(57)【要約】  本開示は、PTPRK(e13)-RSPO3(e2) R-スポンジン遺伝子融合物を増幅することができるプライマー対を含む、Wntシグナリング経路の阻害剤による治療に感受性の悪性腫瘍を患う対象を特定するための多重化増幅反応キットを提供する。また、PTPRK(e13)-RSPO3(e2) R-スポンジン遺伝子融合物をプライマー対により検出する工程を含む、悪性腫瘍を患う対象においてWntシグナリングの阻害剤への感受性を特定する方法が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
PTPRK(e13)-RSPO3(e2) R-スポンジン遺伝子融合物を増幅することができるプライマー対、
野生型PTPRK及び/若しくは野生型RSPO3配列を増幅することができるコントロールプライマー対、並びに/又は
合成オリゴヌクレオチド内部コントロール鋳型配列、及び合成内部コントロール鋳型配列を増幅することができる内部コントロールプライマー対
を含む、Wntシグナリング経路の阻害剤による治療に感受性の悪性腫瘍を患う対象を特定するための多重化増幅反応キット。
【請求項２】
1つ若しくは複数のR-スポンジン遺伝子融合物を増幅することができるプライマー対であって、R-スポンジン遺伝子融合物が、PTPRK(e1)-RSPO3(e2)融合物、PTPRK(e7)-RSPO3(e2)融合物若しくはEIF3E(e1)-RSPO2(e2)融合物である、プライマー対、
野生型PTPRK、野生型EIF3E、野生型RSPO2及び/若しくは野生型RSPO3配列を増幅することができるコントロールプライマー対、並びに/又は
合成オリゴヌクレオチド内部コントロール鋳型配列、及び1つ若しくは複数の合成内部コントロール鋳型配列を増幅することができる内部コントロールプライマー対
を含む1つ又は複数の追加の多重化増幅反応
を更に含む、請求項1に記載のキット。
【請求項３】
1つ若しくは複数のR-スポンジン遺伝子融合物、1つ若しくは複数の野生型遺伝子又は1つ若しくは複数の内部コントロール配列における配列と相補的な1つ又は複数のプローブ配列を更に含む、請求項1又は2に記載のキット。
【請求項４】
1つ又は複数のプローブ配列が、フルオロフォア部分を更に含む、請求項3に記載のキット。
【請求項５】
フルオロフォア部分が、FAM、HEX、JOE、Cy3、Cy5、TAMRA、Tye 563、Tye 556、TEX 615、Cal Red 610又はLCRED640である、請求項4に記載のキット。
【請求項６】
リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応を実行するための試薬を更に含む、請求項4に記載のキット。
【請求項７】
Wnt阻害剤が、構造(I):
【化１】
2020503018.tif 000093
{式中、
R1、R2、R3、R4及びR5は各々独立して、H又はアルキル基であり;
Dは、H、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、アリール及びジアルキルアミノからなる群から選択され、各々(H及びハロゲン以外)は、任意選択で置換され;
Arは、任意選択で置換されているアリール又はヘテロアリール基であり;
Cyは、少なくとも1つのヘテロ原子を含有するアリール、ヘテロアリール又は飽和環であり、各々は、任意選択で置換され;
nは、1〜3の整数であり、
n=1である場合、R3及びR4のうちの1つはメチルであり、他方はHであり、化合物の立体化学は、部分構造(II):
【化２】
2020503018.tif 000094
において示される通りである}
を有する、請求項1又は2に記載のキット。
【請求項８】
Wnt阻害剤が、構造(III):
【化３】
2020503018.tif 000095
{式中:
R1は、H;任意選択で置換されているアルキル(任意選択の置換基は、C1-6アルコキシ、NH2、-NHC1-3アルキル及び-N(C1-3アルキル)2から各々独立して選択される1つ又は複数の置換基を含む);-C(O)Oアルキル;ハロアルキル;ハロアルコキシ;又は-アルキルアリールを表し;
各R2は独立して、H;任意選択で置換されているアルキル(任意選択の置換基は、C1-6アルコキシ、NH2、-NHC1-3アルキル及び-N(C1-3アルキル)2から各々独立して選択される1つ又は複数の置換基を含む);-アルキルアリール;任意選択で置換されているカルボシクリル(任意選択の置換基は、C1-6アルキル、C1-6アルコキシ、C1-6ハロアルキル、C1-6ハロアルコキシ及びハロから各々独立して選択される1つ又は複数の置換基を含む);任意選択で置換されているヘテロシクリル(任意選択の置換基は、C1-6アルキル、C1-6アルコキシ、-C(O)OC1-6アルキル、-C(O)C1-6アルキル及び-C(O)NHC1-6アルキルから各々独立して選択される1つ又は複数の置換基を含む);-NHアルキル;-N(アルキル)2;アミノ;ヒドロキシル;アルコキシ又はハロを表し;
nは、0、1又は2を表し;
R3は、H又はアルキルを表し;
R4は、H又はアルキルを表し;
R5は、H又はアルキルを表し;
W及びXは各々独立して、C=O;C=S;又はCH2を表し;
Yは、アリール;ヘテロアリール;任意選択で置換されているカルボシクリル(任意選択の置換基は、C1-6アルキル、C1-6アルコキシ、C1-6ハロアルキル、C1-6ハロアルコキシ及びハロから各々独立して選択される1つ又は複数の置換基を含む);又は任意選択で置換されているヘテロシクリル(任意選択の置換基は、C1-6アルキル、C1-6アルコキシ、-C(O)OC1-6アルキル、-C(O)C1-6アルキル及び-C(O)NHC1-6アルキルから各々独立して選択される1つ又は複数の置換基を含む)を表し;
Zは、任意選択で置換されているアルキル(任意選択の置換基は、C1-6アルコキシ、NH2、-NHC1-3アルキル及び-N(C1-3アルキル)2から各々独立して選択される1つ又は複数の置換基を含む);アリール;ヘテロアリール;-アルキルアリール;-アルキルヘテロアリール;任意選択で置換されているカルボシクリル(任意選択の置換基は、C1-6アルキル、C1-6アルコキシ、C1-6ハロアルキル、C1-6ハロアルコキシ及びハロから各々独立して選択される1つ又は複数の置換基を含む);任意選択で置換されているヘテロシクリル(任意選択の置換基は、C1-6アルキル、C1-6アルコキシ、-C(O)OC1-6アルキル、-C(O)C1-6アルキル及び-C(O)NHC1-6アルキルから各々独立して選択される1つ又は複数の置換基を含む);カルボシクリルが任意選択で置換されている-アルキルカルボシクリル(任意選択の置換基は、C1-6アルキル、C1-6アルコキシ、C1-6ハロアルコキシ及びハロから各々独立して選択される1つ又は複数の置換基を含む);ヘテロシクリルが任意選択で置換されている-アルキルヘテロシクリル(任意選択の置換基は、C1-6アルキル、-C(O)OC1-6アルキル、-C(O)C1-6アルキル及び-C(O)NHC1-6アルキルから各々独立して選択される1つ又は複数の置換基を含む);カルボシクリルが任意選択で置換されている-アリールカルボシクリル(任意選択の置換基は、C1-6アルキル、C1-6アルコキシ、C1-6ハロアルコキシ及びハロから各々独立して選択される1つ又は複数の置換基を含む);又はヘテロシクリルが任意選択で置換されている-アリールヘテロシクリル(任意選択の置換基は、C1-6アルキル、-C(O)OC1-6アルキル、-C(O)C1-6アルキル及び-C(O)NHC1-6アルキルから各々独立して選択される1つ又は複数の置換基を含む)を表す}
を有する、請求項1又は2に記載のキット。
【請求項９】
Wntシグナリング経路の阻害剤が、porcupine阻害剤である、請求項1又は2に記載のキット。
【請求項１０】
porcupine阻害剤が、
2-(1,3-ジメチル-2,6-ジオキソ-1,2,3,6-テトラヒドロ-7H-プリン-7-イル)-N-(6-フェニルピリダジン-3-イル)アセトアミド、2-(1,3-ジメチル-2,6-ジオキソ-2,3-ジヒドロ-1H-プリン-7(6H)-イル)-N-(6-フェニルピリダジン-3-イル)アセトアミド、若しくは構造(IV):
【化４】
2020503018.tif 000096
の化合物;又は
4-(2-メチル-6,7-ジヒドロピラゾロール[1,5-a]ピリミジン-4(5H)-イル)-4-オキソ-N-(6-(ピリジン-3-イル)ピラジジン-3-イル)ブタンアミド、若しくは構造(V):
【化５】
2020503018.tif 000097
の化合物
である、請求項9に記載のキット。
【請求項１１】
悪性腫瘍が、上昇したWnt活性レベルによって特徴付けられる、請求項1又は2に記載のキット。
【請求項１２】
上昇したWnt活性レベルが、転写において、又は転写後において上昇している、請求項11に記載のキット。
【請求項１３】
悪性腫瘍が、固形悪性腫瘍である、請求項1又は2に記載のキット。
【請求項１４】
悪性腫瘍が、食道、胆嚢、肝臓、膵臓、胃、小腸、大腸、結腸、直腸又は肛門の消化器がんである、請求項1又は2に記載のキット。
【請求項１５】
悪性腫瘍を患う対象においてPTPRK(e13)-RSPO3(e2) R-スポンジン遺伝子融合物を検出する方法であって、
対象からの試料から核酸を抽出する工程と、
1つ又は複数のプライマー対により核酸を増幅する工程であって、
プライマー対が、PTPRK(e13)-RSPO3(e2)遺伝子融合物を増幅することができる、
工程と、
増幅した核酸を検出する工程と
を含む方法。
【請求項１６】
PTPRK(e1)-RSPO3(e2)融合物、PTPRK(e7)-RSPO3(e2)融合物及び/又はEIF3E(e1)-RSPO2(e2)融合物を増幅することができる1つ又は複数のプライマー対により核酸を増幅する工程を更に含む、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
試料が、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)固定腫瘍組織又は新鮮凍結腫瘍からの組織である、請求項15又は16に記載の方法。
【請求項１８】
核酸が、RNAである、請求項15又は16に記載の方法。
【請求項１９】
増幅工程が、リアルタイムPCR増幅反応を含む、請求項15又は16に記載の方法。
【請求項２０】
悪性腫瘍が、食道、胆嚢、肝臓、膵臓、胃、小腸、大腸、結腸、直腸又は肛門の消化器がんである、請求項15又は16に記載の方法。
【請求項２１】
1つ又は複数のR-スポンジン遺伝子融合物が検出された場合、Wntシグナリング経路の阻害剤により対象を治療する工程を更に含む、請求項15又は16に記載の方法。
【請求項２２】
Wntシグナリング経路の阻害剤が、porcupine阻害剤である、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
porcupine阻害剤が、
2-(1,3-ジメチル-2,6-ジオキソ-1,2,3,6-テトラヒドロ-7H-プリン-7-イル)-N-(6-フェニルピリダジン-3-イル)アセトアミド、2-(1,3-ジメチル-2,6-ジオキソ-2,3-ジヒドロ-1H-プリン-7(6H)-イル)-N-(6-フェニルピリダジン-3-イル)アセトアミド、若しくは構造(IV):
【化６】
2020503018.tif 000098
の化合物;又は
4-(2-メチル-6,7-ジヒドロピラゾロール[1,5-a]ピリミジン-4(5H)-イル)-4-オキソ-N-(6-(ピリジン-3-イル)ピラジジン-3-イル)ブタンアミド、若しくは構造(V):
【化７】
2020503018.tif 000099
の化合物
である、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
悪性腫瘍を患う対象においてWntシグナリングの阻害剤への感受性を特定する方法であって、
対象からの試料から核酸を抽出する工程と、
PTPRK(e13)-RSPO3(e2) R-スポンジン遺伝子融合物を増幅することができるプライマー対により核酸を増幅する工程と、
PTPRK(e13)-RSPO3(e2) R-スポンジン遺伝子融合物が増幅された場合、Wntシグナリングの阻害剤への感受性を特定する工程と
を含む方法。
【請求項２５】
PTPRK(e1)-RSPO3(e2)融合物、PTPRK(e7)-RSPO3(e2)融合物又はEIF3E(e1)-RSPO2(e2)融合物を増幅することができる1つ又は複数の追加のプライマー対により核酸を増幅する工程と、
PTPRK(e1)-RSPO3(e2)融合物、PTPRK(e7)-RSPO3(e2)融合物、PTPRK(e13)-RSPO3(e2)融合物又はEIF3E(e1)-RSPO2(e2)融合物が増幅された場合、Wntシグナリングの阻害剤への感受性を特定する工程と
を更に含む、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
前記悪性腫瘍が、請求項25又は26に記載の方法に従って特定されている、悪性腫瘍を有する対象を治療する方法。
【請求項２７】
対象が、Wntシグナリング経路の阻害剤により治療される、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
対象が、Wnt-porcupine阻害剤により治療される、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
Wnt-porcupine阻害剤が、
2-(1,3-ジメチル-2,6-ジオキソ-1,2,3,6-テトラヒドロ-7H-プリン-7-イル)-N-(6-フェニルピリダジン-3-イル)アセトアミド、2-(1,3-ジメチル-2,6-ジオキソ-2,3-ジヒドロ-1H-プリン-7(6H)-イル)-N-(6-フェニルピリダジン-3-イル)アセトアミド、若しくは構造(IV):
【化８】
2020503018.tif 000100
の化合物;又は
4-(2-メチル-6,7-ジヒドロピラゾロール[1,5-a]ピリミジン-4(5H)-イル)-4-オキソ-N-(6-(ピリジン-3-イル)ピラジジン-3-イル)ブタンアミド、若しくは構造(V):
【化９】
2020503018.tif 000101
の化合物
である、請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
悪性腫瘍が、食道、胆嚢、肝臓、膵臓、胃、小腸、大腸、結腸、直腸又は肛門の消化器がんである、請求項24又は25に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2016年12月21日出願のシンガポール仮出願第10201610735P号及び2017年5月19日出願のシンガポール仮出願第10201704134V号の優先権の利益を主張し、両出願の内容は、すべての目的でその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、分子生物学、特にバイオマーカーに関する。特に、本発明は、Wntシグナリング経路の阻害剤による治療に感受性であるか、又は感受性である可能性が高い悪性腫瘍と関連付けられるバイオマーカーの検出及び定量に関する。
【背景技術】
【０００３】
がんは、世界で第2位の死亡原因であり、2012年において820万例の死亡原因である。ここ数十年、標準医療は、群ベースの疫学研究によってガイドされており、個体の遺伝的変異によっては説明されず、結論のほとんどは、集団レベルに基づく。更に、がんの治療は歴史的に、全身性細胞傷害性化学療法からなっている。化学療法は、増殖又は分裂中の細胞を殺滅する一般的な目的を有し、化学療法は、がんを有する一部の患者においては症状を低減し、クオリティ・オブ・ライフを改善し、生存を延長する。しかしながら、全身性細胞傷害性化学療法はまた、正常な非がん性細胞を殺滅し、したがって、多くの副作用、例えば脱毛、下痢、吐き気、嘔吐、血液障害、消化器障害及び排尿障害をもたらす。
【０００４】
現代の個別化医療の発展は、過去十年にわたり改善されてきた。現代の個別化医療は、ターゲティング療法に基づく。ターゲティングがん療法においては、がんを引き起こす変更された経路及び成分についての情報が利用可能であることが重要である。個別化医療の目的は、適切な薬物を適切な用量で、最小限の毒性で、又は毒性を伴わずに、適切な患者について適切な時間に使用することである。悪性腫瘍を駆動する分子経路の理解の改善は、悪性細胞の開始における特定の分子経路をターゲティングする剤の開発をもたらした。これらの剤が、悪性細胞を優先的に殺滅することができるが、正常細胞には比較的無害であることが期待されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許出願公開第20040162263号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
がんを有する患者において、多くの型の遺伝的及び後成的変異が存在するので、様々ながん患者のための様々なターゲティングがん療法を開発することについて継続中の要求が存在している。また、がん患者をスクリーニングし、がん患者に適切なターゲティングがん療法を選択する、より迅速かつ高感度の方法について継続中の要求が存在している。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
第1の態様においては、PTPRK(e13)-RSPO3(e2) R-スポンジン遺伝子融合物を増幅することができるプライマー対、野生型PTPRK及び/若しくは野生型RSPO3配列を増幅することができるコントロールプライマー対、並びに/又は合成オリゴヌクレオチド内部コントロール鋳型配列、及び合成内部コントロール鋳型配列を増幅することができる内部コントロールプライマー対を含む、Wntシグナリング経路の阻害剤による治療に感受性の悪性腫瘍を患う対象を特定するための多重化増幅反応キットが提供される。
【０００８】
第2の態様においては、悪性腫瘍を患う対象においてPTPRK(e13)-RSPO3(e2) R-スポンジン遺伝子融合物を検出する方法であって、対象からの試料から核酸を抽出する工程と;1つ又は複数のプライマー対により核酸を増幅する工程であって、プライマー対が、PTPRK(e13)-RSPO3(e2)遺伝子融合物を増幅することができる、工程と;増幅した核酸を検出する工程とを含む方法が提供される。
【０００９】
第3の態様においては、悪性腫瘍を患う対象においてWntシグナリングの阻害剤への感受性を特定する方法であって、対象からの試料から核酸を抽出する工程と;PTPRK(e13)-RSPO3(e2) R-スポンジン遺伝子融合物を増幅することができるプライマー対により核酸を増幅する工程と;PTPRK(e13)-RSPO3(e2) R-スポンジン遺伝子融合物が増幅された場合、Wntシグナリングの阻害剤への感受性を特定する工程とを含む方法が提供される。
【００１０】
第4の態様においては、前記悪性腫瘍が、第2又は第3の態様の方法に従って特定されている、悪性腫瘍を有する対象を治療する方法が提供される。
【００１１】
本発明は、詳細な説明を参照して、非限定的な実施例及び添付の図面と併せて考慮するとより理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１−１】RSPO遺伝子融合物を有する2つ異なる結腸直腸がん患者由来s.c.異種移植、CR2506及びCR3150におけるETC-1922159の効果を示した図である。雌Balb/cヌードマウス(8〜10週齢)の両側腹部に腫瘍断片を移植した(n=6動物/12腫瘍/群)。平均腫瘍体積が120及び143mm3である0日目に連日経口投与を開始し、(A)は移植してから35日後で、(C)は移植してから22日後であり、腫瘍体積の図は動物当たり2腫瘍の群平均(n=12)を示し、*はD24に1匹の動物が死んだ後のn=10の平均を示す。剖検時に、腫瘍を切除し、個々の質量を測定した(B及びD)。平均群体重(n=6)をE及びFに示し、*で示した媒体群についてはn=5である。結果は、ETC-1922159が両異種移植において抗腫瘍抗力を表すことを示す。
【図１−２】RSPO遺伝子融合物を有する2つ異なる結腸直腸がん患者由来s.c.異種移植、CR2506及びCR3150におけるETC-1922159の効果を示した図である。雌Balb/cヌードマウス(8〜10週齢)の両側腹部に腫瘍断片を移植した(n=6動物/12腫瘍/群)。平均腫瘍体積が120及び143mm3である0日目に連日経口投与を開始し、(A)は移植してから35日後で、(C)は移植してから22日後であり、腫瘍体積の図は動物当たり2腫瘍の群平均(n=12)を示し、*はD24に1匹の動物が死んだ後のn=10の平均を示す。剖検時に、腫瘍を切除し、個々の質量を測定した(B及びD)。平均群体重(n=6)をE及びFに示し、*で示した媒体群についてはn=5である。結果は、ETC-1922159が両異種移植において抗腫瘍抗力を表すことを示す。
【図１−３】RSPO遺伝子融合物を有する2つ異なる結腸直腸がん患者由来s.c.異種移植、CR2506及びCR3150におけるETC-1922159の効果を示した図である。雌Balb/cヌードマウス(8〜10週齢)の両側腹部に腫瘍断片を移植した(n=6動物/12腫瘍/群)。平均腫瘍体積が120及び143mm3である0日目に連日経口投与を開始し、(A)は移植してから35日後で、(C)は移植してから22日後であり、腫瘍体積の図は動物当たり2腫瘍の群平均(n=12)を示し、*はD24に1匹の動物が死んだ後のn=10の平均を示す。剖検時に、腫瘍を切除し、個々の質量を測定した(B及びD)。平均群体重(n=6)をE及びFに示し、*で示した媒体群についてはn=5である。結果は、ETC-1922159が両異種移植において抗腫瘍抗力を表すことを示す。
【図２−１】CR3150結腸直腸がんPDXモデルにおけるETC-1922159の抗腫瘍抗力及び忍容性を示した図である。CR3150腫瘍は、接種腫瘍の断片からトロカール針を使用してBalb/Cヌードマウスの右側腹部に皮下移植された。動物を群分けし(媒体群n=12、残存群n=10)、媒体又はETC-1922159のいずれかで隔日治療した(17日目以降、Gr.2のみn=9)。(A)は連日測定した平均体重を示し、(B)はキャピラリーを使用して隔日測定した腫瘍体積を示す。最終投与後に動物を殺処分し、バイオマーカー分析のために腫瘍及び代替組織を収集した。エラーバーはすべてSEMを示す。(C)については、腫瘍湿質量を群当たりn=9のみから収集し(動物1〜9)、アスタリスクはP<0.001を示す。結果は、ETC-1922159の抗腫瘍抗力及び忍容性がPTPRK-RSPO3遺伝子融合物を有するCR3150結腸直腸がんPDXモデルにおいて認められることを示す。
【図２−２】CR3150結腸直腸がんPDXモデルにおけるETC-1922159の抗腫瘍抗力及び忍容性を示した図である。CR3150腫瘍は、接種腫瘍の断片からトロカール針を使用してBalb/Cヌードマウスの右側腹部に皮下移植された。動物を群分けし(媒体群n=12、残存群n=10)、媒体又はETC-1922159のいずれかで隔日治療した(17日目以降、Gr.2のみn=9)。(A)は連日測定した平均体重を示し、(B)はキャピラリーを使用して隔日測定した腫瘍体積を示す。最終投与後に動物を殺処分し、バイオマーカー分析のために腫瘍及び代替組織を収集した。エラーバーはすべてSEMを示す。(C)については、腫瘍湿質量を群当たりn=9のみから収集し(動物1〜9)、アスタリスクはP<0.001を示す。結果は、ETC-1922159の抗腫瘍抗力及び忍容性がPTPRK-RSPO3遺伝子融合物を有するCR3150結腸直腸がんPDXモデルにおいて認められることを示す。
【図３−１】様々な用量のETC-1922159の効果を示した図である。CR3150腫瘍を有するマウスの腫瘍(n=3/群)を媒体又はETC-1922159の最終投与の24時間後に採取し、FFPE固定した。免疫組織化学分析のために、切片はVentana社CONFIRM抗Ki-67(30-9)一次モノクローナル抗体でLeica社BondRX自動染色装置によって染色した。病理学者の検討を支援するため、対応する切片はH&Eで染色した。免疫組織学的染色の評価は、病理学者が手作業によって、及びデジタル的に実施した。判定されたパーセンテージは、3つの低倍率視野画像の平均である。(A)は群当たりn=3のKi67染色(20×)を示す。(B)はKi67染色の平均%を示しており、左はデジタル的に計数し、右は手作業によって評価している(C)。エラーバーは標準偏差を示す。結果は、ETC-1922159治療が用量依存的に腫瘍細胞増幅を阻害することを示す。
【図３−２】様々な用量のETC-1922159の効果を示した図である。CR3150腫瘍を有するマウスの腫瘍(n=3/群)を媒体又はETC-1922159の最終投与の24時間後に採取し、FFPE固定した。免疫組織化学分析のために、切片はVentana社CONFIRM抗Ki-67(30-9)一次モノクローナル抗体でLeica社BondRX自動染色装置によって染色した。病理学者の検討を支援するため、対応する切片はH&Eで染色した。免疫組織学的染色の評価は、病理学者が手作業によって、及びデジタル的に実施した。判定されたパーセンテージは、3つの低倍率視野画像の平均である。(A)は群当たりn=3のKi67染色(20×)を示す。(B)はKi67染色の平均%を示しており、左はデジタル的に計数し、右は手作業によって評価している(C)。エラーバーは標準偏差を示す。結果は、ETC-1922159治療が用量依存的に腫瘍細胞増幅を阻害することを示す。
【図４−１】PTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合物(A)及び内部コントロール(B)の増幅プロットを示す図である。各試料は、100コピーの内部コントロールプラスミド及び1000、100、10又は1コピーの陽性コントロールプラスミドをそれぞれ含有する。結果は、考案したPCR増幅反応がPTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合物陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールプラスミドをうまく増幅させることができることを示す。
【図４−２】PTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合物(A)及び内部コントロール(B)の増幅プロットを示す図である。各試料は、100コピーの内部コントロールプラスミド及び1000、100、10又は1コピーの陽性コントロールプラスミドをそれぞれ含有する。結果は、考案したPCR増幅反応がPTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合物陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールプラスミドをうまく増幅させることができることを示す。
【図５−１】PTPRK(e1/e2)野生型陽性コントロールプラスミドを含有する試料(A)及びヒト全RNAを含有する試料(C)中におけるPTPRK(e1/e2)野生型の増幅プロットを示す図である。図5はまた、PTPRK(e1/e2)野生型陽性コントロールプラスミドを含有する試料(B)及びヒト全RNAを含有する試料(D)中における内部コントロールの増幅プロットを示す。結果は、考案されたPCR増幅反応がPTPRK(e1/e2)野生型陽性コントロールプラスミドを含有する試料及びヒト全RNAを含有する試料においてPTPRK(e1/e2)野生型及び内部コントロールプラスミドをうまく増幅させることができることを示す。
【図５−２】PTPRK(e1/e2)野生型陽性コントロールプラスミドを含有する試料(A)及びヒト全RNAを含有する試料(C)中におけるPTPRK(e1/e2)野生型の増幅プロットを示す図である。図5はまた、PTPRK(e1/e2)野生型陽性コントロールプラスミドを含有する試料(B)及びヒト全RNAを含有する試料(D)中における内部コントロールの増幅プロットを示す。結果は、考案されたPCR増幅反応がPTPRK(e1/e2)野生型陽性コントロールプラスミドを含有する試料及びヒト全RNAを含有する試料においてPTPRK(e1/e2)野生型及び内部コントロールプラスミドをうまく増幅させることができることを示す。
【図５−３】PTPRK(e1/e2)野生型陽性コントロールプラスミドを含有する試料(A)及びヒト全RNAを含有する試料(C)中におけるPTPRK(e1/e2)野生型の増幅プロットを示す図である。図5はまた、PTPRK(e1/e2)野生型陽性コントロールプラスミドを含有する試料(B)及びヒト全RNAを含有する試料(D)中における内部コントロールの増幅プロットを示す。結果は、考案されたPCR増幅反応がPTPRK(e1/e2)野生型陽性コントロールプラスミドを含有する試料及びヒト全RNAを含有する試料においてPTPRK(e1/e2)野生型及び内部コントロールプラスミドをうまく増幅させることができることを示す。
【図５−４】PTPRK(e1/e2)野生型陽性コントロールプラスミドを含有する試料(A)及びヒト全RNAを含有する試料(C)中におけるPTPRK(e1/e2)野生型の増幅プロットを示す図である。図5はまた、PTPRK(e1/e2)野生型陽性コントロールプラスミドを含有する試料(B)及びヒト全RNAを含有する試料(D)中における内部コントロールの増幅プロットを示す。結果は、考案されたPCR増幅反応がPTPRK(e1/e2)野生型陽性コントロールプラスミドを含有する試料及びヒト全RNAを含有する試料においてPTPRK(e1/e2)野生型及び内部コントロールプラスミドをうまく増幅させることができることを示す。
【図６−１】RSPO3(e1/e2)野生型陽性コントロールプラスミドを含有する試料(A)及びヒト全RNAを含有する試料(C)中におけるRSPO3(e1/e2)野生型の増幅プロットを示す図である。図6はまた、RSPO3(e1/e2)野生型陽性コントロールプラスミドを含有する試料(B)及びヒト全RNAを含有する試料(D)中における内部コントロールの増幅プロットを示す。結果は、考案されたPCR増幅反応がRSPO3(e1/e2)野生型陽性コントロールプラスミドを含有する試料及びヒト全RNAを含有する試料中においてRSPO3(e1/e2)野生型及び内部コントロールプラスミドをうまく増幅させることができることを示す。
【図６−２】RSPO3(e1/e2)野生型陽性コントロールプラスミドを含有する試料(A)及びヒト全RNAを含有する試料(C)中におけるRSPO3(e1/e2)野生型の増幅プロットを示す図である。図6はまた、RSPO3(e1/e2)野生型陽性コントロールプラスミドを含有する試料(B)及びヒト全RNAを含有する試料(D)中における内部コントロールの増幅プロットを示す。結果は、考案されたPCR増幅反応がRSPO3(e1/e2)野生型陽性コントロールプラスミドを含有する試料及びヒト全RNAを含有する試料中においてRSPO3(e1/e2)野生型及び内部コントロールプラスミドをうまく増幅させることができることを示す。
【図６−３】RSPO3(e1/e2)野生型陽性コントロールプラスミドを含有する試料(A)及びヒト全RNAを含有する試料(C)中におけるRSPO3(e1/e2)野生型の増幅プロットを示す図である。図6はまた、RSPO3(e1/e2)野生型陽性コントロールプラスミドを含有する試料(B)及びヒト全RNAを含有する試料(D)中における内部コントロールの増幅プロットを示す。結果は、考案されたPCR増幅反応がRSPO3(e1/e2)野生型陽性コントロールプラスミドを含有する試料及びヒト全RNAを含有する試料中においてRSPO3(e1/e2)野生型及び内部コントロールプラスミドをうまく増幅させることができることを示す。
【図６−４】RSPO3(e1/e2)野生型陽性コントロールプラスミドを含有する試料(A)及びヒト全RNAを含有する試料(C)中におけるRSPO3(e1/e2)野生型の増幅プロットを示す図である。図6はまた、RSPO3(e1/e2)野生型陽性コントロールプラスミドを含有する試料(B)及びヒト全RNAを含有する試料(D)中における内部コントロールの増幅プロットを示す。結果は、考案されたPCR増幅反応がRSPO3(e1/e2)野生型陽性コントロールプラスミドを含有する試料及びヒト全RNAを含有する試料中においてRSPO3(e1/e2)野生型及び内部コントロールプラスミドをうまく増幅させることができることを示す。
【図７−１】連続希釈した陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールを含有する試料中におけるPTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合物(A)及び内部コントロールプラスミド(C)の多重化増幅プロットを示す図である。連続希釈した陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールを含有する試料中におけるPTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合物(B)及び内部コントロールプラスミド(D)の単一化増幅プロットも示される。結果は、陰性ΔCt値によって示されるように、全般的に多重化増幅反応は単一化反応より敏感であることを示す。
【図７−２】連続希釈した陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールを含有する試料中におけるPTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合物(A)及び内部コントロールプラスミド(C)の多重化増幅プロットを示す図である。連続希釈した陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールを含有する試料中におけるPTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合物(B)及び内部コントロールプラスミド(D)の単一化増幅プロットも示される。結果は、陰性ΔCt値によって示されるように、全般的に多重化増幅反応は単一化反応より敏感であることを示す。
【図７−３】連続希釈した陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールを含有する試料中におけるPTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合物(A)及び内部コントロールプラスミド(C)の多重化増幅プロットを示す図である。連続希釈した陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールを含有する試料中におけるPTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合物(B)及び内部コントロールプラスミド(D)の単一化増幅プロットも示される。結果は、陰性ΔCt値によって示されるように、全般的に多重化増幅反応は単一化反応より敏感であることを示す。
【図７−４】連続希釈した陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールを含有する試料中におけるPTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合物(A)及び内部コントロールプラスミド(C)の多重化増幅プロットを示す図である。連続希釈した陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールを含有する試料中におけるPTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合物(B)及び内部コントロールプラスミド(D)の単一化増幅プロットも示される。結果は、陰性ΔCt値によって示されるように、全般的に多重化増幅反応は単一化反応より敏感であることを示す。
【図８−１】連続希釈した陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールを含有する試料中におけるPTPRK(e1/e2)野生型(A)及び内部コントロールプラスミド(C)の多重化増幅プロットを示す図である。連続希釈した陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールを含有する試料中におけるPTPRK(e1/e2)野生型(B)及び内部コントロールプラスミド(D)の単一化増幅プロットも示される。結果は、陰性ΔCt値によって示されるように、全般的に多重化増幅反応は単一化反応より敏感であることを示す。
【図８−２】連続希釈した陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールを含有する試料中におけるPTPRK(e1/e2)野生型(A)及び内部コントロールプラスミド(C)の多重化増幅プロットを示す図である。連続希釈した陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールを含有する試料中におけるPTPRK(e1/e2)野生型(B)及び内部コントロールプラスミド(D)の単一化増幅プロットも示される。結果は、陰性ΔCt値によって示されるように、全般的に多重化増幅反応は単一化反応より敏感であることを示す。
【図８−３】連続希釈した陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールを含有する試料中におけるPTPRK(e1/e2)野生型(A)及び内部コントロールプラスミド(C)の多重化増幅プロットを示す図である。連続希釈した陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールを含有する試料中におけるPTPRK(e1/e2)野生型(B)及び内部コントロールプラスミド(D)の単一化増幅プロットも示される。結果は、陰性ΔCt値によって示されるように、全般的に多重化増幅反応は単一化反応より敏感であることを示す。
【図８−４】連続希釈した陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールを含有する試料中におけるPTPRK(e1/e2)野生型(A)及び内部コントロールプラスミド(C)の多重化増幅プロットを示す図である。連続希釈した陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールを含有する試料中におけるPTPRK(e1/e2)野生型(B)及び内部コントロールプラスミド(D)の単一化増幅プロットも示される。結果は、陰性ΔCt値によって示されるように、全般的に多重化増幅反応は単一化反応より敏感であることを示す。
【図９−１】連続希釈した陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールを含有する試料中におけるRSPO3(e1/e2)野生型(A)及び内部コントロールプラスミド(C)の多重化増幅プロットを示す図である。連続希釈した陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールを含有する試料中におけるRSPO3(e1/e2)野生型(B)及び内部コントロールプラスミド(D)の単一化増幅プロットも示される。結果は、陰性ΔCt値によって示されるように、全般的に多重化増幅反応は単一化反応より敏感であることを示す。
【図９−２】連続希釈した陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールを含有する試料中におけるRSPO3(e1/e2)野生型(A)及び内部コントロールプラスミド(C)の多重化増幅プロットを示す図である。連続希釈した陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールを含有する試料中におけるRSPO3(e1/e2)野生型(B)及び内部コントロールプラスミド(D)の単一化増幅プロットも示される。結果は、陰性ΔCt値によって示されるように、全般的に多重化増幅反応は単一化反応より敏感であることを示す。
【図９−３】連続希釈した陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールを含有する試料中におけるRSPO3(e1/e2)野生型(A)及び内部コントロールプラスミド(C)の多重化増幅プロットを示す図である。連続希釈した陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールを含有する試料中におけるRSPO3(e1/e2)野生型(B)及び内部コントロールプラスミド(D)の単一化増幅プロットも示される。結果は、陰性ΔCt値によって示されるように、全般的に多重化増幅反応は単一化反応より敏感であることを示す。
【図９−４】連続希釈した陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールを含有する試料中におけるRSPO3(e1/e2)野生型(A)及び内部コントロールプラスミド(C)の多重化増幅プロットを示す図である。連続希釈した陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールを含有する試料中におけるRSPO3(e1/e2)野生型(B)及び内部コントロールプラスミド(D)の単一化増幅プロットも示される。結果は、陰性ΔCt値によって示されるように、全般的に多重化増幅反応は単一化反応より敏感であることを示す。
【図１０−１】ヒト全RNAを含有する試料中におけるPTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合物、PTPRK(e1/e2)野生型、RSPO3(e1/e2)野生型及び内部コントロールの多重化検出の増幅プロットを示す図である(A)。図10はまた、PTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合物(B)、PTPRK(e1/e2)野生型(C)及びRSPO3(e1/e2)野生型(D)の単一化反応のそれぞれの増幅プロットを示す。各Ct値は、増幅プロットの下に示される。多重化増幅反応を使用して得られたCt値と単一化増幅反応を使用して得られたCt値の間の差はΔCtによって表され、また表に含まれる。結果は、PTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合物がヒト全RNA試料中で検出されなかったことを示す。結果はまた、陰性ΔCt値によって示されるように、PTPRK(e1/e2)野生型の増幅の多重化増幅反応は同じ標的についての単一化反応より敏感であることを示す。
【図１０−２】ヒト全RNAを含有する試料中におけるPTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合物、PTPRK(e1/e2)野生型、RSPO3(e1/e2)野生型及び内部コントロールの多重化検出の増幅プロットを示す図である(A)。図10はまた、PTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合物(B)、PTPRK(e1/e2)野生型(C)及びRSPO3(e1/e2)野生型(D)の単一化反応のそれぞれの増幅プロットを示す。各Ct値は、増幅プロットの下に示される。多重化増幅反応を使用して得られたCt値と単一化増幅反応を使用して得られたCt値の間の差はΔCtによって表され、また表に含まれる。結果は、PTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合物がヒト全RNA試料中で検出されなかったことを示す。結果はまた、陰性ΔCt値によって示されるように、PTPRK(e1/e2)野生型の増幅の多重化増幅反応は同じ標的についての単一化反応より敏感であることを示す。
【図１０−３】ヒト全RNAを含有する試料中におけるPTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合物、PTPRK(e1/e2)野生型、RSPO3(e1/e2)野生型及び内部コントロールの多重化検出の増幅プロットを示す図である(A)。図10はまた、PTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合物(B)、PTPRK(e1/e2)野生型(C)及びRSPO3(e1/e2)野生型(D)の単一化反応のそれぞれの増幅プロットを示す。各Ct値は、増幅プロットの下に示される。多重化増幅反応を使用して得られたCt値と単一化増幅反応を使用して得られたCt値の間の差はΔCtによって表され、また表に含まれる。結果は、PTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合物がヒト全RNA試料中で検出されなかったことを示す。結果はまた、陰性ΔCt値によって示されるように、PTPRK(e1/e2)野生型の増幅の多重化増幅反応は同じ標的についての単一化反応より敏感であることを示す。
【図１１−１】CR3150腫瘍RNAを含有する試料中におけるPTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合物、PTPRK(e1/e2)野生型、RSPO3(e1/e2)野生型及び内部コントロールの多重化検出の増幅プロットを示す図である(A)。CR3150腫瘍は、PTPRK(e1)+RSPO3(e2)遺伝子融合物を含有することが知られていた。図11はまた、PTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合物(B)、PTPRK(e1/e2)野生型(C)及びRSPO3(e1/e2)野生型(D)の単一化反応のそれぞれの増幅プロットを示す。各Ct値は、増幅プロットの下に示す。多重化増幅反応を使用して得られたCt値と単一化増幅反応を使用して得られたCt値の間の差はΔCtによって表され、また表に含まれる。結果は、PTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合物がCR3150腫瘍RNA試料中で検出されたことを示す。結果はまた、陰性ΔCt値によって示されるように、全般的に多重化増幅反応は同じ標的についての単一化反応より敏感であることを示す。
【図１１−２】CR3150腫瘍RNAを含有する試料中におけるPTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合物、PTPRK(e1/e2)野生型、RSPO3(e1/e2)野生型及び内部コントロールの多重化検出の増幅プロットを示す図である(A)。CR3150腫瘍は、PTPRK(e1)+RSPO3(e2)遺伝子融合物を含有することが知られていた。図11はまた、PTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合物(B)、PTPRK(e1/e2)野生型(C)及びRSPO3(e1/e2)野生型(D)の単一化反応のそれぞれの増幅プロットを示す。各Ct値は、増幅プロットの下に示す。多重化増幅反応を使用して得られたCt値と単一化増幅反応を使用して得られたCt値の間の差はΔCtによって表され、また表に含まれる。結果は、PTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合物がCR3150腫瘍RNA試料中で検出されたことを示す。結果はまた、陰性ΔCt値によって示されるように、全般的に多重化増幅反応は同じ標的についての単一化反応より敏感であることを示す。
【図１１−３】CR3150腫瘍RNAを含有する試料中におけるPTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合物、PTPRK(e1/e2)野生型、RSPO3(e1/e2)野生型及び内部コントロールの多重化検出の増幅プロットを示す図である(A)。CR3150腫瘍は、PTPRK(e1)+RSPO3(e2)遺伝子融合物を含有することが知られていた。図11はまた、PTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合物(B)、PTPRK(e1/e2)野生型(C)及びRSPO3(e1/e2)野生型(D)の単一化反応のそれぞれの増幅プロットを示す。各Ct値は、増幅プロットの下に示す。多重化増幅反応を使用して得られたCt値と単一化増幅反応を使用して得られたCt値の間の差はΔCtによって表され、また表に含まれる。結果は、PTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合物がCR3150腫瘍RNA試料中で検出されたことを示す。結果はまた、陰性ΔCt値によって示されるように、全般的に多重化増幅反応は同じ標的についての単一化反応より敏感であることを示す。
【図１２−１】連続希釈した陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールを含有する試料中におけるPTPRK(e7)+RSPO3(e2)融合物(A)及び内部コントロールプラスミド(C)の多重化増幅プロットを示す図である。連続希釈した陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールを含有する試料中におけるPTPRK(e7)+RSPO3(e2)融合物(B)及び内部コントロールプラスミド(D)の単一化増幅プロットも示される。結果は、陰性ΔCt値によって示されるように、全般的に多重化増幅反応は単一化反応より敏感であることを示す。
【図１２−２】連続希釈した陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールを含有する試料中におけるPTPRK(e7)+RSPO3(e2)融合物(A)及び内部コントロールプラスミド(C)の多重化増幅プロットを示す図である。連続希釈した陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールを含有する試料中におけるPTPRK(e7)+RSPO3(e2)融合物(B)及び内部コントロールプラスミド(D)の単一化増幅プロットも示される。結果は、陰性ΔCt値によって示されるように、全般的に多重化増幅反応は単一化反応より敏感であることを示す。
【図１２−３】連続希釈した陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールを含有する試料中におけるPTPRK(e7)+RSPO3(e2)融合物(A)及び内部コントロールプラスミド(C)の多重化増幅プロットを示す図である。連続希釈した陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールを含有する試料中におけるPTPRK(e7)+RSPO3(e2)融合物(B)及び内部コントロールプラスミド(D)の単一化増幅プロットも示される。結果は、陰性ΔCt値によって示されるように、全般的に多重化増幅反応は単一化反応より敏感であることを示す。
【図１２−４】連続希釈した陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールを含有する試料中におけるPTPRK(e7)+RSPO3(e2)融合物(A)及び内部コントロールプラスミド(C)の多重化増幅プロットを示す図である。連続希釈した陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールを含有する試料中におけるPTPRK(e7)+RSPO3(e2)融合物(B)及び内部コントロールプラスミド(D)の単一化増幅プロットも示される。結果は、陰性ΔCt値によって示されるように、全般的に多重化増幅反応は単一化反応より敏感であることを示す。
【図１３−１】連続希釈した陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールを含有する試料中におけるPTPRK(e7/e8)野生型(A)及び内部コントロールプラスミド(C)の多重化増幅プロットを示す図である。連続希釈した陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールを含有する試料中におけるPTPRK(e7/e8)野生型(B)及び内部コントロールプラスミド(D)の単一化増幅プロットも示される。結果は、陰性ΔCt値によって示されるように、全般的に多重化増幅反応は単一化反応より敏感であることを示す。
【図１３−２】連続希釈した陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールを含有する試料中におけるPTPRK(e7/e8)野生型(A)及び内部コントロールプラスミド(C)の多重化増幅プロットを示す図である。連続希釈した陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールを含有する試料中におけるPTPRK(e7/e8)野生型(B)及び内部コントロールプラスミド(D)の単一化増幅プロットも示される。結果は、陰性ΔCt値によって示されるように、全般的に多重化増幅反応は単一化反応より敏感であることを示す。
【図１３−３】連続希釈した陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールを含有する試料中におけるPTPRK(e7/e8)野生型(A)及び内部コントロールプラスミド(C)の多重化増幅プロットを示す図である。連続希釈した陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールを含有する試料中におけるPTPRK(e7/e8)野生型(B)及び内部コントロールプラスミド(D)の単一化増幅プロットも示される。結果は、陰性ΔCt値によって示されるように、全般的に多重化増幅反応は単一化反応より敏感であることを示す。
【図１３−４】連続希釈した陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールを含有する試料中におけるPTPRK(e7/e8)野生型(A)及び内部コントロールプラスミド(C)の多重化増幅プロットを示す図である。連続希釈した陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールを含有する試料中におけるPTPRK(e7/e8)野生型(B)及び内部コントロールプラスミド(D)の単一化増幅プロットも示される。結果は、陰性ΔCt値によって示されるように、全般的に多重化増幅反応は単一化反応より敏感であることを示す。
【図１４−１】連続希釈した陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールを含有する試料中におけるRSPO3(e1/e2)野生型(A)及び内部コントロールプラスミド(C)の多重化増幅プロットを示す図である。連続希釈した陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールを含有する試料中におけるRSPO3(e1/e2)野生型(B)及び内部コントロールプラスミド(D)の単一化増幅プロットも示される。結果は、陰性ΔCt値によって示されるように、全般的に多重化増幅反応は単一化反応より敏感であることを示す。
【図１４−２】連続希釈した陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールを含有する試料中におけるRSPO3(e1/e2)野生型(A)及び内部コントロールプラスミド(C)の多重化増幅プロットを示す図である。連続希釈した陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールを含有する試料中におけるRSPO3(e1/e2)野生型(B)及び内部コントロールプラスミド(D)の単一化増幅プロットも示される。結果は、陰性ΔCt値によって示されるように、全般的に多重化増幅反応は単一化反応より敏感であることを示す。
【図１４−３】連続希釈した陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールを含有する試料中におけるRSPO3(e1/e2)野生型(A)及び内部コントロールプラスミド(C)の多重化増幅プロットを示す図である。連続希釈した陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールを含有する試料中におけるRSPO3(e1/e2)野生型(B)及び内部コントロールプラスミド(D)の単一化増幅プロットも示される。結果は、陰性ΔCt値によって示されるように、全般的に多重化増幅反応は単一化反応より敏感であることを示す。
【図１４−４】連続希釈した陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールを含有する試料中におけるRSPO3(e1/e2)野生型(A)及び内部コントロールプラスミド(C)の多重化増幅プロットを示す図である。連続希釈した陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールを含有する試料中におけるRSPO3(e1/e2)野生型(B)及び内部コントロールプラスミド(D)の単一化増幅プロットも示される。結果は、陰性ΔCt値によって示されるように、全般的に多重化増幅反応は単一化反応より敏感であることを示す。
【図１５−１】ヒト全RNAを含有する試料中におけるPTPRK(e7)+RSPO3(e2)融合物、PTPRK(e7/e8)野生型、RSPO3(e1/e2)野生型及び内部コントロールの多重化検出の増幅プロットを示す図である(A)。図15はまた、PTPRK(e7)+RSPO3(e2)融合物(B)、PTPRK(e7/e8)野生型(C)及びRSPO3(e1/e2)野生型(D)の単一化反応のそれぞれの増幅プロットを示す。各Ct値は、増幅プロットの下に示される。多重化増幅反応を使用して得られたCt値と単一化増幅反応を使用して得られたCt値の間の差はΔCtによって表され、また表に含まれる。結果は、PTPRK(e7)+RSPO3(e2)融合物がヒト全RNA試料中で検出されなかったことを示す。結果はまた、陰性ΔCt値によって示されるように、PTPRK(e7/e8)野生型及びRSPO3(e1/e2)野生型の増幅の多重化増幅反応は同じ標的についての単一化反応より敏感であることを示す。
【図１５−２】ヒト全RNAを含有する試料中におけるPTPRK(e7)+RSPO3(e2)融合物、PTPRK(e7/e8)野生型、RSPO3(e1/e2)野生型及び内部コントロールの多重化検出の増幅プロットを示す図である(A)。図15はまた、PTPRK(e7)+RSPO3(e2)融合物(B)、PTPRK(e7/e8)野生型(C)及びRSPO3(e1/e2)野生型(D)の単一化反応のそれぞれの増幅プロットを示す。各Ct値は、増幅プロットの下に示される。多重化増幅反応を使用して得られたCt値と単一化増幅反応を使用して得られたCt値の間の差はΔCtによって表され、また表に含まれる。結果は、PTPRK(e7)+RSPO3(e2)融合物がヒト全RNA試料中で検出されなかったことを示す。結果はまた、陰性ΔCt値によって示されるように、PTPRK(e7/e8)野生型及びRSPO3(e1/e2)野生型の増幅の多重化増幅反応は同じ標的についての単一化反応より敏感であることを示す。
【図１５−３】ヒト全RNAを含有する試料中におけるPTPRK(e7)+RSPO3(e2)融合物、PTPRK(e7/e8)野生型、RSPO3(e1/e2)野生型及び内部コントロールの多重化検出の増幅プロットを示す図である(A)。図15はまた、PTPRK(e7)+RSPO3(e2)融合物(B)、PTPRK(e7/e8)野生型(C)及びRSPO3(e1/e2)野生型(D)の単一化反応のそれぞれの増幅プロットを示す。各Ct値は、増幅プロットの下に示される。多重化増幅反応を使用して得られたCt値と単一化増幅反応を使用して得られたCt値の間の差はΔCtによって表され、また表に含まれる。結果は、PTPRK(e7)+RSPO3(e2)融合物がヒト全RNA試料中で検出されなかったことを示す。結果はまた、陰性ΔCt値によって示されるように、PTPRK(e7/e8)野生型及びRSPO3(e1/e2)野生型の増幅の多重化増幅反応は同じ標的についての単一化反応より敏感であることを示す。
【図１６−１】EIF3E(e1)+RSPO2(e2)融合物(A)及び内部コントロール(B)の増幅プロットを示す図である。各試料は、100コピーの内部コントロールプラスミド及び1000、100、10又は1コピーの陽性コントロールプラスミドをそれぞれ含有する。結果は、考案したPCR増幅反応がEIF3E(e1)+RSPO2(e2)融合物陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールプラスミドをうまく増幅することができることを示す。
【図１６−２】EIF3E(e1)+RSPO2(e2)融合物(A)及び内部コントロール(B)の増幅プロットを示す図である。各試料は、100コピーの内部コントロールプラスミド及び1000、100、10又は1コピーの陽性コントロールプラスミドをそれぞれ含有する。結果は、考案したPCR増幅反応がEIF3E(e1)+RSPO2(e2)融合物陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールプラスミドをうまく増幅することができることを示す。
【図１７−１】EIF3E(e1/e2)野生型(A)及び内部コントロール(B)の増幅プロットを示す図である。各試料は、100コピーの内部コントロールプラスミド及び1000、100、10又は1コピーの陽性コントロールプラスミドをそれぞれ含有する。結果は、考案したPCR増幅反応がEIF3E(e1/e2)野生型陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールプラスミドをうまく増幅することができることを示す。
【図１７−２】EIF3E(e1/e2)野生型(A)及び内部コントロール(B)の増幅プロットを示す図である。各試料は、100コピーの内部コントロールプラスミド及び1000、100、10又は1コピーの陽性コントロールプラスミドをそれぞれ含有する。結果は、考案したPCR増幅反応がEIF3E(e1/e2)野生型陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールプラスミドをうまく増幅することができることを示す。
【図１８−１】RSPO2(e1/e2)野生型(A)及び内部コントロール(B)の増幅プロットを示す図である。各試料は、100コピーの内部コントロールプラスミド及び1000、100、10又は1コピーの陽性コントロールプラスミドをそれぞれ含有する。結果は、考案したPCR増幅反応はRSPO2(e1/e2)野生型陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールプラスミドをうまく増幅することができることを示す。
【図１８−２】RSPO2(e1/e2)野生型(A)及び内部コントロール(B)の増幅プロットを示す図である。各試料は、100コピーの内部コントロールプラスミド及び1000、100、10又は1コピーの陽性コントロールプラスミドをそれぞれ含有する。結果は、考案したPCR増幅反応はRSPO2(e1/e2)野生型陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールプラスミドをうまく増幅することができることを示す。
【図１９−１】ヒト全RNAを含有する試料中におけるEIF3E(e1)+RSPO2(e2)融合物、EIF3E(e1/e2)野生型、RSPO2(e1/e2)野生型及び内部コントロールの多重化検出の増幅プロットを示す図である。結果は、EIF3E(e1)+RSPO2(e2)遺伝子融合物が正常なヒト全RNA中で検出されなかったことを示す。
【図１９−２】ヒト全RNAを含有する試料中におけるEIF3E(e1)+RSPO2(e2)融合物、EIF3E(e1/e2)野生型、RSPO2(e1/e2)野生型及び内部コントロールの多重化検出の増幅プロットを示す図である。結果は、EIF3E(e1)+RSPO2(e2)遺伝子融合物が正常なヒト全RNA中で検出されなかったことを示す。
【図２０−１】PTPRK(e13)+RSPO3(e2)融合物(A)及び内部コントロール(B)の増幅プロットを示す図である。各試料は、100コピーの内部コントロールプラスミド及び1000、100、10又は1コピーの陽性コントロールプラスミドをそれぞれ含有する。結果は、考案したPCR増幅反応がPTPRK(e13)+RSPO3(e2)融合物陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールプラスミドをうまく増幅することができることを示す。セット1では、フォワードプライマー200nM、リバースプライマー200nM及びプローブ100nMが使用される。セット2では、フォワードプライマー300nM、リバースプライマー300nM及びプローブ150nMが使用される。(A)で示された融合物C:FAMの表の平均ΔCt値は0.26である。(B)で示されたIC77:HEXの表の平均ΔCt値は-0.10である。
【図２０−２】PTPRK(e13)+RSPO3(e2)融合物(A)及び内部コントロール(B)の増幅プロットを示す図である。各試料は、100コピーの内部コントロールプラスミド及び1000、100、10又は1コピーの陽性コントロールプラスミドをそれぞれ含有する。結果は、考案したPCR増幅反応がPTPRK(e13)+RSPO3(e2)融合物陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールプラスミドをうまく増幅することができることを示す。セット1では、フォワードプライマー200nM、リバースプライマー200nM及びプローブ100nMが使用される。セット2では、フォワードプライマー300nM、リバースプライマー300nM及びプローブ150nMが使用される。(A)で示された融合物C:FAMの表の平均ΔCt値は0.26である。(B)で示されたIC77:HEXの表の平均ΔCt値は-0.10である。
【図２１−１】PTPRK(e12-e14)野生型(A)及び内部コントロール(B)の増幅プロットを示す図である。各試料は、100コピーの内部コントロールプラスミド及び1000、100、10又は1コピーの陽性コントロールプラスミドをそれぞれ含有する。結果は、考案したPCR増幅反応がPTPRK(e12-e14)野生型陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールプラスミドをうまく増幅することができることを示す。セット1では、フォワードプライマー200nM、リバースプライマー200nM及びプローブ100nMが使用される。セット2では、フォワードプライマー300nM、リバースプライマー300nM及びプローブ150nMが使用される。(A)で示されたPTPRK:TxRdの表の平均ΔCt値は1.72である。(B)で示されたIC77:HEXの表の平均ΔCt値は0.11である。
【図２１−２】PTPRK(e12-e14)野生型(A)及び内部コントロール(B)の増幅プロットを示す図である。各試料は、100コピーの内部コントロールプラスミド及び1000、100、10又は1コピーの陽性コントロールプラスミドをそれぞれ含有する。結果は、考案したPCR増幅反応がPTPRK(e12-e14)野生型陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールプラスミドをうまく増幅することができることを示す。セット1では、フォワードプライマー200nM、リバースプライマー200nM及びプローブ100nMが使用される。セット2では、フォワードプライマー300nM、リバースプライマー300nM及びプローブ150nMが使用される。(A)で示されたPTPRK:TxRdの表の平均ΔCt値は1.72である。(B)で示されたIC77:HEXの表の平均ΔCt値は0.11である。
【図２２−１】ヒト全RNAを含有する試料中におけるPTPRK(e13)+RSPO3(e2)融合物、PTPRK(e12-e14)野生型及び内部コントロールの多重化検出の増幅プロットを示す図である。結果は、PTPRK(e13)+RSPO3(e2)遺伝子融合物が正常なヒト全RNA中で検出されなかったことを示す。セット1(A)では、フォワードプライマー200nM、リバースプライマー200nM及びプローブ100nMが使用される。セット2(B)では、フォワードプライマー300nM、リバースプライマー300nM及びプローブ150nMが使用される。
【図２２−２】ヒト全RNAを含有する試料中におけるPTPRK(e13)+RSPO3(e2)融合物、PTPRK(e12-e14)野生型及び内部コントロールの多重化検出の増幅プロットを示す図である。結果は、PTPRK(e13)+RSPO3(e2)遺伝子融合物が正常なヒト全RNA中で検出されなかったことを示す。セット1(A)では、フォワードプライマー200nM、リバースプライマー200nM及びプローブ100nMが使用される。セット2(B)では、フォワードプライマー300nM、リバースプライマー300nM及びプローブ150nMが使用される。
【図２３−１】CR2506腫瘍RNAを含有する試料中におけるPTPRK(e13)+RSPO3(e2)融合物、PTPRK(e12-e14)野生型及び内部コントロールの多重化検出の増幅プロットを示す図である。CR2506腫瘍は、PTPRK(e13)+RSPO3(e2)遺伝子融合物を含有することが知られていた。各Ct値は、(B)の下に示される。結果は、PTPRK(e13)+RSPO3(e2)融合物がCR2506腫瘍RNA試料中で検出されたことを示す。セット1(A)では、フォワードプライマー200nM、リバースプライマー200nM及びプローブ100nMが使用される。セット2(B)では、フォワードプライマー300nM、リバースプライマー300nM及びプローブ150nMが使用される。
【図２３−２】CR2506腫瘍RNAを含有する試料中におけるPTPRK(e13)+RSPO3(e2)融合物、PTPRK(e12-e14)野生型及び内部コントロールの多重化検出の増幅プロットを示す図である。CR2506腫瘍は、PTPRK(e13)+RSPO3(e2)遺伝子融合物を含有することが知られていた。各Ct値は、(B)の下に示される。結果は、PTPRK(e13)+RSPO3(e2)融合物がCR2506腫瘍RNA試料中で検出されたことを示す。セット1(A)では、フォワードプライマー200nM、リバースプライマー200nM及びプローブ100nMが使用される。セット2(B)では、フォワードプライマー300nM、リバースプライマー300nM及びプローブ150nMが使用される。
【図２４−１】EIF3E(e1)+RSPO2(e2)融合物(A)及び内部コントロール(B)の増幅プロットを示す図である。各試料は、100コピーの内部コントロールプラスミド及び1000、100、10又は1コピーの陽性コントロールプラスミドをそれぞれ含有する。結果は、考案したPCR増幅反応がEIF3E(e1)+RSPO2(e2)融合物陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールプラスミドをうまく増幅することができることを示す。セット1では、フォワードプライマー200nM、リバースプライマー200nM及びプローブ100nMが使用される。セット2では、フォワードプライマー300nM、リバースプライマー300nM及びプローブ150nMが使用される。(A)で示された融合物D:FAMの表の平均ΔCt値は0.61である。(B)で示されたIC77:HEXの表の平均ΔCt値は0.43である。
【図２４−２】EIF3E(e1)+RSPO2(e2)融合物(A)及び内部コントロール(B)の増幅プロットを示す図である。各試料は、100コピーの内部コントロールプラスミド及び1000、100、10又は1コピーの陽性コントロールプラスミドをそれぞれ含有する。結果は、考案したPCR増幅反応がEIF3E(e1)+RSPO2(e2)融合物陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールプラスミドをうまく増幅することができることを示す。セット1では、フォワードプライマー200nM、リバースプライマー200nM及びプローブ100nMが使用される。セット2では、フォワードプライマー300nM、リバースプライマー300nM及びプローブ150nMが使用される。(A)で示された融合物D:FAMの表の平均ΔCt値は0.61である。(B)で示されたIC77:HEXの表の平均ΔCt値は0.43である。
【図２５−１】EIF3E(e1/e2)野生型(A)及び内部コントロール(B)の増幅プロットを示す図である。各試料は、100コピーの内部コントロールプラスミド及び1000、100、10又は1コピーの陽性コントロールプラスミドをそれぞれ含有する。結果は、考案したPCR増幅反応がEIF3E(e1/e2)野生型陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールプラスミドをうまく増幅することができることを示す。セット1では、フォワードプライマー200nM、リバースプライマー200nM及びプローブ100nMが使用される。セット2では、フォワードプライマー300nM、リバースプライマー300nM及びプローブ150nMが使用される。(A)で示されたEIF3E:TxRdの表の平均ΔCt値は0.99である。(B)で示されたIC77:HEXの表の平均ΔCt値は0.47である。
【図２５−２】EIF3E(e1/e2)野生型(A)及び内部コントロール(B)の増幅プロットを示す図である。各試料は、100コピーの内部コントロールプラスミド及び1000、100、10又は1コピーの陽性コントロールプラスミドをそれぞれ含有する。結果は、考案したPCR増幅反応がEIF3E(e1/e2)野生型陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールプラスミドをうまく増幅することができることを示す。セット1では、フォワードプライマー200nM、リバースプライマー200nM及びプローブ100nMが使用される。セット2では、フォワードプライマー300nM、リバースプライマー300nM及びプローブ150nMが使用される。(A)で示されたEIF3E:TxRdの表の平均ΔCt値は0.99である。(B)で示されたIC77:HEXの表の平均ΔCt値は0.47である。
【図２６−１】RSPO2(e1/e2)野生型(A)及び内部コントロール(B)の増幅プロットを示す図である。各試料は、100コピーの内部コントロールプラスミド及び1000、100、10又は1コピーの陽性コントロールプラスミドをそれぞれ含有する。結果は、考案したPCR増幅反応がRSPO2(e1/e2)野生型陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールプラスミドをうまく増幅することができることを示す。セット1では、フォワードプライマー200nM、リバースプライマー200nM及びプローブ100nMが使用される。セット2では、フォワードプライマー300nM、リバースプライマー300nM及びプローブ150nMが使用される。(A)で示されたRSPO2-004:Cy5の表の平均ΔCt値は0.11である。(B)で示されたIC77:HEXの表の平均ΔCt値は-0.18である。
【図２６−２】RSPO2(e1/e2)野生型(A)及び内部コントロール(B)の増幅プロットを示す図である。各試料は、100コピーの内部コントロールプラスミド及び1000、100、10又は1コピーの陽性コントロールプラスミドをそれぞれ含有する。結果は、考案したPCR増幅反応がRSPO2(e1/e2)野生型陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールプラスミドをうまく増幅することができることを示す。セット1では、フォワードプライマー200nM、リバースプライマー200nM及びプローブ100nMが使用される。セット2では、フォワードプライマー300nM、リバースプライマー300nM及びプローブ150nMが使用される。(A)で示されたRSPO2-004:Cy5の表の平均ΔCt値は0.11である。(B)で示されたIC77:HEXの表の平均ΔCt値は-0.18である。
【図２７−１】ヒト全RNAを含有する試料中におけるEIF3E(e1)+RSPO2(e2)融合物、EIF3E(e1/e2)野生型、RSPO2(e1/e2)野生型及び内部コントロールの多重化検出の増幅プロットを示す図である。結果は、EIF3E(e1)+RSPO2(e2)遺伝子融合物及びRSPO2(e1/e2)野生型が正常なヒト全RNA中で検出されなかったことを示す。セット1(A)では、フォワードプライマー200nM、リバースプライマー200nM及びプローブ100nMが使用される。セット2(B)では、フォワードプライマー300nM、リバースプライマー300nM及びプローブ150nMが使用される。
【図２７−２】ヒト全RNAを含有する試料中におけるEIF3E(e1)+RSPO2(e2)融合物、EIF3E(e1/e2)野生型、RSPO2(e1/e2)野生型及び内部コントロールの多重化検出の増幅プロットを示す図である。結果は、EIF3E(e1)+RSPO2(e2)遺伝子融合物及びRSPO2(e1/e2)野生型が正常なヒト全RNA中で検出されなかったことを示す。セット1(A)では、フォワードプライマー200nM、リバースプライマー200nM及びプローブ100nMが使用される。セット2(B)では、フォワードプライマー300nM、リバースプライマー300nM及びプローブ150nMが使用される。
【図２８−１】CR205腫瘍RNAを含有する試料中におけるEIF3E(e1)+RSPO2(e2)融合物、EIF3E(e1/e2)野生型、RSPO2(e1/e2)野生型及び内部コントロールの多重化検出の増幅プロットを示す図である。各Ct値は、(B)の下に示される。結果は、EIF3E(e1)+RSPO2(e2)遺伝子融合物がCR205腫瘍RNA中で検出されなかったことを示す。セット1(A)では、フォワードプライマー200nM、リバースプライマー200nM及びプローブ100nMが使用される。セット2(B)では、フォワードプライマー300nM、リバースプライマー300nM及びプローブ150nMが使用される。
【図２８−２】CR205腫瘍RNAを含有する試料中におけるEIF3E(e1)+RSPO2(e2)融合物、EIF3E(e1/e2)野生型、RSPO2(e1/e2)野生型及び内部コントロールの多重化検出の増幅プロットを示す図である。各Ct値は、(B)の下に示される。結果は、EIF3E(e1)+RSPO2(e2)遺伝子融合物がCR205腫瘍RNA中で検出されなかったことを示す。セット1(A)では、フォワードプライマー200nM、リバースプライマー200nM及びプローブ100nMが使用される。セット2(B)では、フォワードプライマー300nM、リバースプライマー300nM及びプローブ150nMが使用される。
【図２９−１】CR210腫瘍RNAを含有する試料中におけるEIF3E(e1)+RSPO2(e2)融合物、EIF3E(e1/e2)野生型、RSPO2(e1/e2)野生型及び内部コントロールの多重化検出の増幅プロットを示す図である。CR210腫瘍は、EIF3E(e1)+RSPO2(e2)遺伝子融合物を含有することが知られていた。各Ct値は、(B)の下に示される。結果は、EIF3E(e1)+RSPO2(e2)遺伝子融合物がCR210腫瘍RNA中で検出されたことを示す。セット1(A)では、フォワードプライマー200nM、リバースプライマー200nM及びプローブ100nMが使用される。セット2(B)では、フォワードプライマー300nM、リバースプライマー300nM及びプローブ150nMが使用される。
【図２９−２】CR210腫瘍RNAを含有する試料中におけるEIF3E(e1)+RSPO2(e2)融合物、EIF3E(e1/e2)野生型、RSPO2(e1/e2)野生型及び内部コントロールの多重化検出の増幅プロットを示す図である。CR210腫瘍は、EIF3E(e1)+RSPO2(e2)遺伝子融合物を含有することが知られていた。各Ct値は、(B)の下に示される。結果は、EIF3E(e1)+RSPO2(e2)遺伝子融合物がCR210腫瘍RNA中で検出されたことを示す。セット1(A)では、フォワードプライマー200nM、リバースプライマー200nM及びプローブ100nMが使用される。セット2(B)では、フォワードプライマー300nM、リバースプライマー300nM及びプローブ150nMが使用される。
【図３０−１】CR214腫瘍RNAを含有する試料中におけるEIF3E(e1)+RSPO2(e2)融合物、EIF3E(e1/e2)野生型、RSPO2(e1/e2)野生型及び内部コントロールの多重化検出の増幅プロットを示す図である。各Ct値は、(B)の下に示される。結果は、EIF3E(e1)+RSPO2(e2)遺伝子融合物がCR214腫瘍RNA中で検出されなかったことを示す。セット1(A)では、フォワードプライマー200nM、リバースプライマー200nM及びプローブ100nMが使用される。セット2(B)では、フォワードプライマー300nM、リバースプライマー300nM及びプローブ150nMが使用される。
【図３０−２】CR214腫瘍RNAを含有する試料中におけるEIF3E(e1)+RSPO2(e2)融合物、EIF3E(e1/e2)野生型、RSPO2(e1/e2)野生型及び内部コントロールの多重化検出の増幅プロットを示す図である。各Ct値は、(B)の下に示される。結果は、EIF3E(e1)+RSPO2(e2)遺伝子融合物がCR214腫瘍RNA中で検出されなかったことを示す。セット1(A)では、フォワードプライマー200nM、リバースプライマー200nM及びプローブ100nMが使用される。セット2(B)では、フォワードプライマー300nM、リバースプライマー300nM及びプローブ150nMが使用される。
【図３１】得られたPCR生成物のゲル電気泳動を示す図である。標的の単位複製配列のサイズも図31に含める。以下の試料は、列1〜8で使用される。列1:鋳型コントロール無し;列2:EIF3E(e1)+RSPO2(e2)陽性コントロールプラスミド;列3:EIF3E(e1/e2)野生型コントロールプラスミド;列4:RSPO2(e1/e2)野生型コントロールプラスミド;列5:ヒト全RNA;列6:CR205RNA;列7:CR210RNA;列8:CR214RNA。
【図３２】本出願で使用したpUC57ベクターのプラスミドマップの概略を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
同じがん療法を与えても、がん患者は概して、異なって反応することが知られており、他の患者より明確に反応する患者もいれば、全く反応しない患者もいる。このような差についての根底にある理由は、大部分は知られていない。したがって、本分野における研究者らは、好適なターゲティングがん療法を提供するために、がん患者の反応におけるこのような差をもたらす様々な理由を特定しようとしてきた。本出願においては、本発明者らは、PTPRK(e13)-RSPO3(e2) R-スポンジン遺伝子融合物を有する患者は、そのような遺伝子融合物を有しない患者と比較して、Wntシグナリング経路の阻害剤により、より良く治療され得ることを発見した。別の例においては、PTPRK(e1)-RSPO3(e2) R-スポンジン遺伝子融合物を有する患者はまた、そのような遺伝子融合物を有しない患者と比較して、Wntシグナリング経路の阻害剤により治療され得ることが分かった。それゆえ、患者試料においてPTPRK(e13)-RSPO3(e2) R-スポンジン遺伝子融合物及び/又はPTPRK(e1)-RSPO3(e2) R-スポンジン遺伝子融合物を検出することは、Wntシグナリング経路の阻害剤を使用するターゲティング療法に好適な患者を特定することにおいて有用であり得る。
【００１４】
第1の態様においては、本発明は、PTPRK(e13)-RSPO3(e2) R-スポンジン遺伝子融合物を増幅することができるプライマー対(又はそれを増幅するプライマー対);野生型PTPRK及び/若しくは野生型RSPO3配列を増幅することができるコントロールプライマー対(又はそれを増幅するコントロールプライマー対);並びに/又は合成オリゴヌクレオチド内部コントロール鋳型配列、及び合成内部コントロール鋳型配列を増幅することができる内部コントロールプライマー対(又はそれを増幅する内部コントロールプライマー対)を含む、Wntシグナリング経路の阻害剤による治療に感受性の悪性腫瘍を患う対象を特定するための多重化増幅反応キットについて言及する。別の例においては、PTPRK(e1)-RSPO3(e2) R-スポンジン遺伝子融合物を増幅することができるプライマー対(又はそれを増幅するプライマー対);野生型PTPRK及び/若しくは野生型RSPO3配列を増幅することができるコントロールプライマー対(又はそれを増幅するコントロールプライマー対);並びに/又は合成オリゴヌクレオチド内部コントロール鋳型配列、及び合成内部コントロール鋳型配列を増幅することができる内部コントロールプライマー対(又はそれを増幅する内部コントロールプライマー対)を含む、Wntシグナリング経路の阻害剤による治療に感受性の悪性腫瘍を患う対象を特定するための多重化増幅反応キットが開示される。
【００１５】
本明細書において使用するとき、「多重」という用語又はその文法的同等物は、単一の増幅実験における所与の試料中の1つを超える目的の標的配列の検出及び/又は増幅を指す。一例においては、そのような1つを超える目的の標的配列のうちの1つのみが、Wntシグナリング経路の阻害剤による治療に感受性の悪性腫瘍を患う対象の特定のために使用され、他の目的の標的配列は、コントロールとして働く。言及を容易にするために、そのような1つの目的の標的配列は、「目的のキー標的配列」と本明細書において呼ばれる。多重増幅実験においては、多数のプライマー組が典型的に、多数の目的の標的配列を同時に増幅するために、同じ増幅反応において使用される。一度に多数の目的の配列をターゲティングすることによって、単一の増幅反応から追加の情報を得てもよく、そうしない場合は、実行するのに数倍の試薬及びより長い時間を要し得る。特定の一実施形態においては、多重は、単一の増幅実験における所与の試料中の3つの異なる標的配列の検出及び/又は増幅を指す。別の特定の実施形態においては、多重は、単一の増幅実験における所与の試料中の4つの異なる標的配列の検出及び/又は増幅を指す。様々な他の実施形態においては、多重は、単一の増幅実験における所与の試料中の2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個又はそれよりも多い異なる標的配列の検出及び/又は増幅を指す。
【００１６】
「増幅反応」という用語は、本明細書において使用するとき、標的配列の追加のコピーを生成する反応を指す。標的配列を増幅するために分子生物学において使用される典型的な増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)である。PCRの例として、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応、リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、デジタルポリメラーゼ連鎖反応、定量ポリメラーゼ連鎖反応、定性ポリメラーゼ連鎖反応、定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応又は定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応が挙げられるが、これらに限定されない。特定の一例においては、増幅反応は、リアルタイムPCR増幅反応である。
【００１７】
リアルタイムPCRは、PCR中に、すなわち、リアルタイムで、従来型PCRにおけるようにその終わりにではなく、ターゲティングしたDNA分子の増幅をモニターする。リアルタイムPCRは、定量的に(定量リアルタイムPCR)、及び半定量的に、すなわち、ある特定の量のDNA分子を超えて/未満で(半定量リアルタイムPCR)、使用することができる。定量リアルタイムPCR(qrt-PCR)法は、増幅が進行するにつれて増幅した生成物の量を測定するために、蛍光色素又はフルオロフォア含有DNAプローブを使用する。
【００１８】
デジタルPCR(dPCR:Digital PCR)は、数千の試料を同時に増幅し、各々は、エマルション内の別々の水滴中にある。
【００１９】
定量PCR(qPCR)は、試料中の特定の量の標的DNA(又はRNA)を測定するために使用される。真の指数関数的増幅相内のみの増幅を測定することによって、測定した生成物の量は、標的の開始量をより正確に反映する。増幅中に生成物の量をモニターする特別なサーマルサイクラーが使用される。
【００２０】
定性PCRは、存在する量を定量することなく、試料中の標的DNA(RNA)の存在又は非存在を検出するために使用されるPCR法を指す。
【００２１】
逆転写PCRは、RNAをcDNAに逆転写し、増幅するために使用される。PCRに先行して、RNAをcDNAに変換する酵素である逆転写酵素を使用する反応が行われる。2つの反応を、管内で組み合わせてもよく、PCRの初期加熱工程は、転写酵素を不活性化するために使用される。RT-PCRは、遺伝子の発現を検出する発現プロファイリングにおいて広く使用される。それはまた、RNA転写産物の配列を得るために使用することができ、これは転写開始及び終止部位の決定を補助し、遺伝子配列中のエクソン及びイントロンの位置のマッピングを促進し得る。
【００２２】
一部の例においては、PCR増幅は、TaqManプローブの使用を含む。TaqManプローブは、定量PCRの特異性を増大させるために設計された加水分解プローブである。TaqManプローブ原理は、相補的標的配列へのハイブリダイゼーション中に二重標識プローブを切断するTaqポリメラーゼの5'-3'エキソヌクレアーゼ活性、及びフルオロフォアベースの検出に頼る。他の定量PCR法と同様に、得られた蛍光シグナルは、PCRの指数関数的段階中の生成物蓄積の定量測定を可能にする。TaqManプローブは、検出の特異性を顕著に増大させる。
【００２３】
「対象」という用語は、本明細書において使用するとき、治療、観察又は実験の対象である動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを指す。一例においては、対象は、ヒトではない。対象は、例えば非ヒト哺乳動物であってもよい。
【００２４】
「悪性腫瘍」という用語は、本明細書において使用するとき、異常な細胞が制御なく分裂し、近傍の組織に侵入する疾患を指す。悪性疾患は通常、がんとして公知である。本明細書において説明する方法又はキットによって特定又は治療され得るがんの主要な型として、癌腫、肉腫、リンパ腫、胚細胞腫瘍及び芽腫が挙げられるが、これらに限定されない。がんの特定の型として、肺がん、黒色腫、結腸直腸がん、神経芽細胞腫、乳がん、前立腺がん、腎細胞がん、移行上皮癌、胆管細胞癌、脳がん、非小細胞肺がん、膵がん、胃癌、膀胱がん、食道がん、中皮腫、甲状腺がん、頭頸部がん、骨肉腫、肝細胞癌、原発不明癌、卵巣癌、子宮内膜癌、神経膠芽腫、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫が挙げられるが、これらに限定されない。一部の特定の例においては、本明細書において開示する方法又はキットによって特定又は治療される悪性腫瘍は、肺がん、黒色腫、結腸直腸がん、リンパ腫及び神経芽細胞腫である。一例においては、悪性腫瘍は、固形悪性腫瘍である。一部の例においては、悪性腫瘍は、食道、胆嚢、肝臓、膵臓、胃、小腸、大腸、結腸、直腸又は肛門の消化器がんである。
【００２５】
特定の一例においては、悪性腫瘍は、結腸直腸がんである。一例においては、がんは、侵襲性及び/又は転移性がんである。別の例においては、がんは、ステージIIがん、ステージIIIがん又はステージIVがんである。別の例においては、がんは、初期転移性がんである。一例においては、初期転移性がんは、必ずしも初期段階のがんではない。一部の例においては、悪性腫瘍は、上昇したWnt活性レベルによって特徴付けられる。上昇したWnt活性レベルは、悪性腫瘍を有しない対象のWnt活性レベル又は所与の集団中の悪性腫瘍を有しない対象における平均Wnt活性レベルの少なくとも10%、又は少なくとも20%、又は少なくとも30%、又は少なくとも40%、又は少なくとも50%、又は少なくとも60%、又は少なくとも70%、又は少なくとも80%、又は少なくとも90%、又は少なくとも100%、又は少なくとも110%、又は少なくとも120%、又は少なくとも130%、又は少なくとも140%、又は少なくとも150%、又は少なくとも160%、又は少なくとも170%、又は少なくとも180%、又は少なくとも190%、又は少なくとも200%であるWnt活性によって定義することができる。一部の例においては、上昇したWnt活性レベルは、転写において、又は転写後において上昇している。
【００２６】
「PTPRK」という用語は、本明細書において使用するとき、ヒトにおいてタンパク質チロシンホスファターゼ受容体タイプKをコードするPTPRK遺伝子を指す。タンパク質チロシンホスファターゼ受容体タイプKは、タンパク質チロシンホスファターゼ(PTP)ファミリーのメンバーである。タンパク質チロシンホスファターゼ受容体タイプKは、細胞外領域、単一の膜貫通領域及び2つのタンデム触媒ドメインを所有し、したがって、受容体型のPTPを示す。細胞外領域は、メプリン-A5抗原-PTP mu(MAM)ドメイン、Ig様ドメイン及び4つのフィブロネクチンタイプIII様反復を含有する。PTPRKはまた、PTPカッパ又はPTPκとして公知である。ヒトPTPRK遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号1によって表され、全部で30個のエクソンを有する。
【００２７】
「PTPRK(en)」という用語は、本明細書において使用するとき、PTPRK遺伝子のエクソン番号nを指す。例えば、「PTPRK(e13)」という用語は、本明細書において使用するとき、PTPRK遺伝子のエクソン13を指す。ヒトPTPRK遺伝子のエクソン13のヌクレオチド配列は、配列番号2によって表される。
【００２８】
「RSPO3」という用語は、本明細書において使用するとき、RSPO3遺伝子を指す。この遺伝子は、R-スポンジンファミリーに属し、タンパク質R-スポンジン-3をコードする。ヒトRSPO3遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号3によって表され、全部で5個のエクソンを有する。
【００２９】
「RSPO3(em)」という用語は、本明細書において使用するとき、RSPO3遺伝子のエクソン番号mを指す。例えば、「RSPO3(e2)」という用語は、本明細書において使用するとき、RSPO3遺伝子のエクソン2を指す。ヒトRSPO3遺伝子のエクソン2のヌクレオチド配列は、配列番号4によって表される。
【００３０】
「遺伝子融合物」という用語は、本明細書において使用するとき、2つの以前に分離した遺伝子から形成したハイブリッド遺伝子を指す。それは通常、転座、中間部欠損又は染色体逆位の結果として起こり得る。遺伝子融合物は、悪性腫瘍の形成において重要な役割を果たす突然変異の一形態である。
【００３１】
「野生型」という用語は、遺伝子の文脈で本明細書において使用するとき、特定の集団中の健康な個体集団における遺伝子の最も一般的な遺伝子型を指す。野生型遺伝子は、任意の突然変異、特に遺伝子融合物を含有しない遺伝子である。野生型遺伝子は、多重化増幅反応においてコントロールとして使用される。試料中の目的の標的配列が遺伝子融合物、例えばA-B遺伝子融合物である場合、野生型遺伝子A及び野生型遺伝子Bの両方又はそれらの組合せを、コントロールとして使用することができる。
【００３２】
標的配列を増幅することができるプライマー対(又はそれを増幅するプライマー対)は典型的に、フォワードプライマー及びリバースプライマーを含む。標的遺伝子融合物を増幅することができるプライマー対(又はそれを増幅するプライマー対)は典型的に、融合部位にまたがる。
【００３３】
一例においては、標的配列が、PTPRK(e13)-RSPO3(e2) R-スポンジン遺伝子融合物を含む場合、標的配列を増幅することができるプライマー対(又はそれを増幅するプライマー対)は、PTPRK(e13)の3'末端及びRSPO3(e2)の5'末端にまたがる。特定の一例においては、プライマー対は、PTPRK(e13)をターゲティングするフォワードプライマーと、RSPO3(e2)をターゲティングするリバースプライマーとを含む。別の例においては、プライマー対は、PTPRK(e12/e13)をターゲティングするフォワードプライマーと、RSPO3(e2)をターゲティングするリバースプライマーとを含む。ヒトPTPRK遺伝子のエクソン12のヌクレオチド配列は、配列番号5によって表される。標的配列PTPRK(e13)-RSPO3(e2) R-スポンジン遺伝子融合物のためのフォワードプライマーの特定の一例は、(5'-3')GGAGAAGGAAACTARAACCCAGT(配列番号6)の配列を含み、同じ標的配列のためのリバースプライマーの特定の一例は、(5'-3')GTCTGGGCTTACATGACAARCATC(配列番号7)の配列を含む。一例においては、標的配列PTPRK(e13)-RSPO3(e2) R-スポンジン遺伝子融合物のためのフォワードプライマーは、配列番号6の配列又はその相補配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%の配列同一性を有する。別の例においては、標的配列PTPRK(e13)-RSPO3(e2) R-スポンジン遺伝子融合物のためのリバースプライマーは、配列番号7の配列又はその相補配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%の配列同一性を有する。
【００３４】
一例においては、野生型PTPRK遺伝子を検出するために、PTPRK(e12〜e14)によって表されるPTPRK遺伝子のエクソン12〜14を、標的配列として使用する。この標的配列を増幅することができるプライマー対(又はそれを増幅するプライマー対)は、したがって、PTPRK(e12)の3'末端、全PTPRK(e13)及びPTPRK(e14)の5'末端にまたがる。ヒトPTPRK遺伝子のエクソン14のヌクレオチド配列は、配列番号8によって表される。特定の一例においては、プライマー対は、PTPRK(e12)をターゲティングするフォワードプライマーと、PTPRK(e14)をターゲティングするリバースプライマーとを含む。別の例においては、プライマー対は、PTPRK(e12/e13)をターゲティングするフォワードプライマーと、PTPRK(e14)をターゲティングするリバースプライマーとを含む。標的配列PTPRK(e12〜e14)のためのフォワードプライマーの特定の一例は、(5'-3')GGAGAAGGAAACTARAACCCAGT(配列番号9)の配列を含み、同じ標的配列のためのリバースプライマーの特定の一例は、(5'-3')GCTATTTTCACCACTCTGTCYGT(配列番号10)の配列を含む。一例においては、標的配列PTPRK(e12〜e14)のためのフォワードプライマーは、配列番号9の配列又はその相補配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%の配列同一性を有する。別の例においては、標的配列PTPRK(e12〜e14)のためのリバースプライマーは、配列番号10の配列又はその相補配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%の配列同一性を有する。
【００３５】
一例においては、野生型RSPO3遺伝子を検出するために、RSPO3(e1/e2)によって表されるRSPO3遺伝子のエクソン1及び2を、標的配列として使用する。この標的配列を増幅することができるプライマー対(又はそれを増幅するプライマー対)は、したがって、RSPO3(e1)の3'末端及びRSPO3(e2)の5'末端にまたがる。ヒトRSPO3遺伝子のエクソン1のヌクレオチド配列は、配列番号11によって表される。特定の一例においては、プライマー対は、(5'-3')CTCYTTGGCAGCCTTGACT(配列番号12)の配列を含むフォワードプライマーと、配列(5'-3')AATACATCGGCAGCCAAAACG(配列番号13)又は(5'-3')AATACMTYGGCAGCCAAAACG(配列番号14)を含むリバースプライマーとを含む。一例においては、標的配列RSPO3(e1/e2)のためのフォワードプライマーは、配列番号12の配列又はその相補配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%の配列同一性を有する。別の例においては、標的配列RSPO3(e1/e2)のためのリバースプライマーは、配列番号13若しくは配列番号14の配列又はその相補配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%の配列同一性を有する。
【００３６】
「内部コントロール」という用語は、本明細書において使用するとき、増幅系が機能しているかどうかを示すために、及び真の標的陰性を、例えばPCR阻害によって引き起こされる増幅失敗と区別するために使用され得る参照配列である内部陽性コントロールを指す。内部コントロールは、任意の天然に存在する生物において見られない人工標的配列を含む。
【００３７】
試料中に内部コントロールがない場合、試験した標的配列について増幅シグナルが検出されないとき、真の陰性と偽陰性とを識別することは可能ではない。試料中に内部コントロールが含まれるが、うまく増幅されず、試験した標的配列について増幅シグナルが検出されない場合、それは、陰性増幅結果が、偽陰性であることを示す。試料中に内部コントロールが含まれ、うまく増幅されたが、試験した標的配列について増幅シグナルが検出されない場合、それは、陰性増幅結果が、真の陰性であることを示す。
【００３８】
一部の例においては、内部コントロールは、配列番号69の標的配列、その相補配列、断片又はバリアントを含む。一部の例においては、内部コントロール標的配列を増幅することができる内部コントロールプライマー対(又はそれを増幅する内部コントロールプライマー対)は、(5'-3')GCGCCCGAACAGTATCGCGTTT(配列番号16)の配列を含むフォワードプライマーと、(5'-3')AGCCTCCGCTAGTCACCCAA(配列番号17)の配列を含むリバースプライマーとを含む。一例においては、内部コントロール標的配列のためのフォワードプライマーは、配列番号16の配列又はその相補配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%の配列同一性を有する。別の例においては、内部コントロール標的配列のためのリバースプライマーは、配列番号17の配列又はその相補配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%の配列同一性を有する。
【００３９】
上記に説明する成分を有するキットは、1つの目的のキー標的配列の検出のために設計した多重化増幅反応のために使用される。例えば、偽陽性又は偽陰性特定率を低減することによって、Wntシグナリング経路の阻害剤による治療に感受性の悪性腫瘍を患う対象をより良く特定するために、1つの目的のキー標的配列の検出結果は、他の1つ又は複数の目的のキー標的配列の検出結果との組合せにおいて使用することができる。したがって、一部の例においては、第1の態様のキットは、1つ又は複数の追加の多重化増幅反応を行うために設計した成分を含む。そのような1つ又は複数の追加の多重化増幅反応は、1つ又は複数のR-スポンジン遺伝子融合物、例えば非限定的に、PTPRK(e1)-RSPO3(e2)融合物、PTPRK(e7)-RSPO3(e2)融合物及びEIF3E(e1)-RSPO2(e2)融合物の検出のために設計される。したがって、一部の例においては、第1の態様のキットは、1つ若しくは複数のR-スポンジン遺伝子融合物を増幅することができるプライマー対(又はそれを増幅するプライマー対)であって、R-スポンジン遺伝子融合物が、PTPRK(e1)-RSPO3(e2)融合物、PTPRK(e7)-RSPO3(e2)融合物及びEIF3E(e1)-RSPO2(e2)融合物である、プライマー対;野生型PTPRK、野生型EIF3E、野生型RSPO2及び/若しくは野生型RSPO3配列を増幅することができるコントロールプライマー対(又はそれを増幅するコントロールプライマー対);並びに/又は合成オリゴヌクレオチド内部コントロール鋳型配列、及び1つ若しくは複数の合成内部コントロール鋳型配列を増幅することができる内部コントロールプライマー対(又はそれを増幅する内部コントロールプライマー対)を更に含む。好ましい例においては、多重化増幅反応間の相互作用を最小限にするために、1つ又は複数の多重化増幅反応は、別々に行われる。しかしながら、様々な検出可能な標識を伴うプローブの適切な使用により、多重化増幅反応のうちの1つ又は複数は、1つの反応に組み合わせることができる。
【００４０】
「PTPRK(e1)」という用語は、本明細書において使用するとき、PTPRK遺伝子のエクソン1を指す。ヒトPTPRK遺伝子のエクソン1のヌクレオチド配列は、配列番号18によって表される。PTPRK(e1)-RSPO3(e2)融合物を増幅することができるプライマー対(又はそれを増幅するプライマー対)は、PTPRK(e1)の3'末端及びRSPO3(e2)の5'末端にまたがる。特定の一例においては、プライマー対は、PTPRK(e1)をターゲティングするフォワードプライマーと、RSPO3(e2)をターゲティングするリバースプライマーとを含む。標的配列PTPRK(e1)-RSPO3(e2) R-スポンジン遺伝子融合物のためのフォワードプライマーの特定の一例は、(5'-3')CTSYTTTTGTGGCGYTCT(配列番号19)の配列を含み、同じ標的配列のためのリバースプライマーの特定の一例は、(5'-3')CTCYTTGGCAGCCTTGACT(配列番号20)の配列を含む。一例においては、標的配列PTPRK(e1)-RSPO3(e2) R-スポンジン遺伝子融合物のためのフォワードプライマーは、配列番号19の配列又はその相補配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%の配列同一性を有する。別の例においては、標的配列PTPRK(e1)-RSPO3(e2) R-スポンジン遺伝子融合物のためのリバースプライマーは、配列番号20の配列又はその相補配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%の配列同一性を有する。
【００４１】
目的のキー標的配列PTPRK(e1)-RSPO3(e2)融合物の検出のために設計した多重化増幅反応について、野生型PTPRK遺伝子を検出するために、PTPRK(e1/e2)によって表されるPTPRK遺伝子のエクソン1及び2を、標的配列として使用する。ヒトPTPRK遺伝子のエクソン2のヌクレオチド配列は、配列番号21によって表される。この標的配列を増幅することができるプライマー対(又はそれを増幅するプライマー対)は、したがって、PTPRK(e1)の3'末端及びPTPRK(e2)の5'末端にまたがる。特定の一例においては、プライマー対は、PTPRK(e1)をターゲティングするフォワードプライマーと、PTPRK(e2)をターゲティングするリバースプライマーとを含む。標的配列PTPRK(e1/e2)のためのフォワードプライマーの特定の一例は、(5'-3')CTSYTTTTGTGGCGYTCT (配列番号22)の配列を含み、同じ標的配列のためのリバースプライマーの特定の例は、(5'-3')CCTGGTGGTAATCACAGGS(配列番号23)又は(5'-3')CCTGGTGGTAATCACAGGC(配列番号24)の配列を含む。一例においては、標的配列PTPRK(e1/e2)のためのフォワードプライマーは、配列番号22の配列又はその相補配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%の配列同一性を有する。別の例においては、標的配列PTPRK(e1/e2)のためのリバースプライマーは、配列番号23若しくは配列番号24の配列又はその相補配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%の配列同一性を有する。
【００４２】
目的のキー標的配列PTPRK(e1)-RSPO3(e2)融合物の検出のために設計した多重化増幅反応について、野生型RSPO3遺伝子を検出するために、RSPO3(e1/e2)を、標的配列として使用する。RSPO3(e1/e2)の検出のために使用されるプライマーの例は、上記に説明する。
【００４３】
「PTPRK(e7)」という用語は、本明細書において使用するとき、PTPRK遺伝子のエクソン7を指す。ヒトPTPRK遺伝子のエクソン7のヌクレオチド配列は、配列番号25によって表される。PTPRK(e7)-RSPO3(e2)融合物を増幅することができるプライマー対(又はそれを増幅するプライマー対)は、PTPRK(e7)の3'末端及びRSPO3(e2)の5'末端にまたがる。特定の一例においては、プライマー対は、PTPRK(e7)をターゲティングするフォワードプライマーと、RSPO3(e2)をターゲティングするリバースプライマーとを含む。標的配列PTPRK(e7)-RSPO3(e2) R-スポンジン遺伝子融合物のためのフォワードプライマーの特定の一例は、(5'-3')ATCCGAGTTCTRCTTACAAGACCT(配列番号26)の配列を含み、同じ標的配列のためのリバースプライマーの特定の一例は、(5'-3')CTCYTTGGCAGCCTTGACT(配列番号27)の配列を含む。一例においては、標的配列PTPRK(e7)-RSPO3(e2) R-スポンジン遺伝子融合物のためのフォワードプライマーは、配列番号26の配列又はその相補配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%の配列同一性を有する。別の例においては、標的配列PTPRK(e7)-RSPO3(e2) R-スポンジン遺伝子融合物のためのリバースプライマーは、配列番号27の配列又はその相補配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%の配列同一性を有する。
【００４４】
目的のキー標的配列PTPRK(e7)-RSPO3(e2)融合物の検出のために設計した多重化増幅反応について、野生型PTPRK遺伝子を検出するために、PTPRK(e7/e8)によって表されるPTPRK遺伝子のエクソン7及び8を、標的配列として使用する。ヒトPTPRK遺伝子のエクソン8のヌクレオチド配列は、配列番号28によって表される。この標的配列を増幅することができるプライマー対(又はそれを増幅するプライマー対)は、したがって、PTPRK(e7)の3'末端及びPTPRK(e8)の5'末端にまたがる。特定の一例においては、プライマー対は、PTPRK(e7)をターゲティングするフォワードプライマーと、PTPRK(e8)をターゲティングするリバースプライマーとを含む。標的配列PTPRK(e7/e8)のためのフォワードプライマーの特定の一例は、(5'-3')ATCCGAGTTCTRCTTACAAGACCT(配列番号29)の配列を含み、同じ標的配列のためのリバースプライマーの特定の例は、(5'-3')CCGTCTTGCCTGTATTTSAGC(配列番号30)の配列を含む。一例においては、標的配列PTPRK(e7/e8)のためのフォワードプライマーは、配列番号29の配列又はその相補配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%の配列同一性を有する。別の例においては、標的配列PTPRK(e7/e8)のためのリバースプライマーは、配列番号30の配列又はその相補配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%の配列同一性を有する。
【００４５】
目的のキー標的配列PTPRK(e7)-RSPO3(e2)融合物の検出のために設計した多重化増幅反応について、野生型RSPO3遺伝子を検出するために、RSPO3(e1/e2)を、標的配列として使用する。RSPO3(e1/e2)の検出のために使用されるプライマーの例は、上記に説明する。
【００４６】
「EIF3E」という用語は、本明細書において使用するとき、翻訳開始を刺激する複合体である真核生物翻訳開始因子3(省略形eIF3)複合体のeIF3サブユニットである、サブユニットEをコードする、EIF3E遺伝子を指す。ヒトにおいては、eIF3は、13個の非同一サブユニット(eIF3a〜m)からなる。ヒトEIF3E遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号31によって表され、全部で13個のエクソンを有する。
【００４７】
「EIF3E(ep)」という用語は、本明細書において使用するとき、EIF3E遺伝子のエクソン番号pを指す。例えば、「EIF3E(e1)」という用語は、本明細書において使用するとき、EIF3E遺伝子のエクソン1を指す。ヒトEIF3E遺伝子のエクソン1のヌクレオチド配列は、配列番号32によって表される。
【００４８】
「RSPO2」という用語は、本明細書において使用するとき、RSPO2遺伝子を指す。この遺伝子は、R-スポンジンファミリーに属し、タンパク質R-スポンジン-2をコードする。ヒトRSPO2遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号33によって表され、全部で3個のエクソンを有する。
【００４９】
「RSPO2(eq)」という用語は、本明細書において使用するとき、RSPO2遺伝子のエクソン番号qを指す。例えば、「RSPO2(e2)」という用語は、本明細書において使用するとき、RSPO2遺伝子のエクソン2を指す。ヒトRSPO2遺伝子のエクソン2のヌクレオチド配列は、配列番号34によって表される。
【００５０】
EIF3E(e1)-RSPO2(e2)融合物を増幅することができるプライマー対(又はそれを増幅するプライマー対)は、EIF3E(e1)の3'末端及びRSPO2(e2)の5'末端にまたがる。特定の一例においては、プライマー対は、EIF3E(e1)をターゲティングするフォワードプライマーと、RSPO2(e2)をターゲティングするリバースプライマーとを含む。標的配列EIF3E(e1)-RSPO2(e2) R-スポンジン遺伝子融合物のためのフォワードプライマーの特定の一例は、(5'-3')TCGGCATCTAGTCTTTCCGCTTYGGAGAAGGAAACTARAACCCAGT(配列番号35)の配列を含み、標的配列EIF3E(e1)-RSPO2(e2) R-スポンジン遺伝子融合物のためのフォワードプライマーの別の例は、(5'-3')TCGGCATCTAGTCTTTCCGCTTY(配列番号36)の配列を含み、同じ標的配列のためのリバースプライマーの特定の一例は、(5'-3')AGTTCAGCGCGATCAGCA(配列番号37)の配列を含む。一例においては、標的配列EIF3E(e1)-RSPO2(e2) R-スポンジン遺伝子融合物のためのフォワードプライマーは、配列番号35若しくは36の配列又はその相補配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%の配列同一性を有する。別の例においては、標的配列EIF3E(e1)-RSPO2(e2) R-スポンジン遺伝子融合物のためのリバースプライマーは、配列番号37の配列又はその相補配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%の配列同一性を有する。
【００５１】
一例においては、野生型EIF3E遺伝子を検出するために、EIF3E(e1/e2)によって表されるEIF3E遺伝子のエクソン1及び2を、標的配列として使用する。この標的配列を増幅することができるプライマー対(又はそれを増幅するプライマー対)は、したがって、EIF3E(e1)の3'末端及びEIF3E(e2)の5'末端にまたがる。ヒトEIF3E遺伝子のエクソン2のヌクレオチド配列は、配列番号38によって表される。特定の一例においては、プライマー対は、EIF3E(e1)をターゲティングするフォワードプライマーと、EIF3E(e2)をターゲティングするリバースプライマーとを含む。標的配列EIF3E(e1/e2)のためのフォワードプライマーの特定の一例は、(5'-3')GCATCTAGTCTTTCCGCTT(配列番号39)の配列を含み、同じ標的配列のためのリバースプライマーの特定の一例は、(5'-3')ACATCCATAGCAAAGTCTACC(配列番号40)の配列を含む。一例においては、標的配列EIF3E(e1/e2)のためのフォワードプライマーは、配列番号39の配列又はその相補配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%の配列同一性を有する。別の例においては、標的配列EIF3E(e1/e2)のためのリバースプライマーは、配列番号40の配列又はその相補配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%の配列同一性を有する。
【００５２】
一例においては、野生型RSPO2遺伝子を検出するために、RSPO2(e1/e2)によって表されるRSPO2遺伝子のエクソン1及び2を、標的配列として使用する。この標的配列を増幅することができるプライマー対(又はそれを増幅するプライマー対)は、したがって、RSPO2(e1)の3'末端及びRSPO2(e2)の5'末端にまたがる。ヒトRSPO2遺伝子のエクソン1のヌクレオチド配列は、配列番号41によって表される。特定の一例においては、プライマー対は、(5'-3')ACGTGCTAACCAAGCGGCTC(配列番号42)又は(5'-3')TTCTGCCTTCTACAGCTCGGA(配列番号43)の配列を含むフォワードプライマーと、(5'-3')TTCAGCGCGATCAGCATCTCT(配列番号44)又は(5'-3')AGTTCAGCGCGATCAGCA(配列番号45)の配列を含むリバースプライマーとを含む。一例においては、標的配列RSPO2(e1/e2)のためのフォワードプライマーは、配列番号42若しくは43の配列又はその相補配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%の配列同一性を有する。別の例においては、標的配列RSPO2(e1/e2)のためのリバースプライマーは、配列番号44若しくは45の配列又はその相補配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%の配列同一性を有する。
【００５３】
一部の例においては、1つ又は複数の多重化増幅反応において使用される内部コントロールは同じであり、それゆえ、内部コントロールを増幅することができる内部コントロールプライマー対(又はそれを増幅する内部コントロールプライマー対)もまた、同じである。様々な内部コントロール及びそれらのそれぞれのプライマー対は、公知の方法を使用して設計することができる。当業者は、必要な内部コントロールが、本分野において利用可能な情報及び知識に基づいて当業者によって構築され得ることを認識及び理解し得る。一例においては、内部コントロール配列は、配列番号69として提供されている。
【００５４】
好適なプライマーを使用することの他に、標的配列の増幅は、標的配列に結合することができるプローブ(又はそれに結合するプローブ)の使用を更に含み得る。
【００５５】
一部の例においては、第1の態様のキットは、1つ若しくは複数のR-スポンジン遺伝子融合物、1つ若しくは複数の野生型遺伝子又は1つ若しくは複数の内部コントロール配列における配列に相補的な1つ又は複数のプローブ配列を更に含む。
【００５６】
一例においては、使用されるプローブは、少なくとも1つの検出可能な標識を含む成分を含む。一例においては、検出可能な標識は、光学シグナルを生成することができる。一例においては、検出可能な標識は、フルオロフォア部分を含む。フルオロフォアの例として、蛍光タンパク質、例えばGFP(緑色蛍光タンパク質)、YFP(黄色蛍光タンパク質)、RFP(赤色蛍光タンパク質);キサンテン誘導体(例えばフルオレセイン、ローダミン、オレゴングリーン、エオシン、6-カルボキシフルオレセイン及びテキサスレッド)、シアニン誘導体(例えばシアニン、インドカルボシアニン、オキサカルボシアニン、チアカルボシアニン及びメロシアニン)、Seta、SeTau及びSquare色素を含むスクアライン誘導体及び環置換スクアライン、ナフタレン誘導体(ダンシル及びプロダン誘導体)、クマリン誘導体、オキサジアゾール誘導体(例えばピリジルオキサゾール、ニトロベンゾキサジアゾール及びベンゾキサジアゾール)、アントラセン誘導体(例えばアントラキノン、DRAQ5、DRAQ7及びCyTRAKオレンジ)、ピレン誘導体(例えばカスケードブルー)、オキサジン誘導体(例えばナイルレッド、ナイルブルー、クレシルバイオレット、オキサジン170)、アクリジン誘導体(例えばプロフラビン、アクリジンオレンジ、アクリジンイエロー)、アリールメチン誘導体(例えばオーラミン、クリスタルバイオレット、マラカイトグリーン)、テトラピロール誘導体(例えばポルフィン、フタロシアニン、ビリルビン)からなる群から選択される非タンパク質フルオロフォア並びにそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。一部の例においては、フルオロフォアは、FAM(カルボキシフルオレセイン)、HEX(カルボキシ-2,4,4,5,7,7-ヘキサクロロフルオレセインスクシンイミジルエステル)、JOE(6-カルボキシ-4',5'-ジクロロ-2',7'-ジメトキシフルオレセインスクシンイミジルエステル)、シアニン3、シアニン5、TAMRA(5-(及び-6)-カルボキシテトラメチルローダミンスクシンイミジルエステル)、Tye 563、Tye 556、TEX 615、LCRED640、テキサスレッド(スルホローダミン101酸塩化物)又はCal Red 610である。一部の特定の例においては、フルオロフォアは、FAM、シアニン5、テキサスレッド、Cal Red 610又はHEXである。
【００５７】
多数の標的配列の検出のための多重化増幅反応においては、様々な標的配列について典型的に様々な検出可能な標識が使用される。例えば、検出可能な標識Aは、キー標的配列Aのために使用され、検出可能な標識Bは、野生型コントロールBのために使用され、検出可能な標識Cは、野生型コントロールCのために使用され、検出可能な標識Dは、野生型コントロールDのために使用される。好ましい例においては、様々な検出可能な標識の発光波長は、干渉を最小限にするために十分に分離されている。例えば、各発光波長間の差は、少なくとも30nm、又は少なくとも40nm、又は少なくとも50nm、又は少なくとも60nm、又は少なくとも70nm、又は少なくとも80nm、又は少なくとも90nm、又は少なくとも100nm、又は少なくとも110nm、又は少なくとも120nm、又は少なくとも130nm、又は少なくとも140nm、又は少なくとも150nm、又は少なくとも160nm、又は少なくとも170nm、又は少なくとも180nm、又は少なくとも190nm、又は少なくとも200nm、又は少なくとも210nm、又は少なくとも220nm、又は少なくとも230nm、又は少なくとも240nm、又は少なくとも250nm、又は少なくとも260nm、又は少なくとも270nm、又は少なくとも280nm、又は少なくとも290nm、又は少なくとも300nmである。一部の特定の例においては、キー標的配列のためのプローブにおいて使用されるフルオロフォアは、FAM(カルボキシフルオレセイン)であり、野生型コントロールのためのプローブにおいて使用されるフルオロフォアは、テキサスレッド(スルホローダミン101酸塩化物)であり、別の野生型コントロールのためのプローブにおいて使用されるフルオロフォアは、シアニン5であり、内部コントロールのためのプローブにおいて使用されるフルオロフォアは、HEX(カルボキシ-2,4,4,5,7,7-ヘキサクロロフルオレセインスクシンイミジルエステル)である。
【００５８】
一例においては、少なくとも1つの検出可能な標識は、可変性シグナルを生成することができる。可変性シグナルは、プローブの標的配列へのハイブリダイゼーションに際して生成され得る。例えば、シグナルは、プローブが標的配列に結合する前に検出可能であってもよく、プローブの標的配列へのハイブリダイゼーションに際して、シグナルは、強度が低減するか、又は完全に検出不能になる。別の例においては、検出可能なシグナルは、プローブの標的配列へのハイブリダイゼーションに際してのみ生成してもよく、或いは、検出可能なシグナルの強度は、プローブの標的配列へのハイブリダイゼーションに際して増大してもよい。
【００５９】
一例においては、成分は、2つの検出可能な標識を含む。一例においては、2つの検出可能な標識は独立して機能し、一方で別の例においては、2つの検出可能な標識は、相互作用標識対である。相互作用標識対は、可変性シグナルを産生することができる。例えば、シグナルは、プローブが標的配列に結合する前に検出可能であってもよく、プローブの標的配列へのハイブリダイゼーションに際して、シグナルは、強度が低減するか、又は完全に検出不能になる。別の例においては、検出可能なシグナルは、プローブの標的配列へのハイブリダイゼーションに際してのみ生成してもよく、或いは、検出可能なシグナルの強度は、プローブの標的配列へのハイブリダイゼーションに際して増大してもよい。特定の一例においては、両方の検出可能な標識がプローブ配列によって共に連結されている場合、検出可能なシグナルは産生しない。少なくとも1つの検出可能な標識がプローブから切断されると、検出可能なシグナルが産生する。
【００６０】
一部の例においては、相互作用標識対は、フルオロフォアとクエンチャーとの対を含み得る。特定の一例においては、フルオロフォアは、プローブの5'末端に位置し、クエンチャーは、プローブの3'末端に位置する。クエンチャーの例として、TAMRA(テトラメチルローダミン)、TaqMan(登録商標)MGB(小溝結合剤)及びBHQ(商標)(Black Hole Quencher(商標))が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６１】
多重化増幅反応において使用され得る一部の特定の例示的なプローブ配列として、PTPRK(e1)-RSPO3(e2)融合物のための(6FAM)5'-CCAGYTCYCCKCAGTGCATCCT-3'(BHQ1)(配列番号46)、PTPRK(e1/e2)野生型コントロールのための(TxRd)5'-AAGTACAGCCACCTGCGGAGA-3'(BHQ2)(配列番号47)又は(TxRd)5'-AAGTAYAGCCAYCTGMGGAGA-3'(BHQ2)(配列番号48)、RSPO3(e1/e2)野生型コントロールのための(Cy5)5'-TGCATTCTTCGCTGGCGCCTT-3'(BHQ2)(配列番号49)、内部コントロールのための(HEX)5'-AGGTCGGGTGGGCGGGTCGTTA-3'(BHQ1)(配列番号50)、PTPRK(e7)-RSPO3(e2)融合物のための(6FAM)5'-ACCAGAASAAAATGTGCAGTGCATCC-3'(BHQ1)(配列番号51)、PTPRK(e7/e8)野生型コントロールのための(TxRd)5'-ATGTGCMGAACCTATGAGAACCCCAA-3'(BHQ2)(配列番号52)、PTPRK(e13)-RSPO3(e2)融合物のための(6FAM)5'-AYGCATTGCTACAAAAGTGCATCCTA-3'(BHQ1)(配列番号53)又は(6FAM)5'-ACTAACGTTAGGATGCAMTTTTGTAGCAATG-3'(BHQ1)(配列番号54)、PTPRK(e12〜e14)野生型コントロールのための(TxRd)5'-AYCCCAGATCCCGCCAAGCA-3'(BHQ2)(配列番号55)、EIF3E(e1)-RSPO2(e2)融合物のための(6FAM)5'-SCGCCACGAACCTCCTTTACAGAG-3'(BHQ1)(配列番号56)、EIF3E(e1/e2)野生型コントロールのための(TxRd)5'-ATTGGARCTTCTTAGTGATACCAACA-3'(BHQ2)(配列番号57)及びRSPO2(e1/e2)野生型コントロールのための(Cy5)5'-CTCCCTAGGCGCSGTGCTCCATC-3'(BHQ2)(配列番号58)又は(Cy5)5'-CCACGAACCAATTGTRTCGCTTCCTG-3'(BHQ2)(配列番号59)が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
一部の例においては、第1の態様のキットは、1つ又は複数の陽性コントロールを更に含み、各々は、目的の遺伝子融合物及び野生型コントロールについてのものである。各々の陽性コントロールは一般的に、目的の標的配列に対応する単一の長いオリゴヌクレオチドを含有するプラスミドを含む。各多重化増幅反応中に、増幅反応が機能していることを確実にするために、好適な陽性コントロール反応は、試験反応に伴って設定される。
【００６３】
対応するプラスミドマップは、図31において見ることができ、インサート配列は、配列番号59〜68において見ることができる。
【００６４】
第1の態様のキットのプライマー及びプローブは、短いアンプリコンの増幅及び検出のために設計される。短いアンプリコンは、例えば約300塩基対未満、約290塩基対未満、約280塩基対未満、約270塩基対未満、約260塩基対未満、約250塩基対未満、約240塩基対未満、約230塩基対未満、約220塩基対未満、約210塩基対未満、約200塩基対未満、約190塩基対未満、約180塩基対未満、約170塩基対未満、約160塩基対未満、約150塩基対未満、約140塩基対未満、約130塩基対未満、約120塩基対未満、約110塩基対未満、約100塩基対未満、約90塩基対未満、約80塩基対未満、約70塩基対未満、約60塩基対未満又は約50塩基対未満のアンプリコンを指す。短いアンプリコンの特定の例は、150塩基対未満、140塩基対未満、130塩基対未満、120塩基対未満、110塩基対未満又は100塩基対未満を有する。特定の一例においては、短いアンプリコンは、130塩基対未満である。
【００６５】
一部の例においては、第1の態様のキットは、ポリメラーゼ連鎖反応を実行するための試薬を更に含む。そのような試薬として、デオキシリボヌクレオチド(dNTP)、DNAポリメラーゼ、塩及び緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない。DNAポリメラーゼは、鋳型鎖に相補的な塩基を付加することによって、伸長中のDNA鎖へのdNTPの付加を触媒する。
【００６６】
第2の態様においては、悪性腫瘍を患う対象においてPTPRK(e13)-RSPO3(e2) R-スポンジン遺伝子融合物を検出する方法であって、対象からの試料から核酸を抽出する工程と;1つ又は複数のプライマー対により核酸を増幅する工程であって、プライマー対が、PTPRK(e13)-RSPO3(e2)遺伝子融合物を増幅することができる、工程と;増幅した核酸を検出する工程とを含む方法が提供される。一部の例においては、第2の態様の方法は、PTPRK(e1)-RSPO3(e2)融合物、PTPRK(e7)-RSPO3(e2)融合物及び/又はEIF3E(e1)-RSPO2(e2)融合物を増幅することができる1つ又は複数のプライマー対(又はそれを増幅する1つ又は複数のプライマー対)により核酸を増幅する工程を更に含む。
【００６７】
第3の態様においては、悪性腫瘍を患う対象においてWntシグナリングの阻害剤への感受性を特定する方法であって、対象からの試料から核酸を抽出する工程と;PTPRK(e13)-RSPO3(e2) R-スポンジン遺伝子融合物を増幅することができるプライマー対(又はそれを増幅するプライマー対)により核酸を増幅する工程と;PTPRK(e13)-RSPO3(e2) R-スポンジン遺伝子融合物が増幅された場合、Wntシグナリングの阻害剤への感受性を特定する工程とを含む方法が提供される。一部の例においては、第3の態様の方法は、PTPRK(e1)-RSPO3(e2)融合物、PTPRK(e7)-RSPO3(e2)融合物又はEIF3E(e1)-RSPO2(e2)融合物を増幅することができる1つ又は複数の追加のプライマー対(又はそれを増幅する1つ若しくは複数の追加のプライマー対)により核酸を増幅する工程と、PTPRK(e1)-RSPO3(e2)融合物、PTPRK(e7)-RSPO3(e2)融合物、PTPRK(e13)-RSPO3(e2)融合物又はEIF3E(e1)-RSPO2(e2)融合物が増幅された場合、Wntシグナリングの阻害剤への感受性を特定する工程とを更に含む。
【００６８】
PTPRK(e13)-RSPO3(e2) R-スポンジン遺伝子融合物、PTPRK(e1)-RSPO3(e2)融合物、PTPRK(e7)-RSPO3(e2)融合物及び/又はEIF3E(e1)-RSPO2(e2)融合物を増幅することができるプライマー及びプライマー対(又はそれを増幅するプライマー及びプライマー対)は、本開示において説明する通りである。
【００６９】
各多重化増幅実験について、少なくとも以下の反応(及びその反復):遺伝子融合物及び野生型コントロールの各々についての陽性コントロール反応、陰性コントロール反応並びに試験反応が設定される。すべての反応は、同じ試薬、プライマー及び/又はプローブを含有し、唯一の相違は、各反応に添加される試料である。陽性コントロール反応に添加される試料は、上記に定義する標的遺伝子融合物又は野生型配列についての陽性コントロールである。陰性コントロールに添加される試料は、任意の鋳型を含有しない。陰性コントロールに添加される典型的な試料は、ヌクレアーゼフリー水である。試験反応に添加される試料は、目的の対象から得た生物試料である。一例においては、融合物Aは、3重(例えば、融合物A及び2 WT)として行われる。別の例においては、融合物Bは、2重(例えば、融合物B及びWT)として行われる。また別の例においては、融合物Cは、2重(例えば、融合物C及びWT)として行われる。別の例においては、融合物Cは、2重(例えば、融合物C+WT PTPRK)として行われる。更なる例においては、融合物Dは、3重(例えば、融合物D及びWT)として行われる。また別の例においては、融合物Dは、3重(例えば、融合物D及びWT EIF3E及びWT RSPO2)として行われる。
【００７０】
一例においては、生物試料は、少なくとも一部の生物材料、例えば核酸分子、特にリボ核酸(RNA)を含む。一部の例においては、生物試料は、固形組織試料又は液体試料(例えば、全血、血清、血漿、脳脊髄液、中枢脊髄液、リンパ液、嚢胞液、痰、便、胸水、粘液、胸腔内液、腹水、羊水、腹腔液、唾液、気管支洗浄液及び尿)から得たRNAを含む。一部の特定の例においては、生物試料は、腫瘍組織、例えばホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)固定腫瘍組織又は新鮮凍結腫瘍からの組織から得たRNAを含む。
【００７１】
第1の態様のキットを使用して行った多重化増幅反応の各々の結果は、公知の多重増幅反応分析法を使用して分析することができる。使用した増幅反応がリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(リアルタイムPCR)である場合、リアルタイムPCR反応からの結果は、主にCt値を使用して分析される。
【００７２】
本明細書において互換的に使用される「Ct値」又は閾値サイクル値という用語は、反応中に産生した蛍光が、バックグラウンド蛍光を顕著に超える蛍光シグナルである蛍光閾値と交差するサイクル数を指す。閾値サイクルでは、反応の初期指数関数的増幅相中に検出可能な量のアンプリコン生成物が産生している。閾値サイクルは、目的の遺伝子の元の相対的発現レベルに対して反比例する。
【００７３】
リアルタイムPCR反応においては、Ct値は、増幅曲線及び蛍光閾値に基づいて容易に得ることができる。増幅曲線は、試料の連続希釈物について得られた半対数曲線であり、Y軸は、ログスケールの蛍光レベルを表し、X軸は、サイクル数を表す。増幅曲線は、初期相、指数関数的増幅相及びプラトー相を有する。
【００７４】
多重化増幅反応における目的の標的配列の各々の増幅曲線に基づいて、標的配列の各々についてCt値を得ることができる。目的の標的遺伝子融合物配列のCt値は、Cttと表し、目的の標的野生型コントロール配列のCt値は、Ctcと表す。1つを超える野生型コントロールを使用した場合、異なるCtc値は、Ctc1、Ctc2等と表すことができる。目的の標的遺伝子融合物と目的の標的野生型コントロール配列とのCt値間の差は、ΔCtと表し、ΔCt=Ctt-Ctcである。1つを超える野生型コントロールを使用した場合、異なるΔCt値は、ΔCt1、ΔCt2等と表すことができる。各遺伝子融合物についてのΔCtは、試料中の融合物の割合を示す。
【００７５】
多重化増幅反応を適切に設定することを確実にするために、陽性コントロール反応の各々のCt値は、所定のCt値範囲内に入らなければならない。例えば、陽性コントロール反応が、目的の標的遺伝子融合物についての陽性コントロールである場合、目的の標的遺伝子融合物のCt値は、所定のCt値範囲内に入らなければならず;陽性コントロール反応が、目的の標的野生型遺伝子についての陽性コントロールである場合、目的の標的野生型遺伝子のCt値は、所定のCt値範囲内に入らなければならない。Ct値範囲は典型的に、約15〜約40、又は約16〜約39、又は約17〜約38、又は約18〜約37、又は約19〜約36、又は約20〜約35、又は約21〜約34、又は約22〜約33、又は約23〜約32、又は約24〜約31、又は約25〜約30、又は約26〜約29、又は約27〜約28である。陽性コントロールのCt値が所定の範囲外に入る場合、陽性コントロール反応は、失敗と考えられる。
【００７６】
陰性コントロール反応における目的の標的遺伝子融合物及び目的の標的野生型遺伝子の両方のCt値は、反応設定において汚染がないことを確実にするために、約40を超えるべきである。陰性コントロール反応における内部コントロールのCt値は、所定のCt値範囲内に入らなければならない。Ct値範囲は典型的に、約15〜約40、又は約16〜約39、又は約17〜約38、又は約18〜約37、又は約19〜約36、又は約20〜約35、又は約21〜約34、又は約22〜約33、又は約23〜約32、又は約24〜約31、又は約25〜約30、又は約26〜約29、又は約27〜約28である。陰性コントロール反応における内部コントロールのCt値が所定の範囲外に入る場合、陰性コントロール反応は、失敗と考えられる。
【００７７】
上記に説明する陽性コントロール反応及び陰性コントロール反応のいずれか1つが失敗した場合、すべての試験反応の結果を使用すべきない。上記に説明する陽性コントロール反応及び陰性コントロール反応の両方の設定が成功した場合、試験反応から得た結果を、試料分析に使用することができる。
【００７８】
各試験反応においては、内部コントロール反応のCt値は、所定のCt値範囲内に入らなければならない。Ct値範囲は典型的に、約15〜約40、又は約16〜約39、又は約17〜約38、又は約18〜約37、又は約19〜約36、又は約20〜約35、又は約21〜約34、又は約22〜約33、又は約23〜約32、又は約24〜約31、又は約25〜約30、又は約26〜約29、又は約27〜約28である。1つの特定の試験反応における内部コントロールのCt値が、所定の範囲外に入る場合、この試験反応は、失敗と考えられ、この試験反応から得た結果は、試料を分析するときに無視するべきである。
【００７９】
試験反応において、目的の標的遺伝子融合物のCt値(すなわち、Ctt)が、所定のCt値範囲内に入る場合、試験反応は、目的の標的遺伝子融合物について増幅陽性と考えられる。Cttが、所定のCt値範囲の上限を超える場合、試験反応は、目的の標的遺伝子融合物について増幅陰性と考えられる。同様に、目的の標的野生型コントロールのCt値(すなわち、Ctc1、Ctc2等)が、所定のCt値範囲内に入る場合、試験反応は、目的の標的野生型コントロールについて増幅陽性と考えられる。Ctc1及び/又はCtc2等が、所定のCt値範囲の上限を超える場合、試験反応は、目的の標的野生型コントロールについて増幅陰性と考えられる。Ct値範囲は典型的に、約15〜約40、又は約16〜約39、又は約17〜約38、又は約18〜約37、又は約19〜約36、又は約20〜約35、又は約21〜約34、又は約22〜約33、又は約23〜約32、又は約24〜約31、又は約25〜約30、又は約26〜約29、又は約27〜約28である。
【００８０】
試験反応が、目的の標的遺伝子融合物について増幅陰性である場合、試験した対象は、Wntシグナリング経路の阻害剤による治療に感受性である悪性腫瘍を患っていないと特定される。試験反応が、目的の標的遺伝子融合物及び目的の標的野生型コントロールの両方について増幅陽性である場合、試験した対象が、Wntシグナリング経路の阻害剤による治療に感受性である悪性腫瘍を患っているかどうかを決定するために、上記に定義する値ΔCt(又はΔCt1、ΔCt2等)を使用する。
【００８１】
値ΔCt(又はΔCt1、ΔCt2等)が、カットオフ値又はそれ未満である場合、試験した対象は、Wntシグナリング経路の阻害剤による治療に感受性である悪性腫瘍を患っていると特定される。値ΔCt(又はΔCt1、ΔCt2等)が、カットオフ値を超える場合、試験した対象は、Wntシグナリング経路の阻害剤による治療に感受性である悪性腫瘍を患っていないと特定される。
【００８２】
試験反応からの結果はまた、がんの検出に使用することができる。試験反応が、目的の標的遺伝子融合物について増幅陰性である場合、試験した対象は、がんを患っていないと特定される。試験反応が、目的の標的遺伝子融合物及び目的の標的野生型コントロールの両方について増幅陽性である場合、試験した対象が、がんを患っているかどうかを決定するために、上記に定義する値ΔCt(又はΔCt1、ΔCt2等)を使用する。値ΔCt(又はΔCt1、ΔCt2等)が、カットオフ値又はそれ未満である場合、試験した対象は、がんを患っていると特定される。ΔCt(又はΔCt1、ΔCt2等)が、カットオフ値を超える場合、試験した対象は、がんを患っていないと特定される。
【００８３】
本明細書において開示するキットを使用して行われる多重化増幅反応は、結果が、多くの場合2日、又は1日、又は22時間、又は20時間、又は18時間、又は16時間、又は12時間、又は10時間、又は8時間、又は6時間、又は4時間、又は2時間より短い、短期間内に分析に利用可能になることを可能にする。
【００８４】
第4の態様においては、悪性腫瘍を患う対象を治療する方法であって、第1の態様のキット、又は第2若しくは第3の態様の方法を使用して悪性腫瘍を特定する工程と、Wntシグナリング経路の阻害剤により対象を治療する工程とを含む方法が提供される。また、Wntシグナリング経路の阻害剤による治療に感受性の悪性腫瘍の治療のための医薬の製造における、Wntシグナリング経路の阻害剤の使用が提供され、ここで悪性腫瘍は、第1の態様のキット、又は第2若しくは第3の態様の方法を使用して特定される。
【００８５】
阻害剤の酵素への結合、及び後続の、酵素からの放出の測定値は、所与の基質濃度で50%酵素活性をもたらす阻害剤濃度を反映する「IC50」値である。
【００８６】
「治療有効量」という用語は、本明細書において使用するとき、研究者、獣医、医師又は他の臨床医が探求する組織系、動物又はヒトにおいて、治療される疾患又は障害の症状の軽減を含む、生物応答又は医療応答を誘発する活性化合物又は医薬剤の量を意味する。
【００８７】
本明細書において使用するとき、「薬学的に許容される」という用語は、ヒト及び獣医学的使用の両方を包含する:例えば、「薬学的に許容される」という用語は、獣医学的に許容される化合物又はヒト医薬及び健康管理において許容される化合物を包含する。一例においては、ヒト医薬及び健康管理は除外される。
【００８８】
「任意選択で置換されている」という用語は、1つ若しくは複数の置換基が存在し得るか、又は置換基が存在しない場合があることを示す。置換基は、上記基(アルキル、アリール、ヘテロアリール、非芳香環)上に存在してもよく、存在しなくてもよい。基の構造によって指示される通り、基上に0、1、2、3若しくは4つ、又は4つよりも多い置換基が存在し得る。可能な置換基として、ハロゲン(例えば、フッ素、塩素又は臭素)、アルキル基、アルコキシ基(すなわち、アルキルが上記に定義する通りであるO-アルキル)、アリールオキシ基(すなわち、アリールが上記に定義する通りであるO-アリール)、エステル、アミド又はスルホン酸エステル基(すなわち、Rが上記に定義するアルキルであるCO2R、CONHR、SO3R)が挙げられるが、しかしながら、他の置換基は、追加的に、又は代替として存在してもよい。置換基が示されている場合、「任意選択で置換されている」という用語は、示されていない追加の置換基の可能性を示す。したがって、例えば構造Iにおいて、Arは「任意選択で置換されている」と示されている場合、これは、Cy及びNR5に加えて更なる置換基の可能性を示すが、Cy又はNR5のいずれかが非存在であり得る可能性を示さない。したがって、例えば、Arは「二置換されている」芳香環であると示されている場合、これは、環上に2つの置換基のみが存在する、すなわち、Cy及びアミド窒素以外の追加の置換基はないことを意味すると解釈するべきである。例えば、化合物1における1,4-フェニレン基は、「二置換されている」とみなされる。
【００８９】
説明及び特許請求の範囲全体を通して、「アルキル」という表現は、具体的に限定しない限り、C1〜12アルキル基又はC1〜12を超えるアルキル基、好適にはC1〜6アルキル基、例えばC1〜4アルキル基を示す。アルキル基は、直鎖又は分岐鎖であり得る。好適なアルキル基として、例えばメチル、エチル、プロピル(例えばn-プロピル及びイソプロピル)、ブチル(例えばn-ブチル、イソ-ブチル、sec-ブチル及びtert-ブチル)、ペンチル(例えばn-ペンチル)、ヘキシル(例えばn-ヘキシル)、ヘプチル(例えばn-ヘプチル)、オクチル(例えばn-オクチル)、イソオクチル、デシル及びドデシルが挙げられる。例えば「アルコキシ」、「ハロアルキル」及び「チオアルキル」という表現における「アルク(alk)」という表現は、「アルキル」の定義に従って解釈するべきである。アルコキシ基の例として、メトキシ、エトキシ、プロポキシ(例えばn-プロポキシ)、ブトキシ(例えばn-ブトキシ)、ペントキシ(例えばn-ペントキシ)、ヘキソキシ(例えばn-ヘキソキシ)、ヘプトキシ(例えばn-ヘプトキシ)及びオクトキシ(例えばn-オクトキシ)が挙げられる。チオアルキル基の例として、メチルチオ-が挙げられる。ハロアルキル基の例として、フルオロアルキル、例えばCF3が挙げられる。ある特定の場合、それらは、環状構造を含有し得る。環状構造基の例として、シクロヘキシル、メチルシクロヘキシル、イソプロピルシクロペンチル、シクロブチルエチル等が挙げられる。ある特定の例においては、それらは、かご構造、例えばアダマンチルではない。
【００９０】
「アルケニル」という表現は、具体的に限定しない限り、任意の所望の位置に少なくとも1つの二重結合を含有し、任意の三重結合を含有しないC2〜12アルケニル基、好適にはC2〜6アルケニル基、例えばC2〜4アルケニル基を示す。アルケニル基は、直鎖又は分岐鎖であり得る。1つの二重結合を含むアルケニル基の例として、プロペニル及びブテニルが挙げられる。2つの二重結合を含むアルケニル基の例として、ペンタジエニル、例えば(1E,3E)-ペンタジエニルが挙げられる。
【００９１】
「アルキニル」という表現は、具体的に限定しない限り、任意の所望の位置に少なくとも1つの三重結合を含有し、また1つ又は複数の二重結合を含有する場合もあり、含有しない場合もあるC2〜12アルキニル基、好適にはC2〜6アルキニル基、例えばC2〜4アルキニル基を示す。アルキニル基は、直鎖又は分岐鎖であり得る。アルキニル基の例として、プロピニル及びブチニルが挙げられる。
【００９２】
「アルキレン」という表現は、nが、具体的に限定しない限り、整数、例えば1〜12、1〜6、2〜6又は2〜5である、式-(CH2)n-の鎖を示す。
【００９３】
「シクロアルキル」という表現は、具体的に限定しない限り、C3〜10シクロアルキル基(すなわち、3〜10個の環炭素原子)、より好適にはC3〜8シクロアルキル基、例えばC3〜6シクロアルキル基を示す。シクロアルキル基の例として、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル及びシクロオクチルが挙げられる。環炭素原子の最も好適な数は、3〜6個である。
【００９４】
「シクロアルケニル」という表現は、具体的に限定しない限り、C3〜10シクロアルケニル基(すなわち、3〜10個の環炭素原子)、好適にはC5〜10シクロアルケニル基(すなわち、5〜10個の環炭素原子)、より好適にはC5〜8シクロアルケニル基、例えばC5〜6シクロアルケニル基を示す。シクロアルケニル基の例として、シクロプロペニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル及びシクロオクテニルが挙げられる。環炭素原子の最も好適な数は、5〜6個である。
【００９５】
「カルボシクリル」という表現は、具体的に限定しない限り、すべての環原子が炭素であり、3〜12個の環炭素原子、好適には3〜10個の炭素原子、より好適には3〜8個の炭素原子を含有する任意の環系を示す。カルボシクリル基は、飽和又は部分不飽和であり得るが、芳香環を含まない。カルボシクリル基の例として、単環式、二環式及び三環式環系、特に単環式及び二環式環系が挙げられる。他のカルボシクリル基として、架橋環系(例えばビシクロ[2.2.1]ヘプテニル)が挙げられる。カルボシクリル基の特定の例は、シクロアルキル基である。カルボシクリル基の更なる例は、シクロアルケニル基である。
【００９６】
「ヘテロシクリル」及び「非芳香環」という表現は、具体的に限定しない限り、説明内で互換的に使用してもよく、1つ又は複数(例えば1、2又は3つ)の環原子がヘテロ原子によって置換されているカルボシクリル基を指す。環は、4〜8つの環原子、通常5又は6つを有し得る。ヘテロ原子は通常、N、S及びOから選択される。ヘテロシクリル基の特定の例は、1つ又は複数(例えば1、2又は3つ、特に1又は2つ、具体的に1つ)の環原子がN、S又はOから選択されるヘテロ原子によって置換されているシクロアルキル基(例えばシクロペンチル又はより特にシクロヘキシル)である。1つのヘテロ原子を含有するヘテロシクリル基の例として、ピロリジン、テトラヒドロフラン及びピペリジンが挙げられ、2つのヘテロ原子を含有するヘテロシクリル基の例として、モルホリン及びピペラジンが挙げられる。ヘテロシクリル基の更なる特定の例は、1つ又は複数(例えば1、2又は3つ、特に1又は2つ、具体的に1つ)の環原子が、N、S及びOから選択されるヘテロ原子によって置換されているシクロアルケニル基(例えばシクロヘキセニル基)である。このような基の例は、ジヒドロピラニル(例えば3,4-ジヒドロ-2H-ピラン-2-イル-)である。ヘテロシクリル基は、炭素環原子又は窒素環原子によって分子の他の1つ又は複数の部分に連結され得る。構造(I)中のCy基は、そのような環の例であり得る。
【００９７】
「アリール」という表現は、具体的に限定しない限り、C6〜12アリール基、好適にはC6〜10アリール基、より好適にはC6〜8アリール基を示す。アリール基は、少なくとも1つの芳香環(例えば1、2又は3つの環)を含有する。多数の芳香環を有するアリール基として、縮合芳香環及び1つの単結合によって互いにつながった芳香環が挙げられる。1つの芳香環を有する典型的なアリール基の例は、フェニルである。2つの縮合芳香環を有する典型的なアリール基の例は、ナフチルである。2つの直接つながった芳香環を有する芳香基の例は、ビフェニルである。アリール基は、別に示さない限り、任意の好適な置換パターン、例えばオルト、メタ、パラを有する。示さない限り、それらは、任意の適切な数の置換基を有し得る(例えば単環式芳香族は、1〜5つの置換基を有してもよく、縮合二環式芳香族は、1〜7つの置換基を有してもよい等)。
【００９８】
「ヘテロアリール」という表現は、具体的に限定しない限り、1つ又は複数(例えば1、2、3又は4つ、好適には1、2又は3つ)の環原子がヘテロ原子によって置換されており、前記ヘテロ原子が通常、N、S及びO、そうでなければ1つ又は複数(例えば1、2、3又は4つ、好適には1、2又は3つ)の環原子を含有する5員芳香環から(独立して)選択され、前記ヘテロ原子が通常、N、S及びOから選択される、アリール残基を示す。ヘテロアリール基は、窒素以外の環ヘテロ原子を有しない。ヘテロアリール基は典型的に、それらが二環式又は多環式でない限り、5又は6つの環原子を有する。別に示さない限り、それらは、任意の好適な置換パターンを有してもよく、任意の適切な数の置換基を有してもよい。ヘテロアリール基は、単環式又は二環式又は多環式であり得る。縮合環は各々、少なくとも1つがヘテロアリールであれば、ヘテロアリール環又はホモアリール環のいずれかであってもよい。1つのヘテロ原子を有する単環式ヘテロアリール基の例として、5員環(例えばピロール、フラン、チオフェン)及び6員環(例えばピリジン、例えばピリジン-2-イル、ピリジン-3-イル及びピリジン-4-イル)が挙げられる。2つのヘテロ原子を有する単環式ヘテロアリール基の例として、5員環(例えばピラゾール、オキサゾール、イソキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、イミダゾール、例えばイミダゾール-1-イル、イミダゾール-2-イル、イミダゾール-4-イル)及び6員環(例えばピリダジン、ピリミジン、ピラジン)が挙げられる。3つのヘテロ原子を有する単環式ヘテロアリール基の例として、1,2,3-トリアゾール、1,2,4-トリアゾール、1,2,3-オキサジアゾール及び1,2,4-オキサジアゾールが挙げられる。4つのヘテロ原子を有する単環式ヘテロアリール基の例として、テトラゾールが挙げられる。二環式ヘテロアリール基の例として、インドール(例えばインドール-6-イル)、ベンゾフラン、ベンズチオフェン、キノリン、イソキノリン、インダゾール、ベンズイミダゾール、ベンズチアゾール、キナゾリン及びプリンが挙げられる。ヘテロアリール基は、炭素環原子又は窒素環原子によって分子の他の1つ又は複数の部分に連結され得る。
【００９９】
上記に挙げるアリール及びヘテロアリール基は、適切な場合、任意選択で、各々独立して一価又は多価の(すなわち、1より大きい結合価を有する)官能基から選択される1つ又は複数(例えば1、2又は3つ、好適には1又は2つ)の基によって置換されていてもよい。好適な置換基として、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、-アルコキシ(例えばOMe)、シクロアルキル、アルケニルオキシ-、アルキニルオキシ-、アルコキシアルキル-、ニトロ、ハロゲン(例えばフルオロ、クロロ及びブロモ)、シアノ、ヒドロキシル、オキソ、-C(O)-アルキル(例えばCOMe)、C(O)OH、-C(O)Oアルキル(例えば-C(O)OMe)、-OC(O)アルキル(例えば-OC(O)Me)、-NH2、-NHアルキル(例えば-NHMe)、-N(アルキル)2(例えばジメチルアミノ-)、-C(O)NH2、-C(O)NH(アルキル)(例えば-C(O)NHMe)、-NHC(O)アルキル(例えば-NHC(O)Me)、-C(NH)NH2、チオアルキル(例えば-チオメチル)、-SO2アルキル(例えばSO2Me)、-SOアルキル(例えば-SOMe)、-SO2シクロアルキル及び-SOシクロアルキルが挙げられる。より典型的には、置換基は、アルキル(例えばMe)、フルオロアルキル(例えばCF3及びCHF2)、アルコキシ(例えばOMe)、ハロゲン及びヒドロキシルから選択される。
【０１００】
「-アルキルアリール」という表現は、具体的に限定しない限り、アルキレン部分、例えばC1〜4アルキレン部分を介してつながっているアリール残基を示す。そのような基の例は、ベンジル:PhCH2-である。
【０１０１】
「ハロゲン」又は「ハロ」という用語は、フッ素(F)、塩素(Cl)及び臭素(Br)を含む。
【０１０２】
「アミノ」という用語は、-NH2基を指す。
【０１０３】
「オキソ」という用語は、それが置換している炭素原子と共に、カルボニル基C=Oを形成する酸素原子を指す。
【０１０４】
「-アリールヘテロシクリル」という用語は、アリール部分を介してつながっているヘテロシクリル残基を指す。
【０１０５】
「結合」という用語は、化合物又は分子中の原子間の連結である。結合は、単結合、二重結合又は三重結合であってもよい。
【０１０６】
立体異性体:
【０１０７】
特許請求に係る化合物のすべての可能な立体異性体は、本発明に含まれる。
【０１０８】
本発明による化合物が、少なくとも1つのキラル中心を有する場合、それらは、したがって、エナンチオマーとして存在し得る。化合物が、2つ又はそれよりも多いキラル中心を所有する場合、それらは、加えて、ジアステレオマーとして存在し得る。すべてのそのような異性体及びそれらの混合物は、本発明の範囲内に包含されることが理解されるべきである。
【０１０９】
立体異性体の調製及び単離:
【０１１０】
本発明による化合物の調製のための方法が、立体異性体の混合物を生じる場合、これらの異性体は、従来技術、例えば分取クロマトグラフィーによって分離してもよい。化合物を、ラセミ体で調製してもよく、或いは、個々のエナンチオマーを、エナンチオ特異的合成又は分解のいずれかによって調製してもよい。化合物を、例えば、標準技術、例えば、(-)-ジ-p-トルオイル-d-酒石酸及び/又は(+)-ジ-p-トルオイル-l-酒石酸等の光学活性酸との塩形成によるジアステレオマー対の形成、並びに後続の分別再結晶及び遊離塩基の再生によってそれらの成分エナンチオマーに分解してもよい。化合物をまた、ジアステレオマーエステル又はアミドの形成、並びに後続のクロマトグラフィー分離及びキラル補助剤の除去によって分解してもよい。或いは、化合物を、キラルHPLCカラムを使用して分解してもよい。
【０１１１】
薬学的に許容される塩:
【０１１２】
遊離化合物とそれらの塩又は溶媒和物の形態の化合物との間の密接な関係に照らして、化合物がこの文脈において言及される場合、対応する塩、溶媒和物又は多形体もまた、それらがその状況下で可能であるか、又は適切であるならば、意図される。
【０１１３】
式(I)の化合物の塩及び溶媒和物、並びに医薬における使用のために好適なそれらの生理学的に機能的な誘導体は、対イオン又は関連付けられる溶媒が薬学的に許容されるものである。しかしながら、薬学的に許容されない対イオン又は関連付けられる溶媒を有する塩及び溶媒和物は、例えば、他の化合物並びにそれらの薬学的に許容される塩及び溶媒和物の調製における中間体としての使用のために、本発明の範囲内である。
【０１１４】
本発明による好適な塩は、有機及び無機両方の酸又は塩基で形成した塩を含む。薬学的に許容される酸付加塩として、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、クエン酸、酒石酸、リン酸、乳酸、ピルビン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、トリフェニル酢酸、スルファミン酸、スルファニル酸、コハク酸、シュウ酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、オキサロ酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、アリールスルホン酸(例えばp-トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸又はナフタレンジスルホン酸)、サリチル酸、グルタル酸、グルコン酸、トリカルバリル酸、桂皮酸、置換されている桂皮酸(例えば4-メチル及び4-メトキシ桂皮酸を含むフェニル、メチル、メトキシ又はハロ置換桂皮酸)、アスコルビン酸、オレイン酸、ナフトン酸、ヒドロキシナフトン酸(例えば1-又は3-ヒドロキシ-2-ナフトン酸)、ナフタレンアクリル酸(例えばナフタレン-2-アクリル酸)、安息香酸、4-メトキシ安息香酸、2-又は4-ヒドロキシ安息香酸、4-クロロ安息香酸、4-フェニル安息香酸、ベンゼンアクリル酸(例えば1,4-ベンゼンジアクリル酸)、イセチオン酸、過塩素酸、プロピオン酸、グリコール酸、ヒドロキシエタンスルホン酸、パモ酸、シクロヘキサンスルファミン酸、サリチル酸、サッカリン酸及びトリフルオロ酢酸から形成した塩が挙げられる。薬学的に許容される塩基塩として、アンモニウム塩、ナトリウム及びカリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム及びマグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩、並びにジシクロヘキシルアミン及びN-メチル-D-グルカミン等の有機塩基による塩が挙げられる。
【０１１５】
本発明の化合物のすべての薬学的に許容される酸付加塩形態は、本発明の範囲によって包含されることが意図される。
【０１１６】
多形結晶形態:
【０１１７】
更に、化合物の結晶形態の一部は、多形体として存在してもよく、それ自体、本発明に含まれることが意図される。加えて、化合物の一部は、水との溶媒和物(すなわち、水和物)又は通常の有機溶媒との溶媒和物を形成してもよく、そのような溶媒和物はまた、本発明の範囲内に包含されることが意図される。塩を含む化合物はまた、それらの水和物の形態で得ることができるか、又はそれらの結晶化のために使用される他の溶媒を含み得る。
【０１１８】
プロドラッグ:
【０１１９】
本発明は、その範囲内に本発明の化合物のプロドラッグを更に含む。一般的に、そのようなプロドラッグは、in vivoで容易に所望の治療活性化合物に変換可能な、化合物の機能的誘導体である。したがって、これらの場合、本発明の治療方法において、「投与すること」という用語は、特許請求に係る化合物のうちの1つ又は複数のプロドラッグバージョンであるが、対象への投与後にin vivoで上記特定の化合物に変換するプロドラッグバージョンにより説明される様々な障害の治療を包含する。
【０１２０】
保護基:
【０１２１】
本発明の化合物の調製のための方法のいずれかの間、関係する分子のいずれか上の感受性又は反応性の基を保護することが必要、かつ/又は望ましい場合がある。これは、従来型保護基の手段によって達成され得る。保護基は、本分野から公知の方法を使用して便利な後続段階で除去され得る。
【０１２２】
本明細書において使用するとき、「組成物」という用語は、治療有効量の特許請求に係る化合物を含む製品、及び直接又は間接的に特許請求に係る化合物の組合せから生じる任意の製品を包含すると意図される。
【０１２３】
ガレヌス製剤のための担体及び添加剤:
【０１２４】
混合物に添加され得る担体は、非限定的に、好適な結合剤、懸濁剤、潤滑剤、風味材料、甘味料、保存剤、コーティング、崩壊剤、色素及び着色剤を含む、必要かつ不活性な医薬賦形剤を含む。
【０１２５】
したがって、例えば懸濁剤、エリキシル剤及び溶液等の液体経口調製物について、好適な担体及び添加剤は有利に、水、グリコール、油、アルコール、着香剤、保存剤、着色剤等を含む場合があり;例えば粉末、カプセル、ジェルキャップ及び錠剤等の固体経口調製物について、好適な担体及び添加剤は、デンプン、糖、希釈剤、造粒剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤等を含む。
【０１２６】
ターゲティング可能な薬物担体としての可溶性ポリマーは、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミドフェノール、ポリヒドロキシエチルアスパルトアミドフェノール、又はパルミトイル残基で置換されているポリエチレンオキシド-ポリルリジンを含み得る。更に、本発明の化合物は、薬物の制御放出を達成することにおいて有用な生分解性ポリマーのクラス、例えばポリ乳酸、ポリイプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレート及びハイドロゲルの架橋又は両親媒性ブロックコポリマーに連結され得る。
【０１２７】
好適な結合剤として、デンプン、ゼラチン、ブドウ糖若しくはベータ乳糖等の天然糖、トウモロコシ甘味料、アカシア、トラガカント等の天然及び合成ガム、又はオレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２８】
崩壊剤として、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガム等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２９】
構造(I)を有するWnt阻害剤の例示的で非限定的な実施形態をここで開示する。
【０１３０】
本開示は、構造(I):
【０１３１】
【化１】
2020503018.tif 000002
【０１３２】
{式中:
R1、R2、R3、R4及びR5は各々独立して、H又はアルキル基であってもよく;
Dは、H、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、アリール及びジアルキルアミノからなる群から選択してもよく、各々(H及びハロゲン以外)は、任意選択で置換され;
Arは、各々任意選択で置換されているアリール又はヘテロアリール基であってもよく;
Cyは、少なくとも1つのヘテロ原子を含有するアリール、ヘテロアリール又は飽和環であってもよく、各々は、任意選択で置換され;
nは、1〜3の整数であってもよい}
を有するWnt阻害剤を提供する。
【０１３３】
一部の例においては、n=1であり、R3及びR4のうちの1つがメチルであり、他方がHである場合、化合物の立体化学は、部分構造(II)
【０１３４】
【化２】
2020503018.tif 000003
【０１３５】
において示される通りである。
【０１３６】
一部の特定の例においては、n=1であり、R3及びR4のうちの1つはメチルであり、他方はHであり、化合物の立体化学は、部分構造(II)において示される通りである。
【０１３７】
本明細書において後に構造(I)の化合物5と呼ばれる化合物(ETC-1922159又は省略してETC-159とも呼ばれる)は、構造(I)を有するWnt阻害剤の範囲内に明白に含まれる。構造(I)の化合物5は、後に定義する構造(IV)
【０１３８】
【化３】
2020503018.tif 000004
【０１３９】
の化合物として更に公知である。
【０１４０】
以下の特定の選択肢は、個々に、又は任意の好適な組合せにおいて、構造(I)を有するWnt阻害剤と関連して使用され得る。
【０１４１】
R1及びR2は独立して、メチル又はエチルであってもよい。それらは、両方ともメチルであってもよい。R3及びR4は、両方ともHであってもよい。それらは、両方ともアルキル、例えばメチル又はエチルであってもよい。R3及びR4のうちの1つは、アルキル(例えばメチル又はエチル)であってもよく、他方は、Hであってもよい。R5は、水素であってもよい。それは、メチルであってもよく、又は一部の他のアルキルであってもよい。
【０１４２】
Arが、6員環である場合、それは、1,4-二置換されていてもよい。Arが、5員環である場合、それは、1,3-二置換されていてもよい。Arは、1,2-二置換されていない環であってもよい。この文脈においては、「二置換されている」は、Cy及びNR5による置換を指す。
【０１４３】
Arは、二置換ベンゼン環(すなわち、フェニレン環)、二置換チオフェン環、又は1〜4つの窒素原子を有する二置換窒素ヘテロ環であってもよい。それは、0〜2つの窒素原子を有する6員芳香環であってもよい。それは、2-チアゾリル環ではない環であってもよい。それは、ピリダジン環、例えばピリダジン-3,6-ジイルであってもよい。
【０１４４】
Cyは、0〜2つの窒素原子、0又は1つの硫黄原子及び0又は1つの酸素原子を有する5又は6員芳香環であってもよい。或いは、それは、ピペラジンであってもよい。ピペラジンは、両方の窒素原子上で置換されていてもよい。Cyは、塩素を含有しなくてもよい。それは、(任意選択で追加的に置換されている)クロロフェニル基ではない基であってもよい。一部の例においては、化合物Iは、塩素を有しない。
【０１４５】
nは、1であってもよい。
【０１４６】
Dは、Hであってもよい。
【０１４７】
モジュレートすることは、阻害することであってもよい。
【０１４８】
特定の例においては、R1及びR2は、両方ともメチルである。R3、R4、R5及びDは、すべてHであり、nは、1である。この例の特定の場合においては、Arは、1又は2つの窒素原子を有し、Cy及びアミド窒素以外の置換基を有しない6員環であり、これらは、環上で1,4-関係である。
【０１４９】
Wnt阻害剤の構造(I)及び(II)においては、nは、1〜5であってもよい。それは、1〜3であってもよい。それは、1、2、3、4又は5のいずれか1つであってもよい。置換基Dは、H、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、アリール又はジアルキルアミノであってもよく、各々(H及びハロゲン以外)は、任意選択で置換されている。例として、水素、塩素、臭素、メチル、エチル、プロピル、シクロプロピル、フェニル、トリフルオロメチル、ジメチルアミノ、N-ピペリジニル、N-ピペラジニル、N-メチル-N'-ピペラジニル等が挙げられる。
【０１５０】
多くの例において、nは、1である。
【０１５１】
一部の場合、置換基R3及びR4は同じであり、その他の場合、それらは異なる。それらが異なる事象においては、それらは、それらが結合する炭素原子で立体化学を生じる。一般的に、その炭素での(又は各炭素での)立体化学は、(S)又は(R)であり得る。特定の例においては、nが1であり、R3及びR4のうちの1つがHであり、他方がアルキル基である場合、好ましい立体化学は、構造(II)において示される通りであり、Meは、アルキル基を表し得る。アルキル基がメチルである場合、この立体化学は、特に好ましい。
【０１５２】
構造(I)におけるAr基の例として、1,4-フェニレン、2,5-ピリジンジイル、3,6-ピリダジンジイル、2,5-ピラジンジイル、2,5-チオフェンジイル、2,4-チオフェンジイル、2,5-フランジイル、2,4-フランジイル等が挙げられる。構造(I)におけるCy基の例として、フェニル、チアゾール-2-イル、チオフェン-2-イル、チオフェン-3-イル、ピリジン-1-イル、ピリジン-2-イル、ピリジン-3-イル、ピリダジン-3-イル、ピリダジン-4-イル、ピリミジン-2-イル、ピリミジン-4-イル、ピリミジン-4-イル、N-イミダゾリル、2-、4-若しくは5-チアゾリル、2-、4-若しくは5-オキサゾリル、N-モルホリニル又はN'置換N-ピペラジニルが挙げられる。ピペラジニル置換基のN'位上の好適な置換基として、Xが、t-ブトキシ、ネオペンチル、メチル、フェニル、p-クロロフェニル、ベンジル、α,α-ジフルオロベンジル、クロロベンジル、フルオロベンジル等である-C(=O)Xが挙げられる。
【０１５３】
一部の例においては、R1及びR2は、同じである。それらは、両方ともメチルであってもよい。それらは、両方ともエチルであってもよい。後者の場合、Arは、1,4-フェニレンであってもよく、Cyは、チオフェン-3-イルであってもよい。
【０１５４】
一部の例においては、DはHである。他の例においては、Dは、メチル、シクロプロピル、トリフルオロメチル、フェニル、ジメチルアミノ、モルホリン-N-イル、チオフェン-3-イル又はブロモであってもよい。DがHではない(例えば、メチル、シクロプロピル、トリフルオロメチル、フェニル、ジメチルアミノ、モルホリン-N-イル、チオフェン-3-イル又はブロモである)事象においては、Arは、1,4-フェニレンであってもよく、Cyは、チオフェン-3-イルであってもよい。
【０１５５】
一部の例においては、nは1であり、他の例においては、それは2又は3である。nが2又は3である事象においては、Arは、1,4-フェニレンであってもよく、Cyは、チオフェン-3-イル又はチアゾール-2-イルであってもよい。
【０１５６】
一部の例においては、R3及びR4は、両方ともH又は両方ともメチルのいずれかである。他の例においては、1つはHであり、他方はメチル又はエチルである。それらが両方ともHではない事象においては、Arは、1,4-フェニレンであってもよい。或いは、それらが両方ともHではない場合、Arは、1,4-フェニレンであるか、若しくはCyは、フェニルであるか、又はいずれかは、チアゾール-2-イルである。
【０１５７】
一部の例においては、R5は、Hである。
【０１５８】
一部の例においては、Arは、1,4-フェニレンであり、Cyは、チオフェン-3-イル又はチアゾール-2-イルである。特定の例においては、Arは、1,4-フェニレンであり、Cyは、チオフェン-3-イルである。
【０１５９】
特定の例においては、R1及びR2は両方ともMeであり、DはHであり、nは1であり、R3及びR4は両方ともHである。この例においては、Arが、1,4-フェニレンである場合、Cyが、チオフェン-3-イルではないことが好ましい。この例の変形形態においては、R1及びR2は両方ともメチルではないか、又はDはHではないか、又はnは1ではないか、又はR3及びR4は両方ともHではなく(任意選択で、これらのうちの1つを超えるもの、及び特定の場合すべてが適用し)、Arは、1,4-フェニレンであり、Cyは、チオフェン-3-イル又はチアゾール-2-イルである(任意選択で、Arは、1,4-フェニレンであり、Cyは、チオフェン-3-イルである)。
【０１６０】
一部の例においては、構造(I)として定義する化合物7、13、27、28、39、42、43、44、58、65、71、80及び83のうちの任意の1つ又は複数、任意選択ですべては、本発明の範囲から除外され得る。一部の例においては、化合物8、12、55及び85のうちの任意の1つ又は複数、任意選択ですべてはまた、除外され得る。
【０１６１】
一部の例においては、Ar及びCyは、両方とも任意選択で置換されているフェニル環ではない。一部の例においては、Ar及びCyのうちの少なくとも1つは、ヘテロ芳香族又は非芳香族である。一部の例においては、Ar及びCyのうちの少なくとも1つは、ヘテロ芳香族である。
【０１６２】
一部の例においては、Arが、1,4-フェニレン又は2,5-ピリジルである場合、Cyは、1つ以下の環窒素原子を有する。他の例においては、Arが、5員環である場合、それは、オキサゾールジイルではない。また他の例においては、Arが、5員環である場合、それは、チオフェンジイル、例えばチオフェン-2,4-ジイルであってもよい。本明細書の文脈においては、「Aである場合、Bである」という言及は、Aがその場合ではないこと、又はA及びBの両方がその場合ではないことのいずれかの可能性を示すと解釈されるべきである。それゆえ、例えば、「Arが5員環である場合、それはチオフェンジイルであってもよい」という記載は、Arが5員環ではないこと、そうでなければArがチオフェンジイル環であることのいずれかを意味すると解釈され得る。そのような場合、Arは、例えばピリジンジイル環であり得るが、フランジイル環ではあり得ない。
【０１６３】
本開示は、特に、構造(I)の2-(1,3-ジメチル-2,6-ジオキソ-1,2,3,6-テトラヒドロ-7H-プリン-7-イル)-N-(6-フェニルピリダジン-3-イル)アセトアミドの遊離塩基の無水形態、この遊離塩基の無水形態を含有する医薬組成物、及びある特定の健康状態の治療におけるこの遊離塩基の無水形態の使用方法を包含し得る。この化合物、構造(I)の2-(1,3-ジメチル-2,6-ジオキソ-1,2,3,6-テトラヒドロ-7H-プリン-7-イル)-N-(6-フェニルピリダジン-3-イル)アセトアミド又は2-(1,3-ジメチル-2,6-ジオキソ-2,3-ジヒドロ-1H-プリン-7(6H)-イル)-N-(6-フェニルピリダジン-3-イル)アセトアミドは、構造(IV)の化合物として更に標識され、これは、構造(I)の化合物5(ETC-159)としても公知である。
【０１６４】
構造(I)の2-(1,3-ジメチル-2,6-ジオキソ-1,2,3,6-テトラヒドロ-7H-プリン-7-イル)-N-(6-フェニルピリダジン-3-イル)アセトアミドに関連して、初期研究は、好ましい化学的形態である遊離塩基について行われ、製造条件によって1つを超える結晶形態をとることが分かったこの化合物について、多形は頻繁にあることを示した。加えて、含水量はバッチ毎に変動することが観察された。
【０１６５】
したがって、上記に特定した問題のうちの1つ又は複数を克服又は改善する、構造(I)の2-(1,3-ジメチル-2,6-ジオキソ-1,2,3,6-テトラヒドロ-7H-プリン-7-イル)-N-(6-フェニルピリダジン-3-イル)アセトアミドの単一の多形形態を調製した。
【０１６６】
本開示は、それゆえ、構造(I)の2-(1,3-ジメチル-2,6-ジオキソ-1,2,3,6-テトラヒドロ-7H-プリン-7-イル)-n-(6-フェニルピリダジン-3-イル)アセトアミドの遊離塩基の無水形態(非水和型単一多形体)を包含する。
【０１６７】
無水遊離塩基は、結晶であってもよい。結晶無水遊離塩基は、X線回折で22.2°±0.5°での2シータスケール上のピークを示す。それはまた、X線回折で5.5°±0.5°及び14.2°±0.5°での2シータスケール上のピークを示す。特に、それは、X線回折で5.5°±0.5°及び12.5°±0.5°、14.2°±0.5°、16.7°±0.5°、17.7°±0.5°、18.8°±0.5°、22.4°±0.5°、24.2°±0.5°及び31.7°±0.5°からなる群から選択される2シータスケール上の少なくとも4つのピークを示す。具体的には、それは、X線回折で5.5°±0.5°及び12.5°±0.5°、14.2°±0.5°、16.7°±0.5°、17.7°±0.5°、18.0°±0.5°、18.8°±0.5°、19.6°±0.5°、20.6°±0.5°、22.4°±0.5°、24.2°±0.5°、24.4°±0.5°、25.0°±0.5°、27.0°±0.5°、27.6°±0.5°、29.8°±0.5°、31.7°±0.5°及び32.2°±0.5°の2シータスケール上のピークを示す。
【０１６８】
様々な例において上記に示す限定の(すべてではないが)多くは、組み合わせて共に使用してもよく、本発明は、それらが実行可能なそのような組合せを明白に企図することが理解される。
【０１６９】
構造(I)を有するWnt阻害剤の特定の(しかし、非限定的な)例を、以下:
【０１７０】
【化４Ａ】
2020503018.tif 000005
【０１７１】
【化４Ｂ】
2020503018.tif 000006
【０１７２】
【化４Ｃ】
2020503018.tif 000007
【０１７３】
【化４Ｄ】
2020503018.tif 000008
【０１７４】
【化４Ｅ】
2020503018.tif 000009
【０１７５】
【化４Ｆ】
2020503018.tif 000010
【０１７６】
【化４Ｇ】
2020503018.tif 000011
【０１７７】
【化４Ｈ】
2020503018.tif 000012
【０１７８】
【化４Ｉ】
2020503018.tif 000013
【０１７９】
【化４Ｊ】
2020503018.tif 000014
【０１８０】
に示す。
【０１８１】
構造(III)を有するWnt阻害剤の例示的で非限定的な実施形態を、ここで開示する。本開示は、構造(III):
【０１８２】
【化５】
2020503018.tif 000015
【０１８３】
、又はそのすべての互変異性体及び立体異性体を含むその薬学的に許容される塩、溶媒和物若しくは多形体を有するWnt阻害剤を提供し、式中、以下の通りである:
【０１８４】
R1は、H;任意選択で、C1〜6アルコキシ、NH2、-NHC1〜3アルキル及び-N(C1〜3アルキル)2から各々独立して選択される1つ若しくは複数の置換基によって置換されているアルキル;-C(O)Oアルキル;ハロアルキル;ハロアルコキシ;又は-アルキルアリールを表し得る;
【０１８５】
各R2は独立して、H;任意選択で、C1〜6アルコキシ、NH2、-NHC1〜3アルキル及び-N(C1〜3アルキル)2から各々独立して選択される1つ若しくは複数の置換基によって置換されているアルキル;-アルキルアリール;任意選択で、C1〜6アルキル、C1〜6アルコキシ、C1〜6ハロアルキル、C1〜6ハロアルコキシ及びハロから各々独立して選択される1つ若しくは複数の置換基によって置換されているカルボシクリル;任意選択で、C1〜6アルキル、C1〜6アルコキシ、-C(O)OC1〜6アルキル、-C(O)C1〜6アルキル及び-C(O)NHC1〜6アルキルから各々独立して選択される1つ若しくは複数の置換基によって置換されているヘテロシクリル;-NHアルキル;-N(アルキル)2;アミノ;ヒドロキシル;アルコキシ;又はハロを表し得る;
【０１８６】
nは、0、1又は2を表し得る;
【０１８７】
R3は、H又はアルキルを表し得る;
【０１８８】
R4は、H又はアルキルを表し得る;
【０１８９】
R5は、H又はアルキルを表し得る;
【０１９０】
W及びXは各々独立して、C=O;C=S;又はCH2を表し得る;
【０１９１】
Yは、アリール;ヘテロアリール;任意選択で、C1〜6アルキル、C1〜6アルコキシ、C1〜6ハロアルキル、C1〜6ハロアルコキシ及びハロから各々独立して選択される1つ若しくは複数の置換基によって置換されているカルボシクリル;又は任意選択で、C1〜6アルキル、C1〜6アルコキシ、-C(O)OC1〜6アルキル、-C(O)C1〜6アルキル及び-C(O)NHC1〜6アルキルから各々独立して選択される1つ若しくは複数の置換基によって置換されているヘテロシクリルを表し得る;
【０１９２】
Yは、アリール又は6員単環式ヘテロアリールを更に表し得る;
【０１９３】
Zは、任意選択で、C1〜6アルコキシ、NH2、-NHC1〜3アルキル及び-N(C1〜3アルキル)2から各々独立して選択される1つ若しくは複数の置換基によって置換されているアルキル;アリール;ヘテロアリール;-アルキルアリール;-アルキルヘテロアリール;任意選択で、C1〜6アルキル、C1〜6アルコキシ、C1〜6ハロアルキル、C1〜6ハロアルコキシ及びハロから各々独立して選択される1つ若しくは複数の置換基によって置換されているカルボシクリル;任意選択で、C1〜6アルキル、C1〜6アルコキシ、-C(O)OC1〜6アルキル、-C(O)C1〜6アルキル及び-C(O)NHC1〜6アルキルから各々独立して選択される1つ若しくは複数の置換基によって置換されているヘテロシクリル;カルボシクリルが、任意選択で、C1〜6アルキル、C1〜6アルコキシ、C1〜6ハロアルキル、C1〜6ハロアルコキシ及びハロから各々独立して選択される1つ若しくは複数の置換基によって置換されている-アルキルカルボシクリル;ヘテロシクリルが、任意選択で、C1〜6アルキル、-C(O)OC1〜6アルキル、-C(O)C1〜6アルキル及び-C(O)NHC1〜6アルキルから各々独立して選択される1つ若しくは複数の置換基によって置換されている-アルキルヘテロシクリル;カルボシクリルが、任意選択で、C1〜6アルキル、C1〜6アルコキシ、C1〜6ハロアルキル、C1〜6ハロアルコキシ及びハロから各々独立して選択される1つ若しくは複数の置換基によって置換されている-アリールカルボシクリル;又はヘテロシクリルが、任意選択で、C1〜6アルキル、-C(O)OC1〜6アルキル、-C(O)C1〜6アルキル及び-C(O)NHC1〜6アルキルから各々独立して選択される1つ若しくは複数の置換基によって置換されている-アリールヘテロシクリルを表し得る;
【０１９４】
Zは、アリール又はヘテロアリールを更に表し得る。
【０１９５】
可変性のYの文脈においては、Yは連結基であり、末端基ではないので、「アリール」という用語は、「アリーレン」を意味すると理解される(例えば、「フェニル」は、「フェニレン」(すなわち、C6H4)を意味すると理解される)。他のY環(例えばヘテロアリール)についての用語は、同様に解釈されるべきである。Yが置換されていないと言及される場合、これは、Z及びNR5以外の他の置換基は意味しないと理解される。Yが単置換されていると言及される場合、これは、Z及びNR5以外の1つの置換基を意味すると理解される。
【０１９６】
R1が、任意選択で、C1〜6アルコキシ、NH2、-NHC1〜3アルキル及び-N(C1〜3アルキル)2から各々独立して選択され得る1つ又は複数の置換基によって置換されているアルキルを表す場合、置換基の例として、メトキシ、-NH2、-NHメチル及び-NH(メチル)2が挙げられる。例として、C1〜6アルキル(例えば置換されていないC1〜6アルキル)、例えばメチル、エチル、プロピル(例えばn-プロピル、イソプロピル)、ブチル(例えばn-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル)、ペンチル(例えばn-ペンチル)及びヘキシル(例えばn-ヘキシル)が挙げられる。C1〜6アルキル基の例は、メチル及びエチル、特にメチルである。
【０１９７】
R1が、-C(O)Oアルキルを表す場合、例として、-C(O)OC1〜6アルキル、例えば-C(O)OMe、-C(O)OEt、-C(O)OPr及び-C(O)OiPrが挙げられる。特定の例は、-C(O)OMeである。
【０１９８】
R1が、ハロアルキルを表す場合、例として、C1〜6ハロアルキル、例えばCH2F、CHF2、CF3、CH2CH2F、CH2CHF2、CH2CF3、CHFCH3及びCF2CH3が挙げられる。特定の例は、CF3である。
【０１９９】
R1が、ハロアルコキシを表す場合、例として、C1〜6ハロアルコキシ、例えばOCF3が挙げられる。
【０２００】
R2が、任意選択で、C1〜6アルコキシ、NH2、-NHC1〜3アルキル及び-N(C1〜3アルキル)2から各々独立して選択され得る1つ又は複数の置換基によって置換されているアルキルを表す場合、置換基の例として、メトキシ、-NH2、-NHメチル及び-NH(メチル)2が挙げられる。例として、C1〜6アルキル(例えば置換されていないC1〜6アルキル)、例えばメチル、エチル、プロピル(例えばn-プロピル、イソプロピル)、ブチル(例えばn-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル)、ペンチル(例えばn-ペンチル)及びヘキシル(例えばn-ヘキシル)が挙げられる。C1〜6アルキル基の例は、メチルである。
【０２０１】
R2が、-アルキルアリールを表す場合、例として、ベンジルが挙げられる。
【０２０２】
R2が、任意選択で、C1〜6アルキル(例えばメチル)、C1〜6アルコキシ(例えばメトキシ)、C1〜6ハロアルキル(例えばフルオロメチル、例えばトリフルオロメチル)、C1〜6ハロアルコキシ(例えばフルオロメトキシ、例えばトリフルオロメトキシ)及びハロ(例えばフルオロ、例えばクロロ)から各々独立して選択され得る1つ又は複数の置換基によって置換されているカルボシクリルを表す場合、例として、C3〜C6シクロアルキル、例えばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル及びシクロヘキシルが挙げられる。置換されている例として、メチルによって置換されているシクロヘキシルが挙げられる。
【０２０３】
R2が、任意選択で、C1〜6アルキル、C1〜6アルコキシ、-C(O)OC1〜6アルキル、-C(O)C1〜6アルキル及び-C(O)NHC1〜6アルキルから各々独立して選択され得る1つ又は複数の置換基によって置換されているヘテロシクリルを表す場合、Yは、任意選択で、C1〜6アルキル(例えばメチル)によって置換されているヘテロシクリルを表し得る。例として、単環式ヘテロシクリルが挙げられる。ヘテロシクリル基は、置換されていなくてもよく、又は例えば1若しくは2つ(例えば1つ)の置換基(例えば1つのメチル基)を有してもよい。例として、ピペリジニル、モルホリニル、ピロリジニル、4,5-ジヒドロピラゾリル及び4,5-ジヒドロイソキサゾリルが挙げられる。特定の例は、ピロリジニルである。
【０２０４】
R2が、-NHアルキルを表す場合、例として、-NHMe、NHEt、NHPr及びNHiPr、特にNHMeが挙げられる。
【０２０５】
R2が、-N(アルキル)2を表す場合、例として、-N(Me)2が挙げられる。
【０２０６】
R2が、アルコキシを表す場合、例として、メトキシ及びエトキシ、とりわけメトキシが挙げられる。
【０２０７】
nが、1を表す場合、-(CHR2)n-の例として、-CH2-及び-CH(CH3)-が挙げられる。
【０２０８】
nが、2を表す場合、-(CHR2)n-の例として、-CH2-CH2-、-CH2CH(CH3)-、-CH(CH3)CH2-及び-CH(CH3)-CH(CH3)-が挙げられる。-(CHR2)2-基の例は、-CH2-CH2-である。
【０２０９】
R3が、アルキルを表す場合、例として、C1〜6アルキル、例えばメチル、エチル、プロピル(例えばn-プロピル、イソプロピル)、ブチル(例えばn-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル)、ペンチル(例えばn-ペンチル)及びヘキシル(例えばn-ヘキシル)が挙げられる。C1〜6アルキル基の例は、メチルである。
【０２１０】
R4が、アルキルを表す場合、例として、C1〜6アルキル、例えばメチル、エチル、プロピル(例えばn-プロピル、イソプロピル)、ブチル(例えばn-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル)、ペンチル(例えばn-ペンチル)及びヘキシル(例えばn-ヘキシル)が挙げられる。C1〜6アルキル基の例は、メチルである。
【０２１１】
R5が、アルキルを表す場合、例として、C1〜6アルキル、例えばメチル、エチル、プロピル(例えばn-プロピル、イソプロピル)、ブチル(例えばn-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル)、ペンチル(例えばn-ペンチル)及びヘキシル(例えばn-ヘキシル)が挙げられる。C1〜6アルキル基の例は、メチルである。
【０２１２】
Yが、アリールを表す場合、例として、任意選択で置換されているフェニルが挙げられる。置換基の例として、C1〜6アルキル(例えばメチル)、C1〜6アルコキシ(例えばメトキシ)、ハロ及びC1〜6ハロアルキル(例えばフルオロメチル、例えばトリフルオロメチル)から各々独立して選択され得る1つ又は複数(例えば1又は2つ、とりわけ1つ)の置換基が挙げられる。例として、置換されていないフェニル、メチルフェニル、メトキシフェニル、フルオロフェニル、クロロフェニル及びトリフルオロメチルフェニルが挙げられる。特定の例として、置換されていないフェニルが挙げられる。特定の例としてまた、メチルフェニル、メトキシフェニル、フルオロフェニルが挙げられる。Z及びNR5は、フェニル環上で互いに対して1及び4位に位置し得る(すなわち、Z及びNR5は、パラ関係を有する)。
【０２１３】
Yが、ヘテロアリールを表す場合、例として、単環式(例えば5及び6員)及び二環式(例えば9及び10員)ヘテロアリール環、とりわけ単環式ヘテロアリール環、特に6員単環式ヘテロアリール環が挙げられる。単環式ヘテロアリールの例は、1又は2つの窒素原子(例えば1つ又は例えば2つ)及び任意選択で、酸素又は硫黄原子を含む、1、2又は3つの環ヘテロ原子(例えば1又は2つ、例えば1つ)を含み得る。5員単環式ヘテロアリール基の例として、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサジアゾリル及びチアジアゾリルが挙げられる。Yが、5員単環式ヘテロアリールである場合、Z及びNR5は、環上で非隣接環原子に位置し得る。6員単環式ヘテロアリール基の例として、ピリジニルが挙げられる。6員単環式ヘテロアリール基の例としてまた、ピリダジニル、ピリミジニル及びピラジニルが挙げられる。Yが、6員単環式ヘテロアリールである場合、Z及びNR5は、環上で互いに対して1及び4位に位置し得る(すなわち、Z及びNR5は、パラ関係を有する)。上記に挙げたヘテロアリール基は、置換されていなくてもよく、1つ又は複数(例えば1又は2つ、特に1つ)の置換基によって置換されていてもよい。置換基の例は、C1〜6アルキル(例えばメチル)、C1〜6アルコキシ(例えばメトキシ)、ハロ(例えばフルオロ)及びC1〜6ハロアルキル(例えばフルオロメチル、例えばトリフルオロメチル)から独立して選択される。Yが、置換されていないヘテロアリールである場合、例として、イソキサゾリル(例えば(NR5が5位に存在し、Zが3位に存在する)イソキサゾリル-5-イル及び(NR5が3位に存在し、Zが5位に存在する)イソキサゾリル-3-イル、とりわけイソキサゾリル-5-イル)、オキサジアゾリル、ピリジニル(例えばピリジン-2-イル又はピリジン-3-イル)、ピリダジニル(例えばピリダジン-3-イル)、ピリミジニル(例えばピリミジン-3-イル)、ピラジニル(例えばピラジン-2-イル)が挙げられる。Yが、置換されているヘテロアリールである場合、Yは、例えばメチル又はフルオロによって置換されていてもよい。Yが、置換されているヘテロアリールである場合、例として、メチルピリジニル、フルオロピリジニル、メチルピリダジニル、メチルピラジニル、メチルピリミジニル及び1-メチルピラゾリルが挙げられる。
【０２１４】
Yが、任意選択で、C1〜6アルキル(例えばメチル)、C1〜6アルコキシ(例えばメトキシ)、C1〜6ハロアルキル(例えばフルオロメチル、例えばトリフルオロメチル)、C1〜6ハロアルコキシ(例えばフルオロメトキシ)及びハロ(例えばフルオロ、例えばクロロ)から各々独立して選択され得る1つ又は複数の置換基によって置換されているカルボシクリルを表す場合、Yは、任意選択で、C1〜6アルキルによって置換されているカルボシクリルを表し得る。例として、任意選択で、C1〜6アルキル(例えばメチル)によって置換されている単環式カルボシクリルが挙げられる。カルボシクリルの例として、C3〜8シクロアルキル(例えばシクロヘキシル)及びC5〜8シクロアルケニル(例えばシクロヘキセニル)が挙げられる。カルボシクリル環は、任意選択で、1、2又は3つの、独立して選択され得る置換基(例えば1又は2つ、とりわけ1つ、例えば1つのメチル基)によって置換されている。Yが、カルボシクリルを表す場合、Yは、C3〜8シクロアルキル、例えばC5〜6シクロアルキルを表し得る。特定の例は、シクロヘキシルである。Yが、6員カルボシクリルである場合、Z及びNR5は、カルボシクリル環上で互いに対して1及び4位に位置し得る。
【０２１５】
Yが、任意選択で、C1〜6アルキル、C1〜6アルコキシ、-C(O)OC1〜6アルキル、-C(O)C1〜6アルキル及び-C(O)NHC1〜6アルキルから各々独立して選択され得る1つ又は複数の置換基によって置換されているヘテロシクリルを表す場合、Yは、任意選択で、C1〜6アルキル(例えばメチル)によって置換されているヘテロシクリルを表し得る。例として、単環式ヘテロシクリルが挙げられる。ヘテロシクリル基は、置換されていなくてもよく、例えば1又は2つ(例えば1つ)の置換基(例えば1つのメチル基)を有してもよい。例として、ピペリジニル、モルホリニル、ピロリジニル、4,5-ジヒドロピラゾリル及び4,5-ジヒドロイソキサゾリルが挙げられる。特定の例として、4,5-ジヒドロイソキサゾリル(例えば4,5-ジヒドロイソキサゾール-5-イル)及びピペリジニル(例えばピペリジン-4-イル)が挙げられる。Yが、6員ヘテロシクリルである場合、Z及びNR5は、ヘテロシクリル環上で互いに対して1及び4位に位置し得る。Yが、ヘテロシクリルを表す場合、一実施形態においては、Zは、-アルキルアリールを表さない。
【０２１６】
Zが、任意選択で、C1〜6アルコキシ、NH2、-NHC1〜3アルキル及び-N(C1〜3アルキル)2から各々独立して選択され得る1つ又は複数の置換基によって置換されているアルキルを表す場合、置換基の例として、メトキシ、-NH2、-NHメチル及び-NH(メチル)2が挙げられる。例として、C1〜6アルキル(例えば置換されていないC1〜6アルキル)、例えばメチル、エチル、プロピル(例えばn-プロピル、イソプロピル)、ブチル(例えばn-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル)、ペンチル(例えばn-ペンチル)及びヘキシル(例えばn-ヘキシル)が挙げられる。例としてまた、C3〜6アルキル(例えば置換されていないC3〜6アルキル)、例えばプロピル(例えばn-プロピル、イソプロピル)、ブチル(例えばn-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル)、ペンチル(例えばn-ペンチル)及びヘキシル(例えばn-ヘキシル)が挙げられる。C1〜6アルキル基の例は、メチル及びtert-ブチルである。
【０２１７】
Zが、アリールを表す場合、例として、任意選択で置換されているフェニルが挙げられる。置換基の例として、フルオロ、クロロ、ブロモ、アミノ、メトキシ、メチル、ハロアルキル(例えばフルオロメチル、例えばトリフルオロメチル)、-COOH、-C(O)NMe2、ジメチルアミノ及び-NHC(O)Meから各々独立して選択され得る1つ又は複数(例えば1又は2つ、とりわけ1つ)の置換基が挙げられる。例として、置換されていないフェニルが挙げられる。置換されている例として、フルオロフェニル(例えば2-フルオロフェニル、3-フルオロフェニル及び4-フルオロフェニル)、クロロフェニル(例えば2-クロロフェニル、3-クロロフェニル、4-クロロフェニル及び3,4-ジクロロフェニル)、ブロモフェニル(例えば2-ブロモフェニル、3-ブロモフェニル及び4-ブロモフェニル)、アミノフェニル(例えば2-アミノフェニル、3-アミノフェニル、4-アミノフェニル)、メトキシフェニル(例えば2-メトキシフェニル、3-メトキシフェニル及び4-メトキシフェニル)、メチルフェニル(例えば2-メチルフェニル、3-メチルフェニル及び4-メチルフェニル)、フルオロメチルフェニル(例えば3-トリフルオロメチルフェニル及び4-トリフルオロメチルフェニル)、カルボキシフェニル(例えば3-(COOH)-フェニル)、3-(C(O)NMe2)-フェニル)、3-ジメチルアミノフェニル及び3-(NHC(O)Me)-フェニルが挙げられる。
【０２１８】
Zが、ヘテロアリールを表す場合、例として、単環式(例えば5及び6員)及び二環式(例えば9及び10員)ヘテロアリール環、とりわけ単環式環が挙げられる。単環式ヘテロアリールの例は、1又は2つの窒素原子(例えば1つ又は例えば2つ)及び任意選択で、酸素又は硫黄原子を含む、1、2又は3つの環ヘテロ原子(例えば1又は2つ、例えば1つ)を含む。5員単環式ヘテロアリール基の例として、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサジアゾリル及びチアジアゾリルが挙げられる。6員単環式ヘテロアリール基の例として、ピリジニルが挙げられる。6員単環式ヘテロアリール基の例としてまた、ピリダジニル、ピリミジニル及びピラジニルが挙げられる。上記に挙げたヘテロアリール基は、置換されていなくてもよく、1つ又は複数(例えば1又は2つ、特に1つ)の置換基によって置換されていてもよい。置換基の例は、メチル、フルオロ、クロロ、アミノ、ハロメチル(例えばフルオロメチル、例えばトリフルオロメチル)から独立して選択される。置換されていない例として、ピリジニル(例えばピリジン-2-イル、ピリジン-3-イル及びピリジン-4-イル)、ピラジニル(例えばピラジン-2-イル)、ピリダジニル(例えばピリダジン-3-イル)、ピリミジニル(例えばピリミジン-2-イル、ピリミジン-4-イル及びピリミジン-5-イル)、オキサゾリル(例えばオキサゾール-2-イル及びオキサゾール-5-イル)、チアゾリル(例えばチアゾール-2-イル及びチアゾール-5-イル)及びピラゾリル(例えばピラゾール-1-イル)が挙げられる。置換されている例として、クロロピリジニル(例えば4-クロロピリジン-2-イル、5-クロロピリジン-2-イル及び5-クロロピリジン-3-イル)、フルオロピリジニル(例えば4-フルオロピリジン-2-イル、5-フルオロピリジン-2-イル及び5-フルオロピリジン-3-イル)、メチルピリジニル(例えば2-メチルピリジン-5-イル、6-メチルピリジン-2-イル及び5-メチルピリジン-3-イル)、フルオロメチルピリジニル(例えば5-トリフルオロメチルピリジン-3-イル)、アミノピリジニル(例えば5-アミノピリジン-3-イル)、メチルピラジニル(例えば5-メチルピラジン-2-イル)、メチルチアゾリル(例えば2-メチルチアゾール-4-イル)及びメチルピラゾリル(例えば1-メチルピラゾール-5-イル)が挙げられる。
【０２１９】
Zが、-アルキルアリールを表す場合、例として、ベンジルが挙げられる。
【０２２０】
Zが、-アルキルヘテロアリール(例えば-CH2-ヘテロアリール)を表す場合、例として、-アルキルピロリル、-アルキルピラゾリル、-アルキルイミダゾリル、-アルキルオキサゾリル、-アルキルイソキサゾリル、-アルキルチアゾリル、-アルキルイソチアゾリル、-アルキルオキサジアゾリル、-アルキルチアジアゾリル、-アルキルピリジニル、-アルキルピリダジニル、-アルキルピリミジニル及び-アルキルピラジニルが挙げられる。
【０２２１】
Zが、任意選択で、C1〜6アルキル(例えばメチル)、C1〜6アルコキシ(例えばメトキシ)、C1〜6ハロアルキル(例えばフルオロメチル)、C1〜6ハロアルコキシ(例えばフルオロメトキシ)及びハロ(例えばフルオロ、例えばクロロ)から各々独立して選択され得る1つ又は複数の置換基によって置換されているカルボシクリルを表す場合、Zは、任意選択で、C1〜6アルキルによって置換されているカルボシクリルを表し得る。例として、任意選択で、C1〜6アルキル(例えばメチル)によって置換されている単環式カルボシクリルが挙げられる。カルボシクリルの例として、C3〜8シクロアルキル(例えばシクロヘキシル)及びC5〜8シクロアルケニル(例えばシクロヘキセニル)が挙げられる。カルボシクリル環は、任意選択で、1、2又は3つの置換基(例えば1又は2つ、とりわけ1つ、例えば1つのメチル基)によって置換されていてもよい。Zが、カルボシクリルを表す場合、Zは、C3〜8シクロアルキル、例えばC5〜6シクロアルキルを表し得る。特定の例は、シクロヘキシルである。
【０２２２】
Zが、任意選択で、C1〜6アルキル、C1〜6アルコキシ、-C(O)OC1〜6アルキル、-C(O)C1〜6アルキル、-C(O)NHC1〜6アルキル、C1〜6アルキル(例えばメチル)、-C(O)OC1〜6アルキル(例えば-C(O)Oメチル)、-C(O)C1〜6アルキル(例えば-C(O)メチル)、-C(O)NHC1〜6アルキル(例えば-C(O)NHメチル)から各々独立して選択され得る1つ又は複数の置換基によって置換されているヘテロシクリルを表す場合、例として、置換されていないヘテロシクリル及び1又は2つ(例えば1つ)の置換基を有するヘテロシクリルが挙げられる。例として、1つの窒素原子(例えばピロリジニル及びピペリジニル)又は2つの窒素原子(例えばピペラジニル)を含有するヘテロシクリル基が挙げられる。例としてまた、1つの窒素原子及び1つの酸素原子(例えばモルホリニル)又は1つの硫黄原子(例えばチオモルホリニル)を含有するヘテロシクリル基が挙げられる。一例においては、Zが置換されている場合、環窒素原子は置換されていてもよい。置換されている例として、置換されているピペラジニル、例えば4-置換ピペラジニル、例えば4-Boc-ピペラジニル、4-(C(O)Me)-ピペラジニル、4-(C(O)NHEt)ピペラジニル及び4-メチルピペラジニルが挙げられる。
【０２２３】
Zが、カルボシクリルが、任意選択で、C1〜6アルキル(例えばメチル)、C1〜6ハロアルキル(例えばフルオロメチル、例えばトリフルオロメチル)、C1〜6アルコキシ(例えばメトキシ)、C1〜6ハロアルコキシ(例えばフルオロメトキシ)及びハロ(例えばフルオロ、例えばクロロ)から各々独立して選択され得る1つ又は複数の置換基によって置換されている-アルキルカルボシクリル(例えば-CH2-カルボシクリル)を表す場合、例として、-CH2-シクロプロピル及び-CH2-シクロブチルが挙げられる。
【０２２４】
Zが、ヘテロシクリルが、任意選択で、C1〜6アルキル、-C(O)OC1〜6アルキル、-C(O)C1〜6アルキル、-C(O)NHC1〜6アルキル、C1〜6アルキル(例えばメチル)、-C(O)OC1〜6アルキル(例えば-C(O)Oメチル)、-C(O)C1〜6アルキル(例えば-C(O)メチル)、-C(O)NHC1〜6アルキル(例えば-C(O)NHメチル)から各々独立して選択され得る1つ又は複数の置換基によって置換されている-アルキルヘテロシクリルを表す場合、例として、-CH2-ヘテロシクリル、例えば-CH2-モルホリニル、-CH2-ピペラジニル、-CH2-ピペリジニル及び-CH2-ピロリジニルが挙げられる。
【０２２５】
Zが、カルボシクリルが、任意選択で、C1〜6アルキル(例えばメチル)、C1〜6アルコキシ(例えばメトキシ)、C1〜6ハロアルキル(例えばフルオロメチル、例えばトリフルオロメチル)、C1〜6ハロアルコキシ(例えばフルオロメトキシ)及びハロ(例えばフルオロ、例えばクロロ)から各々独立して選択され得る1つ又は複数の置換基によって置換されている-アリールカルボシクリルを表す場合、Zは、フェニルカルボシクリルであってもよい。カルボシクリル環は、置換されていなくてもよく、1つ又は複数のC1〜6アルキル基によって置換されていてもよい。カルボシクリル環は、単環式であってもよい。カルボシクリル環の例は、シクロアルキルである。例として、シクロプロピルフェニル-及びシクロヘキシルフェニル-が挙げられる。
【０２２６】
Zが、ヘテロシクリルが、任意選択で、C1〜6アルキル、C1〜6アルコキシ、-C(O)OC1〜6アルキル、-C(O)C1〜6アルキル、-C(O)NHC1〜6アルキル、C1〜6アルキル(例えばメチル)、-C(O)OC1〜6アルキル(例えば-C(O)Oメチル)、-C(O)C1〜6アルキル(例えば-C(O)メチル)、-C(O)NHC1〜6アルキル(例えば-C(O)NHメチル)から各々独立して選択され得る1つ又は複数の置換基によって置換されている-アリールヘテロシクリルを表す場合、Zは、-フェニルヘテロシクリルであってもよい。ヘテロシクリル環は、単環式であってもよく、1又は2つ(例えば1つ)の窒素原子を含有してもよい。例として、モルフィノリルフェニル-、ピペラジニルフェニル-、ピペリジニルフェニル-、ピロリジニルフェニル-が挙げられる。特定の例は、3-(モルホリン-4-イル)フェニル-である。
【０２２７】
好適には、R1は、H、メチル、エチル、-C(O)OMe、CF3又はOMeを表し得る。一例においては、R1は、メチルを表す。
【０２２８】
好適には、各R2は独立して、H又はアルキルを表し得る。より好適には、R2は、H又はメチルを表す。一例においては、R2は、Hを表す。一例においては、R2は、メチルを表す。
【０２２９】
好適には、nは、0又は1を表してもよく、例えばnは、1を表す。
【０２３０】
好適には、R3は、H又はメチルを表してもよく、例えばR3は、Hを表す。
【０２３１】
好適には、R4は、H又はメチルを表してもよく、例えばR4は、Hを表す。
【０２３２】
好適には、R5は、H又はメチルを表してもよく、例えばR5は、Hを表す。
【０２３３】
好適には、W及びXは、互いに同じである。
【０２３４】
好適には、W及びXは各々、C=Oを表し得る。
【０２３５】
好適には、Yは、アリール(例えばフェニル)又はヘテロアリール(例えば1又は2つの窒素原子を含む1、2又は3つの環ヘテロ原子を含む5又は6員単環式ヘテロアリール、例えばイソキサゾリル、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニル又はピラジニル)を表し得る。一例においては、Yは、フェニルを表す。一例においては、Yは、単環式ヘテロアリールを表す。一例においては、Yは、C1〜6アルキル、C1〜6アルコキシ、ハロ及びC1〜6ハロアルキルから各々独立して選択される1つ又は複数の置換基によって置換されている。一例においては、Yは、置換されていない。一例においては、Yは、単置換されている。Yが、5員である場合、好適には、Z及びNR5は、環上で非隣接環原子に位置する。Yが、6員である場合、好適には、Z及びNR5は、環上で互いに対して1及び4位に位置する(すなわち、Z及びNR5は、パラ関係を有する)。
【０２３６】
好適には、Zは、アリール(例えばフェニル)又はヘテロアリール(例えば6員ヘテロアリール、例えばピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニル又はピラジニル、とりわけピリジニル;又は5員ヘテロアリール、例えばオキサゾリル、チアゾリル、ピラゾリル)を表し得る。一例においては、Zは、ヘテロアリールを表す。一例においては、Zは、アリールを表す。一例においては、Zは、メチル又はエチルを表さない。一例においては、Zは、置換されていないアルキルを表さない。
【０２３７】
本開示は、式(IIIA):
【０２３８】
【化６】
2020503018.tif 000016
【０２３９】
の化合物、又はそのすべての互変異性体及び立体異性体を含むその薬学的に許容される塩、溶媒和物若しくは多形体である、構造(III)を有するWnt阻害剤を提供し、式中:
R1は、アルキルを表し得る;
各R2は独立して、H;アルキル;任意選択で、C1〜6アルキル、C1〜6アルコキシ、C1〜6ハロアルコキシ及びハロから各々独立して選択される1つ若しくは複数の置換基によって置換されていてもよいカルボシクリル;-NHアルキル;-N(アルキル)2;アミノ;ヒドロキシル;アルコキシ;又はハロを表し得る;
nは、0、1又は2を表し得る;
R4は、H又はアルキルを表し得る;
R5は、H又はアルキルを表し得る;
W及びXは各々独立して、C=O又はC=Sを表し得る(一部の例においては、W及びXは、両方ともC=Oである);
Yは、アリール;ヘテロアリール;任意選択で、C1〜6アルキル、C1〜6アルコキシ、C1〜6ハロアルキル、C1〜6ハロアルコキシ及びハロから各々独立して選択される1つ若しくは複数の置換基によって置換されているカルボシクリル;又は任意選択で、C1〜6アルキル、-C(O)OC1〜6アルキル、-C(O)C1〜6アルキル及び-C(O)NHC1〜6アルキルから各々独立して選択される1つ若しくは複数の置換基によって置換されているヘテロシクリルを表し得る;
Zは、アルキル;アリール;ヘテロアリール;任意選択で、C1〜6アルキル、C1〜6アルコキシ、C1〜6ハロアルコキシ(例えばフルオロメトキシ)、C1〜6ハロアルコキシ及びハロから各々独立して選択される1つ若しくは複数の置換基によって置換されているカルボシクリル;任意選択で、C1〜6アルキル、-C(O)OC1〜6アルキル、-C(O)C1〜6アルキル及び-C(O)NHC1〜6アルキルから各々独立して選択される1つ若しくは複数の置換基によって置換されているヘテロシクリル;カルボシクリルが、任意選択で、C1〜6アルキル、C1〜6アルコキシ、C1〜6ハロアルコキシ及びハロから各々独立して選択される1つ若しくは複数の置換基によって置換されている-アリールカルボシクリル;又はヘテロシクリルが、任意選択で、C1〜6アルキル、-C(O)OC1〜6アルキル、-C(O)C1〜6アルキル及び-C(O)NHC1〜6アルキルから各々独立して選択される1つ若しくは複数の置換基によって置換されている-アリールヘテロシクリルを表し得る。
【０２４０】
一例においては、R1がメチルを表し;R2がHを表し;nが1を表し;W及びXが各々、C=Oを表し;R3がHを表し;R4がHを表し;Yがイソキサゾリルを表し;Zが、任意選択で、クロロ、フルオロ、ブロモ、メチル又はメトキシによって置換されているフェニルを表す、構造(III)を有するWnt阻害剤が提供される。
【０２４１】
一例においては、R1がメチルを表し;R2がHを表し;nが1を表し;W及びXが各々、C=Oを表し;R3がHを表し;R4がHを表し;Yがフェニルを表し;Zが、任意選択で、フルオロ、クロロ、アミノ、メチル又はメトキシによって置換されているフェニルを表す、構造(III)を有するWnt阻害剤が提供される。
【０２４２】
一例においては、R1がメチルを表し;R2がHを表し;nが1を表し;W及びXが各々、C=Oを表し;R3がHを表し;R4がHを表し;Yがピリジニルを表し;Zが、任意選択で、フルオロ、クロロ、メチル、アミノ又はトリフルオロメチルによって置換されているピリジニルを表す、構造(III)を有するWnt阻害剤が提供される。
【０２４３】
一例においては、R1がメチルを表し;R2がHを表し;nが1を表し;W及びXが各々、C=Oを表し;R3がHを表し;R4がHを表し;Yが、ピリダジニル、ピリミジニル又はピラジニルを表し;Zが、任意選択で、フルオロ、クロロ、メチル、アミノ又はトリフルオロメチルによって置換されているピリジニルを表す、構造(III)を有するWnt阻害剤が提供される。
【０２４４】
一例においては、R2、R4及びR5は、すべてHであり、n=1であり、W及びXは、両方ともC=Oである。
【０２４５】
更なる例においては、構造(III)の4-(2-メチル-6,7-ジヒドロピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-4(5H)-イル)-4-オキソ-N-(6-(ピリジン-3-イル)ピリダジン-3-イル)ブタンアミドが提供され得る。4-(2-メチル-6,7-ジヒドロピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-4(5H)-イル)-4-オキソ-N-(6-(ピリジン-3-イル)ピリダジン-3-イル)ブタンアミドという化合物名を有する構造(III)の化合物51(ETC-569)は、後に定義する構造(V)の化合物としても公知であり得る。
【０２４６】
一例においては、Zは、トリフルオロアルキルによって置換されているフェニルではない。
【０２４７】
一例においては、Yが、イソキサゾリルである場合、Zは、イソキサゾリル環の4位に位置しない。
【０２４８】
構造(III)を有するWnt阻害剤の化合物の特定の(しかし、非限定的な)例を、以下に示す:
【０２４９】
【表１Ａ】
2020503018.tif 000017
【０２５０】
【表１Ｂ】
2020503018.tif 000018
【０２５１】
【表１Ｃ】
2020503018.tif 000019
【０２５２】
【表１Ｄ】
2020503018.tif 000020
【０２５３】
【表１Ｅ】
2020503018.tif 000021
【０２５４】
【表１Ｆ】
2020503018.tif 000022
【０２５５】
【表１Ｇ】
2020503018.tif 000023
【０２５６】
【表１Ｈ】
2020503018.tif 000024
【０２５７】
【表１Ｉ】
2020503018.tif 000025
【０２５８】
【表１Ｊ】
2020503018.tif 000026
【０２５９】
【表１Ｋ】
2020503018.tif 000027
【０２６０】
【表１Ｌ】
2020503018.tif 000028
【０２６１】
【表１Ｍ】
2020503018.tif 000029
【０２６２】
【表１Ｎ】
2020503018.tif 000030
【０２６３】
【表１Ｏ】
2020503018.tif 000031
【０２６４】
【表１Ｐ】
2020503018.tif 000032
【０２６５】
【表１Ｑ】
2020503018.tif 000033
【０２６６】
【表１Ｒ】
2020503018.tif 000034
【０２６７】
【表１Ｓ】
2020503018.tif 000035
【０２６８】
【表１Ｔ】
2020503018.tif 000036
【０２６９】
【表１Ｕ】
2020503018.tif 000037
【０２７０】
【表１Ｖ】
2020503018.tif 000038
【０２７１】
【表１Ｗ】
2020503018.tif 000039
【０２７２】
【表１Ｘ】
2020503018.tif 000040
【０２７３】
【表１Ｙ】
2020503018.tif 000041
【０２７４】
【表１Ｚ】
2020503018.tif 000042
【０２７５】
【表１ａ】
2020503018.tif 000043
【０２７６】
【表１ｂ】
2020503018.tif 000044
【０２７７】
Wntシグナリング経路の阻害剤は、porcupine阻害剤であり得る。porcupine阻害剤は、Wnt-porcupine阻害剤であり得る。
【０２７８】
porcupine阻害剤は、2-(1,3-ジメチル-2,6-ジオキソ-1,2,3,6-テトラヒドロ-7H-プリン-7-イル)-N-(6-フェニルピリダジン-3-イル)アセトアミド、2-(1,3-ジメチル-2,6-ジオキソ-2,3-ジヒドロ-1H-プリン-7(6H)-イル)-N-(6-フェニルピリダジン-3-イル)アセトアミド又は構造(IV)の化合物であってもよく、4-(2-メチル-6,7-ジヒドロピラゾロール[1,5-a]ピリミジン-4(5H)-イル)-4-オキソ-N-(6-(ピリジン-3-イル)ピラジジン-3-イル)ブタンアミド又は構造(V)の化合物であってもよい。porcupine阻害剤はまた、構造(I)の化合物5(ETC-159)又は構造(III)の化合物51(ETC-569)であり得る。
【０２７９】
porcupine阻害剤は、2-(1,3-ジメチル-2,6-ジオキソ-1,2,3,6-テトラヒドロ-7H-プリン-7-イル)-N-(6-フェニルピリダジン-3-イル)アセトアミド、2-(1,3-ジメチル-2,6-ジオキソ-2,3-ジヒドロ-1H-プリン-7(6H)-イル)-N-(6-フェニルピリダジン-3-イル)アセトアミド又は構造(IV)の化合物であり得る。porcupine阻害剤はまた、構造(I)の化合物5(ETC-159)であり得る。porcupine阻害剤は、4-(2-メチル-6,7-ジヒドロピラゾロール[1,5-a]ピリミジン-4(5H)-イル)-4-オキソ-N-(6-(ピリジン-3-イル)ピラジジン-3-イル)ブタンアミド又は構造(V)の化合物であり得る。porcupine阻害剤は、構造(III)の化合物51(ETC-569)であり得る。
【０２８０】
Wnt-porcupine阻害剤は、2-(1,3-ジメチル-2,6-ジオキソ-1,2,3,6-テトラヒドロ-7H-プリン-7-イル)-N-(6-フェニルピリダジン-3-イル)アセトアミド、2-(1,3-ジメチル-2,6-ジオキソ-2,3-ジヒドロ-1H-プリン-7(6H)-イル)-N-(6-フェニルピリダジン-3-イル)アセトアミド又は構造(IV)の化合物であってもよく、4-(2-メチル-6,7-ジヒドロピラゾロール[1,5-a]ピリミジン-4(5H)-イル)-4-オキソ-N-(6-(ピリジン-3-イル)ピラジジン-3-イル)ブタンアミド又は構造(V)の化合物であってもよい。Wnt-porcupine阻害剤はまた、構造(I)の化合物5(ETC-159)又は構造(III)の化合物51(ETC-569)であり得る。
【０２８１】
Wnt-porcupine阻害剤は、2-(1,3-ジメチル-2,6-ジオキソ-1,2,3,6-テトラヒドロ-7H-プリン-7-イル)-N-(6-フェニルピリダジン-3-イル)アセトアミド、2-(1,3-ジメチル-2,6-ジオキソ-2,3-ジヒドロ-1H-プリン-7(6H)-イル)-N-(6-フェニルピリダジン-3-イル)アセトアミド又は構造(IV)の化合物であり得る。Wnt-porcupine阻害剤は、4-(2-メチル-6,7-ジヒドロピラゾロール[1,5-a]ピリミジン-4(5H)-イル)-4-オキソ-N-(6-(ピリジン-3-イル)ピラジジン-3-イル)ブタンアミド又は構造(V)の化合物であり得る。Wnt-porcupine阻害剤はまた、構造(I)の化合物5(ETC-159)であり得る。Wnt-porcupine阻害剤はまた、構造(III)の化合物51(ETC-569)であり得る。
【０２８２】
スケールアップ及びcGMP生成に、最終的には臨床使用及び商業使用に好適な固体状態形態の薬物の開発において、目的の標的に対する許容される薬物活性レベルは、重要な変数のうちの、考慮しなければならない唯一のものである。例えば、医薬組成物の製剤において、薬学的に活性な物質が、商業的製造方法において容易に再生することができ、薬学的に活性な物質が曝露される条件に耐えるのに十分に強固である形態であることは不可避である。
【０２８３】
製造の意味においては、商業的製造中に、薬学的に活性な物質の製造方法が、同じ製造条件を使用した場合に同じ材料が再生されるようなものであることが重要である。加えて、薬学的に活性な物質が固体形態で存在し、製造条件の若干の変化が、生成される薬学的に活性な物質の固体形態の主要な変化をもたらさないことが望ましい。例えば、製造方法は、信頼できる基礎に基づいて同じ結晶特性を有する材料を生成し、また、同じ水和レベルを有する材料を生成することが重要である。
【０２８４】
加えて、薬学的に活性な物質が、分解、吸湿性及び後続のその固体形態への変化の両方に対して安定であることが重要である。薬学的に活性な成分の、医薬製剤への組込みを促進するために、これは重要である。薬学的に活性な物質が、それが(ゆっくりと、又は経時的に)水を吸収するという意味において吸湿性(「粘着性」)である場合、同じ投与形態を提供するのに添加するべき物質の量が、水和の程度によって大きく変動するので、薬学的に活性な物質を薬物に確実に配合することはほとんど不可能である。更に、水和又は固体形態における変動(「多形」)は、物理化学特性、例えば可溶性又は溶解速度における変化をもたらす場合があり、これは次に、患者における経口吸収の不定を引き起こし得る。
【０２８５】
したがって、薬学的に活性な剤の化学的安定性、固体状態安定性及び「棚寿命」は、非常に重要な因子である。理想的な状況においては、薬学的に活性な剤及びそれを含有する任意の組成物は、活性成分の物理化学特性、例えばその活性、含水量、溶解特性、固体形態等における顕著な変化を示すことなく、かなりの期間にわたり有効に保存することが可能であるべきである。
【０２８６】
本開示はまた、上記に説明する無水遊離塩基を含む医薬組成物を包含する。
【０２８７】
本開示のモジュレーター化合物及び阻害化合物並びにモジュレーター剤及び阻害剤は、治療的に、又は予防的に組成物として投与され得る。治療適用においては、組成物は、疾患及びその合併症を治療又は少なくとも部分的に阻止するのに十分な量で、疾患を既に患っている患者に投与される。組成物は、患者を有効に治療するのに十分な量の化合物又は剤を提供するべきである。
【０２８８】
任意の特定の患者について治療的に有効な用量レベルは、治療する障害及び障害の重症度;使用する化合物又は剤の活性;使用する組成物;患者の年齢、体重、健康状態、性別及び食事;投与時間;投与経路;剤又は化合物の隔離速度;治療期間;治療との組合せで、又は治療と同時に使用する薬物を含む様々な因子に、医薬において周知の他の関連する因子と共に、依存する。
【０２８９】
当業者は、ルーチン実験によって、適用可能な疾患を治療するのに必要であり得る剤又は化合物の有効な非毒性量を決定することができる。
【０２９０】
一般的には、有効な投与量は、約0.0001mg〜約1000mg/体重kg/24時間の範囲内;典型的に約0.001mg〜約750mg/体重kg/24時間;約0.01mg〜約500mg/体重kg/24時間;約0.1mg〜約500mg/体重kg/24時間;約0.1mg〜約250mg/体重kg/24時間;約1.0mg〜約250mg/体重kg/24時間であると予測される。より典型的には、有効な用量範囲は、約1.0mg〜約200mg/体重kg/24時間;約1.0mg〜約100mg/体重kg/24時間;約1.0mg〜約50mg/体重kg/24時間;約1.0mg〜約25mg/体重kg/24時間;約5.0mg〜約50mg/体重kg/24時間;約5.0mg〜約20mg/体重kg/24時間;約5.0mg〜約15mg/体重kg/24時間の範囲内であると予測される。
【０２９１】
或いは、有効な投与量は、最高で約500mg/m2であり得る。一般的には、有効な投与量は、約25〜約500mg/m2、好ましくは約25〜約350mg/m2、より好ましくは約25〜約300mg/m2、またより好ましくは約25〜約250mg/m2、更により好ましくは約50〜約250mg/m2、また更により好ましくは約75〜約150mg/m2の範囲内であると予測される。
【０２９２】
典型的には、治療適用においては、治療は通常、疾患状態の持続期間の間であり得る。
【０２９３】
更に、最適量及び個々の投与量の間隔は、治療する疾患状態の性質及び程度、投与の形態、経路及び部位、並びに治療する特定の個体の性質によって決定されることが、当業者に明らかである。更に、そのような最適条件は、従来技術によって決定することができる。
【０２９４】
また、最適治療過程、例えば規定日数について1日当たりに与えられる組成物の用量数は、従来型の治療決定試験過程を使用して、当業者によって確認することができることは、当業者に明らかである。
【０２９５】
一般的に、好適な組成物は、当業者に公知の方法に従って調製してもよく、したがって、薬学的に許容される担体、希釈剤及び/又は補助剤を含んでもよい。
【０２９６】
これらの組成物は、標準の経路によって投与することができる。一般的に、組成物は、非経口(例えば静脈内、脊髄内、皮下又は筋内)、経口又は局所経路によって投与され得る。より好ましくは、投与は、非経口経路による。
【０２９７】
担体、希釈剤及び補助剤は、組成物の他の成分と調和し、その受容者に有害でないという点で「許容される」ものでなければならない。
【０２９８】
薬学的に許容される担体又は希釈剤の例は、鉱質除去水又は蒸留水;食塩水;植物ベースの油、例えばピーナッツ油、ベニバナ油、オリーブ油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油、ラッカセイ油又はココナッツ油;ポリシロキサン、例えばメチルポリシロキサン、フェニルポリシロキサン及びメチルフェニルポリシロキサンを含むシリコーン油;揮発性シリコーン;鉱油、例えば流動パラフィン、ソフトパラフィン又はスクアラン;セルロース誘導体、例えばメチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム又はヒドロキシプロピルメチルセルロース;低級アルカノール、例えばエタノール又はイソプロパノール;低級アラルカノール;低級ポリアルキレングリコール又は低級アルキレングリコール、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール又はグリセリン;脂肪酸エステル、例えばパルミチン酸イソプロピル、ミリスチン酸イソプロピル又はオレイン酸エチル;ポリビニルピロリドン;寒天;カラゲナン;トラガカントガム又はアカシアガム及び黄色ワセリンである。典型的に、1つ又は複数の担体は、組成物の10質量%〜99.9質量%を形成する。
【０２９９】
本明細書において開示する組成物は、注射による投与に好適な形態、経口摂取に好適な製剤の形態(例えばカプセル、錠剤、キャプレット、エリキシル剤等)、吸入による、例えば鼻内吸入又は経口吸入による投与に好適なエーロゾル形態、非経口投与、すなわち、皮下、筋内又は静脈内注射に好適な形態であり得る。
【０３００】
注射用溶液又は懸濁液としての投与のために、非毒性の非経口で許容される希釈剤又は担体は、リンガー液、等張食塩水、リン酸緩衝食塩水、エタノール及び1,2プロピレングリコールを含み得る。
【０３０１】
経口使用に好適な担体、希釈剤、賦形剤及び補助剤の一部の例として、ピーナッツ油、流動パラフィン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、アカシアガム、トラガカントガム、デキストロース、ショ糖、ソルビトール、マンニトール、ゼラチン及びレシチンが挙げられる。加えて、これらの経口製剤は、好適な着香剤及び着色剤を含有し得る。カプセル形態で使用される場合、カプセルは、崩壊を遅延させるグリセリルモノステアレート又はグリセリルジステアレート等の化合物でコーティングされ得る。
【０３０２】
補助剤として典型的に、軟化薬、乳化剤、増粘剤、保存剤、殺菌剤及び緩衝剤が挙げられる。
【０３０３】
経口投与のための固体形態は、ヒト及び獣医学的医薬の実施において許容される結合剤、甘味料、崩壊剤、希釈剤、着香料、コーティング剤、保存剤、潤滑剤及び/又は時間遅延剤を含有し得る。好適な結合剤として、アカシアガム、ゼラチン、トウモロコシデンプン、トラガカントガム、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース又はポリエチレングリコールが挙げられる。好適な甘味料として、ショ糖、乳糖、ブドウ糖、アスパルテーム又はサッカリンが挙げられる。好適な崩壊剤として、トウモロコシデンプン、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、グアーガム、キサンタンガム、ベントナイト、アルギン酸又は寒天が挙げられる。好適な希釈剤として、乳糖、ソルビトール、マンニトール、デキストロース、カオリン、セルロース、炭酸カルシウム、ケイ酸カルシウム又はリン酸二カルシウムが挙げられる。好適な着香剤として、ペパーミント油、ヒメコウジ油、サクランボ、オレンジ又はラズベリー着香料が挙げられる。好適なコーティング剤として、アクリル酸及び/若しくはメタクリル酸並びに/若しくはそれらのエステルのポリマー若しくはコポリマー、ワックス、脂肪アルコール、ゼイン、シェラック又はグルテンが挙げられる。好適な保存剤として、安息香酸ナトリウム、ビタミンE、アルファ-トコフェロール、アスコルビン酸、メチルパラベン、プロピルパラベン又は重亜硫酸ナトリウムが挙げられる。好適な潤滑剤として、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、オレイン酸ナトリウム、塩化ナトリウム又はタルクが挙げられる。好適な時間遅延剤として、グリセリルモノステアレート又はグリセリルジステアレートが挙げられる。
【０３０４】
経口投与のための液体形態は、上記の剤に加えて、液体担体を含有し得る。好適な液体担体として、水、油、例えばオリーブ油、ピーナッツ油、ゴマ油、ヒマワリ油、ベニバナ油、ラッカセイ油、ココナッツ油、流動パラフィン、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、グリセロール、脂肪アルコール、トリグリセリド又はそれらの混合物が挙げられる。
【０３０５】
経口投与のための懸濁液は、分散剤及び/又は懸濁剤を更に含み得る。好適な懸濁剤として、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、アルギン酸ナトリウム又はアセチルアルコールが挙げられる。好適な分散剤として、レシチン;ステアリン酸等の脂肪酸のポリオキシエチレンエステル;ポリオキシエチレンソルビトールモノ又はジオレイン酸塩、ステアリン酸塩又はラウリン酸塩;ポリオキシエチレンソルビタンモノ又はジオレイン酸塩、ステアリン酸塩又はラウリン酸塩等が挙げられる。
【０３０６】
経口投与のためのエマルションは、1つ又は複数の乳化剤を更に含み得る。好適な乳化剤として、上記に例示する分散剤、又は天然ガム、例えばグアーガム、アカシアガム若しくはトラガカントガムが挙げられる。
【０３０７】
非経口で投与可能な組成物を調製するための方法は、当業者に明らかである。
【０３０８】
組成物は、任意の好適な界面活性剤、例えばアニオン性、カチオン性又は非イオン性界面活性剤、例えばソルビタンエステル又はそのポリオキシエチレン誘導体を組み込み得る。懸濁剤、例えば天然ガム、セルロース誘導体、又は無機材料、例えばシリカ系シリカ類、及び他の成分、例えばラノリンもまた、含めてもよい。
【０３０９】
組成物はまた、リポソームの形態で投与してもよい。リポソームは一般的に、リン脂質又は他の脂質物質に由来し、水性媒体中に分散される単層又は多層水和液体結晶によって形成される。リポソームを形成することができる任意の非毒性の生理学的に許容され、かつ代謝可能な脂質を使用することができる。リポソーム形態の組成物は、安定化剤、保存剤、賦形剤等を含有してもよい。好ましい脂質は、天然及び合成の両方である、リン脂質及びホスファチジルコリン(レシチン)である。リポソームを形成するための方法は、本分野において公知である。
【０３１０】
経口製剤を、1つ又は複数の薬理学的に許容される成分と共に配合して、腸溶コーティングを伴う錠剤又はカプセル等を作製してもよい。そのような製剤のための方法は、当業者に周知である。腸溶コーティングは、Sandsらの、2004年8月19日公開の「Pharmaceutical formulations targeting specific regions of the gastrointestinal tract」という題名の米国特許出願公開第20040162263号において記載されているような、バイオアベイラビリティを向上させるために組成物又は活性薬物の、消化管の特定の領域への送達を向上させる腸溶コーティングであり得る。
【０３１１】
本明細書において使用するとき、「a」、「an」及び「the」という単数形は、文脈が明らかにそうでないことを規定しない限り、複数の参照物を含む。例えば、「プライマー」という用語は、その混合物を含む複数のプライマーを含む。
【０３１２】
本明細書において使用するとき、「約」という用語は、製剤の成分の濃度の文脈において、典型的には示される値の+/-5%、より典型的には示される値の+/-4%、より典型的には示される値の+/-3%、より典型的には示される値の+/-2%、更により典型的には示される値の+/-1%、更により典型的には示される値の+/-0.5%を意味する。時間の持続期間の文脈において使用する場合、「約」という用語は、典型的には示される時間の+/-20%、より典型的には示される時間の+/-15%、より典型的には示される時間の+/-10%、より典型的には示される時間の+/-5%、更により典型的には示される時間の+/-2%、更により典型的には示される時間の+/-1%を意味する。例えば、示される時間の持続期間が1日である場合、「約1日」という用語は、1日+/-0〜6時間を指し得る。別の例として、示される時間の持続期間が1時間である場合、「約1時間」という用語は、1時間+/-0〜10分間を指し得る。
【０３１３】
本開示全体を通して、ある特定の例が、範囲形式で開示され得る。範囲形式の説明は単に便利及び簡潔さのためであり、開示される範囲に対する変更不可能な限定として解釈されるべきではないことが理解されるべきである。したがって、範囲の説明は、特に開示されるすべての可能な下位範囲及びその範囲内の個々の数値を有すると考えられるべきである。例えば、1〜6等の範囲の説明は、特に開示される下位範囲、例えば1〜3、1〜4、1〜5、2〜4、2〜6、3〜6等並びにその範囲内の個々の数、例えば1、2、3、4、5及び6を有すると考えられるべきである。これは、範囲の広さにかかわらず適用される。
【０３１４】
本明細書において例示的に説明する本発明は、好適に、本明細書において具体的に開示されていない任意の1つ又は複数の要素、1つ又は複数の限定の非存在下において実施され得る。したがって、例えば、「〜を含む(comprising)」、「〜を含む(including)」、「〜を含有する(containing)」等の用語は、拡張的に、かつ限定することなく解釈されるべきである。加えて、本明細書において用いる上記用語及び表現は、説明の用語として、限定の用語としてではなく、使用されており、そのような用語及び表現の使用において、示され、説明される特徴又はその部分の任意の均等物を除外する意図はないが、様々な改変が、特許請求に係る本発明の範囲内で可能であることが認識される。したがって、本発明は好ましい実施形態によって具体的に開示されているが、本明細書において開示するその中で具体化される本発明の任意選択の特徴、改変及び変形形態に、当業者は頼ることができ、そのような改変及び変形形態は、本発明の範囲内であると考えられることが理解されるべきである。
【０３１５】
本発明は、本明細書において広く、一般的に説明されている。一般的な開示内に入る、より狭い種及び亜属の分類の各々はまた、本発明の部分を形成する。これは、切除された材料が本明細書において具体的に列挙されるかどうかにかかわらず、部類から任意の主題を除去するという条件付き又は消極的限定の、本発明の一般的な説明を含む。
【０３１６】
他の実施形態は、以下の特許請求の範囲及び非限定的な実施例の範囲内にある。加えて、本発明の特徴又は態様がマーカッシュ群において説明される場合、当業者は、本発明がまた、それによってマーカッシュ群の任意の個々のメンバー又はメンバーの下位群において説明されることを認識する。
【実施例】
【０３１７】
(実施例1)
単一化PTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合物陽性コントロール検証のためのPCRプロトコル
【０３１８】
PCR試薬
SuperScript III Platinum一段階定量的RT-PCRシステム(100反応用のカタログ番号11732-020、500反応用のカタログ番号11732-088、Invitrogen社)
【０３１９】
マスターミックス調製
PCR反応用のマスターミックスは、Table 1(表2)に記載したように調製される(反応量=25μl)。
【０３２０】
【表２】
2020503018.tif 000045
【０３２１】
RT-PCRサイクリング条件
【０３２２】
【表３】
2020503018.tif 000046
【０３２３】
データ分析
【０３２４】
【表４】
2020503018.tif 000047
【０３２５】
PTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合物の増幅曲線を作成するために、陽性コントロールプラスミドの試料が陽性コントロールプラスミドの1000、100、10及び1コピーをそれぞれ含有するように、PTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合物を含有する陽性コントロールプラスミドの連続希釈を実施する。内部コントロールプラスミド100コピーを各試料に添加する。連続希釈した陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールを含有する試料の増幅プロットを図4A及び図4Bに示し、それぞれのCt値は各増幅プロットの下に示した。
【０３２６】
(実施例2)
単一化PTPRK(e1/e2)野生型陽性プラスミドコントロール検証のためのPCRプロトコル及びヒト全RNA中におけるPTPRK(e1/e2)野生型の単一化検出
【０３２７】
使用したPCR試薬は実施例1と同じである。
【０３２８】
マスターミックス調製
PCR反応用のマスターミックスは、Table 4(表5)に記載したように調製される(反応量=25μl)。
【０３２９】
【表５】
2020503018.tif 000048
【０３３０】
RT-PCRサイクリング条件は実施例1と同じである。
【０３３１】
データ分析
【０３３２】
【表６】
2020503018.tif 000049
【０３３３】
PTPRK(e1/e2)野生型の増幅曲線を作成するために、陽性コントロールプラスミドの試料が陽性コントロールプラスミドの1000、100、10及び1コピーをそれぞれ含有するように、PTPRK(e1/e2)野生型を含有する陽性コントロールプラスミドの連続希釈を実施する。内部コントロールプラスミド100コピーを各試料に添加する。連続希釈した陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールを含有する試料の増幅プロットを図5A及び図5Bに示し、ヒト全RNAを含有する試料中のPTPRK(e1/e2)野生型及び内部コントロールの増幅プロットを図5C及び図5Dに示す。各Ct値は、各増幅プロットの下に示す。
【０３３４】
(実施例3)
単一化RSPO3(e1/e2)野生型陽性プラスミドコントロール検証のためのPCRプロトコル及びヒト全RNA中におけるRSPO3(e1/e2)野生型の単一化検出
【０３３５】
使用したPCR試薬は実施例1と同じである。
【０３３６】
マスターミックス調製
PCR反応用のマスターミックスは、Table 6(表7)に記載したように調製される(反応量=25μl)。
【０３３７】
【表７】
2020503018.tif 000050
【０３３８】
RT-PCRサイクリング条件は実施例1と同じである。
【０３３９】
データ分析
【０３４０】
【表８】
2020503018.tif 000051
【０３４１】
RSPO3(e1/e2)野生型の増幅曲線を作成するために、陽性コントロールプラスミドの試料が陽性コントロールプラスミドの1000、100、10及び1コピーをそれぞれ含有するように、RSPO3(e1/e2)野生型を含有する陽性コントロールプラスミドの連続希釈を実施する。内部コントロールプラスミド100コピーを各試料に添加する。連続希釈した陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールを含有する試料の増幅プロットを図6A及び図6Bに示し、ヒト全RNAを含有する試料中のRSPO3(e1/e2)野生型及び内部コントロールの増幅プロットを図6C及び図6Dに示す。各Ct値は、各増幅プロットの下に示す。
【０３４２】
(実施例4)
多重化PTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合物陽性コントロール検証のためのPCRプロトコル及び単一化プロトコルとの比較
【０３４３】
使用したPCR試薬は実施例1と同じである。
【０３４４】
マスターミックス調製
PCR反応用のマスターミックスは、Table 8(表9)に記載したように調製される(反応量=25μl)。
【０３４５】
【表９】
2020503018.tif 000052
【０３４６】
RT-PCRサイクリング条件は実施例1と同じである。
【０３４７】
データ分析
【０３４８】
【表１０】
2020503018.tif 000053
【０３４９】
PTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合物の増幅曲線を作成するために、陽性コントロールプラスミドの試料が陽性コントロールプラスミドの1000、100、10及び1コピーをそれぞれ含有するように、PTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合物を含有する陽性コントロールプラスミドの連続希釈を実施する。連続希釈した陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールを含有する試料の多重化増幅プロットを図7A及び図7Cに示す。連続希釈した陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールを含有する試料の単一化増幅プロットを図7B及び図7Dに示す。各Ct値は、増幅プロットの下に示す。多重化増幅反応を使用して得られたCt値と単一化増幅反応を使用して得られたCt値の間の差はΔCtによって表され、また表に含まれる。PTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合物の検出のために算出された平均ΔCt値は-2.44で、1プラスミドコピー/μlの試料のCt値は算出から除外する。内部コントロールの検出のために算出された平均ΔCt値は-0.41である。
【０３５０】
(実施例5)
多重化PTPRK(e1/e2)野生型陽性プラスミドコントロール検証のためのPCRプロトコル及び単一化プロトコルとの比較
【０３５１】
使用したPCR試薬は実施例1と同じである。
【０３５２】
マスターミックス調製
PCR反応用のマスターミックスは、Table 10(表11)に記載したように調製される(反応量=25μl)。
【０３５３】
【表１１】
2020503018.tif 000054
【０３５４】
RT-PCRサイクリング条件は実施例1と同じである。
【０３５５】
データ分析
【０３５６】
【表１２】
2020503018.tif 000055
【０３５７】
PTPRK(e1/e2)野生型の増幅曲線を作成するために、陽性コントロールプラスミドの試料が陽性コントロールプラスミドの1000、100、10及び1コピーをそれぞれ含有するように、PTPRK(e1/e2)野生型を含有する陽性コントロールプラスミドの連続希釈を実施する。内部コントロールプラスミド100コピーを各試料に添加する。連続希釈した陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールを含有する試料の多重化増幅プロットを図8A及び図8Cに示す。連続希釈した陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールを含有する試料の単一化増幅プロットを図8B及び図8Dに示す。各Ct値は、増幅プロットの下に示す。多重化増幅反応を使用して得られたCt値と単一化増幅反応を使用して得られたCt値の間の差はΔCtによって表され、また表に含まれる。PTPRK(e1/e2)野生型の検出のために算出された平均ΔCt値は-1.47で、1プラスミドコピー/μlの試料のCt値は算出から除外する。内部コントロールの検出のために算出された平均ΔCt値は-0.07である。
【０３５８】
(実施例6)
多重化RSPO3(e1/e2)野生型陽性プラスミドコントロール検証のためのPCRプロトコル及び単一化プロトコルとの比較
【０３５９】
使用したPCR試薬は実施例1と同じである。
【０３６０】
マスターミックス調製
PCR反応用のマスターミックスは、Table 12(表13)に記載したように調製される(反応量=25μl)。
【０３６１】
【表１３】
2020503018.tif 000056
【０３６２】
RT-PCRサイクリング条件は実施例1と同じである。
【０３６３】
データ分析
【０３６４】
【表１４】
2020503018.tif 000057
【０３６５】
RSPO3(e1/e2)野生型の増幅曲線を作成するために、陽性コントロールプラスミドの試料が陽性コントロールプラスミドの1000、100、10及び1コピーをそれぞれ含有するように、RSPO3(e1/e2)野生型を含有する陽性コントロールプラスミドの連続希釈を実施する。連続希釈した陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールを含有する試料の多重化増幅プロットを図9A及び図9Cに示す。連続希釈した陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールを含有する試料の単一化増幅プロットを図9B及び図9Dに示す。各Ct値は、増幅プロットの下に示す。多重化増幅反応を使用して得られたCt値と単一化増幅反応を使用して得られたCt値の間の差はΔCtによって表され、また表に含まれる。RSPO3(e1/e2)野生型の検出のために算出された平均ΔCt値は-0.31で、内部コントロールの検出のために算出された平均ΔCt値は0.20である。
【０３６６】
(実施例7)
ヒト全RNA中のPTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合物、PTPRK(e1/e2)野生型及びRSPO3(e1/e2)野生型の多重化検出のためのPCRプロトコル並びに単一化プロトコルとの比較
【０３６７】
使用したPCR試薬は実施例1と同じである。
【０３６８】
マスターミックス調製
PCR反応用のマスターミックスは、Table 14(表15)に記載したように調製される(反応量=25μl)。
【０３６９】
【表１５】
2020503018.tif 000058
【０３７０】
RT-PCRサイクリング条件は実施例1と同じである。
【０３７１】
データ分析
【０３７２】
【表１６】
2020503018.tif 000059
【０３７３】
ヒト全RNAを含有する試料中のPTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合物、PTPRK(e1/e2)野生型及びRSPO3(e1/e2)野生型並びに内部コントロールの多重化検出の増幅プロットを図10Aに示す。PTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合物、PTPRK(e1/e2)野生型及びRSPO3(e1/e2)野生型の単一化反応のそれぞれの増幅プロットを図10B〜図10Dに示す。各Ct値は、増幅プロットの下に示す。多重化増幅反応を使用して得られたCt値と単一化増幅反応を使用して得られたCt値の間の差はΔCtによって表され、また表に含まれる。
【０３７４】
(実施例8)
CR3150腫瘍RNA中のPTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合物、PTPRK(e1/e2)野生型及びRSPO3(e1/e2)野生型の多重化検出のためのPCRプロトコル並びに単一化プロトコルとの比較
【０３７５】
使用したPCR試薬は実施例1と同じである。
【０３７６】
マスターミックス調製
PCR反応用のマスターミックスは、Table 16(表17)に記載したように調製される(反応量=25μl)。
【０３７７】
【表１７】
2020503018.tif 000060
【０３７８】
RT-PCRサイクリング条件は実施例1と同じである。
【０３７９】
データ分析
【０３８０】
【表１８】
2020503018.tif 000061
【０３８１】
CR3150腫瘍RNAを含有する試料中のPTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合物、PTPRK(e1/e2)野生型及びRSPO3(e1/e2)野生型並びに内部コントロールの多重化検出の増幅プロットを図11Aに示す。PTPRK(e1)+RSPO3(e2)融合物、PTPRK(e1/e2)野生型及びRSPO3(e1/e2)野生型の単一化反応のそれぞれの増幅プロットを図11B〜図11Dに示す。各Ct値は、増幅プロットの下に示す。多重化増幅反応を使用して得られたCt値と単一化増幅反応を使用して得られたCt値の間の差はΔCtによって表され、また表に含まれる。
【０３８２】
(実施例9)
多重化PTPRK(e7)+RSPO3(e2)融合物陽性コントロール検証のためのPCRプロトコル及び単一化プロトコルとの比較
【０３８３】
使用したPCR試薬は実施例1と同じである。
【０３８４】
マスターミックス調製
PCR反応用のマスターミックスは、Table 18(表19)に記載したように調製される(反応量=25μl)。
【０３８５】
【表１９】
2020503018.tif 000062
【０３８６】
RT-PCRサイクリング条件は実施例1と同じである。
【０３８７】
データ分析
【０３８８】
【表２０】
2020503018.tif 000063
【０３８９】
PTPRK(e7)+RSPO3(e2)融合物の増幅曲線を作成するために、陽性コントロールプラスミドの試料が陽性コントロールプラスミドの1000、100、10及び1コピーをそれぞれ含有するように、PTPRK(e7)+RSPO3(e2)融合物を含有する陽性コントロールプラスミドの連続希釈を実施する。内部コントロールプラスミド100コピーを各試料に添加する。連続希釈した陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールを含有する試料の多重化増幅プロットを図12A及び図12Cに示す。連続希釈した陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールを含有する試料の単一化増幅プロットを図12B及び図12Dに示す。各Ct値は、増幅プロットの下に示す。多重化増幅反応を使用して得られたCt値と単一化増幅反応を使用して得られたCt値の間の差はΔCtによって表され、また表に含まれる。PTPRK(e7)+RSPO3(e2)融合物の検出のために算出された平均ΔCt値は-1.14で、1プラスミドコピー/μlの試料のCt値は算出から除外する。内部コントロールの検出のために算出された平均ΔCt値は-0.58である。
【０３９０】
(実施例10)
多重化PTPRK(e7/e8)野生型陽性プラスミドコントロール検証のためのPCRプロトコル及び単一化プロトコルとの比較
【０３９１】
使用したPCR試薬は実施例1と同じである。
【０３９２】
マスターミックス調製
PCR反応用のマスターミックスは、Table 20(表21)に記載したように調製される(反応量=25μl)。
【０３９３】
【表２１】
2020503018.tif 000064
【０３９４】
RT-PCRサイクリング条件は実施例1と同じである。
【０３９５】
データ分析
【０３９６】
【表２２】
2020503018.tif 000065
【０３９７】
PTPRK(e7/e8)野生型の増幅曲線を作成するために、陽性コントロールプラスミドの試料が陽性コントロールプラスミドの1000、100、10及び1コピーをそれぞれ含有するように、PTPRK(e7/e8)野生型を含有する陽性コントロールプラスミドの連続希釈を実施する。内部コントロールプラスミド100コピーを各試料に添加する。連続希釈した陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールを含有する試料の多重化増幅プロットを図13A及び図13Cに示す。連続希釈した陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールを含有する試料の単一化増幅プロットを図13B及び図13Dに示す。各Ct値は、増幅プロットの下に示す。多重化増幅反応を使用して得られたCt値と単一化増幅反応を使用して得られたCt値の間の差はΔCtによって表され、また表に含まれる。PTPRK(e7/e8)野生型の検出のために算出された平均ΔCt値は-0.23で、1プラスミドコピー/μlの試料のCt値は算出から除外する。内部コントロールの検出のために算出された平均ΔCt値は-0.55である。
【０３９８】
(実施例11)
多重化RSPO3(e1/e2)野生型陽性プラスミドコントロール検証のためのPCRプロトコル及び単一化プロトコルとの比較
【０３９９】
使用したPCR試薬は実施例1と同じである。
【０４００】
マスターミックス調製
PCR反応用のマスターミックスは、Table 22(表23)に記載したように調製される(反応量=25μl)。
【０４０１】
【表２３】
2020503018.tif 000066
【０４０２】
RT-PCRサイクリング条件は実施例1と同じである。
【０４０３】
データ分析
【０４０４】
【表２４】
2020503018.tif 000067
【０４０５】
RSPO3(e1/e2)野生型の増幅曲線を作成するために、陽性コントロールプラスミドの試料が陽性コントロールプラスミドの1000、100、10及び1コピーをそれぞれ含有するように、RSPO3(e1/e2)野生型を含有する陽性コントロールプラスミドの連続希釈を実施する。内部コントロールプラスミド100コピーを各試料に添加する。連続希釈した陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールを含有する試料の多重化増幅プロットを図14A及び図14Cに示す。連続希釈した陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールを含有する試料の単一化増幅プロットを図14B及び図14Dに示す。各Ct値は、増幅プロットの下に示す。多重化増幅反応を使用して得られたCt値と単一化増幅反応を使用して得られたCt値の間の差はΔCtによって表され、また表に含まれる。RSPO3(e1/e2)野生型の検出のために算出された平均ΔCt値は-0.73で、1プラスミドコピー/μlの試料のCt値は算出から除外する。内部コントロールの検出のために算出された平均ΔCt値は-0.18である。
【０４０６】
(実施例12)
ヒト全RNA中のPTPRK(e7)+RSPO3(e2)融合物、PTPRK(e7/e8)野生型及びRSPO3(e1/e2)野生型の多重化検出のためのPCRプロトコル並びに単一化プロトコルとの比較
【０４０７】
使用したPCR試薬は実施例1と同じである。
【０４０８】
マスターミックス調製
PCR反応用のマスターミックスは、Table 24(表25)に記載したように調製される(反応量=25μl)。
【０４０９】
【表２５】
2020503018.tif 000068
【０４１０】
RT-PCRサイクリング条件は実施例1と同じである。
【０４１１】
データ分析
【０４１２】
【表２６】
2020503018.tif 000069
【０４１３】
ヒト全RNAを含有する試料中のPTPRK(e7)+RSPO3(e2)融合物、PTPRK(e7/e8)野生型及びRSPO3(e1/e2)野生型並びに内部コントロールの多重化検出の増幅プロットを図15Aに示す。PTPRK(e7)+RSPO3(e2)融合物、PTPRK(e7/e8)野生型及びRSPO3(e1/e2)野生型の単一化反応のそれぞれの増幅プロットを図15B〜図15Dに示す。各Ct値は、増幅プロットの下に示す。多重化増幅反応を使用して得られたCt値と単一化増幅反応を使用して得られたCt値の間の差はΔCtによって表され、また表に含まれる。
【０４１４】
(実施例13)
多重化PTPRK(e13)+RSPO3(e2)融合物陽性コントロール検証のためのPCRプロトコル及び単一化プロトコルとの比較
【０４１５】
使用したPCR試薬は実施例1と同じである。
【０４１６】
マスターミックス調製
PCR反応用のマスターミックスは、Table 26(表27)に記載したように調製される(反応量=25μl)。
【０４１７】
【表２７】
2020503018.tif 000070
【０４１８】
RT-PCRサイクリング条件は実施例1と同じである。
【０４１９】
データ分析
【０４２０】
【表２８】
2020503018.tif 000071
【０４２１】
PTPRK(e13)+RSPO3(e2)融合物の増幅曲線を作成するために、陽性コントロールプラスミドの試料が陽性コントロールプラスミドの1000、100、10及び1コピーをそれぞれ含有するように、PTPRK(e13)+RSPO3(e2)融合物を含有する陽性コントロールプラスミドの連続希釈を実施する。内部コントロールプラスミド100コピーを各試料に添加する。多重化増幅反応を使用して得られたCt値と単一化増幅反応を使用して得られたCt値の間の差はΔCtによって表され、また表に含まれる。PTPRK(e13)+RSPO3(e2)融合物の検出のために算出された平均ΔCt値は-0.33で、1プラスミドコピー/μlの試料のCt値は算出から除外する。内部コントロールの検出のために算出された平均ΔCt値は0.01である。
【０４２２】
(実施例14)
多重化PTPRK(e12-e14)野生型陽性プラスミドコントロール検証のためのPCRプロトコル及び単一化プロトコルとの比較
【０４２３】
使用したPCR試薬は実施例1と同じである。
【０４２４】
マスターミックス調製
PCR反応用のマスターミックスは、Table 28(表29)に記載したように調製される(反応量=25μl)。
【０４２５】
【表２９】
2020503018.tif 000072
【０４２６】
RT-PCRサイクリング条件は実施例1と同じである。
【０４２７】
データ分析
【０４２８】
【表３０】
2020503018.tif 000073
【０４２９】
PTPRK(e12-e14)野生型の増幅曲線を作成するために、陽性コントロールプラスミドの試料が陽性コントロールプラスミドの1000、100、10及び1コピーをそれぞれ含有するように、PTPRK(e12-e14)野生型を含有する陽性コントロールプラスミドの連続希釈を実施する。内部コントロールプラスミド100コピーを各試料に添加する。各Ct値は、増幅プロットの下に示す。多重化増幅反応を使用して得られたCt値と単一化増幅反応を使用して得られたCt値の間の差はΔCtによって表され、また表に含まれる。PTPRK(e12-e14)野生型の検出のために算出された平均ΔCt値は0.25である。内部コントロールの検出のために算出された平均ΔCt値は0.07である。
【０４３０】
(実施例15)
ヒト全RNA中のPTPRK(e13)+RSPO3(e2)融合物及びPTPRK(e12-e14)野生型の多重化検出のためのPCRプロトコル並びに単一化プロトコルとの比較
【０４３１】
使用したPCR試薬は実施例1と同じである。
【０４３２】
マスターミックス調製
PCR反応用のマスターミックスは、Table 30(表31)に記載したように調製される(反応量=25μl)。
【０４３３】
【表３１】
2020503018.tif 000074
【０４３４】
RT-PCRサイクリング条件は実施例1と同じである。
【０４３５】
データ分析
【０４３６】
【表３２】
2020503018.tif 000075
【０４３７】
多重化増幅反応を使用して得られたCt値と単一化増幅反応を使用して得られたCt値の間の差はΔCtによって表され、また表に含まれる。
【０４３８】
(実施例16)
CR2506腫瘍RNA中のPTPRK(e13)+RSPO3(e2)融合物及びPTPRK(e12-e14)野生型の多重化検出のためのPCRプロトコル並びに単一化プロトコルとの比較
【０４３９】
使用したPCR試薬は実施例1と同じである。
【０４４０】
マスターミックス調製
PCR反応用のマスターミックスは、Table 32(表33)に記載したように調製される(反応量=25μl)。
【０４４１】
【表３３】
2020503018.tif 000076
【０４４２】
RT-PCRサイクリング条件は実施例1と同じである。
【０４４３】
データ分析
【０４４４】
【表３４】
2020503018.tif 000077
【０４４５】
各Ct値は、増幅プロットの下に示す。多重化増幅反応を使用して得られたCt値と単一化増幅反応を使用して得られたCt値の間の差はΔCtによって表され、また表に含まれる。
【０４４６】
(実施例17)
単一化EIF3E(e1)+RSPO2(e2)融合物陽性コントロール検証のためのPCRプロトコル
【０４４７】
使用したPCR試薬は実施例1と同じである。
【０４４８】
マスターミックス調製
PCR反応用のマスターミックスは、Table 34(表35)に記載したように調製される(反応量=25μl)。
【０４４９】
【表３５】
2020503018.tif 000078
【０４５０】
RT-PCRサイクリング条件は実施例1と同じである。
【０４５１】
データ分析
【０４５２】
【表３６】
2020503018.tif 000079
【０４５３】
EIF3E(e1)+RSPO2(e2)融合物の増幅曲線を作成するために、陽性コントロールプラスミドの試料が陽性コントロールプラスミドの1000、100、10及び1コピーをそれぞれ含有するように、EIF3E(e1)+RSPO2(e2)融合物を含有する陽性コントロールプラスミドの連続希釈を実施する。内部コントロールプラスミド100コピーを各試料に添加する。連続希釈した陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールを含有する試料の増幅プロットを図16A及び図16Bに示し、それぞれのCt値は各増幅プロットの下に示した。
【０４５４】
(実施例18)
単一化EIF3E(e1/e2)野生型陽性プラスミドコントロール検証のためのPCRプロトコル
【０４５５】
使用したPCR試薬は実施例1と同じである。
【０４５６】
マスターミックス調製
PCR反応用のマスターミックスは、Table 36(表37)に記載したように調製される(反応量=25μl)。
【０４５７】
【表３７】
2020503018.tif 000080
【０４５８】
RT-PCRサイクリング条件は実施例1と同じである。
【０４５９】
データ分析
【０４６０】
【表３８】
2020503018.tif 000081
【０４６１】
EIF3E(e1/e2)野生型の増幅曲線を作成するために、陽性コントロールプラスミドの試料が陽性コントロールプラスミドの1000、100、10及び1コピーをそれぞれ含有するように、EIF3E(e1/e2)野生型を含有する陽性コントロールプラスミドの連続希釈を実施する。内部コントロールプラスミド100コピーを各試料に添加する。連続希釈した陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールを含有する試料の増幅プロットを図17A及び図17Bに示し、それぞれのCt値は各増幅プロットの下に示した。
【０４６２】
(実施例19)
単一化RSPO2(e1/e2)野生型陽性プラスミドコントロール検証のためのPCRプロトコル
【０４６３】
使用したPCR試薬は実施例1と同じである。
【０４６４】
マスターミックス調製
PCR反応用のマスターミックスは、Table 38(表39)に記載したように調製される(反応量=25μl)。
【０４６５】
【表３９】
2020503018.tif 000082
【０４６６】
RT-PCRサイクリング条件は実施例1と同じである。
【０４６７】
データ分析
【０４６８】
【表４０】
2020503018.tif 000083
【０４６９】
RSPO2(e1/e2)野生型の増幅曲線を作成するために、陽性コントロールプラスミドの試料が陽性コントロールプラスミドの1000、100、10及び1コピーをそれぞれ含有するように、RSPO2(e1/e2)野生型を含有する陽性コントロールプラスミドの連続希釈を実施する。内部コントロールプラスミド100コピーを各試料に添加する。連続希釈した陽性コントロールプラスミド及び内部コントロールを含有する試料の増幅プロットを図18A及び図18Bに示し、それぞれのCt値は各増幅プロットの下に示した。
【０４７０】
(実施例23)
ヒト全RNA中のEIF3E(e1)+RSPO2(e2)融合物、EIF3E(e1/e2)野生型及びRSPO2(e1/e2)野生型の多重化検出のためのPCRプロトコル
【０４７１】
使用したPCR試薬は実施例1と同じである。
【０４７２】
マスターミックス調製
PCR反応用のマスターミックスは、Table 40(表41)に記載したように調製される(反応量=25μl)。
【０４７３】
【表４１】
2020503018.tif 000084
【０４７４】
RT-PCRサイクリング条件は実施例1と同じである。
【０４７５】
データ分析
【０４７６】
【表４２】
2020503018.tif 000085
【０４７７】
ヒト全RNAを含有する試料中のEIF3E(e1)+RSPO2(e2)融合物、EIF3E(e1/e2)野生型及びRSPO2(e1/e2)野生型並びに内部コントロールの多重化検出の増幅プロットを図19A及び図19Bに示す。各Ct値は、増幅プロットの下に示す。
【０４７８】
結果分析のための諾否の基準を確立するために使用した方法の例を以下の実施例において提供する。
【０４７９】
(実施例24)
操作コントロール許容基準
【０４８０】
結果分析で使用するための許容可能な操作Ct値の例をここに挙げる。
【０４８１】
【表４３】
2020503018.tif 000086
【０４８２】
*特に記載がない限り、許容可能な値は規定した値内で、規定した値を含む。増幅無しはCt>42を意味する。
【０４８３】
陽性コントロール(PC)については、各PC反応のFAM、TxRd及びCy5シグナルがCt範囲内であることを確実にする。Ct値が許容範囲外の場合、実施例25に進む。
【０４８４】
鋳型無しコントロール(NTC)
FAM、TxRd及びCy5反応において、各NTC反応が増幅無し(すなわち、Ct>42)を示すことを確実にする(増幅があれば汚染を意味する)。任意のNTCアッセイがFAM、TxRd及び/又はCy5チャネルにおいて増幅を示す場合、すなわち、Ct値が42未満か、42と等しい場合、実施例25に進む。
【０４８５】
内部コントロール(IC)
この反応は融合物/WTアッセイ反応より劣っていることがあるので、PCウェルのIC(HEX)増幅は評価しないものとする。各NTC反応が範囲内であるHEXチャネル(IC)のCt値を示すことを確実にする。任意のNTC反応が許容範囲外のHEX値を有する場合、操作は操作コントロール許容基準を満たさず、操作者は実施例25に進めなければならない。操作コントロールがすべて許容範囲内の場合、実施例26に進む。
【０４８６】
(実施例25)
操作コントロール再試験基準
操作コントロールが実施例24で規定した基準を満たさなかった場合、使用者は以下に記載したように進めなければならない。再試験の詳細を実行し、必要ならば、調査及び判断理由の詳細を試験報告書に付録として添えるものとする。必要ならば、偏差を記録する。
【０４８７】
陽性コントロール(PC)
FAM、TxRd及びCy5Ct値が任意の反応の規定から外れる場合、全操作は無効で、反復しなければならない。無効な操作を記録し、失敗が体系的と思われる場合(偶発的な場合とは対照的に)、失敗の原因を調査して記録する。調査はまた、研究は反復すべきか、又は問題が露見した点から継続することができるかも考慮する。
【０４８８】
無効な操作を2回反復してもよい。同じFAM、TxRd及びC5Ct値が規定から外れたままの場合、原因は体系的と考えられ、したがって調査する。反復操作が異なる理由、例えば、NTC汚染のために失敗した場合、その失敗は本来の失敗理由のために実施され得る反復の数に加算しないものとする。
【０４８９】
鋳型無しコントロール(NTC)
任意のNTC反応で、増幅がFAM、TxRd及び/又はCy5チャネルでCt42の前に(又はCt42で)検出される場合、全操作は無効と考えられる。無効な操作を記録し、失敗が体系的と思われる場合(偶発的な場合とは対照的に)、失敗の原因を調査して記録する。調査はまた、研究は反復すべきか、又は問題が露見した点から継続することができるかも考慮する。
【０４９０】
無効な操作を2回反復してもよい。同じFAM、TxRd及び/又はCy5汚染が残存する場合、原因は体系的と考えられ、したがって調査する。反復操作が異なる理由、例えば、PC失敗のために失敗した場合、その失敗は本来の失敗理由のために実施され得る反復の数に加算しないものとする。
【０４９１】
内部コントロール(IC)
NTCにおいてIC(HEX)Ct値が規定を外れている場合、反応は無効である。この反応によるデータは使用することができず、全操作は無効と考えられる。無効な操作を記録し、失敗が体系的と思われる場合(偶発的な場合とは対照的に)、失敗の原因を調査して記録する。調査はまた、研究は反復すべきか、又は問題が露見した点から継続することができるかも考慮する。
【０４９２】
無効な操作を2回反復してもよい。同じIC(HEX)Ctが規定から外れたままの場合、原因は体系的と考えられ、したがって調査する。反復操作が異なる理由、例えば、PC失敗のために失敗した場合、その失敗は本来の失敗理由のために実施され得る反復の数に加算しないものとする。
【０４９３】
(実施例26)
試料許容基準
試料を含有する反応が有効であることを確認するために、以下に記載したように調べるべきである。
【０４９４】
試料:PTPRK WT反応許容基準
各試料のPTPRK WT反応TxRd Ct値が範囲内であることを確認し、アッセイに過剰に添加されておらず、使用されたDNAが不十分ではないことを検証する。Ct値が範囲内である場合、試料PTPRK WT反応許容基準は満たされており、試料融合反応は評価することができる。操作者は以下の項目「試料:融合アッセイ許容基準」に進むべきである。Ct値が許容範囲を外れる場合、その試料を使用する反応はすべて無効であり、データは使用することはできない。操作者は実施例27の再試験基準に進むべきである。
【０４９５】
試料:RSPO3 WT反応許容基準
【０４９６】
【表４４】
2020503018.tif 000087
【０４９７】
*特に記載がない限り、許容可能な値は規定した値内で、規定した値を含む。
【０４９８】
各試料のRSPO3 WT反応Cy5 Ct値が範囲内であることを確認し、上記の表に示した。Cy5 Ct値が範囲内である場合、試料RSPO3 WT反応許容基準は満たされており、試料融合反応は評価することができる。操作者は以下の項目「試料:融合アッセイ許容基準」に進むべきである。Cy5 Ct値が許容範囲を外れるが、TxRd Ct値が上記に示した範囲内にある場合、その試料を使用する反応はすべて依然として有効であり、データは使用される。操作者は以下の項目「試料:融合アッセイ許容基準」に進むべきである。Cy5 Ct値が許容範囲を外れ、TxRd Ct値もPTPRK WT反応ミックスの許容範囲を外れる場合、その試料を使用する反応はすべて無効であり、データは使用することができない。操作者は実施例27の再試験基準に進むべきである。
【０４９９】
試料:融合アッセイ許容基準
【０５００】
【表４５】
2020503018.tif 000088
【０５０１】
*許容可能な値は、規定した値内で、規定した値を含む。
【０５０２】
FAM Ctが上記表で述べた許容可能な範囲を上回るか、又はFAM増幅がない場合、操作者は以下の項目「試料:内部コントロール(HEX)許容基準」に進みIC(HEX)を評価するべきである。IC(HEX)が有効な場合、結果は「変異は検出されない」と考えられる。これらの試料は反復せず、統計学的分析を支持するデータセットに利用される。
【０５０３】
試料:内部コントロール(HEX)許容基準
FAM/TxRd/Cy5反応における陽性増幅の反応について(すなわち、Ct≦42)、FAM/TxRd/Cy5反応よりも劣っている可能性があるので、IC HEX Ctは必ずしも規定範囲内ではない。FAM、TxRd及びCy5増幅がない場合、HEX Ct値は規定範囲内にあるはずであり、そうでなければ反応は失敗と考えられ、以下の実施例27で記載した再試験基準の対象となる。
【０５０４】
(実施例27)
試料再試験基準
試料:PTPRK WT反応再試験基準
試料が実施例26で規定した基準を満たさなかった場合、使用者は以下に記載したように進めるべきである。再試験の詳細を実施し、必要ならば、調査及び判断理由の詳細を試験報告書に付録として添えるものとする。必要ならば、偏差を記録する。無効な試料はもう1回再試験してもよい。同じTxRd Ctが規定を外れたままの場合、試料は元の希釈していない100%融合物標準を使用して再度製造され、再試験しなければならない。反復操作が異なる理由、例えば、NTC汚染のために失敗した場合、その失敗は本来の失敗理由のために実施され得る反復の数に加算しないものとする。
【０５０５】
試料: RSPO3 WT反応再試験基準
試料が実施例26で規定した基準を満たさなかった場合、使用者は以下に記載したように進めるべきである。再試験の詳細を実施し、必要ならば、調査及び判断理由の詳細を試験報告書に付録として添えるものとする。必要ならば、偏差を記録する。無効な試料はもう1回再試験してもよい。同じCy5及びTxRd Ct値が規定を外れたままの場合、試料は元の希釈していない100%融合物標準を使用して再度製造され、再試験しなければならない。反復操作が異なる理由、例えば、NTC汚染のために失敗した場合、その失敗は本来の失敗理由のために実施され得る反復の数に加算しないものとする。
【０５０６】
試料:融合アッセイ再試験基準
試料が実施例26で規定した基準を満たさなかった場合、使用者は以下に記載したように進めるべきである。再試験の詳細を実施し、必要ならば、調査及び判断理由の詳細を試験報告書に付録として添えるものとする。必要ならば、偏差を記録する。無効な試料はもう1回再試験してもよい。同じFAM Ct値が規定を外れたままの場合、試料は元の希釈していない100%融合物標準を使用して再度製造され、再試験しなければならない。反復操作が異なる理由、例えば、NTC汚染のために失敗した場合、その失敗は本来の失敗理由のために実施され得る反復の数に加算しないものとする。
【０５０７】
試料:内部コントロール(HEX)再試験基準
試料が実施例26で規定した基準を満たさなかった場合、使用者は以下に記載したように進めるべきである。再試験の詳細を実施し、必要ならば、調査及び判断理由の詳細を試験報告書に付録として添えるものとする。必要ならば、偏差を記録する。FAM、TxRd及びCy5増幅がなく(すなわち、Ct>42)、IC(HEX)Ct値が範囲外の場合、これらの反応は失敗で、これらの反応のデータは使用することができない。無効な試料はもう1回再試験してもよい。IC (HEX) Ctが規定を外れたままの場合、試料は元の希釈していない100%変異標準を使用して再度製造し、再試験しなければならない。反復操作が異なる理由、例えば、PC失敗のために失敗した場合、その失敗は本来の失敗理由のために実施され得る反復の数に加算しないものとする。
【０５０８】
(実施例28)
試料融合物状態の割当
操作が一旦許容基準を満たしたら、試料融合物状態は以下に記載したように定義される。
【０５０９】
ΔCtの算出
全融合反応について、以下の式を用いてΔCt値を算出する。
ΔCt=Ct融合反応-CtPTPRK WT反応
【０５１０】
ΔCt値を提供されたアッセイカットオフ値と比較する。ΔCt値がカットオフを下回るか、同等の場合、「融合物は検出された」ものとする。ΔCt値が規定した範囲を下回る場合、すなわち陰性ΔCt値の場合、「融合物は検出された」ものとする。ΔCt値がカットオフを上回る場合、「融合物は検出されなかった」ものとする。
【０５１１】
【表４６Ａ】
2020503018.tif 000089
【０５１２】
【表４６Ｂ】
2020503018.tif 000090
【０５１３】
【表４６Ｃ】
2020503018.tif 000091
【０５１４】
【表４６Ｄ】
2020503018.tif 000092
【図１−１】
2020503018.tif 000102
【図１−２】
2020503018.tif 000103
【図１−３】
2020503018.tif 000104
【図２−１】
2020503018.tif 000105
【図２−２】
2020503018.tif 000106
【図３−１】
2020503018.tif 000107
【図３−２】
2020503018.tif 000108
【図４−１】
2020503018.tif 000109
【図４−２】
2020503018.tif 000110
【図５−１】
2020503018.tif 000111
【図５−２】
2020503018.tif 000112
【図５−３】
2020503018.tif 000113
【図５−４】
2020503018.tif 000114
【図６−１】
2020503018.tif 000115
【図６−２】
2020503018.tif 000116
【図６−３】
2020503018.tif 000117
【図６−４】
2020503018.tif 000118
【図７−１】
2020503018.tif 000119
【図７−２】
2020503018.tif 000120
【図７−３】
2020503018.tif 000121
【図７−４】
2020503018.tif 000122
【図８−１】
2020503018.tif 000123
【図８−２】
2020503018.tif 000124
【図８−３】
2020503018.tif 000125
【図８−４】
2020503018.tif 000126
【図９−１】
2020503018.tif 000127
【図９−２】
2020503018.tif 000128
【図９−３】
2020503018.tif 000129
【図９−４】
2020503018.tif 000130
【図１０−１】
2020503018.tif 000131
【図１０−２】
2020503018.tif 000132
【図１０−３】
2020503018.tif 000133
【図１１−１】
2020503018.tif 000134
【図１１−２】
2020503018.tif 000135
【図１１−３】
2020503018.tif 000136
【図１２−１】
2020503018.tif 000137
【図１２−２】
2020503018.tif 000138
【図１２−３】
2020503018.tif 000139
【図１２−４】
2020503018.tif 000140
【図１３−１】
2020503018.tif 000141
【図１３−２】
2020503018.tif 000142
【図１３−３】
2020503018.tif 000143
【図１３−４】
2020503018.tif 000144
【図１４−１】
2020503018.tif 000145
【図１４−２】
2020503018.tif 000146
【図１４−３】
2020503018.tif 000147
【図１４−４】
2020503018.tif 000148
【図１５−１】
2020503018.tif 000149
【図１５−２】
2020503018.tif 000150
【図１５−３】
2020503018.tif 000151
【図１６−１】
2020503018.tif 000152
【図１６−２】
2020503018.tif 000153
【図１７−１】
2020503018.tif 000154
【図１７−２】
2020503018.tif 000155
【図１８−１】
2020503018.tif 000156
【図１８−２】
2020503018.tif 000157
【図１９−１】
2020503018.tif 000158
【図１９−２】
2020503018.tif 000159
【図２０−１】
2020503018.tif 000160
【図２０−２】
2020503018.tif 000161
【図２１−１】
2020503018.tif 000162
【図２１−２】
2020503018.tif 000163
【図２２−１】
2020503018.tif 000164
【図２２−２】
2020503018.tif 000165
【図２３−１】
2020503018.tif 000166
【図２３−２】
2020503018.tif 000167
【図２４−１】
2020503018.tif 000168
【図２４−２】
2020503018.tif 000169
【図２５−１】
2020503018.tif 000170
【図２５−２】
2020503018.tif 000171
【図２６−１】
2020503018.tif 000172
【図２６−２】
2020503018.tif 000173
【図２７−１】
2020503018.tif 000174
【図２７−２】
2020503018.tif 000175
【図２８−１】
2020503018.tif 000176
【図２８−２】
2020503018.tif 000177
【図２９−１】
2020503018.tif 000178
【図２９−２】
2020503018.tif 000179
【図３０−１】
2020503018.tif 000180
【図３０−２】
2020503018.tif 000181
【図３１】
2020503018.tif 000182
【図３２】
2020503018.tif 000183
【配列表】
2020503018000001.app
【国際調査報告】
2020503018.tif 000184
2020503018.tif 000185
2020503018.tif 000186