(57)【要約】  単一色素蛍光染色および強度とスペクトル発光の両方の相違の組み合わせにより、細菌を不活性化するために必要な抗生物質の最小濃度（最小阻止濃度（ＭＩＣ））の決定が可能になり、それによって迅速な抗生物質感受性試験（ＡＳＴ）の手段が提供される。これにより、臨床医は、細菌感染症や最終的に敗血症に至るものに罹患している患者に適した治療法を迅速かつ簡単に決定できる。
2020527039.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の一つ以上の細菌の最小阻止濃度を決定する方法であって、
ａ．前記サンプル中の前記一つ以上の細菌のグラムタイプを決定する工程と、
ｂ．複数の容器中で複数の細菌懸濁液を調製する工程と、
ｃ．工程ｂに抗菌剤の濃度を変えて添加し、それによって細菌と抗菌剤の組み合わせを含む複数の懸濁液を作製する工程と、
ｄ．工程ｃの細菌と抗菌剤との組み合わせを含む前記複数の懸濁液を好適な温度で好適な時間インキュベーションし、それによって、細菌と抗菌剤の組み合わせを含む複数のインキュベーションされた懸濁液を作製する工程と、
ｅ．工程ｄの懸濁液に、単膜会合色素を添加する工程と、
ｆ．工程ｅの懸濁液を一つ以上の励起波長の光で照射する工程と、
ｇ．光散乱ゲーティング分析を実施して、細菌と懸濁液クラッターとを区別する工程と、
ｈ．各懸濁液中の個々の細菌細胞の二つの発光波長で放射光の強度を測定する工程と、
ｉ．工程ｈに基づいてスペクトル強度比を決定する工程と、
ｊ．各細菌懸濁液から、各懸濁液の、工程ｈに基づく前記細菌細胞の死／生（Ｄ／Ｌ）比を決定する工程と、
ｋ．工程ｉの前記スペクトル強度比を使用することによりＳＤＬの値を計算し、それらに工程ｊのＤ／Ｌ比を掛ける工程と、
ｌ．工程ｋに基づいて前記最小阻止濃度を決定する工程であって、前記ＳＤＬが前記抗菌剤の濃度の関数である工程と、を含む、方法。
【請求項２】
工程ｌの関数が、
【数１】
2020527039.tif 000017
の形式のステップ関数であり、
式中、ａはスケーリングパラメータであり、ｂはステップ勾配を決定し、ｃはＭＩＣ値である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記単膜会合色素がスチリル色素またはシアニン色素である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記単膜会合色素がＦＭ  １−４３またはＦＭ  ４−６４である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
一つの前記励起波長が３６０ｎｍから５７０ｎｍ間の範囲で選択された波長である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
一つの前記発光波長が５２０ｎｍから８５０ｎｍ間の範囲で選択される波長である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記サンプルが体液である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記サンプルが血液または尿である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記サンプルが臨床単離株である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
適切な前記インキュベーションの前記温度が３５℃〜４０℃である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
適切な前記インキュベーションの前記時間が３０分から５時間の間である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
抗菌剤の濃度を変えることにより、前記抗菌剤が段階希釈により調製されることを意味する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記サンプルを最初にろ過し、前記細菌を濃縮形態で単離し、その後、細菌の固定濃度に希釈する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記サンプルを最初に遠心分離によって濃縮し、その後、細菌の固定濃度に希釈する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記希釈が液体成長培地で生じる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記希釈が液体増殖培地で生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記方法が、細菌および抗菌剤の組み合わせを含む前記複数のインキュベーションされた懸濁液のそれぞれの一部を除去し、工程ｃの後に前記一部を新しい容器に入れることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記光が入射光である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
工程ｌが前記抗菌剤濃度の関数として前記ＳＤＬをプロットすることによって決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記最小発育阻止濃度が前記ＳＤＬの一次導関数または二次導関数である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、それぞれが参照により全体として本明細書中に組み込まれる、「フローサイトメトリー死対生集団比により改善された膜蛍光染色およびスペクトル強度比を使用する迅速な抗生物質感受性試験」と題する、２０１７年７月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／５３２，０９１号および２０１８年７月１２日に出願された米国実用新案出願第１６／０３３，９６３号の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
細菌感染の強度は、感染を引き起こす微生物および微生物の病原性によって異なり得る。結果として、適切な治療には微生物の特定が不可欠である。たとえば、敗血症は世界中で毎年２６００万人以上の人々が罹患しており、子供の最大の死因であり、毎年５００万人以上が死亡している（たとえば、https://www.sepsis.org/faq/“Sepsis Fact Sheet”（非特許文献１）を参照）。集中治療室での敗血症による死亡率は世界中で４０％〜６０％の範囲であり、死因の一つは、患者が最初に不適切な抗生物質療法で治療されたことである（https://www.medicinenet.com/sepsis/article.htm（非特許文献２））。これは主に、最先端の臨床微生物学研究所でさえ、病原体タイプの厳密な診断を得るのに数日かかるためである。さらに、最初に誤った治療を受けた患者は、疾患の過程の初期から最適な治療法で治療された患者よりも低い生存率を示し、平均余命が短くなり、生活の質が損なわれる可能性が高くなる（https://www.sepsis.org/faq/“Sepsis Fact Sheet”（非特許文献１））。したがって、微生物感染症の患者における病原体診断の速度は、患者の予後に大きく影響する可能性がある。
【０００３】
過去３０年間本質的にはほとんど変わらないままである、微生物感染を検出するための当該技術の現状は、病院または商業的な臨床微生物学研究所で血液を培養することである。液体培養では、１６〜３０時間以内に、流体中のあるタイプの成長中の生物の存在の検出が可能になり得る。このアッセイは定量的ではなく、病原体のタイプおよびそれらの特異的抗生物質感受性についての知識はなく、この時点で投与できるのは広域抗生物質のみであり、これはよくても次善である。特定タイプの病原体を特定し、感受性試験を実施してさまざまな潜在的な抗生物質治療に対するそれらの応答を判定するには、液体培地で成長する病原体を他の成長培地（寒天プレートなど）に移さなければならない。完全な診断と感受性試験の合計時間は通常３〜７日であり、臨床症状に基づく経験的な抗生物質治療は、抗生物質感受性の結果が得られるかなり前に開始される。
【０００４】
したがって、迅速で信頼性の高い診断および治療方法は、効果的な患者ケアに不可欠である。残念ながら、上記のように、現在の抗菌剤感受性試験技術は概して、培養による微生物の事前の単離（例えば、約１２〜約４８時間）を必要とし、その後さらに約６〜約２４時間を必要とするプロセスを行う。たとえば、感染のタイプに関する確定診断には、伝統的に、血液培養物の接種、１６〜２４時間のインキュベーション、原因微生物の固体培地上へのプレーティング、さらなるインキュベーション期間、および１〜２日後の最終同定を含む微生物分析が必要である。即時かつ積極的な治療を行っても、感染の種類によっては、患者の予後に大きな影響を与え、場合によっては死に至る可能性がある。
【０００５】
正しい治療が施されるまでに時間が費やされるほどに患者の転帰に重大な違いが生じる可能性がある。したがって、医師が、感染を引き起こしている正確な微生物と、治療に有効な抗生物質を迅速に判断することが重要である。現在の方法では回答が得られるまでに二日以上を要する場合があるので、より迅速な抗生物質感受性試験、好ましくは血液サンプル採取後わずか数時間以内に特定の抗生物質感受性を特定できるものが強く求められている。たとえば、血液サンプル採取後、１〜３時間、１〜５時間、１〜１０時間、２４時間未満、または２４時間後。別の例では、血液サンプルが採取されてから２４時間後に、細菌感染について陽性であると特定される。したがって、このタイプの迅速な試験により、医師は、準最適または完全に無効な抗生物質で開始するのではなく、前記開始時から最適な薬物療法を開始でき、それにより臨床応答性が大幅に向上する。
【０００６】
細菌感染症の患者の治療で遭遇する別の問題は、抗生物質耐性の結果である。抗菌剤（すなわち、抗細菌剤）耐性は、微生物（すなわち、細菌および／または細菌株）が自発的または遺伝子導入によって遺伝的変異を獲得するときに発生し、一つ以上の抗細菌剤、すなわち抗生物質の治療に対して耐性になる。薬剤耐性生物は、一次抗生物質に対する耐性を獲得する可能性があり、微生物が感受性である二次薬剤の使用を必要とする。複数の薬物に対する耐性を獲得したいくつかの細菌株の場合、二次および三次抗生物質への耐性も順次獲得される。
【０００７】
耐性は、自発的または誘導された遺伝的突然変異、または、接合、形質導入、もしくは形質転換を介した遺伝子の水平伝播による他の細菌種からの耐性遺伝子の獲得の形態をとる。多くの抗生物質耐性遺伝子は、伝達を促進する伝達性プラスミド上に存在する。抗生物質耐性プラスミドには、しばしば、いくつかの異なる抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子が含まれている。
【０００８】
臨床診療で見られる抗生物質耐性細菌感染の増加率は、ヒトおよび獣医学の両方での抗生物質の使用に起因している。抗生物質を使用すると、細菌集団の進化的選択圧が高まり得、耐性菌は繁殖し、非耐性菌は死滅する。抗生物質に対する耐性がさらに一般的になるにつれて、代替治療の必要性が高まっている。抗生物質耐性は、公衆衛生にとって重大かつ深刻化する世界的な問題を引き起こす。抗生物質に対する耐性を有する細菌株の数が増えると、医療援助を必要とする個人は、必要とする適切な治療を受けることができない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】https://www.sepsis.org/faq/“Sepsis Fact Sheet”
【非特許文献２】https://www.medicinenet.com/sepsis/article.htm
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、適切な薬物療法を決定することに加えて、施される薬物療法の濃度／投与量を決定することも重要である。したがって、本発明の目的は、１）微生物の抗生物質感受性の即時、迅速な判定、および、２）微生物の阻害に必要な最小濃度を提供することである。
【００１１】
関連技術の説明
既存の抗菌剤感受性試験（ＡＳＴ）技術は冗長なプロセスである。概して、抗生物質耐性遺伝子を含む細菌株と含まない細菌株を特定、分離、識別するための現在の慣行は、多くの場合、微生物学研究所での複雑で冗長なプロセスを伴う。現行のプロセスでは、細菌を含む生体サンプルが最初に研究所に受け入れられる。ＢＤ  ＰｈｏｅｎｉｘおよびｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ  Ｖｉｔｅｘ  ２システムのようなシステムを使用して、当該技術分野で公知の方法で細菌株を検出できる。別のプロセスでは、その後、栄養豊富な培地（例えば、溶原性ブロスまたは任意の他の適切なブロス）を含む寒天プレート上で、滅菌されたループを使用して、生物学的サンプルを画線する。この寒天プレートには、抗生物質で処理されたスポットが含まれている。検体がプレートに画線されたら、寒天プレートを最低１２時間専用のインキュベーターに入れる。次に、寒天プレートを定期的に細菌コロニーの成長についてチェックする。当業者によって理解されるように、生体サンプルが細菌を含む場合、抗生物質を含まないスポット上では細菌コロニーの成長が予想される。前記細菌が抗生物質耐性遺伝子を獲得していない場合、前記抗生物質を含むスポット上での増殖は予想されない。ただし、前記細菌株が抗生物質耐性遺伝子を獲得している場合、前記抗生物質で処理されたスポット上でコロニーの成長が起こる。例えば、共同所有の米国特許出願公開第２００８／０２２０４６５号を参照。
【００１２】
別のプロセスでは、生物学的サンプルを、収集時に選別し、標識し、その後、滅菌済ループを使用して、血液寒天培地または任意の他の適切な栄養豊富な成長培地（例えば、溶原性ブロス）を含むガラス製丸底試験管に接種する。その後、検体を専用のインキュベーターに１２〜２４時間入れる。次に、サンプルを観察し、陽性（すなわち、細菌を含む）および陰性（すなわち、細菌を含まない）培養物についてスクリーニングする。陽性培養物を含むと思われるサンプルは、生化学的液体中の細菌を分離し懸濁するために処理される。このプロセスには、懸濁、希釈、ボルテックス、および濁度の測定が含まれ、その結果、生化学廃棄物が生じる。次に、培養物を、種の同定と抗生物質感受性試験に供し、細菌懸濁液を複数の試薬に曝露する。さらに６〜２４時間のインキュベーション期間の後、知見は検査技師によって解釈および報告される。このプロセス全体は、一般に、標本の結果を得るために少なくとも１１、またはそれ以上の工程と少なくとも５０時間かかり、当該プロセスは労働集約的である。
【００１３】
細菌種および／または菌株を識別および特定する他のプロセスには、さまざまなタイプの核酸配列決定法が含まれる。簡単に言うと、ＤＮＡ配列決定は、ＤＮＡ分子内のヌクレオチドの正確な順序を決定するプロセスである。ＤＮＡ配列決定には、ＤＮＡの鎖中の４つの塩基であるアデニン、グアニン、シトシン、およびチミンの順序を決定するために使用される任意の方法または技術が含まれる。これらの方法では、生体サンプルが得られたら、前記生体サンプルに含まれる細菌を最初に増幅する必要がある。言い換えれば、前記生体サンプルをまず収集し、その後、適切な細菌成長培地（例えば、血液成長培地または溶原性ブロス）に接種するために使用する。その後、前記接種サンプルを適切な条件で１２〜２４時間成長させる。成長したら、細菌細胞を前記培養培地からペレット化し、溶解させ、細菌ＤＮＡを抽出するために処理する。細菌ＤＮＡを次に清浄化し、精製し、ＤＮＡシーケンサーに入れる。細菌の成長および細菌ＤＮＡの単離は、試薬を必要とするだけでなく、バイオ廃棄物を生成し、さらにタイムリーなプロセスである。さらに、核酸配列決定法では、プライマー配列の使用が必要とされる。プライマーは、ＤＮＡ合成の開始点として機能する短い核酸配列（通常は約１０塩基対）の鎖である。このプロセスを触媒する酵素であるＤＮＡポリメラーゼは、既存のＤＮＡ鎖に新しいヌクレオチドの追加しかできないため、ＤＮＡ複製にはプライマーが必要である。プライマー配列を必要とすることにより、この方法は、さらに、細菌株のタイプに関する最小限の知識を必要とする。さらに、示されているように、配列決定には時間がかかり、費用がかかり得る。
【００１４】
微生物が特定されたら、患者は抗生物質で治療される。場合によっては、抗生物質耐性などのさまざまな理由により、初期濃度／用量が効果的でない可能性がある。その結果、適切な抗生物質を正しい用量で患者が受ける時間によって、予後は著しく阻害される可能性がある。
【００１５】
したがって、前記したことを考慮して、それを必要とする患者に効果的な治療を即時に提供するために、迅速な抗菌剤感受性試験方法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
（発明の概要）
本明細書において提供されるのは、
ａ．サンプル中の一つ以上の細菌のグラムタイプを決定する工程と、
ｂ．複数の容器中で複数の細菌懸濁液を調製する工程と、
ｃ．工程ｂに抗菌剤の濃度を変えて添加し、それによって細菌と抗菌剤の組み合わせを含む複数の懸濁液を作製する工程と、
ｄ．工程ｃの細菌と抗菌剤の組み合わせを含む前記複数の懸濁液を適切な温度で適切な時間インキュベーションし、それによって細菌と抗菌剤の組み合わせを含む複数のインキュベーションされた懸濁液を作製する工程と、
ｅ．工程ｄの前記懸濁液に、単膜会合色素（ｓｉｎｇｌｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｄｙｅ）を添加する工程と、
ｆ．工程ｅの懸濁液を一つ以上の励起波長の光で照射する工程と、
ｇ．光散乱ゲーティング分析を実施して、細菌と懸濁液クラッターとを識別する工程と、
ｈ．各懸濁液中の個々の細菌細胞の二つの発光波長で放射光の強度を測定する工程と、
ｉ．工程ｈに基づいてスペクトル強度比を決定する工程と、
ｊ．それぞれの細菌懸濁液から、各懸濁液の、工程ｈに基づく細菌細胞の死／生（Ｄ／Ｌ）比を決定する工程と、
ｋ．工程ｉの前記スペクトル強度比を使用することによりＳＤＬ値を計算し、それらに工程ｊの前記Ｄ／Ｌ比を掛ける工程と、
ｌ．工程ｋに基づいて最小阻止濃度を決定する工程であって、ＳＤＬが抗菌剤濃度の関数である工程と、を含む、サンプル中の一つ以上の細菌の最小阻止濃度を決定する方法である。
【００１７】
工程ｌの関数が
【数１】
2020527039.tif 000003
の形式でのステップ関数である方法であり、
式中、ａはスケーリングパラメータであり、ｂはステップ勾配を決定し、ｃはＭＩＣ値である。
【００１８】
前記単膜会合色素がスチリル色素またはシアニン色素である、前記方法。
【００１９】
前記単膜会合色素がＦＭ  １−４３またはＦＭ  ４−６４である、前記方法。
【００２０】
一つの前記励起波長が、３６０ｎｍから５７０ｎｍの範囲間で選択される波長である、前記方法。
【００２１】
一つの前記発光波長が、５２０ｎｍから８５０ｎｍの範囲間で選択される波長である、前記方法。
【００２２】
前記サンプルが体液である、前記方法。
【００２３】
前記サンプルが血液または尿である、前記方法。
【００２４】
前記サンプルが臨床単離株である、前記方法。
【００２５】
前記適切なインキュベーション温度が３５℃〜４０℃の間である、前記方法。
【００２６】
前記インキュベーション時間の適切な期間が３０分から５時間の間である、前記方法。
【００２７】
抗菌剤の濃度を変えることにより、前記抗菌剤が連続希釈により調製されることを意味する、前記方法。
【００２８】
前記サンプルをまず濾過して前記細菌を濃縮形態で単離し、次いで固定濃度の細菌に希釈する前記方法。
【００２９】
前記サンプルをまず遠心分離により濃縮し、次に固定濃度の細菌に希釈する、前記方法。
【００３０】
前記希釈が液体成長培地で起こる、前記方法。
【００３１】
細菌および抗菌剤の組み合わせを含む前記複数のインキュベーションされた懸濁液のそれぞれの一部分を除去し、工程ｃの後に新しい容器に前記部分を入れることを含む、前記方法。
【００３２】
前記光が入射光である、前記方法。
【００３３】
工程ｌが、前記抗菌剤濃度の関数としてＳＤＬをプロットすることにより決定される、前記方法。
【００３４】
前記最小発育阻止濃度が、一次導関数もしくは二次導関数のＳＤＬのまたは（ｍａｘ（ＳＤＬ）ｍｉｎ（ＳＤＬ））／２である、前記方法。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】活性な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（活性として表示）、および、不活性な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（不活性として表示）のフローサイトメーター散乱プロットを示す。
【図２】ＦＭ  １−４３色素で染色された活性大腸菌および不活性大腸菌の蛍光スペクトルを示す。
【図３】ゲンタマイシンに曝露されたＫ．ニューモニア（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）の二波長蛍光散乱プロットを示す（活性として示されている領域は活性なＫ．ニューモニア（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）集団を示し、不活性として示されている領域は不活性なＫ．ニューモニア（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）集団を示す）。
【図４】ゲンタマイシンに曝露されたＫ．ニューモニア（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）に対する抗生物質濃度の関数としてのスペクトル強度比（ＳＩＲ）を示す（円は測定されたスペクトル強度比（ＳＩＲ）を示し、実線は近似ステップ関数を表す）。図４、図６、および、図１１は、前記ｙ軸が正規化されたＳＩＲＳであることを示し、前記ＳＩＲ読取値は、前記ＳＩＲデータに基づく誤差関数のより簡単な計算を行うために通常−１から１の間である。
【図５】アンピシリンに曝露されたＫ．ニューモニア（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）の二波長蛍光散乱プロットを示す（活性として示されている領域は活性なＫ．ニューモニア（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）集団を示し、不活性として示されている領域は不活性なＫ．ニューモニア（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）集団を示す）。
【図６】アンピシリンに曝露されたＫ．ニューモニア（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）に対する抗生物質濃度の関数としてのスペクトル強度比（ＳＩＲ）を示す（円は測定されたスペクトル強度比（ＳＩＲ）を示し、実線は近似されたステップ関数を示す）。図４、図６、および、図１１は、ｙ軸が正規化されたＳＩＲＳであることを示し、前記ＳＩＲ読取値は、前記ＳＩＲデータに基づく誤差関数のより簡単な計算を行うために通常−１から１の間である。
【図７】アンピシリンに曝露された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の二波長蛍光散乱プロットを示す。
【図８】アンピシリン治療に対して耐性である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の抗生物質濃度の関数としてのスペクトル強度比（ＳＩＲ）を示す。
【図９】ゲンタマイシンに曝露された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の二波長蛍光散乱プロットを示す（活性と表示された領域は活性な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）集団を示し、不活性と表示された領域は不活性な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）集団を示す）。
【図１０】抗生物質濃度の関数（それぞれ活性または不活性と表示された線）としての活性および不活性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）集団を示す。
【図１１】ゲンタマイシン処理に曝露された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対する抗生物質濃度の関数としてのスペクトル強度比（ＳＩＲ）を示す（円は算出されたＳＩＲを示し、実線は近似されたステップ関数を示す）。  図４、図６、および、図１１は、前記ｙ軸が正規化されたＳＩＲＳであることを示し、前記ＳＩＲ読取値は、前記ＳＩＲデータに基づく誤差関数のより簡単な計算を行うために通常−１から１の間である。
【図１２】ゲンタマイシン耐性Ｃ．フロインディ（Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉ）の二波長蛍光散乱プロットを示す（パネル（ａ）対照（未処理）、および、パネル（ｂ）３２μｇ／ｍｌ）。
【図１３】ゲンタマイシン耐性Ｃ．フロインディ（Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉ）の抗生物質濃度の関数としてのスペクトル強度比（ＳＩＲ）を示す。
【図１４】図１４のＡは、細菌なしで１２０分間インキュベーションした後の生の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の代表的な蛍光ドットプロットを示す。図１４のＢは、ＭＩＣ以下（１μｇ／ｍｌ）のゲンタマイシンとともにインキュベーションした細菌が、黒いドットである、依然として主な集団であることを示し、これは９５．２％であり、死集団は４．６％へとわずかに増加した（「死」と表示）。図１４Ｃは、ＭＩＣ超（８μｇ／ｍｌ）のゲンタマイシンとともにインキュベーションした細菌を示している。
【図１５】ＳＩＲ、ＳＤＬ、および、ＤＬ対抗生物質濃度のプロットとして示す（「ＳＩＲ」および「ＳＤＬ」と表示）。
【図１６】誤差関数の式を示しており、これによりＭＩＣを決定できる。
【図１７】図１７のＡは、測定されたＳＩＲと誤差関数が抗生物質濃度の関数として適合していることを示す。図１７のＢは、抗生物質濃度の関数として、測定されたＳＤＬと誤差関数が適合することを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明の説明
以下の説明は、本質的に単なる例示であり、本発明、その適用、または、使用を限定することを意図するものではない。本説明は、当該技術分野の当業者が本発明を作製および使用できるように設計されており、そのために具体例が提供されているが、それらは決して限定と見なされるべきではない。以下の様々な改変が、添付の特許請求の範囲に含まれることは、当該技術分野の当業者には明らかであろう。実施例または本明細書の他の箇所で提供されるかに関わらず、本発明は、現在開示される態様に限定されるとみなされるべきでない。
【００３７】
本願で特定されるさまざまな範囲の数値の使用は、特に明記しない限り、範囲内の最小値と最大値がどちらも「約」という語がその前にあるかのように近似値として記載されている。このように、範囲の上下のわずかな変動を使用して、範囲内の値と実質的に同じ結果を達成できる。また、特に明記しない限り、範囲の開示は、最小値と最大値の間のすべての値を含む連続的な範囲として意図されている。本明細書中で使用される場合、「ａ」および「ａｎ」は一つ以上を指す。
【００３８】
本明細書で使用する場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ、ｃｏｍｐｒｉｓｅまたはｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」およびそれらの変形はオープンエンドであり、特定されていない他の要素の存在を排除しない。これに対して、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ０）」という用語およびその変形は、クローズであることを意図しており、微量であっても追加要素を除外する。
【００３９】
本明細書で使用する「患者」または「対象」という前記用語は、ヒトを含むがこれに限定されない動物界のメンバーを指し、「哺乳類」は、ヒトを含むがこれに限定されないすべての哺乳類を指す。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「サンプル」という用語は、試験または分析される材料を指す。サンプルには細菌を含み、さまざまな供給源から取得できる。例えば、分析されるサンプルは、液体、半液体、または、乾燥サンプルであってもよい。サンプルは、飲料水、食品または飲料、医薬品、パーソナルケア製品、または、体液から取得されてもよい。サンプルは、地方自治体の水道システム、井戸、飲料水、廃水、天然水源、親水施設、または土壌から入手される。異なる実施形態では、サンプルは医療機器から取得される。医療機器の例には、インプラント、パッチ、心臓弁が含まれるが、これらに限定されない。他の例では、体液からサンプルを入手してもよい。これらには、血液もしくは血漿、唾液、尿、咽頭サンプル、または胃腸液が含まれるが、これらに限定されない（これらは「生体サンプル」とも呼ばれる）。「サンプル」は臨床単離株を指す場合もある。臨床単離株は、場合によっては、体液から単離され、適切な実験室手段によって保存された細菌を指す場合がある。一般に、臨床単離株は単離された細菌を指す。したがって、要するに、「サンプル」という用語は、最も広義には、細菌の存在（または推測される存在）を指す。場合によっては、サンプルは供給源から単離された細菌（臨床単離株など）であり得るが、他の場合では、サンプルは細菌／微生物因子を保有する物質（血液、尿、水など）を指す場合がある。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「細菌」（細菌性または細菌）および「微生物」（微生物性）という用語は、同じものを指す。つまり、単細胞、原核生物、微生物を指し、小さく、通常は桿状または球菌状の形態であり、病気を引き起こす可能性がある。細菌によって引き起こされる病気は通常、抗生物質で治療される。さらに、「細菌株」または「細菌単離株」は、同じものを指す。さらに、本明細書に記載の「臨床単離株」とは、「細菌単離株」と同じものを指す。つまり、菌株／単離株は、細菌の遺伝的変異体またはサブタイプである。言い換えれば、ある種の細菌にはいくつかの異なる株が含まれている可能性がある。株は、抗生物質耐性遺伝子などの追加の遺伝子の取得などにより、遺伝的変異に基づいて異なる。これらの用語は、当該技術分野の当業者によって理解されるであろう。
【００４２】
本明細書で使用する場合、「抗細菌剤」および「抗菌剤」という用語は前記同じものを指す。つまり、それらは細菌または微生物を殺滅および／または不活性化できるものを指す。
【００４３】
本明細書中で使用される場合、「生細胞」、「生菌」、または「活性菌」とは、成長および分裂する可能性を有する細菌細胞を意味する。「死」と「不活性化」は交換可能に使用され、死んだ細菌細胞を指す。図１、３、５、７、９、および１０に関して、明るいドットまたは線は活性な細胞を表し、前記暗いドットまたは線は不活性な細胞を表す（図においてそのように表示）。
【００４４】
本明細書で使用される、創傷、欠損（ｄｅｆｅｃｔ）、感染などの「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔまたはｔｒｅａｔｉｎｇ）」とは、任意の適切な投与計画（ｄｏｓａｇｅ  ｒｅｇｉｍｅｎ）、手順、および／または適用経路により、患者に対して、前駆細胞の誘引、創傷の治癒、欠損の修正などを含む、望ましい臨床／医療エンドポイントに有効であり、その達成の目的のための量の組成物、デバイス、または構造を投与することを意味する。
【００４５】
「投与計画」とは、服用間の時間（例えば、６時間ごと）、または、服用されるべき時間（例えば、毎日午前８時と午後４時）、および、特定された各時刻に与えられる薬剤の量（つまり、濃度）を含む、単位時間あたりの特定の濃度での治療薬の服用のスケジュールを意味する。
【００４６】
「治療有効量」とは、望ましい治療結果を達成するために有効な用量および必要な期間を指す。状態の治療についての「有効量」は、決定可能なエンドポイントを達成するのに有効な、本明細書に記載の上記コアセルベート組成物などの活性剤の量または投与形態である。「有効量」は、少なくとも、治療の利益が不利益を上回る、ならびに／または、不利益が当業者および／もしくは米国食品医薬品局などの適切な規制機関に許容される程度に安全であることが好ましい。薬物の治療有効量または投与計画は、個体の疾患状態、年齢、性別、体重、および、個体における所望の応答を誘発する薬物の能力または投与計画などの要因によって異なり得る。治療有効量は、薬物または投与計画の毒性または有害な効果よりも治療上有益な効果が上回る量でもある。「予防有効量」とは、所望の予防結果を達成するために必要な投与量および期間で有効な量を指す。典型的には、予防的用量は疾患に先立ってまたは初期の段階で対象において使用されるため、予防有効量は治療有効量よりも少ない場合がある。
【００４７】
投与計画は、最適な所望の応答（例えば、治療的または予防的応答）を提供するために調整され得る。たとえば、単一のボーラスを投与するか、経時的に複数の分割用量を投与するか、または、組成物を連続的もしくはパルス方式で投与し、用量もしくは部分用量は一定の間隔で、たとえば１０、１５、２０、３０、４５、６０、９０、または１２０分ごと、１日２時間から１２時間ごと、または１日おきなど、治療状況の緊急性によって示されるように比例して増減させて投与される。場合によっては、投与の容易さおよび用量の均一性のために、単位投与形態で非経口組成物を製剤化することが特に有利であり得る。本発明の単位投与形態についての仕様は、（ａ）活性化合物の固有の特性および達成されるべき特定の治療または予防効果、ならびに、（ｂ）個体における感受性の治療のためのそのような活性化合物を配合する当該技術分野に固有の制限によって決まり、それらに直接依存する。
【００４８】
場合によっては、本明細書で提供されるように、投与計画は、それを必要とする患者への一つ以上の抗生物質および特定の濃度、特定の時間での投与を意味し得る。
【００４９】
蛍光分光法は、化学および生化学における分子構造と機能の研究に広く活用されてきた。しかし、微生物の同定と特性評価におけるその有効性は、前記この２０年間の最近になって認識されたばかりである。
【００５０】
簡潔に言えば、当該技術分野の当業者によって理解されるように、蛍光分光法は、サンプルからの蛍光を分析する電磁分光法の一種を指す。蛍光分光法は、ある特定の化合物の分子内の電子を励起し、光を、必ずしもそうである必要はないが、典型的には可視光を発光する光線（たとえば、紫外線）の使用を伴う。
【００５１】
本明細書で提供されるのは、蛍光分光法を活用して、死菌と比較して生菌の検出を可能にし、さらに、抗生物質が細菌の活性を阻害するために必要な最小濃度の決定を可能にする方法である。
【００５２】
具体的には、本明細書で提供されるのは、サンプルから細菌微生物のタイプを特定し、投与計画の有効性を決定し、投与計画の最小阻止濃度を決定するための方法である。一般に、前記工程には、細菌を含むサンプルを取得し、前記サンプルを含む試験管または９６ウェルプレート（最初の容器）のセットを準備し、適切な温度（３０℃〜５０℃、３５℃〜４０℃など、または３７℃付近）で抗菌剤のさまざまな濃度範囲（段階希釈によるなど）で所定の時間（たとえば、３０分〜５時間、または２時間〜４時間）、サンプルを含む試験管またはプレートをインキュベーションし、インキュベーション後、インキュベーションされたサンプルの一部を光学カップまたはキュベット（第二の、または、新しい、容器）に移し、適切な蛍光色素を試験管／プレートに添加し、次に、試験管／プレートを光学分析に供し、光学分析は、フローサイトメーターを含み、光学分析は、異なる波長での液体サンプルの励起、前記蛍光発光の収集、および検出を含み、少なくとも二つの波長からの発光強度の比率を決定し、それによって死菌に対する生菌の比率を決定し、そして当該比率に基づいて最小阻止濃度を決定することを含む。
【００５３】
サンプルが例えば体液の場合、方法はまず以下の工程、１）前記体液サンプルを取得する工程と、２）前記サンプルを遠心分離（たとえば、２４×ｇで１５分）する工程と、３）上清を適切なブロス（例えば、カチオン調整ミューラーヒントンブロス（ＣＡＭＨＢ））で希釈する工程とを含む。
【００５４】
いくつかの例では、サンプルは、たとえば、臨床単離株である。方法は、まず以下の工程、１）臨床単離株を取得し、２）適切な成長培地を含む寒天プレート（例えば血液寒天プレート）上に前記臨床単離株を画線し、３）プレートを３７℃で一晩インキュベーションし、４）単一のコロニーを選択し、適切な緩衝液（例えばリン酸塩緩衝生理食塩水）中に懸濁させ、細菌数を０．５マクファーランド標準に対して調整する工程を含み得る。
【００５５】
本明細書で提供される方法は、特定の抗菌剤が所定の微生物を不活性化するために必要な最小濃度を決定するために、場合によっては段階希釈に依存する。段階希釈は、当該技術分野で周知であり、一般に、溶液中の物質の段階的希釈を指す。通常、各工程での希釈係数は一定であり、結果として対数により濃度の等比級数が得られる。本明細書で提供されるように、前記抗菌剤の段階希釈は、抗菌剤が微生物の不活性化に有効であるか否かを判定し、もしそうであれば、微生物を不活性化するために必要な最小濃度を決定するために、抗菌剤のある範囲の濃度の試験を可能にする。
【００５６】
本明細書で提供されるように、抗菌剤の所定の濃度は、微生物ごとに（既知の場合）、抗菌剤ごとに、微生物における耐性遺伝子の存在、または任意の他の要因によって異なり得る。段階希釈の各工程での抗菌剤の濃度は、これらの要因および他の要因に基づいて異なり、限定的な特徴であることを意図していない。例えば、抗菌剤の濃度は、０μｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌ、およびその間のすべての部分範囲を含む。前記抗菌剤の濃度の一例の範囲は、例えば、０（対照サンプル）、０．５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ、８μｇ／ｍｌ、１６μｇ／ｍｌ、３２μｇ／ｍｌ、６４μｇ／ｍｌ、１２８μｇ／ｍｌ、２５６μｇ／ｍｌ、およびその間のすべての部分範囲であり得る。また、希釈は２５６μｇ／ｍｌを超える場合がある。
【００５７】
方法は、色素をさらに含み得る。例えば、細菌をスチリル色素などの蛍光膜色素で染色すると、不活性細菌に対して、生菌の蛍光は弱くなりシフトする。このような現象は、細胞質のより親水性の高い環境に色素が挿入される、生細胞と不活性細胞における親油性膜環境における色素の相互作用の結果であり得る。
【００５８】
色素には、脂質二重層に組み込まれる蛍光色素が含まれるが、これに限定されない。蛍光色素の例には、スチリル色素およびシアニン色素が含まれる。代表的なスチリル色素には、ＦＭ（登録商標）１−４３、ＦＭ（登録商標）１−４３ＦＸ、ＦＭ（登録商標）４−６４およびＦＭ（登録商標）４−６４ＦＸ、ＦＭ（登録商標）２−１０色素が含まれる。代表的なシアニン色素には、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７が含まれる。ＦＭ  １−４３は、Ｎ−（３−トリエチルアンモニウムプロピル）−４−（４−（ジブチルアミノ）スチリル）ピリジニウムジブロミドであり、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（＃Ｔ−３５３５６）から購入し、Ｓｉｇｍａから「Ｓｙｎａｐｔｏｇｒｅｅｎ」（＃Ｓ６８１４）としても販売されている。ＦＭ  ４−６４は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（＃Ｔ−１３３２０）またはＳｉｇｍａから「Ｓｙｎａｐｔｏｒｅｄ」（＃Ｓ６６８９）として購入したＮ−（３−トリエチルアンモニウムプロピル）−４−（６−（４−（ジエチルアミノ）フェニル）ヘキサトリエニル）ピリジニウムジブロミドである。ＦＭ  ４−６４はグラム陽性色素であり、Ｓｙｎａｐｔｏｒｅｄとしても知られている。
【００５９】
複数の色素を使用できるが、本方法は単一の色素で実行されてもよい。単一の色素の使用は、方法を単純化するだけでなく、二つの色素の存在によって引き起こされる変動性を低減する。
【００６０】
本明細書で提供されるのは、いくつかの例において、生菌と不活性細菌を識別し比較する方法である。本方法は、スペクトル強度比分析（ＳＩＲ）を使用して実行される。ＳＩＲは、二つの波長での励起後の放射光の強度を測定し、二つの波長間の放射光の比率を得る。具体的には、特定の波長で検体を励起すると、生菌および不活性菌の間で最大発光ピークと発光強度の両方で測定可能な差が見られる。したがって、二つの指定された波長での発光強度の比またはスペクトル強度比は、生菌を不活性細菌と識別する手段として使用できる。ＳＩＲは強度の比に依存するため、ＳＩＲの使用は、使用する色素の量や細胞の数に依存しないと考えられる。
【００６１】
より具体的には、スペクトル強度比（ＳＩＲ）は次のように決定できる。
【数２】
2020527039.tif 000004
式中、Iλ１＝Ｉ１＝第一波長での発光強度、および
式中、Iλ２＝Ｉ２＝第二波長での発光強度、たとえば
【数３】
2020527039.tif 000005
式中、「Ｉ」（発光強度）は、各波長での散乱プロットの平均値である。
【００６２】
この場合、Ｉλ＝６１０は前記６１０ｎｍの波長での強度であり、Ｉλ＝５３０は５３０ｎｍの波長での強度であり、Ｉ２＝Ｉλ＝６１０およびＩ１＝Ｉλ＝５３０はグラム陰性菌に好ましい。低いＳＩＲ値は活性細菌集団に相当し、高い値はより大きな不活性細菌集団を示す。Ｉλは、特にグラム陽性細菌に対して特異的な他の波長であり得、Ｉ２＝Ｉλ＝７８０およびＩ１＝Ｉλ＝６７０であり、Ｉ２＝７８０ｎｍおよびＩ１＝６７０ｎｍである。また、グラム陽性染色細菌は、一つの波長、たとえば４８８ｎｍ、または、二つの波長、たとえば４８８ｎｍと５３２ｎｍで照射されてもよい。グラム陽性菌に適切な色素が使用される。
【００６３】
上記した通り、本発明の方法は、インキュベーション後にサンプルの一部を除去すること、異なる濃度の抗菌剤を有するインキュベーションされたサンプルの部分をキュベットに移すこと、適切な蛍光色素をキュベットに添加し、次いでキュベットに含まれるサンプルを光学分析に供してＳＩＲを取得することを含み得る。ただし、いくつかの例においては、色素および測定値は、一つの微生物剤とのインキュベーション後に、異なる濃度の微生物剤を有する希釈サンプルに直接置くことができる。本発明の方法は、培養に基づく検証ではなく、単一の細菌レベルに基づく分析での励起／発光に依存するとともに、うまく区別するために使用する色素は一つしか必要としないことにより、不活性細胞から生細胞を正確かつ迅速に区別することを可能にする。したがって、上記のように、いくつかの例においては、前記方法には、前記サンプルを単膜会合色素で染色し、励起時に入射光でサンプルを照射し、各細菌細胞について（ｉ）波長λ１での放射光の強度Ｉ１、および、（ｉｉ）波長λ２の放射光の強度Ｉ２を測定し、Ｉ２／Ｉ１の比率を計算する工程が含まれ得る。一実施形態では、これは単一の細胞で行われてもよく、別の実施形態では、この同じプロセスは複数の細胞で実施されてもよい。さらなるそのような実施形態では、バルク強度を測定して、前記サンプルが生菌または不活性菌を含むかどうかを判定できる。上記のように、光学分析は、インキュベーションに使用される前記元の試験管とは別の試験管で行うことができる。また、励起波長は、グラム陰性菌の検体については４８８ｎｍ、グラム陽性菌については４８８または５３２ｎｍが好ましいが、他の励起波長を使用することもできる。
【００６４】
本発明の方法を実施するためのシステムは、好ましくは、膜会合色素を励起し、フローサイトメーター、蛍光顕微鏡、もしくは、これらに限定されないが所定の波長λ１およびλ２で発光強度を測定できる装置であるか、または蛍光分析が可能な他の機器である。
【００６５】
発光スペクトルプロファイルを、スペクトルアナライザーまたは発光フィルターで測定する。励起波長は約３６０ｎｍ〜約６００ｎｍであり、Ｉ１およびＩ２が測定される波長は約５２０ｎｍ〜約８００ｎｍである。一実施形態では、色素ＦＭ  １−４３について、励起波長は４８８ｎｍであり、Ｉ１およびＩ２が測定される発光波長はそれぞれ５３０ｎｍおよび６１０ｎｍである。色素ＦＭ  ４−６４について、励起波長は４８８〜５７０ｎｍであり、Ｉ１とＩ２が測定される前記発光波長はそれぞれ６７０ｎｍと７８０ｎｍである。
【００６６】
フローサイトメトリー（ＦＣＭ）は一度に単一の細胞を試験するため、成長曲線などの群全体の効果としてではなく、単一の細菌レベルでの抗生物質効果の検出を可能にする。ＦＣＭの前記二つの発光波長チャネルで、単回の試験で多数の細菌集団を測定することにより、細菌状態の変化の初期段階で抗菌処理が成功したか否かを判断できる。図１は、活性および不活性細菌のフローサイトメトリー蛍光測定を示す蛍光ドットプロットである。当該図からわかるように、二つの波長チャネル（５３０ｎｍと６１０ｎｍ）を使用すると、活性細菌と不活性細菌を区別できる。スペクトル強度比（ＳＩＲ）の計算は、６１０ｎｍチャネルの平均蛍光値を５３０ｎｍチャネルの平均蛍光値で除算することにより行われる。活性細菌のＳＩＲの典型的な値は０．７〜２で、不活性細菌の値はさらに高い（＞２．５）。
【００６７】
いくつかの実施形態では、サンプルは、抗生物質性のまたは抗菌性の処理（本明細書では抗菌剤とも称する）、塩素不活性化、加熱、エタノール、および中圧によるＵＶ照射などの（ただしこれらに限定されない）細菌不活性化処理の成功または失敗について分析することができる。さらなる実施形態において、閾値は、前処理サンプルのI２／Ｉ１を取得することにより決定でき、次いでサンプルのＩ２／Ｉ１と比較して、細菌不活性化処理の有効性を決定できる。
【００６８】
本明細書に記載されるように、「最小阻止濃度」または「ＭＩＣ」は、一晩のインキュベーション後に微生物の目に見える成長を阻害する抗菌性（例えば抗生物質性の）薬物の最低濃度を指す。試験に適切な数の細胞を確保するためには、前記プロセスの前に検体を培養培地中でインキュベーションする必要があると考えられる。
【００６９】
本明細書で提供されるように、ＭＩＣは、ＳＩＲを抗菌剤濃度の関数としてプロットし、それを例えば、
【数４】
2020527039.tif 000006
の形式のステップ関数に近似することにより計算される。
式中、ａ、ｂ、ｃはパラメータであり、ｅｒｆは誤差関数である。ＭＩＣは、パラメータｃの値である。
【００７０】
他の適切な関数、例えば前記ｔａｎｈ関数を使用してもよい。ＭＩＣグラフ（たとえば、図１１を参照）で示すような様々な濃度についてのＳＩＲ、ａ、ｂ、およびｃは、ケースバイケースで決定される。
【００７１】
使用される関数のタイプは、細菌の感受性に依存することに注意することが重要である。細菌が抗菌剤に対して耐性である場合、抗菌剤濃度の関数としてプロットされたＳＩＲは、ｘ軸に対してほぼ平行な直線であり、ステップ関数ではない。これは、抗菌剤を投与するための医療ガイドラインが菌ＭＩＣを上回る場合にも当てはまる。ＭＩＣが試験した抗菌剤濃度値の範囲内である場合にのみ、ステップ関数が得られる。
【００７２】
誤差関数の値は次のとおりである。ｙ（ｘ）は前記ＳＩＲまたは前記ＳＤＬである。ＳＩＲとＳＤＬは、ＳＩＲ強度の場合には、同じ物理量の比率であるため、どちらも無次元の物理値である。パラメータ「ａ」はスケーリング値であり、無次元でもあり、「ｂ」はステップ勾配を決定し、ｌ／（抗生物質濃度）の次元を有し、「ｃ」は誤差関数がゼロに等しいｘ値であり、抗菌剤濃度の次元［μｇｒ／ｍｌ］を有する。
【００７３】
ＭＩＣを決定するための他の適切な方法が使用され得る。たとえば、一つの選択肢は、各ポイント（つまり、各ＳＩＲまたはＳＤＬポイント）について一次導関数を計算することである。ＭＩＣは、一次導関数の最大値に対応する抗菌剤濃度である。別の選択肢は、式：
（Ｍａｘ（ＳＩＲまたはＳＤＬ）＋Ｍｉｎ（ＳＩＲまたはＳＤＬ））／２
を使用し、その値に対応する抗菌剤濃度の値を見つけることである。
【００７４】
上記のように、本発明は、細菌の生存率、最小阻止濃度、および抗生物質治療に対する細菌の感受性もしくは耐性を決定するために膜蛍光染色およびＳＩＲを利用する方法に対する改善に関する。
【００７５】
染色後、前記サンプルは、上記のように、蛍光フィルターを用いて蛍光強度を決定し（たとえば、λ１＝５３０／３０ｎｍおよびλ２＝６１６／１６ｎｍ）、ＳＩＲを決定し分析する。さらに、細菌をゲーティングするための光散乱分析でフローサイトメトリー分析を実施する。フローサイトメトリーは、生菌と非生菌の集団事象を定量的に決定するために使用され、それらの比率（つまり、死／生）を決定できる。
【００７６】
具体的には、フローサイトメトリーのデータ分析は、基本的に、ゲーティングの原理に基づいている。フローサイトメーターによって生成されたデータは、一次元でプロットしてヒストグラムを作成したり、２次元のドットプロットや３次元でプロットしたりすることもできる。これらのプロット上の領域は、「ゲート」と呼ばれる一連のサブセット抽出を作成することにより、蛍光強度および／または光散乱に基づいて連続的に分離できる。ゲートおよび領域は、共通の特性、通常は前方散乱、側方散乱、マーカー発現を有する細胞の集団の周囲に配置され、これらの関心のある集団を調査および定量化する。本発明にいて、フローサイトメトリーゲーティング分析は、生細菌細胞の集団から死菌細胞の集団をゲーティングするために使用できる。次に、両方の集団の平均蛍光強度を各ゲート内で決定できる。その後、このゲーティング分析に基づいて死／生比率を決定できる。前記比率の「死」部分は、ゲーティングされた死菌集団の平均強度を指し、前記比率の「生」部分は、前記ゲーティングされた生菌集団の平均強度を指す。
【００７７】
次に、死／生比（以下、「Ｄ／Ｌ」）を、上記で概説したように、計算されたＳＩＲ指数に乗算し、それによって結果として得られるシグナルを高める。ＳＩＲによるＤ／Ｌ比の乗算は、次のように記載される。
ＳＤＬ＝ＳＩＲ＊（死／生）
【００７８】
上記のように、ＳＩＲを、抗菌剤濃度の関数としてプロットし、ステップ関数に近似して、ＭＩＣを決定する。同様に、ＳＤＬ（スペクトル死−生比（Ｓｐｅｃｔｒａｌ−Ｄｅａｄ−Ｌｉｖｅ  ｒａｔｉｏ））も、抗菌剤濃度の関数としてプロットし、ＭＩＣを決定するためにステップ関数に近似できる。
【００７９】
前記Ｄ／Ｌ比を組み込むと、死集団と生集団の間の差が大きくなるため、誤差関数の決定が容易になる。ステップ関数をＳＩＲのみで使用すると、結果は小さくなる。ＳＤＬを組み込むと、ステップ関数が大きくなり、ＭＩＣの決定が容易になる。さらに、ステップ関数が大きくなるため、抗生物質治療の効果は確認および／または決定しやすくなる。さらに、ステップ関数が大きくなる結果として、細菌サンプルのインキュベーション時間も短縮できる。全体として、ＳＩＲではなくＳＤＬを組み込むと、感受性が改善され、ＭＩＣをより簡単に決定できる。本発明のさらなる利点は、比率を使用することにより、使用される色素の量が分析の結果に影響を及ぼさないことである。
【００８０】
ＳＩＲと同様に、ＳＤＬは細菌が治療に耐性があるかどうかを判断するために使用できる。ＳＤＬおよびＳＩＲは同じ挙動をする。ＳＤＬのＳＩＲよりも優れた利点は、生集団と死集団の間の違いを強調することであり、したがって、ステップ関数はより明確である。細菌が耐性であるかまたは感受性であるかの判定に関しては、ＳＩＲと同じ方法で行われる。ＳＤＬが直線のように挙動し、その値が対照サンプルのＳＤＬよりも大きい場合、細菌は抗菌剤の影響を受けやすくなっている。ＳＤＬが直線のように挙動し、その値が対照サンプル値と同じオーダーの場合、細菌は抗菌剤に対して耐性である。
【００８１】
細菌には、グラム陰性細菌およびグラム陽性細菌、例えば、大腸菌群、腸内細菌、サルモネラ菌、リステリア菌、赤痢菌、シュードモナス菌、ブドウ球菌またはメタノバクテリウムが含まれるが、これらに限定されない。例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、クレブシエラ・ニューモニア（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、エンテロコッカス・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃｌｏａｃａｅ）、アエロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｓ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、およびシトロバクター・フロインディ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）。
【００８２】
抗生物質（または抗菌剤）には、アンピシリン、ゲンタマイシン、キノロン（例、シプロフロキサシン）、アモキシシリン、カルバペネム（例、イミペネム）、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、チカルシリン、バクトリムなどが含まれるが、これらに限定されない。
【００８３】
いくつかの態様では、サンプルをまずろ過して細菌を濃縮形態で単離し、その後、最近の固定濃度に希釈する。他の態様では、サンプルをまず遠心分離によって濃縮し、その後、細菌の固定濃度に希釈する。濃縮細菌の希釈は、液体増殖培地などの適切な培地で起こり得る。
【００８４】
本発明は、以下のＳＩＲおよびＳＤＬの両方に関する実施例により詳細に説明されており、これらは例示のみを目的としている。
【実施例】
【００８５】
実施例１
この実施例では、２〜４時間の抗生物質曝露後のターンアラウンドタイム１５分で、血液培養から直接ＡＳＴおよびＭＩＣを決定する迅速な方法が示されている。
【００８６】
材料と方法：
一般に、本方法には、血液培養遠心分離、２〜４時間の細菌抗菌剤曝露、単一蛍光色素による細菌染色とそれに続くフローサイトメトリー測定、および数学的分析が含まれる。
【００８７】
サンプル調製−マクロ希釈法：
３１の陽性血液培養物をＳｈｅｂａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｒａｍａｔ−Ｇａｎ、Ｉｓｒａｅｌ）から入手し、ゲンタマイシンおよびアンピシリン抗生物質（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）で抗菌剤感受性を試験した。合計６２の陽性血液サンプルと抗生物質の組み合わせを試験した。
【００８８】
ａ）Ｓｈｅｂａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒから陽性の血液サンプルを受け取り、各サンプル２ｍｌを２４×ｇで１５分間遠心分離し、上清をカチオン調整ミューラーヒントンブロス（ＣＡＭＨＢ）で１：１０００に希釈した。
【００８９】
ｂ）抗菌剤ストック溶液は、ＣＬＳＩの推奨に従って調製し、ＣＡＭＨＢで各抗菌剤の組み合わせに推奨される最高濃度から２倍の濃度に希釈した（「クラスＩＩ特別管理ガイダンス文書：抗菌剤感受性試験（ＡＳＴ）システム」、２００９年８月２８日、ＦＤＡ）。
【００９０】
ｃ）各サンプル／抗菌剤の組み合わせについて、第一試験管を除き、１ｍｌのＣＡＭＨＢ培地を添加した試験管セットを準備した。
【００９１】
ｄ）当該セットの各第一試験管に、前記抗菌剤ストック溶液（ｂ）から２ｍｌを分注した。
【００９２】
ｅ）第一試験管から、２倍の段階希釈液を、ＣＬＳＩによる最低必要濃度になるまで溶液１ｍｌを次の試験管に移すことにより調製した。各セットの試験管の最後の試験管から１ｍｌを廃棄した。
【００９３】
ｆ）当該セットの各試験管に、１ｍｌの細菌サンプル溶液（ａ）を添加した。
【００９４】
ｇ）段階希釈セットごとに、二つの対照を加えた。陰性対照としては、２ｍｌのＣＡＭＨＢを含む試験管。陽性対照としては、細菌サンプル溶液の入った抗菌剤を含まない試験管（ａ）。
【００９５】
ｈ）すべての試験管を３７℃でインキュベーションした。
【００９６】
ｉ）インキュベーション開始から２〜４時間、各試験管から２００μＬを新しい試験管に移し、２μｌのシナプトグリーン（Ｓｙｎａｐｔｏｇｒｅｅｎ）またはＦＭ  １−４３（それぞれ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で染色し、フローサイトメーターで測定した。当該サンプルの残りをさらに１６〜２０時間インキュベーションし、成長について視覚的に評価した。
【００９７】
データの解釈：
特定の抗菌剤曝露の影響を定量化するために、スペクトル強度比（ＳＩＲ）を次のように定義する。
【数５】
2020527039.tif 000007
式中、（Ｉ）は、各波長での散乱プロットの平均値である。低いスペクトル強度比（ＳＩＲ）値は、活性細菌集団に対応し、高い値は、より大きな不活性細菌集団を示す。単一の色素およびスペクトル強度比（ＳＩＲ）を使用することの主な利点は、色素濃度および光学効率への結果依存性の排除である。
【００９８】
ＭＩＣは、抗菌剤濃度の関数としてスペクトル強度比（ＳＩＲ）をプロットし、それを、
【数６】
2020527039.tif 000008
の形式のステップ関数に近似することにより算出する。
式中、ａ、ｂ、およびｃはパラメータであり、ｅｒｆは誤差関数である。パラメータは、測定されたＳＩＲをステップ関数に近似するために使用され、ａはスケーリングパラメータであり、ｂはステップ勾配を決定し、ｃはＭＩＣ値、または、その関数である。ＳＩＲ値は、最適な近似によりｅｒｆパラメータを決定するために使用される。
【００９９】
結果：
６２のサンプル（３１の陽性血液培養物と二つの抗生物質の組み合わせ）を三連で分析した。各サンプルは、フローサイトメーターによって測定し、ＭＩＣは、スペクトル強度比（ＳＩＲ）計算とステップ関数推定を使用して算出した。サンプル内で特定された細菌は、大腸菌（１５サンプル）、Ｋ．ニューモニア（６サンプル）、Ａ．バウマニ（Ａ．ｂａｕｍｍａｎｉｉ）（４サンプル）、Ｐ．ミラビリス（２サンプル）、Ｅ．クロアカ（２サンプル）、アエロモナス種（１サンプル）、およびＫ．オキシトカ（１サンプル）であった。
【０１００】
図３は、ゲンタマイシンで処理したＫ．ニューモニアの蛍光散乱プロット（典型的なフローサイトメトリー測定）を示す。当該図からわかるように、抗生物質の濃度がＭＩＣを下回っている限り、細菌集団の過半数は活性である（当該散乱プロットで活性として示されている領域）。抗生物質濃度がＭＩＣに達すると、不活性細菌集団が大幅に増加する（当該散乱プロットで不活性として示される領域）。不活性細菌集団の増加は、図４に見られるようにスペクトル強度比（ＳＩＲ）を増加させる。抗生物質濃度の関数としてのスペクトル強度比（ＳＩＲ）はステップ関数に近似され（図４の実線）、ＭＩＣは１μｇ／ｍｌであると判定される。
【０１０１】
Ｋ．ニューモニアとアンピシリンでも同様の結果（図５および図６）が得られた。今回、ＭＩＣは４μｇ／ｍｌであることが判明した。
【０１０２】
アンピシリン耐性であることがわかった大腸菌、株の例は、図７および図８に示されている。図７からわかるように、前記フローサイトメトリーの蛍光散乱プロットは、抗生物質の濃度が高い場合でも実質的に同じままである。これは、スペクトル強度比（ＳＩＲ）（図８）に反映されており、この場合、勾配は負であり、かつ小さい。
【０１０３】
以下の表は、この研究における方法の性能をまとめたものである。９８．４％（６１／６２）の基本的な一致（ＭＩＣの結果は、参照方法から抗生物質希釈の±１以内）と１００％のカテゴリーの一致である（「クラスＩＩ特別管理ガイダンス文書：抗菌剤感受性試験（ＡＳＴ）システム」、２００９年８月２８日、ＦＤＡ）。
【０１０４】
表１および２は、参照方法としてマクロ希釈を使用した、陽性血液サンプル実験の結果を示している。表１からわかるように、本質的一致は９８．４％であり、分類上一致は１００％である。「クラスＩＩ特別管理ガイダンス文書：抗菌剤感受性試験（ＡＳＴ）システム」、２００９年８月２８日、ＦＤＡで定義されているような誤差はない。
【０１０５】
表２は、基準方法と同じＭＩＣ値であるサンプルの数、当該基準方法のＭＩＣ値から逸脱した数、および希釈の数を示すことにより、当該方法の精度を示す。表２からわかるように、結果の大部分はＭＩＣ値の＋／−１以内であり、これはＦＤＡが許容できる結果である。
【０１０６】
【表１】
2020527039.tif 000009
【０１０７】
【表２】
2020527039.tif 000010
【０１０８】
この研究は、単一の色素染色とフローサイトメトリー測定を使用して、陽性血液サンプルの抗生物質感受性試験を実施できることを示している。スペクトル強度比（ＳＩＲ）パラメータを定義し、抗生物質濃度の関数としてプロットすることにより、細菌ＭＩＣと、陽性の血液サンプルから直接得た特定の抗生物質に対して感受性、中間、または、耐性であるかどうかを判断できる。スペクトル強度比（ＳＩＲ）法は、２〜４時間の抗生物質曝露後１５分以内に行われる。
【０１０９】
実施例２
この実施例は、臨床単離株からのＡＳＴおよびＭＩＣの迅速な測定方法である。
【０１１０】
材料と方法：
本発明者らの方法には、２〜４時間の細菌の抗菌剤処理、単一の蛍光色素による細菌染色、それに続くフローサイトメトリー測定、および数学的分析が含まれる。以下の段落で当該方法について詳細に説明する。
【０１１１】
サンプル調製−マクロ希釈法：
ＪＭＩ  Ｌａｂｓ（ＩＡ、米国）から購入した大腸菌、Ｋ．ニューモニア、Ｅ．クロアカ、Ｐ．ミラビリス、および、Ｃ，フロインディの３０の臨床単離株を、ゲンタマイシン、アンピシリン、および、シプロフロキサシン抗生物質（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）について試験した。合計９０の単離株と抗生物質の組み合わせを試験した。
【０１１２】
ａ）すべての菌株を５％ヒツジ血液寒天（Ｈｙｌａｂｓ、イスラエル）上で培養し、一晩インキュベーションした後、コロニーを回収し、リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中に懸濁させた。次に、各細菌溶液を０．５ＭｃＦａｒｌａｎｄ標準（〜１．５×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）に調整した。
【０１１３】
ｂ）調整した細菌懸濁液を、カチオン調整ミューラーヒントンブロス（ＣＡＭＨＢ、Ｈｙｌａｂｓ、イスラエル）で１：１００に希釈して〜１×１０６ＣＦＵ／ｍｌの濃度にした。
【０１１４】
ｃ）抗菌剤ストック溶液は、各細菌／抗菌剤の組み合わせの最高濃度から２倍高い濃度で始めて、ＣＬＳＩの推奨に従ってＣＡＭＨＢで調製した（“Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｔｅｓｔｉｎｇ”，  Ｍ１００−Ｓ１７、Ｖ．２７、Ｎｏ．１、ＣＬＳＩ）。
【０１１５】
ｄ）各細菌／抗菌剤の組み合わせについて、第一試験管を除き、１ｍｌのＣＡＭＨＢ培地を添加した試験管のセットを準備した。
【０１１６】
ｅ）前記セットの各第一試験管に、抗菌剤ストック溶液（ｃ）から２ｍｌを分注した。
【０１１７】
ｆ）前記第一試験管から、２倍希釈の段階希釈液を、各細菌／抗菌剤の組み合わせについてＣＬＳＩによって必要とされる最低濃度まで１ｍｌの溶液を次の試験管に移すことにより調製した。試験管の各セットの最後の試験管から１ｍｌを廃棄した。
【０１１８】
ｇ）段階希釈セットごとに、二つの対照を加えた。陰性対照としては、２ｍｌのＣＡＭＨＢを含む試験管。陽性対照としては、抗菌剤を含まない細菌接種物を含む試験管。
【０１１９】
ｈ）当該セットの各試験管に、１ｍｌの細菌溶液（ｂ）を添加し、最終接種物濃度が約５×１０５ＣＦＵ／ｍＬになるようにした。
【０１２０】
ｉ）すべての試験管を３７℃でインキュベーションした。
【０１２１】
ｊ）インキュベーション開始から２〜４時間後に、各試験管から２００μｌを新しい試験管に移し、２μｌのシナプトグリーン（Ｓｙｎａｐｔｏｇｒｅｅｎ）またはＦＭ  １−４３（それぞれ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で染色し、フローサイトメーターで測定した。当該サンプルの残りをさらに１６〜２０時間インキュベーションし、成長について視覚的に評価した。
【０１２２】
データの解釈：
特定の抗菌剤処理の影響を定量化するために、前記スペクトル強度比（ＳＩＲ）を次のように定義する。
【数７】
2020527039.tif 000011
式中、（Ｉ）は、各波長での散乱プロットの平均値である。
【０１２３】
低いスペクトル強度比（ＳＩＲ）値は活性な細菌集団に対応し、高い値はより大きな不活細菌集団を示す。単一の色素およびスペクトル強度比（ＳＩＲ）を使用することの主な利点は、色素濃度と光学効率への結果依存性が排除されることである。
【０１２４】
ＭＩＣは、抗菌剤濃度の関数としてスペクトル強度比（ＳＩＲ）をプロットし、それを、
【数８】
2020527039.tif 000012
の形式のステップ関数に近似することにより算出する。
式中、ａ、ｂ、およびｃはパラメータであり、ｅｒｆは誤差関数である。当該パラメータは、測定されたＳＩＲをステップ関数に近似するために使用され、ａはスケーリングパラメータであり、ｂは前記ステップ勾配を決定し、ｃはＭＩＣ値である。ＳＩＲ値は、最適な近似によりｅｒｆパラメータを決定するために使用される。
【０１２５】
結果：
９０のサンプル（３０株と３種類の抗生物質との組み合わせ）を三連で分析した。各サンプルは、フローサイトメーターによって測定し、ＭＩＣは、スペクトル強度比（ＳＩＲ）計算とステップ関数推定を使用して算出した。
【０１２６】
図９は、ゲンタマイシンで処理した大腸菌の蛍光散乱プロット（典型的なフローサイトメトリー測定）を示す。当該図からわかるように、抗生物質濃度がＭＩＣを下回っている限り、細菌集団の過半数が活性である（当該散乱プロットと図１０で活性として表示されている領域）。抗生物質濃度がＭＩＣに達すると、不活性細菌集団が大幅に増加する（当該散乱プロットと図１０で不活性として表示される領域）。不活性細菌集団の増加は、図１１からわかるように、前記スペクトル強度比（ＳＩＲ）を増加させる。抗生物質濃度の関数としてのスペクトル強度比（ＳＩＲ）は、ステップ関数（図１１の実線）に近似され、ＭＩＣは２μｇ／ｍｌと決定される。
【０１２７】
図１２および図１３は、ゲンタマイシンに対して耐性である耐性株、Ｃ．フロインディの例である。図１２からわかるように、フローサイトメトリー蛍光散乱プロットは、抗生物質の濃度が高い場合でも実質的に同じままである。これは、スペクトル強度比（ＳＩＲ）（図１３）に即座に反映され、値はほぼ一定のままである。
【０１２８】
以下の表は、本方法の性能をまとめたものである。スペクトル強度比（ＳＩＲ）法は、９７．８％（８８／９０）の本質的一致（ＭＩＣ結果は参照法から±１抗生物質希釈以内）と９２．２％の分類上一致を有する（「クラスＩＩ特別管理ガイダンス文書：抗菌剤感受性試験（ＡＳＴ）システム」、２００９年８月２８日、ＦＤＡ）。唯一の誤差は軽微な誤差であった（「クラスＩＩ特別管理ガイダンス文書：抗菌剤感受性試験（ＡＳＴ）システム」、２００９年８月２８日、ＦＤＡ）。
【０１２９】
表３および４は、参照法としてマクロ希釈を使用した陽性血液サンプル実験の結果を示す。表３からわかるように、本質的一致は９８．４％であり、分類上一致は１００％である。「クラスＩＩ特別管理ガイダンス文書：抗菌剤感受性試験（ＡＳＴ）システム」、２００９年８月２８日、ＦＤＡで定義されているような誤差はない。
【０１３０】
表４は、参照法と同じＭＩＣ値であるサンプルの数、参照法のＭＩＣ値から逸脱した数、および希釈の数を示すことにより、本方法の精度を示す。表２からわかるように、結果の大部分はＭＩＣ値の＋／−１以内であり、これはＦＤＡにより許容される。
【０１３１】
【表３】
2020527039.tif 000013
【０１３２】
【表４】
2020527039.tif 000014
【０１３３】
この研究は、単一の色素染色とフローサイトメトリー測定を使用して抗菌剤感受性試験を実施できることを示す。スペクトル強度比（ＳＩＲ）パラメータを定義し、それを抗生物質濃度の関数としてプロットすることにより、ＭＩＣと、特定の抗生物質に対して感受性であるか、中間であるか、または耐性であるかを判定できる。スペクトル強度比（ＳＩＲ）法は、抗生物質治療の２〜４時間後に、１５分以内に行われる。この例には血液培養が含まれていたが、尿や臨床単離株に見られるような他の細菌の測定にも同様に使用できる。
【０１３４】
実施例３
この実施例では、大腸菌細菌サンプルを、０から３２μｍｒ／ｍｌの段階希釈のゲンタマイシンとともに１２０分間インキュベーションした。インキュベーション後、サンプルを色素ＦＭ  １−４３で染色し、細菌をゲーティングするための光散乱分析のフローサイトメトリー分析と蛍光フィルター：λ１＝５３０／３０、λ２＝６１６／１６ｎｍを使用して直ちに測定して、ＳＩＲを分析した。さらに、死菌と生菌のゲーティングを判定した。
【０１３５】
図１４Ａでは、抗菌剤なしで１２０分間インキュベーションした後、生きている大腸菌の代表的な蛍光ドットプロットを観察できる。生菌を提示する一つの大きな集団がある、９８．２％（「生」と表示）。図１４Ｂでは、細菌をＭＩＣ以下（１μｇ／ｍｌ）のゲンタマイシンとともにインキュベーションしたが、依然として主要な集団は黒い点であり、９５．２％で、死集団は４．６％にわずかに増加した（「死」と表示）。図１４Ｃでは、細菌をＭＩＣ超（８μｇ／ｍｌ）のゲンタマイシンとともにインキュベーションしたところ、生集団は８１％に減少し、死集団は１８％に増加した。これは、抗生物質の効率と細菌の一方向の死滅過程に対する明確な証拠である。
【０１３６】
このような即時フローサイトメトリー分析から、ＳＩＲおよびＳＤＬ値を評価する。抗生物質濃度希釈系列全体にわたって同じ分析を実行しながら、濃度系列に対してＳＩＲおよびＳＤＬ値を抽出し、データを表５にまとめる。表５では、ＦＬ１−ＨおよびＦＬ３−Ｈの平均は、細菌ゲート化集団、つまりすべての測定された細菌の個々のポイントの平均である。言い換えれば、Ｆｌ−１およびＦＬ−３は、単にある特定の蛍光フィルターごとの各事象（細菌）の蛍光強度にすぎない。ＦＬ−１またはＦＬ−３を参照することとは、すべての事象の平均（平均）値をドットプロットで算出されることを意味する。ＦＬ−１は５３０（±１５）ｎｍにあり、ＦＬ−３は６１０（±１０）ｎｍにある。ＳＩＲは、ＦＬ−３／ＦＬ−１の比である。死菌の場合、ＦＬ−３は生菌と比較して増加しているため、死菌のＳＩＲは生菌よりも大きくなる。したがって、ＳＩＲを取得するために必要なのは、ドットプロットでの細菌集団のＦＬ−３およびＦＬ−１平均値である。ＳＩＲが劇的に変化しない場合があるため、生菌および死菌ゲーティング分析を使用することにより、死菌の出現が強化される。所定のゲートを使用することにより、死菌および生菌の数をカウントでき、その後、死菌対生菌の比率を算出し、ＳＩＲを乗算してＳＤＬを取得できる。当該ゲートはＦＬ−１とＦＬ−３との組み合わせであり、対照の生のサンプルによって事前に決定されている。ＳＩＲ、ＳＤＬ、およびＤＬ対抗生物質濃度のプロットを図１５に示す（「ＳＩＲ」，［ＳＤＬ］，および「ＤＬ」と標識する）。図１５では、ＳＩＲ、ＳＤＬ、およびＤＬはすべて、系列（カラム）における最大値／データセットに対して正規化され、その後１００に対して正規化される。わかるように、３つの曲線を比較すると、ＳＤＬの関数は、ＭＩＣ値付近でよりシャープで明確であることがわかる。
【０１３７】
データから、ＭＩＣを抗菌剤濃度の関数として以下のタイプの誤差関数（図１６）に近似することにより、ＭＩＣを決定できる。
【０１３８】
誤差関数の式：
【数９】
2020527039.tif 000015
【０１３９】
ＭＩＣは、パラメータｃの値またはその関数である。具体的には、当該ＭＩＣは、「ｃ」の値を取得する。「ｃ」の値は、その値が−１から１の間で正規化されている場合、ステップ関数がゼロに等しい通常のステップ関数のステップの中間である。
【０１４０】
図１７Ａは、測定されたＳＩＲと誤差関数が抗生物質濃度の関数として適合していることを示す。ｃの値は４．６３であり、ＭＩＣは８とみなされる。図１７Ｂは、抗生物質濃度の関数として、測定されたＳＤＬと前記誤差関数が適合することを示す。ｃの値は５．３８であり、ＭＩＣは８とみなされる。なお、「ｃ」の前記値は前記MICを決定することに留意されたい。ただし、この例では、抗菌剤希釈は２のべき乗であるため、「ｃ」の値は２のべき乗の最も近い値に切り上げられる。たとえば、５．３８は８に切り上げられる。微量希釈感受性試験を並行して実施することにより、１２時間のインキュベーション後、同じ８のＭＩＣ測定値も明らかになった。
【０１４１】
【表５】
2020527039.tif 000016
【０１４２】
本発明の一態様は、ＭＩＣの決定の前に特定の細菌を同定する必要がないことである。しかし、細菌の事前分類は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，３０９，８９７号、第８，８０４，１１４号、第８，８０８，６４９号および第８，５１９，３５８号に記載されているＰｏｃａｒｅｄ  Ｐ１０００などの分析器を使用して実施できる。また、血液または尿の初期濃度は、上記した特定の特許に記載されている遠心分離を介して、またはこれらも参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１１／００９３２０７号、２０１２／０１９６２７１、２０１４／０２４６３８９および２０１５／０１５２４６７号に記載されているようなろ過を介して得ることができる。
【０１４３】
実施例および詳細な説明に関して本発明を説明してきたが、当業者は、本発明の主旨の範囲内で変更を行うことができることを理解するであろう。したがって、本発明が、詳細な実施において多くの変形が可能であり、これは、当該技術分野の当業者が本明細書に含まれる説明から導くことができる。
【図１】
2020527039.tif 000018
【図２】
2020527039.tif 000019
【図３】
2020527039.tif 000020
【図４】
2020527039.tif 000021
【図５】
2020527039.tif 000022
【図６】
2020527039.tif 000023
【図７】
2020527039.tif 000024
【図８】
2020527039.tif 000025
【図９】
2020527039.tif 000026
【図１０】
2020527039.tif 000027
【図１１】
2020527039.tif 000028
【図１２】
2020527039.tif 000029
【図１３】
2020527039.tif 000030
【図１４】
2020527039.tif 000031
【図１５】
2020527039.tif 000032
【図１６】
2020527039.tif 000033
【図１７】
2020527039.tif 000034
【国際調査報告】
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