(57)【要約】  本発明は、概して、（ａ）少なくとも５０ｍｇ／ｍＬのヘモペキシン含有量と；（ｂ）少なくとも１５ｍＭのリン酸緩衝液と；（ｃ）ｐＨ５．８〜８と；（ｄ）少なくとも５０ｍＭの塩化ナトリウムとを含む、精製ヘモペキシンの安定な液体製剤、およびその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
精製ヘモペキシンの安定な液体製剤であって、
（ａ）少なくとも５０ｍｇ／ｍＬのヘモペキシン含有量と；
（ｂ）少なくとも１５ｍＭのリン酸緩衝液と；
（ｃ）ｐＨ５．８〜８と；
（ｄ）少なくとも５０ｍＭの塩化ナトリウムと
を含む、前記精製ヘモペキシンの安定な液体製剤。
【請求項２】
７５ｍｇ／ｍＬ〜３００ｍｇ／ｍＬのヘモペキシンを含む、請求項１に記載の安定な液体製剤。
【請求項３】
１００ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬのヘモペキシンを含む、請求項２に記載の安定な液体製剤。
【請求項４】
２００ｍｇ／ｍＬ〜３００ｍｇ／ｍＬのヘモペキシンを含む、請求項２に記載の安定な液体製剤。
【請求項５】
２００ｍｇ／ｍＬのヘモペキシンを含む、請求項２に記載の安定な液体製剤。
【請求項６】
２５０ｍｇ／ｍＬのヘモペキシンを含む、請求項２に記載の安定な液体製剤。
【請求項７】
３００ｍｇ／ｍＬのヘモペキシンを含む、請求項２に記載の安定な液体製剤。
【請求項８】
少なくとも１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の安定な液体製剤。
【請求項９】
リン酸緩衝液はリン酸ナトリウム、リン酸カリウムおよびクエン酸塩リン酸塩からなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の安定な液体製剤。
【請求項１０】
リン酸緩衝液はクエン酸塩リン酸塩である、請求項９に記載の安定な液体製剤。
【請求項１１】
１５ｍＭ〜２００ｍＭのクエン酸塩リン酸塩と、
１５０ｍＭ〜４００ｍＭの塩化ナトリウムと
を含む、請求項１０に記載の安定な液体製剤。
【請求項１２】
１５ｍＭ〜２００ｍＭのクエン酸塩リン酸塩と、
１５０ｍＭ〜２５０ｍＭの塩化ナトリウムと
を含む、請求項１１に記載の安定な液体製剤。
【請求項１３】
２００ｍＭのクエン酸塩リン酸塩と、
１５０ｍＭの塩化ナトリウムと
を含む、請求項１１に記載の安定な液体製剤。
【請求項１４】
５０ｍＭのクエン酸塩リン酸塩と、
４００ｍＭの塩化ナトリウムと
を含む、請求項１１に記載の安定な液体製剤。
【請求項１５】
１５ｍＭのクエン酸塩リン酸塩と、
１５０ｍＭの塩化ナトリウムと
を含む、請求項１１に記載の安定な液体製剤。
【請求項１６】
リン酸緩衝液はリン酸ナトリウムである、請求項９に記載の安定な液体製剤。
【請求項１７】
５０ｍＭ〜２００ｍＭのリン酸ナトリウムと、
５０ｍＭ〜４００ｍＭの塩化ナトリウムと
を含む、請求項１６に記載の安定な液体製剤。
【請求項１８】
５０ｍＭ〜２００ｍＭのリン酸ナトリウムと、
１５０ｍＭ〜２５０ｍＭの塩化ナトリウムと
を含む、請求項１７に記載の安定な液体製剤。
【請求項１９】
２００ｍＭのリン酸ナトリウムと、
１５０ｍＭの塩化ナトリウムと
を含む、請求項１８に記載の安定な液体製剤。
【請求項２０】
ｐＨは７．０〜７．６である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の安定な液体製剤。
【請求項２１】
ｐＨは７．２である、請求項２０に記載の安定な液体製剤。
【請求項２２】
非イオン性界面活性剤をさらに含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の安定な液体製剤。
【請求項２３】
非イオン性界面活性剤はポリソルベート８０である、請求項２２に記載の安定な液体製剤。
【請求項２４】
非イオン性界面活性剤は少なくとも０．０００５％ｖ／ｖの量で存在する、請求項２２または２３に記載の安定な液体製剤。
【請求項２５】
非イオン性界面活性剤は０．０１％ｖ／ｖ未満の量で存在する、請求項２４に記載の安定な液体製剤。
【請求項２６】
２５℃で測定した場合に２０ｍＰａ＊Ｓ未満の粘度を含む、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の安定な液体製剤。
【請求項２７】
精製ヘモペキシンは、免疫比濁法およびＢｒａｄｆｏｒｄ法または２８０ｎｍでのＵＶ分光法による総タンパク質含有量によってヘモペキシン含有量を測定することによって決定した場合に、総タンパク質の少なくとも９５重量％、または少なくとも９７重量％、または少なくとも９８重量％、または少なくとも９９重量％または少なくとも９９．５重量％を構成する、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の安定な液体製剤。
【請求項２８】
精製ヘモペキシンはヒト血漿に由来する、または組換えヘモペキシン、ヘモペキシン変異体、もしくはヘモペキシンもしくはそのヘム結合断片を含む融合タンパク質からなる群から選択される、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の安定な液体製剤。
【請求項２９】
精製ヘモペキシンは少なくとも500kgのヒト血漿に由来する血漿画分から回収される、請求項２８に記載の安定な液体製剤。
【請求項３０】
３７℃で１カ月間貯蔵した場合、少なくとも７０％のヘモペキシンモノマーを含む、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の安定な液体製剤。
【請求項３１】
３７℃で２カ月間貯蔵した場合、少なくとも５０％のヘモペキシンモノマーを含む、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の安定な液体製剤。
【請求項３２】
３７℃で３カ月間貯蔵した場合、少なくとも５０％のヘモペキシンモノマーを含む、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の安定な液体製剤。
【請求項３３】
３７℃で１カ月間貯蔵した場合、少なくとも８０％のヘモペキシンモノマーを含む、請求項３０に記載の安定な液体製剤。
【請求項３４】
３７℃で２カ月貯蔵した場合、少なくとも７０％のヘモペキシンモノマーを含む、請求項３１に記載の安定な液体製剤。
【請求項３５】
３７℃で３カ月間貯蔵した場合、少なくとも６０％のヘモペキシンモノマーを含む、請求項３２に記載の安定な液体製剤。
【請求項３６】
溶血に関連する状態を治療する方法であって、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の安定な液体製剤を、それを必要とする対象に投与することを含む前記方法。
【請求項３７】
溶血に関連する状態は急性溶血性状態および／または慢性溶血性状態から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
状態は、溶血性貧血、骨髄無形成発症、高度溶血発症、輸血誘発性溶血、溶血性尿毒症症候群、心筋梗塞、急性胸部症候群、肺高血圧症、下肢潰瘍、成長遅滞、骨梗塞、子癇前症、腎不全、急性腎障害、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、出血性脳卒中を含む脳卒中、頭蓋内出血（ＩＣＨ）、脾臓血球貯留、脾梗塞、自己免疫溶血性貧血を含む自己免疫疾患、微生物感染または易感染性増加、マラリア感染、外傷、移植関連状態、心肺バイパス術を使用した開心術、ならびに熱傷後の溶血を伴うヘモグロビン血症またはヘモグロビン尿の治療を含む熱傷からなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
状態は、鎌状赤血球貧血、遺伝性球状赤血球症、遺伝性楕円赤血球症、サラセミア、先天性赤血球異形成貧血および発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、全身性エリテマトーデスおよび慢性リンパ性白血病からなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
状態は、出血性脳卒中および頭蓋内出血（ＩＣＨ）からなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
状態はＡＲＤＳである、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
安定な液体製剤は静脈内投与される、請求項３６〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
安定な液体製剤は皮下投与される、請求項３６〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、ヘモペキシンの安定な液体製剤およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
溶血は、赤血球が破壊されることを特徴とし、酵素欠損、異常ヘモグロビン症、遺伝性球状赤血球症、発作性夜間ヘモグロビン尿症および棘細胞性貧血のような赤血球異常、ならびに脾腫、自己免疫障害（例えば、新生児の溶血性疾患）、遺伝性障害（例えば、鎌状赤血球症またはＧ６ＰＤ欠損）、微小血管症性溶血、グラム陽性菌感染（例えば、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、腸球菌属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｕｓ）およびブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ））、寄生虫感染（例えば、プラスモジウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ））、毒素および外傷（例えば、熱傷）のような外因子に関連する貧血性障害の証しである。溶血はまた、輸血、特に大量輸血のおよび体外心肺補助を使用する患者における一般的な障害でもある。
【０００３】
溶血に関連する状態を有する患者で見られる有害効果は、赤血球からのヘモグロビン（Ｈｂ）およびヘムのような鉄および鉄含有化合物の放出に大いに起因している。生理的条件下では、放出されたヘモグロビンは、ハプトグロビンのような可溶性タンパク質によって結合され、マクロファージおよび肝細胞に輸送される。しかしながら、溶血の発生が加速し、病理学的性質になると、ハプトグロビンの緩衝能が圧倒される。結果として、ヘモグロビンがフェリヘモグロビンに急速に酸化され、今度はこれが遊離ヘム（プロトポルフィリンＩＸおよび鉄を含む）を放出する。ヘムは（例えば、ヘモグロビンおよびミオグロビンのような必須タンパク質の一部として）いくつかの生物学的プロセスで重要な役割を果たすが、遊離ヘムは極めて毒性である。遊離ヘムは、脂質膜、タンパク質および核酸を損傷する極めて毒性の活性酸素種（ＲＯＳ）を産生する酸化還元活性鉄の供給源である。ヘムの毒性は、脂質膜に入り込むその能力によってさらに悪化し、脂質膜でヘムは膜成分の酸化を引き起こし、細胞溶解および死を促進する。
【０００４】
連続的な低レベルの細胞外Ｈｂ／ヘム曝露の進化圧によって、生理的定常状態条件下および軽度の溶血中に遊離Ｈｂ／ヘムの有害効果を制御する代償機構がもたらされた。これらのシステムは、Ｈｂ捕捉剤ハプトグロビン（Ｈｐ）およびヘム捕捉剤タンパク質ヘモペキシン（Ｈｐｘ）およびα１−ミクログロブリンを含む、Ｈｂまたはヘムに結合する血漿タンパク質のグループの放出を含む。
【０００５】
ヘモペキシンは、図１に示されるように９０°の角度でしっかり組み合わさり、ドメイン間リンカーペプチドによって結合した２枚の厚いディスクに似た２つの四翼βプロペラードメインによって形成される、単一４３９アミノ酸長ペプチド鎖で構成される６１ｋＤａ血漿β−１Ｂ−糖タンパク質である（非特許文献１）。ヘムは、血管内および血管外溶血の結果として血液中に放出され、ドメイン間リンカーペプチドによって形成されたポケットの２つの四翼βプロペラードメイン間に結合する。残基Ｈｉｓ２１３およびＨｉｓ２６６がヘム鉄原子に配位して、ヘモグロビンと同様に安定なビスヒスチジル錯体を与える。
【０００６】
ヘモペキシンは、約２０％の、シアル酸、マンノース、ガラクトースおよびグルコサミンを含む炭水化物を含有する。１２個のシステイン残基がタンパク質配列中に見られ、おそらく６つのジスルフィド架橋を説明する。ヘモペキシンは、高い親和性（Ｋｄ＜１ｐＭ）でヘムに結合し、血流から肝臓へのヘム特異的担体として機能するその能力のおかげで、ヘム毒性に対する防御の第一線となる。ヘモペキシンは等モル比でヘムに結合するが、ヘムがこのタンパク質に共有結合しているという証拠はない。
【０００７】
ヘム結合に加えて、ヘモペキシン調製物は、セリンプロテアーゼ活性（非特許文献２）、ならびに抗炎症および炎症促進活性の呈示、細胞接着の阻害ならびに一定の二価金属イオンの結合のようないくつかの他の機能を有することも報告されている。
【０００８】
内因性ヘモペキシンは、生理的定常状態条件下で遊離ヘムの有害効果を制御することができるが、高レベルのヘムが内因性ヘモペキシンの枯渇をもたらし、ヘム媒介酸化組織損傷を引き起こす溶血に関連する条件のような病態生理学的条件下では、定常状態ヘムレベルの維持における効果をほとんど有さない。研究により、ヘモペキシン輸注が、鎌状赤血球症（ＳＣＤ）およびβサラセミアのような溶血性障害の実験的マウスモデルでヘム誘発内皮活性化、炎症および酸化損傷を軽減することが示された。ヘモペキシン投与が、炎症性サイトカインのレベルを有意に低下させ、溶血性動物のヘム誘導血管収縮に対抗することも示されている。しかしながら、精製ヘモペキシンは重要な治療可能性を示しているが、液体調製物としての安定性に乏しいことに悩まされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｍａｕｋ、２０１１；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２０巻、７９１〜８０５頁
【非特許文献２】Ｌｉｎら、２０１６；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２２：２２〜３１、２０１６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本開示は、治療的使用に適したヘモペキシンの安定な液体製剤を提供することによって、この課題を解決または少なくとも部分的に軽減する。
【００１１】
本発明の一態様では、精製ヘモペキシンの安定な液体製剤であって、
（ａ）少なくとも５０ｍｇ／ｍＬのヘモペキシン含有量と；
（ｂ）少なくとも１５ｍＭのリン酸緩衝液と；
（ｃ）ｐＨ５．８〜８と；
（ｄ）少なくとも５０ｍＭの塩化ナトリウムと
を含む、精製ヘモペキシンの安定な液体製剤が提供される。
【００１２】
本発明の別の態様では、溶血に関連する状態を治療する方法であって、本明細書に開示される精製ヘモペキシンの液体製剤を、それを必要とする対象に投与することを含む方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】βプロペラーＣドメイン（薄灰色）、Ｎドメイン（濃い灰色）、リンカー配列およびヘムを示す、ヘム−ヘモペキシン複合体の構造の図である。βプロペラーＣドメインに位置するヒアルロン酸結合モチーフ［３４８〜３５８（濃い灰色）］、ＮドメインとＣドメインの界面にあるＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ配列［１２８〜１３０（矢印）］、およびＪＥＮ１４エピトープの位置も示している。
【図２】ＳＹＰＲＯオレンジの存在下でのタンパク質のアンフォールディングについての温度に対する相対蛍光強度（ＲＦＵ）の典型的な記録を示す図である。Ｔｍは、融解曲線の中点（灰色水平バー）によって決定される。ＰＢＳ、ｐＨ７．４で製剤化したＨｐｘ（破線、Ｔｍ＝５３．０℃）およびクエン酸塩リン酸塩、ｐＨ７．４で製剤化したＨｐｘ（実線、Ｔｍ６０．５℃）を示す。
【図３−１】ヒト血漿由来ヘモペキシン（Ｈｐｘ）の生化学的特性評価を示す図である。Ａ：還元条件および非還元条件下でのＨｐｘバッチＴＯ２９００１６（２０−１．２５μｇ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。ＭＷマーカーを両条件について１レーンにロードした；バンドをクーマシー染色（ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって可視化した；Ｂ：２Ｄ−ＰＡＧＥ分析：ヘモペキシンサンプル（５μｇ）を、固定化ｐＨ勾配ストリップ（ｐＩ３〜１０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、引き続いてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離した。スポットをコロイドブルー染色（ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって可視化し、Ｈｐｘの複数のバンドをボックス内にマークする；Ｃ：ＳＥＣ−ＨＰＬＣ（カラム：ＹＭＣ  Ｐａｃｋ  Ｄｉｏｌ−３００、５μｍ、３００×８ｍｍ）によって分析した、１０％未処理（実線）および老化Ｈｐｘ（「老化」、３７℃で３カ月；破線）の分子サイズ分布。各種のモル質量を、ＭＡＬＳ（Ｄａｗｎ  ＨＥＬＥＯＳ、Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＲＩ検出器（Ｏｐｔｉｌａｂ  Ｔ−ｒＥＸ、Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によりインラインで決定した（薄灰色線）；Ｄ：様々な濃度のヘモペキシン（ＰＢＳ、ｐＨ７．４で製剤化）および対応する粘度をプロットし、ポリクローナルＩｇＧ（三角形）の粘度曲線と比較した。粘度測定は、２５℃で、回転レオメーター（ＨＡＡＫＥ、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において２連で行った。
【図３−２】図３−１の続き。
【図４−１】ＤＳＦデータ評価を示す図である。Ａ：散布図でのＴｍと対応する緩衝液タイプの可視化。緩衝液タイプＡ（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）は参照製剤になる。最も安定な緩衝液（破線の円ａ〜ｃ）の様々な塩（ＮａＣｌ）濃度を、異なる濃淡の灰色によって強調し、ここでは破線の円内の低いデータポイントが低い塩濃度（５０〜１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）を表し、破線の円内の高いデータポイントが高い塩濃度（１５０〜２５０ｍＭ  ＮａＣｌ）を表す；（ａ）クエン酸塩リン酸塩、（ｂ）リン酸ナトリウム、（ｃ）グリシン緩衝液。Ｂ：分析した全ての条件の塩化ナトリウム依存性の可視化。各濃度での平均を線として示す。Ｃ：ｐＨに対するＴｍの密度プロット；Ｄ：クエン酸リン酸製剤化サンプルにおけるＴｍと対応する塩（ＮａＣｌ）濃度の可視化。ＰＢＳは参照製剤（アステリスク）になり、２００ｍＭクエン酸塩リン酸塩、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを白丸として示す。異なる緩衝液強度を異なる濃淡の灰色によって強調し、緩衝液濃度は上から下に低下する（１００ｍＭ〜１５ｍＭクエン酸塩リン酸塩）。各条件を少なくとも３回測定した；エラーバーは標準偏差を示している。
【図４−２】図４−１の続き。
【図５】ＤＳＦによる様々な糖の存在下での熱安定性を示す図である。散布図でのＴｍと対応する緩衝液タイプの可視化。分析した３つの異なる緩衝液の異なる糖濃度を異なる濃淡の灰色にしている。
【図６】ＤＳＦによる様々なアミノ酸の存在下での熱安定性を示す図である。散布図でのＴｍと対応するクエン酸塩リン酸塩緩衝液中のアミノ酸の可視化。各アミノ酸を２つの異なる濃度で試験した（５０μＭのみを分析したグルタミン酸を除く）。
【図７−１】物理的ストレス誘導安定性についてのＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析からのデータを示す図である。Ａ：様々な濃度のＰ８０で、ＰＢＳ、ｐＨ７．４で製剤化したＨｐｘ；Ｂ：様々な濃度のＰ８０で、クエン酸塩リン酸塩、ｐＨ７．４で製剤化したＨｐｘ。分子サイズ分布を１００％積み上げ縦棒グラフとして提示し、各分子種をそれぞれ百分率の量として示す。凝集体およびダイマーを各列の底部で強調する（それぞれ、黒色および灰色）；断片を各列の上部に示す（灰色）。
【図７−２】図７−１の続き。
【図８−１】様々な物理誘導ストレスによる処理後に実行したサンプルについてのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。Ａ：ＰＢＳ、ｐＨ７．４で製剤化したＨｐｘサンプルを還元（上部パネル、５００ｍＭジチオトレイトール、ＤＴＴ）および非還元（底部パネル）条件下で分析した。Ｂ：クエン酸塩リン酸塩、ｐＨ７．４で製剤化したＨｐｘサンプルを還元（上部パネル、５００ｍＭジチオトレイトール、ＤＴＴ）および非還元（底部）条件下で分析した。Ｕ：未処理；Ａ：撹拌；Ｆ／Ｔ：凍結／解凍サイクル。
【図８−２】図８−１の続き。
【図９】物理誘導ストレス時のヘモペキシンへのヘム結合を示す図である。Ａ：ＰＢＳ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４；およびＢ：様々な濃度のＰ８０で、クエン酸塩リン酸塩、ｐＨ７．４で製剤化したＨｐｘ。示される処理；未処理−白丸；撹拌−黒色正方形；凍結／解凍−灰色三角形後のヘム結合を百分率で示す。
【図１０−１】ＰＢＳ中、Ｐ８０の非存在下（ｗ／ｏ  Ｐ８０）および様々な濃度のＰ８０（０．１〜０．００１％ｖ／ｖ）で製剤化し、３カ月間にわたって分析した１０％Ｈｐｘ溶液のＳＥＣ−ＨＰＬＣデータを示す図である。Ａ：３７℃およびＢ：２５℃（ＲＴ）で貯蔵した。分子サイズ分布を１００％積み上げ縦棒グラフとして提示し、各分子種をそれぞれ百分率の量として示す。凝集体およびダイマーを各列の底部で強調する（それぞれ、黒色および灰色）；断片を各列の上部に示す（灰色）。
【図１０−２】図１０−１の続き。
【図１１】ＰＢＳ中、Ｐ８０の非存在下（ｗ／ｏ、三角形）および様々な濃度のＰ８０（０．１〜０．００１％ｖ／ｖ）で製剤化し、３カ月間にわたって分析した１０％Ｈｐｘ溶液のヘム結合能を示す図である。Ａ：３７℃およびＢ：２５℃（ＲＴ）で貯蔵した。
【図１２−１】様々な緩衝液で製剤化し、加速条件（３７℃）貯蔵で６カ月ならびに室温（ＲＴ）および２〜８℃での貯蔵で最大２４カ月にわたって分析した１０％Ｈｐｘ溶液のＳＥＣ−ＨＰＬＣデータを示す図である。Ａ：２００ｍＭクエン酸塩リン酸塩、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２；Ｂ：２００ｍＭ  クエン酸塩リン酸塩、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２；Ｃ：１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．６；Ｄ：１００ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．６；Ｅ：３００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．６；Ｆ：ＰＢＳ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４。全ての製剤（ＰＢＳを除く）が、０．００２％ｖ／ｖ  Ｐ８０を含有している。分子サイズ分布を１００％積み上げ縦棒グラフとして提示し、各分子種をそれぞれ百分率の量として示す。凝集体およびダイマーを各列の底部で強調する（それぞれ、黒色および灰色）；断片を各列の上部に示す（灰色）。
【図１２−２】図１２−１の続き。
【図１３−１】時間０カ月、６カ月および１２カ月のサンプルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。Ａ〜Ｃ：サンプルを還元条件（５００ｍＭジチオトレイトール、ＤＴＴ）下で分析した。Ｄ〜Ｆ：サンプルを非還元条件下で分析した。タンパク質１５μｇを各レーンにロードした。各製剤を示されるように時間０カ月、６カ月および１２カ月で分析した。分子量マーカーを、図に示されるように左レーンにｋＤａ値で示す。１レーン−分子量マーカー、２レーン−２００ｍＭクエン酸塩リン酸塩、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００２％  Ｐ８０、ｐＨ７．２；３レーン−２００ｍＭクエン酸塩リン酸塩、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００２％  Ｐ８０、ｐＨ７．２；４レーン−１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００２％  Ｐ８０、ｐＨ７．６；５レーン−１００ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００２％  Ｐ８０、ｐＨ７．６；６レーン−３００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００２％  Ｐ８０、ｐＨ７．６；７レーン−ＰＢＳ、ｐＨ７．４。
【図１３−２】図１３−１の続き。
【図１４−１】ヘモペキシンへのヘム結合を示す図である。Ａ〜Ｃ：２〜８℃（Ｃ）、ＲＴ（Ｂ）および３７℃（Ａ）で貯蔵したサンプルについての各時点での百分率で示されるヘム結合（実線）。所与の時点での対応するモノマー百分率を各製剤について同じ色で示す（破線）。Ｄ：ヘム結合とＨｐｘモノマーとの間の全体的な相関。Ｎ＝１４４、ノンパラメトリックスピアマン相関、ｒ＝０．８３。
【図１４−２】図１４−１の続き。
【図１５−１】様々な緩衝液で製剤化し、６カ月（３７℃で貯蔵）および２４カ月（ＲＴおよび２〜８℃で貯蔵）にわたって分析した１０％Ｈｐｘ溶液のＳＥＣ−ＨＰＬＣデータを示す図である。Ａ：１５ｍＭクエン酸塩リン酸塩、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２；Ｂ：１５ｍＭクエン酸塩リン酸塩、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２；Ｃ：５０ｍＭクエン酸塩リン酸塩、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２；Ｄ：５０ｍＭクエン酸塩リン酸塩、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２；Ｅ：２００ｍＭクエン酸塩リン酸塩、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２。全ての製剤が０．０１％ｖ／ｖ  Ｐ８０を含有する。分子サイズ分布を１００％積み上げ縦棒グラフとして提示し、各分子種をそれぞれ百分率の量として示す。凝集体およびダイマーを各列の底部で強調する（それぞれ、黒色および灰色）；断片を各列の上部に示す（灰色）。
【図１５−２】図１５−１の続き。
【図１６】時間０カ月、６カ月および１２カ月のサンプルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。サンプルを還元条件（５００ｍＭジチオトレイトール、ＤＴＴ）下で分析した。タンパク質１５μｇを各レーンにロードした。各製剤を示されるように時間０カ月（上部左）、６カ月および１２カ月貯蔵で分析した。分子量マーカーを、図に示されるように右レーンにｋＤａ値で示す；１レーン−１５ｍＭクエン酸塩リン酸塩、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％  Ｐ８０、ｐＨ７．２；２レーン−５０ｍＭクエン酸塩リン酸塩、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％  Ｐ８０、ｐＨ７．２；３レーン−５０ｍＭクエン酸塩リン酸塩、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％  Ｐ８０、ｐＨ７．２；４レーン−３０ｍＭクエン酸塩リン酸塩、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％  Ｐ８０、ｐＨ７．２；５レーン−７５ｍＭクエン酸塩リン酸塩、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％  Ｐ８０、ｐＨ７．２；６レーン−１００ｍＭクエン酸塩リン酸塩、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％  Ｐ８０、ｐＨ７．２；７レーン−１００ｍＭクエン酸塩リン酸塩、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％  Ｐ８０、ｐＨ７．２；８レーン−１５ｍＭクエン酸塩リン酸塩、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％  Ｐ８０、ｐＨ７．２；９レーン−２００ｍＭクエン酸塩リン酸塩、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％  Ｐ８０、ｐＨ７．２；１０レーン−分子量マーカー。
【図１７】時間０カ月、６カ月および１２カ月のサンプルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。サンプルを還元条件下で分析した。タンパク質１５μｇを各レーンにロードした。各製剤を示されるように時間０カ月（上部左）、６カ月および１２カ月貯蔵で分析した。分子量マーカーを、図に示されるように右レーンにｋＤａ値で示す；１レーン−１５ｍＭクエン酸塩リン酸塩、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％  Ｐ８０、ｐＨ７．２；２レーン−５０ｍＭクエン酸塩リン酸塩、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％  Ｐ８０、ｐＨ７．２；３レーン−５０ｍＭクエン酸塩リン酸塩、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％  Ｐ８０、ｐＨ７．２；４レーン−３０ｍＭクエン酸塩リン酸塩、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％  Ｐ８０、ｐＨ７．２；５レーン−７５ｍＭクエン酸塩リン酸塩、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％  Ｐ８０、ｐＨ７．２；６レーン−１００ｍＭクエン酸塩リン酸塩、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％  Ｐ８０、ｐＨ７．２；７レーン−１００ｍＭクエン酸塩リン酸塩、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％  Ｐ８０、ｐＨ７．２；８レーン−１５ｍＭクエン酸塩リン酸塩、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％  Ｐ８０、ｐＨ７．２；９レーン−２００ｍＭクエン酸塩リン酸塩、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％  Ｐ８０、ｐＨ７．２；１０レーン−分子量マーカー。
【図１８】ヘモペキシンへのヘム結合を示す図である。３７℃（Ａ）、ＲＴ（Ｂ）および２〜８℃（Ｃ）で貯蔵したサンプルについての各時点での百分率で示されるヘム結合（実線）。所与の時点での対応するモノマー百分率を各製剤について同じ色で示す（破線）。
【図１９】血漿由来ヒトヘモペキシンの高タンパク質濃度での粘度挙動を示す図である。様々な濃度のヘモペキシンの製剤を調製し（製剤１：２００ｍＭクエン酸塩リン酸塩、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％  Ｐ８０、ｐＨ７．２；製剤２：５０ｍＭクエン酸塩リン酸塩、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％  Ｐ８０、ｐＨ７．２；製剤３：１５ｍＭクエン酸塩リン酸塩、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％  Ｐ８０、ｐＨ７．２；製剤４：ＰＢＳ、０．０１％、Ｐ８０、ｐＨ７．４）、それらの粘度をポリクローナルＩｇＧ（三角形）の粘度曲線と比較した。粘度測定は、２５℃で、回転レオメーター（ＨＡＡＫＥ、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において２連で行った。
【図２０】ＨＵＮＫ自動化学変性システムを使用したΔＧ傾向を示す図である。０〜８Ｍ尿素における３６点変性曲線を、０．２５、１、５、１０、２５、５０、１００、１５０、２５０および３００ｍｇ／ｍＬの濃度のＨｐｘについて作成した。各曲線は、各製剤についての一回の実行を表す。
【図２１−１】様々な濃度のＨｐｘ製剤１（２００ｍＭクエン酸塩リン酸塩、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％  Ｐ８０、ｐＨ７．２）の、６カ月にわたって分析したＳＥＣ−ＨＰＬＣデータを示す図である（Ａ：３００；Ｂ：２５０；Ｃ：２００およびＤ：１００ｇ／Ｌ）。分子サイズ分布を１００％積み上げ縦棒グラフとして提示し、各分子種をそれぞれ百分率の量として示す。凝集体およびダイマーを各列の底部で強調する（それぞれ、黒色および灰色）；断片を各列の上部に示す（灰色）。
【図２１−２】図２１−１の続き。
【図２２−１】様々な濃度のＨｐｘ製剤２（５０ｍＭクエン酸塩リン酸塩、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％  Ｐ８０、ｐＨ７．２）の、６カ月にわたって分析したＳＥＣ−ＨＰＬＣデータを示す図である（Ａ：３００；Ｂ：２５０；Ｃ：２００およびＤ：１００ｇ／Ｌ）。分子サイズ分布を１００％積み上げ縦棒グラフとして提示し、各分子種をそれぞれ百分率の量として示す。凝集体およびダイマーを各列の底部で強調する（それぞれ、黒色および灰色）；断片を各列の上部に示す（灰色）。
【図２２−２】図２２−１の続き。
【図２３−１】様々な濃度のＨｐｘ製剤３（１５ｍＭクエン酸塩リン酸塩、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％  Ｐ８０、ｐＨ７．２）の、６カ月にわたって分析したＳＥＣ−ＨＰＬＣデータを示す図である（Ａ：３００；Ｂ：２５０；Ｃ：２００およびＤ：１００ｇ／Ｌ）。分子サイズ分布を１００％積み上げ縦棒グラフとして提示し、各分子種をそれぞれ百分率の量として示す。斜線模様の棒は、一定の時点の後、ゲル化のために製剤を分析することができなかったことを示す。凝集体およびダイマーを各列の底部で強調する（それぞれ、黒色および灰色）；断片を各列の上部に示す（灰色）。
【図２３−２】図２３−１の続き。
【図２４−１】様々な濃度のＨｐｘ製剤４（ＰＢＳ、０．０１％  Ｐ８０、ｐＨ７．４）の、６カ月にわたって分析したＳＥＣ−ＨＰＬＣデータを示す図である（Ａ：３００；Ｂ：２５０；Ｃ：２００およびＤ：１００ｇ／Ｌ）。分子サイズ分布を１００％積み上げ縦棒グラフとして提示し、各分子種をそれぞれ百分率の量として示す。斜線模様の棒は、一定の時点の後、ゲル化のために製剤を分析することができなかったことを示す。凝集体およびダイマーを各列の底部で強調する（それぞれ、黒色および灰色）；断片を各列の上部に示す（灰色）。
【図２４−２】図２４−１の続き。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本明細書を通して、文脈上他に要求されない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のような変形は、明記される要素もしくは整数または要素もしくは整数の群の包含を意味するが、他の要素もしくは整数または要素もしくは整数の群の排除を意味しないことが理解される。
【００１５】
本明細書における先行刊行物（もしくはそこから得られる情報）または知られている事項への言及は、その先行刊行物（もしくはそこから得られる情報）または知られている事項が、本明細書が関連する活動分野における一般常識の一部を形成することの承認または自認または任意の形態の示唆とみなされず、またみなされるべきでない。
【００１６】
本明細書で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈上他に明確な指示がない限り、複数の事象を含むことに留意しなければならない。よって、例えば、「溶血に関連する状態（ａ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈａｅｍｏｌｙｓｉｓ）」への言及は、単一の状態ならびに２つまたはそれ以上の状態を含み；「薬剤（ａｎ  ａｇｅｎｔ）」への言及は、単一の薬剤ならびに２つまたはそれ以上の薬剤を含み；以下同様である。
【００１７】
反対の指示がない限り、本明細書を通して「％」含有量になされる言及は、％ｗ／ｖ（重量／体積）を意味するものとみなされるべきである。例えば、少なくとも１０％のヘモペキシン含有量を含む液体製剤は、少なくとも１０％ｗ／ｖ（すなわち、少なくとも１００ｍｇ／ｍＬ）のヘモペキシン含有量を含む液体製剤を意味するとみなされる。
【００１８】
本発明は、少なくとも一部は、一定の条件を修正してその液体製剤中のヘモペキシンの安定性を増強することができるという本発明者らの驚くべき発見に基づいている。
【００１９】
よって、本発明の一態様では、精製ヘモペキシンの安定な液体製剤であって、
（ａ）少なくとも５０ｍｇ／ｍＬのヘモペキシン含有量と；
（ｂ）少なくとも１５ｍＭのリン酸緩衝液と；
（ｃ）ｐＨ５．８〜８と；
（ｄ）少なくとも５０ｍＭの塩化ナトリウムと
を含む、精製ヘモペキシンの安定な液体製剤が提供される。
【００２０】
ヘモペキシン
ヘモペキシンは、少なくとも一部は、高い親和性（Ｋｄ＜１ｐＭ）でヘムに結合し、血流から肝臓へのヘム特異的担体として機能するその能力に起因して、ヘム毒性に対する防御の第一線となる。ヘモペキシンはまた、セリンプロテアーゼ活性、ならびに抗炎症および炎症促進活性、細胞接着を阻害する能力ならびに一定の二価金属イオンの結合のようないくつかの他の機能を有することが報告されている。ヘモペキシンの特徴のいくつかを以下の表１に要約する：
【００２１】
【表１】
2020530027.tif 000002
【００２２】
液体製剤のヘモペキシン含有量は意図した用途に依存し得る。例えば、液体製剤をニート組成物（すなわち、さらに希釈しない）としてそれを必要とする対象に投与する場合、ヘモペキシン含有量は、典型的には例えば、必要とされる投与量および投与される体積のような因子に関して、直接投与に適したものとなる。一例として、ヘモペキシン含有量を、それが、所望の治療用量に関して、対象に投与される液体製剤の体積を最小化するのに十分に高く、さらなる希釈なしに投与することを可能にするために液体製剤の粘度を最小化するのに十分に低くなるように最適化することができる。よって、本明細書に開示される一実施形態では、ヘモペキシン含有量が、さらなる希釈なしでの投与に適するように、液体製剤の粘度を最小化するよう最適化される。適切な粘度は、当業者に周知されており、投与経路および／または投与体積のような因子に依存する可能性がある。タンパク質含有製剤の皮下注射についての閾値は５０ｍＰａ＊ｓにもなることが、Ｗ．Ｄｕ＆Ａ．Ｋｌｉｂａｎｏｖ、「Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  Ｓａｌｔｓ  Ｍａｒｋｅｄｌｙ  Ｄｉｍｉｎｉｓｈ  Ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、６３２〜６３６頁、２０１１に言及されている。本明細書に開示される特定の実施形態では、液体製剤は、２５℃で５０ｍＰａ＊ｓ以下の粘度を含む。本明細書に開示される好ましい実施形態では、液体製剤は、２５℃で２０ｍＰａ＊ｓ以下の粘度を含む。
【００２３】
液体製剤をニート組成物（すなわち、さらに希釈しない）としてそれを必要とする対象に投与する場合、精製ヘモペキシンの適切な投与量は当業者に周知されており、治療される溶血性状態の性質および重症度（例えば、内因性遊離ヘムのレベル）、治療される対象の年齢、体重および性別、いずれかの他の根底にある状態の存在ならびに前記の組み合わせのような因子に依存する可能性がある。
【００２４】
「少なくとも５０ｍｇ／ｍＬ」への言及は、５０ｍｇ／ｍＬ、５５ｍｇ／ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬ、６５ｍｇ／ｍＬ、７０ｍｇ／ｍＬ、７５ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍＬ、８５ｍｇ／ｍＬ、９０ｍｇ／ｍＬ、９５ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、１０５ｍｇ／ｍＬ、１１０ｍｇ／ｍＬ、１１５ｍｇ／ｍＬ、１２０ｍｇ／ｍＬ、１２５ｍｇ／ｍＬ、１３０ｍｇ／ｍＬ、１３５ｍｇ／ｍＬ、１４０ｍｇ／ｍＬ、１４５ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍｇ／ｍＬ、１５５ｍｇ／ｍＬ、１６０ｍｇ／ｍＬ、１６５ｍｇ／ｍＬ、１７０ｍｇ／ｍＬ、１７５ｍｇ／ｍＬ、１８０ｍｇ／ｍＬ、１８５ｍｇ／ｍＬ、１９０ｍｇ／ｍＬ、１９５ｍｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｍＬ、２０５ｍｇ／ｍＬ、２１０ｍｇ／ｍＬ、２１５ｍｇ／ｍＬ、２２０ｍｇ／ｍＬ、２２５ｍｇ／ｍＬ、２３０ｍｇ／ｍＬ、２３５ｍｇ／ｍＬ、２４０ｍｇ／ｍＬ、２４５ｍｇ／ｍＬ、２５０ｍｇ／ｍＬ、２５５ｍｇ／ｍＬ、２６０ｍｇ／ｍＬ、２６５ｍｇ／ｍＬ、２７０ｍｇ／ｍＬ、２７５ｍｇ／ｍＬ、２８０ｍｇ／ｍＬ、２８５ｍｇ／ｍＬ、２９０ｍｇ／ｍＬ、２９５ｍｇ／ｍＬ、３００ｍｇ／ｍＬ、３０５ｍｇ／ｍＬ、３１０ｍｇ／ｍＬ、３１５ｍｇ／ｍＬ、３２０ｍｇ／ｍＬ、３２５ｍｇ／ｍＬ、３３０ｍｇ／ｍＬ、３３５ｍｇ／ｍＬ、３４０ｍｇ／ｍＬ、３４５ｍｇ／ｍＬ、３５０ｍｇ／ｍＬ、３５５ｍｇ／ｍＬ、３６０ｍｇ／ｍＬ、３６５ｍｇ／ｍＬ、３７０ｍｇ／ｍＬ、３７５ｍｇ／ｍＬ、３８０ｍｇ／ｍＬ、３８５ｍｇ／ｍＬ、３９０ｍｇ／ｍＬ、４００ｍｇ／ｍＬ、４０５ｍｇ／ｍＬなどを含む。よって、本発明の好ましい形態では、液体製剤は、少なくとも５０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも５５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも６０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも６５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも７０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも７５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも８０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも８５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも９０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも９５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも１０５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも１１０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも１１５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも１２０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも１２５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも１３０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも１３５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも１４０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも１４５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも１５０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも１５５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも１６０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも１６５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも１７０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも１７５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも１８０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも１８５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも１９０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも１９５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも２００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも２０５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも２１０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも２１５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも２２０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも２２５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも２３０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも２３５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも２４０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも２４５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも２５０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも２５５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも２６０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも２６５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも２７０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも２７５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも２８０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも２８５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも２９０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも２９５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも３００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも３０５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも３１０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも３１５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも３２０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも３２５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも３３０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも３３５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも３４０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも３４５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも３５０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも３５５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも３６０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも３６５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも３７０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも３７５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも３８０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも３８５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも３９０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも４００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも４０５ｍｇ／ｍＬなどのヘモペキシン含有量を含む。
【００２５】
本明細書に開示される一実施形態では、液体製剤は、７５ｍｇ／ｍＬ〜３００ｍｇ／ｍＬのヘモペキシンを含む。本明細書に開示される一実施形態では、液体製剤は、７５ｍｇ／ｍＬ〜２５０ｍｇ／ｍＬのヘモペキシンを含む。本明細書に開示される一実施形態では、液体製剤は、７５ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬのヘモペキシンを含む。本明細書に開示される一実施形態では、液体製剤は、７５ｍｇ／ｍＬ〜１５０ｍｇ／ｍＬのヘモペキシンを含む。本明細書に開示される一実施形態では、液体製剤は、１００ｍｇ／ｍＬ〜３００ｍｇ／ｍＬのヘモペキシンを含む。本明細書に開示される一実施形態では、液体製剤は、１５０ｍｇ／ｍＬ〜３００ｍｇ／ｍＬのヘモペキシンを含む。本明細書に開示される一実施形態では、液体製剤は、２００ｍｇ／ｍＬ〜３００ｍｇ／ｍＬのヘモペキシンを含む。本明細書に開示される一実施形態では、液体製剤は、２５０ｍｇ／ｍＬ〜３００ｍｇ／ｍＬのヘモペキシンを含む。本明細書に開示される一実施形態では、液体製剤は、１００ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬのヘモペキシンを含む。本明細書に開示される別の実施形態では、液体製剤は、３００ｍｇ／ｍＬのヘモペキシンを含む。本明細書に開示される別の実施形態では、液体製剤は、２５０ｍｇ／ｍＬのヘモペキシンを含む。本明細書に開示される別の実施形態では、液体製剤は、２００ｍｇ／ｍＬのヘモペキシンを含む。本明細書に開示される別の実施形態では、液体製剤は、１００ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬのヘモペキシンを含む。本明細書に開示されるさらに別の実施形態では、液体製剤は、約１００ｍｇ／ｍＬのヘモペキシンを含む。本明細書に開示される別の実施形態では、液体製剤は、１００ｍｇ／ｍＬのヘモペキシンを含む。
【００２６】
本明細書に開示される一実施形態では、本発明の液体製剤は、少なくとも５ｍＬの体積を有し、少なくとも７５ｍｇ／ｍＬのヘモペキシンを含む。別の実施形態では、液体製剤は、少なくとも５ｍＬの体積を有し、少なくとも１００ｍｇ／ｍＬまたは少なくとも２００ｍｇ／ｍＬのヘモペキシンを含む。特定の実施形態では、液体製剤は、少なくとも５ｍＬの体積を有し、約１００ｍｇ／ｍＬ、約１２５ｍｇ／ｍＬ、約１５０ｍｇ／ｍＬ、約１７５ｍｇ／ｍＬ、約２００ｍｇ／ｍＬ、約２２５ｍｇ／ｍＬ、約２５０ｍｇ／ｍＬ、約２７５ｍｇ／ｍＬ、約３００ｍｇ／ｍＬ、約３２５ｍｇ／ｍＬ、約３５０ｍｇ／ｍＬ、約３７５ｍｇ／ｍＬまたは約４００ｍｇ／ｍＬの濃度のヘモペキシンを含む。別の態様では、少なくとも５ｍＬの精製ヘモペキシンの安定な液体製剤を含有する容器であって、ヘモペキシンの濃度は少なくとも１００ｍｇ／ｍＬまたは少なくとも２００ｍｇ／ｍＬまたは少なくとも２５０ｍｇ／ｍＬまたは少なくとも３００ｍｇ／ｍＬである容器が提供される。別の態様では、少なくとも５ｍＬの精製ヘモペキシンの安定な液体製剤を含有する容器であって、ヘモペキシンの濃度は１００ｍｇ／ｍＬまたは２００ｍｇ／ｍＬまたは２５０ｍｇ／ｍＬまたは３００ｍｇ／ｍＬである容器が提供される。
【００２７】
他の実施形態では、液体製剤をヘモペキシン濃縮物として製造することができ、濃縮物は投与のために希釈される。ヘモペキシン濃縮物としての液体製剤を製造する利点の１つは、それが貯蔵用の体積を最小化することである。濃縮物を、所望であれば対象への投与の前または間に希釈することができる。濃縮物として製造することができる精製ヘモペキシンの適切な濃度は、当業者に周知されている。本明細書に開示される一実施形態では、液体製剤は、少なくとも２５０ｍｇ／ｍＬのヘモペキシン含有量を含む。
【００２８】
「少なくとも２５０ｍｇ／ｍＬ」への言及は、２５０ｍｇ／ｍＬ、２６０ｍｇ／ｍＬ、２７０ｍｇ／ｍＬ、２８０ｍｇ／ｍＬ、２９０ｍｇ／ｍＬ、３００ｍｇ／ｍＬ、３０５ｍｇ／ｍＬ、３１０ｍｇ／ｍＬ、３１５ｍｇ／ｍＬ、３２０ｍｇ／ｍＬ、３２５ｍｇ／ｍＬ、３３０ｍｇ／ｍＬ、３３５ｍｇ／ｍＬ、３４０ｍｇ／ｍＬ、３４５ｍｇ／ｍＬ、３５０ｍｇ／ｍＬ、３５５ｍｇ／ｍＬ、３６０ｍｇ／ｍＬ、３６５ｍｇ／ｍＬ、３７０ｍｇ／ｍＬ、３７５ｍｇ／ｍＬ、３８０ｍｇ／ｍＬ、３８５ｍｇ／ｍＬ、３９０ｍｇ／ｍＬ、４００ｍｇ／ｍＬ、４０５ｍｇ／ｍＬなどを含む。よって、本発明の好ましい形態では、液体製剤は、少なくとも３００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも３０５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも３１０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも３１５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも３２０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも３２５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも３３０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも３３５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも３４０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも３４５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも３５０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも３５５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも３６０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも３６５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも３７０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも３７５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも３８０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも３８５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも３９０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも４００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも４０５ｍｇ／ｍＬなどのヘモペキシン含有量を含む。本明細書に開示される一実施形態では、液体製剤は、少なくとも３００ｍｇ／ｍＬのヘモペキシン含有量を含む。
【００２９】
一実施形態では、ヘモペキシン含有量がＵＶ吸光度分光法によって測定される。一代替実施形態では、ヘモペキシンが免疫比濁法によって測定される。ＵＶ吸光度分光法および免疫比濁法の例示的な例は本明細書の他に記載する。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「ヘモペキシン」という用語は、配列番号１のアミノ酸残基２４〜４６２またはこれと少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、からなるまたはから本質的になる、天然供給源（例えば、血漿）から単離もしくは少なくとも部分的に精製されたヘモペキシンタンパク質または組換え的に産生されたヘモペキシンタンパク質を意味することを意図している。ヘモペキシンは、ヒトおよび非ヒト変異体を含むことができる。液体製剤がヒト対象への投与を意図している場合、ヘモペキシンがヒトヘモペキシンであることが一般的に好ましい。しかしながら、ヘモペキシンの非ヒトアイソフォームがヒトヘムに結合する能力を保持する限り、意図する対象がヒトである場合に、ヘモペキシンの非ヒトアイソフォームを使用してもよいことが理解されるべきである。逆に、液体製剤が非ヒト対象への投与を意図している場合、ヘモペキシンが投与される種に由来することが一般的に好ましいが、ヘモペキシンのヒトアイソフォームが意図する非ヒト対象のまたは対象中のヘムに結合する能力を保持する限り、意図する対象が非ヒト対象である場合に、ヘモペキシンのヒトアイソフォームを使用してもよいことも理解されるべきである。本明細書で使用される場合、「〜に由来する（ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ）」という用語は、その種に由来するヘモペキシンのアミノ酸配列と同一であるまたは実質的に同一であるアミノ酸配列を含む、その天然供給源から単離または少なくとも部分的に精製されたヘモペキシンならびに組換え的に産生されたヘモペキシンを含むことを意図している。ヘモペキシンの非ヒトアイソフォームの例示的な例は当業者に周知されており、その例示的な例としては、ウシ、ウマまたはブタに由来するヘモペキシンが挙げられる。
【００３１】
本明細書に開示される一実施形態では、ヘモペキシンはヒトヘモペキシンである。これには、ヒト血漿から回収された少なくとも部分的に精製されたヘモペキシンまたは組換え的に産生されたヘモペキシンが含まれる。血漿からヘモペキシンを精製する適切な方法は当業者に周知されており、その例示的な例は、その内容全体を参照によって本明細書に組み入れる、国際公開第２０１４／０５５５５２号に記載されている。特定の実施形態では、本発明の精製ヘモペキシンの液体製剤は、血漿画分または組換え供給原料から商業規模で製造される。例示的な例として、血漿画分を出発材料として使用する場合、商業規模の製造は、血漿少なくとも約５００ｋｇに由来する血漿画分の使用を伴う。好ましくは、出発血漿画分が、１バッチ当たり少なくとも約２０００ｋｇ、３０００ｋｇ、４０００ｋｇ、５０００ｋｇ、７５００ｋｇ、１００００ｋｇおよび／または１５０００ｋｇの血漿に由来する。
【００３２】
液体製剤が、血漿のような供給原料から精製され、臨床または獣医学用途（例えば、溶血に関連する状態を有する対象に投与するため）に使用されるヘモペキシンを含む場合、当業者であれば、溶液中の活性ウイルス含有量（ウイルス力価）および他の潜在的な感染因子（例えば、プリオン）のレベルを低下させることが望ましいことを理解するだろう。これは、ヘモペキシンを含む供給原料（すなわち、出発材料）が血漿由来である場合に、特に望ましいだろう。溶液中のウイルス力価を減少させる方法は当業者に知られている。例としては、低温殺菌（例えば、グリシン（例えば、２．７５Ｍ）およびスクロース（例えば、５０％）ならびに／または他の選択された賦形剤もしくは塩のような高濃度の安定剤の存在下、６０℃で１０時間溶液をインキュベートする）、乾式熱処理、ウイルス濾過（ナノフィルターを通した溶液の通過；例えば、２０ｎｍカットオフ）ならびに／または溶液を、溶液中のウイルスを不活性化する期間および条件下、適切な有機溶媒および界面活性剤による処理に供することが挙げられる。溶媒界面活性剤は、特に血漿由来製品中のエンベロープウイルスを不活性化するために２０年以上使用されている。よって、当技術分野で知られている種々の試薬および方法を使用してこれを行うことができる（例えば、全体を参照によって本明細書に組み入れる、米国特許第４５４０５７３号および米国特許第４７６４３６９号参照）。適切な溶媒には、トリ−ｎ−ブチルホスフェート（ＴｎＢＰ）およびエーテルが含まれる。いくつかの実施形態では、溶媒は約０．３％で、好ましくはＴｎＢＰである。適切な界面活性剤には、ポリソルベート（Ｔｗｅｅｎ）８０、ポリソルベート（Ｔｗｅｅｎ）２０、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、オクチルグルコシド（ＯＰＧ）のような非イオン性界面活性剤（典型的には約１％）が含まれる。溶媒および界面活性剤濃度を含む処理条件の選択は、一部は、供給原料の特徴に依存し、純度が低い供給原料は一般的により高濃度の試薬およびより極端な反応条件を要する。好ましい界面活性剤はポリソルベート８０であり、特に好ましい組み合わせはポリソルベート８０とＴｎＢＰである。好ましい界面活性剤はポリソルベート２０であり、特に好ましい組み合わせはポリソルベート２０とＴｎＢＰである。好ましい界面活性剤はＯＰＧであり、特に好ましい組み合わせはＯＰＧとＴｎＢＰである。供給原料を、溶媒および界面活性剤試薬と、存在する可能性のあるエンベロープウイルスを不活性化するのに十分な温度および時間、撹拌することができる。例えば、溶媒界面活性剤処理を２５℃で約４時間行うことができる。その後、溶媒界面活性剤化学物質は、例えばＣ−１８疎水性樹脂のようなクロマトグラフィー媒体への吸着、または目的のタンパク質を吸着する条件下でイオン交換樹脂のドロップスルー（ｄｒｏｐ−ｔｈｒｏｕｇｈ）画分中にこれらを溶出することによって除去される。
【００３３】
ウイルス不活性化工程は、精製方法の任意の適切な段階で行うことができる。本明細書に開示される一実施形態では、ウイルス不活性化工程が、低温殺菌または有機溶媒および界面活性剤による処理を含む。本明細書に開示される別の実施形態では、ウイルス不活性化工程はウイルス濾過を含む。ウイルス濾過を使用する場合、濾過工程前に遊離アミノ酸（例えば、アルギニン）を添加することによって、フィルターを通るヘモペキシンの流動速度および回収率を有意に改善することができる。本明細書に開示される一実施形態では、ヘモペキシンを含む供給原料または溶液は、ヘモペキシンの精製前にウイルス不活性化工程を受ける。精製前に溶媒界面活性剤処理のようなウイルス不活性化工程を使用する利点は、それによって、ヘモペキシンの樹脂への結合ならびにフロースルー（ドロップスルー）画分による有機溶媒および界面活性剤の除去を促進する条件を利用することによって、処理された溶液からの有機溶媒および界面活性剤の除去が可能になることである。
【００３４】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される、精製ヘモペキシンの液体製剤は、これらが通常会合している他の成分（例えば、他の血漿由来タンパク質）を実質的に含まない。よって、一実施形態では、液体製剤は、総タンパク質の２０％未満、好ましくは総タンパク質の１０％未満、より好ましくは総タンパク質の５％未満の、これらが通常会合している他の成分（すなわち、不純物）を含む。当業者であれば、本発明の液体製剤中に存在する不純物のレベルが、組成物の意図した用途に依存することを理解するだろう。例えば、組成物を、それを必要とするヒト対象に投与する場合（すなわち、臨床用途）、組成物が（総タンパク質の）５％未満の不純物を含むことが望ましいだろう。逆に、タンパク質をインビトロで使用する場合、組成物が（総タンパク質の）５％超の不純物を含む場合が許容される。一実施形態では、液体製剤は、総タンパク質の少なくとも９０重量％、好ましくは少なくとも９５重量％、好ましくは少なくとも９７重量％、好ましくはまたは少なくとも９８重量％、好ましくは少なくとも９９重量％、より好ましくは少なくとも９９．５重量％のヘモペキシン含有量を含む。特定の実施形態では、液体製剤中のヘモペキシンの純度のレベルは、免疫比濁法を使用して決定される。免疫比濁法を行う適切な方法は当業者に周知されている。液体製剤中のヘモペキシンの純度のレベルは、ＢＮＩＩ機器（Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｍａｌｖｅｒｎ、ＰＡ、米国）などで免疫比濁法によってヘモペキシン含有量を測定することによって決定することができる。液体製剤の総タンパク質含有量は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法または２８０ｎｍでのＵＶ分光法によって決定することができる。次いで、ヘモペキシン含有量を総タンパク質含有量で割って、１００を掛けることによって、ヘモペキシンの百分率純度を計算することができる。精製ヘモペキシンの安定な液体製剤中に含有される他の微量タンパク質の百分率純度も同様に決定することができる。ヘモペキシンをヒト血漿から精製した場合、液体製剤中に存在する可能性のある微量タンパク質の例示的な例としては、アルブミン、α１酸糖タンパク質、α１アンチトリプシン、α２マクログロブリン、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、アンチトロンビン−ＩＩＩ、セルロプラスミン、ハプトグロビン、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）およびトランスフェリンが挙げられる。
【００３５】
組換えヘモペキシンは当業者に知られている組換え方法によって製造することができる。例えば、ヘモペキシンタンパク質（またはその前駆体）をコードする核酸配列を含む核酸分子を、前記核酸配列を発現することができる適切な宿主細胞にトランスフェクトし、前記宿主細胞を、前記核酸配列の発現に適した条件下でインキュベートし、前記タンパク質を回収することができる。組換えヘモペキシンをコードする核酸分子を製造する適切な方法も、おそらくは組換えヘモペキシンタンパク質を発現および／または分泌するために使用される宿主細胞（例えば、微生物）の性質に基づくコドンの最適化を含む、遺伝暗号の知識に基づいて、当業者に知られている。適切な宿主細胞も当業者に知られており、その例示的な例としては、原核細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））および真核細胞（例えば、ピキア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、国際公開第２０１６／０５４０７２号に記載されるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株ＣＨＯ−Ｋ１およびＣＨＯ−Ｓ；ＮＳ０ハイブリドーマ細胞ならびに国際公開第２０１２／０５０８７４号に記載されるＨＥＫ２９３細胞）が挙げられる。「Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」第５版、第２巻セット：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（著者、編者）、Ｒｏｇｅｒ  Ｂｒｅｎｔ（編者）、Ｒｏｂｅｒｔ  Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ（編者）、Ｄａｖｉｄ  Ｄ．Ｍｏｏｒｅ（編者）、Ｊ．Ｇ．Ｓｅｉｄｍａｎ（編者）、Ｊｏｈｎ  Ａ．Ｓｍｉｔｈ（編者）、Ｋｅｖｉｎ  Ｓｔｒｕｈｌ（編者）、Ｊ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ロンドン）が参照される。組換えヘモペキシンの例示的な例は、その内容を参照によって本明細書に組み入れる、国際公開第２０１６／０５４０７２号に記載されている。
【００３６】
本明細書に開示される一実施形態では、ヘモペキシンは、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０００６０４．１（配列番号１、以下）のアミノ酸残基２４〜４６２またはこれと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、からなるまたはから本質的になる。配列番号１のアミノ酸残基１〜２３（以下の下線を付したテキスト）がシグナル配列をコードすることに留意されたい：
ヒトヘモペキシン前駆体（配列番号１）
ＭＡＲＶＬＧＡＰＶＡ  ＬＧＬＷＳＬＣＷＳＬ  ＡＩＡＴＰＬＰＰＴＳ  ＡＨＧＮＶＡＥＧＥＴ  ＫＰＤＰＤＶＴＥＲＣ  ＳＤＧＷＳＦＤＡＴＴ  ＬＤＤＮＧＴＭＬＦＦ  ＫＧＥＦＶＷＫＳＨＫ  ＷＤＲＥＬＩＳＥＲＷ  ＫＮＦＰＳＰＶＤＡＡ  ＦＲＱＧＨＮＳＶＦＬ  ＩＫＧＤＫＶＷＶＹＰ  ＰＥＫＫＥＫＧＹＰＫ  ＬＬＱＤＥＦＰＧＩＰ  ＳＰＬＤＡＡＶＥＣＨ  ＲＧＥＣＱＡＥＧＶＬ  ＦＦＱＧＤＲＥＷＦＷ  ＤＬＡＴＧＴＭＫＥＲ  ＳＷＰＡＶＧＮＣＳＳ  ＡＬＲＷＬＧＲＹＹＣ  ＦＱＧＮＱＦＬＲＦＤ  ＰＶＲＧＥＶＰＰＲＹ  ＰＲＤＶＲＤＹＦＭＰ  ＣＰＧＲＧＨＧＨＲＮ  ＧＴＧＨＧＮＳＴＨＨ  ＧＰＥＹＭＲＣＳＰＨ  ＬＶＬＳＡＬＴＳＤＮ  ＨＧＡＴＹＡＦＳＧＴ  ＨＹＷＲＬＤＴＳＲＤ  ＧＷＨＳＷＰＩＡＨＱ  ＷＰＱＧＰＳＡＶＤＡ  ＡＦＳＷＥＥＫＬＹＬ  ＶＱＧＴＱＶＹＶＦＬ  ＴＫＧＧＹＴＬＶＳＧ  ＹＰＫＲＬＥＫＥＶＧ  ＴＰＨＧＩＩＬＤＳＶ  ＤＡＡＦＩＣＰＧＳＳ  ＲＬＨＩＭＡＧＲＲＬ  ＷＷＬＤＬＫＳＧＡＱ  ＡＴＷＴＥＬＰＷＰＨ  ＥＫＶＤＧＡＬＣＭＥ  ＫＳＬＧＰＮＳＣＳＡ  ＮＧＰＧＬＹＬＩＨＧ  ＰＮＬＹＣＹＳＤＶＥ  ＫＬＮＡＡＫＡＬＰＱ  ＰＱＮＶＴＳＬＬＧＣ  ＴＨ
【００３７】
別の実施形態では、ヘモペキシンは、配列番号１のアミノ酸残基２４〜４６２またはこれと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、からなるまたはから本質的になるヒトヘモペキシンである。
【００３８】
「少なくとも６０％」への言及は、例えば、最適アラインメントまたは最良適合分析後の６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の配列同一性を含む。よって、本明細書に開示される一実施形態では、ヘモペキシンは、配列番号１のアミノ酸残基２４〜４６２との少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％または好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、からなるまたはから本質的になる。
【００３９】
比較ウィンドウを整列するための配列の最適アラインメントは、アルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ  Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、米国のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータ化された実行、または選択された種々の方法のいずれかによって作成された検査および最良アラインメント（すなわち、比較ウィンドウにわたる最高の百分率相同性をもたらす）によって行うことができる。例えば、Ａｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２５：３３８９によって開示されているＢＬＡＳＴファミリーのプログラムも参照することができる。配列分析の詳細な考察は、Ｕｎｉｔ  １９．３  ｏｆ  Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９４〜１９９８）Ｉｎ：  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．に見出すことができる。
【００４０】
本明細書で使用される「配列同一性」という用語は、比較ウィンドウにわたって、ヌクレオチド間ベースまたはアミノ酸間ベースで配列が同一または構造的に類似である程度を指す。よって、例えば、「配列同一性の百分率」は、比較ウィンドウにわたって２つの最適に配列された配列を比較し、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）または同一のアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＣｙｓおよびＭｅｔ）が両配列中に生じる位置の数を決定して一致した位置の数を得て、一致した位置の数を比較ウィンドウ中の位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）で割り、結果に１００を掛けて配列同一性の百分率を得ることによって計算される。例えば、「配列同一性」は、ソフトウェアに付随する参照マニュアルに使用される標準的デフォルトを使用して、ＤＮＡＳＩＳコンピュータプログラム（ウィンドウズ用バージョン２．５；Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、カリフォルニア、米国から入手可能）によって計算される「一致百分率」である。
【００４１】
本明細書で使用される「配列同一性」という用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸レベルでの比較配列間の正確な同一性を含む。この用語はまた、本明細書において、配列間の差異が、構造的、機能的、生化学的および／またはコンフォメーションレベルで互いに関連しているアミノ酸（またはヌクレオチドの文脈では、前記ヌクレオチドによってコードされるアミノ酸）に関する、ヌクレオチドまたはアミノ酸レベルで正確でない同一性（すなわち、類似性）を含めるためにも使用される。例えば、アミノ酸レベルで非同一性（類似性）がある場合、「類似性」は、それにもかかわらず、構造的、機能的、生化学的および／またはコンフォメーションレベルで互いに関連するアミノ酸を含む。一実施形態では、ヌクレオチドおよび配列比較は類似性よりもむしろ同一性のレベルで行われる。例えば、ロイシンをイソロイシンまたはバリン残基に置換することができる。これを保存的置換と呼ぶことができる。一実施形態では、修飾は、非修飾ポリペプチドと比較した場合に、修飾ポリペプチドの結合特異性にも機能的活性にも効果を有さないまたは無視できるほどの効果しか有さないように、アミノ酸配列をその中に含まれるアミノ酸残基のいずれかの保存的置換によって修飾することができる。
【００４２】
本明細書に記載されるヘモペキシンに関する配列同一性は、配列を整列させ、必要に応じて、ギャップを導入して、最大百分率相同性を達成した後の対応するペプチド配列の残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の百分率に関連し、いずれの保存的置換も配列同一性の一部とみなさない。ＮまたはＣ末端伸長も、挿入も、配列同一性または相同性を減少させると解釈されないものとする。
【００４３】
ヘモペキシンの変異体も本明細書で意図される。本明細書で使用される場合、ヘモペキシンの「変異体」は、ヘモペキシン（ヒトもしくは非ヒト）の天然（自然に存在する）アイソフォームのアミノ酸配列またはその一部分と少なくともいくらかの配列同一性を共有するが、依然としてヘムに結合する能力を保持する分子である。いくつかの実施形態では、変異体は、配列番号１のアミノ酸残基２４〜４６２との少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％または好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、からなるまたはから本質的になる。
【００４４】
本明細書に開示される一実施形態では、変異体は、天然ヘモペキシンのヘム結合断片である。本明細書で互換的に「結合断片」または「ヘム結合断片」とも呼ばれるヘモペキシンのヘム結合断片は、親分子のヘムに結合する機能的活性の少なくとも一部を保持する天然ヘモペキシン分子（ヒトまたは非ヒト）の一部である。本明細書の他で言及されるように、ヘム結合は当業者に知られている方法を使用して容易に決定することができ、その方法の例示的な例は、その内容全体を参照によって本明細書に組み入れる、Ｌｉｐｉｓｋｉら（２０１３、Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ＆Ｒｅｄｏｘ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ、１９（１４）、１６１９〜１６３３頁）によって記載されている方法である。Ｌｉｐｉｓｋｉら（２０１３）による方法へのわずかな修正も本明細書の他に記載されるように使用することができる。
【００４５】
一実施形態では、ヘモペキシンの断片は、ヘム鉄原子を配位して安定なビスヒスチジル錯体をもたらすと記載されている、アミノ酸残基Ｈｉｓ２１３およびＨｉｓ２６６を含む２つの四翼βプロペラードメイン間のインタクトなヘム結合ドメインを含む。
【００４６】
ヘムに対するヘモペキシン（その変異体を含む）の結合親和性は、ヘモペキシン（その変異体を含む）のアミノ酸配列に応じて変化し得ることが当業者によって理解されるだろう。一実施形態では、ヘモペキシンまたはそのヘム結合断片は、１×１０−１２以下の平衡解離定数（ＫＤ）を有する結合親和性でヘムに結合する。
【００４７】
ヘモペキシンまたはそのヘム結合断片を含む融合タンパク質も本明細書で想定される。ヘモペキシンを含む適切な融合タンパク質の例示的な例は、その内容全体を参照によって本明細書に組み入れる、国際公開第２００６／０１８４２８に記載されている。
【００４８】
「少なくとも部分的に精製された（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｐａｒｔｉａｌｌｙ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ）」、「単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」、「精製された（ｐｕｒｉｆｉｅｄ）」などの用語は、本明細書において、ヘモペキシンが単離および／または精製形態で提供される；すなわち、その自然環境から分離、単離または精製され、実質的に純粋なまたは均質な形態で提供されることを意味するために使用される。このようなタンパク質は、典型的には自然の環境またはそれらが製造される環境（例えば、細胞培養）で、このような製造がインビトロもしくはインビボで行われる組換えＤＮＡ技術による場合に見られる他のポリペプチドまたは核酸のような、それらが自然状態で会合している材料を含まないまたは実質的に含まない。例えば、少なくとも部分的に精製されたヘモペキシンは、（総タンパク質の）５０％以下の不純物を含んでよい。よって、本明細書に開示される一実施形態では、精製ヘモペキシンは、（総タンパク質の）５０％以下、好ましくは４５％以下、好ましくは４０％以下、好ましくは３５％以下、好ましくは３０％以下、好ましくは２５％以下、好ましくは２０％以下、好ましくは１５％以下、好ましくは１０％以下または好ましくは５％以下の不純物または好ましくは（総タンパク質の）１％以下の不純物を含む、からなるまたはから本質的になる。
【００４９】
本明細書に開示される別の実施形態では、ヘモペキシンは、富化されている、濃縮されているまたは由来する出発材料中のヘモペキシンの活性、量もしくは濃度よりも大きい比活性、量もしくは濃度を有する、単離および／または精製形態で提供される。一実施形態では、精製ヘモペキシンの液体製剤は血漿に由来する。
【００５０】
塩化ナトリウム
本発明者らは、驚くべきことに、精製ヘモペキシンの液体製剤に組み込まれる塩化ナトリウムの量が、その中のヘモペキシンの安定性と直接相関することを発見した。
【００５１】
「少なくとも５０ｍＭ」への言及は、５０ｍＭ、１００ｍＭ、１５０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、３５０ｍＭ、４００ｍＭ、４５０ｍＭ、５００ｍＭ、５５０ｍＭ、６００ｍＭ、６５０ｍＭなどを含む。よって、本発明の好ましい実施形態では、液体製剤は、その範囲を含む、少なくとも５０ｍＭの塩化ナトリウム、少なくとも１００ｍＭの塩化ナトリウム、少なくとも１５０ｍＭの塩化ナトリウム、少なくとも２００ｍＭの塩化ナトリウム、少なくとも２５０ｍＭの塩化ナトリウム、少なくとも３００ｍＭの塩化ナトリウム、少なくとも３５０ｍＭの塩化ナトリウム、少なくとも４００ｍＭの塩化ナトリウム、少なくとも４５０ｍＭの塩化ナトリウム、少なくとも５００ｍＭの塩化ナトリウム、少なくとも５５０ｍＭの塩化ナトリウム、少なくとも６００ｍＭの塩化ナトリウム、少なくとも６５０ｍＭの塩化ナトリウムなどを含む。
【００５２】
本明細書に開示される一実施形態では、液体製剤は、約５０ｍＭ〜約６００ｍＭの塩化ナトリウムを含む。別の実施形態では、液体製剤は、約１５０ｍＭ〜約４００ｍＭの塩化ナトリウムを含む。別の実施形態では、液体製剤は、約１５０ｍＭ〜約２５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む。
【００５３】
本明細書に開示される一実施形態では、液体製剤は、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む。別の実施形態では、液体製剤は、４００ｍＭの塩化ナトリウムを含む。
【００５４】
リン酸緩衝液
本発明者らは、驚くべきことに、精製ヘモペキシンの液体製剤に組み込まれるリン酸緩衝液の種類および量もヘモペキシンの安定性に影響を及ぼすことを発見した。
【００５５】
適切なリン酸緩衝液は当業者に周知されているが、その例示的な例としてはリン酸ナトリウム、リン酸カリウムおよびクエン酸塩リン酸塩が挙げられる。本発明者らは、予想外に、クエン酸塩リン酸塩およびリン酸ナトリウム緩衝液が、溶液中のヘモペキシンの安定化においてリン酸カリウム緩衝液、グリシン緩衝液およびトリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）緩衝液よりも良く働くことを発見した。よって、本明細書に開示される一実施形態では、リン酸緩衝液は、リン酸ナトリウム、リン酸カリウムおよびクエン酸塩リン酸塩からなる群から選択される。本明細書に開示されるさらなる実施形態では、リン酸緩衝液は、リン酸ナトリウムおよびクエン酸塩リン酸塩からなる群から選択される。
【００５６】
一実施形態では、リン酸緩衝液はリン酸ナトリウムである。一実施形態では、リン酸ナトリウム緩衝液は、第一リン酸ナトリウムおよび第二リン酸ナトリウムを含む。
【００５７】
本発明者らは、予想外に、クエン酸塩リン酸塩が、溶液中のヘモペキシンの安定化においてリン酸ナトリウム緩衝液よりも良く働くことを発見した。よって、別の実施形態では、リン酸緩衝液はクエン酸塩リン酸塩である。一実施形態では、クエン酸塩リン酸塩緩衝液は、クエン酸および第二リン酸ナトリウムを含む。
【００５８】
「少なくとも１５ｍＭ」への言及は、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、５５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、１５０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、３５０ｍＭ、４００ｍＭ、４００ｍＭなどを含む。よって、本発明の好ましい実施形態では、液体製剤は、その範囲を含む、少なくとも１５ｍＭ、少なくとも２０ｍＭ、少なくとも２５ｍＭ、少なくとも３０ｍＭ、少なくとも３５ｍＭ、少なくとも４０ｍＭ、少なくとも４５ｍＭ、少なくとも５０ｍＭ、少なくとも５５ｍＭ、少なくとも６０ｍＭ、少なくとも６５ｍＭ、少なくとも７０ｍＭ、少なくとも７５ｍＭ、少なくとも８０ｍＭ、少なくとも８５ｍＭ、少なくとも９０ｍＭ、少なくとも１００ｍＭ、少なくとも１５０ｍＭ、少なくとも２００ｍＭ、少なくとも２５０ｍＭ、少なくとも３００ｍＭ、少なくとも３５０ｍＭ、少なくとも４００ｍＭ、少なくとも４００ｍＭのリン酸緩衝液などを含む。
【００５９】
本発明者らは、ある範囲のリン酸緩衝液および塩化ナトリウム濃度が溶液中のヘモペキシンの安定性を改善するのに有用であることを示したが、本発明者らはまた、予想外に、一定の濃度のリン酸緩衝液と一定の濃度の塩化ナトリウムを、組み合わせると、最適な安定性をもたらすことも発見した。本明細書に開示される一実施形態では、液体製剤は、１５ｍＭ〜２００ｍＭのクエン酸塩リン酸塩と１５０ｍＭ〜４００ｍＭの塩化ナトリウムを含む。別の実施形態では、液体製剤は、１５ｍＭ〜２００ｍＭのクエン酸塩リン酸塩と１５０ｍＭ〜２５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む。
【００６０】
別の実施形態では、液体製剤は、２００ｍＭのクエン酸塩リン酸塩と１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む。別の実施形態では、液体製剤は、５０ｍＭのクエン酸塩リン酸塩と４００ｍＭの塩化ナトリウムを含む。さらに別の実施形態では、液体製剤は、１５ｍＭのクエン酸塩リン酸塩と１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む。
【００６１】
本明細書に開示される別の実施形態では、液体製剤は、５０ｍＭ〜２００ｍＭのリン酸ナトリウムと５０ｍＭ〜４００ｍＭの塩化ナトリウムを含む。本明細書に開示される別の実施形態では、液体製剤は、５０ｍＭ〜２００ｍＭのリン酸ナトリウムと１５０ｍＭ〜２５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む。本明細書に開示されるさらに別の実施形態では、液体製剤は、２００ｍＭのリン酸ナトリウムと１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む。
【００６２】
ｐＨ
本発明者らはまた、ｐＨも溶液中のヘモペキシンの安定性の維持で役割を果たすことを発見した。
【００６３】
「ｐＨ５．８〜８」への言及は、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９および８．０を含む。よって、本発明の好ましい実施形態では、液体製剤は、ｐＨ５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９または８．０を含む。
【００６４】
本明細書に開示される一実施形態では、液体製剤のｐＨは６．５〜８．０である。本明細書に開示される一実施形態では、液体製剤のｐＨは７．０〜７．６である。本明細書に開示される別の実施形態では、液体製剤のｐＨは７．２である。
【００６５】
液体製剤のｐＨを決定する、および必要に応じて、調整する適切な方法は当業者に周知されている。好ましくは、ｐＨが室温で測定される。
【００６６】
導電率
本発明者らはまた、導電率が、少なくとも部分的に、溶液中のヘモペキシンの安定性に寄与できることを発見した。本明細書に開示される一実施形態では、精製ヘモペキシンの液体製剤は、少なくとも１０ｍＳ／ｃｍの導電率を含む。「少なくとも１０ｍＳ／ｃｍ」は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０ｍＳ／ｃｍなどを意味する。別の実施形態では、精製ヘモペキシンの液体製剤は、１０〜４５ｍＳ／ｃｍの導電率を含む。
【００６７】
導電率「１０〜４５ｍＳ／ｃｍ」への言及は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４および４５ｍＳ／ｃｍを含む。
【００６８】
本明細書に開示される別の実施形態では、液体製剤の導電率は１０〜２５ｍＳ／ｃｍである。本明細書に開示されるさらに別の実施形態では、液体製剤の導電率は１５〜２５ｍＳ／ｃｍである。本明細書に開示されるさらに別の実施形態では、液体製剤の導電率は１０〜１５ｍＳ／ｃｍである。本明細書に開示されるさらなる実施形態では、液体製剤の導電率は少なくとも３０ｍＳ／ｃｍである。
【００６９】
液体製剤の導電率を決定する、および必要に応じて、調整する適切な方法は当業者に周知されているが、その例示的な例は本明細書の他に記載する。好ましくは、導電率が室温で測定される。
【００７０】
安定剤
いくつかの実施形態では、液体製剤は、安定剤をさらに含むことができる。適切な安定剤は当業者に知られているが、その例示的な例としては、アミノ酸、炭水化物、塩および／または界面活性剤（例えば、非イオン性界面活性剤）が挙げられる。いくつかの実施形態では、安定剤は、糖アルコールとアミノ酸の混合物を含む。安定剤は、糖（例えば、スクロースまたはトレハロース）、糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）およびアミノ酸（例えば、プロリン、グリシンおよびアルギニン）の混合物を含むことができる。好ましい実施形態では、製剤は、アルギニンのようなアミノ酸を含む。他の実施形態では、製剤は、最大１００ｍＭの濃度の二価金属イオンおよび米国特許第７０４５６０１号に記載される錯化剤を含む。
【００７１】
本明細書に開示される一実施形態では、液体製剤は、非イオン性界面活性剤をさらに含む。適切な非イオン性界面活性剤は当業者に知られており、その例示的な例としては、ポリソルベート８０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）が挙げられる。本発明者らは、精製ヘモペキシンの液体製剤中のポリソルベート８０の存在が、その中のヘモペキシンの安定性を改善することを発見した。よって、本明細書に開示される一実施形態では、非イオン性界面活性剤はポリソルベート８０である。一実施形態では、非イオン性界面活性剤は、少なくとも０．０００５％ｖ／ｖの量で存在する。「少なくとも０．０００５％ｖ／ｖ」への言及は、０．０００５％、０．０００６％、０．０００７％、０．０００８％、０．０００９％、０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％、０．００６％、０．００７％、０．００８％、０．００９％、０．０１％、０．０１５％、０．０２％、０．０５％、０．１０％、０．１５％ｖ／ｖなどを含む。よって、本発明の好ましい実施形態では、液体製剤は、少なくとも０．００１％ｖ／ｖ、好ましくは少なくとも０．００２％ｖ／ｖ、好ましくは少なくとも０．００５％ｖ／ｖ、好ましくは少なくとも０．０１％ｖ／ｖ、好ましくは少なくとも０．０１５％ｖ／ｖ、好ましくは少なくとも０．０２％ｖ／ｖ、好ましくは少なくとも０．０５％ｖ／ｖ、好ましくは少なくとも０．１０％ｖ／ｖ、好ましくは少なくとも０．１５％ｖ／ｖなどを含む。
【００７２】
本明細書に開示される一実施形態では、非イオン性界面活性剤は０．０１％ｖ／ｖ未満の量で存在する。
【００７３】
本発明の特定の実施形態では、精製ヘモペキシンの安定な液体製剤であって、
（ａ）１００〜３００ｍｇ／ｍＬのヘモペキシン含有量と；
（ｂ）１５ｍＭ〜２００ｍＭのリン酸緩衝液と；
（ｃ）ｐＨ６．５〜８．０と；
（ｄ）１５０ｍＭ〜４００ｍＭの塩化ナトリウムと；
（ｅ）場合により、０．０２％ｖ／ｖ未満の量の非イオン性界面活性剤と
を含む、精製ヘモペキシンの安定な液体製剤が提供される。
【００７４】
１つの好ましい実施形態では、安定な液体製剤は、２５℃で測定した場合に２０ｍＰａ＊Ｓ未満の粘度を有する。
【００７５】
別の好ましい実施形態では、安定な液体製剤は、１００〜２５０ｍｇ／ｍＬのヘモペキシン含有量および２５℃で測定した場合に２０ｍＰａ＊Ｓ未満の粘度を有する。
【００７６】
本発明の特定の実施形態では、精製ヘモペキシンの安定な液体製剤であって、
（ａ）１００〜３００ｍｇ／ｍＬのヘモペキシン含有量と；
（ｂ）１５ｍＭ〜２００ｍＭのリン酸緩衝液と；
（ｃ）ｐＨ６．５〜８．０と；
（ｄ）１５０ｍＭ〜４００ｍＭの塩化ナトリウムと；
（ｅ）０．０２％ｖ／ｖ未満の量の非イオン性界面活性剤と
を含む、精製ヘモペキシンの安定な液体製剤が提供される。
【００７７】
１つの好ましい実施形態では、安定な液体製剤は、２５℃で測定した場合に２０ｍＰａ＊Ｓ未満の粘度を有する。
【００７８】
別の好ましい実施形態では、安定な液体製剤は、１００〜２５０ｍｇ／ｍＬのヘモペキシン含有量および２５℃で測定した場合に２０ｍＰａ＊Ｓ未満の粘度を有する。
【００７９】
本発明の特定の実施形態では、精製ヘモペキシンの安定な液体製剤であって、
（ａ）１００〜３００ｍｇ／ｍＬのヘモペキシン含有量と；
（ｂ）１５ｍＭ〜２００ｍＭのクエン酸塩リン酸塩緩衝液と；
（ｃ）ｐＨ６．５〜８．０と；
（ｄ）１５０ｍＭ〜４００ｍＭの塩化ナトリウムと；
（ｅ）場合により、０．０２％ｖ／ｖ未満の量の非イオン性界面活性剤と
を含む、精製ヘモペキシンの安定な液体製剤が提供される。
【００８０】
１つの好ましい実施形態では、安定な液体製剤は、２５℃で測定した場合に２０ｍＰａ＊Ｓ未満の粘度を有する。
【００８１】
別の好ましい実施形態では、安定な液体製剤は、１００〜２５０ｍｇ／ｍＬのヘモペキシン含有量および２５℃で測定した場合に２０ｍＰａ＊Ｓ未満の粘度を有する。
【００８２】
本発明の特定の実施形態では、精製ヘモペキシンの安定な液体製剤であって、
（ａ）１００〜３００ｍｇ／ｍＬのヘモペキシン含有量と；
（ｂ）１５ｍＭ〜２００ｍＭのクエン酸塩リン酸塩緩衝液と；
（ｃ）ｐＨ６．５〜８．０と；
（ｄ）１５０ｍＭ〜４００ｍＭの塩化ナトリウムと；
（ｅ）０．０２％ｖ／ｖ未満の量の非イオン性界面活性剤と
を含む、精製ヘモペキシンの安定な液体製剤が提供される。
【００８３】
１つの好ましい実施形態では、安定な液体製剤は、２５℃で測定した場合に２０ｍＰａ＊Ｓ未満の粘度を有する。
【００８４】
別の好ましい実施形態では、安定な液体製剤は、１００〜２５０ｍｇ／ｍＬのヘモペキシン含有量および２５℃で測定した場合に２０ｍＰａ＊Ｓ未満の粘度を有する。
【００８５】
本発明の特定の実施形態では、精製ヘモペキシンの安定な液体製剤であって、
（ａ）１００〜３００ｍｇ／ｍＬのヘモペキシン含有量と；
（ｂ）１５ｍＭ〜２００ｍＭのクエン酸塩リン酸塩緩衝液と；
（ｃ）ｐＨ７．０〜７．６と；
（ｄ）１５０ｍＭ〜４００ｍＭの塩化ナトリウムと；
（ｅ）場合により、０．０２％ｖ／ｖ未満の量の非イオン性界面活性剤と
を含む、精製ヘモペキシンの安定な液体製剤が提供される。
【００８６】
１つの好ましい実施形態では、安定な液体製剤は、２５℃で測定した場合に２０ｍＰａ＊Ｓ未満の粘度を有する。
【００８７】
別の好ましい実施形態では、安定な液体製剤は、１００〜２５０ｍｇ／ｍＬのヘモペキシン含有量および２５℃で測定した場合に２０ｍＰａ＊Ｓ未満の粘度を有する。
【００８８】
本発明の特定の実施形態では、精製ヘモペキシンの安定な液体製剤であって、
（ａ）１００〜３００ｍｇ／ｍＬのヘモペキシン含有量と；
（ｂ）１５ｍＭ〜２００ｍＭのクエン酸塩リン酸塩緩衝液と；
（ｃ）ｐＨ７．０〜７．６と；
（ｄ）１５０ｍＭ〜４００ｍＭの塩化ナトリウムと；
（ｅ）０．０２％ｖ／ｖ未満の量の非イオン性界面活性剤と
を含む、精製ヘモペキシンの安定な液体製剤が提供される。
【００８９】
１つの好ましい実施形態では、安定な液体製剤は、２５℃で測定した場合に２０ｍＰａ＊Ｓ未満の粘度を有する。
【００９０】
別の好ましい実施形態では、安定な液体製剤は、１００〜２５０ｍｇ／ｍＬのヘモペキシン含有量および２５℃で測定した場合に２０ｍＰａ＊Ｓ未満の粘度を有する。
【００９１】
安定性
本明細書の他に言及されるように、精製ヘモペキシンは、ＰＢＳのような標準的な緩衝溶液中で本質的に不安定である。このことが、特に経時的な製剤の貯蔵に関して大きな問題をもたらす。例えば、本明細書に開示される本発明者ら自身のデータによって示されるように、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；１０ｍＭリン酸ナトリウム、１．８ｍＭリン酸カリウム、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ；ｐＨ７．４）で製剤化された精製ヘモペキシンは、示差走査蛍光定量（ＤＳＦ）によって決定されるように比較的不安定である。ＰＢＳと対照的に、本発明者らは、ヘモペキシンを塩化ナトリウムおよびクエン酸塩リン酸塩、リン酸ナトリウムまたはリン酸カリウムのような代替リン酸緩衝液で製剤化した場合に、より高いＴｍに向かう予想外の有意なシフトを特定した。より高いＴｍに向かうこのシフトは、ヘモペキシンに対する安定化効果を示している。
【００９２】
同様に、本発明者らは、精製ヘモペキシンをＰＢＳで製剤化した場合に、ヘモペキシン凝集体（ヘモペキシンダイマーを含む）およびヘモペキシン断片の量の増加によって証明されるように、経時的な溶液中のヘモペキシンの有意な分解があることを発見した。例えば、３７℃で３カ月間の貯蔵後、ヘモペキシンのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中液体製剤は、５４．６％ｗ／ｗの凝集体、３．１％ｗ／ｗのダイマーおよび９．８％のヘモペキシン断片を含有しており、わずか３２．５％ｗ／ｗのヘモペキシンモノマーしか残っていなかった。このことは、ヘム結合活性の喪失によっても反映された。対照的に、精製ヘモペキシンを、少なくとも１５ｍＭの代替リン酸緩衝液（例えば、クエン酸塩リン酸塩またはリン酸ナトリウムのような）と組み合わせてＮａＣｌ溶液で製剤化し、３７℃で同じ期間貯蔵すると、溶液中のヘモペキシン凝集体および断片の割合は有意に減少し、５０％超のヘモペキシンモノマーが溶液中に残っていた。このことは、ヘム結合の保護でも反映され、ヘモペキシンに対する有意な安定化効果を示している。本明細書に開示される一実施形態では、ＮａＣｌおよびリン酸緩衝液を含む溶液中のモノマーヘモペキシンの濃度は、サイズ排除ＨＰＬＣによって測定した場合に、総タンパク質の少なくとも７５重量％、少なくとも８０重量％、少なくとも９０重量％または少なくとも９５重量％である。
【００９３】
好ましくは、本明細書に開示される液体製剤は、少なくとも２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１２カ月、１８カ月、２４カ月、３６カ月またはそれ以上の間、元の安定性の特徴を実質的に保持する。例えば、２〜８℃または２５℃で貯蔵した液体製剤は、１カ月以上貯蔵した場合に、典型的にはＨＰＬＣ−ＳＥＣによって測定した場合に実質的に同じ分子サイズ分布を保持する、または実質的に同じヘモペキシンモノマー含有量を保持する。液体製剤の特定の実施形態は、２〜８℃および／または２５℃室温で貯蔵した場合、少なくとも３カ月間またはそれ以上の間でさえ安定で、商業的な医薬使用に適していることができる。
【００９４】
本明細書に開示される一実施形態では、液体製剤は、３７℃で１カ月間貯蔵した場合に、少なくとも７０％のヘモペキシンモノマーを含む。
【００９５】
本明細書に開示される一実施形態では、液体製剤は、３７℃で２カ月間貯蔵した場合に、少なくとも５０％のヘモペキシンモノマーを含む。
【００９６】
本明細書に開示される一実施形態では、液体製剤は、３７℃で３カ月間貯蔵した場合に、少なくとも５０％のヘモペキシンモノマーを含む。
【００９７】
本明細書に開示される一実施形態では、液体製剤は、３７℃で１カ月間貯蔵した場合に、少なくとも８０％のヘモペキシンモノマーを含む。
【００９８】
本明細書に開示される一実施形態では、液体製剤は、３７℃で２カ月間貯蔵した場合に、少なくとも７０％のヘモペキシンモノマーを含む。
【００９９】
本明細書に開示される一実施形態では、液体製剤は、３７℃で３カ月間貯蔵した場合に、少なくとも６０％のヘモペキシンモノマーを含む。
【０１００】
本明細書に開示される液体製剤は、薬学的に許容される担体を用いて製剤化することができる。適切な薬学的に許容される担体、希釈剤および／または賦形剤は当業者に知られている。例としては、溶媒、分散媒、抗真菌および抗菌剤、界面活性剤、等張剤ならびに吸収剤などが挙げられる。
【０１０１】
製剤を、分注および長期貯蔵する前に濾過によって滅菌することもできる。本明細書に記載される組成物は、注射可能な製剤のような多くの可能な剤形のいずれかに製剤化することができる。製剤化およびその後の投与（投薬）は当業者の技能の範囲内である。投薬は、対象の治療に対する反応性に依存するが、望ましい効果（例えば、ヘムレベルの低下）が望まれる限り一定に続く。当業者であれば、最適投与量、投薬方法および繰り返し率を容易に決定することができる。
【０１０２】
本発明の別の態様では、液体製剤中のヘモペキシンのヘム結合活性を決定する方法であって、
（ａ）ヘムとヘム担体分子の複合体を準備することと；
（ｂ）（ａ）の複合体を、ヘモペキシンを含む液体製剤と混合し、ヘムが担体分子からヘモペキシンに移動するのを可能にする期間にわたって、混和物をインキュベートすることと；
（ｃ）４５０ｎｍ〜７００ｎｍの範囲から選択される２つまたはそれ以上の波長で（ｂ）の混和物の吸光度を測定することと
を含み、（ｃ）で測定される２つまたはそれ以上の波長での吸光度値間の差は、液体製剤中のヘモペキシンのヘム結合活性を示す方法が提供される。
【０１０３】
本開示のこの態様は、ヘムがアルブミンまたはヘモペキシンに結合している場合のヘムの異なるスペクトル特徴を使用して、溶液中のヘム−ヘモペキシン複合体の濃度、したがって、ヘモペキシンのヘム結合活性を決定することができるという本発明者らの知見に基づく。一実施形態では、モル過剰のヘム担体分子複合体を、ヘモペキシンを含む液体製剤（必要に応じて、リン酸緩衝食塩水のような適切な緩衝溶液に希釈している）と混合し、ヘムがヘム担体タンパク質からヘモペキシンに移動するのを可能にする期間にわたって、混和物をインキュベートする。次いで、混合物の吸光度を、可視スペクトルの最低２つの波長で測定する。次いで、ベールの法則を、担体分子およびヘモペキシンに結合したヘムについての吸光係数ならびに測定された吸光度値に使用して、得られたヘム−ヘモペキシン複合体の濃度を計算することができる。この濃度を典型的には、アッセイ中に行われる元のヘモペキシン溶液の希釈について補正すると、得られた濃度は、元の液体製剤中の活性ヘモペキシンの量に対応する。ヘム担体分子は、典型的にはヘモペキシンよりも低い親和性でヘムに結合し、一般的に水性環境でヘムに結合することができる。ヘム担体分子の適切な例は当業者に周知されており、その例示的な例としては、ヘモグロビンおよびアルブミンが挙げられる。よって、本明細書に開示される一実施形態では、ヘム担体分子は、ヘモグロビンおよびアルブミンからなる群から選択される。ヘム担体分子が、自然に存在する分子（例えば、ヘモグロビンもしくはアルブミンのような血清由来ヘム担体）であってもよいし、または自然に存在しなくてもよい（例えば、ヒト組換えアルブミンのような組換え的に産生された担体分子）ことが当業者によって理解されるだろう。一実施形態では、ヘム担体タンパク質はアルブミンである。より好ましくは、ヘム担体タンパク質はヒトアルブミンである。アルブミンを使用する利点には、（ｉ）これが容易に入手可能であり、（ｉｉ）これが血漿中で生理的に関連するヘム担体であり、（ｉｉｉ）これがヘムをヘモペキシンに移動させることが知られており、（ｉｖ）これがヘムと規定の１：１複合体を形成することが含まれる（Ａｓｃｅｎｚｉ＆Ｆａｓａｎｏ、２００９、Ｌｉｆｅ、６１（１２）１１１８〜１１２２参照）。
【０１０４】
ヘムが担体分子からヘモペキシンに移動した場合に吸光度変化を示す最低２つの波長が必要である。一実施形態では、２つまたはそれ以上の波長は、一方の波長での吸光度が増加し、他方の波長での吸光度が減少するように選択される。２つまたはそれ以上の波長の間の吸光度の変化の大きさが大きくなるほど、ヘム結合活性の決定における方法の感度が高くなることが予想される。急勾配上ではなく、混合スペクトルのピークまたは谷の近くの波長が好ましく、方法を分光光度計較正の誤差に対してより寛容性にすることができる。本明細書における「４５０ｎｍ〜７００ｎｍ」への言及は、４５０ｎｍ、４６０ｎｍ、４７０ｎｍ、４８０ｎｍ、４９０ｎｍ、５００ｎｍ、５１０ｎｍ、５２０ｎｍ、５３０ｎｍ、５４０ｎｍ、５５０ｎｍ、５６０ｎｍ、５７０ｎｍ、５８０ｎｍ、５９０ｎｍ、６００ｎｍ、６１０ｎｍ、６２０ｎｍ、６３０ｎｍ、６４０ｎｍ、６５０ｎｍ、６６０ｎｍ、６７０ｎｍ、６８０ｎｍ、６９０ｎｍおよび７００ｎｍを含む。可視スペクトルでは、アルブミンに結合したヘムは、約５００ｎｍ、５３３ｎｍおよび６２２ｎｍで吸光度ピークを有するが、ヘモペキシンに結合したヘムは、約５３３ｎｍおよび５６５ｎｍで吸光度ピークを有する。よって、本明細書に開示される一実施形態では、２つまたはそれ以上の波長は、５００ｎｍ〜６３０ｎｍの範囲から選択される。１つの好ましい実施形態では、２つまたはそれ以上の波長は、５００ｎｍ、５３３ｎｍおよび６２２ｎｍからなる群から選択される。さらなる実施形態では、２つまたはそれ以上の波長は５３３ｎｍおよび６２２ｎｍである。６２２ｎｍでの吸光度は、ヘムがアルブミンからヘモペキシンに移動した場合の吸光度の変化の大きさがより大きいために５００ｎｍよりも有利である（これらの両方が同じ変化の向きを示す）。
【０１０５】
これらの波長でのヘム移動混合物の吸光度ならびにヘム−アルブミンおよびヘム−ヘモペキシンの吸光係数に基づいて、ヘム−ヘモペキシン複合体の濃度を計算することができる。最終的な混合物で決定されるヘム−ヘモペキシンの量は、生物学的に活性なヘモペキシンの量を表す。インキュベーション時間および温度は、典型的には溶液中でのヘム結合分子からヘモペキシンへのヘムの移動を可能にするよう選択される。この方法は、典型的には全ての活性ヘモペキシン分子を完全に飽和させるのに十分なヘムが存在することを保証するために、ヘモペキシンに対してかなり過剰のヘム−アルブミン（およそ２．５倍）が存在するように行われる。本明細書に開示される一実施形態では、インキュベーションは、２０〜２５℃または３７℃で約５〜６０分間行われる。１つの好ましい実施形態では、インキュベーションは３７℃で１０〜２０分間行われる。混和物のｐＨおよび緩衝液濃度は、典型的にはヘム担体分子がヘムをヘモペキシンに移動させることを可能にするよう選択される。１つの好ましい実施形態では、ｐＨは生理的条件に近い；すなわち、約ｐＨ６．５〜７．５である。一実施形態では、ｐＨは７．０である。ヘム結合分子およびヘモペキシンの濃度は、２つまたはそれ以上の波長での全吸光度が、分光光度計の直線範囲内にあるように選択される。この方法は、混和物中の全ての活性ヘモペキシン分子を完全に飽和させるのに十分なヘムが存在することを保証するために、ヘモペキシンに対してかなり過剰量のヘム担体分子（例えば、約２．５倍）が存在するように設定することができる。
【０１０６】
本明細書に開示される一実施形態では、液体製剤は、２〜８℃で６カ月間貯蔵した場合に、ヘム結合活性を有する少なくとも９０％のヘモペキシンを含む。
本明細書に開示される一実施形態では、液体製剤は、室温（例えば、２５℃）で６カ月間貯蔵した場合に、少なくとも９０％のヘモペキシンモノマーを含む。
【０１０７】
本明細書に開示される一実施形態では、液体製剤は、３７℃で６カ月間貯蔵した場合に、少なくとも５０％のヘモペキシンモノマーを含む。
【０１０８】
治療方法
本発明の別の態様では、溶血に関連する状態を治療する方法であって、本明細書に開示される精製ヘモペキシンの安定な液体製剤を含む、からなるまたはから本質的になる組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法が提供される。
【０１０９】
本明細書で使用される「対象」という用語は、霊長類（例えば、下等または高等霊長類）を含む動物を指す。高等霊長類はヒトを含む。本発明はヒトでの標的状態への特定の用途を有するが、非ヒト動物も本明細書に開示される組成物および方法から利益を得ることができることが当業者によって理解されるだろう。よって、本発明はヒト用途と獣医学用途の両方を有することが当業者によって理解されるだろう。便宜上、「動物」は、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ラクダ、ヤギ、ロバ、イヌおよびネコのような家畜および伴侶動物を含む。ウマに関しては、これらは競馬産業で使用されるウマならびに娯楽的または家畜産業で使用されるウマを含む。
【０１１０】
本発明の組成物および製剤は、いくつかの方法で対象に投与することができる。適切な投与経路の例としては、静脈内、皮下、心房内または輸注が挙げられる。一実施形態では、組成物または製剤が静脈内投与される。別の実施形態では、組成物または製剤が皮下投与される。
【０１１１】
必要な場合、本発明の方法は、第２の治療剤を投与することをさらに含むことができる。第２の治療用化合物は、順次に（本明細書に開示される組成物もしくは製剤の投与の前もしくは後に）または同時に、対象に共投与することができる。一実施形態では、第２の治療剤は鉄キレート剤（例えば、デフェロキサミンまたはデフェリプロン）である。
【０１１２】
本発明の別の態様では、溶血に関連する状態を治療するための医薬品の製造における、本明細書に開示される本発明の組成物または製剤の使用が提供される。このような組成物または製剤は、好ましくはヒト患者での使用に適している。
【０１１３】
本発明の別の態様では、それを必要とする対象の溶血に関連する状態の治療に使用するための、本明細書に開示される本発明の組成物または製剤が提供される。
【０１１４】
溶血に関連するまたはヘモグロビン／ヘム媒介毒性のリスクがある状態は当技術分野で知られている。一実施形態では、状態が急性溶血性状態および／または慢性溶血性状態から選択される。一実施形態では、状態は、溶血性貧血、骨髄無形成発症、高度溶血発症、輸血誘発性溶血、溶血性尿毒症症候群、心筋梗塞、急性胸部症候群、肺高血圧症、下肢潰瘍、成長遅滞、骨梗塞、子癇前症、腎不全、急性腎障害、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、出血性脳卒中を含む脳卒中、頭蓋内出血（ＩＣＨ）、脾臓血球貯留、脾梗塞、自己免疫疾患（例えば、自己免疫溶血性貧血）、微生物感染または易感染性増加（例えば、マラリア感染）、外傷、移植関連状態、心肺バイパス術を使用した開心術、および熱傷（熱傷後の溶血を伴うヘモグロビン血症またはヘモグロビン尿の治療を含む）からなる群から選択される。
【０１１５】
一実施形態では、状態は、鎌状赤血球貧血、遺伝性球状赤血球症、遺伝性楕円赤血球症、サラセミア、先天性赤血球異形成貧血および発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、全身性エリテマトーデスおよび慢性リンパ性白血病からなる群から選択される。
【０１１６】
一実施形態では、状態は、出血性脳卒中および頭蓋内出血（ＩＣＨ）からなる群から選択される。
【０１１７】
一実施形態では、状態は、溶血および炎症を引き起こす、遺伝子または遺伝性の疾患または障害である。
【０１１８】
一実施形態では、状態はＡＲＤＳである。
【０１１９】
当業者であれば、本明細書に記載される本発明が、具体的に記載されているもの以外の変形および修正が可能であることを理解するだろう。本発明が、精神および範囲内に含まれる全てのこのような変形および修正を含むことを理解すべきである。本発明はまた、個別にまたは集合的に本明細書で言及されているまたは示されている工程、構成、組成物および化合物の全て、ならびに前記工程または構成のいずれか２つまたはそれ以上のいずれかのおよび全ての組み合わせも含む。
【０１２０】
本発明の一定の実施形態をここで、以下の実施例を参照して記載するが、これらの実施例は例示目的のみを意図しており、上に記載される一般性の範囲を限定することを意図するものではない。
【０１２１】
実施例
材料および方法
Ａ．サンプル製造
報告されている製剤開発のために、ヘモペキシン（Ｈｐｘ）をＫａｎｋａｋｅｅのヒト血漿（Ｋｉｓｔｌｅｒ−Ｃｏｈｎ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ  ＩＶ）から精製した。精製方法の詳細は、その内容全体を参照によって本明細書に組み入れる、国際公開第２０１４／０５５５５２号に以前記載された方法に基づいた。精製Ｈｐｘを、タンパク質濃度３〜４％で、ＰＢＳ、ｐＨ７．４で提供した。
【０１２２】
Ｃａｒｙ６０分光光度計（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度を測定することによって、製剤のタンパク質濃度を決定した。手短に言えば、タンパク質溶液を、機器の精度範囲内（＜１．５ｍｇ／ｍＬ）の濃度までＮａＣｌ  ０．９％に希釈し、ＵＶ−Ｖｉｓ使い捨てキュベット（経路長：１ｃｍ）に入れた。測定した吸光度を、吸光係数１．９７１を使用して、ランベルト・ベールの法則に従って変換した：Ａ＝ε×ｃ×ｌ（式中、ｃは濃度であり、ｌはキュベットの経路長（ｃｍ）であり、εは吸光係数であり（２８０ｎｍで０．１％；１ｃｍ経路長）、Ａは所与の波長での吸光度である）。タンパク質濃度を、２つの独立した測定からの平均ｍｇ／ｍＬとして表した。
【０１２３】
ＤＳＦ実験のために、Ｈｐｘを、調査の緩衝液／賦形剤に最終濃度０．１ｍｇ／ｍＬまで希釈した。ストレス誘導安定性試験のためのより高度に濃縮された（最大３５％）Ｈｐｘ製剤は、１０ｋＤａ  ＭＷカットオフ濾過カセット（ＰＥＳ、５０ｃｍ２、ＰＡＬＬ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、Ａｋｔａフラックス装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によるダイアフィルトレーションによって得た。
【０１２４】
Ｂ．安定性試験
【０１２５】
【表２】
2020530027.tif 000003
【０１２６】
Ｃ．示差走査蛍光定量（ＤＳＦ）
示差走査蛍光定量（ＤＳＦ）は、様々な安定剤および賦形剤の存在下での精製タンパク質の熱安定性を調査する迅速な方法である。タンパク質がアンフォールドする温度は、タンパク質がアンフォールドするにつれて露出するタンパク質の疎水性部分に対する親和性を有する色素の蛍光の増加によって測定される。Ｎｉｅｓｅｎら（Ｎｉｅｓｅｎ、２００７）によるアッセイプロトコルを適宜適合および修正した。手短に言えば、精製Ｈｐｘ（およそ４％）を、様々な賦形剤の存在下で所望の緩衝液に最終タンパク質濃度０．１ｍｇ／ｍＬまで希釈した。０．１ｍｇ／ｍＬタンパク質２０μＬおよびＳＹＰＲＯオレンジ（ＰＢＳに１：４００に事前希釈）０．５μＬを添加することによって、サンプルをＰＣＲプレートのウェルに分配した。各条件を３連で測定した。プレートを光学用箔で密封し、短時間遠心沈殿してウェルの底で全ての溶液を回収した。２５℃から８０℃までの温度傾斜（０．５℃／分）をＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲシステム（ＢｉｏＲａｄ）で行い、励起波長および発光波長をそれぞれ４９２ｎｍおよび６１０ｎｍに設定した。データ収集をＣＦＸ  Ｍａｎａｇｅｒ（商標）ソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ）で行った。温度上昇によるタンパク質のアンフォールディングを通して、新たに露出した疎水性区画と結合している色素によって６１０ｎｍでの強力な蛍光が発せられた。このようにして、各条件についての融解曲線を図２に示されるように作成した。ピークになった後、蛍光強度は徐々に減少したが、これはタンパク質が沈殿および凝集によって溶液から取り除かれることによって主に説明される。ピークのＳ字状上昇曲線は二相転移によって説明することができ、各融解曲線の変曲点をＴｍの決定に使用した（一次微分）。Ｈｐｘを（不）安定化する緩衝液条件を特定するために、各スクリーニング条件下のタンパク質のＴｍ値を参照Ｔｍ（ＰＢＳ、ｐＨ７．４中のＨｐｘ）と比較した。
【０１２７】
Ｄ．ヘム結合アッセイＩ
Ｌｉｐｉｓｋｉ（２０１３；Ｈｕｍａｎ  Ｈｐ１−１  ａｎｄ  Ｈｐ２−２  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｈａｐｔｏｇｌｏｂｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ａｒｅ  Ｂｏｔｈ  Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  Ｇｕｉｎｅａ  Ｐｉｇｓ  ｔｏ  Ａｔｔｅｎｕａｔｅ  Ｈａｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ＆Ｒｅｄｏｘ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ、１９（１４）、１６１９〜１６３３頁）によって以前記載された方法を適合させることによって、ヘム結合を測定した。手短に言えば、ｍｅｔ−Ｈｂ（Ｆｅ３＋）（ＰＢＳ中１５μＭ）またはヒトアルブミンに結合したヘミン（ＰＢＳ中２５μＭ）を、１０μＭヒトＨｐｘとインキュベートした。経時的なｍｅｔ−Ｈｂ／ヘミンのヘム−Ｈｐｘへの移行を追跡するために、Ｃａｒｙ  ６０  ＵＶ−ＶＩＳ分光光度計（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、連続的ＵＶ−ＶＩＳスペクトルを記録した（３５０〜６５０ｎｍ）。各時点で、ＳｃｉＰｙ（ｗｗｗ．ｓｃｉｐｙ．ｏｒｇ）のＬａｗｓｏｎ−Ｈａｎｓｏｎ’ｓ  Ｎｏｎ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｌｅａｓｔ  Ｓｑｕａｒｅｓアルゴリズムを適用することによって、フルスペクトルのデコンボリューションによって、反応混合物中のｍｅｔ−Ｈｂ／ヘミンおよびヘム−Ｈｐｘの濃度を決定した。デコンボリューションスクリプトはＵＺＨ（Ｊ．ＤｅｕｅｌおよびＤ．Ｓｃｈａｅｒ）によって提供された。プラトーに到達した後、少なくとも１５のデータポイントを平均し、移動したヘムの量（μＭ）として表した。Ｈｐｘ活性を、最初に適用したＨｐｘの総量と比較したヘム／ヘミン結合Ｈｐｘの量としての百分率で表した。
【０１２８】
Ｅ．ヘム結合アッセイＩＩ
以下は、溶液中の活性ヘモペキシンの量を測定するための代替アッセイである。
【０１２９】
ヘモペキシンは、知られているタンパク質の中で最も高い親和性でヘミン（フェリヘムとしても知られている、クロリド配位子を有し鉄（ＩＩＩ）を含有するプロトポルフィリンＩＸからなる、ヘムの完全酸化型）に結合し、アルブミンに結合しているヘミンと競合することができる。ヘミンは、ソーレー領域に特徴的な強い吸収帯を有すると同時に、スペクトルの可視領域にあまり強くない帯を有する。これらの帯の吸収極大のシフトは、溶液中のヘミンの酸化および配位子結合状態に依存する。遊離ヘミンは、３８５ｎｍに吸収極大を有するので、これを溶液中の遊離ヘミンの正確な濃度決定に使用することができる。可視領域では、アルブミンに結合したヘミンのスペクトルは、５００ｎｍ、５３３ｎｍおよび６２２ｎｍに極大のピークを有し、ヘモペキシンに結合したヘミンのスペクトルは、５３３ｎｍおよび５６５ｎｍにピーク極大を有する。この方法では、精製ヘモペキシンを過剰量のヘム−アルブミン複合体に添加し、分光光度法を使用して、５３３ｎｍおよび６２２ｎｍでのアルブミンからヘモペキシンへのヘミン移動中の吸光度変化を測定する。上記波長でのヘミン移動混合物の吸光度ならびにヘム−アルブミンおよびヘム−ヘモペキシンの吸光係数に基づいて、ヘム−ヘモペキシン複合体の濃度を計算することができる。最終混合物で決定されるヘム−ヘモペキシンの量は、活性ヘモペキシンの量に相当する。
【０１３０】
略語：
ＣＶ  変動係数
Ｈｐｘ  ヘモペキシン
ＰＢＳ  リン酸緩衝食塩水
ＰＶＤＦ  ポリフッ化ビニリデン
Ｑ．Ｓ．  適量
ＳＯＰ  標準業務手順書
ＵＶ  紫外線
Ｖｉｓ  可視
【０１３１】
材料および装置：
・ヘミン：Ｆｒｏｎｔｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｈ６５１−９。
・精製ヒトアルブミン：すなわち、ＣＳＬＢ  Ａｌｂｕｍｉｎａｒ  ２５％またはＡｌｂｕＲｘ  ２５％。
・ヘモペキシン対照および試験用サンプル。
・ＰＢＳ  ｐＨ７．４：ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ２８３４８  ２０×濃縮物または等価物。
・リン酸：Ｆｉｓｈｅｒ  Ａ２６０−５００、８５重量％（１４．６２Ｍに相当）。
・水：Ｆｉｓｈｅｒ  Ｗ５−４、ＨＰＬＣグレードまたはそれ以上。
・使い捨てＵＶキュベット：１．５ｍＬ、セミミクロ（１２．５×１２．５×４５ｍｍ）カタログ番号：７５９１６５、ブランドＧｍｂＨ、１ｃｍ経路長。
・０．２２μｍ  ＰＶＤＦシリンジフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＳＬＧＶ０３３ＲＳ、低タンパク質結合Ｄｕｒａｐｏｒｅまたは等価物）。
・サーモスタットマルチセルチャンバーを備えたＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計（または等価物）。
・較正した調整可能なピペット。
・較正したｐＨメーター。
【０１３２】
手順
（ｉ）緩衝液製造
５Ｍリン酸溶液：８５重量％リン酸３．４２ｍＬを脱イオン水２．５ｍＬにゆっくり添加する。１×ＰＢＳ：２０×ＰＢＳ濃縮物を脱イオン水に希釈して１×ＰＢＳにする。
【０１３３】
（ｉｉ）ヘム−アルブミン複合体の製造
ヘミンおよそ６６ｍｇを、０．１Ｍ  ＮａＯＨを使用して、メスフラスコ中で溶解して、Ｑ．Ｓ．〜１０ｍＬにし、３７℃で３分間インキュベートし、最終濃度約１０ｍＭに調整した。ヘミンストック溶液の濃度を決定するために、最終的な希釈係数が１０００で、ヘミン濃度が約１０μＭとなるように、ヘミン溶液５００μＬを５ｍＭ  ＮａＯＨ  ４５００μＬに添加することによって、１０倍系列希釈を３回行った。ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計を５ｍＭ  ＮａＯＨでゼロに合わせ、希釈溶液の吸光度をＡ３８５で読み取り、以下の式１を使用して、ヘミンストックについての実際の濃度（ｍＭ）を計算した。５ｍＭ  ＮａＯＨ中のヘミン吸光係数は５８４００Ｍ−１ｃｍ−１である（Ｋｉｒｓｃｈｎｅｒ−Ｚｉｌｂｅｒら、１９８２；Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  ６９０：２０〜３０頁）。
【０１３４】
式１
ｃ上記のステップ（ｉｉ）からのストックヘミン＝Ａ３８５÷５８４００×１０６
【０１３５】
ストックヘミン溶液およそ２．５ｍＬを、０．１Ｍ  ＮａＯＨを使用して１０ｍＬに希釈した（４倍希釈、およそ２．５ｍＭ）。２５％アルブミン８ｍＬ、ＨＰＬＣグレードの水２ｍＬおよび０．１Ｍ  ＮａＯＨ溶液中２．５ｍＭヘミン１０ｍＬを混合し、次いで、３７℃で１時間インキュベートした。５Ｍリン酸（約８０〜１００μＬが必要であった）でｐＨを７．４に調整した。メスフラスコ中、ＨＰＬＣグレードの水またはそれ以上のものを使用して希釈溶液をＱ．Ｓ．〜２５ｍＬにし、次いで、０．２２μｍフィルターに通過させ、必要に応じて−８０℃でのその後の貯蔵のために０．５ｍＬに分割した。アルブミンの最終濃度は約１．２１ｍＭ（６６ｋＤａ、８０ｍｇ／ｍＬに基づく）であった。ヘム−アルブミン複合体の最終濃度は、上記の式１から計算したストックヘミン濃度を総希釈係数１０で割ったものに等しい。
【０１３６】
（ｉｉｉ）ヘモペキシン試験サンプル希釈
較正した調整可能なピペットを使用して、ヘモペキシン溶液を、ＰＢＳ中およそ１０ｍｇ／ｍＬのヘモペキシンに希釈した。
【０１３７】
（ｉｖ）ヘモペキシンアッセイ対照
ヘモペキシンアッセイ対照は、確立された（既知の）機能的活性を有するヘモペキシンサンプルとした。ヘモペキシン試験サンプルを分析する場合、アッセイ対照を各アッセイに含めた。ヘモペキシン対照サンプルの活性値を確立するために、上記のヘム移動アッセイを、対照サンプルで異なる日に少なくとも３回行うことができる。異なる繰り返しのＣＶ％は理想的には１０％以内になり、さもなければ新たに作製した緩衝液および試薬でアッセイを繰り返した。
【０１３８】
（ｖ）アルブミンからヘモペキシンへのヘム移動
プラスチックキュベット中で、ヘム−アルブミン溶液２５０μｌを、１０ｍｇ／ｍＬヘモペキシン試験サンプルまたはアッセイ対照６００μＬ、およびＰＢＳ１１５０μＬと混合した。次いで、各サンプルについての混合物を、上に概説されるように、単一ヘモペキシン希釈を使用して３連で製造した。混合物を３７℃で１０〜２０分間インキュベートし、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｒｅａｄｓ  Ｍｏｄｅおよび１８セルホルダーを使用して、ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計で吸光度値を測定した。測定前にＰＢＳを使用して分光光度計を０に合わせた。以下の設定を使用した：
・波長：５３３ｎｍ、６２２ｎｍおよび７００ｎｍ。平均時間：１秒。キュベット温度：３７℃。
【０１３９】
（ｖｉ）計算、データ分析および受入れ基準
７００ｎｍでの吸光度値を、典型的には読取り値の最小限の光散乱干渉を保証するために０．１ＡＵ未満に維持した。次いで、ヘム−ヘモペキシン（すなわち、総活性ヘモペキシン）の濃度を、以下の式２を使用して、各移動反応について計算した。計算したヘモペキシン濃度をμＭ単位で報告し、キュベットは１ｃｍの経路長（ｌ）を有していた：
式２
【数１】
2020530027.tif 000004
【０１４０】
次いで、結果に希釈係数を掛けて、元の溶液中の活性ヘモペキシン濃度を決定した。次いで、各サンプルの３連を平均した。アッセイ対照についての平均活性ヘモペキシン濃度は、典型的にはアッセイ対照のそのバッチについて前に確立された値の１０％以内であるべきである。
【０１４１】
Ｆ．安定性評価および指示するタンパク質特性評価の方法
表２は他の全てのアッセイおよび手順を要約しており、これらをＨｐｘ安定性およびタンパク質特性評価のさらなる調査に使用した。
【０１４２】
【表３】
2020530027.tif 000005
【実施例１】
【０１４３】
精製（ＰＢＳ製剤化）ヒトヘモペキシンの生化学的特性評価
最初のアプローチでは、精製ＰＢＳ製剤化Ｈｐｘをいくつかの生化学的方法によって分析して、分析ベンチマーク（参照値）を設定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＳＥＣ−ＨＰＬＣデータは、精製Ｈｐｘについて９８％超のタンパク質純度を実証した（図３）。他者（Ｍａｕｋ、２０１１）によって以前示されているように、Ｈｐｘは、非還元条件（およそ６０ｋＤａ）と比較して、還元条件下で増加した分子量（およそ６５〜７０ｋＤａ）を示した（図３Ａ）。ＳＥＣ−ＨＰＬＣによる分子サイズ分布は、５７ｋＤａのモル質量を有するモノマーＨｐｘに対応する１つの主ピークを明らかにした（ＳＬＳ測定によって確認、図３Ｃ）。老化および熱ストレスサンプルでは、２つの別個のフラグメントピークを特定することができ（３２〜３５ｋＤａおよび１７〜２０ｋＤａ）、２つのピークはより高分子量の種に対応し、そのうちの一方はＨｐｘダイマー（１３０〜１３８ｋＤａ）と特定された。第２のピークはさらに高い分子量に対応し、より高次のポリマーまたは凝集体を反映していた。
【０１４４】
さらに、等電点電気泳動によって、図３Ｂに示されるように、ｐＨ６．５５の理論上の等電点を確認することができ（およそｐＨ６）、複数のＨｐｘバンドを炭水化物変動性、特にＭａｕｋ、２０１１によって記載されているシアリル化の程度に帰することができた。２Ｄ−ＰＡＧＥ分析は、ごく微量の不純物を明らかにした。
【０１４５】
最後に、ヒトヘモペキシンを最大３５０ｇ／Ｌ（３５％）まで濃縮し（ＰＢＳ、ｐＨ７．４で製剤化）、サンプルを断続的に採取して、対応するタンパク質濃度での溶液粘度を分析した（図３Ｄ）。以下に示されるように、最大３００ｇ／Ｌの濃度まで、粘度が２０ｍＰａ＊Ｓ未満のままであり、これはいずれの送達システムにとっても許容的粘度と考えられる（Ｄｕ、２０１１；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、６３２〜６３６頁）。
【実施例２】
【０１４６】
緩衝液スクリーニング
いくつかの緩衝液候補を定義し、熱安定性に関して最適な緩衝液条件についてのスクリーニングをＤＳＦによって行った。このハイスループット法は、ＤＳＣデータ（示差走査熱量測定（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ））と非常によく相関することが示されたが、いくつかの条件を同時に分析することができるという利点を有する。最初のスクリーニングで、全ての緩衝液を、１５０ｍＭ塩化ナトリウムの存在下および非存在下で、ならびに対応する緩衝液の緩衝能範囲内の少なくとも０．５のｐＨ段階で分析した。以下の表３に、分析した条件全てを要約している。さらに、以下の表３に示されるように、Ｈｐｘにとって最も有望な緩衝液環境（Ｄ、ＧおよびＫ）を、様々な緩衝液濃度（１５〜３００ｍＭ）および様々な塩化ナトリウム濃度（５０〜６００ｍＭ）の添加に関してさらに分析した。
【０１４７】
【表４】
2020530027.tif 000006
【０１４８】
各条件について、対応するＴｍ値を決定し、参照ＴｍになるＰＢＳ、ｐＨ７．４中Ｈｐｘと比較した。結果を絶対Ｔｍとしてまたは参照（ＰＢＳに希釈したＨｐｘのＴｍ）に対するΔＴｍとして表した。図４Ａに示されるように、３つの緩衝液（ａ、ｂおよびｃ；クエン酸塩リン酸塩、リン酸ナトリウムおよびグリシン）は、明らかに高いＨｐｘのＴｍへの熱シフトを誘導し、タンパク質に対する安定化効果を暗示した。さらに、塩化ナトリウムの非存在下では、３つの緩衝液全てがタンパク質融解の早期開始を示し（付属書類Ａに示されるデータ；スクリーニングＩ）、安定剤としての塩化ナトリウムの必要性を実証した。この所見を、３つの安定化緩衝液に様々な濃度の塩化ナトリウム（５０〜２５０ｍＭ）を補充することによってさらに分析した。図４Ａおよび図４Ｂに示されるように、塩化ナトリウムの濃度が増加すると、用量依存的に熱安定性の増強を達成することができた。試験した全ての緩衝液によって広範なｐＨ範囲を網羅することができたが、図４Ｃによると、ｐＨ７．０〜７．６が最適な条件であるように思われた。
【０１４９】
クエン酸塩リン酸塩緩衝液（２００ｍＭ）で１５０ｍＭ  ＮａＣｌの存在下、ｐＨ７．２で製剤化されたＨｐｘはかなり良好な熱安定性（ΔＴｍ：７℃）をもたらしたが、得られた容量オスモル濃度は都合悪く高かった（およそ８８０ｍＯｓｍ／Ｌ）。そのため、図４Ｄに示されるように、クエン酸塩リン酸塩濃度と塩化ナトリウム濃度のいくつかの組み合わせを分析した。低いクエン酸塩リン酸塩濃度で同様の熱安定性を維持するために、より高い塩化ナトリウム濃度を適用することが必要であったが、これは溶液の全体的な容量オスモル濃度に全く影響を及ぼさないまた増加の影響さえ及ぼした。低い容量オスモル濃度は緩衝液と塩化ナトリウムの両方を低下させることによってのみ達成することができるが、これはまた熱安定性の減少を引き起こした。
【０１５０】
要約すると、中性ｐＨでクエン酸塩リン酸塩またはリン酸ナトリウムを含み、塩化ナトリウム（＞１５０ｍＭ）と組み合わせた緩衝液系は、少なくとも熱安定性に関しては、ヒト血漿由来のヘモペキシンに適切な製剤となるだろう。その後、ヘモペキシンを、以下の節に記載されるように上記の塩の様々な緩衝液系に様々な濃度の組み合わせでダイアフィルトレーションした。
【０１５１】
分析した全ての組み合わせの完全なデータセットは付属書類Ａに要約している。
【実施例３】
【０１５２】
賦形剤スクリーニング
３．１．糖
糖の熱安定性に対する影響を調査した。熱タンパク質安定性を増強した前に定義した緩衝液に、様々な濃度の様々な糖を補充した。手短に言えば、２．５％、５％、７．５％および１０％のスクロース、トレハロースまたはマンニトールを、以下の表４に示されるように、１５０ｍＭ  ＮａＣｌの存在下で、対応する緩衝液に添加した。
【０１５３】
【表５】
2020530027.tif 000007
【０１５４】
熱安定性を上記と同じ設定で評価し、結果を絶対ＴｍとしてまたはＰＢＳに希釈したＨｐｘのＴｍに対するΔＴｍとして表した。図５に示されるように、熱安定性の増加は全くないかまたはごくわずかであり、最高の糖濃度に限定された。定義によって、少なくとも１℃の変化を示すのに（破線として図に示される）、熱安定性に対する大きな効果が必要であった；これに満たない変化は全て測定誤差内である可能性が高かった。
【０１５５】
参照製剤（ＰＢＳ；Ｔｍ：５３℃）と比較して、Ｔｍが既に上昇していた（およそ６０℃）ので、クエン酸塩リン酸塩で製剤化したＨｐｘについては、試験した全ての糖が熱安定性に対する相加効果を有さなかった。リン酸ナトリウム製剤化Ｈｐｘの場合、３つ糖の添加で明らかな用量依存的増加があったが、また有意な増加は最高濃度でのみ達成された。グリシン製剤化Ｈｐｘでも、Ｔｍの糖用量依存的増加があったが、達成された熱安定性はそれでもまだクエン酸塩リン酸塩製剤によるものよりもはるかに低かった。
【０１５６】
３．２．アミノ酸
ＤＳＦスクリーニングを完了するために、賦形剤としてのアミノ酸をそのＨｐｘ安定化能力について分析した。報告されている刊行物に基づいてその潜在的な安定化効果に従ってアミノ酸を選択した。各サブタイプ、すなわち極性、帯電および疎水性アミノ酸を表した。分析した全ての条件の要約を以下の表５に示す。
【０１５７】
【表６】
2020530027.tif 000008
【０１５８】
各アミノ酸を、２つの異なる濃度（５０μＭおよび１００μＭ）で、ｐＨ７．２の２００ｍＭクエン酸塩リン酸塩緩衝液の存在下で分析した。１００μＭで不溶性であったため、グルタミン酸は５０μＭでのみ分析した。データを図６に提示しているが、糖で達成された結果と同様に、アミノ酸の添加によって熱安定性のわずかな増加しか達成されず、最も高い差はアルギニンおよびプロリンで見られた。これらの結果に基づくと、溶液中のヘモペキシンの安定性に対するアミノ酸の寄与は無視できると思われる。
【０１５９】
３．３．非イオン性界面活性剤：ポリソルベート８０（Ｐ８０）
非イオン性界面活性剤をタンパク質製剤に使用して、撹拌または振盪によるタンパク質凝集を阻害することができる。タンパク質を安定化する能力は、気液界面のような疎水性表面についてタンパク質分子を打ち負かし、それによってこれらの疎水性界面でタンパク質がアンフォールディングするのを防ぐ能力に主に起因する。この試験では、溶液中のヘモペキシンに対するポリソルベート８０（Ｐ８０）の潜在的な安定化効果を調査した。ＤＳＦ分析に使用される蛍光色素がＰ８０の疎水性尾部に結合するので、代替の安定性アッセイを使用してＨｐｘ製剤へのＰ８０の影響を評価した。手短に言えば、Ｈｐｘを最終タンパク質濃度１０％（１００ｍｇ／ｍＬ）に濃縮し、表６に示される（ｉ）２００ｍＭクエン酸塩リン酸塩、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２または（ｉｉ）ＰＢＳ、ｐＨ７．４に対してダイアフィルトレーションした。ポリソルベート８０を、０．００１％から初めて０．１％までの濃度で最終製剤化Ｈｐｘ溶液に添加した。非添加サンプルが対照になった。
【０１６０】
【表７】
2020530027.tif 000009
【０１６１】
Ｐ８０添加製剤を、以下の表７に示されるように、撹拌および凍結／解凍サイクルを含む様々なストレス条件に曝露して、室温（ＲＴ）および３７℃で３カ月の貯蔵期間にわたるその相対的な安定性を評価した。
【０１６２】
【表８】
2020530027.tif 000010
【０１６３】
最初の一連の実験で、各Ｈｐｘ製剤を、せん断応力下での製品の安定性を理解するための一定の撹拌に供して、非イオン性界面活性剤が、タンパク質安定性に関して有益であるかそうでないかを決定した。サンプルを、２５℃で４時間、１０００ｒｐｍでベンチトップサーモサイクラーで撹拌した。撹拌なしの同一のサンプルセットが対照になった。撹拌期間後、サンプルを図７に示されるようにＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析した。撹拌した製剤は、ストレスでの大規模な凝集もダイマーまたは断片形成の変化も示さなかった。さらに、８つの製剤全てを、−７０℃〜周囲温度の５連続凍結／解凍サイクルに供して、物理的安定性を評価した；また、凍結／解凍サイクルを受けない同一製剤のセットを対照として使用した。ＳＥＣ−ＨＰＬＣは、図７に示されるように、５連続凍結／解凍サイクル後に、未処理対照群と比較して、凝集体の量がわずかに増加することを明らかにした。この観察は具体的なＰ８０濃度と無関係に、８つの製剤全てでなされた。興味深いことに、凍結／解凍サイクルを受けた製剤は断片を全く示さなかった。
【０１６４】
ＳＥＣ−ＨＰＬＣは、具体的なＰ８０濃度と無関係ではあるが、連続凍結／解凍サイクル後に凝集体のわずかな増加を明らかにしたが、図８に示されるように、全てのサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元および非還元）によって分析した後、差は観察されなかった。さらに、ヘム結合アッセイによって実証された（図９）、Ｈｐｘがヘムに結合する能力は、様々なＰ８０濃度の存在によっては影響を受けなかった。種々のＰ８０濃度間のヘム結合能の差は、アッセイの変動性（＜５％）の範囲内であった。したがって、Ｐ８０は、試験したいずれの濃度および処理でもヘム結合を損なわなかった。
【０１６５】
上記のように、全ての製剤を、加速条件（３７℃）下およびＲＴで少なくとも３カ月間貯蔵し、サンプルを各貯蔵月後に分析した（以下の実施例４参照）。
【実施例４】
【０１６６】
種々の条件下での安定性試験
４．１．製剤製造
様々な貯蔵条件（短期間および長期間）下で、安定性試験を行うことによって、上記のＤＳＦに基づく以前の好ましい条件をさらに調査した。手短に言えば、ＰＢＳで製剤化したＨｐｘを、１０％Ｈｐｘに濃縮し、以下の表８に示される望ましい緩衝液および賦形剤組成にダイアフィルトレーションした。必要に応じて、０．２Ｍ  ＨＣｌまたは０．２Ｍ  ＮａＯＨを慎重に滴定してｐＨ調整を行った。その後、各製剤を滅菌濾過し、滅菌ガラスバイアルに充填し、０、１、２および３カ月または他に示される時点でのその後の分析のために様々な温度で貯蔵した。
【０１６７】
【表９】
2020530027.tif 000011
【０１６８】
４．２．ＰＢＳ中様々な濃度のポリソルベート８０による短期間安定性試験
ＰＢＳで製剤化したＨｐｘを１０％に濃縮し、その後、表８（Ｉ〜ＶＩ）に示されるように様々な濃度のＰ８０を添加した。
【０１６９】
全ての製剤を、光から保護して、室温および３７℃で３カ月間貯蔵した。各時点で、サンプルをＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析して、オリゴマーおよび断片の潜在的な生成を監視した。３カ月後の各Ｐ８０濃度についての分子サイズ分布結果を図１０に示す。
【０１７０】
３７℃での貯蔵後、Ｈｐｘ製剤の各々は、ＲＴで３カ月間貯蔵した製剤（凝集体の増加１％未満）と比較して、凝集体の有意な増加（３カ月後６３〜７０％）を示した。３７℃で３カ月間の貯蔵後の対照およびＰ８０含有サンプルのＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析からの％ピーク面積結果を以下の表９に示す。両貯蔵条件についての０、１、２および３カ月時点からの完全なＳＥＣ−ＨＰＬＣ結果は付属書類Ａに示す。
【０１７１】
【表１０】
2020530027.tif 000012
【０１７２】
さらに、ヘモペキシンのヘム結合能を３カ月の期間にわたって各時点で評価すると、データ（図１１）は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣデータ分析後に観察されたのと類似の様相を明らかにした。ヘム結合は、３７℃で３カ月間の貯蔵後に、９５％からおよそ２０〜２５％まで大いに減少し、これはその時点でのＨｐｘモノマーの量（表９）と極めてよく相関していた。また、他の濃度と比較して低いヘム結合活性を示した最高Ｐ８０濃度（０．１％、黒色曲線）を除いて、Ｐ８０濃度間の差は観察されなかった。
【０１７３】
ＲＴで３カ月間貯蔵したサンプルは、活性とＨｐｘモノマー含有量との間の類似の相関を示した。しかしながら、０．１％  Ｐ８０を含有するサンプルと他の全てのサンプルとの間の差は、ＲＴでは３７℃ほど明白でなかった（図１１Ｂ）。
【０１７４】
要約すると、０．０２％およびそれ未満のＰ８０濃度は、分子サイズ分布およびヘム結合活性に関して安定性を損なわなかった。ＰＢＳで製剤化したＨｐｘは、Ｐ８０濃度に関わらず、３７℃で３カ月間にわたってタンパク質モノマー含有量およびヘム結合活性の大幅な減少を示すことも分かった。したがって、ＰＢＳ製剤は、加速温度で、要求されるＨｐｘ安定性を提供しなかった。
【０１７５】
４．３．安定性試験：リード製剤
表８（ａ〜ｆ）に概説されるように、様々な緩衝液および塩濃度で製剤化したＨｐｘを製造した。全ての製剤にＰ８０を添加して最終Ｐ８０濃度０．００２％を達成し（ＰＢＳを除く）、光から保護して、２〜８℃、ＲＴ（２５℃）または３７℃で少なくとも６カ月間貯蔵した。各時点で、サンプルを採取し、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析に供して、Ｈｐｘのモノマー、オリゴマーおよび断片の量を測定した（表１０）。分子サイズ分布結果を図１２に示す。２〜８℃で貯蔵した場合、様々な製剤間で凝集体および断片の有意な変化は観察されず、モノマーＨｐｘ（９４％超）は、試験期間（２４カ月）全体を通して安定なままであった。同様に、ＲＴ（２４カ月）で貯蔵した製剤は、製剤と無関係に観察された経時的な断片のわずかな増加を除いて、ほぼ変化しないままであった。３７℃の貯蔵後、Ｈｐｘ製剤の各々は凝集体および断片の増加を示したが、クエン酸塩リン酸塩で製剤化したＨｐｘが最も安定な製剤であるように思われた。クエン酸塩リン酸塩製剤の安定性は、加速条件（３７℃）下６カ月後の６３．３％（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）および６８．９％（３００ｍＭ  ＮａＣｌ）Ｈｐｘモノマー含有量によって示されるように、塩化ナトリウム濃度の増加（製剤Ａおよび製剤Ｂ）によってさらに改善された。
【０１７６】
リン酸ナトリウム緩衝液を含む製剤は、あまり安定でなく、６カ月後に最大３６％の凝集体の増加を示した（より高い塩濃度または増加した緩衝液濃度の存在下でより良い結果）。断片含有量はＲＴおよび２〜８℃で極めて低いままであったが、３７℃では経時的におよそ２０％の断片が生成された。
【０１７７】
これらのデータは、ＤＳＦによって得られた熱安定性データと極めて良く相関していた。したがって、具体的な製剤でのＨｐｘのＴｍを、より高いタンパク質濃度での短期間安定性試験の結果の指標として使用することができた。
【０１７８】
【表１１】
2020530027.tif 000013
【表１２】
2020530027.tif 000014
【０１７９】
また、これらの製剤のＨｐｘの安定性をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。各製剤から、サンプルを時間０および３カ月後に採取し、図１３に例示されるように、各貯蔵温度で、非還元または還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析からのデータは、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ結果と一致していた。２〜８℃の貯蔵では、還元および非還元条件下で追加のバンドもバンド強度の有意な変化も観察されなかった。ＲＴで貯蔵したサンプルは、Ｈｐｘダイマーの形成を反映した可能性が高いおよそ１２５ｋＤａの低強度のバンド、ならびにいくつかの低分子量バンド、最も顕著には約３０ｋＤａおよび２０ｋＤａを示した。これらの所見は、「老化および熱ストレス」サンプルにおいてＳＬＳによって決定された断片サイズと一致していた（図３Ｃ参照）。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ下では、３７℃で貯蔵したサンプルが、２５０ｋＤａより上の強い高分子量バンドを示し、各製剤についての強度が、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって検出された凝集体とよく相関していた。さらに、ＲＴサンプルで見られるような低分子量バンドパターンが、増加した強度であるが、観察された。
【０１８０】
機能的パラメーターとして、Ｈｐｘのヘム結合を、各製剤について各時点で評価した。図１４に示されるように、３７℃でインキュベーションすると、ヘモペキシンのヘムへの結合が経時的に減少し、この減少は対応するＨｐｘモノマー含有量（ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって決定される）と強く相関していた。
【０１８１】
４．４．安定性試験：リン酸塩濃度が低く、容量オスモル濃度が減少したリード製剤
加速条件下では、（ｉ）２００ｍＭクエン酸塩リン酸塩および１５０ｍＭまたは（ｉｉ）３００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．２を含む製剤（タンパク質濃度１０％）が最大の安定性を示した。これらの全体的な容量オスモル濃度（それぞれ、８７６ｍＯｓｍ／Ｌおよび１１７６ｍＯｓｍ／Ｌ）は高かったが、比較的高い容量オスモル濃度（すなわち、１２％サンドグロブリン、高スクロース濃度により８９２．３ｍＯｓｍ／Ｌ）を有する製剤を用いた静脈内（ｉ．ｖ．）施用のための現在認可されている医薬品が存在することに留意すると、これらの製剤はまだｉ．ｖ．投与に適していた。さらに、これらの医薬品は、Ｈｐｘ製品について現在推定される（すなわち、２０〜３０ｍＬ／注射未満）よりもずっと高い投与量（１００ｍＬ／注射超）で注入されている。ＤＳＦデータは、図４に示されるように、容量オスモル濃度と熱安定性との間に直接的な関係があることを示唆している。等しい熱安定性を維持するために、より低いクエン酸塩リン酸塩濃度をより高い塩化ナトリウム濃度と組み合わせることができ、逆もまた同様である。各製剤についてのＤＳＦおよび対応するＴｍによって得られる結果は、加速条件（すなわち、３７℃）下での短期間安定性試験での挙動の点から予測的であると考えられるが、より低い賦形剤濃度で製剤化したいくつかのＨｐｘ溶液を、表８（１〜５）に示されるように、３カ月安定性試験用に製造した。全ての製剤にＰ８０を添加して最終Ｐ８０濃度０．０１％を達成し、光から保護して、２〜８℃、ＲＴ（２５℃）または３７℃で少なくとも６カ月の期間貯蔵した。毎月の時点で、サンプルを温度貯蔵から採取し、分析した。
【０１８２】
少なくとも６カ月の期間にわたる各製剤についての分子サイズ分布結果を表１１および図１５に示す。２〜８℃では、モノマーＨｐｘの含有量（９３％超）が試験期間（２４カ月）を通して安定なままであり、２４カ月後のＲＴではごくわずかな差しかなかった。３７℃の加速温度では、Ｈｐｘ製剤の各々が、経時的に凝集体および断片の顕著な増加を示した。凝集体含有量に関して、製剤間で大きな差が見られた。ほぼ等張の製剤は凝集を促進したが、高張性製剤は、前のＤＳＦ分析によって予測されるようにタンパク質を安定化するように思われた。
【０１８３】
【表１３】
2020530027.tif 000015
【表１４】
2020530027.tif 000016
【０１８４】
同様に、上記Ｈｐｘ製剤を、各製剤含有量および貯蔵温度についてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。サンプルを時間０および３カ月後に採取し、還元（図１６）および非還元（図１７）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってそれぞれ分析した。これらの分析からのデータはＳＥＣ−ＨＰＬＣ結果と一致していた。２〜８℃の貯蔵では、還元と非還元の両条件下で、追加のバンドに関するわずかな変化が観察された。ＲＴで貯蔵したサンプルは、およそ１２５ｋＤａのかすかなバンドの強度の弱含みの増加、約５０ｋＤａのバンドのより大幅な増加および２０ｋＤａ〜４０ｋＤａのいくつかの追加の低分子バンドを示した。最後に、３７℃で貯蔵したサンプルは、その強度がＳＥＣ−ＨＰＬＣによって決定される凝集体含有量とよく相関する明白な高分子量バンド、ならびに追加の低分子量バンド（ＲＴで貯蔵したサンプルでも、より低いバンド強度であるが、既に観察されている）を示した。
【０１８５】
機能的パラメーターとしてのＨｐｘのヘム結合能も、各貯蔵温度条件について各時点で評価した。他の製剤で前に見られたように、ヘモペキシンのヘムへの結合は、Ｈｐｘモノマー含有量（ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって決定される）とよく相関し、３７℃での貯蔵中に顕著に減少した（図１８）。
【０１８６】
４．５．短期間安定性試験−再現性
ヒトＨｐｘについてのリード製剤を定義するためのデータセットをさらに作成するために、特定された２つ最も安定な製剤を上記のように２つの新たなＨｐｘバッチで製造して、再現性およびバッチ間変動性について点検した。サンプルを３７℃で貯蔵し、ＳＥＣ−ＨＰＬＣおよびヘム結合アッセイによって分析した。
【０１８７】
以下の表１２〜１４に示されるように、クエン酸塩リン酸塩に基づく２つの製剤から得られた結果は、分析した全ての時点で同等であり、堅牢な分析再現性ならびにバッチ間一貫性を実証した。
【０１８８】
【表１５】
2020530027.tif 000017
【０１８９】
【表１６】
2020530027.tif 000018
【０１９０】
【表１７】
2020530027.tif 000019
【実施例５】
【０１９１】
トリス緩衝液中でのＨｐｘ安定性
ヘモペキシン精製後、貯蔵のためにタンパク質溶液を濃縮し、ＰＢＳ、ｐＨ７．５にダイアフィルトレーションした。溶媒界面活性剤除去のためのクロマトグラフィー工程の準備において、ＰＢＳ中の塩の存在が、溶媒界面活性剤除去に使用されるＣａｐｔｏ  Ｑ強陰イオン交換樹脂でのヘモペキシン結合を妨害する恐れがあることに留意して、ヘモペキシンを５０ｍＭトリス緩衝液にダイアフィルトレーションした。このクロマトグラフィー工程を妨害しないようにするために、５０ｍＭトリス、ｐＨ７．４をヘモペキシン貯蔵緩衝液として選択した。
【０１９２】
ヘモペキシンの２つのバッチ、ＴＯ３０２００１およびＴＯ２９４１３１を、５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．５で製造した。ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析で、これらのトリス緩衝ヘモペキシンバッチでは有意なタンパク質凝集が明らかであった。いくつかのＰＢＳ中ヘモペキシンバッチならびに２つのトリス中バッチについてＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析によって決定されるモノマー含有量の要約を以下の表１５に示す。表１５の結果によって示されるように、ＰＢＳ緩衝Ｈｐｘバッチと比較して、トリス緩衝Ｈｐｘバッチ中のＨｐｘモノマーの量の有意な低下があった。モノマー含有量の減少は、Ｈｐｘ調製物中に通常は存在しない複数の高分子量ピークの存在の増加に関連していた。
【０１９３】
【表１８】
2020530027.tif 000020
【０１９４】
２つの異なるＨｐｘバッチについて透析およびＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析を使用して、異なる緩衝液中でのヘモペキシン安定性をさらに調査した。５０ｍＭトリス中で貯蔵したＨｐｘバッチＴＯ３０２００１のサンプルをＰＢＳに透析して、トリス緩衝液中での貯蔵後のタンパク質凝集が可逆的であるかどうかを決定した。ＰＢＳ中で貯蔵したＨｐｘバッチＴＯ２９０２３５のサンプルを５０ｍＭトリスおよび２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．５にも透析して、トリスまたは２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中の透析の前のＰＢＳ中の透析がＨｐｘ凝集を防ぐかどうかを決定した。この試験の結果を以下の表１６に示す。
【０１９５】
【表１９】
2020530027.tif 000021
【０１９６】
トリス緩衝ＨｐｘのＰＢＳへの透析は、タンパク質凝集を逆転させるように見えなかった。ＰＢＳ緩衝ヘモペキシンの５０ｍＭトリス緩衝液への透析は、前にトリス中で貯蔵した２つのＨｐｘバッチと類似のタンパク質凝集を示した。ＰＢＳ緩衝Ｈｐｘのリン酸ナトリウムへの透析は、より高いＨｐｘモノマー含有量を示した。これらの結果は、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５が、溶媒界面活性剤除去用にＣａｐｔｏ  Ｑ樹脂で使用するための適切な低塩Ｈｐｘ緩衝液代替物であることを示している。
【０１９７】
Ｈｐｘ精製に使用される固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）カラムのニッケルの存在がトリス緩衝液の存在下でのＨｐｘ凝集に影響を及ぼす（ａｔｔｒｉｂｕｔｉｎｇ  ｔｏ）か及ぼさないかを決定するために、Ｈｐｘのいくつかのサンプルを種々のＥＤＴＡ溶液とインキュベートした（ＴＯ３０３０１１およびＴＯ３０３０３０）。以下の表１７は、ＥＤＴＡインキュベーション後に得られたＳＥＣ−ＨＰＬＣデータの要約を提供している。
【０１９８】
【表２０】
2020530027.tif 000022
【０１９９】
結果は、ニッケルの存在が、トリス緩衝液の存在下でのＨｐｘ凝集に対してほとんど効果を有さないことを示している。
【０２００】
トリス緩衝液中でのヘモペキシン安定性をさらに調査して、トリスでの透析前のニッケル除去が少ないＨｐｘ凝集をもたらすかどうかを決定した。このために、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４を利用して、Ｈｐｘ精製プロセスで追加のダイアフィルトレーション工程を実行して、Ｈｐｘ溶液からニッケルを除去した。種々のプロセス工程でのＨｐｘバッチＴＯ２９４１７９からの３つのサンプルを５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．５に透析した。ＳＥＣ−ＨＰＬＣ結果を以下の表１８に提示する。
【０２０１】
【表２１】
2020530027.tif 000023
【０２０２】
結果は、５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．５に透析した３つのサンプル全てがＨｐｘ凝集を示し、ＥＤＴＡ透析後にＨｐｘ凝集の増加があったことを示した。いったん５０ｍＭトリス緩衝液に交換したら、ニッケルの非存在がまだＨｐｘ凝集をもたらしたことに留意すると、ＥＤＴＡ透析後のＨｐｘ凝集の増加がニッケルの存在に起因するようには思えなかった。結果は、いくつかの例で、Ｈｐｘ凝集の可能性のために貯蔵緩衝液として５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．５を回避すべきであることを示唆した。さらなる安定性試験は、高レベルのＮａＣｌが存在する場合を除いて、トリス緩衝液中のＨｐｘ安定性の減少を確認した。トリス緩衝液の存在下でのＨｐｘ収率喪失および凝集を最小化するための代替緩衝液を評価する必要があるかもしれない。
【実施例６】
【０２０３】
高タンパク質濃度でのＨｐｘ安定性
６．１．サンプル製造
報告された製剤開発のために、Ｈｐｘをヒト血漿（Ｋｉｓｔｌｅｒ−Ｃｏｈｎ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ  ＩＶ）から精製した。精製プロセス詳細は他に記載されている［６］。精製Ｈｐｘを、タンパク質濃度３〜４％で、ＰＢＳ、ｐＨ７．４で提供した。ストレス誘導安定性試験用の高濃度（最大３０％）Ｈｐｘ製剤を、１０ｋＤ  ＭＷカットオフ濾過カセット（ＰＥＳ、５０ｃｍ２、ＰＡＬＬ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、Ａｋｔａフラックス装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で限外濾過およびダイアフィルトレーションによって得た。
【０２０４】
６．２  安定性評価および指示タンパク質特性評価のための方法
６．２．1  ΔＧおよびΔＧ傾向
ΔＧおよびΔＧ傾向を、Ｕｎｃｈａｉｎｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製の化学変性システムであるＨＵＮＫを使用して測定した。サンプルを、０〜８Ｍ尿素中３６点変性曲線を使用して変性させた。ΔＧを計算するために、天然Ｈｐｘと完全変性Ｈｐｘの固有蛍光波長比を使用して、データを当てはめた。１０の異なるＨｐｘ濃度：０．２５、１、５、１０、２５、５０、１００、２００、２５０および３００．０ｍｇ／ｍＬでΔＧを測定することによって、ΔＧ傾向を決定した。結果を傾向についてΔＧまたはΔΔＧとして表した。
【０２０５】
６．２．２  特性評価のための他のアッセイ
表１９は、Ｈｐｘ安定性およびタンパク質特性評価のさらなる調査のために使用される他の全てのアッセイおよび手順を要約している。
【０２０６】
【表２２】
2020530027.tif 000024
【０２０７】
６．３  高タンパク質濃度での安定性試験
６．３．１  製剤製造
以下のリード製剤を、高タンパク質濃度のＨｐｘでさらに調査し、その後、加速貯蔵条件（３７℃）、長期貯蔵（２〜８℃）下で分析した：
・製剤１：２００ｍＭクエン酸塩リン酸塩、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％  Ｐ８０、ｐＨ７．２；
・製剤２：５０ｍＭクエン酸塩リン酸塩、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％  Ｐ８０、ｐＨ７．２；
・製剤３：１５ｍＭクエン酸塩リン酸塩、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％  Ｐ８０、ｐＨ７．２；
・製剤４：ＰＢＳ、０．０１％  Ｐ８０、ｐＨ７．４。
【０２０８】
化学変性試験および熱安定性調査を行うことによって、製剤をさらに特性評価した。手短に言えば、ＰＢＳで製剤化したＨｐｘ製剤を３０％Ｈｐｘに濃縮し、表２０に示されるように所望の緩衝液および賦形剤組成物にダイアフィルトレーションした。必要に応じて、０．２Ｍ  ＨＣｌまたは０．２Ｍ  ＮａＯＨで慎重に滴定することによって、ｐＨ調整を行った。その後、様々な製剤を製剤緩衝液で所望の濃度に希釈した。最後に、各製剤を滅菌濾過し、滅菌ガラスバイアルに充填し、０カ月、１カ月、２カ月、３カ月および６カ月または他に示される時点でのその後の分析のために様々な温度で貯蔵した。
【０２０９】
【表２３】
2020530027.tif 000025
【０２１０】
６．３．２  高タンパク質濃度での粘度挙動
製造したＨｐｘ製剤の粘度挙動を、以下のタンパク質濃度で分析した（表２１）。図１９に示されるように、最大２５０ｇ／Ｌの標的濃度まで、粘度は２０ｍＰａ＊ｓ未満のままであり、これはいずれの送達システムにとっても許容的粘度とみなされる。Ｗ．Ｄｕ＆Ａ．Ｋｌｉｂａｎｏｖ、「Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  Ｓａｌｔｓ  Ｍａｒｋｅｄｌｙ  Ｄｉｍｉｎｉｓｈ  Ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、６３２〜６３６頁、２０１１。これらの著者らは、皮下注射のための閾値が５０ｍＰａ＊ｓにもなることを示していることに留意されたい。この試験はまた、いずれの所与の標的タンパク質濃度の各Ｈｐｘ製剤も類似の粘度を示すことを実証した。また、予想されるように、標的タンパク質濃度の増加には粘度増加が伴った。さらに、これらの製剤のタンパク質濃度が標的レベル（すなわち、１００、２００、２５０および３００ｍｇ／Ｌ）より上であったので、結果として生じる粘度は、実施例１で測定されたものと比較して比較的高くなった（図３Ｄと図１９を比較）。最後に、容量オスモル濃度増加（より高い塩濃度）は、粘度に有意には影響を及ぼさなかった。
【０２１１】
【表２４】
2020530027.tif 000026
【０２１２】
６．３．３  化学安定性：ＨＵＮＫを使用したΔＧおよびΔΔＧ決定
タンパク質のΔＧの小さな増加が、タンパク質の安定性の１０倍の増加をもたらすことができる（以下の表２２参照）。
【０２１３】
【表２５】
2020530027.tif 000027
【０２１４】
最も安定な形態のタンパク質は、典型的には、濃度依存性ではない（すなわち、平坦な線）高いΔＧ値を示す。１０点ΔＧ傾向をＨｐｘ濃度０．２５、１、５、１０、２５、５０、１００、２００、２５０および３００ｍｇ／ｍＬで作製して、各製剤の安定性および凝集状態を決定した（３．２．２節参照）。ΔＧ傾向の結果を図２０に示す。
【０２１５】
製剤１および２では、Ｈｐｘが、分析した全ての濃度で６．０ｋＣａｌ／ｍｏｌ超のΔＧ値を示した。これは、これらの２つの製剤でＨｐｘが極めて安定であり、存在する変性タンパク質の量が極めて少ないことを示していた；しかしながら、製剤２のＨｐｘは、わずかに上向きのΔＧ傾向のために、１よりもわずかに安定性が低く、天然状態での凝集の存在を示した。
【０２１６】
製剤１および２と対照的に、製剤３および４のΔＧ値はずっと低く、高レベルの変性Ｈｐｘを示した。製剤３は、製剤４よりも安定性を提供し、製剤４で中程度〜高レベルなのと比較して、製剤３では変性タンパク質が中程度レベルのみであった。さらに、製剤４のＨｐｘは下向きのΔＧ傾向に基づいて変性状態で凝集を示していたが、製剤３の傾向は濃度によって影響を受けなかった。これらの結果によって、製剤にクエン酸塩を含めることによって得られる安定性も確認された。
【０２１７】
要約すると、製剤１、２および３はＨｐｘを有効に安定化し、中程度〜低レベルの変性タンパク質しか存在しなかった。対照的に、製剤４は安定化したＨｐｘが最小であり、変性状態で凝集した高レベルの変性タンパク質が存在していた。製剤４と比較して、製剤３で観察された安定性が大きかったことによって示されるように、クエン酸塩がＨｐｘの安定性に寄与した。
【０２１８】
６．３．４  高タンパク質濃度での経時的な分子サイズ分布
製剤１〜４を、光から保護して、３７℃および２〜８℃で少なくとも６カ月間さらに貯蔵した。各時点で、サンプルを採取し、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析に供して、Ｈｐｘのモノマー、オリゴマーおよび断片を監視した。６カ月後の各濃度についての分子サイズ分布結果を以下の図２１〜図２４および表２３および表２４に示す。
【０２１９】
３７℃での貯蔵後、Ｈｐｘ製剤の各々は、経時的に凝集体および断片の増加を示した。高容量オスモル濃度製剤で製剤化したＨｐｘがより安定であるように思われ、同じ時点で分析した場合、タンパク質濃度の増加で観察されたタンパク質凝集体の増加がごくわずかであった。対照的に、高タンパク質濃度での低い賦形剤濃度は、強い凝集をもたらし、一定期間後にはタンパク質のゲル化さえもたらした（製剤３および４）。以前のデータに基づいて２〜８℃の貯蔵温度を選択したので、全ての製剤を同様に２〜８℃に保ち、６カ月後に分析した。２〜８℃で貯蔵した場合、異なる製剤間で凝集体および断片の有意な変化は観察されなかった。これらの貯蔵条件下では、６カ月の試験期間を通して、モノマーＨｐｘ（９３％超）が安定なままであり、これは製剤およびタンパク質濃度に関係なく観察された。
【０２２０】
【表２６】
2020530027.tif 000028
【表２７】
2020530027.tif 000029
【０２２１】
【表２８】
2020530027.tif 000030
【表２９】
2020530027.tif 000031
【０２２２】
６．３．５  結論
化学変性試験の結果は、製剤１、引き続いて製剤２でＨｐｘが最も安定であったことを示している。ほぼ生理的容量オスモル濃度でクエン酸塩を含有していた製剤３は、製剤４（ＰＢＳ対照）よりも、化学変性分析でＨｐｘに安定性をもたらした。化学変性によって得られたこれらのデータは、経時的に分析したＳＥＣ−ＨＰＬＣによって評価した安定性試験データと一致している。
【０２２３】
１５ｍＭクエン酸塩リン酸塩は、熱安定性、化学変性、オリゴマー化および断片化試験の結果によって証明されるように、Ｈｐｘの安定性を改善し、ＰＢＳのみと比較して優れた性能をもたらした。重要なことに、化学変性データおよびＳＥＣ−ＨＰＬＣデータによって証明されるように、Ｈｐｘ製剤を２〜８℃で６カ月間にわたって貯蔵した場合でさえ、１００ｇ／Ｌから３００ｇ／Ｌまで製剤１、２および３中のＨｐｘの濃度を増加させることによって安定性は有意には失われなかった。
【０２２４】
付属文書Ａ
【化１】
2020530027.tif 000032
【化２】
2020530027.tif 000033
【０２２５】
【化３】
2020530027.tif 000034
【０２２６】
【化４】
2020530027.tif 000035
【０２２７】
【化５】
2020530027.tif 000036
【０２２８】
【化６】
2020530027.tif 000037
【０２２９】
【化７】
2020530027.tif 000038
【化８】
2020530027.tif 000039
【０２３０】
【化９】
2020530027.tif 000040
【０２３１】
付属書類Ｂ
【表３０】
2020530027.tif 000041
【表３１】
2020530027.tif 000042
【０２３２】
【表３２】
2020530027.tif 000043
【図１】
2020530027.tif 000044
【図２】
2020530027.tif 000045
【図３−１】
2020530027.tif 000046
【図３−２】
2020530027.tif 000047
【図４−１】
2020530027.tif 000048
【図４−２】
2020530027.tif 000049
【図５】
2020530027.tif 000050
【図６】
2020530027.tif 000051
【図７−１】
2020530027.tif 000052
【図７−２】
2020530027.tif 000053
【図８−１】
2020530027.tif 000054
【図８−２】
2020530027.tif 000055
【図９】
2020530027.tif 000056
【図１０−１】
2020530027.tif 000057
【図１０−２】
2020530027.tif 000058
【図１１】
2020530027.tif 000059
【図１２−１】
2020530027.tif 000060
【図１２−２】
2020530027.tif 000061
【図１３−１】
2020530027.tif 000062
【図１３−２】
2020530027.tif 000063
【図１４−１】
2020530027.tif 000064
【図１４−２】
2020530027.tif 000065
【図１５−１】
2020530027.tif 000066
【図１５−２】
2020530027.tif 000067
【図１６】
2020530027.tif 000068
【図１７】
2020530027.tif 000069
【図１８】
2020530027.tif 000070
【図１９】
2020530027.tif 000071
【図２０】
2020530027.tif 000072
【図２１−１】
2020530027.tif 000073
【図２１−２】
2020530027.tif 000074
【図２２−１】
2020530027.tif 000075
【図２２−２】
2020530027.tif 000076
【図２３−１】
2020530027.tif 000077
【図２３−２】
2020530027.tif 000078
【図２４−１】
2020530027.tif 000079
【図２４−２】
2020530027.tif 000080
【配列表】
2020530027000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年5月26日(2020.5.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
精製ヘモペキシンの安定な液体製剤であって、
（ａ）少なくとも５０ｍｇ／ｍＬのヘモペキシン含有量と；
（ｂ）少なくとも１５ｍＭのリン酸緩衝液と；
（ｃ）ｐＨ５．８〜８と；
（ｄ）少なくとも５０ｍＭの塩化ナトリウムと
を含む、前記精製ヘモペキシンの安定な液体製剤。
【請求項２】
７５ｍｇ／ｍＬ〜３００ｍｇ／ｍＬのヘモペキシンを含む、請求項１に記載の安定な液体製剤。
【請求項３】
１００ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬのヘモペキシンを含む、請求項２に記載の安定な液体製剤。
【請求項４】
２００ｍｇ／ｍＬ〜３００ｍｇ／ｍＬのヘモペキシンを含む、請求項２に記載の安定な液体製剤。
【請求項５】
２００ｍｇ／ｍＬのヘモペキシンを含む、請求項２に記載の安定な液体製剤。
【請求項６】
２５０ｍｇ／ｍＬのヘモペキシンを含む、請求項２に記載の安定な液体製剤。
【請求項７】
３００ｍｇ／ｍＬのヘモペキシンを含む、請求項２に記載の安定な液体製剤。
【請求項８】
少なくとも１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の安定な液体製剤。
【請求項９】
リン酸緩衝液はリン酸ナトリウム、リン酸カリウムおよびクエン酸塩リン酸塩からなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の安定な液体製剤。
【請求項１０】
リン酸緩衝液はクエン酸塩リン酸塩である、請求項９に記載の安定な液体製剤。
【請求項１１】
１５ｍＭ〜２００ｍＭのクエン酸塩リン酸塩と、
１５０ｍＭ〜４００ｍＭの塩化ナトリウムと
を含む、請求項１０に記載の安定な液体製剤。
【請求項１２】
１５ｍＭ〜２００ｍＭのクエン酸塩リン酸塩と、
１５０ｍＭ〜２５０ｍＭの塩化ナトリウムと
を含む、請求項１１に記載の安定な液体製剤。
【請求項１３】
２００ｍＭのクエン酸塩リン酸塩と、
１５０ｍＭの塩化ナトリウムと
を含む、請求項１１に記載の安定な液体製剤。
【請求項１４】
５０ｍＭのクエン酸塩リン酸塩と、
４００ｍＭの塩化ナトリウムと
を含む、請求項１１に記載の安定な液体製剤。
【請求項１５】
１５ｍＭのクエン酸塩リン酸塩と、
１５０ｍＭの塩化ナトリウムと
を含む、請求項１１に記載の安定な液体製剤。
【請求項１６】
リン酸緩衝液はリン酸ナトリウムである、請求項９に記載の安定な液体製剤。
【請求項１７】
５０ｍＭ〜２００ｍＭのリン酸ナトリウムと、
５０ｍＭ〜４００ｍＭの塩化ナトリウムと
を含む、請求項１６に記載の安定な液体製剤。
【請求項１８】
５０ｍＭ〜２００ｍＭのリン酸ナトリウムと、
１５０ｍＭ〜２５０ｍＭの塩化ナトリウムと
を含む、請求項１７に記載の安定な液体製剤。
【請求項１９】
２００ｍＭのリン酸ナトリウムと、
１５０ｍＭの塩化ナトリウムと
を含む、請求項１８に記載の安定な液体製剤。
【請求項２０】
ｐＨは７．０〜７．６である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の安定な液体製剤。
【請求項２１】
ｐＨは７．２である、請求項２０に記載の安定な液体製剤。
【請求項２２】
非イオン性界面活性剤をさらに含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の安定な液体製剤。
【請求項２３】
非イオン性界面活性剤はポリソルベート８０である、請求項２２に記載の安定な液体製剤。
【請求項２４】
非イオン性界面活性剤は少なくとも０．０００５％ｖ／ｖの量で存在する、請求項２２または２３に記載の安定な液体製剤。
【請求項２５】
非イオン性界面活性剤は０．０１％ｖ／ｖ未満の量で存在する、請求項２４に記載の安
定な液体製剤。
【請求項２６】
２５℃で測定した場合に２０ｍＰａ＊Ｓ未満の粘度を含む、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の安定な液体製剤。
【請求項２７】
精製ヘモペキシンは、免疫比濁法およびＢｒａｄｆｏｒｄ法または２８０ｎｍでのＵＶ分光法による総タンパク質含有量によってヘモペキシン含有量を測定することによって決定した場合に、総タンパク質の少なくとも９５重量％、または少なくとも９７重量％、または少なくとも９８重量％、または少なくとも９９重量％または少なくとも９９．５重量％を構成する、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の安定な液体製剤。
【請求項２８】
精製ヘモペキシンはヒト血漿に由来する、または組換えヘモペキシン、ヘモペキシン変異体、もしくはヘモペキシンもしくはそのヘム結合断片を含む融合タンパク質からなる群から選択される、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の安定な液体製剤。
【請求項２９】
精製ヘモペキシンは少なくとも500kgのヒト血漿に由来する血漿画分から回収される、
請求項２８に記載の安定な液体製剤。
【請求項３０】
３７℃で１カ月間貯蔵した場合、少なくとも７０％のヘモペキシンモノマーを含む、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の安定な液体製剤。
【請求項３１】
３７℃で２カ月間貯蔵した場合、少なくとも５０％のヘモペキシンモノマーを含む、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の安定な液体製剤。
【請求項３２】
３７℃で３カ月間貯蔵した場合、少なくとも５０％のヘモペキシンモノマーを含む、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の安定な液体製剤。
【請求項３３】
３７℃で１カ月間貯蔵した場合、少なくとも８０％のヘモペキシンモノマーを含む、請求項３０に記載の安定な液体製剤。
【請求項３４】
３７℃で２カ月貯蔵した場合、少なくとも７０％のヘモペキシンモノマーを含む、請求項３１に記載の安定な液体製剤。
【請求項３５】
３７℃で３カ月間貯蔵した場合、少なくとも６０％のヘモペキシンモノマーを含む、請求項３２に記載の安定な液体製剤。
【請求項３６】
溶血に関連する状態を治療する方法で使用するための請求項１〜３５のいずれか１項に記載の安定な液体製剤であって、前記方法は、それを必要とする対象に投与することを含む、前記安定な液体製剤。
【請求項３７】
溶血に関連する状態は急性溶血性状態および／または慢性溶血性状態から選択される、請求項３６に記載の安定な液体製剤。
【請求項３８】
状態は、溶血性貧血、骨髄無形成発症、高度溶血発症、輸血誘発性溶血、溶血性尿毒症症候群、心筋梗塞、急性胸部症候群、肺高血圧症、下肢潰瘍、成長遅滞、骨梗塞、子癇前症、腎不全、急性腎障害、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、出血性脳卒中を含む脳卒中、頭蓋内出血（ＩＣＨ）、脾臓血球貯留、脾梗塞、自己免疫溶血性貧血を含む自己免疫疾患、微生物感染または易感染性増加、マラリア感染、外傷、移植関連状態、心肺バイパス術を使用した開心術、ならびに熱傷後の溶血を伴うヘモグロビン血症またはヘモグロビン尿の治療を含む熱傷からなる群から選択される、請求項３６に記載の安定な液体製剤。
【請求項３９】
状態は、鎌状赤血球貧血、遺伝性球状赤血球症、遺伝性楕円赤血球症、サラセミア、先天性赤血球異形成貧血および発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、全身性エリテマトーデスおよび慢性リンパ性白血病からなる群から選択される、請求項３６に記載の安定な液体製剤。
【請求項４０】
状態は、出血性脳卒中および頭蓋内出血（ＩＣＨ）からなる群から選択される、請求項３６に記載の安定な液体製剤。
【請求項４１】
状態はＡＲＤＳである、請求項３６に記載の安定な液体製剤。
【請求項４２】
安定な液体製剤は静脈内投与される、請求項３６〜４１のいずれか１項に記載の安定な液体製剤。
【請求項４３】
安定な液体製剤は皮下投与される、請求項３６〜４１のいずれか１項に記載の安定な液体製剤。
【国際調査報告】
2020530027.tif 000081
2020530027.tif 000082
2020530027.tif 000083