(57)【要約】同じ個体の複数のクローン細胞集団について集団の大きさを測定するための、例えば、同じ個体内の複数のクローン的に無関係の腫瘍について腫瘍の大きさを測定するための組成物及び方法が提供される。主題の方法は、（ａ）個体を、遺伝性であり、互いに区別可能である複数の細胞マーカーと接触させて、遺伝的に特徴がある細胞の複数の区別可能な系譜を生成することと、（ｂ）遺伝的に特徴がある細胞が少なくとも１回の分裂を受けるために十分な時間が経過した後、接触させた組織に存在する複数の細胞マーカーのうちの少なくとも２つの量を検出及び測定し、それにより、測定した値のセットを生成することと、（ｃ）測定した値のセットを使用して、存在する遺伝的に特徴がある細胞（例えば、遺伝的に特徴がある細胞の区別可能な系譜のうちの少なくとも２つ）の数を計算することとを含み得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
同じ組織内の複数のクローン細胞集団について集団の大きさを測定するための方法であって、
（ａ）生体組織を、遺伝性であり、互いに区別可能である複数の細胞マーカーと接触させて、接触させた組織内の遺伝的に特徴がある細胞の複数の区別可能な系譜を生成することと、
（ｂ）前記遺伝的に特徴がある細胞の少なくとも一部が少なくとも１回の分裂を受けるために十分な時間が経過した後、接触させた組織に存在する前記複数の細胞マーカーのうちの少なくとも２つの量を検出及び測定し、それにより、測定した値のセットを生成することと、
（ｃ）前記測定した値のセットを入力として使用して、前記遺伝的に特徴がある細胞の区別可能な系譜のうちの少なくとも２つについての、接触させた組織に存在する遺伝的に特徴がある細胞の数を計算することと
を含む、方法。
【請求項２】
接触させた組織内の前記遺伝的に特徴がある細胞は、新生細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組織は、ステップ（ａ）の前に新生細胞及び／または腫瘍を含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｂ）の検出及び測定は、前記組織から回収された生体試料で行われる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｂ）の検出及び測定は、接触させた組織の組織試料で行われる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記複数の細胞マーカーの各細胞マーカーは、遺伝的に特徴がある細胞の系譜の既知の細胞遺伝子型に対応する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記接触させることは、前記組織の細胞を遺伝的に改変して、遺伝的に特徴がある細胞を生成することを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記同じ組織の複数の腫瘍について腫瘍の大きさを測定する方法である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記組織を接触させるステップは、新生細胞を誘導することを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞マーカーは、新生細胞形成及び／または腫瘍形成を誘導する薬剤である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
検出及び測定は、接触の結果として、接触させた組織内で腫瘍が形成されるために十分な時間が経過した後に行われる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記複数の細胞マーカーは、バーコード化された核酸を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
検出及び測定は、各検出されたバーコードについての、ハイスループットシーケンシン
グ、及び配列リードの数の定量化を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記複数の細胞マーカーは、新生細胞形成を誘導するバーコード化された核酸を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記バーコード化された核酸は、新生細胞形成を誘導し、相同組換え修復（ＨＤＲ）ＤＮＡドナーテンプレート、１つ以上のがん遺伝子をコードする核酸、１つ以上の野生型タンパク質をコードする核酸、１つ以上の変異タンパク質をコードする核酸、１つ以上のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡをコードする核酸、１つ以上の短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする核酸、及び１つ以上のゲノム編集タンパク質をコードする核酸のうちの１つ以上を含む、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ゲノム編集タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ＲＮＡガイドタンパク質、転写活性化因子または抑制因子ポリペプチドに融合したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ＲＮＡガイドタンパク質、Ｃａｓ９タンパク質、転写活性化因子または抑制因子ポリペプチドに融合したＣａｓ９タンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥＮ、ファージ由来インテグラーゼ、Ｃｒｅタンパク質、Ｆｌｐタンパク質、及びメガヌクレアーゼタンパク質から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記バーコード化された核酸は、線状または環状ＤＮＡ分子である、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記バーコード化された核酸は、プラスミド、合成核酸断片、及びミニサークルから選択される、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記バーコード化された核酸は、ＲＮＡ分子である、請求項１２〜１６のいずれか一0項に記載の方法。
【請求項２０】
前記バーコード化された核酸は、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドまたは核酸／タンパク質複合体である、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記組織は、無脊椎動物組織である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記組織は、脊椎動物組織である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記組織は、哺乳類または魚の組織である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記組織は、ラット組織、マウス組織、ブタ組織、非ヒト霊長類組織、またはヒト組織である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記組織は、生きている動物の一部である、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記組織は、動物の体外で成長した操作された組織である、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記組織は、筋肉、肺、気管支、膵臓、乳房、肝臓、胆管、胆嚢、腎臓、脾臓、血液、腸、脳、骨、膀胱、前立腺、卵巣、眼、鼻、舌、口、咽頭、喉頭、甲状腺、脂肪、食道、胃、小腸、結腸、直腸、副腎、軟組織、平滑筋、脈管構造、軟骨、リンパ管、前立腺、心
臓、皮膚、網膜、生殖器系、及び性器系から選択される、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記遺伝的に特徴がある細胞の少なくとも一部が少なくとも１回の分裂を受けるために十分な時間が経過した後、（ｉ）前記遺伝的に特徴がある細胞のバイオマーカーを検出及び／または測定することと、（ｉｉ）前記バイオマーカーの検出及び／または測定の結果に基づいて前記遺伝的に特徴がある細胞を分類することと
をさらに含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記バイオマーカーは、細胞増殖状態、細胞型、発達的細胞系譜、細胞死、及び細胞のシグナル伝達状態のうちの１つ以上のバイオマーカーである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞マーカーは、ウイルスベクターを介して前記組織に送達される、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ウイルスベクターは、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、及びレトロウイルスベクターから選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
同じ組織の複数のクローン的に無関係な腫瘍について腫瘍の大きさを測定する方法であって、
（ａ）組織を、複数のバーコード化された核酸細胞マーカーと接触させ、それにより、接触させた組織内の遺伝的に特徴がある新生細胞の複数の区別可能な系譜を生成することと、
（ｂ）前記遺伝的に特徴がある新生細胞の少なくとも一部が少なくとも１回の分裂を受けるために十分な時間が経過した後、ハイスループット核酸シーケンシングを行って、接触させた組織に存在する前記バーコード化された核酸細胞マーカーのうちの少なくとも２つの量を検出及び測定し、それにより、測定した値のセットを生成することと、
（ｃ）前記測定した値のセットを入力として使用して、前記遺伝的に特徴がある新生細胞の区別可能な系譜のうちの少なくとも２つについての、接触させた組織に存在する遺伝的に特徴がある新生細胞の数を計算することと
を含む、方法。
【請求項３３】
前記組織は、ステップ（ａ）の前に新生細胞及び／または腫瘍を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ステップ（ｂ）の前記ハイスループット核酸シーケンシングは、前記組織から回収された生体試料で行われる、請求項３２または請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ステップ（ｂ）の前記ハイスループット核酸シーケンシングは、前記接触させた組織の組織試料で行われる、請求項３２または請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記複数のバーコード化された核酸細胞マーカーの各バーコード化された核酸細胞マーカーは、遺伝的に特徴がある新生細胞の系譜の既知の細胞遺伝子型に対応する、請求項３２〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記接触させることは、前記組織の細胞を遺伝的に改変して、前記遺伝的に特徴がある新生細胞を生成することを含む、請求項３２〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
バーコード化された核酸は、新生細胞形成を誘導する、請求項３２〜３７のいずれか一
項に記載の方法。
【請求項３９】
バーコード化された核酸は、新生細胞形成を誘導し、相同組換え修復（ＨＤＲ）ＤＮＡドナーテンプレート、１つ以上のがん遺伝子をコードする核酸、１つ以上の野生型タンパク質をコードする核酸、１つ以上の変異タンパク質をコードする核酸、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡをコードする核酸、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする核酸、及びゲノム編集タンパク質をコードする核酸のうちの１つ以上を含む、請求項３２〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記ゲノム編集タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ＲＮＡガイドタンパク質、転写活性化因子または抑制因子ポリペプチドに融合したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ＲＮＡガイドタンパク質、Ｃａｓ９タンパク質、転写活性化因子または抑制因子ポリペプチドに融合したＣａｓ９タンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥＮ、ファージ由来インテグラーゼ、Ｃｒｅタンパク質、Ｆｌｐタンパク質、及びメガヌクレアーゼタンパク質から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
バーコード化された核酸は、線状または環状ＤＮＡ分子である、請求項３２〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
バーコード化された核酸は、プラスミド、合成核酸断片、及びミニサークルから選択される、請求項３２〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
バーコード化された核酸は、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドまたは核酸／タンパク質複合体である、請求項３２〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記組織は、無脊椎動物組織である、請求項３２〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記組織は、脊椎動物組織である、請求項３２〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記組織は、哺乳類または魚の組織である、請求項３２〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記組織は、ラット組織、マウス組織、ブタ組織、非ヒト霊長類組織、またはヒト組織である、請求項３２〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記組織は、生きている動物の一部である、請求項３２〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記組織は、動物の体外で成長した操作された組織である、請求項３２〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記組織は、筋肉、肺、気管支、膵臓、乳房、肝臓、胆管、胆嚢、腎臓、脾臓、血液、腸、脳、骨、膀胱、前立腺、卵巣、眼、鼻、舌、口、咽頭、喉頭、甲状腺、脂肪、食道、胃、小腸、結腸、直腸、副腎、軟組織、平滑筋、脈管構造、軟骨、リンパ管、前立腺、心臓、皮膚、網膜、生殖器系、及び性器系から選択される、請求項３２〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記遺伝的に特徴がある新生細胞の少なくとも一部が少なくとも１回の分裂を受けるために十分な時間が経過した後、（ｉ）前記遺伝的に特徴がある新生細胞のバイオマーカーを検出及び／または測定することと、（ｉｉ）前記バイオマーカーの検出及び／または測
定の結果に基づいて前記遺伝的に特徴がある新生細胞を分類することと
をさらに含む、請求項３２〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記バイオマーカーは、細胞増殖状態、細胞型、発達的細胞系譜、細胞死、及び細胞のシグナル伝達状態のうちの１つ以上のバイオマーカーである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記核酸細胞マーカーは、ウイルスベクターを介して前記組織に送達される、請求項３２〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記ウイルスベクターは、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ボカウイルスベクター、泡沫状ウイルスベクター、及びレトロウイルスベクターから選択される、請求項５３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ゲノムシーケンシングは、全ゲノムレベルでヒトがんの体細胞改変をカタログ化し、多くの潜在的に重要な遺伝子（例えば、推定上の腫瘍抑制遺伝子、推定上のがん遺伝子、治療抵抗性または感受性につながり得る遺伝子）を同定してきた。しかしながら、ゲノム改変の同定は、がんにおけるそれらの機能上の重要性を必ずしも示さず、単独でのまたは他の遺伝子改変（体細胞または生殖系列のいずれか）もしくは微小環境の相違と組み合わせた、遺伝子の不活性化または改変の影響を、がんゲノムシーケンシングデータのみから収集することは依然として困難である。
【０００２】
新生物成長に対する遺伝子改変の分子及び細胞の影響は、細胞株におけるノックダウン、ノックアウト、及び過剰発現研究、ならびに遺伝子操作されたマウスモデル系を使用して直接調査されてきた。過去数十年にわたって、培養におけるがん細胞株の遺伝子機能の分析は、がんの多くの態様を明らかにしてきた。
【０００３】
しかしながら、培養におけるがん細胞株の近最適成長、広範な既存の遺伝的及び後成的変化、ならびに自発性微小環境の欠如は、異なる遺伝子がどのようにインビボ表現型（例えば、がん成長、転移、治療応答）を制限または駆動するのかを明らかにするこれらの系の能力を制限している。対照的に、ヒトがんの遺伝子操作されたマウスモデルは、それらの天然インビボ環境内での腫瘍の発生及び成長をもたらす、定義された遺伝子改変の正常な成人細胞への導入を容易にする。これは、多くの経路がインビボ腫瘍微小環境の特性により影響を受けるため、特に重要である。
【０００４】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓに基づく遺伝子標的などのインビボシステムは、インビトロ及びインビボ機能分析の規模を増加させたが、インビボ系は、腫瘍成長の比較的粗雑な測定に依存し続けており、最も劇的な作用を有する遺伝子の分析へのそれらの適用を制限する。インビボで遺伝子機能を分析するための厳密な定量的システムの欠如は、腫瘍成長を駆動もしくは制限するか、または他の重要な発がんの態様（例えば、腫瘍抑制経路）のいずれかに影響を及ぼす経路の幅広い理解を妨げてきた。
【０００５】
複数のクローン細胞集団（例えば、異なる同定可能な腫瘍または腫瘍内の異なる同定可能なサブクローンのいずれかである、複数の区別可能な細胞系譜）を有する個体におけるクローン集団の大きさ（例えば、各腫瘍の大きさ、各腫瘍またはサブクローンにおける新生細胞の数など）の正確な定量化を容易にする組成物及び方法が必要である。本開示の組成物及び方法はこの必要性に対処し、異なる個々の遺伝子（例えば、腫瘍抑制因子、がん遺伝子）または遺伝子改変（例えば、挿入、欠失、点変異）、または遺伝子及び／もしくは遺伝子改変の組み合わせが、細胞集団の成長（例えば、腫瘍成長）、ならびに重要な他の表現型（例えば、腫瘍の進化、進行、転移傾向）に対して異なる全体的な作用を有するかを明らかにする能力を提供する。本開示の組成物及び方法は、同じ組織内（例えば、同じ個体内）の複数の異なるクローン細胞集団（例えば、類似の遺伝子型だが異なる発生事象の複数の腫瘍、異なる遺伝子型を有する複数の腫瘍など）の成長に対する潜在的な治療薬、例えば、放射線、化学療法、絶食、化合物、例えば、薬物、生物製剤などの作用を試験する能力も提供し、これは、試料間のばらつき（例えば、動物間のばらつき）により導入される誤差を劇的に低減し得る。これらの方法は合理的な薬物の組み合わせの開発及び試験も容易にする。
【発明の概要】
【０００６】
同じ組織内（例えば、同じ個体内）または異なる組織内の複数のクローン細胞集団につ
いて集団の大きさを測定するための組成物及び方法が提供される。例として、場合によっては、主題の方法は、同じ組織内（例えば、同じ個体内）の複数のクローン的に無関係な腫瘍細胞集団（例えば、異なる腫瘍）について腫瘍の大きさを測定する方法である。
【０００７】
図示的な例として実施例において以下に記載されるように、発明者らは、細胞のバーコード化（例えば、腫瘍のバーコード化）及びハイスループットシーケンシング（実施例において「Ｔｕｂａ−ｓｅｑ」と称される）とヒトがんの遺伝子操作されたマウスモデルとを組み合わせて、前例がない分解能で腫瘍成長を定量化した。個々の腫瘍の大きさの正確な定量化は、異なる腫瘍抑制遺伝子（例えば、既知の腫瘍抑制遺伝子）の不活性化の影響を明らかにすることを可能にした。さらに、発明者らは、これらの方法を、多重ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介ゲノム編集と統合し、これは、推定上の腫瘍抑制遺伝子のパネルの不活性化及び機能的定量化を並行して行うことを可能にし、機能性肺腫瘍抑制因子の同定をもたらした。本方法は、インビボでのがん成長に対する遺伝子改変の影響を研究するための、迅速、多重、かつ高度に定量的なプラットホームである。
【０００８】
以下の実施例にも記載されるように、発明者らは、バーコード化されたＨＤＲドナーテンプレートによる多重体細胞相同組換え修復（ＨＤＲ）を使用して、個々のマウス内の遺伝的に多様なバーコード化された腫瘍（例えば、定義された遺伝子において遺伝的に多様な点変異を有する腫瘍）を産生し、定量的腫瘍分析（ハイスループットシーケンシングを使用する）を用いて、同じ動物において複数の正確な変異（例えば、定義された点変異）の機能を同時に迅速かつ定量的に調べた。
【０００９】
いくつかの実施形態では、主題の方法は、組織（例えば、筋肉、肺、気管支、膵臓、乳房、肝臓、胆管、胆嚢、腎臓、脾臓、血液、腸、脳、骨、膀胱、前立腺、卵巣、眼、鼻、舌、口、咽頭、喉頭、甲状腺、脂肪、食道、胃、小腸、結腸、直腸、副腎、軟組織、平滑筋、脈管構造、軟骨、リンパ管、前立腺、心臓、皮膚、網膜、ならびに生殖器及び性器系、例えば、精巣、生殖組織など）を、遺伝性であり、互いに区別可能である複数の細胞マーカーと接触させて、接触させた組織内の遺伝的に特徴がある細胞の複数の区別可能な系譜を生成するステップを含む。いくつかの実施形態では、組織を接触させるために使用される細胞マーカーは、バーコード化された核酸（例えば、ＲＮＡ分子、または環状もしくは線状ＤＮＡ分子、例えば、プラスミド、天然もしくは合成の一本鎖または二本鎖の核酸断片、及びミニサークル）である。いくつかの実施形態では（例えば、細胞マーカーがバーコード化された核酸である場合）、細胞マーカーは、ウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、及びレトロウイルスベクター）を介して組織に送達され得る。場合によっては、接触させられる組織は、細胞マーカーと接触させる前に、既に新生細胞を含む。場合によっては、細胞マーカーは、新生細胞形成及び／または腫瘍形成を誘導し得る。場合によっては、細胞マーカーに連結される構成要素は、新生細胞形成及び／または腫瘍形成を誘導し得る。場合によっては、細胞マーカーは、新生細胞形成及び／または腫瘍形成を誘導し得るバーコード化された核酸（例えば、相同組換え修復（ＨＤＲ）ＤＮＡドナーテンプレート、ゲノム編集タンパク質（複数可）をコードする核酸、がん遺伝子をコードする核酸、タンパク質（複数可）、例えば、野生型及び／または変異タンパク質（複数可）をコードする核酸［例えば、成長／増殖以外の何らかの方法で、例えば、腫瘍に有害なタンパク質をコードする野生型または変異ｃＤＮＡ］、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、他のゲノム編集システムの標的構成要素をコードする核酸など）である。
【００１０】
主題の方法はまた、（遺伝的に特徴がある細胞の少なくとも一部が少なくとも１回の分裂を受けるために十分な時間が経過した後）、接触させた組織に存在する複数の細胞マーカーのうちの少なくとも２つの量を検出及び測定し、それにより、例えば、特徴がある細
胞と遺伝的に関連する、接触させた組織に残存する細胞マーカーの同一性及び量を表す、測定した値のセットを生成するステップも含み得る。場合によっては、（例えば、細胞マーカーがバーコード化された核酸である場合）、検出及び測定は、各検出されたバーコードについての、ハイスループットシーケンシング、及び配列リードの数の定量化を含む方法を介して行われ得る。
【００１１】
場合によっては、測定した値の生成されたセットを入力として使用して、接触させた組織に存在する遺伝的に特徴がある細胞の数（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも１００個、少なくとも１，０００個、少なくとも１０，０００個、または少なくとも１００，０００個の遺伝的に特徴がある細胞の検出された区別可能な系譜）（例えば、場合によっては、１０〜１，０００，０００個、１０〜１００，０００個、１０〜１０，０００個、または１０〜１，０００個の範囲の遺伝的に特徴がある細胞の検出された区別可能な系譜）を計算する（例えば、コンピュータを使用して）。遺伝的に特徴がある細胞の計算された数は、絶対的（例えば、存在すると決定された細胞の実際の数）であり得るか、または相対的（例えば、遺伝的に特徴がある細胞の第１の系譜の集団の大きさは、遺伝的に特徴がある細胞の第２の系譜の集団の大きさに対して、いずれの系譜に存在する細胞の実際の数を必ずしも決定することなく決定され得る）であり得る。
【００１２】
いくつかの実施形態では、主題の方法は、例えば、細胞マーカーを導入した後、例えば、組織の複数の細胞マーカーとの接触を介して新生細胞（またはサブクローン）を誘導するステップの後、試験化合物（例えば、薬物）を組織に投与する（例えば、オルガノイドなどの合成エクスビボ組織の接触を介する個体への投与を介して）ステップを含む。いくつかのそのような場合では、試験化合物を投与するステップの後に、複数の特徴がある細胞の系譜／細胞集団について集団の大きさ（例えば、腫瘍の大きさ、各腫瘍における新生細胞の数）を測定するステップが続く。同じ組織内（例えば、同じ動物内）の異なる区別可能な特徴がある細胞の系譜について複数の細胞集団が測定され得る（例えば、複数の腫瘍の大きさが測定され得る）ため、薬物応答の試料間の変動（例えば、動物間の変動）に起因する誤差のリスクは、排除されないとしても、大幅に低減され得る。
【００１３】
本発明は、以下の詳細な説明を添付の図面とあわせて読むことにより、最もよく理解される。一般的な慣例に従い、図面の様々な特徴が縮尺通りではないことを強調する。反対に、様々な特徴の寸法を、明確化のために場合により拡大または縮小させる。図面には、以下の図が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】Ｔｕｂａ−ｓｅｑは、腫瘍バーコード化とハイスループットシーケンシングとを組み合わせて、腫瘍の大きさを並行して定量化することを可能にする。Ａは、肺腫瘍の大きさの分布を評価するためのＴｕｂａ−ｓｅｑパイプラインの図式を示す。ランダムな１５−ヌクレオチドＤＮＡバーコード（ＢＣ）を含有するウイルスであるＬｅｎｔｉ−ｍＢＣ／Ｃｒｅを用いて、ＫｒａｓＬＳＬ−Ｇ１２Ｄ／＋；Ｒｏｓａ２６ＬＳＬ−Ｔｏｍａｔｏ（ＫＴ）、ＫＴ；Ｌｋｂ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ（ＫＬＴ）、及びＫＴ；ｐ５３ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ（ＫＰＴ）マウスにおいて腫瘍を発生させた。腫瘍の大きさは、腫瘍保有肺からのＤＮＡのバルクバーコードシーケンシングを介して計算された。Ｂは、Ｌｅｎｔｉ−ｍＢＣ／Ｃｒｅ発生腫瘍を有するＫＴ、ＫＬＴ、及びＫＰＴマウスからの肺葉の蛍光解剖スコープ画像を示す。肺葉は、白色の破線で輪郭が描かれている。Ｌｅｎｔｉ−ｍＢＣ／Ｃｒｅの力価を示す。全体的な腫瘍成長の相違に左右されずにほぼ等しい総腫瘍負荷を生成するために、異なる遺伝的背景において異なる力価が使用された。上のパネルのスケールバー＝５ｍｍであり、下のパネルのスケールバー＝１ｍｍである。Ｃは、ＫＴ、ＫＬＴ、及びＫＰＴマウスの腫瘍の大きさの分布（１群当たりのマウスの数を示す）を示す。各点は腫瘍を表す。各点の面積は、各腫瘍のがん細胞の数に比例する。直径１ｍｍの球状腫瘍のがん細胞のおよその数に相当する点は、参照のためデータの右側に示される。
【図２−１】Ｔｕｂａ−ｓｅｑは、腫瘍の大きさを定量化するための頑強かつ再現性がある方法である。Ａでは、アンプリコンデータのディープシーケンシング用に設計されたノイズ除去アルゴリズムであるＤＡＤＡ２は、偽腫瘍として現れる場合がある繰り返し起こるリードエラーを排除する。既知のバーコードを有する細胞株が各マウスからの各肺試料に添加された（各々５×１０５細胞）。これらの既知のバーコードに由来する繰り返し起こるリードエラーは、約５，０００個の細胞で偽腫瘍として現れる。ＤＡＤＡ２は、これらの繰り返し起こるリード（シーケンシング）エラーを特定し、大幅に低減する。Ｂ、Ｃでは、個々のバルク肺試料から調製された技術的反復シーケンシングライブラリは、個々の病変の大きさ（Ｂ）と大きさのプロファイル（Ｃ）との間に高い一致を示す（５０〜９９．９パーセンタイルの腫瘍が示される）。
【図２−２】Ｔｕｂａ−ｓｅｑは、腫瘍の大きさを定量化するための頑強かつ再現性がある方法である。Ｄでは、発明者らの分析パイプラインは、リード深度、ＤＮＡバーコードのＧＣ含有量、及びバーコードライブラリの多様性の変動に対して頑強である。腫瘍は、シーケンシング深度、腫瘍バーコードのＧＣ含有量、及び推定された固有のバーコードの数の各技術的パラメータの高、中、及び低レベルに対応して３分の１に分配された（方法を参照されたい）。ウィスカーは、１．５ＩＱＲでキャップされた。Ｅは、５匹のＫＬＴマウスにわたる大きさの分布の再現性を示す。マウスは、マウス間の腫瘍の大きさの相違が小さいにもかかわらず、全体的に類似する大きさのプロファイルを有する。個々のマウスにおいて示されるパーセンタイルの腫瘍の大きさは線でつながれる。Ｆでは、同じマウス内の腫瘍が比較されるとき、大きさのプロファイルの再現性は向上し、腫瘍の大きさにおける有意なマウス間のばらつきを示唆する。各マウスの腫瘍を２つの群に分配し、これらの群のプロファイルを比較した。個々のマウスにおける示されるパーセンタイルの腫瘍の大きさは線でつながれる。Ｇは、定義されたパーセンタイルの腫瘍の大きさ間の総最小二乗距離に基づいたＫＴ、ＫＰＴ、及びＫＬＴマウスの教師なし階層的クラスター化（ウォード分散最小アルゴリズムによりクラスター化された）を示す。遺伝子型によるマウスのクラスターにより、Ｔｕｂａ−ｓｅｑは各遺伝子型の大きさスペクトルにおける再現性がある相違が特定されることを示唆する。
【図３−１】腫瘍の大きさを大規模に並行して定量化することにより、複数の遺伝子型にわたる確率分布適合を可能にする。Ａ、Ｂは、ＫＬＴ（ｎ＝５）マウス（Ａ）及びＫＰＴ（ｎ＝３）マウス（Ｂ）における示されるパーセンタイルの腫瘍の大きさ対ＫＴマウス（ｎ＝７）における示されるパーセンタイルの腫瘍の大きさを示す。各パーセンタイルは、Ｌｅｎｔｉ−ｍＢＣ／Ｃｒｅを用いて腫瘍発生させた１１週間後に各遺伝子型の全マウスからの全ての腫瘍を使用して計算された。Ｃは、同じパーセンタイルのＫＴ腫瘍に対する各遺伝子型の示されるパーセンタイルの腫瘍の大きさを示す。エラーバーは、ブートストラップを介して得られた９５％信頼区間である。対応するＫＴパーセンタイルとは大幅に異なるパーセンタイルには色が付けられている。
【図３−２】腫瘍の大きさを大規模に並行して定量化することにより、複数の遺伝子型にわたる確率分布適合を可能にする。Ｄでは、正規分布した成長速度の指数関数的な腫瘍成長に関して予想されるように、腫瘍の大きさの分布は対数正規分布により最もぴったりと適合した。ＫＬＴマウスの腫瘍は、それらの大きさスペクトル（中央）全体を通して対数正規分布により最も良く説明される。ＫＴマウス（左）及びＫＰＴマウス（右）の腫瘍の大きさの分布は、より小さいスケールの対数正規分布とより大きいスケールのべき乗則分布との組み合わせによってより良く説明された。これらの相違は、個々の遺伝子（または遺伝子の組み合わせ）がどのように腫瘍成長の増加をもたらすかを考える際に基本的に重要である。べき乗則の関係は、対数−対数軸上で直線的に下に傾き、ＫＴマウスの腫瘍の上位約１％以内の稀であるが非常に大きな腫瘍、及びＫＰＴマウスの約１０％の腫瘍と一致する。注記：ＫＰＴマウスの腫瘍のみが１１週間後に１００万個の細胞を常に超え、ｐ５３欠損と一致し、発明者らの研究において最も大きな腫瘍の生成を可能にする。
【図４−１】Ｔｕｂａ−ｓｅｑ及び多重ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介遺伝子の不活性化を使用した、腫瘍抑制因子表現型の迅速な定量化を示す。Ａは、各ｓｇＲＮＡに連結した８ヌクレオチド「ｓｇＩＤ」配列を有する２構成要素バーコード、ならびにランダムな１５ヌクレオチドランダムバーコード（ＢＣ）を含有するＬｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅベクターの図式を示す。Ｂでは、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅは、不活性ｓｇＲＮＡを有する４つのベクターと、既知及び候補腫瘍抑制遺伝子を標的とする１１のベクターとを含有する。各ｓｇＲＮＡベクターは、固有のｓｇＩＤ及びランダムなバーコードを含有する。ＮＴ＝非標的である。Ｃは、インビボでの肺腫成長に対する各標的遺伝子の機能を評価するための、Ｔｕｂａ−ｓｅｑと結合された多重ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介腫瘍抑制因子不活性化の図式を示す。Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅウイルスを用いて、ＫＴ及びＫＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９（ＫＴ；Ｃａｓ９）マウスにおいて腫瘍を発生させた。
【図４−２】Ｔｕｂａ−ｓｅｑ及び多重ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介遺伝子の不活性化を使用した、腫瘍抑制因子表現型の迅速な定量化を示す。Ｄは、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅを用いて腫瘍を発生させた１２週間後のＫＴ及びＫＴ；Ｃａｓ９マウスからの肺葉の明視野（上）及び蛍光解剖スコープ画像（下）を示す。肺葉は、蛍光画像において白色の破線で輪郭が描かれている。ウイルス力価を示す。スケールバー＝５ｍｍである。Ｅでは、組織診断は、ＫＴマウスが過形成及び小さい腫瘍を有し、一方、ＫＴ；Ｃａｓ９マウスがはるかにより大きい腫瘍を有することを確認する。ウイルス力価を示す。上のスケールバー＝３ｍｍであり、下のスケールバー＝５００μｍである。
【図５−１】Ｔｕｂａ−ｓｅｑは、前例がない分解能で既知及び新規の腫瘍抑制因子を明らかにする。Ａでは、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅを用いて腫瘍を発生させた１２週間後のＫＴ；Ｃａｓ９マウスの相対的な腫瘍の大きさの分析は、６つの腫瘍成長抑制遺伝子を同定した。示されるパーセンタイルの腫瘍の相対的な大きさは、８匹のマウスからの統合データを表し、ｓｇＩｎｅｒｔ腫瘍の平均の大きさに対して正規化される。９５％信頼区間を示す。ｓｇＩｎｅｒｔよりも有意に大きいパーセンタイルは色が付けられている。Ｂでは、対数正規の腫瘍の大きさの分布を仮定する平均腫瘍の大きさの推定により、ＫＴ；Ｃａｓ９マウスにおいて成長を大幅に増加させるｓｇＲＮＡを同定した。ボンフェローニ補正ブートストラップｐ値を示す。ｐ値＜０．０５及びそれらの対応する平均は太字である。Ｃは、腫瘍発生の１２週間後のＫＴ及びＫＴ；Ｃａｓ９マウス、ならびに腫瘍発生の１５週間後のＫＴ；Ｃａｓ９マウスにおける、各ｓｇＲＮＡを有する腫瘍の９５パーセンタイルの腫瘍（左）、対数正規（ＬＮ）平均（中央）、及び対数正規（ＬＮ）ｐ値（右）の相対的大きさを示す。
【図５−２】Ｔｕｂａ−ｓｅｑは、前例がない分解能で既知及び新規の腫瘍抑制因子を明らかにする。Ｄでは、ＫＴマウスに対するＫＴ；Ｃａｓ９マウスの全体的なｓｇＩＤ表示の倍率変化（ΔｓｇＩＤ表示）は、表示が増加するいくつかのｓｇＲＮＡを同定し、標的腫瘍抑制遺伝子の不活性化による腫瘍の成長の増加と一致した。ΔｓｇＩＤ表示は、ＫＴ；Ｃａｓ９マウス対ＫＴマウスにおける各ｓｇＩＤを有するリードのパーセントでの倍率変化であり、ｓｇＩｎｅｒｔのΔｓｇＩＤ表示＝１であるように正規化される。平均及び９５％信頼区間を示す。Ｅ、Ｆでは、腫瘍抑制作用を検出する能力は、ｓｇＲＮＡ表示のみの組み込みと比較して、バーコードシーケンシングからの個々の腫瘍の大きさを組み込むことにより劇的に向上する。現在の全てのアプローチはｓｇＲＮＡ表示に依存し、これはＴｕｂａ−ｓｅｑよりもはるかに劣る。９５パーセンタイル腫瘍の相対的大きさ及びＴｕｂａ−ｓｅｑにより決定された対数正規の統計的有意性は、ΔｓｇＩＤ表示における平均倍率変化及びそれらの関連するｐ値よりも多い遺伝子を腫瘍抑制因子として同定した。Ｅのエラーバーは、９５％信頼区間である。Ｆの点線は、０．０５有意閾値を示す。点の色は、図４ＢのｓｇＲＮＡの色に対応する。
【図６】独立した方法は、肺腫瘍成長の強力な抑制因子としてＳｅｔｄ２を同定した。Ａでは、標的遺伝子座にインデルを含有するリードのパーセントは、３つの独立したネオマイシン遺伝子座にインデルを含有するリードの平均パーセントに対して正規化された。この値は、３匹の個々のマウスについての各ｓｇＲＮＡの９５パーセンタイルの腫瘍の大きさに対してプロットされる。的確なｓｇＲＮＡ切断の選択と一致する、Ｓｅｔｄ２、Ｌｋｂ１、及びＲｂ１における高頻度のインデルを示す。各点は、１匹のマウスからのｓｇＲＮＡを表す。ｓｇＮｅｏの点は黒色であり、他の全ての点は図４Ｂに従い着色される。Ｂでは、腫瘍発生の９週間後に分析した、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＳｅｔｄ２＃１／Ｃｒｅ、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＳｅｔｄ２＃２／Ｃｒｅ、またはＬｅｎｔｉ−ｓｇＮｅｏ２／Ｃｒｅに感染させた（形質導入した）ＫＴ；Ｃａｓ９マウスからの肺葉の蛍光解剖スコープ画像及びＨ＆Ｅ。肺葉は、蛍光解剖スコープ画像において白色の破線で輪郭が描かれている。上のスケールバー＝５ｍｍであり、下のスケールバー＝２ｍｍである。Ｃでは、組織診断による腫瘍面積パーセントの定量化は、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＳｅｔｄ２＃１／ＣｒｅまたはＬｅｎｔｉ−ｓｇＳｅｔｄ２＃２／Ｃｒｅに感染させた（形質導入した）ＫＴマウスと比較して、同じウイルスに感染させた（形質導入した）ＫＴ；Ｃａｓ９マウスにおける腫瘍負荷において大幅な増加を示す。各点はマウスを表し、バーは平均である。＊ｐ値＜０．０５であり、ＮＳ＝有意ではない。Ｄは、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＳｅｔｄ２＃１／Ｃｒｅ発生腫瘍対Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＮｅｏ２／Ｃｒｅ発生腫瘍を有するＫＴ；Ｃａｓ９マウスからの示されるパーセンタイルの腫瘍の大きさ（Ｎ＝４匹のマウス／群）を示す。パーセンタイルは、各群の全てのマウスからの全ての腫瘍を使用して計算された。
【図７】ヒト肺腺癌におけるゲノム改変の頻度ならびに腫瘍発生及びバーコード化の説明を示す。Ａでは、各腫瘍抑制遺伝子において潜在的な不活性化改変（フレームシフトもしくは非同議変異、またはゲノム喪失）を有する腫瘍のパーセントは、全ての腫瘍（Ａｌｌ）に関して、ならびに発がん性ＫＲＡＳ変異を有する腫瘍（ＫＲＡＳｍｕｔ）において示される。各データセットにおいてＫＲＡＳに発がん性変異を有する腫瘍の数及びパーセントが示される。Ｂでは、バーコード化されたレンチウイルス−Ｃｒｅベクターの吸入は、遺伝子操作されたマウスモデルの肺腫瘍を発生させる。重要なことには、レンチウイルスベクターは、形質導入細胞のゲノムに安定して組み込まれる。各固有にバーコード化された細胞の相対的拡大は、ハイスループットシーケンシングに基づいた方法により決定され得る。Ｃは、１．７×１０４Ｌｅｎｔｉ−Ｃｒｅウイルスに感染させた（形質導入した）ＫｒａｓＬＳＬ−Ｇ１２Ｄ／＋；Ｒ２６ＬＳＬ−Ｔｏｍａｔｏ（ＫＴ）マウスからの肺組織切片のヘモトキシリン及びエオジン（Ｈ＆Ｅ）染色を示す。これらのマウスは、新生細胞の小さな拡大、ならびにより大きな腺腫を発達させる。スケールバー＝５０μｍである。
【図８−１】インビボで腫瘍の大きさを定量化するためのＴｕｂａ−ｓｅｑパイプラインを示す。Ａでは、組み込まれたレンチウイルスベクターのＤＮＡバーコード領域のＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）シーケンシングは、病変の大きさの正確な測定を可能にする。最初に、不十分なＰｈｒｅｄ品質スコアまたは予想外の配列を有するリードを廃棄した。次に、リードを固有のバーコードを有する群にまとめた。繰り返し起こるＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）シーケンシングエラーは、初めは完全なリード長ディープシーケンシングアンプリコンを同定するために設計されたＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）シーケンシングエラーのモデルであるＤＡＤＡ２を使用して小さい病変から明らかにされた。このクラスター化アルゴリズムにより、大きい腫瘍の増幅されたバーコード領域からの繰り返し起こるシーケンシングエラーであると見なされる小さいバーコードのパイルアップを、これらのより大きいパイルアップと組み合わせた。リードのパイルアップは、ベンチマーク対照を使用して絶対細胞数に変換された。最後に、パイプラインの再現性を最大にするために、シーケンシング情報と絶対細胞数との両方を使用して、病変を呼び出すための最小カットオフを確立した。Ｂでは、固有のリードのパイルアップは、固有の病変と対応せず、むしろ非常に大きい腫瘍（例えば、はるかにより大きい腫瘍）からのバーコードの繰り返し起こるシーケンシングエラーから生じる場合がある。ＤＡＤＡ２を使用して、小さいリードのパイルアップを、十分な大きさ及び配列類似性のより大きい病変と統合した。アルゴリズムは、発明者らのディープシーケンシング領域（すなわち、バーコードに隣接するレンチウイルスベクターの領域）の非縮重領域からシーケンシングエラー率を計算する。
【図８−２】インビボで腫瘍の大きさを定量化するためのＴｕｂａ−ｓｅｑパイプラインを示す。Ｃでは、全ての転位及び転換（Ａ〜Ｃに示される）の尤度は、各実行に特異的なエラーモデルを生成するために、全てのＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）Ｐｈｒｅｄスコアについて計算された。公表されたＰｈｒｅｄエラー率（赤）は一般的に、観察されたものよりも低い（黒；正則化のために使用されたＬＯＥＳＳ回帰）。次に、これらのエラーモデル（各Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）装置に対して訓練された）を使用して、より小さいリードのパイルアップを、強い配列類似性を有するより大きいパイルアップに束ねられる（より小さいパイルアップが繰り返し起こるリードエラーであることを示唆する）べきか、または別の病変として残すかを決定した。Ｄ〜Ｆでは、発明者らの最初の実験試料（図１のＫＴ、ＫＬＴ、及びＫＰＴ）を３つの異なるＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）装置でシーケンシングして、入念に調べ、ＤＡＤＡ２をパラメータ化した。妥当な病変呼び出しプロトコルは、（Ｄ）呼び出した病変の数において強い類似性、（Ｅ）バーコードの大きさ間で良好な相関関係、及び（Ｆ）３回の実行にわたって各ｓｇＩＤプールの類似する平均の大きさを示すと予想された。３回の実行は、シーケンシング深度が必然的に異なり（前処理後、４０．１×１０６、２２．２×１０６、及び３４．９×１０６リード）、塩当たりのそれらの予想されるエラー率が必然的に異なり（０．８５％、０．９５％、及び０．２５％）、本方法の一致を入念に調べるために有用な技術的摂動を提供する。病変の大きさを５００個の細胞で切り詰め、ＤＡＤＡ２クラスター化の確率（オメガ）を１０−１０（赤色の四角）で切り詰めることにより、非常に小さいスケールで病変の大きさのプロファイルを提供し、一方で、発明者らの試験測定基準でのばらつきを尚も最小にすることを発明者らは発見した。
【図９】ベンチマーク対照は、各肺試料内の各腫瘍のがん細胞の数を計算することを可能にする。Ａは、既知のバーコードを有する３つのベンチマーク対照細胞株を使用したプロトコルの図式を示す。各細胞株の５×１０５細胞を各肺試料に添加した。次いで、ＤＮＡを肺と３つ全てのベンチマーク対照とから抽出し、バーコードをＰＣＲ増幅し、ディープシーケンシングを行った。次いで、ベンチマークに関連するリード％を各腫瘍から観察されたリード％（固有のバーコード）で除し、５×１０５を乗ずることにより、その肺試料内の各腫瘍のがん細胞の数を計算して、がん細胞数を得た。Ｂは、非常に異なる腫瘍負荷を有する２つの肺の例を示す。全体的な腫瘍負荷にかかわらず、これらのベンチマーク細胞株を使用して、個々の腫瘍内のがん細胞の数を決定することができる。周囲の「正常な肺」組織は、この組織がレンチウイルスの組み込みがなく、したがってリードに貢献しないため、この計算に影響がないことにも留意されたい。ベンチマーク対照（例えば、５×１０５、５×１０４、５×１０３、５×１０２、または５０個の細胞）の滴定の生成は、拡張されるＴｕｂａ−ｓｅｑの分解能をより小さいクローンに拡大することを容易にする。
【図１０−１】ＤＡＤＡ２に基づく腫瘍呼び出しパイプラインは頑強かつ再現可能である。Ａでは、腫瘍の大きさは、わずかなＧＣの偏りを示した。残存腫瘍の大きさのばらつきは、全てのマウスの各ｓｇＲＮＡの平均の大きさにより、大きさの対数変換及び各腫瘍の正規化により最小限に抑えられた。中間ＧＣ含有量のバーコードは、最も効率的にＰＣＲ増幅されるように見える。残りの偏りへの４次多項式適合は、病変の大きさを最も効率的に補正した。この補正は、計算され、全ての後続の分析に適用され、これは、各病変の大きさを平均５％調整し、各マウスにおける各ｓｇＩＤの病変の大きさの標準偏差を平均に対して２．９％しか低減せず、測定可能であるが、ＧＣの偏りによってもたらされたばらつきが最小であったことを示唆する。Ｂでは、ランダムなバーコードは、意図するヌクレオチドにわたって高度のランダム性を示す。Ｃは、Ｔｕｂａ−ｓｅｑを使用した、マウス当たりの呼び出された病変の数を示す。２つの異なる細胞数カットオフ（１０００及び５００）を上回る腫瘍の数は、マウス当たりの腫瘍の平均数±標準偏差として示される。ＫＴマウスは、高力価（６．８×１０５）（本文で使用された）及び低力価（１．７×１０５；ＫＴｌｏｗ）に曝された。いずれかのカットオフで、カプシド当たりで観察された腫瘍の数に統計的に有意な相違はなく、バーコードの多様性が５０万個を上回る腫瘍に尚も限定されず、小さい腫瘍が腫瘍密集により生じないことを示唆する。Ｄは、定義されたパーセンタイルの腫瘍の大きさ間の総最小二乗距離に基づいたＫＴ、ＫＴｌｏｗ、ＫＰＴ、及びＫＬＴマウスの教師なし階層的クラスター化（ウォード増分アルゴリズムにより決定された連結）を示す。同じ遺伝子型であるが、異なるウイルス力価のマウスを一緒にクラスター化し、これは、大きさのプロファイルの相違がウイルス力価の相違ではなく、主に腫瘍遺伝学（遺伝子型）によって決定されることを示唆する。
【図１０−２】ＤＡＤＡ２に基づく腫瘍呼び出しパイプラインは頑強かつ再現可能である。Ｅ、Ｆでは、病変の大きさは、リード深度の相違によって劇的に影響を受けない。個々のマウスの腫瘍保有肺からのバーコード領域は、非常に高深度でシーケンシングされ、次いで、典型的なリード深度にランダムにダウンサンプリングされた。Ｅでは、完全（ｘ軸）及びダウンサンプリング（ｙ軸）データセットの腫瘍の大きさの分布は、非常に類似しており、発明者らの分析パラメータがリード深度により偏らず、かなり頑強であることを示す。Ｆでは、パーセンタイル計算もダウンサンプリングしたときに再現性がある。Ｇでは、Ｌｅｎｔｉ−ｍＢＣ／Ｃｒｅ発生腫瘍を有するＫＴ、ＫＬＴ、及びＫＰＴマウス（図１から）は、６つの固有のＬｅｎｔｉ−ｓｇＩＤ−ＢＣ／Ｃｒｅウイルス（各々固有のｓｇＩＤ及び必然的に異なるバーコード多様性を有する）を有する腫瘍を保有する。これは、発明者らに、各マウス内に６つの反復を有するＤＡＤＡ２呼び出し腫瘍の大きさにおける変動を定量化することを可能にした。腫瘍の大きさの分布は、各マウスからの全ての腫瘍を使用するとき、及び所与のｓｇＩＤを有する腫瘍の各サブセットを使用するとき、再現性よく呼び出される。示されるパーセンタイルの腫瘍の大きさは、ＫＴ（左）、ＫＬＴ（中央）、及びＫＰＴ（右）についてプロットされる。各点は、単一のｓｇＩＤ内の腫瘍を使用して計算されたパーセンタイルの値を表す。パーセンタイルは、灰色のスケールで表される。異なるｓｇＩＤを有する腫瘍の大きさの６つの反復パーセンタイル値は、それらの強い相関が各ｓｇＩＤのマーカーが非常に重複していることを意味するため、区別することが難しい。
【図１１】Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９対立遺伝子を有するマウスにおいてレンチウイルス−ｓｇＲＮＡ／Ｃｒｅベクターで発生させた肺腫瘍の効率的なゲノム編集を示す。Ａは、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴｏｍａｔｏ／Ｃｒｅ（Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴｏｍ／Ｃｒｅ）ウイルスベクター及びＨ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９対立遺伝子を使用して、肺癌モデルにおいて体細胞ゲノム編集を試験するための実験の図式を示す。ホモ接合体欠失の頻度を決定するために、全てのマウスは、Ｒ２６ＬＳＬ−Ｔｏｍａｔｏ対立遺伝子に関してホモ接合であった。Ｂは、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴｏｍａｔｏ／Ｃｒｅ発生腫瘍を有するＫＰＴ；Ｃａｓ９マウスからの肺葉の蛍光解剖スコープ画像を示す。Ｔｏｍａｔｏ陰性腫瘍は、破線で輪郭が描かれている。上のスケールバー＝５ｍｍであり、下のスケールバー＝１ｍｍである。Ｃでは、Ｔｏｍａｔｏタンパク質の免疫組織化学は、Ｔｏｍａｔｏ陽性（Ｐｏｓ）、Ｔｏｍａｔｏ混合（Ｍｉｘｅｄ）、及びＴｏｍａｔｏ陰性（Ｎｅｇ）腫瘍を明らかにした。腫瘍は、破線で輪郭が描かれている。スケールバー＝２００μｍである。Ｄでは、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴｏｍ／Ｃｒｅ発生腫瘍を有する４匹のＫＰＴ；Ｃａｓ９マウスにおけるＴｏｍａｔｏ発現の定量化は、腫瘍のおよそ半分が少なくともわずかながん細胞において標的遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介ホモ接合体不活性化を有することを示す。Ｔｏｍａｔｏ陽性、混合、及び陰性腫瘍のパーセントは、括弧で示される各群の腫瘍の数とともに示される。Ｅは、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＬｋｂ１／Ｃｒｅウイルス及びＨ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９対立遺伝子を使用して、肺において体細胞ゲノム編集を試験するための実験の図式を示す。Ｆでは、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＬｋｂ１／Ｃｒｅに感染させた（形質導入した）ＫＴ及びＫＴ；Ｃａｓ９マウスの肺葉の蛍光解剖スコープ画像は、ＫＴ；Ｃａｓ９マウスにおける腫瘍負荷の増加を示す。肺葉は、白色の破線で輪郭が描かれている。スケールバー＝２ｍｍである。Ｇでは、肺の重量により表される腫瘍負荷は、ＫＴマウスに対してＬｅｎｔｉ−ｓｇＬｋｂ１／Ｃｒｅ感染（形質導入）ＫＴ；Ｃａｓ９マウスにおいて増加し、腫瘍抑制因子Ｌｋｂ１の良好な欠失と一致する。正常な肺の重量は、赤色の点線で示される。＊ｐ値＜０．０２である。各点はマウスであり、バーは平均を表す。Ｈでは、ウエスタンブロットは、ＫＴ；Ｃａｓ９マウスのＬｅｎｔｉ−ｓｇＬｋｂ１／Ｃｒｅ発生腫瘍がＣａｓ９を発現し、Ｌｋｂ１タンパク質を欠くことを示す。Ｈｓｐ９０は、負荷を示す。
【図１２−１】１１個の既知及び候補腫瘍抑制遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡの選択及び特徴付けを示す。Ａでは、ｓｇＲＮＡは、各遺伝子内のそれらの位置、スプライスアクセプター／スプライスドナー（ＳＡ／ＳＤ）領域に対するそれらの近接、それらは注釈が付けられた機能ドメインの上流（またはその内）であったか否か、それらは記述されるヒト変異の上流（またはそれに隣接する）であったか否か、ならびにそれらの予測された的確な切断効率スコア（最大スコアは１．０である；高いスコア＝より大きい活性）及び標的外切断スコア（最大スコアは１００．０である；高いスコア＝大きい特異性）に基づいて選択された（Ｄｏｅｎｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１４；Ｈｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。
【図１２−２】１１個の既知及び候補腫瘍抑制遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡの選択及び特徴付けを示す。Ｂは、これらの腫瘍抑制遺伝子がＫｒａｓＧ１２Ｄ駆動肺癌モデルの状況において不活性化された公開研究からのデータの要約を示す。Ｃでは、各ベクターは固有のｓｇＩＤを有し、ランダムなバーコードで多様化された。ベクターの各々のｓｇＩＤ、及び各ｓｇＲＮＡに関連するバーコードの推定数が示される。Ｄは、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅ内の各ｓｇＲＮＡの初期表示を評価するための実験の図式を示す。Ｅは、３回の反復感染からの試料のシーケンシングにより決定されたときのＬｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅ内の各ｓｇＲＮＡのパーセントを示す。平均＋／−ＳＤを示す。プール内の各ベクターのパーセントは、各ベクターの予想された表示からわずかに外れた（赤色の破線）。
【図１３】インビトロｓｇＲＮＡ切断効率を示す。Ａは、Ｃａｓ９細胞を各々個々のｓｇＲＮＡを有するレンチウイルスに感染させることにより、各ｓｇＲＮＡのインビトロ切断効率を評価するための実験の図式を示す。発明者らは各標的遺伝子座の３つの個々のｓｇＲＮＡを試験し、最良のｓｇＲＮＡの切断効率を報告する。Ｂは、各標的腫瘍抑制因子の最良のｓｇＲＮＡの切断効率を示す。切断効率は、サンガーシーケンシング及びＴＩＤＥ分析ソフトウェアにより評価された（Ｂｒｉｎｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０１４）。Ｃは、Ｃａｓ９細胞をＬｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅに感染させることにより、各ｓｇＲＮＡのインビトロ切断効率を評価するための実験の図式を示す。感染（形質導入）の４８時間後に細胞を採取し、ゲノムＤＮＡを抽出し、１４個の標的領域をＰＣＲ増幅し、産物をシーケンシングした。各領域のインデルの％を計算し、プールにおける表示及びＳｅｔｄ２インデル％の両方に対して正規化し、相対切断効率をプール内の各ｓｇＲＮＡについて決定した。Ｄでは、各ｓｇＲＮＡの相対切断効率は、不活性Ｎｅｏ標的対照を示す。
【図１４−１】Ｔｕｂａ−ｓｅｑを使用した複数の時間点での腫瘍抑制因子の同定及び検証を示す。Ａは、腫瘍発生の１２週間後のＫＴマウスにおける各Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＲＮＡ／Ｃｒｅベクターのパーセント表示（各ｓｇＩＤ／全てのｓｇＩＤリードを用いたリード数の１００倍として計算された）を示す。ＫＴマウスにおいてＣａｓ９媒介遺伝子不活性化はないため、これらのマウスにおける各ｓｇＩＤのパーセントは、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅプール内に各ｓｇＲＮＡを有するウイルスベクターのパーセントを表す。Ｂでは、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅを用いて腫瘍を発生させた１２週間後のＫＴマウス（Ｃａｓ９を欠く）における相対的な腫瘍の大きさの分析は、基本的に、均一な腫瘍の大きさの分布を特定した。示されるパーセンタイルの相対的な腫瘍の大きさは、１０匹のマウスからの統合データを表し、ｓｇＩｎｅｒｔ腫瘍の平均に対して正規化される。９５％信頼区間を示す。ｓｇＩｎｅｒｔとは有意に異なるパーセンタイルは色が付けられている。Ｃでは、対数正規の腫瘍の大きさの分布を仮定する平均腫瘍の大きさの推定は、ＫＴマウスにおける予想されたわずかなばらつきを示した。ボンフェローニ補正ブートストラップｐ値を示す。ｐ値＜０．０５及びそれらの対応する平均は太字である。
【図１４−２】Ｔｕｂａ−ｓｅｑを使用した複数の時間点での腫瘍抑制因子の同定及び検証を示す。Ｄは、腫瘍発生の１２週間後のＫＴ；Ｃａｓ９マウスにおける各Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＲＮＡ／Ｃｒｅベクターのパーセント表示（各ｓｇＩＤ／全てのｓｇＩＤリードを用いたリード数の１００倍として計算された）を示す。Ｅは、同じパーセンタイルのｓｇＩｎｅｒｔ含有腫瘍の平均に対する各ｓｇＲＮＡの示されるパーセンタイルの腫瘍の大きさを示す。Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅで腫瘍を発生させた１５週間後の３匹のＫＴ；Ｃａｓ９マウスからの統合データを示す。点線は、Ｉｎｅｒｔから変化がないことを表す。エラーバーは、９５％信頼区間を表す。信頼区間が点線と重複しないパーセンタイルは色が付けられている。Ｆでは、対数正規を仮定する平均腫瘍の大きさの推定は、ＫＴ；Ｃａｓ９マウスにおいて有意な成長利点を有するｓｇＲＮＡを同定した。ボンフェローニ補正ブートストラップｐ値を示す。ｐ値＜０．０５及びそれらの対応する平均推定は太字である。
【図１５−１】２つの独立した時間点でＬｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ／Ｃｒｅ発生腫瘍を有するＫＴ；Ｃａｓ９マウスにおけるｐ５３媒介腫瘍抑制の同定を示す。Ａ、Ｂでは、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅで腫瘍を発生させた１２週間後（ａ）及び１５週間後（ｂ）のＫＴ；Ｃａｓ９マウスにおける相対的な腫瘍の大きさの分析は、両時間点でべき乗則統計を使用して、ｐ５３を腫瘍抑制因子として同定する。示されるパーセンタイルの相対的な腫瘍の大きさは、それぞれ、８匹及び３匹のマウスからの統合データであり、ｓｇＩｎｅｒｔ腫瘍の平均に対して正規化される。９５％信頼区間を示す。ｓｇＩｎｅｒｔよりも有意に大きいパーセンタイルは色が付けられている。べき乗則ｐ値を示す。この実験環境では、非常に最大のｓｇｐ５３発生腫瘍のみがｓｇＩｎｅｒｔ腫瘍よりも大きさが大きいことに留意する。これは一部、ｓｇｐ５３の比較的切断効率が悪いことにより説明される可能性がある（図１３Ｄ）。
【図１５−２】２つの独立した時間点でＬｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ／Ｃｒｅ発生腫瘍を有するＫＴ；Ｃａｓ９マウスにおけるｐ５３媒介腫瘍抑制の同定を示す。Ｃ〜Ｆでは、ｐ５３遺伝子座の各大きさのインデル（１０のヌクレオチド欠失（−１０）〜３つのヌクレオチド挿入（＋３））のパーセントは、所与の大きさのインデルを有するリード数をインデルを有するリードの総数で除することにより計算された。インフレームインデルは灰色で示される。発明者らは、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅに感染させた（形質導入した）Ｃａｓ９発現細胞株において、感染（形質導入）の４８時間後に、インビトロで生成されたｐ５３遺伝子座のインデルのスペクトルを評価した。（Ｃ）フレーム外変異に対する優先度はない。次いで、発明者らは、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅ発生腫瘍を有する３匹の個々のＫＴ；Ｃａｓ９マウスを、疾患進行の１５週間後に分析した（Ｄ〜Ｆ）。インフレームインデルがより少なく（−９、−６、−３、及び＋３）、拡張する腫瘍におけるフレーム外機能喪失改変の選択と一致し、ｐ５３の腫瘍抑制機能と一致する。Ｔｕｂａ−ｓｅｑの知見と一致するが、これらの種類の分析は、Ｔｕｂａ−ｓｅｑプラットホームと比べて不正確である。
【図１６】腫瘍の大きさの分布の分析は、Ｌｋｂ１及びＳｅｔｄ２欠損が対数正規であることを示す。Ａ、Ｂは、ｓｇＬｋｂ１（ａ）またはｓｇＳｅｔｄ２（ｂ）の示されるパーセンタイル（％ｉｌｅ）の腫瘍の大きさ対同じパーセンタイルのｓｇＩｎｅｒｔ発生腫瘍の大きさを示す。各パーセンタイルは、腫瘍発生の１２週間後に分析した、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅ発生腫瘍を有する全てのＫＴ；Ｃａｓ９マウスからの各ｓｇＲＮＡを有する全ての腫瘍を使用して計算された（Ｎ＝８匹のマウス）。ｓｇＩｎｅｒｔ発生腫瘍に対する大きさは、破線で示される。Ｃでは、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅ発生腫瘍を有するＫＴ；Ｃａｓ９マウスにおける、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＳｅｔｄ２／Ｃｒｅで発生させた腫瘍の確率密度プロットは、ＫＬＴマウスにおいて見られたものと非常に類似する対数正規的に分布された腫瘍の大きさを示す。これは、Ｓｅｔｄ２欠損が追加の有利な改変の生成またはそれに対する耐性を有意に増加させることなく腫瘍成長を駆動することを示す。
【図１７】的確なｓｇＲＮＡ作用の確認を示す。Ａ、Ｂでは、各インデル（１０のヌクレオチド欠失（−１０）〜４つのヌクレオチド挿入（＋４））のパーセントは、所与の大きさのインデルを有するリード数を、各上位の腫瘍抑制遺伝子内にインデルを有するリードの総数で除することにより計算された。（Ａ）Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅ発生腫瘍を有する３匹のＫＴ；Ｃａｓ９マウスの平均パーセンテージ及び標準偏差は、Ｓｅｔｄ２、Ｌｋｂ１、Ｒｂ１、及びＮｅｏの３つの標的部位（Ｎｅｏ１〜３）の平均に関して示される。インフレーム変異は灰色で示される。Ｎｅｏ１〜３の平均及び標準偏差は、単一群として３匹全てのマウス及び３つ全てのＮｅｏ標的部位を平均することにより計算された。一般に、インフレームインデルがより少なく（−９、−６、−３、及び＋３）、拡張する腫瘍におけるこれらの遺伝子のフレーム外機能喪失改変の選択と一致する。（Ｂ）発明者らは、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅで感染させた（形質導入した）Ｃａｓ９発現細胞株において、感染（形質導入）４８時間後に、インビトロで生成したインデルのスペクトルも評価した。これらのゲノム位置のいずれかにおいて、インフレーム変異の優先度は検出されず、ＫＴ；Ｃａｓ９マウスにおける偏りがフレーム外インデル（すなわち、ヌル対立遺伝子）を有する腫瘍の有利な拡大に起因する可能性が最も高いことを示唆する。Ｃは、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＳｍａｄ４／Ｃｒｅ誘導腫瘍を有するＫＴ及びＫＴ；Ｃａｓ９マウスのカプラン−マイヤー生存曲線を示す。発がん性ＫｒａｓＧ１２Ｄの存在下でのＳｍａｄ４のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介不活性化は生存率を低減せず、存在する場合、Ｓｍａｄ４の不活性化から腫瘍成長の増加が限られることを示唆する。Ｄでは、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＳｍａｄ４／Ｃｒｅ感染（形質導入）ＫＴ；Ｃａｓ９マウスの腫瘍の大半は、同じウイルスで感染させた（形質導入した）ＫＴマウスと比較して、Ｓｍａｄ４タンパク質発現を失い、Ｓｍａｄ４遺伝子座でのインデル創出と一致する。スケールバー＝５０μｍである。Ｅでは、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅ感染（形質導入）ＫＴ；Ｃａｓ９マウスのいくつかの腫瘍は、均一に大きい核の異なる乳頭組織構造を有し、Ｓｏｘ９陽性であり、Ａｐｃ欠損Ｋｒａｓ駆動肺腫瘍の公開された表現型と一致した（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｒｉｖｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１４）。代表的なＳｏｘ９−陰性及びＳｏｘ９陽性腫瘍を示す。スケールバー＝１００μｍ（上）及び２５μｍ（下）である。
【図１８】２つの独立したｓｇＲＮＡの各々を使用して、Ｓｅｔｄ２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介不活性化を有するマウスの腫瘍負荷の増加を示すさらなる画像である。腫瘍を発生させた９週間後に分析した、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＮｅｏ２／Ｃｒｅ（左）、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＳｅｔｄ２＃１／Ｃｒｅ（中央）、またはＬｅｎｔｉ−ｓｇＳｅｔｄ２＃２／Ｃｒｅ（右）で発生させた腫瘍を有するＫＴ；Ｃａｓ９マウスからの肺葉のさらなる代表的な蛍光解剖スコープ画像を示す。肺葉は、白色の破線で輪郭が描かれている。スケールバー＝５ｍｍである。
【図１９−１】肺腺癌マウスモデルにおける腫瘍抑制遺伝子機能を評価するための系の比較を示す。腫瘍抑制遺伝子不活性化の方法（フロキシング対立遺伝子のＣｒｅ／ＬｏｘＰ媒介欠失対ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介ゲノム編集）、個々の腫瘍の遺伝子バーコード化により腫瘍の数及び大きさを定量化する能力、ならびにプールされた形式で複数の遺伝子を不活性化する能力が示される。各系の特に関連がある利点及び欠点、ならびに参考例が示される。膵癌を研究するためにプールしたｓｇＲＮＡトランスフェクションを使用したＭａｒｅｓｃｈらを除いて、強調される研究は全て、肺癌においてである。フロキシング対立遺伝子を使用して肺腺癌モデルにおける腫瘍抑制遺伝子を評価するという現実は、過去１５年間にわたって発明者らが疑問を抱いた腫瘍抑制遺伝子のうちの６つのみがＫｒａｓＬＳＬ−Ｇ１２Ｄと組み合わせてフロキシング対立遺伝子を使用して調査されたという事実により最もよく例示される。定量方法の欠如は、既知及び未知の技術的及び生物学的変数（例えば、腫瘍発生の再現性、マウスの性別、年齢、及び系統）に起因して、中程度しかない腫瘍抑制作用を有する遺伝子の同定も著しく妨げる。フロキシング対立遺伝子を有する遺伝子を削除することにより生成されたデータも、異なる研究室で使用される異なる実験環境（例えば、異なるウイルス力価、発生後の時間、定量化の方法、マウス系統）間で比較することが困難であるため制限される。したがって、異なる腫瘍抑制遺伝子の相対的作用は、文献から収集することが困難である。最後に、腫瘍のバーコード化による個々の腫瘍細胞数の定量化は、前例がない精度を提供するだけでなく、腫瘍抑制の異なる機能機序を反映する可能性がある腫瘍の大きさの分布に対する遺伝子特異的作用も明らかにする。
【図１９−２】肺腺癌マウスモデルにおける腫瘍抑制遺伝子機能を評価するための系の比較を示す。腫瘍抑制遺伝子不活性化の方法（フロキシング対立遺伝子のＣｒｅ／ＬｏｘＰ媒介欠失対ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介ゲノム編集）、個々の腫瘍の遺伝子バーコード化により腫瘍の数及び大きさを定量化する能力、ならびにプールされた形式で複数の遺伝子を不活性化する能力が示される。各系の特に関連がある利点及び欠点、ならびに参考例が示される。膵癌を研究するためにプールしたｓｇＲＮＡトランスフェクションを使用したＭａｒｅｓｃｈらを除いて、強調される研究は全て、肺癌においてである。フロキシング対立遺伝子を使用して肺腺癌モデルにおける腫瘍抑制遺伝子を評価するという現実は、過去１５年間にわたって発明者らが疑問を抱いた腫瘍抑制遺伝子のうちの６つのみがＫｒａｓＬＳＬ−Ｇ１２Ｄと組み合わせてフロキシング対立遺伝子を使用して調査されたという事実により最もよく例示される。定量方法の欠如は、既知及び未知の技術的及び生物学的変数（例えば、腫瘍発生の再現性、マウスの性別、年齢、及び系統）に起因して、中程度しかない腫瘍抑制作用を有する遺伝子の同定も著しく妨げる。フロキシング対立遺伝子を有する遺伝子を削除することにより生成されたデータも、異なる研究室で使用される異なる実験環境（例えば、異なるウイルス力価、発生後の時間、定量化の方法、マウス系統）間で比較することが困難であるため制限される。したがって、異なる腫瘍抑制遺伝子の相対的作用は、文献から収集することが困難である。最後に、腫瘍のバーコード化による個々の腫瘍細胞数の定量化は、前例がない精度を提供するだけでなく、腫瘍抑制の異なる機能機序を反映する可能性がある腫瘍の大きさの分布に対する遺伝子特異的作用も明らかにする。
【図２０】マウスにわたる腫瘍の大きさの分布及びｓｇＲＮＡの腫瘍の大きさの共分散の統計特性を示す。Ａは、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＰｏｏｌ／Ｃｒｅ発生腫瘍を有する全てのマウスの各ｓｇＩＤ分布の平均及び分散を示す。マウスの遺伝子型は示されるように着色される。一般に、分散は全ての遺伝子型の平均の二乗で増加され、病変の大きさの対数変換は分散を安定させ、不等分散性を回避する。一部の分布は、平均の二乗を超えて増加された分散を示す。Ｂ〜Ｄでは．遺伝子改変に応答するマウス間のばらつきは、１２週で屠殺されたＫＴ；Ｃａｓ９マウスにおいて調べた。各マウスの各ｓｇＲＮＡのＬＮ  ＭＬＥ平均の共分散を調査した。遺伝子型は、マウスにわたって互いに正に相関する大きさを意味する（例えば、より大きいｓｇＬｋｂ１腫瘍を保有するマウスはより大きいｓｇＳｅｔｄ２腫瘍を有する）。１２個全てのｓｇＲＮＡの間の相関マトリックスのＰＣＡ分解（ｓｇＩｎｅｒｔは強化された）は、単一の主構成要素（ＰＣ１）ベクターにより説明可能なマウス間のばらつきの実質的なレベルを明らかにした。各点は、ＰＣ１に投影された１匹のマウスを表し、これはｓｇＲＮＡの平均の大きさのマウス間の観察されたばらつきの７５％を説明する。（Ｂ）ＰＣ１は全体的な肺の重量と相関し、（Ｃ）平均の病変の大きさは、より大きい腫瘍を有するマウスが強い駆動物質により駆動される腫瘍成長をより受けやすいことを示す（ＰＣ１はｓｇＳｅｔｄ２及びｓｇＬｋｂ１の大きさと相関した、データ示さず）。（Ｄ）マウスは、最初の２つの主構成要素に投影されたとき、異なるクラスターを形成するように見えない。同型マウスは、ほぼ必ず同じケージに収容された同胞であった。Ｍｉｘｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓモデルを使用して、外部のノイズ源を最小に抑えた（方法を参照されたい）。
【図２１】腫瘍進行の数学的モデルを示す。
【図２２】同じマウスの各病変とその最隣接との間の大きさの相違と比較したレンチウイルス感染（形質導入）の頻度を示す。
【図２３−１】インビボでの推定上の発がん点変異の迅速な導入及び機能調査を可能にする腫瘍バーコード化及びシーケンシングとＡＡＶ／Ｃａｓ９媒介体細胞ＨＤＲとを統合するプラットホームを示す。Ａ〜Ｄは、定義された点変異のパネルのインビボ発がん性を定量的に測定するためのパイプラインの図式的概観を示す。ＡＡＶベクターのライブラリを、各ＡＡＶが、遺伝子操作されたマウスにおいて、１）隣接するゆらぎ塩基にコードされた推定上の発がん性点変異及びランダムＤＮＡバーコードを含有する相同組換え修復（ＨＤＲ）のためのテンプレート、２）ＨＤＲの内因性遺伝子座を標的とするｓｇＲＮＡ、ならびに３）条件付きＣａｓ９対立遺伝子（Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９）及び他のＣｒｅ依存性対立遺伝子を活性化するためのＣｒｅリコンビナーゼを含有するように生成した（Ａ）。ＡＡＶライブラリは、目的の組織に送達される（Ｂ）。形質導入後、細胞のサブセットは、目的の遺伝子座がｓｇＲＮＡ標的部位でＣａｓ９により切断され、ＡＡＶ  ＨＤＲテンプレートを使用して修復される、ＡＡＶ／Ｃａｓ９媒介ＨＤＲを受けた。これにより、所望の点変異及び固有のＤＮＡバーコードが標的の遺伝子座に正確に導入される（Ｃ）。点変異で操作された体細胞は、導入された変異が腫瘍形成を発生させるために十分であり、腫瘍成長を駆動する場合、新しい腫瘍に発達し得る。Ｄでは、２つの独立したアプローチを使用して、腫瘍を分析することができる：１）腫瘍は、標的遺伝子の両方の対立遺伝子を特徴付けるために個々にシーケンシングされ得るか、または２）バルク腫瘍保有組織全体からのバーコード化された変異ＨＤＲ対立遺伝子は、各変異を有する腫瘍の数及び大きさを定量化するためにディープシーケンシングされ得る。
【図２３−２】インビボでの推定上の発がん点変異の迅速な導入及び機能調査を可能にする腫瘍バーコード化及びシーケンシングとＡＡＶ／Ｃａｓ９媒介体細胞ＨＤＲとを統合するプラットホームを示す。Ｅは、内因性Ｋｒａｓ遺伝子座内へのＣａｓ９媒介ＨＤＲのためのＡＡＶベクタープール（ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅ）を示す。各ベクターは、コドン１２及び１３に１２の非同議Ｋｒａｓ変異のうちの１つ（または野生型Ｋｒａｓ）、ＰＡＭ及びｓｇＲＮＡ相同領域（ＰＡＭ＊）内にサイレント変異、ならびに個々の腫瘍のＤＮＡバーコード化のために下流コドンのゆらぎ位置内に８ヌクレオチドランダムバーコードを有するＨＤＲテンプレートを含有する。Ｆは、ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅプラスミドライブラリにおける各Ｋｒａｓコドン１２及び１３対立遺伝子の表示を示す。Ｇは、ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅプラスミドライブラリにおけるバーコード領域の多様性を示す。
【図２４】ＡＡＶ／Ｃａｓ９媒介体細胞ＨＤＲは、転移状態に進行しうる発がん性Ｋｒａｓ駆動肺腫瘍を発生させる。Ａは、ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅの気管内投与により、Ｒｏｓａ２６ＬＳＬ−ｔｄＴｏｍａｔｏ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９（Ｔ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９）、ｐ５３ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ；Ｔ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９（ＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９）、及びＬｋｂ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ；Ｔ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９（ＬＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９）マウスの肺上皮細胞の内因性Ｋｒａｓ遺伝子座に点変異及びＤＮＡバーコードを導入するための実験の図式を示す。Ｂは、ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅ処置ＬＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９、ＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９、及びＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスのＴｏｍａｔｏ陽性肺腫瘍及び組織診断の代表的な画像を示す。スケールバー＝５ｍｍである。Ｃは、示されるＡＡＶベクター（ｓｇＫｒａｓを有する、及び有しない）に感染させた（形質導入した）マウスの示される遺伝子型における肺腫瘍の定量化を示す。各点は１匹のマウスを示す。１：１０，０００希釈のＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅで形質導入されたＫｒａｓＬＳＬ−Ｇ１２Ｄ；ＬＴ（ＫＬＴ）及びＫｒａｓＬＳＬ−Ｇ１２Ｄ；ＰＴ（ＫＰＴ）マウスは、未希釈のウイルスに感染させた（形質導入した）ＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９及びＬＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスのほぼ半分の腫瘍を発達させた。したがって、ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅライブラリの全てのＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子が発がん性であると仮定すると、これは、ＡＡＶ／Ｃａｓ９媒介ＨＤＲが形質導入細胞のおよそ０．０２％において生じることを示唆する。あるいは、ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅライブラリの変異対立遺伝子の２０％のみが腫瘍形成を駆動すると仮定される場合、ＨＤＲの割合はおよそ０．１％である。Ｄは、ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅ発生肺腫瘍を有するＬＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスの胸膜腔のＴｏｍａｔｏ陽性播種性腫瘍細胞（ＤＴＣ）を示す代表的なＦＡＣＳプロットを示す。Ｅは、ＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスのＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅ発生肺腫瘍からの転移の組織診断を示す。スケールバー＝５０μｍである。Ｆは、個々の肺腫瘍における多様なＨＤＲ生成発がん性Ｋｒａｓ対立遺伝子を示す。各対立遺伝子を有するいくつかの腫瘍を示す。いずれの肺腫瘍においても同定されなかった対立遺伝子は示されない。
【図２５】ＡＡＶ／Ｃａｓ９媒介ＨＤＲによる変異Ｋｒａｓ変異型の体細胞性膵臓及び筋肉細胞への導入は、侵襲性がんの形成を駆動する。Ａは、膵癌を誘導するための、ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／ＣｒｅのＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスへの逆行膵管注射の図式を示す。Ｂは、ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／ＣｒｅのＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスへの逆行膵管注射により発生させた膵腫瘍の組織診断を示す。スケールバー＝７５μｍである。Ｃは、原発性ＰＤＡＣを有するＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスにおけるリンパ節（上のパネル）及び横隔膜（下のパネル）の転移の組織診断を示す。スケールバー＝５０μｍである。Ｄは、膵腫瘍塊におけるＨＤＲ生成発がん性Ｋｒａｓ対立遺伝子を示す。各対立遺伝子を有するいくつかの腫瘍を示す。いずれの膵腫瘍塊においても同定されなかった対立遺伝子は示されない。Ｅは、肉腫を誘導するための、ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／ＣｒｅのＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスの腓腹筋への筋肉内注射の図式を示す。Ｆ、Ｇは、ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／ＣｒｅのＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスの腓腹筋への筋肉内注射により発生させた常同性肉腫（Ｆ）及び侵襲性肉腫（Ｇ）の組織診断を示す。スケールバー＝７５μｍである。Ｈは、肉腫におけるＨＤＲ生成発がん性Ｋｒａｓ対立遺伝子を示す。各対立遺伝子を有するいくつかの腫瘍を示す。いずれの肉腫においても同定されなかった対立遺伝子は示されない。これらのデータは、複数の組織にわたって細胞系譜のクローン作製を記述する。
【図２６−１】個々にバーコード化された腫瘍のＡＡＶ／Ｃａｓ９媒介体細胞ＨＤＲ及びハイスループットシーケンシングを使用した、Ｋｒａｓ変異発がん性の多重定量分析を示す。Ａは、腫瘍バーコードのハイスループットシーケンシングによるバルク肺試料からの個々の腫瘍の大きさ及び数を定量的に測定するためのパイプラインを示す。Ｂは、その初期表示（ＡＡＶプラスミドライブラリの変異表示／ＡＡＶプラスミドライブラリのＷＴ表示）に対して正規化され、かつＷＴ（変異腫瘍＃／ＷＴ腫瘍＃）と比較した、各変異Ｋｒａｓ対立遺伝子を保有する肺腫瘍の数を示す。ＷＴよりも有意に多い（ｐ＜０．０１）腫瘍に存在する変異型は青色に着色される。紺青色はＧ１２Ｄから有意な相違がない（ｐ＞０．０５）ことを示す。淡青色はＧ１２Ｄよりもその変異型を有する腫瘍が有意に少ない（ｐ＜０．０１）ことを示す。Ｃは、異なる遺伝子型にわたって各Ｋｒａｓ変異型を有する肺腫瘍の数の両側多項カイ二乗検定からのｐ値を示す。有意なｐ値（ｐ＜０．０５）は太字である。
【図２６−２】個々にバーコード化された腫瘍のＡＡＶ／Ｃａｓ９媒介体細胞ＨＤＲ及びハイスループットシーケンシングを使用した、Ｋｒａｓ変異発がん性の多重定量分析を示す。Ｄ、Ｅは、全てのＬＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９（Ｄ）またはＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９（Ｅ）マウスにわたって、Ｂで発がん性と同定された、Ｋｒａｓ変異型の肺腫瘍の大きさの分布を示す。各点は、固有のＫｒａｓ変異型−バーコード対を有する１つの腫瘍を表す。各点の大きさは、それが表す腫瘍の大きさに比例し、これは、腫瘍リード計数を正規化対照リード計数に対して正規化することによって推定される。Ｆは、膵腫瘍塊の腫瘍バーコードシーケンシングによって同定された多様なＨＤＲ生成Ｋｒａｓ対立遺伝子を示す。各対立遺伝子を有する固有にバーコード化された腫瘍の数を示す。いずれの膵腫瘍塊において同定されなかった対立遺伝子は示されない。Ｇでは、１匹のＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅ処置ＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスからの原発性膵腫瘍塊及び転移のハイスループットシーケンシングは、変異Ｋｒａｓ対立遺伝子の多様なスペクトルを明らかにし、原発性腫瘍とそれらの転移性子孫との間のクローン関係の確立を可能にした。各点は、示される試料内の、示されるＫｒａｓ変異型及び固有のバーコードを有する１つの腫瘍を表す。着色線により連結される点は同じバーコードを保有し、それらがクローン的に関係することを示唆する。各点の大きさは、それが表す腫瘍の大きさに従い拡大縮小される（点の直径＝相対的大きさ１／４）。膵腫瘍の大きさは対照に対して正規化されないため、腫瘍の大きさは同じ試料内でのみ比較され得る。したがって、各試料における最大腫瘍は同じ標準の大きさに設定される。
【図２７−１】Ｋｒａｓの多重変異のためのＡＡＶライブラリの設計、生成、及び検証を示す。Ａは、Ｋｒａｓエクソン２を標的とする３つのｓｇＲＮＡの配列を示す。各ｓｇＲＮＡの切断効率は、各ｓｇＲＮＡをコードするレンチウイルスベクターを形質導入した４８時間後に、Ｃａｓ９発現ＭＥＦからのＤＮＡをシーケンシングすることにより決定された。３つ全てのｓｇＲＮＡは、標的遺伝子座でインデル形成を誘導した。したがって、Ｋｒａｓコドン１２及び１３に最も近い配列を標的とするｓｇＲＮＡ（ｓｇＫｒａｓ＃３）を全ての後続の実験に使用して、ＨＤＲの尤度を増加させた。Ｂは、野生型（ＷＴ）Ｋｒａｓ配列＋コドン１２及び１３に１２の非同議単一ヌクレオチドＫｒａｓ変異体の各々、ＰＡＭ及びｓｇＲＮＡ相同領域（ＰＡＭ＊）内にサイレント変異、ならびに個々の腫瘍のバーコード化のために下流コドンのゆらぎ位置内に８ヌクレオチドランダムバーコードを含有するｄｓＤＮＡ断片の合成ライブラリを示す。各Ｋｒａｓ対立遺伝子は、約２．４×１０４の固有のバーコードと関連し得る。断片もクローニングのために制限部位を含有した。Ｃでは、ＡＡＶベクターライブラリを、合成領域を親ＡＡＶベクターに大量にライゲートすることにより生成し、Ｋｒａｓコドン１２及び１３に、ＷＴ  Ｋｒａｓ及び１２全ての単一ヌクレオチド非同義変異を有するバーコード化されたプールを創出した。Ｄは、ＫｒａｓＨＤＲテンプレート内のＫｒａｓエクソン２の位置を示す。相同アームの長さを示す。Ｅは、ＨＤＲの偏りを試験するための実験の図式を示す。Ｃａｓ９発現細胞株はＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅで形質導入され、次いで、ＨＤＲ事象を定量化するためにシーケンシングされた。
【図２７−２】Ｋｒａｓの多重変異のためのＡＡＶライブラリの設計、生成、及び検証を示す。Ｆでは、ＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子を特異的に増幅するためのＰＣＲ戦略の図式は、ＨＤＲを介してゲノムに導入された。フォワードプライマー１（Ｆ１）は、３つのＰＡＭ＊変異を含有する配列に結合し、一方、リバースプライマー１（Ｒ１）は、ＫｒａｓＨＤＲテンプレートの相同アームに存在する配列の外の内因性Ｋｒａｓ遺伝子座に結合する。Ｆ２はＦ１により付加されたＩｌｌｕｍｉｎａアダプターに結合し、Ｒ２はエクソン２付近の領域に結合し、Ｒ３は、Ｒ２により同じ領域に付加されたＩｌｌｕｍｉｎａアダプターに結合する。Ｇでは、内因性Ｋｒａｓ遺伝子座内の各Ｋｒａｓ対立遺伝子の表示は、培養においてＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅベクターライブラリで形質導入されたＣａｓ９発現細胞のＨＤＲにより生成された。Ｈでは、各ＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子のＨＤＲ事象の頻度は、ウイルスライブラリを生成するために使用された、ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅプラスミドライブラリの各Ｋｒａｓ変異対立遺伝子の初期頻度に対してプロットされた。初期のプラスミドライブラリとＨＤＲ後の変異Ｋｒａｓ対立遺伝子の表示との間の高い相関は、ＨＤＲの偏りがほとんどまたは全くないことを示唆する。
【図２８−１】成体の肺上皮細胞形質導入のための最適なＡＡＶ血清型の同定を示す。Ａは、成体の肺上皮細胞形質導入のための１１のＡＡＶ血清型をスクリーニングするための実験の概要を示す。ＧＦＰをコードするＡＡＶベクターを、異なるＡＡＶカプシド血清型でパッケージングし、野生型レシピエントマウスに気管内投与した。処置の５日後に、肺を分離し、ＧＦＰ陽性上皮細胞のパーセントをフローサイトメトリーで決定した。Ｂでは、異なるＡＡＶ血清型は異なる濃度で産生することができる。発明者らの目的は、ＤＮＡテンプレートを肺上皮細胞に送達することが可能なＡＡＶ血清型を同定することであり、これは、主に、達成可能なウイルス力価及びビリオン当たりの形質導入効率の両方によって決定づけられる。したがって、感染（形質導入）前にＡＡＶ血清型の力価を正規化するのではなく、むしろ６０μｌの未希釈の精製ウイルスの投与後に感染（形質導入）パーセントを決定した。Ｃでは、異なるＡＡＶ血清型で形質導入された肺上皮細胞のパーセントを評価するために、感染（形質導入）マウスの肺を単一細胞懸濁液に分離し、ＧＦＰ、ならびに造血細胞（ＣＤ４５、Ｔｅｒ１１９及びＦ４／８０）、内皮細胞（ＣＤ３１）、及び上皮細胞（ＥｐＣＡＭ）のマーカーに関してフローサイトメトリーを行った。プロットは、ＦＳＣ／ＳＳＣゲーティングされた生存可能な（ＤＡＰＩ陰性）肺上皮（ＣＤ４５／Ｔｅｒ１１９／Ｆ４−８０／ＣＤ３１陰性、ＥｐＣＡＭ陽性）細胞を示す。各試料のＧＦＰ陽性上皮細胞パーセントは、ゲートの上に示される。ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、及びＡＡＶＤＪは、全ての他の血清型よりもかなり良好であり（Ｐｌａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１４において効率的なＨＤＲをもたらすことができなかったＡＡＶ６を含む）、これらの血清型の高い最大力価と一致する。発明者らは、このデータ、及びＡＡＶ８がインビボで効率的に多くの他のマウス細胞型を形質導入する記述される能力に基づいてＡＡＶ８を使用することを選択する。
【図２８−２】成体の肺上皮細胞形質導入のための最適なＡＡＶ血清型の同定を示す。Ｃでは、異なるＡＡＶ血清型で形質導入された肺上皮細胞のパーセントを評価するために、感染（形質導入）マウスの肺を単一細胞懸濁液に分離し、ＧＦＰ、ならびに造血細胞（ＣＤ４５、Ｔｅｒ１１９及びＦ４／８０）、内皮細胞（ＣＤ３１）、及び上皮細胞（ＥｐＣＡＭ）のマーカーに関してフローサイトメトリーを行った。プロットは、ＦＳＣ／ＳＳＣゲーティングされた生存可能な（ＤＡＰＩ陰性）肺上皮（ＣＤ４５／Ｔｅｒ１１９／Ｆ４−８０／ＣＤ３１陰性、ＥｐＣＡＭ陽性）細胞を示す。各試料のＧＦＰ陽性上皮細胞パーセントは、ゲートの上に示される。ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、及びＡＡＶＤＪは、全ての他の血清型よりもかなり良好であり（Ｐｌａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１４において効率的なＨＤＲをもたらすことができなかったＡＡＶ６を含む）、これらの血清型の高い最大力価と一致する。発明者らは、このデータ、及びＡＡＶ８がインビボで効率的に多くの他のマウス細胞型を形質導入する記述される能力に基づいてＡＡＶ８を使用することを選択する。
【図２９】肺上皮細胞におけるＡＡＶ／Ｃａｓ９媒介インビボＨＤＲは、進行して転移能力を獲得することができる原発性腫瘍を発生させる。Ａは、ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅの気管内投与により、Ｌｋｂ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ；Ｒ２６ＬＳＬ−Ｔｏｍａｔｏ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９（ＬＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９）、ｐ５３ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ；Ｒ２６ＬＳＬ−Ｔｏｍａｔｏ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９（ＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９）、及びＲ２６ＬＳＬ−Ｔｏｍａｔｏ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９（Ｔ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９）マウスの内因性Ｋｒａｓ遺伝子座及びバーコード肺上皮細胞に点変異を導入するための実験の図式を示す。Ｂでは、図２Ａの蛍光画像に対応する照明画像。高拡大率の組織診断画像は、ｐ５３欠損腫瘍の腺癌組織診断及びより大きい核異型を記録する。上のスケールバー＝５ｍｍであり、下のスケールバー＝５０μｍである。Ｃは、ＬＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９、ＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９、及びＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスにおけるＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅ誘導肺腫瘍のさらなる例を示す。スケールバー＝５ｍｍである。高い形質導入効率に起因して、大半の肺細胞はＴｏｍａｔｏを発現するが、腫瘍は、各腫瘍の細胞の数及び密度が大きいため、非常に明るいことに留意する。Ｄは、ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅで発生させた腫瘍を有する各遺伝子型のマウスの総肺重量を示す。各点は１匹のマウスを示す。Ｅは、１：１０希釈されたＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅに感染させた（形質導入した）各遺伝子型のマウスの蛍光解剖スコープ下で同定した表面肺腫瘍の数を示す。各点は１匹のマウスを示す。Ｆは、ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅ発生肺腫瘍を有するＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスにおいて形成されたリンパ性微転移の組織診断を示す。スケールバー＝５０μｍである。Ｇは、胸膜腔（ＤＴＣｓ＞１０）に播種性腫瘍細胞及びリンパ節転移を有した各遺伝子型のマウスの数を示す。数は、ＤＴＣまたは転移を有するマウスの数／分析されたマウスの総数を表す。
【図３０】ヌクレアーゼ不含ＡＡＶ媒介ＨＤＲは、多数の肺腫瘍を発生させるために十分に高い割合で生じない。Ａは、１２個の単一ヌクレオチド非同義変異及びバーコードを有するが、ｓｇＲＮＡ標的Ｋｒａｓを有しない２．５ｋｂのＫｒａｓ  ＨＤＲテンプレートを含有する対照ＡＡＶベクターライブラリの図式を示す。Ｂは、ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／Ｃｒｅプラスミドプールにおける各Ｋｒａｓコドン１２及び１３対立遺伝子の表示を示す。パーセンテージは、３つ組シーケンシングの平均である。Ｃは、ＡＡＶベクターライブラリの力価（ｖｇ＝ベクターゲノム）を示す。重要なことには、対照ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／Ｃｒｅウイルス調製物は、ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅよりも高い力価である。Ｄは、６０μＬの未希釈または１：１０希釈のＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／Ｃｒｅプールの投与後に腫瘍を発達させたＬＴ、ＰＴ、及びＴマウスの数の定量化を示す。
【図３１−１】個々の腫瘍の分析は、発がん性Ｋｒａｓ対立遺伝子を同定し、非ＨＤＲ  Ｋｒａｓ対立遺伝子のインデルを明らかにする。Ａは、ＰＡＭ＊変異、Ｇ１２Ｄ変異、及びバーコードを有するＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子の例示的なシーケンシングトレースを示す。Ｂは、サンガーシーケンシングにより個々の肺腫瘍において検出された４つの代表的な発がん性Ｋｒａｓ対立遺伝子の配列を示す。分析された各原発性腫瘍は、予想通り、固有の変異型−バーコード対を有し、変異型当たりの可能なバーコードは約２．４×１０４である。この遺伝子座でのＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲテンプレート配列の改変された塩基及び野生型Ｋｒａｓ配列は、参照のために示される。Ｃでは、ＨＤＲ事象は一般的に、２つの操作された制限部位の外で生じる。しかしながら、一部の腫瘍は、エクソン２と制限部位のうちの１つとの間の組換えと一致するＫｒａｓ対立遺伝子を有し、Ｃａｓ９／ｓｇＫｒａｓ誘導二本鎖ＤＮＡ破壊に非常に近い組換えを示唆する。Ｄは、完全なＨＤＲを受けなかった個々の腫瘍における発がん性Ｋｒａｓ対立遺伝子の図である。完全及び不完全の両方のＨＤＲ事象は、各マウスの遺伝子型において見られる（ＬＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスの１４／３０の腫瘍、及びＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスの３／７の腫瘍において完全なＨＤＲ）。不完全なＨＤＲ事象は、エクソン２の上流のＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲテンプレートの５’端の相同組換え、及びＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲテンプレートの３’端の、Ｃａｓ９／ｓｇＫｒａｓ誘導二本鎖ＤＮＡ破壊のすぐ下流のエクソン２領域へのライゲーションによりＫｒａｓ遺伝子座に組み込まれる可能性がある対立遺伝子を含んだ。この不完全なＨＤＲは、Ｋｒａｓエクソン２の下流のイントロン配列の挿入または欠失をもたらした。挿入及び欠失は、長さが不定であり（サンガーシーケンシングまたはゲル電気泳動により近似される大きさ）、時折、野生型エクソン２の一部もしくは全て、または稀な場合では、ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅベクターのセグメントを含んだ。これらの部分的ＨＤＲ事象のいずれも変異エクソン２からエクソン３へのスプライシングを改変させることを予測せず、腫瘍形成のための発がん性Ｋｒａｓ対立遺伝子の発現の要件と一致した。
【図３１−２】個々の腫瘍の分析は、発がん性Ｋｒａｓ対立遺伝子を同定し、非ＨＤＲ  Ｋｒａｓ対立遺伝子のインデルを明らかにする。Ｅ、Ｆでは、処置されたＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９及びＬＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスからの大きい個々の腫瘍における発がん性Ｋｒａｓ対立遺伝子は、ほぼ必ずエクソン２におけるＣａｓ９媒介インデル形成による他のＫｒａｓ対立遺伝子の不活性化を伴った。サンガーシーケンシングは、個々の腫瘍の４７／４８（９８％）において、ＰＡＭ配列に隣接するインデルを同定した。例示的なインデル（Ｅ）及び全てのインデルの要約（Ｆ）を示す。ＮＤは、野生型対立遺伝子を検出することができないことを示し、これは、ヘテロ接合性の非常に大きいインデルの喪失、またはプライマー結合部位のうちの１つを包含した大きい欠失のいずれかと一致する。
【図３２】膵細胞における発がん性変異の内因性Ｋｒａｓ遺伝子座へのＨＤＲ媒介導入は、膵管腺癌の形成をもたらす。Ａは、膵癌を誘導するための、ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／ＣｒｅのＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスへの逆行膵管注射の図式を示す。Ｂは、ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅで形質導入したＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスにおいて発達した膵腫瘍の代表的な照明及び蛍光画像を示す。スケールバー＝５ｍｍである。Ｃは、前がん性ＰａｎＩＮ病変（左上）、高分化腫瘍領域（右上）、及び低分化ＰＤＡＣ（左下）を含む膵腫瘍進行の異なる段階の組織診断画像を示す。右下は、ＰＤＡＣ内のコラーゲン豊富間質環境の発達（トリクロームで染色された）を示す。スケールバー＝７５μｍである。Ｄは、ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅ発生ＰＤＡＣを有するＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスの腹膜腔におけるＴｏｍａｔｏ陽性播種性腫瘍細胞（ＤＴＣ）を示す代表的なＦＡＣＳプロットを示す。プロットは、ＦＳＣ／ＳＳＣゲーティングされた生存可能ながん細胞（ＤＡＰＩ／ＣＤ４５／ＣＤ３１／Ｆ４−８０／Ｔｅｒ１１９陰性）を示す。Ｅでは、ＨＤＲ誘導ＰＤＡＣは、進行して、リンパ節及び横隔膜上に転移を播種する転移能力を獲得することができる。照明及び蛍光解剖スコープ画像を示す。スケールバー＝３ｍｍである。Ｆは、示されるＡＡＶベクターライブラリでの感染（形質導入）３〜１３ヶ月後のＰＤＡＣの発生率、腹膜腔におけるＤＴＣ、及びマウスの示される遺伝子型の転移を示す（分析されたマウスの総数のうち、がんＤＴＣ、または転移を有するマウスの数として示される）。
【図３３】骨格筋における発がん性ＫｒａｓのＨＤＲ媒介誘導は肉腫を誘導する。Ａは、肉腫を誘導するための、ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／ＣｒｅのＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスの腓腹筋への筋肉内注射の図式を示す。Ｂは、ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅで注射した後のマウス腓腹筋の代表的なホールマウント照明（上のパネル）及び蛍光解剖スコープ（下のパネル）画像を示す。広範なＴｏｍａｔｏ陽性組織（データ示さず）により証明されるように、効率的な形質導入にもかかわらず、右の腓腹筋は肉腫であるが、左は肉腫ではない。スケールバー＝５ｍｍである。Ｃは、定型的な組織診断、また周囲筋肉への浸潤により肉腫の存在を確認する組織学的Ｈ＆Ｅ切片の画像を示す。スケールバー＝７５μｍである。Ｄは、ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅの筋肉内注射の３〜７ヶ月後のＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスにおける肉腫の発生率を示す。発生率は、注射されたマウスの総数のうち、肉腫を発達させたマウスの数を表す。処置された７匹のマウスのうち１匹がまだ分析されていなかったが、感染（形質導入）の６ヶ月後に明らかな肉腫を有さなかった。Ｅでは、肉腫におけるＫｒａｓＨＤＲ遺伝子座のシーケンシングは、変異Ｋｒａｓ対立遺伝子及びバーコードを明らかにする。
【図３４】各変異Ｋｒａｓ対立遺伝子を有する肺腫瘍の大きさ及び数を定量化するためのバルク肺組織のＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）シーケンシング用の試料及び調製物を示す。Ａは、バーコード化されたＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子のＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）シーケンシング用の、ＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅで気管内投与されたマウスからのバルク肺組織試料を示す。試料名、マウス遺伝子型、及びＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅの希釈が示される。各試料のＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）シーケンシングのためにプールされた重量、腫瘍数、解剖された腫瘍の数、ならびに増幅されたＤＮＡの量、及びＰＣＲ反応の数が示される。反復試料は技術的反復である。ＮＤ＝データなしである。Ｂは、各腫瘍における細胞数の推定を可能にし、別個のマウスからのデータを組み合わせることを可能にする、既知の細胞数のベンチマーク対照からのリードを使用したバルク肺試料からのシーケンシングリードの正規化のための簡易化したパイプラインを示す。
【図３５】バーコードシーケンシングに基づくバルク組織からの腫瘍遺伝子型、大きさ、及び数の並行分析の再現性を示す。Ａ〜Ｄは、技術的反復（すなわち、バルク組織ライセートからの独立したＤＮＡ抽出及びＰＣＲ反応）にわたってハイスループットシーケンシングにより検出される、示されるＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子及び固有のバーコードを有する個々の腫瘍の回帰プロットを示す。Ａ及びＢの反復は、異なる多重タグを有するプライマーを使用してＰＣＲ増幅されたが、同じシーケンシングレーンで実行された。Ｃ及びＤの反復は、同じプライマーを使用してＰＣＲ増幅されたが、異なるシーケンシングレーンで実行された。推定されるように、バルク肺重量により測定された上記の平均腫瘍負荷（Ａ、Ｃ）及び以下の平均腫瘍負荷（Ｂ、Ｄ）を有するマウスは、不定の腫瘍数の試料にわたってこのパイプラインの技術的及び計算的再現性を確認するために分析された。
【図３６−１】バルク肺組織からの腫瘍のハイスループットバーコードシーケンシングは、腫瘍の多様な数及び大きさを明らかにする。Ａ〜Ｃは、ＬＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９（Ｎ＝６）（Ａ）、ＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９（Ｎ＝７）（Ｂ）、またはＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９（Ｎ＝３）（Ｃ）マウス全てにわたる全てのＫｒａｓ変異型の腫瘍の大きさの分布を示す。各点は、固有のＫｒａｓ変異型−バーコード対を有する腫瘍を表す。各点の大きさは、それが表す腫瘍の大きさに比例し、これは、腫瘍リード計数を正規化対照リード計数に対して正規化することによって推定される。ＷＴ  ＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子を保有する病変は、発がん性ＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子を有する腫瘍においてヒッチハイカーであると考えられる（方法を参照されたい）。
【図３６−２】バルク肺組織からの腫瘍のハイスループットバーコードシーケンシングは、腫瘍の多様な数及び大きさを明らかにする。Ｄ、Ｅは、各遺伝子型にわたって各Ｋｒａｓ変異型を保有する腫瘍の未加工（Ｄ）及び正規化（Ｅ）の数の表（個々の腫瘍の解剖及び分析によって同定された各変異型を有する腫瘍を含む）を示す。Ｅにおいて、各Ｋｒａｓ変異型を保有する腫瘍の数は、ＡＡＶプラスミドライブラリの各変異型の初期表示、及び同じ遺伝子型内にＷＴ対立遺伝子を有する病変の数に対して正規化される。Ｅのヒートマップの色強度スケールは、比較を容易にするため、各遺伝子型に固有であることに留意する。
【図３７】膵腫瘍塊及び転移のハイスループットシーケンシングは、発がん性Ｋｒａｓ変異体を同定する。Ａは、バーコード化されたＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子のＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングのために逆行膵管注射によりＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅを投与されたマウスからのバルク膵臓組織及び転移試料を示す。試料名、マウス遺伝子型、ウイルス希釈、及び組織が示される。ＦＳＣ／ＳＳＣゲーティングされた生存可能ながん細胞（ＤＡＰＩ／ＣＤ４５／ＣＤ３１／Ｆ４−８０／Ｔｅｒ１１９陰性）をこれらの試料からＦＡＣＳ単離した後、原発性腫瘍塊の異なる領域に存在するＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子ならびに転移がＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）シーケンシングにより分析された。Ｂは、ＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスの膵臓内のＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅ発生腫瘍塊においてＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子を同定するための分析パイプラインを示す。Ｃでは、１匹のＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅ処置ＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスにおける大きい膵腫瘍塊の多領域シーケンシングは、変異Ｋｒａｓ対立遺伝子の多様なスペクトルを明らかにし、原発性腫瘍とそれらの転移性子孫とを関係づけた。各点は、示されるＫｒａｓ変異型及び示される試料（１〜４と標識される）に固有のバーコードを有する腫瘍を表す。異なる原発性腫瘍試料（１〜３と標識される）にわたってつながれる点は、同じＫｒａｓ変異型−バーコード対を共有し、したがって、おそらく複数の試料に存在した同じ原発性腫瘍の領域である。着色線は、同じＫｒａｓ変異型−バーコード対を保有する原発性腫瘍及びリンパ節転移を関係づけ、クローン関係を示す。各点の大きさは、それが表す腫瘍の大きさに従い拡大縮小される（点の直径＝相対的大きさ１／２）。膵腫瘍の大きさは対照に対して正規化されないため、腫瘍の大きさは同じ試料内の他の腫瘍と比較され得る。したがって、各試料内の最大腫瘍は同じ標準の大きさに拡大縮小される。ｇ＝胆嚢、ｓｔｏ＝胃、ｄｕｏ＝十二指腸、ｐａｎ＝膵臓、ｓｐ＝脾臓、ｌｎ＝腸間膜リンパ節である。
【図３８】Ｋｒａｓ変異体のインビボ発がん性と生化学挙動との間の関係を示す。Ａ〜Ｃは、Ｈｕｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５で報告された示される生化学特性の関数としての、ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅで形質導入されたマウスにおける肺腫瘍の相対数（図４ｂを参照されたい）を示す。相対的な肺腫瘍数は、ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅプラスミドプールにおける各Ｋｒａｓ変異型の初期表示に対して正規化される。垂直バーは、正規化された相対的な肺腫瘍数の９５％信頼区間を表す。水平バーは、Ｈｕｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５に記載される３つの反復実験の平均の標準誤差を表す。Ｐ１２０ＧＡＰはＧＡＰ刺激ＧＴＰ加水分解速度を決定するために使用された（Ｈｕｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。Ｄ〜Ｆは、Ｈｕｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５で報告された示される生化学特性の関数としての、ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅで形質導入されたマウスにおける膵腫瘍の数を示す（図４Ｆを参照されたい）。垂直バーは、膵腫瘍数の９５％信頼区間を表す。水平バーは、Ｈｕｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５に記載される３つの反復実験の平均の標準誤差を表す。Ｐ１２０ＧＡＰはＧＡＰ刺激ＧＴＰ加水分解速度を決定するために使用された（Ｈｕｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。
【図３９−１】組み合わされた遺伝子改変の調査を示し、ｐ５３欠損はインビボでのＫｒａｓＧ１２Ｄ駆動肺腫瘍における腫瘍抑制の成長作用を変化させる。Ａ．インビボで組み合わせ腫瘍抑制因子を研究するためのＴｕｂａ−ｓｅｑアプローチを示す。３つの異なる遺伝子操作マウス背景：ＫｒａｓＬＳＬ−Ｇ１２Ｄ／＋；Ｒｏｓａ２６ＬＳＬ−ｔｄＴｏｍａｔｏ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９（ＫＴ；Ｃａｓ９）、ＫＴ；ｐ５３ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ；Ｃａｓ９（ＫＰＴ；Ｃａｓ９）、及びＫＴ；Ｌｋｂ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ；Ｃａｓ９（ＫＬＴ；Ｃａｓ９）において、腫瘍をＬｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅ（４つの不活性ｓｇＲＮＡベクターと、既知及び候補腫瘍抑制遺伝子を標的とする１１のベクターとを含有する）で発生させた。各ｓｇＲＮＡベクターは、固有のｓｇＩＤ及びランダムなバーコードを含有し、ディープシーケンシングを介して個々の腫瘍の大きさを定量化するために使用された。Ｂは、腫瘍発生の１５週間後のＫＴ；Ｃａｓ９マウスの相対的な腫瘍の大きさの分析を示す。示されるパーセンタイルの腫瘍の相対的な大きさは、１０匹のマウスからの統合データであり、ｓｇＩｎｅｒｔ腫瘍の平均の大きさに対して正規化される。この研究を通して、エラーバーは、ブートストラップサンプリングにより決定された９５％信頼区間を示す。ｓｇＩｎｅｒｔとは有意に異なるパーセンタイルは色が付けられている。
【図３９−２】組み合わされた遺伝子改変の調査を示し、ｐ５３欠損はインビボでのＫｒａｓＧ１２Ｄ駆動肺腫瘍における腫瘍抑制の成長作用を変化させる。Ｃでは、対数正規腫瘍の大きさの分布を仮定する平均腫瘍の大きさの推定により、ＫＴ；Ｃａｓ９マウスにおける成長を有意に増加させるｓｇＲＮＡを同定した。ボンフェローニ補正ブートストラップｐ値を示す。Ｐ値＜０．０５を有するｓｇＲＮＡは太字である。Ｄ、Ｅは、１２匹のＫＰＴ；Ｃａｓ９マウスからの統合データであることを除き、Ｂ、Ｃと同様である。Ｆは、ゲノム標的不活性ｓｇＲＮＡｓ  Ｎｅｏ１〜３の中央値に対する標的遺伝子座でのインデルの存在量を示す。Ａに従う着色がなされている。Ｇは、ＴＣＧＡ及びＧＥＮＩＥデータセットからのヒト肺腺癌におけるＴＰ５３及びＲＢ１の機能変異（Ｎ＝１７９２）を示す。ＲＢ１及びＴＰ５３の改変が同時に生じる。
【図４０−１】組み合わされた遺伝子改変の調査を示し、Ｌｋｂ１欠損腫瘍における腫瘍抑制因子不活性化の減衰作用は、凸凹の適応度ランドスケープをさらに強調する。Ａは、同じパーセンタイルでのｓｇＩｎｅｒｔ含有腫瘍の平均に対する各ｓｇＲＮＡの示されるパーセンタイルの腫瘍の大きさを示す。Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅによる腫瘍発生の１５週間後の１３匹のＫＴ；Ｌｋｂ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ；Ｃａｓ９（ＫＬＴ；Ｃａｓ９）マウスからの統合データを示す。ｓｇＩｎｅｒｔとは有意に異なるパーセンタイルは色が付けられている。Ｂでは、対数正規の腫瘍の大きさの分布を仮定する平均の腫瘍の大きさの推定により、ＫＬＴ；Ｃａｓ９マウスにおける成長を有意に増加させるｓｇＲＮＡを同定した。ボンフェローニ補正ブートストラップｐ値を示す。Ｐ値＜０．０５を有するｓｇＲＮＡは太字である。Ｃは、ＴＣＧＡ及びＧＥＮＩＥデータセットからのヒト肺腺癌におけるＬＫＢ１（ＳＴＫ１１）及びＳＥＴＤ２変異の相互排他性（Ｎ＝１７９２）を示す。
【図４０−２】組み合わされた遺伝子改変の調査を示し、Ｌｋｂ１欠損腫瘍における腫瘍抑制因子不活性化の減衰作用は、凸凹の適応度ランドスケープをさらに強調する。Ｄは、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＳｅｔｄ２／Ｃｒｅ発生腫瘍を有するＫＰＴ；Ｃａｓ９マウス（Ｎ＝７）対Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＮｅｏ２／Ｃｒｅ発生腫瘍を有するＫＰＴ；Ｃａｓ９マウス（Ｎ＝３）の腫瘍の大きさを示す。Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＳｅｔｄ２／Ｃｒｅ発生腫瘍は、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＮｅｏ２／Ｃｒｅ発生腫瘍よりも２．４倍高いＬＮ平均、及び４．６倍高い９５パーセンタイルの腫瘍の大きさを有する。Ｅは、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＳｅｔｄ２／Ｃｒｅ発生腫瘍を有するＫＬＴ；Ｃａｓ９マウス（Ｎ＝７）対Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＮｅｏ２／Ｃｒｅ発生腫瘍を有するＫＬＴ；Ｃａｓ９マウス（Ｎ＝５）の腫瘍の大きさを示す。相対的なＬＮ平均及び相対的な９５パーセンタイルは、２．２及び２．８であり、これは、両方とも図２ｄよりも有意に低い（それぞれ、Ｐ＜０．０４及びＰ＜０．０００１）。Ｆは、遺伝子背景にわたる腫瘍抑制因子の適応度作用（ＬＮ平均により決定される）のピアソン相関を示す。ｓｇｐ５３及びｓｇＬｋｂ１成長速度は、ＫＰＴ；Ｃａｓ９及びＫＬＴ；Ｃａｓ９マウスにおいて除外された。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１である。Ｇは、発がん性Ｋｒａｓ駆動肺腫瘍の状況内の、ならびに同時ｐ５３−またはＬｋｂ１欠損による各腫瘍抑制遺伝子の差次的作用を示す。ｓｇＩｎｅｒｔ腫瘍から有意に外れる９５パーセンタイルは青色で示される。Ｈは、駆動物質として候補腫瘍抑制因子を同定する尤度（ｇに定義される）対研究された遺伝子背景の数を示す。全ての遺伝学的状況は平均化された。
【図４１】この研究における推定上の腫瘍抑制因子改変の分析のための肺癌の遺伝子操作されたマウスモデルの現状及びヒト肺腺癌におけるこれらのゲノム改変の頻度を示す。Ａは、本明細書で研究される推定上の腫瘍抑制遺伝子がｐ５３またはＬｋｂ１の不活性化を伴うまたは伴わない発がん性Ｋｒａｓ駆動肺癌モデルの状況において不活性化された、公開研究からのデータの要約を示す。Ｂは、全ての腫瘍（Ａｌｌ）、ならびにＴＰ５３（ＴＰ５３ｍｕｔ）またはＬＫＢ１（ＬＫＢ１ｍｕｔ）において潜在的な不活性化改変を有する腫瘍に関する、各腫瘍抑制遺伝子において潜在的な不活性化改変（フレームシフトもしくは非同議変異、またはゲノム喪失）を有する腫瘍のパーセントを示す。各種類の改変を有する腫瘍のパーセントを示す。データは、２つの臨床がんゲノム研究について示される：Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ，２０１４）及びＧｅｎｏｍｉｃｓ  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ（ＧＥＮＩＥ，２０１７）データベースである。
【図４２】インビボでの腫瘍の大きさの分布を定量化するための多重レンチウイルスベクター、腫瘍発生、及びＴｕｂａ−ｓｅｑパイプラインの説明を示す。Ａでは、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅは、不活性ｓｇＲＮＡを有する４つのベクターと、ｓｇＲＮＡを標的とする腫瘍抑制遺伝子を有する１１のベクターとを含有する。各ｓｇＲＮＡベクターは、固有のｓｇＩＤ及びランダムなバーコードを含有する。ＮＴ＝非標的である。Ｂは、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／ＣｒｅにおけるベクターのｓｇＩＤ−バーコード領域の図式を示す。Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅは、所与のｓｇＩＤ−バーコードリードを特定のｓｇＲＮＡに連結する１５個の異なる８ヌクレオチド固有識別子（ｓｇＩＤ）を有するベクターを含有する。これらのベクターは１５−ヌクレオチドランダムバーコード要素も含有する。この二重バーコードシステムは、個々の腫瘍、ならびに各腫瘍を発生させるベクター中のｓｇＲＮＡの同定を可能にする。Ｃでは、肺上皮細胞をバーコード化されたＬｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅプールで形質導入することにより、（１）Ｃｒｅ調節された発がん性ＫｒａｓＧ１２Ｄ（ＫｒａｓＬＳＬ−Ｇ１２Ｄ／＋）対立遺伝子、（２）Ｃｒｅレポーター対立遺伝子（Ｒｏｓａ２６ＬＳＬ−Ｔｏｍａｔｏ）、（３）Ｃｒｅ調節されたＣａｓ９対立遺伝子（Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９）、ならびに（４）ｐ５３またはＬｋｂ１のいずれかのホモ接合フロキシング対立遺伝子を有する遺伝子操作されたマウスモデルにおいて肺腫瘍を発生させる。レンチウイルスベクターは形質導入細胞のゲノムに安定して組み込まれる。腫瘍をＫＴ；Ｃａｓ９，ＫＰＴ；Ｃａｓ９及びＫＬＴ；Ｃａｓ９マウスにおいて発生させて、３１個の異なる遺伝子型の肺腫瘍を生成した。腫瘍成長の１５週間後にマウスを分析した。バーコード化された「ベンチマーク」細胞株を添加した後、ゲノムＤＮＡを全肺から抽出し、ｓｇＩＤ−バーコード領域をＰＣＲ増幅し、ディープシーケンシングし、Ｔｕｂａ−ｓｅｑパイプラインを使用して各固有にバーコード化された腫瘍の相対的拡大を決定するために分析した。
【図４３−１】インビボでのＫｒａｓＧ１２Ｄ駆動肺腺癌における腫瘍抑制を示す。Ａは、Ｃａｓ９を欠き、したがって、ｓｇＩｎｅｒｔと比べて拡張しないＫＴマウスに対するＫＴ；Ｃａｓ９マウスのｓｇＩＤ表示（ΔｓｇＩＤ表示）の倍率変化を示す。いくつかのｓｇＲＮＡｓ（ｓｇＩＤ）は、表示が増加し、標的腫瘍抑制遺伝子の不活性化による腫瘍の成長増加を反映する。平均及び９５％信頼区間を示す。Ｂ、Ｃでは、腫瘍抑制作用を検出する能力は、バルクｓｇＲＮＡ表示（ΔｓｇＩＤ表示）と比較して、個々にバーコード化された腫瘍を分析することにより向上した。Ｂでは、各ｓｇＲＮＡを有する９５パーセンタイル腫瘍の相対的な大きさの分析は、バルクΔｓｇＩＤ表示と幾分類似する相対的な腫瘍の大きさの推定を同定し、これはより広い信頼区間を示す。Ｃは、相対的な腫瘍の大きさの対数正規平均（ＬＮ平均）測定のＰ値対Ｐ値ΔｓｇＩＤ表示を示す。個々の腫瘍の大きさが測定され、その後、適切に正規化されて外部のノイズ源を排除したため、９５パーセンタイル及びＬＮ平均基準の両方が、より大きい信頼及び精度で機能的腫瘍抑制因子を同定する。ｐ５３喪失は、その成長作用が対数正規分布により十分に説明されないため、例外である。全てのＰ値は、両側であり、調査された腫瘍抑制因子の数に関して、２×１０６ブートストラップ並べ替え検定及びボンフェローニ補正を介して得られた。Ｄ〜Ｆは、ＫＰＴ；Ｃａｓ９マウスの成長作用であることを除き、Ａ〜Ｃと同じである。倍率変化はＫＴマウスに対してであり、一方、９５パーセンタイル及びＬＮ平均大きさ推定はＫＰＴ；Ｃａｓ９内部ｓｇＩｎｅｒｔ対照に対してである。
【図４３−２】インビボでのＫｒａｓＧ１２Ｄ駆動肺腺癌における腫瘍抑制を示す。Ａは、Ｃａｓ９を欠き、したがって、ｓｇＩｎｅｒｔと比べて拡張しないＫＴマウスに対するＫＴ；Ｃａｓ９マウスのｓｇＩＤ表示（ΔｓｇＩＤ表示）の倍率変化を示す。Ｇ〜Ｉは、ＫＬＴ；Ｃａｓ９マウスの成長作用であることを除き、Ａ〜Ｃと同じである。Ｔｕｂａ−ｓｅｑなしで腫瘍抑制因子は同定されなかった。
【図４４】肺腺癌におけるＲｂ及びｐ５３腫瘍抑制因子の協同性は、Ｔｕｂａ−ｓｅｑにより同定され、Ｃｒｅ／ｌｏｘ調節された対立遺伝子を使用してマウスモデルにおいて確認され、ヒト肺腺癌におけるＲＢ１及びＴＰ５３変異の同時発生により支持された。Ａは、ｓｇＳｅｔｄ２、ｓｇＬｋｂ１、及びｓｇＲｂ１腫瘍の相対的なＬＮの平均の大きさを示す。Ｒｂ１不活性化は、ｐ５３能力ＫＴ；Ｃａｓ９背景においてＳｅｔｄ２またはＬｋｂ１不活性化よりも腫瘍の大きさを増加させない。逆に、Ｒｂ１不活性化は、ｐ５３欠損ＫＰＴ；Ｃａｓ９背景のＳｅｔｄ２またはＬｋｂ１不活性化と類似する程度まで腫瘍の大きさを増加させる。Ｐ値は、ｓｇＲｂ１と類似するＬＮ平均の帰無仮説を試験する。Ｐ＜０．０５は太字である。Ｂは、Ａｄｅｎｏ−ＣＭＶ／Ｃｒｅを用いて発生させた腫瘍を有するＫＰ及びＫＰ；Ｒｂ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスからの代表的な肺葉のＨ＆Ｅ染色を示す。腫瘍発生の１２週間後にマウスを分析した。スケールバー＝５００μｍである。Ｃは、ＫＰ及びＫＰ；Ｒｂ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスからの肺の代表的なエクスビボμＣＴ画像を示す。肺葉は、白色の破線で輪郭が描かれている。Ｄは、Ｋ；Ｒｂ１ｗｔ／ｗｔ、Ｋ；Ｒｂ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ、ＫＰ；Ｒｂ１ｗｔ／ｗｔ、及びＫＰ；Ｒｂ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスの腫瘍面積パーセントの定量化を示す。組織学的定量化は、Ｒｂ１欠失がｐ５３欠損腫瘍においてより劇的に腫瘍負荷を増加させることを確認する。＊ｐ値＜０．０５、ｎ．ｓ．＝有意ではないである。Ａｄ−Ｃｒｅの力価を示す。Ｅ、Ｆは、２つのヒト肺腺癌ゲノムデータセットにおけるＲＢ１及びＴＰ５３変異の同時発生を示し、（ｅ）ＴＣＧＡ  ２０１４  データセット及び（ｆ）ＧＥＮＩＥ  ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ２０１７を示す。Ｐ値は、体細胞改変についてのＤＩＳＣＯＶＥＲ統計的独立性検定を使用して計算された。
【図４５】標的ゲノム遺伝子座のディープシーケンシングは、全ての標的遺伝子座でのインデルの創出を確認し、最も強い腫瘍抑制遺伝子にインデルを有するがん細胞の選択的拡大を示す。Ａは、４匹のＫＰＴ；Ｃａｓ９マウスの標的領域からの全肺ＤＮＡのディープシーケンシングにより決定される、ｓｇＲＮＡにより標的とされる各領域のインデルの存在量を示す。インデルの存在量は、ｓｇＮｅｏ１、ｓｇＮｅｏ２、及びｓｇＮｅｏ３の中央存在量に対して正規化される。エラーバーは、観察された存在量の範囲を表示し、一方、点は中央値を示す。インデルは全ての標的領域において観察された。ｓｇｐ５３は、その標的部位がｐ５３ｆｌｏｘｅｄ対立遺伝子のＣｒｅ媒介組換えにより欠失されるため、示されない。Ｂは、Ａに記載されるインデルの存在量対Ｔｕｂａ−ｓｅｑにより決定される９５パーセンタイルの腫瘍の大きさ（図１ｄに記載される）を示す。各点は、個々のマウスの単一のｓｇＲＮＡを表し、各マウスは固有の形で表される。インデルの存在量はＴｕｂａ−ｓｅｑの大きさのプロファイルと相関する（予想通り）が、インデルの存在量は個々の腫瘍の大きさを測定せず、より大きい統計的ノイズを示す。Ｔｕｂａ−ｓｅｑにより決定されるように、この全分析において最も大きい単一の腫瘍は、同様にインデル分析において外れ値のように見えるｓｇＣｄｋｎ２ａ腫瘍であり、Ｔｕｂａ−ｓｅｑによる遺伝学的事象の正確な分析をさらに実証する。
【図４６】マウスモデル及びヒト肺腺癌におけるＳｅｔｄ２とＬｋｂ１との間の冗長性の検証を示す。Ａは、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＳｅｔｄ２＃１／ＣｒｅまたはＬｅｎｔｉ−ｓｇＮｅｏ２／Ｃｒｅ発生腫瘍を有するＫＰＴ及びＫＰＴ；Ｃａｓ９マウスからの肺葉の蛍光解剖スコープ画像（上）及びＨ＆Ｅ染色部分を示す。腫瘍成長の９週間後にマウスを分析した。肺葉は、蛍光解剖スコープ画像において白色の破線で輪郭が描かれている。上のスケールバー＝５ｍｍである。下のスケールバー＝４ｍｍである。Ｂは、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＳｅｔｄ２＃１／ＣｒｅまたはＬｅｎｔｉ−ｓｇＮｅｏ２／Ｃｒｅ発生腫瘍を有するＫＰＴ；Ｃａｓ９マウス、及びＬｅｎｔｉ−ｓｇＳｅｔｄ２＃１／Ｃｒｅ発生腫瘍を有するＫＰＴマウスにおける腫瘍面積パーセントの定量化を示す。各点はマウスを表し、水平バーは平均である。同じウイルスで発生させた腫瘍を有するＫＰＴ；Ｃａｓ９とＫＰＴマウスとの間の腫瘍面積において増加があるが、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＳｅｔｄ２＃１／Ｃｒｅで発生させたＫＰＴ；Ｃａｓ９マウス腫瘍とＬｅｎｔｉ−ｓｇＮｅｏ２／Ｃｒｅで発生させた腫瘍との間に相違はなく、おそらく高いマウス間のばらつきに起因する。これらのレンチウイルスベクターはバーコード化されたため、これらのマウスのＴｕｂａ−ｓｅｑ分析を行い、誘導した腫瘍の大きさを定量化した。ｓｇＳｅｔｄ２は、ｓｇＮｅｏ２に対して、ＫＰＴ；Ｃａｓ９における腫瘍の大きさを増加させた。＊＊Ｐ＜０．０１、ｎ．ｓ．＝有意ではないである。Ｃは、ｄ．Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＳｅｔｄ２＃１／ＣｒｅまたはＬｅｎｔｉ−ｓｇＮｅｏ２／Ｃｒｅ発生腫瘍を有するＫＬＴ；Ｃａｓ９マウスついてであることを除き、Ａ、Ｂと同じである。腫瘍成長の９週間後にマウスを分析した。上のスケールバー＝５ｍｍであり、下のスケールバー＝４ｍｍである。Ｅ、Ｆは、２つのヒト肺腺癌ゲノムデータセットにおけるＳＥＴＤ２及びＬＫＢ１（ＨＧＮＣ名ＳＴＫ１１）の同時発生、（Ｅ）ＴＣＧＡ  ２０１４データセット１４（Ｎ＝２２９の患者）及び（Ｆ）ＧＥＮＩＥ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（Ｎ＝１５６３の患者）を示す。両側Ｐ値は、ＤＩＳＣＯＶＥＲ統計的独立性検定を使用して計算された。
【図４７】ヒトゲノムパターンに対するＴｕｂａ−ｓｅｑ適応度測定値の対応を示す。Ａは、発明者らが調査した１９の対相互作用の相対的な適応度測定値及びヒト同時発生率を示す。ＬＮ平均比は、目的の背景内の相対的なＬＮ平均（ｓｇＴＳ／ｓｇＩｎｅｒｔ）を３つ全ての背景の平均の相対的なＬＮ平均で除した比率である。背景率は、３つの背景の非加重平均（未加工）またはヒト肺腺癌における発生の各背景率による加重（加重）のいずれかであり得る。＊ＯＲ＝ヒトデータ内の遺伝子対の同時発生率の「オッズ比」である。ヒト同時発生率の片側Ｐ値（＞０．５は相互排他的を示唆する）は、ＤＩＳＣＯＶＥＲ検定を使用して決定された。組み合わせたＰ値はスタウファー法（方法）を使用して生成した。Ｐ＜０．０２５及びＰ＞０．９７５は太字である。適応度測定値及び同時発生率は一般に対応する（スピアマンのｒ＝０．５０、加重ＬＮ平均比率についてはＰ値＝０．０３、非加重についてはｒ＝０．４）。Ｂは、Ａからの適応度測定値及び同時発生率のグラフィカルな要約を示す。ヒト遺伝学的協同性は、オッズ比＞１及び重複＜１の組み合わせにより定義された。Ｔｕｂａ−ｓｅｑデータの協同性は、ＬＮ平均比＞１及び重複性＜１を示す。Ｃは、２１個の腫瘍の種類の汎がん分析から示唆される統計的に有意な遺伝子相互作用の数を示す。腫瘍の種類の略語はＴＣＧＡから拝借する。肺腺癌（ＬＵＡＤ）は黒色であり、中央値に類似する遺伝子相互作用の量を含有すると予測され、本明細書で研究された適応度ランドスケープの凹凸が一般にがんの進化の代表であり得ることを示唆する。
【図４８】より大きい遺伝学的調査の力分析を示す。対数正規の腫瘍の大きさの分布を仮定することにより、より大きい遺伝学的調査において、駆動物質成長作用及び非加法的駆動物質相互作用を検出するためＴｕｂａ−ｓｅｑの統計力を提案することができる。今後の実験は、より大きいマウスコホート及び推定上の腫瘍抑制因子を標的とするより大きいｓｇＲＮＡのプールを利用することが可能である。全ての仮設に基づいた実験では、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅ力価及び（正規化のための）不活性ｓｇＲＮＡを有するプールの画分は、発明者らの最初の実験と一致したままであった。Ａでは、Ｐ値は、弱い駆動物質を検出する際の信頼度に合う（ＫＴ；Ｃａｓ９マウスのｓｇＣｄｋｎ２ａ分布によりパラメータ化される）。輪郭を超える任意の実験設定は、輪郭のＰ値以上の信頼度で弱い駆動物質を検出する。Ｂ、Ｃは、それぞれ、中程度及び強い駆動物質であることを除き、Ａと同じである（ＫＴ；Ｃａｓ９マウスのｓｇＲｂ１及びｓｇＬｋｂ１によりパラメータ化される）。これらの作用強度を用いて遺伝子を調査するとき、より大きいスクリーニングが可能であるため、ｓｇＲＮＡプールの大きさは、５００の標的（プールの１００の標的の代わりに）に拡張される。Ｄ〜Ｆは、駆動物質相互作用であることを除き、Ａ〜Ｃと同じである。駆動物質の相互作用（ＬＮ平均比）は、１つの帰無仮説とは統計的に異なる駆動物質成長速度（背景＃１のｓｇＴＳ／ｓｇＩｎｅｒｔ）／（背景＃２のｓｇＴＳ／ｓｇＩｎｅｒｔ）の比率として定義される。（Ｄ）Ｒｂｍ１０−ｐ５３によりパラメータ化された弱い駆動物質相互作用（７％効果量）であり、（Ｅ）Ｒｂ１−ｐ５３によりパラメータ化された中程度の駆動部室相互作用（１３％効果量）であり、（Ｆ）Ｓｅｔｄ２−Ｌｋｂ１によりパラメータ化された強い駆動物質相互作用（６８％効果量）である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本方法及び組成物を説明する前に、本発明は、記載される特定の方法または組成物に限定されず、したがって、言うまでもなく、変化し得ることを理解されたい。本明細書に使用される用語が特定の実施形態を単に説明する目的のためであり、本発明の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定するよう意図されないことも理解されたい。
【００１６】
値の範囲が提供される場合、文脈が別途明確に指示しない限り、下限値の単位の１０分の１までの、その範囲の上限値から下限値の間の各介在値も具体的に開示されることを理解する。いずれかの記載値、または記載範囲内の介在値からいずれかの他の記載値またはその記載範囲内の介在値の間の各々のより小さな範囲が本発明内に包含される。これらのより小さい範囲の上限値及び下限値は、この範囲内に独立して含まれても、含まれなくてもよく、またこれらのより小さい範囲内に、これら限界値のいずれか一方を含む、いかなる限界値も含まない、またはこれらの限界値の両方を含む各範囲も、この記載範囲内のいずれかの具体的に除外された制限に従い、本発明内に包含される。記載範囲がそれらの上限値及び下限値のうちの一方または両方を含む場合、それらの含まれる上限値及び下限値のいずれか一方または両方を除外する範囲も本発明に含まれる。
【００１７】
別途の定めがない限り、本明細書中で使用する全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載の方法及び物質と同様もしくは同等の任意の方法及び物質を本発明の実践または試験において使用することができるが、いくつかの可能かつ好ましい方法及び物質が、ここで説明される。本明細書で言及する全ての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれ、該刊行物の引用に関連した方法及び／または材料を開示ならびに説明する。矛盾がある限り、本開示が組み込まれた刊行物のいかなる開示にも優先することを理解する。
【００１８】
本開示を読めば当業者には明らかであるように、本明細書に記載及び例示される個々の実施形態の各々は、本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のうちのいずれかの特徴から容易に切り離されるか、または組み合わされ得る別個の構成要素及び特徴を有する。いずれの列挙した方法は、列挙した事象の順序で、または論理的に可能な他の任意の順序で実行することができる。
【００１９】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈ
ｅ」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数指示対象を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」への言及は、複数のそのような細胞（例えば、そのような細胞の集団）を含み、「このタンパク質（ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」への言及は、１つ以上のタンパク質及び当業者に既知のそれらの等価物、例えば、ポリペプチド等への言及を含む。
【００２０】
本明細書で論じられる刊行物は、本出願の出願日前に単独でそれらの開示が提供されている。本明細書におけるいかなる内容も、本発明が先行発明によりそのような刊行物に先行する権利がないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、提供される刊行物の日付は、実際の刊行日とは異なる場合があり、別々に確認される必要があり得る。
【００２１】
方法及び組成物
上記に要約されるように、組成物及び方法は、同じ個体における複数のクローン細胞集団について集団の大きさを測定するために提供される。例として、場合によっては、主題の方法は、同じ個体の複数のクローン的に無関係な腫瘍細胞集団（例えば、異なる腫瘍）の腫瘍の大きさ（例えば、腫瘍内の新生細胞の数）を測定する方法である。場合によっては、本方法は、（ａ）個体の組織を、遺伝性であり、互いに区別可能である複数の細胞マーカーと接触させて、接触させた組織内の遺伝的に特徴がある細胞の複数の区別可能な系譜を生成することと、（ｂ）遺伝的に特徴がある細胞が少なくとも１回の分裂を受けるために十分な時間が経過した後、接触させた組織に存在する複数の細胞マーカーのうちの少なくとも２つの量を検出及び測定し、それにより、測定した値のセットを生成することと、（ｃ）測定した値のセットを入力として使用して、遺伝的に特徴がある細胞のこれらの区別可能な系譜のうちの少なくとも２つについての、接触させた組織に存在する遺伝的に特徴がある細胞の数を計算することとを含み得る。
【００２２】
組織の接触
いくつかの実施形態では、主題の方法は、組織（例えば、個々の組織）（例えば、筋肉、肺、気管支、膵臓、乳房、肝臓、胆管、胆嚢、腎臓、脾臓、血液、腸、脳、骨、膀胱、前立腺、卵巣、眼、鼻、舌、口、咽頭、喉頭、甲状腺、脂肪、食道、胃、小腸、結腸、直腸、副腎、軟組織、平滑筋、脈管構造、軟骨、リンパ管、前立腺、心臓、皮膚、網膜、ならびに生殖器及び性器系、例えば、精巣、生殖組織など）を、遺伝性であり、互いに区別可能である複数の細胞マーカーと接触させて、接触させた組織内の遺伝的に特徴がある細胞の複数の区別可能な系譜を生成するステップを含む。場合によっては、組織は、動物の体外で成長した操作された組織（例えば、オルガノイド、培養物中の細胞など）である。場合によっては、組織は生きている動物の一部であり、したがって、組織は個体の組織と考えられ、この接触は細胞マーカーを個体に投与することによって（例えば、注射を介して）行われ得る。
【００２３】
任意の簡便な投与経路（例えば、気管内、鼻腔内、逆行膵管、筋肉内、静脈内、腹腔内、小胞内、関節内、局所的に、皮下、経口的に、腫瘍内など）を使用することができる。場合によっては、投与は注射（例えば、直接標的組織への、ウイルスライブラリなどのライブラリの注射）を介してである。場合によっては、細胞内へのマーカーの移行は、電気穿孔（例えば、ヌクレオフェクション）、トランスフェクション（例えば、リン酸カルシウム、カチオン性ポリマー、カチオン性脂質などを使用して）、水力学的送達、ソノポレーション、微粒子銃送達、またはマグネトフェクションを介してである。任意の簡便な送達ベクター（例えば、ウイルス粒子、ウイルス様粒子、ネイキッド核酸、プラスミド、オリゴヌクレオチド、エクソソーム、リポプレックス、小胞、ポリマーソーム、ポリプレックス、デンドリマー、ナノ粒子、微粒子銃粒子、リボ核タンパク質複合体、デンドリマー、細胞透過性ペプチドなど）を使用することができる。
【００２４】
組織は、任意の所望の動物からの任意の組織型である得る。例えば、いくつかの実施形態では、接触させた組織は、無脊椎動物の組織（例えば、脱皮動物、冠輪動物、海綿動物、刺胞動物、有櫛動物、節足動物、環形動物、軟体動物、扁形動物、輪虫類、節足動物、昆虫、または虫の組織）である。いくつかの実施形態では、接触させた組織は、脊椎動物の組織（例えば、鳥、魚、両生類、爬虫類、または哺乳類の組織）である。好適な組織には、ゲッ歯類（例えば、ラット組織、マウス組織）、有蹄動物、農場動物、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジ、非ヒト霊長類、及びヒトからの組織も含まれるが、これらに限定されない。標的組織には、筋肉、肺、気管支、膵臓、乳房、肝臓、胆管、胆嚢、腎臓、脾臓、血液、腸、脳、骨、膀胱、前立腺、卵巣、眼、鼻、舌、口、咽頭、喉頭、甲状腺、脂肪、食道、胃、小腸、結腸、直腸、副腎、軟組織、平滑筋、脈管構造、軟骨、リンパ管、前立腺、心臓、皮膚、網膜、ならびに生殖器及び性器系、例えば、精巣、生殖組織などが含まれ得るが、これらに限定されない。
【００２５】
場合によっては、組織は新生物となるように細胞を誘導する目的のために接触させられ、例えば、場合によっては、組織は複数の独立した腫瘍を発生させて形成する目的のために接触させられる。例えば、場合によっては、導入された細胞マーカー（及び／または細胞マーカーと連結された構成要素）は、新生物形質転換を引き起こし（新生細胞形成をもたらし）、複数の異なる新生物発生事象の結果は、各事象が同定可能な遺伝性の細胞マーカーで固有に特徴がつけられたため、互いに比較することができる。いくつかのそのような場合では、細胞マーカーは、誘導した腫瘍が同じ型（またはさらには同一）の遺伝的摂動に起因して始まるが、各発生事象の結果が、各個々の細胞マーカーが互いに区別可能であるため追跡することができるように同じ遺伝子変化を発生させる。そのような方法の目的は、例えば、所与の目的の遺伝子型の集団の大きさ（例えば、腫瘍の大きさ、各腫瘍における新生細胞の数）の分布プロファイルを生成するために、同じ組織（及び／または同じ動物）において複数の独立した細胞系譜を追跡するためであり得る。あるいは、場合によっては、異なる遺伝的摂動が使用され（例えば、細胞マーカーは２つ以上の異なる遺伝的摂動を引き起こすことができ、細胞マーカーに連結された構成要素は２つ以上の異なる遺伝的摂動を引き起こすことができる）、同じ組織における（例えば、場合によっては、同じ動物における）異なる遺伝子型からの結果（例えば、同じ組織に存在する異なる遺伝的基盤を有する異なる腫瘍、例えば、肺、筋肉、腎臓などにおける複数の異なる腫瘍）を比較することができる。
【００２６】
いくつかの実施形態では、組織は、細胞マーカーと接触させる前に既に新生細胞（例えば、腫瘍）を既に含有する。場合によっては、腫瘍は細胞マーカーと接触させられる（例えば、細胞マーカーは、腫瘍内に注射され得る、腫瘍（複数可）に接触させるために血流中に注射され得る、腫瘍（複数可）に接触させるために別の臓器または組織に投与され得るなど）。例として、場合によっては、細胞マーカーは、新生物または腫瘍内の異なる細胞など、独立した新生細胞に特徴をつける方法として使用され、次いで、各特徴がある細胞は、別個の系譜として処理され得、１回以上の細胞分裂後に存在する各マーカーを有する細胞の数（存在する各マーカーを有する細胞）を計数することによって各追跡された系譜について産生された細胞の数を追跡することができる。場合によっては、本方法は、細胞マーカーが導入される細胞を遺伝的に修飾することを含む。例えば、組織は、主題の方法を行う前に１つ以上の腫瘍を既に有している場合があり、細胞マーカーを導入する目的は、さらなる遺伝的修飾を腫瘍細胞に導入することの作用（すなわち、新生細胞に既に存在するものに加えた変化）を試験するためである。そのため、各区別可能な細胞マーカーは、（例えば、各ガイドＲＮＡ及び、したがって、各遺伝的修飾がＤＮＡバーコードなどの固有の識別子と関連するように、特定の遺伝的標的を標的とするガイドＲＮＡをコードする核酸とＤＮＡバーコードなどの固有の識別子とを対合することによって）異なる遺伝子変化と関連し得る。そのような場合、特徴がある系譜は、互いに遺伝的に異なる（例えば、特定の遺伝子座に変異を有する）細胞のセットを表す。
【００２７】
あるいは、場合によっては、腫瘍の各々は遺伝的に同じであり、細胞マーカーは必ずしも互いに遺伝的に異ならない系譜を追跡する。これは、本方法の実施者が、同じ動物において複数の独立した細胞系譜を追跡し、所与の目的の遺伝子型の集団の大きさ（例えば、腫瘍の大きさ、腫瘍における新生細胞の数）の分布プロファイルを生成することを可能にする。
【００２８】
細胞マーカー
複数の細胞マーカー（すなわち、導入された（異種、人工）細胞マーカー、つまり、マーカーが細胞に既存するものではない場合、例えば、導入されたマーカーは単純に腫瘍内の既存のクローン体細胞変異ではない）は、２つ以上（例えば、３つ以上、５つ以上、１０個以上、または１５個以上、５０個以上、１００個以上、２００個以上、５００個以上、１０００個以上、１０，０００個以上、１００，０００個以上、１，０００，０００個以上、１，０００，０００，０００個以上など）の細胞マーカーである。同様に、複数の特徴がある細胞系譜は、２つ以上（例えば、３つ以上、５つ以上、１０個以上、または１５個以上、１００個以上、１，０００個以上、１０，０００個以上、１００，０００個以上）の特徴がある細胞系譜である。任意の簡便な遺伝性細胞マーカー（互いに区別可能である）を使用することができ、いくつかの遺伝性細胞マーカーは当業者に既知である。場合によっては、細胞マーカー（すなわち、遺伝性であり、互いに区別可能である導入された（異種、人工））は、バーコード化された核酸である。場合によっては、バーコード化された核酸は標的細胞のゲノムに組み込まれ得るか、または場合によっては、バーコード化された核酸はエピソームに保持され得る。バーコード化された核酸は、検出され、定量化／測定される各細胞系譜に固有の識別子を提供するヌクレオチド配列を含む。場合によっては、遺伝性であり、互いに区別可能な複数の細胞マーカーは、バーコードの正確な配列があるランダムな要素を有する場合、バーコード化された核酸のライブラリである。例えば、場合によっては、バーコードは、一連のＮ（例えば、各ヌクレオチドは定義されないが、基準のまたは非基準のヌクレオチドの全ての可能なまたは定義されたサブセットのうちの１つである核酸配列の位置）で記載され得る。主題のバーコード化され核酸は、任意の簡便な数のＮを含み得る。
【００２９】
場合によっては、主題のバーコード化され核酸（複数／ライブラリ）は、５つ以上（例えば、６つ以上、７つ以上、８つ以上、１０個以上、１２個以上、または１５個以上）のランダム化された位置、例えば、ヌクレオチドが予め決められていない５つ以上（例えば、６つ以上、７つ以上、８つ以上、１０個以上、１２個以上、または１５個以上）の位置を含む。場合によっては、バーコード化された核酸のライブラリ（複数）の式は、５つ以上の位置（例えば、６つ以上、７つ以上、８つ以上、１０個以上、１２個以上、または１５個以上の位置）が定義されない（すなわち、塩基同一性がライブラリのメンバー間で異なる）、少なくとも１０塩基対（ｂｐ）長（例えば、少なくとも１２ｂｐ、１５ｂｐ、１７ｂｐ、または２０ｂｐ長）のヌクレオチドの伸張を含む。場合によっては、バーコード化された核酸のライブラリ（複数）の式は、５〜４０の位置（例えば、５〜３０、５〜２５、５〜２０、５〜１８、５〜１５、５〜１０、８〜４０、８〜３０、８〜２５、８〜２０、８〜１８、８〜１５、８〜１０、１０〜４０、１０〜３０、１０〜２５、１０〜２０、１０〜１８、１０〜１５、１２〜４０、１２〜３０、１２〜２５、１２〜２０、１２〜１８、または１２〜１５の位置）が定義されていない（すなわち、塩基同一性がライブラリのメンバー間で異なる）ヌクレオチドの伸張を含む。場合によっては、バーコード化された核酸のライブラリ（複数）の式は、５〜１０００の位置（例えば、５〜８００、５〜６００、５〜５００、５〜２５０、５〜１５０、５〜１００、５〜５０、５〜３０、５〜２５、５〜２０、５〜１８、５〜１５、５〜１０、８〜１０００、８〜８００、８〜６００、８〜５００、８〜２５０、８〜１５０、８〜１００、８〜５０、８〜４０、８〜３０、８〜２５、８〜２０、８〜１８、８〜１５、８〜１０、１０〜１０００、１０〜８００
、１０〜６００、１０〜５００、１０〜２５０、１０〜１５０、１０〜１００、１０〜５０、１０〜４０、１０〜３０、１０〜２５、１０〜２０、１０〜１８、１０〜１５、１２〜１０００、１２〜８００、１２〜６００、１２〜５００、１２〜２５０、１２〜１５０、１２〜１００、１２〜５０、１２〜４０、１２〜３０、１２〜２５、１２〜２０、１２〜１８、または１２〜１５の位置）が定義されていない（すなわち、塩基同一性がライブラリのメンバー間で異なる）ヌクレオチドの伸張を含む。
【００３０】
バーコード化された核酸は、線状（例えば、ウイルス）または環状（例えば、プラスミド）ＤＮＡ分子であり得る。バーコード化された核酸は、一本鎖または二本鎖ＤＮＡ分子であり得る。非限定的な例としては、プラスミド、合成核酸断片、合成オリゴヌクレオチド、ミニサークル、及びウイルスＤＮＡが挙げられる。バーコード化された核酸は、ＲＮＡ分子、ＤＮＡ（ＤＮＡ分子）、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド、または核酸／タンパク質複合体であり得る。
【００３１】
場合によっては、細胞マーカーは、単独で、または互いに区別可能な、ならびに組み合わせで使用されるとき、複数の他のバイオマーカーと区別可能な同じもしくは異なる型の複数の他のバイオマーカーと組み合わせて、遺伝性であり、互いに区別可能な複数のバイオマーカー（例えば、抗体、蛍光タンパク質、細胞表面タンパク質）を含み得る。そのような場合、バイオマーカーは、予め定義されたまたはランダム化様式で、個々の細胞及び／または細胞系譜内または外に存在し得、当業者に一般的に知られる方法（例えば、ハイスループット／次世代ＤＮＡシーケンシング、顕微鏡、フローサイトメトリー、質量分析計など）を使用して定量化及び／または測定され得る。
【００３２】
細胞マーカーは、任意の簡便な方法を使用して細胞に送達され得る。場合によっては、細胞マーカー（例えば、バーコード化された核酸）は、ウイルスベクターを介して組織に送達される。任意の簡便なウイルスベクターを使用することができ、例としては、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ボカウイルスベクター、泡沫状ウイルスベクター、及びレトロウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】
以下の実施例からの一例では（図４Ａを参照されたい）、複数の細胞マーカーは、レンチウイルスベクターを介して標的組織に送達された。各ウイルス粒子が、第１の構成要素が各コードされたガイドＲＮＡに固有であり、第２の構成要素が各分子に固有であり、そのため、同時に、検出され、定量化／測定されるべき各細胞系譜に固有である、二構成要素バーコードを含んだ１つのバーコード化された核酸を含んだレンチウイルス粒子のライブラリが使用された。バーコードの第２の構成要素の配列の式は、ＮＮＮＮＮＴＴＮＮＮＮＮＡＡＮＮＮＮＮであった。したがって、１９の塩基対の伸張において、それらのうちの１５は、定義されなかった（例えば、ランダム化された）。ライブラリの各バーコード化された核酸は、（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡをコードした、（ｉｉ）第１のバーコード、つまり、各異なるガイドＲＮＡ配列がその自身の固有の８ヌクレオチドバーコードに連結されるように、ガイドＲＮＡに連結された固有の識別子である８ヌクレオチドバーコードを含んだ、（ｉｉｉ）第２のバーコード、つまり、１５の未定義の位置を有する上記のランダムな１９のヌクレオチドバーコードを含んだ［細胞系譜を追跡するため］、及び（ｉｖ）その発現が標的組織においてＣａｓ９発現をもたらす遺伝子編集タンパク質（ＣＲＥ）をコードした。したがって、この場合、複数のバーコード化された核酸の複数の異なるメンバーは、同じ第１のバーコードを含み、各第１のバーコードは「対応する」ガイドＲＮＡを有した。しかしながら、第２のバーコードは、検出され、定量化／測定される各細胞系譜が固有の識別子を有するように、ライブラリの各メンバーに固有であった。したがって、一部のメンバーは、共通のガイドＲＮＡを共有したため、第１のバーコード配列を共有したが、ライブラリの各メンバーは、各組み込み（すなわち、系譜）
を追跡するために使用され得る固有の第２のバーコード有した。
【００３４】
場合によっては、遺伝性であり、区別可能な複数の細胞マーカーは、遺伝性であり、互いに区別可能な、ならびにそれらが関連する他の複数の細胞マーカーの細胞マーカーと区別可能な、１つ以上（例えば、１つ以上、２つ以上、３つ以上、５つ以上、７つ以上、９つ以上、１１個以上、１３個以上、１５個以上、または２０個以上）の複数の細胞マーカーと関連する。例えば、１つのバーコード化された核酸は、第１の構成要素が候補療法（例えば、候補抗がん化合物）に固有であり、第２の構成要素が各個体（例えば、候補療法を受け得る、または受けない場合があるマウス）に固有であり、第３の構成要素がコードされたガイドＲＮＡに固有であり、第４の構成要素が各分子に固有であり、そのため、同時に、バーコード化された核酸が、検出され、定量化／測定されるべき各細胞系譜に固有である、４構成要素バーコードを含み得る。したがって、この例では、各細胞系譜における細胞の数が定量化／測定され得、各細胞系譜はまた、その４構成要素核酸バーコードにより、その細胞系譜におけるガイドＲＮＡにより誘導された特定の遺伝的摂動、その細胞系譜が遭遇する特定の候補療法、及び細胞系譜が存在する特定の個体（例えば、マウス）に直接連結され得る。
【００３５】
場合によっては、バーコードは、相同組換え修復（ＨＤＲ）、または例えば、定義された核酸配列をゲノムの所望の位置に組み込む任意の他の機序のためのＤＮＡドナーテンプレートに組み込まれる。例えば、ＨＤＲ修復テンプレートは、同じコード変化（例えば、同じコード対立遺伝子）、またはさらには所望の変化のサブセットを、それが接触する細胞のゲノムに導入するために使用され得るが、各組み込み事象は、ＨＤＲテンプレートのライブラリが特定の位置でランダム化されているため独立してタグ付けされ得る。以下の実施例からの一例では（図２３Ａを参照されたい）、複数の細胞マーカー（各ＡＡＶ粒子が１つのＨＤＲテンプレートを含んだＡＡＶ粒子のライブラリ）は、ＡＡＶ粒子により標的組織に送達された。各ＡＡＶのＨＤＲテンプレートは、ＨＤＲを受ける各細胞を固有にタグ付けするために、Ｋｒａｓコドン１２及び１３に１２の可能な非同義単一ヌクレオチド点変異のうちの１つ、または野生型Ｋｒａｓ配列ならびに隣接するコドンのゆらぎ位置にランダムな８ヌクレオチドバーコードを含んだ。バーコードは、（Ｎ）ＧＧ（Ｎ）ＡＡ（Ｒ）ＴＣ（Ｎ）ＧＣ（Ｎ）ＣＴ（Ｎ）ＡＣ（Ｎ）ＡＴ（Ｈ）（配列番号１）であり、したがって、８つの位置が定義されなかった２２の塩基対の伸張であった。
【００３６】
場合によっては、外部摂動（例えば、候補抗がん療法）に応じて、細胞マーカーを組織に接触させることができる。そのような場合、外部摂動因子の投与は、調節可能な確率で、またはシグナル（例えば、予め定義された細胞の生理学的状態、特定の遺伝子の発現レベル、遺伝子のセット（複数可）、特定の経路（複数可）の活性レベル、及び／または細胞もしくは細胞系譜の内部または外部の他のシグナル［例えば、組織の同一性、血液供給レベル、個体全体の免疫状態、細胞の物理的位置など]）の組み合わせ一致の結果として確率的に生じ得る。例えば、組織が存在する個体に投与される化合物に応じて、特定の型の上皮細胞に特異的なエンハンサーの制御下のガイドＲＮＡ及びＣａｓ９の両方の発現時に、細胞マーカー（例えば、バーコード化されたＤＮＡ）を組織に接触させることができる。
【００３７】
場合によっては、細胞マーカーを、個々の生きている生物においてインビボで、または培養物中またはオルガノイド培養物中の細胞集団においてインビトロで、健康なもしくは疾患状態の細胞集団または組織に接触させてもよい。場合によっては、細胞マーカーを、数が増加もしくは減少している、または静止の新生細胞系譜に接触させてもよい。場合によっては、薬物の投与または他の生理学的もしくは環境摂動に応じて、確率的に調節可能な摂動で、あるいは調節可能な手段及び分散ならびに他の時点により、またはシグナルの組み合わせ一致の結果として、正確にまたは確率的に、ある特定の数の細胞分裂の後に組
織に接触させるように細胞マーカーを誘導した計数機序を介して、細胞マーカーを組織に接触させてもよい。
【００３８】
標的細胞の遺伝的修飾（改変）
上述したように、いくつかの実施形態では、本方法は、細胞マーカーが導入される細胞を遺伝的に修飾することを含む。いくつかのそのような場合では、導入された細胞マーカーは、遺伝的修飾の薬剤である。例えば、場合によっては、細胞マーカーは、遺伝的修飾（例えば、ゲノム修飾）を誘導するバーコード化された核酸であり、いくつかのそのような場合では、新生細胞形成を誘導するバーコード化された核酸である。例えば、バーコード化された核酸からのＲＮＡ（例えば、ガイドＲＮＡ）及び／またはタンパク質（例えば、Ｃｒｅ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ＲＮＡガイドタンパク質など）の発現は、１つ以上のゲノム改変をもたらし得、場合によっては、ゲノム改変は、標的細胞の新生細胞への形質転換をもたらす（例えば、場合によっては、腫瘍形成をもたらす場合がある）。
【００３９】
しかしながら、細胞マーカー（例えば、バーコード化された核酸）がゲノム修飾を導入するかは、それが新生細胞形成を誘導することができるかに依存し得る。例えば、場合によっては、バーコード化された核酸は、がん遺伝子（タンパク質として発現されたときに新生細胞形成につながり得る遺伝子）をコードし得る。いくつかのそのような場合では、バーコード化された核酸は、標的細胞においてゲノム変化を誘導しないが、がん遺伝子の発現に起因して新生細胞形成を誘導する。場合によっては、がん遺伝子は、タンパク質が過剰発現されるとき、細胞が新生物になる可能性がある野生型タンパク質をコードする。場合によっては、がん遺伝子は、タンパク質が発現されるとき、細胞が新生物になる可能性がある変異タンパク質（例えば、ＫＲＡＳの変異型）をコードする。場合によっては、細胞マーカー（例えば、バーコード化された核酸）は、標的細胞にゲノム修飾を導入するが、修飾は、細胞マーカー及び関連するゲノム修飾の導入前、導入中、または導入後のある期間に生じ得る１つ以上のさらなるゲノム修飾と組み合わせてのみ新生物形成（例えば、腫瘍／がんの形成）を誘導する。
【００４０】
一方、場合によっては、細胞マーカー（例えば、バーコード化された核酸）は、標的細胞にゲノム修飾を導入するが、修飾は、新生物形成（例えば、腫瘍／がんの形成）を誘導しない。例えば、場合によっては、バーコード化された核酸は、不活性方法で標的細胞のゲノムに組み込まれる。
【００４１】
場合によっては、バーコード化された核酸は、タンパク質が必ずしもがんに関連しないタンパク質（例えば、野生型または変異タンパク質）をコードし、例えば、タンパク質（複数可）は目的の任意の生物学的プロセスに関与し得、その発現は、細胞増殖及び／または新生細胞形成に作用を有しない場合がある（例えば、がん遺伝子または腫瘍抑制因子ではない場合がある）。いくつかのそのような場合では、核酸は標的細胞のゲノムに組み込まれ、他の場合では、核酸はゲノムに組み込まれない（例えば、エピソームに保持され得る）。場合によっては、バーコード化された核酸は、例えば、成長／増殖制御以外の何らかの方法で、腫瘍に有害なタンパク質をコードする野生型または変異タンパク質、例えば、ｃＤＮＡをコードする。
【００４２】
いくつかの実施形態では、主題の細胞マーカー（例えば、バーコード化された核酸）は、標的細胞にゲノム修飾を導入し、また新生細胞形成（例えば、腫瘍／がんの形成）も導入するという両方である。例えば、場合によっては、バーコード化された核酸は、腫瘍抑制因子を修飾する、がん遺伝子の発現を改変する、新生物誘導対立遺伝子になるように遺伝子（例えば、Ｋｒａｓ）を編集するようになど、標的遺伝子座に編集を引き起こし得る。
【００４３】
上述したように、バーコード化された核酸からのＲＮＡ（例えば、ガイドＲＮＡ）及び／またはタンパク質（例えば、Ｃｒｅ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ＲＮＡガイドタンパク質など）の発現は、１つ以上のゲノム改変をもたらし得、場合によっては、ゲノム改変は、標的細胞の新生細胞への形質転換をもたらす（例えば、場合によっては、腫瘍形成をもたらす場合がある）。いくつかの実施形態では、標的細胞のゲノム改変は、新生物特徴の発生（例えば、腫瘍発生）から時間的に分離され得る。例として、ベクター（複数可）は、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡの時間的制御及び／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ核酸ガイドタンパク質活性（例えば、Ｃａｓ９活性）の時間的制御を可能にするように操作され得る。
【００４４】
場合によっては、遺伝的（例えば、ゲノム）修飾を導入するタンパク質は、標的細胞において発現される。タンパク質は、タンパク質として、またはタンパク質をコードする核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）として標的細胞に導入され得る。タンパク質はまた、細胞内の核酸によって既にコードされていてもよく（例えば、細胞内のゲノムＤＮＡによってコードされる）、本方法は、タンパク質の発現を誘導することを含む。場合によっては、標的組織の標的細胞に遺伝的修飾を導入するタンパク質は、ゲノム編集タンパク質／エンドヌクレアーゼ（そのうちの一部は、「プログラム可能」であり、そのうちの一部はそうではない）である。例としては、プログラム可能な遺伝子編集タンパク質（例えば、転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクター（ＴＡＬＥｓ）、ＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＤＮＡガイドポリペプチド（Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｒｅｇｏｒｙｉ  Ａｒｇｏｎａｕｔｅ（ＮｇＡｇｏ）など）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ＲＮＡガイドタンパク質（Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１など）（例えば、Ｓｈｍａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１７  Ｍａｒ；１５（３）：１６９−１８２及びＢｕｒｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１７  Ｆｅｂ  ９；５４２（７６４０）：２３７−２４１）を参照されたい）、トランスポゾン（例えば、クラスＩまたはクラスＩＩトランスポゾン、例えば、ｐｉｇｇｙｂａｃ、ｓｌｅｅｐｉｎｇ
ｂｅａｕｔｙ、Ｔｃ１／ｍａｒｉｎｅｒ、Ｔｏｌ２、ＰＩＦ／ｈａｒｂｉｎｇｅｒ、ｈＡＴ、ｍｕｔａｔｏｒ、ｍｅｒｌｉｎ、ｔｒａｎｓｉｂ、ｈｅｌｉｔｒｏｎ、ｍａｖｅｒｉｃｋ、ｆｒｏｇ  ｐｒｉｎｃｅ、ｍｉｎｏｓ、Ｈｉｍａｒ１など）、メガヌクレアーゼ（例えば、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＤｍｏＩ、Ｉ−ＣｈｕＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＦｌｍｕＩ、Ｉ−ＦｌｍｕＩＩ、Ｉ−Ａｎｉｌ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＰａｎＩＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＬｔｒＩ、Ｉ−ＧｐｉＩ、Ｉ−ＧＺｅＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、ＰＩ−ＭｌｅＩ、ＰＩ−ＭｔｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｔｌｉ  Ｉ、ＰＩ−Ｔｌｉ  ＩＩ、ＰＩ−ＳｃｅＶなど）、メガＴＡＬ（例えば、Ｂｏｉｓｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１４  Ｆｅｂ；４２（４）：２５９１−２６０１を参照されたい）、ファージ由来インテグラーゼ、Ｃｒｅタンパク質、Ｆｌｐタンパク質などが挙げられるが、これらに限定されない。場合によっては、ゲノム編集ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ＲＮＡガイドタンパク質）は、ヌクレアーゼ活性を除去する（ヌクレアーゼ死亡タンパク質である）１つ以上の変異を有し、タンパク質は転写活性化因子または抑制因子ポリペプチド（例えば、ＣＲＩＳＰＲａ／ＣＲＩＳＰＲｉ）に融合する。場合によっては、ゲノム編集ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ
ＲＮＡガイドタンパク質）は、ヌクレアーゼ活性を除去する（ヌクレアーゼ死亡タンパク質である）か、またはヌクレアーゼ活性を部分的に除去する（ニッカーゼタンパク質である）１つ以上の変異を有し、タンパク質の機能または活性を調節する１つ以上のさらなる変異を有し得、タンパク質は、それ自体がタンパク質の機能もしくは活性を調節する１つ以上のさらなる変異を有し得るデアミナーゼドメイン（例えば、ＡＤＡＲ、ＡＰＯＢＥＣ１など）に融合されるか、または同じくタンパク質の機能もしくは活性を調節する１つ
以上のさらなる変異（例えば、ＲＮＡ塩基エディタ、ＤＮＡ塩基エディタ）を有し得る、デアミナーゼドメイン及び１つ以上のさらなるタンパク質もしくはペプチド（例えば、バクテリオファージＧａｍタンパク質、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤など）に融合される。
【００４５】
場合によっては、ＣｒｅまたはＦｌｐなどの編集タンパク質は、ゲノムから別のタンパク質（例えば、Ｃａｓ９などのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ＲＮＡガイドタンパク質）の発現を誘導する目的のために標的組織に導入され得、例えば、動物は、Ｃａｓ９のｌｏｘ−ｓｔｏｐ−ｌｏｘ対立遺伝子を含有し得、導入されたＣｒｅタンパク質（例えば、バーコード化された核酸によりコードされる）は、「ｓｔｏｐ」の除去をもたらし、したがって、Ｃａｓ９タンパク質の発現をもたらす。
【００４６】
いくつかの実施形態では、バーコード化された核酸は、新生細胞形成を誘導することができ、相同組換え修復（ＨＤＲ）ＤＮＡドナーテンプレート、がん遺伝子をコードする核酸（タンパク質の野生型及び／または変異対立遺伝子を含む）、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡをコードする核酸、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする核酸、及びゲノム編集タンパク質をコードする核酸のうちの１つ以上を含む（例えば、上記を参照されたい）。
【００４７】
場合によっては、バーコード化された核酸がＨＤＲ  ＤＮＡドナーテンプレートである場合、それらは標的細胞のゲノムに変異を導入することができる。いくつかのそのような場合では、ゲノム編集ヌクレアーゼは、ドナーテンプレートがバーコード化された配列を挿入するために使用されるように標的ＤＮＡを切断する細胞に存在する（導入されるか、または主題の方法の一部として誘導するか、または標的細胞において既に発現されているかのいずれか）。場合によっては、ＨＤＲ  ＤＮＡドナーテンプレートのライブラリ（複数）は、各分子に対して固有の配列識別子（バーコード）を有するメンバーを含むが、分子は、同じ機能的摂動をもたらす（例えば、それらは全て、例えば、場合によっては、変異アミノ酸配列を有する、同じタンパク質の発現をもたらし得るが、それらは、コドンのゆらぎ位置で異なる場合があり、その結果、同じ変異タンパク質を発現するかにかかわらず、得られた複数の細胞系譜が互いに区別可能であるようにタンパク質をコードする）。場合によっては、ＨＤＲ  ＤＮＡドナーテンプレートのライブラリ（複数）は、各分子に対して固有の配列識別子（バーコード）を有するメンバーを含み、分子は、異なる機能的摂動をもたらす（例えば、異なる遺伝子座を標的とすることができる、同じ遺伝子座を標的とするが、異なる対立遺伝子を導入することができるなど）。
【００４８】
場合によっては、バーコード化された核酸は、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡであるか、またはＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ分子である。そのような分子のライブラリは、異なる遺伝子座を標的とする分子及び／または同じ遺伝子座を標的とする分子を含み得る。場合によっては、バーコード化された核酸は、本開示の目的のため、過剰発現されたときに新生細胞形成をもたらし得る野生型タンパク質、ならびに新生細胞形成をもたらし得る変異タンパク質（例えば、ＫＲＡＳ、以下の実施例を参照されたい）を含むがん遺伝子をコードする。そのような分子のライブラリは、同じがん遺伝子を発現する分子、または異なるがん遺伝子を発現する分子のライブラリを含み得る。場合によっては、バーコード化された核酸は、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）及び／またはｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ分子（複数可）（例えば、任意の所望の遺伝子、例えば、腫瘍抑制因子に標的化され得る）を含む。そのような分子のライブラリは、同じｓｈＲＮＡを発現する分子、または異なるｓｈＲＮＡを発現する分子のライブラリを含み得る。場合によっては、バーコード化された核酸は、１つ以上のゲノム編集タンパク質／エンドヌクレアーゼ（例については上記を参照されたい、例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、ＣａｓＸ、またはＣａｓＹなどのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ＲＮＡガイドタンパク質、Ｃｒｅリコ
ンビナーゼ、Ｆｌｐリコンビナーゼ、ＺＦＮ；ＴＡＬＥＮなど）をコードするＲＮＡ及び／またはＤＮＡを含む。そのような分子のライブラリは、同じゲノム編集タンパク質／エンドヌクレアーゼを発現する分子、または異なるゲノム編集タンパク質／エンドヌクレアーゼを発現する分子のライブラリを含み得る。
【００４９】
いくつかの実施形態では、細胞マーカーは、区別可能に標識された粒子（例えば、ビーズ、ナノ粒子など）である。例えば、場合によっては、粒子は、区別可能な質量タグ（質量分析を介して分析され得る）、区別可能な蛍光タンパク質、区別可能な放射線タグなどで標識され得る。
【００５０】
検出／測定／計算
主題の方法は、例えば、遺伝的に特徴がある細胞の少なくとも一部が少なくとも１回の分裂を受けるために十分な時間が経過した後、接触させた組織に存在する複数の細胞マーカーのうちの少なくとも２つの量を検出及び測定するステップも含み得る。
【００５１】
場合によっては、ステップ（ａ）と（ｂ）との間［組織を複数の細胞マーカーと接触させることと組織に存在する細胞マーカーを検出／測定することとの間］で経過した時間期間は、遺伝的に特徴がある細胞の少なくとも一部（例えば、区別可能に特徴がある細胞のうちの少なくとも２つ）が少なくとも１回の分裂（例えば、少なくとも２回、４回、６回、８回、１０回、または１５回の細胞分裂）を受けるために十分な時間期間である。場合によっては、ステップ（ａ）と（ｂ）との間［組織を複数の細胞マーカーと接触させることと組織に存在する細胞マーカーを検出／測定することとの間］で経過した時間期間は、２時間以上（例えば、４時間以上、６時間以上、８時間以上、１０時間以上、１２時間以上、１５時間以上、１８時間以上、２４時間以上、または３６時間以上）である。場合によっては、ステップ（ａ）と（ｂ）との間［組織を複数の細胞マーカーと接触させることと組織に存在する細胞マーカーを検出／測定することとの間］で経過した時間期間は、１日間以上（例えば、２日間以上、３日間以上、４日間以上、５日間以上、７日間以上、１０日間以上、もしくは１５日間以上、２０日間以上、または２４日間以上）である。場合によっては、ステップ（ａ）と（ｂ）との間［組織を複数の細胞マーカーと接触させることと組織に存在する細胞マーカーを検出／測定することとの間］で経過した時間期間は、１週間以上（例えば、２週間以上、３週間以上、４週間以上、５週間以上、７週間以上、または１０週間以上）である。場合によっては、ステップ（ａ）と（ｂ）との間［組織を複数の細胞マーカーと接触させることと組織に存在する細胞マーカーを検出／測定することとの間］で経過した時間期間は、２時間〜６０週間（例えば、２時間〜４０週間、２時間〜３０週間、２時間〜２０週間、２時間〜１５週間、１０時間〜６０週間、１０時間〜４０週間、１０時間〜３０週間、１０時間〜２０週間、１０時間〜１５週間、１８時間〜６０週間、１８時間〜４０週間、１８時間〜３０週間、１８時間〜２０週間、１８時間〜１５週間、１日間〜６０週間、１日間〜４０週間、１日間〜３０週間、１日間〜２０週間、１日間〜１５週間、３日間〜６０週間、３日間〜４０週間、３日間〜３０週間、３日間〜２０週間、３日間〜１５週間、１週間〜６０週間、１週間〜４０週間、１週間〜３０週間、１週間〜２０週間、または１週間〜１５週間）の範囲である。場合によっては、ステップ（ａ）と（ｂ）との間［組織を複数の細胞マーカーと接触させることと組織に存在する細胞マーカーを検出／測定することとの間］で経過した時間期間は、２時間〜３００週間（例えば、２時間〜２５０週間、２時間〜２００週間、２時間〜１５０週間、２時間〜１００週間、２時間〜６０週間、２時間〜４０週間、２時間〜３０週間、２時間〜２０週間、２時〜１５週間、１０時間〜３００週間、１０時間〜２５０週間、１０時間〜２００週間、１０時間〜１５０週間、１０時間〜１００週間、１０時間〜６０週間、１０時間〜４０週間、１０時間〜３０週間、１０時間〜２０週間、１０時間〜１５週間、１８時間〜３００週間、１８時間〜２５０週間、１８時間〜２００週間、１８時間〜１５０週間、１８時間〜１００週間、１８時間〜６０週間、１８時間〜４０週間、１８時間〜３０週間、
１８時間〜２０週間、１８時間〜１５週間、１日間〜３００週間、１日間〜２５０週間、１日間〜２００週間、１日間〜１５０週間、１日間〜１００週間、１日間〜６０週間、１日間〜４０週間、１日間〜３０週間、１日間〜２０週間、１日間〜１５週間、３日間〜３００週間、３日間〜２５０週間、３日間〜２００週間、３日間〜１５０週間、３日間〜１００週間、３日間〜６０週間、３日間〜４０週間、３日間〜３０週間、３日間〜２０週間、３日間〜１５週間、１週間〜３００週間、１週間〜２５０週間、１週間〜２００週間、１週間〜１５０週間、１週間〜１００週間、１週間〜６０週間、１週間〜４０週間、１週間〜３０週間、１週間２０週間、または１週間〜１５週間）の範囲である。
【００５２】
各区別可能な細胞マーカー（例えば、バーコード化された核酸）に関して検出されたシグナルの量（レベル）は、接触させた組織（遺伝性の細胞マーカーが導入された組織）に存在する細胞の数を決定するために使用され得る。任意の簡便な方法は、細胞マーカーを検出／測定するために使用され得、当業者は、測定のためにどの方法が使用されるべきかは使用される細胞マーカーの種類により左右されることを理解する。例えば、質量タグが使用される場合、質量分析が測定のための選択方法であり得る。バーコード化された核酸が細胞マーカーとして使用される場合、シーケンシング（例えば、ハイスループット／次世代シーケンシング）が測定のための選択方法であり得る。場合によっては、ハイスループットシーケンシングが使用され、各検出されたバーコードの配列リードの数は、その特定のバーコードを含有した細胞の数を決定するために使用され得る。場合によっては、重要な基準は、各系譜における細胞の数ではなく、むしろある特定の細胞数を超えるクローン系譜の数である。
【００５３】
場合によっては、シーケンシング（例えば、ハイスループット／次世代シーケンシング）は、ＰＣＲ産物が細胞内の細胞マーカーから（場合によっては、バーコード化された核酸が組み込まれたゲノム領域から）のバーコード領域を増幅したＰＣＲ反応からである場合、ＰＣＲ産物で行われる（例えば、図１Ａを参照されたい）。
【００５４】
場合によっては、腫瘍内の新生細胞の数の定量化、ならびにさらなる表現型決定及び分析は、プールした試料、単一、複数、もしくは組み合わせにより配置されたバイオマーカー（例えば、蛍光タンパク質、細胞表面タンパク質、及び抗体）を介して選別された試料から、または組織、臓器、細胞培養物からの個々の腫瘍の解剖、または他の可能な細胞伝播手段を介して行われる。
【００５５】
場合によっては、「ベンチマーク」が、細胞数の計算を補助するために使用され得る。例えば、場合によっては、対照が、試料中に「スパイク」され得る。例えば、スパイクされた（スパイクイン）対照は、細胞当たりの配列リードの数（例えば、配列リード当たりの細胞の数）を決定するために使用され得る。例えば、場合によっては、スパイクされた（スパイクイン）対照は、測定されたＤＮＡの量をＤＮＡが由来する細胞の数と相関させるためにも使用され得る。例えば、既知の細胞数を使用してＤＮＡを調製することができ、ＤＮＡは、接触させた組織（本開示の方法により遺伝性の細胞マーカーと接触させた組織）の細胞から抽出したＤＮＡと並行して処理され得る。そのようなスパイクされた（スパイクイン）対照（「ベンチマーカー」）はそれ自身の固有のバーコードを含み得る。スパイクされた対照からの結果を使用して、シーケンシング反応において検出された配列の数により表される細胞の数を導く／計算することができる（すなわち、スパイクされた（スパイクイン）対照は、測定値の量、例えば、配列リードの数を、細胞数、例えば、絶対細胞数に変換するための係数を提供するために使用され得る）。そのようなプロセスは、「正規化」と呼ばれる場合があり、例えば、シーケンシングの結果は検出される各固有のバーコードのリード数を提供し、この値は、次いで、検出された固有のバーコードを含んだ細胞の絶対数を計算するために、１つ以上の「ベンチマーク」と比較され得る（例えば、図１Ａを参照されたい）。
【００５６】
場合によっては、複数のクローン細胞集団は主題の組織を遺伝性の細胞マーカーと接触させることにより検出可能であり、場合によっては、各区別可能な細胞集団は類似する遺伝子型を有するため、主題の方法は、特定の表現型についての集団の大きさの分布（例えば、腫瘍の大きさの分布）を提供するために使用され得る。例えば、初期の接触は全ての接触させた細胞において類似するゲノム改変をもたらす（例えば、全ての細胞が同じ遺伝子座を標的とするガイドＲＮＡを受容する場合、全ての細胞が同じがん遺伝子対立遺伝子をコードする核酸を受容する場合など）が、各細胞集団（例えば、腫瘍）が無関係である場合、得られた細胞集団の大きさは、その特定の遺伝子型についてのクローン細胞集団の大きさの分布を提供することができる。例えば、主題の方法を行うことの目標は、特定の方法で腫瘍の挙動を改変する（例えば、腫瘍本来の数を変化させることなく大きさの分布を変化させる）ゲノム変化を探索することであり得る。例えば、以下の実施例（例えば、実施例１）は、ｐ５３欠損を備えた腫瘍を有する動物が最も大きい腫瘍にべき乗則分布された腫瘍の大きさの分布（非常に大きい腫瘍がさらなる稀に獲得される駆動物質変異により生成されるマルコフプロセスと一致する）を生成する証拠を含む。逆に、Ｌｋｂ１不活性化を有する腫瘍を有する動物は大部分の病変の大きさを増加させ、通常の指数関数的成長プロセスを示唆した（例えば、図１０、１３、１６、及び２０を参照されたい）。
【００５７】
大きさの分布の測定値はいくつかの異なる方法で使用され得る。例えば、本明細書に記載される方法を行うことにより、所与の遺伝子型の細胞集団の大きさ（例えば、腫瘍の大きさ）のベースラインの大きさの分布を決定し、それを、同様に処置された動物が試験化合物（例えば、候補抗がん療法）でも処置されたときに測定される大きさの分布と比較することができる。大きさの分布の変化は、試験化合物が効果的であったか否かの基準として使用され得る。図示的な例として、発明者らは、ｐ５３欠損を備えた腫瘍を有するマウスの腫瘍の大きさの分布のベースライン測定値を決定し、ｐ５３欠損が他の腫瘍と比較してはるかにより大きいいくつかの腫瘍をもたらす傾向があったことを見出した。したがって、ｐ５３欠損腫瘍の大きさの分布は、標準分布ではないが、代わりに外れ値腫瘍を含んだ。本明細書に記載される方法を使用して、腫瘍の大きさの分布を変化させるが、動物の腫瘍を必ずしも治癒しない潜在的な治療薬（例えば、小分子、大分子、放射線、化学、絶食、抗体、免疫細胞療法、酵素、ウイルス、生物製剤、化合物など）についてスクリーニングすることが可能である。例えば、全てのｐ５３欠損腫瘍を根絶しないが、代わりに、外れ値が大きい腫瘍が形成されることを阻害する療法（例えば、化合物）が見出される可能性がある。そのような変化は、試験した化合物が全体的な腫瘍数（腫瘍負荷）を必ずしも低減しないか、またはさらには腫瘍の大きさを平均化しないため、標準方法を使用して検出されない場合がある（そしてそのような化合物は、他の方法を使用して、腫瘍成長の阻害に対して効果がない化合物として廃棄される可能性がある）が、そのような療法（例えば、化合物）は、最も進行した腫瘍（例えば、最も大きくより危険な腫瘍）に対して効果的であるため（例えば、外れ値の腫瘍のリスクを低減する）、ｐ５３欠損腫瘍を有する患者を治療する臨床環境において非常に有用であり得る。
【００５８】
したがって、場合によっては、主題の方法は、集団の大きさ（例えば、腫瘍の成長／増殖）に対するそれらの効果について候補療法（例えば、小分子、大分子、放射線、化学療法、絶食、抗体、免疫細胞療法、酵素、ウイルス、生物製剤、化合物など）についてスクリーニングするために使用され得る。例えば、主題の方法は、試験療法、例えば、化合物（例えば、薬物）の存在下で行うことができ（例えば、本方法は、例えば、個体への投与を介して、組織を試験化合物と接触させるステップを含み得る）、例えば、薬物が添加されない（例えば、対照ビヒクル）並行実験との比較により、薬物の作用を測定することができる。系譜の特徴がある細胞集団が遺伝的に同じ（または類似する）場合、そのような方法は、化合物が細胞集団の大きさの分布に対して作用があるかを試験することができる。異なる特徴がある細胞が異なる遺伝子型を有する（例えば、異なる遺伝子が変異されて
おり、及び／または異なる細胞系譜において発現される）場合、療法（例えば、化合物）は、組織がインビボの生きている動物内にある場合、例えば、同じ動物において同時に複数の異なる遺伝子型に対して試験され得る。場合によっては、そのような実験及び／または療法（例えば、化合物）のスクリーニングは、培養において成長させた組織（例えば、２Ｄ培養組織、３Ｄ培養組織、オルガノイド培養物）で行うことができる。場合によっては、そのような方法は、ゲッ歯類（例えば、マウス、ラット）、ブタ、モルモット、非ヒト霊長類などの非ヒト動物において行われ得る。
【００５９】
任意の摂動因子（例えば、小分子、大分子［例えば、抗体またはデコイ受容体）、放射線療法、化学療法、炎症誘導因子、ホルモン、ナノ粒子、免疫細胞療法、酵素、ウイルス、環境的介入（例えば、間欠的絶食、急性運動、食事制御）など）が複数の特徴がある細胞集団についての集団の大きさに対するその作用について評価され得る。遺伝的摂動もそれらの影響を評価するために全てのクローン系譜において誘導され得る。全ての系譜が同じ初期の遺伝子型のものである場合、個々のクローン系譜（例えば、腫瘍）の応答が決定され得る。クローン系譜が異なる定義された改変を有するように誘導された場合、異なる改変を有するクローン系譜に対する誘導性の遺伝的摂動の影響が決定され得る。誘導性の遺伝子改変を生成するための系は、Ｆｌｐ／ＦＲＴもしくはＣｒｅ／ｌｏｘＰ系（ＦｌｐまたはＣｒｅ調節された対立遺伝子で発生させなかった細胞系譜において）またはテトラサイクリン調節可能な系（例えば、ＴＲＥ−ｃＤＮＡ（複数可）及び／またはＴＲＥ−ｓｈＲＮＡ（複数可）及び／またはＴＲＥ−ｓｇＲＮＡ（複数可）を有するｔＴＡまたはｒｔＴＡ）の使用を含むが、これらに限定されない。調節可能なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集及び新生細胞の二次的形質導入は、一時的な様式でゲノム改変を生成し得る。
【００６０】
場合によっては、複数の特徴がある細胞集団を有する個体による外部摂動因子（例えば、候補抗がん療法）の作用及びそれに対する応答（例えば、薬理学的、化学的、代謝的、薬物動態、免疫原性、毒性学的、行動的など）は、細胞マーカーの測定前、測定中、及び／または測定後に評価される。
【００６１】
いくつかの実施形態では、主題の方法は、遺伝的に特徴がある細胞（例えば、遺伝的に特徴がある腫瘍）を生成した後、特徴がある細胞集団（例えば、腫瘍（複数可）の全てまたは一部）のうちの１つ以上をレシピエント（例えば、二次レシピエント）または複数のレシピエントに移植して、例えば、レシピエント（複数化）に腫瘍を播種することを含む。場合によっては、そのようなステップは、試験化合物に対して多数の動物をスクリーニングすることができ、各動物が同じ開始腫瘍からの細胞から播種される「レプリカ平板培養」に類似すると考えられ得る。したがって、場合によっては、本方法は、例えば、移植した細胞の成長を評価する（及び場合によっては、これは試験化合物の存在及び／または不在下で行われ得る）ために、試験化合物が移植のレシピエント（複数可）に投与される（例えば、本方法は、二次レシピエントに存在する複数の細胞マーカーのうちの少なくとも２つの量を検出及び測定する）ステップを含む。したがって、主題の方法は、初期に生成された遺伝的に特徴がある細胞（例えば、遺伝的に特徴がある腫瘍）が１つ以上のレシピエントに移植され、接触させた組織に存在する遺伝的に特徴がある細胞の数が遺伝的に特徴がある細胞の区別可能な系譜のうちの少なくとも２つについて計算され得る、連続移植研究の一部として使用され得る。上記の場合のいくつかにおいて（例えば、連続移植）、試験化合物は、連続移植レシピエントに投与され得、結果は対照（移植を受けたが、試験化合物を受容しなかった動物、試験化合物を受容したが、移植を受けなかった動物など）と比較され得る。
【００６２】
いくつかの実施形態では、１つ以上の遺伝的に特徴がある細胞は再度特徴をつけられる（例えば、再度バーコード化される）。換言すると、場合によっては、既に遺伝的に特徴がある細胞集団（例えば、腫瘍）は、遺伝性であり、互いに区別可能であり、かつ第１の
複数の細胞マーカーの細胞マーカーと区別可能である第２の複数の細胞マーカーと接触させられる。この方法では、ユーザは、例えば特徴がある細胞集団（例えば、腫瘍）内に存在するばらつきを調査することができる。いくつかの実施形態では、遺伝性のマーカー自体が経時的に変化して、クローン系譜を有する細胞の系統発生（例えば、ヌクレオチドバーコードの進化）を記録する。
【００６３】
遺伝性の系譜マーカーは、特徴がある細胞からのｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの分析を通して細胞系譜を決定することを容易にする発現された遺伝子（内因性または操作されたのいずれか）内にもコードされ得る。場合によっては、細胞マーカーは、異なる種類の細胞マーカー（例えば、バーコード化されたＲＮＡまたはタンパク質として特徴がある細胞により発現されたバーコード化されたＤＮＡ）に変換される。そのような場合、当業者は、細胞マーカーを測定するために使用される方法が測定されることが望まれる測定時の細胞マーカーの種類により決定されることを理解する。例えば、バーコード化されたＤＮＡが細胞マーカーとして使用され、バーコード化されたＤＮＡがバーコード化されたＲＮＡとして発現される場合、ＲＮＡシーケンシング（例えば、全トランスクリプトームシーケンシング、単一細胞ＲＮＡシーケンシングなど）が、ＲＮＡバーコードが測定されることが望まれる細胞マーカーの種類である場合に測定に使用される方法であり得るか、またはＤＮＡシーケンシング（例えば、全ゲノムシーケンシング、全エキソームシーケンシング、標的ＤＮＡシーケンシングなど）が、ＤＮＡバーコードが測定されることが望まれる細胞マーカーの種類である場合に測定に使用される方法であり得る。そのような場合、測定するための細胞マーカーの選択は、調査する、及び細胞マーカーに直接連結する細胞の所望の表現型により導かれてもよい（例えば、バーコード化されたＲＮＡ細胞マーカーは、ＲＮＡ発現パターンが細胞マーカーに直接連結され得るように、単一細胞ＲＮＡシーケンシングを使用して測定されてもよい）。場合によっては、細胞系譜マーカーは、各系譜からの個々の細胞が各々他の系譜からの個々の細胞と関連し得るように、単一細胞分析方法（例えば、単一細胞ＲＮＡ−ｓｅｑ、フローサイトメトリー、マスサイトメトリー（ＣｙＴＯＦ）、ＭＥＲＦＩＳＨ、単一細胞プロテオミクス）を使用して測定され得る。そのような場合、各系譜内の細胞の表現型が調査される。そのような場合、これらの分析は、外部摂動（例えば、薬物治療）に対する異なる系譜の細胞の表現型応答を評価するためにも使用することができる。
【００６４】
遺伝性細胞マーカー（例えば、バーコード化された核酸）を検出及び測定するとき、場合によっては、測定は全組織に由来する。そのため、組織試料は、組織から採取された一部であり得るか、または全組織（例えば、全肺、腎臓、脾臓、血液、膵臓など）であり得る。そのため、細胞マーカー（例えば、核酸）は、残りの細胞を表すように組織試料から抽出され得るか、または全組織から抽出され得る。
【００６５】
場合によっては、生体試料は血液試料である。場合によっては、生体試料は血液試料であるが、接触させた組織は血液ではない。例えば、場合によっては、遺伝的に特徴がある細胞は、血液中に化合物（例えば、タンパク質または核酸などの固有の分泌されたマーカー）を分泌することができ、血液中に存在する化合物の量は、その特定の化合物を分泌する存在する細胞の数を計算するために使用することができる。例えば、遺伝的に特徴がある細胞は、場合によっては、血液中に蛍光タンパク質を分泌することができ、蛍光タンパク質は、検出及び測定され、特定の化合物を分泌する細胞についての細胞集団の大きさを計算するために使用され得る。場合によっては、これらの分泌された遺伝性マーカーは、非摂動の個体において、または外部摂動（例えば、薬物）の投与後に検出される。
【００６６】
場合によっては、生体試料は、体液（例えば、血液、血漿、血清、尿、唾液、腹膜腔からの流体、胸膜腔からの流体、脳脊髄液など）である。場合によっては、生体試料は体液であるが、接触させた組織は体液ではない。例えば、場合によっては、遺伝的に特徴があ
る細胞は、分析物（例えば、タンパク質、核酸、または代謝物などの固有のマーカー）を尿中に放出することができ、尿中に存在する化合物の量は、単独で、または外部摂動（例えば、候補抗がん療法）に応じてのいずれかで、その特定の化合物を放出した細胞の数または細胞系譜の数を計算するために使用することができる。
【００６７】
場合によっては、生体試料中の細胞マーカーの測定は、細胞マーカーと直接または間接的に関連し得、同じ生体試料または別個の生体試料に存在し得る、細胞、細胞構成要素（例えば、無細胞ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、代謝物など）、または任意の他の分析物（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、代謝物、ホルモン、溶解酸素、溶解二酸化炭素、ビタミンＤ、グルコース、インスリン、温度、ｐＨ、ナトリウム、カリウム、塩化物、カルシウム、コレステロール、赤血球、ヘマトクリット、ヘモグロビンなど）の分析と並行して行われる。
【００６８】
場合によっては、上述したように、検出及び測定は、個体から収集した生体試料（例えば、血液試料）で行われる。場合によっては、検出及び測定は、場合によっては、接触させた組織の一部であり得るか、または全組織であり得る、接触させた組織の組織試料で行われる。
【００６９】
検出及び測定するとき、バイオマーカー（導入された遺伝性細胞マーカーとは異なる）が考慮され得る。例えば、主題の方法は、遺伝的に特徴がある細胞のバイオマーカーを検出及び／または測定するステップと、バイオマーカー測定の結果に基づいて遺伝的に特徴がある細胞を分類するステップとを含み得る。そのようなバイオマーカーは、いくつかの細胞特徴のいずれか、例えば、増殖状況（例えば、Ｋｉ−６７タンパク質の検出、ＢｒｄＵ組み込みなど）、細胞型（例えば、様々な細胞型のバイオマーカーを使用して）、発達細胞系譜、幹細胞性（例えば、細胞が幹細胞であるか、及び／またはどんな型の幹細胞か）、細胞死（例えば、アネキシンＶ染色、切断されたカスパーゼ３、ＴＵＮＥＬなど）、及び細胞シグナル伝達状態（例えば、ホスホ特異的抗体を使用して、例えば、シグナル伝達タンパク質のリン酸化状態を検出する）を示し得る。
【００７０】
場合によっては、ある特定の療法または摂動の遺伝子型特異性の理解は、（他の療法または摂動に対する類似性により）その療法または摂動の作用機序を伝えるために使用され得る。遺伝子型特異性を明らかにすることにより、本明細書に開示される方法は、定義された遺伝子型の併用療法の予測を行い、試験するために使用され得る。療法のパネルはそれらの遺伝子型特異性を確立するために試験され得る。
【００７１】
キット及びシステム
例えば、上記の方法のいずれかを実践するためのキット及びシステムも提供される。主題のキット及び／またはシステムの内容は、大きく異なり得る。キット及び／またはシステムは、例えば、（ｉ）互いに区別可能な遺伝性細胞マーカーのライブラリ（例えば、バーコード化された核酸）、（ｉｉ）主題の方法を行うための指示、（ｉｉｉ）主題の方法の検出及び測定ステップから生成された値から細胞数を計算するためのソフトウェア、（ｉｖ）構成されたコンピュータシステムのうちの１つ以上を含み得る。
【００７２】
上記の構成要素に加えて、主題のキットは、主題の方法を実践するための説明書をさらに含み得る。これらの説明書は、様々な形態で主題のキットに存在し得、そのうちの１つ以上がキットに存在し得る。これらの説明書が存在する１つの形態は、適切な媒体または基材上に印刷された情報として、例えば、情報を印刷する紙（複数可）として、キットのパッケージ中に、添付文書などの中に存在し得る。さらに別の手段は、情報を記録している、コンピュータ可読媒体、例えば、ディスケット、ＣＤ、フラッシュドライブなどである。存在し得るさらに別の手段は、インターネットを介して使用され、離れたサイトで情
報にアクセスすることができるウェブサイトアドレスである。任意の簡便な手段がキットに存在し得る。
【００７３】
有用性
本開示の主題の様々な用途の例は、以下を含むが、これらに限定されない。より複雑な遺伝子型の作用の定量化：発明者らは、各腫瘍の２つの標的遺伝子の欠失を容易にする、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の対を発現するレンチウイルスベクターを既に生成し、検証した。腫瘍抑制因子の対の組み合わせを標的とするｓｇＲＮＡを有するレンチウイルス−Ｃｒｅベクターの生成は、非常に並行な様式で腫瘍抑制因子間の協同性及び拮抗性を明らかにする。
【００７４】
併用療法のスクリーニングを可能にする多重インビボゲノム編集。多くの系の適応能力に起因して、併用療法は、多くの疾患を治療するための効果的な方法として浮上している。非常に多くの潜在的な治療の組み合わせは、全ての組み合わせが患者またはさらには前臨床動物モデルにおいて決して試験されることができない難しい状況をすぐに生み出す。しかしながら、このアッセイできない薬物の組み合わせのマトリックスは、患者に有効である組み合わせを含んでいる可能性がある。薬物治療を、さらなる薬物標的をコードするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介遺伝子欠失と組み合わせることにより、治療組み合わせの多重モデル化が可能となり得る。＞１００の対の薬物治療の作用を調べるには、本開示に記載される組成物及び方法を使用して並行して行うことができる。例えば、ヒト肺癌のマウスモデルにおいて３つの肺癌遺伝子型の状況におけるこれらの順列を調査するには、インビボでの対の薬物標的の作用を調べるためにセミハイスループット系を生成する。
【００７５】
他のがんの種類への拡張：本明細書に記載される方法は、細胞成長／増殖（例えば、新生物、例えば、肺腺癌の状況において）のゲノム薬理学的感受性を明らかにするために使用され得、本方法は、区別可能な系譜の集団の大きさが目的のものである、任意の簡便ながんの種類及び／または任意の簡便な状況に適用され得る。例えば、本開示に概要が述べられるアプローチは、例えば、ウイルスベクターを使用して、遺伝子操作されたモデルにおいて誘導され得る任意のがん（例えば、肉腫、膀胱癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌、造血性など）に適用することができる。
【００７６】
ヒト肺腺癌内の多種多様な腫瘍遺伝子型及び潜在的な療法の数の増大により、本開示に記載される多重定量的プラットホームは、橋渡しがん生物学の中心となり得る。本明細書に記載されるアプローチは、正しい療法を正しい患者に効率的に一致させるための橋渡し研究を可能にし、臨床における患者ケアに直接影響する。治療に最も応答する可能性がある腫瘍を有する患者の部分集団で臨床試験を実行するためにも役立ち得、したがって、薬物開発の成功率を向上し、またあまり標的とされない臨床試験に失敗した薬物を救うこともできる。
【００７７】
本開示の非限定的な態様の例
上述した本発明の主題の実施形態を含む態様は、単独でも、１つ以上の他の態様または実施形態と組み合わせても有益であり得る。上述の記載を限定することなく、１〜５７の番号が付された、本開示のある特定の非限定的態様が以下に提示される。当業者に明らかであるように、本開示を読む際に、各々の個別に番号が付された態様が、任意の先行するまたは後に続く個別の番号の付された態様と共に使用され得るか、または組み合わせ得る。これは、態様の全てのそのような組み合わせのサポートを提供することを意図し、以下に明示的に記載されている態様の組み合わせに限定することを意図しない。
【００７８】
１．同じ組織内の複数のクローン細胞集団について集団の大きさを測定するための方法であって、
（ａ）生体組織を、遺伝性であり、互いに区別可能である複数の細胞マーカーと接触させて、接触させた組織内の遺伝的に特徴がある細胞の複数の区別可能な系譜を生成することと、
（ｂ）遺伝的に特徴がある細胞の少なくとも一部が少なくとも１回の分裂を受けるため十分な時間が経過した後、接触させた組織に存在する複数の細胞マーカーのうちの少なくとも２つの量を検出及び測定し、それにより、測定した値のセットを生成することと、
（ｃ）測定した値のセットを入力として使用して、遺伝的に特徴がある細胞の区別可能な系譜のうちの少なくとも２つについての、接触させた組織に存在する遺伝的に特徴がある細胞の数を計算することと
を含む、方法。
２．接触させた組織内の遺伝的に特徴がある細胞は、新生細胞である、態様１に記載の方法。
３．組織は、ステップ（ａ）の前に新生細胞及び／または腫瘍を含む、態様１または２に記載の方法。
４．ステップ（ｂ）の検出及び測定は、組織から回収された生体試料で行われる、態様１〜３のいずれか一つに記載の方法。
５．ステップ（ｂ）の検出及び測定は、接触させた組織の組織試料で行われる、態様１〜３のいずれか一つに記載の方法。
【００７９】
６．複数の細胞マーカーの各細胞マーカーは、遺伝的に特徴がある細胞の系譜の既知の細胞遺伝子型に対応する、態様１〜５のいずれか一つに記載の方法。
７．接触は、組織の細胞を遺伝的に改変して、遺伝的に特徴がある細胞を生成することを含む、態様１〜６のいずれか一つに記載の方法。
８．同じ組織の複数の腫瘍について腫瘍の大きさを測定する方法である、態様１〜７のいずれか一つに記載の方法。
９．組織を接触させるステップは、新生細胞を誘導することを含む、態様１〜８のいずれか一つに記載の方法。
１０．細胞マーカーは、新生細胞形成及び／または腫瘍形成を誘導する薬剤である、態様１〜９のいずれか一つに記載の方法。
【００８０】
１１．検出及び測定は、接触の結果として、接触させた組織内で腫瘍が形成されるために十分な時間が経過した後に行われる、態様１〜１０のいずれか一つに記載の方法。
１２．複数の細胞マーカーは、バーコード化された核酸を含む、態様１〜１１のいずれか一つに記載の方法。
１３．検出及び測定は、各検出されたバーコードについての、ハイスループットシーケンシング、及び配列リードの数の定量化を含む、態様１２に記載の方法。
１４．複数の細胞マーカーは、新生細胞形成を誘導するバーコード化された核酸を含む、態様１〜１３のいずれか一つ項に記載の方法。
１５．バーコード化された核酸は、新生細胞形成を誘導し、相同組換え修復（ＨＤＲ）ＤＮＡドナーテンプレート、１つ以上のがん遺伝子をコードする核酸、１つ以上の野生型タンパク質をコードする核酸、１つ以上の変異タンパク質をコードする核酸、１つ以上のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡをコードする核酸、１つ以上の短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする核酸、及び１つ以上のゲノム編集タンパク質をコードする核酸のうちの１つ以上を含む、態様１２〜１４のいずれか一つに記載の方法。
【００８１】
１６．ゲノム編集タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ＲＮＡガイドタンパク質、転写活性化因子または抑制因子ポリペプチドに融合したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ＲＮＡガイドタンパク質、Ｃａｓ９タンパク質、転写活性化因子または抑制因子ポリペプチドに融合したＣａｓ９タンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥＮ、ファージ由来インテグラーゼ、Ｃｒｅタンパク質、Ｆｌｐタンパク質、及びメガヌクレアーゼ
タンパク質から選択される、態様１５に記載の方法。
１７．バーコード化された核酸は、線状または環状ＤＮＡ分子である、態様１２〜１６のいずれか一つに記載の方法。
１８．バーコード化された核酸は、プラスミド、合成核酸断片、及びミニサークルから選択される、態様１２〜１６のいずれか一つに記載の方法。
１９．バーコード化された核酸は、ＲＮＡ分子である、態様１２〜１６のいずれか一つに記載の方法。
２０．バーコード化された核酸は、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドまたは核酸／タンパク質複合体である、態様１２〜１６のいずれか一つに記載の方法。
【００８２】
２１．組織は、無脊椎動物組織である、態様１〜１９のいずれか一つに記載の方法。
２２．組織は、脊椎動物組織である、態様１〜１９のいずれか一つに記載の方法。
２３．組織は、哺乳類または魚の組織である、態様１〜１９のいずれか一つに記載の方法。
２４．組織は、ラット組織、マウス組織、ブタ組織、非ヒト霊長類組織、またはヒト組織である、態様１〜１９のいずれか一つに記載の方法。
２５．組織は、生きている動物の一部である、態様１〜２４のいずれか一つに記載の方法。
【００８３】
２６．組織は、動物の体外で成長した操作された組織である、態様１〜２４のいずれか一つに記載の方法。
２７．組織は、筋肉、肺、気管支、膵臓、乳房、肝臓、胆管、胆嚢、腎臓、脾臓、血液、腸、脳、骨、膀胱、前立腺、卵巣、眼、鼻、舌、口、咽頭、喉頭、甲状腺、脂肪、食道、胃、小腸、結腸、直腸、副腎、軟組織、平滑筋、脈管構造、軟骨、リンパ管、前立腺、心臓、皮膚、網膜、生殖器系、及び性器系から選択される、態様１〜２６のいずれか一つに記載の方法。
２８．遺伝的に特徴がある細胞の少なくとも一部が少なくとも１回の分裂を受けるために十分な時間が経過した後、（ｉ）遺伝的に特徴がある細胞のバイオマーカーを検出及び／または測定することと、（ｉｉ）バイオマーカーの検出及び／または測定の結果に基づいて遺伝的に特徴がある細胞を分類することとをさらに含む、態様１〜２７のいずれか一つに記載の方法。
２９．バイオマーカーは、細胞増殖状態、細胞型、発達的細胞系譜、細胞死、及び細胞のシグナル伝達状態のうちの１つ以上のバイオマーカーである態様２８に記載の方法。
３０．細胞マーカーは、ウイルスベクターを介して組織に送達される、態様１〜２９のいずれか一つに記載の方法。
【００８４】
３１．ウイルスベクターは、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、及びレトロウイルスベクターから選択される、態様３０に記載の方法。
３２．同じ組織の複数のクローン的に無関係な腫瘍について腫瘍の大きさを測定する方法であって、
（ａ）組織を、複数のバーコード化された核酸細胞マーカーと接触させ、それにより、接触させた組織内の遺伝的に特徴がある新生細胞の複数の区別可能な系譜を生成することと、
（ｂ）遺伝的に特徴がある新生細胞の少なくとも一部が少なくとも１回の分裂を受けるために十分な時間が経過した後、ハイスループット核酸シーケンシングを行って、接触させた組織に存在するバーコード化された核酸細胞マーカーのうちの少なくとも２つの量を検出及び測定し、それにより、測定した値のセットを生成することと、
（ｃ）測定した値のセットを入力として使用して、遺伝的に特徴がある新生細胞の区別可能な系譜のうちの少なくとも２つについての、接触させた組織に存在する遺伝的に特徴
がある新生細胞の数を計算することと
を含む、方法。
３３．組織は、ステップ（ａ）の前に新生細胞及び／または腫瘍を含む、態様３２に記載の方法。
３４．ステップ（ｂ）のハイスループット核酸シーケンシングは、組織から回収された生体試料で行われる、態様３２または３３に記載の方法。
３５．ステップ（ｂ）のハイスループット核酸シーケンシングは、接触させた組織の組織試料で行われる、態様３２または３３に記載の方法。
【００８５】
３６．複数のバーコード化された核酸細胞マーカーの各バーコード化された核酸細胞マーカーは、遺伝的に特徴がある新生細胞の系譜の既知の細胞遺伝子型に対応する、態様３２〜３５のいずれか一つに記載の方法。
３７．接触は、組織の細胞を遺伝的に改変して、遺伝的に特徴がある新生細胞を生成することを含む、態様３２〜３６のいずれか一つに記載の方法。
３８．バーコード化された核酸は、新生細胞形成を誘導する、態様３２〜３７のいずれか一つに記載の方法。
３９．バーコード化された核酸が、新生細胞形成を誘導し、相同組換え修復（ＨＤＲ）ＤＮＡドナーテンプレート、１つ以上のがん遺伝子をコードする核酸、１つ以上の野生型タンパク質をコードする核酸、１つ以上の変異タンパク質をコードする核酸、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡをコードする核酸、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする核酸、及びゲノム編集タンパク質をコードする核酸のうちの１つ以上を含む、態様３２〜３７のいずれか一つに記載の方法。
４０．ゲノム編集タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ＲＮＡガイドタンパク質、転写活性化因子または抑制因子ポリペプチドに融合したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ＲＮＡガイドタンパク質、Ｃａｓ９タンパク質、転写活性化因子または抑制因子ポリペプチドに融合したＣａｓ９タンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥＮ、ファージ由来インテグラーゼ、Ｃｒｅタンパク質、Ｆｌｐタンパク質、及びメガヌクレアーゼタンパク質から選択される、態様３９に記載の方法。
【００８６】
４１．バーコード化された核酸は、線状または環状ＤＮＡ分子である、態様３２〜４０のいずれか一つに記載の方法。
４２．バーコード化された核酸は、プラスミド、合成核酸断片、及びミニサークルから選択される、態様３２〜４０のいずれか一つに記載の方法。
４３．バーコード化された核酸は、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドまたは核酸／タンパク質複合体である、態様３２〜４２のいずれか一つに記載の方法。
４４．組織は、無脊椎動物組織である、態様３２〜４３のいずれか一つに記載の方法。
４５．組織は、脊椎動物組織である、態様３２〜４３のいずれか一つに記載の方法。
【００８７】
４６．前記組織が、哺乳類または魚の組織である、３２〜４３のいずれか一つに記載の方法。
４７．組織は、ラット組織、マウス組織、ブタ組織、非ヒト霊長類組織、またはヒト組織である、態様３２〜４３のいずれか一つに記載の方法。
４８．組織は、生きている動物の一部である、態様３２〜４７のいずれか一つに記載の方法。
４９．組織は、動物の体外で成長した操作された組織である、態様３２〜４７のいずれか一つに記載の方法。
５０．組織は、筋肉、肺、気管支、膵臓、乳房、肝臓、胆管、胆嚢、腎臓、脾臓、血液、腸、脳、骨、膀胱、前立腺、卵巣、眼、鼻、舌、口、咽頭、喉頭、甲状腺、脂肪、食道、胃、小腸、結腸、直腸、副腎、軟組織、平滑筋、脈管構造、軟骨、リンパ管、前立腺、心臓、皮膚、網膜、生殖器系、及び性器系から選択される、態様３２〜４９のいずれか一
つに記載の方法。
【００８８】
５１．遺伝的に特徴がある新生細胞の少なくとも一部が少なくとも１回の分裂を受けるために十分な時間が経過した後、（ｉ）遺伝的に特徴がある新生細胞のバイオマーカーを検出及び／または測定することと、（ｉｉ）バイオマーカーの検出及び／または測定の結果に基づいて遺伝的に特徴がある新生細胞を分類することとをさらに含む、態様３２〜５０のいずれか一つに記載の方法。
５２．バイオマーカーは、細胞増殖状態、細胞型、発達的細胞系譜、細胞死、及び細胞のシグナル伝達状態のうちの１つ以上のバイオマーカーである、態様５１に記載の方法。
５３．細胞マーカーは、ウイルスベクターを介して前記組織に送達される、態様３２〜５２のいずれか一つに記載の方法。
５４．ウイルスベクターは、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ボカウイルスベクター、泡沫状ウイルスベクター、及びレトロウイルスベクターから選択される、態様５３に記載の方法。
５５．組織を試験化合物（例えば、試験薬物）と接触させ、試験化合物が、細胞集団の大きさ及び／または細胞集団の大きさの分布に作用を有したかを決定することを含む、態様１〜５４のいずれか一つに記載の方法。
【００８９】
５６．前記遺伝的に特徴がある細胞を生成した後、遺伝的に特徴がある細胞（例えば、１つ以上の腫瘍を移植する）のうちの１つ以上を１つ以上のレシピエント（例えば、二次レシピエント、例えば、二次レシピエントに腫瘍を播種する）に移植することを含む、態様１〜５５のいずれか一つに記載の方法。
５７．試験化合物は１つ以上のレシピエントに投与され、レシピエント（複数可）に存在する複数の細胞マーカーのうちの少なくとも２つの量を検出及び測定する（例えば、試験化合物の存在に応答して移植した細胞の成長を評価するため）ことを含む、態様５６に記載の方法。
【実施例】
【００９０】
以下の実施例は、当業者に本発明の製造方法及び使用方法の完全な開示及び説明を提供するために提示するものであり、発明者らが考える発明の範囲を限定することを意図するものではなく、また、以下の実験が行われた全てまたは唯一の実験であることを表すことを意図するものでもない。使用する数字（例えば、量、温度など）に関して、正確さを確保するための努力を行ってはいるが、いくらかの実験誤差及び偏差は考慮されるべきである。別途示されない限り、部は、重量部であり、分子量は、重量平均分子量であり、温度は、摂氏温度であり、圧力は、大気圧であるか、またはそれに近い。
【００９１】
実施例１：Ｔｕｂａ−ｓｅｑ：インビボでの腫瘍抑制の適応度ランドスケープを明らかにするための定量的及び多重アプローチ
がんの成長及び進行は、多段階の確率的な進化プロセスである。がんゲノムシーケンシングはヒト腫瘍で生じるゲノム改変を同定する際の機器であったが、天然組織内の腫瘍成長に対するこれらの改変の結果はほとんど明らかにされないままである。ヒトがんの遺伝子操作されたマウスモデルは、インビボでの腫瘍成長の研究を可能にするが、正確かつ測定可能な様式で得られた腫瘍の大きさを定量化するための方法の欠如により、個々の腫瘍抑制遺伝子の作用の規模及びモードを理解する発明者らの能力が制限されてきた。ここで、発明者らは、腫瘍バーコード化をウルトラディープバーコードシーケンシング（Ｔｕｂａ−ｓｅｑ）と統合して、ヒトがんのマウスモデルにおいて腫瘍抑制因子機能を調べる方法を提示する。Ｔｕｂａ−ｓｅｑは、肺腫瘍の３つの典型的な遺伝子型における腫瘍の大きさの異なる分布を明らかにする。Ｔｕｂａ−ｓｅｑを多重ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介ゲノム編集と組み合わせることにより、発明者らはヒト肺腺癌において最も頻繁に不活性化された腫瘍抑制経路のうちの１１種の作用をさらに定量化した。このアプローチは、メ
チルトランスフェラーゼＳｅｔｄ２及びスプライシング因子Ｒｂｍ１０を肺腺癌成長の新規抑制因子として同定する。前例がない分解能、並列化、及び精度で、Ｔｕｂａ−ｓｅｑは腫瘍抑制遺伝子機能の適応度ランドスケープの広範な定量化を可能にする。
【００９２】
結果
ウルトラディープバーコードシーケンシング（Ｔｕｂａ−ｓｅｑ）との腫瘍バーコード化は、腫瘍の大きさの精度及び並列定量化を可能にする。
発がん性ＫＲＡＳはヒト肺腺癌の主要な駆動物質であり、早期肺腫瘍は、肺上皮細胞におけるＣｒｅの発現が発がん性ＫｒａｓＧ１２Ｄの発現をもたらすＬｏｘＰ−Ｓｔｏｐ−ＬｏｘＰ  ＫｒａｓＧ１２Ｄノックインマウス（ＫｒａｓＬＳＬ−Ｇ１２Ｄ／＋）を使用してモデル化することができる。ＬＫＢ１及びＰ５３は、発がん性ＫＲＡＳ駆動ヒト肺腺癌において頻繁に変異される腫瘍抑制因子であり、Ｌｋｂ１及びｐ５３の欠損は発がん性ＫｒａｓＧ１２Ｄ駆動肺腫瘍のマウスモデルにおいて腫瘍負荷を増加させる（図７Ａ）。肺癌のウイルス−Ｃｒｅ誘導マウスモデルは、多数の腫瘍の同時発生を可能にし、個々の腫瘍はレンチウイルス媒介ＤＮＡバーコード化により安定してタグ付けされ得る。したがって、発明者らは、バルク腫瘍保有肺からのレンチウイルスバーコード領域のハイスループットシーケンシングが各固有にバーコード化された腫瘍内のがん細胞の数を定量することができるかを決定しようとした（図７Ｂ）。
【００９３】
発がん性ＫｒａｓＧ１２Ｄ駆動肺腫瘍の成長、ならびに腫瘍成長に対するＬｋｂ１及びｐ５３の喪失の影響を調べるために、発明者らは、１０６個を超える固有のＤＮＡ  バーコードを含有するレンチウイルス−Ｃｒｅベクターのライブラリ（Ｌｅｎｔｉ−ｍＢＣ／Ｃｒｅ；図１Ａ及び図７Ｂ）を用いて、ＫｒａｓＬＳＬ−Ｇ１２Ｄ／＋；Ｒｏｓａ２６ＬＳＬ−Ｔｏｍａｔｏ（ＫＴ）、ＫＴ；Ｌｋｂ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ（ＫＬＴ）、及びＫＴ；ｐ５３ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ（ＫＰＴ）マウスにおいて肺腫瘍を発生させた。腫瘍発生の１１週間後、ＫＴマウスは、広範な過形成及びいくつかの小さい腫瘍塊を発達させた（図１Ｂ及び図７Ｃ）。興味深いことに、ＫＬＴマウスは比較的均一の大きさの大きい腫瘍を有し、ＫＰＴマウスは非常に多様な腫瘍の大きさを有した（図１Ｂ）。
【００９４】
ウルトラディープシーケンシングを使用して全ての病変のがん細胞数を定量化するために、発明者らは、各マウスから単離したバルク肺ＤＮＡの約１／１０の組み込んだレンチウイルスバーコード領域をＰＣＲ増幅し、これをマウス当たり１０７リードを超える平均深度までシーケンシングした（図１Ａ、方法）。マウス内の腫瘍の大きさにおいて１０００倍を超える変動が観察された（図１Ｃ）。小さい病変からのバーコードリードは、固有の腫瘍を表すか、または大きい腫瘍からの類似するバーコードの繰り返し起こるシーケンシングエラーから生成された可能性がある。これらの偽腫瘍の発生を最小にするために、シーケンシングエラーの統計モデルを生成するアルゴリズムを使用して（ＤＡＤＡ２：図２及び図８）、同じ腫瘍バーコードに由来すると予想されるリードを集約した。ＤＡＤＡ２集約速度及び最小腫瘍の大きさは、発明者らの呼び出しパイプラインの再現性を最大にするようにも選択された（図８Ｄ〜Ｆ）。これらのアプローチは非常に限られているが、腫瘍定量化に対する繰り返し起こるシーケンシングエラーの作用をおそらく完全には排除しない（図２Ａ）。
【００９５】
各腫瘍におけるがん細胞の絶対数の定量化により、同じ遺伝子型の個々のマウスからのデータの集約、及び遺伝子型にわたる腫瘍の大きさの比較が可能となる。リード計数のがん細胞数への変換を可能にするために、組織均質化及びＤＮＡ抽出の前に、定義された数で、既知のバーコードを有する細胞を各肺の試料に添加した（図１Ａ及び図９）。したがって、腫瘍リード計数を「ベンチマーク」リード計数に対して正規化することにより、各マウスの各腫瘍におけるがん細胞の絶対数を計算することができた（図１Ａ及び図９）。
【００９６】
Ｔｕｂａ−ｓｅｑは、技術的反復間で非常に再現性があり、シーケンシングエラー、個々のＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）シーケンシング装置の本質的なエラー率の変動、バーコードＧＣ含有量、バーコードの多様性、マウス内の腫瘍数、及びリード深度を含む腫瘍の大きさの分布を偏らせる可能性がある多くの技術的変数に非感受性である（図２Ｂ〜Ｄ、図１０）。中程度の測定誤差は小さい大きさで存在し、これは全体的な大きさの分布を偏らせない。腫瘍の大きさの分布は、同じ遺伝子型のマウス間でも非常に再現性があった（Ｒ２＞０．９８；図２Ｅ、Ｆ、図１０Ｇ）。実際、大きさの分布の教師なし階層的クラスター化は、腫瘍が異なる力価のＬｅｎｔｉ−ｍＢＣ／Ｃｒｅで誘導された場合でも、それらの遺伝子型によりマウスを明らかに分離した（図２Ｇ及び図１０Ｄ）。しかしながら、発明者らの方法は、同じ遺伝子型のマウス間の腫瘍の大きさのスペクトルにおいて変動を検出した。この変動は、同じマウス内の腫瘍の２つの画分間で観察されたランダムなノイズよりも非常に大きく、Ｔｕｂａ−ｓｅｑがマウス間の腫瘍負荷における本質的なばらつきよりも有意により正確であることを示唆する（図２Ｅ、Ｇ）。したがって、Ｔｕｂａ−ｓｅｑは、ＫＴ、ＫＬＴ、及びＫＰＴマウスにおける数千の肺病変内のがん細胞の数を迅速かつ正確に定量化した（図１Ｃ、図１０Ｃ）。
【００９７】
腫瘍の大きさの分析は、２つの腫瘍抑制モードを明らかにする。
腫瘍成長に対するｐ５３またはＬｋｂ１のいずれかの欠損の作用を評価するために、分布内の異なるパーセンタイルの腫瘍内のがん細胞の数を計算した。興味深いことに、ＫＬＴマウスの腫瘍は一貫してＫＴ腫瘍よりも大きく、ｐ５３の欠失は、腫瘍の大部分においてがん細胞の数を改変しなかった（図３Ａ〜Ｃ）。代わりに、ｐ５３欠損腫瘍が小さい画分が例外的な大きさに成長し、マウスのいずれかにおいて最も大きいものであった（図１Ｃ）。
【００９８】
ｐ５３及びＬｋｂ１の欠損により付与された腫瘍成長における相違をより良く理解するために、ＫＴ、ＫＬＴ、及びＫＰＴマウスにおける腫瘍の大きさの分布に最も適合する数学的分布を定義した。Ｌｋｂ１欠損腫瘍は、分布の全範囲にわたって対数正規的に分布された（図３Ｄ）。対数正規分布は、正常に分布される速度で単純指数関数的腫瘍成長から予想される。非常に大きい腫瘍がこの基準を大幅にシフトさせることなく平均の腫瘍の大きさを予測するために、腫瘍の大きさの対数正規分布を所与としてがん細胞の平均数（ＬＮ平均）の最尤推定量も計算した。この測定により、ＫＬＴ腫瘍は、平均して、ＫＴ腫瘍よりも７倍多いがん細胞を有し、増殖を制限するＬｋｂ１の役割と一致する（図３Ａ、Ｃ）。ＫＰＴマウスにおけるより大きい腫瘍負荷及び明らかにより大きい腫瘍にもかかわらず、ｐ５３欠損は、発明者らの平均の病変の大きさについての推定を増加させなかった。代わりに、ｐ５３欠損腫瘍は、大きい大きさでべき乗則分布され、全腫瘍負荷の上昇は、稀な例外的に大きい腫瘍により引き起こされた（図３Ｄ）これは、ｐ５３欠損腫瘍が、後の迅速な成長を駆動する、稀だが大いに腫瘍原性のさらなる事象を獲得することを示唆する。
【００９９】
腫瘍抑制遺伝子の多重ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介不活性化のためのバーコード化されたレンチウイルスベクターのライブラリの生成
ヒト肺腺癌は、多様なゲノム改変を有するが、腫瘍成長に対するそれらの影響を説明する定量的データが不足している（図７Ａ及び１２Ｂ）。多くの既知及び候補腫瘍抑制遺伝子の腫瘍抑制機能を並行して同時に定量化するために、Ｔｕｂａ−ｓｅｑ及び従来のＣｒｅに基づくマウスモデルを多重ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介インビボゲノム編集と組み合わせた（図４Ａ〜Ｃ）。単一マウスにおける異なる腫瘍遺伝子型の評価は、マウス間のばらつきの作用を排除することにより、Ｔｕｂａ−ｓｅｑの分解能も最大にするはずである。発明者らは、最初に、ｔｄＴｏｍａｔｏ受容体またはＬｋｂ１のいずれかを標的とするレンチウイルス−ｓｇＲＮＡ／Ｃｒｅベクターで腫瘍を発生させることにより、Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９対立遺伝子を有するマウスにおいて肺腫瘍の効率的なＣａｓ９媒介遺伝子
の不活性化を確認した（図１１）。ｔｄＴｏｍａｔｏのホモ接合不活性化は約４０％の腫瘍において達成され、Ｃａｓ９媒介Ｌｋｂ１不活性は腫瘍負荷を増加させた（図１１）。これらのデータは、発明者らの能力がこれらの方法を使用してＫｒａｓ駆動肺癌モデルにおいて腫瘍を遺伝的に改変することを示す。
【０１００】
発明者らは、クロマチンリモデリング（Ｓｅｔｄ２及びＡｒｉｄ１ａ）、スプライシング（Ｒｂｍ１０）、ＤＮＡ損傷応答（Ａｔｍ及びｐ５３）、細胞周期制御（Ｒｂ１及びＣｄｋｎ２ａ）、栄養及び酸化ストレス感知（Ｌｋｂ１及びＫｅａｐ１）、環境ストレス応答（ｐ５３）、ならびにＴＧＦ−β及びＷｎｔシグナル伝達（それぞれ、Ｓｍａｄ４及びＡｐｃ）に広く関与する遺伝子を含む、多様な経路を表す、１１個の既知及び推定上の肺腺癌腫瘍抑制遺伝子を選択した（図４Ｂ及び図７Ａ）。転写物の初期、既知の機能ドメインの上流、及びヒト腫瘍に存在する大半の変異の上流においてインデルを生成した効率的なｓｇＲＮＡが同定された（図１２Ａ）。Ｔｕｂａ−ｓｅｑを使用して各腫瘍内のがん細胞の数の正確な定量化を可能にするために、各腫瘍抑制因子標的Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＲＮＡ／Ｃｒｅベクター、及び二構成要素バーコードを有する４つのＬｅｎｔｉ−ｓｇＩｎｅｒｔ／Ｃｒｅ陰性対照ベクターを多様化した。このバーコードは、各腫瘍を固有にタグ付けするために、各ｓｇＲＮＡに特異的な固有の８−ヌクレオチド「ｓｇＩＤ」及びランダムな１５−ヌクレオチドバーコード（ＢＣ）からなった（ｓｇＩＤ−ＢＣ；図４Ａ、Ｂ、及び図１２Ｃ〜Ｅ）。インビトロ切断効率は、個々に及びプール内のｓｇＲＮＡの各々について決定された（図１３）。
【０１０１】
インビボでの腫瘍抑制機能の並行定量化
多重様式で肺腫瘍成長に対する各遺伝子の不活性化の作用を定量化するために、１１個のバーコード化されたＬｅｎｔｉ−ｓｇＲＮＡ／Ｃｒｅベクター及び４つのバーコード化されたＬｅｎｔｉ−ｓｇＩｎｅｒｔ／Ｃｒｅベクターのプールを用いてＫＴ及びＫＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９（ＫＴ；Ｃａｓ９）マウスにおいて腫瘍を発生させた（Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅ；図４Ｂ、Ｃ）。ＫＴマウスと比較して低用量のウイルスを受容したにもかかわらず、ＫＴ；Ｃａｓ９マウスは、腫瘍発生の１２週間後、ＫＴマウスに対して巨視的腫瘍の数及び大きさが増加した（図４Ｄ、Ｅ）。各ｓｇＲＮＡを有する各腫瘍内のがん細胞の数を決定するために、バルク腫瘍保有肺ＤＮＡからのｓｇＩＤ−ＢＣ領域を増幅し、産物をディープシーケンシングし、発明者らのＴｕｂａ−ｓｅｑ分析パイプラインを適用した。各マウス内の不活性ｓｇＲＮＡの分布に対して各腫瘍抑制因子についての成長作用の全分布を計算した。各ｓｇＲＮＡについて、分布内の異なるパーセンタイルの腫瘍内のがん細胞の数は、不活性分布において対応するパーセンタイルの大きさによって分割された（図５Ａ）。この相対的及びマウス内比較は、Ｔｕｂａ−ｓｅｑの精度を最大にした（方法）。一般的にがん成長を抑制する腫瘍抑制因子を同定するために、１１個の腫瘍抑制因子標的ｓｇＲＮＡの各々を含有する腫瘍の相対的な対数正規（ＬＮ）の平均の大きさも決定した（図５Ｂ）。これらの分析は、ＫｒａｓＧ１２Ｄ駆動肺腫瘍成長においてＬｋｂ１、Ｒｂ１、Ｃｄｋｎ２ａ、及びＡｐｃの既知の腫瘍抑制機能を確認した（図５Ａ、Ｂ、及び図１２Ｂ）。ＫＴマウス（Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９対立遺伝子を欠く）においてＬｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅで発生させた腫瘍は、各ｓｇＲＮＡを有する腫瘍の大きさの分布において相違がほんのわずかであった（図１４Ａ〜Ｃ）。
【０１０２】
この方法の再現性を評価するために、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅで腫瘍を発生させた１５週間後にさらなるＫＴ；Ｃａｓ９マウスのコホートを分析した。腫瘍発生後１２週間で同定された全ての腫瘍抑制因子の腫瘍抑制作用が確認された（図５Ｃ及び図１４Ｅ〜Ｆ）。多重レンチウイルス−ｓｇＲＮＡ／Ｃｒｅ送達及び腫瘍バーコードシーケンシングを使用して腫瘍抑制因子を検出する発明者らの能力は、９５パーセンタイル腫瘍のＬＮの平均の大きさ及びがん細胞の相対数の両方により評価されるとき、再現性があった（図５Ｃ及び図１４Ｅ、Ｆ）。９５パーセンタイル腫瘍での成長作用は、非常に良く
相関し（Ｒ２＝０．９５３）、ＬＮ平均に関連するｐ値は、１５週の時間点で、３匹のマウスしか使用しなかったにもかかわらず、２つの時間点間で類似した（図５Ｃ）。
【０１０３】
ｐ５３媒介腫瘍抑制の同定及び腫瘍抑制因子プール内の腫瘍の大きさの分布の再現
ＫＰＴマウスにおける腫瘍の大きさの分布と一致して、ＬＮ平均または９５パーセンタイルまでの腫瘍の分析のいずれも、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴＳＰｏｏｌ／Ｃｒｅ発生腫瘍を有するＫＴ；Ｃａｓ９マウスにおいてｐ５３標的化の作用を明らかにしなかった（図５）。予想どおり、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇｐ５３／Ｃｒｅ発生腫瘍はより大きい大きさでべき乗則分布を示し、ｓｇｐ５３はＬｅｎｔｉ−ｓｇＴＳＰｏｏｌ／Ｃｒｅ誘導腫瘍を有するＫＴ；Ｃａｓ９マウスにおいて最も大きい腫瘍内で濃縮された（図１５Ａ、Ｂ）。これは、小さい画分の腫瘍が大きい大きさに成長することを可能にするｐ５３不活性化と一致する。ｐ５３標的化の作用は、さらなる改変の進行性蓄積及び腫瘍進行を制限する際の既知のｐ５３の作用と一致する後の１５週の時間点でより大きかった（図１５Ａ、Ｂ）。
【０１０４】
重要なことには、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴＳＰｏｏｌ／Ｃｒｅ発生腫瘍を有するＫＴ；Ｃａｓ９マウスにおいて、Ｌｋｂ１欠損腫瘍は、ＫＬＴマウスからのデータと一致する腫瘍の大きさの対数正規分布を示した（図１６Ａ）。したがって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介ゲノム編集により生成されたｐ５３欠損及びＬｋｂ１欠損腫瘍の両方は、従来のフロキシング対立遺伝子を使用して発生させたものと類似する大きさの分布を有する。これは、プールされた環境においても、個々の腫瘍の大きさの定量化が腫瘍抑制因子不活性化時に腫瘍の大きさが異なる特徴的な分布を明らかにすることができることを示唆する。
【０１０５】
インビボでの肺腫瘍成長の抑制因子としてのＳｅｔｄ２及びＲｂｍ１０の同定
興味深いことに、インビボでの肺腫瘍成長に対する既知の作用によりいくつかの腫瘍抑制因子を適切に明らかにすることに加えて、Ｔｕｂａ−ｓｅｑもメチルトランスフェラーゼＳｅｔｄ２及びスプライシング因子Ｒｂｍ１０を肺腫瘍成長の主な抑制因子として同定した。Ｓｅｔｄ２は、唯一のヒストンＨ３Ｋ３６ｍｅ３メチルトランスフェラーゼであり、微小管のメチル化を通してゲノム安定性にも影響を及ぼし得る。肺腺癌を含むいくつかの主要ながんの種類において頻繁に変異されるにもかかわらず、インビボでの腫瘍抑制因子としてのその役割についてはほとんど知られていない。Ｓｅｔｄ２の不活性化は腫瘍の大きさを劇的に増加させ、ｓｇＳｅｔｄ２含有腫瘍は、対照腫瘍よりも５倍超多いがん細胞を有する（図５Ａ、Ｂ、及び図１６Ｂ）。興味深いことに、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＳｅｔｄ２／Ｃｒｅで発生させた腫瘍は、腫瘍の大きさの対数正規分布を示した（図１６Ｃ）。実際、Ｌｋｂ１不活性化のみが類似する適応度利点をもたらし、肺腺癌患者において過剰腫瘍成長を駆動する際のＳＥＴＤ２変異の潜在的な重要性を強調する（図１６）。
【０１０６】
スプライシング因子も多くのがんの種類において潜在的な腫瘍抑制因子として現れている。スプライソソームの構成要素は１０〜１５％のヒト肺腺癌において変異するが、腫瘍抑制に対するそれらの機能的寄与についてはほとんど知られていない。Ｒｂｍ１０の不活性化は、上位５０パーセントの肺腫瘍においてがん細胞の数を大幅に増加させ、ＬＮの平均の大きさを増加させた（図５Ａ、Ｂ）。これらのデータは、Ｓｅｔｄ２媒介リジンメチル化の不在及び異常な前ｍＲＮＡスプライシングが各々、肺腺癌において顕著な腫瘍原性促進作用を有することを示唆する。
【０１０７】
Ｔｕｂａ−ｓｅｑはインビボでの腫瘍抑制を定量化するための正確かつ高感度な方法である。
同じマウス内に異なる遺伝子改変を保有する多くの腫瘍内のがん細胞の数を定量化することにより、複数の生物学的及び技術的変動源の同定及び排除が可能となった（方法）。マウス当たり多くの病変を発生させ、全ての病変をバーコード化し、複数のｓｇＲＮＡを各マウス内にプールし、プールとともに不活性ｓｇＲＮＡを含むことにより、腫瘍成長に
おけるばらつきの多くの源を同定し、補正することができる。これらの重要な特徴なしには、発明者らの分析は、発生させた腫瘍の数におけるばらつき（ＣＶ＝２７％）、同じ遺伝子型のマウス間の平均腫瘍の大きさ（ＣＶ＝３８％）、ならびに個々のマウス内の異なる腫瘍抑制遺伝子不活性化の平均効果量間のわずかな相関（ＣＶ＝１１％）に困惑する。
【０１０８】
全ての腫瘍内のｓｇＲＮＡの表示などのバルク測定値を使用するよりも、各腫瘍の大きさを計算することにより、異なる腫瘍抑制因子不活性化の成長作用をより正確かつ高感度に確かめた。興味深いことに、発明者らの同定した腫瘍抑制因子（Ａｐｃ、Ｒｂ１、Ｒｂｍ１０、及びＣｄｋｎ２ａ）の３分の２は、各バーコード化された腫瘍内のがん細胞の数を考慮したときにのみ同定され、ｓｇＩＤ表示の倍率変化のみを考慮したときには同定されなかった（図５Ｄ）。実際、効果量、統計的有意性、及び小さい作用で腫瘍抑制因子を検出する能力は全て、ｓｇＩＤ表示における変化の単純な分析と比較して、Ｔｕｂａ−ｓｅｑパイプリンを使用して向上した（図５Ｅ、Ｆ）。したがって、Ｔｕｂａ−ｓｅｑは、機能的腫瘍抑制遺伝子の成長抑制作用を正確に捕捉するために必要な分解能レベルを提供する。
【０１０９】
的確なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介ゲノム編集の確認
腫瘍抑制因子不活性化についての選択を調査し、的確なｓｇＲＮＡ媒介ゲノム編集を確認するための直交アプローチとして、３匹のＬｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅ感染（形質導入）ＫＴ；Ｃａｓ９マウスのバルク肺ＤＮＡからの各ｓｇＲＮＡ標的領域をＰＣＲ増幅し、ディープシーケンシングした。比較的高画分のＳｅｔｄ２、Ｌｋｂ１、及びＲｂ１対立遺伝子が、的確なｓｇＲＮＡ活性、及びこれらの遺伝子の不活性化を伴う腫瘍拡大と一致する標的部位で不活性化インデルを有した（図６Ａ及び図１５Ｃ〜Ｆならびに１７Ａ、Ｂ）。
【０１１０】
Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅ感染（形質導入）ＫＴ；Ｃａｓ９マウスのバルク肺ＤＮＡからのこれらの遺伝子の標的領域の増幅及びシーケンシングも、全ての標的遺伝子がインデルを含有したことを確認した（図６Ａ）。発明者らのプールに含まれた遺伝子の全てはヒト肺腺癌において繰り返し変異され、発がん性ＫＲＡＳを有する腫瘍において頻繁に変異された（図７Ａ）が、Ａｒｉｄ１ａ、Ｓｍａｄ４、Ｋｅａｐ１、及びＡｔｍは、いずれの基準によっても腫瘍抑制因子として同定されなかった（図５及び６Ａならびに図１４Ｄ〜Ｆ）。Ａｔｍの腫瘍抑制機能の欠如は、Ａｔｍｆｌｏｘｅｄ対立遺伝子を使用した結果と一致し、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＳｍａｄ４／Ｃｒｅに感染させた（形質導入した）ＫＴ；Ｃａｓ９マウスにおけるインビボでの発がん性ＫｒａｓＧ１２Ｄ駆動肺腫瘍成長でのＳｍａｄ４の腫瘍抑制機能の欠如を確認した（図１７Ｃ、Ｄ）。これらの遺伝子について、遺伝子発現もしくは環境状況の変化、追加時間、または同時がん遺伝子及び／もしくは腫瘍抑制因子改変は、肺がん細胞において成長利点を付与するこれらの経路の不活性化に必要であり得る。
【０１１１】
Ｓｅｔｄ２の腫瘍抑制作用をさらに検証し、Ｓｅｔｄ２欠損腫瘍の組織診断を評価するために、不活性ｓｇＲＮＡ（ｓｇＮｅｏ２）またはＳｅｔｄ２を標的とする２つの異なるｓｇＲＮＡのいずれかを含有するレンチウイルスベクターを用いてＫＴ及びＫＴ；Ｃａｓ９マウスにおいて腫瘍を誘導した。Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＳｅｔｄ２／Ｃｒｅベクターのいずれかで発生させた腫瘍を有するＫＴ；Ｃａｓ９マウスは、大きい腺腫及び腺癌を発達させ、同じウイルスで発生させた腫瘍を有するＫＴマウスよりも全体的に有意に大きい腫瘍負荷を有した（図６Ｂ、Ｃ）。これらのマウスの組織学的分析は大きいマウス間のばらつきを明らかにしたが、Ｔｕｂａ−ｓｅｑによる個々の腫瘍の大きさの分析は、対照腫瘍に対してＳｅｔｄ２欠損腫瘍においてがん細胞の数がほぼ４倍増加したことを確認した（図６Ｃ、Ｄ、及び図１８）。重要なことには、従来の方法によるＳｅｔｄ２腫瘍抑制の検証は、発明者らの初期の１１の推定上の腫瘍抑制因子のスクリーニングよりも多いマウスを必
要とし、スループットを増加させ、コストを削減する多重ｓｇＲＮＡの利益を強調する。
【０１１２】
考察
多くの推定上の腫瘍抑制因子ががんゲノムシーケンシングから同定されてきたが、限られた戦略が、迅速、系統的、かつ定量的様式で、それらの機能を試験する（例えば、インビボで）ために存在する（図１９）。ＤＮＡバーコード化、ハイスループットシーケンシング、及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介ゲノム編集を組み合わせることにより、Ｔｕｂａ−ｓｅｑは、これらの分析のスループットを増加させるだけでなく、インビボでの腫瘍成長の例外的に正確かつ詳細な定量化を可能にする。
【０１１３】
興味深いことに、同時に、同じマウスで、同じゲノム改変で発生させた腫瘍は、成長のたった１２週間後に大いに異なる大きさに成長した。したがって、さらなる自発的改変、初期の形質転換細胞の状態における相違、または局所微小環境は、どのくらい迅速に腫瘍が成長し、拡大し続ける能力を有するかに影響を及ぼし得る。Ｔｕｂａ−ｓｅｑは、遺伝子機能の特性を明らかにした腫瘍の大きさの遺伝子型特異的分布を固有に明らかにすることもできた。ｐ５３欠損は、最も大きい腫瘍についてべき乗則分布される腫瘍の大きさの分布を生成し、非常に大きい腫瘍がさらなる稀に獲得される駆動物質変異により生成されるマルコフプロセスと一致する。逆に、Ｌｋｂ１不活性化は、大部分の病変の大きさを増加させ、通常の指数関数的成長プロセスを示唆した。したがって、腫瘍抑制因子は、Ｔｕｂａ−ｓｅｑを介して同定される、それらの分子機能の兆候となり得る、異なる腫瘍抑制モードを有することができる。興味深いことに、Ｓｅｔｄ２は、近年、チューブリンをメチル化することが示唆され、Ｓｅｔｄ２欠損は、微小管における改変に起因して、微小核及び遅滞染色体を含む様々な形態のゲノム不安定性をもたらし得る。ゲノム不安定性は、稀な有利な改変、ならびに非常に確率的であり、べき乗則分布される腫瘍成長を生成することが予想される。しかしながら、発明者らの研究におけるＳｅｔｄ２欠損肺腫瘍の大きさの分布は、厳密に対数正規であり、したがって、Ｓｅｔｄ２喪失の主な影響が一般的に成長を調節不全にする遺伝子発現プログラムの誘導であると推測する（図６Ｄ及び図１６Ｂ、Ｃ）。
【０１１４】
数千の個々の腫瘍を評価した発明者らの分析のスケールは、機能的腫瘍抑制遺伝子を同定する発明者らの能力を劇的に向上させた。バルク測定を介した腫瘍成長の推定は、腫瘍成長に対する利点として発明者らが明らかにした腫瘍抑制因子の３分の１しか同定しなかった（図５Ｄ〜Ｆ）。従来のフロキシングされた対立遺伝子とは異なり、肺におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介ゲノム編集は、全ての腫瘍のおよそ半分においてホモ接合性ヌル対立遺伝子を生成した（図１１Ｄ）。したがって、標的遺伝子の均一なホモ接合体欠失の欠如は、各腫瘍のバーコード化及び分析により、バルク測定からの腫瘍抑制シグナルを減少させ、Ｔｕｂａ−ｓｅｑは、この技術的限界を効果的に克服する。
【０１１５】
多数の抑制因子を分析することにより、発明者らのデータは、初期の新生細胞が、多くの腫瘍抑制因子改変が適応性であり、成長利点を付与した、進化的に発生期の状態で存在することを示唆する。対照的に、がん細胞株におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９スクリーニングは、さらなる腫瘍抑制因子改変があまり利点を提供せず、さらには有害であり得ることを見出した。この知見は、それらの進行期疾患起源、ならびに培養における最適増殖能のための選択に起因して、最適成長適応度に達する、非常に成熟した進化状態において存在するがん細胞株と一致する。さらに、腫瘍抑制とインビボ環境の多くの態様との間の密接な関連は、インビボでの（または例えば、オルガノイド培養物もしくは３Ｄ培養組織などの組織の状況において）腫瘍において腫瘍抑制因子喪失の作用を分析する重要性を強調する。
【０１１６】
興味深いことに、ヒトがんにおける腫瘍抑制因子改変の頻度は、それらの腫瘍抑制因子
の機能の規模に直接対応しなかった。例えば、ＳＥＴＤ２及びＲＢＭ１０は、類似するパーセンテージのヒト肺腺癌において変異するが、Ｓｅｔｄ２欠損はＲｂｍ１０欠損よりも非常に大きい成長利益を付与した（図５Ａ、Ｂ）。これは、個々の患者に大いに重要であり得る低頻度の推定上の腫瘍抑制因子の機能上の重要性を決定するために、インビボでの遺伝子機能の迅速かつ定量的分析を可能にする方法の高まる必要性を強調する。
【０１１７】
腫瘍抑制因子改変の臨床上の重要性についての理解は非常に限られており、これは依然として主な満たされない必要性であるが、腫瘍成長が強い駆動物質は弱い駆動物質よりも魅力的な臨床標的を表し得る。Ｔｕｂａ−ｓｅｑは、腫瘍抑制遺伝子喪失のより複雑な組み合わせの調査、ならびに腫瘍成長及び進行の他の態様の分析を可能にする。Ｔｕｂａ−ｓｅｑは、他のがんの種類を研究するようにも適応可能であり、腫瘍成長を阻害するのではなく、通常促進する遺伝子の調査を可能にするはずである。最後に、本方法は、最終的により正確で個々の患者に合わせた治療をもたらし得る遺伝子型特異的治療応答の調査を可能にする。
【０１１８】
本研究における病変の統計特性
腫瘍の大きさの分布は一般的に、マウス−ｓｇＲＮＡ対内で見たとき、２次べき乗則に対する傾きと対数正規であった（図２０）。発明者らの研究の各腫瘍を、それを保有したマウスｍにより定義された対数変換された大きさｔｍｒｂ、その最初のバーコードにより同定された同族ｓｇＲＮＡ  ｒ、及び固有のバーコード配列（ＤＡＤＡ２クラスターのコンセンサス）ｂに割り当てた。発明者らのアプローチは、様々なエラー源を調べ、それに対処するように設計された。発明者らは、（ｉ）同じ挿管手順を介して、同じレンチウイルス力価で感染させた（形質導入した）同型マウス（多くの場合、同腹仔）内の引き起こされた腫瘍の数が大いに変動した、（ｉｉ）平均の腫瘍の大きさが同型マウス内で変動した、（ｉｉｉ）ある特定のマウスが、特定の腫瘍抑制因子を標的とするｓｇＲＮＡを有する腫瘍の成長により適していた、及び（ｉｖ）同じマウス内で同じｓｇＲＮＡを有する腫瘍の大きさが劇的に変動したことを見出した。
【０１１９】
【表１】
2020512817.tif 000002
【０１２０】
全体的に、腫瘍負荷に対する腫瘍抑制因子の不活性化の作用は、これらの他の源と比較して小さい。従来のウイルス−Ｃｒｅに基づく遺伝子操作されたマウスモデルは、マウス当たり数百〜数千の腫瘍を発生させることによりばらつきの主な源に対処する。発明者らは、この環境においても同じ遺伝子構築物を有する同じマウス内で引き起こされた腫瘍の大きさにおいて確率的に観察した。これらの実験において個々の腫瘍内のがん細胞の数は決して正確に測定されることはなく、代わりに、平均の腫瘍の大きさ及び引き起こされた腫瘍の数の合体である総腫瘍面積が最もよく測定される。したがって、このアプローチは、（ｉ）サンプリングされた平均の大きさは平均の大きさの最良の推定量ではない、（ｉｉ）引き起こされた腫瘍の数は決して直接測定されない（２７％の変動係数（ＣＶ）で変動する量）、（ｉｉｉ）マウス背景におけるばらつきは無視される、及び（ｉｖ）腫瘍面積を評価するために使用される方法もばらつきを導入するため、欠点がある。これらの理由のため、ＫｒａｓＧ１２Ｄ／＋背景において最も強力な腫瘍抑制因子（Ｓｅｔｄ２）でさえ作用の規模は、同型マウス間の分散よりも小さい（図６Ｃ）。
【０１２１】
個々のマウス内のウイルス−Ｃｒｅベクターにより引き起こされた病変の数におけるばらつきは、腫瘍抑制因子の作用の推定にも影響を与える。各腫瘍を固有にバーコード化し、次いで方法において詳述される発明者らの計算的アプローチを使用して腫瘍を正確に呼び出すことにより、このばらつきの源を最小にする。発明者らのパイプラインにおいて呼び出された病変の数の分散は、反復シーケンシング実行にわたって１０．７％のＣＶを示し、一方で、同型マウス間の呼び出された病変の変動は２７％のＣＶを示した。したがっ
て、固有のＤＮＡバーコードに基づいた発明者らの腫瘍数の推定は、腫瘍の数が同型マウス間で一定であると仮定するよりも有意により正確である（感染（形質導入）による技術的ばらつきに起因して、レンチウイルスベクターにより感染させた（形質導入した）上皮細胞の数が異なる可能性がある）。以下に、上記表に列記したばらつきの残りの源を調べ、軽減し、論じる。
【０１２２】
ｓｇＲＮＡに依存しないマウス間のばらつき
発明者らの多重アプローチは、（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的腫瘍抑制遺伝子、（ｉｉ）個々のマウス、及び（ｉｉｉ）それらの相互作用に起因する成長作用を調べる。これは、単に、各マウス内に多くのｓｇＲＮＡが含まれ、同じマウスにおいて同じｓｇＲＮＡを有する多くの病変が測定されるため、可能である。発明者らは、各ｓｇＲＮＡの平均が対数変換され、偏り補正された予想の大きさにおいて表面上同型マウス間で統計的に有意な相違を観察した（ηｍｒ＝Ｅｍｒ［ｔｍｒｂ］）。これらの相違は、簡潔に要約され、その後、ｔｍｒｂから差し引いて、各腫瘍抑制因子の強度をより良く決定する。
【０１２３】
マウスは、ｓｇＲＮＡに依存しない成長摂動ηｍ＝Ｅｒ［ηｍｒ］（すなわち、腫瘍感受性及び腫瘍抵抗性マウスのスペクトルがあった）及びマウス内でｓｇＲＮＡ依存共分散ηｍｒ（例えば、異常に大きいＬｋｂ１欠損腫瘍を保有したマウスは異常に大きいＳｅｔｄ２欠損腫瘍も保有した）の両方を示した。約４０％のマウス間のばらつきは、ηｍを正しく正規化することによって排除されたが、ｓｇＲＮＡに依存しない要因に起因しないηｍｒにおけるばらつきは、たった１０．７％であると推定された。発明者らは、このηｍｒのばらつきの５分の１のみを排除することができた（以下に詳述される）。したがって、腫瘍感受性におけるばらつきの大半は、ｓｇＲＮＡに依存しないように見えるが、わずかな遺伝子−マウス共分散は、精度＜１０％まで平均腫瘍成長の利点を推定するとき、尚も派生的である。
【０１２４】
腫瘍発生後、同じ時間点で分析された同型マウス、すなわち、同じ遺伝子操作された要素を有するものは、同腹仔及び同ケージであることが多いが、混合１２９／ＢＬ６背景に由来する。これらのマウスは、実在の患者よりもはるかに同種の遺伝子型及び環境を有する可能性があるが、個々のマウス間の関連がある相違は尚も現れた。これらの傾向は発明者らの前例がない分解能により、発明者らのデータにおいて同定され得るが、変動は小さく、異なるマウス構築物を比較する実験（例えば、目的の遺伝子のフロキシングされた対立遺伝子を有する、または有しないマウスにおいて腫瘍成長を比較する従来のアプローチ、またはＬｅｎｔｉ−ｓｇＳｅｔｄ２／Ｃｒｅ対Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＮｅｏ／Ｃｒｅで発生させた腫瘍を有するマウスからの発明者らの結果（図６を参照されたい））に対してさらに大きな作用を有するはずである。
【０１２５】
各マウスはいくつかの不活性ｓｇＲＮＡを含有したため（その平均はマウス内で互いにはっきりと異ならない）、集約した不活性ｓｇＲＮＡ平均に対して大きさを単純に正規化することによりｓｇＲＮＡに依存しないマウス作用を差し引くことができた：μｍｒ＝Ｅｍｒ［ｔｍｒｂ］−Ｅｍ，ｉｎｅｒｔｓ［ｔｍｒｂ］。発明者らのノンパラメトリックアプローチにおいて、ＬＮ  ＭＬＥ平均とほぼ同一である傾向がある不活性ｓｇＲＮＡ中央値で単純に分割する。
【０１２６】
ｓｇＲＮＡ特異的なマウス間のばらつき
単一マウスにおける複数の活性ｓｇＲＮＡのばらつきは、発明者らにｓｇＲＮＡ特異的マウス作用を調べることを可能にした。全体的に、μｍｒマトリックスは、ＫＴ；Ｃａｓ９マウスにおいて活性ｓｇＲＮＡ間で非常に正に相関した。発明者らは、主構成要素分析（ＰＣＡ）を使用してこれらの相関を分解した。第１の主構成要素（ＰＣ１）は、同型ＫＴ；Ｃａｓ９マウスにわたってμｍｒにおける分散の７５％を説明した。発明者らはこの
共分散についてのいくつかの仮説を試験した。
１．平均してより大きい腫瘍を保有したマウスは対数スケールでより大きい腫瘍分散も有した。そうであれば、ｓｇＬｋｂ１対ｓｇＩｎｅｒｔの腫瘍の大きさ比は、ｓｇＳｅｔｄ２対ｓｇＩｎｅｒｔの腫瘍の大きさ比と共変動する。
２．マウスの性別がこれらの異なる成長パターンを駆動する。
３．Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ切断効率は、Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９／＋のマウス対
Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９／ＬＳＬ−Ｃａｓ９のマウスの間で変動した。
４．マウス内の未知の遺伝的または環境要因は、駆動物質のサブセットの強度を乱す。
【０１２７】
ＰＣ１と平均腫瘍の大きさとを比較することにより、及び発明者らのＫＴ；Ｃａｓ９の１２週コホートのＫＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９／＋とＫＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９／ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスとを比較することにより、これら最初の２つの仮説を調査した。ＰＣ１は、平均腫瘍の大きさ（発明者らのパイプラインを介して計算される）及び肺重量（図２０Ｂ〜Ｄ）の両方と良く相関した。肺重量（グラム）は、肺試料の収集時に決定され、腫瘍の数及び平均腫瘍の大きさによって影響される可能性がある。ＰＣ１との肺重量の相関は、平均腫瘍の大きさと同様、これらの観察された傾向がパイプライン人工産物ではないことを確実にする。雄のマウスが、より大きい腫瘍、及び強い駆動物質と不活性との間でより大きい大きさ不一致を示したため、マウスの性別もＰＣ１と共変動し（点双列相関ｒ＝０．７５、データ示さず）、発明者らの最初の仮説と一致する。
【０１２８】
Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９対立遺伝子状態（ヘテロ接合またはホモ接合）は、１２週ＫＴ；Ｃａｓ９マウスにおいてＰＣ１（ｒ＝０．３４、データ示さず）と統計的に有意に相関しなかった。したがって、発明者らは、Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９対立遺伝子にヘテロ接合またはホモ接合であることが実質的に遺伝子不活性化の有効性に実質的に貢献するとは考えない。
【０１２９】
最後に、潜在的な遺伝的または環境要因の仮説は、ここで試験するにはあまりにも制約がない。しかしながら、発明者らの方法論は、これらの要因の研究を前進させることを可能にする。
【０１３０】
したがって、発明者らは、腫瘍許容性及びマウス性別が同型マウス間でこれらのｓｇＲＮＡ特異的相違に最も関与し、またＣａｓ９エンドヌクレアーゼヘテロ接合性がはっきりと腫瘍成長に影響を及ぼすようには見えず、発明者らの分析パイプラインの結果が他のマウス測定と一致すると結論付ける。
【０１３１】
確率的主構成要素モデルの混合は、μｍｒからηｍｒを排除するために使用された。このモデルは、その同型のコホートの他と同じ分布から生じるマウスの対数尤度を定義する。本質的に、このモデルは、異常なｓｇＲＮＡのプロファイルを有するマウスを同定する。しかしながら、マウスを「外れ値」または「許容される」マウスのいずれかに分類するのではなく、単純に外れるその尤度に基づいて各マウスを量った。統計的に、「外れ値」は、そのコホートとは異なる分布から得られるように見える点として定義される。実際、発明者らは、類似する外れ値マウスがマハラノビス距離（多次元データにおいて外れ値を特定するための一般的な基準）を使用して同定されたことを見出した。しかしながら、マハラノビス距離基準は、発明者らの用途においてその場限りである外れ値を分類するためのある閾値を必要とする。発明者らの確率的主構成要素モデルの混合を使用してマウスを量ることにより、ＫＴ；Ｃａｓ９マウスのＥｒ［μｍｒ］のばらつきを２．１％低減した。これはほんの軽度の向上であるが、この値は同定されたばらつきの全ての源を説明するはずであると感じたため、この補正をｓｇＲＮＡにより付与された平均成長利点の発明者らの最終報告に含めた。同型マウスのコホートにおける各ｓｇＲＮＡの最終的に報告された平均成長作用は、発明者らの混合モデルＰ（ｍ；μｍｒ）において各マウスｍの尤度に
よって量られた全てのマウスにわたるμｍｒの算術平均、すなわち以下であった。
【０１３２】
【数１】
2020512817.tif 000003
【０１３３】
発明者らのパラメトリック及びノンパラメトリックアプローチ、ならびに統計試験
腫瘍成長の大きさスペクトルを包括的に測定し、その後、このスペクトルの背景にある外因的要因全てを同定することは、難問を提示する。成長利点は、全ての既知の定量化された懸念を説明した腫瘍の大きさの高度に処理された手段により要約することができるか、または成長利点は、より少ない仮定を立てる様式でより明確に要約することができる。発明者らは両極端を選択した。定性的な結論は、いずれの場合においてもあまり異ならないが、同意は励みになり、異なるアプローチは異なる感覚を有する読者にアピールし得るため、両アプローチを提示する。
【０１３４】
最尤推定に基づいた発明者らのアプローチは上のセクションで詳述される。要約すると、大きさの分布の対数正規形状、ならびに（ｉ）引き起こされた腫瘍の数、（ｉｉ）全体的な腫瘍許容性、及び（ｉｉｉ）ｓｇＲＮＡ特異的なばらつきにおけるマウス間のばらつきについての発明者らの理解を説明することを試みる。それは、発明者らの大きさ測定の多次元性を活用し、発明者らが見出した全ての既知の外因的要因について補正する。以下に、対数正規を仮定する限界を論じ、パラメトリックアプローチを、べき乗則テールを示す腫瘍抑制因子分布に拡大する。
【０１３５】
発明者らのノンパラメトリック要約は、大きさの分布の様々な位置で増加した腫瘍成長についてアッセイするために、ｔ（ノンパラメトリック）ｍｒｂ（上記に定義される）のパーセンタイルを提示する。腫瘍分布の形状の仮定を立てず、マウス間のばらつきをモデル化しない。しかし、不活性の中央値大きさ及び各マウスに存在する腫瘍の数について補正することによって、マウス間のばらつきの大部分は排除される。この理由のため、最初の実験後に、パーセンタイルは対応する不活性パーセンタイルに対して常に報告された。ｓｇＲＮＡについての異なるパーセンタイル層間の自動補正が予想及び観察される。異なるパーセンタイル層は統計的に独立した値ではなく、それらの独立性を仮定する統計試験は展開されない。
【０１３６】
ノンパラメトリックアプローチは一般的に、活性ｓｇＲＮＡの分布の９０〜９９パーセンタイルが不活性から最大に外れることを見出す。分布が少なくとも対数正規的に歪んでいるという発明者らの知見は、この現象と一致する。さらに、活性ｓｇＲＮＡは、不活性分布を模倣するはずであるインフレーム挿入及び欠失を導入することができるため、インフレーム変異を有する活性ｓｇＲＮＡ分布において最小腫瘍または模倣する変異がない不活性の大きさが予想された。最後に、単一のヌル対立遺伝子のハプロ不全は、一般的に不明であるが、ハプロ不全は部分的に優性であるか、または存在しない場合、大きさの分布はより高い（９０〜９９）パーセンタイルで最も歪む。
【０１３７】
したがって、概して、ヌル変異率、接合状態、統計分解能（より高いパーセンタイルで降下する）、及び発明者らの大きさの分布の理解の懸念をおおよそ均衡したため、駆動物質の成長利益のだいたいの要約として９５パーセンタイルを使用した。発明者らのデータは、腫瘍抑制因子の喪失が全ての個々の腫瘍にわたって必ずしも成長利点もたらさないことを示唆する（例えば、図１及び２のｐ５３−対Ｌｋｂ１欠損）。実際、９５パーセンタイル測定は、ｐ５３喪失及び裾が重い分布の予想される結果と一致する理由のため、発明者らの実験においてｐ５３の検出に失敗する。それにもかかわらず、単純化は有用であり得、大きさの９５パーセンタイルは、成長の相違を良好に要約する。
【０１３８】
全ての信頼区間及びｐ値は、ｔｍｒｂのブートストラップを介して得られた。ブートス
トラップサンプリング後、発明者らの分析パイプラインの全ての後続ステップは、全てのブートストラップについて再計算された（不活性への正規化、ＰＣＡなど）。ブートストラップ試料は、各実験において大きさが元のｔｍｒｂと等しく（例えば、腫瘍発生の１２週間後に分析したＫＴ；Ｃａｓ９マウスの腫瘍）、復元でサンプリングした。２００，０００個の試料を報告された各９５％信頼区間について得、２，０００，０００個の試料を報告された全てのｐ値について得た。比率の信頼区間は、活性ｓｇＲＮＡ分布及び不活性ｓｇＲＮＡ分布の両方において不確かさを反映する。したがって、ｓｇＲＮＡ比の信頼区間が１を包含しない場合、ｓｇＲＮＡのこの要約統計が不活性ｓｇＲＮＡと一致するという帰無仮説は、ｐ＜０．０５（多重仮説について補正なしと仮定する）で棄却される可能性がある。
【０１３９】
全てのｐ値は、ｓｇＲＮＡ要約統計が不活性ｓｇＲＮＡ要約統計とは異なり、１１個の活性ｓｇＲＮＡのうちのいずれか１つが成長利点または欠点を招くという発明者らの多重仮説についてボンフェローニ補正された、両側仮説を報告する。活性ｓｇＲＮＡは常に全ｓｇＲＮＡ分布（４つの異なる不活性ｓｇＲＮＡ）と比較されたが、不活性ｓｇＲＮＡは他の３つの不活性の分布と比較されたのみであった。ｐ値は、２，０００，０００個の試料に限定された場合、ブートストラップの分解能の限界であるため、０．０００１を超えて報告されなかった。
【０１４０】
大きさ分布の包括的なパラメトリック説明
病変の大きさは、いくつかの遺伝子型において過剰量が非常に大きい病変を有して、おおよそ対数正規的に分布された。各遺伝子型及び時間についての観察された病変の大きさの分布に多種多様の２〜３つのパラメータ確率分布を適合する：（対数）−正規、（対数）−ガンマ、（対数）−ロジスティック、指数関数、ベータ、生成された極値（Ｇｕｍｂｅｌを含む）、及びべき乗則（パレートを含む）。全ての病変大きさ分布は、対数正規、対数−ガンマ、または対数−ロジスティック分布のいずれかに最も適合したが、他の全てより優れた単一分布はなかった。コルモゴルフ・スミルノフ検定は、最良適合単一分布を棄却することが多かった、すなわち、最も不適切でない適合のみが多くの場合において見出すことができた。この欠点は、発明者らが初めて測定することができた莫大な量の腫瘍の大きさ、及び腫瘍進行の複雑さを強調する。したがって、集合パラメトリック適合を調査した。
【０１４１】
いくつかの分布について対数正規及びべき乗則スケーリングの組み合わせが発明者らのデータを最も良く説明した。対数−ガンマ及び対数−ロジスティック適合は、対数正規適合よりも時折優れていたが、これらの代替え分布は、単にべき乗則挙動を示唆する急成長高次積率を有する。さらに、対数−ガンマ及び対数−ロジスティック分布パラメータの最尤推定量は、集束の保証なしに数値的に解決されなければならない。
【０１４２】
べき乗則分布を公平に同定する注意が払われた。潜在的なべき乗則適合は、最大尤度を使用してパラメータ化され、周辺尤度を使用して判定された。
１．正の実数の完全な支持のために、下記の各ｓｇＲＮＡ分布の最大尤度対数正規適合が同定された。
【０１４３】
【数２】
2020512817.tif 000004
【０１４４】
２．ドメイン［ｘ（ｍｉｎ）ｒ，∞）に対する下記のような腫瘍の最大尤度べき乗則適合を同定した。
【０１４５】
【数３】
2020512817.tif 000005
【０１４６】
ここで、ステップ１からの指数αｒ及び対数正規適合が使用される。べき乗則は、ｘ（ｍｉｎ）＝０のとき定義されず、そのため、自由変動が最小の（ｆｒｅｅｌｙ−ｆｌｏａｔｉｎｇ  ｍｉｎｉｍｕｍ）限られた支持に対してべき乗則を試験することが慣例である。
３．多適合モデルは、周辺尤度を使用して判定された。観察されたデータの尤度はベイズ情報量規準（ＢＩＣ）を使用してモデルの自由度について補正された。
【０１４７】
このアプローチはＡｌｓｔｏｔらによって推奨され、それらの付随するソフトウェアパッケージがこの分析に使用された。最大尤度適合の詳細は図３に提供される。報告されたｐ値は、共同対数正規及びべき乗則適合の周辺尤度の変形であり、そのため、ｐ＝１／（１＋Ｅｘｐ［周辺尤度］）である。これらの値は、データがその完全な支持を通して対数正規される帰無仮説を試験する。
【０１４８】
発明者らは、大きさが指数関数的に切り詰められたべき乗則に従い分布されるという仮説も試験する。この比較は、通常のべき乗則に対する一般的な対立仮説であり、スケールフリー挙動が有限区間に対してのみ存在することを暗示する。指数関数的に切り詰められたべき乗則挙動についての良好なエビデンスは見られない（データ示さず）。この理由のため、データが以下に論じる遺伝子型において腫瘍進行のスケールフリーモデルを支持すると考える。
【０１４９】
ｐ５３欠損腫瘍が大規模にべき乗則分布されるという強い反復的エビデンスが観察される。べき乗則力学は、ＫｒａｓＧ１２Ｄ／＋／ｐ５３Δ遺伝子型（ＫＰＴ腫瘍、及び両方のＫＴ；Ｃａｓ９  ｓｇｐ５３腫瘍時間点）の全ての転生物において観察された。これらのべき乗則分布適合の全ての周辺尤度は、良好または優良であった。この一致は、ＫｒａｓＧ１２Ｄ／＋／ｐ５３Δ遺伝子型が腫瘍の大きさにおいてべき乗則分布されるという仮説を強く支持する。
【０１５０】
一般に、べき乗則適合のＭＬ指数はおよそ２（αは約２）であった。べき乗則力学は、がん発生率を説明すると仮説されたが、この仮説を試験するための測定が以前はひどく時間がかかり、高価であったため、腫瘍の大きさの分布は十分に研究されておらず、そのため、次のセクションで大きさのべき乗則分布をもたらす単純な進化モデルを探索した。病変の大きさを深く調べることにより、駆動物質の成長利点を正確に同定するだけでなく、それらの根底にある作用モードの態様を明らかにするためにも有用であることが証明された。
【０１５１】
さらに稀に獲得される駆動物質変異は、腫瘍の大きさのべき乗則分布を予測する。
ｐ５３欠損腫瘍は、それらの最右裾で大きさのべき乗則分布を示す（図３Ｄ）。べき乗則分布は一般的に、単一ステップマルコフプロセスから生じず、代わりに、化合物ランダムプロセス、例えば、ランダムウォークまたは降着プロセスから生じる。最も単純で、発明者らが最も可能性があると考える、この観察されたべき乗則分布の説明は、指数関数的プロセスの組み合わせ、つまり、指数関数的拡張における第２の駆動物質事象の稀な取得であるｐ５３欠損腫瘍である。
【０１５２】
下記のように、腫瘍の大きさＮ（ｔ）が最初に時間ｔにわたって、速度ｒ１で指数関数的に成長すると仮定する。
【０１５３】
【数４】
2020512817.tif 000006
【０１５４】
Ｎ（ｔ＝０）＝１とする、すなわち、ｔ＝０と定義される感染（形質導入）時に１つの腫瘍原性細胞がある。さらに、時間ｔ＊で、新しい駆動物質を有する新しいクローンが腫
瘍集団に現れ、非常に速い速度ｒ２で成長したため、このクローンが屠殺の時点ｔＦで腫瘍集団を支配する、すなわち、下記であると仮定する。
【０１５５】
【数５】
2020512817.tif 000007
【０１５６】
０≦ｔ＊＜ｔＦであることに留意する。最後に、この変形させる力を有するクローンが腫瘍の大きさに比例する確率に合わせてランダムに現れる、すなわち、ｐ（ｔ＊）〜μＮ（ｔ）であると仮定する。このシナリオにおいて、分析時の腫瘍の大きさＮ（ｔ＝ｔＦ）＝ｎは、以下のように示される。
【０１５７】
【数６】
2020512817.tif 000008
【０１５８】
Ｎｅｗｍａｎ，Ｍ．Ｐｏｗｅｒ  ｌａｗｓ，Ｐａｒｅｔｏ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｚｉｐｆ’ｓ  ｌａｗ．Ｃｏｎｔｅｍｐ．Ｐｈｙｓ．４６，３２３−３５１（２００５）、表題Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌｓ（セクション４．１）に概説される偏差に基づいて、以下であることがわかる。
【０１５９】
【数７】
2020512817.tif 000009
【０１６０】
腫瘍の大きさは下記の指数でべき乗則分布される。
【０１６１】
【数８】
2020512817.tif 000010
【０１６２】
この結果は、観察された指数が２未満でなければならないか、またはさらなる駆動物質が獲得されなければならないかのいずれかであることを暗示する。１１週で屠殺されたＫＰＴマウスの指数の最尤推定は、２よりもわずかに大きいが、１５週で屠殺されたＫＴ；Ｃａｓ９マウスのｓｇｐ５３腫瘍の指数は２よりもわずかに小さい（しかし、これらの値の両方はそれらの９５％ＣＩにおいて２を包含する）。
【０１６３】
【表２】
2020512817.tif 000011
【０１６４】
上記仮定の全てが腫瘍進行の他の基本的な数理モデルにおいて立てられた。したがって、マルコフプロセスは観察されたべき乗則の最良の説明であると考える。
【０１６５】
最後に、ｔ＊での変形させる力を有する事象は特定されない。それは、遺伝子改変、後成的変化、細胞シグナル伝達状態の切り替えなどであり得る。べき乗則分布を生成し得る他のプロセスがあることにさらに留意する。
【０１６６】
複数のレンチウイルス感染を伴う腫瘍のエビデンス
大きさの測定は、複数のレンチウイルスベクターにより推定上感染させた（形質導入した）病変を同定するために十分正確である。発明者らの最初の実験（ＫＴ、ＫＬＴ、ＫＰＴマウス）は、より大きいウイルス力価（６，０００〜２２，０００カプシド）を使用したため、複数感染がより一般的であると予想した。２つの異なるウイルスベクターが同じ創始細胞を感染させた（形質導入した）場合、両方のレンチウイルスバーコードにより２つの病変として注釈が付けられた単一の腫瘍に拡張する。したがって、個々のマウス内の同じ大きさの２つのバーコード化された腫瘍が観察された場合、これらは単一の病変を発生させた２つのレンチウイルスベクターから生じたと予想され得る。したがって、同じマウスにおいて各病変とその最近傍との間の大きさの相違を調査した。
【０１６７】
小さい画分の病変が、予想よりも大きさがほぼ同じであることが観察され、一部の病変
が２つ以上のレンチウイルスベクターでの感染（形質導入）により発生させた場合の細胞から生じた可能性があることを示唆する。発明者ら（ヌル）の予想した分布は、異なる（ランダムに選択された）マウスにおける、観察された病変の大きさとそれらの最近傍との間の大きさの相違を表す。発明者らのデータは、複数感染が約１％の腫瘍において生じることを示唆するが、この稀な発生は、（ｉ）複数感染が稀であるように見える、及び（ｉｉ）複数感染が発明者らの推定の駆動物質の成長利益を減衰するはずであるため（複数感染は発明者らのベースラインのｓｇＩｎｅｒｔ構築物に成長利点を付与すると思われるため）、発明者らの研究の他の結論に実質的に影響を及ぼすとは考えられない。それにもかかわらず、この予備発見は、再度、発明者らのアプローチが従来の技法を使用して新しい生物学を明らかにする能力を図示する。
【０１６８】
方法
マウス及び腫瘍発
ＫｒａｓＬＳＬ−Ｇ１２Ｄ（Ｋ）、Ｌｋｂ１ｆｌｏｘ（Ｌ）、ｐ５３ｆｌｏｘ（Ｐ）、Ｒ２６ＬＳＬ−Ｔｏｍａｔｏ（Ｔ）、及びＨ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９（Ｃａｓ９）マウスが説明されてきた。肺腫瘍は、前述したように、示される力価でレンチウイルス−Ｃｒｅベクターを使用して、マウスの気管内感染（形質導入）により発生させた。腫瘍負荷は、示されるように、蛍光顕微鏡、肺重量、及び組織診断により評価された。全ての実験は、Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅのガイドラインに従い行われた。
【０１６９】
バーコード化されたＬｅｎｔｉ−ｍＢＣ／Ｃｒｅ及びＬｅｎｔｉ−ｓｇＰｏｏｌ／Ｃｒｅベクタープールの生成
ハイスループットシーケンシングを使用して、並行して個々の腫瘍内のがん細胞の数の定量化を可能にするために、レンチウイルスベクターを初期の感染させた（形質導入した）肺上皮細胞に安定して組み込むことにより、各腫瘍に固有である短いバーコード配列でレンチウイルス−Ｃｒｅベクターを多様化した。バーコード化されたレンチウイルスベクターの２つの異なるプールを用いて、様々なマウス背景で腫瘍を発生させた。１つ目は、Ｌｅｎｔｉ−ＰＧＫ−Ｃｒｅ（Ｌｅｎｔｉ−ｍｉｌｌｉｏｎＢＣ／Ｃｒｅ；Ｌｅｎｔｉ−ｍＢＣ／Ｃｒｅ、６つのバーコード化されたＬｅｎｔｉ−Ｕ６−ｓｇＲＮＡ／ＰＧＫ−Ｃｒｅベクターをプールすることにより生成される）の、約１０６個の固有にバーコード化された変異型のプールであり、これは、ＫｒａｓＬＳＬ−Ｇ１２Ｄ／＋；Ｒ２６ＬＳＬ−Ｔｏｍａｔｏ（ＫＴ）、ＫｒａｓＬＳＬ−Ｇ１２Ｄ／＋；ｐ５３ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ；Ｒ２６ＬＳＬ−Ｔｏｍａｔｏ（ＫＰＴ）、及びＫｒａｓＬＳＬ−Ｇ１２Ｄ／＋；Ｌｋｂ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ；Ｒ２６ＬＳＬ−Ｔｏｍａｔｏ（ＫＬＴ）マウスにおいて誘導された腫瘍内のがん細胞の数を分析するために使用した（図１）。２つ目は、１５個のバーコード化されたＬｅｎｔｉ−Ｕ６−ｓｇＲＮＡ／ＰＧＫ−Ｃｒｅベクターのプールであり、これは、ＫＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９（ＫＴ；Ｃａｓ９）及びＫＴマウスを感染させることにより、３つの異なる遺伝的背景において候補腫瘍抑制遺伝子の腫瘍抑制作用を評価するために使用した。発明者らのＬｅｎｔｉ−ｓｇＩｎｅｒｔ／Ｃｒｅベクターは、積極的に切断するが、機能的に不活性な陰性対照ｓｇＲＮＡである、Ｒｏｓａ２６ＬＳＬ−Ｔｏｍａｔｏ対立遺伝子内のＮｅｏＲ遺伝子を標的とする３つのｓｇＲＮＡを含んだ。
【０１７０】
ｓｇＲＮＡの設計、生成、及びスクリーニング
Ｃｒｅ、ならびに１１個の既知及び推定上の肺腺癌腫瘍抑制因子：ｓｇＬｋｂ１、ｓｇＰ５３、ｓｇＡｐｃ、ｓｇＡｔｍ、ｓｇＡｒｉｄ１ａ、ｓｇＣｄｋｎ２ａ、ｓｇＫｅａｐ１、ｓｇＲｂ１、ｓｇＲｂｍ１０、ｓｇＳｅｔｄ２、及びｓｇＳｍａｄ４の各々を標的とするｓｇＲＮＡを有するレンチウイルスベクターを生成した。不活性ガイド：ｓｇＮｅｏ１、ｓｇＮｅｏ２、ｓｇＮｅｏ３、ｓｇＮＴ１、及びｓｇＮＴ３を有するベクターも生成された。目的の各腫瘍抑制遺伝子を標的とする全ての可能な２０−ｂｐのｓｇＲＮＡ（Ｎ
ＧＧ  ＰＡＭを使用する）が同定され、利用可能なｓｇＲＮＡ設計／スコア化アルゴリズムを使用して、予測された的確な切断効率についてスコア化した。各腫瘍抑制遺伝子について、ヌル対立遺伝子を産生する可能性が最も高いと予測された３つの固有のｓｇＲＮＡを選択し、最高の予測された切断効率を有するｓｇＲＮＡ、ならびに全ての既知のスプライスアイソフォーム（ＥＮＳＥＭＢＬ）に保存されるエクソンを標的とするもの、スプライスアクセプター／スプライスドナー部位に最も近いもの、遺伝子コード領域において最も初期に位置付けられるもの、注釈が付けられた機能ドメイン（ＩｎｔｅｒＰｒｏ；ＵｎｉＰｒｏｔ）の上流に生じるもの、及び既知のヒト肺腺癌変異部位の上流に生じるものを優先した。各ｓｇＲＮＡを含有するＬｅｎｔｉ−Ｕ６−ｓｇＲＮＡ／Ｃｒｅベクターは、前述したように生成された。簡潔に、Ｑ５部位特異的変異誘発（ＮＥＢ  Ｅ０５５４Ｓ）を使用して、ｓｇＲＮＡを、Ｕ６プロモータならびにＰＧＫ−Ｃｒｅを含有する親レンチウイルスベクターに挿入した。各ｓｇＲＮＡの切断効率は、ＬＳＬ−ＹＦＰ；Ｃａｓ９細胞を各Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＲＮＡ／Ｃｒｅウイルスに感染させることにより決定された。感染（形質導入）の４８時間後に、ＹＦＰ陽性細胞のフローサイトメトリー定量化を使用して、感染（形質導入）パーセントを決定した。次いで、ＤＮＡを全ての細胞から抽出し、標的腫瘍抑制遺伝子座をＰＣＲにより増幅した。
【０１７１】
ＰＣＲアンプリコンは、サンガーシーケンシングされ、ＴＩＤＥ分析を使用して分析されて、インデル形成パーセントを定量化した。最後に、フローサイトメトリーにより決定される、ＴＩＤＥにより決定されたインデルパーセントをＬＳＬ−ＹＦＰ；Ｃａｓ９細胞の感染（形質導入）パーセントで除して、ｓｇＲＮＡ切断効率を決定した。目的の各腫瘍抑制遺伝子を標的とする最も効率的なｓｇＲＮＡは後続の実験に使用された。Ｔｏｍａｔｏ及びＬｋｂ１を標的とするｓｇＲＮＡは前述されており、ｐ５３を標的とするｓｇＲＮＡは以前に検討した（未公開データ）。この研究に使用された上位ガイドの標的インデル領域を増幅するために使用されたプライマー配列は以下である。
【０１７２】
【表３】
2020512817.tif 000012
【０１７３】
Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＲＮＡ／Ｃｒｅのバーコード多様化
目的の各腫瘍抑制因子を標的とする最良のｓｇＲＮＡを同定した後、各個々のｓｇＲＮＡに特異的な既知の８−ヌクレオチドＩＤ（ｓｇＩＤ；太字）及び１５−ヌクレオチドランダムバーコード（ＢＣ；下線付き）を用いて対応するＬｅｎｔｉ−ｓｇＲＮＡ／Ｃｒｅベクターを多様化した（図１０Ａを参照されたい）。
【０１７４】
【表４】
2020512817.tif 000013
【０１７５】
これらのプライマーを使用して、ＰＧＫプロモータの３’端及びＣｒｅの５’部分を含んだＬｅｎｔｉ−ＰＧＫ−Ｃｒｅベクターの領域をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲは、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（ｐｒｅｍｉｘ）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｒ０４０Ａ）を使用して行われ、ＰＣＲ産物はＱｉａｇｅｎ（登録商標）ＰＣＲ精製キット（２８１０６）を使用して精製された。ＰＣＲインサートをＢｓｐＥＩ及びＢａｍＨＩで消化し、ＸｍａＩ（ＢｓｐＥＩ比較可能端を産生する）及びＢａｍＨＩで切断したＬｅｎｔｉ−ｓｇＲＮＡ−Ｃｒｅベクターでライゲートした。
【０１７６】
多数の固有にバーコード化されたベクターを生成するために、Ｔ４リガーゼ（ＮＥＢ，Ｍ０２０２Ｌ）及び標準のプロトコル（８０μｌの総反応体積）を使用して、３００ｎｇの各ＸｍａＩ、ＢａｍＨＩ消化Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＲＮＡ−Ｃｒｅベクターを１８０ｎｇの各ＢｓｐＥＩ、ＢａｍＨＩ消化ＰＣＲ産物でライゲートした。ライゲーションは、残留塩を除去するためにＱｉａｇｅｎ（登録商標）ＰＣＲ精製キットを使用してＰＣＲ精製された。最大可能数の固有にバーコード化されたＬｅｎｔｉ−ｓｇＲＮＡ／Ｃｒｅベクターの
プールを得るために、１μｌの精製したライゲーションを、２０μｌのＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ  ＤＨ１０Ｂ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，１８２９００１５）に形質転換した。ＢＤ  ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ（商標）エレクトロポレーター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，１６５−２１００）において、１．９ｋＶで、０．１ｃｍのＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ／ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒキュベット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，１６５−２０８９）中で細胞を電気穿孔した。次いで、５００μｌの培地を添加し、３７℃で３０分間、２００ｒｐｍで振盪することにより、細胞を解放した。各ライゲーションについて、７つのＬＢ−Ａｍｐプレート（１つのプレートは１μｌ、１つのプレートは１０μｌ、そして５つのプレートは１００μｌ）上で細菌を平板培養した。翌日、１μｌまたは１０μｌのプレート上のコロニーを計数して、１００μｌのプレート上のコロニー数を推定し、これを、各ＩＤに関連する固有のバーコードの数の初期推定として使用した。
【０１７７】
１０ｍｌの液体ＬＢ−Ａｍｐを細菌の各プレートに添加して、コロニーをプールした。コロニーをプレートから液体中にそぎ落とし、各形質転換からの全てのプレートをフラスコ内に合わせた。フラスコを、３７℃で３０分間、２００ｒｐｍで振盪させて混合した。Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）ＨｉＳｐｅｅｄ  ＭｉｄｉＰｒｅｐキット（１２６４３）を使用して、ＤＮＡを中間調製した。Ｑｕｂｉｔ  ｄｓＤＮＡ  ＨＳキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｑ３２８５１）を使用して、ＤＮＡ濃度を決定した。
【０１７８】
品質管理手段として、各Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＲＮＡ−ｓｇＩＤ−ＢＣ／Ｃｒｅ  プラスミドプールからのｓｇＩＤ−ＢＣ領域を、製造業者の指示に従い、ＧｏＴａｑ  Ｇｒｅｅｎポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｍ７１２３）でＰＣＲ増幅した。これらのＰＣＲ産物を、サンガーシーケンシング（Ｓｔａｎｆｏｒｄ  ＰＡＮ  ｆａｃｉｌｉｔｙ）して、予想されたｓｇＩＤ及びランダムＢＣの存在を確認した。ＢｓｐＥＩ及びＸｍａＩは比較可能なオーバーハングを有するが、異なる認識部位を有するため、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＲＮＡ−ｓｇＩＤ−ＢＣ／Ｃｒｅベクターは、ＸｍａＩ部位を欠ｓｇＩＤ／ＢＣの良好なライゲーションから生成された。したがって、サンガーシーケンシングにより決定された（＞５％）、検出可能な量のバーコード化されていない親Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＲＮＡ／Ｃｒｅプラスミドを有したプールについて、標準方法を使用して、ＸｍａＩ（ＮＥＢ，１００μｌの反応物）でプールを消化することにより親のバーコード化されていないベクターを破壊した。Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）ＰＣＲ精製キットを使用して、これらの再消化したプラスミドプールを再精製し、ＮａｎｏＤｒｏｐにより濃度を再決定した。
【０１７９】
Ｌｅｎｔｉ−ｍＢＣ／Ｃｒｅ及びＬｅｎｔｉ−ＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅの生成
Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９対立遺伝子を欠いたマウスにおいて発明者らの初期の実験に使用するための、およそ１０６個の関連するバーコードを有するライブラリを得るために、６つのｓｇＩＤ−ＢＣバーコード化されたベクターをプールして、Ｌｅｎｔｉ−ｍｉｌｌｉｏｎバーコード／Ｃｒｅ（Ｌｅｎｔｉ−ｍＢＣ／Ｃｒｅ）を創出した。次いで、バーコード化されたＬｅｎｔｉ−ｓｇＲＮＡ−ｓｇＩＤ−ＢＣ／Ｃｒｅベクター（ｓｇＬｋｂ１、ｓｇｐ５３、ｓｇＡｐｃ、ｓｇＡｔｍ、ｓｇＡｒｉｄ１ａ、ｓｇＣｄｋｎ２ａ、ｓｇＫｅａｐ１、ｓｇＮｅｏ１、ｓｇＮｅｏ２、ｓｇＮｅｏ３、ｓｇＮＴ１、ｓｇＲｂ１、ｓｇＲｂｍ１０、ｓｇＳｅｔｄ２、及びｓｇＳｍａｄ４）をプールして、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅを生成した。レンチウイルス産生の前にＱｕｂｉｔ濃度により決定されるように、全てのプラスミドは等しい比率でプールされた。
【０１８０】
レンチウイルスの産生、精製、及び滴定
レンチウイルスベクターは、レンチウイルスベクターならびにデルタ８．２及びＶＳＶ−Ｇパッケージングプラスミドで２９３Ｔ細胞のポリエチレンイミン（ＰＥＩ）に基づくトランスフェクションを使用して産生された。Ｌｅｎｔｉ−ｍＢＣ／Ｃｒｅ、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅ、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴｏｍａｔｏ／Ｃｒｅ、Ｌｅｎｔｉ−
ｓｇＬｋｂ１、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＳｅｔｄ２＃１／Ｃｒｅ、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＳｅｔｄ２＃３／Ｃｒｅ、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＮｅｏ２／Ｃｒｅ、及びＬｅｎｔｉ−ｓｇＳｍａｄ４／Ｃｒｅを腫瘍発生のために生成した。トランスフェクションの８時間後に、酪酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｂ５８８７）を０．２ｍＭの最終濃度で添加して、ウイルス粒子の産生を増加させた。ウイルス含有培地を、トランスフェクションの３６、４８、及び６０時間後に収集し、超遠心分離（１．５〜２時間、２５，０００ｒｐｍ）により濃縮し、ＰＢＳに一晩再懸濁し、−８０℃で凍結した。濃縮したレンチウイルス粒子を、ＬＳＬ−ＹＦＰ細胞（Ｄｒ．Ａｌｅｊａｎｄｒｏ  Ｓｗｅｅｔ−Ｃｏｒｄｅｒｏからの寄贈）を感染させることにより滴定し、ＹＦＰ陽性細胞パーセントをフローサイトメトリーにより決定し、感染力価を既知の力価のレンチウイルス調製物と比較した。
【０１８１】
「ベンチマーク」細胞株の生成
ｓｇＩＤ「ＴＴＣＴＧＣＣＴ」を有する３つの固有にバーコード化されたＬｅｎｔｉ−Ｃｒｅベクターを使用して、既知の細胞数で各バルク肺試料にスパイクされ得るベンチマーク細胞株を生成し、各腫瘍内のがん細胞数の計算を可能にした。個々の細菌コロニーからのプラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（２７１０６）を使用して単離した。クローンをサンガーシーケンシングし、レンチウイルスを上述したように産生し、およそ３％の細胞が４８時間後にＹＦＰ陽性であるように、ＬＳＬ−ＹＦＰ細胞を非常に低い感染（形質導入）多重度で感染させた（形質導入した）。感染させた（形質導入した）細胞を拡張し、ＢＤ  Ａｒｉａ  ＩＩ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して選別した。ＹＦＰ陽性選別した細胞を再度平板培養し、拡張して、多数の細胞を得た。拡張後、ＢＤ  ＬＳＲ  ＩＩ（商標）分析器（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で、細胞をＹＦＰ陽性細胞パーセントについて再分析した。このパーセンテージを使用して、５×１０５個の組み込まれたバーコード化されたレンチウイルスベクターを含有する必要がある総細胞数を、３つの細胞株の各々について計算し、この計算に基づいて細胞をアリコートに分け、凍結した。
【０１８２】
【表５】
2020512817.tif 000014
【０１８３】
マウス肺からのゲノムＤＮＡの単離
バーコードシーケンシングを使用して、各腫瘍内のがん細胞の数を定量化する実験について、Ｆｉｓｈｅｒ  ＴｉｓｓｕｅＭｅｉｓｅｒを使用して、各マウスからの全肺を均質化した。３つの個々にバーコード化されたベンチマーク細胞株の各々からの５×１０５個の細胞を均質化時に添加した。組織を、２００μｌの２０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＡＭ２５４４）とともに、２０ｍｌの溶解緩衝液（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  ＳＤＳ）に均質化した。均質化した組織を５５℃で一晩インキュベートした。全ての腫瘍の正確な表示を維持するために、標準プロトコルを使用して、ＤＮＡをフェノール−クロロホルム抽出し、総肺ライセートの約１／１０からエタノール沈殿させた。ＤＮＡ収量を増加させるために、０．３グラム未満の重量の肺については、ＤＮＡは総肺ライセートの約１／５から抽出され、０．２グラム未満の重量のものについては、ＤＮＡは総肺ライセートの約３／１０から抽出された。
【０１８４】
シーケンシングのためのｓｇＩＤ−ＢＣライブラリの調製
マウス当たり３２μｇのゲノムＤＮＡからｓｇＩＤ−ＢＣ領域を増幅することにより、ライブラリを調製した。組み込まれたＬｅｎｔｉ−ｓｇＲＮＡ−ＢＣ／ＣｒｅベクターのｓｇＩＤ−ＢＣ領域は、ＴｒｕＳｅｑ  Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）アダプター及び５’多重タグ（ＴｒｕＳｅｑ  ｉ７インデックス領域は太字で示される）を含有する２４のプライマー対のうちの１つを使用してＰＣＲ増幅された。
【０１８５】
【表６】
2020512817.tif 000015
【０１８６】
ｓｇＩＤ−ＢＣ領域の単一ステップＰＣＲ増幅が使用され、これは、各腫瘍内のがん細胞数を決定するために非常に再現性があり、定量的な方法であることが見出された。以下のＰＣＲプログラムで、標準緩衝液（ＮＥＢ，Ｍ０４８２Ｌ）とともにＯｎｅＴａｑ  ２Ｘ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを使用して、マウス当たり８つの１００μｌ  ＰＣＲ反応（反応当たり４μｇのＤＮＡ）を行った。
１．９４Ｃ  １０分
２．９４Ｃ  ３０秒
３．５５Ｃ  ３０秒
４．６８Ｃ  ３０秒
５．ＧＯ  ＴＯ  ２（３４ｘ）
６．６８Ｃ  ７分
７．４Ｃ  無限大
【０１８７】
ゲル電気穿孔によりプールしたＰＣＲ産物を単離し、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキットを使用してゲル抽出した。個々のマウスからの精製したＰＣＲ産物の濃度は、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により決定され、等しい比率でプールされた。試料をＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ＨｉＳｅｑでシーケンシングして、１００ｂｐのシングルエンドリードを生成する（ＥＬＩＭ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ）。
【０１８８】
ウルトラディープシーケンシングを介した異なるｓｇＲＮＡ及び腫瘍の同定
固有のｓｇＩＤ−ＢＣは腫瘍を同定する。これらのｓｇＩＤ−ＢＣは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ＨｉＳｅｑで次世代シーケンシングを介して検出された。細胞数に対する各腫瘍の大きさは、各固有のｓｇＩＤ−ＢＣ対の存在量にほぼ対応すると予想された。腫瘍の大きさは、リードシーケンシングエラー率よりも大きい倍数分変動するため、真の腫瘍を繰り返し起こるリードエラーと区別するには、ディープシーケンシングデータを慎重に分析する必要があった。
【０１８９】
腫瘍及びそれらのそれぞれのｓｇＲＮＡは３つのステップにおいて同定された。（ｉ）異常及び低品質のリードは、ウルトラディープシーケンシング実行から廃棄され、（ｉｉ）固有のバーコードパイルアップは、同じ腫瘍から生じると予想した群に束ねられ、及び（ｉｉｉ）細胞数は、最も再現性があると証明された様式でこれらの束から推定された。
【０１９０】
リード前処理
リードは、発明者らのフォワードプライマーの下流の４９のヌクレオチドで始まり、発明者らの１００−ｂｐのシングルエンドリードの端部の上流の２２のヌクレオチドで終わった二構成要素ＤＮＡバーコード（８−ヌクレオチドｓｇＩＤ及び１５のランダムなヌクレオチドを含有する２１−ヌクレオチドバーコード配列）を含有した。異常なリード：脇側レンチウイルス配列を欠くもの、予想外のバーコードを含有したもの、及び高いエラー率を有するものは廃棄された。これは、３つのステップにおいて達成された（図８Ａ）。
１．ｓｇＩＤ−ＢＣのすぐ上流及び下流の１２個のレンチウイルスヌクレオチドを検査した。これら１２個のヌクレオチドは、各６−ｍｅｒが１つのミスマッチを許容することができるように、隣接する６−ｍｅｒ探索文字列の対を使用して同定された。これら１２のヌクレオチドがリード内の３７位で始まると予想したが、この位置付けを必要としなかったか、またはこの情報を活用しなかった。ネステッド６−ｍｅｒアプローチ（ｓｇＩＤ−ＢＣの脇側に位置するレンチウイルス配列を同定するための２つの機会による）を使用して、リード廃棄を最小にした。これは、発明者らのリードの非バーコード化領域がシーケンシングエラー率を推定するために使用され、したがって、リードエラーに対して偏る
べきではないため、この最初のステップにおいて特に重要であった。約７〜８％のリードについて、この第２の６−ｍｅｒの一致はリードを復旧させる、すなわち、ｓｇＩＤ−ＢＣのすぐ脇側に位置する６−ｍｅｒは予想した通りではなかった（発明者らの１つのミスマッチの許容にもかかわらず）が、これら内部６−ｍｅｒ配列のすぐ外側の６−ｍｅｒは認識され、発明者らにリードを復旧させ、バーコードを同定することを可能にした。
２．次いで、いずれかの方向で、長さが２ヌクレオチドを超えてｓｇＩＤ−ＢＣが外れるリードを廃棄した。発明者らの最初のバーコードは１５個のｓｇＩＤのうちの１つを含有することが予想されたため、これら１５個の配列のうちの１つと一致しなかったリードを廃棄した。１つのミスマッチ及び１つのインデルが整合において許容された。
３．次いで、１８ｂｐがｓｇＩＤ−ＢＣのいずれかの端部の脇側に位置するように、各リードの端部を刈り込んだ。次いで、品質スコアに従い刈り込んだリードをフィルタ処理し、２個以下のシーケンシングエラーを含有することが予測されたものを維持した。第２の（ランダム）バーコードに不要な塩基を有するリードも廃棄し、他の箇所の不要な塩基を修正した。
【０１９１】
これら３つの段階において、１４％のリードが段階１で廃棄され、約７％が段階２で廃棄され、＜２％が段階３で廃棄された。
【０１９２】
次いで、各段階で不合格であったそれらのリードを検査した。ＢＬＡＳＴ探索を行うことにより、段階１で廃棄されたそれらのリードが、発明者らの調製物（Ｐｈｉ  Ｘバクテリオファージゲノム及びマウスゲノム）またはレーン上で発明者らのと対にされる他の試料（一般的なプラスミドＤＮＡ）のいずれかからの人工産物に対応する情報価値がない配列を含有することが多かったと決定された。段階２において、異常なバーコード長は大きいインデルを含有したか、またはそれらのｓｇＩＤ−ＢＣのうちの１つもしくは両方が完全に欠けていることが多かったことが分かった。最後に、リードの内部領域が対応する末端よりも高い品質スコアを示したという事実に起因して、段階３で廃棄されたリードは非常に少なかった。この傾向の結果として、３つ以上のシーケンシングエラーを含有すると予想されるそれらのリードを廃棄する前に、リードの端部を刈り込むことが一般的な慣例である。
【０１９３】
ＤＡＤＡ２を介した固有のリードパイルアップのクラスター化
ｓｇＩＤ−ＢＣリードは、同一の配列のセットに集約され、計数された。固有のＤＮＡバーコード対の計数は、大きい腫瘍が繰り返し起こるシーケンシングエラーを生成すると予想されるため、固有の腫瘍に直接対応しない（図８Ｂ）。したがって、大きい腫瘍から生じる繰り返し起こるシーケンシングエラーから小さい腫瘍を区別するための方法（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）装置が０．１〜１％のエラー率を有する場合、１千万個の細胞の腫瘍が１万〜１０万個の細胞の腫瘍を模倣するシーケンシングエラーパイルアップを産生すると考える）を開発するために相当な努力を費やした。ＤＡＤＡ２は、ウルトラディープシーケンシングを伴うバーコード化実験においてこの問題に対処するために以前に使用されている。しかしながら、それは完全長Ｉｌｌｕｍｉｎａアンプリコンのウルトラディープシーケンシング用に設計されたため、発明者らの目的に合わせ、較正しなければならなかった。
【０１９４】
ＤＡＤＡ２において、より大きいパイルアップの繰り返し起こるシーケンシングエラーに起因するバーコードパイルアップの尤度は、以下に依存する。
１．より大きいパイルアップの存在量、
２．より小さいパイルアップとより大きいパイルアップとの間の特定のヌクレオチドの相違、及び
３．可変位置でのより小さいパイルアップの平均品質スコア。
【０１９５】
要因１及び２は、最初、発見的に（計算速度を最大にするため）、その後、ニードルマン−ウンシュアルゴリズムを介してより正確（必要な場合）に考えられた。ＤＡＤＡ２は、より小さいパイルアップがシーケンシングエラーにより生成された確率がΩ未満である場合、クラスターを２つに分ける。したがって、この値は、より大きいクラスターを分けるための閾値を表す。この閾値が大きい場合、リードパイルアップは許容的に分けられ（呼び出された腫瘍が多い、おそらく大きい腫瘍を分割する）、Ωが小さい場合、リードパイルアップは制限的に分けられる（呼び出された腫瘍が少ない、おそらく異なる小さい腫瘍を集約する）。
【０１９６】
シーケンシングエラーの尤度は、発明者らのウルトラディープシーケンシングデータから推測された。Ｐｈｒｅｄ品質スコアは、シーケンシングエラー率の理論推定値を提供するが、これらの推定値は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）装置によって異なる傾向があり、発明者らのプロトコルの特質（例えば、高忠実度ポリメラーゼを使用するにもかかわらず、ＰＣＲ増幅を介して導入される偶発的なエラーを含む）を説明しない。通常、ＤＡＤＡ２は、固有のＤＮＡクラスターと同時にシーケンシングエラー率を推定するが、発明者らのレンチウイルス構築物は、シーケンシングエラー率を直接推測するために使用され得る発明者らのｓｇＩＤ−ＢＣ領域の外側の非縮重領域を有した。さらに、エラー率及びバーコードクラスターを一緒に推定することは、計算量が多く、発明者らの全データセットをクラスター化し、関連があるクラスター化パラメータを探索するためには２０，０００を超えるＣＰＵ時間を必要とする。
【０１９７】
シーケンシングエラーモデルは、各Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）装置に対して、
１．発明者らのｓｇＩＤ−ＢＣのすぐ上流の１８のヌクレオチドとバーコードのすぐ下流の１８のヌクレオチドとを連結することにより、訓練偽リードを生成し、次いで
２．ＤＡＤＡ２の単一実行を使用してこれらの偽リードをクラスター化し、
３．ＤＡＤＡ２の単一実行を使用してｓｇＩＤ−ＢＣをクラスター化するためのこの訓練実行から推定されたエラー率を使用することにより、訓練された。
【０１９８】
レンチウイルスｓｇＩＤ−ＢＣ脇側配列の１つのクラスターのみを予想したため、訓練実行におけるシーケンシングエラーを推定するために、Ω＝１０−１００の非常に低い値を使用した。この値の改変は発明者らの訓練実行にはっきりと影響を及ぼさないが、それにもかかわらず、この値においても偶発的な非常に小さい派生的クラスターが発明者らのレンチウイルス配列から観察された。これらの派生的クラスターは、おそらく稀なＤＮＡ人工産物であり、決して我々の処理したリードの＞２％に達しなかった。シーケンシングエラーを推定するために非常に厳密なＤＡＤＡ２実行を使用することが優れたアプローチを表す（ゴルディロックスの原理により）と感じた。より許容された閾値はシーケンシングエラーを過剰適合する可能性があり、シーケンシングエラー率を過少評価し、一方で、エラー率が予想からの各リードの異常から直接推定されるアプローチ（Ω＝０であるＤＡＤＡ２実行に似ている）は、発明者らのデータのＤＮＡ人工産物の存在を無視し、したがって、シーケンシングエラー率を過大評価する。
【０１９９】
我々は、この研究に使用された各Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）装置（合計７台）でシーケンシングエラー率を訓練した。訓練は、全ての置換の種類（Ａ→Ｃ、Ａ→Ｔなど）の確率が推定されることを可能にする。Ｐｈｒｅｄ品質スコアの関数としてのエラー率は、利用可能なデータのＬＯＥＳＳ回帰を使用して決定された（図８Ｃ）。一般的に、エラー率は、トランスバージョンについてのＰｈｒｅｄ品質スコアにより予測されるよりもおよそ２〜３倍高かった（移行についての予想とおよそ一致する）。このエラー率の上昇は典型的であり、装置の較正ミス及び／またはＰＣＲ中に導入された変異を反映し得る。
【０２００】
ＤＡＤＡ２を使用して発明者らの前処理フィルタを通過した２重バーコードをクラスタ
ー化した。バーコード内の任意のインデルが同定され得るように（適切な脇側配列、時折、複数点変異としてインデルを間違って呼び出すＤＮＡアライメントアルゴリズムなしで）、非縮重レンチウイルス脇側領域の７つのヌクレオチドをバーコードに与えた。クラスター化中、（ｉ）クラスターが少なくとも２つの塩基分互いから外れる（すなわち、ＭＩＮ＿ＨＡＭＭＩＮＧ＿ＤＩＳＴＡＮＣＥ＝２）、（ｉｉ）新しいクラスターは、パイルアップの大きさがエラープロセス下で少なくとも２の倍数によって予測を超えたときにのみ形成される（ＭＩＮ＿ＦＯＬＤ＝２）、及び（ｉｉｉ）ニードルマン−ウンシュアルゴリズムが最大で４つの正味挿入または欠失とのアライメントのみを考慮する（  ＢＡＮＤ＿ＳＩＺＥ＝４、ＶＥＣＴＯＲＩＺＥＤ＿ＡＬＩＧＮＭＥＮＴ＝ＦＡＬＳＥ）ことも必要とされた。これらの選択のいずれもはっきりと結果に影響を及ぼさないが、それらは計算性能を増大し、バーコードが妥当な大きさの腫瘍に集約されるさらなる検証を提示した。
【０２０１】
パイプラインの調査及び較正
発明者らの最初のＰＣＲ増幅された多重ＤＮＡライブラリ（ＫＴ、ＫＬＴ、及びＫＰＴの腫瘍から）を３つ組でシーケンシングして調査し、発明者らの腫瘍呼び出しアプローチを設計した。
【０２０２】
再現性は３つの方法で調べた。（ｉ）全てのバーコード及び全てのマウスに関する推定された細胞存在量間の相関、（ｉｉ）発明者らの最初の実験において各マウスの各ｓｇＩＤについて呼び出された病変の数における変動、及び（ｉｉｉ）Ｃａｓ９を発現しないマウスにおいて一定であるべきである各ｓｇＩＤの平均の大きさにおける変動である。発明者らの３つ組実行のリード深度は必然的に変動するため（前処理後、４０．１×１０６、２２．２×１０６、及び３４．９×１０６リード）、これらの３つの実行は異なるシーケンシングエラー率で異なるＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）装置で行われ、また発明者らの初期のレンチウイルスプールは様々なレベルのバーコード多様性を有する６つの異なるｓｇＩＤを含有したため、発明者らの調査プロセスにおける技術的ばらつきは後の実験の技術的ばらつきを十分に近似した。発明者らの腫瘍大きさ分析パイプラインにおいて、発明者らは以下のことを見出した。
１．発明者らの３つの「ベンチマーク」ＤＮＡバーコードの平均存在量は、中央値存在量よりも反復実行間でより再現性があった。したがって、このベンチマークリード存在量の平均値（５００，０００個の細胞に相当する）を使用して、リード存在量を各腫瘍内のがん細胞の絶対細胞数に変換した（図９）。
２．再現性を向上したクラスターのコンセンサスバーコードからの≧２のエラーを有するリードを無視する。典型的には、バーコードクラスターにおける約８０〜９０％のリードはコンセンサスバーコードと正確に一致するが、約５％のリードはこのリードからの単一エラーであり、約５〜１５％のリードは≧２のエラーで外れた。≧２のエラーを有するこれらのリードは、反復実行間で十分に相関せず、絶対細胞数／腫瘍の大きさを再現性よく推定する発明者らの能力を妨げた。これらのリードはおそらく、それら自身の病変と考えられるには十分なエビデンスがなく、また大きいクラスターに計数されるには十分なエビデンスもない。したがって、これらのリードは除外された。
３．ＤＡＤＡ２のクラスターを分ける傾向は、Ω＝１０−１０での閾値であり、反復実行間の再現性を最大にするために、病変が、図１〜３については≧５００個の細胞、及び図４〜６については≧１０００個の細胞を含有することが必要とされた（図８Ｄ〜Ｆ）。高特異性（小さいΩ、高最小細胞数）の閾値パラメータは、病変の大きさをより再現性よく呼び出し、一方、高感度（大きいΩ、低最小細胞数）の閾値パラメータは病変量をより再現性良く呼び出した。１様相のみの再現性を過剰に優先することは軽率である。測定誤差が異なる様相を考慮する２つの閾値により、これらの競合優先がより良く平衡化された。
【０２０３】
このパイプラインで、発明者らのスクリーニングにおいてバーコードの多様性をいくつ
かの方法で調べた。第１に、このバーコードにおいてヌクレオチドがＡ’ｓ、Ｔ’ｓ、Ｃ’ｓ、及びＧ’ｓの間で等しく分布されたことが確認された（図１０Ｂ）。第２に、過剰な反復文字列（例えば、配列ＡＡＡＡＡ）についてのエビデンスは見出されなかった。第３に、発明者らのレンチウイルスプールにおける各ｓｇＩＤと対のランダムなバーコードの数を計算した。発明者らのバーコードライゲーションアプローチ（Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＲＮＡ／Ｃｒｅのバーコード多様化を参照されたい）を通して生成された各ベクターの多数の固有にバーコード化された変異型に起因して、発明者らのレンチウイルスプールに存在する大半のバーコードは、実験のいずれにおいてもいずれの病変で全く検出されなかった（多様性がその総病変数よりも非常に高かったため）。それにもかかわらず、尚も観察されたバーコードからバーコード多様性の量が推測された。これを推測するために、ｉマウスにおいてバーコードを観察する確率がポアソン分布されると仮定した。Ｐ（ｋ＝ｉ；λ）＝λｋｅ−λ／ｋ！、ここで、λｒ＝Ｌｒ／Ｄｒは、発明者らの全データセット（既知の量）の各ｓｇＩＤ  ｒについて呼び出された病変の数の比率Ｌｒを、各ｓｇＩＤの固有のバーコードの総数Ｄｒで除す。λｒ／（１−ｅ−λｒ）＝μｎｏｎ−ｚｅｒｏであることに留意し、ここで、μｎｏｎ−ｚｅｒｏ＝Σｉ＝１∞Ｐ（ｋ＝ｉ；λｒ）は、単純に、１回以上生じた各バーコードの発生の平均数であり、Ｄｒと計算することができる。発明者らの全データセットにわたって、同じマウスにおいて２つの異なる腫瘍を発生させる同じバーコードの平均確率は０．９１％であった。
【０２０４】
良好なバーコード多様性は、Ｌｅｎｔｉ−ｍＢＣ／Ｃｒｅ実験において６つのｓｇＩＤによっても示される。バーコードの多様性が低く、バーコードがマウス内でしばしば重複する場合、同じバーコードを有する２つの異なる腫瘍が一緒に束ねられるため、あまり多様ではないｓｇＩＤの平均の大きさは増加する。しかしながら、各ｓｇＩＤの平均の大きさは同型マウス内で＜１％変動し、したがって、この確率を否定する。生リード配列に基づいてクラスター化する前に各リードの同族ｓｇＩＤを同定することにより、またはクラスターのコンセンサス配列に基づいてクラスター化した後に同族ｓｇＩＤを同定することによる２つの方法で、ディープシーケンシング実行を処理することにより、シーケンシングエラーにもかかわらず、ｓｇＩＤを正確に呼び出す発明者らの能力も評価した。いずれかのアプローチを使用して、９９．８％のリードが同じ同族ｓｇＩＤと対になり、したがって、ｓｇＩＤが正確に同定される保証を提供する。後者のアプローチを発明者らの最終分析に用いることを選択した。
【０２０５】
発明者らの腫瘍呼び出しパイプラインを十分に開発し調査することにより、大きさの解像度の余分な１０年間を省いた。発明者らの３つのＤＮＡベンチマーク（ＤＮＡ調製の初めに肺試料に添加される）（図９）はこの解像度の一見を提示する。ＤＮＡベンチマークのシーケンシングエラーは、ＤＮＡベンチマークの固有のｓｇＩＤ及び既知の二次バーコードにより容易に同定される。これらのシーケンシングエラーは通常廃棄されるが、それらを通常のリードパイルアップとして処理し、潜在的なシーケンシングエラーの特性を観察することができる。発明者らの較正した分析パイプラインなしでは、シーケンシングエラーは約１０３個の細胞の病変として現れ、発明者らのパイプラインを用いると、これらのシーケンシングエラーは、発明者らの最小細胞閾値を下回る約１０２個の細胞の病変として出現する（図２Ａ）。
【０２０６】
より重要なことには、発明者らのパイプラインは、技術的摂動に対して頑強である。最初の実験からの２匹の特定のマウスにおいて２つのさらなる技術的摂動を用いて再現性をより集中的にプロファイリングした。第１に、ＫＬＴ  １１週のマウス（ＪＢ１３４９）を大深度でシーケンシングし、次いで、典型的なリード深度に１０倍ランダムにダウンサンプリングした（このダウンサンプリングは発明者らの研究を通して実際に検出されたリード深度におけるいずれのばらつきよりも劇的であった）。病変の大きさは、この最初の摂動において非常に高度に相関した（図２Ｂ）。加えて、ＫＴ  １１週のマウス（ＩＷ１
３０１）は、異なる多重タグで２つのＰＣＲ反応において増幅された（図２Ｃ）。ＰＣＲ及び多重は、リード深度よりも再現性を妨げるように思えるが、再現性は全体的に良好である。これらのマウスは、２つの有望な再現性の傾向も表す。（ｉ）より大きい病変／腫瘍は、反復間で最も一貫しており、かつ（ｉｉ）腫瘍病変の大きさの全体的な形状（ヒストグラム）は、個々の腫瘍よりも反復間で良好に相関した（例えば、ＩＷ１３０１の各病変についてはｒ＝０．８９、一方、図８Ｂの６０のヒストグラムビン内の腫瘍の存在量についてはｒ＝０．９９３）。この２番目の所見は、発明者らの技術的摂動は偏りがないノイズを導入することを暗示する。また、全ての相関は対数の大きさを比較する。より大きい腫瘍が良好に相関するため、この形質転換は、実質的に、ピアソン相関係数を低減する。
【０２０７】
腫瘍大きさ呼び出しに対するＧＣ増幅の偏りの影響を最小にする。
発明者らの研究の各腫瘍を、それを保有したマウスｍに対応する大きさｔｍｒｂ、その最初のバーコードにより同定された同族ｓｇＲＮＡ  ｒ、及び固有のバーコード配列（ＤＡＤＡ２クラスターのコンセンサス）ｂにより定義する。発明者らのデータのおよその対数正規の構造を考慮すると（図３ｄ及びデータ示さず）、τｍｒｂ＝Ｌｎ（Ｔｍｒｂ／Ｅｍｒ［Ｔｍｒｂ］）であるように大きさを対数形質転換し、正規化した。ここで、Ｅｍｒ［Ｔｍｒｂ］＝Σｂ  Ｔｍｒｂ／Ｎｍｒは、所与のマウスｍ及びｓｇＲＮＡ  ｒについての予想された病変の大きさであり、この表記を期待値に使用する。集約された指数が下付き文字から外されるこの表示は全体を通して使用される。ＧＣの偏りはわずかであった。Ｅｍｒ［Ｔｍｒｂ］の変動係数（ＣＶ）は５．０％であった。この周辺分布は、尚も、４次最小二乗多項式適合（Ｅｂ［τｍｒｂ］のｆ４（ｂ））によって最も良く説明された組み合わされたバーコード配列のＧＣ含有量に対するわずかな依存を示した（調整されたｒ２＝０．９９４）。ｓｇＩＤは全て十分に平衡化されたＧＣ含有量で設計されたが、第２のバーコードはランダムな配列を含む。バーコードを生成する多項プロセスはＧＣ含有量の中間レベルを最も一般的なものにしたが、ＧＣ含有量のある偏差が観察された。ｆ４（ｂ）の最大値は中間ＧＣ含有量で生じ、ＰＣＲは増幅を中間体融解温度のテンプレートＤＮＡへ偏らせることを示唆する。このＧＣの偏りの作用を対数形質転換された値から差し引いた：ｔｍｒｂ＝Ｌｎ［Ｔｍｒｂ］−ｆ４（ｂ）。この補正は平均して５％腫瘍の大きさを改変する。
【０２０８】
Ｌｅｎｔｉ−ＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅウイルスを使用したインビトロ切断効率の計算
細胞株を発現するＣａｓ９をＬｅｎｔｉ−ＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅウイルスに感染させ（形質導入し）、４８時間後に採取した。ｇＤＮＡを抽出し、標的遺伝子座を上記プライマーを使用して増幅した。
【０２０９】
標的部位でのインデルの分析
インビボでのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９誘導インデル形成を確認するために、ＧｏＴａｑ
Ｇｒｅｅｎポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｍ７１２３）、及び以下のペアエンドシーケンシングに適している短いアンプリコンをもたらすプライマー対を使用して、目的の各遺伝子の標的領域を、バルク肺試料から抽出したゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。
【０２１０】
【表７】
2020512817.tif 000016
【０２１１】
ＰＣＲ産物は、ゲル抽出されるか、またはＱｉａｇｅｎ（登録商標）ＭｉｎＥｌｕｔｅキットを使用して直接精製されるかのいずれかであった。ＤＮＡ濃度は、製造業者の指示に従い、Ｑｕｂｉｔ  ＨＳアッセイを使用して決定された。１４個全ての精製されたＰＣＲ産物を、各マウスについて等しい比率で組み合わせた。ＴｒｕＳｅｑ  Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）シーケンシングアダプターは、標準プロトコルで、ＳＰＲＩｗｏｒｋｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ａ８８２６７）を使用して、マウス当たり単一の多重
タグとともにプールされたＰＣＲ産物上にライゲートされた。シーケンシングは、シングルエンドの１５０−ｂｐリードを生成するためにＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑで行われた（Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）。
【０２１２】
Ｃｕｓｔｏｍ  Ｐｙｔｈｏｎスクリプトを使用してインデルシーケンシングデータを分析した。１４個の標的領域の各々について、８−ｍｅｒは、４６の塩基対領域を生成するために、標的領域のいずれかの側で選択された。リードは両方のアンカーを含有することが必要であり、シーケンシングエラーは許容されなかった。次いで、２つのアンカー間の各断片の長さを決定し、予想された長さと比較した。インデルは、挿入または欠失された塩基対の数に従い分類された。
【０２１３】
各個々のマウスにおける各個々の遺伝子座のインデルのパーセントは以下のように計算された。
【０２１４】
【数９】
2020512817.tif 000017
【０２１５】
次いで、３つのＮｅｏ遺伝子座におけるインデルの平均％が計算され、他の全ての標的遺伝子のインデル％はこの値に対して正規化されて、図６ＡにプロットされるＮｅｏに対するインデル％を生成した。
【０２１６】
Ｌｅｎｔｉ−ＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅウイルスを使用したインビトロ切断効率の計算
細胞株を発現するＣａｓ９をＬｅｎｔｉ−ＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅウイルスに感染させ（形質導入し）、４８時間後に採取した。ｇＤＮＡを抽出し、標的遺伝子座を上記プライマーを使用して増幅した（標的部位でのインデルの分析を参照されたい）。第１に、全てのプライマーをプールし、ＧｏＴａｑ  Ｇｒｅｅｎポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｍ７１２３）を使用して１５回のＰＣＲを行った。次いで、上述の個々のプライマー対で、これらの産物を後続の増幅に使用した。シーケンシングライブラリを上述したように調製した。
【０２１７】
組織診断、免疫組織化学、及び腫瘍分析
試料を４％ホルマリンで固定し、パラフィン包埋した。ＡＢＣ  Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、Ｔｏｍａｔｏ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，  ６００−４０１−３７９）、Ｓｍａｄ４（ＡｂＣａｍ，ＡＢ４０７５９）、及びＳｏｘ９（ＥＭＤ  Ｍｉｌｉｐｏｒｅ，ＡＢ５５３５）に対する抗体で免疫組織化学を４μｍの切片で行った。切片をＤＡＢで発色させ、ヘマトキシリンで対比染色した。標準方法を使用してヘマトキシリン及びエオシン染色を行った。
【０２１８】
Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴｏｍａｔｏ／Ｃｒｅに感染させた（形質導入した）肺からの切片をＴｏｍａｔｏに対して染色し、腫瘍を、陽性（＞９５％  Ｔｏｍａｔｏ陽性がん細胞）、陰性（Ｔｏｍａｔｏ陽性がん細胞なし）、または混合（全ての他の腫瘍）としてスコア化した。腫瘍を分類し、４匹の独立したマウスからの全ての肺葉を通して単一の切片から計数した。
【０２１９】
Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＳｅｔｄ２及びＬｅｎｔｉ−ｓｇＮｅｏで誘導した腫瘍面積の定量化及び腫瘍のバーコードシーケンシング
Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＳｅｔｄ２＃１／Ｃｒｅ、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＳｅｔｄ２＃２／Ｃｒｅ、またはＬｅｎｔｉ−ｓｇＮｅｏ２／Ｃｒｅウイルスに感染させた（形質導入した）マウスからの腫瘍保有肺葉をパラフィン包埋し、切片し、ヘマトキシリン及びエオシンで染色
した。腫瘍面積パーセントをＩｍａｇｅＪを使用して決定した。
【０２２０】
Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＳｅｔｄ２＃１／Ｃｒｅ及びＬｅｎｔｉ−ｓｇＮｅｏ２／Ｃｒｅに感染させた（形質導入した）ＫＴ；Ｃａｓ９マウスにおける個々の腫瘍内のがん細胞の数の分布を、上述したように、それらのそれぞれのレンチウイルスバーコードのＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）シーケンシング、及び後続の分析により評価した。
【０２２１】
Ｌｋｂ１及びＣａｓ９のウエスタンブロッティング
Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＬｋｂ１／Ｃｒｅ発生腫瘍を有するＫＴ及びＫＴ；Ｃａｓ９マウスからの顕微解剖されたＴｏｍａｔｏ陽性肺腫瘍を、Ｃａｓ９及びＬｋｂ１タンパク質発現について分析した。試料をＲＩＰＡ緩衝液に溶解し、ＬＤＳローディングダイとともに煮沸した。変性試料を４％〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（ＮｕＰａｇｅ）で流し、ＰＶＤＦ膜上に移動させた。Ｈｓｐ９０（ＢＤ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，６１０４１９）、Ｌｋｂ１（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，  １３０３１Ｐ）、Ｃａｓ９（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，ＮＢＰ２−３６４４０）に対する一次抗体、ならびに二次ＨＲＰコンジュゲートされた抗マウス（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｓｃ−２００５）及び抗ウサギ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｓｃ−２００４）抗体を使用して膜を免疫ブロットした。
【０２２２】
Ｓｍａｄ４のＣａｓ９媒介不活性化を伴うマウスの生存分析
Ｓｍａｄ４に起因する機能性腫瘍抑制の欠如を確認するために、ＫＴ及びＫＴ；Ｃａｓ９マウスを１０５  Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＳｍａｄ４／Ｃｒｅで気管内感染させた（形質導入された）。生存を評価するために、マウスが眼に見える窮迫な兆候を示したときに屠殺した。
【０２２３】
実施例２：インビボでの発がん性変異型の多重定量分析
ヒトがんの大規模なゲノム分析は、腫瘍発達を発生させ、がん成長を維持すると考えられる体細胞点変異をカタログ化した。しかしながら、特定の改変の機能的意義を決定することは、発明者らのがんの遺伝的決定因子の理解において依然として主な支障となっている。ここで、発明者らは、マウスにおいて新しいがんにおける複数のゲノム改変を同時に調査するために、ＤＮＡバーコード化及びハイスループットシーケンシングと多重ＡＡＶ／Ｃａｓ９媒介相同組換え修復（ＨＤＲ）を統合するプラットホームを提示する。このアプローチを使用して、非同議変異のバーコード化されたライブラリを、成体の体細胞のＫｒａｓのホットスポットコドン１２及び１３に導入して、肺、膵臓、及び筋肉において腫瘍を発生させた。バルク肺及び膵臓からのバーコード化されたＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子のハイスループットシーケンシングは、Ｋｒａｓ変異型発がん性において驚くべき多様性を明らかにした。インビボでの正確なゲノム改変の機能を同時に調査するための迅速で対費用効果が高い定量的アプローチは、発がん性についての生物学的及び臨床的にすぐに実行可能な見解を明らかにする。
【０２２４】
結果
定量的かつ比較的にハイスループットの様式でインビボでの多様な点変異の発がん性機能を分析するために、いくつかのがんの種類の自発性マウスモデルにおいて、ＤＮＡバーコード化及びハイスループットシーケンシングを組み込む体細胞ＡＡＶ／Ｃａｓ９媒介ＨＤＲのためのプラットホームを開発した（図２３Ａ〜Ｄ）。多重様式で、全ての可能なＫｒａｓコドン１２及び１３単一ヌクレオチド非同点変異を体細胞マウス細胞に導入するために、ＡＡＶベクターのライブラリを設計、生成、及び検証した（図２３Ｅ〜Ｇ及び図２７）。各ＡＡＶは、Ｋｒａｓの第２のエクソンを標的とするｓｇＲＮＡ、約２ｋｂのＫｒａｓ  ＨＤＲテンプレート、及びＣｒｅリコンビナーゼ（ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅ；図２３Ｅ及び図２７Ａ〜Ｃ）を含有した。
【０２２５】
ＫｒａｓＨＤＲテンプレートは、Ｋｒａｓのコドン１２及び１３に野生型（ＷＴ）Ｋｒａｓまたは１２個の単一ヌクレオチド非同義変異のうちの１つのいずれか、ならびにＫｒａｓの第２のエクソンの脇側に位置するゲノム配列を含有した。各ＫｒａｓＨＤＲテンプレートは、ＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子のＣａｓ９媒介切断を防止するために、ｓｇＫｒａｓ標的配列内にサイレント変異及び関連プロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ＊）も含有した。バルク組織からのＤＮＡのハイスループットシーケンシングにより個々の腫瘍の並行定量化を可能にするために、１２及び１３の下流のコドンのゆらぎ位置内に操作されたランダムな８−ヌクレオチドバーコードを用いて各ＫｒａｓＨＤＲテンプレートを多様化した（図２３Ｅ及び図２７Ｂ、Ｃ）。
【０２２６】
ＡＡＶベクターもＣｒｅリコンビナーゼをコードした。Ｃｒｅ発現は、Ｃｒｅ調節されたＣａｓ９対立遺伝子（Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９）、蛍光Ｃｒｅレポーター対立遺伝子（Ｒ２６ＬＳＬ−Ｔｏｍａｔｏ）、ならびに周知の腫瘍抑制遺伝子ｐ５３（ｐ５３ｆｌｏｘ）またはＬｋｂ１（Ｌｋｂ１ｆｌｏｘ）のフロキシングされた対立遺伝子を含有するマウスにおける腫瘍発生を可能にした。高力価産生、インビボでのマウス肺上皮細胞の効率的な形質導入（図２８）、及び広範な成体マウス組織の形質導入を可能にするＡＡＶ８カプシドを使用して、ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅライブラリをパッケージした。
【０２２７】
培養においてＣａｓ９発現細胞をＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅで形質導入して、ＡＡＶ／Ｃａｓ９媒介ＨＤＲが点変異を内因性Ｋｒａｓ遺伝子座内に操作するための偏りがない方法であるかを決定した（図２７Ｅ）。ＫｒａｓＨＤＲ特異的ＰＣＲ増幅、続いて形質導入された細胞のハイスループットシーケンシングは、全ての点変異体Ｋｒａｓ対立遺伝子の生成を確認した（図２７Ｆ、Ｇ）。さらに、インビボＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子頻度は、ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅプラスミドライブラリにおいてそれらの表示と相関した。この結果は、発明者らのＡＡＶベクターを使用するＨＤＲが、ＫｒａｓＨＤＲテンプレートにおける任意の単一ヌクレオチドＫｒａｓコドン１２または１３の点変異により劇的に偏らないことを確認する。したがって、特定のＫｒａｓ変異対立遺伝子を保有する腫瘍の任意の差次的な拡張は、各Ｋｒａｓ対立遺伝子を有するドナーＤＮＡテンプレートを使用するＨＤＲの効率における相違ではなく、Ｋｒａｓ変異型間の生化学的な相違に起因し得る（図２７Ｈ）。
【０２２８】
体細胞におけるＨＤＲが腫瘍を発生させることができるかを決定するために、及びＫｒａｓ変異型が腫瘍形成を駆動するそれらの能力において異なるかを調査するために、ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅライブラリを、Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９対立遺伝子を有するマウスの肺に気管内送達した（図２４及び２９）。具体的には、腫瘍抑制遺伝子の同時不活性化がＫｒａｓ変異型発がん性を調節するかの見解を得るために、マウスの３つの異なる遺伝子型を形質導入した：１）Ｒｏｓａ２６ＬＳＬ−Ｔｏｍａｔｏ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９（Ｔ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９）マウス、２）ウイルスにより発生させた腫瘍がｐ５３を欠くｐ５３ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ；Ｔ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９（ＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９）マウス、及び３）ウイルスにより発生させた腫瘍がＬｋｂ１を欠くＬｋｂ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ；Ｔ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９（ＬＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９）マウス（図２４Ａ及び図２９Ａ）。
【０２２９】
ＬＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスは、ＡＡＶ投与のおよそ５ヶ月後に、頻呼吸及び体重減少を含む腫瘍発達の兆候を最初に示した。これは、Ｃｒｅ調節されたＫｒａｓＧ１２Ｄ対立遺伝子及びＬｋｂ１の喪失を有するマウスにおける肺腫瘍の迅速な成長と一致する。ＬＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスは、多くの原発性肺腫瘍に起因する非常に高い腫瘍負荷を有した（図２４Ｂ、Ｃ及び図２９Ｂ〜Ｄ）。これらのマウスの肺の組織学的分
析は、大きい腺腫及び腺癌の存在を確認した（図２４Ｂ及び図２９Ｂ）。ＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスも多くの大きい原発性肺腫瘍を発達させた。ＬＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスと比較して、ＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスにおいて発生した腫瘍は、ｐ５３欠損の特有の特徴であるより明白な核異型を有した。最後に、Ｔ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスは、後の時間点でも、より小さく、あまり進行していない病変を発達させた（図２４Ｂ、Ｃ及び図２９Ｂ〜Ｄ）。１０倍低い用量のＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅを形質導入されたマウスは、比例的に少ない腫瘍を発達させた（図２９Ｅ）。
【０２３０】
ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅを形質導入された数匹のＬＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９及びＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスも、侵襲性の原発性肺腫瘍、胸膜腔に播種性腫瘍細胞（ＤＴＣ）、及びリンパ節転移を発達させた（図２４Ｄ、Ｅ及び図２９Ｆ、Ｇ）。したがって、ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅ誘導腫瘍は、悪性及び転移性肺癌に進行し得る。
【０２３１】
発がん性ＫｒａｓＧ１２Ｄが全てのウイルスにより形質導入された細胞において発現されるように、ＫｒａｓＬＳＬ−Ｇ１２Ｄ；ＰＴ及びＫｒａｓＬＳＬ−Ｇ１２Ｄ；ＬＴマウスを１：１０，０００希釈のＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅに感染させることにより、肺におけるＡＡＶ／Ｃａｓ９媒介体細胞ＨＤＲの効率を推定した。これらのマウスは、発がん性Ｋｒａｓ対立遺伝子がＡＡＶ／Ｃａｓ９媒介体細胞ＨＤＲによって生成されたマウスの腫瘍の数のおよそ半分を発達させた。この結果は０．０２％〜０．１％のＨＤＲ頻度と一致し、個々のマウスにおいて並行して複数の肺腫瘍を堅固に発生させることができる（図２４Ｃ）。重要なことには、ｓｇＫｒａｓ（ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／Ｃｒｅ）を有しない類似のベクターライブラリのＴ、ＰＴ、及びＬＴマウスへの送達は、効率的な腫瘍発生をもたらさず、高レベルのＡＡＶベクター形質導入と組み合わされたｐ５３欠損またはＬｋｂ１欠損のいずれも肺腫瘍形成を駆動するために十分ではないことを示唆する（図２４Ｃ及び図３０）。
【０２３２】
腫瘍がＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅ保有変異ＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子を使用して発生されたことを検証するために、ＬＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９及びＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスの大きい個々の肺腫瘍からＦＡＣＳ単離されたＴｏｍａｔｏ陽性がん細胞のＫｒａｓ遺伝子座を分析した。ＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子に特異的なプライマーを使用したＰＣＲ増幅は、各腫瘍内に固有のバーコードを有する発がん性Ｋｒａｓ対立遺伝子の存在を確認した（図２４Ｆ及び図３１Ａ、Ｂ）。興味深いことに、初期のＡＡＶライブラリにおいて任意の検出可能なＨＤＲの偏り及び変異対立遺伝子の比較的均一な表示がないにもかかわらず、１３個のＫｒａｓ変異型のうちの５つしか約５０個の大きい肺腫瘍において同定されなかった（図２４Ｆ）。この結果は、肺腫瘍形成におけるＫｒａｓ変異型の差次的な選択と一致する。
【０２３３】
個々の腫瘍を分析することにより、腫瘍細胞に存在するＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子ならびに第２のＫｒａｓ対立遺伝子の両方を注意深く評価することができた（図３１）。発がん性ＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子のおよそ半分は、Ｋｒａｓ点変異及び固有のバーコードが内因性Ｋｒａｓ遺伝子座内にシームレスに組換えられた、完全なＨＤＲ事象に起因した。残りのＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子は、５’端から変異エクソン２までシームレスであったが、イントロン２に小さい重複、挿入、または欠失を含有した（図３１Ｄ）。重要なことには、これらの改変のいずれも変異エクソン２からエクソン３へのスプライシングを破壊するとは予想されない。加えて、ほぼすべての腫瘍は第２のＫｒａｓ対立遺伝子にＣａｓ９誘導されたインデルを保有し、これは、発がん性ＫＲＡＳ駆動ヒト腫瘍における野生型Ｋｒａｓ対立遺伝子の頻繁な喪失と一致する（図３１Ｅ、Ｆ）。以前の研究は、マウスにおける野生型Ｋｒａｓ対立遺伝子の不活性化後のＫｒａｓＧ１２Ｄ−及びＫｒａｓＱ６１
Ｌ駆動肺腫瘍成長の増強を記述していたが、発明者らの結果は、多くの発がん性Ｋｒａｓ変異型が肺腫瘍成長中に野生型Ｋｒａｓによって抑制される可能性があることを示唆する。
【０２３４】
ヒト肺癌の駆動に加えて、発がん性ＫＲＡＳは、ヒト膵管腺癌（ＰＤＡＣ）においてほぼ偏在する。ＫｒａｓＧ１２ＤまたはＫｒａｓＧ１２Ｖの発現及びｐ５３の不活性化は、マウスモデルにおいてＰＤＡＣの発達をもたらす。ＡＡＶ／Ｃａｓ９媒介体細胞ＨＤＲが膵上皮細胞においてがんを発生させる発がん性点変異を誘導することもできるかを決定するために、逆行膵管注射により、ＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスにＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅを形質導入した（図２５Ａ及び図３２Ａ）。これらのマウスは、前がん性膵上皮内新生物（ＰａｎＩＮｓ）ならびにＰＤＡＣ（図２５Ｂ及び図３２Ｂ、Ｃ、Ｆ）を発達させた。数匹のマウスも侵襲性及び転移性のＰＤＡＣを発達させ、ヒト疾患の攻撃的な性質と一致した（図２５Ｃ及び図３２Ｄ〜Ｆ）。いくつかの大きい膵腫瘍塊からのＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子のシーケンシングにより、固有のバーコードを有する発がん性Ｋｒａｓ対立遺伝子が明らかとなった（図２４Ｄ）。興味深いことに、４つの試料が分析されただけだが、ヒト膵癌において最も頻繁な２つのＫＲＡＳ変異であるＫｒａｓＧ１２Ｄ及びＫｒａｓＧ１２Ｖのみが観察された。発がん性ＫｒａｓがＰＤＡＣを発生させる要件と一致し、発明者らの陰性対照ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／Ｃｒｅベクターの逆行膵管注射によるＰＴマウスにおける膵細胞の形質導入は、いずれの膵腫瘍も誘導しなかった（図３２Ｆ）。
【０２３５】
ヒト軟組織肉腫もＲＡＳ経路ならびにＴＰ５３において頻繁に変異を保有する。肉腫は、ＫｒａｓＧ１２Ｄの発現及びｐ５３の不活性化を通して遺伝子操作されたマウスにおいて誘導されてきた。ＡＡＶ／Ｃａｓ９媒介体細胞ＨＤＲを使用して点変異をＫｒａｓ内に導入し、肉腫形成を駆動することができるかを決定するために、ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅの、ＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスの腓腹筋への筋肉内注射を行った（図２５Ｅ及び図３３Ａ）。これらのマウスは、固有にバーコード化されたＫｒａｓＧ１２Ｄ、ＫｒａｓＧ１２Ａ、及びＫｒａｓＧ１３Ｒ対立遺伝子を保有した迅速に成長する侵襲性の肉腫を発達させた（図２５Ｆ〜Ｈ及び図３３）。異なる組織において発生から悪性進行までの腫瘍形成をモデル化するためのこのプラットホームの適用の成功は、広範囲のがんの種類における発がん性駆動物質変異の多重機能分析に対するその広範な適用性を強調する。
【０２３６】
自発性がんモデルにおいて遺伝子機能を評価するための現在の方法は、腫瘍の数及び大きさの手動による定量化に大きく依存するが、発明者らは、バルク組織から直接腫瘍細胞数を腫瘍遺伝子型に連結する単純だがハイスループットの多重アプローチを確立した（図２３Ｄ及び４Ａ）。ＨＤＲにより体細胞に導入された固有のＤＮＡバーコードは、細胞が分裂すると数が増加するため、所与の腫瘍内のがん細胞の相対数はバーコード領域のディープシーケンシングにより決定され得る。さらに、各腫瘍内の細胞の絶対数は、ディープシーケンシングの前に正規化対照を各試料に添加することにより推定され得る。ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅを形質導入されたＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９、ＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９、及びＬＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスからの全肺の各腫瘍内の遺伝子型を決定し、がん細胞の絶対数を推定するために、既知のバーコードを有する５×１０５個の細胞からのＤＮＡを各試料に最初に添加した（図２６Ａ及び図３４）。次いで、バルク肺試料からＤＮＡを抽出し、ＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子をＰＣＲ増幅し、各対立遺伝子の変異型−バーコード領域をディープシーケンシングした（図２３Ｄ及び４Ａ、ならびに図３４）。
【０２３７】
ハイスループットシーケンシング後、繰り返し起こるシーケンシングエラー及び同一のバーコードを有する個々腫瘍の可能性に対して補正された。次いで、腫瘍バーコードシー
ケンシングリード計数を正規化対照ＤＮＡからのリード数に対して正規化することにより、各腫瘍内のがん細胞の絶対数を推定した。この分析パイプラインは例外的に再現性があり、技術的反復にわたる腫瘍の大きさの一致度が高かった（図３５）。バルク組織からの個々の腫瘍の並行した定量分析を可能にすることにより、このＨＤＲに基づくバーコード化及びディープシーケンシングアプローチは、前例がないインビボ腫瘍ランドスケープ像を提供する。
【０２３８】
ＫｒａｓＨＤＲ変異型−バーコード領域のハイスループットシーケンシングは、Ｔ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９、ＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９、及びＬＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスにおいて多くのＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅ誘導された肺腫瘍を明らかにした（図３６Ａ〜Ｃ）。腫瘍数を、ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅベクターライブラリの各ＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子の初期表示に対して正規化することにより、各Ｋｒａｓ変異型のインビボ発がん性を直接比較することが可能となった（図２６Ｂ及び図３６Ｄ、Ｅ）。５００個を超える腫瘍にわたって、ＫｒａｓＧ１２Ｄは最も一般的な変異型であり、ＫＲＡＳＧ１２Ｄが禁煙者のヒト肺腺癌において最も頻繁なＫＲＡＳ変異であることと一致した。ＫｒａｓＧ１２Ａ、ＫｒａｓＧ１２Ｃ及びＫｒａｓＧ１２Ｖ（ヒト肺腺癌において、ＫＲＡＳＧ１２Ｄの後に最も頻繁なＫＲＡＳ変異型）、ならびにＫｒａｓＧ１３Ｓは、肺腫瘍形成の中程度の駆動物質として同定されたが、ＫｒａｓＧ１２Ｄよりも顕著に少ない腫瘍に存在した（図２６Ｂ）。興味深いことに、ヒト肺癌においてあまり頻繁に変異しないにも関わらず、ＫｒａｓＧ１２Ｒ及びＫｒａｓＧ１３Ｒも強力な発がん性変異型として同定された（図２６Ｂ）。
【０２３９】
ＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９及びＬＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスにおいて腫瘍を発生させて、同時腫瘍抑制因子改変が異なるＫｒａｓ変異型の腫瘍成長を発生及び駆動する能力を調節するかを直接評価した。興味深いことに、Ｋｒａｓ発がん性の全体的なスペクトルがＬｋｂ１不活性化により顕著に変化したが、ｐ５３またはＬｋｂ１の同時不活性化の腫瘍において、個々のＫｒａｓ変異型の相対的腫瘍原性の可能性に劇的な相違は観察されなかった（図２６Ｃ〜Ｅ及び図３６）。このデータは、インビボでこれらの発がん性Ｋｒａｓ変異型により誘導されたシグナル伝達の強度がｐ５３経路に関与するためは不十分であるモデルと一致し、したがって、ｐ５３は腫瘍進行を制限するが、ある特定のＫｒａｓ遺伝子型を有する腫瘍の初期拡大を限定しない。加えて、Ｌｋｂ１欠損は腫瘍成長を増加させるが、Ｌｋｂ１欠損により誘導されたシグナル伝達はＫｒａｓの特定の変異形態により誘導された下流シグナルと優先的に共同作用しない。
【０２４０】
発明者らの腫瘍バーコード化及びシーケンシングプラットホームはバルク肺からの多くの個々の肺腫瘍を並行して同定することを可能にするため、このアプローチを使用して、ヒトＰＤＡＣ３１の自発性マウスモデルにおいて発生させた多源性腫瘍塊における個々の膵腫瘍クローンを同定及び分析する課題を克服することもできると予想した。したがって、ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅを形質導入されたＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスからのバルク膵腫瘍試料も分析した（図２６Ｆ及び図３７Ａ、Ｂ）。膵腫瘍塊のバーコードシーケンシングは、マウス当たりの複数の原発性腫瘍クローンを明らかにし、各々、Ｋｒａｓコドン１２または１３に点変異を保有するＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子、ならびに固有のＤＮＡバーコードを保有した。膵腫瘍は発がん性Ｋｒａｓ対立遺伝子優先を示し、ＫｒａｓＧ１２Ｄ、ＫｒａｓＧ１２Ｖ、及びＫｒａｓＧ１２Ｒが最も一般的な変異型であった（図２６Ｆ）。とりわけ、これら３つのＫｒａｓ変異型は、ヒトＰＤＡＣにおいて最も一般的な発がん性ＫＲＡＳ変異でもある。
【０２４１】
特定のＫｒａｓ変異型のインビボ発がん性を決定することに加えて、発明者らのバーコード−シーケンシングアプローチは、ＰＤＡＣ塊の多領域シーケンシングから連続腫瘍クローンを同定し、原発性腫瘍とそれらの転移性子孫との間のクローン関係を明らかにする
ことを可能にする（図２６Ｇ及び３７Ｃ）。
【０２４２】
ヒトがんにおける変異の蔓延は、変異が起こる頻度及び変異が腫瘍形成を駆動する程度の両方の関数である。ＡＡＶ／Ｃａｓ９媒介体細胞ＨＤＲを使用して、偏らない様式で点変異を内因性Ｋｒａｓ遺伝子座に導入することにより、Ｋｒａｓ変異型が肺腫瘍形成を駆動するために定量的に異なる能力を有すると決定された（図４Ｂ及び図３６）。さらに、発明者らのＨＤＲに基づくアプローチを使用してマウスにおいて発生させた膵腫瘍は、ヒトＰＤＡＣと同じ優性Ｋｒａｓ変異型に対する選択を示し、ヒトＰＤＡＣにおいて観察されたＫＲＡＳ変異のスペクトルがそれらの変異速度における相違によるのではなく、ＫＲＡＳ変異体間の生化学的相違により駆動される可能性があることを示唆する（図２６Ｆ及び図３７）。
【０２４３】
各Ｋｒａｓ変異型の生化学的特性がどのようにそのインビボ発がん性に影響を及ぼすかを理解し始めるために、以前に記述されたＫｒａｓ変異型の生化学的挙動と、発明者らの研究の肺または膵腫瘍形成を駆動するそれらの能力との間の関係を調査した（図３８）。とりわけ、ＫＲＡＳ変異は、ＫＲＡＳ機能に重要であると考えられる生化学的特徴（例えば、ＧＴＰａｓｅ活性及びＲＡＦキナーゼ親和性）において劇的な相違をもたらすが、１つの生化学的特性もインビボＫｒａｓ変異型発がん性において予想されなかった。この結果は、Ｋｒａｓ変異型のインビボ発がん性が、別の生化学的特性により、またはおそらくより高い可能性としては複数の生化学的出力の相互作用を通して最も良く説明され得ることを示唆する。
【０２４４】
この作業は、並行した変異のパネルのインビボ発がん性の対費用効果が高くかつ系統的な研究のための、定量的で測定可能なモジュール式アプローチとしての発明者らのＡＡＶ／Ｃａｓ９媒介体細胞ＨＤＲアプローチを強調する。インビボでのＫｒａｓ機能の遺伝学的解剖を可能にする多重アプローチは、ＲＡＳタンパク質の変異形態の進行中の生化学及び細胞培養研究に対して重要な補足を表す。この方法は、多くの一般的ながんの種類にわたって、一般的ながん遺伝子における多様な変異ならびに稀な推定上の発がん性変異の機能の前例がない理解を可能にする。最後に、このプラットホームが正確に定義されたがんの遺伝子サブタイプに対する標的療法の発見及び前臨床検討の両方を劇的に加速することを想定する。
【０２４５】
方法
Ｋｒａｓを標的とするｓｇＲＮＡの設計、生成、及びスクリーニング
体細胞マウス細胞において相同組換え修復（ＨＤＲ）を強化するためにＫｒａｓを標的とするｓｇＲＮＡを得るために、Ｋｒａｓエクソン２及び脇側のイントロン配列を標的とする全ての可能な２０−ｂｐ  ｓｇＲＮＡを同定し（コンセンサスＣａｓ９  ＰＡＭ：ＮＧＧを使用して）、利用可能なｓｇＲＮＡ設計／スコア化アルゴリズムを使用して、予測された的確な切断効率についてそれらをスコア化した。次いで、Ｋｒａｓを標的とする３つのｓｇＲＮＡ（ｓｇＫｒａｓ＃１：ＧＣＡＧＣＧＴＴＡＣＣＴＣＴＡＴＣＧＴＡ、ｓｇＫｒａｓ＃２：ＧＣＴＡＡＴＴＣＡＧＡＡＴＣＡＣＴＴＴＧ、ｓｇＫｒａｓ＃３：ＧＡＣＴＧＡＧＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧ）の切断効率を経験的に決定した（図２７Ａ）。簡潔に、Ｌｅｎｔｉ−Ｕ６−ｓｇＲＮＡ／Ｃｒｅベクターを、前述したように、Ｋｒａｓを標的とする各ｓｇＲＮＡのために生成した。Ｑ５（登録商標）部位特異的変異誘発（ＮＥＢ）を使用して、ｓｇＲＮＡを、ｓｇＲＮＡ転写を駆動するためのＵ６プロモータならびにＣｒｅリコンビナーゼを駆動するＰＧＫプロモータを含有する親レンチウイルスベクターに挿入した。各ｓｇＫｒａｓの切断効率は、各Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅウイルスで、培養においてＬＳＬ−ＹＦＰ；Ｃａｓ９細胞の形質導入を介して決定された。感染（形質導入）の４８時間後にＦＡＣＳによりＹＦＰ陽性細胞を単離し、ＤＮＡを抽出し、標的Ｋｒａｓ遺伝子座をＰＣＲ増幅し（フォワードプライマー：ＴＣＣＣＣＴＣＴＴＧ
ＧＴＧＣＣＴＧＴＧＴＧ、リバースプライマー：ＡＡＧＣＣＣＴＴＣＣＴＧＣＴＡＡＴＣＴＣＧＧＡＧ）、アンプリコンをサンガーシーケンシングした（シーケンシングプライマー：ＧＣＡＣＧＧＡＴＧＧＣＡＴＣＴＴＧＧＡＣＣ）。ＴＩＤＥによりシーケンシングトレースを分析して、インデル誘導パーセントを決定した。３つ全てのｓｇＲＮＡが予想された遺伝子座でインデルを誘導したため、Ｋｒａｓコドン１２及び１３に最も近い配列を標的とするｓｇＫｒａｓ（ｓｇＫｒａｓ＃３）を全ての後続の実験に使用した。これは、所望の遺伝子座でＨＤＲを最良に促進すると予想されたためである（図２７Ａ）。
【０２４６】
ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲプラスミドライブラリの設計、構築、及び検証
ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅ骨格の生成
ｐＬＬ３．３；Ｕ６−ｓｇＫｒａｓ／ＰＧＫ−ＣｒｅからのＵ６−ｓｇＫｒａｓ／ＰＧＫ−Ｃｒｅカセットを、Ｑ５（登録商標）ポリメラーゼ（ＮＥＢ）でＰＣＲ増幅し、ＴＯＰＯクローニングし（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、シーケンシングにより検証した。ＡＡＶ−ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅベクターを生成するために、３８８−ＭＣＳ  ＡＡＶプラスミド骨格のＩＴＲ間の配列を、ＸｈｏＩ／ＳｐｅＩを使用して除去した。Ｕ６−ｓｇＫｒａｓ／ＰＧＫ−Ｃｒｅカセットを、ＸｈｏＩ／ＸｂａＩでＴＯＰＯベクターから消化し、１．９−ｋｂ断片をＸｈｏＩ／ＳｐｅＩ消化された３８８−ＭＣＳ骨格にライゲートし、ＳｐｅＩ部位を破壊した。ＭｌｕＩ消化後、ＢＧＨ  ｐｏｌｙＡ配列をＣｒｅの３’に挿入した。マウスＫｒａｓのエクソン２を囲む約２−ｋｂの領域を、ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した（フォワードプライマー：ＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＣＡＧＴＴＣＴＴＴＴＧＴＡＴＣＣＡＴＴＴＧＴＣＴＣＴＴＴＡＴＣＴＧＣ、リバースプライマー：ＧＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＴＣＴＴＧＴＧＴＧＴＡＴＧＡＡＧＡＣＡＧＴＧＡＣＡＣＴＧ）。その後、アンプリコンをＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。Ｑ５（登録商標）部位特異的変異誘発（ＮＥＢ）を使用して、ＡｖｒＩＩ／ＢｓｉＷＩ部位をＴＯＰＯクローニングされた２−ｋｂ  Ｋｒａｓ配列に導入した（ＡｖｒＩＩフォワードプライマー：ＴＧＡＧＴＧＴＴＡＡＡＡＴＡＴＴＧＡＴＡＡＡＧＴＴＴＴＴＧ、ＡｖｒＩＩ  リバースプライマー：下記（ｉ）の組成、ＢｓｉＷＩ  フォワードプライマー：ＣＴＴＧＴＡＡＡＧＧＡＣＧＧＣＡＧＣＣ、ＢｓｉＷＩ  リバースプライマー：下記（ｉｉ）の組成、制限部位は下線付きであり、ミスマッチ塩基は小文字である）。ＡｖｒＩＩ／ＢｓｉＷＩ部位を保有するＫｒａｓ断片はＮｃｏＩ／ＸｈｏＩでＴＯＰＯから放出され、ＮｃｏＩ／ＸｈｏＩ消化されたＡＡＶ−ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅにライゲートされて、ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅ骨格を産生した。
【０２４７】
【化１】
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【０２４８】
ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／Ｃｒｅ骨格の生成
Ｋｒａｓを標的とするｓｇＲＮＡなしでＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ骨格を生成するために、ＰＧＫ−ＣｒｅをＮｏｔＩ／ＸｂａＩでＴＯＰＯクローンから切除し、ＮｏｔＩ／ＸｂａＩ消化された３８８−ＭＣＳ  ＡＡＶプラスミド骨格にライゲートした。ＢＧＨ  ｐｏｌｙＡ配列及びマウスＫｒａｓ断片を上述したように付加して、対照ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／Ｃｒｅ骨格を産生した。
【０２４９】
多様なＫｒａｓ変異型／バーコード領域の設計及び合成
活性化単一点変異及びＤＮＡバーコードのライブラリをＡＡＶ骨格のＫｒａｓＨＤＲ配列に導入するために、Ｋｒａｓコドン１２及び１３の最初の２つの塩基対の各々で、縮重「Ｎ」塩基（Ａ、Ｔ、Ｃ、及びＧ）を用いて４つの２９５−ｂｐ  Ｋｒａｓ断片を合成した（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（図２７Ｂ）。意図的に、４つの断片プールの各々は、対照として機能するように、コドン１２及び１３に３つの非同義単一ヌクレオチド変異、ならびに野生型Ｋｒａｓ配列からなった。したがって、４つのプールの各々は野生型断片を含有したため、野生型Ｋｒａｓ対立遺伝子の全体的な
表示は、変異Ｋｒａｓ対立遺伝子の各々よりもおよそ４倍高いと予想された。合成された断片は、ｓｇＫｒａｓ標的配列内にサイレント変異及び関連プロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ＊）も含有し、８−ヌクレオチドランダムバーコードは、個々の腫瘍バーコード化のために、縮重塩基を下流Ｋｒａｓコドンのゆらぎ位置に導入することにより創出された（図２７Ｂ）。最後に、各断片は、ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ骨格内にクローニングするための脇側ＡｖｒＩＩ及びＢｓｉＷＩ制限部位を含んだ（図２７Ｂ）。
【０２５０】
Ｋｒａｓ変異体／バーコード断片のＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲベクターへのライゲーション
４つの合成断片プールを等しい比率で混合し、ＰＣＲ増幅した（フォワードプライマー：ＣＡＣＡＣＣＴＡＧＧＴＧＡＧＴＧＴＴＡＡＡＡＴＡＴＴＧ、リバースプライマー：ＧＴＡＧＣＴＣＡＣＴＡＧＴＧＧＴＣＧＣＣ）。アンプリコンをＡｖｒＩＩ／ＢｓｉＷＩで消化し、エタノール沈殿により精製し、両ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ骨格内にライゲートした（図２７Ｃ）。各ライゲートされたプラスミドライブラリをＳｔｂｌ３エレクトロコンピテント細胞（ＮＥＢ）に形質転換し、２０ＬＢ−Ａｍｐプレート上で平板培養し、これはライブラリ当たり約３×１０５個の細菌コロニーを生成した。コロニーをＬＢ−Ａｍｐ液体培地中にそぎ落とし、３７℃で６時間拡張させて、プラスミドの収率を増加させ、ＡＡＶ産生のための十分なプラスミドＤＮＡを得た。次いで、Ｍａｘｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、プラスミドＤＮＡを細菌培養物から抽出した。
【０２５１】
ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲプラスミドライブラリの検証
各Ｋｒａｓ変異型の表示及び各ＡＡＶプラスミドライブラリ内のバーコードヌクレオチドの分布を決定するために、精製したＡＡＶプラスミドライブラリを、多重タグ（下線付きＮ）を含有するＩｌｌｕｍｉｎａアダプター（小文字）を付けられたプライマーでＰＣＲ増幅し（フォワードプライマー：ａａｔｇａｔａｃｇｇｃｇａｃｃａｃｃｇａｇａｔｃｔａｃａｃｔｃｔｔｔｃｃｃｔａｃａｃｇａｃｇｃｔｃｔｔｃｃｇａｔｃｔＣＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＧＴＡＴＡＡＡＣＴＡＧＴＡＧＴＣ、リバースプライマー：下記（ｉｉｉ）の組成、次いで、ＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標））でディープシーケンシングした。
【０２５２】
【化２】
2020512817.tif 000019
【０２５３】
ＡＡＶカプシド血清型肺上皮細胞形質導入分析
Ｃａ３（ＰＯ４）２トリプルトランスフェクションプロトコルを使用して、以下の目的の９つのカプシドの各々に関してｐＡｄ５ヘルパー、ｓｓＡＡＶ−ＲＳＶ−ＧＦＰ導入ベクター、及びシュードタイピングプラスミドを用いて、組換えＡＡＶ−ＧＦＰベクターを産生した：ＡＡＶ１、２、３ｂ、４、５、６、８、９＿ｈｕ１４、及びＤＪ。前述したように、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）においてウイルスを産生し、その後、二重塩化セシウム密度勾配精製及び透析を行った。ｒＡＡＶベクター調製物を、ＧＦＰについてＴａｑＭａｎ  ｑＰＣＲにより滴定した（フォワードプライマー：ＧＡＣＧＴＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧＴＴ、リバースプライマー：ＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴＣＡＧＣＴＴＧＣ、プローブ：６−ＦＡＭ／ＣＧＡＧＧＧＣＧＡＴＧＣＣＡＣＣＴＡＣＧ／ＢＨＱ−１）。成体肺上皮細胞形質導入に最適なＡＡＶ血清型を同定するために、各マウスは、気管内投与を介して、最大力価の６０μｌのシュードタイプ化ＡＡＶ−ＧＦＰを受容した。ＡＡＶ投与の５日後にマウスを分析した。前述したように、肺を単一細胞懸濁液に分離し、ＧＦＰ陽性細胞のＦＡＣＳ分析用に調製した。ＧＦＰ陽性パーセンテージを、＞１０，０００個の生存ゲーティングされた細胞を分析することにより決定した（図２８を参照されたい）。
【０２５４】
ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲプラスミドライブラリの産生及び滴定
Ｃａ３（ＰＯ４）２トリプルトランスフェクションプロトコルを使用して、上述のｐＡ
ｄ５ヘルパー、ｐＡＡＶ２／８パッケージングプラスミド、及びバーコード化されたＫｒａｓライブラリ導入ベクタープールを用いて、ＡＡＶライブラリを産生した。前述したように、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてトランスフェクションを行い、その後、二重塩化セシウム密度勾配精製及び透析を行った。ＡＡＶライブラリを、ＣｒｅについてＴａｑＭａｎ
ｑＰＣＲにより滴定した（フォワードプライマー：ＴＴＴＧＴＴＧＣＣＣＴＴＴＡＴＴＧＣＡＧ、リバースプライマー：ＣＣＣＴＴＧＣＧＧＴＡＴＴＣＴＴＴＧＴＴ、プローブ：６−ＦＡＭ／ＴＧＣＡＧＴＴＧＴＴＧＧＣＴＣＣＡＡＣＡＣ／ＢＨＱ−１）。
【０２５５】
インビトロＡＡＶ／Ｃａｓ９媒介ＨＤＲ
コドン１２及び１３の変異を囲むヌクレオチド変化（ｓｇＲＮＡ認識部位及びＰＡＭモチーフを変異させるコドン１２／１３の５’の３つのヌクレオチド変化、バーコード配列においては最大１０の変化）は、Ｋｒａｓコドン１２及び１３の点変異がＨＤＲの速度に差次的に影響を及ぼす可能性を低くする。それにもかかわらず、発明者らは、ＨＤＲ効率が個々のＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子の配列における相違によって影響を受ける可能性があるかを試験した。インビトロＡＡＶ／Ｃａｓ９媒介ＨＤＲを誘導するために、精製したＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／ＣｒｅライブラリでＬＳＬ−ＹＦＰ／Ｃａｓ９細胞を形質導入した（図２７Ｅ）。非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の阻害剤である１０μＭ  ＳＣＲ７（Ｘｃｅｓｓｂｉｏ）を含む細胞培養培地に細胞を維持して、相同組換え修復を促進した。形質導入の９６時間後に、フェノール／クロロホルム抽出、続いてエタノール沈殿により、ＤＮＡをＬＳＬ−ＹＦＰ／Ｃａｓ９細胞から単離した。Ｋｒａｓ遺伝子座は、内因性Ｋｒａｓ遺伝子座に組み込まれたＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子の特異的な増幅のために発明者らが開発したＰＣＲ戦略を使用して、このＤＮＡから増幅された。次いで、インビトロＨＤＲ後にこれらのアンプリコンをディープシーケンシングして、ＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子の表示を決定した（ＰＣＲ及びシーケンシングの詳細については以下の「Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ライブラリ調製及びバルク組織からの腫瘍バーコードのシーケンシング」のセクションを参照されたい）。
【０２５６】
マウス及び腫瘍発生
Ｌｋｂ１ｆｌｏｘ（Ｌ）、ｐ５３ｆｌｏｘ（Ｐ）、Ｒ２６ＬＳＬ−Ｔｏｍａｔｏ（Ｔ）、Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９、及びＫｒａｓＬＳＬ−Ｇ１２Ｄ（Ｋ）マウスは以前に説明されている。肺腫瘍を発生させるための気管内吸入によるＡＡＶ投与、膵腫瘍を発生させるための逆行膵管注射、及び肉腫を発生させるための筋肉内腓腹筋注射は記載されるように行われた。肺腫瘍は、６０μｌのＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅ（１．４×１０１２ｖｇ／ｍｌ）を用いてＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９、ＬＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９、及びＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスにおいて、６０μｌのＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／Ｃｒｅ（２．４×１０１２ｖｇ／ｍｌ）を用いてＰＴ、ＬＴ、及びＴマウスにおいて、または１ＸＰＢＳに１：１０，０００希釈された６０μｌのＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅ（１．４×１０１２ｖｇ／ｍｌ）を用いてＫＰＴ及びＫＬＴマウスにおいて発生させた。膵腫瘍は、１００〜１５０μｌのＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅ（１．４×１０１２ｖｇ／ｍｌ）を用いてＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスにおいて、または１００〜１５０μｌのＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／Ｃｒｅ（２．４×１０１２ｖｇ／ｍｌ）を用いてＰＴマウスにおいて発生させた。１ＸＰＢＳへのＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅの１：１０希釈は、示される場合、マウスの肺または膵臓にも投与された。肉腫は、３０μｌのＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅ（５．２×１０１２ｖｇ／ｍｌ）を用いてＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９において発生させた。マウスは、腫瘍発達の症状を表したときに安楽死させた。Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ＆  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙにより全てのマウス手順が承認された。
【０２５７】
個々の腫瘍の分析
個々の肺腫瘍の分析
腫瘍発達の症状を表す肺腫瘍保有マウスは、ウイルス投与の４〜１０ヶ月後に分析された。肺腫瘍負荷は、肺重量により、及び示される蛍光解剖スコープ下での顕微鏡Ｔｏｍａｔｏ陽性腫瘍の定量化により評価された（１匹のＬＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスは、１つの肺葉の小さい領域に制限された最小Ｔｏｍａｔｏ陽性シグナルを有し、ＡＡＶの不適切な気管内投与を示し、研究から外された）。視覚的に多源性ではない最も大きい個々の肺腫瘍は、シーケンシングのために蛍光解剖顕微鏡下でバルク肺から解剖された。いくつかの肺腫瘍に関して、Ｔｏｍａｔｏ陽性腫瘍細胞は、Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｓｈａｒｅｄ  ＦＡＣＳ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ内で、ＦＡＣＳ装置（Ａｒｉａ  ｓｏｒｔｅｒ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して精製された。個々のマウスからのいくつかの肺葉も組織学的分析のために収集された。
【０２５８】
個々の膵腫瘍塊の分析
膵腫瘍保有マウスは腫瘍発達の症状を表し、ウイルス投与の３〜４ヶ月後に分析された。膵腫瘍は主に多源性であるように見えるため、Ｔｏｍａｔｏ陽性腫瘍塊を含有する膵臓の個々の領域を解剖し、シーケンシングのためにＦＡＣＳ精製した（ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅライブラリの１：１０希釈で処置したマウスも膵腫瘍塊を発達させ、したがって、これらの分析に含まれた）。いくつかの膵臓の領域を組織学的分析のために保持した。
【０２５９】
個々の肉腫の分析
明らかな腫瘍発達を有する肉腫保持マウスを、ウイルス投与の３〜７ヶ月後に分析した。各肉腫の領域をシーケンシングのために保持し、隣接領域を組織学的分析のために確保した。
【０２６０】
個々の腫瘍におけるＫｒａｓ対立遺伝子の特徴付け
ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ及びＴｉｓｓｕｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、シーケンシングのためのＤＮＡをＦＡＣＳ精製腫瘍細胞及び選別されていない腫瘍試料から抽出した。腫瘍内のＫｒａｓ点変異及びバーコードを同定するために、ＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子を、アニーリング温度、伸張時間、及びプライマー配列（プロトコル１−フォワードプライマー：ＣＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＧＴＡＴＡＡＡＣＴＡＧＴＡＧＴＣ、リバースプライマー：ＡＧＣＡＧＴＴＧＧＣＣＴＴＴＡＡＴＴＧＧＴＴ、シーケンシングプライマー：ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣ、アニーリング温度６６℃；プロトコル２−フォワードプライマー：ＧＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＧＴＡＴＡＡＡＣＴＡＧＴＡＧＴＣ、リバースプライマー：ＴＴＡＧＣＡＧＴＴＧＧＣＣＴＴＴＡＡＴＴＧＧ、シーケンシングプライマー：ＧＣＡＣＧＧＡＴＧＧＣＡＴＣＴＴＧＧＡＣＣ；アニーリング温度：６４℃）を含むいくつかの変数にわたって最適化した２つのプロトコルを使用してＰＣＲ増幅及びシーケンシングした。各々がコドン１２及び１３の上流のＰＡＭ領域に操作された変異と重複するフォワードプライマー、及び相同アームの外側にリバースプライマーを組み込んだため、これらのプロトコルを使用して、個々の腫瘍から組み込んだＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子を特異的に増幅した。長い伸張時間（２〜３分間）を使用して、全てのＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子（Ｋｒａｓ遺伝子座のイントロン２に挿入または重複を含有するものでも）の増幅を可能にした（図３１Ｄ）。
【０２６１】
ＨＤＲを介して所望の点変異を内因性Ｋｒａｓ遺伝子座に導入することとは別に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用したＫｒａｓエクソン２を標的とすることにより、ＨＤＲではなくＮＨＥＪによるＤＮＡ修復後に、切断部位でインデルをもたらすことも予想された。これらの修飾を特徴付けるために、一般的なＰＣＲプロトコルを使用して、両方のＫｒａｓ対立遺伝子を増幅した（フォワードプライマー：ＴＣＣＣＣＴＣＴＴＧＧＴＧＣＣＴＧ
ＴＧＴＧ、リバースプライマー：ＧＧＣＴＧＧＣＴＧＣＣＧＴＣＣＴＴＴＡＣ、シーケンシングプライマー：ＣＡＡＧＣＴＣＡＴＧＣＧＧＧＴＧＴＧＴＣ、アニーリング温度：７２℃）。ＤＮＡ切断部位での挿入及び欠失のスペクトルは、このアプローチにより同定された（図３１Ｅ、Ｆ）。いくつかの個々の腫瘍試料に関して、両方のＫｒａｓ対立遺伝子の配列は、上記のＰＣＲ及びシーケンシング戦略後すぐに明らかにならなかった。これらの試料からのＰＣＲ産物は、ＴＯＰＯクローニング（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び形質転換され、各試料からのいくつかのコロニーをプラスミド調製し、シーケンシングして、各腫瘍の両方のＫｒａｓ対立遺伝子を特徴付けた。このアプローチは、生物学的及び技術的反復の両方にわたって再現性及び信頼性があり、様々なＨＤＲ誘導された発がん性Ｋｒａｓ対立遺伝子が同定された。インデル含有Ｋｒａｓ対立遺伝子は約５０個の腫瘍において同定された（図３１Ａ、Ｂ）。
【０２６２】
これらの分析は、個々の肺腫瘍からのＫｒａｓ対立遺伝子のいくつかにおいて、いくつかの他の予想外の特徴も明らかにした。コドン２４（Ｉ２４Ｌ、Ｉ２４Ｎ、Ｉ２４Ｍ）での３つの異なるミスセンス変異が分析した個々の肺腫瘍の小さいサブセットにおいて観察された。これらの改変の機能は、存在する場合、不明である。
【０２６３】
さらに、発明者らは、ＫｒａｓＨＤＲテンプレートの内因性Ｋｒａｓ遺伝子座への組換えがＫｒａｓＨＤＲテンプレート内に操作されたＡｖｒＩＩ及びＢｓｉＷＩ部位の外側で生じると最初に予測した（図３１Ｃ）。しかしながら、エクソン２の９７塩基対上流の２塩基対を改変することにより操作されたＡｖｒＩＩ部位は、ＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子のこの領域を直接分析した２５個の腫瘍のうち５つで不在であった。エクソン２の２０塩基対下流の１塩基対を改変することにより操作されたＢｓｉＷＩ部位は、５８個の腫瘍のうち１１個で不在であった。これらの知見は、ＫｒａｓＨＤＲテンプレートの組換えがより大きくより距離がある相同アーム内で生じることが最も多いが、５’及び３’ミスマッチ（ＰＡＭ＊変異、Ｋｒａｓコドン１２または１３変異、及びバーコード内の８つの潜在的なミスマッチを含む）の脇側に位置する非常に短い相同領域内でも検出可能な頻度で生じることを示した。
【０２６４】
いくつかの腫瘍内のＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子において重複の存在を最初に同定した後、ＨＤＲ組み込みＫｒａｓ遺伝子座のいずれかの側で生じたＫｒａｓエクソン２の重複を特異的に増幅するためにＰＣＲプライマーを設計した（右側の重複−フォワードプライマー：ＴＧＡＣＣＣＴＡＣＧＡＴＡＧＡＧＧＴＡＡＣＧ、リバースプライマー：ＣＴＣＡＴＣＣＡＣＡＡＡＧＴＧＡＴＴＣＴＧＡ、シーケンシングプライマー：ＴＧＡＣＣＣＴＡＣＧＡＴＡＧＡＧＧＴＡＡＣＧ；左側の重複−フォワードプライマー：ＴＧＡＧＴＧＴＴＡＡＡＡＴＡＴＴＧＡＴＡＡＡＧＴＴＴＴＴＧ、リバースプライマー：ＴＣＣＧＡＡＴＴＣＡＧＴＧＡＣＴＡＣＡＧＡＴＧ、シーケンシングプライマー：ＴＧＡＧＴＧＴＴＡＡＡＡＴＡＴＴＧＡＴＡＡＡＧＴＴＴＴＴＧ）。これらの重複特異的ＰＣＲプロトコルの各々は逆の配向で隣接のプライマー対を使用し、増幅の重複が存在した場合にのみ生じることを確実にした。野生型エクソン２の後半またはエクソン２全体（しかし、スプライスアクセプターの重要な領域を欠く）の重複を含む、様々な長さの重複が同定された（図３１Ｄ）。イントロン２の領域の欠失及び重複も観察された。さらに、Ｕ６プロモータ及びウイルスＩＴＲを含むＡＡＶベクターの部分のイントロン２への組み込みが観察された。これらの改変の大きさ及び位置を考慮すると、腫瘍形成を駆動するための発がん性Ｋｒａｓの要件と一致し、誰もＫｒａｓ変異エクソン２のエクソン３へのスプライシングを変更するとは予想しない。
【０２６５】
既知のＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子及びバーコードを有する細胞株からのハイスループットシーケンシングのための正規化対照の生成
シーケンシング正規化対照として使用するための細胞株を確立するために、ＰＴ；Ｈ１
１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスから単一の大きい腫瘍を解剖し、単一細胞懸濁液中に消化し、平板培養して細胞株を生成した。これらの細胞を拡張し、次いで、ＤＮＡを抽出した後、Ｋｒａｓエクソン２をＰＣＲ増幅した（フォワードプライマー：ＴＣＣＣＣＴＣＴＴＧＧＴＧＣＣＴＧＴＧＴＧ、リバースプライマー：ＧＧＣＴＧＧＣＴＧＣＣＧＴＣＣＴＴＴＡＣ）。ＰＣＲ産物をシーケンシングして（上述の特異的及び一般的なシーケンシングプライマーを使用する）、ＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子及びバーコードの存在を確認した。固有のバーコード（下記（ｉｖ）の組成）を有する単一ＫｒａｓＧ１２Ｖ対立遺伝子を同定した。この細胞株からのゲノムＤＮＡを、全てのバルク肺試料のハイスループットシーケンシングの正規化対照として使用した（図３４）。
【０２６６】
【化３】
2020512817.tif 000020
【０２６７】
バルク組織処理及びＤＮＡ抽出
バルク肺組織処理及びＤＮＡ抽出
バルク肺試料を感染させた（形質導入した）マウスから切断し、処理前に−８０℃で保管した。シーケンシングのためのＤＮＡを抽出するために、試料を解凍し、５０ｍＬの円錐管に移した。２０ｍＬの溶解緩衝液（Ｈ２Ｏ中、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．６、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０、０．５％ＳＤＳ）及び２００μＬのプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍＬ）を各試料に添加した。次に、正規化対照ＤＮＡの３μｇ（約５×１０５ゲノム）を各試料に添加した（図２５Ａ及び図３５Ｂ）。次いで、組織ブレンダーを使用して、試料を慎重に均質化し、組織ブレンダーはきれいな１０％漂白剤、７０％エタノール、及び１ＸＰＢＳを通過させることにより各試料の間に洗浄された。均質化した試料を５５℃で一晩溶解した。フェノール／クロロホルム抽出、続いてエタノール沈殿により、ＤＮＡを組織ライセートから単離した（図３７Ａ、Ｂ）。
【０２６８】
バルク膵組織処理及びＤＮＡ抽出
膵腫瘍塊を解剖し、消化し、生存（ＤＡＰＩ陰性）、系統（ＣＤ４５、ＣＤ３１、Ｔｅｒ１１９、Ｆ４／８０）陰性、Ｔｏｍａｔｏ陽性細胞をＦＡＣＳにより単離した。正規化対照は膵癌試料には添加されなかった。ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ＤＮＡをＦＡＣＳ単離した新生細胞から単離し、次いで、エタノール沈殿によりさらに精製した。
【０２６９】
ｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ライブラリ調製及びバルク組織からのＩ腫瘍バーコードのシーケンシング
大規模に並行かつ定量的様式で各Ｋｒａｓ変異型を保有する腫瘍の数及び大きさを明らかにするために、バーコード化されたＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子の多重Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）シーケンシングを可能にした２回ＰＣＲ戦略を開発した（図２７ｆ）。１回目のＰＣＲに関して、３つのＰＡＭ及びｓｇＲＮＡ標的部位変異（ＰＡＭ＊；１回目のフォワードプライマー配列は太字である）を含有するＫｒａｓＨＤＲ配列に相補的なフォワードプライマー（１回目のフォワードプライマー：下記（ｖ）の組成（配列番号２）、ならびにＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／ＣｒｅベクターのＨＤＲテンプレートに存在しない内因性Ｋｒａｓ遺伝子座の下流領域に相補的なリバースプライマー（１回目のリバースプライマー：ＴＴＡＧＣＡＧＴＴＧＧＣＣＴＴＴＡＡＴＴＧＧ）（配列番号３）が使用された。このプライマー対は、バルク腫瘍保持組織から精製されたＤＮＡに存在する豊富な野生型Ｋｒａｓ対立遺伝子または潜在的なエピソームＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅベクターを増幅することなく、ゲノムＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子を特異的に増幅するように選択された。加えて、多重Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）シーケンシングを可能にするために、Ｐ５アダプター（イタリック体）、８−ｂｐカスタムｉ５インデックス（Ｎ’ｓ）、及びＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）シーケンシングプライマー配列（リード１）（下線付き）が、１回目のフォワードプライマーの５’端に含まれた（
Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシング用の１回目のフォワードプライマー：下記（ｖｉ）の組成（配列番号４）。
【０２７０】
【化４】
2020512817.tif 000021
【０２７１】
重要なことには、個々の腫瘍内のＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子の特徴付けは、Ｋｒａｓイントロン２において多様なインデルをもたらすＨＤＲにおいてあるばらつきを明らかにしたため（図３２Ｄ）、４（肺試料）または６（膵臓試料）サイクルのみを１回目のＰＣＲにおいて行って、可変長の産物の増幅中の偏りの可能性を最小にした。さらに、高効率ポリメラーゼ（Ｑ５（登録商標）Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼ、ＮＥＢ；６４℃のアニーリング温度）及び長い伸張時間（３：００分間）を使用して、全てのＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子の頑強な増幅を確実にした。ゲノム肺ＤＮＡにおけるＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子は、４〜４０個の別個の１００μＬのＰＣＲ反応物を使用して増幅され、次いで、増幅後にプールして、ＰＣＲジャックポットの作用を低減した（図３４ａ）。これらの１００μＬのＰＣＲ反応物の各々は、大きい初期のＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子のプールから増幅するために、４μｇのＤＮＡテンプレートを含有した。１回目の増幅後、全ての反復ＰＣＲ反応物をプールし、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、１００μＬの各試料を洗浄した。
【０２７２】
１００μＬの２回目のＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ライブラリＰＣＲのために、精製した１回目のＰＣＲアンプリコンをテンプレートＤＮＡとして使用した（Ｑ５（登録商標）Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼ、ＮＥＢ；７２℃のアニーリング温度；肺試料に関しては３５サイクル、膵臓試料に関しては４０サイクル）。２回目のＰＣＲは、１回目のＰＣＲアンプリコンに存在したＫｒａｓエクソン２配列内の１１２−ｂｐ領域を全体的に増幅した。２回目のリバースプライマーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａライブラリの二重インデックスされたペアエンドシーケンシングを可能にするために、５’端にＰ７アダプター（イタリック体）、逆相補８−ｂｐカスタムｉ７インデックス（「Ｎｓ」）、及び逆相補Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングプライマー配列（リード２）（下線付き）を含有した（２回目のリバースプライマー＃１：下記（ｖｉｉ）の組成（配列番号５）。２回目のＰＣＲフォワードプライマーは、１回目のＰＣＲ中に、フォワードプライマーにより増幅したＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子に付加されたＰ５  Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプターに相補的であった（２回目のフォワードプライマー：ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣ）（配列番号６）。このプライマーを使用して、１回目のＰＣＲ反応から持ち越された可能性がある任意の汚染ゲノムＤＮＡを増幅することなく、１回目のＰＣＲアンプリコンを増幅した。さらに、Ｐ７アダプター配列をコードする２回目のリバースプライマーは、他の２つのプライマーと同じ濃度で、２回目のＰＣＲ反応物に添加された（２回目のリバースプライマー＃２：ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ）（配列番号７）。このプライマーは、２回目のリバースプライマー＃１により、ＫｒａｓＨＤＲアンプリコンに付加された逆相補Ｐ７アダプター配列に結合する。２回目のＰＣＲは３５〜４０サイクルにわたって行われたため、Ｐ７アダプター（２回目のリバースプライマー＃２）は、長い２回目のリバースプライマー＃１により産生された非特異的増幅の量を制限するために付加された。
【０２７３】
【化５】
2020512817.tif 000022
【０２７４】
２回目の増幅後、１００−μＬのＰＣＲ反応物は２．５％アガロースゲルで実行され、予想された大きさのバンドは切除された。ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ＤＮＡをゲル断片から抽出した。精製したＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ライブラリの質及び濃度は、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇ
ｉｌｅｎｔ）を使用して決定された。次いで、固有の二重インデックスを有する個々のＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ライブラリは、より大きい腫瘍負荷を有するマウスに本来由来するライブラリがより低い腫瘍負荷を有するマウスからのものよりも最終プールにおいて高い比率で表示されるように、一緒にプールされた（図３４Ａ）。合計３５個の個々の試料が２つのＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ライブラリプールに組み合わされた。各プールの質及び濃度はＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）で確認された。次いで、各最終Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ライブラリプールは、多重１５０ｂｐペアエンドＲａｐｉｄ  Ｒｕｎシーケンシングプログラム（Ｅｌｉｍ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を使用して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ＨｉＳｅｑレーンでディープシーケンシングされた。
【０２７５】
バーコード化された腫瘍の大きさ及び数を推定するためのＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングデータの分析
発明者らの逆多重Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）シーケンシングデータから腫瘍を呼び出すためのパイプラインを開発した。パイプラインは、固有のバーコード配列を集計し、アンプリコンのディープシーケンシングデータ（ＤＡＤＡ２）のノイズ除去をするように設計されたアルゴリズムを使用して、繰り返し起こるシーケンシングエラーを排除する。このアルゴリズムを、偽腫瘍呼び出しの発生を最小にし、技術的偏り（リード深度における変動、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）シーケンシング装置エラー率における変動、及びバーコード多様性における変動を含む）を最小にするように調整した。ＡＡＶ／Ｃａｓ９媒介体細胞ＨＤＲ駆動腫瘍形成後の腫瘍遺伝子型及びバーコードの分析に対する修正を含むこのパイプラインを以下に説明する。
【０２７６】
ペアエンドリードの統合、フィルタ処理、及びトリミング
発明者らのＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）シーケンシングライブラリは、ＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子の小さい１１２−ｂｐ断片を含有したが、これらの断片の１５０ｂｐペアエンドシーケンシングを行い、重複するフォワード及びリバースリードを統合して、ＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子のＫｒａｓコドン１２及び１３ならびにバーコード領域におけるＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）シーケンシングエラーの可能性を低減した。重複するペアエンドリードを統合し、品質フィルタ処理し、ＰＡＮＤＡｓｅｑを使用してトリミングした（断片長：６０ｂｐ、フォワードトリミングプライマー：ＡＴＧＡＣＴＧＡＧＴＡＴＡＡＡＣＴ；リバーストリミングプライマー：ＣＴＣＡＴＣＣＡＣＡＡＡＧＴＧＡ）。
【０２７７】
固有の腫瘍の呼び出し
フォワード及びリバースリードを統合して、シーケンシングエラーを低減した後でも、おそらく繰り返し起こるｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）シーケンシングエラー（または可能性は少ないが繰り返し起こるＰＣＲエラー）からの１０，０００塩基当たり平均約１つのエラーが検出された。このエラー率を考慮すると、単一ヌクレオチドミスマッチを含有する大きい固有にバーコード化された腫瘍からのリードは、大きい実際の腫瘍の大きさの約１／１０，０００の小さい偽腫瘍として呼び出されることが予想された。特定のマウスにおいて、最も大きい腫瘍に対して約３〜４桁小さく、１ヌクレオチド偏位を含有した偽「腫瘍」の小さいクラスターが観察されたため、この現象は眼で確認できた。加えて、各ＫｒａｓＨＤＲ変異型−バーコード対も発がん性コドン１２または１３の変異塩基において繰り返し起こるシーケンシングエラーを生成した。
【０２７８】
腫瘍を正確に呼び出すために、以下のステップを用いて、腫瘍バーコードシーケンシングデータを分析するための計算及び統計パイプラインを開発した。
ＤＡＤＡ２を使用して、リードの非バーコード領域からのエラーモデルを訓練し、固有のリードパイルアップを腫瘍にクラスター化する。
ＫＲＡＳコドン１２の上流の７つのヌクレオチド及び最終バーコード塩基の下流の７つ
のヌクレオチドからのシーケンシング／ＰＣＲエラーの残存率を推定した。次いで、ＤＡＤＡ２を介して、発明者らのシーケンシングエラーのモデルを使用して、固有のリードパイルアップ（バーコード化された塩基の７つのヌクレオチド以内に切り詰められた）を固有の腫瘍にクラスター化した。固有のクラスター起源の最小信頼度０．０１（すなわち、オメガ＿ａ＝０．０１）を使用した。閾値がより大きいと、マウス試料において呼び出された固有の腫瘍の数が増加した。ペアエンドシーケンシングが、固有のパイルアップが本当に異なる腫瘍であったという大きい信頼度をもたらすように思えたため、このより大きい値を選択した。例えば、この閾値が全ての意図されないリード配列（例えば、バーコードの外側の不適切なヌクレオチドを有するリード）を排除し、この閾値が生物学的反復間でより一貫した各マウス内の病変の総数を呼び出したことを見出した。これらは、リードエラーを適切に取り扱うことなく、呼び出された腫瘍の数がシーケンシングリード深度と正に相関し得るため、考慮すべき重要なことであった。最後に、１０，０００倍大きかった病変から１ヌクレオチドだけ偏位したＤＮＡ配列を有するあらゆる腫瘍を排除した。これは腫瘍呼び出しの１．５６％のみに影響を及ぼした。
【０２７９】
リードパイルアップを正規化対照に対して正規化しておよその腫瘍の大きさを得る。
リードパイルアップを生成し、上述の補正を行った後、各呼び出した腫瘍からのリード数を、バルク腫瘍保有組織ライセートからＤＮＡを抽出する前に各試料にスパイクされた正規化対照からのリード数に対して正規化した。これは、各腫瘍の呼び出し数の妥当な推定を得ることを可能にし、同じ遺伝子型及び処置のマウスからのデータを統合することを可能にした。しかしながら、各腫瘍内の細胞の絶対数を正確に定量化する発明者らの能力に影響を与えるいくつかの要因が存在する。
【０２８０】
最初に考慮するべきことは、個々の腫瘍内のＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子の一部がＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）シーケンシングのためのＰＣＲプライマー内のＫｒａｓイントロン２に挿入または欠失を保有したということである。異なる大きさのアンプリコンの存在がＰＣＲの偏りを生成した可能性があるが、長い伸張時間（約３分間）を使用し、また高速（２０〜３０秒／ｋｂ）、高忠実度ポリメラーゼ（Ｑ５（登録商標）；ＮＥＢ）を使用して、１回目のＩｌｌｕｍｉｎａライブラリＰＣＲにおいて４〜６サイクルのみを行うことにより、これを低減する試みを行った。２回目の増幅における最終Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ライブラリＰＣＲ産物は、全ての使用にわたって短くかつ均一であったため、ＰＣＲ増幅はこのステップにおいて偏っていないはずである。
【０２８１】
さらに、Ｋｒａｓ変異型及びバーコードが内因性Ｋｒａｓ遺伝子座にノックインされることを考慮すると、いくつかの腫瘍において、この領域はゲノム的に増幅されることが可能である（これは、肺癌のマウスモデルにおいて発生させたＫｒａｓＧ１２Ｄ駆動肺腫瘍において記述されている）。Ｋｒａｓ増幅は典型的には、非常に高いＫｒａｓコピー数をもたらすが、発明者らのリード計数から細胞数への変換は、各細胞がバーコード化されたＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子の単一コピーを含有すると仮定されるため、あらゆる増幅は、増幅したＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子を有する腫瘍内の細胞数についてわずかな過大評価をもたらす。
【０２８２】
最後に、正規化対照自体は、Ｋｒａｓイントロン２に既知の重複を有する腫瘍からの細胞から生成され、これは、重複を有しない腫瘍よりも１回目のＩｌｌｕｍｉｎａライブラリ調製物において、より大きいＰＣＲ産物をもたらす。したがって、正規化対照のＫｒａｓ対立遺伝子から離れるあらゆるＰＣＲの偏りは、重複を有しない腫瘍の大きさの系統的な過少評価をもたらす。
【０２８３】
バーコード重複率の推定及び腫瘍の大きさの分布の補正
発明者らのパイプラインと組み合わせたＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）Ｈｉ−Ｓｅｑ  
Ｒａｐｉｄ  Ｒｕｎの２レーン上の３５個の試料からの腫瘍バーコードのシーケンシングは、５桁超を網羅するリード計数で固有のバーコードの検出を可能にする。したがって、このアプローチの前例がない分解能は、大きい病変ならびにバルク組織内の小さい過形成の検出を可能にする。しかしながら、バルク組織内の多数の病変を検出する能力は、バーコード衝突、つまり、同じマウスにおいて同じＤＮＡバーコードを有する２つ以上の病変の発生の確率を増加させる。バーコード衝突は、２つの小さい「衝突」腫瘍が単一のより大きい腫瘍として同定されるため、観察された腫瘍の大きさを誇張し得る。したがって、発明者らは、この問題が中程度であり、呼び出された腫瘍の推定された大きさを明白に偏らせないことを確実にするために、バーコード衝突の統計モデルを開発した。
【０２８４】
発明者らのバーコード衝突モデルは、発明者らの研究の各Ｋｒａｓ変異型の２４，５７６個の可能なバーコードｉの各々を観察するという尤度ｐｉを説明する。発明者らのプールにおけるバーコード頻度間の再現性がある変動の大部分は、各ゆらぎ塩基でのヌクレオチド頻度における統計的に独立した変動に由来する（すなわち、各バーコードは、バーコード断片の合成中のヌクレオチド濃度にわずかな変動があるため、等しくプールに存在しない可能性がある）（図２３Ｇ）。したがって、バーコード内の各塩基ｂでの各ヌクレオチドｎの独立した頻度ｆｂ，ｎを推定し、この表を使用して、以下のように、各バーコードの配列Ｂｉ，ｂ，ｎに基づいたバーコード尤度を予測する（ここで、バーコードｉが位置ｂでヌクレオチドｎを有する場合、Ｂは１であり、そうでなければ０である）。
【０２８５】
【数１０】
2020512817.tif 000023
【０２８６】
ここで、マトリックス表記を使用して、点乗積を示す。このモデルは、２１個の自由パラメータのみを用いて全てのバーコードの頻度を予測する。バーコードのある残存過剰表示が肺試料に存続したため、ヌクレオチド頻度について補正した後、全ての肺分析から最も頻繁に観察されたバーコード１０％を単純に廃棄した。これらの最も頻繁に観察されたバーコードは、ウイルス産生の前に、発明者らのＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／ＣｒｅプラスミドプールのＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）シーケンシング（ＭｉＳｅｑ）によって、発明者らのマウス実験とは関係なく同定された。この処理後、次いで、Σｉ
ｐｉを１に再正規化した。
【０２８７】
次いで、各マウス内の各バーコードの発生が多項サンプリングプロセスであると仮定した。そうすると、各マウス内の各観察されたバーコードの衝突Ｃｉの平均数は以下である。
【０２８８】
【数１１】
2020512817.tif 000024
【０２８９】
ここで、μｉは各マウス内のバーコードの平均数を示し、一方、Ｎは腫瘍の総数を示す（両方とも不明である）。Ｎは、下記の方程式及びＢｒｅｎｔ法を使用して、各マウスの観察された腫瘍数Ｎ（ｏｂｓ）から決定された。
【０２９０】
【数１２】
2020512817.tif 000025
【０２９１】
このモデルは、バーコード衝突が発明者らのマウス試料において一般的に稀であった（平均４．０４％）ことを見出した。しかしながら、衝突の尤度はマウス及びＫｒａｓ変異型により変動し得る。例えば、ＷＴ  ＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子の衝突の平均予測数は５．８％であり、１匹のマウスでは１２％に達する。ＷＴ  Ｋｒａｓベクターは、初期のＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅプラスミドプール）において各変異Ｋｒａｓベクターよりも意図的に約４倍多く表示されるため、ＷＴ  ＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子は、最高数の衝突となると予想された（図２３Ｆ）。したがって、発明者らは、各病変の
大きさを１＋Ｃｉで分割して、バーコード衝突が腫瘍の大きさの分布に影響を及ぼす偏りを最小にした。衝突は稀な事象であるため、特定のマウス内の特定の衝突数は、実質的にＣｉとは異なり得る。この制限のため、この補正はバーコード衝突に起因する腫瘍の大きさの分布における系統的な偏りを最小にすると考えるが、生じた特定の衝突を効率的に同定することができない。
【０２９２】
Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）シーケンシングの質及び再現性の決定
Ｋｒａｓ変異型が腫瘍形成を駆動する定量的に異なる能力を有するかを決定するために、１００，０００個を超える細胞を含有することが推定される腫瘍（すなわち、約５×１０５個の細胞に由来した各試料に添加された正規化対照ＤＮＡの「大きさ」の１／５）に重点を置くことを選択した。反復試料（独立した試料調製、シーケンシング、及び処理）からこの細胞数カットオフを上回る腫瘍の回帰分析は、高い相関を示した（全てのＲ２値は０．９９を上回った。図３６を参照されたい）。さらに、このカットオフを下回る腫瘍内の細胞の推定数は、バーコード衝突、ならびにＰＣＲ増幅及びシーケンシングにおけるばらつきにより偏る可能性が高く、それらの全てが各Ｋｒａｓ変異型を保有する腫瘍の大きさ及び数を正確に呼び出す発明者らの能力を減少させる。
【０２９３】
バルク腫瘍保有肺からのシーケンシングデータの分析
Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９対立遺伝子（ＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９、ＬＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９、及びＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９）を有する全てのマウス遺伝子型において１００，００個の細胞を超える腫瘍を計数し、各変異型を、ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅプラスミドプールにおけるその初期の表示で分けることにより、各ＫｒａｓＧ変異型を保有する腫瘍の相対数を定量化した（この分析に関して、プラスミドプールにおける各変異型の初期表示は、バーコード存在量の９８パーセンタイルを上回るバーコードを除去した後、各Ｋｒａｓ変異型と関連するリードの総数から計算された。この制限は、はっきりとは結果を改変せず、非常に豊富な変異型−バーコード対が特定の変異型の全体的な表示に明白に影響を及ぼさなかったことを確実にするために単に適用された）。
【０２９４】
次いで、ＷＴ  Ｋｒａｓ変異型が１の表示を有するように相対腫瘍数を調整した。１００，０００個の細胞を超える腫瘍から生じるように見えた比較的少数のＷＴ  ＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子が存在した。これらは、ＨＤＲ事象が非発がん性Ｋｒａｓ  ＷＴ遺伝子型を創出したが、それにもかかわらず、他の理由で腫瘍に進化したか、またはＷＴ  Ｋｒａｓ変異型が同じ肺細胞において同時ＨＤＲにより発がん性Ｋｒａｓ変異型と「ヒッチハイク」し、続いて、拡大駆動だが、発がん性変異型となった腫瘍を表し得る。
【０２９５】
バルク組織から解剖した（及び上述したように分析された）個々の腫瘍からの少数の残存細胞は、通常、発明者らのバルク腫瘍シーケンシングデータにおいて検出可能であった。腫瘍の大きさの全ての分析において、これらの解剖された腫瘍は、それらの真の大きさを推測することができなかったため、除外された。しかしながら、各処置されたマウスの遺伝子型において１００，０００個を超える細胞の腫瘍数を分析したとき、解剖可能な腫瘍が常に任意のマウス内で観察された最大のものの中にあり、したがって、１００，０００個の細胞閾値を確実に超えるため、個々に解剖された腫瘍からのデータを含めた。
【０２９６】
腫瘍数において統計的に有意な相違は、フィッシャーの正確検定を使用して決定された。各変異型に関して、２つの試験を行い、Ｇ１２ＤまたはＷＴ  ＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子の頻度のいずれかと比較した。全てのｐ値は、調査された変異型の数についてボンフェローニ補正され、両側であった。両側「多数細胞」ピアソンカイ二乗検定を使用して、Ｔ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスに対するＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９及びＬＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスの全てのＫｒａｓ変異型にわたって腫瘍数の分布を比較した。
【０２９７】
実施例３．インビボでの肺腺癌における腫瘍抑制の適応度ランドスケープ
単独でまたは組み合わせでがんにおいて見出される大半のゲノム改変の機能的な影響はほとんど不明のままである。本明細書に記載の実験とともに、腫瘍バーコード化の組み込み、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介ゲノム編集、及びウルトラディープバーコードシーケンシングが、ヒト肺腺癌の自発性マウスモデルにおいて腫瘍抑制因子改変の対の組み合わせを調べるために示される。３１個の一般的な肺腺癌遺伝子型の腫瘍抑制作用がマッピングされ、状況依存及び差次的作用強度の凸凹のランドスケープを明らかにした。
【０２９８】
結果
がん成長は、主に、複数の協同性ゲノム改変の結果である。がんゲノムシーケンシングは、ヒトがん内の多数の改変をカタログ化してきたが、腫瘍成長に対するこれらの改変の組み合わせ作用はほとんど不明である。大半の推定上の駆動物質は１０パーセント未満の腫瘍において改変され、これらの改変が、不活性である、弱く有益である、またはある特定のゲノム状況においてのみ有益である可能性があることを示唆する。可能な組み合わせの数が候補遺伝子数と要因的に対応するため、同時発生率単独により遺伝子相互作用を調べることは実際には不可能である。遺伝子操作されたマウスモデルは、自発性環境内の腫瘍成長における遺伝子機能の見識を提供することができるが、実際的な考慮は、組み合わせ腫瘍抑制遺伝子不活性化の広範な研究を妨げてきた（図４１）。したがって、インビボでの腫瘍成長を駆動する遺伝子相互作用の発明者らの理解は限られたままである。
【０２９９】
これらの実際的な問題に対処するために、ディープシーケンシングと組み合わせた腫瘍バーコード化（Ｔｕｂａ−ｓｅｑ）を使用して、並行して多くの異なる腫瘍抑制遺伝子改変の作用を定量的に測定するための方法が開発された（本明細書に記載される）。Ｔｕｂａ−ｓｅｑは、肺腺癌の遺伝子操作されたマウスモデルを、腫瘍抑制因子不活性化（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介）、腫瘍バーコード化、及びディープシーケンシングと組み合わせる。Ｔｕｂａ−ｓｅｑは全ての腫瘍の大きさを測定し、個々のマウスの多重腫瘍遺伝子型に適合するため、前例がない精度、感度、及びスループットで成長作用を測定することができる。ここで、このアプローチは用いた。３１個の一般的な腫瘍抑制遺伝子型を有する発がん性ＫｒａｓＧ１２Ｄ駆動肺腫瘍の成長を定量化する（図３９）。予想外の遺伝子相互作用が同定され、大半の腫瘍抑制因子の作用は状況依存であることが見出され、ヒト肺腺癌における遺伝子改変のいくつかのパターンが説明された。
【０３００】
腫瘍抑制因子ＴＰ５３は、ヒト肺腺癌の半分以上において不活性化される。他の１０個の推定上の腫瘍抑制因子の成長抑制作用に対するｐ５３欠失の作用を決定するために、多くの一般的な腫瘍抑制遺伝子を標的とするバーコード化されたＬｅｎｔｉ−ｓｇＲＮＡ／Ｃｒｅベクターのプール、及び４つのバーコード化されたＬｅｎｔｉ−ｓｇＩｎｅｒｔ／Ｃｒｅベクター（Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅ；図３９、４１、及び４２）を使用して、ＫｒａｓＬＳＬ−Ｇ１２Ｄ；Ｒｏｓａ２６ＬＳＬ−ｔｄＴｏｍａｔｏ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９（ＫＴ；Ｃａｓ９）及びＫＴ；ｐ５３ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ；Ｃａｓ９（ＫＰＴ；Ｃａｓ９）マウスにおいて腫瘍を発生させた。バーコードは、各腫瘍及びそのｓｇＲＮＡを固有に同定する２つの構成要素を含有した（ｓｇＩＤ−ＢＣ；図４２）。各遺伝子型の各腫瘍における新生細胞の数は、肺が広範な過形成、腺腫、及びある程度の初期の腺癌を含有した腫瘍発生の１５週間後に決定した。ｓｇＩＤ−ＢＣ領域をバルク腫瘍保有肺ゲノムＤＮＡから増幅し、産物をディープシーケンシングし、Ｔｕｂａ−ｓｅｑ分析パイプライン（本明細書に記載される）を適用した。
【０３０１】
ＫＴ；Ｃａｓ９及びＫＰＴ；Ｃａｓ９マウスのＴｕｂａ−ｓｅｑ分析は、発明者らの調査の遺伝子の多くについての腫瘍抑制作用の改変されたスペクトルを明らかにした（図３９及び４３）。腫瘍の大きさは、前に入念に調べた２つの測定：対数正規（ＬＮ）平均及
び９５パーセンタイル腫瘍の大きさにより要約された（図３９）。ｐ５３欠損腫瘍において、Ｒｂ１、Ｓｅｔｄ２、Ｌｋｂ１／Ｓｔｋ１１、Ｃｄｋｎ２ａ、またはＡｐｃ  ｓｔｉｌｌの不活性化は、尚も成長利点を提供し、一方、Ｓｍａｄ４、Ａｒｉｄ１ａ、及びＡｔｍは、ｐ５３の不在下でのみ腫瘍抑制因子として現れた（図３９及び４３）。この背景でのさらなる腫瘍抑制因子の出現は、ｐ５３欠損が後の腫瘍進化を促進することを示唆する。より多くの変異を適応性にさせることにより、ｐ５３の喪失は、腫瘍進化の予測可能性を減少させ、治療抵抗性及び転移疾患の出現を含むさらなる腫瘍進化を容易にする可能性がある。
【０３０２】
ｐ５３の同時欠失は、より多くの改変を適応性にさせるだけでなく、腫瘍抑制因子喪失の作用規模も大幅に変更した。ＫＴ；Ｃａｓ９マウスにおいて、Ｒｂ１欠損は、Ｌｋｂ１−またはＳｅｔｄ２欠損よりも腫瘍の大きさを増加させなかった（図３９及び図４４ａ；別途指定されない限り、Ｐ＜０．０００１ブートストラップ試験）。対照的に、ｐ５３欠損背景において、Ｒｂ１欠損は、Ｌｋｂ１−またはＳｅｔｄ２欠損と比較可能な成長利点を付与し（Ｐ＞０．０５）、ｐ５３とＲｂ１腫瘍抑制因子経路との間の強い互助作用と一致した（図３９）。バルクＫＰＴ；Ｃａｓ９肺ＤＮＡにおける各標的遺伝子座のＣａｓ９生成インデルの定量化は、比較可能な高いパーセンテージのインデルを有するＬｋｂ１、Ｓｅｔｄ２、及びＲｂ１対立遺伝子を確認した（図３９及び４５）。最後に、肺がん成長に対するｐ５３及びＲｂ１の同時不活性化の作用は、従来のＣｒｅ／ＬｏｘＰに基づくマウスモデルを使用して確認された（図４４）。
【０３０３】
ｐ５３能力対ｐ５３欠損腫瘍におけるＲｂ１不活性化の定量的に異なる成長利益は、駆動物質の適応度強度における変化がヒト肺腺癌においてその改変の頻度を改変するかを調査する機会を提示した。実際、ＲＢ１改変（ＳＮＶ及びＣＮＶ）及びＴＰ５３改変の同時発生はヒト肺腺癌において富化された（Ｐ＝０．０３；Ｆｉｇ．図３９及び図４４）。とりわけ、これら２つの改変の同時発生において約５倍富化したにもかかわらず、この相互作用は、複数の仮説試験に関して補正された後の全ての可能な対の駆動物質相互作用の未処理調査において統計的に有意ではなく、したがって、同時発生パターンを超えた遺伝子相互作用を機能的に研究する必要性を図示する（１０個の対の相互作用のボンフェローニ補正後、Ｐ＝０．３２）。
【０３０４】
次に、ＫＴ；Ｌｋｂ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ；Ｃａｓ９（ＫＬＴ；Ｃａｓ９）マウスにおいて腫瘍をＬｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅで発生させることにより、Ｌｋｂ１及び他の推定上の腫瘍抑制因子の組み合わせ喪失の作用が調査された（図４０及び４３）。Ｌｋｂ１は、自発性モデルにおいて肺腫瘍成長を劇的に増加させ、ヒト肺腺癌において頻繁に不活性化されるため、調査された（図４１）。興味深いことに、適応性腫瘍抑制因子喪失の数及び中央成長利益の両方が既に急速に成長するＬｋｂ１欠損腫瘍において減衰した（マウス背景間の統計力の変化に関係なく、Ｐ＜０．０５、方法）。再度、これは単一の改変が腫瘍の適応度ランドスケープ全体を変更することができることを示す。収穫逓減エピスタシスと称される適応度利益の全般的な減衰は、進化において一般的であり、腫瘍が最終的には適応度プラトーに達し得ることを示唆する。
【０３０５】
Ａｐｃ及びＲｂ１の不活性化は、Ｌｋｂ１欠損腫瘍に対して顕著な成長利点を提供する唯一の改変であった（図４０）。Ｒｂ１欠損が腫瘍の大きさを増加させる能力は、同時Ｌｋｂ１欠損を伴っても、細胞周期調節におけるＲｂ１の完全な役割及び基本的に異なるＬｋｂ１喪失からの作用機序を強調する。Ａｐｃ喪失も肺癌成長の主要な駆動物質であり、Ａｐｃは研究した３つ全ての背景において腫瘍抑制性であった。
【０３０６】
驚くべきことに、Ｌｋｂ１欠損腫瘍の成長に対するＳｅｔｄ２欠損の作用は、中程度であり、統計的に有意ではなかった（図４０）。この重複は、Ｌｋｂ１及びＳｅｔｄ２両方
の不活性化がＫＴ；Ｃａｓ９及びＫＰＴ；Ｃａｓ９マウスにおいて成長を強く促進したため、そしてこれらの遺伝子が同じ経路で機能するというエビデンスがないため、際立った。したがって、Ｓｅｔｄ２不活性化の状況依存を試験し、ＫＰＴ，ＫＰＴ；Ｃａｓ９、及びＫＬＴ；Ｃａｓ９マウスにおいて腫瘍をＬｅｎｔｉ−ｓｇＮｅｏ２／Ｃｒｅ及びＬｅｎｔｉ−ｓｇＳｅｔｄ２／Ｃｒｅを用いて発生させることにより確認した。Ｓｅｔｄ２不活性化は、もしあれば、Ｌｋｂ１欠損腫瘍に成長利点をほとんど付与することなく、Ｌｋｂ１能力肺腫瘍成長を増強した（組織学的分析に関しては（ＫＰＴ；Ｃａｓ９／ＫＬＴ；Ｃａｓ９のｓｇＳｅｔｄ２）／（ＫＰＴ；Ｃａｓ９／ＫＬＴ；Ｃａｓ９のｓｇＮｅｏ２）のＰ＜０．０５、Ｔｕｂａ−ｓｅｑ分析に関してはＰ＜０．０００１、図４０及び４６）。この所見も、ヒト肺腺癌におけるＬＫＢ１／ＳＴＫ１１及びＳＥＴＤ２の改変の相互排他性により十分に支持される（Ｐ＜０．００１、図４０及び４６）。
【０３０７】
これらの研究の大半の遺伝子は、ｐ５３またはＬｋｂ１の存在下または不在下でのみ腫瘍成長を駆動する状況依存成長作用を示した（図４０）。３つ全ての状況において利点を付与した腫瘍抑制因子改変（Ｒｂ１及びＡｐｃ）でさえ、腫瘍抑制の状況依存規模を尚も示した。そのような広範の状況依存は、駆動物質相互作用が無視されるか、または限られた相関のみを考慮することを正当化するためには十分に稀であり、及び／もしくは弱いと推定されるかのいずれかである、駆動物質の包括的な調査により見逃される。それにもかかわらず、発明者らの適応度測定は、これらのデータの限られた統計的分解能にもかかわらず、ヒト肺癌において変異同時発生パターンと全体的に一致する（ピアスマンのＲ＝０．５０、Ｐ＜０．０５、図４７）。さらに、肺癌は、それらの状況依存の程度において固有であるようには見えないが（図４７）、ここでの知見は、他のがんの種類における状況依存の直接的な測定が保証されることを示唆する。
【０３０８】
腫瘍進化のこの凹凸のランドスケープは、いくつかの意味合いがある。第１に、遺伝子機能を理解するために、調査の大半の遺伝子（１１個中８個）は一部の状況においてのみ適応性であったため、複数の遺伝学的状況において推定上の駆動物質を調査することが重要であり得る（図４０）。第２に、広い適応度プロファイリングが望ましい。ここでの検出力分析は、約５００種の中強度相互作用がＴｕｂａ−ｓｅｑを使用して１００匹のマウスコホートで調査することができたことを示唆する（図４８）。より大きいゲノムスクリーニングは、より多くの推定上の駆動物質、他の発がん性事象との相互作用、同じ遺伝子を標的とする複数のｓｇＲＮＡ、または腫瘍抑制因子改変の３つ組を調査することができた。最後に、駆動物質改変は特定の遺伝学的状況にのみ有益であるため、この広範な状況依存は、大半の駆動物質改変が固定される頻度は低いことを示唆する。
【０３０９】
本明細書に記載されるインビボでの組み合わせ腫瘍抑制因子喪失の適応度作用の研究は、従来の方法論ならびにヒト肺腺癌ゲノムデータにより検証された予想外の遺伝子相互作用を同定した。本明細書に記載されるバーコード化された、多重のゲノム編集アプローチは、これらの遺伝子相互作用の機能的結果（治療応答に対するそれらの影響、細胞シグナル伝達、及び／または転移進行を含む）を調べるために容易に利用することができた。
【０３１０】
相互参照
本出願は、２０１７年４月３日出願の米国仮特許出願第６２／４８１，０６７号の利益を主張するものであり、この出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２８−１】
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【図２８−２】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１−１】
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【図３１−２】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６−１】
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【図３６−２】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９−１】
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【図３９−２】
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【図４０−１】
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【図４０−２】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３−１】
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【図４３−２】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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