(57)【要約】  本発明は、試料のイン・サイチュ(in situ)温度誘導抗原賦活化のための装置および方法に関し、すべてのステップが、試料支持体上に固定された試料に対して大気圧より高い圧力下で実行され、試料は、任意選択で、急速な、高感度かつ信頼できる方法における同じ試料上の多分子読み出しを通じたさまざまな分子標的のイメージングを可能にするサイクル多重化によって、同じ試料支持体上で染色およびイメージングをさらに受けることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料支持体（１２）上に固定された生体試料（１）のイン・サイチュ(in situ)温度誘導抗原賦活化のための方法であって、
ａ）前記試料支持体上に固定された前記生体試料を提供するステップと、
ｂ）マイクロ流体チャンバ（４０）と、前記マイクロ流体チャンバの一端にある少なくとも１つの流体入口（３２）と、前記マイクロ流体チャンバの他端にある少なくとも１つの流体出口（３４）と、を含み、流体供給システム（１０）から前記マイクロ流体チャンバ（４０）を介して圧力下で供給される流体を導くように構成された、マイクロ流体装置（８）を提供するステップであって、前記マイクロ流体チャンバの少なくとも１つの壁が、前記試料支持体によって形成され、前記マイクロ流体チャンバ（４０）の第１の壁（３３）にクランプ機構（１６）によって流体密かつ取り外し可能な方法でシール（４２）に対して取り付けられ、前記マイクロ流体チャンバの容積は２.５μLと２００μlとの間である、ステップと、
ｃ）前記生体試料（１）が前記マイクロ流体チャンバ（４０）の内側に面する状態で、前記マイクロ流体チャンバと前記試料支持体とを流体密な方法で一緒に取り付けるステップと、
ｄ）大気圧より高い圧力で温度制御抗原賦活化ステップＳ１を実行するステップであって、ステップＳ１は、
-  大気圧を超える前記マイクロ流体チャンバにおける圧力Ｐchamberで前記流体入口を介してエピトープ脱マスキング溶液で前記マイクロ流体チャンバを満たすステップと、
-  前記マイクロ流体チャンバをインキュベーション温度設定点（ＴAR）まで加熱し、インキュベーション持続期間ｔiの間、前記マイクロ流体チャンバの温度を前記インキュベーション温度設定点に維持するステップと、
-  冷却持続期間ｔcの間、前記インキュベーション温度設定点未満かつ室温以上の冷却温度まで前記マイクロ流体チャンバを冷却するステップと、
を含み、前記インキュベーション温度設定点ＴARは約６０℃から２００℃の間に含まれ、前記マイクロ流体チャンバにおける圧力Ｐchamberは１.５バールより大きく、前記インキュベーション持続期間ｔiは０.５から３０分の間に含まれる、ステップと、
を含んでなることを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記冷却持続期間ｔcは１から３０分の間に含まれることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記温度制御抗原賦活化ステップＳ１中の前記インキュベーション温度設定点ＴARは１１０℃から２００℃の間に含まれることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記温度制御抗原賦活化ステップＳ１中の前記マイクロ流体チャンバにおける前記圧力Ｐchamberは約２.５から５バールの間に含まれることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記インキュベーション持続期間ｔiは、２から２０分の間、好ましくは２から１５分の間に含まれることを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項に記載の方法を実施するステップを含むサイクル多重化による試料のイン・サイチュ(in situ)イメージングのための方法であって、
ｅ）少なくとも１つのイメージングプローブを含む複数の試薬を、約１μｌ／ｓと約１００μｌ／ｓとの間の範囲の流量で、前記流体入口を介して前記マイクロ流体チャンバ内へ順に注入するステップと、
ｆ）前記少なくとも１つのイメージングプローブと反応した前記試料の成分によって放出される信号をイメージングするステップと、
ｇ）さまざまなイメージングプローブでステップ（ｅ）とステップ（ｆ）とを繰り返すステップと、
をさらに含んでなることを特徴とする、方法。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか一項に記載の方法において用いるのに適した生体試料処理装置（２）であって、支持機構（４）、熱ユニット（６）、マイクロ流体装置（８）、加圧流体供給システム（１０）、および制御システムを含み、
前記マイクロ流体装置（８）は、マイクロ流体チャンバ（４０）であって、２.５μLと２００μlとの間に含まれる容積と、前記マイクロ流体チャンバの一端にある少なくとも１つの流体入口（３２）と、前記マイクロ流体チャンバの他端にある少なくとも１つの流体出口（３４）と、を有する、マイクロ流体チャンバ（４０）を含み、前記マイクロ流体チャンバ内部の前記生体試料と反応させるために前記マイクロ流体チャンバ（４０）を介して流体を導くように構成され、前記マイクロ流体チャンバの少なくとも１つの壁が、前記試料支持体によって形成され、１.５バールより大きい、好ましくは２バールより大きい、特に２.５バールより大きい、より好ましくは３バールより大きい前記マイクロ流体チャンバにおける圧力Ｐchamberを収容するのに十分な程度まで前記試料支持体とマイクロ流体装置との間のシール（４２）を圧縮するように構成されたクランプ機構（１６）によって前記マイクロ流体チャンバ（４０）の第１の壁（３３）に流体密かつ取り外し可能な方法で前記シール（４２）に対して取り付けられていることを特徴とする、生体試料処理装置。
【請求項８】
前記マイクロ流体装置は、流体入口オリフィス（３２）に接続されたマイクロ流体入口チャネルネットワーク（３６）と、流体出口オリフィス（３４）に接続されたマイクロ流体出口チャネルネットワーク（３８）と、を中に含む光透過性材料の実質的に平坦な基板（９）の形態であり、前記流体入口オリフィス（３２）と流体出口オリフィス（３４）との両方が、前記基板のチャンバ境界側に対応する前記基板の第１の側（３３）に開口していることを特徴とする、請求項７に記載の試料処理装置。
【請求項９】
第１の面（３３）と試料支持体（１２）との間のチャンバの高さが、前記試料支持体上に配置された生体組織試料（１）に沿った試薬の移流輸送を保証するように構成された１００μｍ未満であることを特徴とする、請求項７または８に記載の試料処理装置。
【請求項１０】
前記支持機構（４）はベース構造（１４）および前記クランプ機構（１６）を含み、前記クランプ機構は、顕微鏡で透明基板を介して前記生体試料を見ることを可能にする窓（２０）を備えたクランププレート（１８）を含むことを特徴とする、請求項７から９のいずれか一項に記載の試料処理装置。
【請求項１１】
前記マイクロ流体装置（８）は、前記マイクロ流体装置のチャンバ側（３３）およびシール（４２）が前記試料支持体（１２）に対向するとともに前記生体試料（１）を覆って下向きの状態で、前記試料支持体（１２）の上部に配置されていることを特徴とする、請求項７から１０のいずれか一項に記載の試料処理装置。
【請求項１２】
加圧下流体供給システム（１０）は、ベース構造に取り付けられた流体供給チャネル（４４）および流体出口チャネル（４６）を含み、それぞれが、前記クランプ機構の可動クランププレート（１８）に面するそのオリフィス端でシール（４８）を含み、前記シールは、それぞれ前記マイクロ流体装置の流体入口オリフィス（３２）、流体出口オリフィス（３４）の周囲の位置で、前記マイクロ流体装置の基板（９）のチャンバに面する側（３３）に対して圧縮され、圧縮下の前記シールは、少なくとも１.５バール、好ましくは２バールより大きい、特に２.５バールより大きい、より好ましくは３バールより大きい圧力を支持するように構成されていることを特徴とする、請求項７から１１のいずれか一項に記載の試料処理装置。
【請求項１３】
前記熱ユニット（６）は、前記試料支持体（１２）の位置より下のベース構造（１４）に取り付けられ、前記熱ユニットは、前記試料支持体に熱を伝導し、前記試料支持体のすぐ下に配置されている熱伝達ユニット（２４）に任意選択で取り付けられた、たとえばペルティエ素子または複数の積み重ねられたペルティエ素子を含む加熱ユニット（２６）を含むことを特徴とする、請求項７から１２のいずれか一項に記載の試料処理装置。
【請求項１４】
前記熱ユニットは、たとえば、冷却流体が流れる流体流チャネル（５６）のラビリンスを含んで、前記試料支持体（１２）の能動冷却を提供する冷却ブロック（５４）の形態の冷却ユニット（２８）をさらに含むことを特徴とする、請求項７から１３のいずれか一項に記載の試料処理装置。
【請求項１５】
前記試料支持体（１２）または前記マイクロ流体装置（８）における、および／または加熱ユニット（２６）および／または熱伝達ユニット（２４）における温度を測定するように構成されたベース構造（１４）および／またはクランププレート（１８）に統合された１つまたは複数の温度センサをさらに含み、前記１つまたは複数の温度センサは、前記熱ユニットの動作を制御するように構成された温度制御システムの一部を形成していることを特徴とする、請求項７から１４のいずれか一項に記載の試料処理装置。
【請求項１６】
前記試料支持体（１２）を前記マイクロ流体装置（８）に対して下から押して、前記マイクロ流体装置と試料支持体との間で圧縮された前記シール（４２）によるクランプおよび流体封止を改善する調整可能なピストン機構（５１）を含むクランプ装置をさらに含むことを特徴とする、請求項７から１５のいずれか一項に記載の試料処理装置。
【請求項１７】
前記ピストン機構は、圧縮ガス、たとえば圧縮空気によって作動することを特徴とする、請求項１６に記載の試料処理装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して生体試料調製の分野、特に試料のイン・サイチュ(in situ)イメージングを考慮した抗原賦活化に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫組織化学（Immunohistochemistry: IHC）は、抗体のような特定のプローブ分子を用いて、組織試料における細胞によって発現し得る特定のバイオマーカー（たとえば抗原）の存在を検出することを伴う技術である。IHCは、たとえば一種のがんのような特定の疾患を診断するため、または疾患予後と新規バイオマーカーの発現との間の相関関係を調査するため、臨床と研究との両方の設定において広く用いられている。IHCの主要な応用分野はがんの診断であるが、ウイルスのような感染性因子の検出（McMahonら、１９９６年、Histochem J.、２８（３）:１５７〜６４）およびアルツハイマー病のような他の疾患の診断を支援すること（Dandreaら、２００１年、Biotech Histochem.、７６（２）:９７〜１０６）を含む他の応用分野もある。
【０００３】
抗原賦活化（Antigen retrieval: AR）は、さまざまな種類の組織試料、主にホルマリン固定パラフィン包埋（formalin-fixed paraffin embedded: FFPE）組織切片の抗原性を高めるために用いられるIHCのための前処理技術である。これは、その最初の導入以来、広範囲の組織タイプと標的マーカーのために業界のゴールドスタンダードとして急速に採用されてきた（Shiら、１９９１年、J Histochem Cytochem.、３９:７４１〜７４８、米国特許第５,２４４,７８７号明細書）。
【０００４】
抗原賦活化処理の有効性の背後にある正確なメカニズムは依然として不明ではあるが、ホルマリン誘導ペプチド結合の形成を逆転させて標的エピトープを活性化するというその効果に関してはコンセンサスがある。エピトープの応答性を高めるために用いられる２つの主な方法、すなわち酵素誘導抗原賦活化（Enzyme-induced antigen retrieval: EIAR）および熱誘導抗原賦活化（heat-induced antigen retrieval: HIAR）がある。酵素物質には本質的に触媒性があるため、EIARは、組織形態を乱し、標的タンパク質部位を非機能的にする可能性がより高い（Wernerら、１９９６年、Histochemistry and Cell Biology、１０５:４ ２５３〜２６０）。したがって、HIARが、この２つの中でより広く用いられている方法である。
【０００５】
HIARを実行するためのさまざまな装置および方法論がある。従来の方法は、塩基性緩衝液を含む熱浴における試料のインキュベーションである。この方法では、一般的な傾向として、より低いAR温度について同じ抗原性を得るためにより長いインキュベーション時間が要求される。たとえば、６０℃での一晩のインキュベーションまたは９５℃での１時間のインキュベーションが両方ともプレIHC ARに用いるのに成功したと報告されている（Yamashita、２００７年、Prog Histochem Cytochem.、４１（３）:１４１〜２００７）。マイクロ波処理は、試料が定電力マイクロ波処理または加熱と休止のサイクルのいずれかを受ける他の一般的な方法である（米国特許第５,２４４,７８７号明細書）。これはまた、免疫蛍光（LongおよびC. Buggs、２００８年、J Mol Histol. ３９（１）: １〜４）および特別な染色用途（Temelら、２００５年、Biotech Histochem.、８０（３〜４）:１２３〜３２）において抗原性を改善するために用いられている。
【０００６】
HIAR方法とEIAR方法とを組み合わせることも可能である。Keyらは、FFPE試料のマイクロ波処理に用いられる熱安定性酵素を含むAR緩衝液を開示した。AR温度が１００℃まで上昇するこれらの方法について、さまざまな乳がんマーカーに対するARの成功が示された（国際公開第２００９／１１０９３６号）。他の代替例は、AR媒体の温度をその大気中の沸騰温度を超えて上げることが可能になる圧力支援HIARである。Angrosらは、この目的のために高圧環境においてARを実行するための自動装置を開示した（米国特許第７,９５１,６１２号明細書）。
【０００７】
HIARは、ARの能力を改善するために修正されたさまざまな環境において、またはさまざまな溶液において実行することができる。たとえば、Gourevitchは、AR中に試料の完全性を促進する新規な溶液を開示し（米国特許出願公開第２００４／００２９１８４号明細書）、Namimatsuは、ARの能力を向上させるためにCCAおよびNaOHを含むAR溶液を用いることを開示した（米国特許出願公開第２００２／０１８２６５３号明細書）。Eriksenは、標的エピトープに存在するアミン基間の特定の架橋を反転させるため、さまざまな非イオン性界面活性剤が添加されたAR溶液を開示した（米国特許第９,５０６,９２８号明細書）。
【０００８】
ARを高温で実行することができるように、大気圧で溶液の沸点を上げる多数のAR溶液製剤が当該技術において知られている。Keyらは、自動試料温度制御のための装置に加えて、さまざまな添加剤および粘度で沸点を最高１３５℃まで上げたAR溶液を開示した（米国特許出願公開第２００６／０１３４７９３号明細書、国際公開第２００９／０８５５７４号）。Christensenらは、改良された緩衝液を用いて１２０℃から１３０℃のAR温度が得られた水平AR装置および方法を開示した（米国特許出願公開第２０１０／０１３６６１２号明細書）。Kramらは、２００℃を超える沸点に達する有機塩またはイオン液を含むAR溶液を開示した（国際公開第２００６／０６６０３９号）。
【０００９】
AR効率を改善するためにさまざまな緩衝液を連続して適用することも当該技術において知られている。たとえば、Gerdesらは、複数の抗原の検出のため、さまざまなpH値のAR緩衝液で試料を処理する方法を開示している（米国特許出願公開第２０１２／００９６６６号明細書）。
【００１０】
免疫染色前の試料前処理時間を減らすための他のアプローチは、FFPE試料の脱パラフィンと抗原賦活化との両方において用いられる緩衝液を提供することである。Aghassiらは、同時に脱パラフィンとARとを行うのに用いられたさまざまな界面活性剤を含む緩衝液を開示した（米国特許第６,６４９,３６８号明細書）
【００１１】
上記の方法は、特に抗原賦活化が染色処理の前に試料調製の一部として実行されるため、試料処理時間の長さおよび効率の低さの問題に十分に対処していない。
【００１２】
したがって、処理時間の短縮は病理学的ワークフローにおけるスループットの向上、および限定された臨床検査資源のより効率的な使用につながるため、処理時間の短縮を必要とする組織処理方法を実行するための新たな技術、機器、および道具の必要性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】米国特許第５,２４４,７８７号明細書
【特許文献２】国際公開第２００９／１１０９３６号
【特許文献３】米国特許第７,９５１,６１２号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００４／００２９１８４号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００２／０１８２６５３号明細書
【特許文献６】米国特許第９,５０６,９２８号明細書
【特許文献７】米国特許出願公開第２００６／０１３４７９３号明細書
【特許文献８】国際公開第２００９／０８５５７４号
【特許文献９】米国特許出願公開第２０１０／０１３６６１２号明細書
【特許文献１０】国際公開第２００６／０６６０３９号
【特許文献１１】米国特許出願公開第２０１２／００９６６６号明細書
【特許文献１２】米国特許第６,６４９,３６８号明細書
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】McMahonら、１９９６年、Histochem J.、２８（３）:１５７〜６４
【非特許文献２】Dandreaら、２００１年、Biotech Histochem.、７６（２）:９７〜１０６
【非特許文献３】Shiら、１９９１年、J Histochem Cytochem.、３９:７４１〜７４８
【非特許文献４】Wernerら、１９９６年、Histochemistry and Cell Biology、１０５:４ ２５３〜２６０
【非特許文献５】Yamashita、２００７年、Prog Histochem Cytochem.、４１（３）:１４１〜２００７
【非特許文献６】LongおよびC. Buggs、２００８年、J Mol Histol. ３９（１）: １〜４
【非特許文献７】Temelら、２００５年、Biotech Histochem.、８０（３〜４）:１２３〜３２
【非特許文献８】M.A. Hayat、「Microscopy, Immunohistochemistry, and Antigen Retrieval Methods: For Light and Electron Microscopy」、２００２年、Springer Science+Business Media New York
【非特許文献９】Modern Pathology、２０１１年、２４、６１３〜６２３、doi:１０.１０３８／modpathol.２０１０.２２８
【非特許文献１０】Dabbs、Diagnostic Immunohistochemistry: theranostic and diagnostic applications、４th edition、２０１４年、ISBN ９７８-１-４５５７-４４６１-９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の目的は、試料支持体上に固定された試料に対して大気圧より高い圧力下ですべてのステップが実行され、同じ試料支持体上での上記試料の染色およびイメージングの前に抗原賦活化を可能にする、試料のイン・サイチュ(in situ)温度誘導抗原賦活化の方法を提供することである。
【００１６】
標的エピトープの急速かつ再現可能な温度誘導脱マスキングを可能にする完全に自動化された迅速な高温誘導変性効果および冷却誘導リフォールディング温度を達成することを可能にする大気圧より高い圧力下での試料のイン・サイチュ(in situ)温度誘導抗原賦活化の方法を提供することは有利である。
【００１７】
試料の完全性が維持されるとともに、染色前に抗原賦活化のための複数の処理ステップを試料に受けさせること、ならびに抗原賦活化および染色のためにさまざまな試料支持体上に試料を取り付けることの回避によって処理時間が減少した、同じ試料支持体上での上記試料のその後の染色およびイメージングを可能にする、試料支持体上に固定された組織または細胞試料のイン・サイチュ(in situ)温度誘導抗原賦活化の方法を提供することは有利である。
【００１８】
他の実装の一形態において、試料支持体上に固定された組織または細胞試料のイン・サイチュ(in situ)温度誘導抗原賦活化の方法を提供し、同じ試料支持体上で上記試料にその後の染色およびイメージングを受けさせることは有利であり、ここで温度誘導抗原賦活化ステップ後の試料の温度は室温より高い温度に冷却され、その後の染色およびイメージングステップは室温より高い温度で行われ、処理時間を減らして染色の効率を高めている。
【００１９】
他の実装の一形態において、試料支持体上に固定された組織または細胞試料のイン・サイチュ(in situ)温度誘導抗原賦活化の方法を提供することは有利であり、ここで上記試料は、同じ試料支持体上で、試料の標識化とイメージングとの完全なサイクルを実行するとともに、同じ試料上のさまざまなマーカーの免疫染色を促進し、測定されたイメージング信号の再現性および／または感度を低下させることなく、可能な試料標識化サイクルの数を増やすハイスループットな方法でこのようなサイクルを繰り返すための特定のシーケンスにおける直接試料の表面でのイメージングプローブのその後の完全に制御可能な流れを受ける。
【００２０】
本発明の目的は、請求項１に記載の方法を提供することによって達成された。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明の第１の態様によれば、本明細書に開示されているのは、試料支持体上に固定された生体試料のイン・サイチュ(in situ)温度誘導抗原賦活化のための方法であって、
ａ）上記試料支持体上に固定された上記生体試料を提供するステップと、
ｂ）マイクロ流体チャンバと、このマイクロ流体チャンバの一端にある少なくとも１つの流体入口と、このマイクロ流体チャンバの他端にある少なくとも１つの流体出口と、を含み、流体供給システムからマイクロ流体チャンバを介して圧力下で供給される流体を導くように構成された、マイクロ流体装置を提供するステップであって、マイクロ流体チャンバの少なくとも１つの壁が、試料支持体によって形成され、マイクロ流体チャンバの第１の壁にクランプ機構によって流体密かつ取り外し可能な方法でシールに対して取り付けられ、マイクロ流体チャンバの容積は２.５μｌと２００μｌとの間である、ステップと、
ｃ）試料がマイクロ流体チャンバの内側に面する状態で、上記マイクロ流体チャンバと上記試料支持体とを流体密な方法で一緒に取り付けるステップと、
ｄ）大気圧より高い圧力で温度制御抗原賦活化ステップを実行するステップであって、上記賦活化ステップは、
-  大気圧を超えるマイクロ流体チャンバにおける圧力Ｐchamberで流体入口を介してエピトープ脱マスキング溶液でマイクロ流体チャンバを満たすステップと、
-  マイクロ流体チャンバをインキュベーション温度設定点（ＴAR）まで加熱し、インキュベーション持続期間ｔiの間、マイクロ流体チャンバの温度を上記インキュベーション温度設定点に維持するステップと、
-  冷却持続期間ｔcの間、上記インキュベーション温度設定点未満かつ室温以上の冷却温度までマイクロ流体チャンバを冷却するステップと、
を含み、上記インキュベーション温度設定点ＴARは約６０℃から２００℃の間に含まれ、マイクロ流体チャンバにおける圧力Ｐchamberは１.５バールより大きく、インキュベーション持続期間ｔiは０.５から３０分の間に含まれる、ステップと、
を含む、方法である。
【００２２】
有利な一実施形態において、冷却持続期間ｔcは１から３０分の間に含まれ得る。
【００２３】
有利な一実施形態において、温度制御抗原賦活化ステップＳ１中のインキュベーション温度設定点TARは、１１０℃と２００℃との間に含まれ得る。
【００２４】
有利な一実施形態において、温度制御抗原賦活化ステップＳ１中のマイクロ流体チャンバにおける圧力Ｐchamberは、約２.５から５バールの間に含まれ得る。
【００２５】
有利な一実施形態において、インキュベーション持続期間ｔiは、２から２０分の間、好ましくは２から１５分の間に含まれ得る。
【００２６】
有利な一実施形態において、本発明の方法は、
ｅ）少なくとも１つのイメージングプローブを含む複数の試薬を、約１μｌ／ｓと約１００μｌ／ｓとの間の範囲の流量で、流体入口を介してマイクロ流体チャンバ内へ順に注入するステップと、
ｆ）上記少なくとも１つのイメージングプローブと反応した試料の成分によって放出される信号をイメージングするステップと、
ｇ）さまざまなイメージングプローブでステップ（ｅ）とステップ（ｆ）とを繰り返すステップと、をさらに含む。
【００２７】
有利な一実施形態において、複数の試薬を順に注入するステップは、
-  試料上に残っている可能性がある望ましくない物質を除去するために溶出緩衝液が注入される溶出ステップと、
-  ブロッキング緩衝液が注入される任意選択の非特異的結合ブロッキングステップと、
-  イメージングプローブが注入される試料標識化ステップと、
を含み、
これらのステップのそれぞれは、洗浄緩衝液が注入される任意選択の洗浄ステップによって先行され、
上記少なくとも１つのイメージングプローブは、上記試料内の分析されるべき分子実体を標的とする、標識プローブおよび色素原または蛍光検出分子としての一連の特定の抗体の注入から生じる。
【００２８】
有利な一実施形態において、注入される複数の試薬のシーケンスにおける各ステップは、各試薬について２つの流量ステップ、すなわち、
-  約１μｌ／ｓと約１００μｌ／ｓとの間の範囲の初期流量で試薬が注入される第１の流量ステップと、
-  シーケンスにおける次の試薬を注入する前に、同じ試薬がより低流量（通常約０.００１から約１.０μｌ／ｓ）で注入され、その試薬を試料と確実にインキュベートする、第２の流量ステップと、
を含む。
【００２９】
有利な一実施形態において、第１の流量ステップは１秒から１２０秒の間続く。
【００３０】
有利な一実施形態において、試薬の第２の流量ステップは約１分から約３０分続く。
【００３１】
有利な一実施形態において、試料標識化ステップは、標識RNAまたはDNAプローブなどの、試料内の何らかのDNA／RNA物質とのイン・サイチュ(in situ)ハイブリダイゼーションのために少なくとも１つの標識プローブを注入するステップを含むことができる。
【００３２】
有利な一実施形態において、試料標識化ステップは、試料内のDNA／RNA物質をRNAまたはDNAプローブとハイブリダイズさせるため、マイクロ流体チャンバ内で温度サイクルを適用するステップをさらに含むことができる。
【００３３】
有利な一実施形態において、イメージングステップは、蛍光顕微鏡法または明視野顕微鏡法によって行うことができる。
【００３４】
有利な一実施形態において、溶出ステップは、他の試料標識化ステップでこの方法を繰り返す前に、試料上に残っている可能性がある望ましくないイン・サイチュ(in situ)ハイブリダイズしたプローブまたはマーカーを確実に除去するための温度サイクルを適用しながら実行することができる。
【００３５】
本発明の他の目的は、請求項７に記載の装置を提供することによって達成された。
【００３６】
本発明の第２の態様によれば、本明細書に開示されているのは、先行する請求項のいずれかに記載の方法において用いるのに適した生体試料処理装置であって、支持機構、熱ユニット、マイクロ流体装置、加圧流体供給システム、および制御システムを含み、マイクロ流体装置は、マイクロ流体チャンバであって、２.５μLと２００μlとの間に含まれる容積と、上記マイクロ流体チャンバの一端にある少なくとも１つの流体入口と、上記マイクロ流体チャンバの他端にある少なくとも１つの流体出口と、を有する、マイクロ流体チャンバを含み、上記マイクロ流体チャンバ内部の試料と反応させるためにマイクロ流体チャンバを介して流体を導くように構成され、マイクロ流体チャンバの少なくとも１つの壁が、試料支持体によって形成され、１.５バールより大きい、好ましくは２バールより大きい、特に２.５バールより大きい、より好ましくは３バールより大きいマイクロ流体チャンバにおける圧力Ｐchamberを収容するのに十分な程度まで試料支持体とマイクロ流体装置との間のシールを圧縮するように構成されたクランプ機構によってマイクロ流体チャンバの第１の壁に流体密かつ取り外し可能な方法でシールに対して取り付けられている。
【００３７】
有利な一実施形態において、マイクロ流体装置は、流体入口オリフィスに接続されたマイクロ流体入口チャネルネットワークと、流体出口オリフィスに接続されたマイクロ流体出口チャネルネットワークと、を中に含む光透過性材料の実質的に平坦な基板の形態であり得、流体入口オリフィスと流体出口オリフィスとの両方が、基板のチャンバ境界側に対応する基板の第１の側に開口している。
【００３８】
有利な一実施形態において、第１の面と試料支持体との間のチャンバの高さは、試料支持体上に配置された生体組織試料に沿った試薬の移流輸送を保証するように構成された１００μm未満である。
【００３９】
有利な一実施形態において、支持機構はベース構造および上記クランプ機構を含み、クランプ機構は、顕微鏡で透明基板を介して生体試料を見ることを可能にする窓を備えたクランププレートを含む。
【００４０】
有利な一実施形態において、マイクロ流体装置は、マイクロ流体装置のチャンバ側およびシールが試料支持体に対向するとともに生体試料を覆って下向きの状態で、試料支持体の上部に配置することができる。
【００４１】
有利な一実施形態において、加圧下流体供給システムは、ベース構造に取り付けられた流体供給チャネルおよび流体出口チャネルを含み、それぞれが、クランプ機構の可動クランププレートに面するそのオリフィス端でシールを含み、シールは、それぞれマイクロ流体装置の流体入口オリフィス、流体出口オリフィスの周囲の位置で、マイクロ流体装置の基板のチャンバに面する側に対して圧縮され、圧縮下の上記シールは、少なくとも１.５バール、好ましくは２バールより大きい、特に２.５バールより大きい、より好ましくは３バールより大きい圧力を支持するように構成されている。
【００４２】
有利な一実施形態において、熱ユニットは、試料支持体の位置より下のベース構造に取り付けられ、熱ユニットは、試料支持体に熱を伝導し、試料支持体のすぐ下に配置されている熱伝達ユニットに任意選択で取り付けられる加熱ユニットを含む。
【００４３】
有利な一実施形態において、加熱ユニットは、ペルティエ素子または複数の積み重ねられたペルティエ素子を含む。
【００４４】
有利な一実施形態において、熱ユニットは、たとえば、冷却流体が流れる流体流チャネルのラビリンスを含んで、試料支持体の能動冷却を提供する冷却ブロックの形態の冷却ユニットをさらに含む。
【００４５】
一実施形態において、試料処理装置は、試料支持体またはマイクロ流体装置における、および／または加熱ユニットおよび／または熱伝達ユニットにおける温度を測定するように構成されたベース構造および／またはクランププレートに統合された１つまたは複数の温度センサをさらに含み、１つまたは複数の温度センサは、熱ユニットの動作を制御するように構成された温度制御システムの一部を形成している。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１ａ】本発明の一実施形態による生体試料処理装置２を示し、この装置を、使用の準備ができた閉位置において示している。
【図１ｂ】マイクロ流体ネットワーク装置が取り外された状態で、開位置にあるクランプ機構を示す図１ａの装置の斜視図である。
【図１ｃ】図１ａの線１ｃ-１ｃに沿った断面図である。
【図１ｄ】図１ｂの線１ｄ-１ｄに沿った断面図である。
【図１ｅ】図１ａの線１ｅ-１ｅを通る断面図である。
【図１ｆ】図１ｂの線１ｆ-１ｆを通る断面図である。
【図１ｇ】図１ｃの断面図の一部の拡大図である。
【図２ａ】各主要フローステップ（S１からS４）間の任意選択の洗浄緩衝液ステップを省略しながら、本発明の方法のイン・サイチュ(in situ)抗原賦活化、染色およびイメージングステップサイクルにおいて用いられるプロセスシーケンスを示す。
【図２ｂ】ARのためのステップＳ１の下で用いられる温度制御プロトコルを示す。
【図３】実施例２に記載したようなイン・サイチュ(in situ)抗原賦活化後に実行された免疫染色で得られたDAPI（A）およびPR（B）チャネルおよび組み合わせ（C）の蛍光画像を示す。
【図４ａ】実施例３に記載したような本発明の方法の温度制御AR処理ステップにおいて用いられるさまざまな温度制御プロトコル（約１分で室温から１０５℃まで加熱し、この温度で約１０分間インキュベートし、約７分かけて３℃ずつ８５℃まで冷却して、室温まで冷却）を示す。
【図４ｂ】実施例３に記載したような本発明の方法の温度制御AR治療ステップにおいて用いられるさまざまな温度制御プロトコル（約１分で室温から９８℃まで加熱し、この温度で約１０分間インキュベートし、約４分かけて３℃ずつ８５℃まで冷却して、室温まで冷却）を示す。
【図５】免疫染色の前に（１）標準的な温度誘導抗原賦活化手順、または（２）本発明の方法によるイン・サイチュ(in situ)抗原賦活化および溶出ステップ、を受けた乳がん組織切片上のさまざまなバイオマーカーの実施例４の共局在染色中に得られた連続画像を示す。画像の順序AからDは、プロトコルにおいて示した取得順序に対応している。
【図６ａ】本発明の一実施形態による生体処理装置のマイクロ流体装置および試料支持体の概略断面図である。
【図６ｂ】図６ａの線VIb-VIbを通るマイクロ流体装置の断面の斜視図であり、マイクロ流体チャンバへの流体の入口および出口のためのマイクロ流体チャネルネットワークを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
「エピトープ脱マスキング溶液」という表現は、熱誘導エピトープ賦活化に適しており、当業者に知られている任意の溶液を指す。通常のエピトープ脱マスキング溶液は、M.A. Hayatによる「Microscopy, Immunohistochemistry, and Antigen Retrieval Methods: For Light and Electron Microscopy」、２００２年、Springer Science+Business Media New Yorkに記載されているようなものである。
【００４８】
図面、特にまず図１ａ〜図１ｇおよび図６ａ〜図６ｂを参照すると、本発明の一実施形態による生体試料処理装置２が示されている。生体試料処理装置２は、生体試料のイン・サイチュ(in situ)温度誘導抗原賦活化を行うために構成され、サイクル多重化によって試料のイン・サイチュ(in situ)イメージングを実行するようにさらに構成することができる。生体試料処理装置２は、大気圧での試薬の沸騰温度以上の温度でマイクロ流体チャンバ４０に注入された試薬を加熱するため、大気圧より高い圧力でチャンバ４０に試薬を注入するように構成されている。有利な一実施形態において、この装置は、チャンバにおける圧力が１.５から５バールの範囲になるように構成されている。
【００４９】
本発明の一実施形態において、試料処理装置２は、支持機構４、熱ユニット６、マイクロ流体装置８、加圧流体供給システム１０、および制御システム（図示せず）を含む。
【００５０】
制御システムは、装置の、特に、マイクロ流体チャンバ４０内に注入される流体および試薬の温度および流体圧力パラメータを制御するため、熱ユニットおよび加圧流体供給システムの自動またはユーザベースの制御のため、装置２の温度および圧力センサから温度および圧力入力を受信するマイクロプロセッサを含む。
【００５１】
試料処理装置２は、その中に生体試料支持体１２を収容する。生体試料支持体は、たとえば、組織試料および他の生体試料の顕微鏡検査のためにそれ自体一般的に知られているように、顕微鏡下で視覚化するためのガラススライドの形態であり得る。
【００５２】
マイクロ流体装置８は、図６ａにおいて最もよく分かるように、閉位置において試料支持体１２に対して取り付けられ、その間にマイクロ流体チャンバ４０を形成している。マイクロ流体装置は、チャンバ４０を完全に囲むように構成されたシール４２を含み、これによって、試料支持体１２が一定のクランプ力Fの下でマイクロ流体装置８に対して固定されるとき、シール４２は、試料支持体１２とマイクロ流体装置８との間で、少なくとも１.５バールを超える、いくつかの実施形態においては、５バール以上の圧力に耐えるのに十分な程度まで圧縮される。チャンバ４０に注入される試薬はこのように、大気圧での沸点を超える温度で試薬を加熱することができるようにするため、抗原賦活化プロセス中に１.５から５バール以上の範囲の圧力下で供給することができる。
【００５３】
マイクロ流体装置８は、一実施形態において、光透過性材料の実質的に平坦な基板９の形態である。基板は、流体入口オリフィス３２に接続されたマイクロ流体入口チャネルネットワーク３６と、流体出口オリフィス３４に接続されたマイクロ流体出口チャネルネットワーク３８と、をその中に含む。流体入口オリフィス３２と流体出口オリフィス３４との両方が、基板９のチャンバ境界側に対応するプレートの第１の側３３に開口している。
【００５４】
マイクロ流体入口チャネルネットワーク３６は、試薬がチャンバ内に流入するチャンバ４０の入口縁部に沿って延びる複数のオリフィス３７内に供給される。マイクロ流体出口チャネルネットワーク３８は、試薬がチャンバから流出するチャンバ４０の出口縁部に沿って延びる複数のオリフィス３９内に供給される。マイクロ流体入口および出口チャネルネットワーク３６、３８は、基板内に形成され、単一の入口３２を複数のチャンバ入口オリフィス３７に、単一の出口を複数のチャンバ出口オリフィス３９に、それぞれ相互接続するように構成されている。
【００５５】
特定の一態様によれば、マイクロ流体チャンバ４０は、上記マイクロ流体チャンバ４０内部の流体の移流輸送のために構成されている。第１の面３３と試料支持体１２との間のチャンバの高さは、試料支持体上に配置された生物組織試料１に沿った試薬の移流輸送を可能にし、確実にするため、好ましくは１００μｍ未満である。移流輸送は、試薬と組織試料との間の最適な交換を提供する。また、チャンバの高さが低いことにより、チャンバ４０を非常に急速に加熱し、必要であれば、急速に、または所望の制御された冷却速度で冷却することを可能にするチャンバ４０内の最小容積が確保されるので、高温での抗原賦活化のための時間が短縮される。
【００５６】
シール４２は、チャンバ４０、チャンバ入口オリフィス３７、およびチャンバ出口オリフィス３９を囲む基板９における対応する溝に部分的に埋め込まれたガスケットシールの形態であり得る。
【００５７】
支持機構４はベース構造１４およびクランプ機構１６を含み、クランプ機構は、作動レバー機構２２によって作動するクランププレート１８を含む。図１ｄおよび図１ｆに示すように、クランププレート１８は上および開位置にある。試料支持体１２は、生体試料１が上向きの状態でベース１４上に配置することができる。マイクロ流体装置８は、チャンバ側３３およびシール４２が試料支持体１２に対向するとともに生体試料を覆って下向きの状態で、試料支持体１２の上部に配置することができる。顕微鏡で透明基板９を介して生体試料１を見ることを可能にするため、クランププレート１８に窓２０を設けることができる。たとえば、透明なポリマーまたはガラスにおけるスペーサプレート１９を、クランププレート１８とマイクロ流体装置１２との間の界面として作用するように、クランププレートの底部に設けることができる。
【００５８】
加圧下流体供給システム１０は、流体供給チャネル４４および流体出口チャネル４６を含み、流体供給チャネルと出口チャネルとの両方が、クランププレート１８に面するそのオリフィス端にシール４８を含む。シール４８は、たとえば、ベース１４における対応する溝内に部分的に適合する小さなガスケットまたはOリングの形態であり得る。装置が閉じられると、シールは、それぞれマイクロ流体装置８の流体入口オリフィス３２、流体出口オリフィス３４の周りの位置で、基板９のチャンバに面する側３３に対して圧縮される。このように、マイクロ流体装置が試料支持体１２の上部に配置されると、マイクロ流体装置のシール４２は試料支持体１２に対して圧縮され、流体供給システムのシール４８は基板９とベース１４との間で圧縮される。この圧縮および封止構成は、少なくとも１.５バール、好ましくは２から５バール以上の範囲の圧力を支持するように構成されている。
【００５９】
クランプ機構１６は、たとえば３０ニュートンから５００ニュートンの範囲の高いクランプ力をマイクロ流体ネットワーク装置８の基板９上に加えることを可能にするレバーアーム効果を備えたヒンジリンケージ１７を有する。このような効果を提供することができるさまざまな技術において用いられる関節機構はそれ自体よく知られており、より詳細に説明する必要はない。本発明の範囲内で、ベースおよび試料支持体に対してマイクロ流体装置を固定するために要求される力を生成するように構成されたさまざまなクランプ手段を用いることができる。
【００６０】
流体入口および出口４４、４６は、図１ｇに最もよく示されているように、ベース構造１４の下側に接続され、流体供給および廃棄システム（図示せず）に接続されたチューブに接続され得る。流体供給および廃棄システムは、要求される試薬の供給部に接続されたポンプシステムを含み、ポンプシステムは、１.５バールを超える、好ましくは２〜５バール以上の範囲の圧力を超える圧力で生体試料処理装置２に試薬を送達するように構成されている。
【００６１】
熱ユニット６は、試料支持体１２の位置より下のベース構造１４に取り付けられている。熱ユニットは、ペルティエ素子または複数のペルティエ素子、たとえば、一対の積み重ねられたペルティエ素子を有利に含むことができる加熱ユニット２６を含む。しかしながら、加熱ユニット２６は、変形例において、誘導コイルまたは抵抗性電気ヒータのような他のヒータ装置を含むことができる。加熱ユニット２６は、図示の実施形態に示すように、試料支持体１２に熱を伝導し、試料支持体１２の真下に配置された熱伝達ユニット２４に任意選択で取り付けられてもよい。加熱ユニット２６または熱伝達ユニット２４は、試料支持体１２に対して直接接触するか、または小さなギャップでそこから分離することができる。図示の実施形態において、ペルティエ素子２６は、たとえば試料支持体１２に熱を伝導する金属製の、本質的に伝導性ブロックを形成する熱伝達ユニット２４に取り付けられている。伝導および放射による熱伝達のため、加熱ユニット２６と試料支持体１２との間の熱伝達ユニット２４に、通路２５または複数の通路を設けることができる。通路２５は、代わりに、または加えて、熱ユニット６の動作、および特に加熱ユニット２６の動作を制御するため、温度制御システムの温度センサを中に取り付けるのに役立つこともできる。
【００６２】
熱ユニット６は、任意選択で、高温下での抗原賦活化ステップの終わりで試料支持体１２の能動冷却を提供するため、たとえば冷却流体が流れる流体流チャネル５６のラビリンスを含む冷却ブロック５４の形態の、冷却ユニット２８をさらに含むことができる。しかしながら、変形例に応じて、能動冷却は要求されないことがあり、たとえば、冷却ユニット２８の省略によって、または冷却流体が冷却ユニットブロック内を通過することなく冷却ユニット２８の空冷によって受動冷却が実施されることもある。熱ユニットは、固定された取り付け構造によって、またはクランプ装置５０によってベース１４に固定することができる。
【００６３】
クランプ装置には、調整可能なピストン機構５１を有利に設けることができる。ピストン機構は、機械的または油圧的または空圧的に作動させることができる。好ましい実施形態において、ピストン機構は、入口５３を介してピストン５１の下に注入される圧縮ガス、たとえば圧縮空気によって作動する。ピストン機構５１は、試料支持体１２をマイクロ流体装置８に対して下から押して、マイクロ流体装置８と試料支持体１２との間で圧縮されたシール４２によるクランプおよび流体封止を改善するのに役立つとともに、試料支持体１２とマイクロ流体装置８との間のどのようなずれ／非平坦性でも自動的に補償することを可能にし、本発明において実施することができる高圧下（通常３バールを超える）での漏れを防ぐ。ピストン機構は、加熱ユニット２６およびベース１４に対する冷却ユニットの圧力を調整するのにも役立つことができる。ピストン機構の圧縮ガス作動は、マイクロ流体装置８に対する試料支持体１２の安定した正確に制御された付勢力を有利に提供する。
【００６４】
生体試料処理装置２は、ベース構造１４（たとえば通路２５に）および／またはクランププレート１８に統合された、試料支持体１２またはマイクロ流体装置８における、および／または加熱ユニット２６および／または熱伝達ユニット２４における温度を測定するように構成された１つまたは複数の温度センサをさらに含むことができる。温度センサは、たとえば光学検出器、赤外線検出器による温度測定の技術においてそれ自体よく知られているさまざまなセンサを含むことができる。好ましい実施形態において、温度センサは抵抗性センサである。温度センサは流体出口４４に接続されてもよい。１つまたは複数の温度センサは、とりわけ、抗原賦活化処理ステップ中の熱ユニットの動作を制御するように構成された温度制御システムの一部を形成することができる。
【００６５】
一実施形態において、温度制御システムならびに熱ユニット６は、自動制御システムに接続されている。制御システムは、当該技術において知られているフィードバック要素、たとえば、試薬の供給用のポンプおよびバルブシステムを制御し、指定されたプロセスパラメータの関数として加熱および冷却動作用の熱ユニット６を制御する比例、積分、および微分フィードバック要素の任意の有用な組み合わせを含むことができる。一実施形態において、自動制御システムは、たとえば市販の電子PIDコントローラを含むことができ、自動制御システムのパラメータは、コンピュータソフトウェアを用いて調整することができる。
【００６６】
図面、特に図２を参照すると、本発明の一実施形態による、試料支持体上に固定された試料のイン・サイチュ(in situ)温度誘導抗原賦活化のための方法は、
（i）試料支持体１２上に固定された試料１を提供するステップと、
（ii）マイクロ流体チャンバ４０と、このマイクロ流体チャンバの一端にある少なくとも１つの流体入口３２と、このマイクロ流体チャンバの他端にある少なくとも１つの流体出口３４と、を含み、上記マイクロ流体チャンバ内部の流体物質および試薬を均一な方法で輸送するため、流体供給システム１０からマイクロ流体チャンバ４０を介して圧力下で供給される流体を導くように構成された、マイクロ流体装置８を提供するステップであって、マイクロ流体チャンバの少なくとも１つの壁が、試料支持体１２によって形成され、マイクロ流体チャンバ４０の他方の壁３３にクランプ機構１６によって流体密かつ取り外し可能な方法でシール４２に対して取り付けられ、マイクロ流体チャンバの容積は２.５μLと２００μlとの間である、ステップと、
（iii）試料１がマイクロ流体チャンバ４０の内側に面する状態で、上記マイクロ流体チャンバと上記試料支持体とを流体密な方法で一緒に取り付けるステップと、
（iv）大気圧より高い圧力で温度制御抗原賦活化ステップＳ１を実行するステップであって、このステップは、
- １.５から５バールの間に含まれるマイクロ流体チャンバ４０における圧力Ｐchamberで流体入口３２を介してエピトープ脱マスキング溶液でマイクロ流体チャンバ４０を満たすステップと、
-  マイクロ流体チャンバをインキュベーション温度設定点（ＴAR）まで加熱し、インキュベーション持続期間ｔiの間、マイクロ流体チャンバの温度を上記インキュベーション温度設定点に維持するステップと、
-  冷却持続期間ｔcの間、上記インキュベーション温度設定点未満かつ室温以上の冷却温度までマイクロ流体チャンバを冷却するステップと、
を含み、上記インキュベーション温度設定点ＴARは約６０℃から２００℃の間に含まれ、インキュベーション持続期間ｔiは約０.５から３０分の間に含まれ、冷却持続期間ｔcは約１から３０分の間に含まれる、ステップと、
を有利に含むことができる。
【００６７】
さらなる一態様によれば、本発明による試料支持体上に固定された試料のイン・サイチュ(in situ)温度誘導抗原賦活化のための方法が提供され、上記固定された試料は、続いて同じ試料支持体上で染色、特に免疫染色およびイメージングされる。
【００６８】
さらなる一態様によれば、本発明による試料支持体上に固定された試料のイン・サイチュ(in situ)温度誘導抗原賦活化のための方法が提供され、この方法は、温度制御抗原賦活化ステップＳ１の後、
（v）少なくとも１つのイメージングプローブを含む複数の試薬を、約１μｌ／ｓと約１００μｌ／ｓとの間の範囲の流量で、流体入口を介してマイクロ流体チャンバ内に順に注入するステップと、
（vi）上記少なくとも１つのイメージングプローブと反応した試料の成分によって放出される信号をイメージングするステップ（S４）と、
をさらに含み、
複数の試薬を順に注入する上記ステップは、
-  試料上に残っている可能性がある抗体のような望ましくない物質を先のサイクルから除去するために溶出緩衝液が注入される溶出ステップ（S２、S２'）と、
-  イメージングプローブが注入される試料標識化ステップ（S３'、S３''などを含むS３）と、
を含み、
これらのステップのそれぞれは、洗浄緩衝液が注入される任意選択の洗浄ステップによって先行される。
【００６９】
他のさらなる一態様によれば、本発明による試料支持体上に固定された試料のイン・サイチュ(in situ)温度誘導抗原賦活化のための方法が提供され、この方法は、ステップ（vi）の後、
（vii）試料上に残っている可能性がある標識プローブ（たとえば抗体またはマーカー）のような望ましくない物質を除去するために溶出緩衝液が注入される溶出ステップ（S０）と、
（vi）さまざまなイメージングプローブでステップ（iv）とステップ（vii）とを繰り返すステップと、
をさらに含む。
【００７０】
一態様によれば、マイクロ流体チャンバの温度を上記インキュベーション温度設定点未満の温度まで下げることは、加熱ユニット２４をオフにすること（自然または受動冷却）によって、または、たとえば冷却ブロック５４のチャネル５６に冷却流体を流すことによる冷却ユニット２８による、強制または能動冷却によって達成することができる。冷却流体の流量を用いて、冷却の程度を制御することができる。冷却ユニット２８は、温度低下プロファイルに従って冷却期間中に冷却温度設定点（Ｔc）に達するように温度制御システムを設定することによって、すなわち冷却時間、冷却ステップサイズ、勾配を設定することによって制御することができる（能動冷却）。冷却期間は、２つ以上の温度増分の（最初のおよび後続の冷却温度設定値（Ｔc）までの）ダウンを含む、個別の性質であり得る。他の実施形態において、冷却期間は、自然冷却を伴う冷却を継続する前に、第１の冷却温度設定点（Ｔc）まで離散化される。
【００７１】
一実施形態において、第１の冷却温度設定点値（Ｔc）は、４０℃と２００℃との間の範囲から選択され、上記冷却温度設定点値は、インキュベーション温度設定点よりも低く、特に約４０℃から約６０℃である。たとえば、これは約５０℃、６０℃、７０℃、８０℃、９０℃、１００℃、１２０℃、１４０℃、１６０℃、１８０℃または２００℃であり得る。
【００７２】
一実施形態において、マイクロ流体チャンバの内部圧力値（Pchamber）は、２、２.５、３、３.５、４、４.５または５バールのような約２から５バールの間に含まれる。好ましい一実施形態において、これは１.５と３バールとの間、特に２から３バールの間である。
【００７３】
他の一実施形態において、インキュベーション温度設定点値（ＴAR）は約６０℃と約２００℃との間に含まれる。たとえば、これは約６０℃、７０℃、８０℃、９０℃、９５℃、１００℃、１１０℃、１１５℃、１２０℃、１４０℃、１６０℃、１８０℃または２００℃であり得る。好ましい一実施形態において、これは１１０℃と１４０℃との間である。
【００７４】
他の一実施形態において、インキュベーション期間の持続時間（ti）は、通常２と２０分との間、特に２から５または５から１０分である。たとえば、これは約２分、２.５分、４分、５分、１０分または２０分であり得る。全体の試料処理時間が低く保たれるように、同じ望ましい効果を達成することができれば、tiをできるだけ短く保つことが有利である。
【００７５】
他の一実施形態において、エピトープ脱マスキング溶液のpH値は５.５より高い。たとえば、エピトープ脱マスキング溶液は、６のpHまたは９のpHを有することができる。最適なAR条件は、さまざまな緩衝液組成で得ることができる。たとえば、Tween ２０を含む６のpHのクエン酸ナトリウム緩衝液または９のpHのTris-EDTA緩衝液が用いられる。他の実施形態において、より酸性の溶液（たとえばpHが５より小さい）もエピトープ脱マスキング溶液として用いることができる。
【００７６】
一実施形態において、イメージングプローブは、試料上の特定の分子実体と相互作用するのに適した標識プローブである。たとえば、イメージングプローブは、試料からのRNAまたはDNA配列（相補配列）とイン・サイチュ(in situ)ハイブリダイズさせるのに有用な標識RNAまたはDNA配列であり得る。他の例において、イメージングプローブは、標的抗原を直接結合する標識一次抗体（たとえば蛍光）である。
【００７７】
他の一実施形態において、イメージングプローブは、試料内の分析されるべき分子実体を標的とする、特定の抗体および色素原または蛍光検出分子のような一連の標識プローブの注入から生じる。一実施形態において、イメージングプローブは、一次抗体の後に注入される標識二次（たとえば蛍光）抗体から生じる。
【００７８】
特定の一実施形態によれば、注入される複数の試薬の流量は、約５μｌ／ｓから約３０μｌ／ｓ（たとえば約２５μｌ／ｓ）のような、約１μｌ／ｓから約３０μｌ／ｓの範囲である。
【００７９】
他の特定の一実施形態によれば、試料支持体１２の壁からマイクロ流体チャンバの反対側の壁３３までの距離によって画定されるようなマイクロ流体チャンバの高さは、約１０μｍから約３００μｍの範囲であり、マイクロ流体チャンバの対角線または直径は約１００μｍから約５６ｍｍの範囲であり、浅くて広い形状を形成している。
【００８０】
他の一実施形態において、注入される複数の試薬のシーケンスにおける各ステップは、マイクロ流体チャンバから溶液フローステップシーケンスにおける前の溶液を洗い流すのに必要な期間適用され、この洗い流しは、前に注入された濃度の１%までの前の溶液の濃度の減少に対応する。
【００８１】
他の一実施形態において、注入される複数の試薬のシーケンスにおける各ステップは、注入される溶液の濃度をマイクロ流体チャンバ内の意図されたプロトコル濃度の９９%まで増加させるのに必要な期間適用される。
【００８２】
一実施形態において、注入される複数の試薬のシーケンスにおける各ステップは、約５秒から約２０秒（たとえば約１０秒）のように、約１秒から約１２０秒続く。
【００８３】
他の特定の一実施形態において、複数の試薬を順に注入するステップは、
-  ブロッキング緩衝液が注入される任意選択のブロッキングステップ（S２'）と、
-  前に注入されたブロッキング緩衝液が任意のフロー条件あり、またはなしでインキュベートされる任意選択のインキュベーションステップと、
-  洗浄緩衝液が注入される任意選択の洗浄ステップと、
-  イメージングプローブが注入される試料標識化ステップ（S３）と、
-  前に注入されたイメージングプローブが任意のフロー条件あり、またはなしでインキュベートされる任意選択のインキュベーションステップと、
-  洗浄緩衝液が注入される洗浄ステップ（S３ａ）と、
-  イメージング緩衝液が注入される任意選択のプレイメージングステップ（S４'）と、
を含み、
試料標識化ステップは、標識プローブを直接、またはイメージングプローブにつながる一連の標識プローブのいずれかを注入するステップを含む。
【００８４】
特定の一実施形態によれば、試料標識化ステップＳ３は、一次抗体が注入される第１のステップ（S３'）と、洗浄緩衝液が注入される洗浄ステップ（S３'''）と、標識二次抗体が注入されるさらなるステップ（S３''）と、を含むイメージングプローブにつながる一連の標識プローブを注入するステップと、を含む。
【００８５】
特定の一実施形態において、試料標識化ステップＳ３は、一次抗体が注入される第１のステップ（SB３'）と、洗浄緩衝液が注入される洗浄ステップ（SB３'''）と、酵素結合二次抗体が注入される第２のステップ（SB３''）と、洗浄緩衝液が注入される洗浄ステップ（SB３''''）と、二次抗体に結合した酵素と反応する色素原または蛍光検出分子が注入されるさらなるステップＳB３*と、を含む。
【００８６】
他の特定の一実施形態において、試料標識化ステップは、一次抗体が注入される第１のステップ（SB３'）と、洗浄緩衝液が注入される洗浄ステップ（SC３'''）と、ポスト一次抗体が注入される第２のステップと、洗浄緩衝液が注入される洗浄ステップ（SC３''）と、酵素結合二次抗体が注入される第３のステップ（SC３''''）と、洗浄緩衝液が注入される洗浄ステップ（SC３*）と、二次抗体に結合した酵素と反応する色素原または蛍光検出分子が注入されるさらなるステップＳC３**と、を含む。
【００８７】
他の特定の一実施形態において、試料標識化ステップは、標識RNAまたはDNAプローブのような、試料内の何らかのDNA／RNA物質とのイン・サイチュ(in situ)ハイブリダイゼーションのために少なくとも１つの標識プローブを注入するステップを含む。
【００８８】
さらなる特定の一実施形態において、試料標識化ステップが、試料内の何らかのDNA／RNA物質とのイン・サイチュ(in situ)ハイブリダイゼーションのために少なくとも１つの標識プローブを注入するステップを含むとき、本発明の方法は、試料内の何らかのDNA／RNA物質とRNAまたはDNAプローブ（相補配列）のハイブリダイゼーションおよびデハイブリダイゼーションステップに要求されるマイクロ流体チャンバ内の温度サイクルを適用することをさらに含む。たとえば、マイクロ流体チャンバまたは試料支持体の外部のヒータが、このような温度サイクルを適用することができる。イン・サイチュ(in situ)ハイブリダイゼーションは、たとえば、Modern Pathology、２０１１年、２４、６１３〜６２３、doi:１０.１０３８／modpathol.２０１０.２２８において定義されたように達成することができる。次いでRNAおよびDNA配列検出用の固定ハイブリダイゼーションプローブ（標識相補配列プローブ）上でイメージングを達成することができる。
【００８９】
特定の一実施形態において、注入される複数の試薬のシーケンスにおける各ステップは、各試薬について２つの流量ステップ、すなわち、
-  約１μｌ／ｓと約１００μｌ／ｓとの間の範囲の初期流量で試薬が注入される第１の流量ステップと、
-  シーケンスにおける次の試薬を注入する前に、同じ試薬がより低流量（通常約０.００１から約１.０μｌ／ｓ）で注入され、その試薬の試料との十分な流れを確実にする、第２の流量ステップと、
を含む。
【００９０】
さらなる特定の一実施形態において、試薬の第２の流量ステップは約１分から約３０分（たとえば約２から約１５分）続く。
【００９１】
特定の一実施形態によれば、第２の流量ステップの持続時間は、用いられるマイクロ流体チャンバ４０の容積、および試薬の試料とのインキュベーションに必要な時間に依存する。通常の一次抗体分子について、１００μｍ未満のチャンバ高さには約１分の計算されたインキュベーション時間が要求される。
【００９２】
一実施形態において、イメージングステップ（vi）は、共焦点蛍光顕微鏡法によって行われる。
【００９３】
一実施形態において、イメージングステップ（vi）は、蛍光顕微鏡法によって行われる。
【００９４】
一実施形態において、イメージングステップ（vi）は、明視野顕微鏡法によって行われる。
【００９５】
特定の一実施形態によれば、洗浄緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）およびトリス緩衝生理食塩水（TBS）から選択される。
【００９６】
特定の一実施形態によれば、溶出緩衝液は、界面活性剤（TritonX）が補充された低pH（たとえばpH２）の溶液から選択される。溶出緩衝液溶液は、高イオン塩濃度（たとえば、約０.００１M NaClから約１M NaClまで）またはカオトロピック剤をさらに含むことができる。
【００９７】
特定の一実施形態によれば、ブロッキング緩衝液は、クエン酸ナトリウム緩衝液、およびタンパク質（たとえばウシ血清アルブミンまたは血清）および／または界面活性剤（たとえばTween）を補充したPBSから選択される。
【００９８】
特定の一実施形態によれば、非特異的結合ブロッキングステップ（S２）は任意選択である。
【００９９】
特定の一実施形態によれば、試料標識化ステップは、一次抗体が注入される第１のステップ（S３'）と、洗浄緩衝液が注入される洗浄ステップ（S３'''）と、二次抗体が注入されるさらなるステップ（S３''）と、を含む。
【０１００】
特定の一実施形態によれば、本発明の一次抗体は、Dabbs、Diagnostic Immunohistochemistry: theranostic and diagnostic applications、４th edition、２０１４年、ISBN ９７８-１-４５５７-４４６１-９に記載されたような任意の免疫組織化学および免疫蛍光アッセイのための任意の適切な抗体であり得る。たとえば、適切な抗体は、臨床的に関連するエピトープに対するマウスまたはウサギ抗ヒト免疫グロブリンGまたはY抗体である。
【０１０１】
他の一実施形態において、流れは連続的な方法で適用される。
【０１０２】
特定の一実施形態によれば、本発明による方法は、少なくとも約２から８０サイクルのステップ（iv）から（vii）、特に少なくとも約２０から８０サイクルのステップ（iv）から（vii）を含む。
【０１０３】
特定の一実施形態によれば、本発明による方法は、２から約２００サイクルまでのステップ（iv）から（vii）、特に２から約２０サイクルまで、または２から約１００サイクルまでを含む。
【０１０４】
一態様によれば、本発明の方法は、さまざまな試料、特に組織切片、細胞培養物、タンパク質または核酸調製物を含む生体試料に関する分子プロファイリングのサイクル多重化による試料のイン・サイチュ(in situ)イメージングを可能にする。
【０１０５】
他の一態様によれば、さまざまな種類の技術によって固定されたような本発明の方法による分析のために提供される試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織試料、低温固定組織試料、細胞塗抹標本、生検試料、および固定細胞製剤を含む。特に、本発明に記載の方法は、全組織試料、乳房、肺、扁桃、リンパ節、前立腺、腸、肝臓または腎臓を含むがこれらに限定されない組織タイプの外科的または針生検のような、架橋剤によって固定される試料に適用することができる。これらの方法は、がん、たとえば乳がん、肺がん、前立腺がん、卵巣がん、結腸直腸がんおよび黒色腫からの生検を含む、固定された腫瘍試料にも適用することができる。これらの方法は、体液のような流体性の固定化試料、たとえば固定化血液試料または細胞塗抹標本にも適用することができる。これらの方法は、細菌のような微生物の性質の試料にも適用することができる。試料の種類および所望の用途に応じて、さまざまな種類の試料調製ステップを実現することができる。たとえば、本発明に記載の方法は、薄片に切断され、その後顕微鏡スライドのような支持体に適用される架橋剤によって固定される試料にも適用することができる。開示された方法での使用に適した顕微鏡スライドは、ポリリジン被覆スライドまたはゲル被覆スライドのような被覆スライドまたは帯電スライドを含む。開示された方法は、たとえば、少なくとも１つの表面が生体標的の固定および捕捉能力を備えた（認識分子で被覆された表面など）マイクロ流体装置の閉鎖チャンバの変形を提供して、浮遊試料をチャンバ内に注入することによって、浮遊状態の浮遊試料で実行することもできる。
【０１０６】
この代替例において、本発明の方法において用いられる試料支持体上に固定された試料は、試料に対して特異的な親和性を有する試料支持体の表面上に浮遊試料を固定することによって予備的に得られる。
【０１０７】
他の一態様によれば、標識プローブは、イン・サイチュ(in situ)ハイブリダイゼーションまたは増幅プローブのようなイメージングプローブにつながる化学染料、抗体および抗体フラグメント、またはオリゴヌクレオチドを含む。
【０１０８】
上記特徴は、任意の適切な方法で組み合わせることができる。
【０１０９】
本発明の方法についての顕著な利点は、特に各イメージングサイクルを通して、抗原の脱マスキングを行うため、およびイメージングのために試料カバースリップを繰り返し取り付けおよび取り外しする必要性を取り除くことであり、これは試料の完全性に影響を与え、再現性の低下をもたらすとともに、再現可能な標識化にも不可欠である、このような処理の完全な自動化を妨げることがある。
【０１１０】
本発明の方法についてのさらなる顕著な利点は、抗原賦活化のようなステップのための前処理時間および用いられる試薬量を削減することであり、この結果、より低い試薬消費でより高いスループットが得られる。
【０１１１】
試料分析から離れて、本発明による方法は、イン・サイチュ(in situ)ハイブリダイゼーションなどによる遺伝子配列検出の多重化に有用であり得る。
【０１１２】
本発明の他の特徴および利点は、特許請求の範囲、詳細な説明、および図面から明らかになるであろう。本発明を説明してきたが、以下の実施例は、限定ではなく例示として提示されている。
【０１１３】
（実施例）
（実施例１）
連続的な試料標識化サイクルを実行するための可能な多重化プロトコルでのイン・サイチュ(in situ)抗原賦活化および免疫蛍光免疫染色
試料のイン・サイチュ(in situ)高圧温度制御抗原賦活化および免疫蛍光免疫染色のための本発明の方法が、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織試料上で図１に示したような装置において実施され、連続的な試料標識化サイクルを実行するための任意選択のサイクル多重化で図２に示したようなプロトコルに従う。
【０１１４】
ａ）試料調製の例
試料の種類および所望の用途に応じて、さまざまな種類の試料調製ステップを実現することができる。この例において、前に実行されたFFPE組織試料のための試料調製ステップを典型的な一例としてここで説明する。
【０１１５】
生体試料の組織スライドは、まずHistoclear（商標）溶液において手動で脱パラフィンされ、標準的な手順に従ってEtOHシリーズにおいて徐々に再水和される。この手順は、本発明の装置のマイクロ流体チャンバの外部で実行される（「オフチップ」）。試料は次いで、図１ａ〜図１ｇおよび図６ａ〜図６ｂに示した実施形態に関して上で議論した例示的な装置において示したような本発明の方法を実施する準備ができる。例示的な生体試料処理装置２は、本発明によるイン・サイチュ(in situ)抗原賦活化および免疫蛍光免疫染色（「オンチップ」）の方法を実施するために用いられ、たとえばａ）の下で調製された試料１が試料支持体１２上に固定され、この試料支持体はマイクロ流体装置８に対して維持され、前述したようなプロセス中、マイクロ流体チャンバ４０の周りに耐圧流体密シールを形成する。
【０１１６】
ｂ）本発明の方法を実施するための装置を準備する例
まず、マイクロ流体チャンバ４０は、自動化することができる流体送達制御システムを介して作動させることができる装置の試薬送達システムを介して、抗原賦活化のための媒体として適切な特性を有する溶液（抗原賦活化溶液）で満たされる（図２AのステップＳ１'）。マイクロ流体チャンバ４０内部の圧力は、圧力センサ（たとえばマノメータ）を含む生体試料処理装置の制御システムによって制御される流体供給システム１０によって、大気圧より高い圧力値（Pchamber）で生成される（通常約１.５〜５バール、たとえば約２〜３バール）。
【０１１７】
（実施例２）
イン・サイチュ(in situ)高圧温度誘導抗原賦活化および免疫蛍光免疫染色シーケンス
本発明の方法の初期イン・サイチュ(in situ)高圧温度制御抗原賦活化ステップは、組織および試薬の調製後に開始することができる。
【０１１８】
温度制御AR処理ステップ（図２AのステップＳ１''）が、生体試料処理装置２の温度制御システムを介して高圧（約２から３バール）下で行われ、マイクロ流体チャンバ４０における温度は、
（i）マイクロ流体チャンバの温度が制御下で室温からインキュベーション温度設定点（ＴAR）まで加熱される制御された加熱期間と、
（ii）マイクロ流体チャンバの温度（Ｔi）がインキュベーション温度設定点（ＴAR）に維持されるインキュベーション期間と、
（iii）マイクロ流体チャンバの温度がインキュベーション温度設定点から冷却温度設定点まで冷却され、マイクロ流体チャンバの冷却は、自然冷却または能動冷却、すなわち制御下のいずれかであり得る、冷却期間と、
を含む温度制御プロトコルを介して制御される。
【０１１９】
インキュベーション温度設定点、冷却温度設定点、加熱および冷却時間、温度ステップサイズ、勾配は、脱マスクするエピトープの種類に依存する。
【０１２０】
温度制御プロトコルを図２Bに概略的に表している。
【０１２１】
通常、制御された加熱期間（t１からt２）は約１分から約３分続き、インキュベーション温度設定点は約８０から約１３０℃であり、インキュベーション期間（t２からt３）は約２分から約２０分続き、冷却期間（t３からt４）は約１分から約２０分続き、冷却温度設定点は、自然冷却の場合は室温、またはインキュベーション温度設定点より約２０から約９０%低い温度のいずれかであり得る。例示的な温度制御プロトコルが、実施例２および実施例３の下で提供されている。
【０１２２】
冷却期間中、または好ましくはその直後に初期免疫染色／イメージングシーケンスを開始することができる。連続的な試料標識化およびイメージングサイクルを実行するために利用される本発明による方法において用いられるイメージング試薬シーケンス（洗浄／溶出溶液、ブロッキング溶液、標識プローブ溶液などを含む）を図２Aに概説している。このようなイメージング試薬シーケンスは、流体供給システムによって流体入口３２を介してマイクロ流体チャンバ４０に連続的に導入される。この方法が多重化モードで用いられるとき、最初のイメージングステップの後、抗原賦活化ステップから他の標的マーカーのイメージングステップまでのすべてのステップは、以下に詳述するように繰り返すことができる。
【０１２３】
溶出ステップ（ステップＳ０またはS２、図２A）
免疫染色／イメージングシーケンスの各サイクル（S２で始まる最初のサイクルを除く）は、溶出緩衝液を流すことによって組織試料をまず溶出させることで始まり、溶出緩衝液の組成およびpH条件は、試料上に残っている可能性がある望ましくない物質（たとえば抗体のような標識プローブ）を除去するための分析試料によって異なり得る。たとえば、０.０５%のTritonX界面活性剤を補充したpH２での０.１Mのグリシン緩衝液を溶出緩衝液として用いることができる。
【０１２４】
任意選択の非特異的結合ブロッキングステップ（ステップＳ２'、図２A）
ブロッキング緩衝液（たとえばクエン酸ナトリウム緩衝液またはウシ血清アルブミンを含むPBS-Tween）が次いで、その後のステップにおいてタンパク質の非特異的結合を低下させるため、マイクロ流体チャンバを介してイメージング試薬シーケンスのシーケンスにおいて任意選択で流される。
【０１２５】
試料標識化ステップ（ステップＳ３（S３'〜S３''）図２A）
イメージングプローブまたはイメージングプローブにつながる標識プローブが次いで、マイクロ流体チャネルを流れるイメージング試薬のシーケンスに導入される。たとえば、標識化プローブにつながる標識プローブのシーケンスは、一次抗体および次いで二次抗体（標識プローブ）が流れてインキュベートされながら、各ステップ間に洗浄緩衝液で試料を洗浄するシーケンスを含む。標識プローブの希釈率は、最適化されたプロトコルまたはベンダーの指示に応じて決定される。
【０１２６】
あるいは、試料標識化ステップの他の一例は、イン・サイチュ(in situ)ハイブリダイゼーションのためにRNAまたはDNA標識プローブを注入するステップを含む。この場合、この方法は、試料内のRNAまたはDNA物質のRNAまたはDNA標識プローブの相補配列とのハイブリダイゼーションを確実にするために適切な温度サイクルを適用するステップをさらに含む。
【０１２７】
イメージングステップ（ステップＳ４、図２A）
このサイクルの終了後にイメージングが実行される。
【０１２８】
さまざまなイメージングプローブでサイクル的プロセス全体（ステップＳ０からS４）を約５０回まで繰り返すことができる。
【０１２９】
本発明の方法の使用の例を本明細書で提供する。
【０１３０】
- FFPE乳房腫瘍切片のプロゲステロン受容体（PR）染色のためのエピトープ活性化
以下のTable １（表１）は、試料の調製（１、２）の、および図３に示すような染色画像につながる本発明の方法のステップＳ１からS４（３〜８）の一サイクルを試料に受けさせる例を示している。
【０１３１】
【表１】
2020527707.tif 000002
【０１３２】
Table １（表１）に記載されたように試料が調製され、スライドグラスが再度PBSで洗浄されて、０.２５%のTriton-X界面活性剤を補充したPBSに１５分間浸される。その後、スライドは、本発明の方法を実施するための本明細書に記載したような装置内に挿入される。
【０１３３】
この例において、温度制御AR処理ステップＳ１のプロセス全体の持続は、高圧（約２から３バール）下で行われ、以下のように１０分未満に保たれる。
（i）約２.５分で室温からインキュベーション温度設定点までマイクロ流体チャンバ４０を制御加熱すること
（ii）インキュベーション温度設定点で試料をAR溶液と２から５分間インキュベートするためのインキュベーション期間
（iii）約２.５分から７分以内にインキュベーション温度設定点から室温に戻すマイクロ流体チャンバ４０の能動冷却
【０１３４】
高圧温度制御AR処理ステップに続く冷却期間の後、試料の免疫染色／イメージングが、流体供給システムによって流体入口を介してマイクロ流体チャンバ４０にイメージング試薬のシーケンスを連続的に導入することによって開始され、イメージングプローブは、Table １（表１）に記載したように標識プローブとして一連の抗体（一次および二次）を注入した結果、生じるものである。
【０１３５】
一次抗体結合:１５μｌ／ｓの流量で１０秒間適用され、次いで４分間インキュベートされる。（S３'）
【０１３６】
洗浄:PBSが２５μｌ／ｓの流量で１０秒間適用される。（S３'''）
【０１３７】
二次抗体結合:１５μｌ／ｓの流量で１０秒間適用され、次いで４分間インキュベートされる。（S３''）
【０１３８】
洗浄:PBSが２５μｌ／ｓの流量で１０秒間適用される。（S３'''）
【０１３９】
イメージング:免疫蛍光染色後、スライドを対比染色し、カバースリップで取り付けて、顕微鏡下でイメージングした（S４）。次いで、画像をZeiss Axiovision（登録商標）ソフトウェア上で視覚化し、ImageJ（登録商標）で分析した。図３は、記載の試料処理および蛍光免疫染色方法を用いて得られた画像を示している。DAPIチャネルは、試料上の核の局在化を支援するために示されている。次いで、PRチャネルおよび２つのチャネルの組み合わせが別個に示されている。本発明の温度制御支援方法を用いると、この例に見られるように試料処理時間が劇的に削減された。
【０１４０】
- 同じ試料上の複数のマーカーの連続的エピトープ賦活化および蛍光免疫染色
本発明の方法を用いて、４つの異なるマーカー、HER２（ヒト上皮成長因子受容体２）、ER（エストロゲン受容体）、PR（プロゲステロン受容体）およびCK（サイトケラチン）を共発現する領域を有する試料（FFPE乳房切片）上でイン・サイチュ(in situ)高圧温度制御AR処理ステップを行い、以下のように本発明の方法に従って約２から３バールの圧力下において各ステップ間で標的エピトープが再活性化された。
【０１４１】
マイクロ流体装置の外部で試料の前処理を実行し、乳房腫瘍切片について上述したように試料の脱パラフィンを実行した。Table ２（表２〜表４）は、用いた方法の特定のプロトコルを要約したものである。
【０１４２】
しかしながら、この例において、９５℃の熱浴と４０分のインキュベーションにおける標準的な手順に従ってマイクロ流体装置の外部で染色する前に最初の温度制御AR処理ステップを行って（「オフチップ」）、エピトープを再活性化する染色サイクル間で温度制御AR処理ステップの単独の効果を調査した。
【０１４３】
次いで温度制御AR処理後の試料上で、４サイクルのチラミドシグナル増幅（TSA）ベースの蛍光免疫染色によって試料の反復免疫染色を実行し、免疫染色は、以下のTable ２（表２〜表４）に挙げた条件下で本発明の方法を適用した試料についてマイクロ流体装置内でイン・サイチュ(in situ)で実行した。４番目のバイオマーカーが染色された後、細胞核の可視化のため、SlowFade Gold（商標）を用いて試料を対比染色した。
【０１４４】
【表２】
2020527707.tif 000003
【０１４５】
【表３】
2020527707.tif 000004
【０１４６】
【表４】
2020527707.tif 000005
【０１４７】
次いで、イメージングプローブの波長、３５０、４８８、５９４および６４７ｎｍに対応する４つの別々のチャネルにおいて共焦点顕微鏡上で画像を取得した。
【０１４８】
本発明の中間抗原賦活化処理方法により、短時間で次の染色サイクルに進むことが可能になり、その結果、各サイクルが約１０分未満に短縮される一方、試料の高性能の多重化標識を達成したことが分かった。
【０１４９】
（実施例３）
HER２のためのFFPE乳房腫瘍切片のイン・サイチュ(in situ)抗原賦活化および蛍光免疫染色
以下のように２つの異なるプロトコルに従って標準的なスライド上に固定されたFFPE乳房切片からのHER２エピトープ活性化のために本発明の抗原賦活化方法を用いた。
【０１５０】
試料は、実施例２のように前処理した（EtOHにおける脱パラフィンと段階的な再水和）。次いで、６のpHのAR溶液（ThermoScientific L pH６）をマイクロ流体チャンバに充填し、図４ａおよび図４ｂにおいて見られるように２つの異なる温度制御プロトコルを温度制御要素に適用した。第１のプロトコルにおいて、AR溶液を試料に対して１０５℃で５から１０分間インキュベートした。次いで、温度制御システムを用いて３℃の１分ステップで８５℃までチャンバを徐々に冷却した後、室温に達するまで高速能動冷却ステップを行なった（図４ａ）。第２のプロトコルは、AR溶液で試料を９８℃で１０分間インキュベートした後、制御された４ステップの冷却および高速冷却ステップを行った他の変形を示している（図４ｂ）。
【０１５１】
（実施例４）
本発明のイン・サイチュ(in situ)抗原賦活化方法とFFPE乳房腫瘍切片上の標準的な抗原賦活化との比較
本発明のイン・サイチュ(in situ)高圧温度制御AR処理方法を、FFPE乳房切片試料を用いた熱浴における標準的なAR手順と比較した。AR処理ステップ後、４つの異なるマーカー（HER２（ヒト上皮成長因子受容体２）、ER（エストロゲン受容体）、PR（プロゲステロン受容体）およびCK（サイトケラチン）の１つについて各試料を染色し、次いで画質およびコントラストを分析および比較した。
【０１５２】
制御試料についてのAR処理を、９５℃の熱浴において３０分のインキュベーション時間で実行した。本発明のAR方法で処理された試料に、実施例１において説明したARプロトコルを受けさせた。
【０１５３】
染色プロトコルは、２つの異なるARプロトコルで処理された試料について同一に保った。実施例１において定義したプロトコルを用いたが、唯一の違いは、蛍光二次抗体の代わりにHRPベースの発色性検出要素を用いたことである。
【０１５４】
図５は、これらの異なるバイオマーカーについての染色のそれぞれについてコントラストが少なくとも倍増加し、したがって、画質はオフチップAR後に標準的な方法で実行された染色よりはるかに高いことを示している一方、本発明のプロセス持続時間は実質的に短縮された（３０分とは対照的に約５分の高温インキュベーション）。
【符号の説明】
【０１５５】
１  試料
２  生体試料処理装置
４  支持機構
６  熱ユニット
８  マイクロ流体装置
９  基板
１０  流体供給システム
１２  試料支持体
１４  ベース構造
１６  クランプ機構
１７  ヒンジリンケージ
１８  クランププレート
１９  スペーサ
２０  観察通路
２２  作動レバー機構
２４  熱伝達ユニット
２５  通路
２６  加熱ユニット（ペルティエ素子）
２８  冷却ユニット
３０  冷却流体入口／出口
３２  流体入口オリフィス
３３  第１の面
３４  流体出口オリフィス
３５  第２の面
３６  マイクロ流体入口チャネルネットワーク
３７  チャンバ入口オリフィス
３８  マイクロ流体出口チャネルネットワーク
３９  チャンバ出口オリフィス
４０  マイクロ流体チャンバ
４２  シール
４４  流体供給チャネル
４６  流体出口チャネル
４８  シール
５０  取り付け装置
５１  可動ピストン
５３  圧縮空気入口
５４  冷却ブロック
５６  流体流チャネル
【図１ａ】
2020527707.tif 000006
【図１ｂ】
2020527707.tif 000007
【図１ｃ】
2020527707.tif 000008
【図１ｄ】
2020527707.tif 000009
【図１ｅ】
2020527707.tif 000010
【図１ｆ】
2020527707.tif 000011
【図１ｇ】
2020527707.tif 000012
【図２ａ】
2020527707.tif 000013
【図２ｂ】
2020527707.tif 000014
【図３Ａ】
2020527707.tif 000015
【図３Ｂ】
2020527707.tif 000016
【図３Ｃ】
2020527707.tif 000017
【図４ａ】
2020527707.tif 000018
【図４ｂ】
2020527707.tif 000019
【図５】
2020527707.tif 000020
【図６ａ】
2020527707.tif 000021
【図６ｂ】
2020527707.tif 000022
【国際調査報告】
2020527707.tif 000023
2020527707.tif 000024
2020527707.tif 000025