(57)【要約】本開示は、複製可能ウイルスゲノムをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドであって、非ウイルス性送達ビヒクルによって細胞内に導入されたときに複製可能ウイルスを生み出すことができる、当該ポリヌクレオチドに関する。本開示はさらに、ポリヌクレオチドのカプセル封入ならびに、がんの治療及び防止のためのポリヌクレオチド及び／または粒子の使用に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
複製可能ウイルスゲノムをコードするポリヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡ分子を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）であって、
前記ポリヌクレオチド配列が、哺乳動物ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ  ＩＩ）に結合することができるプロモーター配列に機能可能に繋げられており、かつ３’リボザイムコード配列と５’リボザイムコード配列とに挟まれており、
前記複製可能ウイルスゲノムをコードする前記ポリヌクレオチドの起源が非ウイルス性である、前記ＬＮＰ。
【請求項２】
前記複製可能ウイルスゲノムが一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）ウイルスである、請求項１に記載のＬＮＰ。
【請求項３】
前記複製可能ウイルスゲノムが、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）ウイルスであり、プラスセンス（（＋）センス）またはマイナスセンス（（−）センス）ｓｓＲＮＡウイルスである、請求項１に記載のＬＮＰ。
【請求項４】
前記複製可能ウイルスゲノムが（＋）センスｓｓＲＮＡウイルスであり、前記（＋）センスｓｓＲＮＡウイルスがピコルナウイルスである、請求項３に記載のＬＮＰ。
【請求項５】
前記ピコルナウイルスがセネカバレーウイルス（ＳＶＶ）またはコクサッキーウイルスである、請求項４に記載のＬＮＰ。
【請求項６】
前記ＬＮＰを細胞と接触させることでウイルス粒子が前記細胞によって産生され、前記ウイルス粒子が感染性及び溶解性である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＬＮＰ。
【請求項７】
前記組換えＤＮＡ分子がさらに、外来搭載薬タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のＬＮＰ。
【請求項８】
前記外来搭載薬タンパク質が、蛍光タンパク質、酵素タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、または細胞表面受容体に結合することができる抗原結合性分子である、請求項７に記載のＬＮＰ。
【請求項９】
前記サイトカインがＦｌｔ３リガンド及びＩＬ−１８から選択される、請求項８に記載のＬＮＰ。
【請求項１０】
前記ケモカインがＣＸＣＬ１０及びＣＣＬ４から選択される、請求項８に記載のＬＮＰ。
【請求項１１】
前記抗原結合性分子が、免疫チェックポイント受容体に対する結合及び阻害を行うことができる、請求項８に記載のＬＮＰ。
【請求項１２】
前記免疫チェックポイント受容体がＰＤ１である、請求項１１に記載のＬＮＰ。
【請求項１３】
前記複製可能ウイルスゲノムをコードする前記核酸配列の中にマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）標的配列（ｍｉＲ−ＴＳ）カセットが挿入されており、前記ｍｉＲ−ＴＳカセットが１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を含み、細胞における対応する１つ以上のｍｉＲＮＡの発現が前記細胞における前記複製可能ウイルスゲノムの複製を阻害する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＬＮＰ。
【請求項１４】
前記１つ以上のｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−２１９、ｍｉＲ−２１９ａ、ｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−１３７、及びｍｉＲ−１２６から選択される、請求項１３に記載のＬＮＰ。
【請求項１５】
前記ｍｉＲ−ＴＳカセットが、ｍｉＲ−１２４標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ−１標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ−１４３標的配列の１つ以上のコピーを含む、請求項１４に記載のＬＮＰ。
【請求項１６】
前記ｍｉＲ−ＴＳカセットが、ｍｉＲ−１２８標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ−２１９ａ標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ−１２２標的配列の１つ以上のコピーを含む、請求項１４に記載のＬＮＰ。
【請求項１７】
前記ｍｉＲ−ＴＳカセットが、ｍｉＲ−１２８標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ−２０４標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ−２１９標的配列の１つ以上のコピーを含む、請求項１４に記載のＬＮＰ。
【請求項１８】
前記ｍｉＲ−ＴＳカセットが、ｍｉＲ−２１７標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ−１３７標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ−１２６標的配列の１つ以上のコピーを含む、請求項１４に記載のＬＮＰ。
【請求項１９】
前記組換えＤＮＡ分子が、複製可能ウイルスゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド配列を含むプラスミドである、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のＬＮＰ。
【請求項２０】
前記ＬＮＰが、カチオン性脂質、コレステロール及び中性脂質を含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のＬＮＰ。
【請求項２１】
前記カチオン性脂質が１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）であり、前記中性脂質が１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）または１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である、請求項２０に記載のＬＮＰ。
【請求項２２】
リン脂質−ポリマー複合体をさらに含み、
前記リン脂質−ポリマー複合体が、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−ポリ（エチレングリコール）（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）、または１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［アミノ（ポリエチレングリコール）］（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−アミン）である、
請求項２０または請求項２１に記載のＬＮＰ。
【請求項２３】
ヒアルロナンが前記ＬＮＰの表面と複合している、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のＬＮＰ。
【請求項２４】
複数の、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子
を含む、治療用組成物であって、前記複数のＬＮＰの平均粒径が約１５０ｎｍ〜約５００ｎｍである、前記治療用組成物。
【請求項２５】
前記複数のＬＮＰの平均粒径が、約２００ｎｍ〜約５００ｎｍ、約３００ｎｍ〜約５００ｎｍ、約３５０ｎｍ〜約５００ｎｍ、約４００ｎｍ〜約５００ｎｍ、約４２５ｎｍ〜約５００ｎｍ、約４５０ｎｍ〜約５００ｎｍ、または約４７５ｎｍ〜約５００ｎｍである、請求項２４に記載の治療用組成物。
【請求項２６】
前記複数のＬＮＰの平均ゼータ電位が、約−２０ｍＶ未満、約−３０ｍＶ未満、約３５ｍＶ未満、または約−４０ｍＶ未満である、請求項２４または請求項２５に記載の治療用組成物。
【請求項２７】
前記複数のＬＮＰの平均ゼータ電位が、約−５０ｍＶ〜約−２０ｍＶ、約−４０ｍＶ〜約−２０ｍＶ、または約−３０ｍＶ〜約−２０ｍＶである、請求項２６に記載の治療用組成物。
【請求項２８】
前記複数のＬＮＰの平均ゼータ電位が、約−３０ｍＶ、約−３１ｍＶ、約−３２ｍＶ、約−３３ｍＶ、約−３４ｍＶ、約−３５ｍＶ、約−３６ｍＶ、約−３７ｍＶ、約−３８ｍＶ、約−３９ｍＶ、または約−４０ｍＶである、請求項２６または請求項２７に記載の治療用組成物。
【請求項２９】
対象への前記治療用組成物の投与によって前記組換えＤＮＡポリヌクレオチドが前記対象の標的細胞に送達され、前記組換えＤＮＡポリヌクレオチドが、前記対象の前記標的細胞を溶解させることができる感染性ウイルスを生み出す、請求項２４〜２８のいずれか１項に記載の治療用組成物。
【請求項３０】
前記組成物が静脈内または腫瘍内に送達される、請求項２９に記載の治療用組成物。
【請求項３１】
前記標的細胞ががん細胞である、請求項２９に記載の治療用組成物。
【請求項３２】
がん性腫瘍の成長を阻害することを、それを必要とする対象において行う方法であって、請求項２４〜３１のいずれか１項に記載の治療用組成物を、それを必要とする前記対象に投与することを含み、前記組成物の投与が前記腫瘍の前記成長を阻害する、前記方法。
【請求項３３】
前記投与が腫瘍内投与または静脈内投与である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記がんが肺癌または肝臓癌である、請求項３２または請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
複製可能ウイルスゲノムをコードするポリヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡ分子であって、
前記ポリヌクレオチド配列が、哺乳動物ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ  ＩＩ）に結合することができるプロモーター配列に機能可能に繋げられており、かつ３’リボザイムコード配列と５’リボザイムコード配列とに挟まれており、
前記複製可能ウイルスゲノムをコードする前記ポリヌクレオチドの起源が非ウイルス性である、前記組換えＤＮＡ分子。
【請求項３６】
前記コードされるウイルスが一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）ウイルスである、請求項３５に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項３７】
前記ｓｓＲＮＡウイルスがプラスセンス（（＋）センス）またはマイナスセンス（（−）センス）ｓｓＲＮＡウイルスである、請求項３６に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項３８】
前記（＋）センスｓｓＲＮＡウイルスがピコルナウイルスである、請求項３７に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項３９】
前記ピコルナウイルスがセネカバレーウイルス（ＳＶＶ）またはコクサッキーウイルスである、請求項３８に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項４０】
前記組換えＤＮＡ分子が、非ウイルス性送達ビヒクルによって細胞内に導入されたときに感染性の溶解性ウイルスを生み出すことができる、請求項３５〜３９のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項４１】
前記組換えＤＮＡ分子がさらに、外来搭載薬タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む、請求項３５〜３９のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項４２】
前記外来搭載薬タンパク質が、蛍光タンパク質、酵素タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、細胞表面受容体に対するリガンド、または細胞表面受容体に結合することができる抗原結合性分子である、請求項４１に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項４３】
前記サイトカインがＩＬ−１８である、請求項４２に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項４４】
細胞表面受容体に対する前記リガンドがＦｌｔ３リガンドである、請求項４２に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項４５】
前記ケモカインがＣＸＣＬ１０及びＣＣＬ４から選択される、請求項４２に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項４６】
前記抗原結合性分子が、免疫チェックポイント受容体に対する結合及び阻害を行うことができる、請求項４２に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項４７】
前記免疫チェックポイント受容体がＰＤ１である、請求項４６に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項４８】
前記複製可能ウイルスゲノムをコードする前記核酸配列の中にマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）標的配列（ｍｉＲ−ＴＳ）カセットが挿入されており、
前記ｍｉＲ−ＴＳカセットが１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を含み、
細胞における対応する１つ以上のｍｉＲＮＡの発現が、前記細胞における前記コードされるウイルスの複製を阻害する、
請求項３５〜４７のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項４９】
前記１つ以上のｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−２１９、ｍｉＲ−２１９ａ、ｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−１３７、及びｍｉＲ−１２６から選択される、請求項４８に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項５０】
前記ｍｉＲ−ＴＳカセットが、ｍｉＲ−１２４標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ−１標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ−１４３標的配列の１つ以上のコピーを含む、請求項４９に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項５１】
前記ｍｉＲ−ＴＳカセットが、ｍｉＲ−１２８標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ−２１９ａ標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ−１２２標的配列の１つ以上のコピーを含む、請求項４９に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項５２】
前記ｍｉＲ−ＴＳカセットが、ｍｉＲ−１２８標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ−２０４標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ−２１９標的配列の１つ以上のコピーを含む、請求項４９に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項５３】
前記ｍｉＲ−ＴＳカセットが、ｍｉＲ−２１７標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ−１３７標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ−１２６標的配列の１つ以上のコピーを含む、請求項４９に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項５４】
前記組換えＤＮＡ分子が、複製可能ウイルスゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド配列を含むプラスミドまたはＮａｎｏＶである、請求項３５〜５３のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項５５】
複製可能ウイルスゲノムをコードするポリヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡ分子であって、
前記複製可能ウイルスをコードする前記ポリヌクレオチド配列の起源が非ウイルス性であり、
前記組換えＤＮＡ分子が、非ウイルス性送達ビヒクルによって細胞内に導入されたときに複製可能ウイルスを生み出すことができる、
前記組換えＤＮＡ分子。
【請求項５６】
前記複製可能ウイルスゲノムがＤＮＡウイルスのゲノムまたはＲＮＡウイルスのゲノムである、請求項５５に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項５７】
前記ＤＮＡゲノムまたはＲＮＡゲノムが二本鎖または一本鎖ウイルスである、請求項５６に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項５８】
前記一本鎖ゲノムがプラスセンス（（＋）センス）またはマイナスセンス（（−）センス）ゲノムである、請求項５７に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項５９】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項５５に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項６０】
前記細胞が、哺乳動物対象の中に存在している哺乳動物細胞である、請求項５９に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項６１】
前記複製可能ウイルスが、アデノウイルス、コクサッキーウイルス、ポリオウイルス、セネカバレーウイルス、ウマヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）、ラッサウイルス、マウス白血病ウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、ニューカッスル病ウイルス、麻疹ウイルス、パルボウイルス、レオウイルス、シンドビスウイルス、ワクチニアウイルス、粘液腫ウイルス、水疱性口炎ウイルス（ＶＳＶ）、マラバウイルスからなる群から選択される、請求項５５に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項６２】
前記複製可能ウイルスゲノムをコードする前記ポリヌクレオチドの中に挿入された１つ以上のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）標的配列（ｍｉＲ−ＴＳ）カセットをさらに含み、
前記ｍｉＲ−ＴＳカセットが１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を含み、
細胞における対応する１つ以上のｍｉＲＮＡの発現が、前記細胞における前記コードされるウイルスの複製を阻害する、
請求項５５〜６１のいずれかに記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項６３】
前記１つ以上のｍｉＲ−ＴＳカセットが１つ以上の必須ウイルス遺伝子の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）または３’ＵＴＲの中に組み込まれている、請求項６２に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項６４】
前記１つ以上の必須ウイルス遺伝子が、ＵＬ１、ＵＬ５、ＵＬ６、ＵＬ７、ＵＬ８、ＵＬ９、ＵＬ１１、ＵＬ１２、ＵＬ１４、ＵＬ１５、ＵＬ１７、ＵＬ１８、ＵＬ１９、ＵＬ２０、ＵＬ２２、ＵＬ２５、ＵＬ２６、ＵＬ２６．５、ＵＬ２７、ＵＬ２８、ＵＬ２９、ＵＬ３０、ＵＬ３１、ＵＬ３２、ＵＬ３３、ＵＬ３４、ＵＬ３５、ＵＬ３６、ＵＬ３７、ＵＬ３８、ＵＬ３９、ＵＬ４０、ＵＬ４２、ＵＬ４８、ＵＬ４９、ＵＬ５０、ＵＬ５２、ＵＬ５３、ＵＬ５４、ＵＳ１、ＵＳ３、ＵＳ４、ＵＳ５、ＵＳ６、ＵＳ７、ＵＳ８、ＵＳ１２、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、ＰＢ、Ｆ、Ｂ５Ｒ、ＳＥＲＯ−１、Ｃａｐ、Ｒｅｖ、ＶＰ１〜４、核タンパク質（Ｎ）、リンタンパク質（Ｐ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、糖タンパク質（Ｇ）、ポリメラーゼ（Ｌ）、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ３、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、及び３Ｄからなる群から選択される、請求項６３に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項６５】
前記１つ以上のｍｉＲ−ＴＳカセットが１つ以上の非必須遺伝子の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）または３’ＵＴＲの中に組み込まれている、請求項６２に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項６６】
前記ポリヌクレオチドが、レプリコン、プラスミド、コスミド、ファージミド、トランスポゾン、細菌人工染色体、酵母人工染色体、または末端閉鎖型線形二本鎖腫瘍溶解性ウイルス（Ｏｖ）ＤＮＡ分子から選択される核酸ベクターの中に挿入されている、請求項５５〜６５のいずれかに記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項６７】
前記ポリヌクレオチドが、ＤＮＡポリヌクレオチドであり、さらに、前記複製可能ウイルスゲノムをコードする前記核酸配列の５’末端に第１ＡＡＶ由来末端逆位反復配列（ＩＴＲ）、及び前記複製可能ウイルスゲノムをコードする前記核酸配列の３’末端に第２ＡＡＶ由来ＩＴＲを含む、請求項５５に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項６８】
前記ポリヌクレオチドが、ＤＮＡポリヌクレオチドであり、さらに、前記複製可能ウイルスゲノムをコードする前記核酸配列のすぐ３’側の第１リボザイムコード配列、及び前記複製可能ウイルスゲノムをコードする前記核酸配列のすぐ５’側の第２リボザイムコード配列を含む、請求項５５に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項６９】
前記第１及び第２リボザイムコード配列が、ハンマーヘッド型リボザイムまたはデルタ肝炎ウイルスリボザイムをコードする、請求項６８に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項７０】
前記プロモーター配列が、真核生物ＲＮＡポリメラーゼに結合することができる、請求項５５に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項７１】
前記プロモーター配列が、哺乳動物ＲＮＡポリメラーゼに結合することができる、請求項５５に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項７２】
前記ポリヌクレオチドがＤＮＡポリヌクレオチドであり、前記哺乳動物ポリメラーゼが感染性複製可能ＲＮＡウイルスの転写を促す、請求項５５に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項７３】
前記ポリヌクレオチドがＤＮＡポリヌクレオチドであり、前記哺乳動物ポリメラーゼが感染性複製可能ＤＮＡウイルスの転写を促す、請求項５５に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項７４】
前記プロモーター配列が選択的にがん細胞における前記ポリヌクレオチドの転写を促す、請求項５５に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項７５】
前記プロモーター配列が、ｈＴＥＲＴ、ＨＥ４、ＣＥＡ、ＯＣ、ＡＲＦ、ＣｇＡ、ＧＲＰ７８、ＣＸＣＲ４、ＨＭＧＢ２、ＩＮＳＭ１、メソテリン、ＯＰＮ、ＲＡＤ５１、ＴＥＴＰ、Ｈ１９、ｕＰＡＲ、ＥＲＢＢ２、ＭＵＣ１、Ｆｒｚ１、またはＩＧＦ２−Ｐ４からなる群から選択される遺伝子に由来する、請求項５５〜７６のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項７６】
細胞毒性ポリペプチド、サイトカイン、ケモカイン、抗原結合性分子、細胞表面受容体に対するリガンド、可溶性受容体、酵素、サソリポリペプチド、ヘビポリペプチド、クモポリペプチド、ハチポリペプチド、カエルポリペプチド及び治療用核酸からなる群から選択される搭載薬分子をコードする核酸配列をさらに含む、請求項５５〜７５のいずれかに記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項７７】
１つ以上のｍｉＲ−ＴＳカセットが、前記搭載薬分子をコードする前記核酸配列の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）または３’ＵＴＲ配列の中に組み込まれている、請求項７６に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項７８】
前記細胞毒性ポリペプチドが、ｐ５３、ジフテリア毒素（ＤＴ）、シュードモナス外毒素Ａ（ＰＥＡ）、Ｉ型リボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）、ＩＩ型ＲＩＰ、または志賀様毒素１（Ｓｌｔ１）から選択される、請求項７６に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項７９】
前記酵素が、
メタロプロテアーゼ、コラゲナーゼ、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、カスパーゼ、ゼラチナーゼ、または
遺伝子指向性酵素プロドラッグ療法（ＧＤＥＰＴ）システムの一部であり単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、カルボキシペプチダーゼＧ２、プリンヌクレオシドホスホリラーゼもしくはシトクロムＰ４５０から選択される酵素
から選択される、請求項７６に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項８０】
前記ゼラチナーゼが線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）である、請求項７９に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項８１】
前記メタロプロテアーゼがマトリックスメタロプロテアーゼ（例えばＭＭＰ９）またはＡＤＡＭ１７である、請求項７９に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項８２】
前記サイトカインが、オステオポンチン、ＩＬ−１３、ＴＧＦβ、ＩＬ−３５、ＩＬ−１８、ＩＬ−１５、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγからなる群から選択される、請求項７６に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項８３】
前記ケモカインが、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ９及びＣＣＬ２１から選択される、請求項７６に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項８４】
細胞表面受容体に対する前記リガンドが、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ニューロピリンリガンド、Ｆｌｔ３リガンド、ＣＤ４７リガンドである、請求項７６に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項８５】
前記抗原結合性分子が、
ＰＤ−１、ＰＤＬ−１、ＣＴＬＡ４、ＣＣＲ４、ＯＸ４０、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ４７、ＣＳＦ１Ｒ、ＥｐｈＡ２、ＣＤ１９、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡ、ＰＳＭＡ、ＣＤ３３、ＥＧＦＲ、ＣＣＲ４、ＣＤ２００、ＣＤ４０、ＣＤ４７、ＨＥＲ２、ＤＬＬ３、４−１ＢＢ、１７−１Ａ、ＧＤ２、及び表７中に列挙されている腫瘍抗原のうちの任意の１つ以上
からなる群から選択される細胞表面抗原に結合する、請求項７６に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項８６】
前記サソリポリペプチドが、クロロトキシン、ＢｍＫｎ−２、ネオプラジン１、ネオプラジン２及びマウリポリン（ｍａｕｒｉｐｏｒｉｎ）からなる群から選択される、請求項７６に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項８７】
前記ヘビポリペプチドが、コントルトロスタチン、アポキシンＩ、ボトロプストキシンＩ、ＢＪｃｕＬ、ＯＨＡＰ−１、ロドストミン（ｒｈｏｄｏｓｔｏｍｉｎ）、ｄｒＣＴ−Ｉ、ＣＴＸ−ＩＩＩ、Ｂ１Ｌ、及びＡＣＴＸ−６からなる群から選択される、請求項７６に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項８８】
前記クモポリペプチドが、ラタルシン及びヒアルロニダーゼからなる群から選択される、請求項７６に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項８９】
前記ハチポリペプチドが、メリチン及びアパミンからなる群から選択される、請求項７６に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項９０】
前記カエルポリペプチドが、ＰｓＴ−１、ＰｄＴ−１、及びＰｄＴ−２からなる群から選択される、請求項７６に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項９１】
前記搭載薬タンパク質が免疫細胞に対して作用する、請求項７６〜８４のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項９２】
前記免疫細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫＴ細胞、マクロファージ、及び／または樹状細胞からなる群から選択される、請求項９１に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項９３】
前記搭載薬ポリペプチドが、
ヒト細胞表面抗原に結合することができる第１ドメインと、ヒト腫瘍細胞抗原に結合することができる第２ドメインとを含む二分ポリペプチド
である、請求項７６に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項９４】
前記二分ポリペプチドの片方または両方のドメインが、抗体、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ）、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン、ダイアボディ、フレキシボディ、ＤＯＣＫ−ＡＮＤ−ＬＯＣＫ（商標）抗体、及びモノクローナル抗イディオタイプ抗体（ｍＡｂ２）からなる群から選択される抗原結合性分子である、請求項９３に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項９５】
前記二分ポリペプチドが、二重可変ドメイン抗体（ＤＶＤ−Ｉｇ（商標））、二重特異性Ｔ細胞係合子（ＢｉＴＥ（商標））、ＤｕｏＢｏｄｙ（登録商標）、二重親和性再指向性（ＤＡＲＴ）ポリペプチドまたはＴａｎｄａｂ（登録商標）である、請求項９４に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項９６】
前記抗体が、操作されたＦｃドメインを有するＩｇＧ抗体である、請求項９４に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項９７】
前記治療用核酸が、アンタゴミール、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、リボザイムまたはアプタマーである、請求項７６に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項９８】
前記ｍｉＲ−ＴＳカセット中に含まれた前記ｍｉＲＮＡ標的配列に結合するｍｉＲＮＡが発現している細胞において前記ポリヌクレオチドが複製されない、または最小限に複製される、請求項６２〜９７のいずれかに記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項９９】
前記ｍｉＲＮＡが表３から選択される、請求項９８に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項１００】
前記１つ以上のｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−２１９、ｍｉＲ−２１９ａ、ｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−１３７、及びｍｉＲ−１２６から選択される、請求項９８に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項１０１】
前記ｍｉＲ−ＴＳカセットが、ｍｉＲ−１２４標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ−１標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ−１４３標的配列の１つ以上のコピーを含む、請求項１００に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項１０２】
前記ｍｉＲ−ＴＳカセットが、ｍｉＲ−１２８標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ−２１９ａ標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ−１２２標的配列の１つ以上のコピーを含む、請求項１００に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項１０３】
前記ｍｉＲ−ＴＳカセットが、ｍｉＲ−１２８標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ−２０４標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ−２１９標的配列の１つ以上のコピーを含む、請求項１００に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項１０４】
前記ｍｉＲ−ＴＳカセットが、ｍｉＲ−２１７標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ−１３７標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ−１２６標的配列の１つ以上のコピーを含む、請求項１００に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項１０５】
前記組換えＤＮＡ分子が、前記自己複製性ポリヌクレオチドを含むプラスミドである、請求項５５〜１０４のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項１０６】
組換えＤＮＡ分子であって、
（ｉ）ウイルスゲノムのセンス配列を含む第１一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）分子、及び
（ｉｉ）前記ウイルスゲノムのアンチセンス配列を含む第２ｓｓＤＮＡ分子
を含み、
前記第１及び第２ｓｓＤＮＡ分子の各々が３’末端逆位反復配列及び５’末端逆位反復配列を含むものであり、
前記センスｓｓＤＮＡ分子の前記３’末端が前記アンチセンスｓｓＤＮＡ分子の前記５’末端に共有結合で繋げられ、かつ前記センスｓｓＤＮＡ分子の前記５’末端が前記アンチセンスｓｓＤＮＡ分子の前記３’末端に共有結合で繋げられて末端閉鎖型線形二本鎖腫瘍溶解性ウイルス（Ｏｖ）ＤＮＡ分子を形成している、前記組換えＤＮＡ分子。
【請求項１０７】
前記コードされるウイルスがマイナスセンスまたはプラスセンス一本鎖（ｓｓ）ＲＮＡウイルスである、請求項１０６に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項１０８】
前記プラスセンスｓｓＲＮＡウイルスがポリオウイルス（ＰＶ）である、請求項１０７に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項１０９】
前記マイナスセンスｓｓＲＮＡウイルスが水疱性口炎ウイルス（ＶＳＶ）ゲノムである、請求項１０７に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項１１０】
前記第１及び第２ｓｓＤＮＡ分子の各々がさらに、前記ウイルスゲノム配列のすぐ５’側のリボザイムコード配列、及び前記ウイルスゲノム配列のすぐ３’側のリボザイムコード配列を含む、請求項１０６に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項１１１】
前記ウイルスゲノムが、１つ以上の必須ウイルス遺伝子の中に挿入された１つ以上のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）標的配列を含む、請求項１０６〜１１０のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項１１２】
前記１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列が、前記１つ以上の必須ウイルス遺伝子の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）及び／または５’ＵＴＲの中に挿入されている、請求項１１１に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項１１３】
前記１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列が、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つまたはそれより多くの必須ウイルス遺伝子の中に挿入されている、請求項１１１または請求項１１２に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項１１４】
少なくとも２つ、少なくとも３つまたは少なくとも４つのｍｉＲＮＡ標的配列が１つ以上の必須ウイルス遺伝子の中に挿入されている、請求項１１１〜１１３のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項１１５】
前記少なくとも２つ、少なくとも３つまたは少なくとも４つのｍｉＲＮＡ標的配列が、１つのｍｉＲＮＡの標的配列を含む、請求項１１４に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項１１６】
前記少なくとも２つ、少なくとも３つまたは少なくとも４つのｍｉＲＮＡ標的配列が、少なくとも２つ、少なくとも３つまたは少なくとも４つの異なるｍｉＲＮＡの標的配列を含む、請求項１１４に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項１１７】
前記ウイルスゲノムがＶＳＶゲノムであり、前記１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列が、核タンパク質（Ｎ）、リンタンパク質（Ｐ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、糖タンパク質（Ｇ）及び／またはポリメラーゼ（Ｌ）タンパク質をコードする遺伝子の１つ以上の中に挿入されている、請求項１０６に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項１１８】
前記ウイルスゲノムがＰＶゲノムであり、前記１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列が、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、３Ａ、３Ｂ（ＶＰｇ）、３Ｃまたは３Ｄタンパク質をコードする遺伝子の１つ以上の中に挿入されている、請求項１０６に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項１１９】
３’及び５’ＩＴＲがＡＡＶに由来する、請求項１０６〜１１８のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項１２０】
前記ＡＡＶがＡＡＶ２である、請求項１１９に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項１２１】
有効量の、請求項１〜１２０のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡ分子と、
哺乳動物対象への投与に適した担体と
を含む組成物。
【請求項１２２】
請求項５５〜１２０のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡ分子を含む粒子。
【請求項１２３】
前記粒子が生分解性である、請求項１２２に記載の粒子。
【請求項１２４】
前記粒子が、ナノ粒子、エクソソーム、リポソーム及びリポプレックスからなる群から選択される、請求項１２３に記載の粒子。
【請求項１２５】
前記エクソソームが、完全エクソソームまたは空エクソソームに由来する改変型エクソソームである、請求項１２４に記載の粒子。
【請求項１２６】
前記ナノ粒子が、カチオン性脂質、コレステロール及び中性脂質を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である、請求項１２４に記載の粒子。
【請求項１２７】
前記カチオン性脂質が１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）であり、前記中性脂質が１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）または１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である、請求項１２６に記載のＬＮＰ。
【請求項１２８】
リン脂質−ポリマー複合体をさらに含み、
前記リン脂質−ポリマー複合体が、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−ポリ（エチレングリコール）（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）、または１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［アミノ（ポリエチレングリコール）］（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−アミン）である、
請求項１２６または請求項１２７に記載のＬＮＰ。
【請求項１２９】
ヒアルロナンが前記ＬＮＰの表面と複合している、請求項１２６〜１２８のいずれか１項に記載のＬＮＰ。
【請求項１３０】
複数の、請求項１２６〜１２９のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子
を含む、治療用組成物であって、前記複数のＬＮＰの平均粒径が約１５０ｎｍ〜約５００ｎｍである、前記治療用組成物。
【請求項１３１】
前記複数のＬＮＰの平均粒径が、約２００ｎｍ〜約５００ｎｍ、約３００ｎｍ〜約５００ｎｍ、約３５０ｎｍ〜約５００ｎｍ、約４００ｎｍ〜約５００ｎｍ、約４２５ｎｍ〜約５００ｎｍ、約４５０ｎｍ〜約５００ｎｍ、または約４７５ｎｍ〜約５００ｎｍである、請求項１３０に記載の治療用組成物。
【請求項１３２】
前記複数のＬＮＰの平均ゼータ電位が、約−２０ｍＶ未満、約−３０ｍＶ未満、約３５ｍＶ未満、または約−４０ｍＶ未満である、請求項１３０または請求項１３１に記載の治療用組成物。
【請求項１３３】
前記複数のＬＮＰの平均ゼータ電位が、約−５０ｍＶ〜約−２０ｍＶ、約−４０ｍＶ〜約−２０ｍＶ、または約−３０ｍＶ〜約−２０ｍＶである、請求項１３２に記載の治療用組成物。
【請求項１３４】
前記複数のＬＮＰの平均ゼータ電位が、約−３０ｍＶ、約−３１ｍＶ、約−３２ｍＶ、約−３３ｍＶ、約−３４ｍＶ、約−３５ｍＶ、約−３６ｍＶ、約−３７ｍＶ、約−３８ｍＶ、約−３９ｍＶ、または約−４０ｍＶである、請求項１３１または請求項１３２に記載の治療用組成物。
【請求項１３５】
対象への前記組成物の送達によって前記カプセル封入ＤＮＡ発現カセットが標的細胞に送達され、前記カプセル封入ＤＮＡ発現カセットが、前記標的細胞を溶解させることができる感染性ウイルスを生み出す、請求項１３０〜１３４のいずれか１項に記載の治療用組成物。
【請求項１３６】
前記組成物が静脈内または腫瘍内に送達される、請求項１３５に記載の治療用組成物。
【請求項１３７】
前記標的細胞ががん細胞である、請求項１３６に記載の治療用組成物。
【請求項１３８】
請求項１〜１２０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む無機粒子。
【請求項１３９】
前記無機粒子が、金ナノ粒子（ＧＮＰ）、金ナノロッド（ＧＮＲ）、磁気ナノ粒子（ＭＮＰ）、磁気ナノチューブ（ＭＮＴ）、カーボンナノホーン（ＣＮＨ）、カーボンフラーレン、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）、リン酸カルシウムナノ粒子（ＣＰＮＰ）、メソポーラスシリカナノ粒子（ＭＳＮ）、シリカナノチューブ（ＳＮＴ）、または星状中空シリカナノ粒子（ＳＨＳＮ）からなる群から選択される、請求項１３８に記載の粒子。
【請求項１４０】
前記粒子の平均直径が、約５００ｎｍ未満である、約２５０ｎｍ〜約５００ｎｍである、または約３５０ｎｍである、請求項１３８または請求項１３９に記載の粒子を含む組成物。
【請求項１４１】
がん細胞を死滅させる方法であって、
前記がん細胞を、請求項１２２〜１４０のいずれか１項に記載の粒子もしくは組成物、またはその組成物に、前記粒子を前記がん細胞に細胞内送達するのに十分な条件の下で曝露すること
を含み、カプセル封入ポリヌクレオチドによって生み出される複製可能ウイルスが前記がん細胞の死滅をもたらす、前記方法。
【請求項１４２】
前記複製可能ウイルスが非がん性細胞では生み出されない、請求項１４１に記載の方法。
【請求項１４３】
前記方法が、生体内、試験管内または生体外で実施される、請求項１４１または請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４４】
対象のがんを治療する方法であって、
前記がんに罹患している対象に有効量の、請求項１２２〜１４０のいずれか１項に記載の粒子もしくは組成物、またはその組成物を投与すること
を含む、前記方法。
【請求項１４５】
前記粒子またはその組成物が、静脈内に投与される、鼻腔内に投与される、吸入剤として投与される、または腫瘍中に直接注射される、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１４６】
前記粒子またはその組成物が前記対象に繰り返し投与される、請求項１４４または請求項１４５に記載の方法。
【請求項１４７】
前記対象が、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウマ、非ヒト霊長類またはヒトである、請求項１４４〜１４６のいずれかに記載の方法。
【請求項１４８】
前記がんが、肺癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、前立腺癌、精巣癌、大腸癌、結腸癌、膵臓癌、肝臓癌、胃癌、頭頸部癌、甲状腺癌、悪性神経膠腫、神経膠芽腫、メラノーマ、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、及び辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）から選択される、請求項１４４〜１４７のいずれかに記載の方法。
【請求項１４９】
前記肺癌が小細胞肺癌または非小細胞肺癌である、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５０】
前記肝臓癌が肝細胞癌腫（ＨＣＣ）である、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５１】
先行請求項のいずれかに記載の組換えＤＮＡ分子を製造する方法であって、
ａ．前記組換えＤＮＡ分子を第１ウイルス発現ベクターの中に挿入すること
であって、前記組換えＤＮＡ分子が前記ポリヌクレオチドの５’アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来末端逆位反復配列（ＩＴＲ）及び３’ＡＡＶ由来ＩＴＲ末端を含む、前記挿入すること、
ｂ．ＩＴＲによって媒介される複製に必要とされるＡＡＶタンパク質をコードするポリヌクレオチドを第２ウイルス発現ベクターの中に挿入すること、ならびに
ｃ．前記第１及び前記第２ウイルス発現ベクターを細胞に細胞内送達すること
を含み、
前記組換えＤＮＡ分子がゲノムの中に安定的に組み込まれ、
前記細胞が、前記ＩＴＲに挟まれたポリヌクレオチドを、ＩＴＲの非存在下で生み出される場合よりも多い量で産生する、前記方法。
【請求項１５２】
前記ウイルス発現ベクターがヘルペスウイルスまたはバキュロウイルスである、請求項１４４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１７年７月１４日に出願された米国仮出願第６２／５３２，８８６号及び２０１８年３月２７日に出願された第６２／６４８，６５１号に基づく優先権を主張するものであり、参照によりこれらの各々の全体を本明細書に援用する。
【０００２】
配列表に関する記載
本願に関連する配列表は紙のコピーの代わりにテキスト形式で提供され、これをもって参照により本明細書に援用される。配列表が入ったテキストファイルの名前はＯＮＣＲ＿００５＿０３ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは２３ＫＢであり、２０１８年７月１３日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂによって電子出願されている。
【０００３】
分野
本開示は、総じて免疫学、炎症及びがん治療学の分野に関する。より具体的には、本開示は、粒子内に封入された、複製可能ウイルスゲノムをコードするポリヌクレオチドに関する。本開示はさらに、がんなどの増殖性疾患の治療及び防止に関する。
【背景技術】
【０００４】
腫瘍溶解ウイルスは、腫瘍細胞に感染してそれを溶解させることができる溶解性の生活環を有する複製可能ウイルスである。直接的な腫瘍細胞溶解は細胞死をもたらすだけでなく、局部の抗原提示細胞によって取り込まれ提示された腫瘍抗原に対する適応免疫応答の発生ももたらす。したがって、腫瘍溶解ウイルスは、直接的な細胞溶解と、ウイルスクリアランス後に抗腫瘍応答を維持することができる抗原特異的な適応応答を促進することとの両方によって腫瘍細胞成長に対向する。
【０００５】
しかしながら、複製可能ウイルスの臨床での使用はいくつかの難題を突き付けている。一般に、ウイルス曝露は自然免疫経路を活性化し、結果として広範な非特異的炎症応答を招く。患者が以前にウイルスに曝露されたことがない場合、この初回の自然免疫応答は適応抗ウイルス応答の発達及び中和抗体の産生を引き起こし得る。患者が以前にウイルスに曝露されたことがある場合、既存の中和抗ウイルス抗体は、望まれる溶解作用を妨げ得る。どちらの場合にも、中和抗体の存在は、標的細胞のウイルス性溶解を妨げるだけでなく、ウイルス治療薬の再投与を非効果的なものにもする。これらの因子は転移がんの治療におけるウイルス治療薬の使用を制限する、というのも、そのようながんの治療に必要とされる繰り返される全身投与の有効性は自然発生の抗ウイルス応答によって妨害されるからである。そのような障壁が存在していない場合でさえ、非疾患細胞における後のウイルス複製は、周囲の細胞及び組織に対する疾患以外によるかなりの副次的損傷を招く可能性がある。
【０００６】
当技術分野では複製可能ウイルスの治療的使用に関係する組成物及び方法の必要性が長年にわたって充たされないままである。本開示は、そのような組成物及び方法ならびにそれ以上のものを提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示は、自己複製性ポリヌクレオチドをコードするＤＮＡポリヌクレオチドならびに関連する組成物及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、複製可能ウイルスゲノムをコードする核酸配列を含み、ポリヌクレオチドは、非ウイルス性送達ビヒクルによって細胞内に導入されたときに複製可能ウイルスを生み出すことができるものである。
【０００８】
一態様では、本開示は、複製可能ウイルスゲノムをコードするポリヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡ分子を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）であって、ポリヌクレオチド配列が、哺乳動物ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ  ＩＩ）に結合することができるプロモーター配列に機能可能に繋げられており、かつ３’リボザイムコード配列と５’リボザイムコード配列とに挟まれており、複製可能ウイルスゲノムをコードする当該ポリヌクレオチドの起源が非ウイルス性である、当該ＬＮＰを提供する。
【０００９】
一実施形態では、複製可能ウイルスゲノムは一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）ウイルスである。
【００１０】
一実施形態では、複製可能ウイルスゲノムは、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）ウイルスであり、プラスセンス（（＋）センス）またはマイナスセンス（（−）センス）ｓｓＲＮＡウイルスである。
【００１１】
一実施形態では、複製可能ウイルスゲノムは（＋）センスｓｓＲＮＡウイルスであり、（＋）センスｓｓＲＮＡウイルスがピコルナウイルスである。
【００１２】
一実施形態では、ピコルナウイルスはセネカバレーウイルス（ＳＶＶ）またはコクサッキーウイルスである。
【００１３】
一実施形態では、ＬＮＰを細胞と接触させることでウイルス粒子が細胞によって産生され、ウイルス粒子は感染性及び溶解性である。
【００１４】
一実施形態では、組換えＤＮＡ分子はさらに、外来搭載薬タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む。
【００１５】
一実施形態では、外来搭載薬タンパク質は、蛍光タンパク質、酵素タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、または細胞表面受容体に結合することができる抗原結合性分子である。
【００１６】
一実施形態では、サイトカインはＦｌｔ３リガンド及びＩＬ−１８から選択される。
【００１７】
一実施形態では、ケモカインはＣＸＣＬ１０及びＣＣＬ４から選択される。
【００１８】
一実施形態では、抗原結合性分子は、免疫チェックポイント受容体に対する結合及び阻害を行うことができる。
【００１９】
一実施形態では、免疫チェックポイント受容体はＰＤ１である。
【００２０】
一実施形態では、複製可能ウイルスゲノムをコードする核酸配列の中にマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）標的配列（ｍｉＲ−ＴＳ）カセットが挿入されており、ｍｉＲ−ＴＳカセットは１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を含み、細胞における対応する１つ以上のｍｉＲＮＡの発現は細胞における複製可能ウイルスゲノムの複製を阻害する。
【００２１】
一実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−２１９、ｍｉＲ−２１９ａ、ｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−１３７、及びｍｉＲ−１２６から選択される。
【００２２】
一実施形態では、ｍｉＲ−ＴＳカセットは、ｍｉＲ−１２４標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ−１標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ−１４３標的配列の１つ以上のコピーを含む。
【００２３】
一実施形態では、ｍｉＲ−ＴＳカセットは、ｍｉＲ−１２８標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ−２１９ａ標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ−１２２標的配列の１つ以上のコピーを含む。
【００２４】
一実施形態では、ｍｉＲ−ＴＳカセットは、ｍｉＲ−１２８標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ−２０４標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ−２１９標的配列の１つ以上のコピーを含む。
【００２５】
一実施形態では、ｍｉＲ−ＴＳカセットは、ｍｉＲ−２１７標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ−１３７標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ−１２６標的配列の１つ以上のコピーを含む。
【００２６】
一実施形態では、組換えＤＮＡ分子は、複製可能ウイルスゲノムをコードするポリヌクレオチド配列を含むプラスミドである。
【００２７】
一実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性脂質、コレステロール及び中性脂質を含む。
【００２８】
一実施形態では、カチオン性脂質は１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）であり、中性脂質は１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）または１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である。
【００２９】
一実施形態では、ＬＮＰはリン脂質−ポリマー複合体を含み、リン脂質−ポリマー複合体が、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−ポリ（エチレングリコール）（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）、または１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［アミノ（ポリエチレングリコール）］（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−アミン）である。
【００３０】
一実施形態では、ヒアルロナンがＬＮＰの表面と複合している。
【００３１】
一態様では、本開示は、複数の脂質ナノ粒子を含む治療用組成物であって、複数のＬＮＰの平均粒径が約１５０ｎｍ〜約５００ｎｍである、当該治療用組成物を提供する。
【００３２】
一実施形態では、複数のＬＮＰの平均粒径は、約２００ｎｍ〜約５００ｎｍ、約３００ｎｍ〜約５００ｎｍ、約３５０ｎｍ〜約５００ｎｍ、約４００ｎｍ〜約５００ｎｍ、約４２５ｎｍ〜約５００ｎｍ、約４５０ｎｍ〜約５００ｎｍ、または約４７５ｎｍ〜約５００ｎｍである。
【００３３】
一実施形態では、複数のＬＮＰの平均ゼータ電位は、約−２０ｍＶ未満、約−３０ｍＶ未満、約３５ｍＶ未満、または約−４０ｍＶ未満である。
【００３４】
一実施形態では、複数のＬＮＰの平均ゼータ電位は、約−５０ｍＶ〜約−２０ｍＶ、約−４０ｍＶ〜約−２０ｍＶ、または約−３０ｍＶ〜約−２０ｍＶである。
【００３５】
一実施形態では、複数のＬＮＰの平均ゼータ電位は、約−３０ｍＶ、約−３１ｍＶ、約−３２ｍＶ、約−３３ｍＶ、約−３４ｍＶ、約−３５ｍＶ、約−３６ｍＶ、約−３７ｍＶ、約−３８ｍＶ、約−３９ｍＶ、または約−４０ｍＶである。
【００３６】
一実施形態では、対象への治療用組成物の投与によって組換えＤＮＡポリヌクレオチドが対象の標的細胞に送達され、組換えＤＮＡポリヌクレオチドが、対象の標的細胞を溶解させることができる感染性ウイルスを生み出す。
【００３７】
一実施形態では、組成物は静脈内または腫瘍内に送達される。
【００３８】
一実施形態では、標的細胞はがん細胞である。
【００３９】
一態様では、本開示は、がん性腫瘍の成長を阻害することを、それを必要とする対象において行う方法であって、治療用組成物を、それを必要とする対象に投与することを含み、組成物の投与が腫瘍の成長を阻害する、当該方法を提供する。
【００４０】
一実施形態では、投与は腫瘍内投与または静脈内投与である。
【００４１】
一実施形態では、がんは肺癌または肝臓癌である。
【００４２】
一態様では、本開示は、複製可能ウイルスゲノムをコードするポリヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡ分子であって、ポリヌクレオチド配列が、哺乳動物ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ  ＩＩ）に結合することができるプロモーター配列に機能可能に繋げられており、かつ３’リボザイムコード配列と５’リボザイムコード配列とに挟まれており、複製可能ウイルスゲノムをコードするポリヌクレオチドの起源が非ウイルス性である、当該組換えＤＮＡ分子を提供する。
【００４３】
一実施形態では、コードされるウイルスは一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）ウイルスである。
【００４４】
一実施形態では、ｓｓＲＮＡウイルスはプラスセンス（（＋）センス）またはマイナスセンス（（−）センス）ｓｓＲＮＡウイルスである。
【００４５】
一実施形態では、（＋）センスｓｓＲＮＡウイルスはピコルナウイルスである。
【００４６】
一実施形態では、ピコルナウイルスはセネカバレーウイルス（ＳＶＶ）またはコクサッキーウイルスである。
【００４７】
一実施形態では、組換えＤＮＡ分子は、非ウイルス性送達ビヒクルによって細胞内に導入されたときに感染性の溶解性ウイルスを生み出すことができる。
【００４８】
一実施形態では、組換えＤＮＡ分子はさらに、外来搭載薬タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む。
【００４９】
一実施形態では、外来搭載薬タンパク質は、蛍光タンパク質、酵素タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、細胞表面受容体に対するリガンド、または細胞表面受容体に結合することができる抗原結合性分子である。
【００５０】
一実施形態では、サイトカインがＩＬ−１８である。
【００５１】
一実施形態では、細胞表面受容体に対するリガンドはＦｌｔ３リガンドである。
【００５２】
一実施形態では、ケモカインはＣＸＣＬ１０及びＣＣＬ４から選択される。
【００５３】
一実施形態では、抗原結合性分子は、免疫チェックポイント受容体に対する結合及び阻害を行うことができる。
【００５４】
一実施形態では、免疫チェックポイント受容体はＰＤ１である。
【００５５】
一実施形態では、複製可能ウイルスゲノムをコードする核酸配列の中にマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）標的配列（ｍｉＲ−ＴＳ）カセットが挿入されており、ｍｉＲ−ＴＳカセットは１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を含み、細胞における対応する１つ以上のｍｉＲＮＡの発現は、細胞におけるコードされるウイルスの複製を阻害する。
【００５６】
一実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−２１９、ｍｉＲ−２１９ａ、ｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−１３７、及びｍｉＲ−１２６から選択される。
【００５７】
一実施形態では、ｍｉＲ−ＴＳカセットは、ｍｉＲ−１２４標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ−１標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ−１４３標的配列の１つ以上のコピーを含む。
【００５８】
一実施形態では、ｍｉＲ−ＴＳカセットは、ｍｉＲ−１２８標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ−２１９ａ標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ−１２２標的配列の１つ以上のコピーを含む。
【００５９】
一実施形態では、ｍｉＲ−ＴＳカセットは、ｍｉＲ−１２８標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ−２０４標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ−２１９標的配列の１つ以上のコピーを含む。
【００６０】
一実施形態では、ｍｉＲ−ＴＳカセットは、ｍｉＲ−２１７標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ−１３７標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ−１２６標的配列の１つ以上のコピーを含む。
【００６１】
一実施形態では、組換えＤＮＡ分子は、複製可能ウイルスゲノムをコードするポリヌクレオチド配列を含むプラスミドである。
【００６２】
一態様では、本開示は、複製可能ウイルスゲノムをコードするポリヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡ分子であって、複製可能ウイルスをコードするポリヌクレオチド配列の起源が非ウイルス性であり、組換えＤＮＡ分子が、非ウイルス性送達ビヒクルによって細胞内に導入されたときに複製可能ウイルスを生み出すことができる、当該組換えＤＮＡ分子を提供する。
【００６３】
一実施形態では、複製可能ウイルスゲノムは、ＤＮＡウイルスのゲノムまたはＲＮＡウイルスのゲノムである。
【００６４】
一実施形態では、ＤＮＡゲノムまたはＲＮＡゲノムは二本鎖または一本鎖ウイルスである。
【００６５】
一実施形態では、一本鎖ゲノムはプラスセンス（（＋）センス）またはマイナスセンス（（−）センス）ゲノムである。
【００６６】
一実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。
【００６７】
一実施形態では、細胞は、哺乳動物対象の中に存在している哺乳動物細胞である。
【００６８】
一実施形態では、複製可能ウイルスは、アデノウイルス、コクサッキーウイルス、ウマヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、ラッサウイルス、マラバウイルス、麻疹ウイルス、マウス白血病ウイルス、粘液腫ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、オルトミクソウイルス、パルボウイルス、ポリオウイルス（ＰＶＳ−ＲＩＰＯなどのキメラポリオウイルスを含む）、レオウイルス、セネカバレーウイルス（例えば、Ｓｅｎｅｃａ  Ａ）、シンドビスウイルス、ワクチニアウイルス及び水疱性口炎ウイルスからなる群から選択される。
【００６９】
一実施形態では、組換えＤＮＡポリヌクレオチドはさらに、複製可能ウイルスゲノムをコードするポリヌクレオチドの中に挿入された１つ以上のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）標的配列（ｍｉＲ−ＴＳ）カセットをさらに含み、ｍｉＲ−ＴＳカセットは１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を含み、細胞における対応する１つ以上のｍｉＲＮＡの発現は、細胞におけるコードされるウイルスの複製を阻害する。
【００７０】
一実施形態では、１つ以上のｍｉＲ−ＴＳカセットは１つ以上の必須ウイルス遺伝子の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）または３’ＵＴＲの中に組み込まれている。
【００７１】
一実施形態では、１つ以上の必須ウイルス遺伝子は、ＵＬ１、ＵＬ５、ＵＬ６、ＵＬ７、ＵＬ８、ＵＬ９、ＵＬ１１、ＵＬ１２、ＵＬ１４、ＵＬ１５、ＵＬ１７、ＵＬ１８、ＵＬ１９、ＵＬ２０、ＵＬ２２、ＵＬ２５、ＵＬ２６、ＵＬ２６．５、ＵＬ２７、ＵＬ２８、ＵＬ２９、ＵＬ３０、ＵＬ３１、ＵＬ３２、ＵＬ３３、ＵＬ３４、ＵＬ３５、ＵＬ３６、ＵＬ３７、ＵＬ３８、ＵＬ３９、ＵＬ４０、ＵＬ４２、ＵＬ４８、ＵＬ４９、ＵＬ５０、ＵＬ５２、ＵＬ５３、ＵＬ５４、ＵＳ１、ＵＳ３、ＵＳ４、ＵＳ５、ＵＳ６、ＵＳ７、ＵＳ８、ＵＳ１２、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、ＰＢ、Ｆ、Ｂ５Ｒ、ＳＥＲＯ−１、Ｃａｐ、Ｒｅｖ、ＶＰ１〜４、核タンパク質（Ｎ）、リンタンパク質（Ｐ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、糖タンパク質（Ｇ）、ポリメラーゼ（Ｌ）、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ３、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、及び３Ｄからなる群から選択される。
【００７２】
一実施形態では、１つ以上のｍｉＲ−ＴＳカセットは１つ以上の非必須遺伝子の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）または３’ＵＴＲの中に組み込まれている。
【００７３】
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、レプリコン、プラスミド、コスミド、ファージミド、トランスポゾン、細菌人工染色体、酵母人工染色体、または末端閉鎖型線形二本鎖腫瘍溶解性ウイルス（Ｏｖ）ＤＮＡ分子から選択される核酸ベクターの中に挿入されている。
【００７４】
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡポリヌクレオチドであり、さらに、複製可能ウイルスゲノムをコードする核酸配列の５’末端に第１ＡＡＶ由来末端逆位反復配列（ＩＴＲ）、及び複製可能ウイルスゲノムをコードする核酸配列の３’末端に第２ＡＡＶ由来ＩＴＲを含む。
【００７５】
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡポリヌクレオチドであり、さらに、複製可能ウイルスゲノムをコードする核酸配列のすぐ３’側の第１リボザイムコード配列、及び複製可能ウイルスゲノムをコードする核酸配列のすぐ５’側の第２リボザイムコード配列を含む。
【００７６】
一実施形態では、第１及び第２リボザイムコード配列は、ハンマーヘッド型リボザイムまたはデルタ肝炎ウイルスリボザイムをコードする。
【００７７】
一実施形態では、プロモーター配列は、真核生物ＲＮＡポリメラーゼに結合することができる。
【００７８】
一実施形態では、プロモーター配列は、哺乳動物ＲＮＡポリメラーゼに結合することができる。
【００７９】
一実施形態では、ポリヌクレオチドはＤＮＡポリヌクレオチドであり、哺乳動物ポリメラーゼが感染性複製可能ＲＮＡウイルスの転写を促す。
【００８０】
一実施形態では、ポリヌクレオチドはＤＮＡポリヌクレオチドであり、哺乳動物ポリメラーゼが感染性複製可能ＤＮＡウイルスの転写を促す。
【００８１】
一実施形態では、プロモーター配列は選択的にがん細胞におけるポリヌクレオチドの転写を促す。
【００８２】
一実施形態では、プロモーター配列は、ｈＴＥＲＴ、ＨＥ４、ＣＥＡ、ＯＣ、ＡＲＦ、ＣｇＡ、ＧＲＰ７８、ＣＸＣＲ４、ＨＭＧＢ２、ＩＮＳＭ１、メソテリン、ＯＰＮ、ＲＡＤ５１、ＴＥＴＰ、Ｈ１９、ｕＰＡＲ、ＥＲＢＢ２、ＭＵＣ１、Ｆｒｚ１、またはＩＧＦ２−Ｐ４からなる群から選択される遺伝子に由来する。
【００８３】
一実施形態では、組換えＤＮＡポリヌクレオチドはさらに、細胞毒性ポリペプチド、サイトカイン、ケモカイン、抗原結合性分子、細胞表面受容体に対するリガンド、可溶性受容体、酵素、サソリポリペプチド、ヘビポリペプチド、クモポリペプチド、ハチポリペプチド、カエルポリペプチド及び治療用核酸からなる群から選択される搭載薬分子をコードする核酸配列を含む。
【００８４】
一実施形態では、１つ以上のｍｉＲ−ＴＳカセットは、搭載薬分子をコードする核酸配列の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）または３’ＵＴＲ配列の中に組み込まれている。
【００８５】
一実施形態では、細胞毒性ポリペプチドは、ｐ５３、ジフテリア毒素（ＤＴ）、シュードモナス外毒素Ａ（ＰＥＡ）、Ｉ型リボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）、ＩＩ型ＲＩＰ、または志賀様毒素１（Ｓｌｔ１）から選択される。
【００８６】
一実施形態では、酵素は、メタロプロテアーゼ、コラゲナーゼ、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、カスパーゼ、ゼラチナーゼ、または遺伝子指向性酵素プロドラッグ療法（ＧＤＥＰＴ）システムの一部であり単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、カルボキシペプチダーゼＧ２、プリンヌクレオシドホスホリラーゼもしくはシトクロムＰ４５０から選択される酵素から選択される。
【００８７】
一実施形態では、ゼラチナーゼは線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）である。
【００８８】
一実施形態では、メタロプロテアーゼはマトリックスメタロプロテアーゼ（例えばＭＭＰ９）またはＡＤＡＭ１７である。
【００８９】
一実施形態では、サイトカインは、オステオポンチン、ＩＬ−１３、ＴＧＦβ、ＩＬ−３５、ＩＬ−１８、ＩＬ−１５、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγからなる群から選択される。
【００９０】
一実施形態では、ケモカインは、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ９及びＣＣＬ２１から選択される。
【００９１】
一実施形態では、細胞表面受容体に対するリガンドは、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ニューロピリンリガンド、Ｆｌｔ３リガンド、ＣＤ４７リガンドである。
【００９２】
一実施形態では、抗原結合性分子は、ＰＤ−１、ＰＤＬ−１、ＣＴＬＡ４、ＣＣＲ４、ＯＸ４０、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ４７、ＣＳＦ１Ｒ、ＥｐｈＡ２、ＣＤ１９、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡ、ＰＳＭＡ、ＣＤ３３、ＥＧＦＲ、ＣＣＲ４、ＣＤ２００、ＣＤ４０、ＣＤ４７、ＨＥＲ２、ＤＬＬ３、４−１ＢＢ、１７−１Ａ、ＧＤ２、及び表７中に列挙されている腫瘍抗原のうちの任意の１つ以上からなる群から選択される細胞表面抗原に結合する。
【００９３】
一実施形態では、サソリポリペプチドは、クロロトキシン、ＢｍＫｎ−２、ネオプラジン１、ネオプラジン２及びマウリポリン（ｍａｕｒｉｐｏｒｉｎ）からなる群から選択される。
【００９４】
一実施形態では、ヘビポリペプチドは、コントルトロスタチン、アポキシンＩ、ボトロプストキシンＩ、ＢＪｃｕＬ、ＯＨＡＰ−１、ロドストミン（ｒｈｏｄｏｓｔｏｍｉｎ）、ｄｒＣＴ−Ｉ、ＣＴＸ−ＩＩＩ、Ｂ１Ｌ、及びＡＣＴＸ−６からなる群から選択される。
【００９５】
一実施形態では、クモポリペプチドは、ラタルシン及びヒアルロニダーゼからなる群から選択される。
【００９６】
一実施形態では、ハチポリペプチドは、メリチン及びアパミンからなる群から選択される。
【００９７】
一実施形態では、カエルポリペプチドは、ＰｓＴ−１、ＰｄＴ−１、及びＰｄＴ−２からなる群から選択される。
【００９８】
一実施形態では、搭載薬タンパク質は免疫細胞に対して作用する。
【００９９】
一実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫＴ細胞、マクロファージ、及び／または樹状細胞からなる群から選択される。
【０１００】
一実施形態では、搭載薬ポリペプチドは、ヒト細胞表面抗原に結合することができる第１ドメインと、ヒト腫瘍細胞抗原に結合することができる第２ドメインとを含む二分ポリペプチドである。
【０１０１】
一実施形態では、二分ポリペプチドの片方または両方のドメインは、抗体、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ）、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン、ダイアボディ、フレキシボディ、ＤＯＣＫ−ＡＮＤ−ＬＯＣＫＴＭ抗体、及びモノクローナル抗イディオタイプ抗体（ｍＡｂ２）からなる群から選択される抗原結合性分子である。
【０１０２】
一実施形態では、二分ポリペプチドは、二重可変ドメイン抗体（ＤＶＤ−ＩｇＴＭ）、二重特異性Ｔ細胞係合子（ＢｉＴＥＴＭ）、ＤｕｏＢｏｄｙ（登録商標）、二重親和性再指向性（ＤＡＲＴ）ポリペプチドまたはＴａｎｄａｂ（登録商標）である。
【０１０３】
一実施形態では、抗体は、操作されたＦｃドメインを有するＩｇＧ抗体である。
【０１０４】
一実施形態では、治療用核酸は、アンタゴミール、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、リボザイムまたはアプタマーである。
【０１０５】
一実施形態では、ｍｉＲ−ＴＳカセット中に含まれたｍｉＲＮＡ標的配列に結合するｍｉＲＮＡが発現している細胞においてポリヌクレオチドは複製されない、または最小限に複製される。
【０１０６】
一実施形態では、ｍｉＲＮＡは表３から選択される。
【０１０７】
一実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−２１９、ｍｉＲ−２１９ａ、ｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−１３７、及びｍｉＲ−１２６から選択される。
【０１０８】
一実施形態では、ｍｉＲ−ＴＳカセットは、ｍｉＲ−１２４標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ−１標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ−１４３標的配列の１つ以上のコピーを含む。
【０１０９】
一実施形態では、ｍｉＲ−ＴＳカセットは、ｍｉＲ−１２８標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ−２１９ａ標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ−１２２標的配列の１つ以上のコピーを含む。
【０１１０】
一実施形態では、ｍｉＲ−ＴＳカセットは、ｍｉＲ−１２８標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ−２０４標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ−２１９標的配列の１つ以上のコピーを含む。
【０１１１】
一実施形態では、ｍｉＲ−ＴＳカセットは、ｍｉＲ−２１７標的配列の１つ以上のコピー、ｍｉＲ−１３７標的配列の１つ以上のコピー、及びｍｉＲ−１２６標的配列の１つ以上のコピーを含む。
【０１１２】
一実施形態では、組換えＤＮＡ分子は、自己複製性ポリヌクレオチドを含むプラスミドである。
【０１１３】
一態様では、本開示は、組換えＤＮＡ分子であって、ウイルスゲノムのセンス配列を含む第１一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）分子、及びウイルスゲノムのアンチセンス配列を含む第２ｓｓＤＮＡ分子を含み、第１及び第２ｓｓＤＮＡ分子の各々が３’末端逆位反復配列及び５’末端逆位反復配列を含むものであり、センスｓｓＤＮＡ分子の３’末端がアンチセンスｓｓＤＮＡ分子の５’末端に共有結合で繋げられかつセンスｓｓＤＮＡ分子の５’末端がアンチセンスｓｓＤＮＡ分子の３’末端に共有結合で繋げられて末端閉鎖型線形二本鎖腫瘍溶解性ウイルス（Ｏｖ）ＤＮＡ分子を形成している、当該組換えＤＮＡ分子を提供する。
【０１１４】
一実施形態では、コードされるウイルスはマイナスセンスまたはプラスセンス一本鎖（ｓｓ）ＲＮＡウイルスである。
【０１１５】
一実施形態では、プラスセンスｓｓＲＮＡウイルスはポリオウイルス（ＰＶ）である。
【０１１６】
一実施形態では、マイナスセンスｓｓＲＮＡウイルスは水疱性口炎ウイルス（ＶＳＶ）ゲノムである。
【０１１７】
一実施形態では、第１及び第２ｓｓＤＮＡ分子の各々はさらに、ウイルスゲノム配列のすぐ５’側のリボザイムコード配列、及びウイルスゲノム配列のすぐ３’側のリボザイムコード配列を含む。
【０１１８】
一実施形態では、ウイルスゲノムは、１つ以上の必須ウイルス遺伝子の中に挿入された１つ以上のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）標的配列を含む。
【０１１９】
一実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列は、１つ以上の必須ウイルス遺伝子の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）及び／または５’ＵＴＲの中に挿入されている。
【０１２０】
一実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つまたはそれより多くの必須ウイルス遺伝子の中に挿入されている。
【０１２１】
一実施形態では、少なくとも２つ、少なくとも３つまたは少なくとも４つのｍｉＲＮＡ標的配列が１つ以上の必須ウイルス遺伝子の中に挿入されている。
【０１２２】
一実施形態では、少なくとも２つ、少なくとも３つまたは少なくとも４つのｍｉＲＮＡ標的配列は、１つのｍｉＲＮＡの標的配列を含む。
【０１２３】
一実施形態では、少なくとも２つ、少なくとも３つまたは少なくとも４つのｍｉＲＮＡ標的配列は、少なくとも２つ、少なくとも３つまたは少なくとも４つの異なるｍｉＲＮＡの標的配列を含む。
【０１２４】
一実施形態では、ウイルスゲノムはＶＳＶゲノムであり、１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列は、核タンパク質（Ｎ）、リンタンパク質（Ｐ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、糖タンパク質（Ｇ）及び／またはポリメラーゼ（Ｌ）タンパク質をコードする遺伝子の１つ以上の中に挿入されている
【０１２５】
一実施形態では、ウイルスゲノムはＰＶゲノムであり、１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列は、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、３Ａ、３Ｂ（ＶＰｇ）、３Ｃまたは３Ｄタンパク質をコードする遺伝子の１つ以上の中に挿入されている。
【０１２６】
一実施形態では、３’及び５’ＩＴＲはＡＡＶに由来する。
【０１２７】
一実施形態では、ＡＡＶはＡＡＶ２である。
【０１２８】
一態様では、本開示は、有効量の組換えＤＮＡ分子と、哺乳動物対象への投与に適した担体とを含む組成物を提供する。
【０１２９】
一態様では、本開示は、任意の本開示の組換えＤＮＡ分子を含む粒子を提供する。
【０１３０】
一実施形態では、粒子は生分解性である。
【０１３１】
一実施形態では、粒子は、ナノ粒子、エクソソーム、リポソーム及びリポプレックスからなる群から選択される。
【０１３２】
一実施形態では、エクソソームは、完全エクソソームまたは空エクソソームに由来する改変型エクソソームである。
【０１３３】
一実施形態では、ナノ粒子は、カチオン性脂質、コレステロール及び中性脂質を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である。
【０１３４】
一実施形態では、カチオン性脂質は１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）であり、中性脂質は１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）または１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である。
【０１３５】
一実施形態では、ＬＮＰはさらにリン脂質−ポリマー複合体を含み、リン脂質−ポリマー複合体は、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−ポリ（エチレングリコール）（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）、または１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［アミノ（ポリエチレングリコール）］（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−アミン）である。
【０１３６】
一実施形態では、ヒアルロナンはＬＮＰの表面と複合している。
【０１３７】
一態様では、本開示は、複数の脂質ナノ粒子を含む治療用組成物であって、複数のＬＮＰの平均粒径が約１５０ｎｍ〜約５００ｎｍである、当該治療用組成物を提供する。
【０１３８】
一実施形態では、複数のＬＮＰの平均粒径は、約２００ｎｍ〜約５００ｎｍ、約３００ｎｍ〜約５００ｎｍ、約３５０ｎｍ〜約５００ｎｍ、約４００ｎｍ〜約５００ｎｍ、約４２５ｎｍ〜約５００ｎｍ、約４５０ｎｍ〜約５００ｎｍ、または約４７５ｎｍ〜約５００ｎｍである。
【０１３９】
一実施形態では、複数のＬＮＰの平均ゼータ電位は、約−２０ｍＶ未満、約−３０ｍＶ未満、約３５ｍＶ未満、または約−４０ｍＶ未満である。
【０１４０】
一実施形態では、複数のＬＮＰの平均ゼータ電位は、約−５０ｍＶ〜約−２０ｍＶ、約−４０ｍＶ〜約−２０ｍＶ、または約−３０ｍＶ〜約−２０ｍＶである。
【０１４１】
一実施形態では、複数のＬＮＰの平均ゼータ電位は、約−３０ｍＶ、約−３１ｍＶ、約−３２ｍＶ、約−３３ｍＶ、約−３４ｍＶ、約−３５ｍＶ、約−３６ｍＶ、約−３７ｍＶ、約−３８ｍＶ、約−３９ｍＶ、または約−４０ｍＶである。
【０１４２】
一実施形態では、対象への組成物の送達によってカプセル封入ＤＮＡ発現カセットが標的細胞に送達され、カプセル封入ＤＮＡ発現カセットは、標的細胞を溶解させることができる感染性ウイルスを生み出す。
【０１４３】
一実施形態では、組成物は静脈内または腫瘍内に送達される。
【０１４４】
一実施形態では、標的細胞はがん細胞である。
【０１４５】
一態様では、本開示は、任意の本開示のポリヌクレオチドを含む無機粒子を提供する。
【０１４６】
一実施形態では、無機粒子は、金ナノ粒子（ＧＮＰ）、金ナノロッド（ＧＮＲ）、磁気ナノ粒子（ＭＮＰ）、磁気ナノチューブ（ＭＮＴ）、カーボンナノホーン（ＣＮＨ）、カーボンフラーレン、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）、リン酸カルシウムナノ粒子（ＣＰＮＰ）、メソポーラスシリカナノ粒子（ＭＳＮ）、シリカナノチューブ（ＳＮＴ）、または星状中空シリカナノ粒子（ＳＨＳＮ）からなる群から選択される。
【０１４７】
一実施形態では、粒子の平均直径は、約５００ｎｍ未満である、約２５０ｎｍ〜約５００ｎｍである、または約３５０ｎｍである。
【０１４８】
一態様では、本開示は、がん細胞を死滅させる方法であって、粒子を上記がん細胞に細胞内送達するのに十分な条件の下で、がん細胞を、請求項１２２〜１４０のいずれか１項に記載の粒子もしくは組成物、またはその組成物に曝露することを含み、カプセル封入ポリヌクレオチドによって生み出される複製可能ウイルスががん細胞の死滅をもたらす、当該方法を提供する。
【０１４９】
一実施形態では、複製可能ウイルスは非がん性細胞では生み出されない。
【０１５０】
一実施形態では、方法は、生体内、試験管内または生体外で実施される。
【０１５１】
一態様では、本開示は、対象のがんを治療する方法であって、がんに罹患している対象に有効量の、請求項１２２〜１４０のいずれか１項に記載の粒子もしくは組成物、またはその組成物を投与することを含む、当該方法を提供する。
【０１５２】
一実施形態では、粒子またはその組成物は、静脈内に投与される、鼻腔内に投与される、吸入剤として投与される、または腫瘍中に直接注射される。
【０１５３】
一実施形態では、粒子またはその組成物が対象に繰り返し投与される。
【０１５４】
一実施形態では、対象は、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウマ、非ヒト霊長類またはヒトである。
【０１５５】
一実施形態では、がんは、肺癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、前立腺癌、精巣癌、大腸癌、結腸癌、膵臓癌、肝臓癌、胃癌、頭頸部癌、甲状腺癌、悪性神経膠腫、神経膠芽腫、メラノーマ、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、及び辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）から選択される。
【０１５６】
一実施形態では、肺癌は小細胞肺癌または非小細胞肺癌である。
【０１５７】
一実施形態では、肝臓癌が肝細胞癌腫（ＨＣＣ）である。
【０１５８】
一態様では、本開示は、先行請求項のいずれかに記載の組換えＤＮＡ分子を製造する方法であって、組換えＤＮＡ分子を第１ウイルス発現ベクターの中に挿入することを含み、組換えＤＮＡ分子がポリヌクレオチドの５’アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来末端逆位反復配列（ＩＴＲ）及び３’ＡＡＶ由来ＩＴＲ末端を含むものであり、ＩＴＲによって媒介される複製に必要とされるＡＡＶタンパク質をコードするポリヌクレオチドを第２ウイルス発現ベクターの中に挿入すること、ならびに第１及び第２ウイルス発現ベクターを細胞に細胞内送達することを含み、組換えＤＮＡ分子がゲノムの中に安定的に組み込まれ、細胞が、ＩＴＲに挟まれたポリヌクレオチドを、ＩＴＲの非存在下で生み出される場合よりも多い量で産生する、当該方法を提供する。
【０１５９】
一実施形態では、ウイルス発現ベクターはヘルペスウイルスまたはバキュロウイルスである。
【図面の簡単な説明】
【０１６０】
【図１】ポリヌクレオチドゲノムの由来となり得る多種多様なＤＮＡまたはＲＮＡウイルスの例を示す。
【図２】自己複製性ポリヌクレオチドを中に封入しておりグリコサミノグリカン（ＣＡＧ）ヒアルロナン（ＨＡ）で被覆されている脂質系ナノ粒子の例を示す（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｑｕｉｅｔｘ．ｃｏｍ）。
【図３】腫瘍を標的とするナノ粒子の中に封入された自己複製性ポリヌクレオチドによるがんの治療の例を示す。
【図４】Ａ〜Ｂは、トランスで発現するＲｅｐ５２及びＲｅｐ７８を使用して５’及び３’ＩＴＲを含む自己複製性ウイルスゲノムを増殖させるため（Ａ）ならびに、内在Ｒｅｐカセットを使用して５’及び３’ＩＴＲを含む自己複製性ウイルスゲノムを増幅させるため（Ｂ）の複製性ＨＳＶベクターの例を示す。ｇＢ：ＮＴ＝ｇＢ遺伝子におけるウイルス進入増進性の二重突然変異；ＢＡＣ＝ｌｏｘＰに挟まれたクロラムフェニコール耐性及びｌａｃＺ配列；Δ接合部＝ＩＣＰ４遺伝子の１つのコピーを含めた全ての内在反復領域の欠失；ＩＴＲ＝ＡＡＶに由来する末端逆位反復配列；Ｐｏｌ  ＩＩｐ＝恒常的Ｐｏｌ  ＩＩプロモーター；Ｒｅｐカセット＝ＩＴＲに挟まれたウイルスゲノムＤＮＡの複製のためのＡＡＶ  Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ７８をコードするカセット；任意選択のｍｉＲＮＡ転写減衰は斜線縞模様の四角で示されている。
【図５】Ａ〜Ｂは、トランスで発現するＲｅｐ５２及びＲｅｐ７８を使用して５’及び３’ＩＴＲを含む自己複製性ポリヌクレオチドを増殖させるため（Ａ）ならびに、内在Ｒｅｐカセットを使用して５’及び３’ＩＴＲを含む自己複製性ウイルスゲノムを増幅させるため（Ｂ）の非複製性ＨＳＶベクターの例の例を示す。ｇＢ：ＮＴ＝ｇＢ遺伝子におけるウイルス進入増進性の二重突然変異；ＢＡＣ＝ｌｏｘＰに挟まれたクロラムフェニコール耐性及びｌａｃＺ配列；Δ接合部＝ＩＣＰ４遺伝子の１つのコピーを含めた全ての内在反復領域の欠失；ＩＴＲ＝ＡＡＶに由来する末端逆位反復配列；Ｐｏｌ  ＩＩｐ＝恒常的Ｐｏｌ  ＩＩプロモーター；Ｒｅｐカセット＝ＩＴＲに挟まれたウイルスゲノムＤＮＡの複製のためのＡＡＶ  Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ７８をコードするカセット；任意選択のｍｉＲＮＡ転写減衰は斜線縞模様の四角で示されている。
【図６】Ａ〜Ｂは、プラス鎖ＲＮＡポリオウイルスＩ型ゲノムをコードするポリヌクレオチドの図を示す。ポリヌクレオチドは場合によって５’及び３’末端においてＡＡＶ由来ＩＴＲと隣接し得る（Ａ及びＢ）。ポリヌクレオチドは場合によって、ｍｉＲＮＡ転写減衰のための１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列カセット（ｍｉＲ  ＴＳカセット）を含み得る（Ｂ）。
【図７】Ａ〜Ｂは、ポリオウイルスＩ型ゲノムをコードする自己複製性ポリヌクレオチドを生み出すための、複製性ＨＳＶベクターの例を示す。ポリオウイルスゲノムは、場合によって、ｍｉＲＮＡ転写減衰のためのｍｉＲＮＡ標的部位を含み得る（斜線縞模様の四角で示されている）。Ｂは、５’及び３’末端においてＡＡＶ由来ＩＴＲと隣接しているポリオウイルスＩ型ゲノムをコードする自己複製性ポリヌクレオチドを生み出すための複製性ＨＳＶベクターを示す。ｇＢ：ＮＴ＝ｇＢ遺伝子におけるウイルス進入増進性の二重突然変異；ＢＡＣ＝ｌｏｘＰに挟まれたクロラムフェニコール耐性及びｌａｃＺ配列；ΔＵＬ１９＝主要カプシドタンパク質ＶＰ５をコードするＵＬ１９遺伝子の欠失；Δ接合部＝ＩＣＰ４遺伝子の１つのコピーを含めた全ての内在反復領域の欠失；Ｐｏｌ  ＩＩｐ＝恒常的ＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩプロモーター；Ｒｅｐカセット＝ＩＴＲに挟まれたウイルスゲノムＤＮＡの複製のためのＡＡＶ  Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ７８をコードするカセット；ポリオウイルスゲノムカセット＝ＨＳＶゲノムの遺伝子間遺伝子座に挿入されている、転写によって生み出されるプラス鎖ゲノム；任意選択のｍｉＲＮＡ転写減衰は斜線縞模様の四角で示されている。
【図８−１】Ａ〜Ｃは、非小細胞肺癌（Ａ）、肝細胞癌腫（Ｂ）及び前立腺癌（Ｃ）などの特定のがんを治療するためのポリオウイルスＩ型ポリヌクレオチドゲノムの例を示す。
【図８−２】同上。
【図９】Ａ〜Ｂは、水疱性口炎ウイルス（ＶＳＶ）ゲノムをコードする自己複製性ポリヌクレオチドの例を示す。ポリヌクレオチドは場合によって５’及び３’末端においてＡＡＶ由来ＩＴＲと隣接し得る（Ｂ）。ポリヌクレオチドは場合によって、斜線縞模様の四角で示されているｍｉＲＮＡ転写減衰のための１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を含み得る（Ｂ）。
【図１０】Ａ〜Ｂは、ＶＳＶゲノムポリヌクレオチドゲノムを生み出すための複製性ＨＳＶベクターの例を示す。ＶＳＶゲノムは場合によって、ｍｉＲＮＡ転写減衰のためのｍｉＲＮＡ標的部位を含み得る（Ａ及びＢ）。Ｂは、５’及び３’末端においてＡＡＶ由来ＩＴＲと隣接しているＶＳＶゲノムを生み出すための複製性ＨＳＶベクターを示す。ｇＢ：ＮＴ＝ｇＢ遺伝子におけるウイルス進入増進性の二重突然変異；ＢＡＣ＝ｌｏｘＰに挟まれたクロラムフェニコール耐性及びｌａｃＺ配列；Δ接合部＝ＩＣＰ４遺伝子の１つのコピーを含めた全ての内在反復領域の欠失；ΔＵＬ１９＝主要カプシドタンパク質ＶＰ５をコードするＵＬ１９遺伝子の欠失；ＶＳＶゲノムカセット＝アンチゲノム（マイナス鎖）ＶＳＶゲノムと、必須ＶＳＶ遺伝子Ｎ、Ｐ及びＬをコードする哺乳動物発現カセットとがマイナス鎖ＶＳＶゲノム及び必須ＶＳＶ遺伝子の転写のための双方向性Ｐｏｌ  ＩＩプロモーター（ＢＤ  Ｐｏｌ  ＩＩｐ）を伴ってＨＳＶゲノムの遺伝子間遺伝子座に挿入されたもの；任意選択のｍｉＲＮＡ転写減衰は斜線縞模様の四角で示されている；Ｒｅｐカセット＝ＩＴＲに挟まれたウイルスゲノムＤＮＡの複製のためのＡＡＶ  Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ７８をコードするカセット；Ｐｏｌ  ＩＩｐ＝恒常的Ｐｏｌ  ＩＩプロモーター。
【図１１−１】Ａ〜Ｃは、肝細胞癌腫（Ａ）、前立腺癌（Ｂ）及び非小細胞肺癌（Ｃ）などの特定のがんを治療するためのＶＳＶポリヌクレオチドゲノムの例を示す。
【図１１−２】同上。
【図１２】Ａ〜Ｂは、アデノウイルスポリヌクレオチドゲノムの例を示す。ＡＡＶゲノムは場合によって、斜線縞模様の四角で示されているｍｉＲＮＡ転写減衰のためのｍｉＲＮＡ標的部位を含み得る（Ｂ）。
【図１３】Ａ〜Ｃは、肝細胞癌腫（Ａ）、前立腺癌（Ｂ）及び非小細胞肺癌（Ｃ）などの特定のがんを治療するためのＡＡＶポリヌクレオチドゲノムの例を示す。
【図１４】ＣＶＢウイルスゲノムの模式図を示す。ＣＶＢ３は、約７．４ｋｂのゲノムサイズを有する＋センスのｓｓＲＮＡピコルナウイルスである。
【図１５】コクサッキーウイルスＡ２１構築物の模式図を示す。
【図１６】セネカバレーウイルス（ＳＶＶ）構築物の模式図を示す。
【図１７】ＩＴＲに挟まれた腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）ＤＮＡカセットと、Ｒｅｐカセットとを含む組換えＨＳＶ−１細菌人工染色体（ＢＡＣ）ベクターを示す。
【図１８】Ｒｅｐカセット及びＡ／Ｃヘテロ二量体ＡＰ２１９６７によるＲｅｐ発現の対照を示す。
【図１９−１】Ａ〜Ｄは、図１７に示すシステムによって生み出されるＮａｎｏＶ構築物の単量体及び二量体を示す。Ａは、ＮａｎｏＶ単量体及び二量体の構造及び大きさを示す。Ｂは、制限酵素消化後の予測される単量体及び二量体のゲル分析を示す。Ｃは、ＮａｎｏＶ構築物の模式図を内在ＰＣＲプライマーの場所と共に示す。Ｄは、内在プライマーを使用したＮａｎｏＶのＰＣＲ増幅を示す。
【図１９−２】同上。
【図２０−１】Ａ〜Ｃは、予測される配向でのＮａｎｏＶコンカテマーの生成を示す。Ａは、ＮａｎｏＶ単量体中のＡｆｌＩＩ切断部位の場所を示す。Ｂは、あり得るコンカテマー配向、及び予測されるＡｆｌＩＩ切断産物の大きさを示す。Ｃは、ＡｆｌＩＩ消化されたＮａｎｏＶ  ＤＮＡのゲル分析を示す。
【図２０−２】同上。
【図２１】ＮａｎｏＶ  ＤＮＡ構築物からのｍＣｈｅｒｒｙの発現を示す。
【図２２】３’及び５’リボザイム配列を含むピコルナウイルス構築物の模式図を示す。
【図２３】Ａ〜Ｂは、複製可能セネカバレーウイルス（ＳＶＶ）をコードするポリヌクレオチドの設計及び培養プロトコールの図式を描写する。Ａは、哺乳動物５’及び３’ＵＴＲ配列とハンマーヘッド型リボザイムとデルタ肝炎リボザイムとを含むキャップ形成されポリアデニル化された転写産物を示す。Ｂは、感染性ＳＶＶを生み出すための培養プロトコールの模式図を示す。
【図２４】ＳＶＶリボザイム（ＷＴ）及びＳＶＶ−ｍＣｈｅｒｒｙリボザイムをコードするｄｓＤＮＡでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞から産生されたウイルスによる単層の溶解を実証するクリスタルバイオレット染色を示す。
【図２５】Ａ〜Ｃは、図２３に示すＳＶＶ転写産物からの３つの異なる外来搭載薬の発現を示す。図２０Ａは、ｍＣｈｅｒｒｙの明視野及び蛍光顕微鏡観察を示す。図２０Ｂは、ナノルシフェラーゼ（ｎａｎｏｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）アッセイの結果を示す。図２５Ｃは、ＣＸＣＬ１０発現を示す。
【図２６】ＳＶＶコードプラスミド構築物のｍｉＲＮＡ転写減衰を示す。
【図２７Ａ】Ａ〜Ｂは、生体内での感染性ウイルスの産生、及び腫瘍内に送達されたＳＶＶコードＤＮＡプラスミドによる腫瘍成長の阻害を示す。Ａは、ＳＶＶコードプラスミドを腫瘍内に投与した後の腫瘍成長の阻害を示す。
【図２７Ｂ】Ａ〜Ｂは、生体内での感染性ウイルスの産生、及び腫瘍内に送達されたＳＶＶコードＤＮＡプラスミドによる腫瘍成長の阻害を示す。Ｂは、Ａに示す実験から採取された粉砕腫瘍からの生ウイルスの単離を示す。
【図２８】Ａ〜Ｂは、腫瘍内に送達されたＳＶＶコードＤＮＡプラスミドによる外来搭載薬の生体内での発現を示す。図２２Ａは、プラスミドＤＮＡを腫瘍内に注射した後に腫瘍溶解物において検出された平均放射輝度を示す。図２２Ｂは、プラスミドＤＮＡを腫瘍内に注射した後に腫瘍溶解物において検出されたＣＸＣＬ１０レベルを示す。
【図２９】静脈内送達後の腫瘍部位へのＳＶＶコードプラスミドの送達を示す。
【図３０】ＬＮＰ内に封入されたＳＶＶコードプラスミドＤＮＡを静脈内に送達した後の腫瘍成長の阻害を示す。
【図３１Ａ】ＳＶＶコードプラスミドのマップを示す。
【図３１Ｂ】ＣＶＡ２１コードプラスミドのマップを示す。
【図３２Ａ】別個の３’及び５’天然末端を有する＋センスｓｓＲＮＡウイルスゲノムを生み出すためのシステムを示す。
【図３２Ｂ】別個の３’及び５’天然末端を有する＋センスｓｓＲＮＡウイルスゲノムを生み出すためのシステムを示す。
【発明を実施するための形態】
【０１６１】
当技術分野では、中和抗体の存在下で有効であり、繰り返し全身投与されることができ、複製が疾患細胞に限られ、それゆえ正常な非がん性細胞に対する副次的損傷を最小限に抑えながら治療有効性を最大化させる、自己複製性ウイルス療法が必要とされている。本開示は、これらの障壁を克服し、脂質ナノ粒子、ポリマーナノ粒子またはエクソソームなどの非免疫原性粒子の中に封入され得る複製可能ウイルスゲノムをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、複製可能ウイルスをコードする組換えＤＮＡ分子、ならびに増殖性疾患及び障害（例えばがん）の治療及び防止のための使用方法を提供する。特定の実施形態では、組換えＤＮＡ分子はさらに、治療用分子をコードするポリヌクレオチド配列を含む。本開示は、多様な増殖性障害（例えばがん）を治療するのに適した安全で有効な組換えポリヌクレオチドベクターの全身送達を可能にする。
【０１６２】
本明細書中で使用する節の見出しは構成上の目的のためのものであるにすぎず、記載される主題を限定しているとみなされるべきでない。本明細書中で引用される全ての文書または文書の一部は、限定されないが特許、特許出願、論文、書籍及び論説を含めて、これをもって参照によりそれらの全体をあらゆる目的のために明示的に援用される。援用される文書または文書の一部の１つ以上が本願における用語の定義に矛盾した用語を定義している場合には、本願の中で出現する定義が優先される。しかしながら、本明細書中で引用されるいかなる参考文献、論文、刊行物、特許、特許公報及び特許出願に関する言及も、それらが正当な先行技術を構成するかまたは世界のいずれかの国での一般的常識の一部を形成するということの承認または何らかのかたちでの示唆としてみなされず、また、みなされるべきでない。
【０１６３】
Ｉ．定義
本記載において、いかなる濃度範囲、百分率範囲、比率範囲または整数範囲も、別段の指示がない限り列挙された範囲の中に入る任意の整数の値、適切な場合にはその小数（例えば整数の１０分の１及び１００分の１）を含んでいると理解されるべきである。本明細書中で使用する「ａ」及び「ａｎ」という用語は、別段の指定がない限り列挙される構成要素の「１つ以上」を指すと理解されるべきである。選択肢（例えば、「または」）の使用は、選択肢の１つ、両方またはその任意の組合せを意味すると理解されるべきである。本明細書中で使用する場合、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語は同義的に使用される。本明細書中で使用する場合、「複数」は１つ以上の構成要素（例えば１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列）を指し得る。本願において、「または」の使用は、特段の定めがない限り、「及び／または」を意味する。
【０１６４】
本願の中で使用する場合、「約」及び「およそ」という用語は同義語として使用される。本願の中で使用される、約／およそが付いているかまたは付いていないいかなる数字も、関連技術分野で通常の技能を有する者によって認識される任意の通常の変動を包含することが意図される。特定の実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、特段の定めがない限り、または文脈から明らかでない限り、指定された基準値の両方向（上下）に２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％またはそれ未満のうちに入る値の範囲を指す（但し、そのような数が可能な値の１００％を超えることになる場合は除く）。
【０１６５】
「減少する」または「低下させる」は、特定の値が基準値に比べて少なくとも５％、例えば、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９９または１００％減少または低下することを指す。特定の値の減少または低下はまた、基準値と比べたときの値の変化倍率、例えば、基準値に比べて少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１０００倍またはそれ以上の減少としても表され得る。
【０１６６】
「増加」は、特定の値が基準値に比べて少なくとも５％、例えば、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９９、１００、２００、３００、４００、５００％またはそれ以上増加することを指す。特定の値の増加はまた、基準値と比べたときの値の変化倍率、例えば、基準値のレベルに比べて少なくとも１倍、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１０００倍またはそれ以上の増加としても表され得る。
【０１６７】
「配列同一性」という用語は、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の間で同一でありかつ同じ相対位置にある塩基またはアミノ酸の百分率を指す。したがって、あるポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、別のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと比較して特定の配列同一性百分率を有する。配列比較のためには、典型的には１つの配列が、試験配列との比較に供される基準配列としての役割を果たす。「基準配列」という用語は、試験配列との比較に供される分子を指す。
【０１６８】
「相補的」は、天然または非天然の（例えば上記のように改変された）塩基（ヌクレオシド）またはその類縁体を含む２つの配列の間での塩基スタッキング及び特異的水素結合によって対合する能力を指す。例えば、核酸のある位置の塩基が、標的の対応する位置の塩基と水素結合することができる場合には、塩基は互いにその位置で相補的であるとみなされる。核酸は、ユニバーサル塩基、または水素結合に正または負の寄与を何ら提供しない不活性な非塩基性スペーサーを含むことがある。塩基対合には、規範的なワトソン・クリック型塩基対合も、非ワトソン・クリック型の塩基対合（例えば、ゆらぎ（Ｗｏｂｂｌｅ）塩基対合及びフーグスティーン型塩基対合）も含まれ得る。相補的塩基対合ではアデノシン型塩基（Ａ）がチミジン型塩基（Ｔ）またはウラシル型塩基（Ｕ）に対して相補的であり、シトシン型塩基（Ｃ）がグアノシン型塩基（Ｇ）に対して相補的であり、ユニバーサル塩基、例えば３−ニトロピロールまたは５−ニトロインドールが任意のＡ、Ｃ、ＵまたはＴとハイブリダイズすることができ相補的であるとみなされることは理解される。Ｎｉｃｈｏｌｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，１９９４；３６９：４９２−４９３、及びＬｏａｋｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９４；２２：４０３９−４０４３。イノシン（Ｉ）も当技術分野ではユニバーサル塩基であるとみなされており、任意のＡ、Ｃ、ＵまたはＴと相補的であるとみなされる。Ｗａｔｋｉｎｓ  ａｎｄ  ＳａｎｔａＬｕｃｉａ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００５；３３（１９）：６２５８−６２６７を参照されたい。
【０１６９】
「発現カセット」または「発現構築物」は、プロモーターに機能可能に繋げられたＤＮＡポリヌクレオチド配列を指す。「機能可能に繋げられる」は、そう記載されている構成要素が、それらの意図される様式でそれらが機能することを可能にする関係性にある状態で並んで配置されていることを指す。例えば、プロモーターがポリヌクレオチド配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、プロモーターはポリヌクレオチド配列に機能可能に繋げられている。
【０１７０】
「対象」という用語には、動物、例えば哺乳動物などが含まれる。いくつかの実施形態では、哺乳動物は霊長類である。いくつかの実施形態では、哺乳動物はヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、ウシ、ヒツジ、ヤギ、乳牛、ブタなどの家畜；または、イヌ及びネコなどの飼育動物である。いくつかの実施形態（例えば、特に研究との関連）では、対象は、齧歯動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター）、ウサギ、霊長類またはブタ、例えば近交系ブタなどである。「対象」及び「患者」という用語は本明細書において交換可能に使用される。
【０１７１】
「投与」は、本明細書において、薬剤または組成物を対象の中に導入することを指す。
【０１７２】
「治療すること」は、本明細書中で使用される場合、薬剤または組成物を対象に送達して生理学的転帰に影響を及ぼすことを指す。いくつかの実施形態では、治療は、細胞の集団（例えば、改変型免疫エフェクター細胞の集団）を対象に送達することを含む。いくつかの実施形態では、治療することは、哺乳動物、例えばヒトの疾患の治療を指し、（ａ）疾患を阻害すること、つまり疾患の進展を阻止するかまたは疾患の進行を防止すること；（ｂ）疾患を緩和すること、つまり疾患状態の退縮を引き起こすこと；（ｃ）疾患を治癒させることを含む。
【０１７３】
「有効量」という用語は、特定の生理作用をもたらすために必要とされる薬剤または組成物の最小量（例えば、特定の生理作用を増大させる、活性化させる、及び／または強化するのに必要な量）を指す。特定の薬剤の有効量は、薬剤の性質に基づいて様々な方法、例えば、質量／体積、細胞数／体積、粒子／体積、（薬剤の質量）／（対象の体重）、細胞数／（対象の体重）、または粒子／（対象の体重）で表され得る。特定の薬剤の有効量は、半数効果濃度（ＥＣ５０）としても表されることもあり、これは、基準レベルと最大応答レベルとの間の半分の大きさの特定の生理応答をもたらす薬剤の濃度を指す。
【０１７４】
細胞の「集団」は、１より多い任意の数の細胞を指すが、好ましくは、少なくとも１×１０３細胞、少なくとも１×１０４細胞、少なくとも少なくとも１×１０５細胞、少なくとも１×１０６細胞、少なくとも１×１０７細胞、少なくとも１×１０８細胞、少なくとも１×１０９細胞、少なくとも１×１０１０細胞またはそれより多くの細胞を指す。細胞の集団は、試験管内での集団（例えば、培養中の細胞の集団）または生体内での集団（例えば、特定組織に存在する細胞の集団）を指す場合がある。
【０１７５】
「エフェクター機能」は、標的細胞または標的抗原に対する免疫応答の発生、維持及び／または増強に関係する免疫細胞の機能を指す。
【０１７６】
「マイクロＲＮＡ」、「ｍｉＲＮＡ」及び「ｍｉＲ」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、それらの標的となる伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分解または翻訳抑制へと向かわせることによって遺伝子発現を調節する長さ約２１〜２５ヌクレオチドの小さな内因性非コードＲＮＡを指す。
【０１７７】
本明細書中で使用する場合、「組成物」という用語は、対象または細胞に投与または送達されることができる本明細書に記載の自己複製性ポリヌクレオチドまたは粒子内に封入された自己複製性ポリヌクレオチドの配合物を指す。
【０１７８】
「薬学的に許容される」という語句は、健全な医学的判断の範囲内で過度の毒性、炎症、アレルギー反応または他の問題もしくは合併症を伴わずにヒト及び動物の組織に接触させて使用するのに適する、合理的なベネフィット／リスク比に見合った化合物、材料、組成物及び／または剤形を指すために本明細書中で使用される。
【０１７９】
本明細書中で使用する場合、「薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤」には、ヒト及び／または飼育動物における使用が許容されることが米国食品医薬品局によって承認されている任意の佐剤、担体、賦形剤、滑剤、甘味剤、希釈剤、保存剤、色素／着色剤、香味増強剤、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、安定化剤、等張化剤、溶媒、界面活性剤及び／または乳化剤が含まれるが、これらに限定されない。
【０１８０】
「自己複製性ポリヌクレオチド」という用語は、さらなる外来ポリヌクレオチドまたは外来ベクターの非存在下で宿主細胞内で複製することができる外来ポリヌクレオチドを指す。
【０１８１】
「複製可能ウイルスゲノム」という用語は、感染性ウイルス粒子のウイルス複製及び産生に必要なウイルス遺伝子を全てコードするものである本明細書に記載の自己複製性ポリヌクレオチドにコードされるウイルスゲノムを指す。
【０１８２】
「腫瘍溶解性ウイルス」という用語は、がん細胞への優先的な感染をするように改変されているかまたは元来それをするものであるウイルスを指す。
【０１８３】
「ベクター」という用語は、本明細書では、別の核酸分子を移動させるかまたは輸送することができる核酸分子を指して使用される。
【０１８４】
分子細胞生物学において一般的な方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＨａＲＢｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００１）、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  Ｅｄ．（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆Ｓｏｎｓ  １９９９）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｂｏｌｌａｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆Ｓｏｎｓ  １９９６）、Ｎｏｎｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９９）、Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｋａｐｌｉｆｔ  ＆Ｌｏｅｗｙ  ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ（Ｉ．Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ  ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９７）、及びＣｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄｏｙｌｅ  ＆Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９８）などのような標準的な教材の中に見出すことができ、参照によりこれらの開示内容を援用する。
【０１８５】
ＩＩ．自己複製性ポリヌクレオチド
いくつかの実施形態では、本開示は、非ウイルス性送達ビヒクルによって細胞内に導入されたときに感染性の溶解性ウイルスを生み出すことができる複製可能ウイルスゲノムをコードするポリヌクレオチドを含む組換え核酸分子を提供する。本明細書に記載の自己複製性ポリヌクレオチドは、感染性ウイルスを複製及び産生するために追加の外来遺伝子またはタンパク質を細胞内に存在させることを必要としない。もっと正確に言えば、宿主細胞内の内因性転写機構は自己複製性ポリヌクレオチドの最初の第１回目の転写または翻訳を媒介して複製可能ウイルスゲノムを産生する。自己複製性ポリヌクレオチドにコードされるウイルスゲノムは、ウイルスゲノムの複製継続、及び複製可能ウイルスゲノムを含む感染性ウイルス粒子（これはカプシドタンパク質、エンベロープタンパク質及び／または膜タンパク質を含み得る）への組立てに必要なウイルスタンパク質を発現させることができる。かくして、本明細書に記載の自己複製性ポリヌクレオチドにコードされる複製可能ウイルスゲノムは、宿主細胞に感染することができるウイルスを生み出すことができる。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、組換え核酸分子は、複製可能ウイルスゲノムをコードするＤＮＡポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、組換えＤＮＡ分子は、レプリコン、プラスミド、コスミド、ファージミド、トランスポゾン、細菌人工染色体、または酵母人工染色体である。いくつかの実施形態では、組換えＤＮＡ分子は、自己複製性ポリヌクレオチドを含むプラスミドである。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換え核酸分子は、自己複製性ポリヌクレオチドの転写を促すかまたは調節するプロモーターなどの転写制御エレメントに機能可能に繋げられた自己複製性ポリヌクレオチド（例えば、複製可能ウイルスゲノムをコードするポリヌクレオチド）を含む。いくつかの実施形態では、転写制御エレメントは、哺乳動物プロモーター配列である。いくつかの実施形態では、哺乳動物プロモーター配列は、哺乳動物ＲＮＡポリメラーゼに結合することができる。例えば、いくつかの実施形態では、哺乳動物プロモーター配列は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ  ＩＩ）プロモーターである。いくつかの実施形態では、哺乳動物プロモーターは、恒常的プロモーター、例えば、ＣＡＧ、ＵｂＣ、ＥＦ１ａまたはＰＧＫプロモーターである。いくつかの実施形態では、転写制御エレメントはファージ由来プロモーター配列、例えばＴ７プロモーターである。そのような実施形態では、Ｔ７プロモーターの制御下にあるポリヌクレオチドは、細胞のサイトゾルの中で転写される。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、プロモーターは誘導性プロモーター、例えば、テトラサイクリン誘導性プロモーター（例えば、ＴＲＥ−Ｔｉｇｈｔ）、ドキシサイクリン（ｄｏｘｙｃｌｉｎｅ）誘導性プロモーター、温度誘導性プロモーター（例えば、Ｈｓｐ７０またはＨｓｐ９０由来プロモーター）、ラクトース誘導性プロモーター（例えば、ｐＬａｃプロモーター）である。いくつかの実施形態では、プロモーター配列は、転写を調節する１つ以上の転写エンハンサーエレメントを含む。例えば、いくつかの実施形態では、プロモーターは、１つ以上の低酸素応答エレメントまたは１つ以上の放射線応答エレメントを含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、がん細胞において優位に自己複製性ポリヌクレオチドの転写を促す。例えば、いくつかの実施形態では、転写制御エレメントは、がん細胞において発現が増加する遺伝子、例えば、ｈＴＥＲＴ、ＨＥ４、ＣＥＡ、ＯＣ、ＡＲＦ、ＣｇＡ、ＧＲＰ７８、ＣＸＣＲ４、ＨＭＧＢ２、ＩＮＳＭ１、メソテリン、ＯＰＮ、ＲＡＤ５１、ＴＥＴＰ、Ｈ１９、ｕＰＡＲ、ＥＲＢＢ２、ＭＵＣ１、Ｆｒｚ１、ＩＧＦ２−Ｐ４、ＭｙｃまたはＥ２Ｆに由来するプロモーターである。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換え核酸分子は、複製可能ウイルスゲノムをコードするポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドは５’及び３’末端において末端逆位反復（ＩＴＲ）配列と隣接している。本明細書において、「末端逆位反復配列」または「ＩＴＲ」という用語は、異種ポリヌクレオチド配列（例えば、複製可能ウイルスゲノムをコードする核酸）の３’及び／または５’末端に位置する、１つ以上のストレッチの非パリンドローム配列によって隔てられたパリンドローム配列を含むポリヌクレオチド配列を指す。「パリンドローム」配列は、５’から３’への方向に読まれた場合にその相補鎖と等しい、核酸配列を指す。ＩＴＲのポリヌクレオチド配列は、パリンドローム配列間の相補的塩基対合によってステム−ループ構造（例えばヘアピンループ）を形成することになる。ＩＴＲポリヌクレオチド配列は、配列がステム−ループ構造を形成することができる限り、任意の長さであり得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは以下の構造を含む：
【０１９０】
５’−ＩＴＲ−センスウイルスゲノム−ＩＴＲ−３’、または
【０１９１】
３’−ＩＴＲ−アンチセンスウイルスゲノム−ＩＴＲ−５’。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＩＴＲ配列は、ステム−ループ構造を形成することができるパリンドローム配列、Ｒｅｐ結合部位及び末端分解部位を最小限に含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＩＴＲは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来する。そのような実施形態では、ＩＴＲは、ＡＡＶの任意の既知の血清型（例えば、ＡＡＶ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１）に由来し得る（例えば米国特許第９，５９８，７０３号を参照のこと）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＩＴＲは、パルボウイルスに由来し得る（例えば米国特許第５，５８５，２５４号を参照のこと）。本開示における使用に適するさらなる末端逆位反復配列は、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１７／１５２１４９号及び第ＷＯ２０１６／１７２００８号、ならびに米国特許出願公開第ＵＳ２０１７−０３６２６０８号に記載されている。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換え核酸分子は、ＩＴＲに挟まれたポリヌクレオチド分子を２つ含み、第１分子の５’ＩＴＲは第２分子の３’ＩＴＲに共有結合で繋げられており、第１分子の３’ＩＴＲは第２分子の５’ＩＴＲに共有結合で繋げられている。そのような実施形態では、共有結合で繋げられたＩＴＲに挟まれたポリヌクレオチドは末端閉鎖型線形二本鎖腫瘍溶解性ウイルス核酸分子を形成している。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換え核酸分子は、（ｉ）ウイルスゲノムのセンス配列をコードするポリヌクレオチドを含む第１一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）分子、及び（ｉｉ）ウイルスゲノムのアンチセンス配列をコードするポリヌクレオチドを含む第２ｓｓＤＮＡ分子を含み、第１及び第２ｓｓＤＮＡ分子の各々は３’ＩＴＲ及び５’ＩＴＲを含むものであり、第１ｓｓＤＮＡ分子の３’末端が第２ｓｓＤＮＡ分子の５’末端に共有結合で繋げられかつ第１ｓｓＤＮＡ分子の５’末端が第２ｓｓＤＮＡ分子の３’末端に共有結合で繋げられて本明細書中で「ＮａｎｏＶ分子」と呼称される末端閉鎖型線形二本鎖腫瘍溶解性ウイルス（Ｏｖ）ＤＮＡ分子を形成している。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、自己複製性ポリヌクレオチドは、複製可能なＤＮＡまたはＲＮＡウイルスゲノムをコードする。いくつかの実施形態では、複製可能ウイルスゲノムは一本鎖ゲノム（例えばｓｓＲＮＡゲノムまたはｓｓＤＮＡゲノム）である。そのような実施形態では、一本鎖ゲノムはプラスセンスまたはマイナスセンスゲノムであり得る。いくつかの実施形態では、複製可能ウイルスゲノムは、二本鎖ゲノム（例えばｄｓＲＮＡゲノムまたはｄｓＤＮＡゲノム）である。いくつかの実施形態では、自己複製性ポリヌクレオチドは、複製可能腫瘍溶解性ウイルスをコードする。本明細書中で使用する場合、「腫瘍溶解性ウイルス」という用語は、がん細胞への優先的な感染をするように改変されているかまたは元来それをするものであるウイルスを指す。腫瘍溶解性ウイルスの例は、当技術分野で既知であり、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、ポリオウイルス、ワクチニアウイルス、麻疹ウイルス、水疱性口炎ウイルス、オルトミクソウイルス、パルボウイルス、マラバウイルスまたはコクサッキーウイルスを含むがこれらに限定されない。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドによって生み出される複製可能ウイルスは、アデノウイルス科の任意のウイルス、例えばアデノウイルス、ピコルナウイルス科の任意のウイルス、例えばコクサッキーウイルス、ポリオウイルスもしくはセネカバレーウイルス、ヘルペスウイルス科の任意のウイルス、例えばウマヘルペスウイルスもしくは単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）、アレナウイルス科の任意のウイルス、例えばラッサウイルス、レトロウイルス科の任意のウイルス、例えばマウス白血病ウイルス、オルトミクソウイルス科の任意のウイルス、例えばＡ型インフルエンザウイルス、パラミクソウイルス科の任意のウイルス、例えばニューカッスル病ウイルスもしくは麻疹ウイルス、パルボウイルス科の任意のウイルス、レオウイルス科の任意のウイルス、例えば哺乳動物オルソレオウイルス、トガウイルス科の任意のウイルス、例えばシンドビスウイルス、ポックスウイルス科の任意のウイルス、例えばワクチニアウイルスもしくは粘液腫ウイルス、またはラブドウイルス科の任意のウイルス、例えば水疱性口炎ウイルス（ＶＳＶ）もしくはマラバウイルスであり、その例は図１に示される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドによって生み出される複製可能ウイルスは、キメラウイルス、例えば改変型ポリオウイルス（例えば、ＰＶＳ−ＲＩＰＯ）である。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、本明細書において開示される組換え核酸分子は、組換え核酸分子が細胞内に導入される場合、細胞の内因性ポリメラーゼ（複数可）によって転写されて、感染性ウイルスに組立てられることができるウイルスゲノムを生み出す。生み出された感染性ウイルスの量は、培養物中で成長させた細胞の上清または対象の組織において標的細胞内または標的細胞の集団の中に存在するウイルスＲＮＡまたはウイルスＤＮＡの量を定量することを含むがこれに限定されない当技術分野で知られている方法によって測定され得る。そのような実施形態では、総ＤＮＡまたはＲＮＡを標的細胞から単離することができ、ウイルスゲノム中に存在するＲＮＡまたはＤＮＡ配列に対する特異的プライマーを使用してｑＰＣＲを実施することができる。いくつかの実施形態では、標的細胞の集団（例えば、試験管内の試料、または生体内の腫瘍から単離された試料）に組換え核酸が導入されている細胞の集団から産生されたウイルス粒子の数を、当技術分野で知られている方法によって定量することができる。いくつかの実施形態では、本開示の製剤は、少なくとも約１０３〜１０９ＴＣＩＤ５０／ｍＬ、例えば、少なくとも約１０３ＴＣＩＤ５０／ｍＬ、約１０４ＴＣＩＤ５０／ｍＬ、約１０５ＴＣＩＤ５０／ｍＬ、約１０６ＴＣＩＤ５０／ｍＬ、約１０７ＴＣＩＤ５０／ｍＬ、約１０８ＴＣＩＤ５０／ｍＬ、または約１０９ＴＣＩＤ５０／ｍＬの５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）を含む。いくつかの実施形態では、本開示の製剤は生体内での腫瘍成長を著しく阻害する。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、本明細書において開示される組換え核酸分子は、配列番号１〜２と少なくとも約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または約１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。
【０１９８】
Ａ．一本鎖ＲＮＡウイルス
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の自己複製性ポリヌクレオチドは、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）ウイルスゲノムをコードする。いくつかの実施形態では、ｓｓＲＮＡウイルスは、プラスセンスｓｓＲＮＡ（＋センスｓｓＲＮＡ）ウイルスまたはマイナスセンスｓｓＲＮＡ（−センスｓｓＲＮＡ）ウイルスである。
【０１９９】
１．プラスセンス一本鎖ＲＮＡウイルイス
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の自己複製性ポリヌクレオチドは、プラスセンス一本鎖ＲＮＡ（＋センスｓｓＲＮＡ）ウイルスゲノムをコードする。例示的な＋センスｓｓＲＮＡウイルスとしては、ピコルナウイルス科（例えば、コクサッキーウイルス、ポリオウイルス及び、ＳＶＶ−Ａを含めたセネカバレーウイルス（ＳＶＶ））、コロナウイルス科（例えば、アルファコロナウイルス、例えばＨＣｏＶ−２２９Ｅ及びＨＣｏＶ−ＮＬ６３、ベータコロナウイルス、例えば、ＨＣｏＶ−ＨＫＵ１、ＨＣｏＶ−ＯＣ３及びＭＥＲＳ−ＣｏＶ）、レトロウイルス科（例えばマウス白血病ウイルス）及びトガウイルス科（例えばシンドビスウイルス）のメンバーが挙げられる。他の例示的なプラスセンスｓｓＲＮＡウイルスの属及び種を以下の表４に示す。
【表４−１】
2020530778.tif 000003
【表４−２】
2020530778.tif 000004
【０２００】
＋センスｓｓＲＮＡウイルスのゲノムは、５’−３’配向のｓｓＲＮＡ分子を含み、宿主細胞によって直接ウイルスタンパク質に翻訳され得る。したがって、＋センスｓｓＲＮＡウイルスをコードする自己複製性ポリヌクレオチドは、感染性ウイルス粒子を生み出すために追加のウイルス複製タンパク質の存在を何ら必要としない。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドにコードされる＋センスｓｓＲＮＡ複製可能ウイルスゲノムは、ウイルス本来の別個の５’及び３’末端を必要とする。哺乳動物ＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩによって産生されるｍＲＮＡ転写産物は、哺乳動物５’及び３’ＵＴＲを含有し、よって、感染性ｓｓＲＮＡウイルスの産生に必要とされる別個の天然末端を含有しない。したがって、いくつかの実施形態において、感染性＋センスｓｓＲＮＡウイルス（例えば、表５に示すウイルス）を産生するには、ウイルスの別個の内因性５’及び３’末端を維持すべく非ウイルス性ＲＮＡが転写産物から除去されるような、Ｐｏｌ  ＩＩによってコードされるウイルスゲノム転写産物をウイルスｓｓＲＮＡと哺乳動物ｍＲＮＡ配列との連結部のところで切断することを可能にする追加の５’及び３’配列が必要である。そのような配列は、本明細書において連結部切断配列と呼称される。例えば、いくつかの実施形態では、自己ポリヌクレオチドは以下の構造を含む：
（ａ）５’−Ｐｏｌ  ＩＩ−連結部切断−センスウイルスゲノム−連結部切断−３’、
（ｂ）３’−Ｐｏｌ  ＩＩ−連結部切断−アンチセンスウイルスゲノム−連結部切断−５’。
【０２０２】
連結部切断配列、及びウイルスゲノム転写産物からの非ウイルス性ＲＮＡの除去は、様々な方法で成し遂げられ得る。例えば、いくつかの実施形態では、連結部切断配列はｓｉＲＮＡ標的配列であり、自己複製性ポリヌクレオチドの５’及び３’末端の中に組み込まれている。そのような実施形態では、ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）またはＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質によるウイルスゲノム転写産物の切断を媒介すべく生成し得る。例示的な構築物デザインは図３２Ａ及び図３２Ｂに描写される。いくつかの実施形態では、連結部切断配列は、前駆体ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）をコードする配列であり、自己複製性ポリヌクレオチドの５’及び３’末端の中に組み込まれている。そのような実施形態では、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ配列は、Ｄｒｏｓｈａによるウイルスゲノム転写産物の切断を可能にするヘアピンループを形成する。いくつかの実施形態では、連結部切断配列はガイドＲＮＡ標的配列であり、自己複製性ポリヌクレオチドの５’及び３’末端の中に組み込まれている。そのような実施形態では、ｇＲＮＡは、ＲＮアーゼ活性を有するＣａｓエンドヌクレアーゼと共に設計及び導入されて正確な連結部位でのウイルスゲノム転写産物の切断を媒介し得る。いくつかの実施形態では、連結部切断配列はリボザイムコード配列であり、ウイルスゲノムをコードするポリヌクレオチド配列のすぐ５’及び３’側で本明細書に記載の自己複製性ポリヌクレオチドの中に組み込まれている。そうして、コードしているリボザイムはウイルスゲノム転写産物の切断を媒介してウイルスの別個の天然末端を生成する。さらには、当技術分野で現在知られている、または将来定義されることになっている、ＲＮＡ転写産物を特定部位で切断するための任意のシステムを用いて、本明細書に記載の自己複製性ポリヌクレオチドにコードされるウイルス本来の別個の末端を生成することができる。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、自己複製性ポリヌクレオチドは、ウイルス転写産物の別個の天然末端を生成するための５’及び３’連結部切断配列を含み、５’及び３’ＩＴＲに挟まれている。例えば、いくつかの実施形態では、自己ポリヌクレオチドは以下の構造を含む：
（ａ）５’−ＩＴＲ−Ｐｏｌ  ＩＩ−連結部切断−センスウイルスゲノム−連結部切断−ＩＴＲ−３’、または
（ｂ）３’−ＩＴＲ−Ｐｏｌ  ＩＩ−連結部切断−アンチセンスウイルスゲノム−連結部切断−ＩＴＲ−５’。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは以下の構造を含む：
（ａ）５’−Ｐｏｌ  ＩＩ−リボザイム−センスウイルスゲノム−リボザイム−３’、
（ｂ）３’−Ｐｏｌ  ＩＩ−リボザイム−アンチセンスウイルスゲノム−リボザイム−５’、
（ｃ）５’−ＩＴＲ−Ｐｏｌ  ＩＩ−リボザイム−センスウイルスゲノム−リボザイム−ＩＴＲ−３’、または
（ｄ）３’−ＩＴＲ−Ｐｏｌ  ＩＩ−リボザイム−アンチセンスウイルスゲノム−リボザイム−ＩＴＲ−５’。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、３’リボザイムコード配列及び５’リボザイムコード配列は同じリボザイムをコードする。いくつかの実施形態では、リボザイムコード配列はデルタ肝炎ウイルスリボザイムまたはハンマーヘッド型リボザイムをコードする。いくつかの実施形態では、３’リボザイムコード配列及び５’リボザイムコード配列は異なるリボザイムをコードする。いくつかの実施形態では、３’リボザイムコード配列はデルタ肝炎ウイルスリボザイムをコードし、５’リボザイムコード配列はハンマーヘッド型リボザイムをコードする。
【０２０６】
２．マイナスセンスｓｓＲＮＡウイルス
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、マイナスセンス一本鎖ＲＮＡ（−センスｓｓＲＮＡ）ウイルスゲノムをコードする。−センスｓｓＲＮＡウイルスのゲノムは、３’−５’配向のｓｓＲＮＡ分子を含み、直接タンパク質に翻訳されることができない。もっと正確に言えば、−センスｓｓＲＮＡウイルスのゲノムは最初にＲＮＡポリメラーゼによって＋センスｍＲＮＡ分子に転写されねばならない。例示的な−センスｓｓＲＮＡウイルスとしては、パラミクソウイルス科（例えば麻疹ウイルス及びニューカッスル病ウイルス）、ラブドウイルス科（例えば水疱性口炎ウイルス（ＶＳＶ）及びマラバ（ｍａｒｂａ）ウイルス）、アレナウイルス科（例えばラッサウイルス）及びオルトミクソウイルス科（例えばインフルエンザウイルス、例えば、Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザ、Ｃ型インフルエンザ及びＤ型インフルエンザ）のメンバーが挙げられる。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、−センスｓｓＲＮＡウイルスゲノムをコードする自己複製性ポリヌクレオチドは、−センスｓｓＲＮＡゲノムの複製に必要なウイルスタンパク質に直接翻訳されることができるｍＲＮＡ転写産物をコードする第１ポリヌクレオチド配列と、ウイルスゲノムのアンチゲノム配列を含む第２ポリヌクレオチド配列とを含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２ポリヌクレオチド配列は、真核細胞における発現が可能なプロモーター、例えば哺乳動物プロモーターに機能可能に繋げられている。いくつかの実施形態では、第１及び第２ポリヌクレオチド配列は双方向性プロモーター、例えば双方向性Ｐｏｌ  ＩＩプロモーターに機能可能に繋げられている（例えば、図９、図１０及び図１１を参照のこと）。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、−センスｓｓＲＮＡゲノムの複製に必要とされるウイルス遺伝子は同じ発現カセットから発現する。いくつかの実施形態では、−センスｓｓＲＮＡゲノムの複製に必要とされるウイルス遺伝子は、異なる発現カセット、例えば２つまたは３つの発現カセット、例えば、遺伝子１つにつき１つの発現カセット、または３つのうち２つの遺伝子についての１つの発現カセットと３つ目の遺伝子についてのもう１つの発現カセットとから発現する。−センスｓｓＲＮＡゲノムの複製に必要とされるウイルス遺伝子は、同じオープンリーディングフレームから、または２つもしくは３つの異なるオープンリーディングフレームから翻訳され得る。一実施形態では、−センスｓｓＲＮＡゲノムの複製に必要とされるウイルス遺伝子は、単一のオープンリーディングフレームから同時翻訳的に発現し、翻訳後に成熟ポリペプチドにプロセシングされる。一実施形態では、−センスｓｓＲＮＡゲノムの複製に必要とされるウイルス遺伝子は２Ａペプチド配列によって繋げられており、その結果、オープンリーディングフレームから翻訳されたポリペプチドが自己切断されて個々のポリペプチドになる。−センスｓｓＲＮＡゲノム遺伝子の複製に必要とされるウイルス遺伝子はいかなる順序で並んでいてもよい。いくつかの実施形態では、発現カセットは、−センスｓｓＲＮＡゲノム遺伝子の複製に必要とされるウイルス遺伝子の１つ以上の機能性変異体を含む。当業者であれば、特定の−センスｓｓＲＮＡウイルスに必要とされる遺伝子エレメントに応じて上記システムの適切な変化形態を操作する方法を認識するであろう。この操作は、複製に必須となる追加遺伝子を追加する形態をとり得る。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、複製に必要なウイルスタンパク質に直接翻訳されることができるｍＲＮＡ転写産物をコードする第１ポリヌクレオチド配列は、真核細胞における発現が可能なプロモーター、例えば哺乳動物Ｐｏｌ  ＩＩプロモーターに機能可能に繋げられており、さらにＴ７ポリメラーゼをコードする。そのような実施形態では、第２ポリヌクレオチド配列はＴ７プロモーターに機能可能に繋げられている。例えば、いくつかの実施形態では、自己複製性ポリヌクレオチドは以下の構造を含む：
（ａ）５’−［複製に必要なウイルス遺伝子］−双方向性プロモーター−［アンチゲノムウイルスゲノム］−３’、
（ｂ）５’−Ｐｏｌ  ＩＩ−［複製に必要なウイルス遺伝子＋Ｔ７  ｐｏｌ］−Ｔ７プロモーター−［アンチゲノムウイルスゲノム］−３’。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、−センスｓｓＲＮＡウイルスゲノムをコードする自己複製性ポリヌクレオチドは、５’及び３’末端においてＡＡＶ由来ＩＴＲと隣接しており、例えば、
（ａ）５’−ＩＴＲ−［複製に必要なウイルス遺伝子］−双方向性プロモーター−［アンチゲノムウイルスゲノム］−ＩＴＲ−３’、
（ｂ）５’−ＩＴＲ−Ｐｏｌ  ＩＩ−［複製に必要なウイルス遺伝子＋Ｔ７  ｐｏｌ］−Ｔ７プロモーター−［アンチゲノムウイルスゲノム］−ＩＴＲ−３’
である。
【０２１１】
Ｂ．二本鎖ＲＮＡウイルス
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の自己複製性ポリヌクレオチドは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）ウイルスゲノムをコードする。例示的なｄｓＲＮＡウイルスとしては、アマルガウイルス科、ビルナウイルス科、クリソウイルス科、シストウイルス科、エンドルナウイルス科、ハイポウイルス科、メガビルナウイルス科、パルティティウイルス科、ピコビルナウイルス科、クオドリウイルス科、レオウイルス科、トティウイルス科のメンバーが挙げられる。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の自己複製性ポリヌクレオチドはｄｓＲＮＡウイルスゲノムをコードする。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡウイルスゲノムは、マイナスセンス（相補）鎖の５’側のプラスセンス鎖としてコードされる。かくして、いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡウイルスゲノムは、同じＤＮＡポリヌクレオチド鎖からもう一方に相補的な２つのＲＮＡ分子として転写される。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡウイルスゲノムの２つのＲＮＡ分子は単一のＲＮＡとして転写され、これが例えばリボザイム、エンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ系システムまたはそれに類似するものによって切断されてプラス及びマイナスセンス分子になる。
【０２１３】
一実施形態では、ｄｓＲＮＡウイルスゲノムは、共有ｄｓＤＮＡ鋳型に隣接するプロモーターに機能可能に繋げられた共有ｄｓＤＮＡ鋳型から転写される。片方のプロモーターはＤＮＡポリヌクレオチドのワトソン鎖からの転写を引き起こし、それによってｄｓＲＮＡゲノムのプラス鎖を生成する。もう片方のプロモーターはＤＮＡポリヌクレオチドのクリック鎖からの転写を引き起こし、それによってｄｓＲＮＡゲノムのマイナス鎖を生成する。いくつかのｄｓＲＮＡウイルス、例えばレオウイルスは、それらのゲノムが複数のＲＮＡ分子からなり、ある場合においてはｄｓＲＮＡとｓｓＲＮＡとの混合物からなる、という意味でセグメント化されたウイルスである。本開示は、ＤＮＡポリヌクレオチドが各セグメントの転写単位を含んでいる実施形態を提供する。いくつかの実施形態では、セグメントは、ＤＮＡポリヌクレオチドのワトソン及び／またはクリック鎖上のいくつかのプロモーターから転写される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡセグメントは、例えばリボザイム、エンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ系システムまたはそれに類似するものによる１つ以上のＲＮＡセグメントの転写後切断によって生成する。いくつかの実施形態では、システムのプロモーターの１つ以上はＴ７プロモーターであり、システムは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｔ７システムの使用は、ｄｓＲＮＡウイルスゲノムの１つ以上のセグメントの天然５’末端を生成する。いくつかの実施形態では、システムのプロモーターの１つ以上は、真核生物において活性なプロモーター、例えば哺乳動物プロモーターである。
【０２１４】
Ｃ．一本鎖ＤＮＡウイルス
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の自己複製性ポリヌクレオチドは一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ウイルスゲノムをコードする。例示的なｓｓＤＮＡウイルスとしては、パルボウイルス科（例えばアデノ随伴ウイルス）、アネロウイルス科、ビドナウイルス科、サーコウイルス科、ジェミニウイルス科、ゲノモウイルス科、イノウイルス科、ミクロウイルス科、ナノウイルス科、スマコウイルス科及びスピラウイルス科のメンバーが挙げられる。一実施形態では、自己複製性ポリヌクレオチドはパルボウイルスをコードする。一実施形態では、自己複製性ポリヌクレオチドはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）をコードする。
【０２１５】
Ｄ．二本鎖ＤＮＡウイルス
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の自己複製性ポリヌクレオチドは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ウイルスゲノムをコードする。例示的なｄｓＤＮＡウイルスとしては、マイオウイルス科、ポドウイルス科、サイフォウイルス科、アロヘルペスウイルス科、ヘルペスウイルス科（例えば、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−１、ウマヘルペスウイルス）、ポックスウイルス科（例えばワクチニアウイルス及び粘液腫ウイルス）のメンバーが挙げられる。一実施形態では、自己複製性ポリヌクレオチドはアデノウイルスをコードする。
【０２１６】
Ｅ．ｍｉＲＮＡ転写減衰
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の自己複製性ポリヌクレオチドは、１つ以上の必須ウイルス遺伝子の中に挿入された１つ以上のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）標的配列を含む複製可能ウイルスゲノムをコードする。ｍｉＲは、細胞増殖及びアポトーシスの制御に関与するものを含めた幾多のタンパク質をコードする多くの転写産物を調節する。ｍｉＲによって調節される例示的なタンパク質としては、一般的な原がんタンパク質及び腫瘍抑制因子、例えば、Ｒａｓ、Ｍｙｃ、Ｂｃｌ２、ＰＴＥＮ及びｐ５３が挙げられる。
【０２１７】
ｍｉＲＮＡは正常細胞プロセスに密接に関連しており、それらの調節不全は、がんを含めた多様な疾患の原因になる。重要なことに、ｍｉＲＮＡは、正常組織に比べてがん組織において差次的に発現しており、それらを様々ながんの標的機構として役立てることを可能にする。発がん、悪性形質転換または転移との（正あるいは負の）関連を有するｍｉＲＮＡは「ｏｎｃｏｍｉＲ」として知られている。表２は、ｏｎｃｏｍｉＲ及び特定のがんにおけるそれらの相対的発現の一覧を示す。
【０２１８】
いくつかの態様では、特定のｍｉＲＮＡの発現は特定のがん及び／または転移の進展または維持との正の関連を有する。そのようなｍｉＲのことを本明細書では「発がん性ｍｉＲＮＡ」または「ｏｎｃｏｍｉＲ」と呼ぶ。いくつかの実施形態では、がんの細胞または組織において発がん性ｍｉＲＮＡの発現は、非がん性対照細胞（すなわち正常または健常対照）に認められる発現レベルと比較して増加するかまたは、異なるがんタイプに由来するがん細胞に認められる発現レベルと比較して増加する。例えば、がん細胞における発がん性ｍｉＲＮＡの発現は、非がん性対照細胞または異なるがんタイプに由来するがん細胞における発がん性ｍｉＲＮＡの発現と比較して少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、１０００％またはそれ以上増加し得る。いくつかの態様では、がん細胞は、非がん性対照細胞に発現しない発がん性ｍｉＲＮＡを発現させ得る。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、特定のｏｎｃｏｍｉＲの発現は特定のがん及び／または転移の進展または維持との負の関連を有する。そのようなｏｎｃｏｍｉＲのことを本明細書では「腫瘍抑制因子ｍｉＲＮＡ」または「腫瘍抑制性ｍｉＲＮＡ」と呼ぶ、というのも、それらの発現はがんの進展を防止または抑制するからである。いくつかの実施形態では、がんの細胞または組織において腫瘍抑制因子ｍｉＲＮＡの発現は、非がん性対照細胞（すなわち正常または健常対照）に認められる発現レベルと比較して減少するかまたは、異なるがんタイプに由来するがん細胞に認められる腫瘍抑制因子ｍｉＲＮＡの発現レベルと比較して減少する。例えば、がん細胞における腫瘍抑制因子ｍｉＲＮＡの発現は、非がん性対照細胞または異なるがんタイプに由来するがん細胞における腫瘍抑制因子ｍｉＲＮＡの発現と比較して少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％減少し得る。いくつかの態様では、非がん性対照細胞は、がん細胞に発現しない腫瘍抑制因子ｍｉＲＮＡを発現させ得る。
【０２２０】
典型的には、腫瘍抑制性ｍｉＲＮＡと対比して発がん性ｍｉＲＮＡとして特定のｍｉＲＮＡを指定することは、がんのタイプによって異なるであろう。例えば、特定のがんにおいて、あるｍｉＲＮＡの発現は増加すること及びそのがんの進展に関係することがある一方、同じｍｉＲＮＡの発現が、異なるがんでは減少すること及びそのがんの進展の防止に関係することがある。しかしながら、いくつかのｍｉＲＮＡはがんのタイプに無関係に発がん性ｍｉＲＮＡとして機能することがある。例えば、いくつかのｍｉＲＮＡは、腫瘍抑制因子遺伝子のｍＲＮＡ転写産物を分解の標的とし、それによって腫瘍抑制因子タンパク質の発現を減少させる。表２は、いくつかのがん、及び各がんタイプに認められる対応する「上方制御される」ｍｉＲＮＡ及び「下方制御される」ｍｉＲＮＡの一覧を示す。表２中、上方制御されるｍｉＲＮＡは、その特定のがんにおいて発がん性の可能性があるｍｉＲＮＡであり、他方、下方制御されるｍｉＲＮＡは、その特定のがんにおいて腫瘍抑制性の可能性がある。さらなる腫瘍抑制性ｍｉＲＮＡの一覧を表３に示す。表１は、選出された１２個のｏｎｃｏｍｉＲ（９個の腫瘍抑制因子及び３個の発がん性ｍｉＲＮＡ）と幾多のがんとの関係性を示す。
【０２２１】
いくつかの態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチドによって生み出されたウイルスの複製は、ウイルスゲノム中の１つ以上の場所に１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列が組み込まれていることで腫瘍細胞に限定される。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列は、複製可能ウイルスゲノムの５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲの中に組み込まれている。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列は、必須ウイルス遺伝子の１つ以上の遺伝子座に組み込まれている。本明細書中で使用する場合、「必須ウイルス遺伝子」は、ウイルス複製、ウイルス遺伝子産物の感染性粒子への組立てに必要とされる、または組立てられた感染性粒子の構造的完全性を維持するのに必要とされる、ウイルス遺伝子を指す。いくつかの実施形態において、必須ウイルス遺伝子には、ＵＬ１、ＵＬ５、ＵＬ６、ＵＬ７、ＵＬ８、ＵＬ９、ＵＬ１１、ＵＬ１２、ＵＬ１４、ＵＬ１５、ＵＬ１７、ＵＬ１８、ＵＬ１９、ＵＬ２０、ＵＬ２２、ＵＬ２５、ＵＬ２６、ＵＬ２６．５、ＵＬ２７、ＵＬ２８、ＵＬ２９、ＵＬ３０、ＵＬ３１、ＵＬ３２、ＵＬ３３、ＵＬ３４、ＵＬ３５、ＵＬ３６、ＵＬ３７、ＵＬ３８、ＵＬ３９、ＵＬ４０、ＵＬ４２、ＵＬ４８、ＵＬ４９、ＵＬ５０、ＵＬ５２、ＵＬ５３、ＵＬ５４、ＵＳ１、ＵＳ３、ＵＳ４、ＵＳ５、ＵＳ６、ＵＳ７、ＵＳ８、ＵＳ１２、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、ＰＢ、Ｆ、Ｂ５Ｒ、ＳＥＲＯ−１、Ｃａｐ、Ｒｅｖ、ＶＰ１〜４、核タンパク質（Ｎ）、リンタンパク質（Ｐ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、糖タンパク質（Ｇ）、ポリメラーゼ（Ｌ）、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、３Ａ、３Ｂ、３Ｃ及び３Ｄが含まれ得る。
【０２２２】
いくつかの実施形態では、必須ウイルス遺伝子の１つ以上の遺伝子座に挿入されているｍｉＲＮＡ標的配列は、正常な非がん性細胞によって発現されるががん細胞では発現しないかまたは発現の減少を示すｍｉＲＮＡに対応している。正常（非がん性）細胞に発現するｍｉＲＮＡは、ポリヌクレオチド中の対応する標的配列に結合することになり、ｍｉＲＮＡ標的配列を含有するウイルス遺伝子の発現を抑制することになり、それによってウイルス複製及び／または感染性粒子への構造組立てを防止する。かくして、ｍｉＲＮＡ標的配列の挿入は、コードされるウイルスの溶解作用から正常細胞を保護する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的配列は、腫瘍抑制性ｍｉＲＮＡ（例えば、表３中に列挙されるｍｉＲＮＡ）の標的配列である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個または少なくとも１０個の必須ウイルス遺伝子の遺伝子座に挿入されたｍｉＲＮＡ標的配列を含み得る。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列が１つ以上の必須ウイルス遺伝子の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）及び／または３’ＵＴＲの中に組み込まれている。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列がウイルスゲノム中の非必須遺伝子（例えば、ガンマ３４．５）の３’または５’ＵＴＲの中に組み込まれている。
【０２２３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、必須ウイルス遺伝子の遺伝子座に組み込まれたｍｉＲＮＡ標的配列を含む。いくつかの態様では、本明細書に記載の自己複製性ポリヌクレオチドは、１つ以上の必須ウイルス遺伝子の中に組み込まれた複数のｍｉＲＮＡ標的配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、複数（例えば２つ以上）の必須ウイルス遺伝子の中に組み込まれたｍｉＲＮＡ標的配列を含む。例えば、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれより多くの必須ウイルス遺伝子の中に挿入されたｍｉＲＮＡ標的配列を含み得る。そのような実施形態では、各必須ウイルス遺伝子が１つのｍｉＲＮＡ標的配列を含むことになると同時に、ポリヌクレオチドが全体として複数のｍｉＲＮＡ標的配列を含むことになるであろう。そのような実施形態では、複数のｍｉＲＮＡ標的配列が同じｍｉＲＮＡに対応していてもよい。例えば、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれより多くの必須ウイルス遺伝子の中に挿入された同じｍｉＲＮＡ標的配列を含み得る。そのような実施形態では、複数のｍｉＲＮＡ標的配列が、２つ以上の異なるｍｉＲＮＡに対応していてもよい。例えば、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、第１必須ウイルス遺伝子の中に挿入され第１ｍｉＲＮＡに対応しているｍｉＲＮＡ標的配列、第２必須ウイルス遺伝子の中に挿入され第２ｍｉＲＮＡに対応しているｍｉＲＮＡ標的配列、第３必須ウイルス遺伝子の中に挿入され第３ｍｉＲＮＡに対応しているｍｉＲＮＡ標的配列などを含み得る。
【０２２４】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的配列の複数のコピーが必須ウイルス遺伝子の遺伝子座の中に組み込まれている。例えば、いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的配列の２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれより多くのコピーが必須ウイルス遺伝子の遺伝子座に挿入され得る。いくつかの実施形態では、必須ウイルス遺伝子の遺伝子座に挿入されている複数のｍｉＲＮＡ標的配列の各々は、同じｍｉＲＮＡに対応している。いくつかの実施形態では、必須ウイルス遺伝子の遺伝子座に挿入されている複数のｍｉＲＮＡ標的配列の各々は、異なるｍｉＲＮＡに対応している。例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれより多くの異なるｍｉＲＮＡに対応するｍｉＲＮＡ標的配列が必須ウイルス遺伝子の遺伝子座に挿入され得る。
【０２２５】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的配列の複数のコピーが複数の必須ウイルス遺伝子の遺伝子座の中に組み込まれている。例えば、いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的配列の２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれより多くのコピーが２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれより多くの必須ウイルス遺伝子の遺伝子座に挿入され得る。いくつかの実施形態では、特定の必須ウイルス遺伝子の中に挿入されている複数のｍｉＲＮＡ標的配列が全て、同じｍｉＲＮＡに対応し得る。例えば、いくつかの実施形態では、第１必須ウイルス遺伝子は、各々第１ｍｉＲＮＡに対応している複数のｍｉＲＮＡ標的配列を含み得、第２必須ウイルス遺伝子は、各々第２ｍｉＲＮＡに対応している複数のｍｉＲＮＡ標的配列を含み得る。いくつかの実施形態では、自己複製性ポリヌクレオチドはさらに、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９または第１０ｍｉＲＮＡに各々対応する複数のｍｉＲＮＡ標的配列を含んだそれぞれ第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９または第１０の必須ウイルス遺伝子を含み得る。
【０２２６】
いくつかの実施形態では、異なるｍｉＲＮＡに対応する複数のｍｉＲＮＡ標的配列が、複数の必須ウイルス遺伝子遺伝子座に挿入されている。例えば、いくつかの実施形態では、第１必須ウイルス遺伝子は、２つ以上の異なるｍｉＲＮＡに対応する複数のｍｉＲＮＡ標的配列を含み得、第２必須ウイルス遺伝子は、２つ以上の異なるｍｉＲＮＡに対応する複数のｍｉＲＮＡ標的配列を含み得る。そのような実施形態では、第１必須ウイルス遺伝子中のｍｉＲＮＡ標的配列は第２必須ウイルス遺伝子中のｍｉＲＮＡ標的配列と同じであってもよいし、または異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、自己複製性ポリヌクレオチドはさらに、異なるｍｉＲＮＡに対応する複数のｍｉＲＮＡ標的配列を各々含むものである第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９または第１０必須ウイルス遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態では、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９または第１０必須ウイルス遺伝子のうちのいずれか１つの中にあるｍｉＲＮＡ標的配列は、その他の必須ウイルス遺伝子のうちのいずれかの中にあるｍｉＲＮＡ標的配列と同じであり得る。いくつかの実施形態では、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９または第１０必須ウイルス遺伝子のうちのいずれか１つの中にあるｍｉＲＮＡ標的配列は、その他の必須ウイルス遺伝子のうちのいずれかの中にあるｍｉＲＮＡ標的配列とは異なり得る。
【０２２７】
いくつかの実施形態では、複数のｍｉＲＮＡ標的配列が縦並びに１つ以上の必須ウイルス遺伝子の遺伝子座に挿入されており、互いにリンカー配列またはスペーサー配列によって隔てられている。いくつかの実施形態では、リンカーまたはスペーサー空間配列は４つ以上のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、リンカーまたはスペーサー空間配列は５、６、７、８、９、１０個またはそれより多くのヌクレオチドを含む。一実施形態では、リンカー配列またはスペーサー配列は少なくとも４つ〜少なくとも６つのヌクレオチドを含む。
【０２２８】
いくつかの実施形態では、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれより多くの下記サブユニットのどちらかが縦並びに１つ以上の必須ウイルス遺伝子の遺伝子座に挿入されている：（ａ）第１ｍｉＲＮＡの標的配列−リンカーまたはスペーサー配列−第１ｍｉＲＮＡの標的配列、または（ｂ）第１ｍｉＲＮＡの標的配列−リンカーまたはスペーサー配列−第２ｍｉＲＮＡの標的配列。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的配列は、表３中に列挙されるｍｉＲＮＡのうちのいずれか１つ以上の標的配列である。
【０２２９】
Ｆ．搭載薬分子
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、搭載薬分子をコードする核酸配列を含む。本明細書中で使用する場合、「搭載薬分子」（「治療用分子」とも呼称される）は、本明細書に記載の自己複製性ポリヌクレオチドにコードされるウイルスまたはその感染性粒子の治療有効性をさらに増強することができる任意の分子を指す。本開示において使用するのに適する搭載薬分子としては、タンパク質またはペプチド、例えば細胞毒性ペプチド、免疫調節性ペプチド（例えば、抗原結合性分子、例えば抗体またはその抗原結合性断片、サイトカイン、ケモカイン、可溶性受容体、細胞表面受容体リガンド、二分ペプチド、及び酵素が挙げられる。そのような搭載薬分子はさらに、核酸配列（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、アンタゴミール、リボザイム及びアプタマー）を含んでいてもよい。搭載薬分子の性質は疾患の種類及び望まれる治療転帰によって様々であろう。
【０２３０】
いくつかの実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列は、搭載薬分子をコードするポリヌクレオチド配列の３’または５’ＵＴＲの中に組み込まれている。そのような実施形態では、搭載薬の翻訳及びその後の発現は、対応するｍｉＲＮＡが発現する細胞では起こらないかまたはかなり低減される。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列は、治療用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の３’及び／または５’ＵＴＲの中に挿入されている。
【０２３１】
いくつかの実施形態では、治療用分子の発現は、非がん性細胞に比べてがん細胞において増進する治療用分子の発現を促す転写制御エレメント（例えば、ｈＴＥＲＴ、ＨＥ４、ＣＥＡ、ＯＣ、ＡＲＦ、ＣｇＡ、ＧＲＰ７８、ＣＸＣＲ４、ＨＭＧＢ２、ＩＮＳＭ１、メソテリン、ＯＰＮ、ＲＡＤ５１、ＴＥＴＰ、Ｈ１９、ｕＰＡＲ、ＥＲＢＢ２、ＭＵＣ１、Ｆｒｚ１、ＩＧＦ２−Ｐ４または低酸素（ＨＲＥ）及び放射線応答エレメントに由来するプロモーター）によってさらに調節され得る。いくつかの実施形態では、搭載薬分子の発現は自己複製性ポリヌクレオチドと同じ転写制御エレメントの制御下にある。
【０２３２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換え核酸分子は自己複製性ポリヌクレオチドを含み、さらに、細胞毒性ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。本明細書中で使用する場合、「細胞毒性ペプチド」は、宿主細胞に発現した場合に細胞死を、及び／または宿主細胞によって分泌された場合に隣接細胞の細胞死を誘導することができるタンパク質を指す。いくつかの実施形態では、細胞毒性ペプチドは、カスパーゼ、ｐ５３、ジフテリア毒素（ＤＴ）、シュードモナス外毒素Ａ（ＰＥＡ）、Ｉ型リボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）（例えば、サポリン及びゲロニン）、ＩＩ型ＲＩＰ（例えばリシン）、志賀様毒素１（Ｓｌｔ１）、感光性活性酸素種（例えば、ｋｉｌｌｅｒ−ｒｅｄ）である。特定の実施形態では、細胞毒性ペプチドは、カスパーゼ遺伝子などのアポトーシスによる細胞死を招く自殺遺伝子にコードされる。
【０２３３】
いくつかの実施形態では、搭載薬は免疫調節性ペプチドである。本明細書中で使用する場合、「免疫調節性ペプチド」は、特定の免疫受容体及び／または経路を調節すること（例えば、活性化させること、または阻害すること）ができるペプチドである。いくつかの実施形態では、免疫調節性ペプチドは、免疫細胞、組織細胞及び間質細胞を含めた任意の哺乳動物細胞に作用することができる。好ましい実施形態では、免疫調節性ペプチドは、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ  Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージ、好塩基球、マスト細胞または好酸球などの免疫細胞に対して作用する。例示的な免疫調節性ペプチドとしては、抗原結合性分子、例えば抗体またはその抗原結合性断片、サイトカイン、ケモカイン、可溶性受容体、細胞表面受容体リガンド、二分ペプチド、及び酵素が挙げられる。
【０２３４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換え核酸分子は、自己複製性ポリヌクレオチドを含み、さらに、ＩＬ−１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＴＮＦα、ＩＦＮα、ＩＦＮβまたはＩＦＮγなどのサイトカインをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換え核酸分子は、自己複製性ポリヌクレオチドを含み、さらに、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ９、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ４またはＣＣＬ５などのケモカインをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換え核酸分子は、自己複製性ポリヌクレオチドを含み、さらに、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ニューロピリンリガンド、Ｆｌｔ３リガンド、ＣＤ４７リガンド（例えばＳＩＲＰ１α）などの、細胞表面受容体のリガンドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換え核酸分子は、自己複製性ポリヌクレオチドを含み、さらに、可溶性受容体、例えば可溶性サイトカイン受容体（例えば、ＩＬ−１３Ｒ、ＴＧＦβＲ１、ＴＧＦβＲ２、ＩＬ−３５Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−１２Ｒ、及びインターフェロン受容体）または可溶性自然免疫受容体（例えば、ｔｏｌｌ様受容体、補体受容体など）をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換え核酸分子は、自己複製性ポリヌクレオチドを含み、さらに、細胞内ＲＮＡ及び／またはＤＮＡの感知に関与するタンパク質の優勢作動薬型突然変異体（例えば、ＳＴＩＮＧ、ＲＩＧ−１またはＭＤＡ−５の優勢作動薬型突然変異体）をコードするポリヌクレオチドを含む。
【０２３５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換え核酸分子は、自己複製性ポリヌクレオチドを含み、さらに、抗体またはその抗原結合性断片（例えば、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ）など）などの抗原結合性分子をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合性分子は、細胞表面受容体、例えば、免疫チェックポイント受容体（例えば、ＰＤ１、ＰＤＬ１及びＣＴＬＡ４）、または細胞成長及び活性化に関与する別の細胞表面受容体（例えば、ＯＸ４０、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ４７、ＣＳＦ１Ｒ、４１ＢＢ、ＣＤ４０及びＮＫＧ２Ｄ）に特異的に結合する。
【０２３６】
いくつかの実施形態では、搭載薬分子は、サソリポリペプチド、例えば、クロロトキシン、ＢｍＫｎ−２、ネオプラジン１、ネオプラジン２及びマウリポリン（ｍａｕｒｉｐｏｒｉｎ）である。いくつかの実施形態では、治療用分子は、ヘビポリペプチド、例えば、コントルトロスタチン、アポキシンＩ、ボトロプストキシンＩ、ＢＪｃｕＬ、ＯＨＡＰ−１、ロドストミン（ｒｈｏｄｏｓｔｏｍｉｎ）、ｄｒＣＴ−Ｉ、ＣＴＸ−ＩＩＩ、Ｂ１Ｌ、及びＡＣＴＸ−６である。いくつかの実施形態では、搭載薬分子は、クモポリペプチド、例えばラタルシン及びヒアルロニダーゼである。いくつかの実施形態では、搭載薬分子は、ハチポリペプチド、例えばメリチン及びアパミンである。いくつかの実施形態では、搭載薬分子は、カエルポリペプチド、例えば、ＰｓＴ−１、ＰｄＴ−１、及びＰｄＴ−２である。
【０２３７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換え核酸分子は、自己複製性ポリヌクレオチドを含み、さらに、酵素をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、酵素は、細胞外マトリックスを改変することによって腫瘍微小環境を調整することができる。そのような実施形態において、酵素には、マトリックスメタロプロテアーゼ（例えばＭＭＰ９）、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、ゼラチナーゼまたはエラスターゼが含まれ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、酵素は、遺伝子指向性酵素プロドラッグ療法（ＧＤＥＰＴ）システムの一部、例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、カルボキシペプチダーゼＧ２、プリンヌクレオシドホスホリラーゼもしくはシトクロムＰ４５０である。いくつかの実施形態では、酵素は、標的細胞において細胞死経路を誘導するかまたは活性化させることができる（例えばカスパーゼ）。
【０２３８】
いくつかの実施形態では、搭載薬分子は二分ペプチドである。本明細書中で使用する場合、「二分ペプチド」は、非がん性エフェクター細胞上に発現した細胞表面抗原に結合することができる第１ドメインと、標的細胞（例えば、がん細胞、腫瘍細胞、または異なる種類のエフェクター細胞）によって発現された細胞表面抗原に結合することができる第２ドメインとからなる多量体タンパク質を指す。いくつかの実施形態では、二分ポリペプチドの個々のポリペプチドドメインは、抗体またはその抗原結合断片（例えば、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）またはＦ（ａｂ））、サソリポリペプチド、ダイアボディ、フレキシボディ、ＤＯＣＫ−ＡＮＤ−ＬＯＣＫ（商標）抗体、またはモノクローナル抗イディオタイプ抗体（ｍＡｂ２）を含み得る。いくつかの実施形態では、二分ポリペプチドの構造は、二重可変ドメイン抗体（ＤＶＤ−Ｉｇ（商標））、Ｔａｎｄａｂ（登録商標）、二重特異性Ｔ細胞係合子（ＢｉＴＥ（商標））、ＤｕｏＢｏｄｙ（登録商標）または二重親和性再指向性（ＤＡＲＴ）ポリペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、二分ポリペプチドはＢｉＴＥであり、表６及び／または表７に示す抗原に特異的に結合するドメインを含む。例示的なＢｉＴＥを以下の表５に示す。
【表５−１】
2020530778.tif 000005
【表５−２】
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【０２３９】
いくつかの実施形態では、エフェクター細胞上に発現する細胞表面抗原は、以下の表６から選択される。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞上またはエフェクター細胞上に発現する細胞表面抗原は、以下の表７から選択される。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞上に発現する細胞表面抗原は、腫瘍抗原である。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、ＣＤ１９、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡ、ＰＳＭＡ、ＣＤ３３、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＥｐｈＡ２、ＭＣＳＰ、ＡＤＡＭ１７、ＰＳＣＡ、１７−Ａ１、ＮＫＧＤ２リガンド、ＣＳＦ１Ｒ、ＦＡＰ、ＧＤ２、ＤＬＬ３またはニューロピリンから選択される。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、表７に列挙されるものから選択される。
【表６】
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【表７−１】
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【表７−２】
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【０２４０】
ＩＩＩ．自己複製性ポリヌクレオチドを含む組換え核酸分子を製造する方法
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換え核酸分子は、１つ以上のベクターを使用して試験管内で製造される。「ベクター」という用語は、別の核酸分子を移動させるかまたは輸送することができる核酸分子を指して本明細書中で使用される。大抵は、移動させる核酸をベクター核酸分子の中に挿入する。ベクターは、細胞における自律複製を指示する配列を含み得、及び／または宿主細胞ＤＮＡ中への組込みを可能にするのに十分な配列を含み得る。
【０２４１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換え核酸分子は、本明細書に記載の自己複製性ポリヌクレオチドをプラスミド主鎖の中に挿入することによって製造される。
【０２４２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換え核酸分子は、１つ以上のウイルスベクターを使用して製造される。時としてウイルスベクターのことを「組換えウイルス」または「ウイルス」と呼ぶことがある。いくつかの実施形態では、二ベクターシステムを使用する。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の自己複製性ポリヌクレオチドをＡＡＶ由来ＩＴＲで挟む。そうした上で、ＩＴＲに挟まれたポリヌクレオチドを第１発現ベクターの中に挿入し、第２発現ベクターの中には、ＩＴＲによって媒介される複製に必要とされるＡＡＶタンパク質（例えばＲｅｐ７８及びＲｅｐ５２）をコードするポリヌクレオチドを挿入する。そのような実施形態では、第１及び第２ベクターを（トランスフェクション、形質導入、電気穿孔などの手段で）好適な宿主細胞（例えば昆虫細胞株）に細胞内送達して、ＩＴＲに挟まれたポリヌクレオチドが宿主細胞のゲノムの中に安定的に組み込まれた細胞を生成する。いくつかの実施形態では、第１及び第２ベクターはヘルペスウイルス発現ベクターである。いくつかの実施形態では、第１及び第２ベクターはバキュロウイルス発現ベクターである。そのような発現システムは、例えば、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ，８：８，２０１３に記載されている。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＩＴＲに挟まれた自己複製性ポリヌクレオチドを、ＩＴＲの非存在下で生み出される量よりも多い量で産生する。いくつかの実施形態では、ＩＴＲに挟まれた導入遺伝子をトランスフェクトした宿主細胞から得られるＩＴＲに挟まれたウイルスゲノムＤＮＡは、ＩＴＲを含有せずに同様に（例えば組換えバキュロウイルス感染によって）トランスフェクトされた導入遺伝子に比べて４〜６０倍多いＤＮＡを生み出し得る。（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２０１３を参照のこと）。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、単一ベクター発現システムを使用して試験管内で製造される。例えば、いくつかの実施形態では、ＡＡＶ  ＩＴＲに挟まれた本明細書に記載の自己複製性ポリヌクレオチドを含む発現カセットを組換えＨＳＶゲノム主鎖のＵＬ３遺伝子とＵＬ４遺伝子との間（例えば遺伝子間遺伝子座）またはＩＣＰ４遺伝子座に挿入する（例えば図４Ｂ及び図５Ｂを参照のこと）。ＩＴＲによって媒介される複製に必要とされるＡＡＶタンパク質（例えばＲｅｐ７８及びＲｅｐ５２）をコードするポリヌクレオチドを含む第２発現カセットは組換えＨＳＶゲノム主鎖のＩＣＰ０またはＩＣＰ４遺伝子座に挿入する。Ｒｅｐタンパク質の発現は、ＩＴＲに挟まれたポリヌクレオチドが単一ベクターから効率的に複製されることを可能にする。いくつかの実施形態では、Ｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、調節性または誘導性プロモーターに機能可能に繋げられている。
【０２４４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換え核酸分子は、ＩＴＲに挟まれた自己複製性ポリヌクレオチドを含む発現カセットと、ＩＴＲによって媒介される複製に必要なＡＡＶタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットとを含むＨＳＶベクターを好適な宿主細胞の細胞内に（例えば、トランスフェクション、形質導入、電気穿孔などの手段で）送達することによって製造される。好適な宿主細胞としては、昆虫及び哺乳動物細胞株が挙げられる。ＨＳＶベクターを含む宿主細胞は、挿入された発現カセットの発現及び組換えＤＮＡ分子の産生を可能にする適切な時間量にわたって培養される。その後、組換えＤＮＡ分子を宿主細胞ＤＮＡから単離し、治療的使用のために製剤化する（例えば、粒子内に封入する）。
【０２４５】
いくつかの実施形態では、上記ＡＡＶ−ＩＴＲシステムによって製造される組換えＤＮＡ分子は、各末端が共有結合で繋がっている２本の一本鎖ＤＮＡ分子の産生をもたらす。例えば、第１ＤＮＡ分子の５’ＩＴＲは第２ＤＮＡ分子の３’ＩＴＲに共有結合で繋げられており、第１ＤＮＡ分子の３’ＩＴＲは第２ＤＮＡ分子の５’ＩＴＲに共有結合で繋げられている。そのような実施形態では、共有結合で繋げられた、ＩＴＲに挟まれたポリヌクレオチドは、本明細書中でＮａｎｏＶ分子と呼称される末端閉鎖型線形二本鎖腫瘍溶解性ウイルス核酸分子を形成している。いくつかの実施形態では、各一本鎖ＤＮＡ分子は、ＩＴＲに挟まれたポリヌクレオチドを１つ含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＮａｎｏＶ分子は２つのｓｓＤＮＡ分子を含むものであり、ここで、１つのｓｓＤＮＡ分子は下記構造：５’−ＩＴＲ−［自己複製性ポリヌクレオチドのセンス配列］−ＩＴＲ−３’を含んでおり、１つのｓｓＤＮＡ分子は下記構造：３’−ＩＴＲ−［自己複製性ポリヌクレオチドのアンチセンス配列］−ＩＴＲ−３’を含んでいる。いくつかの実施形態では、各一本鎖ＤＮＡ分子は、ＩＴＲに挟まれたポリヌクレオチドを２つ以上含む（つまり、ＩＴＲに挟まれたポリヌクレオチドのコンカテマー）。ＩＴＲに挟まれたポリヌクレオチドのコンカテマーは様々な配向を有し得る。例えば、いくつかの実施形態では、コンカテマーは頭−頭配向または尾−尾配向で形成される。
【０２４６】
ＩＶ．自己複製性ポリヌクレオチドを含む粒子
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは「粒子」の中に封入されている。本明細書中で使用する場合、粒子は、非組織由来構成物、例えば、リポソーム、リポプレックス、ナノ粒子、ナノカプセル、マイクロ粒子、マイクロスフェア、脂質粒子、エクソソーム、小胞などを指す。特定の実施形態では、粒子は、非タンパク質性及び非免疫原性である。そのような実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドのカプセル封入は、全身性の抗ウイルス免疫応答を誘導することなくウイルス性搭載薬の送達を可能にし、中和抗ウイルス抗体の作用を軽減する。さらに、本明細書に記載のポリヌクレオチドのカプセル封入は、ポリヌクレオチドを分解から防護し、標的宿主細胞内へのポリヌクレオチドの導入を容易にする。
【０２４７】
いくつかの実施形態では、粒子は対象の中で生分解性である。そのような実施形態では、対象における粒子の蓄積を伴わずして多回用量の粒子を対象に投与することができる。好適な粒子の例としては、ポリスチレン粒子、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）ＰＬＧＡ粒子、ポリペプチド系カチオン性ポリマー粒子、シクロデキストリン粒子、キトサン粒子、脂質系粒子、ポリ（β−アミノエステル）粒子、低分子量ポリエチレンイミン粒子、ポリホスホエステル粒子、ジスルフィド架橋ポリマー粒子、ポリアミドアミン粒子、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）粒子、及びＰＬＵＲＩＯＮＩＣＳ安定化ポリプロピレンスルフィド粒子が挙げられる。
【０２４８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは無機粒子の中に封入されている。いくつかの実施形態では、無機粒子は、金ナノ粒子（ＧＮＰ）、金ナノロッド（ＧＮＲ）、磁気ナノ粒子（ＭＮＰ）、磁気ナノチューブ（ＭＮＴ）、カーボンナノホーン（ＣＮＨ）、カーボンフラーレン、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）、リン酸カルシウムナノ粒子（ＣＰＮＰ）、メソポーラスシリカナノ粒子（ＭＳＮ）、シリカナノチューブ（ＳＮＴ）、または星状中空シリカナノ粒子（ＳＨＮＰ）である。
【０２４９】
Ａ．エクソソーム
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドはエクソソームの中に封入されている。エクソソームは、多胞体と親細胞（例えば、本明細書中でドナー細胞とも呼称される、エクソソームを放出する細胞）の形質膜との融合の後に細胞外環境へと放出される、細胞内に起源を有する小さな膜小胞である。エクソソームの表面は、親細胞の細胞膜に由来する脂質二重層を含み、親細胞表面に発現した膜タンパク質をさらに含むことがある。いくつかの実施形態では、エクソソームはさらに、親細胞からのサイトゾルを含有することがある。エクソソームは、上皮細胞、Ｂ及びＴリンパ細胞、マスト細胞（ＭＣ）ならびに樹状細胞（ＤＣ）を含めた多様な細胞種によって産生され、血漿、尿、気管支肺胞洗浄液、腸管上皮細胞及び腫瘍組織の中に確認されている。エクソソームの組成はその由来となる親細胞種に依存するため、「エクソソーム特有の」タンパク質は存在しない。しかしながら、多くのエクソソームは、親細胞においてエクソソームの起源となった細胞内小胞に関連するタンパク質（例えば、エンドソーム及びリソソームに関連する及び／またはそれらによって発現されるタンパク質）を含む。例えば、エクソソームは、抗原提示分子、例えば主要組織適合性複合体Ｉ及びＩＩ（ＭＨＣ−Ｉ及びＭＨＣ−ＩＩ）、テトラスパニン（例えばＣＤ６３）、いくつかの熱ショックタンパク質、細胞骨格構成要素、例えばアクチン及びチューブリン、細胞内膜融合、細胞−細胞相互作用（例えばＣＤ５４）に関与するタンパク質、シグナル伝達タンパク質、ならびにサイトゾル酵素に富んでいることがある。
【０２５０】
エクソソームは、エクソソーム膜と標的細胞の形質膜との融合によって１つの細胞（例えば親細胞）から標的またはレシピエント細胞への細胞タンパク質の移動を媒介し得る。したがって、エクソソームによって封入される材料を変更することは、本明細書に記載のポリヌクレオチドなどの外来薬剤を標的細胞に導入し得る機構を提供する。１つ以上の外来薬剤（例えば本明細書に記載のポリヌクレオチド）を含有すべく改変されたエクソソームのことを本明細書では「改変型エクソソーム」と呼ぶ。いくつかの実施形態では、改変型エクソソームは、外来薬剤（例えば本明細書に記載のポリヌクレオチド）を親細胞内に導入することによって製造される。そのような実施形態では、親細胞から産生される改変型エクソソームの中に外来核酸自体または外来核酸の転写産物が組み込まれるように、エクソソーム産生親細胞の中に外来核酸を導入する。当技術分野で知られている手段、例えば、外来核酸の形質導入、トランスフェクション、形質転換及び／またはマイクロインジェクションによって親細胞に外来核酸を導入することができる。
【０２５１】
いくつかの実施形態では、改変型エクソソームは、本明細書に記載のポリヌクレオチドをエクソソーム内に直接導入することによって製造される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドを完全エクソソームの中に導入する。「完全エクソソーム」は、産生の由来を親細胞とするタンパク質及び／または遺伝物質を含むエクソソームを指す。完全エクソソームを得る方法は当技術分野で既知である（例えば、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１  Ａｐｒ；２９（４）：３４−５、Ｏｈｎｏ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２０１３  Ｊａｎ；２１（１）：１８５−９１、及び欧州特許公報第２０１０６６３号を参照のこと）。
【０２５２】
特定の実施形態では、外来薬剤（例えば本明細書に記載のポリヌクレオチド）を空エクソソームの中に導入する。「空エクソソーム」は、親細胞に由来するタンパク質及び／または遺伝物質（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）を欠くエクソソームを指す。空エクソソーム（例えば、親細胞由来の遺伝物質を欠くもの）を製造する方法は、ＵＶ曝露、エクソソーム内への核酸の装填を媒介する内因性タンパク質の突然変異／欠失、ならびに空いた穴から内因性遺伝物質がエクソソームの外へ抜け出るような穴をエクソソーム膜に空ける電気穿孔及び化学処理を含めて当技術分野で既知である。いくつかの実施形態では、空エクソソームは、ｐＨが約９〜約１４である水溶液による処理によってエクソソームを開いてエクソソーム膜を得ること、小胞内成分（例えば小胞内タンパク質及び／または核酸）を除去すること、及びエクソソーム膜の再組立てを行って空エクソソームを形成することによって製造される。いくつかの実施形態では、小胞内成分（例えば小胞内タンパク質及び／または核酸）を超遠心分離または密度勾配超遠心分離によって除去する。いくつかの実施形態では、超音波処理、機械的振動、多孔質膜に通す押出し、電流、またはこれらの技術のうちの１つ以上の組合せによって膜の再組立てを行う。特定の実施形態では、超音波処理によって膜の再組立てを行う。
【０２５３】
いくつかの実施形態では、完全または空エクソソームに外来薬剤（例えば本明細書に記載のポリヌクレオチド）を装填して改変型エクソソームを生成することは、従来の分子生物学技術、例えば、試験管内での形質転換、トランスフェクション及び／またはマイクロインジェクションを用いて成し遂げられ得る。いくつかの実施形態では、電気穿孔によって完全または空エクソソームの中に外来薬剤（例えば本明細書に記載のポリヌクレオチド）を直接導入する。いくつかの実施形態では、リポフェクション（例えばトランスフェクション）によって完全または空エクソソームの中に外来薬剤（例えば本明細書に記載のポリヌクレオチド）を直接導入する。本開示に係るエクソソームの製造に使用するのに適するリポフェクションキットは当技術分野で既知であり、市販されている（例えば、Ｒｏｃｈｅ提供のＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤトランスフェクション試薬、及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ提供のＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２０００）。いくつかの実施形態では、熱ショックを用いる形質転換によって完全または空エクソソームの中に外来薬剤（例えば本明細書に記載のポリヌクレオチド）を直接導入する。そのような実施形態では、親細胞から単離したエクソソームをエクソソーム膜の透過化のために二価カチオン、例えば（ＣａＣｌ２の）Ｃａ２＋の存在下で冷却する。その後、エクソソームに外来核酸とのインキュベート及び短時間の熱ショック処理（例えば、４２℃で３０〜１２０秒間のインキュベート）が行われ得る。特定の実施形態では、外来核酸が環状ＤＮＡプラスミドである場合に、熱ショック法を用いる完全または空エクソソームの形質転換を用いる。特定の実施形態では、空エクソソームへの外来薬剤（例えば本明細書に記載のポリヌクレオチド）の装填は、小胞内成分の除去後に薬剤とエクソソーム膜との混合または共インキュベーションを行うことによって成し遂げられ得る。したがって、エクソソーム膜から再組立てされた改変型エクソソームは小胞内空間内に外来薬剤が組み込まれることになる。エクソソーム内に封入された核酸を製造するためのさらなる方法は当技術分野で既知である（例えば、米国特許第９，８８９，２１０号、第９，６２９，９２９号及び第９，０８５，７７８号；国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１７／１６１０１０号及び第ＷＯ２０１８／０３９１１９号を参照のこと）。
【０２５４】
エクソソームは、細胞株、骨髄由来細胞及び一次患者試料に由来する細胞を含めた幾多の異なる親細胞から得ることができる。親細胞から放出されたエクソソームは、当技術分野で知られている手段によって親細胞培養物の上清から単離され得る。例えば、エクソソームの物理特性を利用してそれらを培地またはその他の材料源から分離することができ、これには、電荷（例えば電気泳動分離）、大きさ（例えば、濾過、分子ふるいなど）、密度（例えば、通常の遠心分離、または勾配遠心分離）及びスベドベリ定数（例えば、外力を伴うかまたは伴わない沈降など）に基づく分離が含まれる。あるいは、またはさらに、単離は、１つ以上の生物学的特性に基づくものであり得、表面マーカーを利用することができる方法（例えば、沈降の場合、固相との可逆的結合、ＦＡＣＳ分離、特異的リガンド結合、非特異的リガンド結合など）を含み得る。エクソソーム表面タンパク質の分析は、エクソソームと会合したＣＤ６３などのタンパク質に対する蛍光標識抗体を使用するフローサイトメトリーによって決定され得る。エクソソームを特性評価するためのさらなるマーカーは国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１７／１６１０１０号に記載されている。さらに他の企図される方法では、ＰＥＧによって誘導される融合及び／または超音波融合を含めた化学的及び／または物理的方法を用いてエクソソームを融合させることもできる。
【０２５５】
いくつかの実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーを利用してエクソソームを単離することができる。いくつかの実施形態では、当技術分野で一般的に知られているように、クロマトグラフィー分離後に（１つ以上のクロマトグラフィー画分の）遠心分離技術によってエクソソームをさらに単離することができる。いくつかの実施形態では、エクソソームの単離は、以前に記載（Ｒａｐｏｓｏ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３，１１６１−１１７２（１９９６））を参照のこと）がなされている分画遠心法、超遠心分離、サイズに基づく膜濾過、濃縮、及び／またはレートゾーナル遠心法を含むがこれらに限定されない方法の組合せを伴い得る。
【０２５６】
いくつかの実施形態では、エクソソーム膜は、リン脂質、糖脂質、脂肪酸、スフィンゴ脂質、ホスホグリセリド、ステロール、コレステロール及びホスファチジルセリンのうちの１つ以上を含む。加えて、膜は１つ以上のポリペプチド及び１つ以上の多糖、例えばグリカンを含むことがある。例示的なエクソソーム膜組成、及び１つ以上の膜成分の相対量を変化させる方法は国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１８／０３９１１９号に記載されている。
【０２５７】
好ましくは、本明細書に記載の粒子は、溶解性を増大させ、生体内での凝集によって引き起こされる可能性がある合併症を回避し、ピノサイトーシスを容易にするために、ナノスケールの大きさを有する。いくつかの実施形態では、粒子の平均直径は約１０００ｎｍ未満である。いくつかの実施形態では、粒子の平均直径は約５００ｎｍ未満である。いくつかの実施形態では、粒子の平均直径は約３０〜約１００ｎｍ、約５０〜約１００ｎｍ、または約７５〜約１００ｎｍである。いくつかの実施形態では、粒子の平均直径は約３０〜約７５ｎｍ、または約３０〜約５０ｎｍである。いくつかの実施形態では、粒子の平均直径は約１００〜約５００ｎｍである。いくつかの実施形態では、粒子の平均直径は約２００〜約４００ｎｍである。いくつかの実施形態では、粒子の平均粒径は約３５０ｎｍである。
【０２５８】
いくつかの実施形態では、粒子はエクソソームであり、直径が約３０〜約１００ｎｍ、約３０〜約２００ｎｍ、または約３０〜約５００ｎｍである。いくつかの実施形態では、粒子はエクソソームであり、直径が約１０〜約１００ｎｍ、約２０〜約１００ｎｍ、約３０〜約１００ｎｍ、約４０〜約１００ｎｍ、約５０〜約１００ｎｍ、約６０〜約１００ｎｍ、約７０〜約１００ｎｍ、約８０〜約１００ｎｍ、約９０〜約１００ｎｍ、約１００〜約２００ｎｍ、約１００〜約１５０ｎｍ、約１５０〜約２００ｎｍ、約１００〜約２５０ｎｍ、約２５０〜約５００ｎｍ、または約１０〜約１０００ｎｍである。いくつかの実施形態では、粒子はエクソソームであり、直径が約２０ｎｍ〜３００ｎｍ、約４０ｎｍ〜２００ｎｍ、約２０ｎｍ〜２５０ｎｍ、約３０ｎｍ〜１５０ｎｍ、または約３０ｎｍ〜１００ｎｍである。
【０２５９】
Ｂ．脂質ナノ粒子
特定の実施形態では、本明細書に記載の組換えＤＮＡ分子は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の中に封入されている。特定の実施形態では、ＬＮＰは、１つ以上の脂質、例えば、トリグリセリド（例えばトリステアリン）、ジグリセリド（例えばベヘン酸グリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｂａｈｅｎａｔｅ））、モノグリセリド（例えば、モノステアリン酸グリセロール）、脂肪酸（例えばステアリン酸）、ステロイド（例えばコレステロール）及びワックス（例えばパルミチン酸セチル）を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰはカチオン性脂質及び１つ以上のヘルパー脂質を含む。
【０２６０】
カチオン性脂質は、選択されたｐＨ、例えば生理的ｐＨで正味の正電荷を有するいくつかの脂質種のいずれかを指す。そのような脂質としては、限定されないが、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、ジオクタデシルジメチルアンモニウム（ＤＯＤＭＡ）、ジステアリルジメチルアンモニウム（ＤＳＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、３−（Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル）コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、及びＮ−（１，２−ジミリストイルオキシプロパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）が挙げられる。例えば、生理的ｐＨ未満で正電荷を有するカチオン性脂質としては、限定されないが、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡ、及びＤＭＤＭＡが挙げられる。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、Ｃ１８アルキル鎖、頭部基とアルキル鎖との間のエーテル結合、及び０〜３個の二重結合を含む。そのような脂質としては、例えば、ＤＳＤＭＡ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｅｎＤＭＡ、及びＤＯＤＭＡが挙げられる。カチオン性脂質は、エーテル結合、及びｐＨ滴定可能な頭部基を含み得る。そのような脂質としては、例えば、ＤＯＤＭＡが挙げられる。さらなるカチオン性脂質は、参照により本明細書に援用される米国特許第７，７４５，６５１号、第５，２０８，０３６号、第５，２６４，６１８号、第５，２７９，８３３号、第５，２８３，１８５号、第５，７５３，６１３号、第５，７８５，９９２号に記載されている。
【０２６１】
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、プロトン化可能な第三級アミン頭部基を含む。そのような脂質のことを本明細書ではイオン化可能脂質と呼ぶ。イオン化可能脂質は、イオン化可能アミン頭部基を含み典型的に約７未満のｐＫａを含む脂質種を指す。したがって、酸性ｐＨを有する環境においてイオン化可能アミン頭部基は、負に帯電した分子（例えば核酸、例えば本明細書に記載の組換えポリヌクレオチド）と優先的にイオン化可能脂質が相互作用するようにプロトン化され、かくしてナノ粒子の組立て及びカプセル封入を容易にする。したがって、いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、脂質ナノ粒子内への核酸の装填を増加させることができる。ｐＨが約７より高い環境（例えば、約７．４の生理的ｐＨ）では、イオン化可能脂質は中性電荷を含む。イオン化可能脂質を含む粒子がエンドソームの低ｐＨ（例えばｐＨ＜７）環境中に取り込まれると、イオン化可能脂質は再びプロトン化され、アニオン性エンドソーム膜と会合し、粒子の中に封入された内容物の放出が促進される。
【０２６２】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは１つ以上の非カチオン性ヘルパー脂質を含む。例示的なヘルパー脂質としては、（１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）（ＤＬＰＥ）、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤｉＰＰＥ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ＤＯＰＧ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、セラミド、スフィンゴミエリン及びコレステロールが挙げられる。
【０２６３】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾リン脂質及び誘導体化脂質、例えば誘導体化セラミド（ＰＥＧ−ＣＥＲ）、例えばＮ−オクタノイル−スフィンゴシン−１−［スクシニル（メトキシポリエチレングリコール）−２０００］（Ｃ８  ＰＥＧ−２０００セラミド）を、好ましくは本明細書において開示される化合物及び脂質の１つ以上と組み合わせて、本明細書に記載のリポソーム性医薬組成物に使用する及び含ませることも、企図される。
【０２６４】
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子はさらに、１つ以上のＣ６−Ｃ２０アルキルを含む脂質と共有結合した５ｋＤａ以下の長さのポリ（エチレン）グリコール鎖を含むＰＥＧ修飾脂質を１つ以上含み得る。いくつかの実施形態では、ＬＮＰはさらに、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−ポリ（エチレングリコール）（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）、または１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［アミノ（ポリエチレングリコール）］（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−アミン）を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、脂質ナノ粒子中の総脂質含有量の約０．１％〜約１％を構成する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は脂質ナノ粒子中の総脂質含有量の約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、または約１．０％を構成する。
【０２６５】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰはカチオン性脂質及び１つ以上のヘルパー脂質を含み、カチオン性脂質はＤＯＴＡＰである。いくつかの実施形態では、ＬＮＰはカチオン性脂質及び１つ以上のヘルパー脂質を含み、１つ以上のヘルパー脂質はコレステロールを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰはカチオン性脂質及び１つ以上のヘルパー脂質を含み、１つ以上のヘルパー脂質はＤＬＰＥを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰはカチオン性脂質及び１つ以上のヘルパー脂質を含み、１つ以上のヘルパー脂質はＤＯＰＥを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰはカチオン性脂質及び少なくとも２つのヘルパー脂質を含み、カチオン性脂質はＤＯＴＡＰであり、少なくとも２つのヘルパー脂質はコレステロール及びＤＬＰＥを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのヘルパー脂質はコレステロール及びＤＯＰＥを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰはカチオン性脂質及び少なくとも３つのヘルパー脂質を含み、カチオン性脂質はＤＯＴＡＰであり、少なくとも３つのヘルパー脂質はコレステロール、ＤＬＰＥ及びＤＳＰＥを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも３つのヘルパー脂質はコレステロール、ＤＯＰＥ及びＤＳＰＥを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰはＤＯＴＡＰ、コレステロール及びＤＬＰＥを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰはＤＯＴＡＰ、コレステロール及びＤＯＰＥを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰはＤＯＴＡＰ、コレステロール、ＤＬＰＥ及びＤＳＰＥを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰはＤＯＴＡＰ、コレステロール、ＤＬＰＥ及びＤＳＰＥ−ＰＥＧを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰはＤＯＴＡＰ、コレステロール、ＤＯＰＥ及びＤＳＰＥを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰはＤＯＴＡＰ、コレステロール、ＤＯＰＥ及びＤＳＰＥ−ＰＥＧを含む。
【０２６６】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰはＤＯＴＡＰ、コレステロール（Ｃｈｏｌ）及びＤＬＰＥを含み、ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ：ＤＬＰＥの比は（総脂質含有量に占める百分率として）約５０：３５：１５である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰはＤＯＴＡＰ、コレステロール（Ｃｈｏｌ）及びＤＬＰＥを含み、ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ：ＤＯＰＥの比は（総脂質含有量に占める百分率として）約５０：３５：１５である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰはＤＯＴＡＰ、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、ＤＬＰＥ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧを含み、ＤＯＴＰ：Ｃｈｏｌ：ＤＬＰＥの比は（総脂質含有量に占める百分率として）約５０：３５：１５であり、粒子は約０．２％のＤＳＰＥ−ＰＥＧを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、イオン化可能脂質、例えば、７．ＳＳ切断可能なｐＨ応答性脂質様物質（例えばＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳシリーズ）を含む。カチオン性の、またはイオン化可能な、本開示の製剤及び方法に適する脂質のさらなる例は、例えば、ＷＯ２０１８０８９５４０Ａ１、ＷＯ２０１７０４９２４５Ａ２、ＵＳ２０１５０１７４２６１、ＵＳ２０１４３０８３０４、ＵＳ２０１５３７６１１５、ＷＯ２０１／１９９９５２、及びＷＯ２０１６／１７６３３０に記載されている。
【０２６７】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、標的細胞によるナノ粒子の取込みを調節するまたは容易にするために、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）で被覆されている（図２）。ＧＡＧは、ヘパリン／ヘパリン硫酸（ｈｅｐａｒｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）、コンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸、ケラチン硫酸（ｋｅｒａｔｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）、またはヒアルロン酸（ＨＡ）であり得る。特定の実施形態では、ナノ粒子の表面はＨＡで被覆されており、腫瘍細胞による取込みのために粒子を指向する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子はアルギニン−グリシン−アスパラギン酸トリペプチド（ＲＧＤペプチド）で被覆されている（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，２４，２０１２，３７４７−３７５６、及びＢｅｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，３２（１８），２０１１，４２０５−４２１０を参照のこと）。
【０２６８】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰの平均粒径は約１５０ｎｍ〜約５００ｎｍである。例えば、いくつかの実施形態では、ＬＮＰの平均粒径は約２００ｎｍ〜約５００ｎｍ、約３００ｎｍ〜約５００ｎｍ、約３５０ｎｍ〜約５００ｎｍ、約４００ｎｍ〜約５００ｎｍ、約４２５ｎｍ〜約５００ｎｍ、約４５０ｎｍ〜約５００ｎｍ、または約４７５ｎｍ〜約５００ｎｍである。
【０２６９】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰの平均ゼータ電位は約−２０ｍＶ未満である。例えば、いくつかの実施形態では、ＬＮＰの平均ゼータ電位は、約−３０ｍＶ未満、約３５ｍＶ未満、または約−４０ｍＶ未満である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰの平均ゼータ電位は、約−５０ｍＶ〜約−２０ｍＶ、約−４０ｍＶ〜約−２０ｍＶ、または約−３０ｍＶ〜約−２０ｍＶである。いくつかの実施形態では、ＬＮＰの平均ゼータ電位は、約−３０ｍＶ、約−３１ｍＶ、約−３２ｍＶ、約−３３ｍＶ、約−３４ｍＶ、約−３５ｍＶ、約−３６ｍＶ、約−３７ｍＶ、約−３８ｍＶ、約−３９ｍＶ、または約−４０ｍＶである。
【０２７０】
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、本明細書に記載の組換え核酸分子を含み、脂質（Ｌ）対核酸（Ｎ）の比を約３：１（Ｌ：Ｎ）で含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、本明細書に記載の組換え核酸分子を含み、Ｌ：Ｎ比を約４：１、約５：１、約６：１または約７：１で含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、本明細書に記載の組換え核酸分子を含み、Ｌ：Ｎ比を約４．５：１、約４．６：１、約４．７：１、約４．８：１、約４．９：１、約５：１、約５．１：１、約５．２：１、約５．３：１、約５．４：１、または約５．５：１で含む。
【０２７１】
ＶＩ．治療用組成物及び使用方法
本開示の一態様は、本明細書に記載の組換え核酸分子を含む治療用組成物、または本明細書に記載の組換え核酸分子を含む粒子、及びがんの治療方法に関する。本明細書に記載の組成物は、所望の送達経路に適した任意の様式で製剤化され得る。典型的には、製剤は、誘導体またはプロドラッグ、溶媒和物、立体異性体、ラセミ体または互変異性体を含めたあらゆる生理学的に許容される構成物を、薬学的に許容される任意の担体、希釈剤及び／または賦形剤と共に含んでいる。
【０２７２】
本明細書中で使用する場合、「薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤」には、ヒトまたは飼育動物における使用が許容されることが米国食品医薬品局によって承認されている任意の佐剤、担体、賦形剤、滑剤、甘味剤、希釈剤、保存剤、色素／着色剤、香味増強剤、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、安定化剤、等張化剤、溶媒、界面活性剤または乳化剤が含まれるが、これらに限定されない。例示的な薬学的に許容される担体としては、限定されないが、糖、例えば、ラクトース、グルコース及びスクロース；澱粉、例えばトウモロコシ澱粉及びジャガイモ澱粉；セルロース及びその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及び酢酸セルロース；トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；ココアバター、蝋、動物性及び植物性脂肪、パラフィン、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、酸化亜鉛；油、例えば、ピーナッツ油、綿実油、紅花油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油及び大豆油；グリコール、例えばプロピレングリコール；ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコール；エステル、例えばオレイン酸エチル及びラウリン酸エチル；寒天；緩衝剤、例えば水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウム；アルギン酸；発熱原不含水；等張生理食塩水；リンガー液；エチルアルコール；リン酸緩衝液；ならびに医薬製剤に採用される他の適合する任意の物質が挙げられる。
【０２７３】
「薬学的に許容される塩」には酸付加塩と塩基付加塩とが両方とも含まれる。薬学的に許容される塩には（タンパク質の遊離アミノ基を使用して形成される）酸付加塩が含まれるが、これは、無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸など、及び有機酸、例えば、限定されないが、酢酸、２，２−ジクロロ酢酸、アジピン酸、アルギン酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、４−アセトアミド安息香酸、カンファー酸、カンファー−１０−スルホン酸、カプリン酸、カプロン酸、カプリル酸、炭酸、ケイ皮酸、クエン酸、サイクラミン酸、ドデシル硫酸、エタン−１，２−ジスルホン酸、エタンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ギ酸、フマル酸、ガラクタル酸、ゲンチジン酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルクロン酸、グルタミン酸、グルタル酸、２−オキソ−グルタル酸、グリセロリン酸、グリコール酸、馬尿酸、イソ酪酸、乳酸、ラクトビオン酸、ラウリン酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、粘液酸、ナフタレン−１，５−ジスルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、ニコチン酸、オレイン酸、オロト酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸、プロピオン酸、ピログルタミン酸、ピルビン酸、サリチル酸、４−アミノサリチル酸、セバシン酸、ステアリン酸、コハク酸、酒石酸、チオシアニン酸、ｐトルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、ウンデシレン酸などによって形成される。また、遊離カルボキシル基を使用して形成される塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウム塩など、無機塩基から誘導され得る。有機塩基から誘導される塩としては、限定されないが、第一級、第二級及び第三級アミン、置換型アミン、例えば、天然に存在する置換型アミン、環状アミン、及び塩基性イオン交換樹脂、例えば、アンモニア、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、ジエタノールアミン、エタノールアミン、デアノール、２−ジメチルアミノエタノール、２−ジエチルアミノエタノール、ジシクロヘキシルアミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、ベネタミン、ベンザチン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルカミン、テオブロミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、Ｎ−エチルピペリジン、ポリアミン樹脂などの塩が挙げられる。特に好ましい有機塩基は、イソプロピルアミン、ジエチルアミン、エタノールアミン、トリメチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、コリン及びカフェインである。
【０２７４】
本開示は、がん細胞または標的細胞を死滅させる方法であって、組成物をがん細胞に細胞内送達するのに十分な条件の下で、細胞を本明細書に記載のポリヌクレオチドもしくは粒子、またはその組成物に曝露することを含む、当該方法を提供する。本明細書中で使用する場合、「がん細胞」または「標的細胞」は、本明細書に記載のポリヌクレオチドもしくは粒子または本明細書に記載のその組成物による治療または投与のために選択された哺乳動物細胞を指す。本明細書中で使用する場合、「がん細胞を死滅させること」は、具体的には、アポトーシスまたは壊死によるがん細胞の死滅を指す。がん細胞の死滅は、腫瘍サイズ測定、細胞計数ならびに、アネキシンＶ及びヨウ化プロピジウムの組込みなどの細胞死マーカーを検出するためのフローサイトメトリーを含むがこれらに限定されない、当技術分野で知られている方法によって決定され得る。
【０２７５】
本開示はさらに、がんの治療または防止を、それを必要とする対象において行う方法であって、有効量の本明細書に記載の治療用組成物を対象に投与するものである、当該方法を提供する。投与経路は、治療する疾患の場所及び性質によって当然様々であろうが、例えば、皮内、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、皮下（ｓｕｂｄｅｒｍａｌ）、非経口、経鼻、静脈内、筋肉内、鼻腔内、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、経皮（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、気管内、腹腔内、腫瘍内、灌流、洗浄、直接注射及び経口投与が含まれ得る。本明細書に記載のカプセル封入ポリヌクレオチド組成物は、複数の臓器及び／または細胞種に組成物を送達するために全身投与が必要となり得る転移がんの治療に特に有用である。したがって、特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物は全身投与される。
【０２７６】
本明細書中で交換可能に使用される「有効量」または「有効用量」は、疾患または症状の症候の改善または矯正をもたらす、本明細書に記載の組成物の量及びまたは用量を指す。改善は、疾患もしくは症状、または疾患もしくは症状の症候の任意の改善または矯正である。改善は、観察可能もしくは測定可能な改善であり、または、対象の全体的幸福感の改善であり得る。したがって、当業者であれば、治療は疾患症状を改善し得るが疾患の完全な治癒でない場合があるということを理解する。対象における改善としては、腫瘍負荷の減少、腫瘍細胞増殖の減少、腫瘍細胞死の増加、免疫経路の活性化、腫瘍が進行するまでの時間の増加、がん疼痛の減少、生存率の上昇または生活の質の向上が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【０２７７】
いくつかの実施形態では、有効用量の投与は、単回用量の本明細書に記載の組成物の投与によって成し遂げられ得る。本明細書中で使用する場合、「用量」は、一度に送達される組成物の量を指す。いくつかの実施形態では、用量は、所与の体積の中の粒子の数（例えば、粒子／ｍＬ）で測定されてもよい。いくつかの実施形態では、用量は、各粒子の中に存在する本明細書に記載のポリヌクレオチドのゲノムコピー数（例えば、各粒子がポリヌクレオチドの少なくとも１つのゲノムコピーを含む場合の粒子数／ｍＬ）によってより厳密に表されてもよい。いくつかの実施形態では、有効用量の送達には、多回用量の本明細書に記載の組成物の投与が必要となり得る。したがって、有効用量の投与には、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０回またはそれより多い回数の用量の本明細書に記載の組成物を投与することが必要となり得る。
【０２７８】
多回用量の本明細書に記載の組成物が投与される実施形態では、各用量を同じ施与者によって及び／または同じ地理的位置で投与する必要はない。さらに、投薬は所定のスケジュールに従って施され得る。例えば、所定の投薬スケジュールは、本明細書に記載の組成物の用量を１日１回、２日に１回、週に１回、２週間に１回、１ヶ月に１回、１ヶ月に２回、１年に１回、半年に１回などで投与することを含み得る。所定の投薬スケジュールを所与の患者のために必要に応じて調節してもよい（例えば、投与する組成物の量を加減してもよく、及び／または用量の頻度を増減してもよく、及び／または投与する用量の総数を増減してもよい）。
【０２７９】
本明細書中で使用する場合、「防止」または「予防」は、疾患の症候の完全な防止、疾患の症候の発症の遅延、または後に進展する疾患症候の重症度の低減を意味し得る。
【０２８０】
「対象」または「患者」という用語は、本明細書中で使用される場合、本明細書に記載の方法に従って本明細書に記載の組成物を投与される任意の哺乳動物対象を意味するものとして解釈される。具体的な実施形態では、本開示の方法は、ヒト対象を治療するために採用される。また、非ヒト霊長類（例えば、サル、ヒヒ及びチンパンジー）、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、ブタ、ウサギ、ヤギ、シカ、ヒツジ、フェレット、アレチネズミ、モルモット、ハムスター、コウモリ、トリ（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ及びアヒル）、魚類及び爬虫類を治療するために本開示の方法を採用してもよい。
【０２８１】
「がん」は、本明細書中で使用される場合、制御されない細胞成長を典型的な特徴とする、哺乳動物の生理学的状態を指す、または表す。がんの例としては、限定されないが、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫（脂肪肉腫、骨原性肉腫、脈管肉腫、内皮肉腫、平滑筋肉腫、脊索腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、横紋筋肉腫、線維肉腫、粘液肉腫及び軟骨肉腫を含む）、神経内分泌腫瘍、中皮腫、滑液膜腫、シュワン細胞腫、髄膜腫、腺腫、メラノーマ、及び白血病またはリンパ系悪性腫瘍が挙げられる。そのようながんのより詳しい例としては、扁平上皮癌（例えば表皮扁平上皮癌）、肺癌、例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌及び肺扁平上皮癌腫、小細胞肺癌腫、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌、例えば消化器癌、膵臓癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、直腸癌、大腸癌、子宮内膜または子宮癌腫、唾液腺癌腫、腎臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝細胞癌腫、肛門癌腫、陰茎癌腫、精巣癌、食道癌、胆道の腫瘍、ユーイング腫瘍、基底細胞癌腫、腺癌、汗腺癌腫、皮脂腺癌腫、乳頭癌腫、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌腫、気管支原性癌腫、腎細胞癌腫、肝細胞腫、胆管癌腫、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌種、ウィルムス腫瘍、精巣腫瘍、肺癌腫、膀胱癌腫、上皮癌腫、神経膠腫、星細胞腫、骨芽種、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽腫、網膜芽細胞腫、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、骨髄異形成病、重鎖病、神経内分泌腫瘍、シュワン細胞腫及び他の癌腫、ならびに頭頸部癌が挙げられる。さらに、良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、髄膜腫、シュワン細胞腫、神経線維腫症、ケロイド、筋腫及び子宮筋腫、ならびにその他を含めて良性（すなわち非がん性）過剰増殖性の疾患、障害及び症状もまた、本明細書において開示される開示物を用いて治療され得る。
【０２８２】
Ａ．例示的な自己複製性ポリヌクレオチド
当業者であれば、コードされるウイルスの性質が様々であろうこと、及び治療される疾患兆候によって決まるであろうことを理解するであろう。例えば、いくつかの実施形態では、特定のがんの治療にポリオウイルスが使用され得る。ポリオウイルスゲノムは、単一のポリプロテインをコードする一本鎖プラスセンス極性ＲＮＡ分子を含む。５’非翻訳領域（ＵＴＲ）は２つの機能性ドメインであるクローバーリーフ及び配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を内包し、ウイルスタンパク質ＶＰｇに共有結合で繋げられている。３’ＵＴＲはポリアデニル化されている（例えば図６Ａを参照のこと）。いくつかの実施形態では、ポリオウイルスゲノムは５’及び３’末端においてＡＡＶ由来ＩＴＲと隣接している（例えば図６Ａを参照のこと）。
【０２８３】
いくつかの実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列はウイルス遺伝子、例えば必須ウイルス遺伝子に機能可能に繋げられている。例えば、ポリオウイルスゲノムは、この目的に適したいくつかの遺伝子、例えば、限定されないが、ウイルスＲＮＡゲノムの複数のコピーを作る機能を有するＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、３Ｄｐｏｌ；ウイルスＲＮＡに結合しウイルスのプラス及びマイナス鎖ＲＮＡの合成に必要とされるタンパク質であるウイルスポリペプチドＶＰｇ（３Ｂ）を切断するプロテアーゼ、２Ａｐｒｏ及び３Ｃｐｒｏ／３ＣＤｐｒｏ；ウイルス複製に必要なタンパク質複合体を構成する２ＢＣ、２Ｂ、２Ｃ（ＡＴＰアーゼ）、３ＡＢ、３Ａ、３Ｂタンパク質；ウイルスカプシドのタンパク質でありＶＰ２及びＶＰ４、ＶＰ１及びＶＰ３へとさらに切断される、ＶＰ０を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ転写減衰型ポリオウイルスゲノムは、ポリヌクレオチドの複製及び核内進入に役立つＡＡＶ由来ＩＴＲ配列に挟まれている（例えば図６Ｂを参照のこと）。他の遺伝子を適宜選択してもよい。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的配列は、遺伝子の機能性ポリペプチドをコードする能力を維持しながらｍｉＲＮＡ標的配列の転写をもたらす遺伝子座内の場所にｍｉＲＮＡ標的配列を挿入することによって、ウイルス遺伝子、例えば必須ウイルス遺伝子に機能可能に繋げられている。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的配列はウイルス遺伝子の５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲの中に挿入されている。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的配列は、オープンリーディングフレーム内、例えば、ポリペプチドを翻訳及び翻訳後切断して２つ以上の機能性タンパク質にするのを可能にしてｍｉＲＮＡ標的配列がインフレームとなるような２つのポリペプチドのコード配列の間などに挿入されている。例えば、ｍｉＲＮＡ標的配列は２つの２Ａペプチド配列の間に挿入され得、ｍｉＲＮＡ標的配列の挿入部位の下流（３’側）には、ポリペプチド配列のリーディングフレームを保つために必要に応じて追加のヌクレオチドが加えられ得る。
【０２８４】
いくつかの実施形態では、四量体ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−３４ａ、及びｌｅｔ７標的部位を含有するｍｉＲＮＡ標的配列カセットを１つ以上の必須ポリオウイルス遺伝子の転写減衰のために３’ＵＴＲの中に挿入することによって野生型ポリオウイルスゲノムが改変されている（図８Ａ）。いくつかの実施形態では、このｍｉＲＮＡ転写減衰型ポリオウイルスは、非小細胞肺癌の治療に使用するのに適している（図８Ａ）。いくつかの実施形態では、四量体ｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−３４ａ、及びｌｅｔ７標的部位を含有するｍｉＲＮＡ標的配列カセットを１つ以上の必須ポリオウイルス遺伝子の３’ＵＴＲの中に挿入することによって野生型ＰＶゲノムが改変されている（図８Ｂ）。いくつかの実施形態では、このｍｉＲＮＡ転写減衰型ポリオウイルスは、肝細胞癌腫の治療に使用するのに適している（図８Ｂ）。いくつかの実施形態では、四量体ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４５、及びｌｅｔ７標的部位を含有するｍｉＲＮＡ標的配列カセットを１つ以上の必須ポリオウイルス遺伝子の転写減衰のための３’ＵＴＲの中に挿入することによって野生型ポリオウイルスゲノムが改変されている（図８Ｃ）。いくつかの実施形態では、このｍｉＲＮＡ転写減衰型ポリオウイルスは、前立腺癌の治療に使用するのに適している（図８Ｃ）。
【０２８５】
いくつかの実施形態では、特定のがんの治療にＶＳＶが使用され得る。ＶＳＶゲノムは、５つの主要タンパク質：核タンパク質（Ｎ）、リンタンパク質（Ｐ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、糖タンパク質（Ｇ）及びポリメラーゼ（Ｌ）をコードする一本鎖マイナスセンス極性ＲＮＡ分子を含む。ウイルスがコードする５つのタンパク質１つにつき単シストロン性ｍＲＮＡが１つ存在している。ｍＲＮＡは、キャップ形成、メチル化及びポリアデニル化されている。ＶＳＶは細胞質性マイナスセンスＲＮＡウイルスであるため、ｍＲＮＡ合成及び修飾のための酵素はビリオン内にパッケージングされている（図９Ａ）。いくつかの実施形態では、ＶＳＶゲノムは、ポリヌクレオチドの複製及び核内進入に役立つＡＡＶ由来ＩＴＲ配列に挟まれている（図９Ａ）。
【０２８６】
いくつかの実施形態では、ＶＳＶゲノムの１つ以上の必須ウイルス遺伝子（例えば、Ｎ、Ｐ、Ｍ、ＧまたはＬ遺伝子の１つ以上）の遺伝子座に挿入された１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を含むｍｉＲＮＡ標的配列カセットを挿入することによって野生型ＶＳＶゲノムが改変されている（図９Ｂ）。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的配列は遺伝子の５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲの中に挿入されている。いくつかの実施形態では、四量体ｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−３４ａ、及びｌｅｔ７標的部位を含むｍｉＲＮＡ標的配列カセットを転写減衰のための５つのウイルスコード転写産物のうちの４つ（例えば、Ｎ、Ｐ、Ｍ、ＧまたはＬ遺伝子のうちの４つ）の３’ＵＴＲの中に挿入することによって野生型ＶＳＶゲノムが改変されている（図１１Ａ）。いくつかの実施形態では、このｍｉＲＮＡ転写減衰型ＶＳＶは肝細胞癌腫の治療に使用するのに適している（図１１Ａ）。いくつかの実施形態では、四量体ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４５、及びｌｅｔ７標的部位を含むｍｉＲＮＡ標的配列カセットを転写減衰のための５つのウイルスコード転写産物のうちの４つ（例えば、Ｎ、Ｐ、Ｍ、ＧまたはＬ遺伝子のうちの４つ）の３’ＵＴＲの中に挿入することによって野生型ＶＳＶゲノムが改変されている（図１１Ｂ）。いくつかの実施形態では、このｍｉＲＮＡ転写減衰型ＶＳＶは前立腺癌の治療に使用するのに適している（図１１Ｂ）。いくつかの実施形態では、四量体ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−３４ａ、及びｌｅｔ７標的部位を含むｍｉＲＮＡ標的配列カセットを転写減衰のための５つのウイルスコード転写産物のうちの４つ（例えば、Ｎ、Ｐ、Ｍ、ＧまたはＬ遺伝子のうちの４つ）の３’ＵＴＲの中に挿入することによって野生型ＶＳＶゲノムが改変されている（図１１Ｃ）。いくつかの実施形態では、このｍｉＲＮＡ転写減衰型ＶＳＶは非小細胞肺癌の治療に使用するのに適している（図１１Ｃ）。
【０２８７】
いくつかの実施形態では、特定のがんの治療にアデノウイルスが使用され得る。ＡＡＶゲノムは、２４〜３６個のタンパク質コード遺伝子をコードする二本鎖ＤＮＡ分子を含む。Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３及びＥ４転写単位はウイルス再生サイクルにおいて早くに転写される（図１２Ａ）。これらの転写単位の中で遺伝子にコードされるタンパク質は主にウイルス転写の調節、ウイルスＤＮＡの複製、及び感染に対する宿主応答の抑制に関与する。いくつかの実施形態では、アデノウイルスゲノムは、ポリヌクレオチドの複製及び核内進入に役立つＡＡＶ由来ＩＴＲ配列に挟まれている（図１２Ａ）。
【０２８８】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶゲノムの１つ以上の必須ウイルス遺伝子（例えば、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３またはＥ４の１つ以上）の中に挿入された１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を含むｍｉＲＮＡ標的配列カセットの挿入によって野生型ＡＡＶゲノムが改変されている（図１２Ｂ）。いくつかの実施形態では、四量体ｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−３４ａ、及びｌｅｔ７標的部位を含むｍｉＲＮＡ標的配列カセットを１つ以上の必須遺伝子（例えば、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３またはＥ４の１つ以上）の３’ＵＴＲの中に挿入することによって野生型ＡＡＶゲノムが改変されている（図１３Ａ）。いくつかの実施形態では、このｍｉＲＮＡ転写減衰型アデノウイルスは肝細胞癌腫の治療に使用するのに適している（図１３Ａ）。いくつかの実施形態では、四量体ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４５、及びｌｅｔ７標的部位を含むｍｉＲＮＡ標的配列カセットを１つ以上の必須遺伝子（例えば、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３またはＥ４の１つ以上）の３’ＵＴＲの中に挿入することによって野生型ＡＡＶゲノムが改変されている（図１３Ｂ）。いくつかの実施形態では、このｍｉＲＮＡ転写減衰型アデノウイルスは前立腺癌の治療に使用するのに適している（図１３Ｂ）。いくつかの実施形態では、四量体ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−３４ａ、及びｌｅｔ７標的部位を含むｍｉＲＮＡ標的配列カセットを１つ以上の必須遺伝子（例えば、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３またはＥ４の１つ以上）の３’ＵＴＲの中に挿入することによって野生型ＡＡＶゲノムが改変されている（図１３Ｃ）。いくつかの実施形態では、このｍｉＲＮＡ転写減衰型アデノウイルスは非小細胞肺癌の治療に使用するのに適している（図１３Ｃ）。
【実施例】
【０２８９】
以下の実施例は、本開示の様々な実施形態を例示する目的のために提供されるものであり、本開示を何らかのかたちで制限する意図はない。本発明の実施例は、本明細書に記載の方法と併せて、好ましい実施形態をさしあたって代表するものであり、例示的なものであり、本開示の範囲に対する限定の意図はない。その中での変更、及び特許請求の範囲から明確にされる本開示の趣旨の中に包含される他の用途は、当業者によって想到されるであろう。
【０２９０】
実施例１：複製可能ウイルスゲノムをコードするポリヌクレオチド構築物の操作
本明細書に記載の自己複製性ポリヌクレオチド構築物は、標準的な分子生物学及び遺伝学の技術を用いて操作及び製造される。特定のウイルスをコードする例示的な構築物、及びこれらの構築物を使用した治療のための対応するがんを以下の表１３、表１４及び表１５に記載する。しかしながら、適切なウイルスは、ウイルスの所望の特質及び治療するがんの特質に基づいて選択され得る。同様に、ｍｉＲＮＡ標的配列カセット（ｍｉＲ  ＴＳ）をウイルスゲノム中の１つ以上の場所に挿入して、正常な非がん性細胞においてコードされるウイルスゲノムの複製を制御しながらがん細胞において複製を可能にすることができる。例示的な構築物は本開示の全体を通して記載されている。作製した構築物を以下の表８にまとめる。
【表８】
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【０２９１】
自己複製性ポリヌクレオチドの設計後、構築物を送達のためにプラスミド主鎖中への挿入またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来の末端逆位反復配列（ＩＴＲ）の追加によって操作する。これらの２つの特定タイプの送達機構、すなわち、プラスミドゲノム構築物、及びＩＴＲに挟まれたナノウイルス（ＮａｎｏＶ）構築物を設計するためのプロトコール及び方法を開発したので以下に説明する。
【０２９２】
実施例２：複製可能ウイルスゲノムをコードするポリヌクレオチド構築物を含むプラスミドの設計及び製造
ＳＶＶウイルスＤＮＡはＧｅｎｓｃｒｉｐｔにて合成され、ポリ（Ａ）、５’ハンマーヘッド型リボザイム及び３’デルタ肝炎リボザイムは、ギブソン・アセンブリによるベースベクター中への挿入時に融合ＰＣＲによって加えられた。このベースベクターは長さが２．４ｋｂであり、最小限の複製起点、及び哺乳動物細胞での使用のために最適化されたカナマイシン耐性カセットを含有する（図３１Ａ）。発現カセットは配列ＩＤ：１として開示されている。似たようなベクターをコクサッキーウイルスで構築したが（ＣＶＡ２１）、これを図３１Ｂに示す。ＣＶＡ２１発現カセットは配列番号２として開示されている。
【０２９３】
実施例３：ＩＴＲに挟まれたＮａｎｏＶ構築物の設計及び製造
ＩＴＲに挟まれたＮａｎｏＶ構築物を製造するためには自己複製性ポリヌクレオチド構築物を、テトラサイクリン（Ｔｅｔ）応答性プロモーターの制御下にある、ＡＡＶ由来ＩＴＲに挟まれた発現カセットの中に挿入する。図１７は、模範的なＮａｎｏＶ構築物の模式図を示す。テトラサイクリン応答性プロモーターであるＴＲＥ−ｔｉｇｈｔはｍＣｈｅｒｒｙの発現を促すが、このｍＣｈｅｒｒｙは代用物として使用されており、適切なウイルスゲノム構築物（図１７中、ＯＶで示される）で置き換えられ得る。テトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｔＴＡ）の発現は、図１７中にＵｂＣＰとして示される恒常的プロモーターによって制御される。このＮａｎｏＶ構築物は、種々のＮａｎｏＶカセットの速やかな挿入を可能にするＧａｔｅｗａｙクローニングシステム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を用いてＨＳＶ−１のＵＬ３／４遺伝子間領域に挿入される。培養培地にテトラサイクリンを添加するとＴｅｔがｔＴＡに結合し、ｍＣｈｅｒｒｙ構築物の発現が妨げられる。したがって、培養培地からのＴｅｔの除去は誘導性ｍＣｈｅｒｒｙ発現を可能にする。加えて、第２の恒常的プロモーター（例えばＣＭＶ）の制御下にあるｉＤｉｍｅｒｉｚｅカセット（Ｔａｋａｒａ）をＨＳＶ−１  ＢＡＣ内のＵＬ５０／５１遺伝子間遺伝子座に挿入する。ｉＤｉｍｅｒｉｚｅカセットは、ヘテロ二量体化剤誘導性Ｒｅｐ７８／５２発現を調節する２つのヘテロ二量体化ドメイン（ＤｍｒＡ及びＤｍｒＣ）を含む。Ａ／Ｃヘテロ二量体化剤ＡＰ２１９６７を培養培地に添加することによってｉＤｉｍｅｒｉｚｅカセットが活性化され、その結果、ＩＴＲに挟まれたＮａｎｏＶ構築物の複製を促すものであるＲｅｐ７８／５２発現がもたらされる。
【０２９４】
ｉＤｉｍｅｒｉｚｅカセットによるＲｅｐ７８／５２発現の調節を実証するために、Ｖｅｒｏ細胞にｉＤｉｍｅｒｉｚｅ−Ｒｅｐカセットを０．５ｎｍ、５ｎｍ、５０ｎｍまたは５００ｎｍのＡＰ２１９６７の存在下でトランスフェクトした。Ｒｅｐタンパク質をコードするプラスミド（ｐＣＤＮＡ−Ｒｅｐ）を陽性対照として使用した。トランスフェクションから２４時間後にタンパク質を細胞から抽出し、α−Ｒｅｐまたはα−アクチン抗体を使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウェスタンブロット分析に供した。図１８に示すように、５０ｎＭ以上のヘテロ二量体化剤濃度はｉＤｉｍｅｒｉｚｅカセットからのＲｅｐ７８／５２発現を誘導したが、ヘテロ二量体化剤の添加はｐＣＤＮＡ−Ｒｅｐトランスフェクト細胞におけるＲｅｐ発現レベルに何ら影響を与えなかった。
【０２９５】
ＮａｎｏＶ構築物の産生を実証するために、図１７に示す組換えＨＳＶ−１ベクターにＵ２ＯＳ細胞を感染させた。感染から３日後に感染細胞を採集し、Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ＤＮＡ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＤＮＡを精製した。このシステムによって産生される、予測されるＮａｎｏＶ単量体及び二量体を図１９Ａに示す。ＮａｎｏＶ  ＤＮＡではなくＨＳＶ  ＤＮＡの自由末端を露出させるため及び閉鎖末端を有さないＤＮＡを分解するために、抽出したＤＮＡをＮｈｅＩ及びＥｘｏＩＩＩ消化に供した。その後、消化されたＤＮＡ断片をアガロースゲルで分析してＮａｎｏＶ単量体及び二量体の存在を判定した。図１９Ｂに示すように、単量体及び二量体断片の両方について、予測された大きさのところにバンドが現れている（それぞれ３．７ｋｂ及び７．４ｋｂ）。３．７ｋｂと７．４ｋｂとの両方のバンドからＤＮＡを抽出し、続いて、内在ｍＣｈｅｒｒｙカセットに特異的な内在物を使用するＰＣＲ分析を実施した（図１９Ｃの模式図を参照のこと）。図１９Ｄに示すように、これらのＰＣＲ反応は、３．７及び７．４ｋｂの両バンドから抽出されたＤＮＡから１．９ｋｂのアンプリコンを生成し、このことから、ＩＴＲの内部のポリヌクレオチド配列が複製されたことが実証された。
【０２９６】
ＮａｎｏＶコンカテマーの配向を決定するために、３．７ｋｂ単量体及び７．４ｋｂ二量体の両方から抽出したＤＮＡをＡｆｌＩＩで消化し、非還元性アガロースゲル電気泳動によって分析した。予想されるＡｆｌＩＩの切断部位はＵｂＣプロモーター内にあり、それによって、図２０Ａに示すように単量体では予測される１．２ｋｂ及び２．５ｋｂの大きさを有する切断生成物が生成する。コンカテマーから予測される生成物の大きさは二量体の配向（例えば、図２０Ｂに示すように、頭−頭、尾−尾、または頭−尾）によって様々であろう。図１８Ｂからの３．７ｋｂ断片から抽出されたＤＮＡのＡｆｌＩＩ切断は、予測された１．２ｋｂ及び２．５ｋｂの断片を生成した（図２０Ｃ、バンドの存在を白いバーが示している）。図１９Ｂからの７．４ｋｂ断片から抽出されたＤＮＡのＡｆｌＩＩ切断は、コンカテマーの尾−尾配向を示唆する１．２ｋｂ及び５ｋｂ、ならびにコンカテマーの頭−頭配向を示唆する２．５ｋｂ及び２．４ｋｂの断片の大きさを生じさせた。
【０２９７】
実施例４：プラスミドゲノムから感染性ピコルナウイルスウイルスを生み出すには３’及び５’リボザイムが必要である
哺乳動物Ｐｏｌ  ＩＩプロモーターの制御下にあるＳＶＶコードポリヌクレオチドを含んでいる実施例２で生成したプラスミドから感染性ＳＶＶウイルスを生み出す能力を評価するために、実験を実施した。プラスセンス一本鎖ＲＮＡウイルス、例えばＳＶＶ及びコクサッキーウイルスは、適切な複製のためにウイルス本来の別個の５’及び３’末端を必要とするが、これらは、哺乳動物５’及び３’ＵＴＲを含有する哺乳動物ＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩ転写産物によって生み出されないものである。したがって、感染性＋センスｓｓＲＮＡウイルスの産生には、Ｐｏｌ  ＩＩによってコードされるＳＶＶ転写産物から非ウイルス性ＲＮＡを除去するのを触媒する、及び複製可能な感染性ＳＶＶの発現を可能にする、５’及び３’リボザイム配列を内包することが必要であった（図２２及び図２３Ａの概略図解を参照のこと）。
【０２９８】
手短に述べると、５’及び３’リボザイムコード配列の挿入を含む（ＳＶＶ  ｗ／Ｒ）、及び含まない（ＳＶＶ  ｗ／ｏ  Ｒ）、ＳＶＶウイルスゲノムをコードするＤＮＡポリヌクレオチドを生成させた（図２３Ａ）。これらの構築物を、実施例２に記載されているようにＤＮＡプラスミドの中に挿入した。末端リボザイム配列を含む、及び含まないＳＶＶコードプラスミドの感染性ウイルスを生み出す能力を試験するために、２９３Ｔ細胞を１×１０６細胞／ウェルで６ウェルプレートに播種した。播種から２４時間後に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００中の１μｇの上記ＳＶＶプラスミド構築物を２９３Ｔ細胞に４時間トランスフェクトし、この時点で完全培地を各ウェルに加えた。トランスフェクトされた２９３Ｔからの上清を７２時間後に回収し、０．４５μＭフィルターでシリンジ濾過を行い、Ｈ１２９９細胞に対して段階希釈した（図２３Ｂ中のプロトコール図解を参照のこと）。４８時間後、上清をＨ１２９９培養物から除去し、細胞をクリスタルバイオレットで染色してウイルス感染力を評価した。図２４に示すように、末端リボザイムを含む構築物からのみ活性溶解性ＳＶＶが生み出されたことがクリスタルバイオレット染色における透明性の低下から示唆される。したがって、これらのデータは、本明細書に記載のポリヌクレオチドの中へのリボザイムコード配列の組込みが感染性ＳＶＶウイルスの製造に必要であることを示している。
【０２９９】
実施例５：ＳＶＶコードポリヌクレオチドを含むＤＮＡプラスミドは試験管内で搭載薬タンパク質を発現させることができる
ＳＶＶコードポリヌクレオチドの中に組み込まれた搭載薬コード配列から搭載薬タンパク質を発現させる、実施例２に記載のＳＶＶプラスミドの能力を評価するために、実験を実施した。３つの搭載薬を試験した：ｍＣｈｅｒｒｙレポーター、ナノルシフェラーゼ（Ｎａｎｏｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）タンパク質、及びＣＸＣＬ１０。末端リボザイム配列を含むＳＶＶコードプラスミドは、ｍＣｈｅｒｒｙタンパク質を発現させることができたが、末端リボザイム配列を含まないＳＶＶコードプラスミドはそれができなかった（図２５Ａ）。さらに、ＳＶＶコードプラスミドはナノルシフェラーゼ（Ｎａｎｏｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）を発現させることができた（図２５Ｂ）。そしてさらに、ＳＶＶコードプラスミドはＣＸＣＬ１０を発現させることができた（図２５Ｃ）。これらのデータは、これらのプラスミド構築物が、感染性ＳＶＶを生み出すことに加えて、蛍光タンパク質（ｍＣｈｅｒｒｙによって例示される）、酵素タンパク質（ナノルシフェラーゼ（Ｎａｎｏｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）によって例示される）及び組換えケモカイン（ＣＸＣＬ１０によって例示される）を含めた複数の異なる種類の搭載薬タンパク質を発現させることもできたということを実証している。
【０３００】
実施例６：ＳＶＶをコードする自己複製性ポリヌクレオチドのｍＲＮＡ転写減衰
実施例２に記載のＳＶＶコードポリヌクレオチドがｍｉＲＮＡ転写減衰され得るか否かを判定するために、実験を実施した。図２６に示すように、ｍｉＲ−１及びｍｉＲ−１２２標的配列を含むｍｉＲＮＡ標的カセット（ｍｉＲ−Ｔ）を、インフレームでＳＶＶウイルスポリプロテインと共に内因性ウイルス２Ａ及び合成Ｔ２Ａ配列の間に挿入した（図１６も参照のこと）。ｍｉＲ−１標的配列は、筋肉細胞においてウイルス複製を制御すると予測され、ｍｉＲ−１２２標的配列は、肝細胞においてウイルス複製を制御すると予測される。実施例４に記載されるように、ＳＶＶコードプラスミドがトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞の上清からのウイルスの単離によってｍｉＲＮＡ転写減衰型ＳＶＶ及びＷＴ（対照）ＳＶＶウイルスを製造した。このウイルスを使用して、ｍｉＲ−１及びｍｉＲ−１２２模倣体が発現している許容Ｈ１２９９細胞に感染させた。４８時間後、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  ＧｌｏアッセイによってＨ４４６上清中のウイルス力価を評価することにより、ＷＴ  ＳＶＶと対比してＳＶＶ  ｍｉＲ−Ｔ構築物のｍｉＲＮＡ転写減衰を判定した。以下の表９の左列に示すように、陰性対照模倣体、ｍｉＲ−１、及びｍｉＲ−１２２のＴＣＩＤ５０／ｍＬは同等であり、したがって、ＷＴウイルスの場合、同族ｍｉＲＮＡはウイルス複製に対して何ら影響を与えなかった。しかしながら、ｍｉＲ−１かｍｉＲ−１２２かのどちらかが発現している細胞にＳＶＶ  ｍｉＲ−Ｔ構築物を感染させたときに複数の対数の感染力価の減少が認められたとおり、標的細胞にｍｉＲ−１またはｍｉＲ−１２２模倣体がトランスフェクトされている場合にＳＶＶ  ｍｉＲ−Ｔ（右列）のＩＣ５０はＳＶＶ  ＷＴウイルス（左列）に比べて大幅に低減された。これらのデータは、本明細書に記載の自己複製性ポリヌクレオチドから生み出されるウイルスが複数の組織特異的ｍｉＲＮＡの挿入によって転写減衰され得ることを実証している。
【表９】
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【０３０１】
実施例７：ＳＶＶコードポリヌクレオチドを含むプラスミドは生体内で感染性ウイルスを生み出す
Ｈ１２９９異種移植モデルを使用して、ＳＶＶコードポリヌクレオチドを含むプラスミドの生体内で感染性ウイルスを生み出す能力を決定するために実験を実施した。手短に述べると、５×１０６個のＨ１２９９細胞を８週齢の雌の無胸腺ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の右側腹に皮下接種した。腫瘍体積がおよそ１００ｍｍ３の体積に達したときにマウスを無作為に２つの実験群に割り当て、以下に本明細書に記載しているとおりに処置した。
【０３０２】
図２２に例示される、ＳＳＶをコードするリボザイム有効発現カセット（ＳＶＶ  ｗ／Ｒ）及びリボザイム無効（ＳＶＶ  ｗ／ｏ  Ｒ）カセットを含むプラスミドをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００で製剤化した。手短に述べると、各構築物１４μｇを１：１の比でＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００と混合し、ボルテックスし、次いで１０分間インキュベートし、その後、注射した。１４μｇ／用量のプラスミドＤＮＡの２回の投薬を、接種後１８日目及び２０日目に腫瘍内に投与した。電気測径器を使用して腫瘍体積を週に３回測定した。感染性ウイルスの評価のために２０、２２及び２３日目に腫瘍を採取した。
【０３０３】
図２７Ａに示すように、リボザイム有効ＳＶＶコードプラスミドで処置したマウスは、リボザイム無効ＳＶＶコードプラスミドで処置したマウスに比べて腫瘍成長の有意な阻害を実証した。各群から採取した腫瘍からウイルスを単離してＨ１２９９細胞に対して滴定し、ウイルス性溶解をクリスタルバイオレット染色で評価した。図２７Ｂに示すように、ＳＶＶ  ｗ／ｏ  Ｒ群から単離されたウイルス（図２７Ｂの左パネル）に比べて、ＳＶＶ  ｗ／Ｒプラスミドで処置したマウスに由来する腫瘍からの単離物（図２７Ｂの右パネル）は、クリスタルバイオレット染色における透明性の低下によって示される活性な溶解性ウイルスを含有していた。これらのデータは、ＳＶＶをコードするリボザイム有効ポリヌクレオチドを含むプラスミドが、生体内で感染性の溶解性ウイルスを生み出し、腫瘍内に送達された場合に腫瘍成長を阻害する、ということを実証している。
【０３０４】
実施例８：ＳＶＶコードポリヌクレオチドを含むプラスミドは生体内で搭載薬を発現させる
ＳＶＶコードポリヌクレオチドを含むプラスミドの、生体内に投与された場合に様々な搭載薬を発現させる能力を評価するために、さらなる実験を実施した。実施例７に記載されるように、リボザイム有効プラスミドＤＮＡ構築物を製剤化し、Ｈ１２９９異種移植モデルの腫瘍内に注射した。ＳＶＶコードポリヌクレオチド配列に加えて、ナノルシフェラーゼ（Ｎａｎｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）（図２８Ａ）またはＣＸＣＬ１０（図２８Ｂ）をコードする配列をプラスミドインサートの中に組み込んだ。２日目（ナノルシフェラーゼ（Ｎａｎｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ））または６日目（ＣＸＣＬ１０）に腫瘍を採取し、各々の搭載薬タンパク質の発現について評価した。図２８Ａ〜２８Ｂに示すとおり、ルシフェラーゼコードポリヌクレオチドを含むＳＶＶプラスミド、またはＣＸＣＬ１０コードポリヌクレオチドを含むＳＶＶプラスミドの腫瘍内投与は、単離された腫瘍における各搭載薬の検出をもたらした（図２８Ａは、増強された発光を示し、図２８Ｂは、上昇したＣＸＣＬ１０のレベルを示す）。これらのデータは、ＳＶＶコードプラスミドが、感染性ウイルスを生み出すことに加えて、生体内で外来酵素及びサイトカイン搭載薬を発現させることができるということを実証している。
【０３０５】
実施例９：ＳＶＶコードプラスミドを静脈内送達するための脂質ナノ粒子の製剤化
プラスミドの静脈内送達のために、ＳＶＶコードプラスミドを脂質ナノ粒子に製剤化した。
脂質ナノ粒子製造：
脂質：
【０３０６】
以下の脂質を脂質ナノ粒子の製剤化に使用した：
（ａ）Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＡＰ）、
（ｂ）コレステロール、
（ｃ）１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、
（ｄ）１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［アミノ（ポリエチレングリコール）（ＰＥＧ−ＤＳＰＥアミン）
（ｅ）１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−（ポリエチレングリコール）（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）。
【０３０７】
製剤化：
脂質をエタノールに５０：３５：１５（ＤＯＴＡＰ：コレステロール：ＤＬＰＥ）の比で調製した。また、ある場合には脂質ナノ粒子を０．２％ＰＥＧ−ＤＳＰＥまたはＰＥＧ−ＤＳＰＥアミンと共に製剤化した。マイクロ流体マイクロ混合物（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ）を使用して２ｍＬ／分（エタノール、脂質混合物を０．５ｍＬ／分、水性緩衝液、プラスミドＤＮＡを１．５ｍＬ／分）の混合流速で粒子を調製した。得られた粒子をタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）によってＣａ及びＭｇを含有するＰＢＳで洗浄した。
【０３０８】
ＨＡ複合化手順：
高分子量ヒアルロナン（ＨＡ）（７００ＫＤａ（Ｌｉｆｅｃｏｒｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ））を０．２ＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）に溶解させて５ｍｇ／ｍＬの終濃度にした。ＨＡ混合物を１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ）で１：１：６（ＨＡ：ＥＤＣ：ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ）のモル比で活性化した。３０分の活性化の後、脂質粒子を添加し、ｐＨを７．４に調節した。溶液を室温で２時間インキュベートした。
【０３０９】
各カプセル封入製剤について得られたパラメータを以下の表１０に示す。
【表１０】
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【０３１０】
粒子製剤の物理的特質の分析：
表１０に記載される得られた粒子製剤の各々について粒径分布及びゼータ電位測定を、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｎａｎｏ−ＺＳ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を使用して光散乱によって決定した。粒径測定はＨＢＳ中でｐＨ７．４で実施し、ゼータ電位測定は０．０１Ｍ  ＨＢＳ中でｐＨ７．４で実施した。ＨＡ複合化に先立って、ＴＦＦの前後に製剤の特性を評価した。これらの評価の結果を以下の表１１に示す。
【表１１】
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【０３１１】
結果：
プラスミドＤＮＡを細胞に好結果に送達して感染性ウイルスを生み出す各製剤の能力を評価するために、Ｈ１２９９細胞に各製剤をトランスフェクトした。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを使用して製剤化されたプラスミドＤＮＡを陽性対照として使用し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ単独を陰性対照として使用した。トランスフェクションから３日後に上清を採集し、Ｈ４６６細胞に対する上清の滴定、及びＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ生存能アッセイによってＳＶＶ  ＴＣＩＤ５０／ｍＬを算出した。
【表１２】
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【０３１２】
表１２に示すとおり、種々の製剤のＴＣＩＤ５０／ｍＬ値が感染性ウイルスの産生を実証していることから、プラスミドＤＮＡの脂質粒子製剤はプラスミドＤＮＡを細胞に送達することができ、感染性ウイルスを生み出した。
【０３１３】
実施例１０：プラスミドＤＮＡの静脈内注射は腫瘍部位への送達及び腫瘍成長の阻害をもたらす
肺癌異種移植モデルにおける静脈内送達
ＳＶＶコードプラスミドＤＮＡの脂質粒子製剤が全身投与された場合にｐＤＮＡを腫瘍に送達することができるか否かを判定する実験を実施した。実施例９及び表１０に記載の製剤５２０２１−４Ｄを選択し、粒子をＰＢＳ中に、約９５％の活性ＤＮＡ回収率及び脂質カプシド化効率で製剤化した。
【０３１４】
腫瘍体積がおよそ１５０ｍｍ３の体積に達したときに１００μＬ（およそ２７μｇのＤＮＡ）のＬＮＰを静脈内投与した。ＰＢＳをビヒクル対照として使用した。２つの追加用量のＬＮＰまたはビヒクル対照を１日おきに、合計３回の用量で静脈内投与した。最後の投薬から４８時間後にマウスを屠殺し、腫瘍組織を回収した。
【０３１５】
図２９に示すように、ＬＮＰで処置したマウスから採取した腫瘍にＳＶＶプラスミドＤＮＡが検出された。したがって、ＬＮＰはプラスミドＤＮＡを腫瘍部位に送達することができる。
【０３１６】
ＳＶＶコードプラスミドＤＮＡの脂質粒子製剤が実施例７に記載のＨ１２９９異種移植モデルに静脈内投与された場合に腫瘍成長に影響を及ぼすことができるか否かを判定する実験を実施した。標的指向性部分ヒアルロン酸及び試験管内での機能が存在するため、実施例９及び表１０に記載の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤５２０２１−２Ｄをさらなる分析のために選択し、粒子をＰＢＳ中に、約９５％の活性ＤＮＡ回収率及び脂質カプシド化効率で製剤化した。
【０３１７】
腫瘍体積がおよそ１５０ｍｍ３の体積に達したときに１００μＬ（およそ２７μｇのＤＮＡ）のＬＮＰを静脈内投与した。ＰＢＳをビヒクル対照として使用した。３つの追加用量のＬＮＰまたはビヒクル対照を１日おきに合計４回の用量で静脈内投与した。電気測径器を使用して腫瘍体積を週に少なくとも２回測定した。
【０３１８】
図３０に示すように、ＬＮＰに製剤化されたプラスミドＤＮＡの静脈内送達は、ＰＢＳ対照において観察された成長と比較して、時の経過と共に腫瘍成長を有意に阻害した（図３０、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正を伴う二元配置ＡＮＯＶＡ）。これらの結果は、感染性ウイルスをコードするプラスミドＤＮＡが非ウイルス性ビヒクル中で静脈内送達されることができ、生体内での腫瘍成長を有意に阻害することができる、ということを実証している。
【０３１９】
肝細胞癌腫異種移植モデルにおける静脈内送達：
肝細胞癌腫のマウス異種移植モデルにおける静脈内ＬＮＰ送達の効果を評価するには、同様の実験を実施することになる。手短に述べると、マウスに３×１０６個のＨｅｐＧ２細胞を接種し、上記のとおりに製剤化されたＬＮＰで静脈内に処置することになる。腫瘍成長を経時的に測定することになり、実験の最後に腫瘍をさらなる分析のために採取することになる。これらの実験は、腫瘍溶解性ウイルスをコードし静脈内投与されるＬＮＰ封入構築物の、肝細胞癌腫モデルにおける腫瘍成長を阻害する能力を実証すると予測される。
【０３２０】
実施例１１：ＬＮＰ内に封入されウイルスゲノムをコードする自己複製性ポリヌクレオチドによる、がんに罹患している患者の処置
がんに罹患している患者を治療する本明細書に記載の自己複製性ウイルスゲノムの能力を評価するために実験が実施され得る。そのような実験では、ウイルスゲノムをコードする自己複製性ポリヌクレオチドを、概して実施例１に記載されているとおりに操作する。
【０３２１】
これらの自己複製性ポリヌクレオチドは、プラスミド主鎖中への組込みのためにさらに操作され得る。あるいは、自己複製性ポリヌクレオチドを大規模に試験管内で増殖させるためには、ポリヌクレオチド複製及び核内進入に役立つＡＡＶ−ＩＴＲ配列を、ウイルスゲノム全体を挟むように組み込んでＮａｎｏＶ構築物を生成することができる。ＩＴＲに挟まれたゲノムの全体を、組換えＨＳＶゲノム主鎖の遺伝子間遺伝子座（図４Ｂ、図７Ｂ）、あるいはＩＣＰ４遺伝子座（図５Ｂ、図１０Ｂ、ＩＣＰ４はＩＣＰ４補足細胞株によってトランスで提供される）に挿入する。ＩＴＲに挟まれたウイルスゲノムＤＮＡの効率的な複製を可能にするためにＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子をＩＣＰ０の中に挿入する（実施例３を参照のこと）。
【０３２２】
標準的な分子生物学技術（例えば、Ｍａｘｉ−ｐｒｅｐ）を用いてプラスミドゲノムまたはＮａｎｏＶゲノムを培養物から精製し、その後、凍結乾燥させたヒアルロナン（ＨＡ）で表面改質された脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の中に封入する（実施例９を参照のこと）。カプセル封入されていないウイルスゲノムＤＮＡを超遠心分離によって除去し、ナノ粒子内に封入されたウイルスゲノムをｑＰＣＲによって定量する。がんに罹患している患者への生体内投与のために、ＬＮＰを薬学的に許容される安定化剤と共にリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で調製する。１日目に、体積１０ｍＬの薬学的に許容される担体の中に入った１０１０個のベクターゲノムで患者を静脈内輸注によって処置する。標準的な医療手順を用いて患者をがんの存在について追跡評価する。あり得るこれらの実験の転帰としては、腫瘍成長の部分的または完全な阻害、腫瘍転移の阻害、寛解する時間の延長、及び／または標準治療と比較したときの再発率の減少が挙げられる。
【０３２３】
実施例１２：ＬＮＰ内に封入されウイルスゲノムをコードする自己複製性ポリヌクレオチドによる、肺癌に罹患している患者の治療
非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）に罹患している患者または小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）に罹患している患者を治療する、本明細書に記載の自己複製性ウイルスゲノムの能力を評価するために、実施例１１に従って実験が実施され得る。
【０３２４】
ＬＮＰ内に封入され得る及びＮＳＣＬＣ及びＳＣＬＣの治療に使用され得る例示的な自己複製性ポリヌクレオチドの概要を、以下の表１３に示す。
【表１３−１】
2020530778.tif 000015
【表１３−２】
2020530778.tif 000016
【表１３−３】
2020530778.tif 000017
【０３２５】
実施例１３：肝細胞癌腫に罹患している患者の治療。
肝細胞癌腫に罹患している患者を治療する、本明細書に記載の自己複製性ウイルスゲノムの能力を評価するために、実施例１１に従って実験が実施され得る。
【０３２６】
ＬＮＰ内に封入され得る及び肝細胞癌腫の治療に使用され得る例示的な自己複製性ポリヌクレオチドの概要を、以下の表１４に示す。
【表１４−１】
2020530778.tif 000018
【表１４−２】
2020530778.tif 000019
【０３２７】
実施例１４：前立腺癌に罹患している患者の治療。
前立腺癌に罹患している患者を治療する、本明細書に記載の自己複製性ウイルスゲノムの能力を評価するために、実施例１１に従って実験が実施され得る。
【０３２８】
ＬＮＰ内に封入され得る及び前立腺癌の治療に使用され得る例示的な自己複製性ポリヌクレオチドの概要を、以下の表１５に示す。
【表１５−１】
2020530778.tif 000020
【表１５−２】
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【表１５−３】
2020530778.tif 000022
【０３２９】
参照による援用
本明細書中で引用される全ての参考文献、論文、刊行物、特許、特許公報及び特許出願は、参照によりそれらの全体があらゆる目的のために援用される。しかしながら、本明細書中で引用される何らか参考文献、論文、刊行物、特許、特許公報及び特許出願に対する言及は、それらが有効な先行技術をなす、または世界のいずれかの国において一般常識の一部を形成する、ということの承認または何らかのかたちの示唆として解釈されず、また、そう解釈されるべきでない。
【０３３０】
本明細書では本開示の好ましい実施形態を示し説明してきたが、そのような実施形態が例として提供されているにすぎないことは当業者には明らかであろう。今や、当業者であれば本開示から逸脱することなく幾多の変化形態、変更及び置換えを想到するであろう。本開示を実施する際、本明細書に記載の本開示の実施形態に対する様々な代替形態が採用され得ることは、理解されるべきである。以下の請求項によって本開示の範囲を画定すること、またこれらの請求項の範囲内に入る方法及び構造体ならびにそれらの均等物をそれによって包含することを企図する。
【表１−１】
2020530778.tif 000023
【表１−２】
2020530778.tif 000024
【表２−１】
2020530778.tif 000025
【表２−２】
2020530778.tif 000026
【表２−３】
2020530778.tif 000027
【表２−４】
2020530778.tif 000028
【表２−５】
2020530778.tif 000029
【表２−６】
2020530778.tif 000030
【表２−７】
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【表２−８】
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【表２−９】
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【表２−１０】
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【表２−１１】
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【表２−１２】
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【表３−１】
2020530778.tif 000037
【表３−２】
2020530778.tif 000038
【表３−３】
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【表３−４】
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【表３−５】
2020530778.tif 000041
【表３−６】
2020530778.tif 000042
【表３−７】
2020530778.tif 000043
参考文献
１．Ｌｏｆｆｌｅｒ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０００；９５：２０９８−２１０３
２．Ｂａｒｇｏｕ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００８；３２１：９７４−９７７
３．Ｋｌｉｎｇｅｒ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１２；１１９：６２２６−６２３３
４．Ｔｏｐｐ  ＭＳ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２０１１；２９：２４９３−２４９８。
５．Ｌｏｆｆｌｅｒ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ．２００３；１７：９００−９０９
６．Ｔｏｐｐ  ＭＳ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１２；１２０：５１８５−５１８７
７．Ｂｒｉｓｃｈｗｅｉｎ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６；４３：１１２９−１１４３
８．Ｈｅｒｒｍａｎｎ  Ｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ．２０１０；５：ｅ１３４７４。
９．Ｃｉｏｆｆｉ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１２；１８：４６５−４７４
１０．Ｗｉｔｔｈａｕｅｒ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；１１７：４７１−４８１
１１．Ｏｓａｄａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．２０１０；１０２：１２４−１３３
１２．Ｌｕｔｔｅｒｂｕｅｓｅ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００９；３２：３４１−３５２。
１３．Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．２０１２；１１：２６６４−２６７３
１４．Ｌａｓｚｌｏ  ＧＳ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１４；１２３：５５４−５６１
１５．Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．２０１４；１３：１５４９−１５５７
１６．Ｌｕｔｔｅｒｂｕｅｓｅ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，２０１０；１０７：１２６０５−１２６１０
１７．Ｗｕｅｌｌｎｅｒ  Ｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ２０１５，４，４２６−４４０
１８．Ｌｏｐｅｚ−Ａｌｂａｉｔｅｒｏ  Ａ，Ｘｕ  Ｈ，Ｇｕｏ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１７；６（３）：ｅ１２６７８９１
１９．Ｈａｍｍｏｎｄ  ＳＡ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２００７；６７：３９２７−３９３５
２０．Ｔｏｒｉｓｕ−Ｉｔａｋｕｒａ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０１１；３４：５９７−６０５
２１．Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２０１２；４４５：１３５−１４４
２２．Ｆｅｌｄｍａｎｎ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１２；１８９：３２４９−３２５９
２３．Ｍａｃｋ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ．１９９５；９２：７０２１−７０２５
２４．Ｚｈａｎｇ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１１；７１：２０６６−２０７６
２５．Ｇｏｄｂｅｒｓｅｎ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．２０１７  Ｊｕｌ；１６（７）：１３３５−１３４６
２６．Ｒｏｓｓ  ＳＬ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２０１７；ｅ０ｌ８３３９０
【図１】
2020530778.tif 000044
【図２】
2020530778.tif 000045
【図３】
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【図４】
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【図５】
2020530778.tif 000048
【図６】
2020530778.tif 000049
【図７】
2020530778.tif 000050
【図８−１】
2020530778.tif 000051
【図８−２】
2020530778.tif 000052
【図９】
2020530778.tif 000053
【図１０】
2020530778.tif 000054
【図１１−１】
2020530778.tif 000055
【図１１−２】
2020530778.tif 000056
【図１２】
2020530778.tif 000057
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2020530778.tif 000060
【図１６】
2020530778.tif 000061
【図１７】
2020530778.tif 000062
【図１８】
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【図１９−１】
2020530778.tif 000064
【図１９−２】
2020530778.tif 000065
【図２０−１】
2020530778.tif 000066
【図２０−２】
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【図２１】
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【図２２】
2020530778.tif 000069
【図２３】
2020530778.tif 000070
【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
2020530778.tif 000073
【図２７Ａ】
2020530778.tif 000074
【図２７Ｂ】
2020530778.tif 000075
【図２８】
2020530778.tif 000076
【図２９】
2020530778.tif 000077
【図３０】
2020530778.tif 000078
【図３１Ａ】
2020530778.tif 000079
【図３１Ｂ】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
2020530778.tif 000082
【配列表】
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【国際調査報告】
2020530778.tif 000083
2020530778.tif 000084
2020530778.tif 000085
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