(57)【要約】  本発明は、ＳＬＩＴリガンドに結合し、そのＲＯＢＯ２細胞表面受容体に対する結合を阻止するように設計された、組換えＲｏｕｎｄａｂｏｕｔ受容体２（ＲＯＢＯ２）タンパク質を提供する。これらの組換えＲＯＢＯ２タンパク質の使用方法もまた提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えＲｏｕｎｄａｂｏｕｔ受容体２（ＲＯＢＯ２）タンパク質であって、（ｉ）ＲＯＢＯ２細胞外ドメインの一部、および（ｉｉ）免疫グロブリンドメインを含み、前記ＲＯＢＯ２細胞外ドメインの一部が、ＲＯＢＯ２プレ免疫グロブリン様１（Ｉｇ１）配列、第１の免疫グロブリン様ドメイン（Ｉｇ１）、第１の免疫グロブリン様ドメインと第２の免疫グロブリン様ドメインとの間のドメイン間リンカー（Ｉｇ１−Ｉｇ２ドメイン間リンカー）、第２の免疫グロブリン様ドメイン（Ｉｇ２）、および第２の免疫グロブリン様ドメインと第３の免疫グロブリン様ドメインとの間のドメイン間リンカー（Ｉｇ２−Ｉｇ３ドメイン間リンカー）から本質的になる、組換えＲＯＢＯ２タンパク質。
【請求項２】
前記ＲＯＢＯ２細胞外ドメインの一部が、配列番号１の番号付けによるアミノ酸残基１〜２０３から本質的になる、請求項１に記載の組換えＲＯＢＯ２。
【請求項３】
前記免疫グロブリンドメインが、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のＦｃドメインである、請求項１または２に記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質。
【請求項４】
前記Ｆｃドメインが、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインである、請求項３に記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質。
【請求項５】
前記ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインが、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＧ２３７Ａ置換（Ｅｕ番号付け）を含み、かつＫ４４７（Ｅｕ番号付け）を含まない、請求項４に記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質。
【請求項６】
前記Ｆｃドメインが、配列番号１の番号付けによるアミノ酸残基２１０〜４４０を含む、請求項５に記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質。
【請求項７】
配列番号１の番号付けによる前記アミノ酸残基１〜２０３が、前記免疫グロブリンドメインと隣接している、請求項２に記載の、または請求項２に従属する場合の請求項３から６のいずれか一項に記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質。
【請求項８】
配列番号１の番号付けによる前記アミノ酸残基１〜２０３が、リンカーを介して前記免疫グロブリンドメインに接続されている、請求項２に記載の、または請求項２に従属する場合の請求項３から６のいずれか一項に記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質。
【請求項９】
前記リンカーが、約１〜３０アミノ酸残基を含むペプチジルリンカーである、請求項８に記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質。
【請求項１０】
前記ペプチジルリンカーが、
ａ）グリシンリッチペプチド；
ｂ）グリシンおよびセリンを含むペプチド；
ｃ）配列［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］ｎ（式中、ｎは１、２、３、４、５、または６である）（配列番号２２）を有するペプチド；および
ｄ）配列［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］ｎ（式中、ｎは１、２、３、４、５、または６である）（配列番号２３）を有するペプチド
からなる群から選択される、請求項９に記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質。
【請求項１１】
前記ペプチジルリンカーが、［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］２（配列番号１５）である、請求項１０に記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質。
【請求項１２】
配列番号１のアミノ酸配列を含む、組換えＲｏｕｎｄａｂｏｕｔ受容体２（ＲＯＢＯ２）−Ｆｃタンパク質。
【請求項１３】
配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む、組換えＲｏｕｎｄａｂｏｕｔ受容体２（ＲＯＢＯ２）−Ｆｃタンパク質。
【請求項１４】
ＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２４００８を有するプラスミドのインサートによってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の組換えＲＯＢＯ２−Ｆｃタンパク質。
【請求項１５】
約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約２ｎＭ、約１ｎＭ、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２５０ｐＭ、約２００ｐＭ、約１５０ｐＭ、約１００ｐＭ、約５０ｐＭ、約４０ｐＭ、約３０ｐＭ、約２５ｐＭ、約２０ｐＭ、約１５ｐＭ、約１０ｐＭ、約５ｐＭ、または約１ｐＭ以下のＫＤでＳＬＩＴ２に結合する、請求項１から１４のいずれか一項に記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質。
【請求項１６】
ＳＬＩＴ２に対するＲＯＢＯ１の結合のＫＤ値の、少なくとも約２分の１、約４分の１、約６分の１、約８分の１、約１０分の１、約２０分の１、約４０分の１、約６０分の１、約８０分の１、約１００分の１、約１２０分の１、約１４０分の１、約１６０分の１のＫＤでＳＬＩＴ２に結合する、請求項１から１５のいずれか一項に記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質。
【請求項１７】
ＳＬＩＴ２に対するＲＯＢＯ１−Ｆｃタンパク質の結合のＫＤ値の、少なくとも約２分の１、約４分の１、約６分の１、約８分の１、約１０分の１、約２０分の１、約４０分の１、約６０分の１、約８０分の１、約１００分の１、約１２０分の１、約１４０分の１、約１６０分の１のＫＤでＳＬＩＴ２に結合する、請求項１から１６のいずれか一項に記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質。
【請求項１８】
前記ＫＤが、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００装置を使用していてもよい表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定される、請求項１５から１７のいずれか一項に記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質。
【請求項１９】
前記ＫＤが、ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔ装置を使用していてもよいバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）によって測定される、請求項１５から１７のいずれか一項に記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質。
【請求項２０】
ＳＬＩＴとＲＯＢＯ２との結合を阻害し、かつ／またはＲＯＢＯ２依存的ＳＬＩＴ−Ｎ活性を阻害する、請求項１から１９のいずれか一項に記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質。
【請求項２１】
ＳＬＩＴ２に対するＲＯＢＯ２の結合の阻害に関する均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）アッセイによって測定される、約１５ｎＭ、約１３ｎＭ、約１１ｎＭ、約９ｎＭ、約７ｎＭ、約６ｎＭ、約５ｎＭ、約４ｎＭ、約３ｎＭ、約２ｎＭ、約１ｎＭ以下の半最大阻害濃度（ＩＣ５０）を有する、請求項１から２０のいずれか一項に記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質。
【請求項２２】
神経細胞遊走のＳＬＩＴ２−Ｎ媒介性阻害を測定することによってアセスメントされる、約７５ｎＭ、約６５ｎＭ、約５５ｎＭ、約４５ｎＭ、約３５ｎＭ、約２５ｎＭ、約１５ｎＭ、約５ｎＭ以下の半最大阻害濃度（ＩＣ５０）を有する、請求項１から２０のいずれか一項に記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質。
【請求項２３】
請求項１から２２のいずれか一項に記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項２４】
配列番号２１の核酸配列を含む、請求項２３に記載の単離された核酸分子。
【請求項２５】
請求項２３または２４に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項２６】
請求項２３に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
【請求項２７】
請求項１から２２のいずれか一項に記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質、および薬学的に許容できる担体または添加剤を含む、医薬組成物。
【請求項２８】
腎疾患を処置する方法であって、それを必要としている対象に、治療有効量の請求項１から２２のいずれか一項に記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質を投与するステップを含む、方法。
【請求項２９】
前記腎疾患が、糸球体疾患、巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、または腎症である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
腎疾患を処置するための方法において使用するための、請求項１から２２のいずれか一項に記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質。
【請求項３１】
前記腎疾患が、糸球体疾患、巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、または腎症である、請求項３０に記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質。
【請求項３２】
腎疾患を処置するための医薬の製造における、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質の使用。
【請求項３３】
前記腎疾患が、糸球体疾患、巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、または腎症である、請求項３２に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１７年６月２日出願の米国仮出願第６２／５１４，２４２号；および２０１８年４月２６日出願の同第６２／６６３，０８２号の利益を主張する。
【０００２】
共同研究同意書の当事者
ここで特許請求される発明は、以下に記載されている共同研究契約の当事者によって、または当事者に代わってなされた。共同研究契約は、特許請求された発明がなされた日以前に有効であり、特許請求された発明は、共同研究契約の範囲内で行われた活動の結果としてなされた。共同研究契約の当事者は、ＢＯＳＴＯＮ  ＭＥＤＩＣＡＬ  ＣＥＮＴＥＲ  ＣＯＲＰ．およびＰＦＩＺＥＲ  ＩＮＣ．である。
【０００３】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含有する。２０１８年５月３日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーはＰＣＦＣ−００４３−ＷＯ１＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、サイズは５４，７５４バイトである。
【背景技術】
【０００４】
慢性腎疾患（ＣＫＤ）は世界的な公衆衛生上の問題であり、多くの場合、末期腎不全に至る。ＣＫＤには、米国では人口の推定１３％または約２７００万が、世界中では５億を超える人が罹患している。一般人口において糖尿病および肥満が持続的に流行していることから、ＣＫＤの有病率は増加し続けることが予測される。米国内の約５０万人のＣＫＤ患者（世界中で約７００万）が末期腎疾患（ＥＳＲＤ）まで進行し、生存するために透析または腎移植を必要とする。ＥＳＲＤの罹患率および死亡率は高く、米国では毎年少なくとも４００億ドルの費用が発生している。タンパク尿（すなわち、尿中に過剰の血清タンパク質が存在することであり、一般に、３０ｍｇ／日を超える尿アルブミンレベルと定義される）は、糖尿病に罹患していてもいなくてもＣＫＤ患者において、ＣＫＤの早期バイオマーカー、リスク因子およびサロゲートアウトカムである。ＣＫＤの早期の間にタンパク尿のレベルを低下させる処置は、ＥＳＲＤへの進行を遅らせることができる。しかしながら、タンパク尿を有するＣＫＤ患者のための現在利用可能な腎足細胞特異的な抗タンパク尿処置はない。
【０００５】
足細胞は、一次および二次突起を伸ばして糸球体基底膜の外表面を覆う特殊な上皮細胞である。近傍の足細胞から伸びる、アクチンが豊富な噛み合わせ構造の二次突起（すなわち、足突起）は、タンパク質透過に対する最終的な障壁を形成する半多孔性のスリット膜によって架橋された濾過スリットを作り出す。タンパク尿は、糖尿病性および非糖尿病性腎疾患における足細胞損傷の臨床徴候である。足細胞の分子構成要素における遺伝性の先天的または後天的な異常がタンパク尿につながるということを示す類いの研究発表が増えている。ネフリンおよびポドシンなどの足細胞スリット膜タンパク質の遺伝子変異はタンパク尿性腎疾患の遺伝形式と関連しているが、スリット膜を構成しそれと関連するタンパク質が、単なる構造障壁を上回るものであることが次第に明らかになってきた。よって、実質的証拠により、これらのタンパク質が、アクチン細胞骨格との相互作用によって足細胞足突起構造および機能に影響を及ぼし得る均衡のとれたシグナル伝達ネットワークを形成することが示唆される。
【０００６】
Ｒｏｕｎｄａｂｏｕｔ（ＲＯＢＯ）受容体
Ｒｏｕｎｄａｂｏｕｔ受容体２（ＲＯＢＯ２、Ｒｏｕｎｄａｂｏｕｔガイダンス受容体２またはＲｏｕｎｄａｂｏｕｔホモログ２とも称される）は、スリットガイダンスリガンド（Ｓｌｉｔ  Ｇｕｉｄａｎｃｅ  Ｌｉｇａｎｄ）（ＳＬＩＴ）タンパク質リガンドの受容体である。ＲＯＢＯ２は、腎臓内の腎糸球体足細胞の基底面において発現され、スリットガイダンスリガンド２（ＳＬＩＴ２）は、腎糸球体内に存在する。ＳＬＩＴ２結合時、ＲＯＢＯ２は、腎糸球体の濾過障壁内でネフリンと複合体を形成し、負の制御因子として作用してネフリン誘導性アクチン重合を阻害する。ＲＯＢＯ２の減少は、足細胞におけるアクチン重合を増加させ、ネフリン欠損マウスにおいて認められる異常な足細胞の構造的な表現型を軽減する。ＲＯＢＯ２の減少はまた、マウスにおける足細胞の糸球体基底膜への接着を増加させる。これらのデータは、ＲＯＢＯ２染色体転座を有する患者ではタンパク尿が認められないという観察結果とともに、ＳＬＩＴ２−ＲＯＢＯ２シグナル伝達経路を遮断することにより、ネフリン誘導性アクチン重合が増加してタンパク尿が減少することを示唆する。ＲＯＢＯ２シグナル伝達を遮断することにより、ネフリン誘導性アクチン重合の上方制御によって、タンパク尿疾患における腎糸球体の濾過障壁もまた回復し得る。
【０００７】
ＳＬＩＴ１、ＳＬＩＴ２およびＳＬＩＴ３。ＳＬＩＴは、細胞外マトリックスと関連した分泌タンパク質である。すべてのＳＬＩＴのタンパク質配列は、高度に保存されており、以下の同じ構造を有する：Ｎ末端シグナルペプチド；Ｄ１〜Ｄ４と呼ばれる４つのタンデムロイシンリッチリピートドメイン（ＬＲＲ）；６つの上皮成長因子（ＥＧＦ）様ドメイン；ラミニンＧ様ドメイン；さらに１つの（無脊椎動物）または３つの（脊椎動物）ＥＧＦ様ドメインおよびＣ末端システインノットドメイン。ＳＬＩＴリガンドは切断されて、機能未知の短いＣ末端断片（ＳＬＩＴ−Ｃ産物）および活性でありＲＯＢＯへの結合を媒介する長いＮ末端断片（ＳＬＩＴ−Ｎ産物）を生じることができる。ＳＬＩＴリガンド、ならびに本明細書に記載されている切断産物（例えば、ＳＬＩＴ−Ｎ、ＳＬＩＴ２−Ｄ２）を使用して、ＲＯＢＯ２活性をアセスメントすることができる。
【０００８】
脊椎動物において、以下の４つのＲＯＢＯ受容体：ＲＯＢＯ１／Ｄｕｔｔ１；ＲＯＢＯ２；ＲＯＢＯ３／Ｒｉｇ−１およびＲＯＢＯ４／Ｍａｇｉｃ  Ｒｏｕｎｄａｂｏｕｔが特徴付けられている。ＲＯＢＯ１、ＲＯＢＯ２およびＲＯＢＯ３は、細胞接着分子を連想させる共通の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）構造を共有している。この領域は、５つの免疫グロブリン様（Ｉｇ様）ドメイン（Ｉｇ１、Ｉｇ２、Ｉｇ３、Ｉｇ４およびＩｇ５）、その後に３つのフィブロネクチン３型（ＦＮ３）リピートを含有する（図１Ａ）。加えて、ＲＯＢＯ２は、図１Ａに示されている通りその細胞内ドメイン中に４つの細胞質保存（ＣＣ）配列を有する。
【０００９】
完全長ヒトＲＯＢＯ２前駆体の配列を配列番号２４として示す。２１アミノ酸ＲＯＢＯ２リーダー配列（配列番号１７；配列番号２４に記載の番号付けによる残基１〜２１）は、タンパク質産生の間に切断されて成熟ＲＯＢＯ２を生成する（図１Ａ）。配列番号２４に記載の番号付けによる残基２２〜８５９は細胞外ドメインを形成し、配列番号２４に記載の残基８６０〜８８０は膜貫通ドメインを形成し、配列番号２４に記載の残基８８１〜１３７８は細胞質ドメインを形成する（図１Ａ）。
【００１０】
ＲＯＢＯ２の５つのＩｇ様ドメイン（Ｉｇ１、Ｉｇ２、Ｉｇ３、Ｉｇ４およびＩｇ５）の例示的な配列を表２３に示す。ＲＯＢＯ２プレＩｇ１配列（配列番号８）、Ｉｇ１−Ｉｇ２ドメイン間リンカー（配列番号１０）およびＩｇ２−Ｉｇ３ドメイン間リンカー（配列番号１２）もまた表２３において開示する。
【００１１】
ＳＬＩＴのＤ２  ＬＲＲドメインならびにＲＯＢＯのＩｇ１およびＩｇ２ドメインは進化的に保存されており、結合に関与している。ＲＯＢＯのＩｇ１およびＩｇ２ドメイン共にＳＬＩＴ結合ドメインとも称する。ＲＯＢＯ２の両方の免疫グロブリン様（Ｉｇ様）ドメイン１および２（Ｉｇ１およびＩｇ２）がＳＬＩＴと相互作用するが、第１のＩｇ様ドメイン（Ｉｇ１）がＳＬＩＴの主要結合部位であることが研究により示されている。加えて、以前の研究では、３つのフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮＩＩＩ）リピートを除去することは、第３および第４の免疫グロブリン様ドメイン（Ｉｇ３およびＩｇ４）の除去よりも、ＳＬＩＴへのＲＯＢＯ結合に対してより不利な影響を与えることが示唆されている（例えば、Ｌｉｕら、２００４、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｎｅｕｒｏａｎａｔｏｍｙ  ３９：２５６〜２６１を参照されたい）。
【００１２】
ＲＯＢＯ−ＳＬＩＴ結合時、Ｒｈｏ  ＧＴＰアーゼおよびその制御因子（ＧＡＰおよびＧＥＦ）は、下流のシグナル伝達経路に関与している。ＳＬＩＴの存在下で、ＳＬＩＴ−ＲＯＢＯ  Ｒｈｏ  ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質１（ｓｒＧＡＰ１）は、ＲＯＢＯのＣＣ３ドメインに結合し、ＲｈｏＡおよびＣｄｃ４２を不活性化する。これらのエフェクタータンパク質は、他のアウトカムのなかでも、反発、細胞骨格ダイナミクスおよび細胞極性の調節を媒介することができる。ＳＬＩＴの存在下で、Ｖｉｌｓｅ／ＣｒｏｓｓＧＡＰもまたＲＯＢＯのＣＣ２ドメインに結合し、Ｒａｃ１およびＣｄｃ４２を阻害することができる。Ｒａｃ１はまた、アダプタータンパク質Ｄｒｅａｄｌｏｃｋｓ（Ｄｏｃｋ）を介してＲＯＢＯのＣＣ２−３ドメインに結合するＧＥＦタンパク質Ｓｏｎ  ｏｆ  ｓｅｖｅｎｌｅｓｓ（Ｓｏｓ）の動員によって活性化される。これにより、Ｒａｃ１の下流の標的およびこれもまたＲＯＢＯのＣＣ２−３ドメインに結合するｐ２１活性化キナーゼ（Ｐａｋ）が活性化される。ＲＯＢＯのこれらの下流のシグナル伝達パートナーは、反発および細胞骨格ダイナミクスを調節する。チロシンキナーゼＡｂｅｌｓｏｎ（Ａｂｌ）もまた、ＲＯＢＯのＣＣ３ドメインに結合し、ＣＣ１ドメインのリン酸化を介してＲＯＢＯシグナル伝達に拮抗し、細胞接着を媒介することができる。Ａｂｌの基質であるＥｎａｂｌｅｄ（Ｅｎａ）もまたＲＯＢＯのＣＣ１およびＣＣ２ドメインに結合する。すべてのこれらの下流ＲＯＢＯ−ＳＬＩＴ分子を使用して、ＲＯＢＯ２活性をアセスメントすること、ならびに本明細書で開示されている新規な組換えＲＯＢＯ２タンパク質の中和作用をアセスメントすることができる。
【００１３】
腎臓において、ＲＯＢＯ２は、アダプタータンパク質Ｎｃｋを介してネフリンと複合体を形成する。アクチン重合を促進するネフリンの役割とは対照的に、ＳＬＩＴ−ＲＯＢＯ２シグナル伝達は、ネフリン誘導性アクチン重合を阻害する。よって、ＲＯＢＯ２細胞内ドメインとＮｃｋとの結合を使用して、ＲＯＢＯ２活性をアセスメントすることができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
多くの糸球体疾患（巣状分節性糸球体硬化症を含む）に罹患している患者には、現在、腎機能を維持するための、またはそれ以外の方法で疾患を処置するための利用可能な治療法がない。さらに、タンパク尿を有するＣＫＤ患者のために現在利用可能な処置はない。したがって、ＲＯＢＯ２−ＳＬＩＴシグナル伝達をモジュレートし、それにより足細胞機能を維持もしくはモジュレートし、タンパク尿を減少させるか、またはそれ以外の方法でＲＯＢＯ２−ＳＬＩＴ結合およびシグナル伝達に関連した、もしくはそれらによって媒介される腎疾患を処置もしくは予防する、治療薬を開発することが必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、ＳＬＩＴリガンドに結合する組換えＲＯＢＯ２タンパク質、ならびにその使用および関連方法を提供する。当業者は、常法通りの実験だけを使用して、本明細書に記載されている本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識するであろうし、または確認することができるであろう。そのような均等物は、以下の実施形態（Ｅ）に包含されることが意図される。
【００１６】
Ｅ１．配列番号１の番号付けによるアミノ酸残基１〜２０３を含み、免疫グロブリン重鎖定常ドメインをさらに含む、組換えＲｏｕｎｄａｂｏｕｔ受容体２（ＲＯＢＯ２）タンパク質。
【００１７】
Ｅ２．配列番号１の番号付けによるアミノ酸残基１〜２０３、および免疫グロブリン重鎖定常ドメインから本質的になる、組換えＲｏｕｎｄａｂｏｕｔ受容体２（ＲＯＢＯ２）タンパク質。
【００１８】
Ｅ３．（ｉ）ＳＬＩＴ結合部分、および（ｉｉ）半減期延長部分を含む、組換えＲｏｕｎｄａｂｏｕｔ受容体２（ＲＯＢＯ２）タンパク質であって、前記ＳＬＩＴ結合部分が、ＲＯＢＯ２細胞外ドメインの一部を含む、組換えＲＯＢＯ２タンパク質。
【００１９】
Ｅ４．前記ＲＯＢＯ２細胞外ドメインの前記一部が、ＲＯＢＯ２の初めの２つの免疫グロブリン様（Ｉｇ１およびＩｇ２）ドメインおよび配列番号１２の配列からなるＣ末端配列を含む、Ｅ３に記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質。
【００２０】
Ｅ５．前記ＲＯＢＯ２細胞外ドメインの前記一部が、ＲＯＢＯ２プレ免疫グロブリン様１（Ｉｇ１）配列（ＳＲＬＲＱＥＤＦＰ（配列番号８）、第１の免疫グロブリン様ドメイン（Ｉｇ１）、第１の免疫グロブリン様ドメインと第２の免疫グロブリン様ドメインとの間のドメイン間リンカー（Ｉｇ１−Ｉｇ２ドメイン間リンカー；ＶＡＬＬＲ（配列番号１０））、第２の免疫グロブリン様ドメイン（Ｉｇ２）、および第２の免疫グロブリン様ドメインと第３の免疫グロブリン様ドメインとの間のドメイン間リンカー（Ｉｇ２−Ｉｇ３ドメイン間リンカー；ＶＦＥＲ（配列番号１２））から本質的になる、Ｅ３に記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質。
【００２１】
Ｅ６．前記ＲＯＢＯ２細胞外ドメインの前記一部が、配列番号１の番号付けによるアミノ酸残基１〜２０３から本質的になる、Ｅ３〜Ｅ５のいずれか１つに記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質。
【００２２】
Ｅ７．前記半減期延長部分が、免疫グロブリンドメインを含む、Ｅ３〜Ｅ６のいずれか１つに記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質。
【００２３】
Ｅ８．前記免疫グロブリンドメインが、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のＦｃドメインである、Ｅ１、Ｅ２またはＥ７のいずれか１つに記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質。
【００２４】
Ｅ９．前記Ｆｃドメインが、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインである、Ｅ８に記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質。
【００２５】
Ｅ１０．前記Ｆｃドメインが、エフェクター機能をなくすように修飾されている、Ｅ９に記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質。
【００２６】
Ｅ１１．前記Ｆｃドメインが、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインであり、前記ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインが、すべてＫａｂａｔに記載のＥｕ番号付けによる、アミノ酸残基番号２３４でのロイシンからアラニンへの置換（Ｌ２３４Ａ）、アミノ酸残基番号２３５でのロイシンからアラニンへの置換（Ｌ２３５Ａ）、およびアミノ酸残基番号２３７でのグリシンからアラニンへの置換（Ｇ２３７Ａ）からなる群から選択される少なくとも１つの変異を含む、Ｅ１０に記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質。
【００２７】
Ｅ１２．前記ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインが、Ｋａｂａｔに記載のＥｕ番号付けによる残基番号４４７においてリシンを含まない、Ｅ９〜Ｅ１１に記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質。
【００２８】
Ｅ１３．前記Ｆｃドメインが、配列番号１の番号付けによるアミノ酸残基２１０〜４４０を含む、Ｅ１１〜Ｅ１２のいずれか１つに記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質。
【００２９】
Ｅ１４．前記Ｆｃドメインが、配列番号１の番号付けによるアミノ酸残基２１０〜４４０からなる、Ｅ１１〜Ｅ１２のいずれか１つに記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質。
【００３０】
Ｅ１５．配列番号１の番号付けによる前記アミノ酸残基１〜２０３が、前記免疫グロブリンドメインと隣接している、Ｅ１、Ｅ２またはＥ７のいずれか１つに記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質。
【００３１】
Ｅ１６．配列番号１の番号付けによる前記アミノ酸残基１〜２０３が、リンカーを介して前記免疫グロブリンドメインに接続されている、Ｅ１、Ｅ２またはＥ７のいずれか１つに記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質。
【００３２】
Ｅ１７．前記リンカーが、約１個から３０個のアミノ酸残基を含むペプチジルリンカーである、Ｅ１６に記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質。
【００３３】
Ｅ１８．前記ペプチジルリンカーが、
ａ）グリシンリッチペプチド；
ｂ）グリシンおよびセリンを含むペプチド；
ｃ）配列（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎは１、２、３、４、５、または６である）（配列番号２２）を有するペプチド；および
ｄ）配列（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎは１、２、３、４、５、または６である）（配列番号２３）を有するペプチド
からなる群から選択される、Ｅ１７に記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質。
【００３４】
Ｅ１９．前記ペプチジルリンカーが、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）２（配列番号１５）である、Ｅ１８に記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質。
【００３５】
Ｅ２０．配列番号１のアミノ酸配列を含む、組換えＲＯＢＯ２−Ｆｃタンパク質。
【００３６】
Ｅ２１．配列番号１のアミノ酸配列からなる、組換えＲＯＢＯ２−Ｆｃタンパク質。
【００３７】
Ｅ２２．配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む、組換えＲＯＢＯ２−Ｆｃタンパク質。
【００３８】
Ｅ２３．ＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２４００８を有するプラスミドのインサートによってコードされるアミノ酸配列を含む、Ｅ１〜Ｅ２２のいずれか１つに記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質。
【００３９】
Ｅ２４．ＲＯＢＯ２の前記Ｉｇ１が、それぞれ配列番号１に従って番号付けされる以下の変異：Ｓ１７ＴおよびＲ７３Ｙのうちの少なくとも１つを含む、Ｅ４またはＥ５のいずれか１つに記載の組換えＲＯＢＯ２−Ｆｃタンパク質。
【００４０】
Ｅ２５．配列番号１９のアミノ酸配列を含む、組換えＲＯＢＯ２−Ｆｃタンパク質。
【００４１】
Ｅ２６．配列番号１９の番号付けによるアミノ酸残基番号４４１の位置にあるＣ末端リシンを含まない、Ｅ２５に記載の組換えＲＯＢＯ２−Ｆｃタンパク質。
【００４２】
Ｅ２７．前記ＲＯＢＯ２が、ヒトＲＯＢＯ２である、Ｅ１〜Ｅ２６のいずれか１つに記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質。
【００４３】
Ｅ２８．約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約２ｎＭ、約１ｎＭ、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２５０ｐＭ、約２００ｐＭ、約１５０ｐＭ、約１００ｐＭ、約５０ｐＭ、約４０ｐＭ、約３０ｐＭ、約２５ｐＭ、約２０ｐＭ、約１５ｐＭ、約１０ｐＭ、約５ｐＭ、または約１ｐＭ以下の結合親和性（ＫＤ）でＳＬＩＴ２に結合する、Ｅ１〜Ｅ２７のいずれか１つに記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質。
【００４４】
Ｅ２９．ＳＬＩＴ２に対するＲＯＢＯ１の結合のＫＤ値の、少なくとも約２分の１、約４分の１、約６分の１、約８分の１、約１０分の１、約２０分の１、約４０分の１、約６０分の１、約８０分の１、約１００分の１、約１２０分の１、約１４０分の１、約１６０分の１のＫＤでＳＬＩＴ２に結合する、Ｅ１〜Ｅ２７のいずれか１つに記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質。
【００４５】
Ｅ３０．ＳＬＩＴ２に対するＲＯＢＯ１−Ｆｃタンパク質の結合のＫＤ値の、少なくとも約２分の１、約４分の１、約６分の１、約８分の１、約１０分の１、約２０分の１、約４０分の１、約６０分の１、約８０分の１、約１００分の１、約１２０分の１、約１４０分の１、約１６０分の１のＫＤ値でＳＬＩＴ２に結合する、Ｅ１〜Ｅ２９のいずれか１つに記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質。
【００４６】
Ｅ３１．前記ＫＤが、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定される、Ｅ２８〜Ｅ３０のいずれか１つに記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質。
【００４７】
Ｅ３２．前記ＫＤが、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００装置を使用して測定される、Ｅ３１に記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質。
【００４８】
Ｅ３３．前記ＫＤが、バイオレイヤー干渉法（ｂｉｏ−ｌａｙｅｒ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ）（ＢＬＩ）によって測定される、Ｅ２８〜Ｅ３０のいずれか１つに記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質。
【００４９】
Ｅ３４．前記ＫＤが、ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔ装置を使用して測定される、Ｅ３３に記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質。
【００５０】
Ｅ３５．ＳＬＩＴリガンドとＲＯＢＯ２との結合を阻害する、Ｅ１〜Ｅ３４のいずれか１つに記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質。
【００５１】
Ｅ３６．ＲＯＢＯ２依存的ＳＬＩＴｘ−Ｎ活性を阻害する、Ｅ１〜Ｅ３４のいずれか１つに記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質。
【００５２】
Ｅ３７．ＳＬＩＴリガンドとＲＯＢＯ２との結合を阻害し、かつＲＯＢＯ２依存的ＳＬＩＴ−Ｎ活性を阻害する、Ｅ１〜Ｅ３６のいずれか１つに記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質。
【００５３】
Ｅ３８．前記ＲＯＢＯ２依存的ＳＬＩＴｘ−Ｎ活性が、アクチン重合、足細胞接着、および神経細胞遊走の阻害からなる群から選択される、Ｅ１〜Ｅ３７のいずれか１つに記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質。
【００５４】
Ｅ３９．約１５ｎＭ、約１３ｎＭ、約１１ｎＭ、約９ｎＭ、約７ｎＭ、約６ｎＭ、約５ｎＭ、約４ｎＭ、約３ｎＭ、約２ｎＭ、約１ｎＭ以下の半最大阻害濃度（ＩＣ５０）を有する、Ｅ１〜Ｅ３８のいずれか１つに記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質。
【００５５】
Ｅ４０．前記ＩＣ５０が、ＳＬＩＴ２に対するＲＯＢＯ２結合の阻害に関する均一時間分解蛍光（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）（ＨＴＲＦ）アッセイによって測定される、Ｅ３９に記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質。
【００５６】
Ｅ４１．約７５ｎＭ、約６５ｎＭ、約５５ｎＭ、約４５ｎＭ、約３５ｎＭ、約２５ｎＭ、約１５ｎＭ、約５ｎＭ以下の半最大ＩＣ５０を有する、Ｅ１〜Ｅ４０のいずれか１つに記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質。
【００５７】
Ｅ４２．前記ＩＣ５０が、神経細胞遊走のＳＬＩＴ２−Ｎ媒介性阻害を測定することによってアセスメントされる、Ｅ４１に記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質。
【００５８】
Ｅ４３．前記ＳＬＩＴ２が、ヒトＳＬＩＴ２である、Ｅ２８〜Ｅ４２のいずれか１つに記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質。
【００５９】
Ｅ４４．２つの前記組換えＲＯＢＯ２タンパク質が、会合してホモ二量体を形成する、Ｅ１〜Ｅ４３のいずれか１つに記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質。
【００６０】
Ｅ４５．Ｅ１〜Ｅ４４のいずれか１つに記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質をコードする、単離された核酸分子。
【００６１】
Ｅ４６．配列番号２１の核酸配列を含む、Ｅ４５に記載の単離された核酸分子。
【００６２】
Ｅ４７．配列番号２１の核酸配列からなる、Ｅ４５に記載の単離された核酸分子。
【００６３】
Ｅ４８．ＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２４００８を有するプラスミドのインサートの核酸配列を含む、単離された核酸。
【００６４】
Ｅ４９．配列番号２１の配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、組換えＲＯＢＯ２タンパク質。
【００６５】
Ｅ５０．配列番号２１の配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、または９９％同一な配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、組換えＲＯＢＯ２タンパク質。
【００６６】
Ｅ５１．高度にストリンジェントな条件下で配列番号２１の配列にハイブリダイズすることができる配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、組換えＲＯＢＯ２タンパク質。
【００６７】
Ｅ５２．Ｅ４５〜Ｅ４８のいずれか１つに記載の核酸分子を含む、ベクター。
【００６８】
Ｅ５３．Ｅ４５〜Ｅ４８のいずれか１つに記載の核酸分子を含む、宿主細胞。
【００６９】
Ｅ５４．Ｅ５２に記載のベクターを含む宿主細胞。
【００７０】
Ｅ５５．哺乳動物細胞である、Ｅ５３またはＥ５４に記載の宿主細胞。
【００７１】
Ｅ５６．ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、またはＳｐ２．０細胞である、Ｅ５３またはＥ５４に記載の宿主細胞。
【００７２】
Ｅ５７．組換えＲＯＢＯ２タンパク質の製造方法であって、前記組換えＲＯＢＯ２タンパク質が発現される条件下で、Ｅ５３〜Ｅ５６のいずれか１つに記載の宿主細胞を培養するステップを含む、方法。
【００７３】
Ｅ５８．前記組換えＲＯＢＯ２タンパク質を単離するステップをさらに含む、Ｅ５７に記載の方法。
【００７４】
Ｅ５９．Ｅ１〜Ｅ４４のいずれか１つに記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質、および薬学的に許容できる担体または賦形剤を含む、医薬組成物。
【００７５】
Ｅ６０．ＲＯＢＯ２の生物学的活性を低下させる方法であって、それを必要としている対象に、治療有効量のＥ１〜Ｅ４４のいずれか１つに記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質、またはＥ５９に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
【００７６】
Ｅ６１．ＲＯＢＯ２の前記生物学的活性が、少なくとも１つのＳＬＩＴリガンドに対する結合、アクチン重合、足細胞接着、神経細胞遊走のＳＬＩＴ２−Ｎに媒介される阻害の阻害、ＲＯＢＯ２のｓｒＧＡＰ１との結合、およびＲＯＢＯ２のＮｃｋとの結合からなる群から選択される、Ｅ６０に記載の方法。
【００７７】
Ｅ６２．腎疾患を処置する方法であって、それを必要としている対象に、治療有効量のＥ１〜Ｅ４４のいずれか１つに記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質、またはＥ５９に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
【００７８】
Ｅ６３．足細胞機能を保持する方法であって、前記足細胞を、Ｅ１〜Ｅ４４のいずれか１つに記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質、またはＥ５９に記載の医薬組成物と接触させるステップを含む、方法。
【００７９】
Ｅ６４．足細胞機能をモジュレートする方法であって、前記足細胞を、Ｅ１〜Ｅ４４のいずれか１つに記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質、またはＥ５９に記載の医薬組成物と接触させるステップを含む、方法。
【００８０】
Ｅ６５．糸球体疾患を処置する方法であって、それを必要としている対象に、治療有効量のＥ１〜Ｅ４４のいずれか１つに記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質、またはＥ５９に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
【００８１】
Ｅ６６．巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）を処置する方法であって、それを必要としている対象に、治療有効量のＥ１〜Ｅ４４のいずれか１つに記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質、またはＥ５９に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
【００８２】
Ｅ６７．腎症を処置する方法であって、それを必要としている対象に、治療有効量のＥ１〜Ｅ４４のいずれか１つに記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質、またはＥ５９に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
【００８３】
Ｅ６８．前記腎症が、ＩｇＡ腎症である、Ｅ６７に記載の方法。
【００８４】
Ｅ６９．前記対象がヒトである、Ｅ６０〜Ｅ６８のいずれか１つに記載の方法。
【００８５】
Ｅ７０．前記組換えＲＯＢＯ２タンパク質、または医薬組成物が、静脈内投与される、Ｅ６０〜Ｅ６９のいずれか１つに記載の方法。
【００８６】
Ｅ７１．前記組換えＲＯＢＯ２タンパク質、または医薬組成物が、皮下投与される、Ｅ６０〜Ｅ６９のいずれか１つに記載の方法。
【００８７】
Ｅ７２．組換えＲＯＢＯ２タンパク質、または医薬組成物が、約１週間に２回、１週間に１回、２週間ごとに１回、３週間ごとに１回、４週間ごとに１回、５週間ごとに１回、６週間ごとに１回、７週間ごとに１回、８週間ごとに１回、９週間ごとに１回、１０週間ごとに１回、１カ月に２回、１カ月に１回、２カ月ごとに１回、３カ月ごとに１回、または４カ月ごとに１回投与される、Ｅ６０〜Ｅ７１のいずれか１つに記載の方法。
【００８８】
Ｅ７３．医薬として使用するための、Ｅ１〜Ｅ４４のいずれか１つに記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質、またはＥ５９に記載の医薬組成物。
【００８９】
Ｅ７４．細胞においてＲＯＢＯ２の活性を低下させるのに使用するための、Ｅ１〜Ｅ４４のいずれか１つに記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質、またはＥ５９に記載の医薬組成物。
【００９０】
Ｅ７５．対象においてＲＯＢＯ２の活性を低下させるのに使用するための、Ｅ１〜Ｅ４４のいずれか１つに記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質、またはＥ５９に記載の医薬組成物。
【００９１】
Ｅ７６．対象において足細胞機能を維持するのに使用するための、Ｅ１〜Ｅ４４のいずれか１つに記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質、またはＥ５９に記載の医薬組成物。
【００９２】
Ｅ７７．対象において足細胞機能をモジュレートするのに使用するための、Ｅ１〜Ｅ４４のいずれか１つに記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質、またはＥ５９に記載の医薬組成物。
【００９３】
Ｅ７８．対象において糸球体疾患を処置するのに使用するための、Ｅ１〜Ｅ４４のいずれか１つに記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質、またはＥ５９に記載の医薬組成物。
【００９４】
Ｅ７９．前記糸球体疾患が、ＦＳＧＳである、Ｅ７８に記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質。
【００９５】
Ｅ８０．対象において腎症を処置するのに使用するための、Ｅ１〜Ｅ４４のいずれか１つに記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質、またはＥ５９に記載の医薬組成物。
【００９６】
Ｅ８１．前記腎症が、ＩｇＡ腎症である、Ｅ８０に記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質。
【００９７】
Ｅ８２．細胞においてＲＯＢＯ２の活性を低下させるための医薬の製造における、Ｅ１〜Ｅ４４のいずれか１つに記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質、またはＥ５９に記載の医薬組成物の使用。
【００９８】
Ｅ８３．対象においてＲＯＢＯ２の活性を低下させるための医薬の製造における、Ｅ１〜Ｅ４４のいずれか１つに記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質、またはＥ５９に記載の医薬組成物の使用。
【００９９】
Ｅ８４．対象において足細胞機能を維持するための医薬の製造における、Ｅ１〜Ｅ４４のいずれか１つに記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質、またはＥ５９に記載の医薬組成物の使用。
【０１００】
Ｅ８５．対象において足細胞機能をモジュレートするための医薬の製造における、Ｅ１〜Ｅ４４のいずれか１つに記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質、またはＥ５９に記載の医薬組成物の使用。
【０１０１】
Ｅ８６．対象において糸球体疾患を処置するための医薬の製造における、Ｅ１〜Ｅ４４のいずれか１つに記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質、またはＥ５９に記載の医薬組成物の使用。
【０１０２】
Ｅ８７．対象において腎症を処置するための医薬の製造における、Ｅ１〜Ｅ４４のいずれか１つに記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質、またはＥ５９に記載の医薬組成物の使用。
【０１０３】
Ｅ８８．容器と、Ｅ１〜Ｅ４４のいずれか１つに記載の組換えＲＯＢＯ２タンパク質、またはＥ５９に記載の医薬組成物を含む容器内の組成物と、それを必要とする患者の処置のための、治療有効量の組換えＲＯＢＯ２タンパク質または医薬組成物を投与するという指示を含有する添付文書とを含む、キット。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１−１】図１Ａ：ヒトＲＯＢＯ２のドメインを図式的に表した図である。２１−アミノ酸ＲＯＢＯ２リーダー配列（配列番号１７；配列番号２４に記載の番号付けによる残基１〜２１）が、タンパク質産生の間に切断されて成熟ＲＯＢＯ２を生成する。配列番号２４に記載の番号付けによる残基２２〜８５９は細胞外ドメインを形成し、配列番号２４の番号付けによる残基８６０〜８８０は膜貫通ドメインを形成し、配列番号２４の番号付けによる残基８８１〜１３７８は細胞質ドメインを形成する。ＲＯＢＯ２プレＩｇ１配列（配列番号８）、Ｉｇ１−Ｉｇ２ドメイン間リンカー（配列番号１０）およびＩｇ２−Ｉｇ３ドメイン間リンカー（配列番号１２）もまた示されている。
【図１−２】図１Ｂ：例示的な本明細書に記載の組換えＲＯＢＯ２−Ｆｃ融合体タンパク質を示す図式的に表した図である。ＲＯＢＯ２−Ｆｃ．１．０（Ｉｇ１ドメインだけ、すなわち、配列番号２４の番号付けによるアミノ酸残基３１〜１２７を含有する）、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ．１．１（Ｉｇ１ドメインおよびＩｇ１−Ｉｇ２ドメイン間リンカー、すなわち、配列番号２４の番号付けによるアミノ酸残基３１〜１３２を含有する）、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ．２．０（Ｉｇ１ドメイン、Ｉｇ１−Ｉｇ２ドメイン間リンカー、およびＩｇ２ドメイン、すなわち、配列番号２４の番号付けによるアミノ酸残基３１〜２２０を含有する）、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ．２．１（Ｉｇ１ドメイン、Ｉｇ１−Ｉｇ２ドメイン間リンカー、Ｉｇ２ドメイン、およびＩｇ２−Ｉｇ３ドメイン間リンカー、すなわち、配列番号２４の番号付けによるアミノ酸残基３１〜２２４を含有する）、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ．２．２（プレＩｇ１配列、Ｉｇ１ドメイン、Ｉｇ１−Ｉｇ２ドメイン間リンカー、Ｉｇ２ドメイン、およびＩｇ２−Ｉｇ３ドメイン間リンカー、すなわち、配列番号２４の番号付けによるアミノ酸残基２２〜２２４を含有する）、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ．３．０（Ｉｇ１ドメイン、Ｉｇ１−Ｉｇ２ドメイン間リンカー、Ｉｇ２ドメイン、Ｉｇ２−Ｉｇ３ドメイン間リンカー、Ｉｇ３ドメイン、すなわち、配列番号２４の番号付けによるアミノ酸残基３１〜３０９を含有する）およびＲＯＢＯ２−Ｆｃ．４．０（Ｉｇ１ドメイン、Ｉｇ１−Ｉｇ２ドメイン間リンカー、Ｉｇ２ドメイン、Ｉｇ２−Ｉｇ３ドメイン間リンカー、Ｉｇ３ドメイン、Ｉｇ３−Ｉｇ４ドメイン間リンカーおよびＩｇ４、すなわち、配列番号２４の番号付けによるアミノ酸残基３１〜４０９を含有する）がここに記載されている。
【図２】ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２アミノ酸配列（配列番号１）を示す図である。残基は、Ｎ末端から始めて順に番号を付した。Ｉｇ１およびＩｇ２ドメインをすべて大文字で示し、Ｆｃドメインを小文字で示す。プレＩｇ１配列（配列番号８）およびＩｇ２−Ｉｇ３ドメイン間リンカー（配列番号１２）を太字かつイタリック体で示し、Ｉｇ１−Ｉｇ２ドメイン間リンカー（配列番号１０）をイタリック体で示す。予測される鎖内および鎖間ジスルフィド結合は、線を結んで示している。単一のポリペプチド鎖を、Ｆｃヒンジ領域中のジスルフィド結合とともに示しており、これにより第２のＦｃを含むポリペプチド鎖と二量体化可能である。カノニカルなＮ連結グリコシル化コンセンサス配列部位を丸で囲んでおり（すなわち、ＮＸＳ／Ｔ、ここで、グリカンがアスパラギン残基に連結しており、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸であってよく、３番目のアミノ酸はセリンまたはトレオニンのいずれかである）、Ａ２２８、Ａ２２９、およびＡ２３１に位置するＦｃ−エフェクター機能欠損点変異を太字で示す。６アミノ酸Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー配列は、四角で囲んだ領域中に示す。
【図３】ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．１（配列番号２）はＳＬＩＴ２に結合するが、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ１．１（配列番号４）およびＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．０（配列番号３）は結合しないことを示す図である。Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄを利用して、ＲＯＢＯ２−Ｆｃタンパク質を抗ヒト結晶化断片（ＡＨＦｃ）センサー上に１０μｇ／ｍｌでロードし、１００ｎＭのＳＬＩＴ２とともに７分間インキュベートし、次いで、センサーをバッファー単独に６４０秒間移した。結合の陽性対照としてＲＯＢＯ２−Ｆｃ４．０（配列番号７）を含めた。ＲＯＢＯ２のＩｇ２ドメインの後に配列ＶＦＥＲ（配列番号１２）を付加してＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．１（配列番号２）を作出することは、ＳＬＩＴ２に結合するＲＯＢＯ２−Ｆｃ融合タンパク質を生成するために不可欠であった。
【図４−１】図４Ａ：ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２（配列番号１）が、高い親和性でＳＬＩＴ２に結合することを示す図である。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用してＫＤ値を測定した。ヒト／カニクイザルＳＬＩＴ２−Ｄ２（ＲＯＢＯ２結合ドメイン、１００％同一）に対するＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２のＫＤは０．２９３ｎＭであった。
【図４−２】図４Ｂ：ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２（配列番号１）が、高い親和性でＳＬＩＴ２に結合することを示す図である。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用してＫＤ値を測定した。ヒトＳＬＩＴ２−Ｎ（Ｎ末端断片）に対するＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２のＫＤは０．２７９ｎＭであった。
【図４−３】図４Ｃ：ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２（配列番号１）が、高い親和性でＳＬＩＴ２に結合することを示す図である。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用してＫＤ値を測定した。ラットＳＬＩＴ２−Ｎに対するＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２のＫＤは０．５４３ｎＭであった。
【図５】ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２（配列番号１）が、ヒト胚性腎（ＨＥＫ２９３）細胞において過剰発現されるヒトＳＬＩＴ２−Ｎに対して９ｎＭのＥＣ５０を有する高い親和性で結合することを実証する図である。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７（ＡＦ６４７）で標識したＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２の１２段階の２倍希釈系列を、ＳＬＩＴ２−Ｎを発現しているＨＥＫ２９３細胞または対照ＨＥＫ２９３細胞のいずれかとともにインキュベートした。データは、ＳＬＩＴ２−Ｎ  ＨＥＫ２９３細胞におけるＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２  ＡＦ６４７の幾何平均蛍光強度（Ｇｅｏ  ＭＦＩ）から対照ＨＥＫ２９３細胞におけるＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２  ＡＦ６４７の幾何平均蛍光強度を引いたものとして示した。
【図６】図６Ａ：均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）によってアセスメントした、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２（配列番号１）による、細胞表面ＲＯＢＯ２へのＳＬＩＴ２−Ｎ結合の用量（ｄｏｓｅ）依存的な阻害を示す図である。ＲＯＢＯ−Ｆｃ２．２（黒色の四角）またはアイソタイプ対照抗体（黒色の丸）の１１段階の４倍用量漸増を、ヒトＳＬＩＴ２−ＮヒトＲＯＢＯ２  ＨＴＲＦアッセイに添加した。ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２は、ヒトＳＬＩＴ２−Ｎ：ヒトＲＯＢＯ２（ＩＣ５０は７ｎＭ）結合の強力な中和剤であった。  図６Ｂ：均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）によってアセスメントした、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２（配列番号１）による、細胞表面ＲＯＢＯ２へのＳＬＩＴ２−Ｎ結合の用量依存的な阻害を示す図である。ＲＯＢＯ−Ｆｃ２．２（黒色の四角）またはアイソタイプ対照抗体（黒色の丸）の１１段階の４倍用量漸増を、ラットＳＬＩＴ２−ＮヒトＲＯＢＯ２  ＨＴＲＦアッセイに添加した。ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２は、ラットＳＬＩＴ２−Ｎ：ヒトＲＯＢＯ２（ＩＣ５０は４ｎＭ）結合の強力な中和剤であった。
【図７】ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２による、神経細胞遊走のＳＬＩＴ２−Ｎ媒介性阻害の用量依存的な阻害を示す図である。脳室下帯（ＳＶＺ）神経組織細胞外植片を、１ｎＭのＳＬＩＴ２−Ｎおよびある用量範囲のＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２の存在下で終夜培養した。ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２は、５１ｎＭのＩＣ５０で神経細胞遊走を用量依存的に回復させることができた。
【図８】例示的な予防的用量レジメンを用いたラット受身ヘイマン腎炎モデルにおける、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２の処置によるタンパク尿の阻害を示す図である。示した群のそれぞれにおいて１２匹の動物に、示した用量のＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２または無関係のアイソタイプ対照モノクローナル抗体（対照）を、０日目でのモデルの誘導の前日から開始して３日ごとに皮下に処置した。Ｙ軸は、足細胞損傷を示す、尿中へのタンパク質漏出の指標として尿アルブミンのクレアチニンに対する比（ｍｇ／ｍｇ）を示す。Ｌｅｗｉｓラットに、ラット腎刷子縁（抗Ｆｘ１ａ、基底膜および足細胞）に対して作製されたヒツジ抗血清を注射した。ラットは、ラット足細胞に結合したヒツジ血清に対して免疫反応を起こした。足細胞が損傷し、足突起消失するほど、タンパク尿は増加する。２５ｍｇ／ｋｇでのＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２の最高用量を用いた処置は、対照抗体処置と比較して、反復測定分散分析統計学的解析によって０．００１未満のｐ値で、タンパク尿を最大で４５％減少させた。用量効果もまた、０．００１未満のｐ値で統計学的に有意であった。
【図９】例示的な治療的投与レジメンを用いたラット受身ヘイマン腎炎モデルにおける、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２の処置によるタンパク尿の阻害を示す図である。示した群のそれぞれにおいて１２匹の動物に、示した用量のＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２または無関係の対照モノクロール抗体（対照）を以下の投与レジメンで３日ごとに皮下に処置した：対照抗体を０日目に投与し（丸）、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２を０日目（四角）、６日目（三角形）または９日目（逆三角形）に投与した。Ｙ軸は、足細胞損傷を示す、尿中へのタンパク質漏出の指標として尿アルブミンのクレアチニンに対する比（ｍｇ／ｍｇ）を示す。Ｌｅｗｉｓラットに、ラット腎刷子縁（抗Ｆｘ１ａ、基底膜および足細胞）に対して作製されたヒツジ抗血清を注射した。ラットは、ラット足細胞に結合したヒツジ血清に対して免疫反応を起こした。足細胞が損傷し、突起消失するほど、タンパク尿は増加した。０、６および９日目に投与されたＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２による処置は、対照抗体処置と比較して、各ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２処置群についての反復測定分散分析統計学的解析によって０．００１未満のｐ値で、タンパク尿を同程度、最大で４０％減少させた。
【図１０】図１０Ａ：ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２による処置は、受身ヘイマン腎炎モデルにおける足細胞下部構造への損傷を減少させることを実証する図である。示した群のそれぞれにおいて１２匹の動物に、示した用量のＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２または無関係の対照モノクロール抗体を、０日目でのモデルの誘導の前日から開始して３日ごとに２５ｍｇ／ｋｇで皮下に処置して、１００％標的カバー率を達成した。１６日目で動物を犠牲にした後、選択された腎臓サンプルを、透過型電子顕微鏡を使用してデジタル画像化した。反復は行わずに、２００×の倍率で見出された最初の３つの糸球体の３つの毛細管ループを、５０００×および１０，０００×の倍率で画像化した。ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ｖｅｒｓｉｏｎ  １．４７ｖ；Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、米国）を使用して、高倍率の透過型電子顕微鏡画像において、隣接する足突起を手作業でトレースしその幅を測定するとともに、糸球体基底膜（ＧＢＭ）の単位長さ当たりのスリット膜の密度を測定した。サンプルは、３つの別個の実験にわたって分析した。ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２で処置した動物の足細胞足突起は、対照抗体で処置した動物より顕著に短く、足細胞の足突起はそれほど消失せず、糸球体の傷害から保護されることを示した。  図１０Ｂ：ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２による処置は、受身ヘイマン腎炎モデルにおける足細胞下部構造への損傷を減少させることを実証する図である。示した群のそれぞれにおいて１２匹の動物に、示した用量のＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２または無関係の対照モノクロール抗体を、０日目でのモデルの誘導の前日から開始して３日ごとに２５ｍｇ／ｋｇで皮下に処置して、１００％標的カバー率を達成した。１６日目で動物を犠牲にした後、選択された腎臓サンプルを、透過型電子顕微鏡を使用してデジタル画像化した。反復は行わずに、２００×の倍率で見出された最初の３つの糸球体の３つの毛細管ループを、５０００×および１０，０００×の倍率で画像化した。ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ｖｅｒｓｉｏｎ  １．４７ｖ；Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、米国）を使用して、高倍率の透過型電子顕微鏡画像において、隣接する足突起を手作業でトレースしその幅を測定するとともに、糸球体基底膜（ＧＢＭ）の単位長さ当たりのスリット膜の密度を測定した。サンプルは、３つの別個の実験にわたって分析した。スリット膜の密度は、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２で処置した動物において顕著により高く（両側ｔ検定によるｐ値０．０１未満）、足細胞の足突起はそれほど消失せず、糸球体の傷害から保護されることを示した。
【図１１】ＲＯＢＯ２−Ｆｃ  Ｓ１７Ｔ／Ｒ７３Ｙが、２．５ｎＭのＥＣ５０を有する高い親和性で、ヒト胚性腎（ＨＥＫ２９３）細胞において過剰発現されるヒトＳＬＩＴ２−Ｎに結合することを示す図である。１２段階の２倍希釈系列のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（ＡＦ６４７）で標識されたＲＯＢＯ２−Ｆｃ  Ｓ１７Ｔ／Ｒ７３Ｙを、ＳＬＩＴ２−Ｎを発現しているＨＥＫ２９３細胞または対照ＨＥＫ２９３細胞のいずれかとともにインキュベートした。データは、ＳＬＩＴ２−Ｎ  ＨＥＫ２９３細胞におけるＲＯＢＯ２−Ｆｃ  Ｓ１７Ｔ／Ｒ７３Ｙ  ＡＦ６４７の幾何平均蛍光強度（Ｇｅｏ  ＭＦＩ）から、対照ＨＥＫ２９３細胞におけるＲＯＢＯ２−Ｆｃ  Ｓ１７Ｔ／Ｒ７３Ｙ  ＡＦ６４７の幾何平均蛍光強度を引いたものとして示した。
【図１２】均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）によってアセスメントした、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ  Ｓ１７Ｔ／Ｒ７３Ｙによる、細胞表面ＲＯＢＯ２へのＳＬＩＴ２−Ｎ結合の用量依存的な阻害を実証する図である。ＲＯＢＯ２−Ｆｃ  Ｓ１７Ｔ／Ｒ７３Ｙ（黒色の四角）またはアイソタイプ対照抗体（黒色の丸）の１１段階の４倍用量漸増を、ヒトＳＬＩＴ２−ＮヒトＲＯＢＯ２  ＨＴＲＦアッセイに添加した。ＲＯＢＯ２−Ｆｃ  Ｓ１７Ｔ／Ｒ７３Ｙは、１．４ｎＭのＩＣ５０を有する、ヒトＳＬＩＴ２−Ｎ：ヒトＲＯＢＯ２結合の強力な中和剤であった。
【図１３】ＲＯＢＯ２−Ｆｃ  Ｓ１７Ｔ／Ｒ７３Ｙによる、神経細胞遊走のＳＬＩＴ２−Ｎ媒介性阻害の用量依存的な阻害を示す図である。脳室下帯（ＳＶＺ）神経組織細胞外植片を、１ｎＭのＳＬＩＴ２−Ｎの存在下でＲＯＢＯ２−Ｆｃ  Ｓ１７Ｔ／Ｒ７３Ｙの量を漸増させて終夜培養した。ＲＯＢＯ２−Ｆｃ  Ｓ１７Ｔ／Ｒ７３Ｙは、１１．５ｎＭのＩＣ５０で、神経細胞遊走を用量依存的に回復させることができた。
【図１４】Ｃ末端に６×ヒスチジンタグ（Ｈｉｓ６）（配列番号２５）を有し、ＲＯＢＯ２  プレＩｇ１配列（ＳＲＬＲＱＥＤＦＰ；配列番号８）、Ｉｇ１ドメイン、Ｉｇ２ドメインおよびＲＯＢＯ２  Ｉｇ２−３ドメイン間リンカー（ＶＦＥＲ；配列番号１２）からなるＲＯＢＯ２−Ｈｉｓ構築物の結晶構造を描画した図である。ＲＯＢＯ２−Ｈｉｓの結晶構造から、Ａｓｐ７、Ｐｈｅ８、およびＰｒｏ９が、ＲＯＢＯ２のＩｇ１ドメインの構造完全性に不可欠な相互作用に実質的に関与していることが明らかである。
【図１５】ＲＯＢＯ２−Ｈｉｓ構築物の結晶構造を描画した図である。ＲＯＢＯ２−Ｈｉｓ６の結晶構造（配列番号２５として開示されている「Ｈｉｓ６」）から、ＲＯＢＯ２  Ｉｇ２−３ドメイン間リンカー、バリン２００−フェニルアラニン２０１−グルタミン酸２０２−アルギニン２０３（配列番号１２）が、ＲＯＢＯ２のＩｇ２ドメインのＣ末端領域における構造のフォールディングを効果的に安定化させることが明らかである。
【図１６】ＳＬＩＴ２と複合体形成したＲＯＢＯ２  Ｓ１７Ｔ／Ｒ７３Ｙの第１の免疫グロブリン様ドメイン（Ｉｇ１）の結晶構造を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０１０５】
１．概要
本発明は、ＳＬＩＴリガンド（例えば、ＳＬＩＴ２リガンド）に結合し、それによりＳＬＩＴのＲＯＢＯ２との相互作用を阻害し、その結果としてＳＬＩＴ２−ＲＯＢＯ２シグナル伝達経路を阻害することができる、新規な組換えＲＯＢＯ２タンパク質を包含する。以前の研究により、ＲＯＢＯ２の免疫グロブリン様（Ｉｇ様）ドメイン１および２（Ｉｇ１およびＩｇ２）の両方がＳＬＩＴリガンドと相互作用し、一方、第１のＩｇ様ドメイン（Ｉｇ１）がＳＬＩＴに対する主要結合部位であることが示されている。加えて、以前の研究では、３つのフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮＩＩＩ）リピートの除去は、第３および第４の免疫グロブリン様ドメイン（Ｉｇ３およびＩｇ４）の除去よりも、ＳＬＩＴリガンドへのＲＯＢＯ結合に対してより不利な影響を有することが示されている。すなわち、ＦＮＩＩＩの欠失は、Ｉｇ３およびＩｇ４の欠失よりも、ＳＬＩＴリガンドへのＲＯＢＯ結合を大きく減少させる。
【０１０６】
驚くべきことに、Ｉｇ２−３ドメイン間リンカー、ＶＦＥＲ（配列番号１２）とともに初めの２つの免疫グロブリン様ドメイン（Ｉｇ１およびＩｇ２）だけを含み、かつ３つのフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮＩＩＩ）リピートを含まない構築物、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．１（配列番号２；図１Ｂ）が、ＳＬＩＴ２に結合した（図３）ことがここで初めて示されている。対照的に、３つのフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮＩＩＩ）リピートを含まないが、
（ｉ）ＲＯＢＯ２のＩｇ１ドメイン（ＲＯＢＯ２−Ｆｃ１．１；配列番号４；図１Ｂ）、
（ｉｉ）ＲＯＢＯ２のＩｇ１およびＩｇ２ドメイン（ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．０；配列番号３；図１Ｂ）、または
（ｉｉｉ）ＲＯＢＯ２のＩｇ１、Ｉｇ２およびＩｇ３ドメイン（ＲＯＢＯ２−Ｆｃ３．０；配列番号６；図１Ｂ）
からなる組換えＲＯＢＯ２タンパク質は、ＳＬＩＴ２に結合しなかった（図３）。
【０１０７】
よって、Ｉｇ１−Ｉｇ２ドメインのＣ末端へのＶＦＥＲ（配列番号１２）の付加は、ＦＮＩＩＩリピートの非存在下でのＳＬＩＴ２に対する強固な結合プロファイルを有するＲＯＢＯ２−Ｆｃ構築物（ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．１；配列番号２）を作り出すために必要であった。このＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．１構築物は、第３、第４および第５の免疫グロブリン様ドメイン（Ｉｇ３、Ｉｇ４およびＩｇ５）を欠くだけでなく、３つのフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮＩＩＩ）リピートも含まない。驚くべきことに、ＳＬＩＴ２に結合するかしないかの違いは、４アミノ酸ＶＦＥＲ配列（配列番号１２）の存在であることが分かった。
【０１０８】
上記の組換えＲＯＢＯ２タンパク質構築物はいずれも、ＲＯＢＯ２プレＩｇ１配列（配列番号８）は含有しない。驚くべきことに、本明細書で開示および例示されているこれらの組換えＲＯＢＯ２タンパク質の産生が、ＲＯＢＯ２プレＩｇ１配列（配列番号８）を含むことによって劇的に増加し得ることが発見された。この配列の付加は、ＳＬＩＴ２に対する高親和性結合を維持しながら、この配列を欠く構築物と比較してタンパク質産生を約２５倍増加させた（図３〜４Ａ〜Ｃ）。図１４に示されているように、このＲＯＢＯ２プレＩｇ１配列は、ＲＯＢＯ２のＩｇ１ドメインの２つのβシートを一緒に架橋し、Ｎ末端領域のフォールディング構造を安定化させると考えられる。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、プレＩｇ１配列は、この新規なタンパク質の発現増強に寄与するようである。
【０１０９】
２．定義
いくつかの態様では、ＳＬＩＴに結合することができ、免疫グロブリンドメインを含む組換えＲＯＢＯ２タンパク質が本発明において提供される。
【０１１０】
「組換えタンパク質」という用語は、一般に、そのポリペプチドをコードするＤＮＡを適した発現ベクター中に挿入し、次にこれを宿主細胞中に導入して組換えタンパク質を産生する、組換えＤＮＡ技術により生成されるポリペプチドを指す。本明細書で使用される場合、「タンパク質」は、アミノ酸を含み、当業者からタンパク質と認識される任意の組成物を指す。「タンパク質」、「ペプチド」および「ポリペプチド」という用語は、本明細書において互いに交換可能に使用される。アミノ酸は、それらの正式名称（例えば、アラニン）で、または認められている１文字（例えば、Ａ）、もしくは３文字（例えば、Ａｌａ）略号で表されてもよい。
【０１１１】
本明細書で使用される場合、「免疫グロブリンドメイン」は、免疫グロブリンに由来するポリペプチドである。いくつかの実施形態では、免疫グロブリンドメインは、免疫グロブリン重鎖またはその一部を含む。いくつかの実施形態では、重鎖の一部は、結晶化可能断片（Ｆｃ）またはその一部である。本明細書で使用される場合、Ｆｃ断片は、免疫グロブリンの重鎖ヒンジ領域、ならびに重鎖のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。重鎖（またはその一部）は、公知の重鎖アイソタイプ：ＩｇＧ（γ）、ＩｇＭ（μ）、ＩｇＤ（δ）、ＩｇＥ（ε）、またはＩｇＡ（α）のうちのいずれか１つに由来し得る。加えて、重鎖（またはその一部）は、公知の重鎖アイソタイプまたはサブタイプ：ＩｇＧ１（γ１）、ＩｇＧ２（γ２）、ＩｇＧ３（γ３）、ＩｇＧ４（γ４）、ＩｇＡ１（α１）、ＩｇＡ２（α２）のうちのいずれか１つに由来し得る。いくつかの実施形態では、免疫グロブリンドメインは、免疫グロブリンの中断されていない生来の（すなわち、野生型）配列を含む。いくつかの実施形態では、免疫グロブリンＦｃドメインは、バリアントＦｃ領域を含む。
【０１１２】
本発明において論じられているすべての重鎖定常領域アミノ酸の位置に関して、番号付けは、シーケンシングされた最初のヒトＩｇＧ１である骨髄腫タンパク質Ｅｕのアミノ酸配列を記載している、Ｅｄｅｌｍａｎら、１９６９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６３（１）：７８〜８５において最初に記載されたＥｕインデックスによるものである。ＥｄｅｌｍａｎらのＥｕインデックスはまた、Ｋａｂａｔら、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、米国公衆衛生局、米国国立衛生研究所、Ｂｅｔｈｅｓｄａにも記載されている。よって、「Ｋａｂａｔに記載のＥｕインデックス」または「ＫａｂａｔのＥｕインデックス」は、Ｋａｂａｔ  １９９１に記載のＥｄｅｌｍａｎらのヒトＩｇＧ１  Ｅｕ抗体に基づく残基番号付けシステムを指す。
【０１１３】
「生来の配列のＦｃ領域」は、自然界で見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。「バリアントＦｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾によって生来の配列のＦｃ領域のものとは異なるアミノ酸配列を含む。好ましくは、バリアントＦｃ領域は、生来の配列のＦｃ領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換、例えば、生来の配列のＦｃ領域と比較して約１個から約１０個までのアミノ酸置換、好ましくは、約１個から約５個までのアミノ酸置換を有する。本発明におけるバリアントＦｃ領域は、好ましくは、生来の配列のＦｃ領域と少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは、該領域との少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは、該領域との少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、最も好ましくは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有する。
【０１１４】
本明細書で使用される場合、「リンカー」は、２つの別個の実体（例えば、組換えＲＯＢＯ２−Ｆｃタンパク質の細胞外ドメインおよび免疫グロブリンドメイン）を互いに結合させ、２つの実体が例えば、それらの同族リガンド（例えば、ＳＬＩＴリガンド）に特異的に結合するコンフォメーションを実現することができるように、その２つの実体の間に間隔および柔軟性を与えることができる、分子または分子群である。タンパク質リンカーが特に好ましく、これは、当技術分野において周知の標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して、組換えタンパク質の構成成分として発現させることができる。
【０１１５】
「ＩＣ５０」または「半最大阻害濃度」という用語は、例えば、ＲＯＢＯ２−ＳＬＩＴシグナル伝達経路、ＲＯＢＯ２−ＳＬＩＴ２シグナル伝達経路の５０％阻害に必要とされる組換えＲＯＢＯ２タンパク質の濃度を指す。ＩＣ５０は、ＲＯＢＯ２−ＳＬＩＴ生物学的プロセス、例えば、ＲＯＢＯ２とＳＬＩＴリガンドとの間の結合、ＲＯＢＯ２の細胞内ドメインに対する細胞内シグナル伝達分子（例えば、ｓｒＧＡＰ１またはＮｃｋなど）の結合および／またはＲＯＢＯ２−ＳＬＩＴシグナル伝達の下流の活性（例えば、アクチン重合、足細胞接着、および／または神経細胞遊走のＳＬＩＴｘ−Ｎ媒介性阻害など）などを５０％阻害するために組換えＲＯＢＯ２タンパク質がどれだけ必要とされるかという指標である。ＩＣ５０がより低ければ、より少ない量の組換えＲＯＢＯ２タンパク質でより強力な阻害作用を媒介するため、作用がより強力であることを示す。
【０１１６】
本明細書で使用される場合、「ＳＬＩＴｘ」という用語は概して、ＳＬＩＴリガンドを指す。同様に、「ＳＬＩＴｘ−Ｎ」およびＳＬＩＴｘ−Ｃ」という用語は概して、それぞれＳＬＩＴリガンドのＮ末端およびＣ末端断片を指す。ＳＬＩＴリガンドは哺乳動物ＳＬＩＴリガンド、好ましくはヒトＳＬＩＴリガンドであり得る。いくつかの実施形態では、ＳＬＩＴリガンドは、ＳＬＩＴ１リガンド、ＳＬＩＴ２リガンド、およびＳＬＩＴ３リガンドからなる群から選択される。ＳＬＩＴリガンドは、ＳＬＩＴ２リガンド、好ましくはヒトＳＬＩＴ２リガンドであり得る。
【０１１７】
本明細書で使用される場合、「対象」は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくは非ヒト霊長類、最も好ましくはヒトである。「対象」、「個体」および「患者」という用語は、本明細書において互いに交換可能に使用される。すべての実施形態では、ヒト核酸およびヒトポリペプチドが好ましい。本明細書において他の箇所で記述されているヒト、ラットおよびカニクイザル分子を使用して得られた結果は、他の相同配列を使用して得られ得る結果を予測するものであると考えられる。
【０１１８】
本明細書で使用される場合、「処置」は、有益なまたは所望の臨床結果を得るための手法である。本発明の目的のために、有益なまたは所望の臨床結果は、以下の１つまたは複数を含むがこれらに限定されない：タンパク尿を減少させること（すなわち、薬物投与を行わない場合の尿中のタンパク質のレベルと比較して尿中のタンパク質の量を減少させること）、浮腫を減少させること、および／または血中アルブミンレベルを回復させること。「処置」という用語は、予防的および／または治療的処置を含む。ある状態の臨床症状の前に投与される場合、その処置は予防的であるとみなされる。治療的処置は、例えば、疾患の重症度を改善するもしくは低下させること、または疾患の長さを短縮することを含む。
【０１１９】
「治療有効量」という用語は、対象における、疾患または障害を「処置する」ために有効な本発明の治療剤の量を指す。例えば、治療有効量は、疾患の１つもしくは複数の症状を軽減する量または疾患を寛解状態に保つために必要な量であり得る。巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）の場合、治療有効量は、以下の作用のうちの少なくとも１つを有する量を指す：タンパク尿を減少させること（すなわち、薬物投与を行わない場合の尿中のタンパク質のレベルと比較して尿中のタンパク質の量を減少させること）、浮腫を減少させること、および／または血中アルブミンレベルを回復させること。
【０１２０】
測定可能な数値変数に関して使用される場合の「約」または「およそ」、は、その変数の示されている値、および示されている値の実験的誤差内（例えば、平均の９５％信頼区間内）または示されている値の±１０％のいずれか大きい方の変数の全ての値を指す。数値範囲は、その範囲の境界を定める数字を含む。
【０１２１】
結合親和性
「結合親和性」は一般に、１つの結合パートナー（例えば、本明細書で開示されている組換えＲＯＢＯ２タンパク質）の接触残基と、その結合パートナー（例えば、ＳＬＩＴリガンド）の接触残基との間の非共有結合性相互作用の全体の強度を指す。別途示されない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、結合対または結合パートナーのメンバー（例えば、組換えＲＯＢＯ２タンパク質およびＳＬＩＴ２リガンド）間の１：１の相互作用を反映する結合親和性を指す。
【０１２２】
その最も詳細なレベルにおいて、ＲＯＢＯ２とＳＬＩＴリガンドとの間の相互作用に関する結合親和性は、ＲＯＢＯ２／ＳＬＩＴ相互作用において存在する原子接触を規定する空間座標、ならびに結合熱力学に対するそれらの相対的寄与に関する情報によって定義することができる。１つのレベルにおいて、接触残基は、ＲＯＢＯ２とＳＬＩＴとの間の原子接触を規定する空間座標によって特徴付けることができる。一態様では、接触残基は、ＲＯＢＯ２アミノ酸残基の重原子およびＳＬＩＴのアミノ酸残基の重原子からの特定の基準、例えば、ＲＯＢＯ２タンパク質アミノ酸残基中の原子とＳＬＩＴタンパク質アミノ酸残基中の原子との間の距離（例えば、約４Å以下の距離（例えば、本発明の実施例で使用される３．８Åなど）によって定義することができる。別の態様では、接触残基は、同族の結合パートナーとの、または結合パートナーにやはり水素結合している水分子（すなわち、水に媒介される水素結合）との、水素結合相互作用に関与していると特徴付けることができる。別の態様では、接触残基は、結合パートナーの残基と塩橋を形成していると特徴付けることができる。さらに別の態様では、接触残基は、結合パートナーの接触残基との相互作用による埋没表面積（ｂｕｒｉｅｄ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｒｅａ：ＢＳＡ）の変化がゼロでない残基と特徴付けることができる。やや大局的なレベルでは、結合親和性は、機能によって、例えば、別のタンパク質との競合結合によって特徴付けることができる。
【０１２３】
低親和性組換えタンパク質は一般に、それらのリガンドにゆっくりと結合し、容易に解離しやすく、一方で、高親和性組換えタンパク質は一般に、それらのリガンドにより速く結合し、より長く結合し続けやすい。結合親和性を測定する様々な方法は当技術分野において公知であり、それらはいずれも、本発明の目的のために使用することができる。結合親和性を測定するための具体的な説明的および例示的な実施形態は、以下に記載されている。
【０１２４】
結合親和性はＫＤ値として表すことができ、これは、特定の組換えＲＯＢＯ２タンパク質−ＳＬＩＴリガンド相互作用の解離速度を指す。ＫＤは、「解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）（ｋｏｆｆ）」とも呼ばれる解離の速度の、会合速度または「結合速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）（ｋｏｎ）」に対する比である。よって、ＫＤはｋｏｆｆ／ｋｏｎに等しく、モル濃度（Ｍ）として表され、ＫＤが小さいほど結合の親和性は強い。ＫＤ値は、当技術分野において十分に確立されている方法を使用して決定することができる。ＫＤを測定するための１つの例示的な方法は、当技術分野で周知の方法である、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である（例えば、Ｎｇｕｙｅｎら  Ｓｅｎｓｏｒｓ（Ｂａｓｅｌ）。２０１５  Ｍａｙ  ５；１５（５）：１０４８１〜５１０）。ＫＤ値は、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを使用したＳＰＲによって測定してもよい。ＢＩＡｃｏｒｅ動態解析は、チップ表面上で分子（例えばエピトープ結合ドメインを含む分子）を固定したチップからの抗原の結合および解離を分析することを含む。当技術分野で周知のタンパク質のＫＤを決定するための別の方法は、バイオレイヤー干渉法（例えば、Ｓｈａｈら  Ｊ  Ｖｉｓ  Ｅｘｐ．２０１４；（８４）：５１３８３）を使用したものである。ＫＤ値は、ＯＣＴＥＴ（登録商標）技術（Ｏｃｔｅｔ  ＱＫｅシステム、ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して測定してもよい。代替としてまたは加えて、Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｂｏｉｓｅ、Ｉｄ．）から入手可能なＫｉｎＥｘＡ（登録商標）（結合平衡除外法（Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ））アッセイもまた使用することができる。２つの結合パートナー間の結合親和性をアセスメントするための当技術分野で公知のあらゆる方法が本発明に包含される。
【０１２５】
３．組換えＲＯＢＯ２タンパク質
いくつかの態様では、本開示は組換えＲＯＢＯ２タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されている組換えＲＯＢＯ２タンパク質はＳＬＩＴリガンド（特に、ＳＬＩＴ２リガンド）に結合し、それによりＳＬＩＴが細胞のＲＯＢＯ２受容体に結合するのを阻止し、したがって、ＳＬＩＴ中和リガンドトラップと称される。驚くべきことに、実施例において示されているように、Ｉｇ２−３ドメイン間リンカー、ＶＦＥＲ（配列番号１２）とともに、初めの２つの免疫グロブリン様ドメイン（Ｉｇ１およびＩｇ２）、Ｉｇ１−Ｉｇ２ドメイン間リンカーを含み、３つのフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮＩＩＩ）リピートは含まない構築物であるＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．１（配列番号２；図１Ｂ）は、ＳＬＩＴ２に結合した（図３）。結晶構造研究によれば、ＲＯＢＯ２  Ｉｇ２−Ｉｇ３ドメイン間リンカー、ＶＦＥＲ（Ｖ２００−Ｆ２０１−Ｅ２０２−Ｒ２０３；配列番号１２）を含めることにより、ＲＯＢＯ２の第２のＩｇドメインのＣ末端領域においてフォールディング構造が効果的に安定化し（図１５）、組換えＲＯＢＯ２タンパク質の発現レベルが著しく増加することもまた示される。
【０１２６】
いくつかの態様では、本開示は、ＳＬＩＴ結合部分および半減期延長部分を含む組換えポリペプチドを提供する。「ＳＬＩＴ結合部分」は、組換えＲＯＢＯ２タンパク質にＳＬＩＴ結合能を付与する。いくつかの実施形態では、ＳＬＩＴ結合部分は、ＲＯＢＯ２細胞外ドメインの一部を含む。いくつかの実施形態では、ＲＯＢＯ２細胞外ドメインの一部は、少なくとも２つの免疫グロブリン様（Ｉｇ様）ドメイン、およびＶＦＥＲ（配列番号１２）からなるＣ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのＩｇ様ドメインは、Ｉｇ１、Ｉｇ２、Ｉｇ３、Ｉｇ４およびＩｇ５からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのＩｇ様ドメインは、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３および配列番号１４の配列からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＲＯＢＯ２細胞外ドメインの一部は、ＲＯＢＯ２の初めの２つのＩｇ様ドメイン（Ｉｇ１およびＩｇ２）を含む。いくつかの実施形態では、ＲＯＢＯ２細胞外ドメインの一部は、配列番号９および／または配列番号１１を含む。
【０１２７】
タンパク質産生試験により、本明細書で開示および例示されている組換えＲＯＢＯ２タンパク質の産生が、ＲＯＢＯ２プレＩｇ１配列（配列番号８）を含むことによって劇的に増加し得ることが判定された。この配列の付加は、ＳＬＩＴに対する高親和性結合を維持しながら、一過性におよび／または安定にトランスフェクトされた哺乳動物細胞におけるタンパク質産生を約２５倍増加させる（図３〜５）。
【０１２８】
したがって、いくつかの実施形態では、ＲＯＢＯ２細胞外ドメインの一部は、ＲＯＢＯ２プレＩｇ１配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＲＯＢＯ２プレＩｇ１配列は配列番号８を含む。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、ＲＯＢＯ２細胞外ドメインの一部は、ＲＯＢＯ２プレＩｇ１配列、Ｉｇ１、Ｉｇ１−Ｉｇ２ドメイン間リンカー、Ｉｇ２、およびＩｇ２−Ｉｇ３ドメイン間リンカーを含む。ＲＯＢＯ２プレＩｇ１配列（配列番号８）、Ｉｇ１（配列番号９）、Ｉｇ１−Ｉｇ２ドメイン間リンカー（配列番号１０）、Ｉｇ２（配列番号１１）、およびＩｇ２−Ｉｇ３ドメイン間リンカー（配列番号１２）の例示的な配列を表２３に示し、図２にも図示する。本発明は、本明細書で開示されている配列に限定されない。別のＲＯＢＯ２ホモログ、アイソフォーム、バリアント、または断片由来の対応する残基は、当技術分野で公知の配列アラインメントまたは構造アラインメントによって同定することができる。例えば、アラインメントは、手動で、または周知の配列アラインメントプログラム、例えばＣｌｕｓｔａｌＷ２、もしくは「ＢＬＡＳＴ  ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」などを用いてデフォルトパラメーターを使用して、行うことができる。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、ＲＯＢＯ２細胞外ドメインの一部は、配列番号１の番号付けによるアミノ酸残基１〜２０３を含む。いくつかの実施形態では、組換えＲＯＢＯ２タンパク質は、配列番号１の番号付けによるアミノ酸残基１〜２０３に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を共有するＲＯＢＯ２細胞外ドメインの一部を含む。いくつかの実施形態では、組換えＲＯＢＯ２タンパク質は、配列番号１の番号付けによるアミノ酸残基１〜２０３からなる細胞外ドメインを含む。
【０１３１】
いくつかの態様では、ＲＯＢＯ２は、ヒトＲＯＢＯ２である。いくつかの態様では、ＲＯＢＯ２は、ラットＲＯＢＯ２である。いくつかの態様では、ＲＯＢＯ２は、マウスＲＯＢＯ２である。いくつかの態様では、ＲＯＢＯ２は、霊長類ＲＯＢＯ２である。いくつかの態様では、ＲＯＢＯ２は、類人猿ＲＯＢＯ２である。いくつかの態様では、ＲＯＢＯ２は、サルＲＯＢＯ２である。いくつかの態様では、ＲＯＢＯ２は、カニクイザルＲＯＢＯ２である。
【０１３２】
ＳＬＩＴ結合部分に加えて、新規な組換えＲＯＢＯ２タンパク質は、半減期延長部分を含む。「半減期延長部分」は、半減期延長部分を有さない同じＲＯＢＯ２タンパク質と比較して、組換えＲＯＢＯ２タンパク質のインビボでの血清中半減期を延長させる。半減期延長部分の例としては、ポリヒスチジン、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、免疫グロブリンドメイン、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、半減期延長部分は、免疫グロブリンドメインを含む。いくつかの実施形態では、免疫グロブリンドメインは、Ｆｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、公知の重鎖アイソタイプ：ＩｇＧ（γ）、ＩｇＭ（μ）、ＩｇＤ（δ）、ＩｇＥ（ε）、またはＩｇＡ（α）のうちのいずれか１つに由来する。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、公知の重鎖アイソタイプまたはサブタイプ：ＩｇＧ１（γ１）、ＩｇＧ２（γ２）、ＩｇＧ３（γ３）、ＩｇＧ４（γ４）、ＩｇＡ１（α１）、ＩｇＡ２（α２）のうちのいずれか１つに由来する。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインである。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの中断されていない生来の配列（すなわち、野生型配列）を含む。いくつかの実施形態では、免疫グロブリンＦｃドメインは、変更された生物学的活性をもたらすバリアントＦｃドメインを含む。例えば、少なくとも１つの点変異または欠失を、エフェクター活性を低下させるまたはなくすように（例えば、ＷＯ２００５／０６３８１５）、および／または組換えタンパク質の産生中の均一性を増大するように、Ｆｃドメイン中に導入してもよい。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインであり、以下のエフェクター欠損置換：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＧ２３７Ａ（Ｅｕ番号付け）または配列番号１の番号付けを基準としたＬ２２８Ａ、Ｌ２２９ＡおよびＧ２３１Ａのうちの１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１のＣ末端の位置にあるリシン（すなわち、Ｅｕ番号付けによるＫ４４７）を含まない。このリシンが存在しないことにより、組換えタンパク質の産生中の均一性は増大し得る。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｃ末端の位置にあるリシン（Ｋ４４７、Ｅｕ番号付け）を含む。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、組換えＲＯＢＯ２ポリペプチドは、ＲＯＢＯ２細胞外ドメイン中またはＦｃドメイン中に位置し得る１つの、２つの、３つのまたは４つの鎖内ジスルフィド結合を含む。いくつかの実施形態では、組換えＲＯＢＯ２ポリペプチドは、４つの鎖内ジスルフィド結合を含み、そのうちの２つはＲＯＢＯ２細胞外ドメイン中に位置し、２つはＦｃドメイン中に位置する。いくつかの実施形態では、ＲＯＢＯ２細胞外ドメイン中に位置する鎖内ジスルフィド結合は、すべて配列番号１の番号付けによるＣｙｓ３１とＣｙｓ８９との間、およびＣｙｓ１３３とＣｙｓ１８２との間である。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン中に位置する鎖内ジスルフィド結合は、すべて配列番号１の番号付けによるＣｙｓ２５５とＣｙｓ３１５との間、およびＣｙｓ３６１とＣｙｓ４１９との間である。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、２つの組換えＲＯＢＯ２ポリペプチドは、共有結合により、例えば、ジスルフィド結合、ポリペプチド結合もしくは架橋剤によって、または非共有結合により、会合してホモ二量体タンパク質を生成する。いくつかの実施形態では、２つの組換えＲＯＢＯ２ポリペプチドは共有結合により会合して、好ましくは各ポリペプチドの免疫グロブリンＦｃ領域内に位置する、システイン残基を介した少なくとも１つの、より好ましくは２つの鎖間ジスルフィド結合によるホモ二量体を形成する。いくつかの実施形態では、２つの鎖間ジスルフィド結合は、Ｃｙｓ２２０とＣｙｓ２２３との間である。いくつかの実施形態では、組換えＲＯＢＯ２ポリペプチドの９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、８％未満、５％未満、４％未満、２％未満、１％未満が会合してホモ二量体を形成する。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、組換えＲＯＢＯ２ポリペプチドは、共有結合により、例えば、ジスルフィド結合、ポリペプチド結合もしくは架橋剤によって、または非共有結合により、別のポリペプチドと会合してヘテロ二量体タンパク質を生成する。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、二重特異性または多重特異性である。一部の実施形態では、他のポリペプチドは、免疫グロブリンドメインを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは共有結合により会合して、好ましくは各ポリペプチドの免疫グロブリンＦｃ領域内に位置する、システイン残基を介した少なくとも１つの、より好ましくは２つの鎖間ジスルフィド結合によるヘテロ二量体を形成する。いくつかの実施形態では、２つの鎖間ジスルフィド結合は、組換えＲＯＢＯ２ポリペプチドのＣｙｓ２２０とＣｙｓ２２３との間である。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、２つの異なる組換えＲＯＢＯ２ポリペプチドを含む。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、組換えＲＯＢＯ２タンパク質のＦｃドメインは、配列番号１の番号付けによるアミノ酸残基２１０〜４４０を含む。いくつかの実施形態では、組換えＲＯＢＯ２タンパク質は、配列番号１の番号付けによるアミノ酸残基２１０〜４４０と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を共有するＦｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、組換えＲＯＢＯ２タンパク質は、配列番号１の番号付けによるアミノ酸残基２１０〜４４０からなるＦｃドメインを含む。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、組換えＲＯＢＯ２タンパク質の細胞外ドメインは、免疫グロブリンドメインと隣接している。すなわち、ＲＯＢＯ２タンパク質の細胞外ドメインの最後のＣ末端アミノ酸残基が、免疫グロブリンドメインの最初のＮ末端アミノ酸残基と、ペプチジル結合によって共有結合的に連結されている。いくつかの実施形態では、組換えＲＯＢＯ２タンパク質の細胞外ドメインは、リンカーを介して免疫グロブリンドメインに接続されている。いくつかの実施形態では、リンカーはペプチジルリンカーである。いくつかの実施形態では、ペプチジルリンカーは、約１〜３０アミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、ペプチジルリンカーは、グリシンリッチペプチド；グリシンおよびセリンを含むペプチド；配列［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］ｎ（式中、ｎは１、２、３、４、５、または６である）（配列番号２２）を有するペプチド；ならびに配列［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］ｎ（式中、ｎは１、２、３、４、５、または６である）（配列番号２３）を有するペプチドからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ペプチジルリンカーは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号１５）である。グリシンリッチペプチドリンカーは、残基の少なくとも２５％がグリシンであるペプチドリンカーを含む。グリシンリッチペプチドリンカーは、当技術分野において周知である（例えば、Ｃｈｉｃｈｉｌｉら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．２０１３  Ｆｅｂ；２２（２）：１５３〜１６７）。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、組換えＲＯＢＯ２−Ｆｃタンパク質は、配列番号１の配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えＲＯＢＯ２−Ｆｃタンパク質は、配列番号１の配列からなる。いくつかの実施形態では、組換えＲＯＢＯ２−Ｆｃタンパク質は、配列番号１の配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えＲＯＢＯ２−Ｆｃタンパク質は、配列番号１の配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えＲＯＢＯ２−Ｆｃタンパク質は、配列番号１の配列と少なくとも９６％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えＲＯＢＯ２−Ｆｃタンパク質は、配列番号１の配列と少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えＲＯＢＯ２−Ｆｃタンパク質は、配列番号１の配列と少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えＲＯＢＯ２−Ｆｃタンパク質は、配列番号１の配列と少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、配列番号１の配列に対して１０個以下の、９個以下の、８個以下の、７個以下の、６個以下の、５個以下の、４個以下の、３個以下の、２個以下の、または１個以下の置換がなされる。いくつかの実施形態では、配列番号１の配列に対して５個以下の置換がなされる。いくつかの実施形態では、配列番号１の配列に対して４個以下の置換がなされる。いくつかの実施形態では、配列番号１の配列に対して３個以下の置換がなされる。いくつかの実施形態では、配列番号１の配列に対して２個以下の置換がなされる。いくつかの実施形態では、配列番号１の配列に対して１個以下の置換がなされる。いくつかの実施形態では、置換は、配列番号１の配列を含むタンパク質のＫＤと比較して、ＫＤに１０００倍を超える、１００倍を超える、または１０倍の変化をもたらさない。ある特定の実施形態では、置換は、表１に従う保存的置換である。
【０１４１】
【表１】
2020522248.tif 000002
【０１４２】
いくつかの実施形態では、表４〜１５に列挙されているＲＯＢＯ２アミノ酸残基の１つまたは複数は、置換されていない（例えば、それぞれ配列番号１を基準として番号付けされたＥ６、Ｄ７、Ｆ８、Ｐ９、Ｖ２００、Ｆ２０１、Ｅ２０２、Ｒ２０３）。いくつかの実施形態では、表４〜１５に列挙されているアミノ酸残基（例えば、配列番号１を基準として番号付けされたＥ６、Ｄ７、Ｆ８、Ｐ９、Ｖ２００、Ｆ２０１、Ｅ２０２、Ｒ２０３）は、１つも置換されていない。表４〜１５に開示されているＲＯＢＯ２アミノ酸残基は、結晶構造試験（実施例５を参照されたい）によれば、ＳＬＩＴ結合ドメインの構造完全性を支持するために重要であると考えられるアミノ酸残基である。これらの位置でのアミノ酸置換は、ＳＬＩＴ結合に潜在的に影響を及ぼす可能性がある。したがって、これらの位置では置換が起こらないことが所望され得る。いくつかの実施形態では、組換えＲＯＢＯ２タンパク質は、配列番号１に記載の配列のアミノ酸残基１〜２０３と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を共有するＲＯＢＯ２細胞外ドメインの一部を含み、１つまたは複数の残基Ｅ６、Ｄ７、Ｆ８、Ｐ９、Ｖ２００、Ｆ２０１、Ｅ２０２、およびＲ２０３（配列番号１の配列による番号付け）をさらに含む。
【０１４３】
いくつかの態様では、配列番号１の配列に対する１つまたは複数の点変異を導入して、ＳＬＩＴリガンド、例えば、ＳＬＩＴ２に対する組換えＲＯＢＯ２タンパク質の親和性を増加させてもよい。実施例において示されているように、ＳＬＩＴ２に対する結合親和性は、配列番号１の配列に対して点変異Ｓ１７ＴおよびＲ７３Ｙを導入することによって、約１０倍増加させることができる（図１１〜１３）。したがって、いくつかの態様では、本開示は、以下の変異：配列番号１の配列に対するＳ１７ＴおよびＲ７３Ｙのうちの１つまたは複数を有する組換えＲＯＢＯ２タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、組換えＲＯＢＯ２タンパク質は、配列番号１９に記載の配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えＲＯＢＯ２タンパク質は、配列番号１９に記載の配列からなる。いくつかの実施形態では、組換えＲＯＢＯ２タンパク質は、配列番号１９の番号付けによるアミノ酸残基４４１に位置するＣ末端リシンを含まない。ある特定の実施形態では、本発明の組換えＲＯＢＯ２タンパク質は、約１×１０−６Ｍ以下、例えば１×１０−７Ｍ以下、９×１０−８Ｍ以下、８×１０−８Ｍ以下、７×１０−８Ｍ以下、６×１０−８Ｍ以下、５×１０−８Ｍ以下、４×１０−８Ｍ以下、３×１０−８Ｍ以下、２×１０−８Ｍ以下、１×１０−８Ｍ以下、９×１０−９Ｍ以下、８×１０−９Ｍ以下、７×１０−９Ｍ以下、６×１０−９Ｍ以下、５×１０−９Ｍ以下、４×１０−９Ｍ以下、３×１０−９Ｍ以下、２×１０−９Ｍ以下、１×１０−９Ｍ以下、９×１０−１０Ｍ以下、８×１０−１０Ｍ以下、７×１０−１０Ｍ以下、６×１０−１０Ｍ以下、５×１０−１０Ｍ以下、４×１０−１０Ｍ以下、３×１０−１０Ｍ以下、２×１０−１０Ｍ以下、１×１０−１０Ｍ以下、９×１０−１１Ｍ以下、８×１０−１１Ｍ以下、７×１０−１１Ｍ以下、６×１０−１１Ｍ以下、５×１０−１１Ｍ以下、４×１０−１１Ｍ以下、３×１０−１１Ｍ以下、２×１０−１１Ｍ以下、１×１０−１１Ｍ以下、約９×１０−１２Ｍ以下、８×１０−１２Ｍ以下、７×１０−１２Ｍ以下、６×１０−１２Ｍ以下、５×１０−１２Ｍ以下、４×１０−１２Ｍ以下、３×１０−１２Ｍ以下、２×１０−１２Ｍ以下、１×１０−１２Ｍ以下、９×１０−１３Ｍ以下、８×１０−１３Ｍ以下、７×１０−１３Ｍ以下、６×１０−１３Ｍ以下、５×１０−１３Ｍ以下、４×１０−１３Ｍ以下、３×１０−１３Ｍ以下、２×１０−１３Ｍ以下、約１×１０−１３以下などのＫＤを有する。
【０１４４】
ある特定の実施形態では、本発明の組換えＲＯＢＯ２タンパク質は、約１×１０−７Ｍから約１×１０−１４Ｍまで、約９×１０−８Ｍから約１×１０−１４Ｍまで、約８×１０−８Ｍから約１×１０−１４Ｍまで、約７×１０−８Ｍから約１×１０−１４Ｍまで、約６×１０−８Ｍから約１×１０−１４Ｍまで、約５×１０−８Ｍから約１×１０−１４Ｍまで、約４×１０−８Ｍから約１×１０−１４Ｍまで、約３×１０−８Ｍから約１×１０−１４Ｍまで、約２×１０−８Ｍから約１×１０−１４Ｍまで、約１×１０−８Ｍから約１×１０−１４Ｍまで、約９×１０−９Ｍから約１×１０−１４Ｍまで、約８×１０−９Ｍから約１×１０−１４Ｍまで、約７×１０−９Ｍから約１×１０−１４Ｍまで、約６×１０−９Ｍから約１×１０−１４Ｍまで、約５×１０−９Ｍから約１×１０−１４Ｍまで、約４×１０−９Ｍから約１×１０−１４Ｍまで、約３×１０−９Ｍから約１×１０−１４Ｍまで、約２×１０−９Ｍから約１×１０−１４Ｍまで、約１×１０−９Ｍから約１×１０−１４Ｍまで、約１×１０−７Ｍから約１×１０−１３Ｍまで、約９×１０−８Ｍから約１×１０−１３Ｍまで、約８×１０−８Ｍから約１×１０−１３Ｍまで、約７×１０−８Ｍから約１×１０−１３Ｍまで、約６×１０−８Ｍから約１×１０−１３Ｍまで、約５×１０−８Ｍから約１×１０−１３Ｍまで、約４×１０−８Ｍから約１×１０−１３Ｍまで、約３×１０−８Ｍから約１×１０−１３Ｍまで、約２×１０−８Ｍから約１×１０−１３Ｍまで、約１×１０−８Ｍから約１×１０−１３Ｍまで、約９×１０−９Ｍから約１×１０−１３Ｍまで、約８×１０−９Ｍから約１×１０−１３Ｍまで、約７×１０−９Ｍから約１×１０−１３Ｍまで、約６×１０−９Ｍから約１×１０−１３Ｍまで、約５×１０−９Ｍから約１×１０−１３Ｍまで、約４×１０−９Ｍから約１×１０−１３Ｍまで、約３×１０−９Ｍから約１×１０−１３Ｍまで、約２×１０−９Ｍから約１×１０−１３Ｍまで、または約１×１０−９Ｍから約１×１０−１３Ｍまでの範囲のＫＤを有する。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、組換えＲＯＢＯ２タンパク質は、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約２ｎＭ、約１ｎＭ、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２５０ｐＭ、約２００ｐＭ、約１５０ｐＭ、約１００ｐＭ、約５０ｐＭ、約４０ｐＭ、約３０ｐＭ、約２５ｐＭ、約２０ｐＭ、約１５ｐＭ、約１０ｐＭ、約５ｐＭ、または約１ｐＭ以下のＫＤでＳＬＩＴ２に結合する。いくつかの実施形態では、組換えＲＯＢＯ２タンパク質は、約６００ｐＭのＫＤでＳＬＩＴ２に結合する。いくつかの実施形態では、組換えＲＯＢＯ２タンパク質は、約５００ｐＭのＫＤでＳＬＩＴ２に結合する。いくつかの実施形態では、組換えＲＯＢＯ２タンパク質は、約４００ｐＭのＫＤでＳＬＩＴ２に結合する。いくつかの実施形態では、組換えＲＯＢＯ２タンパク質は、約３００ｐＭのＫＤでＳＬＩＴ２に結合する。いくつかの実施形態では、組換えＲＯＢＯ２タンパク質は、約２５０ｐＭのＫＤでＳＬＩＴ２に結合する。いくつかの実施形態では、組換えＲＯＢＯ２タンパク質は、約２００ｐＭのＫＤでＳＬＩＴ２に結合する。
【０１４６】
一般に、ＲＯＢＯ２の活性を効果的に遮断するためには、組換えＲＯＢＯ２−Ｆｃタンパク質は、高い親和性でＳＬＩＴリガンド（例えば、ＳＬＩＴ２）に結合しなければならない。組換えＲＯＢＯ２−Ｆｃタンパク質は、約１×１０−８Ｍ以下などの低ナノモルおよびピコモル範囲内の結合親和性（ＫＤ）を有することが望ましい。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、組換えＲＯＢＯ−Ｆｃタンパク質は、ＳＬＩＴ２に対するＲＯＢＯ１の結合のＫＤ値の、少なくとも約２分の１、約４分の１、約６分の１、約８分の１、約１０分の１、約２０分の１、約４０分の１、約６０分の１、約８０分の１、約１００分の１、約１２０分の１、約１４０分の１、約１６０分の１のＫＤでＳＬＩＴ２に結合する。いくつかの実施形態では、組換えＲＯＢＯ２−Ｆｃタンパク質は、ＳＬＩＴ２に対するＲＯＢＯ１−Ｆｃタンパク質の結合のＫＤ値の、少なくとも約２分の１、約４分の１、約６分の１、約８分の１、約１０分の１、約２０分の１、約４０分の１、約６０分の１、約８０分の１、約１００分の１、約１２０分の１、約１４０分の１、約１６０分の１のＫＤでＳＬＩＴ２に結合する。
【０１４８】
生物学的活性アッセイ
ある特定の実施形態では、本明細書で開示されている組換えＲＯＢＯ２−Ｆｃタンパク質は、ＲＯＢＯ２−ＳＬＩＴシグナル伝達の少なくとも１つの生物学的活性を低下させる。そのような活性は、当技術分野において公知の他のＲＯＢＯ２−ＳＬＩＴ活性のなかでも、ＲＯＢＯ２とＳＬＩＴリガンドとの間の結合、ＲＯＢＯ２の細胞内ドメインに対する細胞内シグナル伝達分子（例えば、ｓｒＧＡＰ１またはＮｃｋなど）の結合、ならびに／またはＲＯＢＯ２−ＳＬＩＴシグナル伝達の下流の活性、例えば、アクチン重合、足細胞接着、および／もしくは神経細胞遊走のＳＬＩＴ２−Ｎ媒介性阻害などを含むがこれらに限定されない。組換えＲＯＢＯ２−Ｆｃタンパク質がＲＯＢＯ２の活性を低下させるかどうかは、当技術分野において周知のいくつかのアッセイによってアセスメントすることができる。例えば、当技術分野において公知のアッセイを使用して、組換えＲＯＢＯ２−Ｆｃタンパク質が、（ａ）ＳＬＩＴのＲＯＢＯ２への結合を阻害する；（ｂ）ｓｒＧＡＰ１とＲＯＢＯ２との結合を減少させる；（ｃ）ＮｃｋとＲＯＢＯ２との結合を減少させる；（ｄ）ＲＯＢＯ２依存的ＳＬＩＴ２−Ｎ活性を阻害する；（ｅ）アクチン重合を阻害する；（ｆ）足細胞接着を阻害する；および／または（ｇ）神経細胞遊走のＳＬＩＴ２−Ｎ媒介性阻害を阻害するかどうかを判定することができる。
【０１４９】
ある特定の実施形態では、組換えＲＯＢＯ２−Ｆｃタンパク質は、ＳＬＩＴリガンドのＲＯＢＯ２への結合を阻害する（例えば、ＳＬＩＴ２に対する組換えＲＯＢＯ２−Ｆｃタンパク質とＲＯＢＯ２との間の競合的結合をアセスメントすることによってアセスメントすることができる）。例えば、アッセイは、（ｉ）組換えＲＯＢＯ２−Ｆｃタンパク質の存在下でのＲＯＢＯ２およびＳＬＩＴの結合を、（ｉｉ）組換えＲＯＢＯ２−Ｆｃタンパク質の非存在下でのＲＯＢＯ２およびＳＬＩＴの結合と比較してもよい。ＲＯＢＯ２およびＳＬＩＴの結合の減少は、試験組換えＲＯＢＯ２−Ｆｃタンパク質の非存在下でのＲＯＢＯ２およびＳＬＩＴの結合と比較して、組換えＲＯＢＯ２−Ｆｃタンパク質の存在下で、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％であり得る。組換えＲＯＢＯ２−Ｆｃタンパク質の非存在下でのＳＬＩＴのＲＯＢＯ２への予期される結合は、１００％とすることができる。
【０１５０】
ある特定の実施形態では、組換えＲＯＢＯ２−Ｆｃタンパク質は、約１×１０−７Ｍ以下、約１×１０−８Ｍ以下、約１×１０−９Ｍ以下、約１×１０−１０Ｍ以下、約１×１０−１１Ｍ以下、約１×１０−１２Ｍ以下、約１×１０−１３Ｍ以下、約１×１０−１４Ｍ以下、約１×１０−１５Ｍ以下、約１×１０−７Ｍから約５×１０−１４Ｍまで、約１×１０−７Ｍから約１×１０−１４Ｍまで、約１×１０−７Ｍから約５×１０−１３Ｍまで、約１×１０−７Ｍから約１×１０−１３Ｍまで、約１×１０−７Ｍから約５×１０−１２Ｍまで、または約１×１０−７Ｍから約１×１０−１２Ｍまでの半最大阻害濃度（ＩＣ５０）で、ＳＬＩＴのＲＯＢＯ２への結合を阻害する。いくつかの実施形態では、組換えＲＯＢＯ２−Ｆｃタンパク質は、ＳＬＩＴ２に対するＲＯＢＯ２結合の阻害に関する均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）アッセイによって測定される、１５ｎＭ、約１３ｎＭ、約１１ｎＭ、約９ｎＭ、約７ｎＭ、約６ｎＭ、約５ｎＭ、約４ｎＭ、約３ｎＭ、約２ｎＭ、約１ｎＭ以下の半最大阻害濃度（ＩＣ５０）を有する。ＩＣ５０は、ＳＬＩＴまたはＲＯＢＯ２の断片、例えば、ＳＬＩＴ−Ｎ、ならびにＲＯＢＯ２のＩｇドメイン１、またはＲＯＢＯ２のＩｇドメイン１および２などを使用してアセスメントしてもよい。
【０１５１】
組換えＲＯＢＯ２−Ｆｃタンパク質の阻害活性は、ＲＯＢＯ２依存的ＳＬＩＴ−Ｎ活性、例えば、アクチン重合、足細胞接着、および／または神経細胞遊走のＳＬＩＴ２−Ｎ媒介性阻害などのレベルを測定することによってもアセスメントすることができる。例えば、アッセイは、（ｉ）ＲＯＢＯ２、ＳＬＩＴ、および組換えＲＯＢＯ２−Ｆｃタンパク質の存在下での神経細胞遊走を、（ｉｉ）ＲＯＢＯ２、ＳＬＩＴの存在下であるが組換えＲＯＢＯ２−Ｆｃタンパク質の非存在下での神経細胞遊走と比較することができる。組換えＲＯＢＯ２−Ｆｃタンパク質の非存在下での神経細胞遊走と比較して、組換えＲＯＢＯ２−Ｆｃタンパク質の存在下での神経細胞遊走の増加は、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％であり得る。組換えＲＯＢＯ２−Ｆｃタンパク質の非存在下でのベースラインの神経細胞遊走は、０％とすることができる。
【０１５２】
ある特定の実施形態では、組換えＲＯＢＯ２−Ｆｃタンパク質は、約１×１０−７Ｍ以下、約１×１０−８Ｍ以下、約１×１０−９Ｍ以下、約１×１０−１０Ｍ以下、約１×１０−１１Ｍ以下、約１×１０−１２Ｍ以下、約１×１０−１３Ｍ以下、約１×１０−１４Ｍ以下、約１×１０−１５Ｍ以下、約１×１０−７Ｍから約５×１０−１４Ｍまで、約１×１０−７Ｍから約１×１０−１４Ｍまで、約１×１０−７Ｍから約５×１０−１３Ｍまで、約１×１０−７Ｍから約１×１０−１３Ｍまで、約１×１０−７Ｍから約５×１０−１２Ｍまで、または約１×１０−７Ｍから約１×１０−１２Ｍまでの半最大阻害濃度（ＩＣ５０）で、ＲＯＢＯ２依存的ＳＬＩＴ−Ｎ活性、例えば、アクチン重合、足細胞接着、および／または神経細胞遊走のＳＬＩＴ２−Ｎ媒介性阻害などを阻害する。ある特定の実施形態では、約１×１０−１０Ｍから約１×１０−１３ＭまでのＩＣ５０が好ましい。ある特定の実施形態では、約５×１０−１１Ｍから約５×１０−１２ＭまでのＩＣ５０が好ましい。いくつかの実施形態では、組換えＲＯＢＯ−Ｆｃタンパク質は、神経細胞遊走のＳＬＩＴ２−Ｎ媒介性阻害を測定することによってアセスメントされる、約７５ｎＭ、約６５ｎＭ、約５５ｎＭ、約４５ｎＭ、約３５ｎＭ、約２５ｎＭ、約１５ｎＭ、約５ｎＭ以下の半最大阻害濃度（ＩＣ５０）を有する。
【０１５３】
ある特定の実施形態では、本発明の組換えＲＯＢＯ−Ｆｃタンパク質の特性は、例えば、その効力、薬理学的活性、および治療剤としての潜在的な有効性を評価するために、他の生物学的活性アッセイを使用してさらにアセスメントされる。そのようなアッセイは当技術分野において公知であり、組換えタンパク質の意図される使用に依存する。例としては、例えば、毒性アッセイ、免疫原性アッセイ、安定性アッセイ、抗薬物抗体アッセイ、および／またはＰＫ／ＰＤプロファイリングが挙げられる。
【０１５４】
核酸および組換えＲＯＢＯ２タンパク質を製造する方法
本発明はまた、本発明の組換えＲＯＢＯ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドも提供する。本発明はまた、本明細書において記載されているポリヌクレオチドのいずれかを作製する方法も提供する。ポリヌクレオチドは、当技術分野において公知の手順によって作製するおよび発現させることができる。
【０１５５】
一態様では、本発明は、ＲＯＢＯ２細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の一部を含み、免疫グロブリンドメインをさらに含む、組換えＲＯＢＯ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む組成物であって、細胞外ドメインが、少なくとも２つの免疫グロブリン様（Ｉｇ様）ドメイン、および配列番号１２の配列からなるＣ末端配列を含む、ポリヌクレオチドまたは組成物を提供する。
【０１５６】
一態様では、本発明は、配列番号１に記載の番号付けによるアミノ酸残基１〜２０３を含み、免疫グロブリンドメインをさらに含む、組換えＲＯＢＯ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、本発明は、以下の組換えＲＯＢＯ２タンパク質：ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２（配列番号１）、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．１（配列番号２）、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．０（配列番号３）、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ１．１（配列番号４）、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ１．０（配列番号５）、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ３．０（配列番号６）、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ４．０（配列番号７）、およびＲＯＢＯ２−Ｆｃ  Ｓ１７Ｔ  Ｒ７３Ｙ（配列番号１９）のうちのいずれか１つをコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２（配列番号１）をコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．１（配列番号２）をコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．０（配列番号３）をコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。
【０１５８】
本発明はまた、ポリヌクレオチドが、ＡＴＣＣに寄託されているＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２４００８を有するプラスミドのＤＮＡインサートの配列を含む、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。
【０１５９】
別の態様では、本発明は、組換えＲＯＢＯ２−Ｆｃタンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびそのバリアントを提供し、そのようなバリアントポリヌクレオチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７および１９の核酸ならびにＡＴＣＣに寄託されているＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２４００８を有するプラスミドのインサートの核酸配列を含む核酸などであるがこれらに限定されない、本明細書で開示されている任意の核酸と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、そのようなバリアントポリヌクレオチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７および１９の核酸を含む核酸などであるがこれらに限定されない、本明細書で開示されている任意の核酸と、少なくとも９５％の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、そのようなバリアントポリヌクレオチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７および１９の核酸を含む核酸などであるがこれらに限定されない、本明細書で開示されている任意の核酸と、少なくとも９６％の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、そのようなバリアントポリヌクレオチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７および１９の核酸を含む核酸などであるがこれらに限定されない、本明細書で開示されている任意の核酸と、少なくとも９７％の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、そのようなバリアントポリヌクレオチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７および１９の核酸を含む核酸などであるがこれらに限定されない、本明細書で開示されている任意の核酸と、少なくとも９８％の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、そのようなバリアントポリヌクレオチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７および１９の核酸を含む核酸などであるがこれらに限定されない、本明細書で開示されている任意の核酸と、少なくとも９９％の配列同一性を共有する。
【０１６０】
別の態様では、本発明は、配列番号２１に記載の核酸配列を含むポリヌクレオチドおよびそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号２１に記載の核酸配列を含み、配列番号１７または配列番号１８に記載のアミノ酸配列をコードする核酸配列をさらに含む、ポリヌクレオチドおよびそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、配列番号１７または配列番号１８に記載のアミノ酸配列をコードする核酸配列は、配列番号２１に記載の核酸配列のＮ末端側である。
【０１６１】
一実施態様では、ＲＯＢＯ２の細胞外ドメインおよび免疫グロブリンＦｃドメインは、別個のポリヌクレオチドによってコードされる。あるいは、ＲＯＢＯ２の細胞外ドメインおよび免疫グロブリンＦｃドメインは両方とも、単一のポリヌクレオチドによってコードされる。
【０１６２】
任意のそのような配列と相補的なポリヌクレオチドもまた、本開示によって包含される。ポリヌクレオチドは、単鎖（コーディングまたはアンチセンス）または二本鎖であってもよく、ＤＮＡ（組換え、ｃＤＮＡまたは合成）またはＲＮＡ分子であってもよい。ＲＮＡ分子は、イントロンを含有し１対１の様式でＤＮＡ分子に対応するｈｎＲＮＡ分子、およびイントロンを含有しないｍＲＮＡ分子を含む。さらなるコーディングまたはノンコーディング配列は、そうである必要はないが、本開示のポリヌクレオチド内に存在してもよく、ポリヌクレオチドは、そうである必要はないが、他の分子および／または支持材料と連結されていてもよい。
【０１６３】
ポリヌクレオチドは、生来の配列（すなわち、野生型配列）を含んでもよく、またはそのような配列の生来ではないもの（すなわち、バリアント）を含んでもよい。ポリヌクレオチドバリアントは、コードされるポリペプチドのＳＬＩＴ結合能が生来の分子と比べて低下しないような、１つまたは複数の置換、付加、欠失および／または挿入を含有する。コードされるポリペプチドのＳＬＩＴ結合活性に対する影響は一般に、本明細書に記載されている通りアセスメントすることができる。いくつかの実施形態では、バリアントは、ＲＯＢＯ２およびＦｃドメインの生来の（野生型）配列を含む組換えＲＯＢＯ２−Ｆｃタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％の同一性、いくつかの実施形態では、少なくとも約８０％の同一性、いくつかの実施形態では、少なくとも約９０％の同一性、およびいくつかの実施形態では、少なくとも約９５％の同一性を示す。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、バリアントは、配列番号１に記載の番号付けによるアミノ酸残基１〜２０３の少なくとも２０、少なくとも１９、少なくとも１８、少なくとも１７、少なくとも１６、少なくとも１５、少なくとも１４、少なくとも１３、少なくとも１２、少なくとも１１、少なくとも１０、少なくとも９、少なくとも８、少なくとも７、少なくとも６、少なくとも５、少なくとも４、少なくとも３、少なくとも２、または少なくとも１アミノ酸置換を有するアミノ酸残基を含む組換えＲＯＢＯ２タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、バリアントは、配列番号１に記載の番号付けによるアミノ酸残基１〜２０３の少なくとも５アミノ酸置換を有するアミノ酸残基を含む組換えＲＯＢＯ２タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、バリアントは、配列番号１に記載の番号付けによるアミノ酸残基１〜２０３の少なくとも４アミノ酸置換を有するアミノ酸残基を含む組換えＲＯＢＯ２タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、バリアントは、配列番号１に記載の番号付けによるアミノ酸残基１〜２０３の少なくとも３アミノ酸置換を有するアミノ酸残基を含む組換えＲＯＢＯ２タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、バリアントは、配列番号１に記載の番号付けによるアミノ酸残基１〜２０３の少なくとも２アミノ酸置換を有するアミノ酸残基を含む組換えＲＯＢＯ２タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、バリアントは、配列番号１に記載の番号付けによるアミノ酸残基１〜２０３の少なくとも１アミノ酸置換を有するアミノ酸残基を含む組換えＲＯＢＯ２タンパク質をコードする。これらの量は限定を意図するものではなく、列挙されたパーセンテージ間の増分は、本開示の一部として明確に想定される。
【０１６５】
２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、以下に記載のように、対応が最大になるようにアラインメントしたときにその２つの配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸の配列が同じであれば、「同一」であると言われる。２つの配列間の比較は典型的には、配列を比較ウィンドウ上で比較して、配列類似性の局所的な領域を特定および比較することによって実施される。本明細書で使用される「比較ウィンドウ」は、その中のある配列が、同じ数の連続的な位置の参照配列と、２つの配列が最適にアラインメントされた後に比較され得る、少なくとも約２０の、通常は５０〜約４５０、または１００〜約３００の、連続的な位置のセグメントを指す。
【０１６６】
比較のための配列の最適なアラインメントは、バイオインフォマティクスソフトウェアのＬａｓｅｒｇｅｎｅ（登録商標）スイート（ＤＮＡＳＴＡＲ（登録商標），Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（登録商標）プログラムを使用して、デフォルトパラメーターを使用して行うことができる。このプログラムは、以下の参考文献において記載されているいくつかのアラインメントスキームを包含する：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．、１９７８、Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（編）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ  Ｖｏｌ．５、Ｓｕｐｐｌ．３、ｐｐ．３４５〜３５８；Ｈｅｉｎ  Ｊ．、１９９０、Ｕｎｉｆｉｅｄ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ  ｐｐ．６２６〜６４５  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．１８３、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ；  Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．およびＳｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．、１９８９、ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１〜１５３；Ｍｙｅｒｓ，  Ｅ．Ｗ．およびＭｕｌｌｅｒ  Ｗ．、１９８８、ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１〜１７；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．、１９７１、Ｃｏｍｂ．Ｔｈｅｏｒ．１１：１０５；  Ｓａｎｔｏｕ，Ｎ．、Ｎｅｓ，Ｍ．、１９８７、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４：４０６〜４２５；  Ｓｎｅａｔｈ，Ｐ．Ｈ．Ａ．およびＳｏｋａｌ，Ｒ．Ｒ．、１９７３、Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ｔｈｅ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ、Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ；  Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．、１９８３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：７２６〜７３０。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、「配列同一性のパーセンテージ」は、少なくとも２０の位置の比較ウィンドウ上で２つの最適にアラインメントされた配列を比較することによって決定され、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の一部は、参照配列（これは付加または欠失を含まない）と比較して、２つの配列の最適なアラインメントに関して、２０パーセント以下、通常５〜１５パーセント、または１０〜１２パーセントの付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでいてもよい。パーセンテージは、両配列において同一な核酸塩基またはアミノ酸残基が存在する位置の数を決定して、一致した位置の数を得、一致した位置の数を、参照配列中の位置の合計数（すなわち、ウィンドウサイズ）で割り、結果に１００を乗じて配列同一性パーセントを得ることによって算出される。
【０１６８】
バリアントはさらに、または代替として、生来の遺伝子、またはその一部もしくは相補体と実質的に相同であってもよい。そのようなポリヌクレオチドバリアントは、ＲＯＢＯ２およびＦｃドメインの生来の（野生型）配列（または相補的配列）を含む組換えＲＯＢＯ２−Ｆｃタンパク質をコードする、天然に存在するＤＮＡ配列と、中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる。
【０１６９】
好適な「中程度にストリンジェントな条件」は、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中で予洗すること；５０℃〜６５℃、５×ＳＳＣで終夜ハイブリダイズさせること；続いて０．１％ＳＤＳを含有する２×、０．５×および０．２×ＳＳＣのそれぞれで２０分間６５℃で２回洗浄することを含む。
【０１７０】
本明細書で使用される場合、「高度にストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー条件」は、（１）洗浄に低イオン強度および高温、例えば５０℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを用いる；（２）ハイブリダイゼーション中に変性剤、例えば、４２℃でのホルムアミド、例えば、０．１％ウシ血清アルブミンを含む５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド／０．１％フィコール／０．１％ポリビニルピロリドン／７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを含むｐＨ６．５の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液などを用いる；または（３）４２℃での５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハート液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍＬ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％硫酸デキストランを用い、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中４２℃で洗浄および５５℃で５０％ホルムアミドで洗浄し、続いて５５℃でのＥＤＴＡを含有する０．１×ＳＳＣからなる高ストリンジェンシー洗浄を行う条件である。当業者は、プローブ長などの因子を適応させるために必要に応じて、温度、イオン強度などをどのように調整するかを認識するであろう。
【０１７１】
遺伝子コードの縮重の結果として、本明細書に記載されているアミノ酸配列を含むＲＯＢＯ２−Ｆｃポリペプチドをコードする多くのヌクレオチド配列が存在することが、当業者には理解されるであろう。これらのポリヌクレオチドの一部は、任意の生来の遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小限の相同性を有する。それでもやはり、コドン使用頻度の差異のために様々に異なるポリヌクレオチドが、本開示によって明確に意図される。さらに、本発明において提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子は、本開示の範囲内である。対立遺伝子は、ヌクレオチドの欠失、付加、および／または置換などの１つまたは複数の変異の結果として変更される内因性の遺伝子である。得られたｍＲＮＡおよびタンパク質は、そうである必要はないが、変更された構造または機能を有してもよい。対立遺伝子は、標準的な技術（ハイブリダイゼーション、増幅および／またはデータベース配列比較など）を使用して同定することができる。
【０１７２】
本発明はまた、特定の細胞における発現を最大化するように核酸配列が最適化されているコドン最適化ポリヌクレオチドを含む。一般に、コドン最適化は、生来の配列の少なくとも１つのコドン（例えば約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０もしくはそれ以上の、またはこれらの数を超えるコドン）を、生来のアミノ酸配列を維持しながら、その宿主細胞の遺伝子においてより高頻度でまたは最も高頻度で使用されているコドンと置き換えることによって、対象とする宿主細胞における発現増強のために核酸配列を修飾するプロセスを指す。様々な種が、特定のアミノ酸のある特定のコドンに対して特定のバイアスを示す。コドンバイアス（生物間でのコドン使用頻度の差異）は多くの場合、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率と相互に関連しており、そして次に、とりわけ、翻訳されているコドンの性質および特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存していると考えられる。選択されたｔＲＮＡが細胞中に圧倒的に多く存在することは、一般に、ペプチド合成において最も高頻度で使用されるコドンを反映している。したがって、遺伝子は、コドン最適化に基づいて、所与の生物における最適な遺伝子発現に合わせて調整することができる。コドン使用頻度表は容易に利用可能であり、これらの表はいくつかの方式で適合させることができる（例えば、Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．ら、「Ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ  ｔａｂｕｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａｂａｓｅｓ：ｓｔａｔｕｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｙｅａｒ  ２０００」Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：２９２（２０００））。特定の宿主細胞における発現のために特定の配列をコドン最適化するためのコンピュータアルゴリズムもまた利用可能であり、例えば、Ｇｅｎｅ  Ｆｏｒｇｅ（Ａｐｔａｇｅｎ；Ｊａｃｏｂｕｓ，Ｐａ．）などもまた利用可能である。いくつかの実施形態では、組換えＲＯＢＯ２−Ｆｃタンパク質をコードする配列における１つまたは複数のコドン（例えば１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、もしくはそれ以上の、またはすべてのコドン）が、特定のアミノ酸に関して最も高頻度で使用されるコドンに対応する。
【０１７３】
よって、一態様では、修飾された核酸配列は、他の点では同一な細胞における例えばＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２（配列番号２１）をコードする核酸の野生型核酸配列からの組換えＲＯＢＯ２タンパク質の発現と比較して、細胞における組換えＲＯＢＯ２タンパク質を検出可能なより高レベルに発現させる。これは、「発現が最適化された」または「発現が増強された」核酸、または単に、「修飾された核酸」と称することができる。
【０１７４】
本明細書において互いに交換可能に称される「最適化された」または「コドン最適化された」は、例えば、低頻度コドンの使用頻度を最小限にすること、ＣｐＧジヌクレオチドの数を減少させること、潜在的なスプライス供与部位またはアクセプター部位を除去すること、Ｋｏｚａｋ配列を除去すること、リボソーム進入部位を除去することなどによって、コーディング配列の発現を増加させるように、野生型コーディング配列（例えば、ヒトＲＯＢＯ２および／またはヒトＦｃドメインのコーディング配列）と比べて最適化されているコーディング配列を指す。
【０１７５】
修飾の例としては、１つまたは複数のｃｉｓ作用性モチーフの排除および１つまたは複数のＫｏｚａｋ配列の導入が挙げられる。一実施形態では、１つまたは複数のｃｉｓ作用性モチーフが排除され、１つまたは複数のＫｏｚａｋ配列が導入される。
【０１７６】
排除され得るｃｉｓ作用性モチーフの例としては、内部のＴＡＴＡボックス；カイ部位；リボソーム進入部位；ＡＲＥ、ＩＮＳ、および／またはＣＲＳ配列要素；リピート配列および／またはＲＮＡ二次構造；（潜在的な）スプライス供与部位および／またはアクセプター部位、分岐点；およびＳａｌＩが挙げられる。
【０１７７】
一実施形態では、ＧＣ含有量（例えば、核酸配列中に存在するＧおよびＣヌクレオチドの数）は、野生型ＲＯＢＯ２および／または本発明の新規なＲＯＢＯ２タンパク質のヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメイン遺伝子配列と比べて高められる。ＧＣ含有量は、野生型遺伝子（例えば、配列番号２１）よりも、好ましくは少なくとも５％、より好ましくは、少なくとも６％、いっそうより好ましくは、少なくとも７％、さらにより好ましくは、少なくとも８％、より好ましくは、少なくとも９％、さらにより好ましくは、少なくとも１０％、いっそうより好ましくは、少なくとも１２％、さらにより好ましくは、少なくとも１４％、いっそうより好ましくは、少なくとも１５％、より好ましくは、少なくとも１７％、さらにより好ましくは、少なくとも２０％、さらにより好ましくは、少なくとも３０％、いっそうより好ましくは、少なくとも４０％、より好ましくは、少なくとも５０％、さらにより好ましくは、少なくとも６０％、最も好ましくは、少なくとも７０％高い。
【０１７８】
別の実施形態では、ＧＣ含有量は、配列中のＧ（グアニン）およびＣ（シトシン）ヌクレオチドのパーセンテージとして表される。すなわち、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２（配列番号２１）をコードする野生型核酸のＧＣ含有量は、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２をコードするコドン最適化された核酸配列のＧＣ含有量より少ない。
【０１７９】
一実施形態では、本発明の修飾された核酸のＧＣ含有量は、配列番号２１の核酸配列を含むＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２をコードする野生型核酸のＧＣ含有量より多い。当業者は、核酸コードの縮重を知っているため、タンパク質をコードする核酸の配列に関係なく、それから発現されるＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２のアミノ酸配列は、好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列であることを理解するであろう。
【０１８０】
ＣｐＧジヌクレオチドのメチル化は、真核生物における遺伝子発現の制御において重要な役割を果たすことが知られている。詳細には、真核生物におけるＣｐＧジヌクレオチドのメチル化は本質的に、転写機構に干渉することによって遺伝子発現をサイレンシングするように作用する。したがって、ＣｐＧモチーフのメチル化によって誘起された遺伝子サイレンシングのために、ＣｐＧジヌクレオチド数が減少した本発明の核酸およびベクターは、長期間持続する高い導入遺伝子発現レベルをもたらすであろう。
【０１８１】
潜在的なＣｐＧアイランドは、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｏｒｇ／ｓｍｓ２／ｃｐｇ＿ｉｓｌａｎｄｓ．ｈｔｍｌにおいて見出される公開されているソフトウェアを使用して同定することができる。ＣｐＧ  Ｉｓｌａｎｄｓソフトウェアは、潜在的なＣｐＧアイランドを同定するための当技術分野において周知の多くの他の方法のなかでも、Ｇａｒｄｉｎｅｒ−ＧａｒｄｅｎおよびＦｒｏｍｍｅｒ、１９８７、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６（２）：２６１〜２８２に記載されている方法を使用して、潜在的なＣｐＧアイランド領域を報告することができる。配列にわたり１ｂｐ間隔で移動する２００塩基対（ｂｐ）ウィンドウを使用して、計算を行うことができる。ＣｐＧアイランドは、Ｏｂｓ／Ｅｘｐ値が０．６より大きく、ＧＣ含有量が５０％より多い配列範囲と定義される。ウィンドウにおけるＣｐＧ二量体の予期される数は、ウィンドウ内の「Ｃ」の数にウィンドウ内の「Ｇ」の数を掛け、ウィンドウの長さで割ったものの数として算出することができる。よって、核酸配列中に存在する潜在的なＣｐＧアイランドは、問題となっている配列を、ソフトウェアが示すウィンドウに入力すること（「未処理配列または１つもしくは複数のＦＡＳＴＡ配列を下のテキストエリアに貼り付けてください。入力限界は１０００００文字です。（Ｐａｓｔｅ  ｔｈｅ  ｒａｗ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｒ  ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ  ＦＡＳＴＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｔｅｘｔ  ａｒｅａ  ｂｅｌｏｗ．Ｉｎｐｕｔ  ｌｉｍｉｔ  ｉｓ  １０００００  ｃｈａｒａｃｔｅｒｓ．）」という指示によって示される）によって、容易に決定することができる。ＣｐＧアイランドは脊椎動物遺伝子の５’領域中に見出されることが多いため、このプログラムを使用して、ゲノム配列中の潜在的な遺伝子を浮き彫りにすることができる。
【０１８２】
本開示のポリヌクレオチドは、化学合成、組換え法、またはＰＣＲを使用して得ることができる。化学的なポリヌクレオチド合成の方法は、当技術分野において周知であり、本明細書において詳細に記載される必要はない。当業者は本明細書で示されている配列および市販のＤＮＡ合成装置を使用して、所望のＤＮＡ配列を製造することができる。
【０１８３】
組換え法を使用してポリヌクレオチドを調製するために、本明細書でさらに論じられているように、所望の配列を含むポリヌクレオチドを適したベクター中に挿入することができ、このベクターを次は、複製および増幅に好適な宿主細胞中に導入することができる。ポリヌクレオチドは、当技術分野において公知の任意の手段によって、宿主細胞中に挿入することができる。細胞は、直接取り込み、エンドサイトーシス、トランスフェクション、Ｆ因子による接合またはエレクトロポレーションにより外因性ポリヌクレオチドを導入することによって形質転換させる。導入されたら、外因性ポリヌクレオチドは、非組込みベクター（プラスミドなど）として、または宿主細胞ゲノム中に組み込まれて、細胞内に維持することができる。そのように増幅されたポリヌクレオチドは、当技術分野内で周知の方法によって宿主細胞から単離することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９を参照されたい。
【０１８４】
あるいは、ＰＣＲによりＤＮＡ配列を複製することができる。ＰＣＲ技術は、当技術分野において周知であり、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，８００，１５９号、同第４，７５４，０６５号および同第４，６８３，２０２号、ならびにＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ、Ｍｕｌｌｉｓら編、Ｂｉｒｋａｕｓｗｅｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、１９９４において記載されている。
【０１８５】
ＲＮＡは、適切なベクターにおいて単離ＤＮＡを使用し、それを好適な宿主細胞中に挿入することによって得ることができる。細胞が複製し、ＤＮＡがＲＮＡに転写される場合、次いで、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９に記載されているような当業者に周知の方法を使用して、ＲＮＡを単離することができる。
【０１８６】
好適なクローニングベクターは、標準的な技術に従って構築することができ、または当技術分野において利用可能な多数のクローニングベクターから選択することができる。選択されるクローニングベクターは、使用されることが意図される宿主細胞によって様々になり得るが、有用なクローニングベクターは一般に自己複製能を有するはずであり、特定の制限エンドヌクレアーゼの単一の標的を有してもよく、および／またはベクターを含有するクローンを選択するのに使用することができるマーカーの遺伝子を保有してもよい。好適な例としては、プラスミドおよび細菌ウイルス、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（例えば、ｐＢＳ  ＳＫ＋）およびその誘導体、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ＲＰ４、ファージＤＮＡ、ならびにシャトルベクター、例えばｐＳＡ３およびｐＡＴ２８などが挙げられる。これらのおよび多くの他のクローニングベクターは、民間の販売業者、例えば、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎなどから入手可能である。
【０１８７】
発現ベクターをさらに記載する。発現ベクターは概して、本開示によるポリヌクレオチドを含有する複製可能なポリヌクレオチド構築物である。発現ベクターは、エピソームまたは染色体ＤＮＡの一体化した部分のいずれかとして、宿主細胞において複製可能でなければならないことが含意される。好適な発現ベクターは、プラスミド、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスを含むウイルスベクター、コスミド、およびＰＣＴ公開番号ＷＯ８７／０４４６２において開示されている発現ベクターを含むがこれらに限定的されない。ベクター構成成分は一般に、以下：シグナル配列；複製起点；１つまたは複数のマーカー遺伝子；好適な転写調節エレメント（プロモーター、エンハンサーおよびターミネーターなど）の１つまたは複数を含み得るがこれらに限定されない。発現（すなわち、翻訳）のために、１つまたは複数の翻訳調節エレメント、例えば、リボソーム結合部位、翻訳開始部位、および終止コドンなどもまた通常必要とされる。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号２１に記載の核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号２１に記載の核酸分子、および配列番号１７または配列番号１８に記載のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、配列番号１７または配列番号１８に記載のアミノ酸配列をコードする核酸配列は、配列番号２１に記載の核酸配列のＮ末端側である。
【０１８９】
目的のポリヌクレオチドを含有するベクターおよび／またはポリヌクレオチド自体は、エレクトロポレーション、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、または他の物質を用いるトランスフェクション；微粒子銃；リポフェクション；および感染（例えば、ベクターがワクシニアウイルスなどの感染性病原体である場合）を含むいくつかの適切な手段のいずれかによって、宿主細胞中に導入することができる。ベクターまたはポリヌクレオチド導入の選択は多くの場合、宿主細胞の特徴に依存するであろう。
【０１９０】
例示的な宿主細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、酵母細胞、昆虫細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞が挙げられる。好ましい宿主細胞としては、当技術分野において周知の多くの細胞のなかでも、ＣＨＯ細胞、ヒト胚性腎（ＨＥＫ）２９３細胞、またはＳｐ２．０細胞が挙げられる。
【０１９１】
宿主細胞は、コードされる組換えＲＯＢＯ２タンパク質を発現させることができる条件下で培養され得る。いくつかの実施形態では、コードされる組換えＲＯＢＯ２−Ｆｃタンパク質は、配列番号１７に記載のＲＯＢＯ２リーダー配列または配列番号１８に記載のＩｇリーダー配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＯＢＯ２リーダー配列（配列番号１７）は、タンパク質産生の間に切断されて成熟ＲＯＢＯ２−Ｆｃを生成する。いくつかの実施形態では、Ｉｇリーダー配列（配列番号１８）は、タンパク質産生の間に切断されて成熟ＲＯＢＯ２−Ｆｃ、例えば、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２を生成する。
【０１９２】
４．製剤および使用
本発明の組換えＲＯＢＯ２タンパク質は、医薬組成物として製剤化することができる。医薬組成物は、凍結乾燥製剤または水性液剤の形態で、薬学的に許容できる担体、賦形剤、および／または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  第２０版、２０００、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＷｉｌｋｉｎｓ編  Ｋ．Ｅ．Ｈｏｏｖｅｒ）をさらに含んでもよい。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容できる担体」または「薬学的に許容できる賦形剤」は、活性成分と組み合わせた場合、その成分が生物学的活性を保持することができ、かつ対象の免疫系と反応しない、任意の材料を含む。例として、標準的な医薬担体、例えば、リン酸緩衝塩類溶液、水、油／水型エマルジョン剤などのエマルジョン剤、および様々なタイプの湿潤剤などのいずれかが挙げられるがこれらに限定的されない。エアロゾルまたは非経口投与用に好ましい希釈剤は、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）または生理（０．９％）食塩水である。そのような担体を含む組成物は、周知の従来の方法によって製剤化される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９９０；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、２０００を参照されたい）。
【０１９３】
許容できる担体、賦形剤、または安定剤は、その投薬量および濃度で受容者に対して非毒性であり、リン酸、クエン酸、および別の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸およびメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリシンなどのアミノ酸；単糖、二糖、およびグルコース、マンノース、またはデキストランを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩を形成する対イオン；金属複合体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；および／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含んでいてもよい。薬学的に許容できる賦形剤は、本明細書においてさらに記載されている。
【０１９４】
診断的使用
本発明の組換えＲＯＢＯ２タンパク質は、様々な治療上または診断上の目的のために使用することができる。例えば、本発明の組換えＲＯＢＯ２タンパク質は、親和性精製剤（例えば、ＳＬＩＴ２などのＳＬＩＴリガンドのインビトロ精製のために）として、診断薬（例えば、ＳＬＩＴリガンドの発現を検出するため（例えば、特定の細胞、組織、または血清中のＳＬＩＴ２）として使用されてもよい。ＳＬＩＴ２などのＳＬＩＴリガンドのための例示的な診断アッセイは、例えば、患者から得られたサンプルを、組換えＲＯＢＯ２タンパク質が検出可能な標識またはレポーター分子で標識されている、本発明の組換えＲＯＢＯ２タンパク質と接触させることを含み得る。
【０１９５】
本発明は、サンプル、細胞、組織または患者におけるＳＬＩＴ２などのＳＬＩＴリガンドを可視化するための画像診断法としての、本明細書で開示されている組換えＲＯＢＯ２タンパク質の使用を包含する。例えば、組換えＲＯＢＯ２タンパク質は、組換えＲＯＢＯ２タンパク質の存在を検出し、それによりＳＬＩＴ２などのＳＬＩＴリガンドの存在を検出できるように、造影剤とコンジュゲートすることができる。
【０１９６】
治療的使用
本発明の組換えＲＯＢＯ２タンパク質の例示的な治療的使用は、糸球体疾患、巣状分節性糸球体疾患（ＦＳＧＳ）などの腎疾患を処置することを含む。本発明の組換えＲＯＢＯ２タンパク質はまた、予防的処置（例えば、疾患症状を示していないが糸球体疾患、ＦＳＧＳなどの腎疾患に罹患しやすい対象に投与すること）において使用されてもよい。
【０１９７】
別の態様では、本発明は、疾患、障害または状態の非存在下での尿中のタンパク質レベルと比較した、尿中のタンパク質レベルの増加によって媒介される、またはそれに関連した任意の障害、疾患または状態の処置を含む。そのような疾患、障害または状態は、ループス腎炎、ＩｇＡ腎症、膜性腎症（ＭＮ）、微小変化群（ＭＣＤ）、線維症（例えば、肝線維症など）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、タンパク尿、アルブミン尿、糸球体腎炎、糖尿病性腎症、ネフローゼ症候群、巣状糸球体硬化症、急性腎不全、急性尿細管間質性腎炎、腎盂腎炎、腎移植拒絶反応、および逆流性腎症を含むがこれらに限定されない。
【０１９８】
治療的用途のために、本発明の組換えＲＯＢＯ２タンパク質は、従来技術によって、例えば、静脈内に（ボーラスとして、またはある期間にわたる持続注入によって）、筋肉内に、腹腔内に、脳脊髄内に、皮下に、関節内に、滑液嚢内に、髄腔内に、経口的に、局所的に、または吸入などによって、哺乳動物、特にヒトに投与することができる。本発明の組換えＲＯＢＯ２タンパク質はまた、腫瘍内、腫瘍編縁部、病巣内、または病巣編縁部経路によって好適に投与することができる。
【０１９９】
したがって、一態様では、本発明は、ＲＯＢＯ２の活性を低下させる方法であって、それを必要とする対象（例えば、ヒト）に治療有効量の本発明の組換えＲＯＢＯ２タンパク質を投与するステップを含む、方法を提供する。
【０２００】
別の態様では、本発明は、足細胞機能を維持またはモジュレートする方法であって、それを必要とする対象（例えば、ヒト）に治療有効量の本発明の組換えＲＯＢＯ２タンパク質を投与するステップを含む、方法を提供する。
【０２０１】
ある特定の実施形態では、対象は、腎疾患に罹患しているかまたは罹患しやすい。ある特定の実施形態では、腎疾患は、糸球体疾患である。ある特定の実施形態では、腎疾患はＦＳＧＳである。
【０２０２】
ある特定の実施形態では、対象は、腎症に罹患しているかまたは罹患しやすい。
【０２０３】
別の態様では、本発明は、本明細書で開示されている処置方法において使用するための、本発明の組換えＲＯＢＯ２タンパク質を提供する。例えば、本発明は、細胞中のＲＯＢＯ２の活性を低下させる、対象においてＲＯＢＯ２の活性を低下させる、対象において足細胞機能を維持する、対象において足細胞機能をモジュレートする、対象において糸球体疾患を処置する、および対象において腎症を処置するのに使用するための、本発明の組換えＲＯＢＯ２タンパク質を提供する。
【０２０４】
さらなる態様では、本発明は、細胞においてＲＯＢＯ２の活性を低下させるため、対象においてＲＯＢＯ２の活性を低下させるため、対象において足細胞機能を維持するため、対象において足細胞機能をモジュレートするため、対象において糸球体疾患を処置するため、および対象において腎症を処置するための医薬の製造における、本発明の組換えＲＯＢＯ２タンパク質の使用を提供する。
【０２０５】
用量および投与
ある特定の実施形態では、本発明の組換えＲＯＢＯ２タンパク質は、皮下投与される。ある特定の実施形態では、本発明の組換えＲＯＢＯ２タンパク質は、静脈内投与される。
【０２０６】
医薬組成物は、それを必要としている対象に、腎疾患の重症度によって様々になり得る頻度で投与することができる。予防的療法の場合、頻度は、腎疾患に対する対象の感受性または素因に応じて変化し得る。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、単回用量として皮下または静脈内投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、複数用量として皮下または静脈内投与される。
【０２０７】
組成物は、必要とする患者に、ボーラスとしてまたは持続注入によって投与することができる。例えば、組換えＲＯＢＯ２タンパク質のボーラス投与は、０．００２５〜２００ｍｇ／ｋｇ体重、０．０２５〜０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．０１０〜０．１０ｍｇ／ｋｇまたは０．１０〜０．５０ｍｇ／ｋｇの量であり得る。持続注入では、組換えＲＯＢＯ２タンパク質は、０．００１〜２００ｍｇ／ｋｇ体重／分、０．０１２５〜１．２５ｍｇ／ｋｇ／分、０．０１０〜０．７５ｍｇ／ｋｇ／分、０．０１０〜１．０ｍｇ／ｋｇ／分、または０．１０〜０．５０ｍｇ／ｋｇ／分で、１〜２４時間、１〜１２時間、２〜１２時間、６〜１２時間、２〜８時間、または１〜２時間にわたって投与され得る。
【０２０８】
組換えＲＯＢＯ２タンパク質の投与では、投薬量は、約１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇまで、約２ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇまで、約３ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇまで、約４ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇまで、約５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇまで、約１ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇまで、約２ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇまで、約３ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇまで、約４ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇまで、約５ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇまで、約１ｍｇ／ｋｇ以上、約２ｍｇ／ｋｇ以上、約３ｍｇ／ｋｇ以上、約４ｍｇ／ｋｇ以上、約５ｍｇ／ｋｇ以上、約６ｍｇ／ｋｇ以上、約７ｍｇ／ｋｇ以上、約８ｍｇ／ｋｇ以上、約９ｍｇ／ｋｇ以上、約１０ｍｇ／ｋｇ以上、約１１ｍｇ／ｋｇ以上、約１２ｍｇ／ｋｇ以上、約１３ｍｇ／ｋｇ以上、約１４ｍｇ／ｋｇ以上、約１５ｍｇ／ｋｇ以上、約１６ｍｇ／ｋｇ以上、約１７ｍｇ／ｋｇ以上、約１９ｍｇ／ｋｇ以上、または約２０ｍｇ／ｋｇ以上であり得る。投与の頻度は、状態の重症度に依存するであろう。頻度は、１週間に３回から２週間または３週間ごとに１回までの範囲であり得る。
【０２０９】
加えて、組成物は、皮下注射によって患者に投与することができる。例えば、１〜２００ｍｇの用量の組換えＲＯＢＯ２タンパク質を、１週間に２回、１週間に１回、２週間ごとに１回、３週間ごとに１回、４週間ごとに１回、５週間ごとに１回、６週間ごとに１回、７週間ごとに１回、８週間ごとに１回、９週間ごとに１回、１０週間ごとに１回、１カ月に２回、１カ月に１回、２カ月ごとに１回、または３カ月ごとに１回、投与される皮下または静脈内注射によって患者に投与することができる。
【０２１０】
ある特定の実施形態では、ヒトにおける組換えＲＯＢＯ２タンパク質の半減期は、約２４時間、約２日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１３日、約１４日、約１５日、約１６日、約１７日、約１８日、約１９日、約２０日、約２１日、約２２日、約２３日、約２４日、約２５日、約２６日、約２７日、約２８日、約２９日、約３０日、約５日から約４０日まで、約５日から約３５日まで、約５日から約３０日まで、約５日から約２５日まで、約１０日から約４０日まで、約１０日から約３５日まで、約１０日から約３０日まで、約１０日から約２５日まで、約１５日から約４０日まで、約１５日から約３５日まで、約１５日から約３０日まで、または約１５日から約２５日までである。
【０２１１】
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、２〜６週間ごとに、約０．１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇまで、約０．５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇまで、約１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇまで、約１．５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇまで、約２ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇまで、約０．１ｍｇ／ｋｇから約８ｍｇ／ｋｇまで、約０．５ｍｇ／ｋｇから約８ｍｇ／ｋｇまで、約１ｍｇ／ｋｇから約８ｍｇ／ｋｇまで、約１．５ｍｇ／ｋｇから約８ｍｇ／ｋｇまで、約２ｍｇ／ｋｇから約８ｍｇ／ｋｇまで、約０．１ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇまで、約０．５ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇまで、約１ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇまで、約１．５ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇまで、約２ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇまで、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１．０ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２．０ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ、約３．０ｍｇ／ｋｇ、約３．５ｍｇ／ｋｇ、約４．０ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇ、約５．０ｍｇ／ｋｇ、約５．５ｍｇ／ｋｇ、約６．０ｍｇ／ｋｇ、約６．５ｍｇ／ｋｇ、約７．０ｍｇ／ｋｇ、約７．５ｍｇ／ｋｇ、約８．０ｍｇ／ｋｇ、約８．５ｍｇ／ｋｇ、約９．０ｍｇ／ｋｇ、約９．５ｍｇ／ｋｇ、または約１０．０ｍｇ／ｋｇの用量で皮下または静脈内投与される。
【０２１２】
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、２〜６週間ごとに、約３．０ｍｇ／ｋｇの用量で皮下または静脈内投与される。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、２〜６週間ごとに、約２．０ｍｇ／ｋｇから約１０．０ｍｇ／ｋｇまでの用量で皮下または静脈内投与される。
【０２１３】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、毎週または２週間ごとに、約２５ｍｇ、５０ｍｇ、７５ｍｇ、１００ｍｇ、１２５ｍｇ、１５０ｍｇ、１７５ｍｇ、２００ｍｇ、２２５ｍｇ、２５０ｍｇ、２７５ｍｇ、または３００ｍｇの用量で皮下または静脈内投与される。
【０２１４】
例示的な一実施形態では、医薬組成物は、毎週または２週間ごとに皮下投与される。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、毎週、約２ｍｇ／ｋｇの用量で皮下投与される。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、毎週、約１５０ｍｇの用量で皮下投与される。
【０２１５】
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、２〜６週間ごとに、約１０．０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内または皮下投与される。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、２〜６週間ごとに、約１．０ｍｇ／ｋｇから約１０．０ｍｇ／ｋｇまでの用量で皮下または静脈内投与される。
【０２１６】
例示的な一実施形態では、医薬組成物は、毎月、静脈内投与される。
【０２１７】
本発明の組換えＲＯＢＯ２タンパク質は、単独療法として、または例えば腎疾患を処置するための他の療法と組み合わせて使用することができる。腎疾患を処置するための他の療法は、当技術分野において周知であり、本明細書中には列挙されていない。
【０２１８】
５．キット
本発明はまた、本発明の組換えＲＯＢＯ２タンパク質、および使用説明書を含む、キットまたは製造物品を提供する。したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、容器、組換えＲＯＢＯ２タンパク質を含む容器内の組成物、およびそれを必要とする患者を処置するために治療有効量の組換えＲＯＢＯ２タンパク質を投与するという指示を含有する添付文書を含む、キットまたは製造物品を提供する。
【０２１９】
ある特定の実施形態では、キットは、乾燥タンパク質が入った第１の容器および水性製剤が入った第２の容器の両方を含有することができる。ある特定の実施形態では、単室および複室の充填済みシリンジ（例えば、液体シリンジおよびリオシリンジ（ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅ））を含有するキットが含まれる。
【０２２０】
本発明の組換えＲＯＢＯ２タンパク質の使用に関する指示は一般に、投薬量、投与スケジュール、および意図される処置のための投与経路に関する情報を含む。容器は、単位用量、バルク包装（例えば、複数用量包装）または単位用量未満用であり得る。本発明のキットにおいて提供される指示は、典型的には、ラベルまたは添付文書（例えば、キット中に含まれる紙のシート）上の書面による指示であるが、機械可読な指示（例えば、磁気または光学記憶ディスクに記憶されている指示）もまた提供される。
【０２２１】
本発明のキットは、好適に包装されている。好適な包装は、バイアル、瓶、広口瓶、フレキシブル包装（例えば、密封されたマイラーバックまたはビニール袋）などを含むがこれらに限定されない。特定のデバイス、例えば、吸入器、経鼻投与デバイス（例えば、噴霧器）または注入デバイス、例えば、ミニポンプなどと組み合わせて使用するための包装もまた企図される。キットは、無菌のアクセスポートを有してもよい（例えば容器は、静脈内注射用溶液バッグまたは皮下注射針によって貫通可能な栓を有するバイアルであってもよい）。容器もまた、無菌のアクセスポートを有してもよい（例えば容器は、静脈内注射用溶液バッグまたは皮下注射針によって貫通可能な栓を有するバイアルであってもよい）。容器は、第２の薬学的に活性な作用物質をさらに含んでもよい。
【０２２２】
キットは、さらなる構成成分、例えば、緩衝剤および説明的な情報などを提供していてもよい。通常、キットは、容器および容器表面のまたは容器に関連したラベルまたは添付文書を含む。
【０２２３】
６．生物学的材料の寄託
本発明の代表的な材料は、米国微生物系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．２０１１０−２２０９、米国）において、２０１７年２月２３日に寄託された。ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２４００８を有するベクターＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２は、配列番号１をコードするＤＮＡインサートを含む。寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約およびそれに付属する規則（ブダペスト条約）の規定のもとで行われた。これは、寄託物の製造可能な培養物の維持を、寄託日から３０年間保証する。寄託物は、ブダペスト条約の条項のもとで、かつ、関連する米国特許が発行されるときまたは任意の米国もしくは外国特許出願が一般公開されるときのいずれか先に来る時点で、寄託物の培養物の後代が、永続的かつ制限なく一般に利用可能となることを保証する、Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．とＡＴＣＣとの間の合意を条件として、ＡＴＣＣが利用可能となり、米国特許法第１２２条およびそれに従う施行規則（８８６  ＯＧ  ６３８を特に参照して米国特許規則第１．１４条を含む）により、米国特許商標庁長官からその権利を有すると決定された者が、後代を使用できることを保証する。
【０２２４】
本出願の出願人であるＰｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．は、寄託された材料の培養物が、好適な条件下で培養された場合に死滅するまたは紛失されるまたは破壊されるようなことがあれば、材料は、通知があり次第直ちに別の同材料と置き換えられることに合意している。寄託された材料の利用可能性は、任意の政府の管轄下でその特許法に従って与えられた権利に違反して本発明を実施する許諾と解釈されるものではない。
【実施例】
【０２２５】
例示的な方法および材料を本明細書に記載するが、本明細書に記載されているものと同様の又は等価の方法および材料もまた、本発明の実施または試験において使用することができる。材料、方法、および実施例は例示にすぎず、限定的であることを意図しない。
【０２２６】
（実施例１）
ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２の作製
複数のＲＯＢＯ２−Ｆｃ融合タンパク質のデザインを通じたＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２の選択
最適なＲＯＢＯ２−Ｆｃリガンドトラップを選択するために、様々な長さの、グリシン−セリン（ＧＳ）リンカーによってＩｇＧ１  Ｆｃドメインに融合されているＲＯＢＯ２細胞外ドメインからなる複数のタンパク質を作製した。研究により、ＲＯＢＯ１およびＲＯＢＯ２受容体では、それらのＩｇ１ドメインは、ＳＬＩＴリガンドのＤ２ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）ドメインに結合するのに十分であることが示された。ＲＯＢＯ２は、５つのＩｇドメイン（Ｉｇ１〜５）を含有する。選択基準としてまず、ＳＬＩＴ２に結合可能な最小のＲＯＢＯ２配列を有するＲＯＢＯ２−Ｆｃ融合タンパク質を作製することに注目し、次いで、その分子をＨＥＫ２９３細胞における組換えタンパク質発現用に最適化することに注目した。最初に、ＧＳリンカーを介してヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に融合されている、Ｉｇ１ドメイン（ＲＯＢＯ２−Ｆｃ１．０；配列番号５）、Ｉｇ１およびＩｇ２ドメイン（ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．０；配列番号３）、Ｉｇ１、Ｉｇ２、およびＩｇ３ドメイン（ＲＯＢＯ２−Ｆｃ３．０；配列番号６）、ならびにＩｇ１、Ｉｇ２、Ｉｇ３、およびＩｇ４ドメイン（ＲＯＢＯ２−Ｆｃ４．０；配列番号７）からなるポリペプチド配列の発現のために、４つのＤＮＡ構築物を作製した（表２３）。構築物の発現は、Ｉｇリーダー（配列番号１８）によって駆動される。ＲＯＢＯ２−Ｆｃ１．０、２．０および３．０タンパク質はＳＬＩＴ２に結合しなかった。ＲＯＢＯ２−Ｆｃ４．０は結合した。Ｆｃ融合体のＲＯＢＯ２部分を最小化するために、Ｉｇ１ドメインがＣ末端にＩｇ１−Ｉｇ２ドメイン間リンカー（配列番号１０）を含むバージョン（ＲＯＢＯ２−Ｆｃ１．１；配列番号４）を含めて、さらにタンパク質を作製した。別の構築物は、Ｉｇ１およびＩｇ２ドメインならびにＩｇ２−Ｉｇ３ドメイン間リンカー（ＶＦＥＲ（配列番号１２））（ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．１；配列番号２）を含んで関与した。Ｉｇ１−Ｉｇ２ドメインのＣ末端にＶＦＥＲ（配列番号１２）を付加してＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．１タンパク質を作出することにより、ＳＬＩＴ２に対する強固な結合が可能となった（図３）。ＲＯＢＯ２−Ｆｃ１．１はＳＬＩＴ２に結合しなかった。Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄを利用して、ＲＯＢＯ２−Ｆｃタンパク質を、抗ヒト−Ｆｃ（ＡＨＣ）センサー上に１０μｇ／ｍｌでロードし、１００ｎＭのＳＬＩＴ２とともに７分間インキュベートし、次いで、センサーをバッファー単独に６４０秒間移した。ＲＯＢＯ２−Ｆｃ４．０を、結合に関する陽性対照として含めた。
【０２２７】
ＨＥＫ２９３細胞におけるＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．１の組換えタンパク質発現は非常に少なかった（３μｇ／ｍｌ）。発現を増加させるために、ＲＯＢＯ２プレＩｇ１配列（配列番号８）を付加し、ＲＯＢＯ２リーダー配列（配列番号１７）もＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．１発現構築物に含めてＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２発現構築物を作出した。ＲＯＢＯ２リーダー配列（配列番号１７）は、タンパク質産生の間に切断されて成熟ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２を生成する。ＲＯＢＯ２プレＩｇ１配列（配列番号８）の付加は、他の点では同一な宿主細胞におけるプレＩｇ１配列ＳＲＬＲＱＥＤＦＰ（配列番号８）をコードしていない他の点では同一な発現構築物の発現と比較して、タンパク質発現を２５倍を超えて増加させた。増加した発現は、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２の生物学的活性に影響を及ぼさず、依然として高い親和性でＳＬＩＴ２と結合した（図３〜４Ａ〜Ｃ）。
【０２２８】
（実施例２）
ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２結合および中和活性の特徴付け
ＳＬＩＴ２−Ｎ結合、ＳＬＩＴ２−Ｎ結合の中和、およびＳＬＩＴｘ−Ｎ機能的活性の阻害に関して、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２を多くのアッセイにおいてスクリーニングした。ＳＬＩＴ２に対するＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２の結合を、２つの方式で、第１に、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、第２に、細胞ベースのフローサイトメトリーアッセイを使用して、アセスメントして、細胞で発現されるヒトＳＬＩＴ２−Ｎに対するＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２の結合を検出した。
【０２２９】
ＳＰＲ分析
ヒトＳＬＩＴ２は、カニクイザルＳＬＩＴ２と高レベルの相同性を共有しており、全体の相同性は９９％であり、ＲＯＢＯ２結合部位を含有するＳＬＩＴ２のロイシンリッチリピートドメイン２（Ｄ２）内の相同性は、１００％である。カニクイザルと同様に、ヒトおよびラットＳＬＩＴ２も高度の相同性を共有しており、全体のおよびＤ２結合ドメイン内の配列同一性は９７％である。Ｄ２領域を含有するヒトおよびラットＳＬＩＴ２のＮ末端断片（ＳＬＩＴ２−Ｎ）、ならびにヒトおよびカニクイザルの特定のＳＬＩＴ２  Ｄ２ドメイン（１００％同一）に対するＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２の結合をＳＰＲによってアセスメントした。速度論的漸増実験（図４Ａ〜４Ｃ）の各サイクルに関して、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２分子は、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２のヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域に結合する、Ｃ１チップに付着している抗ヒトＦｃ（ＡＨＦｃ）によって、非共有結合的に捕捉された。次いで、捕捉されたＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２を、様々な濃度のＳＬＩＴ２リガンドに曝露させて、会合および解離動態をモニタリングした。ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２は、２ｎＭに希釈した。ＨＢＳ−ＥＰを希釈剤として使用した。ヒト／カニクイザルＳＬＩＴ２−Ｄ２、ヒトＳＬＩＴ２−ＮおよびラットＳＬＩＴ２−Ｎを、それらの原液濃度からＨＢＳ−ＥＰＢ中で２ｎＭに希釈した。ＳＬＩＴ２リガンドに対して、希釈液としてＨＢＳ−ＥＰＢを使用して、２ｎＭから１５．６ｐＭの範囲で８段階の２倍希釈系列を実施した。ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２を、１０〜１５ＲＵ同等物の読取り値まで捕捉し、次いで、漸増する量の特定のＳＬＩＴ２分析物（すなわちヒト／カニクイザルＳＬＩＴ２−Ｄ２、ヒトＳＬＩＴ２−Ｎ、またはラットＳＬＩＴ２−Ｎ）に曝露させた。意図されるＳＬＩＴ２リガンドの会合を１２０秒間追跡し、解離を１８０秒間モニタリングした。速度論的速度定数の単純な１：１相互作用モデルを使用して、見かけの結合親和性を決定した。ヒト／カニクイザルＳＬＩＴ２−Ｄ２（ＲＯＢＯ２結合ドメイン、１００％同一）に対するＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２結合のＫＤは、０．２９３ｎＭであると決定された（図４Ａ）。ヒトＳＬＩＴ２−Ｎ（Ｎ末端断片）に対するＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２結合のＫＤは０．２７９ｎＭであると決定され（図４Ｂ）、最後に、ラットＳＬＩＴ２−Ｎに対するＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２結合のＫＤは０．５４３ｎＭであると決定された（図４Ｃ）。
【０２３０】
フローサイトメトリーアッセイ
ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２を、製造業者の使用説明書に従って、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（ＡＦ）６４７にコンジュゲートした。染色のための調製において、ヒトＳＬＩＴ２−Ｎを過剰発現するヒト胚性腎（ＨＥＫ２９３）を、５％ウシ胎児血清を含有するバッファー中に再懸濁させた。ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２−ＡＦ６４７で細胞を染色するために、２×ストックを調製し、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）バッファー中で１１〜１２段階の２倍希釈系列を作製した。細胞およびＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２−ＡＦ６４７の相当する希釈物を９６ウェルＵ底プレート中で合わせ、４℃で４５分間インキュベートした。インキュベーション後、１ウェル当たり１５０ｍＬのＦＡＣＳバッファーを添加して細胞を洗浄した。洗浄後、Ｆｏｒｔｅｓｓａ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒにおいてデータを取得するために、細胞をバッファー中に再懸濁した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用してデータを分析し、ＳＬＩＴ２−Ｎを発現しているＨＥＫ２９３細胞の幾何平均蛍光強度（Ｇｅｏ  ＭＦＩ）から対照ＨＥＫ２９３細胞のＧｅｏ  ＭＦＩを引いたものとして表した。ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２は、９ｎＭのＥＣ５０を有する高い親和性で、ＨＥＫ２９３細胞において過剰発現されるヒトＳＬＩＴ２−Ｎに用量依存的に結合する（図５）。
【０２３１】
均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）アッセイ
ＲＯＢＯ２−Ｆｃは、おそらくリガンドトラップとして作用することによって、細胞のＲＯＢＯ２受容体に対するＳＬＩＴ２などのＳＬＩＴリガンドの結合を阻害する。ＲＯＢＯ２−ＳＬＩＴｘ−Ｎ  ＨＴＲＦ色素標識アッセイを使用して、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２がヒトＲＯＢＯ２へのＳＬＩＴリガンドの結合を中和する能力をアセスメントした。このアッセイでは、テルビウム（Ｔｂ）標識された（ドナー）、ＳＮＡＰタグ付き（ＳＮＡＰタグ（登録商標）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ；Ｋｅｐｐｌｅｒら、２００３、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：８６もまた参照されたい）ヒトＲＯＢＯ２発現ＨＥＫ２９３細胞を、５ｎＭのｄ２標識（アクセプター）した様々な種由来のＳＬＩＴｘ−Ｎ（Ｃｉｓｂｉｏ  ｄ２色素標識キットを使用して製造業者の使用説明書に従って調製した）とともに、漸増する量のＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２の存在下で１時間インキュベートした。インキュベーション後、６６５ｎｍおよび６２０ｎｍでの蛍光を、Ｅｎｖｉｓｉｏｎマルチラベルプレートリーダーにおいて測定した。ＨＴＲＦ比は以下の通り算出した：６６５ｎｍでの蛍光／６２０ｎｍでの蛍光×１０，０００。最大シグナルは、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２の非存在下でのｄ２標識されたＳＬＩＴ２−Ｎを有するＴｂ標識されたＲＯＢＯ２細胞のＨＴＲＦ比と定義し、最小シグナルは、Ｔｂ標識されたＲＯＢＯ２発現ＨＥＫ２９３細胞だけのＨＴＲＦ比と定義した。ヒト、カニクイザル、ウサギ、ラットおよびマウスを含むいくつかの種由来の３つの異なるＳＬＩＴリガンド（ＳＬＩＴ１−Ｎ、ＳＬＩＴ２−ＮおよびＳＬＩＴ３−Ｎ）の中和を、アッセイにおいて使用した。最高濃度が４０００ｎＭの、１１段階の４倍希釈系列を使用して、各ＳＬＩＴｘ−ＮのＩＣ５０を決定した。３つの独立した実験間でのＩＣ５０の幾何平均を算出し、評価したすべてのリガンドについてまとめた（表２）。
【０２３２】
【表２】
2020522248.tif 000003
【０２３３】
ＨＴＲＦによってアセスメントされるＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２によるヒトＲＯＢＯ２に対する様々な種由来のＳＬＩＴリガンド結合の用量依存的な阻害。ヒト、カニクイザル、ウサギ、ラットまたはマウスＳＬＩＴリガンドのパネルに対して、ＨＴＲＦアッセイにおいて、１１段階の４倍用量漸増のＲＯＢＯ−Ｆｃ２．２を使用してＩＣ５０を決定した。ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２は、ヒトＲＯＢＯ２に対するヒト、カニクイザル、ウサギおよびラットＳＬＩＴ１−Ｎの結合の強力な中和剤であり、ＩＣ５０は５．９ｎＭ（ヒト）の最低値から９．８ｎＭ（ウサギ）の最高値の範囲であり；ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２はまた、ヒトＲＯＢＯ２に対するＳＬＩＴ２−Ｎ結合の用量依存的な阻害も実証し、ＩＣ５０は３．９ｎＭ（ヒト）から５．７ｎＭ（ウサギ）までの範囲であった。ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２は、ヒトＲＯＢＯ２に対するＳＬＩＴ３−Ｎ結合の強力な中和剤であり、ＩＣ５０は３．６ｎＭ（カニクイザル）から１０．２ｎＭ（ウサギ）までの範囲であった。最後に、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２は、ヒトＳＬＩＴ２−Ｎ：ヒトＲＯＢＯ２（図６Ａ）およびラットＳＬＩＴ２−Ｎ：ヒトＲＯＢＯ２（図６Ｂ）結合の両方の強力な中和剤であり、ＩＣ５０はそれぞれ７ｎＭまたは４ｎＭであった。
【０２３４】
神経細胞遊走アッセイ
最終選択スクリーニングは、ＲＯＢＯ２依存的ＳＬＩＴ２−Ｎ活性の機能中和であった。ＳＬＩＴ２−ＲＯＢＯ２相互作用は、発生の間の軸索の移動の重要な制御因子である。ＳＬＩＴ２は、脳室下帯ニューロンに対して化学反発性であること、およびこの活性はＲＯＢＯ２依存的であることが知られている。ラットの脳室下帯（ＳＶＺ）からの神経組織外植片を単離し、コラーゲンマトリックス中に包埋した。ＳＬＩＴ２−Ｎの存在下で、神経細胞遊走は阻害される（ＳＶＺアッセイ）ので、組織外植片を、漸増する量のＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２あり、またはなしで、１ｎＭのＳＬＩＴ２−Ｎの存在下でインキュベートした。インキュベーション後、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色した。１０×高ＮＡ対物を用いたＯｐｅｒｅｔｔａ  Ｈｉｇｈ  Ｃｏｎｔｅｎｔ  Ｉｍａｇｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で、広視野の蛍光画像を取得した。５％オーバーラップで１ウェル当たり９つの視野を取得してウェルの中心エリア全体を捕捉した。各面間の距離が１μｍの６面からなるＺスタックを各視野について取得して、組織外植片の厚さ全体を捕捉した。Ｖｏｌｏｃｉｔｙソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）において解析を行った。各ウェルにおけるすべての視野を継ぎ合わせた。中心にある組織外植片のエリアおよび組織外植片の外側のそれぞれの核を、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色によって検出した。個々の核を計数し、それぞれの核の中心から組織外植片の最も近い縁部までの距離をμｍ単位で測定した。各ウェルに関して、ウェル中での核の平均移動距離に核数を掛けて総移動距離を得た。ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２は、５１ｎＭのＩＣ５０で神経細胞遊走を用量依存的に回復させることができた（図７）。これらの結果により、ＳＶＺニューロンに関して、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２は、ＲＯＢＯ２に対するＳＬＩＴ２の結合を阻害することができるだけでなく、ＲＯＢＯ２依存性ＳＬＩＴ２化学反発活性に対して強力な用量依存的な中和作用も有することが実証される。
【０２３５】
（実施例３）
新規なＲＯＢＯ２タンパク質のインビボでの作用
受身ヘイマン腎炎は、糸球体足細胞に影響を及ぼし、タンパク尿の増加をもたらす腎毒性損傷のラットモデルである。このモデルを使用して、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２がタンパク尿を減少させる有効性をアセスメントした。ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２によるラットの処置はタンパク尿を減少させただけでなく、足細胞足突起構造も保護した。図８および図９で示されているように、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２の予防的または治療的投与レジメンのいずれかを用いたラットの処置は、タンパク尿の量を減少させた。Ｌｅｗｉｓラットに、ラット腎刷子縁に対して作製されたヒツジ抗血清（抗Ｆｘ１ａ（Ｐｒｏｂｅｔｅｘ  Ｉｎｃ）、基底膜および足細胞）を注射した。ラットは、ヒツジ血清に応答して免疫反応を起こした。補体活性化により、足細胞は足突起消失し、タンパク尿は３日目から１２日目の間に増加しその後プラトーに達した。この機序は、足細胞タンパク質ＰＬＡ２Ｒに対する自己抗体（症例の７０％において）が足細胞消失およびネフローゼ域のタンパク尿を引き起こしその後補体が関与する膜性腎症において見られるものとよく似ている。ラットを、ヒツジ抗血清投与の２４時間前に、およそ５０、９０および９９％（１、５、および２５ｍｇ／ｋｇ）の糸球体ＲＯＢＯ２をカバーする用量範囲で、およびその後は７２時間ごとに前処理した（予防的用量レジメン）。治療的投与レジメンでは、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２を６日目または９日目（ヒツジ抗血清投与の５日後または８日後）に投与した、ヒツジ抗血清投与の２４時間前に投与される用量もまたこの試験に含めた。タンパク尿の最大減少は処置を予防的に開始した場合に４５％（図８）であり、反復測定分散分析統計分析は、０．００１未満のｐ値で用量応答を裏付けた。０、６および９日目に投与されたＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２による処置は、各ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２処置群に関して、対照抗体処置と比較して、タンパク尿を同程度（図９）まで、最大で４０％および反復測定分散分析統計学的解析による０．００１未満のｐ値で減少させた。補体ＩＨＣスコアリングによって決定した腎臓中の免疫複合体沈着は減少せず、この応答は足細胞保護的作用によるものであることを示した。
【０２３６】
足細胞機能および構造のモジュレーションをさらに確信できるものにするために、足細胞下部構造の電子顕微鏡写真の定量的分析を下記の通り実施した。
【０２３７】
収集、サンプリング、および切片化
浸漬（４％ホルムアルデヒド／１％グルタルアルデヒド）により固定化した正面向きのサンプル腎臓（１動物当たり１個の腎臓）を受け取り、ちょうど皮質を含むように切り取り、各腎臓の５つのサンプルをエポキシ樹脂中に包埋した。各腎臓の最初に包埋されたサンプルを切片化した。このサンプルが３つの糸球体を含有した場合は、サンプルを薄切片化し、画像化した。この第１のサンプルが糸球体を含有しなかった場合は、その腎臓由来の他の包埋サンプルを順次切片化し、同様に評価して３つの糸球体を含むサンプルを見出した。
【０２３８】
観察および画像化
選択された腎臓サンプルを、透過型電子顕微鏡（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｈ−７１００）およびデジタルＣＣＤカメラシステム（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）を使用してデジタル画像化した。反復は行わずに、２００×の倍率で見出された最初の３つの糸球体の３つの毛細管ループを、５，０００×および１０，０００×倍率で画像化した。これにより１個の腎臓につき１８のデジタル画像を得た（すなわち、１つの腎臓サンプルにつき３つの糸球体×１つの糸球体につき３領域×２つの倍率）。盲検法での評価を可能にするために、各画像は試験番号、動物番号、サンプル番号、および倍率だけで特定した。
【０２３９】
足細胞足突起幅およびスリット膜密度測定
ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ｖｅｒｓｉｏｎ  １．４７ｖ；Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、米国）を使用して、高倍率の透過型電子顕微鏡画像における糸球体基底膜（ＧＢＭ）の単位長さ当たりの、隣接する足突起の幅を手作業でトレースおよび測定した。手短に述べると、１群当たり６匹のラットにおいて、各ラットから９枚の５０００×ＴＥＭ画像で、測定を行った。ＧＢＭに平行な線を引くことによって、スリット膜の一端から他端まで足細胞足突起幅を測定した。画像の足突起すべてに関してこれを反復した。次いでこれらの結果をスケールバーに関して調整し、各画像に関して調和平均を算出した。
【０２４０】
スリット膜密度：スリット膜密度は、スリット膜の数を計数し、これらのスリット膜の領域にわたって存在するＧＢＭの全長で割ることによって算出する。手短に述べると、１群当たり６匹のラットにおいて、各ラットから９枚の５０００×ＴＥＭ画像において、測定を行った。スリット膜の数をＧＢＭ長さで割ることによって密度を算出した。もし複数のＧＢＭ領域が見えたら、または足突起が見えないためにＧＢＭが切れていたら、上記の手順を反復し、これらの測定の平均を使用して、スリット膜密度を算出した。噛み合っている足突起のスリット膜間の距離を多数の毛細管ループにわたって算出し、平均足突起幅を決定した。足突起消失足細胞の足突起幅は、通常の足突起消失していない足細胞のものより大きいであろう。
【０２４１】
図１０Ａにおいて示されているように、２５ｍｇ／ｋｇ用量でＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２処置した動物の足突起幅は、対照抗体で処置した動物より顕著に短い。これらのデータは、タンパク尿の減少が足細胞下部構造の変化によるものであったことを実証する。加えて、図１０Ｂにおいて示されているように、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２による処置はスリット膜の密度を増加させ（両側ｔ検定によるｐ値０．０１未満）、足突起はそれほど消失せず、糸球体の傷害から保護されることを示した。
【０２４２】
これらの結果は、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２が、糸球体疾患の２つの特徴：タンパク尿およびびまん性の足細胞消失の阻害において効果的であることを実証する。よって、これらの結果は、それだけに限らないが、巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）などの糸球体疾患を処置するための潜在的な治療薬としての、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２の使用を支持する。
【０２４３】
ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２の重要な薬理学的特性を表３にまとめている。
【０２４４】
【表３】
2020522248.tif 000004
【０２４５】
インビトロ薬理学試験は、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２が同じ高い親和性でヒトＳＬＩＴ２−Ｎおよび同一なヒトおよびカニクイザルＳＬＩＴ２−Ｄ２ドメインと結合することを実証した。ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２も、同様に高い親和性でラットＳＬＩＴ２−Ｎと結合した。ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２は、ヒトＳＬＩＴ２−Ｎを発現する細胞と用量依存的に結合した。加えて、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２は、細胞ベースの結合ＨＴＲＦアッセイにおいて、ヒトＲＯＢＯ２に対するラットおよびヒトＳＬＩＴ２−Ｎの結合を強力に阻害した。インビボでの機構的、薬理学、および有効性試験もまた、タンパク尿糸球体疾患のラットモデルを使用して行った。予防的または治療的投与レジメンのいずれかでのＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２の投与は、ＰＨＮモデルにおいてタンパク尿の統計学的に有意な減少をもたらした。これらの結果は、巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）などの糸球体疾患を処置するためのＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２の使用を支持する。
【０２４６】
（実施例４）
ＲＯＢＯ２−Ｆｃ  Ｓ１７Ｔ／Ｒ７３Ｙ結合および中和活性の特徴付け
フローサイトメトリーアッセイ
ＲＯＢＯ２−Ｆｃ  Ｓ１７Ｔ／Ｒ７３Ｙを、製造業者の使用説明書に従って、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（ＡＦ）６４７にコンジュゲートした。染色のための調製において、５％ウシ胎児血清を含有するバッファー中にヒトＳＬＩＴ２−Ｎ過剰発現細胞を再懸濁した。細胞をＲＯＢＯ２−Ｆｃ  Ｓ１７Ｔ／Ｒ７３Ｙ−ＡＦ６４７で染色するために、２×ストックを調製し、１１〜１２段階の２倍希釈系列をＦＡＣＳバッファー中で作製した。細胞およびＲＯＢＯ２−Ｆｃ  Ｓ１７Ｔ／Ｒ７３Ｙ−ＡＦ６４７の相当する希釈物を９６ウェルＵ底プレート中で合わせ、４℃で４５分間置いた。インキュベーション後、１ウェル当たり１５０ｍＬのＦＡＣＳバッファーを添加して細胞を洗浄した。洗浄後、Ｆｏｒｔｅｓｓａ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒにおいてデータを取得するために、細胞をバッファー中に再懸濁した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用してデータを分析し、ＳＬＩＴ２−Ｎを発現しているＨＥＫ２９３細胞の幾何平均蛍光強度（Ｇｅｏ  ＭＦＩ）−対照ＨＥＫ２９３細胞のＧｅｏ  ＭＦＩとして表した。ＲＯＢＯ２−Ｆｃ  Ｓ１７Ｔ／Ｒ７３Ｙは、ヒト胚性腎（ＨＥＫ２９３）細胞において過剰発現されるヒトＳＬＩＴ２−Ｎと、２．５ｎＭのＥＣ５０を有する高い親和性で結合した（図１１）。
【０２４７】
均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）アッセイ
ＲＯＢＯ２−ＳＬＩＴ２−Ｎ均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）アッセイを使用して、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ  Ｓ１７Ｔ／Ｒ７３ＹがＳＬＩＴ２−Ｎと細胞に発現されるＲＯＢＯ２との相互作用を遮断する能力をアセスメントした。このアッセイでは、テルビウム（Ｔｂ）標識された（供与体）、ＳＮＡＰタグ付きＲＯＢＯ２発現ＨＥＫ２９３細胞を、５ｎＭのｄ２標識（アクセプター）ヒトＳＬＩＴ２−Ｎとともに、漸増する量のＲＯＢＯ２−Ｆｃ  Ｓ１７Ｔ／Ｒ７３Ｙの存在下で１時間、製造業者の使用説明書に従ってインキュベートした（Ｃｉｓｂｉｏ  ＨＴＲＦ  ｄ２  Ｌａｂｅｌｉｎｇキット６２Ｄ２ＤＰＥＡおよびＴｅｒｂｉｕｍ  Ｃｒｙｐｔａｔｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇキット６２ＴＢＳＰＥＡ）。インキュベーション後、６６５ｎｍおよび６２０ｎｍでの蛍光を、Ｅｎｖｉｓｉｏｎマルチラベルプレートリーダーにおいて測定した。ＨＴＲＦ比は以下の通り算出した：６６５ｎｍでの蛍光／６２０ｎｍでの蛍光×１０，０００。最大シグナルは、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ  Ｓ１７Ｔ  Ｒ７３Ｙの非存在下でのｄ２標識されたＳＬＩＴ２−Ｎを有するＴｂ標識されたＲＯＢＯ２細胞のＨＴＲＦ比と定義し、最小シグナルは、Ｔｂ標識されたＲＯＢＯ２発現ＨＥＫ２９３細胞だけのＨＴＲＦ比と定義した。ＲＯＢＯ２−Ｆｃ  Ｓ１７Ｔ  Ｒ７３Ｙは、１．４ｎＭのＩＣ５０を有する、ヒトＳＬＩＴ２−Ｎ：ヒトＲＯＢＯ２結合の強力な中和剤であった（図１２）。
【０２４８】
神経細胞遊走アッセイ
ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２で行ったように、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ  Ｓ１７Ｔ／Ｒ７３Ｙを、神経細胞遊走のＳＬＩＴ２−Ｎ媒介性阻害を用量依存的に回復させる能力に関して評価した。ラットの脳室下帯（ＳＶＺ）からの神経組織外植片を単離し、コラーゲンマトリックス中に包埋した。ＳＬＩＴ２−Ｎの存在下で神経細胞遊走は阻害される（ＳＶＺアッセイ）ので、組織外植片を、１ｎＭのＳＬＩＴ２−Ｎの存在下で、漸増する量のＲＯＢＯ２−Ｆｃ  Ｓ１７Ｔ  Ｒ７３Ｙあり、またはなしでインキュベートした。インキュベーション後、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色した。１０×高ＮＡ対物を用いたＯｐｅｒｅｔｔａ  Ｈｉｇｈ  Ｃｏｎｔｅｎｔ  Ｉｍａｇｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で、広視野の蛍光画像を取得した。５％オーバーラップで１ウェル当たり９つの視野を取得してウェルの中心エリア全体を捕捉した。各面間の距離が１μｍの６面からなるＺスタックを各視野について取得して、組織外植片の厚さ全体を捕捉した。Ｖｏｌｏｃｉｔｙソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して解析を行った。各ウェルにおけるすべての視野を継ぎ合わせた。中心にある組織外植片の領域および組織外植片の外側のそれぞれの核を、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色によって検出した。個々の核を計数し、それぞれの核の中心から組織外植片の最も近い縁部までの距離をμｍ単位で測定した。各ウェルに関して、ウェル中での核の平均移動距離に核数を掛けて総移動距離を得た。ＲＯＢＯ２−Ｆｃ  Ｓ１７Ｔ／Ｒ７３Ｙは、１１．５ｎＭのＩＣ５０で、神経細胞遊走を用量依存的に回復させることができた（図１３）。
【０２４９】
これらの結果は、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２のように、ＳＶＺニューロンに関して、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ  Ｓ１７Ｔ／Ｒ７３Ｙは、ＲＯＢＯ２に対するＳＬＩＴ２の結合を阻害することができるだけでなく、ＲＯＢＯ２依存性ＳＬＩＴ２化学反発活性に対する強力な用量依存的中和機能的作用も有することを実証する。よって、これらのデータは、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２のように、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ  Ｓ１７Ｔ／Ｒ７３Ｙは、ＲＯＢＯ２−ＳＬＩＴ相互作用に関わる、巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）などの糸球体疾患を処置するために有用であり得る潜在的な治療薬であり得ることを示唆する。
【０２５０】
（実施例５）
ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２の構造解析
材料調製、結晶化、データ収集、および構造決定：
ＲＯＢＯ２−Ｈｉｓ構築物の発現および精製
Ｃ末端に６×ヒスチジンタグ（配列番号２５）を有する、ＲＯＢＯ２プレＩｇ１配列（配列番号８）、Ｉｇ１ドメイン、Ｉｇ２ドメインおよびＲＯＢＯ２Ｉｇ２−３ドメイン間リンカー（配列番号１２）からなるＲＯＢＯ２構築物（ＲＯＢＯ２−Ｈｉｓ６（「Ｈｉｓ６」は配列番号２５として開示されている））を、ＨＥＫ２９３細胞において発現させた。イミダゾール勾配溶出を用いるＮｉ  Ｅｘｃｅｌカラムによって、構築物を精製した。構築物は、ＨｉＬｏａｄ  ２６／２００  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用したサイズ排除クロマトグラフィーによって、均一になるまでさらに精製した。
【０２５１】
結晶化
ＲＯＢＯ２−Ｈｉｓの結晶を以下の条件下：１００ｍＭのクエン酸ナトリウムｐＨ４．５、１２％ＰＥＧ８０００で得、これにより２．１９Åまで回折する結晶を得た。
【０２５２】
データ収集
結晶は一過性に低温保護し（ｃｒｙｏ−ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ）、シンクロトロンデータ収集は、高度光子源（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ）（ＡＰＳ）において遠隔で実施した。画像フレームは、ソフトウェアＡｕｔｏＰＲＯＣ（Ｇｌｏｂａｌ  Ｐｈａｓｉｎｇ  Ｌｔｄ）を使用して処理した。データは空間群Ｐ２１に属し、単位格子は以下の通りである：ａ＝７９．３０７Å、ｂ＝５０．８８７Å、ｃ＝９３．８５４Å、α＝γ＝９０°、β＝１１４．９２、非対称単位当たり２コピーのヒトＲＯＢＯ２（Ｉｇ１＋Ｉｇ２）である。
【０２５３】
構造決定および精密化
ＲＯＢＯ１（Ｉｇ１＋Ｉｇ２、ＰＤＢコード：２Ｖ９Ｑ）の相同性モデルを使用したＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ検索により、各構成成分の確かな解答が得られた。精密化は、ソフトウェアａｕｔｏＢＵＳＴＥＲ（Ｇｌｏｂａｌ  Ｐｈａｓｉｎｇ  Ｌｔｄ）を使用して実施し、２．１９Åでの最終的なＲ／Ｒｆｒｅｅ因子は、それぞれ０．２１１９および０．２４２５であり、結合のＲＭＳＤは０．０１０Å、角度のＲＭＳＤは１．１９°である。
【０２５４】
構造結果および解析：
ＲＯＢＯ２プレＩｇ１配列による発現の増強
実施例１において、野生型ＲＯＢＯ２プレＩｇ１配列ＳＲＬＲＱＥＤＦＰ（配列番号８）を含めることによりＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２の発現レベルが大きく増大することが実証された。ＲＯＢＯ２−Ｈｉｓ６の結晶構造（「Ｈｉｓ６」は配列番号２５として開示されている）から、Ａｓｐ７（Ｄ７）、Ｐｈｅ８（Ｆ８）、およびＰｒｏ９（Ｐ９）が、ＲＯＢＯ２の第１のＩｇドメインの構造完全性に不可欠な相互作用に実質的に関与していることが明らかである（図１４）。Ａｓｐ７はＴｙｒ９４と水素結合を形成し、一方、Ｐｈｅ８はＡｒｇ３６およびＡｓｎ９３と二重結合を形成する（表４〜５；隣接残基間の距離は、３．８Å以下の距離の範囲内である）。加えて、Ａｓｐ７（Ｄ７）、Ｐｈｅ８（Ｆ８）、およびＰｒｏ９（Ｐ９）はまた、隣接残基との広範なファンデルワールス接触も伴い、それらの表面積の５０％超を埋没させている（表６〜９）。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、これらのデータは、ＲＯＢＯ２プレＩｇ１配列がＲＯＢＯ２の第１のＩｇドメインの２つのβ−シートを互いに橋架けし、それによりＮ末端領域のフォールディング構造を顕著に安定化させることを実証する。驚くべきことに、これらのデータは、フォールディング構造の安定化が、プレＩｇ１配列を欠くＲＯＢＯ２−Ｆｃ構築物の発現と比較した、適切にフォールディングされたＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２の発現の増加を媒介することを示唆する。
【０２５５】
【表４】
2020522248.tif 000005
【０２５６】
【表５】
2020522248.tif 000006
【０２５７】
【表６】
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【０２５８】
【表７】
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【０２５９】
【表８】
2020522248.tif 000009
【０２６０】
【表９】
2020522248.tif 000010
【０２６１】
ＲＯＢＯ２  Ｉｇ２−３ドメイン間リンカーによる発現の増強：
ＲＯＢＯ２  Ｉｇ２−３ドメイン間リンカーＶ２００−Ｆ２０１−Ｅ２０２−Ｒ２０３（ＶＦＥＲ；配列番号１２）を含めることにより、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２の発現レベルは著しく増加した。Ｖａｌ２００は、ＲＯＢＯ２のＩｇ２ドメイン中の最後のβ−鎖の一部である。Ｖ２００は、広範なファンデルワールス接触によって隣接残基ですっかり取り囲まれており（表１０〜１１）、その結果、その表面積の８５％が埋没している（表１２〜１３）。Ｖａｌ２００に加えて、Ｐｈｅ２０１−Ｇｌｕ２０２−Ａｒｇ２０３もまた、その領域内の水素結合およびファンデルワールス相互作用に実質的に関与している（表１０〜１１、１４〜１５）。まとめると、これらのデータは、これらの４つのアミノ酸残基が、ＲＯＢＯ２のＩｇ２ドメインのＣ末端領域におけるフォールディング構造を効果的に安定化させることを示唆する（図１５）。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、これらのデータは、フォールディング構造の安定化が、Ｉｇ２−３ドメイン間リンカーを欠くＲＯＢＯ２−Ｆｃ構築物の減少した発現と比較して、適切にフォールディングされたＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２の発現を増加させることを示唆する。
【０２６２】
【表１０】
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【０２６３】
【表１１】
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【０２６４】
【表１２】
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【０２６５】
【表１３】
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【０２６６】
【表１４】
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【０２６７】
【表１５】
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【０２６８】
（実施例６）
ＲＯＢＯ２−Ｆｃ  Ｓ１７Ｔ／Ｒ７３Ｙの構造解析
材料調製、結晶化、データ収集、および構造決定：
発現
ヒトＲＯＢＯ２  Ｓ１７Ｔ／Ｒ７３Ｙ−Ｈｉｓ６構築物（「Ｈｉｓ６」は配列番号２５として開示されている）は、２つの点変異（Ｓ１７ＴおよびＲ７３Ｙ）を有するヒトＲＯＢＯ２  Ｉｇ１ドメイン、その後に続くＣ末端Ｈｉｓ×６タグ（配列番号２５）からなる。ヒトＳＬＩＴ２構築物は、ＳＬＩＴ２のＤ２ドメイン（２７１〜４７９）、その後に続くＣ末端Ｈｉｓ６タグ（配列番号２５）からなる。これらの構築物を、別個にＨＥＫ２９３細胞において発現させ、トランスフェクションの１２０時間後に馴化培地を回収した。
【０２６９】
ヒトＲＯＢＯ２  Ｓ１７Ｔ／Ｒ７３Ｙ−Ｈｉｓ６（「Ｈｉｓ６」は配列番号２５として開示されている）およびＳＬＩＴ２  Ｄ２ドメインの精製
Ｎｉｃｋｅｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）およびイミダゾールの勾配を使用して、ヒトＲＯＢＯ２  Ｓ１７Ｔ／Ｒ７３Ｙ−Ｈｉｓ６（「Ｈｉｓ６」は配列番号２５として開示されている）を馴化培地から精製した。ピーク画分を合わせて２０ｍＭのＮａＣｌまで希釈し、ｐＨ６．０に調整し、ＨｉＴｒａｐ強陽イオンスルホプロピル（ＳＰ）高性能（ＨＰ）カラムと直列に配置したＨｉＴｒａｐ、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ｑ  ＦＦ）カラムにロードした。十分に洗浄した後、Ｑ  ＦＦカラムを取り外し、ＮａＣｌの勾配をＳＰ  ＨＰカラムにかけた。グリコシル化の程度に基づいて画分をプールし、ＴＢＳに対して透析した。
【０２７０】
Ｎｉｃｋｅｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して馴化培地からヒトＳＬＩＴ２  Ｄ２ドメインを捕捉し、イミダゾールの勾配で精製した。ピーク画分をプールし、５０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０００ｍＭのＮａＣｌを含有するバッファーのもとでＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００サイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製した。ＳＬＩＴ２  Ｄ２を含有する画分をプールし、５００ｍＭ  ＮａＣｌに調整した。
【０２７１】
ヒトＲＯＢＯ２  Ｓ１７Ｔ／Ｒ７３Ｙ−ＨｉｓとＳＬＩＴ２  Ｄ２ドメインとの複合体形成
ＳＬＩＴ２とゲル濾過カラムの樹脂との間の予期しない相互作用のために、ＲＯＢＯ２  Ｓ１７Ｔ／Ｒ７３Ｙ−Ｈｉｓ６（「Ｈｉｓ６」は配列番号２５として開示されている）とＳＬＩＴ２との複合体を、サイズ排除クロマトグラフィーによって得ることができなかった。その代わり、精製したＲＯＢＯ２  Ｓ１７Ｔ／Ｒ７３Ｙ−Ｈｉｓ６（「Ｈｉｓ６」は配列番号２５として開示されている）を、ＳＬＩＴ２  Ｄ２ドメインと１：１のモル比で混合し、結晶化を試みるために濃縮した。
【０２７２】
結晶化
ＳＬＩＴ２  Ｄ２ドメインと複合体形成しているＲＯＢＯ２  Ｓ１７Ｔ／Ｒ７３Ｙ−Ｈｉｓ６（「Ｈｉｓ６」は配列番号２５として開示されている）の結晶を以下の条件：１００ｍＭクエン酸ナトリウム  ｐＨ５．５、１５％ＰＥＧ６０００で得た。これにより１．７８Åまで回折する結晶を得た。
【０２７３】
データ収集
結晶は一過性に低温保護し、シンクロトロンデータ収集は、高度光子源（ＡＰＳ）において遠隔で実施した。画像フレームは、ソフトウェアＡｕｔｏＰＲＯＣ（Ｇｌｏｂａｌ  Ｐｈａｓｉｎｇ  Ｌｔｄ）を使用して処理した。データは空間群Ｐ２１２１２１に属し、単位格子は以下の通り：ａ＝１６３．２５１Å、ｂ＝４１．８９６Å、ｃ＝５０．９３８Å、α＝β＝γ＝９０°であり、非対称単位当たり１コピーの複合体である。
【０２７４】
構造決定および精密化
ＲＯＢＯ１  Ｉｇ１ドメインおよびＳＬＩＴ２  Ｄ２ドメイン（ＰＤＢコード：２Ｖ９Ｔ）の相同性モデルを使用したＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ検索により、各構成成分の確かな解答が得られた。精密化は、ソフトウェアａｕｔｏＢＵＳＴＥＲ（Ｇｌｏｂａｌ  Ｐｈａｓｉｎｇ  Ｌｔｄ）を使用して実施し、１．７８Åでの最終的なＲ／Ｒｆｒｅｅ因子はそれぞれ０．１８４８および０．２３５４であり、結合のＲＭＳＤは０．０１０Å、角度のＲＭＳＤは１．１０°であった。
【０２７５】
構造結果および解析
ＲＯＢＯ２  Ｓ１７Ｔ／Ｒ７３Ｙ−Ｈｉｓ６−ＳＬＩＴ２（「Ｈｉｓ６」は配列番号２５として開示されている）の結晶構造は、ＲＯＢＯ１−ＳＬＩＴ２の結晶構造と広範囲にわたってアライメントされ、ＲＯＢＯ−ＳＬＩＴ境界は、ＲＯＢＯ２とＲＯＢＯ１との間で高度に保存されている。そのため、一般に公開されているＲＯＢＯ１−ＳＬＩＴ２構造は、Ｓ１７ＴおよびＲ７３Ｙの影響を調べるための構造比較のために、ＲＯＢＯ２−ＳＬＩＴ２の代替物として使用することができる。
【０２７６】
ＲＯＢＯ２のＳｅｒ１７（Ｓ１７）は、水素結合を介してＳＬＩＴ２のＡｒｇ２８７と相互作用する（図１６）。アルギニンとの水素結合は、その変異にかかわらず保存されているが、Ｔｈｒ１７はＡｒｇ２８７とのさらなるファンデルワールス接触をもたらし、よって、野生型Ｓｅｒ１７よりもわずかにエネルギー的な優位性を引き出す。
【０２７７】
ＲＯＢＯ２のＲ７３Ｙは、ＳＬＩＴ２のＴｙｒ４０４と相互作用する（図１６）。２つのチロシン残基のパイ−パイスタッキングによって引き起こされるファンデルワールス相互作用は、チロシンと柔軟なアルギニン側鎖との間のものより明らかに優位である。このことは、埋没表面積のパーセンテージ（Ｔｙｒ７３の４２％対Ａｒｇ７３の２２％；表１６〜１９）によって明らかである。ＲＯＢＯ２  Ｓ１７Ｔ／Ｒ７３ＹにおけるＡｒｇからＴｙｒへの変異は、Ｓ１７およびＲ７３を含む野生型ＲＯＢＯ２と比較した親和性の増加の主因のようである。
【０２７８】
加えて、Ｓ１７ＴおよびＲ７３Ｙは、ＲＯＢＯ２−ＳＬＩＴ２境界の反対側端部に位置する（図１６）。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、これらの位置での相互作用を安定化させることにより、ＲＯＢＯ２がＳＬＩＴ２によりよく「付着する」のに役立ち、よって２つのタンパク質の全体的な結合親和性を増加させるようである。
【０２７９】
【表１６】
2020522248.tif 000017
【０２８０】
【表１７】
2020522248.tif 000018
【０２８１】
【表１８】
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【０２８２】
【表１９】
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【０２８３】
（実施例７）
ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２の翻訳後修飾
ＬＣ／ＭＳ−ペプチドマッピング
ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２の翻訳後修飾の分析は、ペプチドマッピングによって達成した。手短に述べると、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２を還元し、アルキル化し、リシン特異的プロテアーゼであるＬｙｓｙｌ  Ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ（Ｌｙｓ−Ｃ）で消化した。Ｌｙｓ−Ｃタンパク質分解ペプチドを、２１４ｎｍでのＵＶ検出を用いる逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）で分析した。
【０２８４】
ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２に関するペプチドマップ中のすべてのメジャーピークおよびマイナーピークを、オンラインエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＲＰ−ＨＰＬＣ／ＥＳＩ  ＭＳまたはＬＣ／ＭＳ）によって特定した。各ピークについて観察された質量は、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２由来の予期されるＬｙｓ−Ｃタンパク質分解ペプチドと一致した。これらのＬＣ／ＭＳ−ペプチドマッピングの結果は、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２が、ｃＤＮＡ配列から予想される通りの正しいアミノ酸配列を含有することを実証する。ＬＣ／ＭＳ分析は、Ｎ連結グリコシル化のためのＮ１０２ＡＳコンセンサス配列を含有する、ペプチドＫ６におけるＮ連結オリゴ糖の存在（これはＫ４Ｋ５Ｋ６として検出された）を示した。Ｋ４Ｋ５Ｋ６グリコペプチドにおいて特定された主要なオリゴ糖構造は、２つのガラクトース残基と１つの末端Ｎ−アセチルノイラミン酸残基（Ｇ２Ｆ＋１ＮｅｕＡｃ）または２つの末端Ｎ−アセチルノイラミン酸残基（Ｇ２Ｆ＋２ＮｅｕＡｃ）のいずれかを含有する二分岐の複合型構造を含む。２つの末端ガラクトース残基（Ｇ２Ｆ）を含有するＫ４Ｋ５Ｋ６グリコペプチドがマイナーレベルで観察された。最大４つの末端Ｎ−アセチルノイラミン酸残基を含有する、コア置換フコースを有する三分岐および四分岐の複合型構造を呈する他のマイナーレベルの種が観察された。
【０２８５】
ＬＣ／ＭＳ分析はまた、Ｎ連結グリコシル化のためのＮ２９１ＳＴコンセンサス配列を含有する、ペプチドＫ１９におけるＮ連結オリゴ糖（Ｋ１８Ｋ１９として観察される）の存在も示した。Ｋ１８Ｋ１９において特定された主要なオリゴ糖構造は、ゼロ（Ｇ０Ｆ）または１つの（Ｇ１Ｆ）末端ガラクトース残基を含有するアシアロ−二分岐複合型構造を含む。２つのガラクトース残基（Ｇ２Ｆ）を含有するアシアロ−二分岐複合型構造を有するＫ１８Ｋ１９がマイナーレベルで観察された。切断型のＮグリカンおよび最大で２つの末端Ｎ−アセチルノイラミン酸残基を含有する複合型Ｎグリカンを含有するグリコペプチドＫ１８Ｋ１９が、マイナーおよび痕跡レベルで検出された。
【０２８６】
【表２０】
2020522248.tif 000021
【０２８７】
（実施例８）
安全性薬理学試験
ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２を週１回、静脈内（ＩＶ）注射によって６週間にわたって（合計６用量）５０ｍｇ／ｋｇ／用量の用量で、遠隔測定された雄のサルに投与して、心血管（ＣＶ）エンドポイントを評価した。心拍数（ＨＲ）および活動量において統計学的に有意な差異が観察された。しかしながら、これらの差異は、その大きさが小さく、散発的な性質であり、長期間は持続しなかったため、これらの差異はＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２に関連しないとみなされた。５０ｍｇ／ｋｇ／用量で週１回、６週間にわたるＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２のＩＶ投与は、血圧（ＢＰ）、ＨＲ、または活動量（ａｃｔｉｖｉｔｙ）において、試験を通してどの時点でもＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２に関連する変化を生じさせなかった。Ｃｍａｘ値は、１、２２、および３６日目においてそれぞれ１０６０、１０３０、および１０７０μｇ／ｍｌであった。
【０２８８】
遠隔測定された雄および雌のカニクイザルにおける反復投与予備的毒性試験（ＥＴＳ）において、心電図（ＥＣＧ）および血圧（ＢＰ）パラメーターならびに活動量に対する、５０ｍｇ／ｋｇ／用量での２９日間にわたる（合計５用量）ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２の週１回のＩＶ投与の作用をアセスメントした。９日目を通して収集したＣＶ測定値に対して、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２に関連する作用はなかった。２９日目に、性別を合わせたＣｍａｘは４９７μｇ／ｍＬであった。
【０２８９】
ＥＣＧおよびＨＲ測定を、医薬品の安全性に関する非臨床試験の実施の基準（ＧＬＰ）に準拠した、雄および雌のカニクイザルにおける、２０、１００、または３００ｍｇ／ｋｇ／用量のＩＶ、または３００ｍｇ／ｋｇ／用量の皮下（ＳＣ）の用量での、３カ月反復投与毒性試験に組み込んだ。この試験におけるＥＣＧまたはＨＲに対して、最大で９２１０μｇ／ｍの性別を合わせた平均Ｃｍａｘで、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２に関連する作用はなかった。加えて、なんらかの呼吸または中枢神経系の作用を示唆するであろう、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２に関連する臨床的観察はなかった。
【０２９０】
加えて、神経機能エンドポイントを、ラットにおける３カ月毒性試験においてアセスメントした。最大で４２５ｍｇ／ｋｇ／用量のＩＶまたは４２５ｍｇ／ｋｇ／用量のＳＣの用量で（性別を合わせた平均Ｃｍａｘは最大で７６１０μｇ／ｍＬ）、自発運動量または機能観察総合評価法（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎａｌ  ｂａｔｔｅｒｙ）に対して、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２に関連する作用はなかった。
【０２９１】
（実施例９）
動物における薬物動態および生成物代謝
分析方法
Ｉ．ラットおよびサル血清におけるＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２の定量化
電気化学発光（ＥＣＬ）アッセイを、Ｗｉｓｔａｒ  Ｈａｎラットおよびカニクイザル血清におけるＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２の定量化に関して、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ（登録商標））アッセイプラットホーム（１５−１６１１、１５−１６０９）において検証した。これらのアッセイにおいて、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２を含有するサンプルを、ビオチン化抗ＲＯＢＯ２−Ｆｃ抗体捕捉試薬をコーテイングしたストレプトアビジンコートＭＳＤプレート上でインキュベートした。結合したＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２を、ルテニウム標識した（ｒｕｔｈｅｎｙｌａｔｅｄ）マウス抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体で検出した。最終的な検出は、ＭＳＤ  Ｒｅａｄ  Ｂｕｆｆｅｒを添加して、ＭＳＤプレートリーダーを使用して読み取るＥＣＬシグナルを生成させることによって達成した。結果として得られるＥＣＬシグナルは、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２の濃度と正比例していた。サンプル濃度は、１／ｙの重み係数を用いた４ＰＬロジスティック（自動推定）モデルを使用して適合させた標準曲線から、内挿法によって決定した。１００％血清における定量化の範囲は、２０×の最小必要希釈倍率係数（ＭＲＤ）で、５０〜１２８０ｎｇ／ｍＬであった。
【０２９２】
ＩＩ．ラットおよびサル血清における抗ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２抗体の検出
ＭＳＤ（登録商標）アッセイプラットホームを使用して、Ｗｉｓｔａｒ  Ｈａｎラットおよびカニクイザル血清において抗薬物抗体（ＡＤＡ）の存在を検出するために、ＥＣＬアッセイを検証した。これらのアッセイにおいて、ビオチンおよびルテニウム標識されたＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２を、試験サンプル、陽性対照（Ｗｉｓｔａｒ  Ｈａｎまたはカニクイザル血清における抗ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２抗体）、または陰性対照（プールされた正常なＷｉｓｔａｒ  Ｈａｎまたはカニクイザル血清）とともに共インキュベートした。サンプル中に存在するＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２に対する抗体は、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２のビオチンおよびルテニウム標識されたバージョンの両方に結合し、これらのアッセイにおいて検出されるはずである。結合したＡＤＡを、ストレプトアビジンコートＭＳＤプレートを使用して捕捉した。最終的な検出は、トリプロピルアミンを使用して、ＭＳＤプレートリーダーを使用して測定され、また相対的発光単位（ＲＬＵ）で報告されるＥＣＬシグナルを生成させて達成した。
【０２９３】
階層化法を使用して、試験サンプルをＡＤＡに関して試験した。サンプルをまず、最小必要希釈倍率１：５０でスクリーニングアッセイにおいて試験した。アッセイカットオフポイントを下回るＲＬＵを発生させたサンプルを、陰性として報告した（＜１．７０、最小必要希釈倍率係数のｌｏｇ１０、５０）。アッセイカットオフポイント以上のＲＬＵを発生させたサンプルを完全な希釈系列において再分析して、陽性の結果を確認し、抗体価を決定した。抗体価は、アッセイカットオフポイントＲＬＵと同等のＲＬＵを発生させたであろうサンプルの希釈率の逆数と定義し、その力価のｌｏｇ（１０を底とする）を報告した。
【０２９４】
ＡＤＡの誘導に関する結論は、１日目の投与前に収集したサンプルおよび投与後サンプルの結果の比較に基づいてなされた。投与前サンプルがＡＤＡに関して試験で陰性となり、かつ対応する投与後サンプルが試験で陽性となった場合、その動物は、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２に対するＡＤＡ応答の誘導に関して陽性であるとみなされた。投与前および投与後サンプルの両方がＡＤＡに関して試験で陽性となった場合、投与後サンプル力価がさらに、投与前サンプルの力価よりも少なくとも０．４８（ｌｏｇ３、連続希釈係数）高い場合だけ、その動物は、ＡＤＡ応答の誘導に関して陽性であるとみなされた。
【０２９５】
結果
Ｉ．薬物動態
Ａ．単回投与薬物動態
１０ｍｇ／ｋｇでの単回ＩＶ投与後にＬｅｗｉｓラット（ｎ＝３）およびカニクイザル（ｎ＝２）において、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２の血清ＰＫを決定した。ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２は、ラットにおいて１．５ｍＬ／時間／ｋｇ、サルにおいて０．８９ｍＬ／時間／ｋｇのクリアランス（ＣＬ）、およびラットにおいて０．１９Ｌ／ｋｇ、サルにおいて０．０９Ｌ／ｋｇの定常状態の分布容積（Ｖｓｓ）を示し、消失半減期（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）（ｔ１／２）はラットおよびサルにおいてそれぞれおよそ５日間および８日間となった。ラットに対してＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２を１０ｍｇ／ｋｇＳＣ投与した後、推定されるバイオアベイラビリティは５６％であった。
【０２９６】
Ｂ．反復投与薬物動態（毒物動態；ＴＫ）
ラット毒物動態
６週間の回復期間を設けた３カ月ＧＬＰピボタル毒性試験の一部として、雄および雌のＷｉｓｔａｒ  Ｈａｎラット（ｎ＝６／性別／投与群）に３日ごとに１回投与される、２５、１２５、または４２５ｍｇ／ｋｇ／用量のＩＶ投与後、および４２５ｍｇ／ｋｇ／用量のＳＣ投与後に、ＴＫおよびＡＤＡ評価を行った。
【０２９７】
１日目の投与前に収集および分析したサンプルにおいて、またはビヒクル対照群から収集および分析したサンプルにおいて、定量可能な濃度のＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２は存在しなかった。ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２投与群では、定量可能な濃度のＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２が８８日目（回収された最後のサンプル）まで、および回復期間の最終日（１３５日目）まで観察された。
【０２９８】
いずれの投与群においても、全身曝露（最大濃度［Ｃｍａｘ］および０時間から７２時間までの濃度曲線下面積（ＡＵＣ）［ＡＵＣ７２］によってアセスメント）において明らかな性別に関連する差異はなかった。１日目から８８日目まで、用量が漸増するにつれて平均全身曝露は用量にほぼ比例して増加した。ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２全身バイオアベイラビリティは、１日目および８８日目にＳＣ投与した後、それぞれ２４．４％および２５．４％であった。蓄積比（ＡＵＣ、８８日目／１日目）は、ＩＶ群およびＳＣ群に関して＜２．０であった（表２１）。
【０２９９】
ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２に対するＡＤＡ誘導の発生率は、２５、１２５および４２５ｍｇ／ｋｇのＩＶ群においてそれぞれ０．０％（０／１２動物）、０．０％（０／１２動物）、および０．０％（０／１２動物）であり、４２５ｍｇ／ｋｇのＳＣ群において４１．７％（５／１２動物）であった。血清ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２濃度は、ＡＤＡ陰性動物と比較してＡＤＡ陽性動物において同等であった。しかしながら、サンプル中に存在するＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２の循環レベルがＡＤＡの検出を妨げた可能性があることに留意するべきである。
【０３００】
カニクイザル毒物動態
６週間の回復期間を設けた３カ月ＧＬＰピボタル毒性試験の一部として、雄および雌のカニクイザル（ｎ＝３または５／性別／投与群）に週に１回投与される、２０、１００、または３００ｍｇ／ｋｇ／用量のＩＶ投与後、および３００ｍｇ／ｋｇ／用量のＳＣ投与後、ＴＫおよびＡＤＡ評価を行った。
【０３０１】
１日目の投与前に収集および分析したサンプルにおいて、またはビヒクル対照群から収集および分析したサンプルにおいて、定量可能な濃度のＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２は存在しなかった。ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２投与群において、７８日目（回収された最後のサンプル）まで、および回復期間の最終日（１２７日目または１２８日目）まで、定量可能な濃度のＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２が観察された。
【０３０２】
いずれの投与群においても、全身曝露（ＣｍａｘおよびＡＵＣ１６８によってアセスメント）における明らかな性別に関連する差異は存在しなかった。１日目から７８日目まで、用量が漸増するにつれて平均全身曝露は用量にほぼ比例して増加した。ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２全身バイオアベイラビリティ（３００ｍｇ／ｋｇのＩＶおよびＳＣ投与）は、１日目および７８日目にＳＣ投与した後それぞれ５３．７％および７７．０％であった。蓄積比（ＡＵＣ、７８日目／１日目）ＩＶ群では＜２．０であり、その比はＳＣ群では２．１であった（表２１）。
【０３０３】
ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２に対するＡＤＡ誘導の発生率は、２０、１００および３００ｍｇ／ｋｇのＩＶ群においてそれぞれ０％（０／６動物）、０％（０／６動物）、および２０％（２／１０動物）であり、３００ｍｇ／ｋｇのＳＣ群において３３％（２／６動物）であった。血清ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２濃度は、ＡＤＡ陰性動物と比較してＡＤＡ陽性動物において同等であった。しかしながら、サンプル中に存在するＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２の循環レベルがＡＤＡの検出を妨げた可能性があることに留意するべきである。
【０３０４】
ＩＩ．分布
単回ＩＶ投与後のラット（０．１９Ｌ／ｋｇ）およびサル（０．０９Ｌ／ｋｇ）におけるＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２のＶｓｓは、Ｆｃ含有タンパク質の細胞外液中への限局的な分布と一致して低かった。
【０３０５】
ＩＩＩ．薬物動態−薬力学およびヒトＰＫ予測
ＰＫ／ＰＤモデリング（予測されるヒトＰＫ、測定されるＲＯＢＯ２およびＳＬＩＴ２の血清および腎臓濃度データを組み込んだ）に基づいて、腎臓中でＣｍｉｎ標的カバー率＞９０％を維持するために、２ｍｇ／ｋｇ（１５０ｍｇ）の推定による１週当たりのヒトＳＣ用量が予測される。予想されるヒトに効果的な濃度（Ｃｅｆｆ）約１１μｇ／ｍｌ血清は、腎臓中の標的カバー率＞９０％をもたらす。２ｍｇ／ｋｇ（１５０ｍｇ）の週ヒトＳＣ用量に関連して予想されるヒト定常状態ＣｍａｘおよびＡＵＣｔａｕはそれぞれ、１８．２μｇ／ｍＬおよび２６１０μｇ・時間／ｍＬである。
【０３０６】
ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２に関するヒトＰＫの予測は、アロメトリック指数に基づくカニクイザル静脈内ＰＫデータのスケーリングによって行われた。ヒトにおいて、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２は、０．５ｍＬ／時間／ｋｇのクリアランスおよび９０ｍＬ／ｋｇの定常状態の分布容積を示し、およそ１４日間の消失半減期をもたらすと予測される。ヒトＳＣバイオアベイラビリティは６０％であると予測される。
【０３０７】
初期の臨床試験において、予想されるヒトに効果的な用量（１５０ｍｇ  ＳＣ  週１回）で、予想されるヒトに効果的な曝露の１６１×および２９×の曝露マージンに関連してそれぞれ決定して、曝露限界は２９３０μｇ／ｍＬのＣｍａｘおよび７４５００μｇ・時間／ｍＬのＡＵＣに設定されるであろう。この曝露限界は、ラットにおける３カ月ＧＬＰ毒性試験から特定された無毒性量（ＮＯＡＥＬ）に基づいている。
【０３０８】
ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２を週１回１０ｍｇ／ｋｇ／用量のＳＣでまたは５０もしくは２００ｍｇ／ｋｇ／用量のＩＶでそれぞれ投与した後、ラットまたはカニクイザルＥＴＳにおける３カ月ＧＬＰ毒性試験において、血清サイトカインレベルに対するＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２関連の作用は認められなかったが、ＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−６の増加が、８人のヒトドナーのうち１人、および１２匹のサルのうち１匹においてインビトロで観察された。インビトロでの発見の応用可能性（ｔｒａｎｓｌａｔａｂｉｌｉｔｙ）は十分に理解されていないが、投与の中断／終了、バイタルサイン、臨床症状の綿密なモニタリングおよびサイトカインレベルのアセスメントを可能にするために、試験の単回漸増投与期間における措置、例えば、ＩＶ注入によるＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２の緩徐な投与（総用量のうちの小画分を最初の１時間に投与した後、残りの用量を次の１時間にわたって投与する）などが行われるであろう。
【０３０９】
【表２１−１】
2020522248.tif 000022
【０３１０】
【表２１−２】
2020522248.tif 000023
【０３１１】
（実施例１０）
毒性学
最大で３カ月（１３週間）の期間の、予備的（医薬品の安全性に関する非臨床試験の実施の基準［ＧＬＰ］非準拠）およびピボタル（ＧＬＰ準拠）毒性試験において、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２をラットおよびカニクイザルにＩＶおよびＳＣ注射によって投与した。３カ月の投与後の無毒性量（ＮＯＡＥＬ）は以下であった：
（ｉ）ラットにおいて１２５ｍｇ／ｋｇ／用量のＩＶ（Ｃｍａｘ  ２９３０μｇ／ｍＬおよびＡＵＣ７２  ７４，５００μｇ・時間／ｍＬ）および４２５ｍｇ／ｋｇ／用量のＳＣ（Ｃｍａｘ  ８４２μｇ／ｍＬおよびＡＵＣ７２  ５０，５００μｇ・時間／ｍＬ）、ならびに
（ｉｉ）サルにおいて３００ｍｇ／ｋｇ／用量のＩＶ（Ｃｍａｘ  ９２１０μｇ／ｍＬおよびＡＵＣ１６８  ４２７，０００μｇ・時間／ｍＬ）およびＳＣ（Ｃｍａｘ２３４０μｇ／ｍＬおよびＡＵＣ１６８  ３２８，０００μｇ・時間／ｍＬ）。
【０３１２】
Ｉ．反復投与毒性
ラットおよびカニクイザルにおいてＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２を用いて予備的およびピボタル反復投与毒性試験を行った。
【０３１３】
Ａ．ラット試験
（ｉ）予備的毒性試験（ＥＴＳ）
雄のラットにおける予備的毒性試験（ＥＴＳ）において、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２を、３日ごとに１回、１４日間にわたって（合計５用量）、２００ｍｇ／ｋｇ／用量のＩＶまたは１０、５０、または２００ｍｇ／ｋｇ／用量のＳＣで投与し、すべての用量で許容された。ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２に関連する臨床徴候はなく、体重または摂餌量パラメーターに変化はなかった。
【０３１４】
ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２に関連する作用は以下を含んでいた：≧１０ｍｇ／ｋｇ／用量のＳＣで、ＳＣ注射部位における極軽度から中等度のＳＣ血管周囲炎；顕微鏡的相関関係とは関連しない、≧１０ｍｇ／ｋｇ／用量のＳＣおよびＩＶでの、より高い胸腺絶対重量（１．２１×−１．４４×対照）および胸腺相対重量の増加（臓器対体重では１．１７×−１．３９×対照および臓器対脳重量では１．２２×−１．４６×対照）；２００ｍｇ／ｋｇ／用量のＳＣおよびＩＶでの、より高い尿クレアチニン（１．７０×および１．８３×対照）およびより低い尿量（それぞれ０．５２×および０．５５×対照）；２００ＳＣおよび２００ＩＶ  ｍｇ／ｋｇ／用量での、より高い平均尿比重（１．０１１×−１．０１２×対照）；ならびに２００ｍｇ／ｋｇ／用量のＩＶでのより高い平均血清コレステロール（１．３８×対照）。臨床化学および臓器重量所見は、いかなる顕微鏡所見とも関連していなかった。
【０３１５】
（ｉｉ）反復投与毒性試験
ピボタル反復投与ラット毒性試験において、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２を３日ごとに１回、３カ月にわたって（合計３１用量）、２５、１２５、または４２５ｍｇ／ｋｇ／用量のＩＶでまたは４２５ｍｇ／ｋｇ／用量のＳＣでラットに投与し、その後６週間の回復期間を続けた（対照および４２５ｍｇ／ｋｇ／用量のＩＶ）。ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２の神経機能作用もまた評価した。ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２に関連する臨床徴候は、投与期間中の４２５ｍｇ／ｋｇ／用量のＳＣでの４／１０の雄ラットにおいて認められる皮膚病変（背部、胸部、頭部、または注射部位）を含んでいた。発生率が対照群（２／１５雄）と比較してわずかに高いだけであったため、また変化は投与期間中に散発的に認められただけであり、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２を最大で４２５ｍｇ／ｋｇ／用量のＩＶの用量で投与された動物においては存在しなかったことから、これらの変化は有害とはみなされなかった。ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２に関連する体重の、摂餌量の、眼科の、神経機能の、または肉眼的な所見はなかった。
【０３１６】
雄において、腎所見は、≧１２５ｍｇ／ｋｇ／用量のＩＶでの極軽度の糸球体症からなっていた。雌では、極軽度の糸球体症がまた、４２５ｍｇ／ｋｇ／用量のＩＶにおいてのみ観察され、極軽度から軽度の尿細管の好塩基球増加症および尿細管硝子円柱、ならびにより高い尿タンパク（１００ｍｇ／ｄＬ）を伴った。雌における糸球体症、尿細管の好塩基球増加症、および尿細管硝子円柱の形態的な所見は、非有害なより高い尿タンパクとのその組み合わせは腎機能障害を示すため、有害であった。雄において、その所見が、分布が非常に狭く、尿細管の好塩基球増加症および硝子円柱の非存在下で発生しており、より高い尿タンパクに関連していなかったことから、糸球体症は有害ではなかった。糸球体症は、光学顕微鏡によって観察される腎皮質中の糸球体における顆粒状好酸性物質の凝集物および透過型電子顕微鏡によって観察される糸球体の毛細管ループを取り囲んでいる足細胞足突起融合体によって特徴付けられた。回復期間の終了時に、雄において糸球体症は完全に回復し、雌において部分的に回復し、有害ではなかった。雌において、尿細管の好塩基球増加症、尿細管硝子円柱、および尿タンパクも完全に回復した。より高い血清全タンパク質（１．０９×−１．１８×）および血清アルブミン（１．１０×−１．２０×）が、雄群において４２５ｍｇ／ｋｇ／用量のＩＶで、雌群において≧２５ｍｇ／ｋｇ／用量のＩＶおよび４２５ｍｇ／ｋｇ／用量のＳＣで見られた。これは、より高い尿タンパクにもかかわらず、４２５ｍｇ／ｋｇ／用量のＩＶで雌群において観察された。
【０３１７】
さらなるＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２に関連する顕微鏡所見が、４２５ｍｇ／ｋｇ／用量のＳＣで投与した動物において出現し、対照（極軽度から軽度）と比較した注射部位の出血および炎症の発生率ならびに／または重症度の増加（中等度）および流入領域リンパ節における極軽度のリンパ過形成の発生率の増加からなっていた。ＳＣ注射部位での出血および炎症の増加は、これらは同時の対照よりわずかに重度であるだけであり、注射手技の結果として予期されるであろうものを超える顕著な組織損傷とは関連していなかったため、有害ではなかった。流入領域リンパ節における極軽度のリンパ過形成の発生率の増加は、それが対照と形態学的に類似していたため、またＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２および／または投与手技に対するわずかな免疫応答であったため、有害ではなかった。注射が投与されなくなれば、これらの所見は回復するであろうことが予期される。
【０３１８】
投与期間の終わりで認められるＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２に関連するより高い肝臓重量は、有害ではなく、≧１２５ｍｇ／ｋｇ／用量のＩＶおよび４２５ｍｇ／ｋｇ／用量のＳＣでの雌群におけるより高い絶対および相対平均体重および脳重量（対照と比較して１．１１×〜１．１７×）からなっていた。これらのより高い肝臓重量は、相関する肉眼的および顕微鏡所見が存在しないこと、および組織損傷の指標となる肝酵素が変化しないことから、有害ではなかった。より高い肝臓重量は完全に回復した。
【０３１９】
さらなる臨床病理凝固および臨床化学パラメーター変化は、有害ではなく、≧１２５ｍｇ／ｋｇ／用量のＩＶでの雄群および雌群におけるより高いフィブリノゲン（１．２１×−１．４８×）、≧１２５ｍｇ／ｋｇ／用量のＩＶでの雄群においての、ならびに≧２５ｍｇ／ｋｇ／用量のＩＶおよび４２５ｍｇ／ｋｇ／用量のＳＣでの雌群においての、より高いコレステロール（１．３７×−２．５２×）およびトリグリセリド（１．５８×−３．１１×）ならびに４２５ｍｇ／ｋｇ／用量のＩＶでの雌群におけるより高いグロブリン（１．１６×）およびより高いカルシウム（１．０９×）からなっていた。雄群および雌群においてフィブリノゲン、コレステロール、トリグリセリド、全タンパク質、血清アルブミン、およびグロブリンは完全に回復したが、４２５ｍｇ／ｋｇ／用量のＩＶでの雌群においてカルシウムは部分的に回復しただけであった（回復時１．０４×対照群）。これらの臨床病理変化は、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２投与群平均と対照群平均と間の差異の大きさが小さいこと、ならびに相関する肉眼的および顕微鏡所見が存在しないことに基づいて、有害ではなかった。
【０３２０】
ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２を３カ月投与した後のラットにおける毒物動態の概要は、表２２において見られる。ラットに対して３カ月にわたって（合計３１用量）、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２を２５、１２５、または４２５ｍｇ／ｋｇ／用量でＩＶ投与、または４２５ｍｇ／ｋｇ／用量で３日ごとに１回ＳＣ投与した後、１２５ｍｇ／ｋｇ／用量のＩＶおよび４２５ｍｇ／ｋｇ／用量のＳＣをＮＯＡＥＬと特定した。
【０３２１】
Ｂ．サル試験
（ｉ）予備的毒性試験（ＥＴＳ）
雄および雌のカニクイザルにおけるＥＴＳにおいて、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２を週１回、２９日間にわたって（合計５用量）、５０または２００ｍｇ／ｋｇ／用量のＩＶでまたは１０ｍｇ／ｋｇ／用量のＳＣで投与した。テレメトリー埋込み動物において、５０ｍｇ／ｋｇ／用量のＩＶ群において心血管作用を評価した。３０日目、最後の投与の翌日に、選択した動物を剖検した。忍容性および毒物動態をアセスメントするために、５０ｍｇ／ｋｇ／用量のＩＶ群の２匹のサルを７１日目まで保持した。ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２の投与は、すべての用量で許容された。生存、臨床徴候、体重、摂餌量、心血管測定値、インビボでのサイトカインアセスメント、血液学的および凝固パラメーター、ならびに肉眼的および顕微鏡所見に関して、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２に関連する作用はなかった。ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２に関連する作用は、５０ｍｇ／ｋｇ／用量のＩＶの雌（１．２６×−１．５１×ベースライン）および２００ｍｇ／ｋｇ／用量のＩＶの雄および雌動物（それぞれ１．５９×および１．５５×ベースライン）の両方におけるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼのわずかな増加および５０ｍｇ／ｋｇ／用量のＩＶ（１．２９×−２．０５×ベースライン）および２００ｍｇ／ｋｇ／用量のＩＶ（１．２９×ベースライン）の同じ雌におけるアラニンアミノトランスフェラーゼのわずかな増加を含んでいた。これらの動物の肝臓において、これらの酵素増加は、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２に関連する顕微鏡的変化に関連していなかった。
【０３２２】
（ｉｉ）反復投与毒性試験
ピボタル反復投与カニクイザル毒性試験において、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２を週１回、３カ月にわたって（合計１３用量）、２０、１００、または３００ｍｇ／ｋｇ／用量のＩＶでまたは３００ｍｇ／ｋｇ／用量のＳＣで投与し、その後に６週間の回復期間（対照および３００ｍｇ／ｋｇ／用量のＩＶ）を続けた。この試験において評価したいかなるエンドポイントにおいても、有害なＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２に関連する所見はなかった。ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２に関連する臨床徴候、体重、摂餌量、心電図／心拍数、血液学、凝固、検尿、眼科、臓器重量、または肉眼的な所見はなかった。ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２に関連する臨床化学変化は、３００ｍｇ／ｋｇ／用量のＩＶまたはＳＣでのコレステロールの増加（１．２５×−１．６１×ベースライン）、≧２０ｍｇ／ｋｇ／用量のＩＶまたは３００ｍｇ／ｋｇ／用量のＳＣでのトリグリセリドの増加（１．５８×−４．５９×ベースライン）、ならびに≧１００ｍｇ／ｋｇ／用量のＩＶまたは３００ｍｇ／ｋｇ／用量のＳＣでのグロブリンの減少（０．８３×−０．８７×ベースライン）を含んでいた。すべての臨床化学変化は、それらの変化の大きさが小さいこと、および関連する組織変化が存在しないことから、有害ではなかった。臨床化学変化は、定量可能な濃度のＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２が回復期間の１２８／１２７日目まで存在していた回復期間後、３００ｍｇ／ｋｇ／用量のＩＶ雄において存続した（２．７８×−６．７９×ベースライン）トリグリセリドの増加を除いて完全に回復した。
【０３２３】
リンパ濾胞の細胞充実性の増加は、３００ｍｇ／ｋｇ／用量をＳＣ投与した動物の流入領域（左腋窩）および腋窩（右腋窩）リンパ節において観察された。この所見は、目立った胚中心形成を伴うリンパ濾胞の大きさおよび数の極軽度から軽度の増加によって特徴付けられ、抗原刺激に対する応答と一致した。この所見は、その重症度が極軽度から軽度であることから、有害ではなかった。注射が投与されなくなればこの所見は回復するであろうことが予期される。対照的に、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２を最大で３００ｍｇ／ｋｇ／用量までの用量でＩＶ投与された動物において、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２に関連する顕微鏡所見は存在しなかった。
【０３２４】
３カ月のＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２投与後のカニクイザルにおける毒物動態の概要は、表２２において見られる。サルに対してＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２を週１回３カ月にわたって（合計１３用量）、２０、１００、または３００ｍｇ／ｋｇ／用量でＩＶまたは３００ｍｇ／ｋｇ／用量でＳＣ投与した後、３００ｍｇ／ｋｇ／用量のＩＶおよび３００ｍｇ／ｋｇ／用量のＳＣをＮＯＡＥＬと特定した。
【０３２５】
ＩＩ．局所忍容性
ＩＶおよびＳＣ注射部位を、予備的およびピボタルラットおよびカニクイザル反復投与毒性試験において顕微鏡により評価した。ラットのＩＶ注射部位においてＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２に関連する所見はなかった。ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２に関連する所見は、ラットのＳＣ注射部位においてのみ認められた。ラットＥＴＳにおいて、≧１０ｍｇ／ｋｇ／用量のＳＣでの極軽度から中等度の皮下血管周囲炎は、注射の身体的外傷に起因すると考えられ、有害ではないとみなされた。ピボタルラット試験において、出血の重症度の増加（中等度）は、これらは同時の対照よりわずかに重度であるだけであり、注射手技の結果として予期されるであろうものを超える顕著な組織損傷とは関連していなかったため、有害ではないとみなされた。ピボタルラット試験においてまた、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２に関連する皮膚病変（背部、胸部、頭部、または注射部位）は、投与期間中に雄において４２５ｍｇ／ｋｇ／用量のＳＣで認められた。これらの変化は、発生率が対照群と比較してわずかに高いだけであるため、また投与期間中に散発的に認められたため、有害とはみなされなかった。
【０３２６】
カニクイザルのＩＶ注射部位において、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２に関連する所見はなかった。最大で２００ｍｇ／ｋｇ／用量の用量のＩＶでのＥＴＳにおいて、対照を含む大部分の動物においてＩＶ注射部位に存在する様々な重症度の出血および／または好中球性炎症ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２に関連するとはみなされず、ピボタルカニクイザル試験において最大で３００ｍｇ／ｋｇ／用量までのＩＶの用量で、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２に関連するＩＶ注射部位所見はなかった。サルのＳＣ注射部位において、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２に関連する所見はなかった。
【０３２７】
ＩＩＩ．サイトカイン放出アッセイ
ヒト全血サンプルを使用したインビトロでのサイトカイン放出アッセイ（ＣＲＡ）において、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２は、試験したヒトドナー８人のうちの１人由来の全血サンプルにおいて、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）およびインターロイキン−６（ＩＬ−６）の産生を誘発した。ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２ともにインキュベートしたヒト全血サンプルにおいて、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２に関連するインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）放出は観察されなかった。
【０３２８】
投与開始前に回収したカニクイザル全血サンプルを使用したインビトロＣＲＡにおいて、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２は、試験したカニクイザル１２匹のうち１匹由来の全血サンプルにおいてにおいてＩＬ−６産生を誘発し、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２に関連するＴＮＦ−αまたはＩＦＮ−γ放出は観察されなかった。
【０３２９】
加えて、サイトカイン濃度の変化を特徴付けるために、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２を週１回、１０ｍｇ／ｋｇ／用量でＳＣまたは５０もしくは２００ｍｇ／ｋｇ／用量でＩＶ投与した後のＥＴＳにおいて、カニクイザルから血液サンプルを回収した。ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２に関連する、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、またはＩＦＮ−γの血清濃度の変化はなかった。
【０３３０】
ＩＶ．Ｃ１ｑおよびＦｃγＲ結合アッセイ
補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）を誘発するその潜在能を試験するために補体タンパク質１ｑ（Ｃ１ｑ）結合ＥＬＩＳＡにおいて、および抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性についてのその潜在能を試験するために断片結晶化可能なガンマ受容体（ＦｃγＲ）結合アッセイにおいて、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２をインビトロで評価した。ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２は、試験した濃度までＣ１ｑに結合しなかったため、ＣＤＣの誘導に関して低い潜在能を有すると考えられる。試験したすべてのＦｃγＲに対するＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２の結合は、アッセイ対照抗体で見られる結合と比較して同等またはそれより少なく、陽性対照抗体のデータと比較してより少なかった。これらのデータは、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２が有するＡＤＣＣ活性を誘発する潜在能は低いことを示唆する。
【０３３１】
Ｖ．所見と薬物動態の関係
試験した用量範囲にわたって、ラットおよびカニクイザルに対する反復ＩＶおよびＳＣ投与後、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２曝露（ＣｍａｘおよびＡＵＣによってアセスメント）は、用量が増加するにつれて用量にほぼ比例して増加した。明らかな性別に関連する曝露の差異は観察されなかった。重要な応答に関連するＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２の閾値濃度およびこれらの重要な応答に対して算出された曝露マージンは、表２２において見られる。
【０３３２】
【表２２−１】
2020522248.tif 000024
【０３３３】
【表２２−２】
2020522248.tif 000025
【０３３４】
要するに、これらのデータは、ＲＯＢＯ２−Ｆｃ２．２が様々な疾患、障害および状態のための潜在的なヒト用治療薬であることを示唆する。
【０３３５】
上に述べたように、本発明を広く開示し、上記の代表的な実施形態に関して例示してきた。当業者は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく本発明に対して様々な修正を行うことができることを認識するであろう。すべての出版物、特許出願、および発行済み特許は、各個々の出版物、特許出願または発行済み特許が、その全体が参照により組み込まれると具体的かつ個別に示されている場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。参照により組み込まれる文言に含有される定義は、これらが本開示中の定義と矛盾する範囲については除外される。
【０３３６】
明確にするために別個の実施形態との関連において記述されている本発明のある特定の特徴はまた、単一の実施形態では組み合わせで提供してもよいことが理解される。逆に、簡潔にするために単一の実施形態の文脈において記述されている本発明の様々な特徴はまた、別個にまたは任意の好適な部分的組み合わせで提供されてもよい。
【０３３７】
本発明の一実施形態に関して論じられている任意の限定は、本発明の任意の他の実施形態に適用され得ることが特に企図される。さらに、本発明の任意の組成物を、本発明の任意の方法において使用してもよく、本発明の任意の方法を使用して、本発明の任意の組成物を生成または利用してもよい。特に、単独のまたは１つもしくは複数のさらなる特許請求の範囲および／もしくは明細書の態様と組み合わせた、特許請求の範囲に記載されている本発明の任意の態様は、特許請求の範囲および／または明細書および／または配列表および／または図面中の他の箇所に記載されている本発明の他の態様と組み合わせられると理解されるべきである。
【０３３８】
本明細書に見出される特定の例が発明の範囲内でない限りにおいては、前記特定の例は権利を明示的に放棄され得る。
【０３３９】
特許請求の範囲における「または」という用語の使用は、択一形式のみを指すまたは選択肢が互いに矛盾することが明示的に示されない限り、「および／または」を意味するために使用されるが、本開示は、択一形式のみおよび「および／または」を指す定義を支持する。本明細書で使用される場合、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、他に明らかな指示がない限り、１つまたは複数を意味し得る。本明細書で特許請求の範囲において使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語とともに使用されるとき、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」という語は、１つまたは１つを超えるを意味し得る。本明細書で使用される場合、「別の」は、少なくとも第２のまたはそれ以上のを意味し得る。本明細書で別段定義されていない限り、本発明に関連して使用される科学的および技術的用語は、当業者が一般に理解している意味を有するものとする。さらに、文脈上別の解釈が必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）／含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語および「有すること（ｈａｖｉｎｇ）／含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という語は、本発明に関して本明細書で使用される場合、記載されている特徴、整数、ステップまたは構成成分の存在を記載するために使用されるが、１つまたは複数の他の特徴、整数、ステップ、構成成分またはそれらの群が存在することまたは付加されることを除外しない。
【０３４０】
様々な用途、方法、および組成物に関して開示されている教示を記載してきたが、本明細書の教示および下記で特許請求されている発明から逸脱することなく、様々な変更および修正を行うことができることが理解されるであろう。実施例は、開示されている教示をよりよく例示するために記載しており、本明細書で提示されている教示の範囲を限定することを意図しない。これらの例示的な実施形態に関して本教示を記載してきたが、これらの例示的な実施形態の多くの変形形態および修正形態が、過度の実験を行うことなく可能である。すべてのそのような変形形態および修正形態は、本教示の範囲内である。
【０３４１】
本発明の態様または実施形態がマーカッシュ群または他の択一形式による群に関して記載されている場合、本発明は、群の各要素を個々にしかし全体として列挙した群全体および主群のすべての可能な部分群だけでなく、群の要素の１つまたは複数を欠く主群も包含する。本発明はまた、特許請求されている発明における群要素のいずれかの１つまたは複数の明示的な除外を想定する。
【０３４２】
特許、特許出願、研究論文、教科書などを含む本明細書において引用されているすべての参考文献およびそこで引用されている参考文献は、言及されていない程度まで、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。組み込まれた文献および類似資料の１つまたは複数が、定義されている用語、用語の用法、記載されている技術などを含むがこれらに限定されない本出願と異なるまたは矛盾する場合には、本出願が優先される。
【０３４３】
説明および例によって本発明のある特定の具体的な実施形態を詳述し、本発明者らが企図する最良の形態を記載している。しかしながら、前述のものが本文中でいかに詳述してあっても、本発明は多くの方式で実施することができ、本発明は添付の特許請求の範囲およびその任意の均等物に従って解釈されるべきであることが理解されるであろう。
【０３４４】
【表２３−１】
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【０３４５】
【表２３−２】
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【０３４６】
【表２３−３】
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【０３４７】
【表２３−４】
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【０３４８】
【表２３−５】
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【０３４９】
【表２４】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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