(57)【要約】  様々な状態および疾患を治療するための、アデノ随伴ウイルスベクターおよび初代細胞などの遺伝子修飾された組成物。癌の治療のための修飾されたアデノ随伴ウイルスもまた開示される。さらに、様々な疾患、状態、および癌の治療において遺伝子修飾された組成物を作製および使用する方法も開示される。【選択図】図２４Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヌクレオチド配列と比較して、ＶＰ１領域に第１の突然変異、およびＶＰ３領域に第２の突然変異を含むＡＡＶキャプシドヌクレオチド配列を含む単離された天然に存在しない核酸であって、前記単離された天然に存在しない核酸は、複数の細胞と接触すると、野生型ＡＡＶ核酸、または同等の複数の細胞における前記キャプシドタンパク質のＶＰ領域における単一の突然変異を有するＡＡＶヌクレオチド配列と比較して、前記複数の細胞におけるトランスフェクションまたは形質導入後の導入遺伝子の発現が増加している核酸。
【請求項２】
野生型アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヌクレオチド配列と比較して、ＶＰ１領域に第１の突然変異、およびＶＰ２領域に第２の突然変異を含むＡＡＶキャプシドヌクレオチド配列を含む単離された天然に存在しない核酸であって、前記単離された天然に存在しない核酸は、複数の細胞と接触すると、野生型ＡＡＶ核酸、または同等の複数の細胞における前記キャプシドタンパク質のＶＰ領域における単一の突然変異を有するＡＡＶヌクレオチド配列と比較して、前記複数の細胞におけるトランスフェクションまたは形質導入後の導入遺伝子の発現が増加している核酸。
【請求項３】
前記ＡＡＶヌクレオチド配列が、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、およびそれらの任意の組み合わせのものである、請求項１または２に記載の核酸。
【請求項４】
前記ＡＡＶヌクレオチド配列がＡＡＶ６血清型のものである、請求項３に記載の核酸。
【請求項５】
前記単離された天然に存在しない核酸が、ＤＮＡまたはＲＮＡの少なくとも１つである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項６】
前記単離された天然に存在しない核酸がＤＮＡである、請求項５に記載の核酸。
【請求項７】
前記第１の突然変異および前記第２の突然変異が、点突然変異、ミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異、挿入、欠失、複製、フレームシフト、または反復伸長の少なくとも１つを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項８】
前記第１の突然変異および前記第２の突然変異が点突然変異である、請求項７に記載の核酸。
【請求項９】
前記第１の突然変異が、前記ＶＰ１領域内のフェニルアラニン（Ｆ）コード配列の突然変異である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１０】
前記第１の突然変異が、前記核酸によってコードされるポリペプチドの１２９位のＦコード配列にある、請求項９に記載の核酸。
【請求項１１】
前記突然変異が、前記ポリペプチドの１２９位のＦから非極性脂肪族アミノ酸への突然変異をコードする、請求項１０に記載の核酸。
【請求項１２】
前記非極性脂肪族アミノ酸が、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、およびバリン（Ｖ）から選択される、請求項１１に記載の核酸。
【請求項１３】
前記非極性脂肪族アミノ酸がＬである、請求項１２に記載の核酸。
【請求項１４】
前記第２の突然変異が、前記ポリペプチドのロイシン（Ｌ）コード配列にある、請求項１および３〜８のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１５】
前記第２の突然変異が、前記核酸によってコードされる前記ポリペプチドの５８４位のＬコード配列にある、請求項１４に記載の核酸。
【請求項１６】
前記第２の突然変異が、前記ポリペプチドの５８４位のＬから極性アミノ酸への突然変異をコードする、請求項１５に記載の核酸。
【請求項１７】
前記極性アミノ酸が、アスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）から選択される、請求項１６に記載の核酸。
【請求項１８】
前記極性アミノ酸がＮである、請求項１７に記載の核酸。
【請求項１９】
前記第２の突然変異が、５８４位のＬから正に帯電したアミノ酸への突然変異をコードする、請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項２０】
前記正に帯電したアミノ酸がヒスチジン（Ｈ）である、請求項１９に記載の核酸。
【請求項２１】
前記第２の突然変異が、前記ポリペプチドの５８４位のＬから負に帯電したアミノ酸への突然変異をコードする、請求項１４〜２０のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項２２】
前記負に帯電したアミノ酸が、アスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）から選択される、請求項２１に記載の核酸。
【請求項２３】
前記負に帯電したアミノ酸がＤである、請求項２２に記載の核酸。
【請求項２４】
前記第２の突然変異が、前記ポリペプチドのバリン（Ｖ）コード配列にある、請求項１および３〜８のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項２５】
前記第２の突然変異が、前記核酸によってコードされる前記ポリペプチドの５９８位のＶコード配列にある、請求項２４に記載の核酸。
【請求項２６】
前記第２の突然変異が、前記ポリペプチドの５９８位のＶから非極性脂肪族アミノ酸への突然変異をコードする、請求項２５に記載の核酸。
【請求項２７】
前記非極性脂肪族アミノ酸が、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、およびバリン（Ｖ）から選択される、請求項２６に記載の核酸。
【請求項２８】
前記非極性脂肪族アミノ酸がＬである、請求項２７に記載の核酸。
【請求項２９】
前記非極性脂肪族アミノ酸がＩである、請求項２７に記載の核酸。
【請求項３０】
前記第２の突然変異が、前記ポリペプチドのヒスチジン（Ｈ）コード領域にある、請求項１および３〜８のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項３１】
前記第２の突然変異が、前記ポリペプチドの６４２位のＨコード領域にある、請求項３０に記載の核酸。
【請求項３２】
前記第２の突然変異が、前記ポリペプチドの６４２位のＨから極性アミノ酸をコードする、請求項３１に記載の核酸。
【請求項３３】
前記極性アミノ酸が、アスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）から選択される、請求項３２に記載の核酸。
【請求項３４】
前記極性アミノ酸がＮである、請求項３３に記載の核酸。
【請求項３５】
前記第１の突然変異が、前記第２の突然変異の前の核酸の芳香族アミノ酸コード配列にあり、前記第２の突然変異が、前記核酸によってコードされるポリペプチドの非極性脂肪族アミノ酸をコードする、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項３６】
前記芳香族アミノ酸が、前記ＶＰ１領域によってコードされるＶＰ１ポリペプチドの１２９位にある、請求項３５に記載の核酸。
【請求項３７】
前記第１の突然変異が、前記第２の突然変異の前の前記配列の位置でコードされるアミノ酸よりも疎水性が高いアミノ酸をコードする配列にある、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項３８】
前記第２の突然変異が、正に帯電したアミノ酸から極性アミノ酸、負に帯電したアミノ酸から極性アミノ酸からなる群から選択される少なくとも１つの突然変異をコードする、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項３９】
前記第２の突然変異が保存的突然変異をコードする、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項４０】
前記保存的突然変異が、非極性脂肪族アミノ酸から非極性脂肪族アミノ酸、極性アミノ酸から極性アミノ酸、正に帯電したアミノ酸から正に帯電したアミノ酸、負に帯電したアミノ酸から負に帯電したアミノ酸、および芳香族アミノ酸から芳香族アミノ酸からなる群から選択される、請求項３９に記載の核酸。
【請求項４１】
前記第１の突然変異が、前記第２の突然変異の前の前記配列の位置でコードされるアミノ酸よりも疎水性が低いアミノ酸をコードする配列にある、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項４２】
前記第２の突然変異がＶＰ３領域にある場合、前記第２の突然変異が、ＨからＮ、ＤからＮ、ＤからＮ、ＶからＬ、およびＶからＩからなる群から選択される少なくとも１つの突然変異をコードする、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項４３】
ＶＰ３領域における前記第２の突然変異が、前記ＡＡＶヌクレオチド配列によってコードされるＡＡＶポリペプチド配列の４１８、４６２、５８４、５９８、または６４２位で生じる、請求項４２に記載の核酸。
【請求項４４】
前記単離された天然に存在しない核酸が、Ｆ１２９Ｌ、Ｈ６４２Ｎ、およびＤ４１８Ｎ突然変異の少なくとも１つをコードする、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項４５】
前記単離された天然に存在しない核酸が、Ｆ１２９Ｌ、Ｈ６４２Ｎ、およびＬ５８４Ｎ突然変異の少なくとも１つをコードする、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項４６】
前記単離された天然に存在しない核酸が、Ｆ１２９Ｌ、Ｈ４６２Ｎ、およびＶ５９８Ｌ突然変異の少なくとも１つをコードする、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項４７】
前記単離された天然に存在しない核酸が、Ｆ１２９Ｌ、Ｈ４６２Ｎ、およびＶ５９８Ｉ突然変異の少なくとも１つをコードする、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項４８】
前記複数の細胞が複数の初代細胞である、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項４９】
前記単離された天然に存在しない核酸が、外因性受容体配列の少なくとも一部をコードする、請求項１〜４８のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項５０】
前記単離された天然に存在しない核酸が医薬組成物に製剤化される、請求項１〜４９のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項５１】
前記野生型ＡＡＶ核酸が、配列番号５５と少なくとも６０％の配列同一性を含む、請求項１〜５０のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項５２】
Ｆ１２９Ｌ、Ｈ６４２Ｎ、およびＤ４１８Ｎからなる群から選択される少なくとも２つの突然変異をコードする、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドヌクレオチド配列。
【請求項５３】
Ｆ１２９Ｌ、Ｈ６４２Ｎ、およびＤ５８４Ｎからなる群から選択される少なくとも２つの突然変異をコードする、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドヌクレオチド配列。
【請求項５４】
Ｆ１２９Ｌ、Ｈ４６２Ｎ、およびＶ５９８Ｌからなる群から選択される少なくとも２つの突然変異をコードする、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドヌクレオチド配列。
【請求項５５】
Ｆ１２９Ｌ、Ｈ６４２Ｎ、およびＶ５９８Ｉからなる群から選択される少なくとも２つの突然変異をコードする、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドヌクレオチド配列。
【請求項５６】
請求項５２〜５５のいずれか一項に記載のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドヌクレオチド配列から生成された、単離および精製されたタンパク質。
【請求項５７】
配列番号１〜配列番号１９の核酸配列のいずれか１つと少なくとも６０％の配列同一性または類似性を含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシド核酸配列。
【請求項５８】
前記配列同一性が、約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％から最大約１００％である、請求項５７に記載の単離および精製されたＡＡＶ核酸配列。
【請求項５９】
ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３配列を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドヌクレオチド配列を含む単離された天然に存在しない核酸であって、前記ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３配列のうちの２つは第１のＡＡＶ血清型に由来し、前記ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３配列の１つは第２のＡＡＶ血清型に由来し、前記単離された天然に存在しない核酸は、複数の細胞に導入すると、野生型ＡＡＶ核酸と比較して、トランスフェクションまたは形質導入後の導入遺伝子の発現の増加を付与する核酸。
【請求項６０】
前記第１のＡＡＶ血清型および前記第２のＡＡＶ血清型が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、またはそれらの任意の組み合わせから選択される、請求項５９に記載の核酸。
【請求項６１】
前記第１のＡＡＶ血清型および前記第２のＡＡＶ血清型が、ＡＡＶ４およびＡＡＶ６、ＡＡＶ５およびＡＡＶ６、ＡＡＶ１１およびＡＡＶ６、ＡＡＶ１２およびＡＡＶ６、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項５９または６０に記載の核酸。
【請求項６２】
前記単離された天然に存在しない核酸が、ＤＮＡまたはＲＮＡの少なくとも１つである、請求項５９〜６１のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項６３】
前記単離された天然に存在しない核酸がＤＮＡである、請求項６２に記載の核酸。
【請求項６４】
前記細胞が初代細胞、不死化細胞、または組換え細胞である、請求項５９〜６３のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項６５】
前記導入遺伝子が外因性受容体配列の少なくとも一部をコードする、請求項５９〜６４のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項６６】
前記単離された天然に存在しない核酸が医薬組成物に製剤化される、請求項５９〜６５のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項６７】
前記ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３領域が、キャプシドの少なくとも一部の中に含まれる、請求項５９〜６６のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項６８】
配列番号１９５〜配列番号２１３のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも６０％の配列同一性または類似性を含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシド核酸配列。
【請求項６９】
前記配列同一性が、約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％から最大約１００％である、請求項６８に記載の単離および精製されたＡＡＶ核酸配列。
【請求項７０】
請求項１〜６７のいずれか一項に記載の単離および精製されたＡＡＶ核酸配列で細胞をトランスフェクトすることにより生成された、操作された細胞。
【請求項７１】
請求項７０に記載の操作された細胞から単離された複数のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子。
【請求項７２】
単位剤形で請求項７１に記載のアデノ随伴ウイルス粒子を含む組成物。
【請求項７３】
前記組成物が凍結保存されている、請求項７２に記載の組成物。
【請求項７４】
請求項７２または７３に記載の組成物を含む容器。
【請求項７５】
複数の細胞を請求項７１に記載の複数のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子と接触させるステップを含む、操作された細胞を作製する方法。
【請求項７６】
前記複数の細胞が哺乳動物細胞である、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記ヒト細胞がリンパ球である、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記細胞が、前記複数のＡＡＶ粒子との前記接触の前に刺激される、請求項７５〜７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
前記刺激が、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、およびインターロイキンの少なくとも１つで実施される、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記接触が、前記刺激の前、後、または同時に実施される、請求項７９または８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記複数の細胞と前記複数のＡＡＶ粒子との前記接触が、前記刺激の後に実施される、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記刺激が、前記複数の細胞と前記複数のＡＡＶ粒子との前記接触の４日前から２４時間前に実施される、請求項７９〜８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
前記刺激が、前記複数の細胞と前記複数のＡＡＶ粒子との前記接触の３日前に実施される、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記複数の細胞のゲノムにゲノム破壊を導入するステップをさらに含む、請求項７５〜８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
前記ゲノム破壊が、クラスター化規則的間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）システムを含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記ゲノム破壊が、前記複数の細胞と前記複数のＡＡＶ粒子との前記接触の前に実施される、請求項８５または８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記操作された細胞を拡大させるステップをさらに含む、請求項７５〜８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
それを必要とする対象に、単位剤形で前記操作された細胞を投与するステップをさらに含む、請求項７５〜８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
前記投与が注入である、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記操作された細胞の前記投与が、それを必要とする前記対象の疾患または状態を少なくとも部分的に改善する、請求項８９または９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記疾患または状態が癌を含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記改善が、コンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャンにより測定した場合、少なくとも約３０％の前記癌の減少を含む、請求項９１または９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記改善が、コンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャンにより測定した場合、腫瘍病変の径のベースライン測定で１０％未満の変化により測定される腫瘍サイズの安定化を含む、請求項９１または９２に記載の方法。
【請求項９５】
複数の操作されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子をスクリーニングする方法であって、
ａ．突然変異または外因性ＡＡＶゲノムの少なくとも１つをアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドヌクレオチド配列のゲノムに導入して、操作されたＡＡＶ粒子を形成するステップ；
ｂ．ａからの複数の前記操作されたＡＡＶ粒子を複数の細胞ゲノムに導入するステップ；および
ｃ．前記複数の細胞ゲノム中の前記複数のＡＡＶ粒子によってコードされる導入遺伝子の発現レベルを定量化するステップであって、前記発現レベルは、ａからの異なる突然変異または外因性ＡＡＶゲノムを導入した第２のＡＡＶ粒子から得られる第２の発現レベルと比較されるステップ
を含む方法。
【請求項９６】
前記突然変異が、点突然変異、ミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異、挿入、欠失、複製、フレームシフト、または反復伸長の少なくとも１つを含む、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
前記突然変異が点突然変異を含む、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドヌクレオチド配列のゲノムが血清型ＡＡＶ６のものである、請求項９５〜９７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９９】
前記外因性ＡＡＶゲノムが、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、またはＡＡＶ１２のものである、請求項９５〜９８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
前記外因性ＡＡＶゲノムがＡＡＶ４である、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記外因性ＡＡＶゲノムがＡＡＶ５である、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０２】
前記外因性ＡＡＶゲノムがＡＡＶ１１である、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０３】
前記外因性ＡＡＶゲノムがＡＡＶ１２である、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０４】
前記複数の細胞ゲノムが、初代細胞、不死化細胞、または組換え細胞に由来する、請求項９５〜１０３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０５】
前記発現レベルの前記定量化が、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット、またはＰＣＲによって決定される、請求項９５〜１０４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０６】
前記操作されたＡＡＶ粒子が、前記複数の細胞ゲノムに導入された場合、操作されていないＡＡＶ粒子と比較して、形質導入後の導入遺伝子の発現の増加を付与する、請求項９５〜１０５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０７】
前記発現の増加が、前記ａからの異なる突然変異または外因性ＡＡＶゲノムを導入した第２のＡＡＶ粒子から得られる第２の発現レベルと比較して、約３０％、４０％、５０％、６０％から最大約１００％である、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記定量化が、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット、またはＰＣＲによって測定される、請求項９５〜１０７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０９】
操作された細胞を作製する方法であって、複数の細胞を、キャプシドタンパク質のＶＰ１領域の第１の突然変異およびＶＰ３領域の第２の突然変異を含む有効量のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子と接触させ、それにより複数の操作された細胞を生成するステップを含み、前記操作された細胞の形質導入後の導入遺伝子の発現は、野生型ＡＡＶ粒子、または前記キャプシドタンパク質のＶＰ領域に単一の突然変異を含むＡＡＶ粒子と接触した同等の複数の細胞と比較して増加する方法。
【請求項１１０】
操作された細胞を作製する方法であって、複数の細胞を、キャプシドタンパク質のＶＰ１領域の第１の突然変異およびＶＰ３領域の第２の突然変異を含む有効量のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子と接触させ、それにより複数の操作された細胞を生成するステップを含み、前記複数の細胞の形質導入後の導入遺伝子の発現は、２００，０００ＧＣ／ｍＬの平均感染力（ＭＯＩ）で、野生型ＡＡＶ粒子、または前記キャプシドタンパク質のＶＰ領域に単一の突然変異を含むＡＡＶ粒子と接触した同等の複数の細胞と比較して、前記ＭＯＩで約１０倍〜３００倍増加する方法。
【請求項１１１】
操作された細胞を作製する方法であって、複数の細胞を、導入遺伝子をコードし、キャプシドタンパク質のＶＰ１領域の第１の突然変異およびＶＰ３領域の第２の突然変異を含む有効量のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子と接触させ、それにより複数の操作された細胞を生成するステップを含み、前記複数の細胞における前記導入遺伝子の発現は、野生型ＡＡＶ粒子、または前記キャプシドタンパク質のＶＰ領域に単一の突然変異を含むＡＡＶ粒子と接触した細胞と比較して増加し、前記野生型ＡＡＶ粒子、または前記キャプシドタンパク質のＶＰ領域に単一の突然変異を含むＡＡＶ粒子はまた前記導入遺伝子をコードする方法。
【請求項１１２】
前記導入遺伝子が細胞受容体またはその一部をコードする、請求項１０９〜１１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１３】
前記細胞受容体またはその一部がＴ細胞受容体である、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
前記細胞受容体またはその一部がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
前記第１の突然変異が、前記核酸によってコードされるポリペプチドの１２９位のＦコード配列にある、請求項１０９〜１１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１６】
前記第１の突然変異が、前記ポリペプチドの１２９位のＦから非極性脂肪族アミノ酸への突然変異をコードする、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
前記非極性脂肪族アミノ酸が、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、およびバリン（Ｖ）から選択される、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
前記非極性脂肪族アミノ酸がＬである、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
前記第１の突然変異が、前記ポリペプチドのロイシン（Ｌ）コード配列にある、請求項１０９〜１１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２０】
前記第１の突然変異が、前記核酸によってコードされる前記ポリペプチドの５８４位のＬコード配列にある、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
前記第１の突然変異が、前記ポリペプチドの５８４位のＬから極性アミノ酸への突然変異をコードする、請求項１１９または１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
前記極性アミノ酸が、アスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）から選択される、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２３】
前記極性アミノ酸がＮである、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
前記第１の突然変異が、５８４位のＬから正に帯電したアミノ酸への突然変異をコードする、請求項１０９〜１２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２５】
前記正に帯電したアミノ酸がヒスチジン（Ｈ）である、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２６】
前記第１の突然変異が、前記ポリペプチドの５８４位のＬから負に帯電したアミノ酸への突然変異をコードする、請求項１０９〜１２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２７】
前記負に帯電したアミノ酸が、アスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）から選択される、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
前記負に帯電したアミノ酸がＤである、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
前記第１の突然変異が、前記ポリペプチドのバリン（Ｖ）コード配列にある、請求項１０９〜１２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３０】
前記第１の突然変異が、前記核酸によってコードされる前記ポリペプチドの５９８位のＶコード配列にある、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３１】
前記第１の突然変異が、前記ポリペプチドの５９８位のＶから非極性脂肪族アミノ酸への突然変異をコードする、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３２】
前記非極性脂肪族アミノ酸が、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、およびバリン（Ｖ）から選択される、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３３】
前記非極性脂肪族アミノ酸がＬである、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３４】
前記非極性脂肪族アミノ酸がＩである、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３５】
前記第２の突然変異が、前記ポリペプチドのヒスチジン（Ｈ）コード領域にある、請求項１１０〜１３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３６】
前記第２の突然変異が、前記ポリペプチドの６４２位のＨコード領域にある、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１３７】
前記突然変異が、前記ポリペプチドの６４２位のＨから極性アミノ酸への突然変異をコードする、請求項１３６に記載の方法。
【請求項１３８】
前記極性アミノ酸が、アスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）から選択される、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１３９】
前記極性アミノ酸がＮである、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４０】
前記第１の突然変異が、前記第２の突然変異の前の核酸の芳香族アミノ酸コード配列にあり、前記第２の突然変異が、前記核酸によってコードされるポリペプチドの非極性脂肪族アミノ酸をコードする、請求項１０９〜１３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４１】
前記芳香族アミノ酸が、前記ＶＰ１領域を含むポリペプチドの１２９位にある、請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４２】
前記第１の突然変異が、前記第２の突然変異の前の前記配列の位置でコードされるアミノ酸よりも疎水性が高いアミノ酸をコードする配列にある、請求項１０９〜１４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４３】
前記第２の突然変異が、正に帯電したアミノ酸から極性アミノ酸、負に帯電したアミノ酸から極性アミノ酸アミノ酸からなる群から選択される少なくとも１つの突然変異をコードする、請求項１１０〜１４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４４】
前記第２の突然変異が保存的突然変異をコードする、請求項１１０〜１４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４５】
前記保存的突然変異が、非極性脂肪族アミノ酸から非極性脂肪族アミノ酸、極性アミノ酸から極性アミノ酸、正に荷電したアミノ酸から正に帯電したアミノ酸、負に帯電したアミノ酸から負に帯電したアミノ酸、および芳香族アミノ酸から芳香族アミノ酸からなる群から選択される、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１４６】
前記第１の突然変異が、前記第２の突然変異の前の前記配列の位置でコードされるアミノ酸よりも疎水性が低いアミノ酸をコードする配列にある、請求項１０９〜１４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４７】
前記キャプシドタンパク質のＶＰ領域における前記第１の突然変異が、前記キャプシドタンパク質のＶＰ１またはＶＰ３領域における単一の突然変異である、請求項１０９〜１４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４８】
ＶＰ１領域における前記第１の突然変異がＦからＬへの突然変異を含む、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１４９】
ＶＰ１領域における前記第１の突然変異が、前記ＡＡＶヌクレオチド配列によってコードされるＡＡＶポリペプチド配列の１２９位で生じる、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５０】
前記第２の突然変異がＶＰ３領域にある場合、前記第２の突然変異が、ＨからＮ、ＤからＮ、ＤからＮ、ＶからＬ、およびＶからＩからなる群から選択される少なくとも１つの突然変異を含む、請求項１１０〜１４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５１】
ＶＰ３領域における前記第２の突然変異が、前記ＡＡＶヌクレオチド配列によってコードされるＡＡＶポリペプチド配列の４１８、４６２、５８４、５９８、または６４２位で生じる、請求項１５０に記載の方法。
【請求項１５２】
ＶＰ３領域における前記第２の突然変異が、Ｆ１２９Ｌ、Ｈ６４２Ｎ、Ｄ４１８Ｎ、Ｌ５８４Ｎ、Ｖ５９８Ｌ、Ｖ５９８Ｉの少なくとも１つを含む、請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５３】
前記複数の細胞をクラスター化規則的間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）システムと接触させ、それによりゲノム破壊を含む複数の操作された細胞を生成するステップをさらに含む、請求項１０９〜１５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５４】
前記接触が、前記ＡＡＶ粒子との前記接触の前、同時、または後である、請求項１５３に記載の方法。
【請求項１５５】
前記ゲノム破壊が免疫チェックポイント遺伝子の少なくとも一部を含む、請求項１５３または１５４に記載の方法。
【請求項１５６】
免疫チェックポイント遺伝子の前記ゲノム破壊が、前記免疫チェックポイント遺伝子によってコードされるタンパク質の発現の減少をもたらす、請求項１５５に記載の方法。
【請求項１５７】
前記ＣＲＩＳＰＲシステムが、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）およびエンドヌクレアーゼを含む、請求項１５３〜１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５８】
前記ｇＲＮＡが、前記免疫チェックポイント遺伝子の少なくとも一部に結合する、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１５９】
前記エンドヌクレアーゼがＣａｓである、請求項１５７または１５８に記載の方法。
【請求項１６０】
前記Ｃａｓが、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１またはＣｓｘ１２としても公知である）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１Ｓ、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、ＣｓＯ、Ｃｓｆ４、Ｃｐｆ１、ｃ２ｃ１、ｃ２ｃ３、Ｃａｓ９ＨｉＦｉ、それらの相同体、およびそれらの修飾バージョンからなる群から選択される、請求項１５９に記載の方法。
【請求項１６１】
前記ＣＲＩＳＰＲシステムが、前記複数の細胞にエレクトロポレーションまたはヌクレオフェクションされる、請求項１５３〜１６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６２】
前記ＣＲＩＳＰＲシステムが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはこれらの組み合わせによってコードされる、請求項１５３〜１６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６３】
前記ＣＲＩＳＰＲシステムがＲＮＡによってコードされる、請求項１６２に記載の方法。
【請求項１６４】
前記操作された細胞を拡大させるステップをさらに含む、請求項１０９〜１６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６５】
前記操作された細胞が少なくとも約１×１０８個の細胞に拡大される、請求項１６４に記載の方法。
【請求項１６６】
前記ＡＡＶがＡＡＶ６である、請求項１０９〜１６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６７】
前記ＡＡＶキャプシド核酸配列の少なくとも突然変異Ｆ１２９ＬおよびＨ６４２Ｎをコードする単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシド核酸配列。
【請求項１６８】
前記ＡＡＶキャプシド核酸配列の少なくとも突然変異Ｆ１２９ＬおよびＬ５８４Ｄをコードする単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシド核酸配列。
【請求項１６９】
前記ＡＡＶキャプシド核酸配列の少なくとも突然変異Ｆ１２９ＬおよびＤ４１８Ｎをコードする単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシド核酸配列。
【請求項１７０】
前記ＡＡＶキャプシド核酸配列の少なくとも突然変異Ｆ１２９ＬおよびＬ５８４Ｈをコードする単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシド核酸配列。
【請求項１７１】
前記ＡＡＶキャプシド核酸配列の少なくとも突然変異Ｆ１２９Ｌ、Ｈ６４２ＮおよびＤ４１８Ｎをコードする単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシド核酸配列。
【請求項１７２】
前記ＡＡＶキャプシド核酸配列の少なくとも突然変異Ｆ１２９Ｌ、Ｈ６４２ＮおよびＬ５８４Ｄをコードする単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシド核酸配列。
【請求項１７３】
前記ＡＡＶキャプシド核酸配列の少なくとも突然変異Ｆ１２９Ｌ、Ｈ６４２ＮおよびＬ５８４Ｎをコードする単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシド核酸配列。
【請求項１７４】
前記ＡＡＶキャプシド核酸配列の少なくとも突然変異Ｆ１２９Ｌ、Ｈ６４２ＮおよびＬ５８４Ｈをコードする単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシド核酸配列。
【請求項１７５】
前記ＡＡＶキャプシド核酸配列の少なくとも突然変異Ｆ１２９Ｌ、Ｈ６４２ＮおよびＶ５９８Ｌをコードする単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシド核酸配列。
【請求項１７６】
前記ＡＡＶキャプシド核酸配列の少なくとも突然変異Ｆ１２９Ｌ、Ｈ６４２ＮおよびＶ５９８Ｉをコードする単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシド核酸配列。
【請求項１７７】
請求項１６７〜１７６のいずれか一項に記載の単離および精製されたアデノ随伴ウイルスキャプシド核酸配列を含む細胞。
【請求項１７８】
外因性細胞受容体配列をコードするポリ核酸をさらに含む、請求項１７７に記載の細胞。
【請求項１７９】
操作された細胞を作製する方法であって、複数の細胞を、ＶＰ１配列、ＶＰ２配列、およびＶＰ３配列を含む有効量のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子であって、前記ＶＰ１配列、ＶＰ２配列、およびＶＰ３配列のうちの２つは第１のＡＡＶ血清型に由来し、前記ＶＰ１配列、ＶＰ２配列、およびＶＰ３配列の１つは第２のＡＡＶ血清型に由来するＡＡＶ粒子と接触させ、それにより複数の操作された細胞を生成するステップを含み、前記操作された細胞の形質導入またはトランスフェクション後の導入遺伝子の発現は、野生型ＡＡＶ粒子、または野生型ＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３配列を含むＡＡＶ粒子と接触した同等の複数の細胞と比較して増加する方法。
【請求項１８０】
操作された細胞を作製する方法であって、複数の細胞を、ＶＰ１配列、ＶＰ２配列、およびＶＰ３配列を含む有効量のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子であって、前記ＶＰ１配列、ＶＰ２配列、およびＶＰ３配列のうちの２つは第１のＡＡＶ血清型に由来し、前記ＶＰ１配列、ＶＰ２配列、およびＶＰ３配列の１つは第２のＡＡＶ血清型に由来するＡＡＶ粒子と接触させ、それにより複数の操作された細胞を生成するステップを含み、前記複数の細胞の形質導入またはトランスフェクション後の導入遺伝子の発現は、２００，０００ＧＣ／ｍＬの平均感染力（ＭＯＩ）で、野生型ＡＡＶ粒子、または野生型ＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３配列を含むＡＡＶ粒子と接触した同等の複数の細胞と比較して、前記ＭＯＩで約１０倍〜３００倍増加する方法。
【請求項１８１】
操作された細胞を作製する方法であって、複数の細胞を、導入遺伝子をコードし、ＶＰ１配列、ＶＰ２配列、およびＶＰ３配列を含む有効量のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子であって、前記ＶＰ１配列、ＶＰ２配列、およびＶＰ３配列のうちの２つは第１のＡＡＶ血清型に由来し、前記ＶＰ１配列、ＶＰ２配列、およびＶＰ３配列の１つは第２のＡＡＶ血清型に由来するＡＡＶ粒子と接触させ、それにより複数の操作された細胞を生成するステップを含み、前記複数の細胞における前記導入遺伝子の発現は、野生型ＡＡＶ粒子または野生型ＶＰ配列を含むＡＡＶ粒子と接触した細胞と比較して増加し、前記野生型ＡＡＶ粒子または前記キャプシドタンパク質の野生型ＶＰ配列を含むＡＡＶ粒子はまた前記導入遺伝子をコードする方法。
【請求項１８２】
前記導入遺伝子が細胞受容体またはその一部をコードする、請求項１７９〜１８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８３】
前記細胞受容体またはその一部がＴ細胞受容体である、請求項１８２に記載の方法。
【請求項１８４】
前記細胞受容体またはその一部がキメラ抗原受容体である、請求項１８２に記載の方法。
【請求項１８５】
前記ＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ５  ＶＰ１ｕヌクレオチド配列、ならびにＡＡＶ６  ＶＰ２およびＶＰ３ヌクレオチド配列を含む、請求項１７９〜１８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８６】
前記ＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ４  ＶＰ１およびＶＰ２ヌクレオチド配列、ならびにＡＡＶ６  ＶＰ３ヌクレオチド配列を含む、請求項１７９〜１８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８７】
前記ＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ５  ＶＰ１およびＶＰ２ヌクレオチド配列、ならびにＡＡＶ６  ＶＰ２およびＶＰ３ヌクレオチド配列を含む、請求項１７９〜１８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８８】
前記ＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ１１  ＶＰ１およびＶＰ２ヌクレオチド配列、ならびにＡＡＶ６  ＶＰ３ヌクレオチド配列を含む、請求項１７９〜１８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８９】
前記ＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ１２  ＶＰ１およびＶＰ２ヌクレオチド配列、ならびにＡＡＶ６  ＶＰ３ヌクレオチド配列を含む、請求項１７９〜１８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９０】
前記ＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ１  ＶＰ１ｕヌクレオチド配列、ならびにＡＡＶ６  ＶＰ２およびＶＰ３ヌクレオチド配列を含む、請求項１７９〜１８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９１】
前記ＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ１２  ＶＰ１ｕヌクレオチド配列、ならびにＡＡＶ６  ＶＰ２およびＶＰ３ヌクレオチド配列を含む、請求項１７９〜１８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９２】
前記ＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ５  ＶＰ１ｕ配列、ならびにＡＡＶ６  ＶＰ２およびＶＰ３配列を含む、請求項１７９〜１８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９３】
前記ＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ４  ＶＰ１およびＶＰ２配列、ならびにＡＡＶ６  ＶＰ３配列を含む、請求項１７９〜１８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９４】
前記ＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ５  ＶＰ１およびＶＰ２配列、ならびにＡＡＶ６  ＶＰ２およびＶＰ３配列を含む、請求項１７９〜１８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９５】
前記ＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ１１  ＶＰ１およびＶＰ２配列、ならびにＡＡＶ６  ＶＰ３配列を含む、請求項１７９〜１８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９６】
前記ＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ１２  ＶＰ１およびＶＰ２配列、ならびにＡＡＶ６  ＶＰ３配列を含む、請求項１７９〜１８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９７】
前記ＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ１  ＶＰ１ｕ配列、ならびにＡＡＶ６  ＶＰ２およびＶＰ３配列を含む、請求項１７９〜１８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９８】
前記ＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ１２  ＶＰ１ｕ配列、ならびにＡＡＶ６  ＶＰ２およびＶＰ３配列を含む、請求項１７９〜１８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９９】
前記複数の細胞をクラスター化規則的間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）システムと接触させ、それによりゲノム破壊を含む複数の操作された細胞を生成するステップをさらに含む、請求項１７９〜１９８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２００】
前記接触が、前記ＡＡＶ粒子との前記接触の前、同時、または後である、請求項１９９に記載の方法。
【請求項２０１】
前記ゲノム破壊が免疫チェックポイント遺伝子の少なくとも一部を含む、請求項１７９〜２００のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０２】
Ｆ１２９Ｌ、Ｈ６４２Ｎ、およびＬ５８４Ｄ突然変異をコードする、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドヌクレオチド配列。
【請求項２０３】
Ｆ１２９Ｌ、Ｈ６４２Ｎ、およびＤ４１８Ｎ突然変異をコードする、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドヌクレオチド配列。
【請求項２０４】
Ｆ１２９Ｌ、Ｈ６４２Ｎ、およびＬ５８４Ｎ突然変異をコードする、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドヌクレオチド配列。
【請求項２０５】
Ｆ１２９Ｌ、Ｈ６４２Ｎ、およびＬ５８４Ｄ突然変異をコードする、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドヌクレオチド配列。
【請求項２０６】
Ｆ１２９Ｌ、Ｈ４６２Ｎ、およびＶ５９８Ｌ突然変異をコードする、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドヌクレオチド配列。
【請求項２０７】
Ｆ１２９Ｌ、Ｈ６４２Ｎ、およびＶ５９８Ｉ突然変異をコードする、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドヌクレオチド配列。
【請求項２０８】
請求項２０２〜２０７のいずれか一項に記載の単離および精製されたＡＡＶキャプシドヌクレオチド配列で細胞をトランスフェクトすることにより生成された、操作された細胞。
【請求項２０９】
請求項２０８に記載の操作された細胞から単離された複数のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子。
【請求項２１０】
請求項２０９に記載の複数のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を含む容器。
【請求項２１１】
ＡＡＶ４  ＶＰ１およびＶＰ２ヌクレオチド配列、ならびにＡＡＶ６  ＶＰ３ヌクレオチド配列を含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドヌクレオチド配列。
【請求項２１２】
ＡＡＶ５  ＶＰ１およびＶＰ２ヌクレオチド配列、ならびにＡＡＶ６  ＶＰ２およびＶＰ３ヌクレオチド配列を含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドヌクレオチド配列。
【請求項２１３】
ＡＡＶ１１  ＶＰ１およびＶＰ２ヌクレオチド配列、ならびにＡＡＶ６  ＶＰ３ヌクレオチド配列を含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドヌクレオチド配列。
【請求項２１４】
ＡＡＶ１２  ＶＰ１およびＶＰ２ヌクレオチド配列、ならびにＡＡＶ６  ＶＰ３ヌクレオチド配列を含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドヌクレオチド配列。
【請求項２１５】
ＡＡＶ１  ＶＰ１ｕヌクレオチド配列、ならびにＡＡＶ６  ＶＰ２およびＶＰ３ヌクレオチド配列を含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドヌクレオチド配列。
【請求項２１６】
ＡＡＶ１２  ＶＰ１ｕヌクレオチド配列、ならびにＡＡＶ６  ＶＰ２およびＶＰ３ヌクレオチド配列を含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドヌクレオチド配列。
【請求項２１７】
ＡＡＶ５  ＶＰ１ｕ配列、ならびにＡＡＶ６  ＶＰ２およびＶＰ３配列を含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドヌクレオチド配列。
【請求項２１８】
ＡＡＶ４  ＶＰ１およびＶＰ２配列、ならびにＡＡＶ６  ＶＰ３配列を含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドヌクレオチド配列。
【請求項２１９】
ＡＡＶ５  ＶＰ１およびＶＰ２配列、ならびにＡＡＶ６  ＶＰ２およびＶＰ３配列を含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドヌクレオチド配列。
【請求項２２０】
ＡＡＶ１１  ＶＰ１およびＶＰ２配列、ならびにＡＡＶ６  ＶＰ３配列を含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドヌクレオチド配列。
【請求項２２１】
ＡＡＶ１２  ＶＰ１およびＶＰ２配列、ならびにＡＡＶ６  ＶＰ３配列を含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドヌクレオチド配列。
【請求項２２２】
ＡＡＶ１  ＶＰ１ｕ配列、ならびにＡＡＶ６  ＶＰ２およびＶＰ３配列を含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドヌクレオチド配列。
【請求項２２３】
ＡＡＶ１２  ＶＰ１ｕ配列、ならびにＡＡＶ６  ＶＰ２およびＶＰ３配列を含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドヌクレオチド配列。
【請求項２２４】
請求項２１１〜２２３のいずれか一項に記載の単離および精製されたＡＡＶヌクレオチド配列で細胞をトランスフェクトすることにより生成された、操作された細胞。
【請求項２２５】
請求項２２４に記載の操作された細胞から単離された複数のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子。
【請求項２２６】
請求項２２５に記載の複数のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を含む容器。
【請求項２２７】
操作された細胞を作製する方法であって、複数の細胞を、キャプシドタンパク質のＶＰ１領域の第１の突然変異およびＶＰ２領域の第２の突然変異を含む有効量のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子と接触させ、それにより複数の操作された細胞を生成するステップを含み、前記複数の細胞の形質導入後の導入遺伝子の発現は、２００，０００ＧＣ／ｍＬの平均感染力（ＭＯＩ）で、野生型ＡＡＶ粒子、または前記キャプシドタンパク質のＶＰ領域に単一の突然変異を含むＡＡＶ粒子と接触した同等の複数の細胞と比較して、前記ＭＯＩで約１０倍〜３００倍増加する方法。
【請求項２２８】
操作された細胞を作製する方法であって、複数の細胞を、導入遺伝子をコードし、キャプシドタンパク質のＶＰ１領域の第１の突然変異およびＶＰ２領域の第２の突然変異を含む有効量のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子と接触させ、それにより複数の操作された細胞を生成するステップを含み、前記複数の細胞における前記導入遺伝子の発現は、野生型ＡＡＶ粒子、または前記キャプシドタンパク質のＶＰ領域に単一の突然変異を含むＡＡＶ粒子と接触した細胞と比較して増加し、前記野生型ＡＡＶ粒子、または前記キャプシドタンパク質のＶＰ領域に単一の突然変異を含むＡＡＶ粒子はまた前記導入遺伝子をコードする方法。
【請求項２２９】
前記第２の突然変異がＶＰ２領域にある場合、前記第２の突然変異が、ＨからＮ、ＤからＮ、ＤからＮ、ＶからＬ、およびＶからＩからなる群から選択される少なくとも１つの突然変異を含む、請求項１１０〜１４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３０】
前記キャプシドヌクレオチド配列がＶＰ１ヌクレオチド配列である、請求項２０２〜２０７のいずれか一項に記載の単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドヌクレオチド配列。
【請求項２３１】
前記ＡＡＶがＡＡＶ６である、請求項２３０に記載の単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドヌクレオチド配列。
【請求項２３２】
前記核酸がＡＡＶ６  ＶＰ１ポリペプチド（polupeptide）をコードする、請求項４４〜４７のいずれか一項に記載の核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
[0001]本出願は、２０１７年６月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／５２７，９３７号、２０１８年４月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／６５９，４７２号、および２０１８年５月１日に出願された米国仮特許出願第６２／６６５，２５６号の利益を主張する。これらの出願は、参照により本明書に組み込まれる。
配列表
[0002]本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０１８年６月２９日に作製された前記ＡＳＣＩＩコピーの名称は、４７５３３−７２６＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズは５，９５５，９６５バイトである。
【背景技術】
【０００２】
[0003]過去５０年にわたる癌治療の顕著な進歩にもかかわらず、化学療法、放射線療法または生物療法に抵抗性のある多数の腫瘍タイプが残存し、特に外科的手法では対処できない進行期にあるものが挙げられる。最近、インビボで腫瘍上の分子標的を認識させるためのリンパ球の遺伝子工学において大きな進歩があり、標的腫瘍の顕著な寛解例がもたらされている。しかしながら、これらの成功は、主に血液腫瘍に限定されていて、特定の腫瘍の細胞によって発現される同定可能な分子の欠如、および腫瘍破壊を媒介するために腫瘍標的に特異的に結合するために使用することができる分子の欠如により、固形腫瘍へのより広範な適用が制限されている。
【０００３】
[0004]本明細書に開示される組成物および方法は、細胞療法を強化する修飾されたアデノ随伴ウイルスベクター、ならびに修飾されたアデノ随伴ウイルスベクターの同定方法を提供する。修飾されたアデノ随伴ウイルス法を用いた導入細胞の初代細胞への挿入は、癌などの様々な状態に対する免疫療法を拡大および改善するための新しい機会を開く革新的なアプローチである。
参照による組み込み
[0005]本明細書のすべての刊行物、特許、および特許出願は、あたかも個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み込まれることが具体的におよび個別に示されているのと同程度に参照により組み込まれる。本明細書の用語と組み込まれた参照の用語との間に矛盾がある場合では、本明細書の用語が支配する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
[0006]本明細書では、野生型ＡＡＶヌクレオチド配列と比較して、ＶＰ１領域に第１の突然変異、およびＶＰ３領域に第２の突然変異を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヌクレオチド配列を含む単離された天然に存在しない核酸が開示され、単離された天然に存在しない核酸は、複数の細胞と接触すると、野生型ＡＡＶ核酸、または同等の複数の細胞におけるキャプシドタンパク質のＶＰ領域における単一の突然変異を有するＡＡＶヌクレオチド配列と比較して、複数の細胞におけるトランスフェクションまたは形質導入後の導入遺伝子の発現が増加している。
【０００５】
[0007]本明細書では、野生型ＡＡＶヌクレオチド配列と比較して、ＶＰ１領域に第１の突然変異、およびＶＰ２領域に第２の突然変異を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヌクレオチド配列を含む単離された天然に存在しない核酸が開示され、単離された天然に存在しない核酸は、複数の細胞と接触すると、野生型ＡＡＶ核酸、または同等の複数の細胞におけるキャプシドタンパク質のＶＰ領域における単一の突然変異を有するＡＡＶヌクレオチド配列と比較して、複数の細胞におけるトランスフェクションまたは形質導入後の導入遺伝子の発現が増加している。場合によっては、ＡＡＶヌクレオチド配列は、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、およびそれらの任意の組み合わせのものである。ＡＡＶヌクレオチド配列は、ＡＡＶ６血清型のものであり得る。単離された天然に存在しない核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡの少なくとも１つであり得る。単離された天然に存在しない核酸はＤＮＡであり得る。第１の突然変異および第２の突然変異は、点突然変異、ミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異、挿入、欠失、複製、フレームシフト、または反復伸長の少なくとも１つを含む。第１の突然変異および第２の突然変異は点突然変異であり得る。第１の突然変異は、ＶＰ１領域のフェニルアラニン（Ｆ）コード配列の突然変異であり得る。場合によっては、第１の突然変異は、核酸によってコードされるポリペプチドのＶＰ１領域の１２９位のＦコード配列にあり得る。場合によっては、突然変異は、ポリペプチドの１２９位のＦから非極性脂肪族アミノ酸への突然変異をコードする。場合によっては、非極性脂肪族アミノ酸は、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、およびバリン（Ｖ）から選択され得る。場合によっては、非極性脂肪族アミノ酸はＬである。場合によっては、第２の突然変異は、ポリペプチドのロイシン（Ｌ）コード配列にある。場合によっては、第２の突然変異は、核酸によってコードされるポリペプチドの５８４位のＬコード配列にある。場合によっては、第２の突然変異は、ポリペプチドの５８４位のＬから極性アミノ酸への突然変異をコードする。極性アミノ酸は、アスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）から選択され得る。極性アミノ酸はＮであり得る。場合によっては、第２の突然変異は、５８４位のＬから正に帯電したアミノ酸への突然変異をコードする。正に帯電したアミノ酸はヒスチジン（Ｈ）であり得る。第２の突然変異は、ポリペプチドの５８４位のＬから負に帯電したアミノ酸への突然変異をコードし得る。場合によっては、負に帯電したアミノ酸は、アスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）から選択される。場合によっては、負に帯電したアミノ酸はＤである。場合によっては、第２の突然変異は、ポリペプチドのバリン（Ｖ）コード配列にある。場合によっては、第２の突然変異は、核酸によってコードされるポリペプチドの５９８位のＶコード配列にある。場合によっては、第２の突然変異は、ポリペプチドの５９８位のＶから非極性脂肪族アミノ酸への突然変異をコードする。場合によっては、非極性脂肪族アミノ酸は、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、およびバリン（Ｖ）から選択される。非極性脂肪族アミノ酸はＬであり得る。非極性脂肪族アミノ酸はＩであり得る。場合によっては、第２の突然変異は、ポリペプチドのヒスチジン（Ｈ）コード領域にある。場合によっては、第２の突然変異は、ポリペプチドの６４２位のＨコード領域にあり得る。場合によっては、第２の突然変異は、前記ポリペプチドの６４２位のＨから極性アミノ酸への突然変異をコードする。場合によっては、極性アミノ酸は、アスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）から選択される。場合によっては、極性アミノ酸はＮである。場合によっては、第１の突然変異は、第２の突然変異の前の核酸の芳香族アミノ酸コード配列にあり得、第２の突然変異は、核酸によってコードされるポリペプチドの非極性脂肪族アミノ酸をコードし得る。場合によっては、芳香族アミノ酸は、ＶＰ１領域によってコードされるＶＰ１ポリペプチドの１２９位にあり得る。場合によっては、第１の突然変異は、第２の突然変異の前の配列の位置でコードされるアミノ酸よりも疎水性が高いアミノ酸をコードする配列にある。場合によっては、第２の突然変異は、正に帯電したアミノ酸から極性アミノ酸、負に帯電したアミノ酸から極性アミノ酸からなる群から選択される少なくとも１つの突然変異をコードする。場合によっては、第２の突然変異は保存的突然変異をコードする。保存的突然変異は、非極性脂肪族アミノ酸から非極性脂肪族アミノ酸、極性アミノ酸から極性アミノ酸、正に帯電したアミノ酸から正に帯電したアミノ酸、負に帯電したアミノ酸から負に帯電したアミノ酸、および芳香族アミノ酸から芳香族アミノ酸なる群から選択することができる。場合によっては、第１の突然変異は、第２の突然変異の前に前記配列の位置でコードされるアミノ酸よりも疎水性が低いアミノ酸をコードする配列にある。場合によっては、第２の突然変異はＶＰ３領域にあり、第２の突然変異は、ＨからＮ、ＤからＮ、ＤからＮ、ＶからＬ、およびＶからＩからなる群から選択される少なくとも１つの突然変異をコードすることができる。場合によっては、ＶＰ３領域の第２の突然変異は、ＡＡＶヌクレオチド配列によってコードされるＡＡＶポリペプチド配列の４１８、４６２、５８４、５９８、または６４２位に生じる。場合によっては、単離された天然に存在しない核酸は、Ｆ１２９Ｌ、Ｈ６４２Ｎ、およびＤ４１８Ｎ突然変異の少なくとも１つを含む。場合によっては、単離された天然に存在しない核酸は、Ｆ１２９Ｌ、Ｈ６４２Ｎ、およびＬ５８４Ｎ突然変異の少なくとも１つをコードする。場合によっては、単離された天然に存在しない核酸は、Ｆ１２９Ｌ、Ｈ４６２Ｎ、およびＶ５９８Ｌの突然変異の少なくとも１つを含む。場合によっては、単離された天然に存在しない核酸は、Ｆ１２９Ｌ、Ｈ４６２Ｎ、およびＶ５９８Ｉ突然変異の少なくとも１つを含む。場合によっては、複数の細胞は、複数の初代細胞であり得る。場合によっては、単離された天然に存在しない核酸は、外因性受容体配列の少なくとも一部をコードする。場合によっては、単離された天然に存在しない核酸は医薬組成物に製剤化することができる。場合によっては、野生型ＡＡＶ核酸は、配列番号５５と少なくとも６０％の配列同一性を含む。
【０００６】
[0008]本明細書では、Ｆ１２９Ｌ、Ｈ６４２Ｎ、およびＤ４１８Ｎからなる群から選択される少なくとも２つの突然変異をコードする、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドヌクレオチド配列が開示される。
【０００７】
[0009]本明細書では、Ｆ１２９Ｌ、Ｈ６４２Ｎ、およびＬ５８４Ｎからなる群から選択される少なくとも２つの突然変異をコードする、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヌクレオチド配列が開示される。
【０００８】
[0010]本明細書では、Ｆ１２９Ｌ、Ｈ４６２Ｎ、およびＶ５９８Ｌからなる群から選択される少なくとも２つの突然変異をコードする、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヌクレオチド配列が開示される。
【０００９】
[0011]本明細書では、Ｆ１２９Ｌ、Ｈ６４２Ｎ、およびＶ５９８Ｉからなる群から選択される少なくとも２つの突然変異をコードする、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヌクレオチド配列が開示される。
【００１０】
[0012]本明細書では、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヌクレオチド配列から生成される単離および精製されたタンパク質である。
[0013]本明細書では、配列番号１〜配列番号１９の核酸配列のいずれか１つと少なくとも６０％の配列同一性または類似性を含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）核酸配列である。配列同一性は、約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％から最大約１００％であり得る。
【００１１】
[0014]本明細書では、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３配列を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヌクレオチド配列を含む単離された天然に存在しない核酸が開示され、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３配列のうちの２つは第１のＡＡＶ血清型に由来し、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３配列の１つは第２のＡＡＶ血清型に由来し、単離された天然に存在しない核酸は、複数の細胞に導入すると、野生型ＡＡＶ核酸と比較して、トランスフェクションまたは形質導入後の導入遺伝子の発現の増加をもたらす。場合によっては、第１のＡＡＶ血清型および第２のＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、またはそれらの任意の組み合わせから選択される。場合によっては、第１のＡＡＶ血清型および第２のＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ４およびＡＡＶ６、ＡＡＶ５およびＡＡＶ６、ＡＡＶ１１およびＡＡＶ６、ＡＡＶ１２およびＡＡＶ６、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。場合によっては、単離された天然に存在しない核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡの少なくとも１つであり得る。場合によっては、単離された天然に存在しない核酸はＤＮＡであり得る。場合によっては、細胞は、初代細胞、不死化細胞、または組換え細胞である。場合によっては、導入遺伝子は、外因性受容体配列の少なくとも一部をコードする。場合によっては、単離された天然に存在しない核酸は医薬組成物に製剤化することができる。場合によっては、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３領域は、キャプシドの少なくとも一部の中に含まれる。
【００１２】
[0015]本明細書では、配列番号１９５〜配列番号２１３のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも６０％の配列同一性または類似性を含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）核酸配列が開示される。配列同一性は、約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％から最大約１００％であり得る。
【００１３】
[0016]本明細書では、細胞を、単離および精製されたＡＡＶ核酸配列でトランスフェクトすることにより生成された、操作された細胞である。
[0017]本明細書では、操作された細胞から単離された複数のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子が開示される。
【００１４】
[0018]本明細書では、単位剤形でアデノ随伴ウイルス粒子を含む組成物が開示される。組成物は凍結保存することができる。
[0019]本明細書では、組成物を含む容器が開示される。
【００１５】
[0020]本明細書では、複数の細胞を複数のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子と接触させるステップを含む、操作された細胞を作製する方法が開示される。場合によっては、複数の細胞は哺乳動物細胞である。場合によっては、哺乳動物細胞はヒト細胞である。場合によっては、ヒト細胞はリンパ球である。場合によっては、細胞は、複数のＡＡＶ粒子と接触させる前に刺激することができる。場合によっては、刺激は、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、およびインターロイキンの少なくとも１つで行うことができる。場合によっては、接触は、刺激の前、後、または同時に行うことができる。場合によっては、複数の細胞を複数のＡＡＶ粒子と接触させることは、刺激後に行われる。刺激は、複数の細胞を複数のＡＡＶ粒子と接触させる４日前から２４時間前に行うことができる。刺激は、複数の細胞を複数のＡＡＶ粒子と接触させる３日前に行うことができる。方法は、複数の細胞のゲノムにゲノム破壊を導入することをさらに含むことができる。ゲノム破壊は、クラスター化規則的間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）システムを含むことができる。ゲノム破壊は、複数の細胞を複数のＡＡＶ粒子と接触させる前に行うことができる。方法は、操作された細胞を拡大することをさらに含むことができる。方法は、それを必要とする対象に、単位剤形で操作された細胞を投与することをさらに含むことができる。場合によっては、投与は注入である。場合によっては、操作された細胞の投与は、それを必要とする対象の疾患または状態を少なくとも部分的に改善する。場合によっては、疾患または状態は癌を含む。場合によっては、改善は、コンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャンによって測定した場合、癌の少なくとも約３０％の減少を含む。場合によっては、改善には、コンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャンで測定した場合、腫瘍病変の径のベースライン測定値で１０％未満の変化で測定される腫瘍サイズの安定化を含む。
【００１６】
[0021]本明細書では、複数の操作されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子をスクリーニングする方法であって、突然変異または外因性ＡＡＶゲノムの少なくとも１つをアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヌクレオチド配列のゲノムに導入して、操作されたＡＡＶ粒子を形成するステップ；ａからの複数の操作されたＡＡＶ粒子を複数の細胞ゲノムに導入するステップ；および複数の細胞ゲノム中の複数のＡＡＶ粒子によってコードされる導入遺伝子の発現レベルを定量化するステップであって、発現のレベルは、ａからの異なる突然変異または外因性ＡＡＶゲノムを導入した第２のＡＡＶ粒子から得られる第２の発現レベルと比較されるステップを含む方法が開示される。場合によっては、突然変異は、点突然変異、ミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異、挿入、欠失、複製、フレームシフト、または反復伸長の少なくとも１つを含む。場合によっては、突然変異は点突然変異を含む。場合によっては、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヌクレオチド配列のゲノムは血清型ＡＡＶ６のものである。外因性ＡＡＶゲノムは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、またはＡＡＶ１２のものであり得る。外因性ＡＡＶゲノムはＡＡＶ４であり得る。外因性ＡＡＶゲノムはＡＡＶ５であり得る。外因性ＡＡＶゲノムはＡＡＶ１１であり得る。外因性ＡＡＶゲノムはＡＡＶ１２であり得る。複数の細胞ゲノムは、初代細胞、不死化細胞、または組換え細胞に由来し得る。場合によっては、発現レベルの定量化は、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット、またはＰＣＲによって決定され得る。場合によっては、複数の細胞ゲノムに導入された場合、操作されたＡＡＶ粒子は、操作されていないＡＡＶ粒子と比較して、形質導入後の導入遺伝子の発現の増加をもたらす。発現の増加は、ａからの異なる突然変異または外因性ＡＡＶゲノムを導入した第２のＡＡＶ粒子から得られた第２のレベルの発現と比較して、約３０％、４０％、５０％、６０％から最大約１００％であり得る。定量化は、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット、またはＰＣＲにより測定され得る。
【００１７】
[0022]本明細書では、操作された細胞を作製する方法であって、複数の細胞を、キャプシドタンパク質のＶＰ１領域の第１の突然変異およびＶＰ３領域の第２の突然変異を含む有効量のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子と接触させ、それにより複数の操作された細胞を生成するステップを含み、操作された細胞の形質導入後の導入遺伝子の発現は、野生型ＡＡＶ粒子、またはキャプシドタンパク質のＶＰ領域に単一の突然変異を含むＡＡＶ粒子と接触した同等の複数の細胞と比較して増加する方法が開示される。
【００１８】
[0023]本明細書では、操作された細胞を作製する方法であって、複数の細胞を、キャプシドタンパク質のＶＰ１領域の第１の突然変異およびＶＰ３領域の第２の突然変異を含む有効量のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子と接触させ、それにより複数の操作された細胞を生成するステップを含み、複数の細胞の形質導入後の導入遺伝子の発現は、２００，０００ＧＣ／ｍＬの平均感染力（ＭＯＩ）で、野生型ＡＡＶ粒子、またはキャプシドタンパク質のＶＰ領域に単一の突然変異を含むＡＡＶ粒子と接触した同等の複数の細胞と比較して、該ＭＯＩで約１０倍〜３００倍増加する方法が開示される。
【００１９】
[0024]本明細書では、操作された細胞を作製する方法であって、複数の細胞を、導入遺伝子をコードし、キャプシドタンパク質のＶＰ１領域の第１の突然変異およびＶＰ３領域の第２の突然変異を含む有効量のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子と接触させ、それにより複数の操作された細胞を生成するステップを含み、ここで、前記複数の細胞における前記導入遺伝子の発現は、野生型ＡＡＶ粒子、または前記キャプシドタンパク質のＶＰ領域に単一の突然変異を含むＡＡＶ粒子と接触した細胞と比較して増加し、前記野生型ＡＡＶ粒子、または前記キャプシドタンパク質のＶＰ領域に単一の突然変異を含むＡＡＶ粒子はまた前記導入遺伝子をコードする方法が開示される。場合によっては、導入遺伝子は細胞受容体またはその一部をコードする。細胞受容体またはその一部はＴ細胞受容体であり得る。細胞受容体またはその一部は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であり得る。場合によっては、第１の突然変異は、本方法によってコードされるポリペプチドのＶＰ１領域の１２９位のＦコード配列にある。場合によっては、第１の突然変異は、ポリペプチドの１２９位のＦから非極性脂肪族アミノ酸への突然変異をコードする。場合によっては、非極性脂肪族アミノ酸は、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、およびバリン（Ｖ）から選択することができる。場合によっては、非極性脂肪族アミノ酸はＬであり得る。場合によっては、第１の突然変異は、ポリペプチドのロイシン（Ｌ）コード配列にある。場合によっては、第１の突然変異は、核酸によってコードされるポリペプチドの５８４位のＬコード配列にある。場合によっては、第１の突然変異は、ポリペプチドの５８４位のＬから極性アミノ酸への突然変異をコードする。極性アミノ酸は、アスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）から選択することができる。極性アミノ酸はＮであり得る。場合によっては、第１の突然変異は、５８４位のＬから正に帯電したアミノ酸への突然変異をコードする。正に帯電したアミノ酸はヒスチジン（Ｈ）であり得る。第１の突然変異は、ポリペプチドの５８４位のＬから負に帯電したアミノ酸への突然変異をコードすることができる。負に帯電したアミノ酸は、アスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）から選択することができる。負に帯電したアミノ酸はＤであり得る。場合によっては、第１の突然変異は、ポリペプチドのバリン（Ｖ）コード配列にあり得る。場合によっては、第１の突然変異は、核酸によってコードされるポリペプチドの５９８位のＶコード配列にあり得る。第１の突然変異は、ポリペプチドの５９８位のＶから非極性脂肪族アミノ酸への突然変異をコードすることができる。非極性脂肪族アミノ酸は、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、およびバリン（Ｖ）から選択することができる。非極性脂肪族アミノ酸はＬであり得る。非極性脂肪族アミノ酸はＩであり得る。第２の突然変異は、ポリペプチドのヒスチジン（Ｈ）コード領域にあり得る。第２の突然変異は、ポリペプチドの６４２位のＨコード領域にあり得る。第２の突然変異は、ポリペプチドの６４２位のＨから極性アミノ酸への突然変異をコードすることができる。場合によっては、極性アミノ酸はアスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）から選択することができる。極性アミノ酸はＮであり得る。第１の突然変異は、前記第２の突然変異の前の核酸の芳香族アミノ酸コード配列にあり得、前記第２の突然変異は、核酸によってコードされるポリペプチドの非極性脂肪族アミノ酸をコードする。場合によっては、芳香族アミノ酸は、ＶＰ１領域によってコードされるＶＰ１ポリペプチドの１２９位にあり得る。場合によっては、第１の突然変異は、第２の突然変異の前の配列の位置でコードされるアミノ酸よりも疎水性が高いアミノ酸をコードする配列にあり得る。場合によっては、第２の突然変異は、正に帯電したアミノ酸から極性アミノ酸、負に帯電したアミノ酸から極性アミノ酸からなる群から選択される少なくとも１つの突然変異をコードする。第２の突然変異は、保存的突然変異をコードし得る。保存的突然変異は、非極性脂肪族アミノ酸から非極性脂肪族アミノ酸、極性アミノ酸から極性アミノ酸、正に帯電したアミノ酸から正に帯電したアミノ酸、負に帯電したアミノ酸から負に帯電したアミノ酸、および芳香族アミノ酸から芳香族アミノ酸からなる群から選択することができる。場合によっては、第１の突然変異は、第２の突然変異の前の前記配列の位置でコードされるアミノ酸よりも疎水性が低いアミノ酸をコードする配列にあり得る。場合によっては、キャプシドタンパク質のＶＰ領域の第１の突然変異は、キャプシドタンパク質のＶＰ１またはＶＰ３領域の単一の突然変異であり得る。場合によっては、ＶＰ１領域の第１の突然変異は、ＦからＬへの突然変異を含む。場合によっては、ＶＰ１領域の第１の突然変異は、ＡＡＶヌクレオチド配列によってコードされるＡＡＶポリペプチド配列の１２９位で生じる。場合によっては、第２の突然変異はＶＰ３領域にあり、第２の突然変異は、ＨからＮ、ＤからＮ、ＤからＮ、ＶからＬ、およびＶからＩからなる群から選択される少なくとも１つの突然変異を含む。場合によっては、ＶＰ３領域の第２の突然変異は、ＡＡＶヌクレオチド配列によってコードされるＡＡＶポリペプチド配列の４１８、４６２、５８４、５９８、または６４２位で生じる可能性がある。ＶＰ３領域の第２の突然変異は、Ｆ１２９Ｌ、Ｈ６４２Ｎ、Ｄ４１８Ｎ、Ｌ５８４Ｎ、Ｖ５９８Ｌ、Ｖ５９８Ｉの少なくとも１つを含むことができる。方法は、複数の細胞を、クラスター化規則的間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）システムと接触させ、それによりゲノム破壊を含む複数の操作された細胞を生成することをさらに含むことができる。場合によっては、接触は、ＡＡＶ粒子との接触の前、同時、または後であり得る。エンドヌクレアーゼはＣａｓであり得る。Ｃａｓは、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１またはＣｓｘ１２としても公知である）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１Ｓ、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、ＣｓＯ、Ｃｓｆ４、Ｃｐｆ１、ｃ２ｃ１、ｃ２ｃ３、Ｃａｓ９ＨｉＦｉ、それらの相同体、およびそれらの修飾バージョンからなる群から選択され得る。ＣＲＩＳＰＲシステムは、複数の細胞にエレクトロポレーションまたはヌクレオフェクションすることができる。ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはこれらの組み合わせによってコードされ得る。ＣＲＩＳＰＲシステムはＲＮＡによってコードされ得る。方法は、操作された細胞を拡大することをさらに含むことができる。場合によっては、操作された細胞は、少なくとも約１×１０８細胞に拡大される。ＡＡＶはＡＡＶ６であり得る。
【００２０】
[0025]本明細書では、操作された細胞を作製する方法であって、複数の細胞を、クラスター化規則的間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）システムと接触させ、それによりゲノム破壊を含む複数の操作された細胞を生成するステップ；および操作された細胞を、細胞受容体をコードし、キャプシドタンパク質のＶＰ１領域の第１突然変異およびＶＰ３領域の第２突然変異を含む有効量のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子と接触させ、それにより複数の操作された形質導入された細胞を生成するステップを含み、細胞受容体の発現は、操作された形質導入された細胞において、２００，０００ＧＣ／ｍＬの平均感染力（ＭＯＩ）で、野生型ＡＡＶ粒子、または前記キャプシドタンパク質のＶＰ１領域に単一の突然変異を含むＡＡＶ粒子と接触した同等の細胞と比較して、ＭＯＩで約１０倍〜３００倍増加し、野生型ＡＡＶ粒子、またはキャプシドタンパク質のＶＰ１領域に単一の突然変異を含むＡＡＶ粒子はまた細胞受容体をコードする方法が開示される。場合によっては、複数の細胞は複数の初代細胞であり得る。場合によっては、初代細胞はリンパ球である。場合によっては、ＡＡＶ粒子はＡＡＶ６であり得る。場合によっては、第１の突然変異は、核酸によってコードされるポリペプチドのＶＰ１領域の１２９位のＦコード配列にあり得る。場合によっては、第１の突然変異は、ポリペプチドの１２９位のＦから非極性脂肪族アミノ酸への突然変異をコードする。場合によっては、非極性脂肪族アミノ酸は、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、およびバリン（Ｖ）から選択することができる。非極性脂肪族アミノ酸はＬであり得る。第２の突然変異は、ポリペプチドのロイシン（Ｌ）コード配列であり得る。第２の突然変異は、核酸によってコードされるポリペプチドの５８４位のＬコード配列にあり得る。第２の突然変異は、ポリペプチドの５８４位のＬから極性アミノ酸への突然変異をコードし得る。極性アミノ酸は、アスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）から選択することができる。極性アミノ酸はＮであり得る。場合によっては、第２の突然変異は、５８４位のＬから正に帯電したアミノ酸への突然変異をコードする。場合によっては、正に帯電したアミノ酸はヒスチジン（Ｈ）である。場合によっては、突然変異は、ポリペプチドの５８４位のＬから負に帯電したアミノ酸への突然変異をコードする。負に帯電したアミノ酸は、アスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）から選択することができる。負に帯電したアミノ酸はＤであり得る。場合によっては、第２の突然変異は、ポリペプチドのバリン（Ｖ）コード配列にあり得る。場合によっては、第２の突然変異は、核酸によってコードされるポリペプチドの５９８位のＶコード配列にある。突然変異は、ポリペプチドの５９８位のＶを非極性脂肪族アミノ酸にコードすることができる。場合によっては、非極性脂肪族アミノ酸は、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、およびバリン（Ｖ）から選択することができる。非極性脂肪族アミノ酸はＬであり得る。非極性脂肪族アミノ酸はＩであり得る。第２の突然変異は、ポリペプチドのヒスチジン（Ｈ）コード領域にあり得る。第２の突然変異は、ポリペプチドの６４２位のＨコード領域にあり得る。場合によっては、第２の突然変異は、ポリペプチドの６４２位のＨから極性アミノ酸への突然変異をコードする。場合によっては、極性アミノ酸は、アスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）から選択することができる。極性アミノ酸はＮであり得る。第１の突然変異は、第２の突然変異の前の核酸の芳香族アミノ酸コード配列にあり得、第２の突然変異は、核酸によってコードされるポリペプチドの非極性脂肪族アミノ酸をコードし得る。芳香族アミノ酸は、ＶＰ１領域によってコードされるＶＰ１ポリペプチドの１２９位にあり得る。第１の突然変異は、第２の突然変異の前の配列の位置でコードされるアミノ酸よりも疎水性が高いアミノ酸をコードする配列にあり得る。第２の突然変異は、正に帯電したアミノ酸から極性アミノ酸、負に帯電したアミノ酸から極性アミノ酸からなる群から選択される少なくとも１つの突然変異をコードすることができる。第２の突然変異は、保存的突然変異をコードする。保存的突然変異は、非極性脂肪族アミノ酸から非極性脂肪族アミノ酸、極性アミノ酸から極性アミノ酸、正に帯電したアミノ酸から正に帯電したアミノ酸、負に帯電したアミノ酸から負に帯電したアミノ酸、および芳香族アミノ酸から芳香族アミノ酸からなる群から選択することができる。第１の突然変異は、第２の突然変異の前の配列の位置でコードされるアミノ酸よりも疎水性が低いアミノ酸をコードする配列にあり得る。第１の突然変異および第２の突然変異は、Ｆ１２９Ｌ、Ｈ６４２Ｎ、およびＤ４１８Ｎ；Ｆ１２９Ｌ、Ｈ６４２Ｎ、およびＬ５８４Ｎ；Ｆ１２９Ｌ、Ｈ４６２Ｎ、およびＶ５９８Ｌ；Ｆ１２９Ｌ、Ｈ４６２Ｎ、およびＶ５９８Ｉからなる群から選択することができる。細胞受容体は、Ｔ細胞受容体であり得る。方法は、操作された細胞を拡大することをさらに含むことができる。方法は、それを必要とする対象に操作された細胞を投与することをさらに含むことができる。対象は、癌を有することができる。癌は固形癌であり得る。
【００２１】
[0026]本明細書では、キャプシド核酸配列によってコードされるＡＡＶポリペプチドに突然変異Ｆ１２９ＬおよびＨ６４２Ｎを含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシド核酸配列が開示される。
【００２２】
[0027]本明細書では、キャプシド核酸配列によってコードされるＡＡＶポリペプチドに突然変異Ｆ１２９ＬおよびＬ５８４Ｄを含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシド核酸配列が開示される。
【００２３】
[0028]本明細書では、キャプシド核酸配列によってコードされるＡＡＶポリペプチドに突然変異Ｆ１２９ＬおよびＤ４１８Ｎを含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシド核酸配列が開示される。
【００２４】
[0029]本明細書では、キャプシド核酸配列によってコードされるＡＡＶポリペプチドに突然変異Ｆ１２９ＬおよびＬ５８４Ｈを含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシド核酸配列が開示される。
【００２５】
[0030]本明細書では、キャプシド核酸配列によってコードされるＡＡＶポリペプチドに突然変異Ｆ１２９Ｌ、Ｈ６４２Ｎ、およびＤ４１８Ｎを含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシド核酸配列が開示される。
【００２６】
[0031]本明細書では、キャプシド核酸配列によってコードされるＡＡＶポリペプチドに突然変異Ｆ１２９Ｌ、Ｈ６４２Ｎ、およびＬ５８４Ｄを含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシド核酸配列が開示される。
【００２７】
[0032]本明細書では、キャプシド核酸配列によってコードされるＡＡＶポリペプチドに突然変異Ｆ１２９Ｌ、Ｈ６４２Ｎ、およびＬ５８４Ｎを含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシド核酸配列が開示される。
【００２８】
[0033]本明細書では、キャプシド核酸配列によってコードされるＡＡＶポリペプチドに突然変異Ｆ１２９Ｌ、Ｈ６４２Ｎ、およびＬ５８４Ｈを含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシド核酸配列が開示される。
【００２９】
[0034]本明細書では、キャプシド核酸配列によってコードされるＡＡＶポリペプチドに突然変異Ｆ１２９Ｌ、Ｈ６４２Ｎ、およびＶ５９８Ｌを含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシド核酸配列が開示される。
【００３０】
[0035]本明細書では、キャプシド核酸配列によってコードされるＡＡＶポリペプチドに突然変異Ｆ１２９Ｌ、Ｈ６４２Ｎ、およびＶ５９８Ｉを含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシド核酸配列が開示される。
【００３１】
[0036]本明細書では、単離および精製されたポリ核酸を含む細胞が開示される。
[0037]本明細書では、ガイド核酸の配列を細胞に導入するステップを含む、操作された細胞を作製する方法が開示される。
【００３２】
[0038]本明細書では、操作された細胞を作製する方法であって、複数の細胞を、ＶＰ１配列、ＶＰ２配列、およびＶＰ３配列を含む有効量のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子であって、ＶＰ１配列、ＶＰ２配列、およびＶＰ３配列のうちの２つは第１のＡＡＶ血清型に由来し、ＶＰ１配列、ＶＰ２配列、およびＶＰ３配列の１つは第２のＡＡＶ血清型に由来するＡＡＶ粒子と接触させ、それにより複数の操作された細胞を生成するステップを含み、操作された細胞の形質導入またはトランスフェクション後の導入遺伝子の発現は、野生型ＡＡＶ粒子、または野生型ＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３配列を含むＡＡＶ粒子と接触した同等の複数の細胞と比較して増加する方法が開示される。
【００３３】
[0039]本明細書では、操作された細胞を作製する方法であって、複数の細胞を、ＶＰ１配列、ＶＰ２配列、およびＶＰ３配列を含む有効量のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子であって、ＶＰ１配列、ＶＰ２配列、およびＶＰ３配列のうちの２つは第１のＡＡＶ血清型に由来し、ＶＰ１配列、ＶＰ２配列、およびＶＰ３配列の１つは第２のＡＡＶ血清型に由来するＡＡＶ粒子と接触させ、それにより複数の操作された細胞を生成するステップを含み、前記複数の細胞の形質導入またはトランスフェクション後の導入遺伝子の発現は、２００，０００ＧＣ／ｍＬの平均感染力（ＭＯＩ）で、野生型ＡＡＶ粒子、または野生型ＶＰ１、ＶＰ２、もしくはＶＰ３配列を含むＡＡＶ粒子と接触した同等の複数の細胞と比較して、ＭＯＩで約１０倍〜３００倍増加する方法が開示される。
【００３４】
[0040]本明細書では、操作された細胞を作製する方法であって、複数の細胞を、導入遺伝子をコードし、ＶＰ１配列、ＶＰ２配列、およびＶＰ３配列を含む有効量のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子であって、ＶＰ１配列、ＶＰ２配列、およびＶＰ３配列のうちの２つは第１のＡＡＶ血清型に由来し、ＶＰ１配列、ＶＰ２配列、およびＶＰ３配列の１つは第２のＡＡＶ血清型に由来するＡＡＶ粒子と接触させ、それにより複数の操作された細胞を生成するステップを含み、複数の細胞における導入遺伝子の発現は、野生型ＡＡＶ粒子、または野生型ＶＰ配列を含むＡＡＶ粒子と接触した細胞と比較して増加し、野生型ＡＡＶ粒子、またはキャプシドタンパク質の野生型ＶＰ配列を含むＡＡＶ粒子はまた導入遺伝子をコードする方法が開示される。場合によっては、導入遺伝子は、細胞受容体またはその一部をコードする。場合によっては、細胞受容体またはその一部はＴ細胞受容体である。場合によっては、細胞受容体またはその一部はキメラ抗原受容体である。場合によっては、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ５  ＶＰ１ｕヌクレオチド配列、ならびにＡＡＶ６  ＶＰ２およびＶＰ３ヌクレオチド配列を含む。場合によっては、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ４  ＶＰ１およびＶＰ２ヌクレオチド配列、ならびにＡＡＶ６  ＶＰ３ヌクレオチド配列を含む。場合によっては、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ５  ＶＰ１およびＶＰ２ヌクレオチド配列、ならびにＡＡＶ６  ＶＰ２およびＶＰ３ヌクレオチド配列を含む。場合によっては、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１１  ＶＰ１およびＶＰ２ヌクレオチド配列、ならびにＡＡＶ６  ＶＰ３ヌクレオチド配列を含む。場合によっては、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１２  ＶＰ１およびＶＰ２ヌクレオチド配列、ならびにＡＡＶ６  ＶＰ３ヌクレオチド配列を含む。場合によっては、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１  ＶＰ１ｕヌクレオチド配列、ならびにＡＡＶ６  ＶＰ２およびＶＰ３ヌクレオチド配列を含む。場合によっては、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１２  ＶＰ１ｕヌクレオチド配列、ならびにＡＡＶ６  ＶＰ２およびＶＰ３ヌクレオチド配列を含む。場合によっては、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ５  ＶＰ１ｕ配列、ならびにＡＡＶ６  ＶＰ２およびＶＰ３配列を含む。場合によっては、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ４  ＶＰ１およびＶＰ２配列、ならびにＡＡＶ６  ＶＰ３配列を含む。場合によっては、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ５  ＶＰ１およびＶＰ２配列、ならびにＡＡＶ６  ＶＰ２およびＶＰ３配列を含む。場合によっては、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１１  ＶＰ１およびＶＰ２配列、ならびにＡＡＶ６  ＶＰ３配列を含む。場合によっては、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１２  ＶＰ１およびＶＰ２配列、ならびにＡＡＶ６  ＶＰ３配列を含む。場合によっては、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１  ＶＰ１ｕ配列、ならびにＡＡＶ６  ＶＰ２およびＶＰ３配列を含む。場合によっては、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１２  ＶＰ１ｕ配列、ならびにＡＡＶ６  ＶＰ２およびＶＰ３配列を含む。場合によっては、方法は、複数の細胞をクラスター化規則的間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）システムと接触させ、それによりゲノム破壊を含む複数の操作された細胞を生成することをさらに含む。場合によっては、接触は、前記ＡＡＶ粒子との前記接触の前、同時、または後である。
【００３５】
[0041]本明細書では、操作された形質導入された細胞を作製する方法であって、複数の細胞をクラスター化規則的間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）システムと接触させ、それによりゲノム破壊を含む複数の操作された細胞を生成するステップ；操作された細胞を、細胞受容体をコードし、ＶＰ１配列、ＶＰ２配列、およびＶＰ３配列を含む有効量のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子であって、ＶＰ１配列、ＶＰ２配列、およびＶＰ３配列のうちの２つは第１のＡＡＶ血清型に由来し、ＶＰ１配列、ＶＰ２配列、およびＶＰ３配列の１つは第２のＡＡＶ血清型に由来するＡＡＶ粒子と接触させ、それにより複数の操作された形質導入された細胞を生成するステップを含み、細胞受容体の発現は、前記操作された形質導入された細胞において、２００，０００ＧＣ／ｍＬの平均感染力（ＭＯＩ）で、野生型ＡＡＶ粒子、または野生型ＶＰ配列を含むＡＡＶ粒子と接触した同等の細胞と比較して、該ＭＯＩで約１０倍〜３００倍増加し、前記野生型ＡＡＶ粒子、または野生型ＶＰ配列を含むＡＡＶ粒子はまた細胞受容体をコードする方法が開示される。場合によっては、複数の細胞は、複数の初代細胞であり得る。方法は、それを必要とする対象に操作された細胞を投与することをさらに含むことができる。場合によっては、対象は癌を有する。場合によっては、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ５  ＶＰ１ｕヌクレオチド配列、ならびにＡＡＶ６  ＶＰ２およびＶＰ３ヌクレオチド配列を含む。場合によっては、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ４  ＶＰ１およびＶＰ２ヌクレオチド配列、ならびにＡＡＶ６  ＶＰ３ヌクレオチド配列を含む。場合によっては、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ５  ＶＰ１およびＶＰ２ヌクレオチド配列、ならびにＡＡＶ６  ＶＰ２およびＶＰ３ヌクレオチド配列を含む。場合によっては、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１１  ＶＰ１およびＶＰ２ヌクレオチド配列、ならびにＡＡＶ６  ＶＰ３ヌクレオチド配列を含む。場合によっては、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１２  ＶＰ１およびＶＰ２ヌクレオチド配列、ならびにＡＡＶ６  ＶＰ３ヌクレオチド配列を含む。場合によっては、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１  ＶＰ１ｕヌクレオチド配列、ならびにＡＡＶ６  ＶＰ２およびＶＰ３ヌクレオチド配列を含む。場合によっては、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１２  ＶＰ１ｕヌクレオチド配列、ならびにＡＡＶ６  ＶＰ２およびＶＰ３ヌクレオチド配列を含む。場合によっては、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ５  ＶＰ１ｕ配列、ならびにＡＡＶ６  ＶＰ２およびＶＰ３配列を含む。場合によっては、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ４  ＶＰ１およびＶＰ２配列、ならびにＡＡＶ６  ＶＰ３配列を含む。場合によっては、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ５  ＶＰ１およびＶＰ２配列、ならびにＡＡＶ６  ＶＰ２およびＶＰ３配列を含む。場合によっては、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１１  ＶＰ１およびＶＰ２配列、ならびにＡＡＶ６  ＶＰ３配列を含む。場合によっては、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１２  ＶＰ１およびＶＰ２配列、ならびにＡＡＶ６  ＶＰ３配列を含む。場合によっては、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１  ＶＰ１ｕ配列、ならびにＡＡＶ６  ＶＰ２およびＶＰ３配列を含む。場合によっては、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１２  ＶＰ１ｕ配列、ならびにＡＡＶ６  ＶＰ２およびＶＰ３配列を含む。場合によって���、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ６粒子を含むことができる。場合によっては、接触は、ＡＡＶ粒子との接触の前、同時、または後であり得る。ＣＲＩＳＰＲシステムは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）およびエンドヌクレアーゼを含む。エンドヌクレアーゼは、ＣＡＳであり得る。Ｃａｓは、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１またはＣｓｘ１２としても公知である）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１Ｓ、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、ＣｓＯ、Ｃｓｆ４、Ｃｐｆ１、ｃ２ｃ１、ｃ２ｃ３、Ｃａｓ９ＨｉＦｉ、それらの相同体、およびそれらの修飾バージョンからなる群から選択され得る。ＣＲＩＳＰＲシステムは、複数の細胞にエレクトロポレーションまたはヌクレオフェクションすることができる。ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはこれらの組み合わせによってコードされ得る。ＣＲＩＳＰＲシステムはＲＮＡによってコードされ得る。方法は、操作された細胞を拡大することをさらに含むことができる。操作された細胞は、少なくとも約１×１０８細胞に拡大され得る。
【００３６】
[0042]本明細書では、Ｆ１２９Ｌ、Ｈ６４２Ｎ、およびＬ５８４Ｄ突然変異を含むキャプシドをコードする、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヌクレオチド配列が開示される。
【００３７】
[0043]本明細書では、Ｆ１２９Ｌ、Ｈ６４２Ｎ、およびＤ４１８Ｎ突然変異を含むキャプシドをコードする、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヌクレオチド配列が開示される。
【００３８】
[0044]本明細書では、Ｆ１２９Ｌ、Ｈ６４２Ｎ、およびＬ５８４Ｎ突然変異を含むキャプシドをコードする、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヌクレオチド配列が開示される。
【００３９】
[0045]本明細書では、Ｆ１２９Ｌ、Ｈ６４２Ｎ、およびＬ５８４Ｄ突然変異を含むキャプシドをコードする、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヌクレオチド配列が開示される。
【００４０】
[0046]本明細書では、Ｆ１２９Ｌ、Ｈ４６２Ｎ、およびＶ５９８Ｌ突然変異を含むキャプシドをコードする、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヌクレオチド配列が開示される。
【００４１】
[0047]本明細書では、Ｆ１２９Ｌ、Ｈ６４２Ｎ、およびＶ５９８Ｉ突然変異を含むキャプシドをコードする、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヌクレオチド配列が開示される。
【００４２】
[0048]本明細書では、細胞を、単離および精製されたＡＡＶヌクレオチド配列でトランスフェクトすることにより生成された、操作された細胞が開示される。
[0049]本明細書では、操作された細胞から単離された複数のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子が開示される。
【００４３】
[0050]本明細書では、複数のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を含む容器が開示される。
[0051]本明細書では、ＡＡＶ４  ＶＰ１およびＶＰ２ヌクレオチド配列と、ＡＡＶ６  ＶＰ３ヌクレオチド配列とを含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヌクレオチド配列が開示される。
【００４４】
[0052]本明細書では、ＡＡＶ５  ＶＰ１およびＶＰ２ヌクレオチド配列と、ＡＡＶ６  ＶＰ２およびＶＰ３ヌクレオチド配列とを含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヌクレオチド配列が開示される。
【００４５】
[0053]本明細書では、ＡＡＶ１１  ＶＰ１およびＶＰ２ヌクレオチド配列と、ＡＡＶ６  ＶＰ３ヌクレオチド配列とを含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヌクレオチド配列が開示される。
【００４６】
[0054]本明細書では、ＡＡＶ１２  ＶＰ１およびＶＰ２ヌクレオチド配列と、ＡＡＶ６  ＶＰ３ヌクレオチド配列とを含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヌクレオチド配列が開示される。
【００４７】
[0055]本明細書では、ＡＡＶ１  ＶＰ１ヌクレオチド配列と、ＡＡＶ６  ＶＰ２およびＶＰ３ヌクレオチド配列とを含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヌクレオチド配列が開示される。一部の実施形態では、ＡＡＶ１  ＶＰ１ヌクレオチド配列は、ＡＡＶ１  ＶＰ１ｕヌクレオチド配列である。
【００４８】
[0056]本明細書では、ＡＡＶ１２  ＶＰ１ヌクレオチド配列と、ＡＡＶ６  ＶＰ２およびＶＰ３ヌクレオチド配列とを含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヌクレオチド配列が開示される。一部の実施形態では、ＡＡＶ１  ＶＰ１ヌクレオチド配列は、ＡＡＶ１  ＶＰ１ｕヌクレオチド配列である。
【００４９】
[0057]本明細書では、ＡＡＶ５  ＶＰ１配列と、ＡＡＶ６  ＶＰ２およびＶＰ３配列とを含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヌクレオチド配列が開示される。一部の実施形態では、ＡＡＶ１  ＶＰ１ヌクレオチド配列は、ＡＡＶ１  ＶＰ１ｕヌクレオチド配列である。
【００５０】
[0058]本明細書では、ＡＡＶ４  ＶＰ１およびＶＰ２配列と、ＡＡＶ６  ＶＰ３配列を含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヌクレオチド配列が開示される。
【００５１】
[0059]本明細書では、ＡＡＶ５  ＶＰ１およびＶＰ２配列と、ＡＡＶ６  ＶＰ２およびＶＰ３配列とを含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヌクレオチド配列が開示される。
【００５２】
[0060]本明細書では、ＡＡＶ１１  ＶＰ１およびＶＰ２配列と、ＡＡＶ６  ＶＰ３配列とを含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヌクレオチド配列が開示される。
【００５３】
[0061]本明細書では、ＡＡＶ１２  ＶＰ１およびＶＰ２配列と、ＡＡＶ６  ＶＰ３配列とを含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヌクレオチド配列が開示される。
【００５４】
[0062]本明細書では、ＡＡＶ１  ＶＰ１配列と、ＡＡＶ６  ＶＰ２およびＶＰ３配列とを含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヌクレオチド配列が開示される。一部の実施形態では、ＡＡＶ１  ＶＰ１ヌクレオチド配列は、ＡＡＶ１  ＶＰ１ｕヌクレオチド配列である。
【００５５】
[0063]本明細書では、ＡＡＶ１２  ＶＰ１配列と、ＡＡＶ６  ＶＰ２およびＶＰ３配列とを含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヌクレオチド配列が開示される。一部の実施形態では、ＡＡＶ１  ＶＰ１ヌクレオチド配列は、ＡＡＶ１  ＶＰ１ｕヌクレオチド配列である。
【００５６】
[0064]本明細書では、細胞を、単離および精製されたＡＡＶヌクレオチド配列でトランスフェクトすることにより生成された、操作された細胞が開示される。
[0065]本明細書では、操作された細胞から単離された複数のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子が開示される。
【００５７】
[0066]本明細書では、複数のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を含む容器が開示される。
[0067]本明細書では、野生型ＡＡＶヌクレオチド配列と比較して、ＶＰ１領域に第１の突然変異、およびＶＰ３領域に第２の突然変異を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヌクレオチド配列を含む、単離された天然に存在しない核酸が開示され、複数の細胞への導入時に、単離された天然に存在しない核酸は、野生型ＡＡＶ核酸と比較して複数の細胞におけるＡＡＶ形質導入効率の増加をもたらす。場合によっては、ＡＡＶは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、およびそれらの任意の組み合わせのものであり得る。場合によっては、ＡＡＶは、ＡＡＶ６であり得る。核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡの少なくとも１つであり得る。場合によっては、核酸はＤＮＡであり得る。場合によっては、突然変異は、点突然変異、ミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異、挿入、欠失、複製、フレームシフト、または反復伸長の少なくとも１つを含むことができる。突然変異は、点突然変異であり得る。場合によっては、ＶＰ１領域の第１の突然変異は、ＦからＬへの突然変異を含む。場合によっては、ＶＰ１領域の第１の突然変異は、ＡＡＶヌクレオチド配列の１２９位で生じ得る。場合によっては、ＶＰ３領域の第２の突然変異は、ＨからＮ、ＤからＮ、ＤからＮ、ＶからＬ、およびＶからＩからなる群から選択される少なくとも１つの突然変異を含むことができる。ＶＰ３領域における第２の突然変異は、前記ＡＡＶヌクレオチド配列によってコードされるＡＡＶポリペプチド配列の４１８、４６２、５８４、５９８、または６４２位で生じ得る。場合によっては、核酸は、Ｆ１２９Ｌ、Ｈ６４２Ｎ、およびＤ４１８Ｎの少なくとも１つを含むことができる。場合によっては、核酸は、Ｆ１２９Ｌ、Ｈ６４２Ｎ、およびＬ５８４Ｎの少なくとも１つを含むことができる。場合によっては、核酸は、Ｆ１２９Ｌ、Ｈ４６２Ｎ、またはＶ５９８Ｌの少なくとも１つを含むことができる。場合によっては、核酸は、Ｆ１２９Ｌ、Ｈ４６２Ｎ、またはＶ５９８Ｉの少なくとも１つを含むことができる。場合によっては、複数の細胞は、初代細胞であり得る。ＡＡＶヌクレオチド配列は、外因性受容体配列の少なくとも一部をコードすることができる。場合によっては、核酸を医薬組成物に製剤化することができる。場合によっては、野生型ＡＡＶ核酸は、配列番号５５と少なくとも６０％の配列同一性を含むことができる。
【００５８】
[0068]本明細書では、Ｆ１２９Ｌ、Ｈ６４２Ｎ、およびＤ４１８Ｎからなる群から選択される少なくとも２つの突然変異を含むキャプシドをコードする、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヌクレオチド配列が開示される。
【００５９】
[0069]本明細書では、Ｆ１２９Ｌ、Ｈ６４２Ｎ、およびＬ５８４Ｎからなる群から選択される少なくとも２つの突然変異を含むキャプシドをコードする、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヌクレオチド配列が開示される。
【００６０】
[0070]本明細書では、Ｆ１２９Ｌ、Ｈ４６２Ｎ、およびＶ５９８Ｌからなる群から選択される少なくとも２つの突然変異を含むキャプシドをコードする、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヌクレオチド配列が開示される。
【００６１】
[0071]本明細書では、Ｆ１２９Ｌ、Ｈ６４２Ｎ、およびＶ５９８Ｉからなる群から選択される少なくとも２つの突然変異を含むキャプシドをコードする単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヌクレオチド配列が開示される。
【００６２】
[0072]本明細書では、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヌクレオチド配列から生成される単離および精製されたタンパク質が開示される。
[0073]本明細書では、配列番号１〜配列番号１９のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも６０％の配列同一性または類似性を含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）核酸配列が開示される。場合によっては、配列の同一性は、約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％から最大約１００％であり得る。
【００６３】
[0074]本明細書では、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３配列を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヌクレオチド配列を含む単離された天然に存在しない核酸であり、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３配列のうちの２つは第１のＡＡＶ血清型に由来し、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３配列の１つは第２のＡＡＶ血清型に由来し、複数の細胞への導入時に単離された天然に存在しない核酸は、野生型ＡＡＶ核酸と比較してＡＡＶ形質導入効率の増加をもたらす。場合によっては、第１のＡＡＶ血清型および第２のＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、またはそれらの任意の組み合わせから選択することができる。場合によっては、第１のＡＡＶ血清型および第２のＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ４およびＡＡＶ６、ＡＡＶ５およびＡＡＶ６、ＡＡＶ１１およびＡＡＶ６、ＡＡＶ１２およびＡＡＶ６、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択することができる。場合によっては、核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡの少なくとも１つであり得る。核酸はＤＮＡであり得る。形質導入効率は、複数の細胞上の核酸によってコードされる導入遺伝子の発現を含み得る。場合によっては、細胞が初代細胞であり得る。導入遺伝子は、外因性受容体配列の少なくとも一部をコードし得る。場合によっては、単離された天然に存在しない核酸は、医薬組成物に製剤化することができる。場合によっては、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３領域は、キャプシドの少なくとも一部を構成することができる。
【００６４】
[0075]本明細書では、配列番号１〜配列番号１９および配列番号１９５〜配列番号２１３のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも６０％の配列同一性または類似性を含む単離および精製アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）核酸配列が開示される。場合によっては、配列同一性は、約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％から最大約１００％であり得る。
【００６５】
[0076]本明細書では、単離および精製されたＡＡＶ核酸配列で細胞をトランスフェクトすることにより生成された、操作された細胞が開示される。
[0077]本明細書では、第１のＶＰ１領域の第１の突然変異および第１のＶＰ３領域の第２の突然変異；ならびに第２のＶＰ１、第１のＶＰ２、および第２のＶＰ３配列、の少なくとも１つを含む複数のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子が開示され、第２のＶＰ１、第１のＶＰ２、および第２のＶＰ３配列のうちの２つは第１のＡＡＶ血清型に由来し、第２のＶＰ１、第１のＶＰ２、および第２のＶＰ３配列の１つは第２のＡＡＶ血清型に由来し、ＡＡＶ粒子が細胞を形質導入する場合、ＡＡＶ粒子は、複数の野生型ＡＡＶ粒子と比較して増加した形質導入効率を付与する。場合によっては、第１および第２のＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、およびそれらの任意の組み合わせから選択することができる。場合によっては、第１のＡＡＶ血清型および第２のＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ４およびＡＡＶ６、ＡＡＶ５およびＡＡＶ６、ＡＡＶ１１およびＡＡＶ６、ＡＡＶ１２およびＡＡＶ６、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択することができる。第１のＡＡＶ血清型および第２のＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ４およびＡＡＶ６であり得る。第１のＡＡＶ血清型および第２のＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ５およびＡＡＶ６であり得る。第１のＡＡＶ血清型および第２のＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ１１およびＡＡＶ６であり得る。第１のＡＡＶ血清型および第２のＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ１２およびＡＡＶ６であり得る。場合によっては、第１および第２の突然変異は、点突然変異、ミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異、挿入、欠失、複製、フレームシフト、または反復伸長からなる群から選択することができる。場合によっては、第１の突然変異と第２の突然変異は点突然変異である。点突然変異は、ＦからＬ、ＨからＮ、ＤからＮ、ＤからＮ、ＶからＬ、およびＶからＩからなる群から選択することができる。第１のＶＰ１領域の第１の突然変異は、前記ＡＡＶヌクレオチド配列によってコードされるＡＡＶポリペプチド配列の１２９位で生じ得る。第１のＶＰ３領域における第２の突然変異は、前記ＡＡＶヌクレオチド配列によってコードされるＡＡＶポリペプチド配列の４１８、４６２、５８４、５９８、および６４２からなる群から選択される位置で生じ得る。第１の突然変異および第２の突然変異は、Ｆ１２９Ｌ、Ｈ６４２Ｎ、およびＤ４１８Ｎ；Ｆ１２９Ｌ、Ｈ６４２Ｎ、およびＬ５８４Ｎ；Ｆ１２９Ｌ、Ｈ４６２Ｎ、およびＶ５９８Ｌ；Ｆ１２９Ｌ、Ｈ４６２Ｎ、およびＶ５９８Ｉからなる群から選択される少なくとも２つの突然変異であり得る。第１のＶＰ１領域の第１の突然変異および第１のＶＰ３領域の第２の突然変異は、Ｆ１２９Ｌ、Ｈ６４２Ｎ、およびＤ４１８Ｎから選択される少なくとも２つの突然変異であり得る。場合によっては、第１のＶＰ１領域の第１の突然変異および第１のＶＰ３領域の第２の突然変異は、Ｆ１２９Ｌ、Ｈ６４２Ｎ、およびＬ５８４Ｎから選択される少なくとも２つの突然変異であり得る。場合によっては、第１のＶＰ１領域の第１の突然変異および第１のＶＰ３領域の第２の突然変異は、Ｌ５８４Ｎ、Ｆ１２９Ｌ、およびＨ４６２Ｎから選択される少なくとも２つの突然変異であり得る。場合によっては、第１のＶＰ１領域の第１の突然変異および第１のＶＰ３領域の第２の突然変異は、Ｆ１２９Ｌ、Ｈ６４２Ｎ、およびＶ５９８Ｉから選択される少なくとも２つの突然変異であり得る。場合によっては、第１のＶＰ１領域の第１の突然変異および第１のＶＰ３領域の第２の突然変異は、ウイルスキャプシド配列の少なくとも一部で生じ得る。場合によっては、第１のＶＰ１領域の第１の突然変異および第１のＶＰ３領域の第２の突然変異は、ＡＡＶヌクレオチド配列のＮ末端またはＣ末端に生じる。場合によっては、細胞は哺乳動物細胞であり得る。哺乳動物細胞はヒト細胞であり得る。場合によっては、ヒト細胞は初代細胞であり得る。場合によっては、ＡＡＶ粒子は、約２００ＧＣ／ｍＬから最大約１×１０８ＧＣ／ｍＬの感染多重度（ＭＯＩ）でＡＡＶ粒子を細胞に導入され得る。場合によっては、ＭＯＩは１×１０６ＧＣ／ｍＬであり得る。場合によっては、ＭＯＩは、約２．７７×１０１２ＧＣ／ｍｌから２．８０×１０１４ＧＣ／ｍｌであり得る。場合によっては、形質導入率は、細胞の約３０％、４０％、５０％、６０％から最大１００％であり得る。形質導入率は、フローサイトメトリーで測定することができる。場合によっては、ＡＡＶ粒子は、外因性受容体の少なくとも一部をコードすることができる。ＡＡＶ粒子は凍結保存することができる。場合によっては、ＡＡＶ粒子は、細胞に導入する前に解凍することができる。ＡＡＶ粒子は、適正製造基準（ＧＭＰ）に適合し得る。
【００６６】
[0078]本明細書では、細胞を複数のＡＡＶ粒子と接触させるステップを含む、操作された細胞を作製する方法が開示される。場合によっては、細胞は哺乳動物細胞であり得る。哺乳動物細胞はヒト細胞であり得る。ヒト細胞は初代細胞であり得る。場合によっては、細胞は、複数のＡＡＶ粒子と接触させる前に細胞を刺激することができる。場合によっては、刺激は、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、およびそれらの任意の組み合わせで行うことができる。場合によっては、接触は、刺激の前、後、または同時に行うことができる。場合によっては、複数のＡＡＶ粒子との細胞の接触は、刺激後に行うことができる。場合によっては、刺激は、細胞を複数のＡＡＶ粒子と接触させる４日前から２４時間前に行うことができる。場合によっては、刺激は、細胞を複数のＡＡＶ粒子と接触させる３日前に行うことができる。場合によっては、方法は、ゲノム破壊をさらに含むことができる。ゲノム破壊は、ＣＲＩＳＰＲシステムを構成することができる。場合によっては、ゲノム破壊は、細胞を複数のＡＡＶ粒子と接触させる前に行うことができる。場合によっては、方法は、操作された細胞を拡大することをさらに含むことができる。場合によっては、方法は、それを必要とする対象に、単位剤形で操作された細胞を投与することをさらに含むことができる。投与は注入であり得る。操作された細胞の投与は、それを必要とする対象の疾患または状態を少なくとも部分的に改善することができる。疾患または状態は癌を含み得る。場合によっては、改善は、コンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャンによって測定した場合、少なくとも約３０％の癌の減少を含むことができる。改善は、コンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャンによって測定した場合、腫瘍病変の径のベースライン測定値の１０％未満の変化によって測定される腫瘍サイズの安定化を含み得る。
【００６７】
[0079]本明細書では、複数の操作されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子をスクリーニングする方法であって、Ａ．突然変異または外因性ＡＡＶゲノムの少なくとも１つをアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヌクレオチド配列のゲノムに導入して、操作されたＡＡＶ粒子を形成するステップ；Ｂ．Ａからの複数の操作されたＡＡＶ粒子を複数の細胞ゲノムに導入するステップ；およびＣ．複数の細胞ゲノム中の複数のＡＡＶ粒子によってコードされる導入遺伝子の発現レベルを定量化するステップであって、発現レベルは、Ａからの異なる突然変異または外因性ＡＡＶゲノムを導入した第２のＡＡＶ粒子から得られる第２の発現レベルと比較されるステップを含む方法が開示される。突然変異は、点突然変異、ミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異、挿入、欠失、複製、フレームシフト、または反復伸長の少なくとも１つを含むことができる。突然変異は点突然変異を含むことができる。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヌクレオチド配列のゲノムは、血清型ＡＡＶ６であり得る。外因性ＡＡＶゲノムは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、またはＡＡＶ１２のものであり得る。外因性ＡＡＶゲノムはＡＡＶ４であり得る。外因性ＡＡＶゲノムはＡＡＶ５であり得る。外因性ＡＡＶゲノムはＡＡＶ１１であり得る。外因性ＡＡＶゲノムはＡＡＶ１２であり得る。場合によっては、細胞ゲノムは初代細胞に由来し得る。場合によっては、発現レベルの定量化は、フローサイトメトリーにより決定することができる。場合によっては、細胞ゲノムに導入された場合、操作されたＡＡＶ粒子は、操作されていないＡＡＶ粒子と比較して、形質導入の増加をもたらすことができる。場合によっては、Ａからの異なる突然変異または外因性ＡＡＶゲノムを導入した第２のＡＡＶ粒子から得られる第２のレベルの発現と比較して、約３０％、４０％、５０％、６０％から最大１００％の形質導入の増加があり得る。形質導入は、フローサイトメトリーで測定することができる。
【００６８】
[0080]本明細書では、配列番号１９５〜配列番号２２０の少なくとも１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、および最大９９％同一であるウイルス配列を細胞に導入するステップを含む、操作された細胞を作製する方法が開示される。場合によっては、操作された細胞は、操作された細胞の集団に拡大することができる。操作された細胞の集団は、医薬組成物に製剤化することができる。
【００６９】
[0081]本明細書では、細胞にポリ核酸を導入するステップを含む、ウイルス上清を作製する方法が開示される。場合によっては、方法は、導入後の少なくとも約２４〜７２時間から、細胞または複数の細胞からウイルス上清を回収することをさらに含むことができる。場合によっては、回収は、上清中のウイルス粒子の濃度を決定することを含むことができる。方法は、ウイルス上清を単位剤形で凍結保存するステップをさらに含むことができる。
【００７０】
[0082]本明細書では、細胞にウイルス上清を導入するステップを含む、細胞における外因性導入遺伝子の発現を増加させる方法が開示される。
[0083]本明細書では、操作された細胞を作製する方法であって、ＣＲＩＳＰＲシステムを用いて遺伝子の少なくとも一部をゲノム破壊するステップ；およびキャプシドタンパク質または血清学的にキメラなキャプシドタンパク質の突然変異の少なくとも１つを含む複数のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を細胞に導入し、細胞を拡大するステップを含む方法が開示される。細胞は初代細胞であり得る。遺伝子は、免疫チェックポイント遺伝子であり得る。ＡＡＶ粒子はＡＡＶ６であり得る。突然変異は、Ｆ１２９Ｌ、Ｈ６４２Ｎ、およびＤ４１８Ｎ；Ｆ１２９Ｌ、Ｈ６４２Ｎ、およびＬ５８４Ｎ；Ｆ１２９Ｌ、Ｈ４６２Ｎ、およびＶ５９８Ｌ；ならびにＦ１２９Ｌ、Ｈ４６２Ｎ、およびＶ５９８Ｉからなる群から選択することができる。血清学的にキメラなキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ４およびＡＡＶ６、ＡＡＶ５およびＡＡＶ６、ＡＡＶ１１およびＡＡＶ６、ＡＡＶ１２およびＡＡＶ６、ならびにそれらの任意の組み合わせ由来のキャプシドの少なくとも一部を含むことができる。ＡＡＶ粒子は、少なくとも１つの導入遺伝子をコードすることができる。導入遺伝子は、外因性受容体をコードすることができる。場合によっては、方法は、それを必要とする対象に、操作された細胞を投与することをさらに含むことができる。場合によっては、対象は、癌を有し得る。
【００７１】
[0084]本明細書では、ＡＡＶ核酸配列中に突然変異Ｆ１２９ＬおよびＨ６４２Ｎを含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）核酸配列が開示される。
[0085]本明細書では、ＡＡＶ核酸配列中に突然変異Ｆ１２９ＬおよびＬ５８４Ｄを含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）核酸配列が開示される。
【００７２】
[0086]本明細書では、ＡＡＶ核酸配列中に突然変異Ｆ１２９ＬおよびＤ４１８Ｎを含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）核酸配列が開示される。
[0087]本明細書では、ＡＡＶ核酸配列中に突然変異Ｆ１２９ＬおよびＬ５８４Ｈを含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）核酸配列が開示される。
【００７３】
[0088]本明細書では、ＡＡＶ核酸配列中に突然変異Ｆ１２９Ｌ、Ｈ６４２Ｎ、およびＤ４１８Ｎを含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）核酸配列が開示される。
【００７４】
[0089]本明細書では、ＡＡＶ核酸配列中に突然変異Ｆ１２９Ｌ、Ｈ６４２Ｎ、およびＬ５８４Ｄを含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）核酸配列が開示される。
【００７５】
[0090]本明細書では、ＡＡＶ核酸配列中に突然変異Ｆ１２９Ｌ、Ｈ６４２Ｎ、およびＬ５８４Ｎを含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）核酸配列が開示される。
【００７６】
[0091]本明細書では、ＡＡＶ核酸配列中に突然変異Ｆ１２９Ｌ、Ｈ６４２Ｎ、およびＬ５８４Ｈを含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）核酸配列が開示される。
【００７７】
[0092]本明細書では、ＡＡＶ核酸配列中に突然変異Ｆ１２９Ｌ、Ｈ６４２Ｎ、およびＶ５９８Ｌを含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）核酸配列が開示される。
【００７８】
[0093]本明細書では、ＡＡＶ核酸配列中に突然変異Ｆ１２９Ｌ、Ｈ６４２Ｎ、およびＶ５９８Ｉを含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）核酸配列が開示される。
【００７９】
[0094]本明細書では、操作された細胞を作製する方法であって、遺伝子の少なくとも一部をＣＲＩＳＰＲシステムでゲノム的に破壊するステップ；複数の細胞に、キャプシドタンパク質、または少なくともＡＡＶ６キャプシドタンパク質の一部を含む血清学的にキメラなキャプシドタンパク質において、ＶＰ１領域の第１突然変異およびＶＰ３領域の第２突然変異の少なくとも１つを含む複数のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を導入するステップ；ならびに細胞を拡大するステップを含む方法が開示される。
【００８０】
[0095]本発明の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲に具体的に記載されている。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を記載する以下の詳細な説明、および添付の図面を参照することにより得られる。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】[0096]図１は、外因性ＴＣＲをコードする例示的なＡＡＶベクターを示す図である。
【図２−１】[0097]図２は、対照（ＣＲＩＳＰＲなしのエレクトロポレーション）と比較した、標的遺伝子部位でのＡＡＶ  Ｖ１（ＷＴ）またはＦ１２９Ｌ（Ｖ２）およびＣＲＩＳＰＲで形質導入されたヒト初代細胞における受容体発現パーセントの比較を示す図である。実験は、１×１０６ＧＣ／ｍＬのＭＯＩで行われた。
【図２−２】[0097]図２は、対照（ＣＲＩＳＰＲなしのエレクトロポレーション）と比較した、標的遺伝子部位でのＡＡＶ  Ｖ１（ＷＴ）またはＦ１２９Ｌ（Ｖ２）およびＣＲＩＳＰＲで形質導入されたヒト初代細胞における受容体発現パーセントの比較を示す図である。実験は、１×１０６ＧＣ／ｍＬのＭＯＩで行われた。
【図２−３】[0097]図２は、対照（ＣＲＩＳＰＲなしのエレクトロポレーション）と比較した、標的遺伝子部位でのＡＡＶ  Ｖ１（ＷＴ）またはＦ１２９Ｌ（Ｖ２）およびＣＲＩＳＰＲで形質導入されたヒト初代細胞における受容体発現パーセントの比較を示す図である。実験は、１×１０６ＧＣ／ｍＬのＭＯＩで行われた。
【図３Ａ】[0098]図３Ａは、連続したエレクトロポレーション実験のフローサイトメトリーにより決定された受容体発現パーセントの要約を示す図である。初代ヒト細胞は、標的遺伝子部位にてＣＲＩＳＰＲ  ｇＲＮＡでエレクトロポレーションされ、ＡＡＶ  Ｖ１（ＷＴ）で形質導入された。
【図３Ｂ】図３Ｂは、連続したエレクトロポレーション実験のフローサイトメトリーにより決定された受容体発現パーセントの要約を示す図である。ヒト初代細胞は、標的遺伝子部位にＣＲＩＳＰＲ  ｇＲＮＡでエレクトロポレーションされ、ＡＡＶ  Ｖ２（Ｆ１２９Ｌ）で形質導入された。
【図４−１】[0099]図４は、ＣＲＩＳＰＲおよびＡＡＶベクター、Ｖ１（ＷＴ）、または外因性ＴＣＲ導入遺伝子をコードするＶ２（Ｆ１２９Ｌ）によるゲノム修飾後の３、７、および１４日目のＴＣＲ受容体発現パーセントを示す図である。
【図４−２】[0099]図４は、ＣＲＩＳＰＲおよびＡＡＶベクター、Ｖ１（ＷＴ）、または外因性ＴＣＲ導入遺伝子をコードするＶ２（Ｆ１２９Ｌ）によるゲノム修飾後の３、７、および１４日目のＴＣＲ受容体発現パーセントを示す図である。
【図５Ａ】[00100]図５Ａは、標的遺伝子でのＣＲＩＳＰＲによるゲノム修飾およびＡＡＶ  Ｖ１（ＷＴ）またはＦ１２９Ｌ（Ｖ２）による形質導入後の１４日目の受容体発現パーセントを示す図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、標的遺伝子でのＣＲＩＳＰＲによるゲノム修飾およびＡＡＶ  Ｖ１（ＷＴ）またはＦ１２９Ｌ（Ｖ２）による形質導入後の１４日目の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す図である。
【図６Ａ】[00101]図６Ａは、標的遺伝子でのＣＲＩＳＰＲによるゲノム修飾、および高力価（１×１０６ＧＣ／ｍＬのＭＯＩ）ＡＡＶ  Ｖ１（ＷＴ）またはＦ１２９Ｌ（Ｖ２）による形質導入後の１３または１４日目の受容体発現パーセントを示す図である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、標的遺伝子ＡＡＶＳ１、ＣＩＳＨ、ＣＴＬＡ４、またはＰＤ−１でのＣＲＩＳＰＲによるゲノム修飾、および高力価（１×１０６ＧＣ／ｍＬのＭＯＩ）ＡＡＶ  Ｖ１またはＶ２による形質転換後の１３または１４日目の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す図である。
【図７Ａ】[00102]図７Ａは、ウイルス上清を生成するための２９３Ｔ細胞へのＡＡＶウイルス粒子のトランスフェクション概略図を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ｐＤＧ６−ＡＡＶ６ヘルパーフリーパッケージングプラスミドを示す図である。
【図８】[00103]図８は、隣接するＡＡＶ２逆方向末端反復を伴う外因性ＴＣＲをコードするＡＡＶＳ１特異的導入遺伝子ドナーを示す図である。
【図９】[00104]図９は、ＡＡＶＳ１、ＣＩＳＨ、ＰＤ１、またはＣＴＬＡ４のいずれか１つに対する相同性アームを有する外因性ＴＣＲをコードする導入遺伝子ドナーのＡＡＶ媒介性相同組換えの概略図を示す。
【図１０】[00105]図１０は、リンパ球ＣＲＩＳＰＲおよびＡＡＶ修飾のタイムラインを示す図である。
【図１１Ａ】[00106]図１１Ａは、ＷＴ  ＡＡＶと比較した、三重突然変異ＡＡＶ変異体１５、１７、１９、および２０によるゲノム修飾後の５日目のＧＦＰ発現パーセントを示す図である。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、ＷＴ  ＡＡＶと比較した、三重突然変異ＡＡＶ変異体１５、１７、１９、および２０によるゲノム修飾後の８日目のＧＦＰ発現パーセントを示す図である。
【図１２】[00107]図１２は、ＷＴ  ＡＡＶと比較した、一重、二重、および三重ＡＡＶ突然変異体のゲノム修飾後の３、７、および１４日目のＧＦＰ発現パーセントを示す図である。
【図１３】[00108]図１３は、注釈付きのＡＡＶ６  ＷＴ配列（配列番号２４６）を示す図である。
【図１４Ａ】[00109]図１４Ａは、異なるゲノム標的でのＴＣＲ発現パーセントの変動性を評価するために、三重にして行われた単一ドナーの形質導入後の７、１４、および２１日目の平均ＴＣＲ発現パーセントを示す図である。細胞は、ＴＣＲをコードするＶＰ１  Ｆ１２９Ｌ突然変異ＡＡＶウイルスで細胞を形質導入され、ＡＡＶＳ１遺伝子の破壊に特異的なＣＲＩＳＰＲシステムでゲノム編集もされた。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、ＴＣＲをコードするＶＰ１  Ｆ１２９Ｌ突然変異ＡＡＶウイルスで形質導入され、ＣＩＳＨ遺伝子の破壊に特異的なＣＲＩＳＰＲシステムでゲノム編集もされた、三重にして行われた細胞の単一ドナーの形質導入後の７、１４、および２１日目の平均ＴＣＲ発現パーセントを示す図である。
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、三重にして行われた単一ドナーの形質導入後の７、１４、および２１日目の平均ＴＣＲ発現パーセントを示す図である。細胞は、ＴＣＲをコードするＦ１２９Ｌ突然変異ＡＡＶウイルスで形質導入され、ＣＴＬＡ−４遺伝子の破壊に特異的なＣＲＩＳＰＲシステムでゲノム編集も行われた。
【図１４Ｄ】図１４Ｄは、二重にして行われた単一ドナーの形質導入後の７、１４、および２１日目の平均ＴＣＲ発現パーセントを示す図である。細胞は、ＴＣＲをコードするＶＰ１  Ｆ１２９Ｌ突然変異ＡＡＶウイルスで形質導入され、ＰＤ−１遺伝子の破壊に特異的なＣＲＩＳＰＲシステムでゲノム編集も行われた。
【図１５−１】[00110]図１５は、外因性ＴＣＲをコードするＶＰ１  Ｆ１２９Ｌ突然変異ＡＡＶウイルス粒子による形質導入後の７、１４、または２１日目のＴＣＲ発現の３重にした実験のフローサイトメトリープロットを示す図である。細胞はまた、ＣＩＳＨ遺伝子破壊に特異的なＣＲＩＳＰＲシステムでゲノム編集された。
【図１５−２】[00110]図１５は、外因性ＴＣＲをコードするＶＰ１  Ｆ１２９Ｌ突然変異ＡＡＶウイルス粒子による形質導入後の７、１４、または２１日目のＴＣＲ発現の３重にした実験のフローサイトメトリープロットを示す図である。細胞はまた、ＣＩＳＨ遺伝子破壊に特異的なＣＲＩＳＰＲシステムでゲノム編集された。
【図１６−１】[00111]図１６は、ＴＣＲをコードするＶＰ１  Ｆ１２９Ｌ突然変異ＡＡＶウイルス粒子による形質導入後の７、１４、または２１日目のＴＣＲ発現の３重にした実験のフローサイトメトリープロットを示す図である。細胞はまた、ＡＡＶＳ１遺伝子破壊に特異的なＣＲＩＳＰＲシステムでゲノム編集された。
【図１６−２】[00111]図１６は、ＴＣＲをコードするＶＰ１  Ｆ１２９Ｌ突然変異ＡＡＶウイルス粒子による形質導入後の７、１４、または２１日目のＴＣＲ発現の３重にした実験のフローサイトメトリープロットを示す図である。細胞はまた、ＡＡＶＳ１遺伝子破壊に特異的なＣＲＩＳＰＲシステムでゲノム編集された。
【図１７Ａ−１】[00112]図１７Ａは、形質導入されていないヒトＣＤ３＋細胞（対照）のフローサイトメトリー結果を示す図である。
【図１７Ａ−２】[00112]図１７Ａは、形質導入されていないヒトＣＤ３＋細胞（対照）のフローサイトメトリー結果を示す図である。
【図１７Ｂ−１】図１７Ｂは、表１４の突然変異体１〜２０で形質導入されたヒトＣＤ３＋細胞のフローサイトメトリーの結果を示す図である。
【図１７Ｂ−２】図１７Ｂは、表１４の突然変異体１〜２０で形質導入されたヒトＣＤ３＋細胞のフローサイトメトリーの結果を示す図である。
【図１７Ｂ−３】図１７Ｂは、表１４の突然変異体１〜２０で形質導入されたヒトＣＤ３＋細胞のフローサイトメトリーの結果を示す図である。
【図１７Ｃ】図１７Ｃは、突然変異体１〜２０で形質導入されたＣＤ３＋細胞のＧＦＰパーセントの要約を示す図である。
【図１８Ａ−１】[00113]図１８Ａは、異なる対照の３日後のＣＲＩＳＰＲ／ＡＡＶフローサイトメトリーの結果を示す図である：刺激されて拡大されたが、ＣＲＩＳＰＲでエレクトロポレーションされていない、形質導入されていないヒトＣＤ３＋細胞、ＧＦＰ導入遺伝子をコードする対照ＡＡＶ６、Ｚａｐ（エレクトロポレーション）対照、ＧＦＰ  ｍＲＮＡ、ＡＡＶＳ１  ｇＲＮＡおよびＣａｓ９。
【図１８Ａ−２】[00113]図１８Ａは、異なる対照の３日後のＣＲＩＳＰＲ／ＡＡＶフローサイトメトリーの結果を示す図である：刺激されて拡大されたが、ＣＲＩＳＰＲでエレクトロポレーションされていない、形質導入されていないヒトＣＤ３＋細胞、ＧＦＰ導入遺伝子をコードする対照ＡＡＶ６、Ｚａｐ（エレクトロポレーション）対照、ＧＦＰ  ｍＲＮＡ、ＡＡＶＳ１  ｇＲＮＡおよびＣａｓ９。
【図１８Ｂ−１】図１８Ｂは、ＣＲＩＳＰＲ修飾された、修飾ＡＡＶ（表１４の変異体１〜２０）形質導入されたヒト細胞のフローサイトメトリーによるＧＦＰパーセントを示す図である。
【図１８Ｂ−２】図１８Ｂは、ＣＲＩＳＰＲ修飾された、修飾ＡＡＶ（表１４の変異体１〜２０）形質導入されたヒト細胞のフローサイトメトリーによるＧＦＰパーセントを示す図である。
【図１８Ｂ−３】図１８Ｂは、ＣＲＩＳＰＲ修飾された、修飾ＡＡＶ（表１４の変異体１〜２０）形質導入されたヒト細胞のフローサイトメトリーによるＧＦＰパーセントを示す図である。
【図１８Ｂ−４】図１８Ｂは、ＣＲＩＳＰＲ修飾された、修飾ＡＡＶ（表１４の変異体１〜２０）形質導入されたヒト細胞のフローサイトメトリーによるＧＦＰパーセントを示す図である。
【図１９Ａ−１】[00114]図１９Ａは、異なる対照のＣＲＩＳＰＲ／ＡＡＶフローサイトメトリーの７日後の結果を示す図である：刺激されて拡大されたが、ＣＲＩＳＰＲでエレクトロポレーションされていない、形質導入されていないヒトＣＤ３＋細胞、ＧＦＰ導入遺伝子をコードする対照ＡＡＶ６、Ｚａｐ（エレクトロポレーション）対照、ＧＦＰ  ｍＲＮＡ、ＡＡＶＳ１  ｇＲＮＡおよびＣａｓ９。
【図１９Ａ−２】[00114]図１９Ａは、異なる対照のＣＲＩＳＰＲ／ＡＡＶフローサイトメトリーの７日後の結果を示す図である：刺激されて拡大されたが、ＣＲＩＳＰＲでエレクトロポレーションされていない、形質導入されていないヒトＣＤ３＋細胞、ＧＦＰ導入遺伝子をコードする対照ＡＡＶ６、Ｚａｐ（エレクトロポレーション）対照、ＧＦＰ  ｍＲＮＡ、ＡＡＶＳ１  ｇＲＮＡおよびＣａｓ９。
【図１９Ｂ−１】図１９Ｂは、ＣＲＩＳＰＲおよびＡＡＶ後の７日目ＣＲＩＳＰＲ修飾された、ＡＡＶ（表１４の変異体１〜２０）形質導入されたヒト細胞のフローサイトメトリーによるＧＦＰパーセントを示す図である。
【図１９Ｂ−２】図１９Ｂは、ＣＲＩＳＰＲおよびＡＡＶ後の７日目ＣＲＩＳＰＲ修飾された、ＡＡＶ（表１４の変異体１〜２０）形質導入されたヒト細胞のフローサイトメトリーによるＧＦＰパーセントを示す図である。
【図１９Ｂ−３】図１９Ｂは、ＣＲＩＳＰＲおよびＡＡＶ後の７日目ＣＲＩＳＰＲ修飾された、ＡＡＶ（表１４の変異体１〜２０）形質導入されたヒト細胞のフローサイトメトリーによるＧＦＰパーセントを示す図である。
【図１９Ｂ−４】図１９Ｂは、ＣＲＩＳＰＲおよびＡＡＶ後の７日目ＣＲＩＳＰＲ修飾された、ＡＡＶ（表１４の変異体１〜２０）形質導入されたヒト細胞のフローサイトメトリーによるＧＦＰパーセントを示す図である。
【図２０】[00115]図２０は、スプライスアクセプターＧＦＰをコードする、表１４のＡＡＶ変異体粒子１〜２０による形質導入／ＣＲＩＳＰＲ編集後の３日目および７日目のＧＦＰ発現パーセントのプロットを示す図である。細胞はまたＡＡＶＳ１に特異的なガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲシステムで編集された。
【図２１Ａ−１】[00116]図２１Ａは、様々な対照のＣＲＩＳＰＲ／ＡＡＶフローサイトメトリーの１４日後の結果を示す図である：刺激されて拡大されたが、ＣＲＩＳＰＲでエレクトロポレーションされていない、形質導入されていないヒトＣＤ３＋細胞、ＧＦＰ導入遺伝子をコードするＡＡＶ６、Ｚａｐ、ＧＦＰ  ｍＲＮＡ、ＡＡＶＳ１  ｇＲＮＡおよびＣａｓ９。
【図２１Ａ−２】[00116]図２１Ａは、様々な対照のＣＲＩＳＰＲ／ＡＡＶフローサイトメトリーの１４日後の結果を示す図である：刺激されて拡大されたが、ＣＲＩＳＰＲでエレクトロポレーションされていない、形質導入されていないヒトＣＤ３＋細胞、ＧＦＰ導入遺伝子をコードするＡＡＶ６、Ｚａｐ、ＧＦＰ  ｍＲＮＡ、ＡＡＶＳ１  ｇＲＮＡおよびＣａｓ９。
【図２１Ａ−３】[00116]図２１Ａは、様々な対照のＣＲＩＳＰＲ／ＡＡＶフローサイトメトリーの１４日後の結果を示す図である：刺激されて拡大されたが、ＣＲＩＳＰＲでエレクトロポレーションされていない、形質導入されていないヒトＣＤ３＋細胞、ＧＦＰ導入遺伝子をコードするＡＡＶ６、Ｚａｐ、ＧＦＰ  ｍＲＮＡ、ＡＡＶＳ１  ｇＲＮＡおよびＣａｓ９。
【図２１Ｂ】図２１Ｂは、ＭＯＩ１×１０６、２×１０５、１×１０５、１×１０４、１×１０３、または２×１０２で形質導入された、ＣＲＩＳＰＲ修飾されたＡＶ−ＷＴ細胞のフローサイトメトリーによるスプライスアクセプター（ＳＡ）−ＧＦＰの割合を示す図である。
【図２１Ｃ】図２１Ｃは、ＭＯＩ１×１０６、２×１０５、１×１０５、１×１０４、１×１０３、または２×１０２で形質導入された、ＣＲＩＳＰＲ修飾されたＡＡＶ変異体１５細胞のフローサイトメトリーによるＳＡ−ＧＦＰパーセントを示す図である。
【図２１Ｄ】図２１Ｄは、ＭＯＩ１×１０６、２×１０５、１×１０５、１×１０４、１×１０３、または２×１０２で形質導入された、ＣＲＩＳＰＲ修飾およびＡＡＶ変異体１７細胞のフローサイトメトリーによるＳＡ−ＧＦＰパーセントを示す図である。
【図２１Ｅ】図２１Ｅは、ＭＯＩ１×１０６、２×１０５、１×１０５、１×１０４、１×１０３、または２×１０２で形質導入された、ＣＲＩＳＰＲ修飾およびＡＡＶ変異体１９細胞のフローサイトメトリーによるＳＡ−ＧＦＰパーセントを示す図である。
【図２１Ｆ】図２１Ｆは、ＭＯＩ１×１０６、２×１０５、１×１０５、１×１０４、１×１０３、または２×１０２で形質導入された、ＣＲＩＳＰＲ修飾およびＡＡＶ変異体２０細胞のフローサイトメトリーによるＳＡ−ＧＦＰパーセントを示す図である。
【図２１Ｇ】図２１Ｇは、様々なＭＯＩでＷＴまたはＡＡＶ変異体で形質導入されたヒトＣＤ３＋細胞のＧＦＰ発現パーセントの要約を示す図である。
【図２２Ａ】[00117]図２２Ａは、様々なＭＯＩでのＣＲＩＳＰＲおよびＡＡＶ（ＷＴまたは変異体１５、１７、１９、または２０）後の９日目の発光データを示す図である。凡例を図２２Ｂに示す。
【図２２Ｂ】図２２Ｂは、様々なＭＯＩでのＣＲＩＳＰＲおよびＡＡＶＸ（ＷＴまたは変異体１５、１７、１９、または２０）後の１４日目の発光データを示す図である。
【図２２Ｃ】図２２Ｃは、４つのＡＡＶ変異体の平均パッケージング効率を示す図である。ｎ＝３。
【図２３】[00118]図２３は、様々なＭＯＩでのＣＲＩＳＰＲおよびＡＡＶ（ＷＴまたは表１５のキメラ１〜８）の１４日後の発光データを示す図である。
【図２４Ａ】[00119]図２４Ａは、様々なＭＯＩでのＣＲＩＳＰＲおよびＡＡＶ（ＷＴ、トランスフェクトされていない、または表１５のキメラ１〜８）後の７日目の発光データを示す図である。
【図２４Ｂ】図２４Ｂは、様々なＭＯＩでのＣＲＩＳＰＲおよびＡＡＶ（ＷＴ、トランスフェクトされていない、または表１５のキメラ１〜８）後の１４日目の発光データを示す図である。
【図２５Ａ】[00120]図２５Ａおよび図２５Ｂは、ＡＡＶ血清型を同定するためにＡＡＶシグネチャー領域の領域を増幅するＰＣＲ戦略の概略図を示す。
【図２５Ｂ】[00120]図２５Ａおよび図２５Ｂは、ＡＡＶ血清型を同定するためにＡＡＶシグネチャー領域の領域を増幅するＰＣＲ戦略の概略図を示す。
【図２６Ａ】[00121]図２６Ａは、ＣＩＳＨ対照プライマー、フォワードプライマー：０７５２およびリバースプライマー０７５３を使用してＡＡＶシグネチャーについてスクリーニングされたヒトＰＢＭＣドナーのウエスタンブロットを示す図である；アンプリコンのサイズ：４５５ｂｐ、およびＡＡＶシグネチャー領域ＮＴＣ、ｐＡＡＶ  ＤＪ、およびｐＤＧ。
【図２６Ｂ】図２６Ｂは、１６００ｂｐの生成物を生じるプライマーフォワード−２およびリバース−４を使用してＡＡＶについてスクリーニングされたヒトＰＢＭＣドナーのウエスタンブロットを示す図である。
【図２６Ｃ】図２６Ｃは、２５８ｂｐ生成物を生じるプライマーフォワード−２およびリバース−３を使用してＡＡＶについてスクリーニングされたヒトＰＢＭＣドナーのウエスタンブロットを示す図である。
【図２６Ｄ】図２６Ｄは、９２１ｂｐ生成物を生じるプライマーフォワード−５およびリバース−３を使用してＡＡＶについてスクリーニングされたヒトＰＢＭＣドナーのウエスタンブロットを示す図である。
【図２６Ｅ】図２６Ｅは、１６３９ｂｐ生成物を生じるプライマーフォワード−６およびリバース−４を使用してＡＡＶについてスクリーニングされたヒトＰＢＭＣドナーのウエスタンブロットを示す図である。
【図２７Ａ】[00122]図２７Ａは、細胞溶解物および精製後を使用した滴定された（tired）ＡＡＶキメラ３、５、および６のｑＰＣＲ要約を示す図である。
【図２７Ｂ】図２７Ｂは、細胞溶解物および精製後のＡＡＶキメラ３、５、および６のＥＬＩＳＡ結果を示す図である。
【図２８Ａ】[00123]図２８Ａは、１０，０００ＧＣ／ｍＬのＭＯＩでのＷＴ−ＡＡＶ６またはキメラ３、５、もしくは６（ＣＭＶ  ＮａｎｏＬｕｃウイルス）によるＣＤ３４＋細胞の形質導入後の７日目の発光（ＲＬＵ）の要約を示す図である。ウイルスのみ、およびウイルス＋ＣＲＩＳＰＲが対照として示される。
【図２８Ｂ】図２８Ｂは、１０，０００ＧＣ／ｍＬのＭＯＩでのＷＴ−ＡＡＶ６またはキメラ３、５、もしくは６（ＣＭＶ  ＮａｎｏＬｕｃウイルス）によるＴ細胞の形質導入後の７日目の発光（ＲＬＵ）の要約を示す図である。ウイルスのみ、およびウイルス＋ＣＲＩＳＰＲが対照として示される。
【図２９Ａ】[00124]図２９Ａは、ＡＡＶキメラの概略図を示す図である。
【図２９Ｂ−１】図２９Ｂは、ＡＡＶ６（配列番号３０９）と比較したＡＡＶキメラ６（配列番号３０７）および８（配列番号３０８）の概略図を示す。
【図２９Ｂ−２】図２９Ｂは、ＡＡＶ６（配列番号３０９）と比較したＡＡＶキメラ６（配列番号３０７）および８（配列番号３０８）の概略図を示す。
【図３０Ａ】[00125]図３０Ａは、１０，０００ＧＣ／ｍＬのＭＯＩでのＷＴ−ＡＡＶ６またはキメラ３、５、もしくは６（ＣＭＶ  ＮａｎｏＬｕｃウイルス）によるＴ細胞の形質導入後の７日目の発光（ＲＬＵ）の要約を示す図である。ウイルスのみ、およびウイルス＋ＣＲＩＳＰＲが対照として示される。
【図３０Ｂ】図３０Ｂは、１０，０００ＧＣ／ｍＬのＭＯＩでのＷＴ−ＡＡＶ６ならびにキメラ３、５、および６（ＣＭＶ  ＮａｎｏＬｕｃウイルス）によるＴ細胞の形質導入後の１４日目の発光（ＲＬＵ）の要約を示す図である。ウイルスのみ、およびウイルス＋ＣＲＩＳＰＲが対照として示される。ＣＲＩＳＰＲ編集は、８８％の編集効率でＴＩＤＥ分析によって確認された。
【図３１】[00126]図３１は、１ｅ４  ＧＣ／ｍＬまたは１ｅ６  ＧＣ／ｍＬのＭＯＩでのＷＴ−ＡＡＶ６またはキメラ３、５、もしくは６（ＣＭＶ  ＮａｎｏＬｕｃウイルス）によるＴ細胞の形質導入後の７日目の発光（ＲＬＵ）を示す図である。ＲＣはＲｅｐ  Ｃａｐの略であり、トランスフェクションで使用されるｒｅｐ／ｃａｐプラスミドの量を指す。
【図３２Ａ】[00127]図３２Ａは、ＭＯＩが１ｅ４  ＧＣ／ｍＬまたは１ｅ６  ＧＣ／ｍＬのＷＴ−ＡＡＶ６またはキメラ６（ＣＭＶ  ＮａｎｏＬｕｃウイルス）によるＴ細胞の形質導入後の７日目の発光（ＲＬＵ）を示す図である。
【図３２Ｂ】図３２Ｂは、１ｅ４  ＧＣ  ／  ｍＬまたは１ｅ６  ＧＣ  ／  ｍＬのＭＯＩでのＷＴ−ＡＡＶ６またはキメラ６（ＣＭＶ  ＮａｎｏＬｕｃウイルス）によるＴ細胞の形質導入後の１５日目の発光（ＲＬＵ）を示す図である。
【図３２Ｃ】図３２Ｃは、１ｅ４  ＧＣ／ｍＬまたは１ｅ６  ＧＣ／ｍＬのＭＯＩでのＷＴ−ＡＡＶ６またはキメラ６（ＣＭＶ  ＮａｎｏＬｕｃウイルス）によるＴ細胞の形質導入後の７日目の発光（ＲＬＵ）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００８２】
[00128]以下の説明および実施例は、本発明の実施形態を詳細に説明するものである。本発明は、本明細書に記載される特定の実施形態に限定されるものではなく、したがって、変化し得ることを理解されたい。当業者は、本発明の範囲内に包含される本発明の多数の変形および修飾があることを認識する。
定義
[00129]「ＡＡＶ」、「ＡＡＶ構築物」、もしくは「組換えＡＡＶ」または「ＡＡＶ」という用語は、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８、ＡＡＶ−９、ＡＡＶ−１０、ＡＡＶ−１１、またはＡＡＶ−１２、ｓｃＡＡＶ、ｒｈ１０、キメラもしくはハイブリッドＡＡＶ、あるいはその任意の組み合わせ、誘導体、または変異体を含む公知の血清型のいずれかのアデノ随伴ウイルスを指す。ＡＡＶは、エンベロープを持たない小さな一本鎖ＤＮＡウイルスである。それらは、非病原性パルボウイルスであり、複製にはアデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ＣＭＶなどのヘルパーウイルスが必要である。野生型ＡＡＶは、一般集団において通常であり、いずれもの公知の病理とは関連付けられない。ハイブリッドＡＡＶは、１つのＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質および別のＡＡＶ血清型からのゲノム物質を含むＡＡＶである。キメラＡＡＶは、２つ以上のＡＡＶ血清型に由来する遺伝的および／またはタンパク質配列を含み、それらの２つ以上のＡＡＶ血清型の遺伝子配列に対して行われた突然変異を含むことができる。例示的なキメラＡＡＶは、キメラＡＡＶキャプシド、例えば、２つ以上のＡＡＶ血清型に由来するアミノ酸の１つ以上の領域を有するキャプシドタンパク質を含むことができる。ＡＡＶ変異体は、その親ＡＡＶと比較してそのゲノムまたはタンパク質に１つ以上のアミノ酸突然変異、例えば、その親ＡＡＶと比較してそのキャプシドタンパク質に１つ以上のアミノ酸突然変異を含むＡＡＶである。ＡＡＶには、本明細書で使用するとき、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、およびヒツジＡＡＶが含まれ、霊長類ＡＡＶは、非霊長類に感染するＡＡＶを指し、非霊長類ＡＡＶは、鳥類動物に感染する鳥類ＡＡＶなどの非霊長類動物に感染するＡＡＶを指す。場合によっては、野生型ＡＡＶは、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含み、ｒｅｐ遺伝子はウイルスの複製に必要であり、ｃａｐ遺伝子はキャプシドタンパク質の合成に必要である。本明細書で使用するとき、「組換えＡＡＶ」および「ｒＡＡＶ」という用語は、交換可能である。
【００８３】
[00130]「組換えＡＡＶベクター」または「ＡＡＶベクター」または「ＡＡＶベクター」という用語は、前記のＡＡＶ血清型のいずれかに由来するベクターを指す。場合によっては、ＡＡＶベクターは、ｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子などの全体または一部が削除された１つ以上のＡＡＶ野生型遺伝子を含むことができるが、遺伝子治療用にＡＡＶウイルスのパッケージングおよび使用に必要とされる機能的要素を含む。例えば、オープンリーディングフレームに隣接する機能的な逆方向末端反復配列もしくはＩＴＲ配列、またはクローニングされた外因性配列は、ＡＡＶビリオンの複製およびパッケージングに重要であることが公知であるが、ＩＴＲ配列は、ヌクレオチドの挿入、欠失、または置換など、野生型ヌクレオチド配列から修飾することができ、そのため、ＡＡＶは、遺伝子治療または遺伝子送達システムなどの本明細書に記載される実施形態に使用するのに適している。一部の態様では、自己相補性ＡＡＶベクターなどの自己相補性ベクター（ｓｃ）を使用することができ、これは、参照により本明細書に組み込まれるＷｕ，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００７年，１８巻（２号）：１７１〜８２頁に記載されるように、ウイルスの二本鎖ＤＮＡ合成の要件を迂回することができ、導入遺伝子タンパク質の発現率を高めることができる。一部の態様では、ＡＡＶベクターを生成して、最適な血清型、プロモーター、および導入遺伝子の選択を可能にすることができる。場合によっては、ベクターは、免疫細胞に選択的に結合または感染する標的ベクターまたは修飾ベクターであり得る。
【００８４】
[00131]「ＡＡＶビリオン」または「ＡＡＶビリオン」という用語は、本明細書に記載されるＡＡＶベクターをキャプシド化する少なくとも１つのＡＡＶキャプシドタンパク質を含むキャプシドを含むウイルス粒子を指し、ベクターは、異種ポリヌクレオチド配列または一部の実施形態では導入遺伝子をさらに含むことができる。
【００８５】
[00132]参照数値に関する「約」なる用語およびその文法的同等物は、本明細書で使用するとき、その値から±１０％の範囲の値を含むことができる。例えば、「約１０」という量には、９〜１１の量が含まれる。参照数値に関連する用語「約」はまた、その値からプラスまたはマイナス１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％の範囲を含むことができる。
【００８６】
[00133]本明細書で使用される「活性化」という用語およびその文法的同等物は、細胞が静止状態から活性状態に移行するプロセスを指すことができる。このプロセスは、抗原への応答、移動、および／または機能的に活性な状態への表現型もしくは遺伝的変化を含むことができる。例えば、「活性化」という用語は、Ｔ細胞活性化の段階的なプロセスを指すことができる。例えば、Ｔ細胞は、完全に活性化になるには、少なくとも２つのシグナルが必要になる場合がある。１番目のシグナルは、抗原−ＭＨＣ複合体によるＴＣＲの関与後に生じる場合があり、２番目のシグナルは、共刺激分子の関与により発生する可能性がある。抗ＣＤ３はインビトロで１番目のシグナルを模倣でき、抗ＣＤ２８は２番目のシグナルを模倣することができる。
【００８７】
[00134]本明細書で使用される「隣接する」という用語およびその文法的同等物は、参照対象のすぐ隣りを指すことができる。例えば、ヌクレオチド配列に関連した隣接するという用語は、間にいずれものヌクレオチドが含まれないことを意味し得る。例えば、ポリヌクレオチドＢに隣接するポリヌクレオチドＡは、ＡとＢの間にいずれものヌクレオチドを含まないＡＢを意味し得る。
【００８８】
[00135]本明細書で使用される「抗原」という用語およびその文法的同等物は、１つ以上の受容体が結合することができる１つ以上のエピトープを含む分子を指すことができる。例えば、抗原は、宿主の免疫系を刺激して、抗原が提示された場合に細胞抗原特異的な免疫応答もしくは体液性抗体応答を引き起こすことができる。抗原はまた、それ自体で、または別の分子と組み合わせて存在する場合に、細胞性および／または体液性応答を誘発する能力も有し得る。例えば、腫瘍細胞抗原は、ＴＣＲによって認識され得る。
【００８９】
[00136]本明細書で使用される「エピトープ」という用語およびその文法的同等物は、抗体、Ｂ細胞、Ｔ細胞または操作された細胞によって認識され得る抗原の一部を指すことができる。例えば、エピトープは、ＴＣＲによって認識される癌エピトープであり得る。抗原内の複数のエピトープもまた認識され得る。エピトープはまた突然変異され得る。
【００９０】
[00137]本明細書で使用される「自己」という用語およびその文法的同等物は、同一存在に由来するものを指すことができる。例えば、試料（例えば細胞）を取り出して処理し、後で同じ対象（例えば、対象）に戻すことができる。自己プロセスは、ドナーとレシピエントが異なる対象である同種異系プロセスとは区別される。
【００９１】
[00138]「バーコードされる」という用語は、第１の分子が第２の分子を識別するために使用できるバーコードを含む分子間の関係を指す。
[00139]本明細書で使用される「癌」という用語およびその文法的同等物は、その独特の特性−正常な制御の喪失−が無秩序な増殖、分化の欠如、局所的な組織浸潤、および転移をもたらす細胞の過剰増殖を指すことができる。本発明の方法に関して、癌は、任意の癌であり得、例えば、急性リンパ球性癌、急性骨髄性白血病、肺胞横紋筋肉腫、膀胱癌、骨癌、脳癌、乳癌、肛門癌、肛門管、直腸、目の癌、肝内胆管の癌、関節の癌、首、胆嚢、または胸膜の癌、鼻、鼻腔、または中耳の癌、口腔の癌、外陰部の癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性癌、結腸癌、食道癌、子宮頸癌、線維肉腫、胃腸カルチノイド腫瘍、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、腎臓癌、喉頭癌、白血病、液体腫瘍、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、悪性中皮腫、肥満細胞腫、黒色腫、多発性骨髄腫、鼻咽頭癌、非ホジキンリンパ腫、卵巣癌、膵臓癌、腹膜、大網、および腸間膜癌、咽頭癌、前立腺癌、直腸癌、腎臓癌、皮膚癌、小腸癌、軟部組織癌、固形腫瘍、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、尿管癌、および／または膀胱癌が挙げられる。本明細書で使用される「腫瘍」という用語は、例えば、悪性型もしくは良性型の細胞または組織の異常な増殖を指す。
【００９２】
[00140]本明細書で使用される「癌ネオ抗原」または「ネオ抗原」または「ネオエピトープ」という用語およびその文法的同等物は、正常な、突然変異していない宿主ゲノムにコードされていない抗原を指すことができる。「ネオ抗原」は、場合によっては、発癌性ウイルスタンパク質、または体細胞突然変異の結果として生じる異常タンパク質のいずれかを表すことができる。例えば、ネオ抗原は、ウイルス抗原の活性を介した細胞機構の破壊により生じる場合がある。別の例は、発癌性化合物の曝露であり得、場合によって、体細胞突然変異をもたらす可能性がある。この体細胞突然変異は、最終的には、腫瘍／癌の形成をもたらす可能性がある。
【００９３】
[00141]本明細書で使用される「細胞傷害性」という用語は、細胞の正常な状態における意図しないまたは望ましくない変化を指す。細胞の正常な状態とは、細胞が細胞傷害性組成物、薬剤、および／または状態に曝露される前に現れるまたは存在する状態を指すことができる。一般的に、正常な状態にある細胞は、恒常性にある細胞である。細胞の正常な状態の意図しないまたは望ましくない変化は、例えば、細胞死（例えば、プログラム細胞死）、複製能力の低下、膜の完全性などの細胞の完全性の低下、代謝活性の低下、発達能力の低下、または本願に開示されている細胞傷害性効果のいずれかの形で現れ得る。
【００９４】
[00142]「細胞傷害性の低下」または「細胞傷害性を低下させる」という語句は、細胞傷害性組成物、薬剤および／または状態への曝露による細胞の正常状態の意図しないまたは望ましくない変化の程度または頻度の低下を指す。語句は、細胞傷害性組成物、薬剤および／または状態に曝露される個々の細胞の細胞傷害性の程度を低下させること、または細胞集団が細胞傷害性組成物、薬剤および／または状態に曝露されるときに細胞傷害性を示す集団の細胞数を低下させることを指すことができる。
【００９５】
[00143]本明細書で使用される「操作された」という用語およびその文法的同等物は、核酸、例えば生物のゲノム内の核酸、の１つ以上の変化を指すことができる。「操作された」という用語は、遺伝子の変更、付加、および／または欠失を指す場合がある。操作された細胞はまた、遺伝子が付加、欠失、および／または変更された細胞を指すこともあり得る。
【００９６】
[00144]本明細書で使用される「細胞」または「操作された細胞」という用語およびそれらの文法的同等物は、ヒトまたは非ヒト動物起源の細胞を指すことができる。
[00145]本明細書で使用される「チェックポイント遺伝子」という用語およびその文法的同等物は、免疫応答、例えば、有害な応答の制御されない伝播を軽減する免疫抑制フィードバックループの振幅を調節するように作用する阻害性プロセス（例えば、フィードバックループ）に関与する任意の遺伝子を指すことができる。これらの応答には、感染に対する免疫応答応および／または末梢自己寛容の維持中に発生する可能性のある付随的な組織損傷から保護する分子シールドへの貢献が含まれ得る。チェックポイント遺伝子の非限定的な例には、受容体の拡大ＣＤ２８ファミリーおよびそれらのリガンドのメンバー、ならびに共阻害経路に関与する遺伝子（例えば、ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１）が含まれ得る。「チェックポイント遺伝子」という用語は、免疫チェックポイント遺伝子を指す場合もある。
【００９７】
[00146]「ＣＲＩＳＰＲ」、「ＣＲＩＳＰＲシステムシステム」、または「ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼシステム」およびそれらの文法的同等物は、ヌクレアーゼ機能（例えば、２つのヌクレアーゼドメイン）を有する、ＤＮＡおよびＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）に結合する非コードＲＮＡ分子（例えば、ガイドＲＮＡ）を含み得る。例えば、Ｓａｎｄｅｒ，Ｊ．Ｄ．ら，「ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｅｄｉｔｉｎｇ，ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｇｅｎｏｍｅｓ」，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３２巻：３４７〜３５５頁（２０１４年）を参照されたい。また、例えば、Ｈｓｕ，Ｐ．Ｄ．ら，「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｆｏｒ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」，Ｃｅｌｌ  １５７巻（６号）：１２６２〜１２７８頁（２０１４年）も参照されたい。
【００９８】
[00147]本明細書で使用される「破壊する」という用語およびその文法的同等物は、例えば、欠失、挿入、突然変異、再配列、またはそれらの任意の組み合わせにより、遺伝子を変更するプロセスを指し得る。例えば、遺伝子は、ノックアウトによって破壊される場合がある。遺伝子を破壊することは、遺伝子の発現を部分的に低下させるか、または完全に抑制することであり得る。また、遺伝子を破壊することは、異なる遺伝子、例えば、下流の遺伝子の活性化も引き起こす可能性もある。
【００９９】
[00148]本明細書で使用される「操作された」という用語およびその文法的同等物は、核酸、例えば生物のゲノム内の核酸、の１つ以上の変化を指すことができる。「操作された」という用語は、遺伝子の変更、付加、および／または欠失を指す場合がある。操作された細胞はまた、遺伝子が付加、欠失、および／または変更された細胞を指すこともあり得る。
【０１００】
[00149]本明細書で使用される「機能」という用語およびその文法的同等物は、意図された目的を操作、保有、または提供する能力を指すことができる。機能的は、ベースラインから通常機能の１００％までの任意のパーセントで構成することができる。例えば、機能的は、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、および／または１００％の通常機能を含むことができるかまたは含む。場合によっては、機能的という用語は、通常機能の１００％以上または約１００％以上、例えば、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００％および／またはそれ以上の通常機能を意味し得る。
【０１０１】
[00150]本明細書で使用される「遺伝子編集」という用語およびその文法的同等物は、１つ以上のヌクレオチドがゲノムに挿入、置換、または除去される遺伝子工学を指すことができる。遺伝子編集は、ヌクレアーゼ（例えば、天然に存在するヌクレアーゼまたは人工的に操作されたヌクレアーゼ）を使用して行うことができる。
【０１０２】
[00151]本明細書で使用される「適正製造基準」（ＧＭＰ）という用語およびその文法的同等物は、ＦＤＡに従って安全、有効、または純粋な製造物を指すことができる。ＧＭＰはまた、「ｃＧＭＰ」と呼ばれることもある。「ｃ」は「現在の（ｃｕｒｒｅｎｔ）」を表す。製造物の製造元は、ＧＭＰ製造物の規制に準拠するために最新の技術およびシステムを使用できる。ＧＭＰ互換製造物は、典型的には、研究環境とは対照的に臨床環境で使用される。
【０１０３】
[00152]本明細書で使用される「突然変異」という用語およびその文法的同等物は、ポリヌクレオチド中の１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、および挿入を含むことができる。例えば、ポリヌクレオチド（ｃＤＮＡ、遺伝子）またはポリペプチド配列の最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、４０、５０、またはそれ以上のヌクレオチド／アミノ酸が、置換、欠失、および／または挿入され得る。突然変異は、遺伝子のコード配列またはその調節配列に影響を与え得る。突然変異はまた、ゲノム配列の構造またはコードされたｍＲＮＡの構造／安定性に影響を与える可能性がある。核酸の突然変異は、突然変異される位置でコードされたアミノ酸の親水性を増加または減少させる突然変異をコードすることができる。核酸の突然変異は、突然変異される位置でコードされたアミノ酸の疎水性を増加または減少させる突然変異をコードすることができる。核酸の突然変異は、非極性脂肪族アミノ酸（例えば、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ）、芳香族アミノ酸（例えば、Ｆ、Ｙ、Ｗ）、正に帯電したアミノ酸（例えば、Ｋ、Ｒ、Ｈ）、負に帯電したアミノ酸（例えば、Ｄ、Ｅ）、および極性アミノ酸（例えば、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｐ、Ｎ、Ｑ）から選択されるアミノ酸をコードすることができる。核酸の突然変異は、前記のグループの１つ内（例えば、ＶからＩへの突然変異）またはグループ間（例えば、ＦからＬへの突然変異）でコードされたアミノ酸を変更することができる。一部の実施形態では、突然変異は、芳香族アミノ酸から非極性脂肪族アミノ酸への変化をコードすることができる。一部の実施形態では、突然変異は、正に帯電したアミノ酸から極性アミノ酸への変化をコードすることができる。一部の実施形態では、突然変異は、非極性脂肪族アミノ酸から別の非極性アミノ酸への変化をコードすることができる。一部の実施形態では、突然変異は、非極性脂肪族アミノ酸から負に帯電したアミノ酸への変化をコードすることができる。一部の実施形態では、突然変異は、非極性脂肪族アミノ酸を正に帯電したアミノ酸への変化をコードすることができる。
【０１０４】
[00153]本明細書で使用される「非ヒト動物」という用語およびその文法的同等物は、天然動物または遺伝子修飾された非ヒト動物であり得る、非ヒト哺乳動物を含むヒト以外のすべての動物種を含み得る。「核酸」、「ポリヌクレオチド」、「ポリ核酸」、および「オリゴヌクレオチド」という用語とそれらの文法的同等物は、互換的に使用することができ、線状または環状の立体構造の、および単一または二本鎖の形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指すことができる。本開示の目的のために、これらの用語は、長さに関して制限するものとして解釈されるべきではない。この用語はまた、天然ヌクレオチドの類似体、ならびに塩基、糖および／またはリン酸部分で修飾されたヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート骨格）も包含することができる。用語の変更には、脱メチル化、ＣｐＧメチル化の追加、細菌のメチル化の除去、および／または哺乳動物のメチル化の追加も含まれ得る。一般的に、特定のヌクレオチドの類似体は、同じ塩基対特異性を有することができる。すなわち、Ａの類似体は、Ｔと塩基対を形成することができる。
【０１０５】
[00154]「同一性パーセント（％）」という用語は、タンパク質の全長またはその断片にわたって、アミノ酸配列について容易に決定することができる。適切には、断片は、長さが少なくとも約８アミノ酸であり、最大約７００アミノ酸であり得る。一般的に、２つの異なるアデノ随伴ウイルス間の「同一性」、「相同性」、または「類似性」を指す場合、「同一性」、「相同性」、または「類似性」は、「整列された」配列を基準として決定される。「整列された」配列または「整列」とは、参照配列と比較して、欠落または追加の塩基またはアミノ酸の修正を含むことが多い、複数の核酸配列またはタンパク質（アミノ酸）配列を指す。
【０１０６】
[00155]本明細書で使用される用語「末梢血リンパ球」（ＰＢＬ）およびその文法的同等物は、血液（例えば、末梢血）を循環するリンパ球を指し得る。末梢血リンパ球とは、臓器に局在しないリンパ球を指すことができる。末梢血リンパ球は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。
【０１０７】
[00156]本明細書で使用される「表現型」という用語およびその文法的同等物は、生物の形態、発生、生化学的または生理学的特性、生物季節学、行動、および行動産物などの生物の観察可能な特徴または特性の複合を指し得る。文脈に応じて、「表現型」という用語は、集団の観察可能な特徴または特性の複合を指す場合がある。
【０１０８】
[00157]本明細書で使用される「プロトスペーサー」という用語およびその文法的同等物は、ガイドＲＮＡのスペーサー配列または操作された標的部分などのガイドＲＮＡの一部にハイブリダイズすることができるＰＡＭ隣接核酸配列を指し得る。プロトスペーサーは、ガイドＲＮＡによって標的とされる遺伝子、ゲノム、または染色体内のヌクレオチド配列である。天然の状態では、プロトスペーサーはＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）に隣接している。ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼによる切断部位は、プロトスペーサー配列内にある。例えば、ガイドＲＮＡが特定のプロトスペーサーを標的とする場合、Ｃａｓタンパク質は、プロトスペーサー配列内に二本鎖切断を生成し、それによりプロトスペーサーを切断する。切断後、プロトスペーサーの破壊は、非相同末端接続（ＮＨＥＪ）または相同性指向修復（ＨＤＲ）を介してもたらされる可能性がある。プロトスペーサーの破壊は、プロトスペーサーの削除をもたらす場合がある。追加的にまたは代替的に、プロトスペーサーの破壊は、外因性核酸配列をプロトスペーサーに挿入されるかまたは置換させる場合がある。
【０１０９】
[00158]本明細書で使用される「レシピエント」という用語およびそれらの文法的同等物は、ヒトまたは非ヒト動物を指すことができる。レシピエントはまた、それを必要としている場合がある。
【０１１０】
[00159]本明細書で使用される「組換え」という用語およびその文法的同等物は、２つのポリ核酸間で遺伝情報を交換するプロセスを指すことができる。本開示の目的のために、「相同組換え」または「ＨＲ」は、例えば、二本鎖切断の修復中に起こり得るこのような遺伝子交換の特殊な形態を指すことができる。このプロセスは、例えば、標的分子（例えば、二本鎖切断を経験した分子）の鋳型修復にドナー分子を使用するヌクレオチド配列相同性を必要とする場合があり、非クロスオーバー遺伝子変換または短管遺伝子変換として公知である場合もある。また、このような移行には、破壊された標的とドナーの間に形成されるヘテロ二重鎖ＤＮＡのミスマッチ補正、および／またはドナーを使用して標的の一部になり得る遺伝情報を再合成することができる合成依存的な鎖アニーリング、および／または関連プロセスも含まれる。このような特殊化されたＨＲは、しばしば、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全部を標的ポリヌクレオチド内に組み込むことができるように、標的分子の配列の変更をもたらすことができる。場合によっては、「組換えアーム」および「相同性アーム」という用語は互換的に使用することができる。
【０１１１】
[00160]「標的ベクター」および「標的化ベクター」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
[00161]本明細書で使用される「導入遺伝子」という用語およびその文法的同等物は、生物に移入される遺伝子または遺伝物質を指すことができる。例えば、導入遺伝子は、生物に導入される遺伝子を含むＤＮＡのストレッチまたはセグメントであり得る。導入遺伝子が生物に導入された場合、その生物は、トランスジェニック生物と呼ばれる。導入遺伝子は、トランスジェニック生物でＲＮＡまたはポリペプチド（例えば、タンパク質）を産生する能力を保持することができる。導入遺伝子は、ＲＮＡやＤＮＡなどの様々な核酸で構成され得る。導入遺伝子は、ＴＣＲ導入遺伝子などの操作されたＴ細胞受容体をコードすることができる。導入遺伝子はＴＣＲ配列であり得る。導入遺伝子は受容体であり得る。導入遺伝子は組換えアームを含み得る。導入遺伝子は、操作された部位を含むことができる。
【０１１２】
[00162]本明細書で使用される「Ｔ細胞」という用語およびその文法的同等物は、任意の起源からのＴ細胞を指すことができる。例えば、Ｔ細胞は、初代Ｔ細胞、例えば、自己Ｔ細胞、細胞株などであり得る。Ｔ細胞はまた、ヒトまたは非ヒトであり得る。
【０１１３】
[00163]本明細書で使用される用語「ＴＩＬ」または腫瘍浸潤リンパ球およびその文法的同等物は、腫瘍から単離された細胞を指すことができる。例えば、ＴＩＬは、腫瘍に移動した細胞であり得る。ＴＩＬはまた、腫瘍に浸潤した細胞であり得る。ＴＩＬは、腫瘍内に見られる任意の細胞であり得る。例えば、ＴＩＬは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、ナチュラルキラー細胞、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。ＴＩＬは、細胞の混合集団であり得る。ＴＩＬ集団は、異なる表現型の細胞、異なる分化程度の細胞、異なる系統の細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。
【０１１４】
[00164]治療される状態に変化がある場合、「治療効果」が生じ得る。変化は、プラスまたはマイナスになり得る。例えば、「プラス効果」は、対象の活性化Ｔ細胞の数の増加に対応し得る。別の実施例では、「負の効果」は、対象における腫瘍の量またはサイズの減少に対応し得る。少なくとも１０％の改善、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは１００％の改善がある場合、治療される状態に「変化」がある。変化は、本発明の組成物が組み合わせて投与される治療組成物による治療の有無による、個体における治療状態の重症度の改善、または個体集団における改善された状態の頻度の違いに基づくことができる。同様に、本開示の方法は、「治療上有効な」量の細胞を対象に投与することを含むことができる。「治療上有効な」という用語は、「治療効果を有する」に対応する定義を有すると理解されるべきである。
【０１１５】
[00165]本明細書で使用される「セーフハーバー」および「免疫セーフハーバー」という用語ならびにそれらの文法的同等物は、外因性核酸を組み込むために使用することができるゲノム内の場所を指し得、その組み込みは、核酸のみの添加による宿主細胞の増殖においていずれもの有意な効果を生じさせない。セーフハーバーの非限定的な例には、ＨＰＲＴ、ＡＡＶＳ  ＳＩＴＥ（例えば、ＡＡＶＳ１、ＡＡＶＳ２、ＥＴＣ）、ＣＣＲ５、またはＲｏｓａ２６が含まれる。例えば、ヒトパルボウイルス、ＡＡＶは、優先的にヒト染色体１９  ｑ１３．３−ｑｔｅｒまたはＡＡＶＳ１遺伝子座に組み込まれることが公知である。ＡＡＶＳ１遺伝子座に目的の遺伝子を組み込むことは、様々な細胞タイプでの導入遺伝子の安定した発現を支持することができる。場合によっては、ヌクレアーゼを操作して、ＡＡＶＳ１遺伝子座で導入遺伝子の組み込みを可能にするために、ＡＡＶＳ１遺伝子座で二本鎖切断の生成を標的とし、または本明細書に開示される目的の導入遺伝子、細胞受容体、もしくは任意の遺伝子などの、ＡＡＶＳ１部位に外因性の核酸配列を組み込むために、ＡＡＶＳ１遺伝子座で相同組換えを促進することができる。場合によっては、ＡＡＶウイルスベクターを使用して、外因性ヌクレアーゼの有無にかかわらず、ＡＡＶＳ１部位に組み込むための導入遺伝子を送達する。ＡＡＶＳ１を標的とするウイルスベクターは、例えば、図２５Ａまたは図２５Ｂであり得る。
【０１１６】
[00166]本明細書で使用される「配列」という用語およびその文法的同等物は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得るヌクレオチド配列を指すことができ、線状、環状、または分岐であり得、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る。配列を変更することができる。配列は、任意の長さ、例えば、２〜１，０００，０００またはそれ以上のヌクレオチド長（またはその間の任意の整数値）、例えば、約１００〜約１０，０００ヌクレオチド、または約２００〜約５００ヌクレオチドであり得る。
【０１１７】
[00167]「ウイルスベクター」という用語は、ウイルスに由来する遺伝子導入ベクターまたは遺伝子送達システムを指す。このようなベクターは、当該技術分野において公知である組換え技術を使用して構築され得る。一部の態様では、このようなベクターを誘導するためのウイルスは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルパー依存性アデノウイルス、ハイブリッドアデノウイルス、エプスタイン−バーウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス、日本血球凝集ウイルス（ＨＶＪ）、モロニーマウス白血病ウイルス、ポックスウイルス、およびＨＩＶベースのウイルスから選択される。
概要
[00168]本明細書では、細胞内ゲノム移植を行うに有用な修飾されたアデノ随伴ウイルスベクター組成物および方法が開示される。細胞内ゲノム移植は、修飾されたアデノ随伴ウイルスベクターを利用する治療用途のための遺伝子的に修飾された細胞および核酸を含むことができる。全体にわたって記載されている組成物および方法は、操作された細胞の生理学的および免疫学的効力を改善する方法で外因性の細胞受容体を送達するために、突然変異されたまたはキメラなアデノ随伴ウイルスベクターを使用することができる。修飾されたアデノ随伴ウイルスベクターは、例えば、癌（例えば、転移性癌）対象を含む様々な適応症を治療するのに有用であり得る。例えば、自己末梢血リンパ球（ＰＢＬ）は、アデノ随伴ウイルス法を使用して修飾され、癌細胞上の固有の突然変異、新抗原を認識する外因性の細胞受容体を発現させることができ、細胞内ゲノム移植の開示された組成物および方法で使用することができる。場合によっては、アデノ随伴ベクター修飾細胞はまた、少なくとも１つの遺伝子またはその一部のゲノム破壊を含むことがある。突然変異されたおよびキメラなアデノ随伴ウイルスベクターを利用するこれらの組成物、および細胞内ゲノム移植のために前記ＡＡＶベクターを利用する方法は、多くの利点を備えた癌治療を提供することができる。例えば、高効率の遺伝子導入、発現、細胞生存率の増加、組換え二本鎖切断の効率的な導入、および非相同末端接続（ＮＨＥＪ）メカニズムよりも相同性指向修復（ＨＤＲ）を優先するプロセス、ならびに相同組換え体の効率的な回収および拡大を提供することができる。
【０１１８】
[00169]細胞内ゲノム移植は、治療用途のために細胞および核酸を遺伝的に修飾する方法であり得る。全体にわたって記載されている組成物および方法は、突然変異されたおよびキメラアデノ随伴ウイルスベクターを使用して、既存のウイルス送達メカニズムを改善することができる。効果的な養子細胞移植ベースの免疫療法（ＡＣＴ）は、例えば、癌（例えば、転移癌）対象を含む様々な適応症の治療に有用であり得る。例えば、自己末梢血リンパ球（ＰＢＬ）は、キャプシドタンパク質の少なくとも一部に突然変異を有する修飾されたアデノ随伴ウイルスベクター、または少なくとも２つの異なる血清学からのキャプシドタンパク質を有するアデノ随伴ウイルスベクターを使用して修飾され得る。操作されたアデノ随伴ウイルスベクターは、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３のいずれかなどのキャプシドタンパク質に突然変異を含むことができる。現在の文献とは対照的に、開示された修飾されたアデノ随伴ウイルスベクターは、形質導入細胞における導入遺伝子発現率を高めることにより、同等のベクターを改善する。本明細書に記載される修飾されたアデノ随伴ウイルスベクターは、ペイロードを初代細胞に送達するための新規な手段を提供し、増加した程度の形質導入効率および導入遺伝子発現を伴う。修飾されたアデノ随伴ウイルスベクターは、ＣＲＩＳＰＲなどのゲノム修飾の様々なシステムと組み合わせて、癌などの様々な状態の免疫療法用に、細胞受容体などの少なくとも１つの遺伝子破壊および高い比率の導入遺伝子発現を、操作された細胞に提供することができる。
【０１１９】
[00170]場合によっては、修飾されたアデノ随伴ウイルスベクターで初代細胞を修飾する最初のステップは、初代細胞を少なくとも１つの刺激剤と接触させることによる初代細胞の刺激を含み得る。例えば、ＣＤ４  Ｔ細胞またはＣＤ８  Ｔ細胞の増殖を刺激するために、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を使用することができる。例えば、シグナルを提供する薬剤は、溶液中にあるかまたは表面に結合することができる。粒子と細胞の比率は、標的細胞に対する粒子サイズに依存し得る。さらなる実施形態では、Ｔ細胞などの細胞は、薬剤被覆されたビーズと組み合わせることができ、その後、ビーズおよび細胞は分離され、場合により培養され得る。各ビーズは、抗ＣＤ３抗体もしくは抗ＣＤ２８抗体のいずれか、または場合によっては２つの組み合わせで被覆され得る。別の実施形態では、培養の前に、薬剤被覆されたビーズおよび細胞は分離されず、一緒に培養される。抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８を結合させることができる常磁性ビーズ（３ｘ２８ビーズ）をＴ細胞に接触させることにより、細胞表面タンパク質を連結することができる。一実施形態では、細胞およびビーズ（例えば、１：１の比率のＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ−４５０  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔ常磁性ビーズ）は、緩衝液、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（例えば、二価カチオン、例えばカルシウムおよびマグネシウムを含まない）中で合わせられる。任意の細胞濃度を使用することができる。混合物は、１４日までもしくは約１４日までの数時間（例えば、３時間）または約数時間（例えば、約３時間）、あるいはその間の任意の毎時の整数時間、培養することができる。別の実施形態では、混合物は、２１日間もしくは約２１日間、または最大２１日間もしくは最大約２１日間培養することができる。Ｔ細胞培養に適した条件には、血清（例えば、ウシ胎児血清またはヒト血清）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インスリン、ＩＦＮ−ｇ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５、ＴＧＦベータ、およびＴＮＦアルファ、または細胞増殖のための任意の他の添加物などの増殖および生存に必要とされる因子を含むことができる適切な培地（例えば、Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ＭｅｄｉａまたはＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉａ  １６４０またはＸ−ｖｉｖｏ  ５（Ｌｏｎｚａ））が含まれ得る。細胞増殖のための他の添加物には、限定されないが、界面活性剤、プラズマ酸塩、ならびにＮ−アセチルシステインおよび２−メルカプトエタノールなどの還元剤が含まれる。培地には、ＲＰＭＩ  １６４０、Ａ１  Ｍ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、α−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｘ−Ｖｉｖｏ  １、およびＸ−Ｖｉｖｏ  ２０、オプティマイザー、ならびにアミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、およびビタミンが含まれ、無血清であるか、あるいは適切な量の血清（または血漿）または特定のセットのホルモン、および／もしくはＴ細胞の増殖と拡大に十分な量のサイトカイン（複数可）が補足され得る。抗生物質、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンは、実験培養にのみ含めることができ、対象に注入される細胞の培養には含まれない場合がある。標的細胞は、増殖を支持するために必要な条件下；例えば���適切な温度（例えば、３７℃）および大気（例えば、空気＋５％ＣＯ２）で維持することができる。場合によっては、様々な刺激時間に曝露されたＴ細胞は、様々な特性を示すことがある。場合によっては、ヒトＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ２、またはそれらの任意の組み合わせに対する可溶性の単一特異性の四量体抗体を使用することができる。
【０１２０】
[00171]場合によっては、ゲノム移植を受ける細胞は、組織または細胞と共培養することにより活性化または拡大することができる。細胞は抗原提示細胞であり得る。人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、Ｔ細胞受容体および共刺激分子のリガンドを発現することができ、場合によってはそれらの効力および機能を向上させながら、移植用にＴ細胞を活性化および拡大することができる。ａＡＰＣは、Ｔ細胞活性化のための任意の遺伝子を発現するように設計され得る。ａＡＰＣは、Ｔ細胞拡大のための任意の遺伝子を発現するように操作され得る。ａＡＰＣは、ビーズ、細胞、タンパク質、抗体、サイトカイン、または任意の組み合わせであり得る。ａＡＰＣは、ゲノム移植を受けることができる細胞集団にシグナルを送達することができる。例えば、ａＡＰＣは、シグナル１、シグナル２、シグナル３、または任意の組み合わせを送達することができる。シグナル１は抗原認識シグナルであり得る。例えば、シグナル１は、ペプチド−ＭＨＣ複合体によるＴＣＲの連結であるか、またはＣＤ３シグナル伝達複合体の活性化をもたらすことができるＣＤ３に対するアゴニスト抗体の結合であり得る。シグナル２は、共刺激シグナルであり得る。例えば、共刺激シグナルは、それぞれ、ＩＣＯＳ−Ｌ、ＣＤ７０、および４−１ＢＢＬに結合する抗ＣＤ２８、誘導性共刺激（ＩＣＯＳ）、ＣＤ２７、および４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）であり得る。シグナル３は、サイトカインシグナルであり得る。サイトカインは、任意のサイトカインであり得る。サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。場合によっては、ＩＬ−２、ＩＬ−７、およびＩＬ−１５を使用して本発明の細胞を培養する。
【０１２１】
[00172]場合によっては、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を使用して、細胞集団を活性化および／または拡大することができる。場合によっては、ａＡＰＣは同種特異性を誘発しない。場合によっては、ａＡＰＣはＨＬＡを発現しない。ａＡＰＣは、活性化および／または刺激に使用することができる遺伝子を安定に発現させるように遺伝的に修飾され得る。場合によっては、Ｋ５６２細胞は、活性のために使用することができる。Ｋ５６２細胞もまた拡大に使用することができる。Ｋ５６２細胞は、ヒト赤白血病細胞株であり得る。Ｋ５６２細胞は、目的の遺伝子を発現するように操作され得る。場合によっては、Ｋ５６２細胞は、ＨＬＡクラスＩ、ＩＩ、またはＣＤ１ｄ分子を内因的に発現しないが、ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）およびＬＦＡ−３（ＣＤ５８）を発現することができる。Ｋ５６２は、シグナル１をＴ細胞に送達するように操作され得る。例えば、Ｋ５６２細胞は、ＨＬＡクラスＩを発現するように操作することができる。場合によっては、Ｋ５６２細胞を操作して、Ｂ７、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、４−１ＢＢＬ、抗ＣＤ３、抗−ＣＤ３  ｍＡｂ、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２８ｍＡｂ、ＣＤ１ｄ、抗ＣＤ２、膜結合ＩＬ−１５、膜結合ＩＬ−１７、膜結合ＩＬ−２１、膜結合ＩＬ−２、切断型ＣＤ１９、または任意の組み合わせなどの追加の分子を発現するように操作することができる。場合によっては、操作されたＫ５６２細胞は、ＣＤ８０およびＣＤ８３に加えて、膜形態の抗ＣＤ３  ｍＡｂ、クローンＯＫＴ３を発現することができる。場合によっては、操作されたＫ５６２細胞は、ＣＤ８０およびＣＤ８３に加えて、膜形態の抗ＣＤ３  ｍＡｂ、クローンＯＫＴ３、膜形態の抗ＣＤ２８  ｍＡｂを発現することができる。
【０１２２】
[00173]ａＡＰＣはビーズにすることができる。球状ポリスチレンビーズは、ＣＤ３およびＣＤ２８に対する抗体でコーティングでき、Ｔ細胞の活性化に使用できる。ビーズのサイズは任意である。場合によっては、ビーズは約３および６マイクロメートルであるか、または約３および６マイクロメートルである。ビーズは、サイズが約４．５マイクロメートルであるか、または約４．５マイクロメートルであり得る。ビーズは、セルとビーズの比率で使用できる。例えば、ミリリットルあたり１００万個の細胞で３対１のビーズ対細胞比を使用することができる。ａＡＰＣはまた、剛体球形粒子、ポリスチレンラテックスマイクロビーズ、磁気ナノ粒子またはマイクロ粒子、ナノサイズの量子ドット、４、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）マイクロスフェア、非球形粒子、５、カーボンナノチューブバンドル、６、楕円体ＰＬＧＡ微粒子、７、ナノワーム、流体脂質二重層含有システム、８、２Ｄ支持脂質二重層（２Ｄ−ＳＬＢ）、９、リポソーム、１０、ＲＡＦＴｓｏｍｅ／ミクロドメインリポソーム、１１、ＳＬＢ粒子、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。
【０１２３】
[00174]場合によっては、ａＡＰＣはＣＤ４  Ｔ細胞を拡大することができる。例えば、ａＡＰＣは、ＨＬＡクラスＩＩ制限されたＣＤ４  Ｔ細胞の抗原処理および提示経路を模倣するように操作され得る。Ｋ５６２は、ＨＬＡ−Ｄ、ＤＰα、ＤＰβ鎖、Ｉｉ、ＤＭα、ＤＭβ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、またはそれらの任意の組み合わせを発現するように操作され得る。例えば、操作されたＫ５６２細胞は、ＨＬＡ制限された抗原特異的ＣＤ４  Ｔ細胞を拡大するために、ＨＬＡ制限されたペプチドをパルスすることができる。
【０１２４】
[00175]場合によっては、ａＡＰＣの使用は、Ｔ細胞の活性化、拡大、または任意の組み合わせのために外因的に導入されたサイトカインと組み合わせることができる。細胞はまた、例えば、ゲノムに移植された細胞を対象に投与した後、対象の血液中、インビボで拡大することができる。
【０１２５】
[00176]一部の態様では、本明細書に開示される方法は、１つ以上の核酸（例えば、第１の核酸または第２の酸）を細胞に導入することを含む。当業者は、核酸が、一般的に、その分子が長鎖で連結された多数のヌクレオチドからなる物質を指し得ることを理解する。核酸の非限定的な例には、人工核酸類似体（例えば、ペプチド核酸、モルホリノオリゴマー、ロックド核酸、グリコール核酸、またはトレオース核酸）、環状核酸、ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ミニサークルＤＮＡ、プラスミド、プラスミドＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、ウイルスベクター、ガンマ−レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ＲＮＡ、ショートヘアピンＲＮＡ、ｐｓｉＲＮＡおよび／またはそれらのハイブリッドもしくは組み合わせが含まれる。一部の実施形態では、方法は核酸を含むことができ、核酸は合成である。一部の実施形態では、試料は核酸を含むことができ、核酸は断片化することができる。場合によっては、核酸はミニサークルである。核酸は、外因性ＴＣＲなどの導入遺伝子をコードすることができる。外因性ＴＣＲは癌細胞に結合することができる。外因性ＴＣＲが結合され得る特定のエピトープは、例えば、国際公開第２０１６／０５３３３８号に記載されるように、対象の癌の突然変異によってコードされる免疫原性エピトープであり得る。例えば、癌特異的ＴＣＲ導入遺伝子は、ランダムまたは特定の挿入を使用して細胞（例えば、Ｔ細胞）のゲノムに挿入することができる。場合によっては、挿入はウイルス挿入であり得る。場合によっては、導入遺伝子のウイルス挿入は、特定のゲノム部位を標的とすることができ、または他の場合には、導入遺伝子のウイルス挿入は、ゲノム部位へのランダム挿入であり得る。
【０１２６】
[00177]場合によっては、核酸は別の核酸に容易に結合することができる（例えば、核酸は粘着末端またはヌクレオチド突出部を含む）。例えば、核酸は、核酸の第１末端に突出部を含むことができる。一般的に、粘着末端または突出部は、核酸の末端にある一連の不対ヌクレオチドを指す場合がある。場合によっては、核酸は、核酸の１つ以上の末端に一本鎖突出部を含むことができる。場合によっては、核酸の３’末端に突出部が生じる場合がある。場合によっては、核酸の５’末端に突出部が生じる場合がある。突出部は、任意の数のヌクレオチドを含むことができる。例えば、突出部は、１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、もしくは５ヌクレオチド、またはそれ以上のヌクレオチドを含むことができる。場合によっては、核酸は、別の核酸に結合する前に修飾を必要とする場合がある（例えば、核酸をエンドヌクレアーゼで消化する必要がある場合がある）。場合によっては、核酸の修飾は、ヌクレオチド突出部が発生させ得、突出部は任意の数のヌクレオチドを含み得る。例えば、突出部は、１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、もしくは５ヌクレオチド、またはそれ以上のヌクレオチドを含むことができる。一例では、核酸は制限部位を含むことができ、制限部位にある核酸を制限酵素（例えば、ＮｏｔＩ）で消化すると４ヌクレオチドの突出部が生成される。場合によっては、修飾は、核酸の１つ以上の末端に平滑末端を生成することを含む。一般的に、平滑末端とは、両方の鎖が塩基対で終結する二本鎖核酸を指し得る。一例では、核酸は制限部位を含むことができ、制限部位にある核酸を制限酵素（例えば、ＢｓａＩ）で消化すると平滑末端が生成される。
【０１２７】
[00178]プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼと転写因子の結合を調節する核酸の配列であり、遺伝子転写の効率、遺伝子は細胞内のどこで発現され得るか、および／またはどの細胞タイプで遺伝子が発現され得るかに大きな影響を与える場合がある。プロモーターの非限定的な例には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、伸長因子１アルファ（ＥＦ１α）プロモーター、サル空胞化ウイルス（ＳＶ４０）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ１）プロモーター、ユビキチンＣ（Ｕｂｃ）プロモーター、ヒトベータアクチンプロモーター、ＣＡＧプロモーター、テトラサイクリン応答要素（ＴＲＥ）プロモーター、ＵＡＳプロモーター、アクチン５ｃ（Ａｃ５）プロモーター、多面体プロモーター、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩａ）プロモーター、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ  １０プロモーター、ＴＥＦ１プロモーター、グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素（ＧＤＳ）プロモーター、ＡＤＨ１プロモーター、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、Ｕｂｉプロモーター、ヒトポリメラーゼＩＩＩ  ＲＮＡ（Ｈ１）プロモーター、Ｕ６プロモーター、またはその組み合わせが含まれる。
【０１２８】
[00179]プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、Ｕ６、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、陰性制御領域欠失、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）、またはＥＦ１ａであり得る。場合によっては、プロモーターは、外因性ＴＣＲ配列に隣接している場合がある。場合によっては、ＡＡＶベクターは、スプライシングアクセプターをさらに含むことができる。場合によっては、スプライシングアクセプターは、外因性ＴＣＲ配列に隣接している場合がある。プロモーター配列は、ＰＫＧまたはＭＮＤプロモーターであり得る。ＭＮＤプロモーターは、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーを有する修飾されたＭｏＭｕＬＶ  ＬＴＲのＵ３領域を含む合成プロモーターであり得る。
修飾されたアデノ随伴ウイルスベクター
[00180]場合によっては、ウイルスベクターを利用して、導入遺伝子を細胞に導入することができる。ウイルスベクターは、限定されないが、レンチウイルス、レトロウイルス、またはアデノ随伴ウイルスであり得る。ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクターであり得る。場合によっては、アデノ随伴ウイルスを使用して、細胞受容体などの外因性導入遺伝子を導入することができる。場合によっては、ウイルスベクターは、場合によっては同質遺伝子であり得る。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、場合によっては公知のＳＮＰを有するゲノムの一部に組み込まれ得る。一部の実施形態では、アデノ随伴ウイルスベクターは、公知のＳＮＰを有するゲノムの一部に組み込まれない。例えば、ＡＡＶは、対象自身のゲノムＤＮＡと同質または相同になるように設計することができる。場合によっては、同質遺伝子ベクターは、相同組換えの効率を改善することができる。場合によっては、ｇＲＮＡは、公知のＳＮＰを有する領域を標的にしないに設計して、組み込みしたベクター導入遺伝子の発現を改善することができる。ＰＤ−１、ＣＩＳＨ、ＡＡＶＳ１、ＣＴＬＡ−４などのチェックポイント遺伝子でのＳＮＰの頻度を決定することができる。場合によっては、内因性ＴＣＲ遺伝子でのＳＮＰの頻度を決定することができる。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、非病原性の一本鎖ＤＮＡパルボウイルスであり得る。ＡＡＶは、約２６ｎｍ径のキャプシドを有することができる。キャプシドの径はまた、場合によっては約２０ｎｍから約５０ｎｍであり得る。ＡＡＶ一本鎖ＤＮＡゲノムの各末端は、ゲノム複製およびパッケージングに必要とされる唯一のシス作用要素であり得る逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を含むことができる。ＩＴＲは任意のＡＡＶ血清型に由来し得る。例えば、ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、またはＡＡＶ１２由来であり得る。場合によっては、ＩＴＲはＡＡＶ２由来である。ゲノムは、ｒｅｐとｃａｐという２つのウイルス遺伝子を保有する。ウイルスは、２つのプロモーターおよび選択的スプライシングを利用して、複製に必要とされる４つのタンパク質（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ  ６８、Ｒｅｐ  ５２およびＲｅｐ  ４０）を生成し、一方、第３のプロモーターは、３つの構造ウイルスキャプシドタンパク質１、２および３（ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３）を、選択的スプライシングおよび選択的翻訳開始コドンの組み合わせを介して生成する。本明細書で使用するとき、ＶＰ１ｕは、ＶＰ１の固有配列（すなわち、ＶＰ２および／またはＶＰ３と重複しない配列）である。３つのキャプシドタンパク質は、同じＣ末端５３３アミノ酸を共有し、一方、ＶＰ２およびＶＰ１は、それぞれ６５アミノ酸および２０２アミノ酸の追加のＮ末端配列を含む。ＡＡＶビリオンは、Ｔ＝１の正二十面体対称に配置された、計６０個のＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３のコピーを１：１：２０の比率で含めることができる。場合によっては、ＲＥＰタンパク質（例えば、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ  ６８、Ｒｅｐ  ５２またはＲｅｐ  ４０）またはキャプシドタンパク質を修飾し、開示された組成物および方��で利用することができる。場合によっては、キャプシドは、３つのＶＰ：ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３で構成される。ＶＰ１は、固有の１３７アミノ酸Ｎ末端領域（ＶＰ１ｕ）に加えて、ＶＰ２配列全体を含み、ＶＰ２タンパク質は、６５アミノ酸Ｎ末端領域（ＶＰ１／２共通地域）に加えて、ＶＰ３配列全体を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供されるＡＡＶは、アセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）を含む。特定の実施形態では、ＡＡＰは、キャプシドアセンブリを促進する。場合によっては、ＡＡＶは、例えば、キャプシドアセンブリを改善することによって、ＡＡＶキャプシドの構造および機能を増大させるために修飾されたＡＡＰポリペプチドを含むことができる。
【０１２９】
[00181]例えば、一部の実施形態では、修飾されたＲＥＰタンパク質またはキャプシドタンパク質は、改善されたパッケージング効率、収率、感染性、形質導入効率、またはトランスフェクション効率を提供することができる。
【０１３０】
[00182]細胞レベルでは、ＡＡＶは、遺伝子発現を達成する前に５ステップを受けることができる：１）細胞表面受容体への結合または付着、２）エンドサイトーシス、３）核への輸送、４）ゲノムを放出するウイルスの脱コーティング、および５）核内での転写の鋳型としての一本鎖ＤＮＡから二本鎖ＤＮＡへのゲノムの変換。ＡＡＶが個々のステップを正常に実行することができる累積効率により、全体的な形質導入効率が決定され得る。ＡＡＶ形質導入の律速段階には、ウイルスの付着と内在化に必要とされる細胞表面受容体の欠如または低存在量、リソソーム分解をもたらす非効率的なエンドソーム脱出、および一本鎖から二本鎖ＤＮＡ鋳型への遅い変換が含まれる。したがって、ゲノムおよび／またはキャプシドが修飾されたベクターを設計して、遺伝子治療のためのより効率的もしくはより特異的な形質導入または細胞もしくは組織を促進することができる。
【０１３１】
[00183]本明細書では、ＡＡＶ血清型を同定する方法が開示され得る。場合によっては、ＡＡＶ血清型は、ＰＣＲアプローチを用いて特定することができる。ＰＣＲを使用すると、ＡＡＶゲノムの領域、主に、５’および３’配列を保存することができる「シグネチャー領域」と呼ばれるキャプシド遺伝子の２５５ｂｐ断片を増幅することができるが、中央配列は可変性であり、各ＡＡＶ血清型に固有であり得る。場合によっては、シグネチャー領域は、約５０ｂｐ、７５ｂｐ、８０ｂｐ、１００ｂｐ、１２５ｂｐ、１５０ｂｐ、１７５ｂｐ、２００ｂｐ、２２５ｂｐ、２５５ｂｐ、２６０ｂｐ、２７０ｂｐ、２８０ｂｐ、２９０ｂｐ、３００ｂｐ、３２５ｂｐ、３５０ｂｐ、３７５ｂｐ、または４００ｂｐから最大約４５０ｂｐであり得る。プライマーは、ＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子の保存領域にアニーリングして、新規ＡＡＶ血清型を増幅および同定するように設計することができる（例えば、Ｇａｏら，２００２年に示されている）。３つのプライマー対を使用して、単独で、またはＡＡＶ  ｒｅｐおよびキャプシド遺伝子の隣接配列を含めるようにシグネチャー領域を増幅した（図２６Ａに示されている）。ＡＡＶのシグネチャー領域は、ゲノムＤＮＡから増幅することができる。ゲノムＤＮＡは、哺乳動物細胞または非哺乳動物細胞から抽出することができる。場合によっては、ゲノムＤＮＡは、ＨＣＴ１１６、ＨＥＫ２９３、Ｊｕｒｋａｔ、Ｕ−９３７、ＮＣＩ−Ｈ８３８、ｐＤＧ、ＡＡＶ  ＤＪ、またはそれらの組み合わせなどの細胞株から抽出され得る。場合によっては、ゲノムＤＮＡはヒト細胞から抽出することができる。ゲノムＤＮＡは、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から抽出することができる。ゲノムＤＮＡは、肝臓、心臓、脳、腎臓、肺、脾臓、骨、皮膚、頬、血液、唾液などから抽出することができる。
【０１３２】
[00184]場合によっては、ＡＡＶウイルスキャプシドを修飾することができる。修飾は、任意のＡＡＶ血清型のものであり得る。場合によって、修飾は、野生型ＡＡＶ６のものである（図１５）。修飾には、キャプシドコンポーネントの組み合わせの修飾が含まれ得る。例えば、モザイクキャプシドＡＡＶは、異なる血清型由来のウイルスキャプシドタンパク質の混合物で構成され得るビリオンである。キャプシドタンパク質は、様々な比率で混合された別々のプラスミドとの相補性によって提供され得る。ウイルスのアセンブリ中に、異なる血清型のキャプシドタンパク質は、補完するプラスミドの比を化学量論的に反映するサブユニットの比率で、各ビリオンで混合することができる。モザイクキャプシドは、特定の細胞タイプへの結合効率の増加、または未修飾キャプシドと比較した性能の向上を付与することができる。
【０１３３】
[00185]場合によっては、キメラキャプシドＡＡＶを生成することができる。キメラキャプシドは、キャプシド遺伝子のオープンリーディングフレームへの、別の野生型（ｗｔ）ＡＡＶ配列または無関係のタンパク質のいずれか由来の外来タンパク質配列の挿入を有することができる。キメラ修飾には、鋳型として天然に存在する血清型の使用が含まれ、これは、特定の機能を欠くＡＡＶキャプシド配列が別のキャプシドからのＤＮＡ配列と同時トランスフェクトされることを伴う。場合によって、キメラは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、およびＡＡＶ１２から選ばれるＡＡＶ血清型由来の少なくとも１つのキャップポリペプチドを含むことができる。場合によっては、ウイルスベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、およびＡＡＶ１２から選ばれるＡＡＶ血清型由来のＶＰ１を含むポリペプチドを含むことができる。他の場合では、ウイルスベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、およびＡＡＶ１２から選ばれるＡＡＶ血清型由来のＶＰ２を含むポリペプチドを含むことができる。さらに他の場合では、ウイルスベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、およびＡＡＶ１２から選ばれるＡＡＶ血清型由来のＶＰ３を含むポリペプチドを含むことができる。
【０１３４】
[00186]場合によっては、ウイルスベクターは、ＡＡＶ４とＡＡＶ６、ＡＡＶ５とＡＡＶ６、ＡＡＶ１１とＡＡＶ６、ＡＡＶ１２とＡＡＶ６、およびそれらの任意の組み合わせのキャプシドを有するキメラを含むことができる。場合によっては、第１のＡＡＶ血清型はＡＡＶ４であり、第２の血清型はＡＡＶ６であり得る。場合によっては、キメラＡＡＶベクターの第１のＡＡＶ血清型および第２のＡＡＶ血清型はＡＡＶ５およびＡＡＶ６であり得る。場合によっては、キメラＡＡＶベクターの第１のＡＡＶ血清型および第２のＡＡＶ血清型はＡＡＶ１１およびＡＡＶ６であり得る。場合によっては、キメラＡＡＶベクターの第１のＡＡＶ血清型および第２のＡＡＶ血清型はＡＡＶ１２およびＡＡＶ６であり得る。
【０１３５】
[00187]相同組換えは、クロスオーバーポイントで生じ、新しい機能および固有の特性を有するキャプシドをもたらす。他の場合では、遺伝子機能に影響を与えずに、ウイルスキャプシドの表面に新しいペプチドを露出しようとするために、キャプシドコード配列のＮまたはＣ末端のいずれかに融合したエピトープコード配列の使用。場合によっては、キャプシドコード配列の特定の位置に挿入されたエピトープ配列の使用であるが、エピトープをコード配列自体にタグ付けする異なるアプローチの使用を行うことができる。キメラなキャプシドはまた、キャプシドコード配列の特定の位置に挿入されたペプチドライブラリーから同定されたエピトープの使用を含むことができる。遺伝子ライブラリーを使用してスクリーニングを行うことができる。例えば、キメラまたは突然変異ＡＡＶのスクリーンを実施して、細胞を形質導入するために使用した場合、外因性受容体などの導入遺伝子の発現効率および／または発現の増加をもたらすキメラおよび突然変異体を同定することができる。ＡＡＶベクターのキメラキャプシドは、トランスフェクトされ得る細胞タイプの範囲を拡大し、形質導入の効率を増加させることができる。形質導入またはトランスフェクションの増加は、未修飾キャプシドを含むＡＡＶを使用した形質導入と比較して、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％の増加から約３００％までの増加であり得る。例えば、細胞上または細胞内に存在する（核酸またはポリペプチドとして）導入遺伝子の検出に関して、野生型ＡＡＶと比較して、増加した形質導入またはトランスフェクションを測定することができる。一部の実施形態では、２つの異なるＡＡＶ血清型のキメラキャプシドを含むＡＡＶは、キャプシドが由来する野生型ＡＡＶの一方または両方と比較して、形質導入効率が増加している。キメラキャプシドは、縮重、組換え、シャッフル、または他には修飾されたＣａｐタンパク質を含むことができる。例えば、ＶＰタンパク質のＮ末端での受容体特異的リガンドまたは一本鎖抗体の標的化挿入を行うことができる。Ｔ細胞の結合および感染を改善するために、ＡＡＶへのリンパ球抗体または標的の挿入を行うことができる。場合によっては、キメラキャプシド（例えば、変性または他には修飾Ｃａｐタンパク質を含むキャプシド）を有するビリオンを作製することができる。このようなビリオンのキャプシドをさらに変更するため、例えば、リンパ球などの特定の細胞タイプに対する結合親和性を増大または修飾するために、ビリオンのキャプシドに追加の突然変異を導入することができる。例えば、適切なキメラキャプシドは、特定の細胞タイプへのウイルス標的を促進するためのリガンド挿入突然変異を有する場合がある。挿入突然変異体、アラニンスクリーニング突然変異体、およびエピトープタグ突然変異体を含むＡＡＶキャプシド突然変異体の構築および特徴付けは、Ｗｕら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４巻：８６３５〜４５頁，２０００年に記載されている。ＡＡＶキャプシド突然変異体を作製する方法は公知であり、部位特異的突然変異誘発（Ｗｕら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２巻：５９１９〜５９２６頁）；分子育��、核酸、エクソン、およびＤＮＡファミリーシャッフリング（Ｓｏｏｎｇら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２５巻：４３６〜４３９頁，２０００年；Ｃｏｃｏら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２００１年；１９巻：３５４頁；米国特許第５，８３７，４５８；同第５，８１１，２３８号；同第６，１８０，４０６号；ＫｏｌｋｍａｎおよびＳｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９巻：４２３〜４２８頁，２００１年；Ｆｉｓｃｈら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ９３巻：７７６１〜７７６６頁，１９９６年；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７巻：２５９〜２６４頁，１９９９年）；リガンド挿入（Ｇｉｒｏｄら  Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９巻：１０５２〜１０５６頁，１９９９年）；カセット突然変異誘発（Ｒｕｅｄａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２６３巻：８９〜９９頁，１９９９年；Ｂｏｙｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６巻：１０３１〜１０３９頁，１９９２年）；および短いランダムオリゴヌクレオチド配列の挿入を含む。
【０１３６】
[00188]場合によっては、トランスキャプシド化を行うことができる。トランスキャプシド化は、ＡＡＶの１つの血清型のＩＴＲを異なる血清型のキャプシドにパッケージングするプロセスである。別の場合では、ＡＡＶキャプシド表面への受容体リガンドの吸着を行うことができ、ＡＡＶキャプシドの表面への外来ペプチドの付加であり得る。場合によっては、これにより、現在ＡＡＶ血清型が指向性を持たない細胞を特異的に標的とする能力が付与され、これは、遺伝子治療ツールとしてのＡＡＶの使用を大いに拡大する。
【０１３７】
[00189]場合によっては、ＡＡＶベクターを修飾することができる。例えば、ＡＡＶベクターは、挿入、欠失、化学的変更、または合成的修飾などの修飾を含むことができる。場合によっては、単一のヌクレオチドがＡＡＶベクターに挿入される。他の場合では、複数のヌクレオチドがベクターに挿入される。挿入され得るヌクレオチドは、約１ヌクレオチドから約５ｋｂの範囲であり得る。挿入することができるヌクレオチドは、機能性タンパク質をコードすることができる。挿入することができるヌクレオチドは、ベクターを受け取る対象にとって内因性であるかまたは外因性であり得る。例えば、ヒト細胞は、ＴＣＲの一部などのマウスゲノムの少なくとも一部を含むことができるＡＡＶベクターを受け入れることができる。場合によっては、ＡＡＶベクターの挿入または削除などの修飾は、ベクターのタンパク質コード領域または非コード領域を含むことができる。場合によっては、細胞に導入された場合、修飾によってベクターの活性が改善され得る。例えば、修飾は、ヒト細胞に導入された場合にベクターのタンパク質コード領域の発現を改善することができる。
【０１３８】
[00190]場合によっては、宿主細胞は、宿主細胞における新規なＡＡＶキャプシドタンパク質（またはその断片を含むキャプシドタンパク質）の発現を駆動する配列、およびＡＡＶ  ＩＴＲの供給源と同じ供給源、または相互補完する供給源のｒｅｐ配列を含み得る。ＡＡＶ  ｃａｐおよびｒｅｐ配列は、前記のようにＡＡＶ供給源から独立して得ることができ、前記のように当業者に公知である任意の方法で宿主細胞内に導入することができる。さらに、ＡＡＶベクターをシュードタイピングする場合、ｒｅｐタンパク質の各々をコードする配列は、異なるＡＡＶ供給源（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２）から供給することができる。場合によっては、宿主細胞は、適切なプロモーターの制御下でキャプシドタンパク質を安定して含む。他の場合では、キャプシドタンパク質は、誘導性プロモーターの制御下で発現され得る。別の実施形態では、キャプシドタンパク質をトランスで宿主細胞に供給することができる。トランスで宿主細胞に送達される場合、キャプシドタンパク質は、宿主細胞で選択されたキャプシドタンパク質の発現を指向するのに必要な配列を含むプラスミドを介して送達され得る。場合によっては、トランスで宿主細胞に送達される場合、キャプシドタンパク質を保有するプラスミドはまた、ＡＡＶのパッケージングに必要な他の配列、例えば、ｒｅｐ配列を保有する。場合によっては、ｒｅｐおよびｃａｐ配列を単一の核酸分子で宿主細胞にトランスフェクトし、エピソームとして細胞内に安定して存在させることができる。別の実施形態では、ｒｅｐおよびｃａｐ配列は、細胞の染色体に安定して組み込まれている。別の実施形態は、宿主細胞で一過的に発現されるｒｅｐおよびｃａｐ配列を有する。例えば、このようなトランスフェクションに有用な核酸分子は、５’から３’に、プロモーター、プロモーターとｒｅｐ遺伝子配列の開始部位との間に挿入される任意のスペーサー、ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子配列、およびＡＡＶキャップ遺伝子配列を含む。
【０１３９】
[00191]場合によっては、本開示は、ＡＡＶベクター（例えば、外因性受容体配列をコードするベクター）およびキメラなキャプシド（例えば、変性、再結合され、シャッフルされ、または他には修飾されたＣａｐタンパク質を含むキャプシド）で構成されるビリオンのストックを産生するためのＡＡＶ  ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質を提供するヘルパーベクターの構築を提供する。場合によっては、修飾は、修飾されるＡＡＶキャップ核酸、例えば、１より多いＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ血清型１〜１２）に由来する配列の部分を含むキャップ核酸の産生を伴うことができる。このようなキメラ核酸は、多数の突然変異誘発技術により産生され得る。キメラなキャップ遺伝子を生成する方法は、インビトロＤＮＡ増幅反応における縮重オリゴヌクレオチドの使用を伴うことができる。縮退突然変異（例えば、異なるＡＡＶ血清型からの多型）を核酸配列に組み込むためのプロトコールは、Ｃｏｃｏら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０巻：１２４６〜１２５０頁，２００２年）に記載されている。縮退ホモ二重鎖組換えとして公知であるこの方法では、遺伝子ファミリー内の遺伝子からの多型（縮重）を含む「トップ鎖」オリゴヌクレオチドが構築される。相補的縮重は、複数の架橋「足場」オリゴヌクレオチドに操作される。単一の一連のアニーリング、ギャップフィリング、および連結ステップにより、親の多型のあらゆる可能な順列を捕捉する核酸ライブラリーの産生がもたらされる。キャプシド遺伝子の任意の部分は、縮退ホモ二重鎖組換えなどの方法を使用して突然変異することができる。しかしながら、特定のキャプシド遺伝子配列が好ましい。例えば、ＡＡＶ２キャプシドのその細胞表面受容体ヘパリン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）への結合に関与する重要な残基がマッピングされている。５８５および５８８位のアルギニン残基は、これらの残基内の非保存的突然変異がヘパリン−アガロースへの結合を排除するため、結合にとって重要である。ＡＡＶ２およびＡＡＶ４原子構造のコンピューターモデリングにより、アルギニン残基５８５および５８８に重なり、キャプシド表面に露出する７つの超可変領域が特定された。これらの超可変領域は、受容体結合を媒介するキャプシド上の表面ループとして露出すると考えられている。したがって、これらのループは、ＷＴビリオンとは異なる指向性を有するキメラビリオンを産生させる方法における突然変異誘発の標的として使用することができる。
【０１４０】
[00192]場合によっては、新規のＡＡＶアミノ酸配列、ペプチドおよびタンパク質は、本明細書に記載されるＡＡＶ核酸配列から発現させることができる。さらに、これらのアミノ酸配列、ペプチドおよびタンパク質は、例えば、化学合成、他の合成技術、または他の方法を含む、当該技術分野において公知である他の方法によって生成することができる。本明細書に提供されるＡＡＶキャプシドのいずれかの配列は、様々な技術を使用して容易に生成することができる。適切な生成技術は、当業者に周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）を参照されたい。あるいは、ペプチドはまた、周知である固相ペプチド合成法（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５巻：２１４９頁（１９６２年）；ＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９６９年）２７〜６２頁）によって合成することができる。本明細書に記載される配列およびタンパク質は、組換え生成、化学合成、または他の合成手段を含む、任意の適切な手段によって生成することができる。このような生成方法は、当業者の知識の範囲内である。
【０１４１】
[00193]場合によっては、配列は、本明細書に記載されるＡＡＶキャプシドまたは修飾ＡＡＶベクターをコードすることができる。別の実施形態では、ベクターは、少なくとも、ＡＡＶ  ｒｅｐタンパク質またはその断片をコードする配列を含むことができる。任意選択的に、ベクターは、ＡＡＶ  ｃａｐとｒｅｐタンパク質の両方を含むことができる。ＡＡＶ  ｒｅｐとｃａｐの両方が提供されるベクターでは、ＡＡＶ  ｒｅｐおよびＡＡＶ  ｃａｐ配列は、同じクレードのＡＡＶに由来し得る。あるいは、本明細書では、ｒｅｐ配列が、ｃａｐ配列を提供しているものとは異なるＡＡＶ源由来であるベクターを提供することができる。一実施形態では、ｒｅｐおよびｃａｐ配列は、別個の供給源（例えば、別個のベクター、または宿主細胞およびベクター）から発現される。別の実施形態では、これらのｒｅｐ配列は、異なるＡＡＶ源のキャップ配列にインフレームで融合され、キメラなＡＡＶベクターを形成する。任意選択に、ベクターは、ＡＡＶキャプシドにパッケージされたベクターであり得る。本明細書に記載されるこれらのベクターおよび他のベクターは、ＡＡＶ  ５’ＩＴＲおよびＡＡＶ  ３’ＩＴＲに隣接する選択された導入遺伝子を含む導入遺伝子をさらに含むことができる。
【０１４２】
[00194]主題の突然変異ＡＡＶビリオンは、少なくとも１つのキャプシドタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３の少なくとも１つ）に突然変異を含むことができる。したがって、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３の少なくとも１つは、野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を有する。場合によっては、突然変異は、ＶＰ１とＶＰ２、ＶＰ１とＶＰ３、ＶＰ２とＶＰ３、またはＶＰ１とＶＰ２とＶＰ３で生じ得る。場合によっては、ＶＰを削除することができる。例えば、一部の実施形態では、突然変異ＡＡＶは、ＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３の少なくとも１つを含まない。場合によっては、ＶＰ１領域の突然変異は、ＦからＬへの突然変異であり得る。場合によっては、ＶＰ１領域の突然変異は、前記ＡＡＶヌクレオチド配列によってコードされるＡＡＶ  ＶＰ１ポリペプチド配列の１２９位にあり得る。場合によっては、ＶＰ２および／またはＶＰ３領域は、任意の数の突然変異を有することができる。ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３領域には、ＨからＮ、ＤからＮ、ＤからＮ、ＶからＬ、およびＶからＩを含み得る突然変異を有することができる。キャプシドの突然変異は、前記ＡＡＶヌクレオチド配列によってコードされるＡＡＶポリペプチド配列の４１８、４６２。５８４、５９８、または６４２位で生じ得る。任意の数の突然変異は、ＡＡＶキャプシドタンパク質またはその一部に対して行われ得る。場合によっては、突然変異は、Ｆ１２９Ｌ、Ｈ６４２Ｎ、およびＤ４１８Ｎの少なくとも１つを含み得る。場合によっては、突然変異は、Ｆ１２９Ｌ、Ｈ６４２Ｎ、およびＬ５８４Ｎの少なくとも１つを含み得る。場合によっては、突然変異は、Ｆ１２９Ｌ、Ｈ４６２Ｎ、またはＶ５９８Ｌを含み得る。場合によっては、配列番号２０のポリペプチド、または配列番号２０の断片をコードする核酸において、前記の突然変異のいずれかを単独でまたは組み合わせて作製することができる。同様に、前記の突然変異のいずれも、配列番号２０に整列する位置で、配列番号２１〜２４のいずれか１つをコードする核酸において、単独でまたは組み合わせて作製され得る。
【０１４３】
[00195]場合によっては、突然変異は、Ｆ１２９Ｌ、Ｈ４６２Ｎ、またはＶ５９８Ｉの少なくとも１つを含むことができる。ＡＡＶキャプシドの突然変異は、追加の場所で生じる場合がある。例えば、ＡＡＶキャプシドの突然変異は、ポリペプチドまたはヌクレオチド配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８��３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、５０７、５０８、５０９、５１０、５１１、５１２、５１３、５１４、５１５、５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６、５６７、５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６００、６０１、６０２、６０３、６０４、６０５、６０６、６０７、６０８、６０９、６１０、６１１、６１２、６１３、６１４、６１５、６１６、６１７、６１８、６１９、６２０、６２１、６２２、６２３、６２４、６２５、６２６、６２７、６２８、６２９、６３０、６３１、６３２、６３３、６３４、６３５、６３６、６３７、６３８、６３９、６４０、６４１、６４２、６４３、６４４、６４５、６４６、６４７、６４８、６４９、６５０、６５１、６５２、６５３、６５４、６５５、６５６、６５７、６５８、６５９、６６０、６６１、６６２、６６３、６６４、６６５、６６６、６６７、６６８、６６９、６７０、６７１、６７２、６７３、６７４、６７５、６７６、６７７、６７８、６７９、��８０、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、６８６、６８７、６８８、６８９、６９０、６９１、６９２、６９３、６９４、６９５、６９６、６９７、６９８、６９９、７００、７０１、７０２、７０３、７０４、７０５、７０６、７０７、７０８、７０９、７１０、７１１、７１２、７１３、７１４、７１５、７１６、７１７、７１８、７１９、７２０、７２１、７２２、７２３、７２４、７２５、７２６、７２７、７２８、７２９、７３０、７３１、７３２、７３３、７３４、７３５、または最大７３６位で、およびその任意の組み合わせで生じ得る。ＡＡＶキャプシドの突然変異は、キャプシドタンパク質の開始場所を参照して行うことができる。ＡＡＶキャプシドは、キャップ遺伝子によってコードされる３つのポリペプチド（例えば、ＡＡＶ６のＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３）を含む。したがって、ＶＰ１ポリペプチドは、ＶＰ２およびＶＰ３領域を含むと言うことができる。これらの３つのポリペプチドは、ｃａｐ遺伝子から転写されたｍＲＮＡからの選択的スプライシングによって形成される。本明細書で使用するとき、特定の位置への言及は、ＶＰ１キャプシドタンパク質に関する。当業者は、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３のうちの２つ以上をコードする位置で突然変異が行われた場合、その位置にアミノ酸を含む得られたポリペプチドの各々にこの突然変異が存在することを理解する。当業者はまた、本明細書に記載される突然変異が、その血清型のキャプシドの対応する位置で、本明細書に記載される選択された血清型のＡＡＶにおいて作製され得ることを認識する。
【０１４４】
[00196]場合によっては、突然変異は、前述のＡＡＶキャプシド位置のいずれかで生じ得、任意の数の突然変異を含み得る。場合によっては、突然変異は、あるアミノ酸から別のアミノ酸への場合がある。標準アミノ酸の任意の組み合わせまたは順列を行うことができる。ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３のいずれかで、次のアミノ酸修飾：ＡからＲ、ＡからＮ、ＡからＤ、ＡからＣ、ＡからＱ、ＡからＥ、ＡからＧ、ＡからＨ、ＡからＩ、ＡからＬ、ＡからＫ、ＡからＭ、ＡからＦ、ＡからＰ、ＡからＳ、ＡからＴ、ＡからＷ、ＡからＹ、ＡからＶ、ＲからＮ、ＲからＤ、ＲからＣ、ＲからＱ、ＲからＥ、ＲからＧ、ＲからＨ、ＲからＩ、ＲからＬ、ＲからＫ、ＲからＭ、ＲからＦ、ＲからＰ、ＲからＳ、ＲからＴ、ＲからＷ、ＲからＹ、ＲからＶ、ＮからＤ、ＮからＣ、ＮからＱ、ＮからＥ、ＮからＧ、ＮからＨ、ＮからＩ、ＮからＬ、ＮからＫ、ＮからＭ、ＮからＦ、ＮからＰ、ＮからＳ、ＮからＴ、ＮからＷ、ＮからＹ、ＮからＶ、ＤからＣ、ＤからＱ、ＤからＥ、ＤからＧ、ＤからＨ、ＤからＩ、ＤからＬ、ＤからＫ、ＤからＭ、ＤからＦ、ＤからＰ、ＤからＳ、ＤからＴ、ＤからＷ、ＤからＹ、ＤからＶ、ＣからＱ、ＣからＥ、ＣからＧ、ＣからＨ、ＣからＩ、ＣからＬ、ＣからＫ、ＣからＭ、ＣからＦ、ＣからＰ、ＣからＳ、ＣからＴ、ＣからＷ、ＣからＹ、ＣからＶ、ＱからＥ、ＱからＧ、ＱからＨ、ＱからＩ、ＱからＬ、ＱからＫ、ＱからＭ、ＱからＦ、ＱからＰ、ＱからＳ、ＱからＴ、ＱからＷ、ＱからＹ、ＱからＶ、ＥからＧ、ＥからＨ、ＥからＩ、ＥからＬ、ＥからＫ、ＥからＭ、ＥからＦ、ＥからＰ、ＥからＳ、ＥからＴ、ＥからＷ、ＥからＹ、ＥからＶ、ＧからＨ、ＧからＩ、ＧからＬ、ＧからＫ、ＧからＭ、ＧからＦ、ＧからＰ、ＧからＳ、ＧからＴ、ＧからＷ、ＧからＹ、ＧからＶ、ＨからＩ、ＨからＬ、ＨからＫ、ＨからＭ、ＨからＦ、ＨからＰ、ＨからＳ、ＨからＴ、ＨからＷ、ＨからＹ、ＨからＶ、ＩからＬ、ＩからＫ、ＩからＭ、ＩからＦ、ＩからＰ、ＩからＳ、ＩからＴ、ＩからＷ、ＩからＹ、ＩからＶ、ＬからＫ、ＬからＭ、ＬからＦ、ＬからＰ、ＬからＳ、ＬからＴ、ＬからＷ、ＬからＹ、ＬからＶ、ＫからＭ、ＫからＦ、ＫからＰ、ＫからＳ、ＫからＴ、ＫからＷ、ＫからＹ、ＫからＶ、ＭからＦ、ＭからＰ、ＭからＳ、ＭからＴ、ＭからＷ、ＭからＹ、ＭからＶ、ＦからＰ、ＦからＳ、ＦからＴ、ＦからＷ、ＦからＹ、ＦからＶ、ＰからＳ、ＰからＴ、ＰからＷ、ＰからＹ、ＰからＶ、ＳからＴ、ＳからＷ、ＳからＹ、ＳからＶ、ＴからＷ、ＴからＹ、ＴからＶ、ＷからＹ、ＷからＶ、ＹからＶ、のいずれか、および先に記載した突然変異の逆のいずれかを行うことができる。
【０１４５】
[00197]突然変異は、保存的突然変異または置換であり得る。例えば、２０個の天然に存在するアミノ酸は、同様の特徴を共有し得る。脂肪族アミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、またはイソロイシンであり得る。ヒドロキシルまたは硫黄／セレン含有アミノ酸は、セリン、システイン、セレノシステイン、スレオニン、またはメチオニンであり得る。環状アミノ酸はプロリンであり得る。芳香族アミノ酸は、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンであり得る。塩基性アミノ酸は、ヒスチジン、リジン、およびアルギニンであり得る。酸性アミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、またはグルタミンであり得る。保存的突然変異は、セリンからグリシン、セリンからアラニン、セリンからセリン、セリンからスレオニン、セリンからプロリンであり得る。保存的突然変異は、アルギニンからアスパラギン、アルギニンからリジン、アルギニンからグルタミン、アルギニンからアルギニン、アルギニンからヒスチジンであり得る。保存的突然変異は、ロイシンからフェニルアラニン、ロイシンからイソロイシン、ロイシンからバリン、ロイシンからロイシン、ロイシンからメチオニンであり得る。保存的突然変異は、プロリンからグリシン、プロリンからアラニン、プロリンからセリン、プロリンからスレオニン、プロリンからプロリンであり得る。保存的突然変異は、スレオニンからグリシン、スレオニンからアラニン、スレオニンからセリン、スレオニンからスレオニン、スレオニンからプロリンであり得る。保存的突然変異は、アラニンからグリシン、アラニンからスレオニン、アラニンからプロリン、アラニンからアラニン、アラニンからセリンであり得る。保存的突然変異は、バリンからメチオニン、バリンからフェニルアラニン、バリンからイソロイシン、バリンからロイシン、バリンからバリンであり得る。保存的突然変異は、グリシンからアラニン、グリシンからスレオニン、グリシンからプロリン、グリシンからセリン、グリシンからグリシンであり得る。保存的突然変異は、イソロイシンからフェニルアラニン、イソロイシンからイソロイシン、イソロイシンからバリン、イソロイシンからロイシン、イソロイシンからメチオニンであり得る。保存的突然変異は、フェニルアラニンからトリプトファン、フェニルアラニンからフェニルアラニン、フェニルアラニンからチロシンであり得る。保存的突然変異は、チロシンからトリプトファン、チロシンからフェニルアラニン、チロシンからチロシンであり得る。保存的突然変異は、システインからセリン、システインからスレオニン、システインからシステインであり得る。保存的突然変異は、ヒスチジンからアスパラギン、ヒスチジンからリジン、ヒスチジンからグルタミン、ヒスチジンからアルギニン、ヒスチジンからヒスチジンであり得る。保存的突然変異は、グルタミンからグルタミン酸、グルタミンからアスパラギン、グルタミンからアスパラギン酸、グルタミンからグルタミンであり得る。保存的突然変異は、アスパラギンからグルタミン酸、アスパラギンからアスパラギン、アスパラギンからアスパラギン酸、アスパラギンからグルタミンであり得る。保存的突然変異は、リジンからアスパラギン、��ジンからリジン、リジンからグルタミン、リジンからアルギニン、リジンからヒスチジンであり得る。保存的突然変異は、アスパラギン酸からグルタミン酸、アスパラギン酸からアスパラギン、アスパラギン酸からアスパラギン酸、アスパラギン酸からグルタミンであり得る。保存的突然変異は、グルタミンからグルタミン、グルタミンからアスパラギン、グルタミンからアスパラギン酸、グルタミンからグルタミンであり得る。保存的突然変異は、メチオニンからフェニルアラニン、メチオニンからイソロイシン、メチオニンからバリン、メチオニンからロイシン、メチオニンからメチオニンであり得る。保存的突然変異は、トリプトファンからトリプトファン、トリプトファンからフェニルアラニン、トリプトファンからチロシンであり得る。
【０１４６】
[00198]一部の実施形態では、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３の少なくとも１つは、野生型ＡＡＶ  ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３と比較して、１から約２５のアミノ酸置換、例えば、野生型ＡＡＶ  ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３と比較して、約１から約５、約５から約１０、約１０から約１５、約１５から約２０、または約２０から約２５のアミノ酸置換を有する。場合によっては、突然変異ＡＡＶビリオンは、キャプシド配列などのＡＡＶ配列の少なくとも一部において、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８から最大１００個の突然変異を有することができる。キャプシド配列の突然変異は、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３のいずれか、またはそれらの組み合わせ内にあり得る。場合によっては、突然変異ＡＡＶ変異体は、キャプシド配列に１つの突然変異を有することができる。場合によっては、突然変異ＡＡＶ変異体は、キャプシド配列に２つの突然変異を有することができる。場合によっては、突然変異ＡＡＶ変異体は、キャプシド配列に３つの突然変異を有することができる。あるいは、主題の突然変異ＡＡＶビリオンは、野生型キャプシドタンパク質と比較して、少なくとも１つのキャプシドタンパク質に１つ以上のアミノ酸欠失および／または挿入を含む。一部の実施形態では、主題の突然変異ＡＡＶビリオンは、野生型キャプシドタンパク質と比較して、キャプシドタンパク質に１つ以上のアミノ酸置換および／または欠失および／または挿入を含む。場合によっては、突然変異は点突然変異であり得る。場合によっては、ＡＡＶの少なくとも一部を突然変異させることができる。例えば、ＡＡＶのキャプシドは、点突然変異、ミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異、挿入、欠失、複製、フレームシフト、または反復伸長などの突然変異を有することができる。
【０１４７】
[00199]場合によっては、ＷＴ  ＡＡＶ  ｃａｐ遺伝子に関連する１つ以上の突然変異を含む突然変異ＡＡＶライブラリーを生成することができる。ＷＴ  ｃａｐ遺伝子は、配列番号５５に記載されるヌクレオチド配列を含むキャップであり得る。ＡＡＶ  ｃａｐ遺伝子の突然変異は、任意の公知の方法を使用して生成される。スターターＡＡＶ  ｃａｐ遺伝子の突然変異誘発に適した方法には、限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ベースの方法、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、飽和突然変異誘発、ループ交換突然変異誘発、断片シャッフリング突然変異誘発（すなわち、ＤＮＡシャッフリング）などが含まれる。突然変異を生じさせる方法は、当該技術分野において十分に説明されている。例えば、Ｚｈａｏら，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９８年５月；１６巻（３号）：２３４〜５頁；Ｋｏｅｒｂｅｒら，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００８年１０月；１６巻（１０号）：１７０３〜９頁；Ｋｏｅｒｂｅｒら，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００９年１２月；１７巻（１２号）：２０８８〜９５頁；米国特許第６，５７９，６７８号；米国特許第６，５７３，０９８号；および米国特許第６，５８２，９１４号を参照されたい。これらはすべて、突然変異誘発に関連するそれらの教示のために参照により本明細書に組み込まれる。ライブラリーが生成されると、特定のビリオンの特性（すなわち、感染の特性の変更、またはトランスフェクションもしくは形質導入効率の増加）のためにライブラリーを選択することができる。ウイルス粒子が生成され（したがって、修飾ＡＡＶビリオンのライブラリーが生成される）、ＷＴ  ＡＡＶと比較して感染特性が変更した修飾ＡＡＶビリオンを特定するために、１つ以上の選択ステップに供される。選択される感染の特性には、限定されないが、以下が含まれる：１）ＡＡＶ中和抗体への結合の変更（例えば、結合の減少）；２）ＡＡＶ中和抗体の回避の増加；３）ＡＡＶの感染に耐性のある細胞の感染性の増加；および４）形質導入細胞における導入遺伝子発現の増加。場合によっては、修飾ＡＡＶは、修飾されていない細胞と比較して、トランスフェクション、形質導入、または感染機能を増加することができる。例えば、修飾ＡＡＶベクトルは、同等のＷＴ  ＡＡＶベクターと比較して、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８から最大約１００％機能し得る。場合によっては、突然変異されたまたはキメラなＡＡＶベクターは、トランスフェクトまたは形質導入された細胞における導入遺伝子の発現率により測定した場合、ＷＴ  ＡＡＶベクターの１００％以上で機能し得る。���えば、トランスフェクトまたは形質導入された細胞は、同等の導入遺伝子をコードするＷＴ  ＡＡＶベクターでトランスフェクトまたは形質導入された同等の細胞の１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、または最大約５０００％機能し得る。
【０１４８】
[00200]場合によっては、キャップ遺伝子に突然変異を含む突然変異ＡＡＶライブラリーは、互い違いの伸長プロセスを使用して生成させることができる。互い違いの伸長プロセスは、ＰＣＲベースの方法を用いたｃａｐ遺伝子の増幅を伴うことができる。特定のＰＣＲプライマーを使用して鋳型キャップ遺伝子をプライミングし、その後、変性および非常に短いアニーリング／ポリメラーゼ触媒伸長のサイクルを繰り返すことができる。各サイクルでは、成長する断片は、配列相補性に基づいて異なる鋳型にアニーリングし、さらに伸長する。変性、アニーリング、伸長のサイクルは、全長の配列が形成されるまで繰り返される。得られた全長配列は、野生型ＡＡＶキャップ遺伝子と比較して、キャップ遺伝子に少なくとも１つの突然変異を含む。
【０１４９】
[00201]場合によっては、修飾は、ＡＡＶ血清型６キャプシドのものであり得る。キャプシドへの修飾は、キャプシド配列内の一重、二重、または三重突然変異であり得る。場合によっては、主題の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質（または主題の核酸によってコードされる変異ＡＡＶキャプシドタンパク質）は、表１の核酸、配列番号１〜配列番号１９、またはタンパク質配列、配列番号２６７〜配列番号２８５のいずれか１つに対して、約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５  ％、７０％、７５％、８０％、８５％９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または最大１００％の相同性を含むことができる。場合によっては、対象の突然変異または変異されたベクターは、表１２に開示される配列、配列番号１９５〜配列番号２１３のいずれかに対して、約１０％、１５％、２０％、２５％、３０のいずれか１つに対する相同性を含むことができる％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５  ％、９６％、９７％、９８％、９９％または最大１００％の相同性を含むことができる。
【０１５０】
【表１−１】
2020530307.tif 000003
【０１５１】
【表１−１−１】
2020530307.tif 000004
【０１５２】
【表１−２】
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【０１５３】
【表１−２−１】
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【０１５４】
【表１−３】
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【０１５５】
【表１−４】
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【０１５６】
【表１−４−１】
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【０１５７】
【表１−５】
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【０１５８】
【表１−５−１】
2020530307.tif 000011
【０１５９】
【表１−６】
2020530307.tif 000012
【０１６０】
【表１−６−１】
2020530307.tif 000013
【０１６１】
【表１−７】
2020530307.tif 000014
【０１６２】
【表１−８】
2020530307.tif 000015
【０１６３】
【表１−８−１】
2020530307.tif 000016
【０１６４】
【表１−９】
2020530307.tif 000017
【０１６５】
【表１−９−１】
2020530307.tif 000018
【０１６６】
【表１−１０】
2020530307.tif 000019
【０１６７】
【表１−１０−１】
2020530307.tif 000020
【０１６８】
【表１−１１】
2020530307.tif 000021
【０１６９】
【表１−１２】
2020530307.tif 000022
【０１７０】
【表１−１２−１】
2020530307.tif 000023
【０１７１】
【表１−１３】
2020530307.tif 000024
【０１７２】
【表１−１３−１】
2020530307.tif 000025
【０１７３】
【表１−１４】
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【０１７４】
【表１−１４−１】
2020530307.tif 000027
【０１７５】
【表１−１５】
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【０１７６】
【表１−１６】
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【０１７７】
【表１−１６−１】
2020530307.tif 000030
【０１７８】
【表１−１７】
2020530307.tif 000031
【０１７９】
【表１−１７−１】
2020530307.tif 000032
【０１８０】
【表１−１８】
2020530307.tif 000033
【０１８１】
【表１−１８−１】
2020530307.tif 000034
【０１８２】
【表１−１９】
2020530307.tif 000035
【０１８３】
【表１−２０】
2020530307.tif 000036
【０１８４】
【表１−２０−１】
2020530307.tif 000037
【０１８５】
【表１−２１】
2020530307.tif 000038
【０１８６】
【表１−２１−１】
2020530307.tif 000039
【０１８７】
【表１−２２】
2020530307.tif 000040
【０１８８】
【表１−２２−１】
2020530307.tif 000041
【０１８９】
【表１−２３】
2020530307.tif 000042
【０１９０】
【表１−２４】
2020530307.tif 000043
【０１９１】
【表１−２４−１】
2020530307.tif 000044
【０１９２】
【表１−２５】
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【０１９３】
【表１−２５−１】
2020530307.tif 000046
【０１９４】
【表１−２６】
2020530307.tif 000047
【０１９５】
[00202]場合によっては、修飾は、ＡＡＶ血清型６キャプシドのものであり得る。場合によっては、ＡＡＶキャプシドタンパク質は、突然変異されまたは他には修飾され得る。突然変異させることができるＡＡＶキャプシドタンパク質は、表２のウイルス血清型のいずれか１つであり得る。修飾ＡＡＶキャプシドは、配列番号２０〜配列番号２４のタンパク質配列、または配列番号２８６〜配列番号２９０の核酸配列のいずれか１つに対して、約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０から％、７５％、８０％、８５％９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または最大１００％の相同性を含むことができる。場合によっては、ＷＴ  ＡＡＶまたは対照ＡＡＶは、配列番号２０〜配列番号２４のタンパク質配列、または配列番号２８６〜配列番号２９０の核酸配列のいずれか１つに対して、約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％９０から％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または最大１００％の相同性を含むことができる。場合によっては、主題の突然変異または修飾されたベクターは、表１３に開示される配列、配列番号２１４〜配列番号２２０のいずれか１つに対して、約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または最大１００％の相同性を含むことができる。
【０１９６】
【表２−１】
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【０１９７】
【表２−２】
2020530307.tif 000049
【０１９８】
【表２−３】
2020530307.tif 000050
【０１９９】
【表２−４】
2020530307.tif 000051
【０２００】
【表２−５】
2020530307.tif 000052
【０２０１】
【表２−６】
2020530307.tif 000053
【０２０２】
【表２−７】
2020530307.tif 000054
【０２０３】
【表２−８】
2020530307.tif 000055
【０２０４】
【表２−９】
2020530307.tif 000056
【０２０５】
【表２−１０】
2020530307.tif 000057
【０２０６】
[00203]場合によっては、修飾は、ＡＡＶ血清型６キャプシドのものであり得る。場合によっては、主題の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質（または主題の核酸によってコードされる突然変異ＡＡＶキャプシドタンパク質）は、表３におけるタンパク、配列番号２５〜配列番号３２、または核酸配列、配列番号２９１〜配列番号２９７のいずれか１つに対して、約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または最大１００％の相同性を含むことができる。
【０２０７】
【表３−１】
2020530307.tif 000058
【０２０８】
【表３−２】
2020530307.tif 000059
【０２０９】
【表３−３】
2020530307.tif 000060
【０２１０】
【表３−４】
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【０２１１】
【表３−５】
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【０２１２】
【表３−６】
2020530307.tif 000063
【０２１３】
【表３−７】
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【０２１４】
【表３−８】
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【０２１５】
【表３−９】
2020530307.tif 000066
【０２１６】
【表３−１０】
2020530307.tif 000067
【０２１７】
【表３−１１】
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【０２１８】
【表３−１２】
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【０２１９】
【表３−１３】
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【０２２０】
【表３−１４】
2020530307.tif 000071
【０２２１】
【表３−１５】
2020530307.tif 000072
【０２２２】
[00204]単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）核酸配列は、ＡＡＶキャプシド核酸配列の対応するポリペプチド配列に突然変異Ｆ１２９ＬおよびＨ６４２Ｎをコードすることができる。単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）核酸配列は、ＡＡＶキャプシド核酸配列の対応するポリペプチド配列に突然変異Ｆ１２９ＬおよびＬ５８４Ｄを有することができる。単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）核酸配列は、ＡＡＶキャプシド核酸配列の対応するポリペプチド配列に突然変異Ｆ１２９ＬおよびＤ４１８Ｎを有することができる。単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）核酸配列は、ＡＡＶキャプシド核酸配列の対応するポリペプチド配列に突然変異Ｆ１２９ＬおよびＬ５８４Ｈを有することができる。単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）核酸配列は、ＡＡＶキャプシド核酸配列の対応するポリペプチド配列に突然変異Ｆ１２９Ｌ、Ｈ６４２Ｎ、およびＤ４１８Ｎを有することができる。単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）核酸配列は、ＡＡＶキャプシド核酸配列の対応するポリペプチド配列に突然変異Ｆ１２９Ｌ、Ｈ６４２Ｎ、およびＬ５８４Ｄを有することができる。単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）核酸配列は、ＡＡＶキャプシド核酸配列の対応するポリペプチド配列に突然変異Ｆ１２９Ｌ、Ｈ６４２Ｎ、およびＬ５８４Ｎを有することができる。単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）核酸配列は、ＡＡＶキャプシド核酸配列の対応するポリペプチド配列に突然変異Ｆ１２９Ｌ、Ｈ６４２ＮおよびＬ５８４Ｈを有することができる。単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）核酸配列は、ＡＡＶキャプシド核酸配列の対応するポリペプチド配列に突然変異Ｆ１２９Ｌ、Ｈ６４２Ｎ、およびＶ５９８Ｌを有することができる。単離および精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）核酸配列は、ＡＡＶキャプシド核酸配列の対応するポリペプチド配列に突然変異Ｆ１２９Ｌ、Ｈ６４２Ｎ、およびＶ５９８Ｉを有することができる。
【０２２３】
[00205]本発明の方法で使用することができる別の突然変異誘発技術は、ＤＮＡシャッフリングである。ＤＮＡまたは遺伝子シャッフリングは、遺伝子ファミリーのメンバーのランダム断片の作製、および多数の新しい組み合わせを生成するためのそれらの組換えを伴う。ＡＡＶキャプシド遺伝子をシャッフルするために、３つのキャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３の関与、および８つの血清型間の異なる程度の相同性を含むいくつかのパラメータを考慮することができる。細胞または組織特異的な指向性を有する実施可能なＡＡＶベクターを取得する可能性を高めるために、例えば、高い多様性および多数の順列を生じさせるシャッフルプロトコールが好ましい。キメラＡＡＶを生成するためのＤＮＡシャッフリングプロトコールの例は、一過性鋳型上のランダムキメラ化（ＲＡＣＨＩＴＴ）、Ｃｏｃｏら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９巻：３５４〜３５８頁，２００１年である。ＲＡＣＨＩＴＴ法を使用して、２つの異なる血清型（例えば、ＡＡＶ  ５ｄ  ＡＡＶ６）のＡＡＶゲノムに由来する２つのＰＣＲ断片を組換えることができる。例えば、ｃａｐ遺伝子の保存領域、８５％同一であり、約１ｋｂｐにわたる３つの遺伝子すべて（ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３）の開始コドンを含むセグメントは、ＲＡＴＣＨＩＴＴまたは他のＤＮＡシャッフリングプロトコール、例えば、インビトロシャッフリングプロトコール（米国特許第５，０９３，２５７号；Ｖｏｌｋｏｖら，ＮＡＲ  ２７：ｅ１８，１９９９年；およびＷａｎｇ  Ｐ．Ｌ．，Ｄｉｓ．Ｍａｒｋｅｒｓ  １６巻：３〜１３頁，２０００年）を使用してシャッフルすることができる。得られたコンビナトリアルキメラライブラリーを適切なＡＡＶ  ＴＲ含有ベクターにクローニングして、ＷＴ  ＡＡＶゲノムの各断片を置き換えることができる。Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  ７  ＳｕｉｔｅソフトウェアのＡｌｉｇｎＸアプリケーションを使用して、ランダムクローンを配列決定し、親ゲノムと整列させることができる。配列決定およびアラインメントから、１Ｋｂｐ遺伝子あたりの組換えクロスオーバー数を決定することができる。あるいは、本発明の方法を使用して、ＡＡＶゲノムの可変ドメインをシャッフルすることができる。例えば、ＶＰ３に粒子表面ループを形成する可能性が高いＡＡＶの２つのアミノ酸クラスター（アミノ酸５０９〜５２２および５６１〜５９１）内で突然変異を生成させることができる。この低相同性ドメインをシャッフルするために、親の相同性とは独立した組換えプロトコール（Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７巻：１２０５〜１２０９頁，１９９９年；Ｌｕｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ９８巻：１１２４８〜−１１２５３頁，２００１年；およびＬｕｔｚら，ＮＡＲ  ２９：Ｅ１６，２００１年）、または低い相同性のＤＮＡ断片をアニーリングおよび再結合するように修飾されたＲＡＣＨＩＴＴプロトコールを利用することができる。
【０２２４】
[00206]場合によっては、ＡＡＶキャプシド上のＳ／Ｔ／Ｋ残基の標的突然変異を行うことができる。受容体を介したエンドサイトーシスによるＡＡＶの細胞内在化後、ＡＡＶは、サイトゾルを通過し、エンドソームで酸性化されてから放出される。エンドソーム脱出後、ＡＡＶは核輸送を受け、そこではウイルスキャプシドの非コーティングが解除され、そのゲノムの放出および遺伝子発現の誘導がもたらされる。Ｓ／Ｔ／Ｋ残基は、リン酸化とそれに続くポリユビキチン化の潜在的な部位であり、キャプシドタンパク質のプロテアソーム分解の合図として機能する。これは、ベクターの核への輸送を妨げ、その導入遺伝子、外因性ＴＣＲを発現させ、低い遺伝子発現をもたらすことができる。また、プロテアソームで分解されたキャプシド断片は、ＣＤ８  Ｔ細胞認識のために、細胞表面のＭＨＣクラスＩ分子によって提示され得る。これは、免疫応答が生じさせ、したがって、形質導入細胞が破壊され、持続的な導入遺伝子の発現をさらに低下させる。Ｓ／ＴからＡ、およびＫからＲへの点突然変異は、キャプシド上のリン酸化部位を防止／減少させることができる。これは、ユビキチン化およびプロテオソーム分解の減少をもたらし、より多数の無傷のベクターが核に入り、導入遺伝子を発現させることができるようにする。全体的なキャプシド分解の防止／減少はまた、Ｔ細胞への抗原提示を減少させ、ベクターに対する宿主免疫応答の低下をもたらす。
【０２２５】
[00207]場合によっては、操作されたＡＡＶには、代替の血清型由来の外因性配列が含まれ得る。例えば、少なくとも２つの異なるＡＡＶ血清型由来の配列を含むことができるキメラＡＡＶを生成することができる。「血清型」という用語は、血清学的に他のＡＡＶ血清型とは異なるキャプシドを有するＡＡＶに対して区別となり得る。血清学的特徴は、他のＡＡＶと比較して、ＡＡＶに対する抗体間の交差反応性の欠如に基づいて決定することができる。交差反応性は、中和抗体アッセイで測定することができる。このアッセイでは、アデノ随伴ウイルスを使用して、ウサギまたは他の適切な動物モデルにおける特定のＡＡＶに対してポリクローナル血清を生成させることができる。次に、このアッセイでは、特定のＡＡＶに対して生成された血清は、同じ（同種）または異種のＡＡＶを中和する能力において試験され得る。５０％の中和を達成する希釈は、中和抗体力価とみなされる。２つのＡＡＶについて、異種力価を同種力価で割った商が逆数をとって１６を下回った場合、これらの２つのベクターは同じ血清型とみなされる。反対に、同種の力価に対する異種の力価の比が逆数をとって１６以上である場合、２つのＡＡＶは異なる血清型とみなされる。
【０２２６】
[00208]場合によっては、修飾は、ＡＡＶ血清型６キャプシドのものであり得る。場合によっては、主題の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質（または主題の核酸によってコードされる変異ＡＡＶキャプシドタンパク質）は、表４における核酸配列および／またはそれからコードされるタンパク質配列、配列番号３８〜の核酸配列４５のいずれか１つに対して、約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％から、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または最大１００％の相同性を含むことができる。
【０２２７】
【表４−１】
2020530307.tif 000073
【０２２８】
【表４−２】
2020530307.tif 000074
【０２２９】
【表４−３】
2020530307.tif 000075
【０２３０】
【表４−４】
2020530307.tif 000076
【０２３１】
【表４−５】
2020530307.tif 000077
【０２３２】
【表４−６】
2020530307.tif 000078
【０２３３】
【表４−７】
2020530307.tif 000079
【０２３４】
【表４−８】
2020530307.tif 000080
【０２３５】
[00209]場合によっては、修飾は、ＡＡＶ血清型６キャプシドのものであり得る。場合によっては、主題の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質（または主題のアミノ酸によってコードされる変異ＡＡＶキャプシドタンパク質）は、表５のタンパク質または核酸配列のいずれか１つに対して、約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または最大１００％の相同性を含むことができる。
【０２３６】
【表５−１】
2020530307.tif 000081
【０２３７】
【表５−１−１】
2020530307.tif 000082
【０２３８】
【表５−２】
2020530307.tif 000083
【０２３９】
【表５−２−１】
2020530307.tif 000084
【０２４０】
【表５−３】
2020530307.tif 000085
【０２４１】
【表５−３−１】
2020530307.tif 000086
【０２４２】
【表５−４】
2020530307.tif 000087
【０２４３】
【表５−４−１】
2020530307.tif 000088
【０２４４】
【表５−５】
2020530307.tif 000089
【０２４５】
【表５−６】
2020530307.tif 000090
【０２４６】
[00210]場合によっては、タンパク質は、前記で特定したヌクレオチド配列によってコードされるＡＡＶキャプシドタンパク質を含むことができる。ＡＡＶキャプシドは、３つのタンパク質、ｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３で構成され得、これらは、代替スプライス変異体であり得る。キャプシドタンパク質の他の望ましい断片には、超可変領域（ＨＶＲ）間に位置する定常領域および可変領域が含まれる。場合によっては、キャプシドタンパク質の断片には、ＨＶＲ自体が含まれる。
【０２４７】
[00211]一部の態様では、ＡＡＶ  ＩＴＲに隣接する目的のヌクレオチド配列を含むＡＡＶベクターは、異種配列をＡＡＶベクターに直接挿入することにより構築することができる。これらの構築物は、当該技術分野において周知である技術を用いて設計することができる。例えば、Ｃａｒｔｅｒ  Ｂ．，Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３巻：５３３〜５３９頁（１９９２年）；およびＫｏｔｉｎ  ＲＭ，Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ａｓ  ａ  ｖｅｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ５巻：７９３〜８０１頁（１９９４年）を参照されたい。
【０２４８】
[00212]一部の実施形態では、ＡＡＶ発現ベクターは、治療効果を有する導入遺伝子などの目的の異種核酸配列を含む。ＡＡＶビリオンは、当該技術分野において周知である方法を用いて構築することができる。例えば、Ｋｏｅｒｂｅｒら（２００９年）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７巻：２０８８頁；Ｋｏｅｒｂｅｒら（２００８年）Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．１６巻：１７０３〜１７０９頁；米国特許第７，４３９，０６５号および同第６，４９１，９０７号を参照されたい。例えば、外因性または異種配列（複数可）をＡＡＶゲノムに挿入することができ、その主要なＡＡＶオープンリーディングフレームはそこから切除されている。ＡＡＶゲノムの他の部分もまた削除することができ、ＩＴＲの特定の部分は、複製およびパッケージング機能をサポートするために無傷のままである。このような構築物は、当該技術分野において周知である技術を用いて設計することができる。例えば、米国特許第５，１７３，４１４号および同第５，１３９，９４１号；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら（１９８８年）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８巻：３９８８〜３９９６頁を参照されたい。
【０２４９】
[00213]本明細書では、ＷＴキャプシドタンパク質から変異ＡＡＶキャプシドタンパク質を生成する方法であり得、この方法は、ＷＴキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を、ポリメラーゼ連鎖反応突然変異誘発、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、飽和突然変異誘発、ループ交換突然変異誘発、断片シャッフリング突然変異誘発、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるあるタイプの突然変異誘発に供することを含む。場合によっては、複数の突然変異されたＡＡＶから非常に効果的な突然変異されたＡＡＶを分離するためのスクリーンを行うことができる。例えば、スクリーンは、ＷＴ  ＡＡＶと比較してより高い効率で初代細胞を形質導入することができる突然変異されたまたはキメラなＡＡＶを決定するためのフローサイトメトリーアッセイを含むことができる。突然変異されたまたはキメラなＡＡＶキャプシドタンパク質（または主題の核酸によってコードされる任意の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質）は、野生型ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ６（野生型ＡＡＶ血清型６））または野生型キャプシドタンパク質を含むＡＡＶによって示される形質導入と比較して、哺乳動物細胞の形質導入の増加を感染性ＡＡＶビリオンに付与すると言うことができる。場合によっては、形質導入の増加は、野生型ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ６（野生型ＡＡＶ血清型６））または野生型キャプシドタンパク質を含むＡＡＶによって示される形質導入よりも少なくとも約１．５倍（例えば、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約７．５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約１７倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１５０倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約２５０倍、少なくとも約３００倍など）である。場合によっては、形質導入の増加は、フローサイトメトリーによる導入遺伝子の検出によって測定した場合、野生型ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ６（野生型ＡＡＶ血清型６））または野生型キャプシドタンパク質を含むＡＡＶによって示される形質導入よりも少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または最大約１００％大きい。場合によっては、トランスフェクションの増加は、フローサイトメトリーによる導入遺伝子の検出によって測定した場合、野生型ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ６（野生型ＡＡＶ血清型６））または野生型キャプシドタンパク質を含むＡＡＶによって示される形質導入よりも少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または最大約１００％大きくなり得る。２９３Ｔ細胞などのプロデューサー細胞、またはリンパ球（例えば、腫瘍浸潤リンパ球）などの初代細胞において形質導入およびトランスフェクションを検出できる。場合によっては、形質導入またはトランスフェクションの増加は、フローサイトメトリーによる導入遺伝子の検出によって測定した場合、野生型ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ６（野生型ＡＡＶ血清型６））または野生型キャプシドタンパク質を含むＡＡＶによって示される形質導入よりも少なくとも約５％〜１０％、１５％〜２０％、２５％〜３０％、３５％〜４０％、４５％〜５０％、５５％〜６０％、６５％〜７０％、７５％〜８０％、８５％〜９０％、９５％または最大約１００％大きい。トランスフェクションまたは形質導入効率は、いくつか例を挙げると、ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、細胞内染色、フローサイトメトリー、定量的ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡなどのインビトロアッセイにより検出することができる。
【０２５０】
[00214]場合によっては、主題の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質（または主題の核酸によってコードされる変異ＡＡＶキャプシドタンパク質）は、野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質に結合する中和抗体への結合の低下を示す。例えば、主題の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質は、野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質への抗体の結合親和性と比較して、野生型キャプシドＡＡＶタンパク質に結合する中和抗体への少なくとも約１．５倍（例えば、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約７．５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約１７倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１５０倍、少なくとも約２００倍倍、少なくとも約２５０倍、少なくとも約３００倍など）の結合の低下（例えば、親和性の低下）を示すことができる。
修飾されたＡＡＶを製造する方法
[00215]本出願は、細胞内で１つ以上の目的のタンパク質を発現することができる組換えＡＡＶを生成するための方法および材料を提供する。本明細書に記載されるように、本明細書に開示される方法および材料は、インビボで治療効果を達成するレベルで目的のタンパク質の高生産または生産を可能にする。目的のタンパク質の例は外因性受容体である。外因性受容体はＴＣＲであり得る。
【０２５１】
[00216]一般的なＡＡＶビリオンまたはウイルス粒子に対して、ＡＡＶ発現ベクターは、トランスフェクションなどの公知の技術を使用して適切な宿主細胞に導入される。トランスフェクション技術は当該技術分野において公知である。例えば、Ｇｒａｈａｍら（１９７３年）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２巻：４５６頁，Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｄａｖｉｓら（１９８６年）Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，およびＣｈｕら（１９８１年）Ｇｅｎｅ  １３巻：１９７頁を参照されたい。適切なトランスフェクション法には、当該技術分野において公知である、リン酸カルシウム共沈殿、直接的なマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソーム媒介遺伝子導入、および知られている高速微小発射体を使用した核酸送達が含まれる。
【０２５２】
[00217]場合によっては、組換えＡＡＶを産生する方法は、本明細書に記載されるものなどのＡＡＶの５’逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）および３’ＡＡＶ  ＩＴＲを含むウイルス構築物、産生性ＡＡＶ感染を生じされるためのヘルパー機能、およびＡＡＶ  ｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞株に提供し、パッケージング細胞株の上清から組換えＡＡＶを回収することを含む。様々なタイプの細胞をパッケージング細胞株として使用することができる。例えば、使用することができるパッケージング細胞株には、限定されないが、いくつか例を挙げると、ＨＥＫ  ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、およびＶｅｒｏ細胞が含まれる。場合によっては、パッケージング細胞株の上清は、ウイルスを濃縮するためにＰＥＧ沈殿によって処理される。他の場合では、遠心分離ステップを使用してウイルスを濃縮することができる。例えば、カラムを使用して、遠心分離中にウイルスを濃縮することができる。一部の実施形態では、沈殿は、少なくとも約２時間、少なくとも約３時間、少なくとも約４時間、少なくとも約６時間、少なくとも約９時間、少なくとも約１２時間、または少なくとも約２４時間、約４℃以下（例えば、約３℃、約２℃、約１℃、または約１℃）で生じる。一部の実施形態では、組換えＡＡＶは、低速遠心分離とそれに続くＣｓＣｌ勾配によって、ＰＥＧ沈殿させた上清から単離される。低速遠心分離は、約２０分間、約３０分間、約４０分間、約５０分間または約６０分間、約４０００ｒｐｍ、約４５００ｒｐｍ、約５０００ｒｐｍ、または約６０００ｒｐｍであり得る。場合によっては、約５０００ｒｐｍで約３０分間の遠心分離とそれに続くＣｓＣｌ勾配によって、ＰＥＧ沈殿させた上清から組換えＡＡＶを単離する。場合によっては、ＣｓＣｌ精製をＩＤＸ勾配超遠心分離に置き換えることができる。上清は、トランスフェクション後、約１２時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約７２時間、約９６時間、約１２０時間、またはこれら２つの時点のいずれかの時点で回収することができる。上清を精製、濃縮、またはそれらを組み合わせてすることもできる。例えば、濃度またはウイルス力価は、ｑＰＣＲまたは銀染色によって決定することができる。ウイルス力価は、約１０２ｖｐ／ｍＬ、１０３ｖｐ／ｍＬ、１０４ｖｐ／ｍＬ、１０５ｖｐ／ｍＬ、１０６ｖｐ／ｍＬ、１０７ｖｐ／ｍＬ、または１０８ｖｐ／ｍＬから最大約１０９ｖｐ／ｍＬであり得る。ウイルス力価は、約１０２ＧＣ／ｍＬ、１０３ＧＣ／ｍＬ、１０４ＧＣ／ｍＬ、１０５ＧＣ／ｍＬ、１０６ＧＣ／ｍＬ、１０７ＧＣ／ｍＬ、または１０８ＧＣ／ｍＬから最大約１０９ＧＣ／ｍＬであり得る。場合によっては、ウイルス力価は、約１０２ＴＵ／ｍＬ、１０３ＴＵ／ｍＬ、１０４ＴＵ／ｍＬ、１０５ＴＵ／ｍＬ、１０６ＴＵ／ｍＬ、１０７ＴＵ／ｍＬ、または１０８ＴＵ／ｍＬから最大約１０９ＴＵ／ｍＬであり得る。最適なウイルス力価は、形質導入される細胞のタイプに依存して変化し得る。ウイルスの範囲は、約１０００ＭＯＩから２０００ＭＯＩ、１５００ＭＯＩから２５００ＭＯＩ、２０００ＭＯＩから３０００ＭＯＩ、３０００ＭＯＩから４０００ＭＯＩ、４０００ＭＯＩから５０００ＭＯＩ、５０００ＭＯＩから６００��ＭＯＩ、６０００ＭＯＩから７０００ＭＯＩ、７０００ＭＯＩから８０００ＭＯＩ、８０００ＭＯＩから９０００ＭＯＩ、９０００ＭＯＩから１０，０００ＭＯＩであり得る。例えば、１０，０００のＭＯＩを使用して１００万個の細胞を感染させるには、１０，０００×１，０００，０００＝１０１０ＧＣが必要である。
【０２５３】
[00218]プラスミドまたはウイルスの宿主細胞への導入はまた、当業者に公知である技術を使用して、本明細書の全体にわたって検討されているように達成することができる。場合によっては、標準的なトランスフェクション技術、例えば、ＣａＰＯ４トランスフェクションまたはエレクトロポレーション、および／またはハイブリッドアデノウイルス／ＡＡＶベクターによるヒト胎児腎細胞株ＨＥＫ２９３（トランス作用性Ｅ１タンパク質を提供する機能性アデノウイルスＥ１遺伝子を含むヒト腎細胞株）などの細胞株への感染が使用される。当業者は、本発明の新規ＡＡＶ配列が、インビトロ、エクスビボまたはインビボ遺伝子送達のためのこれらおよび他のウイルスベクター系での使用に容易に適合できることを容易に理解する。同様に、当業者は、様々なＡＡＶおよび非ＡＡＶベクター系で使用するために、本発明のＡＡＶゲノムの他の断片を容易に選択することができる。このようなベクター系には、とりわけ、例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアウイルス、およびアデノウイルス系が含まれ得る。これらのベクター系の選択は、本発明の限定ではない。
【０２５４】
[00219]一部の実施形態では、ヘルパー機能は、アデノウイルスヘルパー遺伝子を含む１つ以上のヘルパープラスミドまたはヘルパーウイルスによって提供される。アデノウイルスヘルパー遺伝子の非限定的な例には、ＡＡＶパッケージングにヘルパー機能を提供することができるＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４およびＶＡが含まれる。場合によっては、ＡＡＶ  ｃａｐ遺伝子はプラスミドに存在することができる。プラスミドは、ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子をさらに含むことができる。
【０２５５】
[00220]血清学は、ある血清型のウイルスキャプシドタンパク質に応答して、別の血清型のウイルスキャプシドタンパク質を中和することができない抗体として定義することができる。場合によっては、任意のＡＡＶ血清型のｃａｐ遺伝子および／またはｒｅｐ遺伝子（限定されないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、およびそれらの突然変異体または誘導体を含む）を本明細書で使用して、本明細書で開示される組換えＡＡＶを作製し、目的の１つ以上のタンパク質を発現させることができる。アデノ随伴ウイルスは、ＡＡＶ５もしくはＡＡＶ６またはその変異体であり得る。場合によっては、ＡＡＶ  ｃａｐ遺伝子は、血清型１、血清型２、血清型３、血清型４、血清型５、血清型６、血清型７、血清型８、血清型９、血清型１０、血清型１１、血清型１２、またはその変異体由来のキャプシドをコードすることができる。一部の実施形態では、パッケージング細胞株は、ヘルパープラスミドまたはヘルパーウイルス、ウイルス構築物、およびＡＡＶキャップ遺伝子をコードするプラスミドでトランスフェクトされ得る。組換えＡＡＶウイルスは、同時トランスフェクション後の様々な時点で回収することができる。例えば、組換えＡＡＶウイルスは、同時トランスフェクション後の約１２時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約７２時間、約９６時間、約１２０時間、またはこれらの２つの時点のいずれかの間の時間で回収することができる。
【０２５６】
[00221]場合によっては、修飾は、ＡＡＶ血清型６キャプシドのものであり得る。場合によっては、主題の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質（または主題の核酸によってコードされる変異ＡＡＶキャプシドタンパク質）は、配列番号５５に対して約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または最大１００％の相同性を含むことができるＡＡＶ６などのＷＴ  ＡＡＶと比較することができる。
【０２５７】
【表６】
2020530307.tif 000091
【０２５８】
[00222]場合によっては、複数の操作されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子をスクリーニングする方法は、突然変異または外因性ＡＡＶゲノムの少なくとも１つをアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヌクレオチド配列のゲノムに導入して、操作されたＡＡＶ粒子を形成するステップを含むことができる。場合によっては、次に、操作されたＡＡＶ粒子が複数の細胞ゲノムに導入される。スクリーンは、異なる突然変異またはキメラＡＡＶ変異体の複数の細胞ゲノム中の複数のＡＡＶ粒子によってコードされる導入遺伝子の発現レベルを比較することを含み得る。場合によっては、導入遺伝子の発現レベルは定量化される。他の場合では、形質導入された細胞集団の細胞死のレベルが定量化される。他の場合では、細胞集団における導入遺伝子の持続性レベルが定量化される。
【０２５９】
[00223]場合によっては、スクリーニング方法は、ウイルス上清の滴定実験の実施を伴い得る。例えば、細胞は、突然変異されたまたはキメラな修飾されたＡＡＶウイルスからのＡＡＶ上清を用いて形質導入して、修飾ＡＡＶウイルスからのウイルス粒子の感染性の程度を決定することができる。例えば、ＭＯＩは、１×１０６ＧＣ／ｍＬから２００ＧＣ／ｍＬまで滴定することができる。形質導入された細胞での導入遺伝子の発現などの産生量を定量化して、選択され得る突然変異体またはキメラを決定することができる。
【０２６０】
[00224]ＡＡＶのヘルパーウイルスは当該技術分野において公知であり、例えば、アデノウイルス科およびヘルペスウイルス科に由来するウイルスが含まれる。ＡＡＶのヘルパーウイルスの例には、限定されないが、米国特許出願公開第２０１１／０２０１０８８号に記載されるＳＡｄＶ−１３ヘルパーウイルスおよびＳＡｄＶ−１３様ヘルパーウイルス、ヘルパーベクターｐＨＥＬＰ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｖｉｒｏｍｉｃｓ）が含まれる。当業者は、ＡＡＶに適切なヘルパー機能を提供することができるＡＡＶの任意のヘルパーウイルスまたはヘルパープラスミドを本明細書において使用することができることを理解する。本明細書に開示される組換えＡＡＶウイルスはまた、感染性組換えＡＡＶの産生に適した当該技術分野において公知である任意の従来方法を使用して産生することもできる。場合によっては、組換えＡＡＶは、ＡＡＶ粒子産生に必要な成分のいくつかを安定して発現する細胞株を使用することにより産生され得る。例えば、ＡＡＶ  ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、およびネオマイシン耐性遺伝子などの選択マーカーを含むプラスミド（または複数のプラスミド）は、細胞（パッケージング細胞）のゲノムに組み込むことができる。次に、パッケージング細胞株は、ヘルパーウイルス（例えば、ヘルパー機能を提供するアデノウイルス）、ならびに５’および３’ＡＡＶ  ＩＴＲ、ならびに目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むウイルスベクターで同時感染され得る。別の非限定的な例では、プラスミドというよりはむしろアデノウイルスまたはバキュロウイルスを使用して、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞に導入することができる。さらに別の非限定的な例として、５’および３’ＡＡＶ  ＩＴＲとｒｅｐ−ｃａｐ遺伝子の両方を含むウイルスベクターをプロデューサー細胞のＤＮＡに安定して組み込むことができ、ヘルパー機能は、野生型アデノウイルスによって提供されて、組換えＡＡＶを産生することができる。
【０２６１】
[00225]場合によっては、パッケージングプラスミドは、１つのプラスミド上に必要なすべてのウイルスタンパク質を含み、ＩＴＲに隣接したドナー鋳型の、複製不能ウイルス粒子へのパッキングを可能にすることができる。
【０２６２】
[00226]ＡＡＶビリオンまたはウイルス粒子を産生するために使用することができる適切な宿主細胞には、酵母細胞、昆虫細胞、微生物、および哺乳動物細胞が含まれる。様々な安定したヒト細胞株を使用することができ、限定されないが、２９３細胞が含まれる。宿主細胞を操作してヘルパー機能を提供し、ＡＡＶ  ＩＴＲに隣接するヌクレオチド配列を複製およびキャプシド化して、ウイルス粒子またはＡＡＶビリオンを産生させることができる。ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶ複製およびパッケージングのためにトランスでＡＡＶ遺伝子産物を提供するために、宿主細胞で発現されるＡＡＶ由来のコード配列によって提供され得る。ＡＡＶウイルスは、複製を可能にし、または複製を不能にすることができる。一般的に、複製欠損ＡＡＶウイルスには１つ以上のＡＡＶパッケージング遺伝子を欠損している。細胞は、本明細書に記載されるウイルスベクター、ウイルス粒子、またはウイルスとインビトロ、エクスビボ、またはインビボで接触させることができる。一部の実施形態では、インビトロで接触する細胞は、樹立された細胞株または対象由来の初代細胞に由来し得、対象に戻すためにエクスビボで修飾されるか、またはインビトロで培養にて増殖させることができる。一部の態様では、ウイルスを使用してエクスビボで初代細胞にウイルスベクターを送達して、細胞を修飾する。例えば、免疫細胞、または特にＴ細胞に外因性核酸配列、導入遺伝子、または操作された細胞受容体を導入し、続いて、培養における拡大、選択、または限られた数の継代を行った後、このような修飾された細胞を対象に戻す。一部の態様では、このような修飾された細胞は、癌を含む疾患または状態を治療するための細胞ベース療法で使用される。
【０２６３】
[00227]場合によっては、操作されたＡＡＶは自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ではない。本明細書に記載される実施形態では、組換えＡＡＶを精製するために、ＡＡＶの精製に適した任意の従来方法を使用することができる。例えば、組換え体は、パッケージング細胞および／またはパッケージング細胞の上清から単離および精製することができる。一部の実施形態では、ＡＡＶは、ＣｓＣｌ勾配を使用する分離方法により精製され得る。また、米国特許出願公開第２００２／０１３６７１０号は、ＡＡＶを精製する方法の別の非限定的な例を記載し、ＡＡＶは、ＡＡＶ付着を媒介する人工受容体または受容体様分子が固定されるマトリックスを含む固体支持体を使用して、試料から単離および精製された。
【０２６４】
[00228]場合によっては、細胞集団は、ウイルスベクター、例えばＡＡＶで形質導入することができる。ウイルスによる形質導入は、ＣＲＩＳＰＲシステムによるゲノム破壊前、またはＣＲＩＳＰＲシステムによるゲノム破壊後に生じる場合がある。例えば、ＣＲＩＳＰＲシステムを使用したゲノム破壊は、外因性ポリ核酸のゲノムの一部への組み込みを促進することができる。場合によっては、ＣＲＩＳＰＲシステムを使用して、免疫チェックポイント遺伝子もしくはセーフハーバー遺伝子またはその一部などの遺伝子を含むゲノムの一部に二本鎖切断を導入することができる。二本鎖切断は、ウイルスベクター、場合によってはＡＡＶによって、細胞に送達される外因性受容体配列を導入することにより修復することができる。ＡＡＶは、ＣＲＩＳＰＲシステムによって破壊された遺伝子の一部への組換えアームを有するポリ核酸を含むことができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲシステムでは、ＣＩＳＨ遺伝子に二本鎖切断を導入することができる。次に、ＣＩＳＨ遺伝子は、外因性ＴＣＲをコードする導入遺伝子の導入によって修復することができ、導入遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲシステムによって以前に破壊されたゲノムの一部に相補的な領域を有する組換えアームに隣接させることができる。ゲノム破壊およびウイルス導入を含む細胞集団を形質導入することができる。形質導入された細胞集団は、約５％〜約１００％であり得る。
【０２６５】
[00229]本明細書に記載される方法の１つ以上の導入遺伝子は、細胞のゲノムにランダムに挿入することができる。これらの導入遺伝子は、ゲノムのどこかに挿入されると機能し得る。例えば、導入遺伝子はそれ自身のプロモーターをコードし得るか、または内在性プロモーターの制御下にある位置に挿入され得る。あるいは、導入遺伝子は、遺伝子のイントロン、遺伝子のエクソン、プロモーター、または非コード領域などの遺伝子に挿入することができる。
【０２６６】
[00230]導入遺伝子配列をコードする核酸、例えばＲＮＡは、細胞の染色体にランダムに挿入され得る。ランダムな組み込みは、細胞に核酸、例えばＲＮＡを導入する任意の方法から生じさせることができる。例えば、この方法は、限定されないが、エレクトロポレーション、ソノポレーション、遺伝子銃の使用、リポトランスフェクション、リン酸カルシウムトランスフェクション、デンドリマーの使用、マイクロインジェクション、およびアデノウイルス、ＡＡＶ、およびレトロウイルスベクターを含むウイルスベクターの使用、および／またはグループＩＩリボザイムであり得る。
【０２６７】
[00231]また、導入遺伝子またはその発現産物の存在がレポーター遺伝子の活性化を介して検出することができるように、導入遺伝子をコードするＲＮＡはレポーター遺伝子を含むように設計することができる。前記で開示されたものなど、任意のレポーター遺伝子を使用することができる。細胞培養でレポーター遺伝子が活性化された細胞を選択することにより、導入遺伝子を含む細胞を選択することができる。
【０２６８】
[00232]挿入される導入遺伝子は、ゲノム中の標的化された二本鎖切断部位に類似する操作された部位に隣接して、二本鎖切断領域に挿入することができるように、ポリ核酸から導入遺伝子を切り出すことができる。場合によっては、導入遺伝子をウイルス的に導入することができる。例えば、ＡＡＶウイルスを利用して、細胞に導入遺伝子を感染させることができる。フローサイトメトリーを利用して、ＡＡＶウイルスによって、組み込まれた導入遺伝子の発現を測定することができる。場合によっては、ＡＡＶウイルスによる導入遺伝子の組み込みは細胞毒性を誘発しない。場合によっては、ＡＡＶウイルスを利用して操作された細胞集団のフローサイトメトリーによって測定した場合の細胞生存率は、約３０％から１００％の生存率であり得る。操作された細胞集団のフローサイトメトリーによって測定した場合の細胞生存率は、約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％から約１００％までであり得る。場合によっては、ＡＡＶウイルスは細胞のゲノムに導入遺伝子を導入することができる。組み込まれた導入遺伝子は、ゲノム導入直後から操作された細胞によって、操作された細胞の寿命まで発現させることができる。例えば、組み込まれた導入遺伝子は、細胞のゲノムへの導入後の約０．１分から、導入遺伝子の細胞への最初の導入後の１時間から５時間、５時間から１０時間、１０時間から２０時間、２０時間から１日、１日からしてから３日、３日から５日、５日から１５日、１５日から３０日、３０日から５０日、５０日から１００日、または最大１０００日まで検出することができる。導入遺伝子の発現は、３日から検出することができる。導入遺伝子の発現は、７日から検出することができる。導入遺伝子の発現は、細胞のゲノムへの導入遺伝子の導入後、約４時間、６時間、８時間、１２時間、１８時間から約２４時間まで検出することができる。場合によっては、ウイルス力価が導入遺伝子発現のパーセントに影響を及ぼす場合がある。
【０２６９】
[00233]場合によっては、本明細書に記載される目的の遺伝子または導入遺伝子を含むＡＡＶウイルスベクターなどのウイルスベクターは、ウイルスベクターを含むウイルス粒子による細胞のトランスフェクション後に細胞のゲノムにランダムに挿入することができる。このような挿入のためのランダムな部位には、二本鎖切断を伴うゲノム部位が含まれる。レトロウイルスなどの一部のウイルスは、ウイルスベクターのランダム挿入を引き起こす可能性のあるインテグラーゼなどの因子を含む。
【０２７０】
[00234]場合によっては、修飾または操作されたＡＡＶウイルスを使用して、導入遺伝子を細胞に導入することができる。修飾されたまたは野生型のＡＡＶは、少なくとも１つのゲノムの場所への相同性アームを含むことができる。
【０２７１】
[00235]導入遺伝子をコードするＲＮＡは、エレクトロポレーションを介して細胞に導入することができる。ＲＮＡはまた、リポフェクション、感染、または形質転換を介して細胞に導入することもできる。エレクトロポレーションおよび／またはリポフェクションを使用して、初代細胞をトランスフェクションすることができる。エレクトロポレーションおよび／またはリポフェクションを使用して、初代造血細胞をトランスフェクトすることができる。場合によっては、細胞内でＲＮＡをＤＮＡに逆転写することができる。次に、ＤＮＡ基質を相同組換え反応に使用することができる。ＤＮＡはまた、相同組換えを使用せずに細胞ゲノムに導入することもできる。場合によっては、ゲノムの標的二本鎖切断領域に相補的な遺伝子操作部位がＤＮＡの側面にある場合がある。場合によっては、ＤＮＡをポリ核酸から切り出すことができ、そのため、相同組換えなしに二本鎖切断領域に挿入することができる。
【０２７２】
[00236]導入遺伝子の発現は、発現アッセイ、例えば、ｑＰＣＲにより、またはＲＮＡレベルを測定することにより検証することができる。発現レベルはまたコピー数を示すことができる。例えば、発現レベルが非常に高い場合、これは、導入遺伝子の１を超えるコピーがゲノムに組み込まれたことを示し得る。あるいは、高発現は、導入遺伝子が高度に転写された領域、例えば、高度に発現したプロモーターの近傍に組み込まれたことを示し得る。発現はまた、ウエスタンブロッティングを介するなど、タンパク質レベルを測定することによって検証することができる。場合によっては、スプライスアクセプターアッセイをレポーターシステムとともに使用して、導入遺伝子の組み込みを測定することができる。例えば、スプライスアクセプターは、内在性プロモーターの制御下でゲノムに正常に組み込まれた場合、発現を示すことができる。場合によっては、ＡＡＶシステムを使用して導入遺伝子がゲノムに導入された場合、導入遺伝子の組み込みを測定するために、スプライスアクセプターアッセイをレポーターシステムとともに使用することができる。
【０２７３】
[00237]本明細書に開示される方法のいずれかにおける１つ以上の導入遺伝子の挿入は、部位特異的であり得る。例えば、１つ以上の導入遺伝子をプロモーターに隣接してまたはその近傍に挿入することができる。別の例では、１つ以上の導入遺伝子は、遺伝子（例えば、ＰＤ−１遺伝子）のエクソンに隣接して、その近傍に、またはその中に挿入することができる。このような挿入を使用して、導入遺伝子（例えば、癌特異的ＴＣＲ導入遺伝子）をノックインすると同時に、別の遺伝子（例えば、ＰＤ−１遺伝子）を破壊することができる。別の例では、１つ以上の導入遺伝子は、遺伝子のイントロンに隣接して、その近傍に、またはその中に挿入することができる。導入遺伝子は、ＡＡＶウイルスベクターによって導入され、標的のゲノムの場所に組み込まれ得る。場合によっては、ＡＡＶベクターを使用して、特定の場所に導入遺伝子を直接挿入することができる。例えば、場合によっては、導入遺伝子は、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、ＡＡＶＳ１、またはＣＩＳＨ遺伝子の少なくとも一部にＡＡＶによって組み込むことができる。
【０２７４】
[00238]細胞の標的遺伝子座の修飾は、ＤＮＡを細胞に導入することにより生成することができ、ＤＮＡは標的遺伝子座と相同性を有する。ＤＮＡは、マーカー遺伝子を含むことができ、組み込まれた構築物を含む細胞の選択を可能にする。標的ベクター内の相補的ＤＮＡは、標的遺伝子座で染色体ＤＮＡと組換えることができる。マーカー遺伝子は、相補的ＤＮＡ配列、３’組換えアーム、および５’組換えアームが隣接し得る。細胞内の複数の遺伝子座を標的にすることができる。例えば、１つ以上の標的遺伝子座に特異的な組換えアームを有する導入遺伝子を一度に導入して、それにより、単一のステップで複数のゲノム修飾を行うことができる。
【０２７５】
[00239]場合によっては、特定のゲノム部位に対する組換えアームまたは相同性アームは、長さが約０．２ｋｂから約５ｋｂであり得る。組換えアームは、長さが約０．２ｋｂ、０．４ｋｂ、０．６ｋｂ、０．８ｋｂ、１．０ｋｂ、１．２ｋｂ、１．４ｋｂ、１．６ｋｂ、１．８ｋｂ、２．０ｋｂ、２．２ｋｂ、２．４ｋｂ、２．６ｋｂ、２．８ｋｂ、３．０ｋｂ、３．２ｋｂ、３．４ｋｂ、３．６ｋｂ、３．８ｋｂ、４．０ｋｂ、４．２ｋｂ、４．４ｋｂ、４．６ｋｂ、４．８ｋｂから約５．０ｋｂまでであり得る。組換えアームはまた、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９から最大約２００塩基または塩基対であり得る。
【０２７６】
[00240]様々な酵素が、外来ＤＮＡの宿主ゲノムへの挿入を触媒することができる。例えば、部位特異的リコンビナーゼは、異なる生化学的特性を有する２つのタンパク質ファミリー、すなわち、チロシンリコンビナーゼ（ＤＮＡがチロシン残基に共有結合している）およびセリンリコンビナーゼ（共有結合がセリン残基で発生している場合）にクラスター化することができる。場合によっては、リコンビナーゼは、Ｃｒｅ、ｆＣ３１インテグラーゼ（ストレプトマイセスファージｆＣ３１に由来するセリンリコンビナーゼ）、またはバクテリオファージ由来の部位特異的リコンビナーゼ（Ｆｌｐ、ラムダインテグラーゼ、バクテリオファージＨＫ０２２リコンビナーゼ、バクテリオファージＲ４インテグラーゼおよびファージＴＰ９０１−１インテグラーゼを含む）を含むことができる。
【０２７７】
[00241]発現制御配列はまた構築物に使用することができる。例えば、発現制御配列は、多種多様な細胞タイプで発現される構成的プロモーターを含むことができる。組織特異的プロモーターはまた使用され得、特定の細胞系統に発現を指向するために使用することができる。
【０２７８】
[00242]部位特異的遺伝子編集は、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ（米国特許出願第１４／１９３，０３７号を参照されたい）、トランスポゾンベース、ＺＦＮ、メガヌクレアーゼ、またはメガ−ＴＡＬ、またはトランスポゾンベースシステムなどの非ウイルス遺伝子編集を使用して達成することができる。例えば、ＰｉｇｇｙＢａｃ（Ｍｏｒｉａｒｔｙ，Ｂ．Ｓ．ら，「Ｍｏｄｕｌａｒ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔａｂｌｅ  ｍｕｌｔｉｇｅｎｅ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｕｓｉｎｇ  ＲｅｃＷａｙ  ａｓｓｅｍｂｌｙ」，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（８）：ｅ９２（２０１３年）を参照されたい）またはＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（Ａｒｏｎｏｖｉｃｈ，Ｅ．Ｌら，「Ｔｈｅ  Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ  ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ：ａ  ｎｏｎ−ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ」，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，２０（Ｒ１）：Ｒ１４−Ｒ２０．（２０１１年））トランスポゾンシステムを使用することができる。
【０２７９】
[00243]部位特異的遺伝子編集はまた、相同組換えなしに達成され得る。相同組換えを使用せずに、外因性ポリ核酸を細胞ゲノムに導入することができる。場合によっては、ゲノム内の標的二本鎖切断領域に相補的である遺伝子操作部位が導入遺伝子に隣接する場合がある。導入遺伝子は、ポリ核酸から切り出すことができるため、相同組換えなしに二本鎖切断領域に挿入され得る。
【０２８０】
[00244]導入遺伝子のゲノム組み込みが望ましい一部の実施形態では、ヌクレアーゼがゲノムＤＮＡを切断する部位での導入遺伝子の組み込みを促進するために、外因性または操作されたヌクレアーゼは、導入遺伝子を含むプラスミド、線状もしくは環状ポリヌクレオチド、ウイルスまたは非ウイルスベクターに加えて、細胞に導入することができる。導入遺伝子の細胞ゲノムへの組み込みにより、長期にわたって導入遺伝子の安定した発現が可能になる。一部の局面では、ウイルスベクターを使用して、導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを導入することができる。他の場合、ウイルスベクターはプロモーターを含まない。これは、挿入された導入遺伝子を発現するための内因性プロモーターを含む標的遺伝子座での導入遺伝子の挿入を必要とする。
【０２８１】
[00245]他の実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶＳ１部位またはセーフハーバー部位などの標的ゲノム遺伝子座への導入遺伝子の組み込みを指向する相同性アームを含む。一実施形態では、第１のヌクレアーゼは、特定のゲノム部位で切断して、癌遺伝子、チェックポイント阻害剤遺伝子、または癌などの疾患もしくは状態に関係する遺伝子などの有害な遺伝子を抑制または無効にするように操作される。ヌクレアーゼによってこのようなゲノム遺伝子座で二本鎖切断が生成された後、非ウイルスベクターまたはウイルスベクター（例えば、ＡＡＶウイルスベクター）を導入して、ＤＮＡ切断部位またはヌクレアーゼにより生成される二本鎖切断部位で、導入遺伝子または治療効果を有する外因性核酸配列の組み込みを可能にし得る。あるいは、導入遺伝子は、ＡＡＶＳ１部位またはセーフハーバー遺伝子座などの所望の挿入部位に相補的な配列を含む相同性アームを使用して、相同組換えによる部位特異的挿入などの、当該技術分野において公知である方法を使用して異なるゲノム部位に挿入することができる。場合によっては、第１のヌクレアーゼによるＤＮＡ切断部位とは異なる遺伝子座での導入遺伝子の部位特異的挿入を促進するために、第２のヌクレアーゼを提供することができる。一部の実施形態では、ＡＡＶウイルスまたはＡＡＶウイルスベクターを、Ｔ細胞受容体などの導入遺伝子を導入するための送達システムとして使用することができる。ＡＡＶドナーの相同性アームは、５００塩基対から２０００塩基対であり得る。例えば、ＡＡＶドナーの相同性アームは、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１０００ｂｐ、１１００ｂｐ、１２００ｂｐ、１３００ｂｐ、１４００ｂｐ、１５００ｂｐ、１６００ｂｐ、１７００ｂｐ、１８００ｂｐ、または１９００ｂｐから最大２０００ｂｐまでの長さであり得る。相同性アームの長さは８５０ｂｐであり得る。他の場合では、相同性アームの長さは１０４０ｂｐであり得る。場合によっては、ドナーの正確な組み込みを可能にするために、相同性アームが拡張される。他の場合では、ドナーの組み込みを改善するために相同性アームが拡張される。場合によっては、ドナーポリ核酸のサイズを損なうことなく相同アームの長さを増加させるために、ドナーポリ核酸の代替部分を排除することができる。場合によっては、ポリＡ尾部を小さくして、相同性アームの長さを長くすることができる。
【０２８２】
[00246]本明細書では、機能的ＡＡＶが開示され得る。機能性ＡＡＶは、ＡＡＶ６などのＷＴ  ＡＡＶのいずれか１つと同等またはそれ以上のパッケージングおよび形質導入効率を有するウイルス粒子を産生する能力によって特徴付けられるＡＡＶであり得る。機能は、ＡＡＶ６  ｒｅｐおよびＡＡＶ６  ＩＴＲを使用した偽型設定で評価することができる。したがって、変更された親ＡＡＶは、従来技術を使用して構築することができ、ＡＡＶ６などのＷＴ  ＡＡＶの産生と比較した場合、ウイルスが少なくとも５０％の力価で親ＡＡＶから産生される場合、ＡＡＶベクターは機能的とみなすことができる。さらに、細胞を形質導入するＡＡＶの能力は、当業者によって容易に決定され得る。例えば、親のＡＡＶは、ウイルスをすぐに検出することができるマーカー遺伝子を含むように構築され得る。例えば、ＡＡＶには、ｅＧＦＰまたは蛍光検出を可能にする別の導入遺伝子を含めることができる。ＡＡＶにＣＭＶ−ｅＧＦＰが含まれる場合、変更された親ＡＡＶキャプシドから産生されたウイルスが１０４の感染多重度で２９３細胞に形質導入されると、細胞が２０の感染多重度で２時間、野生型ヒトアデノウイルス５型で前処理された場合との関連で、全細胞のＧＦＰ蛍光が５％を超える場合に機能が実証される。
導入遺伝子
[00247]場合によっては、本明細書に開示される方法は、核酸（例えば、第１の核酸および／または第２の核酸）を含むことができる。場合によっては、核酸は導入遺伝子をエンコードすることができる。一般的に、導入遺伝子は、複数のヌクレオチドサブユニットを含む線状ポリマーを指し得る。導入遺伝子は、任意の数のヌクレオチドを含むことができる。場合によっては、導入遺伝子は、約１００個未満のヌクレオチドを含むことができる。場合によっては、導入遺伝子は、少なくとも約１００個のヌクレオチドを含むことができる。場合によっては、導入遺伝子は、少なくとも約２００個のヌクレオチドを含むことができる。場合によっては、導入遺伝子は、少なくとも約３００個のヌクレオチドを含むことができる。場合によっては、導入遺伝子は、少なくとも約４００個のヌクレオチドを含むことができる。場合によっては、導入遺伝子は、少なくとも約５００個のヌクレオチドを含むことができる。場合によっては、導入遺伝子は、少なくとも約１０００個のヌクレオチドを含むことができる。場合によっては、導入遺伝子は、少なくとも約５０００個のヌクレオチドを含むことができる。場合によっては、導入遺伝子は、少なくとも約１０，０００個のヌクレオチドを含むことができる。場合によっては、導入遺伝子は、少なくとも約２０，０００個のヌクレオチドを含むことができる。場合によっては、導入遺伝子は、少なくとも約３０，０００個のヌクレオチドを含むことができる。場合によっては、導入遺伝子は、少なくとも約４０，０００個のヌクレオチドを含むことができる。場合によっては、導入遺伝子は、少なくとも約５０，０００個のヌクレオチドを含むことができる。場合によっては、導入遺伝子は、約５００〜約５０００個のヌクレオチドを含むことができる。場合によっては、導入遺伝子は、約５０００〜約１０，０００ヌクレオチドを含むことができる。本明細書に開示されるいずれの場合においても、導入遺伝子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡとＲＮＡのハイブリッドを含むことができる。場合によっては、導入遺伝子は、一本鎖であり得る。場合によっては、導入遺伝子は二本鎖であり得る。
【０２８３】
[00248]導入遺伝子は、導入遺伝子なしでよりも高いレベルで内因性遺伝子を発現する、例えば過剰発現するのに有用であり得る。さらに、導入遺伝子を使用して、バックグラウンド、すなわち、導入遺伝子でトランスフェクトされていない細胞よりも高いレベルで外因性遺伝子を発現させることができる。導入遺伝子はまた、他のタイプの遺伝子、例えば、ドミナントネガティブ遺伝子を含むことができる。
【０２８４】
[00249]導入遺伝子は、導入遺伝子の産物を生成する方法で、生物、細胞、組織、または臓器に配置することができる。ポリ核酸は、導入遺伝子を含むことができる。ポリ核酸は、外因性受容体をコードすることができる。例えば、本明細書には、アデノシンＡ２ａ受容体、ＣＤ２７６、Ｖセットドメインを含むＴ細胞活性化阻害剤１、ＢおよびＴリンパ球関連、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ１、キラー細胞免疫グロブリン様受容体、３つのドメイン、長い細胞質尾部、１、リンパ球活性化遺伝子３、プログラム細胞死１、Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体２、Ｔ細胞活性化のＶドメイン免疫グロブリン抑制因子、またはナチュラルキラー細胞受容体２Ｂ４である、ゲノム配列内のポリヌクレオチドに相補的な配列を有する少なくとも２つの組換えアームに隣接する少なくとも１つの外因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）配列を含むポリ核酸が開示される。１つ以上の導入遺伝子は、１つ以上の破壊と組み合わせることができる。
【０２８５】
[00250]導入遺伝子（例えば、外因性配列）の挿入は、例えば、ポリペプチドの発現、突然変異遺伝子の修正、または野生型遺伝子の発現増加のために使用することができる。導入遺伝子は、典型的には、配置されているゲノム配列と同一ではない。ドナー導入遺伝子は、目的の場所での効率的なＨＤＲを可能にするために、２つの相同領域に隣接する非相同配列を含むことができる。さらに、導入遺伝子配列は、細胞クロマチンの目的の領域と相同ではない配列を含むベクター分子を含むことができる。導入遺伝子には、細胞クロマチンと相同性のある不連続な領域がいくつか含まれる場合がある。例えば、通常、目的の領域に存在しない配列の標的挿入について、配列は、ドナー核酸分子に存在し、目的の領域の配列と相同性のある領域が隣接し得る。
【０２８６】
[00251]導入遺伝子ポリ核酸は、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡであり得、線状または環状の形態で細胞に導入され得る。導入遺伝子配列（複数可）は、ＤＮＡミニサークル内に含めることができ、これは環状または線状の形態で細胞に導入することができる。線状の形態で導入した場合、導入遺伝子配列の末端は、任意の方法で（例えば、エキソヌクレアーゼ分解から）保護することができる。例えば、１つ以上のジデオキシヌクレオチド残基は、線状分子の３’末端に付加することができ、および／または自己相補的オリゴヌクレオチドを一方または両方の末端に連結することができる。外因性ポリヌクレオチドを分解から保護する追加の方法には、限定されないが、末端アミノ基（複数可）の追加、および、例えば、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、およびＯ−メチルリボースまたはデオキシリボース残基などの修飾されたヌクレオチド間連結の使用が含まれる。
【０２８７】
[00252]ポリヌクレオチドは、例えば、複製起点、プロモーターおよび抗生物質耐性をコードする遺伝子などの追加の配列を有するベクター分子の一部として細胞内に導入することができる。さらに、導入遺伝子ポリヌクレオチドは、裸の核酸として、リポソームまたはポロキサマーなどの薬剤と複合化された核酸として導入され得るか、またはウイルス（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルスおよびインテグラーゼ欠損レンチウイルス（ＩＤＬＶ））によって送達され得る。導入遺伝子を送達することができるウイルスは、ＡＡＶウイルスであり得る。
【０２８８】
[00253]導入遺伝子は、一般的に、その発現が組み込み部位で内因性プロモーター、すなわち、導入遺伝子が挿入される内因性遺伝子（例えば、ＡＡＶＳ  ＳＩＴＥ（例えば、ＡＡＶＳ１、ＡＡＶＳ２など）、ＣＣＲ５、ＨＰＲＴ）の発現を促進するプロモーターによって駆動されるように挿入される。導入遺伝子は、プロモーターおよび／またはエンハンサー、例えば、構成的プロモーターまたは誘導性もしくは組織／細胞特異的プロモーターを含むことができる。ミニサークルベクターは導入遺伝子をコードすることができる。
【０２８９】
[00254]また、非コード核酸配列の標的挿入を達成することができる。アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ、およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードする配列はまた、標的挿入に使用され得る。
【０２９０】
[00255]導入遺伝子は、内因性遺伝子のすべて、一部が発現し、または全く発現しないように内因性遺伝子に挿入することができる。例えば、本明細書に記載される導入遺伝子は、例えば、導入遺伝子との融合として、内因性配列の一部（導入遺伝子に対してＮ末端および／またはＣ末端）が発現し、または発現しないように内因性遺伝子座に挿入することができる。他の場合では、導入遺伝子（例えば、内因性遺伝子などの追加のコード配列の有無にかかわらず）は、任意の内因性遺伝子座、例えばセーフハーバー遺伝子座に組み込まれる。例えば、ＴＣＲ導入遺伝子を内因性ＴＣＲ遺伝子に挿入することができる。導入遺伝子は、任意の遺伝子、例えば、本明細書に記載される遺伝子に挿入することができる。
【０２９１】
[00256]内因性配列（内因性または導入遺伝子の一部）が導入遺伝子により発現される場合、内因性配列は、完全長配列（野生型または突然変異体）または部分配列であり得る。内因性配列は機能的であり得る。これらの完全長配列または部分配列の機能の非限定的な例には、導入遺伝子（例えば、治療遺伝子）によって発現されるおよび／または担体として作用するポリペプチドの血清半減期の増加が含まれる。
【０２９２】
[00257]Ｔ細胞は、１つ以上の導入遺伝子を含むことができる。１つ以上の導入遺伝子は、抗原上の少なくとも１つのエピトープ（例えば、癌エピトープ）を認識して結合するか、または抗原上の突然変異されたエピトープに結合する、ＴＣＲアルファ、ベータ、ガンマ、および／またはデルタ鎖タンパク質を発現することができる。ＴＣＲは癌のｎｅｏ抗原に結合することができる。ＴＣＲは、機能的なＴＣＲであり得る。ＴＣＲは、本明細書に定義されるアルファ鎖またはベータ鎖配列の一方のみを含むことができ（例えば、それぞれさらなるアルファ鎖またはベータ鎖と組み合わせて）、または両方の鎖を含むことができる。ＴＣＲは、本明細書に定義されるガンマ鎖またはデルタ鎖配列の一方のみを含むことができ（例えば、それぞれさらなるガンマ鎖またはデルタ鎖と組み合わせて）、または両方の鎖を含むことができる。機能的ＴＣＲは、融合タンパク質において少なくとも実質的な生物学的活性を維持する。ＴＣＲのアルファ鎖および／またはベータ鎖の場合では、これは、両鎖が、（非修飾アルファ鎖および／もしくはベータ鎖、または別の融合タンパク質アルファ鎖および／もしくはベータ鎖を有する）Ｔ細胞受容体を形成することができる状態であることを意味し、その生物学的機能、特にＴＣＲの特定のペプチド−ＭＨＣ複合体への結合、および／またはペプチド活性化時に機能的なシグナル伝達を発揮する。ＴＣＲのガンマ鎖および／またはデルタ鎖の場合では、これは、両鎖が、（非修飾ガンマ鎖および／もしくはデルタ鎖、または別の融合タンパク質ガンマ鎖および／もしくはデルタ鎖を有する）Ｔ細胞受容体を形成できる状態であることを意味し、その生物学的機能、特にＴＣＲの特定のペプチド−ＭＨＣ複合体への結合、および／またはペプチド活性化時に機能的なシグナル伝達を発揮する。Ｔ細胞はまた、１つ以上のＴＣＲを含むことができる。Ｔ細胞はまた、１を超える標的に特異的な単一のＴＣＲを含むことができる。
【０２９３】
[00258]使用することができ、特に意図される導入遺伝子には、本明細書に開示する遺伝子、導入遺伝子、またはベクター、例えばＴＣＲ遺伝子に対して特定の同一性および／または相同性を示す遺伝子、ベクター、またはベクターカーゴが含まれ得る。したがって、本明細書に記載される配列が、（核酸またはタンパク質レベルで）少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは最大１００％の相同性を示すか、または少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは最大１００％の相同性を示す場合、導入遺伝子として使用し得ることが意図される。導入遺伝子を含むベクターは、表８の配列のいずれか１つにより記載することができる。導入遺伝子を含むベクターは、表８に記載されている任意の配列に対して約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または最大１００％までの同一性パーセントを有することができる。場合によっては、導入遺伝子が機能し得、導入遺伝子が導入されていないかまたは対称の導入遺伝子を受ける同等の細胞と比較して、約１０％、１５％、２０％、２５％  ３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または最大１００％に、操作された細胞の性能を増大させることができる。
【０２９４】
[00259]導入遺伝子を細胞に組み込むことができる。例えば、導入遺伝子を生物の生殖細胞系に組み込むことができる。導入遺伝子は、細胞に挿入された場合、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のコピーである相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）セグメントか、またはゲノムＤＮＡの元の領域に存在する遺伝子自体（イントロンの有無にかかわらず）のいずれかになり得る。タンパク質Ｘの導入遺伝子は、タンパク質Ｘをコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を指し得る。本明細書で使用するとき、場合によっては、タンパク質Ｘをコードする導入遺伝子は、タンパク質Ｘのアミノ酸配列の１００％または約１００％をコードする導入遺伝子であり得る。他の場合では、タンパク質Ｘをコードする導入遺伝子は、タンパク質Ｘのアミノ酸配列の少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、もしくは１％、または少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、もしくは１％をコードする導入遺伝子であり得る。導入遺伝子の発現は、最終的に、機能性タンパク質、例えば、部分的、完全、または過度に機能的なタンパク質をもたらす場合がある。上述のように、部分配列が発現された場合、最終的な結果は、非機能性タンパク質またはドミナントネガティブタンパク質になり得る。非機能性タンパク質またはドミナントネガティブタンパク質はまた、機能性（内因性または外因性）タンパク質と競合する場合がある。導入遺伝子はまた、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｍｉｃｒｏＲＮＡ）をコードすることができる。場合によっては、導入遺伝子がｍＲＮＡをコードする場合、これをポリペプチド（タンパク質など）に翻訳することができる。したがって、導入遺伝子はタンパク質をコードし得ることが意図される。導入遺伝子は、場合によっては、タンパク質またはタンパク質の一部をコードすることができる。さらに、タンパク質は、野生型ポリペプチドと比較して、１つ以上の突然変異（例えば、欠失、挿入、アミノ酸置換、または再配列）を有する場合がある。タンパク質は、天然のポリペプチドまたは人工のポリペプチド（例えば、組換えポリペプチド）であり得る。導入遺伝子は、２つ以上のポリペプチドによって形成される融合タンパク質をコードすることができる。Ｔ細胞は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、もしくはそれ以上の導入遺伝子を含むか、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、もしくはそれ以上の導入遺伝子を含むことができる。例えば、Ｔ細胞は、ＴＣＲ遺伝子を含む１つ以上の導入遺伝子を含むことができる。
【０２９５】
[00260]導入遺伝子（例えば、ＴＣＲ遺伝子）は、セーフハーバー遺伝子座に挿入することができる。セーフハーバーは、内在性の活性を乱すことなく導入遺伝子が組み込み、機能することができるゲノムの場所を含むことができる。例えば、１つ以上の導入遺伝子は、ＨＰＲＴ、ＡＡＶＳサイト（Ｅ．Ｇ．ＡＡＶＳ１、ＡＡＶＳ２、ＥＴＣ）、ＣＣＲ５、ｈＲＯＳＡ２６、および／またはそれらの任意の組み合わせのいずれか１つに挿入することができる。導入遺伝子（例えば、ＴＣＲ遺伝子）はまた、内在性の免疫チェックポイント遺伝子に挿入することができる。内因性免疫チェックポイント遺伝子は、刺激性チェックポイント遺伝子または阻害性チェックポイント遺伝子であり得る。導入遺伝子（例えば、ＴＣＲ遺伝子）はまた、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＣＤ１２２、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ１３７、ＣＤ２８、またはＩＣＯＳなどの刺激性チェックポイント遺伝子に挿入することができる。免疫チェックポイント遺伝子の場所は、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｕｉｌｄ  ３８パッチリリース２（ＧＲＣｈ３８．ｐ２）アセンブリを使用して提供される。導入遺伝子（例えば、ＴＣＲ遺伝子）はまた、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ−４、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、ＶＩＳＴＡまたはＣＩＳＨなどの内因性の阻害性チェックポイント遺伝子に挿入することができる。例えば、１つ以上の導入遺伝子は、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＣＤ１２２、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ１３７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ−４、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、ＶＩＳＴＡ、ＨＰＲＴ、ＡＡＶＳ部位（例えば、ＡＡＶＳ１、ＡＡＶＳ２など）、ＣＣＲ５、および／またはそれらの任意の組み合わせのいずれかに挿入することができる。内在性ＴＣＲ遺伝子に導入遺伝子を挿入することができる。導入遺伝子は、コーディングゲノム領域内に挿入することができる。導入遺伝子はまた、非コーディングゲノム領域内に挿入することができる。導入遺伝子は、相同組換えなしにゲノムに挿入することができる。導入遺伝子の挿入は、細胞内ゲノム移植のステップを含むことができる。導入遺伝子は、ＰＤ−１遺伝子に挿入することができる。場合によっては、１を超えるガイドは免疫チェックポイントを標的にすることができる。他の場合では、導入遺伝子をＣＴＬＡ−４遺伝子に組み込むことができる。他の場合では、導入遺伝子をＣＴＬＡ−４遺伝子およびＰＤ−１遺伝子に組み込むことができる。導入遺伝子はまた、ＡＡＶＳ１などのセーフハーバーに組み込むことができる。導入遺伝子は、ＡＡＶ組み込み部位に挿入することができる。ＡＡＶ組み込み部位は、場合によってはセーフハーバーになり得る。第５染色体のＡＡＶＳ２または第３染色体のＡＡＶＳ３などの代替のＡＡＶ組み込み部位が存在する場合がある。ＡＡＶＳ２、ＡＡＶＳ３、ＡＡＶＳ４、ＡＡＶＳ５、ＡＡＶＳ６、ＡＡＶＳ７、ＡＡＶＳ８などの追加のＡＡＶ組み込み部位はまた、ＴＣＲなどの外因性受容体可能な組み込み部位であるとみなされる。本明細書で使用されるとき、ＡＡＶＳは、ＡＡＶＳ１���ならびに関連するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶＳ）組み込み部位を指し得る。
【０２９６】
[00261]キメラ抗原受容体は、細胞外抗原認識ドメイン、膜貫通ドメイン、およびＴ細胞活性化を制御するシグナル伝達領域で構成することができる。細胞外抗原認識ドメインは、マウス、ヒト化または完全ヒトモノクローナル抗体に由来し得る。具体的には、細胞外抗原認識ドメインは、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の形態でクローニングされ、ヒンジおよび膜貫通ドメインを介してＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体の細胞内シグナル伝達分子に接続したモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖の可変領域、ならびに少なくとも１つの共刺激分子で構成される。場合によっては、共刺激ドメインは使用されない。
【０２９７】
[00262]細胞受容体などの導入遺伝子は、前記のように、ランダムまたは部位特異的な方法でＴ細胞のゲノムに挿入することができる。例えば、導入遺伝子は、Ｔ細胞のゲノムのランダムな遺伝子座に挿入することができる。これらの導入遺伝子は機能的であり、例えば、ゲノムのどこかに挿入されると完全に機能することができる。例えば、導入遺伝子は、それ自身のプロモーターをコードするか、または内在性プロモーターの制御下にある位置に挿入することができる。あるいは、導入遺伝子は、遺伝子のイントロンもしくは遺伝子のエクソン、プロモーター、または非コード領域などの遺伝子に挿入することができる。挿入が遺伝子、例えば内因性チェックポイントを破壊するように、導入遺伝子を挿入することができる。導入遺伝子の挿入は、内因性チェックポイント領域を含むことができる。導入遺伝子の挿入は、導入遺伝子に隣接することができる組換えアームによって誘導され得る。
【０２９８】
[00263]細胞受容体などの導入遺伝子の発現は、１つ以上のプロモーターによって制御することができる。プロモーターは、ユビキタスな構成的（関連遺伝子の連続転写を可能にする調節されないプロモーター）、組織特異的プロモーター、または誘導性プロモーターであり得る。プロモーターに隣接してまたはその近傍に挿入される導入遺伝子の発現を調節することができる。例えば、ユビキタスなプロモーターの近傍またはその隣りに導入遺伝子を挿入することができる。一部のユビキタスなプロモーターは、ＣＡＧＧＳプロモーター、ｈＣＭＶプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、またはＲＯＳＡ２６プロモーターであり得る。
【０２９９】
[00264]プロモーターは内因性または外因性であり得る。例えば、１つ以上の導入遺伝子を内因性または外因性ＲＯＳＡ２６プロモーターに隣接してまたは近傍に挿入することができる。さらに、プロモーターはＴ細胞に特異的であり得る。例えば、ブタＲＯＳＡ２６プロモーターに隣接してまたは近傍に１つ以上の導入遺伝子を挿入することができる。組織特異的プロモーターまたは細胞特異的プロモーターを使用して、発現の場所を制御することができる。例えば、１つ以上の導入遺伝子を組織特異的プロモーターに隣接してまたは近傍に挿入することができる。組織特異的プロモーターは、ＦＡＢＰプロモーター、Ｌｃｋプロモーター、ＣａｍＫＩＩプロモーター、ＣＤ１９プロモーター、ケラチンプロモーター、アルブミンプロモーター、ａＰ２プロモーター、インスリンプロモーター、ＭＣＫプロモーター、ＭｙＨＣプロモーター、ＷＡＰプロモーター、またはＣｏｌ２Ａプロモーターであり得る。
【０３００】
[00265]誘導性プロモーターも同様に使用することができる。これらの誘導性プロモーターは、誘導剤を追加または除去することにより、必要に応じてオンとオフを切り替えることができる。誘導性プロモーターは、限定されないが、Ｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ａｒａＢＡＤ、ｐｈｏＡ、ｒｅｃＡ、ｐｒｏＵ、ｃｓｔ−１、ｔｅｔＡ、ｃａｄＡ、ｎａｒ、ＰＬ、ｃｓｐＡ、Ｔ７、ＶＨＢ、ＭＸ、および／またはＴｒｅｘであり得ることが意図される。
【０３０１】
[00266]細胞は、内因性遺伝子をノックアウトするように操作され得る。ノックアウトされ得る内因性遺伝子には、免疫チェックポイント遺伝子が含まれ得る。免疫チェックポイント遺伝子は、刺激性チェックポイント遺伝子または阻害性チェックポイント遺伝子であり得る。免疫チェックポイント遺伝子の場所は、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｕｉｌｄ  ３８パッチリリース２（ＧＲＣｈ３８．ｐ２）アセンブリを使用して提供することができる。ノックアウトされる遺伝子は、データベースを用いて選択することができる。場合によっては、特定の内因性遺伝子がゲノム工学に対してより修正可能になる。データベースには、エピジェネティックに許容される標的部位を含めることができる。場合によっては、データベースをＥＮＣＯＤＥ（ＤＮＡエレメントの百科事典）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｇｏｖ／１０００５１０７）にすることができる。データベース化により、オープンクロマチンを含む領域を同定することができ、これは、ゲノム工学に対してより寛容になる。
【０３０２】
[00267]Ｔ細胞は、１つ以上の破壊された遺伝子を含むことができる。例えば、発現が破壊される１つ以上の遺伝子は、アデノシンＡ２ａ受容体（ＡＤＯＲＡ）、ＣＤ２７６、Ｔ細胞活性化阻害剤１を含むＶセットドメイン（ＶＴＣＮ１）、ＢおよびＴリンパ球関連（ＢＴＬＡ）、細胞傷害性Ｔ−リンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ１（ＩＤＯ１）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体、３つのドメイン、長い細胞質尾部、１（ＫＩＲ３ＤＬ１）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）、プログラム細胞死１（ＰＤ−１）、Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体２（ＨＡＶＣＲ２）、Ｔ細胞活性化のＶドメイン免疫グロブリンサプレッサー（ＶＩＳＴＡ）、ナチュラルキラー細胞受容体２Ｂ４（ＣＤ２４４）、サイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ）、アデノ随伴ウイルス組み込み部位（ＡＡＶＳ  ＳＩＴＥ（例えば、ＡＡＶＳ１、ＡＡＶＳ２など））、またはケモカイン（ＣＣモチーフ）受容体５（遺伝子／偽遺伝子）（ＣＣＲ５）、ＣＤ１６０分子（ＣＤ１６０）、ＩｇおよびＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）、ＣＤ９６分子（ＣＤ９６）、細胞傷害性および調節性Ｔ細胞分子（ＣＲＴＡＭ）、受容体１のような白血球関連免疫グロブリン（ＬＡＩＲ１）、レクチン７のようなシアル酸結合Ｉｇ（ＳＩＧＬＥＣ７）、レクチン９のようなシアル酸結合Ｉｇ（ＳＩＧＬＥＣ９）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１０ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１０ａ（ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ）、カスパーゼ８（ＣＡＳＰ８）、カスパーゼ１０（ＣＡＳＰ１０）、カスパーゼ３（ＣＡＳＰ３）、カスパーゼ６（ＣＡＳＰ６）、カスパーゼ７（ＣＡＳＰ７）、Ｆａｓ関連死ドメイン（ＦＡＤＤ）、Ｆａｓ細胞表面死受容体（ＦＡＳ）、形質転換増殖因子ベータ受容体ＩＩ（ＴＧＦＢＲＩＩ）、形質転換増殖因子ベータ受容体Ｉ（ＴＧＦＢＲ１）、ＳＭＡＤファミリーメンバー２（ＳＭＡＤ２）、ＳＭＡＤファミリーメンバー３（ＳＭＡＤ３）、ＳＭＡＤファミリーメンバー４  （ＳＭＡＤ４）、ＳＫＩ癌原遺伝子（ＳＫＩ）、ＳＫＩ様癌原遺伝子（ＳＫＩＬ）、ＴＧＦＢ誘導因子ホメオボックス１（ＴＧＩＦ１）、インターロイキン１０受容体サブユニットアルファ（ＩＬ１０ＲＡ）、インターロイキン１０受容体サブユニットベータ（ＩＬ１０ＲＢ）、ヘムオキシゲナーゼ２（ＨＭＯＸ２）、インターロイキン６受容体（ＩＬ６Ｒ）、インターロイキン６シグナルトランスデューサー（ＩＬ６ＳＴ）、ｃ−ｓｒｃチロシンキナーゼ（ＣＳＫ）、スフィンゴ糖脂質マイクロドメイン１（ＰＡＧ１）を有するリンタンパク質膜アンカー、膜貫通アダプター１（ＳＩＴ１）を調節するシグナル伝達閾値、フォークヘッドボックスＰ３（ＦＯＸＰ３）、ＰＲドメイン１（ＰＲＤＭ１）、塩基性ロイシンジッパー転写因子、ＡＴＦ様（ＢＡＴＦ）、グアニル酸シクラーゼ１、可溶性、アルファ２（ＧＵＣＹ１Ａ２）、グアニル酸シクラーゼ１、可溶性、アルファ３（ＧＵＣＹ１Ａ３）、グアニル酸シクラーゼ１、可溶性、ベータ２（ＧＵＣＹ１Ｂ���）、グアニル酸シクラーゼ１、可溶性、ベータ３（ＧＵＣＹ１Ｂ３）、サイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）、またはその任意の組み合わせのいずれか１つを含み得る。場合によっては、内因性ＴＣＲをノックアウトすることもできる。例えば、単に様々な組み合わせを説明するために、その発現が破壊される１つ以上の遺伝子は、ＰＤ−１、ＣＬＴＡ−４、およびＣＩＳＨを含むことができる。
【０３０３】
[00268]Ｔ細胞は、１つ以上の抑制された遺伝子を含むことができる。例えば、発現が抑制されている１つ以上の遺伝子は、アデノシンＡ２ａ受容体（ＡＤＯＲＡ）、ＣＤ２７６、Ｔ細胞活性化阻害剤１を含むＶセットドメイン（ＶＴＣＮ１）、ＢおよびＴリンパ球関連（ＢＴＬＡ）、細胞傷害性Ｔ−リンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ１（ＩＤＯ１）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体、３つのドメイン、長い細胞質尾部、１（ＫＩＲ３ＤＬ１）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）、プログラム細胞死１（ＰＤ−１）、Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体２（ＨＡＶＣＲ２）、Ｔ細胞活性化のＶドメイン免疫グロブリンサプレッサー（ＶＩＳＴＡ）、ナチュラルキラー細胞受容体２Ｂ４（ＣＤ２４４）、サイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ）、アデノ随伴ウイルス組み込み部位（ＡＡＶＳ１）、またはケモカイン（ＣＣモチーフ）受容体５（遺伝子／偽遺伝子）（ＣＣＲ５）、ＣＤ１６０分子（ＣＤ１６０）、ＩｇおよびＩＴＩＭを含むＴ細胞免疫受容体ドメイン（ＴＩＧＩＴ）、ＣＤ９６分子（ＣＤ９６）、細胞傷害性および調節性Ｔ細胞分子（ＣＲＴＡＭ）、白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）、レクチン７のようなシアル酸結合Ｉｇ（ＳＩＧＬＥＣ７）、レクチン９のようなシアル酸結合Ｉｇ（ＳＩＧＬＥＣ９）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１０ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１０ａ（ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ）、カスパーゼ８（ＣＡＳＰ８）、カスパーゼ１０（ＣＡＳＰ１０）、カスパーゼ３（ＣＡＳＰ３）、カスパーゼ６（ＣＡＳＰ６）、カスパーゼ７（ＣＡＳＰ７）、死ドメインを介したＦａｓ関連（ＦＡＤＤ）、Ｆａｓ細胞表面死レセプター（ＦＡＳ）、形質転換増殖因子ベータ受容体ＩＩ（ＴＧＦＢＲＩＩ）、形質転換増殖因子ベータ受容体Ｉ（ＴＧＦＢＲ１）、ＳＭＡＤファミリーメンバー２（ＳＭＡＤ２）、ＳＭＡＤファミリーメンバー３（ＳＭＡＤ３）、ＳＭＡＤファミリーメンバー４（ＳＭＡＤ４）、ＳＫＩプロト癌遺伝子（ＳＫＩ）、ＳＫＩ様プロト癌遺伝子（ＳＫＩＬ）、ＴＧＦＢ誘導因子ホメオボックス１（ＴＧＩＦ１）、インターロイキン１０受容体サブユニットアルファ（ＩＬ１０ＲＡ）、インターロイキン１０受容体サブユニットベータ（ＩＬ１０ＲＢ）、ヘムオキシゲナーゼ２（ＨＭＯＸ２）、インターロイキン６受容体（ＩＬ６Ｒ）、インターロイキン６シグナルトランスデューサー（ＩＬ６ＳＴ）、ｃ−ｓｒｃチロシンキナーゼ（ＣＳＫ）、糖スフィンゴ脂質マイクロドメインを有するリンタンパク質膜アンカー１（ＰＡＧ１）、膜貫通アダプターを調節するシグナル閾値１（ＳＩＴ１）、フォークヘッドボックスＰ３（ＦＯＸＰ３）、ＰＲドメイン１（ＰＲＤＭ１）、塩基性ロイシンジッパー転写因子、ＡＴＦ様（ＢＡＴＦ）、グアニル酸シクラーゼ１、可溶性、アルファ２（ＧＵＣＹ１Ａ２）、グアニル酸シクラーゼ１、可溶性、アルファ３（ＧＵＣＹ１Ａ３）、グアニル酸シクラーゼ１、可溶性、ベータ２（ＧＵＣＹ１Ｂ２）、グアニル酸シクラーゼ１、可溶��、ベータ３（ＧＵＣＹ１Ｂ３）、サイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）、またはその任意の組み合わせのいずれか１つを含み得る。例えば、単に様々な組み合わせを説明するために、その発現が抑制される１つ以上の遺伝子は、ＰＤ−１、ＣＬＴＡ−４、およびＣＩＳＨを含むことができる。
【０３０４】
[00269]修飾されたアデノ随伴ウイルスで修飾された細胞などの操作された細胞は、抗原を標的とすることができる。操作された細胞はまた、エピトープを標的にすることもできる。抗原は腫瘍細胞抗原であり得る。エピトープは腫瘍細胞エピトープであり得る。このような腫瘍細胞エピトープは、突然変異に起因する腫瘍の抗原（ｎｅｏ抗原またはｎｅｏエピトープ）、共有腫瘍特異抗原、分化抗原、および腫瘍において過剰発現された抗原など、多種多様な腫瘍抗原に由来し得る。これらの抗原は、いくつか例を挙げると、例えば、アルファ−アクチニン−４、ＡＲＴＣ１、ＢＣＲ−ＡＢＬ融合タンパク質（ｂ３ａ２）、Ｂ−ＲＡＦ、ＣＡＳＰ−５、ＣＡＳＰ−８、ベータ−カテニン、Ｃｄｃ２７、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＯＡ−１、ｄｅｋ−ｃａｎ融合タンパク質、ＥＦＴＵＤ２、伸長因子２、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１融合タンパク質、ＦＬＴ３−ＩＴＤ、ＦＮ１、ＧＰＮＭＢ、ＬＤＬＲ−フコシルトランスフェラーゼ融合タンパク質、ＨＬＡ−Ａ２ｄ、ＨＬＡ−Ａ１  １ｄ、ｈｓｐ７０−２、ＫＩＡＡＯ２０５、ＭＡＲＴ２、ＭＥ１、ＭＵＭ−１ｆ、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、ｎｅｏ−ＰＡＰ、ミオシンクラスＩ、ＮＦＹＣ、ＯＧＴ、ＯＳ−９、ｐ５３、ｐｍｌ−ＲＡＲａｌｐｈａ融合タンパク質、ＰＲＤＸ５、ＰＴＰＲＫ、Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、ＲＢＡＦ６００、ＳＩＲＴ２、ＳＮＲＰＤ１、ＳＹＴ−ＳＳＸ１−もしくは−ＳＳＸ２融合タンパク質、ＴＧＦ−ベータＲＩＩ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ＢＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−１、２、８、Ｇａｇｅ  ３、４、５、６、７、ＧｎＴＶｆ、ＨＥＲＶ−Ｋ−ＭＥＬ、ＫＫ−ＬＣ−１、ＫＭ−ＨＮ−１、ＬＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＧＥ−Ｃ２、ｍｕｃｉｎｋ、ＮＡ−８８、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−２、ＳＡＧＥ、Ｓｐ１７、ＳＳＸ−２、ＳＳＸ−４、ＴＡＧ−１、ＴＡＧ−２、ＴＲＡＧ−３、ＴＲＰ２−ＩＮＴ２ｇ、ＸＡＧＥ−１ｂ、ＣＥＡ、ｇｐ１００／Ｐｍｅｌ１７、カリクレイン４、マンマグロビンＡ、メランＡ／ＭＡＲＴ−１、ＮＹ−ＢＲ−１、ＯＡ１、ＰＳＡ、ＲＡＢ３８／ＮＹ−ＭＥＬ−１、ＴＲＰ−１／ｇｐ７５、ＴＲＰ−２、チロシナーゼ、アジポフィリン、ＡＩＭ−２、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＢＣＬＸ（Ｌ）、ＢＣＭＡ、ＢＩＮＧ−４、ＣＰＳＦ、サイクリンＤ１、ＤＫＫ１、ＥＮＡＨ（ｈＭｅｎａ）、ＥＰ−ＣＡＭ、ＥｐｈＡ３、ＥＺＨ２、ＦＧＦ５、Ｇ２５０／ＭＮ／ＣＡＩＸ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＩＬ１３Ｒアルファ２、腸内カルボキシルエステラーゼ、アルファフェトプロテイン、Ｍ−ＣＳＦＴ、ＭＣＳＰ、ｍｄｍ−２、ＭＭＰ−２、ＭＵＣ１、ｐ５３、ＰＢＦ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ、ＲＡＧＥ−１、ＲＧＳ５、ＲＮＦ４３、ＲＵ２ＡＳ、ｓｅｃｅｒｎｉｎ  １、ＳＯＸ１０、ＳＴＲＡＰ１、ＰＩＫ３、スルビビン、テロメラーゼ、ＶＥＧＦ、および／またはＷＴ１に由来し得る。腫瘍関連抗原は、宿主によって通常は発現されない抗原である。それらは、宿主によって通常発現される分子の突然変異、切断、誤った折り畳み、またはその他の異常な発現であり得る。それらは、通常は発現してい��が、異常に高レベルで発現している分子と同一である可能性がある。または、それらは異常な事情または環境で発現され得る。腫瘍関連抗原は、例えば、タンパク質またはタンパク質断片、複合炭水化物、ガングリオシド、ハプテン、核酸、他の生体分子またはそれらの任意の組み合わせであり得る。場合によっては、ホスファチジルイノシトール−４，５−ビスリン酸３−キナーゼ（ＰＩＫ３）、キルステンラット肉腫（ＫＲＡＳ）、またはＥｒｂｂ２相互作用タンパク質（ＥＲＢＢ２ＩＰ）（「ＭＢ」とも呼ばれる）遺伝子の抗原の一部またはエピトープは、操作された細胞を標的とすることができる。腫瘍抗原に特異的なＴＣＲ配列は、例えば国際公開第２０１７／０４８５９３Ａ１号および米国特許出願公開第２０１８／００３０１１０号に記載されように、配列決定によって容易に同定することができる。
【０３０５】
[00270]場合によっては、標的はｎｅｏ抗原またはｎｅｏエピトープである。例えば、ｎｅｏ抗原は、ＥＲＢＢ２ＩＰのＥ８０５Ｇ突然変異によってコードされ得る。ネオ抗原およびネオエピトープは、場合によっては全エクソーム配列決定によって同定することができる。ネオ抗原およびネオエピトープ標的は、場合によっては胃腸癌細胞によって発現され得る。ｎｅｏ抗原およびｎｅｏエピトープは、上皮癌で発現することができる。場合によっては、操作された細胞は、ネオ抗原やネオエピトープなどの普遍的抗原を標的とすることができる。
【０３０６】
[00271]エピトープは間質性エピトープであり得る。このようなエピトープは、腫瘍微小環境の間質上にあり得る。抗原は間質抗原であり得る。このような抗原は、腫瘍微小環境の間質上にあり得る。例えば、これらの抗原およびエピトープは、ほんの数例を挙げると、腫瘍内皮細胞、腫瘍血管系、腫瘍線維芽細胞、腫瘍周皮細胞、腫瘍間質、および／または腫瘍間葉細胞に存在し得る。これらの抗原は、例えば、ＣＤ３４、ＭＣＳＰ、ＦＡＰ、ＣＤ３１、ＰＣＮＡ、ＣＤ１１７、ＣＤ４０、ＭＭＰ４、および／またはテネイシンを含むことができる。
ＣＲＩＳＰＲシステム
[00272]本明細書に記載される方法は、ＣＲＩＳＰＲシステムを利用することができる。少なくとも５種類のＣＲＩＳＰＲシステムがあり、これらはすべてＲＮＡおよびＣａｓタンパク質を組み込む。タイプＩ、ＩＩＩ、およびＩＶは、ｃｒＲＮＡに相補的である核酸を切断することができるマルチＣａｓタンパク質複合体をアセンブルする。タイプＩとＩＩＩはともに、処理されたｃｒＲＮＡをマルチＣａｓタンパク質複合体にアセンブルする前に、ｃｒ−ＲＮＡ前処理を必要とする。タイプＩＩおよびＶのＣＲＩＳＰＲシステムは、少なくとも１つの誘導ＲＮＡと複合化した単一のＣａｓタンパク質を含む。
【０３０７】
[00273]ＣＲＩＳＰＲシステムの一般的なメカニズムおよび最近の進歩については、Ｃｏｎｇ，Ｌ．ら，「Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ  ｓｙｓｔｅｍｓ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３９巻（６１２１号）：８１９−８２３頁（２０１３年）；Ｆｕ，  Ｙ．ら，「Ｈｉｇｈ−ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ」，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３１巻，８２２〜８２６頁（２０１３年）；Ｃｈｕ，ＶＴら「Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｒｅｐａｉｒ  ｆｏｒ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｒｅｃｉｓｅ  ｇｅｎｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ」，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３３巻，５４３〜５４８頁（２０１５年）；Ｓｈｍａｋｏｖ，Ｓ．ら，「Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｖｅｒｓｅ  Ｃｌａｓｓ  ２  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ」，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ，６０巻，１〜１３頁（２０１５年）；Ｍａｋａｒｏｖａ，ＫＳら，「Ａｎ  ｕｐｄａｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ」，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１３巻，１〜１５頁（２０１５年）に検討されている。標的ＤＮＡの部位特異的切断は、１）ガイドＲＮＡと標的ＤＮＡとの間の塩基対相補性（プロトスペーサーとも呼ばれる）と、２）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる標的ＤＮＡの短いモチーフの両方によって決定される場所で生じる。例えば、操作された細胞は、ＣＲＩＳＰＲシステム、例えば、タイプＩＩ  ＣＲＩＳＰＲシステムを使用して生成させることができる。本明細書に開示される方法において使用されるＣａｓ酵素は、ＤＮＡ切断を触媒するＣａｓ９であり得る。化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）由来のＣａｓ９または任意の密接に関連するＣａｓ９による酵素作用により、ガイド配列の２０ヌクレオチドにハイブリダイズし、標的配列の２０ヌクレオチドに続くプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を有する標的部位配列に二本鎖切断が生じ得る。
【０３０８】
[00274]ベクターは、Ｃａｓタンパク質（ＣＲＩＳＰＲ関連（CRISPR-associated）タンパク質）などのＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に連結され得る。Ｃａｓタンパク質の非限定的な例には、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１またはＣｓｘ１２とも呼ばれる）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ、ＣｓＸ、ＣｓＸ、ＣｓＸ、ＣｓＸ、Ｃｓｘ、ＣｓＸ、Ｃｓｘ、ＣｓＸ、Ｃｓｘ、ＣｓＸ、Ｃｓｘ、Ｃｓｘ、Ｃｓｆ２、ＣｓＯ、Ｃｓｆ４、Ｃｐｆ１、ｃ２ｃ１、ｃ２ｃ３、Ｃａｓ９ＨｉＦｉ、それらの相同体、またはそれらの修飾バージョンが含まれ得る。修飾されていないＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９などのＤＮＡ切断活性を有することができる。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列内および／または標的配列の相補体内などの標的配列での一方または両方の鎖の切断を指向することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の最初または最後のヌクレオチドから１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、５００、もしくはそれ以上の塩基対内、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、５００、もしくはそれ以上の塩基対内で一方または両方の鎖の切断を指向することができる。突然変異されたＣＲＩＳＰＲ酵素が標的配列を含む標的ポリヌクレオチドの一方または両方の鎖を切断する能力を欠くように、対応する野生型酵素に関して突然変異したＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするベクターを使用することができる。Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９ＨｉＦｉなどの高忠実度Ｃａｓタンパク質であり得る。
【０３０９】
【表７】
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【０３１０】
[00275]Ｃａｓ９は、野生型の例示的なＣａｓ９ポリペプチド（例えば、化膿連鎖球菌由来のＣａｓ９）と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％の配列同一性および／もしくは配列類似性、または少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％の配列同一性および／もしくは配列類似性を有するポリペプチドを指すことができる。Ｃａｓ９は、野生型の例示的なＣａｓ９ポリペプチド（例えば、化膿連鎖球菌由来）と最大で５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％の配列同一性および／もしくは配列類似性、または最大で約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％の配列同一性および／もしくは配列類似性を有するポリペプチドを指し得る。Ｃａｓ９は、Ｃａｓ９タンパク質の野生型、または欠失、挿入、置換、変異、突然変異、融合、キメラ、もしくはそれらの任意の組み合わせなどのアミノ酸変化を含むことができるＣａｓ９タンパク質の修飾形態を指すことができる。Ｃａｓ９は、配列番号５６に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の配列同一性および／もしくは配列類似性、または少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の配列同一性および／もしくは配列類似性を有するポリペプチドを指すことができる。本明細書に開示される配列同一性は、２つの配列間の同一性パーセントを決定することにより計算することができる。例えば、同一性パーセントは、配列対の一致した数に１００を掛け、整列した領域の長さで割ることによって計算することができる。いくつか例を挙げると、例えば、ＬＡＬＩＧＮ、ＦＦＡＳ、ＢＬＡＳＴ、ＧｅｎｅＷｉｓｅ、ＳＩＭ、ＳＳＥＡなどの様々な配列アライメントプログラムを利用することができる。
【０３１１】
[00276]エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド（例えば、Ｃａｓ９などのＣａｓタンパク質）は、真核細胞などの特定の細胞における発現のためにコドン最適化することができる。このタイプの最適化では、同じタンパク質をエンコードしながら、意図された宿主生物または細胞のコドン優先度を模倣するために、外来由来（例えば、組換え）ＤＮＡの突然変異を伴うことがある。
【０３１２】
[00277]エンドヌクレアーゼは、野生型の例示的な部位特異的ポリペプチド（例えば、化膿連鎖球菌由来のＣａｓ９）のヌクレアーゼドメインに対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、もしくは１００％のアミノ酸配列同一性、または少なくとも約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、もしくは１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
【０３１３】
[00278]表７の化膿連鎖球菌Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）は、ゲノム工学のためのＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼとして一般的に使用されるが、それはすべての標的切除部位に対して最良のエンドヌクレアーゼではない場合がある。例えば、ＳｐＣａｓ９（５’ＮＧＧ３’）のＰＡＭ配列は、ヒトゲノムの全体にわたって豊富に存在するが、ＮＧＧ配列は、修飾のために所望の遺伝子を標的とするために常に正しく配置されるとは限らない。場合によっては、特定のゲノム標的を標的にするために、異なるエンドヌクレアーゼを使用することができる。場合によっては、非ＮＧＧ  ＰＡＭ配列を有する合成ＳｐＣａｓ９由来の変異を使用することができる。さらに、様々な種由来の他のＣａｓ９オルソログが同定されており、これらの「非ＳｐＣａｓ９」はまた、本発明に有用であり得る様々なＰＡＭ配列に結合する。例えば、サイズが比較的大きいＳｐＣａｓ９（約４ｋｂのコード配列）は、ＳｐＣａｓ９  ｃＤＮＡを保有するプラスミドが細胞内で常に効率的に発現されるとは限らないことを意味する。逆に、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）のコード配列は、ＳｐＣａｓ９よりも約１キロベース短く、細胞内で効率的に発現される可能性がある。ＳｐＣａｓ９と同様に、ＳａＣａｓ９エンドヌクレアーゼは、インビトロでの哺乳動物細胞およびインビボでのマウスの標的遺伝子を修飾できる。
【０３１４】
[00279]化膿連鎖球菌Ｃａｓ９の代替物には、哺乳動物細胞において切断活性を示すＣｐｆ１ファミリーからのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが含まれ得る。Ｃａｓ９ヌクレアーゼとは異なり、Ｃｐｆ１を介したＤＮＡ切断の結果は、短い３’突出部を伴う二本鎖切断である。Ｃｐｆ１の互い違いの切断パターンは、従来の制限酵素クローニングと同様に、遺伝子編集の効率を高めることができる、指向性のある遺伝子導入の可能性を開くことができる。前記のＣａｓ９変異体およびオルソログと同様に、Ｃｐｆ１はまた、ＣＲＩＳＰＲによって標的化され得る部位数を、ＳｐＣａｓ９が好むＮＧＧ  ＰＡＭサイトを欠損するＡＴリッチ領域またはＡＴリッチゲノムに拡張することができる。
【０３１５】
[00280]ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、標的ＤＮＡに特異的であり得るＲＮＡを指すことができ、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成することができる。ガイドＲＮＡは、標的部位を特定し、切断のために特定された標的ＤＮＡにＲＮＡ／Ｃａｓ複合体を導くガイド配列またはスペーサー配列を含み得る。場合によっては、ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ複合体を３つの遺伝子に標的化し、標的化された二本鎖切断を行うことができる。標的ＤＮＡの部位特異的切断は、１）ガイドＲＮＡと標的ＤＮＡの間の塩基対相補性（プロトスペーサーとも呼ばれる）と、２）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる標的ＤＮＡの短いモチーフの両方によって決定される場所で生じる。誘導ポリ核酸は、例えば、Ｂｅｎｃｈｌｉｎｇ、ＭＩＴ、またはＷｅｌｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔツールなどの公衆に利用可能なソフトウェアを用いて、当業者に公知である方法を使用して設計することができる。
【０３１６】
[00281]本明細書に開示される方法はまた、少なくとも１つのガイドＲＮＡまたは核酸、例えば、少なくとも１つのガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ、を細胞または胚に導入することを含めることができる。ガイドＲＮＡは、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼと相互作用して、エンドヌクレアーゼを特定の標的部位に指向する。この部位では、ガイドＲＮＡの５’末端が染色体配列の特定のプロトスペーサー配列と対をなす。
【０３１７】
[00282]ガイドＲＮＡは、２つのＲＮＡ、例えば、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含むことができる。ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの一部（例えば、機能的な部分）の融合によって形成される単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含み得る。ガイドＲＮＡはまた、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む二重ＲＮＡであり得る。ガイドＲＮＡはｃｒＲＮＡを含み、ｔｒａｃｒＲＮＡを欠損している場合がある。さらに、ｃｒＲＮＡは、標的ＤＮＡまたはプロトスペーサー配列とハイブリダイズすることができる。
【０３１８】
[00283]前記で検討したように、ガイドＲＮＡは発現産物であり得る。例えば、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、ガイドＲＮＡをコードする配列を含むベクターであり得る。ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡをコードする配列およびプロモーターを含む単離されたガイドＲＮＡまたはプラスミドＤＮＡで細胞または生物をトランスフェクトすることにより、細胞または生物に移入することができる。ガイドＲＮＡはまた、ウイルスが媒介した遺伝子送達の使用など、他の方法で細胞または生物に移入することができる。
【０３１９】
[00284]ガイドＲＮＡを単離することができる。例えば、ガイドＲＮＡは、単離されたＲＮＡの形態で細胞または生物にトランスフェクトすることができる。ガイドＲＮＡは、インビトロ転写システムを使用したインビトロ転写によって調製され得る。ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡのコード配列を含むプラスミドの形態というよりはむしろ、単離されたＲＮＡの形態で細胞に導入することができる。
【０３２０】
[00285]ガイドＲＮＡは、ＤＮＡ標的化セグメントおよびタンパク質結合セグメントを含むことができる。ＤＮＡ標的セグメント（またはＤＮＡ標的配列、またはスペーサー配列）は、標的ＤＮＡ内の特定の配列（例えば、プロトスペーサー）に相補的であり得るヌクレオチド配列を含む。タンパク質結合セグメント（またはタンパク質結合配列）は、部位特異的修飾ポリペプチド、例えば、Ｃａｓタンパク質などのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼと相互作用することができる。「セグメント」とは、分子のセグメント／セクション／領域、例えば、ＲＮＡ内の連続したヌクレオチドのストレッチを意味する。セグメントはまた、セグメントが１を超える分子の領域を含むことができるように、複合体の領域／セクションを意味する場合がある。例えば、場合によっては、ＤＮＡ標的ＲＮＡのタンパク質結合セグメントは１つのＲＮＡ分子であり、したがってタンパク質結合セグメントはそのＲＮＡ分子の領域を含む。他の場合では、ＤＮＡ標的ＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、相補性の領域に沿ってハイブリダイズする２つの別個の分子を含む。
【０３２１】
[00286]ガイドＲＮＡは、２つの別個のＲＮＡ分子または単一のＲＮＡ分子を含むことができる。例示的な単一分子ガイドＲＮＡは、ＤＮＡ標的セグメントとタンパク質結合セグメントの両方を含む。
【０３２２】
[00287]例示的な２分子ＤＮＡ標的ＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ様（「ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ」または「ターゲッター（ｔａｒｇｅｔｅｒ）ＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡ反復」）分子および対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様（「トランス作用性ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ」または「アクティベーターＲＮＡ」または「ｔｒａｃｒＲＮＡ」）分子を含み得る。第１のＲＮＡ分子は、ｃｒＲＮＡ様分子（ターゲッターＲＮＡ）であり、ＤＮＡ標的セグメント（例えば、スペーサー）、およびガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントを含む二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）二重鎖の半分を形成することができるヌクレオチドのストレッチを含み得る。第２のＲＮＡ分子は、ガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖の他の半分を形成することができるヌクレオチドのストレッチを含み得る対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様分子（アクティベーターＲＮＡ）であり得る。言い換えれば、ｃｒＲＮＡ様分子のヌクレオチドのストレッチは、ｔｒａｃｒＲＮＡ様分子のヌクレオチドのストレッチと相補的であり、それとハイブリダイズして、ガイドＲＮＡのタンパク質結合ドメインのｄｓＲＮＡ二重鎖を形成することができる。そのため、各ｃｒＲＮＡ様分子は、対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様分子を有していると言うことができる。さらに、ｃｒＲＮＡ様分子は、一本鎖ＤＮＡ標的セグメント、またはスペーサー配列を提供することができる。したがって、ｃｒＲＮＡ様およびｔｒａｃｒＲＮＡ様分子（対応する対として）はハイブリダイズして、ガイドＲＮＡを形成することができる。主題の２分子ガイドＲＮＡは、任意の対応するｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの対を含むことができる。
【０３２３】
[00288]ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的セグメントまたはスペーサー配列は、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的セグメントが標的部位またはプロトスペーサーと塩基対を形成することができるように、染色体配列（例えば、プロトスペーサー配列）の標的部位で配列に相補的であり得る。場合によっては、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的セグメントは、（約）１０ヌクレオチドから（約）２５ヌクレオチドまたは以上を含むことができる。例えば、ガイドＲＮＡの第１の領域と染色体配列の標的部位との間の塩基対形成の領域は、長さが（約）１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５であるかまたは２５を超えるヌクレオチドであり得る。時には、ガイドＲＮＡの第１の領域は、長さ（約）１９、２０、または２１ヌクレオチドであり得る。
【０３２４】
[00289]ガイドＲＮＡは、（約）２０ヌクレオチドの核酸配列を標的とすることができる。標的核酸は、（約）２０ヌクレオチド未満であり得る。標的核酸は、少なくとも（約）５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０またはそれ以上のヌクレオチドであり得る。標的核酸は、最大で約５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０またはそれ以上のヌクレオチドであり得る。標的核酸配列は、ＰＡＭの第１のヌクレオチドのすぐ５’の（約）１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０塩基であり得る。ガイドＲＮＡは、核酸配列を標的にすることができる。
【０３２５】
[00290]ガイド核酸、例えばガイドＲＮＡは、別の核酸、例えば細胞のゲノム中の標的核酸またはプロトスペーサーにハイブリダイズすることができる核酸を指すことができる。ガイド核酸はＲＮＡであり得る。ガイド核酸はＤＮＡであり得る。ガイド核酸は、核酸配列に部位特異的に結合するようにプログラムまたは設計することができる。ガイド核酸はポリヌクレオチド鎖を含むことができ、単一ガイド核酸と呼ばれることがある。ガイド核酸は２つのポリヌクレオチド鎖を含むことができ、二重ガイド核酸と呼ばれることがある。
【０３２６】
[00291]ガイド核酸は、核酸に新しいまたは増大された特徴を提供するための１つ以上の修飾を含むことができる。ガイド核酸は、核酸親和性タグを含むことができる。ガイド核酸は、合成ヌクレオチド、合成ヌクレオチド類似体、ヌクレオチド誘導体、および／または修飾ヌクレオチドを含むことができる。
【０３２７】
[00292]ガイド核酸は、例えば、５’末端または３’末端でまたはその近傍に、標的核酸（例えば、プロトスペーサー）の配列にハイブリダイズできるヌクレオチド配列（例えば、スペーサー）を含むことができる。ガイド核酸のスペーサーは、ハイブリダイゼーション（すなわち、塩基対形成）を介して配列特異的な方法で標的核酸と相互作用することができる。スペーサー配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５’または３’に位置する標的核酸にハイブリダイズすることができる。スペーサー配列の長さは、少なくとも５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０もしくはそれ以上のヌクレオチド、または少なくとも約５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０もしくはそれ以上のヌクレオチドであり得る。スペーサー配列の長さは、最大で５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０もしくはそれ以上のヌクレオチド、または最大で約５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０もしくはそれ以上のヌクレオチドであり得る。
であり得る。
【０３２８】
[00293]ガイドＲＮＡは、二次構造を形成するｄｓＲＮＡ二重鎖領域も含むことができる。例えば、ガイドＲＮＡによって形成される二次構造は、ステム（またはヘアピン）およびループを含むことができる。ループおよびステムの長さは変化し得る。例えば、ループは、長さが約３〜約１０ヌクレオチドの範囲であり得、ステムは、長さが約６〜約２０塩基対の範囲であり得る。ステムは、１〜約１０ヌクレオチドの１つ以上のバルジを含むことができる。第２の領域の全長は、長さが約１６〜約６０ヌクレオチドの範囲であり得る。例えば、ループは、長さが４ヌクレオチドであり得るかまたは約４ヌクレオチドであり得、ステムは、１２塩基対であり得るかまたは約１２塩基対であり得る。ｄｓＲＮＡ二重鎖領域は、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼなどのＲＮＡ結合タンパク質、例えば、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成できるタンパク質結合セグメントを含むことができる。
【０３２９】
[00294]ガイドＲＮＡはまた、本質的に一本鎖であり得る、５’または３’末端に尾部領域を含むことができる。例えば、尾部領域は、目的の細胞のいずれもの染色体配列と相補的でない場合があり、ガイドＲＮＡの残りの部分と相補的でない場合もある。さらに、尾部領域の長さは変化し得る。尾部領域は、長さが４ヌクレオチド以上または約４ヌクレオチド以上であり得る。例えば、尾部領域の長さは、長さが５ヌクレオチド〜６０ヌクレオチド、または約５ヌクレオチド〜約６０ヌクレオチドの範囲であり得る。
【０３３０】
[00295]ガイドＲＮＡは、ＲＮＡ分子として細胞または胚に導入することができる。例えば、ＲＮＡ分子は、インビトロで転写され得、および／または化学的に合成され得る。次に、ガイドＲＮＡをＲＮＡ分子として細胞または胚に導入することができる。ガイドＲＮＡはまた、非ＲＮＡ核酸分子、例えば、ＤＮＡ分子の形態で細胞または胚に導入することができる。例えば、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、目的の細胞または胚においてガイドＲＮＡを発現させるためのプロモーター制御配列に作動可能に連結され得る。ＲＮＡコーディング配列は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ  ＩＩＩ）により認識されるプロモーター配列に作動可能に連結され得る。
【０３３１】
[00296]ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ分子はまた線状であり得る。ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ分子はまた環状であり得る。
[00297]ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ配列はまた、ベクターの一部であり得る。ベクターのいくつかの例には、プラスミドベクター、ファージミド、コスミド、人工／ミニ染色体、トランスポゾン、およびウイルスベクターが含まれる。例えば、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡは、プラスミドベクターに存在する。適切なプラスミドベクターの他の非限定的な例には、ｐＵＣ、ｐＢＲ３２２、ｐＥＴ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、およびそれらの変異体が含まれる。さらに、ベクターは、追加の発現制御配列（例えば、エンハンサー配列、コザック配列、ポリアデニル化配列、転写終結配列など）、選択可能なマーカー配列（例えば、抗生物質耐性遺伝子）、複製起点などを含むことができる。
【０３３２】
[00298]ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼとガイドＲＮＡの両方がＤＮＡ分子として細胞内に導入された場合、各々は、別個の分子の一部であり得る（例えば、融合タンパク質コード配列を含む１つのベクターおよびガイドＲＮＡコード配列を含む第２のベクターである）か、または両方が同じ分子（例えば、融合タンパク質とガイドＲＮＡの両方のコーディング（および調節）配列を含む１つのベクター）の一部であり得る。
【０３３３】
[00299]Ｃａｓ９タンパク質またはその任意の誘導体などのＣａｓタンパク質は、ガイドＲＮＡと予め複合体化されて、リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成することができる。ＲＮＰ複合体は、初代免疫細胞に導入することができる。ＲＮＰ複合体の導入は、タイミングを合わせることができる。細胞は、細胞周期のＧ１、Ｓ、および／またはＭ期で他の細胞と同期することができる。ＲＮＰ複合体は、ＨＤＲが増大されるように細胞期で送達され得る。ＲＮＰ複合体は、相同性指向型修復を促進することができる。
【０３３４】
[00300]ガイドＲＮＡはまた修飾することができる。修飾は、化学的変更、合成修飾、ヌクレオチド付加、および／またはヌクレオチド減算を含むことができる。修飾は、ＣＲＩＳＰＲゲノム工学を増大させることができる。修飾は、ｇＲＮＡのキラリティを変更することができる。場合によっては、キラリティは、変更後、均一または立体的に純粋であり得る。ガイドＲＮＡを合成することができる。合成されたガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲゲノム工学を増大させることができる。ガイドＲＮＡはまた切断することができる。切断は、望ましくないオフターゲット突然変異誘発を減らすために使用され得る。切断は、任意の数のヌクレオチド欠失を含むことができる。例えば、切断は、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、またはそれ以上のヌクレオチドを含むことができる。ガイドＲＮＡは、任意の長さの標的相補性の領域を含むことができる。例えば、標的相補性の領域は、長さが２０ヌクレオチド未満であり得る。標的相補性の領域は、長さが２０ヌクレオチドを超える場合がある。
【０３３５】
[00301]場合によっては、二本鎖切断を導入するために二重ニッカーゼアプローチを使用することができる。Ｃａｓタンパク質は、いずれかのヌクレアーゼドメイン内の公知のアミノ酸で突然変異することができ、それにより１つのヌクレアーゼドメインの活性が削除され、一本鎖切断を生成できるニッカーゼＣａｓタンパク質が生成される。ニッカーゼと反対鎖を標的とする２つの異なるガイドＲＮＡを利用して、標的部位内にＤＳＢを生成できる（しばしば「ダブルニック」または「二重ニッカーゼ」ＣＲＩＳＰＲシステムと呼ばれる）。このアプローチは、ＤＳＢを引き起こすのに十分な近さで２つのオフターゲットニックが生成される可能性が低いため、標的の特異性を劇的に高めることができる。
【０３３６】
[00302]場合によっては、ＧＵＩＤＥ−Ｓｅｑ分析を行って、操作されたガイドＲＮＡの特異性を決定することができる。ＣＲＩＳＰＲシステムのヌクレアーゼによるオフターゲット切断のＧＵＩＤＥ−Ｓｅｑプロファイリングの一般的なメカニズムとプロトコールは、Ｔｓａｉ，Ｓ．ら，「ＧＵＩＤＥ−Ｓｅｑ  ｅｎａｂｌｅｓ  ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｂｙ  ＣＲＩＳＰＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ」，Ｎａｔｕｒｅ，３３巻：１８７〜１９７頁（２０１５）において検討されている。
【０３３７】
[00303]ｇＲＮＡは、任意の機能的濃度で導入され得る。例えば、ｇＲＮＡは、１０マイクログラムで細胞に導入することができる。他の場合では、ｇＲＮＡは、０．５マイクログラムから１００マイクログラムで導入することができる。ｇＲＮＡは、０．５、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００マイクログラムから導入することができる。
【０３３８】
[00304]場合によっては、方法は、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１Ｓ、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、ＣｓＯ、Ｃｓｆ４、Ｃｐｆ１、ｃ２ｃ１、ｃ２ｃ３、Ｃａｓ９ＨｉＦｉ、それらの相同体またはそれらの修飾バージョンからなる群から選択されるエンドヌクレアーゼを含むことができる。Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９であり得る。場合によっては、方法は、少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をさらに含むことができる。ｇＲＮＡは、少なくとも１つの修飾を含むことができる。外因性ＴＣＲは、癌の新抗原に結合することができる。
【０３３９】
[00305]本明細書では、操作された細胞を作製する方法であって、少なくとも１つの外因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）受容体配列をコードする少なくとも１つのポリ核酸を導入するステップ；少なくとも１つの修飾を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を導入するステップ；および少なくとも１つのエンドヌクレアーゼを導入するステップを含み、ｇＲＮＡは、少なくとも１つの内因性ゲノムに相補的な少なくとも１つの配列を含む方法が開示される。場合によっては、修飾は、５’末端、３’末端、５’末端から３’末端、単一の塩基修飾、２’リボース修飾、またはそれらの任意の組み合わせで行われる。修飾は、塩基置換、挿入、欠失、化学修飾、物理修飾、安定化、精製、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択することができる。
【０３４０】
[00306]場合によっては、修飾は化学修飾である。修飾は、５’アデニル酸、５’グアノシン三リン酸キャップ、５’Ｎ７−メチルグアノシン三リン酸キャップ、５’三リン酸キャップ、３’リン酸、３’チオリン酸、５’リン酸、５’チオリン酸、Ｃｉｓ−Ｓｙｎチミジン二量体、三量体、Ｃ１２スペーサー、Ｃ３スペーサー、Ｃ６スペーサー、ｄスペーサー、ＰＣスペーサー、ｒスペーサー、スペーサー１８、スペーサー９、３’−３’修飾、５’−５’修飾、脱塩基、アクリジン、アゾベンゼン、ビオチン、ビオチンＢＢ、ビオチンＴＥＧ、コレステリルＴＥＧ、デスチオビオチンＴＥＧ、ＤＮＰ  ＴＥＧ、ＤＮＰ−Ｘ、ＤＯＴＡ、ｄＴ−ビオチン、二重ビオチン、ＰＣビオチン、ソラレンＣ２、ソラレンＣ６、ＴＩＮＡ、３’ＤＡＢＣＹＬ、ブラックホールクエンチャー１、ブラックホールクエンチャー２、ＤＡＢＣＹＬ  ＳＥ、ｄＴ−ＤＡＢＣＹＬ、ＩＲＤｙｅ  ＱＣ−１、ＱＳＹ−２１、ＱＳＹ−３５、ＱＳＹ−７、ＱＳＹ−９、カルボキシルリンカー、チオールリンカー、２’デオキシリボヌクレオシドアナログプリン、２’デオキシリボヌクレオシドアナログピリミジン、リボヌクレオシドアナログ、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオシド類似体、糖修飾類似体、ゆらぎ／ユニバーサル塩基、蛍光色素ラベル、２’フルオロＲＮＡ、２’Ｏ−メチルＲＮＡ、メチルホスホネート、ホスホジエステルＤＮＡ、ホスホジエステルＲＮＡ、ホスホチオエートＤＮＡ、ホスホロチオエートＲＮＡ、ＵＮＡ、プソイドウリジン−５’−三リン酸、５−メチルシチジン−５’−三リン酸、２−Ｏ−メチル３ホスホロチオエート、またはそれらの任意の組み合わせから選択され得る。修飾は、プソイドウリジン修飾であり得る。場合によっては、修飾は生存率に影響しない。
【０３４１】
[00307]場合によっては、修飾は、２−Ｏ−メチル３ホスホロチオエート付加である。２−Ｏ−メチル３ホスホロチオエート付加は、１塩基から１５０塩基で行うことができる。２−Ｏ−メチル３ホスホロチオエート付加は、１塩基から４塩基で行うことができる。２−Ｏ−メチル３ホスホロチオエート付加は、２塩基で行うことができる。２−Ｏ−メチル３ホスホロチオエート付加は、４塩基で行うことができる。修飾はまた切断することができる。切断は、５塩基切断であり得る。
【０３４２】
[00308]場合によっては、５塩基切断は、Ｃａｓタンパク質が切断を行うのを防ぐことができる。エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲシステム、ＴＡＬＥＮ、亜鉛フィンガー、トランスポゾンベース、ＺＦＮ、メガヌクレアーゼ、Ｍｅｇａ−ＴＡＬ、および任意の組み合わせからなる群から選択することができる。エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼであり得る。Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１Ｓ、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、ＣｓＯ、Ｃｓｆ４、Ｃｐｆ１、ｃ２ｃ１、ｃ２ｃ３、Ｃａｓ９ＨｉＦｉ、それらの相同体またはそれらの修飾バージョンからなる群から選択され得る。Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、配列番号２２１の配列に対して、少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは最大約１００％、または少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは最大約１００％の配列同一性および／または配列類似性を有することができる。Ｃａｓの修飾バージョンは、クリーンなＣａｓであり得る。Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９であり得る。Ｃａｓ９は、前記少なくとも１つの内因性ゲノムに二本鎖切断を引き起こすことができる。場合によっては、内因性ゲノムは、少なくとも１つの遺伝子を含む。遺伝子は、ＣＩＳＨ、ＰＤ−１、ＴＲＡ、ＴＲＢ、またはそれらの組み合わせであり得る。場合によっては、二本鎖切断は、相同性指向修復（ＨＲ）、非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）、マイクロホモロジー媒介性の末端結合（ＭＭＥＪ）、またはそれらの任意の組み合わせもしくは誘導体を使用して修復することができる。ＴＣＲは、二本鎖切断に組み込むことができる。
【０３４３】
[00309]Ｔ細胞は、１つ以上の破壊された標的遺伝子および１つ以上の導入遺伝子、例えば、受容体を含むことができる。例えば、その発現が破壊される１つ以上の標的遺伝子は、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＣＤ１２２、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ１３７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ−４、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、ＶＩＳＴＡ、ＣＩＳＨ、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ、および／またはそれらの任意の組み合わせのいずれか１つを含むことができる。例えば、単に様々な組み合わせを説明するために、その発現が破壊される１つ以上の遺伝子はＰＤ−１を含むことができ、１つ以上の導入遺伝子はＴＣＲを含む。別の例では、その発現が破壊される１つ以上の標的遺伝子はまたＣＴＬＡ−４を含むことができ、１つ以上の導入遺伝子はＴＣＲを含む。破壊は、破壊された遺伝子またはその一部のゲノム転写物のコピー数の減少をもたらし得る。例えば、破壊され得る標的遺伝子は、破壊されていない細胞内の同じ標的遺伝子と比較して、転写物量が減少している可能性がある。破壊は、１４５コピー／μＬ、１４０コピー／μＬ、１３５コピー／μＬ、１３０コピー／μＬ、１２５コピー／μＬ、１２０コピー／μＬ、１１５コピー／μＬ、１１０コピー／μＬ、１０５コピー／μＬ、１００コピー／μＬ、９５コピー／μＬ、１９０コピー／μＬ、１８５コピー／μＬ、８０コピー／μＬ、７５コピー／μＬ、７０コピー／μＬ、６５コピー／μＬ、６０コピー／μＬ、５５コピー／μＬ、５０コピー／μＬ、４５コピー／μＬ、４０コピー／μＬ、３５コピー／μＬ、３０コピー／μＬ、２５コピー／μＬ、２０コピー／μＬ、１５コピー／μＬ、１０コピー／μＬ、５コピー／μＬ、１コピー／μＬ、または０．０５コピー／μＬ未満の破壊結果をもたらし得る。破壊は、場合によっては１００コピー／μＬ未満をもたらすことができる。
【０３４４】
【表８−１】
2020530307.tif 000093
【０３４５】
【表８−２】
2020530307.tif 000094
【０３４６】
【表８−３】
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【０３４７】
【表８−４】
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【０３４８】
【表８−５】
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【０３４９】
【表８−６】
2020530307.tif 000098
【０３５０】
[00310]Ｔ細胞は、１つ以上の抑制された遺伝子および１つ以上の導入遺伝子、例えば、受容体を含むことができる。例えば、その発現が抑制される１つ以上の遺伝子は、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＣＤ１２２、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ１３７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ−４、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、ＶＩＳＴＡ、ＣＩＳＨ、および／またはそれらの任意の組み合わせのいずれか１つを含むことができる。例えば、単に様々な組み合わせを説明するために、その発現が抑制される１つ以上の遺伝子はＰＤ−１を含むことができ、１つ以上の導入遺伝子はＴＣＲを含むことができる。別の例では、その発現が抑制される１つ以上の遺伝子はまたＣＴＬＡ−４を含むことができ、１つ以上の導入遺伝子は外因性ＴＣＲを含むことができる。
【０３５１】
[00311]導入遺伝子の挿入は、遺伝子の破壊の有無にかかわらず行うことができる。導入遺伝子は、遺伝子、例えば、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＣＤ１２２、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ１３７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ−４、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、ＶＩＳＴＡ、ＨＰＲＴ、ＡＡＶＳ部位（例えば、ＡＡＶＳ１、ＡＡＶＳ２など）、ＣＣＲ５、またはＣＩＳＨに隣接して、その近傍に、または内部に挿入して、遺伝子の活性または発現を低下または排除することができる。例えば、癌特異的ＴＣＲ導入遺伝子は、遺伝子の活性または発現を低下または排除するために、遺伝子（例えば、ＰＤ−１）に隣接して、その近傍に、またはその内部に挿入することができる。導入遺伝子の挿入は、内在性ＴＣＲ遺伝子で行うことができる。場合によっては、内在性ＴＣＲがＣＲＩＳＰＲシステムで破壊され得る。
【０３５２】
[00312]遺伝子の破壊は、任意の特定の遺伝子のものであり得る。この用途内の遺伝子の遺伝的相同体（例えば、遺伝子の任意の哺乳動物バージョン）が網羅されることが意図される。例えば、破壊される遺伝子は、本明細書に開示される遺伝子、例えば、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＣＤ１２２、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ１３７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ−４、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、ＶＩＳＴＡ、ＨＰＲＴ、ＣＣＲ５、ＡＡＶＳ部位（例えば、ＡＡＶＳ１、ＡＡＶＳ２など）、またはＣＩＳＨに対して特定の同一性および／または相同性を示し得る。したがって、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性（核酸またはタンパク質レベルで）を示すか、または約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性（核酸またはタンパク質レベルで）を示す遺伝子が破壊され得ることが意図される。また、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性（核酸またはタンパク質レベルで）を示すか、または約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性（核酸またはタンパク質レベルで）を示す遺伝子が破壊され得ることが意図される。一部の遺伝的相同体は当該技術分野に公知であるが、場合によっては、相同体は公知でない。しかしながら、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴなどの公衆に利用可能なデータベースを使用して、核酸（ＤＮＡもしくはＲＮＡ）配列またはタンパク質配列を比較することにより、哺乳動物間の相同遺伝子を見つけることができる。
【０３５３】
[00313]破壊することができる遺伝子は、遺伝子ファミリーのメンバーであり得る。例えば、破壊することができる遺伝子は、癌免疫療法の治療可能性を改善し得る。場合によっては、遺伝子はＣＩＳＨであり得る。ＣＩＳＨ遺伝子は、サイトカインシグナルのサプレッサー（ＳＯＣＳ）またはＳＴＡＴ誘導性ＳＴＡＴ阻害剤（ＳＳＩ）としても知られるサイトカイン誘導性ＳＴＡＴ阻害剤（ＣＩＳ）タンパク質ファミリーのメンバーであり得る（例えば、Ｐａｌｍｅｒら，Ｃｉｓｈ  ａｃｔｉｖｅｌｙ  ｓｉｌｅｎｃｅｓ  ＴＣＲ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｍａｉｎｔａｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０２巻（１２号），２０９５−２１１３頁（２０１５年））。遺伝子は、サイトカインシグナル伝達を調節することができる古典的な負のフィードバックシステムの一部を形成し得るタンパク質のＳＯＣＳファミリーの一部であり得る。破壊される遺伝子はＣＩＳＨであり得る。ＣＩＳＨは、エリスロポエチン、プロラクチンまたはインターロイキン３（ＩＬ−３）受容体などの、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ５経路を介してシグナルを伝達するサイトカインの負の調節に関与し得る。遺伝子は、チロシンのリン酸化を抑制することにより、ＳＴＡＴ５トランス活性化を阻害することができる。ＣＩＳＨファミリーのメンバーは、サイトカインシグナル伝達のサイトカイン誘導性の負の調節因子であることが公知である。遺伝子の発現は、造血細胞のＩＬ２、ＩＬ３、ＧＭ−ＣＳＦまたはＥＰＯによって誘導され得る。遺伝子タンパク質のプロテアソーム媒介性分解は、エリスロポエチン受容体の不活性化に関与し得る。場合によっては、標的とする遺伝子を腫瘍特異的Ｔ細胞において発現させることができる。標的とされる遺伝子は、破壊された場合、抗原関連腫瘍への操作された細胞の浸潤を増加させることができる。場合によっては、標的とされる遺伝子はＣＩＳＨであり得る。
【０３５４】
[00314]破壊され得る遺伝子は、ＴＣＲシグナル伝達、機能的結合力、または癌に対する免疫の減弱に関与し得る。場合によっては、破壊される遺伝子は、ＴＣＲが刺激された場合、上方制御される。遺伝子は、細胞の拡大、機能的結合力、またはサイトカインの多機能性の阻害に関与し得る。遺伝子は、細胞性サイトカイン産生の負の調節に関与し得る。例えば、遺伝子は、エフェクターサイトカイン、例えば、ＩＦＮ−ガンマおよび／またはＴＮＦの産生の阻害に関与し得る。遺伝子はまた、ＴＣＲ刺激後のＩＬ−２などの支持性サイトカインの発現の阻害に関与し得る。
【０３５５】
[00315]遺伝子抑制はまた、多数の方法で行うことができる。例えば、遺伝子発現は、ノックアウト、遺伝子のプロモーターの変更、および／または干渉ＲＮＡの投与によって抑制することができる。これは、生物レベルまたは組織、臓器、および／もしくは細胞レベルで行うことができる。１つ以上の遺伝子が細胞、組織、および／または臓器でノックダウンされた場合、１つ以上の遺伝子は、ＲＮＡ干渉試薬、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはマイクロＲＮＡを投与することによって抑制することができる。例えば、ｓｈＲＮＡを発現させることができる核酸を細胞に安定的にトランスフェクトして、発現をノックダウンさせることができる。さらに、ｓｈＲＮＡを発現することができる核酸をＴ細胞のゲノムに挿入して、よって、Ｔ細胞内の遺伝子をノックダウンさせることができる。
【０３５６】
[00316]Ｔ細胞内の１つ以上の遺伝子は、任意の方法を使用してノックアウトまたは破壊することができる。例えば、１つ以上の遺伝子をノックアウトすることは、Ｔ細胞のゲノムから１つ以上の遺伝子を削除することを含み得る。ノックアウトはまた、Ｔ細胞から遺伝子配列の全部または一部を除去することを含むことができる。また、ノックアウトは、Ｔ細胞のゲノム中の遺伝子の全部または一部を１つ以上のヌクレオチドで置換することを含み得ることが意図される。１つ以上の遺伝子をノックアウトすることはまた、１つ以上の遺伝子に配列を挿入し、それにより１つ以上の遺伝子の発現を破壊することを含むことができる。例えば、配列を挿入すると、１つ以上の遺伝子の中央に終止コドンが生成され得る。配列を挿入することはまた、１つ以上の遺伝子の読み取り枠をシフトさせる場合がある。
細胞膜へのベクター送達
[00317]ヌクレアーゼおよび転写因子、それをコードするポリヌクレオチド、および／および任意の導入遺伝子ポリヌクレオチド、ならびに本明細書に記載されるタンパク質および／またはポリヌクレオチドを含む組成物は、任意の適切な手段により標的細胞に送達させることができる。
【０３５７】
[00318]適切な細胞には、真核細胞および原核細胞および／または細胞株が含まれ得るが、これらに限定されない。適切な細胞は、ヒト初代細胞であり得る。ヒト初代細胞は免疫細胞であり得る。免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、および／またはＴＩＬであり得る。このような細胞、またはこのような細胞から生成された細胞株の非限定的な例には、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳＯ、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３−Ｆ、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ）、およびｐｅｒＣ６細胞、ならびにツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ）、またはサッカロミセス（Saccharomyces）、ピキア（Pichia）およびシゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）などの真菌細胞が含まれる。場合によっては、細胞株は、ＣＨＯ−Ｋ１、ＭＤＣＫまたはＨＥＫ２９３細胞株であり得る。場合によっては、適切な初代細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）、および、限定されないが、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、単球、ナチュラルキラーＴ細胞、単球前駆細胞、造血幹細胞または非多能性幹細胞などの血液細胞サブセットが含まれる。場合によっては、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、または任意の他のタイプのＴ細胞などの腫瘍浸潤細胞（ＴＩＬ）などの任意のＴ細胞を含む免疫細胞であり得る。Ｔ細胞はまた、記憶Ｔ細胞、記憶幹Ｔ細胞、またはエフェクターＴ細胞も含み得る。Ｔ細胞はまた、例えば、全血からＴ細胞を選択するなど、バルク集団から選択することができる。Ｔ細胞はまた、バルク集団から拡大することができる。Ｔ細胞はまた、特定の集団および表現型に偏っていることもある。例えば、Ｔ細胞は、表現型的にＣＤ４５ＲＯ（−）、ＣＣＲ７（＋）、ＣＤ４５ＲＡ（＋）、ＣＤ６２Ｌ（＋）、ＣＤ２７（＋）、ＣＤ２８（＋）および／またはＩＬ−７Ｒα（＋）を含むように偏っている場合がある。ＣＤ４５ＲＯ（−）、ＣＣＲ７（＋）、ＣＤ４５ＲＡ（＋）、ＣＤ６２Ｌ（＋）、ＣＤ２７（＋）、ＣＤ２８（＋）および／またはＩＬ−７Ｒα（＋）を含むリストから選択される１つ以上のマーカーを含む適切な細胞を選択することできる。また、適切な細胞には、例えば、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞および間葉幹細胞などの幹細胞も含まれる。適切な細胞は、ヒト細胞、非ヒト細胞、および／またはマウス細胞などの任意の数の初代細胞を含むことができる。適切な細胞は前駆細胞であり得る。適切な細胞は、治療される対象（例えば、対象）に由来し得る。適切な細胞は、ヒトのドナーに由来し得る。適切な細胞は、ＣＤ４５ＲＯ（−）、ＣＣＲ７（＋）、ＣＤ４５ＲＡ（＋）、ＣＤ６２Ｌ＋（Ｌ−セレクチン）、ＣＤ２７＋、ＣＤ２８＋およびＩＬ−７Ｒα＋で構成される幹記憶ＴＳＣＭ細胞、であり得、幹記憶細胞はまた、ＣＤ９５、ＩＬ−２Ｒβ、ＣＸＣＲ３、およびＬＦＡ−１を発現することができ、幹記憶細胞に特有の多数の機能的属性を示す。適切な��胞は、Ｌ−セレクチンおよびＣＣＲ７を含む中心記憶ＴＣＭ細胞であり得、中心記憶細胞は、例えば、ＩＬ−２を分泌するが、ＩＦＮγおよびＩＬ−４を分泌しない。適切な細胞はまた、Ｌ−セレクチンまたはＣＣＲ７を含むエフェクター記憶ＴＥＭ細胞であり得、例えば、ＩＦＮγおよびＩＬ−４などのエフェクターサイトカインを産生する。
【０３５８】
[00319]場合によっては、ＣＲＩＳＰＲおよびＡＡＶ修飾された細胞は、ＣＤ４５ＲＯ（−）、ＣＣＲ７（＋）、ＣＤ４５ＲＡ（＋）、ＣＤ６２Ｌ＋（Ｌ−セレクチン）、ＣＤ２７＋、ＣＤ２８＋およびＩＬ−７Ｒα＋で構成される幹記憶ＴＳＣＭ細胞、であり得、幹記憶細胞はまた、ＣＤ９５、ＩＬ−２Ｒβ、ＣＸＣＲ３、およびＬＦＡ−１を発現することができ、幹記憶細胞に特有の多数の機能的属性を示す。ＣＲＩＳＰＲやＡＡＶ修飾された細胞などの操作された細胞は、Ｌ−セレクチンとＣＣＲ７を含む中央記憶ＴＣＭ細胞でもあり、中心記憶細胞は、例えばＩＬ−２を分泌することができるが、ＩＦＮγおよびＩＬ−４を分泌することができない。操作された細胞はまた、Ｌ−セレクチンまたはＣＣＲ７を含むエフェクター記憶ＴＥＭ細胞であり得、例えば、ＩＦＮγおよびＩＬ−４などのエフェクターサイトカインを産生することができる。場合によっては、細胞集団を対象に導入することができる。例えば、細胞集団は、Ｔ細胞とＮＫ細胞の組み合わせであり得る。他の場合では、集団は、ナイーブ細胞とエフェクター細胞の組み合わせであり得る。
【０３５９】
[00320]ヒト初代細胞などの適切な細胞を達成する方法は、細胞を選択することを含むことができる。場合によっては、細胞は、細胞用に選択することができるマーカーを含めることができる。例えば、このようなマーカーは、ＧＦＰ、耐性遺伝子、細胞表面マーカー、内因性タグを含むことができる。細胞は、内在性マーカーを使用して選択され得る。適切な細胞は、任意の技術を使用して選択することがきる。このような技術は、フローサイトメトリーおよび／または磁気カラムを含むことができる。次に、選択した細胞を対象に注入することができる。選択した細胞はまた多数に拡大することもできる。選択した細胞は注入前に拡大することができる。
【０３６０】
[00321]本明細書に記載される転写因子およびヌクレアーゼは、例えば、１つ以上のタンパク質をコードする配列を含むベクターを使用して送達され得る。ポリヌクレオチドをコードする導入遺伝子はまた同様に送達され得る。限定されないが、プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクターを含む任意のベクターシステムを使用することができる。さらに、これらのベクターはいずれも、１つ以上の転写因子、ヌクレアーゼ、および／または導入遺伝子を含むことができる。したがって、１つ以上のＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、トランスポゾンベース、ＺＦＮ、メガヌクレアーゼ、またはＭｅｇａ−ＴＡＬ分子および／または導入遺伝子が細胞に導入された場合、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、トランスポゾンベース、ＺＦＮ、メガヌクレアーゼ、またはＭｅｇａ−ＴＡＬ分子および／もしくは導入遺伝子は、同じベクターまたは異なるベクターで運搬することができる。複数のベクターを使用する場合、各ベクターは、１つまたは複数のＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、トランスポゾンベース、ＺＦＮ、メガヌクレアーゼ、またはＭｅｇａ−ＴＡＬ分子および／もしくは導入遺伝子をコードする配列を含むことができる。
【０３６１】
[00322]従来のウイルスおよび非ウイルスベースの遺伝子導入方法を使用して、細胞（例えば、哺乳動物細胞）および標的組織に遺伝子操作されたＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、トランスポゾンベース、ＺＦＮ、メガヌクレアーゼ、またはＭｅｇａ−ＴＡＬ分子および／もしくは導入遺伝子をコードする核酸を導入することができる。このような方法はまた、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、トランスポゾンベース、ＺＦＮ、メガヌクレアーゼ、またはＭｅｇａ−ＴＡＬ分子および／もしくは導入遺伝子をコードする核酸をインビトロ細胞に投与するために使用することができる。一部の例では、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、トランスポゾンベース、ＺＦＮ、メガヌクレアーゼ、またはＭｅｇａ−ＴＡＬ分子および／または導入遺伝子をコードする核酸は、インビボまたはエクスビボでの免疫療法用に投与することができる。非ウイルスベクター送達システムは、ＤＮＡプラスミド、裸の核酸、およびリポソームまたはポロキサマーなどの送達ビヒクルと複合化した核酸を含むことができる。ウイルスベクター送達システムには、細胞への送達後にエピソームまたは組み込まれたゲノムのいずれかを有するＤＮＡおよびＲＮＡウイルスを含むことができる。
【０３６２】
[00323]核酸の非ウイルス送達の方法には、エレクトロポレーション、リポフェクション、ヌクレオフェクション、金ナノ粒子送達、マイクロインジェクション、バイオリスティクス、ウイロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、裸のＤＮＡ、ｍＲＮＡ、人工ビリオン、および薬剤により増大したＤＮＡ取り込みなどが含まれる。例えば、ソニトロン２０００システム（Ｒｉｃｈ−Ｍａｒ）を使用したソノポレーションはまた、核酸の送達に使用することができる。追加の例示的な核酸送達システムには、ＡＭＡＸＡ（登録商標）Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｌｏｇｎｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、Ｍｄ．）、ＭＡＸＣＹＴＥ，Ｉｎｃ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．）、ＢＴＸ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．）およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．（例えば、米国特許第６，００８，３３６号を参照）によって提供されているものが含まれる。リポフェクション試薬は市販されている（例えば、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（登録商標）およびＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標））。送達は、細胞（エクスビボ投与）または標的組織（インビボ投与）に対して行うことができる。追加の送達方法には、送達される核酸をＥｎＧｅｎｅＩＣ送達ビヒクル（ＥＤＶ）にパッケージ化した使用が含まれる。これらのＥＤＶは、抗体の一方のアームが標的組織に特異性を有し、他方のアームがＥＤＶに特異性を有する二重特異性抗体を使用して、標的組織に特異的に送達される。抗体は、ＥＤＶを標的細胞表面に運び、次に、ＥＤＶがエンドサイトーシスによって細胞に運ばれる。
【０３６３】
[00324]操作されたＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、トランスポゾンベース、ＺＦＮ、メガヌクレアーゼ、またはメガＴＡＬ分子、トランスポゾンおよび／または導入遺伝子をコードする核酸を含むウイルスおよび非ウイルスベクターを含むベクターは、インビボで細胞の形質導入のために生物に直接投与され得る。あるいは、裸のＤＮＡまたはｍＲＮＡを投与することができる。投与は、限定されないが、注射、注入、局所適用およびエレクトロポレーションを含む、血液または組織細胞との最終的な接触に分子を導入するために通常使用される経路のいずれかによる。特定の組成物を投与するために、１を超える経路を使用することができる。薬学的に許容される担体は、投与される特定の組成物によって、ならびに組成物を投与するために使用される特定の方法によって部分的に決定することができる。
【０３６４】
[00325]場合によっては、外因性ＴＣＲをコードするベクターを細胞性ヌクレアーゼにシャトルすることができる。例えば、ベクターには核局在化配列（ＮＬＳ）を含めることができる。ベクターはまた、タンパク質またはタンパク質複合体によってシャトルされ得る。場合によっては、Ｃａｓ９はミニサークルベクトルをシャトルする手段として使用することができる。ＣａｓはＮＬＳを構成することができる。場合によっては、ベクターは、エレクトロポレーションの前にＣａｓタンパク質と予め複合化させることができる。シャトルに使用することができるＣａｓタンパク質は、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）タンパク質であり得る。シャトルに使用することができるＣａｓタンパク質は、ヌクレアーゼコンピテントＣａｓ９であり得る。場合によっては、Ｃａｓタンパク質は、ガイドＲＮＡおよび外因性ＴＣＲをコードするプラスミドと予め混合することができる。
【０３６５】
[00326]ベクターは、個々の対象への投与により、典型的には全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、または頭蓋内注入）または下記のような局所適用によりインビボで送達され得る。あるいは、個々の対象から外植された細胞（例えば、リンパ球、Ｔ細胞、骨髄穿刺液、組織生検）などの細胞にエクスビボでベクターを送達することができ、続いて、通常は、ベクターが組み込まれた細胞の選択後に、細胞を対象に再移植することができる。選択の前または後に、細胞を拡大することができる。
【０３６６】
[00327]細胞は、外因性ＴＣＲおよびＣＲＩＳＰＲシステムをコードする突然変異またはキメラなアデノ随伴ウイルスベクターでトランスフェクトすることができる。ＡＡＶベクターの濃度は、０．５ナノグラムから５０マイクログラムであり得る。場合によっては、エレクトロポレーションによって細胞に導入することができる核酸（例えば、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ＲＮＡな）の量を変えて、トランスフェクション効率および／または細胞生存率を最適化することができる。場合によっては、約１００ピコグラム未満の核酸を各細胞（例えば、エレクトロポレーションされる１つ以上の細胞）に追加し得る。場合によっては、少なくとも約１００ピコグラム、少なくとも約２００ピコグラム、少なくとも約３００ピコグラム、少なくとも約４００ピコグラム、少なくとも約５００ピコグラム、少なくとも約６００ピコグラム、少なくとも約７００ピコグラム、少なくとも約８００ピコグラム、少なくとも約９００ピコグラム、少なくとも約１マイクログラム、少なくとも約１．５マイクログラム、少なくとも約２マイクログラム、少なくとも約２．５マイクログラム、少なくとも約３マイクログラム、少なくとも約３．５マイクログラム、少なくとも約４マイクログラム、少なくとも約４．５マイクログラム、少なくとも約５マイクログラム、少なくとも約５．５マイクログラム、少なくとも約６マイクログラム、少なくとも約６．５マイクログラム、少なくとも約７マイクログラム、少なくとも約７．５マイクログラム、少なくとも約８マイクログラム、少なくとも約８．５マイクログラム、少なくとも約９マイクログラム、少なくとも約９．５マイクログラム、少なくとも約１０マイクログラム、少なくとも約１１マイクログラム、少なくとも約１２マイクログラム、少なくとも約１３マイクログラム、少なくとも約１４マイクログラム、少なくとも約１５ミクログラム、少なくとも約２０マイクログラム、少なくとも約２５マイクログラム、少なくとも約３０マイクログラム、少なくとも約３５マイクログラム、少なくとも約４０マイクログラム、少なくとも約４５マイクログラム、または少なくとも約５０マイクログラムの核酸が、各細胞試料（例えば、エレクトロポレーションされる１つ以上の細胞）に追加することができる。例えば、１マイクログラムのｄｓＤＮＡをエレクトロポレーション用に各細胞試料に追加することができる。場合によっては、最適なトランスフェクション効率および／または細胞生存率に必要とされる核酸（例えば、ｄｓＤＮＡ）の量は、細胞型に特異的であり得る。場合によっては、各試料に使用される核酸（例えば、ｄｓＤＮＡ）の量は、トランスフェクション効率および／または細胞生存率に直接対応し得る。
【０３６７】
[00328]本明細書に記載される核酸送達プラットフォームのいずれか、例えば、ヌクレオフェクションまたはエレクトロポレーションを用いた細胞のトランスフェクション効率は、約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、もしくは９９．９％超であり得るか、または約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、または９９．９％超であり得る。一部の実施形態では、トランスフェクション効率は、対照送達プラットフォーム（例えば、野生型ＡＡＶを用いた送達プラットフォーム）を使用した同等の細胞のトランスフェクション効率と比較して、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、もしくは９９．９％超であり得るか、または約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、もしくは９９．９％超であり得る。場合によっては、細胞の選択、選別などがなければ、トランスフェクションまたは形質導入効率を定量化することができる。
【０３６８】
[00329]突然変異されたおよびキメラなアデノ随伴ウイルスベクターなどの本明細書に記載されるベクターは、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡコーティングペレット、ウイルス感染およびプロトプラスト融合を含む任意の適切な方法により送達させることができる。本発明の任意の実施形態を構築するために使用される方法は、核酸操作における当業者に公知であり、遺伝子工学、組換え工学、および合成技術が含まれる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参照されたい。例えば、Ｎｅｏｎ（登録商標）トランスフェクションシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）またはＡＭＡＸＡ（登録商標）Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（ＡＭＡＸＡ（登録商標）Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用したエレクトロポレーションはまた、核酸を細胞に送達するために使用することができる。エレクトロポレーションパラメータは、トランスフェクション効率および／または細胞生存率を最適化するために調整され得る。エレクトロポレーション装置は、指数関数的減衰、時定数および方形波などの複数の電気波形パルス設定を有することができる。すべての細胞型は、適用されるパルスパラメータ（例えば、電圧、静電容量および抵抗）に依存する固有の最適電界強度（Ｅ）を有する。最適な電界強度の適用は、膜貫通電圧の誘導を介した電気透過性を生じさせ、核酸が細胞膜を通過できるようにする。場合によっては、エレクトロポレーションパルス電圧、エレクトロポレーションパルス幅、パルス数、細胞密度、およびチップタイプを調整して、トランスフェクション効率および／または細胞生存率を最適化することができる。
【０３６９】
[00330]場合によっては、エレクトロポレーションのパルス電圧を変えて、トランスフェクション効率および／または細胞生存率を最適化することができる。場合によっては、エレクトロポレーション電圧は、約５００ボルト未満であり得る。場合によっては、エレクトロポレーション電圧は、少なくとも約５００ボルト、少なくとも約６００ボルト、少なくとも約７００ボルト、少なくとも約８００ボルト、少なくとも約９００ボルト、少なくとも約１０００ボルト、少なくとも約１１００ボルト、少なくとも約１２００ボルト、少なくとも約１３００ボルト、少なくとも約１４００ボルト、少なくとも約１５００ボルト、少なくとも約１６００ボルト、少なくとも約１７００ボルト、少なくとも約１８００ボルト、少なくとも約１９００ボルト、少なくとも約２０００ボルト、少なくとも約２１００ボルト、少なくとも約２２００ボルト、少なくとも約２３００ボルト、少なくとも約２４００ボルト、少なくとも約２５００ボルト、少なくとも約２６００ボルト、少なくとも約２７００ボルト、少なくとも約２８００ボルト、少なくとも約２９００ボルト、または少なくとも約３０００ボルトであり得る。場合によっては、最適なトランスフェクション効率および／または細胞生存率に必要とされるエレクトロポレーションパルス電圧は、細胞型に特異的であり得る。例えば、１９００ボルトのエレクトロポレーション電圧は、マクロファージ細胞に最適であり得る（例えば、最大の生存率および／またはトランスフェクション効率を提供し得る）。別の例では、約１３５０ボルトのエレクトロポレーション電圧は、Ｊｕｒｋａｔ細胞、またはＴ細胞などの初代ヒト細胞に最適であり得る（例えば、最大の生存率および／またはトランスフェクション効率を提供し得る）。場合によっては、ある範囲のエレクトロポレーション電圧が特定の細胞型に最適であり得る。例えば、ヒト５７８Ｔ細胞に対しては、約１０００ボルト〜約１３００ボルトのエレクトロポレーション電圧が最適であり得る（例えば、最大の生存率および／またはトランスフェクション効率を提供し得る）。
【０３７０】
[00331]場合によっては、エレクトロポレーションのパルス幅を変えて、トランスフェクション効率および／または細胞生存率を最適化することができる。場合によっては、エレクトロポレーションのパルス幅は、約５ミリ秒未満であり得る。場合によっては、エレクトロポレーション幅は、少なくとも約５ミリ秒、少なくとも約６ミリ秒、少なくとも約７ミリ秒、少なくとも約８ミリ秒、少なくとも約９ミリ秒、少なくとも約１０ミリ秒、少なくとも約１１ミリ秒、少なくとも約１２ミリ秒、少なくとも約１３ミリ秒、少なくとも約１４ミリ秒、少なくとも約１５ミリ秒、少なくとも約１６ミリ秒、少なくとも約１７ミリ秒、少なくとも約１８ミリ秒、少なくとも約１９ミリ秒、少なくとも約２０ミリ秒、少なくとも約２１ミリ秒、少なくとも約２２ミリ秒、少なくとも約２３ミリ秒、少なくとも約２４ミリ秒、少なくとも約２５ミリ秒、少なくとも約２６ミリ秒、少なくとも約２７ミリ秒、少なくとも約２８ミリ秒、少なくとも約２９ミリ秒、少なくとも約３０ミリ秒、少なくとも約３１ミリ秒、少なくとも約３２ミリ秒、少なくとも約３３ミリ秒、少なくとも約３４ミリ秒、少なくとも約３５ミリ秒、少なくとも約３６ミリ秒、少なくとも約３７ミリ秒、少なくとも約３８ミリ秒、少なくとも約３９ミリ秒、少なくとも約４０ミリ秒、少なくとも約４１ミリ秒、少なくとも約４２ミリ秒、少なくとも約４３ミリ秒、少なくとも約４４ミリ秒、少なくとも約４５ミリ秒、少なくとも約４６ミリ秒、少なくとも約４７ミリ秒、少なくとも約４８ミリ秒、少なくとも約４９ミリ秒、または少なくとも約５０ミリ秒であり得る。場合によっては、最適なトランスフェクション効率および／または細胞生存率に必要とされるエレクトロポレーションのパルス幅は、細胞型に特異的であり得る。例えば、３０ミリ秒のエレクトロポレーションパルス幅は、マクロファージ細胞に最適であり得る（例えば、最大の生存率および／またはトランスフェクション効率を提供し得る）。別の例では、約１０ミリ秒のエレクトロポレーション幅は、Ｊｕｒｋａｔ細胞に最適であり得る（例えば、最大の生存率および／またはトランスフェクション効率を提供し得る）。場合によっては、ある範囲のエレクトロポレーション幅の範囲が、所定の細胞型に最適であり得る。例えば、約２０ミリ秒から約３０ミリ秒の間のエレクトロポレーション幅は、ヒト５７８Ｔ細胞に最適であり得る（例えば、最大の生存率および／またはトランスフェクション効率を提供し得る）。
【０３７１】
[00332]場合によっては、エレクトロポレーションパルスの数を変えて、トランスフェクション効率ｏｙｏｂｉ細胞生存率を最適化することができる。場合によっては、エレクトロポレーションは、単一のパルスを含み得る。場合によっては、エレクトロポレーションは、１を超えるパルスを含むことができる。場合によっては、エレクトロポレーションは、２パルス、３パルス、４パルス、５パルス、６パルス、７パルス、８パルス、９パルス、もしくは１０またはそれ以上のパルスを含むことができる。場合によっては、最適なトランスフェクション効率および／または細胞生存率に必要とされるエレクトロポレーションパルスの数は、細胞型に特異的であり得る。例えば、単一のパルスを用いたエレクトロポレーションは、マクロファージ細胞に最適であり得る（例えば、最大の生存率および／またはトランスフェクション効率を提供し得る）。別の例では、３パルスのエレクトロポレーションが、初代細胞に対して最適であり得る（例えば、最大の生存率および／またはトランスフェクション効率を提供し得る）。場合によっては、ある範囲のエレクトロポレーション幅が、特定の細胞型に対して最適であり得る。例えば、約１から約３パルスの間のエレクトロポレーションは、ヒト細胞に対して最適であり得る（例えば、最大の生存率および／またはトランスフェクション効率を提供し得る）。
【０３７２】
[00333]場合によっては、エレクトロポレーションの開始細胞密度を変えて、トランスフェクション効率および／または細胞生存率を最適化することができる。場合によっては、エレクトロポレーションの開始細胞密度は、約１×１０５細胞未満であり得る。場合によっては、エレクトロポレーションの開始細胞密度は、少なくとも約１×１０５細胞、少なくとも約２×１０５細胞、少なくとも約３×１０５細胞、少なくとも約４×１０５細胞、少なくとも約５×１０５細胞、少なくとも約６×１０５細胞、少なくとも約７×１０５細胞、少なくとも約８×１０５細胞、少なくとも約９×１０５細胞、少なくとも約１×１０６細胞、少なくとも約１．５×１０６細胞、少なくとも約２×１０６細胞、少なくとも約２．５×１０６細胞、少なくとも約３×１０６細胞、少なくとも約３．５×１０６細胞、少なくとも約４×１０６細胞、少なくとも約４．５×１０６細胞、少なくとも約５×１０６細胞、少なくとも約５．５×１０６細胞、少なくとも約６×１０６細胞、少なくとも約６．５×１０６細胞、少なくとも約７×１０６細胞、少なくとも約７．５×１０６細胞、少なくとも約８×１０６細胞、少なくとも約８．５×１０６細胞、少なくとも約９×１０６細胞、少なくとも約９．５×１０６細胞、少なくとも約１×１０７細胞、少なくとも約１．２×１０７細胞、少なくとも約１．４×１０７細胞、少なくとも約１．６×１０７細胞、少なくとも約１．８×１０７細胞、少なくとも約２×１０７細胞、少なくとも約２．２×１０７細胞、少なくとも約２．４×１０７細胞、少なくとも約２．６×１０７細胞、少なくとも約２．８×１０７細胞、少なくとも約３×１０７細胞、少なくとも約３．２×１０７細胞、少なくとも約３．４×１０７細胞、少なくとも約３．６×１０７細胞、少なくとも約３．８×１０７細胞、少なくとも約４×１０７細胞、少なくとも約４．２×１０７細胞、少なくとも約４．４×１０７細胞、少なくとも約４．６×１０７細胞、少なくとも約４．８×１０７細胞、または少なくとも約５×１０７個の細胞であり得る。場合によっては、最適なトランスフェクション効率および／または細胞生存率に必要とされるエレクトロポレーションの開始細胞密度は、細胞型に特異的であり得る。例えば、１．５×１０６細胞のエレクトロポレーションの開始細胞密度は、マクロファージ細胞に最適であり得る（例えば、最大の生存率および／またはトランスフェクション効率を提供し得る）。別の例では、５×１０６細胞のエレクトロポレーションの開始細胞密度は、ヒト細胞に最適であり得る（例えば、最大の生存率および／またはトランスフェクション効率を提供し得る）。場合によっては、エレクトロポレーションの開始細胞密度の範囲は、所定の細胞型に最適であり得る。例えば、５．６×１０６から５×１０７の間のエレクトロポレーションの開始細胞密度は、Ｔ細胞などのヒト細胞に最適であり得る（例えば、最大の生存率および／またはトランスフェクション効率を提供し得る）。
【０３７３】
[00334]外因性ＴＣＲをコードする核酸配列の、例えば、ＣＲＩＳＰＲシステムを用いた細胞のゲノムへの組み込み効率は、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、もしくは９９．９％以上であり得るか、または約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、もしくは９９．９％以上であり得る。
【０３７４】
[00335]ＴＣＲなどの外因性ポリ核酸の組み込みは、任意の技術を使用して測定することができる。例えば、組み込みは、フローサイトメトリー、サーベイヤーヌクレアーゼアッセイ、分解によるインデルの追跡（tracking of indels by decomposition）（ＴＩＤＥ）、ジャンクションＰＣＲ、またはそれらの任意の組み合わせによって測定することができる。代表的なＴＩＤＥ分析は、ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４ガイドＲＮＡで示されるように、遺伝子編集効率パーセントで示される。他の場合、導入遺伝子の組み込みは、ＰＣＲによって測定することができる。ＴＩＤＥ分析はまた、ＡＡＶ形質導入と、続く内因性チェックポイント遺伝子のＣＲＩＳＰＲノックアウトによって外因性ＴＣＲを発現するように操作された細胞において行うことができる。
【０３７５】
[00336]エクスビボ細胞トランスフェクションはまた、診断、研究、または遺伝子治療に使用することができる（例えば、トランスフェクトされた細胞の宿主生物への再注入による）。場合によっては、細胞を対象生物から単離し、核酸（例えば、遺伝子またはｃＤＮＡ）でトランスフェクトし、対象生物（例えば、対象）に戻し、再注入する。
【０３７６】
[00337]対象において治療的に有効であるために必要であり得るＣＲＩＳＰＲおよびＡＡＶ修飾された細胞の量は、細胞の生存率、および細胞が遺伝的に修飾された効率（例えば、導入遺伝子が１つ以上の細胞に組み込まれた効率）に依存して変化し得る。場合によっては、遺伝子修飾後の細胞の生存率と導入遺伝子の組み込み効率の積（例えば、乗算）は、対象への投与に利用可能な細胞の治療的アリコートに対応し得る。場合によっては、遺伝子改変後の細胞の生存率の増加は、投与が対象において治療的に有効であることが必要である細胞量の減少に対応し得る。場合によっては、導入遺伝子が１つ以上の細胞に組み込まれている効率の増加は、投与が対象において治療的に有効であることが必要である細胞量の減少に対応し得る。場合によっては、治療的に有効であることが必要とされる細胞量を決定することは、経時的な細胞の生存率の変化に対応する機能を決定することを含み得る。場合によっては、治療的に有効であることが必要な細胞の量を決定することは、時間依存変数（例えば、細胞培養時間、エレクトロポレーション時間、細胞刺激時間）に関して導入遺伝子を１つ以上の細胞に組み込むことができる効率の変化に対応する機能を決定することを含むことができる。
【０３７７】
[00338]本明細書に記載されるように、ＡＡＶなどのウイルス粒子を使用して、目的の遺伝子、または外因性ＴＣＲなどの導入遺伝子を含むウイルスベクターをエクスビボまたはインビボで細胞に送達することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示される突然変異されたまたはキメラなアデノ随伴ウイルスベクターは、ｐｆｕ（プラーク形成単位）として測定することができる。場合によっては、本開示の組成物および方法の組換えウイルスまたは突然変異されたもしくはキメラアデノ随伴ウイルスベクターのｐｆｕは、約１０８〜約５×１０１０ｐｆｕであり得る。場合によって、本開示の組換えウイルスは、少なくとも約１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、および５×１０１０ｐｆｕである。場合によっては、本開示の組換えウイルスは、せいぜい約１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、および５×１０１０ｐｆｕである。一部の態様では、本開示の突然変異されたまたはキメラなアデノ随伴ウイルスベクターは、ベクターゲノムとして測定することができる。場合によっては、本開示の組換えウイルスは、１×１０１０〜３×１０１２ベクターゲノム、または１×１０９〜３×１０１３ベクターゲノム、もしくは１×１０８〜３×１０１４ベクターゲノム、または少なくとも約１×１０１、１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、１×１０１５、１×１０１６、１×１０１７、および１×１０１８のベクターゲノムであるか、または１×１０８〜３×１０１４のベクターゲノム、もしくはせいぜい約１×１０１、１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、１×１０１５、１×１０１６、１×１０１７、および１×１０１８のベクターゲノムである。
【０３７８】
[00339]場合によっては、本開示の突然変異されたまたはキメラなアデノ随伴ウイルスベクターは、感染多重度（ＭＯＩ）を使用して測定することができる。場合によっては、ＭＯＩは、ベクターまたはウイルスゲノムの、核酸が送達され得る細胞に対する比率、または倍数を指すことができる。場合によっては、ＭＯＩは、１×１０６ＧＣ／ｍＬであり得る。場合によっては、ＭＯＩは、１×１０５ＧＣ／ｍＬから１×１０７ＧＣ／ｍＬであり得る。場合によっては、ＭＯＩは、１×１０４ＧＣ／ｍＬから１×１０８ＧＣ／ｍＬであり得る。場合によっては、本開示の組換えウイルスは、少なくとも約１×１０１ＧＣ／ｍＬ、１×１０２ＧＣ／ｍＬ、１×１０３ＧＣ／ｍＬ、１×１０４ＧＣ／ｍＬ、１×１０５ＧＣ／ｍＬ、１×１０６ＧＣ／ｍＬ、１×１０７ＧＣ／ｍＬ、１×１０８ＧＣ／ｍＬ、１×１０９ＧＣ／ｍＬ、１×１０１０ＧＣ／ｍＬ、１×１０１１ＧＣ／ｍＬ、１×１０１２ＧＣ／ｍＬ、１×１０１３ＧＣ／ｍＬ、１×１０１４ＧＣ／ｍＬ、１×１０１５ＧＣ／ｍＬ、１×１０１６ＧＣ／ｍＬ、１×１０１７ＧＣ／ｍＬ、１×１０１８ＧＣ／ｍＬのＭＯＩである。場合によっては、本開示の突然変異されたまたはキメラアデノ随伴ウイルスは、約１×１０８ＧＣ／ｍＬ〜約３×１０１４ＧＣ／ｍＬのＭＯＩであるか、またはせいぜい約１×１０１ＧＣ／ｍＬ、１×１０２ＧＣ／ｍＬ、１×１０３ＧＣ／ｍＬ、１×１０４ＧＣ／ｍＬ、１×１０５ＧＣ／ｍＬ、１×１０６ＧＣ／ｍＬ、１×１０７ＧＣ／ｍＬ、１×１０８ＧＣ／ｍＬ、１×１０９ＧＣ／ｍＬ、１×１０１０ＧＣ／ｍＬ、１×１０１１ＧＣ／ｍＬ、１×１０１２ＧＣ／ｍＬ、１×１０１３ＧＣ／ｍＬ、１×１０１４ＧＣ／ｍＬ、１×１０１５ＧＣ／ｍＬ、１×１０１６ＧＣ／ｍＬ、１×１０１７ＧＣ／ｍＬ、および１×１０１８ＧＣ／ｍＬのＭＯＩである。場合によっては、本開示のウイルスベクターは、修飾されていないベクターと比較して、細胞の形質導入中により効果的であり、オフターゲット効果が低い場合がある。例えば、修飾されたウイルスの低いＭＯＩは、同等の細胞に、修飾されていないベクターを形質導入する場合と比較して、オフターゲット導入遺伝子の挿入が少なくなる場合がある。
【０３７９】
[00340]一部の態様では、非ウイルスベクターまたは核酸は、突然変異されたまたはキメラなアデノ随伴ウイルスベクターを使用せずに送達され得、核酸の量に従って測定され得る。一般的に、任意の適切な量の核酸を本開示の組成物および方法とともに使用することができる。場合によっては、核酸は、少なくとも約１ｐｇ、１０ｐｇ、１００ｐｇ、１ｐｇ、１０ｐｇ、１００ｐｇ、２００ｐｇ、３００ｐｇ、４００ｐｇ、５００ｐｇ、６００ｐｇ、７００ｐｇ、８００ｐｇ、９００ｐｇ、１μｇ、１０μｇ、１００μｇ、２００μｇ、３００μｇ、４００μｇ、５００μｇ、６００μｇ、７００μｇ、８００μｇ、９００μｇ、１ｎｇ、１０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ、３００ｎｇ、４００ｎｇ、５００ｎｇ、６００ｎｇ、７００ｎｇ、８００ｎｇ、９００ｎｇ、１ｍｇ、１０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、７００ｍｇ、８００ｍｇ、９００ｍｇ、１ｇ、２ｇ、３ｇ、４ｇ、または５ｇであり得る。場合によっては、核酸は、せいぜい約１ｐｇ、１０ｐｇ、１００ｐｇ、１ｐｇ、１０ｐｇ、１００ｐｇ、２００ｐｇ、３００ｐｇ、４００ｐｇ、５００ｐｇ、６００ｐｇ、７００ｐｇ、８００ｐｇ、９００ｐｇ、１μｇ、１０μｇ、１００μｇ、２００μｇ、３００μｇ、４００μｇ、５００μｇ、６００μｇ、７００μｇ、８００μｇ、９００μｇ、１ｎｇ、１０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ、３００ｎｇ、４００ｎｇ、５００ｎｇ、６００ｎｇ、７００ｎｇ、８００ｎｇ、９００ｎｇ、１ｍｇ、１０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、７００ｍｇ、８００ｍｇ、９００ｍｇ、１ｇ、２ｇ、３ｇ、４ｇ、または５ｇであり得る。
【０３８０】
[00341]移植前、移植後、および／または移植中の細胞（例えば、操作された細胞または操作された初代Ｔ細胞）は機能的であり得る。例えば、移植された細胞は、移植後の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００日間、または少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００日間、機能的であり得る。移植された細胞は、移植後の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２カ月間、または少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２カ月間、機能的であり得る。移植された細胞は、移植後の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、もしくは３０年間、または少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、もしくは３０年間、機能的であり得る。場合によっては、移植された細胞は、レシピエントの最大の寿命まで機能し得る。
【０３８１】
[00342]さらに、移植された細胞は、その通常の意図された動作の１００％で機能することができる。移植された細胞はまた、その通常の意図された動作の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％で機能し得る。
【０３８２】
[00343]移植された細胞はまた、その通常の意図された動作の１００％を超えて機能し得る。例えば、移植された細胞は、その通常の意図された動作の１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００またはそれ以上で機能し得る。
【０３８３】
[00344]１つ以上のサイトカインは、本発明の細胞とともに導入され得る。サイトカインは、細胞障害性Ｔリンパ球（養子移植された腫瘍特異的細胞傷害性Ｔリンパ球を含む）をブーストして、腫瘍微小環境内で拡大するために利用することができる。場合によっては、ＩＬ−２を使用して、本明細書に記載される細胞の拡大を促進することができる。ＩＬ−１５などのサイトカインはまた使用され得る。ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、またはそれらの任意の組み合わせなどの、免疫療法の分野における他の関連するサイトカインはまた利用することができる。
【０３８４】
[00345]場合において、ＩＬ−２は、細胞注入の２４時間以内に投与を開始し、最大約４日間（最大１２用量）を継続して投与することができる。場合によっては、ＩＬ−２は、初回の投与後、最大約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０日間投与することができる。
【０３８５】
[00346]ＩＬ−２の用量は、８時間ごとに投与することができる。場合によっては、ＩＬ−２は、初回の投与後、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４時間投与することができる。場合によっては、ＩＬ−２投薬は、毒性が検出された場合、停止させることができる。場合によっては、対照が、下痢、悪心、嘔吐、低血圧、皮膚の変化、食欲不振、粘膜炎、嚥下障害などのアルデスロイキンに共通する可逆的なグレード３の毒性を除いたアルデスロイキンによるグレード３もしくはグレード４の毒性に達した場合、または体質の症状および研究室が変更した場合、投薬を遅らせるかまた停止させることができる。場合によっては、これらの毒性が、支援措置によって２４時間以内に簡単に回復され得る場合、追加の用量を与えることができる。さらに、投薬は、医師の裁量で保持または停止させることができる。
医薬組成物および製剤
[00347]全体にわたって記載される組成物は、薬学的な医薬に製剤化され得、それを必要とする、疾患、例えば癌と診断されたヒトまたは哺乳動物を治療するために使用することができる。これらの薬剤は、１つ以上の化学療法剤または化学療法化合物と併せて、１つ以上のＴ細胞（例えば、操作されたＴ細胞）とともにヒトまたは哺乳動物に同時に投与することができる。
【０３８６】
[00348]本明細書で使用される「化学療法剤」または「化学療法化合物」およびそれらの文法的同等物は、癌の治療に有用な化合物であり得る。開示されたＴ細胞と組み合わせて使用することができる化学療法癌剤には、限定されないが、有糸分裂阻害剤（ビンカアルカロイド）が含まれる。これらには、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、およびナベルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（商標））（ビノレルビン、５’−ノルアンヒドロブラスチン）が含まれる。さらに他の場合では、化学療法癌剤には、カンプトテシン化合物などのトポイソメラーゼＩ阻害剤が含まれる。本明細書で使用するとき、「カンプトテシン化合物」には、カンプトサール（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ）（商標）（イリノテカンＨＣＬ）、ハイカムチン（Ｈｙｃａｍｔｉｎ）（商標）（トポテカンＨＣＬ）、ならびにカンプトテシンおよびその類似体に由来する他の化合物が含まれる。本明細書に開示される方法および組成物で使用することができる化学療法癌剤の別のカテゴリーは、エトポシド、テニポシドおよびミトポドジドなどのポドフィロトキシン誘導体であり得る。本開示は、腫瘍細胞中の遺伝物質をアルキル化するアルキル化剤として公知である他の化学療法癌剤をさらに包含する。これらには、限定されないが、シスプラチン、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、トリメチレンチオホスホラミド、カルムスチン、ブスルファン、クロラムブシル、ベラスチン、ウラシルマスタード、クロマファジン、およびダカルバジンが含まれる。本開示は、化学療法剤としての代謝拮抗剤を包含する。これらのタイプの薬剤の例には、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル、メトトレキサート、メルカプトプリン、アザチオプライム、およびプロカルバジンが含まれる。本明細書に開示される方法および組成物で使用することができる化学療法癌剤の追加のカテゴリーには、抗生物質が含まれる。例としては、限定されないが、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ミトラマイシン、マイトマイシン、マイトマイシンＣ、およびダウノマイシンが含まれる。これらの化合物に関して市販されている多くのリポソーム製剤がある。本開示は、限定されないが、抗腫瘍抗体、ダカルバジン、アザシチジン、アムサクリン、メルファラン、イホスファミドおよびミトキサントロンを含む他の化学療法癌剤をさらに包含する。
【０３８７】
[00349]本明細書に開示されるＴ細胞は、細胞傷害性／抗腫瘍剤および抗血管新生剤を含む他の抗腫瘍剤と組み合わせて投与することができる。細胞傷害性／抗腫瘍剤は、癌細胞を攻撃しおよび死滅させる薬剤として定義され得る。一部の細胞傷害性／抗腫瘍剤は、腫瘍細胞の遺伝物質をアルキル化するアルキル化剤であり得、例えば、シスプラチン、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、トリメチレンチオホスホラミド、カルムスチン、ブスルファン、クロラムブシル、ベラスチン、ウラシルマスタード、クロマファジン、およびダカバジンが挙げられる。他の細胞傷害性／抗腫瘍剤は、腫瘍細胞の代謝拮抗剤であり得、例えば、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル、メトトレキサート、メルカプトプリン、アザチオプライム、およびプロカルバジンが挙げられる。他の細胞傷害性／抗腫瘍剤は、抗生物質であり得、例えば、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ミトラマイシン、マイトマイシン、マイトマイシンＣ、およびダウノマイシンが挙げられる。これらの化合物に関して市販されている多数のリポソーム製剤がある。さらに他の細胞傷害性／抗腫瘍剤は、有糸分裂阻害剤（ビンカアルカロイド）であり得る。これらには、ビンクリスチン、ビンブラスチン、およびエトポシドが含まれる。様々な細胞傷害性／抗腫瘍剤には、タキソールおよびその誘導体、Ｌ−アスパラギナーゼ、抗腫瘍抗体、ダカルバジン、アザシチジン、アムサクリン、メルファラン、ＶＭ−２６、イホスファミド、ミトキサントロン、およびビンデシンが含まれる。
【０３８８】
[00350]抗血管新生剤はまた使用され得る。開示された方法および組成物における使用に適した抗血管新生剤には、ヒト化抗体およびキメラ抗体を含む抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＶＥＧＦアプタマーおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。血管新生の他の阻害剤には、アンジオスタチン、エンドスタチン、インターフェロン、インターロイキン１（αおよびβを含む）、インターロイキン１２、レチノイン酸、ならびにメタロプロテイナーゼ−１および−２（ＴＩＭＰ−１および−２）の組織阻害剤が含まれる。抗血管新生活性を有するトポイソメラーゼＩＩ阻害剤であるラゾキサンなどのトポイソメラーゼを含む小分子も使用することができる。
【０３８９】
[00351]開示されたＴ細胞と組み合わせて使用することができる他の抗癌剤には、限定されないが、以下が含まれる：アシビシン；アクラルビシン；アコダゾール塩酸塩；アクロニン；アドゼレシン；アルデスロイキン；アルトレタミン；アンボマイシン；アメタントロン酢酸塩；アミノグルテチミド；アムサクリン；アナストロゾール；アントラマイシン；アスパラギナーゼ；アスペルリン；アバスチン；アザシチジン；アゼテパ；アゾトマイシン；バチマスタット；ベンゾデパ；ビカルタミド；ビサントレン塩酸塩；ビスナフィドジメシル酸塩；ビゼレシン；ブレオマイシン硫酸塩；ブレキナールナトリウム；ブロピリミン；ブスルファン；カクチノマイシン；カルステロン；カラセミド；カーベタイマー；カルボプラチン；カルムスチン；カルビシン塩酸塩；カルゼレシン；セデフィンゴール；クロラムブシル；シロレマイシン；シスプラチン；クラドリビン；クリスナトールメシル酸塩；シクロホスファミド；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン；ダウノルビシン塩酸塩；デシタビン；デキソルマプラチン；デザグアニン；デザグアニンメシル酸塩；ジアジコン；ドセタキセル；ドキソルビシン；ドキソルビシン塩酸塩；ドロロキシフェン；ドロロキシフェンクエン酸塩；ドロモスタノロンプロピオン酸塩；デュアゾマイシン；エダトレキサート；エフロルニチン塩酸塩；エルサミトルシン；エンロプラチン；エンプロメート；エピプロピジン；エピルビシン塩酸塩；エルブロゾール；エソルビシン塩酸塩；エストラムスチン；エストラムスチンリン酸ナトリウム；エタニダゾール；エトポシド；エトポシドリン酸塩；エトプリン；ファドロゾール塩酸塩；ファザラビン；フェンレチニド；フロクスウリジン；フルダラビンリン酸塩；フルオロウラシル；フルロシタビン；フォスホキドン；フォストリシンナトリウム；ゲムシタビン；ゲムシタビン塩酸塩；ヒドロキシウレア；イダルビシン塩酸塩；イホスファミド；イルモフォシン；インターロイキンＩＩ（組換えインターロイキンＩＩまたはｒＩＬ２を含む）、インターフェロンアルファ−２ａ；インターフェロンアルファ−２ｂ；インターフェロンアルファ−ｎ１；インターフェロンアルファ−ｎ３；インターフェロンベータ−Ｉａ；インターフェロンガンマ−Ｉｂ；イプロプラチン；イリノテカン塩酸塩；ランレオチド酢酸塩；レトロゾール；リュープロリド酢酸塩；リアロゾール塩酸塩；ロメトレキソールナトリウム；ロムスチン；ロソキサントロン塩酸塩；マソプロコール；カンタンシン；メクロレタミン塩酸塩；メゲストロール酢酸塩；メレンゲストロール酢酸塩；メルファラン；メノガリル；メルカプトプリン；メトトレキサート；メトトレキサートナトリウム；メトプリン；メツレデパ；ミチンドマイド；ミトカルシン；ミトクロミン；ミトギリン；ミトマルシン；マイトマイシン；ミトスペル；ミトタン；ミトキサントロン塩酸塩；ミコフェノール酸；ノコダゾール；ノガラマイシン；オルマプラチン；オキシスラン；パクリタキセル；ペガスパルガーゼ；ペリオマイシン；ペンタムスチン；ペプロマイシン硫酸塩；ペルホスファミド；ピポブロマン；ピポスルファン；ピロキサントロン塩酸塩；プリカマイシン；プロメスタン；ポルフィメルナ��リウム；ポルフィロマイシン；プレドニムスチン；プロカルバジン塩酸塩；ピューロマイシン；ピューロマイシン塩酸塩；ピラゾフリン；リボプリン；ログレチミド；サフィンゴール；サフィンゴール塩酸塩；セムスチン；シムトラゼン；スパルフォセートナトリウム；スパルソマイシン；スピロゲルマニウム塩酸塩；スピロムスチン；スピロプラチン；ストレプトニグリン；ストレプトゾシン；スロフェヌル；タリソマイシン；テコガランナトリウム；テガフール；テロキサントロン塩酸塩；テモポルフィン；テニポシド；テロキシロン；テストラクトン；チアミプリン；チオグアニン；チオテパ；チアゾフリン；チラパザミン；トレミフェンクエン酸塩；トレストロン酢酸塩；トリシリビンリン酸塩；トリメトレキサート；トリメトレキサートグルクロン酸塩；トリプトレリン；ツブロゾール塩酸塩；ウラシルマスタード；ウレデパ；バプレオチド；ベルテポルフィン；ビンブラスチン硫酸塩；ビンクリスチン硫酸塩；ビンデシン；ビンデシン硫酸塩；ビネピジン硫酸塩；ビングリシネート硫酸塩；ビンラウロシン硫酸塩；酒石酸ビノレルビン；ビンロシジン硫酸塩；ビンゾリジン硫酸塩；ヴォロゾール；ゼニプラチン；ジノスタチン；ゾルビシン塩酸塩。他の抗癌剤には、限定されないが、以下が含まれる：２０−エピ−１，２５ジヒドロキシビタミンＤ３；５−エチニルウラシル；アビラテロン；アクラルビシン；アシルフルベン；アデシペノール；アドゼレシン；アルデスロイキン；ＡＬＬ−ＴＫアンタゴニスト；アルトレタミン；アンバムスチン；アミドックス；アミフォスチン；アミノレブリン酸；アムルビシン；アムサクリン；アナグレリド；アナストロゾール；アンドログラフォライド；血管新生阻害剤；アンタゴニストＤ；アンタゴニストＧ；アンタレリクス；反背方化形態形成タンパク質−１；抗アンドロゲン、前立腺癌；抗エストロゲン；抗新生物；アンチセンスオリゴヌクレオチド；アフィジコリングリシン酸塩；アポトーシス遺伝子モジュレーター；アポトーシス調節因子；プリン酸；ａｒａ−ＣＤＰ−ＤＬ−ＰＴＢＡ；アルギニンデアミナーゼ；アスラクリン；アタメスタン；アトリムスチン；アキシナスタチン１；アキシナスタチン２；アキシナスタチン３；アザセトロン；アザトキシン；アザチロシン；バッカチンＩＩＩ誘導体；バラノール；バチマスタット；ＢＣＲ／ＡＢＬアンタゴニスト；ベンゾクロリン；ベンゾイルスタウロスポリン；ベータ−ラクタム誘導体；ベータ−アレチン；ベータクラマイシンＢ；ベツリン酸；ｂＦＧＦ阻害剤；ビカルタミド；ビサントレン；ビサジリジニルスペルミン；ビスナフィド；ビストラテンＡ；ビゼレシン；ブレフレート；ブロピリミン；ブドチタン；ブチオニンスルホキシミン；カルシポトリオール；カルフォスチンＣ；カンプトテシン誘導体；カナリポックスＩＬ−２；カペシタビン；カルボキサミド−アミノ−トリアゾール；カルボキシアミドトリアゾール；ＣａＲｅｓｔ  Ｍ３；ＣＡＲＮ  ７００；軟骨由来阻害剤；カルゼレシン；カゼインキナーゼ阻害剤（ＩＣＯＳ）；カスタノスペルミン；セクロピンＢ；セトロレリクス；クロリンス；クロロキノキサリンスルホンアミド；シカプロスト；シス−ポルフィリン；クラドリビン；クロミフェ���類似体；クロトリマゾール；コリスマイシンＡ；コリスマイシンＢ；コンブレタスタチンＡ４；コンブレタスタチン類似体；コナゲニン；クランベシジン８１６；クリスナトール；クリプトフィシン８；クリプトフィシンＡ誘導体；キュラシンＡ；シクロペンタントラキノン；シクロプラタム；シペマイシン；シタラビンオクホスファート；細胞溶解因子；サイトスタチン；ダクリキシマブ；デシタビン；デヒドロジデムニンＢ；デスロレリン；デキサメタゾン；デキシホスファミド；デキスラゾキサン；デキスベラパミル；ジアジコン；ジデムニンＢ；ジドックス；ジエチルノルスペルミン；ジヒドロ−５−アザシチジン；ジヒドロタキソール、９−；ジオキサマイシン；ジフェニルスピロムスチン；ドセタキセル；ドコサノール；ドラセトロン；ドキシフルリジン；ドロロキシフェン；ドロナビノール；デュオカルマイシンＳＡ；エブセレン；エコムスチン；エデルフォシン；エドレコロマブ；エフロルニチン；エレメン；エミテフール；エピルビシン；エプリステリド；エストラムスチン類似体；エストロゲンアゴニスト；エストロゲンアンタゴニスト；エタニダゾール；エトポシドリン酸塩；エキセメスタン；ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フィルグラスチム；フィナステリド；フラボピリドール；フレゼラスチン；フルアステロン；フルダラビン；フルオロダウノルニシン塩酸塩；フォルフェニメックス；フォルメスタン；フォストリエシン；フォテムスチン；ガドリニウムテキサフィリン；ガリウム硝酸塩；ガロシタビン；ガニレリクス；ゼラチナーゼ阻害剤；ゲムシタビン；グルタチオン阻害剤；ヘプスルファム；ヘレグリン；ヘキサメチレンビスアセトアミド；ヒペリシン；イバンドロン酸；イダルビシン；イドキシフェン；イドラマントン；イルモフォシン；イロマスタット；イミダゾアクリドン；イミキモド；免疫刺激ペプチド；インスリン様増殖因子−１受容体阻害剤；インターフェロンアゴニスト；インターフェロン；インターロイキン；イオベングアン；ヨードドキソルビシン；イポメアノール、４−；イロプラクト；イルソグラジン；イソベンガゾール；イソホモハリコンドリンＢ；イタセトロン；ジャスプラキノリド；カハラリドＦ；ラメラリン−Ｎトリアセテート；ランレオチド；レイナマイシン；レノグラスチム；レンチナン硫酸塩；レプトルスタチン；レトロゾール；白血病抑制因子；白血球アルファインターフェロン；リュープロリド＋エストロゲン＋プロゲステロン；リュープロレリン；レバミソール；リアロゾール；線状ポリアミン類似体；親油性二糖ペプチド；親油性白金化合物；リソクリンアミド７；ロバプラチン；ロンブリシン；ロメトレキソール；ロニダミン；ロソキサントロン；ロバスタチン；ロキソリビン；ルルトテカン；ルテチウムテキサフィリン；リソフィリン；溶解性ペプチド；マイタンシン；マンノスタチンＡ；マリマスタット；マソプロコール；マスピン；マトリライシン阻害剤；マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤；メノガリル；メルバロン；メテリン；メチオニナーゼ；メトクロプラミド；ＭＩＦ阻害剤；ミフェプリストン；ミルテフォシン；ミリモスチン；ミスマッチの二本鎖ＲＮＡ；ミトグアゾン；ミトララクトール；マイト���イシン類似体；ミトナフィド；マイトトキシン線維芽細胞増殖長因子−サポリン；ミトキサントロン；モファロテン；モルグラモスチム；モノクローナル抗体、ヒト絨毛性ゴナドトロピン；モノホスホリルリピドＡ＋ミオバクテリア細胞壁ｓｋ；モピダモール；多剤耐性遺伝子阻害剤；複数の腫瘍抑制因子１ベースの治療剤；マスタード抗癌剤；ミカペロキシドＢ；マイコバクテリア細胞壁抽出物；ミリアポロン；Ｎ−アセチルジナリン；Ｎ−置換ベンズアミド；ナファレリン；ナグレスチプ；ナロキソン＋ペンタゾシン；ナパビン；ナフテルピン；ナルトグラスチム；ネダプラチン；ネモルビシン；ネリドロン酸；中性エンドペプチダーゼ；ニルタミド；ニサマイシン；一酸化窒素モジュレーター；ニトロキシド酸化防止剤；ニトロリン；Ｏ６−ベンジルグアニン；オクトレオチド；オキセノン；オリゴヌクレオチド；オナプリストン；オンダンセトロン；オンダンセトロン；オラシン；経口サイトカイン誘導剤；オルマプラチン；オサテロン；オキサリプラチン；オキサウノマイシン；パクリタキセル；パクリタキセル類似体；パクリタキセル誘導体；パラウアミン；パルミトイルリゾキシン；パミドロン酸；パナキシトリオール；パノミフェン；パラバクチン；パゼリプチン；ペガスパルガーゼ；ペルデシン；ペントサンポリ硫酸ナトリウム；ペントスタチン；ペントロゾール；パーフルブロン；ペルホスファミド；ペリリルアルコール；フェナジノマイシン；フェニルアセテート；ホスファターゼ阻害剤；ピシバニル；ピロカルピン塩酸塩；ピラルビシン；ピリトレキシム；プラセチンＡ；プラセチンＢ；プラスミノーゲン活性化因子阻害剤；白金錯体；白金化合物；白金−トリアミン錯体；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニゾン；プロピルビスアクリドン；プロスタグランジンＪ２；プロテアソーム阻害剤；プロテインＡベースの免疫モジュレーター；プロテインキナーゼＣ阻害剤；プロテインキナーゼＣ阻害剤、微細藻類；プロテインチロシンホスファターゼ阻害剤；プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤；プルプリン；ピラゾロアクリジン；ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレンコンジュゲート；ｒａｆアンタゴニスト；ラルチトレキセド；ラモセトロン；ｒａｓファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤；ｒａｓ阻害剤；ｒａｓ−ＧＡＰ阻害剤；レテリプチン脱メチル化；
レニウムＲｅ  １８６エチドロネート；リゾキシン；リボザイム；ＲＩＩレチンアミド；ログレチミド；ロヒツカイン；ロムルチド；ロキニメックス；ルビジノンＢ１；ルボキシル；サフィンゴール；サントピン；ＳａｒＣＮＵ；サルコフィトールＡ；サルグラモスティム；Ｓｄｉ  １模倣物；セムスチン；老化由来阻害剤１；センスオリゴヌクレオチド；シグナル伝達阻害剤；シグナル伝達変調器；単鎖抗原結合タンパク質；シゾフィラン；ソブゾキサン；ボロカプテン酸ナトリウム；フェニル酢酸ナトリウム；ソルベロール；ソマトメジン結合タンパク質；ソネルミン；スパルフォス酸；スピカマイシンＤ；スピロムスチン；スプレノペンチン；スポンギスタチン１；スクアラミン；幹細胞阻害剤；幹細胞分裂阻害剤；スチピアミド；ストロメリシン阻害剤；スルフィノシン；超活性血管作用性腸管ペプチドアンタゴニスト；スラディスタ；スラミン；スワインソニン；合成グリコサミノグリカン；タリムスチン；タモキシフェンメチオジド；タウロムスチン；タザロテン；テコガランナトリウム；テガフール；テルラピリリウム；テロメラーゼ阻害剤；テモポルフィン；テモゾロミド；テニポシド；テトラクロロデカオキシド；テトラゾミン；タリブラスチン；チオコラリン；トロンボポエチン；トロンボポエチン模倣薬；チマルファシン；チモポエチン受容体アゴニスト；チモトリナン；甲状腺刺激ホルモン；エチルエチオプルプリン錫；チラパザミン；チタノセンビクロライド；トップセンチン；トレミフェン；全能性幹細胞因子；翻訳阻害剤；トレチノイン；トリアセチルウリジン；トリシリビン；トリメトレキサート；トリプトレリン；トロピセトロン；ツロステリド；チロシンキナーゼ阻害剤；チルホスチン；ＵＢＣ阻害剤；ウベニメクス；泌尿生殖洞由来の増殖阻害因子；ウロキナーゼ受容体拮抗薬；バプレオチド；バリオリンＢ；ベクターシステム、赤血球遺伝子治療；ベラレソル；ベラミン；ベルジン；ベルテポルフィン；ビノレルビン；ビンサルチン；ビタキシン；ヴォロゾール；ザノテロン；ゼニプラチン；ジラスコルブ；およびジノスタチン刺激因子。一実施形態では、抗癌薬は、５−フルオロウラシル、タキソール、またはロイコボリンである。
【０３９０】
[00352]場合によっては、例えば、癌を治療するための組成物、製剤および方法において、投与される組成物または製剤の単位投薬量は、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００ｍｇであり得る。場合によっては、投与される組成物または製剤の総量は、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ｇであり得る。
【０３９１】
[00353]場合によっては、本発明は、単独で、または医薬的に許容される担体もしくは賦形剤とともに、任意の経路で投与し得る、Ｔ細胞を含む医薬組成物を提供し、このような投与は、単回および複数回投与の両方で実施することができる。より詳細には、医薬組成物は、錠剤、カプセル、ロゼンジ、トローチ、ハンドキャンディー、粉末、スプレー、水性懸濁液、注射液、エリキシル剤、シロップなどの形態で、様々な薬学的に許容される不活性担体と組み合わせることができる。このような担体には、固体希釈剤または充填剤、滅菌水性媒体および様々な非毒性有機溶媒などが含まれる。さらに、このような経口医薬製剤は、このような目的に通常使用されるタイプの様々な薬剤によって適切に甘味および／または風味を付けることができる。
【０３９２】
[00354]例えば、ＣＲＩＳＰＲおよびＡＡＶ修飾された細胞は、限定されないが、抗ウイルス療法、シドフォビル、およびインターロイキン−２、またはシタラビン（ＡＲＡ−Ｃとしても公知である）などの薬剤による治療を含む、任意の数の関連する治療法と併せて（例えば、その前、それと同時、またはその後に）対象に投与することができる。場合によっては、操作された細胞は、化学療法、放射線、免疫抑制剤、例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸、ＦＫ５０６、抗体、または他の免疫アブレーション（ｉｍｍｕｎｏａｂｌａｔｉｖｅ）剤、例えば、ＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体もしくは他の抗体療法、サイトキシン、フルダリビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコプリエノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン、および照射と組み合わせて使用することができる。また、操作された細胞組成物は、骨髄移植、フルダラビンなどの化学療法剤、外部ビーム放射線療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミド、または抗体、例えば、ＯＫＴ３もしくはＣＡＭＰＡＴＨのいずれかを使用したＴ細胞アブレーション療法と併せて（例えば、その前に、それと同時またはその後に）対象に投与することができる。場合によっては、本発明の操作された細胞組成物は、ＣＤ２０と反応する薬剤、例えば、リツキサンなどのＢ細胞アブレーション療法後に投与することができる。例えば、対象は、高用量化学療法、それに続く末梢血幹細胞移植による標準治療を受けることができる。特定の場合では、移植後、対象は、本発明の操作された細胞、例えば、拡大された操作された細胞の注入を受けることができる。さらに、拡大されたＣＲＩＳＰＲおよびＡＡＶ修飾された細胞は、手術の前または後に投与することができる。本明細書に記載される方法のいずれか１つによって得られた操作された細胞は、宿主対移植片（ＨｖＧ）拒絶および移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）に対して、それを必要とする対象を治療するための本発明の特定の態様において使用することができる。したがって、不活性化ＴＣＲアルファおよび／またはＴＣＲベータ遺伝子を含む有効量の操作された細胞を対象に投与することにより対象を治療することを含む、宿主対移植片（ＨｖＧ）拒絶および移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）に対してそれを必要とする対象を治療する方法が意図される。
【０３９３】
[00355]場合によっては、免疫介在性の操作された細胞拒絶を最小限に抑えるためにリンパ球の減少を行うことができる。例えば、対象をシクロホスファミド（Ｃｙ）で治療した後、フルダラビン（Ｆｌｕ）リンパ球減少治療を行うことができる。Ｃｙなどの化学療法剤の用量は、約１ｍｇ／ｋｇから約２００ｍｇ／ｋｇであり得る。Ｃｙの用量は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８  ７９  ８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０から最大約２００ｍｇ／ｋｇの対象であり得る。あるいは、Ｃｙ治療の例示的な用量およびレジメンは、１〜３日間、好ましくは１〜２日間、約０．５〜５ｇ／ｍ２／日、好ましくは０．６〜３ｇ／ｍ２／日、より好ましくは１〜２ｇ／ｍ２／日であり得る。
【０３９４】
[00356]インフルエンザの用量は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８  ７９  ８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０から最大約２００ｍｇ／ｍ２の対象であり得る。あるいは、フルダラビン治療の例示的な用量およびレジメンは、２〜１０、３〜８、または４、５、６、または７日間、約２０〜８０ｍｇ／ｍ２／日、好ましくは２５〜７０ｍｇ／ｍ２／日または２５〜３０ｍｇ／ｍ２／日であり得る。
【０３９５】
[00357]場合によっては、ＣｙおよびＦｌｕの併用を適用することができる。例えば、２〜８日または３〜６日間の約１０〜６０ｍｇ／ｍ２／日または１５〜５０ｍｇ／ｍ２／日または２０〜３０ｍｇ／ｍ２／日の範囲のＦｌｕの初回用量は、その後、１〜５または２〜３日間の約０．２〜１ｍｇ／ｍ２／日または０．３〜０．８ｍｇ／ｍ２／日または０．４〜０．６ｇ／ｍ２／日の量のＣｙが続く。
【０３９６】
[00358]本明細書に記載されるように、細胞をヒトから抽出することができる。細胞はエクスビボで遺伝的に変更され、それに応じて使用することができる。これらの細胞は、細胞ベースの治療に使用することができる。これらの細胞は、レシピエント（例えば、ヒト）の病気を治療するために使用することができる。例えば、これらの細胞は、癌の治療に使用することができる。
【０３９７】
[00359]本明細書には、操作された細胞を含む１つ以上の細胞（臓器および／または組織を含む）をレシピエントに移植するステップを含む、レシピエントにおける疾患（例えば、癌）を治療する方法が記載される。細胞内ゲノム移植によって調製された細胞は、癌の治療に使用することができる。
【０３９８】
[00360]本明細書には、レシピエントに１つ以上のＣＲＩＳＰＲおよびＡＡＶ修飾された細胞（臓器および／または組織を含む）を移植するステップを含む、レシピエントにおける疾患（例えば、癌）を治療する方法が記載される。一般的に、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲおよびＡＡＶ修飾された細胞は、ＣＤ３  ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激することができる薬剤と、Ｔ細胞の表面上の共刺激分子を刺激することができるリガンドとが付着している表面との接触により拡大され得る。特に、Ｔ細胞集団は、表面上に固定化された抗ＣＤ３抗体もしくはその抗原結合断片または抗ＣＤ２抗体との接触によって、あるいはプロテインキナーゼＣ活性化因子（例えば、ブリオスタチン）（時にはカルシウムイオノフォアと組み合わせて）との接触などによって、インビトロで刺激することができる。ＣＲＩＳＰＲおよびＡＡＶ修飾された細胞の表面上のアクセサリー分子の共刺激について、アクセサリー分子に結合するリガンドを使用することができる。例えば、Ｔ細胞の増殖を刺激することができる条件下で、Ｔ細胞の集団を抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と接触させることができる。場合によっては、４−１ＢＢを使用して細胞を刺激することができる。例えば、細胞は、４−１ＢＢおよびＩＬ−２１または別のサイトカインで刺激することができる。場合によっては、５×１０１０個の細胞が対象に投与される。他の場合には、５×１０１１個の細胞が対象に投与される。
【０３９９】
[00361]一部の実施形態では、約５×１０１０個の細胞が対象に投与される。一部の実施形態では、約５×１０１０個の細胞は、対象に投与される細胞の量の中央値を表す。一部の実施形態では、約５×１０１０個の細胞が、対象の治療反応に影響を及ぼすのに必要とされる。一部の実施形態では、少なくとも約１×１０７細胞、少なくとも約２×１０７細胞、少なくとも約３×１０７細胞、少なくとも約４×１０７細胞、少なくとも約５×１０７細胞、少なくとも約６×１０７細胞、少なくとも約６×１０７細胞、少なくとも約８×１０７細胞、少なくとも約９×１０７細胞、少なくとも約１×１０８細胞、少なくとも約２×１０８細胞、少なくとも約３×１０８細胞、少なくとも約４×１０８細胞、少なくとも約５×１０８細胞、少なくとも約６×１０８細胞、少なくとも約６×１０８細胞、少なくとも約８×１０８細胞、少なくとも約９×１０８細胞、少なくとも約１×１０９細胞、少なくとも約２×１０９細胞、少なくとも約３×１０９細胞、少なくとも約４×１０９細胞、少なくとも約５×１０９細胞、少なくとも約６×１０９細胞、少なくとも約６×１０９細胞、少なくとも約８×１０９細胞、少なくとも約９×１０９細胞、少なくとも約１×１０１０細胞、少なくとも約２×１０１０細胞、少なくとも約３×１０１０細胞、少なくとも約４×１０１０細胞、少なくとも約５×１０１０細胞、少なくとも約６×１０１０細胞、少なくとも約６×１０１０細胞、少なくとも約８×１０１０細胞、少なくとも約９×１０１０細胞、少なくとも約１×１０１１細胞、少なくとも約２×１０１１細胞、少なくとも約３×１０１１細胞、少なくとも約４×１０１１細胞、少なくとも約５×１０１１細胞、少なくとも約６×１０１１細胞、少なくとも約６×１０１１細胞、少なくとも約８×１０１１細胞、少なくとも約９×１０１１細胞、または少なくとも約１×１０１２細胞。例えば、約５×１０１０個の細胞が対象に投与され得る。別の例では、３×１０６個の細胞から開始して、細胞は、約５×１０１０個の細胞に拡大し、対象に投与され得る。場合によっては、細胞は、治療に十分な数に拡大される。例えば、５×１０７個の細胞は、急速に拡大されて、治療使用に十分な数を生成され得る。場合によっては、治療使用に十分な数は５×１０１０個であり得る。任意の数の細胞を治療使用に注入することができる。例えば、１×１０６個以上５×１０１２個以下の数の細胞を対象に注入することができる。対象は、それらのために生成され得る、できる限り多数の細胞を注入することができる。場合によっては、対象に注入される細胞はすべて、操作されているわけではない。例えば、対象に注入される細胞の少なくとも９０％を操作することができる。他の例では、対象に注入される細胞の少なくとも４０％を操作することができる。
【０４００】
[00362]一部の実施形態では、本開示の方法は、対象の治療応答に影響を与えるのに必要なＣＲＩＳＰＲおよびＡＡＶ修飾された細胞の量を計算し、および／または対象に投与することを含む。一部の実施形態では、治療応答に影響を与えるのに必要な操作された細胞の量の計算には、細胞の生存率、および／または導入遺伝子が細胞のゲノムに組み込まれた効率が含まれる。一部の実施形態では、対象の治療応答に影響を与えるために、対象に投与することができるＣＲＩＳＰＲおよびＡＡＶ修飾された細胞は生存可能であり得る。一部の実施形態では、対象において治療応答をもたらすために、少なくとも約９５％、少なくとも約９０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８０％、少なくとも約７５％、少なくとも約７０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６０％、少なくとも約５５％、少なくとも約５０％、少なくとも約４５％、少なくとも約４０％、少なくとも約３５％、少なくとも約３０％、少なくとも約２５％、少なくとも約２０％、少なくとも約１５％、少なくとも約１０％の細胞が生存細胞である。一部の実施形態では、対象の治療応答に影響を及ぼすために、対象に投与されるＣＲＩＳＰＲおよびＡＡＶ修飾された細胞は、細胞のゲノムに首尾よく組み込まれた、外因性ＴＣＲなどの１つ以上の導入遺伝子を有する細胞であり得る。一部の実施形態では、対象において治療応答をもたらすために、少なくとも約９５％、少なくとも約９０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８０％、少なくとも約７５％、少なくとも約７０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６０％、少なくとも約５５％、少なくとも約５０％、少なくとも約４５％、少なくとも約４０％、少なくとも約３５％、少なくとも約３０％、少なくとも約２５％、少なくとも約２０％、少なくとも約１５％、少なくとも約１０％の細胞が、細胞のゲノムに首尾よく組み込まれた１つ以上の導入遺伝子を有していた。
【０４０１】
[00363]本明細書に開示される方法は、外因性ＴＣＲをコードするＣＲＩＳＰＲおよびＡＡＶ修飾された細胞を、それを必要とする対象に投与することにより、疾患、例えば、限定されないが、癌、心血管疾患、肺疾患、肝臓疾患、皮膚疾患、または神経疾患の治療または予防に使用することができる。
【０４０２】
[00364]移植は、任意のタイプの移植によるものであり得る。部位は、限定されないが、肝嚢下腔、脾嚢下腔、腎被膜下腔、大網、胃もしくは腸の粘膜下層、小腸の血管部分、静脈嚢、精巣、脳、脾臓、または角膜を含み得る。例えば、移植は、嚢下移植であり得る。移植はまた、筋肉内移植であり得る。移植は、門脈内移植であり得る。
【０４０３】
[00365]移植は、ヒト由来の１つ以上の細胞のものであり得る。例えば、１つ以上の細胞は、臓器由来であり得、臓器には、脳、心臓、肺、目、胃、膵臓、腎臓、肝臓、腸、子宮、膀胱、皮膚、毛髪、爪、耳、腺、鼻、口、唇、脾臓、歯茎、歯、舌、唾液腺、扁桃、咽頭、食道、大腸、小腸、直腸、肛門、甲状腺、胸腺、骨、軟骨、腱、靭帯、腎上体、骨格筋、平滑筋、血管、血液、脊髄、気管、尿管、尿道、視床下部、下垂体、幽門、副腎、卵巣、卵管、子宮、膣、乳腺、精巣、精嚢、陰茎、リンパ、リンパ節またはリンパ管が含まれ得る。１つ以上の細胞はまた、脳、心臓、肝臓、皮膚、腸、肺、腎臓、目、小腸、または膵臓に由来し得る。１つ以上の細胞は、膵臓、腎臓、目、肝臓、小腸、肺、または心臓に由来し得る。１つ以上の細胞は、膵臓由来であり得る。１つ以上の細胞は、膵島細胞、例えば、膵β細胞であり得る。１つ以上の細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、リンパ球、単球またはマクロファージなどの任意の血液細胞であり得る。１つ以上の細胞は、リンパ球、Ｂ細胞、Ｔ細胞などの任意の免疫細胞であり得る。
【０４０４】
[00366]本明細書に開示される方法はまた、１つ以上の細胞を移植することを含むことができ、１つ以上の細胞は、任意のタイプの細胞であり得る。例えば、１つ以上の細胞は、上皮細胞、線維芽細胞、神経細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラニン細胞、軟骨細胞、リンパ球（ＢおよびＴ）、マクロファージ、単球、単核細胞、心筋細胞、他の筋肉細胞、顆粒膜細胞、卵丘細胞、表皮細胞、内皮細胞、膵島細胞、血液細胞、血液前駆細胞、骨細胞、骨前駆細胞、神経幹細胞、始原幹細胞、肝細胞、ケラチノサイト、臍静脈内皮細胞、大動脈内皮細胞、微小血管内皮細胞、線維芽細胞、肝星細胞、大動脈平滑筋細胞、心筋細胞、ニューロン、クッパー細胞、平滑筋細胞、シュワン細胞、および上皮細胞、赤血球、血小板、好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球、脂肪細胞、軟骨細胞、膵島細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、耳下腺細胞、腫瘍細胞、グリア細胞、星状細胞、赤血球、白血球細胞、マクロファージ、上皮細胞、体細胞、下垂体細胞、副腎細胞、有毛細胞、膀胱細胞、腎臓細胞、網膜細胞、桿体細胞、錐体細胞、心臓細胞、ペースメーカー細胞、脾臓細胞、抗原提示細胞、記憶細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、形質細胞、筋肉細胞、卵巣細胞、子宮細胞、前立腺細胞、膣上皮細胞、精子細胞、精巣細胞、生殖細胞、卵細胞、ライディッヒ細胞、尿細管周囲細胞、セルトリ細胞、ルテイン細胞、子宮頸部細胞、子宮内膜細胞、乳腺細胞、卵胞細胞、粘液細胞、繊毛細胞、非角化上皮細胞、角化上皮細胞、肺細胞、杯細胞、円柱上皮細胞、ドーパミ作動性細胞、扁平上皮細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、ドーパミン作動性細胞、胚性幹細胞、線維芽細胞および胎児線維芽細胞であり得る。さらに、１つ以上の細胞は、限定されないが、膵臓α細胞、膵臓β細胞、膵臓δ細胞、膵臓Ｆ細胞（例えば、ＰＰ細胞）、または膵臓ε細胞を含む、膵島細胞および／または細胞クラスターなどであり得る。一例では、１つ以上の細胞は、膵臓α細胞であり得る。別の例では、１つ以上の細胞は、膵臓β細胞であり得る。
【０４０５】
[00367]ドナーは、限定されないが、胎児、新生児、若年および成人などの任意の発達段階にあり得る。例えば、ドナーＴ細胞は成人から分離することができる。ドナーのヒトＴ細胞は、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１歳未満であり得る。例えば、Ｔ細胞はまた、６歳未満のヒトから分離することができる。Ｔ細胞はまた、３歳未満のヒトから分離することができる。ドナーは１０歳を超えることができる。
キット
[00368]本明細書では、組成物を含むキットが開示され得る。また、本明細書には、癌、病原体感染、免疫障害もしくは同種異系移植の治療または予防用のキットが開示され得る。一実施形態では、キットは、有効量のＣＲＩＳＰＲおよびＡＡＶ修飾された細胞の組成物を単位剤形で含む、治療用または予防用の組成物を含むことができる。一部の実施形態では、キットは、操作されたＴ細胞の治療組成物を含むことができる滅菌容器を含む。このような容器は、ボックス、アンプル、ボトル、バイアル、チューブ、バッグ、ポーチ、ブリスターパック、または当該技術分野において公知である他の適切な容器形態であり得る。このような容器は、プラスチック、ガラス、ラミネートペーパー、金属箔、または薬剤を保持するのに適した他の材料で作製することができる。場合によっては、ＣＲＩＳＰＲおよびＡＡＶ修飾された細胞は、癌、病原体感染、免疫障害もしくは同種異系移植を有するかまたは発症するリスクのある対象に細胞を投与するための説明書とともに提供することができる。説明書には、一般的に、癌、病原体感染、免疫障害、もしくは同種異系移植の治療または予防のための組成物の使用に関する情報を含めることができる。場合によっては、キットには、約１×１０４細胞から約１×１０１２細胞を含めることができる。場合によっては、キットは、少なくとも約１×１０５細胞、少なくとも約１×１０６細胞、少なくとも約１×１０７細胞、少なくとも約４×１０７細胞、少なくとも約５×１０７細胞、少なくとも約６×１０７細胞、少なくとも約６×１０７細胞、少なくとも約８×１０７細胞、少なくとも約９×１０７細胞、少なくとも約１×１０８細胞、少なくとも約２×１０８細胞、少なくとも約３×１０８細胞、少なくとも約４×１０８細胞、少なくとも約５×１０８細胞、少なくとも約６×１０８細胞、少なくとも約６×１０８細胞、少なくとも約８×１０８細胞、少なくとも約９×１０８細胞、少なくとも約１×１０９細胞、少なくとも約２×１０９細胞、少なくとも約３×１０９細胞、少なくとも約４×１０９細胞、少なくとも約５×１０９細胞、少なくとも約６×１０９細胞、少なくとも約６×１０９細胞、少なくとも約８×１０９細胞、少なくとも約９×１０９細胞、少なくとも約１×１０１０細胞、少なくとも約２×１０１０細胞、少なくとも約３×１０１０細胞、少なくとも約４×１０１０細胞、少なくとも約５×１０１０細胞、少なくとも約６×１０１０細胞、少なくとも約６×１０１０細胞、少なくとも約８×１０１０細胞、少なくとも約９×１０１０細胞、少なくとも約１×１０１１細胞、少なくとも約２×１０１１細胞、少なくとも約３×１０１１細胞、少なくとも約４×１０１１細胞、少なくとも約５×１０１１細胞、少なくとも約６×１０１１細胞、少なくとも約６×１０１１細胞、少なくとも約８×１０１１細胞、少なくとも約９×１０１１細胞、または少なくとも約１×１０１２細胞を含むことができる。例えば、約５×１０１０細胞をキットに含めることができる。別の例では、キットには、３×１０６細胞を含めることができる。細胞は、約５×１０１０細胞に拡大され、対象に投与することができる。
【０４０６】
[00369]場合によっては、キットは、同種異系細胞を含むことができる。場合によっては、キットは、ゲノム修飾を含み得る細胞を含むことができる。場合によっては、キットは、「既製の」細胞を含むことができる。場合によっては、キットは、臨床用に拡大し得る細胞を含むことができる。場合によっては、キットは、研究目的のコンテンツを含めることができる。
【０４０７】
[00370]場合によっては、指示書は、以下の少なくとも１つを含む：治療薬の説明；新生物、病原体感染、免疫障害もしくは同種異系移植またはそれらの症状の治療または予防のための投薬スケジュールおよび投与；注意事項；警告；適応症；対抗適用；過剰摂取情報；副作用；動物薬理学；臨床研究；および／または参考文献。指示書は、直接容器に（存在する場合）、容器に貼付されるラベルとして、または容器にもしくは容器内に供給される別のシート、パンフレット、カード、もしくはフォルダとして印刷することができる。場合によっては、指示書は、化学療法剤の投与後、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０日目、または最大２日、３日、４日、５日、６日、もしくは７日間、ＣＲＩＳＰＲおよびＡＡＶ修飾された細胞を投与する手順を提供する。場合によっては、説明書は、化学療法薬の投与後の少なくとも２４時間に、操作されたＴ細胞を投与する手順を提供する。ＣＲＩＳＰＲおよびＡＡＶ修飾された細胞は、静脈内注射用に製剤化することができる。ＣＲＩＳＰＲおよびＡＡＶ修飾された細胞は、注入用に製剤化することができる。場合によっては、キットは、小児用量の製品を含めることができる。
【実施例】
【０４０８】
実施例１
ヒトＴ細胞のＡＡＶ／ＣＲＩＳＰＲゲノム修飾
３日目：回復および刺激
[00371]１０％ヒト血清をＸ−ＶＩＶＯ１５培地に添加し、３７℃で予め加温した。ヒトＰＢＭＣを水浴中で解凍した。解凍後すぐに、細胞を再懸濁し、３００ｇで５〜１０分間回転させた。細胞をＰＢＳで洗浄し、血球計でカウントした。次に、細胞をＸ−ＶＩＶＯ１５＋１０％ヒト血清＋３００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２＋５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７およびＩＬ−１５に１ｍｌあたり１００万個の細胞で再懸濁した。抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓを約１〜２の比率の細胞：ビーズ刺激するために添加した。細胞を３日間培養した。
【０４０９】
０日目：ビーズの除去、トランスフェクション、および形質導入
[00372]細胞をＰＢＳで洗浄し、約１分間、ＤｙｎａＭａｇ１５に入れた。ビーズを２回洗い流し、次に、細胞を１ｍｌあたり１００万個の細胞で、Ｘ−ＶＩＶＯ１５＋血清＋ＩＬ−２＋ＩＬ−７＋ＩＬ−１５に再懸濁し、ペレット化した。その後、細胞をトランスフェクション前に３７℃で２時間培養した。
【０４１０】
[00373]トランスフェクションのために、細胞をＰＢＳで洗浄し、ペレット化した。細胞ペレットをＴ緩衝液に再懸濁した。必要とされる体積の細胞（表９を参照）を、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡを含む滅菌済み微量遠心チューブに添加した。細胞、ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡを穏やかなピペッティングにより混合した。気泡が存在しないことを確保しながら、細胞溶液をＮｅｏｎチップに慎重に取り込んだ。細胞は、プログラムされた条件で攻撃された。トランスフェクション後、ＡＡＶウイルスを添加する前に、細胞を３０℃で２時間培養した。トランスフェクションプロトコールの概略図、図７Ａおよび代表的なベクター、図７Ｂ。三重ベクタートランスフェクションを利用する導入遺伝子カセットの概略図を図１４Ａ〜図１４Ｃに示す。
【０４１１】
【表９】
2020530307.tif 000099
【０４１２】
【表１０】
2020530307.tif 000100
【０４１３】
[00374]ＭＯＩが１ｅ６のＡＡＶウイルスを細胞に形質導入し、３０℃で一晩培養した。
１日目：培地交換
[00375]形質導入の２４時間後に、細胞を形質導入培地から取り出し、フェノールレッドおよびゲンタマイシンを含む培地（赤色培地）−血清およびＩＬ−２＋ＩＬ−７＋ＩＬ−１５−に移した。細胞を３７℃で培養した。代表的なプロトコールの概略図、図１１。
【０４１４】
実施例２
フローサイトメトリーによるＴＣＲ発現の決定
[00376]ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＡＡＶＳ１、およびＣＩＳＨでのＣＲＩＳＰＲによるエレクトロポレーション後、およびｒＡＡＶ６での形質導入後の３日目以降（典型的には３、７および１４日目）に、フローサイトメトリーにより細胞をＴＣＲ導入遺伝子の発現について評価した。細胞のアリコートを培養物から回収し、洗浄し、ペレット化し、ＰＢＳ＋０．５％ＦＢＳで希釈されたＡｂ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＴＣＲベータＰＥ）１／１００−試料あたり５０〜１００μｌ−に再懸濁した。再懸濁された細胞は、約５０〜１００μｌのＡｂに含まれた。細胞を４℃で３０分間インキュベートした。また、製造元の指示に従って、生存率染料ｅＦｌｕｏｒ７８０またはＳＹＴＯＸ  Ｂｌｕｅ生存率染色を追加した。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、分析のために１００〜２００μｌのＰＢＳに再懸濁した。
【０４１５】
[00377]３日目、７日目、および１４日目に、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＡＡＶＳ１、およびＣＩＳＨでＣＲＩＳＰＲを用いて細胞を修飾し、ＷＴ  ＡＡＶ６またはＦ１２９Ｌ突然変異体ＡＡＶ６（ＶＰ１にあるＦ１２９Ｌ突然変異）で形質導入し、外因性ＴＣＲをコードする２をＴＣＲ発現についてフローサイトメトリーによって評価した。図２、図３Ａ、図３Ｂ、および図４。１４日目に、ＴＣＲの平均蛍光強度を定量化した。図５Ｂおよび図６Ｂ、ならびにＴＣＲ発現、図５Ａおよび図６Ａ。代表的なフローサイトメトリーアッセイ、図１１。２１日目、ＴＣＲ発現パーセント、図１２Ａ、および３日目から２１日目までのＴＣＲ発現の要約、図１２Ｂ。
【０４１６】
実施例２
ベクター構築およびウイルス生産を標的とするＡＡＶ
[00378]標的化ベクターは、相同性アームのＤＮＡ合成およびｍＴＣＲ発現カセットのＰＣＲ増幅により生成された。合成された断片およびｍＴＣＲカセットは、制限酵素消化およびＡＡＶ２逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列の２つのコピー間のｐＡＡＶ−ＭＣＳ骨格プラスミド（Ａｇｉｌｅｎｔ）への連結によってクローニングされ、ウイルスパッケージングを促進した。図８。連結されたプラスミドをＯｎｅ  Ｓｈｏｔ  ＴＯＰ１０の化学的にコンピテントな大腸菌（Ｔｈｅｒｍｏ  ｆｉｓｈｅｒ）に形質転換した。各ベクターについて１ｍｇのプラスミドＤＮＡをＥｎｄｏＦｒｅｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して細菌から精製し、感染性ＡＡＶを生産するためにＶｉｇｅｎｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＭＤ  ＵＳＡに送付した。１ｍｌあたり１×１０１３ウイルスゲノムコピーを超える精製されたウイルスの力価を決定し、表１１、凍結ストックを作製した。
【０４１７】
【表１１】
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【０４１８】
実施例３
ＡＡＶ修飾されたＴ細胞の臨床的拡大
[00379]多数の形質導入されたＴ細胞を生成するために、急速拡大プロトコール（ＲＥＰ）を使用して、Ｔ細胞が増殖するように誘導する。ＲＥＰで使用される前に、Ｔ細胞は、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８およびＩＬ−２とともに培養が開始され、上で詳述したように培養開始後の２日目に形質導入される。細胞を７５ｃｍ２フラスコで３７℃、５％ＣＯ２で培養する。細胞をカウントし、培養中に保持される残りの時間、２日ごとに３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む新鮮なＴ細胞培地に０．５×１０６細胞／ｍＬの濃度で懸濁する。
【０４１９】
実施例４
ＡＡＶスクリーン：ＧＦＰ滴定
[00380]細胞に導入した場合、形質導入の増加および結果として生じる発現を付与する推定ＡＡＶ突然変異体およびキメラを同定および単離するために、スクリーンを行った。４つのＡＡＶ６突然変異体が生成された：Ｆ１２９Ｌ、Ｈ６４２Ｎ、およびＤ４１８Ｎ；Ｆ１２９Ｌ、Ｈ６４２Ｎ、およびＬ５８４Ｎ；Ｆ１２９Ｌ、Ｈ４６２Ｎ、またはＶ５９８Ｌ；およびＦ１２９Ｌ、Ｈ４６２Ｎ、またはＶ５９８Ｉ。ＯＫＴ３および抗ＣＤ２８活性化ヒトＴ細胞をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９でゲノム修飾し、ＡＡＶＳ１遺伝子をノックアウトした。ＣＲＩＳＰＲ修飾の２時間後、各突然変異体のウイルス上清を使用して、１×１０６ＧＣ／ｍＬから２００ＧＣ／ｍＬに下げたＭＯＩでノックアウト細胞を形質導入した。
【０４２０】
[00381]形質導入後５および８日目に、細胞を回収し、ＧＦＰの発現についてフローサイトメトリーによって分析した。図１３Ａおよび図１３Ｂ。３日目から１４日目までの様々な突然変異にわたるＧＦＰ発現パーセントの要約。図１１Ａおよび図１１Ｂ。
【０４２１】
実施例５
臨床試験
[00382]評価可能な癌を有する対象は、末梢血単核細胞を単離するためにアフェレーシスを受ける。リンパ球を単離し、外因性ＴＣＲをコードする組換えＡＡＶ６でウイルスによって形質導入し、拡大し、免疫学的試験のためにアリコートを採取する。Ｔ細胞投与の−７および−６日目に、対象は、１時間にわたって６０ｍｇ／ｋｇ／日×２日のＩＶでシクロホスファミドの調製レジメンを受ける。細胞投与の−７および−３日目に、対象は、５日間、３０分間にわたって毎日、フルダラビン２５ｍｇ／ｍ２／日のＩＶＰＢの調製レジメンを受ける。調製レジメン中、対象は毎日、全血球カウント（ＣＢＣ）試験を受ける。
【０４２２】
[00383]第Ｉ相研究の最初の部分では、対象あたり１０９個の操作されたＴ細胞から開始して、グループあたり１人の対象を利用して用量漸増が開始される。個々の対象は、ログの半分の増分で処置される。したがって、以下の用量：１０９、３×１０９細胞、１０１０細胞、３×１０１０細胞、および最大１×１０１１細胞が利用される。自己Ｔ細胞は、フィルターなしのチューブを介して２０〜３０分かけて静脈内投与される。
【０４２３】
[00384]すべての対象は、細胞生成物の投与後の６週間の評価のために病院に戻る。
実施例６
定量的ＰＣＲ
[00385]定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を使用して、Ｔ細胞注入の前および後の異なる時間点で回収したＰＢＭＣ中のＴＣＲ導入遺伝子を検出することにより、組換えＡＡＶ６およびＣＲＩＳＰＲ修飾されたＴリンパ球のＡＡＶ被積分を定量する。ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ血液ミキキット（Ｑｉａｇｅｎ）でＤＮＡを抽出した後、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７９００ＨＴ配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、γδＴＣＲ導入遺伝子に特異的なプライマーおよびＴａｑＭａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＤＮＡを３重に増幅する。ベースライン範囲はサイクル６〜１５に設定され、閾値はベースライン蛍光より１０ＳＤ高い。ＤＮＡ標準を生成するために、ＴＣＲ導入遺伝子カセットをコードするＤＮＡプラスミドの連続希釈を使用する。
【０４２４】
実施例７
修飾された組換えＡＡＶ６ウイルスの品質管理アッセイ
[00386]組換えＡＡＶ６ウイルスは、１０９個のＨｅｋ２９３細胞から産生され、イオジキサノール勾配超遠心分離により精製された。得られたウイルスは５００μｌに濃縮され、ウイルス力価は１０１３ｖｐ／ｍｌ以上であった。品質管理アッセイを実施した：ウイルスの力価および純度を評価するために、ｑＰＣＲおよび銀染色により決定される物理的力価（ｖｇ／ｍｌ）。ＡＡＶ粒子はＦ６８／ＰＢＳに保存された
【０４２５】
【表１２−１】
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【０４２６】
【表１２−２】
2020530307.tif 000103
【０４２７】
【表１２−３】
2020530307.tif 000104
【０４２８】
【表１２−４】
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【０４２９】
【表１２−５】
2020530307.tif 000106
【０４３０】
【表１２−６】
2020530307.tif 000107
【０４３１】
【表１２−７】
2020530307.tif 000108
【０４３２】
【表１２−８】
2020530307.tif 000109
【０４３３】
【表１２−９】
2020530307.tif 000110
【０４３４】
【表１２−１０】
2020530307.tif 000111
【０４３５】
【表１２−１１】
2020530307.tif 000112
【０４３６】
【表１２−１２】
2020530307.tif 000113
【０４３７】
【表１２−１３】
2020530307.tif 000114
【０４３８】
【表１２−１４】
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【０４３９】
【表１２−１５】
2020530307.tif 000116
【０４４０】
【表１２−１６】
2020530307.tif 000117
【０４４１】
【表１２−１７】
2020530307.tif 000118
【０４４２】
【表１２−１８】
2020530307.tif 000119
【０４４３】
【表１２−１９】
2020530307.tif 000120
【０４４４】
【表１２−２０】
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【０４４５】
【表１２−２１】
2020530307.tif 000122
【０４４６】
【表１２−２２】
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【０４４７】
【表１２−２３】
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【０４４８】
【表１２−２４】
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【０４４９】
【表１２−２５】
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【０４５０】
【表１２−２６】
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【０４５１】
【表１２−２７】
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【０４５２】
【表１２−２８】
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【０４５３】
【表１２−２９】
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【０４５４】
【表１２−３０】
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【０４５５】
【表１２−３１】
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【０４５６】
【表１２−３２】
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【０４５７】
【表１２−３３】
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【０４５８】
【表１２−３４】
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【０４５９】
【表１２−３５】
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【０４６０】
【表１２−３６】
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【０４６１】
【表１２−３７】
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【０４６２】
【表１２−３８】
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【０４６３】
【表１２−３９】
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【０４６４】
【表１２−４０】
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【０４６５】
【表１２−４１】
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【０４６６】
【表１２−４２】
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【０４６７】
【表１２−４３】
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【０４６８】
【表１２−４４】
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【０４６９】
【表１２−４５】
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【０４７０】
【表１２−４６】
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【０４７１】
【表１２−４７】
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【０４７２】
【表１２−４８】
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【０４７３】
【表１２−４９】
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【０４７４】
【表１２−５０】
2020530307.tif 000151
【０４７５】
【表１３−１】
2020530307.tif 000152
【０４７６】
【表１３−２】
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【０４７７】
【表１３−３】
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【０４７８】
【表１３−４】
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【０４７９】
【表１３−５】
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【０４８０】
【表１３−６】
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【０４８１】
【表１３−７】
2020530307.tif 000158
【０４８２】
【表１３−８】
2020530307.tif 000159
【０４８３】
【表１３−９】
2020530307.tif 000160
【０４８４】
【表１３−１０】
2020530307.tif 000161
【０４８５】
【表１３−１１】
2020530307.tif 000162
【０４８６】
【表１３−１２】
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【０４８７】
【表１３−１３】
2020530307.tif 000164
【０４８８】
【表１３−１４】
2020530307.tif 000165
【０４８９】
【表１３−１５】
2020530307.tif 000166
【０４９０】
【表１３−１６】
2020530307.tif 000167
【０４９１】
【表１３−１７】
2020530307.tif 000168
【０４９２】
【表１３−１８】
2020530307.tif 000169
【０４９３】
実施例８
組換えＡＡＶ６変異ウイルス産生および細胞形質導入
ウイルス産生
[00387]２０個のウイルス変異体は、ＡＡＶ６タンパク質のキャプシド配列に一重、二重、または三重の突然変異を含むように設計された（表１）。ＨＥＫ２９３細胞は、組換えＡＡＶ６（表１２のウイルス変異体のいずれか１つに特異的なａｐ配列を含むプラスミド）、ＣＭＶ−ＧＦＰ、およびｐヘルパープラスミドで同時トランスフェクトされた。トランスフェクションの７２時間後、ウイルス粒子を回収し、ＡＡＶａｎｃｅｄ濃縮試薬で精製した。ウイルス力価は、ＣＭＶプロモーター標準曲線（Ｔａｑｍａｎ）、ｙ＝−１．０５４ｌｎ（ｘ）＋３６．６８５に基づいて計算された。Ｒ２＝０．９７５５。細胞形質導入：２０キャプシド変異体
[00388]細胞培養物は、形質導入前の３日間、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｇｉｂｃｏ）で刺激された。０日目に、４×１０４のＣＤ３＋Ｔ細胞に、ＭＯＩが１×１０４ＧＣ／ｍＬでウイルスを感染させた。ウイルス１１、１２、および１８を形質導入した細胞は力価が低く、したがって、６０００、８００、および７３００ＧＣ／ｍＬなどの低いＭＯＩをそれぞれ使用した。形質導入後の１日目に、培地（Ｘ−Ｖｉｖｏ  １５培地＋１０％ヒト血清（Ｓｉｇｍａ）、ＩＬ−２（３０００Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−７（５ｎｇ／ｍＬ）、およびＩＬ−１５（５ｎｇ／ｍＬ）（Ｐｅｐｔｒｏｔｅｃｈ））を交換した。形質導入後の７日目に、ＧＦＰ発現をフローサイトメトリーにより測定し、図１７Ａ、図１７Ｂ、および図１７Ｃに要約した。
組換えＡＡＶ６変異体およびＣＲＩＳＰＲ
[00389]細胞培養物は、ＣＲＩＳＰＲによる編集前の３日間、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｇｉｂｃｏ）で刺激された。０日目に、３×１０６個のＣＤ３＋Ｔ細胞は、パラメータ：パルス電圧１４００、パルス幅１０ｍｓ、３パルスを用いたＮｅｏｎエレクトロポレーションシステムを使用して、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ（１５μｇ）、ＡＡＶＳ１  ｇＲＮＡ（１０μｇ）をエレクトロポレートされた。細胞をエレクトロポレーション後に２時間インキュベートし、次に、組換えＡＡＶ６変異ウイルスと接触させた。
【０４９４】
[00390]０日目に、ＣＲＩＳＰＲ後の２時間のインキュベーションの完了時に、２×１０５個のＣＤ３＋Ｔ細胞は、１×１０６ＧＣ／ｍＬのＭＯＩで、ＡＡＶＳ１スプライスアクセプターＧＦＰ（ＳＡ−ＧＦＰ）を含むウイルスに感染された。形質導入後の１日目に、培地（Ｘ−Ｖｉｖｏ  １５培地＋１０％ヒト血清（Ｓｉｇｍａ）、ＩＬ−２（３０００Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−７（５ｎｇ／ｍＬ）、およびＩＬ−１５（５ｎｇ／ｍＬ）（Ｐｅｐｔｒｏｔｅｃｈ））を交換した。対照は、刺激および拡大されたがＣＲＩＳＰＲでエレクトロポレートされていない、形質導入されていないヒトＣＤ３＋細胞、ＡＡＶ６  ＧＦＰ：ＣＭＶ  ＧＦＰ陽性対照を含むＷＴ  ＡＡＶ６で感染された２×１０５個のＴ細胞、Ｚａｐ：２μＬの１×ＰＢＳとともにＮｅｏｎでエレクトロポレートされた２×１０５個のＴ細胞、ＧＥＰ  ｍＲＮＡ：陽性対照として０．３５μｇ  ＧＦＰ  ｍＲＮＡと１．５μＬの１×ＰＢＳでエレクトロポレートされたかまたはＡＡＶＳ１  ｇＲＮＡでエレクトロポレートされた２×１０５個のＴ細胞、およびＣａｓ９：１μｇのＡＡＶＳ１  ｇＲＮＡおよび１。５μｇのＣａｓ９  ｍＲＮＡでエレクトロポレートされた２×１０５個のＴ細胞からなった。
【０４９５】
[00391]ＣＲＩＳＰＲおよび組換えＡＡＶ６修飾後の３日目および７日目に、ＧＦＰ発現をフローサイトメトリーにより測定した（図１８Ａ、図１８Ｂ、図１９Ａ、図１９Ｂ、および図２０）（変異体１〜２０におけるＧＦＰ発現の要約）。
組換えＡＡＶ６変異スプライスアクセプターＧＦＰ滴定
[00392]４つの三重突然変異体（ウイルス番号：１５、１７、１９、および２０）をＧＦＰ発現パーセントに基づいて選択し、滴定アッセイで利用して、突然変異体（mutant variant）がより低いＭＯＩでＷＴ  ＡＡＶ６より優れているかどうかを決定した。細胞培養物は、ＣＲＩＳＰＲによる編集前に、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｇｉｂｃｏ）で３日間刺激された。０日目に、３×１０６個のＣＤ３＋Ｔ細胞は、パルス電圧１４００、パルス幅１０ｍｓ、３パルスのエレクトロポレーションパラメータでＮｅｏｎシステムを使用して、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ（１５μｇ）およびＡＡＶＳ１  ｇＲＮＡ（１０μｇ）でトランスフェクトされた。細胞は、エレクトロポレーション後の２時間、ＣＲＩＳＰＲでインキュベートされた。
【０４９６】
[00393]０日目に、ＣＲＩＳＰＲ後の２時間のインキュベーションの完了時に、２×１０５個のＣＤ３＋Ｔ細胞を５つの条件下で感染させた：ＷＴ、ウイルス番号：１５、１７、１９、または２０（ＡＡＶＳ１スプライスアクセプターＧＦＰ含有（ＳＡ−ＧＦＰ））、ＭＯＩは１×１０６、２×１０５、１×１０５、１×１０４、１×１０３、または２×１０２である。形質導入後の１日目に、培地（Ｘ−Ｖｉｖｏ  １５培地＋１０％ヒト血清（Ｓｉｇｍａ）、ＩＬ−２（３０００Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−７（５ｎｇ／ｍＬ）、およびＩＬ−１５（５ｎｇ／ｍＬ））（Ｐｅｐｔｒｏｔｅｃｈ）を交換した。５日目、８日目、および１４日目に、ＧＲＰパーセントをフローサイトメトリーにより測定したさ。図２１Ａ〜図２１Ｆ。図２１Ｇはデータの要約を示す。
スプライスアクセプターＮａｎｏＬｕｃ変異体
[00394]４つの三重突然変異体（ウイルス番号１５、１７、１９、および２０）を使用して、ＡＡＶＳ１スプライスアクセプターＮａｎｏＬｕｃ（ＣＭＶ−ＮａｎｏＬｕｃ）を含む組換えＡＡＶ６ウイルス粒子を生成した。ＮａｎｏＬｕｃは、それが使用される実験の範囲および感受性を向上させる高度に発現されたレポーターである。細胞培養物は、ＣＲＩＳＰＲのよる編集前に、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｇｉｂｃｏ）で３日間刺激された。０日目に、３×１０６個のＣＤ３＋Ｔ細胞は、パルス電圧１４００、パルス幅１０ｍｓ、３パルスのエレクトロポレーションパラメータでＮｅｏｎシステムを使用して、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ（１５μｇ）およびＡＡＶＳ１  ｇＲＮＡ（１０μｇ）でトランスフェクトされた。細胞は、エレクトロポレーション後の２時間、ＣＲＩＳＰＲでインキュベートされた。
【０４９７】
[00395]０日目に、ＣＲＩＳＰＲ後の２時間のインキュベーションの完了時に、３×１０５個のＣＤ３＋Ｔ細胞を５つの条件下で感染させた：ＷＴ、ウイルス番号：１５、１７、１９、または２０（ＳＡ−ＮａｎｏＬｕｃ含有）、ＭＯＩは１×１０６、２×１０５、１×１０５、１×１０４、１×１０３、または２×１０２である。トランスフェクションの完了時に、細胞を３０℃で一晩インキュベートした。形質導入後の１日目に、細胞を３７℃に移した。９日目および１４日目に、ＧＦＰパーセントは、プレートリーダーを用いて発光（ＲＬＵ）により測定された。図２２Ａおよび図２２Ｂ。
【０４９８】
[00396]ウイルス変異体１５、１７、１９、および２０のパッケージング効率は、各変異体のウイルスゲノム対ウイルスキャプシド比として計算された。１に最も近いキャプシド比は、最良のパッケージング効率を示す。ｑＰＣＲを使用してゲノム力価を決定し、ＡＤＫ１  ＥＬＩＳＡ（Ｐｒｏｇｅｎ）を使用してキャプシドを定量した。図２２Ｃ。
【０４９９】
【表１４】
2020530307.tif 000170
【０５００】
実施例９
変異ｒＡＡＶ６
キメラＮａｎｏＬｕｃ滴定
[00397]細胞培養物は、ＣＲＩＳＰＲによる編集前の３日間、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｇｉｂｃｏ）で刺激された。０日目に、３×１０６個のＣＤ３＋Ｔ細胞は、パルス電圧１４００、パルス幅１０ｍｓ、３パルスのエレクトロポレーションパラメータでＮｅｏｎシステムを使用して、表１６の核酸由来のＣａｓ９  ｍＲＮＡ（１５μｇ）、およびＡＡＶＳ１  ｇＲＮＡ（１０μｇ）でトランスフェクトされた。細胞は、エレクトロポレーション後の２時間、ＣＲＩＳＰＲでインキュベートされた。
【０５０１】
[00398]０日目に、ＣＲＩＳＰＲの完了時に、修飾されたＣＤ３＋Ｔ細胞をプールし、１×１０６、２×１０５、１×１０５、１×１０４、１×１０３、または２×１０２個で９６ウェルプレートに分注した。編集された細胞を３０℃で一晩インキュベートした。編集後の１日目に、細胞を３７℃に移し、７日目および１４日目までインキュベートした。編集後の７日目と１４日目に、Ｎａｎｏ−Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加し、蛍光は、プレートリーダーを用いて５×１０４細胞から測定された。発光を３重にして計算し、ＨＣＴ１１６  ＮａｎｏＬｕｃ細胞株陽性対照と比較した。図２３、図２４Ａ、図２４Ｂ。Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ、ＡＡＶＳ１  ｇＲＮＡによるトランスフェクション、およびＣＭＶプロモーターから発現されたＮａｎｏＬｕｃ導入遺伝子を含むウイルスによる形質導入後の１４日目にＮａｎｏ−Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加した後の５×１０４細胞から得られた発光読み取り。ＷＴ  ＡＡＶ６は赤色で、キメラ３、５、および６はそれぞれ薄緑色、黒色、ピンク色（plink）で示される。キメラ３、５、および６は、力価が低すぎて、滴定実験で高いＭＯＩを達成することができなかった。ＷＴ  ＡＡＶ６および非トランスフェクト細胞と比較した場合、ＡＡＶキメラ３、５、および６でトランスフェクトされた細胞は、０から１，０００，０００のＭＩで修飾後の７および１４日目に、発光（ＲＬＵ）の増加を示し、これはトランスフェクション効率の増加を示す。キメラ３、５、および６は、ＷＴ  ＡＡＶ６よりも優れた発光レベルを示し、ＣＭＶ−ＮａｎｏＬｕｃ導入遺伝子も含むＷＴ  ＡＡＶ６よりも約１００倍優れていた。
【０５０２】
[00399]初代細胞にキメラ３、５、および６を形質導入した。細胞溶解物を回収し、ｑＰＣＲを実行して、ＡＡＶキメラ３、５、および６のコピー数を決定した。図５５Ａ。また、形質導入された初代細胞の上清は、溶解物対精製後について回収され、抗ＡＤＫ１（ＡＡＶ６キャプシド上の立体構造エピトープに特異的である）ＥＬＩＳＡをＷＴ、ならびにＡＡＶキメラ３、５、および６で形質導入された細胞で実行された。図５５Ｂ。
【０５０３】
【表１５】
2020530307.tif 000171
【０５０４】
【表１６−１】
2020530307.tif 000172
【０５０５】
【表１６−２】
2020530307.tif 000173
【０５０６】
実施例１０
ＡＡＶスクリーン
[00400]新規なＡＡＶ血清型を同定するために、図２５Ｂに示されるようにＡＡＶシグネチャー領域の領域を増幅するゲノムＤＮＡにおいてＰＣＲ反応を行った。対照プライマー１〜４は、領域ＡＶ１ＮＳ、１９ｓ、１８ａｓ、およびＡＶ２Ｃａｓに対応する（Ｇａｏら，２００２年）。
【０５０７】
[00401]
【０５０８】
【表１７】
2020530307.tif 000174
【０５０９】
[00402]ＰＣＲアッセイは、表１８において以下の通りに設定された。
【０５１０】
【表１８】
2020530307.tif 000175
【０５１１】
[00403]ＰＣＲ条件は、表１９において以下の通りであった。ＰＣＲは、９６ウェルプレートで設定された。各ＰＣＲ実行に含まれる対照は、鋳型なし対照（負の対照として鋳型の代わりにヌクレアーゼ不含水）、肝臓ＤＮＡ（陽性シグネチャー領域対照）および２つのＡＡＶヘルパープラスミド陽性対照（ｐＤＧおよびＡＡＶ  ＤＪ）であった。図２６Ａ〜２６Ｅ。Ｔ細胞ＤＮＡ試料の品質を確認するために、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨが含まれた。
【０５１２】
[00404]
【０５１３】
【表１９】
2020530307.tif 000176
【０５１４】
実施例１１
ＣＤ３４＋細胞およびＴ細胞のＡＡＶキメラ形質導入
ＣＤ３４細胞
[00405]複数の細胞型におけるＡＡＶキメラの相同組換えの有効性を評価するために、ＣＤ３４＋細胞は、１０，０００ＧＣ／ｍＬのＭＯＩでＷＴ  ＡＡＶ６またはＡＡＶキメラ３、５もしくは６（ＣＭＶ  ＮａｎｏＬｕｃウイルス）で形質導入された。ＡＡＶ６ウイルスおよびＣＲＩＳＰＲ（ｇＲＮＡ＋Ｃａｓ９）を対照として使用した。形質導入後の７日目に、細胞を発光（ＲＬＵ）についてアッセイした。
【０５１５】
[00406]結果は、ＷＴと比較して、キメラ３、５、および６がＣＤ３４＋細胞において約１００倍の優れた感染性を示すことを示している。図２８Ａおよび図２８Ｂ。
キメラ３、５、または６で形質導入されたＴ細胞
[00407]細胞におけるＡＡＶキメラの相同組換えの有効性を評価するために、Ｔ細胞は、１０，０００ＧＣ／ｍＬのＭＯＩでＷＴ  ＡＡＶ６またはＡＡＶキメラ３、５もしくは６（ＣＭＶ  ＮａｎｏＬｕｃウイルス）で形質導入された。ＡＡＶ６ウイルスおよびＣＲＩＳＰＲ（ｇＲＮＡ＋Ｃａｓ９）を対照として使用した。ＣＲＩＳＰＲ編集は、ＴＩＤＥによって８８％の編集効率を有することが確認された。形質導入後の７日目および１４日目に、細胞を発光（ＲＬＵ）についてアッセイした。
【０５１６】
[00408]結果は、ＷＴと比較して、キメラ３、５、および６は、Ｔ細胞において約１００の優れた感染性を示すことを示している。図３０Ａおよび３０Ｂ。
キメラ６で形質導入されたＴ細胞
[00409]キメラ６（１ｅ４  ＧＣ／ｍＬのＭＯＩ  ＯＤで）が１ｅ６  ＧＣ／ｍＬのＭＯＩでＷＴ  ＡＡＶ６と比較する方法を決定するために、Ｔ細胞は、１ｅ６または１ｅ４  ＧＣ／ｍＬのＭＯＩでＷＴ  ＡＡＶ６およびキメラ６（ＣＭＶ  ＮａｎｏＬｕｃウイルス）に感染された。
【０５１７】
[00410]ＮａｎｏＬｕｃの結果は、ＷＴと比較して、キメラ６がＴ細胞において優れた感染性を示すことを示している、図３１、７日目（図３２Ａ）、１４日目（図３２Ｂ）、および２１日目（図３２Ｃ）。結果は、ＧＦＰレポーターを使用した同等の実験で検証されている。
【０５１８】
【表２０−１】
2020530307.tif 000177
【０５１９】
【表２０−２】
2020530307.tif 000178
【図１】
2020530307.tif 000179
【図２−１】
2020530307.tif 000180
【図２−２】
2020530307.tif 000181
【図２−３】
2020530307.tif 000182
【図３Ａ】
2020530307.tif 000183
【図３Ｂ】
2020530307.tif 000184
【図４−１】
2020530307.tif 000185
【図４−２】
2020530307.tif 000186
【図５Ａ】
2020530307.tif 000187
【図５Ｂ】
2020530307.tif 000188
【図６Ａ】
2020530307.tif 000189
【図６Ｂ】
2020530307.tif 000190
【図７Ａ】
2020530307.tif 000191
【図７Ｂ】
2020530307.tif 000192
【図８】
2020530307.tif 000193
【図９】
2020530307.tif 000194
【図１０】
2020530307.tif 000195
【図１１Ａ】
2020530307.tif 000196
【図１１Ｂ】
2020530307.tif 000197
【図１２】
2020530307.tif 000198
【図１３】
2020530307.tif 000199
【図１４Ａ】
2020530307.tif 000200
【図１４Ｂ】
2020530307.tif 000201
【図１４Ｃ】
2020530307.tif 000202
【図１４Ｄ】
2020530307.tif 000203
【図１５−１】
2020530307.tif 000204
【図１５−２】
2020530307.tif 000205
【図１６−１】
2020530307.tif 000206
【図１６−２】
2020530307.tif 000207
【図１７Ａ−１】
2020530307.tif 000208
【図１７Ａ−２】
2020530307.tif 000209
【図１７Ｂ−１】
2020530307.tif 000210
【図１７Ｂ−２】
2020530307.tif 000211
【図１７Ｂ−３】
2020530307.tif 000212
【図１７Ｃ】
2020530307.tif 000213
【図１８Ａ−１】
2020530307.tif 000214
【図１８Ａ−２】
2020530307.tif 000215
【図１８Ｂ−１】
2020530307.tif 000216
【図１８Ｂ−２】
2020530307.tif 000217
【図１８Ｂ−３】
2020530307.tif 000218
【図１８Ｂ−４】
2020530307.tif 000219
【図１９Ａ−１】
2020530307.tif 000220
【図１９Ａ−２】
2020530307.tif 000221
【図１９Ｂ−１】
2020530307.tif 000222
【図１９Ｂ−２】
2020530307.tif 000223
【図１９Ｂ−３】
2020530307.tif 000224
【図１９Ｂ−４】
2020530307.tif 000225
【図２０】
2020530307.tif 000226
【図２１Ａ−１】
2020530307.tif 000227
【図２１Ａ−２】
2020530307.tif 000228
【図２１Ａ−３】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
2020530307.tif 000232
【図２１Ｅ】
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【図２１Ｆ】
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【図２１Ｇ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２６Ｄ】
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【図２６Ｅ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ−１】
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【図２９Ｂ−２】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３２Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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