(57)【要約】本発明は、癌治療（癌バイオマーカーを利用する治療を含むがこれに限定されない）のための組成物および方法に関し、特に、癌治療への対象の応答を予測するための組成物および方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌を治療する方法であって、
癌細胞を含むサンプルを対象から得ること、
in vitroでの分析によって前記癌細胞における前記ＲＡＢ５の発現レベルを測定すること、および
前記癌細胞サンプルにおける前記ＲＡＢ５の発現レベルが所定の基準レベルと比較して増加する場合には、前記癌細胞の表面抗原を標的とする免疫複合体の有効量を投与し、前記癌細胞サンプルにおける前記ＲＡＢ５の発現レベルが前記所定の基準レベルと比較して低下する場合には、前記癌細胞の表面抗原を標的とする、薬物または毒素を含まない抗原結合タンパク質を投与することを含む、癌を治療する方法。
【請求項２】
前記癌細胞における前記ＲＡＢ５の発現レベルを測定することが、ＲＡＢ５  ｍＲＮＡのレベルを測定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記癌細胞における前記ＲＡＢ５の発現レベルを測定することが、ＲＡＢ５タンパク質のレベルを測定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＲＡＢ５が、ＲＡＢ５Ａである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＲＡＢ５が、ＲＡＢ５Ｂである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＲＡＢ５が、ＲＡＢ５Ｃである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ＲＡＢ４、ＲＡＢ１１またはＨＳＰ９０のうちの１つ以上の発現レベルを分析する工程をさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＲＡＢ４、ＲＡＢ１１またはＨＳＰ９０のうちの１つ以上の発現レベルを、前記ＲＡＢ５の発現レベルと共に発現指数に組み込む工程、および
該発現指数が所定の基準レベルと比較して増加する場合には、前記癌細胞の表面抗原を標的とする前記免疫複合体の有効量を投与する工程をさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記癌細胞は、外科腫瘍サンプル、生検サンプルまたは血液サンプルから得られる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記免疫複合体が、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＥＧＦＲ、ＣＤ３ε、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５６、ＣＥＡ（ＣＤ６６ｅ）、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ１３８、ＮａＰｉ２ｂ、ｇｐＮＭＢ、ＴＲＯＰ−２、ＧＵＣＹ２Ｃ、Ｎｅｃｔｉｎ−４、ＳＣ−１６、ＳＴＥＡＰ１、ＦＲα、ＩＬ−２Ｒ、ＥｐＣＡＭおよびＭＳＬＮからなる群より選択される抗原に結合する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記免疫複合体が、トラスツズマブエムタンシン、ブレンツキシマブベドチン、イノツズマブオゾガマイシン、ピナツズマブベドチン、ポラツズマブベドチン、リファスツズマブベドチン、グレンバツズマブベドチン（glembatuzumab vedotin）、コルツキシマブラブタンシン、ロルボツズマブメルタンシン、インダツキシマブラブタンシン、サシツズマブゴビチカン（sacitizumab govitican）、ラベツズマブゴビチカン（labetuzumab govitican）、ミラツズマブドキソルビシン、インデュサツマブベドチン、バダスツキシマブタリリン、デニンツズマブマホドチン、エンホルツマブベドチン、ロバルピツズマブテシリン、バンドルツズマブベドチン、ミルベツキシマブソラブタンシン、ＡＢＴ−４１４、ＩＭＧＮ２８９およびＡＭＧ５９５からなる群より選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記免疫複合体が、ＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌ、デニロイキンディフティトックス、モキセツモマブパスドトクス、オポルツズマブモノトキス（oportuzumab monotox）、レジミューン（resimmune）、ＬＭＢ−２、ＤＴ２２１９ＡＲＬ、ＨｕＭ１９５／ｒＧｅｌ、ＲＧ７７８７、ＭＯＣ３１ＰＥおよびＤ２Ｃ７−ＩＴからなる群より選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記癌細胞が、乳癌細胞、結腸直腸癌細胞、肺癌細胞、前立腺癌細胞、黒色腫細胞、神経膠芽腫細胞、膵癌細胞、腎細胞癌細胞、卵巣癌細胞、膀胱癌細胞、子宮内膜癌細胞、胃腸癌細胞、中皮腫細胞、多発性骨髄腫細胞、急性骨髄性白血病細胞、急性リンパ芽球性白血病細胞および非ホジキンリンパ腫からなる群より選択される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記癌細胞の表面抗原の発現を分析する工程をさらに含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記癌細胞が乳癌細胞である、請求項１〜１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記表面抗原が、上皮成長因子受容体（ＨＥＲ１）、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびこれらの組み合わせのうちの少なくとも１つからなる群から選択され、前記抗体薬物複合体または免疫毒素は、該表面抗原の標的である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗体薬物複合体または免疫毒素が、トラスツズマブエムタンシン（Ｔ−ＤＭ１）、ＡＢＴ−４１４、ＩＭＧＮ２８９、ＡＭＧ５９５およびＡＭＧ５９５からなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記表面抗原が、ＨＥＲ２である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記免疫複合体がトラスツズマブエムタンシン（Ｔ−ＤＭ１）である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
患者における癌の治療のための方法において使用するための、表面抗原を標的とする免疫複合体であって、前記患者由来の癌細胞が前記抗原を発現し、in vitroでの発現分析により分析されたＲＡＢ５の発現レベルが、所定の基準レベルと比較して増加する、免疫複合体。
【請求項２１】
前記in vitroでの発現分析が、ＲＡＢ５  ｍＲＮＡの分析である、請求項２０に記載の使用のための免疫複合体。
【請求項２２】
前記in vitroでの発現分析が、ＲＡＢ５タンパク質の分析である、請求項２０に記載の使用のための免疫複合体。
【請求項２３】
前記ＲＡＢ５が、ＲＡＢ５Ａである、請求項２０〜２２に記載の使用のための免疫複合体。
【請求項２４】
前記ＲＡＢ５が、ＲＡＢ５Ｂである、請求項２０〜２２に記載の使用のための免疫複合体。
【請求項２５】
前記ＲＡＢ５が、ＲＡＢ５Ｃである、請求項２０〜２２に記載の使用のための免疫複合体。
【請求項２６】
前記免疫複合体が、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＥＧＦＲ、ＣＤ３ε、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５６、ＣＥＡ（ＣＤ６６ｅ）、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ１３８、ＮａＰｉ２ｂ、ｇｐＮＭＢ、ＴＲＯＰ−２、ＧＵＣＹ２Ｃ、Ｎｅｃｔｉｎ−４、ＳＣ−１６、ＳＴＥＡＰ１、ＦＲα、ＩＬ−２Ｒ、ＥｐＣＡＭおよびＭＳＬＮからなる群より選択される抗原に結合する、請求項１７〜２５のいずれか１項に記載の使用のための免疫複合体。
【請求項２７】
前記免疫複合体が、トラスツズマブエムタンシン、ブレンツキシマブベドチン、イノツズマブオゾガマイシン、ピナツズマブベドチン、ポラツズマブベドチン、リファスツズマブベドチン、グレンバツズマブベドチン（glembatuzumab vedotin）、コルツキシマブラブタンシン、ロルボツズマブメルタンシン、インダツキシマブラブタンシン、サシツズマブゴビチカン（sacitizumab govitican）、ラベツズマブゴビチカン（labetuzumab govitican）、ミラツズマブドキソルビシン、インデュサツマブベドチン、バダスツキシマブタリリン、デニンツズマブマホドチン、エンホルツマブベドチン、ロバルピツズマブテシリン、バンドルツズマブベドチン、ミルベツキシマブソラブタンシン、ＡＢＴ−４１４、ＩＭＧＮ２８９およびＡＭＧ５９５からなる群より選択される、請求項１７〜２５のいずれか１項に記載の使用のための免疫複合体。
【請求項２８】
前記免疫複合体が、ＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌ、デニロイキンディフティトックス、モキセツモマブパスドトクス、オポルツズマブモノトキス（oportuzumab monotox）、レジミューン（resimmune）、ＬＭＢ−２、ＤＴ２２１９ＡＲＬ、ＨｕＭ１９５／ｒＧｅｌ、ＲＧ７７８７、ＭＯＣ３１ＰＥおよびＤ２Ｃ７−ＩＴからなる群より選択される、請求項１７〜２５のいずれか１項に記載の使用のための免疫複合体。
【請求項２９】
前記癌細胞が、乳癌細胞、結腸直腸癌細胞、肺癌細胞、前立腺癌細胞、黒色腫細胞、神経膠芽腫細胞、膵癌細胞、腎細胞癌細胞、卵巣癌細胞、膀胱癌細胞、子宮内膜癌細胞、胃腸癌細胞、中皮腫細胞、多発性骨髄腫細胞、急性骨髄性白血病細胞、急性リンパ芽球性白血病細胞および非ホジキンリンパ腫からなる群より選択される、請求項１７〜２８のいずれか１項に記載の使用のための免疫複合体。
【請求項３０】
前記癌細胞が乳癌細胞である、請求項２８に記載の使用のための免疫複合体。
【請求項３１】
前記表面抗原が、上皮成長因子受容体（ＨＥＲ１）、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびこれらの組み合わせのうちの少なくとも１つからなる群から選択され、前記抗体薬物複合体または免疫毒素は、該表面抗原の標的である、請求項３０に記載の使用のための免疫複合体。
【請求項３２】
前記抗体薬物複合体または免疫毒素が、トラスツズマブエムタンシン（Ｔ−ＤＭ１）、ＡＢＴ−４１４、ＩＭＧＮ２８９、ＡＭＧ５９５およびＡＭＧ５９５からなる群より選択される、請求項３１に記載の使用のための免疫複合体。
【請求項３３】
前記表面抗原が、ＨＥＲ２である、請求項３０に記載の使用のための免疫複合体。
【請求項３４】
前記免疫複合体がトラスツズマブエムタンシン（Ｔ−ＤＭ１）である、請求項３３に記載の使用のための免疫複合体。
【請求項３５】
ヒト癌細胞が、癌細胞の表面抗原を標的とする免疫複合体に対して応答性があるかどうかを、in vitroで決定するための方法であって、
患者から癌細胞を含むサンプルを得ること、およびin vitroでの分析によって前記癌細胞における前記ＲＡＢ５の発現レベルを測定することを含み、
所定の基準レベルと比較して増加した前記ＲＡＢ５の発現レベルが、前記免疫複合体に対する応答性を示す、方法。
【請求項３６】
前記癌細胞における前記ＲＡＢ５の発現レベルを測定することが、ＲＡＢ５  ｍＲＮＡのレベルを測定することを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記癌細胞における前記ＲＡＢ５の発現レベルを測定することが、ＲＡＢ５タンパク質のレベルを測定することを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＲＡＢ５が、ＲＡＢ５Ａである、請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＲＡＢ５が、ＲＡＢ５Ｂである、請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＲＡＢ５が、ＲＡＢ５Ｃである、請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
ＲＡＢ４、ＲＡＢ１１またはＨＳＰ９０のうちの１つ以上の発現レベルを分析する工程をさらに含む、請求項３５〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＲＡＢ４、ＲＡＢ１１またはＨＳＰ９０のうちの１つ以上の発現レベルを、前記ＲＡＢ５の発現レベルと共に発現指数に組み込む工程をさらに含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記癌細胞は、外科腫瘍サンプル、生検サンプルまたは血液サンプルから得られる、請求項３５〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記癌細胞が、乳癌細胞、結腸直腸癌細胞、肺癌細胞、前立腺癌細胞、黒色腫細胞、神経膠芽腫細胞、膵癌細胞、腎細胞癌細胞、卵巣癌細胞、膀胱癌細胞、子宮内膜癌細胞、胃腸癌細胞、中皮腫細胞、多発性骨髄腫細胞、急性骨髄性白血病細胞、急性リンパ芽球性白血病細胞および非ホジキンリンパ腫からなる群より選択される、請求項３５〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記癌細胞が乳癌細胞である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記癌細胞の表面抗原の発現を分析する工程をさらに含む、請求項３５〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記表面抗原が、上皮成長因子受容体（ＨＥＲ１）、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびこれらの組み合わせのうちの少なくとも１つからなる群から選択され、前記抗体薬物複合体または免疫毒素は、該上皮成長因子受容体（ＨＥＲ１）、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３のうちの１つの標的である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記表面抗原が、ＨＥＲ２である、請求項３５〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記ＲＡＢ５の発現レベルがＲＡＢ５の基準の発現レベルと比較して増加する場合に、免疫複合体を対象に投与する工程をさらに含む、請求項３５〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記ＲＡＢ５の発現レベルがＲＡＢ５の基準の発現レベルと比較して低下する場合に、薬物または毒素を含まない抗体を対象に投与する工程をさらに含む、請求項３５〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
＜関連出願への相互参照＞
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１７年６月２３日に出願された米国仮出願第６２／５２４，１１６号の優先権および利益を主張する。
【０００２】
＜技術分野＞
本発明は癌マーカーを含むがこれに限定されない、癌診断、研究および治療のための組成物および方法に関する。特に、本発明は、癌治療に対する対象の応答を予測するための組成物および方法に関する。
【０００３】
＜背景技術＞
個人用医薬品への注目が増加していることは、癌生物学に関する我々の知識の増加と共に、癌治療におけるバイオマーカーの高い可能性を明らかにしている。異なるバイオマーカーのスペクトルは患者の生存を予測するため、治療効果を評価するため、または疾患の進行をモニターするために、臨床実務に既に組み込まれている（Bailey et al, Discovery medicine,2014,17:101-114）。高コストの標的癌治療薬は、治療から利益を得る可能性が最も高い患者を選択するためのバイオマーカーの開発にとって強力な推進力である。この目的のために、規制当局は、臨床評価中の新しい治療のための予測バイオマーカーの組み込みをますます必要とする（Marton & Weiner,Biomed Res Int. 2013; 2013:891391.）。
【０００４】
乳がんは、米国において女性では２番目に多くみられるがんの形態であり、女性では２番目に多いがん死因である。１９８０年代には乳癌の新規症例数が急増したが、現在ではその数は安定しているように思われる。乳癌による死亡率の低下は、おそらく、より多くの女性がマンモグラフィーを受けているという事実によるものである。早期に発見されると、乳癌の治療が成功する機会が大幅に改善される。
【０００５】
乳癌は手術、放射線療法、化学療法、およびホルモン療法によって治療されるが、初期段階で検出された場合に最もしばしば治癒可能である。マンモグラフィーは、乳癌の早期発見のための最も重要なスクリーニング様式である。乳癌は種々のサブタイプに分類されるが、これらのうちのほんの少数が現在、予後または治療の選択に影響を及ぼすことが知られている。最初に乳がんの疑いを認めた患者の管理としては一般に、診断の確定、病期の評価、治療法の選択を行う。診断は、吸引細胞診、触知できない病変に対する定位または超音波技術を用いたコアニードル生検、または切開または切除生検によって確認することができる。
【０００６】
予後は、患者の年齢、疾患の段階、腫瘍壊死の存在を含む原発腫瘍の病理学的特性、腫瘍組織中のエストロゲン受容体（ＥＲ）およびプロゲステロン受容体（ＰＲ）レベル、ＨＥＲ２過剰発現状態および増殖能の測定、ならびに閉経状態および全身健康に影響される。過体重患者はより不良な予後を有し得る（Bastarrachea et al, Annals of Internal Medicine,120: 18[1994]）。予後はまた、人種によって、黒人によって、およびより少ない程度で、白色よりも不良な予後を有するヒスパニック系統によって変化し得る（Elledge et al, Journal of National Cancｅr Institute 86: 705[1994]; Edwards et al, Journal of Clinical Oncology 16: 2693[1998］）。
【０００７】
乳癌に対する３つの主要な治療は、手術、放射線、および薬物療法である。全ての患者に適合する治療はなく、しばしば、２つ以上が必要とされる。この選択は患者の年齢および閉経状態、癌の型（例えば、管対小葉）、その病期、腫瘍がホルモン受容性であるか否か、およびその浸潤性のレベルを含む、多くの因子によって決定される。
【０００８】
乳癌治療は、局所的または全身的として定義される。手術および放射線療法は、腫瘍、乳房、リンパ節、または他の特定の領域を直接治療するため、局所療法とみなされる。薬物療法は、その効果が広範囲に及ぶため、全身療法と呼ばれる。薬物療法には、古典的な化学療法薬、ホルモン遮断治療（例えば、アロマターゼ阻害剤、選択的エストロゲン受容体モジュレーター、およびエストロゲン受容体ダウンレギュレーター）、およびモノクローナル抗体治療（例えば、ＨＥＲ２に対する）が含まれる。それらは、別々に、またはほとんどの場合、異なる組み合わせで使用されてもよい。
【０００９】
ＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２）は乳癌における有効なバイオマーカーであり、ＨＥＲ２遺伝子増幅またはタンパク質過剰発現は新たに診断された乳癌患者の約２０％において見出される（Slamon et al, Science,1989,244,707−712; Hernandez−Blanquistt et al, Breast（Edinburgh, Scotland）,2016,29,170−177）。ＨＥＲ２は、ＨＥＲ２標的化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）（トラスツズマブおよびペルツズマブ）およびチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）（ラパチニブおよびアファチニブ）（Hernandez−Blanquistt, et al., Breast（Edinburgh, Scotland）,2016,29,170−177）での処置のための治療バイオマーカーとして利用される。ＨＥＲ２標的化ｍＡｂおよびＴＫＩの薬理学的効果は薬物−標的相互作用の直接的な結果であり、そして抗体仲介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）（ｍＡｂ）、ＨＥＲ２ダウンレギュレーションおよび成長促進信号の阻害を含む（Rimawi et al, Annual review of medicing,2015,66,111−128; Clynes et al, Nature medicine,2000,6,443−446; Harbeck et al, Breast care,2013,8,49−55）。ＨＥＲ２が受容体仲介エンドサイトーシスを受ける能力はまた、この膜貫通タンパク質を、癌細胞への細胞毒素物質の送達のための候補にする。これは、実際に、２０１３年に転移性乳癌の治療のためのＦＤＡ承認を受けた抗体−薬物結合体（ＡＤＣ）トラスツズマブエムタシン（Ｔ−ＤＭ１）（Lewis Phillips et al, cancer research,2008,68,9280−9290; Verma et al, The New England journal of medicine,2012,367,1783−1791; Barok et al, Breast Cancer research,2011,13,R46）によって例示されている。
【００１０】
Ｔ−ＤＭ１はチオエーテル（Ｎ−マレイミドメチルシクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＭＣＣ））によって高度に細胞毒性のメイタンシン由来薬物ＤＭ−１に連結されたトラスツズマブからなる（Baron et al, Journal of oncology pharmacy practice,2015,21,132-142）。投与すると、Ｔ−ＤＭ１はＨＥＲ２に結合し、ＨＥＲ２仲介エンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれる。エンド／リソソーム経路内のトラスツズマブ構成要素のタンパク質分解は続いて微小管不安定化および細胞死を誘導するＤＭ１の細胞質ゾル放出のメカニズムとして仮定される（Erickson et al, Cancer research,2006,66,4426-4433; Martinez et al, Critical reviews in oncology/hematology,2016,97,96-106）。従って、Ｔ−ＤＭ１は、そのトラスツズマブ構成要素によって生じる薬理学的効果に加えて、細胞内での作用の細胞毒性メカニズムを誘導する。
【００１１】
薬物輸送体としてＨＥＲ２を利用する別のさらに実験的なアプローチはＩ型リボソーム不活性化タンパク質毒素ゲロニンに遺伝的に融合されたＨＥＲ２結合一本鎖可変断片ＭＨ３−Ｂ１からなる、ＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌなどのＨＥＲ２標的融合毒素の使用によるものである（Cao et al, Cancer Res.,2009,69,8987−8995; Cao et al, Mol.Cancer Ther.,2012,11,143−153）。ＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌはＨＥＲ２仲介エンドサイトーシスを介して取り込まれ、続いて細胞質ゾル中に放出され、そこでリボソームに結合し、翻訳を阻害する（Stirpe et al, J Biol.Chem.,1980,255,6947−6953）。従って、ＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌはまた、ＨＥＲ２に対するその結合効果に加えて、細胞内の細胞毒性効果を誘導する。
【００１２】
細胞内作用点を有するＨＥＲ２結合薬物のメカニズムはＨＥＲ２標的化ｍＡｂおよびＴＫＩと比較して明らかにより複雑であり、これは、薬物応答を予測するために使用されるバイオマーカーに反映されるべきである（Ritchie et al, mAbs,2013,5,13−21）。しかし、Ｔ−ＤＭ１有効性のバイオマーカーの評価はＨＥＲ３に加えてＨＥＲ２およびその下流シグナル伝達に焦点が当てられており（Baselga et al, Clinical cancer research,2016,22,3755-3763; Kim et al, Int J Cancer,2016,139,2336-2342）、エンドサイトーシス、エンドサイトーシス小胞輸送およびエキソサイトーシスに関与するタンパク質の影響についてはほとんど知られていない。ＨＥＲ２および他の標的化受容体を標的とする抗体薬物複合体および免疫毒素の予測値を改善するためのさらなるバイオマーカーが必要とされている。本研究は、Ｒａｂ  ＧＴＰａｓｅファミリーのタンパク質（Stenmark, Nature reviews.Molecular cell biology,2009,10,513-525）ならびにＨＥＲ２エンドサイトーシスに特異的に関与するタンパク質を、ＨＥＲ２標的ＡＤＣおよび免疫毒素の治療効果のための可能性のあるバイオマーカーとして評価することを目的とした。
【００１３】
＜発明の概要＞
本発明は、癌バイオマーカーを利用する治療を含むがこれに限定されない癌治療のための組成物および方法に関する。特に、本発明は、癌治療に対する対象の応答を予測するための組成物および方法に関する。
【００１４】
標的となる治療は、患者が利益を得る可能性が最も高い治療を選択するために、検証されたバイオマーカーに強く依存する。ＨＥＲ２は、既に、いくつかのチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）およびＨＥＲ２に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）のための治療バイオマーカーとして役立っている。しかし、ＨＥＲ２は、また、例えば、ＨＥＲ２標的抗体薬物複合体（ＡＤＣ）および抗体毒素複合体（免疫毒素）のような細胞毒素物質を、細胞質ゾルに運搬するための輸送ゲートとしても利用され得る。このような薬物の治療バイオマーカーは、標的として作用するバイオマーカーに加えて、薬物取り込みおよび細胞内作用のメカニズムを反映し得るので、ＴＫＩおよびｍＡｂのバイオマーカーと比較してより複雑であり得る。
【００１５】
本研究では、ＨＥＲ２陽性乳癌細胞株および卵巣癌細胞株のパネルを、ＡＤＣトラスツズマブ−エムタンシン（Ｔ−ＤＭ１）および抗体毒素複合体ＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌの２つのＨＥＲ２標的薬物に対する感受性に関して、評価した。薬物感受性は、ＨＥＲ３およびＥＧＦＲと組み合わせたＨＥＲ２の発現レベルと相関し、これは、エンドサイトーシス輸送に関与するＲａｂ４、Ｒａｂ５、Ｒａｂ１１およびＨＳＰ９０と同様に、毒性部分の薬理学に影響を及ぼし得ると共に、薬物の標的部分の薬理学に影響を及ぼし得る。初期エンドソームマーカーＲａｂ５および初期リサイクリングマーカーＲａｂ４は、Ｔ−ＤＭ１およびＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌの両方に対する治療バイオマーカーである可能性が示された。さらに、ＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌの毒性は、ＨＳＰ９０およびＲａｂ１１（逆）に依存することが示された。本結果は、初めて、ＨＥＲ２標的ＡＤＣおよび抗体毒素複合体、ならびにＡＤＣおよび標的抗体毒素複合体一般のための、可能性のあるバイオマーカーとしての、エンドサイトーシス輸送に関与するタンパク質の概要を説明する。さらに、バイオマーカーと多様な寄与係数との組み合わせを検証するために、数学的アプローチを提供する。
【００１６】
したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、癌と診断された患者を処置するための、抗体薬物複合体または抗体毒素複合体を用いた方法を提供する。当該方法は、ａ）該患者からの生物学的サンプル中における、抗体薬物複合体または抗体毒素複合体の抗体成分の受容体、並びに、Ｒａｂ５、Ｒａｂ４、Ｒａｂ１１およびＨＳＰ９０から選択される少なくとも１つのさらなるタンパク質マーカーの、正規化タンパク質の発現レベルを決定すること；ｂ）該受容体および該マーカーのタンパク質の発現レベルの化合物発現指数を生成すること；ならびにｃ）該化合物発現指数に基づいて、該患者を該抗体薬物複合体または抗体毒素複合体で処置すること、を含む。いくつかの実施形態において、受容体はＨＥＲ２、ＨＥＲ３またはＥＧＦＲである。
【００１７】
いくつかの実施形態において、この方法は、ＲＡＢ５に加えてＨＥＲ２のタンパク質発現のレベルが増加した発現指数を決定した場合に、抗体薬物複合体または抗体毒素複合体を投与することを包む。いくつかの実施形態において、この方法は、Ｒａｂ５およびＲａｂ４に加えてＨＥＲ２のタンパク質の発現レベルが増加した発現指数を決定した場合に、抗体薬物複合体または抗体毒素複合体を投与することを包む。いくつかの実施形態において、この方法は、Ｒａｂ５およびＲａｂ４に加えてＨＥＲ２のタンパク質の発現レベルが増加した発現指数を決定した場合に、抗体薬物複合体または抗体毒素複合体を投与することを包む。いくつかの実施形態において、この方法は、ＲＡＢ５、ＲＡＢ４およびＨＳＰ９０に加えてＨＥＲ２のタンパク質の発現レベルが増加した発現指数を決定した場合に、抗体薬物複合体または抗体毒素複合体を投与する工程を包含する。
【００１８】
いくつかの実施形態において、前記患者からの生物学的サンプルが外科腫瘍サンプル、生検サンプル、または血液サンプルである。いくつかの実施形態において、癌は乳癌、結腸直腸癌、肺癌、前立腺癌、黒色腫、神経膠芽腫、膵癌、腎細胞癌、卵巣癌、膀胱癌、胃腸癌、中皮腫、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、および非ホジキンリンパ腫である。
【００１９】
いくつかの実施形態において、抗体薬物複合体は、トラスツズマブエムタンシン（Ｔ−ＤＭ１、Ｋａｄｃｙｌａ）、ブレンツキシマブベドチン（ＳＧＮ−３５）、イノツズマブオゾガマイシン（ＣＭＣ−５４４）、ピナツズマブベドチン（ＲＧ−７５９３）、ポラツズマブベドチン（ＲＧ−７５９６）、リファスツズマブベドチン（ＤＮＩＢ０６００Ａ、ＲＧ−７５９９）、グレンバツズマブラブタンシン（Glembatuzumab ravtansine）（ＣＤＸ−０１１）、コルツキシマブラブタンシン（ＳＡＲ３４１９）、ロルボツズマブメルタンシン（ＩＭＧＮ−９０１）、インダツキシマブラブタンシン（ＢＴ−０６２）、サシツズマブゴビチカン（sacitizumab govitican）（ＩＭＭＵ−１３２）、ラベツズマブゴビチカン（labetuzumab govitican）（ＩＭＭＵ−１３０）、ミラツズマブドキソルビシン（ＩＭＭＵ−１１０）、インデュサツマブベドチン（ＭＬＮ−０２６４）、バダスツキシマブタリリン（ＳＧＮ−ＣＤ３３Ａ）、デニンツズマブマホドチン（ＳＧＮ−ＣＤ１９Ａ）、エンホルツマブベドチン（ＡＳＧ−２２ＭＥ）、ロバルピツズマブテシリン（ＳＣ１６ＬＤ６．５）、バンドルツズマブベドチン（ＤＳＴＰ３０８６Ｓ、ＲＧ７４５０）、ミルベツキシマブソラブタンシン（ＩＭＧＮ８５３）、ＡＢＴ−４１４、ＩＭＧＮ２８９、またはＡＭＧ５９５である。
【００２０】
いくつかの実施形態において、抗体毒素複合体は、ＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌ、デニロイキンディフティトックス（ＤＡＢ３８９ＩＬ２）、モキセツモマブパスドトクス（ＣＡＴ−８０１５）、オポルツズマブモノトキス（oportuzumab monotox）（ＶＢ４−８４５）、レジミューン（resimmune）、ＬＭＢ−２、ＤＴ２２１９ＡＲＬ、ＨｕＭ１９５／ｒＧｅｌ、ＲＧ７７８７、ＭＯＣ３１ＰＥまたはＤ２Ｃ７−ＩＴである。いくつかの実施形態において、決定することは、免疫分析を含む。
【００２１】
さらなる実施形態は、治療計画を決定する方法を提供する。当該方法は、ａ）前記患者由来の生物学的サンプル中の、抗体薬物複合体または抗体毒素複合体の抗体成分の受容体、ならびに、ＲＡＢ５、ＲＡＢ４、ＲＡＢ１１およびＨＳＰ９０から選択される少なくとも１つのさらなるマーカーの、正規化タンパク質の発現レベルを決定すること；ｂ）前記受容体および前記マーカーのタンパク質の発現レベルの化合物発現指数を生成すること；およびｃ）前記化合物発現指数に基づいて治療計画を推薦することを含む。
【００２２】
さらなる実施形態は、癌を診断された患者由来の生物学的サンプル中の化合物発現指数を決定するための方法を提供する。当該方法は、ａ）患者由来の生物学的サンプル中の、抗体薬物複合体または抗体毒素複合体の抗体成分のリガンド、ならびに、例えば、ＲＡＢ５、ＲＡＢ４、ＲＡＢ１１およびＨＳＰ９０から選択される少なくとも１つのさらなるマーカーの、正規化タンパク質の発現レベルを決定すること、および、ｂ）リガンドおよびマーカーのタンパク質の発現レベルの化合物発現指数を生成すること、を含む。
【００２３】
さらに他の実施形態は、キットを提供する。当該キットは、例えばＨＥＲ２、ＨＥＲ３、およびＥＧＦＲから選択される少なくとも１つの第１のマーカーのタンパク質の発現レベルを検出するための少なくとも１つの第１の試薬と、例えばＲＡＢ５、ＲＡＢ４、ＲＡＢ１１、またはＨＳＰ９０から選択される少なくとも１つの第２のマーカーの発現レベルを検出するための少なくとも１つの第２の試薬と、を含む。いくつかの実施形態において、試薬は抗体である。
【００２４】
さらなる実施形態は、システムを提供する。当該システムは、ａ）例えばＨＥＲ２、ＨＥＲ３、およびＥＧＦＲから選択される少なくとも１つの第１のマーカーの発現レベルを検出するための少なくとも１つの第１の試薬、ならびに、例えばＲＡＢ５、ＲＡＢ４、ＲＡＢ１１、またはＨＳＰ９０から選択される少なくとも１つの第２のマーカーの発現レベルを検出するための少なくとも１つの第２の試薬、および、ｂ）発現レベルに基づいて化合物発現指数を計算するためのコンピュータプロセッサおよびコンピュータソフトウェアを含む。
【００２５】
さらに他の実施形態において、本発明は、患者における癌を治療する方法を提供する。当該方法は、患者から癌細胞を得ること、in vitroでの分析によって癌細胞中のＲＡＢ５の発現レベルを測定すること、癌細胞サンプル中のＲＡＢ５の発現レベルが所定の基準レベルと比較して増加する場合には、癌細胞の表面抗原を標的とする免疫複合体の有効量を投与し、癌細胞サンプル中のＲＡＢ５の発現レベルが所定の基準レベルと比較して低下している場合には、薬物または毒素を含まない抗原結合タンパク質を投与すること、を含む。
【００２６】
いくつかの好ましい実施形態において、癌細胞におけるＲＡＢ５の発現レベルを測定することは、ＲＡＢ５  ｍＲＮＡのレベルを測定することを含む。いくつかの好ましい実施形態において、癌細胞におけるＲＡＢ５の発現レベルを測定することは、ＲＡＢ５タンパク質のレベルを測定することを含む。いくつかの好ましい実施形態において、ＲＡＢ５はＲＡＢ５Ａである。いくつかの好ましい実施形態において、ＲＡＢ５はＲＡＢ５Ｂである。いくつかの好ましい実施形態において、ＲＡＢ５はＲＡＢ５Ｃである。
【００２７】
いくつかの好ましい実施形態において、本方法は、ＲＡＢ４、ＲＡＢ１１またはＨＳＰ９０のうちの１つ以上の発現レベルを分析する工程をさらに含む。いくつかの好ましい実施形態において、この方法は、ＲＡＢ４、ＲＡＢ１１またはＨＳＰ９０のうちの１つ以上の発現レベルを、ＲＡＢ５発現レベルと共に発現指数に組み込む工程、および、発現指数が所定の基準レベルと比較して増加する場合には、癌細胞の表面抗原を標的とする免疫複合体の有効量を投与する工程をさらに包含する。
【００２８】
いくつかの好ましい実施形態において、癌細胞は、外科腫瘍サンプル、生検サンプルまたは血液サンプルから得られる。
【００２９】
いくつかの好ましい実施形態において、免疫複合体は、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＥＧＦＲ、ＣＤ３ε、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５６、ＣＥＡ（ＣＤ６６ｅ）、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ１３８、ＮａＰｉ２ｂ、ｇｐＮＭＢ、ＴＲＯＰ−２、ＧＵＣＹ２Ｃ、Ｎｅｃｔｉｎ−４、ＳＣ−１６、ＳＴＥＡＰ１、ＦＲα、ＩＬ−２Ｒ、ＥｐＣＡＭ、およびＭＳＬＮからなる群より選択される抗原に結合する。いくつかの好ましい実施形態において、免疫複合体は、トラスツズマブエムタンシン、ブレンツキシマブベドチン、イノツズマブオゾガミシン、ピナツズマブベドチン、ポラツズマブベドチン、リファスツズマブベドチン、グレンバツズマブベドチン（glembatuzumab vedotin）、コルツキシマブラブタンシン）、ロルボツズマブメルタンシン、インダツキシマブラブタンシン、サシツズマブゴビチカン（sacitizumab govitican）、ラベツズマブゴビチカン（labetuzumab govitican）、ミラツズマブドキソルビシン、インデュサツマブベドチン、バダスツキシマブタリリン、デニンツズマブマホドチン、エンホルツマブベドチン、ロバルピツズマブテシリン、バンドルツズマブベドチン、ミルベツキシマブソラブタンシン、ＡＢＴ−４１４、ＩＭＧＮ２８９、およびＡＭＧ５９５からなる群より選択される抗体薬物複合体である。いくつかの好ましい実施形態においては、免疫複合体は、ＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌ、デニロイキンディフティトックス、モキセツモマブパスドトクス、オポルツズマブモノトキス（oportuzumab monotox）、レジミューン（resimmune）、ＬＭＢ−２、ＤＴ２２１９ＡＲＬ、ＨｕＭ１９５／ｒＧｅｌ、ＲＧ７７８７、ＭＯＣ３１ＰＥ、およびＤ２Ｃ７−ＩＴからなる群より選択される免疫毒素である。
【００３０】
いくつかの好ましい実施形態において、癌細胞は、乳癌細胞、結腸直腸癌細胞、肺癌細胞、前立腺癌細胞、黒色腫細胞、神経膠芽腫細胞、膵癌細胞、腎細胞癌細胞、卵巣癌細胞、膀胱癌細胞、子宮内膜癌細胞、胃腸癌細胞、中皮腫細胞、多発性骨髄腫細胞、急性骨髄性白血病細胞、急性リンパ芽球性白血病細胞、および非ホジキンリンパ腫からなる群より選択される。
【００３１】
いくつかの好ましい実施形態において、本方法は、癌細胞上の表面抗原の発現を分析する工程をさらに含む。
【００３２】
いくつかの特に好ましい実施形態において、癌細胞は乳癌細胞である。いくつかの好ましい実施形態において、表面抗原は、表皮成長因子受容体（ＨＥＲ１）、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、およびそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つからなる群から選択され、免疫複合体は前記表面抗原に標的とされる。いくつかの好ましい実施形態において、抗体薬物複合体または免疫毒素は、トラスツズマブエムタンシン（Ｔ−ＤＭ１）、ＡＢＴ−４１４、ＩＭＧＮ２８９、ＡＭＧ５９５、およびＡＭＧ５９５からなる群より選択される。いくつかの好ましい実施形態において、表面抗原はＨＥＲ２である。いくつかの好ましい実施形態において、免疫複合体はトラスツズマブエムタンシン（Ｔ−ＤＭ１）である。
【００３３】
いくつかの好ましい実施形態において、本発明は、患者における癌の治療のための方法において使用するための、表面抗原を標的とする免疫複合体を提供し、ここで、該患者由来の癌細胞は該抗原を発現し、そして、in vitroでの発現分析によって分析されるような、所定の基準レベルと比較して増加したＲＡＢ５の発現レベルを示す。他の好ましい実施形態において、本発明は、患者における癌の治療のための方法において使用するための、薬物または毒素に結合していない抗原結合タンパク質を提供し、ここで、該患者由来の癌細胞は該抗原を発現し、そして、in vitroでの発現分析によって分析されるような、所定の基準レベルと比較して低下したＲＡＢ５の発現レベルを示す。
【００３４】
いくつかの好ましい実施形態において、in vitroでの発現分析は、ＲＡＢ５  ｍＲＮＡ分析である。いくつかの好ましい実施形態において、in vitroでの発現分析、ＲＡＢ５タンパク質の分析である。いくつかの好ましい実施形態において、ＲＡＢ５は、ＲＡＢ５Ａである。いくつかの好ましい実施形態において、ＲＡＢ５は、ＲＡＢ５Ｂである。いくつかの好ましい実施形態において、ＲＡＢ５は、ＲＡＢ５Ｃである。
【００３５】
いくつかの好ましい実施形態において、免疫複合体は、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＥＧＦＲ、ＣＤ３ε、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５６、ＣＥＡ（ＣＤ６６ｅ）、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ１３８、ＮａＰｉ２ｂ、ｇｐＮＭＢ、ＴＲＯＰ−２、ＧＵＣＹ２Ｃ、Ｎｅｃｔｉｎ−４、ＳＣ−１６、ＳＴＥＡＰ１、ＦＲα、ＩＬ−２Ｒ、ＥｐＣＡＭ、およびＭＳＬＮからなる群より選択される抗原に結合する。いくつかの好ましい実施形態において、免疫複合体は、トラスツズマブエムタンシン、ブレンツキシマブベドチン、イノツズマブオゾガマイシン、ピナツズマブベドチン、ポラツズマブベドチン、リファスツズマブベドチン、グレンバツズマブベドチン（glembatuzumab vedotin）、コルツキシマブラブタンシン、ロルボツズマブメルタンシン、インダツキシマブラブタンシン、サシツズマブゴビチカン（sacitizumab govitican）、ラベツズマブゴビチカン（labetuzumab govitican）、ミラツズマブドキソルビシン、インデュサツマブベドチン、バダスツキシマブタリリン、デニンツズマブマホドチン、エンホルツマブベドチン、ロバルピツズマブテシリン、バンドルツズマブベドチン、ミルベツキシマブソラブタンシン、ＡＢＴ−４１４、ＩＭＧＮ２８９およびＡＭＧ５９５からなる群より選択される抗体薬物複合体である。いくつかの好ましい実施形態において、免疫複合体は、MH3−B1／rGel、デニロイキンディフティトックス、モキセツモマブパスドトクス、オポルツズマブモノトキス（oportuzumab monotox）、レジミューン（resimmune）、ＬＭＢ−２、ＤＴ２２１９ＡＲＬ、ＨｕＭ１９５／ｒＧｅｌ、ＲＧ７７８７、ＭＯＣ３１ＰＥおよびＤ２Ｃ７−ＩＴからなる群より選択される。
【００３６】
いくつかの好ましい実施形態において、癌細胞は、乳癌細胞、結腸直腸癌細胞、肺癌細胞、前立腺癌細胞、黒色腫細胞、神経膠芽腫細胞、膵癌細胞、腎細胞癌細胞、卵巣癌細胞、膀胱癌細胞、子宮内膜癌細胞、胃腸癌細胞、中皮腫細胞、多発性骨髄腫細胞、急性骨髄性白血病細胞、急性リンパ芽球性白血病細胞、および非ホジキンリンパ腫からなる群より選択される。
【００３７】
いくつかの好ましい実施において、癌細胞は乳癌細胞である。いくつかの好ましい実施形態において、表面抗原は、上皮成長因子受容体（ＨＥＲ１）、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、およびそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つからなる群から選択され、抗体薬物複合体または免疫毒素は、該表面抗原に標的とされる。いくつかの好ましい実施形態において、抗体薬物複合体または免疫毒素は、トラスツズマブエムタンシン（Ｔ−ＤＭ１）、ＡＢＴ−４１４、ＩＭＧＮ２８９、ＡＭＧ５９５、およびＡＭＧ５９５からなる群より選択される。いくつかの好ましい実施において、表面抗原はＨＥＲ２である。いくつかの好ましい実施形態において、免疫複合体は、トラスツズマブエムタンシン（Ｔ−ＤＭ１）である。
【００３８】
なおさらなる好ましい実施形態において、本発明は、ヒト癌細胞が癌細胞上の表面抗原を標的とする免疫複合体に応答性であるかどうかを決定するための、in vitroの方法を提供する。この方法は、患者から癌細胞を含むサンプルを得ること；およびin vitroでの発現分析によって癌細胞中のＲＡＢ５の発現レベルを測定することを含み、ここで、所定の基準レベルと比較して増加したＲＡＢ５発現レベルが、前記免疫複合体に対する応答性を示す。
【００３９】
いくつかの好ましい実施形態において、in vitroでの発現分析は、ＲＡＢ５  ｍＲＮＡ分析である。いくつかの好ましい実施形態において、in vitroでの発現分析は、ＲＡＢ５タンパク質分析である。いくつかの好ましい実施形態において、ＲＡＢ５は、ＲＡＢ５Ａである。いくつかの好ましい実施形態において、ＲＡＢ５は、ＲＡＢ５Ｂである。いくつかの好ましい実施形態において、ＲＡＢ５は、ＲＡＢ５Ｃである。いくつかの好ましい実施形態において、本方法は、ＲＡＢ４、ＲＡＢ１１またはＨＳＰ９０のうちの１つ以上の発現レベルを分析する工程をさらに含む。いくつかの好ましい実施形態において、本方法は、ＲＡＢ４、ＲＡＢ１１またはＨＳＰ９０のうちの１つ以上の発現レベルを、ＲＡＢ５発現レベルと共に発現指数に組み込む工程をさらに含む。
【００４０】
いくつかの好ましい実施形態において、癌細胞は、外科腫瘍サンプル、生検サンプルまたは血液サンプルから得られる。いくつかの好ましい実施形態において、癌細胞は、乳癌細胞、結腸直腸癌細胞、肺癌細胞、前立腺癌細胞、黒色腫細胞、神経膠芽腫細胞、膵癌細胞、腎細胞癌細胞、卵巣癌細胞、膀胱癌細胞、子宮内膜癌細胞、胃腸癌細胞、中皮腫細胞、多発性骨髄腫細胞、急性骨髄性白血病細胞、急性リンパ芽球性白血病細胞、および非ホジキンリンパ腫からなる群より選択される。
【００４１】
いくつかの好ましい実施において、癌細胞は乳癌細胞である。いくつかの好ましい実施形態において、本方法は、癌細胞の表面抗原の発現を分析する工程をさらに含む。いくつかの好ましい実施形態において、表面抗原は、上皮成長因子受容体（ＨＥＲ１）、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、およびそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つからなる群から選択され、抗体薬物複合体または免疫毒素は、上皮成長因子受容体（ＨＥＲ１）、ＨＥＲ２、およびＨＥＲ３のうちの１つを標的とする。いくつかの特に好ましい実施形態において、表面抗原は、ＨＥＲ２である。
【００４２】
いくつかの好ましい実施形態において、本方法は、ＲＡＢ５の基準の発現レベルと比較して増加する場合に、対象に免疫複合体を投与する工程をさらに含む。
【００４３】
いくつかの好ましい実施形態において、本方法は、ＲＡＢ５の発現レベルがＲＡＢ５の基準の発現レベルと比較して低下する場合に、薬物または毒素を含まない抗体を対象に投与する工程をさらに含む。
【００４４】
追加の実施形態を本明細書に記載する。
【００４５】
＜図面の簡単な説明＞
図１のＡは、ＳＫ−ＢＲ−３、ＳＫＯＶ−３、ＨＣＣ１９５４、ＡＵ−５６５、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるＨＥＲ２およびγ-チューブリンの発現のウエスタンブロットの結果である。図１のＢは、ＳＫ−ＢＲ−３、ＳＫＯＶ−３、ＡＵ−５６５、ＨＣＣ１９５４およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５の、各薬物による７２時間の治療後の相対的生存率（ＭＴＴ）を示す。Ｔ−ＤＭ１にはＳ字曲線適合モデルａ／（１＋ｅｘｐ（−（ｘ−ｘ０）／ｂ））を用いた。データの値（％）は、３つの独立した実験（トラスツズマブ、エラーバー：ＳＥ）の平均、または少なくとも３つの別々の実験（Ｔ−ＤＭ１およびＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌ、エラーバー：ＳＤ）のうち１つの結果を代表して表している。
【００４６】
図２のＡは、細胞内作用性の標的治療薬であるトラスツズマブおよびＨＥＲ２への細胞感受性の模式図である。図２のＢは、ＳＫ−ＢＲ−３、ＳＫＯＶ−３、ＡＵ−５６５、ＨＣＣ１９５４およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞のうち、トラスツズマブ、Ｔ−ＤＭ１およびＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌへの細胞感受性を示す。ＩＣ５０は、細胞の５０％の生存率を阻害する薬物濃度を示す。ＴＩは、ＩＣ５０（ｒＧｅｌ）／ＩＣ５０（ＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌ）である。ＳＫ−ＢＲ−３、ＳＫＯＶ−３、ＡＵ−５６５、ＨＣＣ１９５４およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞における、ＨＥＲ２（Ｄ１）、ＨＥＲ３（Ｄ２）、ＥＧＦＲ（Ｄ３）およびγ−チューブリン発現の、ウエスタンブロット（ｎ＝２）による代表の結果（Ｃ）および発現量の結果（Ｄ）を示す。また、ＨＥＲ２とＴ−ＤＭ１感度（１／ＩＣ５０（Ｔ−ＤＭ１））（Ｅ１）またはＭＨ３−Ｂ１／Ｇｅｌ感度（ＴＩ）（Ｅ２）との線形回帰解析曲線を示す。
【００４７】
図３は、Ｔ−ＤＭ１感受性（ＡおよびＢ）およびＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌ感受性（Ｃ、ＤおよびＥ）に対するＨＥＲ３およびＥＧＦＲ発現のＨＥＲ２を伴う影響を示す。図３のＡおよびＢについて、左の図は、５つの細胞株におけるＨＥＲ３（Ａ１）またはＥＧＦＲ（Ｂ１）発現とＴ−ＤＭ１感受性との線形回帰分析曲線を示す。中央の図は、５つの細胞株におけるＴ−ＤＭ１感受性に対するＨＥＲ２発現に加え、ＨＥＲ３（Ａ２）またはＥＧＦＲ（Ｂ２）発現からの寄与係数の機能として、線形回帰によるＲ２値を示す。Ａ３は最適化された線形回帰分析曲線を表し、ここで、Ｔ−ＤＭ１感度は、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３発現の両方に、線形相関がみられた（寄与係数：０．２）。Ｂ３は、５つの細胞株におけるＴ−ＤＭ１感受性に対するＨＥＲ２発現およびＨＥＲ３発現（寄与係数０．２）に加えて、ＥＧＦＲ発現からの影響係数の機能として、線形回帰によるＲ２値を示す。図３のＣおよびＤについて、左の図は、５つの細胞株におけるＨＥＲ３（Ｃ１）またはＥＧＦＲ（Ｄ１）発現とＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌ感受性との間の線形回帰分析曲線を示す。中央の図は、５つの細胞株におけるＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌ感受性に対するＨＥＲ２発現のものに加えて、ＨＥＲ３（Ｃ２）またはＥＧＦＲ（Ｄ２）発現の影響の機能として、線形回帰によるＲ２値を示す。右の図は、ＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌ感度がＨＥＲ２およびＨＥＲ３発現（寄与係数：０．４）（Ｃ３）またはＨＥＲ２およびＥＧＦＲ発現（寄与係数：０．３）（Ｄ３）の両方に線形相関する、最適化された線形回帰分析曲線を表す。Ｅ１は、５つの細胞株におけるＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌ感受性に対するＨＥＲ２およびＥＧＦＲ発現（寄与係数０．３）に加えて、ＨＥＲ３発現からの影響係数の機能として、線形回帰によるＲ２値を示す。Ｅ２は、ＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌ感度がＨＥＲ２、ＥＧＦＲ（寄与係数０．３）およびＨＥＲ３発現（寄与係数０．４）に線形相関する、最適化された線形回帰分析曲線を表す。
【００４８】
図４は、ＳＫ−ＢＲ−３、ＳＫＯＶ−３、ＡＵ−５６５、ＨＣＣ１９５４およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞におけるＲａｂ５、Ｒａｂ４、ＨＳＰ９０、Ｒａｂ１１およびγ−チューブリン発現のウエスタンブロット（ｎ＝２）による代表の結果（Ａ）および発現量の結果（Ｂ−Ｅ）を示す。
【００４９】
図５は、Ｔ−ＤＭ１感受性に対するＲａｂ５、Ｒａｂ４、ＨＳＰ９０およびＲａｂ１１発現のＨＥＲ２を伴う影響を示す。左の図は、５つの細胞株におけるＲａｂ５（Ａ１）、Ｒａｂ４（Ｂ１）、ＨＳＰ９０（Ｃ１）またはＲａｂ１１（Ｄ１）発現とＴ−ＤＭ１感受性との間の線形回帰分析曲線を示す。中央の図は、５つの細胞株におけるＴ−ＤＭ１感受性に対するＨＥＲ２発現のものに加えて、Ｒａｂ５（Ａ２）、Ｒａｂ４（Ｂ２）、ＨＳＰ９０（Ｃ２）または１／Ｒａｂ１１（Ｄ２）発現からの影響係数の機能として、線形回帰によるＲ２値を示す。右の図は、Ｔ−ＤＭ１感度がＨＥＲ２およびＲａｂ５（寄与係数：０．３）（Ａ３）、Ｒａｂ４（寄与係数：０．４）（Ｂ３）または１／Ｒａｂ１１（寄与係数：０．２）（Ｄ３）発現の両方に線形相関する最適化された線形回帰分析曲線を表す。
【００５０】
図６は、ＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌ感受性に対するＲａｂ５、Ｒａｂ４、ＨＳＰ９０およびＲａｂ１１発現のＨＥＲ２を伴う影響を示す。左の図は、５つの細胞株におけるＲａｂ５（Ａ１）、Ｒａｂ４（Ｂ１）、ＨＳＰ９０（Ｃ１）またはＲａｂ１１（Ｄ１）発現とＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌ感受性との間の線形回帰分析曲線を示す。中央の図は、５つの細胞株におけるＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌ感受性に対するＨＥＲ２発現のものに加えて、Ｒａｂ５（Ａ２）、Ｒａｂ４（Ｂ２）、ＨＳＰ９０（Ｃ２）または１／Ｒａｂ１１（Ｄ２）発現からの影響係数の機能として、線形回帰によるＲ２値を示す。右の図は、ＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌ感度がＨＥＲ２およびＲａｂ５（寄与係数：０．３）（Ａ３）、Ｒａｂ４（寄与係数：０．６）（Ｂ３）、ＨＳＰ９０（寄与係数：１）（Ｃ３）または１／Ｒａｂ１１（寄与係数：１）（Ｄ３）発現の両方に線形相関する、最適化された線形回帰分析曲線を表す。
【００５１】
図７は、ＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌ感受性に対するＲａｂ５、Ｒａｂ４およびＨＳＰ９０または１／Ｒａｂ１１発現のＨＥＲ２を伴う影響を示す。Ａ１は、５つの細胞株におけるＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌ感受性に対するＨＥＲ２およびＲａｂ５発現（寄与係数０．３）に加えて、Ｒａｂ４発現からの影響係数の機能として、線形回帰によるＲ２値を示す。Ａ２は、ＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌ感度がＨＥＲ２、Ｒａｂ５（寄与係数０．３）およびＲａｂ４発現（寄与係数０．６）に線形相関する最適化された線形回帰分析曲線を表す。Ｂ１は、５つの細胞株におけるＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌ感受性に対するＨＥＲ２、Ｒａｂ５（寄与係数０．３）、およびＲａｂ４（寄与係数０．６）に加えて、ＨＳＰ９０発現からの影響係数の機能として、線形回帰によるＲ２値を示す。Ｂ２は、ＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌ感度がＨＥＲ２、Ｒａｂ５（寄与係数０．３）、Ｒａｂ４発現（寄与係数０．６）およびＨＳＰ９０発現（寄与係数０．８）に線形相関する最適化された線形回帰分析曲線を表す。Ｃ１は、５つの細胞株におけるＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌ感受性に対するＨＥＲ２、Ｒａｂ５（寄与係数０．３）、Ｒａｂ４（寄与係数０．６）およびＨＳＰ９０（寄与係数０．８）に加えて、１／Ｒａｂ１１発現からの影響係数の機能として、線形回帰によるＲ２値を示す。Ｃ２は、ＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌ感度がＨＥＲ２、Ｒａｂ５（寄与係数０．３）、Ｒａｂ４発現（寄与係数０．６）、ＨＳＰ９０発現（寄与係数０．８）および１／Ｒａｂ１１発現（寄与係数０．４）に線形相関する最適化された線形回帰分析曲線を表す。
【００５２】
図８は、Ｔ−ＤＭ１（Ａ）またはＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌ感受性（Ｂ）に対する、ＨＥＲ３およびＥＧＦＲの組み合わせ（Ａ１、Ｂ１）、または、Ｒａｂ５、Ｒａｂ４、ＨＳＰ９０および１／Ｒａｂ１１の組み合わせの発現（Ａ２、Ｂ２）のＨＥＲ２を伴う影響を示す。提示された結果は図５、６および７に示したものと同じであるが、ここでは同じ図面に組み込まれる。先に示した（Ｃ）における、Ｔ−ＤＭ１およびＭＨ３−Ｂ１／Ｇｅｒ感受性のバイオマーカーを模式的に示している。矢印はそのバイオマーカーによって示唆された薬物を示し、矢印の幅は、薬物感受性に対するタンパク質の影響を示す。丸は、組み合わせについて示す２つのプールされたバイオマーカーを示す。
【００５３】
図９は、バイオマーカーｘ処置相互作用のｐ値を最小化する閾値を決定するためのモンテカルロ２倍交差検定手順の結果を示す。
【００５４】
図１０は、ＲＡＢ５Ａ発現に関連するベイズｐＣＲ確率曲線を示す。
【００５５】
＜定義＞
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語および表現を下記とおり定義する。
【００５６】
本明細書中で使用される場合、用語「抗原結合タンパク質」は、抗原に結合する部分、および必要に応じて、抗原結合部分が、抗原結合タンパク質の抗原への結合を促進するコンホメーションをとることを可能にする、足場またはフレームワーク部分を含むタンパク質をいう。抗原結合タンパク質の例としては、抗体、抗体フラグメント（例えば、抗体の抗原結合部分）、抗体誘導体、および抗体アナログが挙げられる。抗原結合タンパク質は、例えば、代替のタンパク質足場、または移植されたＣＤＲもしくはＣＤＲ誘導体を有する人工足場を含み得る。このような足場には、例えば、抗原結合タンパク質の三次元構造を安定化するために導入された突然変異を含む抗体由来足場、ならびに、例えば、生体適合性ポリマーを含む完全合成足場が含まれるが、これらに限定されない。抗原結合タンパク質の例としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体、ミニボディ、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、一本鎖Ｆｖフラグメントなどを含むが、これらに限定されない。
【００５７】
本明細書中で使用される場合、用語「免疫複合体」は、薬物または毒素のような別の薬剤に、例えば化学結合またはペプチドリンカーによって連結または結合する抗原結合タンパク質を含む分子をいう。用語「免疫複合体」は、抗体薬物複合体、免疫毒素、およびアフィニティトキシン（affinity toxins）を包含する。この分子の抗原結合タンパク質部分は、免疫グロブリンまたはその抗原結合断片もしくは抗原結合誘導体であり、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体、ミニボディ、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、一本鎖Ｆｖフラグメントなどであり得る。抗原結合タンパク質部分は、また、細胞表面抗原に結合することができるタンパク質リガンドであってもよい。例えば、ＥＧＦは、細胞表面に発現したＥＧＦ受容体を標的とすることができる。
【００５８】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体薬物複合体（ＡＤＣ）」は、薬物分子に、通常は化学結合を介して連結されるか、またはそうでなければ結合する、抗原結合タンパク質を含む分子に関する。
【００５９】
本明細書中で使用される場合、用語「免疫毒素」は、毒素分子に、通常はペプチドリンカーを介して連結されるか、またはそうでなければ結合する抗原結合タンパク質を含む分子に関する。
【００６０】
本明細書中で使用される場合、用語「親和性毒素」は、細胞表面抗原に結合することができるタンパク質リガンドを含む分子に関し、ここで、タンパク質リガンドは、毒素分子に、通常はペプチドリンカーを介して連結されるか、またはそうでなければ結合する。
【００６１】
本明細書中で使用される場合、癌細胞は、細胞と免疫複合体との接触の際に測定可能な毒素反応が検出され得る場合に、免疫複合体に対して「応答性」である。
【００６２】
本明細書中で使用される場合、用語「検出する」、「検出されている」、または「検出」は、組成物を発見もしくは識別する一般的な行為、または、特定の観察のいずれかを表し得る。
【００６３】
本明細書中で使用される場合、用語「核酸分子」はＤＮＡまたはＲＮＡを含むがこれらに限定されない、任意の核酸含有分子に関する。この用語は、４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、プソイドイソシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルプソイドウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルケオシン、５’−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、プソイドウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、プソイドウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、および２，６−ジアミノプリンを含むが、これらに限定されない、ＤＮＡおよびＲＮＡの既知の塩基類似体のいずれかを含む。
【００６４】
本明細書中で使用される場合、用語「増幅オリゴヌクレオチド」は、標的核酸またはその相補体にハイブリダイズし、そして核酸増幅反応に関与するオリゴヌクレオチドに関する。増幅オリゴヌクレオチドの例は、増幅プロセスにおいて、テンプレート核酸にハイブリダイズし、ポリメラーゼによって伸長される３’ＯＨ端部を含む「プライマー」である。増幅オリゴヌクレオチドの別の例は、ポリメラーゼによって伸長されないが（例えば、３’ブロック末端を有するため）、増幅に関与するか、または増幅を促進するオリゴヌクレオチドである。増幅オリゴヌクレオチドは、任意選択で、増幅反応に関与するが標的核酸に相補的ではないか、または標的核酸に含まれない、修飾ヌクレオチドもしくはアナログ、または追加のヌクレオチドを含むことができる。増幅オリゴヌクレオチドは、標的またはテンプレート配列に相補的でない配列を含み得る。例えば、プライマーの５’領域は、標的核酸に非相補的であるプロモーター配列（「プロモーター−プライマー」と呼ばれる）を含み得る。当業者は、プライマーとして機能する増幅オリゴヌクレオチドが５’プロモーター配列を含むように改変され得、したがって、プロモーター−プライマーとして機能し得ることを理解する。同様に、プロモーター−プライマーは、プロモーター配列を除去するように改変されてもよく、また、プロモーター配列を有さないように合成されてもよく、それでもなおプライマーとして機能する。３’ブロック増幅オリゴヌクレオチドは、プロモーター配列を提供し得、そして重合のためのテンプレート（「プロモーター−提供者」と呼ばれる）として役立ち得る。
【００６５】
本明細書中で使用される場合、用語「プライマー」は、オリゴヌクレオチドに関し、精製された制限消化物として天然に存在するか、または合成的に生成されるかに関わらず、核酸鎖に相補的であるプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下（例えば、ヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼのような誘導剤の存在下、そして適切な温度およびｐＨ環境下）に置かれた場合に、合成の開始点として作用し得る。プライマーは増幅における効率を最大化するために、好ましくは一本鎖であるが、代わりに二本鎖であってもよい。二本鎖の場合、プライマーは伸長産物を調製するために使用される前に、最初にその鎖を分離するように処理される。好ましくは、プライマーがオリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、誘導剤の存在下で伸長産物の合成を開始するのに十分な長さであるべきである。プライマーの正確な長さは、温度、プライマーの供給源、および方法の使用を含む多くの因子に依存する。
【００６６】
本明細書中で使用される場合、用語「プローブ」は、オリゴヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）に関し、精製された制限消化物として天然に存在するか、または合成的に、組換え的に、またはＰＣＲ増幅によって生成されたかに関わらず、目的の別のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部にハイブリダイズし得る。プローブは、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。プローブは、特定の遺伝子配列の検出、同定および単離に有用である。本発明において使用される任意のプローブは、任意の「レポーター分子」で標識され、その結果、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡ、ならびに酵素に基づく組織化学分析）、蛍光系、放射性系、および発光系を含むがこれらに限定されない、任意の検出系において検出可能であることが意図される。本発明を、任意の特定の検出システムまたは標識に限定することは意図しない。いくつかの実施形態において、レポーター分子は「外因性のレポーター分子」である。
【００６７】
用語「外因性のレポーター分子」は、検出試薬（例えば、プローブ、核酸、または抗体）に関連した、天然に見出されないレポーター分子または標識に関する。その例として、酵素レポーター分子、蛍光レポーター分子、放射性レポーター分子、または発光レポーター分子が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６８】
「単離された」という用語は、核酸に関して使用する場合、「単離されたオリゴヌクレオチド」または「単離されたポリヌクレオチド」というように、その天然の供給源において通常関連する少なくとも１つの構成要素または汚染物質から同定および分離される核酸配列に関する。単離された核酸は、天然に見出されるものとは異なる形態または設定で存在する。対照的に、ＤＮＡおよびＲＮＡのような核酸のような単離されていない核酸は、それらが天然に存在する状態で見出される。例えば、所定のＤＮＡ配列（例えば、遺伝子）は宿主細胞染色体上で隣接する遺伝子の近傍に見出され；特定のタンパク質をコードする特異的ｍＲＮＡ配列のようなＲＮＡ配列は、多数のタンパク質をコードする多数の他のｍＲＮＡとの混合物として細胞内に見出される。しかしながら、所定のタンパク質をコードする単離された核酸は、例として、核酸が天然細胞の染色体位置とは異なる染色体位置にあるか、または天然に見出されるものとは異なる核酸配列によって隣接される、所与のタンパク質を通常発現する細胞中のそのような核酸を含む。単離された核酸、オリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖の形態で存在し得る。単離された核酸、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを利用してタンパク質を発現させる場合、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、最小限のセンス鎖またはコード鎖を含有するが（すなわち、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは一本鎖であってもよい）、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含有する可能性がある（すなわち、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは二本鎖であってもよい）。
【００６９】
本明細書中で使用される場合、用語「精製された」または「精製する」は、サンプルからの成分（例えば、汚染物質）の除去に関する。例えば、抗体は、混入している非免疫グロブリンタンパク質の除去によって精製され、それらはまた、標的分子に結合しない免疫グロブリンの除去によって精製される。非免疫グロブリンタンパク質の除去および／または標的分子に結合しない免疫グロブリンの除去は、サンプル中の免疫グロブリンの標的反応性比率の増加をもたらす。別の例では、組換えポリペプチドを細菌宿主細胞中で発現させ、宿主細胞タンパク質の除去によってポリペプチドを精製し、それによってサンプル中の組換えポリペプチドの比率を増加させる。
【００７０】
本明細書において使用される用語「サンプル」は、その最も広範な意味で使用される。１つの意味では、生物学的サンプルおよび環境サンプルと同様に、任意の供給源から得られた標本または培養物を含むことを意味する。生物学的サンプルは、動物（ヒトを含む）から得られ、液体、固体、組織、および気体を包含する。生物学的サンプルは、血漿、血清などのような血液産物を含む。環境サンプルは、地表物質、土壌、水、結晶および産業サンプルのような環境材料を含む。しかしながら、このような例は、本発明に適用可能なサンプルの種類を限定するものとして解釈されるべきではない。
【００７１】
＜発明の詳細な説明＞
本発明は、癌バイオマーカーを利用する治療を含むがこれに限定されない、癌治療のための組成物および方法に関する。特に、本発明は、癌治療に対する対象の反応を予測するための組成物および方法に関する。
【００７２】
個人専用医薬品への焦点の拡大は、癌生物学に関する我々の知識の増加と共に、癌治療におけるバイオマーカーの使用の大きな可能性を明らかにした。患者の生存を予測し、治療効果を評価し、または疾患進行をモニタリングするために、様々なバイオマーカーのスペクトルが臨床診療にすでに組み込まれている。予測バイオマーカーは、患者による、特定の治療から利益を得る可能性が最も高い注意深い選択を可能にし、したがって、このような知識は、現在および将来の高コスト標的癌治療を合理的に活用するために極めて重要である。
【００７３】
したがって、ここで提供するのは、１つ以上のタンパク質マーカーの発現に基づいて、癌（例えば、乳癌）を有する対象に対する処置を決定する、推薦する、および／または投与するためのシステムおよび方法である。本発明は、特定のマーカーに限定されない。いくつかの実施形態において、抗体（例えば、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＥＧＦＲ）に対する抗原と、１つ以上のさらなるマーカー（例えば、ＲＡＢ５（好ましくはＲＡＢ５Ａ）、ＲＡＢ４、ＲＡＢ１１およびＨＳＰ９０またはＨＥＲ３およびＥＧＦＲ）との組み合わせは、単独でまたは組み合わせて検出される。いくつかの実施形態において、前記組み合わせ物または複数のマーカーの発現レベルを組み合わせて、化合物発現指数を生成する。
【００７４】
いくつかの好ましい実施形態において、本発明は、患者における癌を治療するための方法を提供する。当該方法は、患者から癌細胞を得ること、in vitroでの発現分析によって癌細胞中のＲＡＢ５の発現レベルを測定すること、ならびに、癌細胞サンプル中のＲＡＢ５の発現レベルが所定の基準レベルと比較して増加する場合、癌細胞の表面抗原を標的とする免疫複合体の有効量を投与すること、または、癌細胞サンプル中のＲＡＢ５の発現レベルが所定の基準レベルと比較して低下する場合、薬物または毒素を含まない抗原結合タンパク質を投与すること、を含む。ＲＡＢ５Ａ、ＲＡＢ５Ｂ、もしくはＲＡＢ５Ｃ、またはそれらの組み合わせのいずれか１つの発現を分析してもよい。いくつかの特に好ましい実施形態において、ＲＡＢ５Ａの発現を分析する。
【００７５】
上述したように、いくつかの好ましい実施形態において、免疫複合体または毒素または薬物に結合されていない抗原結合タンパク質を投与するかどうかの決定は、所定の基準レベルまたは閾値レベルと比較した、患者サンプル中のＲＡＢ５、好ましくはＲＡＢ５Ａの測定された発現の比較に基づく。当業者は、基準レベルまたは閾値レベルが適切な患者集団から得られた発現データを適用した統計的手順によって決定され得ることを認識する。適切な統計的方法論は実施例において提供するが、当業者は他の統計的手順もまた利用できることを認識する。さらに、異なる統計的手順または同じ手順が異なるまたは拡張されたデータセットを実行し、異なる基準レベルまたは閾値レベルを生成し得ることは認識される。したがって、本発明は、任意の特定のマーカー（例えば、ＲＡＢ５Ａ）またはマーカーの組み合わせの発現のための、任意の特定の基準レベルまたは閾値レベルの使用に限定されない。この点に関して、いくつかの実施形態において、本発明の方法は、ＲＡＢ４、ＲＡＢ１１またはＨＳＰ９０のうちの１つ以上の発現レベルを分析することをさらに含む。いくつかの好ましい実施形態において、ＲＡＢ４、ＲＡＢ１１、またはＨＳＰ９０のうちの１つ以上のサンプル中の発現レベルは、ＲＡＢ５の発現レベル、好ましくはＲＡＢ５Ａの発現レベルを有する発現指数に組み込まれ、発現指数が所定の基準レベルと比較して増加する場合、癌細胞の表面抗原を標的とする免疫複合体の有効量を投与する。
【００７６】
いくつかの好ましい実施形態において、本発明の方法において使用する患者サンプルは癌細胞を含む。細胞を含む適切なサンプルは、生検、手術からのサンプル、および採血からのサンプルを含むがこれらに限定されない、種々の方法によって得ることができる。いくつかの好ましい実施形態において、サンプルは、１つ以上の細胞表面抗原の存在について予め分析されている。いくつかの実施形態において、本方法は、サンプルが以前に特徴付けられていない場合、１つ以上の細胞表面抗原の発現について、サンプルを分析することをさらに含む。本発明は、任意の特定の細胞表面抗原の分析に限定されないが、内在化しやすい（例えば、エンドサイトーシスによって）細胞表面抗原が好ましい。内在化しやすい細胞表面抗原の例として、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＥＧＦＲ、ＣＤ３ε、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５６、ＣＥＡ（ＣＤ６６ｅ）、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ１３８、ＮａＰｉ２ｂ、ｇｐＮＭＢ、ＴＲＯＰ−２、ＧＵＣＹ２Ｃ、Ｎｅｃｔｉｎ−４、ＳＣ−１６、ＳＴＥＡＰ１、ＦＲα、ＩＬ−２Ｒ、ＥｐＣＡＭ、およびＭＳＬＮが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７７】
いくつかの特に好ましい実施形態において、サンプルは、乳癌細胞を含む。これらの実施形態において、乳癌細胞は、好ましくは、上皮成長因子受容体（ＨＥＲ１）、ＨＥＲ２、および／またはＨＥＲ３の発現について特徴付けられる。さらにより好ましい実施形態において、サンプルをＨＥＲ２受容体について分析するか、または、サンプルを以前に分析し、そしてＨＥＲ２受容体を有すると同定している。
【００７８】
上述したように、いくつかの実施形態において、化合物発現指数を本発明の方法において利用する。本発明は、任意の特定の化合物発現指数の使用に限定されない。適切な化合物発現指数の例を以下に示す。
【００７９】
いくつかの実施形態において、化合物発現指数は、相対的なＨＥＲ２発現×（１−（１−相対的なＲＡＢ５発現）×０．３）×（１−（１−相対的なＲＡＢ４発現）×０．６）×（１−（１−相対的なＨＳＰ９０発現）×０．８）／（１−（１−（１／相対的なＲＡＢ１１発現））×０．４である。
【００８０】
いくつかの実施形態において、化合物発現指数は、相対的なＨＥＲ２発現×（１−（１−相対的なＲＡＢ４発現）×０．６）×（１−（１−相対的なＲＡＢ５発現）×０．３）×（１−（１−相対的なＨＳＰ９０発現）×０．８）である。
【００８１】
いくつかの実施形態において、化合物発現指数は、相対的なＨＥＲ２発現×（１−（１−相対的なＲＡＢ４発現）×０．６）×（１−（１−相対的なＲＡＢ５発現）×０．２）×（１−（１−相対的なＨＳＰ９０発現）×０．６）である。
【００８２】
いくつかの実施形態において、化合物発現指数は、相対的なＨＥＲ２発現×（１−（１−相対的なＲＡＢ４発現）×０．４）×（１−（１−相対的なＲＡＢ５発現）×０．２）である。
【００８３】
いくつかの実施形態では、化合物発現指数は、相対的なＨＥＲ２発現×（１−（１−相対的なＲＡＢ５発現）×０．３）×（１−（１−相対的なＲＡＢ４発現）×０．６）である。
【００８４】
いくつかの実施形態において、化合物発現指数は、相対的なＨＥＲ２発現×（１−（１−相対的なＲＡＢ５発現）×０．３）である。
【００８５】
いくつかの実施形態において、化合物発現指数は、相対的なＨＥＲ２発現×（１−（１−相対的なＲＡＢ４発現）×０．４）である。
【００８６】
いくつかの実施形態において、化合物発現指数は、相対的なＨＥＲ２発現×（１−（１−相対的なＲＡＢ４発現）×０．６）である。
【００８７】
いくつかの実施形態において、化合物発現指数は、相対的なＨＥＲ２発現×（１−（１−相対的なＲＡＢ１１発現）×０．２）である。
【００８８】
いくつかの実施形態において、化合物発現指数は、相対的なＨＥＲ２発現×（１−（１−相対的なＨＳＰ９０発現）である。
【００８９】
いくつかの実施形態において、発現はタンパク質発現である。いくつかの実施形態において、決定する工程は免疫分析を含む。いくつかの実施形態において、発現はｍＲＮＡ発現である。いくつかの実施形態において、決定する工程は、ｃＤＮＡを提供するためのｍＲＮＡの逆転写、および、バイオマーカーに特異的なプライマーを用いたｃＤＮＡの増幅を含む。いくつかの実施形態において、検出技術はＲＴ−ＰＣＲである。
【００９０】
本発明において利用される発現分析は、ＲＡＢ５Ａのような単一のバイオマーカー、またはバイオマーカーのパネル（例えば、ＲＡＢ５ＡおよびＲＡＢ４、ＲＡＢ１１またはＨＳＰ９０のうちの１つ以上；ＲＡＢ５ＡおよびＨＥＲ２；ＲＡＢ５Ａ、ＨＥＲ２およびＲＡＢ４、ＲＡＢ１１またはＨＳＰ９０のうちの１つ以上）を利用し得る。いくつかの実施形態において、本発明のパネルまたは分析は、１００、７５、５０、２５、２０、１５、１０、または５未満のバイオマーカー、または、他の好ましい実施形態では合計で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または２０までのバイオマーカーを含む。
【００９１】
いくつかの実施形態において、タンパク質発現のレベルを、対象由来のサンプルにおいて検出する。いくつかの実施形態において、対象は癌（例えば、乳癌）と診断されている。いくつかの実施形態において、サンプルは、組織（例えば、生検組織）、血液、血清、尿などである。
【００９２】
タンパク質マーカーを検出する例示的な方法を以下に提供する。しかしながら、腫瘍マーカータンパク質を検出する任意の適切な方法が利用され得る。
【００９３】
免疫分析の限定されない例としては以下が挙げられるが、これらに限定されない；免疫沈降、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学、免疫サイトメトリー、フローサイトメトリー、および免疫−ＰＣＲ。当業者に公知の種々の技術（例えば、比色、蛍光、化学発光または放射性）を使用して検出可能に標識されたポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、免疫分析における使用に適している。
【００９４】
免疫沈降は、その抗原に特異的な抗体を用いて、抗原を溶出して沈降させる技術である。このプロセスは、複合体中に存在すると考えられるタンパク質を標的とすることによって、細胞抽出物中に存在するタンパク質複合体を同定するために使用され得る。プロテインＡおよびプロテインＧのように、細菌から最初に単離された不溶性抗体結合タンパク質によって、複合体を溶出する。溶出物から容易に単離することができるセファロースビーズに抗体を結合させることもできる。洗浄後、沈降物を、質量分析、ウエスタンブロット、または複合体中の成分を同定するための任意の数の他の方法を使用して分析してもよい。
【００９５】
ウエスタンブロットまたは免疫ブロットは、組織ホモジネートまたは抽出物の所定のサンプル中のタンパク質を検出するための方法である。この方法においては、ゲル電気泳動を使用して、変性タンパク質を質量によって分離する。次いで、タンパク質をゲルから膜（典型的にはポリビニルジフルオリドまたはニトロセルロース）上に転写し、そこで目的のタンパク質に特異的な抗体を用いて標識する。結果として、研究者は所定のサンプル中のタンパク質の量を試験し、いくつかの群間でレベルを比較することができる。
【００９６】
酵素結合免疫吸着分析の略であるＥＬＩＳＡは、サンプル中の抗体または抗原の存在を検出するための生化学的技術である。この技術は、少なくとも２つの抗体を利用し、その一方は抗原に特異的であり、他方は酵素に結合している。第２の抗体は、発色基質または蛍光基質に信号を生成させる。ＥＬＩＳＡの変法には、サンドイッチＥＬＩＳＡ、競合ＥＬＩＳＡ、およびＥＬＩＳＰＯＴが含まれる。ＥＬＩＳＡは、サンプル中の抗原の存在または抗体の存在のいずれかを評価するために実施され得るので、血清抗体濃度を決定するため、および抗原の存在を検出するための両方に有用なツールである。
【００９７】
免疫組織化学および免疫細胞化学は、それぞれの抗体に結合する組織または細胞中の抗原の原理を介して、それぞれ組織切片または細胞中のタンパク質を局在化するプロセスに関する。可視化は、発色または蛍光タグで抗体をタグ付けすることによって可能になる。発色タグの典型的な例として、ホースラディッシュペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼが挙げられるが、これらに限定されない。蛍光タグの典型的な例として、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）またはフィコエリトリン（ＰＥ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９８】
フローサイトメトリーは、流体の流れ中に懸濁した微細粒子を計数し、試験し、そして選別するための技術である。この技術は、光学／電子検出装置を通って流れる単一細胞の物理的および／または化学的特性の同時マルチパラメトリック分析を可能にする。単一の周波数または色の光のビーム（例えば、レーザ）を、流体力学的に集束した流体の流れに向ける。いくつかの検出器は、ストリームが光ビームを通過する点に向けられ、１つは光ビームと一列に並んでおり（前方散乱またはＦＳＣ）、いくつかはそれに垂直である（側方散乱（ＳＳＣ）および１つ以上の蛍光検出器）。ビームを通過する各懸濁粒子は何らかの方法で光を散乱させ、粒子中の蛍光化学物質は励起されて、光源よりも低い周波数で光を放出することができる。散乱光と蛍光との組み合わせは、検出器によって検出され、各検出器における輝度の変動を、各蛍光発光ピークに対して１つずつ分析することによって、個々の粒子のそれぞれの物理的および化学的構造に関する様々な事実を推定することが可能である。ＦＳＣは細胞体積と相関し、ＳＳＣは粒子の密度または内側複雑性（例えば、核の形状、細胞質顆粒の量およびタイプ、または膜粗さ）と相関する。
【００９９】
免疫ポリメラーゼ連鎖反応（ＩＰＣＲ）は、抗体ベースの免疫分析におけるシグナル生成を増加させるために、核酸増幅技術を利用する。ＰＣＲのタンパク質等価性が存在しないため、すなわち、核酸がＰＣＲの間に複製されるのと同じ様式でタンパク質を複製することができないため、検出感度を増加させる唯一の方法は、シグナル増幅によるものである。標的タンパク質は、オリゴヌクレオチドに直接または間接的に結合する抗体に結合する。結合していない抗体は洗い流され、残りの結合した抗体は増幅したオリゴヌクレオチドを有する。タンパク質検出は、リアルタイム法を含む標準的な核酸検出法を用いて増幅されたオリゴヌクレオチドを検出することによって行われる。
【０１００】
いくつかの実施形態において、免疫磁気検出が利用される。いくつかの実施形態において、検出は自動化される。例示的な免疫磁気検出方法にはＶｅｒｉｄｅｘ（Ｒａｒｉｔａｎ、ＮＪ）から市販されているものが含まれるが、これらに限定されない。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、コンピュータベースの分析プログラムを使用して、検出分析によって生成した生データ（例えば、マーカー発現の存在、非存在、または量）を、臨床医の予測値のデータ（例えば、癌治療または化合物発現指数の選択）に翻訳する。臨床医は、任意の適切な手段を使用して予測データにアクセスすることができる。したがって、いくつかの好ましい実施形態において、遺伝子または分子生物学において訓練される可能性が低い臨床医が生データを理解する必要がないというさらなる利益を、本発明は提供する。データは、最も有用な形態で臨床医に直接提示される。次いで、臨床医は対象の治療を最適化するために、情報を直ちに利用することができる。
【０１０２】
本発明は、分析を実施する研究施設、情報提供者、医療関係者、および対象からまたはこれらに対して情報を受信、処理、および送信することができる任意の方法を検討する。例えば、本発明のいくつかの実施形態において、サンプル（例えば、生検または血液または血清サンプル）は対象から得られ、そして、生データを生成するために、世界の任意の場所（例えば、対象が存在する国または情報が最終的に使用される国とは異なる国）に位置するプロファイリングサービス（例えば、医療施設における臨床研究所、ゲノムプロファイリングビジネスなど）に提出される。サンプルが組織または他の生物学的サンプルを含む場合、対象は医療センターを訪れて、サンプルを得てプロファイリングセンターに送ることができ、または対象はサンプル自体（例えば、尿サンプル）を収集し、それをプロファイリングセンターに直接送ることができる。サンプルが事前に決定された生物学的情報を含む場合、情報は対象によってプロファイリングサービスに直接送られてもよい（例えば、情報を含む情報カードはコンピュータによってスキャンされてもよく、データは電子通信システムを使用してプロファイリングセンターのコンピュータに送信されてもよい）。プロファイリングサービスによって受信されると、サンプルは処理され、対象が所望する診断または予後情報に特異的なプロファイルが生成される（すなわち、発現データ）。
【０１０３】
次いで、プロファイルデータを、治療する臨床医による解釈に適したフォーマットで準備する。例えば、生データを提供するのではなく、準備されたフォーマットは、特定の治療選択肢に対する水栓と共に、対象に対する診断またはリスク評価（例えば、癌治療が成功する可能性または化合物発現指数）を表してもよい。データは、任意の適切な方法によって臨床医に表示されてもよい。例えば、いくつかの実施形態において、プロファイリングサービスは、臨床医のために（例えば、治療の時点で）印刷することができ、またはコンピュータモニタ上で臨床医に表示することができるレポートを生成する。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、情報は、最初にケアの時点でまたは地域施設で、分析される。次いで、生データをさらなる分析のために、および／または生データを臨床医または患者に有用な情報に変換するために、中央処理施設に送る。中央処理施設は、プライバシー（全てのデータが均一なセキュリティプロトコルで中央施設に記憶される）、速度、及びデータ分析の均一性の利点を提供する。次いで、中央処理施設は、対象の治療後のデータの運命を制御することができる。例えば、電子通信システムを使用して、中央施設は、臨床医、対象、または研究者にデータを提供することができる。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、対象は、電子通信システムを使用してデータに直接アクセスすることができる。対象は、結果に基づいてさらなる介入またはカウンセリングを選択することができる。いくつかの実施形態において、データは研究用途に使用される。例えば、このデータは、特定の状態または疾患の段階の有用な指標としてマーカーの包含または排除をさらに最適化するために使用され得る。
【０１０６】
本発明の診断、予後、および治療方法において使用する組成物には、プローブ、増幅オリゴヌクレオチド、および抗体が含まれるがこれらに限定されない。特に好ましい組成物は、サンプル中のマーカーの発現レベルの存在を検出する。
【０１０７】
これらの組成物のいずれかは、単独で、または本発明の他の組成物と組み合わせて、キットの形成で提供され得る。例えば、単一標識プローブおよび一対の増幅オリゴヌクレオチドまたは抗体、ならびに免疫分析の構成要素は、マーカーの増幅および検出のためのキットにおいて提供され得る。キットは、適切なコントロール試薬および／または検出試薬をさらに含み得る。
【０１０８】
本発明のプローブおよび抗体組成物はまた、アレイまたはパネルアッセイの形態で提供され得る。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、本発明は、治療計画を決定および実施するためのシステム、キットおよび方法を提供する。
【０１１０】
本発明の方法は、種々の癌の治療における使用を見出す。本発明に従って処置され得る癌としては、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、前立腺癌、黒色腫、神経膠芽腫、膵臓癌、腎細胞癌、卵巣癌、膀胱癌、子宮内膜癌、胃腸癌、中皮腫、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、および非ホジキンリンパ腫が挙げられるが、これらに限定されない。上記のように、バイオマーカーまたはバイオマーカーの組み合わせの発現レベルが、基準または閾値レベルあるいは化合物発現指数と比較して、患者サンプルにおいて増加する好ましい実施形態においては、その後、患者に免疫複合体を投与するための呼び出しがなされる。同様に、バイオマーカーまたはバイオマーカーの組み合わせの発現レベルが、基準もしくは閾値発現レベルあるいは化合物発現指数と比較して、患者サンプルにおいて低下する他の好ましい実施形態において、その後、薬物または毒素に結合されていない抗原結合タンパク質を患者に投与するための呼び出しがなされる。免疫複合体の投与が必要とされる実施形態では、次いで、患者の腫瘍または癌細胞に発現する表面抗原に結合する免疫複合体が選択される。免疫複合体が向けられ得る適切な表面抗原としては、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＥＧＦＲ、ＣＤ３ε、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５６、ＣＥＡ（ＣＤ６６ｅ）、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ１３８、ＮａＰｉ２ｂ、ｇｐＮＭＢ、ＴＲＯＰ−２、ＧＵＣＹ２Ｃ、Ｎｅｃｔｉｎ−４、ＳＣ−１６、ＳＴＥＡＰ１、ＦＲα、ＩＬ−２Ｒ、ＥｐＣＡＭ、およびＭＳＬＮが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、免疫複合体は、抗体薬物複合体である。適切な抗体薬物複合体には、トラスツズマブエムタンシン（Ｔ−ＤＭ１、Ｋａｄｃｙｌａ）、ブレンツキシマブベドチン（ＳＧＮ−３５）、イノツズマブオゾガマイシン（ＣＭＣ−５４４）、ピナツズマブベドチン（ＲＧ−７５９３）、ポラツズマブベドチン（ＲＧ−７５９６）、リファスツズマブベドチン（ＤＮＩＢ０６００Ａ、ＲＧ−７５９９）、グレンバツズマブベドチン（glembatuzumab vedotin）（ＣＤＸ−０１１）、コルツキシマブラブタンシン（ＳＡＲ３４１９）、ロルボツズマブメルタンシン（ＩＭＧＮ−９０１）、インダツキシマブラブタンシン（ＢＴ−０６２）、サシツズマブゴビチカン（sacitizumab govitican）（ＩＭＭＵ−１３２）、ラベツズマブゴビチカン（labetuzumab govitican）（ＩＭＭＵ−１３０）、ミラツズマブドキソルビシン（ＩＭＭＵ−１１０）、インデュサツマブベドチン（ＭＬＮ−０２６４）、バダスツキシマブタリリン（ＳＧＮ−ＣＤ３３Ａ）、デニンツズマブマホドチン（ＳＧＮ−ＣＤ１９Ａ）、エンホルツマブベドチン（ＡＳＧ−２２ＭＥ）、ロバルピツズマブテシリン（ＳＣ１６ＬＤ６．５）、バンドルツズマブベドチン（ＤＳＴＰ３０８６Ｓ、ＲＧ７４５０）、ミルベツキシマブソラブタンシン（ＩＭＧＮ８５３）、ＡＢＴ−４１４、ＩＭＧＮ２８９、またはＡＭＧ５９５が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、抗体毒素複合体は、ＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌ、デニロイキンジフチトクス（ＤＡＢ３８９ＩＬ２）、モキセツモマブパスウドトクス（ＣＡＴ−８０１５）、オポルツズマブモノトックス（ＶＢ４−８４５）、レジミューン（resimmune）、ＬＭＢ−２、ＤＴ２２１９ＡＲＬ、ＨｕＭ１９５／ｒＧｅｌ、ＲＧ７７８７、ＭＯＣ３１ＰＥまたはＤ２Ｃ７−ＩＴである。上述したように、本発明の方法において使用する抗体薬物複合体の選択は、対象における癌細胞に発現する特異的表面抗原に依存する。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、免疫複合体は免疫毒素である。適切な免疫毒素としては、ＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌ、デニレウキンジフチトックス、（ＤＡＢ３８９ＩＬ２）、モキセツモマブパスドトクス（ＣＡＴ−８０１５）、オポルツズマブモノトックス（ＶＢ４−８４５）、レジミューン（resimmune）、ＬＭＢ−２、ＤＴ２２１９ＡＲＬ、ＨｕＭ１９５／ｒＧｅｌ、ＲＧ７７８７、ＭＯＣ３１ＰＥまたはＤ２Ｃ７−ＩＴが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、上述したように、本発明の方法において使用する免疫毒素の選択は、対象における癌細胞によって発現される特定の表面抗原に依存する。
【０１１３】
＜実施例＞
以下の実施例は本発明の特定の実施形態を実証し、さらに例示するために提供され、その範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０１１４】
〔実施例１〕
（材料及び方法）
細胞および培養：
本研究では、乳癌細胞株ＳＫ−ＢＲ−３、ＡＵ−５６５（ＣＲＬ−２３５１）、ＨＣＣ１９５４（ＣＲＬ−２３３８）およびＭＤＡ−ＭＢ−４５３（ＨＴＢ−１３１）および卵巣がん細胞株ＳＫＯＶ−３（ＨＴＢ−７７）という５つのＨＥＲ２発現性ヒト細胞株を用いた。ＨＥＲ２陰性のヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を、ＨＥＲ２発現のネガティブコントロールとして使用した。すべての細胞株は、ノルウェー、オスロの癌研究所の生化学部門ノルウェーラジウム病院、オスロ大学病院から提供されたＳＫ−ＢＲ−３を除き、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（American Type Culture Collection）（Manassas、VA、USA）から入手した。時間経過による細胞株の特性の変化を回避するために、全ての細胞株を継代数３〜２５の間で使用し、細胞をマイコプラズマ感染について常時にチェックした。ＳＫ−ＢＲ−３およびＳＫＯＶ−３細胞を、ＭｃＣｏｙ  ５Ａ培地中で、ＡＵ−５６５、ＨＣＣ１９５４およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をＲＰＭＩ−１６４０培地中（両方とも、Sigma-Aldrich, St. Louis、MO、USAから入手）で培養し、一方、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３を、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ  Ｌ−１５培地（Lonza, Verviers, Belgium）中で培養した。全ての培地は、文献１９にしたがって補給した。
【０１１５】
細胞毒性実験：
９６ウェルプレート（Nunc、ロスキルデ、デンマーク）に８×１０３（ＳＫ−ＢＲ−３）、１．８×１０３（ＳＫＯＶ−３）、６×１０３（ＡＵ−５６５）、４×１０３（ＨＣＣ１９５４）または１×１０４細胞／ウェル（ＭＤＡ−ＭＢ−４５３）で細胞を播種し、一晩付着させた。次いで、細胞を、７２時間、濃度を増加させながらトラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標）、ロシュ、バーゼル、スイス）、Ｔ−ＤＭ１（ａｄｏ−トラスツズマブエムタンシン、カドサイラ（登録商標）、ジェネンテック、カリフォルニア州サンフランシスコ、米国カリフォルニア州サンフランシスコ）、ＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌまたはｒＧｅｌ（文献１３、２０に従って発現および精製）とインキュベートし、その後、文献２１に従い、ＭＴＴアッセイにより細胞生存率を評価した。ＩＣ５０値をＳ字曲線から計算した（適合モデル：ａ／（１＋ｅｘｐ（−（ｘ−ｘ０）／ｂ）。
【０１１６】
ウエスタンブロット分析法：
全細胞抽出物を得て、文献１９に記載したようにウエスタンブロットにより分析した。タンパク質のブロット転写は、Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ（登録商標）Ｔｕｒｂｏ（商標）Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Bio-Rad Laboratories、CA、USA）を用いて行った。細胞タンパク質発現を、Cell Signaling Technology（Danvers, MA, USA）から得たＥＧＦＲ（＃４２６７）、ＨＥＲ２（＃２１６５）、ＨＥＲ３（＃１２７０８）、ＨＳＰ９０（＃４８７７）抗体、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（San Jose, CA, USA）から得たＲａｂ５（６１０２８１）およびＲａｂ１１（６１０６５６）抗体、ならびにＲａｂ４（Ｒ５７８０）抗体（Sigma-Aldrich）を使用して検出した。タンパク質の発現は、抗原（＃Ｔ６５５７）（Sigma-Aldrich）によって検出されたγ−チューブリンと相関していた。Supersignal West Dura Extended duration Substrate（Thermo Scientific, Rockford, IL, USA）およびＣｈｅｍｉＤｏｃ（商標）デンシトメーター（Bio-Rad）を膜上のタンパク質バンドの検出に使用した。ＩｍａｇｅＬａｂ  ４．１（Bio-Radのソフトウェア）を、タンパク質発現の定量のために使用した。各タンパク質の発現を、最高発現細胞株に対して計算した。
【０１１７】
相関分析：
細胞株におけるＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＥＧＦＲ、Ｒａｂ４、Ｒａｂ５、Ｒａｂ１１およびＨＳＰ９０の相対的発現を、１／ＩＣ５０（Ｔ−ＤＭ１）またはターゲティング指数（ＴＩ）（ＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌ）によって測定した２つのＨＥＲ２標的治療薬に対する細胞株感受性に対してプロットし、線形回帰を評価した。いくつかのタンパク質は、ＨＥＲ２と共にＴ−ＤＭ１またはＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌに毒性に影響を及ぼし得る。しかしながら、ＨＥＲ２と比較した場合の影響のレベルは変化し得る。ここでは、ＨＥＲ２と線形相関する１／ＩＣ５０（Ｔ−ＤＭ１）またはＴＩ（ＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌ）によって得られたＲ２値が他のタンパク質（ＨＥＲ３、ＥＧＦＲ、Ｒａｂ４、Ｒａｂ５、Ｒａｂ１１およびＨＳＰ９０）の相対的発現を回帰に組み込むことによって増加し得るかどうかを計算した。これらの回帰曲線は、以下の式を用いて、ＨＥＲ２と共に各タンパク質について１〜０の範囲の寄与係数を減少させて確立した；
正の勾配を有する曲線についてはＨＥＲ２×（１−（１−タンパク質）×Ｆ）、および
負の勾配を有する曲線についてはＨＥＲ２／（１−（１−タンパク質）×Ｆ）であり、ここで、ＨＥＲ２はＨＥＲ２の相対的発現であり、タンパク質は目的のタンパク質の相対的発現であり、Ｆは１〜０の寄与係数である。
【０１１８】
Ｒ２値は、それぞれのタンパク質の寄与係数の関数としてプロットした。ＨＥＲ２単独で得られたものと比較してＲ２の増加をもたらす寄与係数に属するタンパク質を、Ｔ−ＤＭ１およびＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌ感受性についての最終回帰曲線に組み込み、Ｒ２によって測定したＴ−ＤＭ１−およびＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌ感受性に最も高い相関を有する発現パラメーターの組合せを設定した。
【０１１９】
（結果）
Ｔ−ＤＭ１およびＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌの有効性はトラスツズマブ感受性と相関していなかった。ＨＥＲ２陰性として報告されているＭＤＡ−ＭＢ−２３１における低発現と比較して、本研究で使用した５つのＨＥＲ２発現細胞株において、強いＨＥＲ２発現が立証された（図１のＡ）（文献２２）。ＨＥＲ２を標的としたｍＡｂトラスツズマブおよび細胞内作用性ＨＥＲ２を標的とした治療薬Ｔ−ＤＭ１およびＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌの抗増殖効果は、５つのＨＥＲ２陽性細胞株において確立された（図１のＢ）。細胞をトラスツズマブ、Ｔ−ＤＭ１またはＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌで７２時間処理すると、ＳＫ−ＢＲ−３およびＡＵ−５６５細胞は３つの治療薬すべてに高感受性であることが明らかになったが、逆に、ＳＫＯＶ−３細胞はトラスツズマブに非応答性であることが見出され、Ｔ−ＤＭ１およびＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌに対して低感受性であったことが、それぞれ１．２μｇ／ｍＬという比較的高いＩＣ５０および２．４という低いＴＩ５０によって実証された（図１および図２のＢ）。ＨＣＣ１９５４およびＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞はいずれもトラスツズマブ治療に対して低感受性から中感受性であることが見出されたが、細胞内作用性ＨＥＲ２標的治療薬に対しては異なる反応を示し、ＨＣＣ１９５４細胞はＴ−ＤＭ１およびＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌの両方に対して高感受性を示したが、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞はこれら２つの薬物に対して低感受性を示した（図１および図２のＢ）。したがって、トラスツズマブ感受性とＴ−ＤＭ１およびＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌに対する感受性との間には、５つの細胞株間で明確な関連性は認められなかった（図１および図２のＢ）。Ｔ−ＤＭ１およびＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌは細胞内で明確に異なる作用点を有するが、細胞株の間でこれらの２つの治療薬に対する感受性の間に一貫性が明らかにされ、ここで、２つの治療薬の一方に対する高／低応答は他方に対する同様の高／低応答を予測させるように思われた。
【０１２０】
これらの知見に基づき、細胞株を３つのカテゴリーに分類した；（ｉ）トラスツズマブ、Ｔ−ＤＭ１およびＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌに対する高感受性（ＳＫ−ＢＲ−３およびＡＵ−５６５）、（ｉｉ）トラスツズマブ、Ｔ−ＤＭ１およびＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌに対する低／中等度感受性（ＳＫＯＶ−３およびＭＤＡ−ＭＢ−４５３）、（ｉｉｉ）トラスツズマブに対する低／中等度感受性であるが、Ｔ−ＤＭ１およびＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌに対する高感受性（ＨＣＣ１９５４）（図２Ａ）。
【０１２１】
ＨＥＲ２発現とＴ−ＤＭ１毒性との相関は、ＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌ毒性について観察されるものよりも強い。ＨＥＲ２発現は、Ｔ−ＤＭ１およびＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌ毒性の両方に必須である。しかし、発現レベルは細胞間の薬物処理（例えば、取り込み、細胞内輸送および細胞内薬物標的との相互作用）の差異に起因して、薬物感受性に必ずしも直接相関しない可能性がある。５つの細胞株におけるＨＥＲ２発現の定量はＡＵ−５６５がＨＥＲ２の最高発現レベルを有することを示し、ＨＣＣ１９５４（０．９）およびＳＫ−ＢＲ−３（０．８）がそれに接近して続いた（図２ＣおよびＤ１）。ＡＵ−５６５に比べてＳＫＯＶ−３細胞では５０％低いＨＥＲ２発現が認められ、パネルでＨＥＲ２発現が最も低い（０．４）細胞株としてＭＤＡ−ＭＢ−４５３が示された（図２ＣおよびＤ１）。本稿で報告したＨＥＲ２発現量は、最近の報告と一致している（文献２２、２３）。さらに、ＨＥＲ２発現とＴ−ＤＭ１およびＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌ感受性との間に直線的な関連性が認められ、その結果、Ｔ−ＤＭ１では０．９２６、ＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌでは０．８００のＲ２値が得られた（図２Ｅ１およびＥ２）。
【０１２２】
ＨＥＲ３は、Ｔ−ＤＭ１感受性についてのＨＥＲ２に対するさらなるバイオマーカーとして役立ち得る。ＨＥＲ２は、ＥＧＦＲファミリーの他のメンバーと複合体を形成することが知られている。従って、ＨＥＲ３およびＥＧＦＲを定量して、Ｔ−ＤＭ１とＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌ毒性とＥＧＦＲファミリーのこれら２つのメンバーの発現との間の関係を調べた。細胞株の選択されたパネルは、ＨＥＲ３およびＥＧＦＲ発現の両方のレベルにおいて実質的に変化することが見出された（図２Ｃ、２Ｄ２および２Ｄ３）。しかし、ＨＥＲ３またはＥＧＦＲのレベルと、Ｔ−ＤＭ１（図３Ａ１およびＢ１）またはＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌ（図３Ｃ１およびＤ１）に対する感受性との間には明らかな相関は見られなかった。ＥＧＦＲおよびＨＥＲ３がＨＥＲ２と共にＴ−ＤＭ１−およびＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌ感受性と相関するかどうかをさらに評価した。１／ＩＣ５０（Ｔ−ＤＭ１）およびＨＥＲ２とＨＥＲ３の線形回帰のＲ２値を、寄与係数の増加と共に確立することは、ＨＥＲ２を単独で使用した場合（Ｒ２＝０．９２６、図２Ｅ１）と比較して、ＨＥＲ３発現が０．２の寄与係数で相関解析に含まれた場合（図３Ａ２および３Ａ３）、０．９５３のより大きなＲ２を実証した。Ｔ−ＤＭ１感受性とＨＥＲ２発現との間の回帰分析に影響係数の増加を伴うＥＧＦＲを組み込むことによって、線形相関の増加は検出されなかった（図３Ｂ２）。Ｔ−ＤＭ１とＨＥＲ２×ＨＥＲ３との間の回帰におけるＥＧＦＲ発現の影響（寄与係数０．２）も評価した。また、ここでは、ＥＧＦＲの寄与係数の増加に伴うＲ２値はすべて、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３（寄与係数０．２）のみで観察されたものよりも少ないことが見出された（図３Ｂ３）。
【０１２３】
ＨＥＲ３およびＥＧＦＲは、ＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌ感受性についてのＨＥＲ２に対するさらなるバイオマーカーとして役立ち得る。ＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌ感受性とＨＥＲ２発現との間の回帰分析にＥＧＦＲとＨＥＲ３の寄与を組み込むと、ＨＥＲ２発現のみによって得られたものと比較して、Ｒ２値が増加した（寄与係数０．４を有するＨＥＲ２×ＨＥＲ３についてはＲ２＝０．９７０、寄与係数０．３を有するＨＥＲ２×ＥＧＦＲについてはＲ２＝０．８２６）（図２Ｅ２、３Ｃ２、３Ｃ３、３Ｄ２および３Ｄ３）。ＨＥＲ２とＥＧＦＲ（寄与係数０．３）とＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌ感受性との間の回帰に寄与係数の増加に伴うＨＥＲ３発現の影響を加えると、ＨＥＲ３寄与係数０．４で観測された最高値でのＲ２値の増加によって測定されるように、相関の増加が示された（Ｒ２＝０．９９７、図３Ｅ１および３Ｅ２）。
【０１２４】
ＨＥＲ２発現細胞株は、エンドサイトーシス輸送に関与するタンパク質の発現レベルが異なる。Ｔ−ＤＭ１およびＭＨ３Ｂ１／ｒＧｅｌは細胞内移行および細胞内輸送に依存し、それらの細胞内作用機構を発揮するので、エンドサイトーシス機構に関与するタンパク質をパネル細胞株で定量した。これらのタンパク質には細胞膜から初期のエンドソームへの積み荷の運搬と、エンドソーム融合に関与するＲａｂ５（図４ＡおよびＢ）、初期のエンドソームからの再利用に関与するＲａｂ４（図４ＡおよびＣ）、ＨＥＲ２リサイクリングを調節していると報告されているＨＳＰ９０（図４ＡおよびＤ）、および核周囲のリサイクリングエンドソームおよび細胞膜−ゴルジ輸送を介した再利用に関与しているＲａｂ１１（図４ＡおよびＥ）が含まれていた（文献２４、２５）。細胞株間のこれらのタンパク質の発現レベルは大きな差異を示し、発現レベル間で単純な関係は見出されなかった。
【０１２５】
Ｒａｂ５およびＲａｂ４は、Ｔ−ＤＭ１感受性を予測するためのＨＥＲ２に対するさらなるバイオマーカーとして機能し得る。エンドサイトーシス機構に関与する調査されたタンパク質（図４）が、細胞株間のＴ−ＤＭ１感受性に影響を及ぼすかどうかをさらに評価した。２．５〜３倍高いＲａｂ５の発現レベルが、パネル中の他の細胞株と比較して、高Ｔ−ＤＭ１感受性ＳＫ−ＢＲ−３およびＡＵ−５６５細胞において見出された（図４ＡおよびＢ）。Ｔ−ＤＭ１毒性とＲａｂ５発現との間には比較的弱い相関が認められた（Ｒ２＝０．６４３）（図５Ａ１）。Ｒａｂ５発現の寄与係数の増加を伴うＴ−ＤＭ１毒性およびＨＥＲ２発現についての線形回帰曲線の確立は、Ｒａｂ５がＨＥＲ２と共にＴ−ＤＭ１毒性に影響を及ぼすことを示した（図５Ａ２）。ＨＥＲ２およびＲａｂ５の最大Ｒ２は、Ｒａｂ５を０．３の寄与係数で添加した場合に見出され（図５Ａ２）、Ｒａｂ５からの３０％の寄与を含めることによって０．９２６から０．９８６に増加した（図５Ａ３）。Ｒａｂ４発現とＴ−ＤＭ１感受性との間に線形相関は見られなかった（Ｒ２＝０．０８８、図５Ｂ１）。Ｔ−ＤＭ１感受性がＨＥＲ２と相関し、Ｒａｂ４からの寄与係数が０．４であった場合、Ｒ２値のわずかな増加が見られた（図５Ｂ２および５Ｂ３）。Ｒａｂ４がＨＥＲ２とＴ−ＤＭ１感受性と逆相関するかどうかも調べた。しかし、１／Ｒａｂ４発現を回帰式に組み込んだ場合、ＨＥＲ２単独で得られたものと比較して、Ｒ２の増加は見られなかった（データは示さず）。ＨＳＰ９０発現とＴ−ＤＭ１感受性の線形回帰は、Ｒ２値０．２６６という不良な相関を示し（図５Ｃ１）、ＨＥＲ２単独で得られたものと比較して、ＨＳＰ９０の影響をＨＥＲ２での回帰式に組み込むことによって、Ｒ２値の増大は観察されなかった（図５Ｃ２）。Ｒａｂ１１発現とＴ−ＤＭ１感受性との間に逆線形相関（Ｒ２＝０．４５９）が見られた（図５Ｄ１）。１／Ｒａｂ１１発現の増加する寄与係数を伴うＴ−ＤＭ１感受性とＨＥＲ２との間の線形回帰は、ＨＥＲ２単独で得られたものと比較して、Ｒ２値の増加をほとんど示さなかった（０．９２９対０．９２６、図５Ｄ２および５Ｄ３）。
【０１２６】
図５に示すように、Ｒａｂ５およびＲａｂ４の発現レベルは、ＨＥＲ２と共にＴ−ＤＭ１感受性の可能性のあるバイオマーカーとして１つずつ示された。次に、Ｒａｂ５およびＲａｂ４をＨＥＲ２と組み合わせると、Ｔ−ＤＭ１感度との相関がさらに増加するかどうかを評価した。しかし、回帰式にＲａｂ４の影響を組み込んだ場合、ＨＥＲ２×０．３  Ｒａｂ５で観察されたものと比較して、Ｒ２の増加は見られなかった（データは示さず）。総合すると、Ｔ−ＤＭ１感受性に対する最良の線形相関は、ＨＥＲ２とＲａｂ５との組み合わせで０．３の影響係数でのみ見出された（Ｒ２＝０．９８６、図５Ａ３）。
【０１２７】
Ｒａｂ５、Ｒａｂ４、ＨＳＰ９０およびＲａｂ１１はすべて、ＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌ感受性についてのＨＥＲ２に対するさらなるバイオマーカーとして機能し得る。Ｒａｂ５、Ｒａｂ４、ＨＳＰ９０およびＲａｂ１１の細胞発現レベル（図４）も、ＴＩによって測定したＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌ感受性に対してプロットした（図６）。Ｒａｂ５とＴＩの線形相関が細胞株間で検出された（Ｒ２＝０．４８６、図６Ａ１）。ＨＥＲ２およびＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌ毒性の確立された線形回帰曲線に寄与係数を増加させたＲａｂ５を組み込むことは、ＨＥＲ２のみを用いた回帰と比較してＲ２値の増加によって可視化されるように（Ｒ２＝０．８００、図２Ｅ２）、ＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌ毒性に影響を及ぼすＲａｂ５をＨＥＲ２と一緒に示した（図６Ａ２）。０．８５６という最も高いＲ２はＴ−ＤＭ１相関（図５Ａ３）についても観察されるように、Ｒａｂ５からの３０％の寄与を含めることによって見られた（図６Ａ２および６Ａ３）。Ｒａｂ４発現とＭＨ３Ｂ１／ｒＧｅｌ感受性との間に相関は見られなかった（Ｒ２＝０．０２４、図６Ｂ１）。しかし、ＨＥＲ２に対するさらなるバイオマーカーとして影響係数が増加するＲａｂ４発現を利用すると、ＨＥＲ２のみと比較してＴＩとの線形相関が強化された。０．９３０の最大Ｒ２は、ＨＥＲ２およびＴＩ回帰分析に０．６の影響係数を有するＲａｂ４を加えることによって得られた（図６Ｂ１および６Ｂ２）。ＨＳＰ９０および１／Ｒａｂ１１はまた、それほど強くはないがＭＨ３Ｂ１／ｒＧｅｌ感受性と相関することが示された（ＨＳＰ９０についてはＲ２＝０．５５２、１／Ｒａｂ１１については０．４０６、図６Ｃ１およびＤ１）。ＨＳＰ９０および１／Ｒａｂ１１はさらに、ＨＥＲ２発現とＭＨ３Ｂ１／ｒＧｅｌ感受性との関連性を増大させることが１つずつ示され、両タンパク質の寄与係数１で最大Ｒ２が得られた（図６Ｃ２、Ｃ３、Ｄ２およびＤ３）。
【０１２８】
図６に示すように、Ｒａｂ５、Ｒａｂ４、ＨＳＰ９０および１／Ｒａｂ１１はすべて、ＭＨ３Ｂ１／ｒＧｅｌ感受性についてＨＥＲ２と共に、可能性のあるバイオマーカーとして１つずつ示された。これらの４つのバイオマーカーとＨＥＲ２との組み合わせが、ＭＨ３Ｂ１／ｒＧｅｌ感受性に対する相関をさらに増加させるかどうかをさらに研究した。異なるタンパク質を回帰式に組み合わせる順番はＲａｂ５（エンドサイトーシス）で開始し、次いでＲａｂ４（初期リサイクリング）、ＨＳＰ９０（初期リサイクリング）および１／Ｒａｂ１１（後期リサイクリング）が加わるエンドサイトーシスおよび輸送の経路に基づいた。図６Ａ３に示すように、Ｒａｂ５（影響係数０．３）はＨＥＲ２と共にＭＨ３Ｂ１／ｒＧｅｌ感受性とよく相関した（Ｒ２＝０．８５６）。しかし、回帰分析に影響係数を増加させたＲａｂ４発現を加えると、Ｒ２値が増加した。Ｒａｂ４をＨＥＲ２および０．３×Ｒａｂ５の寄与係数に対して０．６の寄与係数で添加した場合、０．９３８の最大Ｒ２に達した（図７Ａ１およびＡ２）。ＨＳＰ９０発現を、ＨＥＲ２、Ｒａｂ５およびＲａｂ４を用いた回帰分析にさらに組み込んだ。ＭＨ３Ｂ１／ｒＧｅｌ感受性とＨＥＲ２、Ｒａｂ５（寄与係数０．３）およびＲａｂ４（寄与係数０．６）との間の回帰分析にＨＳＰ９０からの８０％の寄与を含めることによって、０．９７４の最大Ｒ２が得られた（図７Ｂ）。図６Ｄに示すように、１／Ｒａｂ１１は、ＨＥＲ２と共にＭＨ３Ｂ１／ｒＧｅｌ感受性とよく相関することが示された（Ｒ２＝０．８９４）。ＭＨ３Ｂ１／ｒＧｅｌ感受性とＨＥＲ２、Ｒａｂ５、Ｒａｂ４およびＨＳＰ９０発現との間の回帰分析に１／Ｒａｂ１１発現の影響を加えると、図７Ｃ１に示すようにＲ２も増加した。ＭＨ３Ｂ１／ｒＧｅｌ感受性がＨＥＲ２、Ｒａｂ５（寄与係数０．３）、Ｒａｂ４（寄与係数０．６）、ＨＳＰ９０（寄与係数０．８）と相関した場合、１／Ｒａｂ１１発現と他のタンパク質およびＭＨ３Ｂ１／ｒＧｅｌ感受性との最大相関は０．４（図７Ｃ２）であり、最大Ｒ２は０．９９３であった（図７Ｃ２）。回帰分析はまた、ＭＨ３Ｂ１／ｒＧｅｌ感受性と相関させた場合に得られたＲ２値に大きな影響を及ぼすことなく、非生物学的注文で種々のタンパク質の寄与を加えることによって行った（データは示さず）。全般的に、種々のタンパク質の寄与を加えた場合に確立されたＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌ毒性とタンパク質の発現レベルとの間の最良の相関は、ＴＩが以下に対してプロットされた場合に、生物学的理論的順番（Ｒ２＝０．９９３）（図７Ｃ２）で見いだされた；
相対的ＨＥＲ２発現×
（１−（１−Ｒａｂ５発現）×０．３）×
（１−（１−Ｒａｂ４発現）×０．６）×
（１−（１−相対的ＨＳＰ９０発現）×０．８）／
（１−（１−（１／相対的Ｒａｂ１１発現））×０．４）
バイオマーカー主導の個人用癌治療の分野は、臨床的に承認された標的化抗癌治療剤の数が増加することにつれて急速に成長している。全体として、薬物ベースの個別化された癌治療の効力は、予後、応答および／または耐性を予測するための選択されたバイオマーカーの信頼性に依存する。ＨＥＲ２標的ｍＡｂトラスツズマブの開発は、ＨＥＲ２陽性（全乳癌の約２０％）に分類される乳癌患者としてのバイオマーカー主導の個別化がん治療の分野で、治療の一環としてトラスツズマブをルーチン投与することに成功した話である（文献２６）。他の例としては、イマチニブの使用のための慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）におけるＢＣＲ−ＡＢＬ融合、または大腸癌の治療におけるセツキシマブの使用のためのＥＧＦＲおよびＲＡＳ野生型発現の評価がある（文献２７）。
【０１２９】
癌の治療のために現在承認されている標的化薬物の大部分はｍＡｂまたは小分子阻害剤であり、そのための薬物標的はまた、作用のメカニズムの標的を示す。標的自体は、耐性または低い忍容性を経験する可能性が高い患者を除くために追加のバイオマーカーが必要とされ得るにもかかわらず、これらの薬物による治療のための明確なバイオマーカーを示す。しかしながら、癌治療における薬物開発は現在、標的化部分および細胞毒性成分（例えば、細胞増殖抑制薬（ＡＤＣ）または毒素（標的化毒素））の両方からなる、より複合な標的化治療に移行している。これらの多機能治療薬については、細胞内伝達および／または細胞毒性作用機序に関連する他のバイオマーカーが治療成績に影響を及ぼす可能性が高い（文献１５）。これは、ここではＨＥＲ２陽性細胞株の選択されたパネルにおけるトラスツズマブとＴ−ＤＭ１／ＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌ感受性との間の一貫性の欠如によって示される。
【０１３０】
ここでは、細胞のＨＥＲ２発現とＴ−ＤＭ１に対する応答との間に強い線形相関が報告されている（図２Ｅ１）。これは、ＨＥＲ２ｍＲＮＡレベルが中央値を上回る患者では中央値を下回るサブグループの患者と比較してＴ−ＤＭ１の奏効率が高いことを実証したいくつかの臨床研究と一致している（文献１６、１７、２８）。薬物活性とＨＥＲ２発現との間の相関はここではＲ２値によって測定されるように、ＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌと比較してＴ−ＤＭ１についてより強く示され（図２Ｅ２）、これは、これらの薬物の細胞毒性成分の差異によって引き起こされ得る。Ｔ−ＤＭ１の細胞毒性成分（ＤＭ１）は比較的小さく親油性の薬物であり、エンドサイトーシス小胞中のトラスツズマブ成分から放出されると、エンドサイトーシス膜を横切って細胞質ゾル中に拡散することができ、そこで微小管にその効果を及ぼす。これはＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌの細胞傷害性部分（２８ｋＤａの親水性Ｉ型リボソーム不活性化タンパク質毒素（ゲロニン）であり、これは細胞質ゾルに入るための有効な輸送機構を欠くが、依然として未知の機構によって細胞質ゾルに入ることをある程度可能にする）とは非常に対照的である。ＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌおよびＨＥＲ２発現と比較して、Ｔ−ＤＭ１およびＨＥＲ２発現の相関解析により得られたより高いＲ２はおそらく、これら２つの薬物間のエンドサイトーシス逃避のメカニズムの差異を反映しており、ここで、より多くの障害がゲロニン経路について示される。ＤＭ１と比較してより複雑なゲロニンの細胞内放出経路もまた、Ｔ−ＤＭ１についてのＲａｂ５およびＲａｂ４と比較して、ＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌ感受性に影響を及ぼす調査されたタンパク質（Ｒａｂ５、Ｒａｂ４、ＨＳＰ９０およびＲａｂ１１）の重要性に反映される。
【０１３１】
Ｔ−ＤＭ１とＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌの両方に対する細胞感受性は、ここではＨＥＲ２に加えてＨＥＲ３と相関することが示された。第ＩＩＩ相臨床試験におけるＴ−ＤＭ１の治療効果は、ＨＥＲ３発現サブグループで同様であることがこれまでに報告されている（文献１７）。これは、ＨＥＲ３発現のみとＴ−ＤＭ１感受性との間に相関が見られない、本書に示されるデータと一致する（図３Ａ１）。しかしながら、本発明は、バイオマーカーを異なる寄与係数と組み合わせるための数学的アプローチに焦点を当てている。これらの計算は、ＨＥＲ２と組み合わせたＨＥＲ３がＨＥＲ２単独と比較して、Ｔ−ＤＭ１応答についてのより良好なバイオマーカーとして役立ち得ることを示す。ＨＥＲ３はＨＥＲ２の好ましい二量体化パートナーとして認識されており、ヘテロ二量体は高活性チロシンキナーゼシグナル伝達を誘導することが報告されている（文献２９）。したがって、Ｔ−ＤＭ１と、ＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌ感受性と、ＨＥＲ２と一緒のＨＥＲ３発現との相関は、トラスツズマブおよびＭＨ３−Ｂ１がＨＥＲ２に結合した際のこれらのヘテロ二量体の間接的阻害を反映している可能性がある。Ｔ−ＤＭ１中の全長抗体トラスツズマブと比較して、ＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌは一本鎖ｆｖ断片からなる。したがって、ヘテロ二量体の一部としてのＭＨ３−Ｂ１のＨＥＲ２への結合は除外できない（ＨＥＲ２／ＨＥＲ３およびＨＥＲ２／ＥＧＦＲの両方）。これはさらに、ＭＨ−３Ｂ１／ｒＧｅｌ感受性（Ｒ２は０．８００から０．９７０に増加した）とＨＥＲ２に加えてＨＥＲ３発現（図８Ｂ１）との間の明らかに強い相関（Ｒ２は０．９２６から０．９５３に増加した、図８Ａ１）、ならびにＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌ感受性がＨＥＲ２およびＨＥＲ３に加えてＥＧＦＲと相関した場合のＲ２のわずかな増加によって示されるが、Ｔ−ＤＭ１についてはこのような相関は見られなかった（図８Ａ１およびＢ１）。
【０１３２】
Ｒａｂ５は初期エンドソームに局在し、エンドサイトーシスとクラスリン被覆小胞のエンドソーム融合の両方を制御する（文献１８）。Ｔ−ＤＭ１およびＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌ感受性の両方がここでは、ＨＥＲ２に加えて０．３の寄与係数でＲａｂ５に依存することが示された（図５Ａ３および６Ａ３）。両方のＨＥＲ２標的化治療薬に対するＲａｂ５の同様の影響はおそらく、エンドサイトーシスおよびその後のエンドサイトーシス輸送におけるＲａｂ５の初期の機能に関連しており、ここで、２つの薬物は、エンドサイトーシスのための同じＨＥＲ２仲介経路に従う可能性が高い。また、Ｒａｂ４は初期エンドソームからのリサイクリングを制御することによってエンドサイトーシス経路の初期に作用し、ＨＥＲ２とともにＴ−ＤＭ１およびＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌ感受性と相関することが示された（図５Ｂ３および６Ｂ３）（文献３０）。ＨＥＲ２の迅速なリサイクリングは細胞の薬物取り込みを増加させ得るが、また、細胞内の初期エンドソームにおいて薬物を受動的に局在化される。
【０１３３】
ＨＥＲ２と共にＲａｂ４を組み込んだ場合の０．８３０から０．９３０へのＲ２の増大（図８Ｂ２）は、ＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌの細胞質ゾル放出のメカニズムとして、初期エンドソームからのサイトゾルトランスロケーションを示している。Ｔ−ＤＭ１感受性に対する、ＨＥＲ２に加えたＲａｂ４の寄与がわずかであること（Ｒ２は０．９２６から０．９４４に上昇、図８Ａ２）はエムタンシンもある程度初期エンドソームから放出されることを示しており、これまでの報告（文献７、１０）で示唆されているように、エムタンシンのサイトゾルトランスロケーションはＴ−ＤＭ１のトラスツズマブ部分のリソソーム隔離のみに依存しているわけではないことを示している。これまでに、Ｒａｂ５発現は乳癌患者の予後不良を予測し、Ｒａｂ５／Ｒａｂ４リサイクリングは細胞外マトリックス浸潤と転移を促進することが示されている（文献３１）。したがって、本結果は、Ｒａｂ５／Ｒａｂ４およびＨＥＲ２陽性乳癌患者がＴ−ＤＭ１およびＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌベースの治療の最有力候補であることを示している。
【０１３４】
ＨＳＰ９０はＨＥＲ２シャペロンであり、急速再利用を含むいくつかのメカニズムによってＨＥＲ２分解を阻害すると主張されている（文献３２、３３）。ＨＳＰ９０はここではＨＥＲ２と共にＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌ毒性と相関することが示されているが（図８Ｂ２）、Ｔ−ＤＭ１とは対照的に、このような相関は見られなかった（図８Ａ２）。Ｒａｂ４依存性の違いについて述べたように、これらの薬物の細胞毒性に対するＨＳＰ９０の影響の違いは、サイトゾルトランスロケーションのメカニズムの違いを反映している可能性がある。この差異はまた、これらの薬物間の異なるＨＥＲ２標的化部分の結果であり得る。一方、Ｒａｂ１１はエンドサイトーシスリサイクリングコンパートメント（ＥＲＣ）に局在し、後に結合物を再利用して細胞膜に戻すことによりエンドサイトーシス過程で作用する（文献３４）。ＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌ有効度とＲａｂ１１発現との間に負の相関が見られ（図６Ｂ）、ＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌ有効度を阻害するためのリサイクリングおよびその後のエキソサイトーシスを示した。Ｔ−ＤＭ１毒性に対するＨＥＲ２と共にＲａｂ１１の影響の欠如（図５Ｄ）は、おそらく、Ｔ−ＤＭ１およびＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌがそれらの細胞傷害性部分の化学的特性に沿って異なる細胞内経路をたどることを示している。ＤＭ１は例えば、Ｒａｂ１１正リサイクリングエンドソームに蓄積する前に、エンドサイトーシス小胞から逃れることができる可能性が高い。
【０１３５】
合計で、６つのタンパク質を、ＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌおよびＴ−ＤＭ１応答について、ＨＥＲ２と共に潜在的なバイオマーカーとして本書で試験した。試験したバイオマーカーを、ここでは、ＨＥＲ２標的化薬物（ＥＧＦＲおよびＨＥＲ３）の標的化部分または薬物の細胞内輸送成分（Ｒａｂ５、Ｒａｂ４、ＨＳＰ９０およびＲａｂ１１）のいずれかを反映する２つの群に分けた（図８）。薬物感受性に対する最良の相関はこれらの群内のバイオマーカーをプールすることによって得られ、薬物感受性に対する増加した相関はバイオマーカーのこれらの２つの群を組み合わせることによって示されなかった（データは示さず）。これらの結果は２つの群のタンパク質が完全に独立していないことを示し、これは、薬物のエンドサイトーシス輸送が細胞結合およびエンドサイトーシスに明らかに依存するので、驚くべきことではない。従って、バイオマーカーとしてのＨＥＲ２はＴ−ＤＭ１およびＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌに対する細胞感受性を予測するために、ＨＥＲ３およびＥＧＦＲまたはＲａｂ４、Ｒａｂ５、ＨＳＰ９０および１／Ｒａｂ１１のいずれかと組み合わせるべきである（図８）。図３、５、６および７は、ＨＥＲ２の寄与係数に対する寄与係数の増加を伴うバイオマーカーとしての６つのタンパク質の添加の影響を示す。しかし、異なるタンパク質の重要性は図８Ａおよび８Ｂに例示されるように比較され得、バイオマーカーの両方の群についてのＲ２相関データは同じ図に組み込まれる。薬物感受性に対する増大した相関はバイオマーカーとしてのＨＥＲ２の発現に細胞外タンパク質ＨＥＲ３または細胞内タンパク質Ｒａｂ５およびＲａｂ４の発現を加えることによってＨＥＲ２標的化薬物の両方について見出されたが、図８Ａ、ＢおよびＣに可視化されるように、Ｒ２値への様々な影響を伴って、ＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌ感受性はまた、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３に加えてＥＧＦＲ発現に依存し、ＨＳＰ９０および１／Ｒａｂ１１発現にＨＥＲ２、Ｒａｂ５およびＲａｂ４に依存することがある程度示された。Ｔ−ＤＭ１と比較してＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌ感受性に相関するバイオマーカーのより複雑なプールはＴ−ＤＭ１と比較してＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌのサイトゾルトランスロケーション経路がより障害されていることによって引き起こされる可能性があり、これらの薬物間のＨＥＲ２標的化部分の差を反映している可能性もある。
【０１３６】
結論として、本報告は、エンドサイトーシス輸送に関与するタンパク質がＨＥＲ２に加えて、細胞内作用点を有するＨＥＲ２標的化治療薬に対する応答を予測するために使用され得ることを初めて示す。しかし、異なるタンパク質の影響は、ＨＥＲ２標的化部分および薬物の細胞内作用成分の両方、ならびにその後のエンドサイトーシス輸送および細胞質ゾル放出の機構に関連するように思われる。ＡＤＣならびに細胞内作用メカニズムを有する他の標的化薬物の将来の開発はバイオマーカーの薬物依存性プールを組み込むべきであり、そして今日最も使用されている標的化および耐性のマーカーに加えて、取り込みおよび細胞輸送のためのマーカーを含むべきである。本明細書中で使用されるような数学的アプローチは、予後的ならびに治療的に使用される異なる寄与係数を有するバイオマーカーのプールを確立するために使用され得る。
【０１３７】
ここで述べる一般的な発明概念は、すべての抗体薬物複合体（ＡＤＣ）および抗体毒物複合体（免疫毒素）に適用可能である。この方法に従って投与され得るいくつかの好ましい薬物は、表１（ＡＤＣ）および表２（免疫毒素）に提示される。
【０１３８】
【表１】
2020524720.tif 000002
【０１３９】
【表２】
2020524720.tif 000003
【０１４０】
〔実施例２〕
患者集団：
治療前発現および病理学的完全奏効（ｐＣＲ）データはＴ−ＤＭ１＋ペルツズマブ（ＴＤＭ１＋Ｐ）群の５２人の患者について利用可能であり、トラスツズマブ制御（ＴＨ）群の３１人の患者について分析のために利用可能であった。進行した患者、同意を撤回した患者、治療施設を離れた患者、または手術前に非プロトコール療法を受けた患者は、この分析のために非ｐＣＲとみなされる。以下の表は、各アーム内のＨＲサブタイプによるｐＣＲ速度を示す；
【０１４１】
【表３】
2020524720.tif 000004
【０１４２】
ＴＨ発現データ：
すべてのＩ−ＳＰＹ２サンプルは、Ａｇｉｌｅｎｔの２つのカスタムアレイ（１５７４６および３２６２７デザイン）のいずれかに分析される。ＴＤＭ１＋Ｐアーム中の全てのサンプルを３２６２７アレイ上でアッセイし、一方、ＴＨアームをプラットフォーム間で分割し、古い１５７４６プラットフォーム上の２２サンプルおよび３２６２７アレイ上の９サンプルを用いた。２つの設計にわたるデータを組み合わせるために、１５７４６プラットフォームのプローブアノテーションを更新し（２０１６年９月）、各プラットフォームについて、複数のプローブによって表される遺伝子がプローブにわたる平均として計算されるように、平均化することによって正規化された発現データを崩壊させた。次に、ＣｏｍＢａｔアルゴリズムを適用して、プラットフォームバイアスを調整し、２つのプラットフォームからのデータを組み合わせた。この手順は、実験群にかかわらず、最初の８８０人のＩ−ＳＰＹ  ２患者の治療前データについて行われた。ＴＨおよびＴＤＭ１＋Ｐアームからの組み合わされたプラットフォーム調整されたデータは３２６２７および更新された１５７４６アレイ設計のためのアノテーションファイルとともに、この送達に含まれる。
【０１４３】
バイオマーカー分析の適格性確認：
ＲＡＢ５Ａ、ＲＡＢ４Ａ、ＲＡＢ１１Ａ、およびＨＳＰ９０ＡＡ１の正規化され、プラットフォーム補正された治療前発現レベルを、最初に、適格バイオマーカー評価（ＱＢＥ）計画に従って、ＴＤＭ１＋Ｐに対する応答の特定バイオマーカーとして個別に試験した。
【０１４４】
＝ステップ１  ＴＤＭ１＋Ｐに対する応答の特定予測因子としてバイオマーカーを評価する＝
・モデル１Ａ：ＴＤＭ１＋ＰアームにおけるｐＣＲ〜バイオマーカー
・モデル１Ｂ：ＴＨアームにおけるｐＣＲ〜バイオマーカー
・モデル１Ｃ：ｐＣＲ〜治療＋バイオマーカー＋治療ｘバイオマーカー
・モデル１Ｄ：ｐＣＲ〜治療＋バイオマーカー＋治療ｘバイオマーカー＋ＨＲステータス
評価されたバイオマーカーのうち、ＲＡＢ５Ａのみが、ＴＤＭ１＋ｐアーム（尤度比（ＬＲ）試験ｐ＝０．０１２）での応答と関連しているが、対照アーム（ＬＲ試験ｐ＝０．２４２）では関連していない。
【０１４５】
【表４】
2020524720.tif 000005
【０１４６】
ＲＡＢ５Ａ発現と治療との間の相互作用についてのｐ値は０．０２４であり、これは、ＨＲ状態について調整した後に＜０．０５のままである。以下の表は、評価された４つのバイオマーカーについての結果を要約する。
【０１４７】
ＲＡＢ５Ａは連続的な適格バイオマーカーとして成功し、ＱＢＥ工程２で評価される。
【０１４８】
＝ステップ２  二分しきい値を識別する＝
本発明者らはバイオマーカーｘ処置相互作用のｐ値を最小化する閾値を同定するために、モンテカルロ２倍交差検定手順を使用した。具体的には１００回の反復について、本発明者らは本発明者らの訓練セットとして、治療群とｐＣＲ状態とのバランスをとって、症例の半分を無作為に選択した。我々は１０パーセンタイルと９０パーセンタイルとの間のあらゆる値を、トレーニングセットを「高」対「低」ＲＡＢ５Ａ発現群に二分するための潜在的閾値として考慮し、一連のロジスティック回帰モデルに適合させて、バイオマーカーｘ処置相互作用を評価した（モデル１Ｃ）。本発明者らはトレーニングセット中の相互作用項についてのＬＲ試験ｐ値を最小にする閾値を選択し、それを使用して試験セットを二分し、試験セット中のバイオマーカーｘ処置相互作用の有意性を評価した。次に、ロジット方法を用いて１００個の試験セットにわたってＬＲｐ値結合し、最小結合ＬＲ試験ｐ値生じる閾値を選択した。
【０１４９】
この手順を用いて、９．７６の閾値を選択した。図９を参照されたい。二分可変として、高いＲＡＢ５Ａレベルを有することはまた、ＴＤＭ１＋ｐ（ＯＲ＝５．９９（９５％ＣＩ：１．２３〜４０．２７）、サーモフィッシャーサイエンティフィックの正確検定ｐ＝０．０１）における応答と関連するが、対照群（ＯＲ：０（９５％ＣＩ：０〜１．７４）、サーモフィッシャーサイエンティフィックの正確検定ｐ＝０．０６）とは関連せず、ＬＲｐ＝０．００１を有するバイオマーカーｘ処置相互作用タームを有する。
【０１５０】
９．７６がこの手順で同定された最適閾値であったが、ＲＡＢ５Ａ値が９．７６未満の患者はＴＨアームで２例のみであった。これは部分的にはＴＨおよびＴＤＭ１＋ＰアームにおけるＲＡＢ５Ａ発現の差異に起因し得、ここで、ＲＡＢ５ＡレベルはＴＤＭ１＋ＰアームよりもＴＨアームにおいて有意に高い。アレイ設計は、この差に寄与し得る。我々はＴＤＭ１＋Ｐアームのみでバイオマーカーの性能を評価することを検討することを望むかもしれない（分析計画で事前に指定されたように、バイオマーカー×治療相互作用を評価するモデルを使用するのではなく）。上述したものと同様のモンテカルロ法（ただし、ＴＤＭ１＋Ｐのみにモデル１Ａを当てはめる）を用い、選択される最適閾値は、９．７６のままであった。
【０１５１】
＝ステップ３  ＨＥＲ２＋段階的シグネチャーの文脈におけるＲＡＢ５Ａ群内のベイズ推定ｐＣＲ速度＝
・モデル２：ｐＣＲ〜ＨＲ＋ＲＡＢ５Ａ＋治療＋ＨＲｘ処置＋ＲＡＢ５Ａｘ処置
患者をＲＡＢ５Ａ−高（＞＝９．７６）群とＲＡＢ５Ａ−低（＜９．７６）群に二分するために同定した最適閾値（９．７６）を適用した場合、ベイズ推定ｐＣＲ確率は、ＲＡＢ５Ａ−高の患者の対照群の２４％に対してＴＤＭ１＋Ｐ群で６８％であった。対照的に、推定ｐＣＲ確率はＴＤＭ１＋ＰアームにおけるＲＡＢ５Ａ−低サブセットにおいて２８％であり、ＴＨアームにおいて４２％である。比較のために、同じモデルを用いて、ＨＥＲ２＋群全体の推定ｐＣＲ確率は、ＴＤＭ１＋Ｐ群で６１％、ＴＨ群で２７％である。ベイズｐＣＲ確率曲線を図１０に示す。
【０１５２】
〔実施例３〕
本実施例は、１−ＳＰＹ２試験におけるＴＨ−およびＴ−ＤＭ１＋Ｐ群のＨＳＰ９０、Ｒａｂ１１ａ、Ｒａｂ４ＡおよびＲａｂ５ａ発現プロファイルと治療成績との相関の評価を示す。１−ＳＰＹ−２データからのＲＮＡ発現プロファイルを、Ｔ−トラスツズマブ＋化学療法（ＴＨ）またはトラスツズマブ−エムタシン＋ペルツズマブ＋化学療法（ＴＤＭ１＋Ｐ）を受けた２つの治療群において、ｐＣＲとＨＳＰ９０、Ｒａｂ１１Ａ、Ｒａｂ４ＡおよびＲａｂ５ａの発現レベルとの間の相関について評価した。Ｔ−ＤＭ１＋Ｐアームにおいて、ｐＣＲ０群とｐＣＲ１群との間でＲａｂ５Ａの発現レベルに有意差がある。２つのアームのいずれにおいても、他のタンパク質のいずれについても有意差は見出されなかった。
【０１５３】
【表５】
2020524720.tif 000006
【０１５４】
【表６】
2020524720.tif 000007
【０１５５】
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上記明細書に記載された全ての刊行物、特許、特許出願およびアクセッション番号は、その全体が参照により本明細書に援用される。本発明は、特定の実施形態に関して開示されているが、特許請求の範囲に記載された本発明がそのような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことは、理解されるべきである。実際、本発明に記載された組成物および方法の種々の改変および変形は当業者にとって明らかであり、以下の特許請求の範囲に示した範囲に含まれることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１５６】
【図１Ａ】ＳＫ−ＢＲ−３、ＳＫＯＶ−３、ＨＣＣ１９５４、ＡＵ−５６５、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるＨＥＲ２およびγ-チューブリンの発現のウエスタンブロットの結果である。
【図１Ｂ】ＳＫ−ＢＲ−３、ＳＫＯＶ−３、ＡＵ−５６５、ＨＣＣ１９５４およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５の、各薬物による７２時間の治療後の相対的生存率（ＭＴＴ）を示す。
【図２Ａ】細胞内作用性の標的治療薬であるトラスツズマブおよびＨＥＲ２に対する細胞感受性の模式図である。
【図２Ｂ】ＳＫ−ＢＲ−３、ＳＫＯＶ−３、ＡＵ−５６５、ＨＣＣ１９５４およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞のうち、トラスツズマブ、Ｔ−ＤＭ１およびＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌに対する細胞感受性を示す。
【図２Ｃ】ＳＫ−ＢＲ−３、ＳＫＯＶ−３、ＡＵ−５６５、ＨＣＣ１９５４およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞における、ＨＥＲ２（Ｄ１）、ＨＥＲ３（Ｄ２）、ＥＧＦＲ（Ｄ３）およびγ−チューブリン発現の、ウエスタンブロット（ｎ＝２）による代表の結果を示す。
【図２Ｄ】ＳＫ−ＢＲ−３、ＳＫＯＶ−３、ＡＵ−５６５、ＨＣＣ１９５４およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞における、ＨＥＲ２（Ｄ１）、ＨＥＲ３（Ｄ２）、ＥＧＦＲ（Ｄ３）およびγ−チューブリン発現の、ウエスタンブロット（ｎ＝２）による発現量の結果を示す。
【図２Ｅ】ＨＥＲ２とＴ−ＤＭ１感度（１／ＩＣ５０（Ｔ−ＤＭ１））（Ｅ１）またはＭＨ３−Ｂ１／Ｇｅｌ感度（ＴＩ）（Ｅ２）との線形回帰解析曲線を示す。
【図３Ａ】Ｔ−ＤＭ１感受性に対するＨＥＲ３およびＥＧＦＲ発現のＨＥＲ２を伴う影響を示す。
【図３Ｂ】Ｔ−ＤＭ１感受性に対するＨＥＲ３およびＥＧＦＲ発現のＨＥＲ２を伴う影響を示す。
【図３Ｃ】ＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌ感受性に対するＨＥＲ３およびＥＧＦＲ発現のＨＥＲ２を伴う影響を示す。
【図３Ｄ】ＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌ感受性に対するＨＥＲ３およびＥＧＦＲ発現のＨＥＲ２を伴う影響を示す。
【図３Ｅ】ＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌ感受性に対するＨＥＲ３およびＥＧＦＲ発現のＨＥＲ２を伴う影響を示す。
【図４Ａ】ＳＫ−ＢＲ−３、ＳＫＯＶ−３、ＡＵ−５６５、ＨＣＣ１９５４およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞におけるＲａｂ５、Ｒａｂ４、ＨＳＰ９０、Ｒａｂ１１およびγ−チューブリン発現のウエスタンブロット（ｎ＝２）による代表の結果を示す。
【図４Ｂ】ＳＫ−ＢＲ−３、ＳＫＯＶ−３、ＡＵ−５６５、ＨＣＣ１９５４およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞におけるＲａｂ５、Ｒａｂ４、ＨＳＰ９０、Ｒａｂ１１およびγ−チューブリン発現のウエスタンブロット（ｎ＝２）による発現量の結果を示す。
【図４Ｃ】ＳＫ−ＢＲ−３、ＳＫＯＶ−３、ＡＵ−５６５、ＨＣＣ１９５４およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞におけるＲａｂ５、Ｒａｂ４、ＨＳＰ９０、Ｒａｂ１１およびγ−チューブリン発現のウエスタンブロット（ｎ＝２）による発現量の結果を示す。
【図４Ｄ】ＳＫ−ＢＲ−３、ＳＫＯＶ−３、ＡＵ−５６５、ＨＣＣ１９５４およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞におけるＲａｂ５、Ｒａｂ４、ＨＳＰ９０、Ｒａｂ１１およびγ−チューブリン発現のウエスタンブロット（ｎ＝２）による発現量の結果を示す。
【図４Ｅ】ＳＫ−ＢＲ−３、ＳＫＯＶ−３、ＡＵ−５６５、ＨＣＣ１９５４およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞におけるＲａｂ５、Ｒａｂ４、ＨＳＰ９０、Ｒａｂ１１およびγ−チューブリン発現のウエスタンブロット（ｎ＝２）による発現量の結果を示す。
【図５】Ｔ−ＤＭ１感受性に対するＲａｂ５、Ｒａｂ４、ＨＳＰ９０およびＲａｂ１１発現のＨＥＲ２を伴う影響を示す。
【図６】ＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌ感受性に対するＲａｂ５、Ｒａｂ４、ＨＳＰ９０およびＲａｂ１１発現のＨＥＲ２を伴う影響を示す。
【図７】ＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌ感受性に対するＲａｂ５、Ｒａｂ４およびＨＳＰ９０または１／Ｒａｂ１１発現のＨＥＲ２を伴う影響を示す。
【図８】Ｔ−ＤＭ１（Ａ）またはＭＨ３−Ｂ１／ｒＧｅｌ感受性（Ｂ）に対する、ＨＥＲ３およびＥＧＦＲの組み合わせ（Ａ１、Ｂ１）、または、Ｒａｂ５、Ｒａｂ４、ＨＳＰ９０および１／Ｒａｂ１１の組み合わせの発現（Ａ２、Ｂ２）のＨＥＲ２を伴う影響を示す。
【図９】バイオマーカーｘ処置相互作用のｐ値を最小化する閾値を決定するためのモンテカルロ２倍交差検定手順の結果を示す。
【図１０】ＲＡＢ５Ａ発現に関連するベイズｐＣＲ確率曲線を示す。
【図１Ａ】
2020524720.tif 000008
【図１Ｂ】
2020524720.tif 000009
【図２Ａ】
2020524720.tif 000010
【図２Ｂ】
2020524720.tif 000011
【図２Ｃ】
2020524720.tif 000012
【図２Ｄ】
2020524720.tif 000013
【図２Ｅ】
2020524720.tif 000014
【図３Ａ】
2020524720.tif 000015
【図３Ｂ】
2020524720.tif 000016
【図３Ｃ】
2020524720.tif 000017
【図３Ｄ】
2020524720.tif 000018
【図３Ｅ】
2020524720.tif 000019
【図４Ａ】
2020524720.tif 000020
【図４Ｂ】
2020524720.tif 000021
【図４Ｃ】
2020524720.tif 000022
【図４Ｄ】
2020524720.tif 000023
【図４Ｅ】
2020524720.tif 000024
【図５】
2020524720.tif 000025
【図６】
2020524720.tif 000026
【図７】
2020524720.tif 000027
【図８】
2020524720.tif 000028
【図９】
2020524720.tif 000029
【図１０】
2020524720.tif 000030
【国際調査報告】
2020524720.tif 000031
2020524720.tif 000032
2020524720.tif 000033
2020524720.tif 000034
2020524720.tif 000035
2020524720.tif 000036