(57)【要約】  本発明は、子宮内でアルコールに暴露された対象において、胎児性アルコール症候群ＦＡＳ）、脳血管疾患、および成長遅滞を含んでなる群から選択される胎児性アルコール症候群障害（ＦＡＳＤ）の予防および／または治療において薬物として使用される胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）に関する。本発明はまた、その治療的使用のための、ＰｌＧＦを含んでなる医薬組成物または製品に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
子宮内でアルコールに暴露されていた対象における胎児性アルコールスペクトラム障害（ＦＡＳＤ）の予防および／または治療において使用するための胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）。
【請求項２】
前記ＦＡＳＤが、脳血管損傷に関連することを特徴とする、請求項１に記載の使用のためのＰｌＧＦ。
【請求項３】
前記ＰｌＧＦが、脳血管新生を刺激することを特徴とする、請求項１または２に記載の使用のためのＰｌＧＦ。
【請求項４】
前記ＦＡＳＤが、胎児性アルコール症候群（ＦＡＳ）、特に、子宮内でアルコールに暴露されていた対象において発育不全として発現する場合であることを特徴とする、請求項１に記載の使用のためのＰｌＧＦ。
【請求項５】
前記発育不全が、対象全体あるいは胴、腹部および頭蓋から選択されるその一部のうちの一箇所の発育不全であることを特徴とする、請求項４に記載の使用のためのＰｌＧＦ。
【請求項６】
前記ＰｌＧＦが、配列番号１〜４のうち１つにより表される配列を有することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用のためのＰｌＧＦ。
【請求項７】
遺伝子工学または化学合成によって得られることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用のためのＰｌＧＦ。
【請求項８】
子宮内でアルコールに暴露されていた対象が、胚、胎児および小児、特に、早産児から選択されることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用のためのＰｌＧＦ。
【請求項９】
子宮内もしくは子宮外で、または子宮内次いで子宮外で投与されることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用のためのＰｌＧＦ。
【請求項１０】
子宮外で早産児に投与されることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用のためのＰｌＧＦ。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に定義されるＰｌＧＦと薬学上許容される担体とを含んでなる、胎児性アルコールスペクトラム障害（ＦＡＳＤ）の予防および／または治療において使用するための医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の使用のためのＰｌＧＦまたは請求項１１に記載の使用のための医薬組成物であって、前記使用が対象を特定する予備工程を含んでなり、前記特定が下記の工程：
ａ）前記対象に由来する、好ましくは、胎盤または臍帯血に由来する生体サンプル中のＰｌＧＦ量の測定、
ｂ）工程ａ）のＰｌＧＦ量と健康な対象のＰｌＧＦ量の測定値である参照値との比較、および
ｃ）前記対象におけるＦＡＳＤまたはＦＡＳＤ発症リスクの決定
を含んでなる、ＰｌＧＦまたは組成物。
【請求項１３】
工程ａ）で測定されたＰｌＧＦ量が、工程ｂ）で参照値未満であれば、対象はＦＡＳＤに罹患しているか、あるいはＦＡＳＤ発症リスクがあると特定されたことを特徴とする、請求項１２に記載の使用のためのＰｌＧＦまたは組成物。
【請求項１４】
ＰｌＧＦ量が、ＰｌＧＦ核酸の量またはＰｌＧＦポリペプチドの量を測定することによって決定されることを特徴とする、請求項１２に記載の使用のためのＰｌＧＦまたは組成物。
【請求項１５】
ＰｌＧＦ量が、ノーザンブロット、サザンブロット、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、ＳＡＧＥおよびその派生法、核酸チップ、特に、ｃＤＮＡチップ、オリゴヌクレオチドチップおよびｍＲＮＡチップ、組織チップおよびＲＮＡ−Ｓｅｑから選択される方法、ならびに／または免疫組織学、免疫沈降、ウエスタンブロット、ドットブロット、ＥＬＩＳＡもしくはＥＬＩＳＰＯＴ、タンパク質チップ、抗体チップ、もしくは組織チップと免疫組織化学の併用、ＦＲＥＴもしくはＢＲＥＴ技術、特に共焦点顕微鏡法および電子顕微鏡法を含む顕微鏡法もしくは組織化学法、１以上の励起波長および適当な光学法の使用に基づく方法、例えば、電気化学的方法（ボルタンメトリーおよびアンペロメトリー技術）、原子間力顕微鏡法、および高周波法、例えば、多重極、共焦点および非共焦点共鳴分光法、蛍光、発光、化学発光、吸光度、反射率、透過率、および複屈折もしくは屈折率の検出（例えば、表面プラズモン共鳴、偏光解析法、共鳴鏡法などによる）、フローサイトメトリー、放射性同位元素もしくは磁気共鳴画像法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）；ＨＰＬＣ−質量分光測光法、液体クロマトグラフィー／質量分光測光／質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）から選択される方法によって測定されることを特徴とする、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の使用のためのＰｌＧＦまたは組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
緒言
アルコールは身体障害および行動障害の原因となる催奇形物質である。ヒトにおいて、出生前のアルコール暴露は脳の発生に変化をもたらし得る。例えば、フランスおよび世界全域において、妊娠期間中のアルコール摂取（胎児のアルコール暴露）は、非遺伝的起源の障害、特に、精神遅滞の主要な原因である。
【０００２】
損傷は、胎児が暴露された時期、血中アルコール濃度、遺伝的要因および環境要因、ならびに摂取パターン（慢性、過度の飲酒）により異なる。
【０００３】
胎児性アルコール症候群（ＦＡＳ）は、最も極度で障害度の高い胎児性アルコールスペクトラム障害（ＦＡＳＤ）である。フランスにおけるその罹患率は出生数の１．５％であると推定されている。ＦＡＳは、発育不全（成長遅滞）、頭蓋顔面異形症などの身体的異常および神経行動学的異常を併せ持ち、認知機能障害（注意障害、運動障害、学習障害または記憶障害）をもたらす。ＦＡＳＤの小児においては神経学的後遺症も認められ、フランスにおけるその罹患率は出生数のほぼ１％であると推定されている。
【０００４】
脳血管新生は神経発生プロセスと並行しており、神経細胞に栄養、酸素および栄養因子を供給することにより健全な脳の発達に寄与する。特に、脳血管新生は神経細胞ネットワークの適切な発達に必須である。さらに、神経細胞集団および乏突起神経膠細胞の移動プロセスに対する脳血管の直接的な影響が最近になって証明された。また、以前に本発明者らにより、子宮内におけるアルコール暴露が脳血管新生を妨げ、この作用がアルコール暴露の脳異常に寄与していることも立証されている。
【０００５】
従って、子宮内アルコール暴露の血管異常の標的化は、アルコールの神経発達学的損傷を低減し、損なわれた脳機能を是正するための治療戦略であると思われる。実際、ＦＡＳＤの小児に対する現在の管理の意図するところは、運動および認知機能の刺激を通して、多くの場合４〜５歳の間に学校教育時に遅れて診断されることの多い言語障害、学習障害または注意障害を軽減することである。そのような追跡調査により得られる結果は限定的なものであり、子宮内アルコール暴露障害は、これらの将来の成人の社会的統合および専門的統合に対して長期にわたる影響を及ぼす。今日、ＦＡＳＤ児におけるアルコールの神経発達学的作用に対する治癒的治療は存在しない。
【０００６】
従って、特に脳の血管異常を治療し、血管新生またはそれに伴う発達障害を改善することを意図する、子宮内アルコール暴露に関連する障害に対する新規治療法を開発する必要がある。
【発明の概要】
【０００７】
本発明者らは従前に、胎盤における胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）の定量により、子宮内でアルコールに暴露された小児のうち、脳に損傷を受けた小児を特定し得ることを実証した。特に、これらの小児では損なわれた脳血管新生に応じて胎盤のＰｌＧＦレベルが低下している。
【０００８】
その後、子宮内アルコール暴露の前臨床モデルにおいて、本発明者らは、胎盤のＰｌＧＦの補給が胎児成長の形態計測学的および解剖学的パラメーター指標、例えば出生時の身長および頭囲などに対するアルコールの作用を是正することを見出した。さらに、本発明者らはＰｌＧＦ量を増加させると胎児の脳の血管新生に対するアルコールの有害な作用が強く低減されることを実証した。特に、ＰｌＧＦ量の増量は脳血管新生を改善し、アルコールにより誘発される微小血管の崩壊を是正する。
【０００９】
胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）は、従来技術において心血管疾患、網膜症、皮膚疾患および癌の治療の標的として記載されている(Lu et al., Discov Med, 2016 21:349-61, Aprile et al., Crit Rev Oncol Hematol, 2015 95:165-78およびShibuya, Endocr Metab Immune Disord Drug Targets, 2015, 15:135-44)。より具体的には、ＰｌＧＦは成人における網膜症（ＵＳ２０１５０１３３５９）および小児における網膜症(Hard et al., Fondation Act Paediatrica 2011 100, pp. 1063-1065)の治療に関して記載されている。しかしながら、胎児性アルコールスペクトラム障害（ＦＡＳＤ）の治療におけるＰｌＧＦの治療効果を示唆した研究はない。さらに、脳血管新生および子宮内でアルコールに暴露された対象の成長に対するアルコールの有害な作用を是正するための治療はまだ特定されていない。よって、本発明は、妊娠期間中のアルコール摂取後の脳障害または成長障害（発育不全）における異常な血管依存性神経細胞および乏突起神経膠細胞の移動を原因とするＦＡＳＤの予防および／または治療、特に、神経障害（例えば、多動性、注意欠陥、うつ病、不安、情緒障害、過度の被刺激性、行動上の問題など）の予防および／または治療に新たな道を拓くものである。
【００１０】
よって、第１の側面において、本発明は、子宮内でアルコールに暴露されていた対象における胎児性アルコールスペクトラム障害（ＦＡＳＤ）の予防および／または治療において使用するための胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）に関する。
【００１１】
用語「ＰｌＧＦ」または「胎盤増殖因子」（これらの用語は同義である）は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）ファミリーのタンパク質を指す。特に、ＰｌＧＦは、本発明の意味の範囲内で、ＶＥＧＦ−Ａと類似性の高い１４９アミノ酸のタンパク質であり、ＶＥＧＦ−Ａと同じ受容体、すなわちＶＥＧＦ−Ｒ１により認識されるが、ＶＥＧＦ−Ｒ２によっては認識されない。ＰｌＧＦは胎盤で強く発現されるが、胎児、特に、胎児の脳によっては発現されない。Ｎ末端がグリコシル化されたＰｌＧＦが分泌され、二量体として血管新生を制御する働きをする。用語「ＰｌＧＦ」は、特に４つのアイソフォームＰｌＧＦ１〜４の総てを指し、ＰｌＧＦ−１およびＰｌＧＦ−３は非ヘパリン結合アイソフォームであり、ＰｌＧＦ−２およびＰｌＧＦ−４は付加的なヘパリン結合ドメインを含む。いっそうより好ましくは、ＰｌＧＦは、配列が、本願に添付されている配列表に示されるＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ４９７６３−２（配列番号１に相当するアミノ酸配列を有するＰｌＧＦ−１）；Ｐ４９７６３−３（配列番号２に相当するアミノ酸配列を有するＰｌＧＦ−２）；Ｐ４９７６３−１（配列番号３に相当するアミノ酸配列を有するＰｌＧＦ−３）；Ｐ４９７６３−４（配列番号４に相当するアミノ酸配列を有するＰｌＧＦ−４）により特定されるアイソフォームのいずれかから１つ選択されるヒトタンパク質を指す。
【００１２】
本発明の一つの態様によれば、ヒトＰｌＧＦの組換えＰｌＧＦまたはタンパク質類似体はまた、ＦＡＳＤの予防および／または治療において使用され得る。
【００１３】
特に、本発明のＰｌＧＦは、原核生物または真核生物組換えタンパク質生産系を使用することによって、特に、（ｉ）ヒトＰｌＧＦをコードするヌクレオチド配列（遺伝子のＮＣＢＩ受託番号５２２８；転写産物の受託番号ＮＭ＿００２６３２．５（配列番号５）、ＮＭ００１２０７０１２．１（配列番号６）、ＮＭ＿００１２９３６４３．１（配列番号７））を用いて形質転換した微生物または真核細胞を培養すること、およびｉｉ）前記微生物または前記真核細胞により生産されたタンパク質を単離することによって得られる。この技術は当業者に周知である。さらに詳しくは、下記の書籍：Recombinant DNA Technology I, Editors Ales Prokop, Raskesh K Bajpai; Annals of the New York Academy of Sciences, Volume 646, 1991を参照。ＰｌＧＦタンパク質は、それが発現および／または分泌された細胞溶解液および／または細胞上清から精製／単離されることが好ましい。この精製は、当業者に公知のいずれの手段によって行ってもよい。いくつかの精製技術がVoet D and Voet JG, Techniques of protein and nucleic acid purificationに記載されている。
【００１４】
組換えタンパク質生産系は、合成されるポリペプチドをコードする核酸を含んでなるヌクレオチドベクターを使用し、そのベクターを前記ポリペプチドを生産する宿主細胞に導入する（さらに詳しくは、“Recombinant DNA Technology I”, Editors Ales Prokop, Raskesh K Bajpai; Annals of the New York Academy of Sciences, Volume 646, 1991を参照。
【００１５】
真核生物または原核生物宿主細胞に導入し、維持するために目的の核酸分子を挿入することができる多くのベクターが知られ、適当なベクターの選択は、このベクターの意図される使用（例えば、目的配列の複製、この配列の発現、この配列の染色体外形態での維持または宿主の染色体材料への組み込み）、ならびに宿主細胞の性質（例えば、プラスミドは好ましくは細菌細胞に導入されるが、ＹＡＣは好ましくは酵母で使用される）によって異なる。これらの発現ベクターは、プラスミド、ＹＡＣ、コスミド、レトロウイルス、ＥＢＶ由来エピソーム、および当業者が前記の鎖の発現に適当であると見なし得る任意のベクターであり得る。
【００１６】
本発明によるベクターは、ＰｌＧＦをコードする核酸または類似の配列、ならびにその発現に必要な手段を含んでなる。「ペプチドの発現に必要な手段」という表現は（ペプチドという用語はタンパク質、ポリタンパク質、ポリペプチドなどのいずれのペプチド分子に対しても使用される）、特に、プロモーター、転写ターミネーター、複製起点および好ましくは選択マーカーなど、ペプチドが得られ得るいずれの手段も指す。ペプチドの発現に必要な手段は、本発明のポリペプチド断片をコードする核酸配列に機能的連結されている。「機能的連結された」とは、本発明のポリペプチド断片をコードする遺伝子の発現に必要な前記の要素の並列を意味し、これらはそれらが予想されるように機能し得る関係にある。例えば、プロモーターと本発明のポリペプチド断片をコードする遺伝子の間には、それらの機能的関係が保持される限り、付加的な塩基が存在してもよい。ペプチドの発現に必要な手段は同種手段であってもよく、これは使用するベクターのゲノム内に天然に含まれることを意味し、またはそれらの手段は異種であってもよく、これは別のベクターおよび／または生物体から人工的に付加されることを意味する。後者の場合、前記の手段は発現させるポリペプチド断片とともにクローニングされる。異種プロモーターの例としては、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ−ＨＳＶ−１）遺伝子プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーターおよびアデノウイルス主要後期プロモーター（ＭＬＰ）などのウイルスプロモーター、ならびに構成的ホスホグリセンリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）遺伝子プロモーター(Adra et al., Gene Volume 60, Issue 1, 1987, Pages 65-74)、プロモーター肝臓特異的遺伝子α１−アンチトリプシンおよびＦＩＸならびに平滑筋細胞に特異的なＳＭ２２プロモーター(Moessler et al., Development 1996 Aug;122(8):2415-25)などの高等真核生物においてペプチドをコードする遺伝子の転写を制御する任意の細胞プロモーターが含まれる。発現ベクターにおけるＤＮＡ配列の欠失および挿入の方法は当業者に広く知られており、特に、酵素的消化およびライゲーション工程からなる。本発明のベクターはまた、特定の細胞コンパートメントにペプチドを標的化するために必要な配列も含み得る。標的化の一例は、アデノウイルスＥ３リーダー配列タイプのアドレッシング配列を使用することによって得られる小胞体への標的化であり得る(Ciernik I. F., et al., The Journal of Immunology, vol. 162, 1999, pages 3915-3925)。
【００１７】
用語「転写ターミネーター」は、本明細書では、遺伝子またはオペロンのメッセンジャーＲＮＡへの転写の終了の目印となるゲノム配列を指す。転写終結機構は原核生物と真核生物とでも異なる。当業者は、細胞腫の違いに応じてどちらのシグナルを使うかを知っている。例えば、ベクターが導入される細胞が細菌であれば、Ｒｈｏ非依存性ターミネーター（逆方向反復配列の後に一連のＴ（転写されたＲＮＡではウラシル）が続く）またはＲｈｏ依存性ターミネーター（Ｒｈｏタンパク質により認識されるコンセンサス配列からなる）を使用する。
【００１８】
用語「複製起点」（ｏｒｉとも呼ばれる）は、複製を開始させるユニークなＤＮＡ配列である。一方向または双方向の複製が始まるのはこの配列からである。当業者は、複製起点の構造が種ごとに異なり、従って、種間にいくつかの共通の特徴があるもののそれは種に特異的であることを知っている。タンパク質複合体はこの配列において形成され、ＤＮＡをほどき、複製を開始させる。
【００１９】
ＰｌＧＦをコードする遺伝子配列を含んでなるベクターは、当業者に慣用される方法によって作製される。得られたクローンは、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための当業者に公知の標準的な方法によって適当な宿主に導入することができる。このような方法としては、デキストラン形質転換、リン酸カルシウム沈殿法、ポリブレントランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ポリヌクレオチドのリポソームへの封入、微粒子銃注入および核への直接ＤＮＡマイクロインジェクションが挙げられる。前記配列（単離されるか、またはプラスミドベクターへ挿入される）はまた、宿主の細胞膜を通過することを可能とする物質、例えば、ナノ輸送体もしくはリポソーム製剤などの輸送体、または陽イオンポリマーに会合させることもできる。加えて、これらの方法は、有利には、例えばエレクトロポレーションを用いてリポソームと組み合わせることもできる。
【００２０】
本発明の目的に好適な微生物の例としては、酵母(Buckholz RG, Current Opinion in Biotechnology vol. 4, no. 5, 1993, pages 538-42)および細菌(Olins and Lee, Current Opinion in Biotechnology vol. 4, no. 5, 1993, pages 520-5)が含まれる。真核細胞の例としては、哺乳類(Edwards CP and Aruffo A, Current Opinion in Biotechnology vol. 4, no. 5, 1993, pages 558-63)、爬虫類、および同等のものなどの動物由来の細胞が含まれる。植物細胞も使用可能である。使用可能な哺乳類細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、サル（ＣＯＳおよびＶｅｒｏ）細胞、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、ブタ腎（ＰＫ１５）細胞およびウサギ腎（ＲＫ１３細胞）、ヒト骨肉腫（１４３Ｂ）細胞株、ヒトＨｅＬａ細胞株およびヒト肝細胞腫細胞株（Ｈｅｐ  Ｇ２細胞種）が含まれる。また、例えばバキュロウイルスプロセスが使用可能な昆虫細胞を使用することもできる(Luckow VA, Journal of Virology vol. 67, no. 8, 1993, pages 4566-79)。本発明の好ましい態様では、本発明の断片を生産するために使用される宿主細胞は、細菌、好ましくは、大腸菌(E. coli)である。
【００２１】
当業者は、これらの細胞を増殖させる条件、ならびにこれらの細胞によるポリペプチド断片の発現に必要な実験条件を知っている。
【００２２】
組換えＰｌＧＦ生産法は、下記の工程を含み得る：
ａ）好適な培地および培養条件でのＰｌＧＦをコードするベクターを含んでなる宿主細胞の培養；および
ｂ）工程ａ）で生産されたＰｌＧＦの単離。
【００２３】
ＰｌＧＦは、それが発現された細胞から単離（精製）することができる。この場合、前記細胞の溶解という予備工程が必要となる場合がある。
【００２４】
組換えタンパク質の生産に使用される各細胞種に関連する培養培地および培養条件は当業者に周知である。
【００２５】
ＰｌＧＦの単離（または精製）は、当業者に公知のいずれの手段によって行ってもよい。例としては、示差沈殿または超遠心分離が含まれる。それはまた、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、分子篩操作、または等電点電気泳動によってＰｌＧＦを精製するためにも有利であり得る。これらの技術は総て、Voet D and Voet JG, Techniques of Protein and Nucleic Acid Purification, Chapter 6, Biochemistry, 第2版に記載されている。
【００２６】
より厳密には、第１の工程で、タンパク質が抽出される材料（動物または植物組織、細菌など）を一般に摩砕する。この目的で種々の装置（ワーリングブレンダー、ポッターエルベージェム装置、「ポリトロン」など）を使用することができる。このホモジナイゼーションは、当業者に周知の好適な組成のバッファー中で行う。このようにして得たホモジネートを次に、摩砕の不十分な大きい粒子を除去するため、または所望のタンパク質を含有する細胞画分を得るために、ほとんどの場合、遠心分離によって清澄化する。タンパク質が厳密に細胞コンパートメント内にある場合には、このコンパートメントの膜を溶かすことによってそれを放出させるために通常、弱い洗剤（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ  ２０、デオキシコール酸ナトリウムなど）が使用される。洗剤はリソソームを破裂させ、従って、単離されるタンパク質またはその他の分子を攻撃および破壊し得る加水分解酵素（プロテアーゼ、ヌクレアーゼなど）を放出し得るので、洗剤の使用は多くの場合、制御された様式で行わなければならない。分解に感受性のある、または数が少ないタンパク質を取り扱う場合には特別な予防措置を採らなければならない。この問題に対する一般的な解決策は、溶液中に、生理学的プロテアーゼ阻害剤（トリプシン阻害剤、アンチパイン、ロイペプチンなど）または人工プロテアーゼ阻害剤（Ｅ６４、ＰＭＳＦなど）を含めることである。次に、所望のタンパク質を単離するためには種々の技術が存在する。
【００２７】
大容量に最も適している方法の一つは、硫酸アンモニウムを用いた示差沈殿である。また、イオン交換クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィー法も大容量のサンプルに適用可能であり、かなり良好な分離力を有しているため、良好な中間手順である。精製を終了させるために、多くの場合、分子篩または等電点電気泳動が用いられる。これらの技術は、精製されて純度は高くなるが、非常に小容量の濃縮されたタンパク質を必要とする。多くの場合、これらの工程の間に、これらのクロマトグラフィー法で使用された塩または生成物を除去することが有利である。これは透析または限外濾過により達成され得る。
【００２８】
また、本発明のＰｌＧＦを同定するための配列を有するベクターの使用も有利であり得る。さらに、原核生物または真核生物系で分泌を促進することも有利であり得る。実際、この場合において、目的の組換えタンパク質は、宿主細胞内部よりも細胞培養液上清に存在する。
【００２９】
ＰｌＧＦは、少なくとも細胞培養液１リットル当たり１ｍｇ、好ましくは、１リットル当たり２ｍｇ、さらにより好ましくは、１リットル当たり５ｍｇの割合で生産することができる。
【００３０】
あるいは、化学合成によりＰｌＧＦを作製することも可能である。当業者は、例えば、タンパク質濃縮による固相技術もしくは部分固相技術または従来の溶液合成による化学合成プロセスに精通している。本発明の断片は、例えば、メリフィールド合成などの合成技術により合成可能であり、この合成技術は純度、抗原特異性、不必要な副産物がないこと、および製造が容易であるなどの理由から有利である。この化学合成は遺伝子工学アプローチと組み合わせることもでき、または例えば、Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989に記載の当業者に周知の技術を用いて遺伝子工学単独でも合成され得る。試薬および出発材料は市販されているか、または周知の従来技術（例えば、ＷＯ００／１２５０８、ＷＯ２００５／０８５２６０参照）により合成され得る。
【００３１】
特に、ＰｌＧＦ類似体はZheng et al.(Acta Ophthalmologica 2012 90(7):e512-e523)により記載された技術を用いて合成することができる。
【００３２】
従前に示したように、本発明の目的はＦＡＳＤの予防および治療において使用するためのＰｌＧＦである。用語「胎児性アルコールスペクトラム障害（ＦＡＳＤ）」は、妊娠期間中のアルコール暴露により引き起こされる小児におけるあらゆる障害を指す。とりわけ、この用語には、年齢とともに次第に現れてくる総ての行動障害が含まれる。これらの障害を有する小児は「ＦＡＳＤ児」と称される。最も重度の形態では、ＦＡＳＤは胎児性アルコール症候群（ＦＡＳ）に該当する。後者は、頭蓋顔面異形症（眼瞼裂短縮、なめらかで長く平坦な鼻唇溝および薄い上唇を含む）；出生前または出生直後のまたは両方におけるものであり得る非特異的な成長遅滞（身長または体重または頭囲）；様々な随伴奇形（心臓疾患、泌尿生殖器奇形、消化器奇形または脳構造の障害）ならびに時として精神遅滞およびより頻繁には学習困難として表現される神経学的発達障害をもたらす。ＦＡＳを患う小児は「ＦＡＳ児」と呼ばれる。
【００３３】
大半のＦＡＳＤ児は不適応および行動障害を有し、年齢とともに次第に現れてくる（授乳および摂食困難、睡眠障害ならびに、学齢期においては、行動異常、学習に影響を及ぼす認知障害、知能指数（ＩＱ）が２０ポイント（１〜２標準偏差）低い知的障害、読み取りにおける学習困難（読字障害）およびさらに算術における学習困難（計算障害）、多動性または運動過多を伴う注意障害を含む）。それらは注意欠陥／多動性障害（ＡＤＨＤ）として知られている。ＦＡＳＤのフランス語用語は「ｌｅｓ  ｔｒｏｕｂｌｅｓ  ｃａｕｓｅｓ  ｐａｒ  ｌ’ａｌｃｏｏｌｉｓａｔｉｏｎ  ｆｅｔａｌｅ（ＴＣＡＦ）」である。ＦＡＳＤの完全な定義についてはフランス医学アカデミーの胎児のアルコール暴露に関する報告（２０１６年３月２２日採択）に記載されている。
【００３４】
本発明者らは従前に、アルコール暴露が脳血管損傷を引き起こすことを示した。本明細書において用語「脳血管損傷」は、脳血管系のいずれの変化も指し、特に、前記脳血管系の損なわれた機能、またはさらには欠陥のある機能をもたらす変化も指す。本発明に関して脳血管損傷には脳血管系の崩壊が含まれ得る。より詳しくは、胎児のアルコール暴露は脳血管のランダムな配向を誘発する。特定の態様によれば、胎児性アルコールスペクトラム障害は脳血管疾患と関連している。より詳しくは、前記胎児性アルコールスペクトラム障害は脳血管系の崩壊と関連している。
【００３５】
本発明者らはまた、従前の研究を通して胎児のアルコール暴露が脳血管新生において障害を引き起こすことを実証した。脳血管新生は、脳における血管形成のプロセスである。
【００３６】
本発明の一つの態様によれば、ＰｌＧＦは脳血管新生を刺激し、よって、脳機能を改善するために使用される。
【００３７】
本発明のさらに別の態様によれば、ＰｌＧＦは、上述の不適応および行動障害のいずれかから選択される少なくとも１つのＦＡＳＤを予防および／または治療するために使用され得る。また、ＰｌＧＦは、胎児性アルコール症候群（ＦＡＳ）、特にＦＡＳが発育不全として発現する場合に、それを予防および／または治療するために使用することもできる。
【００３８】
本発明に関して、用語「胎児性アルコール症候群（ＦＡＳ）」は、胎児性アルコールスペクトラム障害（ＦＡＳＤ）の最も極度で障害度の高い症状を指す。ＦＡＳは発育不全（成長遅滞）、頭蓋顔面異形症などの身体的異常および神経行動学的異常を併せ持ち、認知機能障害（注意障害、運動障害、学習障害または記憶障害）をもたらす。部分ＦＡＳは、小児が一部のＦＡＳ症状のみを有している症例である。しかしながら、部分ＦＡＳ児はそれでもなお１以上の神経行動学的異常を有する。
【００３９】
本発明に関して、ＦＡＳ児、特に新生児は、その体重および身長が参照曲線の１０パーセンタイル値未満であれば「発育不全」であるとみなされる。これは多くの場合、早産の新生児および子宮内でアルコールに暴露された新生児の症例である。また、発育不全は出生前に超音波によっても診断することができ、これは胎児発育不全または子宮内成長遅滞と呼ばれる。
【００４０】
また、本発明者らは、ＰｌＧＦ量の増加が胎児の全身サイズまたは一箇所以上の身体部分、特に頭蓋サイズ、身体サイズ、腹部サイズおよび腹部厚径を増加させることも実証した。これにより、正常な形態計測学的外観の部分的または完全な回復が可能である。従って、ＰｌＧＦの投与は最も重篤な形態のＦＡＳＤを呈するＦＡＳ対象の発育不全を補う。
【００４１】
よってもう一つの態様によれば、本発明は、特に、ＦＡＳが子宮内アルコール暴露による発育不全として発現する場合の、ＦＡＳの予防および／または治療において使用するためのＰｌＧＦに関する。特に、発育不全とは対象全身または胴（身体とも呼ばれる）、腹部および頭蓋から選択されるその一部のうち一箇所以上の発育不全である。特に、前記対象は胎児または小児、特に早産児である。
【００４２】
本発明の一つの態様によれば、子宮内でアルコールに暴露されていた対象は、胚、胎児または小児、好ましくは、胎児または小児、特に、早産児から選択される。
【００４３】
妊娠３０週目および妊娠期間の間の期間は、脳血管新生が最も盛んな期間である。従って、子宮内でアルコールに暴露された胎児にはまさにこの時期にＰｌＧＦを投与することが特に好ましい。
【００４４】
本発明の特定の態様によれば、ＦＡＳＤ対象が早産児である場合、治療は失われた子宮内生活の週数に相当する子宮外期間にわたってこの対象にＰｌＧＦを補給することからなる。好ましくは、治療ウィンドウは、妊娠３０週目から理論上の期間（妊娠４０週）まで延長することが可能であり、その期間中はヒトにおける脳血管新生が特に著しい。
【００４５】
本発明によれば、用語「対象」は、ヒト、好ましくは、胚、胎児または小児を意味する。用語「胚」は、本明細書で使用する場合、３ヵ月齢未満の受精卵母細胞である。本明細書において用語「胎児」は、出生前の個人であり、その在胎期間は３〜９ヵ月を含む。出産後、対象は小児となる。本発明によれば、用語「小児」は、その年齢が３歳未満である個人を意味する。よって、本発明による小児のカテゴリーには、０〜１ヵ月の新生児、１ヵ月〜２歳の乳児、および少なくとも２歳の小児自身を含む。用語「新生児」は、本発明で使用する場合、出生予定日に生まれたか、または早産であり得る。本願に関して、用語「早産」は、３７週間の無月経の前に生きて生まれた小児を指す。この用語は３つのサブカテゴリーを含む：極早産（２８週未満）；超早産（２８〜３２週）；中等度〜後期早産（３２〜３７週）。本発明において、ＰｌＧＦで処置された早産児は好ましくは、中等度〜後期早産のカテゴリーである。
【００４６】
用語「胎児性アルコールスペクトラム障害を有する対象」または「ＦＡＳＤ対象」は、本明細書で使用する場合、子宮内でアルコールに暴露されたまたは暴露される可能性のある胚、胎児または対象、特にヒト対象を指し、前記対象は、胎児性アルコールスペクトラム障害に罹患しているか、または母体のアルコール摂取のために、前記の作用を含む胎児性アルコールスペクトラム障害に関連する病態の一つを発症リスクがある。特に、ＦＡＳＤ対象は全身またはその一部が正常より小さく、脳血管系が崩壊している場合があり、前記崩壊は特に、脳血管のランダムな配向に関連している。ＦＡＳＤ対象がＦＡＳに罹患している場合、特に、これを「ＦＡＳ対象」と称する。
【００４７】
用語「治療」は、本明細書で使用する場合、ＦＡＳＤの症状または原因を低減または排除するためのいずれの行為も指す。本発明の意図において治療には、精神療法の追跡調査の有無にかかわらず、ＰｌＧＦ、それを含有する医薬組成物または製品の投与を含み得る。
【００４８】
用語「予防」は、本明細書で使用する場合、ＦＡＳＤの症状または原因のリスクを完全にまたは部分的に予防するいずれの行為も指す。本発明の意図において予防とは、子宮内でアルコールに暴露された対象または子宮内でアルコールに暴露されていたがＦＡＳＤの症状はまだ発現しておらず、脳血管新生がなお進行している対象に対するＰｌＧＦ、医薬組成物の投与を含んでなる。本発明者らは、健康な対象の胎児発生のこれらの段階においてＰｌＧＦが天然の血管新生因子であるということを利用し、これはＦＡＳＤの予防においてＰｌＧＦを補う方法が使いやすいという利点を有する。
【００４９】
本発明の一つの態様によれば、胎盤増殖因子は、子宮内でアルコールに暴露されていた対象に治療上有効な量で投与される。
【００５０】
本発明に関して、「治療上有効な量」とは、特定の病状の治療経過に影響を及ぼすに十分な量を意味する。治療上有効な量はまた、用剤の総ての毒性作用または二次的作用が、使用した有効成分の治療上の有益な作用により相殺される量である。
【００５１】
本発明のもう一つの態様によれば、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）は、子宮内および／または子宮外で投与される。従って、ＰｌＧＦの投与による治療（または予防）は、子宮内期間中から開始し、出産後、特に小児が未熟児として生まれ、その結果胎盤ＰｌＧＦの生理的供給を受けられなくなった場合に、投与を継続することができる。
【００５２】
好ましくは、ＰｌＧＦは単独で、または医薬組成物として、全身投与経路で、特に静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下または経口経路により投与される。より好ましくは、ＰｌＧＦは数回、時間をあけて投与される。
【００５３】
特に、ＰｌＧＦが子宮内投与される場合、好ましくは、胎児の脳により迅速に到達するように、および母体によるタンパク質分解を避けるために、胎盤に直接投与される。
【００５４】
ＰｌＧＦが生後に投与される場合、好ましくは、非経口的に、好ましくは、特に早産児または新生児に投与される場合に静脈内に投与される。
【００５５】
最適な投与方法、用量および投与形は、患者の年齢または体重、その全身状態の重篤度、治療に対する忍容性および観察された副作用など、患者に適した治療の確立において一般的に考慮される判定基準に従って決定され得る。
【００５６】
ＰｌＧＦが医薬組成物として投与される場合、皮下、筋肉内、静脈内、局所経皮投与のために、ＰｌＧＦは従来の医薬担体と混合してそれを必要とする対象に単位投与形として投与してよい。適当な単位投与形には、筋肉内、静脈内剤形が含まれる。
【００５７】
前述のように、最も適当な投与経路の選択は、この投与がいつ実施されるかにより決まる。特に、ＰｌＧＦを含有する化粧用組成物の投与が子宮内で行われる場合、筋肉間または静脈内経路により、好ましくは、胎盤に投与される。ＰｌＧＦを含有する医薬組成物の新生児または早産児への投与は好ましくは、静脈内に行われる。
【００５８】
非経口、鼻腔内または眼内投与のためには、水性懸濁液、等張性生理食塩液または薬理学的に適合する分散剤および／または湿潤剤を含有する滅菌注射用溶液が使用される。
【００５９】
非経口投与のための剤形は、ＰｌＧＦをバッファー、安定剤、保存剤、可溶化剤、等張剤および懸濁化剤と混合することにより従来の方法で得られる。公知の技術に従って、これらの混合物を次に滅菌し、静脈内注射剤として包装する。
【００６０】
バッファーとしては、当業者は有機リン酸塩系のバッファーを使用し得る。懸濁化剤の例には、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、アラビアガムおよびカルボキシメチルセルロースナトリウムが含まれる。さらに、本発明に有用な安定剤は、亜硫酸ナトリウムおよびメタ重亜硫酸ナトリウムであり、保存剤の例としてはｐ−ヒドロキシ安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、クレゾールおよびクロロクレゾールが挙げられる。
【００６１】
本発明の医薬組成物は、患者に単一経路または異なる経路で投与されるように製剤化され得る。
【００６２】
当然のことながら、用量は、ＰｌＧＦが投与される剤形、投与方法、治療適応症、患者の年齢および状態によって決まる。
【００６３】
投与される用量は好ましくは、ＰｌＧＦ１日当たり０．００１〜２５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、ＰｌＧＦ１日当たり０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは、ＰｌＧＦ１日当たり０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ、さらにより好ましくは、ＰｌＧＦ１日当たり１〜２５ｍｇ／ｋｇである。
【００６４】
ＰｌＧＦの単位用量は好ましくは、本化合物を０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ含有する。
【００６５】
本発明の一つの態様によれば、投与されるＰｌＧＦ初期用量は、この治療に対する治療対象の応答に従って、必要があれば治療中に調節してよい。この一般的知識および本明細書の記載に基づいて、当業者はその治療効果を最適化するためにＰｌＧＦの用量を調節することができる。
【００６６】
発明の詳細な説明に前述したように、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）はまた、医薬組成物において有効成分として使用することもできる。
【００６７】
よって、第２の側面によれば、本発明は、胎児性アルコールスペクトラム障害（ＦＡＳＤ）の予防および／または治療において使用するための、上記で定義した胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）および薬学上許容される担体を含んでなる医薬組成物に関する。
【００６８】
本発明の医薬組成物は、下記にＰｌＧＦに関して記載される様々なタイプのＦＡＳＤの予防および／または治療において使用し得る。特に、これらのＦＡＳＤは、特に子宮内アルコール暴露により発育不全および脳血管損傷として発現する場合の、不適応および行動障害または胎児性アルコール症候群（ＦＡＳ）からなる群から選択される。
【００６９】
本発明の組成物はまた、子宮内でアルコールに暴露されていた対象の脳血管新生を改善するために使用してもよい。
【００７０】
本発明の意図において、「薬学上許容される担体」とは、医薬製剤における使用のために好適な任意の材料を意味する。薬学上許容される担体の例としては、ラクトース、任意選択により修飾されていてもよいデンプン、セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、デキストロース、硫酸カルシウム、リン酸カルシウム、乳酸カルシウム、デキストレート、イノシトール、炭酸カルシウム、グリシン、ベントナイトおよびその混合物が挙げられる。
【００７１】
本発明の医薬組成物は、上記に詳細に示したように、様々な剤形をとってよく、様々な方法で投与されてよい。
【００７２】
一つの態様によれば、本発明の医薬組成物は、医薬組成物が投与される対象の全体重に基づき、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜２５０ｍｇ／ｋｇ体重を含む濃度で、ＰｌＧＦを有効成分として含んでなる。
【００７３】
優先的には、ＰｌＧＦ濃度は、医薬組成物が投与される対象の体重に基づき、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、より詳しくは、医薬組成物が投与される対象の体重に基づき０．１５ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ体重、または組成物が投与される対象の全体重に基づき１ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇ体重を含む。
【００７４】
本発明者らは、ＰｌＧＦ量の増量が脳血管新生損傷の修復、よって、神経細胞機能を正常な状態へと修復するのに特に有効であることを実証した。
【００７５】
従って、本発明の一つの態様によれば、ＰｌＧＦまたはそれを含んでなる医薬組成物は、子宮内アルコール暴露による脳血管新生損傷の治療および／または予防に使用される。
【００７６】
さらに、本発明者らはまた、子宮内期間においてアルコールに暴露された後、ＰｌＧＦ量の増加が胎児の全身サイズまたは一箇所以上の身体部分、特に、頭蓋サイズ、身体サイズ、腹部サイズおよび腹部厚径を増加させることも実証した。これにより、正常な形態計測学的外観の部分的または完全な回復が可能である。
【００７７】
よって、もう一つの態様によれば、本発明は、子宮内アルコール暴露による発育不全、特に、この発育不全がＦＡＳの徴候である場合の予防および／または治療において使用するためのＰｌＧＦまたはそれを含んでなる医薬組成物に関する。特に、それは対象全体の全身の発育不全、あるいは胴（身体とも呼ばれる）、腹部および頭蓋から選択されるその一部のうちの一箇所以上の発育不全である。特に、対象は胎児または新生児、特に早産児であるＦＡＳ対象である。
【００７８】
本発明の第４の側面は、対象における胎児性アルコールスペクトラム障害の治療方法に関する。この方法は、胎児性アルコール症候群（ＦＡＳ）を有する対象に、特に、子宮内でアルコールに暴露されていた対象において発育不全および／または脳血管損傷として発現する場合に、ＰｌＧＦを投与するもしくは過剰発現させる工程、またはＰｌＧＦを含んでなる医薬組成物を投与する工程を含んでなる。
【００７９】
この治療方法には、ＦＡＳＤを診断する予備工程が含まれ得る。
【００８０】
第５の側面によれば、本発明は、ＦＡＳＤの治療において使用するための、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）、本発明のＰｌＧＦを含んでなる医薬組成物または製品に関し、前記使用が対象を特定する前の工程を含み、前記特定は下記の工程：
ａ）前記対象に由来する、好ましくは、胎盤または臍帯血に由来する生体サンプル中のＰｌＧＦ量の測定；
ｂ）工程ａ）のＰｌＧＦ量と健康な個人のＰｌＧＦ量の測定値である参照値との比較、および
ｃ）前記対象におけるＦＡＳＤまたはＦＡＳＤ発症リスクの決定
を含んでなる。
【００８１】
本発明によれば、「生体サンプル」は、対象から採取することのできる任意のサンプルを意味する。あるいは、前記生体サンプルは胎盤、特に臍帯に由来するサンプルである。実際、ＰｌＧＦは妊娠期間中を通して胎盤細胞により発現される。このことより、特に対象が胚または胎児である場合に、対象の完全性を損なうことなく、ＰｌＧＦを測定することができる。一般に、生体サンプルはＰｌＧＦ発現率を測定できるものでなくてはならない。試験サンプルは、生体源から直接得られたものを使用してよく、またはサンプルの特性を改変する前処理の後に使用してもよい。例えば、そのような前処理には、血液からの血漿の調製、粘稠な液体の希釈などが含まれ得る。前処理プロセスにはまた、濾過、沈殿、希釈、蒸留、混合、濃縮、破壊的な成分の不活性化、試薬の添加、溶解などが含まれ得る。さらに、液体培地を作製するためまたは分析物を放出させるために固形の試験サンプルを改変することも有利であり得る。
【００８２】
ＰｌＧＦタンパク質は、分泌タンパク質である(DeFalco, Exp Mol Med. 44(1):1-9, 2012)。前記タンパク質の発現率の測定のために好ましい生体サンプルには、特に、血液、血漿またはリンパサンプルが含まれる。好ましくは、前記生体サンプルは血液サンプルである。さらにより好ましくは、前記生体サンプルは、胎盤の血液または臍帯血サンプルである。後者は通常、出産中に採取される。次いでＰｌＧＦレベルを測定するために胎盤血管由来の血液を得ることができる。
【００８３】
一つの態様によれば、工程ａ）で測定されたＰｌＧＦ量が参照値より低い場合、対象はＦＡＳＤ、特に、脳血管新生損傷またはＦＡＳ、特に発育不全であるか、またはその発症リスクがあると決定される。
【００８４】
本発明によれば、ＰｌＧＦ量は、対象が子宮内アルコール暴露に関連する可能性のある少なくとも１つの障害を有する場合に測定される。また、ＰｌＧＦ量は、対象が子宮内アルコール暴露に関連する１以上の特定の障害を有していないが、この期間中の対象のアルコール暴露が証明されているかまたは想定される場合にも測定される。よって、上記のようにＰｌＧＦ量を測定することは、治療的管理を行う前にＦＡＳＤまたはその発症リスクを確認または除外することになる。
【００８５】
一つの態様によれば、ＰｌＧＦ量は、ＰｌＧＦをコードしている転写産物の数またはポリペプチドの量を測定することにより決定される．
【００８６】
遺伝子またはタンパク質発現レベルは、当業者に利用可能な多くの方法により測定できる。生体サンプル採取とＰｌＧＦ発現の測定の間にはいくつかの中間工程が存在してよく、前記工程は、前記サンプルからのｍＲＮＡ（もしくは対応するｃＤＮＡ）サンプルまたはタンパク質サンプルの抽出に相当する。次にこれをＰｌＧＦ発現の測定に直接使用することができる。しかしながら、細胞サンプルからのｍＲＮＡの調製または抽出（ならびにそのｃＤＮＡへの逆転写）またはタンパク質の調製または抽出は当業者に周知の常法である。
【００８７】
ｍＲＮＡ（もしくは対応するｃＤＮＡ）またはタンパク質サンプルが得られたら、ｍＲＮＡ（すなわち、サンプル中に存在する総てのｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡ）またはタンパク質（すなわち、サンプル中に存在する総てのタンパク質）いずれかのレベルにおけるＰｌＧＦ発現を測定することができる。よって、そのために使用される方法は、形質転換のタイプ（ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはタンパク質）および利用可能なサンプルのタイプによって決まる。
【００８８】
ＰｌＧＦ発現がｍＲＮＡ（もしくは対応するｃＤＮＡ）レベルで測定される場合、通常当業者に使用されるいずれの技術も使用可能である。遺伝子発現のレベルを分析するためのこれらの技術、例えばトランスクリプトーム分析は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、ＤＮＡから開始する場合）、逆転写−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡから開始する場合）またはハイスループットのための定量的ＲＴ−ＰＣＲまたは核酸チップ（ＤＮＡチップおよびオリゴヌクレオチドチップを含む）などの周知の方法を含む。
【００８９】
用語「核酸チップ」は本明細書において、支持体に結合されているいくつかの異なる核酸プローブを指し、ここで支持体はマイクロチップ、ガラススライドまたはミクロスフェアサイズのビーズであり得る。マイクロチップは、ポリマー、プラスチック、樹脂、多糖類、シリカ、またはシリカ、炭素、金属、無機ガラスもしくはニトロセルロースを基にした材料から作製され得る。
【００９０】
プローブは、核酸、例えばｃＤＮＡ（「ｃＤＮＡチップ」）、ｍＲＮＡ（「ｍＲＮＡチップ」）またはオリゴヌクレオチド（「オリゴヌクレオチドチップ」）であり得、オリゴヌクレオチドは一般に約２５〜６０ヌクレオチドを含む長さを有し得る。
【００９１】
特定の遺伝子の発現プロファイルを決定するために、前記遺伝子の総てまたは部分に対応する核酸を標識し、次いでハイブリダイゼーション条件下でチップと接触させ、前記標識標的核酸と、その核酸と相補的であるチップ表面に結合させたプローブの間で複合体を形成させる。その後、標識されたハイブリッド複合体の存在を検出する。
【００９２】
これらの技術により、生体サンプル（細胞、組織など）中のゲノムの特定の遺伝子または複数の遺伝子またはさらには総ての遺伝子（全ゲノムまたは全トランスクリプトーム）の発現レベルもモニタリングが可能となる。これらの技術は当業者によって慣用されており、従って、本明細書において詳細に記載する必要はない。
【００９３】
あるいは、サンプル中のｍＲＮＡ量に基づいて遺伝子発現の定量を可能にする、現行の技術または将来の技術のいずれを使用することも可能である。例えば、当業者は遺伝子の発現を、標識核酸プローブを用いるハイブリダイゼーション、例えばノーザンブロット（ｍＲＮＡの場合）またはサザンブロット（ｃＤＮＡの場合）により測定することができるが、例えば遺伝子発現連鎖解析（ＳＡＧＥ）およびその派生法、例えば、ＬｏｎｇＳＡＧＥ、ＳｕｐｅｒＳＡＧＥ、ＤｅｅｐＳＡＧＥなどの技術によっても測定することができる。また、組織チップ（組織マイクロアレイ、ＴＭＡとしても知られる）を用いることも可能である。組織チップとともに通常使用される試験には、免疫組織化学および蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが含まれる。ｍＲＮＡ分析のためには、組織チップは蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションと併用することができる。最終的に、サンプル中のｍＲＮＡ量を決定するためには大規模並列シーケンシング（ＲＮＡ−Ｓｅｑまたは全トランスクリプトームショットガンシーケンシング）を使用することが可能である。この目的のためにはいくつかの大規模並列シーケンシング法が使用可能である。そのような方法は、例えば、米国特許第４，８８２，１２７号、同第４，８４９，０７７号；同第７，５５６，９２２号；同第６，７２３，５１３号；国際出願公開第０３／０６６８９６号；同第２００７／１１１９２４号；米国特許出願公開第２００８／００２０３９２号；国際出願公開第２００６／０８４１３２号；米国特許出願公開第２００９／０１８６３４９号；同第２００９／０１８１８６０号；同第２００９／０１８１３８５号；同第２００６／０２７５７８２号；ＥＰ−Ｂ１−１１４１３９９；Shendure & Ji, Nat Biotechnol., 26(10):1135-45. 2008; Pihlak et al., Nat Biotechnol., 26(6): 676-684, 2008; Fuller et al., Nature Biotechnol., 27(11):1013-1023, 2009; Mardis, Genome Med., 1(4):40, 2009; Metzker, Nature Rev. Genet., 11(1):31-46, 2010に記載されている。
【００９４】
好ましくは、ＰｌＧＦ発現は、免疫組織学、免疫沈降、ウエスタンブロット、ドットブロット、ＥＬＩＳＡもしくはＥＬＩＳＰＯＴ、タンパク質チップ、抗体チップ、もしくは組織チップと免疫組織化学の併用、ＦＲＥＴもしくはＢＲＥＴ技術、特に、共焦点顕微鏡法および電子顕微鏡法を含む顕微鏡法もしくは組織化学法、１以上の励起波長および適当な光学法の使用に基づく方法、例えば、電気化学的方法（ボルタンメトリーおよびアンペロメトリー技術）、原子間力顕微鏡法、および高周波法、例えば、多重極、共焦点および非共焦点共鳴分光法、蛍光、発光、化学発光、吸光度、反射率、透過率、および複屈折もしくは屈折率の検出（例えば、表面プラズモン共鳴、偏光解析法、共鳴鏡法などによる）、フローサイトメトリー、放射性同位元素もしくは磁気共鳴画像法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）；ＨＰＬＣ−質量分光測光法、液体クロマトグラフィー／質量分光測光法／質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）から選択される方法によってタンパク質レベルで測定される。
【００９５】
より優先的には、ＰｌＧＦ量は、免疫沈降、免疫組織学、ウエスタンブロット、ドットブロット、ＥＬＩＳＡもしくはＥＬＩＳＰＯＴ、タンパク質チップ、抗体チップ、または組織チップと免疫組織化学の併用から選択される方法によって決定される。ＰｌＧＦに対する抗体は市販されており（例えば、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、Ａｂｃａｍなどを参照）、本発明の方法において使用することができる。さらにより好ましくは、ＰｌＧＦ発現はウエスタンブロットまたはＥＬＩＳＡにより測定される。
【００９６】
さらに、ＰｌＧＦ量は対照マーカーに対してノーマライズされ、対照マーカーは、Ｂ２Ｍ、ＴＦＲＣ、ＹＷＨＡＺ、ＲＰＬＯ、１８Ｓ、ＧＵＳＢ、ＵＢＣ、ＴＢＰ、ＧＡＰＤＨ、ＰＰＩＡ、ＰＯＬＲ２Ａ、ＡＣＴＢ、ＰＧＫ１、ＨＰＲＴ１、ＩＰＯ８およびＨＭＢＳから選択される遺伝子、または前記遺伝子の産物から選択されるポリペプチドであってよい。
【００９７】
測定されたＰｌＧＦ発現率は、次いで参照ＰｌＧＦ発現レベルと比較し、対象がＦＡＳＤであるかどうかを決定する。
【００９８】
本願の意図において「参照ＰｌＧＦ発現率」とは、参照値として使用される前記因子のいずれの発現率も意味する。例えば、参照発現率は健康な対象に由来する生体サンプル、例えば、胎盤または臍帯血におけるＰｌＧＦ発現率の測定により得ることができ、ここで健康な対象とは子宮内でアルコールに暴露されなかった対象を意味する。
【００９９】
本発明を、以下の実施例を用いてより詳細に記載する。前記実施例は単に例示の目的で本明細書に提供され、特に断りのない限り、本発明を限定することを意図するものではない。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】図１：Ｅ２０マウス胚における皮質血管新生に及ぼす子宮内アルコール暴露の影響。Ａ、Ｂ：対照動物（Ａ）およびアルコール暴露動物（Ｂ）における皮質微小血管の組織化に及ぼすＧＤ１５からＧＤ２０までの胎児アルコール暴露の影響。脳の微小血管は、抗ＣＤ３１免疫組織化学によって可視化した。矢印は、「対照」群において放射状の配向を有する脳の微小血管を示す。「アルコール」群では放射状の組織化が欠如していることに留意されたい。Ｉ〜ＶＩ：皮質層；ＣＣ：脳梁。Ｃ：ＧＤ２０胎児の未熟皮質における皮質微小血管の配向分布（角度クラス）。統計分析はカイ二乗検定を用いて行った。Ｄ：ＧＤ２０におけるＣＤ３１の皮質発現に及ぼす妊娠最終週中の胎児アルコール暴露の影響のウエスタンブロット定量。ｎｓは、対応のないｔ検定を用いて「対照」群と比較。
【図２】図２：Ｅ２０マウス胚におけるＶＥＧＦ／ＰｌＧＦファミリーメンバーの発現に及ぼす子宮内アルコール暴露の影響。Ａ〜Ｅ：「対照」および「アルコール」群の皮質におけるＶＥＧＦＡ（Ａ）、ＰｌＧＦ（Ｂ）、ｓＶＥＧＦ−Ｒ１（Ｃ）、ｍＶＥＧＦ−Ｒ１（Ｄ）およびＶＥＧＦ−Ｒ２タンパク質レベルのウエスタンブロット定量。Ｆ：「対照」群のＥ２０胚の皮質および胎盤におけるＰｌＧＦタンパク質レベルのウエスタンブロット比較。＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．００１は、対応のないｔ検定を用いて「対照」群と比較。
【図３】図３：ＧＤ２０マウスにおける胎盤の超微細構造に及ぼす子宮内アルコール暴露の影響。Ａ：胎盤の層状構造に及ぼすアルコール暴露の影響のクレシルバイオレット染色による観察。胎盤の母胎側が上向き。アルコールは接合層と迷路層の分離（点線）に影響を及ぼす。Ｂ：ライヘルト膜厚に及ぼすアルコールの影響の画像解析定量。Ｃ、Ｄ：「対照」群（Ｃ）および「アルコール」群（Ｄ）における巨大栄養芽層の低倍率像。矢印は、巨大栄養芽細胞を示す。後者は、「対照」群の胎盤では典型的な方形を示し、「アルコール」群では円形を示す。Ｅ〜Ｈ：「対照」群（Ｅ、Ｇ）および「アルコール」群（Ｆ、Ｈ）における巨大栄養芽細胞の細胞形態および密着結合の存在（矢印）を示す中倍率（Ｅ、Ｆ）および高倍率（Ｇ、Ｈ）の電子顕微鏡により取得された像。密着結合（星）は、アルコール処置動物ではもはや見られない。ＥおよびＦ中の挿入部は、それぞれＧおよびＨにて高倍率で観察される区画を示す。Ｄ：母体の脱落膜；Ｊ：接合層；Ｌ：迷路層；Ｔｇ：巨大栄養芽層。＊＊＊ｐ＜０．００１は、対応のないｔ検定を用いて「対照」群と比較。
【図４】図４：胎盤関門および胎盤エネルギー代謝に関与するタンパク質の発現に及ぼす子宮内アルコール暴露の影響。Ａ、Ｂ：「対照」群（Ａ）および「アルコール」群（Ｂ）におけるマウスの胎盤迷路層中のＺＯ−１タンパク質の免疫組織化学像。ＺＯ−１タンパク質は、「対照」群ではドット群を形成していると見られるが（矢印）、「アルコール」群では、染色は拡散している。栄養芽層は、グルコース輸送体Ｇｌｕｔ−１との免疫反応性によって可視化した。核はヘキストで染色した。Ｃ：「対照」胎盤の迷路層におけるモノカルボン酸ＭＣＴ−１およびグルコース輸送体に対する抗体による二重染色。Ｇｌｕｔ−１とは対照的に、ＭＣＴ−１の発現は、母体の合胞体栄養芽層に関連している。核はヘキストで染色した。Ｄ：「対照」群および「アルコール」群の胎盤におけるＺＯ−１およびＭＣＴ−１タンパク質の発現レベルのウエスタンブロット定量。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１は、対応のないｔ検定を用いて対照群と比較。ウエスタンブロット分析は、アルコール暴露動物の胎盤ではＺＯ−１レベルは有意に低下したが、ＭＣＴ−１タンパク質レベルは有意に上昇したことを示した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１は、対応のないｔ検定を用いて対照群と比較。Ｅ〜Ｈ：免疫組織化学検査は、マウス胎盤の合胞体栄養芽層におけるＶＥＧＦ−Ｒ１（Ｅ）、Ｇｌｕｔ−１（Ｆ、Ｇ）およびＰｌＧＦ（Ｈ）の分布を示す。核はヘキストで染色した。
【図５】図５：マウス胎盤におけるＶＥＧＦ／ＰｌＧＦファミリーメンバーの発現に及ぼす子宮内アルコール暴露の影響。Ａ〜Ｆ：ＧＤ２０におけるＶＥＧＦ−Ａ（Ａ）、ＰｌＧＦ（Ｂ）、ｓＶＥＧＦ−Ｒ１（Ｃ）、ｍＶＥＧＦ−Ｒ１（Ｄ）、ＶＥＧＦ−Ｒ２（Ｅ）およびＣＤ３１（Ｆ）の胎盤発現に及ぼす妊娠最終週中のアルコール暴露の影響のウエスタンブロット定量。Ｇ、Ｈ：Ｇｌｕｔ−１で染色した胎盤の合胞体栄養芽層（Ｈ）におけるＶＥＧＦ−Ｒ２の分布（Ｇ）を示す免疫組織化学染色。核はヘキストで染色した。＊ｐ＜０．０５は、対応のないｔ検定を用いて対照群と比較。
【図６】図６：子宮内注入したエバンスブルーおよび組換えヒトＰｌＧＦの胎盤から胎児脳への拡散および脳の血管新生に及ぼすＰｌＧＦの胎盤抑制の影響。Ａ、Ｂ：ＧＤ１５において妊娠マウスの胎盤にマイクロインジェクションにより投与したエバンスブルー像の経時的推移。蛍光はＵＶ照射により検出し（Ａ）、擬色スケール（Ｂ）を用いて表す。Ｃ、Ｄ：ＧＤ１５における胎盤マイクロインジェクション後の胎児脳のエバンスブルー蛍光像の経時的推移。蛍光はＵＶ照射により検出し（Ｃ）、擬色スケール（Ｄ）を用いて表す。Ｅ、Ｆ：胎盤へ（Ｅ）および次いで対応する胎児の脳へ注入されたエバンスブルーのシグナルの５９５ｎｍにおける吸光度の分光光度定量の経時的推移（Ｆ）。Ｇ：ＧＤ１５における妊娠マウスの胎盤へのｈＰｌＧＦの注入３０分後の胎児マウス脳におけるヒトＰｌＧＦのＥＬＩＳＡ定量。＊ｐ＜０．０５は、対応のないｔ検定を用いて対照群と比較。Ｈ：ｅＧＦＰをコードしているプラスミドによるＧＤ１５妊娠マウス胎盤の子宮内トランスフェクション４８時間後のｅＧＦＰ発現を可視化した顕微鏡写真。Ｉ、Ｊ：ｅＧＦＰ蛍光（Ｉ）は、Ｇｌｕｔ−１で染色された胎児栄養芽層（Ｊ）（矢印の先）に主として関連があることを示すｅＧＦＰ／Ｇｌｕｔ−１／ヘキストによる三重染色。栄養芽層の胎児部分は、胎児循環の特異的な有核赤血球の存在（矢印）により同定される。Ｋ：非トランスフェクト動物（ｓｈ−／ＧＦＰ−）、ＧＦＰトランスフェクト動物（ｓｈ−／ＧＦＰ＋）およびｓｈＰＬＧＦ／ＧＦＰトランスフェクト動物（ｓｈ＋／ＧＦＰ＋）の胎盤におけるＰｌＧＦ、ＧＦＰおよびアクチンタンパク質のウエスタンブロット像。Ｌ、Ｍ：トランスフェクション４日後の非トランスフェクト動物（ｓｈ−／ＧＦＰ−）、ＧＦＰトランスフェクト動物（ｓｈ−／ＧＦＰ＋）およびｓｈＰＬＧＦ／ＧＦＰトランスフェクト動物（ｓｈ＋／ＧＦＰ＋）の胎盤におけるＰｌＧＦレベル（Ｌ）およびＧＦＰ発現（Ｍ）のウエスタンブロット定量。Ｎ：トランスフェクション４日後の非トランスフェクト胎盤（ｓｈ−／ＧＦＰ−）、ＧＦＰトランスフェクト胎盤（ｓｈ−／ＧＦＰ＋）およびｓｈＰＬＧＦ／ＧＦＰトランスフェクト胎盤（ｓｈ＋／ＧＦＰ＋）由来の胎児脳におけるＶＥＧＦ−Ｒ１発現レベルのウエスタン移行定量。＊ｐ＜０．０５は、一元配置ＡＮＯＶＡとその後のテューキーの事後検定を用いて「ｓｈ−／ＧＦＰ」群と比較。Ｏ〜Ｒ：非トランスフェクト胎盤（Ｓｈ−／ＧＦＰ−）（Ｏ）、ＧＦＰトランスフェクト胎盤（Ｓｈ−／ＧＦＰ＋）（Ｐ）およびｓｈＰＬＧＦ／ＧＦＰトランスフェクト胎盤（Ｓｈ＋／ＧＦＰ＋）（Ｑ）由来の胎児皮質における血管新生の像。カイ二乗検定を用いて行った皮質血管崩壊の統計分析（Ｒ）。
【図７】図７：妊娠２０〜２５週のヒト胎盤に及ぼす子宮内アルコール暴露の影響の形態計測的特性評価。Ａ、Ｂ：妊娠齢［２０〜２５ＷＧ］における「対照」群（Ａ）および「ＦＡＳ／ｐＦＡＳ」群（Ｂ）の胎盤絨毛（青）に存在する微小血管（茶）を可視化するための抗ＣＤ３１免疫組織化学染色およびトルイジンブルー対比染色。Ｃ：妊娠齢［２０〜２５ＷＧ］における「対照」群および「ＦＡＳ／ｐＦＡＳ」群の胎盤のサイズにより分類される絨毛のパーセンテージ。Ｄ：妊娠齢［２０〜２５ＷＧ]における「対照」群および「ＦＡＳ／ｐＦＡＳ」群の胎盤の絨毛サイズによる血管分布。Ｅ：妊娠齢［２０〜２５ＷＧ］における「対照」群および「ＦＡＳ／ｐＦＡＳ」群の胎盤の絨毛サイズによる血管表面積。＊ｐ＜０．０５は、対応のないｔ検定を用いて対照群と比較。
【図８】図８：妊娠２５〜３５週ヒト胎盤に及ぼす子宮内アルコール暴露の影響の形態計測的特性評価。Ａ、Ｂ：妊娠齢［２５〜３５ＷＧ］における「対照」群（Ａ）および「ＦＡＳ／ｐＦＡＳ」群（Ｂ）の胎盤絨毛（青）に存在する微小血管（茶）を可視化するための抗ＣＤ３１免疫組織化学染色およびトルイジンブルー染色。Ｃ：妊娠齢［２５〜３５ＷＧ］における「対照」群および「ＦＡＳ／ｐＦＡＳ」群の胎盤の大きさにより分類される絨毛のパーセンテージ。Ｄ：妊娠齢［２５〜３５ＷＧ］における「対照」群および「ＦＡＳ／ｐＦＡＳ」群の胎盤の絨毛サイズによる血管分布。Ｅ：妊娠齢［２５〜３５ＷＧ］における「対照」群および「ＦＡＳ／ｐＦＡＳ」群の胎盤の絨毛サイズによる血管表面積。＊ｐ＜０．０５は、対応のないｔ検定を用いて対照群と比較。
【図９】図９：妊娠３５〜４２週ヒト胎盤に及ぼす子宮内アルコール暴露の影響の形態計測的特性評価。Ａ、Ｂ：［３５〜４２ＷＧ］の範囲の妊娠齢における「対照」群（Ａ）および「ＦＡＳ／ｐＦＡＳ」群（Ｂ）の胎盤絨毛（青）に存在する微小血管（茶）を可視化するための抗ＣＤ３１免疫組織化学染色およびトルイジンブルー染色。微小血管内腔面積は「ＦＡＳ／ｐＦａｓ」群で大幅に減少する。Ｃ：［３５〜４２ＷＧ］の範囲の妊娠齢における「対照」群および「ＦＡＳ／ｐＦＡＳ」群の胎盤のサイズにより分類される絨毛のパーセンテージ。Ｄ：［３５〜４２ＷＧ]の範囲の妊娠齢における「対照」群および「ＦＡＳ／ｐＦＡＳ」群の胎盤の絨毛サイズによる血管分布。Ｅ：［３５〜４２ＷＧ］の範囲の妊娠齢における「対照」群および「ＦＡＳ／ｐＦＡＳ」群の絨毛サイズによる血管表面積。＊ｐ＜０．０５は、対応のないｔ検定を用いて対照群と比較。
【図１０】図１０：ヒト胎盤の絨毛密度および血管密度に及ぼす子宮内アルコール暴露の影響の経時的推移ならびに血管新生促進タンパク質およびエネルギー代謝のウエスタンブロット特性評価。Ａ：妊娠齢［２０〜２５ＷＧ］、［２５〜３５ＷＧ］および［３５〜４２ＷＧ］における「対照」群（Ａ）および「ＦＡＳ／ｐＦＡＳ」群（Ｂ）群の胎盤の絨毛密度の変化。Ｂ：妊娠齢［２０〜２５ＷＧ］、［２５〜３５ＷＧ］および［３５〜４２ＷＧ］における「対照」群および「ＦＡＳ／ｐＦＡＳ」群の血管密度の変化。＃ｐ＜０．０５、＃＃ｐ＜０．０１は、グラフに示すように「対照」群と比較。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１は、所与の妊娠齢群に関する「対照」群と「アルコール」群の比較。Ｃ〜Ｈ：「対照」群および「ＦＡＳ／ｐＦＡＳ」群の胎盤におけるＺＯ−１（Ｃ）、ＭＣＴ−１（Ｄ）、ＰｌＧＦ（Ｅ）、ＶＥＧＦＡ（Ｆ）、ＶＥＧＦ−Ｒ１（Ｇ）およびＶＥＧＦ−Ｒ２（Ｈ）タンパク質レベルのウエスタンブロット定量。＊ｐ＜０．０５は、対応のないｔ検定を用いて対照群と比較。
【図１１】図１１：ヒト胎児に見られ、子宮内アルコール暴露により誘発される脳損傷と胎盤損傷の比較および統計相関。Ａ〜Ｈ：ＷＧ２２（Ａ、Ｅ）およびＷＧ３１（Ｃ、Ｇ）における「対照」群の患者の脳（Ａ、Ｄ）および胎盤（Ｅ、Ｈ）の血管の組織化ならびにＷＧ２１（Ｂ、Ｆ）およびＷＧ３３（Ｄ、Ｈ）における「ＦＡＳ／ｐＦＡＳ」群の患者の脳（Ｂ、Ｄ）および胎盤（Ｆ、Ｈ）の血管の組織化。Ｉ、Ｊ：「対照」群（Ｉ）およびＦＡＳ／ｐＦＡＳ群（Ｊ）の患者における皮質血管の崩壊と胎盤血管密度の間の統計相関。
【図１２】図１２：子宮内アルコール暴露中の胎児成長および皮質血管新生に及ぼす子宮内ＰｌＧＦ過剰発現の影響。Ａ、Ｂ：ＧＤ１３（Ａ）においてＰＧＦ／ＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓ９活性化アプローチと胎盤の子宮内エレクトロポレーションの併用を実施し、ＧＤ２０においてＰｌＧＦ過剰発現を確認した（Ｂ）。「アルコール」群において、子宮内アルコール暴露はＧＤ１５〜ＧＤ２０の間に生じる。Ｃ、Ｄ：ＮａＣｌ（Ｃ）またはアルコール（Ｄ）に暴露した妊娠マウス由来のＥ２０胎児の像。アルコール暴露胎児のサイズの小ささに留意されたい。バーは、実施された形態計測的測定を示す（頭部サイズ（ａ）；身体サイズ（ｂ）、腹部サイズ（ｃ）および胎児の全身サイズ（ａ＋ｂ））。Ｅ、Ｆ：「対照」群（Ｅ）またはアルコール暴露妊娠マウス（Ｆ）の胎盤におけるＰＧＦ／ＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９プラスミドの子宮内エレクトロポレーション後の妊娠マウス由来のＥ２０胎児の像。Ｇ、Ｈ：「対照」（ＮａＣｌ）群および「アルコール」群における腹部サイズ（Ｇ）および胎児全身サイズ（Ｈ）の定量。同じ子宮角に、エレクトロポレーションを受けなかった胎盤（黒いバー）と、対照ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ９プラスミドでエレクトロポレーションを受けた胎盤（灰色のバー）またはＰＧＦ／ＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９プラスミドでエレクトロポレーションを受けた胎盤（白いバー）があった。＃＃ｐ＜０．０１；＃＃＃ｐ＜０．００１；＃＃＃＃ｐ＜０．０００１は「対照」群と比較し、示されたように＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１は、二元配置ＡＮＯＶＡとその後のテューキーの事後検定を用いて示される。Ｉ〜Ｋ：対照（ＮａＣｌ）／非トランスフェクト胎盤（Ｉ）、ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ９トランスフェクト胎盤のアルコール／対照（Ｊ）およびアルコールＰＧＦ／ＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９トランスフェクト胎盤由来のＥ２０胎児の皮質の像。胎盤におけるＰｌＧＦの過剰発現は子宮内アルコール暴露により誘発された脳血管新生の崩壊を是正することに留意されたい。Ｌ：エレクトロポレーションを受けなかった胎盤（黒いバー）、ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ９対照プラスミドでエレクトロポレーションを受けた胎盤（灰色のバー）およびＰＧＦ  ＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９プラスミドでエレクトロポレーションを受けた胎盤（白いバー）由来のＥ２０胎児の皮質における放射状血管のパーセンテージの定量。＃ｐ＜０．０５；＃＃ｐ＜０．０１は、「対照」群と比較し、＊ｐ＜０．０５は、二元配置ＡＮＯＶＡとその後のテューキーの事後検定を用いて示される。
【図１３】図１３：「対照」群および「アルコール」群におけるＥ２０胎児の頭部および身体サイズに及ぼす胎盤ＰｌＧＦの過剰発現の影響。Ａ、Ｂ：「対照」（ＮａＣｌ）群および「アルコール」群における頭部サイズ（Ａ）および身体サイズ（Ｂ）の定量。同じ子宮角に、エレクトロポレーションを受けなかった胎盤（黒いバー）と、ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ９対照プラスミドでエレクトロポレーションを受けた胎盤（灰色のバー）またはＰＧＦ  ＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９プラスミドでエレクトロポレーションを受けた胎盤（白いバー）があった。＃＃Ｐ＜０．０１；＃＃＃Ｐ＜０．００１；＃＃＃＃Ｐ＜０．０００１は、「対照」群と比較し、＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１は、二元配置ＡＮＯＶＡとその後のテューキーの事後検定を用いて示される。
【実施例】
【０１０１】
実施例Ａ：子宮内アルコール暴露後の異常
以下の実施例Ａは、本発明に先立ち実施した試験からのいくつかの試験結果を含み、これらの試験結果はマウスおよびヒトにおいて以下のことを示す。
・胎児のアルコール暴露は、脳血管新生および脳血管系の組織化に影響を及ぼす、
・これらの脳の変化は、胎盤の血管の異常と相関している、
・胎盤の血管新生促進因子は胎児の脳に到達することができる、
・ＦＡＳＤ児の脳血管新生の神経発達学的異常は、胎盤のＰｌＧＦ／脳のＶＥＧＦ−Ｒ１系の調節不全と関連している、
・胎盤のＰｌＧＦの無効化は、脳のＶＥＧＦ−Ｒ１に及ぼす胎児のアルコール暴露の影響を再現する、および
・胎児のアルコール暴露後の胎盤のＰｌＧＦレベルの調節不全が脳損傷を予測する。
【０１０２】
子宮内アルコール暴露後の脳血管新生における異常
脳血管系の発生に及ぼす子宮内アルコール暴露の影響
本発明者らは従前に、出生前のアルコール暴露が脳血管の崩壊を誘発することを実証した。特に、アルコールの影響は放射状配向の皮質血管数の有意な減少およびランダムな配向の微小管数の増加と関連している（図１）。マウスでの試験と並行して、ヒトにおける脳微小血管系の分析では、マウスと同様に、「対照」群において放射状配向を有する皮質微小血管が「ＦＡＳ／ｐＦＡＳ」群では完全に乱れていることが示された（図１１およびJegou et al., vol. 72, no. 6, 31 December 2012, pages 952-960)。
【０１０３】
マウスにおいて血管系の代表的な遺伝子の発現に及ぼす子宮内アルコール暴露の影響
定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｍＲＮＡ）およびウエスタンブロット（タンパク質）試験では、ＶＥＧＦＡまたはＰｌＧＦなどの因子の血管新生促進作用を中継ぎするＶＥＧＦ−Ｒ１およびＶＥＧＦ−Ｒ２受容体レベルの調節不全が染色により明らかになった。従って、脳血管系の異常は、血管新生を促進する脳の受容体の発現の調節不全に関連している（図２およびJegou et al., vol. 72, no. 6, December 31 2012, pages 952-960）．
【０１０４】
子宮内アルコール暴露後の胎盤の血管新生における異常
特に胎盤の絨毛密度およびサイズ、血管密度および表面積、ならびに絨毛当たりの血管の割合を含む、免疫組織化学アプローチと形態計測学的分析とを併用して、マウス（図３〜５）およびヒト（図７〜９）において様々な胎盤のパラメーターが試験された。ヒトでは、これらのパラメーターが測定され、対照の３４名の胎盤と子宮内でアルコールに暴露された３６名の胎盤が比較された。胎盤は、脳の試験における週齢群と同様の３つの週齢群に分けた(Jegou et al., vol. 72, no. 6, December 31 2012, pages 952-960)。本文書に週齢群［２０〜２５ＧＷ]、［２５〜３５ＧＷ］および［３５〜４２ＧＷ］の結果を示す。
【０１０５】
特に、形態計測学的分析では、絨毛サイズおよび血管表面積による胎盤血管分布がアルコール暴露によって有意な影響を受けていることが示されている（図１０）。さらに、「週齢」因子を考慮した血管密度の縦断的分析では、「対照」群において［２０〜２５ＧＷ]および［２５〜３５ＧＷ］間で胎盤の血管新生が著しく増加していることが示されている。この胎盤の血管新生の実質的な増加は、妊娠第３半期中の実質的な脳の発達によるものであり、これには酸素および栄養素供給の増加が必要である。その一方で、胎児のアルコール暴露は胎盤の血管密度の停滞または減少を誘発する（図１０）。
【０１０６】
結論として、この結果から、アルコールに暴露された対象のヒト胎盤および大脳皮質の両方において血管の異常が存在することが示される。従って、これらの結果は、脳障害と胎盤の血管新生不足の間の相関についての仮説を支持するものである。
【０１０７】
胎盤の血管異常と脳の血管異常の間の相関性の実証
子宮内アルコール暴露後にヒトにおいて観察された胎盤の血管異常と脳の血管異常は、因果関係のない完全に独立したプロセス、または逆に、密接に関係しているプロセスの結果であり得る。ＰｌＧＦ源は胎盤のみであるという事実は、第２の仮説を支持するものである。しかしながら、脳血管損傷と胎盤損傷の間の関連性を実証するために、一方では「対照」群の対象、他方では「ＦＡＳ／ｐＦＡＳ」群の個人において相関試験を実施した（図１１）。
【０１０８】
結果から、「対照」群において胎盤の血管新生の増加は皮質血管の放射状組織化に影響を及ぼさないことが示される（Ｒ２  ０．４７１９）。これに対して、「ＦＡＳ／ｐＦＡＳ」群で観察された胎盤の血管新生の欠陥は、皮質血管のランダムな配向と密接に相関している（Ｒ２  ０．９９９５）。従って、胎盤と脳の血管変化の間には極めて有意な相互作用が認められる。
【０１０９】
胎盤のＰｌＧＦとその脳受容体の間の機能上の関連性の実証
妊娠マウス（ＧＤ１５日）の胎盤に蛍光分子を子宮内投与すると、２０〜３０分後に胎児の脳内に蛍光分子が認められる（図６）。さらに、マウス胎盤に組換えヒトＰｌＧＦを注射すると、３０分後にＥＬＩＳＡにより胎児の脳内に検出される（図６）。これらのデータから、胎盤の分子、特にＰｌＧＦは胎児の脳に到達可能であることが示される。
【０１１０】
ｓｈＲＮＡによる子宮内胎盤トランスフェクションでマウスＰｌＧＦの無効化を行うと、４８時間後に胎盤のＰｌＧＦタンパク質レベルが抑制される（図６）。この影響は、ＶＥＧＦ−Ｒ１タンパク質レベルの急激な減少という脳レベルの変化と関連している（図６）。これらの結果から、ｉ）胎盤ＰｌＧＦの特異的な抑制が脳の受容体発現に直接影響を及ぼすこと、ｉｉ）胎盤ＰｌＧＦの特異的な抑制が脳のＶＥＧＦ−Ｒ１発現に対するアルコールの作用を模していることが示される（図２および６）。
【０１１１】
血管新生に関与するかまたは血管系に特異的であるかのいずれかであることが知られているタンパク質の発現レベルを、ウエスタンブロットにより定量した。この研究は、動物（マウス；胎盤／脳）およびヒト（胎盤）において実施した。
【０１１２】
マウスにおいて、胎盤のＶＥＧＦＡおよびＰｌＧＦの発現率の定量を行ったところ、ＰｌＧＦのみにおいて有意な減少を示す（ＰｌＧＦに関しては、身体の中で胎盤が唯一の起源である；図５）。同時に、ＶＥＧＦＡ受容体およびＰｌＧＦ受容体の定量では、ＶＥＧＦＲ１の発現（唯一のＰｌＧＦ受容体）が胎盤および脳の両方において減少していることが示されている（図２および５）。この極めて著しい減少は、約５０％である。脳におけるＶＥＧＦＲ２の発現に関する限り、影響は認められない。さらに、胎盤および血液脳関門の確立に関与する血管タンパク質ＺＯ−１の定量を行ったところ、胎盤において大幅に減少している（図４）。
【０１１３】
マウスにおいて実施された研究と並行して、母体のアルコール暴露および小児生存が証明されているヒト胎盤に対するタンパク質発現分析を実施した。本発明者らは、７個の「対照」および６個の「アルコール」胎盤を採取し、ウエスタンブロットによりマウスにおいて同定された候補マーカーを定量した。結果は、「アルコール」群において、ＰｌＧＦおよびＺＯ−１の発現はマウスと同様に極めて著しく減少したことを示している（図１０）。これらのデータは、胎盤および脳レベルで観察された胎児アルコール暴露の影響は、２つの異なる動物種、マウスおよびヒトにおいて認められたことを示している。
【０１１４】
実施例Ｂ：ＰｌＧＦの治療効果
これらの実施例は、胎盤レベルのＰｌＧＦ過剰発現試験により得られた結果に相当し、よって、胎児の形態およびサイズ、ならびに脳血管新生に及ぼすアルコールの有害作用を逆転させる。
【０１１５】
１．材料および方法
ＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９システムにおけるＰＧＦ遺伝子のイン・ビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）活性化によるＰｌＧＦの胎盤過剰発現
イン・ビボ  エレクトロポレーションと併用する、ＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９アプローチは、発生プロセスにおける内因性タンパク質の役割の特定のための革新的な遺伝子過剰発現法である。相乗的活性化メディエータ(Synergistic activation mediator、ＳＡＭ)複合体を構成するＰＧＦ  ＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９（ｓｃ−４２２２１１−ＡＣＴ）活性化プラスミドは、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙにより設計、供給された。ＳＡＭはＰＧＦ遺伝子転写開始部位の上流の特定の部位に結合し、これにより標的遺伝子の内因性の転写を活性化する。実際には、ＰＧＦ−ＣＲＩＳＰＲ  ｄＣａｓ９活性化プラスミドをＧＤ１３において２群のマウス（「対照」および「アルコール」）に子宮内エレクトロポレーションによりトランスフェクトする。アルコール暴露はＧＤ１５〜ＧＤ２０の間に行う。プラスミド発現およびＰＬＧＦ過剰発現を可能とするには、ＰＧＦ  ＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９活性化プラスミドのトランスフェクションとアルコール処置の間の２日間の延期が必要である。妊娠マウスに対して、３匹の胎盤にはＰＧＦ  ＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９活性化プラスミドをトランスフェクトし、３匹の胎盤には２０ｎｔ非特異的ガイドＲＮＡを標的とするＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ９（ｓｃ−４１８９２２）対照プラスミドをトランスフェクトした（陰性対照）。もう１匹の胎盤にはトランスフェクトを行わず、対照として使用する（「対照」群）。
【０１１６】
２．結果
胎盤のＰＧＦ遺伝子過剰発現は子宮内アルコール暴露により変化を受けた胎児脳血管新生を回復させる
【０１１７】
子宮内トランスフェクションと組み合わせたＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ９活性化戦略を用いて、アルコールで処理していない妊娠マウス（対照群）およびアルコールに暴露された妊娠マウス（アルコール群）の胎盤中に内因性ＰＧＦ遺伝子の強い発現を誘発した（図１２、ＡおよびＢ）。ＧＤ２０に、子宮内アルコール暴露が胎児の子宮内成長の抑制をもたらしたことが観察され（図１２、ＣおよびＤ）、頭囲（ｐ＜０．０１；図１３）、身体サイズ（ｐ＜０．０００１；図Ｓ２）、腹部サイズ（ｐ＜＃＃；図１２、Ｇ）および胎児の全身サイズ（ｐ＜＃＃＃＃；図１２、Ｈ）において有意な減少が認められた。「対照」群では、ＰＧＦ過剰発現は胎児の巨視的形態学的進化を誘発し（図１２、ＣおよびＥ）、腹部サイズの有意な増加（ｐ＜０．０１；図１２、Ｇ）および胎児の全身サイズの有意な増加（ｐ＜０．０１；図１２、Ｈ）が認められる。「アルコール」群では、ＰＧＦ過剰発現は身体サイズ（ｐ＜０．０５；図１３）および胎児の全身サイズ（ｐ＜０．０１；図１２、Ｈ）を有意に増加させる。「対照」群と比較して、ＰＧＦ過剰発現は頭囲（図１３）および腹部サイズ図１２、Ｇ）に対するアルコールの有害な作用を抑制し、身体サイズ（図１３）および胎児の全身サイズ（図１２、Ｈ）に対するアルコールの作用をそれぞれ３８．６±２．８％および４６．８±２．９％減少させた。ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ９対照プラスミドを用いてトランスフェクトされた妊娠マウスにおいて胎児の形態学に及ぼす影響は観察されなかった（図１２、ＧおよびＨ）。従前に実証されたように、Ｅ２０のマウスの胎児の脳において、子宮内アルコール暴露は皮質血管系の崩壊を引き起こす（図１、ＡおよびＢ）。ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ９対照プラスミドを用いる胎盤のトランスフェクションは、子宮内アルコール暴露により誘発された血管新生の変化に影響を及ぼさなかった（図１２、Ｉ、ＪおよびＬ）。これに対して、胎盤がＣＲＩＳＰＲ−ＰＧＦ  ｄＣａｓ９活性化プラスミドでトランスフェクトされた妊娠マウスにおいて、皮質微小血管の放射状組織化が有意に回復した（ｐ＜０．０５；図４、Ｋ、Ｌ）。これらのデータは、胎盤におけるＰＬＧＦ過剰発現が子宮内アルコール暴露により誘発された脳血管新生の形態学的欠損および異常を部分的にまたは完全に回復させることを初めて実証するものである。
【０１１８】
結論
本発明者らにより妊娠マウスにおいて得られた様々な結果を考慮すれば、以下のようなことが考えられる。
・アルコールに暴露された妊娠マウスの胎盤におけるＰｌＧＦの過剰発現は、胎児の腹部および頭蓋のアルコール暴露に関連する形態計測学的異常を完全に解消する。よって、アルコール暴露後に減少した頭蓋および腹部のサイズは、ＰｌＧＦの過剰発現後に正常に回復する。
・アルコールに暴露された妊娠マウスの胎盤におけるＰｌＧＦの過剰発現は、アルコール暴露に関連する胎児の身体および胎児全身の形態計測学的異常を低減する。よって、アルコール暴露によって減少した胎児の身体サイズおよび胎児の全身サイズは、ＰｌＧＦ過剰発現後はほぼ正常にまで回復する。
・胎盤レベルでのＰｌＧＦの過剰発現は、妊娠マウスのアルコール暴露による変化を受けた胎児の脳血管新生を改善する。よって、この胎児の神経細胞機能は改善する。
・ＰｌＧＦの過剰発現は、ＦＡＳＤタイプの異常の治療において、特に、ＦＡＳＤ胎児の脳血管新生を改善するため、かつ／または血管新生の正常な形態学的外観を回復させるために医薬品として効果的に使用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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