(57)【要約】  唾液中のＴＢＩに関連するｍｉＲＮＡの濃度レベルを検知することによって外傷性脳傷害またはＴＢＩを検知または診断するための方法を提示する。更に、唾液ｍｉＲＮＡ濃度レベルの制御及び正規化された比較のための方法を提示する。唾液ｍｉＲＮＡ、唾液ｍｉＲＮＡを検知するためのプローブ及び／またはプライマーを含むアッセイキットも提示する。
2020512017.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳震盪、軽度外傷性脳傷害（「ｍＴＢＩ」）、または他の外傷性脳傷害（「ＴＢＩ」）を検知または診断するための方法であって、
（ａ）ヒト対象から採取された唾液サンプル中の１種以上のマイクロＲＮＡ（「ｍｉＲＮＡ」）の存在量または濃度レベル（複数可）を判定することと、
（ｂ）前記１種以上のｍｉＲＮＡの前記判定された存在量または濃度レベル（複数可）を同じ１種以上のｍｉＲＮＡの正常レベル（複数可）に対して比較することであって、前記正常（または対照）レベルが、脳震盪、軽度外傷性脳傷害を有しない対象に見られるものか、もしくは脳震盪、軽度外傷性脳傷害を有しない２名以上の対象の平均か、または脳震盪、ｍＴＢＩ、もしくは他のＴＢＩをもたらし得る事象の前に前記対象において判定された存在量もしくは濃度レベル（複数可）である、前記比較することと、
（ｃ）前記１種以上のｍｉＲＮＡの異常なレベルを有する対象を、脳震盪、軽度外傷性脳傷害（「ｍＴＢＩ」）、もしくは他の外傷性脳傷害（「ＴＢＩ」）を有するか、または有するリスクがより高いものとして選択することと
を含み、
前記１種以上のｍｉＲＮＡが、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２３ｂ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２５、ｈｓａ−ｍｉＲ−２５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２６ａ−１、ｈｓａ−ｍｉｒ−２６ａ−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−９２ａ−１、ｈｓａ−ｍｉｒ−９２ａ−２、ｈｓａ−ｍｉｒ−１０３ａ−１、ｈｓａ−ｍｉｒ−１０３ａ−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−１５１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−１８１ａ−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２１８−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８ｆ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８ｇ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８ｉ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５３２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７７、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７４４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７３ｇ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２８５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０７４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−３１６０−１、ｈｓａ−ｍｉｒ−３６１３、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９１６、ｈｓａ−ｍｉｒ−４５３２、ｈｓａ−ｍｉｒ−５０９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６７７０−５ｐ、及び上掲のｍｉＲＮＡと共通のシード配列をもつｍｉＲＮＡからなる群から選択され、及び／または、ｍｉＲ−７６９、ｍｉＲ−７６９−３ｐ、ｍｉＲ−７６９−５ｐ、ｍｉＲ−３２０ｃ−１、ｍｉＲ−３２０ｃ−１−３ｐ、ｍｉＲ−３２０ｃ−１−５ｐ、ｍｉＲ−４７９２、ｍｉＲ−４７９２−３ｐ、ｍｉＲ−４７９２−５ｐ、ｍｉＲ−１４０、ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｍｉＲ−１４０−５ｐ、ｍｉＲ−６２９、ｍｉＲ−６２９−３ｐ、ｍｉＲ−６２９−５ｐ、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１９２−３ｐ、ｍｉＲ−１９２−５ｐ、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４５−３ｐ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｌｅｔ−７ａ、ｌｅｔ−７ａ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｓ−５ｐ、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１３０７、ｍｉＲ−１３０７−３ｐ、ｍｉＲ−１３０７−５ｐ、ｍｉＲ−２００ｂ、ｍｉＲ−２００ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２００ｂ−５ｐ、ｌｅｔ−７ａ、ｌｅｔ−７ａ−３ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４５０８、ｍｉＲ−４５０８−３ｐ、ｍｉＲ−４５０８−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｂ、ｌｅｔ−７ｂ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−１９４−３ｐ、ｍｉＲ−１９４−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｆ、ｌｅｔ−７ｆ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１２８−３ｐ、ｍｉＲ−１２８−５ｐ、ｍｉＲ−２１５、ｍｉＲ−２１５−３ｐ、ｍｉＲ−２１５−５ｐ、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−１４９−３ｐ、ｍｉＲ−１４９−５ｐ、ｍｉＲ−４２１、ｍｉＲ−４２１−３ｐ、及びｍｉＲ−４２１−５ｐのうち少なくとも１種、ならびに上掲のｍｉＲＮＡと共通のシード配列をもつｍｉＲＮＡからなる群から選択される、
前記方法。
【請求項２】
前記ｍｉＲＮＡの発現レベルが、ＲＮＡ発現レベルが実質的に不変である１種以上のハウスキーピング遺伝子の発現レベルもしくは平均発現レベルに対して正規化され、及び／または、前記ｍｉＲＮＡのレベルが、前記１種以上のｍｉＲＮＡの前記発現レベルにおける日周変動もしくは概日変動を補償するように正規化されるか、食物摂取もしくは心拍数を上げるエクササイズに起因する前記１種以上のｍｉＲＮＡの前記発現レベルの変動を補償するように制御もしくは正規化されるか、または年齢、性別、もしくは遺伝的バックグラウンドの差を補償するように調整される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ａ）１種以上のｍｉＲＮＡの存在量または濃度を判定することが、ＲＮＡシーケンシング（「ＲＮＡ−ｓｅｑ」）、ｑＰＣＲ、ｍｉＲＮＡアレイ、またはマルチプレックスｍｉＲＮＡプロファイリングによって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記唾液サンプルが、ｍＴＢＩを有する疑いのあるヒト対象から採取され、前記ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−７６９、ｍｉＲ−７６９−３ｐ、ｍｉＲ−７６９−５ｐ、ｍｉＲ−３２０ｃ−１、ｍｉＲ−３２０ｃ−１−３ｐ、ｍｉＲ−３２０ｃ−１−５ｐ、ｍｉＲ−４７９２、ｍｉＲ−４７９２−３ｐ、ｍｉＲ−４７９２−５ｐ、ｍｉＲ−１４０、ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｍｉＲ−１４０−５ｐ、ｍｉＲ−６２９、ｍｉＲ−６２９−３ｐ、ｍｉＲ−６２９−５ｐ、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１９２−３ｐ、ｍｉＲ−１９２−５ｐ、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４５−３ｐ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｌｅｔ−７ａ、ｌｅｔ−７ａ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｓ−５ｐ、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１３０７、ｍｉＲ−１３０７−３ｐ、ｍｉＲ−１３０７−５ｐ、ｍｉＲ−２００ｂ、ｍｉＲ−２００ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２００ｂ−５ｐ、ｌｅｔ−７ａ、ｌｅｔ−７ａ−３ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４５０８、ｍｉＲ−４５０８−３ｐ、ｍｉＲ−４５０８−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｂ、ｌｅｔ−７ｂ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−１９４−３ｐ、ｍｉＲ−１９４−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｆ、ｌｅｔ−７ｆ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１２８−３ｐ、ｍｉＲ−１２８−５ｐ、ｍｉＲ−２１５、ｍｉＲ−２１５−３ｐ、ｍｉＲ−２１５−５ｐ、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−１４９−３ｐ、ｍｉＲ−１４９−５ｐ、ｍｉＲ−４２１、ｍｉＲ−４２１−３ｐ、及びｍｉＲ−４２１−５ｐのうち少なくとも１種、ならびに上掲のｍｉＲＮＡと共通のシード配列をもつｍｉＲＮＡからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記唾液サンプルが、脳震盪を有する疑いのあるヒト対象から採取され、前記ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−２９ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｍｉＲ−３２０ｃ、及びｍｉＲ−２２１−３ｐのうち少なくとも１種、ならびに上掲のｍｉＲＮＡと共通のシード配列をもつｍｉＲＮＡからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記唾液サンプルが、特定の時刻において前記ヒト対象から採取され、前記サンプル中のｍｉＲＮＡの前記存在量または濃度レベル（複数可）が、別途同一の条件下の同時刻に採取された唾液中の正常なｍｉＲＮＡ値と比較される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、ｍｉＲＮＡの前記正常レベル（複数可）が判定された時刻とは異なる時刻で前記唾液サンプルが前記ヒト対象から採取され、ｍｉＲＮＡレベル（複数可）の日周変動もしくは概日変動を補償するように、前記唾液サンプル中で判定された前記ｍｉＲＮＡレベル（複数可）の値を調整または正規化することを更に含む、前記方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、ｍｉＲＮＡの前記正常レベル（複数可）が判定された時刻とは異なる時刻で前記唾液サンプルが前記ヒト対象から採取され、回帰モデルもしくは他の統計分析を使用してｍｉＲＮＡレベル（複数可）の日周変動もしくは概日変動を補償するように、または年齢、性別、もしくは遺伝的バックグラウンドを補償するように、前記唾液サンプル中で判定された前記ｍｉＲＮＡレベル（複数可）の値を調整または正規化することを更に含む、前記方法。
【請求項９】
前記唾液サンプルが、覚醒の１時間以内、歯磨きもしくは洗口の前、飲食の前、及び／または心拍数を上昇させるエクササイズの前に採取される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記選択することが、前記ｍｉＲＮＡのうちの４種以上の異常なレベルを有する対象を選択することと、場合により、前記異常なｍｉＲＮＡレベルの、脳震盪、ｍＴＢＩ、またはＴＢＩの少なくとも１種の症状とのＰｅａｒｓｏｎ相関係数を計算することとを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記選択することが、前記ｍｉＲＮＡのうちの１０種以上の異常なレベルを有する対象を選択することと、場合により、前記異常なｍｉＲＮＡレベルの、脳震盪、ｍＴＢＩ、またはＴＢＩの少なくとも１種の症状とのＰｅａｒｓｏｎ相関係数を計算することとを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
唾液ｍｉＲＮＡレベルを判定することが、ＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡ−ｓｅｑ）によって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記シーケンシングデータの生リードカウントを分位数正規化し、平均センタリングし、各変数の標準偏差で除算し、サンプル間カウント変化を考慮するためにデータを正規化し、及び／または、相対発現レベル及び／または絶対発現レベルを表現するために１種以上の不変のｍｉＲＮＡの発現に対してデータを正規化し、場合により、前記正規化されたデータを更に統計的に分析する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ｍｉＲＮＡの少なくとも１種の異常なレベルを有する対象を、１種以上のｍｉＲＮＡの前記少なくとも１種の異常な唾液中レベルを低下させるレジメンで処置することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも２つの異なる時点で前記対象から唾液サンプルを得ることと、前記第２または後続の唾液サンプルのｍｉＲＮＡレベル（複数可）の存在量または発現レベルが正常により近い場合、処置レジメンの有効性を判定することとを更に含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
脳震盪、軽度外傷性脳傷害（ｍＴＢＩ）を有するか、または有するリスクがより高いものとして選択された対象を、１種以上のｍｉＲＮＡの少なくとも１種の異常な唾液中レベルを低下させるレジメンで処置することを更に含み、前記レジメンが、手術療法、薬物療法、ｍｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡアンタゴニスト療法、抗菌療法、食事もしくは栄養療法、理学療法、光線療法、精神療法、行動療法、または代替医学療法のうちの１つ以上を供与することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
ｍｉＲＮＡを検知するためのｍｉＲＮＡアッセイキットであって、
ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２３ｂ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２５、ｈｓａ−ｍｉＲ−２５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２６ａ−１、ｈｓａ−ｍｉｒ−２６ａ−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−９２ａ−１、ｈｓａ−ｍｉｒ−９２ａ−２、ｈｓａ−ｍｉｒ−１０３ａ−１、ｈｓａ−ｍｉｒ−１０３ａ−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−１５１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−１８１ａ−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２１８−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８ｆ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８ｇ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８ｉ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５３２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７７、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７４４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７３ｇ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２８５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０７４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−３１６０−１、ｈｓａ−ｍｉｒ−３６１３、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９１６、ｈｓａ−ｍｉｒ−４５３２、ｈｓａ−ｍｉｒ−５０９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６７７０−５ｐ、及び上掲のｍｉＲＮＡと共通のシード配列をもつｍｉＲＮＡからなる群から選択されるｍｉＲＮＡに相補的であるか、ないしはｍｉＲＮＡの増幅及び／または検知に好適な、１つ、２つ、またはそれ以上のプローブまたはプライマーを含み、及び／または、前記アッセイキットが、ｍｉＲ−７６９、ｍｉＲ−７６９−３ｐ、ｍｉＲ−７６９−５ｐ、ｍｉＲ−３２０ｃ−１、ｍｉＲ−３２０ｃ−１−３ｐ、ｍｉＲ−３２０ｃ−１−５ｐ、ｍｉＲ−４７９２、ｍｉＲ−４７９２−３ｐ、ｍｉＲ−４７９２−５ｐ、ｍｉＲ−１４０、ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｍｉＲ−１４０−５ｐ、ｍｉＲ−６２９、ｍｉＲ−６２９−３ｐ、ｍｉＲ−６２９−５ｐ、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１９２−３ｐ、ｍｉＲ−１９２−５ｐ、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４５−３ｐ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｌｅｔ−７ａ、ｌｅｔ−７ａ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｓ−５ｐ、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１３０７、ｍｉＲ−１３０７−３ｐ、ｍｉＲ−１３０７−５ｐ、ｍｉＲ−２００ｂ、ｍｉＲ−２００ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２００ｂ−５ｐ、ｌｅｔ−７ａ、ｌｅｔ−７ａ−３ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４５０８、ｍｉＲ−４５０８−３ｐ、ｍｉＲ−４５０８−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｂ、ｌｅｔ−７ｂ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−１９４−３ｐ、ｍｉＲ−１９４−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｆ、ｌｅｔ−７ｆ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１２８−３ｐ、ｍｉＲ−１２８−５ｐ、ｍｉＲ−２１５、ｍｉＲ−２１５−３ｐ、ｍｉＲ−２１５−５ｐ、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−１４９−３ｐ、ｍｉＲ−１４９−５ｐ、ｍｉＲ−４２１、ｍｉＲ−４２１−３ｐ、及びｍｉＲ−４２１−５ｐ、ならびに上掲のｍｉＲＮＡと共通のシード配列をもつｍｉＲＮＡのうち少なくとも１種を検知し、場合により、１つ以上のサンプル収集ツール、１つ以上のサンプル収集容器、前記ｍｉＲＮＡの増幅及び／または検知及び／または定量化のための１つ以上の試薬、１つ以上の陽性対照もしくは陰性対照、１つ以上の反応基質もしくはプラットフォーム、パッケージング材料（複数可）、及び／または使用説明書を含む、
前記アッセイキット。
【請求項１８】
ｍｉＲ−７６９、ｍｉＲ−７６９−３ｐ、ｍｉＲ−７６９−５ｐ、ｍｉＲ−３２０ｃ−１、ｍｉＲ−３２０ｃ−１−３ｐ、ｍｉＲ−３２０ｃ−１−５ｐ、ｍｉＲ−４７９２、ｍｉＲ−４７９２−３ｐ、ｍｉＲ−４７９２−５ｐ、ｍｉＲ−１４０、ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｍｉＲ−１４０−５ｐ、ｍｉＲ−６２９、ｍｉＲ−６２９−３ｐ、ｍｉＲ−６２９−５ｐ、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１９２−３ｐ、ｍｉＲ−１９２−５ｐ、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４５−３ｐ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｌｅｔ−７ａ、ｌｅｔ−７ａ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｓ−５ｐ、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１３０７、ｍｉＲ−１３０７−３ｐ、ｍｉＲ−１３０７−５ｐ、ｍｉＲ−２００ｂ、ｍｉＲ−２００ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２００ｂ−５ｐ、ｌｅｔ−７ａ、ｌｅｔ−７ａ−３ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４５０８、ｍｉＲ−４５０８−３ｐ、ｍｉＲ−４５０８−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｂ、ｌｅｔ−７ｂ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−１９４−３ｐ、ｍｉＲ−１９４−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｆ、ｌｅｔ−７ｆ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１２８−３ｐ、ｍｉＲ−１２８−５ｐ、ｍｉＲ−２１５、ｍｉＲ−２１５−３ｐ、ｍｉＲ−２１５−５ｐ、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−１４９−３ｐ、ｍｉＲ−１４９−５ｐ、ｍｉＲ−４２１、ｍｉＲ−４２１−３ｐ、及びｍｉＲ−４２１−５ｐ、ならびに上掲のｍｉＲＮＡと共通のシード配列をもつｍｉＲＮＡのうち少なくとも１種を検知する、ｍＴＢＩの診断または検知のための請求項１８に記載のアッセイキット。
【請求項１９】
ｍｉＲ−２９ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｍｉＲ−３２０ｃ、及びｍｉＲ−２２１−３ｐ、ならびに上掲のｍｉＲＮＡと共通のシード配列をもつｍｉＲＮＡのレベルを検知する、脳震盪の診断または検知のための請求項１８に記載のアッセイキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年３月２３日に出願された仮特許出願第６２／４７５，６９８号、２０１７年３月３１日に出願された同第６２／４８０，０７９号、２０１７年５月５日に出願された同第６２／５０２，１０７号、及び２０１８年１月２９日に出願された同第６２／６２３，１４５号に基づく優先権を主張する。これらの出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。
【０００２】
本発明は、外傷性脳傷害（ＴＢＩ）を受けた成人及び小児の対象、ならびにＴＢＩに起因する脳震盪後症候群（ＰＣＳ）を発症する可能性が高い対象を診断し特定する分野に関する。本発明は、唾液ｍｉＲＮＡレベルにおける概日変動などの時間的変化を補償するように唾液中のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）レベルの値を補正または正規化することに加えて、疾患、傷害、もしくは他の障害、または健康のステータスと相関する唾液ｍｉ−ＲＮＡレベルの異常な時間的変化を検知するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
米国では毎年３００万件の脳震盪が発生し、およそ２／３は子供及び青年に起こる。これは２００７年から約２５０％の増加である（ＭｃＣａｒｔｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。小児の脳震盪の８０％超は軽度外傷性脳傷害（ｍＴＢＩ）に起因する（Ｋｉｒｋｗｏｏｄ，ｅｔ  ａｌ．，２００６）。ｍＴＢＩは、精神状態の変化、意識消失（＜２０分間）、または記憶喪失（＜２４時間）として顕在化し、初期のグラスゴー昏睡尺度スコアが≧１３であり、局所神経障害がない、外傷による脳機能の混乱として定義されている（Ｊ．Ｈｅａｄ  Ｔｒａｕｍａ  Ｒｅｈａｂｉｌ．，１９９３）。ほとんどの子供において脳震盪の症状は２週間以内に解消するが、一部の子供は、この期間を過ぎて続く認知症状、身体症状、情動症状、及び行動症状を経験する（Ｂａｂｃｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３、Ｂａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１、Ｓｃｏｒｚａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。症状が２８日よりも長く続く個体は、子供における発生率が６％から５９％に及ぶ脳震盪後症候群（ＰＣＳ）を有するものと分類され得る（Ａｙｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９、Ｂｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７、Ｙｅａｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９、Ｂａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。
【０００４】
ほとんどの小児科医は脳震盪を診断する能力があると考えているが、現在のところ、ＰＣＳを発症する子供のサブセットを信頼性高く特定することができる確立された臨床ツールは存在しない（Ｚｅｍｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３、Ｚｏｎｆｒｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。脳震盪を起こした一部の子供がＰＣＳにかかりやすくなる要因に関する知識が不足しているため、小児科医が予測的ガイドラインを策定することは困難である。脳震盪を起こした子供を評価する客観的尺度が存在しないことで、専門医の紹介及び個別化された処置計画の実行が遅れる場合がある（Ｂａｚａｒｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。
【０００５】
過去の小児科学研究では、ＰＣＳリスクと、女性、高齢、初期の頭痛の存在、及び入院などの因子との間の相関性が見出されている（Ｂａｂｃｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３、Ｚｅｍｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３、Ｓｃｏｐａｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。２０１２年のＣｏｎｓｅｎｓｕｓ  Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ  ｏｎ  Ｃｏｎｃｕｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｐｏｒｔでは、脳震盪の正確な臨床評価のために年齢に適した症状チェックリストを子供、親、教師、及び介助者に供与することが推奨された。チェックリスト機能を用いる臨床リスクスコアは、頭部傷害の４８時間以内に現れる患者のＰＣＳリスクを予測する中程度の能力を示している（Ｚｅｍｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。しかしながら、典型的な臨床診察の時間的制約内で複数の年齢別質問表を供与しスコアリングすることの実現可能性により、医師が共通の脳震盪評価ツールを採用することが妨げられてきた（Ｚｏｎｆｒｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。むしろ、多くの研究者は脳震盪の代替的な診断アプローチを探求し始めている。
【０００６】
脳震盪の経過を診断、モニタリング、及び予測する手段としてのタンパク質バイオマーカーの使用に関する研究は、過去１０年間で著しく増加した（Ｐａｐａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。最も広範に調査されているバイオマーカーのうちの１つは、アストロサイトで発現し、脳脊髄液（ＣＳＦ）及び血清において低レベルで見られる低分子量タンパク質のＳ１００βである（Ｐａｐａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５、Ｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。Ｓ１００βのレベルは、成人におけるｍＴＢＩ後の頭部コンピュータ断層撮影（ＣＴ）の所見と相関するが、小児の頭部外傷におけるその精度に関しては矛盾する報告が存在する（Ｊｅｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３、Ｕｎｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。
【０００７】
Ｓ１００βの基準範囲は存在するが、主として成人のデータに基づいており、子供の発育中の年齢及び性別による変動を考慮しなければならない（Ｇａｚｚｏｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。Ｓ１００βは中枢神経系（ＣＮＳ）の外でも産生され、骨折及び腹腔内傷害を含む病状の影響を受ける（Ｋｏｖｅｓｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。これらの要因のため、ｍＴＢＩ診断試験としてのＳ１００βの特異性は不十分である（Ｂａｚａｒｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。加えて、Ｓ１００βはエクササイズの影響を受けるため、青年に一般的な機転であるスポーツによる脳震盪におけるその有用性は限定される（Ｏｔｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。年齢にかかわらず、現在研究されているタンパク質バイオマーカーのほとんどは、検知可能な頭蓋内病変を有しない個体においてｍＴＢＩを検知するには低い感度を有する（Ｂｈｏｍｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。また、ｍＴＢＩ後のＰＣＳを信頼性高く予測することができているタンパク質バイオマーカーは存在しない（Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８、Ｂｅｇａｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。
【０００８】
マイクロリボ核酸（ｍｉＲＮＡ）は、ヒトの全身におけるタンパク質翻訳に影響する小さな内因性の非コード分子である（Ｎａｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。これらは、保護的なエキソソーム及び微小胞により細胞外空間を通って輸送されるか、またはタンパク質に結合し、このため、血清、ＣＳＦ、または唾液中で容易に検知することが可能である（Ｂｈｏｍｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６、Ｖａｌａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。損傷した細胞によって放出される組織特異的ｍＲＮＡのレベルは、ヒト疾患のバイオマーカーとして機能し得る。ｍｉＲＮＡは、その存在量、変動するｐＨレベルでの安定性、酵素分解に対する抵抗性、及び転写調節における本質的役割を理由として、良好なバイオマーカー候補であり得る（Ｇｉｌａｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。
【０００９】
７つの過去の研究では、ヒトＴＢＩにおけるｍｉＲＮＡバイオマーカーの有用性が調査された。Ｐａｓｉｎｅｔｔｉ及び共同研究者らは、１種のｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−６７１−５ｐ）が、外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）及びｍＴＢＩを併発している９名の退役軍人の末梢血単核球中では、ＰＴＳＤのみを有する９名の対照退役軍人と比較して減少していることを見出した（Ｐａｓｉｎｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。Ｒｅｄｅｌｌ及び共同研究者らは、同齢、同性、及び同人種の対照の血漿中で特定された１０８種のｍｉＲＮＡのうち５２種が、重度ＴＢＩ（ｓＴＢＩ）後の１０名の対象において「変化した」ことを見出した。この研究では、ｓＴＢＩ（ＧＣＳ＜６）及びｍＴＢＩ（ＧＣＳ＞１２）の両方を傷害後２４時間以内に特定するためのｍｉＲＮＡの有用性が更に調査された。同研究者らは、健康な志願者と比較してｓＴＢＩを有する８名の対象では１種のｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−７６５）が増加し、２種のｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−１６及びｍｉＲ−９２ａ）が減少したことに加え、ｍＴＢＩを有する１１名の対象では２種のｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−９２ａ及びｍｉＲ−１６）が増加したことを見出した（Ｒｅｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。
【００１０】
Ｂｈｏｍｉａ及び共同研究者らは、軽度から中等度のＴＢＩ（ＧＣＳ≧９）を患う８名の対象及びｓＴＢＩ（ＧＣＳ≦８）を患う８名の対象の血清中に存在した１０種のｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−３０ｄ、ｍｉＲ−３２８、ｍｉＲ−３６２−３ｐ、ｍｉＲ−４８６、ｍｉＲ−５０５、ｍｉＲ−９２ａ、及びｍｍｕ−ｍｉＲ−４５１）の群を特定した。血清中に見られたｍｉＲＮＡの存在を検証するため、この研究では、重度ＴＢＩを有する８名の対象のＣＳＦが調査され、１０種中４種のｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−３２８、ｍｉＲ−３６２−３ｐ、ｍｉＲ−４５１、及びｍｉＲ−４８６）の増加が見られた（Ｂｈｏｍｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。Ｄｉ  Ｐｉｅｔｒｏ及び共同研究者らによる研究では、ｍＴＢＩを有する５名の個体、ｓＴＢＩを有する５名の個体、及び５名の健康な対照における血清ｍｉＲＮＡ発現が調査された。同著者らは、ｍＴＢＩ群では２種のｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−４２５−５ｐ及びｍｉＲ−５０２）が下方調節され、ｓＴＢＩ群では２種のｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−２１及びｍｉＲ−３３５）が上方調節されたことを見出した（Ｄｉ  Ｐｉｅｔｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。
【００１１】
Ｙａｎｇ及び共同研究者らは、軽度ＴＢＩ（ＧＣＳ≧１３）を有する２５名の対象、中等度ＴＢＩ（ＧＣＳ  ９〜１２）を有する２６名の対象、及び重度ＴＢＩ（ＧＣＳ≦８）を有する２５名の対象の血清中で、健康な対照と比較して上方調節された３種のｍｉＲＮＡ（ｍｉｒ−９３、ｍｉｒ−１９１、及びｍｉｒ−４９９）を特定した。同研究者らは、これらのｍｉＲＮＡのレベルが、軽度及び中等度ＴＢＩ群と比較すると、重度ＴＢＩ群においてより高いレベルまで上昇したことも認識した（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。Ｍｉｔｒａ及び共同研究者らは、２種のｍｉＲＮＡ（ｍｉｒ−１４２−３ｐ及びｍｉｒ−４２３−３ｐ）が、ＴＢＩのみを有する１２名の対象と比較したとき、ＴＢＩ及び記憶喪失の組み合わせを有する１２名の対象の血清中で上昇したことを見出した（Ｍｉｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。
【００１２】
外傷性脳傷害（ＴＢＩ）は、米国だけで毎年少なくとも１７０万人に影響する重要な大衆の健康問題であり、ＷＨＯによると「２０２０年までに死亡及び能力障害の主因として多くの疾患を上回る」と予測されている。この障害は、軽度から重度まで及ぶスペクトルで分類され、軽度ＴＢＩ（ｍＴＢＩ）は全ＴＢＩ症例の少なくとも８５％を占める。注目すべきことに、ｍＴＢＩの発生は一般的に、特にスポーツ競技との関連では過小報告されていると見なされている。スポーツ競技においてアスリートは、正式な医学的評価が完了して競技プロトコールに戻るまで、強制的に参加が停止されスポーツ競技から脱退させられることを避けたがることが多い。結果としてｍＴＢＩは、「静かな大流行（ｓｉｌｅｎｔ  ｅｐｉｄｅｍｉｃ）」と呼ばれてきた。
【００１３】
ｍＴＢＩにおける典型的な頭部衝撃は、脳への急速な打撃（衝撃側／対側）損傷及び／または捻転（回転）損傷を誘導し、直接的な脳細胞の損失を伴う実質内出血及びくも膜下出血、ならびに軸索伸展、及び数年にわたって持続し得るびまん性軸索傷害をもたらす。更に、頻回のｍＴＢＩは、脳震盪後症候群及び慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）を含む深刻な長期後遺症と関連付けられ、ＣＴＥは多くの場合、認知障害、精神神経症状、認知症、及びボクサーパーキンソニズム（ｐｕｇｉｌｉｓｔｉｃ  ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ）につながる。更にｍＴＢＩは、過小報告、症状の発症遅延、及び軽度脳傷害の検知における従来型の評価技術の限られた感度を理由として診断されないことが多く、これが診断、予後診断、及び治療のアプローチを妨げている。
【００１４】
これらの症状は時間をかけて発症し、従来型の神経画像処理技術による検知では初期の傷害が見逃されることが多いため、ｍＴＢＩは診断上の課題を提示し、その病態生理の時間経過を調査する試みを遅らせている。その結果、ｍＴＢＩの診断、予後診断、及び治療のアプローチが不足している。この問題を悪化させることに、ｍＴＢＩがそもそも起こったことを確認できなければ、ｍＴＢＩが容易に繰り返され、ＣＴＥのリスクが増加し得る。したがって、ｍＴＢＩの早期検知及び診断を助け、その予後を示し、究極的には処置への応答をモニタリングするための手段となる正確かつ確実な診断マーカーを確立することが非常に重要である。
【００１５】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、標的ｍＲＮＡの翻訳及びトランスクリプトームの大部分に対する安定性を抑制する小さな非コードＲＮＡ（約２２ヌクレオチド）であり、がん及び糖尿病を含むいくつかの障害の有用なバイオマーカーとして浮上している。遺伝子発現に対するｍｉＲＮＡの影響は、それらを合成する細胞内で生じるだけでなく、細胞外輸送によって遠隔の細胞内でも生じる。ドナー細胞から放出されると、ｍｉＲＮＡは、様々な細胞外液を通して移動し、レシピエント細胞における遺伝子発現に対して調節作用を及ぼすことができる。よって、ｍｉＲＮＡは、幅広い細胞及び組織において、そしてそれらの間で、細胞機能の重要な主要調節因子である。傷害後の血漿中で循環ｍｉＲＮＡが上昇していること、そして健康な状態と疾患の状態との間でｍｉＲＮＡ発現プロファイルが異なることを示す近年のデータにより、ｍｉＲＮＡが細胞及び組織の損傷またはがんの末梢バイオマーカーとして機能する可能性に大きな関心が寄せられている。加えて、特定のｍｉＲＮＡネットワークの異常調節は、アルツハイマー病及びパーキンソン病などのいくつかの神経変性障害、ならびにアルコール中毒と関連付けられてきた。神経変性疾患を有する生きている対象から脳組織を入手するのは容易ではないが、脳特異的ｍｉＲＮＡが末梢生体液に放出されるという事実は、ｍｉＲＮＡプロファイルが、ＣＮＳ内で起こる病理学的プロセスの代理、すなわち間接的な読み出し情報として機能し得ることを示唆する。したがって、ｍＴＢＩの特異的なバイオマーカーを特定すれば、症状が出る前の段階での早期検知が容易になり得、ｍＴＢＩ後の後遺症を最小限に抑えるかまたは更には防止するための新規の標的に関する見識が得られるだろう。近年、末梢ｍｉＲＮＡバイオマーカーを使用してｍＴＢＩ後のアウトカムメジャーを予測することの実現可能性の裏付けが、小児集団に対する２つの研究において提示された。第１の研究では、脳脊髄液（ＣＳＦ）及び唾液の両方に存在するｍｉＲＮＡのかなりの重複（６３％）が示され、また、これらのｍｉＲＮＡのうちのいくつかについては、重度ＴＢＩを有する子供及び軽度ＴＢＩを有する子供において平行した変化も示された。同じ群のフォローアップ研究では、ｍＴＢＩ後数日以内に脳震盪診療所に連れてこられた子供における唾液中のｍｉＲＮＡのパターンが、こうした子供が急性脳震盪症候群（ＡＣＳ）または長期脳震盪症候群（ＰＣＳ）を発症するかどうかを高い精度で予測し得ることが示された。注目すべきことに、前述の研究から欠けている要素のうちの１つは、ｍＴＢＩエピソードを後に経験した個体における、あらゆるタイプの分子または機能的なベースライン評価である。
【００１６】
本発明者らは、唾液及び血清のｍｉＲＮＡにおける変化のパターン、及びアマチュアの総合格闘技（ＭＭＡ）大会中におそらくｍＴＢＩ事象を経験した後の成人アスリートにおける多数の神経認知機能の尺度の変化を直接的に比較し、この問題に具体的に対処した。更に本発明者らは、ｍｉＲＮＡの変化と機能的尺度の変化との間の関連の強固性を定量化し、それらの潜在的な診断有用性を評価した。
【００１７】
本発明者らは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）がｍＴＢＩの高感度かつ特異的な末梢バイオマーカーとして機能する有用性も評価した。上述のように、ｍｉＲＮＡは、がん、糖尿病、神経発達障害、及び神経変性障害における有用なバイオマーカー候補として浮上している、タンパク質発現を抑制する小さな非コードＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは身体のあらゆる組織及び器官において作られるが、その多くは組織特異性を示す。更に、ｍｉＲＮＡは、それらを合成する細胞内で作用することもできるし、細胞外空間（ＥＣ）に放出され、生体液中を移動して他の細胞に影響を及ぼすこともできる。多数の研究により、健康な状態と病的状態との間でｍｉＲＮＡ発現プロファイルが異なること、そして組織損傷後ではＥＣへのｍｉＲＮＡの放出が上昇すると思われることが示されている。本明細書において示すように、本発明者らは、ｍｉＲＮＡの末梢測定値、例えば唾液中レベル、可能性のあるｍＴＢＩ重症度の客観的評価、ならびにバランス及び認知機能の感度指標の間の関係を立証する。多くの研究により、成人ＴＢＩにおいて異常調節されるｍｉＲＮＡ標的が特定されているが、子供のＰＣＳの予測におけるその有用性を調査したものは存在しない。
【００１８】
本発明者らは、ｍＴＢＩを有する６０名の子供において唾液ｍｉＲＮＡのバイオマーカーとしての可能性を精査し、ｓＴＢＩを有する子供のＣＳＦ及びｍＴＢＩを有する子供の唾液の両方において異常調節された６種のｍｉＲＮＡを特定した。本発明者らはまた、ＰＣＳの発生及び重症度の予測における唾液ｍｉＲＮＡの臨床的精度をスポーツ脳震盪評価ツール（ＳＣＡＴ−３）に対して評価した。本発明者らは、脳傷害及び修復に生理的に関連するｍｉＲＮＡが、典型的な脳震盪の持続時間を有する対照と比べてＰＣＳを有する子供において変化するかどうか、また、唾液ｍｉＲＮＡの予測値が、ＳＣＡＴ−３などの現在の臨床ツールのものを超えるかどうかを確かめることを目指した。本明細書において示すように、本発明者らは、唾液ｍｉＲＮＡプロファイルが脳震盪症状の持続時間を予測し得ることを見出した。例えば、本発明者らは、ｍＴＢＩを有する子供及び青年の唾液ｍｉＲＮＡプロファイルは、１）ＴＢＩを有する子供及び青年のＣＳＦプロファイルを反映し、２）ｍＴＢＩの存在を正確に特定し、３）成人のｍＴＢＩのｍｉＲＮＡバイオマーカーとは異なることを見出した。ｍｉＲＮＡの破壊は、脳傷害及び修復と機能的に関連している。
【００１９】
本明細書に記載されるシステム及び方法は、スポーツ傷害に起因するものをはじめとするＴＢＩを検知、診断、及びモニタリングする既存の方法論に関する問題の多くを解決する。
【発明の概要】
【００２０】
唾液などの生体液中のレベル、例えばその存在量またはモル濃度を測定することにより、脳震盪及び軽度外傷性脳傷害を含む外傷性脳傷害を検知、診断、及び予後診断する方法。これらの方法は、小児及び成人の両方の対象に適用可能であり、処置及びＴＢＩからの回復をモニタリングするのに適用され得る。ｍｉＲＮＡレベルのリードデータ、例えばＲＮＡシーケンシング工程によって得られたものは、例えば１種以上の不変のＲＮＡのレベルとの比較により、更に正規化され得る。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡのレベルは、唾液のような生体液中のｍｉＲＮＡレベルの概日変動に基づいて更に正規化される。唾液及び他の生体液中のＴＢＩ関連ｍｉＲＮＡのレベルを検知するためには、ＴＢＩと関連付けられることが本明細書において開示されるｍｉＲＮＡのレベルを検知及び定量化するプローブ及び／またはプライマーを含むアッセイキットを使用することができる。これら及び他の本発明の目的は、単独か、またはそれらの組み合わせかを問わず、以下の好ましい実施形態の詳細な説明と併せてより明らかになるだろう。
【００２１】
本開示の目的及びその利点の多くは、以下に説明する添付の図面と以下の詳細な説明を関連付けて考慮し参照することによってより良好に理解されるため、そのより全面的な理解は容易に得られるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】脳震盪の正確かつ生理的に関連性のあるｍｉＲＮＡマーカーを特定するための方法論的パイプラインを示す図である。略語：骨折（ｆｘ）；軽度外傷性脳傷害（ｍＴＢＩ）；重度外傷性脳傷害（ｓＴＢＩ）。
【図２】脳震盪群及び対照群における目的の６種のｍｉＲＮＡのＣＳＦ及び唾液中の平均濃度を示す箱ひげ図である。Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定により、ｍｉＲ−２９ｃ−３ｐ（ＣＳＦ  ｐ＝０．０３２；唾液ｐ＝０．００８）、ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ（ＣＳＦ  ｐ＝０．００３；唾液ｐ＝０．０１６）、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ（ＣＳＦ  ｐ＝０．０４５；唾液ｐ＝０．００９）、ｍｉＲ−１８２−５ｐ（ＣＳＦ  ｐ＝０．００９；唾液ｐ＝０．０１３）、ｍｉＲ−３２０ｃ（ＣＳＦ  ｐ＝０．０３７；唾液ｐ＝０．０１６）、及びｍｉＲ−２２１−３ｐ（ＣＳＦ  ｐ＝０．０１４；唾液ｐ＝０．００５）で名目上有意な変化が検知された。６種全てのｍｉＲＮＡで誤検知率補正は≦０．１５であった。略語：脳脊髄液（ＣＳＦ）；軽度外傷性脳傷害（ｍＴＢＩ）；重度外傷性脳傷害（ｓＴＢＩ）。
【図３Ａ】目的の６種のｍｉＲＮＡが多変数回帰分析においてｍＴＢＩステータスを正確に特定することを示す図である。６種のｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−２９ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｍｉＲ−３２０ｃ、及びｍｉＲ−２２１−３ｐ）の唾液中濃度を用いる受信者動作特性曲線は、ｍＴＢＩステータスのランダムフォレスト検定で０．８５２の曲線下面積（ＡＵＣ）を示した。
【図３Ｂ】目的の６種のｍｉＲＮＡが多変数回帰分析においてｍＴＢＩステータスを正確に特定することを示す図である。確立されたアルゴリズムは、２名の対照対象及び１５名のｍＴＢＩ対象を誤分類した。
【図３Ｃ】目的の６種のｍｉＲＮＡが多変数回帰分析においてｍＴＢＩステータスを正確に特定することを示す図である。対照及びｍＴＢＩ対象の１／４をランダムにホールドアウトしたこのツールの１００重交差検証は、同様の精度を呈した。
【図４】階層的クラスタリング（ＨＣ）分析を示す図である。目的の６種のｍｉＲＮＡの唾液中濃度、ならびに子供のＳＣＡＴ−３スコア（Ａ）、親のＳＣＡＴ−３スコア（Ｂ）、及び医学的／人口学的特性（Ｃ）についてＳｐｅａｒｍａｎ順位相関検定を行った。カラースケール値は、目的の２つの特徴の間のＳｐｅａｒｍａｎの順位相関を示す。
【図５】脳脊髄液ＲＮＡの品質分析を示す図である。Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ＲＮＡ  Ｎａｎｏｃｈｉｐを使用し、抽出したＲＮＡを検査したところ、脳脊髄液サンプル中で比較的低いＲＮＡ収率が示されたが、ピークは１８〜２５ヌクレオチドで一貫していた（ｍｉＲＮＡ抽出の成功と一致する）。
【図６】ＭＭＡ試合後に評価された機能的尺度の変化に対するＴＢＩ尤度分類の有意効果を示す図である。
【図７】唾液または血清サンプルを提供し、３つの異なるＴＢＩ尤度カテゴリー（低尤度、中尤度、高尤度）に分類された対象において、２つの異なる機能試験の間に見られた、試合後対試合前の身体の揺れの一貫した変化の箱ひげ図である。Ａ及びＢ−上のプロット、左から右；Ｃ及びＤ−下のプロット、左から右。なお、揺れ尺度の一方は、認知課題遂行中に得られ（数字逆唱、Ａ−Ｂ）、他方は、視覚的ガイダンスなしで行われたバランス試験中に得られた（両足閉眼、Ｃ−Ｄ）。ＴＢＩ低尤度群と比較して、中尤度群及び高尤度群では、両セットの尺度で揺れの増加が明白である。
【図８】ＴＢＩ尤度により群分けされた対象において、２つの異なる機能試験の間に見られた、試合後対試合前の身体の揺れまたは完了時間スコアにおける、さほど一貫していない変化を示す図である。規則は図７と同じである。高尤度群のＴＭＢ＿Ｂａｌ課題スコアは、血清サンプルを採取した場合にわずかに上昇し（しかし唾液サンプルには当てはまらない）（Ａ−Ｂ、上のプロット、左から右）、ＴＭＡ＿Ｃｏｇスコアは中尤度群においてわずかに上昇した（しかし高尤度群には当てはまらない）（Ｃ−Ｄ、下のプロット、左から右）ことに留意されたい。
【図９】頭部打撃（ＨＴＨ）に関連する試合後の血清ＵＣＨＬ１の変化を示す図である。なお、この回帰は主に、３０超のＨＴＨを受けた４名の選手によって求められた。しかしながら全体としては、試合後対試合前の選手群に有意差はなかった。
【図１０】頭部打撃（ＨＴＨ）と比較した血清タンパク質変化を示す図である。９種のタンパク質のそれぞれについて、試合前と比較した試合後の変化は、試合前レベルに対するパーセンテージとして表され、Ｙ軸上にプロットされている。Ｘ軸は、各ＭＭＡ試合の動画記録の独立した視聴者によってカウントされたＨＴＨ値を示す。これらのタンパク質のいずれもＨＴＨとの強い関連性を示さず、最大ｒ２値は０．０９未満であったことに留意されたい。
【図１１】統計分析前の生体液タイプ及びＴＢＩ尤度に対して正規性があり高度に球状のサンプルタイプの分布を示す主成分分析（ＰＣＡ）を示す図である。画像（Ａ）はサンプルの混在を示し、主要データクラウドからの高尤度血清サンプル（緑／グレースケールの四角）の分離はわずかに示唆されるのみである。全てのデータを統合（ｃｏｌｌａｐｓｅ）すると、変化値は正規性の高い様式で分布する（Ｂ）。
【図１２】試合前のベースラインと比較した血清または唾液サンプルからのｍｉＲＮＡ発現の変化に基づいてＴＢＩ尤度を予測する精度を示す図である。
【図１３】ＴＢＩ後の唾液及び血清中のｍｉＲＮＡ発現レベルの変化を例示する箱ひげ図である。各横列は異なるｍｉＲＮＡ例を表し（３種のｍｉＲＮＡが示されている）、各ドットは、特定のサンプルにおける各ｍｉＲＮＡの発現レベルを表す。上のプロット：Ａ−Ｂ、左から右；中央のプロット：Ｃ−Ｄ、左から右；下のプロット：Ｅ−Ｆ、左から右。
【図１４Ａ】ＫＥＧＧユビキチン依存性タンパク質分解経路における標的遺伝子に関する変化したｍｉＲＮＡの濃縮を示す図である。
【図１４Ｂ】ＫＥＧＧユビキチン依存性タンパク質分解経路における標的遺伝子に関する変化したｍｉＲＮＡの濃縮を示す図である。
【図１４Ｃ】ＫＥＧＧユビキチン依存性タンパク質分解経路における標的遺伝子に関する変化したｍｉＲＮＡの濃縮を示す図である。
【図１５】ＫＥＧＧ  ＴＧＦ−ベータシグナル伝達経路における標的遺伝子に関する変化したｍｉＲＮＡの濃縮を示す図である。
【図１６】ＫＥＧＧ軸索ガイダンス経路における標的遺伝子に関する変化したｍｉＲＮＡの濃縮を示す図である。
【図１７】ＫＥＧＧグルタミン酸作動性シナプス経路における標的遺伝子に関する変化したｍｉＲＮＡの濃縮を示す図である。
【図１８】分離に関与する上位１５種のｍｉＲＮＡを示す図である。部分的最小二乗判別分析において、長期の脳震盪症状（ＰＣＳ）を有する子供を、急性脳震盪症状（ＡＣＳ）を有するものから差別するのに最も重要な、１５種のｍｉＲＮＡのＶＩＰスコアである。
【図１９】全ｍｉＲＮＡプロファイルがＡＣＳ群とＰＣＳ群との部分的分離を達成することを示す図である。ＰＬＳＤＡは、唾液ｍｉＲＮＡプロファイルを使用したＡＣＳ群とＰＣＳ群との空間的分離を示す。
【図２０】１５種のｍｉＲＮＡの階層的クラスタリング分析が、遺伝子標的の機能に基づく３つの特徴的なｍｉＲＮＡクラスター：ｍｉＲ−６２９−３ｐ及びｍｉＲ−１３３ａ−５ｐ；ｌｅｔ−７ａ−５ｐ及びｌｅｔ−７ｂ−５ｐ；ｍｉＲ−３２０ｃ及びｍｉＲ−２００ｂ−３ｐを示したことを示す図である。
【図２１】初診時（傷害の２週間以内）の濃度が４週間後の特定の症状と相関する個々のｍｉＲＮＡを特定する相関マトリックスを示す図である。
【図２２】ロジスティック回帰分析（Ａ）、交差検証技術（Ｂ）、２０％のホールドアウト技術（Ｃ）を用い、ＰＣＳ群とＡＣＳ群とを差別するにあたっての、５種のｍｉＲＮＡのパネル（ｍｉＲ−３２０ｃ−１、ｍｉＲ−１３３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−７６９−５ｐ、ｌｅｔ−７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３０７−３ｐ）の受信者動作特性曲線を示す図である。比較すると、小児ＳＣＡＴ３（Ｄ）、親ＳＣＡＴ３（Ｅ）、及び小児ＰＣＳ臨床リスクスコア（Ｆ）などの現在の臨床ツールは、大幅に低いＡＵＣを有する。
【図２３】ＴＢＩ後の唾液−ＣＳＦにおけるｍｉＲＮＡの重複を示す図である。
【図２４】ｍｉＲＮＡを使用したロジスティック回帰分析を示す図である（感度：７５％、特異度：９３％、１０重ＣＶ：０．８７）。
【図２５】ｍｉＲＮＡを使用したロジスティック回帰分析を示す図である。青（上）：ｍｉＲＮＡ  ＡＵＳ＝０．８９８；小児ＳＣＡＴ３  ＡＵＣ＝０．６４９。
【図２６】ｍｉＲＮＡを使用したロジスティック回帰分析を示す図である。青（左から１番目）：ｍｉＲＮＡ  ＡＵＩＳ＝０．８９８、赤（左から２番目）小児ＳＣＡＴ３  ＡＵＳ＝０．６４９、緑（左から３番目）親ＳＣＡＴ３＝０．５６２。
【図２７】４週間時点で特定の症状に関連するｍｉＲ−３２０ｃを示す図である。
【図２８】Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎツール（Ｚｅｍｅｋ  ｅｔ  ａｌ．２０１６）を使用した回帰分析を示す図である。
【図２９Ａ】ＰＣＳステータスを予測するためにこれらｍｉＲＮＡのサブセットを使用するロジスティック回帰モデルを示す図である。
【図２９Ｂ】ＰＣＳステータスを予測するためにこれらｍｉＲＮＡのサブセットを使用するロジスティック回帰モデルを示す図である。
【図３０】高信頼度ｍＲＮＡ標的のタンパク質相互作用ネットワークを示す図である。このネットワークには、Ｓｔｒｉｎｇ  ｖ１０  ソフトウェアにおいて調べた目的の６種のｍｉＲＮＡの標的となる２８０種のｍＲＮＡが含まれる。２８０種のｍＲＮＡのうち２４７種は、機能的に相互作用するタンパク質産物を有する。これは０．７７５のクラスタリング係数を表し、偶然だけで予想される相互作用の数を超える（ｐ＜０．０００１）。赤色のｍＲＮＡは、神経系の発達に機能的に関連するもの（６１種の遺伝子；ｐ＝８．５６Ｅ−０９）を表す。大きなノードは公知の三次元構造を有し、小さなノードの構造は未知である。エッジ幅は相互作用の意義を定義し、太いエッジは実験的に判定された共発現または相同性を表す。
【図３１】小児ＳＣＡＴ−３スコアを使用した比較のための（性能不良の）ロジスティック回帰モデルを示す図である。
【図３２】収集１における２４個のサンプル及び収集２における４８個のサンプルの分析から得た重複するｍｉＲＮＡのベン図である。
【図３３】２回／日（午前８時、午後８時）の頻度における３日間のサンプリング（１日目、３日目、７日目）の間で、４名の対象から得た２４個のサンプル中、収集時間によって変化した１９種のｍｉＲＮＡに関する発現データのヒートマップクラスタリングを示す図である。
【図３４】４回／日（午前８時、午後１２時、午後４時、午後８時）の頻度における４日間のサンプリング（１日目、５日目、１０日目、１５日目）の間で、３名の対象から得た４８個のサンプル中、収集時間によって変化した１９種のｍｉＲＮＡに関する発現データのヒートマップクラスタリングを示す図である。
【図３５】収集３（様々な時点での収集）における対象のうち３名について示された、上位１９種のｍｉＲＮＡのうち１種の正規化データを示す図である。上（黒）の線：Ｒ２＝０．８３８６、中央（緑／グレースケール）の線：Ｒ２＝０．９２９１、下（青／グレースケール）：Ｒ２＝０．９４９。
【図３６】概日リズムシグナル伝達に関与する４５種の遺伝子が、ｃｉｒｃａＭｉＲのうち１４種の標的として特定されたことを示す図である。これは、ＩＰＡにおける概日機能に関与する合計１３９種のアノテートされた遺伝子のほぼ１／３である。この図では、１種のｍｉＲＮＡの標的となる遺伝子は灰色で強調され、１４種中２種以上のｍｉＲＮＡの標的となる遺伝子は赤で強調されている。標的にならなかった遺伝子は白で表示されている。
【図３７】時間、体液、及び相互作用の効果に起因して血清及び唾液中の存在量が変化したｍｉＲＮＡを示す図である。
【図３８】１２種のｍｉＲＮＡが、非特異的なエクササイズまたは事象に関連する時点（緑／グレースケールの陰影付き領域）におけるものを超えた、試合１時間後の時点（青／グレースケールの陰影付き領域）における唾液サンプル（Ａ−上部）中の急性時間的効果（全て増加）により特定されたことを示す図である。ｍｉＲＮＡのほとんどが、試合２〜３日後までにベースライン近くに戻ったことに留意されたい。同じｍｉＲＮＡのパターンは、血清中で明確に異なっていた（Ｂ−下部）（いくつかは変化なしであり、いくつかは遅発型減少を有した）。
【図３９】非特異的なエクササイズまたは事象に関連する時点（緑／グレースケールの陰影付き領域）におけるものを超えた、試合１週間後（Ａ−上部、青／グレースケールの陰影付き領域）における血清中の主に遅発型の増加（実線）及び減少（破線）により特定されたｍｉＲＮＡを示す図である。これらのｍｉＲＮＡは、唾液中で変化なしであったか、または非特異的増加のある程度の証拠を示したことに留意されたい（Ｂ−下部）。
【図４０】ＫＥＧＧグルタミン酸作動性シナプス経路における標的遺伝子に関する変化したｍｉＲＮＡの濃縮を示す図である。規則は図１０と同じである。唾液ｍｉＲＮＡ（Ａ）及び血清ｍｉＲＮＡ（Ｂ）の両方が、この経路における同じ遺伝子の多くを標的とすることに留意されたい。
【図４１】唾液（長期抑圧、Ａ）、及び血清（長期増強、Ｂ）中の、学習及び記憶に関与する経路における時間的に調節されたｍｉＲＮＡの濃縮を示す図である。規則は図１０と同じである。
【図４２】急性唾液応答ｍｉＲＮＡと相関する機能的尺度を示す図である。実線は、認知的尺度を示す（より高い値は、より良好な成績を示す）。破線は、正規化された身体の揺れ尺度を示す（より高い値は、より不良な成績を示す）。
【図４３】遅発型血清応答ｍｉＲＮＡと相関する機能的尺度を示す図である。実線は、明らかな学習効果（ＨＴＨなし対照及び試合１時間後の時点における揺れの減少）があり、後の試合後２〜３日目に揺れの増加を示したバランス尺度（ＴＳＥＯ）を示す。破線は、遅発効果のあるバランス尺度（ＴＭＢ＿Ｄｕａｌ＿Ｂａｌ）、または急性効果に加えて遅発効果のあるバランス尺度（ＤＳＢ＿Ｂａｌ）の２種を示す。
【図４４】試合前と比較した試合後の血清及び唾液中のｍｉＲＮＡ発現変化に対するＴＢＩ尤度の効果を示す図である。合計９２５種のｍｉＲＮＡを試験したところ、２１種はＴＢＩ尤度の有意な主効果を示し、このうち２種は体液の有意な主効果も示し、２種は有意な体液×ＴＢＩの相互作用を示した。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明の実践においては、本明細書に記載されるものと同様または同等のあらゆる方法及び物質を使用することができる。本明細書では、好適な方法及び物質を記載する。別途規定されない限り、本明細書に記載の物質、方法、及び例は例示に過ぎず、限定を意図するものではない。
【００２４】
唾液は、水、ムチン、タンパク質、塩、そして多くの場合にはデンプン分解酵素（プチアリンとして）からなるわずかにアルカリ性の分泌物であり、唾液腺により口内に分泌され、摂取された食物を滑らかにし、多くの場合デンプンの分解を始める。唾液は、顎下腺、耳下腺、及び／または舌下腺によって放出され、唾液の放出は、交感神経系及び／または副交感神経系の活動によって刺激され得る。主に交感神経または副交感神経の誘導により放出される唾液は、マイクロＲＮＡを単離するために使用され得る。
【００２５】
唾液は、喀痰、口内の拭き取り、受動的流涎、または当技術分野で公知の他の方法によって収集することができる。一部の実施形態では、唾液腺から引き出してもよい。一部の実施形態では、例えば遠心分離または濾過によって唾液サンプルを更に精製してもよい。例えば、０．２２ミクロンまたは０．４５ミクロンの膜、及びこの間のサイズのあらゆる膜によって唾液サンプルを濾過し、分離した成分を使用してマイクロＲＮＡを回収することができる。他の実施形態では、唾液サンプル中のマイクロＲＮＡを分解するタンパク質または酵素を除去、不活性化、または中和してもよい。
【００２６】
いくつかの代表的だが非限定的な唾液収集及びｍｉＲＮＡ精製手段は、例えば、ＴＲＩ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ＬＳ、ＴｒｉＺｏｌ精製法、または同様の方法を使用し、ＯｒａｇｅｎｅのＲＮＡ精製プロトコールに従って唾液ＲＮＡを精製することを含む。Ｏｒａｇｅｎｅの精製プロトコールは概して複数のパートを含む。第１のパートでは、サンプルを８秒以上勢いよく振盪し、このサンプルを独自のバイアルで５０℃の水浴中１時間、またはエアインキュベータ内で２時間インキュベートする。第２のパートでは、唾液の２５０〜５００μＬのアリコートを微小遠心管に移し、微小遠心管を９０℃で１５分間インキュベートし、室温に冷まし、微小遠心管を氷上で１０分間インキュベートし、唾液サンプルを最大速度（＞１３，０００×ｇ）で３分間遠心分離し、透明な上清を新しい微小遠心管に移し、沈殿物を捨て、２倍容量の９５％冷ＥｔＯＨを透明な上清に添加して混合し、上清混合物を−２０℃で３０分間インキュベートし、微小遠心管を最大速度で遠心分離し、上清を捨てながら沈殿物を収集し、沈殿物を３５０μＬのバッファーＲＬＴに溶解させ、溶解したペレット混合物に３５０μＬの７０％ＥｔＯＨを添加し、ボルテックスにより混合する。初めの２つのパートの後にＱｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙクリーンアップ工程を続けてもよい。
【００２７】
精製プロセスは、例えばＱｉａｇｅｎによるＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎを使用して唾液サンプルを精製する第２の精製ステップを更に含み得る。生体サンプルの精製は、任意の好適な数のステップを任意の好適な順序で含んでよい。精製プロセスは、対象から収集される生体サンプルのタイプに基づいて異なってもよい。精製された生体サンプルの収率及び品質は、例えば、ＲＮＡの収率及び品質が所定の閾値を超えるかどうかを判定するために、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒなどのデバイスによって評価され得る。
【００２８】
マイクロＲＮＡすなわちｍｉＲＮＡは、植物、動物、及び一部のウイルスに見られる、ＲＮＡサイレンシング及び遺伝子発現の転写後調節において機能する約２２ヌクレオチドを含有する小さな非コードＲＮＡ分子である（Ａｍｂｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４、Ｂａｒｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００４を参照されたい）。マイクロＲＮＡは、ＣＬＯＣＫ、ＢＭＡＬ１、及び他の概日遺伝子をはじめとするヒト遺伝子の大多数の発現に影響する。注目すべきことに、ｍｉＲＮＡは、それらを作る細胞によって放出され、あらゆる細胞外液中で全身を循環し、細胞外液中で他の組織及び細胞と相互作用する。近年の証拠により、ヒトｍｉＲＮＡは、下部消化管に生息する腸内マイクロバイオームと呼ばれる細菌細胞の集団とさえ相互作用することが示されている。更に、腸内マイクロバイオームにおける概日変化が近年立証された。小さな非コードＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、タンパク質発現を抑制し、がん、糖尿病、神経発達障害、及び神経変性障害における有用なバイオマーカーとして浮上している。ｍｉＲＮＡは身体のあらゆる組織及び器官において作られるが、その多くは組織特異性を示す。更に、ｍｉＲＮＡは、それらを合成する細胞内で作用することもできるし、細胞外空間（ＥＣ）に放出され、生体液中を移動して他の細胞に影響を及ぼすこともできる。多数の研究により、健康な状態と病的状態との間でｍｉＲＮＡ発現プロファイルが異なること、そして組織損傷後ではＥＣへのｍｉＲＮＡの放出が上昇すると思われることが示されている。エピジェネティックデータは、ｍｉＲＮＡに関するデータを含む。本発明者らの目的の中には、ｍｉＲＮＡの末梢測定値、可能性のあるｍＴＢＩ重症度の客観的評価、ならびにバランス及び認知機能の感度指標の間の関係を立証することがあった。
【００２９】
ｍｉＲＮＡの標準的な命名法は、「ｍｉＲ」という接頭辞を使用し、その後にダッシュ及び番号が続く。この番号は多くの場合、命名の順番を示す。例えば、ｍｉＲ−１２０はｍｉＲ−２４１の前に命名され、おそらくその前に発見された。大文字の「ｍｉＲ−」はｍｉＲＮＡの成熟型を指し、小文字の「ｍｉｒ−」はプレｍｉＲＮＡ及びプリｍｉＲＮＡを指し、「ＭＩＲ」はそれらをコードする遺伝子を指す。「ｈｓａ−」という接頭辞はヒトｍｉＲＮＡを表す。
【００３０】
ｍｉＲＮＡの配列は公知であり、ＭｉｒＢａｓｅ，Ｈｙｐｅｒ  Ｔｅｘｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ（ＨＴＴＰ）：／／ＷｏｒｌｄＷｉｄｅＷｅｂ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ／ｂｌｏｇ／２０１８／０３／ｍｉｒｂａｓｅ−２２−ｒｅｌｅａｓｅ／（最終アクセス日２０１８年３月１９日、参照により組み込まれている）及び／またはＨｙｐｅｒ  Ｔｅｘｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ（ＨＴＴＰ）：／／ＷｏｒｌｄＷｉｄｅＷｅｂ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌ（最終アクセス日２０１８年３月１９日；参照により組み込まれている）を参照することにより得ることができる。
【００３１】
ｍｉＲＮＡ成分。エキソソームならびに他の微小胞及び親油性担体によるｍｉＲＮＡの細胞外輸送は、細胞が近隣及び遠隔の細胞における遺伝子発現を変化させる確立されたエピジェネティック機構である。微小胞及び担体は細胞外空間に押し出され、ここで細胞にドッキングして細胞に入り、ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を阻止し得る（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。加えて、微小胞及び担体は血液及び唾液などの様々な体液中に存在するため（Ｇａｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）、単に唾液を収集することにより、中枢神経系（ＣＮＳ）から生じた可能性があるエピジェネティック物質を測定することが可能である。実際、本発明者らは、唾液中で検知されるｍｉＲＮＡの多くが、舌及び唾液腺を神経支配する感覚神経求心端及び運動神経遠心端を介して口腔に分泌されるため、個体のＣＮＳにおいて異常調節される可能性があるｍｉＲＮＡをアッセイする比較的直接的な手段を提供すると考える。したがって、唾液中の細胞外ｍｉＲＮＡの定量化は、疾患または障害または傷害を有する子供において脳関連バイオマーカーを特定するための魅力的かつ低侵襲性の技術をもたらす。更に、本方法は、これまでに用いられている死後の脳組織または末梢白血球の分析に関連する制約（発現変化の関連性、痛みを伴う採血）の多くを最小限に抑える。
【００３２】
唾液などの生体サンプルからのｍｉＲＮＡの単離及びその分析は、Ｙｏｓｈｉｚａｗａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓａｌｉｖａｒｙ  ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ  ａｎｄ  Ｏｒａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２０１３；９３６：３１３−３２４に記載の方法をはじめとする当技術分野で公知の方法によって、またはｍｉｒＶａｎａ（商標）ｍｉＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔなどの市販のキットを使用することによって行うことができる。
【００３３】
睡眠−覚醒サイクル中には、多数の分子変化、細胞変化、及び生理的変化が生じる。これらの変化の多くは、ＣＬＯＣＫ及びＢＭＡＬ１などの概日調節遺伝子と呼ばれるものによって推進される。これらは次いで、生理的に関連性のある遺伝子、タンパク質、及びホルモンの発現に多数の変化を引き起こす。明暗サイクル以外に、概日遺伝子の発現に影響する因子は完全に理解されていない。まとめると、本発明者らのデータは、これまで知られていなかった唾液ｍｉＲＮＡと微生物内容物との関係、ならびにｍｉＲＮＡ（及び／または微生物）自体に対する時間的影響（すなわち、時間的変化）を示唆する。時間的変化を受けるエピジェネティックデータ（シーケンシングデータまたは他のデータ）を正規化するための本明細書に記載のシステム及び方法は、時間的変化がデータに影響を及ぼし得る任意の好適な用途において使用され得る。
【００３４】
本発明の一態様は、対象が疾患、障害、または状態を有するかどうかを判定するのに好適な、プローブセットの２つ以上のｍｉＲＮＡプローブを含むキットである。各ｍｉＲＮＡプローブは、本明細書に記載の特定のｍｉＲＮＡに対応するリボヌクレオチド配列を含み得る。ある実施態様では、本キットは、２つ以上のｍｉＲＮＡプローブに結合した固体支持体を更に含み得る。ある実施態様では、本キットは、（ａ）陰性対照として使用されるように適合された、１つのランダムに生成されたｍｉＲＮＡ配列、（ｂ）全ＲＮＡ分解の標準対照として使用される、ハウスキーピング遺伝子に由来する少なくとも１つのオリゴヌクレオチド配列、または（ｃ）陽性対照として使用される、少なくとも１つのランダムに生成された配列のうち、少なくとも１つを更に含み得る。代替的に、プローブセットは、本明細書に記載の特定のマイクロバイオームに由来するＤＮＡ配列に対応するリボヌクレオチド配列を有するｍｉＲＮＡプローブを含んでもよい。
【００３５】
単独か、またはそれらの組み合わせかを問わず、以下の好ましい実施形態の詳細な説明と併せてより明らかになる、これら及び他の本発明の目的は、本方法、システム、キット、アレイにより果たされ、本発明者らにより本明細書に提示される。
【００３６】
本発明者らの目的の１つは、小児期ＴＢＩ後の唾液のｍｉＲＮＡ及び脳脊髄液（ＣＳＦ）のｍｉＲＮＡにおける変化を比較し、小児脳震盪の正確かつ生理的に関連性のあるマーカーとしてのｍｉＲＮＡの循環濃度の有用性を精査することであった。
【００３７】
本発明者らの別の目的は、ｍｉＲＮＡの末梢測定値、可能性のあるｍＴＢＩ重症度の客観的評価、ならびにバランス及び認知機能の感度指数の間の関係を立証することであった。
【００３８】
本発明者らの別の目的は、軽度頭部外傷を受けたばかりの成人対象において、血液及び唾液中のｍｉＲＮＡの末梢測定値と、バランス及び認知機能の客観的尺度との関係を判定し、特定されたｍｉＲＮＡのいずれかが、脳機能及び傷害応答に関連する特定の生物学的経路に関与しているかどうかを調査し、ｍｉＲＮＡと機能的尺度との間の関係の強固性を定量化し、それらの潜在的な診断有用性を判定することであった。
【００３９】
本発明者らの目的の１つは、外傷性脳傷害（ＴＢＩ）の疑いがある対象のエピジェネティックデータを、１名以上の健康な対照対象または健康な対照対象のコンペンディア（ここで、それぞれの健康な対照対象は、ＴＢＩまたはＴＢＩの症状を経験したことがないことが分かっている）と比較する方法であって、
対象から採取された生体サンプル中の１種以上のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）のカウントを判定することと、
サンプル間カウント変化を考慮するために対象のエピジェネティックデータを正規化することであって、カウント正規化が１種以上の不変のｍｉＲＮＡを使用する、正規化することと、
生体サンプルが採取された時刻を判定することと、
対象のｍｉＲＮＡ発現レベルを時刻に対して更に正規化するために、時刻を使用することにより、カウント正規化されたｍｉＲＮＡに時刻正規化を適用することと、
１種以上のｍｉＲＮＡのカウント及び時刻正規化された発現レベルを、１名以上の健康な対照対象または健康な対照対象のコンペンディアから得た１種以上の対照ｍｉＲＮＡのカウント及び時刻正規化された発現レベルに対して比較することであって、１名以上の健康な対照対象または健康な対照対象のコンペンディアから得た同じ１種以上のｍｉＲＮＡと比較した、対象のｍｉＲＮＡのうちの１種以上の発現レベルの上昇または低下が、対象がＴＢＩを受けた可能性があることを示す、比較することと
を含む、方法を提供することであった。
【００４０】
本発明者らの別の目的は、外傷性脳傷害（ＴＢＩ）の疑いを有する対象のエピジェネティックデータを、１名以上の健康な対照対象または健康な対照対象のコンペンディア（ここで、それぞれの健康な対照対象は、ＴＢＩまたはＴＢＩの症状を経験したことがないことが分かっている）と比較する方法であって、
対象から採取された生体サンプル中の１種以上のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）のカウントを判定することと、
サンプル間カウント変化を考慮するために対象のエピジェネティックデータを正規化することであって、カウント正規化が１種以上の不変のｍｉＲＮＡを使用する、正規化することと、
生体サンプルが採取された時刻を判定することと、
対象のｍｉＲＮＡ発現レベルを時刻に対して更に正規化するために、時刻を使用することにより、カウント正規化されたｍｉＲＮＡに時刻正規化を適用することと、
対象のｍｉＲＮＡのうちの１種以上のカウント及び時刻正規化された発現レベルを、１名以上の健康な対照対象または健康な対照対象のコンペンディアから得た同じ１種以上のｍｉＲＮＡのカウント及び時刻正規化された発現レベルに対して比較することであって、１名以上の健康な対照対象または健康な対照対象のコンペンディアから得た同じ１種以上のｍｉＲＮＡに対する、対象のｍｉＲＮＡのうちの１種以上の発現レベルの上昇または低下が、対象が経験している可能性があるかまたは経験する可能性が高い症状を示す、比較することと
を含む、方法を提供することであった。
【００４１】
別の目的は、外傷性脳傷害（ＴＢＩ）の疑いがある対象のエピジェネティックデータを、１名以上の健康な対照対象または健康な対照対象のコンペンディア（ここで、それぞれの健康な対照対象は、ＴＢＩまたはＴＢＩの症状を経験したことがないことが分かっている）と比較する方法であって、
対象から採取された生体サンプル中の１種以上のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）のカウントを判定することと、
サンプル間カウント変化を考慮するために対象のエピジェネティックデータを正規化することであって、カウント正規化が１種以上の不変のｍｉＲＮＡを使用する、正規化することと、
生体サンプルが採取された時刻を判定することと、
対象のｍｉＲＮＡ発現レベルを時刻に対して更に正規化するために、時刻を使用することにより、カウント正規化されたｍｉＲＮＡに時刻正規化を適用することと、
対象のｍｉＲＮＡのうちの１種以上のカウント及び時刻正規化された発現レベルを、１名以上の健康な対照対象または健康な対照対象のコンペンディアから得た同じ１種以上のｍｉＲＮＡのカウント及び時刻正規化された発現レベルと比較することであって、１名以上の健康な対照対象または健康な対照対象のコンペンディアから得た同じ１種以上のｍｉＲＮＡと比較した、対象のｍｉＲＮＡのうちの１種以上の発現レベルの正または負の差が、ＴＢＩの重症度を示し、かつ対象が経験しているかまたは経験する可能性が高い症状の潜在的な持続時間を示す、比較することと
を含む、方法を提供することであった。
【００４２】
一実施形態において、ｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２３ｂ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２５、ｈｓａ−ｍｉＲ−２５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２６ａ−１、ｈｓａ−ｍｉｒ−２６ａ−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−９２ａ−１、ｈｓａ−ｍｉｒ−９２ａ−２、ｈｓａ−ｍｉｒ−１０３ａ−１、ｈｓａ−ｍｉｒ−１０３ａ−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−１５１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−１８１ａ−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２１８−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８ｆ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８ｇ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８ｉ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５３２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７７、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７４４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７３ｇ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２８５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０７４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−３１６０−１、ｈｓａ−ｍｉｒ−３６１３、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９１６、ｈｓａ−ｍｉｒ−４５３２、ｈｓａ−ｍｉｒ−５０９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６７７０−５ｐ、及び上掲のｍｉＲＮＡと共通のシード配列をもつｍｉＲＮＡからなる群から選択される。
【００４３】
本発明者らの別の目的は、対象の傷害、障害、または病状の進行をモニタリングする方法であって、
同じ対象から異なる時点で採取された少なくとも２つの生体サンプルを分析して、少なくとも２つの生体サンプルのそれぞれにおける１種以上のｍｉＲＮＡのカウント及び時刻正規化された発現レベルを判定することと、
１種以上のｍｉＲＮＡの判定されたレベルを経時的に比較して、対象の１種以上の特定のｍｉＲＮＡのカウント及び時刻正規化された発現レベルが経時的に変化しているかどうかを判定することと
を含み、
１種以上のｍｉＲＮＡのカウント及び時刻正規化された発現レベルの経時的な上昇または低下が、対象のＴＢＩの進行を示し、及び／または、１種以上のｍｉＲＮＡのカウント及び時刻正規化された発現レベルの発現レベルの経時的な正または負の差が、対象のＴＢＩの進行を示す、
方法を提供することであった。
【００４４】
一実施形態において、時刻正規化の対象となるｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２３ｂ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２５、ｈｓａ−ｍｉＲ−２５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２６ａ−１、ｈｓａ−ｍｉｒ−２６ａ−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−９２ａ−１、ｈｓａ−ｍｉｒ−９２ａ−２、ｈｓａ−ｍｉｒ−１０３ａ−１、ｈｓａ−ｍｉｒ−１０３ａ−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−１５１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−１８１ａ−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２１８−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８ｆ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８ｇ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８ｉ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５３２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７７、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７４４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７３ｇ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２８５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０７４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−３１６０−１、ｈｓａ−ｍｉｒ−３６１３、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９１６、ｈｓａ−ｍｉｒ−４５３２、ｈｓａ−ｍｉｒ−５０９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６７７０−５ｐ、及び上掲のｍｉＲＮＡと共通のシード配列をもつｍｉＲＮＡからなる群から選択される。
【００４５】
別の実施形態では、時刻正規化の対象となるｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２３ｂ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２５、ｈｓａ−ｍｉＲ−２５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２６ａ−１、ｈｓａ−ｍｉｒ−２６ａ−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−９２ａ−１、ｈｓａ−ｍｉｒ−９２ａ−２、ｈｓａ−ｍｉｒ−１０３ａ−１、ｈｓａ−ｍｉｒ−１０３ａ−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−１５１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−１８１ａ−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２１８−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８ｆ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８ｇ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８ｉ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５３２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７７、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７４４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７３ｇ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２８５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０７４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−３１６０−１、ｈｓａ−ｍｉｒ−３６１３、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９１６、ｈｓａ−ｍｉｒ−４５３２、ｈｓａ−ｍｉｒ−５０９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６７７０−５ｐ、及び上掲のｍｉＲＮＡと共通のシード配列をもつｍｉＲＮＡからなる群から選択される。
【００４６】
本発明者らの別の目的は、生体サンプル中のｍｉＲＮＡ配列または複数のｍｉＲＮＡ配列を検知する方法であって、
対象から生体サンプルを得ることと、
生体サンプル中に見られる、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２３ｂ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２５、ｈｓａ−ｍｉＲ−２５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２６ａ−１、ｈｓａ−ｍｉｒ−２６ａ−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−９２ａ−１、ｈｓａ−ｍｉｒ−９２ａ−２、ｈｓａ−ｍｉｒ−１０３ａ−１、ｈｓａ−ｍｉｒ−１０３ａ−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−１５１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−１８１ａ−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２１８−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８ｆ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８ｇ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８ｉ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５３２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７７、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７４４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７３ｇ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２８５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０７４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−３１６０−１、ｈｓａ−ｍｉｒ−３６１３、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９１６、ｈｓａ−ｍｉｒ−４５３２、ｈｓａ−ｍｉｒ−５０９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６７７０−５ｐ、及び上掲のｍｉＲＮＡと共通のシード配列をもつｍｉＲＮＡからなる群から選択される１種以上のｍｉＲＮＡ配列のそれぞれに対し、二本鎖の相補的ＤＮＡ配列（ｃＤＮＡ）を作出することと、
ノーザンブロット、リアルタイムＰＣＲ、または次世代シーケンシングを用い、ｃＤＮＡ及びｃＤＮＡの存在、非存在、または相対量を検知することであって、ｃＤＮＡの存在、非存在、または相対量が、相補的ｍｉＲＮＡ配列の存在、非存在、または相対量を示す、検知することと
を含む、方法を提供することであった。
【００４７】
一実施形態において、生体サンプルは、第１の時点で採取された第１の生体サンプルであり、ｃＤＮＡは、第１のｃＤＮＡであり、本方法は、
該対象から第２の時点で第２の生体サンプルを得ることと、
第２の生体サンプル中に見られる、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２３ｂ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２５、ｈｓａ−ｍｉＲ−２５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２６ａ−１、ｈｓａ−ｍｉｒ−２６ａ−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−９２ａ−１、ｈｓａ−ｍｉｒ−９２ａ−２、ｈｓａ−ｍｉｒ−１０３ａ−１、ｈｓａ−ｍｉｒ−１０３ａ−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−１５１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−１８１ａ−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２１８−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８ｆ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８ｇ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８ｉ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５３２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７７、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７４４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７３ｇ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２８５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０７４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−３１６０−１、ｈｓａ−ｍｉｒ−３６１３、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９１６、ｈｓａ−ｍｉｒ−４５３２、ｈｓａ−ｍｉｒ−５０９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６７７０−５ｐ、及び上掲のｍｉＲＮＡと共通のシード配列をもつｍｉＲＮＡからなる群から選択される１種以上のｍｉＲＮＡ配列のそれぞれに対し、第２のｃＤＮＡを作出することと、
ノーザンブロット、リアルタイムＰＣＲ、または次世代シーケンシングを用い、第２のｃＤＮＡ及び第２のｃＤＮＡの存在、非存在、または相対量を検知することであって、
該第２の時点で得た該生体サンプル中の第２のｃＤＮＡの存在、非存在、または相対量は、この第２の時点における相補的ｍｉＲＮＡ配列の存在、非存在、または相対量を示す、検知することと、
場合により、第１の時点からの結果を第２の時点からの結果と比較することによって、ＴＢＩの進行を追跡することと
を更に含む。
【００４８】
また、本発明者らの目的は、対象が外傷性脳傷害を有するかどうかを判定するためのキットであって、
第２の生体サンプル中に見られる、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２３ｂ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２５、ｈｓａ−ｍｉＲ−２５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２６ａ−１、ｈｓａ−ｍｉｒ−２６ａ−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−９２ａ−１、ｈｓａ−ｍｉｒ−９２ａ−２、ｈｓａ−ｍｉｒ−１０３ａ−１、ｈｓａ−ｍｉｒ−１０３ａ−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−１５１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−１８１ａ−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２１８−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８ｆ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８ｇ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８ｉ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５３２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７７、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７４４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７３ｇ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２８５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０７４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−３１６０−１、ｈｓａ−ｍｉｒ−３６１３、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９１６、ｈｓａ−ｍｉｒ−４５３２、ｈｓａ−ｍｉｒ−５０９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６７７０−５ｐ、及びこれらのｍｉＲＮＡと共通のシード配列をもつｍｉＲＮＡからなる群から選択されるｍｉＲＮＡのリボヌクレオチド配列に対応するリボヌクレオチド配列を有する、２つ以上のｍｉＲＮＡプローブを含むプローブセットを含む、
キットを提供することであった。
【００４９】
一実施形態において、本キットは、該プローブセットに結合した固体支持体を更に含む。別の実施形態では、本キットは、
（ａ）陰性対照として使用される、１つのランダムに生成されたリボヌクレオチド配列、（ｂ）全ＲＮＡ分解の標準対照として使用される、ハウスキーピング遺伝子に由来する少なくとも１つのオリゴヌクレオチド配列、または（ｃ）陽性対照として使用される、少なくとも１つのランダムに生成されたリボヌクレオチド配列のうち、少なくとも１つを更に含む。
【００５０】
本発明者らの別の目的は、軽度外傷性脳傷害（ｍＴＢＩ）を受けたことがある対象における脳震盪後症候群（ＰＣＳ）を評価するための方法であって、
対象の唾液サンプルにおけるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）アレイの発現を測定することと、対象のサンプル中のｍｉＲＮＡの発現レベルの上昇または低下が、対象がＰＣＳを発症する可能性が高いことを示すように、ｍｉＲＮＡアレイの発現プロファイルを、健康な対象及び／または急性脳震盪症状（ＡＣＳ）を有する対象のｍｉＲＮＡの対照アレイと比較することとを含み、
ｍｉＲＮＡのアレイが、少なくとも１０種、好ましくは少なくとも１５種、より好ましくは少なくとも２０種のｍｉＲＮＡを含み、アレイ中のｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−７６９、ｍｉＲ−７６９−３ｐ、ｍｉＲ−７６９−５ｐ、ｍｉＲ−３２０ｃ−１、ｍｉＲ−３２０ｃ−１−３ｐ、ｍｉＲ−３２０ｃ−１−５ｐ、ｍｉＲ−４７９２、ｍｉＲ−４７９２−３ｐ、ｍｉＲ−４７９２−５ｐ、ｍｉＲ−１４０、ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｍｉＲ−１４０−５ｐ、ｍｉＲ−６２９、ｍｉＲ−６２９−３ｐ、ｍｉＲ−６２９−５ｐ、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１９２−３ｐ、ｍｉＲ−１９２−５ｐ、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４５−３ｐ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｌｅｔ−７ａ、ｌｅｔ−７ａ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｓ−５ｐ、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１３０７、ｍｉＲ−１３０７−３ｐ、ｍｉＲ−１３０７−５ｐ、ｍｉＲ−２００ｂ、ｍｉＲ−２００ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２００ｂ−５ｐ、ｌｅｔ−７ａ、ｌｅｔ−７ａ−３ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４５０８、ｍｉＲ−４５０８−３ｐ、ｍｉＲ−４５０８−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｂ、ｌｅｔ−７ｂ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−１９４−３ｐ、ｍｉＲ−１９４−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｆ、ｌｅｔ−７ｆ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１２８−３ｐ、ｍｉＲ−１２８−５ｐ、ｍｉＲ−２１５、ｍｉＲ−２１５−３ｐ、ｍｉＲ−２１５−５ｐ、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−１４９−３ｐ、ｍｉＲ−１４９−５ｐ、ｍｉＲ−４２１、ｍｉＲ−４２１−３ｐ、及びｍｉＲ−４２１−５ｐからなる群から選択される、
方法を提供することであった。
【００５１】
別の目的は、対象の唾液サンプル中のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）のアレイを検知する方法であって、
対象から唾液サンプルを得ることと、
サンプル中のｍｉＲＮＡのアレイの存在または非存在を検知することであって、アレイが少なくとも１０種、１１種、１２種、１３種、１４種、１５種、１６種、１７種、１８種、１９種、２０種またはそれ以上のｍｉＲＮＡ、好ましくは少なくとも１５種のｍｉＲＮＡ、より好ましくは少なくとも２０種のｍｉＲＮＡを含む、検知することと
を含み、
ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−７６９、ｍｉＲ−７６９−３ｐ、ｍｉＲ−７６９−５ｐ、ｍｉＲ−３２０ｃ−１、ｍｉＲ−３２０ｃ−１−３ｐ、ｍｉＲ−３２０ｃ−１−５ｐ、ｍｉＲ−４７９２、ｍｉＲ−４７９２−３ｐ、ｍｉＲ−４７９２−５ｐ、ｍｉＲ−１４０、ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｍｉＲ−１４０−５ｐ、ｍｉＲ−６２９、ｍｉＲ−６２９−３ｐ、ｍｉＲ−６２９−５ｐ、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１９２−３ｐ、ｍｉＲ−１９２−５ｐ、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４５−３ｐ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｌｅｔ−７ａ、ｌｅｔ−７ａ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｓ−５ｐ、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１３０７、ｍｉＲ−１３０７−３ｐ、ｍｉＲ−１３０７−５ｐ、ｍｉＲ−２００ｂ、ｍｉＲ−２００ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２００ｂ−５ｐ、ｌｅｔ−７ａ、ｌｅｔ−７ａ−３ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４５０８、ｍｉＲ−４５０８−３ｐ、ｍｉＲ−４５０８−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｂ、ｌｅｔ−７ｂ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−１９４−３ｐ、ｍｉＲ−１９４−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｆ、ｌｅｔ−７ｆ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１２８−３ｐ、ｍｉＲ−１２８−５ｐ、ｍｉＲ−２１５、ｍｉＲ−２１５−３ｐ、ｍｉＲ−２１５−５ｐ、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−１４９−３ｐ、ｍｉＲ−１４９−５ｐ、ｍｉＲ−４２１、ｍｉＲ−４２１−３ｐ、及びｍｉＲ−４２１−５ｐからなる群から選択される、
方法を提供することであった。
【００５２】
別の目的は、脳震盪を起こした軽度外傷性脳傷害（ｍＴＢＩ）と診断された対象における脳震盪後症候群（ＰＣＳ）を評価するためのキットであって、
ｍｉＲ−７６９、ｍｉＲ−７６９−３ｐ、ｍｉＲ−７６９−５ｐ、ｍｉＲ−３２０ｃ−１、ｍｉＲ−３２０ｃ−１−３ｐ、ｍｉＲ−３２０ｃ−１−５ｐ、ｍｉＲ−４７９２、ｍｉＲ−４７９２−３ｐ、ｍｉＲ−４７９２−５ｐ、ｍｉＲ−１４０、ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｍｉＲ−１４０−５ｐ、ｍｉＲ−６２９、ｍｉＲ−６２９−３ｐ、ｍｉＲ−６２９−５ｐ、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１９２−３ｐ、ｍｉＲ−１９２−５ｐ、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４５−３ｐ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｌｅｔ−７ａ、ｌｅｔ−７ａ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｓ−５ｐ、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１３０７、ｍｉＲ−１３０７−３ｐ、ｍｉＲ−１３０７−５ｐ、ｍｉＲ−２００ｂ、ｍｉＲ−２００ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２００ｂ−５ｐ、ｌｅｔ−７ａ、ｌｅｔ−７ａ−３ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４５０８、ｍｉＲ−４５０８−３ｐ、ｍｉＲ−４５０８−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｂ、ｌｅｔ−７ｂ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−１９４−３ｐ、ｍｉＲ−１９４−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｆ、ｌｅｔ−７ｆ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１２８−３ｐ、ｍｉＲ−１２８−５ｐ、ｍｉＲ−２１５、ｍｉＲ−２１５−３ｐ、ｍｉＲ−２１５−５ｐ、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−１４９−３ｐ、ｍｉＲ−１４９−５ｐ、ｍｉＲ−４２１、ｍｉＲ−４２１−３ｐ、及びｍｉＲ−４２１−５ｐからなる群から選択されるｍｉＲＮＡの配列に対応するか、またはこれらの配列と少なくとも９０％の相同性を有し、かつｍｉＲＮＡに特異的に結合する、核酸プローブのアレイを含み、アレイが、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、より好ましくは少なくとも２０個の核酸プローブを含む、
キットを提供することであった。
【００５３】
本発明者らの別の目的は、脳震盪後症候群を有する対象を処置する方法であって、片頭痛の薬物療法、緊張型頭痛の薬物療法、抗うつ薬、認知療法、精神療法、不安症の薬物療法、及びうつ病の薬物療法のうち少なくとも１つを対象に提供することを含み、対象が本発明の方法によって脳震盪後症候群を有するものと特定された、方法を提供することであった。
【００５４】
一実施形態において、対象は、頭痛、めまい、疲労、易刺激性、不安、不眠、集中力低下、記憶消失、雑音への過敏性、及び光への過敏性からなる群から選択される少なくとも１つの症状を有する。
【００５５】
本発明者らの別の目的は、対象の脳傷害のステータスまたは予後をモニタリングするための方法であって、
対象の唾液中の脳傷害に関連する１種以上のマイクロＲＮＡを検知することと、該マイクロＲＮＡが、脳傷害のない対照対象の量を有意に下回るかまたは上回る量で存在する場合、脳傷害ステータスを評価または予後診断することと、場合により、脳傷害を有する対象を処置することと
を含む、方法を提供することであった。
【００５６】
一実施形態において、予後診断することは、バランス及び／または認知に関連する１種以上のマイクロＲＮＡの異常なレベルを検知することを含む。
【００５７】
別の実施形態では、対象は新生児であるか、または対象は、少なくとも月齢０か月、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、もしくは１２か月、または１歳、２歳、３歳、４歳、５歳、６歳、７歳、８歳、９歳、１０歳、１１歳、１２歳、１３歳、１４歳、１５歳、１６歳、１７歳、１８歳、１９歳、２０歳、２１歳、２２歳、２３歳、２４歳、もしくは２５歳である。
【００５８】
別の目的は、小児ＴＢＩを有しない子供の値を上回るレベルのｌｅｔ−７ｆマイクロＲＮＡを検知することを含む、小児ＴＢＩを検知するための方法を提供することであった。
【００５９】
本発明者らの目的の１つは、外傷性脳傷害（「ＴＢＩ」）を検知、診断、予後診断、またはモニタリングするための方法であって、
対象の唾液または血清中で、ＴＢＩに関連する１種以上のマイクロＲＮＡを検知することと、
該マイクロＲＮＡが、対照対象において検知される量を有意に下回るかまたは上回る量で存在する場合、ＴＢＩを検知、診断、予後診断、またはモニタリングすることと、
場合により、異常に低いかまたは高いレベルが検知された場合、他のＴＢＩ症状について患者を更に評価すること、または対象のＴＢＩを処置することと
を含む、方法を提供することであった。
【００６０】
一実施形態において、ＴＢＩは軽度ＴＢＩである。別の実施形態では、検知することは、少なくとも２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、２０種、または５０種のｍｉＲＮＡを検知する。更に別の実施形態では、検知することは、唾液中の１種以上のｍｉＲＮＡを検知することを含む。異なる実施形態では、検知することは、血清中の１種以上のｍｉＲＮＡを検知することを含む。別の実施形態では、検知することは、ＣｌｅａｒＥｄｇｅ（商標）評価システム（Ｈｙｐｅｒ  Ｔｅｘｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  Ｓｅｃｕｒｅ（ＨＴＴＰＳ）：／／ＷｏｒｌｄＷｉｄｅＷｅｂ．ｃｌｅａｒｅｄｇｅｔｅｓｔ．ｃｏｍ／、最終アクセス日２０１８年１月２２日）によって説明される認知のバランスまたは症状の測定値、あるいはバランス及び／または認知の他の機能的測定値のうちの１つ以上の測定値に関連する、１種以上のｍｉＲＮＡの異常なレベルを検知することを含む。
【００６１】
一実施形態において、少なくとも１種のｍｉＲＮＡは、プロテオグリカン合成、ムチン型Ｏ−グリカン生合成、グリコサミノグリカン生合成、またはケラチンサルフェート生合成、ＦｏｘＯシグナル伝達、エンドサイトーシス、不整脈原性右室心筋症、ＥｒｂＢシグナル伝達、ＧＡＢＡ作動性シナプス、幹細胞多能性の調節、モルヒネ嗜癖、ウイルス発癌、ｃＡＭＰシグナル伝達、プロラクチンシグナル伝達、神経膠腫、アクチン細胞骨格の調節、ビオチン代謝、及び接着結合（接着帯）に関連する経路のうち少なくとも１つを標的とする。
【００６２】
別の態様では、検知することは、ユビキチン依存性タンパク質分解経路、軸索ガイダンス経路、またはＴＧＦ−ベータシグナル伝達経路において濃縮される少なくとも１種のｍｉＲＮＡを検知する。
【００６３】
別の実施形態では、本方法は、ＴＢＩまたはｍＴＢＩを有する対象を少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、または９５％の精度で検知する。
【００６４】
異なる実施形態では、本方法は、１種以上のｍｉＲＮＡのレベルをＴＢＩまたはｍＴＢＩの増悪または寛解の指標としてモニタリングすることを含む。
【００６５】
別の実施形態では、本方法は、対象のＴＢＩまたはｍＴＢＩを処置し、処置前、処置中、または処置後の１種以上のｍｉＲＮＡのレベルをＴＢＩまたはｍＴＢＩの増悪または寛解の指標としてモニタリングすることを含む。
【００６６】
本発明者らの別の目的は、唾液または血清中のＴＢＩまたはｍＴＢＩに関連する少なくとも１種のｍｉＲＮＡを特定するプローブ及び／またはプライマーを含む組成物を提供することであった。一実施形態において、プローブ及び／またはプライマーは、少なくとも２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１５種、２０種、５０種またはそれ以上のｍｉＲＮＡを特定する。別の実施形態では、本組成物は、ＴＢＩまたはｍＴＢＩを有する対象のユビキチン依存性タンパク質分解経路、軸索ガイダンス経路、またはＴＧＦ−ベータシグナル伝達経路において濃縮される少なくとも１種のｍｉＲＮＡを検知するプローブ及び／またはプライマーを含む。別の実施形態では、本組成物はマイクロアレイ、バイオチップ、またはチップである。
【００６７】
本発明者らの別の目的は、ＴＢＩまたはｍＴＢＩに関連する複数のｍｉＲＮＡを集合的に認識するプローブまたはプライマーを含むマイクロアレイと、場合により、シグナル伝送要素、情報処理要素、及びデータ表示要素または出力要素とを含む、唾液中のｍｉＲＮＡを検知するためのシステムを提供することであった。
【００６８】
一実施形態において、本システムは、ｍｉＲＮＡを受け、場合により精製または単離するための少なくとも１つの要素を更に含む。
【００６９】
本発明者らの別の目的は、ＴＢＩもしくはｍＴＢＩのリスクがある対象またはそれを有する対象において欠乏している（健康な対照よりも低い）１種以上のｍｉＲＮＡを、ＴＢＩもしくはｍＴＢＩを受けたオルガネラ、細胞内コンパートメント、組織、または部位への投与に好適な形態で含む組成物；あるいは、ＴＢＩもしくはｍＴＢＩのリスクがある対象またはそれを有する対象において健康な対照と比較して上昇している１種以上のｍｉＲＮＡを低下または不活性化させる１つ以上の薬剤を、ＴＢＩもしくはｍＴＢＩを受けたオルガネラ、細胞内コンパートメント、組織、または部位への投与に好適な形態で含む組成物を提供することであった。
【００７０】
一実施形態において、本組成物は、天然もしくは合成のリポソーム、微小胞、タンパク質複合体、リポタンパク質複合体、エキソソームもしくは多胞体、またはプロバイオティクス製品もしくはプレバイオティクス製品の形態である。
【００７１】
本発明者らの目的の１つは、処置を必要とする対象に本明細書に開示される組成物４４を投与することを含む、ＴＢＩのリスクがあるかまたはＴＢＩを有する対象を処置するための方法を提供することであった。
【００７２】
本発明の実施形態の多くまたはほとんどにおいて、対象はヒトである。
【００７３】
生体サンプルは、唾液、脳脊髄液、血液、血清、血漿、尿、糞便、粘膜排泄物、涙、及び組織のうちの少なくとも１つであり得る。好都合なことには、本発明は唾液サンプルを使用して実践される。
【００７４】
本発明の一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡの発現レベルは、ＲＮＡシーケンシング、リアルタイムＰＣＲ、次世代シーケンシング、または他の適切な方法によって判定され得る。
【００７５】
近年の研究において、本発明者らは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）レベルの日周変化との関係を調査した。本発明者らは、概日遺伝子を標的とするｍｉＲＮＡの一部分自体が強い概日リズムを示すであろうと仮定した。ｍｉＲＮＡはあらゆる細胞外液中で全身を循環することができるため、我々はヒトの唾液中でｍｉＲＮＡを測定した。唾液サンプルを使用した更なる理由は、マイクロバイオームと呼ばれるヒトの口内に存在する微生物のレベル及び多様性とｍｉＲＮＡの関係の分析を可能にするためであった。下部消化管に関する過去の研究は、宿主ｍｉＲＮＡと常在細菌との間の強い関係を示している。更に、腸内マイクロバイオームにおける概日変化が立証されている。したがって、本発明者らの目的の１つは、概日振動するｍｉＲＮＡ及び微生物のサブセットにおける相関した変化の証拠を得ることであった。２０１７年３月２３日に出願された米国仮出願第６２／４７５，７０５号、及び２０１８年３月２０日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ１８／２３３３６は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。
【００７６】
初期研究には１１名のヒト対象志願者が参加し、連日様々な時刻で唾液サンプルを提供した。唾液ｍｉＲＮＡ及び微生物内容物の特定及び定量化は、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）、リアルタイムＰＣＲを使用して行ったか、またはその後に統計分析を行った。本発明者らはまず、２つの独立したサンプルセットに二元分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して、収集日（ルーチンにおける毎日の変化に強く影響される可能性があった）ではなく収集時間によって有意に変化したｍｉＲＮＡ及び微生物を特定した。次に、これらのｍｉＲＮＡ及び微生物のサブセットを第３のサンプルセットに使用し、多変数回帰を使用して収集時間を予測した。その結果は、ヒトの唾液には、信頼性高く定量化されたおよそ４００種のｍｉＲＮＡ及び２０００種の微生物が含有されていたことを示した。このうち１９種の異なるｍｉＲＮＡ及び多くの微生物に関しては、収集時間に伴う強く予測可能な変化が明らかであった。最初の２つのサンプルセット中のｍｉＲＮＡデータからモデルを開発した。これは、１５％の誤差限界以内で第３のサンプルセットの収集時間を予測することができた。微生物データも最初の２つのサンプルセットの収集時間との強い相関性を示したが、第３のサンプルセットの収集時間を予測することにおいてはさほど正確ではなかった。また、ｍｉＲＮＡのうちのいくつかと微生物との間には、非常に有意な相関性が観察された。興味深いことに、最も優れた時間予測子であるｍｉＲＮＡの生物情報学的分析は、ほとんどが、脳及び免疫機能に関与する遺伝子に加えて少なくとも１種以上の概日遺伝子を標的とすることを示した。まとめると、我々のデータは、これまで知られていなかった唾液ｍｉＲＮＡと微生物内容物との関係、ならびにｍｉＲＮＡ（及び／または微生物）自体に対する時間的影響（すなわち、時間的変化）を示唆する。時間的変化を受けるエピジェネティックデータ（シーケンシングデータまたは他のデータ）を正規化するための本明細書に記載のシステム及び方法は、時間的変化がデータに影響を及ぼし得る任意の好適な用途において使用され得る。一例において、本明細書に記載のシステム及び方法は、医学的状態の発症及び／または医学的状態の変化を検知するため、より具体的には、自閉症、睡眠障害、及び外傷性脳傷害（ＴＢＩ）などの神経障害の発症及び／または変化を検知するための用途において使用され得る。
【００７７】
したがって、本発明者らの目的は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）発現の時間的変化を考慮するためにエピジェネティック配列データを正規化する方法であって、
対象から採取された生体サンプル中の１種以上のｍｉＲＮＡのリードカウントを判定することと、
サンプル間リードカウント変化を考慮するために対象のエピジェネティックデータを正規化することであって、リードカウント正規化が１種以上の不変のｍｉＲＮＡを使用する、正規化することと、
生体サンプルが採取された時刻を判定することと、
リードカウント正規化されたｍｉＲＮＡにアルゴリズムを適用することであって、アルゴリズムが、対象のｍｉＲＮＡ発現レベルを時刻に対して正規化するために時刻を使用する、適用することと
を含む、方法を提供することであった。
【００７８】
本発明者らの別の目的は、対象の障害、病状、または傷害の進行をモニタリングする方法であって、
対象から異なる時点で採取された少なくとも２つの生体サンプルを分析して、少なくとも２つの生体サンプルのそれぞれにおける１種以上の特定のｍｉＲＮＡのリードカウント及び時刻正規化された発現レベルを判定することと、
１種以上の特定のｍｉＲＮＡの判定されたレベルを経時的に比較して、対象の１種以上の特定のｍｉＲＮＡのリードカウント及び時刻正規化された発現レベルが経時的に変化しているかどうかを判定することと
を含み、
１種以上の特定のｍｉＲＮＡのリードカウント及び時刻正規化された発現レベルの経時的な上昇または低下が、対象の障害または病状または傷害が改善または悪化していることを示す、
方法を提供することであった。
【００７９】
一実施形態において、時刻正規化の対象となるｍｉＲＮＡは、Ａ群のｃｉｒｃａＭｉＲ及び／またはＡ群のｃｉｒｃａＭｉＲと共通のシード配列をもつｍｉＲＮＡからなる群から選択される。
【００８０】
別の実施形態では、時刻正規化の対象となるｍｉＲＮＡは、Ａ群のｃｉｒｃａＭｉＲ及びＢ群のｃｉｒｃａＭｉＲ、及び／またはＡ群のｃｉｒｃａＭｉＲ及びＢ群のｃｉｒｃａＭｉＲと共通のシード配列をもつｍｉＲＮＡからなる群から選択される。
【００８１】
一実施形態において、対象は、脳震盪後症候群（ＰＣＳ）を有する対象である。別の実施形態では、対象は、ＴＢＩまたはｍＴＢＩを有する対象である。
【００８２】
本発明者らの別の目的は、第１の生体サンプル中のｍｉＲＮＡまたは複数のｍｉＲＮＡを検知する方法であって、
対象から生体サンプルを得ることと、
Ａ群のｃｉｒｃａＭｉＲ及びＢ群のｃｉｒｃａＭｉＲから選択される１種以上のｍｉＲＮＡのそれぞれに対し、二本鎖の相補的ＤＮＡ配列（ｃＤＮＡ）を作出することと、
ｃＤＮＡの存在、非存在、または相対量を検知することであって、ｃＤＮＡの存在、非存在、または相対量が、相補的ｍｉＲＮＡの存在、非存在、または相対量を示す、検知することと
を含む、方法を提供することであった。
【００８３】
別の目的は、第２の生体サンプル中のｍｉＲＮＡまたは複数のｍｉＲＮＡを検知する方法であって、
該対象から第２の時点で生体サンプルを得ることと、
Ａ群のｃｉｒｃａＭｉＲ及びＢ群のｃｉｒｃａＭｉＲから選択される１種以上のｍｉＲＮＡのそれぞれに対し、二本鎖の相補的ＤＮＡ配列（ｃＤＮＡ）を作出することと、
ｃＤＮＡの存在、非存在、または相対量を検知することであって、該第２の時点で得た該生体サンプル中のｃＤＮＡの存在、非存在、または相対量が、第２の時点における相補的ｍｉＲＮＡの存在、非存在、または相対量を示す、検知することと、
場合により、第１の時点からの結果を第２の時点からの結果と比較することによって、障害、疾患、または傷害の進行を追跡することと
を含む、方法を提供することであった。
【００８４】
対象は、ＴＢＩ、ｍＴＢＩ、または脳震盪後症候群（ＰＣＳ）を有する対象であり得る。
【００８５】
本発明者らの別の目的は、時間的リズムの変化を検知するための方法であって、
１名以上の正常な対象による対照値と比較して、唾液または血清中のｍｉＲＮＡレベルの少なくとも１つの異常なパターンまたは変化したパターンを検知することと、
ｍｉＲＮＡの量の少なくとも１つの異常なパターンまたは変化したパターンを有する対象を選択することと、
場合により、一時的リズムの変化に関連するＴＢＩ、ｍＴＢＩ、またはＰＣＳ関連症状を有する対象を選択することと、
場合により、ｍｉＲＮＡの量の少なくとも１つの異常なパターンまたは変化したパターンを低減または再同期させる処置を供与することと
を含む、方法を提供することであった。
【００８６】
一実施形態において、１種以上のｍｉＲＮＡの量の異常なパターンまたは変化したパターンが検知される。
【００８７】
本発明の様々な実施形態において、生体サンプルは、唾液、脳脊髄液、血液、血清、血漿、尿、糞便、粘膜排泄物、涙、または組織であり得る。
【００８８】
本技術の非限定的な実施形態は、以下を含む。
１．脳震盪、軽度外傷性脳傷害（「ｍＴＢＩ」）、または他の外傷性脳傷害（「ＴＢＩ」）を検知または診断するための方法であって、
（ａ）ヒト対象から採取された唾液サンプル中の１種以上のマイクロＲＮＡ（「ｍｉＲＮＡ」）の濃度レベル（複数可）を判定することと、
（ｂ）前記１種以上のｍｉＲＮＡの前記判定された濃度レベル（複数可）を同じ１種以上のｍｉＲＮＡの正常レベル（複数可）に対して比較することであって、前記正常（または対照）レベルが、脳震盪、軽度外傷性脳傷害を有しない対象に見られるものか、脳震盪、軽度外傷性脳傷害を有しない２名、３名、４名、５名、６名、７名、８名、９名、１０名もしくはそれ以上の対象の平均か、または脳震盪、ｍＴＢＩ、もしくはＴＢＩをもたらし得る事象の前に前記対象において判定された濃度レベル（複数可）である、前記比較することと、
（ｃ）前記１種以上のｍｉＲＮＡの異常なレベルを有する対象を、脳震盪、軽度外傷性脳傷害（「ｍＴＢＩ」）、もしくは他の外傷性脳傷害（「ＴＢＩ」）を有するか、または有するリスクがより高いものとして選択することと
を含み、
前記１種以上のｍｉＲＮＡが、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２３ｂ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２５、ｈｓａ−ｍｉＲ−２５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２６ａ−１、ｈｓａ−ｍｉｒ−２６ａ−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−９２ａ−１、ｈｓａ−ｍｉｒ−９２ａ−２、ｈｓａ−ｍｉｒ−１０３ａ−１、ｈｓａ−ｍｉｒ−１０３ａ−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−１５１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−１８１ａ−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２１８−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８ｆ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８ｇ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８ｉ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５３２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７７、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７４４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７３ｇ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２８５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０７４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−３１６０−１、ｈｓａ−ｍｉｒ−３６１３、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９１６、ｈｓａ−ｍｉｒ−４５３２、ｈｓａ−ｍｉｒ−５０９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６７７０−５ｐ、及び上掲のｍｉＲＮＡと共通のシード配列をもつｍｉＲＮＡからなる群から選択され、及び／または、ｍｉＲ−７６９、ｍｉＲ−７６９−３ｐ、ｍｉＲ−７６９−５ｐ、ｍｉＲ−３２０ｃ−１、ｍｉＲ−３２０ｃ−１−３ｐ、ｍｉＲ−３２０ｃ−１−５ｐ、ｍｉＲ−４７９２、ｍｉＲ−４７９２−３ｐ、ｍｉＲ−４７９２−５ｐ、ｍｉＲ−１４０、ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｍｉＲ−１４０−５ｐ、ｍｉＲ−６２９、ｍｉＲ−６２９−３ｐ、ｍｉＲ−６２９−５ｐ、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１９２−３ｐ、ｍｉＲ−１９２−５ｐ、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４５−３ｐ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｌｅｔ−７ａ、ｌｅｔ−７ａ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｓ−５ｐ、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１３０７、ｍｉＲ−１３０７−３ｐ、ｍｉＲ−１３０７−５ｐ、ｍｉＲ−２００ｂ、ｍｉＲ−２００ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２００ｂ−５ｐ、ｌｅｔ−７ａ、ｌｅｔ−７ａ−３ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４５０８、ｍｉＲ−４５０８−３ｐ、ｍｉＲ−４５０８−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｂ、ｌｅｔ−７ｂ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−１９４−３ｐ、ｍｉＲ−１９４−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｆ、ｌｅｔ−７ｆ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１２８−３ｐ、ｍｉＲ−１２８−５ｐ、ｍｉＲ−２１５、ｍｉＲ−２１５−３ｐ、ｍｉＲ−２１５−５ｐ、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−１４９−３ｐ、ｍｉＲ−１４９−５ｐ、ｍｉＲ−４２１、ｍｉＲ−４２１−３ｐ、及びｍｉＲ−４２１−５ｐのうち少なくとも１種、ならびに上掲のｍｉＲＮＡと共通のシード配列をもつｍｉＲＮＡからなる群から選択される、
前記方法。ＴＢＩの前に起こり得る事象としては、スポーツに関連した転倒及び傷害、例えばフットボール、フラッグフットボール、サッカー、ラグビー、アイスホッケー、ラクロス、バスケットボール、及び他のコンタクトスポーツ、テニス、ゴルフ、野球、クリケット、陸上競技、体操、ボクシング、柔道、空手、テコンドー、及び他の格闘技、ウマを用いるスポーツ、ロデオスポーツ、高飛び込み及びスキンダイビングを含むダイビング、スカイダイビング、登山、サイクリング、チアリーディング、車両スポーツ、及び他のスポーツにおける高速衝突に起因するもの、ならびに車両事故、及び業務に関連した衝撃、転倒、及び傷害が挙げられる。銃撃、突風もしくは爆発などの衝撃、超音波エネルギーもしくは音響エネルギーへの曝露、揺さぶり（例えば乳児の激しい揺さぶり）、あるいは拳、足、または重い物体、密な物体、もしくは鈍器などによる身体の強打といった他の事象がＴＢＩの前に起こる場合もある。
【００８９】
２．前記ｍｉＲＮＡの発現レベルが、ＲＮＡ発現レベルが実質的に不変である１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種もしくはそれ以上のハウスキーピング遺伝子の発現レベルもしくは平均発現レベルに対して正規化され、及び／または、前記ｍｉＲＮＡのレベルが、前記１種以上のｍｉＲＮＡの前記発現レベルにおける日周変動もしくは概日変動を補償するように正規化されるか、食物摂取もしくは心拍数を上げるエクササイズに起因する前記１種以上のｍｉＲＮＡの前記発現レベルの変動を補償するように正規化されるか、または年齢、性別、もしくは遺伝的バックグラウンドの差を補償するように調整される、実施形態１に記載の方法。ハウスキーピング遺伝子としては、ＲＮＡシーケンシングデータの較正に有用なもの、例えばＥｉｓｅｎｂｅｒｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２９（１０：５６９−５７４，Ｃｅｌｌ  Ｐｒｅｓｓ（２０１３；参照により本明細書に組み込まれている）に記載のものが挙げられる。
【００９０】
３．（ａ）１種以上のｍｉＲＮＡの濃度を判定することが、ＲＮＡシーケンシング（「ＲＮＡ−ｓｅｑ」）、ｑＰＣＲ、ｍｉＲＮＡアレイ、またはマルチプレックスｍｉＲＮＡプロファイリングによって行われる、実施形態１または２に記載の方法。そのような方法は当技術分野で公知であり、また、Ｈｙｐｅｒ  Ｔｅｘｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ（ＨＴＴＰ）：／／＿ＷｏｒｌｄＷｉｄｅＷｅｂ．ａｂｃａｍ．ｃｏｍ／ｋｉｔｓ／ｒｅｖｉｅｗ−ｏｆ−ｍｉｒｎａ−ａｓｓａｙ−ｍｅｔｈｏｄｓ−ｑｐｃｒ−ａｒｒａｙｓ−ａｎｄ−ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（最終アクセス日２０１８年３月１９日、参照により組み込まれている）にも記載されている。
【００９１】
４．前記唾液サンプルが、ｍＴＢＩを有する疑いのあるヒト対象から採取され、前記ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−７６９、ｍｉＲ−７６９−３ｐ、ｍｉＲ−７６９−５ｐ、ｍｉＲ−３２０ｃ−１、ｍｉＲ−３２０ｃ−１−３ｐ、ｍｉＲ−３２０ｃ−１−５ｐ、ｍｉＲ−４７９２、ｍｉＲ−４７９２−３ｐ、ｍｉＲ−４７９２−５ｐ、ｍｉＲ−１４０、ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｍｉＲ−１４０−５ｐ、ｍｉＲ−６２９、ｍｉＲ−６２９−３ｐ、ｍｉＲ−６２９−５ｐ、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１９２−３ｐ、ｍｉＲ−１９２−５ｐ、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４５−３ｐ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｌｅｔ−７ａ、ｌｅｔ−７ａ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｓ−５ｐ、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１３０７、ｍｉＲ−１３０７−３ｐ、ｍｉＲ−１３０７−５ｐ、ｍｉＲ−２００ｂ、ｍｉＲ−２００ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２００ｂ−５ｐ、ｌｅｔ−７ａ、ｌｅｔ−７ａ−３ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４５０８、ｍｉＲ−４５０８−３ｐ、ｍｉＲ−４５０８−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｂ、ｌｅｔ−７ｂ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−１９４−３ｐ、ｍｉＲ−１９４−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｆ、ｌｅｔ−７ｆ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１２８−３ｐ、ｍｉＲ−１２８−５ｐ、ｍｉＲ−２１５、ｍｉＲ−２１５−３ｐ、ｍｉＲ−２１５−５ｐ、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−１４９−３ｐ、ｍｉＲ−１４９−５ｐ、ｍｉＲ−４２１、ｍｉＲ−４２１−３ｐ、及びｍｉＲ−４２１−５ｐのうち少なくとも１種、ならびに上掲のｍｉＲＮＡと共通のシード配列をもつｍｉＲＮＡからなる群から選択される、実施形態１、２、または３に記載の方法。
【００９２】
５．前記唾液サンプルが、脳震盪を有する疑いのあるヒト対象から採取され、前記ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−２９ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｍｉＲ−３２０ｃ、及びｍｉＲ−２２１−３ｐのうち少なくとも１種、ならびに上掲のｍｉＲＮＡと共通のシード配列をもつｍｉＲＮＡからなる群から選択される、実施形態１、２、３、または４に記載の方法。
【００９３】
６．前記唾液サンプルが、特定の時刻において前記ヒト対象から採取され、前記サンプル中のｍｉＲＮＡの前記濃度レベル（複数可）が、別途同一の条件下の同時刻に採取された唾液中の正常なｍｉＲＮＡ値と比較される、実施形態１〜５のいずれか１つの実施形態に記載の方法。
【００９４】
７．実施形態１〜５のいずれか１つに記載の方法であって、ｍｉＲＮＡの前記正常レベル（複数可）が判定された時刻とは異なる時刻で前記唾液サンプルが前記ヒト対象から採取され、ｍｉＲＮＡレベル（複数可）の日周変動もしくは概日変動を補償するように、前記唾液サンプル中で判定された前記ｍｉＲＮＡレベル（複数可）の値を調整または正規化することを更に含む、前記方法。
【００９５】
８．実施形態１〜５のいずれか１つに記載の方法であって、ｍｉＲＮＡの前記正常レベル（複数可）が判定された時刻とは異なる時刻で前記唾液サンプルが前記ヒト対象から採取され、回帰モデルもしくは他の統計分析を使用してｍｉＲＮＡレベル（複数可）の日周変動もしくは概日変動を補償するように、または年齢、性別、もしくは遺伝的バックグラウンドを補償するように、前記唾液サンプル中で判定された前記ｍｉＲＮＡレベル（複数可）の値を調整または正規化することを更に含む、前記方法。
【００９６】
９．前記唾液サンプルが、覚醒の１時間以内、歯磨きもしくは洗口の前、飲食の前、及び／または心拍数を上昇させるエクササイズの前に採取される、実施形態１〜８のいずれか１つに記載の方法。
【００９７】
１０．前記選択することが、前記ｍｉＲＮＡのうちの４種以上の異常なレベルを有する対象を選択することと、場合により、前記異常なｍｉＲＮＡレベルの、脳震盪、ｍＴＢＩ、またはＴＢＩの少なくとも１種の症状とのＰｅａｒｓｏｎ相関係数を計算することとを含む、実施形態１〜９のいずれか１つに記載の方法。
【００９８】
１１．前記選択することが、前記ｍｉＲＮＡのうちの１０種以上の異常なレベルを有する対象を選択することと、場合により、前記異常なｍｉＲＮＡレベルの、脳震盪、ｍＴＢＩ、またはＴＢＩの少なくとも１種の症状とのＰｅａｒｓｏｎ相関係数を計算することとを含む、実施形態１〜９のいずれか１つに記載の方法。
【００９９】
１２．Ｆａｌｃｏｎｉｄ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ  ＡＴＣＣ  ２５８４５、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｔ３Ｔ１、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ  ｐａｒｖｕｌａ  ＤＳＭ  ２００８、Ｍａｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｅｏｌｙｔｉｃｕｓ  ＪＳＣＣ５４０２、Ｆｕｓｏｂａｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  ｓｕｂｓｐ．ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  ２５５８６、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  ｓｕｂｓｐ．ｖｉｎｃｅｎｔｉｉ、Ｍａｓｏｎ−Ｐｆｉｚｅｒサルウイルス、Ｃａｍｐｌｙｏｂａｃｅｒ  ｈｏｍｉｎｉｓ  ＡＴＣＣ、及びＰｒｅｖｏｔｅｌｌａからなる群から選択される１種以上の唾液中微生物、またはそれらと少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、もしくは１００％同様もしくは同一のＲＮＡを有する微生物からのＲＮＡ（複数可）の発現レベルを判定することと、
前記微生物のＲＮＡの前記発現レベル（複数可）を同じ１種以上の微生物のＲＮＡの正常レベル（複数可）に対して比較することであって、前記正常（または対照）発現レベルが、ＴＢＩを有しない対象に見られるものか、ＴＢＩを有しない２名以上の対象の平均か、またはＴＢＩの１種以上の症状の出現前に前記対象において判定された濃度レベル（複数可）である、前記比較することと、
更に、前記１種以上の微生物ＲＮＡの異常な発現レベルを有する対象を、前記ＴＢＩを有するか、または有するリスクがより高いものとして選択することと
を更に含む、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載の方法。
【０１００】
ＢＬＡＳＴＮを使用すると、参照ポリヌクレオチドまたは公知のゲノム配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８７．５％、９０％、９２．５％、９５％、９７．５％、９８％、９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を特定することができる。高度に類似した配列を見出すように最適化された代表的なＢＬＡＳＴＮ設定は、１０のＥｘｐｅｃｔ  Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ及び２８のＷｏｒｄｓｉｚｅ、０のクエリ範囲内最大マッチ数、１／−２のマッチ／ミスマッチスコア、ならびにリニアギャップコストを使用する。低複雑度領域はフィルタリング／マスクされ得る。デフォルト設定は、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？ＰＲＯＧＲＡＭ＝ｂｌａｓｔｎ＆ＢＬＡＳＴ＿ＰＲＯＧＲＡＭＳ＝ｍｅｇａＢｌａｓｔ＆ＰＡＧＥ＿ＴＹＰＥ＝ＢｌａｓｔＳｅａｒｃｈ＆ＳＨＯＷ＿ＤＥＦＡＵＬＴＳ＝ｏｎ＆ＬＩＮＫ＿ＬＯＣ＝ｂｌａｓｔｈｏｍｅ（最終アクセス日２０１８年３月１９日）（参照により本明細書に組み込まれている）に記載されており、これを参照することにより組み込まれている。
【０１０１】
１３．唾液ｍｉＲＮＡレベルを判定することが、ＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡ−ｓｅｑ）によって行われる、実施形態１〜１２のいずれか１つに記載の方法。
【０１０２】
１４．前記シーケンシングデータの生リードカウントを分位数正規化し、平均センタリングし、各変数の標準偏差で除算し、サンプル間カウント変化を考慮するためにデータを正規化し、及び／または、相対発現レベル及び／または絶対発現レベルを表現するために１種以上の不変のｍｉＲＮＡの発現に対してデータを正規化し、場合により、前記正規化されたデータを更に統計的に分析する、実施形態１３に記載の方法。
【０１０３】
１５．ｍｉＲＮＡの少なくとも１種の異常なレベル及び／または異常な微生物発現レベルを有する対象を、１種以上のｍｉＲＮＡの前記少なくとも１種の異常な唾液中レベルを低下させるレジメンで処置することを更に含む、実施形態１〜１４のいずれか１つに記載の方法。
【０１０４】
１６．少なくとも２つの異なる時点で前記対象から唾液サンプルを得ることと、前記第２または後続の唾液サンプルがｍｉＲＮＡレベル（複数可）を有する場合、処置レジメンの有効性を判定することとを更に含む、実施形態１５に記載の方法。
【０１０５】
１７．脳震盪、軽度外傷性脳傷害（「ｍＴＢＩ」）を有するか、または有するリスクがより高いものとして選択された対象を、１種以上のｍｉＲＮＡの少なくとも１種の異常な唾液中レベルを低下させるレジメンで処置することを更に含み、前記レジメンが、手術療法、薬物療法、ｍｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡアンタゴニスト療法、食事もしくは栄養療法、理学療法、光線療法、精神療法、行動療法、または代替医学療法のうちの１つ以上を供与することを含む、実施形態１〜１５のいずれか１つに記載の方法。
【０１０６】
１８．ｍｉＲＮＡを検知するためのｍｉＲＮＡアッセイキットであって、
ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２３ｂ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２５、ｈｓａ−ｍｉＲ−２５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２６ａ−１、ｈｓａ−ｍｉｒ−２６ａ−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−９２ａ−１、ｈｓａ−ｍｉｒ−９２ａ−２、ｈｓａ−ｍｉｒ−１０３ａ−１、ｈｓａ−ｍｉｒ−１０３ａ−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−１５１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−１８１ａ−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２１８−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８ｆ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８ｇ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８ｉ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５３２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７７、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７４４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７３ｇ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２８５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０７４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−３１６０−１、ｈｓａ−ｍｉｒ−３６１３、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９１６、ｈｓａ−ｍｉｒ−４５３２、ｈｓａ−ｍｉｒ−５０９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６７７０−５ｐ、及び上掲のｍｉＲＮＡと共通のシード配列をもつｍｉＲＮＡからなる群から選択されるｍｉＲＮＡに相補的であるか、ないしはｍｉＲＮＡの増幅及び／または検知に好適な、１つ、２つ、またはそれ以上のプローブまたはプライマーを含み、及び／または、前記アッセイキットが、ｍｉＲ−７６９、ｍｉＲ−７６９−３ｐ、ｍｉＲ−７６９−５ｐ、ｍｉＲ−３２０ｃ−１、ｍｉＲ−３２０ｃ−１−３ｐ、ｍｉＲ−３２０ｃ−１−５ｐ、ｍｉＲ−４７９２、ｍｉＲ−４７９２−３ｐ、ｍｉＲ−４７９２−５ｐ、ｍｉＲ−１４０、ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｍｉＲ−１４０−５ｐ、ｍｉＲ−６２９、ｍｉＲ−６２９−３ｐ、ｍｉＲ−６２９−５ｐ、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１９２−３ｐ、ｍｉＲ−１９２−５ｐ、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４５−３ｐ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｌｅｔ−７ａ、ｌｅｔ−７ａ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｓ−５ｐ、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１３０７、ｍｉＲ−１３０７−３ｐ、ｍｉＲ−１３０７−５ｐ、ｍｉＲ−２００ｂ、ｍｉＲ−２００ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２００ｂ−５ｐ、ｌｅｔ−７ａ、ｌｅｔ−７ａ−３ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４５０８、ｍｉＲ−４５０８−３ｐ、ｍｉＲ−４５０８−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｂ、ｌｅｔ−７ｂ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−１９４−３ｐ、ｍｉＲ−１９４−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｆ、ｌｅｔ−７ｆ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１２８−３ｐ、ｍｉＲ−１２８−５ｐ、ｍｉＲ−２１５、ｍｉＲ−２１５−３ｐ、ｍｉＲ−２１５−５ｐ、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−１４９−３ｐ、ｍｉＲ−１４９−５ｐ、ｍｉＲ−４２１、ｍｉＲ−４２１−３ｐ、及びｍｉＲ−４２１−５ｐ、ならびに上掲のｍｉＲＮＡと共通のシード配列をもつｍｉＲＮＡのうち少なくとも１種を検知し、
前記ｍｉＲＮＡの増幅及び／または検知のための試薬と、場合により、反応基質、プラットフォーム、装置、アレイ、パッケージング材料、及び／または使用説明書とを含む、
前記アッセイキット。
【０１０７】
１９．ｍｉＲ−７６９、ｍｉＲ−７６９−３ｐ、ｍｉＲ−７６９−５ｐ、ｍｉＲ−３２０ｃ−１、ｍｉＲ−３２０ｃ−１−３ｐ、ｍｉＲ−３２０ｃ−１−５ｐ、ｍｉＲ−４７９２、ｍｉＲ−４７９２−３ｐ、ｍｉＲ−４７９２−５ｐ、ｍｉＲ−１４０、ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｍｉＲ−１４０−５ｐ、ｍｉＲ−６２９、ｍｉＲ−６２９−３ｐ、ｍｉＲ−６２９−５ｐ、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１９２−３ｐ、ｍｉＲ−１９２−５ｐ、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４５−３ｐ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｌｅｔ−７ａ、ｌｅｔ−７ａ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｓ−５ｐ、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１３０７、ｍｉＲ−１３０７−３ｐ、ｍｉＲ−１３０７−５ｐ、ｍｉＲ−２００ｂ、ｍｉＲ−２００ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２００ｂ−５ｐ、ｌｅｔ−７ａ、ｌｅｔ−７ａ−３ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４５０８、ｍｉＲ−４５０８−３ｐ、ｍｉＲ−４５０８−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｂ、ｌｅｔ−７ｂ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−１９４−３ｐ、ｍｉＲ−１９４−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｆ、ｌｅｔ−７ｆ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１２８−３ｐ、ｍｉＲ−１２８−５ｐ、ｍｉＲ−２１５、ｍｉＲ−２１５−３ｐ、ｍｉＲ−２１５−５ｐ、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−１４９−３ｐ、ｍｉＲ−１４９−５ｐ、ｍｉＲ−４２１、ｍｉＲ−４２１−３ｐ、及びｍｉＲ−４２１−５ｐ、ならびに上掲のｍｉＲＮＡと共通のシード配列をもつｍｉＲＮＡのうち少なくとも１種を検知する、ｍＴＢＩの診断または検知のための実施形態１８に記載のアッセイキット。
【０１０８】
２０．ｍｉＲ−２９ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｍｉＲ−３２０ｃ、及びｍｉＲ−２２１−３ｐ、ならびに上掲のｍｉＲＮＡと共通のシード配列をもつｍｉＲＮＡのレベルを検知する、脳震盪の診断または検知のための実施形態１８に記載のアッセイキット。
【０１０９】
２１．ヒト唾液中の濃度が日周リズムまたは概日リズムに従って変動するｍｉＲＮＡを特定するための方法であって、
（ａ）２４時間中の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上の時点または間隔において１名以上の対象から唾液サンプルを収集することと、
（ｂ）前記サンプル中のｍｉＲＮＡをシーケンシングすることと、
（ｃ）ｍｉＲＮＡ毎のシーケンシングリードをカウントし、配列リードデータを正規化し、正規化された配列リードカウントを異なる時点で採取された唾液サンプル間で比較することにより、差次的に発現されるｍｉＲＮＡを特定することと、
（ｄ）ハウスキーピング遺伝子もしくはｍｉＲＮＡ（２４時間にわたって不変の発現を呈する）のＲＮＡ発現、または２種以上のハウスキーピング遺伝子からの平均ＲＮＡ発現に対して、配列リードデータを正規化することと、
（ｅ）異なる時点または間隔で得た、正規化されたＲＮＡ発現データに対して、多変数回帰分析または他の統計分析を行うことと、
（ｆ）場合により、唾液中に見られる１種以上のｍｉＲＮＡの濃度レベルを表す取得データについて、Ｐｅａｒｓｏｎ相関係数を計算することと、
（ｇ）日周リズムまたは概日リズムに従って変動する発現レベルを有する１種以上のｍｉＲＮＡを選択することと、
（ｈ）場合により、ＤＩＡＮＡ  ｍｉＲｐａｔｈまたは他のソフトウェアを使用して、ｍｉＲＮＡの標的遺伝子を判定することと
を含む、前記方法。
【０１１０】
本発明を大まかに説明したが、ある特定の具体例を参照することにより、更なる理解を得ることができる。これらの具体例は、本明細書において説明のみを目的として提示されるものであり、別途規定されない限り限定を意図するものではない。
【実施例】
【０１１１】
実施例１
小児脳震盪
小児脳震盪の正確かつ生理的に関連性のあるマーカーとしてのｍｉＲＮＡの循環濃度の有用性を評価するため、本発明者らは、小児期ＴＢＩ後の唾液のｍｉＲＮＡ及び脳脊髄液（ＣＳＦ）のｍｉＲＮＡにおける変化を比較した。略語：曲線下面積（ＡＵＣ）；中枢神経系（ＣＮＳ）；脳脊髄液（ＣＳＦ）；脳室外ドレーン（ＥＶＤ）；グラスゴー昏睡スコア（ＧＣＳ）；マイクロリボ核酸（ｍｉＲＮＡ）；軽度外傷性脳傷害（ｍＴＢＩ）；受信者動作特性（ＲＯＣ）；重度外傷性脳傷害（ｓＴＢＩ）。
【０１１２】
研究デザイン。ケース−コホートデザインを使用して、重度ＴＢＩを有する７名の子供のＣＳＦ中の長期的なｍｉＲＮＡ濃度を、ＴＢＩのない３名の対照と比較した。ＣＳＦ中で「変化した」ｍｉＲＮＡを、軽度ＴＢＩを有する６０名の子供の唾液中で調べ、１８名の同齢及び同性の対照と比較した。多変数回帰技術を使用して、ＣＳＦ及び唾液中で平行した変化（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定）があったｍｉＲＮＡのＴＢＩステータス予測精度を調べた。Ｓｐｅａｒｍａｎ順位相関を用い、目的のｍｉＲＮＡと臨床的特徴との間の相関性を精査した。ＤＩＡＮＡ  ｍｉｒＰａｔｈソフトウェアを用いた機能分析により、関連するｍＲＮＡ標的／経路が特定された。
【０１１３】
結果。本明細書において示すように、唾液ｍｉＲＮＡは、小児ＴＢＩを特定するための、容易に測定され、生理的に関連性があり、かつ正確なバイオマーカーである。ＣＳＦ中では２１４種のｍｉＲＮＡが検知され、１３５種（６３％）は唾液中にも存在した。６種のｍｉＲＮＡは、ＣＳＦ及び唾液の両方で平行して変化した（ｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｍｉｒ−２６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３２０ｃ、ｍｉＲ−２９ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ）。これら６種のｍｉＲＮＡは、小児対象の軽度ＴＢＩステータスの特定に関し、０．８５２の曲線下面積を示した。これらのｍｉＲＮＡのうち３種（ｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−３２０ｃ）は、ＴＢＩ後のＣＳＦ及び／または唾液中で長期的傾向を呈し、３種全てが神経発達に関するｍＲＮＡを標的とした。ｍｉＲ−３２０ｃの濃度は、子供（Ｒ＝０．３６、ＦＤＲ＝０．０２）及び親（Ｒ＝０．３７、ＦＤＲ＝０．００３）両方によるスポーツ脳震盪評価ツール３の注意困難の報告と直接相関した。
【０１１４】
ｓＴＢＩの募集及びサンプル収集。ｓＴＢＩを有する子供及び青年のＦ２−イソプロスタンレベルに関する研究（Ｖａｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）で過去に収集されたＣＳＦサンプルを、ＣＳＦ  ｍｉＲＮＡの長期的特性評価のために用いた。簡潔に述べると、ｓＴＢＩを有する８名の子供から収集された脳室ＣＳＦサンプルを、今回の研究のためにランダムに選択した。サンプルの選択バイアスを除去するため、サンプル選択前に参加者の特性を研究者らに対して盲検化した。選択されたコホートには、ｓＴＢＩ後の頭蓋内圧上昇について脳室外ドレーン（ＥＶＤ）が臨床適応されたグラスゴー昏睡スコア（ＧＣＳ）＜８を有する４〜１７歳の子供が含まれた。受傷機転は、転倒及び自動車衝突を含んだ。ＣＳＦは、傷害後１日目、４〜７日目、及び８〜１７日目の３つの時点で各対象のＥＶＤから無菌様式で受動的に抽出した。各対象について、年齢、性別、受傷機転、及び収集時間を記録した（表１）。対照ＣＳＦには、てんかんのために臨床適応された脊椎穿刺を受けたか、または敗血症除外（ｒｕｌｅ−ｏｕｔ−ｓｅｐｓｉｓ）プロトコールの一環として脊椎穿刺を受けた３名の対象（１〜８歳）から得た１２個のサンプルが含まれた。
【表１】
2020512017.tif 000003
【０１１５】
ｍＴＢＩの募集及びサンプル収集
ｍＴＢＩの臨床診断ありまたはなしの対象（５〜２１歳）において、今回の研究の一環として得た唾液ｍｉＲＮＡプロファイルを精査した。ｍＴＢＩコホートには、初回傷害の１４日以内にｍＴＢＩの評価のために医療センターを訪れた６１名の子供及び青年が含まれた。１４日のカットオフは、ほとんどの臨床症状及びバイオマーカープロファイルが脳震盪の２週間以内にベースラインに戻ると示唆した過去の調査（Ｙｏｋｏｂｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）に基づいて選択した。ｍＴＢＩ群の除外基準は、ＧＣＳ＜１２、重度ＴＢＩの臨床診断、穿通性頭部傷害、頭蓋骨骨折、頭蓋内出血、または潜在する心理的障害（例えば抑うつまたは不安）に起因し得る症状を含んだ。対照コホートには、定期的に予定された小児科検診のために小児科医院を訪れた１９名の子供及び青年が含まれた。この群の除外基準は、脳震盪の既往歴、継続中のリウマチ状態、または直近の整形外科的傷害を含んだ。歯周病、上気道感染症、発作性障害、知的障害、片頭痛歴、または薬物／アルコール使用障害のある対象は両群から除外した。唾液サンプルは、登録時に非絶食状態の各参加者に、水道水で口をゆすぎＯｒａｇｅｎｅ  ＲＥ−１００唾液収集キット（ＤＮＡ  Ｇｅｎｏｔｅｋ；Ｏｔｔａｗａ，Ｃａｎａｄａ）に喀痰させて収集した。サンプルを５〜１０回手で振盪し、４℃の冷蔵庫に移す前に室温で最長１０日間保管した。年齢、性別、人種／民族性、身長、体重、食事制限、医療歴、選択的セロトニン再取り込み阻害薬の使用、アレルギー、薬物、及び中咽頭のステータス（表２Ａ〜Ｂ）をはじめとする医学的及び人口学的情報を、ｍＴＢＩ及び対照参加者の両方から収集した。ｍＴＢＩコホートは、脳震盪の既往歴、現在の脳震盪の詳細（傷害後の日数、機転、関連する嘔吐、脱力感、記憶喪失、骨折、または意識消失）、及び最後に鎮痛薬（非ステロイド性抗炎症薬またはアセトアミノフェン）を使用した時間についても報告した。最後に、ｍＴＢＩ対象及びその親／保護者が、小児スポーツ脳震盪評価ツール（ＳＣＡＴ−３）を使用した震盪性症状の調査表に記入した。
【表２】
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【０１１６】
ＲＮＡのプロセシング及び定量化
過去に報告されているように（Ｘｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）、Ｎｏｒｇｅｎ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｅｘｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｎｏｒｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｋ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）を製造元の説明に従って使用して、唾液及びＣＳＦサンプルからＲＮＡを抽出した。最終的なＲＮＡ濃度をＮａｎｏｄｒｏｐ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｍｅｔｅｒで定量化し、抽出したＲＮＡをシーケンシングする前に−８０℃で保管した。ライブラリー構築の前にＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いてＲＮＡの収率及び品質を評価した。唾液ＲＮＡのシーケンシングは、ＮＥＸＴｆｌｅｘ（登録商標）Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ  Ｋｉｔ  ｖ３（Ｂｉｏｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘａｓ）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ（登録商標）２５００  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、及び１サンプル当たり３００万リードの標的深度を使用して行った。ＣＳＦ  ＲＮＡサンプルのシーケンシングは、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＳＵＮＹ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｃｏｒｅにて、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＴｒｕＳｅｑ  Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐプロトコール（Ｉｌｌｕｍｉｎａ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ機器、及び１サンプル当たり３００万リードの標的深度を使用して行った。Ｐａｒｔｅｋ  Ｆｌｏｗ（Ｐａｒｔｅｋ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）でＳＨＲｉＭＰ２アライナを使用し、リードをヒトゲノムのｈｇ３８ビルドにアラインメントした。ｍｉＲＢａｓｅ  ｍａｔｕｒｅ−ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｖ２１を用い、各サンプル中の全ｍｉＲＮＡカウントを定量化した。全カウントが５×１０３未満であった唾液サンプルを最終分析から除外し、結果として６０個のｍＴＢＩ唾液サンプル及び１８個の対照唾液サンプルを得た。ＣＳＦ及び唾液のそれぞれで、少なくとも２５％のサンプルにおいて生リードカウントが１０超であったｍｉＲＮＡのみを、差次的発現分析において評価した。また、ｓＴＢＩ  ＣＳＦサンプルの２５％に存在し、対照ＣＳＦサンプルのいずれにも存在しなかったｍｉＲＮＡを、「上方調節された」ｍｉＲＮＡとして精査した。統計分析の前に、リードカウントの和の正規化を行い、平均センタリングし、各変数の標準偏差で除算した。「リード」または「リードカウント」という用語は、例えば、サンプル中の全てのｍｉＲＮＡのレベルをより正確に比較することができるように、予測可能なレベルで唾液中に常に存在するある特定の対照ｍｉＲＮＡまたは代謝物の発現レベルを使用してそれらを正規化することなど、サンプル間の変化を考慮するためにｍｉＲＮＡまたはマイクロバイオームの発現データを調整するための任意の方法に適用されるものと理解されたい。
【０１１７】
代替的な実施形態では、ｍｉＲＮＡ及び／またはマイクロバイオームのレベルを判定するために、蛍光を用いる方法を使用してもよい。一例では、リガンドを基質上にまとめて固定してもよい。標的ｍｉＲＮＡ及びマイクロバイオーム配列には、リガンドに結合する前または後のいずれかで、蛍光タグ（または非蛍光色素）をタグ付けすることができる。この用途では、各リガンド群における相対強度が、存在するｍｉＲＮＡ及び／またはマイクロバイオームの量の尺度になり得る。この方法は、チップタイプのアッセイで実施してもよい。当業者には、ｍｉＲＮＡ及び／またはマイクロバイオームのレベルを判定するために、他の好適なチップタイプのアッセイを使用してもよいことが認識されよう。更に別の実施形態では、等温増幅を使用してｍｉＲＮＡレベルを検知してもよい。
【０１１８】
図５は、脳脊髄液ＲＮＡの品質分析を示す。Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ＲＮＡ  Ｎａｎｏｃｈｉｐを使用し、抽出したＲＮＡを検査したところ、脳脊髄液サンプル中で比較的低いＲＮＡ収率が示されたが、ピークは１８〜２５ヌクレオチドで一貫していた（ｍｉＲＮＡ抽出の成功と一致する）。
【０１１９】
統計分析。次の３ステップの工程を使用し、脳震盪バイオマーカーとしての生理的関連性が最も高いｍｉＲＮＡを特定した。１）Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ  Ｈｏｃｈｂｅｒｇの誤検知率（ＦＤＲ）補正を用いたノンパラメトリックＷｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定により、ｓＴＢＩ  ＣＳＦサンプル中にのみ存在するｍｉＲＮＡ、またはｓＴＢＩ  ＣＳＦ中の濃度（１００万当たりのリード数；ＲＰＭとして測定）が「変化した」ｍｉＲＮＡを特定した。２）Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定を使用し、ｍＴＢＩ唾液サンプル中の（対照唾液と比較した）これらのｍｉＲＮＡ標的の濃度（ＲＰＭ）を精査した。３）ＣＳＦ及び唾液両方のＴＢＩサンプル中で「変化した」ｍｉＲＮＡを、対照に対して平行した上方調節または下方調節について調査した（図１）。Ｓｐｅａｒｍａｎの順位相関メトリック（ｍｉＲＮＡ濃度を傷害後の日数と相関付ける）を使用して、ＣＳＦ及び唾液両方の脳震盪サンプルにおける目的のｍｉＲＮＡの長期的傾向を検査した。これらのバイオマーカー候補の診断精度を多変数ロジスティック回帰分析で評価し、結果を受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線で可視化した。データセットの「オーバーモデリング」を避け、ｍｉＲＮＡバイオマーカーが対照とｍＴＢＩ対象とを正確に差別するのを確実にするために、Ｍｅｔａｂｏａｎａｌｙｓｔソフトウェアの１／４サンプルホールドアウトプロシージャと共に１００重Ｍｏｎｔｅ−Ｃａｒｌｏ交差検証（ＭＣＣＶ）技術を用いる二次的アプローチを採った（Ｘｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。Ｓｐｅａｒｍａｎの順位相関を用い、医学的／人口学的特性と目的の唾液ｍｉＲＮＡとの関係を調査した。両側スチューデントｔ検定により、ｍＴＢＩ群及び対照群間の医学的データ及び人口学的データの分析を達成した。
【０１２０】
機能分析。ｍＴＢＩのｍｉＲＮＡバイオマーカーを、ｍｉｃｒｏＴ−ＣＤＳアルゴリズムを使用したＤＩＡＮＡ  ｍｉｒＰａｔｈ  ｖ３オンラインソフトウェア（Ｈｙｐｅｒｔｅｘｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ（ＨＴＴＰ）：／／ｓｎｆ−５１５７８８．ｖｍ．ｏｋｅａｎｏｓ．ｇｒｎｅｔ．ｇｒ／）の機能予測分析にかけ、種特異的なｍＲＮＡ標的を特定した（Ｖｌａｃｈｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。ＤＩＡＮＡ（登録商標）ｍｉｒＰａｔｈは、Ｆｉｓｈｅｒ直接検定を使用して有意に（ＦＤＲ＜０．０５）標的が濃縮されたジーンオントロジー（ＧＯ）カテゴリーを特定した。Ｓｔｒｉｎｇ  ｖ１０ソフトウェア（Ｈｙｐｅｒｔｅｘｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ（ＨＴＴＰ）：／／ｓｔｒｉｎｇ−ｄｂ．ｏｒｇ）の中ストリンジェンシー設定（相互作用スコア＞０．４０）を使用し、高信頼度のｍＲＮＡ標的（ｍｉｃｒｏＴ−ＣＤＳスコア≧０．９９）のリストをタンパク質間相互作用ネットワークについて調べた（Ｓｚｋｌａｒｃｚｙｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。
【０１２１】
ｍｉＲＮＡバイオマーカーにおける時間的変化の考慮。ある実施形態では、エピジェネティックデータ（例えば、エピジェネティックシーケンシングデータ）が時間的変化を含み得る（例えば、データが正弦周期または概日周期中に変動し得る）ため、対象が外傷性脳傷害を経験したかどうかを判定したり、傷害の重症度もしくは予後を検知したり、または外傷性脳傷害に起因する病状の変化が起こったかどうかを検知したりするために分析を行う前に、エピジェネティックデータが時刻に基づいて正規化され得る。一例では、ｍｉＲＮＡの量／レベルが、ヒト／対象におけるｍｉＲＮＡの量／レベルに自然発生する変化を考慮するために、時刻に基づいて正規化され得る。時刻正規化されたｍｉＲＮＡの量は、ヒト／対象が外傷性脳傷害またはその病状における変化を有するかどうかを判定するために、対照／健康な参照対象または対照／健康な対象のコンペンディアと比較され得る。エピジェネティックデータを正規化するためのシステム及び方法の更なる詳解は、参照により全体が本明細書に組み込まれている２０１７年３月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／４７５，７０５号に見ることができる。
【０１２２】
医学的特性及び人口学的特性。ｍＴＢＩ群と対照群との間で、参加者の年齢（ｐ＝０．４８）、性別（ｐ＝０．２７）、または人種／民族性（白人の％；ｐ＝０．７０）の有意差はなかった（表２）。食物／薬物アレルギー（ｐ＝０．６３）、食事制限（ｐ＝０．７９）、または抗うつ薬（ｐ＝０．８８）のある参加者のパーセンテージに差はなかった。ｍＴＢＩ群は有意に身長が高く（ｐ＝０．００２）、唾液収集前の６時間以内により高い頻度で非ステロイド性抗炎症薬（ｐ＝０．００１）、及びアセトアミノフェン（ｐ＝０．００３）を用いていた。ｍＴＢＩ群及び対照群の平均収集時間は、それぞれ１３：００及び１３：３０であった（ｐ＝０．４３）。ｍＴＢＩ参加者の唾液収集は、平均して脳震盪の６．５日後に行われた。この群で最も一般的な受傷機転には、スポーツ関連傷害（５９％）、自動車事故（１８％）、及び転倒（１６％）が含まれた。ｍＴＢＩ群内の脳震盪後の症状には、意識消失（２５％）、嘔吐（２１％）、脱力感（３１％）、及び記憶消失（４４％）が含まれた。ｍＴＢＩ参加者の平均ＳＣＡＴ３スコアは、子供の報告で２３．７、親の報告で２１．８であり、参加者１名当たり平均して１１種の症状からなっていた。ｍＴＢＩ参加者の６６％では症状が４週間を超えて続き、４３％は脳震盪の既往歴を報告した。
【０１２３】
重度ＴＢＩ（ｓＴＢＩ）におけるＣＳＦ  ｍｉＲＮＡ。ｓＴＢＩ後のＣＳＦ（１サンプル当たりのアラインメントされたｍｉＲＮＡリード数平均＝５６５，８０５）では、対照のＣＳＦ（１サンプル当たりのアラインメントされたリード数２２，８８５）と比べてよりロバストなｍｉＲＮＡ発現があった。調べた２８１３種の成熟ヒトｍｉＲＮＡのうち、２１４種（７．６％）がＣＳＦサンプル中に存在した（表３）。１１４種のｍｉＲＮＡの発現には名目上の差（ｐ＜０．０５）があり、８６種はｓＴＢＩ群と対照群との間で有意な変化（ＦＤＲ＜０．０５）があった。ｓＴＢＩにおいて７２種は下方調節され、４２種は上方調節された。
【表３】
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【０１２４】
軽度ＴＢＩ（ｍＴＢＩ）における唾液ｍｉＲＮＡ。対照とｍＴＢＩサンプルとの両方でロバストに発現した唾液ｍｉＲＮＡは２１４種あった（表４）。唾液中で測定されたｍｉＲＮＡのうち４０種には、正規化されたリードカウントに名目上の差があり、１０種には対照群とｍＴＢＩ群との間で有意差があった。９種のｍｉＲＮＡはｍＴＢＩ唾液中で下方調節され、３１種は上方調節された。
【表４】
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【０１２５】
ＣＳＦ及び唾液ｍｉＲＮＡの複合分析。ＣＳＦ中で検知された２１４種のｍｉＲＮＡのうち、１３５種（６３％）は唾液中にも存在した。ｓＴＢＩ対象のＣＳＦ中で名目上の変化があった１１４種のｍｉＲＮＡのうち、６４種（５６％）は唾液中に存在し、１０種（８．７％）はｍＴＢＩ群において名目上の差を示した。これら１０種のｍｉＲＮＡのうち６種は、過去の脳震盪研究（Ｒｅｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０、Ｂｈｏｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６、Ｍｉｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）において報告されている。これらのｍｉＲＮＡうち、重複するシード配列を有するものはない。１０種の重複するｍｉＲＮＡのうち６種は、唾液及びＣＳＦ両方のＴＢＩサンプル中で同じ方向に変化していた（表５）。４種は下方調節され（ｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｍｉｒ−２６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３２０ｃ）、２種（ｍｉＲ−２９ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ）は上方調節された（図２Ａ〜２Ｌ）。
【表５】
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矢印は、ＴＢＩサンプル中の変化の方向を示す。
【０１２６】
ｍｉＲＮＡバイオマーカーパネルの予測精度。ｍＴＢＩ及び対照の唾液サンプルを差別するランダムフォレスト多変数回帰分析で使用したとき、６種のｍｉＲＮＡは０．８５２の合計曲線下面積（ＡＵＣ）を有した（図３Ａ）。アルゴリズムは２／１８の対照対象及び１５／６０のｍＴＢＩ対象を誤分類し（図３Ｂ）、７５％の感度及び８９％の特異度をもたらし、精度は７８％であった。サンプルの２５％をランダムにホールドアウトした１００重交差検証工程では、交差検証セットでは０．８００のＡＵＣ、そしてホールドアウトセットでは０．９１７のＡＵＣで、このモデルの妥当性が立証された（図３Ｃ）。
【０１２７】
脳震盪関連ｍｉＲＮＡにおける長期的変化。ＣＳＦ及び唾液サンプル中で平行して変化した６種のｍｉＲＮＡを、脳震盪後の長期的傾向について調べた。ＣＳＦ及び唾液サンプルの両方について、ｍｉＲＮＡ濃度と傷害からの時間（日数）との間のＳｐｅａｒｍａｎ順位相関を求めた（表６）。
【表６】
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【０１２８】
６種のｍｉＲＮＡのうち３種は、ＣＳＦ及び唾液中で平行した相関性を示した。ｍｉＲ−２９ｃ−３ｐ及びｍｉＲ−１８２−５ｐの相対濃度（ＲＰＭ）は、ＣＳＦ及び唾液の両方で経時的に低下する傾向を示した。ｍｉＲ−３２０ｃの相対濃度は、両方の生体液中で経時的に上昇する傾向を示した。この傾向は、ｍｉＲ−３２０ｃについてはＣＳＦ及び唾液の両方で、そしてｍｉＲ−２９ｃ−３ｐについては唾液中で有意であった（ＦＤＲ＜０．０５）。
【０１２９】
機能分析。ｍＴＢＩステータスの予測有用性がある６種のｍｉＲＮＡは、予測された高信頼度の７００種のｍＲＮＡ標的を有し、このうち３５４種は実験的に検証されたものだった（表７）。
【表７】
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【０１３０】
上記表中のデータにより、当業者は、本明細書において開示される方法に好適な特定のｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡのサブセットを選択することができるであろう。
【０１３１】
２種以上のｍｉＲＮＡの標的となったｍＲＮＡは３４種あった。７００種のｍＲＮＡ標的は、３０のＧＯカテゴリーと有意な関連性を有した（表８）。注目すべきことに、４種のｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、及びｍｉＲ−３２０ｃ）の標的となる３７種の遺伝子を含む経路である神経系の発達に関連するｍＲＮＡ標的について、有意な濃縮が示された（ｐ＝２．６７Ｅ−０７）。Ｓｔｒｉｎｇ  ｖ１０において最も信頼度の高いｍＲＮＡ標的（ｍｉｃｒｏＴ−ＣＤＳスコア≧０．９９９）の２８０種について、タンパク質間相互作用ネットワークが定義された。この分析は、０．７７５のクラスタリング係数で、２６９のノード及び２４７のエッジを含有する有意なタンパク質間相互作用ネットワーク（ｐ＜０．０００１）を特定した（図３０）。このネットワークの分析により、神経系の発達（６１遺伝子；ｐ＝８．５６Ｅ−０９）、ニューロン発達（２９遺伝子；ｐ＝８．４５Ｅ−０５）、及び軸索発達（２１遺伝子；ｐ＝４．８９Ｅ−０４）を含め、有意な濃縮を示す６７種の生物学的プロセスが特定された（表８Ｂ）。
【表８】
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【表９】
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【０１３２】
医学的特性と唾液ｍｉＲＮＡとの間の関係
目的の６種の唾液ｍｉＲＮＡの、子供のＳＣＡＴ３スコア、親のＳＣＡＴ３スコア、及び医学的／人口学的因子との相関性を探求した（図４Ａ〜Ｃ）。子供の報告によるＳＣＡＴ−３評価と、ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ及びｍｉＲ−３２０ｃの唾液中濃度との間には、有意な相関性があった（表１０Ａ）。ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐのレベルは「かなり疲れる」及び「すぐに疲れる」の報告と逆相関しており、一方ｍｉＲ−３２０ｃのレベルは、「白昼夢をよくみる」及び「混乱する」の報告と直接相関していた。また、ｍｉＲ−３２０ｃと、「注意力の持続が困難」及び「すぐに気が散る」を含む親の報告によるＳＣＡＴ−３評価との間にも、有意な直接相関性があった（表１０Ｂ）。女性と、ｍｉＲ−１８２−５ｐ及びｍｉＲ−２２１−３ｐの唾液中濃度との間には、名目上の相関性があった（表１０Ｃ）。しかしながら、目的の６種のｍｉＲＮＡと、参加者の年齢、民族性、体重、身長、抗うつ薬の使用、または食事制限を含む他の医学的／人口学的特性との間には、有意な相関性は見られなかった。また、６種のｍｉＲＮＡの濃度とスポーツ中の骨折または脳震盪との間にも相関性はなかった。
【表１０】
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【０１３３】
ＣＳＦ中に見られたｍｉＲＮＡの５０％超は唾液中にも見られ、約１０％は震盪性頭部外傷後に平行した変化を示した。これらのｍｉＲＮＡのうち６種の唾液中濃度は脳震盪ステータスを予測し、５種は成人ヒト血清の過去の研究において説明されている。重要なことに、これら６種のｍｉＲＮＡは、骨損傷、スポーツ参加、または参加者の人口学的特性との相関性を有しなかった。これらはまた、神経発達に関連するｍＲＮＡ標的の著しい濃縮も示した。これらの因子は、収集及び定量化の容易さと相まって、唾液ｍｉＲＮＡを脳震盪評価の理想的な基質とする。
【０１３４】
可能性のある脳関連ｍｉＲＮＡの唾液による輸送機構。血液ベースのアッセイが主に用いられる医学界において、唾液のサンプリングが脳への窓口になるという考えは理解し難いかもしれない。しかしながら、医学的検査の圧倒的多数が口内の酵素環境において容易に分解されるタンパク質の測定に依存することを想起されたい。それに比べ、ｍｉＲＮＡはその短い一本鎖構造のため、酵素分解に比較的抵抗性がある（Ｇｉｌａｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００８７）。またｍｉＲＮＡは通常、細胞外輸送中に微小胞またはタンパク質結合機構によって保護される（Ｖａｌａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。これらの要素は、健康な対象における唾液ｍｉＲＮＡシグネチャーの経時的な安定性及び再現性の主な原因である（Ｂａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。これらはまた、脳関連ｍｉＲＮＡがどのように唾液に移動するかを説明するのに役立つ。エキソソームによるｍｉＲＮＡの輸送は、中咽頭を神経支配する脳神経（舌咽神経、顔面神経、迷走神経、及び三叉神経）から直接生じる場合もあれば（Ｍａｊｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）、唾液腺内の特殊化した細胞による血液からの抽出によって間接的に生じる場合もある（Ｂａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。この後者の機構は、なぜ血中に見られるペプチド及び脂質の多くが唾液中にも存在するのか（Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）、そしてなぜ今回の研究において、脳震盪の血清ベースのｍｉＲＮＡバイオマーカーと、唾液中で検知されるものとの間で、かように高度な重複が見られるのかを部分的に示す。脳神経の髄鞘内の動脈周囲組織及び嗅球によるＣＳＦの代謝回転の調節を助けるグリンパティック系は、脳関連分子が末梢循環に入る主要ルートを表す（Ｐｌｏｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。これらの構造が中咽頭に近接していることを考えると、グリンパティック系が脳関連ｍｉＲＮＡの唾液への輸送にも関与している可能性は高いと思われる。
【０１３５】
外傷性脳傷害への生理的応答におけるｍｉＲＮＡの役割。今回の調査で特定された６種のｍｉＲＮＡは、単に脳震盪の存在または非存在と相関しているだけではない。これらはまた、外傷性脳傷害に対する生理的応答と神経生物学的に関係している。例えばｍｉＲ−３２０ｃは、ｓＴＢＩ対象のＣＳＦ及びｍＴＢＩ対象の唾液中で下方調節される。両方の生体液中のｍｉＲ−３２０ｃの濃度は、傷害後の時間と直接相関している（すなわち、経時的にベースラインに戻る）。ＭｉＲ−３２０ｃは、可塑性、気分、及び概日リズムを含む神経系機能に重要ないくつかの経路に関係している。
【０１３６】
ｍｉＲ−３２０ｃの１つのｍＲＮＡ標的は、神経興奮中に動的に発現され神経可塑性を調節する可塑性関連遺伝子ファミリーのメンバーである、ＬＰＰＲ１（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｒｅｌａｔｅｄ  １）である（Ｓａｖａｓｋａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。可塑性関連遺伝子は注意欠陥に関係しており、今回の調査においてｍｉＲ−３２０ｃの濃度は、子供による白日夢の増加の報告及び親による子供の注意散漫の報告と直接相関していた。ｍｉＲ−３２０レベルのベースラインへの長期的回復は、これらの症状を軽減し得る。その一方で、ｍｉＲ−３２０ｃの無制限の増加は、脳震盪後症候群において一般的に報告される気分調節不全につながり得る。この考えは、ｍｉＲ−３２０ｃの著しい増加が見られた自殺完遂後の成人の前脳におけるｍｉＲＮＡ発現の研究（Ｌｏｐｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）によって裏付けられる。
【０１３７】
脳震盪管理への影響。この調査で特定された唾液ｍｉＲＮＡは、小児脳震盪の診断及び管理に応用される可能性がある。このパネルは、ＭＲＩ造影アプローチよりも安価であり、血清サンプルよりも容易に得られ、かつ主観的な脳震盪調査を行いスコアリングするよりも時間のかからない、脳傷害の客観的尺度を提供する。ｍｉＲＮＡシグネチャーは傷害の約２週間後まで上昇したままであり、その間にベースラインに向かう傾向を示すため、救急診療所の初診時または救急科環境だけでなく、脳震盪の専門医によるフォローアップ診察時にも臨床応用性を有する。ｍｉＲＮＡ濃度における長期的傾向は、専門医の紹介の優先順位を決定したり、個人に合わせた医学療法を開始したり、療法への臨床応答を追跡したりするための潜在的有用性を有する。この調査で特定されたｍｉＲＮＡのパネルは、７８名中１７名の対象のみを誤分類した。誤分類された対照には、抗うつ薬及び非ステロイド性抗炎症薬を服用していた食物アレルギー及び１型真性糖尿病のある１名の対象、ならびに特定可能な医学的状態がなかった１名の対象が含まれた。１５名の誤分類されたｍＴＢＩ対象は、脳震盪の既往歴（ｎ＝５）、脱力感（ｎ＝３）、嘔吐（ｎ＝３）、近視（ｎ＝３）、及び抗炎症薬の使用（ｎ＝６）によって特徴付けられた。したがって、これらの因子の唾液ｍｉＲＮＡとの関係を調べるには今後の調査が必要である。
【０１３８】
ｍｉＲＮＡの表１１は、患者／対象の外傷性脳傷害を特定及び／または特性評価するのに使用され得る６８種のｍｉＲＮＡのリストである。患者／対象の外傷性脳傷害を特定及び／または特性評価するには、表１のｍｉＲＮＡのいずれかと同じシード配列を共有するｍｉＲＮＡを使用してもよい。
【表１１】
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【０１３９】
この調査では、ｓＴＢＩにおけるＣＳＦパターンを反映し、ｍＴＢＩステータスの診断精度を示す、ｍＴＢＩにおいて変化した６種の唾液ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｍｉｒ−２６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３２０ｃ、ｍｉＲ−２９ｃ−３ｐ、及びｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ）が特定された。これら６種のｍｉＲＮＡは神経発達に機能的に関連しており、脳震盪症状の報告との興味深い相関性を示す。いくつかは成人の脳震盪に関する過去の血清研究において特定されているが、ここで本発明者らは、それらが唾液中で容易に測定され、傷害後最長２週間にわたって持続する異常調節を呈することを示す。
【０１４０】
実施例２
成人総合格闘技選手におけるｍＴＢＩの特定及び特性評価のための血清及び唾液ｍｉＲＮＡの比較。
この研究における本発明者らの目的は、軽度頭部外傷を受けたばかりの成人対象において、血液及び唾液中のｍｉＲＮＡの末梢測定値と、バランス及び認知機能の客観的尺度との関係を判定し、特定されたｍｉＲＮＡのいずれかが、脳機能及び傷害応答に関連する特定の生物学的経路に関与しているかどうかを調査し、ｍｉＲＮＡと機能的尺度との間の関係の強固性を定量化し、それらの潜在的な診断有用性を判定することであった。
【０１４１】
対象。ヒト対象の使用に関するプロトコールは全て、ＳＵＮＹ  Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの機関審査委員会によって審査され認可された。研究登録及びサンプル収集前に全てのヒト対象から書面による同意を得た。対象はその参加に対して金銭的補償を受けた。８５の唾液サンプル及び１３１の血清サンプルを含む合計２１６個のサンプルを５０名のＭＭＡ選手（４２名のユニーク選手、８名のリピート選手）から収集した。サンプルは、試合の１週間前または１時間前の時点、及び次の４つの試合後の時点：試合直後（１５〜３０分）、２〜３日後、１週間後、及び３週間以上後のうちの１つ以上で収集した（表１２）。各ＭＭＡ試合は、選手がノックアウトされるか、または降参により試合放棄した場合を除き、各３分間のラウンド３回からなった。訓練を受けた瀉血専門医により、その場で無菌のＢＤ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ  ＳＳＴ管（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）に採血を行い、２０分間静置し、製造元の説明に従って遠心分離した。唾液は、Ｏｒａｇｅｎｅ  ＲＮＡ収集バイアル（ＲＥ−１００、ＤＮＡＧｅｎｏｔｅｋ，Ｏｔｔａｗａ，ＯＮ）への喀痰、またはＯｒａｇｅｎｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ  Ｋｉｔスワブ（Ｐ−１５７、ＤＮＡＧｅｎｏｔｅｋ，Ｏｔｔａｗａ，ＯＮ）を使用したスワブ吸収により収集した。
【０１４２】
ＭＭＡ対象には４０名の男性及び２名の女性が含まれ、平均年齢は２６．５歳、平均ＢＭＩは２４．６であった。対象の２／３（６６％）はコーカサス人種、１７％はアフリカ系アメリカ人、１４％はラテンアメリカ系であると自己申告した。選手のうち合計２９％は、合併症のない脳震盪の既往歴も報告した。試合前及び試合後のｍＴＢＩのタンパク質バイオマーカーにおける潜在的変化を評価するため、これらの選手のサブセットから得た血清サンプルを使用した。これらのサンプルは、１８〜４２歳（平均２４．９歳）で平均ＢＭＩが２３．４である２４名の選手（男性２３名）から得た。対象のうち１名は過去に聴力損失の記録があり、５名は単回の脳震盪の既往歴を有した（合併症なし）。選手の過半数（５７％）はコーカサス人種であり、２０％はアフリカ系アメリカ人であり、２０％はラテンアメリカ系であった。
【表１２】
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【０１４３】
血清中のタンパク質バイオマーカー。選手のサブセット（ｎ＝２４）について、ＥＬＩＳＡまたはＬｕｍｉｎｅｘプラットフォームを使用した既存の文献（重度ＴＢＩ症例または動物モデルに焦点を当てたものが多い）に基づくＴＢＩのタンパク質バイオマーカー候補のいくつかの発現を調査した。両方のアッセイで同じ血清のアリコートを使用した。これは、表１２に示した時点で収集し、後続処理のために−８０℃で保管した。
【０１４４】
Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイ：カスタムの８−ｐｌｅｘ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｐａｎｅｌ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ；カタログ番号ＬＸＳＡＨＭ）を使用し、製造元のプロトコールに従って血清サンプル中のＢＤＮＦ、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＣＲＰ、ＩＣＡＭ１、ＩＬ−６、ＮＳＥ２、Ｓ１００Ｂ、及びＶＣＡＭの発現レベルをアッセイした。各分析物の感度限界はそれぞれ、０．３２、９．９、１１６、１４０、８７．９、１．７、４．３４、及び２３８ｐｇ／ｍＬであった。Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｂｉｏｐｌｅｘ（登録商標）２００  Ｓｙｓｔｅｍでサンプルの蛍光を読み取り、Ｂｉｏｐｌｅｘ（登録商標）Ｍａｎａｇｅｒ  ６．１ソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して分析した。
【０１４５】
ＥＬＩＳＡ：製造元の説明に従ってＭｙｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  ＥＬＩＳＡキット（ＭｙＢｉｏｓｏｕｒｃｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用し、ＵＣＨＬ１、ＭＢＰ、ＧＦＡＰの血清レベルを検知した。カタログ番号及び検知限界は次の通りであった：ＵＣＨＬ１（＃ＭＢＳ２５１２７６０）、７８．１２５〜５０００ｐｇ／ｍＬ；ＭＢＰ（＃ＭＢＳ２６１４６３）、１０００ｐｇ／ｍｌ〜１５．６ｐｇ／ｍｌ；及びＧＦＡＰ（＃ＭＢＳ２６２８０１）、２０ｎｇ／ｍｌ〜０．３１２ｎｇ／ｍｌ。４５０ｎｍの波長でＳｙｎｅｒｇｙ  ２マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）を使用し、ペルオキシダーゼ産物の光学密度を分光光度的に測定した。
【０１４６】
２４名の選手の試合後レベルを試合前レベルと比較するペアワイズＴ検定、ならびに各対象について試合動画から観察された頭部打撃（ＨＴＨ）の回数と比較した試合後レベルの変化の関係を調査するための線形回帰を使用し、タンパク質バイオマーカーデータの統計分析を行った。
【０１４７】
ＲＮＡの単離。ｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｓｅｒｕｍ／Ｐｌａｓｍａ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ）を製造元の説明に従って使用し、血清及び唾液からＲＮＡを単離した。血清：凍結血清サンプルを氷上で解凍し、２００μＬの血清を１ｍＬのＱＩＡｚｏｌ溶解試薬に添加した。勢いよくボルテックスした後、２００μＬのクロロホルムを添加し、サンプルを室温（ＲＴ）で５分間インキュベートしてから、１２，０００×ｇにて１５分間ＲＴで遠心分離した。結果として生じた水相を取り出し、１．５倍容量の１００％エタノールと混合し、ＲＮｅａｓｙ  ＭｉｎＥｌｕｔｅスピンカラムに移し、１５秒間遠心分離した。製造元の表示容量のバッファーＲＷＴ及びＲＰＥでカラムを洗浄し、３０μＬのＲＮａｓｅ不含水でＲＮＡを溶出させた。唾液：最初にＯｒａｇｅｎｅバイアルまたはスワブ収集キットに収集した冷蔵した唾液サンプルを５０℃で１時間インキュベートした。次に２５０μＬのアリコートを取り出し、微小遠心管に移し、９０℃で１５分間インキュベートし、ＲＴに冷ました。７５０μＬのＱＩＡｚｏｌ溶解試薬を添加し、サンプルを１分間勢いよくボルテックスし、５分間ＲＴでインキュベートした。クロロホルム（２００μＬ）を添加し、サンプルを１分間ボルテックスしてから、最大速度（＞１３，０００×ｇ）で１０分間遠心分離した。結果として生じた水相４５０μＬを新しい管に移し、６７５μＬの１００％エタノールと混合し、ＲＮｅａｓｙ  ＭｉｎＥｌｕｔｅスピンカラムに移し、１５秒間遠心分離した。その後、製造元の表示容量のバッファーＲＷＴ及びＲＰＥでカラムを洗浄し、３０μＬのＲＮａｓｅ不含水でＲＮＡを溶出させた。Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒのＲＮＡ  Ｎａｎｏｃｈｉｐを使用してＲＮＡの品質を評価した。
【０１４８】
ＲＮＡシーケンシング。製造元の説明に従ってＴｒｕＳｅｑ  Ｓｔｒａｎｄｅｄ  Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ  Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用し、Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡシーケンシングライブラリーを調製した。１サンプル当たり１０００万リードの標的シーケンシング深度で、４８のバッチでサンプルにインデックスを付けた。シーケンシングは、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＳＵＮＹ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｃｏｒｅ（ＳＵＮＹＭＡＣ）にて、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＮｅｘｔＳｅｑ  ５００機器で３６ｂｐのシングルエンドリードを使用して行った。ＦａｓｔＱファイルをトリミングしてアダプター配列を除去し、Ｐａｒｔｅｋ  Ｆｌｏｗ（Ｐａｒｔｅｋ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）でＳｈｒｉｍｐ２アルゴリズムを使用して、成熟したｍｉＲｂａｓｅ２１データベースにアラインメントを行った。
【０１４９】
ＲＮＡ−Ｓｅｑ分析。アラインメントされたリードを定量化し、比較的不変の内部基準ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−２４−３ｐ）に対して正規化し、ｌｏｇ２スケールに変換した。次に、各対象の正規化されたｍｉＲＮＡ試合後データをそれぞれの試合前／ベースライン値（試合の１週間前または直前のいずれかに得た）と対比し、合計１４１のサンプル差分値（ｎ＝６２唾液、７９血清）を得た。統計分析の前に主成分分析（ＰＣＡ）を使用して、正規化されたｍｉＲＮＡ差分値を真球度についてスクリーニングし、６０％超の欠損があったものをフィルタリングして排除した。
【０１５０】
我々は、２つの異なる分析ワークフローを使用して、ｍＴＢＩに関連するｍｉＲＮＡを特定した。第１の方法では、選手が経験した頭部打撃（ＨＴＨ）の回数に基づく、ｍＴＢＩが収集時またはその前に生じている確率に基づいて、１４１個のサンプルを３つの群に分けた。これらのＨＴＨ値は、各試合の動画記録から得た。定義された群は、高尤度（１０＋ＨＴＨ；平均＝２４．２）、中尤度（４〜９ＨＴＨ；平均＝６．５）、及び低尤度（０〜３ＨＴＨ；平均＝０．３）であった（表１３）。
【表１３】
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【０１５１】
対象のビニング。我々はまず、二元分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用してサンプルタイプ及びＴＢＩ分類ならびにそれらの相互作用の主効果を調査し、ＨＴＨスコアに基づくＴＢＩ確率評点の有意効果があったｍｉＲＮＡについてスクリーニングした。これは両方の生体液から得たサンプルの全てで行い、誤発見率（ＦＤＲ）補正は＜０．１５であった。このフィルターを通過したｍｉＲＮＡを次に段階的線形回帰に使用して、実際のＨＴＨ値を最も良好に予測したｍｉＲＮＡを明らかにした。次に、ロジスティック回帰分類分析を完了して、高尤度及び低尤度のＴＢＩサンプルの全てを互いから区別する能力を評価した（中尤度群をホールドアウトした）。１００重Ｍｏｎｔｅ−Ｃａｒｌｏ交差検証（ＭＣＣＶ）を行い、生体液間の経験的精度を推定した。次に、最も強い予測有用性を示したｍｉＲＮＡを、Ｄｉａｎａ  Ｔｏｏｌｓ  ｍｉＲｐａｔｈｖ３を使用した機能分析に供した。また、相関分析を使用し、強い判別力を示すｍｉＲＮＡにおける差の相関性を様々な機能的尺度との関連で評価した。
【０１５２】
時間的ビニング。第１の分析では、試合後の各対象から得た全ての初期サンプルを同じＴＢＩ確率クラスにまとめたので、一部のｍｉＲＮＡは、急性効果または遅発効果のみを有した場合、検知を逃れることができた可能性があった。とはいえ、そのような時間依存性応答は、対象ビニングから得られたもののいずれとも同じ程度に重要であり得る。潜在的な急性効果または遅発効果を明らかにするため、我々は一般線形モデルを使用し、４つの異なる時間的ビンに基づいて、時間及びサンプルタイプならびにそれらの相互作用が相対ｍｉＲＮＡ発現量に及ぼす効果を調査した。前述のように、この分析で使用した１２２個のサンプルを試合前の発現レベルに対して正規化した（表１２）。したがって、時間１には、ＭＭＡマッチに出席したが試合には参加せず、それでも生体液サンプルを提供した対象から得たサンプル（これらは事象の非特異的効果のための対照とした）、ならびにマッチに参加したが頭部打撃を受けなかった対象（これらはエクササイズ対照とした）が含まれた。これらをまとめて時間１対照と呼ぶ。残りの時間的ビンは、マッチに参加し、少なくとも２回の頭部打撃（ＨＴＨ）を受けた選手によるものであった。これらを収集時点によって時間１  ＨＴＨ（試合後１時間以内）、時間２  ＨＴＨ（試合２〜３日後）、及び時間３  ＨＴＨ（試合７日後）に群分けした。有意な時間効果があった全てのｍｉＲＮＡの時間的プロファイルを可視化し、教師あり分類分析に供して最も顕著なパターンを特定した。次に、目的の発現プロファイルを有するｍｉＲＮＡを、Ｄｉａｎａ  Ｔｏｏｌｓ  ｍｉＲｐａｔｈｖ３を使用した機能分析に供し、対象ビニング分析から得たｍｉＲＮＡと比較した。
【０１５３】
機能的研究。Ｑｕａｄｒａｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｓｙｒａｃｕｓｅ  ＮＹ）によって開発されたバージョンのＣｌｅａｒＥｄｇｅ（商標）評価システムを使用して、ＭＭＡ選手のバランス及び認知機能の評価を行い、８つの異なる立位保持中の三次元における身体の揺れ、ならびに二重運動課題及び認知課題の遂行中の身体の揺れ及び完了時間を測定した。二重課題及び認知課題は、各対象が手持ち式のタブレットコンピュータ（Ｔｏｓｈｉｂａ、モデル：ＷＴＢ−Ｂ）及びスタイラスを使用して完了した。身体の揺れ（バランス）の分析は、各対象の腰回りに装着させた慣性センサを使用し、２５０Ｈｚの周波数で全３平面の動きをサンプリングすることによって測定し、結果として得られたデータを各タブレットから後処理のためにダウンロードした。各対象には靴を脱いだ状態で床またはフォームパッドのいずれかに立たせて各立位を３０秒間保たせ、開眼状態または閉眼状態でデータを得た。立位保持中の両足の位置は、両足の足首または内側面が接触した状態で横並びにしたか、あるいは利き足を前に出し、非利き足をすぐ後ろに置き、後ろに置いた足のつま先に利き足の踵を接触させた継ぎ足姿勢にした。二重課題の認知コンポーネントは、タブレットを注視しながらタブレットを安定して持つだけの単純な二重課題に加えて、デジタル版のトレイルＡ課題及びトレイルＢ課題、ならびに聴覚作業記憶課題（数字逆唱）を含んだ。トレイルＡでは、対象に、スクリーン上の円で囲まれた数を昇順（１−２−３など）にスタイラスで素早くつなげさせた。トレイルＢでは、対象に、円で囲まれた数及び文字をアルファベットと数値が交互になった昇順配列（１−Ａ−２−Ｂ−３−Ｃなど）につなげさせた。数字逆唱課題は、ヘッドホンを介して各対象に伝えられた次第に長くなる数値列の逆順復唱を測定することからなった。これらの選手について、全体で１４の課題を測定した。注目すべきことに、同じ対象で同時に機能的尺度及び生体液尺度を得るのは、サンプル時間のおよそ半数（４８％）でのみ可能であった。
【０１５４】
ｍｉＲＮＡデータと同様に、各対象で共通の試合前の時点と全ての試合後の時点を比較することにより、機能的データを標準化差の尺度に変換した。数字逆唱課題尺度の一部で欠損していたデータ点は、Ｋ最近傍アプローチを使用して埋めた。統計分析の前に主成分分析（ＰＣＡ）を使用して、機能的データを真球度についてスクリーニングした。次に、二元（サンプルタイプ×ＴＢＩ分類）分散分析（ＡＮＯＶＡ）を行って、収集時間におけるＴＢＩ分類割当の有意効果があった機能的尺度についてスクリーニングし、誤発見率（ＦＤＲ）は＜０．０５であった。また我々は、Ｐｅａｒｓｏｎ相関メトリック及びＲによる有意性のＴ検定を使用して、有意に変化した機能的パラメータの互いとの関係を調査した。最後に、ＨＴＨの尤度またはＨＴＨからの時間的間隔に関連する機能的アウトカムを特定するため、ｍｉＲＮＡの尺度と同様の様式で二元ＡＮＯＶＡを行った。
【０１５５】
機能的データ及びｍｉＲＮＡデータにおける時間的パターンの複合分析。目的の発現プロファイルを有するｍｉＲＮＡを特定した後、我々は、時間を通じて最も高い類似性を示す分子的特徴及び機能的特徴を検知するため、主成分分析（ＰＣＡ）を使用し、バランス及び認知スコアデータを分子データと併せて調査した。この分析では、試合後のサンプル（ｎ＝３９唾液、ｎ＝３１血清）の全ての機能的データと併せて、ＡＳＲまたはＤＳＲ  ｍｉＲＮＡのみを使用した。コーティマックスルート曲線抽出（ｑｕａｒｔｉｍａｘ  ｒｏｏｔ  ｃｕｒｖｅ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）を使用して反復主因子ＰＣＡを行った。ｍｉＲＮＡ変数と最も類似する機能変数を特定するために因子の重みを調査し、可視化の目的のために線プロットを作成した。
【表１４】
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【０１５６】
結果：ＭＭＡ選手の機能的変化。１４種中４種の機能的尺度は、ＴＢＩ尤度分類による有意差を示した。予想された通り、１４種の機能的尺度のいずれも、収集時間でサンプリングされた生体液のタイプに影響されず、またいずれも相互作用効果を示さなかった。表１５及び図６を参照されたい。これらの課題は、身体の揺れの尺度３つ（ＴＬＥＣ、ＤＳＢ＿Ｂａｌ、ＴＭＢ＿Ｂａｌ）及び認知機能の尺度１つ（ＴＭＡ＿Ｃｏｇ）を含んだ。図６は、ＭＭＡ試合後に評価された機能的尺度の変化に対するＴＢＩ尤度分類の有意効果を示す。
【表１５】
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【０１５７】
生体液タイプの効果はなかったが、我々は、別々に唾液及び血清を提供した対象セットの機能的変化パターンを調査し、再現性を測る助けとした。ＤＳＢ及びＴＬＥＣ課題中の身体の揺れ尺度における変化パターンの例を図７Ａ〜７Ｄに提示する。全体としてこれらの機能的尺度はいずれも、中尤度及び高尤度ＴＢＩ群において低尤度群と比べて増加した。注目すべきことに、異なる対象群を評価したため（唾液及び血清の両方を提供した数名の対象で部分的にのみ重複した）、パターンは両方の対象サンプルセットにおいて同一ではなかった。図７Ａ〜７Ｄは、唾液または血清サンプルを提供し、３つの異なるＴＢＩ尤度カテゴリー（低尤度、中尤度、高尤度）に分類された対象において、２つの異なる機能試験の間に見られた、試合後対試合前の身体の揺れの一貫した変化の箱ひげ図である。なお、揺れ尺度の一方は、認知課題遂行中に得られ（数字逆唱、上部）、他方は、視覚的ガイダンスなしで行われたバランス試験中に得られた（両足閉眼、下部）。ＴＢＩ低尤度群と比較して、中尤度群及び高尤度群では、両セットの尺度で揺れの増加が明白である。
【０１５８】
ＴＢＩの確率に従うＭＭＡ選手の機能障害の明らかな段階的勾配を示した２つの機能的尺度に加えて、有意に変化した機能的尺度は他に２つあった。これらは、さほど明らかなＴＢＩ尤度に従うパターンを示さなかった。図８。これらは、トレイルメイキングＢ課題中の揺れ（ＴＭＢ＿Ｂａｌ）及びトレイルメイキングＡ課題の完了時間（ＴＭＡ＿Ｃｏｇ）の差分スコアを含んだ。ＴＭＢ＿Ｂａｌ課題では、高尤度群、特に血清サンプルを提供した対象においてスコア上昇が示唆されたが、これは唾液サンプルを提供した対象ではさほど明白ではなかった。図８（Ａ−Ｂ、上部）。ＴＭＡ＿Ｃｏｇ課題では、中尤度群には完了時間の増加の可能性が見られたが、高尤度群では変化なしまたはわずかな減少と、パターンが混合していた。図８（Ｃ−Ｄ、下部）。図８は、ＴＢＩ尤度により群分けされた対象において、２つの異なる機能試験の間に見られた、試合後対試合前の身体の揺れまたは完了時間スコアにおける、さほど一貫していない変化を示す（規則は図７Ａ〜Ｄと同じである）。高尤度群のＴＭＢ＿Ｂａｌ課題スコアは、血清サンプルを採取した場合にわずかに上昇し（しかし唾液サンプルには当てはまらない）（上部）、ＴＭＡ＿Ｃｏｇスコアは中尤度群においてわずかに上昇した（しかし高尤度群には当てはまらない）（下部）ことに留意されたい。
【０１５９】
機能的変化の探求は、ＴＬＥＣ課題及びＤＳＢ＿Ｂａｌ課題中の身体の揺れの差分スコア尺度が、最も感度の高いＴＢＩ尤度の予測子であったことを示した。これら２つの変数間の相関性を調査した。我々は、５１の尺度ペアを使用して（Ｋ最近傍アルゴリズムによって置き換えられた欠損値を除く）、２つの尺度には相関性がまったくないことを観察した（ＰｅａｒｓｏｎのＲ＝０．００、ｐ＝０．９９）。したがって、両課題は、ＴＢＩの尤度（すなわち頭部打撃）に応じたバランスの差の影響を受けやすいが、これらは明らかに異なる情報を提供する。しかしながら、数唱スコアを得るにはヘッドホンを装着する必要があるため、全ての対象でスコアを得る難度が高いことを考えると、ＴＬＥＣ課題には明らかに実用的利点がある。
【０１６０】
血清タンパク質バイオマーカー。試合前と比較した試合直後の２４名の選手の１１種の血清タンパク質のレベルにおける潜在的変化を調査した。これらのタンパク質には、ＵＣＨＬ１、ＭＢＰ、ＧＦＡＰ（ＥＬＩＳＡにより分析した）、ならびにＢＤＮＦ、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＣＲＰ、ＩＣＡＭ１、ＩＬ−６、ＮＳＥ２、Ｓ１００Ｂ、及びＶＣＡＭ（カスタムのＬｕｍｉｎｅｘアッセイにより分析した）が含まれた。ＩＬ−６サンプル値の全てがそのアッセイの最低標準濃度未満であったため、この分析物に関する結果は入手できなかった。試合前サンプルのＳ１００Ｂ値の過半数（２１／２４）も最低標準濃度未満であった。しかしながら、同じ選手から得たサンプルのうち１６個は、試合後に測定可能なレベルのＳ１００Ｂを有した。これら１６個のサンプルについて変化の程度を推定し、統計比較を行うため、試合前濃度を試合後の最低濃度値（２２．７ｐｇ／ｍＬ）の半分に等しい値に設定した。我々が濃度を得た１０種のタンパク質のうち４種は、試合後対試合前の血清サンプル中で有意なペアワイズの変化（全て増加）を示した。これらは、ＧＦＡＰ（ｐ＝１．４ｅ−７、変化％中央値＝３３．１％）、ＭＢＰ（ｐ＝０．００３、変化％中央値＝６５．４）、ＮＳＥ２（ｐ＝０．０３７、変化％中央値＝５０．４）、及びＳ１００Ｂ（ｐ＝０．００６、変化％中央値＝７４７％）を含んだ。
【０１６１】
これら１０種のタンパク質の変化と、各選手が受けた頭部打撃の回数との潜在的関係を調査した。バイオマーカーのうち１種（ＵＣＨＬ１）のみが有意な回帰を示した；ｒ２＝０．７３３９、図９。だが注目すべきことに、ＵＣＨＬ１は、試合後対試合前の有意な全体的効果を示さなかった（ｐ＝０．９３４、変化％中央値＝１．２）。残りのタンパク質は、０．００５〜０．０９のｒ２係数を示した。図１０Ａ〜図１０Ｉ。
【０１６２】
ｍｉＲＮＡバイオマーカー。唾液及び血清を合わせたサンプル中、合計９２５種のｍｉＲＮＡがＲＮＡ−Ｓｅｑによって信頼性高く定量化され、これらを下流分析に供した。正規化後、統計分析の前に主成分分析（ＰＣＡ）を使用して、ｍｉＲＮＡ値の変化を真球度及び正規性について視覚的にスクリーニングした。図１１Ａ及び図１１Ｂを参照されたい。結果は、生体液タイプにかかわらず概ね偏りのないデータセットを示し、クラスタリング及びＰＣＡ軸サイズに基づく明らかな外れ値はなかった。図１１Ａ及び図１１Ｂに示すように、主成分分析（ＰＣＡ）は、統計分析前の生体液タイプ及びＴＢＩ尤度に対して正規性があり高度に球状のサンプルタイプの分布を示す。上部の画像（図１１Ａ）はサンプルの混在を示し、主要データクラウドからの高尤度血清サンプル（緑／グレースケールの四角）の分離はわずかに示唆されるのみである。全てのデータを統合すると、変化値は正規性の高い様式で分布する（１１Ｂ下部）。
【０１６３】
図４４及び表１６に示すように、多重検定のための補正（ＦＤＲ＜０．１５）を行った後、合計２１種のｍｉＲＮＡが、ＴＢＩ尤度分類に従う有意な変化を示した。このうち２種は体液タイプの有意効果も示し、２種は体液タイプ×ＴＢＩ尤度の相互作用効果を示した。図４４は、試合前と比較した試合後の血清及び唾液中のｍｉＲＮＡ発現変化に対するＴＢＩ尤度の効果を示す。合計９２５種のｍｉＲＮＡを試験したところ、２１種はＴＢＩ尤度の有意な主効果を示し、このうち２種は体液の有意な主効果も示し、２種は有意な体液×ＴＢＩの相互作用を示した。
【表１６】
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【０１６４】
ＴＢＩの尤度を予測する能力が最も優れたｍｉＲＮＡを特定しようとして、特徴選択及び１００重Ｍｏｎｔｅ  Ｃａｒｌｏ交差検証と共に受信者動作曲線（ＲＯＣ）二項分類検定を使用し、ｍｉＲＮＡの更なる検査を行った。この場合では、低尤度ＴＢＩ群と高尤度ＴＢＩ群とを比較した。加えて、ＴＢＩ予測子の選択は、完全なサンプルセットにおいてｍｉＲＮＡの発現変化と頭部打撃の回数との関係（段階的線形回帰により判定）を具体的に示したｍｉＲＮＡに限定した。この分析の結果は、体液タイプにかかわらず、わずか１３種のｍｉＲＮＡを使用し、所与のサンプルにおけるＴＢＩ尤度をほぼ９０％の精度（ＡＵＣ＝０．８９）で予測する多変数予測モデルをもたらした。図１２を参照されたい。図１２は、試合前のベースラインと比較した血清または唾液サンプルからのｍｉＲＮＡ発現の変化に基づいてＴＢＩ尤度を予測する精度を示す。これらの分析では、段階的線形回帰を使用して、頭部打撃（ＨＴＨ）値の予測に最適なｍｉＲＮＡの数を事前に選択し、この１３種のセットを、低尤度ＴＢＩサンプルから高尤度ＴＢＩサンプルを区別する分類精度を推定するために、ランダムフォレストを使用した１００重Ｍｏｎｔｅ  Ｃａｒｌｏ交差検証（ＭＣＣＶ）に供した。
【０１６５】
特定されたｍｉＲＮＡバイオマーカーの妥当性を更に立証するために、２つの異なるサンプルタイプを複合あるいは分離したロジスティック回帰分析でＲＯＣ分析を補完した。結果は、別々のロジスティック回帰モデルを用いた場合（各生体液に異なるベータ係数を用いた）、同じ１３種のｍｉＲＮＡが完全な分類を達成したことを示した（表１７）。したがって、血清及び唾液のいずれも、ＴＢＩ尤度に従ってサンプルを正確に分類することができるｍｉＲＮＡのサブセットを含有するが、それぞれによって提供される情報はいくぶん特徴的であると結論された。
【表１７】
2020512017.tif 000064
【０１６６】
試合後の発現に変化があった血清及び唾液中の２１種のｍｉＲＮＡの一部の例を図１３Ａ〜図１３Ｆに示す。興味深いことに、これらのｍｉＲＮＡの一部は、ＴＢＩ後の両生体液中で増加した発現パターンを示し（図１３Ａ及び図１３Ｂ、ｍｉＲ−３０ｂ−５ｐ、上）、一方その他は、ただ一種の生体液タイプで最も明白であった変化を示した。例えば、ｍｉＲ−９２ａ−３ｐ（図１３Ｃ及び図１３Ｄ、中央）は、ＴＢＩ後の唾液中で大きく減少したが、ｍｉＲ−１２２−５ｐ（図１３Ｅ及び図１３Ｆ、下）は、ＴＢＩ後の血清中で大きく増加した。図１３Ａ〜図１３Ｆは、ＴＢＩ後の唾液及び血清中のｍｉＲＮＡ発現レベルの変化を例示する箱ひげ図を示す。各横列は異なるｍｉＲＮＡ例を表し（３種のｍｉＲＮＡが示されている）、各ドットは、特定のサンプルにおける各ｍｉＲＮＡの発現レベルを表す。一部のｍｉＲＮＡ（３０ｂ−５ｐ、上）は、ＴＢＩ後の両生体液中で増加のパターンを示し、一方その他（例えば、９２ａ−３ｐ及び１２２−５ｐ）は、ただ一種の生体液タイプで最も明白であった変化を示したことに留意されたい。
【０１６７】
変化したｍｉＲＮＡの生物学的マッピング。ＤＩＡＮＡ  Ｔｏｏｌｓ  ｍｉＲｐａｔｈ  ｖ．３を使用し（ＦＤＲ補正は＜０．０５に設定した）、２１種の有意に変化したｍｉＲＮＡに関する所見の生物学的関連性を更に探求した。この分析は予測された標的に基づき、特徴的な一組の生物学的経路が上位ｍｉＲＮＡの標的遺伝子において過剰表現されたことを示した。Ｋｙｏｔｏ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅｓ（ＫＥＧＧ）データベースにおいて定義されている上位１０種の経路が、各生体液について示された高尤度ＴＢＩと低尤度ＴＢＩの比較において、関連する各ｍｉＲＮＡの正味の発現変化と併せて示された（表１８）。注目すべきことに、最も濃縮された経路の全ての間で、関連するｍｉＲＮＡは、いくつかが増加し、いくつかが減少した混合効果を示した。ｍｉＲＮＡの半数超（ｎ＝１３）が、２種の生体液中の変化の混合した方向性を示し、一方の生体液における増加または減少は、他方の生体液中の変化を伴わなかったか、または反対方向の変化を伴った。しかしながら、増加した２種（ｍｉＲ−１０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ−５ｐ）及び減少した５種（ｍｉＲ−３６７８−３ｐ、ｍｉＲ−４５５−５ｐ、ｍｉＲ−５６９４、ｍｉＲ−６８０９−３ｐ、及びｍｉＲ−９２ａ−３ｐ）を含め、７種のｍｉＲＮＡは２種の生体液中で同じ方向の変化を示した。
【表１８】
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【０１６８】
注目すべきことに、上位１０種のＫＥＧＧ経路のうち４種は、ＴＢＩに対する潜在的関連性のため、特に関心の対象であった。これらの経路は、ユビキチン依存性タンパク質分解、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）、軸索ガイダンス、及びグルタミン酸作動性シナプスを含んだ。これらの経路のそれぞれにおいて合計４６〜８０種の遺伝子が、合計２０種のｍｉＲＮＡの標的となった。ＤＩＡＮＡ  Ｔｏｏｌｓを使用してこれらの所見を更に調査し、１種以上のｍｉＲＮＡの標的となる遺伝子を示した各経路のマップを表示した。図１４、１５、１６、及び１７を参照されたい。
【０１６９】
図１４は、ＫＥＧＧユビキチン依存性タンパク質分解経路における標的遺伝子に関する変化したｍｉＲＮＡの濃縮を示す。この経路では、８０種の遺伝子が、合計１９種のｍｉＲＮＡの標的となった。１種のｍｉＲＮＡの標的となった遺伝子は黄色で示し、２種以上のｍｉＲＮＡの標的となった遺伝子はオレンジ色で示してある。緑色の遺伝子は、それらを標的とすることが予測されるｍｉＲＮＡを有するが、そのいずれも、２１種の変化したｍｉＲＮＡのリストに含まれていなかった。白色の遺伝子は、それらを標的とする予測されたｍｉＲＮＡを有しない。図１５は、ＫＥＧＧ  ＴＧＦ−ベータシグナル伝達経路における標的遺伝子に関する変化したｍｉＲＮＡの濃縮を示す（規則は図１０と同じである）。この経路は、２０種のｍｉＲＮＡの標的となることが予測された４６種の遺伝子を含んだ。図１６は、ＫＥＧＧ軸索ガイダンス経路における標的遺伝子に関する変化したｍｉＲＮＡの濃縮を示す（規則は図１０と同じである）。この経路は、１７種のｍｉＲＮＡの標的となることが予測された７０種の遺伝子を含んだ。図１７は、ＫＥＧＧグルタミン酸作動性シナプス経路における標的遺伝子に関する変化したｍｉＲＮＡの濃縮を示す（規則は図１０と同じである）。この経路は、２０種のｍｉＲＮＡの標的となることが予測された６１種の遺伝子を含んだ。
【０１７０】
ｍｉＲＮＡ変化及び機能的変化の相関性。最終的に、二元ＡＮＯＶＡによる２１種の最も有意に変化したｍｉＲＮＡと、上位の変化した機能的尺度ならびに実際の頭部打撃値との関係を調査した。この分析は、血清ｍｉＲ−４７６６−５ｐレベルの変化とＴＬＥＣ機能的尺度との間の唯一の名目上有意な負の相関性を明らかにした（表１９）。注目すべきことに、この同じｍｉＲＮＡはまた、血清中のその変化と、ＤＳＢ＿Ｂａｌ試験のバランススコアの差との間に、弱い正の相関性を有した。これらの機能的アウトカムとの名目上有意な相関性とは対照的に、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正後に残った実際のＨＴＨ値（唾液ｍｉＲＮＡでｎ＝７、血清ｍｉＲＮＡでｎ＝３、及び複合サンプルでｎ＝８）との高度に有意な相関性がいくつか観察された。
【表１９】
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【０１７１】
ｍｉＲＮＡ変化の時間的分析。ＴＢＩ尤度のみに基づいて発現の変化をプローブすることに加えて、本発明者らは、より複雑かつ潜在的により生物学的に関連性のある発現変化を有するｍｉＲＮＡを特定することを目指した。これは、サンプルの時間的ビニングならびに時間及びサンプルタイプを包含する一般線形モデルによって達成された。本発明者らはこのアプローチを使用し、試験した１１９７種のｍｉＲＮＡのうち、４７種のｍｉＲＮＡには時間の有意効果があり、２２６種にはサンプルタイプ（体液）の有意効果があり、４４種には時間と体液との間の相互作用の有意効果があったことを見出した。図３７は、時間、体液、及び相互作用の効果に起因して血清及び唾液中の存在量が変化したｍｉＲＮＡを示す。いずれかの生体液中でｍＴＢＩ事象の発生を反映し得る時間的効果を特定することが目標であったため、本発明者らは、時間の有意効果があった４７種のｍｉＲＮＡだけに焦点を当てた（表２０）。このうち２１種は体液の有意効果を有し、２０種は有意な相互作用効果を有し、それらの変化が２種の生体液中で異なる時間的効果を示したことが示される。これら４７種から、かなり特徴的なパターンを有する２５種（表２１）が特定された。
【表２０】
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太字のｍｉＲＮＡはＴＢＩ尤度によって変化した（表１６）。パターン化されたｍｉＲＮＡを（図３７及び図３８）に示す。
【表２１】
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【０１７２】
有意に変化したｍｉＲＮＡの時間的パターンの目視検査を使用して、事象そして場合により労作に関連するが頭部打撃（ＨＴＨ）には関連しない試合日に見られた非特異的変化の程度を超えた急性、遅発型、または持続的な効果のいずれかの顕著なパターンを試合後の時点で有する潜在的なバイオマーカーを特定した。この工程には２つの判断基準を使用した：試合後の時点のうちの１つ以上における変化の程度は、１．３倍（±０．２８のｌｏｇ２変化）を上回り、また、ＨＴＨなし群における変化の程度を少なくとも２倍上回る必要があった。これら２つの単純な判断基準は、生体液サンプル中で非常に特徴的なパターンをもつ２つのｍｉＲＮＡセットを明らかにした。第１のｍｉＲＮＡセットは、試合直後の唾液中で急性増加を示し、それから試合後２〜３日目及び１週間後に正常レベルに戻った。このパターンは主に唾液サンプル中で明白であり、有意なＡＮＯＶＡ効果があった４７種のｍｉＲＮＡのうち１２種を正確に表した（図３８Ａ）。これらを急性唾液応答（ＡＳＲ）ｍｉＲＮＡと名付けた。際だったことに、これらの同じｍｉＲＮＡは、血清サンプル中で明確に異なる変化パターンを示した。具体的に述べると、増加したものはなく、少数は変化を示さず、いくつかは試合の２〜３日後から始まる遅発型減少を示した（図３８Ｂ）。
【０１７３】
第２のパターンは遅発効果であった。これは通常、２〜３日目における発現の段階的な増加または減少であり、試合１週間後にピークに達し、初期の試合後時点には存在しなかった。このパターンは血清サンプル中で非常に明らかであり、４７種中１３種のｍｉＲＮＡにおける変化を正確に表した（図３９Ａ）。これらを遅発型血清応答（ＤＳＲ）ｍｉＲＮＡと名付けた。注目すべきことに、これらの同じｍｉＲＮＡは、唾液サンプル中で同様のパターンを呈さなかった。むしろ、ほとんどは変化なしだったか、または、潜在的に非特異的な変化もしくはエクササイズに関連した変化を含む、初期の時点で中程度に増加した発現の傾向を示すかのいずれかだった（図３９Ｂ）。
【０１７４】
唾液及び血清中のｍｉＲＮＡが中枢神経系源からの放出を反映する可能性を確認するため、ｍｉＲＧａｔｏｒ３．０ツールを使用した。複数のＣＮＳ源にわたるｍｉＲＮＡの発現中央値が、ｍｉＲＧａｔｏｒ  ３．０データベース内の３１種の非神経器官及び５１種の非神経組織のいずれかの発現中央値を超えた場合、そのｍｉＲＮＡは「脳で濃縮される」と見なした。マッピング情報が入手可能な１１種のＡＳＲ  ｍｉＲＮＡのうち４種が脳で濃縮されるものと特定され、試合後１時間以内に増加した唾液ｍｉＲＮＡがＣＮＳに由来する可能性を示唆している（表２０）。この所見は、マッピング情報が入手可能な１１種の血清ｍｉＲＮＡのうち、脳で濃縮されることが見出されたのが１種のみであったＤＳＲ  ｍｉＲＮＡとは対照的である（表２０）。
【０１７５】
図３８Ａ及び図３８Ｂは、１２種のｍｉＲＮＡが、非特異的なエクササイズまたは事象に関連する時点（緑の陰影付き領域）におけるものを超えた、試合後１時間時点（青の陰影付き領域）における唾液サンプル（上部）中の急性時間的効果（全て増加）により特定されたことを示す。ｍｉＲＮＡのほとんどが、試合２〜３日後までにベースライン近くに戻ったことに留意されたい。同じｍｉＲＮＡのパターンは、血清中で明確に異なっていた（いくつかは変化なしであり、いくつかは遅発型減少を有した）。図３９Ａ及び図３９Ｂは、非特異的なエクササイズまたは事象に関連する時点（緑の陰影付き領域）におけるものを超えた、試合１週間後（上部、青の陰影付き領域）における血清中の主に遅発型の増加（実線）及び減少（破線）により特定されたｍｉＲＮＡを示す。これらのｍｉＲＮＡは、唾液中で変化なしであったか、または非特異的増加のある程度の証拠を示したことに留意されたい（下部）。
【０１７６】
ＴＢＩに関連する急性変化または遅発変化があったｍｉＲＮＡの生物学的マッピング。急性の試合１時間後の時点において唾液中で著しく増加した１２種のｍｉＲＮＡ、及び血清中の試合１週間後にピークに達した遅発変化（増加及び減少の両方）により特定された１３種のｍｉＲＮＡに関する所見の生物学的関連性を更に探求した。この分析は、各ｍｉＲＮＡセットについて特定された上位１５種のＫＥＧＧ経路の濃縮と共に、ＤＩＡＮＡ  Ｔｏｏｌｓ  ｍｉＲｐａｔｈ  ３．０を使用して行った。急性唾液応答ｍｉＲＮＡの予測された標的において濃縮された経路のうちのいくつかは、プリオン病、長期抑圧、グルタミン酸作動性シナプス、軸索ガイダンス、アンフェタミン嗜癖、及びコカイン嗜癖を含む脳機能に関連するものであった（表２２）。これらのｍｉＲＮＡは全て増加した（赤の上向き矢印によって表されている）ため、これらの脳関連経路（及び掲げられたその他のもの）のそれぞれが抑制された可能性があるということが暗示される。
【表２２】
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【表２３】
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【０１７７】
脳機能に関連するいくつかのＫＥＧＧ経路は、軸索ガイダンス、長期増強、及びグルタミン酸作動性シナプスを含め、遅発型血清応答ｍｉＲＮＡの予測された標的において濃縮されたものの中にも含まれていた（表２３）。これらのｍｉＲＮＡの一部は増加し、その他は減少したため（それぞれ赤の矢印及び緑の矢印）、これらの所見の因果関係を解釈するのはより困難である。
【０１７８】
注目すべきことに、表２２及び表２３中のｍｉＲＮＡ標的で濃縮された経路のいくつかは同じであったか、または互いとの関連性が高かった（例えば、長期抑圧及び長期増強）。これらの類似する濃縮の所見を、選択された経路において遺伝子レベルで更に調査した。
【０１７９】
直接比較した第１の経路は、グルタミン酸作動性シナプス経路であった。図４０。同じ遺伝子の多くが、唾液または血清中に見られるｍｉＲＮＡの標的となったことが認められた。重複する標的の一部の例外には、ＳＬＣ１Ａ２／ＥＡＡＴ２（急性応答唾液ｍｉＲＮＡのみの標的となる）、ならびにグルタミナーゼ／ＧＬＳ２及び小胞グルタミン酸輸送体／ＳＬＣ１７Ａ７（遅発型応答血清ｍｉＲＮＡのみの標的となる）が含まれた。
【０１８０】
グルタミン酸作動性シナプス経路の所見に関連していると考えられるが、唾液及び血清に由来するｍｉＲＮＡが、長期抑圧（ＬＴＤ；急性応答唾液ｍｉＲＮＡの標的となる）及び長期増強（ＬＴＰ；遅発型応答血清ｍｉＲＮＡの標的となる）という学習及び記憶に関与する２つの脳関連経路に及ぼす、潜在的に逆説的な作用の証拠も見出された。図４１Ａ及び図４１Ｂ。ＬＴＰは、シナプス後グルタミン酸（ＡＭＰＡ）受容体の挿入を促進し、シナプス成長を増強させ、一方ＬＴＤは、ＡＭＰＡ受容体を内部移行させ、シナプス後応答を低減させるように機能することから、これら２つの生物学的プロセスは、シナプス可塑性のプロセスに重要である。図４０Ａ及び図４０Ｂは、ＫＥＧＧグルタミン酸作動性シナプス経路における標的遺伝子に関する変化したｍｉＲＮＡの濃縮を示す（規則は図１０と同じである）。唾液ｍｉＲＮＡ及び血清ｍｉＲＮＡの両方が、この経路における同じ遺伝子の多くを標的とすることに留意されたい。図４１Ａ及び図４１Ｂは、唾液（長期抑圧、上部）、及び血清（長期増強、下部）中の、学習及び記憶に関与する経路における時間的に調節されたｍｉＲＮＡの濃縮を示す（規則は図１０と同じである）。
【０１８１】
機能的データ及びｍｉＲＮＡデータにおける時間的パターンの複合分析
唾液。本発明者らは、唾液及び血清のｍｉＲＮＡデータにおける時間的変化を特定することができたため、特定の時点で最も大きな変化を示し、ＡＳＲまたはＤＳＲ  ｍｉＲＮＡと相関し得るものを検知するバランス及び認知スコアデータも調査した。これはまず、機能的データと共に、３９個の試合後唾液サンプル中の合計１２種のＡＳＲ  ｍｉＲＮＡ及び１４種の機能的尺度に対するＰＣＡを使用して行った。我々の結果は、３つの因子が複合データにおける分散のおよそ半数を説明したことを示した。一部のｍｉＲＮＡ及び機能的尺度は複数の成分に強く負荷したものの、因子１は、９／１２種のｍｉＲＮＡ及び４種の機能的尺度の最大負荷成分であった（表２４）。注目すべきことに、因子１が負荷する唾液ｍｉＲＮＡのほとんどは、増加した身体の揺れを示すいくつかの機能的尺度と共に、大きな正の重みを示した。対照的に、１種の唾液ｍｉＲＮＡのみが、認知能力の減少を示す複数の機能的尺度（ＴＭＡ＿ＣＯＧ、ＴＭＢ＿Ｄｕａｌ＿ＣＯＧ、及びＴＭＢ＿ＣＯＧ）と共に、因子１に対する大きな負の重みを示した。これらのデータのグラフ表示は、試合直後の時点を除く経時的な身体の揺れの減少の証拠と共に、バランス尺度のうちの１つ（ＴＬＥＯＦＰ）における学習効果の可能性を明らかにした（図４２）。
【表２４】
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【０１８２】
図４２は、急性唾液応答ｍｉＲＮＡと相関する機能的尺度を示す。実線は、認知的尺度を示す（より高い値は、より良好な成績を示す）。破線は、正規化された身体の揺れ尺度を示す（より高い値は、より不良な成績を示す）。認知的尺度は、試合１時間後の時点で成績の下降傾向を示したが、身体の揺れは、同じ時点で増加を示したことに留意されたい。また、認知的尺度のうちの２つ（ＴＭＢ＿ＣＯＧ及びＴＭＢ＿Ｄｕａｌ＿ＣＯＧ）が、明らかな学習効果（試合直後の時点を除く経時的な成績改善）を示したことにも留意されたい。学習効果は、試合直後の時点を除く経時的な身体の揺れの減少の証拠と共に、バランス尺度のうちの１つ（ＴＬＥＯＦＰ）にも見られた。
【０１８３】
血清。時間的効果により特定された血清ｍｉＲＮＡは遅発変化を示す傾向にあり、試合後２〜３日目及び１週間後に増加及び減少が見られた。したがって、合計３１個のサンプルからの複合データにＰＣＡを使用し、これらを唾液ｍｉＲＮＡとは別々に調査した。これにより、発現の遅発型減少を示した３種のｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−１３９−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−１−３ｐ、ｍｉＲ−４２１）、ならびに遅発型増加を示した６種のｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−６８０９−３ｐ、ｍｉＲ−５５８８−５ｐ、ｍｉＲ−３６７８−３ｐ、ｍｉＲ−４５２９−３ｐ、ｍｉＲ３６６４−３ｐ、及びｍｉＲ−４７２７−３ｐ）及び４種の機能的尺度（ＴＳＥＯ、ＤＳＢ＿Ｂａｌ、ＴＭＢ＿ＤｕａｌＢａｌ）に対する強い相互負荷が明らかになった（表２５；図４３）。注目すべきことに、これらの機能的尺度のうちの１種は明らかな学習効果を示し（ＴＳＥＯ）、また１種は、急性応答唾液ｍｉＲＮＡとの関連性が高いものとして特定された（ＤＳＢ＿Ｂａｌ）。
【表２５】
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【０１８４】
図４３は、遅発型血清応答ｍｉＲＮＡと相関する機能的尺度を示す。実線は、明らかな学習効果（ＨＴＨなし対照及び試合１時間後の時点における揺れの減少）があり、後の試合後２〜３日目に揺れの増加を示したバランス尺度（ＴＳＥＯ）を示す。破線は、遅発効果のあるバランス尺度（ＴＭＢ＿Ｄｕａｌ＿Ｂａｌ）、または急性効果に加えて遅発効果のあるバランス尺度（ＤＳＢ＿Ｂａｌ）の２種を示す。
【０１８５】
本発明の開発において、本発明者らは、ｍＴＢＩまたはスポーツ関連脳震盪もしくは頭部衝撃の尤度を正確に予測し得る診断的尺度を確立することを目標として、若年成人アスリートにおける唾液及び血清の分子的尺度ならびに神経認知的尺度及びバランス尺度を、ベースライン及びＭＭＡ事象後の様々な時点の両方で精査した。これは、４つの相補的なアプローチを使用して行われた。まず本発明者らは、既存の文献における主張に基づき、対象がＭＭＡ試合中に受けた頭部打撃の回数に基づくｍＴＢＩ確率で対象のビニングを行い、対象のサブセット中の潜在的な血清タンパク質バイオマーカーセットを分析した。タンパク質のデータは、潜在的なバイオマーカーのうち１種（ＵＣＨＬ１）しか頭部打撃の回数と量的に関連した変化を示さなかったことを示したが、他のバイオマーカーは、エクササイズ効果に起因したかもしれない非特異的増加を示した可能性がある。そこで本発明者らは、高確率の脳震盪サンプルから低確率のものを区別し得る他の潜在的な尺度を特定するため、二元ＡＮＯＶＡ及びＲＯＣ曲線分析を使用し、血清及び唾液のｍｉＲＮＡデータ、ならびに神経認知的尺度及びバランス尺度を調査した。次に本発明者らは、反復測定ＡＮＯＶＡを使用してｍｉＲＮＡデータを調査し、ＭＭＡ試合に対する急性または遅発型のいずれかの時間的効果があった分子バイオマーカーを明らかにした。これは唾液及び血清両方のｍｉＲＮＡに当てはまったが、そのパターンは２種の生体液中で異なる傾向にあった。最も有益（ｉｎｆｏｒｍａｔｉｖｅ）なバイオマーカーは定量化可能な機能的尺度の変化に関連するものであろうと思われたため、本発明者らは次に、複合データのＰＣＡ分析を使用して、急性応答性唾液ｍｉＲＮＡ及び遅発型応答性血清ｍｉＲＮＡに関連する機能的尺度における時間的パターンを描写した。これにより、選択された唾液または血清のバイオマーカーと、特徴的な機能的尺度セットとの間に、強い関係が確認された。機能的尺度はまた、訓練に関連する改善が存在したにもかかわらず、急性効果または遅発効果を示す傾向にあった。全体としてこれらの結果は、ｍＴＢＩにおける分子バイオマーカー及び機能的バイオマーカーの研究が厳正に行われ、データ中の潜在的な学習効果を特定するために十分な頻度でサンプリングされる高感度の尺度を組み込む必要があることを示す。更にこれらのデータは、ｍＴＢＩの影響を最も受けやすいバイオマーカーが、強い生物学的影響を有し得ることも示す。
【０１８６】
機能的アウトカムメジャー。多数のバランス尺度を使用し、ベースライン時またはスポーツ関連脳震盪後の対象を評価してきた。試験には、コンピュータ制御された加速度計及びタブレットデバイスを使用した、いくつかの異なるタイプのバランス尺度が含まれた。本発明者らは、認知課題を完了させる必要性によって対象の気が散っている間のバランスの二重課題評価、及び純粋に認知が要求される課題も追加した。評価のタイミングにかかわらずに行われた１４種の異なる尺度に関する我々の初期分析は、両足閉眼（ＴＬＥＯ）課題、ならびに数字逆唱バランス試験（ＤＳＢ＿Ｂａｌ）及びトレイルメイキングＢ二重課題バランス試験（ＴＭＢ＿Ｄｕａｌ＿Ｂａｌ）を含む２つの二重課題を含め、３つのバランス尺度がｍＴＢＩ尤度の影響を受けやすい可能性があることを明らかにした。また本発明者らは、トレイルメイキングＡ認知試験（ＴＭＡ＿Ｃｏｇ）がｍＴＢＩ尤度の影響を受けやすい可能性があることも見出した。
【０１８７】
ｍＴＢＩを有する対象のバランスまたは神経認知機能における変化については、文献による多くの報告があるが、ベースライン及び時間経過データの組み込みを役立てたものはごくわずかである。今回の研究では、異なる時点でほとんど異なる対象セットを使用したこと、そしてまさにその本質によって対象依存性である潜在的な学習効果が存在したことを理由として、機能的尺度に対する時間的効果を正式な反復測定ＡＮＯＶＡに供しなかった。それにもかかわらず、我々の経時的な機能的データのＰＣＡ分析により、一部の尺度における有意な学習効果の存在、ならびに最も大きな変化を示した時点における差が確認された。これらの観察は、一部のバランス尺度、特に二重課題における認知の要求が高いもの、例えばＴＭＢ＿Ｄｕａｌ＿Ｂａｌ及びＤＳＢ＿Ｂａｌが、急性ではなくいくぶん遅れた時点においてその最大効果を明らかにし得ることを示唆する（図４３）。対照的に、ＭＭＡ試合の１時間以内に行われた急性時点の評価は、最も感度及び信頼度の高い尺度には、認知的尺度（ＴＭＡ＿Ｃｏｇ、ＴＭＢ＿Ｄｕａｌ＿Ｃｏｇ）だけでなく、いくつかの単純なバランス尺度（例えば、ＴＳＥＣＦＰ）が含まれたことを示した（図４２）。他のバランス試験は、試合直前に対する試合後の身体の揺れの増加を明らかにしたが、様々な程度の経時的な揺れの全体的減少（特にＴＬＥＯＦＰ、これは学習効果を表すと思われる）も示した。この課題成績における改善は、対象が姿勢の安定性を調整する助けとなる視覚的フィードバックシグナルを使用できたことを考えれば、驚くべきことではないかもしれない。対照的に、ＴＳＥＣＦＰ課題はおそらく、最も難しい課題を表す。対象は、固有感覚的手がかりのみを使用することができ、視覚的情報を使用することはできない。これは明らかな経時的改善を示さなかった。
【０１８８】
トレイルメイキングＡ及びＢ試験は認知能力を評価するために広く使用されており、近年の研究では、ｍＴＢＩを有する対象の能力を検査するため、これらの試験のコンピュータ制御されたバージョンが実施されている。両方の試験がＴＢＩに対して高感度であると主張されているものの、こうした研究では、トレイルメイキングＢ試験においては有意な学習効果が観察されたが、Ａ試験でこれは観察されていない。本発明者らのデータはこれらの所見と一致しているが、過去に試験を受けたことのある対象におけるトレイルメイキング成績を検査するのに最適な時点があり得ることも示している。
【０１８９】
分子的アウトカムメジャー：
タンパク質バイオマーカー。ヒト対象及び齧歯動物モデルの両方における多数の研究では、ｍＴＢＩ、そしてより一般的には重度ＴＢＩとの関連において、様々な血清タンパク質の潜在的有用性が調査されている。本発明者らは、試合直前及び直後に得られた我々のＭＭＡ選手サンプルのサブセット中、１１種の潜在的なバイオマーカーのセットを調査した。これらのタンパク質の一部は試合前と比べて試合後の上昇を示したが、これは、対象が頭部打撃を多く（または一度でも）経験したかどうかにかかわらず、多くの場合に当てはまった。この唯一の例外は、頭部打撃の回数と相関した試合後の増加を示したＵＣＨＬ１であった。興味深いことに、ＵＣＨＬ１に関する文献には様々な研究における変化に関する多くの報告が含まれているが、これは統一された所見ではなく、また多くの研究は、ｍＴＢＩ後の発現の減少または変化の欠如を主張している。我々のデータは、血清中のＵＣＨＬ１の発現増加が、ｍＴＢＩの最も重度な症例（すなわち、３０回以上の頭部打撃を受けたＭＭＡ選手）にのみ観察され得ることを示す。注目すべきことに、ＵＣＨＬ１及びＧＦＡＰの尺度を用いる脳震盪の血液検査が、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎにより近年認可された［ｈｔｔｐｓ：／／＿ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｎｅｗｓｅｖｅｎｔｓ／ｎｅｗｓｒｏｏｍ／ｐｒｅｓｓａｎｎｏｕｎｃｅｍｅｎｔｓ／ｕｃｍ５９６５３１．ｈｔｍ］。
【０１９０】
ｍｉＲＮＡバイオマーカー。１０代の子供におけるＴＢＩに関する近年の研究を含め、ｍｉＲＮＡを使用したｍＴＢＩの潜在的な血液または他の生体液による尺度に関するいくつかのヒト研究が発表されている。これらの研究は一般的に、ｍＴＢＩ対象及び対照対象のクロスセクション比較における単一の時点の検査、または複数の時点にわたる少数のｍｉＲＮＡの集中的検査に焦点を当てている。エクササイズによる傷害または頭部以外の傷害（例えば、ｍＴＢＩの筋骨格傷害対照）を用いた研究はごくわずかである。実験動物における他の研究は一般的に齧歯動物を用い、多くの場合、複数の時点、または重度ＴＢＩにより類似した開放性ＴＢＩ手術を用いた。開放術式は明らかに、通常の状況下の軽度ＴＢＩにおいて起こる範囲を超えた条件を導入する。我々の研究では、ｍｉＲＮＡデータに関するｍＴＢＩ重症度及び時間の問題を探求し、その変化を機能的データ及び当分野における過去の所見と関連付けようと試みた。
【０１９１】
我々の候補ｍｉＲＮＡバイオマーカーの大多数は、過去の文献において報告されていない。各ｍｉＲＮＡ及び機能的アウトカムメジャーを正規化するためにベースライン時点を使用したことが、より高い検知感度をもたらした可能性が高い。しかしながら、我々の候補ｍＴＢＩバイオマーカーのうちのいくつかは過去に報告されている。これらのｍｉＲＮＡバイオマーカーは、同じｍｉＲＮＡ遺伝子に由来する完全なマッチまたは関連性の高いマッチと規定することができる。我々が頭部打撃に関連する変化を検知したｍｉＲＮＡのうち、１２種は新規であり、９種は、ＴＢＩの過去の研究において特定されたものとの完全なマッチか、またはそれらとの関連性が高かった。我々のデータにおいて決定的な時間経過変化があったｍｉＲＮＡのうち、１７種は新規であり、７種は、ＴＢＩの過去の研究において報告されたものとの完全なマッチか、またはそれらとの関連性が高かった（表２６）。注目すべきことに、我々が特定した今回のｍｉＲＮＡのうち３種は、軽度ＴＢＩを有する子供の唾液中で変化したと過去に報告されているものと同じであり、３種は、それらとの関連性が高かった（表２６）。更に、完全なマッチ及び関連性の高いマッチのうちのいくつかは、ヒトまたは齧歯動物の末梢血、ならびにヒトＣＳＦまたは齧歯動物の脳組織をサンプリングしたＴＢＩの研究においても見られた。
【０１９２】
我々は、中枢神経系（ＣＮＳ）と末梢部位との間のｍｉＲＮＡの輸送に強い関心をもっている。血液脳関門（ＢＢＢ）の阻害はあらゆるレベルのＴＢＩ重症度で起こるため、血清バイオマーカーは、影響を受けた個体のＣＮＳにおいて生じる病理学的プロセスの間接的な読み出し情報として機能し得るとする理解が一般的である。しかしながら、さほど明らかでないのは、脳機能の変化がどのように唾液に反映され得るかである。２つの潜在的なルートが注目に値する。第１に、脳幹は、唾液腺及び舌を神経支配する脳の感覚神経（Ｖ、ＶＩＩ、ＩＸ）及び運動神経（ＸＩＩ、Ｘ、ＸＩＩ）を介し、潜在的なＣＮＳから口腔へのルートをもたらす。同様のＣＮＳから唾液への伝達機構は、狂犬病ウイルス感染において生じる。狂犬病ウイルス感染では、ウイルスが筋肉から脳へ移動し、最終的には唾液腺を神経支配する脳神経に至る。ｍｉＲＮＡが口に送達される第２のルートには、グリンパティック系を介した緩徐な輸送が関わるが、この特性はまだ十分に評価されていない。
【表２６】
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【０１９３】
実施例３
ＴＢＩ及びＴＢＩからの回復に関する唾液ｍｉＲＮＡの予測有用性
研究集団。この研究には、ｍＴＢＩの臨床診断を受けた７〜２１歳の対象が含まれた。ｍＴＢＩ群は、初回頭部傷害の１４日以内にｍＴＢＩの評価のためにＰｅｎｎ  Ｓｔａｔｅ  Ｈｅｒｓｈｅｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒを訪れた６１名の子供及び青年から構成された。この１４日のカットオフ期間は、ほとんどの臨床症状及びバイオマーカープロファイルが脳震盪の２週間以内にベースラインに戻ると示した過去の調査（ＭｃＣａｒｔｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）に基づいて選択した。傷害時にＧＣＳ≦１２、ｓＴＢＩの臨床診断、穿通性頭部傷害、頭蓋骨骨折、頭蓋内出血を有した対象、または抑うつもしくは不安に起因し得る症状があった者は除外した。更なる除外基準は、英語以外の一次言語、法定管理下にある者（ｗａｒｄｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｔａｔｅ）、歯周病、上気道感染症、局所神経障害、片頭痛歴、及び薬物／アルコール乱用であった。
【０１９４】
データ収集。各対象について、年齢、体重、身長、性別、民族性、薬物／食物アレルギー、精神医学的病歴、感音障害、薬歴、及び現在の中咽頭ステータス（例えば季節性アレルギー、歯牙充填）を含む、医学的特性及び人口学的特性を記録した。脳震盪歴：傷害後の時間、受傷機転、直近の症状（記憶喪失、意識消失、嘔吐、発作、骨折、または脱力感）、最後に鎮痛薬（非ステロイド性抗炎症薬またはアセトアミノフェン）を使用した時間、及び脳震盪の既往歴も記録した。認知的及び身体的な脳震盪症状を評価するため、登録時に各対象及びその親に小児ＳＣＡＴ−３の症状評価部分を供与した（Ｋｉｒｋｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。初回傷害日の４週間後、小児ＳＣＡＴ−３による症状の再評価のために対象及び親と電話連絡をとった。４週間時点の自己申告または親による報告のいずれかでＳＣＡＴ−３スコアが≧５であった３０名の対象は、ＰＣＳを有するものとして分類した。可能であれば、電子医療記録の審査によってフォローアップ診察時にＰＣＳの存在を確認した。残りの対象は、急性脳震盪症状（ＡＣＳ）を有するものとして分類した。４週間時点でＰＣＳを有した対象には、更なるＳＣＡＴ−３の電話による評価のために、８週間時点で再度連絡した。４週間時点におけるフォローアップのＳＣＡＴ−３問診が完了できず、フォローアップの来診がなかった７名の対象は、研究から除外した。
【０１９５】
ＲＮＡの収集、プロセシング、及び定量化。登録時に非絶食状態の各対象に、水道水で口をゆすいだ後に喀痰させることにより、唾液を収集した。各対象は、Ｏｒａｇｅｎｅ  ＲＥ−１００唾液収集キット（ＤＮＡ  Ｇｅｎｏｔｅｋ；Ｏｔｔａｗａ，Ｃａｎａｄａ）に喀痰した。サンプルを５〜１０回手で振盪し、４℃の冷蔵庫に移す前に室温で最長１０日間保管した。我々が過去に報告したように（Ｊ．Ｈｅａｄ  Ｔｒａｕｍａ  Ｒｅｈａｂｉｌ．，１９９３）、Ｎｏｒｇｅｎ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｅｘｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｎｏｒｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｋ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）を製造元の説明に従って用い、ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ濃度をＮａｎｏｄｒｏｐ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｍｅｔｅｒで定量化し、シーケンシングする前に−８０℃で保管した。ライブラリー構築の前にＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いてＲＮＡの収率及び品質を評価した。唾液ＲＮＡのシーケンシングは、Ｐｅｎｎ  Ｓｔａｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙにて、ＮＥＸＴｆｌｅｘ  Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ  Ｋｉｔ  ｖ３（Ｂｉｏｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘａｓ）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２５００  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、及び１サンプル当たり３００万リードの標的深度を使用して行った。Ｐａｒｔｅｋ  Ｆｌｏｗソフトウェア（Ｐａｒｔｅｋ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）及びＳＨＲｉＭＰ２アライナを使用し、リードをヒトゲノムのｈｇ３８ビルドにアライメントした。ｍｉＲＢａｓｅ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｖ２１を用い、各サンプル中の全ｍｉＲＮＡカウントを定量化した。全ｍｉＲＮＡカウントが２．５×１０４未満であった３つの唾液サンプルを最終分析から除外し、結果として５２個の最終的なｍＴＢＩサンプルを得た。少なくとも２２／５２（４２％）のサンプルにおいて生リードカウントが１０超であったｍｉＲＮＡのみを、差次的発現分析において評価した。この判断基準は、ＰＣＳを有する対象と、ｍｉＲＮＡがＰＣＳまたはＡＣＳ群にのみ存在し得る可能性との比に基づくものであった。統計分析の前に、生リードカウントを分位数正規化し、平均センタリングし、各変数の標準偏差で除算した。
【０１９６】
統計分析。統計分析は、報告されている（Ｊ．Ｈｅａｄ  Ｔｒａｕｍａ  Ｒｅｈａｂｉｌ．，１９９３）Ｍｅｔａｂｏａｎａｌｙｓｔオンラインソフトウェアを使用して行った。誤検知率（ＦＤＲ）補正を用いたノンパラメトリックＭａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ検定により、ＰＣＳ群とＡＣＳ群との間で差次的に発現した唾液ｍｉＲＮＡを特定した。二次元の部分的最小二乗判別分析（ＰＬＳＤＡ）を使用して、小児ＰＣＳにおける唾液ｍｉＲＮＡプロファイルの予後診断能力を精査した。各ｍｉＲＮＡについて、各次元の説明された分散を考慮に入れたＰＬＳＤＡの重みの重み付き二乗和である、射影における変数重要度（ＶＩＰ：ｖａｒｉａｂｌｅ  ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）を求めた。ＶＩＰスコアが最も大きかった１５種のｍｉＲＮＡを報告した。ＰＬＳＤＡから得た１５種のｍｉＲＮＡのＰＣＳ予測精度を評価するために、多変量ロジスティック回帰分析を使用した。ｍｉＲＮＡの濃度を比として回帰に用い、サンプル間の全ｍｉＲＮＡの変化の第２のレベルの対照とした。受信者動作特性プロットの曲線下面積（ＡＵＣ）を測定することによって精度を判定し、１００重Ｍｏｎｔｅ  Ｃａｒｌｏ交差検証技術を用いて検証した。成績上位のｍｉＲＮＡ群のＡＵＣを、１）ＳＣＡＴ−３のうち子供が回答する部分の合計症状スコア；２）ＳＣＡＴ−３のうち親が回答する部分の合計症状スコア；及び３）Ｚｅｍｅｋ及び共同研究者ら（Ｂａｂｃｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）によって過去に説明されている性別、年齢、脳震盪の既往歴、頭痛、疲労、処理の難しさ、及び片頭痛歴を用いる修正されたＰＣＳリスクスコアという、３つの臨床的尺度のＡＵＣに対して比較した。この最後のツールは、バランス誤差スコア及び雑音への過敏性の評価がないことから、部分的に限定されていたことに留意されたい。１５種の唾液ｍｉＲＮＡ（傷害時に測定）とＰＣＳ特性（傷害の４週間後に測定）との間の関連性を、Ｐｅａｒｓｏｎ相関検定で評価した。Ｐｅａｒｓｏｎ相関は、唾液ｍｉＲＮＡと医学的／人口学的変数との間の潜在的な交絡関係を調査するためにも使用した。両側スチューデントｔ検定を用い、ＰＣＳ群及びＡＣＳ群間の医学的データ及び人口学的データの分析を達成し、ｐ値＜０．０５を群間の有意差ありと見なした。ＤＩＡＮＡ  ｍｉｒＰａｔｈ  ｖ３オンラインソフトウェア（Ｈｙｐｅｒ  Ｔｅｘｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  Ｓｅｃｕｒｅ（ＨＴＴＰＳ）：／／ｓｎｆ−５１５７８８．ｖｍ．ｏｋｅａｎｏｓ．ｇｒｎｅｔ．ｇｒ／）を使用し、上位１５種のｍｉＲＮＡを脳傷害及び修復に対する機能的関連性について検査した。ＤＩＡＮＡのｍｉｃｒｏＴ−ＣＤＳアルゴリズム（０．９０の標的カットオフスコアを用いる）（Ｂａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）を用い、各ｍｉＲＮＡについて、ヒト特異的で高信頼度の遺伝子標的を特定した。ｍｉＲＮＡ遺伝子標的によって過剰表現されたジーンオントロジー（ＧＯ）及びＫＥＧＧ経路カテゴリーを報告した（ＦＤＲ＜０．０５；Ｆｉｓｈｅｒ直接検定）。
【０１９７】
参加者。５２名の参加者（平均年齢１４歳；女性４２％）がこの分析に含まれた。ＡＣＳ群（ｎ＝２２）とＰＣＳ群（ｎ＝３０）との間で、人口学的特性、医学的特性、または脳震盪特性の差はなかった（表２７）。参加者の大多数は白人であり、２５％超は唾液収集の６時間以内に非ステロイド性抗炎症薬またはアセトアミノフェンを使用していた。対象の１５パーセントは、刺激薬または選択的セロトニン再取り込み阻害薬を登録時に服用していた。参加者の大多数は各自の脳震盪から１週間以内に登録し、最も一般的な受傷機転はスポーツ（４２％）及び自動車衝突（１５％）であった。約半数には脳震盪歴があった（４６％）。傷害時に最も一般的に報告された症状は、記憶喪失（４８％）及び意識消失（２７％）であった。
【表２７】
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【０１９８】
症状の報告
小児ＳＣＡＴ−３の症状評価部分を、初回評価時（傷害の２週間以内）、そして傷害の４週間後に再び、全ての参加者及びその親に供与した（表２８）。
【表２８】
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【０１９９】
小児スポーツ脳震盪評価ツール（ＳＣＡＴ−３）の平均症状スコアが示されている。親及び子供による症状報告を、登録時（傷害後０〜１４日目）、傷害４週間後、及び傷害８週間後（ＰＣＳ群のみ）に収集した。各評価時において、子供及び親の両方に２０種の震盪性症状を０〜４のＬｅｉｃｈｅｒスケールで格付けさせた。最大で８０の重症度スコアが可能であり、最大で合計２０種の症状報告が得られる。各診察時に評価された２０種の症状のうち、ＡＣＳ群とＰＣＳ群との間で有意差があったもの（傷害後０〜１４日目）、または最も一般的に報告されたもの（４週間及び８週間）のみを示してある。
【０２００】
初回評価時、ＰＣＳの発症へと進行した子供は、より高い症状重症度スコア（ｐ＝０．０４４）を報告したが、症状の数に差はなかった。ＰＣＳの発症へと進行した子供の親は、初回時には子供の症状重症度または症状の総数の差を報告しなかった。子供の調査において質問された２０種の症状のうち、５種はＡＣＳ群とＰＣＳ群との間で異なっていた。ＰＣＳの発症へと進行した子供は、「集中することが難しい」（ｐ＝０．０３０）、「人に言われたことを覚えておくのが難しい」（ｐ＝０．０２７）、「白昼夢をよくみる」（ｐ＝０．０４８）、「頭痛がある」（ｐ＝０．００５）、及び「かなり疲れる」（ｐ＝０．００２）に対してより高い症状スコアを認めた。ＰＣＳ群の親の初回調査では、２０種の症状のうち、「子供の集中力が乏しい」（ｐ＝０．０１８）、及び「子供がめまいを感じる」（ｐ＝０．０４５）の２種の重度がより高かった。傷害４週間後のＰＣＳ群は１８の平均重症度スコアを有し、平均して１１／２０種の震盪性症状を認めた。「かなり疲れる」及び「すぐに疲れる」は、傷害４週間後の参加者によって最も一般的に認められた症状であり、それぞれ参加者の９０％及び８５％に見られた。１５名の参加者には、傷害後８週間時点で引き続き震盪性症状（ＳＣＡＴ−３スコア＞５及び／または臨床的に関連する来診）があった。この時に最も一般的に報告された症状は、「人に言われたことを覚えておくのが難しい」（９２％）であった。５名のＰＣＳ参加者は傷害後８週間時点で症状が解消しており、１０名の参加者は追跡不能であった。
【０２０１】
マイクロＲＮＡの発現
分析した５２個の唾液サンプルにおいて、平均リードカウントは、１サンプル当たり２．１×１０５リードであり、４３７種のｍｉＲＮＡが少なくとも２２／３０個のサンプルで検知された。これら４３７種のｍｉＲＮＡのうち１４種は、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定（表４Ｂ）においてＡＣＳ群とＰＣＳ群との間で名目上の差を示したが、多重検定補正の後に残ったものはなかった。これら１４種のｍｉＲＮＡのうち３種はＡＣＳ対象において下方調節され、１１種は上方調節された。ＡＣＳ群とＰＣＳ群との間で最も有意に変化した５種のｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−７６９−５ｐ（１．８ＦＣ；ｐ＝０．００２）、ｍｉＲ−２１５−５ｐ（２．４ＦＣ；ｐ＝０．０２４）、ｍｉＲ−７６９（２．５ＦＣ；ｐ＝０．０２５）、ｍｉＲ−３２０ｃ−１（０．４４ＦＣ；ｐ＝０．０２８）、及びｍｉＲ−１９４−２（１．４ＦＣ；ｐ＝０．０２８）を含んだ。４３７種全てのｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ発現レベルを用いたＰＬＳＤＡでは、データセットにおける分散の２１．５％を考慮しつつ、ＡＣＳ群とＰＣＳ群との部分的な空間的分離が達成された（表２９Ａ〜Ｂ）。ＶＩＰスコアにより、ＡＣＳ対象とＰＣＳ対象との分離のために最も重要な１５種のｍｉＲＮＡが特定された（図１８）。これらのｍｉＲＮＡのうちの２種（ｍｉＲ−３０ｅ及びｍｉＲ−３２０ｃ）は、６種の唾液ｍｉＲＮＡのセットにおいて、小児ｍＴＢＩ後の唾液中で（健康な対照と比べて）有意に変化したものとしてこれまでに特定されている。１５種のｍｉＲＮＡのうちある特定のものは、過去のＴＢＩ調査において特定されている。
【表２９】
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【０２０２】
全ｍｉＲＮＡプロファイルはＡＣＳ群とＰＣＳ群との部分的分離を達成する。ＰＬＳＤＡは、唾液ｍｉＲＮＡプロファイルを使用したＡＣＳ群とＰＣＳ群との空間的分離を示す（図１９）。
【０２０３】
マイクロＲＮＡの機能。ＰＬＳＤＡにおいてＡＣＳ群とＰＣＳ群とを最も正確に差別した１５種のｍｉＲＮＡの機能的標的をＤＩＡＮＡ  ｍｉＲＰＡＴＨソフトウェアで調べた。１５種のｍｉＲＮＡは、高信頼度（ｍｉｃｒｏ−ｃ−ｔｄｓスコア＞０．９０）の２４２９種の遺伝子を標的とした。これらの遺伝子は、６２種のＧＯ経路及び２２種のＫＥＧＧ経路に関係していた（表３０）。最も有意に過剰表現されたＧＯ経路はオルガネラであり（ｐ＝２．７７Ｅ−６１；１００９種の遺伝子；１４種のｍｉＲＮＡ）、最も過剰表現されたＫＥＧＧ経路は細胞外マトリックス−受容体相互作用であった（ｐ＝２．３１Ｅ−１３；１６種の遺伝子、７種のｍｉＲＮＡ）。標的とされたＧＯ経路及びＫＥＧＧ経路の中には、シナプス発達、神経細胞移動、及び修復に関連するいくつかのシグナル伝達カスケードがあった（表３１）。標的とされたＧＯ経路には、ニューロトロフィンＴＲＫシグナル伝達（３４種の遺伝子）、軸索ガイダンス（６１種の遺伝子）、及び神経系の発達（５６種の遺伝子）が含まれた。目的のＫＥＧＧ経路の中には、神経膠腫（１４種の遺伝子）、ＦＯＸＯシグナル伝達（２９種の遺伝子）、及びＷｎｔシグナル伝達（２２種の遺伝子）があった。１５種のｍｉＲＮＡの階層的クラスタリング分析は、遺伝子標的の機能に基づく３つの特徴的なｍｉＲＮＡクラスター：ｍｉＲ−６２９−３ｐ及びｍｉＲ−１３３ａ−５ｐ；ｌｅｔ−７ａ−５ｐ及びｌｅｔ−７ｂ−５ｐ；ｍｉＲ−３２０ｃ及びｍｉＲ−２００ｂ−３ｐを示した（図２０）。
【表３０】
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【０２０４】
症状及びｍｉＲＮＡの相関性
症状特性（傷害４週間後）及び１５種の唾液ｍｉＲＮＡの濃度（初回評価時）に関するＰｅａｒｓｏｎ相関を求めた。１２種のｍｉＲＮＡ−症状ペアの間で名目上の相関性（ｐ＜０．０５）が特定された（図２１）。これらの相関性のうち３つは、多重検定補正の後に残った。ｍｉＲ−３２０ｃ−１は、「人に言われたことを覚えておくのが難しい」と正の相関性を有し（Ｒ＝０．５５；ＦＤＲ＝０．０２）、ｍｉＲ−６２９は、「頭痛がある」と正の相関性を有し（Ｒ＝０．４７；ＦＤＲ＝０．０４）、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐは、「かなり疲れる」と正の相関性を有した（Ｒ＝０．４５；ＦＤＲ＝０．０４）。個々のｍｉＲＮＡは、互いと正の相関性及び負の相関性の両方を示し、個々のＳＣＡＴ−３項目の大多数は、互いと正の相関性を有した。しかしながら、個々のＳＣＡＴ−３項目と合計ＳＣＡＴ−３スコアとの間に相関性はなかった。子供と親の合計ＳＣＡＴ−３症状スコアは、互いに正の相関性を有したが、個々のｍｉＲＮＡまたは個々の子供の症状項目とは正の相関性を有しなかった。
【０２０５】
予測有用性。ＰＬＳＤＡから得た１５種のｍｉＲＮＡのＰＣＳ予測精度を評価するために、多変量ロジスティック回帰分析を使用した。最も予測能が高かったｍｉＲＮＡの分類精度の試験を、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線で可視化した。５種のｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−３２０ｃ−１、ｍｉＲ−１３３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−７６９−５ｐ、ｌｅｔ−７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３０７−３ｐ）を用いるモデルは、ＰＣＳステータスに関して８０％の感度及び７５％の特異度で最も高い分類精度（ＡＵＣ＝０．８５６；９５％ＣＩ：０．８２２〜０．８９０）を示した（図２２Ａ）。データのオーバーモデリングを避けるため、２つの検証技術を試験した。１０重交差検証技術は、０．８１２のＡＵＣを示した。加えて、各群のサンプルのうち最初の２０％をホールドアウトし、０．７９２の初期ＡＵＣが得られ、ホールドアウトセットのＡＵＣは０．９３３であった（図２２Ｂ及び図２２Ｃ）。それに比べ、子供の合計ＳＣＡＴ−３重症度スコアまたは親の合計ＳＣＡＴ−３重症度スコアを使用したロジスティック回帰モデルは、それぞれ０．６４９及び０．５６２のＡＵＣを示した（図２２Ｄ及び図２２Ｅ）。合計ＳＣＡＴ−３スコアはＰＣＳリスクの最も正確な臨床評価をもたらさないことがいくつかの研究で示されているため、我々は、ｍｉＲＮＡパネルをＰＣＳリスクの第２の臨床的尺度に対して比較することにした。Ｚｅｍｅｋ及び共同研究者らによって開発されたＰＣＳ予測ツールの修正バージョンを用い、５２名の対象におけるＰＣＳステータスを射影した。各対象につき、９つのうち７つの（バランス及び雑音への過敏性を除外した）利用可能なリスク因子を用い、リスクスコアを遡及的に計算した。我々の対象において、このリスク計算式（ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ）は、ＰＣＳステータスの予測に関し、Ｚｅｍｅｋ及び共同研究者らによる元の報告に記載されたものと同様の性能である０．６２５のＡＵＣを示した（図２２Ｆ）。図２３Ａ〜図２３Ｈは、ＴＢＩ後の唾液−ＣＳＦにおけるｍｉＲＮＡの重複を示す。
【０２０６】
更に、傷害４週間後の症状報告に基づく２つの群を調査した。１つの群はＰＳＣ群であり、第２の群は急性脳震盪症状（ＡＣＳ）群であった。唾液を傷害の２週間以内に収集し、ｍｉＲＮＡをＲＮＡシーケンシングで定量化し、傷害後０週目、４週目、及び８週目にスポーツ脳震盪評価ツール（ＳＣＡＴ−３）を行った。
【０２０７】
本開示は、対象が疾患、障害、または状態（例えば外傷性脳傷害）を有するかどうかを判定するのに好適な、プローブセットの２つ以上のｍｉＲＮＡプローブを含むキットも想定する。各ｍｉＲＮＡプローブは、本明細書に記載の特定のｍｉＲＮＡに対応するリボヌクレオチド配列を含み得る。ある実施態様では、本キットは、２つ以上のｍｉＲＮＡプローブに結合した固体支持体を更に含み得る。ある実施態様では、本キットは、（ａ）陰性対照として使用されるように適合された、１つのランダムに生成されたｍｉＲＮＡ配列、（ｂ）全ＲＮＡ分解の標準対照として使用される、ハウスキーピング遺伝子に由来する少なくとも１つのオリゴヌクレオチド配列、または（ｃ）陽性対照として使用される、少なくとも１つのランダムに生成された配列のうち、少なくとも１つを更に含み得る。
【表３１】
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【０２０８】
生物学的妥当性
ｍｉＲＮＡの標的となるＫＥＧＧ経路：
−ＦｏｘＯシグナル伝達（ｐ＝０．００１；２９種の遺伝子）、
−軸索ガイダンス（ｐ＝０．００３；２３種の遺伝子）、
−神経膠腫（ｐ＝０．０００４；１４種の遺伝子）、
−ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達（ｐ＝０．０００４；５７種の遺伝子）。
【０２０９】
ｍｉＲＮＡ−３２０ｃは、４週間時点で特定の症状に関連している（図２７）。
【０２１０】
本明細書において示すように、唾液マイクロＲＮＡは、高い予後診断の可能性を呈し、唾液中で容易に測定され、ｍＴＢＩ後に変化し、脳で発現する遺伝子と機能的に関連または相互作用し、ＴＢＩ症状の持続時間を予測し、ＴＢＩの臨床的症状または他の身体的症状の性質と関連する。
【０２１１】
図２８は、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎツール（Ｚｅｍｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）を使用した回帰分析を示す。臨床リスクスコアは、性別、年齢、７日を超える症状（頭痛、疲労、処理の難しさ）のある脳震盪歴を含む因子を考慮する。図２９Ａ及び図２９Ｂは、ＰＣＳステータスを予測するためにこれらｍｉＲＮＡのサブセットを使用するロジスティック回帰モデルを提示する。
【表３２】
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【０２１２】
当業者であれば、この表中のデータに基づき、本明細書において開示される方法に適切なｍｉＲＮＡセット（複数可）を選択することができる。
【０２１３】
図３１は、小児ＳＣＡＴ−３スコアを使用した比較のための（性能不良の）ロジスティック回帰モデルを示す。
【０２１４】
ＰＣＳの検知及び予測に有用なＭｉＲＮＡ：ｍｉＲ−７６９、ｍｉＲ−７６９−３ｐ、ｍｉＲ−７６９−５ｐ、ｍｉＲ−３２０ｃ−１、ｍｉＲ−３２０ｃ−１−３ｐ、ｍｉＲ−３２０ｃ−１−５ｐ、ｍｉＲ−４７９２、ｍｉＲ−４７９２−３ｐ、ｍｉＲ−４７９２−５ｐ、ｍｉＲ−１４０、ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｍｉＲ−１４０−５ｐ、ｍｉＲ−６２９、ｍｉＲ−６２９−３ｐ、ｍｉＲ−６２９−５ｐ、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１９２−３ｐ、ｍｉＲ−１９２−５ｐ、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４５−３ｐ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｌｅｔ−７ａ、ｌｅｔ−７ａ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｓ−５ｐ、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１３０７、ｍｉＲ−１３０７−３ｐ、ｍｉＲ−１３０７−５ｐ、ｍｉＲ−２００ｂ、ｍｉＲ−２００ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２００ｂ−５ｐ、ｌｅｔ−７ａ、ｌｅｔ−７ａ−３ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４５０８、ｍｉＲ−４５０８−３ｐ、ｍｉＲ−４５０８−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｂ、ｌｅｔ−７ｂ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−１９４−３ｐ、ｍｉＲ−１９４−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｆ、ｌｅｔ−７ｆ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１２８−３ｐ、ｍｉＲ−１２８−５ｐ、ｍｉＲ−２１５、ｍｉＲ−２１５−３ｐ、ｍｉＲ−２１５−５ｐ、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−１４９−３ｐ、ｍｉＲ−１４９−５ｐ，ｍｉＲ−４２１、ｍｉＲ−４２１−３ｐ、及びｍｉＲ−４２１−５ｐ。
【０２１５】
実施例４
唾液ｍｉＲＮＡの長期的調査
急性時点（傷害の０〜３日後）、亜急性時点（傷害の７〜１７日後）、及び慢性時点（傷害の≧２８日後）で、医師により診断された軽度外傷性脳傷害のために三次医療センターを訪れた５０名の子供（７〜２１歳）から、唾液マイクロＲＮＡを収集した。受傷機転及び人口学的特徴を記録した。ＳＣＡＴ−５調査で主観的症状を評価し、ＣｌｅａｒＥｄｇｅ（登録商標）Ｃｏｎｃｕｓｓｉｏｎ  Ｔｏｏｌｋｉｔでバランス及び認知（例えば、処理速度、分割的注意能力）の機能的症状を測定した。ハイスループットＲＮＡシーケンシングで唾液マイクロＲＮＡレベルを定量化した。マイクロＲＮＡレベルと、１）傷害後の日数、２）ＣｌｅａｒＥｄｇｅ（商標）バランススコア、３）ＣｌｅａｒＥｄｇｅ（商標）認知スコア、及び４）参加者の年齢という４つの連続型変数との間の潜在的関係を特定するため、Ｓｐｅａｒｍａｎの順位相関を使用した。
【０２１６】
初期分析（ｎ＝３５）により、傷害後の日数とレベルが関連している（Ｒ≧０．４０；ｐ＜０．０５）６種のマイクロＲＮＡが特定された。これらのｍｉＲＮＡのうち３種（５０％）は、我々の過去の研究において潜在的バイオマーカーとして特定された（ｍｉＲ−５７４−５ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ）。これらのマイクロＲＮＡのうち１種（ｌｅｔ−７ｆ）は、参加者の年齢と負の関連性があり（Ｒ＝−０．４８；ｐ＝０．００９）、小児脳傷害の独特なバイオマーカーを表し得る。
【０２１７】
７種の唾液ｍｉＲＮＡはＣｌｅａｒＥｄｇｅ認知スコアと関連することが見出され、これらのうち２種（ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、Ｒ＝−０．４８、ｐ＝０．０１５；ｍｉＲ−３２０ｃ、Ｒ＝−０．４３、ｐ＝０．０３４）は過去の研究で特定された。過去に特定された３種のマイクロＲＮＡは、ＣｌｅａｒＥｄｇｅバランススコアとも関連していた（ｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｍｉＲ−７４４−５ｐ、ｍｉＲ−７６９−５ｐ）。
【０２１８】
この研究は、一定期間にわたる脳傷害症状の重症度に関する見識を提供するため、また傷害の回復の程度ならびに持続時間を推定するために、唾液中のｍｉＲＮＡプロファイルを評価することの価値を示す。これまで本発明者らは、外傷性脳傷害後の唾液中のマイクロＲＮＡプロファイルが脳脊髄液中のマイクロＲＮＡプロファイルと重複することを示してきた。これらのプロファイルは、脳傷害ステータスを特定し、どの患者が長期の症状を経験するかを予測するにあたっての有用性を示す。このような情報は、患者及び家族に予測的ガイダンスを提供すること、または個別化された患者管理計画を作成することを目指す臨床医にとって有益となろう。このツールの更なる開発には、脳傷害関連マイクロＲＮＡがどのように経時的に変化するか、そしてマイクロＲＮＡレベルが機能的症状尺度とどのように関連するかの理解を深めることが必要である。
【０２１９】
バランス及び認知の尺度と併せた唾液ｍｉＲＮＡバイオマーカーの長期的調査は、ｍｉＲＮＡが経時的な発現傾向を示し、脳傷害後の客観的症状と関連することを示す。マイクロＲＮＡのサブセットは、患者の年齢と相関し、小児脳傷害の独特なシグネチャーを表し得る。これらの結果は、ｍｉＲＮＡに基づく診断法または予後診断法の、脳傷害の非侵襲性で客観的な尺度としての有用性、ならびに傷害の長期的評価及び回復中のバランス及び認知の評価尺度のためのそれらの有用性を示す。
【０２２０】
実施例５
発現及び存在量において概日リズムを呈する唾液ｍｉＲＮＡ
参照により本明細書に組み込まれている２０１８年３月２０日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０２３３３６に記載されているように、唾液ｍｉＲＮＡの一部分は強い概日リズムを呈し（「ｃｉｒｃａｍｉＲＮＡ」）、その多くが、概日リズムに関連する公知の遺伝子を標的とする。これらのｍｉＲＮＡの一部は、特定の微生物のレベルと関連して振動または変動する。
【０２２１】
１日を超える間隔における唾液収集。この研究には１１名のヒト対象志願者が参加し、連日様々な時刻で、３回の異なるサンプル収集において唾液サンプルを提供した。唾液はスワブによって収集し、唾液調製キットを使用して調製した。
【０２２２】
収集１：１日目、３日目、及び７日目の午前８時及び午後８時にサンプル収集。
【０２２３】
収集２：１日目、５日目、１０日目、及び１５日目の午前８時、午後１２時、午後４時、及び午後８時のサンプル。
【０２２４】
収集３：１日目及び２日目の終日、反復しない１２の時点。
【０２２５】
唾液ｍｉＲＮＡ及び微生物内容物の特定及び定量化は、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＳＵＮＹ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｃｏｒｅ（ＳＵＮＹＭＡＣ）にて、ＮｅｘｔＳｅｑ  ５００機器で次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を使用し、ＴｒｕＳｅｑ（登録商標）Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔプロトコール（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に従って行った。Ｐａｒｔｅｋ  ＦｌｏｗソフトウェアでＳＨＲＲｉＭＰ２（登録商標）アルゴリズムを使用し、ｍｉＲｂａｓｅ２１データベースに対してＮＧＳリードのアラインメントを行い、成熟ｍｉＲＮＡを特定した。Ｋｒａｋｅｎソフトウェア及びＯｎｅＣｏｄｅｘ（登録商標）ソフトウェアを使用し、マイクロバイオームリードのマッピングを行って、両方で一貫して見られた微生物のみを特定した。「リード」または「リードカウント」という用語は、例えば、サンプル中の全てのｍｉＲＮＡのレベルをより正確に比較することができるように、予測可能なレベルで唾液中に常に存在するある特定の対照ｍｉＲＮＡまたは代謝物の発現レベルを使用してそれらを正規化することなど、サンプル間の変化を考慮するためにｍｉＲＮＡまたはマイクロバイオームの発現データを調整するための任意の方法に適用されるものと理解されたい。
【０２２６】
代替的な実施形態では、ｍｉＲＮＡ及び／またはマイクロバイオームのレベルを判定するために、蛍光を用いる方法を使用する。一例では、本明細書に記載の標的ｍｉＲＮＡの一部または全てを標的とする別々のリガンド群を、基質上にまとめて固定する。標的ｍｉＲＮＡ及びマイクロバイオーム配列には、リガンドに結合する前または後のいずれかで、蛍光タグ（または非蛍光色素）をタグ付けする。各リガンド群における相対強度は、存在するｍｉＲＮＡ及び／またはマイクロバイオームの量の尺度になり得る。この方法は、チップタイプのアッセイで実施してもよい。ｍｉＲＮＡ及び／またはマイクロバイオームのレベルを判定するために、他の好適なチップタイプのアッセイを使用してもよい。
【０２２７】
統計分析。収集１及び２のサンプルセットに二元分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して、収集日（ルーチンにおける毎日の変化に強く影響される可能性があった）ではなく収集時間によって有意に変化したｍｉＲＮＡ及び微生物を特定した。次に、これらのｍｉＲＮＡ及び微生物のサブセットを第３のサンプルセットに使用し、多変数線形回帰を使用して収集時間の予測精度を評価した。最も強い概日振動を示したＭｉＲＮＡをｃｉｒｃａＭｉＲと名付け、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）ソフトウェアを使用して、合計１３９種のアノテートされた概日遺伝子の予測される調節因子であるかを調査した。次にＰｅａｒｓｏｎ相関分析を使用し、概日遺伝子を標的とするＣｉｒｃａＭｉＲを、最も強く概日振動する微生物との関連性の証拠について調査した。次にＩＰＡ及びｍｉＲｐａｔｈソフトウェアを使用し、ｃｉｒｃａＭｉＲの標的となる遺伝子の機能を、それらの特異的な生物学的機能について調査した。
【０２２８】
２４サンプルデータセット：合計３５種のｍｉＲＮＡが、収集時間の高度に有意な効果を示し（ＦＤＲ＜０．００１）、収集日の効果はなかった。
４８サンプルデータセット：合計４１種のｍｉＲＮＡが、収集時間の高度に有意な効果を示し（ＦＤＲ＜０．００１）、収集日の効果はなかった。
図３２に示すように、１９種のｍｉＲＮＡは両方で共通して変化し、第３のデータセットにおいて収集時間を予測する能力について調査した。
【表３３】
2020512017.tif 000105
【０２２９】
Ａ群及びＢ群のｃｉｒｃａＭｉＲを表３４に記載する。
【表３４】
2020512017.tif 000106
【０２３０】
表３４は、本明細書に記載の方法を使用して疾患もしくは障害を有する対象から健康な対象を区別するために使用され得るｃｉｒｃａＭｉＲ、または濃度もしくは存在量の概日変動に対して調整するために正規化され得るｃｉｒｃａＭｉＲを掲げる。これらの目的のためには、上記表中のｍｉＲＮＡのいずれかと同じシード配列を共有する他のｍｉＲＮＡを使用してもよい。
【０２３１】
図３３には、２回／日（午前８時、午後８時）の頻度における３日間のサンプリング（１日目、３日目、７日目）の間で、４名の対象から得た２４個のサンプル中、収集時間によって変化した１９種のｍｉＲＮＡに関する発現データのヒートマップクラスタリングが示されている。図３４には、４回／日（午前８時、午後１２時、午後４時、午後８時）の頻度における４日間のサンプリング（１日目、５日目、１０日目、１５日目）の間で、３名の対象から得た４８個のサンプル中、収集時間によって変化した１９種のｍｉＲＮＡに関する発現データのヒートマップクラスタリングが示されている。図３５には、収集３（様々な時点での収集）における対象のうち３名について示された、上位１９種のｍｉＲＮＡのうち１種の正規化データが示されている。概日リズムシグナル伝達に関与する４５種の遺伝子が、ｃｉｒｃａＭｉＲのうち１４種の標的として特定された（図３６）。これは、ＩＰＡにおける概日機能に関与する合計１３９種のアノテートされた遺伝子のほぼ１／３である。図３６では、１種のｍｉＲＮＡの標的となる遺伝子は灰色で強調され、１４種中２種以上のｍｉＲＮＡの標的となる遺伝子は赤で強調されている。標的にならなかった遺伝子は白で表示されている。
【０２３２】
唾液ｍｉＲＮＡレベルの一部分は強い概日パターンを示す。この観察は、過去には説明されていない。ほとんどの唾液ｃｉｒｃａＭｉＲ、例えば表３４に記載のものは、脳、代謝、及びがん機能に関与する遺伝子に加えて、少なくとも１種以上の概日遺伝子を標的とする。
【表３５】
2020512017.tif 000107
【０２３３】
ＴＢＩまたは震盪性傷害などの特定の状態、障害、または疾患と相関または関連し、時間的変動または概日変動も呈するＭｉＲＮＡを使用した診断法及び予後診断法は、ｃｉｒｃａ−ＭｉＲにおける公知の概日変動に基づいて正規化され得る。代替的に、診断法及び予後診断法は、変動を避けるために固定された時刻でサンプルを得ることにより、これらの概日変動を制御し得る。他の実施形態では、診断法または予後診断法は、ｍｉＲＮＡ存在量または濃度の概日変動または他の時間的変動によって導入されるノイズまたは誤差を避けるために、一定または比較的不変の発現を呈するｍｉＲＮＡを使用し得る。
【０２３４】
上記の教示を踏まえ、本発明の多数の改変形態及び変更形態が可能である。したがって、添付の特許請求の範囲内において、本明細書に具体的に記載された以外のかたちで本発明が実施され得ることを理解されたい。
【０２３５】
本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態を説明することを目的としたものに過ぎず、本発明を限定することを意図するものではない。
【０２３６】
本明細書で使用される見出し（例えば「背景技術」及び「発明の概要」）及び小見出しは、本発明における題目を大まかに体系づけることのみを意図するものであり、本発明の開示内容またはそのいずれかの態様を限定することを意図するものではない。特に、「背景技術」に開示された主題は新規技術を含む場合があり、先行技術の記述にあたらない場合がある。「発明の概要」に開示された主題は、本技術またはそのいずれかの実施形態の全範囲の包括的または完全な開示ではない。ある物質が特定の有用性を有するものとして本明細書の一節で分類または詳解されている場合、これは便宜上行われるものであり、その物質が任意の所与の組成物中に使用される場合に本明細書におけるその分類に従って必ずまたは単独で機能する必要があると推断してはならない。
【０２３７】
本明細書において使用される場合、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という単数形は、文脈上他の意味が明らかに示される場合を除き、複数形も含むよう意図される。
【０２３８】
更に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び／または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、本明細書で使用される場合、挙げられた特徴、ステップ、工程、要素、及び／または構成要素の存在を規定するが、１つ以上の他の特徴、ステップ、工程、要素、構成要素、及び／またはそれらの群の存在または付加を除外しないことは理解されよう。
【０２３９】
本明細書において使用される場合、「及び／または（ａｎｄ／ｏｒ）」という用語は、掲げられた関連する項目のうちの１つ以上のありとあらゆる組み合わせを含み、「／」と省略される場合がある。
【０２４０】
リンクは、ｈｔｔｐ：を削除するか、またはｗｗｗの前にスペースもしくは下線付きスペースを挿入することによって無効化される。一部の事例では、「最終アクセス」日にリンクから利用可能な文章が参照により組み込まれている場合がある。
【０２４１】
本明細書及び特許請求の範囲において使用される場合（実施例において使用される場合を含み、別途明記される場合を除く）、全ての数字は、「実質的に」、「約」、または「およそ」という言葉が明示的に記載されていなくとも、これらの用語が前に置かれているかのように解釈され得る。「約」または「およそ」という表現は、程度及び／または位置について説明するとき、記載された値及び／または位置が合理的に予想される値及び／または位置の範囲内にあることを示すために使用され得る。例えば、数値は、挙げられた値（または値の範囲）の±０．１％、挙げられた値（または値の範囲）の±１％、挙げられた値（または値の範囲）の±２％、挙げられた値（または値の範囲）の±５％、挙げられた値（または値の範囲）の±１０％、挙げられた値（または値の範囲）の±１５％、挙げられた値（または値の範囲）の±２０％などである値をとり得る。本明細書に記述されるあらゆる数値範囲は、その中に包含される全ての部分的範囲を含むよう意図される。
【０２４２】
特定のパラメータ（例えば温度、分子量、重量パーセンテージなど）の値及び値の範囲の開示は、本明細書において有用な他の値及び値の範囲を除外するものではない。所与のパラメータについて例示される２つ以上の特定の値は、そのパラメータについて主張され得る値の範囲の両終点を定義し得ると想定される。例えば、本明細書においてパラメータＸが値Ａをとることが例示され、かつ値Ｚをとることも例示される場合、パラメータＸは、約Ａ〜約Ｚの範囲の値をとり得ると想定される。同様に、パラメータの値の２つ以上の範囲（そのような範囲が入れ子になっているか、重複しているか、または別個であるかを問わない）の開示は、開示される範囲の両終点を使用して主張され得る値の範囲の可能性のあるあらゆる組み合わせを包含すると想定される。例えば、本明細書においてパラメータＸが１〜１０の範囲内の値をとることが例示される場合、これは、単なる例として、１〜９、１〜８、１〜７、２〜９、２〜８、２〜７、３〜９、３〜８、３〜７、２〜８、３〜７、４〜６、または７〜１０、８〜１０、または９〜１０を含むパラメータＸの部分的範囲も表す。範囲は、その両終点ならびに終点内の値を包含する。例えば、０〜５の範囲は、０、＞０、１、２、３、４、＜５、及び５を含む。
【０２４３】
本明細書において使用される場合、「好ましい」及び「好ましくは」という言葉は、ある特定の状況下で、ある特定の便益を提供する、本技術の実施形態を指す。しかしながら、同じ状況または他の状況下で他の実施形態が好ましい場合もある。更に、１つ以上の好ましい実施形態に関する記述は、他の実施形態が有用でないことを暗示するものではなく、本技術の範囲から他の実施形態を除外することを意図するものでもない。
【０２４４】
本明細書において言及される場合、全ての組成パーセンテージは、別途規定されない限り、組成物全体の重量によるものである。本明細書において使用される場合、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」という用語及びその変化形は、リストの項目の記述が、本技術に係る物質、組成物、デバイス、及び方法において同様に有用であり得る他の類似項目を除外しないように、非限定的であるよう意図される。同様に、「〜することができる（ｃａｎ）」及び「〜し得る（ｍａｙ）」という用語ならびにそれらの変化形は、ある実施形態がある特定の要素または特徴を含むことができる（ｃａｎ）または含み得る（ｍａｙ）という記述が、それらの要素または特徴を含まない本発明の他の実施形態を除外しないように、非限定的であるよう意図される。
【０２４５】
本明細書において様々な特徴／要素（ステップを含む）を説明するために「第１の」及び「第２の」という用語が使用される場合があるが、文脈上他の意味が示される場合を除き、これらの特徴／要素は、これらの用語によって限定されないものとする。これらの用語は、１つの特徴／要素を別の特徴／要素と区別するために使用され得る。したがって、本発明の教示から逸脱することなく、後述される第１の特徴／要素が第２の特徴／要素と呼ばれることがあり、同様に、後述される第２の特徴／要素が第１の特徴／要素と呼ばれることもある。
【０２４６】
この記述及び具体例は本技術の実施形態を示すものであるが、説明を目的とするものに過ぎず、本技術の範囲を限定することを意図するものではない。更に、挙げられた特徴を有する複数の実施形態の記述は、更なる特徴を有する他の実施形態、または挙げられた特徴の異なる組み合わせを組み込んだ他の実施形態を除外することを意図するものではない。具体例は、本技術に係る組成物をどのように作製し、本技術に係る方法をどのように使用するかを説明する目的で提示されるものであり、別途明記される場合を除き、本技術の所与の実施形態が作製または試験されたか否かの表明を意図するものではない。
【０２４７】
文献
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８．Ｂｕｒｔｏｎ  ＬＪ，Ｑｕｉｎｎ  Ｂ，Ｐｒａｔｔ−Ｃｈｅｎｅｙ  ＪＬ，Ｐｏｕｒａｎｉ  Ｍ．Ｈｅａｄａｃｈｅ  ｅｔｉｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ａ  ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  ｅｍｅｒｇｅｎｃｙ  ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ．Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｅｍｅｒｇ  Ｃａｒｅ．１９９７；１３（１）：１−４．
９．Ｙｅａｔｅｓ  ＫＯ，Ｌｕｒｉａ  Ｊ，Ｂａｒｔｋｏｗｓｋｉ  Ｈ，Ｒｕｓｉｎ  Ｊ，Ｍａｒｔｉｎ  Ｌ，Ｂｉｇｌｅｒ  ＥＤ．Ｐｏｓｔｃｏｎｃｕｓｓｉｖｅ  ｓｙｍｐｔｏｍｓ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｗｉｔｈ  ｍｉｌｄ  ｃｌｏｓｅｄ  ｈｅａｄ  ｉｎｊｕｒｉｅｓ．Ｊ  Ｈｅａｄ  Ｔｒａｕｍａ  Ｒｅｈａｂｉｌ．１９９９；１４（４）：３３７−３５０．
１０．Ｂａｒｌｏｗ  ＫＭ，Ｃｒａｗｆｏｒｄ  Ｓ，Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  Ａ，Ｓａｎｄｈｕ  ＳＳ，Ｂｅｌａｎｇｅｒ  Ｆ，Ｄｅｗｅｙ  Ｄ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｐｏｓｔｃｏｎｃｕｓｓｉｏｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｉｎ  ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  ｍｉｌｄ  ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｊｕｒｙ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ．２０１０；１２６（２）：ｅ３７４−ｅ３８１．
１１．Ｚｅｍｅｋ  ＲＬ，Ｆａｒｉｏｎ  ＫＪ，Ｓａｍｐｓｏｎ  Ｍ，ＭｃＧａｈｅｒｎ  Ｃ．Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ  ｓｙｍｐｔｏｍｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  ｃｏｎｃｕｓｓｉｏｎ．ＪＡＭＡ  Ｐｅｄｉａｔｒ．２０１３；１６７（３）：２５９−２６５．
１２．ＭＲ  Ｚｏｎｆｒｉｌｌｏ，ＣＬ  Ｍａｓｔｅｒ，ＭＦ  Ｇｒａｄｙ，ＦＫ  Ｗｉｎｓｔｏｎ，ＪＭ  Ｃａｌｌａｈａｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  ｐｒｏｖｉｄｅｒｓ’  ｓｅｌｆ−ｒｅｐｏｒｔｅｄ  ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ，ｐｒａｃｔｉｃｅｓ，ａｎｄ  ａｔｔｉｔｕｄｅｓ  ａｂｏｕｔ  ｃｏｎｃｕｓｓｉｏｎ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  １３０（６），１１２０−１１２５，Ｄｅｃ  ２０１２（Ｅｐｕｂ  ２０１２  Ｎｏｖ  １２）．
１３．Ｂａｚａｒｉａｎ，Ｊ．Ｊ．，Ｖｅｅｎｅｍａ，Ｔ．，Ｂｒａｙｅｒ，Ａ．Ｆ．，＆  Ｌｅｅ，Ｅ．（２００１）．Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ  ｏｆ  ｃｏｎｃｕｓｓｉｏｎ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ａｍｏｎｇ  ｐｒａｃｔｉｔｉｏｎｅｒｓ  ｃａｒｉｎｇ  ｆｏｒ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ，４０（４），２０７−２１２．
１４．Ｓｃｏｐａｚ  ＫＡ，Ｈａｔｚｅｎｂｕｅｈｌｅｒ  ＪＲ．Ｒｉｓｋ  ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ  ｆｏｒ  ｃｏｎｃｕｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ．Ｓｐｏｒｔｓ  Ｈｅａｌｔｈ．２０１３；５（６）：５３７−５４１．
１５．Ｚｅｍｅｋ  Ｒ．，Ｂａｒｒｏｗｍａｎ  Ｎ．，Ｆｒｅｅｄｍａｎ  Ｓ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｒｉｓｋ  ｓｃｏｒｅ  ｆｏｒ  ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ  ｐｏｓｔｃｏｎｃｕｓｓｉｏｎ  ｓｙｍｐｔｏｍｓ  ａｍｏｎｇ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｗｉｔｈ  ａｃｕｔｅ  ｃｏｎｃｕｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＥＤ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ．２０１６；３１５（１０）：１０１４−１０２５．ｄｏｉ：１０．１００１／ｊａｍａ．２０１６．１２０３．
１６．Ｐａｐａ，Ｌ，Ｒａｍｉａ，Ｍ．Ｍ．，Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｍ．，Ｂｕｒｋｓ，Ｓ．Ｓ．，Ｐａｗｌｏｗｉｃｚ，Ａ．，ａｎｄ  Ｂｅｒｇｅｒ，Ｒ．Ｐ．（２０１３）．Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｎ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｊｕｒｙ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ  ３０，３２４−３３８．
１７．Ｐａｐａ，Ｌｉｎｄａ，ｅｔ  ａｌ．“Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｅｘａｍｉｎｉｎｇ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ａｔｈｌｅｔｅｓ  ａｆｔｅｒ  ｓｐｏｒｔｓ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｃｏｎｃｕｓｓｉｏｎ．”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ  ３２．１０（２０１５）：６６１−６７３．
１８．Ｂｅｒｇｅｒ，Ｒ．Ｐ．，Ｐｉｅｒｃｅ，Ｍ．Ｃ．，Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋｉ，Ｓ．Ｒ．，…＆  Ｋｏｃｈａｎｅｋ，Ｐ．Ｍ．（２００２）．Ｎｅｕｒｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｎｏｌａｓｅ  ａｎｄ  Ｓ１００Ｂ  ｉｎ  ＣＳＦ  ａｆｔｅｒ  ｓｅｖｅｒｅ  ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｉｎｆａｎｔｓ  ａｎｄ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  １０９，Ｅ３１．
１９．Ｊｅｔｅｒ，Ｃ．Ｂ．，Ｈｅｒｇｅｎｒｏｅｄｅｒ，Ｇ．Ｗ．，Ｈｙｌｉｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｒｅｄｅｌｌ，Ｊ．Ｂ．，…Ｄａｓｈ，Ｐ．Ｋ．（２０１３）．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｍｉｌｄ  ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｊｕｒｙ／ｃｏｎｃｕｓｓｉｏｎ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ，３０（８），６５７−６７０．
２０．Ｕｎｄｅｎ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｒｏｍｎｅｒ，Ｂ．（２００９）．Ａ  ｎｅｗ  ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ＣＴ  ｔｒｉａｇｅ  ａｆｔｅｒ  ｍｉｎｏｒ  ｈｅａｄ  ｉｎｊｕｒｙ−ｓｅｒｕｍ  Ｓ１００Ｂ．Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６９，１３−１７．
２１．Ｇａｚｚｏｌｏ，Ｄ．，Ｍｉｃｈｅｔｔｉ，Ｆ．，Ｂｒｕｓｃｈｅｔｔｉｎｉ，Ｍ．，Ｍａｒｃｈｅｓｅ，＆  Ｂｒｕｓｃｈｅｔｔｉｎｉ，Ｐ．（２００３）．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｓ１００Ｂ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｂｌｏｏｄ：ａｇｅ−ａｎｄ  ｓｅｘ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｃｈａｎｇｅｓ．Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ，４９（６），９６７−９７０．
２２．Ｋｏｖｅｓｄｉ，Ｅ．，Ｌｕｃｋｌ，Ｊ．，Ｂｕｋｏｖｉｃｓ，Ｐ．，．．＆  Ｂｕｋｉ，Ａ．（２０１０）．Ｕｐｄａｔｅ  ｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｉｎ  ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｊｕｒｙ  ｗｉｔｈ  ｅｍｐｈａｓｉｓ  ｏｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｕｓｅ  ｉｎ  ａｄｕｌｔｓ  ａｎｄ  ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ．Ａｃｔａ  ｎｅｕｒｏｃｈｉｒｕｒｇｉｃａ，１５２（１），１−１７．
２３．Ｂａｚａｒｉａｎ，Ｊ．Ｊ．，Ｚｅｍｌａｎ，Ｆ．Ｐ．，Ｍｏｏｋｅｒｊｅｅ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｓｔｉｇｂｒａｎｄ，Ｔ．（２００６）．Ｓｅｒｕｍ  Ｓ−１００Ｂ  ａｎｄ  ｃｌｅａｖｅｄ−ｔａｕ  ａｒｅ  ｐｏｏｒ  ｐｒｅｄｉｃｔｏｒｓ  ｏｆ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ａｆｔｅｒ  ｍｉｌｄ  ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｊｕｒｙ．Ｂｒａｉｎ  Ｉｎｊ．２０，７５９−７６５．
２４．Ｏｔｔｏ，Ｍ．，Ｈｏｌｔｈｕｓｅｎ，Ｓ．，Ｂａｈｎ，Ｅ．，Ｓｏｈｎｃｈｅｎ，Ｎ．，Ｗｉｌｔｆａｎｇ，Ｊ．，Ｇｅｅｓｅ，Ｒ．，．．．＆  Ｒｅｉｍｅｒｓ，Ｃ．Ｄ．（２０００）．Ｂｏｘｉｎｇ  ａｎｄ  ｒｕｎｎｉｎｇ  ｌｅａｄ  ｔｏ  ａ  ｒｉｓｅ  ｉｎ  ｓｅｒｕｍ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  Ｓ−１００Ｂ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｉｎｔｎｔｌ  Ｊ  Ｓｐｏｒｔ  Ｍｅｄ，２１，５５１−５５５．
２５．Ｂｈｏｍｉａ，Ｍ，Ｂａｌａｋａｔｈｉｒｅｓａｎ，ＮＳ，Ｗａｎｇ，ＫＫ，Ｐａｐａ，Ｌ．，＆  Ｍａｈｅｓｈｗａｒｉ，ＲＫ．（２０１６）．Ａ  Ｐａｎｅｌ  ｏｆ  Ｓｅｒｕｍ  ＭｉＲＮＡ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｖｅｒｅ  ｔｏ  Ｍｉｌｄ  Ｔｒａｕｍａｔｉｃ  Ｂｒａｉｎ  Ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎｓ．Ｓｃｉ  Ｒｅｐ，６．
２６．Ｍａ，Ｍ．，Ｌｉｎｄｓｅｌｌ，Ｃ．Ｊ．，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｒｙ，Ｃ．Ｍ．，Ｓｈａｗ，Ｇ．Ｊ．，＆  Ｚｅｍｌａｎ，Ｆ．Ｐ．（２００８）．Ｓｅｒｕｍ  ｃｌｅａｖｅｄ  ｔａｕ  ｄｏｅｓ  ｎｏｔ  ｐｒｅｄｉｃｔ  ｐｏｓｔｃｏｎｃｕｓｓｉｏｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ａｆｔｅｒ  ｍｉｌｄ  ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｊｕｒｙ．Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｍｅｒｇｅｎｃｙ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２６（７），７６３−７６８．
２７．Ｂｅｇａｚ，Ｔ．，Ｋｙｒｉａｃｏｕ，Ｄ．Ｎ．，Ｓｅｇａｌ，Ｊ．，＆  Ｂａｚａｒｉａｎ，Ｊ．Ｊ．（２００６）．Ｓｅｒｕｍ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  ｐｏｓｔ−ｃｏｎｃｕｓｓｉｏｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｉｌｄ  ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｊｕｒｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ，２３（８），１２０１−１２１０．
２８．Ｎａｍ，Ｊ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｌｏｂａｌ  ａｎａｌｙｓｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｏｎｔｅｘｔｓ  ｏｎ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ５３，１０３１−１０４３，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｃｅｌ．２０１４．０２．０１３（２０１４）．
２９．Ｖａｌａｄｉ  Ｈ，Ｅｋｓｔｒｏｍ  Ｋ，Ｂｏｓｓｉｏｓ  Ａ，Ｓｊｏｓｔｒａｎｄ  Ｍ，．．＆Ｌｏｔｖａｌｌ，ＪＯ．（２００７）Ｅｘｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｍＲＮＡｓ  ＆  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ  ｉｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ  ９，６５４−９．
３０．Ｇｉｌａｄ，Ｓ．，Ｍｅｉｒｉ，Ｅ．，Ｙｏｇｅｖ，Ｙ．，Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｓ．，Ｌｅｂａｎｏｎｙ，Ｄ．，Ｙｅｒｕｓｈａｌｍｉ，Ｎ．，Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｈ．，Ｋｕｓｈｎｉｒ，Ｍ．，Ｃｈａｊｕｔ，Ａ．（２００８）．Ｓｅｒｕｍ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ  ａｒｅ  ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ  ｎｏｖｅｌ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ３，ｅ３１４８．
３１．Ｐａｓｉｎｅｔｔｉ，Ｇ．Ｍ．，Ｈｏ，Ｌ．，Ｄｏｏｌｅｙ，Ｃ．，Ａｂｂｉ，Ｂ．，＆  Ｌａｎｇｅ，Ｇ．（２０１２）．Ｓｅｌｅｃｔ  ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡ  ｉｎ  ｂｌｏｏｄ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｐｒｏｖｉｄｅ  ｎｏｖｅｌ  ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ  ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｕｒｒｏｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ＯＥＦ／ＯＩＦ  Ｖｅｔｅｒａｎｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎ  Ｄｉｓ，１（１），８８．
３２．Ｒｅｄｅｌｌ，Ｊ．Ｂ．，Ｍｏｏｒｅ，Ａ．Ｎ．，Ｗａｒｄ  ＩＩＩ，Ｎ．Ｈ．，Ｈｅｒｇｅｎｒｏｅｄｅｒ，Ｇ．Ｗ．，＆  Ｄａｓｈ，Ｐ．Ｋ．（２０１０）．Ｈｕｍａｎ  ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｊｕｒｙ  ａｌｔｅｒｓ  ｐｌａｓｍａ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｌｅｖｅｌｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ，２７（１２），２１４７−２１５６．
３３．Ｄｉ  Ｐｉｅｔｒｏ，Ｖ．，Ｒａｇｕｓａ，Ｍ．，Ｄａｖｉｅｓ，Ｄ．Ｊ．，Ｓｕ，Ｚ．，Ｈａｚｅｌｄｉｎｅ，Ｊ．，Ｌａｚｚａｒｉｎｏ，Ｇ．，．．．＆  Ｌｏｇａｎ，Ａ．（２０１７）．ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ  ａｓ  ｎｏｖｅｌ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｍｉｌｄ  ａｎｄ  ｓｅｖｅｒｅ  ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｊｕｒｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ，（ｊａ）．
【０２４８】
本明細書において言及される全ての公開文献及び特許出願は、各個々の公開文献または特許出願が参照により組み込まれていることが具体的かつ個々に示されている場合と同じ程度に、参照によりその全体が本明細書に組み込まれており、本明細書中で参照による組み込みが記載されているものと同じ文、段落、頁、または節に記載される開示内容が特に参照される。
【０２４９】
本明細書における参照文献の引用は、それらの参照文献が先行技術であること、または本明細書において開示される技術の特許性に何らかの関係があることの承認にはならない。引用される参照文献の内容が詳解される場合、これは参照文献の著者により行われた主張の要旨を提示することを意図するものに過ぎず、かかる参照文献の内容の正確さに関する承認にはならない。
【図１】
2020512017.tif 000108
【図２−１】
2020512017.tif 000109
【図２−２】
2020512017.tif 000110
【図２−３】
2020512017.tif 000111
【図３Ａ】
2020512017.tif 000112
【図３Ｂ】
2020512017.tif 000113
【図３Ｃ】
2020512017.tif 000114
【図４Ａ】
2020512017.tif 000115
【図４Ｂ】
2020512017.tif 000116
【図４Ｃ】
2020512017.tif 000117
【図５Ａ】
2020512017.tif 000118
【図５Ｂ】
2020512017.tif 000119
【図５Ｃ】
2020512017.tif 000120
【図５Ｄ】
2020512017.tif 000121
【図５Ｅ】
2020512017.tif 000122
【図５Ｆ】
2020512017.tif 000123
【図６】
2020512017.tif 000124
【図７】
2020512017.tif 000125
【図８】
2020512017.tif 000126
【図９】
2020512017.tif 000127
【図１０−１】
2020512017.tif 000128
【図１０−２】
2020512017.tif 000129
【図１０−３】
2020512017.tif 000130
【図１１】
2020512017.tif 000131
【図１２】
2020512017.tif 000132
【図１３】
2020512017.tif 000133
【図１４Ａ】
2020512017.tif 000134
【図１４Ｂ】
2020512017.tif 000135
【図１４Ｃ】
2020512017.tif 000136
【図１５】
2020512017.tif 000137
【図１６】
2020512017.tif 000138
【図１７】
2020512017.tif 000139
【図１８】
2020512017.tif 000140
【図１９】
2020512017.tif 000141
【図２０】
2020512017.tif 000142
【図２１】
2020512017.tif 000143
【図２２】
2020512017.tif 000144
【図２３−１】
2020512017.tif 000145
【図２３−２】
2020512017.tif 000146
【図２４】
2020512017.tif 000147
【図２５】
2020512017.tif 000148
【図２６】
2020512017.tif 000149
【図２７】
2020512017.tif 000150
【図２８】
2020512017.tif 000151
【図２９Ａ】
2020512017.tif 000152
【図２９Ｂ】
2020512017.tif 000153
【図３０】
2020512017.tif 000154
【図３１】
2020512017.tif 000155
【図３２】
2020512017.tif 000156
【図３３】
2020512017.tif 000157
【図３４】
2020512017.tif 000158
【図３５】
2020512017.tif 000159
【図３６】
2020512017.tif 000160
【図３７】
2020512017.tif 000161
【図３８Ａ】
2020512017.tif 000162
【図３８Ｂ】
2020512017.tif 000163
【図３９Ａ】
2020512017.tif 000164
【図３９Ｂ】
2020512017.tif 000165
【図４０Ａ】
2020512017.tif 000166
【図４０Ｂ】
2020512017.tif 000167
【図４１Ａ】
2020512017.tif 000168
【図４１Ｂ】
2020512017.tif 000169
【図４２】
2020512017.tif 000170
【図４３】
2020512017.tif 000171
【図４４】
2020512017.tif 000172
【国際調査報告】
2020512017.tif 000173
2020512017.tif 000174
2020512017.tif 000175
2020512017.tif 000176
2020512017.tif 000177