(57)【要約】  本発明は、マイクロサテライト配列を含む、ＤＮＡサンプルの標的断片を増幅するのに適切な一対のプライマー；第１のフルオロフォアで標識した、第１のＭＳオリゴヌクレオチド（ＭＳ）加水分解プローブであって、マイクロサテライト配列を含む野生型配列に相補的である第１のＭＳオリゴヌクレオチドプローブ；第２のフルオロフォアで標識した、第２のオリゴヌクレオチド参照（ＲＥＦ）加水分解プローブであって、前記マイクロサテライト配列を含まない、前記標的ＤＮＡ断片の野生型配列に相補的である第２のオリゴヌクレオチドＲＥＦプローブ、を含むＰＣＲ溶液の存在下で、前記ＤＮＡサンプルをデジタルポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供するステップを含む、ＤＮＡサンプル由来標的断片のマイクロサテライト配列座にある突然変異を検出する方法に関する。本発明は、がんの診断及び予後予測の方法並びにがん処置の効力を決定する方法も包含する。本発明は、マイクロサテライト配列中にある突然変異を検出するキットも含む。【選択図】  図４
2020530763.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロサテライト配列を含む、ＤＮＡサンプルの標的断片を増幅するのに適切な一対のプライマー；
第１のフルオロフォアで標識した、第１のＭＳオリゴヌクレオチド（ＭＳ）加水分解プローブであって、前記マイクロサテライト配列を含む野生型配列に相補的である第１のＭＳオリゴヌクレオチドプローブ；
第２のフルオロフォアで標識した、第２のオリゴヌクレオチド参照（ＲＥＦ）加水分解プローブであって、前記マイクロサテライト配列の外側に位置する、前記標的ＤＮＡ断片の野生型配列に相補的である第２のオリゴヌクレオチドＲＥＦプローブ；
を含むＰＣＲ溶液の存在下で、前記ＤＮＡサンプルをデジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄＰＣＲ）に供するステップを含む、ＤＮＡサンプル由来標的断片のマイクロサテライト配列座にある突然変異を検出する方法。
【請求項２】
前記ＤＮＡサンプルの前記標的断片が、構成的なゲノムＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＤＮＡサンプルの前記標的断片が、ゲノム腫瘍ＤＮＡである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記マイクロサテライト配列座が、ＢＡＴ−２５、ＢＡＴ−２６、ＢＡＴ−３４ｃ４、ＢＡＴ−４０、ＮＲ２１、ＮＲ２４、ＭＯＮＯ−２７、Ｄ２Ｓ１２３、Ｄ５Ｓ３４６、Ｄ１７Ｓ２５０、ＡＣＶＲ２Ａ、ＤＥＦＢ１０５Ａ、ＤＥＦＢ１０５Ｂ、ＲＮＦ４３、ＤＯＣＫ３、ＧＴＦ２ＩＰ１、ＬＯＣ１０００９３６３１、ＰＩＰ５Ｋ１Ａ、ＭＳＨ３、ＴＲＩＭ４３Ｂ、ＰＰＦＩＡ１及びＴＤＲＤ１を含む群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＤＮＡサンプルが、腫瘍組織、播種性細胞、糞便、血液細胞、血漿、血清、リンパ節、尿、唾液、精液、便、痰、脳脊髄液、涙、粘液、膵液、胃液、羊水、脳脊髄液、漿液からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＲＥＦ及びＭＳプローブに関連する前記蛍光シグナルを測定するステップをさらに含み、前記ＲＥＦとＭＳ両方のプローブに関連する最大の蛍光強度シグナルが、前記標的ＤＮＡ断片中の野生型マイクロサテライト配列の存在を示し、前記ＭＳプローブに関連する前記蛍光強度シグナルのシフトが、前記標的ＤＮＡ断片の前記マイクロサテライト配列中の突然変異の存在を示す、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のＤＮＡサンプル由来標的ＤＮＡのマイクロサテライト配列座にある突然変異を検出するステップを含む、対象においてがん、ミスマッチ修復（ＭＭＲ）遺伝子における突然変異に関連する疾患又は家族性腫瘍素因を診断する方法であって、前記標的断片が腫瘍に由来する方法。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のＤＮＡサンプル由来標的断片のマイクロサテライト配列座にある突然変異を検出するステップを含むがんの予後予測の方法であって、前記標的断片が、腫瘍に由来する方法。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のＤＮＡサンプル由来標的断片のマイクロサテライト配列座にある突然変異を検出するステップを含む、がんを患う対象において処置の効力を予測する方法であって、前記標的断片が腫瘍に由来し、前記処置が好ましくは免疫チェックポイント治療などの免疫療法である、方法。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のＤＮＡサンプル由来標的断片のマイクロサテライト配列座にある突然変異を検出するステップと、
突然変異が前記標的断片のマイクロサテライト配列座中に同定される場合に対象へ免疫治療を投与するステップと
を含む、それを必要とする対象においてがんを処置する方法であって、前記ＤＮＡサンプルの前記標的断片が、腫瘍に由来する方法。
【請求項１１】
ＤＮＡサンプル由来標的断片のマイクロサテライト配列座にある突然変異を検出するステップを含む、ＤＮＡミスマッチ修復（ＭＭＲ）障害に関連する腫瘍があると診断された又はそのような腫瘍を患っている患者を監視する方法であって、前記ＤＮＡサンプルの前記標的断片が腫瘍に由来する方法。
【請求項１２】
マイクロサテライト配列を含むＤＮＡサンプル由来標的断片を増幅するのに適切な一対のプライマー；
第１のフルオロフォアで標識した、第１のオリゴヌクレオチド加水分解プローブ（ＭＳ）であって、前記マイクロサテライト配列を含む野生型配列に相補的である第１のオリゴヌクレオチドプローブ；
第２のフルオロフォアで標識した、第２のオリゴヌクレオチド加水分解プローブ（ＲＥＦ）であって、前記マイクロサテライト配列の外側に位置する、前記増幅されたＤＮＡ断片の野生型配列に相補的である第２のオリゴヌクレオチドプローブ；
熱安定性ポリメラーゼ
を含む、ＤＮＡサンプル由来標的断片のマイクロサテライト配列領域にある突然変異を同定するキット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
〔序文〕
マイクロサテライト（ＭＳ）は、ヒトゲノムの全体にわたって豊富に存在する短いＤＮＡ配列の縦列反復である。その高い変異率のため、マイクロサテライト配列は、集団遺伝学及び科学捜査において多形性マーカーとして広く使用されてきた。マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）は、ＤＮＡミスマッチ修復障害（ＭＭＲ）がある腫瘍に生じ、ＤＮＡポリメラーゼスリッページによるマイクロサテライト反復の広範囲にわたる長さ多形及び高頻度の単一ヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ）によって特徴付けられる過突然変異誘発表現型である。ＭＳＩは、体細胞突然変異によるＭＭＲ遺伝子（例えば、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ３、ＭＳＨ６及びＰＭＳ２）の不活性化に起因し、遺伝性生殖細胞突然変異（即ち、リンチ症候群）がある者のがんの危険性を増大させる。ＭＳＩは、ＭＭＲ遺伝子の後成的不活性化（例えば体細胞性ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異に関連するＭＬＨ１及びＭＳＨ２プロモーターの過剰メチル化又はＥｐ−ＣＡＭの３’末端における欠失）又はマイクロＲＮＡによるＭＭＲ遺伝子の下方制御によっても生じる。コード領域内におけるＭＳＩ事象は、読み枠を改変する場合があり、短縮された機能的に障害のあるタンパク質をもたらす（Ｃｏｒｔｅｓ−Ｃｉｒｉａｎｏら、Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．２０１７年  ６月６日；８：１５１８０頁及びＣｏｐｉｊａら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｓｃｉ．２０１７年  １月６日；１８（１）．ｐｉｉ：Ｅ１０７頁も参照のこと）。
【０００２】
ＭＳＩ表現型は、主に胃腸、子宮内膜及び結腸直腸腫瘍の分子診断ツールとして使用され、その表現型は、疾患予後及び処置の合理的な計画に重要な意味を有する（Ｂｏｌａｎｄ及びＧｏｅｌ、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ２０１０年  ６月；１３８（６）：２０７３〜２０８７．ｅ３頁、Ｃｏｐｉｊａら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｓｃｉ．２０１７年  １月６日；１８（１）．ｐｉｉ：Ｅ１０７頁）。ＭＳＩ陽性腫瘍は、特定の位置、低い分化度、高いリンパ球浸潤及び低頻度の遠隔転移に関連するより優れた予後を含めて固有の組織病理学的及び臨床的特徴を示すことが公知である（Ｂｏｌａｎｄ及びＧｏｅｌ、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ２０１０年；１３８（６）：２０７３〜２０８７．ｅ３頁）。
【０００３】
最近の分析はまた、尿路、卵巣、前立腺、肺、頭頸部、肝臓及びグリア芽細胞腫などいくつかの追加のがん型にわたってＭＳＩを同定し、臨床診療におけるＭＳＩスクリーニングの潜在的により広い適用を示唆した（Ｈａｕｓｅら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２０１６年  １１月；２２（１１）：１３４２〜１３５０頁、Ｃｏｒｔｅｓ−Ｃｉｒｉａｎｏら、Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．２０１７年  ６月６日；８：１５１８０頁）。
【０００４】
実際、ＭＳＩは、免疫チェックポイント遮断療法の臨床的有益性を予測する可能性が高い最初の汎腫瘍バイオマーカーとして最近明らかになった（Ｌｅら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２０１５年  ６月２５日；３７２（２６）：２５０９〜２０頁；Ｌｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１７年  ６月８日．ｐｉｉ：ｅａａｎ６７３３頁）。ＦＤＡは、迅速承認工程により、切除不能性若しくは転移性ＭＳＩ陽性又はＭＭＲ欠損した固形腫瘍がある成人及び小児患者の処置に対する抗ＰＤ−１遮断療法の使用を最近認可したことに注目すべきである。
【０００５】
ＭＳＩの分子診断は、腫瘍サンプルから抽出したＤＮＡのいくつかの有益なマイクロサテライト座のＰＣＲ産物を調査することによって現在行われている（Ｂａｃｈｅｒら、Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｍａｒｋｅｒｓ  ２００４年、２３７〜２５０頁）。この方法の短所には、対立遺伝子サイズのシフトを検出するためにキャピラリー電気泳動法を必要とすること、及びこの技術の感度が限られているために、信頼性が高く強力な結果を達成するために最小腫瘍細胞充実度２０％が必要となることが含まれる（Ｓｈｉ及びＷａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ  ２０１２年  １３７：８４７〜８５９頁）。近年では、次世代塩基配列決定方法（ＮＧＳ）が、ＭＳＩ検出におけるより高感度及びより優れた精度のために使用されている（Ｓａｌｉｐａｎｔｅら、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２０１４年  ６月３０日  ６０（９）、１１９２〜１１９９頁；Ｈａｕｓｅら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２０１６年  １１月；２２（１１）：１３４２〜１３５０頁、Ｃｏｒｔｅｓ−Ｃｉｒｉａｎｏら、Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．２０１７年  ６月６日；８：１５１８０頁）。クリニックにおいて現在使用されている方法に対する改善は明らかであるが、ＮＧＳによって得られる感度１％は、ＰＣＲに基づくアッセイの感度を依然として上回っている。
【０００６】
したがって、液体生検から得られる循環腫瘍ＤＮＡに使用可能な高感度のＭＳＩ診断方法の開発が、高い臨床的及び治療的重要性を持つことに変わりはない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
著者は、マイクロサテライト不安定性を検出するデジタルＰＣＲ診断方法を設計し、その方法は、極めて低濃度の標的ＤＮＡを含有するＤＮＡサンプルに対して実行され得る。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
著者は、達成された検出限界（即ち、ブランクの限界と確実に区別される可能性が高い最低濃度であり、その濃度で検出が実現可能である）が、臨床診療において現在適用されている５重アッセイによってＭＳＩ状況を決定するのに必要とされる最小細胞充実度閾値（即ち、少なくとも２０％の細胞充実度）より２５０倍低いことを実際に実証した（Ｂａｃｈｅｒら、２００４年、Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｍａｒｋｅｒｓ  ２０：２３７〜２５０を参照のこと、またＳｈｉ及びＷａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ  ２０１２年  １３７：８４７〜８５９頁を参照のこと）。本明細書に示される結果によると、新しい本ＭＳＩ検出アッセイは、感度が、少なくとも理論的には、０．１％に近づく値に達し得たので、特異性と感度の両方が高い。この革新的な手法は、血液試験の簡単さ及び分析の時間短縮を含めて他のいくつかの利点も提示する。総合すれば、本発明のＭＳＩ診断方法は、より優れた診断精度並びに疾患処置及び疾患進行を診断及び監視するための液体生検におけるＭＳＩバイオマーカーの先例のない使用の見込みがある。
【０００９】
類似の技術が、結腸直腸がんにおけるＢＲＡＦ状況の検出にこれまで使用されてきた（Ｂｉｄｓｈａｈｒｉら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ２０１６年、１８（２）：１９０〜２０４頁を参照のこと）。しかしながら、そのような技術の使用は、変異マイクロサテライト配列の検出に関してこれまで想像されてこなかった。実際に、マイクロサテライト配列のサイズ、より具体的には極度の反復性のため、プローブの効果的な又は信頼性が高いハイブリダイゼーションを得ることができないほどマイクロサテライトを網羅するプローブ（ＭＳプローブ、以下を参照のこと）が反復配列上を滑ることが予想されることになる。
【００１０】
Ｄｉｅｔｍａｉｅｒら（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、２００１年）は、ＲＴ−ＰＣＲによって及び標的したマーカーの特異的配列のハイブリダイゼーションプローブを使用して融点を分析することによってマイクロサテライト配列を検出する技術について記述している。この文書において使用されるＬｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＨｙｂＰｒｏｂｅｓハイブリダイゼーションプローブは、ＷＴと変異体マイクロサテライト配列とを識別する能力がない。したがって変異マイクロサテライトを同定するには、追加の融点分析が、リアルタイムＰＣＲ増幅後に必要とされる。また、Ｄｉｅｔｍａｉｅｒらのプローブは、加水分解プローブとみなされず、デジタルＰＣＲ反応の文脈において適切ではない。
【００１１】
本発明の方法は、同じアンプリコン内に位置する２つの加水分解プローブによる単一の反応に基づく。第１のプローブは、ＷＴマイクロサテライト全配列（ＭＳプローブ）を網羅する。第２のプローブは、非可変領域に位置する参照プローブ（ＲＥＦ）であり、マイクロサテライト配列（ＭＳ）座を含まず、増幅性ＤＮＡを含むドロップレットを定量化するために使用される。したがって、野生型（ＷＴ）配列は、ＲＥＦとＭＳプローブ両方のハイブリダイゼーションに由来する二重陽性蛍光シグナルを示すことになり、一方、変異マイクロサテライト対立遺伝子を含有するドロップレットは、ＲＥＦプローブのみのハイブリダイゼーションの結果として生じるシグナルのシフトを呈すことになる。
【００１２】
したがって、本発明は、
マイクロサテライト配列を含む、ＤＮＡサンプルの標的断片を増幅するのに適切な一対のプライマー；
第１のフルオロフォアで標識した、第１のオリゴヌクレオチドマイクロサテライト（ＭＳ）加水分解プローブであって、マイクロサテライト配列を含む野生型配列に相補的である第１のＭＳオリゴヌクレオチドプローブ；
第２のフルオロフォアで標識した、第２のオリゴヌクレオチド参照（ＲＥＦ）加水分解プローブであって、前記マイクロサテライト配列を含まない、前記標的ＤＮＡ断片の野生型配列に相補的である第２のオリゴヌクレオチドＲＥＦプローブ
を含むＰＣＲ溶液の存在下で、前記ＤＮＡサンプルをデジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄＰＣＲ）に供するステップを含む、ＤＮＡサンプル由来標的断片のマイクロサテライト配列座にある突然変異を検出する方法に関する。
【００１３】
デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）は、デジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）であることが好ましい。ＤＮＡサンプルの標的断片は、構成的なゲノムＤＮＡ若しくはゲノム腫瘍ＤＮＡ又は循環ＤＮＡであり得る。
【００１４】
マイクロサテライト配列座は、ＢＡＴ−２５、ＢＡＴ−２６、ＢＡＴ−３４ｃ４、ＢＡＴ−４０、ＮＲ２１、ＮＲ２４、ＭＯＮＯ−２７、Ｄ２Ｓ１２３、Ｄ５Ｓ３４６、Ｄ１７Ｓ２５０、ＡＣＶＲ２Ａ、ＤＥＦＢ１０５Ａ、ＤＥＦＢ１０５Ｂ、ＲＮＦ４３、ＤＯＣＫ３、ＧＴＦ２ＩＰ１、ＬＯＣ１０００９３６３１、ＰＩＰ５Ｋ１Ａ、ＭＳＨ３、ＴＲＩＭ４３Ｂ、ＰＰＦＩＡ１及びＴＤＲＤ１を含む群から選択され得る。加えて、がんにおいて頻繁に増幅されるゲノムの領域（例えばヒトゲノムのｃｈｒ８ｑ領域）に位置するマイクロサテライト配列を選択して、感度を増大させ得る。
【００１５】
一般に、ＤＮＡサンプルは、腫瘍組織、播種性細胞、糞便、血液細胞、血漿、血清、リンパ節、尿、唾液、精液、便、痰、脳脊髄液、涙、粘液、膵液、胃液、羊水、脳脊髄液、漿液からなる群から選択される。
【００１６】
本発明は、ＲＥＦ及びＭＳプローブに関連する蛍光シグナルを測定するステップをさらに含む前記請求項のいずれか一項に記載の方法であって、ＲＥＦとＭＳ両方のプローブに関連する最大の蛍光強度シグナルが、標的ＤＮＡ断片中の野生型マイクロサテライト配列の存在を示し、ＭＳプローブに関連する蛍光強度シグナルのシフトが、標的ＤＮＡ断片のマイクロサテライト配列中の突然変異の存在を示す方法にも関する。
【００１７】
本発明は、上記のＤＮＡサンプル由来標的ＤＮＡのマイクロサテライト配列座にある突然変異を検出するステップを含む、対象においてがん、ミスマッチ修復（ＭＭＲ）遺伝子における突然変異に関連する疾患又は家族性腫瘍素因を診断する方法にも関し、標的断片は腫瘍に由来する。
【００１８】
本発明は、上記のＤＮＡサンプル由来標的断片のマイクロサテライト配列座にある突然変異を検出するステップを含むがんの予後予測の方法にも関し、標的断片は、腫瘍に由来する。
【００１９】
本発明は、上記のＤＮＡサンプル由来標的断片のマイクロサテライト配列座にある突然変異を検出するステップを含む、がんを患う対象において処置の効力を予測する方法にも関し、標的断片は腫瘍に由来し、処置は、好ましくは免疫チェックポイント治療などの免疫治療である。
【００２０】
本発明は、
上記ＤＮＡサンプル由来標的断片のマイクロサテライト配列座にある突然変異を検出するステップと
突然変異が標的断片のマイクロサテライト配列座中に同定される場合に対象へ免疫治療を投与するステップと
を含む、それを必要とする対象においてがんを処置する方法にも関し、ＤＮＡサンプルの標的断片は、腫瘍に由来する。
【００２１】
本発明は、上記のＤＮＡサンプル由来標的断片のマイクロサテライト配列座にある突然変異を検出するステップを含む、ＤＮＡミスマッチ修復（ＭＭＲ）障害に関連する腫瘍があると診断された又はそのような腫瘍を患っている患者を監視する方法にも関し、
ＤＮＡサンプルの標的断片は、腫瘍に由来する。
【００２２】
最後に、本発明は、
マイクロサテライト配列を含むＤＮＡサンプル由来標的断片を増幅するのに適切な一対のプライマー；
第１のフルオロフォアで標識した、第１のオリゴヌクレオチド加水分解プローブ（ＭＳ）であって、マイクロサテライト配列を含む野生型配列に相補的である第１のオリゴヌクレオチド加水分解プローブ；
第２のフルオロフォアで標識した、第２のオリゴヌクレオチド加水分解プローブ（ＲＥＦ）であって、前記マイクロサテライト配列を含まない、前記増幅されたＤＮＡ断片の野生型配列に相補的である第２のオリゴヌクレオチド加水分解プローブ；
熱安定性ポリメラーゼ
を含むＤＮＡサンプル由来標的断片のマイクロサテライト配列領域にある突然変異を同定するキットも包含する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１Ａ】Ａ〜Ｃ．ＨＣＴ−１１６細胞株ＤＮＡ（ＭＳＩ−Ｈ）、ＰＢＭＣ（ＷＴ）、又はＷＴ  ＤＮＡ中のＨＣＴ−１１６の１０％希釈物を使用するＢＡＴ−２６  ｄｄＰＣＲ  ＭＳＩアッセイの二次元蛍光振幅散布図を示す図である。Ｄ〜Ｆ．ＨＣＴ−１１６細胞株ＤＮＡ（ＭＳＩ−Ｈ）、ＰＢＭＣ（ＷＴ）、又はＷＴ  ＤＮＡ中のＨＣＴ−１１６の１０％希釈物を使用するＤＥＦＢ１０５Ａ／Ｂ  ｄｄＰＣＲ  ＭＳＩアッセイの二次元蛍光振幅散布図を示す図である。Ｇ〜Ｉ．ＨＣＴ−１１６細胞株ＤＮＡ（ＭＳＩ−Ｈ）、ＰＢＭＣ（ＷＴ）、又はＷＴ  ＤＮＡ中のＨＣＴ−１１６の１０％希釈物を使用するＡＣＶＲ２Ａ  ｄｄＰＣＲ  ＭＳＩアッセイの二次元蛍光振幅散布図を示す図である。ＷＴ対立遺伝子を含有するドロップレットは、ＦＡＭとＶＩＣ両方のシグナルについて陽性であり、ＭＳＩ対立遺伝子を含有するドロップレットは、ＶＩＣシグナルのみ陽性である。
【図１Ｂ】Ａ〜Ｃ．ＨＣＴ−１１６細胞株ＤＮＡ（ＭＳＩ−Ｈ）、ＰＢＭＣ（ＷＴ）、又はＷＴ  ＤＮＡ中のＨＣＴ−１１６の１０％希釈物を使用するＢＡＴ−２６  ｄｄＰＣＲ  ＭＳＩアッセイの二次元蛍光振幅散布図を示す図である。Ｄ〜Ｆ．ＨＣＴ−１１６細胞株ＤＮＡ（ＭＳＩ−Ｈ）、ＰＢＭＣ（ＷＴ）、又はＷＴ  ＤＮＡ中のＨＣＴ−１１６の１０％希釈物を使用するＤＥＦＢ１０５Ａ／Ｂ  ｄｄＰＣＲ  ＭＳＩアッセイの二次元蛍光振幅散布図を示す図である。Ｇ〜Ｉ．ＨＣＴ−１１６細胞株ＤＮＡ（ＭＳＩ−Ｈ）、ＰＢＭＣ（ＷＴ）、又はＷＴ  ＤＮＡ中のＨＣＴ−１１６の１０％希釈物を使用するＡＣＶＲ２Ａ  ｄｄＰＣＲ  ＭＳＩアッセイの二次元蛍光振幅散布図を示す図である。ＷＴ対立遺伝子を含有するドロップレットは、ＦＡＭとＶＩＣ両方のシグナルについて陽性であり、ＭＳＩ対立遺伝子を含有するドロップレットは、ＶＩＣシグナルのみ陽性である。
【図１Ｃ】Ａ〜Ｃ．ＨＣＴ−１１６細胞株ＤＮＡ（ＭＳＩ−Ｈ）、ＰＢＭＣ（ＷＴ）、又はＷＴ  ＤＮＡ中のＨＣＴ−１１６の１０％希釈物を使用するＢＡＴ−２６  ｄｄＰＣＲ  ＭＳＩアッセイの二次元蛍光振幅散布図を示す図である。Ｄ〜Ｆ．ＨＣＴ−１１６細胞株ＤＮＡ（ＭＳＩ−Ｈ）、ＰＢＭＣ（ＷＴ）、又はＷＴ  ＤＮＡ中のＨＣＴ−１１６の１０％希釈物を使用するＤＥＦＢ１０５Ａ／Ｂ  ｄｄＰＣＲ  ＭＳＩアッセイの二次元蛍光振幅散布図を示す図である。Ｇ〜Ｉ．ＨＣＴ−１１６細胞株ＤＮＡ（ＭＳＩ−Ｈ）、ＰＢＭＣ（ＷＴ）、又はＷＴ  ＤＮＡ中のＨＣＴ−１１６の１０％希釈物を使用するＡＣＶＲ２Ａ  ｄｄＰＣＲ  ＭＳＩアッセイの二次元蛍光振幅散布図を示す図である。ＷＴ対立遺伝子を含有するドロップレットは、ＦＡＭとＶＩＣ両方のシグナルについて陽性であり、ＭＳＩ対立遺伝子を含有するドロップレットは、ＶＩＣシグナルのみ陽性である。
【図１Ｄ】Ａ〜Ｃ．ＨＣＴ−１１６細胞株ＤＮＡ（ＭＳＩ−Ｈ）、ＰＢＭＣ（ＷＴ）、又はＷＴ  ＤＮＡ中のＨＣＴ−１１６の１０％希釈物を使用するＢＡＴ−２６  ｄｄＰＣＲ  ＭＳＩアッセイの二次元蛍光振幅散布図を示す図である。Ｄ〜Ｆ．ＨＣＴ−１１６細胞株ＤＮＡ（ＭＳＩ−Ｈ）、ＰＢＭＣ（ＷＴ）、又はＷＴ  ＤＮＡ中のＨＣＴ−１１６の１０％希釈物を使用するＤＥＦＢ１０５Ａ／Ｂ  ｄｄＰＣＲ  ＭＳＩアッセイの二次元蛍光振幅散布図を示す図である。Ｇ〜Ｉ．ＨＣＴ−１１６細胞株ＤＮＡ（ＭＳＩ−Ｈ）、ＰＢＭＣ（ＷＴ）、又はＷＴ  ＤＮＡ中のＨＣＴ−１１６の１０％希釈物を使用するＡＣＶＲ２Ａ  ｄｄＰＣＲ  ＭＳＩアッセイの二次元蛍光振幅散布図を示す図である。ＷＴ対立遺伝子を含有するドロップレットは、ＦＡＭとＶＩＣ両方のシグナルについて陽性であり、ＭＳＩ対立遺伝子を含有するドロップレットは、ＶＩＣシグナルのみ陽性である。
【図１Ｅ】Ａ〜Ｃ．ＨＣＴ−１１６細胞株ＤＮＡ（ＭＳＩ−Ｈ）、ＰＢＭＣ（ＷＴ）、又はＷＴ  ＤＮＡ中のＨＣＴ−１１６の１０％希釈物を使用するＢＡＴ−２６  ｄｄＰＣＲ  ＭＳＩアッセイの二次元蛍光振幅散布図を示す図である。Ｄ〜Ｆ．ＨＣＴ−１１６細胞株ＤＮＡ（ＭＳＩ−Ｈ）、ＰＢＭＣ（ＷＴ）、又はＷＴ  ＤＮＡ中のＨＣＴ−１１６の１０％希釈物を使用するＤＥＦＢ１０５Ａ／Ｂ  ｄｄＰＣＲ  ＭＳＩアッセイの二次元蛍光振幅散布図を示す図である。Ｇ〜Ｉ．ＨＣＴ−１１６細胞株ＤＮＡ（ＭＳＩ−Ｈ）、ＰＢＭＣ（ＷＴ）、又はＷＴ  ＤＮＡ中のＨＣＴ−１１６の１０％希釈物を使用するＡＣＶＲ２Ａ  ｄｄＰＣＲ  ＭＳＩアッセイの二次元蛍光振幅散布図を示す図である。ＷＴ対立遺伝子を含有するドロップレットは、ＦＡＭとＶＩＣ両方のシグナルについて陽性であり、ＭＳＩ対立遺伝子を含有するドロップレットは、ＶＩＣシグナルのみ陽性である。
【図１Ｆ】Ａ〜Ｃ．ＨＣＴ−１１６細胞株ＤＮＡ（ＭＳＩ−Ｈ）、ＰＢＭＣ（ＷＴ）、又はＷＴ  ＤＮＡ中のＨＣＴ−１１６の１０％希釈物を使用するＢＡＴ−２６  ｄｄＰＣＲ  ＭＳＩアッセイの二次元蛍光振幅散布図を示す図である。Ｄ〜Ｆ．ＨＣＴ−１１６細胞株ＤＮＡ（ＭＳＩ−Ｈ）、ＰＢＭＣ（ＷＴ）、又はＷＴ  ＤＮＡ中のＨＣＴ−１１６の１０％希釈物を使用するＤＥＦＢ１０５Ａ／Ｂ  ｄｄＰＣＲ  ＭＳＩアッセイの二次元蛍光振幅散布図を示す図である。Ｇ〜Ｉ．ＨＣＴ−１１６細胞株ＤＮＡ（ＭＳＩ−Ｈ）、ＰＢＭＣ（ＷＴ）、又はＷＴ  ＤＮＡ中のＨＣＴ−１１６の１０％希釈物を使用するＡＣＶＲ２Ａ  ｄｄＰＣＲ  ＭＳＩアッセイの二次元蛍光振幅散布図を示す図である。ＷＴ対立遺伝子を含有するドロップレットは、ＦＡＭとＶＩＣ両方のシグナルについて陽性であり、ＭＳＩ対立遺伝子を含有するドロップレットは、ＶＩＣシグナルのみ陽性である。
【図１Ｇ】Ａ〜Ｃ．ＨＣＴ−１１６細胞株ＤＮＡ（ＭＳＩ−Ｈ）、ＰＢＭＣ（ＷＴ）、又はＷＴ  ＤＮＡ中のＨＣＴ−１１６の１０％希釈物を使用するＢＡＴ−２６  ｄｄＰＣＲ  ＭＳＩアッセイの二次元蛍光振幅散布図を示す図である。Ｄ〜Ｆ．ＨＣＴ−１１６細胞株ＤＮＡ（ＭＳＩ−Ｈ）、ＰＢＭＣ（ＷＴ）、又はＷＴ  ＤＮＡ中のＨＣＴ−１１６の１０％希釈物を使用するＤＥＦＢ１０５Ａ／Ｂ  ｄｄＰＣＲ  ＭＳＩアッセイの二次元蛍光振幅散布図を示す図である。Ｇ〜Ｉ．ＨＣＴ−１１６細胞株ＤＮＡ（ＭＳＩ−Ｈ）、ＰＢＭＣ（ＷＴ）、又はＷＴ  ＤＮＡ中のＨＣＴ−１１６の１０％希釈物を使用するＡＣＶＲ２Ａ  ｄｄＰＣＲ  ＭＳＩアッセイの二次元蛍光振幅散布図を示す図である。ＷＴ対立遺伝子を含有するドロップレットは、ＦＡＭとＶＩＣ両方のシグナルについて陽性であり、ＭＳＩ対立遺伝子を含有するドロップレットは、ＶＩＣシグナルのみ陽性である。
【図１Ｈ】Ａ〜Ｃ．ＨＣＴ−１１６細胞株ＤＮＡ（ＭＳＩ−Ｈ）、ＰＢＭＣ（ＷＴ）、又はＷＴ  ＤＮＡ中のＨＣＴ−１１６の１０％希釈物を使用するＢＡＴ−２６  ｄｄＰＣＲ  ＭＳＩアッセイの二次元蛍光振幅散布図を示す図である。Ｄ〜Ｆ．ＨＣＴ−１１６細胞株ＤＮＡ（ＭＳＩ−Ｈ）、ＰＢＭＣ（ＷＴ）、又はＷＴ  ＤＮＡ中のＨＣＴ−１１６の１０％希釈物を使用するＤＥＦＢ１０５Ａ／Ｂ  ｄｄＰＣＲ  ＭＳＩアッセイの二次元蛍光振幅散布図を示す図である。Ｇ〜Ｉ．ＨＣＴ−１１６細胞株ＤＮＡ（ＭＳＩ−Ｈ）、ＰＢＭＣ（ＷＴ）、又はＷＴ  ＤＮＡ中のＨＣＴ−１１６の１０％希釈物を使用するＡＣＶＲ２Ａ  ｄｄＰＣＲ  ＭＳＩアッセイの二次元蛍光振幅散布図を示す図である。ＷＴ対立遺伝子を含有するドロップレットは、ＦＡＭとＶＩＣ両方のシグナルについて陽性であり、ＭＳＩ対立遺伝子を含有するドロップレットは、ＶＩＣシグナルのみ陽性である。
【図１Ｉ】Ａ〜Ｃ．ＨＣＴ−１１６細胞株ＤＮＡ（ＭＳＩ−Ｈ）、ＰＢＭＣ（ＷＴ）、又はＷＴ  ＤＮＡ中のＨＣＴ−１１６の１０％希釈物を使用するＢＡＴ−２６  ｄｄＰＣＲ  ＭＳＩアッセイの二次元蛍光振幅散布図を示す図である。Ｄ〜Ｆ．ＨＣＴ−１１６細胞株ＤＮＡ（ＭＳＩ−Ｈ）、ＰＢＭＣ（ＷＴ）、又はＷＴ  ＤＮＡ中のＨＣＴ−１１６の１０％希釈物を使用するＤＥＦＢ１０５Ａ／Ｂ  ｄｄＰＣＲ  ＭＳＩアッセイの二次元蛍光振幅散布図を示す図である。Ｇ〜Ｉ．ＨＣＴ−１１６細胞株ＤＮＡ（ＭＳＩ−Ｈ）、ＰＢＭＣ（ＷＴ）、又はＷＴ  ＤＮＡ中のＨＣＴ−１１６の１０％希釈物を使用するＡＣＶＲ２Ａ  ｄｄＰＣＲ  ＭＳＩアッセイの二次元蛍光振幅散布図を示す図である。ＷＴ対立遺伝子を含有するドロップレットは、ＦＡＭとＶＩＣ両方のシグナルについて陽性であり、ＭＳＩ対立遺伝子を含有するドロップレットは、ＶＩＣシグナルのみ陽性である。
【図２Ａ】観察されたＭＡＦ対再構成した変異体段階希釈（１０％、５％、２．５％、１．２５％、０．６３％、０．３１％、０．１６％、０．０８％、０．０４％、０．０２％、０．０１％）において予想されるＭＡＦについてＢＡＴ−２６（Ａ）、ＤＥＦＢ１０５Ａ／Ｂ（Ｂ）及びＡＣＶＲ２Ａ（Ｃ）アッセイにより得られた相関曲線を示す図である。点線：ＬＯＢ、ＷＴ  ＤＮＡを含む少なくとも５３個の独立したｄｄＰＣＲ反応における偽陽性判定の上部９５％  ＣＩとして推定される。
【図２Ｂ】観察されたＭＡＦ対再構成した変異体段階希釈（１０％、５％、２．５％、１．２５％、０．６３％、０．３１％、０．１６％、０．０８％、０．０４％、０．０２％、０．０１％）において予想されるＭＡＦについてＢＡＴ−２６（Ａ）、ＤＥＦＢ１０５Ａ／Ｂ（Ｂ）及びＡＣＶＲ２Ａ（Ｃ）アッセイにより得られた相関曲線を示す図である。点線：ＬＯＢ、ＷＴ  ＤＮＡを含む少なくとも５３個の独立したｄｄＰＣＲ反応における偽陽性判定の上部９５％  ＣＩとして推定される。
【図２Ｃ】観察されたＭＡＦ対再構成した変異体段階希釈（１０％、５％、２．５％、１．２５％、０．６３％、０．３１％、０．１６％、０．０８％、０．０４％、０．０２％、０．０１％）において予想されるＭＡＦについてＢＡＴ−２６（Ａ）、ＤＥＦＢ１０５Ａ／Ｂ（Ｂ）及びＡＣＶＲ２Ａ（Ｃ）アッセイにより得られた相関曲線を示す図である。点線：ＬＯＢ、ＷＴ  ＤＮＡを含む少なくとも５３個の独立したｄｄＰＣＲ反応における偽陽性判定の上部９５％  ＣＩとして推定される。
【図３Ａ】ＢＡＴ−２６（Ａ）、ＡＣＶＲ２Ａ（Ｂ）又はＤＥＦＢ１０５Ａ／Ｂ（Ｃ）ｄｄＰＣＲアッセイによって推定されるｃｔＤＮＡの割合と、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ突然変異を特異的に標的するｄｄＰＣＲアッセイによって推定されるｃｔＤＮＡの割合との間の相関を示す図である。
【図３Ｂ】ＢＡＴ−２６（Ａ）、ＡＣＶＲ２Ａ（Ｂ）又はＤＥＦＢ１０５Ａ／Ｂ（Ｃ）ｄｄＰＣＲアッセイによって推定されるｃｔＤＮＡの割合と、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ突然変異を特異的に標的するｄｄＰＣＲアッセイによって推定されるｃｔＤＮＡの割合との間の相関を示す図である。
【図３Ｃ】ＢＡＴ−２６（Ａ）、ＡＣＶＲ２Ａ（Ｂ）又はＤＥＦＢ１０５Ａ／Ｂ（Ｃ）ｄｄＰＣＲアッセイによって推定されるｃｔＤＮＡの割合と、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ突然変異を特異的に標的するｄｄＰＣＲアッセイによって推定されるｃｔＤＮＡの割合との間の相関を示す図である。
【図４】ＷＴ  ＤＮＡ中のＨＣＴ−１１６細胞株の１０％希釈物を使用してＢＡＴ−２６、ＡＣＶＲ２Ａ及びＤＥＦＢ１０５Ａ／Ｂマイクロサテライトマーカーを同時に標的する３重アッセイで得られた蛍光シグナルを例示する二次元蛍光振幅散布図を示す図である。結果は、アニーリング温度及び伸長時間６３℃、３分間で得た。プライマー及びプローブ濃度は：ＢＡＴ−２６：０．２×；ＡＣＶＲ２Ａ：０．６×；ＤＥＦＢ１０５Ａ／Ｂ：１×であった。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
〔詳細な説明〕
Ａ−定義
以下の定義は、本発明を記述並びに定義するのに使用される以下の用語の範囲及び詳細の明瞭且つ一貫した理解の提供を補助するものとする：
本明細書では、この説明及び請求項において使用される動詞「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」並びにその活用型は、単語に続く項目を含むが、具体的に記載されていない項目を除外するものではないことを意味するために非限定的な意義で使用される。加えて、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」による要素の参照は、文脈が、要素が１つである又は１つしかないことを明らかに必要としない限り、複数の要素が存在する可能性を除外しない。したがって、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は、通常「少なくとも１つ」を意味する。
【００２５】
本明細書では、「腫瘍」又は「新生物」（両方の用語は、互換的に使用され得る）は、細胞の異常な新たな成長である。新生物中の細胞は、正常細胞より急速に通常成長し、処置されなければ成長し続けることになる。新生物が成長するにつれて、新生物は、隣接する構造に影響を与え、損傷させる可能性がある。用語新生物は、良性の（通常治療可能）又は悪性の（がん性）成長のことを指し得る。
【００２６】
良性腫瘍又は新生物は、通常限局され、身体の他の部分に拡散しない。大部分の良性腫瘍は、処置によく応答する。しかしながら、無処置のままにすると、一部の良性腫瘍は大きく成長し、そのサイズのため深刻な疾患に至る場合がある。良性腫瘍は、悪性腫瘍に類似している場合もあり、そのため時には処置される。悪性腫瘍は、がん性成長である。悪性腫瘍は、処置にしばしば抵抗性であり、身体の他の部分に拡散することがあり（即ち転移）、除去後に時には再発する。
【００２７】
用語「がん」は、悪性腫瘍に関して本明細書において使用される。
【００２８】
本明細書では「対立遺伝子」とは、特定の染色体位置（座）にある遺伝子又はＤＮＡ配列のいくつかの代替形態のうちの１つのことを指す。各常染色体座において、個体は２つの対立遺伝子を保有し、１つは父親から１つは母親から受け継がれる。
【００２９】
本明細書では「ＤＮＡ多型」とは、集団内の所与の座に対する２つ以上の対立遺伝子の存在のことを指す。本明細書では「座」又は「遺伝子座」とは、個別の遺伝子又はＤＮＡ配列の場所を定義する、染色体の固有の位置のことを指す。本明細書では「座特異的プライマー」とは、その座の少なくとも１つの対立遺伝子に関して、記載される座又はその相補鎖の部分と特異的にハイブリダイズし、増幅方法に使用される条件下で他のＤＮＡ配列と効率的にハイブリダイズしないプライマーのことを指す。
【００３０】
「マイクロサテライト配列座」又は「マイクロサテライト配列」は、互換的に使用され、長さ１（１）〜７（７）、通常１（１）〜５（５）、特に１（１）〜４（４）塩基対の短い反復配列要素を含有するゲノムＤＮＡの領域のことを指す。マイクロサテライト座内で少なくとも１回反復される各配列は、本明細書において「反復単位」と称される。各マイクロサテライト座は、少なくとも７つの反復単位、特に少なくとも１０個の反復単位、好ましくは少なくとも２０個の反復単位を通常含む。
【００３１】
本明細書では「マイクロサテライト不安定性」（以下、「ＭＳＩ」）とは、所与の対象の特定の組織、細胞又は体液から得られるゲノムＤＮＡの対立遺伝子がマイクロサテライト座で変異される遺伝的不安定性の形態のことを指す。
【００３２】
マイクロサテライト座における突然変異は、マイクロサテライト座に少なくとも１つの反復単位の欠失（複数可）、追加（複数可）又は置換（複数可）を一般に通常は含む。一般に、ＭＳＩは、追加（複数可）又は最も頻繁には欠失（複数可）により、マイクロサテライト座で長さの変化をもたらす。
【００３３】
本明細書では、「プライマー／プローブセット」とは、特定の標的ヌクレオチド配列にそれぞれハイブリダイズする一対のオリゴヌクレオチドプライマー及び２つのオリゴヌクレオチドプローブの群のことを指す。前記オリゴヌクレオチドセットは、（ａ）核酸配列の第１の位置にハイブリダイズするフォワード識別プライマー；（ｂ）第１の位置の下流の核酸配列の第２の位置にハイブリダイズするリバース識別プライマー及び（ｃ）プライマー間の標的配列にハイブリダイズする２つのプローブからなる。言い換えれば、プライマー／プローブセットは、核酸配列（マイクロサテライト配列座を通常含む）の反対鎖にアニールして、ＰＣＲ反応の間に核酸配列に特異的なアンプリコンを形成する一対の特異的オリゴ、及びアンプリコンの特定の標的配列にハイブリダイズする（即ち、相補的）、好ましくは蛍光性の２つのプローブからなる。
【００３４】
「アンプリコン」とは、天然又は人工の増幅事象若しくは技術の産物として形成される核酸断片のことを指す。一般に、アンプリコンは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって産生される。本明細書では「増幅する」とは、複数のコピーが、ゲノムＤＮＡなどの核酸の特定の１つの座（即ち上述の標的配列）で作られる工程のことを指す。増幅は、ＰＣＲを使用して完成される（Ｓａｉｋｉら、１９８５年  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１３５０〜１３５４頁）。
【００３５】
本明細書で互換的に使用される「標的（ＤＮＡ）断片」又は「標的（ＤＮＡ）領域」は、プライマー／プローブセットの一対のプライマーによって増幅されるＤＮＡサンプルの断片に関する。本発明によれば、そのような標的断片は、ＭＳ座を含む。互換的に使用される「標的配列」又は「標的ＤＮＡ配列」とは、第１又は第２のオリゴヌクレオチドプローブに相補的なＤＮＡ配列のことを指す。
【００３６】
本明細書では、「デジタルＰＣＲ」とは、リアルタイムＰＣＲにおいて使用されるような標準曲線を使用せずに核酸を定量化する能力を提供する終点測定を可能にするアッセイのことを指す（Ｓｙｋｅｓら、１９９２年  「Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｆｏｒ  ＰＣＲ  ｂｙ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｌｉｍｉｔｉｎｇ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ」、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３、４４４〜４４９頁、Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ及びＫｉｎｚｌｅｒ  １９９９年  「Ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲ」、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９６：９２３６〜９２４１頁、並びにＰｏｈｌ及びＳｈｉｈｌｅ  ２００４年  「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲ」、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｄｉａｇｎ、４：４１〜４７頁を参照のこと、さらにＭｏｎｙａ  Ｂａｋｅｒ  ２０１２年  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ９、５４１〜５４４頁を参照のこと）。
【００３７】
典型的なデジタルＰＣＲ実験において、ＰＣＲ溶液は、古典的なＴａｑＭａｎプローブアッセイと同様に作られ、その溶液は、ＤＮＡサンプル、蛍光消光プローブ（即ち、加水分解プローブ）、プライマー及びＰＣＲマスター混合物を通常含み、その混合物は、最適な濃度でＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、ＭｇＣｌ２及び反応緩衝液を一般に含有する。ＰＣＲ溶液は、一部は標的ＤＮＡを含有せず、他は標的ＤＮＡコピーを１つ以上、最も好ましくは標的ＤＮＡコピーを１つ含有するように別個の（即ち個別の）区分又は区画に次いで無作為に分配される。したがって、この条件において、所与の区分又は区画内のＤＮＡサンプルにおいて標的ＤＮＡの存在に関連する参照シグナルは、０又は１に理論的になるべきである。明らかに、区分又は区画の集団に対する生物学的変動のため、雲は、理論値０又は１それぞれ対応して観察される。
【００３８】
区分は、ＰＣＲの終末平坦相（又は終点）まで個別に増幅され、蛍光を読み取って陽性区分の割合を決定する。区分が同一容積であれば、存在する標的ＤＮＡ分子の数は、以下の式：
λ＝−ｌｎ（１−ｐ）  （１）
によるポアソン統計を使用して陽性終点反応の割合から算出され得、式中、λは、複製反応当たりの標的ＤＮＡ分子の平均数であり、ｐは、陽性終点反応の割合である。λから、各複製ＰＣＲの容積及び分析された複製の総数と一緒に、標的ＤＮＡの絶対濃度の推定値が算出される。
【００３９】
核酸結合表面を持つマイクロウェルプレート、キャピラリー、油エマルジョン及び小型化チャンバーのアレイを使用して、固有の区画又はドロップレットにサンプルを区分化することができる。したがって、本明細書ではデジタルＰＣＲは、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）、ＢＥＡＭｉｎｇ（ビーズ、エマルジョン、増幅及び磁性物質）及び微小流体チップを含めた様々な形式を含む。
【００４０】
「ドロップレットデジタルＰＣＲ」（ｄｄＰＣＲ）とは、ＰＣＲ増幅を支持する別個の、容量分析的に規定された、油中水型ドロップレット区分に封入された核酸分子を計数することによって絶対量を測定するデジタルＰＣＲアッセイのことを指す（Ｈｉｎｓｏｎら、２０１１年、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．８３：８６０４〜８６１０頁；Ｐｉｎｈｅｉｒｏら、２０１２年、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．８４：１００３〜１０１１頁）。単一のｄｄＰＣＲ反応は、ウェル当たり少なくとも２００００個の区分化されたドロップレットから構成され得る。
【００４１】
「ドロップレット」とは、ドロップレットデジタルＰＣＲアッセイにおけるＰＣＲ溶液の個別の区分のことを指す。本出願の以下において、デジタルＰＣＲは、ドロップレットデジタル（又はデジタルドロップレットＰＣＲ、互換的に使用される）に関して記述されることになるが、上で述べたように、デジタルＰＣＲの原理によるＰＣＲ溶液の個別の区分は、様々な技術によって得ることができる。したがって、ドロップレットデジタルＰＣＲに関して以下に記述される本発明の方法は、このデジタルＰＣＲ技術に限定されることなく、類似の様式で他のデジタルＰＣＲ技術に適用されてもよい。
【００４２】
デジタルＰＣＲに利用可能な技術には、微小流体チップ上でのＰＣＲ増幅がある（Ｗａｒｒｅｎら、２００６年  「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｉｎ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ｂｙ  ｄｉｇｉｔａｌ  ＲＴ−ＰＣＲ」、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０３、１７８０７〜１７８１２頁；Ｏｔｔｅｓｅｎら、２００６年  「Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲ  ｅｎａｂｌｅｓ  ｍｕｌｔｉｇｅｎｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｂａｃｔｅｒｉａ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１４、１４６４〜１４６７頁；Ｆａｎ及びＱｕａｋｅ、２００７年「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙ  ｗｉｔｈ  ｄｉｇｉｔａｌ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ」、Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ７９、７５７６〜７５７９頁）。他の系は、マイクロアレイ（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、２００６年  「Ｎａｎｏｌｉｔｅｒ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３４、ｅ１２３頁）又はスピニング微小流体ディスク（Ｓｕｎｄｂｅｒｇら、２０１０年  「Ｓｐｉｎｎｉｎｇ  ｄｉｓｋ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｄｉｇｉｔａｌ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ」Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ８２、１５４６〜１５５０頁）上への分離、及び油−水エマルジョンに基づくドロップレット技術（Ｈｉｎｄｓｏｎ、Ｂｅｎｊａｍｉｎら、２０１１年  「Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ａｂｓｏｌｕｔｅ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ｃｏｐｙ  Ｎｕｍｂｅｒ」  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ８３（２２）：８６０４〜８６１０頁）を含む。一般に、デジタルＰＣＲは、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）、ＢＥＡＭｉｎｇ（ビーズ、エマルジョン、増幅及び磁性物質）及び微小流体チップから選択される。デジタルＰＣＲは、ドロップレットデジタルＰＣＲであることが好ましい。
【００４３】
ドロップレットは、リアルタイムＰＣＲ適用に広く使用されているそれと類似の均質なアッセイ化学及びワークフローを使用する鋳型分子（複数可）のＰＣＲ増幅を支持する（Ｈｉｎｓｏｎら、２０１１年、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．８３：８６０４〜８６１０頁；Ｐｉｎｈｅｉｒｏら、２０１２年、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．８４：１００３〜１０１１頁）。ドロップレットが一旦生成されたら、そのドロップレットは、ＰＣＲプレートに移され得、乳化ＰＣＲ反応は、例えばｄｄＰＣＲに関するＢｉｏｒａｄのガイドラインに記述されるなどの古典的なプログラムの下で、熱サイクラーで行われ得る（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏ−ｒａｄ．ｃｏｍ／ｗｅｂｒｏｏｔ／ｗｅｂ／ｐｄｆ／ｌｓｒ／ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ／Ｂｕｌｌｅｔｉｎ＿６４０７．ｐｄｆ）。
【００４４】
ドロップレットデジタルＰＣＲは、ＰＣＲ増幅を支持する別個の、容量分析的に規定された、油中水型ドロップレット区分に封入された核酸分子を計数することによって絶対量を測定するデジタルＰＣＲアッセイを実行する任意のプラットフォームを使用して実行されてもよい。ドロップレットデジタルＰＣＲの戦略は、以下の通り要約され得る：ＤＮＡサンプルを含有するＰＣＲ溶液が、希釈され、数千〜数百万個の別々の反応チャンバー（油中水型ドロップレット）に区分化され、したがって各反応チェンバーは、対象の核酸分子を１コピー含有する又は含有しない。
【００４５】
標的アンプリコン（即ち標的ＤＮＡ断片）を含有する検出された「陽性」ドロップレット（即ち本発明によるＲＥＦ陽性ドロップレット）の数、対標的アンプリコンを含有しない「陰性」ドロップレット（即ちＲＥＦ陰性ドロップレット）の数を使用して、元のサンプル中に存在した対象となる核酸分子のコピー数を決定してもよい。
【００４６】
ドロップレットデジタルＰＣＲ系の例には、２００００個のナノリットルサイズのドロップレットへ核酸鋳型を含有するサンプルを区分化するＢｉｏ−ＲａｄによるＱＸ１００（商標）ドロップレットデジタルＰＣＲシステム；及び１００００００〜１０００００００個のピコリットルサイズのドロップレットへ核酸鋳型を含有するサンプルを区分化するＲａｉｎＤａｎｃｅによるレインドロップ（ＲａｉｎＤｒｏｐ）（商標）デジタルＰＣＲシステムがある。
【００４７】
ｄＰＣＲ、より具体的にはｄｄＰＣＲ技術の利点には、以下がある：
絶対定量、これは、ｄｄＰＣＲ技術は、標準曲線を行う必要なしに投入サンプル当たりの標的ＤＮＡコピーの絶対計数を提供することによる。
【００４８】
他に類のない精度、これは、ｄｄＰＣＲによって得られる大規模なサンプル区分化が、サンプル間の標的ＤＮＡ配列コピー数における小さい倍数の差異を、信頼性をもって測定することを可能にすることによる。
【００４９】
信号対雑音比の増大：高コピーの鋳型及びバックグラウンドが希釈され、標的陽性区分中の鋳型濃度が効果的に富化され、それにより希薄な標的の鋭敏な検出が可能になる。
【００５０】
ＰＣＲ偏向の除去、これは、ｑＰＣＲの増幅効率依存を除去することにより誤差率が減少されるので、小さい差異（１．２倍）の検出が可能になることによる。
【００５１】
単純化された定量化、これは、絶対定量のための較正標準も参照も必要としないことによる。
【００５２】
消耗品費用の削減、これは、反応容積がピコ〜ナノリットル範囲なので、各データポイントに必要とされる試薬使用及びサンプル量を減少させることによる。
【００５３】
より低い装置費用、これは、エマルジョンに基づく反応系は、ＰＣＲ反応が、複雑なチップ又はマイクロ流体工学を用いずに標準的な熱サイクラーで実行され得ることを意味することによる。
【００５４】
優れた区分化、これは、ｄｄＰＣＲ技術は、サンプル２０μＬ当たり２００００個のドロップレット、９６ウェルプレートにおいてほぼ２００００００個の区分化されたＰＣＲ反応を生じ、一方でチップに基づくデジタルＰＣＲ系は、数百又は数千区分しか産生しないことによる。より多数の区分も、より高い精度を生ずる。
【００５５】
用語「融解温度」又は「Ｔｍ」とは、ポリヌクレオチドがその相補配列から解離する温度のことを指す。一般に、Ｔｍは、二重鎖核酸分子中のワトソン−クリック型塩基対の１／２が壊れる又は解離し（即ち、「溶解する」）、一方でワトソン−クリック型塩基対の他の半分が二本鎖形態で完全なまま残る温度と定義され得る。言い換えれば、Ｔｍは、２本の相補配列のうち５０％のヌクレオチドがアニールしており（二本鎖）５０％のヌクレオチドが変性している（一本鎖）温度と定義される。Ｔｍは、例えばＷｅｔｍｕｒ  １９９１年による最近接計算（Ｗｅｔｍｕｒ、１９９１年「ＤＮＡ  ｐｒｏｂｅｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」、Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２６：２２７〜２５９頁、参照により本明細書に組み込む）又はオリゴ（Ｏｌｉｇｏ）（商標）Ｐｒｉｍｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎを含めた市販のプログラム及びインターネット上で利用可能なプログラムによるなどいくつかの方法によって推定され得る。別法として、Ｔｍは、実際の実験によって決定することができる。例えば、臭化エチジウム又はＳＹＢＲグリーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）などの二本鎖ＤＮＡ結合若しくはインターカレート色素を融解曲線アッセイに使用して、核酸の実際のＴｍを決定することができる。
【００５６】
本明細書では、用語「臨界変性温度」又は「Ｔｃ」とは、野生型配列のＴｍより低い温度のことを指し、その温度において野生型配列と変異体配列との二重鎖が、溶解することになる。（一部の例において、この温度は、変異体配列のホモ二重鎖も溶解する温度でもよい）。
【００５７】
臨界変性温度（Ｔｃ）とは、所与の核酸配列に対するＰＣＲ効率が、その温度以下で急に低下する温度である。
【００５８】
Ｂ−ＤＮＡサンプルのマイクロサテライト配列座にある突然変異を同定する方法
本発明は、
前記ＭＳ座を含むＤＮＡサンプルの標的断片を増幅するのに適切な一対のプライマー；
第１のフルオロフォアで標識した、第１のＭＳオリゴヌクレオチドプローブであって、マイクロサテライト配列を含む第１の野生型標的配列に相補的である第１のＭＳオリゴヌクレオチドプローブ；
第２のフルオロフォアで標識した、第２のオリゴヌクレオチド参照（ＲＥＦ）プローブであって、前記マイクロサテライト配列を含まない、前記増幅されたＤＮＡ断片の第２の野生型標的配列に相補的である第２のオリゴヌクレオチドＲＥＦプローブ
の存在下で前記ＤＮＡサンプルをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供するステップを含む、ＤＮＡサンプル由来標的断片の標的マイクロサテライト配列（ＭＳ）座にある突然変異を検出するステップの方法に関する。
【００５９】
ＤＮＡサンプル由来ＤＮＡ、特に標的ＤＮＡ（又は標的ＤＮＡ断片）は、ゲノムＤＮＡ又はＲＮＡ逆転写から得られるＤＮＡであり得る。ゲノムＤＮＡは、構成的ＤＮＡ、腫瘍に由来するＤＮＡ（即ち腫瘍ゲノムＤＮＡ）、特に悪性腫瘍でもよい。通常はまた、標的ＤＮＡ断片は、循環ＤＮＡなどのセルフリーＤＮＡである。特に、標的ＤＮＡ断片は、セルフリー腫瘍ＤＮＡ、特に循環腫瘍ＤＮＡ又はセルフリー胎児ＤＮＡ（即ち、母体血流中を循環している胎児ＤＮＡ）であり得る。
【００６０】
本方法は、先に定義したプライマー／プローブセットを使用する。
【００６１】
プライマー対は、反応のＴｃより低いＴｍを有するように設計されることが一般に好ましい。プライマーの対は、利用可能なコンピュータプログラムを使用して設計され得る。一般に、本発明によるプローブは、加水分解プローブ（ＴａｑＭａｎプローブとも命名される）である。加水分解プローブは、オリゴヌクレオチドプローブの５’末端に共有結合しているフルオロフォア及び消光剤を有する。
【００６２】
オリゴヌクレオチドプローブは、例えば、ＦＡＭ（５−又は６−カルボキシフルオレセイン）、ＶＩＣ、ＮＥＤ、フルオレセイン、ＦＩＴＣ、ＩＲＤ−７００／８００、ＣＹ３、ＣＹ５、ＣＹ３．５、ＣＹ５．５、ＨＥＸ、ＴＥＴ（５−テトラクロロフルオレセイン）、ＴＡＭＲＡ、ＪＯＥ、ＲＯＸ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ、オレゴングリーン、ローダミングリーン、ローダミンレッド、テキサスレッド、ヤキマイエロー、アレクサフルオールＰＥＴ、バイオサーチブルー（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｂｌｕｅ）（商標）、マリーナブルー（Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ）（登録商標）、ボセルブルー（Ｂｏｔｈｅｌｌ  Ｂｌｕｅ）（登録商標）、アレクサフルオール（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ）（登録商標）、３５０ＦＡＭ（商標）、ＳＹＢＲ（登録商標）グリーン１、フルオレセイン、エバグリーン（ＥｖａＧｒｅｅｎ）（商標）、アレクサフルオール（登録商標）４８８ＪＯＥ（商標）、２５ＶＩＣ（商標）、ＨＥＸ（商標）、ＴＥＴ（商標）、ＣＡＬフルオール（Ｆｌｕｏｒ）（登録商標）ゴールド５４０、ヤキマイエロー（Ｙａｋｉｍａ  Ｙｅｌｌｏｗ）（登録商標）、ＲＯＸ（商標）、ＣＡＬフルオール（登録商標）レッド６１０、Ｃｙ３．５（商標）、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）（登録商標）、アレクサフルオール（登録商標）５６８  Ｃｒｙ５（商標）、クエーサー（Ｑｕａｓａｒ）（商標）６７０、ライトサイクラーレッド６４０（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  Ｒｅｄ６４０）（登録商標）、アレクサフルオール６３３クエーサー（商標）７０５、ライトサイクラーレッド７０５（登録商標）、アレクサフルオール（登録商標）６８０、ＳＹＴ０（登録商標）９、ＬＣグリーン（ＬＣ  Ｇｒｅｅｎ）（登録商標）、ＬＣグリーン（登録商標）Ｐｌｕｓ＋、及びエバグリーン（商標）からなる群から選択され得る蛍光標識で検出可能に標識される。検出可能な標識は、６−カルボキシフルオレセイン、ＦＡＭ若しくはテトラクロロフルオレセイン（頭字語：ＴＥＴ）、テキサスレッド、シアニン５、シアニン３又はＶＩＣ（商標）から選択されることが好ましい。
【００６３】
消光剤は、内部消光剤又はプローブの３’末端に位置する消光剤でもよい。典型的な消光剤は、テトラメチルローダミン、ＴＡＭＲＡ、ブラックホールクエンチャー又は非蛍光消光剤である。本発明により使用可能な加水分解プローブは、本分野において周知である（特にｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｎｉｃａｌ−ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ｂｉｏｌｏｇｙ／ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ−ｐｃｒ−ａｎｄ−ｄｉｇｉｔａｌ−ｐｃｒ−ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ−ｍｅｈｏｄｓ．ｈｔｍｌを参照のこと）。消光分子は、通常ＦＲＥＴ（Ｆｏｒｓｔｅｒ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ）により、サイクラーの光源によって励起されたときにフルオロフォアによって放射される蛍光を消光させる。フルオロフォアと消光剤が近傍にある間、消光は、あらゆる蛍光シグナルを阻害する。そのようなプローブは、特定のセットのプライマーによって増幅される標的領域内にアニールするように設計される。Ｔａｑポリメラーゼは、プライマーを伸長し、新生鎖を合成するので、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼに内在する５’−３’エキソヌクレアーゼ活性は、３’消光剤と５’レポータを次いで切り離し、これにより、アンプリコン収量に比例して蛍光シグナルが生成される。
【００６４】
本発明による第１及び第２のプローブは、同じアンプリコン内に位置する。プローブは、ＰＣＲ人工産物を好ましくは最小限にし、以下で定義する配列と特異的にハイブリダイズするように当技術分野において確立されている業務により設計される。第１及び第２のプローブは固有のフルオロフォアで標識されて、それぞれのシグナルを別々に検出することが可能になる。
【００６５】
一部の実施形態において、本発明による加水分解プローブは、その３’末端に副溝結合剤（ＭＧＢ）部分を含む。そのようなＭＧＢは、プローブの融解温度（Ｔｍ）を一般に増大させ、プローブ−標的ハイブリッドを安定化する。
【００６６】
オリゴヌクレオチドプローブは、約１０〜約５０ヌクレオチド配列長を有する。オリゴヌクレオチドプローブ（特にＭＳプローブ）は、約１５〜４０、又は２５〜５０、特に１５〜３５ヌクレオチド配列長を有することが好ましい。オリゴヌクレオチドプローブ（特にＭＳプローブ）は、約２０〜４０、又は３０〜５０、特に３０〜４０ヌクレオチド配列長を有することが好ましい。
【００６７】
本発明による第１のプローブ（ＭＳプローブとも命名される）は、増幅された標的ＤＮＡ断片の第１の野生型標的配列とハイブリダイズし、その標的配列はマイクロサテライト配列座を含む。プローブは、適切に結合する能力とマイクロサテライト不安定性の場合に得られる不安定化の両方を付与するために、野生型マイクロサテライト全配列を網羅し、各先端に更に数ヌクレオチド（一般に１〜１０、特に２〜８、好ましくは２〜６、最も好ましくは２〜５又は２〜４ヌクレオチド）を伸長することが好ましい。言い換えれば、プローブサイズは、野生型マイクロサテライト配列に適切に結合する能力を付与するが、マイクロサテライト配列中に突然変異が存在する際にＭＳプローブのハイブリダイゼーションを防止するように設計される。
【００６８】
本発明の第２のプローブ（ＲＥＦプローブとも命名される）は、前記増幅されたＤＮＡ断片の第２の野生型標的配列とハイブリダイズし、その標的配列は前記マイクロサテライト配列を含まない。特に、前記第２のプローブは、部分的に前記マイクロサテライト配列と重なってもよく、又は前記マイクロサテライト配列の外側に位置してもよい。本発明による第２のプローブは、前記マイクロサテライト配列の外側に位置することが好ましい。
【００６９】
様々なマイクロサテライト配列座が、本発明による第１の野生型標的配列中に標的され得る。本発明により標的され得るマイクロサテライト配列座又はマーカーは、Ｂａｃｈｅｒら、２００４年  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｍａｒｋｅｒｓ  ２０、２３７〜２５０頁、及びＨａｕｓｅら、２０１６年  Ｎａｔ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １１月２２日（１１）：１３４２〜１３５０頁に特に記述されている。標的されるマイクロサテライト配列座（又はマイクロサテライトマーカー）は、結腸、子宮内膜、直腸及び胃腺癌におけるマイクロサテライトの不安定性の頻度に基づいて、ＭＳＩ陽性腫瘍と高く関連することが判明したマイクロサテライトから選択されることが好ましい。標的されるマイクロサテライト配列座は、腫瘍において頻繁に増幅される領域内に位置することが好ましい。
【００７０】
例えば、標的したマイクロサテライト配列座は、ＢＡＴ−２５、ＢＡＴ−２６、ＢＡＴ−３４ｃ４、ＢＡＴ−４０、ＮＲ２１、ＮＲ２４、ＭＯＮＯ−２７、Ｄ２Ｓ１２３、Ｄ５Ｓ３４６、Ｄ１７Ｓ２５０、ＡＣＶＲ２Ａ、ＤＥＦＢ１０５Ａ、ＤＥＦＢ１０５Ｂ、ＲＮＦ４３、ＤＯＣＫ３、ＧＴＦ２ＩＰ１、ＬＯＣ１０００９３６３１、ＰＩＰ５Ｋ１Ａ、ＭＳＨ３、ＴＲＩＭ４３Ｂ、ＰＰＦＩＡ１及びＴＤＲＤ１から選択され得る。
【００７１】
一実施形態において、標的マイクロサテライト配列座は、ＢＡＴ−２５、ＢＡＴ−２６、Ｄ２Ｓ１２３、Ｄ５Ｓ３４６及びＤ１７Ｓ２５０を含むＢｅｔｈｅｓｄａパネルの中から選択されてもよい。
【００７２】
モノヌクレオチド反復座は、機能障害性ＤＮＡミスマッチ修復系を含む腫瘍において変質の影響を非常に受けやすいことが示されており（Ｐａｒｓｏｎｓ、１９９５年上記）、モノヌクレオチドＭＳＩマーカーが好ましくなり得るように、がん及び機能障害性ＤＮＡミスマッチ修復系に関連する他の疾患の検出に特に有用なそのような座を作製した。
【００７３】
本発明の一実施形態において、標的したマイクロサテライト配列座は、ＢＡＴ−２６及び／又はＡＣＶＲ２Ａ及び／又はＤＥＦＢ１０５Ａ及びＤＥＦＢ１０５Ｂである。
【００７４】
より一般には、本発明により標的され得る適当なマイクロサテライト配列座は、Ｄ２Ｓ１２３、Ｄ５Ｓ３４６、Ｄ１７Ｓ２５０、ＡＣＶＲ２Ａ、ＤＥＦＢ１０５Ａ、ＤＥＦＢ１０５Ｂ、ＲＮＦ４３、ＤＯＣＫ３、ＧＴＦ２ＩＰ１、ＬＯＣ１０００９３６３１、ＰＩＰ５Ｋ１Ａ、ＭＳＨ３、ＴＲＩＭ４３Ｂ、ＰＰＦＩＡ１及びＴＤＲＤ１からなる群に例示される標的マイクロサテライト配列座など、短いマイクロサテライト配列（一般に８〜３０、特に８〜２５、好ましくは、８〜２０、最も好ましくは８〜１５又は８〜１２ヌクレオチドを含む）である。
【００７５】
マイクロサテライト座に応じて、様々なサイズ及びＧ／Ｃ含有量のプローブも、使用され得る。例えば、３０ヌクレオチドより長く及び／又はＧ／Ｃ含有量３０％未満のプローブが使用されてもよい。これは、特にＢＡＴ−２６を含む場合である。例として、ＢＡＴ−２６マイクロサテライト配列を含む配列とハイブリダイズする配列番号４のＭＳプローブが、使用され得る。配列番号１〜２のプライマー並びにそれぞれ配列番号３及び４のＲＥＦプローブ及びＭＳプローブは、本発明により使用され得るプライマー／プローブの例示的なセットを表す。
【００７６】
本発明によると、標的ＤＮＡ断片の増幅は、デジタルＰＣＲ技術により生じる。一般に、そのような技術において、ＰＣＲ溶液は複数の区画又はドロップレットに分けられ、それらはＰＣＲを個別に行うために作製される。一般にまた、区画又はドロップレットの殆どは、増幅されるべき標的ＤＮＡ断片を０又は１コピー含有する。
【００７７】
マイクロサテライト配列など低複雑度配列の増幅に関連する技術的障害を回避するために、一連の修飾を、上述したｄｄＰＣＲに関するＢｉｏｒａｄのガイドラインに加えて、ＷＴ対立遺伝子に対するＭＳプローブの適当なハイブリダイゼーションが達成されてもよい。反応アニーリング温度及び／又は伸長時間は、増大されてもよい。Ｂｉｏｒａｄのガイドラインによる典型的なアニーリング温度は、５５℃である。前記アニーリング温度は、３〜１５℃有利には増大されてもよい。
【００７８】
熱サイクリングは、終点まで実行される。したがって複数のＰＣＲ増幅サイクル後（即ちＰＣＲサイクルを完了した後）に、生ＰＣＲデータが、各ドロップレットに対してＲＥＦ及びＭＳプローブに関連する蛍光シグナルを測定することによって次いで収集される。ＷＴ標的断片を含有するドロップレットは、ＲＥＦとＭＳプローブ両方のハイブリダイゼーションに由来する二重陽性蛍光シグナルを示す（ＲＥＦ＋／ＭＳ＋ドロップレット）。変異マイクロサテライト対立遺伝子を含有するドロップレットにおけるＭＳプローブがハイブリダイズしないと（又はハイブリダイゼーションが非効率だと）、単一のＲＥＦ陽性（ＲＥＦ＋）集団に向かう２次元グラフ上のドロップレット雲のシフトを招き、これは、変異体マイクロサテライト対立遺伝子を含有するドロップレットの割合に比例する。
【００７９】
一般に、生ｄＰＣＲ（又はｄｄＰＣＲ）データは、各ドロップレットに対してＲＥＦ及びＭＳプローブに関連する蛍光シグナルを読み取る又は測定することによってＰＣＲサイクリング後に収集される。
【００８０】
ＰＣＲデータ収集ステップは、光学的検出器（例えばＢｉｏ−Ｒａｄ  ＱＸ−１００ドロップレットリーダーが、ｄｄＰＣＲに使用され得る）において一般に実行される。少なくとも２色検出系が使用されることが好ましい（例えばＦＡＭ及びＨＥＸ又はＶＩＣ蛍光標識のいずれかを検出する）。ドロップレット雲は、ドロップレット当たりの各プローブに対する蛍光レベルを描くことによって２次元グラフ上で一般に確立され得る。一部の実施形態において、分析は、適切なソフトウェア（ｄｄＰＣＲ用のＱｕａｎｔａＳｏｆｔ  ｖ１．７．４ソフトウェア又はＲ［ｈｔｔｐｓ：／／ｃｒａｎ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／ｗｅｂ／ｐａｃｋａｇｅｓ／ｄｄｐｃｒ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ］上のｄｄＰＣＲパッケージなど）で達成されてもよい。Ｑｕａｎｔａｓｏｆｔは、単一のＲＥＦ陽性又は二重ＲＥＦ／ＭＳ陽性集団（即ち又は雲）に対してドロップレットを手動で割当てることができる。Ｒパッケージは、手動の割当てによって導入されるおそれがある偏向を回避するために自動で閾値を定義する。
【００８１】
参照プローブ（ＲＥＦプローブ）について陽性であるドロップレットの数を使用して、サンプル中の標的ＤＮＡ断片の総数を定量化することができる。次いで、陽性ドロップレットの割合をポアソン分布に当てはめて、投入反応混合物中の標的ＤＮＡ断片の絶対的初期コピー数をコピー／μＬ単位で決定することができる。
【００８２】
野生型標的ＤＮＡを含有するドロップレット（標的したＭＳ配列中に突然変異がない）において、最大蛍光シグナルが、ＲＥＦとＭＳ両方のプローブに観察される。反対に、増幅された標的ＤＮＡ断片中に変異配列（即ちマイクロサテライト配列中の突然変異）を含有するドロップレットにおいて、蛍光強度のシフトが、ＭＳプローブに関連するシグナルに観察される。
【００８３】
デジタルＰＣＲ反応は、殆どのドロップレットが、（特に、反応にロードされるＤＮＡの量に応じて）標的したＤＮＡ断片を０又は１コピー含有することを確実にするように設計されることが最も好ましい。この条件において、ＷＴ（ＲＥＦ＋／ＭＳ＋シグナル）対変異マイクロサテライト（又はＭＳＩ）（単一のＲＥＦ＋シグナル）雲の最適な分離が観察され得る。生物学的変動性のため、単一のＲＥＦ＋シグナルに分類されたドロップレットが残存する（即ち、有意でない）ＭＳシグナルを含む可能性がある点に注意しなければならない。ＭＳシグナルが、「残存するＭＳシグナル」と考えられる閾値は、古典的なシグナル分析技術により当業者によって決定され得る。前記閾値は、上で述べたようにＲパッケージを使用して一般に設定され得る。
【００８４】
一般に、変異対立遺伝子頻度は、ＷＴ及び変異マイクロサテライトドロップレット雲を手動で割当てることによるドロップレット計数から決定され得る。上述の通り、ＲＥＦプローブの単一のシグナルがあるドロップレット集団の同定は、ＤＮＡサンプル中の変異マイクロサテライト配列の存在を示す。
【００８５】
上述の通り決定され得る変異対立遺伝子頻度は、対照ＤＮＡサンプルから得られる対照変異対立遺伝子頻度と比較され得る。対照ＤＮＡサンプルは、野生型サンプル又は疾患の時間的経過の間及び／若しくは処置の時間的経過の間より前の時点でＭＳＩ陽性腫瘍若しくはＤＮＡミスマッチ修復における突然変異に関連する疾患と診断された対象において採集したサンプル若しくは細胞株でもよい。
【００８６】
本明細書では、用語「サンプル」とは、ＤＮＡ、特に増幅されるべきＤＮＡ断片を含有し得るどんなものも指す。一部の実施形態において、「サンプル」は、ＲＮＡを含有し、したがって逆転写ステップにかけられる。サンプルは、生体液又は生物組織などの生体サンプルでもよい。生体液の例には、尿、血液、血漿、血清、唾液、精液、便、痰、脳脊髄液、涙、粘液、膵液、胃液、羊水、心膜液、胸腔内液又は腹水などの漿液がある。
【００８７】
生物組織は、結合、上皮、筋肉及び神経組織を含めた、ヒト、動物、植物、細菌、真菌又はウイルス構造の構造材料のうちの１つを形成する細胞間物質と細胞、通常特別な種類の細胞との凝集体である。生物組織の例には、器官、腫瘍組織、リンパ節、動脈及び播種性細胞（複数可）もある。組織は、新鮮な、新鮮に凍結した、又はホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）などの固定した組織であり得る。サンプルは、任意の手段、例えば、生検などの外科的手技、又は剥離若しくは細針吸引を含むがこれに限定されない低侵襲の方法によって得られ得る。ＤＮＡサンプルは、腫瘍組織、播種性細胞、糞便、血液細胞、血漿、血清、リンパ節、尿、唾液、精液、便、痰、脳脊髄液、涙、粘液、膵液、胃液、羊水、脳脊髄液、心膜液、胸腔内液又は腹水などの漿液からなる群から選択されることが好ましい。
【００８８】
ＤＮＡ、特に標的ＤＮＡ断片は、ゲノムＤＮＡ又は逆転写酵素から得られるＤＮＡであり得る。ゲノムＤＮＡは、構成的ＤＮＡ、腫瘍ＤＮＡ又は胎児ＤＮＡであり得る。一部の実施形態において、特にサンプルが生体液である場合、ＤＮＡサンプルは、セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）又は循環ＤＮＡを含有してもよい。初期の研究は、腫瘍ＤＮＡが、循環に放出され、がんのいくつかの異なる型において血漿及び血清中に特に高濃度で存在することを示した（Ｌｅｏｎら、１９７７年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ３７：６４６〜６５０頁；Ｓｔｒｏｕｎら、１９８９年、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ４６：３１８〜３２２）。したがって、本発明によるＤＮＡサンプルは、セルフリー腫瘍ＤＮＡ又は循環腫瘍ＤＮＡを含有し得る。別の実施形態において、ＤＮＡサンプルはセルフリー胎児ＤＮＡを含有する。その高い感度のため、本発明の方法は、セルフリー若しくは循環腫瘍ＤＮＡ若しくは胎児ＤＮＡなど循環又はセルフリー標的ＤＮＡを低濃度含有する血漿サンプルに対して使用され得る。本発明の一部の実施形態において、ＤＮＡは、ＲＮＡサンプルの逆転写から得られ得る。
【００８９】
一般に、本発明によるＤＮＡサンプルは、対象から得られる。本発明の対象又は患者（両方の用語は、互換的に使用され得る）は、哺乳動物、一般にヒトなどの霊長類である。一部の実施形態において、霊長類は、サル又は類人猿である。対象は、男性又は女性であり得、小児、若年、青年、成人及び老人対象を含めた任意の適切な年齢であり得る。一部の実施形態において、対象は、齧歯動物など非霊長類哺乳動物である。
【００９０】
本発明の一部の実施形態において、対象は、がんである、がんの寛解中である、又は家族歴に特に基づいてがんを患う危険性がある。一部の実施形態において例えば、対象は家族性腫瘍素因を有する。
【００９１】
一部の実施形態において、対象は、患っている、寛解中である、又は家族性がん素因を有し、特に、対象は、構成的ミスマッチ修復欠損症候群（ＣＭＭＲＤ症候群）又はリンチ症候群などミスマッチ修復（ＭＭＲ）遺伝子における突然変異に起因する疾患を患っている若しくは患う危険性がある。
【００９２】
がんは、固形がん、又は造血並びにリンパ組織の腫瘍としても公知の血液、骨髄及びリンパ系に影響を及ぼすがんなどの「液性腫瘍」でもよく、特に白血病及びリンパ腫を含む。液性腫瘍には、例えば急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）及びマントル細胞リンパ腫又は非ホジキンスリンパ腫（ＮＨＬ）など様々なリンパ腫を含む慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）がある。
【００９３】
固形がんには、特に、結腸、直腸、皮膚、子宮内膜、肺（非小細胞肺癌を含む）、子宮、骨（骨肉腫、軟骨性肉腫、ユーイング肉腫、線維肉腫、巨細胞腫、エナメル上皮腫及び脊索腫など）、肝臓、腎臓、食道、胃、膀胱、膵臓、頸部、脳（髄膜腫、グリア芽細胞腫、低悪性度星状細胞腫、希突起神経膠細胞腫、下垂体腫瘍、神経鞘腫及び転移性脳がんなど）、卵巣、胸部、頭頸部領域、精巣、前立腺及び甲状腺からなる群から選択される器官のうち１つに影響を及ぼすがんがある。
【００９４】
本発明の一部の実施形態において、がんは構成的ミスマッチ修復欠損症候群（ＣＭＭＲＤ症候群）又はリンチ症候群である。
【００９５】
本発明の文脈において、ＭＳＩに関連するがん（又は腫瘍）は、ＭＳＩ陽性がん（又はＭＳＩ陽性腫瘍）とも命名され、ゲノム腫瘍ＤＮＡが、マイクロサテライト配列中に少なくとも１つの突然変異を呈するがん（又は腫瘍）に関する。したがって、ＭＳＩ陽性がんは、上に挙げたがんのいずれでもあり得、ゲノム腫瘍ＤＮＡは、マイクロサテライト配列中に少なくとも１つの突然変異を呈する。
【００９６】
臨床適用：診断及び予後予測の方法、治療的処置及び患者監視。
【００９７】
上述の標的ＤＮＡ断片中の変異マイクロサテライト配列を同定する方法は、いくつかの主要な及び直接の臨床適用を有する。
【００９８】
第１に、前述のように、マイクロサテライト不安定性は、ＤＮＡミスマッチ修復障害（ＭＭＲ）に関連する腫瘍に生じる超突然変異誘発因子表現型である。したがって、ＭＳＩは、それだけには限らないが、結腸直腸がん、胃がん、子宮内膜がん、卵巣がん、尿路がん、脳がん及び乳がんなど多種多様ながんに関連してきた。ＭＳＩは、大腸がんの帰結として最も一般的である。ＭＳＩは、構成的ミスマッチ修復欠損症候群（ＣＭＭＲＤ症候群）又はリンチ症候群に一般に見られる。
【００９９】
したがって、前述の方法による変異マイクロサテライト配列の検出は、先に定義したがん、特にＤＮＡミスマッチ修復障害に関連するがん（先に定義した）、特にＭＳＩ陽性がん（又は腫瘍）の診断に使用され得る。
【０１００】
本発明の一実施形態において、本方法による変異マイクロサテライト配列の検出は、ミスマッチ修復（ＭＭＲ）遺伝子中の突然変異に起因する疾患、特に構成的ミスマッチ修復欠損症候群（ＣＭＭＲＤ症候群）若しくはリンチ症候群などのＭＳＩ陽性腫瘍の診断、又は対象における家族性腫瘍素因の診断にも使用され得る。
【０１０１】
したがって一態様において、本発明は、本発明によるＤＮＡサンプル由来標的ＤＮＡのマイクロサテライト配列座にある突然変異を検出するステップを含む、対象においてがん、特に、ＭＳＩ陽性腫瘍などミスマッチ修復（ＭＭＲ）遺伝子における突然変異に関連する疾患及び／又はがんの家族性腫瘍素因を診断する方法に関する。一般に、標的ＤＮＡは、腫瘍に由来するゲノムＤＮＡである。サンプルは、前述のとおり対象から得られ得る。一実施形態において、対象由来ＤＮＡサンプルにおける変異マイクロサテライト配列の検出は、対象が、ＭＳＩ陽性腫瘍、特にＣＭＭＲＤ又はリンチ症候群などＭＭＲ遺伝子中の突然変異に起因する疾患を患っていることを示す。対象由来ＤＮＡサンプルにおける変異マイクロサテライト配列の検出は、対象が、ＣＭＭＲＤ又はリンチ症候群などの家族性腫瘍素因を有することも示し得る。
【０１０２】
ＭＭＲ遺伝子における突然変異には、付加、欠失又は置換、特に単一ヌクレオチドバリエーション（ＳＮＶ）及びエピ突然変異（ＤＮＡ超メチル化など）がある。
【０１０３】
ＭＳＩ陽性腫瘍の有病率は、結腸直腸がん、胃がん、子宮内膜がんにおいてより高い。しかしながら、ＭＳＩは、低い有病率であるが、実質的に全ての型のがんにおいてより低い有病率で見出された（Ｈａｕｓｅら、２０１６年  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅを参照のこと）。前述のように、がんのＭＳＩ表現型（即ち陽性又は陰性）は、がん予後及び処置の合理的計画において重要な意味を有する（Ｂｏｌａｎｄ及びＧｏｅｌ、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ２０１０年）。したがって低ＭＳＩ陽性有病率のがんの場合であっても、患者がＭＳＩ陽性腫瘍又はＭＳＩ陰性腫瘍を患っているかどうか同定することは、依然として非常に重要である。したがって本発明の方法は、様々ながんの予後予測に使用され得る。陽性ＭＳＩがんの同定は、良好な予後に一般に関連する。
【０１０４】
したがって、本発明は、本発明によるＤＮＡサンプルのマイクロサテライト配列座にある突然変異を検出するステップを含むがん（先に定義した）の予後予測の方法にも関する。一部の実施形態において、サンプル、好ましくは腫瘍由来ＤＮＡサンプル中の変異マイクロサテライト配列の同定は、前記腫瘍がＭＳＩ陽性であることを示す。
【０１０５】
上記の治療的文脈において、本発明の方法は、その卓越した感度により極めて低濃度の標的ＤＮＡを含有するＤＮＡサンプルにおいてマイクロサテライト不安定性を検出することが可能になるので特に有用である。したがって本発明の方法は、血液サンプル、血漿サンプル、尿又はさらに糞便などの生体サンプルに対して日常的に実行され得る。一般に、本発明の方法は、血液サンプル又は血漿サンプルに対して実行され、標的ＤＮＡは、循環腫瘍ＤＮＡなどのセルフリーＤＮＡである。この点は、生検の術がない脳腫瘍を含め、ＣＭＭＲＤなどの疾患に特に意味がある。
【０１０６】
報告が、例えば、ＭＭＲ欠損の結腸直腸がん患者が、ＰＤ−１免疫チェックポイント遮断による免疫治療に優れた応答を有し、無増悪生存率の改善を示すことを示している通り、本発明は、処置の効力を予測する方法にも関する。したがって、ＭＳＩに関連するがん（即ちＭＳＩ陽性がん又は腫瘍）を患っている患者の同定は、適当な治療戦略の選択と高い臨床的関連性があるものである。
【０１０７】
したがって、本発明の別の態様は、がんを患う対象において処置の効力を予測する方法に関し、前記方法は、前述の対象ＤＮＡサンプル由来標的ＤＮＡ断片のマイクロサテライト配列座にある突然変異を検出するステップを含む。標的ＤＮＡ断片は、腫瘍に由来することが好ましい。通常、ＤＮＡサンプルは、腫瘍を患っている及び／又は家族性がん素因を有する対象から得られる。
【０１０８】
本発明は、本明細書に記述される方法によるＤＮＡサンプル由来標的ＤＮＡ断片のマイクロサテライト配列座にある突然変異を検出するステップを含む、それを必要とする対象においてがんを処置する方法も提唱する。通常、標的ＤＮＡ断片は、腫瘍に由来する。通常、ＤＮＡサンプルは、腫瘍を患っている及び／又は家族性がん素因を有する対象からも得られる。
【０１０９】
処置は免疫治療であることが好ましい。免疫治療には、免疫チェックポイントモジュレータ（即ち阻害剤及び／又はアゴニスト）、モノクローナル抗体、がんワクチンがあるが、これに限定されない。
【０１１０】
処置は、抗ＰＤ−１及び／又は抗ＰＤＬ−１阻害剤などの免疫チェックポイントモジュレータの投与を含むことが最も好ましい。
【０１１１】
ＤＮＡサンプル由来標的ＤＮＡ（特に標的腫瘍ＤＮＡ）のマイクロサテライト配列座において突然変異が検出される場合、免疫治療が対象に投与されることが好ましい。
【０１１２】
さらに、マイクロサテライト不安定性を検出する本発明の方法を使用して、ＤＮＡミスマッチ修復障害に関連する腫瘍と診断された対象を監視してもよい。前記監視は、処置の時間的経過の間に実行されることが好ましい。本方法を使用して、ＤＮＡミスマッチ修復障害に関連する腫瘍を患っている対象におけるがんの再発を監視してもよい。したがって、別の態様において、本発明は、ＤＮＡミスマッチ修復障害に関連する腫瘍が診断された又はＤＮＡミスマッチ修復障害に関連する腫瘍を患っている対象から得られる血漿若しくは血清サンプルから選択されるＤＮＡサンプル由来標的腫瘍ＤＮＡのマイクロサテライト配列中にある突然変異を検出するステップを含む、ＤＮＡミスマッチ修復障害に関連する腫瘍があると診断された又はそのような腫瘍を患っている患者を監視する方法も提供する。ＤＮＡミスマッチ修復障害に関連する腫瘍を患う患者において、循環腫瘍ＤＮＡにおけるマイクロサテライト不安定性の検出は、再発の指標となり得る。
【０１１３】
ＤＮＡサンプル由来標的ＤＮＡのマイクロサテライト配列座において突然変異を検出する多重化アッセイ
がん性腫瘍など特定の疾患に関連する組織においてＭＳＩの存在を検出する力は、多重化複数マーカーによって大いに増大され得る。したがって、本発明の文脈において、先に定義した複数のマイクロサテライト配列座（即ち；パネルマイクロサテライト配列座）が標的され得るように、先に定義したプライマー／プローブの複数のセットが多重化アッセイに使用され得る。
【０１１４】
例として、本発明による多重化アッセイのパネルのマイクロサテライト配列座は、ＢＡＴ−２５、ＢＡＴ−２６、ＢＡＴ−３４ｃ４、ＢＡＴ−４０、ＮＲ２１、ＮＲ２４、ＭＯＮＯ−２７、Ｄ２Ｓ１２３、Ｄ５Ｓ３４６、Ｄ１７Ｓ２５０、ＡＣＶＲ２Ａ、ＤＥＦＢ１０５Ａ、ＤＥＦＢ１０５Ｂ、ＲＮＦ４３、ＤＯＣＫ３、ＧＴＦ２ＩＰ１、ＬＯＣ１０００９３６３１、ＰＩＰ５Ｋ１Ａ、ＭＳＨ３、ＴＲＩＭ４３Ｂ、ＰＰＦＩＡ１及びＴＤＲＤ１からなる群の中から並びに先に定義した群のいずれかの中で選択され得る。
【０１１５】
そのような多重化アッセイは、前述のとおり臨床適用に特に有用である。
【０１１６】
多重化アッセイにおいて、増幅を受けて得られたアンプリコンは同じ融解温度を有すると予測されるように、プライマー対は、利用可能なコンピュータプログラムを使用して設計されることが好ましい。
【０１１７】
デジタル範囲にある場合（全ての区画が０又は１つのいずれかの標的分子を含有する場合）、各標的含有反応は、標的がプライマー／プローブに特異的に結合しながら進行することになるが、標的を含まない区画に反応は生じないことになるので、競合又は交差反応性を考えずに多重ｑＰＣＲアッセイが可能になる。各分子を別々の反応区画内に有することにより、（各区画には平均サンプル容積中の濃度にかかわらず、多くとも１つの標的が有るので）低存在量の標的を「スワンピングアウトする（ｓｗａｍｐｉｎｇ  ｏｕｔ）」ことを考えずに同じ実験で高存在量と低存在量の両方の標的を計数することが可能になる。複数の標的が計数される場合（例えば、２重アッセイ形式において）、標的のうちの１つを、アッセイした他の標的と同一の実験を終えた内部標準化参照（例えば、いくつの増幅可能なゲノム相当物が、ロードされたか）として使用して、別の標的に対するある標的の計数の比（例えば、変異対立遺伝子対野生型対立遺伝子）から「絶対比」を定量化することができる。
【０１１８】
加えて、ｄＰＣＲは、終点反応として実行される（ＰＣＲが蛍光を測定する前に完了まで行われる）ので、単離物中に正確に１つの標的分子を有することにより、プローブ強度に基づく多重化が可能になる（Ｚｈｏｎｇ、Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａら、２０１１年、「Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲ：ｂｒｅａｋｉｎｇ  ｔｈｅ  ｏｎｅ  ｔａｒｇｅｔ  ｐｅｒ  ｃｏｌｏｒ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｏｆ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ」、Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ、１１：２１６７〜２１７４頁）。限界濃度で標的特異的蛍光アッセイを加えることによって、その標的分子を含む区画はＰＣＲ陽性であるが、ＰＣＲ終点において限定的な明るさになる。第２の標的型を計数するために、同じ「色」（即ち同じフルオロフォア）を持つ異なる標的特異的プローブが、異なる濃度で添加される。第２の標的を含む区画は、ＰＣＲ終点で第１の標的を含む区画より明るいシグナルを有することになり、これにより別々の雲を得られ、したがって各標的に対して別々の計数が可能になる。したがって、異なる色のプローブと異なる濃度のプローブ両方の組合せを使用して、より高いレベルで多重化することができる。
【０１１９】
キット：
本発明は、
マイクロサテライト配列を含む、ＤＮＡサンプルの標的ＤＮＡ断片を増幅するのに適切な一対のプライマー；
第１のフルオロフォアで標識した、第１のオリゴヌクレオチドプローブであって、マイクロサテライト配列を含む野生型配列に相補的である第１のオリゴヌクレオチドプローブ；
第２のフルオロフォアで標識した、第２のオリゴヌクレオチドプローブであって、前記マイクロサテライト配列の外側に位置する、前記増幅されたＤＮＡ断片の野生型配列に相補的である第２のオリゴヌクレオチドプローブ；
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ
を含むプライマー／プローブセットを含む、ＤＮＡサンプルのマイクロサテライト配列領域にある突然変異を同定するキットも包含する。
【０１２０】
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼについては、Ｎｅｗｔｏｎ及びＧｒａｈａｍ  １９９４年  Ｉｎ：ＰＣＲ、ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｌｔｄ．、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ  １３に一般に記述されている。熱安定性ポリメラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼであることが有利である。
【０１２１】
一態様において、キットは、複数のプライマー／プローブセットを含み、そのプライマー／プローブセットは、固有のマイクロサテライト配列を含む標的ＤＮＡ断片の増幅及び検出を可能にする。
【０１２２】
上で言及したキットは、前述の臨床適用に使用され得る。
【実施例】
【０１２３】
結果
材料及び方法
プライマー及びプローブ設計
プライマー及びプローブを、Ｐｒｉｍｅｒ３Ｐｌｕｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）の支援で設計した。全てのプライマーを、Ｐｒｉｍｅｒ  ＢＬＡＳＴを使用して非特異的結合について、及び二次構造が無いことを確認した。プライマーを、１４０ｂｐ未満のアンプリコンを生成するように設計して、セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）及びホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）腫瘍サンプルから抽出した断片化ＤＮＡを最適に増幅した。この研究に使用したオリゴヌクレオチド配列を、表１に提供する。ＢＡＴ−２６単独：配列番号１〜４；ＡＣＶＲ２Ａ単独：配列番号５〜８；ＤＥＦＢ１０５Ａ／Ｂ単独：配列番号９〜１２；ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ単独：配列番号１３〜１６；ＢＡＴ−２６−ＡＣＶＲ２Ａ−ＤＥＦＢ１０５Ａ／Ｂ  ３重：配列番号１〜５、７、９、１１、１７〜２０。脱塩プライマー及びＨＰＬＣ精製プローブを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ及びＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＵＫで製造した。
【０１２４】
ｄｄＰＣＲ条件
ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＱＸ１００システムを使用して、製造業者に指示される通り実行した。ＰＣＲ反応を、ｄＵＴＰを含まない２×Ｓｕｐｅｒｍｉｘ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、参照１８６３０２４）１０μＬ、９００ｎＭ各プライマー、２５０ｎＭ各ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ及び５０００コピーに相当するＤＮＡ鋳型最高１６．５ｎｇを含有する２０μＬ容積に調製した。ＰＣＲ反応を、使い捨てドロップレット生成器カセット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、参照８６４００８）に次いで移した。ドロップレット生成油（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  参照１８６３００５）７０μＬを添加し、カセットをドロップレット生成器に搭載した。生成したドロップレット（４０μＬ）を、９６ウェルＰＣＲプレート（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  参照００３０  １２８．５７５）に移した。乳化ＰＣＲ反応を、Ｃ１０００熱サイクラー（Ｂｉｏ−ｒａｄ）によって以下のサイクル条件で次いで行った：９５℃で１０分間の変性、それに続き９４℃で３０秒間、６１℃で３分間（ＢＡＴ−２６）又は５９℃で３分間（ＤＥＦＢ１０５Ａ／Ｂ）又は５５℃で３分間（ＡＣＶＲ２Ａ）又は６０℃で１分間（ＢＲＡＦＶ６００Ｅ）の４０増幅サイクル；９８℃で１０分間最終的な保持。ランプ速度を、２．５℃／秒に設定した。各実行において、ＤＮＡを含まない対照及び１００％  ＷＴ又は１００％変異体ＤＮＡを含有する対照を含めた。クラスタ閾値化及び定量化を、ＱｕａｎｔａＳｏｆｔ  ｖ１．７．４ソフトウェア（Ｂｉｏ−ＲＡＤ）で実行した。ｄｄＰＣＲ  ＭＳＩアッセイの場合、ドロップレットを、蛍光振幅に基づいてＷＴ又はＭＳＩ陽性として手作業で割り当てた：ＷＴ、ＶＩＣ＋／ＦＡＭ＋；ＭＳＩ陽性（変異体）、ＶＩＣ＋／ＦＡＭ−／ｌｏｗ。鋳型を含まないドロップレットを、ＶＩＣ−／ＦＡＭ−に割り当てた。アッセイ最適化を、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）由来ＷＴ  ＤＮＡ中に希釈した又はしていないＨＣＴ−１１６細胞株（ＭＳＩ陽性大腸がん細胞株）のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）で実行した。手動の割当てによるドロップレット計数から、変異対立遺伝子頻度（ＭＡＦ）を決定した。
【０１２５】
ＬＯＢ及びＬＯＤ算出
各アッセイのバックグラウンドシグナル又は偽陽性率を、ＷＴ  ＤＮＡの少なくとも５３個の複製を使用して推定した。ブランク上限（ＬＯＢ）を、平均偽陽性測定値の上部９５％信頼限界と定義した。分析感度を、１０％〜０．０１％（１：２段階希釈）の変異対立遺伝子頻度（ＭＡＦ）において、ＷＴ  ＤＮＡ中のＨＣＴ−１１６細胞株の段階希釈を使用して推定した。希釈点当たりの複製の総数は、稀な事象の検出を最大化するために３〜８（１０％及び５％、３×；２．５％及び１．２５％、４×；０．６３％〜０．１６％、６×；０．０８％〜０．０１％、８×）の範囲であった。検出限界（ＬＯＤ）を、ＬＯＢと確実に区別される可能性が高い最も低い変異体濃度として推定した。
【０１２６】
患者サンプルにおけるｄｄＰＣＲ  ＭＳＩアッセイの検証
主に結腸直腸がん（ＣＲＣ）又は子宮内膜癌（ＥＣ）の患者のホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）腫瘍組織、血漿又は血清サンプルを使用して、ｄｄＰＣＲ  ＭＳＩアッセイを検証した。全てのサンプルを、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ’ｓ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃａｌ  Ｂｏａｒｄの承認のもとＩｎｓｔｉｔｕｔ  Ｃｕｒｉｅ（Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）で処置し、臨床試験に登録した患者から得た。サンプルを、マイクロサテライト安定性（ＭＳＳ）又はマイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ−Ｈ）腫瘍のプールから選択し、ミスマッチ修復（ＭＭＲ）タンパク質（ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＨＳ６及びＰＭＳ２）の免疫組織化学染色（ＩＨＣ）と関連して又はしないで５重ＰＣＲ方法（Ｂａｃｈｅｒら、２００４年）によって同定した。腫瘍組織由来ｇＤＮＡを、製造業者の指示にしたがってＱｉａｇｅｎ  ＤＮＡ  ＦＦＰＥ  Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ  参照５６４０４）を使用して抽出し、−２０℃で貯蔵した。ｃｆＤＮＡを、製造業者の推奨にしたがってキアアンプ（ＱＩＡａｍｐ）（登録商標）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄキット（Ｑｉａｇｅｎ  参照５５１１４）を使用して血漿又は血清０．５〜１．８ｍＬから抽出し、−２０℃で貯蔵した。ＤＮＡを、Ｑｕｂｉｔ  ｄｓＤＮＡ  ＨＳアッセイ及びＬＩＮＥ−１増幅（Ｒａｇｏら、２００７年）を使用して定量化した。ｄｄＰＣＲ反応を、上述の通り実行した。反応当たりの総ＤＮＡ量は、ＦＦＰＥサンプルの場合２．５ｎｇ〜１０ｎｇ、血漿又は血清サンプルの場合１ｎｇ〜１０ｎｇ変動した。
【０１２７】
結果
ＢＡＴ−２６、ＡＣＶＲ２Ａ及びＤＥＦＢ１０５Ａ／Ｂ  ＭＳＩ  ｄｄＰＣＲアッセイは、それぞれＭＳＨ２、ＡＣＶＲ２Ａ並びにＤＥＦＢ１０５Ａ及びＢ遺伝子の内側に位置するマイクロサテライト内の対立遺伝子サイズバリエーションを確実に検出する
３つのモノヌクレオチドポリ（Ａ）マイクロサテライト（ＭＳ）マーカー：ＢＡＴ−２６、ＭＳＨ２遺伝子の第５イントロンに位置する準単形長Ａ２７反復、並びにＡＣＶＲ２Ａの第１０エクソン及びＤＥＦＢ１０５Ａ／Ｂパラロガス遺伝子の第２イントロンにそれぞれ位置する２つのより短いＡ８及びＡ９反復について対立遺伝子サイズバリエーションを検出できるｄｄＰＣＲアッセイを開発した（表１）。ＢＡＴ−２６は、臨床診療において結腸直腸及び子宮内膜腫瘍のＭＳＩ状況を決定するために広く使用されている５つのマイクロサテライトマーカーのうちの１つである（Ｓｕｒａｗｅｅｒａら、２００２年）。ＡＣＶＲ２Ａ及びＤＥＦＢ１０５Ａ／Ｂ遺伝子内に位置するマイクロサテライトは、ＭＳＳ腫瘍と比較してＭＳＩ−Ｈ腫瘍において周期的に不安定であるとしてＴＣＧＡエキソーム配列決定データの分析から最近同定された新規の識別マーカーである（Ｈａｕｓｅら、２０１６年；Ｍａｒｕｖｋａら、２０１７年）。３つのアッセイは、ドロップオフｄｄＰＣＲ戦略に基づいており、その戦略は、ＷＴシグナルの不在に基づいて変異対立遺伝子を同定する（Ｄｅｃｒａｅｎｅら、２０１８年）。各マイクロサテライトマーカーに対して２つのＴａｑｍａｎ加水分解プローブを、同じアンプリコン内に設計した。マイクロサテライト領域の上流又は下流の非可変配列にハイブリダイズするＶＩＣ標識参照プローブ（ＲＥＦ）並びに適切に結合する能力及びマイクロサテライト不安定性に関連する変異対立遺伝子の場合に得られる不安定化を付与するためにポリＡホモポリマー全体を網羅し、両側に＋２〜４塩基あるＦＡＭ標識ドロップオフプローブ（ＭＳ）。ＲＥＦプローブは、アンプリコン（即ちＢＡＴ−２６、ＡＣＶＲ２Ａ又はＤＥＦＢ１０５Ａ／Ｂ  ＤＮＡ断片）の総コピー数を定量化し、ＭＳプローブは、変異体配列に対する非効率的なハイブリダイゼーションによりＷＴとＭＳＩ対立遺伝子とを識別する。したがって、この型のアッセイにより、ＶＩＣ及びＦＡＭ蛍光振幅の二次元散布図は、ドロップレットの考え得る３つのクラスタ：鋳型を含まないドロップレット（ＶＩＣ−／ＦＡＭ−）、ＷＴ対立遺伝子を含有するドロップレット（ＶＩＣ＋／ＦＡＭ＋）及びＭＳＩ陽性対立遺伝子を含有するドロップレット（ＶＩＣ＋／ＦＡＭ−／ｌｏｗ）を示し得る（図１Ａ〜図１Ｉ）。
【０１２８】
ＭＳプローブの複雑さが低いことを考慮すると、ＷＴ対立遺伝子に対する特異的ハイブリダイゼーションを達成するために標準的なｄｄＰＣＲ条件（ＢｉｏＲＡＤガイドライン）を調整する必要があった。アニーリング温度及びアニーリング／伸長時間の増大を伴う熱サイクリングプロトコールは、ＷＴ対立遺伝子に対するＭＳプローブの特異性を有意に改善し、したがって、ＷＴとＭＳＩ陽性雲の分離を改善することを観察した。最適化したアッセイは、ＨＣＴ−１１６  ＭＳＩ−Ｈ細胞株から抽出したＤＮＡ中のＭＳＩ対立遺伝子を特異的に検出できたが、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から得られたＷＴ  ＤＮＡにおいて不安定性は観察されなかった（ＢＡＴ−２６の場合図１Ａ及び図１Ｂ；ＤＥＦＢ１０５Ａ／Ｂの場合図１Ｄ及び図１Ｅ；ＡＣＶＲ２Ａの場合図１Ｇ及び図１Ｈ）。さらに、３つのアッセイは、ＷＴバックグラウンドにおいてＨＣＴ−１１６細胞株の１／１０希釈物においてＭＳＩ対立遺伝子を正確に定量化することができた（図１Ｃ、図１Ｆ、図１Ｉ）。
【０１２９】
ＢＡＴ−２６、ＡＣＶＲ２Ａ及びＤＥＦＢ１０５Ａ／Ｂ  ｄｄＰＣＲアッセイは、非常に特異的であり、０．１％以下の検出限界に達する
ＢＡＴ−２６、ＡＣＶＲ２Ａ及びＤＥＦＢ１０５Ａ／Ｂ  ｄｄＰＣＲ  ＭＳＩアッセイの分析特異性を、ＰＢＭＣから得たＷＴ  ＤＮＡの少なくとも５３個の個別のｄｄＰＣＲ反応において偽陽性ＭＳＩ判定を測定することによって評価した（反応当たりの平均コピー数：ＢＡＴ−２６の場合４５２０個；ＡＣＶＲ２Ａの場合３３８０個、及びＤＥＦＢ１０５Ａ／Ｂの場合３７４０個）。平均偽陽性率は以下の通りであった：ＢＡＴ−２６の場合０．００６９０８±０．０１３６６％（１１／５３個の反応におけるＭＳＩ判定）、ＡＣＶＲ２Ａの場合０．００６１３６±０．０１６２３％（７／５５個の反応におけるＭＳＩ判定）及びＤＥＦＢ１０５Ａ／Ｂの場合０．００５６０４±０．０１９１１％（５／５５個の反応におけるＭＳＩ判定）。各アッセイのブランク上限（ＬＯＢ）は、ＢＡＴ−２６の場合０．０１０６７％（図２Ａ）、ＤＥＦＢ１０５Ａ／Ｂの場合０．０１０７７％（図２Ｂ）及びＡＣＶＲ２Ａの場合０．０１０５２％（図２Ｃ）で推定された。分析感度を、１０％〜０．０１％（１：２段階希釈）の変異対立遺伝子頻度（ＭＡＦ）において、ＷＴ  ＰＢＭＣ  ＤＮＡ中のＨＣＴ−１１６細胞株の段階希釈を使用して推定した。希釈点当たりの複製の総数は、稀な事象の検出を最大化するために３〜８（１０％及び５％、３×；２．５％及び１．２５％、４×；０．６３％〜０．１６％、６×；０．０８％〜０．０１％、８×）の範囲であった。３つのアッセイについて、優れた線形相関が、予想されるＭＡＦと観察したＭＡＦの間に観察され、このことは、３つのアッセイが幅広い頻度でＭＳＩを正確に定量化できることを示した。ＢＡＴ−２６の場合Ｒ２＝０．９９８４  ｐ＜０．０００１（図２Ａ）、ＤＥＦＢ１０５Ａ／Ｂの場合Ｒ２＝０．９９６４  ｐ＜０．０００１（図２Ｂ）及びＡＣＶＲ２Ａの場合Ｒ２＝０．９９５５  ｐ＜０．０００１（図２Ｃ）。ＬＯＢと正確に区別される可能性が高い変異体の最低濃度として推定される検出限界（ＬＯＤ）を、ＢＡＴ−２６で０．０４％（図２Ａ）、及びＤＥＦＢ１０５Ａ／Ｂマーカー（図２Ｂ）とＡＣＶＲ２Ａ（マーカー図２Ｃ）の両方で０．０８％と推定した。３つのＭＳＩ  ｄｄＰＣＲアッセイは、非常に鋭敏且つ特異的であり、より優れた診断精度並びに疾患の処置及び進行を診断及び監視するための液体生検におけるＭＳＩバイオマーカーの先例のない使用の見込みがあると結論する。
【０１３０】
臨床サンプルにおけるｄｄＰＣＲ  ＭＳＩ試験
結腸直腸又は子宮内膜がんの患者から主に得られた１７７個のＦＦＰＥ腫瘍サンプルにおいてＢＡＴ−２６、ＡＣＶＲ２Ａ及びＤＥＦＢ１０５Ａ／Ｂ  ｄｄＰＣＲ  ＭＳＩアッセイの成績を次に評価した（表２）。これらのサンプルは、５つのマイクロサテライトマーカー：ＢＡＴ−２６、ＮＲ−２１、ＢＡＴ−２５、ＭＯＮＯ−２７及びＮＲ−２４においてマイクロサテライト不安定性を評価する標準的な多重ＰＣＲキャピラリー電気泳動方法を使用してＭＳＩ陽性（ＭＳＩ−Ｈ、ｎ＝９４）又はＭＳＩ陰性（ＭＳＳ、ｎ＝８３）とこれまでに特徴付けられている。５つのマーカーのうちの少なくとも２について不安定性を示したサンプルをＭＳＩ陽性（ＭＳＩ−Ｈ）と見なし、不安定性を示さないサンプルをＭＳＩ陰性（ＭＳＳ）に分類した。重要なことに、ｄｄＰＣＲ及び以下の分析を、盲検で、サンプルのＭＳＩ状況の知見なしに実行した。表２に示すように、ＭＳＩ  ｄｄＰＣＲにより、９２、８７及び８１個のサンプルにおいてそれぞれＢＡＴ−２６、ＡＣＶＲ２Ａ及びＤＥＦＢ１０５Ａ／Ｂマーカーについて不安定な対立遺伝子を同定した。ＢＡＴ−２６の場合キャピラリー電気泳動法とｄｄＰＣＲの間で合致する結果が、試験した１７７個のサンプル中１７２個に得られたことは注目に値する。合致しないサンプル５つのうちの３つの場合、ＢＡＴ−２６の状況が、キャピラリー電気泳動法によって決定できず、ｄｄＰＣＲによって不安定であると定義された。他の２つの合致しないサンプルの場合、ＢＡＴ−２６は、キャピラリー電気泳動法によって不安定と分類されたが、ｄｄＰＣＲによって安定と報告され、決定されなかった。不安定性が、分析した３つのｄｄＰＣＲマーカー中の少なくとも２つで判明した場合にサンプルをＭＳＩ−Ｈとみなすとすると、ＭＳＩ  ｄｄＰＣＲは、ＭＳＳサンプルの１００％（８３／８３）をＭＳＳとして、ＭＳＩ−Ｈサンプルの９４％（８８／９４）をＭＳＩ−Ｈとして正しく分類できた。注目すべきことに、合致しない場合のほとんどは、結腸直腸がんより分類が困難であり、偽陰性結果の傾向が高い子宮内膜腫瘍サンプル（４／６）に対応した（Ｓｕｒａｗｅｅｒａら、２００２年；Ｗａｎｇら、２０１７年）。
【０１３１】
ＭＳＩ  ｄｄＰＣＲアッセイの高い感度及び特異性を前提に、ステージＩＶのＭＳＩ−Ｈ結腸直腸又は子宮内膜腫瘍である１２名の患者から採集した２２個の血漿若しくは血清サンプルに対してその成績を次に評価した。注目に値するＭＳＩ  ｄｄＰＣＲアッセイは、ほぼ０．２％の低い変異対立遺伝子頻度を持つサンプルを含めて、試験した全てのサンプルにおいてマイクロサテライト不安定性を検出することができた（表３）。さらに、これら１２名の患者のうち５名は、ＢＲＡＦ変異腫瘍（ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ）を有した。したがって、ＭＳＩ  ｄｄＰＣＲアッセイによって報告された変異対立遺伝子頻度は、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異を特異的に標的したｄｄＰＣＲアッセイで得たものと直接比較され得る。優れた相関（ＢＡＴ−２６の場合Ｒ２＝０．９８５２  ｐ＜０．０００１、ＡＣＶＲ２Ａの場合Ｒ２＝０．９６０３  ｐ＜０．０００１及びＤＥＦＢ１０５Ａ／Ｂの場合Ｒ２＝０．９２７５  ｐ＜０．０００１）が得られ、その相関は、検出のためのｄｄＰＣＲ  ＭＳＩアッセイの信頼性及び循環腫瘍ＤＮＡの定量化をさらに支持する（図３Ａ〜図３Ｃ）。総合すれば、これらの結果は、ＭＳＩ  ｄｄＰＣＲアッセイが、患者サンプルにおいてＭＳＩを正確に検出することができ、したがって、腫瘍組織におけるＭＳＩ試験及び臨床診療における液体生検の代替方法として使用され得ることを実証する。
【０１３２】
多重アッセイの開発
単一の反応でＢＡＴ−２６、ＡＣＶＲ２Ａ及びＤＥＦＢ１０５Ａ／ＢマーカーのＭＳＩ状況を同時に検出できる多重ＭＳＩ  ｄｄＰＣＲアッセイを開発することを次に目指した。多重戦略は、３つのマーカーについてドロップレットのＷＴ及びＭＳＩ陽性クラスタを互いに区別できるように、プライマー及びプローブの濃度を変動させて、終点蛍光を変化させた（Ｂｉｏ−ＲａｄドロップレットデジタルＰＣＲ多重化ガイドラインを参照のこと）。異なるプライマー及びプローブ並びにプライマー及びプローブ濃度、アニーリング温度及び伸長時間の多様な組合せを試験し、その幾つかが満足な結果を生成した。アニーリング／伸長温度／時間６３℃で３分間及び以下のプライマー／プローブ組合せ：ＢＡＴ−２６、配列番号１〜４、０．２×；ＡＣＶＲ２Ａ、配列番号５、７、１７及び１８、０．６×、並びにＤＥＦＢ１０５Ａ／Ｂ、配列番号９、１１、１９及び２０、１×で得た一例を図４に表す。予備的ではあるが、これらの結果は、単一の反応において多様なマイクロサテライト配列を標的する多重化ｄｄＰＣＲアッセイの実現可能性を実証する。
【０１３３】
【表１】
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【０１３４】
【表２】
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【０１３５】
【表３】
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【０１３６】
〔参照文献〕
・Hause RJ, Pritchard CC, Shendure J,Salipante SJ (2016) Classification and characterization of microsatelliteinstability across 18 cancer types. Nature Medicine 22(1):1342-1350
・Rago C, Huso DL, Diehl F, Karim B, LiuG, Papadopoulos N, Samuels Y, Velculescu VE, Vogelstein B, Kinzler KW, Diaz LAJr (2007) Serial assessment of human tumor burdens in mice by the analysis ofcirculating DNA. Cancer Research 67(19:9364-9370
・Suraweera N, Duval A, Reperant M, VaurtC, Furlan D, Leroy K, Seruca R, Lacopetta B, Hamelin R (2002) Evaluation oftumor microsatellite instability using five quasimonomorphic mononucleotiderepeats and pentaplex PCR. Gastroenterology 123:1804-1811
・Maruvka Y, Mouw KW, Karlic R,Parasuraman P, Kamburov A, Polak P, Haradhvala NJ, Hess JM, Rheinbay E, BrodyY, Koren A, Braunstein LZ, D’Andrea A, Lawrence MS, Bass A, Bernards A, Michor F, Getz G (2017)Analysis of somatic microsatellite indels identifies driver events in humantumors. Nature Biotechnology 35:951-959
・Decraene C, Silveira AB, Bidard FC,Vallee A, Michel M, Melaabi S, Vincent-Salomon A, Saliou A, Houy A, Milder M,Lantz O, Ychou M, Denis MG, Pierga JY, Stern MH, Proudhon C (2018) Multiplehotspot mutations scanning by single droplet digital PCR. Clinical Chemistry64:317-328
・Wang Y, Shi C, Eisenberg R,Vnencak-Jones CL (2017) Differences in microsatellite instability profilesbetween endometrioid and colorectal cancers. The Journal of MolecularDiagnostics 19:57-64
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図１Ｉ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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