(57)【要約】  本発明は、マウス由来のモノクローナル抗体から製造して獲得された抗ＣＤ１９のヒト化抗体、当該ヒト化抗体を含むキメラ抗原受容体及び当該ヒト化抗体を発現する免疫細胞に関する。本発明のヒト化抗体は、抗−抗体反応（ＡＡＲ）及びヒト−抗−マウス抗体反応（ＨＡＭＡ）を生じないだけでなく、そしてその親和力がマウス由来の抗体より優れ、良好な活性と安全性を有することにより、ＣＤ１９を発現する腫瘍の治療のために新しいアプローチを提供した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＣＤ１９を安定にトランスフェクトしたＫ５６２細胞との相対的な結合親和力（ＥＣ５０）が１０ｎＭ未満である、ヒトＣＤ１９に対するヒト化抗体。
【請求項２】
前記ヒト化抗体の軽鎖の可変領域のフレームワーク領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の１−２３、３９−５３、６１−９２及び１０２−１１１に示された通りであり；及び／または前記ヒト化抗体の重鎖の可変領域のフレームワーク領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の１−３０、３６−４９、６７−９８及び１１４−１２４に示された通りであることを特徴とする、
請求項１に記載のヒト化抗体。
【請求項３】
前記抗体が、
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示された軽鎖の可変領域またはその変異体を有する抗体；
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示された重鎖の可変領域またはその変異体を有する抗体；
（ｃ）（ａ）に記載の抗体の軽鎖の可変領域及び（ｂ）に記載の抗体の重鎖の可変領域を有する抗体；及び
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つに記載の抗体と競合してヒトＣＤ１９のヒト化抗体に結合する抗体
からなる群より選択されることを特徴とする、
請求項１または２に記載のヒト化抗体。
【請求項４】
（ａ）に記載の変異体が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７に示されたＬＣＤＲ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に示されたＬＣＤＲ２、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４に示されたＬＣＤＲ３を有することを特徴とする、
請求項３に記載のヒト化抗体。
【請求項５】
（ａ）に記載の変異体が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に示された軽鎖の可変領域を有することを特徴とする、
請求項４に記載のヒト化抗体。
【請求項６】
（ｂ）に記載の変異体が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５に示されたＨＣＤＲ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６に示されたＨＣＤＲ２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に示されたＨＣＤＲ３を有することを特徴とする、
請求項３に記載のヒト化抗体。
【請求項７】
（ｂ）に記載の抗体の変異体が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示された重鎖の可変領域を有することを特徴とする、
請求項６に記載のヒト化抗体。
【請求項８】
前記ヒト化抗体が、
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示された軽鎖の可変領域及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示された重鎖の可変領域を有する抗体；
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示された軽鎖の可変領域及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示された重鎖の可変領域を有する抗体；
（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に示された軽鎖の可変領域及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示された重鎖の可変領域を有する抗体；及び
（ｄ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に示された軽鎖の可変領域及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示された重鎖の可変領域を有する抗体
から選択されることを特徴とする、
請求項１〜７のいずれか一項に記載のヒト化抗体。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体をコードするヌクレオチド配列。
【請求項１０】
請求項９に記載のヌクレオチド配列を含む、発現ベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載の発現ベクターを含むか、または、請求項９に記載のヌクレオチド配列が遺伝子中に組み込まれた、宿主細胞。
【請求項１２】
ＣＤ１９を発現する腫瘍細胞を特異的に標的とする標的薬物、抗体薬物コンジュゲートまたは多機能抗体を製造するための；または
ＣＤ１９を発現する腫瘍の診断用試薬を製造するための；または
キメラ抗原受容体修飾の免疫細胞を製造するための、
請求項１〜８のいずれか一項に記載のヒト化抗体の使用。
【請求項１３】
細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナルドメインを含むキメラ抗原受容体であって、
前記細胞外ドメインは、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体を含み、好ましくは、当該抗体は、一本鎖抗体またはドメイン抗体である、前記キメラ抗原受容体。
【請求項１４】
前記細胞内シグナルドメインが、１つまたは複数の共刺激シグナルドメイン及び一次シグナルドメインを含むことを特徴とする、
請求項１３に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１５】
前記キメラ抗原受容体が、さらにヒンジドメインを含むことを特徴とする、
請求項１３に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１６】
前記膜貫通ドメインが、ＴＣＲのａｌｐｈａ鎖、ｂｅｔａ鎖、ｚｅｔａ鎖、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、及びＰＤ１の膜貫通領域から選択され；及び／または
前記共刺激シグナルドメインが、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４、ＣＤ８３、ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４、ＣＤ１５０、ＣＤ１５２、ＣＤ２２３、ＣＤ２７０、ＰＤ−Ｌ２、ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ２７８、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ  ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、ＦｃεＲＩγ、ＭｙＤ８８、及び４１ＢＢＬの細胞内シグナル領域から選択され；及び／または
前記一次シグナルドメインが、ＴＣＲξ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２７８（「ＩＣＯＳ」とも称する）とＣＤ６６ｄ、及びＣＤ３ζから選択され、
より好ましくは、
前記膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ４５、ＰＤ１、ＣＤ１５４及びＣＤ２８の膜貫通ドメインから選択され；及び／または
前記共刺激シグナルドメインは、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４、ＣＤ２８及びＯＸ４０から選択され；及び／または
前記一次シグナルドメインは、ＣＤ３ζから選択され、
最も好ましくは、前記膜貫通ドメインは、ＣＤ８αまたはＣＤ２８から選択され、前記共刺激シグナルドメインは、ＣＤ１３７またはＣＤ２８の細胞内シグナルドメインから選択され、前記一次シグナルドメインは、ＣＤ３ζから選択されることを特徴とする、
請求項１４に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１７】
前記キメラ抗原受容体が、
請求項１ないし８のいずれか一項に記載の抗体、ＣＤ８及びＣＤ３ζ、
請求項１ないし８のいずれか一項に記載の抗体、ＣＤ８、ＣＤ１３７及びＣＤ３ζ、
請求項１ないし８のいずれか一項に記載の抗体、ＣＤ２８分子の膜貫通領域、ＣＤ２８分子の細胞内シグナル領域及びＣＤ３ζ、または
請求項１ないし８のいずれか一項に記載の抗体、ＣＤ２８分子の膜貫通領域、ＣＤ２８分子の細胞内シグナル領域、ＣＤ１３７及びＣＤ３ζのような順で結合された抗体、膜貫通領域及び細胞内シグナル領域を含むことを特徴とする、
請求項１３に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１８】
前記細胞外ドメインが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１に示されたアミノ酸配列を有し、
前記膜貫通ドメインが、ＳＥＱＩＤ  ＮＯ：２７に示されたＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３に示されたＣＤ８膜貫通ドメインから選択され、
前記共刺激シグナルドメインが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９に示されたＣＤ２８細胞内ドメイン、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５に示されたＣＤ１３７の細胞内ドメインまたはそれらの混合物から選択されることを特徴とする、
請求項１３に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１９】
請求項１８に記載のキメラ抗原受容体であって、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１に示された細胞外ドメイン、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５に示されたヒンジドメイン、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７に示された膜貫通ドメイン、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９に示された共刺激シグナルドメイン、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１に示された一次シグナルドメイン（ｈｕＨＤ３７−２８Ｚ）を有するキメラ抗原受容体１；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１に示された細胞外ドメイン、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５に示されたヒンジドメイン、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３に示された膜貫通ドメイン、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５に示された共刺激シグナルドメイン、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１に示された一次シグナルドメイン（ｈｕＨＤ３７−ＢＢＺ）を有するキメラ抗原受容体２；または
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１に示された細胞外ドメイン、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５に示されたヒンジドメイン、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７に示された膜貫通ドメイン、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５に示された共刺激シグナルドメイン、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１に示された一次シグナルドメイン（ｈｕＨＤ３７−２８ＢＢＺ）を有するキメラ抗原受容体３
から選択されることを特徴とする、
前記キメラ抗原受容体。
【請求項２０】
請求項１３〜１９のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列。
【請求項２１】
請求項２０に記載のヌクレオチド配列を含む、発現ベクター。
【請求項２２】
請求項２１に記載の発現ベクターを含む、ウイルス。
【請求項２３】
請求項１３〜１９のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体、または請求項２０に記載のヌクレオチド配列、または請求項２１に記載の発現ベクター、または請求項２２に記載のウイルスの、ＣＤ１９を発現する腫瘍細胞を標的とする遺伝子修飾された免疫細胞を製造するための使用。
【請求項２４】
請求項２０に記載のヌクレオチド配列、または請求項２１に記載の発現ベクターもしくは請求項２２に記載のウイルスが形質導入されるか；または請求項１３〜１９のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体を発現する、遺伝子修飾された免疫細胞。
【請求項２５】
キメラ抗原受容体以外のサイトカイン、他のキメラ抗原受容体、ケモカイン受容体、ＰＤ−１発現を低下させるｓｉＲＮＡまたはＰＤ−Ｌ１を遮断するタンパク質、ＴＣＲ、または安全スイッチを含む他の配列をさらに発現し；
好ましくは、前記サイトカインには、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、またはＩ型インターフェロンが含まれ；
好ましくは、前記ケモカイン受容体には、ＣＣＲ２、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ２、またはＣＸＣＲ４が含まれ；
好ましくは、前記安全スイッチには、ｉＣａｓｐａｓｅ−９、Ｔｒｕａｎｃａｔｅｄ  ＥＧＦＲまたはＲＱＲ８が含まれることを特徴とする、
請求項２４に記載の遺伝子修飾された免疫細胞。
【請求項２６】
ＣＤ１９を発現する腫瘍を阻害するための薬物を製造するための、請求項２４または２５に記載の遺伝子修飾された免疫細胞の使用。
【請求項２７】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体；及び
それに結合された機能性分子を含み；前記機能性分子は、ＣＤ１９以外の他の腫瘍表面マーカーを標的とする分子、腫瘍を阻害する分子、免疫細胞の表面マーカーを標的とする分子または検出可能な標識から選択される、多機能免疫複合体。
【請求項２８】
前記腫瘍表面マーカーを標的とする分子が、腫瘍表面マーカーに結合する抗体またはリガンドであるか；または
前記腫瘍を阻害する分子が、抗腫瘍のサイトカインまたは抗腫瘍の毒素であり；好ましくは、前記サイトカインは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＦＮ−ｂｅｔａ、ＴＮＦ−ａｌｐｈａを含むことを特徴とする、
請求項２７に記載の多機能免疫複合体。
【請求項２９】
前記免疫細胞の表面マーカーを標的とする分子が、Ｔ細胞表面マーカーに結合する抗体であり、それは請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体とともに、Ｔ細胞の関与する二機能性抗体を形成し、好ましくは、前記Ｔ細胞表面マーカーに結合する抗体は、抗ＣＤ３抗体であることを特徴とする、
請求項２７に記載の多機能免疫複合体。
【請求項３０】
融合ポリペプチドであり、リンカーペプチドを請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体とそれに結合された機能性分子との間にさらに含むことを特徴とする、
請求項２７に記載の多機能免疫複合体。
【請求項３１】
請求項２７〜３０のいずれか一項に記載の多機能免疫複合体をコードするヌクレオチド配列。
【請求項３２】
抗腫瘍薬物を製造するための、または
ＣＤ１９を発現する腫瘍の診断用試薬を製造するための；または
キメラ抗原受容体修飾の免疫細胞を製造するための請求項２７〜３０のいずれか一項に記載の多機能免疫複合体の使用。
【請求項３３】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体または当該抗体をコードするヌクレオチド配列；または
請求項１３〜１９のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体または当該キメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列；または
請求項２４または２５に記載の遺伝子修飾された免疫細胞；または
請求項２７〜３０のいずれか一項に記載の免疫複合体または当該複合体をコードするヌクレオチド配列
を含む、薬物組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍免疫療法または診断の分野に属する。さらに詳しくは、本発明は、抗ＣＤ１９のヒト化抗体及びＣＤ１９を標的とする免疫エフェクター細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ細胞には、プレＢ細胞（ｐｒｅ−Ｂ  ｃｅｌｌ）、早期発生Ｂ細胞（即ち、未成熟Ｂ細胞）、及び成熟Ｂ細胞等が含まれ、成熟Ｂ細胞は、最終分化によって形質細胞と悪性Ｂ細胞に分化する。ほとんどのプレＢ急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキン悪性リンパ腫、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ性白血病、有毛細胞性白血病、一般的な急性リンパ性白血病及び一部の非急性リンパ芽球性白血病は、すべてＣＤ１９を高度に発現する（Ｎａｄｌｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３１：２４４−２５０（１９８３）、Ｌｏｋｅｎら、Ｂｌｏｏｄ、７０：１３１６−１３２４（１９８７））。形質細胞上でのＣＤ１９の発現はさらに、それが例えば、多発性骨髄腫、形質細胞腫、原発性マクログロブリン血症のような異なるＢ細胞腫瘍上で発現され得ることを示す（Ｇｒｏｓｓｂａｒｄら、Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ，１０２：５０９−１５（１９９８）、Ｔｒｅｏｎら、Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ，３０：２４８−５２（２００３））。したがって、ＣＤ１９は様々な血液腫瘍の標的と考えられる。
【０００３】
現在、ＣＤ１９に対する抗体は、主にマウス由来の抗体（マウス抗）であり、例えば、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８７  Ｍａｙ  １；  １３８（９）：２７９３−９では、マウス抗ＨＤ３７、Ａｍｇｅｎ社の既に市販されている薬物Ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ等を開示しているが、マウス抗は、強い免疫原性を有し、そして臨床応用においてヒト−抗−マウス抗体反応（ＨＡＭＡ）反応及び抗−抗体反応（ＡＡＲ）等を引き起こして、半減期の短縮、除去し易く、治療効果が弱くなり、そして患者にとって深刻な脅威となる。
【０００４】
マウスの抗免疫原性を低下させるために一般的に使用される方法は、マウスのフレームワーク領域をヒトフレームワーク領域で置換して、人体に対する異種抗体の免疫学的副作用を低下させるなど、それをヒト化することである。例えば、中国のＣＮ１０２２０９５５６Ａは、マウス抗ＨＤ３７に対するヒト化抗体を開示しており、ＶＨ（重鎖の可変領域）の９１位の位置がセリンの代わりにフェニルアラニンで置換されると発現レベルが増加すると主張している。
【０００５】
ヒト化フレームワーク領域が多いので、適切なフレームワーク領域をスクリーニングするとともにヒト抗体を高度に発現させ、そしてヒト化後の抗体の結合能力等が維持される方法は、ヒト化する技術的な困難である。特に、抗体のヒト化後、一般的にはアミノ酸配列の変更のため、ペプチド鎖のサイズ、電荷、疎水性、および空間的立体配座を変化させ、水素結合の形成もマウス由来のと異なり、それによって抗体相補性決定領域（ＣＤＲ）の立体配座に影響を及ぼす。したがって、ヒト化後の抗体の親和力、特異性等は、マウス抗体と比べて一般的に１０倍以上減少する（Ｖａｈｉｄｅｈ  Ａｈｍａｄｚａｄｅｈら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌｕｍｅ  ３３，ｎｕｍｂｅｒ  ２，  ２０１４）。
【０００６】
したがって、マウス抗体に比べて、同じ、さらにより高い親和力を有し、そして抗−抗体反応（ＡＡＲ）及びヒト−抗−マウス抗体反応（ＨＡＭＡ）を生じず、それによってより高い安全性を有するヒト化抗体が緊急に必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、抗ＣＤ１９のヒト化抗体及びＣＤ１９を標的とする免疫エフェクター細胞を提供することに目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
第１の態様において、本発明は、ヒトＣＤ１９を安定にトランスフェクトしたＫ５６２細胞に対して相対的な結合親和力（ＥＣ５０）が１０ｎＭ未満であるヒトＣＤ１９に対するヒト化抗体を提供する。
好ましい実施形態において、前記ヒト化抗体と、ヒトＣＤ１９を安定にトランスフェクトしたＫ５６２細胞との相対的な結合親和力（ＥＣ５０）は、１〜１０ｎＭの間である。
【０００９】
具体的な実施形態において、前記ヒト化抗体の軽鎖の可変領域のフレームワーク領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の１−２３、３９−５３、６１−９２及び１０２−１１１に示された通りであり、及び／または前記ヒト化抗体の重鎖の可変領域のフレームワーク領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の１−３０、３６−４９、６７−９８及び１１４−１２４に示された通りである。
【００１０】
具体的な実施形態において、前記抗体は、
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示された軽鎖の可変領域またはその変異体を有する抗体、
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示された重鎖の可変領域またはその変異体を有する抗体、
（ｃ）（ａ）に記載の抗体の軽鎖の可変領域及び（ｂ）に記載の抗体の重鎖の可変領域を有する抗体、及び
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか一項に記載の抗体と競合してヒトＣＤ１９のヒト化抗体に結合する抗体からなる群より選択される。
【００１１】
具体的な実施形態において、（ａ）に記載の変異体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７に示されたＬＣＤＲ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に示されたＬＣＤＲ２、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４に示されたＬＣＤＲ３を有する。
具体的な実施形態において、（ａ）に記載の変異体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に示された軽鎖の可変領域を有する。
【００１２】
具体的な実施形態において、（ｂ）  に記載の変異体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５に示されたＨＣＤＲ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６に示されたＨＣＤＲ２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に示されたＨＣＤＲ３を有する。
具体的な実施形態において、（ｂ）に記載の抗体の変異体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示された重鎖の可変領域を有する。
【００１３】
具体的な実施形態において、前記ヒト化抗体は、
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示された軽鎖の可変領域及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示された重鎖の可変領域を有する抗体、
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示された軽鎖の可変領域及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示された重鎖の可変領域を有する抗体、
（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に示された軽鎖の可変領域及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示された重鎖の可変領域を有する抗体、及び
（ｄ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に示された軽鎖の可変領域及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示された重鎖の可変領域を有する抗体から選択される。
好ましい実施形態において、前記ヒト化抗体の重鎖の可変領域の９１位は、フェニルアラニンではない。
【００１４】
第２の態様において、本発明は、本発明の第１の態様に記載の抗体をコードするヌクレオチド配列を提供する。
第３の態様において、本発明は、本発明の第２の態様に記載のヌクレオチド配列を含む発現ベクターを提供する。
第４の態様において、本発明は、本発明の第３の態様に記載の発現ベクターまたは本発明の第２の態様に記載のヌクレオチド配列が遺伝子中に組み込まれた宿主細胞を提供する。
【００１５】
第５の態様において、本発明は、ＣＤ１９を発現する腫瘍細胞を特異的に標的とする標的薬物、抗体薬物コンジュゲートまたは多機能抗体を製造するためのこと、または
ＣＤ１９を発現する腫瘍の診断用試薬を製造するためのこと、または
キメラ抗原受容体修飾の免疫細胞を製造するためのことである本発明の第１の態様に記載のヒト化抗体の使用を提供する。
【００１６】
第６の態様において、本発明は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及細胞内シグナルドメインを含むキメラ抗原受容体を提供し、前記細胞外ドメインは、本発明の第１の態様に記載の抗体を含み、好ましくは、当該抗体は、一本鎖抗体またはドメイン抗体である。
【００１７】
具体的な実施形態において、前記細胞内シグナルドメインは、１つまたは複数の共刺激シグナルドメイン及び一次シグナルドメインを含む。
具体的な実施形態において、前記キメラ抗原受容体は、さらにヒンジドメインを含む。
【００１８】
具体的な実施形態において、前記膜貫通ドメインは、ＴＣＲのａｌｐｈａ鎖、ｂｅｔａ鎖、ｚｅｔａ鎖、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、及びＰＤ１の膜貫通領域から選択され、及び／または
前記共刺激シグナルドメインは、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４、ＣＤ８３、ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４、ＣＤ１５０、ＣＤ１５２、ＣＤ２２３、ＣＤ２７０、ＰＤ−Ｌ２、ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ２７８、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ  ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、ＦｃεＲＩγ、ＭｙＤ８８、及び４１ＢＢＬの細胞内シグナル領域から選択され、及び／または
前記一次シグナルドメインは、ＴＣＲξ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２７８（「ＩＣＯＳ」とも称する）とＣＤ６６ｄ、及びＣＤ３ζから選択され、
より好ましくは、
前記膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ４５、ＰＤ１、ＣＤ１５４和ＣＤ２８の膜貫通ドメインから選択され、及び／または
前記共刺激シグナルドメインは、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４、ＣＤ２８及びＯＸ４０から選択され、及び／または
前記一次シグナルドメインは、ＣＤ３ζから選択され、
最も好ましくは、前記膜貫通ドメインは、ＣＤ８αまたはＣＤ２８から選択され、前記共刺激シグナルドメインは、ＣＤ１３７またはＣＤ２８の細胞内シグナルドメインから選択され、前記一次シグナルドメインは、ＣＤ３ζから選択される。
【００１９】
具体的な実施形態において、前記キメラ抗原受容体は、
本発明の第１の態様に記載の抗体、ＣＤ８及びＣＤ３ζ、
本発明の第１の態様に記載の抗体、ＣＤ８、ＣＤ１３７及びＣＤ３ζ、
本発明の第１の態様に記載の抗体、ＣＤ２８分子の膜貫通領域、ＣＤ２８分子の細胞内シグナル領域及びＣＤ３ζ、または
本発明の第１の態様に記載の抗体、ＣＤ２８分子の膜貫通領域、ＣＤ２８分子の細胞内シグナル領域、ＣＤ１３７及びＣＤ３ζのような順で結合された抗体、膜貫通領域及び細胞内シグナル領域を含む。
【００２０】
具体的な実施形態において、
前記細胞外ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１に示されたアミノ酸配列を有し、
前記膜貫通ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７に示されたＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３に示されたＣＤ８膜貫通ドメインから選択され、
前記共刺激シグナルドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９に示されたＣＤ２８細胞内ドメイン、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５に示されたＣＤ１３７の細胞内ドメインまたはそれらの混合物から選択される。
【００２１】
具体的な実施形態において、前記キメラ抗原受容体は、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１に示された細胞外ドメイン、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５に示されたヒンジドメイン、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７に示された膜貫通ドメイン、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９に示された共刺激シグナルドメイン、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１に示された一次シグナルドメイン（ｈｕＨＤ３７−２８Ｚ）を有するキメラ抗原受容体１、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１に示された細胞外ドメイン、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５に示されたヒンジドメイン、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３に示された膜貫通ドメイン、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５に示された共刺激シグナルドメイン、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１に示された一次シグナルドメイン（ｈｕＨＤ３７−ＢＢＺ）を有するキメラ抗原受容体２、または
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１に示された細胞外ドメイン、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５に示されたヒンジドメイン、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７に示された膜貫通ドメイン、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５に示された共刺激シグナルドメイン、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１に示された一次シグナルドメイン（ｈｕＨＤ３７−２８ＢＢＺ）を有するキメラ抗原受容体３から選択される。
【００２２】
第７の態様において、本発明は、本発明の第６の態様に記載のキメラ抗原受容体コードするヌクレオチド配列を提供する。
第８の態様において、本発明は、本発明の第７の態様に記載のヌクレオチド配列を含む発現ベクターを提供する。
第９の態様において、本発明は、本発明の第８の態様に記載の発現ベクターを含むウイルスを提供する。
【００２３】
第１０の態様において、本発明は、ＣＤ１９を発現する腫瘍細胞を標的とする遺伝子修飾された免疫細胞を製造するための、本発明の第６の態様に記載のキメラ抗原受容体、または第７の態様に記載のヌクレオチド配列、または第８の態様に記載の発現ベクター、または第９の態様に記載のウイルスの使用を提供する。
【００２４】
第１１の態様において、本発明は、本発明の第７の態様に記載のヌクレオチド配列、または本発明の第８の態様に記載の発現ベクターまたは本発明の第９の態様に記載のウイルスが形質導入されるか、または本発明の第６の態様に記載のキメラ抗原受容体を発現する遺伝子修飾された免疫細胞を提供する。
【００２５】
具体的な実施形態において、本発明の遺伝子修飾された免疫細胞は、サイトカイン、他のキメラ抗原受容体、ケモカイン受容体、ＰＤ−１発現を低下させるｓｉＲＮＡまたはＰＤ−Ｌ１を遮断するタンパク質、ＴＣＲ、または安全スイッチを含むキメラ抗原受容体以外の他の配列がさらに発現され、
好ましくは、前記サイトカインには、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、またはＩ型インターフェロンが含まれ、
好ましくは、前記ケモカイン受容体には、ＣＣＲ２、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ２、またはＣＸＣＲ４が含まれ、
好ましくは、前記安全スイッチには、ｉＣａｓｐａｓｅ−９、Ｔｒｕａｎｃａｔｅｄ  ＥＧＦＲまたはＲＱＲ８が含まれる。
【００２６】
第１２の態様において、本発明は、ＣＤ１９を発現する腫瘍を阻害するための薬物を製造することに使用される本発明の第１１の態様に記載の遺伝子修飾された免疫細胞の使用を提供する。
【００２７】
第１３の態様において、本発明は、多機能免疫複合体、前記多機能免疫複合体は、
本発明の第１の態様に記載の抗体と、及び
それに結合された機能性分子とを含み、前記機能性分子は、ＣＤ１９以外の他の腫瘍表面マーカーを標的とする分子、腫瘍を阻害する分子、免疫細胞の表面マーカーを標的とする分子または検出可能な標識から選択される。
【００２８】
具体的な実施形態において、前記腫瘍表面マーカーを標的とする分子は、腫瘍表面マーカーに結合する抗体またはリガンドであり、または
前記腫瘍を阻害する分子は、抗腫瘍のサイトカインまたは抗腫瘍の毒素であり、好ましくは、前記サイトカインは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＦＮ−ｂｅｔａ、ＴＮＦ−ａｌｐｈａを含む。
【００２９】
好ましい実施形態において、前記検出可能な標識は、蛍光標識と、発色標識とを含む。
具体的な実施形態において、前記免疫細胞の表面マーカーを標的とする分子は、Ｔ細胞表面マーカーに結合する抗体であり、それは本発明の第１の態様に記載の抗体と、Ｔ細胞の関与する二機能性抗体を形成し、好ましくは、前記Ｔ細胞表面マーカーに結合する抗体は、抗ＣＤ３抗体である。
【００３０】
具体的な実施形態において、本発明の多機能免疫複合体は、融合ポリペプチドであり、本発明の第１の態様に記載の抗体及びそれに結合された機能性分子との間には、リンカーペプチドをさらに含む。
【００３１】
第１４の態様において、本発明は、本発明の第１３の態様に記載の多機能免疫複合体をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。
第１５の態様において、本発明は、抗腫瘍薬物を製造するためのこと、または
ＣＤ１９を発現する腫瘍の診断用試薬を製造するためのこと、または
キメラ抗原受容体修飾の免疫細胞を製造するためのことである本発明の第１３の態様に記載の多機能免疫複合体の使用を提供する。
【００３２】
第１６の態様において、本発明は、
本発明の第１の態様に記載の抗体または当該抗体をコードするヌクレオチド配列、または
本発明の第６の態様に記載のキメラ抗原受容体または当該キメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列、または
本発明の第１１の態様に記載の遺伝子修飾された免疫細胞、または
本発明の第１３の態様に記載の免疫複合体または当該複合体をコードするヌクレオチド配列を含む薬物組成物を提供する。
【００３３】
本発明の範囲内で、本発明の前記各技術の特徴と以下（例えば、実施例）に具体的に記述された各技術的特徴は、互いに組み合わされて、新たなまたは好ましい技術手段を構成することができることを理解すべきである。スペースに限りがあるため、ここでは繰り返して説明しない。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】ＨＤ３７、ヒト抗体可変領域、ヒト抗体可変領域／連結領域、及びヒト化抗体ｈｕＨＤ３７のアミノ酸配列を比較した。
【図２】ｈｕＨＤ３７（ＳｃＦｖ＿Ｆｃ）の凝集状況のＳＥＣ分析を示した。
【図３】還元条件下での精製のｈｕＨＤ３７のＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル電気泳動を示した。
【図４】フローサイトメトリーによって測定した精製ＨＤ３７、ヒト化抗体ｈｕＨＤ３７のＫ５６２−ＣＤ１９及びＫ５６２細胞への結合の状況を示した。
【００３５】
【図５】ＨＤ３７とヒト化の抗体ｈｕＨＤ３７、ＳｃＦｖとヒトＩｇＧ１  Ｆｃが部分的にキメラ化後にヒトＣＤ１９を安定にトランスフェクトしたＫ５６２細胞に対する相対的な結合親和力を示した。
【図６】６Ｂ３、８Ｅ５及びヒト化抗体ｈｕＨＤ３７のアミノ酸配列を比較した。
【図７】クローン６Ｂ３（ｓｃＦｖ＿Ｆｃ）の凝集状況のＳＥＣ分析を示した。
【図８】クローン８Ｅ３（ｓｃＦｖ＿Ｆｃ）の凝集状況のＳＥＣ分析を示した。
【００３６】
【図９】６Ｂ３、８Ｅ３（ｓｃＦｖ＿Ｆｃ）が、ヒトＣＤ１９を安定にトランスフェクトしたＫ５６２細胞に対する相対的な結合親和力を示した。
【図１０】ｈｕＨＤ３７  ＣＡＲの構造模式図を示した。
【図１１】ｈｕＨＤ３７  ＣＡＲ＋Ｔ及びＭｏｃｋ＋Ｔ細胞の陽性率を示した。
【図１２】ＣＤ１９エピトープの腫瘍細胞株への曝露状況を示した。
【図１３】ｈｕＨＤ３７の第２世代及び第４世代ＣＡＲ  Ｔ細胞のインビトロ活性を比較した。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、本発明に係るマウス由来のモノクローナル抗体から製造して獲得されたＣＤ１９に結合するヒト化抗体は、抗−抗体反応（ＡＡＲ）及びヒト−抗−マウス抗体反応（ＨＡＭＡ）を生じないことを予想外に発現し、その親和力は、マウス抗より優れることにより、優れた活性と安全性を持つ。本発明はこれに基づいて完成したものである。
【００３８】
本発明をより理解しやすくするために、まずいくつかの用語を定義する。
用語「ＣＤ１９」は、ヒトＣＤ１９の変異体、アイソフォーム及び種ホモログを含むが、これらに限定されない。場合によっては、本発明のヒト化抗体は、ヒト以外の種のＣＤ１９と交差反応することができる。場合によっては、抗体は、一種または多種のヒトＣＤ１９タンパク質に完全に特異的であり得、種または他のタイプの非ヒト交差反応性を示し得る。例示的なヒトＣＤ１９の完全なアミノ酸配列はＳｗｉｓｓＰｏｒｔ登録番号Ｐ１５３９１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）を有する。ＣＤ１９は、Ｂ細胞表面抗原Ｂ４、Ｂ細胞抗原ＣＤ１９、ＣＤ１９抗原またはＬｅｕ−１２としても知られている。ヒトＣＤ１９は、Ｅｎｔｒｅｚ  ＧｅｎｅによりＧｅｎｅ  ＩＤ：９３０及び、ＨＧＮＣによりＨＧＮＣ：１６３３と呼ぶことができる。ＣＤ１９は、ＣＤ１９の遺伝子コードと呼ぶことができる。本明細書における「ヒトＣＤ１９」の使用は、ヒトＣＤ１９の全ての既知のまたは未だ発見されていない対立遺伝子及び多型形態を含む。
【００３９】
用語「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互連結された少なくとも二つの重（Ｈ）鎖及び二つの軽（Ｌ）鎖糖タンパク質を含む無傷の免疫グロブリン分子であり得る。用語「抗体」はさらに、例えば、原核細胞において発現される抗体、グリコシル化されていない抗体及び抗原に結合された抗体フラグメントと以下に記載の誘導体のような抗体（特に本明細書に記載の抗体）の全ての組換え形態を含む。各重鎖は、重鎖の可変領域（本明細書では、ＶＨと略称する）と重鎖定常領域からなる。各軽鎖は、軽鎖の可変領域（本明細書では、ＶＬと略称する）と軽鎖定常領域からなる。ＶＨ及びＶＬは、相補性決定領域（ＣＤＲ）及びフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へ、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で配置された、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲからなる。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（エフェクター細胞など）及び古典的補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織または因子への当該免疫グロブリンの結合を媒介することができる。
【００４０】
用語「抗体」はさらに、抗原結合フラグメントであり得、これには、Ｆａｂフラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ドメイン抗体、二価一本鎖抗体、一本鎖ファージ抗体、二重特異性二本鎖抗体、三本鎖抗体、四本鎖抗体が含まれるが、これに限定されない。抗体は、様々な方法で修飾することができるので、「抗体」という用語は、抗体結合ドメインまたはそれに同一でありな結合ドメインを有するポリペプチドまたはタンパク質も含むと理解される。用語「Ｆａｂ」は、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ及びＣＬ免疫グロブリンドメインを含むポリペプチドを含む。
【００４１】
本明細書で使用される用語「組換え抗体」は、組換え手段によって製造、発現、生成または単離されるすべての抗体、例えば、（ａ）免疫グロブリン遺伝子が導入遺伝子またはトランスクロモソームである動物（例えば、マウス）またはそれから製造されるハイブリドーマから単離された抗体、（ｂ）抗体を発現するために形質転換された宿主細胞（例えば、トランスフェクトーマ）から単離された抗体、（ｃ）組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーから単離された抗体、及び（ｄ）免疫グロブリン遺伝子配列をＤＮＡ配列にスプライスする他の任意の手段によって製造、発現、生成または単離された抗体のような組換え手段によって製造、発現、生成または単離されるすべての抗体を含む。
【００４２】
本明細書における用語「ヒト化抗体」は、他の哺乳動物種（例えば、マウス）に由来する生殖系のＣＤＲ配列がヒトのフレームワーク配列に移植されていることを指す。ヒトのフレームワーク配列及び他の哺乳動物種に由来する生殖系のＣＤＲ配列においても、更なるフレームワーク領域の修飾を行うことができる。
【００４３】
抗体の可変フレームワーク領域がヒト生殖系の免疫グロブリン遺伝子を使用する系から得られ場合、本明細書で使用されるヒト化抗体は、このような重鎖または軽鎖可変フレームワーク領域を含み、前記可変フレームワーク領域は、特定のヒト生殖系配列（ヒト遺伝子）の「産物」または前記特定のヒト生殖系配列に「由来する」。このようなシステムは、標的抗原を用いてヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスを免疫すること、または標的抗原を用いてファージ上に提示されたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることを含む。ヒト化抗体の重鎖または軽鎖可変フレームワーク領域のアミノ酸配列を、ヒト生殖系免疫グロブリンの重鎖または軽鎖可変フレームワーク領域のアミノ酸配列と比較することによって、このような重鎖または軽鎖可変フレームワーク領域のヒト化抗体を同定することができ、前記可変フレームワーク領域は、ヒト生殖系免疫グロブリン配列の「産物」または前記ヒト免疫グロブリン配列に「由来する」。
【００４４】
特定のヒト生殖系免疫グロブリン配列の「産物」である重鎖または軽鎖可変フレームワーク領域を含むヒト化抗体は、アミノ酸配列と特定のヒト生殖系免疫グロブリン配列との重鎖または軽鎖可変フレームワーク領域が１００％同一である重鎖または軽鎖可変フレームワーク領域を有する。例えば、天然に存在する体細胞変異または意図的導入した定点変異のため、特定の生殖系配列の重鎖または軽鎖可変フレームワーク領域に比べて、前記特定のヒト生殖系免疫グロブリン配列に「由来する」重鎖または軽鎖可変フレームワーク領域を含むヒト化抗体は、アミノ酸の差を含み得る。しかしながら、一般的に、選択されたヒト化抗体の重鎖または軽鎖可変フレームワーク領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系免疫グロブリン遺伝子の重鎖または軽鎖可変フレームワーク領域によってコードするアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であり、そして、他の種の生殖系免疫グロブリンアミノ酸配列（例えば、マウス生殖系配列）と比べた場合、前記ヒト化抗体がヒトに由来することを同定するアミノ酸残基を含む。
【００４５】
場合によっては、ヒト化抗体の重鎖または軽鎖可変フレームワーク領域のアミノ酸配列と生殖系免疫グロブリン遺伝子によってコードされた重鎖または軽鎖可変フレームワーク領域のアミノ酸配列は、好ましくは、少なくとも９５％であり、より好ましくは、少なくとも９６％であり、最も好ましくは、少なくとも９７％であり、特に少なくとも９８％であり、最も特に少なくとも９９％同一である。一般的に、特定のヒト生殖系配列に由来するヒト化抗体の重鎖または軽鎖可変フレームワーク領域は、ヒト生殖系免疫グロブリン遺伝子によってコードされた重鎖または軽鎖可変フレームワーク領域のアミノ酸配列を示すが、１０を超えず、好ましくは、５つを超えず、またはさらにより好ましくは、４つ、３つ、２つまたは１つのアミノ酸の差を超えない。
【００４６】
用語「親抗体」は、他のヒト化抗体のマウス抗またはヒト化抗体を産生するように修飾されるマウス抗ヒト抗体またはヒト化抗体を含む。
本明細書で使用される用語「変異体」は、親の少なくとも１つのアミノ酸修飾と比べて、親抗体配列と異なる抗体配列を含む。具体的な実施形態において、本明細書における変異体抗体配列は、親抗体配列とは、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは、少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは、少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは、少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは、少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、最も好ましくは、少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有する。抗体変異体は、抗体自体を指すことができ、前記親抗体の組成物、またはそれをコードするアミノ酸配列を含む。
【００４７】
用語「アミノ酸修飾」は、アミノ酸の置換、付加及び／または欠失を含み、「アミノ酸置換」は、親ポリペプチド配列中の特定位置上のアミノ酸の他のアミノ酸との置換を意味する。例えば、Ｒ９４Ｋを置換することは、９４位のアルギニンがリジンによって置換されることを意味し、本明細書で使用される「アミノ酸挿入」は、親ポリペプチド配列中の特定位置でのアミノ酸の付加を意味する。本明細書中で使用される「アミノ酸欠失」または「欠失」とは、親ポリペプチド配列中の特定位置上のアミノ酸の除去を意味する。
【００４８】
本明細書で使用される用語「保存的修飾」または「保存的配列修飾」とは、前記アミノ酸配列の抗体の結合特性に有意に影響を及ぼさないまたはそれを変更しないアミノ酸修飾を意味する。このタイプの保存的修飾には、アミノ酸置換、挿入及び欠失を含む。部位特異的突然変異誘発及びＰＣＲ媒介突然変異誘発などの当技術分野において公知の標準的な技術によって修飾を本発明の抗体に導入することがでる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換される置換である。当技術分野では既に類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーに対して定義されている。
【００４９】
これらのファミリーは、塩基性側鎖を含むアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電の急性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。したがって、本発明の抗体のＣＤＲ領域中またはフレームワーク領域中の１つまたは複数のアミノ酸残基を、他の同一の側鎖ファミリーのアミノ酸残基と置換することができ、改変抗体（変異体抗体）によって保持された機能を試験することができる。
【００５０】
本明細書で使用される用語「ＡＤＣＣ」または「抗体依存性細胞媒介の細胞毒性」は、ＦｃγＲを発現する非特異性細胞毒性細胞が標的細胞上に結合した抗体を識別してから、標的細胞の切断を引き起こす細胞媒介性応答を含む。様々な態様において、ＡＤＣＣエフェクター機能を増強することは、増強された効力または増強された効能を意味することができる。実験の背景で使用される「効力」は、特定の治療効能ＥＣ５０を観察するときの抗体の濃度（最大有効濃度の半分）を意味する。実験背景で使用される「効能」は、飽和レベルの抗体の最大可能なエフェクター機能を意味する。
【００５１】
本明細書で使用される用語「ＡＤＣＰ」または「抗体依存性細胞媒介性食作用」は、ＦｃγＲを発現する非特異性細胞毒性細胞が標的細胞上に結合した抗体を識別してから、標的細胞の食作用を引き起こす細胞媒介性応答を含む。
本明細書で使用される用語「ＣＤＣ」または「補体依存性細胞毒性」とは、１種または多種の補体タンパク質成分が標的細胞上に結合した抗体を識別してから、標的細胞を切断する反応を含む。
【００５２】
本明細書で使用される用語「エフェクター機能」は、抗体Ｆｃ領域がＦｃ受容体またはリガンドとの相互作用によって生じる生化学的事象を含む。エフェクター機能には、ＡＤＣＣとＡＤＣＰなどのＦｃγＲ媒介したエフェクター機能、及びＣＤＣなどの補体媒介したエフェクター機能が含まれる。
【００５３】
本明細書で使用される用語「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」とは、抗原に結合することができる細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞質シグナルをドメインに伝達させるポリペプチド（即ち、細胞内シグナルドメイン）を含み、細胞内シグナルドメインは、細胞活性を調節するために、確定されたシグナル伝達経路を介して、第２のメッセンジャーを生成することにより、情報を細胞内に伝達するタンパク質、またはそのようなメッセンジャーに対応することによって、エフェクターとして作用するタンパク質を指し、一次シグナルドメインを含み、以下に定義する刺激分子の機能シグナル伝達ドメイン（即ち、共刺激シグナルドメイン）も含み得る。細胞内シグナルドメインは、ＣＡＲの細胞（例えば、ＣＡＲ  Ｔ細胞）の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを生成し、免疫エフェクター機能の例として、例えば、ＣＡＲＴ細胞において、細胞溶解活性及び補助活性を含み、サイトカイン分泌を含む。
【００５４】
用語「一次シグナルドメイン」は、刺激的な方法でＴＣＲ複合体の初期活性化を調節する。一態様において、一次シグナルドメインは、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体のペプチド付加のＭＨＣ分子への結合によって誘発され、それによってＴ細胞反応（増殖、活性化、分化等を含むがこれらに限定されない）を媒介する。刺激的な方法で機能する一次シグナルドメインは、免疫受容体チロシン活性化モチーフまたはＩＴＡＭのシグナル伝達モチーフを含み得る。本発明において特に有用であるＩＴＡＭの一次シグナルドメインの例は、ＴＣＲξ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２７８（「ＩＣＯＳ」とも呼ばれる）及びＣＤ６６ｄに由来する配列が挙げられるが、これらに限定されなく、本発明の特例のＣＡＲにおいて、任意の１つまたは複数の本発明ＣＡＲにおいて、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ξの一次シグナルドメインなどの細胞内シグナル伝達配列を含む。
【００５５】
用語「共刺激シグナルドメイン」とは、「共刺激分子」を指し、Ｔ細胞上の関連結合性パートナー、共刺激リガンドに特異的に結合し、それによって、例えばこれに限定されないが、増殖などのＴ細胞の共刺激反応を媒介する。共刺激分子は、効果的な免疫応答に必要な、非抗原受容体の細胞表面分子またはそのリガンドである。共刺激分子としては、ＭＨＣ  Ｉ分子、ＢＴＬＡ及びＴｏｌｌリガンド受容体、ならびにＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）及び４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）を含むが、これらに限定されない。
【００５６】
本発明では、一態様において、ＣＡＲは、キメラ化融合タンパク質を含み、前記タンパク質は、細胞外抗原認識ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含み、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、刺激分子に由来する機能シグナル伝達ドメインを含む。一態様において、ＣＡＲは、キメラ化融合タンパク質を含み、前記タンパク質は、細胞外抗原認識ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含み、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激分子に由来する機能性シグナル伝達ドメインと刺激分子に由来する機能性シグナル伝達ドメインを含む。
【００５７】
一態様において、ＣＡＲは、キメラ化融合タンパク質を含み、前記タンパク質は、細胞外抗原認識ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内伝達ドメインを含み、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、１つまたは複数の共刺激分子に由来する少なくとも２つの機能性シグナル伝達ドメインと刺激分子に由来する機能性シグナル伝達ドメインを含む。一態様において、ＣＡＲは、ＣＡＲ融合タンパク質のアミノ酸（ＮＤ末端）は、選択的なリーダー配列を含む。一態様において、ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメインのＮ末端にリーダー配列をさらに含み、ここで、リーダー配列は、ＣＡＲの細胞プロセシング及び細胞膜への位置決めの間に抗原認識ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）から任意に切り取られる。
【００５８】
本明細書における用語「ＣＤ３ξ」とは、ＧｅｎＢａｎ登録番号ＢＡＧ３６６６４．１によって提供されるタンパク質、またはマウス、げっ歯類動物、サル、類人猿等の非ヒト種由来の等価残基として定義される。「ＣＤ３ξドメイン」とは、Ｔ細胞活性化に必要な初期シグナルを機能的に伝達するのに十分なξ鎖の細胞質ドメインのアミノ酸残基として定義される。一態様において、ξの細胞質ドメインは、その機能的オルソログ−マウス、げっ歯類動物、サル、類人猿等の非ヒト種由来の等価残基である、ＧｅｎＢａｎ登録番号ＢＡＧ３６６６４．１の残基５２から１６４を含む。
【００５９】
本明細書における用語「４−１ＢＢ」とは、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ．  Ｎｏ．  ＡＡＡ６２４７８．２のアミノ酸配列、またはマウス、げっ歯類動物、サル、類人猿等の非ヒト種由来の等価残基を有するＴＮＦＲスーパーファミリーの一員を指し、「４−１ＢＢ共刺激ドメイン」とは、ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＣＣ．Ｎｏ．ＡＡＡ６２４７８．２のアミノ酸配列２１４−２５５、またはマウス、げっ歯類動物、サル、類人猿等の非ヒト種由来の等価残基として定義される。一態様において、「４−１ＢＢ共刺激ドメイン」は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５によって提供された配列、またはマウス、げっ歯類動物、サル、類人猿等の非ヒト種由来の等価残基である。
【００６０】
本明細書における用語「インターフェロン」とは、全長のインターフェロン、または実質的に全長を保持する野生型インターフェロンの生物学的活性（例えば、全長の少なくとも８０％を保持し、好ましくは、少なくとも９０％を保持し、より好ましくは、少なくとも９５％を保持し、９８％または９９％を保持する）インターフェロンフラグメント（切断型インターフェロン）またはインターフェロン変異体を指す。インターフェロンは、Ｉ型インターフェロン（例えば、インターフェロンα及びインターフェロンβ）及びＩＩ型インターフェロン（例えば、インターフェロンγ）を含む。
【００６１】
本発明の抗体またはその変異体は、様々な標的抗腫瘍薬物及び腫瘍診断用薬物、特にＣＤ１９を標的とする免疫エフェクター細胞の製造に適用することができる。
【００６２】
抗ＣＤ１９のヒト化抗体
本発明に係るヒト化抗体親抗体は、ＨＤ３７であり、これはマウスＩｇＧ１である（Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｔｙｐｉｎｇ  ＩＩ、ｐｐ  ３９１−４０２）。
【００６３】
これらの重鎖及び軽鎖の可変領域配列がそれぞれヒトＣＤ１９に結合できることを考えると、重鎖及び軽鎖の可変領域配列に「混合及びマッチングする」ことにより、本発明の抗ヒトＣＤ１９の結合分子を生成することができる。例えば、本発明のヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体の軽鎖の可変領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１または７に示された通りであり、重鎖の可変領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３または５に示された通りである。具体的な実施形態において、本発明のヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示された軽鎖の可変領域及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示された重鎖の可変領域を有する抗体、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示された軽鎖の可変領域及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示された重鎖の可変領域を有する抗体、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に示された軽鎖の可変領域及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示された重鎖の可変領域を有する抗体、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に示された軽鎖の可変領域及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示された重鎖の可変領域を有する抗体であることができる。
【００６４】
別の態様において、本発明は、ヒトＣＤ１９に結合する抗体またはそのフラグメントの変異体を提供する。したがって、本発明は、重鎖または軽鎖の可変領域配列と少なくとも８０％同一である重鎖及び／または軽鎖の可変領域を有する抗体またはそのフラグメントを提供する。好ましくは、重鎖及び／または軽鎖の可変領域のアミノ酸配列の同一性が少なくとも８５％であり、より好ましくは、少なくとも９０％であり、最も好ましくは、少なくとも９５％であり、特に９６％であり、さらに特に９７％であり、さらにより特に９８％であり、最も特に９９％であり、例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％及び９９％のアミノ酸配列の同一性を含む。本明細書は、アミノ酸配列の同一性または配列中のヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体またはそのフラグメント同一であるアミノ酸残の割合に関する。
【００６５】
したがって、配列同一性は、２つのポリペプチドのアミノ酸位置の類似性を比較するために一般的に使用されている標準的な方法によって決定することができる。２つのポリペプチドのそれぞれのアミノ酸の最良のマッチング（１つまたは２つの配列の全長に沿って、または１つまたは２つの配列に沿った所定の部分）を比較することは、例えば、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡなどのコンピュータプログラムを使用して配列する。プログラムは、デフォルトのオープンペナルティ及びデフォルトのギャップペナルティを提供し、ＰＡＭ２５０などのスコアリングマトリックス（標準的なスコアリングマトリックス、Ｄａｙｈｏｆｆら、ｉｎ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、第５卷、第３期増補（１９７８））は、コンピュータプログラムに結合して使用することができる。例えば、割合同一性は、同一にマッチングする総数に１００を掛けたものを、マッチングスパン中で長い配列の全長及び２つの配列を比較するために長い配列に注がれるギャップ数で割った値である。
【００６６】
本発明はさらに、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体フラグメントを提供し、前記フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｄ、ｄＡｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、二重特異性一本鎖Ｆｖ二量体、二重抗体、三本鎖抗体及び同一または異なる抗体に遺伝的に融合したｓｃＦｖから選択される。好ましくは、フラグメントは、ｓｃＦｖ、二重特異性一本鎖Ｆｖ二量体及び二重抗体である。本発明はさらにヒトＣＤ１９に結合する全長のヒト化抗体を提供する。
【００６７】
抗ヒトＣＤ１９のヒト化抗体特性
ヒトＣＤ１９のヒト化抗体のような抗体の結合能力を評価するための標準的なアッセイは、当技術分野で公知であり、例えば、ＥＬＩＳＡ、Ｗｅｓｔｅｒｎブロット及びフローサイトメトリーを含む。適切なアッセイは、実施例に詳細に記載されている。結合を評価するために、ＣＤ１９を安定的にトランスフェクションしたＫ５６２細胞を使用することができ、フローサイトメトリーでＥＣ５０を測定することができる。具体的な実施形態において、本発明のヒト化抗体のヒトＣＤ１９を安定にトランスフェクトしたＫ５６２細胞に対する相対的な結合親和力（ＥＣ５０）は、１００ｎＭ未満であり、好ましくは、１０ｎＭ未満であり、より好ましくは、１〜１０ｎＭの間である。
【００６８】
核酸、ベクター及び宿主細胞
本発明はさらに、ヒトＣＤ１９に結合するヒト化抗体及びそのフラグメントの単離をコードする核酸、ベクター及び前記核酸またはベクターを含む宿主細胞を提供する。核酸は、インタクトな細胞中、細胞溶解液中または部分的に精製されたもしくは実質的に精製された形態で位置することができる。
【００６９】
標準的な分子生物学技術で本発明の核酸を獲得することができ、例えば、標準的なＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング技術によって、抗体をコードする軽鎖及び重鎖またはＶＨとＶＬセグメントをコードするｃＤＮＡを獲得することができる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリーから得られた抗体（例えば、ファージディスプレイ技術を使用する）に対しては、ライブラリーから抗体をコードする一種または多種の核酸を回収することができる。外来核酸を宿主細胞に導入する方法は、当技術分野において一般的に知られており、使用される宿主細胞によって異なり得る。
【００７０】
好ましくは、本発明の核酸分子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、８の軽鎖の可変領域から選択されたもの、及び／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、６の重鎖の可変領域から選択されたものをコードするものである。タンパク質を発現させるために、本発明の抗体をコードする核酸を発現ベクターに組み込むことができる。タンパク質発現には、様々な発現ベクターが利用可能である。発現ベクターは、自己複製染色体外ベクター、または宿主遺伝子に組み込まれたベクターを含み得る。本発明において利用される発現ベクターは、哺乳動物細胞、細菌、昆虫細胞、酵母、およびインビトロ系におけるタンパク質の発現を可能にするものを含むが、これらに限定されない。当技術分野で知られているように、様々な発現ベクターが市販で、または他の方法で入手可能である。それは本発明において抗体を発現させるために使用することができる。
【００７１】
抗ＣＤ１９抗体を含むキメラ抗原受容体Ｔ細胞
一態様において、本発明は、ＣＤ１９タンパク質への結合を増強するように操作された抗体または抗体フラグメントを含む多種のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。一態様において、本発明は、ＣＡＲを発現するように操作された細胞（例えば、Ｔ細胞）を提供し、ここで当該ＣＡＲ  Ｔ細胞（「ＣＡＲＴ」）は、抗腫瘍特性を示す。一態様において、細胞をＣＡＲで形質転換し、ＣＡＲを細胞表面に発現させる。ある実施例において、細胞（例えば、Ｔ細胞）は、ＣＡＲをコードするウイルスベクターで形質導入される。ある実施例において、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。ある実施形態において、細胞は、ＣＡＲを安定的に発現することができる。
【００７２】
一態様において、ＣＡＲの抗ＣＤ１９タンパク質の結合部分は、ｓｃＦｖ抗体フラグメントである。一態様において、当該抗体フラグメントは、機能性であり、それによって、それが由来するＩｇＧ抗体と比較して、同等の親和性結合力を保持し、例えば、同等の効能で同一な抗原を結合する。一態様において、当該抗体フラグメントは、機能性であり、それによって、生物化学反応を提供し、前記反応は、免疫応答の活性化、その標的抗原からのシグナル伝達の開始の阻害、キナーゼ活性の阻害等を含み得るがこれらに限定されない。一態様において、ＣＡＲの抗ＣＤ１９抗原結合ドメインは、それが由来するマウス配列ｓｃＦｖに対するヒト化されたｓｃＦｖ抗体フラグメントである。
【００７３】
一態様において、本発明のＣＡＲは、特定抗体の抗原結合ドメインを細胞内シグナル伝達分子と組み合わせる。例えば、ある態様において、細胞内シグナル伝達分子は、ＣＤ３ξ鎖、４−１ＢＢとＣＤ２８シグナル伝達モジュール及びその組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。一態様において、本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように操作された細胞（例えば、Ｔ細胞）を提供し、ここで当該ＣＡＲ  Ｔ細胞（「ＣＡＲＴ」）は、抗腫瘍特性を示す。一態様において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、ｓｃＦＶを含むヒト化の抗ＣＤ１９抗体フラグメントを含む。したがって、本発明は、Ｔ細胞に導入されるように操作された、ヒト化抗ＣＤ１９結合ドメインを含むＣＤ１９−ＣＡＲ、及び養子免疫治療法における使用のための方法を提供する。
【００７４】
一態様において、ＣＤ１９−ＣＡＲは、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含み、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン、ＣＤ３ξシグナルドメイン、及びその任意の組み合わせから選択される。一態様において、ＣＤ１９−ＣＡＲは、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含み、それは１つまたは複数の、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）またはＣＤ２８ではない共刺激分子に由来する。
【００７５】
一態様において、本発明のＣＡＲは、特定抗体の抗原結合ドメインと細胞内シグナル伝達分子と組み合わせながら、ＩＦＮβ発現エレメントを増加させる。例えば、ある態様において、細胞内シグナル伝達分子には、ＣＤ３ξ鎖、４−１ＢＢとＣＤ２８シグナル伝達モジュール及びその組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。一態様において、本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように操作された細胞（例えば、Ｔ細胞）を提供し、ここで当該ＣＡＲ  Ｔ細胞（「ＣＡＲＴ」）は、抗腫瘍特性を示す。一態様において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、ｓｃＦＶを含むヒト化の抗ＣＤ１９抗体フラグメントを含む。他の態様において、ＣＡＲ終結シグナル末端にＩＦＮβ発現エレメントが逆方向に付加され、６つの反復のＮＦＡＴ−ＡＰ−１転写調節結合フラグメントＮＦＡＴ、ＩＬ−２ミニプロモーター（ＩＬ−２  ｍｉｎｉ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、ＩＦＮｂ  ｃＤＮＡ配列及び終結シグナルＰＡ２を含み、したがって、本発明は、Ｔ細胞に導入されるように操作された、ヒト化抗ＣＤ１９結合ドメインを含むＣＤ１９−ＣＡＲとＩＦＮβ、及び養子免疫治療法における使用のための方法が提供される。
【００７６】
本発明の利点：
１．本発明の抗体は、マウス抗に比べて、抗−抗体反応（ＡＡＲ）とヒト−抗−マウス抗体反応（ＨＡＭＡ）を生じない。
２．本発明の抗体は、抗抗体による中和によって快速に除去されず、ＡＤＣＣ及びＣＤＣ作用などの免疫エフェクター機能を有する。
３．マウス抗に比べて、本発明の抗体の親和力は低下されないだけでなく、マウス抗よりもわずかに優れている。
４．本発明の抗体の凝集度が高く、収率が良好であり、そして製造及び精製が容易である。
【００７７】
以下には、具体的な実施例に合わせて、本発明をさらに説明する。これらの実施例は、ただ本発明を説明するためであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではないことを理解すべきである。以下の実施例において、特定の条件を特定しない実験方法は、通常、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら編集、分子クローン実験ガイド、第３版、科学出版社、２００２中に記載の条件等の従来の条件に従うか、または製造業者の提案した条件に従う。
【００７８】
実施例１．抗ＣＤ１９抗体ＨＤ３７のヒト化抗体ｈｕＨＤ３７の製造
本実施例は、親抗体としてマウス抗ＨＤ３７（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８７  Ｍａｙ  １；  １３８（９）：２７９３−９）を用い、マウス抗ＨＤ３７は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９に示された軽鎖の可変領域及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０に示された重鎖の可変領域を有し、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ及びＩＭＧＴの３つの抗体ＣＤＲ領域の命名スキームを組み合わせて、抗体軽鎖及び重鎖の６つのＣＤＲ領域配列を決定する。
【００７９】
軽鎖の可変領域（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）、ＣＤＲ領域を下線で表示した。
ＤＩＱＬＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＬＧＱＲＡＴＩＳＣＫＡＳＱＳＶＤＹＤＧＤＳＹＬＮＷＹＱＱＩＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＶＳＧＩＰＰＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＮＩＨＰＶＥＫＶＤＡＡＴＹＨＣＱＱＳＴＥＤＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲ
【００８０】
重鎖の可変領域（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）ＣＤＲ領域を下線で表示した。
ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＶＲＰＧＳＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＡＦＳＳＹＷＭＮＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＱＩＷＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＥＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＡＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＲＲＥＴＴＴＶＧＲＹＹＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
【００８１】
ａ．抗体テンプレートの選択
ＩＭＧＴデータベースからのｇｅｒｍｌｉｎｅ配列ＩＧＨＶ１−６９＊０１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）＋ＩＧＨＪ６＊０１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）を、ＨＤ３７重鎖の抗体テンプレートとして選択し、ＩＭＧＴデータベースからのｇｅｒｍｌｉｎｅ配列ＩＧＫＶ７−３＊０１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）＋ＩＧＫＪ１＊０１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）を、ＨＤ３７軽鎖の抗体テンプレートとして選択する。
【００８２】
ｂ．ＣＤＲ移植
ＨＤ３７抗体の軽鎖ＣＤＲ領域を抗体テンプレートＩＧＫＶ７−３＊０１＋ＩＧＫＪ１＊０１のＣＤＲ領域で置換して、ヒト化抗体ｈｕＨＤ３７の軽鎖の可変領域（アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示される）を構成した。ＨＤ３７抗体の重鎖ＣＤＲ領域を抗体テンプレートＩＧＨＶ１−６９＊０１＋ＩＧＨＪ６＊０１のＣＤＲ領域で置換し、ＩＧＨＶ１−６９＊０１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）中の第２７位グリシンをチロシンに変異させて、ヒト化抗体ｈｕＨＤ３７の重鎖の可変領域（アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示される）を構成した。
ｈｕＨＤ３７軽鎖の可変領域と、ＨＤ３７、ＶＫ７−３＊０１、ＶＫ７−３＊０１／Ｊ１＊０１の配列とを比較して、及びｈｕＨＤ３７重鎖の可変領域と、ＨＤ３７、ＶＨ１＿６９＊０１、ＶＨ１＿６９＊０１／Ｊ１＊０１の配列とを比較した結果、図１に示された通りである。
【００８３】
ｃ．ヒト化の抗体ｓｃＦｖ＿Ｆｃ型の発現と精製
ヒト化の抗体ｈｕＨＤ３７の軽鎖の可変領域（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、重鎖の可変領域（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）によって、軽鎖の可変領域ヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）及び重鎖の可変領域ヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）を設計及び合成する。
軽鎖ヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）及び重鎖ヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）のそれぞれに対してプライマーを設計し、１５つの柔軟なアミノ酸ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）からなるｌｉｎｋｅｒ連結を導入してｓｃＦｖ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）を生成し、ここで、１−１２４位は、重鎖の可変領域であり、１４０−２５１位は、軽鎖の可変領域であり、ＶＨの上流に適切な酵素切断断部位および保護塩基を導入し、ＶＬの下流に適切な酵素切断断部位および保護塩基を導入する。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル電気泳動で分析し、精製して回收した。酵素切断後、ヒトＦｃ断片の真核発現ベクターＶ１５２に連結された（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｒｕｉｊｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．より購入）。
【００８４】
ｄ．２９３Ｆｅｃｔｉｎにより２９３Ｆ細胞に一過性にトランスフェクトし、発現される。
１）トランスフェクションの１日前に、６−７×１０５／ｍｌの２９３Ｆ細胞を１２５ｍｌ培養フラスコに接種し、トランスフェクション当日に、３×１０７の細胞を２８ｍｌのＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ  ２９３  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍで調整する。
２）Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉで３０ｕｇのＤＮＡを希釈し、最終容量１ｍｌであり、充分に混ぜ、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉで６０ｕｌの２９３ｆｅｃｔｉｎＴＭを希釈し、最終容量１ｍｌであり、充分に混ぜて、室温で５分間インキュベートし、希釈済のＤＮＡを２９３ｆｅｃｔｉｎＴＭと混合させ、室温で２０分間インキュベートし、２ｍｌのＤＮＡ−２９３ｆｅｃｔｉｎ複合体を２８ｍｌの細胞に加えて、３７度、８％のＣＯ２、１２５ｒｐｍで５〜７日培養し、上清を回収してｌｉｐｉｄ−ＤＮＡ複合体を獲得する。
【００８５】
３）２９３Ｆ培養上清を遠心分離により回収し、０．４５ｕｍのフィルターでろ過し、ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａカラムアフィニティークロマトグラフィーにより、ヒト化の抗体ｈｕＨＤ３７を獲得する。
４）ＳＥＣにより抗体の凝集状況を分析し、結果は、図２に示された通りであり、モノマー形態的の抗体の割合は、９４．３％であり、モノマー形態の抗体の割合は、従来のヒト化抗体より有意に優れて、マウス抗ＨＤ３７と比較して、凝集度も有意に低下した。
【００８６】
５）限外濾過により濃縮した後、ＳＤＳ  ＰＡＧＥにより、得られた抗体に定量的及び定性的に分析した。図３に示されたように、還元条件下で、５０Ｋｄのサイズのところに単一バンドがあり、即ち、標的タンパク質であり、収率は、６６ｕｇ／ｍｌ（収率＝最終生成物の品質／トランスフェクション体積）であり、ＣＮ１０２２０９５５６Ａのヒト化抗体の収率５−２５ｍｇ／Ｌよりはるかに高い。
【００８７】
ｅ．ヒト化抗体ｈｕＨＤ３７の結合特性
ヒトＣＤ１９を安定に発現するＫ５６２細胞（Ｋ５６２−ＣＤ１９）とＫ５６２を使用し、細胞を収集し、完全増殖培地で細胞を洗浄し、そして約１−５×１０５個の細胞／ウェルでＵ型底マイクロタイタープレートにプレーティングした。勾配希釈したｈｕＨＤ３７のｓｃＦｖ＿Ｆｃ融合抗体とＫ５６２−ＣＤ１９／Ｋ５６２を氷上で３０分間インキュベートし、続いて第２の抗体としてのＦＩＴＣ標識の抗ヒトＦｃとインキュベートした。２回の洗浄ステップの後、Ｇｕａｖａ  ｅａｓｙＣｙｔｅＴＭ  ＨＴ  Ｓｙｓｔｅｍ装置を用いて分析を行い、そしてＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いて処理して実験データを処理して、ＥＣ５０を得た。図４は、ＨＤ３７及びｈｕＨＤ３７のＫ５６２−ＣＤ１９及びＫ５６２細胞への結合の状況を示した。結果は、ヒト化のｈｕＨＤ３７と親抗体ＨＤ３７の特異性的結合は、Ｋ５６２細胞に結合することなく、ＣＤ１９のＫ５６２細胞を安定にトランスフェクションすることを示した。図５は、ＨＤ３７及びヒト化のｈｕＨＤ３７のＳｃＦｖがヒトＩｇＧ１  Ｆｃに部分的にキメラ化後に、ヒトＣＤ１９を安定にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞との相対的な結合親和力（ＥＣ５０）を示した。親ＨＤ３７と比較して、ヒト化の抗体ｈｕＨＤ３７の親和力は向上された。
【００８８】
実施例２．ｈｕＨＤ３７の改造
本実施例は、ｈｕＨＤ３７を親抗体とし、ファージディスプレイ法によりｈｕＨＤ３７を改造した。ヒト化抗体ｈｕＨＤ３７に基づくファージライブラリーの構築は、軽鎖及び重鎖のＣＤＲ３領域を保持し、縮重プライマーによって、それぞれ軽鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ２または重鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ２をランダム化することによって、２つのファージライブラリーを構築した。プライマー情報は、下表に示された通りである。
【００８９】
【表１】
2020503015.tif 000002
【００９０】
２．１ｈｕＨＤ３７変異体の構築：
まず、抗体ｈｕＨＤ３７（ｓｃＦｖ）（アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１を参照し、ヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２を参照する）に基づいて、テンプレートプラスミドを構築する。軽鎖ＣＤＲ１とＣＤＲ２のランダムされたファージライブラリーに対して、プライマーＬＭＦとＣ３７Ｌ１Ｒ、ＰＣＲ増幅フラグメント１を使用し、プライマーＣ３７Ｌ２ＦとＦｄＲ、ＰＣＲ増幅フラグメント２を使用し、そしてブリッジＰＣＲによってフラグメント１とフラグメント２を連結することにより、ランダム化された配列のｓｃＦｖ全長を得、そしてＮｃｏＩ及びＮｏｔＩを使用して全長のフラグメントを酵素切断し、Ｔ４連結酵素により、同じく酵素切断されたテンプレートプラスミドに連結した。ＴＧ１コンピテントセルへエレクトロポレーションし、記憶容量は、１．７６Ｅ＋９である。
【００９１】
重鎖ＣＤＲ１及びＣＤＲ２のランダム化されたファージライブラリーに対して、プライマーＬＭＦとＣ３７Ｈ１Ｒ、ＰＣＲ増幅フラグメント３を使用し、プライマーＣ３７Ｈ２ＦとＦｄＲ、ＰＣＲ増幅フラグメント４を使用し、そしてブリッジＰＣＲによってフラグメント３とフラグメント４を連結することにより、ランダム化された配列のｓｃＦｖ全長を得、そしてＮｃｏＩ及びＮｏｔＩを使用して全長のフラグメントを酵素切断し、Ｔ４連結酵素により、同じく酵素切断されたテンプレートプラスミドに連結した。ＴＧ１コンピテントセルへエレクトロポレーションし、記憶容量は、１．９Ｅ＋９である。
【００９２】
ファージライブラリーのスクリーニング。Ｋ５６２−ＣＤ１９細胞を収集し、ＰＢＳで細胞を２回洗浄し、１Ｅ＋７個の細胞を２ｍｌの４％ＭＰＢＳ（４ｇの脱脂粉乳を１００ｍｌのＰＢＳに溶解する）に再懸濁し、１ｍｌ（１０１３個のファージ）のファージライブラリーを細胞に加えて、１つの回転計に置いて、ゆっくり１時間半回転させ、そして３０分間放置した。続いて、非特異性的ファージを洗浄し、結合されたファージを溶出して、対数増殖期にある大腸菌ＴＧ１に感染させる。溶出したファージを拡大し、拡大したファージライブラリーを次のスクリーニングラウンドに使用するためにＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿を用いて精製した。Ｋ５６２−ＣＤ１９に特異的に結合するｓｃＦｖファージクローンを濃縮するために、二つサイクルのパニングを行う。実施例１に示されたフローサイトメトリーによって陽性クローンを決定した。発現が親抗体ｈｕＨＤ３７と一致する複数のクローンを得た。
【００９３】
図６は、６Ｂ３、８Ｅ５及びヒト化抗体ｈｕＨＤ３７のアミノ酸配列を比較し、ここで、親抗体ｈｕＨＤ３７と比較して、クローン６Ｂ３は、重鎖上に２つの点変異（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）があり、ここで、ＣＤＲ１上には、１つあり、第３４位メチオニンは、イソロイシンに変わり、ＣＤＲ２上には１つあり、第５７位アスパラギン酸は、グルタミン酸に変わる。親抗体ｈｕＨＤ３７と比較して、クローン８Ｅ３は、軽鎖上に３つの点変異（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）がＣＤＲ１領域にあり、第２７位グルタミンは、ヒスチジンに変わり、第２９位バリンは、ロイシンに変わり、第３５位セリンは、アスパラギンに変わる。
【００９４】
２．２クローン６Ｂ３、８Ｅ３（ｓｃＦｖ＿Ｆｃ）の発現及び精製
実施例１に示されたように、ＶＨの上流に適切な酵素切断断部位及び保護塩基を導入し、ＶＬの下流に適切な酵素切断断部位及び保護塩基を導入した。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル電気泳動で分析し、精製して回収した。酵素切断後、ヒトＦｃ断片の真核発現ベクターＶ１５２に連結された（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｒｕｉｊｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．より購入）。２９３Ｆｅｃｔｉｎにより２９３Ｆ細胞に一過性にトランスフェクトし、発現された。ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａカラムによりアフィニティークロマトグラフィーした。
【００９５】
ＳＥＣにより抗体の凝集状況を分析し、図７と図８に示された通りであり、モノマー形態の抗体の割合はそれぞれ、９７％、９８％である。親抗体ｈｕＨＤ３７と比較して、それぞれ３％及び４％向上され、凝集度はさらに低下した。限外濾過により濃縮した後、ＳＤＳ  ＰＡＧＥにより、得られた抗体に定量的及び定性的に分析した。収率はそれぞれ、１２．８ｕｇ／ｍｌ及び６９ｕｇ／ｍｌ（収率＝最終産物の質量／トランスフェクション体積）である。
【００９６】
２．３  ６Ｂ３、８Ｅ３の結合特性
ヒトＣＤ１９を安定に発現するＫ５６２細胞（Ｋ５６２−ＣＤ１９）とＫ５６２を使用し、細胞を収集し、完全増殖培地で細胞を洗浄し、そして約１−５×１０５個の細胞／ウェルでＵ型底マイクロタイタープレートにプレーティングした。勾配希釈したｓｃＦｖ＿Ｆｃ融合抗体とＫ５６２−ＣＤ１９／Ｋ５６２を氷上で３０分間インキュベートし、続いて第２の抗体としてのＦＩＴＣ標識の抗ヒトＦｃとインキュベートした。２回の洗浄ステップの後、Ｇｕａｖａ  ｅａｓｙＣｙｔｅＴＭ  ＨＴ  Ｓｙｓｔｅｍ装置を用いて分析を行い、そしてＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いて処理して実験データを処理して、ＥＣ５０を得た。
【００９７】
図９は、６Ｂ３、８Ｅ３のＫ５６２−ＣＤ１９及びＫ５６２細胞への結合の状況を示した。結果は、安定性が向上され、凝集度が低下された２つのクローン６Ａ３、８Ｅ３のＫ５６２−ＣＤ１９への結合能力がｈｕＨＤ３７と実質的一致し、さらに向上されたことを示した。
【００９８】
実施例３．抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体プラスミド（ＣＡＲ）の構築
３．１ヒト化抗体キメラ抗原受容体プラスミド（ＣＡＲ）の構築
ベクターとしてＰＲＲＬＳＩＮ−ｃＰＰＴ．ＥＦ−１αを用いて、ＰＲＲＬＳＩＮ−ｃＰＰＴ．ＥＦ−１α−ｈｕＨＤ３７−２８Ｚ、ＰＲＲＬＳＩＮ−ｃＰＰＴ．ＥＦ−１α−ｈｕＨＤ３７−ＢＢＺ、ＰＲＲＬＳＩＮ−ｃＰＰＴ．ＥＦ−１α−ｈｕＨＤ３７−２８Ｚ＆ＩＦＮｂ及びＰＲＲＬＳＩＮ−ｃＰＰＴ．ＥＦ−１α−ｈｕＨＤ３７−ＢＢＺ＆ＩＦＮｂ（図１０）を含むヒト化抗体ｈｕＨＤ３７の第２世代、第４世代キメラ抗原受容体を発現するレンチウイルスプラスミドを構築した。
【００９９】
ｈｕＨＤ３７−２８Ｚ配列は、ＣＤ８αシグナルペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）、ｈｕＨＤ３７  ｓｃＦＶ、ＣＤ８  ｈｉｎｇｅ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）、ＣＤ２８の膜貫通ドメイン（ＳＥＱＩＤ  ＮＯ：２７）と細胞内シグナル伝達ドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）及びＣＤ３の細胞内セグメントＣＤ３ξ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１）からなり、ｈｕＨＤ３７−ＢＢＺ配列は、ＣＤ８αシグナルペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）、ｈｕＨＤ３７ｓｃＦＶ、ＣＤ８  ｈｉｎｇｅ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）と膜貫通ドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）、ＣＤ１３７細胞内シグナル伝達ドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５）及びＣＤ３ξ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１）からなり、ｈｕＨＤ３７−２８ＢＢＺ配列は、ＣＤ８αシグナルペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）、ｈｕＨＤ３７−ｓｃＦＶ、ＣＤ８  ｈｉｎｇｅ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）、ＣＤ２８膜貫通ドメイン（ＳＥＱＩＤ  ＮＯ：２７）と細胞内セグメント（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）、ＣＤ１３７細胞内シグナル伝達ドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５）及びＣＤ３ξ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１）からなる。
【０１００】
ＰＲＲＬＳＩＮ−ｃＰＰＴ．ＥＦ−１α−ｈｕＨＤ３７−２８Ｚ＆ＩＦＮｂ及びＰＲＲＬＳＩＮ−ｃＰＰＴ．ＥＦ−１α−ｈｕＨＤ３７−ＢＢＺ＆ＩＦＮｂにおいては、ｈｕＨＤ３７−２８ＺとｈｕＨＤ３７−ＢＢＺ  ＣＡＲ終結シグナル末端に逆方向に６つの反復ＮＦＡＴ−ＡＰ−１転写調節結合フラグメントＮＦＡＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７）、ＩＬ−２ミニプロモーター（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）、ＩＦＮｂ  ｃＤＮＡ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）及び終結シグナルＰＡ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）を付加した。
【０１０１】
３．２レンチウイルストランスダクションＴリンパ細胞−ＣＡＲ陽性Ｔリンパ球の製造
１）Ｔリンパ球活性化：約１×１０６／ｍＬの密度でリンパ球培養基液で培養し、磁性ビーズ：細胞比２：１で同時に抗ＣＤ３及びＣＤ２８抗体で被覆された磁性ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と最終濃度が５００Ｕ／ｍＬである組換えヒトＩＬ−２（上海華新バイオハイテク株式会社）に加え、４８ｈで刺激培養する。
２）Ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ被覆２４ウェルプレート：１ウェルあたりに３８０μｌ５μｇ／ｍｌのｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ溶液（ＰＢＳ）を加え、４度で一晩インキュベートする。
３）２４ウェルプレート中のｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ溶液（ＰＢＳ）を捨てて、１ｍｌのＰＢＳで２回洗浄する。
【０１０２】
４）細胞をｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ被覆した２４ウェルプレート内に播種し、１ウェルあたりの細胞数は、３×１０５であり、培養液の体積は、６００μｌである。
５）ＭＯＩ＝１０に従って、ＰＢＭＣ細胞に濃縮後のレンチウイルスを加え、３２度、１８００ｒｐｍで、遠心分離４０ｍｉｎ後、細胞培養インキュベーターに移す。
６）増幅培養：感染後の細胞を、５×１０５／ｍＬの密度で一日おきに継代し、同時にリンパ球培養液に最終濃度が５００Ｕ／ｍＬである組換えヒトＩＬ−２を補充する。
【０１０３】
３．３Ｔリンパ球キメラ抗原受容体の発現
１）レンチウイルス感染Ｔリンパ球の培養してから第７日目に、１×１０６のＴ細胞を採取し、２ｍｌの遠心分離管内に等分する。
２）４度、５０００ｒｐｍで、遠心分離５ｍｉｎし、上清を捨て、ＰＢＳで２回洗浄する。
３）対照群細胞を５０μｌのＰＥ−ＳＡ（１：２００で希釈）抗体に加え、氷上で４５ｍｉｎインキュベートし、ＰＢＳ（２％のＮＢＳ）で２回洗浄し、再懸濁して対照とする。
【０１０４】
４）試験群細胞＋５０μｌの１：５０で希釈したｂｉｏｔｉｎ−Ｇｏａｔ  ａｎｔｉ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２抗体、氷上で４５ｍｉｎインキュベートし、ＰＢＳ（２％のＮＢＳ）で２回洗浄し、５０μｌのＰＥ−ＳＡ（１：２００で希釈）抗体を加え、氷上で４５ｍｉｎインキュベートする。
５）２ｍｌのＰＢＳ（２％のＮＢＳ）再懸濁細胞を加え、４℃、５０００ｒｐｍ／ｍｉｎで、５分間遠心分離して、上清を捨て、２回繰り返す。
６）５００μｌのＰＢＳ（２％のＮＢＳ）を加え、フローチューブに移す。フローサイトメトリーによってＰＥチャネルを検出し、ＣＡＲ陽性のＴ細胞の割合を決定した。
【０１０５】
７）フロー検出結果、レンチウイルス感染後のＣＡＲ＋Ｔ細胞の陽性率は、（図１１）以下の通りである。
ｈｕＨＤ３７−２８Ｚ＋Ｔ細胞陽性率：８０．８％
ｈｕＨＤ３７−ＢＢＺ＋Ｔ細胞陽性率：７３．１％
ｈｕＨＤ３７−２８Ｚ＆ＩＦＮｂ＋Ｔ細胞陽性率：５６．４％
ｈｕＨＤ３７−ＢＢＺ＆ＩＦＮｂ＋Ｔ細胞陽性率：５３％
なお、対照群Ｍｏｃｋ＋Ｔ細胞陽性率は９０％である。
【０１０６】
３．４ＣＤ１９エピトープの腫瘍細胞株への曝露状況の分析
１）１０ｃｍプレートでＫ５６２、Ｋ５６２−ＣＤ１９、Ｄａｕｄｉ及びＲａｊｉ細胞のような腫瘍細胞を培養する。
２）１×１０６の前記細胞を採取し、二等分し、４℃、５０００ｒｐｍ／ｍｉｎで、５分間遠心分離する。
３）一群の細胞に５００μｌのＰＢＳ（１％ＮＢＳ）を直接に加え、再懸濁後に対照とする。
【０１０７】
４）一群＋５０μｌの１：２０で希釈したＰｅｒＣＰ−ＣＤ１９抗体を、氷上で４５ｍｉｎインキュベートする。
５）２ｍｌのＰＢＳ（１％のＮＢＳ）再懸濁細胞を加え、４℃、５０００ｒｐｍ／ｍｉｎで、５分間遠心分離し、上清を捨て、２回繰り返す。
６）５００μｌのＰＢＳ（１％のＮＢＳ）再懸濁細胞を加え、細胞をフローチューブに移す。
７）フローサイトメトリーによってＰｅｒＣＰチャネルを検出する。
８）フロー検出結果、Ｋ５６２細胞は、ＣＤ１９タンパク質を発現せず、Ｋ５６２−ＣＤ１９、Ｄａｕｄｉ及びＲａｊｉはすべてＣＤ１９陽性細胞であることを示した（図１２）。
【０１０８】
３．５ｈｕＨＤ３７  ＣＡＲ  Ｔ細胞標的とする細胞毒性測定
１）標的細胞：７５μＬの２×１０５／ｍＬのＫ５６２、Ｋ５６２−ＣＤ１９、Ｄａｕｄｉ及びＲａｊｉを９６ウェルプレートにそれぞれ接種する。
２）エフェクター細胞：３：１、１：１または１：３のエフェクター：標的比にＴ−Ｍｏｃｋ及び異なるキメラ抗原受容体を発現するＣＡＲ  Ｔ細胞を加える。
３）各群にそれぞれ４つの複製ウェルを設け、４つの複製ウェルの平均値を取る。検出時間は１８ｈである。
【０１０９】
４）ここで、各実験群と各対照群は、以下の通りである。
各実験群：各標的細胞＋異なるキメラ抗原受容体を発現するＣＡＲ  Ｔ、
［１］エフェクター細胞からの自発的ＬＤＨ放出：エフェクター細胞から自発的に放出されたＬＤＨを補正する。
［２］標的細胞からの自発的ＬＤＨ放出：標的細胞から自発的に放出されたＬＤＨを補正する。
［３］標的細胞からの最大ＬＤＨ放出：当該対照は、計算時に１００％のＬＤＨ放出を決定するために必要である。
［４］体積補正対照：ライセート（１０×）を加えることによる体積変化を補正する。
［５］培養基背景対照：培養基の血清によって生じるＬＤＨ活性及びフェノールレッドによる背景吸収を補正する。
【０１１０】
５）検出方法：ＣｙｔｏＴｏｘ  ９６非放射性細胞毒性検出キット（Ｐｒｏｍｅｇａ会社）を用いた。具体的に、ＣｙｔｏＴｏｘ  ９６非放射性細胞毒性検出キット説明書を参照する。
６）細胞毒性の計算式は以下の通りである。％細胞毒性＝［（実験群−エフェクター細胞自発群−標的細胞自発群）／（標的細胞最大−標的細胞自発）］×１００。
計算の前に、培養基対照をエフェクター細胞対照、標的細胞対照、実験群から差し引き、標的細胞最大溶解量から体積を差し引いた。
【０１１１】
７）実験結果は、異なるキメラ抗原受容体を発現する各ＣＡＲ  Ｔ細胞がＣＤ１９陽性の細胞に対して、すべて有意なインビトロ殺傷活性を有し、ＣＤ１９陰性のＫ５６２細胞に対して有意なインビトロ殺傷活性を有さないことを示した。（図１３）。
【０１１２】
実施例４．抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体プラスミド（ＣＡＲ）の構築
出願人は、実施例２で得られたクローン６Ｂ３、８Ｅ３を用いて実施例３を繰り返し、結果は、６Ｂ３及び８Ｅ３がｈｕＨＤ３７と同様の効果を生じることを示した。
【０１１３】
本出願において言及される全ての文書は、その全体が単独で参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。なお、本発明の上記の教示内容を読んだ後に、当業者によって様々な修正および変更がなされることができ、これらの同等の形態もまた、添付の特許請求の範囲によって定義される範囲内にあることを理解するべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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