(57)【要約】  本発明は、関心対象のアナライトを検出するための全細胞センサにおいて使用することができるキメラ受容体に関する。本発明者らは、DNA結合ドメイン及び下流の遺伝子発現が、一本鎖可変ドメインで構成される人工二量体化の二量体化を介して活性化され得ることを示した。本発明者らは、リガンドが結合した際に抗体様ドメインを使用する人工細菌受容体が活性化され、そして、転写生成物を生成することができることを初めて立証した。具体的には、本発明は、ｉ）第１のDNA結合ドメインと、ii）アナライトに対する特異性を有する、重鎖可変ドメイン、ラクダVHH、又は抗体ミメティックからなる群から選択される少なくとも１つの結合ドメインと、iii）該DNA結合ドメインと該結合ドメインとの間のリンカーと、を含むキメラ受容体ポリペプチドに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）第１のDNA結合ドメインと、ii）重鎖可変ドメイン、ラクダVHH、及び抗体ミメティックからなる群から選択されるアナライトに対する特異性を有する少なくとも１つの結合ドメインと、iii）前記DNA結合ドメインと前記結合ドメインとの間のリンカーと、を含むキメラ受容体ポリペプチド。
【請求項２】
前記DNA結合ドメインが、配列番号１又は配列番号２と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１記載のキメラ受容体ポリペプチド。
【請求項３】
前記DNA結合ドメインが、配列番号１３と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１記載のキメラ受容体ポリペプチド。
【請求項４】
前記リンカーが、配列番号３〜６と５０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む膜貫通ドメインである、請求項１記載のキメラ受容体ポリペプチド。
【請求項５】
前記抗体ミメティックが、モノボディ、DARPin、又はアルファRepからなる群から選択される、請求項１記載のキメラ受容体ポリペプチド。
【請求項６】
前記リンカーと前記結合ドメインとの間に挿入されたスペーサを更に含む、請求項１記載のキメラ受容体ポリペプチド。
【請求項７】
前記スペーサが、DTRLPMS（配列番号７)又はGGGSG（配列番号１２）からなるアミノ酸配列である、請求項６記載のキメラ受容体ポリペプチド。
【請求項８】
結合ドメインに融合している、配列番号８と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のドメインを含む、請求項１記載のキメラ受容体ポリペプチド。
【請求項９】
請求項１記載のキメラ受容体をコードしている核酸。
【請求項１０】
原核細胞における発現を可能にする制御配列が動作可能に連結している請求項９記載の核酸分子を含む発現カセット。
【請求項１１】
請求項９記載の核酸分子又は請求項１０記載の発現カセットで遺伝子改変された原核細胞。
【請求項１２】
グラム陽性菌又はグラム陰性菌、例えば、大腸菌から選択される、請求項１１記載の原核細胞。
【請求項１３】
CadBAプロモータに動作可能に連結している検出タンパク質をコードしている核酸分子を更に含む、請求項１１記載の原核細胞。
【請求項１４】
少なくとも１つのアナライトのアッセイ方法であって、ｉ）１つの検出タンパク質にカップリングされた前記アナライトに結合することができるキメラ受容体をそれぞれが含む、少なくとも１セットの請求項１１記載の原核細胞を提供することと、ｂ）前記キメラ受容体がオリゴマー化結合し、次いで、前記検出タンパク質を発現するのに十分な時間にわたって、前記セットの細胞を前記アナライトを含有すると思われるサンプルと接触させることと、ｃ）前記検出タンパク質の発現レベルを検出することであって、前記発現レベルが、前記サンプル中に存在する前記アナライトの量と相関していることと、を含む方法。
【請求項１５】
請求項１記載のキメラ受容体ポリペプチドを含む無細胞系。
【請求項１６】
前記キメラ受容体ポリペプチドが、固体支持体に部分的に又は完全に埋め込まれている、請求項１５記載の無細胞系。
【請求項１７】
前記固体支持体が多孔質基材である、請求項１６記載の無細胞系。
【請求項１８】
前記固体支持体が紙である、請求項１６記載の無細胞系。
【請求項１９】
前記固体支持体が、前記無細胞系が限局される幾つかの空間的に個別の反応領域を含む、請求項１６記載の無細胞系。
【請求項２０】
レポータ遺伝子を含む、請求項１５記載の無細胞系。
【請求項２１】
前記レポータ遺伝子が蛍光タンパク質をコードしている、請求項２０記載の無細胞系。
【請求項２２】
前記固体支持体上で凍結乾燥された、請求項１６記載の無細胞系。
【請求項２３】
アナライトの検出方法であって、
（ｉ）請求項１５記載の無細胞系を提供することと、
（ii）前記無細胞系を、前記アナライトについて試験されるサンプルと接触させることと、
（iii）シグナルを検出することであって、前記シグナルの検出が前記アナライトの存在を示すことと、
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、関心対象のアナライトを検出するための全細胞センサにおいて使用することができるキメラ受容体に関する。
【０００２】
背景技術：
発明の背景
インビトロ診断検査（IVD）は、その非侵襲的な性質、並びに結果として得られる使いやすさ及び拡張しやすさから、世界中の健康分野において重要性を増しつつある（１、２）。しかし、IVFのための従来の検出方法は、高価かつ複雑であることが多いので、資源の限られた状況では実施が困難である（３）。これら課題に応えて、生物工学者は、合成ナノプローブ（４〜６）又はマイクロフルイディクス（７、８）に依存する魅力的な方法論を開発した。しかし、家庭で又は遠隔地で臨床的測定を行うために非専門家が使用することができる、使いやすい携帯型バイオセンサ装置が依然として必要とされている（４、９、１０）。バイオセンサ装置の中でも、主に細菌をベースとする全細胞バイオセンサは、広範囲にわたるアナライトの検出及び定量に適用可能であることが証明されている（１１、１２）。生細胞は、診断法開発に関して多くの魅力的な特性を有する。細胞は、高い感度及び特異性で生体分子を検出し、そして、統合された複雑なシグナル処理が可能である。また、細胞は、自律複製を介して自己製造プラットフォームを提供し（１２、１３）、そして、研究室用プロトタイプの生産を既存の工業的枠組みを使用して拡張することができる（１４）。全細胞バイオセンサ由来の芽胞は長時間にわたって機能的であり続けることができるので、過酷な貯蔵条件における診断製品の貯蔵期限が延長される（１５）。最後に、全細胞バイオセンサは汎用性が高く、そして、スタンドアロンデバイスとして使用することもでき、又はエレクトロニクス、マイクロフルイディクス、若しくはマイクロパターニング等の他の技術とインターフェースすることもできる（１６〜１８）。これら利点の全てが、様々な臨床パラメータを測定する全細胞バイオセンサの開発を促してきた（１９〜２４）。多くの課題によって全細胞バイオセンサの臨床へのトランスレーションが制限されている：（ｉ）複雑かつ不均一な臨床サンプルでは、オペレーションが信頼できず、かつシグナル対ノイズ比が低い；（ii）リガンドに合わせたセンサを設計することができない；（iii）シグナル処理能が限られているので、正確な診断のための幾つかのバイオマーカーシグナルの統合が妨げられる；（iv）困難な臨床条件におけるロバスト性を評価するための一貫した枠組みがない；（ｖ）応答時間が、結果を早く引き渡す必要がある診断に適合していない；並びに（vi）臨床フォーマットに対するコンプライアンス。合成生物学研究の新興分野は、生体系の合理的工学技術の効率化を目的としている（２５）。ヘルスケア分野では、合成生物学は、薬物の生合成においてブレークスルーをもたらし（２６〜２９）、そして、トランスレーショナル医療への応用が促進されるという新たな希望を抱かせた（３０〜３２）。最近、全細胞センサは、インビボコンピュテーションが可能になるように改変された（Courbet A, Endy D, Renard E, Molina F, Bonnet J. Detection of pathological biomarkers in human clinical samples via amplifying genetic switches and logic gates. Sci Transl Med. 2015 May 27;7(289):289ra83.）。しかし、該全細胞センサは、天然のセンシング機構が存在しない新規アナライトを検出するには使い勝手が悪かった。更に、これらバイオセンサは、細菌の壁及び膜を通過することができないアナライトを検出することができなかった。
【０００３】
発明の概要：
本発明は、関心対象のアナライトを検出するための全細胞センサにおいて使用することができるキメラ受容体に関する。具体的には、本発明は、特許請求の範囲によって定義される。
【０００４】
発明を実施するための形態
発明の詳細な説明
本発明は、ｉ）第１のDNA結合ドメインと、ii）アナライトに対する特異性を有する少なくとも１つの結合ドメインと、iii）該DNA結合ドメインと該結合ドメインとの間のリンカーと、を含むキメラ受容体ポリペプチドに関する。
【０００５】
本明細書で使用するとき、用語「DNA結合ドメイン」とは、特定のDNA配列（例えば、ゲノムDNA配列）に結合することができるモチーフを指すが、これには限定されない。DNA結合ドメインは、一本鎖又は二本鎖のDNAを認識し、そして、結合する少なくとも１つのモチーフを有する。DNA結合ドメインは、配列特異的に又は非配列特異的にDNAと相互作用することができる。
【０００６】
本明細書で使用するとき、用語「LexA」又は「LexA結合ドメイン」とは、自然界では大腸菌（E.coli）においてlexA遺伝子によってコードされているタンパク質又はドメインを指す。LexAは、細菌のSOS応答に関与する、十分に特性評価されている転写抑制因子である。それは、Ｎ末端DNA結合ドメイン及びＣ末端二量体化／触媒ドメインで構成されている。SOS応答が始まると、活性型のRecAがLexA抑制因子と相互作用してその二量体化ドメインの自己切断を促進し、そして、オペレータから放出する。
【０００７】
幾つかの実施態様では、LexA DNA結合ドメインは、配列番号１３と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０００８】
本明細書で使用するとき、用語「CadC転写活性化因子」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、そして、大腸菌（Escherichia coli）の膜結合型転写調節因子CadCを指す。CadCは、同時に利用可能なリジンを用いて、低い外部pHにおいてcadBAオペロンの発現を活性化して、弱酸性ストレスに対して適応させる。CadCは、単一ポリペプチド内に感覚、シグナル伝達、及びDNA結合の活性を併せ持つ代表的なToxR様タンパク質である。具体的には、CadCは、Ｃ末端周辺質pHセンシングドメイン、単一膜貫通ヘリックス、及びＮ末端細胞質ウイングドヘリックス・ターン・ヘリックスDNA結合ドメインで構成される（Buchner S, Schlundt A, Lassak J, Sattler M, Jung K. Structural and Functional Analysis of the Signal-Transducing Linker in the pH-Responsive One-Component System CadC of Escherichia coli. J Mol Biol. 2015 Jul 31;427(15):2548-61.）。CadCは、そのＣ末端周辺質pHセンシングドメインを介して二量体化する。したがって、「大腸菌CadC転写活性化因子DNA結合ドメイン」という表現は、そのＣ末端融合ドメインのオリゴマー化を介してその機能を回復させることができるCadCの細胞質ドメインを指す。
【０００９】
幾つかの実施態様では、大腸菌CadC転写活性化因子DNA結合ドメインは、配列番号１と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様では、CadC転写活性化因子DNA結合ドメインは、配列番号２と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００１０】
本明細書で使用するとき、用語「結合ドメイン」とは、標的分子（例えば、アナライト）との特異的結合を媒介するポリペプチドの１つ以上の領域を指す。結合ドメインは、天然の受容体結合ドメインによって通常認識されない分子に受容体を結合させることができる。用語「結合」とは、分子の結合ドメイン部分への非共有結合的、好ましくは可逆的な結合を指す。好ましくは、このような結合は、化合物と結合ドメイン部分との間の塩橋、水素結合、ファンデルワールス力、スタッキング力、複合体形成、又はこれらの組み合わせ等の非共有結合性相互作用を含む。また、このような結合は結合ポケットにおける水分子との相互作用も含む。例示的な結合ドメインは、抗体の可変ドメイン、リガンドの受容体結合ドメイン、受容体のリガンド結合ドメイン、又は酵素ドメインを含む。用語「リガンド結合ドメイン」とは、本明細書で使用するとき、任意のネイティブ受容体（例えば、細胞表面受容体）、又は対応するネイティブ受容体の定性的リガンド結合能を少なくとも保持している、その任意の領域若しくは誘導体を指す。用語「受容体結合ドメイン」とは、本明細書で使用するとき、任意のネイティブリガンド、又は対応するネイティブリガンドの定性的受容体結合能を少なくとも保持している、その任意の領域若しくは誘導体を指す。幾つかの実施態様では、本発明の結合ドメインは、少なくとも１、２、３、４、又は５個の結合部位を含む。結合ドメインは、単量体又は多量体のいずれであってもよい。
【００１１】
幾つかの実施態様では、結合ドメインは抗体である。したがって、用語「抗体」は、抗原結合領域を有する任意の抗体様分子を指すために使用される。幾つかの実施態様では、結合ドメインは、天然に軽鎖を有しないラクダ科哺乳類に見出すことができる種類の抗体の単一重鎖可変ドメインである。このような単一ドメイン抗体は、VHH又は「nanobody（登録商標）」とも呼ばれる。（単一）ドメイン抗体の概要については、上に引用した先行技術に加えて、欧州特許第０  ３６８６８４号、Ward et al. (Nature 1989 Oct 12; 341 (6242): 544-6)、Holt et al., Trends Biotechnol., 2003, 21(11):484-490；及び国際公開公報第０６／０３０２２０号、同第０６／００３３８８号も参照されたい。
【００１２】
本明細書で使用するとき、用語「ラクダVHH」とは、ラクダ科の動物でみられる単一ドメイン抗体の可変領域を指す。
【００１３】
本明細書で使用するとき、用語「抗体ミメティック」は、標的配列に特異的に結合し、そして、天然に存在する抗体とは異なる構造を有する有機化合物を説明することを意図する。抗体ミメティックは、タンパク質、核酸、又は低分子を含み得る。
【００１４】
幾つかの実施態様では、抗体ミメティックは、モノボディ、DARPin、又はアルファRepからなる群から選択される。
【００１５】
用語「モノボディ」は、本明細書で使用するとき、重鎖可変ドメインを有し、そして、軽鎖可変ドメインを有しない抗原結合分子を指す。
【００１６】
本明細書で使用するとき、用語「DARpin」とは、典型的には高度に特異的でありかつ高親和性の標的タンパク質結合を示す、遺伝的に改変された抗体ミメティックタンパク質である、設計されたアンキリンリピートタンパク質を指す。
【００１７】
本明細書で使用するとき、用語「アルファRep」とは、人工らせん状リピートタンパク質を指す。
【００１８】
本明細書で使用するとき、用語「アナライト」とは、本発明の少なくとも２つのキメラ受容体が結合することができ及び／又は本発明のキメラ受容体における高次構造を変化させることができ、それによって、CadC転写活性化因子DNA結合ドメインをオリゴマー化させるか又はLexA転写抑制因子結合ドメインを二量体化させる化合物を指す。幾つかの実施態様では、アナライトは、糖、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、核酸、有機酸、アニオン、金属（例えば、モリボラート（molybolate）、水銀、鉄、亜鉛、又はニッケル）又はイオン、酸化物、水酸化物、又はこれらのコンジュゲート、無機イオン（例えば、リン酸、硫酸、又はチオ硫酸）、ポリアミン、及びビタミンからなる群から選択される。本明細書で使用するとき、用語「特異性」とは、他のアナライトに対しては相対的にわずかな検出可能な反応性しか有しないが、関心対象のアナライトには結合する、本発明のキメラ受容体の結合ドメインの能力を指す。特異性は、例えば、本明細書の他の箇所に記載される通り、Biacore機器を使用して結合又は競合結合のアッセイによって相対的に判定され得る。特異性は、他の無関係な分子への非特異的結合に対する特異的抗原への結合において、例えば、約１０：１、約２０：１、約５０：１、約１００：１、１０．０００：１、又はそれ以上の親和性／結合活性の比によって示され得る。用語「親和性」とは、本明細書で使用するとき、エピトープに対する抗体の結合の強さを意味する。例えば、抗体の親和性は、［Ab］×［Ag］／［Ab−Ag］（式中、［Ab−Ag］は、抗体−抗原複合体のモル濃度であり、［Ab］は、未結合抗体のモル濃度であり、そして、［Ag］は、未結合抗原のモル濃度である）として定義される解離定数Kdによって与えられる。親和性定数Kaは、１／Kdによって定義される。mAbの親和性を決定するための好ましい方法は、Harlow, et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988)、Coligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993)、及びMuller, Meth. Enzymol. 92:589-601 (1983)に見出すことができ、これら参照文献は、参照により全体が本明細書に組み入れられる。mAbの親和性を決定するための、当技術分野において周知の１つの好ましい標準的な方法は、Biacore機器の使用である。
【００１９】
幾つかの実施態様では、本発明のキメラ受容体ポリペプチドは、２つの異なるエピトープを標的とする２つの単一重鎖可変ドメインを含む。
【００２０】
本明細書で使用するとき、用語「リンカー」とは、DNA結合ドメイン及び単一重鎖可変ドメインを連結させる少なくとも１つのアミノ酸の配列を指す。
【００２１】
幾つかの実施態様では、リンカーは、配列番号１４と少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００２２】
幾つかの実施態様では、DNA結合ドメインと単一重鎖可変ドメインとの間のリンカーは、膜貫通ドメインである。
【００２３】
使用するとき、「膜貫通ドメイン」とは、E.coli bacteriumの膜にまたがり、そして、アナライトに対する特異性を有する結合ドメインにCadC転写活性化因子DNA結合ドメインを連結させる、天然又はそうではない（すなわち、人工）ドメインを指す。このような膜貫通ドメインは、１８〜２５個のほとんど非極性のアミノ酸で構成され、そして、細胞質Ｎ末端（CadC転写活性化因子DNA結合ドメイン）及び細胞質外Ｃ末端（結合ドメイン）のトポロジーを形成するために、キメラ受容体ポリペプチドの膜への挿入及び固定に関与している。更に、リガンド結合ドメインによって誘発されるオリゴマー化に干渉するのを避けるために、膜貫通ドメインは脂質二重層内で単量体でなければならない。このような膜貫通ドメインは、Zhou et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 98:2250, 2001；Lindner et al., J. Mol. Biol., 426:2942-2957, 2014において特性評価されている。
【００２４】
幾つかの実施態様では、膜貫通ドメインは、配列番号３〜６と５０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００２５】
幾つかの実施態様では、膜貫通ドメインは、更に、膜貫通ドメインと結合ドメインとの間に挿入された細胞外スペーサを含む。本明細書で使用するとき、用語「スペーサ」とは、膜貫通ドメインを結合ドメインと連結させる少なくとも１つのアミノ酸の配列を指す。このようなスペーサは、立体障害を防ぐのに有用であり得る。典型的には、該スペーサは、DTRLPMS（配列番号７）からなるアミノ酸配列又はGGGSG（配列番号１２）からなるアミノ酸配列である。
【００２６】
本発明によれば、本発明のキメラ受容体に含有されているドメインは全て、インフレームで融合されている、すなわち、互いに動作可能に連結されている。
【００２７】
幾つかの実施態様では、本発明のキメラ受容体は、結合ドメインに融合している、配列番号８と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のドメインを含む。
【００２８】
本発明によれば、第２のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有する第１のアミノ酸配列とは、第１の配列が、第２のアミノ酸配列と５０；５１；５２；５３；５４；５５；５６；５７；５８；５９；６０；６１；６２；６３；６４；６５；６６；６７；６８；６９；７０；７１；７２；７３；７４；７５；７６；７７；７８；７９；８０；８１；８２；８３；８４；８５；８６；８７；８８；８９；９０；９１；９２；９３；９４；９５；９６；９７；９８；９９；又は１００％の同一性を有することを意味する。本発明によれば、第２のアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有する第１のアミノ酸配列とは、第１の配列が、第２のアミノ酸配列と７０；７１；７２；７３；７４；７５；７６；７７；７８；７９；８０；８１；８２；８３；８４；８５；８６；８７；８８；８９；９０；９１；９２；９３；９４；９５；９６；９７；９８；９９；又は１００％の同一性を有することを意味する。配列同一性は、同一性（又は類似性若しくは相同性）の百分率単位で測定されることが多く；この百分率が高いほど、２つの配列はより類似している。比較のために配列をアラインメントする方法は、当技術分野において周知である。様々なプログラム及びアラインメントアルゴリズムが、Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482, 1981；Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443, 1970；Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85:2444, 1988；Higgins and Sharp, Gene, 73:237-244, 1988；Higgins and Sharp, CABIOS, 5:151-153, 1989；Corpet et al. Nuc. Acids Res., 16:10881-10890, 1988；Huang et al., Comp. Appls Biosci., 8:155-165, 1992；及びPearson et al., Meth. Mol. Biol., 24:307-31, 1994）に記載されている。Altschul et al., Nat. Genet., 6:119-129, 1994は、配列アラインメント方法及び相同性計算についての詳細な考察を提示している。一例として、アラインメントツールALIGN（Myers and Miller, CABIOS 4:11-17, 1989）又はLFASTA（Pearson and Lipman, 1988）を使用して配列比較を実施することができる（Internet Program（登録商標） 1996, W. R. Pearson and the University of Virginia, fasta20u63 version 2.0u63、公開日１９９６年１２月）。ALIGNは、配列全体を互いに対して比較するが、LFASTAは、局所的に類似している領域を比較する。これらアラインメントツール及びそのそれぞれのチュートリアルは、例えば、NCSAのウェブサイトにおいてインターネットで入手可能である。あるいは、約３０アミノ酸を超えるアミノ酸配列の比較については、デフォルトパラメータ（ギャップイグジステンスコスト（gap existence cost）１１及びパーレジデューギャップコスト（per residue gap cost）１）に設定されたデフォルトBLOSUM62マトリクスを使用して、Blast 2のシークエンス機能を使用することができる。短いペプチド（約３０アミノ酸未満）をアラインメントする場合、デフォルトパラメータ（オープンギャップ９、エクステンションギャップ１ペナルティ）に設定されたPAM30マトリクスを使用して、Blast 2のシークエンス機能を使用してアラインメントを実施しなければならない。BLAST配列比較システムは、例えば、NCBIのウェブサイトから入手可能である；Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410, 1990；Gish. & States, Nature Genet., 3:266-272, 1993；Madden et al. Meth. Enzymol., 266:131-141, 1996；Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402, 1997；及びZhang & Madden, Genome Res., 7:649-656, 1997も参照されたい。
【００２９】
本発明の更なる態様は、本発明のキメラ受容体をコードしている核酸に関する。本明細書で使用するとき、用語「核酸分子」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、そして、DNA又はRNAの分子を指す。しかし、この用語は、例えば、４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、プソイドイソシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−フィウオロウラシル（fiuorouracil）、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチル−アミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルプソイドウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノ−メチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルクエオシン、５’−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン（oxybutoxosine）、プソイドウラシル、クエオシン(queosine)、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、プソイドウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、及び２，６−ジアミノプリンであるが、これらに限定されない、DNA及びRNAの公知の塩基アナログのいずれかを含む配列を取り込む。
【００３０】
更に、本発明は、本発明の核酸分子を含み、そして、原核細胞における発現を可能にする制御配列が動作可能に連結している発現カセットに関する。好適な発現制御配列は、標的宿主生物において適用可能なプロモータを含む。このようなプロモータは、原核生物由来の多様な宿主について当業者に周知であり、そして、文献に記載されている。例えば、このようなプロモータは、天然に存在する遺伝子から単離することもでき、合成又はキメラのプロモータであってもよい。同様に、プロモータは、標的ゲノム中に予め存在していてもよく、そして、例えば相同組み換え等の当技術分野において公知の好適な技術によって核酸分子に連結される。本発明に係る発現カセットは、ベクター又はゲノムDNA等の標的核酸分子への簡便な挿入に特に向いている。この目的のために、発現カセットは、好ましくは、例えば制限酵素認識部位又は例えばリコンビナーゼによって触媒されるような相同組み換えの標的配列等の特異的配列位置からの除去及び該位置への挿入を促進するヌクレオチド配列をその５’及び３’の隣接領域に備える。
【００３１】
また、本発明は、本発明の核酸分子又は発現カセットを含む、従来遺伝子改変で使用されているベクター、特に、プラスミド、コスミド、ウイルス、及びバクテリオファージに関する。幾つかの実施態様では、本発明のベクターは、原核細胞の形質転換に好適である。当業者に周知の方法を使用して、組み換えベクターを構築することができる。本発明の核酸分子又は発現カセットに加えて、該ベクターは、好適な宿主細胞内かつ好適な条件下で該ベクターを選択することを可能にするマーカー遺伝子等の更なる遺伝子を含有していてよい。一般に、該ベクターは、１つ以上の複製起点も含有する。有利には、該ベクターに含有されている核酸分子は、原核細胞における発現を可能にする、すなわち、翻訳可能なRNAの転写及び合成を確実にする発現制御配列に動作可能に連結している。例えば、原核細胞における遺伝子改変の場合、本発明の核酸分子又はこれら分子の一部をプラスミドに導入してよい。発現ベクターは、文献に広く記載されている。概して、該発現ベクターは、選択マーカー遺伝子及び選択された宿主における複製を確実にする複製起点だけでなく、細菌プロモータ、及び殆どの場合、転写の終結シグナルも含有する。プロモータと終結シグナルとの間には、一般に、少なくとも１つの制限部位又はコードヌクレオチド配列の挿入を可能にするポリリンカーが存在する。遺伝子の構成的発現を確実にするプロモータ、及び遺伝子の発現の計画的な制御を可能にする誘導性プロモータを使用することが可能である。これら特性を有する細菌プロモータ配列は、文献に詳細に記載されている。微生物（例えば、大腸菌）における発現の調節配列は、文献に十分に記載されている。誘導性プロモータも可能である。これらプロモータは、多くの場合、構成的プロモータよりも高いタンパク質収量につながる。
【００３２】
更に、本発明は、本発明のキメラ受容体を発現することができる原核細胞を生成する方法であって、本発明の上記核酸分子、発現カセット、又はベクターで細胞を遺伝的に改変することを含む方法に関する。
【００３３】
したがって、本発明の別の目的は、本発明の上記核酸分子、発現カセット、又はベクターで遺伝的に改変された原核細胞、及びこのような形質転換された細胞に由来し、かつ、本発明の核酸分子、発現カセット、又はベクターを含有する細胞、及びそれを生成するための上記方法によって得ることができる細胞に関する。
【００３４】
幾つかの実施態様では、原核細胞は、グラム陽性菌又はグラム陰性菌から選択される。幾つかの実施態様では、原核細胞は大腸菌である。幾つかの実施態様では、原核細胞は、ゲノムに安定的に組み込まれた、導入された核酸分子を含有するように遺伝的に改変されている。本発明に係る核酸分子又はベクターによる原核細胞の形質転換は、標準的な方法によって実施することができる。例えば、原核細胞には塩化カルシウムトランスフェクションが一般的に利用されている。原核細胞は、特にpH値、温度、塩濃度、通気、抗生物質、ビタミン、微量元素等に関して、使用される具体的な原核細胞の要件を満たす栄養培地で培養される。幾つかの実施態様では、本発明の原核細胞は、発現が本発明のキメラ受容体の制御下にある少なくとも１つの検出タンパク質を含む。
【００３５】
具体的には、幾つかの実施態様では、アナライトがキメラ受容体に結合すると、該受容体のオリゴマー化が誘発され、したがって、CadC転写活性化因子DNA結合ドメインがオリゴマー化され、次いで、これによって、CadBAプロモータの制御下にある少なくとも１つの検出タンパク質の発現を活性化することができる。したがって、本発明の原核細胞は、CadBAプロモータに動作可能に連結している検出タンパク質をコードしている核酸分子を更に含む。CadBAプロモータの例示的な核酸は、配列番号９によって表される。
【００３６】
別の実施態様では、アナライトがキメラ受容体に結合すると、該受容体の二量体化及び該受容体のLexAオペレータへの結合が誘発され、レポータ遺伝子の発現がブロックされる。したがって、本発明の原核細胞は、LexAプロモータに動作可能に連結している検出タンパク質をコードしている核酸分子を更に含む。LexAプロモータの例示的な核酸は、配列番号１５によって表される。
【００３７】
幾つかの実施態様では、検出タンパク質とは、生物学的又は物理的な手段によって検出することができる任意のタンパク質を指す。幾つかの実施態様では、検出タンパク質は、蛍光タンパク質である。蛍光タンパク質の出現により、光学的手段によって容易に検出可能な、非侵襲的な細胞内標識が可能になった。オワンクラゲ（Aequorea Victoria）由来の緑色蛍光タンパク質（GFP）は、現在、多くの生物で最も広く使用されているレポータ遺伝子である。様々なスペクトル特性を有する複数の変異体が開発されている。幾つかの実施態様では、原核細胞は、異なる蛍光を提供するエネルギー転移を示す蛍光タンパク質の様々な組み合わせを含む。幾つかの実施態様では、検出タンパク質は、発光タンパク質から選択される。特定の細菌（例えば、ビブリオ・フィシェリ（Vibrio fischeri））は、（ルシフェリンの切断及び青色光の発光を引き起こす）ルシフェラーゼを発現する自己誘導性発光遺伝子を有する。細菌は、シグナル分子であるＮ−アシルホモセインラクトン（N-acyl homoseine lactones）（AEL）を生成し、これは、細菌細胞に侵入し、そして、AHL合成酵素をコードしている遺伝子LuxI及びAHL依存性転写活性化因子をコードしているLuxRの転写活性化を誘導する。細胞内のAHL濃度が十分に高いと、LuxR活性化因子への結合及び発光遺伝子の転写が引き起こされる。あるいは、検出タンパク質は、検出可能な特性を有し、かつ、細胞から分泌される、融合タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質−Fv）であってもよい。したがって、本発明のキメラ受容体に対するアナライトの結合によって分泌を誘発することができる。この場合、検出タンパク質は、アナライトの結合に比例してというよりはむしろ、過剰に生成される。幾つかの実施態様では、蛍光プローブに特異的に結合するRNAアプタマーを使用して検出を実施することができる。アプタマーにプローブが結合すると、その蛍光が増加し、そして、遺伝子発現の検出が可能になる。他の種類の出力シグナルは、特定のオペロン（ビオラセインオペロン等、又はトリプトファンをインディゴに変換するフラビンモノオキシダーゼの発現）を介した、又は例えば、ベータ−ガラクトシダーゼ酵素及びその基質であるX-gal等の外因的に供給された基質が発色生成物に変換される酵素の発現による、色素の生成を含む。細胞コンピュテーションの分野で開発された技術を使用して、より高レベルの機能を有するより複雑な原核細胞を作り出すことができる。これら方法では、細胞は、内部論理ゲートを使用してアナライトの結合等の入力を処理して出力を作成する、生化学的コンピュータとして機能する。複数の入力に対する複雑な条件応答は、例えば、大腸菌細胞においてAND、NOT、OR、XOR、及びIMPLIESの論理ゲートを実行することによって操作されている。例えば、DNA結合タンパク質を使用してこれらゲートを実行して、組み換えベクターの発現を調節することができる。リコンビナーゼベースの論理ゲート、核酸ベースの論理ゲート、又はタンパク質ベースの論理ゲート等であるがこれらに限定されない他の系を使用してもよい。細胞コンピューティングに関する更なる情報については、全て参照により本明細書に組み入れられる、R. Weiss, “Cellular Computation and Communications using Engineered Genetic Regulatory Networks,” Ph.D. Thesis, MIT, 2001；M. L. Simpson et al., “Whole-cell biocomputing,”Trends Biotechnol. 19: 317-323 (2001)；Yaakov Benenson. , ≪Biomolecular computing systems: principles, progress and potential≫. ≪Nature Reviews Genetics, 13(7):455{468, 2012.；Bonnet et al.,“Amplifying genetic logic gates” Science, 340(6132):599{603, 2013.；Brophy JAN and Voigt CA. ≪Principles of genetic circuit design≫. Nature methods, 11(5):508{520, 2014を参照されたい。
【００３８】
幾つかの実施態様では、出力は、アナライトの結合量及びアナライトの性質に比例するシグナルであってよい。様々な検出タンパク質の発現を制御するために様々な結合事象によってスイッチがオンになる様々なプロモータを有する単一プラスミドを作製することができる。
【００３９】
幾つかの実施態様では、出力は、特定のシグナル閾値に応答するように調整され得る遺伝的スイッチを制御することができる。例えば、このようなスイッチは、数桁にわたって応答閾値を調整できるようにするために、様々な翻訳及び／又はタンパク質分解の制御エレメントを有する様々なバージョンのリコンビナーゼを使用することによって改変されている（Courbet et al., “Detection of pathological biomarkers in human clinical samples via amplifying genetic switches and logic gates”. Sci Transl Med. 2015 May 27;7(289):289ra83.を参照されたい）。このようなスイッチを使用して、全細胞バイオセンシング系を、臨床的に又は環境的に関連すると判定された特定のシグナル閾値に応答するように調整することができる。
【００４０】
幾つかの実施態様では、原核細胞はＬ型細菌である。本明細書で使用するとき、用語「Ｌ型細菌」（又は「Ｌ相細菌」、「Ｌ相変異体」、及び「細胞壁欠損（CWD）細菌」）とは、細胞壁を有しない細菌の株を指す。実施例４を参照されたい。
【００４１】
本発明の原核細胞は、アナライトの検出及び定量に好適であり得る全細胞バイオセンサを構成する。
【００４２】
したがって、本発明の更なる目的は、少なくとも１つのアナライトのアッセイ方法であって、ｉ）１つの検出タンパク質にカップリングされた当該アナライトに結合することができるキメラ受容体をそれぞれが含む、少なくとも１セットの本発明の原核細胞を提供することと、ｂ）当該キメラ受容体がオリゴマー化結合し、次いで、当該検出タンパク質が発現するのに十分な時間にわたって、当該セットの細胞を当該アナライトを含有すると思われるサンプルと接触させることと、ｃ）当該検出タンパク質の発現レベルを検出することであって、当該発現レベルが、当該サンプル中に存在する当該アナライトの量と相関していることと、を含む方法に関する。
【００４３】
本発明の方法を用いると、数桁のモル範囲にわたる、サンプル中に溶解している（solved）所与のアナライトの濃度を測定することができる。
【００４４】
本明細書で使用するとき、用語「サンプル」とは、測定されるアナライトが溶液中に存在し得る、任意の体積の液体又は懸濁液を指す。幾つかの実施態様では、サンプルは体液サンプルである。幾つかの実施態様では、サンプルは、血液サンプル（血清又は血漿のサンプルを含む）、尿サンプル、脳脊髄サンプル、涙サンプル、唾液サンプル、及び滑液サンプルからなる群から選択される。
【００４５】
本発明の全細胞センサは、マルチプレックスアッセイにおいて使用することができる。単一のサンプル中の関心対象の複数のアナライトを、異なる細胞の型又はサブセットによる該アナライトの捕捉を介して同時に検出することができる。例えば、各細胞型が関心対象のアナライトに特異的な本発明の独自のキメラ受容体及び独自の検出タンパク質を有するように、アッセイを組み立ててよい。すなわち、アナライトと全細胞センサとの間に１対１関係が存在する。元のサンプル中の各アナライトの量を決定するために、補足されるアナライトの量及び各細胞のアイデンティティを検出する。単一のアナライトのためのアッセイにおいて又は複数の空間的に分離されているアッセイにおいて該細胞を使用することもできることに留意されたい。これは、複数のアッセイをマイクロタイタープレートの別個のウェルで実施するときに有用であり得る。
【００４６】
各ウェルは異なる細胞型を含有し、そして、各ウェル内の細胞のアイデンティティは、細胞の識別子を検出することによって確認される。更に、本発明の全細胞センサに論理ゲートが存在することにより、サンプル中に存在する様々なアナライトを本発明の単一の全細胞センサによって検出することが可能になる。具体的には、本発明の全細胞センサは、２つ以上の転写ユニットを含み得、そして、OR、XOR、AND、又は他の種類の論理ゲートを形成し得る。例えば、このような論理ゲートを構築する１つの方法は、第１の遺伝子及び第１のプロモータを含む第１の転写ユニットを有すると同時に、第２の転写ユニットが、第２の遺伝子及び第２のプロモータを含むことである。両プロモータは、等価な遺伝子転写効果を有していてよい。ORゲートの場合、第１の遺伝子をセンス配向でそのプロモータと連結させてよく、そして、第２の遺伝子をアンチセンス配向で第２のプロモータと連結させてよく、第２の遺伝子は、第１の遺伝子の上流に配置される。上記実施態様では、少なくとも１つのアナライトの存在又は２つのアナライトの存在を検出することができる。ANDゲートの場合、Bonnet et al.,“Amplifying genetic logic gates” Science, 340(6132):599{603, 2013に例示されている通り、プロモータとレポータ遺伝子との間に配置された非対称転写ターミネータの対のうちの一方をそれぞれが反転させる２つの異なるリコンビナーゼの発現を、２つのアナライトの結合が制御することができる。上記実施態様では、２つのアナライトの存在のみを検出することができる。Bonnet et al. 2013に記載されているものが例示されるがこれに限定されない他の論理関数を作成してもよい。
【００４７】
各細胞における検出タンパク質をアッセイ及び検出して、結合しているアナライトを定量する。典型的には、検出タンパク質が蛍光タンパク質であるとき、フローサイトメトリー、レーザー走査サイトメトリー、又はイメージング顕微鏡等の当技術分野において公知の方法によって各細胞における蛍光強度を読み取ることができる。この方法では、各個々の細胞において全ての所望の波長範囲における蛍光強度を検出することができる。この情報から、各細胞におけるアナライトの量及び各細胞のアイデンティティを決定することができる。次いで、標準的な方法を使用して、元のサンプル中のアナライトの量又は濃度を決定することができる。幾つかの実施態様では、既知の濃度のアナライトを含有するサンプルを細胞と合わせたとき、検出タンパク質の発現（すなわち、その蛍光）を測定することによって較正曲線が構築される。再現可能な曲線を構築することができる限り、応答が線形である必要はない。次いで、較正曲線を使用して、アッセイ中の測定された検出タンパク質の蛍光強度をサンプル中のアナライト濃度と相関させることができる。
【００４８】
生物学的及び非生物学的サンプル中のアナライトの検出、同定、及び定量、例えば、医学、獣医科学、及び植物病理学における疾患及び感染体の診断、毒性試験、生体における代謝産物の分析、汚染物質の検出を介した品質保証、並びに環境汚染のモニタリングにおいて本発明の方法を使用できることが当業者には理解されるであろう。これら用途は、商業目的（ルーチン分析の意味で）であってもよく、純粋な研究目的に貢献することもできる。実質的に無限の様々なモダリティを使用して本発明の方法を使用することができるので、数千の異なるアナライトの特異的検出が可能になる。また、本発明の方法は、細胞によってどのアナライトが生成されるかに応じて、異なる細胞型間、又は単一細胞／組織の異なる発生段階間を識別するために使用することもできる。この方法では、疾患の発症（例えば、癌）の早期検出を容易にすることができる。全細胞センサが破壊されない程度まで再利用可能である。したがって、本発明の方法を利用して、複雑な環境モニタリング、例えば、診断及びバイオプロセシング等の分野における複雑なアナライト検出に対処することができる。また、本発明の全細胞センサは、インビトロアッセイの場合には医療診断及び疾患管理としても使用することができるが、埋込み型センサの形態であってもよい。また、本発明の全細胞センサは、病理学的バイオマーカーの検出又は病理学的バイオマーカーシグネチャーを、薬物（大腸菌におけるタキソール等、Stephanopoulosを参照されたい）の合成を導く下流の経路の活性化に関連付けることによって処置装置に、又は標的細胞死を誘発するか若しくは標的細胞に処置分子を送達することができる他の分子装置に変換することもできる。本発明の全細胞センサを使用してバイオセンサ装置を形成して、微小環境若しくはマイクロフルイディクス装置、又はマルチチップモジュール若しくは分散型ワイヤレスネットワークにおけるこれら装置のコレクションに展開することができる。バイオセンサ装置は、１つ以上の特定の化学的及び／又は物理的入力（例えば、熱又は電流）に応答することができ、特定のプロモータに対応することによって細胞のDNA記憶の小さな部分にアクセスし、検出タンパク質の形態で出力を生成し、熱量測定、電気化学、又は好ましくは蛍光生物発光の手段を通して物理的トランスデューサと通信する。
【００４９】
幾つかの実施態様では、本発明のキメラ受容体ポリペプチドは、無細胞系で使用することもできる。本明細書で使用するとき、用語「無細胞系」とは、細胞の非存在下においてインビトロで生合成反応を提供又は支援することができる試薬のセットを指す。例えば、転写反応を提供するために、無細胞系は、プロモータを含有するDNA、RNAポリメラーゼ、リボヌクレオチド、及びバッファ系を含む。無細胞系は、酵素、補酵素、及び組み換え細胞を含む真核又は原核の細胞から単離又は精製された他の細胞内成分を使用して調製することもでき、このような細胞の抽出物又は画分として調製することもできる。無細胞系は、真核及び原核の細胞、例えば、細菌、ウサギ網状赤血球、マウス細胞、ヒト細胞株、初代ヒト細胞株、及び出芽酵母等を含むがこれらに限定されない、様々な起源に由来していてよい。例えば、本発明のキメラ受容体ポリペプチドは、生細胞から調製される細胞抽出物を含む任意のビヒクルにおいて使用することができる。例えば、ビヒクルは、転写及び翻訳に必要な再構成された成分を含有する溶液中で使用することができる。このような系は、低イオン強度バッファ（例えば、生理的食塩、例えば、単純な生理食塩水、又はリン酸及び／若しくはTris緩衝生理食塩水、又は上記の他のもの）、又は全細胞溶解物若しくは分画された細胞溶解物を含み得る。
【００５０】
幾つかの実施態様では、本発明のキメラ受容体ポリペプチドは、固体支持体、好ましくは多孔質基材に部分的に又は完全に埋め込まれる。固体支持体は、ウェル、チューブ、平面基材（例えば、チップ又はプレート）、スフェア、多孔質基材（例えば、メッシュ又はフォーム）、３Ｄスキャホールド、パターン形成表面（例えば、ナノパターン若しくはマイクロパターン、又は両方）、多孔質又は固体のビーズ、ヒドロゲル、チャネル（例えば、マイクロフルイディクスチャネル）、平滑表面、及び粗面を含むがこれらに限定されない、任意の形態であってよい。好ましい実施態様では、固体支持体は、親水性であり、そして、好ましくは多孔質基材である。本明細書で使用するとき、用語「多孔質基材」とは、それを介して液体組成物が基材表面に浸透することができる細孔又は間隙を含有する基材を指す。紙は、多孔質基材の一例である。したがって、幾つかの実施態様では、多孔質基材は紙を含む。幾つかの実施態様では、固体支持体は、幾つかの（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、又はそれ以上）の、無細胞系が限局される空間的に個別の反応領域を含む。無細胞系を含む領域を本明細書では「反応領域」と称する。ほんの一例として、反応領域は、紙片上で疎水性バリアを使用する等の化学的プロセスによって作り出すことができる。疎水性バリアは、水を最低限しか透過させない。無細胞系を含む水溶液を反応領域に添加したとき、疎水性バリアの存在によって、溶液が反応領域内に限局される。疎水性バリアは、疎水性のポリマー又はワックス等の疎水性材料を含んでいてよい。疎水性バリアは、任意の既存のパターン形成方法（例えば、マイクロ接触プリンティング、又はディップペンリソグラフィー、フォトリソグラフィー、ｅ−ビームリソグラフィー、レーザー印刷、インクジェット印刷、又はマイクロアレイヤー）によってパターン形成されてもよい。紙上に疎水性パターンを作製する方法は、当技術分野において公知である。例えば、国際公開公報第２００９１２１０４１号及び同第２００８／０４９０８３号を参照されたい。これらのそれぞれの疎水性パターン形成方法についての内容は、参照により組み入れられる。幾つかの実施態様では、固体支持体は、水性サンプルを添加するための領域を反応領域と接続する１つ以上の流体チャネル（例えば、マイクロ流体チャネル）を含む。この実施態様では、水性サンプルを該領域に添加したとき、流体が反応領域に吸い出され、それによって、複数の反応領域を同じサンプルによって活性化することができる。幾つかの実施態様では、固体支持体は反応チップである。反応チップは、サンプルホスティング層、遮光層、水和層、透明層、湿度維持層、及び水蒸気透過性層を含んでいてよい。水和層は、インキュベート及び／又は測定中に湿度を提供する水和した材料又はチャンバを含んでいてよい。湿度維持層は、水不透過性であってよい。水蒸気透過性層は、サンプルの湿度を制御することができる。
【００５１】
幾つかの実施態様では、無細胞系はセンサとして機能する。幾つかの実施態様では、センサは、アナライトを検出することができる。アナライトが無細胞系と接触したとき、アナライトはセンサを活性化し、これによってシグナルが生成され、このことがアナライトの検出を示す。幾つかの実施態様では、シグナルは光学的である。限定されるわけではないが、光学シグナルは、蛍光、発光、所与の波長の吸収又は反射、紫外線、可視色、又は赤外線であってよい。幾つかの実施態様では、センサはレポータ構成要素を含む。レポータ構成要素の機能は、アナライトが検出されたときに検出可能なシグナルを生成することである。幾つかの実施態様では、レポータ構成要素はレポータ遺伝子を含む。任意の蛍光タンパク質をコードしているレポータ遺伝子が、本発明において適用可能であり得る。蛍光タンパク質は、例えば、GFP、mCherry、Venus、及びCeruleanを含むが、これらに限定されない。本明細書に記載される組成物及び方法に従って使用することができる蛍光タンパク質をコードしている遺伝子の例は、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２０１２／０００３６３０号に提供されているタンパク質を含むが、これらに限定されない。同様に、任意の酵素をコードしているレポータ遺伝子も同様に適用可能である。また、可視化及び／又は定量のために、着色基質を生成する酵素（「発色酵素」）を使用してもよい。分光光度計、又はプレートリーダーを含む吸光度測定を行うことができる他の機器を使用して、酵素生成物を定量することができる（例えば、図２６を参照されたい）。本明細書に記載される組成物及び方法に従って使用することができる発色酵素をコードしている遺伝子の例は、lacZアルファ断片、lacZ（ベータ−ガラクトシダーゼをコードしている、完全長）、及びxylEを含むが、これらに限定されない。また、酵素（例えば、グルコースオキシダーゼ又はグルコースデスヒドロゲナーゼ（Scognamiglio, V. Nanotechnology in glucose monitoring: advances and challenges in the last 10 years Biosens. Bioelectron. 2013, 47, 12- 25）は、反応体積の導電率を変化させることもでき、それによって、電気的又は電子的な読み取りが可能になる（Malitesta et al., Anal Chem 1990, 62, 2735-2740）。別の例では、ヌクレアーゼ酵素は、電子的及び光学的シグナルが生成されるように、核酸配列を切断することができる。更に別の例では、酵素は、蛍光共鳴エネルギー転移（FRET）又は消光対を分離して、蛍光の変化を誘導することができる。蛍光シグナルを生成するセンサの幾つかの実施態様では、顕微鏡、蛍光マイクロプレートリーダー、及び蛍光分光計を含むがこれらに限定されない、蛍光を検出することができる任意の市販の又は自作の装置又はシステムを、シグナルを検出する目的のために使用できることが当業者には明らかであろう。
【００５２】
幾つかの実施態様では、無細胞系は論理回路を含むので、活性化時に１つ以上の論理関数を実行することができる。合成生物学の分野では、生物学的構成要素の設計、及び電子回路を模倣することができるか又はより優れている場合もある論理回路への組み立てが著しく進歩した結果、より多様な論理回路が作り出された。幾つかの実施態様では、論理回路を水及び１つ以上のアナライトを含む組成物と接触させることによって、論理回路を活性化することができる。ほんの一例として、ANDゲートは、ANDゲートをオンにするために２つの適切なアナライトが同時に存在する必要がある、最も基本的な論理回路の１つである。アナライトが１つしか存在しない場合、ANDゲートはオンにならない。
【００５３】
幾つかの実施態様では、無細胞系は、固体支持体上で凍結乾燥されるので、水和時に再活性化することができる。フリーズドライとしても知られている凍結乾燥は、材料を凍結させ、次いで、周囲圧力を低下させて水を昇華させることを含む脱水プロセスである。凍結温度、温度変化速度、及び圧力等のパラメータが、異なる凍結乾燥プロセスについての変数である。したがって、本明細書における方法及び組成物で使用される凍結乾燥プロセスは、特定のパラメータセットに限定されない。好ましい凍結乾燥プロセスから貯蔵期限の長い貯蔵安定性組成物が生成されることは、当業者に明らかであるはずである。無細胞系及び／又は無細胞系が凍結したら、低圧（例えば、真空）を適用するまで、凍結した状態で維持しなければならない、すなわち、解凍を阻止しなければならない。これは、低体積の凍結した無細胞系及び／又は無細胞系を凍結乾燥機に輸送する時間が必要である場合、課題を提示し得る。これは、例えば、冷たくかつ高密度の材料（例えば、−８０℃で又は液体窒素中で凍結させた金属又はアクリル）を無細胞系及び／又は無細胞系と接触させて、凍結乾燥機への移動中に冷熱源として機能させることによって対処できる。該材料は、大きな熱容量を有し得る。幾つかの実施態様では、凍結した無細胞系及び／又は無細胞系は、凍結乾燥プロセス中実質的に遮光されている。これは、感光性の構成要素を保護するために特に有用である。凍結乾燥を実施するための機器は、Cole-Parmer及びMillrock Technology等の供給元を通して市販されている。幾つかの実施態様では、無細胞系及び無細胞系を含む水溶液と固体支持体とを接触させ、そして、該固体支持体を凍結乾燥させることを含むプロセスによって、貯蔵安定性組成物が生成される。幾つかの実施態様では、室温（すなわち、約２０℃〜２４℃）及び相対湿度１０％以下で保管したとき、組成物は、少なくとも２週間、少なくとも１ヶ月間、少なくとも２ヶ月間、又は少なくとも６ヶ月間の貯蔵期限を有する。
【００５４】
本発明の更なる目的は、アナライトを検出する方法であって、（ｉ）本発明の無細胞系を提供することと、（ii）該無細胞系を、該アナライトについて試験されるサンプルと接触させることと、（iii）シグナルを検出することであって、該シグナルの検出が該アナライトの存在を示すことと、を含む方法に関する。
【００５５】
以下の図面及び実施例によって本発明を更に説明する。しかし、これら実施例及び図面は、いかなる方法によっても、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【００５６】
配列：
【化１】
2020527028.tif 000002
2020527028.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】膜結合型一成分系に基づく全細胞バイオセンサキメラ受容体設計の概略図。キメラ受容体は、３つの異なるドメインで構成されている：（ａ）標的アナライトに特異的に結合した際に二量体又は多量体を形成するアナライト結合ドメイン；（ｂ）アナライトによって誘導される該結合ドメインのオリゴマー化を通して活性化され得る大腸菌CadC転写因子；及び（ｃ）キメラ受容体ポリペプチドの膜への挿入に関与し、そして、正確な細胞質Ｎ末端（CadC転写活性化因子DNA結合ドメイン）及び細胞質外Ｃ末端（結合ドメイン）のトポロジーを形成する膜貫通ドメイン。該キメラ受容体が標的アナライトに結合すると、そのオリゴマー化が誘発され、Ｎ末端CadC DNA結合ドメインは、更なるシグナル出力のために下流のシグナル処理事象を活性化することができる。
【図２Ａ】周辺質ドメインのオリゴマー化によるCadC転写因子の活性化。Ａ．CadCが周辺質ドメインのオリゴマー化を通して活性化され得るかどうかを試験するために、CadCのＣ末端pHセンサドメインを自己二量体化ロイシンジッパーGCN4ドメインに置き換える。Ｂ．本発明のコンストラクトにおいて２つの膜貫通ドメインを使用する：１）野生型CadC膜貫通領域（wtTM）及び２）人工１６ロイシン膜貫通ドメイン（artTM）。Ｃ末端周辺質GCN4ロイシンジッパーがなければ、CadC-wtTM融合物もCadC-artTM融合物も下流のレポータ遺伝子GFPの発現を活性化することはできない（CadC-wtTMのみ及びCadC-artTMのみ）。他方、Ｃ末端に自己二量体化ドメインロイシンジッパーGCN4を含有する２つのコンストラクトCadC-wtTM-GCN4及びCadC-artTM-GCN4は、それぞれ、下流のレポータ遺伝子の発現を５０倍及び３００倍活性化することができる。
【図２Ｂ】周辺質ドメインのオリゴマー化によるCadC転写因子の活性化。Ａ．CadCが周辺質ドメインのオリゴマー化を通して活性化され得るかどうかを試験するために、CadCのＣ末端pHセンサドメインを自己二量体化ロイシンジッパーGCN4ドメインに置き換える。Ｂ．本発明のコンストラクトにおいて２つの膜貫通ドメインを使用する：１）野生型CadC膜貫通領域（wtTM）及び２）人工１６ロイシン膜貫通ドメイン（artTM）。Ｃ末端周辺質GCN4ロイシンジッパーがなければ、CadC-wtTM融合物もCadC-artTM融合物も下流のレポータ遺伝子GFPの発現を活性化することはできない（CadC-wtTMのみ及びCadC-artTMのみ）。他方、Ｃ末端に自己二量体化ドメインロイシンジッパーGCN4を含有する２つのコンストラクトCadC-wtTM-GCN4及びCadC-artTM-GCN4は、それぞれ、下流のレポータ遺伝子の発現を５０倍及び３００倍活性化することができる。
【図３Ａ】アナライトによって誘導される結合ドメインのオリゴマー化を介したCadC転写因子の活性化。アナライトによって誘導される結合ドメインのオリゴマー化を通して本発明のキメラ受容体が活性化され得るかどうかを試験するために、カフェインと結合した際に二量体化することができるVHHラクダ抗体であるVHH−カフェインにCadC転写因子DNA結合ドメインを融合させた。タンパク質Rnaseを認識することができる同じスキャホールドを使用するVHHであるVHRaseを、本発明のネガティブコントロールとして使用した。この図に示す通り、コンストラクトCadC-artTM-VHHcafeのみが１mM カフェインの存在によって活性化され得、遺伝子発現の倍数変化は約２００倍である。
【図３Ｂ】アナライトによって誘導される結合ドメインのオリゴマー化を介したCadC転写因子の活性化。アナライトによって誘導される結合ドメインのオリゴマー化を通して本発明のキメラ受容体が活性化され得るかどうかを試験するために、カフェインと結合した際に二量体化することができるVHHラクダ抗体であるVHH−カフェインにCadC転写因子DNA結合ドメインを融合させた。タンパク質Rnaseを認識することができる同じスキャホールドを使用するVHHであるVHRaseを、本発明のネガティブコントロールとして使用した。この図に示す通り、コンストラクトCadC-artTM-VHHcafeのみが１mM カフェインの存在によって活性化され得、遺伝子発現の倍数変化は約２００倍である。
【図４】CadC-artTM-VHHcafeキメラ受容体のカフェインに対する用量依存性応答。CadC-artTM-VHHcafe（２０μM IPTG誘導）コンストラクトを発現している細胞を、様々な濃度のカフェイン中でインキュベートした。１６時間後、フローサイトメーターを使用して蛍光を定量した。細胞は、カフェイン濃度の増大と相関する蛍光の増加を示す。
【図５】LexA-VHHcafe pLexA-deGFP系の全体図。LexA-VHHcafe遺伝子が発現すると、単量体抗体VHHcafeと融合しているスプリットドメインDNA結合（DBD）分子LexAが生成される。２つの分子の二量体化は、カフェイン分子の存在によって誘導される。ホモ二量体は、pLexAプロモータのオペレータに結合し、そして、deGFPの発現を抑制する。
【図６】LexA-Lam4 DsRed系の全体図。LexA-Lam4遺伝子が発現すると、単量体抗体Lam4と融合しているDBD分子LexAが生成される。２つの分子の二量体化は、DsRed分子の存在によって誘導される。ホモ二量体は、pLexAプロモータのオペレータに結合し、そして、deGFPの発現を抑制する。
【図７】カフェインの有り無しにおけるdeGFPの発現を示す。
【図８】DsRedの有り無しにおけるdeGFPの発現を示す。
【００５８】
実施例１：
材料及び方法
細菌株、プラスミド、及び材料
CadC及びLexAの転写因子DNA結合ドメイン、ロイシンジッパーGCN4、VHHcafe、及びVHHRNaseは、Integrated DNA Technologies（IDT）によって合成された。GFPレポータ、CadBAプロモータ、pLexAプロモータ、及びCadC変異体等の様々なDNA構成要素を、Gibsonアセンブリ法によってBioBrick標準ベクターpSB4K5に構築した。得られたコンストラクトを大腸菌株NEB10beta（New England Biolabs, NEB）に形質転換し、そして、その性能を判定した。全てのコンストラクトにおいて、CadC変異体の発現レベルは、IPTGによって誘導され得るpLac-1プロモータの制御下にある。CadC変異体は、pCadBAプロモータを通してレポータGFPの発現を制御する。
【００５９】
CadC変異体の設計及び構築
各コンストラクトの配列の詳細は、補足情報に列挙する。まず、他のCadC変異体によって更に置換するためのテンプレートとして、CadC-wtTM-GCN4を有するコンストラクトCadC作動ユニット（operation unit）を構築した。３対のプライマー（プライマーの詳細を参照されたい）を使用して、４０bp重複領域を有する３つの遺伝子ブロックを増幅した。これら構成要素をGibsonアセンブリ法によって更に組み立てた。
【００６０】
CadC作動ユニットのためのPCRで増幅されたブロックの生成
テンプレートDNA断片 ０．１〜１０ng、各フォワード／リバースプライマー（２０μM） １μL、及びQ5 hot start high-fidelity 2X master mix（NEB） ２０μLからなる反応混合物 ４０μL中でPCR増幅を実施した。９８℃で３０秒間の初期変性後、９８℃で１０秒間、対応するアニーリング温度（各プライマーの組み合わせによって異なる、NEB Tm計算機で計算：http://tmcalculator.neb.com/#!/）で３０秒間、及び７２℃における伸長（２kb／分）のPCR手順を３５サイクル実施し、最後の伸長は７２℃で１０分間であった。ゲル電気泳動によってPCR生成物を確認し、次いで、PCR clean up kitによって精製し、そして、Nanodrop分光光度計によってDNA濃度を決定した。
【００６１】
Gibsonアセンブリ及び電気形質転換
精製されたPCR生成物中の大腸菌由来のDNAテンプレートを、３７℃で１時間、Cut Smart reaction buffer（NEB） ４０μL中DpnI（２０単位／μL、NEB） １μLで更に切断した。得られた生成物をGibsonアセンブリ反応に直接適用した。各Gibsonアセンブリ反応では、ベクターDNA断片 １００ng及び３〜５倍の挿入断片を、５０℃で６０分間、最終体積２０μLで2X Gibsonアセンブリマスターミックス（NEB） １０μLと共にインキュベートした。次のエレクトロポレーション効率に影響を与える反応ミックス中のDNAリガーゼ活性を阻害するために、該反応ミックスを更に８０℃で１５分間熱で不活化した。Gibsonアセンブリ生成物 １μLをNEB10betaエレクトロコンピテントセル ４０μLに添加し、次いで、Biorad 0.1 cm gap Micropulserエレクトロポレーションキュベットに移した。Biorad Micropulser electroporator及びプログラムEC1を用いてエレクトロポレーションした直後、予め加熱しておいた（３７℃）SOC培地 １mLを形質転換体に直ちに添加した。細胞をレスキューするために、激しく振盪しながら更に１時間、細胞培養物を３７℃のインキュベータ内で更にインキュベートした。次いで、抗生物質（例えば、カナマイシン）を含む選択プレートに形質転換体をプレーティングし、そして、３７℃で一晩インキュベートした。Sangerシーケンシングによってコンストラクトを更に確認した。
【００６２】
インビボ特性評価
CadC作動ユニット変異体のシングルコロニーをLB／カナマイシン培地 ３mLにピッキングし、そして、激しく振盪しながら３７℃で一晩インキュベートする。一晩培養物をLB／カナマイシン培地 ３mLで更に１００倍希釈し、そして、対数期（O.D＝０．４〜０．６）に達するまで３７℃で４時間インキュベートする。対数期の培養物を、誘導因子である１mM IPTG（実験については：周辺質ドメインのオリゴマー化によるCadC転写因子の活性化）又は１mM IPTG／１mM カフェイン（実験については：アナライトによって誘導される結合ドメインのオリゴマー化によるCadC転写因子の活性化）を含有する培地で更に５０倍希釈し、次いで、激しく振盪しながら３７℃で一晩インキュベートした。得られた細胞培養物を、更に、Attune NxTフローサイトメーターで分析した。
【００６３】
スプリットDNA結合ドメインを使用した合成バイオセンサの設計。転写調節因子のDNA結合は、一般的に、LBDを介したDBDの二量体化に依存する。LBD／二量体化ドメインが欠失すると、不活性な単量体DBDが生じるが、関心対象の融合タンパク質によって駆動される二量体化を介してその機能を回復させることができる。本発明のスプリットDBD系を改変するために、本発明者らは大腸菌のSOS応答に関与する遺伝子の転写を調節する、十分に特性評価されている転写抑制因子であるLexAのDBDを使用した。SOS応答の誘導時、RecAは、DNA結合ドメインと二量体化ドメインとの間の柔軟性ヒンジの残基８５における自己切断を介したLexAの不活化を促進する。単量体LexA DBDの抑制活性は、ロイシンジッパーとの融合を介してそれを二量体化させることによって回復することができる。タンパク質−タンパク質を探索するために、LexA DBDをツーハイブリッドスクリーニングで使用した。内因性大腸菌LexAからの干渉を防ぐために、本発明者らは突然変異体LexA-408、及び野生型LexAには認識されない対応するそのプロモータを使用した。本発明者らはリガンドによって誘導されるホモ二量体化を受ける単量体LBDにLexA DBDを融合させた。したがって、リガンドの存在下では、LexA DBDがDNAに結合し、そして、標的遺伝子の発現を抑制することができるはずである。
【００６４】
合成リガンド結合ドメインの選択。スケーラブルな受容体プラットフォームを開発するために、本発明者らは理想のLBDスキャホールドを選択するための幾つかの基準を設定した：（ｉ）異なる種類（例えば、タンパク質、低分子）の多くの異なるリガンドに結合するように更に改変するための能力；（ii）高い溶解度及び安定性；並びに（iii）リガンド結合前に単量体状態であることを確実にするための低い凝集傾向。抗体は、様々な種類のリガンドを検出するための理想的なスキャホールドであり、そして、様々な処置又は診断の用途に適用することができる。しかし、IgGは、原核細胞系における発現レベルが低い。この問題に対処するために、研究者らは、ラクダVHH等の単一ドメイン抗体、又は高い安定性及び溶解度で原核細胞系において十分に発現し、そして、多くの異なる抗原を標的とするようにコンビナトリアルライブラリを選択することができる、モノボディ、DARPin、若しくはアルファRep等の抗体ミメティックを開発した。したがって、本発明者らはリガンドの結合時に単量体から二量体へと移行することができる合成抗体を使用することに決定した。概念実証を確立するため、そして、タンパク質に対する膜の透過性が限られていることから、本発明者らは小さな拡散性分子を標的とする抗体について調べた。本発明者らはそのリガンドであるカフェインに結合した際に二量体化することができる単一ドメインVHHラクダ抗体を使用した（本明細書ではVHH-カフェインと命名）。ネガティブコントロールとして、本発明者らはRNase Aを標的とするVHHを選択する（本明細書ではVHH-対照と命名）。
【００６５】
LexA-VHH融合物を使用したカフェインの検出。本発明者らは大腸菌細胞質で発現し、Ｎ末端LexA DBD及びＣ末端VHHで構成され、そして、その発現がイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（IPTG）によって誘導されるpLacO1プロモータの制御下にある、２つのキメラタンパク質を構築した。レポータとして、本発明者らはLexAプロモータによって駆動される緑色蛍光タンパク質（GFP）を使用した。ポジティブ及びネガティブコントロールとして、本発明者らは完全長LexA及びLexA DBDを発現させた。予想通り、完全長LexAによって媒介される抑制はIPTG濃度と共に増大し、そして、カフェインには影響を受けないことが観察された（データは割愛する）。また、LexA DBDは、高濃度で遺伝子を抑制できる（５０μM及び１００μM IPTGで、それぞれ１４％及び３５％の抑制、データは割愛する）ことも観察された。次いで、本発明者らは漸増濃度のIPTG及びカフェインに応答してLexAVHH-カフェイン及びLexA-VHH-対照を発現する細胞の挙動について特性評価した（データは割愛する）。本発明者らは両融合タンパク質が類似のレベルで発現することをウエスタンブロット（WB）によって確認した（データは割愛する）。まず、LexADBDと同様に、融合タンパク質LexA-VHH-カフェイン及びLexA-VHH対照は濃度依存性抑制活性を示す（５０μM及び１００μM IPTG誘導で、それぞれ３０％及び４５％、データは割愛する）ことが観察された。LexA-VHH-カフェイン及びLexAVHH-対照は、同様のIPTG濃度でLexADBDに対して同等の抑制活性を有しており、このことは、この抑制効果が主にDBDに起因すること、そして、VHHが細胞質において単量体の状態であることを示唆している。次いで、本発明者らは様々なIPTG濃度において、漸増濃度のカフェインに対するLexA-VHH融合物の応答をモニタリングした。LexA-VHH-対照についてはカフェインに応答する変化は検出できなかった（データは割愛する）が、LexA-VHHカフェインは、２５μM IPTG濃度及び１００nM カフェインで始まる、カフェインに対する用量依存性応答を有していた（データは割愛する）。これら結果は、そのリガンドの存在下において、VHH-カフェインが二量体化し、そして、LexA DNA結合活性を回復して、レポータ遺伝子を抑制することを示す。カフェインに対する応答は、全細胞集団内で均質であった（データは割愛する）。本発明者らはLexA-VHH-カフェインの抑制倍数を計算した。１００μM IPTG誘導では抑制倍数がより高い（４．３倍）ことが見出された（データは割愛する）。LexA-VHHカフェインは、同様のタンパク質発現レベルで完全長lexAと同等の抑制活性を有していた（それぞれ、１００及び１２．５μM IPTG濃度）。また、本発明者らは変動値（swing values）（すなわち、不活性状態と活性状態との間の蛍光強度の絶対変化）を計算し、そして、２５μM IPTG及び１００μM カフェインで変動が最良である（１５RPU）ことが見出された（データは割愛する）。しかし、より低濃度のカフェインを検出するには、LexA-VHH-カフェインがより高発現することが必要であった。シグナル増加をモニタリングすることがバイオセンサアッセイにとってより実用的であるので、次いで、本発明者らはBetI抑制因子に基づく遺伝的インバータに本発明の系を接続した（データは割愛する）。５０μM IPTG誘導で始まるGFP強度の顕著な増加が観察された（データは割愛する）。変動は抑制因子のみの系よりも少なかった（１００μM IPTGでそれぞれ２．２RPU対１２．２RPU）が、カフェインの非存在下におけるバックグラウンドシグナルが非常に低いことから、倍数変化は依然として顕著であった（４倍、データは割愛する）。興味深いことに、漸増濃度のIPTGにわたってGFPシグナルがわずかしか変化しない（０μM IPTGにおける０．６RPUから１００μM IPTGにおける０．７RPU）ことが見出された。本発明者らは恐らくBetI抑制因子を分解するのに必要な遅延に起因して、インバータモジュールが、高濃度におけるDBDの非特異的抑制効果を緩衝すると仮定する。これら結果は、スプリットDBDを使用して、リガンドによって誘導される抗体ベースのLBDの二量体化を介して活性化される合成受容体を改変できることを立証する。
【００６６】
実施例２
ロイシンジッパーを介したcadc dna結合ドメインの人工的二量体化が遺伝子発現を誘導する
ここでは、本発明者らはCadC DNA結合ドメインを野生型CadC膜貫通領域又は人工膜貫通領域と融合させた。次いで、本発明者らはこれら２つのスキャホールドをGCN4ホモ二量体化ロイシンジッパーと融合させた。本発明者らはGCN4の非存在下ではシグナルは観察されないが、GCN4と融合したコンストラクトはGFP発現を誘発できることを示す（図２）。興味深いことに、wt CadC膜貫通領域に融合したGCN4を用いるコンストラクトは、GCN4を有しないコンストラクトと比べてGFP発現を〜５０倍変化させるが、人工TMを使用するコンストラクトは、３００倍変化させる。
【００６７】
自己二量体化膜貫通ヘリックスを介してCadC DNA結合ドメインを二量体化させると、下流の遺伝子発現を誘発できることは既に立証されているが、これは、我々の知る限り、CadC DNA結合ドメイン及び下流の遺伝子発現が、細胞外二量体化ドメインの二量体化を介して活性化され得ることの最初の証明である。更に、本発明者らは膜貫通領域配列が活性化の効率に大きく影響し得ることを立証する。
【００６８】
実施例３
CadC DBD及びVHHリガンド結合ドメインを使用した合成膜貫通受容体の改変。全細胞バイオセンサの１つの現在の制約は、細胞膜を通過することができないタンパク質等の大きな生体分子を検出するのが困難であることである。哺乳類細胞では合成膜貫通受容体が開発されているが、全細胞バイオセンシングのためのロバストなシャーシである微生物において、可溶性細胞外リガンドを検出するためのスケーラブルな受容体プラットフォームは報告されていない。したがって、本発明者らはスプリットDBDの原理を利用するキメラ膜貫通受容体を改変することを目的とした。本発明者らは既存の大腸菌膜貫通転写調節因子を探し、そして、ToxRファミリー由来の転写活性化因子であるCadCに合わせて調整した。CadCは、Ｎ末端細胞質DBD及びＣ末端周辺質pHセンサドメインで構成されている。それは、環境pHが低下したときかつリジンの存在下で、pCadBAプロモータを活性化する。興味深いことに、細胞質CadC DNA結合ドメインに結合している膜貫通ヘリックスの二量体化は、CadC転写活性を回復させるのに十分である。したがって、本発明者らはリガンドによって誘導される周辺質センサドメインの二量体化を介してCadC活性を回復させることを目的とした。リジン透過酵素LysPによる内因性調節を取り除くために、本発明者らは１６ロイシンリピートで構成される人工膜貫通ドメインを使用した。本発明者らは自己二量体化ロイシンジッパーGCN4をCadCの周辺質Ｃ末端に融合したところ、細胞CadCLeu TM-GCN4が強力なGFPシグナルを生成することが観察され、このことから、二量体化のみでCadCの機能を回復できたことが確認された（データは割愛する）。次いで、本発明者らはCadC DBD、CadC膜近傍ドメイン（JM）、Leu(16)TM、CadC野生型外部リンカー領域（EL）、及びVHHリガンド結合ドメインで構成され（データは割愛する）、そして、その発現がpLacO1プロモータの制御下にある（データは割愛する）２つのCadC-VHH融合タンパク質を構築した。両融合タンパク質は、IPTG濃度範囲にわたって類似の発現レベルを有していた（データは割愛する）。LexA系と同様に、CadC-VHH-カフェインコンストラクトは高IPTG濃度で非特異的活性化を示す（０．６から５．６RPU、約９倍増加）が、CadC-VHH-対照融合物は示さないことが観察された（データは割愛する）。両受容体は同レベルで発現しているので、これら結果は、膜で発現するVHHカフェインがVHH対照よりもオリゴマー化する傾向が強いことを示唆している。受容体の自己活性化にかかわらず、２５μM IPTG濃度及びそれ以上で始まる、漸増濃度のカフェインに対するCadC-VHH-カフェインの強い応答が観察された（データは割愛する）。VHH対照は、GFPシグナルの変化を全く示さなかった。本発明者らはシグナルの変動及びカフェインに対する応答の倍数変化を計算した（データは割愛する）。１００μM カフェインでは、受容体発現の増加と共に変動が増加することが見出された（変動は、２５、５０、及び１００μM IPTGにおいて、それぞれ、６、１９、２１RPUである、データは割愛する）。しかし、倍数変化は２５μM IPTGにおいて最大であり（１０倍）、そして、それを上回るIPTG濃度では減少した（倍数変化は、５０及び１００μM IPTGにおいて、それぞれ、６及び４．６倍である、データは割愛する）。この倍数変化の減少は、より高い発現��ベルにおける非特異的受容体活性化に起因するより高いバックグラウンドノイズによって説明される。したがって、より高い発現レベルのCadC-VHH-カフェインはカフェインに対する細胞の感受性を増大させるにもかかわらず、この過剰発現は非特異的自己活性化も増加させるので、その結果、シグナル対ノイズ比を低下させる。しかし、２５μM IPTG誘導で誘導された細胞は二峰性分布を有していたが、５０μMでは、カフェインに対する応答は全細胞集団にわたって均質であった（データは割愛する）。したがって、受容体発現は、２つの基準を満たすようにバランスをとる必要がある：自己活性化及びバックグラウンドノイズを最小限に抑えながら、均質な応答を支援する。これら結果は、スプリットDBDを周辺質VHHスキャホールドと融合させることによって合成膜貫通受容体を改変できることを立証する。受容体発現レベルは、感受性及びシグナル対ノイズ比に強く影響を与える。
【００６９】
リンカーの改変を介した膜貫通受容体のシグナル対ノイズ比の最適化。次いで、本発明者らはそのバックグラウンドノイズを低減する（educing）ことによって本発明の系のシグナル対ノイズ比を改善しようとした。本発明者らはリンカー配列組成が不適切であると、受容体の非特異的なオリゴマー化及び活性化が促進され得ると仮定した。したがって、本発明者らは受容体の基本の活性化速度及びシグナル対ノイズ比に影響を与えることが示されている外部リンカー領域のアミノ酸組成を改変した。本発明者らは野生型CadC外部リンカー（DTRLPMS（配列番号１６）、wt）を柔軟性（GGGSG（配列番号１７））又は剛性（EAAAK（配列番号１８））のリンカー配列に交換した。また、本発明者らはリンカー領域を完全に除去した（リンカー無し、NL）（データは割愛する）。本発明者らは外部リンカー変異体の自己活性化レベルを、５０μM IPTGにおける１００μM カフェインに対する応答と共に試験した（データは割愛する）。wt又は柔軟性の外部リンカーを有するCadC-VHHカフェインからはカフェインに対して類似の応答が観察されたが、剛性外部リンカーを有するコンストラクトは応答しなかった（データは割愛する）。最後に、外部リンカー領域が除去されているコンストラクトからは、シグナル活性化のわずかな減少と共に、自己活性化の顕著な減少が観察された（データは割愛する）。NLコンストラクトのシグナル変動はわずかに低かったが、倍数変化はwtコンストラクトに比べて３倍超であった（それぞれ５対１６倍変化、データは割愛する）。wt、柔軟性、及びNLのコンストラクトは同様の発現レベルを有していたが、剛性リンカーを有するコンストラクトは強くタンパク質分解されることがWB分析を介して見出され、これによって、この変異体の活性が全て失われたことが説明される（データは割愛する）。本発明者らはCadCVHH-カフェインのNLバージョンの応答範囲をより詳細にマッピングした（データは割愛する）。より低いカフェイン濃度に応答する受容体倍数変化の顕著な改善が観察された。例えば、５０μM IPTG誘導では、NLバージョンは１００nM カフェインに応答して３〜６倍の変化を示したが、wtコンストラクトはわずか２．８倍の変化しか示さなかった。この効果は、１μM カフェイン（NLの８倍変化に対してwtは５倍）、１０μM カフェイン（１２．６対５．７）で更に強かった。本発明者らはしたがって、より優れたS/N比を有しながら、カフェインに応答して強いシグナル変動を示す受容体を得ることができた。これら結果は、ドメイン間リンカー配列を最適化することによってキメラ膜貫通受容体の応答を調整できることを立証する。
【００７０】
実施例４
Ｌ型細菌を使用した、膜貫通受容体によって媒介される細胞外タンパク質の検出。医療診断等の多くのバイオセンシング用途は、疾患のタンパク質バイオマーカー等の大分子の検出を必要とする。しかし、CadC膜貫通受容体系は大腸菌の内膜で発現するので、これら大分子に対するアクセシビリティが制限される。それにもかかわらず、膜貫通受容体は、そのセンシングドメインが細胞外環境に直接露出した場合、このようなリガンドを検出することができるはずである。この可能性を立証するために、本発明者らは大腸菌の外膜欠損型であるＬ型大腸菌を使用することに決めた。Ｌ型細菌は、そのインタクトな細胞壁が欠損していることから、浸透圧感受性（osmosensitive）の球菌として１９３５年に最初に単離された。Ｌ型は、ペプチドグリカンの合成を阻害するか若しくは細胞壁の形成を妨害する抗生物質で一過的に生成することもでき、ペプチドグリカンの合成に関連する遺伝子の突然変異によって永続的に生成することもできる。その外膜が欠損しているので、Ｌ型細菌は、タンパク質等の大分子を検出するための全細胞バイオセンサを開発するための好適な候補となり得た。本発明者らはペプチドグリカンを架橋するペニシリン結合タンパク質（PBP）を阻害することによって細胞壁合成を破壊する（データは割愛する）、抗生物質セフスロジンを含む浸透圧保護性培地において細胞を成長させることによってＬ型大腸菌を調製した。細胞がＬ型の特徴的な球形状を有していることが、顕微鏡観察を介して確認された（データは割愛する）。細胞にIPTG及びカフェインを添加し、そして、蛍光レポータの発現をモニタリングすることによって、この受容体が依然として機能していることが確認された（データは割愛する）。外膜が欠損しているおかげで、免疫蛍光標識を介して受容体が内膜を有効に標的としていることも確認された（データは割愛する）。次いで、本発明者らは抗体への応答をモニタリングすることによって、本発明の受容体が大きなタンパク質リガンドに結合し、そして、該リガンドによって活性化され得るかどうかを試験した。抗体は、感染症又は自己免疫疾患を診断するために使用することができる、関連するクラスのバイオマーカーである。抗体は多価であるので、受容体の細胞外ドメインに対して抗体が結合すると、該受容体の多量体化が誘発され、そして、受容体の活性化を引き起こすはずである。概念実証として、本発明のVHHはＣ末端にc-Mycタグを有するので、本発明者らは抗c-Myc抗体を検出することを目的とした。本発明者らは１０μg/mL（６６nM） 抗c-Myc抗体と共に、CadC-VHHカフェインのNLバージョンを発現しているＬ型大腸菌をインキュベートした（データは割愛する）。c-Myc抗体と共にインキュベートしたＬ型細菌からは、GFPシグナルが３倍増加したことが観察された（データは割愛する）。IPTGの存在下でのみシグナル増加が観察されたので、この応答は受容体の存在に依存していた。最後に、抗c-Myc抗体と共に未処理大腸菌をインキュベートしたときには、シグナル増加は全く観察されなかった（データは割愛する）。これら結果は、細菌のキメラ膜貫通受容体を使用して細胞外環境におけるタンパク質リガンドを検出できること、及びＬ型細菌がこのような用途に好適なフォーマットであり得ることを立証する。
【００７１】
実施例５：
序論：
まず第一に、無細胞系における本発明のキメラ受容体ポリペプチドの有用性を検証するために、本発明者らは二量体化活性化に基づいてインビボで使用される系を試験した。単一ドメイン抗体であるVHH−カフェインは、そのホモ二量体化を誘導するリガンドであるカフェインに結合することによって活性化される。これら抗体を単量体DNA結合ドメイン（LexA-DBD）と融合させ、これは、その二量体化時に、pLexAプロモータのオペレータに結合し、GFPレポータ遺伝子の発現を抑制する（図５）。第２の工程では、本発明者らはより大きなリガンドであるDsRedを使用して系を試験した。DsRedは、赤色蛍光を発する四量体タンパク質である。Lam4 VHHは、DsRedリガンドの結合によって二量体化した。以前の系と同様に、抗体をLexA-DBDと融合させる。次いで、Lam4によって誘導されるLexA-DBDの二量体化によって、pLexAプロモータのオペレータに複合体が結合し、そして、deGFPの発現が抑制される（図６）。
【００７２】
方法：
プラスミドの調製：GFPレポータ、LexA-DBD-VHHcafe、及びLexA-DBD-Lam4をコードしている遺伝子を、Birnboim HC, Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 1979;7: 1513-1523に記載の通りクローニングした。全ての増幅を大腸菌で行った。プラスミドの精製は、Qiagen（登録商標）キットを使用して行った。
【００７３】
細胞抽出物の調製：jove.comで入手可能なプロトコール（Sun ZZ, Hayes CA, Shin J, Caschera F, Murray RM, Noireaux V. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. J Vis Exp. 2013; e50762）に従って、プロセスには４〜５日間かかった。まず第一に、選択用の抗生物質の存在下において大腸菌の株を寒天プレート上で培養し、そして、培養培地を調製する。次いで、培養培地中で増幅を行った。培養物を遠心分離し、そして、洗い流した。最後に、細胞を溶解させた。最後に、抽出物の較正、グルタミン酸、DTT、及びマグネシウムの濃度の最適化を実施する。
【００７４】
プレートの読み取りによる反応速度データの収集：サンプルを３８４ウェルプレートに入れる。Cytation3（登録商標）を使用して、GFP波長（５２８nm）及びDsRed蛍光についてはRFP（６２０nm）から発せられる蛍光を記録する。機械を３０℃でプログラムし、そして、蛍光を１０分間間隔で１６時間読み取る。
【００７５】
結果：
インビトロ系の検証：本発明者らはレポータ遺伝子によるdeGFPの発現によって発せられた蛍光の強度を分析した。本発明者らは培地中のカフェインの有り無し両方で、deGFPの発現に対する成長範囲（growing range）のLexA-VHHcafeプラスミドの影響について試験した（図７）。pLexA-deGFPプラスミドの濃度が２４０ng未満であるとき、レポータdeGFPのシグナルはカフェインの存在によって影響を受けることが観察された。カフェインを含まないpLexA-deGFPプラスミド ８０ngの濃度については、測定されたシグナルは３４，９４４uaである。１００μM カフェインを反応に添加したとき、このシグナルは２９３０u.a、すなわち、ポジティブコントロールの１０％未満に低下する。また、LexA-VHHcafeプラスミドの濃度が２４０ng／反応を上回っているとき、発現したDBD抗体が、カフェイン分子に結合することなく二量体化することも見出された。この効果は、インビボで既に観察されている。したがって、最適化された上記条件では、このバイオセンサ系が機能すると結論づけることができる。無細胞プラットフォームによって、リガンドの検出及び結合を介して二量体化し、そして、deGFPの発現を抑制することができる機能的タンパク質を発現させることが可能になる。
【００７６】
本発明者らはより大きなリガンドであるDsRedの検出：以前の系と同様に、pLexA-deGFPレポータ遺伝子によるdeGFPの発現によって発せられる蛍光を検出した（図８）。本発明者らは培地中のDsRedの有り無し両方で、deGFPの発現に対する成長範囲のLexA-Lam4プラスミドの影響について試験した。この系では、プラスミドpLex-deGFP濃度が１００ng／反応を上回っているとき、レポータ遺伝子に対する著しいリガンドの干渉はない。３００ng／レポータ反応及び８００ng／LexA-Lam4の反応の濃度については、培地中にDsRedが有る場合のシグナル強度（４８５３a.u.）と無い場合のシグナル強度（４１３８０a.u.）との間で〜８．５の比を見出すことができる。この系も無細胞プラットフォームで機能すると結論づけることができる。これは、バイオセンサによる大分子の検出に非常に有望である。無細胞プラットフォームは、大分子の検出を容易にし、そして、診断を改善することができる。更に、ここで提唱した二重二量体化モデル、DNA結合ドメイン、及び単量体抗体は、絶好の機会を与える。
【００７７】
参照文献
本願全体を通して、様々な参照文献が、本発明が関連する技術の最新分野について説明している。これら参照文献の開示は、参照により本開示に組み入れられる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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