(57)【要約】  本発明は、ＯＸ４０に特異的に結合することができる第１の結合ドメインと、ＣＴＬＡ−４に特異的に結合することができる第２の結合ドメインとを含む、二重特異性抗体などの二重特異性ポリペプチドを提供する。本発明はさらに、当該二重特異性ポリペプチドの組成物、ならびにその方法および使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＯＸ４０に特異的に結合することができるＢ１と称される第１の結合ドメインと、ＣＴＬＡ−４に特異的に結合することができるＢ２と称される第２の結合ドメインとを含む、二重特異性ポリペプチド。
【請求項２】
前記第１および／または第２の結合ドメインが、抗体またはその抗原結合断片からなる群から選択される、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記抗原結合断片が、Ｆｖ断片（一本鎖Ｆｖ断片、またはジスルフィド結合Ｆｖ断片など）、Ｆａｂ様断片（Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、またはＦ（ａｂ）２断片など）、およびドメイン抗体からなる群から選択される、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、二重特異性抗体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
（ａ）結合ドメインＢ１および／もしくは結合ドメインＢ２が、インタクトなＩｇＧ抗体であり、
（ｂ）結合ドメインＢ１および／もしくは結合ドメインＢ２が、Ｆｖ断片であり、
（ｃ）結合ドメインＢ１および／もしくは結合ドメインＢ２が、Ｆａｂ断片であり、かつ／または
（ｄ）結合ドメインＢ１および／もしくは結合ドメインＢ２が、単一ドメイン抗体である、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記二重特異性ポリペプチドが、
（ａ）ＩｇＧ−ｓｃＦｖ二重特異性抗体などの二価の二重特異性抗体（例えば、Ｂ１が、インタクトなＩｇＧであり、Ｂ２が、ＩｇＧの軽鎖のＮ末端および／もしくはＣ末端において、かつ／またはＩｇＧの重鎖のＮ末端および／もしくはＣ末端においてＢ１に結合したｓｃＦｖであるか、あるいはその逆であるもの）、
（ｂ）ＤｕｏＢｏｄｙ（登録商標）または「ノブ・イン・ホール」二重特異性抗体（例えば、ｓｃＦｖ−ＫＩＨ、ｓｃＦｖ−ＫＩＨｒ、ＢｉＴＥ−ＫＩＨ、もしくはＢｉＴＥ−ＫＩＨｒなどの一価の二重特異性抗体、
（ｃ）ｓｃＦｖ２−Ｆｃ二重特異性抗体（例えば、ＡＤＡＰＴＩＲ（商標）二重特異性抗体）、
（ｄ）ＢｉＴＥ／ｓｃＦｖ２二重特異性抗体、
（ｅ）用いられる二価またはリンカー／コネクターにかかわらず、ＤＶＤ−Ｉｇ二重特異性抗体または他のＩｇＧ−ＦＡｂ、ＦＡｂ−ＩｇＧ二重特異性抗体、
（ｆ）ＤＡＲＴ系二重特異性抗体（例えば、ＤＡＲＴ−Ｆｃ、ＤＡＲＴ２−Ｆｃ、またはＤＡＲＴ）、
（ｇ）ＤＮＬ−Ｆａｂ３二重特異性抗体、ならびに、
（ｈ）ｓｃＦｖ−ＨＳＡ−ｓｃＦｖ二重特異性抗体からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
ヒトＦｃ領域または前記領域の変異型を含み、前記領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４領域、好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ４領域である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、および／またはアポトーシスを誘導することができる、請求項１〜７のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項９】
Ｂ１が、ＯＸ４０に特異的な抗体またはその抗原結合断片であり、
Ｂ２が、ＣＴＬＡ−４に特異的なポリペプチド結合ドメインであり、
ｉ）配列番号３のアミノ酸配列、または
ｉｉ）当該結合ドメインが野生型ヒトＣＤ８６よりも高い親和性でヒトＣＴＬＡ−４に結合することを条件に、配列番号３のアミノ酸配列と比較すると、少なくとも１つのアミノ酸が変化しているアミノ酸配列、を含むかまたはそれからなる、請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記ポリペプチドによって特異的に結合される前記ＣＴＬＡ−４が、霊長類またはマウス、好ましくはヒトのＣＴＬＡ−４であり、かつ／または前記ポリペプチドによって特異的に結合される前記ＯＸ４０が、霊長類、好ましくはヒトのＯＸ４０である、請求項１〜９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
Ｂ１が、少なくとも１つの重鎖（Ｈ）および／または少なくとも１つの軽鎖（Ｌ）を含み、Ｂ２が、前記少なくとも１つの重鎖（Ｈ）または少なくとも１つの軽鎖（Ｌ）に結合している、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
Ｂ１が、
−少なくとも１つの重鎖（Ｈ）および少なくとも１つの軽鎖（Ｌ）を含み、Ｂ２が、前記重鎖もしくは前記軽鎖のいずれかに結合しているか、または
−２つの同一の重鎖（Ｈ）および２つの同一の軽鎖（Ｌ）を含み、Ｂ２が、両方の重鎖もしくは両方の軽鎖に結合している、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
Ｎ−Ｃ方向に書かれている以下の式：
（Ａ）Ｌ−（Ｘ）ｎ−Ｂ２、
（Ｂ）Ｂ２−（Ｘ）ｎ−Ｌ、
（Ｃ）Ｂ２−（Ｘ）ｎ−Ｈ、
（Ｄ）Ｈ−（Ｘ）ｎ−Ｂ２、のうちのいずれか１つに従って配置されたポリペプチドを含むかまたはそれからなり、
式中、Ｘがリンカーであり、ｎが０または１である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
Ｘが、アミノ酸配列ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４７）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＰ（配列番号４８）、ＮＦＳＱＰ（配列番号４９）、ＫＲＴＶＡ（配列番号５０）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１４４）、またはｍ＝１〜７である（ＳＧ）ｍを有するペプチドである、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
５０×１０−１０Ｍ、２５×１０−１０Ｍ、もしくは２０×１０−１０Ｍ未満のＫｄでヒトＯＸ４０に結合し、かつ／または６０×１０−９Ｍ、２５×１０−９Ｍ、もしくは１０×１０−９Ｍ未満であるＫｄ値でヒトＣＴＬＡ−４に結合する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
エフェクターＴ細胞、好ましくはＣＤ４＋エフェクターＴ細胞の活性の増加を誘導し、任意選択的に、前記増加が、前記Ｔ細胞に別々の分子として投与されたＢ１とＢ２との組み合わせによって誘導されるエフェクターＴ細胞の活性の増加よりも少なくとも１．５倍、４．５倍、または７倍高い、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
前記Ｔ細胞活性における増加が、前記Ｔ細胞による増殖の増加、および／またはＩＬ−２産生の増加である、請求項１６に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
ＯＸ４０への結合について抗体１１６６／１１６７と競合し、かつ／またはＣＴＬＡ−４への結合についてＣＤ８６突然変異体１０４０（配列番号１７）と競合する、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
ＯＸ４０への結合について抗体１１６６／１２６１と競合し、かつ／またはＣＴＬＡ−４への結合について抗体１１６６／１２６１と競合する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
Ｂ２（ｉｉ）の前記アミノ酸配列中の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０個のアミノ酸が、前記配列番号３のアミノ酸配列と比較すると置換されており、任意選択的に、前記配列番号３のアミノ酸配列と比較して挿入または欠失が存在しない、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
前記第１の結合ドメインの前記アミノ酸配列中の前記アミノ酸置換のうちの少なくとも１つが１２２位にあり、任意選択的に、前記アミノ酸配列が、１０７位、１２１位、および１２５位のうちの少なくとも１つで置換されてもいる、請求項２０に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
Ｂ２の前記アミノ酸配列が、配列番号６〜２４（表Ｃに示される）のうちのいずれか１つから選択されるアミノ酸配列、または配列番号６〜２４のアミノ酸配列に対して６０％を超える、もしくは７０％を超える、例えば７５もしくは８０％、好ましくは８５％を超える、例えば９０もしくは９５％を超えるアミノ酸同一性を有する前記配列の変異型を含むかまたはそれからなる、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
Ｂ２の前記アミノ酸配列が、配列番号１７（表Ｃに示されるＣＤ８６突然変異体１０４０）のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
Ｂ１が、Ｂ２とは独立して存在する場合、以下の機能的特徴：
Ｉ．１０×１０−１０Ｍ未満、より好ましくは５×１０−１０Ｍ未満のＫＤ値でヒトＯＸ４０に結合すること、
ＩＩ．マウスＯＸ４０に結合しないこと、および
ＩＩＩ．他のヒトＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー、例えばヒトＣＤ１３７またはＣＤ４０に結合しないこと、のうちの少なくとも１つを呈する、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
Ｂ１が、
（ａ）８アミノ酸長であり、コンセンサス配列「Ｇ、Ｆ、Ｔ、Ｆ、Ｇ／Ｙ／Ｓ、Ｇ／Ｙ／Ｓ、Ｙ／Ｓ、Ｙ／Ｓ／Ａ」を含む重鎖ＣＤＲ１配列、
（ｂ）８アミノ酸長であり、コンセンサス配列「Ｉ、Ｇ／Ｙ／Ｓ／Ｔ、Ｇ／Ｓ／Ｙ、Ｓ／Ｙ、Ｇ／Ｓ／Ｙ、Ｇ／Ｓ／Ｙ、Ｇ／Ｓ／Ｙ、Ｔ」を含む重鎖ＣＤＲ２配列、
（ｃ）９〜１７アミノ酸長であり、コンセンサス配列「Ａ、Ｒ、Ｇ／Ｙ／Ｓ／Ｈ、Ｇ／Ｙ／Ｆ／Ｖ／Ｄ、Ｇ／Ｙ／Ｐ／Ｆ、−／Ｈ／Ｓ、−／Ｎ／Ｄ／Ｈ、−／Ｙ／Ｇ、−／Ｙ、−／Ｙ、−／Ｗ／Ａ／Ｖ、−／Ａ／Ｙ、−／Ｄ／Ａ／Ｙ／Ｇ／Ｈ／Ｎ、Ｙ／Ｓ／Ｗ／Ａ／Ｔ、Ｌ／Ｍ／Ｉ／Ｆ、Ｄ、Ｙ」を含む重鎖ＣＤＲ３配列、
（ｄ）配列「Ｑ、Ｓ、Ｉ、Ｓ、Ｓ、Ｙ」からなる軽鎖ＣＤＲ１配列、
（ｅ）配列「Ａ、Ａ、Ｓ」からなる軽鎖ＣＤＲ２配列、
（ｆ）８〜１０アミノ酸長であり、コンセンサス配列「Ｑ、Ｑ、Ｓ／Ｙ／Ｇ、−／Ｙ／Ｈ／Ｇ、−／Ｓ／Ｙ／Ｇ／Ｄ／Ｗ、Ｓ／Ｙ／Ｇ／Ｄ、Ｓ／Ｙ／Ｇ／Ｔ、Ｐ／Ｌ、Ｙ／Ｓ／Ｈ／Ｌ／Ｆ、Ｔ」を含む軽鎖ＣＤＲ３配列、から独立して選択されるいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ全ての特徴を含み、
（ｃ）の前記重鎖ＣＤＲ３配列が、好ましくは、コンセンサス配列「Ａ、Ｒ、Ｙ／Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ａ／Ｙ／Ｇ、Ｓ／Ｗ／Ａ、Ｍ／Ｌ、Ｄ、Ｙ」を含む１０アミノ酸長の配列であり、
（ｆ）の前記軽鎖ＣＤＲ３配列が、好ましくは、配列「Ｑ、Ｑ、Ｙ、Ｙ、Ｗ、Ｙ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ」からなる、請求項１〜２４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
Ｂ１が、表Ａ（１）に示されるＶＨ配列の３つ全ての重鎖ＣＤＲ配列および／もしくは表Ａ（２）に示されるＶＬ配列の３つ全ての軽鎖ＣＤＲ配列を含むか、またはＢ１が、表Ｂに示される重鎖ＶＨ配列および／もしくは軽鎖ＶＬ配列を含む、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
Ｂ１が、コンセンサス配列「Ａ、Ｒ、Ｙ／Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ａ／Ｙ／Ｇ、Ｓ／Ｗ／Ａ、Ｍ／Ｌ、Ｄ、Ｙ」を含む１１アミノ酸長の重鎖ＣＤＲ３配列と、配列番号８９（表Ｂに示される１１６７）の軽鎖ＶＬ配列とを含み、任意選択的に、配列番号８９の軽鎖ＶＬ配列が、配列番号１２５（表Ｄに示される１２６１）のより長い配列の一部として存在する、請求項１〜２６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
結合ドメインＢ１が、前記配列番号８９（表Ｂに示される１１６７）の軽鎖ＶＬ配列、および配列番号９１（表Ｂに示される１１６６）の重鎖ＶＨ配列、または配列番号８９および／もしくは配列番号９１に対して６０％を超える、もしくは７０％を超える、例えば７５もしくは８０％、好ましくは８５％を超える、例えば９０もしくは９５％を超えるアミノ酸同一性を有する前記配列の変異型を含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
Ｂ１が、ヒトＦｃ領域または前記領域の変異型を含み、前記領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４領域、好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ４領域である、請求項１〜２８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３０】
配列番号１２５〜１３４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、任意選択的に、前記ポリペプチドが、抗体、または配列番号１２５〜１３４のアミノ酸配列に対して６０％を超える、もしくは７０％を超える、例えば７５もしくは８０％、好ましくは８５％を超える、例えば９０もしくは９５％を超えるアミノ酸同一性を有する前記配列の変異型の構成要素部分として提供される、請求項１〜２９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
配列番号１２５（表Ｄに示される１２６１）のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、請求項１〜３０のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
配列番号１２５のアミノ酸配列および／もしくは配列番号９１のアミノ酸配列、または配列番号１２５および／もしくは配列番号９１に対して６０％を超える、もしくは７０％を超える、例えば７５もしくは８０％、好ましくは８５％を超える、例えば９０もしくは９５％を超えるアミノ酸同一性を有する前記配列の変異型を含むかまたはそれからなる、請求項１〜３１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
配列番号１２５（表Ｄに示される１２６１）のアミノ酸配列と、配列番号９１（表Ｂに示される１１６1）のアミノ酸配列とを含むかまたはそれらからなる、請求項１〜３２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
前記二重特異性ポリペプチドが、個々の単一特異性の対応するポリペプチドの複合効果と比較して、腫瘍内ＣＤ８／Ｔｒｅｇ比の相乗的増加を誘導することができる、請求項１〜３３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３５】
医薬品として使用するための、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の二重特異性ポリペプチド。
【請求項３６】
医薬品の製造における、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の二重特異性ポリペプチドの使用。
【請求項３７】
個体における疾患または症状を治療または予防する方法であって、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の二重特異性ポリペプチドを個体に投与することを含む、方法。
【請求項３８】
前記疾患または状態が癌であり、任意選択的に、前記個体がヒトである、請求項３５に記載の二重特異性ポリペプチドまたは請求項３６に記載の使用または請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記方法が、全身または局所に、例えば腫瘍部位にもしくは腫瘍流入領域リンパ節内に、前記二重特異性ポリペプチドを投与することを含むか、あるいは前記二重特異性ポリペプチドが、全身または局所に、例えば腫瘍部位にもしくは腫瘍流入領域リンパ節内に投与するためのものである、請求項３８に記載の二重特異性ポリペプチドまたは使用または方法。
【請求項４０】
前記癌が、前立腺癌、乳癌、結腸直腸癌、膵臓癌、卵巣癌、肺癌、子宮頸癌、横紋筋肉腫、神経芽細胞腫、多発性骨髄腫、白血病、急性リンパ芽球性白血病、黒色腫、膀胱癌、胃癌、頭頸部癌、肝臓癌、皮膚癌、リンパ腫または膠芽腫である、請求項３８または３９に記載の二重特異性ポリペプチドまたは方法または使用。
【請求項４１】
前記ポリペプチドが、１つ以上の追加の治療剤と組み合わせて使用するためのものである、請求項３８〜４０のいずれか１項に記載の二重特異性ポリペプチドまたは方法または使用。
【請求項４２】
前記１つ以上の追加の治療剤が、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ１３７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＤ２７、およびＫＩＲからなる群から選択される標的に結合する免疫療法剤である、請求項４１に記載の二重特異性ポリペプチドまたは方法または使用。
【請求項４３】
前記１つ以上の追加の治療剤が、抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体などのＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１に結合する免疫療法剤である、請求項４２に記載の二重特異性ポリペプチドまたは方法または使用。
【請求項４４】
請求項１〜３４のいずれか１項に記載の二重特異性ポリペプチドの少なくとも１つのポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチド。
【請求項４５】
請求項１〜３４のいずれか１項に記載の二重特異性ポリペプチドと、少なくとも１つの薬学的に許容可能な希釈剤または担体とを含む、組成物。
【請求項４６】
追加の治療部分に共役された、請求項１〜３４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＯＸ４０およびＣＴＬＡ−４、特にヒトＯＸ４０およびヒトＣＴＬＡ−４に特異的に結合する二重特異性ポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、先進国において早死の主な原因である。癌の免疫療法の目的は、腫瘍細胞に対して効果的な免疫応答を仕掛けることである。これは、例えば、腫瘍抗原に対する寛容性を破壊すること、抗腫瘍免疫応答を増強すること、および腫瘍部位における局所的なサイトカイン応答を刺激することによって達成され得る。長期にわたる抗腫瘍免疫応答の主要なエフェクター細胞は、活性化された腫瘍特異的エフェクターＴ細胞である。活性化エフェクターＴ細胞の強力な拡張は、免疫応答を腫瘍に対して再指向することができる。これに関連して、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、抗腫瘍免疫を阻害する役割を果たす。したがって、Ｔｒｅｇを枯渇させるか、阻害するか、元に戻すか、または不活性化することは、抗腫瘍効果を提供し、腫瘍微小環境における免疫抑制を元に戻すことができる。さらに、例えば樹状細胞によるエフェクターＴ細胞の不完全な活性化はＴ細胞アネルギーを引き起こす可能性があり、それは不十分な抗腫瘍応答をもたらすのに対し、樹状細胞による適切な誘導は活性化エフェクターＴ細胞の強力な拡張を生じて、免疫応答を腫瘍に対して再指向することができる。加えて、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、下方制御されたヒト白血球抗原（ＨＬＡ）を発現して腫瘍細胞を攻撃することによって、および抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導することによって、腫瘍免疫学的に重要な役割を果たす。したがって、ＮＫ細胞を刺激することにより、腫瘍の成長をも低下させ得る。
【０００３】
ＯＸ４０（別名ＣＤ１３４またはＴＮＦＲＳＦ４として知られている）は、主に活性化Ｔ細胞（主にＣＤ４＋エフェクターＴ細胞だけでなく、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞および制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ））上に発現するＴＮＦＲファミリーのメンバーである。マウスでは、発現はＴｒｅｇ上では構成的であるが、ヒトでは構成的ではない。ＯＸ４０の発現は、典型的には、活性化（Ｔ細胞受容体の関与）の２４時間以内に起こり、４８〜７２時間後にピークに達する。ＯＸ４０刺激は、活性化Ｔ細胞の生存および増殖にとって重要である。ＯＸ４０の唯一の既知のリガンドはＯＸ４０Ｌであり、これは、主に樹状細胞およびＢ細胞などの抗原提示細胞上に発現し、典型的にはそれらの活性化後に発現する。ＯＸ４０を介したＴ細胞活性化の正味の結果は、ＴＨ１エフェクターＴ細胞活性化プロファイルの誘導、ならびに例えばＡＤＣＣまたはＡＤＣＰを介したＴｒｅｇ細胞の活性および／または数の減少である。全体として、これらの効果は抗腫瘍免疫に寄与する可能性がある。ＯＸ４０は、黒色腫、肺癌、および腎癌などの多くの固形腫瘍の制御性Ｔ細胞に過剰発現する。
【０００４】
マウスにおける腫瘍モデルのＯＸ４０アゴニスト治療は、黒色腫、神経膠腫、肉腫、前立腺癌、結腸癌、および腎癌を含む、いくつかの異なる癌形態の抗腫瘍効果および治癒をもたらすことが示されている。データは、ＣＤ４０アゴニスト治療で見られる効果と同様に、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方が関与する腫瘍特異的Ｔ細胞応答と一致している。ＩＬ−１２および他のサイトカインの追加、ならびに他の免疫調節剤および化学療法／放射線療法との組み合わせは、ＯＸ４０アゴニスト治療の治療効果を改善することが示されている。前臨床モデルからの証拠は、抗ＯＸ４０抗体の効果がＦｃγＲの活性化に依存していることを示唆している。Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｒｅでは、他の全ての治療に失敗した後期患者においてマウス抗ヒトＯＸ４０クローン９Ｂ１２を試験する第Ｉ相臨床研究が実施された。抗体は耐性が良好であった。腫瘍の縮小ならびにＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞増殖の増加が観察された。低毒性は、半減期の短さおよび抗薬物抗体（抗体はマウス抗体であった）によって引き起こされ得るが、非活性化Ｔ細胞でのＯＸ４０の比較的低い発現レベルによっても引き起こされた可能性がある。この抗体による抗腫瘍効果はわずかであった。
【０００５】
ＯＸ４０を標的とする既存の抗体は、一般に、それぞれの受容体を発現する細胞への強いシグナル伝達を誘導するために、例えば他の細胞上のＦｃγ受容体を介した架橋に依存する。したがって、そのような架橋が提供されていないとき、それらは効率的にシグナルを伝達しない。加えて、ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーを通じた持続的かつ継続的な活性化は、免疫の枯渇につながる可能性がある。
【０００６】
Ｔ細胞受容体ＣＴＬＡ−４は、Ｔ細胞活性化の負の制御因子として機能し、最初の活性化に続いてＴ細胞表面上で上方制御される。抗原提示細胞によって発現されるＣＴＬＡ−４受容体のリガンドはＢ７タンパク質である。Ｔ細胞活性化の上方制御を担う対応するリガンド受容体対は、ＣＤ２８−Ｂ７である。ＣＤ２８を介したシグナル伝達は共刺激経路を構成し、続いてＭＨＣ複合体によって提示される抗原ペプチドを認識するＴ細胞受容体を通じてＴ細胞を活性化する。Ｂ７−１および、またはＢ７−２リガンドとのＣＴＬＡ−４の相互作用を遮断することにより、免疫応答の正常なチェックポイントのうちの１つを除去することができる。正味の結果として、抗腫瘍免疫に寄与し得るエフェクターＴ細胞の活性を向上する。ＯＸ４０と同様に、これは、エフェクターＴ細胞の直接活性化に起因し得るが、例えばＡＤＣＣまたはＡＤＣＰを介したＴｒｅｇ細胞の活性および／または数の低下にも起因し得る。臨床研究では、ＣＴＬＡ−４の遮断が抗腫瘍効果を生み出すが、抗ＣＴＬＡ−４抗体の投与は有害な副作用に関連していることが実証されている。ＣＴＬＡ−４は、黒色腫肺癌および腎癌などの多くの固形腫瘍の制御性Ｔ細胞で過剰発現する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｆｕｒｎｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３５（７）：２９０−８
【非特許文献２】Ｗａｌｋｅｒ，２０１４，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １１（１２）：８５２−６３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
例えば、１つのＴ細胞関連タンパク質（ＯＸ４０またはＣＴＬＡ−４など）のみを標的とする既存の単一特異性薬物の代替として、腫瘍細胞付近の宿主免疫細胞を活性化することができる改善された治療剤が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の第１の態様は、ＯＸ４０に特異的に結合することができるＢ１と称される第１の結合ドメインと、ＣＴＬＡ−４に特異的に結合することができるＢ２と称される第２の結合ドメインとを含む、二重特異性ポリペプチドを提供する。
【００１０】
２つのＴ細胞標的、ＣＴＬＡ−４およびＯＸ４０を標的とする二重特異性ポリペプチド、例えば抗体は、両方の標的が過剰発現している位置で免疫系の特異的活性化を誘導する可能性を有する。注目すべきことに、ＣＴＬＡ−４およびＯＸ４０の両方が、腫瘍微小環境の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）上に過剰発現しているが、エフェクターＴ細胞上での共発現は低くなっている。したがって、本発明の二重特異性ポリペプチドは、腫瘍微小環境において制御性Ｔ細胞を選択的に標的とする可能性を有する。
【００１１】
本発明の二重特異性ポリペプチドを用いて腫瘍微小環境におけるＴｒｅｇ細胞を標的とすることで、Ｔｒｅｇの免疫抑制機能を枯渇または逆転させる可能性も有する。この効果は、本発明の二重特異性抗体のＦｃ部分を介したＡＤＣＣもしくはＡＤＣＰ誘導によって（例えば、Ｆｕｒｎｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３５（７）：２９０−８を参照されたい；その開示は参照により本明細書に組み込まれる）、またはＯＸ４０および／もしくはＣＴＬＡ−４を介して誘導されるシグナル伝達によって、および／またはＣＴＬＡ−４シグナル伝達経路の遮断によって媒介され得る（例えば、Ｗａｌｋｅｒ，２０１４，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １１（１２）：８５２−６３を参照されたい；その開示は参照により本明細書に組み込まれる）。一方、エフェクターＴ細胞では、本発明の二重特異性ポリペプチドは、ＯＸ４０刺激およびＣＴＬＡ−４チェックポイント遮断の両方を通じて活性化および機能増加を誘導する可能性を有する。
【００１２】
したがって、ＯＸ４０およびＣＴＬＡ−４を標的とする二重特異性ポリペプチドの正味の効果は次の通りである。
１．単一特異性ポリペプチドと比較した、より高度な免疫活性化。免疫活性化は、単一特異性ポリペプチドの組み合わせにより誘導される活性化よりも高く、すなわち相乗的活性化が達成される。
【００１３】
２．組み合わせた単一特異性ポリペプチドと比較した、ＡＤＣＣのより高度な誘導。
【００１４】
３．より指向された／局在する免疫活性化。免疫活性化は、ＣＴＬＡ−４発現およびＯＸ４０発現の両方が高い環境（例えば、組織）でのみ発生する。腫瘍微小環境は、そのような環境である。これは、身体の他の組織／領域の活性化に伴う有害な副作用なしに、腫瘍部位で免疫活性化を増加させる可能性を有する。したがって、治療域が増加することになる。
【００１５】
「ポリペプチド」とは、２つ以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸類似体、または他のペプチド模倣物の化合物を指すために、本明細書においてその最も広い意味で使用される。したがって、「ポリペプチド」という用語は、短いペプチド配列、ならびにより長いポリペプチドおよびタンパク質を含む。本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、ＤまたはＬ光学異性体の両方を含む天然および／または非天然もしくは合成アミノ酸、ならびにアミノ酸類似体およびペプチド模倣物のいずれかを指す。
【００１６】
本明細書で使用される「二重特異性」という用語は、ポリペプチドが少なくとも２つの標的要素に特異的に結合することができることを意味する。
【００１７】
一実施形態では、第１および／または第２の結合ドメインは、抗体またはその抗原結合断片からなる群から選択されてもよい。
【００１８】
例えば、本発明の二重特異性ポリペプチドは以下を含み得る：
ｉ）抗体可変ドメインもしくはその一部を含むかもしくはそれからなる第１の結合ドメイン、および抗体可変ドメインもしくはその一部を含むかもしくはそれからなる第２の結合ドメイン、または
ｉｉ）抗体可変ドメインもしくはその一部を含むかもしくはそれからなる第１の結合ドメイン、および抗体可変ドメインもしくはその一部ではない第２の結合ドメイン。
【００１９】
したがって、一実施形態では、ポリペプチドは二重特異性抗体である。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、「抗体」または「抗体（複数）」という用語は、抗原結合部位を含有する分子、例えば、免疫グロブリン分子、および抗原結合部位を含有する免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な断片を指す。免疫グロブリン分子は、任意の種類（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）、またはサブクラスの免疫グロブリン分子であり得る。抗体としては、合成抗体、モノクローナル抗体、単一ドメイン抗体、一本鎖抗体、組換え生成された抗体、多重特異性抗体（二重特異性抗体を含む）、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、細胞内抗体、ｓｃＦｖ（例えば、単一特異的および二重特異性などを含む）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、および上記のもののうちのいずれかのエピトープ結合断片が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
「指向された」抗体または「再指向された」抗体という用語は、本明細書では互換的に使用され、ある特定の標的／マーカー／エピトープ／抗原にその結合特異性（複数可）を指向するように構成された抗体、すなわち標的／マーカー／エピトープ／抗原に免疫特異的に結合する抗体を指す。また、ある特定の標的／マーカー／エピトープに「選択的」な抗体という表現は、「指向された」または「再指向された」と同じ定義を有するように使用され得る。２つの異なる標的／マーカー／エピトープ／抗原に指向された（それに対して選択的である）二重特異性抗体は、両方の標的／マーカー／エピトープ／抗原に免疫特異的に結合する。抗体がＯＸ４０などのある特定の標的抗原に指向される場合、当該抗体は、当該標的抗原構造上に存在する任意の好適なエピトープに指向され得ると考えられる。
【００２２】
本明細書で使用される場合、「抗体断片」という用語は、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどの抗体の一部分である。構造にかかわらず、抗体断片は、インタクトな抗体によって認識されるのと同じ抗原に結合する。例えば、抗ＯＸ４０抗体断片はＯＸ４０に結合する。「抗体断片」という用語はまた、重鎖および軽鎖の可変領域からなる「Ｆｖ」断片などの可変領域からなる単離された断片、ならびに軽鎖および重鎖可変領域がペプチドリンカーによって連結している組換え一本鎖ポリペプチド分子（「ｓｃＦｖタンパク質」）を含む。本明細書で使用される場合、「抗体断片」という用語は、Ｆｃ断片または単一アミノ酸残基などの、抗原結合活性を有さない抗体の部分を含まない。
【００２３】
ＳｃＦｖは、本発明の二重特異性ポリペプチドに含めるのに特に好ましい。
【００２４】
したがって、本発明の二重特異性ポリペプチドの例示的な実施形態では、
ａ）結合ドメインＢ１および／もしくは結合ドメインＢ２は、インタクトなＩｇＧ抗体であり（もしくは一緒にインタクトなＩｇＧ抗体を形成し）、
ｂ）結合ドメインＢ１および／もしくは結合ドメインＢ２は、Ｆｖ断片（例えばｓｃＦｖ）であり、
ｃ）結合ドメインＢ１および／もしくは結合ドメインＢ２は、Ｆａｂ断片であり、かつ／または
ｄ）結合ドメインＢ１および／もしくは結合ドメインＢ２は、単一ドメイン抗体（例えばドメイン抗体およびナノボディ）である。
【００２５】
本発明の二重特異性ポリペプチドがいくつかの異なる構造フォーマットのものであってもよいことは、当業者には理解されよう（例えば、Ｃｈａｎ＆Ｃａｒｔｅｒ，２０１６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １０，３０１−３１６を参照されたい。その開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。
【００２６】
例示的な実施形態では、ポリペプチドは、以下からなる群から選択される二重特異性抗体である：
ａ）ＩｇＧ−ｓｃＦｖ二重特異性抗体などの二価の二重特異性抗体（例えば、Ｂ１が、インタクトなＩｇＧであり、Ｂ２が、ＩｇＧの軽鎖のＮ末端および／もしくはＣ末端において、かつ／またはＩｇＧの重鎖のＮ末端および／もしくはＣ末端においてＢ１に結合したｓｃＦｖであるか、あるいはその逆であるもの）、
ｂ）ＤｕｏＢｏｄｙ（登録商標）（Ｇｅｎｍａｂ  ＡＳ、コペンハーゲン、デンマーク）などの一価の二重特異性抗体、または「ノブ・イン・ホール」二重特異性抗体（例えば、ｓｃＦｖ−ＫＩＨ、ｓｃＦｖ−ＫＩＨｒ、ＢｉＴＥ−ＫＩＨ、またはＢｉＴＥ−ＫＩＨｒ（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，ｍＡｂｓ  ７（１）：２３１−２４２参照）、
ｃ）ｓｃＦｖ２−Ｆｃ二重特異性抗体（Ａｐｔｅｖｏ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｉｎｃ，ＵＳからのＡＤＡＰＴＩＲ（商標）二重特異性抗体など）、
ｄ）ＢｉＴＥ／ｓｃＦｖ２二重特異性抗体、
ｅ）ＤＶＤ−Ｉｇ二重特異性抗体、
ｆ）ＤＡＲＴ系二重特異性抗体（例えば、ＤＡＲＴ−Ｆｃ、ＤＡＲＴ２−Ｆｃ、またはＤＡＲＴ）、
ｇ）ＤＮＬ−Ｆａｂ３二重特異性抗体、ならびに
ｈ）ｓｃＦｖ−ＨＳＡ−ｓｃＦｖ二重特異性抗体からなる群から選択される。
【００２７】
本発明は、結合ドメインのうちの１つが非免疫グロブリン結合ドメイン（ＣＴＬＡ−４に結合することができるＣＤ８６ポリペプチドなど）である、上記に列挙されたものと同等のフォーマットも包含することが当業者には理解されるであろう。
【００２８】
例えば、二重特異性ポリペプチドはＩｇＧ−ｓｃＦｖ抗体であり得る。ＩｇＧ−ｓｃＦｖ抗体は、ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨのいずれかの配向であり得る。一実施形態では、ｓｃＦｖは、ＶＨとＶＬとの間のＳ−Ｓ架橋によって安定化され得る。
【００２９】
あるいは、二重特異性ポリペプチドは、ＣＤ８６ポリペプチドに結合した抗ＯＸ４０ＩｇＧ（またはｓｃＦｖなどのその抗原結合断片）であってもよい。
【００３０】
一実施形態では、結合ドメインＢ１および結合ドメインＢ２は、相互に直接融合している。
【００３１】
代替的な実施形態では、結合ドメインＢ１および結合ドメインＢ２は、ポリペプチドリンカーを介して接合している。例えば、ポリペプチドリンカーは、約１０〜約２５アミノ酸の短いリンカーペプチドであってもよい。このリンカーは通常、可撓性のためのグリシン、ならびに可溶性のためのセリンまたはスレオニンに富んでおり、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端と接続すること、またはその逆のいずれかを行うことができる。例示的なリンカーとしては、配列番号４７〜５０、または１４４のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列のペプチドが挙げられる。
【００３２】
本発明の二重特異性ポリペプチドは、当該技術分野において使用されている任意の既知の好適な方法によって製造され得る。本発明の二重特異性抗体を調製する方法としては、ＢｉＴＥ（Ｍｉｃｒｏｍｅｔ）、ＤＡＲＴ（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）、ＦｃａｂおよびＭａｂ２（Ｆ−ｓｔａｒ）、Ｆｃ改変ＩｇＧｌ（Ｘｅｎｃｏｒ）、またはＤｕｏＢｏｄｙ（Ｆａｂアーム交換に基づく、Ｇｅｎｍａｂ）が挙げられる。二重特異性抗体を調製するのに有用な他のプラットフォームの例としては、ＷＯ２００８／１１９３５３（Ｇｅｎｍａｂ）、ＷＯ２０１１／１３１７４６（Ｇｅｎｍａｂ）に記載され、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｎｅｕｔ−Ｋｏｌｆｓｃｈｏｔｅｎらによって報告されたもの（２００７年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１７（５８４４）：１５５４−７）が挙げられるが、これに限定されない。ハイブリッドハイブリドーマおよび化学的共役法（ＭａｒｖｉｎおよびＺｈｕ（２００５年）Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｉｎ  ２６：６４９）などの従来の方法もまた使用することができる。異なる重鎖および軽鎖からなる２つの抗体の宿主細胞中での共発現は、所望の二重特異性抗体に加えて可能性のある抗体生成物の混合物を生じ、これは次いで例えば親和性クロマトグラフィまたは同様の方法によって単離することができる。
【００３３】
二重特異性ポリペプチドが、ヒトＦｃ領域または当該領域の変異型を含み得、この領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４領域、好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ４領域であることは、当業者には理解されよう。
【００３４】
抗体の定常（Ｆｃ）領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１の成分（Ｃｌｑ）を含む、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。Ｆｃ領域は、好ましくはヒトＦｃ領域、または当該領域の変異型である。Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４領域、好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ４領域であり得る。Ｆｃ領域の変異型は、典型的には、親和性が変更されたＦｃガンマＲおよび／または新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）などのＦｃ受容体に結合し、ポリペプチドの機能および／または半減期の改善を提供する。生物学的機能および／または半減期は、天然Ｆｃ領域を含むポリペプチドの半減期と比較して、延長するかまたは減少するかのいずれかであり得る。変異型Ｆｃ領域の存在によって調節され得るそのような生物学的機能の例としては、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、および／またはアポトーシスが挙げられる。
【００３５】
（完全な重鎖を形成するために）本明細書に開示の任意のＶＨ領域配列と組み合わせられ得る例示的な重鎖定常領域アミノ酸配列は、以下に再現されるＩｇＧ１重鎖定常領域配列である。
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
（配列番号１３５）
【００３６】
他の重鎖定常領域配列は、当該技術分野において既知であり、本明細書に開示の任意のＶＨ領域と組み合わせることもできる。例えば、好ましい定常領域は、以下に再現されるものなどの修飾ＩｇＧ４定常領域である。
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
（配列番号１３７）
【００３７】
この修飾ＩｇＧ４配列は、ＦｃＲｎ結合の低下を呈し、したがって野生型ＩｇＧ４と比較して血清半減期の低下をもたらす。加えて、ＩｇＧ４のコアヒンジの安定化を呈し、ＩｇＧ４をより安定にし、Ｆａｂアーム交換を妨げる。
【００３８】
別の好ましい定常領域は、以下に再現されるものなどの修飾ＩｇＧ４定常領域である。
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
（配列番号１３９）
【００３９】
この修飾ＩｇＧ４配列は、ＩｇＧ４のコアヒンジの安定化をもたらし、ＩｇＧ４をより安定にし、Ｆａｂアーム交換を妨げる。
【００４０】
以下に再現されるものなどの野生型ＩｇＧ４定常領域もまた好ましい。
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
（配列番号１３８）
【００４１】
（完全な軽鎖を形成するために）本明細書に開示の任意のＶＬ領域配列と組み合わせられ得る例示的な軽鎖定常領域アミノ酸配列は、以下に再現されるカッパ鎖定常領域配列である。
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
（配列番号１３６）
【００４２】
他の軽鎖定常領域配列は、当該技術分野において既知であり、本明細書に開示の任意のＶＬ領域と組み合わせることもできる。
【００４３】
抗体またはその抗原結合断片は、以下により詳細に説明される、ある特定の好ましい結合特徴および機能的効果を有する。当該抗体またはその抗原結合断片は、本発明の二重特異性ポリペプチドの一部として組み込まれているとき、好ましくは、これらの結合特徴および機能的効果を保持する。
【００４４】
一実施形態では、抗原結合断片は、Ｆｖ断片（一本鎖Ｆｖ断片、またはジスルフィド結合Ｆｖ断片など）、Ｆａｂ様断片（Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、またはＦ（ａｂ）２断片など）、およびドメイン抗体からなる群から選択され得る。
【００４５】
一実施形態では、二重特異性ポリペプチドは、カッパ鎖のＣ末端部分に融合した非免疫グロブリンポリペプチド（ＣＴＬＡ−４結合ドメイン、例えばＣＤ８６、または配列番号１７などのその突然変異形態など；以下参照）を有するＩｇＧ１抗体であり得る。
【００４６】
一実施形態では、二重特異性ポリペプチドは、重鎖ガンマ１のＣ末端に融合したｓｃＦｖ断片を有するＩｇＧ１抗体であり得る。
【００４７】
一実施形態では、二重特異性ポリペプチドは、２つの異なる標的への２〜４のｓｃＦｖ結合を含み得る。
【００４８】
Ｔ細胞標的であるＣＴＬＡ−４およびＯＸ４０が細胞の表面に局在し得ることが、当業者には理解されるであろう。「細胞の表面に局在する」とは、Ｔ細胞標的の１つ以上の領域が細胞表面の外面に存在するように、Ｔ細胞標的が細胞と会合していることを意味する。例えば、Ｔ細胞標的は、細胞外表面上に存在する１つ以上の領域で、細胞原形質膜に挿入され得る（すなわち、膜貫通タンパク質として配向される）。これは、細胞によるＴ細胞標的の発現の過程で起こり得る。したがって、一実施形態では、「細胞の表面に局在する」とは、「細胞の表面に発現する」ことを意味し得る。あるいは、Ｔ細胞標的は、共有結合性相互作用および／またはイオン性相互作用で細胞の外側に存在して、細胞表面の特定の領域または複数の領域に局在し得る。
【００４９】
本発明の二重特異性抗体が、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、および／またはアポトーシスを誘導することができる場合があることが、当業者には理解されるであろう。
【００５０】
さらなる実施形態では、ポリペプチドは腫瘍免疫を誘導することができる。これは、例えば、ＩＬ−２およびＩＦＮγの産生を測定することによって、インビトロでのＴ細胞活性化アッセイで試験することができる。エフェクターＴ細胞の活性化は、腫瘍特異性Ｔ細胞応答がインビボで達成され得ることを意味するであろう。さらに、マウスモデルなどのインビボモデルにおける抗腫瘍応答は、腫瘍に対する成功裏の免疫応答が達成されたことを暗示する。
【００５１】
抗体は、Ｔ細胞標的（ＣＴＬＡ−４またはＯＸ４０）を発現する細胞の活性を調節する場合があり、当該調節は、細胞の活性の増加または減少である。細胞は、典型的にはＴ細胞である。抗体は、ＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋エフェクター細胞の活性を増加させるか、または制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の活性を減少させることができる。いずれの場合においても、本抗体の正味の効果は、エフェクターＴ細胞、特にＣＤ４＋エフェクターＴ細胞の活性の増加である。エフェクターＴ細胞の活性の変化を決定するための方法は周知であり、例えば、対照の存在下でのＴ細胞ＩＬ−２産生および／またはＴ細胞増殖のレベルと比較した、抗体の存在下でのＴ細胞ＩＬ−２産生のレベルの増加、またはＴ細胞増殖の増加についての測定が挙げられる。細胞増殖および／またはＩＬ−２産生についてのアッセイは周知であり、実施例に例示されている。
【００５２】
例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、ＲＩＡ、およびフローサイトメトリー分析を含む、標的に対するリガンドの結合能力を評価するための標準アッセイが、当該技術分野において周知である。ポリペプチドの結合速度（例えば結合親和性）もまた、当該技術分野で既知の標準アッセイによって、例えば表面プラズモン共鳴分析（ＳＰＲ）などによって評価することができる。
【００５３】
「結合活性」および「結合親和性」という用語は、ポリペプチド分子が標的に結合するかまたは結合しない傾向を指すよう意図される。結合親和性は、ポリペプチドおよびその標的の解離定数（Ｋｄ）を決定することによって定量化され得る。より低いＫｄは、標的に対する親和性がより高いことを示す。同様に、ポリペプチドのその標的に対する結合の特異性は、ポリペプチドおよび別の非標的分子に関する解離定数と比較した、ポリペプチドのその標的に対する比較解離定数（Ｋｄ）の観点で定義され得る。
【００５４】
この解離定数の値は、周知の方法によって直接決定することができ、複雑な混合物についてでさえ、例えば、Ｃａｃｅｃｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｙｔｅ  ９：３４０−３６２，１９８４；その開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるものなどの方法によって算出することができる。例えば、Ｗｏｎｇ＆Ｌｏｈｍａｎ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０，５４２８−５４３２，１９９３）に開示されるものなどの二重フィルターニトロセルロースフィルター結合アッセイを使用して、Ｋｄを確立することができる。例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、ＲＩＡ、およびフローサイトメトリー分析を含む、標的に対する抗体などのリガンドの結合能力を評価するための他の標準アッセイが、当該技術分野で既知である。抗体の結合速度（例えば結合親和性）もまた、当該技術分野において知られる標準アッセイによって、例えばＢｉａｃｏｒｅ（商標）システム分析などによって評価することができる。
【００５５】
標的に対する抗体の結合が、その標的の別の既知のリガンド、例えば別の抗体などによる標的の結合と比較される、競合結合アッセイを実施してもよい。５０％の阻害が生じる濃度は、Ｋｉとして知られている。理想的な条件下では、ＫｉはＫｄと等価である。Ｋｉ値は、Ｋｄ未満になることは決してないため、好都合なことに、Ｋｉの測定値を代入してＫｄの上限を求めることができる。
【００５６】
結合親和性の代替的な尺度としては、ＥＣ５０またはＩＣ５０が挙げられる。この文脈において、ＥＣ５０は、ポリペプチドが一定量の標的に対するその最大結合の５０％を達成する濃度を示す。ＩＣ５０は、ポリペプチドが、一定量の標的に対する一定量の競合相手の最大結合の５０％を阻害する濃度を示す。両方の場合において、より低いレベルのＥＣ５０またはＩＣ５０は、標的に対する親和性がより高いことを示す。リガンドのその標的に対するＥＣ５０値およびＩＣ５０値は、両方とも、周知の方法、例えばＥＬＩＳＡによって決定することができる。ポリペプチドのＥＣ５０およびＩＣ５０を評価するための好適なアッセイは、実施例に記載される。
【００５７】
本発明のポリペプチドは、好ましくは、その標的に対して、別の非標的分子に結合するその親和性よりも少なくとも２倍、１０倍、５０倍、１００倍、またはそれ以上である親和性で結合することができる。
【００５８】
本発明のポリペプチドは、任意の好適な手段によって産生され得る。例えば、ポリペプチドの全てまたは一部は、当該ポリペプチドをコードするヌクレオチドを含む細胞によって融合タンパク質として発現され得る。
【００５９】
あるいは、部分Ｂ１およびＢ２を別々に産生し、次いで続いて一緒に接合してもよい。接合は、任意の好適な手段によって、例えば上に概説した化学的共役法およびリンカーを使用して達成され得る。部分Ｂ１およびＢ２の別々の産生は、任意の好適な手段によって達成され得る。例えば、以下により詳細に説明されるように、任意選択的に別々の細胞中の別々のヌクレオチドからの発現による。
【００６０】
変異型
本明細書に記載の二重特異性ポリペプチドまたはその構成要素結合ドメイン（ＯＸ４０またはＣＴＬＡ−４結合ドメインなど）は、ポリペプチドまたは結合ドメインが標的への結合を保持することを条件に、本明細書に列挙されている特定のアミノ酸配列のうちのいずれかの変異型または断片を含み得る。一実施形態では、抗体または抗原結合断片の変異型は、本明細書に列挙されている配列のＣＤＲ配列を保持し得る。例えば、抗ＯＸ４０抗体は、抗体がその標的への結合を保持することを条件に、表Ｂに列挙されている特定のアミノ酸配列のうちのいずれかの変異型または断片を含み得る。そのような変異型または断片は、典型的には表Ｂの当該配列のＣＤＲ配列を保持し得る。ＣＴＬＡ−４結合ドメインは、結合ドメインがその標的への結合を保持することを条件に、表Ｃの配列のうちのいずれかの変異型を含み得る。
【００６１】
本明細書中に列挙されている重鎖または軽鎖アミノ酸配列のうちのいずれか１つの断片は、当該アミノ酸配列からの少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも１８個、少なくとも２０個、または少なくとも２５個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個、または少なくとも１００個の連続アミノ酸を含み得る。
【００６２】
本明細書に列挙される重鎖または軽鎖のアミノ酸配列のうちのいずれか１つの変異型は、当該配列の置換、欠失、または付加変異型であり得る。変異型は、当該配列からの１個、２個、３個、４個、５個、最大１０個、最大２０個、最大３０個、またはそれ以上のアミノ酸置換および／または欠失を含んでもよい。「欠失」変異型は、個々のアミノ酸の欠失、アミノ酸の小群、例えば２個、３個、４個、もしくは５個のアミノ酸の欠失、またはより大きなアミノ酸領域の欠失、例えば特定のアミノ酸ドメインもしくは他の特徴の欠失を含んでもよい。「置換」変異型は、好ましくは、１個以上のアミノ酸を同数のアミノ酸に置き換え、保存的なアミノ酸置換を行うことを伴う。例えば、アミノ酸は、類似の特性を有する代替的なアミノ酸、例えば、別の塩基性アミノ酸、別の酸性アミノ酸、別の中性アミノ酸、別の荷電アミノ酸、別の親水性アミノ酸、別の疎水性アミノ酸、別の極性アミノ酸、別の芳香族アミノ酸、または別の脂肪族アミノ酸で置換されてもよい。好適な置換基を選択するために使用することのできる２０種の主なアミノ酸のいくつかの特性は、以下の通りである。
【００６３】
【表１】
2020518622.tif 000002
【００６４】
本明細書におけるアミノ酸は、正式名、３文字表記、または１文字表記によって称され得る。
【００６５】
好ましい「誘導体」または「変異型」としては、天然に存在するアミノ酸の代わりに、配列内に現れるアミノ酸がその構造的類似体であるものが挙げられる。配列内で使用されるアミノ酸は、抗体の機能が著しく悪影響を受けない限り、誘導体化または修飾、例えば標識されてもよい。
【００６６】
上述の誘導体および変異型は、抗体の合成中に、もしくは産生後の修飾によって調製されてもよく、または抗体が組換え型である場合は、部位特異的変異誘発、ランダム変異誘発、または核酸の酵素的切断および／もしくは連結反応の既知の技術を使用して調製されてもよい。
【００６７】
好ましくは、変異型は、本明細書に開示の配列に示されるような配列に対して、６０％超、または７０％超、例えば７５もしくは８０％、好ましくは８５％超、例えば９０もしくは９５％超のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を有する。アミノ酸同一性のこのレベルは、関連した配列番号の配列の全長にわたって、または全長ポリペプチドのサイズに応じて、２０、３０、５０、７５、１００、１５０、２００、もしくはそれ以上のアミノ酸にわたるなど、配列の一部にわたって見られ得る。
【００６８】
アミノ酸配列との関連で、「配列同一性」は、ＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２（２２）：４６７３−８０；その開示は参照により本明細書に組み込まれる）を使用し、以下のパラメータを用いて評価した場合に、記載される値を有する配列を指す。
ペアワイズアラインメントパラメータ−方法：正確、マトリックス：ＰＡＭ、ギャップオープンペナルティ：１０．００、ギャップエクステンションペナルティ：０．１０、
多重配列アラインメントパラメータ  −マトリックス：ＰＡＭ、ギャップオープンペナルティ：１０．００、遅延の同一性％（％  ｉｄｅｎｔｉｔｙ  ｆｏｒ  ｄｅｌａｙ）：３０、エンドギャップへのペナルティ（Ｐｅｎａｌｉｚｅ  ｅｎｄ  ｇａｐｓ）：オン、ギャップ分離距離：０、ネガティブマトリックス：なし、ギャップ伸長ペナルティ：０．２０、残基特異的（Ｒｅｓｉｄｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）ギャップペナルティ：オン、親水性ギャップペナルティ：オン、親水性残基：ＧＰＳＮＤＱＥＫＲ。特定の残基における配列同一性は、単に誘導体化されている同一の残基を含むよう意図される。
【００６９】
ポリヌクレオチド、ベクター、および細胞
本発明はまた、本発明のポリペプチドの全てまたは一部をコードするポリヌクレオチドに関する。したがって、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載の任意のポリペプチド、またはＢ１の全てもしくは一部、またはＢ２の全てもしくは一部をコードしてもよい。「核酸分子」および「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書では互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれかを問わず、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチド、またはそれらの類似体を指す。ポリヌクレオチドの非限定的な例としては、遺伝子、遺伝子断片、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマーが挙げられる。本発明のポリヌクレオチドは、単離された形態または実質的に単離された形態で提供され得る。実質的に単離されたとは、何らかの周囲媒体からのポリペプチドの完全ではないが実質的な単離があり得ることを意味する。本ポリヌクレオチドは、それらの意図される用途を妨げない担体または希釈剤と混合されても、実質的に単離されていると見なされ得る。
【００７０】
選択されたポリペプチドを「コードする」核酸配列は、適切な制御配列の制御下に置かれると、インビボで転写され（ＤＮＡの場合）、ポリペプチドに翻訳される（ｍＲＮＡの場合）核酸分子である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端における開始コドンと、３’（カルボキシ）末端における翻訳終止コドンとによって決定される。本明細書では、そのような核酸配列は、ウイルス、原核生物、または真核生物のｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡ、ウイルスまたは原核生物のＤＮＡまたはＲＮＡに由来するゲノム配列、およびさらには合成ＤＮＡ配列を含み得るが、これらに限定されない。転写終結配列は、コード配列の３’側に位置していてもよい。
【００７１】
抗体の重鎖または軽鎖アミノ酸配列の例をコードする代表的なポリヌクレオチドは、本明細書に開示のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つ、例えば表Ｂに記載の配列を含み得るかまたはそれからなり得る。表Ｄに示されるポリペプチドをコードする代表的なポリヌクレオチドは、表Ｄにも示されている対応するヌクレオチド配列を含み得るかまたはそれからなり得る（イントロン配列は小文字で示されている）。ＣＴＬＡ−４結合ドメインの例をコードする代表的なポリヌクレオチドは、表Ｅに示されるような配列番号２５〜４３のうちのいずれか１つを含み得るかまたはそれからなり得る。
【００７２】
あるいは、好適なポリヌクレオチド配列は、これらの特定のポリヌクレオチド配列のうちの１つの変異型であり得る。例えば、変異型は、上記の核酸配列のいずれかの置換、欠失、または付加変異型であり得る。変異型ポリヌクレオチドは、配列表に示される配列からの１個、２個、３個、４個、５個、最大１０個、最大２０個、最大３０個、最大４０個、最大５０個、最大７５個、またはそれ以上の核酸置換および／または欠失を含んでもよい。
【００７３】
好適な変異型は、本明細書において開示される核酸配列のうちのいずれか１つのポリヌクレオチドと少なくとも７０％相同、好ましくはそれと少なくとも８０または９０％、より好ましくは少なくとも９５％、９７％、または９９％相同であり得る。好ましくは、これらのレベルでの相同性および同一性は、少なくともポリヌクレオチドのコード領域に関して存在する。相同性を測定する方法は当該技術分野において周知であり、この文脈において、相同性が核酸同一性に基づいて計算されることは、当業者には理解されよう。かかる相同性は、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも３０個、例えば少なくとも４０個、６０個、１００個、２００個、またはそれ以上の連続したヌクレオチドの領域にわたって存在し得る。かかる相同性は、未修飾のポリヌクレオチド配列の全長にわたって存在してもよい。
【００７４】
ポリヌクレオチドの相同性または同一性を測定する方法は、当該技術分野で既知である。例えば、ＵＷＧＣＧパッケージは、相同性を計算するために使用することができるＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（例えば、そのデフォルト設定で使用される）（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２：３８７−３９５；その開示は参照により本明細書に組み込まれる）。
【００７５】
例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９３，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｖｏｌ  ３６：２９０−３００、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ，１９９０，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３−１０（それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して、相同性の計算または配列の整列を（典型的にはそれらのデフォルト設定で）行うこともできる。
【００７６】
ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から公的に利用可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列させたときに、何らかの正の値の閾値スコアＴに一致するかまたはそれを満たすかのいずれかの検索配列中の長さＷの短いワードを同定することによって、高スコアの配列対（ＨＳＰ）をまず同定することを含む。Ｔは、近傍ワードスコア閾値（ｎｅｉｇｈｂｏｕｒｈｏｏｄ  ｗｏｒｄ  ｓｃｏｒｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）と称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、上記）。これらの初期近傍ワードヒットは、それらを含むＨＳＰを見つけるための検索を開始するためのシードとして機能する。ワードヒットは、累積的アラインメントスコアが増加し得る限り、各配列に沿って両方向に延長される。各方向でのワードヒットのための拡張は、次の場合に停止される：残基アラインメントの１つ以上の負のスコア累積に起因して累積的アラインメントスコアがゼロ以下になる；またはいずれかの配列の末端に達する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータであるＷ、Ｔ、およびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスアラインメント（Ｂ）（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５−１０９１９を参照されたい；その開示は参照により本明細書に組み込まれる）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両方のストランドの比較を使用する。
【００７７】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計分析を行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７を参照されたい；その開示は参照により本明細書に組み込まれる）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小和確率（ｓｍａｌｌｅｓｔ  ｓｕｍ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然に起こる確率の指標を提供する。例えば、配列は、第１の配列を第２の配列と比較した最小和確率が約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合に、別の配列と類似していると見なされる。
【００７８】
相同体は、関連したポリヌクレオチド内の配列から、３個未満、５個、１０個、１５個、２０個、またはそれ以上の変異だけ異なり得る（変異のそれぞれは、置換、欠失、または挿入であり得る）。これらの変異は、相同体の、少なくとも３０個、例えば少なくとも４０個、６０個、または１００個それ以上の連続したヌクレオチドの領域にわたって測定され得る。
【００７９】
一実施形態では、変異型配列は、遺伝コードの重複性により、配列表に記載の特定の配列とは異なり得る。ＤＮＡコードは、４つの主な核酸残基（Ａ、Ｔ、Ｃ、およびＧ）を有し、これらを使用して、生物の遺伝子内でタンパク質がコードしたアミノ酸を表す３文字のコドンを「綴る」。ＤＮＡ分子に沿ったコドンの線状配列は、それらの遺伝子によってコードされるタンパク質（複数可）内のアミノ酸の線状配列へと翻訳される。コードは高度に縮重しており、６１個のコドンが２０種の天然アミノ酸をコードし、３個のコドンが「終止」シグナルを表す。したがって、ほとんどのアミノ酸は、２個以上のコドンによってコードされ、実際、いくつかは、４個以上の異なるコドンによってコードされている。したがって、本発明の変異型ポリヌクレオチドは、本発明の別のポリヌクレオチドと同じポリペプチド配列をコードし得るが、同じアミノ酸をコードするために異なるコドンを使用することから異なる核酸配列を有する場合がある。
【００８０】
したがって、本発明のポリペプチドは、それをコードし、発現することができるポリヌクレオチドの形態から産生され得るか、またはその形態で送達され得る。
【００８１】
本発明のポリヌクレオチドは、Ｇｒｅｅｎ＆Ｓａｍｂｒｏｏｋ（２０１２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ；その開示は参照により本明細書に組み込まれる）に例として記載されるように、当該技術分野において周知の方法によって合成することができる。
【００８２】
本発明の核酸分子は、挿入された配列に作動可能に連結している制御配列を含む発現カセットの形態で提供され得、したがってインビボで本発明のポリペプチドの発現を可能にする。これらの発現カセットは、同様に、典型的には、ベクター（例えば、プラスミドまたは組換えウイルスベクター）内で提供される。かかる発現カセットは、宿主対象に直接投与され得る。あるいは、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターが宿主対象に投与されてもよい。好ましくは、ポリヌクレオチドは、遺伝子ベクターを使用して調製および／または投与される。好適なベクターは、十分な量の遺伝情報を保有すること、および本発明のポリペプチドの発現を可能にすることのできる、任意のベクターであり得る。
【００８３】
したがって、本発明は、かかるポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む。かかる発現ベクターは、分子生物学の技術分野で日常的に構築されており、例えば、プラスミドＤＮＡおよび適切なイニシエーター、プロモーター、エンハンサー、および他のエレメント、例えば、本発明のペプチドの発現を可能にするために必要であり得、かつ正しい配向に位置付けられた、ポリアデニル化シグナルなどの使用を伴う場合がある。他の好適なベクターは、当業者には明らかであろう（Ｇｒｅｅｎ＆Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上記参照）。
【００８４】
本発明は、本発明のポリペプチドを発現するように修飾されている細胞も含む。かかる細胞は、哺乳動物細胞もしくは昆虫細胞などの、一過性もしくは好ましくは安定な高等真核細胞株、酵母などの下等真核細胞、または細菌細胞などの原核細胞を含む。本発明のポリペプチドをコードするベクターまたは発現カセットの挿入によって修飾され得る細胞の特定の例としては、哺乳動物ＨＥＫ２９３Ｔ、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＮＳ０、およびＣＯＳ細胞が挙げられる。好ましくは、選択される細胞株は、安定であるだけでなく、ポリペプチドの成熟グリコシル化および細胞表面発現も可能にするものである。
【００８５】
本発明のそのような細胞株は、本発明のポリペプチドを産生するために一般的な方法を使用して培養されてもよいか、または本発明の抗体を対象に送達するために治療的または予防的に使用されてもよい。あるいは、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、またはベクターは、エクスビボで対象由来の細胞に投与され、次いでその細胞を対象の身体に戻してもよい。
【００８６】
医薬製剤、治療的使用および患者群
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の抗体、二重特異性ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、および細胞などの、本発明の分子を含む組成物を提供する。例えば、本発明は、本発明の１つ以上の抗体および／または二重特異性ポリペプチドなどの本発明の１つ以上の分子と、少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体とを含む組成物を提供する。
【００８７】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能な担体」とは、生理学的に適合する、あらゆる全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤、ならびに吸収遅延剤などを含み得る。好ましくは、担体は、非経口投与、例えば静脈内投与、筋肉内投与、または皮下投与（例えば注射または点滴による）に好適である。投与経路に応じて、ポリペプチドを不活性化または変性させ得る酸および他の自然条件の作用からポリペプチドを保護するための材料で、ポリペプチドをコーティングしてもよい。
【００８８】
好ましい薬学的に許容される担体は、水性担体または希釈剤を含む。本発明の組成物に用いられ得る好適な水性担体の例としては、水、緩衝水、および生理食塩水が挙げられる。他の担体の例としては、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびこれらの好適な混合物、オリーブ油などの植物油、ならびにオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが挙げられる。例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用によって、分散液の場合に必要とされる粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって、適切な流動性を維持することができる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖類、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。
【００８９】
本発明の組成物はまた、薬学的に許容可能な抗酸化剤を含み得る。これらの組成物はまた、保存剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤などの補助剤を含有してもよい。微生物の存在の防止は、滅菌手順（上記を参照）、ならびに様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、ソルビン酸フェノールなどの包含の両方によって確実にされ得る。糖類、塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物に含むことも望ましい場合がある。加えて、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることによって、注射用剤型の長期吸収をもたらすことができる。
【００９０】
治療用組成物は、典型的には、製造および貯蔵の条件下で無菌かつ安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルション、リポソーム、または高い薬物濃度に好適な他の規則的な構造として製剤化され得る。
【００９１】
無菌注射用溶液は、必要に応じて上に挙げた成分のうちの１つまたは組み合わせを含む適切な溶媒に必要量の活性剤（例えばポリペプチド）を組み込み、続いて無菌精密濾過することによって調製することができる。一般に、分散液は、活性薬剤を、基本的な分散媒および上に挙げたものから必要な他の成分を含有する無菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。無菌注射可能溶液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性剤およびその予め滅菌濾過された溶液から任意の追加の所望の成分の粉末を得る、真空乾燥および冷凍乾燥（凍結乾燥）である。
【００９２】
特に好ましい組成物は、全身投与用または局所投与用に調合される。局所投与は、腫瘍の部位または腫瘍流入領域リンパ節へ行われてもよい。組成物は、好ましくは一定期間にわたって持続放出するように調合されてもよい。したがって、組成物は、持続放出を促進するマトリックス中にまたはマトリックスの一部として提供されてもよい。好ましい持続放出マトリックスは、モンタニドまたはγ−ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）のナノ粒子を含み得る。本発明のポリペプチドの局所的放出は、任意選択的に持続期間にわたり、ＣＴＬＡ−４アンタゴニストの投与に関連した潜在的な自己免疫副作用を低下し得る。
【００９３】
本発明の組成物は、追加の活性成分、ならびに本発明のポリペプチドを含み得る。上記のように、本発明の組成物は、本発明の１つ以上のポリペプチドを含み得る。それらはまた、追加の治療剤または予防剤を含み得る。
【００９４】
本発明のポリペプチドまたは他の組成物および使用説明書を含むキットもまた、本発明の範囲内である。本キットは、上述の追加の治療剤または予防剤などの１つ以上の追加の試薬をさらに含んでもよい。
【００９５】
本発明に従ったポリペプチドは、治療または予防に使用してもよい。治療用途では、ポリペプチドまたは組成物は、すでに障害または状態を患っている対象に、その病態またはその症状のうちの１つ以上を治癒、軽減、または部分的に抑えるのに十分な量で投与される。かかる治療処置は、疾患症状の重症度の減少、または無症状期間の頻度もしくは持続期間の増加をもたらし得る。これを達成するのに適切な量は、「治療有効量」として定義される。予防用途では、ポリペプチドまたは組成物は、障害または病態の症状をまだ示していない対象に、症状の発症を防止するか、または遅延させるのに十分な量で投与される。そのような量は、「予防有効量」と定義される。対象は、任意の好適な手段によって、疾患または病態を発症するリスクがあるものと特定されていてもよい。
【００９６】
特に、本発明の抗体および二重特異性ポリペプチドは、癌の治療または予防に有用であり得る。したがって、本発明は、癌の治療または予防に使用するための本発明の抗体または二重特異性ポリペプチドを提供する。本発明はまた、個体に本発明のポリペプチドを投与することを含む、癌を治療または予防する方法を提供する。本発明はまた、癌の治療または予防用の医薬品の製造に使用するための、本発明の抗体または二重特異性ポリペプチドを提供する。
【００９７】
癌は、前立腺癌、乳癌、結腸直腸癌、膵臓癌、卵巣癌、肺癌、子宮頸癌、横紋筋肉腫、神経芽細胞腫、多発性骨髄腫、白血病、急性リンパ芽球性白血病、黒色腫、膀胱癌、胃癌、頭頚部癌、肝臓癌、皮膚癌、リンパ腫、または膠芽腫であり得る。
【００９８】
本発明の抗体もしくは二重特異性ポリペプチド、または当該抗体もしくは当該ポリペプチドを含む組成物は、当該技術分野において既知の種々の方法のうちの１つ以上を使用して、１つ以上の投与経路を介して投与され得る。当業者には理解されるであろうように、投与経路および／または方式は、所望の結果に応じて異なるであろう。全身投与または局所投与が好ましい。局所投与は、腫瘍の部位または腫瘍流入領域リンパ節へ行われてもよい。本発明のポリペプチドまたは組成物に好ましい投与方式としては、例えば注射または点滴による、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄、または他の非経口投与方式が挙げられる。本明細書で使用される「非経口投与」という語句は、通常は注射による、経腸投与および局所投与以外の投与方式を意味する。あるいは、本発明のポリペプチドまたは組成物は、局所投与方式、表皮投与方式、または粘膜投与方式などの非経腸（ｎｏｎ−ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）投与方式を介して投与することができる。
【００９９】
本発明の抗体またはポリペプチドの好適な投与量は、熟練した医療施術者によって決定され得る。本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、特定の患者、組成、および投与方式に対して所望の治療応答を達成するのに有効である、患者に対して有害でない活性成分の量を得るように異なり得る。選択される投与量レベルは、用いられる特定のポリペプチドの活性、投与経路、投与時間、ポリペプチドの排泄速度、治療期間、用いられる特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物および／または材料、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、一般的な健康状態および以前の病歴、ならびに医薬技術分野で周知の同様の要因を含む、種々の薬物動態学的要因に依存するであろう。
【０１００】
本発明の抗体またはポリペプチドの好適な用量は、例えば、治療される患者の体重の約０．１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。例えば、好適な用量は、１日当たり体重の約１μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、または１日当たり体重の約１０ｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇであり得る。
【０１０１】
投与計画は、最適な所望の応答（例えば、治療応答）を提供するように調整してもよい。例えば、単回ボーラスを投与してもよいか、数回に分けた用量を経時的に投与してもよいか、または治療状況の緊急性によって示されるように用量を比例的に低下または増加してもよい。投与の容易さおよび投与量の均一性のために、非経口組成物を単位剤形で調合することが特に有利である。本明細書で使用される単位剤形は、治療される対象用の単位用量として適した物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要とされる医薬担体と関連して所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含有する。
【０１０２】
抗体またはポリペプチドは、単回用量または複数回用量で投与してもよい。複数回用量は、同じかまたは異なる経路を介して、同じかまたは異なる位置に投与してもよい。あるいは、抗体またはポリペプチドは、上述のように徐放性製剤として投与することができ、その場合、より少ない頻度の投与が必要である。投与量および頻度は、患者におけるポリペプチドの半減期、および所望の治療期間に応じて異なり得る。投与量および投与の頻度もまた、治療が予防的であるかまたは治療的であるかに応じて異なり得る。予防的用途では、比較的低い投与量を比較的不定期な間隔で、長期間にわたって投与してもよい。治療的用途では、例えば患者が疾患の症状の部分的または完全な改善を示すまで、比較的高い投与量を投与してもよい。
【０１０３】
２つ以上の薬剤の併用投与は、多数の異なる方法で達成され得る。一実施形態では、抗体またはポリペプチドおよび他の薬剤を、単一の組成物中で一緒に投与してもよい。別の実施形態では、抗体またはポリペプチドおよび他の薬剤を、併用療法の一部として別々の組成物中で投与してもよい。例えば、モジュレータは、他の薬剤の前、後、または同時に投与してもよい。
【０１０４】
本発明の抗体、ポリペプチド、または組成物はまた、第１および第２のＴ細胞標的を発現する細胞集団の活性化を増加させる方法において使用され得、方法は、当該細胞と本発明のポリペプチドとの間の相互作用を可能にするのに好適な条件下で、本発明のポリペプチドまたは組成物を当該細胞集団に投与することを含む。細胞集団は、典型的には、第１のＴ細胞標的、典型的にはＴ細胞を発現する少なくともいくつかの細胞と、第２のＴ細胞標的を発現する少なくともいくつかの細胞とを含む。方法は、典型的にはエクスビボで実行される。
【０１０５】
例えば、本発明の抗体、ポリペプチド、または組成物は、上述のような方法である、ヒトＯＸ４０およびヒトＣＴＬＡ−４を発現する細胞集団の活性化を増加させる方法においても使用され得る。
【０１０６】
ＣＴＬＡ−４に対する結合ドメイン
本発明の二重特異性ポリペプチドは、ＣＴＬＡ−４に特異的な結合ドメインを含む。
【０１０７】
ＣＤ８６およびＣＤ８０は、本明細書においてＢ７タンパク質（それぞれＢ７−２およびＢ７−１）と称され得る。これらのタンパク質は、抗原提示細胞の表面上に発現され、Ｔ細胞受容体ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４と相互作用する。ＣＤ２８へのＢ７分子の結合はＴ細胞活性化を促進する一方で、ＣＴＬＡ−４へのＢ７分子の結合はＴ細胞の活性化を止める。Ｂ７タンパク質とＣＤ２８および／またはＣＴＬＡ−４との間の相互作用は、免疫活性化および調節において重要な役割を果たす共刺激シグナル伝達経路を構成する。したがって、Ｂ７分子は、経路の一部であり、免疫阻害を切り離すための操作を受けやすく、それによって患者の免疫を向上する。
【０１０８】
ＣＤ８６タンパク質は単量体であり、２つの細胞外免疫グロブリンスーパーファミリードメインからなる。ＣＤ８６の受容体結合ドメインは、典型的なＩｇＶセット構造を有するのに対し、膜近位ドメインは、Ｃ１セット様構造を有する。ＣＤ８０およびＣＤ８６の構造は、それ自体で、またはＣＴＬＡ−４との複合体で決定されている。ＣＤ８０およびＣＤ８６分子上の接触残基は、可溶性細胞外ドメインにあり、大部分はベータシート中に位置し、（ＣＤＲ様）ループ中には位置しない。
【０１０９】
配列番号３は、ヒト野生型ＣＤ８６の単量体可溶性細胞外ドメインのアミノ酸配列である。この野生型配列は、任意選択的に、Ｎ末端、すなわち２４位および２５位にアラニンおよびプロリンを欠いていてもよい。これらのアミノ酸は、本明細書においてそれぞれＡ２４およびＰ２５と称され得る。
【０１１０】
本発明の二重特異性ポリペプチドは、ポリペプチド結合ドメインとして、ＣＴＬＡ−４に特異的なドメイン、「ＣＴＬＡ−４結合ドメイン」を有する。そのような結合ドメインの好適な例は、ＷＯ２０１４／２０７０６３に開示されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。ＣＴＬＡ−４に特異的な結合ドメインはまた、ＣＤ２８にも結合し得る。本明細書で使用されるＣＴＬＡ−４という用語は、典型的には、ヒトＣＴＬＡ−４を指し、本明細書で使用されるＣＤ２８という用語は、典型的にはヒトＣＤ２８を指す。ヒトＣＴＬＡ−４およびヒトＣＤ２８の配列は、それぞれ配列番号１および２に記載されている。本発明のポリペプチドのＣＴＬＡ−４結合ドメインは、他の哺乳類、例えば霊長類またはマウスのＣＴＬＡ−４またはＣＤ２８からのＣＴＬＡ−４またはＣＤ２８に対していくらかの結合親和性を有し得る。
【０１１１】
ＣＴＬＡ−４結合ドメインは、その天然の状態でＣＴＬＡ−４に、特に細胞の表面に局在するＣＴＬＡ−４に結合する能力を有する。
【０１１２】
「細胞の表面に局在する」は、上記に定義した通りである。
【０１１３】
本発明のポリペプチドのＣＴＬＡ−４結合ドメイン部分は、
（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列、または
（ｉｉ）当該結合ドメインが野生型ヒトＣＤ８６よりも高い親和性でヒトＣＴＬＡ−４に結合することを条件に、配列番号３のアミノ酸配列と比較すると、少なくとも１つのアミノ酸が変化しているアミノ酸配列、を含み得るかまたはそれからなり得る。
【０１１４】
言い換えれば、ＣＴＬＡ−４結合ドメインは、（ｉ）ヒト野生型ＣＤ８６の単量体可溶性細胞外ドメイン、または（ｉｉ）当該ポリペプチド変異型が野生型ヒトＣＤ８６よりも高い親和性でヒトＣＴＬＡ−４に結合することを条件に、当該可溶性細胞外ドメインのポリペプチド変異型、を含むかまたはそれからなる、ヒトＣＴＬＡ−４に特異的なポリペプチド結合ドメインである。
【０１１５】
したがって、本発明のポリペプチドのＣＴＬＡ−４結合ドメインは、ヒト野生型ＣＤ８６と同じ標的結合特性を有し得るか、またはヒト野生型ＣＤ８６の標的結合特性と比較して異なる標的結合特性を有し得る。そのような特性を比較する目的のために、「ヒト野生型ＣＤ８６」は、典型的には、前段落に記載されているようなヒト野生型ＣＤ８６の単量体可溶性細胞外ドメインを指す。
【０１１６】
ヒト野生型ＣＤ８６は、ＣＴＬＡ−４およびＣＤ２８の２つの標的に特異的に結合する。したがって、本発明のポリペプチドのＣＴＬＡ−４結合ドメインの結合特性は、ポリペプチドがこれらの標的の各々に結合する能力の個々の尺度として表すことができる。例えば、ヒト野生型ＣＤ８６の単量体細胞外ドメインのポリペプチド変異型は、好ましくは、ＣＴＬＡ−４に対する野生型ヒトＣＤ８６のものよりも高い結合親和性でＣＴＬＡ−４に結合する。そのようなポリペプチドはまた、任意選択的に、ＣＤ２８に対する野生型ヒトＣＤ８６のものよりも低い結合親和性でＣＤ２８にも結合し得る。
【０１１７】
本発明のポリペプチドのＣＴＬＡ−４結合ドメインは、ＣＴＬＡ−４に特異的なポリペプチド結合ドメインである。これは、好ましくは、別の分子に結合するよりも大きな結合親和性でＣＴＬＡ−４に結合することを意味する。ＣＴＬＡ−４結合ドメインは、好ましくは、ＣＴＬＡ−４に対する野生型ヒトＣＤ８６のものと同じかまたはより高い親和性で、ＣＴＬＡ−４に結合する。
【０１１８】
好ましくは、ヒトＣＴＬＡ−４に対する本発明のポリペプチドのＣＴＬＡ−４結合ドメインのＫｄは、ヒトＣＴＬＡ−４に対する野生型ヒトＣＤ８６のＫｄの、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも８倍、または少なくとも１０倍未満であろう。最も好ましくは、ヒトＣＴＬＡ−４に対するＣＴＬＡ−４結合ドメインのＫｄは、ヒトＣＴＬＡ−４に対する野生型ヒトＣＤ８６のＫｄの、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍未満であろう。ＣＴＬＡ−４に対するポリペプチドのＫｄを決定するための好ましい方法は、例えばＢｉａｃｏｒｅ（商標）システムを用いたＳＰＲ分析である。ポリペプチドのＳＰＲ分析に好適なプロトコルは、実施例に記載されている。
【０１１９】
好ましくは、ヒトＣＴＬＡ−４に対する本発明のポリペプチドのＣＴＬＡ−４結合ドメインのＥＣ５０は、同じ条件下でのヒトＣＴＬＡ−４に対する野生型ヒトＣＤ８６のＥＣ５０の、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１２倍、少なくとも１４倍、少なくとも１５倍、少なくとも１７倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、または少なくとも５０倍未満であろう。最も好ましくは、ヒトＣＴＬＡ−４に対するＣＴＬＡ−４結合ドメインのＥＣ５０は、同じ条件下でのヒトＣＴＬＡ−４に対する野生型ヒトＣＤ８６のＥＣ５０の、少なくとも１０倍、または少なくとも２５倍未満であろう。ＣＴＬＡ−４に対するポリペプチドのＥＣ５０を決定するための好ましい方法は、ＥＬＩＳＡを介したものである。ポリペプチドのＥＣ５０の評価に使用するのに好適なＥＬＩＳＡアッセイは、実施例に記載されている。
【０１２０】
好ましくは、ヒトＣＴＬＡ−４への結合について野生型ヒトＣＤ８６に競合するとき、本発明のポリペプチドのＣＴＬＡ−４結合ドメインのＩＣ５０は、同じ条件下での野生型ヒトＣＤ８６のＩＣ５０の、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１３倍、少なくとも１５倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、または少なくとも３００倍未満であろう。最も好ましくは、ＣＴＬＡ−４結合ドメインのＩＣ５０は、同じ条件下での野生型ヒトＣＤ８６のＩＣ５０の、少なくとも１０倍、または少なくとも３００倍未満であろう。本発明のポリペプチドのＩＣ５０を決定するための好ましい方法は、ＥＬＩＳＡを介したものである。本発明のポリペプチドのＩＣ５０の評価への使用に好適なＥＬＩＳＡアッセイは、実施例に記載されている。
【０１２１】
本発明のポリペプチドのＣＴＬＡ−４結合ドメインはまた、ＣＤ２８に特異的に結合し得る。すなわち、ＣＴＬＡ−４結合ドメインは、ＣＴＬＡ−４を除いて、それが別の分子に結合する場合よりも大きな結合親和性でＣＤ２８に結合し得る。ＣＴＬＡ−４結合ドメインは、ヒトＣＤ２８に対する野生型ヒトＣＤ８６のものよりも低い親和性でヒトＣＤ２８に結合し得る。好ましくは、ヒトＣＤ２８に対するＣＴＬＡ−４結合ドメインのＫｄは、ヒトＣＤ２８に対する野生型ヒトＣＤ８６のＫｄよりも、少なくとも２倍、好ましくは少なくとも５倍、より好ましくは少なくとも１０倍高いであろう。
【０１２２】
本発明のポリペプチドのＣＴＬＡ−４結合ドメインの結合特性はまた、ポリペプチドが２つの標的、ＣＴＬＡ−４およびＣＤ２８に結合する能力の相対的な尺度として表すこともできる。すなわち、ＣＴＬＡ−４結合ドメインの結合特性は、ポリペプチドの、ＣＴＬＡ−４に結合する能力対ＣＤ２８に結合する能力の、相対的な尺度として表すことができる。好ましくは、ヒト野生型ＣＤ８６の、ＣＴＬＡ−４に結合する能力対ＣＤ２８に結合する能力の対応する相対的な能力と比較すると、ＣＴＬＡ−４結合ドメインは、相対的に増加した、ＣＴＬＡ−４に結合する能力対ＣＤ２８に結合する能力を有する。
【０１２３】
ＣＴＬＡ−４およびＣＤ２８の両方に対するポリペプチドの結合親和性が同じパラメータ（例えば、Ｋｄ、ＥＣ５０）を使用して評価される場合、各標的に対するポリペプチドの相対的結合能力は、各標的に対するパラメータの値の単純な比として表すことができる。この比は、ポリペプチドの結合比または結合強度比と称され得る。結合親和性を評価するために使用される多くのパラメータ（例えば、Ｋｄ、ＥＣ５０）では、より低い値は、より高い親和性を示す。これにあたるとき、ＣＴＬＡ−４に対する結合親和性対ＣＤ２８に対する結合親和性の比は、好ましくは、以下の式：
結合比＝［ＣＤ２８に対する結合親和性］÷［ＣＴＬＡ−４に対する結合親和性］、に従って計算された単一の数値として表される。
【０１２４】
あるいは、より高い値がより高い親和性を示すパラメータを使用して結合親和性が評価される場合、上記の式の逆が好ましい。いずれの状況においても、本発明のポリペプチドのＣＴＬＡ−４結合ドメインは、好ましくはヒト野生型ＣＤ８６よりも高い結合比を有する。所与のポリペプチドの結合比対別のポリペプチドの結合比を直接比較するには、典型的には、同じパラメータを使用して、結合親和性を評価し、両方のポリペプチドの結合比を計算することが必要であることが理解されるであろう。
【０１２５】
好ましくは、ポリペプチドの結合比は、各標的に対するポリペプチドのＫｄを決定し、次いで式［ＣＤ２８に対するＫｄ］÷［ＣＴＬＡ−４に対するＫｄ］に従って比を計算することによって計算される。この比は、ポリペプチドのＫｄ結合比と称され得る。標的に対するポリペプチドのＫｄを決定するための好ましい方法は、例えばＢｉａｃｏｒｅ（商標）システムを用いたＳＰＲ分析である。本発明のポリペプチドのＳＰＲ分析のための好適なプロトコルは、実施例に記載されている。この方法に従って計算された本発明のポリペプチドのＣＴＬＡ−４結合ドメインの結合比は、好ましくは、同じ方法に従って計算された野生型ヒトＣＤ８６の結合比よりも、少なくとも２倍、または少なくとも４倍高い。
【０１２６】
あるいは、ポリペプチドの結合比は、各標的に対するポリペプチドのＥＣ５０を決定し、次いで式［ＯＸ４０に対するＥＣ５０］÷［ＣＴＬＡ−４に対するＥＣ５０］に従ってその比を計算することによって計算することができる。この比は、ポリペプチドのＥＣ５０結合比と称され得る。標的に対するポリペプチドのＥＣ５０を決定するための好ましい方法は、ＥＬＩＳＡを介したものである。本発明のポリペプチドのＥＣ５０の評価への使用に好適なＥＬＩＳＡアッセイは、実施例に記載されている。この方法に従って計算された本発明のポリペプチドのＣＴＬＡ−４結合ドメインの結合比は、同じ方法に従って計算された野生型ヒトＣＤ８６の結合比よりも、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、または少なくとも１０倍高い。
【０１２７】
本発明のポリペプチドのＣＴＬＡ−４結合ドメインは、ＣＴＬＡ−４への結合について別のポリペプチドと交差競合（ｃｒｏｓｓ−ｃｏｍｐｅｔｅ）する能力を有し得る。例えば、ＣＴＬＡ−４結合ドメインは、ＣＴＬＡ−４への結合について、配列番号６〜２４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドと交差競合し得る。そのような交差競合性ポリペプチドは、標準的な結合アッセイで同定することができる。例えば、（例えばＢｉａｃｏｒｅ（商標）システムを用いた）ＳＰＲ分析、ＥＬＩＳＡアッセイ、またはフローサイトメトリーを使用して交差競合を実証することができる。
【０１２８】
上記の機能的特徴に加えて、本発明のポリペプチドのＣＴＬＡ−４結合ドメインは、ある特定の好ましい構造的特徴を有する。ＣＴＬＡ−４結合ドメインは、（ｉ）ヒト野生型ＣＤ８６の単量体可溶性細胞外ドメイン、または（ｉｉ）当該ポリペプチド変異型が野生型ヒトＣＤ８６よりも高い親和性でヒトＣＴＬＡ−４に結合することを条件に、当該可溶性細胞外ドメインのポリペプチド変異型、のいずれかを含むかまたはそれからなる。
【０１２９】
ヒト野生型ＣＤ８６の単量体可溶性細胞外ドメインのポリペプチド変異型は、ヒト野生型ＣＤ８６のものに由来するアミノ酸配列、具体的には任意選択的にＡ２４およびＰ２５を欠いている、ヒト野生型ＣＤ８６（配列番号３）の可溶性細胞外ドメインのアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。特に、変異型は、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠いている当該配列）と比較すると、少なくとも１つのアミノ酸が変化しているアミノ酸配列を含む。「変化している」とは、少なくとも１つのアミノ酸が、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠いている当該配列）と比較して、欠失、挿入または置換されていることを意味する。「欠失している」とは、アミノ酸配列が１つのアミノ酸だけ短くなるように、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠いている当該配列）中に存在する少なくとも１つのアミノ酸が除去されていることを意味する。「挿入されている」とは、アミノ酸配列が１つのアミノ酸だけ長くなるように、少なくとも１つの追加のアミノ酸が配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠いている当該配列）に導入されていることを意味する。「置換されている」とは、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠いている当該配列）中の少なくとも１つのアミノ酸が、代替的なアミノ酸で置き換えられていることを意味する。
【０１３０】
典型的には、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠いている当該配列）と比較すると、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、または９つのアミノ酸が、変化している。典型的には、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠いている当該配列）と比較すると、１０個、９つ、８つ、７つ、６つ、５つ、４つ、２つ、または１つ以下のアミノ酸が、変化している。これらの下限のうちのいずれかをこれらの上限のうちのいずれかと組み合わせて、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠いている当該配列）と比較して、許容可能な変化の数の範囲を定義することができることが理解されるであろう。したがって、例えば、本発明のポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠いている当該配列）と比較して、許容可能なアミノ酸の変化の数が、２〜３、２〜４、２〜５、２〜６、２〜７、２〜８、２〜９、２〜１０、３〜４、３〜５、３〜６などの範囲内であるアミノ酸配列を含み得る。
【０１３１】
配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠いている当該配列）と比較すると、少なくとも２つのアミノ酸が変化していることが特に好ましい。好ましくは、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠いている当該配列）と比較して、許容可能なアミノ酸の変化の数は、２〜９、２〜８または２〜７の範囲である。
【０１３２】
上記の数および範囲は、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠いている当該配列）と比較して、欠失、挿入、または置換の任意の組み合わせで達成してもよい。例えば、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠いている当該配列）と比較して、欠失のみ、挿入のみ、もしくは置換のみ、または欠失、挿入、もしくは置換の任意の混合があり得る。好ましくは、変異型は、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠いている当該配列）と比較して、変化の全てが置換であるアミノ酸配列を含む。すなわち、配列番号３の配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠いている当該配列）と比較して、アミノ酸が欠失または挿入されていない配列である。好ましい変異型のアミノ酸配列において、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４を欠いている当該配列）と比較すると、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つのアミノ酸が置換されており、配列番号３の配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠いている当該配列）と比較して、アミノ酸が欠失または挿入されていない。
【０１３３】
好ましくは、配列番号３の配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠いている当該配列）と比較して、変化は、配列番号３のＦＧループ領域（１１４〜１２１位）および／またはベータシート領域にある。ベータシート領域のストランドは、以下の位置、配列番号３：Ａ：２７〜３１、Ｂ：３６〜３７、Ｃ：５４〜５８、Ｃ’：６４〜６９、Ｃ’’：７２〜７４、Ｄ：８６〜８８、Ｅ：９５〜９７、Ｆ：１０７〜１１３、Ｇ：１２２〜１３３を有する。
【０１３４】
最も好ましくは、配列番号３の配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠いている当該配列）と比較して、変化は、３２、４８、４９、５４、７４、７７、７９、１０３、１０７、１１１、１１８、１２０、１２１、１２２、１２５、１２７、または１３４から選択された１つ以上の位置にある。本明細書におけるアミノ酸の位置の全ての番号付けは、配列番号４のアミノ酸をＮ末端から始めて数えたものに基づく。したがって、配列番号３のＮ末端の最初の位置は、２４と番号付けされている（図４の概略図参照）。
【０１３５】
特に好ましい挿入としては、１１６位と１１７位との間に挿入された単一の追加のアミノ酸、および／または１１８位と１１９位との間に挿入された単一の追加のアミノ酸が挙げられる。挿入されるアミノ酸は、好ましくはチロシン（Ｙ）、セリン（Ｓ）、グリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）、またはアスパラギン酸（Ｄ）である。
【０１３６】
特に好ましい置換は、１２２位であり、これはアルギニン（Ｒ）である。配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠いている当該配列）と比較して、本発明のポリペプチドは、好ましくは、少なくとも１２２位が置換されているアミノ酸配列を含む。１２２位での最も好ましい置換は、アルギニン（Ｒ）を、優先順にリシン（Ｋ）またはアスパラギン（Ｎ）で置き換えることである。この置換は、Ｒ１２２Ｋ／Ｎと称され得る。
【０１３７】
他の好ましい置換は、１０７位、１２１位、および１２５位にあり、それぞれロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、およびグルタミン酸（Ｑ）である。１２２位での置換に加えて、本発明のポリペプチドは、好ましくは、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠いている当該配列）と比較して、１０７位、１２１位、および１２５位のアミノ酸のうちの少なくとも１つもまた置換されている、アミノ酸配列を含む。本発明のポリペプチドのアミノ酸配列はまた、３２位、４８位、４９位、５４位、６４位、７４位、７７位、７９位、１０３位、１１１位、１１８位、１２０位、１２７位、および１３４位のうちの１つ以上で置換されていてもよい。
【０１３８】
１０７位での最も好ましい置換は、ロイシン（Ｌ）を、優先順にイソロイシン（Ｉ）、フェニルアラニン（Ｆ）、またはアルギニン（Ｒ）で置き換えることである。この置換は、Ｌ１０７Ｉ／Ｆ／Ｒと称され得る。本明細書に記載の他の置換についても、同様の表記法が使用される。１２１位での最も好ましい置換は、イソロイシン（Ｉ）をバリン（Ｖ）で置き換えることである。この置換は、Ｉ１２１Ｖと称され得る。
【０１３９】
１２５位での最も好ましい置換は、グルタミン（Ｑ）をグルタミン酸（Ｅ）で置き換えることである。この置換は、Ｑ１２５Ｅと称され得る。
【０１４０】
本発明のポリペプチドのアミノ酸配列に好ましい場合のある他の置換としては、Ｆ３２Ｉ、Ｑ４８Ｌ、Ｓ４９Ｔ、Ｖ５４Ｉ、Ｖ６４Ｉ、Ｋ７４Ｉ／Ｒ、Ｓ７７Ａ、Ｈ７９Ｄ／Ｓ／Ａ、Ｋ１０３Ｅ、Ｉ１１１Ｖ、Ｔ１１８Ｓ、Ｍ１２０Ｌ、Ｎ１２７Ｓ／Ｄ、およびＡ１３４Ｔが挙げられる。
【０１４１】
ヒト野生型ＣＤ８６の当該可溶性細胞外ドメインの特に好ましい変異型は、表Ｃに示されている配列番号６〜２４のアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含むかまたはそれからなる。
【０１４２】
配列番号６〜１４に示されているアミノ酸配列は、任意選択的に、Ｎ末端に追加の残基ＡＰを含み得る。配列番号１５〜２４に示されているアミノ酸配列は、任意選択的に、Ｎ末端に残基ＡＰを欠いていてもよい。いずれの場合も、これらの残基は、配列番号３のＡ２４およびＰ２５に対応する。
【０１４３】
本発明のポリペプチドのＣＴＬＡ−４結合ドメインは、ヒト野生型ＣＤ８６の当該可溶性細胞外ドメインの上述の変異型のうちのいずれかを含み得るかまたはそれからなり得る。すなわち、本発明のポリペプチドのＣＴＬＡ−４結合ドメインは、表Ｃに示されている配列番号６〜２４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含み得るかまたはそれからなり得る。
【０１４４】
結合ドメインは、例えばＴ細胞などのＣＴＬＡ−４を発現する細胞に投与すると、ＣＴＬＡ−４からのシグナル伝達を調節し得る。好ましくは、結合ドメインは、当該シグナル伝達を低下させる、すなわち阻害または遮断し、それによって当該細胞の活性化を増加する。試験剤（結合ドメインなど）の投与の結果としてのＣＴＬＡ−４シグナル伝達および細胞活性化の変化は、任意の好適な方法によって決定され得る。好適な方法としては、試験剤の存在下または好適な対照の存在下にあるとき、Ｔ細胞の表面に発現されたＣＴＬＡ−４を通じて膜結合ＣＤ８６（例えばＲａｊｉ細胞上の）が結合しシグナル伝達する能力をアッセイすることが挙げられる。対照の存在下でのＴ細胞ＩＬ−２産生および／またはＴ細胞増殖のレベルと比較した、試験剤の存在下でのＴ細胞ＩＬ−２産生レベルの増加またはＴ細胞増殖の増加は、ＣＴＬＡ−４を通じたシグナル伝達の低下および細胞活性化の増加を示す。この種類の典型的なアッセイは、ＵＳ２００８／０２３３１２２の実施例９に開示されている。
【０１４５】
ＯＸ４０に対する結合ドメイン
本発明の二重特異的結合分子は、結合ドメインとして（例えば、Ｂ１として）任意のＯＸ４０結合ドメイン、例えば抗ＯＸ４０抗体を組み込むことができる。
【０１４６】
ＯＸ４０に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、以下により詳細に説明される、ある特定の好ましい結合特徴および機能的効果を有する。当該抗体またはその抗原結合断片は、本発明の二重特異性抗体の一部として組み込まれているとき、好ましくは、これらの結合特徴および機能的効果を保持する。この結合ドメインは、本発明の二重特異性分子とは独立して提供されてもよい。
【０１４７】
抗体は、好ましくは、ＯＸ４０に特異的に結合する、すなわち、ＯＸ４０には結合するが、他の分子には結合しないか、またはより低い親和性で結合する。本明細書で使用される用語ＯＸ４０は、典型的には、ヒトＯＸ４０を指す。ヒトＯＸ４０の配列は、配列番号５１（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＰ＿００３３１８．１に対応）に記載されている。抗体は、非ヒト霊長類（例えば、Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイザル）、Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）のＯＸ４０など、他の哺乳類からのＯＸ４０に対してある程度の結合親和性を有し得る。抗体は、好ましくは、マウスＯＸ４０に結合せず、かつ／または他のヒトＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー、例えばヒトＣＤ１３７もしくはＣＤ４０に結合しない。
【０１４８】
抗体は、その天然の状態でＯＸ４０に、特に細胞の表面に局在するＯＸ４０に結合する能力を有する。好ましくは、抗体はＯＸ４０に特異的に結合するであろう。すなわち、本発明の抗体は、好ましくは、別の分子に結合する結合親和性よりも高い結合親和性でＯＸ４０に結合するであろう。
【０１４９】
「細胞の表面に局在する」は、上記に定義した通りである。
【０１５０】
抗体は、上記に定義したように、ＯＸ４０を発現する細胞の活性を調節することができ、当該調節は、当該細胞の活性の増加または減少である。細胞は、典型的にはＴ細胞である。抗体は、上述のように、ＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋エフェクター細胞の活性を増加するか、または制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の活性を減少することができる。
【０１５１】
いずれの場合においても、本抗体の正味の効果は、エフェクターＴ細胞、特にＣＤ４＋エフェクターＴ細胞の活性の増加である。エフェクターＴ細胞の活性の変化を決定するための方法は、周知であり、先に記載されている。
【０１５２】
抗体は、好ましくは、５０×１０−１０Ｍ未満、または２５×１０−１０Ｍ未満、より好ましくは１０、９、８、７、または６×１０−１０Ｍ未満、最も好ましくは５×１０−１０Ｍ未満であるＫｄ値でヒトＯＸ４０に結合する。
【０１５３】
例えば、抗体は、好ましくは、マウスＯＸ４０、またはＣＤ１３７もしくはＣＤ４０などの任意の他のＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーに結合しない。したがって、典型的には、ヒトＯＸ４０に対する抗体のＫｄは、マウスＯＸ４０、他のＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー、または任意の他の無関係な物質もしくは環境中の付随する物質などの他の非標的分子に対するＫｄの２倍、好ましくは５倍、より好ましくは１０倍未満であろう。より好ましくは、Ｋｄは、５０倍未満、さらにより好ましくは１００倍未満、およびさらにより好ましくは２００倍未満であろう。
【０１５４】
この解離定数の値は、上述のように、周知の方法によって直接決定することができる。
【０１５５】
本発明のポリペプチドは、好ましくは、その標的に対して、別の非標的分子に結合するその親和性よりも少なくとも２倍、１０倍、５０倍、１００倍、またはそれ以上である親和性で結合することができる。
【０１５６】
したがって、要約すると、抗体は、好ましくは以下の機能的特徴のうちの少なくとも１つを呈する：
Ｉ．１０×１０−１０Ｍ未満のＫＤ値でヒトＯＸ４０に結合する、
ＩＩ．マウスＯＸ４０に結合しない、
ＩＩＩ．他のヒトＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー、例えばヒトＣＤ１３７またはＣＤ４０には結合しない。
【０１５７】
抗体は、ＯＸ４０、典型的にはヒトＯＸ４０に特異的であり、以下のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ全てを含み得る：
（ａ）８アミノ酸長であり、コンセンサス配列「Ｇ、Ｆ、Ｔ、Ｆ、Ｇ／Ｙ／Ｓ、Ｇ／Ｙ／Ｓ、Ｙ／Ｓ、Ｙ／Ｓ／Ａ」を含む重鎖ＣＤＲ１配列、
（ｂ）８アミノ酸長であり、コンセンサス配列「Ｉ、Ｇ／Ｙ／Ｓ／Ｔ、Ｇ／Ｓ／Ｙ、Ｓ／Ｙ、Ｇ／Ｓ／Ｙ、Ｇ／Ｓ／Ｙ、Ｇ／Ｓ／Ｙ、Ｔ」を含む重鎖ＣＤＲ２配列、
（ｃ）９〜１７アミノ酸長であり、コンセンサス配列「Ａ、Ｒ、Ｇ／Ｙ／Ｓ／Ｈ、Ｇ／Ｙ／Ｆ／Ｖ／Ｄ、Ｇ／Ｙ／Ｐ／Ｆ、−／Ｈ／Ｓ、−／Ｎ／Ｄ／Ｈ、−／Ｙ／Ｇ、−／Ｙ、−／Ｙ、−／Ｗ／Ａ／Ｖ、−／Ａ／Ｙ、−／Ｄ／Ａ／Ｙ／Ｇ／Ｈ／Ｎ、Ｙ／Ｓ／Ｗ／Ａ／Ｔ、Ｌ／Ｍ／Ｉ／Ｆ、Ｄ、Ｙ」を含む重鎖ＣＤＲ３配列。この定義内の好ましい重鎖ＣＤＲ３配列には、コンセンサス配列「Ａ、Ｒ、Ｙ／Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ａ／Ｙ／Ｇ、Ｓ／Ｗ／Ａ、Ｍ／Ｌ、Ｄ、Ｙ」を含む１０アミノ酸長のＣＤＲ３配列、またはコンセンサス配列「Ａ、Ｒ、Ｇ／Ｙ、Ｖ／Ｆ／Ｙ、Ｐ、Ｈ、Ｇ／Ｙ／Ｈ、Ｙ、Ｆ／Ｉ、Ｄ、Ｙ」を含む１１アミノ酸長のＣＤＲ３配列が含まれる。
（ｄ）配列「Ｑ、Ｓ、Ｉ、Ｓ、Ｓ、Ｙ」からなる軽鎖ＣＤＲ１配列、
（ｅ）配列「Ａ、Ａ、Ｓ」からなる軽鎖ＣＤＲ２配列、
（ｆ）８〜１０アミノ酸長であり、コンセンサス配列「Ｑ、Ｑ、Ｓ／Ｙ／Ｇ、−／Ｙ／Ｈ／Ｇ、−／Ｓ／Ｙ／Ｇ／Ｄ／Ｗ、Ｓ／Ｙ／Ｇ／Ｄ、Ｓ／Ｙ／Ｇ／Ｔ、Ｐ／Ｌ、Ｙ／Ｓ／Ｈ／Ｌ／Ｆ、Ｔ」を含む軽鎖ＣＤＲ３配列。この定義内の軽鎖ＣＤＲ３配列の好ましい例は、配列「Ｑ、Ｑ、Ｓ、Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、Ｙ、Ｔ」からなる。
抗体は、少なくとも（ｃ）で定義される重鎖ＣＤＲ３および／または（ｆ）で定義される軽鎖ＣＤＲ３を含み得る。抗体は、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の３つ全ての重鎖ＣＤＲ配列および／または（ｄ）、（ｅ）、および（ｆ）の３つ全ての軽鎖ＣＤＲ配列を含み得る。
【０１５８】
例示的なＣＤＲ配列は、表Ａ（１）およびＡ（２）、配列番号５２〜８８に列挙されている。
【０１５９】
好ましい抗ＯＸ４０抗体は、表Ａ（１）の任意の個々の行に定義されるような少なくとも１つの重鎖ＣＤＲ３、および／または表Ａ（２）の任意の個々の行に定義されるような軽鎖ＣＤＲ３を含み得る。抗体は、表Ａ（１）の個々の行に示される３つ全ての重鎖ＣＤＲ配列（すなわち、所与の「ＶＨ数」の３つ全ての重鎖ＣＤＲ）、および／または表Ａ（２）の個々の行に示される３つ全ての軽鎖ＣＤＲ配列（すなわち、所与の「ＶＬ番号」の３つ全ての軽鎖ＣＤＲ）を含み得る。
【０１６０】
完全な重鎖および軽鎖可変領域アミノ酸配列の例を、表Ｂに示す。各アミノ酸配列をコードする例示的な核酸配列も示す。表Ｂの当該ＶＨおよびＶＬ領域の番号付けは、表Ａ（１）および（２）で使用されている番号付けシステムに対応する。したがって、例えば、「１１６７、軽鎖ＶＬ」のアミノ酸配列は、表Ａ（２）に示されるＶＬ番号１１６７の３つ全てのＣＤＲを含む完全なＶＬ領域配列の例であり、「１１６６、重鎖ＶＨ」のアミノ酸配列は、表Ａ（１）に示されるＶＨ番号１１６６の３つ全てのＣＤＲを含む完全なＶＨ領域配列の例である。
【０１６１】
本発明の好ましい抗ＯＸ４０抗体は、特定のＶＨ番号の３つ全てのＣＤＲを含むＶＨ領域、および特定のＶＬ番号の３つ全てのＣＤＲを含むＶＬ領域を含む。例えば、
−抗体は、ＶＨ番号１１６６の３つ全てのＣＤＲ、およびＶＬ番号１１６７の３つ全てのＣＤＲを含み得る。そのような抗体は、１１６６／１１６７と称され得る。そのような抗体は、好ましくは、表Ｂ（配列番号９１および８９）に示されるように、１１６６および１１６７の対応する完全なＶＨおよびＶＬ配列を含み得る。
−抗体は、ＶＨ番号１１７０の３つ全てのＣＤＲ、およびＶＬ番号１１７１の３つ全てのＣＤＲを含み得る。そのような抗体は、１１７０／１１７１と称され得る。そのような抗体は、好ましくは、表Ｂ（配列番号９５および９３）に示されるように、１１７０および１１７１の対応する完全なＶＨおよびＶＬ配列を含み得る。
−抗体は、ＶＨ番号１１６４の３つ全てのＣＤＲ、およびＶＬ番号１１３５の３つ全てのＣＤＲを含み得る。そのような抗体は、１１６４／１１３５と称され得る。そのような抗体は、好ましくは、表Ｂ（配列番号９９および９７）に示されるように、１１６４および１１３５の対応する完全なＶＨおよびＶＬ配列を含み得る。
−抗体は、ＶＨ番号１１６８の３つ全てのＣＤＲ、およびＶＬ番号１１３５の３つ全てのＣＤＲを含み得る。そのような抗体は、１１６８／１１３５と称され得る。そのような抗体は、好ましくは、表Ｂ（配列番号１０１および９７）に示されるように、１１６８および１１３５の対応する完全なＶＨおよびＶＬ配列を含み得る。
−抗体は、ＶＨ番号１４８２の３つ全てのＣＤＲ、およびＶＬ番号１４８３の３つ全てのＣＤＲを含み得る。そのような抗体は、１４８２／１４８３と称され得る。そのような抗体は、好ましくは、表Ｂ（配列番号１０５および１０３）に示されるように、１４８２および１４８３の対応する完全なＶＨおよびＶＬ配列を含み得る。
−抗体は、ＶＨ番号１４９０の３つ全てのＣＤＲ、およびＶＬ番号１１３５の３つ全てのＣＤＲを含み得る。そのような抗体は、１４９０／１１３５と称され得る。そのような抗体は、好ましくは、表Ｂ（配列番号１０７および９７）に示されるように、１４９０および１１３５の対応する完全なＶＨおよびＶＬ配列を含み得る。
−抗体は、ＶＨ番号１５１４の３つ全てのＣＤＲ、およびＶＬ番号１５１５の３つ全てのＣＤＲを含み得る。そのような抗体は、１５１４／１５１５と称され得る。そのような抗体は、好ましくは、表Ｂ（配列番号１１１および１０９）に示されるように、１５１４および１５１５の対応する完全なＶＨおよびＶＬ配列を含み得る。
−抗体は、ＶＨ番号１５２０の３つ全てのＣＤＲ、およびＶＬ番号１１３５の３つ全てのＣＤＲを含み得る。そのような抗体は、１５２０／１１３５と称され得る。そのような抗体は、好ましくは、表Ｂ（配列番号１１３および９７）に示されるように、１５２０および１１３５の対応する完全なＶＨおよびＶＬ配列を含み得る。
−抗体は、ＶＨ番号１５２４の３つ全てのＣＤＲ、およびＶＬ番号１５２５の３つ全てのＣＤＲを含み得る。そのような抗体は、１５２４／１５２５と称され得る。そのような抗体は、好ましくは、表Ｂ（配列番号１１７および１１５）に示されるように、１５２４および１５２５の対応する完全なＶＨおよびＶＬ配列を含み得る。
−抗体は、ＶＨ番号１５２６の３つ全てのＣＤＲ、およびＶＬ番号１５２７の３つ全てのＣＤＲを含み得る。そのような抗体は、１５２６／１５２７と称され得る。そのような抗体は、好ましくは、表Ｂ（配列番号１２１および１１９）に示されるように、１５２６および１５２７の対応する完全なＶＨおよびＶＬ配列を含み得る。
−抗体は、ＶＨ番号１５４２の３つ全てのＣＤＲ、およびＶＬ番号１１３５の３つ全てのＣＤＲを含み得る。そのような抗体は、１５４２／１１３５と称され得る。そのような抗体は、好ましくは、表Ｂ（配列番号１２３および９７）に示されるように、１５４２および１１３５の対応する完全なＶＨおよびＶＬ配列を含み得る。
【０１６２】
抗体は、抗体がヒトＯＸ４０に結合し、機能的特徴Ｉ〜ＩＩＩのうちの少なくとも１つを呈することを条件に、表Ｂに列挙される特定のアミノ酸配列のうちのいずれかの変異型または断片を含み得る。そのような変異型または断片は、典型的には、表Ｂの当該配列のＣＤＲ配列を保持し得る。
【０１６３】
表Ｂに示される重鎖または軽鎖アミノ酸配列のうちのいずれか１つの断片は、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも１８個、少なくとも２０個、または少なくとも２５個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個、または少なくとも１００個の、当該アミノ酸配列からの連続アミノ酸を含み得る。
【０１６４】
表Ｂに示される重鎖または軽鎖アミノ酸配列のうちのいずれか１つの変異型は、上記に定義したように、当該配列の置換、欠失、または付加変異型であり得る。
【０１６５】
抗体は、本明細書に記載の特定の抗体のうちのいずれかと同じエピトープに結合し得る。好ましくは、１１６６／１１６７、１１７０／１１７１、１１６４／１１３５、１１６８／１１３５、１４８２／１４８３、１４９０／１１３５、１５１４／１５１５、１５２０／１１３５、１５２４／１５２５、１５２６／１５２７、および１５４２／１１３５と称される抗体のうちのいずれか１つと同じエピトープに結合する。
【０１６６】
ＩｇＧ１重鎖定常領域配列など、本明細書に開示の任意のＶＨ領域配列（完全な重鎖を形成する）と組み合わせることができる例示的な重鎖定常領域アミノ酸配列は、先に記載されている。
【０１６７】
カッパ鎖定常領域配列など、本明細書に開示の任意のＶＬ領域配列（完全な軽鎖を形成する）と組み合わせることができる例示的な軽鎖定常領域アミノ酸配列は、先に記載されている。
【０１６８】
本発明の二重特異性ポリペプチド
本発明のポリペプチドは、ＯＸ４０およびＣＴＬＡ−４に特異的な結合ドメインを含み、すなわち、Ｂ１はＯＸ４０に特異的であり、Ｂ２はＣＴＬＡ−４に特異的である。
【０１６９】
例えば、二重特異性ポリペプチドは、配列番号１２５のＣＤ８６ドメインに融合したＩｇＧ軽鎖と、配列番号９１のＶＨ領域を含むＩｇＧ重鎖とを含む抗体「１１６６／１２６１」であり得る。あるいは、二重特異性ポリペプチドは、例えば配列番号１２５および／もしくは９１と少なくとも７０％の配列同一性、例えば配列番号１２５および／または９１、配列番号１２５および／または９と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する当該配列の変異型を含み得る。
【０１７０】
実施形態の二重特異性ポリペプチドは、免疫系の細胞の活性を、ＯＸ４０もしくはＣＴＬＡ−４単独の個々のアゴニストよりも、またはそのような個々のアゴニストの組み合わせよりも、大幅に調節することができる。特に、二重特異性ポリペプチドの投与により、より高いレベルのエフェクターＴ細胞活性、特にＣＤ４＋エフェクターＴ細胞活性がもたらされる。二重特異性ポリペプチドは、ＣＴＬＡ−４およびＯＸ４０が両方ともより高度に発現される微小環境においてのみ最大の効果を発揮するので、エフェクターＴ細胞活性の増加はまた、個々のＯＸ４０またはＣＴＬＡ−４アゴニスト単独（またはそれらの組み合わせ）の投与から生じるものよりも、局在する。腫瘍は、そのような微小環境である。腫瘍浸潤制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、高レベルのＣＴＬＡ−４およびＯＸ４０を発現し、エフェクターＴ細胞（ＣＤ４およびＣＤ８の両方）よりも高く発現する。
【０１７１】
エフェクターＴ細胞活性の増加は、ＯＸ４０経路の活性化を介した、もしくはＣＴＬＡ−４阻害経路の遮断を介したエフェクターＴ細胞の刺激から直接生じ得るか、またはＴｒｅｇの枯渇または下方制御から間接的に生じて得、それによってそれらの免疫抑制効果を低下させる。Ｔｒｅｇｓの枯渇／下方制御は、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）または抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）のメカニズムによって媒介される場合がある。エフェクターＴ細胞と比較した、Ｔｒｅｇ上でのＣＴＬＡ−４およびＯＸ４０の両方の高発現は、単一特異性抗体と比較して、Ｔｒｅｇの著しく高い死滅を誘導する可能性がある。ＣＴＬＡ−４およびＯＸ４０の発現が低いエフェクターＴ細胞は、このメカニズムによって枯渇しないであろう。全体として、殺腫瘍活性を直ちに生じるために、非常に強力な、局所化された免疫活性化を結果としてもたらすであろう。
【０１７２】
免疫系の細胞での本発明の二重特異性ポリペプチドの効果の測定は、任意の好適なアッセイで達成され得る。例えば、エフェクターＴ細胞の活性の増加は、二重特異性ポリペプチドの個々の構成要素Ｂ１およびＢ２に関して上述のようなアッセイによって測定され得、二重特異性ポリペプチドの存在下で対照と比較した、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞による増殖またはＩＬ−２産生の測定が挙げられる。対照と比較した増殖またはＩＬ−２産生の増加は、細胞活性化の増加を示す。この種類の典型的なアッセイは、ＵＳ２００８／０２３３１２２の実施例９に開示されている。細胞増殖および／またはＩＬ−２産生についてのアッセイは周知知であり、実施例にも例示されている。同じアッセイで評価した場合、二重特異性分子は、典型的には、同じ標的に結合する単一特異性薬剤の組み合わせによって誘導されるエフェクターＴ細胞の活性の増加よりも、少なくとも１．５倍高い、または少なくとも２倍高い、より好ましくは３倍高い、最も好ましくは５倍高いエフェクターＴ細胞の活性の増加を誘導するであろう。
【０１７３】
本発明の二重特異性ポリペプチドは、ヒトＣＴＬＡ−４およびヒトＯＸ４０の両方に特異的に結合することができ、上記に定義したようなＢ１およびＢ２を含む。
【０１７４】
「ＣＴＬＡ−４およびＯＸ４０の両方に特異的に結合することができる」とは、上記の各部分に提供される定義に従って、部分Ｂ１がＯＸ４０に特異的に結合し、部分Ｂ２がＣＴＬＡ−４に特異的に結合することを意味する。好ましくは、それぞれの標的に対する部分Ｂ１およびＢ２の結合特徴は、別々の要素として存在する場合の部分Ｂ１およびＢ２の当該特徴と比較すると、本発明のポリペプチドの一部として存在する場合には、変化しないか、または実質的に変化しない。
【０１７５】
典型的には、これは、二重特異性分子が、単独で存在するときにＢ１のＯＸ４０に対するＫｄ値と好ましくは実質的に同じであるＯＸ４０に対するＫｄを有することを意味する。あるいは、二重特異性分子が単独で存在するときのＢ１のＯＸ４０に対するＫｄと比較して、増加したＯＸ４０に対するＫｄを有する場合、その増加は１０倍以下、好ましくは、９倍、８倍、７倍、６倍、５倍、４倍、３倍、または２倍以下である。二重特異性分子は、好ましくは、５０×１０−１０Ｍ未満、より好ましくは２５×１０−１０Ｍ未満、最も好ましくは２０×１０−１０ＭであるＫｄ値でヒトＯＸ４０に結合する。加えて、二重特異性分子は、単独で存在する場合、Ｂ２のＣＴＬＡ４に対するＫｄ値と好ましくは実質的に同じであるＣＴＬＡ−４に対するＫｄを独立して有するであろう。あるいは、二重特異性分子が単独で存在する場合のＢ２のＣＴＬＡ−４のＫｄと比較して増加するＣＴＬＡ−４のＫｄを有する場合、増加は３倍以下、好ましくは２倍以下である。二重特異性分子は、好ましくは、６０×１０−９Ｍ未満、より好ましくは２５×１０−９Ｍ未満、最も好ましくは１０×１０−９Ｍ未満のＫｄ値でヒトＣＴＬＡ−４に結合する。
【０１７６】
言い換えれば、二重特異性分子は、５０×１０−１０Ｍ、２５×１０−１０Ｍ、または２０×１０−１０Ｍ未満のＯＸ４０のＫｄを有する場合があり、独立して６０×１０−９Ｍ未満、２５×１０−９Ｍ未満、または１０×１０−９Ｍ未満のＣＴＬＡ−４のＫｄを有し得る。ＯＸ４０について列挙されたＫｄ値のうちのいずれかをＣＴＬＡ−４について列挙されたＫｄ値のうちのいずれかと独立して組み合わせて、所与の二重特異性分子の結合特徴を説明することができることが理解されよう。同様に、ＯＸ４０結合の列挙された倍数変化のうちのいずれかを、ＣＴＬＡ−４結合の列挙された倍数変化のうちのいずれかと独立して組み合わせて、所与の二重特異性分子の結合特徴を説明することができる。
【０１７７】
本発明のポリペプチドの一部として存在する場合、部分Ｂ１およびＢ２の結合特徴は、任意の好適なアッセイにより評価され得る。特に、各別々の部分について上記に記載のアッセイは、それらが本発明のポリペプチドの一部として存在する場合、Ｂ１およびＢ２にも適用され得る。本発明の二重特異性ポリペプチドの結合特徴を評価するための好適なアッセイも、実施例に記載されている。
【０１７８】
二重特異性分子は、ＯＸ４０およびＣＴＬＡ−４の両方が高度に発現されている微小環境にあるとき、免疫系を強力に活性化する。典型的には、二重特異性分子は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋エフェクター細胞の活性を増加するか、または制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の活性を減少することができる。いずれの場合においても、本抗体の正味の効果は、エフェクターＴ細胞、特にＣＤ４＋エフェクターＴ細胞の活性の増加である。同じアッセイで評価した場合、二重特異性分子は、典型的には、同じ標的に結合する単一特異性薬剤の組み合わせによって誘導されるエフェクターＴ細胞の活性の増加よりも、少なくとも１．５倍高い、または少なくとも１．７倍高い、より好ましくは４．５倍高い、最も好ましくは７倍高いエフェクターＴ細胞の活性の増加を誘導するであろう。
【０１７９】
エフェクターＴ細胞の活性の変化を決定するための方法は、周知であり、先に記載された通りである。細胞増殖および／またはＩＬ−２産生についてのアッセイは周知であり、実施例に例示されている。
【０１８０】
例えば、ポリペプチドは、ＣＴＬＡ−４およびＯＸ４０の両方に特異的に結合することができ得、Ｂ１は、ＯＸ４０に特異的な抗体またはその抗原結合断片であり得、Ｂ２は、ＣＴＬＡ−４に特異的なポリペプチド結合ドメインであり得、これは、
【０１８１】
ｉ）配列番号３のアミノ酸配列、または
ｉｉ）当該結合ドメインが野生型ヒトＣＤ８６よりも高い親和性でヒトＣＴＬＡ−４に結合することを条件に、配列番号３のアミノ酸配列と比較すると、少なくとも１つのアミノ酸が変化しているアミノ酸配列、を含むかまたはそれからなる。
【０１８２】
ポリペプチドによって特異的に結合されているＣＴＬＡ−４は、霊長類またはマウス、好ましくはヒトのＣＴＬＡ−４であり得、および／またはポリペプチドによって特異的に結合されているＯＸ４０は、霊長類、好ましくはヒトのＯＸ４０であり得る。
【０１８３】
本発明の二重特異性ポリペプチドは、任意の好適なフォーマットで一緒に配置されるＯＸ４０結合ドメインおよびＣＴＬＡ−４結合ドメインを含み得る。任意の所与の二重特異性フォーマットにおいて、ＯＸ４０結合ドメインおよびＣＴＬＡ−４結合ドメインは、それぞれ独立して、抗体全体またはその抗原結合部分であり得ることが理解されよう。使用される特定の二重特異性フォーマットとは関係なく、本明細書に記載の二重特異性ポリペプチドおよび抗体は、典型的には、ＯＸ４０結合ドメイン（結合ドメイン１と称され得る）の組成およびＣＴＬＡ−４結合ドメイン（結合ドメイン２と称され得る）の組成に基づく番号付けスキームによって称され得る。したがって、番号付けスキームは、典型的には、ＯＸ４０結合ドメイン（結合ドメイン１）の場合はＶＨ１／ＶＬ１、ＣＴＬＡ−４結合ドメイン（結合ドメイン２）の場合はＶＨ２／ＶＬ２の形態で、ＶＨ１／ＶＬ１−ＶＨ２／ＶＬ２として一緒に記述される。この番号付けスキームは、二重特異性ポリペプチドまたは抗体中に存在する結合ドメインの総数も、二重特異性ポリペプチドまたは抗体中の定常領域の有無も反映せず、どちらも使用される二重特異性抗体の特定のフォーマットによって決定されることが理解されよう。結合ドメインの総数および定常領域の有無は、当該技術分野で知られている任意の好適な二重特異性抗体フォーマットに従ってもよい。
【０１８４】
二重特異性ポリペプチドまたは抗体の多くの好適なフォーマットが当該技術分野で知られており、本発明の二重特異性ポリペプチドは、これらのフォーマットのうちのいずれかであり得る。適切なフォーマットには、図１および１４に記載されているものが含まれる（その開示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ＆Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ，２０１５，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ．８３８−８４７も参照されたい）。
【０１８５】
図１４において、定常領域は、薄灰色で塗りつぶされて示されており、可変重鎖領域ＶＨ１は、白黒の格子柄として示されており、可変軽鎖領域ＶＬ１は、白で塗りつぶされて示されており、可変重鎖領域ＶＨ２は、黒で塗りつぶされて示されており、可変軽鎖領域ＶＬ２は、白地に斜線で示されている。したがって、ＯＸ４０結合ドメイン（結合ドメイン１と称される）は、典型的には、格子柄の白黒ドメインと塗りつぶされた白色ドメインとの対として表され、ＣＴＬＡ−４結合ドメイン（結合ドメイン２と称される）は、典型的には、塗りつぶされた黒色ドメインと斜線のある白色ドメインとの対として表される。しかしながら、示されているフォーマットの全てにおいて、結合ドメイン１および２が交換され得ることは理解されよう。すなわち、ＯＸ４０結合ドメインは、ＣＴＬＡ−４ドメインについて図１４に示される任意の位置で発生する可能性があり、その逆も同様である。
【０１８６】
二重特異性ポリペプチドの好ましいフォーマットは、図１４の２行目に最初に示されているｋｉｈまたは「ノブ・イン・ホール」配列である。この配置において、各抗体の重鎖のＣＨ３ドメインは、抗ＯＸ４０抗体からの重鎖と抗ＣＴＬＡ−４抗体からの重鎖との間のヘテロ二量体化を可能にするように突然変異している。各重鎖は、対応する軽鎖と会合して、１つの完全なＯＸ４０結合ドメインと、１つの完全なＣＴＬＡ−４結合ドメインとを形成する。正しい軽鎖との会合を促進するために、重鎖ＣＨ１領域に修飾を加えることができる。ｋｉｈフォーマットの二重特異性抗体は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｒｉｄｇｗａｙ  ｅｔ  ａｌ  １９９６；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  ９：６１７−６２１を参照されたい；その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１８７】
本発明の二重特異性抗体の別の好ましいフォーマットは、ｓｃＦｖ２−Ｆｃフォーマットであり、これは図１４の２行目に示されている２番目のものである。この配置では、各標的に特異的な１つのｓｃＦｖが定常免疫グロブリンドメインに融合する。単鎖は重鎖のＦｃ領域に融合し得、一方の特異性がＦｃ領域のＮ末端に融合し、他方の特異性がＦｃ領域のＣ末端に融合する（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３７（１８）：１１２３−３０；その開示は参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１８８】
本発明の二重特異性ポリペプチドの別の好ましいフォーマットは、ＢＩＴＥ／ｓｃＦｖ２フォーマットであり、これは図１４の２行目に示されている３番目のフォーマットである。この配置では、一方がＯＸ４０に特異的なｓｃＦｖであり、他方がＣＴＬＡ−４に特異的なｓｃＦｖである２つのｓｃＦｖが、リンカーと一緒に融合している（Ｂｒｉｓｃｈｗｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ３０（８）：７９８−８０７；その開示は参照により本明細書に組み込まれる）。リンカーは、任意選択的に、図１４の４行目に示されているように、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの溶解性および血清半減期を増加させ、ｓｃＦｖ−ＨＳＡ−ｓｃＦｖ二重特異性抗体を作成するタンパク質を含み得る。
【０１８９】
本発明の二重特異性ポリペプチドに対する別の好ましいフォーマットは、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）免疫グロブリンであり、これは図１４の２行目に示されている４番目のフォーマットである。この配置では、第２の可変ドメイン（ＶＬ２）は第１の可変軽鎖（ＶＬ１）に融合し、第２の可変重鎖（ＶＨ２）はＩｇＧ分子の第１の可変重鎖（ＶＨ１）に融合する。ＶＨ１およびＶＬ１は結合部位１を形成し、ＶＨ２およびＶＬ２は結合部位２を形成し、したがって二重特異性抗体を作成する（Ｗｕ，２００７，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２５（１１）：１２９０−７；その開示は参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１９０】
本発明の二重特異性ポリペプチドの別の好ましいフォーマットは、ＶＨ１がＶＬ２に融合し、ＶＨ２がＶＬ１に融合し、短いペプチドリンカーでＶＨ１／ＶＬ１およびＶＨ２／ＶＬ２結合部位を形成させる二重親和性再標的化（ＤＡＲＴ）フォーマットである。この構築物は、結合部位間にジスルフィド架橋を形成することにより安定化する可能性がある。ＤＡＲＴフォーマットをＩｇＧ  Ｆｃドメインに融合して、一価の二重特異性抗体（ＤＡＲＴ−Ｆｃ）または二価の二重特異性抗体（ＤＡＲＴ２−Ｆｃ）を作成することができる（Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｂｌｏｏｄ  １１７（１７）：４５４２−５１）。ＤＡＲＴ、ＤＡＲＴ−Ｆｃ、およびＤＡＲＴ２−Ｆｃフォーマットを図１４の３行目に示す。
【０１９１】
本発明の二重特異性ポリペプチドの別の好ましいフォーマットは、ドック−アンド−ロック技術（ＤＮＬ）により生成される二重特異性抗体である。ｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼＡおよびＡキナーゼアンカータンパク質は、各標的の抗体、Ｆａｂ断片、またはｓｃＦｖに融合し、それにより多価の二重特異性抗体、例えばＤＮＬ−Ｆａｂ３を生成することができる（図１４の４行目に示される、Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １３（１８Ｐｔ  ２）：５５８６ｓ−５５９１ｓ；その開示は参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１９２】
本発明の二重特異性ポリペプチドに対する特に好ましいフォーマットは、ｓｃＦｖ−ＩｇＧフォーマットである。このフォーマットの４つの異なる可能な配置を図１４の一番上の行に示す。図１４に示されるように、ｓｃＦｖ−ＩｇＧフォーマットでは、抗ＯＸ４０抗体はＩｇＧ分子全体であり、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、一般的な４つの位置（重鎖定常領域、軽鎖定常領域、重鎖可変領域、軽鎖可変領域）のうちのいずれか１つで抗ＯＸ４０抗体に接続されたｓｃＦｖ抗体である。。いずれの場合も、逆の配置も想定されている。すなわち、ＩｇＧ全体としての抗ＣＴＬＡ−４抗体およびｓｃＦｖとしての抗ＯＸ４０抗体は、４つの一般的な位置のうちのいずれかで抗ＣＴＬＡ−４抗体に接続されている。ｓｃＦｖ−ＩｇＧフォーマットでは、ＩｇＧ分子全体をｓｃＦｖに直接接合することも、リンカーを介して間接的に接合することもできる。例示的なリンカーとしては、配列番号４７〜５０、または１４４のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列のペプチドが挙げられる。
【０１９３】
図１４に示される最初のｓｃＦｖ−ＩｇＧ配置（図の左上）では、二重特異性抗体は、重鎖可変配列ＶＨ２（黒で塗りつぶされた）および軽鎖可変配列ＶＬ２（斜線付きの白）からなるｓｃＦｖ配列に連結された（任意選択的にリンカーを介して）重鎖定常配列（Ｈｃ、灰色に塗りつぶされた）に連結された重鎖可変配列ＶＨ１（格子柄の白黒）を含むポリペプチド鎖の２つのコピーを含む。この鎖は、ＶＨ１−Ｈｃ−ＶＨ２／ＶＬ２（規則的なＮ末端−Ｃ末端）と称され得る。二重特異性抗体は、ＶＬ１−Ｌｃ（規則的なＮ末端−Ｃ末端）と称され得る軽鎖定常配列（Ｌｃ、灰色に塗りつぶされた）に連結された軽鎖可変配列ＶＬ１（白に塗りつぶされた）を含む、より小さな鎖の２つのコピーも含む。図１４に示される代替的なｓｃＦｖ−ＩｇＧ配列は、２つの異なる鎖のそれぞれ２つのコピーも含み、これらは同様の様式で記載され得る。したがって、図２２の一番上の行を左から右に読むと、２番目の配列は、２つのＶＨ１−Ｈｃ鎖と、２つのＶＬ１−Ｌｃ−ＶＨ２／ＶＬ２鎖とを含む。第３の配置は、２つのＶＨ１／ＶＨ２−ＶＨ１−Ｈｃ鎖と、２つのＶＬ１−Ｌｃ鎖とを含む。第４の配置は、２つのＶＨ１−Ｈｃ鎖と、２つのＶＨ１／ＶＨ２−ＶＬ１−Ｌｃ鎖とを含む。
【０１９４】
一実施形態では、本発明の二重特異性ポリペプチドは、図１４（図の左上）に示される最初のｓｃＦｖ−ＩｇＧ配置を有する。
【０１９５】
本発明は、単独で、または好ましくは単一特異性もしくは二重特異性抗体の一部として、表Ａ〜Ｅに記載のアミノ酸配列のうちのいずれかを含むかまたはそれからなるポリペプチドを提供する。表Ａ〜Ｅに示される配列のうちの全てにおいて、重鎖または軽鎖定常領域に対応する配列は例示であり、任意の他の好適な重鎖または軽鎖定常領域配列で置き換えることができる。好ましい重鎖および軽鎖定常領域配列は、配列番号１３５、１３６、１３７、１３８、および１３９の配列である。
【０１９６】
本発明はまた、非抗体ポリペプチドが結合ドメインとして使用される同等の二重特異性ポリペプチドを包含することが理解されるであろう。本発明の実施形態では、本発明のポリペプチドの部分Ｂ１は、抗体またはその抗原結合断片であり、これは、典型的には、少なくとも１つの重鎖（Ｈ）および／または少なくとも１つの軽鎖（Ｌ）を含む。本発明のポリペプチドの部分Ｂ２は、Ｂ１の任意の部分に結合し得るが、典型的には、当該少なくとも１つの重鎖（Ｈ）または少なくとも１つの軽鎖（Ｌ）に、好ましくはＮ末端またはＣ末端のいずれかで結合し得る。本発明のポリペプチドの部分Ｂ２は、直接的にまたは任意の好適な連結分子（リンカー）を介して間接的にかのいずれかでそのように結合されてもよい。
【０１９７】
部分Ｂ１は、好ましくは少なくとも１つの重鎖（Ｈ）および少なくとも１つの軽鎖（Ｌ）を含み、部分Ｂ２は、好ましくは当該重鎖（Ｈ）または当該軽鎖（Ｌ）のいずれかのＮ末端またはＣ末端に結合している。Ｂ１の例示的な抗体は、２つの同一の重鎖（Ｈ）および２つの同一の軽鎖（Ｌ）からなる。そのような抗体は、典型的には２つのアームとして配置され、アームの各々はヘテロ二量体として接合している１つのＨおよび１つのＬを有し、２つのアームは、Ｈ鎖間のジスルフィド結合によって接合している。したがって、抗体は、事実上、２つのＨ−Ｌヘテロ二量体で形成されたホモ二量体である。本発明のポリペプチドの部分Ｂ２は、そのような抗体の両方のＨ鎖もしくは両方のＬ鎖、またはただ１つのＨ鎖もしくはただ１つのＬ鎖に結合され得る。
【０１９８】
したがって、本発明のポリペプチドは、あるいは、ヒト野生型ＣＤ８６またはその変異型の単量体可溶性細胞外ドメインを含むかまたはそれからなる、ＣＴＬＡ−４に特異的な少なくとも１つのポリペプチド結合ドメインが結合している抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合断片として説明され得る。Ｂ１およびＢ２の結合ドメインは、本発明のポリペプチド中の唯一の結合ドメインであり得る。
【０１９９】
本発明のポリペプチドは、Ｎ−Ｃの方向に書かれている以下の式：
（Ａ）Ｌ−（Ｘ）ｎ−Ｂ２、
（Ｂ）Ｂ２−（Ｘ）ｎ−Ｌ、
（Ｃ）Ｂ２−（Ｘ）ｎ−Ｈ、および
（Ｄ）Ｈ−（Ｘ）ｎ−Ｂ２、のうちのいずれか１つに従って配置されているポリペプチドを含み得、
式中、Ｈが抗体（すなわちＢ１）の重鎖であり、Ｌが抗体（すなわちＢ１）の軽鎖であり、Ｘがリンカーであり、ｎが０または１である。リンカー（Ｘ）がペプチドである場合、リンカーは、典型的には、アミノ酸配列ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４７）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＰ（配列番号４８）、ＮＦＳＱＰ（配列番号４９）、ＫＲＴＶＡ（配列番号５０）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１４４）、またはｍ＝１〜７である（ＳＧ）ｍを有する。式（Ａ）〜（Ｄ）の略図を、図１に示す。
【０２００】
本発明はまた、式（Ａ）〜（Ｄ）のうちのいずれかに従って配置されているポリペプチドからなるポリペプチドを提供する。当該ポリペプチドは、単量体として提供されてもよいか、または抗体などの多量体タンパク質の構成要素として存在してもよい。当該ポリペプチドは、単離されていてもよい。そのようなポリペプチドのアミノ酸配列の例を表Ｄに示す。各アミノ酸配列をコードする例示的な核酸配列もまた示す。
【０２０１】
部分Ｂ２は、任意の好適な手段によって、本発明のポリペプチドの任意の部分に、またはリンカーに結合され得る。例えば、ポリペプチドの様々な部分は、ペプチド結合などの化学的共役によって接合されてもよい。したがって、本発明のポリペプチドは、任意選択的にペプチドリンカーによって接合している、Ｂ１（またはその構成要素部分）およびＢ２を含む融合タンパク質を含み得るかまたはそれからなり得る。そのような融合タンパク質では、ＯＸ４０結合ドメインまたはＢ１のドメイン、およびＣＴＬＡ−４結合ドメインまたはＢ２のドメインが、唯一の結合ドメインであり得る。
【０２０２】
分子をポリペプチドに共役するための他の方法は、当該技術分野において既知である。例えば、カルボジイミド共役（Ｂａｕｍｉｎｇｅｒ＆Ｗｉｌｃｈｅｋ，１９８０，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．７０：１５１−１５９参照；その開示は参照により本明細書に組み込まれる）を使用して、ドキソルビシンを含む種々の薬剤を抗体またはペプチドに共役することができる。水溶性カルボジイミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）は、官能部分を結合部分に共役するのに特に有用である。さらなる例として、共役は、過ヨウ素酸ナトリウム酸化、続いて適切な反応物の還元アルキル化によって、またはグルタルアルデヒド架橋によって達成され得る。しかしながら、どの方法が選択されるかにかかわらず、本発明のポリペプチドの一部として存在するとき、部分Ｂ１およびＢ２がそれらの標的結合特性を保持するかまたは実質的に保持するという決定がなされるべきであることが好ましいと認識されている。
【０２０３】
本発明のポリペプチドを別の分子に（直接的にまたは間接的に）連結するために、同じ技術を使用してもよい。他の分子は、治療薬または検出可能な標識であり得る。好適な治療薬としては、細胞傷害性部分または薬物が挙げられる。
【０２０４】
本発明のポリペプチドは、単離された形態、または実質的に単離された形態で提供され得る。実質的に単離されたとは、何らかの周囲媒体からのポリペプチドの完全ではないが実質的な単離があり得ることを意味する。ポリペプチドは、それらの意図される用途を妨害しないであろう担体または希釈剤と混合され得、それでもなお実質的に単離されていると見なされる。
【０２０５】
本発明の例示的なポリペプチドは、表Ｄに示されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含むかまたはそれからなり得る。一実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１２５〜１３４の群内から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、任意選択的に、当該ポリペプチドは、抗体の構成要素部分として提供される。
【０２０６】
抗体の重鎖または軽鎖アミノ酸配列の例をコードする代表的なポリヌクレオチドは、表Ｂに記載のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つを含み得るかまたはそれからなり得る。表Ｄに示されるポリペプチドをコードする代表的なポリヌクレオチドは、表Ｄにも示されている対応するヌクレオチド配列を含み得るかまたはそれからなり得る（イントロン配列は小文字で示されている）。部分Ｂ２の例をコードする代表的なポリヌクレオチドは、表Ｅに示される配列番号２５〜４３のうちのいずれか１つを含み得るかまたはそれからなり得る。あるいは、好適なポリヌクレオチドは、上記に定義したように、これらの配列のうちのいずれかの変異型であり得る。
【０２０７】
本発明の実施形態では、二重特異性ポリペプチドは、腫瘍細胞に対する宿主免疫系の相乗的活性化を誘導する、すなわち、個々の単一特異性の対応するポリペプチド（ＣＴＬＡ−４結合ドメイン、または個々のＯＸ４０単一特異性抗体）の組み合わせ効果と比較して、腫瘍内ＣＤ８／Ｔｒｅｇ比の相乗的増加を誘導することができる。
【０２０８】
本発明の実施形態では、二重特異性ポリペプチドは、腫瘍細胞に対する宿主免疫系の免疫記憶を誘導することができる。
【０２０９】
「免疫記憶」とは、以前に遭遇した体内の腫瘍抗原などの抗原を迅速かつ特異的に認識し、対応する免疫応答を開始する免疫系の能力を意味する。
【０２１０】
本発明の関連する態様
本発明の第２の態様は、上述のように、個体における疾患または状態を治療または予防するための方法に使用するための、本発明の第１の態様に従った二重特異的ポリペプチドを含む。
【０２１１】
本発明の第３の態様は、上述のように、個体における疾患または状態を治療または予防する方法であって、本発明の第１または第２の態様に従った二重特異性ポリペプチドを個体に投与することを含む方法である。
【０２１２】
本発明の第４の態様は、医薬品の製造における本発明の第１の態様に従った二重特異性ポリペプチドの使用である。
【０２１３】
本発明の一実施形態は、疾患もしくは状態が癌であり、任意選択的に個体がヒトである本発明の第２の態様に従った二重特異性ポリペプチドもしくは本発明の第３の態様に従った方法であるか、または医薬品が治療用であり、任意選択的に個体がヒトである本発明の第４の態様に従った使用である。
【０２１４】
さらなる実施形態では、当該方法は、上述のように、二重特異性抗体を、全身または局所に、例えば腫瘍の部位にもしくは腫瘍流入領域リンパ節に投与することを含む。
【０２１５】
癌は、前立腺癌、乳癌、結腸直腸癌、膵臓癌、卵巣癌、肺癌、子宮頸癌、横紋筋肉腫、神経芽細胞腫、多発性骨髄腫、白血病、急性リンパ芽球性白血病、黒色腫、膀胱癌、胃癌、頭頚部癌、肝臓癌、皮膚癌、リンパ腫、または膠芽腫であり得る。
【０２１６】
本発明の第５の態様は、上述のように、本発明の第１または第２の態様に従った二重特異性ポリペプチドの、少なくとも１つのポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドである。
【０２１７】
本発明の第６の態様は、本発明の第１または第２の態様に従った二重特異性ポリペプチドと、少なくとも１つの薬学的に許容可能な希釈剤または担体とを含む組成物である。
【０２１８】
本発明の一実施形態では、実施形態の第１または第２の態様のいずれかに従ったポリペプチドは、追加の治療的部分に共役している。
【０２１９】
薬学的組成物は、薬学的に有効な用量で患者に投与される。本明細書で使用される場合、「治療有効量」または「有効量」または「治療上有効な」は、所与の条件および投与レジメンに対して治療効果を提供する量を指す。これは、必要とされる添加剤および希釈剤、すなわち担体または投与ビヒクルに関連して所望の治療効果をもたらすように計算された、活性材料の所定の量である。さらに、宿主の活性、機能、および応答の臨床的に有意な欠損を低減させ、最も好ましくは防止するために十分な量を意味することが意図される。あるいは、治療有効量は、宿主の臨床的に有意な状態を改善させるために十分である。当業者によって理解されるように、化合物の量は、その特異的活性に応じて変化し得る。好適な投与量は、必要とされる希釈剤に関連して、所望される治療効果をもたらすように計算された、所定量の活性組成物を含有し得る。本発明の化合物の製造のための方法および使用において、治療有効量の活性成分が提供される。治療有効量は、当該技術分野において周知であるように、年齢、体重、性別、病態、合併症、他の疾患などの患者の特徴に基づいて、通常の技能を有する医療または獣医学従事者によって決定され得る。薬学的に有効な用量の投与は、個々の用量単位または複数のより小さい用量単位の形態における単回投与によって、または特定の間隔での細分用量の複数回投与によって行われ得る。あるいは、この用量は、長期間にわたる連続注入として提供されてもよい。
【０２２０】
特に好ましい組成物は、全身投与用に配合される。
【０２２１】
組成物は、好ましくは一定期間にわたって持続放出するように調合されてもよい。したがって、本組成物は、持続放出を促進するマトリックスの一部として提供されてもよい。好ましい持続放出マトリックスは、モンタニドまたはγ−ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）のナノ粒子を含み得る。
【０２２２】
抗体ポリペプチドは、使用されるポリペプチドの有効性／毒性に応じて様々な濃度で配合され得る。例えば、製剤は、活性抗体ポリペプチドを、０．１μＭ〜１ｍＭ、より好ましくは１μＭ〜５００μＭ、５００μＭ〜１ｍＭ、３００μＭ〜７００μＭ、１μＭ〜１００μＭ、１００μＭ〜２００μＭ、２００μＭ〜３００μＭ、３００μＭ〜４００μＭ、４００μＭ〜５００μＭ、５００μＭ〜６００μＭ、６００μＭ〜７００μＭ、８００μＭ〜９００μＭ、または９００μＭ〜１ｍＭの濃度で含み得る。典型的には、製剤は、３００μＭ〜７００μＭの濃度で活性抗体ポリペプチドを含む。
【０２２３】
典型的には、ヒト患者における抗体ポリペプチドの治療用量（治療部分の有無にかかわらず）は、投与あたり１００μｇ〜７００ｍｇの範囲である（７０ｋｇの体重に基づく）。例えば、最大治療用量は、投与あたり０．１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲、例えば０．１〜５ｍｇ／ｋｇまたは１〜５ｍｇ／ｋｇまたは０．１〜２ｍｇ／ｋｇであり得る。そのような用量は、腫瘍専門家／医師によって決定される異なる間隔で投与され得ること、例えば、用量は、毎日、週２回、隔週、または毎月投与され得ることが理解されるであろう。
【０２２４】
本発明の薬学的組成物は、単独で、または癌の治療において使用される他の治療剤、例えば抗代謝剤、アルキル化剤、アントラサイクリンおよび他の細胞傷害性抗生物質、ビンカアルカロイド、エトポシド、白金化合物、タキサン、トポイソメラーゼＩ阻害剤、他の細胞分裂阻害薬、抗増殖免疫抑制剤、コルチコステロイド、性ホルモンおよびホルモンアンタゴニスト、ならびに他の治療抗体（腫瘍関連抗原に対する抗体または免疫チェックポイント調節剤など）と組み合わせて投与され得ることが、当業者には理解されよう。
【０２２５】
例えば、本発明の薬学的組成物は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ１３７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＤ２７、およびＫＩＲからなる群から選択される標的に結合する免疫療法剤と組み合わせて投与され得る。
【０２２６】
したがって、本発明の二重特異性ポリペプチドを含む併用療法を、免疫チェックポイント分子に特異的に結合する、癌の治療に有効なさらなる免疫療法剤と一緒に包含する。さらなる免疫療法剤の治療効果は、阻害性免疫チェックポイント分子の機能を減衰させること、および／または刺激性免疫チェックポイントまたは共刺激分子の機能を活性化することによって媒介され得ることが理解されよう。
【０２２７】
一実施形態では、さらなる免疫療法剤は、
（ａ）ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１の機能を阻害する免疫療法剤、
（ｂ）ＣＤ１３７の機能を活性化する免疫療法剤、ならびに
（ｃ）ＣＤ４０の機能を活性化する免疫療法剤からなる群から選択される。
【０２２８】
したがって、さらなる免疫療法剤は、ＰＤ１阻害剤、例えば抗ＰＤ１抗体、またはＰＤ１機能を阻害することができるその抗原結合断片であり得る（例えば、Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ、Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ、Ｌａｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ、ＰＤＲ−００１、ＭＥＤＩ−０６８０、およびＡＭＰ−２２４）。あるいは、ＰＤ１阻害剤は、ＰＤ１機能を阻害することができる抗ＰＤ−Ｌ１抗体、またはその抗原結合断片を含み得るか、またはそれからなり得る（例えば、Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ、Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ、Ａｖｅｌｕｍａｂ、およびＭＤＸ−１１０５）を含み得るか、またはそれからなり得る。
【０２２９】
さらなる実施形態では、さらなる免疫療法薬は、アゴニスト抗ＣＤ１３７抗体またはその抗原結合部分などのＣＤ１３７を活性化する。
【０２３０】
さらなる実施形態では、さらなる免疫療法薬は、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分などのＣＤ４０を活性化する。
【０２３１】
２つの活性剤（上で詳述されるような）の存在が、対象における腫瘍の治療において相乗的利点をもたらし得ることが、当業者には理解されよう。「相乗的」とは、２つの薬剤の組み合わせの治療効果が（例えば、腫瘍の増殖速度またはサイズを参照して決定される）、それら自身に投与される２つの薬剤の付加的な治療効果よりも大きいことを含む。かかる相乗作用は、固形腫瘍の関連細胞株モデルにおいて、活性剤を単独で、また組み合わせて試験することによって特定され得る。
【０２３２】
本発明のポリペプチドまたは他の組成物および使用説明書を含むキットもまた、本発明の範囲内である。本キットは、上述の追加の治療剤または予防剤などの１つ以上の追加の試薬をさらに含んでもよい。
【０２３３】
本発明の特定の態様を具体化する好ましい非限定的な実施例を、以下の図面を参照して説明する。
【図面の簡単な説明】
【０２３４】
【図１】本発明の二重特異性ポリペプチドの例示的な配置の構造の略図を示す。抗ＯＸ４０抗体可変ドメインは黒で、定常ドメインは白で塗りつぶされている。ＣＴＬＡ−Ａ結合ドメインは斜線で網掛けされている。
【図２】ＥＬＩＳＡ結合アッセイにより決定される、本発明のポリペプチドのＣＴＬＡ−４結合ドメインのＣＴＬＡ−４結合特性を示す。
【図３】ＥＬＩＳＡ阻害アッセイにより決定される本発明のポリペプチドのＣＴＬＡ−４結合ドメインのＣＴＬＡ−４結合特性を示す。
【図４】本明細書に開示のヒト野生型ＣＤ８６アミノ酸配列の略図を提供する。（Ａ）は、Ｎ末端シグナル配列を含まないヒトＣＤ８６の単量体可溶性細胞外ドメインのアミノ酸配列（配列番号３）であり、（Ｂ）は、Ｎ末端シグナル配列を含むヒト野生型ＣＤ８６の単量体細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインのアミノ酸配列（配列番号４）であり、（Ｃ）は、ヒトＣＤ８６の全長アミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＢＫ４１９３１．１；配列番号４４）である。Ａの配列は、任意選択的に、Ｎ末端、すなわち、太字で示されている２４位および２５位にアラニンおよびプロリンを欠いていてもよい。ＢおよびＣのシグナル配列には下線が引かれている。アミノ酸の位置の番号付けは、Ｎ末端から始まる配列番号４および４４に基づく。
【図５】阻害ＥＬＩＳＡの結果を示し、これは、本発明のポリペプチドのＣＴＬＡ−４結合ドメインがヒトおよびマウスＣＴＬＡ−４の両方に対して同様の大きさの結合親和性を有することを実証している。
【図６】表面プラズモン共鳴により決定される、例示的な抗ＯＸ４０抗体に対する解離速度定数対会合速度定数のプロットである。
【図７−１】フローサイトメトリーによって測定された、ＣＨＯ細胞上で過剰発現したヒトＯＸ４０への例示的な抗ＯＸ４０抗体の結合を示す。
【図７−２】図７−１の続きを示す。
【図８】異なる例示的な抗ＯＸ４０抗体とインビトロでインキュベートしたときのＴ細胞によるＩＬ−２産生レベルを示す。ｙ軸は、試験した抗体によるＩＬ−２産生の最高値／参照抗体の最高値の比である。少なくとも４人のドナーからの平均値とＳＥＭ値を示す。
【図９】例示的な二重特異性分子の個々の標的ＯＸ４０およびＣＴＬＡ４への結合についてのＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。
【図１０−１】例示的な二重特異性分子のＯＸ４０およびＣＴＬＡ４の両方への結合の表面プラズモン共鳴分析の結果を示す。異なる二重特異性抗体をセンサーに通した（開始はＩによって示される）。表面がほぼ飽和状態になったら、緩衝液を適用し（ＩＩ）、続いてＣＴＬＡ−４（ＩＩＩ）をセンサー表面に通し、実線で表される第２の会合相を生成した。３分後、緩衝液（ＩＶ）を適用し、次の解離相はＣＴＬＡ−４およびＯＸ４０  Ａｂの両方の解離を反映している。対照として、ＣＴＬＡ−４を含まない緩衝液のみが追加され、点線で表される。
【図１０−２】図１０−１の続きを示す。
【図１１】例示的な二重特異性分子がＯＸ４０およびＣＴＬＡ−４の両方に同時に結合することを示すＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。
【図１２】滴定系列の異なる例示的な二重特異性分子とインビトロでインキュベートしたときのＴ細胞によるＩＬ−２産生レベルを示す：Ａ）１１６４／１１４１および１１６６／１１４１、Ｂ）１１６８／１１４１および１１７０／１２６３、Ｃ）１５１４／１５８１および１５２０／１１４１、Ｄ）１５２６／１５８５および１５４２／１１４１、または各標的に対する２つの対応する単一特異性抗体の組み合わせ（モノクローナルＯＸ４０抗体またはアイソタイプＩｇＧ抗体に連結したＣＴＬＡ−４結合ドメイン：１７５６／１７５７）。ＣＤ３（ＵＣＨＴ１）およびＣＴＬＡ−４（Ｏｒｅｎｃｉａ）でコーティングされたＵ字型の非組織培養処理済み９６ウェルプレート中で、アッセイを行った。４人のドナーの平均を提示する。
【図１３】１．４９ｎＭの異なる例示的な二重特異性分子または各標的に対する対応する単一特異性抗体の組み合わせ（ａ−ＯＸ４０ｍＡｂｓまたはアイソタイプ抗体に連結されたＣＴＬＡ−４ドメイン：１７５６／１７５７）とインビトロでインキュベートした場合のＴ細胞によるＩＬ−２産生レベルを示す。ＣＴＬＡ−４（Ｏｒｅｎｃｉａ）の有無にかかわらず、抗ＣＤ３（ＵＣＨＴ１）でコーティングされたＵ字型の非組織培養処理済み９６ウェルプレート中で、アッセイを行い、＋または−で示す。４人のドナーのうち平均およびＳＤを提示する。
【図１４】本発明の二重特異性抗体の例示的なフォーマットの構造の略図を示す。各フォーマットにおいて、定常領域は、薄灰色で塗りつぶされて示されており、可変重鎖領域ＶＨ１は、白黒の格子柄として示されており、可変軽鎖領域ＶＬ１は、白で塗りつぶされて示されており、可変重鎖領域ＶＨ２は、黒で塗りつぶされて示されており、可変軽鎖領域ＶＬ２は、白地に斜線で示されている。ＯＸ４０結合ドメイン（結合ドメイン１）は、典型的には、白黒の格子柄のドメインと白で塗りつぶされたドメインとの対（ＶＨ１／ＶＬ１）として表され、ＣＤ１３７結合ドメイン（結合ドメイン２）は、典型的には、黒で塗りつぶされたドメインと白地に斜線のドメインとの対（ＶＨ２／ＶＬ２）として表される。しかしながら、示されているフォーマットの全てにおいて、結合ドメイン１および２が交換され得ることは理解されよう。すなわち、ＯＸ４０結合ドメインは、ＣＤ１３７ドメインについてこの図に示される位置において発生する場合があり、その逆も同様である。さらに、結合ドメイン２は、異なる可変重鎖および軽鎖の順序、すなわち、ＶＨ２／ＶＬ２またはＶＬ２／ＶＨ２の順序で発生する可能性がある。
【図１５】ＣＴＬＡ−４およびＯＸ４０を標的とする例示的な二重特異性抗体により誘導されたＡＤＣＣと比較した、単一特異性ＣＴＬＡ−４（ＣＴＬＡ−４結合部分、すなわちドメインを有する対照ＩｇＧ）およびＯＸ４０（１１６６／１１６７）結合分子による異なる濃度でのＡＤＣＣの誘導を、単独で、かつ組み合わせで示す。
【図１６】ＣＴＬＡ−４およびＯＸ４０の両方を発現するＣＨＯ細胞を、低減濃度の１１６６／１２６１または２つの単一特異的結合剤１１６６／１１６７（ＯＸ４０特異的モノクローナル抗体）、およびＣＴＬＡ−４結合部分を有する対照ＩｇＧ（単一特異的ＣＴＬＡ４結合ＩｇＧ融合タンパク質）（２００ｎＭ−０，００３４ｎＭ）で染色し、続いてＰＥ共役抗ヒトＩｇＧで染色した。フローサイトメトリーを使用して蛍光を検出した。「対照ＩｇＧ」は負のアイソタイプ対照である。
【図１７】ＨＥＫ−ＣＴＬＡ４およびＣＨＯ−ＯＸ４０を、それぞれＰＫＨ２６およびＰＫＨ６７で染色し、１１６６／１２６１または２つの単一特異性ＯＸ４０とＣＴＬＡ−４結合分子との組み合わせ（１１６６／１１６７およびＣＴＬＡ−４結合部分を有する対照ＩｇＧ）でインキュベートした。二重陽性／凝集細胞の割合を、フローサイトメトリー（代表的な実験）を使用して定量化した。
【図１８】二重特異性ＯＸ４０−ＣＴＬＡ−４抗体１１６６／１２６１および単一特異性ＯＸ４０抗体１１６６／１１６７の血漿レベルを、投与後のさまざまな時点で測定した。ＯＸ４０をウェルにコーティングし、抗Ｆｃを使用して結合を検出するＥＬＩＳＡ−１と、ＯＸ４０をウェルにコーティングし、ビオチン化ＣＴＬＡ−４を検出のために使用するＥＬＩＳＡ−２との２つの異なるＥＬＩＳＡ方法を使用した。
【図１９】ＨＴ−２９結腸癌細胞（４×１０６）を、０日目に右後腹部／背部に皮下接種した。ヒトＰＢＭＣ細胞（７×１０６）を同じ日に腹腔内投与した。６、１３、および２０日目に腹腔内注射（６６７ｎｍｏｌ／用量）によって治療を行った。Ｎ（マウス）＝５／ドナー、ｎ（ドナー＝４）、ＨＴ２９レスポンダーからのプールされたデータ。
【図２０】ＭＣ３８結腸癌モデルを使用して、ｈＯＸ４０ｔｇマウスで調べた二重特異性ＯＸ４０−ＣＴＬＡ−４抗体の薬力学的効果を示す。２つの独立した実験からプールされたデータは、両方の単一特異性の対応する抗体と比較して、二重特異性抗体による腫瘍内ＣＤ８／Ｔｒｅｇ比に対する統計的に有意な効果を実証した。
【図２１】ＭＣ３８結腸癌モデルを使用したｈＯＸ４０ｔｇマウスの脾臓および腫瘍組織における異なるＴ細胞集団の相対的なレベルを示す。二重特異性抗体の投与の効果を、単一特異性の対応する抗体と比較する。二重特異性抗体は腫瘍内Ｔｒｅｇを減少させるが、全身性Ｔ細胞には影響を与えない。
【図２２】ヒトＯＸ４０用のトランスジェニックマウスにおいてＭＣ３８結腸癌モデルを使用して調べた、二重特異性ＯＸ４０−ＣＴＬＡ−４抗体の抗腫瘍効果を示す。二重特異性抗体は、腫瘍体積の抑制および生存率の増加に対する統計的に有意な効果を実証した。抗腫瘍効果は、単一特異性対照抗体よりも生存率および腫瘍成長の抑制の観点で強力であった。
【図２３】二重特異性ＯＸ４０−ＣＴＬＡ抗体１１６６／１２６１によって誘導される抗腫瘍効果を示す。ｈＯＸ４０トランスジェニックマウスを使用したＭＢ４９膀胱癌モデルで抗腫瘍効果を調べた。皮下ＭＢ４９腫瘍を有するマウスに対する腹腔内治療を、７日目、１０日目、および１３日目に腹腔内で行った。Ａ）１１６６／１２６１または対応する対応するモノクローナル抗体による腫瘍体積の抑制。Ｂ）１１６６／１２６１によって誘導される生存率の増加。腫瘍体積グラフは、いくつかの実施された腫瘍体積平均＋／−ＳＥＭ、ｎ＝１０の例示である。カプラン・マイヤー生存率、２つの個別の実験からのプールされたデータ、ｎ＝１８。
【図２４】特定の腫瘍と同じ腫瘍または無関係な腫瘍で再挑戦の完全なレスポンダーによって実証された免疫記憶を示す。Ａ）同じ腫瘍を有するマウスの再挑戦。未投薬マウスを対照として使用した。（ｎ＝５）。Ｂ）片方の脇腹に１つの特定の腫瘍ＭＢ４９があり、もう片方の脇腹に１つの無関係な腫瘍ＰＡＮＣ０２がある双子型腫瘍モデルのマウスの再挑戦。例示的な実験、グラフは平均＋／−ＳＥＭ、ｎ＝６。
【図２５】Ｔｒｅｇに対する二重特異性抗体の抗腫瘍効果を示す。皮下ＭＢ４９膀胱癌を有するマウスを、１０、１３、および１６日目に１１６６／１２６１の腹腔内注射または対応するモノクローナル抗体（１．３３μｍｏｌ）で治療した。最後の注射の２４時間後に、腫瘍および脾臓を採取し、Ｔｒｅｇおよびエフェクター細胞について染色した。Ａ）腫瘍中の（ＣＤ４５の）Ｔｒｅｇパーセント、Ｂ）腫瘍中の（ＣＤ４５の）ＣＤ８細胞、Ｃ）腫瘍中のＣＤ８／Ｔｒｅｇ比、およびＤ）脾臓中のＣＤ８／Ｔｒｅｇ比。グラフは平均＋ＳＤを示す。
【図２６】ＭＣ３８結腸癌に対する二重特異性抗体の抗腫瘍効果を示す。皮下ＭＣ３８結腸癌を有するマウスを、１０、１３、および１６日目に１１６６／１２６１の腹腔内注射で治療した。最後の注射の２４時間後に、腫瘍を採取し、エフェクター細胞および活性化マーカーについて染色した。Ａ）腫瘍中のＣＤ１０７＋ＣＤ８細胞のパーセント、（Ｂ）腫瘍中のグランザイムＢ＋ＣＤ８細胞のパーセント。グラフは平均＋ＳＤを示す。
【図２７】ＭＣ３８結腸癌を有するｈＯＸ４０ｔｇマウスの腫瘍局在を示す。皮下ＭＣ３８結腸癌を有するマウスを、１７日目にビヒクル、ＩｇＧ１アイソタイプ対照、または１１６６／１２６１で腹腔内治療した。注射の２４時間後に、腫瘍および脾臓を採取し、生存マーカーならびにＣＤ４５およびｈＩｇＧに対する抗体で染色し、その後フローサイトメトリー分析を行った。（Ａ）腫瘍および（Ｂ）脾臓中の生ＣＤ４５＋細胞のうちのｈＩｇＧ＋細胞の割合を、異なる群間で比較した。グラフは平均＋ＳＥＭを示す。
【図２８】ＰＤ−１抗体と１１６６／１２６１との組み合わせ効果を示す。ＰＤ−１治療の有無にかかわらず、１１６６／１２６１の抗腫瘍効果をＭＣ３８結腸癌モデルで調べた。腹腔内治療（１１６６／１２６１、１．３３μｍｏｌまたは２５０μｇのＰＤ−１）を、７日目、１０日目、および１３日目に腹腔内で行った。Ａ）ＰＤ−１の組み合わせの有無にかかわらず、１１６６／１２６１による腫瘍体積の抑制。Ｂ）ＰＤ−１治療の有無にかかわらず、１１６６／１２６１によって誘導される生存率の増加。腫瘍体積グラフは例示的なグラフであり、平均腫瘍体積＋／−ＳＥＭ、またはカプラン・マイヤー生存率、ｎ＝９−１０を提示する。
【図２９】ＰＤ−１抗体と１１６６／１２６１との組み合わせ効果を示す。ＰＤ−１治療の有無にかかわらず、１１６６／１２６１の抗腫瘍効果をＣＴ２６結腸癌モデルで調べた。７日目、１０日目、および１３日目に腹腔内治療を行った。Ａ）ＰＤ−１の有無にかかわらず、１１６６／１２６１による腫瘍体積の抑制。Ｂ）ＰＤ−１治療の有無にかかわらず、１１６６／１２６１年までのカプラン・マイヤー生存率。グラフは、一緒にプールされた２つの独立した実験、腫瘍体積平均＋／−ＳＥＭ、ｎ＝１８を示す。
【図３０】膵臓癌における１１６６／１２６１の抗腫瘍効果を示す。ＰＡＮＣ０２膵臓癌を使用してヒトＯＸ４０用のトランスジェニックマウスにおいて、二重特異性ＯＸ４０−ＣＴＬＡ−４抗体１１６６／１２６１の抗腫瘍効果を調べた。７日目、１０日目、および１３日目に腹腔内治療を行った。Ａ）腫瘍体積の抑制。Ｂ）生存率の増加。グラフは、平均腫瘍体積＋／−ＳＥＭ、またはカプラン・マイヤー生存ｎ＝１８を示す。
【図３１】ＣＴＬＡ−４  Ｂｌｏｃｋａｄｅレポーターアッセイでジャーカットレポーター細胞上のＣＴＬＡ−４を遮断することにより、Ｔ細胞活性化を誘導する１１６６／１２６１およびアイソタイプ対照の能力を示す。２つの実験からのコンパイル済みデータ。
【図３２−１】Ｔ細胞の活性化を示す。Ａ）１１６６／１２６１、単一特異性抗体の組み合わせ、またはアイソタイプ対照によるヒトＣＤ３＋Ｔ細胞の刺激後のＩＦＮ−γ産生。ＣＴＬＡ−４およびαＣＤ３でコーティングされたプレートで実験を行った。４人のドナーからのコンパイル済みデータ。Ｂ）ＣＴＬＡ−４発現ＨＥＫ細胞およびαＣＤ３ビーズの存在下で、１１６６／１２６１または単一特異性抗体の組み合わせで刺激されたＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ−２放出。６人のドナーからのコンパイル済みデータ。
【図３２−２】Ｃ）１１６６／１２６１またはアイソタイプ対照に応じたＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖。６人のドナーからのコンパイル済みデータ。
【図３３】Ｔ細胞の活性化を示す。ＣＤ６４発現ＣＨＯ細胞およびαＣＤ３ビーズの存在下で、１１６６／１２６１または単一特異性抗体の組み合わせで刺激されたＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ−２放出。８人のドナーからのコンパイル済みデータ。
【図３４】１１６６／１２６１によるＡＤＣＣ誘導を示す。Ａ）１１６６／１２６１、対応するモノクローナル抗体またはアイソタイプ対照の混合物に応じたＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１５８）エフェクター細胞の活性化。αＣＤ３／αＣＤ２８ビーズで４８時間活性化された精製Ｔｒｅｇを標的細胞として使用した。データは、培地対照に対する誘導倍率として提示する。Ｂ）ＯＸ４０およびＣＴＬＡ−４の発現を、活性化の前後にＴｒｅｇのフローサイトメトリーにより決定した。３人のドナーの平均を示す。
【図３５】１１６６／１２６１に応じたＡＤＣＣを示す。αＣＤ３／αＣＤ２８ビーズで４８時間活性化された精製Ｔｒｅｇを標的細胞として使用し、同種ＮＫ細胞をエフェクター細胞として使用した。１１６６／１２６１またはアイソタイプ対照の存在下で、エフェクター細胞および標的細胞を１５：１の比率で培養した。４時間後、ＬＤＨ放出を測定した。７人のドナーからのコンパイル済みデータ。
【図３６】１１６６／１２６１処理によるカニクイザルＴ細胞活性化の活性化を示す。Ａ）中央記憶ＣＤ４＋細胞の増殖、Ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞の後期活性化。
【発明を実施するための形態】
【０２３５】
配列の説明
配列番号１は、ヒトＣＴＬＡ−４のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＤ００６９８．１に対応）である。
【０２３６】
配列番号２は、ヒトＣＤ２８のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ５１９４４．１に対応）である。
【０２３７】
配列番号３は、Ｎ末端から２３個のアミノ酸シグナル配列を除いた、ヒト野生型ＣＤ８６の単量体細胞外ドメインのアミノ酸配列である。
【０２３８】
配列番号４は、Ｎ末端シグナル配列を含む、ヒト野生型ＣＤ８６の単量体細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインのアミノ酸配列である（図４参照）。本明細書におけるアミノ酸の位置の全ての番号付けは、Ｎ末端から始まる配列番号４の位置に基づく。したがって、配列番号３のＮ末端のアラニンは２４と番号付けされている。
【０２３９】
配列番号５は、Ｐｅａｃｈら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９５，ｖｏｌ２７０（３６），２１１８１−２１１８７）に開示の、ヒトＣＤ８６の細胞外ドメインの突然変異体形態のアミノ酸配列である。野生型配列の７９位のＨは、配列番号５の配列の対応する位置でＡに置換されている。この変化を、本明細書ではＨ７９Ａと称する。本明細書で言及される他のアミノ酸置換については、全体を通して同等の命名法が使用されている。位置の番号付けは、上に概説したように配列番号４に基づく。
【０２４０】
配列番号６〜２４は、本発明の特定のタンパク質のアミノ酸配列である。
【０２４１】
配列番号２５〜４３はそれぞれ、配列番号６〜２４の各々のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号４４は、ヒトＣＤ８６の全長アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢＫ４１９３１．１に対応）である。
【０２４２】
配列番号４５は、マウスＣＴＬＡ−４のアミノ酸配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ０９７９３．１に対応）である。
【０２４３】
配列番号４６は、マウスＣＤ２８のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ３７３９５．１に対応）である。
【０２４４】
配列番号４７〜５０は、本発明の二重特異性ポリペプチドに使用され得る様々なリンカーである。
【０２４５】
配列番号５１は、ヒトＯＸ４０のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＰ＿００３３１８．１に対応）である。
【０２４６】
配列番号５２〜８８は、本明細書に開示の抗ＯＸ４０抗体の例示的なＣＤＲ配列である。
【０２４７】
配列番号８９から１２４は、本明細書に開示の抗体の重鎖および軽鎖可変領域の例示的なアミノ酸およびヌクレオチド配列である。
【０２４８】
配列番号１２５〜１３４は、本明細書に開示の二重特異性ポリペプチドの例示的なアミノ酸およびヌクレオチド配列である。
【０２４９】
配列番号１３５は、例示的な重鎖定常領域アミノ酸配列である。
【０２５０】
配列番号１３６は、例示的な軽鎖定常領域アミノ酸配列である。
【０２５１】
配列番号１３７は、ヒンジ領域（位置１０８）においてＳｅｒからＰｒｏへの、およびＣＨ３領域（位置３１５）においてＨｉｓからＡｒｇへの突然変異を有する、例示的な修飾ヒト重鎖ＩｇＧ４定常領域配列である。突然変異は、血清半減期の低下、およびＩｇＧ４をより安定にしＦａｂアーム交換を妨げて、ＩｇＧ４のコアヒンジの安定化をもたらす。
【０２５２】
配列番号１３８は、例示的な野生型ヒト重鎖ＩｇＧ４定常領域配列である。それは、配列番号１３７の突然変異を欠く配列である。
【０２５３】
配列番号１３９は、ヒンジ領域（位置１０８）においてＳｅｒからＰｒｏへの単一突然変異を有する、例示的な修飾ヒト重鎖ＩｇＧ４定常領域配列である。突然変異は、ＩｇＧ４をより安定にしＦａｂアーム交換を妨げて、ＩｇＧ４のコアヒンジの安定化をもたらす。
【０２５４】
配列番号１４０は、配列番号１３７のＩｇＧ４定常領域をコードする例示的なｃＤＮＡ配列である（すなわちイントロンを欠く）。
【０２５５】
配列番号１４１は、配列番号１３７のＩｇＧ４定常領域をコードする例示的なゲノムＤＮＡ配列である（すなわちイントロンを含む）。
【０２５６】
配列番号１４２は、配列番号１３８のＩｇＧ４定常領域をコードする例示的なｃＤＮＡ配列である（すなわちイントロンを欠く）。
【０２５７】
配列番号１４３は、配列番号１３８のＩｇＧ４定常領域をコードする例示的なゲノムＤＮＡ配列である（すなわちイントロンを含む）。
【０２５８】
配列番号１４４は、本発明の二重特異性ポリペプチドに使用され得るリンカーである。
【０２５９】
配列番号１４５および１４６はそれぞれ、配列番号１３５のＩｇＧ１定常領域をコードする例示的なｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ配列である。
【０２６０】
配列番号１４７は、配列番号１３６の軽鎖カッパ領域をコードする例示的なＤＮＡ配列である。
【０２６１】
配列番号１４８は、配列番号１３９のＩｇＧ４領域をコードする例示的なｃＤＮＡ配列である（すなわちイントロンを欠く）。
【０２６２】
配列番号１４９は、配列番号１３９のＩｇＧ４領域をコードする例示的なゲノムＤＮＡ配列である（すなわちイントロンを含む）。
【０２６３】
【表２】
2020518622.tif 000003
【０２６４】
【表３】
2020518622.tif 000004
【表４】
2020518622.tif 000005
【表５】
2020518622.tif 000006
【表６】
2020518622.tif 000007
【表７】
2020518622.tif 000008
【表８】
2020518622.tif 000009
【表９】
2020518622.tif 000010
【表１０】
2020518622.tif 000011
【表１１】
2020518622.tif 000012
【０２６５】
【表１２】
2020518622.tif 000013
【表１３】
2020518622.tif 000014
【０２６６】
【表１４】
2020518622.tif 000015
【表１５】
2020518622.tif 000016
【表１６】
2020518622.tif 000017
【表１７】
2020518622.tif 000018
【表１８】
2020518622.tif 000019
【表１９】
2020518622.tif 000020
【表２０】
2020518622.tif 000021
【表２１】
2020518622.tif 000022
【表２２】
2020518622.tif 000023
【０２６７】
【表２３】
2020518622.tif 000024
【表２４】
2020518622.tif 000025
【表２５】
2020518622.tif 000026
【表２６】
2020518622.tif 000027
【表２７】
2020518622.tif 000028
【０２６８】
他の配列
配列番号１（ヒトＣＴＬＡ−４）
ＭＨＶＡＱＰＡＶＶＬＡＳＳＲＧＩＡＳＦＶＣＥＹＡＳＰＧＫＡＴＥＶＲＶＴＶＬＲＱＡＤＳＱＶＴＥＶＣＡＡＴＹＭＭＧＮＥＬＴＦＬＤＤＳＩＣＴＧＴＳＳＧＮＱＶＮＬＴＩＱＧＬＲＡＭＤＴＧＬＹＩＣＫＶＥＬＭＹＰＰＰＹＹＬＧＩＧＮＧＴＱＩＹＶＩＡＫＥＫＫＰＳＹＮＲＧＬＣＥＮＡＰＮＲＡＲＭ
配列番号２（ヒトＣＤ２８）
ＭＬＲＬＬＬＡＬＮＬＦＰＳＩＱＶＴＧＮＫＩＬＶＫＱＳＰＭＬＶＡＹＤＮＡＶＮＬＳＣＫＹＳＹＮＬＦＳＲＥＦＲＡＳＬＨＫＧＬＤＳＡＶＥＶＣＶＶＹＧＮＹＳＱＱＬＱＶＹＳＫＴＧＦＮＣＤＧＫＬＧＮＥＳＶＴＦＹＬＱＮＬＹＶＮＱＴＤＩＹＦＣＫＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳ
配列番号３
ＡＰＬＫＩＱＡＹＦＮＥＴＡＤＬＰＣＱＦＡＮＳＱＮＱＳＬＳＥＬＶＶＦＷＱＤＱＥＮＬＶＬＮＥＶＹＬＧＫＥＫＦＤＳＶＨＳＫＹＭＧＲＴＳＦＤＳＤＳＷＴＬＲＬＨＮＬＱＩＫＤＫＧＬＹＱＣＩＩＨＨＫＫＰＴＧＭＩＲＩＨＱＭＮＳＥＬＳＶＬＡ
配列番号４
ＭＤＰＱＣＴＭＧＬＳＮＩＬＦＶＭＡＦＬＬＳＧＡＡＰＬＫＩＱＡＹＦＮＥＴＡＤＬＰＣＱＦＡＮＳＱＮＱＳＬＳＥＬＶＶＦＷＱＤＱＥＮＬＶＬＮＥＶＹＬＧＫＥＫＦＤＳＶＨＳＫＹＭＧＲＴＳＦＤＳＤＳＷＴＬＲＬＨＮＬＱＩＫＤＫＧＬＹＱＣＩＩＨＨＫＫＰＴＧＭＩＲＩＨＱＭＮＳＥＬＳＶＬＡＮＦＳＱＰＥＩＶＰＩＳＮＩＴＥＮＶＹＩＮＬＴＣＳＳＩＨＧＹＰＥＰＫＫＭＳＶＬＬＲＴＫＮＳＴＩＥＹＤＧＩＭＱＫＳＱＤＮＶＴＥＬＹＤＶＳＩＳＬＳＶＳＦＰＤＶＴＳＮＭＴＩＦＣＩＬＥＴＤＫＴＲＬＬＳＳＰＦＳＩＥＬＥＤＰＱＰＰＰＤＨＩＰ
配列番号５
ＡＰＬＫＩＱＡＹＦＮＥＴＡＤＬＰＣＱＦＡＮＳＱＮＱＳＬＳＥＬＶＶＦＷＱＤＱＥＮＬＶＬＮＥＶＹＬＧＫＥＫＦＤＳＶＡＳＫＹＭＧＲＴＳＦＤＳＤＳＷＴＬＲＬＨＮＬＱＩＫＤＫＧＬＹＱＣＩＩＨＨＫＫＰＴＧＭＩＲＩＨＱＭＮＳＥＬＳＶＬＡ
配列番号４４（ヒトＣＤ８６）
ＭＤＰＱＣＴＭＧＬＳＮＩＬＦＶＭＡＦＬＬＳＧＡＡＰＬＫＩＱＡＹＦＮＥＴＡＤＬＰＣＱＦＡＮＳＱＮＱＳＬＳＥＬＶＶＦＷＱＤＱＥＮＬＶＬＮＥＶＹＬＧＫＥＫＦＤＳＶＨＳＫＹＭＧＲＴＳＦＤＳＤＳＷＴＬＲＬＨＮＬＱＩＫＤＫＧＬＹＱＣＩＩＨＨＫＫＰＴＧＭＩＲＩＨＱＭＮＳＥＬＳＶＬＡＮＦＳＱＰＥＩＶＰＩＳＮＩＴＥＮＶＹＩＮＬＴＣＳＳＩＨＧＹＰＥＰＫＫＭＳＶＬＬＲＴＫＮＳＴＩＥＹＤＧＩＭＱＫＳＱＤＮＶＴＥＬＹＤＶＳＩＳＬＳＶＳＦＰＤＶＴＳＮＭＴＩＦＣＩＬＥＴＤＫＴＲＬＬＳＳＰＦＳＩＥＬＥＤＰＱＰＰＰＤＨＩＰＷＩＴＡＶＬＰＴＶＩＩＣＶＭＶＦＣＬＩＬＷＫＷＫＫＫＫＲＰＲＮＳＹＫＣＧＴＮＴＭＥＲＥＥＳＥＱＴＫＫＲＥＫＩＨＩＰＥＲＳＤＥＡＱＲＶＦＫＳＳＫＴＳＳＣＤＫＳＤＴＣＦ
配列番号４５（マウスＣＴＬＡ−４）
ＭＡＣＬＧＬＲＲＹＫＡＱＬＱＬＰＳＲＴＷＰＦＶＡＬＬＴＬＬＦＩＰＶＦＳＥＡＩＱＶＴＱＰＳＶＶＬＡＳＳＨＧＶＡＳＦＰＣＥＹＳＰＳＨＮＴＤＥＶＲＶＴＶＬＲＱＴＮＤＱＭＴＥＶＣＡＴＴＦＴＥＫＮＴＶＧＦＬＤＹＰＦＣＳＧＴＦＮＥＳＲＶＮＬＴＩＱＧＬＲＡＶＤＴＧＬＹＬＣＫＶＥＬＭＹＰＰＰＹＦＶＧＭＧＮＧＴＱＩＹＶＩＤＰＥＰＣＰＤＳＤＦＬＬＷＩＬＶＡＶＳＬＧＬＦＦＹＳＦＬＶＳＡＶＳＬＳＫＭＬＫＫＲＳＰＬＴＴＧＶＹＶＫＭＰＰＴＥＰＥＣＥＫＱＦＱＰＹＦＩＰＩＮ
配列番号４６（マウスＣＤ２８）
ＭＴＬＲＬＬＦＬＡＬＮＦＦＳＶＱＶＴＥＮＫＩＬＶＫＱＳＰＬＬＶＶＤＳＮＥＶＳＬＳＣＲＹＳＹＮＬＬＡＫＥＦＲＡＳＬＹＫＧＶＮＳＤＶＥＶＣＶＧＮＧＮＦＴＹＱＰＱＦＲＳＮＡＥＦＮＣＤＧＤＦＤＮＥＴＶＴＦＲＬＷＮＬＨＶＮＨＴＤＩＹＦＣＫＩＥＦＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＲＳＮＧＴＩＩＨＩＫＥＫＨＬＣＨＴＱＳＳＰＫＬＦＷＡＬＶＶＶＡＧＶＬＦＣＹＧＬＬＶＴＶＡＬＣＶＩＷＴＮＳＲＲＮＲＬＬＱＶＴＴＭＮＭＴＰＲＲＰＧＬＴＲＫＰＹＱＰＹＡＰＡＲＤＦＡＡＹＲＰ
配列番号５１（ヒトＯＸ４０）
ＭＣＶＧＡＲＲＬＧＲＧＰＣＡＡＬＬＬＬＧＬＧＬＳＴＶＴＧＬＨＣＶＧＤＴＹＰＳＮＤＲＣＣＨＥＣＲＰＧＮＧＭＶＳＲＣＳＲＳＱＮＴＶＣＲＰＣＧＰＧＦＹＮＤＶＶＳＳＫＰＣＫＰＣＴＷＣＮＬＲＳＧＳＥＲＫＱＬＣＴＡＴＱＤＴＶＣＲＣＲＡＧＴＱＰＬＤＳＹＫＰＧＶＤＣＡＰＣＰＰＧＨＦＳＰＧＤＮＱＡＣＫＰＷＴＮＣＴＬＡＧＫＨＴＬＱＰＡＳＮＳＳＤＡＩＣＥＤＲＤＰＰＡＴＱＰＱＥＴＱＧＰＰＡＲＰＩＴＶＱＰＴＥＡＷＰＲＴＳＱＧＰＳＴＲＰＶＥＶＰＧＧＲＡＶＡＡＩＬＧＬＧＬＶＬＧＬＬＧＰＬＡＩＬＬＡＬＹＬＬＲＲＤＱＲＬＰＰＤＡＨＫＰＰＧＧＧＳＦＲＴＰＩＱＥＥＱＡＤＡＨＳＴＬＡＫＩ
【０２６９】
【表２８】
2020518622.tif 000029
【表２９】
2020518622.tif 000030
【表３０】
2020518622.tif 000031
【表３１】
2020518622.tif 000032
【表３２】
2020518622.tif 000033
【表３３】
2020518622.tif 000034
【表３４】
2020518622.tif 000035
【表３５】
2020518622.tif 000036
【表３６】
2020518622.tif 000037
【表３７】
2020518622.tif 000038
【表３８】
2020518622.tif 000039
【表３９】
2020518622.tif 000040
【表４０】
2020518622.tif 000041
【実施例】
【０２７０】
本発明を以下の実施例によってさらに説明するが、これはさらなる限定として解釈されるべきではない。本出願全体を通して引用される全ての図および全ての参考文献、特許および公開された特許出願の内容は、参照により本明細書に明確に組み込まれる。
【０２７１】
実施例１−ＣＴＬＡ−４結合ドメイン
ＣＴＬＡ−４結合ドメインポリペプチドを、ＷＯ２０１４／２０７０６３（実施例を参照）に記載されるように選択および発現し、以下に記載されるＥＬＩＳＡおよび表面プラズモン共鳴の少なくとも一方によりＣＴＬＡ−４への結合についてアッセイした。
【０２７２】
結合ＥＬＩＳＡ
９６ウェル平底高結合プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、＃６５５０７４）を、ＣＴＬＡ４−Ｆｃ（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ、＃３０Ｒ−ＣＤ１５２）またはＣＤ２８−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、３４２−ＣＤ）のいずれかで、４℃で一晩インキュベートすることによりコーティングした。プレートを洗浄し（洗浄緩衝液：ＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０（ＰＢＳＴ）Ｍｅｄｉｃａｇｏ、＃０９−９４１０−１００）、次いで、ＰＢＳＴ＋３％のＢＳＡ（Ｍｅｒｃｋ、＃１．１２０１８．０１００）で遮断した。プレートを再び洗浄し、試料または対照（２００〜０．００１μｇ／ｍｌまで１／５に連続希釈）をウェルに加えた。試料を室温で１時間インキュベートした後、洗浄した。検出抗体、ヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃγ−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ、＃１０９−０３５−０９８）を加え、続いてＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｐｉｃｏ化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃３７０６９）を使用してプレートを開発し、Ｅｎｖｉｓｉｏｎリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で検出した。ＣＴＬＡ４およびＣＤ２８の両方についてＥＣ５０値を計算した。結合比（ＥＣ５０結合比＝［ＣＤ２８に対するＥＣ５０］÷［ＣＴＬＡ−４に対するＥＣ５０］）を各ポリペプチドについて計算し、表１．１に示す。
【０２７３】
表面プラズモン共鳴
ＣＴＬＡ４−Ｆｃ（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ、＃３０Ｒ−ＣＤ１５２）またはＣＤ２８−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、３４２−ＣＤ）を、従来のアミンカップリングを使用してＢｉａｃｏｒｅ（商標）センサーチップＣＭ５に固定した。ＣＤ８６突然変異体分子および対照（１００〜１．５ｎＭまで１／２に連続希釈）を、３０μＬ／ｍＬの流量でＨＢＳ−Ｐ（ＧＥ、＃ＢＲ−１００３−６８）中での結合について分析した。会合を３分間、そして解離を１０分間追跡した。５ｍＭのＮａＯＨを３０秒間使用して再生を２回行った。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ４．１ソフトウェアを使用して動態パラメータと親和定数を計算した（表１．３）。
【０２７４】
阻害ＥＬＩＳＡ
９６ウェル平底プレート高結合プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、＃６５５０７４）を、４℃で一晩インキュベートすることにより、野生型ＣＤ８６−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃７６２５−Ｂ２）でコーティングした。プレートを洗浄し（洗浄緩衝剤：ＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０（ＰＢＳＴ）Ｍｅｄｉｃａｇｏ、＃０９−９４１０−１００）、次いで、ＰＢＳＴ＋３％のＢＳＡ（Ｍｅｒｃｋ、＃１．１２０１８．０１００）で遮断した。試料（ＣＤ８６突然変異体または野生型タンパク質、３００００〜０．３ｎｇ／ｍｌまで１／４に連続希釈）を、室温で１時間、ビオチン化ＣＴＬＡ４（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ、＃３０Ｒ−ＣＤ１５２）でインキュベートし、次いで、混合物をＥＬＩＳＡプレート中の遮断されたウェルに加えた。ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ、＃２１１２６）で検出を行い、続いてＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｐｉｃｏ化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃３７０６９）を使用してプレートを開発し、Ｅｎｖｉｓｉｏｎリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で検出した。結果を図２に示す。ＩＣ５０値を計算し、以下の表に示す。試験した全ての分子が、野生型およびＨ７９Ａの両方よりも優れたＩＣ５０値を示し、最良の突然変異体ＣＤ８６分子のＩＣは、野生型と比較して１００倍以上改善された。例示的な分子９００、９０１、９０４、９０６、９０７、９０８、９１０、９１５、および９３８についての結果を表１．１に示す。Ｋｄ結合比＝［ＣＤ２８に対するＫｄ］÷［ＣＴＬＡ−４に対するＫｄ］。例示的な分子９００、９０１、９０４、９０６、９０７、９０８、９１０、９１５、および９３８についての完全なアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号６〜１４として提供する。
【０２７５】
【表４１】
2020518622.tif 000042
【０２７６】
例示的な分子１０３８、１０３９、１０４０、１０４１、１０４２、１０４３、１０４４、１０４５、１０４６、および１０４７についての結果を、表１．２および１．３、ならびに図２および３に示す。例示的な分子１０３８、１０３９、１０４０、１０４１、１０４２、１０４３、１０４４、１０４５、１０４６、および１０４７の完全なアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１５〜２４として提供する。
【０２７７】
【表４２】
2020518622.tif 000043
【０２７８】
実施例２−クローン１０４０由来の例示的なポリペプチドのマウスＣＴＬＡ−４に対する交差反応性
阻害ＥＬＩＳＡ結合アッセイを使用して、例示的な突然変異体ＣＤ８６分子１０４０のマウスおよびヒトＣＴＬＡ−４に対する相対的親和性を調べた。これらの実験で使用した１０４０分子を、二重特異性分子の一部として抗ＣＤ４０抗体に共役した。ＣＤ８６分子のＣＴＬＡ−４結合特性は、この共役の影響を受けない（データは示されず）。
【０２７９】
簡潔に言えば、９６ウェル平底プレート高結合プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、＃６５５０７４）を、４℃で一晩インキュベートしたヒトＣＴＬＡ−４（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ）でコーティングした。プレートを洗浄し（洗浄緩衝液：ＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０（ＰＢＳＴ）Ｍｅｄｉｃａｇｏ、＃０９−９４１０−１００）、次いでＰＢＳＴ＋３％のＢＳＡ（Ｍｅｒｃｋ、＃１．１２０１８．０１００）で遮断した。
【０２８０】
試料（例示的なＣＤ８６突然変異体）を、室温で１時間、異なる濃度（３００００〜０．３ｎｇ／ｍｌまで１／４に連続希釈）の可溶性ビオチン化ヒトＣＴＬＡ４（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ、＃３０Ｒ−ＣＤ１５２）または可溶性マウスＣＴＬＡ−４（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）でプレインキュベートした。
【０２８１】
次いで、混合物をＥＬＩＳＡプレート中の遮断されたウェルに加えた。ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ、＃２１１２６）で検出を行い、続いてＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｐｉｃｏ化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃３７０６９）を使用してプレートを開発し、Ｅｎｖｉｓｉｏｎリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で検出した。結果を図５に示す。マウスおよびヒトＣＴＬＡ−４で観察された阻害曲線は、ＣＴＬＡ−４の２つの形態に対する例示的なＣＤ８６突然変異体（１０４０）の結合親和性が同様の大きさであることを実証している。実施例１で試験した他のクローンもマウスＣＴＬＡ−４に結合することがわかった（データは示されず）。
【０２８２】
実施例３−ＯＸ４０抗体の特徴付け
例示的なＯＸ４０抗体の特徴を以下の表３．１に要約する。
【０２８３】
【表４３】
2020518622.tif 000044
【０２８４】
これらの研究で比較する目的で、参照抗体として使用するために２つの抗ＯＸ４０抗体を合成した。本明細書では、それらをそれぞれ「７２」または「７２／７６」、および「７４」または「７４／７８」と称する。
【０２８５】
表面プラズモン共鳴による速度定数の測定
従来のアミンカップリングを使用して、ヒトＯＸ４０（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、＃３３５８＿ＯＸ）を、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）センサーチップＣＭ５に固定した。試験した抗体および対照（１００〜２ｎＭまで１／３または１／２に連続希釈）を、３０μＬ／ｍＬの流量でＨＢＳ−Ｐ（ＧＥ、＃ＢＲ−１００３−６８）中での結合について分析した。会合を３分間、そして解離を２０分間追跡した。５０ｍＭのＮａＯＨを６０秒間使用して再生を２回行った。ベースラインがドリフトする１：１ラングミュアモデルを使用して、動態パラメータおよび親和定数を計算した。試験した抗体は全体的にナノモル以下の範囲で、ナノモル範囲がオンとオフの速度で異なった（図６および表３．１）。ほとんどの抗体の親和性は５ｎＭ未満であった。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ４．１ソフトウェアを使用して、動態パラメータおよび親和定数を計算した。
【０２８６】
ＥＬＩＳＡによるヒトおよびマウスＯＸ４０、ならびにＣＤ１３７およびＣＤ４０への結合のＥＬＩＳＡによる測定
ＥＬＩＳＡプレートを、０．１または０．５μｇ／ｍｌのヒトＯＸ４０（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、３３８８−ＯＸ）、ＣＤ４０（Ａｎｃｅｌｌ）、またはＣＤ１３７（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）でコーティングした。ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴで洗浄し、次いでＰＢＳＴ＋２％のＢＳＡで室温で１時間遮断し、その後ＰＢＳＴで再び洗浄した。抗体を希釈系列でＥＬＩＳＡプレートに室温で１時間加えた後、ＰＢＳＴで洗浄した。ヤギ抗ヒトカッパ軽鎖ＨＲＰを使用して、室温で１時間インキュベートした結合を検出した。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｐｉｃｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔを基質として使用し、Ｆｌｕｏｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａを使用して発光を測定した。
【０２８７】
試験した全てのＯＸ４０抗体がヒトＯＸ４０に結合し、１ｎＭ未満のＥＣ５０値を示した。抗体は、マウスＯＸ４０または試験した他のＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーには結合しなかった（データは示されず）。
【０２８８】
ＣＨＯ細胞上で過剰発現したヒトＯＸ４０への結合の測定
ヒトＯＸ４０の細胞外部分を、ｈＣＤ４０の膜貫通および細胞内部分に融合させ、ｐｃＤＮＡ３．０にクローニングした。その後、ベクターを、ＣＨＯ細胞に安定にトランスフェクトした。市販のＯＸ４０抗体（ｈｕＯＸ４０、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で４℃で３０分間インキュベートすることにより、ＯＸ４０の発現を確認し、次いで４℃で３０分間、ａ−ｈｕＩｇＧ−ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）で検出した。アッセイのために、トランスフェクトされた細胞を、４℃で３０分間、試験抗体および対照でインキュベートし、その後４℃で３０分間、ａ−ｈｕＩｇＧ−ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）で検出した。ＦＡＣＳ  Ｖｅｒｓｅ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いたフローサイトメトリーにより、細胞を分析した。
【０２８９】
用量依存的にＣＨＯ細胞上に過剰発現したｈＯＸ４０に結合した全てのクローン（図７）。
【０２９０】
実施例４−ＯＸ４０抗体の配列分析
重鎖および軽鎖可変領域の両方のＣＤＲ配列を各抗体について分析した。表４．１は、ＶＨ  ＣＤＲ３配列に対して実施された分析を例示する。表４．１の位置は、ＩＭＧＴ番号付けシステムに従って定義されている。以下のパターンが特定された。
ＶＨ領域は全て、
（ａ）８アミノ酸長であり、コンセンサス配列「Ｇ、Ｆ、Ｔ、Ｆ、Ｇ／Ｙ／Ｓ、Ｇ／Ｙ／Ｓ、Ｙ／Ｓ、Ｙ／Ｓ／Ａ」を含む重鎖ＣＤＲ１配列、
（ｂ）８アミノ酸長であり、コンセンサス配列「Ｉ、Ｇ／Ｙ／Ｓ／Ｔ、Ｇ／Ｓ／Ｙ、Ｓ／Ｙ、Ｇ／Ｓ／Ｙ、Ｇ／Ｓ／Ｙ、Ｇ／Ｓ／Ｙ、Ｔ」を含む重鎖ＣＤＲ２配列、および
（ｃ）９〜１７アミノ酸長であり、コンセンサス配列「Ａ、Ｒ、Ｇ／Ｙ／Ｓ／Ｈ、Ｇ／Ｙ／Ｆ／Ｖ／Ｄ、Ｇ／Ｙ／Ｐ／Ｆ、−／Ｈ／Ｓ、−／Ｎ／Ｄ／Ｈ、−／Ｙ／Ｇ、−／Ｙ、−／Ｙ、−／Ｗ／Ａ／Ｖ、−／Ａ／Ｙ、−／Ｄ／Ａ／Ｙ／Ｇ／Ｈ／Ｎ、Ｙ／Ｓ／Ｗ／Ａ／Ｔ、Ｌ／Ｍ／Ｉ／Ｆ、Ｄ、Ｙ」を含む重鎖ＣＤＲ３配列、を含む。
【０２９１】
ＶＬ領域は全て、
（ａ）配列「Ｑ、Ｓ、Ｉ、Ｓ、Ｓ、Ｙ」からなる軽鎖ＣＤＲ１配列、
（ｂ）配列「Ａ、Ａ、Ｓ」からなる軽鎖ＣＤＲ２配列、
（ｃ）８〜１０アミノ酸長であり、コンセンサス配列「Ｑ、Ｑ、Ｓ／Ｙ／Ｇ、−／Ｙ／Ｈ／Ｇ、−／Ｓ／Ｙ／Ｇ／Ｄ／Ｗ、Ｓ／Ｙ／Ｇ／Ｄ、Ｓ／Ｙ／Ｇ／Ｔ、Ｐ／Ｌ、Ｙ／Ｓ／Ｈ／Ｌ／Ｆ、Ｔ」を含む軽鎖ＣＤＲ３配列、を含む。
【０２９２】
重鎖ＣＤＲ３に対するコンセンサス配列内で、２つのサブファミリーが同定された。第１のサブファミリーの各抗体は、コンセンサス配列「Ａ、Ｒ、Ｙ／Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ａ／Ｙ／Ｇ、Ｓ／Ｗ／Ａ、Ｍ／Ｌ、Ｄ、Ｙ」を含む１０アミノ酸長のＶＨ  ＣＤＲ３配列を含む。このファミリーの抗体はファミリーＺと称され、表４．１でそのように同定されている。第２のサブファミリーの各抗体は、コンセンサス配列「Ａ、Ｒ、Ｇ／Ｙ、Ｖ／Ｆ／Ｙ、Ｐ、Ｈ、Ｇ／Ｙ／Ｈ、Ｙ、Ｆ／Ｉ、Ｄ、Ｙ」を含む１１アミノ酸長のＶＨ  ＣＤＲ３配列を含む。このファミリーの抗体はファミリーＰと称され、表４．１でそのように同定される。ファミリーＺまたはＰの抗体が好ましい。ファミリーＰ中にＶＨ配列を有する抗体には、典型的には、ＣＤＲ３配列「Ｑ、Ｑ、Ｓ、Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、Ｙ、Ｔ」、ＣＤＲ１配列「Ｑ、Ｓ、Ｉ、Ｓ、Ｓ、Ｙ」、およびＣＤＲ２配列「Ａ、Ａ、Ｓ」とともにＶＬ配列も含まれる。したがって、これらの３つのＣＤＲ配列を含むＶＬ領域を有する抗体が好ましい。
【０２９３】
【表４４】
2020518622.tif 000045
【０２９４】
実施例５−ＯＸ４０抗体のドメインマッピング
ＯＸ４０の細胞外部分は４つのドメインからなり、各ドメインは２つのモジュールに細分され得る。標準的な実験室技術を使用して、ＯＸ４０ヒト／マウスキメラの遺伝子を合成した。ヒトＯＸ４０のドメインまたはモジュールを対応するマウスＯＸ４０と交換することにより、異なるキメラを設計した。キメラは、ヒトおよびマウスの配列の評価ならびにヒトＯＸ４０の３Ｄ調査に基づいて設計された。合成された遺伝子には、プロジェクト固有のＩＤ番号が割り当てられた（表５．１を参照）。構築物をｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。
【０２９５】
マウス／ヒトキメラをＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３−Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に一時的にトランスフェクトし、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に３７℃、８％のＣＯ２、１３５ｒｐｍで４８時間インキュベートした。トランスフェクトした細胞を、４℃で３０分間、ヒトＯＸ４０抗体、ヒトＯＸ４０Ｌ（ｈＯＸ４０Ｌ、ＲｎＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、マウスＯＸ４０Ｌ（ｍＯＸ４０Ｌ、ＲｎＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、および対照でインキュベートし、４℃で３０分間、ａ−ｈｕＩｇＧ−ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）で検出した。細胞をＦＡＣＳ  Ｖｅｒｓｅ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。異なるキメラ構築物への結合を、アイソタイプ対照の結合と比較した相対（平均蛍光強度）ＭＦＩとして計算した。結果を表５．２に示す。
【０２９６】
試験したヒトＯＸ４０抗体はどれもマウスＯＸ４０に結合しない。したがって、所与の抗体が特定のキメラに結合しない場合、これは、抗体がそのキメラのマウスドメインで置き換えられたドメインのうちの１つに特異的であることを示す。
【０２９７】
【表４５】
2020518622.tif 000046
【０２９８】
少なくとも４つの別々の結合パターンが特定された。
【０２９９】
パターンＡ：
抗体１１７０／１１７１、１５２４／１５２５、および１５２６／１５２７は、同様の結合パターンを示し、同じドメインの残基が結合に依存している。結合に重要なアミノ酸残基は、おそらくドメイン２のモジュールＢおよびドメイン２のモジュールＡにある。ＣＤＲＨ３ファミリー「Ｚ」を有する抗体の大部分は、パターンＡ（１１６６／１１６７は例外）に従って結合し、これは、この種のＣＤＲＨ３を有する抗体がこのエピトープに結合する傾向があることを示す。
【０３００】
パターンＢ：
抗体１１６８／１１３５、１５４２／１１３５、１５２０／１１３５、１４９０／１１３５、１４８２／１４８３、および１１６４／１１３５は同様の結合パターンを示し、主にドメイン３にある残基が結合に依存している。ＣＤＲＨ３ファミリー「Ｐ」を有する全ての抗体がこのパターンで結合し、これは、ＣＤＲＨ３配列の類似性が共通の結合エピトープを明らかにすることを実証している。
【０３０１】
パターンＣ：
抗体１１６６／１１６７は特有の結合パターンを有し、ドメイン２のモジュールＡおよびモジュールＢにある残基が結合に依存している可能性が高い。しかしながら、結合を無効にするには、両方のモジュールを同時に交換する必要があり、構造的に複雑なエピトープが示唆される。
【０３０２】
パターンＤ：
抗体１５１４／１５１５は特有の結合プロファイルを示し、結合のために主にドメイン２のモジュールＢにあるアミノ酸に依存している可能性が高い。
【０３０３】
参照抗体７２はパターンＢに従って結合する。ヒトＯＸ４０リガンドの結合パターンはパターンＣと同様である。
【０３０４】
【表４６】
2020518622.tif 000047
【０３０５】
実施例６−Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａとの交差反応性
Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ由来のＯＸ４０の細胞外部分を、ｈＣＤ４０の膜貫通細胞内部分に融合させ、ｐｃＤＮＡ３．０にクローニングした。その後、ベクターをＨＥＫ細胞（ｍａｃＯＸ４０−ＨＥＫ）に安定的にトランスフェクトした。
【０３０６】
市販のＯＸ４０抗体（ｈｕＯＸ４０、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で４℃で３０分間インキュベートすることにより、ＯＸ４０の発現を確認し、次いで４℃で３０分間、ａ−ｈｕＩｇＧ−ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）で検出した。アッセイのために、トランスフェクトされた細胞を、４℃で３０分間、試験抗体および対照でインキュベートし、その後４℃で３０分間、ａ−ｈｕＩｇＧ−ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）で検出した。ＦＡＣＳ  Ｖｅｒｓｅ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いたフローサイトメトリーにより、細胞を分析した。
【０３０７】
以下の表６．１に示されるように、試験した抗体は、Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａのＯＸ４０に結合し、ＥＣ５０値はヒトＯＸ４０で得られた値に匹敵し、Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａが毒物学研究において使用するのに好適であることが示唆される。
【０３０８】
Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａは、遺伝的にＭａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイザル）と非常によく似ており、カニクイザルも毒物学研究に好適な種である可能性が非常に高い。
【０３０９】
【表４７】
2020518622.tif 000048
【０３１０】
実施例７−ヒトＴ細胞アッセイにおけるアゴニスト活性
血液バンク（Ｌｕｎｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）から入手した白血球フィルターのＰＢＭＣのＭｉｌｔｅｎｙｉからの負のＴ細胞選択キットにより、ヒトＴ細胞を入手した。ＯＸ４０抗体を９６ウェル培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＣｏｓｔａｒのＵ字型プレート（＃３７９９）の表面にコーティングし、３μｇ／ｍｌの固定化された抗ＣＤ３抗体（ＵＣＨＴ１）と５μｇ／ｍｌの可溶性の抗ＣＤ２８抗体（ＣＤ２８．２）との組み合わせで培養した。抗ＣＤ３を４℃で一晩プレコートした。翌日、ＰＢＳで１回洗浄した後、ＯＸ４０抗体を３７℃で１〜２時間コーティングした。３７℃、５％のＣＯ２の湿気室で７２時間インキュベートした後、上清中のＩＬ−２レベルを測定した。
【０３１１】
ヒトＴ細胞を刺激してＩＬ−２を産生する抗体の能力を参照抗体７４と比較し、相対活性を図８に示す。抗体の大部分は、参照抗体に匹敵するＴ細胞活性化レベルを提供した。いくつかの抗体がより高いレベルのＴ細胞活性化を提供した。
【０３１２】
二重特異性分子
以下の実施例では、試験した二重特異性分子は、番号、例えば１１６４／１１４１によって称される。これは、分子が表ＢおよびＤに示されるそれぞれのＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列を含むことを意味する。例えば、１１６４／１１４１は、表Ｂに示される重鎖ＶＨ領域配列１１６４（配列番号９９）と、表Ｄに示される二重特異性鎖番号１１４１（配列番号１２９）とを含む。所与の分子の指定されたＶＨ領域配列は、典型的には、配列番号１３５のＩｇＧ１重鎖定常領域配列に（単一の連続したポリペプチド鎖の一部として）連結されて提供される。この配列は、典型的には、表Ｂの指定されたＶＨ領域配列のＣ末端に存在する。
【０３１３】
実施例８−単一標的に結合するための例示的な二重特異性分子の親和性
表面プラズモン共鳴による速度定数の測定
従来のアミンカップリングを使用して、ヒトＯＸ４０（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、＃３３５８＿ＯＸ）を、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）センサーチップＣＭ５に固定した。試験した抗体および対照（１００〜２ｎＭまで１／３または１／２に連続希釈）を、３０μＬ／ｍＬの流量でＨＢＳ−Ｐ（ＧＥ、＃ＢＲ−１００３−６８）中での結合について分析した。会合を３分間、そして解離を２０分間追跡した。５０ｍＭのＮａＯＨを３０秒間使用して再生を２回行った。ベースラインがドリフトする１：１ラングミュアモデルを使用して、動態パラメータおよび親和定数を計算した。試験した分子は、対応する単量体抗体よりも一般的にＯＸ４０に対する親和性が低いオンおよびオフ速度を変化させたが、依然としてナノモル範囲であった（表８．１）。
【０３１４】
【表４８】
2020518622.tif 000049
【０３１５】
ＥＬＩＳＡによる測定
それぞれ０．４または０．５μｇ／ｍｌのヒトＣＴＬＡ−４（ＢＭＳ、Ｏｒｅｎｃｉａ）またはヒトＯＸ４０（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、３３８８−ＯＸ）で、ＥＬＩＳＡプレートをコーティングした。ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴで洗浄し、次いでＰＢＳＴ＋２％のＢＳＡで室温で１時間遮断し、その後ＰＢＳＴで再び洗浄した。二重特異性分子を希釈系列でプレートに加え、室温で１時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、ヤギ抗ヒトカッパ軽鎖ＨＲＰを使用して室温で１時間結合を検出した。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｐｉｃｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔを基質として使用し、Ｆｌｕｏｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａを使用して発光を測定した。
【０３１６】
両方の標的に結合した全ての試験した二重特異性分子およびＥＣ５０値は、単一特異性抗体としてのそれらの親和性に基づいて予想される範囲内である（図９）。
【０３１７】
実施例９−例示的な二重特異性分子の両方の標的への二重結合
表面プラズモン共鳴による測定
従来のアミンカップリングを使用して、ヒトＯＸ４０（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、＃３３５８＿ＯＸ）を、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）センサーチップＣＭ５に固定した。試験した二重特異性分子（０．５μＭまたは０．２５μＭ）および対照を、３０μｌ／ｍｌの流量でチップ上で泳動させた。会合を３分間、そして解離を３分間追跡した。次いで、ＣＴＬＡ４−Ｆｃ（ＢＭＳ、Ｏｒｅｎｃｉａ）を注射し、その後３分間会合させ、３分間解離させた。対照として、ＣＴＬＡ４の代わりに空のＰＢＳを注射した。
【０３１８】
図１０に示されるように、試験した全ての二重特異性分子が両方の標的に同時に結合した。
【０３１９】
ＥＬＩＳＡによる測定
ＯＸ４０−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、＃３３５８＿ＯＸ）（０．４μｇ／ｍｌ）で４℃で一晩、ＥＬＩＳＡプレートをコーティングした。ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴで洗浄し、次いでＰＢＳＴ＋２％のＢＳＡで室温で１時間遮断し、その後ＰＢＳＴで再び洗浄した。二重特異性分子をプレートに希釈して加え、室温で１時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、ビオチン化ＣＴＬＡ−４（１μｇ／ｍｌ）を加え、室温でプレート上でインキュベートした。プレートを洗浄し、結合の検出のためにＨＲＰ標識ストレプトアビジンを使用した。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｐｉｃｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔを基質として使用し、Ｆｌｕｏｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａを使用して発光を測定した。
【０３２０】
試験した全ての二重特異性分子について、両方の標的への結合が確認された。図１１に示されるように、試験した二重特異性分子は、０．０１５μｇ／ｍｌに相当する濃度０．１ｎＭで検出することができる。アッセイにおける相対値は、表面プラズモン共鳴によって測定される親和性によく対応している。
【０３２１】
実施例１０−ヒトＣＤ４  Ｔ細胞アッセイにおける例示的な二重特異性分子のアゴニスト活性
ヒトＣＤ４  Ｔ細胞は、血液バンク（Ｌｕｎｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）から入手した白血球フィルターからのＰＢＭＣの負のＣＤ４  Ｔ細胞選択（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞分離キット１３０−０９６−５３３）により、ヒトＣＤ４  Ｔ細胞を単離した。ＣＴＬＡ−４（Ｏｒｅｎｃｉａ、２．５μｇ／ｍｌ）および抗ＣＤ３（ＵＣＨＴ−１、１ｕｇ／ｍｌ）を、４℃で一晩、９６ウェル培養プレート（非組織培養処理、Ｕ字型の９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、ＶＷＲ＃７３８−０１４７）の表面にコーティングした。ＣＴＬＡ−４およびＣＤ３の両方でコーティングすることにより、このアッセイは、ＣＴＬＡ−４の過剰発現を伴う腫瘍微小環境の実験モデルを提供する。ＣＴＬＡ−４は、対照として一部のウェルから除外した。
【０３２２】
試験する二重特異性分子をウェルに連続希釈で溶解して加え、同じモル濃度で対照と比較した。試験した各二重特異性分子に対して２つの異なる対照を使用した。第１の対照は、１７５６／１７５７と称される二重特異性分子である（１０４０  ＣＴＬＡ４結合領域に融合したアイソタイプ対照抗体＝ＣＴＬＡ４に結合するが、ＯＸ４０には結合しない）。第２の対照は、二重特異性１７５６／１７５７対照と単一特異性ＯＸ４０抗体との混合物であり、これは、試験した二重特異性分子に対応する。３７℃、５％のＣＯ２の湿気室で７２時間インキュベートした後、上清中のＩＬ−２レベルを測定した。
【０３２３】
図１２に示されるように、二重特異性分子には用量依存的な効果があり、ＣＴＬＡ−４でコーティングしたプレート中に培養すると、ヒトＴ細胞活性化の増加（ＩＬ−２産生の増加によって測定される）を誘導する。対照は行わない。図１３は、ＣＴＬＡ−４の存在下または非存在下で、二重特異性抗体および対照（１．５ｎＭ）に対して固定濃度で実施した場合の同じアッセイの結果を示す。Ｔ細胞活性化の増加はＣＴＬＡ−４の非存在下では見られない。対応する単一特異性分子の組み合わせと比較した、各二重特異性分子により誘導されるＩＬ−２レベルの倍率変化を、表１０．１に示す。各二重特異性分子または対照について産生されたＩＬ−２の平均値（ｐｇ／ｍｌ）を表１０．２に示す。
【０３２４】
このアッセイはＣＴＬＡ−４の過剰発現を伴う腫瘍微小環境の実験モデルを表しているため、結果は、試験した二重特異性分子がそのような微小環境における単一特異性抗体よりも大きな効果を期待できることを示唆している。
【０３２５】
【表４９】
2020518622.tif 000050
【０３２６】
１．５ｎＭでの単一特異性分子の対応する組み合わせと比較した、二重特異性分子によって誘導されるＩＬ−２レベルの倍率変化
【０３２７】
【表５０】
2020518622.tif 000051
【０３２８】
実施例１１−例示的な二重特異性分子の安定性
抗体の融点を示差走査蛍光分析法（ＤＳＦ）で分析した。ＰＢＳ中の抗体試料を、１０００倍に希釈されたＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅと混合した。２５〜９５℃の熱走査を実時間ＰＣＲマシンで行い、各程度で測定値を得た。比較のために参照抗体２５０／２５１を使用し、基準に対する融解温度Ｔｍ（ΔＴｍ）の差を決定した。基準と比較して１．１℃を超えるＴｍの差は、統計的に有意と見なされる。表１１．１に示されるように、試験した全ての二重特異性分子は、６５℃以上の値で良好な熱安定性を示した。
【０３２９】
【表５１】
2020518622.tif 000052
【０３３０】
実施例１２−ＣＴＬＡ４およびＯＸ４０を標的とする例示的な二重特異性抗体によるＡＤＣＣの誘導における相乗作用（単独または組み合わせでの単一特異性抗体の効果と比較）
材料および方法
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の評価
ＦｃγＲＩＩＩａ受容体（Ｖ１５８変異型）を安定的に発現するように改変されたジャーカット細胞と、ホタルルシフェラーゼの発現を促進するＮＦＡＴ応答エレメント（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）とを、ＡＤＣＣの評価におけるエフェクター細胞として使用した。９６ウェルの不透明な発光プレートの複製ウェル中に抗体を滴定し、ＯＸ４０およびＣＴＬＡ４の両方を発現するエフェクター細胞および標的細胞を５：１の比率で加えた。３７℃、９５％のＯ２加湿インキュベーターで６時間インキュベートした後、ルシフェラーゼアッセイ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を培地対照ウェル（ブランクサブトラクション用）を含む全てのウェルに加え、ＦＬＵＯｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ  ＬａｂＴｅｃｈ）上で発光を検出した。倍率誘導ＡＤＣＣを次のように計算した：（標的溶解−ブランク）／（自然溶解−ブランク）。Ｐｒｉｓｍ  ６．０（Ｇｒａｐｈｐａｄ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、対数（アゴニスト）対応答（３つのパラメータ）曲線近似に基づいて最高値を計算した。
【０３３１】
抗体
・「１１６６／１１６７」＝単一特異性ＯＸ４０抗体
・「ＣＴＬＡ−４結合部分を有する対照ＩｇＧ」＝ＩｇＧタンパク質に融合した単一特異性ＣＴＬＡ４結合ドメイン
・「１１６６／１２６１」＝ＯＸ４０およびＣＴＬＡ４を標的とする例示的な二重特異性抗体（先に記載されている単一特異的結合剤と同一のＯＸ４０およびＣＴＬＡ−４結合部分を含む）。
・「対照ＩｇＧ」＝負のアイソタイプ対照
【０３３２】
結果
例示的な二重特異性抗体１１６６／１２６１は、ＡＤＣＣの優れた誘導を呈する
図１５に示されるように、ＡＤＣＣの検出可能なレベルは、試験した全ての成分によって誘導された。負のアイソタイプ対照は、いかなるＡＤＣＣも誘導しなかった（データは示されず）。最も注目すべきことに、二重特異性１１６６／１２６１抗体は、対照と比較して約１２３倍のＡＤＣＣを誘導した。単一特異性ＯＸ４０抗体（１１６６／１１６７）は約２９倍、単一特異性ＣＴＬＡ−４結合ドメイン（６２／３７６）は約１０倍のＡＤＣＣを誘導したが、２つの単一特異性成分の混合物（１１６６／１１６７＋６２／３７６））は約３１倍のＡＤＣＣを誘導した。
【０３３３】
したがって、ＯＸ４０およびＣＴＬＡ−４に結合する二重特異性分子によって得られる予想外の顕著な相乗効果がある。
【０３３４】
実施例１３−ＯＸ４０およびＣＴＬＡ４を標的とする二重特異性抗体−ＯＸ４０およびＣＴＬＡ４の両方を発現する細胞への特異的結合
背景技術
この研究の目的は、フローサイトメトリーを使用して、ＯＸ４０およびＣＴＬＡ４の両方を発現する細胞に対する１１６６／１２６１および対応する単一特異的結合要素の結合効率およびＥＣ５０を決定することであった。二重特異性抗体は、ＯＸ４０およびＣＴＬＡ４の両方に同時に結合するように設計されている。この目的のために、標的を安定的に発現するトランスフェクトＣＨＯ細胞を使用した。ＣＨＯ  Ｐ４細胞は、ＯＸ４０およびＣＴＬＡ４の両方の発現レベルが高い。
【０３３５】
方法と結果
ＯＸ４０およびＣＴＬＡ４の両方を発現する二重トランスフェクトＣＨＯ細胞は、本来は、ＦＡＣＳ（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって、両方の標的を高レベルで発現する細胞プール（ＣＨＯ  Ｐ４と表記）に分類されていた。ジェネティシンおよびゼオシンの選択圧下で細胞を培養することにより、標的発現は安定的に保たれた。非トランスフェクトＣＨＯ野生型細胞を対照として使用した。
【０３３６】
低減濃度の１１６６／１２６１（ＯＸ４０およびＣＴＬＡ４を標的とする例示的な二重特異性抗体）、または２つの単一特異的結合剤１１６６／１１６７（ＯＸ４０特異的モノクローナル抗体）、およびＣＴＬＡ−４結合部分を有する対照ＩｇＧ（単一特異性ＣＴＬＡ４結合ＩｇＧ融合タンパク質）（２００ｎＭ〜０，００３４ｎＭ）、続いてＰＥ共役抗ヒトＩｇＧにより、細胞を染色した。ＦＡＣＳｖｅｒｓｅ機器を使用して蛍光を検出し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して取得物を分析した。各染色について蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）を決定した。
【０３３７】
ＣＨＯ  Ｐ４についての結合効率曲線を図１６に提示する（３つのうち１つの代表的な実験）。１１６６／１２６１は、１１６６／１１６７またはＣＴＬＡ−４結合要素を含む対照ＩｇＧよりもＯＸ４０およびＣＴＬＡ４の発現が高い細胞に結合する。これはおそらく、２つの標的を同時に結合することができる１１６６／１２６１の相加効果である。
【０３３８】
実施例１４−ＯＸ４０およびＣＴＬＡ４を標的とする二重特異性抗体−フローサイトメトリーによって測定されたＯＸ４０およびＣＴＬＡ４を発現する細胞の二重結合
目的
フローサイトメトリーを使用して凝集細胞の数を測定することにより、細胞上で過剰発現したＯＸ４０およびＣＴＬＡ４の両方に対する１１６６／１２６１までの同時結合を測定する。
【０３３９】
材料および方法
ＣＨＯ−ＯＸ４０細胞およびＨＥＫ−ＣＴＬＡ４細胞を、それぞれ細胞内で蛍光色素ＰＫＨ−６７（緑色蛍光色素）およびＰＫＨ−２６（赤色蛍光色素）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で染色した。均一に染色された細胞集団を検証した後、細胞を混合し、１１６６／１２６１（ＯＸ４０およびＣＴＬＡ４を標的とする例示的な二重特異性抗体）または２つのモノクローナル抗体１１６６／１１６７（単一特異性抗ＯＸ４０抗体）とＣＴＬＡ４結合ドメインを含む対照ＩｇＧとの組み合わせのいずれかでインキュベートした。染色後、細胞を直ちに固定し、凝集した二重陽性細胞の数をＦＡＣＳ−ｖｅｒｓｅ（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して定量化した。グラフパッドプリズムｖ６を使用してデータ分析および非線形回帰を行った。
【０３４０】
結果および結論
例示的な二重特異性抗体１１６６／１２６１は、濃度の増加とともに凝集細胞の数を増加させる（図１７）（２つのうちの１つの代表的な実験）。
【０３４１】
実施例１５−ＯＸ４０およびＣＴＬＡ４を標的とする二重特異性抗体−マウスの薬物動態
材料および方法
抗体
・１１６６／１２６１（ＯＸ４０およびＣＴＬＡ４を標的とする例示的な二重特異性抗体）
・１１６６／１１６７（ＯＸ４０を標的とする単一特異性対照抗体）
【０３４２】
インビボでの研究
Ｔａｃｏｎｉｃ’ｓ  Ｄｅｎｍａｒｋの雌のＣ５７ＢＬ／６（７〜８週齢）マウスを実験で使用した。全ての実験は、Ｍａｌｍｏ／Ｌｕｎｄ倫理委員会の許可を得て行った。
【０３４３】
各抗体１００μｇをマウスに腹腔内注射し、０時間後、１時間後、４時間後、８時間後、２４時間後、７２時間後、および１週間後に、大伏在静脈または大静脈のいずれか経由でヘパリン処理済みチューブ内に血液を採取した。各時点で３匹のマウスを使用した。２５００ｒｐｍで３０分間血液を回転させ、さらに分析するために血漿を−８０℃で凍結した。
【０３４４】
血漿中の１１６６／１２６１および１１６６／１１６７レベルの決定のためのアッセイ
２つの異なるアッセイを使用した。単一標的ＥＬＩＳＡ（ＥＬＩＳＡ１）および二重ＥＬＩＳＡ（ＥＬＩＳＡ２）。簡潔に言えば、アッセイは以下の工程からなる。白色の高結合平底ＬＩＡプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ＢｉＯ−Ｏｎｅ、Ａｕｓｔｒｉａ）を、０．８μｇ／ｍＬのヒトＯＸ４０−Ｆｃ（ＲｎＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）で一晩コーティングした。洗浄緩衝液（０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０を補充したホスファターゼ緩衝生理食塩水（ＰＢＳＴ）、Ｍｅｄｉｃａｇｏ、Ｓｗｅｄｅｎ）で洗浄した後、２％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳＴ（Ｍｅｒｃｋ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して周囲の室温（ＡＲＴ）で１時間、振とうしながらウェルを遮断し、再び洗浄して、その後、アッセイ緩衝液（ＰＢＳＴ＋０．５％のＢＳＡ）中で１：２００および１：５０００に希釈した血漿試料を検量線試料（１１６６／１２６１、濃度６〜０．００１２μｇ／ｍＬ）と一緒に加えた。ＡＲＴで１時間振とうしながらインキュベートし、続いて洗浄した後、二重ＥＬＩＳＡの製造元の指示に従って、単一標的ＥＬＩＳＡ用のヒト抗カッパ抗体ホースラディッシュペルオキシダーゼ共役（ＨＲＰ）（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ、ＵＫ）または１μｇ／ｍＬのビオチン化ヒトＣＴＬＡ−４−Ｆｃ（Ｏｒｅｎｃｉａ）のいずれかからなる二次試薬、続いてストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＮ、ＵＳＡ）を加えた。ＨＲＰ基質ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｐｉｃｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してシグナルを得た。Ｆｌｕｒｏｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａ（ＭＢＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、暗所で１０分間振とうしながらインキュベートした後、発光測定値を収集した。グラフパッドプリズムプログラムを使用することによってデータを分析した。
【０３４５】
結果
１１６６／１２６１および１１６６／１１６７を注射した後、異なる時点で収集した試料を、それぞれ１１６６／１２６１および１１６６／１１６７の血漿レベルを決定するために、単一標的ＥＬＩＳＡ単独で、または単一標的および二重ＥＬＩＳＡで分析した。結果は、血漿中の１１６６／１２６１および１１６６／１１６７のレベルが、腹膜注射後最初の４時間程で増加し、その後減少したことを示す（図１８の上パネル）。１週間後の血漿中には、検出可能なレベルの１１６６／１２６１および１１６６／１１６７の両方が存在する（図１８の中央パネルおよび下パネル）。
【０３４６】
血漿中の１１６６／１２６１のレベルは、モノクローナル抗体１１６６／１１６７について得られたレベルと類似しており、これは、１１６６／１２６１が同等の単一特異性抗ＯＸ４０抗体の半減期に匹敵する、インビボでの良好な半減期を呈することを示す。
【０３４７】
参照文献
Ｈｅｍｅｒｌｅ  Ｔ．，Ｗｕｌｈｆａｒｄ  Ｓ．，Ｎｅｒｉ  Ｄ．，（２０１２）Ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｕｍｏｕｒ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｄａｔａ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｓｉｇｎ，２５，ｐｐ８５１−８５４．
【０３４８】
実施例１６−ＯＸ４０およびＣＴＬＡ４を標的とする二重特異性抗体−ＨＴ−２９結腸癌モデルにおけるインビボでの抗腫瘍効果
概要
ｈＰＢＭＣヒト化免疫不全マウスおよびＨＴ−２９結腸癌の皮下腫瘍モデルを使用して、１１６６／１２６１（ＯＸ４０およびＣＴＬＡ４を標的とする例示的な二重特異性抗体）の抗腫瘍効果を調べた。
【０３４９】
１１６６−１２６１は、統計的に有意な腫瘍体積の抑制を実証した。
【０３５０】
材料および方法
Ｔａｃｏｎｉｃ’ｓ  Ｄｅｎｍａｒｋの雌ＳＣＩＤ−Ｂｅｉｇｅマウス（６〜９週齢）を実験に使用した。全ての実験は、Ｍａｌｍｏ／Ｌｕｎｄ倫理委員会の許可を得て行った。
【０３５１】
ＨＴ−２９結腸癌細胞をＡＴＣＣから入手し、ＡＴＣＣの推奨に従って培養した。対数期に成長するＨＴ−２９細胞株（０日目（Ｄ０）に１００〜２００μＬ中に４×１０６個の細胞）を皮下注射した。白血球濃縮物から単離されたヒトＰＢＭＣ（２００μＬ中に７×１０６）を同日に腹腔内注射した。６日目、１３日目、および２０日目に、腹腔内治療（６６７ｐｍｏｌ）を行った。
【０３５２】
白血球濃縮物は、Ｌｕｎｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌから取得した。
【０３５３】
腫瘍の幅、長さ、および高さのキャリパーを用いて腫瘍を測定し、その腫瘍体積を計算した（ｗ／２×ｌ／２×ｈ／２×  ｐｉ  ×（４／３））。腫瘍体積が２ｃｍ３に達する前、創傷時、またはマウスの健康に影響が及んだ場合、動物を殺処分した。
【０３５４】
グラフパッドプリズムプログラムを使用したマン・ホイットニー検定によってデータを分析した。レスポンダードナーは、参照抗体１８７４に応答するドナーと見なされた。指数関数的な腫瘍成長期間中の最小１０％の平均腫瘍抑制は、応答と見なされた。
【０３５５】
結果
レスポンダードナー（２つの別々の実験から４人のドナー）を移植したマウスからのプールされたデータは、ビヒクルグループ（ＺＺ）と比較して、１１６６／１２６１抗体（ｐ＝０．０４６９〜ｐ＝０．００７４、マン・ホイットニーノンパラメトリック、２テール）で処理した場合、腫瘍成長の抑制の形態で１２〜１６日目に統計的に有意な抗腫瘍効果を実証した。腫瘍体積の抑制の割合は、１０日目〜２１日目に１１６６／１２６１で２２〜３６％の範囲であった（図１９および表３１．１を参照）。
【０３５６】
結論として、ｈＰＢＭＣヒト化免疫不全マウスおよびＨＴ−２９結腸癌の皮下腫瘍モデルを使用して、１１６６／１２６１の抗腫瘍効果を調べた。１１６６／１２６１は、統計的に有意な腫瘍体積の抑制を実証した。
【０３５７】
【表５２】
2020518622.tif 000053
【０３５８】
実施例１７−ＯＸ４０およびＣＴＬＡ４を標的とする二重特異性抗体−Ｒａｊｉリンパ腫モデルにおけるインビボでの抗腫瘍効果
概要
ｈＰＢＭＣヒト化免疫不全マウスおよびＲａｊｉ  Ｂ細胞リンパ腫の皮下腫瘍モデルを使用して、１１６６／１２６１（ＯＸ４０およびＣＴＬＡ４を標的とする例示的な二重特異性抗体）の抗腫瘍効果を調べた。
【０３５９】
１１６６／１２６１は、統計的に有意な腫瘍体積の抑制を実証した。
【０３６０】
材料および方法
Ｔａｃｏｎｉｃ’ｓ  Ｄｅｎｍａｒｋの雌ＳＣＩＤ−Ｂｅｉｇｅマウス（６〜９ｗ）を実験に使用した。全ての実験は、Ｍａｌｍｏ／Ｌｕｎｄ倫理委員会の許可を得て行った。
【０３６１】
Ｒａｊｉ  Ｂ細胞リンパ腫をＡＴＣＣから取得し、ＡＴＣＣの推奨に従って培養した。対数期に成長するＲａｊｉ細胞株を、バフィーコートから単離されたヒトＰＢＭＣ（２００μＬ中に１０×１０６）と一緒に皮下注射した（１０×１０６個の細胞）。０日目、７日目、および１４日目に、腹腔内治療（６６７ｐｍｏｌ）を行った。
【０３６２】
バフィーコートはカルマル大学病院から入手した。
【０３６３】
腫瘍体積が計算された幅、長さ、および高さのキャリパーで、腫瘍サイズを測定した（ｗ／２×ｌ／２×ｈ／２×ｐｉ×（４／３））。腫瘍体積が２ｃｍ３に達する前、創傷時、またはマウスの健康に影響が及んだ場合、動物を殺処分した。
【０３６４】
グラフパッドプリズムプログラムを使用したマン・ホイットニー検定によってデータを分析した。応答者ドナーは、参照抗体１８７４に応答するドナーと見なされた。指数関数的な腫瘍成長期間中の最小１０％の平均腫瘍抑制は、応答と見なされた。
【０３６５】
結果および結論
応答ドナーを含む実験グループからのプールされたデータである、二重特異性１１６６／１２６１抗体は、ビヒクルと比較して、１４日目および２１日目に統計的に有意な抗腫瘍効果を実証した（ｐ＝０．００６８およびｐ＝０，０２８８、マン・ホイットニー、２テール）（表３２．１）。
【０３６６】
【表５３】
2020518622.tif 000054
【０３６７】
実施例１８−ＭＣ３８結腸癌モデルにおけるインビボでの抗腫瘍効果
概要
ヒトＯＸ４０用のトランスジェニックマウスおよびＭＣ３８結腸癌の皮下腫瘍モデルを使用して、ＯＸ４０−ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体１１６６／１２６１の抗腫瘍効果を調べた。
【０３６８】
１１６６／１２６１は、対応するモノクローナル抗体と比較して、ＣＤ８／Ｔｒｅｇ比に対する統計的に有意な効果を実証した。
【０３６９】
材料および方法
実験では、ヒトＯＸ４０用の雌トランスジェニックマウス（ＧｅｎＯｗａｙが開発したホモ接合型ヒトＯＸ４０ノックインマウスモデル）を使用した。全ての実験は、Ｍａｌｍｏ／Ｌｕｎｄ倫理委員会の許可を得て行った。
【０３７０】
ＲＰＭＩ、１０％の熱不活化ウシ胎児血清、ピルビン酸ナトリウム、ヘペス、および２−メルカプトエタノール中に、ＭＣ３８結腸癌を培養した。対数期に成長するＭＣ３８細胞株（０日目（Ｄ０）に１００μＬ中に１×１０６個の細胞）を皮下注射し、１０日目、１３日目、および１６日目に腹腔内治療（１，３３ｍｏｌ）を行った。最後の注射の２４時間後に、腫瘍および脾臓を採取し、生存マーカー、系統マーカーＣＤ１１ｂ、Ｃ１９、ＭＨＣＩＩ、ＮＫ１．１、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、Ｆｏｘｐ３、Ｋｉ−６７について染色し、フローサイトメトリーを使用して分析した。
【０３７１】
結果
ＭＣ３８結腸癌モデルを使用して、ｈＯＸ４０ｔｇマウスにおける二重特異性ＯＸ４０−ＣＴＬＡ−４抗体の薬力学的効果を調べた。２つの独立した実験からのプールされたデータは、両方の単一特異性の対応する抗体と比較して、二重特異性抗体による腫瘍内ＣＤ８／Ｔｒｅｇ比に対する統計的に有意な効果を実証した（図２０）。脾臓では、ＣＤ８／Ｔｒｅｇ比およびＴｒｅｇにおけるＫｉ−６７（Ｋｉ−６７は増殖についてのマーカーである）の発現レベルのいずれに関しても、ＣＤ８／Ｔｒｅｇ比の変化は見られない。これは、１１６６／１２６１が、周辺のＴ細胞に影響を与えることなく、２つの単一特異性対照抗体によって得られる効果の合計よりも大きい腫瘍のＴｒｅｇに対する有意な効果を誘導することを示す。したがって、この効果は腫瘍微小環境に指向され、それはより大きな治療域、すなわち低い全身傷害を伴う高い抗腫瘍効果を提供し得る。異なるＴ細胞集団の相対的なレベルを図２１に概説する。
【０３７２】
実施例１９−ＭＣ３８結腸癌モデルにおけるインビボでの抗腫瘍効果
概要
ヒトＯＸ４０に対するトランスジェニックマウスおよびＭＣ３８結腸癌の皮下腫瘍モデルを使用して、ＯＸ４０−ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体１１６６／１２６１の抗腫瘍効果を調べた。
【０３７３】
１１６６／１２６１は、腫瘍体積の抑制の形態で統計的に有意な抗腫瘍効果を実証した。
【０３７４】
材料および方法
実験では、ヒトＯＸ４０（ＧｅｎＯｗａｙが開発したホモ接合型ヒトＯＸ４０ノックインマウスモデル）の雌トランスジェニックマウスを使用した。全ての実験は、Ｍａｌｍｏ／Ｌｕｎｄ倫理委員会の許可を得て行った。
【０３７５】
ＭＣ３８結腸癌はスタンフォード大学から入手し、ＲＰＭＩ、１０％の熱不活化ウシ胎児血清、ピルビン酸ナトリウム、ヘペス、２−メルカプトエタノール中に培養した。対数期に成長するＭＣ３８細胞株（０日目（Ｄ０）に１００μＬ中の１×１０６個の細胞）を皮下注射し、７日目、１０日目、および１３日目に、腹腔内治療（１，３３ｍｏｌ）を行った。
【０３７６】
腫瘍の幅、長さ、および高さのキャリパーを用いて腫瘍を測定し、その腫瘍体積を計算した（ｗ／２×ｌ／２×ｈ／２×ｐｉ×（４／３））。腫瘍体積が２ｃｍ３に達する前、創傷時、またはマウスの健康に影響が及んだ場合、動物を殺処分した。
【０３７７】
グラフパッドプリズムおよびエクセルプログラムを使用して、モノクローナル抗体およびビヒクルと比較した、二重特異性抗体の腫瘍体積の抑制についてのデータを分析した。
【０３７８】
結果
３つの独立した実験（ｎ＝２６〜２８）からプールされたデータは、腫瘍体積の抑制および生存率に対する統計的に有意な効果を実証した。
【０３７９】
結論として、ヒトＯＸ４０用のトランスジェニックマウスにおいてＭＣ３８結腸癌モデルを使用して、二重特異性ＯＸ４０−ＣＴＬＡ−４抗体の抗腫瘍効果を調べた。二重特異性抗体は、腫瘍体積の抑制および生存率の増加に対する統計的に有意な効果を実証した。抗腫瘍効果は、単一特異性対照抗体よりも生存率および腫瘍成長の抑制の観点で強力であった（図２２）。
【０３８０】
実施例２０−ＭＢ４９膀胱癌モデルにおけるインビボでの抗腫瘍効果
概要
ヒトＯＸ４０用のトランスジェニックマウスおよびＭＢ４９膀胱癌の皮下腫瘍モデルを使用して、ＯＸ４０−ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体１１６６／１２６１の抗腫瘍効果を調べた。
【０３８１】
１１６６／１２６１は、腫瘍体積の抑制および生存の増加の形態で統計的に有意な抗腫瘍効果を示した。
【０３８２】
材料および方法
実験では、ヒトＯＸ４０（ＧｅｎＯｗａｙが開発したホモ接合型ヒトＯＸ４０ノックインマウスモデル）の雌トランスジェニックマウスを使用した。全ての実験は、Ｍａｌｍｏ／Ｌｕｎｄ倫理委員会の許可を得て行った。
【０３８３】
対数期に成長するＭＢ４９細胞株を０日目に皮下注射し（０．２５×１０６個の細胞）、７日目、１０日目、および１３日目に腹腔内治療（１．３３μｍｏｌ）を行った。
【０３８４】
腫腫瘍体積が計算された幅、長さ、および高さのキャリパーを使用して、腫瘍体積を測定した（（ｗ／２）×（ｌ／２）×（ｈ／２）×ｐｉ×（４／３））。腫瘍体積が２ｃｍ３に達する前、創傷時、またはマウスの健康に影響が及んだ場合、動物を殺処分した。マン・ホイットニー、ノンパラメトリック、２テール検定を使用して腫瘍体積について統計分析を行い、グラフパッドプリズムを使用して生存カプラン・マイヤーログランクについて統計分析を行った。
【０３８５】
結果
ＭＢ４９膀胱癌モデルを使用して、ヒトＯＸ４０用のトランスジェニックマウスにおける二重特異性ＯＸ４０−ＣＴＬＡ−４抗体１１６６／１２６１の抗腫瘍効果を調べた。二重特異性抗体は、腫瘍体積の抑制に対して統計的に有意な効果（図２３Ａ、ｐ＝０．０００３）、および生存率の増加（図２３Ｂ、ｐ＜０．０００１）を実証した。
【０３８６】
実施例２１−１１６６／１２６１により誘導される免疫記憶
概要
免疫調節剤は、免疫記憶を誘導するため、癌に対する長期的な治癒反応を誘導すると考えられている。そのような免疫記憶を実証するために、１１６６／１２６１が完全な腫瘍退縮を誘導したマウスを、同じ特定の腫瘍、ＭＢ４９細胞株、または無関係な腫瘍細胞株ＰＡＮＣ０２で再挑戦した。
【０３８７】
再挑戦実験により、１１６６／１２６１がＭＢ４９膀胱癌に対して腫瘍特異的な免疫記憶を生成するが、無関係な腫瘍ＰＡＮＣ０２に対しては生成しないことが実証された。
【０３８８】
材料および方法
１１６６／１２６１がＭＢ４９膀胱癌から完全な腫瘍退縮を誘導するｇｅｎＯｗａｙによって生成された、ヒトＯＸ４０（ｈＯＸ４０ｔｇ）用の雌のノックインマウスを、単一の腫瘍モデルにおける特定の腫瘍として、または双子型腫瘍モデルを使用した無関係な腫瘍ＰＡＮＣ０２と一緒に、ＭＢ４９で再挑戦した。未投薬マウスを腫瘍成長対照として使用した。
【０３８９】
対数期に成長するＭＢ４９およびＰＡＮＣ０２を、脇腹の各側に１つずつ、単一腫瘍または双子型腫瘍のいずれかとして皮下注射した（０．２５×１０６個の細胞）。腫瘍体積をキャリパーで週３回測定し、式（３／４×π×（幅／２）×（長さ／２）×（高さ／２）を使用して腫瘍体積を計算した。
【０３９０】
結果
これらのマウスを特定の腫瘍ＭＢ４９または無関係な腫瘍で再挑戦することにより、１１６６／１２６１治療後に完全な腫瘍退縮を示すマウスにおける免疫記憶を検査した。完全なレスポンダーは、新しい腫瘍が成長しなかったため、特定の腫瘍ＭＢ４９に対する免疫記憶を実証した（図２４Ａ）。未投薬マウスを腫瘍成長についての正の対照として使用した。さらに、ＭＢ４９および双子型腫瘍モデルにおける無関係な腫瘍ＰＡＮＣ０２で再挑戦した完全なレスポンダーが、以前に遭遇したＭＢ４９腫瘍ではなく無関係な腫瘍のみの成長を実証したため、免疫記憶は腫瘍特異的であることが実証された（図２４Ｂ）。このデータは、１１６６／１２６１が腫瘍特異的な免疫記憶を誘導することを実証している。
【０３９１】
実施例２２−腫瘍内ＣＤ８／Ｔｒｅｇ比の評価によるＭＢ４９膀胱癌モデルのインビボでの抗腫瘍効果
概要
腫瘍環境において、Ｔｒｅｇは、ＯＸ４０およびＣＴＬＡ−４の両方を高度に発現する。ＯＸ４０−ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体は、この腫瘍環境でＴｒｅｇの枯渇を誘導すると予想される。ヒトＯＸ４０用のトランスジェニックマウスおよびＭＢ４９膀胱癌の皮下腫瘍モデルを使用して、腫瘍内Ｔｒｅｇの枯渇を誘導する１１６６／１２６１の能力を調べた。
【０３９２】
１１６６／１２６１は、対応するモノクローナル抗体と比較して、Ｔｒｅｇの枯渇、エフェクター細胞の活性化、およびＣＤ８／Ｔｒｅｇ比の増加に対する統計的に有意な効果を実証した。変更されたＣＤ８／Ｔｒｅｇ比の形態で脾臓に有意な効果は観察されなかったため、この効果は主に腫瘍環境に局在した。
【０３９３】
材料および方法
フランス国のｇｅｎＯｗａｙによって生成された７〜１４週齢のヒトＯＸ４０（ｈＯＸ４０ｔｇ）用の雌ホモ接合体を実験で使用した。全ての実験は、Ｍａｌｍｏ／Ｌｕｎｄ倫理委員会の許可を得て行った。
【０３９４】
対数期に成長するＭＢ４９膀胱癌を０日目に皮下注射し（０．２５×１０６個の細胞）、１０日目、１３日目、および１６日目に腹腔内治療（１．３３μｍｏｌ）を行った。最後の注射の２４時間後、腫瘍および脾臓を採取し、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、Ｆｏｘｐ３、ならびに系統マーカー（ＣＤ１９、ＮＫ１．１、ＭＨＣＩＩ）に対して染色し、フローサイトメトリーを使用して分析した。統計分析は、マン・ホイットニー、ノンパラメトリック、２テールを使用して、特に明記しない限り、グラフパッドプリズムを使用して行った。
【０３９５】
結果
ＭＢ４９膀胱癌を使用して、ｈＯＸ４０ｔｇマウスにおける二重特異性ＯＸ４０−ＣＴＬＡ−４抗体の薬力学的効果を調べた。実験では、１１６６／１２６１が腫瘍内Ｔｒｅｇ含有量（ｐ＝０．００８７、２テール）（図２５Ａ）、腫瘍におけるＣＤ８数（ｐ＝０．０４７、１テール）（図２５Ｂ）、およびＣＤ８／Ｔｒｅｇ比  ｐ＝０．００４３、２テール）（図２５Ｃ）に対する統計的に有意な効果を誘導することが実証された。脾臓ではＣＤ８／Ｔｒｅｇ比の変化は見られず、これは１１６６／１２６１の腫瘍局在を示している（図２５Ｄ）。
【０３９６】
実施例２３−エフェクター細胞活性化の評価によるＭＣ３８結腸癌モデルにおけるインビボでの抗腫瘍効果
概要
制御性Ｔ細胞の枯渇に加えて、ＯＸ４０−ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体の作用機序の一部は、エフェクターＴ細胞の活性化と考えられる。ヒトＯＸ４０用のトランスジェニックマウスおよびＭＣ３８結腸癌の皮下腫瘍モデルを使用して、ＯＸ４０−ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体１１６６／１２６１のこれらの抗腫瘍効果を調べた。
【０３９７】
１１６６／１２６１は、グランザイムＢおよびＣＤ１０７ａ発現の増加の形態で、腫瘍微小環境におけるエフェクターＣＤ８活性化に対する統計的に有意な効果を実証した。
【０３９８】
材料および方法
実験では、ヒトＯＸ４０用の雌トランスジェニックマウス（ＧｅｎＯｗａｙが開発したホモ接合型ヒトＯＸ４０ノックインマウスモデル）を使用した。全ての実験は、Ｍａｌｍｏ／Ｌｕｎｄ倫理委員会の許可を得て行った。
【０３９９】
対数期に成長するＭＣ３８結腸癌を０日目に皮下注射し（１×１０６個の細胞）、１０日目、１３日目、および１６日目に腹腔内治療（１．３３μｍｏｌ）を行った。最後の注射の２４時間後、腫瘍および脾臓を採取し、生存マーカー、系統マーカー（ＣＤ１１ｂ、Ｃ１９、ＭＨＣＩＩ、ＮＫ１．１）、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、グランザイムＢ、およびＣＤ１０７ａについて染色し、フローサイトメトリーを使用して分析した。マン・ホイットニー、ノンパラメトリック、２テール検定を使用してデータを分析した。
【０４００】
結果
ＭＣ３８結腸癌を使用して、ｈＯＸ４０ｔｇマウスにおける二重特異性ＯＸ４０−ＣＴＬＡ−４抗体の薬力学的効果を調べた。実験では、１１６６／１２６１がＣＤ１０７ａ（図２６Ａ、ｐ＝０．００７９）およびグランザイムＢ（図２６Ｂ、ｐ＝０．０１５９）の誘導の形態で腫瘍領域のエフェクターＣＤ８細胞の統計的に有意な活性化を誘導することが実証された。
【０４０１】
実施例２４−例示的な二重特異性抗体「１１６６／１２６１」が腫瘍に局在する
概要
ＯＸ４０およびＣＴＬＡ−４は、腫瘍環境におけるＴ細胞、特にＴｒｅｇ上に高度に発現する。したがって、ＯＸ４０−ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体は、二重標的化により腫瘍局在を誘導すると予想される。ヒトＯＸ４０用のトランスジェニックマウスおよびＭＣ３８結腸癌の皮下腫瘍モデルを使用して、腫瘍に局在する１１６６／１２６１の能力を調べた。１１６６／１２６１は、ビヒクルまたはアイソタイプ対照で処理した動物と比較して、統計的に有意な腫瘍の局在を実証した。脾臓には局在は見られなかった。
【０４０２】
材料および方法
実験では、ヒトＯＸ４０用の雌トランスジェニックマウス（ＧｅｎＯｗａｙが開発したホモ接合型ヒトＯＸ４０ノックインマウスモデル）を使用した。全ての実験は、Ｍａｌｍｏ／Ｌｕｎｄ倫理委員会の許可を得て行った。
【０４０３】
対数期に成長するＭＣ３８結腸癌を０日目に皮下注射（１×１０６個の細胞）した。マ１７日目に１回の治療をマウスに行った（１．３３μｍｏｌのＡｂを腹腔内に投与）。注射の２４時間後、腫瘍および脾臓を採取し、生存マーカー、ＡＰＣＥＦｌｕｏｒ７８０標識抗ＣＤ４５およびＰＥ標識抗ｈＩｇＧで染色し、フローサイトメトリーにより分析した。生きたＣＤ４５＋細胞のうちのｈＩｇＧ＋細胞の割合を、異なるグループ間で比較した。マン・ホイットニー、ノンパラメトリック、２テール検定を使用してデータを分析した。
【０４０４】
結果および結論
ＭＣ３８結腸癌を使用して、ｈＯＸ４０ｔｇマウスにおいて腫瘍局在を誘導する１１６６／１２６１の能力を調べた。実験では、治療後の腫瘍において１１６６／１２６１は検出されたが、アイソタイプ対照は検出されなかった（図２７Ａ）。１１６６／１２６１は脾臓では検出することができず（図２７Ｂ）、腫瘍への局在が示唆された。
【０４０５】
実施例２５−ＭＣ３８結腸癌モデルにおけるＰＤ−１の組み合わせ効果
概要
ＰＤ−１モノクローナル抗体および他の免疫チェックポイント阻害剤を用いた臨床試験の成功により、癌治療の新しい道が開かれた。しかしながら、癌患者の大部分は依然として応答せず、そのため、併用療法の研究が強化されている。ヒトＯＸ４０用のトランスジェニックマウスおよびＭＣ３８結腸癌モデルを使用して、ＰＤ−１の組み合わせにおけるＯＸ４０−ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体を調べた。
【０４０６】
１１６６／１２６１単独で、腫瘍体積の抑制および生存率の増加の形態で統計的に有意な抗腫瘍効果が実証された。加えて、１１６６／１２６１は、ＰＤ−１治療の抗腫瘍効果を著しく向上させることができた。これらのデータは、患者において１１６６／１２６１とＰＤ−１抗体とを組み合わせることの潜在的な利点を示す。
【０４０７】
材料および方法
実験では、フランス国のｇｅｎＯｗａｙによって生成され、社内で飼育された７〜１４週齢のヒトＯＸ４０（ｈＯＸ４０ｔｇ）の雌ホモ接合体を使用した。全ての実験は、Ｍａｌｍｏ／Ｌｕｎｄ倫理委員会の許可を得て行った。
【０４０８】
対数期に成長するＭＣ３８結腸癌を０日目に皮下注射（１×１０６個の細胞）し、１１６６／１２６１（１．３３μｍｏｌ）および／または抗マウスＰＤ−１（２５０μｇ、ＲＰＭ１−１４、ＢｉｏＸｃｅｌｌ、ＵＳＡ）抗体を、７日目、１０日目、および１３日目に腹腔内投与した。腫瘍体積をキャリパーで週３回測定し、式（３／４×π×（幅／２）×（長さ／２）×（高さ／２）を使用して腫瘍体積を計算した。倫理的な腫瘍限界でマウスを殺処分した。マン・ホイットニー、ノンパラメトリック、２テール検定、および生存カプラン・マイヤー、ログランクを使用して、グラフパッドプリズムを使用して腫瘍体積を分析した。
【０４０９】
結果
ＭＣ３８結腸癌モデルを使用して、ｈＯＸ４０ｔｇマウスにおける二重特異性ＯＸ４０−ＣＴＬＡ−４抗体と抗ＰＤ−１との組み合わせ抗腫瘍効果を調べた。実験では、腫瘍体積の抑制および生存率の増加ｐ＝０．０１２４の両方の形態で、１１６６／１２６１によって誘導される抗腫瘍効果が実証された（図２８ＡおよびＢ）。１１６６／１２６１とＰＤ−１治療との組み合わせにより、抗腫瘍効果が有意に増加した（ｐ＜０．０００１）。これらのデータは、１１６６／１２６１が診療所でＰＤ−１抗体を用いて得られた抗腫瘍効果を向上させることができることが実証した。
【０４１０】
実施例２６−ＣＴ２６結腸癌モデルにおけるＰＤ−１の組み合わせ効果
概要
ＰＤ−１モノクローナル抗体および他の免疫チェックポイント阻害剤を用いた臨床試験の成功により、癌治療の新しい道が開かれた。しかしながら、癌患者の大部分は依然として応答せず、そのため、併用療法の研究が強化されている。ヒトＯＸ４０用のトランスジェニックマウスおよびＣＴ２６結腸癌モデルを使用して、ＰＤ−１の組み合わせにおけるＯＸ４０−ＣＴＬＡ二重特異性抗体を調べた。
【０４１１】
１１６６／１２６１単独で、腫瘍体積の抑制および生存率の増加の形態で統計的に有意な抗腫瘍効果が実証された。加えて、１１６６／１２６１は、ＰＤ−１治療の抗腫瘍効果を著しく向上させることができた。これらのデータは、１１６６／１２６１が診療所でＰＤ−１抗体を用いて得られた抗腫瘍効果を向上させることができることを実証した
【０４１２】
材料および方法
実験では、フランス国のｇｅｎＯｗａｙによって生成され、社内で飼育された７〜１４週齢のヒトＯＸ４０（ｈＯＸ４０ｔｇ）の雌ホモ接合体を使用した。全ての実験は、Ｍａｌｍｏ／Ｌｕｎｄ倫理委員会の許可を得て行った。
【０４１３】
対数期に成長するＣＴ２６結腸癌を０日目に皮下注射（１×１０６個の細胞）し、１１６６／１２６１（１．３３μｍｏｌ）および／または抗マウスＰＤ−１（２５０μｇ、ＲＰＭ１−１４、ＢｉｏＸｃｅｌｌ、ＵＳＡ）抗体を、７日目、１０日目、および１３日目に腹腔内投与した。腫瘍体積をキャリパーで週３回測定し、式（３／４×π×（幅／２）×（長さ／２）×（高さ／２）を使用して腫瘍体積を計算した。マン・ホイットニー、ノンパラメトリック、２テール検定、および生存カプラン・マイヤー、ログランクを使用して、グラフパッドプリズムを使用して腫瘍体積を分析した。
【０４１４】
結果
ＣＴ２６結腸癌モデルを使用して、ｈＯＸ４０ｔｇマウスにおける二重特異性ＯＸ４０−ＣＴＬＡ−４抗体と抗ＰＤ−１との組み合わせ抗腫瘍効果を調べた。実験では、腫瘍体積の抑制および生存の増加の両方として、１１６６／１２６１による統計的に有意な効果が実証されたが、ＰＤ−１抗体単独ではいかなる強力な抗腫瘍効果も実証されなかった（図２９ＡおよびＢ）。ＰＤ−１治療に１１６６／１２６１を加えると、ＰＤ−１抗体の抗腫瘍効果が著しく増加した。これらのデータは、１１６６／１２６１が診療所でＰＤ−１抗体を用いて得られた抗腫瘍効果を向上させることができることを実証した。
【０４１５】
実施例２７−ＰＡＮＣ０２膵臓癌に対する１１６６／１２６１の抗腫瘍効果
概要
膵臓腺癌は侵攻性の癌である。膵臓癌の患者は、典型的には、予後が非常に悪く、癌の種類は、米国で４番目に多い癌による死因である。ｈＯＸ４０用のトランスジェニックマウスを使用して、ＰＡＮＣ０２膵臓癌に対する１１６６／１２６１の抗腫瘍効果を検査した。
【０４１６】
１１６６／１２６１は、腫瘍体積の抑制および生存の増加の形態で統計的に有意な抗腫瘍効果を実証した。
【０４１７】
材料および方法
実験では、ｇｅｎＯｗａｙによって生成されたヒトＯＸ４０（ｈＯＸ４０ｔｇ）の雌ノックインマウスを使用した。全ての実験はマルメ／ルンド倫理委員会によって承認された。
【０４１８】
対数期に成長するＰＡＮＣ０２膵臓癌を０日目に皮下注射し（０．２５×１０６個の細胞）、７日目、１０日目、および１３日目に１１６６／１２６１（１．３３μｍｏｌ）による治療を腹腔内で行った。マン・ホイットニー、ノンパラメトリック、２テール検定、および生存カプラン・マイヤー、ログランクを使用して、グラフパッドプリズムを使用して腫瘍体積を分析した。
【０４１９】
結果
ｈＯＸ４０トランスジェニックマウスおよびＰＡＮＣ０２膵臓癌を使用して、膵臓癌に対する１１６６／１２６１の抗腫瘍効果を検査した。１１６６／１２６１は、腫瘍成長の抑制（図３０Ａ）および生存率の増加（図３０Ｂ）の形態で有意な抗腫瘍効果を実証した。
【０４２０】
例２８−１１６６／１２６１はＣＴＬＡ−４遮断を通じてＴ細胞の活性化を回復する
概要
ＣＴＬＡ−４遮断レポーターアッセイで、ＣＴＬＡ−４を遮断し、Ｔ細胞の共刺激および活性化を増加させる１１６６／１２６１の能力を調べた。１１６６／１２６１は、ＣＤ８０／ＣＤ８６のＣＴＬＡ−４への結合を遮断し、ＣＤ２８を介した共刺激を回復させることができ、Ｔ細胞の活性化をもたらした。
【０４２１】
材料および方法
このアッセイでは、ＴＣＲアクチベーターおよびＣＤ８０／ＣＤ８６を発現するＲａｊｉ細胞を使用して、ｌｕｃ２Ｐエレメントを有するＩＬ２プロモーターに接続されたＴＣＲ、ＣＴＬＡ−４、およびＣＤ２８を発現するジャーカットレポーターＴ細胞を共刺激する。活性化は発光として測定される。ＣＴＬＡ−４抗体が存在しない場合、ＣＤ８０／ＣＤ８６はＣＤ２８よりも高い親和性でＣＴＬＡ−４に結合するため、シグナルを遮断する。ＣＴＬＡ−４結合抗体を加えることにより、ＣＴＬＡ−４へのＣＤ８０／ＣＤ８６の結合が遮断され、結果として、ＣＤ２８を介したＴ細胞の共刺激が増加し、Ｔ細胞の活性化をもたらす。
【０４２２】
連続希釈した１１６６／１２６１およびアイソタイプ対照をプレートに固定し、一晩インキュベートした後、ジャーカットレポーター細胞およびＲａｊｉ細胞を加えた。一晩インキュベートした後、Ｔ細胞の活性化を発光として測定した。
【０４２３】
結果および結論
図３１に示されるように、１１６６／１２６１はＴ細胞の活性化を回復することができるが、アイソタイプ対照では効果が見られない。
【０４２４】
実施例２９−ＣＴＬＡ−４架橋に対する１１６６／１２６１により誘導されるＴ細胞活性化
概要
ＣＴＬＡ−４架橋時の連続アゴニストアッセイで、１１６６／１２６１のＴ細胞を活性化する能力を調べた。１１６６／１２６１は、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２の分泌、またはＴ細胞増殖の増加の形態でアゴニストＴ細胞活性化を実証した。
【０４２５】
材料および方法
ヒトＣＤ３＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞を、負の選択（汎Ｔ細胞分離キットまたはＣＤ４＋Ｔ細胞分離キット、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して、ルンド大学病院の血液バンクの白血球フィルターから取得したＰＢＭＣから精製し、連続希釈した１１６６／１２６１、単一特異性抗体１１６６／１１６７＋Ｉｓｏ対照／１２６１またはアイソタイプ対照の混合物と一緒に培養した。
【０４２６】
ＣＴＬＡ−４（Ｏｒｅｎｃｉａ、５μｇ／ｍｌ）およびαＣＤ３（ＯＫＴ３、３μｇ／ｍｌ）でプレコートしたプレート中の試験抗体によりＴ細胞（１００，０００細胞／ウェル）を培養した後に、ＣＤ３＋Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ放出を測定した。７２時間の期間インキュベートした後、ＥＬＩＳＡにより上清中のＩＦＮ−γのレベルを測定した。
【０４２７】
ＣＴＬＡ−４（８００，０００個の受容体／細胞）およびαＣＤ３ビーズ（ＵＣＨＴ−１、セル：ビーズ比１：１．１）を安定して発現する照射ＨＥＫ細胞（３０，０００個の細胞／ウェル）を含むプレート中に試験抗体によりＴ細胞（５０，０００個の細胞／ウェル）を培養することによって、ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ−２の放出を測定した。７２時間後、ＥＬＩＳＡにより上清中のＩＬ−２のレベルを測定した。
【０４２８】
ＣＴＬＡ−４（Ｏｒｅｎｃｉａ、５μｇ／ｍｌ）およびαＣＤ３（ＵＣＨＴ−１、０．１μｇ／ｍｌ）でプレコートしたプレート中に試験化合物によりＣＤ４＋Ｔ細胞（５０，０００個の細胞／ウェル）を培養することによって、増殖を決定した。７２時間後、ＣｅｌｌＴｉｔｒｅ  Ｇｌｏｗ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で増殖を測定した。
【０４２９】
結果および結論
示差Ｔ細胞活性化で、１１６６／１２６１のアゴニスト活性を調べた。図３２の結果は、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２の放出ならびに増殖の観点で１１６６／１２６１の用量依存的効果を実証しているが、これは、単一特異性ＯＸ４０とＣＴＬＡ−４抗体との組み合わせでは見られない。結果は、１１６６／１２６１がＣＴＬＡ−４架橋に対して強力なアゴニスト効果を有することを示す。
【０４３０】
実施例３０ーＦｃγＲ架橋に対する１１６６／１２６１により誘導されるＴ細胞活性化
概要
ＦｃγＲ架橋時のアゴニストアッセイで、Ｔ細胞を活性化する１１６６／１２６１の能力を調べた。１１６６／１２６１は、ＩＬ−２分泌の形態でアゴニストＴ細胞活性化を実証した。
【０４３１】
材料および方法
ＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）を発現するように安定してトランスフェクトされたＣＨＯ細胞に放射線を照射し、プレーティング（１００，０００個の細胞／ウェル）し、一晩接着させた。連続希釈した１１６６／１２６１、単一特異性抗体の組み合わせ（１１６６／１１６７＋対照ＩｇＧ／１２６１）、またはアイソタイプ対照をウェルに加えた。最適以下のＴ細胞活性化のために、αＣＤ３（ＯＫＴ３）でコーティングされたビーズを加えた。負の選択（ＣＤ４＋Ｔ細胞分離キット、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して、ルンド大学病院の血液バンクの白血球フィルターから取得したＰＢＭＣ由来のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を精製し、ウェル（５０，０００個の細胞／ウェル）に加えた。７２時間の期間インキュベートした後、ＥＬＩＳＡによりＩＬ−２分泌を測定した。合計で８人のドナーをアッセイで試験した。
【０４３２】
結果および結論
図３３に示されるように、１１６６／１２６１の用量依存的な活性化が実証されているが、これは単一特異性ＯＸ４０とＣＴＬＡ−４抗体との組み合わせでは見られない。結果は、１１６６／１２６１がＦｃγＲ架橋に対して強力なアゴニスト効果を有することを示す。
【０４３３】
例３１−１１６６／１２６１の主なＴｒｅｇを枯渇させる能力
概要
腫瘍環境では、制御性Ｔ細胞は、ＯＸ４０およびＣＴＬＡ−４の両方の発現が高い。ＯＸ４０−ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体は、特に腫瘍環境において、標的発現細胞のＡＤＣＣを誘導すると予想される。ＡＤＣＣの代理としてヒトＦｃγＲＩＩＩ（Ｖ１５８）に特異的なＡＤＣＣレポーターアッセイを使用して、ＡＤＣＣを誘導する１１６６／１２６１の能力を検査した。１１６６／１２６１は、エフェクター細胞の有意な活性化を実証し、この誘導は、対応するモノクローナル抗体単独（データは示されず）または組み合わせと比較して、活性が優れていた。
【０４３４】
材料および方法
ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１５８）ＡＤＣＣレポーターアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ＡＤＣＣ誘導を決定した。ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒトＣＤ４＋ＣＤ１２７低ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞分離キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した負の選択により、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７低Ｔｒｅｇを単離した。αＣＤ３／αＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｇｉｂｃｏ）の存在下で、Ｔｒｅｇを４８時間活性化し、標的発現を上方制御し、標的細胞として使用した。連続希釈した１１６６／１２６１、単一特異性抗体（１１６６／１１６７＋対照ＩｇＧ／１２６１）の組み合わせ、またはアイソタイプ対照を、エフェクター細胞および標的細胞（５：１の比率）と一緒に６時間培養した。培養の前後のＯＸ４０およびＣＴＬＡ−４の発現をフローサイトメトリーによって測定した。
【０４３５】
結果および結論
１１６６／１２６１がインビトロで制御性Ｔ細胞の枯渇を誘導する能力を、ＡＤＣＣレポーターアッセイによって評価した。図３４Ａに示されるように、１１６６／１２６１には、主なヒトＴｒｅｇでＡＤＣＣを誘導する能力がある。誘導は、対応するモノクローナル抗体単独（データは示されず）またはそれらの混合物よりも著しく高かった。結果は、ＯＸ４０およびＣＴＬＡ−４の発現レベルと相関した。新鮮なまたは未刺激のＴｒｅｇは、低レベルのＯＸ４０およびＣＴＬＡ−４を発現したが、αＣＤ３／αＣＤ２８による活性化後に、それらのレベルは明らかに上方制御された（図３４Ｂ）。
【０４３６】
例３２−１１６６／１２６１の主なＴｒｅｇを枯渇させる能力
概要
腫瘍環境では、制御性Ｔ細胞は、ＯＸ４０およびＣＴＬＡ−４の両方の発現が高い。ＯＸ４０−ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体は、特に腫瘍環境において、標的発現細胞のＡＤＣＣを誘導すると予想される。エフェクター細胞として同種ＮＫ細胞を用いたＬＤＨ放出アッセイを使用して、ＡＤＣＣを誘導する１１６６／１２６１の能力を検査した。１１６６／１２６１は、ＮＫ細胞を介したＴｒｅｇの強力な溶解を誘導した。
【０４３７】
材料および方法
ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒトＣＤ４＋ＣＤ１２７低ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞分離キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した負の選択により、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７低Ｔｒｅｇを単離した。標的発現を上方制御するために、αＣＤ３／αＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｇｉｂｃｏ）の存在下で、Ｔｒｅｇを４８時間活性化し、その後標的細胞として使用した。エフェクター細胞として、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒトＮＫ細胞分離キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した負の選択を使用してＰＢＭＣから単離された同種ＮＫ細胞を使用した。エフェクター細胞および標的細胞を、連続希釈した１１６６／１２６１またはアイソタイプ対照と一緒に１５：１の比率で４時間培養した。その後、上清中のＬＤＨのレベルを測定した。
【０４３８】
結果および結論
図３５に示されるように、１１６６／１２６１には、主なヒトＴｒｅｇにおけるＡＤＣＣを用量依存的に誘導する能力がある。アイソタイプ対照では効果は見られなかった。
【０４３９】
実施例３３−パイロットカニクイザル傷害研究における１１６６／１６２１の評価
概要
カニクイザルで単回投与、用量範囲発見研究を実行した。１１６６／１２６１の単回投与後に、初期（ＣＤ２５＋）および後期（ＣＤ６９＋）Ｔ細胞の数ならびに増殖中枢記憶（ＣＤ１９７＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｋｉ６７＋）の増加が見られた。
【０４４０】
材料および方法
カニクイザルで単回投与、用量範囲発見研究を実行した。用量群は、１匹の雄および１匹の雌からなる。全ての動物が２．５歳以上であった。投与群１〜３は、１時間にわたる静脈内注入として、それぞれ、３、１０、または３０ｍｇ／ｋｇの１１６６／１２６１を受けた。投与群４は、３０ｍｇ／ｋｇの皮下注射を受けた。
【０４４１】
末梢血の免疫表現型検査のために、投与前（２回）および投与後２日目、８日目、１５日目、２９日目、および４３日目に全血試料を採取した。列挙のためにＴｒｕｅｃｏｕｎｔチューブ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用し、染色用の抗体はＢＤ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓまたはＢｉｏｌｅｇｅｎｄから購入した。投与後の試料の倍率差を各個体の２つの投与前の試料の平均と計算することにより、細胞集団の差を比較した。
【０４４２】
結果および結論
１１６６／１２６１の単回投与を受けたカニクイザルにより、初期（ＣＤ６９＋）および後期（ＣＤ２５＋）Ｔ細胞（図３６Ｂ）の数ならびに増殖中枢記憶（ＣＤ１９７＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｋｉ６７＋）Ｔ細胞（図３６Ａ）に対する効果の増加が見られることが実証された。４つの用量群の間に顕著な差は見られなかった。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２−１】
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【図３２−２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年1月7日(2020.1.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
二重特異性ポリペプチドと、１つ以上の治療剤とを含むキットであって、前記二重特異性ポリペプチドが、ＯＸ４０に特異的に結合することができるＢ１と称される第１の結合ドメインと、ＣＴＬＡ−４に特異的に結合することができるＢ２と称される第２の結合ドメインとを含む、キット。
【請求項２】
二重特異性ポリペプチドと、１つ以上の治療剤とを含む組成物であって、前記二重特異性ポリペプチドが、ＯＸ４０に特異的に結合することができるＢ１と称される第１の結合ドメインと、ＣＴＬＡ−４に特異的に結合することができるＢ２と称される第２の結合ドメインとを含む、組成物。
【請求項３】
医薬品として使用するための、ＯＸ４０に特異的に結合することができるＢ１と称される第１の結合ドメインと、ＣＴＬＡ−４に特異的に結合することができるＢ２と称される第２の結合ドメインとを含む、二重特異性ポリペプチドであって、
前記ポリペプチドが、１つ以上の追加の治療剤と組み合わせて使用するためのものである、二重特異性ポリペプチド。
【請求項４】
個体における疾患または症状を治療または予防する方法であって、ＯＸ４０に特異的に結合することができるＢ１と称される第１の結合ドメインと、ＣＴＬＡ−４に特異的に結合することができるＢ２と称される第２の結合ドメインとを含む、二重特異性ポリペプチドを個体に投与することを含み、
前記ポリペプチドが、１つ以上の追加の治療剤と組み合わせて使用するためのものである、方法。
【請求項５】
医薬品の製造における、ＯＸ４０に特異的に結合することができるＢ１と称される第１の結合ドメインと、ＣＴＬＡ−４に特異的に結合することができるＢ２と称される第２の結合ドメインとを含む、二重特異性ポリペプチドの使用であって、
前記ポリペプチドが、１つ以上の追加の治療剤と組み合わせて使用するためのものである、使用。
【請求項６】
前記１つ以上の追加の治療剤、例えば抗代謝剤、アルキル化剤、アントラサイクリンおよび他の細胞傷害性抗生物質、ビンカアルカロイド、エトポシド、白金化合物、タキサン、トポイソメラーゼＩ阻害剤、他の細胞分裂阻害薬、抗増殖免疫抑制剤、コルチコステロイド、性ホルモンおよびホルモンアンタゴニスト、ならびに他の治療抗体（腫瘍関連抗原に対する抗体または免疫チェックポイント調節剤など）が、癌の治療において使用される、請求項１に記載のキット、または請求項２に記載の組成物、または請求項３に記載の使用のための二重特異性ポリペプチド、または請求項４に記載の方法、または請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記１つ以上の追加の治療剤が、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ１３７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＤ２７、およびＫＩＲからなる群から選択される標的に結合する免疫療法剤である、請求項１もしくは６に記載のキット、または請求項２もしくは６に記載の組成物、または請求項３もしくは６に記載の使用のための二重特異性ポリペプチド、または請求項４もしくは６に記載の方法、または請求項５もしくは６に記載の使用。
【請求項８】
前記１つ以上の追加の治療剤が、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１に結合する免疫療法剤、例えばＰＤ１機能を阻害することができる抗ＰＤ１抗体もしくはその抗原結合断片（例えば、Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ、Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ、Ｌａｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ、ＰＤＲ−００１、ＭＥＤＩ−０６８０、およびＡＭＰ−２２４）、またはＰＤ１機能を阻害することができる抗ＰＤ−Ｌ１抗体もしくはその抗原結合断片（例えば、Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ、Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ、Ａｖｅｌｕｍａｂ、およびＭＤＸ−１１０５）である、請求項７に記載のキット、または請求項７に記載の組成物、または請求項７に記載の使用のための二重特異性ポリペプチド、または請求項７に記載の方法、または請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記第１および／または第２の結合ドメインが、抗体またはその抗原結合断片からなる群から選択される、請求項１もしくは６〜８のいずれか１項に記載のキット、または請求項２もしくは６〜８のいずれか１項に記載の組成物、または請求項３もしくは６〜８のいずれか１項に記載の使用のための二重特異性ポリペプチド、または請求項４もしくは６〜８のいずれか１項に記載の方法、または請求項５〜８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
前記抗原結合断片が、Ｆｖ断片（一本鎖Ｆｖ断片、またはジスルフィド結合Ｆｖ断片など）、Ｆａｂ様断片（Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、またはＦ（ａｂ）２断片など）、およびドメイン抗体からなる群から選択される、請求項１もしくは６〜９のいずれか１項に記載のキット、または請求項２もしくは６〜９のいずれか１項に記載の組成物、または請求項３もしくは６〜９のいずれか１項に記載の使用のための二重特異性ポリペプチド、または請求項４もしくは６〜９のいずれか１項に記載の方法、または請求項５〜９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１１】
前記ポリペプチドが、二重特異性抗体である、請求項１もしくは６〜１０のいずれか１項に記載のキット、または請求項２もしくは６〜１０のいずれか１項に記載の組成物、または請求項３もしくは６〜１０のいずれか１項に記載の使用のための二重特異性ポリペプチド、または請求項４もしくは６〜１０のいずれか１項に記載の方法、または請求項５〜１０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１２】
（ａ）結合ドメインＢ１および／もしくは結合ドメインＢ２が、インタクトなＩｇＧ抗体であり、  
（ｂ）結合ドメインＢ１および／もしくは結合ドメインＢ２が、Ｆｖ断片であり、
（ｃ）結合ドメインＢ１および／もしくは結合ドメインＢ２が、Ｆａｂ断片であり、かつ／または
（ｄ）結合ドメインＢ１および／もしくは結合ドメインＢ２が、単一ドメイン抗体である、請求項１１に記載のキット、または請求項１１に記載の組成物、または請求項１１に記載の使用のための二重特異性ポリペプチド、または請求項１１に記載の方法、または請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記二重特異性ポリペプチドが、
（ａ）ＩｇＧ−ｓｃＦｖ二重特異性抗体などの二価の二重特異性抗体（例えば、Ｂ１が、インタクトなＩｇＧであり、Ｂ２が、ＩｇＧの軽鎖のＮ末端および／もしくは軽鎖のＣ末端において、かつ／またはＩｇＧの重鎖のＮ末端および／もしくは重鎖のＣ末端においてＢ１に結合したｓｃＦｖであるか、あるいはその逆であるもの）、
（ｂ）ＤｕｏＢｏｄｙ（登録商標）または「ノブ・イン・ホール」二重特異性抗体（例えば、ｓｃＦｖ−ＫＩＨ、ｓｃＦｖ−ＫＩＨｒ、ＢｉＴＥ−ＫＩＨ、もしくはＢｉＴＥ−ＫＩＨｒなどの一価の二重特異性抗体、
（ｃ）ｓｃＦｖ２−Ｆｃ二重特異性抗体（例えば、ＡＤＡＰＴＩＲ（商標）二重特異性抗体）、
（ｄ）ＢｉＴＥ／ｓｃＦｖ２二重特異性抗体、
（ｅ）用いられる二価またはリンカー／コネクターにかかわらず、ＤＶＤ−Ｉｇ二重特異性抗体または他のＩｇＧ−ＦＡｂ、ＦＡｂ−ＩｇＧ二重特異性抗体、
（ｆ）ＤＡＲＴ系二重特異性抗体（例えば、ＤＡＲＴ−Ｆｃ、ＤＡＲＴ２−Ｆｃ、またはＤＡＲＴ）、
（ｇ）ＤＮＬ−Ｆａｂ３二重特異性抗体、ならびに、
（ｈ）ｓｃＦｖ−ＨＳＡ−ｓｃＦｖ二重特異性抗体からなる群から選択される、請求項１もしくは６〜１２のいずれか１項に記載のキット、または請求項２もしくは６〜１２のいずれか１項に記載の組成物、または請求項３もしくは６〜１２のいずれか１項に記載の使用のための二重特異性ポリペプチド、または請求項４もしくは６〜１２のいずれか１項に記載の方法、または請求項５〜１２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１４】
ヒトＦｃ領域または前記領域の変異型を含み、前記領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４領域、好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ４領域である、請求項１もしくは６〜１３のいずれか１項に記載のキット、または請求項２もしくは６〜１３のいずれか１項に記載の組成物、または請求項３もしくは６〜１３のいずれか１項に記載の使用のための二重特異性ポリペプチド、または請求項４もしくは６〜１３のいずれか１項に記載の方法、または請求項５〜１３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１５】
前記ポリペプチドが、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、および／またはアポトーシスを誘導することができる、請求項１もしくは６〜１４のいずれか１項に記載のキット、または請求項２もしくは６〜１４のいずれか１項に記載の組成物、または請求項３もしくは６〜１４のいずれか１項に記載の使用のための二重特異性ポリペプチド、または請求項４もしくは６〜１４のいずれか１項に記載の方法、または請求項５〜１４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１６】
Ｂ１が、ＯＸ４０に特異的な抗体またはその抗原結合断片であり、
Ｂ２が、ＣＴＬＡ−４に特異的なポリペプチド結合ドメインであり、
ｉ）配列番号３のアミノ酸配列、または
ｉｉ）前記結合ドメインが野生型ヒトＣＤ８６よりも高い親和性でヒトＣＴＬＡ−４に結合することを条件に、配列番号３のアミノ酸配列と比較すると、少なくとも１つのアミノ酸が変化しているアミノ酸配列、を含むかまたはそれからなる、請求項１もしくは６〜１５のいずれか１項に記載のキット、または請求項２もしくは６〜１５のいずれか１項に記載の組成物、または請求項３もしくは６〜１５のいずれか１項に記載の使用のための二重特異性ポリペプチド、または請求項４もしくは６〜１５のいずれか１項に記載の方法、または請求項５〜１５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１７】
前記ポリペプチドによって特異的に結合される前記ＣＴＬＡ−４が、霊長類またはマウス、好ましくはヒトのＣＴＬＡ−４であり、かつ／または前記ポリペプチドによって特異的に結合される前記ＯＸ４０が、霊長類、好ましくはヒトのＯＸ４０である、請求項１もしくは６〜１６のいずれか１項に記載のキット、または請求項２もしくは６〜１６のいずれか１項に記載の組成物、または請求項３もしくは６〜１６のいずれか１項に記載の使用のための二重特異性ポリペプチド、または請求項４もしくは６〜１６のいずれか１項に記載の方法、または請求項５〜１６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１８】
Ｂ１が、少なくとも１つの重鎖（Ｈ）および／または少なくとも１つの軽鎖（Ｌ）を含み、Ｂ２が、前記少なくとも１つの重鎖（Ｈ）または少なくとも１つの軽鎖（Ｌ）に結合している、請求項１もしくは６〜１７のいずれか１項に記載のキット、または請求項２もしくは６〜１７のいずれか１項に記載の組成物、または請求項３もしくは６〜１７のいずれか１項に記載の使用のための二重特異性ポリペプチド、または請求項４もしくは６〜１７のいずれか１項に記載の方法、または請求項５〜１７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１９】
Ｂ１が、
−少なくとも１つの重鎖（Ｈ）および少なくとも１つの軽鎖（Ｌ）を含み、Ｂ２が、前記重鎖もしくは前記軽鎖のいずれかに結合しているか、または
−２つの同一の重鎖（Ｈ）および２つの同一の軽鎖（Ｌ）を含み、Ｂ２が、両方の重鎖もしくは両方の軽鎖に結合している、請求項１８に記載のキット、または請求項１８に記載の組成物、または請求項１８に記載の使用のための二重特異性ポリペプチド、または請求項１８に記載の方法、または請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
Ｎ−Ｃ方向に書かれている以下の式：
（Ａ）Ｌ−（Ｘ）ｎ−Ｂ２、
（Ｂ）Ｂ２−（Ｘ）ｎ−Ｌ、
（Ｃ）Ｂ２−（Ｘ）ｎ−Ｈ、
（Ｄ）Ｈ−（Ｘ）ｎ−Ｂ２、のうちのいずれか１つに従って配置されたポリペプチド鎖を含むかまたはそれからなり、
式中、Ｘがリンカーであり、ｎが０または１である、請求項１もしくは６〜１９のいずれか１項に記載のキット、または請求項２もしくは６〜１９のいずれか１項に記載の組成物、または請求項３もしくは６〜１９のいずれか１項に記載の使用のための二重特異性ポリペプチド、または請求項４もしくは６〜１９のいずれか１項に記載の方法、または請求項５〜１９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２１】
Ｘが、アミノ酸配列ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４７）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＰ（配列番号４８）、ＮＦＳＱＰ（配列番号４９）、ＫＲＴＶＡ（配列番号５０）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１４４）、またはｍ＝１〜７である（ＳＧ）ｍを有するペプチドである、請求項２０に記載のキット、または請求項２０に記載の組成物、または請求項２０に記載の使用のための二重特異性ポリペプチド、または請求項２０に記載の方法、または請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
５０×１０−１０Ｍ、２５×１０−１０Ｍ、もしくは２０×１０−１０Ｍ未満のＫｄでヒトＯＸ４０に結合し、かつ／または６０×１０−９Ｍ、２５×１０−９Ｍ、もしくは１０×１０−９Ｍ未満であるＫｄ値でヒトＣＴＬＡ−４に結合する、請求項１もしくは６〜２１のいずれか１項に記載のキット、または請求項２もしくは６〜２１のいずれか１項に記載の組成物、または請求項３もしくは６〜２１のいずれか１項に記載の使用のための二重特異性ポリペプチド、または請求項４もしくは６〜２１のいずれか１項に記載の方法、または請求項５〜２１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２３】
エフェクターＴ細胞、好ましくはＣＤ４＋エフェクターＴ細胞の活性の増加を誘導し、任意選択的に、前記増加が、前記Ｔ細胞に別々の分子として投与されたＢ１とＢ２との組み合わせによって誘導されるエフェクターＴ細胞の活性の増加よりも少なくとも１．５倍、４．５倍、または７倍高い、請求項１もしくは６〜２２のいずれか１項に記載のキット、または請求項２もしくは６〜２２のいずれか１項に記載の組成物、または請求項３もしくは６〜２２のいずれか１項に記載の使用のための二重特異性ポリペプチド、または請求項４もしくは６〜２２のいずれか１項に記載の方法、または請求項５〜２２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２４】
前記Ｔ細胞活性における増加が、前記Ｔ細胞による増殖の増加、および／またはＩＬ−２産生の増加である、請求項２３に記載のキット、または請求項２３に記載の組成物、または請求項２３に記載の使用のための二重特異性ポリペプチド、または請求項２３に記載の方法、または請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
ＯＸ４０への結合について抗体１１６６／１１６７と競合し、かつ／またはＣＴＬＡ−４への結合についてＣＤ８６突然変異体１０４０（配列番号１７）と競合する、請求項１もしくは６〜２４のいずれか１項に記載のキット、または請求項２もしくは６〜２４のいずれか１項に記載の組成物、または請求項３もしくは６〜２４のいずれか１項に記載の使用のための二重特異性ポリペプチド、または請求項４もしくは６〜２４のいずれか１項に記載の方法、または請求項５〜２４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２６】
ＯＸ４０への結合について抗体１１６６／１２６１と競合し、かつ／またはＣＴＬＡ−４への結合について抗体１１６６／１２６１と競合する、請求項１もしくは６〜２５のいずれか１項に記載のキット、または請求項２もしくは６〜２５のいずれか１項に記載の組成物、または請求項３もしくは６〜２５のいずれか１項に記載の使用のための二重特異性ポリペプチド、または請求項４もしくは６〜２５のいずれか１項に記載の方法、または請求項５〜２５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２７】
Ｂ２（ｉｉ）の前記アミノ酸配列中の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸が、前記配列番号３のアミノ酸配列と比較すると置換されており、任意選択的に、前記配列番号３のアミノ酸配列と比較して挿入または欠失が存在しない、請求項１もしくは６〜２６のいずれか１項に記載のキット、または請求項２もしくは６〜２６のいずれか１項に記載の組成物、または請求項３もしくは６〜２６のいずれか１項に記載の使用のための二重特異性ポリペプチド、または請求項４もしくは６〜２６のいずれか１項に記載の方法、または請求項５〜２６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２８】
前記第１の結合ドメインの前記アミノ酸配列中の前記アミノ酸置換のうちの少なくとも１つが１２２位にあり、任意選択的に、前記アミノ酸配列が、１０７位、１２１位、および１２５位のうちの少なくとも１つで置換されてもいる、請求項２７に記載のキット、または請求項２７に記載の組成物、または請求項２７に記載の使用のための二重特異性ポリペプチド、または請求項２７に記載の方法、または請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
Ｂ２の前記アミノ酸配列が、配列番号６〜２４（表Ｃに示される）のうちのいずれか１つから選択されるアミノ酸配列、または配列番号６〜２４のアミノ酸配列に対して６０％を超える、もしくは７０％を超える、例えば７５もしくは８０％、好ましくは８５％を超える、例えば９０もしくは９５％を超えるアミノ酸同一性を有する前記配列の変異型を含むかまたはそれからなる、請求項１もしくは６〜２８のいずれか１項に記載のキット、または請求項２もしくは６〜２８のいずれか１項に記載の組成物、または請求項３もしくは６〜２８のいずれか１項に記載の使用のための二重特異性ポリペプチド、または請求項４もしくは６〜２８のいずれか１項に記載の方法、または請求項５〜２８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３０】
Ｂ２の前記アミノ酸配列が、配列番号１７（表Ｃに示されるＣＤ８６突然変異体１０４０）のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、請求項１もしくは６〜２９のいずれか１項に記載のキット、または請求項２もしくは６〜２９のいずれか１項に記載の組成物、または請求項３もしくは６〜２９のいずれか１項に記載の使用のための二重特異性ポリペプチド、または請求項４もしくは６〜２９のいずれか１項に記載の方法、または請求項５〜２９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３１】
Ｂ１が、Ｂ２とは独立して存在する場合、以下の機能的特徴：
Ｉ．１０×１０−１０Ｍ未満、より好ましくは５×１０−１０Ｍ未満のＫＤ値でヒトＯＸ４０に結合すること、
ＩＩ．マウスＯＸ４０に結合しないこと、および
ＩＩＩ．他のヒトＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー、例えばヒトＣＤ１３７またはＣＤ４０に結合しないこと、のうちの少なくとも１つを呈する、請求項１もしくは６〜３０のいずれか１項に記載のキット、または請求項２もしくは６〜３０のいずれか１項に記載の組成物、または請求項３もしくは６〜３０のいずれか１項に記載の使用のための二重特異性ポリペプチド、または請求項４もしくは６〜３０のいずれか１項に記載の方法、または請求項５〜３０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３２】
Ｂ１が、
（ａ）８アミノ酸長であり、コンセンサス配列「Ｇ、Ｆ、Ｔ、Ｆ、Ｇ／Ｙ／Ｓ、Ｇ／Ｙ／Ｓ、Ｙ／Ｓ、Ｙ／Ｓ／Ａ」を含む重鎖ＣＤＲ１配列、
（ｂ）８アミノ酸長であり、コンセンサス配列「Ｉ、Ｇ／Ｙ／Ｓ／Ｔ、Ｇ／Ｓ／Ｙ、Ｓ／Ｙ、Ｇ／Ｓ／Ｙ、Ｇ／Ｓ／Ｙ、Ｇ／Ｓ／Ｙ、Ｔ」を含む重鎖ＣＤＲ２配列、
（ｃ）９〜１７アミノ酸長であり、コンセンサス配列「Ａ、Ｒ、Ｇ／Ｙ／Ｓ／Ｈ、Ｇ／Ｙ／Ｆ／Ｖ／Ｄ、Ｇ／Ｙ／Ｐ／Ｆ、−／Ｈ／Ｓ、−／Ｎ／Ｄ／Ｈ、−／Ｙ／Ｇ、−／Ｙ、−／Ｙ、−／Ｗ／Ａ／Ｖ、−／Ａ／Ｙ、−／Ｄ／Ａ／Ｙ／Ｇ／Ｈ／Ｎ、Ｙ／Ｓ／Ｗ／Ａ／Ｔ、Ｌ／Ｍ／Ｉ／Ｆ、Ｄ、Ｙ」を含む重鎖ＣＤＲ３配列、
（ｄ）配列「Ｑ、Ｓ、Ｉ、Ｓ、Ｓ、Ｙ」からなる軽鎖ＣＤＲ１配列、
（ｅ）配列「Ａ、Ａ、Ｓ」からなる軽鎖ＣＤＲ２配列、
（ｆ）８〜１０アミノ酸長であり、コンセンサス配列「Ｑ、Ｑ、Ｓ／Ｙ／Ｇ、−／Ｙ／Ｈ／Ｇ、−／Ｓ／Ｙ／Ｇ／Ｄ／Ｗ、Ｓ／Ｙ／Ｇ／Ｄ、Ｓ／Ｙ／Ｇ／Ｔ、Ｐ／Ｌ、Ｙ／Ｓ／Ｈ／Ｌ／Ｆ、Ｔ」を含む軽鎖ＣＤＲ３配列、から独立して選択されるいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ全ての特徴を含み、
（ｃ）の前記重鎖ＣＤＲ３配列が、好ましくは、コンセンサス配列「Ａ、Ｒ、Ｙ／Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ａ／Ｙ／Ｇ、Ｓ／Ｗ／Ａ、Ｍ／Ｌ、Ｄ、Ｙ」を含む１０アミノ酸長の配列であり、
（ｆ）の前記軽鎖ＣＤＲ３配列が、好ましくは、配列「Ｑ、Ｑ、Ｙ、Ｙ、Ｗ、Ｙ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ」からなる、請求項１もしくは６〜３１のいずれか１項に記載のキット、または請求項２もしくは６〜３１のいずれか１項に記載の組成物、または請求項３もしくは６〜３１のいずれか１項に記載の使用のための二重特異性ポリペプチド、または請求項４もしくは６〜３１のいずれか１項に記載の方法、または請求項５〜３１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３３】
Ｂ１が、表Ａ（１）に示されるＶＨ配列の３つ全ての重鎖ＣＤＲ配列および／もしくは表Ａ（２）に示されるＶＬ配列の３つ全ての軽鎖ＣＤＲ配列を含むか、またはＢ１が、表Ｂに示される重鎖ＶＨ配列および／もしくは軽鎖ＶＬ配列を含む、請求項１もしくは６〜３２のいずれか１項に記載のキット、または請求項２もしくは６〜３２のいずれか１項に記載の組成物、または請求項３もしくは６〜３２のいずれか１項に記載の使用のための二重特異性ポリペプチド、または請求項４もしくは６〜３２のいずれか１項に記載の方法、または請求項５〜３２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３４】
Ｂ１が、コンセンサス配列「Ａ、Ｒ、Ｙ／Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ａ／Ｙ／Ｇ、Ｓ／Ｗ／Ａ、Ｍ／Ｌ、Ｄ、Ｙ」を含む１１アミノ酸長の重鎖ＣＤＲ３配列と、配列番号８９（表Ｂに示される１１６７）の軽鎖ＶＬ配列とを含み、任意選択的に、配列番号８９の軽鎖ＶＬ配列が、配列番号１２５（表Ｄに示される１２６１）のより長い配列の一部として存在する、請求項１もしくは６〜３３のいずれか１項に記載のキット、または請求項２もしくは６〜３３のいずれか１項に記載の組成物、または請求項３もしくは６〜３３のいずれか１項に記載の使用のための二重特異性ポリペプチド、または請求項４もしくは６〜３３のいずれか１項に記載の方法、または請求項５〜３３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３５】
結合ドメインＢ１が、前記配列番号８９（表Ｂに示される１１６７）の軽鎖ＶＬ配列、および配列番号９１（表Ｂに示される１１６６）の重鎖ＶＨ配列、または配列番号８９および／もしくは配列番号９１に対して６０％を超える、もしくは７０％を超える、例えば７５もしくは８０％、好ましくは８５％を超える、例えば９０もしくは９５％を超えるアミノ酸同一性を有する前記配列の変異型を含む、請求項１もしくは６〜３４のいずれか１項に記載のキット、または請求項２もしくは６〜３４のいずれか１項に記載の組成物、または請求項３もしくは６〜３４のいずれか１項に記載の使用のための二重特異性ポリペプチド、または請求項４もしくは６〜３４のいずれか１項に記載の方法、または請求項５〜３４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３６】
Ｂ１が、ヒトＦｃ領域または前記領域の変異型を含み、前記領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４領域、好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ４領域である、請求項１もしくは６〜３５のいずれか１項に記載のキット、または請求項２もしくは６〜３５のいずれか１項に記載の組成物、または請求項３もしくは６〜３５のいずれか１項に記載の使用のための二重特異性ポリペプチド、または請求項４もしくは６〜３５のいずれか１項に記載の方法、または請求項５〜３５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３７】
配列番号１２５〜１３４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、任意選択的に、前記ポリペプチドが、抗体、または配列番号１２５〜１３４のアミノ酸配列に対して６０％を超える、もしくは７０％を超える、例えば７５もしくは８０％、好ましくは８５％を超える、例えば９０もしくは９５％を超えるアミノ酸同一性を有する前記配列の変異型の構成要素部分として提供される、請求項１もしくは６〜３６のいずれか１項に記載のキット、または請求項２もしくは６〜３６のいずれか１項に記載の組成物、または請求項３もしくは６〜３６のいずれか１項に記載の使用のための二重特異性ポリペプチド、または請求項４もしくは６〜３６のいずれか１項に記載の方法、または請求項５〜３６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３８】
配列番号１２５（表Ｄに示される１２６１）のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、請求項１もしくは６〜３７のいずれか１項に記載のキット、または請求項２もしくは６〜３７のいずれか１項に記載の組成物、または請求項３もしくは６〜３７のいずれか１項に記載の使用のための二重特異性ポリペプチド、または請求項４もしくは６〜３７のいずれか１項に記載の方法、または請求項５〜３７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３９】
配列番号１２５のアミノ酸配列および／もしくは配列番号９１のアミノ酸配列、または配列番号１２５および／もしくは配列番号９１に対して６０％を超える、もしくは７０％を超える、例えば７５もしくは８０％、好ましくは８５％を超える、例えば９０もしくは９５％を超えるアミノ酸同一性を有する前記配列の変異型を含むかまたはそれからなる、請求項１もしくは６〜３８のいずれか１項に記載のキット、または請求項２もしくは６〜３８のいずれか１項に記載の組成物、または請求項３もしくは６〜３８のいずれか１項に記載の使用のための二重特異性ポリペプチド、または請求項４もしくは６〜３８のいずれか１項に記載の方法、または請求項５〜３８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４０】
配列番号１２５（表Ｄに示される１２６１）のアミノ酸配列と、配列番号９１（表Ｂに示される１１６１）のアミノ酸配列とを含むかまたはそれらからなる、請求項１もしくは６〜３９のいずれか１項に記載のキット、または請求項２もしくは６〜３９のいずれか１項に記載の組成物、または請求項３もしくは６〜３９のいずれか１項に記載の使用のための二重特異性ポリペプチド、または請求項４もしくは６〜３９のいずれか１項に記載の方法、または請求項５〜３９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４１】
前記二重特異性ポリペプチドが、個々の単一特異性の対応するポリペプチドの複合効果と比較して、腫瘍内ＣＤ８／Ｔｒｅｇ比の相乗的増加を誘導することができる、請求項１もしくは６〜４０のいずれか１項に記載のキット、または請求項２もしくは６〜４０のいずれか１項に記載の組成物、または請求項３もしくは６〜４０のいずれか１項に記載の使用のための二重特異性ポリペプチド、または請求項４もしくは６〜４０のいずれか１項に記載の方法、または請求項５〜４０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４２】
医薬品として使用するための、請求項１もしくは３〜４１のいずれか１項に記載のキット、または請求項２〜４１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４３】
医薬品の製造における、請求項１もしくは３〜４１のいずれか１項に記載のキットの使用、または請求項２〜４１のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項４４】
個体における疾患または症状を治療または予防する方法であって、請求項１もしくは３〜４１のいずれか１項に記載のキット、または請求項２もしくは〜４１のいずれか１項に記載の組成物を個体に投与することを含む、方法。
【請求項４５】
前記疾患または症状が癌であり、任意選択的に、前記個体がヒトである、請求項３もしくは６〜４１のいずれか１項に記載の使用のための二重特異性ポリペプチド、または請求項４２に記載の使用のためのキット、または請求項４２に記載の使用のための組成物、または請求項５〜４１もしくは４３のいずれか１項に記載の使用、または請求項４、６〜４１、もしくは４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記方法が、全身または局所に、例えば腫瘍部位にもしくは腫瘍流入領域リンパ節内に、前記二重特異性ポリペプチドを投与することを含むか、あるいは前記二重特異性ポリペプチドが、全身または局所に、例えば腫瘍部位にもしくは腫瘍流入領域リンパ節内に投与するためのものである、請求項４５に記載の使用のための二重特異性ポリペプチド、または請求項４５に記載の使用のためのキット、または請求項４５に記載の使用のための組成物、または請求項４５に記載の使用、または請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記癌が、前立腺癌、乳癌、結腸直腸癌、膵臓癌、卵巣癌、肺癌、子宮頸癌、横紋筋肉腫、神経芽細胞腫、多発性骨髄腫、白血病、急性リンパ芽球性白血病、黒色腫、膀胱癌、胃癌、頭頸部癌、肝臓癌、皮膚癌、リンパ腫または膠芽腫である、請求項４５もしくは４６に記載の使用のための二重特異性ポリペプチド、または請求項４５もしくは４６に記載の使用のためのキット、または請求項４５もしくは４６に記載の使用のための組成物、または請求項４５もしくは４６に記載の使用、または請求項４５もしくは４６に記載の方法。
【請求項４８】
請求項２もしくは６〜３８のいずれか１項に記載の組成物、および少なくとも１つの薬学的に許容可能な希釈剤または担体。
【国際調査報告】
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