(57)【要約】  本発明は、ヒラメ練肉の加水分解物の分画物から分離されたペプチドを有効成分として含む、高血圧治療または予防用薬学組成物または食品組成物に関し、ヒラメ練肉が血圧降下効果を有し、ヒラメ練肉の加水分解物、前記ヒラメ練肉の加水分解物の分画物と前記分画物から分離されたペプチドがアンジオテンシンＩ転換酵素（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  Ｉ  ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  Ｅｎｚｙｍｅ、ＡＣＥ）阻害活性を有することを確認した。従って、前記ヒラメ練肉の加水分解物の分画物から分離されたペプチドを利用して、高血圧治療または予防用薬学組成物または食品組成物に使用することができる。  また、本発明は、ヒラメ練肉の加水分解物とこれから分離されたペプチドがラジカル消去効果、酸化的ストレスに対する保護効果を有してＲＯＳ生成を抑制し、脂質過酸化、そして細胞死を抑制することを確認した。従って、前記ヒラメ練肉の加水分解物の分画物から分離されたペプチドを利用して、抗酸化用食品組成物に使用することができる。
2020518572.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号２または配列番号３で表示されるアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含む、高血圧治療または予防用薬学組成物。
【請求項２】
前記ペプチドは、ヒラメの加水分解物またはヒラメ練肉の加水分解物の分画物から分離されたものである、請求項１に記載の薬学組成物。
【請求項３】
前記ペプチドは、抗酸化活性を有するものである、請求項１に記載の薬学組成物。
【請求項４】
前記加水分解物は、ペプシン、トリプシン、またはα−キモトリプシンの加水分解物のものである、請求項２に記載の薬学組成物。
【請求項５】
配列番号１、配列番号２または配列番号３で表示されるアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含む、高血圧改善または予防用食品組成物。
【請求項６】
前記ペプチドは、ヒラメの加水分解物またはヒラメ練肉の加水分解物の分画物から分離されたものである、請求項５に記載の食品組成物。
【請求項７】
前記ペプチドは、抗酸化活性を有するものである、請求項５に記載の食品組成物。
【請求項８】
前記食品組成物は、健康機能食品のものである、請求項５に記載の食品組成物。
【請求項９】
配列番号１、配列番号２または配列番号３で表示されるアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含む、ヒラメの練肉。
【請求項１０】
配列番号１、配列番号２または配列番号３で表示されるアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含む、ヒラメの練り製品。
【請求項１１】
ヒラメを磨砕及び水洗した後、精製処理するステップを含む、配列番号１、配列番号２または配列番号３で表示されるアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含む、ヒラメ練肉の製造方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の製造方法により製造されたヒラメ練肉と食塩を混合するステップを含む、ヒラメ練り製品の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒラメ練肉の加水分解物の分画物から分離されたペプチドを含む高血圧治療または予防用薬学組成物または食品組成物、前記ペプチドを含むヒラメの練肉、練り製品、練肉の製造方法及び練り製品の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
高血圧は、全世界的に成人の１５〜２０％が患っている慢性循環器系疾患のうち発生頻度が最も高い疾患であり、比較的に症状がない方であるが、高い血圧により正常な機能を維持していた器官が徐々にその機能を失って脳卒中、心不全、冠動脈疾患等の致命的な合併症を誘発し得るため、より積極的で一貫した患者管理と治療が要求される疾患である。世界健康保健機構（ＷＨＯ）では、最高血圧が１６０ｍｍＨｇ以上で最低血圧が９５ｍｍＨｇ以上である場合を高血圧と規定しており、高血圧疾患の種類としては、大きく原因が不明な本態性高血圧と原因疾病による続発性高血圧とに区別されるが、このうち９０％以上が本態性高血圧に属すると知られており、全世界的に約６億人以上の人々が高血圧を患っており、この高血圧のため毎年３００万人が死亡していて全世界的な課題として浮上している。
【０００３】
生体中に存在している不活性化アンジオテンシンＩ（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  Ｉ）は、アンジオテンシンＩ転換酵素（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  Ｉ  ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  Ｅｎｚｙｍｅ、ＡＣＥ）によってＣ−末端Ｈｉｓ−Ｌｅｕが落ちることで血管壁収縮作用を有するアンジオテンシンＩＩ（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ）に転換されて血管を収縮し、腎臓でアルドステロンの分泌を増加させて体液量を増加させることで血圧を上昇させる作用をする。従って、ＡＣＥの活性を抑制させることで血圧上昇の原因となるアンジオテンシンＩＩの生成低下を通して血圧を抑制できる。
【０００４】
高血圧を改善するための目的でエナラプリル（ｅｎｅｌａｐｒｉｌ）やラミプリル（Ｒａｍｉｐｒｉｌ）等のＡＣＥ阻害剤が開発されて常用されているが、このような薬剤の使用による副作用で味覚異常、白血球減少、血管浮腫、肝機能異常等が発見された。
【０００５】
そこで、天然物質から抗高血圧効果を有する研究への要求が続き、大豆タンパク質加水分解物、キトサン、ミルクカゼイン等から分離されたＡＣＥ阻害剤は、食品医薬品安全処に個別認定機能性食品として認められた。
【０００６】
一方、生体内で安定した状態で存在していた酸素が化学薬品、公害物質、光化学反応のような環境的及び生化学的要因等によりスーパーオキシドアニオンラジカル（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ａｎｉｏｎ  ｒａｄｉｃａｌ、Ｏ２−）、ヒドロキシルラジカル（ｈｙｄｒｏｘｙｌ  ｒａｄｉｃａｌ、ＯＨ−）、過酸化水素（ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｐｅｒｏｘｉｄｅ、Ｈ２Ｏ２）、一重項酸素（ｓｉｎｇｌｅｔ  ｏｘｙｇｅｎ、１Ｏ２）等のように反応性の大きな活性酸素（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ：ＲＯＳ）に転換されると、人体の細胞構成成分であるタンパク質、脂質及びＤＮＡ等に対して非選択的、非可逆的な破壊を誘導すると知られている。このように、酸化的ストレスが各種の疾患を起こす重要な原因であることが明らかになって生体内活性酸素を効果的に除去する活性酸素消去剤を開発しようとする研究が盛んに進行している。特に、活性酸素消去活性が卓越し、かつ、より安全な新たな天然素材基盤の活性酸素消去剤の開発が切実に要求されている。
【０００７】
天然物質から抗高血圧、抗酸化効果を有する研究への要求が続き、特に、生理活性ペプチド（Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ）は、様々なタンパク質加水分解酵素を通して作られ得、天然物由来のペプチドは、食べ物が腸内で消化される間、新陳代謝過程で潜在的な生理的調節因子として機能し得る。また、構造、組成、アミノ酸配列によって抗酸化、抗菌、抗高血圧効能等を期待できる。
【０００８】
また、従来の化学合成方法等を通して製造されていた抗高血圧、抗酸化製剤が副作用等の問題が発生するにつれ、近年、世界各国では、天然物質から抗高血圧及び抗酸化効果を有する物質を得るための努力が持続されている。また、各国では、医薬品はもちろん、酵素と健康補助剤のような食品素材等、様々な用途に活用され得る新たな物質を探索するために自然状態の生物、特に大量培養及び繁殖が容易な生物に関する研究も盛んに進行している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
一方、海洋生物は、陸上生物にない特有の代謝過程とユニークな環境によって様々な新規生理活性物質の探索機能性を有している。また、陸上生物は、既に多くの研究が進行したが、海洋生物は、まだ十分に研究されておらず、新たな有用性を有する天然物質開発への期待値が高い分野でもある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の目的は、配列番号１、配列番号２または配列番号３で表示されるアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含む、高血圧治療または予防用薬学組成物を提供することである。
【００１１】
本発明の他の目的は、配列番号１、配列番号２または配列番号３で表示されるアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含む、高血圧改善または予防用食品組成物を提供することである。
【００１２】
本発明の他の目的は、配列番号１、配列番号２または配列番号３で表示されるアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含む、ヒラメの練肉を提供することである。
【００１３】
本発明の他の目的は、配列番号１、配列番号２または配列番号３で表示されるアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含む、ヒラメの練り製品を提供することである。
【００１４】
本発明の他の目的は、ヒラメを磨砕及び水洗した後、精製処理するステップを含む、配列番号１、配列番号２または配列番号３で表示されるアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含む、ヒラメ練肉の製造方法を提供することである。
【００１５】
本発明の他の目的は、前記練肉の製造方法により製造されたヒラメ練肉と食塩を混合するステップを含む、ヒラメ練り製品の製造方法を提供することである。
【００１６】
本発明の他の目的は、配列番号１、配列番号２または配列番号３で表示されるアミノ酸配列からなるペプチドを個体に投与するステップを含む、高血圧の予防または治療方法を提供することである。
【００１７】
本発明のまた他の目的は、配列番号１、配列番号２または配列番号３で表示されるアミノ酸配列からなるペプチドを高血圧の予防または治療のための医薬品の製造に使用するための用途を提供することである。
【発明の効果】
【００１８】
本発明は、ヒラメ練肉の加水分解物の分画物から分離されたペプチドを有効成分として含む、高血圧治療または予防用薬学組成物または食品組成物に関し、ヒラメ練肉が血圧降下効果を有し、ヒラメ練肉の加水分解物、前記ヒラメ練肉の加水分解物の分画物と前記分画物から分離されたペプチドがアンジオテンシンＩ転換酵素（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  Ｉ  ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  Ｅｎｚｙｍｅ、ＡＣＥ）阻害活性を有することを確認した。従って、前記ヒラメ練肉の加水分解物の分画物から分離されたペプチドを利用して、高血圧治療または予防用薬学組成物または食品組成物に使用することができる。
【００１９】
また、ヒラメ練肉の加水分解物とこれから分離されたペプチドがラジカル消去効果、酸化的ストレスに対する保護効果を有してＲＯＳ生成を抑制し、脂質過酸化、そして細胞死を抑制することを確認した。従って、前記ヒラメ練肉の加水分解物の分画物から分離されたペプチドを利用して、抗酸化用食品組成物に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ヒラメ練肉とヒラメ練り製品を示す。
【図２】ヒラメ練肉加水分解物のＡＣＥ阻害活性を測定したものである。
【図３】血管内皮細胞でヒラメ練肉加水分解物のＮＯ生成効果を示したものである。
【図４】ヒラメ練肉の本態性高血圧ラット（Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ  ｒａｔｓ、ＳＨＲ）への給餌による血圧変化を測定したものである。
【図５】Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムを用いたヒラメ練肉加水分解物のサイズ排除クロマトグラフィーを示したものである。
【図６】ヒラメ練肉加水分解物の分画物の逆相クロマトグラムの結果を示したものである。
【図７】Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５を用いたサイズ排除クロマトグラフィー分画物のＡＣＥ阻害活性を示したものである。
【図８】Ｆｒａｃｔｉｏｎ  ２分画物由来ペプチドのアミノ酸配列、Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ａｒｇ（ＩＶＤＲ）とその分子量を示す。
【図９】Ｆｒａｃｔｉｏｎ  ２分画物由来ペプチドのアミノ酸配列、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ（ＶＡＳＶＩ）とその分子量を示す。
【図１０】Ｆｒａｃｔｉｏｎ  ２分画物由来ペプチドのアミノ酸配列、Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＷＹＫ）とその分子量を示す。
【図１１】ヒラメ練肉加水分解物のラジカル消去活性を測定したものである。
【図１２】Ｖｅｒｏでのヒラメ練肉加水分解物の酸化的ストレス保護効果を示したものである。
【図１３】ヒラメ練肉加水分解物のａｐｏｐｔｏｓｉｓ抑制効果を示したものである。
【図１４】ゼブラフィッシュを用いたヒラメ練肉加水分解物の処理による生存率及び心拍数の測定結果を示したものである。
【図１５】ゼブラフィッシュを用いたヒラメ練肉加水分解物の処理によるＲＯＳ生成量、脂質過酸化、細胞死を測定したものである。
【図１６】ゼブラフィッシュで練肉加水分解物を処理した時のＰｒｏ−ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｍＲＮＡ発現阻害効果を示したものである。
【図１７】Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムを用いたヒラメ練肉加水分解物のサイズ排除クロマトグラフィーを示したものである。
【図１８】ヒラメ練肉加水分解物の分画物の逆相クロマトグラムの結果を示したものである。
【図１９】サイズ排除クロマトグラフィー分画物のＡｌｋｙｌラジカル消去能の測定結果を示したものである。
【図２０】Ｆｒａｃｔｉｏｎ  ２分画物由来ペプチドのアミノ酸配列、Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ａｒｇ（ＩＶＤＲ）とその分子量を示す。
【図２１】Ｆｒａｃｔｉｏｎ  ２分画物由来ペプチドのアミノ酸配列、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ（ＶＡＳＶＩ）とその分子量を示す。
【図２２】Ｆｒａｃｔｉｏｎ  ２分画物由来ペプチドのアミノ酸配列、Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＷＹＫ）とその分子量を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明者は、ヒラメ（ｆｌｏｕｎｄｅｒ）を磨砕及び水洗した後、精製処理して、ヒラメ練肉を製造し、ペプシンを含む人工胃液と、トリプシン、α−キモトリプシンを含む人工腸液を利用して、ヒラメ練肉の加水分解物を製造し、前記加水分解物の各分子量別の分画物と前記分画物から分離された特定アミノ酸配列を有するペプチドがアンジオテンシンＩ転換酵素（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  Ｉ  ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  Ｅｎｚｙｍｅ、ＡＣＥ）阻害活性があることを確認した。
【００２２】
従って、前記ヒラメ練肉の加水分解物の分画物から分離されたペプチドを利用して、高血圧治療または予防用薬学組成物または食品組成物に使用できることを確認し、本発明を完成した。
【００２３】
また、本発明者は、ヒラメ（ｆｌｏｕｎｄｅｒ）を磨砕及び水洗した後、精製処理して、ヒラメ練肉を製造し、ペプシンを含む人工胃液と、トリプシン、α−キモトリプシンを含む人工腸液を利用して、ヒラメ練肉の加水分解物を製造し、前記加水分解物の各分子量別の分画物と前記分画物から分離された特定アミノ酸配列を有するペプチドがラジカル消去効果、酸化的ストレスに対する保護効果を有してＲＯＳ生成を抑制し、脂質過酸化、そして細胞死を抑制することを確認した。従って、前記ヒラメ練肉の加水分解物の分画物から分離されたペプチドを利用して、抗酸化用食品組成物に使用できることを確認し、本発明を完成した。
【００２４】
前記目的を達成するための一つの様態として、本発明は、配列番号１、配列番号２または配列番号３で表示されるアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含む、高血圧治療または予防用薬学組成物を提供する。
【００２５】
本発明において、配列番号１で表示されるアミノ酸配列はＩｌｅ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ａｒｇ（ＩＶＤＲ）であり、前記配列番号２で表示されるアミノ酸配列はＶａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ（ＶＡＳＶＩ）であり、前記配列番号３で表示されるアミノ酸配列はＴｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＷＹＫ）であり、前記高血圧治療または予防用薬学組成物は、前記配列番号１で表示されるＩｌｅ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ａｒｇ（ＩＶＤＲ）、前記配列番号２で表示されるアミノ酸配列Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ（ＶＡＳＶＩ）、または前記配列番号３で表示されるアミノ酸配列Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＷＹＫ）からなるペプチドを有効成分として含む。
【００２６】
前記ペプチドは、ヒラメ（ｆｌｏｕｎｄｅｒ）の加水分解物から分離され得、より具体的に、ヒラメ練肉の加水分解物の分画物から分離され得る。
【００２７】
前記ペプチドは、抗酸化活性を有することができる。
【００２８】
本発明において、前記加水分解物は、前記ヒラメ（ｆｌｏｕｎｄｅｒ）練肉を消化酵素を利用して分解した加水分解物であってよく、前記消化酵素としては、ペプシン（ｐｅｐｓｉｎ）、トリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ）またはα−キモトリプシン（α−キモトリプシン）であってよい。従って、本発明の前記ヒラメ練肉の加水分解物は、ペプシン、トリプシン、またはα−キモトリプシンの加水分解物であってよい。
【００２９】
本発明の一実施例においては、ヒラメを磨砕及び水洗した後、精製処理して、ヒラメの練肉を製造した。具体的に、済州ヒラメの頭部と内臓、皮、骨等を除去して魚肉だけを得た後、ｃｈｏｐｐｅｒ（Ｍ−１２Ｓ、韓国フジー工業、韓国）で磨砕した後、試料の５倍の０．２％重合リン酸塩（Ｎａ５Ｐ３Ｏ１０、（株）イーエス技術研究所、韓国）を添加して２０分間浸漬後、同じ体積の冷水を追加して水洗した後、夾雑物を除去し、脱水機（Ｗ−１１０、（株）ハンイル、韓国）で脱水された魚肉をｓｔｅｐｈａｎ  ｍｉｘｅｒ（７７４０２７−０１、ＵＭＣ  ５  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｃｏ．ＬＴＤ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を利用して４％ソルビトール（（株）ＬＧ生活健康、韓国）、０．２％重合リン酸塩を混合した後、精製処理してヒラメ練肉を製造した。
【００３０】
本発明の一実施例においては、ペプシンを含む人工胃液と、トリプシン、α−キモトリプシンを含む人工腸液を利用して、ヒラメ練肉の加水分解物を製造し、前記加水分解物、そして前記加水分解物の各分子量別の分画物と前記分画物から分離された配列番号１、２または３で表示されるアミノ酸配列からなるペプチドがアンジオテンシンＩ転換酵素（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  Ｉ  ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  Ｅｎｚｙｍｅ、ＡＣＥ）阻害活性があることを確認した。
【００３１】
また、本発明の一実施例においては、ペプシンを含む人工胃液と、トリプシン、α−キモトリプシンを含む人工腸液を利用して、ヒラメ練肉の加水分解物を製造し、前記製造されたヒラメ練肉の人工消化液を用いた加水分解物、そして前記加水分解物の各分子量別の分画物と前記分画物から分離された配列番号１、２または３で表示されるアミノ酸配列からなるペプチドがラジカル消去効果、酸化的ストレスに対する保護効果を有してＲＯＳ生成を抑制し、脂質過酸化、そして細胞死を抑制することを確認した。
【００３２】
また、本発明において、前記分画物は、ヒラメ練肉の加水分解物をサイズ排除クロマトグラフィーを利用して分子量サイズ別に分画した分画物であってよい。
【００３３】
本発明の一実施例においては、前記ヒラメ練肉の加水分解物をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５とサイズ排除クロマトグラフィーを利用して、分子量サイズ別に分画して計３個の分画物を得ており、この中でＦ２分画物でＡＣＥ阻害活性に最も優れて抗高血圧活性に最も優れたことを確認し、前記Ｆ２分画物で抗高血圧活性（ＡＣＥ阻害活性）を示す配列番号１〜３で表示されるアミノ酸配列からなるペプチド３個を分離した。
【００３４】
また、本発明の一実施例においては、前記ヒラメ練肉の加水分解物をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５とサイズ排除クロマトグラフィーを利用して、分子量サイズ別に分画して計３個の分画物を得ており、この中でＦ２分画物でアルキルラジカル消去能に最も優れて抗酸化活性に最も優れたことを確認し、前記Ｆ２分画物で抗酸化活性を示す配列番号１〜３で表示されるアミノ酸配列からなるペプチド３個を分離した。
【００３５】
本発明において、ヒラメは別称でフラットフィッシュと呼ばれ、フラットフィッシュの学名はＰａｒａｌｉｃｈｔｈｙｓ  ｏｌｉｖａｃｅｕｓであり、体長は６０ｃｍ程であり、模様は上下に平たい長い楕円形である。口が大きく、歯がよく発達しており、目は体の左側にある。目のある側は濃い黄褐色の地に黒色及び白色斑点が散らばっているが、目のない側は白色である。水深１０−２００ｍ沿岸の砂や干潟地域に生息し、２−６月に産卵する。韓国の全沿岸に出現し、クリル列島、日本、南シナ海に分布する。平たい体形のため、よく「ヒラメ」と呼び、目が左側にあるため、一般的に目が右側にあるカレイ類と容易に区別される。
【００３６】
本発明において、用語、「抗酸化」は、酸化を抑制する作用を意味するものであり、人体は、酸化促進物質（ｐｒｏｏｘｉｄａｎｔ）と酸化抑制物質（ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ）が均衡を取っているが、様々な要因によりこのような均衡状態が不均衡になって酸化促進の方に傾くと、酸化的ストレス（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ）が誘発されて潜在的な細胞損傷及び病理的疾患を起こすこととなる。このような酸化的ストレスの直接的な原因となる活性酸素種（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ、ＲＯＳ）は、不安定で反応性が高く、様々な生体物質と容易に反応し、体内高分子を攻撃して細胞と組織に非可逆的な損傷を起こすか、突然変異、細胞毒性及び発癌等を招くようになる。ＮＯ、ＨＮＯ２、ＯＮＯＯ−のような活性窒素種（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ、ＲＮＳ）、ＲＯＳのような活性酸素は、体内で細胞を酸化させて破壊させ、それによって各種の疾患に曝露されるようになる。また、前記抗酸化は、細胞内代謝または紫外線の影響による酸化的ストレスによって反応性の高いフリーラジカル（ｆｒｅｅ  ｒａｄｉｃａｌ）または活性酸素種（Ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ、ＲＯＳ）による細胞の酸化を抑制する機能を意味し、フリーラジカルまたは活性酸素種を除去して、これによる細胞の損傷が減少することを含む。
【００３７】
前記ＡＣＥ（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  Ｉ  ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ）は、デカペプチド（ｄｅｃａｐｅｐｔｉｄｅ）であるアンジオテンシンＩからジペプチド（ｄｉｐｅｐｔｉｄｅ、Ｈｉｓ−Ｌｅｕ）を切断することで血管収縮作用を有するアンジオテンシンＩＩに転換させる役割を果たす酵素である。アンジオテンシンＩＩの増加は、強い血圧上昇作用と抗利尿ホルモンであるアルドステロン（ａｌｄｏｓｔｅｒｏｎｅ）の分泌を促進し、水とナトリウムの排泄を抑制して循環血液量を増加させることで高血圧を起こすようにする。また、ＡＣＥは、血管弛緩作用をするブラジキニン（ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ）を分解して不活性化させることで結果的に血圧上昇を誘発する役割を果たす。
【００３８】
本発明の用語「高血圧（ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ）」と関連して、世界健康保健機構（ＷＨＯ）では、最高血圧が１６０ｍｍＨｇ以上で最低血圧が９５ｍｍＨｇ以上である場合を高血圧と規定しており、高血圧疾患の種類としては、大きく原因が不明な本態性高血圧と原因疾病による続発性高血圧とに区別されるが、このうち９０％以上が本態性高血圧に属すると知られている。
【００３９】
本発明において使用される用語、「予防」とは、本発明に係る組成物を個体に投与して高血圧の発病を抑制または遅延させる全ての行為を意味し得る。本発明において使用される用語、「治療」とは、本発明の前記組成物を高血圧発病疑い個体に投与して高血圧による症状が好転するようにするか、有益になるようにする全ての行為を意味し得る。
【００４０】
本発明の前記ペプチドを含む薬学組成物は、薬学組成物の製造に通常使用する適切な担体、賦形体または希釈剤をさらに含むことができる。このとき、前記組成物に含まれるペプチドは、特にこれに制限されないが、組成物の総重量に対して０．００１重量％〜９９重量％であり、好ましくは０．０１重量％〜５０重量％を含むことができる。
【００４１】
前記薬学組成物は、錠剤、丸剤、散剤、粒剤、カプセル剤、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥剤及び坐剤からなる群から選択されるいずれか一つの剤形を有することができ、経口または非経口の様々な剤形であってよい。製剤化する場合は、通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤等の希釈剤または賦形剤を使用して調製される。
【００４２】
経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、粒剤、カプセル剤等が含まれ、このような固形製剤は、少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、デンプン、炭酸カルシウム、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）またはラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、ゼラチン等を混ぜて調製され得る。また、単純な賦形剤以外にステアリン酸マグネシウム、タルク等のような潤滑剤も使用され得る。経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤等が該当するが、よく使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤等が含まれ得る。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁溶剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステル等が使用され得る。坐剤の基剤としては、ウイテプゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイーン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチン等が使用され得る。
【００４３】
本発明の薬学組成物は、薬学的に有効な量で投与し得る。本発明において、用語、「薬学的に有効な量」は、医学的治療に適用可能な合理的な受益／危険割合で疾患を治療するに十分な量を意味し、有効容量水準は、個体の種類及び重症度、年齢、性別、疾病の種類、薬物の活性、薬物への敏感度、投与時間、投与経路及び排出割合、治療期間、同時使用される薬物を含む要素及びその他の医学分野によく知られている要素によって決定され得る。本発明の組成物は、個別治療剤で投与するか、他の治療剤と併用して投与され得、従来の治療剤とは順次または同時に投与され得る。そして、単一または多重投与され得る。前記要素を全て考慮して副作用なしに最小限の量で最大の効果を得ることができる量を投与することが重要であり、当業者によって容易に決定され得る。
【００４４】
本発明の薬学組成物は、高血圧治療を目的とする個体であれば特に限定されず、いずれのものでも適用可能である。例えば、サル、犬、猫、ウサギ、モルモット、ラット、マウス、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ等のような非ヒト動物、ヒト、鳥類及び魚類等をいずれも使用することができ、前記薬学組成物は、非経口、皮下、腹腔内、肺内及び鼻腔内に投与され得、局部的治療のために、必要であれば病変内投与を含む適した方法によって投与され得る。本発明の前記薬学組成物の好ましい投与量は、個体の状態及び体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路及び期間によって異なるが、当業者によって適切に選択され得る。例えば、経口、直腸または静脈、筋肉、皮下、子宮内頸膜または脳血管内注射によって投与され得るが、これに制限されるものではない。
【００４５】
適した１日の総使用量は、正しい医学的判断範囲内で処置医により決定され得、一般的に０．００１〜１０００ｍｇ／ｋｇの量、好ましくは０．０５〜２００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．１〜１００ｍｇ／ｋｇの量を１日１回〜数回に分けて投与できる。
【００４６】
他の一つの様態として、本発明は、配列番号１、配列番号２または配列番号３で表示されるアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含む、高血圧改善または予防用食品組成物を提供する。
【００４７】
本発明において、配列番号１で表示されるアミノ酸配列はＩｌｅ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ａｒｇ（ＩＶＤＲ）であり、前記配列番号２で表示されるアミノ酸配列はＶａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ（ＶＡＳＶＩ）であり、前記配列番号３で表示されるアミノ酸配列はＴｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＷＹＫ）であり、前記高血圧改善または予防用食品組成物は、前記配列番号１で表示されるＩｌｅ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ａｒｇ（ＩＶＤＲ）、前記配列番号２で表示されるアミノ酸配列Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ（ＶＡＳＶＩ）または前記配列番号３で表示されるアミノ酸配列Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＷＹＫ）からなるペプチドを有効成分として含む。
【００４８】
前記ペプチドは、ヒラメ（ｆｌｏｕｎｄｅｒ）の加水分解物から分離され得、より具体的に、ヒラメ練肉の加水分解物の分画物から分離され得る。
【００４９】
前記ペプチドは、抗酸化活性を有することができる。
【００５０】
本発明において、前記ペプチド、高血圧、ヒラメ、練肉、加水分解物、抗酸化、予防については、前述したとおりである。
【００５１】
発明における用語、「改善」は、前記配列番号１、配列番号２または配列番号３で表示されるアミノ酸配列からなるペプチドを利用して予防または治療される高血圧のような疾患の疑い及び発病個体の症状が好転するか、有益になる全ての行為をいう。
【００５２】
具体的に、本発明の前記配列番号１、配列番号２または配列番号３で表示されるアミノ酸配列からなるペプチドを高血圧の改善または予防を目的として食品組成物に添加し得る。
【００５３】
本発明の食品組成物は、丸剤、粉末、顆粒、浸剤、錠剤、カプセルまたは液剤等の形態を含むことができ、本発明の前記ペプチドを添加し得る食品の種類には特別な制限がなく、例えば、各種の飲料、ガム、茶、ビタミン複合剤、健康補助食品類等がある。
【００５４】
前記食品組成物には、前記配列番号１、配列番号２または配列番号３で表示されるアミノ酸配列からなるペプチド以外にも他の成分を加えることができ、その種類は、特に制限されない。例えば、通常の食品のように様々な生薬抽出物、食品学的に許容可能な食品補助添加剤または天然炭水化物等を追加成分として含有することができ、これに制限されない。
【００５５】
本発明において、用語、「食品補助添加剤」とは、食品に補助的に添加され得る構成要素を意味し、各剤形の健康機能食品を製造するのに添加されるものであって、当業者が適宜選択して使用できる。食品補助添加剤の例としては、様々な栄養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、合成風味剤及び天然風味剤等の風味剤、着色剤及び充填剤、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤等が含まれるが、前記例によって本発明の食品補助添加剤の種類が制限されるものではない。
【００５６】
前記天然炭水化物の例は、ブドウ糖、果糖等の単糖類；マルトース、スクロース等の二糖類；及びデキストリン、シクロデキストリン等の多糖類と、キシリトール、ソルビトール、エリスリトール等の糖アルコールがあり、上記したもの以外の香味剤として、天然香味剤（タウマチン等）、ステビア抽出物（レバウディオサイドＡ、グリチルリチン等）及び合成香味剤（サッカリン、アスパルテーム等）を有利に使用することができる。
【００５７】
本発明の食品組成物には、健康機能食品が含まれ得、本発明において、前記食品組成物は、健康機能食品であってよい。本発明において使用された用語「健康機能食品」とは、人体に有用な機能性を有する原料や成分を使用して錠剤、カプセル、粉末、顆粒、液状及び丸等の形態に製造及び加工した食品をいう。ここで、機能性とは、人体の構造及び機能に対して栄養素を調節するか、生理学的作用等のような保健用途に有用な効果を得ることを意味する。本発明の健康機能食品は、当業界で通常使用される方法によって製造可能であり、前記製造時には、当業界で通常添加する原料及び成分を添加して製造し得る。また、一般の薬品とは異なり食品を原料として薬品の長期服用時に発生し得る副作用等がない長所があり、携帯性に優れ得る。
【００５８】
有効成分の混合量は、使用目的（予防、健康または治療的処置）によって適するように決定され得る。一般的に、食品の製造時に、本発明の前記ペプチドは、原料組成物中、１〜５０重量％、好ましくは５〜１０重量％の量で添加され得るが、これに制限されるものではない。しかし、健康及び衛生を目的とするか、または健康調節を目的とする長期間の摂取の場合は、前記量は、前記範囲以下でも使用され得る。
【００５９】
前記食品の種類には、特別な制限はない。前記物質を添加できる食品の例としては、練肉、練り製品、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンディ類、スナック類、菓子類、ピザ、ラーメン、その他の麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種のスープ、飲料水、茶、ドリンク剤、アルコール飲料、及びビタミン複合剤等があり、通常の意味での健康機能食品を全て含む。
【００６０】
他の一つの様態として、本発明は、配列番号１、配列番号２または配列番号３で表示されるアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含む、ヒラメの練肉を提供する。
【００６１】
前記練肉（ｓｕｒｉｍｉ）は、魚の皮と内臓、骨を除去した肉を冷水で数回水洗後に脱水し、糖とリン酸塩を加えて混合したものである。
【００６２】
本発明の一実施例においては、ヒラメを磨砕及び水洗した後、精製処理して、ヒラメの練肉を製造した。
【００６３】
前述したように、前記ヒラメ練肉の加水分解物の分画物で前記配列番号１〜３で表示されるアミノ酸配列からなるペプチドが存在することを確認しており、ヒラメ練肉にも前記配列番号１〜３で表示されるアミノ酸配列からなるペプチドが存在する。従って、本発明は、配列番号１、配列番号２または配列番号３で表示されるアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含む、ヒラメの練肉を提供できる。
【００６４】
他の一つの様態として、本発明は、配列番号１、配列番号２または配列番号３で表示されるアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含む、ヒラメの練り製品を提供する。
【００６５】
本発明の一実施例においては、ヒラメを磨砕及び水洗した後、精製処理してヒラメの練肉を製造し、前記ヒラメ練肉を食塩と混合してヒラメの練り製品を製造した。具体的に、製造された練肉を冷凍した後、冷凍された練肉を４で低温解凍させた後、２０分間ｓｔｅｐｈａｎ  ｍｉｘｅｒで初すり、２０分間２％食塩添加後２回すり、２０分間２％デンプン添加後３回すりをし、以後、直径２ｃｍの円筒状ポリエチレンビニールに注入してケーシングし、２４時間の間４で自然凝固させてヒラメの練り製品を製造した。
【００６６】
前記練り製品とは、魚肉に食塩を加えて肉すりした後、成形して加熱した食品の総称を意味し、かまぼこ、揚かまぼこ、ちくわ、魚肉ハム、ソーセージ等がこれに属する。
【００６７】
前述したように、前記ヒラメ練肉の加水分解物の分画物で前記配列番号１〜３で表示されるアミノ酸配列からなるペプチドが存在することを確認しており、ヒラメ練肉を食塩と混合して製造されたヒラメ練り製品にも配列番号１〜３で表示されるアミノ酸配列からなるペプチドが存在する。従って、本発明は、配列番号１、配列番号２または配列番号３で表示されるアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含む、ヒラメの練肉を提供できる。
【００６８】
他の一つの様態として、本発明は、ヒラメを磨砕及び水洗した後、精製処理するステップを含む、配列番号１、配列番号２または配列番号３で表示されるアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含む、ヒラメ練肉の製造方法を提供する。
【００６９】
前記配列番号１、配列番号２、配列番号３、ペプチド、ヒラメ、練肉、練肉の製造方法についての説明は、前述したとおりである。
【００７０】
他の一つの様態として、本発明は、前記ヒラメ練肉の製造方法により製造されたヒラメ練肉と食塩を混合するステップを含む、ヒラメ練り製品の製造方法を提供する。
【００７１】
前記配列番号１、配列番号２、配列番号３、ペプチド、ヒラメ、練肉、練り製品、練り製品の製造方法についての説明は、前述したとおりである。
【００７２】
他の一つの様態として、本発明は、配列番号１、配列番号２または配列番号３で表示されるアミノ酸配列からなるペプチドを個体に投与するステップを含む、高血圧の予防または治療方法を提供するものである。
【００７３】
本発明において、用語「配列番号１、配列番号２、配列番号３で表示されるアミノ酸配列からなるペプチド」、「高血圧」、「予防」、「治療」についての説明は、前述したとおりである。
【００７４】
本発明において、用語「個体」とは、高血圧が発生したヒトを含む全ての動物を意味する。ウシ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、犬、ヒト等を含む哺乳動物、鳥類等を含み、本発明の前記配列番号１、配列番号２または配列番号３で表示されるアミノ酸配列からなるペプチド投与により高血圧が治療または予防される個体は制限なく含む。
【００７５】
他の一つの様態として、本発明は、配列番号１、配列番号２または配列番号３で表示されるアミノ酸配列からなるペプチドを高血圧の予防または治療のための医薬品の製造に使用するための用途を提供するものである。
【００７６】
本発明において、用語「配列番号１、配列番号２または配列番号３で表示されるアミノ酸配列からなるペプチド」、「高血圧」、「予防」、「治療」についての説明は、前述したとおりである。
【００７７】
以下、本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が容易に実施できるように、本発明の実施例について添付の図面を参考にして詳細に説明する。しかし、本発明は、様々な異なる形態で具現され得、ここで説明する実施例に限定されない。
【００７８】
＜Ａ．抗高血圧効果測定＞
実施例１：原料購入及び練肉、練り製品の製造
本発明に使用された練肉は、済州ヒラメの頭部と内臓、皮、骨等を除去して魚肉だけを得た後、ｃｈｏｐｐｅｒ（Ｍ−１２Ｓ、韓国フジー工業、韓国）で磨砕した。この後、試料の５倍の０．２％重合リン酸塩（Ｎａ５Ｐ３Ｏ１０、（株）イーエス技術研究所、韓国）を添加して２０分間浸漬後、同じ体積の冷水を追加して水洗し、水洗水を除去する工程を４回繰り返した。この後、篩に掛けてその他の夾雑物を除去し、脱水機（Ｗ−１１０、（株）ハンイル、韓国）で脱水した。脱水された魚肉をｓｔｅｐｈａｎ  ｍｉｘｅｒ（７７４０２７−０１、ＵＭＣ  ５  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｃｏ．ＬＴＤ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を利用して４％ソルビトール（（株）ＬＧ生活健康、韓国）、４％砂糖（（株）ＢＥＫＳＵＬ、韓国）、０．２％重合リン酸塩を混合した後、５００ｇずつケースに保管して−７０℃で保管した。練り製品は、冷凍された練肉を４℃で低温解凍させた後、２０分間ｓｔｅｐｈａｎ  ｍｉｘｅｒで初すり、２０分間２％食塩添加後２回すり、２０分間２％デンプン添加後３回すりをした。以後、直径２ｃｍの円筒状ポリエチレンビニールに注入してケーシングし、２４時間の間４℃で自然凝固させた。この後、８５℃ｗａｔｅｒ  ｂａｔｈで３０分間加熱し、４℃で低温冷却させて練り製品の物理的特性実験に使用した。図１は、前記方法で製造されたヒラメ練肉とヒラメ練り製品を示す。
【００７９】
実施例２：ヒラメを利用して製造した練肉及び練り製品の理化学的特性分析
１）一般成分含量分析
一般成分は、ＡＯＡＣ法（１９９５）によって、水分は常圧加熱乾燥法、粗タンパク質はｓｅｍｉｍｉｃｒｏ  Ｋｊｅｌｄａｈｌ法、粗灰分は乾式灰化法、及び粗脂肪はＳｏｘｈｌｅｔ法でそれぞれ測定した。重金属のうち総水銀は、試料を凍結乾燥した後、水銀分析器（ＳＰ−３Ａ、Ｎｉｐｐｏｎ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．，Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を利用するｃｏｍｂｕｓｔｉｏｎ  ｇｏｌｄ  ａｍａｌｇａｍａｔｉｏｎ法で分析し、鉛は、硝酸で有機質を湿式分解して試料を調製した後、ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｐｌａｓｍａ  ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＩＣＰ）（Ａｔｏｍｓｃａｎ  ２５、ＴＪＡ、ＵＳＡ）で分析した。
【００８０】
２）構成アミノ酸分析
構成アミノ酸分析のためにＡｇｉｌｅｎｔ  ６８９０Ｎ  ＧＣ−ＦＩＤ機器を使用し、カラム：ＺＢ−ＡＡＡ（１０ｍｅｔｅｒ  ＊  ０．２５ｍｍ）、注入部の温度２５０℃、温度条件：１１０℃〜３２０℃、検出器３２０℃、注入量：２μｌ、ｓｐｌｉｔ  ｒａｔｉｏ  ５：１、運搬気体：Ｎｉｔｒｏｇｅｎ、１．５ｍＬ／ｍｉｎの条件で分析し、標準溶液は、ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社のＡｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｔａｎｄａｒｄを使用した。
【００８１】
実施例３：ヒラメを利用して製造した練肉及び練り製品の物理的特性分析
１）白色度測定
白色度は、Ｐａｒｋ（１９９４）が言及した方法を若干変形して直視色差計（ＮＥ４０００、Ｎｉｐｐｏｎ  Ｄｅｎｓｈｏｋｕ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｃｏ．，Ｊａｐａｎ）で測定した。白色度は、解凍したすり身（ｓｕｒｉｍｉ、練肉）の場合、容器に満たして、そして円形かまぼこ（練り製品）の場合、表面が一定の大きさ（２．５×２．５ｃｍ）で平衡になるように切断した全断面を試料として色差計でＨｕｎｔｅｒ  Ｌ、ａ及びｂ値を測定した。このとき、直視色差計の標準白板は、Ｌ値が１００．０５、ａ値が−０．０３、及びｂ値が０．０１であった。
【００８２】
２）ゲル強度測定
ゲル強度は、Ｏｋａｄａ（１９６３）の方法を若干変形して測定し、試料は、円形かまぼこ（練り製品）を一定の大きさ（２．５×２．５ｃｍ）に切断して使用した。即ち、ゲル強度は、Ｓｕｎ  ｒｈｅｏｍｅｔｅｒ（ＣＯＭＰＡＣ−１００、Ｓｕｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏ．，Ｊａｐａｎ）を利用して試料の荷重と深さをそれぞれ測定した後、荷重×深さで示した。このとき、ｒｈｅｏｍｅｔｅｒのｌｏａｄは１ｋｇとし、ｐｌｕｎｇｅｒの速度は２０ｍｍ／ｍｉｎとし、ｐｌｕｎｇｅｒは直径５ｍｍの球形を使用した。
【００８３】
実施例４：ヒラメ練肉摂取時の生理活性測定
１）人工消化液の製造及び人工消化液の処理
人工消化モデルに使用される人工胃液と人工腸液は、Ｈｕｒ（２０１１）の方法を若干変更して使用し、組成は表１に示した。ヒラメ練肉５００ｇに人工胃液１Ｌを添加後、ｐＨを１．５に調整し、３７℃で４時間の間撹拌させた。この後、ｐＨを８に調整後、人工腸液１Ｌを添加して、３７℃で４時間の間さらに撹拌し、この後、９５℃で酵素不活性化ステップを経て残渣を除去し、実験に使用した。
【００８４】
【表１】
2020518572.tif 000003
【００８５】
２）ＡＣＥ阻害活性測定
ＡＣＥ阻害活性測定は、ＣｕｓｈｍａｎとＣｈｅｕｎｇの方法を変形して測定し、粗酵素液は、ｒａｂｂｉｔ  ｌｕｎｇ  ａｃｅｔｏｎｅ  ｐｏｗｄｅｒ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）を０．２ｇ／１０ｍＬ（ｗ／ｖ）の濃度で４℃で２４時間抽出した後、遠心分離（４℃、４，０００ｒｐｍ、４０ｍｉｎ）して上澄み液を粗酵素液として使用した。基質は、０．３Ｍ  ＮａＣｌが含有された０．１Ｍ  ｓｏｄｉｕｍ  ｂｏｒａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．３）にｈｉｐｐｕｒｙｌｈｉｓｔｉｄｙｌ−ｌｅｕｃｉｎｅ（ＨＬＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）を５ｍｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ）の濃度で溶かした後、基質として使用した。
【００８６】
ＡＣＥ阻害活性は、試料抽出液５０μＬにＡＣＥ粗酵素液５０μＬを加えた後、３７℃で５分間反応をさせた後、基質５０μＬを加え、さらに３７℃で１時間反応させた。次に１Ｎ  ＨＣｌ  １５０μＬを加えて反応を停止させ、７５０μＬのｅｔｈｙｌ  ａｃｅｔａｔｅを加えた後、１分間撹拌し、遠心分離（３，５００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）した後、５００μＬの上澄み液を得た。この上澄み液を１０５℃で４時間の間完全に乾燥させて２ｍＬのｅｔｈｙｌ  ａｃｅｔａｔｅを入れた後、２２８ｎｍで吸光度を測定した。対照区としては、試料抽出液の代わりに蒸留水５０μＬを加えて測定した。
【００８７】
３）血管のＮＯ生成効果確認
血管のＮＯ生成効果を確認するために、血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ  ｃｅｌｌ）を１×１０５で９６ｗｅｌｌにｓｅｅｄｉｎｇし、２４時間後、各ウェルの培地をｇｒｏｗｔｈ培地からｂａｓｅ培地に取り替えた。２時間以後、試料を処理し、試料処理直後３００μＭのＤＡＦ−ＦＭ−ＤＡ（ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を１０μｌ処理して、１時間３０分後、蛍光値を測定した。
【００８８】
４）血圧変化測定
ヒラメ練肉を本態性高血圧ラット（Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ  ｒａｔｓ、ＳＨＲ）に給餌した後、血圧変化を測定した。具体的に、２５０〜３００ｇのＳＨＲに凍結乾燥されたヒラメ練肉を水に練って５０ｍｇ／Ｋｇの量を給餌し、０、３、６、９時間の際、ｔａｉｌ−ｃｕｆｆ  ｍｅｔｈｏｄ  ＣＯＤＡＴＭ  ｂｌｏｏｄ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｍｏｎｉｔｏｒ（Ｋｅｎｔ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＣＴ、ＵＳＡ）装備を利用して血圧変化を測定した。
【００８９】
実験例１．ヒラメを利用して製造した練肉の一般成分分析及び重金属含量分析
本発明に使用された魚種であるヒラメを利用して冷凍練肉を製造し、製造した練肉の一般成分分析の結果は表２に示した。その結果、ヒラメ練肉の水分含量は７３．１８％であり、タンパク質含量は１８．９３％を示した。
【００９０】
【表２】
2020518572.tif 000004
【００９１】
練肉（ｓｕｒｉｍｉ、すり身）の重金属含量規格基準は、淡水産魚介類で製造したものは、重金属が１０．０ｍｇ以下／ｋｇであるものと定義しており、水銀含量の場合、海産魚介類（深海性魚介類及びマグロ類を除く）で製造したものは、総水銀が０．５ｍｇ以下／ｋｇであるもの、鉛含量は、海産魚介類（深海性魚介類及びマグロ類を除く）で製造したものは、鉛が２．０ｍｇ以下／ｋｇであるものと規定している。
【００９２】
ヒラメ練肉の重金属含量分析の結果、表３に示されたように、ヒラメ練肉で鉛、カドミウム、ヒ素は検出されず、水銀は、基準値未達である０．０２ｍｇ／ｋｇを示すことを確認した。
【００９３】
【表３】
2020518572.tif 000005
【００９４】
実験例２：ヒラメ冷凍練肉の構成アミノ酸分析
ヒラメ練肉５００ｇに人工胃液１Ｌを添加後、ｐＨを１．５に調整し、３７℃で４時間の間撹拌させた。この後、ｐＨを８に調整後、人工腸液１Ｌを添加して、３７℃で４時間の間さらに撹拌し、この後、９５℃で酵素不活性化ステップを経て残渣を除去し、実験に使用した。
【００９５】
ヒラメ練肉とヒラメ練肉加水分解物の構成アミノ酸を分析した結果は、表４に示した。主要アミノ酸であるＬｅｕｃｉｎｅ、Ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄとＬｙｓｉｎｅが多くの含量を占めることは変わらず、Ｌｙｓｉｎｅの場合、加水分解後、減少し、Ｃｙｓｔｉｎｅの場合、加水分解後、検出されることを確認した。
【００９６】
【表４】
2020518572.tif 000006
【００９７】
実験例３：ヒラメ冷凍練肉の白色度
凍結練肉の一般的なアジアの等級基準には、水分含量、ゲル強度、せん断ひずみ、弾力官能検査、白色度等の項目があり、そのうち、白色度は、４５以上がＡ等級、４７以上ＳＡ等級、４９以上３Ａ等級に分類される。従って、白色度は、冷凍練肉の等級を決定する重要な項目であり、白色度が高い練肉は、プレミアム練り製品に使用される高級素材として使用されている。Ｈｅｕ（２０１０）の研究結果によると、一般的に、市販練肉は、ＳＡ、ＦＡ、ＡＡ、Ａ  ＫＡ、ＫＢ、ＲＡ等級が使用されており、これらの等級は、白色度が高いほど練肉の等級が高くなったと報告している。
【００９８】
ヒラメ練肉の場合、６３．６の高い数値を示し、ＳＡ級市販練肉より白色度に優れたものと示された。
【００９９】
【表５】
2020518572.tif 000007
【０１００】
実験例４：ヒラメ練り製品の白色度及びゲル強度
練り製品のゲル強度は、練り製品の等級を決定する重要な要因であり、製品の食感を上昇させる要因と評価されている。Ｈｅｕ（２０１０）の研究結果によると、ＳＡ級メンタイ練り製品のゲル強度は、ＳＡ級９４５．２ｇ×ｃｍ、ＦＡ級７８２．０ｇ×ｃｍ、ＡＡ級７４７．３ｇ×ｃｍ、Ａ級６１１．１ｇ×ｃｍ、ＫＡ級６２８．１ｇ×ｃｍ、ＫＢ級４４４．５ｇ×ｃｍ、ＲＡ級２５６．８ｇ×ｃｍのゲル強度を示し、練り製品の等級別に異なるゲル強度を有していると報告された。
【０１０１】
メンタイ練り製品のゲル強度は１０１２ｇ×ｃｍであり、ＳＡ級と類似したゲル強度を示し、練り製品の製造条件の差によって若干のゲル強度差があるものと見られる。
【０１０２】
ヒラメ練り製品の場合、１０６４ｇ×ｃｍのゲル強度を示し、また加熱及び冷却過程を経てタンパク質の特性上よく変性するので、加熱及び調理過程を経て色度が下がる現象が現れ得、練り製品を作った後、白色度を再び測定した。その結果、調理過程を経て練肉状態での値と相違点が大きいことを確認することができ、ヒラメ練り製品は８９．３２の値を示し、メンタイ練り製品より優れた白色度を示した。
【０１０３】
【表６】
2020518572.tif 000008
【０１０４】
実験例５：ヒラメ練肉摂取時の生理活性測定
イ）ヒラメ練肉加水分解物のＡＣＥ阻害効果
アンジオテンシノーゲン（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎｏｇｅｎ）は、レニン（Ｒｅｎｉｎ）によりアンジオテンシンＩ（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  Ｉ）に変換され、アンジオテンシンＩは、Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  Ｉ  ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ（ＡＣＥ）によりＡｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩに転換される。前記アンジオテンシンＩＩ（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ）は、高血圧を誘発させると知られているが、Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩに転換させる役割を果たすＡＣＥを阻害するものが高血圧を抑制させることができると知られている。従って、ヒラメ練肉加水分解物を利用してＡＣＥ阻害活性を測定し、図２に示した。図２は、ヒラメ練肉加水分解物のＡＣＥ阻害活性を測定したものである。その結果、加水分解物の濃度が高くなるにつれＡＣＥ阻害率が有意的に増加することを確認した。
【０１０５】
ロ）ヒラメ練肉加水分解物のＨＵＶＥＣでのＮＯ生成効果
血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）でのＮＯ生成は、血管を弛緩させて高血圧を緩和させると知られており、これによって、ヒラメ練肉加水分解物を処理することでＮＯ生成量の変化を測定した（図３）。図３は、ヒラメ練肉加水分解物のＮＯ生成効果を示したものである。その結果、ヒラメ練肉加水分解物６．２５μｌ／ｍｌの濃度で有意的にＮＯ生成が増加することを確認し、ヒラメ練肉を摂取したとき、高血圧を抑制させることができることが分かった。
【０１０６】
ハ）ヒラメ練肉の本態性高血圧ラット（Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ  ｒａｔｓ、ＳＨＲ）への給餌による血圧変化測定
高血圧と高脂血症は、冠動脈疾患、心筋梗塞、脳卒中等、心血管疾患の代表的な危険因子であり、その発病率が増加している。高血圧は、慢性循環器系疾患のうち発生頻度が最も高く、特に原因不明の本態性高血圧が全高血圧の９０％に該当する。ＳＨＲは、生後６〜１０週齢に高血圧が発生して収縮期血圧２００ｍｍＨｇ以上を維持するシロネズミであり、血圧増加原因が不明でヒトの本態性高血圧の機序研究に多く活用されてきた。
【０１０７】
そこで、本発明においては、ＳＨＲにヒラメ練肉を給餌した後、血圧変化を図４に示した。図４は、ヒラメ練肉の本態性高血圧ラット（Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ  ｒａｔｓ、ＳＨＲ）への給餌による血圧変化を測定したものである。その結果、ヒラメ練肉給餌３時間後、収縮期血圧を測定したとき、ｓａｌｉｎｅを給餌したグループでは３１％が増加したのに対し、ヒラメ練肉を給餌したとき、２％のみ増加して対照群に対比して２９％血圧が降下したことを確認することができた。参考までに、鰹節（ｋａｔｓｕｏｂｕｓｈｉ）とマイワシ（ｓａｒｄｉｎｏｐｓ  ｍｅｌａｎｏｓｔｉｃｔｕｓ）から分離されたペプチドは、陽性対照群として使用した。
【０１０８】
ニ）Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムを用いたヒラメ練肉加水分解物由来の抗高血圧活性ペプチドの分離
Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５とサイズ排除クロマトグラフィーを利用して、ヒラメ練肉加水分解物を分子量サイズ別に分画して計３個の分画物を得ており、図５は、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムを用いたヒラメ練肉加水分解物のサイズ排除クロマトグラフィーの結果を示したものである。各分画物の逆相クロマトグラムは図６に示し、各分画物は、２２０ｎｍと２８０ｎｍの波長で測定した。分画物１は、非常に多くのピークが検出され、分画物内に多量の物質が含有されたものと見られ、分画物２は、主要ピーク１個の他の小さなピークが検出され、９０％以上の純度を示し、分画物３は、主要ピーク１個の他にピークが検出されず、９５％以上の純度を示した。
【０１０９】
ホ）サイズ排除クロマトグラフィー分画物のＡＣＥ阻害活性測定
前記Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５を利用して得られた３個の分画物のＡＣＥ阻害活性を測定した。表７を参考にすると、分画物１は５ｋＤａを超えるタンパク質を含み、分画物２は１ｋＤａ以下、分画物３は１Ｋｄａ未満のタンパク質を含むことが分かった。
【０１１０】
【表７】
2020518572.tif 000009
【０１１１】
図７は、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５を用いたサイズ排除クロマトグラフィー分画物のＡＣＥ阻害活性を示したものである。その結果、Ｆ２とＦ３の分画物で優れたＡＣＥ阻害能を示した。
【０１１２】
次に、分画物の中で収率が高く、ＡＣＥ阻害活性が高いＦ２分画物を利用してペプチドの分子量及びアミノ酸配列をＱ−ＴＯＦ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ、Ａｌｔｒｉｎｃｈａｍ、ＵＫ）ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ（ＥＳＩ）を使用して測定し、その結果を図８乃至図１０に示した。図８乃至図１０は、Ｆｒａｃｔｉｏｎ  ２分画物由来ペプチドのアミノ酸配列と分子量を示す。図８を参考にすると、Ｆｒａｃｔｉｏｎ  ２分画物由来ペプチドのアミノ酸配列は、Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ａｒｇ（ＩＶＤＲ）であり、分子量は、５０２．３０Ｄａと示された。図９を参考にすると、Ｆｒａｃｔｉｏｎ  ２分画物由来ペプチドのアミノ酸配列は、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ（ＶＡＳＶＩ）であり、分子量は、４８８．３２Ｄａと示された。また、図１０を参考にすると、Ｆｒａｃｔｉｏｎ  ２分画物由来ペプチドのアミノ酸配列は、Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＷＹＫ）であり、分子量は、４９６．２５Ｄａと示された。
【０１１３】
【表８】
2020518572.tif 000010
【０１１４】
また、それぞれのペプチドのＡＣＥ阻害効果を測定し、結果は表８にＩＣ５０値で示した。ＩＶＤＲペプチドは、３２ｕｇ／ｍｌの濃度でＡＣＥを５０％阻害し、ＷＹＫペプチドは、１６ｕｇ／ｍｌで最も低いＩＣ５０値を示し、ＶＡＳＶＩペプチドは、５７ｕｇ／ｍｌの濃度でＡＣＥを５０％抑制できる効果を示した。
【０１１５】
＜Ｂ．抗酸化効果測定＞
実施例１：原料購入及び練肉、練り製品の製造
本発明に使用された練肉、練り製品の製造方法は、抗高血圧効果測定で使用されたものと同じ方法を使用して、練肉の一般成分分析、重金属含量、ヒラメのアミノ酸組成、練肉の白色度、練り製品の白色度、及びゲル強度もまた同じ値を示した。
【０１１６】
実施例２：ヒラメ練肉摂取時の生理活性測定
１）人工消化液の製造及び人工消化液の処理
人工胃液と人工腸液を利用してヒラメ練肉の加水分解物を製造し、人工消化液の製造及び人工消化液の処理方法もまた抗高血圧効果測定で使用されたものと同じ方法を使用した。
【０１１７】
２）ラジカル消去能測定
ＥＳＲ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｓｐｉｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ、ＪＥＳ−ＦＡ  ＥＳＲ、ＪＥＯＬ、Ｊａｐａｎ）を用いたラジカル消去能を確認するために、済州大学校共同実験実習館に保有しているＥＳＲ機器を使用し、実験方法は、Ｈｉｒａｍｏｔｏ（１９９３）の方法を変形して使用した。試料２０μＬと蒸留水２０μＬを混合後、４０ｍＭ  ＡＡＰＨ  ２０μＬと４０ｍＭ  ＰＯＢＮ  ２０μＬを添加して３７℃で３０分間反応させた後、毛細管チューブに移した後、測定した。分析に使用された条件は、ｃｅｎｔｒａｌ  ｆｉｅｌｄ  ３４７５Ｇ、ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｗｉｄｔｈ  ０．２ｍＴ、ａｍｐｌｉｔｕｄｅ  ５００ｍＴ、ｓｃａｎ  ｗｉｄｔｈ  １０ｍＴ、ｍｉｃｒｏｗａｖｅ  ｐｏｗｅｒ  ８ｍＷに設定した後、測定した。
【０１１８】
３）酸化的ストレスからの細胞保護効果
酸化的ストレスからの細胞保護効果を測定するために、ｍｏｎｋｅｙ  ｋｉｄｎｅｙ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ（Ｖｅｒｏ、ＫＣＫＢ  Ｎｏ．１００８１）が使用され、細胞は、３７℃のインキュベーターで５％のＣＯ２を供給しながら培養した。培養に使用された培地は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ）に１０％ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ）とｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（１００μＬ／ｍＬ）を添加して使用した。
【０１１９】
４）細胞でのａｐｏｐｔｏｓｉｓとｎｅｃｒｏｓｉｓを形態学的に確認
細胞でのａｐｏｐｔｏｓｉｓとｎｅｃｒｏｓｉｓを形態学的に確認するために、ＭｃＫｅａｇｕｅの方法を若干変形して使用した。Ｖｅｒｏ  ｃｅｌｌを２４−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅｓに各ｗｅｌｌ当たり５×１０４で５００μＬのｍｅｄｉｕｍと共に分注し、５％ＣＯ２が供給されるｉｎｃｕｂａｔｏｒで１６時間培養した。その後、サンプルを濃度別に処理した後、４８時間の間培養し、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（１Ｘ）とｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ染色薬を１０分間反応させ、蛍光顕微鏡で観察した。
【０１２０】
５）ゼブラフィッシュでの抗酸化効果
２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに１ｗｅｌｌ当たり１５−２０個の受精後、７−９ｈｐｆ（ｈｏｕｒ  ｐｏｓｔ  ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ）が過ぎたゼブラフィッシュｅｍｂｒｙｏを入れ、ｅｍｂｒｙｏ  ｍｅｄｉａ  ０．９ｍＬを満たした。ｓａｍｐｌｅを１時間処理した後、ＡＡＰＨを５０μＬを処理し、３ｄｐｆ（ｄａｙ  ｐｏｓｔ  ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ）時に蛍光（ＲＯＳ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、Ｌｉｐｉｄ  ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、Ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ）を通して抗酸化活性を測定し、生存率は７日まで確認した。
【０１２１】
６）ゼブラフィッシュでの活性酸素（ＲＯＳ）測定
ゼブラフィッシュで活性酸素（ＲＯＳ）を測定するために、２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅでｓａｍｐｌｅと刺激物質が処理されたゼブラフィッシュを１匹ずつ９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに移し、ＤＣＦＨ−ＤＡ溶液（２０μｇ／ｍＬ）を１時間の間２８．５℃の暗室で反応させ、ＲＯＳ生成量を測定した。反応時間が終了した後、新たなｅｍｂｒｙｏ  ｍｅｄｉａで２回洗浄後にＭＳ−２２２（０．００３％）で１分間麻酔させた後、蛍光顕微鏡を利用して形態学的に観察し、ｉｍａｇｅ  Ｊプログラムを利用して数値化させた。
【０１２２】
７）脂質過酸化（Ｌｉｐｉｄ  ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ）の生成量測定
脂質過酸化（Ｌｉｐｉｄ  ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ）の生成量を測定するために、２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅでｓａｍｐｌｅと刺激物質が処理されたゼブラフィッシュを１匹ずつ９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに移し、ＤＰＰＰ（２５μｇ／ｍｌ）を２時間の間２８．５℃の暗室で反応させ、ｌｉｐｉｄ  ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ生成量を測定した。反応時間が終了した後、新たなｅｍｂｒｙｏ  ｍｅｄｉａで２回洗浄後にＭＳ−２２２（０．００３％）で１分間麻酔させた後、蛍光顕微鏡を利用して形態学的に観察し、ｉｍａｇｅ  Ｊプログラムを利用して数値化させた。
【０１２３】
８）ゼブラフィッシュでの細胞死測定
ゼブラフィッシュで細胞死を測定するために、２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅでｓａｍｐｌｅと刺激物質が処理されたゼブラフィッシュを１匹ずつ９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに移し、Ａｃｒｉｄｉｎｅ  ｏｒａｎｇｅ溶液（７μｇ／ｍＬ）を３０分間２８．５℃の暗室で反応させ、細胞死を測定した。反応時間が終了した後、新たなｅｍｂｒｙｏ  ｍｅｄｉａで２回洗浄後にＭＳ−２２２（０．００３％）で１分間麻酔させた後、蛍光顕微鏡を利用して観察し、ｉｍａｇｅ  Ｊプログラムを利用して数値化させた。
【０１２４】
９）ゼブラフィッシュでの毒性（Ｔｏｘｉｃｉｔｙ）測定
ゼブラフィッシュでの毒性（Ｔｏｘｉｃｉｔｙ）測定は、２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに１ｗｅｌｌ当たり１５−２０個の受精後、３−４ｈｐｆ（ｈｏｕｒ  ｐｏｓｔ  ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ）が過ぎたゼブラフィッシュｅｍｂｒｙｏを入れ、ｅｍｂｒｙｏ  ｍｅｄｉａ  ０．９５ｍＬを満たした後、ｓａｍｐｌｅを５０μＬ処理した。２ｄｐｆ（ｄａｙ  ｐｏｓｔ  ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ）時に心拍数を測定し、３ｄｐｆに細胞死（Ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ）を通して毒性の程度を測定し、生存率は７日まで確認した。
【０１２５】
１０）ゼブラフィッシュでの心拍数（Ｈｅａｒｔ  Ｂｅａｔｉｎｇ  ｒａｔｅ）測定
ゼブラフィッシュでの心拍数（Ｈｅａｒｔ  Ｂｅａｔｉｎｇ  ｒａｔｅ）測定は、２ｄｐｆのゼブラフィッシュをスライドガラスの上に載せて、顕微鏡を通して１分間の心拍数を測定した。
【０１２６】
１１）ゼブラフィッシュでのｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲを通したｐｒｅ−ａｐｏｐｔｏｓｉｓサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）測定
３ｄｐｆのゼブラフィッシュをｅ−ｔｕｂｅに入れ、ＴＲＩｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔを入れてｌｙｓｉｓをさせた。室温で５分間反応させた後、クロロホルムを入れて２−３分間反応させた後、１２，０００ｇ、４℃で２０分間遠心処理して上層液を得た。得た上層液を新たなｅ−ｔｕｂｅに移し、１００％ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌを入れて１０分間反応後、１２，０００ｇ、４℃で１０分間遠心処理して上層液を捨てた。得たペレットを７５％エタノールで洗った後、７５００ｇ、４℃で５分間遠心分離後、上層液を捨てて５−１０分間空気中にドライさせた。ＲＮＡを溶かすために、５０ΜｌのＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒを入れて６０℃で１０−１５分間溶かした。ＲＮＡを定量後にｃＤＮＡを合成させて作製されたｐ５３、Ｂａｃ、Ｂｉｄ、ｃａｓｐａｓｅ８、ｃａｓｐａｓｅ３増幅用プライマーと反応させ、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲを通して発現の程度を確認した。
【０１２７】
実験例１：ヒラメ練肉摂取時の生理活性測定
イ）ＥＳＲを用いたヒラメ練肉加水分解物のラジカル消去能活性
Ｆｒｅｅ  ｒａｄｉｃａｌは、生物学的損傷の主な要因とよく知られているが、ＤＰＰＨとＡｌｋｙｌ  ｒａｄｉｃａｌは、抗酸化活性評価をするのに主に使用するラジカルの一つである。従って、ヒラメ練肉が消化されたとき、体内でどのような抗酸化活性を有するかを評価し、ＤＰＰＨとａｌｋｙｌ  ｒａｄｉｃａｌ消去能の結果は図１１に示した。全般的に濃度が高くなるにつれ活性が増加する傾向を示し、濃度別に有意的にラジカル消去能が増加することを確認した。ＤＰＰＨ  ｒａｄｉｃａｌ消去能の場合、１０．６１ｍｇ／ｍＬのＩＣ５０値を示し、ａｌｋｙｌ  ｒａｄｉｃａｌの場合、１．０９ｍｇ／ｍＬのＩＣ５０値を示した。
【０１２８】
ロ）Ｖｅｒｏでのヒラメ練肉加水分解物（ｓｕｒｉｍｉ  ｄｉｇｅｓｔ）の酸化的ストレス保護効果
ＥＳＲ機器を利用してラジカルを消去する結果を得て、次に細胞で酸化的ストレスを誘導させた後、練肉加水分解物がどれほどＲＯＳから細胞を保護するかをＭＴＴ法を利用して測定し、結果は図１２に示した。細胞でＡＡＰＨのみ処理して刺激を与えたとき、生存率が７０％であるのに対し、ヒラメ練肉加水分解物を濃度別に処理したとき、濃度依存的に細胞生存率が増加する傾向を示した。
【０１２９】
ハ）ヒラメ練肉加水分解物のａｐｏｐｔｏｓｉｓ抑制効果
Ｖｅｒｏ細胞で試料の濃度が増加するにつれ細胞の生存率が増加することをｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄ（ＰＩ）とＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２で染色して顕微鏡で観察した。図１３の結果を見ると、Ｃｏｎｔｒｏｌ群では、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２により白いか、ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄ（ＰＩ）により赤色に染色された細胞がほとんど見られないが、ＡＡＰＨを処理したとき、細胞死が起こることを確認することができた。このように酸化的ストレスを起こして細胞死が誘導された細胞にヒラメ練肉加水分解物を濃度別に処理したとき、濃度依存的に細胞死が減少することを確認した。
【０１３０】
ニ）ヒラメ練肉人工消化液加水分解物のｉｎ  ｖｉｖｏ  ｍｏｄｅｌでの抗酸化活性評価
ゼブラフィッシュは、実験動物モデルであるマウスの代わりとなり得る実験動物として脚光を浴びているモデルであり、速い生活史を持っており、卵から孵化して６ヶ月なら成体に成長し、一度に２００個余りの卵を産むため、多くの実験モデルを確保することができる。また、ヒトの臓器システムと相当部分類似しており、遺伝子も相同性が高く、ヒトの疾病及び機能性の研究に多く使用されているモデルである。実験のために、水温は２８℃に維持し、ｐＨは７．０〜７．５、１日に１４時間ずつ光を照射した。
【０１３１】
（１）ゼブラフィッシュを用いた生存率及び心拍数測定
本発明においては、ゼブラフィッシュを利用してｉｎ  ｖｉｖｏでヒラメ練肉加水分解物の抗酸化実験を進行した。ゼブラフィッシュでもまたＡＡＰＨを酸化的ストレスを誘導させる刺激物質として使用し、７日間ＡＡＰＨを処理したとき、生存率が６０％に減少し、ヒラメ練肉加水分解物を処理することで生存率が増加した（図１４）。心拍数もまたＡＡＰＨで誘発された酸化的ストレスにより心拍数が増加することを示したのに対し、ヒラメ練肉加水分解物を処理したとき、心拍数が正常数値に近接する結果を確認することができた。
【０１３２】
（２）ヒラメ練肉加水分解物のＲＯＳ生成抑制活性測定
ヒラメ練肉加水分解物が酸化的ストレスによるＲＯＳ生成量をどれほど減少させるかを確認した結果（図１５Ａ）、ＡＡＰＨだけを単独で処理したとき、ＲＯＳ生成量が３０％増加し、ヒラメ練肉加水分解物を処理することで濃度依存的にＲＯＳ生成量が減少することを確認することができた。これを蛍光顕微鏡を利用して形態学的に観察したとき、ＲＯＳが発生することで発光する部分がヒラメ練肉加水分解物を処理することで減少することを目視でも観察することができた。
【０１３３】
酸化的ストレスにより発生する脂質過酸化もまたヒラメ練肉加水分解物の濃度依存的に減少する傾向を示し（図１５Ｂ）、細胞死もまた濃度依存的に減少することを確認することができた（図１５Ｃ）。
【０１３４】
従って、本発明においては、前記Ｉｎ  ｖｉｔｒｏとＩｎ  ｖｉｖｏ実験を通して、ヒトがヒラメ練肉を実際に摂取し、胃腸管を経て消化液により消化をしたとき、体内での抗酸化活性を有することを確認したのである。
【０１３５】
（３）ヒラメ練肉加水分解物のＰｒｏ−ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｍＲＮＡ発現阻害効果
ゼブラフィッシュにヒラメ練肉加水分解物を処理したとき、ｐｒｏ−ａｐｏｐｔｏｓｉｓに関与するｍＲＮＡが阻害されるかを確認し、結果は図１６に示した。細胞のａｐｏｐｔｏｓｉｓに関与する主要経路としては、細胞が外部からダメージを受けるようになると、ｐ５３を通してＢａｘが発現され、これはＣａｓｐａｓｅ３、６、７の増加につながり、さらにｃａｓｐａｓｅ８、１０とＢｉｄが発現すると知られている。従って、細胞のａｐｏｐｔｏｓｉｓに関与する因子の変化を測定するために、ヒラメ練肉加水分解物を濃度別に処理した。
【０１３６】
全てのｍＲＮＡでＡＡＰＨを処理したとき、数値が上昇することを確認することができ、これは刺激物質ＡＡＰＨがゼブラフィッシュに酸化的ストレスを誘導させると予想できる。また、ヒラメ練肉加水分解物試料を濃度別に処理したとき、ｐ５３、Ｂａｘ、Ｂｉｄが濃度依存的に減少し、ｃａｓｐａｓｅ８とｃａｓｐａｓｅ３もまた濃度依存的に減少することはないが、ヒラメ練肉加水分解物により発現が減少することを確認することができた。
【０１３７】
ホ）Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムを用いたヒラメ練肉加水分解物由来の抗酸化活性ペプチドの分離
Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５とサイズ排除クロマトグラフィーを利用して、ヒラメ練肉加水分解物を分子量サイズ別に分画して計３個の分画物を得ており、図１７は、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムを用いたヒラメ練肉加水分解物のサイズ排除クロマトグラフィーの結果を示したものである。各分画物の逆相クロマトグラムは図１８に示し、各分画物は、２２０ｎｍと２８０ｎｍの波長で測定した。分画物１は、非常に多くのピークが検出され、分画物内に多量の物質が含有されたものと見られ、分画物２は、主要ピーク１個の他に小さなピークが検出され、９０％以上の純度を示し、分画物３は、主要ピーク１個の他にピークが検出されず、９５％以上の純度を示した。
【０１３８】
ヘ）サイズ排除クロマトグラフィー分画物のＡｌｋｙｌラジカル消去能測定
前記Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５を利用して得られた３個の分画物のＡｌｋｙｌラジカル消去能を測定した。表９を参考にすると、分画物１は５ｋＤａを超えるタンパク質を含み、分画物２は１ｋＤａ以下、分画物３は１Ｋｄａ未満のタンパク質を含むことが分かった。
【０１３９】
【表９】
2020518572.tif 000011
【０１４０】
図１９は、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５を用いたサイズ排除クロマトグラフィー分画物のＡｌｋｙｌラジカル消去能を測定した結果を示したものである。その結果、Ｆ２とＦ３の分画物で優れたアルキルラジカル消去能を示した。
【０１４１】
次に、分画物の中で収率が高く、アルキルラジカル消去能が高いＦ２分画物を利用してペプチドの分子量及びアミノ酸配列をＱ−ＴＯＦ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ、Ａｌｔｒｉｎｃｈａｍ、ＵＫ）ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ（ＥＳＩ）を使用して測定し、その結果を図２０乃至図２２に示した。図２０乃至図２２は、Ｆｒａｃｔｉｏｎ  ２分画物由来ペプチドのアミノ酸配列と分子量を示す。図２０を参考にすると、Ｆｒａｃｔｉｏｎ  ２分画物由来ペプチドのアミノ酸配列は、Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ａｒｇ（ＩＶＤＲ）であり、分子量は、５０２．３０Ｄａと示された。図２１を参考にすると、Ｆｒａｃｔｉｏｎ  ２分画物由来ペプチドのアミノ酸配列は、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ（ＶＡＳＶＩ）であり、分子量は、４８８．３２Ｄａと示された。また、図２２を参考にすると、Ｆｒａｃｔｉｏｎ  ２分画物由来ペプチドのアミノ酸配列は、Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＷＹＫ）であり、分子量は、４９６．２５Ｄａと示された。
【０１４２】
【表１０】
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【０１４３】
ヒラメ練肉加水分解物の分画物２から分離された３つのペプチドの抗酸化効果を確認するために、アルキルラジカル消去能を測定した。その結果は表１０に示し、ＩＶＤＲは、６８μｇ／ｍｌの濃度で５０％のラジカル消去能を示し、ＷＹＫペプチドは４０μｇ／ｍｌ、ＶＡＳＶＩペプチドは７７μｇ／ｍｌの濃度で５０％の消去能を示した。
【０１４４】
以上において、本発明の好ましい実施例について詳細に説明したが、本発明の権利範囲は、これに限定されるものではなく、下記の請求の範囲において定義している本発明の基本概念を利用した当業者の様々な変形及び改良形態もまた本発明の権利範囲に属するものである。
【図１】
2020518572.tif 000013
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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