な溶解あるいは完全に近い溶解が結果として生じない溶解プロトコルが記載される。非致死性のデングウイルス株も治療目的のために提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
黒色腫の処置あるいは減少のための方法であって、前記方法は：
ａ）黒色腫を患う被験体にデングウイルスを投与する工程と；
ｂ）前記被験体に刺激された樹状細胞を投与する工程であって、ここで、前記刺激された樹状細胞は、樹状細胞を腫瘍抗原と接触させることにより生成される、工程と、
を含む、方法。
【請求項２】
前記黒色腫は進行性黒色腫である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記黒色腫は進行しており、ステージＩＩＩあるいはステージＩＶの黒色腫である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
デングウイルスの用量を投与する少なくとも１週間前に、前記被験体から前記樹状細胞を得る工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記デングウイルスは１０４ｐｆｕ〜１０８ｐｆｕの量で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記デングウイルスは１０５ｐｆｕ〜１０７ｐｆｕの量で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記デングウイルスは１０，０００ＰＦＵ／ｍＬ〜９０，０００ＰＦＵ／ｍＬの濃度で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記デングウイルスは約３０，０００ＰＦＵ／ｍＬの濃度で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
デングウイルスの用量の投与から４日〜１０日後に、刺激された樹状細胞を投与する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記デングウイルスは皮下に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記デングウイルスは腫瘍内注射によって投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記被験体が発熱症状を示す場合、刺激された樹状細胞を投与する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記被験体の体温が華氏１０１度に達する場合、刺激された樹状細胞を投与する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記被験体に、刺激された樹状細胞の第１のアリコートを第１の時点で投与し、刺激された樹状細胞の第２のアリコートを第２の時点で投与する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１の時点および前記第２の時点は最大３０日離れている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１の時点および前記第２の時点は約３日離れている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記刺激された樹状細胞の第１のアリコートにおける刺激された樹状細胞の数は１０４の細胞〜１０８の細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記刺激された樹状細胞の前記第１のアリコートおよび前記刺激された樹状細胞の第２のアリコートの各々における刺激された樹状細胞の総数は、１０６の細胞〜１０９の細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記樹状細胞は前記被験体に対して同種異系である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記樹状細胞は前記被験体に対して自己由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記被験体から前記樹状細胞を得る工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記樹状細胞を前記被験体からの腫瘍溶解物と接触させる工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記刺激された樹状細胞は少なくとも約１６ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１２ｐ７０を生成する、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記刺激された樹状細胞は少なくとも約２９ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１２ｐ７０を生成する、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記デングウイルスは血清型１、２、３、４、あるいは５である、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記デングウイルスはＤＥＮＶ２  ＃１７１０である、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記デングウイルスはＤＥＮＶ１  ＃４５ＡＺ５である、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記デングウイルスが、Ｓ１６８０３、ＨＯＮ  １９９１Ｃ、ＨＯＮ  １９９１  Ｄ、ＨＯＮ  １９９１  Ｂ、ＨＯＮ  １９９１  Ａ、ＳＡＬ  １９８７、ＴＲＩ  １９８１、ＰＲ  １９６９、ＩＮＤ  １９５７、ＴＲＩ  １９５３、ＴＳＶ０１、ＤＳ０９−２８０１０６、ＤＳ３１−２９１００５、１３４９、ＧＤ０１／０３、４４、４３、Ｃｈｉｎａ  ０４、ＦＪ１１／９９、ＦＪ−１０、ＱＨＤ１３ＣＡＩＱ、ＣＯ／ＢＩＤ−Ｖ３３５８、ＦＪ／ＵＨ２１／１９７１、ＧＵ／ＢＩＤ−Ｖ２９５０、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｉａｎ、ＧＷＬ１８、ＩＮ／ＢＩＤ−Ｖ２９６１、Ｏｄ２１１２、ＲＲ４４、１３９２、１０１６ＤＮ、１０１７ＤＮ、１０７０ＤＮ、９８９００６６３ＤＨＦ、ＢＡ０５ｉ、１０２２ＤＮ、ＮＧＣ、Ｐａｋ−Ｌ−２０１１、Ｐａｋ−Ｋ−２００９、Ｐａｋ−Ｍ−２０１１、ＰａｋＬ−２０１３、Ｐａｋ−−Ｌ−２０１１、Ｐａｋ−Ｌ−２０１０、Ｐａｋ−Ｌ−２００８、ＰＥ／ＮＦＩ１１５９、ＰＥ／ＩＱＡ  ２０８０、ＳＧ／Ｄ２Ｙ９８Ｐ−ＰＰ１、ＳＧ／０５Ｋ３２９５ＤＫ１、ＬＫ／ＢＩＤ／Ｖ２４２１、ＬＫ／ＢＩＤ−Ｖ２４２２、ＬＫ／ＢＩＤ−Ｖ２４１６、１２２２−ＤＦ−０６、ＴＷ／ＢＩＤ−Ｖ５０５６、ＴＨ／ＢＩＤ−Ｖ３３５７、ＵＳ／ＢＩＤ−Ｖ５４１２、ＵＳ／ＢＩＤ−Ｖ５０５５、ＩＱＴ１７９７、ＶＮ／ＢＩＤ−Ｖ７３５、ＵＳ／Ｈａｗａｉｉ／１９４４、ＣＨ５３４８９、あるいは３４１７５０である、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
黒色腫の処置あるいは減少のための方法であって、前記方法は：
ａ）黒色腫を患う被験体にＤＥＮＶ１  ＃４５ＡＺ５を投与する工程と；
ｂ）前記被験体から樹状細胞を得る工程と；
ｃ）刺激された樹状細胞を生成するために、前記樹状細胞を前記被験体からの腫瘍抗原と接触させる工程と；
ｄ）前記被験体に前記刺激された樹状細胞を投与する工程と、
を含む、方法。
【請求項３０】
前記黒色腫は進行性黒色腫である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記黒色腫は進行しており、ステージＩＩＩあるいはステージＩＶの黒色腫である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＤＥＮＶ１  ＃４５ＡＺ５は１０４ｐｆｕ〜１０８ｐｆｕの量で投与される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＤＥＮＶ１  ＃４５ＡＺ５は１０５ｐｆｕ〜１０７ｐｆｕの量で投与される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＤＥＮＶ１  ＃４５ＡＺ５は１０，０００ＰＦＵ／ｍＬ〜９０，０００ＰＦＵ／ｍＬの濃度で投与される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＤＥＮＶ１  ＃４５ＡＺ５は約３０，０００ＰＦＵ／ｍＬの濃度で投与される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
黒色腫の処置あるいは減少のための方法であって、前記方法は：
ａ）黒色腫を患う被験体にＤＥＮＶ２  ＃１７１０を投与する工程と；
ｂ）前記被験体から樹状細胞を得る工程と；
ｃ）刺激された樹状細胞を生成するために、前記樹状細胞を前記被験体からの腫瘍抗原と接触させる工程と；
ｄ）前記被験体に前記刺激された樹状細胞を投与する工程と、
を含む、方法。
【請求項３７】
前記黒色腫は進行性黒色腫である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記黒色腫は進行しており、ステージＩＩＩあるいはステージＩＶの黒色腫である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＤＥＮＶ２  ＃１７１０は１０４ｐｆｕ〜１０８ｐｆｕの量で投与される、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＤＥＮＶ２  ＃１７１０が１０５ｐｆｕ〜１０７ｐｆｕの量で投与される、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＤＥＮＶ２  ＃１７１０は１０，０００ＰＦＵ／ｍＬ〜９０，０００ＰＦＵ／ｍＬの濃度で投与される、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＤＥＮＶ２  ＃１７１０は約３０，０００ＰＦＵ／ｍＬの濃度で投与される、請求項３６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
＜相互参照＞
本出願は、２０１７年６月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／５２０，３４５号の利益を主張し、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
＜配列表＞
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照により全体として本明細書に組み込まれる配列表を含んでいる。２０１８年６月１４日に作成された上記ＡＳＣＩＩのコピーは、４８２５３−７０７＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔという名称で、４５，７４８バイトのサイズである。
【背景技術】
【０００３】
免疫療法は、細胞傷害性薬物、放射線、および手術とは異なり、腫瘍細胞を認識かつ死滅させるために免疫系を刺激するものである。上記免疫系を刺激して腫瘍細胞を認識かつ破壊することにおいて、多数の試みがなされてきた。これらは、免疫療法のために標的として選択されるペプチドの同一性、免疫活性化の欠如、有害事象、および／または腫瘍の免疫回避機構により、限られた成功を収めている。
【０００４】
現行の細胞療法、例えば、樹状細胞治療では、進行した癌の患者において永続性の完全寛解を誘発するための能力が低い（最も免疫原性の癌型において５−１０％、他のものにおいてはより低い）。しばしば、樹状細胞療法では、低い活性化（例えば、適切に癌細胞のすべてを殺すために免疫細胞が十分でない）、低いターゲティング（例えば、正常細胞が殺される、および／または腫瘍細胞が殺されない）、あるいは免疫抑制性の腫瘍微小環境のために、望ましい結果が得られず、薬物の有効性を制限する。したがって、癌を処置するための改善された免疫療法が必要とされる。
【０００５】
腫瘍は、それらの高い有系分裂および細胞代謝率により、しばしば酸素が欠乏している。この酸素欠乏は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を生成するための嫌気性経路のより高い利用度へとつながり、より高いレベルの乳酸塩、および細胞質ならびに核内のより低いｐＨを結果としてもたらす。したがって、高い遺伝的可変性を有するこれらの低潅流腫瘍部位を標的化し、根絶する必要がある。
【発明の概要】
【０００６】
黒色腫の処置あるいは減少のための方法が本明細書に提供され、上記方法は：黒色腫を患う被験体にデングウイルスを投与する工程と；被験体に刺激された樹状細胞を投与する工程であって、ここで、上記刺激された樹状細胞は、樹状細胞を腫瘍抗原と接触させることにより生成される工程と、を含む。上記黒色腫が進行性黒色腫である方法が本明細書でさらに提供される。上記黒色腫は進行しており、ステージＩＩＩまたはステージＩＶの黒色腫である方法がさらに提供される。デングウイルスの用量を投与する少なくとも１週間前に、被験体から樹状細胞を得る工程を含む方法が本明細書でさらに提供される。デングウイルスが１０４ｐｆｕ〜１０８ｐｆｕの量で投与される方法が本明細書でさらに提供される。デングウイルスが１０５ｐｆｕ〜１０７ｐｆｕの量で投与される方法が本明細書でさらに提供される。デングウイルスが１０，０００ＰＦＵ／ｍＬ〜９０，０００ＰＦＵ／ｍＬの濃度で投与される方法が本明細書でさらに提供される。デングウイルスが約３０，０００ＰＦＵ／ｍＬの濃度で投与される方法が本明細書でさらに提供される。デングウイルスの用量の投与後４日〜１０日に、刺激された樹状細胞を投与する工程を含む方法が本明細書でさらに提供される。デングウイルスが皮下に投与される方法が本明細書でさらに提供される。デングウイルスが腫瘍内注射によって投与される方法が本明細書でさらに提供される。上記被験体が発熱症状を示す場合、刺激された樹状細胞を投与する工程を含む方法が本明細書でさらに提供される。上記被験体の体温が１０１°Ｆ（華氏）に達した場合、刺激された樹状細胞を投与する工程を含む方法が本明細書でさらに提供される。刺激された樹状細胞の第１のアリコートを第１の時点で被験体に投与し、刺激された樹状細胞の第２のアリコートを第２の時点で被験体に投与する工程を含む方法が本明細書でさらに提供される。上記第１の時点および上記第２の時点が最大３０日離れている方法が本明細書でさらに提供される。上記第１の時点および上記第２の時点が約３日離れている方法が本明細書でさらに提供される。上記刺激された樹状細胞の第１のアリコートにおける刺激された樹状細胞の数が、１０４の細胞〜１０８の細胞である方法が本明細書でさらに提供される。上記刺激された樹状細胞の第１のアリコートおよび上記刺激された樹状細胞の第２のアリコートの各々において刺激された樹状細胞の総数が、１０６の細胞〜１０９の細胞である方法が本明細書でさらに提供される。上記樹状細胞が上記被験体に対して同種異系である方法が本明細書でさらに提供される。上記樹状細胞が上記被験体に対して自己由来である方法が本明細書でさらに提供される。上記被験体から上記樹状細胞を得る工程を含む方法が本明細書でさらに提供される。上記樹状細胞を上記被験体からの腫瘍溶解物と接触させる工程を含む方法が本明細書でさらに提供される。上記刺激された樹状細胞が少なくとも約１６ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１２ｐ７０を生成する方法が本明細書でさらに提供される。上記刺激された樹状細胞が少なくとも約２９ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１２ｐ７０を生成する方法が本明細書でさらに提供される。上記デングウイルスが血清型１、２、３、４、あるいは５で���る方法である方法が本明細書でさらに提供される。上記デングウイルスがＤＥＮＶ２  ＃１７１０である方法が本明細書でさらに提供される。上記デングウイルスがＤＥＮＶ１  ＃４５ＡＺ５である方法が本明細書でさらに提供される。デングウイルスは、Ｓ１６８０３、ＨＯＮ  １９９１Ｃ、ＨＯＮ  １９９１  Ｄ、ＨＯＮ  １９９１  Ｂ、ＨＯＮ  １９９１  Ａ、ＳＡＬ  １９８７、ＴＲＩ  １９８１、ＰＲ  １９６９、ＩＮＤ  １９５７、ＴＲＩ  １９５３、ＴＳＶ０１、ＤＳ０９−２８０１０６、ＤＳ３１−２９１００５、１３４９、ＧＤ０１／０３、４４、４３、Ｃｈｉｎａ  ０４、ＦＪ１１／９９、ＦＪ−１０、ＱＨＤ１３ＣＡＩＱ、ＣＯ／ＢＩＤ−Ｖ３３５８、ＦＪ／ＵＨ２１／１９７１、ＧＵ／ＢＩＤ−Ｖ２９５０、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｉａｎ、ＧＷＬ１８、ＩＮ／ＢＩＤ−Ｖ２９６１、Ｏｄ２１１２、ＲＲ４４、１３９２、１０１６ＤＮ、１０１７ＤＮ、１０７０ＤＮ、９８９００６６３ＤＨＦ、ＢＡ０５ｉ、１０２２ＤＮ、ＮＧＣ、Ｐａｋ−Ｌ−２０１１、Ｐａｋ−Ｋ−２００９、Ｐａｋ−Ｍ−２０１１、ＰａｋＬ−２０１３、Ｐａｋ−−Ｌ−２０１１、Ｐａｋ−Ｌ−２０１０、Ｐａｋ−Ｌ−２００８、ＰＥ／ＮＦＩ１１５９、ＰＥ／ＩＱＡ  ２０８０、ＳＧ／Ｄ２Ｙ９８Ｐ−ＰＰ１、ＳＧ／０５Ｋ３２９５ＤＫ１、ＬＫ／ＢＩＤ／Ｖ２４２１、ＬＫ／ＢＩＤ−Ｖ２４２２、ＬＫ／ＢＩＤ−Ｖ２４１６、１２２２−ＤＦ−０６、ＴＷ／ＢＩＤ−Ｖ５０５６、ＴＨ／ＢＩＤ−Ｖ３３５７、ＵＳ／ＢＩＤ−Ｖ５４１２、ＵＳ／ＢＩＤ−Ｖ５０５５、ＩＱＴ１７９７、ＶＮ／ＢＩＤ−Ｖ７３５、ＵＳ／Ｈａｗａｉｉ／１９４４、ＣＨ５３４８９、あるいは３４１７５０である。
【０００７】
黒色腫の処置あるいは減少のための方法が本明細書で提供され、上記方法は：黒色腫を患う被験体にＤＥＮＶ１  ＃４５ＡＺ５を投与する工程と；上記被験体から樹状細胞を得る工程と；刺激された樹状細胞を生成するために、上記樹状細胞を上記被験体からの腫瘍抗原と接触させる工程と；上記被験体に上記刺激された樹状細胞を投与する工程と、を含む。上記黒色腫が進行性黒色腫である方法が本明細書でさらに提供される。上記黒色腫は進行しており、ステージＩＩＩまたはステージＩＶの黒色腫である方法がさらに提供される。ＤＥＮＶ１  ＃４５ＡＺ５が１０４ｐｆｕ〜１０８ｐｆｕの量で投与される方法が本明細書でさらに提供される。ＤＥＮＶ１  ＃４５ＡＺ５が１０５ｐｆｕ〜１０７ｐｆｕの量で投与される方法が本明細書でさらに提供される。ＤＥＮＶ１  ＃４５ＡＺ５が１０，０００ＰＦＵ／ｍＬ〜９０，０００ＰＦＵ／ｍＬの濃度で投与される方法が本明細書でさらに提供される。ＤＥＮＶ１  ＃４５ＡＺ５が約３０，０００ＰＦＵ／ｍＬの濃度で投与される方法が本明細書でさらに提供される。
【０００８】
黒色腫の処置あるいは減少のための方法が本明細書で提供され、上記方法は：黒色腫を患う被験体にＤＥＮＶ２  ＃１７１０を投与する工程と；上記被験体から樹状細胞を得る工程と；刺激された樹状細胞を生成するために、上記樹状細胞を上記被験体からの腫瘍抗原と接触させる工程と；上記被験体に上記刺激された樹状細胞を投与する工程と、を含む。上記黒色腫が進行性黒色腫である方法が本明細書でさらに提供される。上記黒色腫は進行しており、ステージＩＩＩまたはステージＩＶの黒色腫である方法がさらに提供される。ＤＥＮＶ２  ＃１７１０が〜１０８ｐｆｕの量で投与される方法が本明細書でさらに提供される。ＤＥＮＶ２  ＃１７１０が１０５ｐｆｕ〜１０７ｐｆｕの量で投与される方法が本明細書でさらに提供される。ＤＥＮＶ２  ＃１７１０が１０，０００ＰＦＵ／ｍＬ〜９０，０００ＰＦＵ／ｍＬの濃度で投与される方法が本明細書でさらに提供される。ＤＥＮＶ２  ＃１７１０が約３０，０００ＰＦＵ／ｍＬの濃度で投与される方法が本明細書でさらに提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】デングウイルスおよび樹状細胞による典型的な処置方法を表す。
【図２】様々な処置条件下での、マウスの黒色腫細胞からの肺転移の数に対応するプロットを示す。パターン化されたバーは、各条件の肺転移の平均数を示す。
【図３】様々な処置条件下での、マウスの黒色腫細胞からの肺転移の数に対応するプロットを示す。パターン化されたバーは、各条件の肺転移の平均数を示す。
【図４】ＣＤ１４＋単球の単離を確認する、フローサイトメトリーデータのプロットを示す。
【図５】コンパレータ方法によって生成されたＤＣの場合と比較した、本明細書に開示される方法によって生成されたＤＣによって発現されるＩＬ−１２ｐ７０のタンパク質発現データのプロットである。
【図６】細胞毒性Ｔリンパ球の存在下における、黒色腫細胞株（ＦＥＭＸ細胞）上のデングウイルス誘導上清（Ｄｅｎｇｕｅ  Ｖｉｒｕｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）の細胞毒性のプロットである。Ｙ軸は全細胞に対する細胞死の割合である。
【図７】細胞毒性Ｔリンパ球の存在下における、黒色腫細胞株（６２４．２８細胞）中のデングウイルス誘導上清の細胞毒性のプロットである。Ｙ軸は全細胞に対する細胞死の割合である。
【図８】黒色腫細胞株（ＦＥＭＸ細胞）上のデングウイルス誘導上清およびナチュラルキラー細胞の細胞毒性のプロットである。Ｙ軸は全細胞に対する細胞死の割合である。
【図９】黒色腫細胞株（ＦＥＭＸ細胞）上のデングウイルス誘導上清およびナチュラルキラー細胞の細胞毒性のプロットである。Ｙ軸は全細胞に対する細胞死の割合である。
【図１０】細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の不在下において、黒色腫細胞株６２４．２８細胞に対して細胞毒性であるＤＶ誘導上清のプロットである。Ｙ軸は全細胞に対する細胞死の割合である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
＜定義＞
この開示の全体にわたり、様々な実施形態が範囲の形式（ｒａｎｇｅ  ｆｏｒｍａｔ）で提示される。範囲の形式における記載は単に利便性と簡潔さのためのものであり、いかなる実施例の範囲に対する確固たる制限として解釈されるべきでないことを理解されたい。従って、範囲の記載は、文脈において明確に別段の指示がない限り、具体的に開示されたすべての可能性のあるサブ範囲、ならびにその範囲の下限の十分の一までの個々の数値を有していると考慮されねばならない。例えば、１〜６などの範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などといった、具体的に開示されたサブ範囲、ならびに、例えば１．１、２、２．３、５、および５．９といった範囲内にある個々の値を有すると考慮されねばならない。これは、範囲の広さにかかわらず適用される。これらの介在する範囲の上限および下限は、より小さな範囲内に独立して含まれてもよく、また、定められた範囲内のあらゆる具体的に除外された限界に従って、本発明内に包含される。記載された範囲が１つまたは両方の限界を含む場合、文脈で明確に別段の指示がない限り、これらの含まれる限界の一方または両方を除外する範囲は本発明にも含まれる。
【００１１】
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、何れの実施形態も制限するようには意図されていない。本明細書で使用されるように、単数形「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈上他の意味を明白に示すものでない限り、同様に複数形を含むことを意図している。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、この明細書において使用される場合、明示された特徴、整数、工程、操作、要素、および／または構成要素の存在を特定するが、１つ以上の他の特徴、整数、工程、操作、要素、構成要素、および／またはその群の存在あるいは追加を排除しないことがさらに理解されるだろう。本明細書に使用されるように、用語「および／または」は、関連する列挙された項目の１つ以上のありとあらゆる組み合わせを含んでいる。
【００１２】
具体的に明示されていないか、または文脈から明白ではない限り、本明細書で使用されるように、数またはその範囲に関して用語「約」とは、数字または数字の範囲に関して、明示された数およびその＋／−１０％の数を意味し、あるいは、範囲について列挙された値に対する下限より１０％低い且つ上限より１０％高い数を意味する。
【００１３】
本明細書で使用される用語「被験体」は、哺乳動物を含む。哺乳動物は、ラット、ハツカネズミ、人類以外の霊長類、および人間を含む霊長類を含んでいる。
【００１４】
＜癌治療＞
必要とする被験体の癌の処置または減少に有効な量で存在するデングウイルスを有する、組成物およびその使用が本明細書に提供される。本明細書に記載されるデングウイルスの使用は、癌などの様々な症状を処置するために、被験体へのデングウイルスの治療的投与を含む。被験体に有効な量のデングウイルスを投与することによって癌を処置する方法が本明細書で提供され、ここで、デングウイルスは、処置されていない被験体と比較して、処置された被験体の癌を処置するか、安定させるか、減少させることができる。さらに、アジュバントとして癌治療に使用することができるデングウイルスを含む組成物が提供される。ある例では、デングウイルスは癌の併用療法の一部である。デングウイルス療法は、腫瘍細胞の増殖を破壊または安定化するために、生理的な（腫瘍潅流の体温上昇の軽減）経路、免疫学的な（適応性自然免疫のエフェクター細胞の活性化）経路、およびアポプトーシス誘導経路（ｓＴＲＡＩＬ）を組み合わせたものなどの様々な抗癌治療と共に行われる。
【００１５】
＜デングウイルス＞
１次感染は風邪より低い死亡率を保持するが、他の特徴の中でもとりわけ、毛細血管透過性およびサイトカイン生産の増加を可能にするため、デングウイルスは本明細書に記載される組成物および方法に有用である。癌の処置のための組成物が本明細書に提供され、ここで、上記組成物は、必要とする被験体の癌の枯渇あるいは減少のために有効な量のデングウイルスを含む。（図１）さらに、癌の枯渇または減少に有効な量のデングウイルスを、必要とする被験体に投与する工程を含む、癌の処置のための方法が本明細書に提供される。さらに、癌の増殖を安定化または制御するのに有効な量のデングウイルスを、必要とする被験体に投与する工程を含む、癌の安定化のための方法が本明細書に提供される。デングウイルスはアルボウイルスであり、それはネッタイシマカおよびヒトスジシマカ種の蚊によってもっぱら伝達される。上記ウイルスは、未確認の森林に住む哺乳類リザーバー（恐らく、霊長類）およびヒトの宿主を含む、複雑な生活環を有する。雌の蚊は感染した人から血（ｂｌｏｏｄ  ｍｅａｌ）を摂取し、上記ウイルスは、腸の上皮細胞において高い感染力価（１０５／ｍｌ）までに複製し、その後、蚊が別の血を摂取した後に逆圧を使用してその口針を引っ込める時に、他の人に伝達される。デング熱流行は毎年５０００万人が感染し、数千人が死に至り、それは、通常、二次感染関連ショックの不適切な処置受けた小児である。
【００１６】
デングウイルスゲノムは、構造タンパク質、カプシドタンパク質Ｃ、膜タンパク質Ｍ、外被タンパク質Ｅ、および非構造タンパク質であるＮＳ１、ＮＳ２ａ、ＮＳ２ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ならびにＮＳ５をコードする。いくつかの例では、デングウイルスはデングウイルスの生きた株である。いくつかの例では、デングウイルスはデングウイルスの強毒株である。いくつかの例では、デングウイルスはデングウイルスの弱体化した株である。いくつかの例では、デングウイルスはデングウイルスの以下の血清型から選択される：ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３、ＤＥＮＶ−４、およびＤＥＮＶ−５、ならびにその組み合わせ。必要とする被験体に、腫瘍細胞を標的化するために刺激されたデングウイルス（ＤＶ）および樹状細胞（ＤＣ）を投与する工程を含む、併用療法のための方法および組成物が本明細書で提供される。
【００１７】
デングウイルスは、トガウイルス群、亜科フラビウイルス科（グループＢ）のプラス鎖ＲＮＡウイルスである。ウイルスは二十面体の幾何学を有しており、直径およそ４０−４５ナノメーターである。１１，０００の塩基ゲノムは、ヌクレオカプシド（ＮＣ）タンパク質、ｐｒＭ膜融合タンパク質、外被糖タンパク質（Ｅ）、および５の非構造タンパク質ＮＳ１−ＮＳ５をコードする。ＮＣタンパク質は、ｐｒＭ複合体を介して結合される外被スパイクとともにウイルスコアを形成する。Ｅ糖タンパク質は中和抗体の顕著な標的であり、および、ＮＳ−３とＮＳ−４タンパク質はＣＤ４＋とＣＤ８＋ＣＴＬの顕著な標的である。
【００１８】
デングウイルスは、ＤＥＮＶ−１〜ＤＥＮＶ−５の５つの別個の血清型を構築する。血清型２および４はＩｇＧに対して交差中和し、型１および３とも交差中和している。しかし、免疫は完全ではなく、デング熱は、非交差中和する血清型による後の感染が、免疫の過活性化からのショック症候群による死亡率のリスクの増加をもたらすという点で、ウイルス感染の中でもユニークである。ある場合には、非致死性の形態のデングウイルスを利用することができる。典型的な非致死性のデングウイルスは、血清型１、２、３、４、あるいは５であり得る。例えば、非致死性のデングウイルスは表１から選択されてもよい。例えば、デングウイルスは、表１の任意の株に対して、配列相同性または構造相同性において約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは最大約１００％同一である。
【００１９】
【表１−１】
2020527540.tif 000003
【００２０】
【表１−２】
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【００２１】
もう１つのデングウイルス株を使用する組成物および方法が本明細書で提供され、ここで、上記組成物は、血清型１、２、３、４、あるいは５のデングウイルス株を含む。いくつかの例では、デングウイルスは血清型１である。場合によっては、ＤＶは株４５ＡＺ５である。４５ＡＺ５ゲノムに対応するＤＮＡ、およびタンパク質配列が表２に提供される。
【００２２】
【表２−１】
2020527540.tif 000005
【００２３】
【表２−２】
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【００２４】
【表２−３】
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【００２５】
【表２−４】
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【００２６】
【表２−５】
2020527540.tif 000009
【００２７】
いくつかの例では、ＤＶは血清型２である。いくつかの例では、ＤＶ血清型２は、ＤＥＮＶ−２株＃１７１０である。ＤＥＮＶ−２株＃１７１０は、１９８５年にプエルトリコから採取されたサンプルからのものであり、外被遺伝子領域に特有の４つのプライマー（表３を参照）を使用した制限部位特異的ＲＴ−ＰＣＲ分析から、Ａ型であるとみなされた。Ｈａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２５３，８６−９５（１９９９）を参照されたい。これらのプライマーを用いた制限部位特異的ＲＴ−ＰＣＲは、５８２の塩基対、７５４の塩基対、および恐らく６７６の塩基対の増幅産物を生成する。ＤＥＮＶ−２株＃１７１０は、エントリーＮｏ．５５５としてＣＤＣデータベース内に記録されている。Ｈａｒｒｉｓ（１９９９）を参照されたい。ＤＥＮＶ−２株＃１７１０は、プエルトリコで流行した際に単離された。この大流行には９，５４０件の疑わしいＤＶの症例があり、その１件はそのウイルスによる死亡と疑われたが、確認はされなかった。このことは、ＤＥＮＶ−２株＃１７１０の毒性が非常に低く、したがって、本明細書において開示される方法に適していることを示す。
【００２８】
【表３】
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【００２９】
癌免疫療法における有力な免疫刺激剤として使用される有利なＤＶの特性が、本明細書に記載される。ＤＶは、単球／マクロファージおよび樹状細胞（ＤＣ）系列の未熟なＢリンパ球ならびに抗原提示細胞（ＡＰＣ）に対して親和性を有する。ＤＶの特有の特徴は、一次感染が、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋のヘルパーインデューサーＣＴＬ、ならびに細胞傷害性エフェクターＣＴＬの、ＴＨ１型の応答の活性化を結果としてもたらすということである。ＡＰＣを殺さずに感染させることによって、ＤＶは、それらのＣＤ８０およびＣＤ８３発現をアップレギュレートし、炎症促進性のＴＨ１サイトカインプロファイルを結果としてもたらす。一次ＤＶ感染は、活性化されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋エフェクターＴ細胞ならびにＬＡＫ細胞とのＴＨ１型の応答を引き起こす。この種の応答は、癌免疫療法に対して完全寛解を有する患者において見られる（表４を参照）。
【００３０】
【表４】
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【００３１】
１次感染では、ＤＶの死亡率は非常に低い（マンソン熱帯病当たり６１，０００の１）。上記ウイルスは、単球マクロファージおよび樹状細胞系列のＡＰＣを感染させるが、殺さない。その後、これらの感染したＡＰＣは、炎症促進性（ＴＮＦアルファおよびＩＬ−１ベータ）およびＴＨ１（ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ１５、およびＩＬ−２１）型のサイトカインカスケードを開始する。これらのサイトカインは、適応性（ＣＴＬ）および自然（ＮＫ）免疫系の両方の強力な活性化を結果としてもたらす。３−５日の潜伏期間の後、熱は３９．５〜４０．５°Ｃに上昇し、４−５日間上昇し続ける。患者は、激しい頭痛、関節痛、倦怠感、および光感受性を経験する。胸、背中、および時々脚および腕を覆う発疹は、発熱の３日目までに現れる。臨床的に、デング熱感染は、出血に結びつく血小板数の減少を引き起こし、それは、軽度なものから、ショック症候群の場合には生命に危険のあるものまで及ぶ。賢明な流体管理に基づく適切な支持療法では、症例の９９％で完全に回復した。
【００３２】
デングウイルスを投与する工程を含む、必要とする被験体の癌細胞を減少させるための組成物および方法が本明細書で提供され、ここで、上記方法は、被験体の癌細胞の少なくとも約４０％の減少をもたらす。いくつかの例では、本明細書で開示される方法および組成物は、癌細胞の少なくとも約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の減少をもたらす。
【００３３】
＜医薬組成物＞
必要とする被験体の癌細胞を減少させるのに有効な量のデングウイルス（ＤＶ）を含む組成物が本明細書で提供される。いくつかの例では、上記有効な量は約１０５のプラーク形成単位（ＰＦＵ）である。いくつかの例では、上記有効な量のＤＶは、約１０，０００〜約９０，０００のＰＦＵ；約２０，０００から約６０，０００のＰＦＵ；約５０，０００〜約８０，０００のＰＦＵである。いくつかの例では、上記有効な量のＤＶは、約４０，０００以上のＰＦＵあるいは約３０，０００以上のＰＦＵである。いくつかの例では、有効な量のＤＶは約９０，０００未満のＰＦＵ；約３０，０００未満のＰＦＵ；あるいは約２０，０００未満のＰＦＵである。ＤＶは表１に記載される株であってもよい。
【００３４】
被験体の少なくとも１つのサイトカインのレベルを上昇させるのに十分な有効な量のデングウイルスを含む組成物が、本明細書で提供される。いくつかの例では、上記有効な量は、上記被験体の血液中の少なくとも１つのサイトカインのレベルを増加させるのに十分な量である。いくつかの例では、上記有効な量は、上記被験体の血清サンプル中の少なくとも１つのサイトカインのレベルを増加させるのに十分な量である。いくつかの例では、上記有効な量は、少なくとも１つのサイトカインのレベルを増加させるのに十分な量である。いくつかの例では、上記有効な量は、少なくとも１つのサイトカインのレベルを約２％〜約２０，０００％に増加させるのに十分な量である。いくつかの例では、上記有効な量は、少なくとも１つのサイトカインのレベルを約５０％〜約２０，０００％増加させるのに十分な量である。いくつかの例では、上記有効な量は、少なくとも１つのサイトカインのレベルを約１００％〜約２０，０００％増加させるのに十分な量である。いくつかの例では、上記有効な量は、少なくとも１つのサイトカインのレベルを約１００％〜約１５，０００％増加させるのに十分な量である。いくつかの例では、上記有効な量は、少なくとも１つのサイトカインのレベルを約１００％〜約１４，０００％増加させるのに十分な量である。いくつかの例では、上記有効な量は、少なくとも１つのサイトカインのレベルを約５０％〜約１５，０００％増加させるのに十分な量である。いくつかの例では、上記有効な量は、少なくとも１つのサイトカインのレベルを約５０％〜約１４，０００％増加させるのに十分な量である。
【００３５】
被験体の少なくとも１つのサイトカインのレベルを増加させるのに十分な量のデングウイルスを含む組成物が、本明細書で提供される。いくつかの例では、上記少なくとも１つのサイトカインはインターロイキン（ＩＬ）である。いくつかの例では、上記少なくとも１つのサイトカインはインターフェロン（ＩＦＮ）である。いくつかの例では、上記少なくとも１つのサイトカインはインターロイキンである。いくつかの例では、上記少なくとも１つのサイトカインは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）アルファ、ＩＦＮアルファ、ＩＦＮベータ、ＩＦＮガンマ、インターフェロンガンマ誘導タンパク質１０（ＩＰ−１０）、ＩＬ−１２、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、およびその組み合わせから選択される。いくつかの例では、ＴＮＦアルファのレベルは約５０％から約５００％増加する。いくつかの例では、ＴＮＦアルファのレベルは約５０％から約３００％増加する。いくつかの例では、ＴＮＦアルファのレベルは約５０％から約２４０％増加する。いくつかの例では、ＩＦＮアルファのレベルは約５０％から約８００％増加する。いくつかの例では、ＩＦＮアルファのレベルは約５０％から約５００％増加する。いくつかの例では、ＩＦＮアルファのレベルは約５０％から約４２０％増加する。いくつかの例では、ＩＦＮベータのレベルは約５０％から約２０，０００％増加する。いくつかの例では、ＩＦＮベータのレベルは約５０％から約１４，０００％増加する。いくつかの例では、ＩＦＮガンマのレベルは約５０％から約２００％増加する。いくつかの例では、ＩＦＮガンマのレベルは約５０％から約１００％増加する。いくつかの例では、ＩＰ−１０のレベルは約５０％から約８０００％増加する。いくつかの例では、ＩＰ−１０のレベルは約５０％から約５０００％増加する。いくつかの例では、ＩＰ−１０のレベルは約５０％から約４０００％増加する。いくつかの例では、ＩＬ−１２のレベルは約２０％から約２００％増加する。いくつかの例では、ＩＬ−１２のレベルは約２０％から約１００％増加する。いくつかの例では、ＩＬ−１２のレベルは約２０％から約８０％増加する。いくつかの例では、ＩＬ−１５のレベルは約２０％から約２００％増加する。いくつかの例では、ＩＬ−１５のレベルは約２０％から約２００％増加する。いくつかの例では、ＩＬ−１５のレベルは約２０％から約１００％増加する。いくつかの例では、ＩＬ−７のレベルは約５０％から約１０００％増加する。いくつかの例では、ＩＬ−７のレベルは約５０％から約１０００％増加する。いくつかの例では、ＩＬ−７のレベルは約５０％から約５００％増加する。いくつかの例では、ＧＭ−ＣＳＦのレベルは約５０％から約１０００％増加する。いくつかの例では、ＧＭ−ＣＳＦのレベルは約５０％から約４００％増加する。いくつかの例では、ＧＭ−ＣＳＦのレベルは約５０％から約３５０％増加する。いくつかの例では、ＩＬ−１２Ｒのレベルは約２０％から約２００％増加する。いくつかの例では、ＩＬ−１２Ｒのレベルは約２０％から約１５０％増加する。
【００３６】
有効な量のデングウイルス（ＤＶ）を含む組成物が本明細書で提供され、ここで、上記有効な量は、腫瘍細胞中のタンパク質の発現を増加させるのに十分な量である。いくつかの例では、上記有効な量は、腫瘍細胞上で発現されたタンパク質の発現を増加させるのに十分な量である。いくつかの例では、タンパク質はチェックポイントタンパク質である。いくつかの例では、これは腫瘍細胞をチェックポイント抑制剤のより良い標的となる。いくつかの例では、チェックポイントタンパク質はプログラムされたデスリガンド１（ＰＤ−Ｌ１）である。いくつかの例では、上記有効な量は、ＰＤ−Ｌ１の発現を約１０％〜約１００％増加させる。いくつかの例では、上記有効な量は、ＰＤ−Ｌ１の発現を約１０％〜約２０％増加させる。いくつかの例では、上記有効な量は、腫瘍細胞上で発現されたタンパク質の複合体の発現を増加させるのに十分な量である。いくつかの例では、複合体は組織適合性主複合体（ＭＨＣ）である。いくつかの例では、ＭＨＣはクラスＩ  ＭＨＣである。いくつかの例では、上記有効な量は、ＭＨＣの発現を約１０％〜約６０％増加させる。いくつかの例では、上記有効な量は、ＭＨＣの発現を約１０％〜約１００％増加させる。いくつかの例では、上記有効な量は、ＭＨＣの発現を約１０％〜約１５０％増加させる。
【００３７】
必要とする被験体の癌細胞を減少させるのに有効な量のデングウイルス（ＤＶ）を含む組成物が本明細書で提供され、ここで、上記有効な量は、上記被験体の免疫細胞上のタンパク質の発現を増加させるのに十分な量である。いくつかの例では、上記有効な量は、免疫細胞中のタンパク質の発現を増加させるのに十分な量である。いくつかの例では、免疫細胞は哺乳動物のＴ細胞である。いくつかの例では、タンパク質は細胞間接着分子（例えば、２つの細胞を一緒に結合する）である。いくつかの例では、細胞間接着分子は細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）である。いくつかの例では、上記有効な量は、ＩＣＡＭ−１の発現を約１０％〜約５００％増加させる。いくつかの例では、上記有効な量は、ＩＣＡＭ−１の発現を約１０％〜約３００％増加させる。有効な量のデングウイルスを含む組成物が本明細書で提供される。いくつかの例では、本明細書で開示される組成物は糖を含む。いくつかの例では、本明細書で開示される組成物は界面活性剤を含む。いくつかの例では、本明細書で開示される組成物はタンパク質を含む。いくつかの例では、本明細書で開示される組成物は塩を含む。いくつかの例では、本明細書で開示される組成物は、非イオン界面活性剤、非還元糖、塩、担体タンパク質、あるいはその組み合わせを含む。
【００３８】
必要とする被験体の癌細胞を減少させるのに有効な量のデングウイルスを含む組成物が本明細書で提供される。いくつかの例では、上記組成物は、非イオン性界面活性剤である。いくつかの例では、非イオン性界面活性剤は非イオン性洗剤である。いくつかの例では、非イオン性界面活性剤は疎水性鎖を含む薬剤である。いくつかの例では、非イオン性界面活性剤はポリオキシエチレンを含む薬剤である。いくつかの例では、非イオン性界面活性剤はポリオキシプロピレンを含む薬剤である。いくつかの例では、非イオン性界面活性剤は、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロック共重合体を含む薬剤である。いくつかの例では、非イオン性界面活性剤は細胞膜の安定剤として作用する薬剤である。いくつかの例では、非イオン性界面活性剤は細胞膜の剪断から保護する薬剤である。いくつかの例では、非イオン性界面活性剤は消泡剤として作用する薬剤である。いくつかの例では、非イオン性界面活性剤はプルロニックＦ−６８を含む。いくつかの例では、非イオン性界面活性剤はプルロニックＦ−６８から本質的になる。本明細書開示される組成物で使用するために考えられた非イオン性界面活性剤の追加の非限定的な例としては、アルキルポリグルコシド、セトマクロゴール  １０００、セトステアリルアルコール、セチルアルコール、コカミドＤＥＡ、コカミドＭＥＡ、デシルグルコシド、デシルポリグルコース、グリセロールモノステアレート、ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０、イソセテス（ｉｓｏｃｅｔｅｔｈ）−２０、ラウリルグルコシド、マルトシド（ｍａｌｔｏｓｉｄｅｓ）、モノラウリン、マイコスブチリン（ｍｙｃｏｓｕｂｔｉｌｉｎ）、狭範エトキシレート（ｎａｒｒｏｗ−ｒａｎｇｅ  ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）、ノニデットＰ−４０、ノノキシノール−９、ノノキシノール、ＮＰ−４０、オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル（ｏｃｔａｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｍｏｎｏｄｏｄｅｃｙｌ  ｅｔｈｅｒ）、Ｎ−オクチルβ−ｄ−チオグルコピラノシド（Ｎ−ｏｃｔｙｌ  ｂｅｔａ−ｄ−ｔｈｉｏｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、オクチルグルコシド、オレイルアルコール、ＰＥＧ−１０ヒマワリグリセリズ、ペンタエチレングリコールモノドデシルエーテル（ｐｅｎｔａｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｍｏｎｏｄｏｄｅｃｙｌ  ｅｔｈｅｒ）  、ポリドカノール、ポロクサマー、ポロクサマー  ４０７、ポリエトキシ化牛脂アミン（ｐｏｌｙｅｔｈｏｘｙｌａｔｅｄ  ｔａｌｌｏｗ  ａｍｉｎｅ）、ポリグリセリンポリリシノレート（ｐｏｌｙｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｐｏｌｙｒｉｃｉｎｏｌｅａｔｅ）、ポリソルベート、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ソルビタン、ソルビタンモノラウレート（ｓｏｒｂｉｔａｎ  ｍｏｎｏｌａｕｒａｔｅ）、ソルビタンモノステアレート（ｓｏｒｂｉｔａｎ  ｔｒｉｓｔｅａｒａｔｅ）、ステアリルアルコール、サーファクチン、トリトンＸ−１００、およびツイーン８０、ならびにその組み合わせが挙げられる。いくつかの例では、非イオン性界面活性剤は、約０．０１％ｗ／ｖ〜約１０％ｗ／ｖへの濃度で組成物中に存在する。いくつかの例では、非イオン性界面活性剤は、約０．１％ｗ／ｖ〜約５％ｗ／ｖの濃度で組成物中に存在する。いくつかの例では、非イオン性界面活性剤は、約１％ｗ／ｖ〜約５％ｗ／ｖの濃度で組成物中に存在する。いくつかの例では、非イオン性界面活性剤は、約２％ｗ／ｖの濃度で組成物中に存在する。
【００３９】
必要とする被験体の癌細胞を減少するのに十分な量のデングウイルスを含む組成物および非還元糖が本明細書で提供される。いくつかの例では、非還元糖は水分子を補足することができる糖である。いくつかの例では、非還元糖は凍結保護物質として機能し、凍結融解の間にデングウイルスの生存率を保護する。いくつかの例では、非還元糖は二糖類を含む。いくつかの例では、非還元糖は、アルファ、アルファ−１、２つのアルファグルコース単位の間の１−グルコシド結合を含む。いくつかの例では、非還元糖は、二糖類から本質的になる。いくつかの例では、非還元糖はトレハロースを含む。トレハロースは、α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→１）−α−Ｄ−グルコピラノシド、ミコース（ｍｙｃｏｓｅ）、およびトレマロース（ｔｒｅｍａｌｏｓｅ）としても知られている。いくつかの実施形態では、非還元糖は、トレハロースから本質的になる。いくつかの例では、トレハロースはαトレハロースである。いくつかの例では、トレハロースはＤ−（＋）−トレハロース二水和物（Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ  ｄｅｈｙｄｒａｔｅ）である。いくつかの例では、トレハロースはＣ１２Ｈ２２Ｏ１１・２Ｈ２Ｏの化学式を有する。いくつかの例では、非還元糖は、約５％ｗ／ｖ〜約２５％ｗ／ｖの濃度で組成物中に存在する。いくつかの例では、非還元糖は、約１％ｗ／ｖ〜約１０％ｗ／ｖの濃度で組成物中に存在する。いくつかの例では、非還元糖は、約１０％ｗ／ｖ〜約２０％ｗ／ｖの濃度で組成物中に存在する。いくつかの例では、非還元糖は、約１５％ｗ／ｖの濃度で組成物中に存在する。
【００４０】
必要とする被験体の癌細胞を減少させるのに有効な量のデングウイルス、および担体タンパク質を含む組成物が本明細書で提供される。担体タンパク質は、ステロイド、脂肪酸、あるいはホルモンのための担体または安定剤として機能し得る。いくつかの例では、上記担体タンパク質は、保存条件（例えば、室温以下）でウイルス外被を安定させることができるタンパク質である。いくつかの例では、上記担体タンパク質は可溶性の単量体タンパク質である。いくつかの例では、上記担体タンパク質はアルブミンである。いくつかの例では、上記担体タンパク質は、本明細書で開示された組成物が適正製造プロトコル（ＧＭＰ）基準に準拠することを保証するヒトのタンパク質である。いくつかの例では、上記担体タンパク質はヒトのアルブミンである。いくつかの例では、上記担体タンパク質は、約０．１％ｗ／ｖ〜約１０％ｗ／ｖの濃度で上記組成物中に存在する。いくつかの例では、上記担体タンパク質は、約１％ｗ／ｖ〜約５％ｗ／ｖの濃度で上記組成物中に存在する。いくつかの例では、上記担体タンパク質は、約２％ｗ／ｖの濃度で上記組成物中に存在する。
【００４１】
必要とする被験体の癌細胞を減少させるのに有効な量のデングウイルスを含む組成物が本明細書で提供される。いくつかの例では、上記組成物は塩を含む。いくつかの例では、上記塩は、カルシウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、ホウ素を含む。いくつかの例では、上記塩は、リン酸塩、塩化物、硫酸塩あるいは重クロム酸塩である。いくつかの例では、上記塩は塩化カルシウムである。いくつかの例では、上記塩は塩化マグネシウムである。いくつかの例では、組成物は塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムを含む。いくつかの例では、上記塩は、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭの濃度で上記組成物中に存在する。いくつかの例では、上記塩は、約０．１ｍＭ〜約５ｍＭの濃度で上記組成物中に存在する。いくつかの例では、上記塩は、約０．１ｍＭ〜約２ｍＭの濃度で上記組成物中に存在する。いくつかの例では、上記塩は約１ｍＭの濃度で上記組成物中に存在する。いくつかの例では、組成物は塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムを含み、塩化カルシウムが約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭで組成物中に存在し、塩化マグネシウムは、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭで組成物中に存在する。いくつかの例では、組成物は塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムを含み、塩化カルシウムが約１ｍＭで組成物中に存在し、塩化マグネシウムが約１ｍＭで組成物中に存在する。
【００４２】
いくつかの例では、本明細書で開示される組成物および方法は、被験者の細胞において遺伝子の発現を改変する。遺伝子発現の典型的な改変は発現の増加あるいは減少であり得る。被験体の細胞における遺伝子の発現はＤＶ感染によって増加することもあり、それは、限定されないが、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ガンマ、ＴＮＦ−アルファ、ＴＮＦ−ベータ、ＧＭ−ＣＳＦ  ＣＤ８抗原、ＩＣＯＳＬＧ、ＣＣＬ３、ＣＣＬ５、ＴＲＡＩＬ、ＩＰ１０、ＧＮＬＹ、ＧＺＭＡ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＬＡ−ＤＰアルファ１、ＨＬＡ−ＤＰベータ１、およびＺＡＰ７０を含む。増加したレベルのこれらの遺伝子に対応するタンパク質が、被験体の循環流体中で観察されることもある。レベルは少なくとも２倍増大し得る。レベルは２倍〜１０００倍増大し得る。レベルは２倍〜１００倍増大し得る。レベルは２倍〜１０倍増大し得る。被験体に投与されたＤＶの細胞型は、ＤＶ感染によって増加することもあり、それは、限定されないが、ＣＤ８＋ＣＤ４４＋６２Ｌ−細胞、ＣＤ４＋ＣＤ４４＋  ＣＤ６２Ｌｌｏ細胞、ＨＬＡ−ＤＲ＋  ＣＤ８＋細胞、Ｔｉａ−１  ＣＤ８＋細胞、ＶＬＡ−４  ＣＤ８＋細胞、ＩＣＡＭ−１  ＣＤ８＋細胞、およびＬＦＡ−１  ＣＤ８＋細胞を含む。いくつかの例では、ＴＮＦ−αはＤＶ感染中に免疫系によって放出される。ＴＮＦαは、ＴＲＡＩＬ（ＴＮＦアポトーシス誘発リガンド）を介する腫瘍細胞の直接的な死滅を含む多面的効果を有する炎症性サイトカインである。
【００４３】
いくつかの例では、ＤＶは、γδＣＴＬ、活性化されたＭ１マクロファージおよび形質細胞様ＤＣ（ｐＤＣ）を含む様々な細胞から高レベルの可溶性のＴＲＡＩＬ（ｓＴＲＡＩＬ）を誘発する。いくつかの例では、ＤＶは、ＩＦＮβ、ＩＦＮαと同じ受容体への１０倍高い親和性を有する多機能性サイトカインを活性化する。ＩＦＮβは、ウイルスＲＮＡの転写を抑える工程において類似の抗ウイルス剤特性を有するが、腫瘍細胞内のアポトーシスの誘発におけるＩＦＮαよりもはるかに効き目がある。一酸化窒素およびＩＦＮβはデング熱感染中に相乗的に作用することができる。これらの分子は、Ｍ１マクロファージ、ｐＤＣ、およびδγＣＴＬによって誘導された、高レベルのｓＴＲＡＩＬによって媒介されるアポプトーシスに対する抵抗を克服するために、連携して機能することもある。
【００４４】
デングウイルスの１つの株を随意に含むことができる医薬組成物が本明細書で提供される。ある場合には、約１、２、３、４、５、あるいはそれ以上のデングウイルスの株が、本明細書に記載される方法または組成物の一部として利用されてもよい。いくつかの例では、医薬組成物は少なくともデングウイルスの一部を含む。デングウイルスの一部は、医薬組成物を受け取る被験体の免疫反応を生成するのに十分な部分であり得る。上記組成物は、１つ以上の薬学的に許容可能な塩、賦形剤またはビヒクルをさらに含み得る。本医薬組成物で使用される薬学的に許容可能な塩、賦形剤、またはビヒクルは、担体、賦形剤、希釈剤、抗酸化剤、保存剤、着色剤、調味料と稀釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、充填剤、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、等張化剤、共溶媒、湿潤剤、錯化剤、緩衝剤、抗菌剤、および界面活性剤を含んでいる。
【００４５】
いくつかの例では、本明細書で開示される担体は中性の緩衝食塩水を含む。医薬組成物は、アスコルビン酸などの抗酸化剤；低分子量ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニトールまたはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；および／または、Ｔｗｅｅｎ、プルロニック、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン界面活性剤を含むこともある。さらに、一例として、適切な等張促進剤は、アルカリ金属ハロゲン化物（好ましくはナトリウムまたは塩化カリウム）、マンニトール、ソルビトールなどを含んでいる。適切な保存剤は塩化ベンザルコニウム、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸などを含んでいる。過酸化水素は保存剤としても使用されることがある。適切な共溶媒はグリセリン、プロピレングリコール、およびＰＥＧを含んでいる。適切な錯化剤はカフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ−シクロデキストリン、またはヒドロキシ−プロピル−ベータ−シクロデキストリンを含んでいる。適切な界面活性剤または湿潤剤は、ソルビタンエステル、ポリソルベート８０などのポリソルベート、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサポールなどを含んでいる。緩衝剤は、酢酸塩、ホウ酸塩、クエン酸塩、リン酸塩、重炭酸塩、またはトリス−ＨＣｌなどの従来の緩衝剤であり得る。緩衝酢酸溶液は約ｐＨ４−５．５であり得、Ｔｒｉｓバッファーは約ｐＨ７−８．５であり得る。
【００４６】
デングウイルスを含む組成物が本明細書で提供され、ここで、上記組成物は、液体形態、凍結乾燥された形態あるいは冷凍乾燥された形態であり、１以上のリオプロテクタント、添加剤、界面活性剤、高分子量構造の添加物、および／または増量剤を含み得る。いくつかの例では、スクロース、ラクトース、またはトレハロースなどの非還元糖であるリオプロテクタントが含まれている。一般に含まれるリオプロテクタントの量は、再構成時に、高張性またはわずかに低張性の製剤も適切ではあるが、結果として生じる製剤が等張性になるような量である。加えて、リオプロテクタントの量は、凍結乾燥時のウイルスの許容しがたい量の分解および／または凝集を防ぐのに十分でなければならない。あらかじめ凍結乾燥された製剤中の糖（例えばスクロース、ラクトース、トレハロース）の典型的なリオプロテクタント濃度は、約１０ｍＭ〜約４００ｍＭである。
【００４７】
本明細書で開示されるデングウイルスを含む組成物が本明細書で提供され、ここで、上記組成物は注射または注入に適している。典型的な組成物は、熟練の作業員に利用可能な任意の経路、例えば、関節内、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、大脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、または損傷内の経路による動物への注射または注入に適している。非経口製剤は、典型的に、随意に薬学的に許容可能な防腐剤を含有している、無菌の、パイロジェンを含まない、等張性水溶液になる。
【００４８】
本明細書に記載されるデングウイルスの注射のための装置は、皮下注射用に形成されてもよい。いくつかの例では、上記装置は皮内注射用には形成されない。上記装置は、ＩＳＯスケールで３０〜１９Ｇの針の規格サイズを有し得る。上記装置は、ＩＳＯスケールで２７〜１９Ｇの針の規格サイズを有し得る。上記装置は、ＩＳＯスケールで２４〜１９Ｇの針の規格サイズを有し得る。上記装置は、ＩＳＯスケールで２３〜１９Ｇの針の規格サイズを有し得る。上記装置は、ＩＳＯスケールで２２〜１９Ｇの針の規格サイズを有し得る。上記装置は、ＩＳＯスケールで２１〜１９Ｇの針の規格サイズを有し得る。上記装置は、３／８インチ〜３／４インチの針の長さを有し得る。上記装置は、１／２インチ〜５／８インチの針の長さを有し得る。針は皮下注射のために４５度〜９０度の角度で注射され得る。注射部位は、腕の三角筋、あるいは大腿の外側股筋であり得る。
【００４９】
ＤＶを製造および保管する方法が本明細書で開示される。いくつかの例では、ＤＶは０．５ｍｌの容器に保管される。いくつかの例では、ＤＶは１．０ｍｌの容器に保管される。いくつかの例では、ＤＶは１．５ｍｌの容器に保管される。いくつかの例では、ＤＶは２．０ｍｌの容器に保管される。いくつかの例では、ＤＶは２．５ｍｌの容器に保管される。いくつかの例では、ＤＶは３．０ｍｌの容器に保管される。いくつかの例では、ＤＶは３．５ｍｌの容器に保管される。いくつかの例では、ＤＶは４．０ｍｌの容器に保管される。いくつかの例では、ＤＶは４．５ｍｌの容器に保管される。いくつかの例では、ＤＶは５．０ｍｌの容器に保管される。いくつかの例では、ＤＶは５．５ｍｌの容器に保管される。いくつかの例では、ＤＶは６．０ｍｌの容器に保管される。いくつかの例では、ＤＶは６．５ｍｌの容器に保管される。いくつかの例では、ＤＶは７．０ｍｌの容器に保管される。いくつかの例では、ＤＶは７．５ｍｌの容器に保管される。いくつかの例では、ＤＶは８．０ｍｌの容器に保管される。いくつかの例では、ＤＶは８．５ｍｌの容器に保管される。いくつかの例では、ＤＶは９．０ｍｌの容器に保管される。いくつかの例では、ＤＶは９．５ｍｌの容器に保管される。いくつかの例では、ＤＶは１０ｍｌの容器に保管される。典型的な容器は、制限されないが、ボトル、バイアル、缶、あるいは注射器を含む。
【００５０】
本明細書に記載されるデングウイルスを含む医薬組成物、および非水溶媒が本明細書で提供される。非水溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機酸エステルである。水性担体は、水、アルコール／水溶液、塩性媒体および緩衝媒体を含むエマルジョンまたは懸濁液を含んでいる。非経口ビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースと塩化ナトリウム、乳酸リンゲルまたは固定油を含んでいる。静脈内のビヒクルは、流体と栄養素の補給物、リンゲルデキストロースに基づくものなどの電解質補充薬を含んでいる。保存剤および他の添加剤、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなども存在することがある。
【００５１】
本明細書に記載されるデングウイルスを含む医薬組成物が本明細書で提供され、ここで、上記医薬組成物は、例えば、乾燥粉末などとして、吸入のために製剤化される。適切なおよび／または好ましい医薬製剤は、意図した投与経路、送達フォーマット、および望ましい投与量に依存して、本開示と製剤技術の一般的な知識とを考慮して決定されてもよい。投与の方法にかかわらず、有効量は患者の体重、体表面積、または臓器のサイズによって計算されることがある。本明細書に記載される製剤の各々を含む処置に適切な投与量を決定するための計算のさらなる改良は、当該技術分野で日常的になされ、当該技術分野で日常的に行なわれる作業の範囲内である。適切な投与量は適切な用量反応データを使用して確認されてもよい。
【００５２】
＜投与の方法＞
必要とする被験体にデングウイルスを投与する工程を含む方法が本明細書で提供される。いくつかの例では、上記ウイルスは水性形態で提供される。いくつかの例では、上記ウイルスは水溶液（例えば、食塩水）中で凍結乾燥および再構成される。いくつかの例では、上記ウイルスは、皮下注射、筋肉内注射、皮内注射、経皮投与、静脈内（「ｉ．ｖ．」）投与、鼻腔内投与、リンパ管内注射、および経口投与から選択される経路によって投与される。いくつかの例では、被験体にリンパ管内のマイクロカテーテルによってウイルスが注入される。
【００５３】
いくつかの例では、本明細書に開示される方法は、１０６ｐｆｕ／ｍｌの約０．５ｍｌの用量でデングウイルスを投与する工程を含む。いくつかの例では、用量は約１０３ｐｆｕ／ｍｌ〜約１０８ｐｆｕ／ｍｌである。いくつかの例では、用量は約１０３ｐｆｕ／ｍｌ〜約１０６ｐｆｕ／ｍｌである。いくつかの例では、用量は、約１０３ｐｆｕ／ｍｌ〜約１０４ｐｆｕ／ｍｌ、約１０４ｐｆｕ／ｍｌ〜約１０６ｐｆｕ／ｍｌ、約１０６ｐｆｕ／ｍｌ〜約１０８ｐｆｕ／ｍｌ、あるいは約１０８ｐｆｕ／ｍｌ〜約１０１０ｐｆｕ／ｍｌである。いくつかの例では、用量は、約１０１ｐｆｕ／ｍｌから、１０２ｐｆｕ／ｍｌ、１０３ｐｆｕ／ｍｌ、１０４ｐｆｕ／ｍｌ、１０５ｐｆｕ／ｍｌ、１０６ｐｆｕ／ｍｌ、１０７ｐｆｕ／ｍｌ、１０８ｐｆｕ／ｍｌ、あるいは最大約１０９ｐｆｕ／ｍｌまでである。いくつかの例では、本明細書に開示される用量は、約０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．１、０．２ｍｌあるいは０．３ｍｌの量である。いくつかの例では、用量は、約０．０１ｍｌ〜約０．０３ｍｌ、約０．０１ｍｌ〜約０．１ｍｌ、０．０３ｍｌ〜約０．０５ｍｌ、０．０５ｍｌ〜約０．０７  ｍｌ、０．０７ｍｌ〜約０．０９ｍｌ、０．１ｍｌ〜約０．２ｍｌ、０．２ｍｌ〜約０．４ｍｌ、０．４ｍｌ〜約０．６ｍｌの量である。
【００５４】
いくつかの例では、本明細書に開示される方法は、１日当たり１０６ｐｆｕ／ｍｌの約０．５ｍｌの用量でデングウイルスを投与する工程を含む。いくつかの例では、用量は、約１０３ｐｆｕ／ｍｌ／日〜約１０８ｐｆｕ／ｍｌ／日である。いくつかの例では、用量は、約１０３ｐｆｕ／ｍｌ／日〜約１０６ｐｆｕ／ｍｌ／日である。いくつかの例では、本明細書に開示される方法は、１日当たり１０６ｐｆｕ／ｍｌの約０．５ｍｌの１回を超える投与でデングウイルスを投与する工程を含む。いくつかの例では、上記方法は、約１０３ｐｆｕ／ｍｌ〜約１０８ｐｆｕ／ｍｌの用量を１日１回以上投与する工程を含む。いくつかの例では、上記方法は、約１０３ｐｆｕ／ｍｌ〜約１０６ｐｆｕ／ｍｌの用量を１日１回以上投与する工程を含む。いくつかの例では、上記方法は、約１０３ｐｆｕ／ｍｌ〜約１０８ｐｆｕ／ｍｌの用量を１日１〜５回投与する工程を含む。いくつかの例では、上記方法は、約１０３ｐｆｕ／ｍｌ〜約１０６ｐｆｕ／ｍｌの用量を１日１〜５回投与する工程を含む。いくつかの例では、上記方法は、約１０３ｐｆｕ／ｍｌ〜約１０８ｐｆｕ／ｍｌの用量を１日１〜３回投与する工程を含む。いくつかの例では、上記方法は、約１０３ｐｆｕ／ｍｌ〜約１０６ｐｆｕ／ｍｌの用量を１日１〜３回投与する工程を含む。
【００５５】
必要とする被験体にデングウイルスを含む組成物を投与する工程を含む方法が本明細書で提供される。いくつかの例では、上記組成物は糖を含む。いくつかの例では、上記組成物は界面活性剤を含む。いくつかの例では、上記組成物はタンパク質を含む。いくつかの例では、上記組成物は塩を含む。いくつかの例では、上記組成物は非イオン性界面活性剤、非還元糖、塩、担体タンパク質、あるいはそれらの組み合わせを含む。いくつかの例では、上記組成物は非イオン性界面活性剤を含む。いくつかの例では、上記非イオン性界面活性剤は非イオン性洗剤である。いくつかの例では、上記非イオン性界面活性剤は疎水性鎖を含む薬剤である。いくつかの例では、上記非イオン性界面活性剤はポリオキシエチレンを含む薬剤である。いくつかの例では、上記非イオン性界面活性剤はポリオキシプロピレンを含む薬剤である。いくつかの例では、上記非イオン性界面活性剤は、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロック共重合体を含む薬剤である。いくつかの例では、上記非イオン性界面活性剤は細胞膜の安定剤として作用する薬剤である。いくつかの例では、上記非イオン性界面活性剤は細胞膜の剪断から保護する薬剤である。いくつかの例では、上記非イオン性界面活性剤は消泡剤として作用する薬剤である。いくつかの例では、上記非イオン性界面活性剤はプルロニックＦ−６８を含む。いくつかの例では、上記非イオン性界面活性剤はプルロニックＦ−６８から本質的になる。本明細書開示される組成物での使用が考えられる非イオン性界面活性剤の追加の非限定的な例としては、アルキルポリグルコシド、セトマクロゴール  １０００、セトステアリルアルコール、セチルアルコール、コカミドＤＥＡ、コカミドＭＥＡ、デシルグルコシド、デシルポリグルコース、グリセロールモノステアレート、ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０、イソセテス（ｉｓｏｃｅｔｅｔｈ）−２０、ラウリルグルコシド、マルトシド（ｍａｌｔｏｓｉｄｅｓ）、モノラウリン、マイコスブチリン（ｍｙｃｏｓｕｂｔｉｌｉｎ）、狭範エトキシレート（ｎａｒｒｏｗ−ｒａｎｇｅ  ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）、ノニデットＰ−４０、ノノキシノール−９、ノノキシノール、ＮＰ−４０、オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル（ｏｃｔａｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｍｏｎｏｄｏｄｅｃｙｌ  ｅｔｈｅｒ）、Ｎ−オクチルβ−ｄ−チオグルコピラノシド（Ｎ−ｏｃｔｙｌ  ｂｅｔａ−ｄ−ｔｈｉｏｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、オクチルグルコシド、オレイルアルコール、ＰＥＧ−１０ヒマワリグリセリズ、ペンタエチレングリコールモノドデシルエーテル（ｐｅｎｔａｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｍｏｎｏｄｏｄｅｃｙｌ  ｅｔｈｅｒ）  、ポリドカノール、ポロクサマー、ポロクサマー  ４０７、ポリエトキシ化牛脂アミン（ｐｏｌｙｅｔｈｏｘｙｌａｔｅｄ  ｔａｌｌｏｗ  ａｍｉｎｅ）、ポリグリセリンポリリシノレート（ｐｏｌｙｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｐｏｌｙｒｉｃｉｎｏｌｅａｔｅ）、ポリソルベート、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ソルビタン、ソルビタンモノラウレート（ｓｏｒｂｉｔａｎ  ｍｏｎｏｌａｕｒａｔｅ）、ソルビタンモノステアレート（ｓｏｒｂｉｔａｎ  ｔｒｉｓｔｅａｒａｔｅ）、ステアリルアルコール、サーファクチン、トリトンＸ−１００、およびＴｗｅｅｎ８０、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの例では、上記非イオン性界面活性剤は、約０．０１％ｗ／ｖ〜約１０％ｗ／ｖの濃度で組成物中に存在する。いくつかの例では、上記非イオン性界面活性剤は、約０．１％ｗ／ｖ〜約５％ｗ／ｖの濃度で組成物中に存在する。いくつかの例では、上記非イオン性界面活性剤は、約１％ｗ／ｖ〜約５％ｗ／ｖの濃度で組成物中に存在する。いくつかの例では、上記非イオン性界面活性剤は、約２％ｗ／ｖの濃度で組成物中に存在する。
【００５６】
必要とする被験体にデングウイルスを含む組成物を投与する工程を含む方法が本明細書で提供される。いくつかの例では、上記組成物は非還元糖を含む。いくつかの例では、上記非還元糖は水分子を補足することができる糖である。いくつかの例では、上記非還元糖は凍結保護物質として機能し、凍結融解の間にデングウイルスの生存率を保護する。いくつかの例では、上記非還元糖は二糖類を含む。いくつかの例では、上記非還元糖は、アルファ、アルファ−１、２つのアルファグルコース単位の間の１−グルコシド結合を含む。いくつかの例では、上記非還元糖は、二糖類から本質的になる。いくつかの例では、上記非還元糖はトレハロースを含む。トレハロースは、α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→１）−α−Ｄ−グルコピラノシド、ミコース、およびトレマロースとしても知られている。いくつかの実施形態では、上記非還元糖は、トレハロースから本質的になる。いくつかの例では、上記トレハロースはαトレハロースである。いくつかの例では、上記トレハロースはＤ−（＋）−トレハロース二水和物である。いくつかの例では、上記トレハロースはＣ１２Ｈ２２Ｏ１１・２Ｈ２Ｏの化学式を有する。いくつかの例では、上記非還元糖は、約５％ｗ／ｖ〜約２５％ｗ／ｖの濃度で組成物中に存在する。いくつかの例では、上記非還元糖は、約１％ｗ／ｖ〜約１０％ｗ／ｖの濃度で組成物中に存在する。いくつかの例では、上記非還元糖は、約１０％ｗ／ｖ〜約２０％ｗ／ｖの濃度で組成物中に存在する。いくつかの例では、上記非還元糖は、約１５％ｗ／ｖの濃度で組成物中に存在する。
【００５７】
必要とする被験体にデングウイルスを含む組成物を投与する工程を含む方法が本明細書で提供される。いくつかの例では、上記組成物は担体タンパク質を含む。担体タンパク質は、ステロイド、脂肪酸、あるいはホルモンのための担体または安定剤として機能し得る。いくつかの例では、担体タンパク質は、保存条件（例えば、室温以下）でウイルス外被を安定させることができるタンパク質である。いくつかの例では、上記担体タンパク質は可溶性の単量体タンパク質である。いくつかの例では、上記担体タンパク質はアルブミンである。いくつかの例では、上記担体タンパク質は、本明細書で開示された組成物が適正製造プロトコル（ＧＭＰ）基準に準拠することを保証するヒトのタンパク質である。いくつかの例では、上記担体タンパク質はヒトのアルブミンである。いくつかの例では、上記担体タンパク質は、約０．１％ｗ／ｖ〜約１０％ｗ／ｖの濃度で組成物中に存在する。いくつかの例では、上記担体タンパク質は、約１％ｗ／ｖ〜約５％ｗ／ｖの濃度で組成物中に存在する。いくつかの例では、上記担体タンパク質は、約２％ｗ／ｖの濃度で組成物中に存在する。
【００５８】
必要とする被験体にデングウイルスを含む組成物を投与する工程を含む方法が本明細書で提供される。いくつかの例では、上記塩は、カルシウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、ホウ素を含む。いくつかの例では、上記塩は、リン酸塩塩、塩化物、硫酸塩あるいは重クロム酸塩である。いくつかの例では、上記塩は塩化カルシウムである。いくつかの例では、上記塩は塩化マグネシウムである。いくつかの例では、組成物は塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムを含む。いくつかの例では、上記塩は、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭの濃度で上記組成物中に存在する。いくつかの例では、上記塩は、約０．１ｍＭ〜約５ｍＭの濃度で上記組成物中に存在する。いくつかの例では、上記塩は、約０．１ｍＭ〜約２ｍＭの濃度で上記組成物中に存在する。いくつかの例では、上記塩は約１ｍＭの濃度で上記組成物中に存在する。いくつかの例では、組成物は塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムを含み、塩化カルシウムが約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭで組成物中に存在し、塩化マグネシウムは、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭで組成物中に存在する。いくつかの例では、組成物は塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムを含み、塩化カルシウムが約１ｍＭで組成物中に存在し、塩化マグネシウムが約１ｍＭで組成物中に存在する。
【００５９】
必要とする被験体に本明細書で開示される有効な量のデングウイルスを投与する工程を含む方法が本明細書で提供される。いくつかの例では、上記有効な量は、上記被験体の少なくとも１つのサイトカインのレベルを増加させるのに十分な量である。いくつかの例では、上記有効な量は、上記被験体の血液中の少なくとも１つのサイトカインのレベルを増加させるのに十分な量である。いくつかの例では、上記有効な量は、上記被験体の血清サンプル中の少なくとも１つのサイトカインのレベルを増加させるのに十分な量である。いくつかの例では、上記有効な量は、少なくとも１つのサイトカインのレベルを増加させるのに十分な量である。いくつかの例では、上記有効な量は、少なくとも１つのサイトカインのレベルを約２％〜約２０，０００％に増加させるのに十分な量である。いくつかの例では、上記有効な量は、少なくとも１つのサイトカインのレベルを約５０％〜約２０，０００％増加させるのに十分な量である。いくつかの例では、上記有効な量は、少なくとも１つのサイトカインのレベルを約１００％〜約２０，０００％増加させるのに十分な量である。いくつかの例では、上記有効な量は、少なくとも１つのサイトカインのレベルを約１００％〜約１５，０００％増加させるのに十分な量である。いくつかの例では、上記有効な量は、少なくとも１つのサイトカインのレベルを約１００％〜約１４，０００％増加させるのに十分な量である。いくつかの例では、上記有効な量は、少なくとも１つのサイトカインのレベルを約５０％〜約１５，０００％増加させるのに十分な量である。いくつかの例では、上記有効な量は、少なくとも１つのサイトカインのレベルを約５０％〜約１４，０００％増加させるのに十分な量である。
【００６０】
必要とする被験体に本明細書で開示される有効な量のデングウイルスを投与する工程を含む方法が本明細書で提供される。いくつかの例では、上記有効な量は、上記被験体の少なくとも１つのサイトカインのレベルを増加させるのに十分な量である。いくつかの例では、少なくとも１つのサイトカインはインターロイキン（ＩＬ）である。いくつかの例では、少なくとも１つのサイトカインはインターフェロン（ＩＦＮ）である。いくつかの例では、少なくとも１つのサイトカインはインターロイキンである。いくつかの例では、上記少なくとも１つのサイトカインは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）アルファ、ＩＦＮアルファ、ＩＦＮベータ、ＩＦＮガンマ、インターフェロンガンマ誘導タンパク質１０（ＩＰ−１０）、ＩＬ−１２、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、およびその組み合わせから選択される。いくつかの例では、ＴＮＦアルファのレベルは約５０％から約５００％増加する。いくつかの例では、ＴＮＦアルファのレベルは約５０％から約３００％増加する。いくつかの例では、ＴＮＦアルファのレベルは約５０％から約２４０％増加する。いくつかの例では、ＩＦＮアルファのレベルは約５０％から約８００％増加する。いくつかの例では、ＩＦＮアルファのレベルは約５０％から約５００％増加する。いくつかの例では、ＩＦＮアルファのレベルは約５０％から約４２０％増加する。いくつかの例では、ＩＦＮベータのレベルは約５０％から約２０，０００％増加する。いくつかの例では、ＩＦＮベータのレベルは約５０％から約１４，０００％増加する。いくつかの例では、ＩＦＮガンマのレベルは約５０％から約２００％増加する。いくつかの例では、ＩＦＮガンマのレベルは約５０％から約１００％増加する。いくつかの例では、ＩＰ−１０のレベルは約５０％から約８０００％増加する。いくつかの例では、ＩＰ−１０のレベルは約５０％から約５０００％増加する。いくつかの例では、ＩＰ−１０のレベルは約５０％から約４０００％増加する。いくつかの例では、ＩＬ−１２のレベルは約２０％から約２００％増加する。いくつかの例では、ＩＬ−１２のレベルは約２０％から約１００％増加する。いくつかの例では、ＩＬ−１２のレベルは約２０％から約８０％増加する。いくつかの例では、ＩＬ−１５のレベルは約２０％から約２００％増加する。いくつかの例では、ＩＬ−１５のレベルは約２０％から約２００％増加する。いくつかの例では、ＩＬ−１５のレベルは約２０％から約１００％増加する。いくつかの例では、ＩＬ−７のレベルは約５０％から約１０００％増加する。いくつかの例では、ＩＬ−７のレベルは約５０％から約１０００％増加する。いくつかの例では、ＩＬ−７のレベルは約５０％から約５００％増加する。いくつかの例では、ＧＭ−ＣＳＦのレベルは約５０％から約１０００％増加する。いくつかの例では、ＧＭ−ＣＳＦのレベルは約５０％から約４００％増加する。いくつかの例では、ＧＭ−ＣＳＦのレベルは、約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、３００％、３１０％、３２０％、３３０％、３４０％、約３５０％増加する。いくつかの例では、ＩＬ−１２Ｒのレベルは、約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、約２００％増加する。いくつかの例では、ＩＬ−１２Ｒのレベルは、約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、最大約２００％増加する。必要とする被験体に本明細書で開示される有効な量のデングウイルスを投与する工程を含む方法が本明細書で提供される。いくつかの例では、上記有効な量は、上記被験体の少なくとも１つのサイトカインのレベルを増加させるのに十分な量である。
【００６１】
必要とする被験体に本明細書で開示される有効な量のデングウイルスを投与する工程を含む方法が本明細書で提供される。いくつかの例では、上記有効な量は、腫瘍細胞中のタンパク質の発現を増加させるのに十分な量である。いくつかの例では、上記有効な量は、腫瘍細胞上で発現されたタンパク質の発現を増加させるのに十分な量である。いくつかの例では、タンパク質はチェックポイントタンパク質である。いくつかの例では、これは腫瘍細胞をチェックポイント抑制剤のより良い標的にする。いくつかの例では、チェックポイントタンパク質はプログラムされたデスリガンド１（ＰＤ−Ｌ１）である。いくつかの例では、上記有効な量は、ＰＤ−Ｌ１の発現を約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、最大約１００％増加させる。いくつかの例では、上記有効な量は、ＰＤ−Ｌ１の発現を約１０％〜約２０％増加させる。いくつかの例では、上記有効な量は、腫瘍細胞上で発現されたタンパク質の複合体の発現を増加させるのに十分な量である。いくつかの例では、複合体は組織適合性主複合体（ＭＨＣ）である。いくつかの例では、ＭＨＣはクラスＩ  ＭＨＣである。いくつかの例では、上記有効な量は、ＭＨＣの発現を約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、最大約６０％増加させる。いくつかの例では、上記有効な量は、ＭＨＣの発現を約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、最大約１００％増加させる。いくつかの例では、上記有効な量は、ＭＨＣの発現を約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、最大約１５０％増加させる。
【００６２】
必要とする被験体に本明細書で開示される有効な量のデングウイルスを投与する工程を含む方法が、本明細書で提供される。いくつかの例では、上記有効な量は、被験体のリンパ球などの血液細胞上のタンパク質の発現を増加させるのに十分な量である。いくつかの例では、上記有効な量は、被験体の循環細胞上のタンパク質の発現を増加させるのに十分な量である。いくつかの例では、上記血液細胞あるいは循環細胞はＴ細胞である。いくつかの例では、タンパク質は細胞間接着分子（例えば、２つの細胞を一緒に結合する）である。いくつかの例では、細胞間接着分子は細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）である。いくつかの例では、ＩＣＡＭ−１はリンパ球などの内皮細胞および免疫細胞によって発現される。Ｔ細胞上のＩＣＡＭ−１発現は、デングウイルスの投与によって増加する場合がある。いくつかの例では、有効な量は、免疫細胞中のＩＣＡＭ−１の表現を約１０％〜約５００％に増加させる。いくつかの例では、ＩＣＡＭ−１の表現は、約１０％、２０％  ３０％  ４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、３００％、３１０％、３２０％、３３０％、３４０％、３５０％、３６０％、３７０％、３８０％、３９０％、４００％、４１０％、４２０％、４３０％、４４０％、４５０％、４６０％  ４７０％  ４８０％  ４９０％、あるいは最大約５００％である。いくつかの例では、有効な量は、ＩＣＡＭ−１の発現を約１０％〜約３００％増加させる。いくつかの例では、ＩＣＡＭ−１は腫瘍細胞によって発現される。腫瘍細胞上のＩＣＡＭ−１の発現は、デングウイルスの投与によって増加する場合がある。いくつかの例では、上記有効な量は、腫瘍細胞におけるＩＣＡＭ−１の発現を約１０％〜約５００％増加させる。いくつかの例では、ＩＣＡＭ−１の発現は、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、３００％、３１０％、３２０％、３３０％、３４０％、３５０％、３６０％、３７０％、３８０％、３９０％、４００％、４１０％、４２０％、４３０％、４４０％、４５０％、４６０％、４７０％、４８０％、４９０％、あるいは最大約５００％である。いくつかの例では、上記有効な量は、ＩＣＡＭ−１の発現を約１０％〜約３００％増加させる。発現のレベルは、フローサイトメトリーなどのインビトロの分析によって測定することができる。
【００６３】
デングウイルスを投与して、免疫細胞あるいは腫瘍細胞中のＩＣＡＭ−１の発現を増加させることによって、癌を処置する方法が本明細書で提供される。ＩＣＡＭ−１発現の増加または持続により、細胞間相互作用の改善が可能となる。細胞間相互作用は、癌細胞への免疫細胞の結合の増加をもたらし得る。
【００６４】
＜併用送達＞
組成物および方法が本明細書で提供され、ここで、腫瘍の免疫回避機構を克服し、腫瘍細胞を枯渇させるために、樹状細胞ワクチン投与がデングウイルス（ＤＶ）の株のアジュバント効果と組み合わせられる。本明細書に記載される方法は、上記被験体から樹状細胞および腫瘍細胞を得て、上記樹状細胞を刺激する（あるいは「活性化する」）ために、上記腫瘍細胞または腫瘍細胞溶解物に上記樹状細胞をさらし（上記樹状細胞を「パルス化する」とも呼ばれる）、被験体の免疫系をＤＶで刺激した後に、結果として生じる刺激され細胞および腫瘍を標的とする樹状細胞を被験体に送達することによって、被験体の癌を処置するために使用することができる（例えば、図１を参照）。随意に、上記腫瘍抗原は被験体由来ではなく、上記樹状細胞のパルス化のために使用することができる。
【００６５】
必要とする被験体の癌を処置または減少する方法が本明細書で提供され、上記方法は：樹状細胞（ＤＣ）を得る工程と；少なくとも１つの腫瘍細胞抗原で上記ＤＣをインキュベートする工程と；上記被験体にデングウイルス２型の血清型の株を投与する工程と；被験体に上記ＤＣを投与する工程と、を含む。いくつかの例では、上記デングウイルス２型の血清型の株はＤＥＮＶ−２  ＃１７１０である。いくつかの例では、上記樹状細胞は自己由来の樹状細胞である。いくつかの例では、上記樹状細胞は同種異系の樹状細胞である。いくつかの例では、少なくとも１つの腫瘍抗原を有する上記ＤＣをインキュベートする工程は、腫瘍細胞を有する上記ＤＣをインキュベートすることを含む。いくつかの例では、少なくとも１つの腫瘍抗原を有する上記ＤＣをインキュベートする工程は、腫瘍細胞溶解物を有する上記ＤＣをインキュベートすることを含む。
【００６６】
必要とする被験体への本明細書に開示されるデングウイルスおよび樹状細胞。いくつかの例では、方法は、本明細書で開示される刺激された樹状細胞を投与する工程をさらに含む。いくつかの例では、上記デングウイルスは、上記樹状細胞を投与する少なくとも２４時間前に最初に投与される。いくつかの例では、上記デングウイルスは、上記樹状細胞を投与する約１２時間〜約９６時間前に最初に投与される。いくつかの例では、上記デングウイルスは、上記刺激された樹状細胞を投与する約２４時間〜約７２時間前に最初に投与される。いくつかの例では、上記デングウイルスは、上記刺激された樹状細胞を投与する１日〜４日前に最初に投与される。いくつかの例では、上記デングウイルスは１回だけ投与される。いくつかの例では、上記デングウイルスは１回以上投与される。いくつかの例では、上記デングウイルスは樹状細胞を受け取る前にのみ投与される。いくつかの例では、上記デングウイルスは上記刺激された樹状細胞を受け取った後に投与される。いくつかの例では、上記デングウイルスは上記刺激された樹状細胞を受け取る前および受け取った後に投与される。
【００６７】
いくつかの例では、上記デングウイルスによる被験体の成功した感染あるいは接種は、高熱または熱の発生によって確認される。いくつかの例では、上記デングウイルスによる被験体の成功した感染あるいは接種は、被験体の血液／血漿中の循環サイトカインの存在またはその増加によって確認される。サイトカインは、限定されないが、インターロイキン−２、インターロイキン−７、インターロイキン−１２、インターロイキン−１５、インターロイキン−２Ｒ、ＴＮＦアルファ、ＩＰ−１０、ＧＭ−ＣＳＦ、インターフェロンアルファ、アンターフェロンベータ、およびインターフェロンガンマを含み得る。
【００６８】
いくつかの例では、本明細書で提供される方法は、必要とする被験体に刺激された樹状細胞を一回だけ投与する工程を含む。いくつかの例では、上記刺激された樹状細胞は１回以上投与される。いくつかの例では、上記刺激された樹状細胞が１回目および２回目に投与され、ここで、１回目および２回目は、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約８日、約１０日、約１２日、約１８日、約２０日、約２５日、約３０日、約３５日、約４０日、約４５日、約５０日、約６０日、約１００日、約１年、約２年、およびそれらの任意の組み合わせで離れている。いくつかの例では、１回目および２回目は、約１週、約２週、約３週、あるいは約１か月離れている。いくつかの例では、１回目および２回目は１か月以上離れている。いくつかの例では、１回目および２回目は１２か月未満離れている。いくつかの例では、１回目および２回目は１２か月以上離れている。
【００６９】
いくつかの例では、被験体の熱が急に上昇した後、刺激された樹状細胞が投与される。いくつかの例では、被験体の体温が約３７．５°Ｃ〜約４２°Ｃに上昇した後、刺激された樹状細胞が投与される。いくつかの例では、被験体の体温が約３８°Ｃ〜約４２°Ｃに上昇した後、上記刺激された樹状細胞が投与される。いくつかの例では、被験体の体温が少なくとも約３８．５°Ｃに上昇した後、上記刺激された樹状細胞が処理される。いくつかの例では、被験体の体温が３８．５°Ｃに上昇した後、上記刺激された樹状細胞が投与される。いくつかの例では、被験体の体温が摂氏３８°Ｃ以上に達した後、上記刺激された樹状細胞が被験体に投与される。いくつかの例では、被験体の体温は鼓室または経口によって測定される。
【００７０】
＜黒色腫の処置のための投与＆評価の方法＞
黒色腫を患う被験体にデングウイルスを投与する工程を含む方法が本明細書で提供される。いくつかの例では、上記デングウイルスは株ＤＶ−２  ＃１７１０である。黒色腫を患う被験体に、本明細書で提供される刺激された樹状細胞を投与する工程を含む方法が本明細書でさらに提供される。さらに、黒色腫を患う被験体に、本明細書で開示されるデングウイルスおよび樹状細胞を投与する工程を含む方法が本明細書で提供される。いくつかの例では、上記黒色腫は進行性黒色腫である。いくつかの例では、上記被験体は切除不可能なステージＩＩＩの黒色腫を有する。いくつかの例では、上記被験体は切除不可能なステージＩＶの黒色腫を有する。いくつかの例では、上記被験体は測定可能な黒色腫（例えば、二次元で測定することができる腫瘍）を有する。黒色腫のタイプおよび病期が本明細書にさらに記載される。
【００７１】
いくつかの例では、方法は黒色腫を患う被験体から腫瘍サンプルを得る工程を含む。いくつかの例では、方法は上記腫瘍サンプルから腫瘍溶解物を調製する工程を含む。いくつかの例では、方法は、上記被験体の黒色腫細胞に対して樹状細胞を刺激するために、上記樹状細胞を腫瘍溶解物と接触させる工程を含む。いくつかの例では、上記樹状細胞は上記被験体に対して同種異系である。いくつかの例では、上記樹状細胞は上記被験体に対して自己由来である。いくつかの例では、方法は、被験体に対して自己由来の樹状細胞を得るために、上記被験体からの血液に対して白血球除去を行なう工程を含む。いくつかの例では、上記方法は樹状細胞およびデングウイルスを投与する工程を含み、ここで、白血球除去は被験体にデングウイルスを接種する前に行なわれ得る。いくつかの例では、白血球除去は、デングウイルスの接種の少なくとも１週間前に行なわれる。いくつかの例では、白血球除去は、被験体にデングウイルスを接種する約１週〜約４週前に行なわれる。
【００７２】
いくつかの方法では、方法は、白血球除去前に被験体を運動させる工程を含む。いくつかの方法では、方法は、白血球除去前に約１５分〜約５時間被験体を運動させる工程を含む。いくつかの方法では、方法は、白血球除去前に約１時間〜約１５分被験体を運動させる工程を含む。いくつかの例では、方法は、白血球除去前に３０分間被験体を運動させる工程を含む。いくつかの例では、運動は、被験体の心拍数を少なくとも約５０％上げる活動を含む。いくつかの例では、運動は、被験体の心拍数を少なくとも約６５％上げる活動を含む。いくつかの例では、運動は、被験体の心拍数を少なくとも約８０％上げる活動を含む。いくつかの例では、運動は、被験体の心拍数を少なくとも約５０％〜少なくとも約８０％上げる活動を含む。いくつかの例では、運動は、得られた樹状細胞の数を増加させる。
【００７３】
いくつかの例では、方法は一定用量のデングウイルスを投与する工程を含み、ここで、上記用量は１回の注射当たり約１０３ｐｆｕのデングウイルスである。いくつかの例では、上記用量を増やす（例えば、被験体はデング熱を発症しない）。いくつかの例では、方法はデングウイルスの用量を投与する工程を含み、ここで、上記用量は１回の注入当たり約１０４ｐｆｕのデングウイルスである。いくつかの例では、方法はデングウイルスの用量を投与する工程を含み、ここで、上記用量は１回の注入当たり約１０５ｐｆｕのデングウイルスである。いくつかの例では、方法はデングウイルスの用量を投与する工程を含み、ここで、上記用量は１回の注入当たり約１０６ｐｆｕのデングウイルスである。いくつかの例では、方法はデングウイルスの用量を投与する工程を含み、ここで、上記用量は１回の注入当たり約１０７ｐｆｕのデングウイルスである。いくつかの例では、方法は１用量当たり約１０３ｐｆｕのデングウイルス〜１０７ｐｆｕのデングウイルスを投与する工程を含む。
【００７４】
いくつかの例では、方法は約５００マイクロリットルの量の用量を投与する工程を含む。いくつかの例では、方法は約１００マイクロリットル〜約１０００マイクロリットルの量の用量を投与する工程を含む。いくつかの例では、方法は用量を１日に約一回投与する工程を含む。いくつかの例では、方法は用量を１日に約３回投与する工程を含む。いくつかの例では、方法は用量を１日約３回〜１日約５回投与する工程を含む。いくつかの例では、方法は用量を１日３回〜１日５回投与する工程を含む。
【００７５】
いくつかの例では、方法は皮下注射によってデングウイルスを投与する工程を含む。いくつかの例では、方法は腫瘍内注射によってデングウイルスを投与する工程を含む。いくつかの例では、方法は筋肉内注射、腹腔内注射、あるいは静脈内注射によってデングウイルスを投与する工程を含む。
【００７６】
ウイルスの注射に続いて、患者は、口腔温を１日３回取るように命じられる。１０１°Ｆ（３８．５°Ｃ）（注射後５−８日）を超える発熱の際に、患者は１回目のＤＣの注入を許可される。
【００７７】
すべての患者は、自己由来の腫瘍溶解物でとともにパルス化された自己由来の樹状細胞を受け取る。
【００７８】
およそ３．０×１０７の腫瘍溶解物でパルス化されたＤＣ（ＴＬ−ＤＣ）は、水浴において３７°Ｃに暖められ、発熱症状が認められると、０．９％の注射グレードのＮａＣｌにおいて、３０分にわたって静脈内に注入される。４８時間後、３．０×１０７のＴＬ−ＤＣの第２のアリコートは、０．９％の注射グレードのＮａＣｌと同時に３０分にわたって静脈内で注入される。随意に、溶解物でパルス化されたＤＣ（６×１０７）の残りのアリコートは、発熱症状の３日目後に注入される。静注経路は、多数のＤＣを肝臓および白脾髄などの臓器に輸送するための簡単な方法を提供するが、最適なＣＴＬ応答のためのＴＨ１サイトカイン環境を必要とする。したがって、ＴＨ１サイトカインレベルの上昇を利用するために、１回目のＤＣの注入を発熱症状の初期症状に行う。２回目の投与はおよそ４８時間後であり、中毒性ショックの大きさの応答を防ぐためにサイトカイン応答がＴＨ２へと変わる前に、ＣＴＬの第２の波を提供する。随意に、ＤＭＳＯへの注入反応のリスクを減らすために、抗ヒスタミン剤がＴＬ−ＤＣ注入の３０分前に被験体に投与される。あるいは、クラスＩＩ注入バッグに移す前に、細胞をオンサイト（ｏｎ−ｓｉｔｅ）で洗浄して、ＤＭＳＯを除去する。
【００７９】
人間ドック（生命徴候、体重を含む）、活動状態（つまり、ＥＣＯＧまたはカルノフスキー）の評価、および安全性臨床検査（ｓａｆｅｔｙ  ｌａｂｓ）が、ベースラインで毎週行なわれる。４週目から始めて１２週目まで、免疫モニタリングおよび経過観察を２週間毎に行う。１２−２４週目は、患者は３週間毎に評価される。２４週目以降は、安定した疾病あるいは応答を有する患者の疾病の進行が記録されるまで、処置後の経過観察が１２週毎に行われる。
【００８０】
いくつかの例では、ＣＴまたはＰＥＴのスキャンは、抗腫瘍活性を判定するために３〜１２週の間隔で行なわれる。ＣＴスキャンは、胸部、腹部、および骨盤部のスキャンを含んでいる。ある場合には、ＣＴまたはＰＥＴのスキャンが抗腫瘍活性を判定するために８週の間隔で行なわれる。代替的にあるいはさらに、疾病または抗腫瘍活動のバイオマーカーが特徴づけられる。疾病または抗腫瘍活動のバイオマーカーを特徴づけることは以下を含む：抗デングウイルス中和抗体価を測定すること；循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）分析を行なうこと；循環黒色腫ＤＮＡ分析を行なうこと；および、Ｔ細胞免疫表現型検査／ＴＣＲ配列決定を行うこと；抗核抗体を検出すること；ならびに、リウマチ因子のレベルを測定すること。コア生検を含む生検は、腫瘍サイズおよび数に応じて行なわれる。従来のＨＥ組織学は、細胞死を経験する腫瘍細胞、および炎症性の好中球あるいはリンパ球によって浸潤した腫瘍を検知する。
【００８１】
本明細書で開示される刺激された樹状細胞（ＤＣ）を調製するための方法が本明細書で提供される。疾病状態、例えば、腫瘍抗原などに関連する抗原に、上記刺激された樹状細胞をさらす方法が本明細書でさらに提供され、細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）から癌細胞への特異的かつ頑強な応答を誘導することができる刺激された樹状細胞が結果として生じる。疾病状態に関連する障害の処置のために、そのようなＤＣを被験体に投与するための方法が本明細書でさらに提供される。いくつかの例では、上記障害は癌である。いくつかの例では、上記障害は自己免疫疾患、例えば、慢性関節リウマチおよび多発性硬化症である。いくつかの例では、上記障害は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染あるいはエイズである。いくつかの例では、被験体は、刺激されたＤＣの投与前にデングウイルスを投与される。
【００８２】
＜樹状細胞（ＤＣ）を単離および刺激する方法＞
樹状細胞を刺激する工程を含む方法が本明細書で提供され、ここで、樹状細胞を刺激する工程は、樹状細胞が標的癌細胞上に存在する１つ以上の腫瘍抗原と接触することを含む。ある場合には、上記樹状細胞は上記腫瘍抗原のみで刺激され、上記腫瘍抗原は合成、単離、または浄化されている。代替的にまたはさらに、上記樹状細胞は腫瘍細胞溶解物で刺激され、上記腫瘍細胞溶解物は上記腫瘍抗原を含む。ある場合には、上記腫瘍抗原を発現する上記樹状細胞は全癌細胞で刺激される。その後、上記樹状細胞は被験体に投与され、ＣＴＬに腫瘍抗原を提示し、したがって、標的癌細胞の認識および破壊のためにＣＴＬを調整する。
【００８３】
プラスチック容器材料に存在するポリマーへの樹状細胞の曝露を制限する方法が本明細書で提供される。例えば、柔らかいビニール袋の場合には、ポリマーは媒体溶液（ｍｅｄｉａ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に浸出し、ＤＣの活性に影響を与えることができる。代わりに、樹状細胞は、ポリスチレン組織培養プレートなどの硬い容器中で、およびその容器上で、培養、保存、および輸送され得る。これは、柔らかいビニール袋に含まれるポリマーへの暴露によって引き起こされ得る樹状細胞の免疫賦活性活動の低下を回避する。例えば、これらのポリマーは、樹状細胞によって生産されるＩＬ−１２の量を減らすことができ、それによって、頑強なＣＴＬ応答を誘導するそれらの能力を低下させる。本明細書で提供される例は、本明細書で開示される方法によって生成される刺激された樹状細胞が、少なくとも１８ｐｇ／ｍＬのＩＬ−１２ｐ７０を分泌することができるが、標準分析法によって生産される樹状細胞が、典型的に４−６ｐｇ／ｍＬのＩＬ−１２ｐ７０しか生成しないことを実証する。
【００８４】
いくつかの例では、腫瘍溶解物で樹状細胞を刺激することが望ましいか、あるいは都合がよい。顕著に、本明細書で開示される方法は、上記腫瘍抗原の完全性を保存する緩やかな細胞溶解プロトコルを利用する。この緩やかな溶解は、カルシウムあるいは次亜塩素酸ナトリウム溶液に腫瘍または癌細胞をせいぜい約３０〜６０分間晒すことにより達成され得る。同様に、樹状細胞を刺激するために使用されるいかなる腫瘍細胞も、例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳシステムなどによって緩やかに切り離される。
【００８５】
本明細書で提供される方法によって調製される刺激された樹状細胞が本明細書で提供され、ここで、上記方法は、被験体の免疫系を高める薬剤と共に、上記刺激された樹状細胞を被験体に投与する工程を含む。ウイルス感染により刺激された樹状細胞の組み合わせは、最小限の投与（恐らく、１回ほど）での有効な処置を提供し、それは、患者の治療順守の困難を回避する。上記刺激された樹状細胞は、被験体自身の細胞に由来することを意味する自己由来であるか、あるいは同様の組織タイプを有する別の被験体に由来する同種異系間であってもよい。
【００８６】
ＤＣを刺激し、必要とする被験体に刺激されたＤＣを投与する工程を含む方法が本明細書で提供され、上記ＤＣは、標的細胞の細胞傷害性をもたらす細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）からの応答を誘導する。ＤＣは、同種異系の樹状細胞または自己由来の樹状細胞を含み得る。いくつかの例では、本明細書に記載される方法は、被験体に対して同種異系の刺激された樹状細胞を投与する工程を含む。いくつかの例では、本明細書に記載される方法は、被験体に対して自己由来の刺激された樹状細胞を投与する工程を含む。被験体に刺激されたＤＣを投与する工程を含む本明細書で開示される方法は、本明細書において「樹状細胞ワクチン投与」と呼ばれ得る。
【００８７】
いくつかの例において、本明細書に記載される方法は、骨髄中のＣＤ３４＋前駆細胞から樹状細胞を得る工程を含む。いくつかの例では、本明細書に記載される方法は、末梢血液中のＣＤ１＋ＣＤ１４＋未成熟の単球から樹状細胞を得る工程を含む。いくつかの例では、上記樹状細胞を得る工程は白血球除去を含む。いくつかの例では、白血球除去は、被験体またはドナーから血液単位を取り除くことを含み、一連の血液成分を分離する：赤血球、血小板、および血漿因子の大部分（これらは白血球を残したまま、被験体に戻される）。いくつかの例では、本明細書に記載される方法は、無菌性に関して白血球を試験する工程、それらを低温（４°Ｃ）で輸送あるいは保存する工程、および／またはアフェレーシス産物からのＤＣを処理する工程を含む。
【００８８】
ＤＣを生成する方法が本明細書に開示され、上記方法は、限定されないが、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、好酸球、および好塩基球を含む他の白血球から、上記血液単位中の単球を分離する工程を含む。これは、免疫磁気選択あるいは付着特性により達成され得る。免疫磁気選択は、上記血液単位の白血球細胞を、非限定的な例として、ＣＤ表面タンパク質：（ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ５６など）の免疫細胞に対する抗体でコーティングされたプラスチックビーズを含む滅菌プラスチックカラムと接触させることを含む。望ましくない（非単球）細胞はビーズに付着し、単球を通過させて収集する。正の選別において、磁気ビーズは、単球を捕らえるためにＣＤ１および／またはＣＤ１４に対する抗体でコーティングされ、磁石はカラムに対して配され、望ましくない細胞は緩衝生理食塩溶液または細胞が生存可能な培地を含むカラムから流し出される。その後、単球はビーズから洗い流され、次の工程で集められる。付着選別において、特定の表面に付く単球の特性を利用して、傾斜させたカラムにアフェレーシス産物を流すことによりそれらを分離する。
【００８９】
上記血液単位から数千の単球だけを集める工程を含み得る細胞採取のための方法が本明細書で提供される。現在利用される免疫療法の方法は、通常５０００万の範囲のＤＣ用量を必要とする。したがって、本明細書に開示される方法は、単球、ならびにその任意の前駆体、およびそれから分化した任意の細胞（例えば、ＤＣ）を拡大する工程を含むことがある。細胞を拡大する工程は、細胞を、成長因子、コロニー刺激因子、サイトカイン、あるいは他の増殖または成長の誘導因子、およびこれらの組み合わせなどの因子に接触させる工程を含むことがある。非限定的な例として、組み換えヒト成長因子ｒｈｕＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−４（ＩＬ−４）およびｒｈｕＧｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を用いて、ＤＣ数の拡大を実行してもよい。加えて、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦは、成熟したＤＣと比較して、抗原の取り込みとＣＴＬ刺激能力が乏しい単球からの成熟したＤＣを発達させる必要があり得る。したがって、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦは、成熟したＤＣのマーカーの数ならびに発達を拡大することがある。ＤＣマーカーは、限定されないが、ＣＤ１１、ＣＤ８０、およびＣＤ８３を含むことがあり、同様に、（ＣＤ８＋細胞への短鎖ペプチドの提示のための）クラスＩと（ＣＤ４＋ヘルパーインデューサーＴリンパ球への長ペプチドの提示のための）クラスＩＩの両方のＭＨＣ複合体の発現を増加させることがある。細胞の拡大は、約２日以内に数千万の成熟したＤＣを生成することができ、細胞の拡大は、約３日以内に数千万の成熟したＤＣを生成することができ、細胞の拡大は、約４日以内に数千万の成熟したＤＣを生成することができ、細胞の拡大は、約５日以内に数千万の成熟したＤＣを生成することができ、あるいは、細胞の拡大は、約１週間以内に数千万の成熟したＤＣを生成することができる。
【００９０】
いくつかの例において、本明細書に記載される方法は、ＤＣを、ペプチド／抗原、腫瘍細胞、腫瘍支持細胞、腫瘍細胞溶解物、および／または腫瘍支持細胞溶解物に接触させるか、あるいはこれらとともにパルス化する工程を含む。用語「パルス化する」とは通常、本明細書で使用されるように、１以上の間隔で１回より多くＤＣを接触させることを指し、特段の定めのない限り、「接触させる」と交換可能に使用され得る。いくつかの例において、上記方法は、ＤＣを、ＭＨＣクラスＩ分子（「ＭＨＣクラスＩペプチド」）を結合するペプチドに接触させるか、またはそれとともにパルス化する工程を含む。いくつかの例において、本明細書に記載される方法は、ＤＣを、ＭＨＣクラスＩＩ分子（「ＭＨＣクラスＩＩペプチド」）を結合するペプチドに接触させるか、またはそれとともにパルス化する工程を含む。いくつかの例において、本明細書に記載される方法は、ＤＣを、ＭＨＣクラスＩペプチドとＭＨＣクラスＩＩペプチドに接触させるか、またはそれらとともにパルス化する工程を含む。いくつかの例において、接触させるかまたはパルス化する工程により、ＤＣがＣＴＬを刺激し、かつ腫瘍に対してＣＴＬを標的化することができるようになる。いくつかの例において、本明細書に記載される方法は、ＤＣを、生産された／合成のクラスＩおよび／またはクラスＩＩのペプチドに接触させるか、それらとともにパルス化する工程を含む。いくつかの例において、クラスＩおよび／またはクラスＩＩのペプチドが生産され、その後、随意にマイクログラム量以下でＤＣ培地に加えられる。いくつかの例において、本明細書に記載される方法は、持続した免疫応答のためにクラスＩＩペプチドを含む。いくつかの例において、本明細書に記載される方法は、ペプチド（すなわち、腫瘍抗原）のＤＮＡまたはＲＮＡを配列決定する工程、および／または、抗原処理を引き起こすためにＤＮＡあるいはＲＮＡをＤＣに挿入するためのエレクトロポレーションを使用する工程を含む。いくつかの例において、本明細書に記載される方法は、ＨＬＡがＤＣに一致することを必要としない。いくつかの例において、ペプチドまたはその一部は、ＥＧＳＲＮＱＤＷＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、（ＴＡＹＲＹＨＬＬ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、またはそれらの組み合わせから選択されるアミノ酸配列により表される。
【００９１】
いくつかの例では、本明細書で開示されるペプチドはクラスＩペプチドである。クラスＩペプチドが生産され、その後、マイクログラム量でＤＣ培地に加えられ得る。しかし、上記ペプチドを被験体のＨＬＡタイプに一致させなければならないため、この技術は高価である。また、腫瘍細胞がその抗原を提示しない場合、上記腫瘍細胞は検出および溶解を回避することができる。ＣＤ４＋ｈｅｌｐを活性化するクラスＩＩペプチドの不足は免疫応答力の急速な衰退につながる。他の方法は、一般の腫瘍抗原のＲＮＡ配列決定を含むことがあり、その後、抗原処理を引き起こすためにＤＣにＲＮＡを挿入するエレクトロポレーションを使用することがある。この方法はＨＬＡの一致を要求せず、持続した免疫応答のためのクラスＩＩペプチドを含む。しかし、ＲＮＡ配列決定は技術的に複雑なことがあり、数千もの潜在的な遺伝子産物の限られた数の抗原しか提示しないこともある。こうした理由から、自己由来の全腫瘍細胞あるいはその溶解物は、低コスト、生検（１−２ｇｍで十分）による利用しやすさという長所を備え、広範囲かつ深い免疫応答のための潜在的な抗原の完全なアレイを含む。
【００９２】
全腫瘍細胞および／またはその溶解物を得る工程を含む、樹状細胞を刺激する方法が本明細書で提供される。腫瘍細胞は、放射線あるいは他の手段によって、および、様々な方法によって溶解物を調製することにより、死滅させられてもよい。いくつかの例において、腫瘍細胞を溶解することは、トリプシン酵素消化および凍結融解サイクルを含まず、単純かつ迅速ではあるが、中にある繊細なペプチドを傷つけかねない。本明細書に開示される方法は自動細胞処理装置（例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳシステム）を利用してもよく、これにより、サンプルを手動で刻んで、ＰＢＳ溶液中で懸濁することができ、その後、あらかじめ選択された組織特異的ソフトウェアにより制御されるローターシステムが腫瘍細胞を分離する。腫瘍ペプチドへの損傷を最小限にとどめて、単細胞懸濁液を膜溶解させることができる。
【００９３】
いくつかの例では、本明細書で開示される方法は、樹状細胞を自己由来の腫瘍細胞あるいはその溶解物と接触させる工程を含む。いくつかの例において、本明細書に記載される方法は、広範囲かつ深い免疫応答のための潜在的な抗原の完全なアレイを含有する自己由来の全腫瘍細胞（例えば、腫瘍細胞および腫瘍支持細胞）またはその溶解物に、樹状細胞を接触させる工程を含む。いくつかの例において、本明細書に記載される樹状細胞刺激のための方法は、上記樹状細胞を、アポトーシス性または壊死性の小体を含む腫瘍細胞溶解物に接触させる工程を含む。さらなる例において、上記腫瘍細胞溶解物は、細胞外マトリックスタンパク質などの、腫瘍細胞を取り囲む微小環境からの腫瘍抗原を含む。
【００９４】
いくつかの例では、本明細書に記載される方法は、ＤＣの刺激、増殖、あるいは生存率を増強する増強剤をＤＣと接触させる工程を含む。非限定的な例として、上記増強剤は、リンフォカイン、モノカイン、サイトカイン、成長因子、細胞、細胞断片、（非タンパク質）小分子、抗体、抗体フラグメント、核酸、およびこれらの組み合わせから選択されてもよい。
【００９５】
いくつかの例では、ＤＣ刺激のために細胞と抗原を調製するための本明細書に記載される方法は、標的細胞（例えば、癌細胞）を細胞分裂できなくする工程を得る。例えば、該方法は、細胞を細胞分裂できなくするためにマイトマイシンＣあるいは放射線を用いて細胞を処置する工程を含んでもよい。これらは、増強剤として加えられる細胞、またはＤＣをパルス化するために用いられる細胞（例えば、腫瘍細胞）を含んでもよい。
【００９６】
いくつかの例において、本明細書に記載される方法は、約１時間〜約２４時間ＤＣをパルス化する工程を含む。いくつかの例において、本明細書に記載される方法は、約１２時間〜約４８時間ＤＣをパルス化する工程を含む。いくつかの例において、本明細書に記載される方法は、約８時間〜約２４時間ＤＣをパルス化する工程を含む。いくつかの例において、本明細書に記載される方法は、約１８時間ＤＣをパルス化する工程を含む。パルス化は、ペプチド／抗原、腫瘍細胞、腫瘍支持細胞、腫瘍細胞溶解物、および／または腫瘍支持細胞溶解物にＤＣを少なくとも１回接触させる工程を含んでもよい。パルス化は、ペプチド／抗原、腫瘍細胞、腫瘍支持細胞、腫瘍細胞溶解物、および／または腫瘍支持細胞溶解物にＤＣを少なくとも２回接触させる工程を含んでもよい。パルス化は、ペプチド／抗原、腫瘍細胞、腫瘍支持細胞、腫瘍細胞溶解物、および／または腫瘍支持細胞溶解物にＤＣを少なくとも３回接触させる工程を含んでもよい。パルス化は、ペプチド／抗原、腫瘍細胞、腫瘍支持細胞、腫瘍細胞溶解物、および／または、腫瘍支持細胞溶解物にＤＣを、２回未満、３回未満、４回未満、５回未満、あるいは１０回未満接触させる工程を含んでもよい。パルス化は、ペプチド／抗原、腫瘍細胞、腫瘍支持細胞、腫瘍細胞溶解物、および／または腫瘍支持細胞溶解物が、ＤＣの培地に堆積するように、ペプチド／抗原、腫瘍細胞、腫瘍支持細胞、腫瘍細胞溶解物、および／または腫瘍支持細胞溶解物をＤＣに１回より多く加えることを含む。パルス化は細胞を洗浄すること、または、１つ以上のパルス化の間にＤＣ培地を取り除くことを含み得る。
【００９７】
本明細書に記載される方法は、ＤＣの成熟を増強するか、完了させるか、あるいは終了させるために、本明細書に記載される成熟化剤にＤＣを接触させる工程を含み得る。いくつかの実施形態では、上記成熟化剤は「危険信号」としても作用する。この危険信号がなければ、上記腫瘍抗原は、最終的にはＣＴＬ活性を低下させるＴｒｅｇ産生あるいは活性を誘発する可能性がある。いくつかの実施形態では、上記成熟化剤／危険信号は炎症性シグナルである。上記炎症性シグナルは炎症性メディエーターと呼ばれることもある。炎症性メディエーターは、サイトカイン、ならびに、当業者によってサイトカインとして分類されないこともあるが、直接的あるいは間接的に炎症に影響する他の因子（例えば、ケモカイン、接着分子など）を含み得る。いくつかの実施形態では、上記炎症性メディエーターは、ケモカイン、サイトカイン、病原体、非ペプチドの小分子、化合物、抗体、ペプチド、その断片、その一部、およびそれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、上記炎症性シグナルは、パターン認識受容体（ＰＲＲ）またはその経路のモジュレーターである。
【００９８】
いくつか例では、本明細書に記載される炎症性シグナルは、インターフェロン、ｔｏｌｌ様受容体シグナル伝達モジュレーター、およびこれらの組み合わせから選択される。非限定的な例として、インターフェロンはインターフェロンガンマであってもよい。いくつかの実施形態では、上記炎症性シグナルはｔｏｌｌ様受容体シグナル伝達経路モジュレーターである。
【００９９】
いくつかの例では、本明細書に記載される炎症性シグナルは、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）シグナル伝達経路制御因子である。非限定的な例として、ｔｏｌｌ様受容体シグナル伝達経路制御因子は、リポ多糖（ＬＰＳ）、細菌細胞壁由来の多糖類であってもよい。いくつかの例では、ｔｏｌｌ様受容体シグナル伝達経路制御因子は、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、およびＴＬＲ１０を制御する、ｔｏｌｌ様受容体シグナル伝達経路制御因子から選択されてもよい。ｔｏｌｌ様受容体シグナル伝達経路制御因子は、ＴＬＲのリガンド、結合タンパク質、抗体、アゴニスト、あるいはアンタゴニストであってもよい。ｔｏｌｌ様受容体シグナル伝達経路制御因子は、ペプチド、タンパク質、細胞断片、細胞壁成分、リポタンパク質、ペプチドグリカン、多糖類、単糖類、および小分子化合物から選択されてもよい。ｔｏｌｌ様受容体シグナル伝達経路制御因子は、動物細胞、植物細胞、細菌細胞、酵母菌、真菌細胞、およびこれらの組み合わせの一部であってもよい。ｔｏｌｌ様受容体シグナル伝達経路制御因子は、ＴＬＲ２シグナル伝達経路制御因子であってもよい。非限定的な例として、ＴＬＲ２シグナル伝達経路制御因子は、リポタイコ酸、ＭＡＬＰ−２、ＭＡＬＰ−４、ＯｓｐＡ、ポーリン、ＬｃｒＶ、リポマンナン、ＧＰＩアンカー、リゾホスファチジルセリン、リポホスホグリカン、グリコホスファチジルイノシトール、チモサン、ｈｓｐ６０、およびヘマグルチニン（ｈｅｍａｇｌｌｕｔｉｎｉｎ）であってもよい。ｔｏｌｌ様受容体シグナル伝達経路制御因子は、ＴＬＲ４シグナル伝達経路制御因子であってもよい。非限定的な例として、ＴＬＲ４シグナル伝達経路制御因子は、ブプレノルフィン、カルバマゼピン、エタノール、フェンタニル、レボルファノール、ＬＰＳ、メタドン、モルヒネ、オクスカルバゼピン、オキシコドン、ペチジン、およびグルクロノキシロマンナンであってもよい。ｔｏｌｌ様受容体シグナル伝達経路制御因子は、ＴＬＲ７シグナル伝達経路制御因子であってもよい。非限定的な例として、ＴＬＲ７シグナル伝達経路制御因子は一本鎖ＲＮＡあるいはイミダゾキノリン化合物であってもよい。ｔｏｌｌ様受容体シグナル伝達経路制御因子は、ＴＬＲ８シグナル伝達経路制御因子であってもよい。非限定的な例として、ＴＬＲ８シグナル伝達経路制御因子は一本鎖ＲＮＡ、Ｇ−ｒｉｃｈオリゴヌクレオチド、あるいはイミダゾキノリン化合物であってもよい。イミダゾキノリン化合物はＲ８４８であってもよい。炎症性シグナルへの曝露後、ＤＣは、そのＣＤ８０／ＣＤ８３＋活性化マーカーをアップレギュレートし、１型ＣＴＬ応答を誘発するためにＩＬ−１２ｐ７０の産生を増大させ、さらなる抗原の取り込みと処理に耐性を持つようになり得る。
【０１００】
いくつかの例では、本明細書に記載される方法は、ＤＣの成熟を増強するか、完了させるか、あるいは終了させるために、本明細書に記載される成熟化剤にＤＣを接触させる工程を含み得る。いくつかの例では、ＤＣの成熟を終了させる薬剤はＬＰＳ細菌細胞壁を含む。いくつかの例では、上記成熟化剤はＩＦＮガンマを含む。いくつかの例では、上記成熟化剤はＲ８４８を含む。いくつかの例では、上記成熟化剤はＣＤ４０Ｌを含む。いくつかの例では、上記成熟化剤は、ＬＰＳ細菌細胞壁、ＩＦＮガンマ、Ｒ８４８およびＣＤ４０Ｌから選択される、少なくとも任意の２つの薬剤の組み合わせを含む。いくつかの例では、上記成熟化剤は、ＬＰＳ細菌細胞壁、ＩＦＮガンマ、Ｒ８４８およびＣＤ４０Ｌから選択される、少なくとも任意の３つの薬剤の組み合わせを含む。いくつかの例では、上記成熟化剤は、ＬＰＳ細菌細胞壁、ＩＦＮガンマ、Ｒ８４８、ＣＤ４０Ｌあるいはその任意の組み合わせを含む。いくつかの例では、上記成熟化剤は同時に投与される。いくつかの例では、上記成熟化剤は連続して投与される。いくつかの例では、上記成熟化剤は、最初に投与されるＬＰＳから始まり、連続して投与される。いくつかの例では、上記成熟化剤は、最初に投与されるＩＦＮガンマから始まり、連続して投与される。いくつかの例では、上記成熟化剤は、最初に投与されるＲ８４８から始まり、連続して投与される。いくつかの例では、上記成熟化剤は、最初に同時に投与されるＬＰＳおよびＩＦＮガンマから始まり、連続して投与される。いくつかの例では、上記成熟化剤は連続して投与され、ＬＰＳおよびＩＦＮガンマが同時に最初に投与され、その後、Ｒ８４８、ＣＤ４０Ｌ、あるいはそれらの任意の組み合わせが投与される。いくつかの例では、上記成熟化剤は連続して投与され、ＬＰＳおよびＩＦＮガンマが同時に最初に投与され、その後、Ｒ８４８が投与される。いくつかの例では、上記成熟化剤は連続して投与され、ＬＰＳ細菌細胞壁およびＩＦＮガンマが同時に最初に投与され、その後、Ｒ８４８、次に、ＣＤ４０Ｌが投与される。
【０１０１】
本明細書に記載される刺激された樹状細胞を生成するための方法が本明細書で提供され、上記方法は、刺激された樹状細胞をインターフェロンガンマと接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、上記方法は、約１００Ｕ／ｍＬ〜約１０，０００Ｕ／ｍＬ、約５００Ｕ／ｍＬ〜約５０００Ｕ／ｍＬ、および約５００Ｕ／ｍＬ〜約２，０００Ｕ／ｍＬから選択されるインターフェロンガンマの濃度の培地で、刺激された樹状細胞を培養する工程を含む。いくつかの実施形態では、上記方法は、約５００Ｕ／ｍＬのインターフェロンガンマの濃度の培地で刺激された樹状細胞を培養する工程を含む。いくつかの実施形態では、上記方法は、約１０００Ｕ／ｍＬのインターフェロンガンマの濃度の培地で刺激された樹状細胞を培養する工程を含む。いくつかの実施形態では、上記方法は、約２０００Ｕ／ｍＬのインターフェロンガンマの濃度の培地で刺激された樹状細胞を培養する工程を含む。
【０１０２】
いくつかの例では、本明細書に記載される刺激された樹状細胞を生成するための方法は、刺激された樹状細胞をＴＬＲ８アゴニストＲ８４８と接触させる工程を含み得る。いくつかの実施形態では、上記方法は、約０．１μｇ／ｍＬ〜約５０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ〜２０μｇ／ｍＬ、および約１μｇ／ｍＬ〜約１０μｇ／ｍＬから選択されるＲ８４８の濃度の培地で、刺激された樹状細胞を培養する工程を含む。いくつかの実施形態では、上記方法は、約１μｇ／ｍＬのＲ８４８の濃度の培地で刺激された樹状細胞を培養する工程を含む。いくつかの実施形態では、上記方法は、約５μｇ／ｍＬのＲ８４８の濃度の培地で刺激された樹状細胞を培養する工程を含む。いくつかの実施形態では、上記方法は、約１０μｇ／ｍＬのＲ８４８の濃度の培地で刺激された樹状細胞を培養する工程を含む。
【０１０３】
いくつかの例では、本明細書に記載される刺激された樹状細胞を生成するための方法は、刺激された樹状細胞をリポ多糖と接触させる工程を含み得る。いくつかの実施形態では、上記方法は、約１ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ〜約５０ｎｇ／ｍＬ、および約１ｎｇ／ｍＬ〜約２５ｎｇ／ｍＬから選択されるリポ多糖の濃度の培地で、刺激された樹状細胞を培養する工程を含む。いくつかの実施形態では、上記方法は、約５ｎｇ／ｍＬのリポ多糖の濃度の培地で刺激された樹状細胞を培養する工程を含む。いくつかの実施形態では、上記方法は、約１０ｎｇ／ｍＬのリポ多糖の濃度の培地で刺激された樹状細胞を培養する工程を含む。いくつかの実施形態では、上記方法は、約１５ｎｇ／ｍＬのリポ多糖の濃度の培地で刺激された樹状細胞を培養する工程を含む。
【０１０４】
本明細書で開示される方法によって生成される刺激されたＤＣの無菌性、特異性、および生存率の試験を含む方法が本明細書で提供される。上記試験はＤＣの輸送または保管前に行うことができる。上記試験はＤＣの輸送または保管後に行うことができる。上記方法は、ＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルのいずれかで、ＤＣにおけるＩＬ−１２ｐ７０の発現レベルを測定する工程を含み得る。ＩＬ−１２ｐ７０は、この２０年間に多くの試みで試験された臨床反応の独立予測因子であり、その一部はおよそ４０％の反応率である。本明細書に開示される方法によって産生される、刺激されたＤＣのＩＬ−１２ｐ７０における発現レベルは、従来の方法によって産生／保管／輸送される、刺激されたＤＣよりも少なくとも約２倍以上大きいこともある。本明細書に開示される方法によって産生される、刺激されたＤＣのＩＬ−１２ｐ７０における発現レベルは、従来の方法によって産生／保管／輸送される、刺激されたＤＣ（「従来の刺激されたＤＣ」）よりも少なくとも約２倍以上大きいこともある。刺激されたＤＣにおけるＩＬ−１２ｐ７０の発現レベルは、従来の刺激されたＤＣよりも、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、あるいは少なくとも約１００％以上大きいこともある。刺激されたＤＣにおけるＩＬ−１２ｐ７０の発現レベルは、従来の刺激されたＤＣよりも少なくとも約３倍以上大きいこともある。刺激されたＤＣにおけるＩＬ−１２ｐ７０の発現レベルは、従来の刺激されたＤＣよりも少なくとも約４倍以上大きいこともある。本明細書に開示される方法によって産生された刺激されたＤＣにおけるＩＬ−１２ｐ７０の発現レベルは、従来の刺激されたＤＣよりも約２０倍以上大きいこともある。
【０１０５】
１６６ｎｇ／ｍＬより多いＩＬ−１２ｐ７０を生成する樹状細胞を生成するための方法が本明細書で提供される。さらに、２０１０ｎｇ／ｍＬより多いＩＬ−１２ｐ７０を生成する樹状細胞が本明細書で提供される。本出願のＤＣは、少なくとも約１５１０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１２ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１９１４ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１６ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１８ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約２０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約２２ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約２４ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約２６ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約２８ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約２９ｎｇ／ｍＬ、あるいは少なくとも約３０ｎｇ／ｍＬを生成することができる。本明細書のＤＣは、約２０ｎｇ１０ｎｇ／ｍＬ〜約３０ｎｇ／ｍＬを生成することができる。本明細書のＤＣは、約２０ｎｇ１０ｎｇ／ｍＬ〜約２９ｎｇ／ｍＬを生成することができる。本明細書のＤＣは、約１５ｎｇ／ｍＬ〜少なくとも約２９ｎｇ／ｍＬを生成することができる
【０１０６】
＜ＣＴＬ応答＞
ＤＣがＣＴＬ応答を誘導する能力を試験する工程を含む、本明細書に記載されるＤＣを生成するための方法が本明細書で開示される。ＣＴＬ応答のレベルを測定することは、被験体の血液、血清、あるいは血漿中のサイトカインまたは炎症性メディエーターを測定することを含み得る。ＣＴＬ応答のレベルを測定することは、被験体の血液、血清、あるいは血漿中のサイトカインまたは炎症性メディエーターのレベルの変化を測定することを含み得る。ＣＴＬ応答のレベルを測定することは、サイトカインまたは炎症性メディエーターの産生をインビトロで測定することを含み得る。サイトカインおよび炎症性メディエーターは、インターロイキン、遊走阻止タンパク質、単球走化性タンパク質、単球化学走化性タンパク質、インターフェロン、腫瘍壊死因子、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、マクロファージ炎症性タンパク質、モノカイン、ケモカイン、ケモカインリガンド（ＣＣＬ）とＣ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン（ＣＸＣＬ）、およびこれらの受容体を含んでもよい。サイトカインおよび炎症性メディエーターは、限定されないが、インターロイキン１ベータ（ＩＬ−１ｂ）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン５（ＩＬ−５）、インターロイキン７（ＩＬ−７）、インターロイキン８（ＩＬ−５）、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン１３（ＩＬ−１３）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン１５（ＩＬ１５）、インターロイキン（ＩＬ−１７）、ランテス、イオタキシン、マクロファージ炎症性タンパク質１α（ＭＩＰ−１ａ）、マクロファージ炎症性タンパク質１β（ＭＩＰ−１ｂ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、インターフェロンアルファ（ＩＦＮａ）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮｇ）、インターロイキン１受容体アルファ（ＩＬ−１Ｒａ）、インターロイキン２受容体（ＩＬ−２Ｒ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦａ）、インターフェロンガンマによって引き起こされたタンパク質（ＩＰ−１０）、およびガンマインターフェロン（ＭＩＧ）によって誘発されたモノカインを含む。ＣＴＬ応答は、高い癌の死滅（「冷たい」腫瘍を「熱く」する）を可能にし、非反応者または低反応者でさらなる腫瘍の収縮を生じさせる、腫瘍反応遺伝子（ＭｘＡなど）の発現によって測定されてもよい。
【０１０７】
＜硬い表面＞
硬い表面上でＤＣを培養することを含む、本明細書に記載されるＤＣを調整するための方法が本明細書で提供される。用語「硬い表面」は一般に、本明細書で使用されるように、標準的なプラスチック組織培養プレートあるいはフラスコ（例えば、ポリスチレンプレート）を指す。本明細書に開示される方法は、ＤＣが付着することができる硬い表面上でＤＣを培養する工程を含む。いくつかの実施形態では、上記硬い表面は、タンパク質、ペプチド、細胞外マトリックス分子、ポリマー、あるいはこれらの組み合わせでコーティングされる。いくつかの実施形態では、上記硬い表面はコーティングされない（例えば、ＤＣは硬いプラスチック表面に直接付着する）。上記硬い表面は、細胞分化バッグとしても知られている軟組織培養袋とは対照的である。軟組織培養バッグは、ＤＣの１型応答能力を低下させるポリマーあるいは化学製品（例えば、フタル酸塩）を含むバッグであってもよい。軟組織培養バッグは、ＤＣからの中性的な０型応答を誘発してＤＣを機能的に不活性にするポリマーあるいは化学製品を含むバッグであってもよい。軟組織培養バッグは、ポリエチレン、フッ素化エチレンプロピレン（ＦＥＰ）、ヘキサフルオロプロピレン、テトラフルオロエチレン、ポリテトラフルオロエチレン、およびそのコポリマー、ならびにこれらの組み合わせから選択されるポリマーを含むバッグであってもよい。
【０１０８】
保管ユニットにＤＣを移動させる工程を含む、本明細書に記載されるＤＣを調製するための方法が本明細書で提供される。保管ユニットは搬送ユニットであってもよい。保管ユニットは、可撓性を有するか、柔らかい容器または表面（例えば、バッグ）、あるいは硬い容器または表面（例えば、フラスコまたはプレート）から選択されてもよい。保管ユニットは硬いプラスチック表面を含むことがある。保管ユニットは硬いプラスチック表面から本質的になることがある。保管ユニットは硬いプラスチック表面からなることがある。保管ユニットは非プラスティック表面（例えば、ガラス）を含むことがある。保管ユニットは非プラスティック表面から本質的になることがある。保管ユニットは非プラスティック表面からなることがある。保管ユニットは、保管ユニット内に保管された細胞によって取り込まれることになる、および／または、該細胞において反応を誘発することになる任意のポリマーを含まないこともある。保管ユニットは、未成熟のＤＣにおいて中性の応答または０型の応答を誘発するポリマーを含まないか、あるいは、実質的に含まないこともある。中性の応答はＩＬ−１２ｐ７０の低い発現を特徴とし得る。保管ユニットは、保管ユニット内に保管された細胞によって取り込まれることになる、および／または、該細胞において反応を誘発することになる任意のポリマーを実質的に含まないこともある。実質的に含まないということは、保管ユニットが、保管ユニット内に保管された細胞によって取り込まれることになる、および／または、該細胞において反応を誘発することになる任意のポリマーを少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％含まないことを意味し得る。実質的に含まないということは、保管ユニットが、保管ユニット内に保管された細胞によって取り込まれることになる、および／または、該細胞において反応を誘発することになる任意のポリマーを少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％含まないことを意味し得る。
【０１０９】
いくつかの例では、保管ユニットは内部表面を含み、ここで、上記内部表面は、保管ユニット内に保管された細胞と接している保管ユニットの表面である。内側表面は硬いプラスチック表面からなることがある。内側表面はガラスであってもよい。内側表面は、保管ユニット内に保管された細胞によって取り込まれることになる、および／または、該細胞において反応を誘発することになる任意のポリマーがないこともある。内側表面は、保管ユニット内に保管された未成熟のＤＣあるいは任意の細胞によって取り込まれないポリマーから構成されてもよい。内側表面は、保管ユニット内に保管された細胞によって取り込まれることになる、および／または、該細胞において反応を誘発することになる任意のポリマーを含まないこともある。内側表面は、保管ユニット内に保管された細胞によって取り込まれることになる、および／または、該細胞において反応を誘発することになる任意のポリマーを実質的に含まないこともある。内側表面は、細胞と保管媒体の追加後に、保管ユニット内に保管された細胞によって取り込まれることになる、および／または、該細胞において反応を誘発することになる任意のポリマーを少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％含まないこともある。内側表面は、細胞と保管媒体の追加後に、保管ユニット内に保管された細胞によって取り込まれることになる、および／または、該細胞において反応を誘発することになる任意のポリマーを少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％含まないこともある。内側表面は、未成熟のＤＣにおいて中性の応答または０型の応答を引き起こすポリマーを含まないか、または、実質的に含まないこともある。中性の応答はＩＬ−１２ｐ７０の低い発現を特徴とし得る。
【０１１０】
本明細書で提供される方法により生成されるＤＣを保管するための方法が本明細書で提供され、上記保管ユニットは、液体のＮ２中で−７０°Ｃで冷凍し、最大１年間保存し、および使用のために病院に輸送するのに適している。上記方法は、成熟したＤＣ、未成熟のＤＣ、単球、あるいは血液を保管ユニット内で保管および／または輸送する工程を含み得る。上記方法は、夜通し細胞を冷却して輸送する工程を含み得る。上記方法は、（例えば、暖水浴内で）細胞を解凍するか、あるいは、３７°Ｃに暖める工程を含んでもよい。
【０１１１】
＜腫瘍細胞を単離および溶解する方法＞
腫瘍細胞を標的とするために本明細書に開示される方法によってＤＣを投与する工程を含む、被験体を処置するための方法が本明細書で開示される。いくつかの例において、ＤＣは被験体由来の腫瘍細胞で刺激される。いくつかの例において、腫瘍細胞は、本明細書において腫瘍支持細胞と呼ばれる、被験体の腫瘍微小環境から単離された細胞である。いくつかの例において、樹状細胞が、腫瘍細胞、および／または、腫瘍の増殖と転移を支持する腫瘍支持細胞（例えば、内皮細胞、血管細胞、免疫細胞など）を標的とするように、腫瘍細胞、腫瘍支持細胞、および／またはそれらのペプチドに晒される、または腫瘍細胞、腫瘍支持細胞および／またはそれらのペプチドとともにパルス化される。いくつかの例において、腫瘍細胞および腫瘍支持細胞由来のペプチド／抗原は、腫瘍細胞と腫瘍支持細胞両方の上でペプチド／抗原に対する受容体を持つ樹状細胞または細胞障害性リンパ球を誘発し、その結果、腫瘍細胞のみではなく腫瘍微小環境への樹状細胞または細胞障害性リンパ球を標的とするようになる。いくつかの例において、腫瘍細胞および／または腫瘍支持細胞は腫瘍組織の生検から得られる。いくつかの例において、上記生検は、腫瘍細胞、脂肪細胞、繊維芽細胞、内皮細胞、浸潤性免疫細胞、およびそれらの組み合わせから選択される細胞を含む。いくつかの実施形態では、上記方法は、ＤＣを効果的かつ最適に刺激／パルス化するべく、十分な数の腫瘍細胞、腫瘍細胞溶解物、あるいは腫瘍細胞抗原を有するために、腫瘍細胞を拡大する工程を含む。拡大する工程は、腫瘍細胞をインビトロで増殖する工程を含み得る。
【０１１２】
腫瘍細胞を標的化するために本明細書に開示されるＤＣを活性化するための方法が本明細書で提供され、上記ＤＣは、溶解した腫瘍細胞および／または腫瘍支持細胞ならびに周囲の細胞外マトリックスで活性化される。いくつかの例において、溶解は、赤血球を除去するために腫瘍細胞および／または腫瘍支持細胞をＮＨ４Ｃｌ酵素溶液と接触させることを含む。いくつかの例において、溶解は、免疫原性細胞死を誘発するために腫瘍細胞および／または腫瘍支持細胞を次亜塩素酸溶液と接触させることを含む。いくつかの例において、細胞は、ペプチドを破壊しないよう十分に緩やかに溶解される。いくつかの例において、細胞は、アポトーシス性または壊死性の小体を生成するために溶解される。いくつかの例において、上記方法は、酵素溶液で腫瘍細胞および／または腫瘍支持細胞を溶解する工程を含む。いくつかの例において、上記方法は、過酸化物を含まない溶液または低過酸化物含有溶液で腫瘍細胞および／または腫瘍支持細胞を溶解する工程を含む。
【０１１３】
次亜塩素酸塩溶液（ＨＯＣＬ）を用いて腫瘍細胞を溶解する工程を含む、本明細書に開示されるＤＣを活性化するための方法が本明細書で提供される。いくつかの例では、次亜塩素酸塩溶液は亜塩素酸ナトリウムを含む。いくつかの例では、次亜塩素酸塩溶液は亜塩素酸カルシウムを含む。いくつかの例では、腫瘍細胞を懸濁する培地中の次亜塩素酸塩の濃度は、約１０μＭ、約２０μＭ、約３０μＭ、約４０μＭ、約５０μＭ、約６０μＭ、約７０μＭ、約８０μＭ、約９０μＭ、あるいは１００μＭである。
【０１１４】
本明細書に記載される方法によってＤＣを活性化するための方法が本明細書で提供され、上記方法は、ＤＣと接触させる前に、腫瘍細胞および／または腫瘍支持細胞を洗浄液で溶解させる工程を含む。いくつかの例において、洗浄液は、限定されないが、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４、ＮＰ−４０、Ｂｒｉｊ−３５、Ｂｒｉｊ−５８、Ｔｗｅｅｎ  ２０、Ｔｗｅｅｎ  ８０、オクチルグルコシド、オクチルチオグルコシド、ＳＤＳ、ＣＨＡＰＳ  ２０、およびＣＨＡＰＳＯから選択される。いくつかの例において、洗浄液は、過酸化物および他の不純物を取り除く。いくつかの例において、約０．１％〜約１０％ｖ／ｖの洗浄液である。いくつかの例において、約０．１％〜約５％ｖ／ｖの洗浄液である。いくつかの例において、約０．５％〜約５％ｖ／ｖの洗浄液である。いくつかの例において、約１％〜約１０％ｖ／ｖの洗浄液である。いくつかの例において、約１％〜約５％ｖ／ｖの洗浄液である。いくつかの例において、上記方法は、細胞の振盪、ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ）、冷凍、解凍、剪断圧力、超音波処理、および／または加熱を行うことなく、細胞を溶解する工程を含む。
【０１１５】
いくつかの例では、本明細書に記載される細胞溶解のための方法は、溶解をやめるか中和する工程を含む。例えば、細胞は、溶解を中和するために緩衝生理食塩水（ホスホ緩衝生理食塩水溶液あるいはハンクス液）で洗浄されてもよい。
【０１１６】
＜キット＞
本明細書で開示されるのは、組成物を含むキットであり得る。本明細書で開示されるのは、癌、病原体感染、あるいは免疫不全の処置または予防のためのキットであり得る。ある場合には、キットが、単位剤形の有効な量のデングウイルスの組成物を含有する治療または予防用組成物を含んでいる場合もある。ある場合には、キットが、デングウイルスの治療用組成物を含有することができる滅菌容器を含み；そのような容器は、箱、アンプル、ボトル、ガラス瓶、チューブ、フラスコ、バッグ、小袋、ブリスター包装、あるいは本分野で既知の他の適切な容器の形態であってもよい。そのような容器はプラスチック、ガラス、ラミネート紙、金属箔、あるいは薬物を保持するのにふさわしい他の材料で作ることができる。ある場合には、キットが細胞を含むことができ、例えば、樹状細胞などの、約１×１０４の細胞〜約１×１０１２の細胞を含むことができる。ある場合には、キットが少なくとも約１ｘ１０５の細胞、少なくとも約１ｘ１０６の細胞、少なくとも約１ｘ１０７の細胞、少なくとも約４ｘ１０７の細胞、少なくとも約５ｘ１０７の細胞、少なくとも約６ｘ１０７の細胞、少なくとも約６ｘ１０７の細胞、少なくとも約８ｘ１０７の細胞、少なくとも約９ｘ１０７の細胞、少なくとも約１ｘ１０８の細胞、少なくとも約２ｘ１０８の細胞、少なくとも約３ｘ１０８の細胞、少なくとも約４ｘ１０８の細胞、少なくとも約５ｘ１０８の細胞、少なくとも約６ｘ１０８の細胞、少なくとも約６ｘ１０８の細胞、少なくとも約８ｘ１０８の細胞、少なくとも約９ｘ１０８の細胞、少なくとも約１ｘ１０９の細胞、少なくとも約２ｘ１０９の細胞、少なくとも約３ｘ１０９の細胞、少なくとも約４ｘ１０９の細胞、少なくとも約５ｘ１０９の細胞、少なくとも約６ｘ１０９の細胞、少なくとも約６ｘ１０９の細胞、少なくとも約８ｘ１０９の細胞、少なくとも９ｘ１０９の細胞、少なくとも約１ｘ１０１０の細胞、少なくとも約２ｘ１０１０の細胞、少なくとも約３ｘ１０１０の細胞、少なくとも約４ｘ１０１０の細胞、少なくとも約５ｘ１０１０の細胞、少なくとも約６ｘ１０１０の細胞、少なくとも約６ｘ１０１０の細胞、少なくとも約８ｘ１０１０の細胞、少なくとも約９ｘ１０１０の細胞、少なくとも約１ｘ１０１１の細胞、少なくとも約２ｘ１０１１の細胞、少なくとも約３ｘ１０１１の細胞、少なくとも約４ｘ１０１１の細胞、少なくとも約５ｘ１０１１の細胞、少なくとも約６ｘ１０１１の細胞、少なくとも約６ｘ１０１１の細胞、少なくとも約８ｘ１０１１の細胞、少なくとも約９ｘ１０１１の細胞、あるいは少なくとも約１ｘ１０１２の細胞を含む。例えば、約５ｘ１０１０の細胞をキットに含むことができる。別の例において、キットは３ｘ１０６の細胞を含むことができ；上記細胞を５ｘ１０１０の細胞に拡大して、被験体に投与することができる。そのようなキットはさらにその使用説明書を含む場合もある。
【０１１７】
＜医薬組成物＞
本明細書で開示される有効な量のデングウイルスを含む医薬組成物が本明細書で提供される。いくつかの例では、上記医薬組成物は、デングウイルスの１を超える株を含む。いくつかの例では、上記医薬組成物は、少なくともデングウイルスの一部を含む。上記デングウイルスの一部は、上記医薬組成物を受け取る被験体において免疫反応を生成するのに十分な部分であり得る。上記組成物は、１つ以上の薬学的に許容可能な塩、賦形剤またはビヒクルをさらに含み得る。本医薬組成物で使用される薬学的に許容可能な塩、賦形剤、またはビヒクルは、担体、賦形剤、希釈剤、抗酸化剤、保存剤、着色剤、調味料およびと稀釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、充填剤、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、等張化剤、共溶媒、湿潤剤、錯化剤、緩衝剤、抗菌剤、および界面活性剤を含んでいる。
【０１１８】
いくつかの例では、本明細書で開示される担体は中性の緩衝食塩水を含む。上記医薬組成物は、アスコルビン酸などの抗酸化剤；低分子量ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトールまたはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；および／または、Ｔｗｅｅｎ、プルロニック、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン界面活性剤を含むこともある。さらに、一例として、適切な等張促進剤は、アルカリ金属ハロゲン化物（好ましくはナトリウムまたは塩化カリウム）、マンニトール、ソルビトールなどを含んでいる。適切な保存剤は塩化ベンザルコニウム、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸などを含んでいる。過酸化水素は保存剤としても使用されることがある。適切な共溶媒はグリセリン、プロピレングリコール、およびＰＥＧを含んでいる。適切な錯化剤はカフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ−シクロデキストリン、またはヒドロキシ−プロピル−ベータ−シクロデキストリンを含んでいる。適切な界面活性剤または湿潤剤は、ソルビタンエステル、ポリソルベート８０などのポリソルベート、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサポールなどを含んでいる。緩衝剤は、酢酸塩、ホウ酸塩、クエン酸塩、リン酸塩、重炭酸塩、またはトリス−ＨＣｌなどの従来の緩衝剤であり得る。緩衝酢酸溶液は約ｐＨ４−５．５であり得、Ｔｒｉｓバッファーは約ｐＨ７−８．５であり得る。
【０１１９】
デングウイルスを含む組成物が本明細書で提供され、ここで、上記組成物は、液体形態、凍結乾燥された形態あるいは冷凍乾燥された形態であり、１以上のリオプロテクタント、添加剤、界面活性剤、高分子量構造の添加物、および／または増量剤を含み得る。いくつかの例では、リオプロテクタントが含まれており、それは、スクロース、ラクトース、またはトレハロースなどの非還元糖である。一般に含まれるリオプロテクタントの量は、再構成時に、高張性またはわずかに低張性の製剤も適切ではあるが、結果として生じる製剤が等張性になるような量である。加えて、上記リオプロテクタントの量は、凍結乾燥時のタンパク質の許容しがたい量の分解および／または凝集を防ぐのに十分でなければならない。あらかじめ凍結乾燥された製剤中の糖（例えばスクロース、ラクトース、トレハロース）の典型的なリオプロテクタント濃度は、約１０ｍＭ〜約４００ｍＭである。
【０１２０】
本明細書で開示されるデングウイルスを含む、注射または注入に適した組成物が本明細書で提供される。典型的な組成物は、熟練の作業員に利用可能な任意の経路、例えば、関節内、皮下、腫瘍内、静脈内、筋肉内、腹腔内、大脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、または損傷内の経路による動物への注射または注入に適している。非経口製剤は、典型的に、随意に薬学的に許容可能な防腐剤を含有している、無菌の、パイロジェンを含まない、等張性水溶液になる。
【０１２１】
本明細書に記載されるデングウイルスを含む医薬組成物、および非水溶媒が本明細書で提供される。非水溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機酸エステルである。水性担体は、水、アルコール／水溶液、塩性媒体および緩衝媒体を含むエマルジョンまたは懸濁液を含んでいる。非経口ビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースと塩化ナトリウム、乳酸リンゲルまたは固定油を含んでいる。静脈内のビヒクルは、流体と栄養素の補給物、リンゲルデキストロースに基づくものなどの電解質補充薬を含んでいる。保存剤および他の添加剤、例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなども存在することがある。
【０１２２】
本明細書に記載されるデングウイルスを含む医薬組成物が本明細書で提供され、ここで、上記医薬組成物は、例えば、乾燥粉末などとして、吸入のために製剤化される。適切なおよび／または好ましい医薬製剤は、意図した投与経路、送達フォーマット、および望ましい投与量に依存して、本開示と製剤技術の一般的な知識とを考慮して決定されてもよい。投与の方法にかかわらず、有効量は患者の体重、体表面積、または臓器のサイズによって計算されることがある。本明細書に記載される製剤の各々を含む処置に適切な投与量を決定するための計算のさらなる改良は、当該技術分野で日常的になされ、当該技術分野で日常的に行なわれる作業の範囲内である。適切な投与量は適切な用量反応データを使用して確認されてもよい。
【実施例】
【０１２３】
＜実施例１＞マウス樹状細胞（ＤＣ）の生成およびパルス化
【０１２４】
Ｌｕｔｚ  Ｍ．，  ｅｔ．  ａｌ．  （Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２２３：７７−９２，  １９９９）で記載される方法が、マウスの骨髄から成熟したＤＣを生成するために使用された。骨髄懸濁液を、組み換えマウスＧＭ−ＣＳＦで捕捉された培地中のペトリ皿において１０日間インキュベートした。非付着細胞を、ＧＭ−ＣＳＦおよびリポ多糖類を含む培地において、収集し、遠心分離機にかけ、および再懸濁した。２日後にＤＣを採取し、それらの増殖力をトリパンブルー色素排除によって測定した。ＤＣの純度をフローサイトメトリー分析によって測定した。ＤＣを、１８時間にわたって１０μｇ／ｍｌの合成ペプチドとともにパルス化した。１８時間のインキュベーション後、ＤＣを採取し、ＨＢＳＳにおいて２回洗浄し、およびさらなる分析のためにＨＥＳＳにおいて再懸濁した（実施例２および３を参照）。
【０１２５】
＜実施例２＞第１のマウスモデルにおける黒色腫の処置のためのデングウイルスおよび樹状細胞
マウスモデル分析を実施して、デングウイルス（ＤＶ）株を使用した癌細胞の標的化と、腫瘍抗原で刺激された樹状細胞（ＤＣ）を使用した癌細胞の標的化との組み合わせからの結果を観察した。ＤＶ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、尾の付け根への注射によって、１ｘ１０６または１ｘ１０７ｐｆｕ／ｍｌで、０．０５ｍｌのデングウイルス（ＤＥＮ−２株＃１７１０）を接種した。デングウイルス（ＤＥＮ−２株  ＃１７１０、ＣＤＣデータベースエントリーＮｏ．５５５、Ｄｒ．  Ｄｕａｎｅ  Ｇｕｂｌｅｒにより提供される）の投与に続いて、５、１０、１５、２０日目に、２，０００（ｒＩＬ−２）および５００  １Ｕ（ｒＩＦＮガンマ）で、組み換えマウスのＩＬ−２（Ｇｅｎｚｙｍｅ）およびＩＦＮガンマ（Ｓｉｇｍａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を、静脈注射によって投与した。上記デングウイルスの投与から７日後に、２つのペプチドで別々にインキュベートされて静脈内に注射されるマウスＤＣで、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを免疫化した。ペプチドが合成された。オバルブミン（ＯＶＡ−８）からのＨ−２ｂ拘束性ペプチド（ＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７）を対照として使用した。抗原ｇｐ１００／ｐｍｅ１１７（ＥＧＳＲＮＱＤＷＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １））およびＴＲＰ−１／７５（ＴＡＹＲＹＨＬＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２））に由来するＢ１６黒色腫関連Ｈ−２ｂ制限ペプチドを、マウスＤＣをパルス化するために使用した（詳細に関しては実施例１を参照）。ＤＣを用いる２回のさらなる免疫化を、１４日の間隔で実施した。最後のＤＣの注入から３日後に、マウスに、５ｘ１０４の生存可能なＢ１６黒色腫細胞を外側尾静脈の静脈内に投与し、次に、生存率を追跡し、それを、腫瘍注入後に経時的（数日）に残存する動物の割合として記録した。データは５匹以上のマウス／群から記録された（表５および図２を参照）。
【０１２６】
【表５】
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【０１２７】
群２（デングウイルス血清型２  株＃１７１０および腫瘍ペプチドで刺激されたＤＣ）中の投与されたマウスにおいて観察された肺転移の数は、デングウイルスなしで、腫瘍ペプチドで刺激されたＤＣが投与された群１中の対照マウスよりも７．５％少なかった。
【０１２８】
＜実施例３＞第２のマウスにおける黒色腫の処置のためのデングウイルスおよび樹状細胞モデル
マウスモデル分析を実施して、デングウイルス（ＤＶ）株、および腫瘍抗原で刺激されたＤＣを使用した癌細胞を標的とする組み合わせからの結果を観察した。ヒトにおいて観察されるＤＶに対する応答に匹敵するように、マウスにサイトカインを投与した。
【０１２９】
Ｈ−２ｂ−拘束性Ｂ１６マウス黒色腫細胞株（ＡＴＣＣ  ＃ＣＲＬ−６３２２）を使用して、腫瘍をマウス内で樹立した。樹状細胞のパルス化のために使用されるペプチド（抗原ｇｐ１００／ｐｍｅ１１７およびＴＲＰ−１／ｇｐ７５に由来するＢ１６黒色腫関連Ｈ−２ｂ拘束性ペプチド）を合成した。Ｌｕｔｚ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２２３：７７−９２，  １９９９）に記載される方法に従って、樹状細胞をマウスの骨髄から生成した。
【０１３０】
０日目に、転移性肺腫瘍を確立するために、マウスは、５ｘ１０４の生存可能なＢ１６黒色腫細胞を外側尾静脈において受け取った。７日目に、尾の付け根に注射することによって、１ｘ１０６あるいは１ｘ１０７ｐｆｕ／ｍｌで０．０５ｍｌのデングウイルス（ＤＥＮ−２株＃１７１０、ＣＤＣデータベースエントリーＮｏ．５５５）を、マウスに接種した。デングウイルス（ＤＥＮ−２  株＃１７１０）の投与後、５日間の間隔で、２，０００  １Ｕ（ｒＩＬ−２）および５００  １Ｕ（ｒＩＦＮガンマ）で、組み換えマウスＩＬ−２（Ｇｅｎｚｙｍｅ）およびＩＦＮガンマ（Ｓｉｇｍａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を静脈注射によって投与した。２１、３５、および４９日目に、マウスＤＣを２つのペプチドで別々にインキュベートし、被験体の投与経路および投与スケジュールと一致させるために、同じ日に２回の連続投与で静脈内に注射した（追加の詳細に関しては実施例２を参照）。マウスの対照群は、デングウイルス、あるいはオバルブミン（ＯＶＡ−８）、ＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７）に由来するＨ−２ｂ拘束性ペプチドでパルス化された樹状細胞を受け取らなかった。処置および対照群は表６に示される。
【０１３１】
【表６】
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【０１３２】
９０日目に動物を屠殺し、肺腫瘍のコロニーを数えた。Ｆｅｋｅｔｔｅ溶液（Ｆｅｋｅｔｔｅ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を肺に注入し固定した後に、転移性肺腫瘍を盲検コード式で数え上げた。データは転移の平均数として報告された；４匹のマウス／群（表７および図３を参照）。以下の主要な臓器系の病理組織診断を実施した：脳、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓および生殖腺（データは示さず）。
【０１３３】
【表７−１】
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【０１３４】
【表７−２】
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【０１３５】
群Ｃ（腫瘍抗原で刺激されたＤＣが投与され、ウイルスは投与されなかった）中のマウスにおいて観察された肺転移の数は、対照群Ｄ（ＤＥＮＶ−２  ＃１７１０および対照ペプチドにさらされたＤＣが投与された）よりも４７％少なかった。群Ａ（ＤＥＮＶ−２  ＃１７１０および腫瘍抗原で刺激されたＤＣが投与された）中のマウスにおいて観察された肺転移の数は、対照群Ｄ（ＤＥＮＶ−２  ＃１７１０および対照ペプチドにさらされたＤＣ）よりも５４％少なかった。群Ｂ（ＤＥＮＶ−２  ＃１７１０および腫瘍抗原で刺激されたＤＣが投与された）中のマウスにおいて観察された肺転移の数は、対照群Ｄ（ＤＥＮＶ−２  ＃１７１０および対照ペプチドにさらされたＤＣ）よりも５１％少なかった。群Ｄと比較された群ＡおよびＢにおける平均減少は、５２．８％であった。
【０１３６】
＜実施例４＞デングウイルスの生産およびスクリーニング
ベロ（アフリカミドリザル腎臓細胞）に由来する、検証および承認された細胞株を備えたマスターセルバンクを生成し、いかなる汚染物質および外来生物も存在しないことを試験した。ベロ株は様々なウイルスのワクチンを生産するために世界保健機関によって使用されている。デングウイルスは、ＦＤＡバイオロジクスセンター（ＣＢＥＲ）によって確立されたガイドラインに従って、マスターセルバンクからの検証されたベロ株で継代され、ワーキングセルバンクとして確立された。最初の原種に由来する２つのデングウイルス２型株（ＤＮＶ−２  ＃１５８４およびＤＥＮＶ−２  ＃１７１０）を、１０−５のＭＯＩでＷＣＢのベロ細胞に加えた。
【０１３７】
第１の４ｍｌの重層培地−−栄養培地（０．１６５％のラクトアルブミン加水分解物［Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｄｅｔｒｏｉｔ，  Ｍｉｃｈ．］）中の１％のＳｅａＫｅｍ  ＬＥアガロース（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ，  Ｍａｉｎｅ）、０．０３３％の酵母抽出物［Ｄｉｆｃｏ］、アール平衡塩類溶液、２５ｍｇのゲンタマイシン硫酸塩［ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，  Ｍｄ．］、および１．０ｍｇのアムホテリシンＢ［ファンギゾン；Ｅ．  Ｒ．  Ｓｑｕｉｂｂ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，  Ｎ．Ｊ．］、リットル当たり、２％のＦＢＳ）を含む−−を、２００ｍｌのウイルスの接種材料の吸着後に、３７°Ｃで１．５時間にわたって加えた。３７°Ｃでの７日間のインキュベーションに続いて、１ｍｌ当たり追加の８０ｍｇのニュートラルレッド生体染色法（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  Ｍｄ．）を含有する第２の２ｍｌの重層培地を加えた。感染後８〜１１日にプラークを数えた。
【０１３８】
プラークアッセイを最終のウイルス培養上で実施した。ＤＮＶ−２  ＃１５８４の力価はおよそ５Ｅの＋０６ＰＦＵ／ｍｌであり、ＤＥＮＶ−２  ＃１７１０の力価は、プラークアッセイから評価されるように、３．５Ｅ＋０６ｐｆｕ／ｍＬであった。ＡＴＣＣからのデングウイルス２（ＤＮＶ−２；＃１５８４）は、感染後５日目のベロ細胞において明らかな細胞変性効果を示したが、ベロ細胞は盲継代＃２（＃１７１０ウイルス）の感染後１１日目に形態変化を有するように見受けられる。（データは示さず。）ＤＥＮＶ−２  ＃１７１０ウイルスは、ＤＮＶ−２  ＃１５８４株ほど細胞変性でないことが示された。
【０１３９】
＜実施例５＞パルス化されたＤＶを用いた、またはＤＶを用いない、癌を殺すアッセイ
対照群では、正常ヒト腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を、ヒトの黒色腫ＦＥＭＸ細胞に直接適用した。Ｔ細胞受容体はＨＬＡ  Ａ２．１＋によってＦＥＭＸ黒色腫細胞株と一致した。処置群では、ヒトのＴＩＬをインターフェロンおよびインターロイキンを含むＤＶ上清にさらした。さらしたＴＩＬ＋ＤＶ上清を、ＦＥＭＸ腫瘍細胞を有する培養液中に置いた。両方の群を、腫瘍細胞に対して５対１のＴ細胞（１００，０００の細胞対２０，０００の細胞）の比率で４時間、癌細胞を殺すために放置した。その後、残存する腫瘍細胞を、フローサイトメトリーによって開始細胞の％として数えた。表８に示される結果は、ＤＶが、パルス化されたＤＣ抗癌応答を越えて、３５％の追加の癌細胞死滅を誘発することを実証する。
【０１４０】
【表８】
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【０１４１】
以下の例は、純粋な単離ＣＤ１４＋単球に由来する高レベルのヒトＩＬ−１２ｐ７０を発現する非常に純粋なＣＤ１１ａ＋成熟ＤＣの集団の生成、ならびに黒色腫細胞溶解物でのＤＣの刺激を実証し、全プロセスは１週間未満で完了する。細胞は硬いプラスチックのプレート上で培養され、柔らかいビニール袋にはさらされなかった。
【０１４２】
ＣＤ１４＋単球を単離して、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ４５および７ＡＡＤの発現について分析した。ｐｒｏｄｉｇｙ実行後、入力細胞の９０．２５％はＣＤ１４＋であった（図４を参照）。プレーティング後に、ＣＤ１４＋細胞をＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４で２４時間処理し、未成熟の樹状細胞を生成した。ｐｒｏｄｉｇｙ実行日に到着したプロビデンス癌研究センターからのＦＥＭＸ黒色腫細胞を、再懸濁し、数えて、プレーティングした。その後、黒色腫細胞を次亜塩素酸カルシウム溶液で処理した。あるいは、細胞を亜塩素酸ナトリウム溶液で処理した。黒色腫細胞溶解物を未成熟のＤＣに加え、ならびに、成熟化剤ＩＦＮガンマ（１０００Ｕ／ｍＬ）、Ｒ８４８（５μｇ／ｍＬ）、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍＬ）、およびＣＤ４０Ｌ（１マイクログラム／ｍＬ）を加た。タイミングの点においては、ＬＰＳを初期に投与し、ＩＦＮガンマおよびＲ８４８を続いて投与した。ＣＤ４０Ｌを成熟プロセスの最後に投与した。
【０１４３】
黒色腫細胞溶解物とともにパルス化してから２２時間後、および成熟化剤を加えてから１８時間後に、マイコプラズマおよびエンドトキシン試験のために、成熟したＤＣからの上清を収集した。生物あるいは増殖は観察されなかった。さらに、ＥＬＩＳＡを使用して、ＤＣ培地上清の１３の希釈物を使用したＤＣの潜在能力の指標である、ＩＬ−１２ｐ７０レベルについて試験した。ＩＬ−１２ｐ７０の濃度は、４−６ｎｇ／ｍＬの業界基準とは対照的に、１９＋／−４ｎｇ／ｍＬであった。図５は、いくつかのコンパレータの生成と比較したＤＣ  ＩＬ−１２ｐ７０生成を示す。これらのコンパレータの方法は、柔らかいビニール袋に細胞をさらし、亜塩素酸塩溶液以外の溶液で細胞を溶解する工程を含み、および細胞を成熟させるためにＬＰＳ、ＩＦＮガンマ、およびＲ８４８の組み合わせを使用しない。ＨＯＣＬ粉末の代わりにＨＯＣＬ溶液を溶解工程に使用した反復実験により、２９ｎｇ／ｍＬもの高いＩＬ−１２ｐ７０の濃度を得た。
【０１４４】
細胞をさらに凍結し、その後、４°Ｃで凍結融解した後に、細胞数および生存率を試験した。これらを、解凍開始後およそ１６時間、１８時間、２０時間、および２２時間で測定した。非パルス化ＤＣの過剰な採取を低温保存研究で試験し、業界基準の７０％の生存率より多い８０％の生存率を示した。低温保存前の生存率は８５〜８９％の範囲であった。
【０１４５】
＜実施例７＞デングウイルスを有するヒトの白血球におけるサイトカインの誘発
単球、樹状細胞、およびＴリンパ球を含むヒトの白血球（ＷＢＣ）を、３つの異なる感染多重度（ＭＯＩ）、０．１のＭＯＩ、０．５のＭＯＩ、および２のＭＯＩで、時間＝０で、模擬ウイルスあるいはデングウイルス（ＤＥＮＶ−２  ＃１７１０）のいずれかに感染させた。様々なサイトカインのレベル（ｐｇ／ｍＬ）を、感染後４８時間、７２時間、９６時間で測定した。処置を３回繰り返して実施した。各時点での結果が表９〜１２に示される。（Ｍ＝模擬。０．１、０．５および２はＭＯＩである）。試験されたＭＯＩでの模擬ウイルスとデングウイルスとの間の変化の３回の平均が計算され、表９においてパーセンテージとして示される。この実験および反復実験は、模擬ウイルスと比較して、ＤＶがＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−７およびＩＰ−１０などのサイトカインの７０％〜４０００％の増加を引き起こすことを実証する。
【０１４６】
【表９−１】
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【０１４７】
【表９−２】
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【０１４８】
【表１０−１】
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【０１４９】
【表１０−２】
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【０１５０】
【表１１−１】
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【０１５１】
【表１１−２】
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【０１５２】
【表１２−１】
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【０１５３】
【表１２−２】
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【０１５４】
＜実施例８＞追加のウイルス生産プロトコル
実施例４の方法に加えて、ベロ細胞およびＦＲｈＬ細胞の両方を、それぞれ盲継代＃２、ＤＥＮＶ−２  ＃１７１０、ＤＮＶ−２  ＃１５８４、および４５ＡＺ５からの上清の希釈液を使用して感染させる。検出感度を増加させるために、蛍光免疫染色を開発して、盲継代＃２からの上清に感染した細胞中のウイルスを検出する。
【０１５５】
必要に応じて、ウイルスを濃縮するために超遠心分離法を使用する。ウイルス力価の確認に続いて、最終生産物を濾過してあらゆる細胞残屑を除去し、外来生物がないことを試験し、および、最終ロットがリリースされると、５ｍｌのボトルに詰めて出荷および投与の準備ができるまで４°Ｃで保管する。
【０１５６】
＜実施例９＞ドナーからのＰＢＭＣの採取
ドナー（自己由来か、ＨＬＡが一致する同種異系間）は、訓練された人員および適切な設備を備えた施設で白血球除去血手術を受けた。アフェレーシスの完了後、赤血球、血小板、および血漿タンパク質がドナーに戻される。アフェレーシス産物は、細菌汚染の存在に関してその部位で試験される（グラム染色試験およびリムルスアメーバ溶解［ＬＡＬ］）。合格後、収集容器（小さな検査サンプル容器が取り付けられた）はドナー固有情報を有するバーコードが付けられ、および無感染の生体物質の保管および出荷に関してＦＤＡおよびＤＯＴ規制の両方に適合する承認済み運送容器に入れられる。上記運送容器は、冷却要素（例えば、固形のＣＯ２、液体のＮ２）、および温度モニタと共に包装される。上記運送容器は硬いプラスチックフラスコである。宅配便業者は上記容器をＧＭＰ生産施設に２４時間以内に輸送する。
【０１５７】
＜実施例１０＞腫瘍抗原でパルス化された樹状細胞の生産および使用
他の採取された白血球（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、好酸球、および好塩基球）から単球を分離する。これは、免疫磁気選択あるいは付着特性により達成され得る。免疫磁気選択は、免疫細胞ＣＤ表面タンパク質に対する抗体でコーティングされたプラスチックビーズを有する無菌のプラスチックカラムに白血球を注ぐことを含む：（ＣＤ４／ＣＤ８／ＣＤ５６など）。
【０１５８】
免疫磁気選択の一例は、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，  Ｂ．Ｃ，  Ｃａｎａｄａ，  ｗｗｗ．ｓｔｅｍｃｅｌｌ．ｃｏｍ）から利用可能な  ＥａｓｙＳｅｐ  Ｍｏｎｏｃｙｔｅ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔキットである。ＥａｓｙＳｅｐキットを使用するために、アフェレーシス産物を無菌のＰＢＳ中で懸濁し、ヒトのＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ５６、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ１２３、およびグリコホリンＡに対するマウス抗体を有する四量体抗体の複合体を含むＥａｓｙＳｅｐのプラスチックカラムへと注ぐ。１０分間のインキュベーション後、ＥａｓｙＳｅｐ磁性粒子を加える。ビーズに付着する細胞は電磁石選別を除外した。磁石を反転させ、所望の細胞分画（単球）を、追加の処理のために無菌のポリスチレンフラスコへと注ぐ。あるいは、陽性の付着選別アッセイにおいて、ＣＤ１＋／ＣＤ１４＋抗体でコーティングされた磁気ビーズを単球と混合し、磁石をカラムに対して配置し、非結合細胞をＰＢＳ溶液でカラムから流し出す。その後、単球をビーズから洗い流す。陽性の付着選別において、特定の表面に付く単球の特性を利用して、傾斜させたカラムにアフェレーシス産物を流すことにより単球を分離する。
【０１５９】
あるいは、ＣＤ３、ＣＤ４および、ＣＤ８に対するモノクローナル抗体を用いた蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって、骨髄細胞はリンパ球およびＭＨＣクラス陽性細胞が枯渇する。残りの細胞を、ヒトのＡＢ血清で補足された基底細胞培地において、５％のＣＯ２雰囲気下で３７°Ｃで夜通し培養する。ヒトのＡＢ血清が選ばれるのは、それが他の血清型より早く細胞を成長させ、かつ無血清培地は非常に低いＴ細胞刺激能力を有するＤＣを生産するからである。２４時間後、上記細胞を、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）および９００Ｕ／ｍｌの組み換えＩＬ−４の存在下で培養する。３〜４日後に、培地を新鮮なサイトカイン培地と交換する。
【０１６０】
あるいは、皮膚の樹状細胞（ＤＤＣ）を以下の方法を用いて準備する：健康な人間ボランティアからの角膜片（ｋｅｒａｔｏｍｅｓ）を、ＲＰＭＩ  １６４０の中の１．２Ｕ／ｍｌの最終濃度で、細菌プロテアーゼディスパーゼ２型の溶液において、３７°Ｃで１時間インキュベートする。インキュベーション後、表皮と真皮が容易に分離される。その後、表皮と真皮のシートを、ＰＢＳで数回洗浄した後に小さな（１−１０ｍｍ）片にカットし、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）で補足されたＲＰＭＩ  １６４０に入れて、１０ｃｍの組織培養プレートに置いた。２〜３日後に、組織の片を取り除いて、上記培地を収集した。組織切片から上記培地中へと移動した細胞を遠心沈殿させ、１〜２ｍｌの新鮮な培地において再懸濁し、トリパンブルーで染色する。メトリザマイド勾配での分離によってさらに濃縮される。細胞を高張性１４．５％のメトリザマイドの３ｍｌのカラム上に重ねて、室温で１０分間６５０ｇで沈殿させる。低密度の間期細胞を収集し、それほど高張性でない洗浄剤（１０％のＦＢＳおよび４０ｍＭのＮａＣｌを有するＲＰＭＩ  １６４０）で２回連続して洗浄することにより、細胞を等張性に戻す。
【０１６１】
単球を収集すると、数千にしかならない場合もある。組み換えヒト成長因子ｒｈｕＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−４（ＩＬ−４）、およびｒｈｕＧｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−マクロファージ−コロニー刺激要因（ＧＭ−ＣＳＦ）は、５０００万の範囲までＤＣの数を拡大するため、マルチステッププロトコルにおいて使用される。ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦの添加後、数の拡大および成熟したＤＣのマーカーの発生：（ＣＤ１１＋、ＣＤ８０＋、ＣＤ８３＋）について、ならびに、クラスＩ（ＣＤ８＋への短いペプチドの提示のため）およびクラスＩＩ（ＣＤ４＋ヘルパーインデューサ−Ｔリンパ球へのより長いペプチドの提示のため）両方のＭＨＣ複合体の発現の増加について、細胞を評価する。およそ３〜４日後に、成熟したＤＣの数を測定する。例えば、単球濃縮画分を、ＮｕｃｌｏｎでコーティングされたＣｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｙ（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）内に置き、ＧＭＰ−２％のヒトのＡＢ血清、５００ＩＵ／ｍｌ（およそ５０ｎｇ／ｍｌ）のｒｈｕＩＬ−４（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）、５００ＩＵ／ｍｌ（およそ５０ｎｇ／ｍｌ）のｒｈｕＧＭ−ＣＳＦ（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）で補足された無血清ＤＣ培地（ＣｅｌｌＧｒｏ，  Ｉｎｃ．）を最初の２４時間後に加えた。最終生産物はおよそ１Ｌの総培地量である。約７２時間の培養後に、未成熟のＤＣの集団を以下のマーカーについて評価する：ＣＤ１＋ＣＤ１１＋ＣＤ１４＋。
【０１６２】
＜実施例１１＞樹状細胞のパルス化
様々な腫瘍抗原源が高品質のＤＣに使用される：ペプチド、自己由来の腫瘍からの溶解物、全腫瘍細胞、および特定の腫瘍抗原をコードするＲＮＡ。白血病細胞またはリンパ腫細胞を含む摘出生検あるいは血液サンプルを手術か採血によって得て、その後、白血病／リンパ腫細胞を得るために磁気選択を行う。一旦腫瘍細胞が得られると、それらは、バーコードを付けられ、アフェレーシスについて前述されたものと同様の認証済みの容器に入れてＧＭＰ施設に送られる。サンプルは、細菌汚染試験を合格した後、−７０°Ｃで冷凍されてもよい。
【０１６３】
全自己由来の腫瘍細胞溶解物を、いくつかの方法によって調製する。溶解物を調製するために、腫瘍サンプルを、水浴あるいは他の手順を使用して、およそ３５°Ｃに再び暖めてもよい。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳシステムなどの自動細胞プロセッサーの開発により、サンプルを手動で刻み、ＰＢＳ溶液中で懸濁させることが可能となり、次に、あらかじめ選択された組織に特有のソフトウェアで制御されたローターシステムが腫瘍細胞を分離する。細胞を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ解離装置（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ）に移す前に、酵素混合物に加える。次亜塩素酸塩溶液を使用して腫瘍ペプチドへの損害を最小にしたまま単細胞懸濁液を細胞膜溶解することができ、これにより、任意の残存腫瘍細胞を殺し、ｄＴＨ２サイトカインを中和し、優れたＣＴＬの親和性、結合力、および活性化のために免疫原性を増加させる。次亜塩素酸塩を加えた後に、培養プレートを、摂氏３７°Ｃ、５％のＣＯ２で１時間インキュベートし、３０分で、穏やかに手動撹拌して次亜塩素酸塩を分散させる。細胞を２回洗浄して溶解反応を中和する（例えば、ＨＢＳＳを使用して）。次亜塩素酸塩で処理した細胞を、後の凍結融解サイクルにさらすこともある。あるいは、サンプルは腫瘍細胞を分離しない。代わりに、サンプルは腫瘍細胞および支持細胞（例えば、腫瘍微環境からの細胞）を含むように残される。細胞を次亜塩素酸カルシウムで溶解して、赤血球を取り除き、および、ＣＴＬ誘導に必要なペプチドを破壊することなく、アポトーシス小体および壊死体を生成する。
【０１６４】
未成熟のＤＣの生成３日目にＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳからの溶解物を加える。未成熟のＤＣを約１６時間、腫瘍溶解物と共培養する。最終工程は炎症性シグナルによる成熟である。臨床グレードＬＰＳ（６０ＥＵ／ｍｌ）（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）、およびインターフェロンガンマ（２０００年ＩＵ／ｍｌ、およそ１００ｎｇ／ｍｌ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）をフラスコに加え、およそ１２時間インキュベートして、パルス化されたＤＣを成熟させる。ＬＰＳへの暴露後、ＤＣをＣＤ８０／ＣＤ８３＋活性化マーカーのアップレギュレーション、およびＩＬ−１２ｐ７０の生産の増加について評価する。プロセスにおいて、この段階での試験には、無菌性（前述される通り）、生存率（トリパンブルー色素排除による％生細胞）、および特異性（ＣＤ１１ｃフローサイトメトリーによって測定された％ＤＣ）が含まれる。
【０１６５】
最終的な無菌性、特異性、および生存率の試験後、ＤＣが、気相Ｎ２で、−１３０°Ｃで凍結するのに適した硬いプラスチック容器に移され、最大１年間保管され、使用のために病院へと送られる。上記容器を夜通し凍結して輸送され、その後、３０分にわたる同時的な０．９％のＮａＣｌ溶液の静脈内投与の前に、乾燥槽において３７°Ｃに再び暖められる。
【０１６６】
＜実施例１２＞癌の処置のための併用送達
デングウイルスの投与は他のウイルスのワクチン注射剤の投与に似ている。被験体の肩（三角筋）領域の皮膚の領域をアルコールで清潔にし、次に、蚊咬傷を模倣するために０．５ｍｌのウイルスを皮膚下に注射する。ＤＶ注射から２−３日後に、被験体の熱が３８．５°Ｃに到達すると、被験体にパルス化された（刺激された）樹状細胞をリンパ管内のマイクロカテーテルによって注入する。被験体が疾病に陰性になるまで、注射を繰り返す。この例におけるＤＶ株は、ＤＥＮＶ−１  ＃４５ＡＺ５あるいはＤＥＮＶ−２  ＃１７１０である。ＤＣの注射剤は実施例６において生産される細胞を使用する。
【０１６７】
＜実施例１３＞癌細胞株におけるデングウイルス細胞毒性の分析
２つの異なる癌細胞株であるＦＥＭＸおよび６２４．２８をそれぞれ、ＤＶ上清（ＭＯＩ２）の存在下あるいは不在下のいずれにおいてＣＴＬで別々に６時間共培養し、および、条件の各セットの細胞死をＬＤＨ遊離アッセイ（ＬＤＨ  ｒｅｌｅａｓｅ  ａｓｓａｙ）を使用して定量化する。実施例７で記載される方法で、ＷＢＣをデングウイルスに感染させた後に、ＤＶ上清を得た。ＤＶ上清は、ＣＴＬがＦＥＭＸ細胞を殺す能力をほとんど２倍にした：ＦＥＭＸ細胞の５１％が模擬上清の存在下でＣＴＬによって殺され、ＦＥＭＸ細胞の９１％がＤＶ上清の存在下でＣＴＬによって殺された。ＤＶ上清は、６２４．２８細胞を殺すＣＴＬの能力を劇的に増加させた：６２４．２８細胞の５％は模擬上清の存在下でＣＴＬによって殺され、６２４．２８細胞の５１％がＤＶ上清の存在下でＣＴＬによって殺された。図６および図７を参照する。
【０１６８】
＜実施例１４＞癌細胞を標的化するナチュラルキラー細胞のデングウイルス活性化の分析
この業界でのナチュラルキラー細胞死滅のためのベンチマークはＫ５６２腫瘍である。なぜなら、これは一致した非抗原であるためである。デングウイルス処置は、ナチュラルキラー細胞を刺激して、Ｋ５６２の約１００％を殺すことが示された（データは示さず）。
【０１６９】
ＦＥＭＸおよび６２４．２８の腫瘍は、通常、ナチュラルキラー細胞にとって殺すのがはるかに難しい。６２４．２８細胞は、高ＨＬＡを有する進行した癌における黒色腫細胞の代表であり、ＣＴＬ攻撃によって殺される。ＦＥＭＸ細胞はＨＬＡ  Ａ２の正常な発現を有する黒色腫細胞であり、それは、ＮＫ−９２細胞による溶解への抑制剤である。したがって、ＦＥＭＸ細胞はＮＫ攻撃に耐性があると予想される。
【０１７０】
ＦＥＭＸおよび６２４．２８の癌細胞株をそれぞれ、ＤＶ上清の存在下あるいは不在下のいずれかにおいて、ナチュラルキラー細胞で別々に共培養し、および、細胞死を各条件下で定量化した。デングウイルスは、癌細胞を枯渇させるナチュラルキラー細胞の能力を２倍にし、１０時間以内に＞８５％の破壊をもたらした。さらに、ＤＶと樹状細胞の組み合わせは、１０時間以内に９０％を超える死滅率をもたらした。図８および図９を参照する。
【０１７１】
６２４．２８細胞およびＦＥＭＸ細胞に対するＤＶで活性化されたＮＫの高い溶解が観察された。ナチュラルキラー細胞は、模擬上清の存在下で６２４．２８細胞の３３％を殺し、ＤＶ上清の存在下で６２４．２８細胞の８６％を殺した。ナチュラルキラー細胞は、ＤＶ上清の存在下でＦＥＭＸ細胞の４８％を殺し、模擬上清の存在下でＦＥＭＸ細胞の８８％を殺した。
【０１７２】
＜実施例１５＞ＷＢＣからのデングウイルス誘導上清
実施例７で記載されるように、ＷＢＣをデングウイルスに感染させた後にＤＶ上清を得た。黒色腫６２４．２８細胞株をＤＶ上清（ＭＯＩ２）のみに６時間さらし、細胞毒性を測定した。対照として、６２４．２８細胞を細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）のみ、あるいは模擬ウイルス上清にさらした。図１０は実験の結果を示す。ＤＶ上清での６２４．２８細胞の処置は、ＤＶ上清のみで約６６％の細胞死をもたらした。
【０１７３】
＜実施例１６＞黒色腫の処置のためのデングウイルスおよび樹状細胞
デングウイルス（ＤＶ）株（ＤＥＮＶ−２  ＃１７１０あるいはＤＥＮＶ−１  ＃４５ＡＺ５）および腫瘍抗原で刺激された樹状細胞（ＤＣ）のマウスモデルを実行する。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、尾静脈注射によって１ｘ１０６あるいは１ｘ１０７ｐｆｕ／ｍｌで０．０５ｍｌのＤＶを接種する。ＤＶの投与後５、１０、１５、および２０日目に、組換えマウスＩＬ−２（Ｇｅｎｚｙｍｅ）およびＩＦＮ−ガンマ（Ｓｉｇｍａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を、２，０００（ｒＩＬ−２）および５００  １Ｕ（ｒＩＦＮ−ガンマ）で静脈注射によって投与する。ＤＶ投与後７日目に、２つのペプチドで別々にインキュベートされて静脈内に注射されるマウスＤＣで、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを免疫化する。ペプチドを合成した。オバルブミン（ＯＶＡ−８）からのＨ−２ｂ拘束性ペプチド（ＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７）を対照として使用する。抗原ｇｐ１００／ｐｍｅ１１７（ＥＧＳＲＮＱＤＷＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １））およびＴＲＰ−１／７５（ＴＡＹＲＹＨＬＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２））に由来するＢ１６黒色腫関連Ｈ−２ｂ拘束性ペプチドを、マウスＤＣをパルス化するために使用する（詳細に関しては実施例１を参照）。ＤＣでの２回の追加の免疫化を１４日の間隔で実施した。最後のＤＣ注入の３日後に、マウスに５ｘ１０４生存可能なＢ１６黒色腫細胞を外側尾静脈の静脈内に投与し、その後、生存率を追跡し、それを、腫瘍注入後に経時的（数日）に残存する動物の割合として記録する。
【０１７４】
本発明の好ましい実施形態が本明細書で示され記載されてきたが、こうした実施形態がほんの一例として提供されているに過ぎないということは当業者にとって明白である。多数の変形、変更、および置き換えは、本発明から逸脱することなく、当業者によって現在想到されるものである。本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代案が、本発明の実施において利用されるかもしれないことを理解されたい。以下の特許請求の範囲は本発明の範囲を定義するものであり、この特許請求の範囲およびその同等物の範囲内の方法および構造は、それにより包含されることが、意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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