(57)【要約】  本開示の実施形態は、血管内皮成長因子ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐなどのタンパク質の電荷変異体を分析する方法に対応する方法、システム、機器、及び、キットに関する。【選択図】図１Ａ
2020531802.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管内皮成長因子ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐの電荷変異体を分析する方法であって：
少なくとも両性電解質担体、メチルセルロース、及び、安定化添加剤の混合物を含む分離用毛細管にタンパク質試料を取り込ませることと；
第１の所定の時間、第１の電圧を印加することであって、前記両性電解質担体に、前記毛細管内でｐＨ勾配を形成させる、前記第１の電圧を印加することと；
第２の所定の時間、第２の電圧を印加することであって、前記毛細管内での前記タンパク質の電荷変異体の移動に焦点を合わせて、前記変異体の全体的な電荷を中性にする、前記第２の電圧を印加することと；
前記タンパク質の電荷変異体を検出及び定量することと、を含む、前記方法。
【請求項２】
電荷変異体の検出及び定量が：
複数の電荷変異体アイソフォームの吸光度を測定することと；
前記複数の電荷変異体アイソフォームを、少なくとも第１の酸／酸性領域（Ｒ１）、第２の中性領域（Ｒ２）、及び、第３の塩基／塩基性領域（Ｒ３）を含む、単離した領域に分離することと；
領域Ｒ１、Ｒ２、及び、Ｒ３のそれぞれに含まれる電荷変異体アイソフォームのパーセンテージを決定することと、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
電荷変異体の検出及び定量の双方を行う、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
電荷変異体を、約２８０ｎｍの波長で検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記毛細管チューブに取り込ませたタンパク質の濃度が、約２．０ｍｇ／ｍｌである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
安定化添加剤が、尿素を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記混合物での尿素の量は、約２Ｍを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記混合物が、約０．３５％のメチルセルロースを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記第１の電圧が、１５００Ｖを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１の所定の時間が、約１分である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記第２の電圧が、３０００Ｖを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記第２の所定の時間が、約７分である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記毛細管チューブに取り込ませたタンパク質の濃度が、約１．０〜８．０ｍｇ／ｍｌ、または、その間のあらゆる範囲である、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
前記混合物での尿素の量が、０Ｍより大きく、かつ、約８Ｍより小さく、または、その間のあらゆる範囲である、請求項６に記載の方法。
【請求項１５】
前記混合物が、約０．０１％〜約０．３５％、または、その間のあらゆる範囲のメチルセルロースを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１の電圧は、約１Ｖ〜約３０００Ｖの間、または、その間のあらゆる範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１の所定の時間は、約１秒〜約５分の間、または、その間のあらゆる範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記第２の電圧は、約１Ｖ〜約６０００Ｖの間、または、その間のあらゆる範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記第２の所定の時間は、約１分〜約１４分、または、その間のあらゆる範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐの電荷変異体分析での使用のために構成したｉＣＩＥＦ毛細管チューブであって：
タンパク質を取り込めるように構成しており、かつ、両性電解質担体、メチルセルロース、及び、安定化添加剤の混合物を有する構成の毛細管チューブを含み、
前記毛細管チューブが、フルオロカーボンコーティングを含む、前記ｉＣＩＥＦ毛細管。
【請求項２１】
前記毛細管の構成要素が、請求項２〜１９のいずれか１つ以上と適合する、請求項２０に記載の毛細管チューブ。
【請求項２２】
請求項１９〜２０のいずれかに記載の１つ以上の毛細管チューブを含む、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐの電荷変異体分析での使用のために構成したｉＣＩＥＦキット。
【請求項２３】
請求項１〜１９のいずれかに記載の方法を行うためのシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年８月１８日に出願した、米国仮出願第６２／５４７，６０２号の優先権を主張するものであって、同出願の全内容を参照により本明細書に援用する。
【０００２】
配列表
本願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩフォーマットで提出し、かつその全内容を参照により本明細書に援用する配列表を含む。２０１８年８月１５日に作成した同ＡＳＣＩＩコピーは、その識別名が、ＲＥＧＥ−００５＿００１ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔであり、そして、大きさは、４，２１４バイトである。
【０００３】
開示の分野
本開示の分野は、試料マトリックスでのＶＥＧＦ  Ｔｒａｐなどのタンパク質の電荷変異体を分析するための方法とシステムに関する。
【背景技術】
【０００４】
電荷変異体は、大抵の場合、かような変化が、薬物の活性、安定性、そして、場合によっては、患者の安全性にも影響を与える場合があるので、電荷変異体の分析は、バイオ医薬品として使用する様々なタンパク質について必要とされている。当該業界で使用している電荷変異体を特定及び特徴決定するための従来の方法として、イオン交換クロマトグラフィー、等電点電気泳動ゲル電気泳動、及び、キャピラリー等電点電気泳動がある。画像キャピラリー等電点電気泳動法は、その解像度の高さ、試料が少量で済むこと、それに、高速での実行時間が故に有用である、ことが認められている。したがって、画像キャピラリー等電点電気泳動を使用して、ＶＥＧＦ  Ｔｒａｐなどのタンパク質の電荷変異体を決定する方法及びシステムは有益である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本明細書では、様々なタンパク質の電荷変異体分析のための方法及びシステムを記載している。例えば、これらの方法とシステムを使用して、ＶＥＧＦ  Ｔｒａｐの電荷変異体を分析することができる。ＶＥＧＦ  Ｔｒａｐを分析するための承認済の方法、すなわち、等電点電気泳動ゲルをバンド３〜９にグループ分けして電荷変異体分布を報告する方法に代えて、本明細書で説明する方法及びシステムは、一般的に、画像キャピラリー等電点電気泳動を使用して、電荷変異体のアイソフォームのパーセンテージに関する電荷不均一性を報告し、そして、それらを電気泳動図の３つの異なる領域にグループ分けする。ここで報告する手順では、ＶＥＧＦ  Ｔｒａｐ試料のアイソフォームで認められる変化に対して、さらに敏感になり得る。
【０００６】
上記したように、本開示の実施形態は、タンパク質の電荷変異体を決定するための方法、システム、及び、機器、特に、以下で「ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ」と称する血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）ブロッカーなどのタンパク質の電荷分散を評価するための画像キャピラリー等電点電気泳動（ｉＣＩＥＦ）アッセイに関する。ｉＣＩＥＦとは、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ電荷変異体分析のための承認済の等電点電気泳動（ＩＥＦ）法の代替法である。
【０００７】
ｉＣＩＥＦの実施形態は、等電点（ｐＩ）に基づいて、タンパク質電荷変異体を分離する技術に対応している。例えば、一部の実施形態では、タンパク質試料を、両性電解質担体（例えば、Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ（商標））、メチルセルロース、及び、安定化添加剤（すなわち、尿素）の混合物を含む分離毛細管に取り込ませる。所定の時間、電圧を印加すると、両性電解質担体が、毛細管内でｐＨ勾配を形成する。一部の実施形態では、当該電圧を、「電気泳動」時間に対応する第２のより長い時間かけて印加する。これにより、当該タンパク質電荷変異体は、当該変異体の全体的な電荷が中性になる時点（すなわち、それらのｐＩ）に達するまで、当該毛細管内を移動する。
【０００８】
そのような実施形態において、当該毛細管チューブ（フルオロカーボン（ＦＣ）でコーティングしたもの）を、タンパク質電荷変異体を直接に検出、及び、定量することを可能にするデジタル（例えば、ＣＣＤ）カメラに接続する。特に、焦点調節した後に、当該毛細管チューブを（好ましくは、リアルタイムで）画像化するようにＣＣＤカメラを構成して、毛細管内のタンパク質を検出する。一部の実施形態では、約２８０ｎｍの波長で検出する。この技術でのパラメーターとして、
−  両性電解質のブランドと濃度、
−  使用する添加物の種類と濃度、及び
−  焦点調節時間と試料濃度、がある。
【０００９】
当該毛細管内でのタンパク質の凝集と沈殿は、電気泳動図の再現性に悪影響を及ぼす。この点に関して、尿素などの添加剤の使用は、タンパク質に対する焦点を調節する際に、当該タンパク質の安定化及び可溶化に役立ち得る。
【００１０】
したがって、一部の実施形態では、血管内皮成長因子ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐの電荷変異体を分析する方法を提供しており、この方法は、少なくとも両性電解質担体、メチルセルロース、及び、安定化添加剤の混合物を含む分離用毛細管にタンパク質試料を取り込ませることと、第１の所定の期間、第１の電圧を印加することであって、当該両性電解質担体に、当該毛細管内でｐＨ勾配を形成させる、当該第１の電圧を印加することと、第２の所定の期間、第２の電圧を印加することであって、それぞれのｐＩまでの当該タンパク質の電荷変異体の移動に対する焦点を合わせる、当該第２の電圧を印加することと、当該タンパク質の電荷変異体を検出及び定量することと、を含む。
【００１１】
そのような実施形態において、電荷変異体の検出及び定量は、複数の電荷変異体アイソフォームの吸光度を測定することと、当該複数の電荷変異体アイソフォームを、少なくとも第１の酸／酸性領域（Ｒ１）、第２の中性領域（Ｒ２）、及び、第３の塩基／塩基性領域（Ｒ３）を含む単離した領域に分離することと、領域Ｒ１、Ｒ２、及び、Ｒ３のそれぞれに含まれる電荷変異体アイソフォームのパーセンテージを決定することと、を含む。
【００１２】
そのような実施形態の場合、検出及び定量のための画像分析は、従来の方法及びシステム（例えば、画像分析ソフトウェアに従うことができる。
【００１３】
上記においてまとめた実施形態では、以下のさらなる特徴／機能の１つ以上を含み得る（その結果、なおもさらなる発明の実施形態を提供する）が、これらの特徴のいずれか１つ以上は相違し得るものであり、かつ、それらは依然として本発明の範囲内にあり得ることを申し添える。以下に提供したリストは一実施形態に過ぎない：
−  電荷変異体を、検出及び定量する；
−  電荷変異体を、約２８０ｎｍの波長で検出する；
−  当該毛細管チューブに取り込ませるタンパク質の濃度は、約２．０ｍｇ／ｍｌである；
−  当該安定化添加剤は、尿素を含む；
−  当該混合物中の尿素の量は、約２Ｍである；
−  当該混合物は、約０．３５％のメチルセルロースを含む；
−  当該第１の電圧は、１５００Ｖを含む；
−  当該第１の所定の時間は、約１分である；
−  当該第２の電圧は、３０００Ｖを含む；
−  当該第２の所定の時間は、約７分である；
−  当該毛細管チューブに取り込ませるタンパク質の濃度は、約１．０〜８．０ｍｇ／ｍｌの間である；
−  当該混合物での尿素の量は、０Ｍより大きく、かつ、約８Ｍ未満である；
−  当該混合物は、約０．０１％〜約０．３５％、または、その間のあらゆる範囲のメチルセルロースを含む；
−  当該第１の電圧は、約１Ｖ〜約３０００Ｖの間、または、その間のあらゆる範囲である；
−  当該第１の所定の時間は、約１秒〜約５分の間、または、その間のあらゆる範囲である；
−  当該第２の電圧は、約１Ｖ〜約３０００Ｖの間、または、その間のあらゆる範囲である；及び／または
−  当該第２の所定の時間は、約１分〜約１４分の間、または、その間のあらゆる範囲である。
【００１４】
一部の実施形態では、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐの電荷変異体分析での使用のために構成したｉＣＩＥＦ毛細管チューブを提供しており、これは、タンパク質を取り込めるように構成しており、かつ、両性電解質担体、メチルセルロース、及び、安定化添加剤の混合物を有する構成の毛細管チューブを含む。当該毛細管チューブは、フルオロカーボンコーティングも含み得る。
【００１５】
一部の実施形態では、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐの電荷変異体分析での使用のために構成したｉＣＩＥＦキットを提供しており、当該ｉＣＩＥＦキットは、タンパク質を取り込めるように構成しており、かつ、両性電解質担体、メチルセルロース、及び、安定化添加剤の混合物を有する構成の１つ以上の毛細管チューブを含み、当該毛細管チューブは、フルオロカーボンコーティングを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１Ａ〜１Ｆは、異なる両性電解質を使用したＶＥＧＦ  Ｔｒａｐの電気泳動図を示す。図１Ａでは、当該両性電解質は、ｐＩが３〜１０のＰｈａｒｍａｌｙｔｅ（商標）であり；図１Ｂでは、当該両性電解質は、ｐＩが５〜８のＰｈａｒｍａｌｙｔｅ（商標）と、ｐＩが８〜１０．５のＰｈａｒｍａｌｙｔｅ（商標）との組み合わせであり；図１Ｃでは、当該両性電解質は、ｐＩが２〜９のＳｅｒｖａｌｙｔ（商標）であり；図１Ｄでは、当該両性電解質は、ｐＩが４〜９のＳｅｒｖａｌｙｔ（商標）であり；図１Ｅでは、当該両性電解質は、ｐＩが３〜１０のＢｉｏｌｙｔｅ（商標）であり；及び、図１Ｆでは、当該両性電解質は、ｐＩが、３〜１０のＰｈａｒｍａｌｙｔｅ（商標）と、ｐＩが６．７〜７のＰｈａｒｍａｌｙｔｅ（商標）との組み合わせである。
【図２】図２Ａ〜２Ｅは、様々な尿素濃度でのＶＥＧＦ  Ｔｒａｐの電気泳動図を比較する。
【図３】等電点電気泳動法と画像キャピラリー等電点電気泳動法とを使用して得たＶＥＧＦ  Ｔｒａｐの電気泳動図を比較する。
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｇは、等電点電気泳動法及び画像キャピラリー等電点電気泳動法を使用するＶＥＧＦ  Ｔｒａｐ  ＯＦＦＧＥＬ分画分析（分画＃５〜＃１０）を例示する。
【図４Ｂ】図４Ａ〜４Ｇは、等電点電気泳動法及び画像キャピラリー等電点電気泳動法を使用するＶＥＧＦ  Ｔｒａｐ  ＯＦＦＧＥＬ分画分析（分画＃５〜＃１０）を例示する。
【図４Ｃ】図４Ａ〜４Ｇは、等電点電気泳動法及び画像キャピラリー等電点電気泳動法を使用するＶＥＧＦ  Ｔｒａｐ  ＯＦＦＧＥＬ分画分析（分画＃５〜＃１０）を例示する。
【図４Ｄ】図４Ａ〜４Ｇは、等電点電気泳動法及び画像キャピラリー等電点電気泳動法を使用するＶＥＧＦ  Ｔｒａｐ  ＯＦＦＧＥＬ分画分析（分画＃５〜＃１０）を例示する。
【図４Ｅ】図４Ａ〜４Ｇは、等電点電気泳動法及び画像キャピラリー等電点電気泳動法を使用するＶＥＧＦ  Ｔｒａｐ  ＯＦＦＧＥＬ分画分析（分画＃５〜＃１０）を例示する。
【図４Ｆ】図４Ａ〜４Ｇは、等電点電気泳動法及び画像キャピラリー等電点電気泳動法を使用するＶＥＧＦ  Ｔｒａｐ  ＯＦＦＧＥＬ分画分析（分画＃５〜＃１０）を例示する。
【図４Ｇ】図４Ａ〜４Ｇは、等電点電気泳動法及び画像キャピラリー等電点電気泳動法を使用するＶＥＧＦ  Ｔｒａｐ  ＯＦＦＧＥＬ分画分析（分画＃５〜＃１０）を例示する。
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｆは、図４Ａ〜４Ｇで分析したＶＥＧＦ  Ｔｒａｐ  ＯＦＦＧＥＬ分画（分画＃５〜＃１０）でスパイクしたＶＥＧＦ  Ｔｒａｐ  ＲＳの電気泳動図を例示する。
【図５Ｂ】図５Ａ〜５Ｆは、図４Ａ〜４Ｇで分析したＶＥＧＦ  Ｔｒａｐ  ＯＦＦＧＥＬ分画（分画＃５〜＃１０）でスパイクしたＶＥＧＦ  Ｔｒａｐ  ＲＳの電気泳動図を例示する。
【図５Ｃ】図５Ａ〜５Ｆは、図４Ａ〜４Ｇで分析したＶＥＧＦ  Ｔｒａｐ  ＯＦＦＧＥＬ分画（分画＃５〜＃１０）でスパイクしたＶＥＧＦ  Ｔｒａｐ  ＲＳの電気泳動図を例示する。
【図５Ｄ】図５Ａ〜５Ｆは、図４Ａ〜４Ｇで分析したＶＥＧＦ  Ｔｒａｐ  ＯＦＦＧＥＬ分画（分画＃５〜＃１０）でスパイクしたＶＥＧＦ  Ｔｒａｐ  ＲＳの電気泳動図を例示する。
【図５Ｅ】図５Ａ〜５Ｆは、図４Ａ〜４Ｇで分析したＶＥＧＦ  Ｔｒａｐ  ＯＦＦＧＥＬ分画（分画＃５〜＃１０）でスパイクしたＶＥＧＦ  Ｔｒａｐ  ＲＳの電気泳動図を例示する。
【図５Ｆ】図５Ａ〜５Ｆは、図４Ａ〜４Ｇで分析したＶＥＧＦ  Ｔｒａｐ  ＯＦＦＧＥＬ分画（分画＃５〜＃１０）でスパイクしたＶＥＧＦ  Ｔｒａｐ  ＲＳの電気泳動図を例示する。
【図６】図６は、ブランクと、独立したマーカーでスパイクしたＶＥＧＦ  Ｔｒａｐの電気泳動図を比較する。
【図７Ａ】領域１、２、及び、３を割り当てたＶＥＧＦ  Ｔｒａｐ  ＲＳ試料の画像キャピラリー等電点電気泳動の電気泳動図を示す。
【図７Ｂ】等電点電気泳動法と画像キャピラリー等電点電気泳動法との差異を、電気泳動図で例示する。
【図８】図８は、ＶＥＧＦ  Ｔｒａｐの安定性に関連する画像キャピラリー等電点電気泳動を使用して得たデータを示す。
【図９】図９は、強制的に分解したＶＥＧＦ  Ｔｒａｐ試料で行った画像キャピラリー等電点電気泳動を使用して得た安定性データを示す。
【図１０Ａ】図９で提供した画像キャピラリー等電点電気泳動データの統計分析を示す。
【図１０Ｂ】図９で提供した画像キャピラリー等電点電気泳動データの統計分析を示す。
【図１０Ｃ】図９で提供した画像キャピラリー等電点電気泳動データの統計分析を示す。
【図１１】図１１は、画像キャピラリー等電点電気泳動法の直線性に関するデータを示す。
【図１２】図１２は、両性電解質の３つの試料の画像キャピラリー等電点電気泳動の電気泳動図を比較する。
【図１３Ａ】従来のＶＥＧＦ  Ｔｒａｐ試料から得た画像キャピラリー等電点電気泳動データの統計分析を示す。
【図１３Ｂ】従来のＶＥＧＦ  Ｔｒａｐ試料から得た画像キャピラリー等電点電気泳動データの統計分析を示す。
【図１３Ｃ】従来のＶＥＧＦ  Ｔｒａｐ試料から得た画像キャピラリー等電点電気泳動データの統計分析を示す。
【図１３Ｄ】従来のＶＥＧＦ  Ｔｒａｐ試料から得た画像キャピラリー等電点電気泳動データの統計分析を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本明細書では、ＶＥＧＦ  Ｔｒａｐなどの様々なタンパク質の電荷変異体分析のための方法及びシステムを説明する。ＶＥＧＦ  Ｔｒａｐは、表１に示す配列を含む融合タンパク質である。ＶＥＧＦ  Ｔｒａｐを分析するための承認済の方法、すなわち、等電点電気泳動ゲルをバンド３〜９にグループ分けして電荷変異体分布を報告する方法に代えて、本明細書で説明する方法及びシステムは、一般的に、画像キャピラリー等電点電気泳動を使用して、電荷変異体のアイソフォームのパーセンテージに関する電荷不均一性を報告し、そして、それらを電気泳動図の３つの異なる領域にグループ分けする。以前に述べたように、ここで報告する手順では、ＶＥＧＦ  Ｔｒａｐ試料のアイソフォームで認められる変化に対して、さらに敏感になり得る。
【表１】
2020531802.tif 000003
【００１８】
本開示を通して、以下の略語を使用する：
−  ｉＣＩＥＦ  −  画像キャピラリー等電点電気泳動
−  ＩＥＦ  −  等電点電気泳動
−  ｐＩ  −  等電点
−  ＲＳ  −  参照標準
−  ＤＳ  −  原薬
−  ＤＳＩ  −  原薬中間体
−  ＦＤＳ  −  製剤原薬。
【００１９】
ＶＥＧＦ  Ｔｒａｐの電荷変異体を分析する方法は、一般的には、少なくとも両性電解質担体、メチルセルロース、及び、安定化添加剤の混合物を含む分離用毛細管にタンパク質試料を取り込ませることと、第１の所定の時間、第１の電圧を印加することであって、当該両性電解質担体に、当該毛細管内でｐＨ勾配を形成させる、当該第１の電圧を印加することと、第２の所定の時間、第２の電圧を印加することであって、当該毛細管内での当該タンパク質の電荷変異体の移動に焦点を合わせて、当該変異体の全体的な電荷を中性にする、当該第２の電圧を印加することと、当該タンパク質の電荷変異体を検出及び定量することと、を含む。
【００２０】
当該分離毛細管には、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約２ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度のＶＥＧＦ  Ｔｒａｐを取り込ませることができる。例えば、当該分離毛細管には、約０．５ｍｇ／ｍＬ、約１．０ｍｇ／ｍＬ、約１．５ｍｇ／ｍＬ、または、約２ｍｇ／ｍＬの濃度のＶＥＧＦ  Ｔｒａｐを取り込ませ得る。一部の実施形態では、当該分離毛細管に、約１．０ｍｇ／ｍＬの濃度のＶＥＧＦ  Ｔｒａｐを取り込む。
【００２１】
当該混合物でのメチルセルロースの量は、約０．０１％〜約０．３５％の範囲とし得る。例えば、当該混合物でのメチルセルロースの量は、約０．０１％、約０．０５％、約０．１０％、約０．１５％、約０．２０％、約０．２５％、約０．３０％、または、約０．３５％とし得る。一部の実施形態では、当該混合物でのメチルセルロースの量は、約０．３５％である。
【００２２】
当該第１の電圧に関して、それは、約１Ｖ〜約３０００Ｖの範囲とし得る。例えば、当該第１の電圧を、約１Ｖ、約１００Ｖ、約５００Ｖ、約１０００Ｖ、約１５００Ｖ、約２０００Ｖ、約２５００Ｖ、または、約３０００Ｖとし得る。一部の実施形態では、当該第１の電圧は、約１５００Ｖである。
【００２３】
当該第２の電圧を、約１Ｖ〜約３０００Ｖの範囲とし得る。例えば、当該第２の電圧を、約１Ｖ、約１００Ｖ、約５００Ｖ、約１０００Ｖ、約１５００Ｖ、約２０００Ｖ、約２５００Ｖ、または、約３０００Ｖとし得る。一部の実施形態では、当該第２の電圧は、約３０００Ｖである。
【００２４】
当該第１の所定の時間を、約１秒〜約５分の範囲とし得る。例えば、当該第１の所定の時間を、約１秒、約１０秒、約２０秒、約３０秒、約４０秒、約５０秒、約１分（６０秒）、約１．５分（９０秒）、約２分（１２０秒）、約２．５分（１５０秒）、約３分（１８０秒）、約３．５分（２１０秒）、約４分（２４０秒）、約４．５分（２７０秒）、または、約５分（３００秒）とし得る。一部の実施形態では、当該第１の所定の時間は、約１分（６０秒）である。
【００２５】
当該第２の所定の時間を、約１分〜約１４分の範囲とし得る。例えば、当該第２の所定の時間を、約１分、約２分、約３分、約４分、約５分、約６分、約７分、約８分、約９分、約１０分、約１１分、約１２分、約１３分、または、約１４分とし得る。一部の実施形態では、当該第２の所定の時間は、約７分である。
【００２６】
あらゆる適切な添加剤を、当該混合物に使用し得る。一部の実施形態では、添加剤として尿素を使用すると、有益となり得る。例えば、２Ｍ尿素を混合物に含めると、有益となり得る。後に詳述するように、様々な試薬（両性電解質）をも当該混合物に含め得る。ある実施形態において、ＶＥＧＦ  Ｔｒａｐを、１．０ｍｇ／ｍＬの濃度で毛細管に取り込ませ、そして、０．３５％メチルセルロース、２Ｍ尿素、及び、３〜１０のｐＩを有する３％両性電解質の混合物を使用する画像キャピラリー等電点電気泳動法を使用して分析する。
【００２７】
試薬及び機器。以下の表２は、本開示の一部の実施形態に従って使用する試薬（両性電解質）と機器とを列挙している。手がけた実施例では、ｉＣＥ３（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ（登録商標））電荷変異体分析器を使用する。特に断りのない限り、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ参照標準（ＲＳＶＩＴＶ−５）を、方法の開発と特徴決定の期間での被験物質として使用した。
【表２】
2020531802.tif 000004
【００２８】
少なくとも一部の実施形態の例：
まず、両性電解質のスクリーニングを、ｐＩの範囲、及び、両性電解質の供給源に基づいて行った。それぞれが固有のｐＩ範囲をカバーする４つの両性電解質を、３つの異なる供給源から得た。これらの両性電解質を、以下の出発物を用いて分析した：
−  ２．０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度、
−  ２Ｍ尿素、
−  ０．３５％メチルセルロース、
−  １５００Ｖで、１分間の事前焦点調節、及び
−  ３０００Ｖで、７分間の焦点調節。
【００２９】
図１Ａ〜Ｆは、両性電解質の６つの範囲を使用して、ｉＣＥ３電荷分析器で得た電気泳動図を例示している。以下の両性電解質範囲を使用した。
図Ａ−  ３〜１０  Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ
図Ｂ−  ５〜８／８〜１０．５  Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅの組み合わせ
図Ｃ−  ２〜９  Ｓｅｒｖａｌｙｔ
図Ｄ−  ４〜９  Ｓｅｒｖａｌｙｔ
図Ｅ−  Ｂｉｏ−Ｌｙｔｅ  ３〜１０、４０％
図Ｆ−  ３〜１０及び６．７〜７．７の３成分混合Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ
【００３０】
選択したタンパク質。ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐに関して、承認済の電荷変異体解析手順で得た電気泳動図に最もよく似ているため、ｐＩ３〜１０の範囲の両性電解質を、ｉＣＩＥＦ電気泳動図の全体的なプロファイルとして選択した（例えば、図３に示したＩＥＦ画像を参照されたい）。
【００３１】
尿素の最適化。一部の実施形態では、方法の最適化は、尿素濃度の変更（尿素不含から最大で８Ｍまで）も含んでいた。図２Ａ〜２Ｅは、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ  ＲＳＶＩＴＶ−５試料の電気泳動図について、このような尿素濃度の変化の効果を示している。一般的に、尿素濃度を下げると解像度が向上するが、尿素を増やすと（８Ｍ）、解像度の低下を招くことが認められた。しかしながら、ネイティブ条件（尿素不含）で解像したＶＥＧＦ−Ｔｒａｐでは、解像度の低下と再現性の欠如という同様の問題が存在していた。したがって、１〜３Ｍの尿素濃度を使用して分離した場合、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐの全体的なピークパターンと分解能とは、互いに同等であった。
【００３２】
両性電解質３〜１０濃度とタンパク質濃度とを最適化するために、２Ｍ尿素を使用して、さらに実験を行った。図３は、タンパク質濃度１．０ｍｇ／ｍＬで、２Ｍ尿素、０．３５％メチルセルロース、及び３％３〜１０両性電解質を使用して得た電気泳動図を示している。当該ｉＣＩＥＦ電気泳動図を、別の電気泳動図と比較し、そして、暫定的なピークを割り当てた（図３）。
【００３３】
方法の特徴決定。当該ｉＣＩＥＦを使用して、全体的な電荷プロファイルと、ピークのパターンとを得て、アッセイ法は、（図２Ａ〜２Ｅに示すように）当該ＩＥＦバンドプロファイルに匹敵していた。しかしながら、当該ＩＥＦアッセイ法のバンドパターンをさらに理解し、そして、ｉＣＩＥＦ分析を使用して得たピークパターンに橋渡しするために、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ試料のＯＦＦＧＥＬ分別を行った。当該ＯＦＦＧＥＬ電気泳動から得た個々の電荷変異体分画を、ＩＥＦ及びｉＣＩＥＦアッセイ法を使用して分析した。Ａｇｉｌｅｎｔ  ３１００  ＯＦＦＧＥＬ  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｏｒを使用して、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ参照標準をその等電点に従って分画し、そして、液体分画として回収した分離アイソフォームを、２つの方法、ＩＥＦ及びｉＣＩＥＦを使用して分析した。ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐで認められたｐＩ範囲の電荷変異体をカバーするｐＨ６〜９の固定化ｐＨ勾配ストリップ（ＩＰＧストリップ）を使用して、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ  ＲＳを分画した。実験と分離の詳細な設定は、以下の通りである：
【００３４】
１）２．３ｍＬの５０％グリセロール、２３０．４μｌのＩＰＧ緩衝剤（ｐＨ６〜１１）、及び、１６．６４ｍｌの水を組み合わせて、総体積を１９．２ｍｌにして、原液を調製した。
【００３５】
２）７３μｇのＶＥＧＦ（４．２ｍｇ）を、１２ｍＬの原液、及び、３ｍＬの水に対して添加して、ＶＥＧＦ  Ｔｒａｐ溶液を調製した。
【００３６】
３）１．１５ｍＬの水と、４．６ｍＬの原液とを組み合わせて、ＩＰＧストリップの再水和溶液を過剰に調製した。
【００３７】
４）ｐＨ範囲が６〜９（２４ｃｍ）であるＩＰＧゲルストリップを、２つの機器トレイの１つおきのレーンに配置し、そして、２４ウェルフレームを、その上の所定の位置に留めた。標準のＯＦＦＧＥＬキットプロトコル（ＯＦＦＧＥＬ使用説明書：Ａｇｉｌｅｎｔ  ３１００  ＯＦＦ  ＧＥＬ  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｏｒ  Ｋｉｔ  ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ  Ｇｕｉｄｅ，５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｓｅｐ  ２０１０を参照されたい）を、ストリップの再水和、抗体の取り込み、及び、機器にトレイを取り付けるために使用した。
【００３８】
５）２０℃のプラットフォーム温度を使用した。２４ウェル設定の標準機器タンパク質焦点調節方法を、５０μＡの定電流、８０００Ｖの最大電圧設定、２００ｍＷの最大電力設定を使用して実行した。
【００３９】
６）３４時間の分別後に、分析を停止し、そして、ウェル３〜１２の各レーンの同様のウェル番号をプールし、次いで、水に交換し、そして、分析前の約５倍にまで濃縮した。
【００４０】
７）各分画の抗体量を、Ｎａｎｏｄｒｏｐの吸光係数１．１５で、２８０ｎｍの吸光度を測定して決定した。１つの機器で当該分画の濃度を決定し、次いで、分画の体積に対して当該濃度を乗じた。
【００４１】
簡単に説明すると、１２個のＩＰＧストリップを使用して、４．２ｍｇのＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ  ＲＳを、３２時間、分画した；同じｐＩ範囲に対応する各ストリップに由来する個々の分画をプールし、そして、透析の後に定量した。分別で十分な回収率を示した合計で７つの分画（分画４〜１０）を、ＩＥＦ及びｉＣＩＥＦを使用して分析した。これらの分画を、２つの方法で分析した：ＩＥＦ及びｉＣＩＥＦアッセイ法を用いた、ＯＦＦＧＥＬ分画（４〜１０）の個別分析（図４を参照されたい）、及びＯＦＦＧＥＬ分画（５〜１０）のＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ  ＲＳへのスパイクと、それに続く、ＩＥＦ及びｉＣＩＥＦを用いたスパイクした試料の分析（図５）である。表３に、ＯＦＦＧＥＬ分別試験で回収した分画と、それに対応する量を示す。
【表３】
2020531802.tif 000005
【００４２】
ＩＥＦ及びｉＣＩＥＦを使用してＯＦＦＧＥＬ分画を個別に分析することに加えて、より高い回収率を示す分画（５〜１０）を、１：０．１の比率（ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ  ＲＳ：分画）でスパイクし、そして、２つの電荷変異体分析法で分析した。図５は、ｉＣＩＥＦ（上部パネル）及びＩＥＦ（下部パネル）アッセイ法を使用して分析した、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ  ＯＦＦＧＥＬ分画（５〜１０）でスパイクしたＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ  ＲＳの電気泳動図のパネルを例示している。ＲＳにスパイクしたＯＦＦＧＥＬ分画の各々について、対応するコントロールＲＳ（スパイクなし）は、ＩＥＦ及びｉＣＩＥＦアッセイ法と重なる。スパイク及び非スパイク（ＲＳ＋ＯＦＦＧＥＬ、及び、ＲＳ）試料の重ね合わせは、ＩＥＦアッセイ法とｉＣＩＥＦアッセイ法と間のピークのパターンの相関関係を視覚化させ、そして、理解させる上で役立つ。各パネルでは、酸性分画（図５Ａ）から塩基性分画（図５Ｆ）に向かう矢印を使用して、スパイクした分画に対応する電荷種の増強を強調表示している。
【００４３】
ゲルをベースとしたＩＥＦバンドパターンと、毛細管をベースとしたｉＣＩＥＦピークパターンとの間の相関関係は、ＯＦＦＧＥＬ分画の分析から明らかであった。図４及び５（スパイクした分画を含む個々の分画分析）から、承認済のＩＥＦゲル法で達成した電荷アイソフォーム分離が、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐに関する毛細管をベースとしたｉＣＩＥＦ方法を使用して得たピークのパターンに匹敵し、また、類似していると推測することができる。
【００４４】
ｉＣＩＥＦ法を使用した電荷変異体の分布の報告。ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ電荷変異体の分布に関して、承認済のＩＥＦ方法は、ＩＥＦゲルのバンド３〜９をグループ分けすることで、電荷分散率を報告する。ミオグロビンのｐＩに基づいてバンド番号を識別するガイドとして、例えば、ミオグロビン（独立したタンパク質マーカー）を使用して、バンド３〜９の面積パーセンテージを合計して報告する。ＩＥＦ方法での現在の仕様許容基準（ＳＰＥＣ）は、８２％（バンド３〜９）である。
【００４５】
同様の手順を、ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ、ｐＩ  ７．０５  Ｍａｒｋｅｒ  Ｃａｔ＃  １０２２２６の独立したマーカーを、ｉＣＩＥＦマスターミックス（２Ｍ尿素、０．３５％メチルセルロース、３％３〜１０両性電解質）にスパイクしている新規のｉＣＩＥＦアッセイ法に適合させた。マスターミックスにスパイクしたマーカー７．０５のｉＣＩＥＦ電気泳動図を図６（トップパネル）に示しており、ｐＩ  ５．１２とｐＩ  ９．５０とを兼ね備えたマーカーを含むマスターミックスを、較正のために使用する。図５の下部パネルは、スパイクした７．０５マーカーを含むブランクで重ね合わせたＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ  ＲＳのｉＣＩＥＦ電気泳動図であり、これは、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ  ｉＣＩＥＦ試料プロファイルでのピーク５を識別するために使用する。マーカーピーク７．０５は、ピーク４と５の間のｐＩで移動し、これは、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐの主要なアイソフォームのクラスター（ピーク５、６、７）での主要なピーク６を識別する上で役立つ。
【００４６】
ＩＥＦ方法のようにピーク３〜９を報告するのではなく、（一部の実施形態での）当該ｉＣＩＥＦ方法では、領域１（酸性）、領域２（中性）、及び、領域３（塩基性）としてグループ分けした電荷変異体アイソフォームのパーセンテージに関して、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ試料の電荷不均一性を報告する。当該ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ  ｉＣＩＥＦ電気泳動図での３つの主要なピーク（ピーク番号５、６、７）のクラスターは、中性ｐＩ範囲の周辺を移動し、かつ最も顕著なアイソフォームであり、領域２（中性）としてグループ分けされる。３つのピークのクラスターの内で、特定のｐＩに向けて移動する主要ピーク５に対応する明確なアイソフォームを、図７に示したような、ブランク注入においてスパイクした独立したｐＩ  ７．０５マーカーを使用して識別する。当該ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ  ｉＣＩＥＦ試料での領域１（酸性）を、当該ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ電気泳動図での３つの主要なピーク（ピーク５、６、及び、７）のクラスターと比較して比較的酸性であるピークのグループとして報告する。当該ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ  ｉＣＩＥＦ試料での領域３（塩基性）を、当該ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ電気泳動図での３つの主要なピーク（ピーク５、６、及び、７）のクラスターと比較して比較的塩基性であるピークのグループとして報告する。
【００４７】
領域１、２、及び、３を使用する報告手法では、従来のＩＥＦゲルをベースとした方法でバンド３〜９をグループ分けすることとは対照的に、３つの領域（領域１、２、及び、３）をモニターすることで、当該電荷変異体アイソフォームを、さらに厳密に制御できるという利点がある。図７Ｂは、ＩＥＦ報告と、本開示のｉＣＩＥＦ法の実施形態での報告との間の差異を例示する。さらに、領域１、２、及び、３に関する報告は、ｉＣＩＥＦアッセイ法に対して、従来の手法よりも遙かに迅速に電荷変異体アイソフォームの変化に対する感度に関して独特の利点を与える。これにより、当該ｉＣＩＥＦアッセイを、その読み出しにおける感度が高く、かつ、従前のＩＥＦアッセイ手順よりも良好な安定性を示すアッセイにする。以下の表４は、ＩＥＦアッセイの従来の３〜９報告とは対照的に、ｉＣＩＥＦアッセイ法に適合した新規のグループ分け手法の能力を示す安定性の例である。加速ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ安定試料を、報告のあった２つの手法−当該ＩＥＦアッセイ法と同様の領域グループ分けとピーク３〜９による新規のｉＣＩＥＦアッセイとを使用して分析を行い、そして、当該ＩＥＦアッセイ法の履歴結果と比較した。
【００４８】
表４（下記）では、領域１、２、３のグループ分け手法の感度が非常に高く、かつ、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ試料の電荷変異体分布の変化を示すことが認められる。当該ＩＥＦ方法は、バンド３〜９で２％の減少を示す全体的な電荷分布の変化を示しており、そして、この変化は、３〜９ピーク手法を使用してグループ分けした場合の当該ｉＣＩＥＦアッセイ方法の結果と同等であった。しかしながら、表４から明らかなように、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐの２５℃加速ストレス試料では、当該ｉＣＩＥＦアッセイを使用して、領域１（または、酸性変異体）の５％の増加と、領域３（塩基性変異体）の約５％の減少が同時に認められた。当該ｉＣＩＥＦアッセイにおけるＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ電荷分布で認められたこの傾向は、そのシアル化の程度に起因する電荷パターンの構造と複雑さに基づいて、当該ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ試料に生じる変化の性質を正確に反映している。加速熱ストレス下での当該ｉＣＩＥＦアッセイ法を使用したＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ試料の酸性変異体（領域１−高度のシアル化種）の増加は、凝集を伴う脱アミド化の可能性を反映している。一方で、当該ＩＥＦ方法による従来の３〜９バンドを使用したグループ分けは、当該ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ電荷アイソフォームで発生する微妙な変化を覆い隠してしまい、そして、異なる電荷種を制御する余地をほとんど残さないので、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ試料の電荷不均一性の微妙な変化を検出する方法ほどの感度を示さない。
【００４９】
ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐには、１０個のグリコシル化部位がある。これらの部位に付着したグリカン鎖は分岐しており、そして、各分岐は、負に帯電した糖モノマーであるシアル酸を終端とし得る、または、し得ない。当該グリカン鎖の末端にあるシアル酸基の存在の自然変異は、正味電荷の範囲を有するＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ電荷変異体の集合体をもたらす。これらのバンドの割合は、存在する荷電種の量によって異なる。したがって、領域１（顕著なシアル化）、２（中程度のシアル化）、３（ほとんどシアル化されていない）に基づいて様々な電荷種をグループ分けする新規の報告手法は、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ試料のシアル型で発生する変化に対するｉＣＩＥＦアッセイの応答性を向上させる。
【表４】
2020531802.tif 000006
【００５０】
ｉＣＩＥＦアッセイ法の安定性を示す能力。ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ  ＤＰ試料のリアルタイム安定性試料（２〜８℃で保持）を、２４か月の期間に及ぶ７つの独立した時点を使用して分析した；表５（下記）は、この研究に対応するデータを示す。これらのＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ試料の履歴ＩＥＦデータを参照用に提供し、そして、領域グループ分け、及び、３〜９ピーク報告でのＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ  ｉＣＩＥＦデータと比較した。履歴ＩＥＦデータに基づいて、当該ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ試料では、２〜８℃のリアルタイム保存条件では、有意な変化は、ほとんど、または、全く認められなかったが、ｉＣＩＥＦ３〜９ピーク手法を使用して報告すると、同様の傾向が認められた。
【表５】
2020531802.tif 000007
【００５１】
図８は、ｉＣＩＥＦを使用して、２４か月間にわたるＶＥＧＦ−Ｔｒａｐの％領域１、２、及び、３の線型フィットを示す。領域３が減少するに伴い、領域１がわずかながらも着実に増加していることが、プロットから明らかである。
【００５２】
強制的に分解したＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ  ＤＳ試料を使用したさらなる分析を、新たなｉＣＩＥＦアッセイ法を使用して行った。この研究では、４５℃で、１５日間にわたって希釈を行い、かつ、ストレスを負荷した熱分解ＶＥＧＦ  ＤＳ試料を、０、３、９、及び、１５日の時点で、ｉＣＩＥＦ法（領域的、及び、３〜９）を使用して分析した。表６（下記）から明らかなように、強制的に分解したＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ試料に関して、なおも早い時点で報告をした３〜９ピークと比較して、領域手法を使用してグループ分けをすると、ｉＣＩＥＦアッセイ法では、酸性電荷変異体（領域１）のわずかな増加が認められる。％３〜９報告は、当該３〜９ピーク全体の電荷分布全体で２％の変化を示したが、同じ条件下での領域１は、７％の増加を示し、そして、領域３では、同時に時間とともに８％の減少を示した。図９は、ｉＣＩＥＦアッセイ法を使用して強制的に分解したＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ試料の電気泳動図を示し；酸性種の増加は、プロファイルから明らかである。
【表６】
2020531802.tif 000008
【００５３】
ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐストレス試料の３つの領域の％分布の統計分析を、当該ＶＥＧＦ非ストレス試料の各々のピークパーセンテージと比較して行った。図１０Ａ〜１０Ｃは、ｉＣＩＥＦデータに関して、熱ストレスを受けたＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ試料の統計分析を示す。統計的に有意な変化が、領域１及び３のそれぞれで認められた。
【００５４】
ｉＣＩＥＦアッセイ法での特徴決定と最適化データに基づいて、アッセイパラメーターを導き出し、そして、表７（下記）にまとめてある。これらの方法条件を、直線性、正確性、精度、及び、中間精度について評価した。
【表７】
2020531802.tif 000009
【００５５】
ｉＣＩＥＦアッセイ法の適格性。ｉＣＩＥＦアッセイ法の直線性。方法の直線性を、１名の分析官が評価した。０．５ｍｇ／ｍＬ、１．０ｍｇ／ｍＬ、１．５ｍｇ／ｍＬ、及び、２．０ｍｇ／ｍＬの様々なタンパク質濃度で、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ参照標準を使用して、試料溶液を調製した。この実験では、当該試料マトリックスでのタンパク質濃度を、０．５〜２ｍｇ／ｍＬに変化させ、そして、その他のマトリックス成分を、３％両性電解質３〜１０、及び、０．３５％メチルセルロースで一定に保った。焦点調節時間も、１＋７分で一定に保った。表８に、０．５〜２．０ｍｇ／ｍＬの線型範囲にわたって、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ試料の領域１、２、及び、３のパーセンテージ分布をまとめてある。当該ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ試料の面積計測値の関数として、濃度の直線性プロットを、図１１に示す。
【表８】
2020531802.tif 000010
【００５６】
当該アッセイは、回帰分析に基づいて、Ｒ２＞０．９９で、０．５ｍｇ／ｍＬ〜２．０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度範囲で、許容可能な直線性を実証した。加えて、アイソフォーム分布は、この同じ濃度範囲で一貫していた。このことは、当該アッセイが、０．５〜２．０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度範囲にあっては、ピーク面積とアイソフォーム分布の両方で一貫した結果を提供できることを示す。
【００５７】
ｉＣＩＥＦアッセイ法の正確性。方法の正確性を、当該直線性データを使用して、１．０ｍｇ／ｍＬの公称濃度と比較することで、希釈比例に基づいて評価した。直線性データに基づいた希釈回収率を、以下の表９に示す。回収率を、＝（測定面積率／公称面積率）×１００％を使用して、計算した。
【表９】
2020531802.tif 000011
【００５８】
当該ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ試料について、タンパク質濃度０．５〜２．０ｍｇ／ｍＬの範囲の希釈比例に基づいた回収率は、３つの領域で、９８％〜１０１％以内であった。
【００５９】
ｉＣＩＥＦ方法の中間精度分析。中間精度は、２名の分析官（Ａ、Ｂ）が、それぞれの試薬製剤を使用して、またＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ  ＲＳ試料について、４日間にわたって、２つのｉＣＥ３電荷変異体分析機器を使用して評価した。分析の結果を、以下の表１０に示す。
【表１０】
2020531802.tif 000012
【００６０】
提案されたＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ  ｉＣＩＥＦ試験方法は、異なる試薬製剤を使用して、異なる分析官が実施した場合に、許容可能な精度を実証した。全体の％ＲＳＤを計算したところ、３つのすべての領域で、２％のＲＳＤ以内であった。
【００６１】
ｉＣＩＥＦアッセイ法のロバスト性。アッセイ法のロバスト性の幾つかの要素を、様々な実験で評価した。これらの実験を、表１１に示す。
【表１１】
2020531802.tif 000013
【００６２】
機械で調製した溶液の安定性。試料マトリックスにおいて参照標準の試料を調製し、そして、ｉＣＩＥＦを使用して試料を分析して、溶液の安定性を評価した。当該試料を、３％の両性電解質３〜１０、０．３５％メチルセルロース、及び、２Ｍ尿素からなるマトリックスにおいて、１０℃で分析した後に、ｉＣＥ３機器に保存した。当該試料を、約２４時間後に、再び分析した。各分析でのアイソフォーム分布を、以下の表１２に示す。
【表１２】
2020531802.tif 000014
【００６３】
Ｔ＝０で分析した試料と、Ｔ＝２４時間で再度分析した試料との間の絶対差を、各時点で認められた範囲（最大、及び、最小）に基づいて計算した。３つの領域に関する絶対差は、０．５％以下であった。このことは、ｉＣＥ３電荷変異体分析器で、１０℃で保存すると、当該試料が、当該マトリックス内で最長で２４時間は安定であることを示している。
【００６４】
両性電解質（３〜１０）の試料の評価。ある供給源に由来する３〜１０両性電解質の幾つかの試料を分析した。異なる試料を使用して分析した当該ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ試料の全体的な電荷変異体プロファイルは同等であった。一部の両性電解質試料の領域１では、ピークパターンに関する電気泳動図プロファイルにわずかな差異が認められたが、パーセンテージの分布は類似しており、かつ、アッセイのばらつきの範囲内であった。両性電解質の３つの試料の代表的な電気泳動図を図１２に示す。
【実施例】
【００６５】
新規のｉＣＩＥＦアッセイ法を使用した、従来のＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ放出試料（ＤＳ、ＦＤＳ、及び、ＤＳＩ）の分析
【００６６】
ｉＣＩＥＦアッセイ法のロバスト性をさらに確立するために、２つの両性電解質の試料を使用するｉＣＩＥＦを使用して、系統が関連しない合計で３７個のユニークな従来のＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ試料を分析した。この分析では、１５個のＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ  ＤＳＩ（原薬中間体、水性緩衝液、ｐＨ６．２、５ｍＭリン酸ナトリウム、５ｍＭクエン酸ナトリウム、及び、１００ｍＭ塩化ナトリウムを含む）、１０個のＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ  ＤＳ試料（原薬ＳＰＥＣ  Ｃ７０１、水性緩衝液、ｐＨ６．２、１０ｍＭリン酸ナトリウムを含む）、及び、１２個のＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ  ＦＤＳ試料（製剤原薬、ＳＰＥＣ  Ｃ７１３、水性緩衝液、ｐＨ６．２、１０ｍＭリン酸ナトリウム、４０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０３％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０、及び、５％（ｗ／ｖ）スクロース）を用いた。これらのＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ試料を、当該ｉＣＩＥＦアッセイ法を使用して分析した。
【００６７】
両性電解質とは、電界の影響下でのｐＨ勾配の確立に役立つ３〜１０の間に等電点のスペクトルを有する両性化合物の異なる同族体の混合物である。当該ｉＣＩＥＦアッセイ法で使用する両性電解質３〜１０は、とある供給源から購入しており、これは、一般的には、数回に分けて製造されている。供給業者の推奨事項と、ｉＣＩＥＦアッセイでのその他のタンパク質に関する実用的な知識に基づいて、異なる試料の間でのわずかな変化が認められており、これは回避できない。したがって、異なる両性電解質試料の全体について、新規のｉＣＩＥＦアッセイのロバスト性を確立するために、両性電解質の２つの試料を分析した。ＤＳ、ＤＳＩ、及び、ＦＤＳ産物段階でのＶＥＧＦ試料を、提案された領域（Ｒ１、Ｒ２、及び、Ｒ３）をグループ分けする手法を使用して、また当該ＩＥＦアッセイ法と同様に、３〜９ピークのグループ分けに基づいて分析した。図１３Ａ〜１３Ｃは、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ  ＤＳ、ＤＳＩ、及び、ＦＤＳ試料の％領域１、２、及び、３、ならびに、ピーク３〜９の関数として、両性電解質試料の統計分析を示す。３７個のＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ試料に対応するデータを、両性電解質試料の１つに関して、表１３に示す。表１４〜１６に、３７個の試料の完全なデータセットを示す。
【表１３】
2020531802.tif 000015
【表１４】
2020531802.tif 000016
【表１５】
2020531802.tif 000017
【表１６】
2020531802.tif 000018
【００６８】
領域１、２、及び、３、ならびに、３〜９のグループ化手法に関する両性電解質の試料について収集したデータに基づいて、マッチドペア分析（図１３Ｄ）を行った。マッチドペア分析のデータを使用して、２つの両性電解質の平均を比較し、そして、両性電解質試料の本質的な差異に起因して認められ得るアッセイの報告での差異を評価した。このデータに基づいて、３つの領域Ｒ１、Ｒ２、及び、Ｒ３の試料の間で認められた最大平均差は、領域の観点から報告した場合では、０．１％未満であると推測することができる。加えて、ｐ−値に基づいて、当該領域手法を使用すると２つの両性電解質試料の間で領域１、２、及び、３での％分布は、統計的に有意でないと結論付けできる。
【００６９】
しかしながら、ＤＳ、ＤＳＩ、及び、ＦＤＳ試料のＶＥＧＦ−Ｔｒａｐデータセットを、ＩＥＦアッセイ法と同様の３〜９ピークグループ分け手法を使用して分析すると、一部の両性電解質試料の間で統計的な有意差が認められる。例えば、一部の試料間では、ｉＣＩＥＦアッセイ法のピーク３〜９に関して報告した平均差は４．８％である。図１３Ａ〜１３Ｄは、異なる両性電解質試料を使用して得たｉＣＩＥＦプロファイルを示しており、そして、画像から、両性電解質試料の間で認められる変化は酸性領域に限定されており、また、領域１、２、３をグループ化することで、変化が覆い隠されていることは明らかである。これにより、当該ｉＣＩＥＦアッセイについて報告する領域的手法を、ロバストかつ再現可能な手法にする。
【００７０】
％領域１、２、及び、３のグループ分けに基づいて、両性電解質試料を使用して、ＤＳＩ、ＤＳ、及び、ＦＤＳ試料分析から得たデータは、当該ｉＣＩＥＦアッセイを、よりロバストなアッセイ方法にする。
【００７１】
したがって、本開示で提示する当該ｉＣＩＥＦシステム、方法、及び、機器は、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ原薬、原薬中間体、製剤原薬、及び、製剤の電荷変異体プロファイルを定量する。そのような実施形態は、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐの電荷不均一性分析のための承認済のゲルをベースとしたＩＥＦ法と置換する上で役立ち得る。
【００７２】
ＯＦＦＧＥＬ  ３１００分留装置を使用して分画した当該ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ電荷変異体は、毛細管をベースとしたｉＣＩＥＦアッセイ法で得たピークと、ゲルをベースとしたＩＥＦアッセイ手順で分離したバンドとの相関の実証を可能にした。ＯＦＦＥＧＥＬで電気泳動したＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ分画を個別に分析し、そして、研究におけるスパイクを通じて、個々のｉＣＩＥＦピークと、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ電荷変異体のＩＥＦバンドとを直接に比較できるようにした。この研究は、新規のｉＣＩＥＦアッセイ手順が、ゲルをベースとしたＩＥＦ方法を使用して、以前に解像したすべての電荷変異体アイソフォームを、同等かつより正確な方法で解像できることを確認した。
【００７３】
したがって、本明細書で開示した領域１、２、及び、３のパーセンテージ分布に基づいた、この報告手法の一部の実施形態は、すべてのＶＥＧＦ−Ｔｒａｐアイソフォームの制御を可能にし、また、アッセイをさらに高感度なものとし、ロバストな安定性を示すアッセイとする。
【００７４】
本明細書では、当該ｉＣＥＦ方法で使用する毛細管チューブについても説明する。一般的に、当該ｉＣＩＥＦ毛細管チューブは、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐの電荷変異体分析での使用のために構成しており、そして、タンパク質を取り込むように構成され、かつ、両性電解質担体、メチルセルロース、及び、安定化添加剤の混合物を有する構成の毛細管チューブを具備している。当該毛細管チューブは、フルオロカーボンコーティングをも含み得る。
【００７５】
一部の実施形態では、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐの電荷変異体分析での使用のために構成したｉＣＩＥＦキットを提供しており、そして、当該ｉＣＩＥＦキットは、タンパク質を取り込むように構成され、かつ、両性電解質担体、メチルセルロース、及び、安定化添加剤の混合物を有する構成の１つ以上の毛細管チューブを具備しており、当該毛細管チューブは、フルオロカーボンコーティングを含む。
【００７６】
様々な発明の実施形態を本明細書で説明及び例示してきたが、当業者であれば、本明細書に記載した機能を実行すること、及び／または、結果、及び／または、１つ以上の利点を獲得するための様々なその他の手段、及び／または構造を容易に想到するものであり、そして、そのような変更、及び／または、改変の各々は、本明細書に記載した本発明の実施形態の範囲内とみなす。より一般的には、当業者であれば、本明細書に記載したすべてのパラメーター、量、パーセンテージ、濃度、寸法、材料、及び、構成が、例示的なものであり、そして、実際のパラメーター、量、パーセンテージ、濃度、寸法、材料、及び／または、構成が、本発明の教示が使用される特定の用途（複数可）によって決定されることを容易に理解する。当業者であれば、日常的な実験だけを行って、本明細書に記載した特定の発明の実施形態の数多くの均等物を認識し、または、確認することができる。したがって、上記した実施形態は、例示のみを目的として提示したものであることを理解されたい。本明細書に開示した本発明の実施形態は、具体的に説明及び特許請求した以外の方法で実施し得る。本明細書に開示した発明の実施形態は、本明細書に記載した個々の特徴、システム、物品、材料、キット、及び、方法も含む。加えて、２つ以上のそのような特徴、システム、物品、材料、キット、及び、方法のあらゆる組み合わせも（それらが、相互に矛盾しないのであれば）発明となる。一部の実施形態は、１つ以上の特徴／要素／機能性を明確に欠いている点で従来技術と区別し得る（すなわち、そのような実施形態に関する請求項は、負の制限を含み得る）。
【００７７】
加えて、上記したように、様々な発明概念を、１つ以上の方法として具体化し得る。当該方法の一部として実行する行為は、あらゆる適切な方法で順序を定め得る。したがって、例示的な実施形態では連続的な行為として示しているが、実施形態は、幾つかの行為を、同時に実行することを含め、例示したものとは異なる順序で実行する構成とし得る。
【００７８】
本出願のあらゆる箇所で示した刊行物またはその他の文書に対する、あらゆる、及び、すべての言及は、それらの全内容を参照により本明細書に援用する。さらに、本明細書で定義、及び、使用したすべての定義は、辞書の定義、参照により援用される文書での定義、及び／または、定義された用語の通常の意味よりも優先されることを理解すべきである。
【図１−１】
2020531802.tif 000019
【図１−２】
2020531802.tif 000020
【図２−１】
2020531802.tif 000021
【図２−２】
2020531802.tif 000022
【図３】
2020531802.tif 000023
【図４Ａ】
2020531802.tif 000024
【図４Ｂ】
2020531802.tif 000025
【図４Ｃ】
2020531802.tif 000026
【図４Ｄ】
2020531802.tif 000027
【図４Ｅ】
2020531802.tif 000028
【図４Ｆ】
2020531802.tif 000029
【図４Ｇ】
2020531802.tif 000030
【図５Ａ】
2020531802.tif 000031
【図５Ｂ】
2020531802.tif 000032
【図５Ｃ】
2020531802.tif 000033
【図５Ｄ】
2020531802.tif 000034
【図５Ｅ】
2020531802.tif 000035
【図５Ｆ】
2020531802.tif 000036
【図６】
2020531802.tif 000037
【図７Ａ】
2020531802.tif 000038
【図７Ｂ】
2020531802.tif 000039
【図８】
2020531802.tif 000040
【図９】
2020531802.tif 000041
【図１０Ａ】
2020531802.tif 000042
【図１０Ｂ】
2020531802.tif 000043
【図１０Ｃ】
2020531802.tif 000044
【図１１】
2020531802.tif 000045
【図１２】
2020531802.tif 000046
【図１３Ａ】
2020531802.tif 000047
【図１３Ｂ】
2020531802.tif 000048
【図１３Ｃ】
2020531802.tif 000049
【図１３Ｄ】
2020531802.tif 000050
【配列表】
2020531802000001.app
【国際調査報告】
2020531802.tif 000051
2020531802.tif 000052