(57)【要約】本発明は、筋骨格系損傷の治療のための方法における使用のための化合物に関し、該化合物は、炎症誘発性応答のレギュレーターであり、かつ特に、制御性Ｔ細胞及び／又はＭ２マクロファージをアップレギュレートすることができる；及び／又はエフェクターＣＤ８＋細胞の生物学的活性をダウンレギュレートすることができる、並びに前記化合物の初回投与が前記筋骨格系損傷後２４時間以降に、患者へ投与することをさらに含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
筋骨格系損傷を治療するため、又は筋骨格系損傷の治癒の遅延若しくは非治癒を防ぐための方法における使用のための化合物であって、前記化合物が、炎症誘発性応答のレギュレーターであり、かつ特に前記化合物が、
−  制御性Ｔ細胞及び／又はＭ２マクロファージをアップレギュレートすることができる、及び／又は
−  エフェクターＣＤ８＋細胞の生物活性をダウンレギュレートすることができる、
並びに、投与レジメン、
−  前記筋骨格系損傷後２４時間以降に、患者に前記化合物の初回投与を行うこと、
をさらに含む、
前記化合物。
【請求項２】
前記化合物が、
−  プロスタサイクリン、
−  ホスホジエステラーゼＩＶ阻害剤、
−  ジブトリル−ｃＡＭＰ、又は
−  ＣＤ３９／ＣＤ７３アゴニスト、
から選択される、
請求項１に記載の、筋骨格系損傷を治療するため、又は筋骨格系損傷の治癒の遅延若しくは非治癒を防ぐための方法における使用のための化合物。
【請求項３】
前記プロスタサイクリンがイロプロストである、請求項１又は２に記載の、筋骨格系損傷を治療するため、又は筋骨格系損傷の治癒の遅延若しくは非治癒を防ぐための方法における使用のための化合物。
【請求項４】
前記化合物が、ロリプラム、アプレミラスト、シロミラスト、クリサボロール、ジアゼパム、イブジラスト、ルテオリン、メセンブレノン又はピクラミラストから選択される、
請求項１又は２に記載の、筋骨格系損傷を治療するため、又は筋骨格系損傷の治癒の遅延若しくは非治癒を防ぐための方法における使用のための化合物。
【請求項５】
前記初回投与が、前記筋骨格系損傷後３６時間以降に、前記患者に投与される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の、筋骨格系損傷を治療するため、又は筋骨格系損傷の治癒の遅延若しくは非治癒を防ぐための方法における使用のための化合物。
【請求項６】
前記初回投与が、前記筋骨格系損傷後３日〜４日の間に前記患者に投与される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の、筋骨格系損傷を治療するため、又は筋骨格系損傷の治癒の遅延若しくは非治癒を防ぐための方法における使用のための化合物。
【請求項７】
前記化合物が、前記筋骨格系損傷後７日以内、特に前記筋骨格系損傷後６日以内に、前記患者に投与される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の、筋骨格系損傷を治療するため、又は筋骨格系損傷の治癒の遅延若しくは非治癒を防ぐための方法における使用のための化合物。
【請求項８】
前記患者が、易感染性である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の、筋骨格系損傷を治療するため、又は筋骨格系損傷の治癒の遅延若しくは非治癒を防ぐための方法における使用のための化合物。
【請求項９】
前記筋骨格系損傷が、骨折、腱損傷、腱断裂、又は筋肉の断裂若しくは損傷から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の、筋骨格系損傷を治療するため、又は筋骨格系損傷の治癒の遅延若しくは非治癒を防ぐための方法における使用のための化合物。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物を含む、筋骨格系損傷を治療するため、又は筋骨格系損傷の治癒の遅延若しくは非治癒を防ぐための方法における使用のための医薬品組成物。
【請求項１１】
前記組成物が、注射用又は移植用に製剤化される、請求項１０に記載の、筋骨格系損傷を治療するため、又は筋骨格系損傷の治癒の遅延若しくは非治癒を防ぐための方法における使用のための組成物。
【請求項１２】
前記組成物が、生分解性ポリマー、特にフィブリンをさらに含む、請求項１０又は１１に記載の、筋骨格系損傷を治療するため、又は筋骨格系損傷の治癒の遅延若しくは非治癒を防ぐための方法における使用のための組成物。
【請求項１３】
前記組成物が、前記生分解性ポリマーに埋め込まれる、かつ任意に前記生分解性ポリマー又は別の生分解性ポリマーでコーティングされる、又は本質的に前記生分解性ポリマー又は別の生分解性ポリマーを含む、又はからなるシェルによって包まれる、請求項１２に記載の、筋骨格系損傷を治療するため、又は筋骨格系損傷の治癒の遅延若しくは非治癒を防ぐための方法における使用のための組成物。
【請求項１４】
請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の組成物を含む、移植片、特に整形外科用移植片。
【請求項１５】
筋骨格系損傷を治療するため、又は筋骨格系損傷の治癒の遅延若しくは非治癒を防ぐための方法であって、請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物、又は請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の組成物を、前記筋骨格系損傷後２４時間以降に、それを必要とする患者に投与することを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に易感染性患者において、筋骨格系損傷を治癒するための、又は筋骨格系損傷の治癒の遅延を防ぐための方法における使用のための化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
筋骨格系損傷は、骨折、筋断裂又はさらには筋損傷又は腱断裂などの運動系の医学的状態を包含する。筋骨格系損傷は、多くの場合、事故又は激しい活動によって引き起こされる。研究では、１年間に最大２５％の人口が何らかの筋骨格系損傷を経験する可能性があると推定している。例えば、ドイツでは、骨折の発生件数は年間１６０万件と見積もられる。これらの損傷による長い治療時間は患者の生活の質を低減し、医療費を高くし、かつ医療休暇をより長いものにする。
【０００３】
治癒の遅延又は治癒不能の状態は、二次的治療介入を必要とすることが多く、本質的に生活の質に大きく影響し、医療費をさらに増大させる。若年患者では、修正手術により、仕事への復帰が遅延する。高齢患者では、修正手術により、機能回復が損なわれることが多く、それ故、高齢患者にとって通常の健康状態に対する脅威となり、致命的な結果を伴う場合さえある。
【０００４】
したがって、筋骨格系損傷は社会及び経済に大きな負担を与えるため、リスクのある患者を事前に特定し、かつ治癒工程を本質的に改善する免疫調節療法を使用することが重要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このような背景から、本発明の目的は、特に易感染性患者において、改善される筋骨格系損傷の治療の手段、又は改善される筋骨格系損傷の治癒の遅延若しくは非治癒の防止の手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の説明
本目的は、請求項１の特徴を有する化合物、請求項１０の特徴を有する組成物、及び請求項１４の特徴を有する移植片によって達成される。好ましい実施形態は、従属請求項及び以下で詳しく説明される。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１Ａ】図１は、骨幹骨（Ａ）及び骨幹端骨（Ｂ）（ヒツジ）のドリル穴における３〜９週間後の骨形成のマイクロコンピュータ断層撮影（μＣＴ）評価を示す。コラーゲン群及びイロプロスト充填コラーゲン群の違いは検出できない。イロプロストが充填されたコラーゲン群において、治癒は、ｉ）自己海綿質を受け取った群と同程度には達成されず、かつ、ｉｉ）新しい骨が形成される前に分解されるべき担体（ゼラチンのみの群を参照）による対照よりもわずかに悪化もしている。
【図１Ｂ】図１は、骨幹骨（Ａ）及び骨幹端骨（Ｂ）（ヒツジ）のドリル穴における３〜９週間後の骨形成のマイクロコンピュータ断層撮影（μＣＴ）評価を示す。コラーゲン群及びイロプロスト充填コラーゲン群の間の違いは検出できない。イロプロストが充填されたコラーゲン群において、治癒は、ｉ）自己海綿質を受け取った群と同程度には達成されず、かつ、ｉｉ）新しい骨が形成される前に分解されるべき担体（ゼラチンのみの群を参照）による対照よりもわずかに悪化もしている。
【図２】図２は、３Ｄ再構成像を示す：３週間の治癒後の、Ａ  対照、Ｂ  コラーゲンのみ、Ｃ  イロプロスト充填コラーゲン、Ｄ  自己海綿質。
【図３ＡＢＣ】図３は、好ましい薬剤放出システムの構造及び機能を示す。（Ａ）：適用前に、薬剤を、フィブリンベースの放出システムのコアに組み込んだ。適用キット（ティスコール（Ｔｉｓｓｕｅｃｏｌ）、バクスター社）の１００％フィブリンの保護シェルを、１５０％フィブリンの薬剤充填コアの周りに構築した。（Ｂ）：空のマウス骨切開切片、及び（Ｃ）：薬剤放出システム適用あり。
【図３Ｄ】（Ｄ）：薬剤の特徴的な２重ピークを有するＨＰＬＣ／ＵＶクロマトグラム。薬剤を、液体−液体抽出を介してタンパク質残渣から分離し、Ｃ−１８カラムで分析した。
【図３Ｅ】（Ｅ）：薬剤放出は、プロテアーゼ−Ｋを添加したＰＢＳで行われた。二重ピークの定量では、シェルに包まれたヒドロゲルからの薬剤の遅延放出を示した。
【図４】図４は、２１日間の治癒期間後の大腿骨のマウス骨切開のマイクロコンピュータ断層撮影（μＣＴ）によるインビボでの免疫調節を示す。薬剤充填放出システムは、新たに形成される骨の体積量（ＢＶ）をより高くした。すなわち、ビヒクル０．４３６ｍｍ３及びビヒクル＋イロプロスト１．３４７ｍｍ３。Ｎ＝６、各試料の種類、中央値、マンホイットニーのＵ検定（ｐ＝０．０１６）。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
請求項１によれば、筋骨格系損傷を治療するため、又は筋骨格系損傷の治癒の遅延若しくは非治癒を防ぐための方法における使用のための化合物が提供され、該化合物は炎症誘発性応答のレギュレーターである。
【０００９】
特に、本発明の化合物は、制御性Ｔ細胞及び／又はＭ２マクロファージをアップレギュレートすることができる免疫モジュレーターとして、及び／又はエフェクターＣＤ８＋細胞の生物活性をダウンレギュレートすることができる免疫モジュレーターとして機能する。
【００１０】
両方の効果は、同じ化合物によって媒介されることが好ましい。
【００１１】
特に、本発明の化合物は、次の投与レジメンに従って投与される：
−  筋骨格系損傷後２４時間以降に、患者に本発明の化合物の初回投与を行うこと。
【００１２】
当業者は、初回投与が、筋骨格系損傷が発生した後の２４時間未満には初回投与されないことを理解するであろう。
【００１３】
特定の実施形態では、本発明の化合物の初回投与が、筋骨格系損傷後３６時間以降に、投与される。
【００１４】
本明細書の文脈における「制御性Ｔ細胞及び／又はＭ２マクロファージをアップレギュレートする」という用語は、特に制御性Ｔ細胞及び／又はＭ２マクロファージの生物活性、特に、筋骨格系損傷後の炎症誘発性応答又は初期炎症反応を減少又は阻害する制御性Ｔ細胞及びＭ２マクロファージの機能を上方制御することを指す。
【００１５】
「エフェクターＣＤ８＋細胞の生物活性をダウンレギュレートする」という用語は、特に、筋骨格系損傷後の炎症誘発性応答又は初期炎症反応を開始又は維持するエフェクターＣＤ８＋細胞の機能を低下又は抑制することを指す。
【００１６】
本明細書の文脈における「免疫モジュレーター」という用語は、各標的細胞の生物活性又は機能を増強又は低下させる化合物又は物質を特に指す。
【００１７】
「制御性Ｔ細胞」という用語は、免疫学の技術で知られている意味で使用される。それはＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋細胞を特に指す。同様に、「エフェクターＣＤ８＋細胞」という用語は、免疫学の技術で知られている意味で使用される。エフェクターＣＤ８＋細胞の非制限例には、エフェクターメモリＣＤ８＋細胞、特にＣＤ８  ＴＥＭＲＡ細胞（ＣＤ８＋１１ａ＋＋２８−５７＋）が含まれる。
【００１８】
特定の実施形態では、本発明の化合物は抗炎症剤である。
【００１９】
本明細書の文脈における「抗炎症剤」という用語は、炎症又は腫脹を低減する化合物又は物質を特に指す。
【００２０】
特定の実施形態では、本発明の化合物は以下から選択される：
−  プロスタサイクリン、
−  ホスホジエステラーゼ阻害剤ＩＶ、
−  ジブトリル−ｃＡＭＰ、又は
−  ＣＤ３９／ＣＤ７３アゴニスト、特にアデノシン／ｃＡＭＰの内因性生成を支持することができる。
【００２１】
特定の実施形態では、プロスタサイクリンが、イロプロスト（Ｉｌｏｐｒｏｓｔ）（ＣＡＳ番号  ７８９１９−１３−８）である。
【００２２】
特定の実施形態では、ホスホジエステラーゼ阻害剤ＩＶが、以下から選択される：
−  ロリプラム（ＣＡＳ番号  ６１４１３−５４−５）、
−  アプレミラスト（ＣＡＳ番号  ６０８１４１−４１−９）、
−  シロミラスト（ＣＡＳ番号  １５３２５９−６５−５）、
−  クリサボロール（ＣＡＳ番号  ９０６６７３−２４−３）、
−  ジアゼパム（ＣＡＳ番号  ４３９−１４−５）、
−  イブジラスト（ＣＡＳ番号  ５０８４７−１１−５）、
−  ルテオリン（ＣＡＳ番号  ４９１−７０−３）、
−  メセンブレノン（ＣＡＳ番号  ４６８−５４−２）、又は
−  ピクラミラスト（ＣＡＳ番号  １４４０３５−８３−６）。
【００２３】
特定の実施形態では、初回投与が、筋骨格系損傷後３日〜４日の間に患者に投与される。
【００２４】
特定の実施形態では、本発明の化合物が、筋骨格損傷後７日以内で患者に投与される。特定の実施形態では、本発明の化合物が、筋骨格損傷後６日以内で患者に投与される。
【００２５】
特定の実施形態では、本発明の化合物が、筋骨格系損傷後２日〜７日の期間内に投与される。特定の実施形態では、本発明の化合物が、筋骨格損傷後２日〜６日の期間内に投与される。
【００２６】
特定の実施形態では、患者が、易感染性である。本明細書の文脈における「易感染性患者」という用語は、特に、高齢、骨粗鬆症、さらなる併存疾患（例えば、糖尿病、カヘキシー（ｃａｃｈｅｘｉａ）などの代謝障害）を有し、免疫不均衡（エフェクターＴ細胞／制御性Ｔ細胞比の増加）も有する患者として定義され、一般的には「免疫不全」の患者に見られる。易感染性患者は、特に、より高い筋骨格系外傷後の治癒の遅延又は不全によって示される再生能の減少を有する。
【００２７】
特定の実施形態では、筋骨格系損傷が、骨折、腱損傷、腱断裂、又は筋肉の断裂若しくは損傷から選択される。
【００２８】
請求項１０によれば、筋骨格系損傷を治療するための、又は筋骨格系損傷の治癒の遅延を防ぐための方法において使用するための医薬品組成物が提供され、該組成物は、上記の態様又は上記の実施形態のいずれか一項に記載の化合物を含む。
【００２９】
特定の実施形態では、本発明の医薬品組成物が、注射用又は移植用に製剤化される。
【００３０】
特定の実施形態では、本発明の医薬品組成物が、生分解性ポリマー又は生分解性ポリマーの混合物をさらに含む。
【００３１】
本明細書の文脈における「生分解性ポリマー」という用語は、標的環境、例えば骨折した骨の近く、又は断裂又は損傷した筋肉の近くにおいて分解又は劣化するポリマーを特に指す。適切な生分解性ポリマーの非限定的な例には、フィブリン及びコラーゲンを含む。
【００３２】
特定の実施形態では、本発明の医薬品組成物が、生分解性ポリマー又は生分解性ポリマーの混合物に埋め込まれる。特定の実施形態では、生分解性ポリマー又は生分解性ポリマーの混合物に埋め込まれる医薬品組成物は、同一の生分解性ポリマー又は生分解性ポリマーの混合物又は異なる生分解性ポリマー又は生分解性ポリマーの混合物でコーティングされる。特定の実施形態では、生分解性ポリマー又は生分解性ポリマーの混合物に埋め込まれる医薬品組成物は、同一の生分解性ポリマー又は混合物、又は異なる生分解性ポリマー又は混合物を含む、又はからなるシェルで包まれる。
【００３３】
請求項１４によれば、移植片、特に整形外科用移植片が提供され、該移植片は、本発明の組成物を含み、上記の実施形態に従い移植用に特に製剤される。
【００３４】
したがって、組成物は、上記のとおりの生分解性ポリマー又は生分解性ポリマーの混合物に好ましく埋め込まれる。さらに好ましくは、生分解性ポリマー又は生分解性ポリマーの混合物に埋め込まれる組成物は、同一の生分解性ポリマー又は混合物、又は異なる生分解性ポリマー又は混合物でコーティングされる、又は同一の生分解性ポリマー又は混合物、又は異なる生分解性ポリマー又は混合物を含む、又はからなるシェルで包まれる。
【００３５】
また、筋骨格系損傷を治療するため、又は筋骨格系損傷の治癒の遅延を防ぐための方法も本発明の範囲内である。該方法は、本発明の第１の態様又はその実施形態のいずれか１項に記載の化合物、又は本発明の上記態様又はその実施形態のいずれか１項に記載の組成物を、薬学的に有効な濃度で、それを必要とする患者に、前記筋骨格系損傷後２４時間以降に、投与することを含む。
【００３６】
特に、筋骨格系損傷を治療するための、又は筋骨格系損傷の治癒の遅延を防ぐための方法は、上記の投与レジメンに従って、発明の化合物を投与することを含む。
【００３７】
単一の分離可能な特徴の代替が、実施形態として本明細書で記載される場合は、このような代替を、自由に組み合わせることができ、本明細書で開示される発明の別々の実施形態を形成できることを理解されたい。
【００３８】
本発明は、以下の実施例及び図によってさらに説明され、そこからさらなる実施形態及び利点を引き出すことができる。これらの実施例は、本発明を説明することを意図しているが、その範囲を限定することは意図していない。
【実施例】
【００３９】
特に本明細書では、筋骨格系損傷を罹患する易感染性患者の予防的治療法を開示する。
【００４０】
この予防的治療は、免疫調節であり、例えば、抗炎症剤（ホスホジエステラーゼＩＶ阻害剤、ジブチリルｃＡＭＰ、イロプロスト（プロスタサイクリン化合物）、又はＣＤ３９／ＣＤ７３アゴニスト、又はその組み合わせなど）を介する、Ｔｒｅｇ及び／又はＭ２マクロファージのアップレギュレーション及び／又はＣＤ８のダウンレギュレーションによるものである。
【００４１】
驚くべきことに、本発明者らは、該治療は初期炎症反応後の限られた時間帯に実施されなければならなく、これが骨修復機構の誘発に不可欠であることを見出した。次いで抗炎症剤は、炎症を低減して、又は免疫系を促進して、損傷部位の炎症応答から抗炎症応答に切り替える。
【００４２】
該方法には、（ＰＣＴ／ＥＰ２０１３／０５２１８１で開示される方法に従う実施例の）ＣＤ４／ＣＤ８比又はＴＥＭＲＡ−ＣＤ８を介する適切な患者群及び６５歳を超える任意のヒトの選択を含んでよい。
【００４３】
驚くべきことに、ヒツジでの実験において、本発明者らは、治療は損傷後の早い段階（通常は２４時間以内）では実施するべきでないことを見出した。その代わりに、本発明者らは、損傷後少なくとも２４〜３６時間の治療のみが効果的であることを測定した。さらに、本発明者らは、治療は７日を超えて継続する必要がないことを見出した。これは、治療を長期間実施しても治癒結果が改善されないためである。この治療レジメンにより、患者の治療への暴露時間が低減され、それ故、副作用の可能性が低減される。
【００４４】
好ましくは、治療は炎症誘発的段階を終了させるため、かつ後続の抗炎症的段階を支援するために、損傷後の３〜４日間のみ実施される必要がある。
【００４５】
この治療は、注射又は移植によって、又は放出システムを介して行うことができる。
【００４６】
本発明者らは、損傷後の２〜６日間に抗炎症剤をほぼ完全に放出する局所持続放出システムを使用した。該放出システムは抗炎症剤が充填され、２４時間以内に３５％未満の薬剤が放出され、６０時間以内に８０％の薬剤が放出された。好ましくは、損傷後７日以内に放出が完了（＞９０％）される。
【００４７】
本発明者らは、この方法による筋骨格系損傷の治癒は、早すぎる段階で適用される場合より、はるかに優れていることを示すことができた。骨修復の適切な段階で治療を適用することが重要である。このように、この方法は、易感染性患者の筋骨格系損傷の治癒を改善するのに特に役立つことが可能である。
【００４８】
該放出システムは、骨折、組織損傷、外傷など、すべての筋骨格系損傷に使用することが可能である。
【００４９】
ヒツジの実験
先行の公開（例えば、米国特許出願第２０１５０１６４８５３  Ａ１号）では、骨の治癒を強化するためにイロプロストを局所的にただちに使用することが有益であると述べられている。これを調査するために、バースト放出の動態を有するコラーゲン足場に薬剤を適用するヒツジの骨の治癒モデルにおいて、高用量のイロプロストを使用した。しかしながら、実施した調査では骨形成の増強は検出できなかった。理論に縛られることなく、本発明者らは、主な炎症誘発性バーストが急速にダウンレギュレートされ、より多くの抗炎症性再生誘発性シグナル伝達に代わると考え、よって、イロプロストの適用の時間を遅延することが、骨の治癒工程に正の効果をもたらすのに不可欠であることを強く示唆すると考えた。
【００５０】
ドリル穴モデルで骨形成を解析した（海綿骨及び皮質骨の欠損における骨組織工学戦略の調査のための前臨床的ヒツジスクリーニングモデルの確立、Ｐｏｂｌｏｔｈ  ＡＭ、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＫＡ、Ｓｃｈｅｌｌ  Ｈ、Ｋｏｌａｒｃｚｉｋ  Ｎ、Ｗｕｌｓｔｅｎ  Ｄ、Ｄｕｄａ  ＧＮ、Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｂｌｅｅｋ  Ｋ、ＢＭＣ  Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔ  Ｄｉｓｏｒｄ、２０１６年３月１；１７：１１１）。空の対照群及びコラーゲンのみの群は陰性対照群として使用され、骨療法における現在の至適基準である自己海綿群は陽性対照群として使用された。イロメディン（Ｉｌｏｍｅｄｉｎ）群では、２つの足場あたり１ｍｌのイロプロスト（イロメディン、２０μＬ／１ｍｌ輸液、バイエルバイタル社、レーヴァークーゼン、ドイツ）の超生理学的用量を使用した。
【００５１】
マウス実験
マウス実験は、動物福祉法、実験動物の管理及び使用に関する国立衛生研究所ガイド及び国立動物福祉ガイドラインによって確立された方針及び原則に従って、１２週齢のＣ５７ＢＬ／６の雌（ｎ＝６、各試料の種類につき）（チャールズリバーラボラトリーズ）で実施された。すべての動物実験は、現地の法務担当者によって承認された。動物を、ＦＥＬＡＳＡの基準に従って監視される強制衛生基準の下に保管した。
【００５２】
骨切開を左大腿骨で行った。イソフルラン麻酔をかけた動物の手術部位をシェービングして消毒した後、大腿骨の中央骨幹アプローチのために、膝から股関節までの皮膚の縦横方向の切開（２ｍｍ）を実施した。大腿骨を、坐骨神経を慎重に残こして、外側広筋及び大腿二頭筋の鈍的な前処理によって露出した。外部固定器の接続バーを通るピン配置（直径０．４５ｍｍ）用に一連の穴をドリルで開けて（ＭｏｕｓｅＥｘＦｉｘ、ＲＩＳｙｓｔｅｍ社、ダボス、スイス）、そして外部固定器を大腿骨に平行に横方向に配置した。中央のピンとピンの間において、Ｇｉｇｌｉワイヤーソー（ＲＩＳｙｓｔｅｍ社、ダボス、スイス）を使用して０．７０ｍｍの骨切開を実施した。その後、該放出システムを適用した。以下を参照。皮膚閉鎖後、マウスをケージに戻し、飲料水に塩酸トラマドールを加えた術後鎮痛を実施した（２５ｍｇ／Ｌ）。動物を２１日間の治癒期間後に安楽死させた。
【００５３】
放出システム
フィブリノゲン溶液及びトロンビン−Ｓ溶液（両方ともティスコールキットイムノ、バクスター社）を３７℃に加熱した。３μＬのフィブリノゲン（１６ｍｇ／１００μｌ）を１μＬのトロンビン−Ｓ（製造元プロトコル後に）へ加え、２分間重合してシェルのゲルを調製した。並行して、コアのゲルは、３μｌのフィブリノゲン（２４ｍｇ／１００μｌ）を１μｌのトロンビン−Ｓへ加え、２分間重合して生成した。このコアのゲルは３μＭのイロプロスト（２０μｇ／ｍｌのイロメディン、バイエル社）又は５，４μｌのＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））のいずれかをそれぞれ治療及び対照に含有した。その後、このコアのゲルを、シェルのゲルに入れ、その後１μｌのトロンビン−Ｓへ加えた３μｌのフィブリノゲン（１６ｍｇ／１００μｌ）をさらに追加して完成させた。２分間の重合後、滅菌ピンセットを使用して、該放出システムを骨切開ギャップに慎重に配置した。最後に、６μｌのフィブリノゲン（１６ｍｇ／１００μｌ）及び２μｌのトロンビン−Ｓを使用して、該ヒドロゲル組成物を骨組織に接着した。２分間の重合後、傷を縫い合わせた。
【００５４】
μＣＴ分析
新しく形成される骨化骨組織を、高解像度のマイクロコンピュータ断層撮影（μＣＴ）を使用して分析した。４％ＰＦＡ／ＰＢＳで固定化し、ショ糖勾配で脱水した後、骨折を１０．５μｍの固定等方性ボクセルサイズでスキャンした（Ｖｉｖａ４０  ｍｉｃｒｏ−Ｃｌ、Ｓｅａｎｅｏ  Ｍｅｄｉｃａｌ社、スイス、７０ＫＶｐ、１１４μＡ）。スキャン軸を、大腿骨の骨幹軸と一致させた。骨折カルスが完全に含まれるように、最低でも１０．５μｍで１９０枚を選択した。さらなるその後の後処理では、皮質骨を対象の体積（ＶＯＩ）から手動で除外した。組織の骨化のみを与えることが可能な固定された広域閾値２４０ｍｇ  ＨＡ／ｃｍ３を選択した。すべての分析は、３Ｄ距離技法（Ｓｃａｎｃｏ  ｓｏｆｔｗａｒｅ、スイス）を使用して、デジタル抽出したカルス組織上で実施した。
【００５５】
統計分析
特に明記しない限り、すべてのデータを中央値±ＳＤで表した。マンホイットニーＵ検定は、群間の比較に使用した。統計解析はＳＰＳＳ１８を用いて実施した。
【００５６】
結果：マウス実験
インビボでの結果は、空のビヒクル対照と比較して、イロプロスト充填放出システムによる再生の２１日後に新しく形成された骨の体積が著しく増加したことを示した。これらのデータは、マイクロコンピュータ断層撮影（μＣＴ）スキャンから得られた。
【図１Ａ】
2020531549.tif 000002
【図１Ｂ】
2020531549.tif 000003
【図２】
2020531549.tif 000004
【図３ＡＢＣ】
2020531549.tif 000005
【図３Ｄ】
2020531549.tif 000006
【図３Ｅ】
2020531549.tif 000007
【図４】
2020531549.tif 000008
【国際調査報告】
2020531549.tif 000009
2020531549.tif 000010