(57)【要約】  植物材料中で活性なプロモーターの制御下でＳＵＳＩＢＡ２またはＳＵＳＩＢＡ２様転写因子をコードするゲノムヌクレオチド配列を含む植物材料。ＳＵＳＩＢＡ２またはＳＵＳＩＢＡ２様転写因子をコードするゲノムヌクレオチド配列は、ＳＵＳＩＢＡ２またはＳＵＳＩＢＡ２様転写因子をコードする野生型のゲノムヌクレオチド配列のイントロンに存在するＳＵＳＩＢＡ１プロモーターまたはＳＵＳＩＢＡ１様プロモーターの活性化領域の少なくとも一部分を欠く。植物材料は、炭水化物、具体的にはデンプンまたはデンプンとフルクタンの産生が制御されている。具体的には、植物材料は、炭水化物を高レベルで産生するよう設計され得る。【選択図】図２６−２
2020512008.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物材料であって、前記植物材料中で活性なプロモーターの転写制御下でオオムギ中糖シグナル伝達２（ＳＵＳＩＢＡ２）またはＳＵＳＩＢＡ２様転写因子をコードするゲノムヌクレオチド配列を含み、前記ＳＵＳＩＢＡ２またはＳＵＳＩＢＡ２様転写因子をコードする前記ゲノムヌクレオチド配列が、前記ＳＵＳＩＢＡ２またはＳＵＳＩＢＡ２様転写因子をコードする野生型の前記ゲノムヌクレオチド配列のイントロンに存在する、ＳＵＳＩＢＡ１またはＳＵＳＩＢＡ１様プロモーター（ＳＵＳＩＢＡ１ｐまたはＳＵＳＩＢＡ１様ｐ）の活性化領域の少なくとも一部分を欠く、植物材料。
【請求項２】
前記ＳＵＳＩＢＡ１ｐまたはＳＵＳＩＢＡ１様ｐの活性化領域の前記少なくとも一部分が、前記ＳＵＳＩＢＡ２またはＳＵＳＩＢＡ２様転写因子をコードする前記ゲノムヌクレオチド配列の前記野生型から欠失される、請求項１に記載の植物材料。
【請求項３】
前記ＳＵＳＩＢＡ１ｐまたはＳＵＳＩＢＡ１様ｐの活性化領域の前記少なくとも一部分が、前記ＳＵＳＩＢＡ２またはＳＵＳＩＢＡ２様転写因子をコードする前記ゲノムヌクレオチド配列の前記野生型からクラスター化された規則的な間隔の短い回文配列リピート、（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）を介する欠失により欠失される、請求項２に記載の植物材料。
【請求項４】
前記ＳＵＳＩＢＡ２またはＳＵＳＩＢＡ２様転写因子をコードする前記ゲノムヌクレオチド配列が、前記ＳＵＳＩＢＡ２またはＳＵＳＩＢＡ２様転写因子をコードするゲノム内在性ヌクレオチド配列である、請求項１〜３のいずれかに記載の植物材料。
【請求項５】
前記ＳＵＳＩＢＡ２またはＳＵＳＩＢＡ２様転写因子をコードする前記ゲノムヌクレオチド配列が、前記ＳＵＳＩＢＡ１ｐまたはＳＵＳＩＢＡ１様ｐの前記活性化領域を欠く、請求項１〜４のいずれかに記載の植物材料。
【請求項６】
前記ＳＵＳＩＢＡ２またはＳＵＳＩＢＡ２様転写因子をコードする前記ゲノムヌクレオチド配列が、配列番号９２、９３または１１２によるヌクレオチド配列を欠く、請求項５に記載の植物材料。
【請求項７】
前記ＳＵＳＵＢＡ２またはＳＵＳＩＢＡ２様転写因子をコードする前記ゲノムヌクレオチド配列が、前記ＳＵＳＩＢＡ２またはＳＵＳＩＢＡ２様転写因子をコードする前記ゲノムヌクレオチド配列の前記イントロンに存在する前記ＳＵＳＩＢＡ１ｐまたはＳＵＳＩＢＡ１様ｐの糖抑制領域の少なくとも一部分を欠く、請求項１〜６のいずれかに記載の植物材料。
【請求項８】
前記ＳＵＳＩＢＡ２またはＳＵＳＩＢＡ２様転写因子をコードする前記ゲノムヌクレオチド配列が、前記ＳＵＳＩＢＡ１ｐまたはＳＵＳＩＢＡ１様ｐの前記糖抑制領域を欠く、請求項７に記載の植物材料。
【請求項９】
前記ＳＵＳＩＢＡ２またはＳＵＳＩＢＡ２様転写因子をコードする前記ゲノムヌクレオチド配列が、配列番号９４、９５または１１３によるヌクレオチド配列を欠く、請求項８に記載の植物材料。
【請求項１０】
前記ＳＵＳＩＢＡ２またはＳＵＳＩＢＡ２様転写因子をコードする前記ゲノムヌクレオチド配列が、前記ＳＵＳＩＢＡ１ｐまたはＳＵＳＩＢＡ１様ｐのイントロン部分を欠く、請求項１〜９のいずれかに記載の植物材料。
【請求項１１】
前記ＳＵＳＩＢＡ２またはＳＵＳＩＢＡ２様転写因子をコードする前記ゲノムヌクレオチド配列が、前記ＳＵＳＩＢＡ２またはＳＵＳＩＢＡ２様転写因子をコードする前記ゲノムヌクレオチド配列のイントロン２を欠く、請求項１〜１０のいずれかに記載の植物材料。
【請求項１２】
前記植物材料が、コメ植物体、コメ植物細胞およびコメ種子からなる群より選択され、かつ
前記ゲノムヌクレオチド配列が、ＳＵＳＩＢＡ２様転写因子をコードしかつ前記ＳＵＳＩＢＡ２様転写因子をコードする野生型の前記ゲノムヌクレオチド配列のイントロンに存在するＳＵＳＩＢＡ１様ｐの活性化領域の少なくとも一部分を欠く、
請求項１〜１１のいずれかに記載の植物材料。
【請求項１３】
前記ＳＵＳＩＢＡ２様転写因子が、配列番号１０５によるアミノ酸配列を有する、請求項１２に記載の植物材料。
【請求項１４】
前記植物材料が、イネ科植物材料、好ましくはオオムギ、コムギおよびエンバクからなる群より選択される、植物体、植物細胞または種子である、請求項１〜１１のいずれかに記載の植物材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本諸実施形態は全般的には植物材料、具体的には炭水化物産生が制御された植物材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖は、光合成を介して太陽エネルギーを地球上の生命体に不可欠な化学エネルギーに伝達するのに重要なエネルギー運搬体である。高等植物では、糖はバイオマス合成の基礎となる基質材料であるばかりでなく、多数の代謝経路のシグナル伝達分子でもある。炭水化物合成には通常、糖が介在する。高等植物は、糖のレベルおよび利用可能性に応じ、様々な戦略を用いて、生長、生育および繁殖のエネルギー要求を満たす短期間の（分）、中期間の（時間）および長期間の（数日〜数年）エネルギー供給のためのエネルギーの貯蔵において様々な炭水化物を合成する。
【０００３】
フルクタン、一時的なデンプンおよび貯蔵デンプンは、様々なエネルギー供給形態からみた炭水化物の例である。これらは、オオムギ、コムギ、エンバクおよび多数の飼料草などの温帯性イネ科を含む多数の顕花植物で産生される。
【０００４】
文献［１］は、ＷＲＫＹタンパク質に属する、オオムギ２（ＳＵＳＩＢＡ２）転写因子（ＴＦ）における糖シグナル伝達を開示する。ＳＵＳＩＢＡ２  ＴＦは、ＩＳＯ１プロモーター中の糖応答性エレメント（ＳＵＲＥ）およびＷ−ｂｏｗエレメントに結合するが、ＳＰ８ａエレメントには結合しない。ＳＵＳＩＢＡ２の転写は糖誘導性であり、デンプン合成の調節転写因子である。
【０００５】
文献［３］は、高デンプンで低メタンのトランスジェニックコメを生じる、コメにおけるオオムギＳＵＳＩＢＡ２  ＴＦの発現を開示する。
【０００６】
文献［１７］は、デンプン合成に関与する酵素をコードする遺伝子のプロモーターを活性化できる、ＳＩＳＩＢＡ２  ＴＦなどの糖シグナル伝達ＴＦをコードする核酸配列を含む、トランスジェニック植物を開示する。
【０００７】
炭水化物の産生が制御された植物材料が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【０００８】
炭水化物の産生が制御された植物材料を提供することが全般的な目的である。
【０００９】
この目的およびその他の目的は本明細書に開示される諸実施形態によって満たされる。
【００１０】
本発明は独立請求項で定められる。さらなる実施形態については従属請求項で定められる。
【００１１】
植物材料は、植物材料で活性なプロモーターの転写制御下のオオムギ中糖シグナル伝達（ｓｕｇａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｂａｒｌｅｙ）２（ＳＵＳＩＢＡ２）転写因子またはＳＵＳＩＢＡ２様転写因子のをコードする、ゲノムヌクレオチド配列を含む。ＳＵＳＩＢＡ２転写因子またはＳＵＳＩＢＡ２様転写因子をコードするゲノムヌクレオチド配列は、ＳＵＳＩＢＡ２転写因子またはＳＵＳＩＢＡ２様転写因子をコードする野生型のゲノムヌクレオチド配列のイントロンに存在するＳＵＳＩＢＡ１プロモーターまたはＳＵＳＩＢＡ１様プロモーター（ＳＵＳＩＢＡ１ｐまたはＳＵＳＩＢＡ１様ｐ）の活性化領域の少なくとも一部分を欠く。
【００１２】
本諸実施形態の植物材料は、炭水化物、具体的にはデンプンまたはデンプンとフルクタンの産生が制御されている。具体的には、本諸実施形態の植物材料は、炭水化物を高レベルで産生するよう設計され得る。本諸実施形態の植物材料は、メタンの放出も低減でき、それにより、高デンプンで低メタンの植物材料または高デンプン、高フルクタン、低メタンの植物材料であり得る。
【００１３】
諸実施形態は、以下の説明を添付図面とともに参照することにより、そのさらなる目的および利点とともに最大限に理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】オオムギの完全長ＳＵＳＩＢＡ１  ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＴ２９０５５８）の同定ならびにＳＵＳＩＢＡ１およびＳＵＳＩＢＡ２から発現された転写産物およびタンパク質の検出を示す図である。（Ａ）ＳＵＳＩＢＡ１  ｃＤＮＡの５’末端を５’−ＲＡＣＥで増幅することにより３つのアンプリコンが得られた（バンド１〜３）。（Ｂ）シーケンシングの結果（配列番号１１４）から、アンプリコン１〜３がＳＵＳＩＢＡ２  ｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ３２３２０６）と同一であることがわかった。最も長いバンド３は黒矢印で示すように、ｎｔ９０７から始まる。ＳＵＳＩＢＡ１  ｃＤＮＡ配列はイタリック体で示されている。ＳＵＳＩＢＡ２およびＳＵＳＩＢＡ１の開始コドンおよび終止コドンの配列には下線が施されている。５’−ＲＡＣＥ増幅に使用したプライマーが矢印で示されている（ネステッドプライマー）。（Ｃ）オオムギの葉および生育中の種子のＳＵＳＩＢＡ１転写産物およびＳＵＳＩＢＡ２転写産物に関するノーザンブロット解析。（Ｄ）オオムギの葉および生育中の種子中のＳＵＳＩＢＡ１およびＳＵＳＩＢＡ２のウエスタンブロット解析。ｄａｆは開花後日数。
【図２】ＳＵＳＩＢＡ１プロモーターおよびＳＵＳＩＢＡ２プロモーター（それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＴ２９０５５９、ＫＴ２９０５６０およびＡＣ２６９４８３）の略図である。ＳＵＳＩＢＡ１プロモーターはＳＵＳＩＢＡ２のイントロン２と５’−エクソン３を含む。ＳＵＳＩＢＡ１プロモーター（配列番号１１５）が示されており、ＳＵＳＩＢＡ２のイントロン２（標準文字）とエクソン３の５’末端（イタリック体および太字）を含む配列が示されている。転写（ＳＵＳＩＢＡ１のバンド３のｃＤＮＡに対応する）の開始が矢印で示されている。ＮＬＳ（核局在シグナル）をコードする配列およびアミノ酸ＷＲＫＹドメインをコードする配列が示されている。
【図３】ＳＵＳＩＢＡ１プロモーター活性の解析を示す図である。様々なアグロバクテリウムの構築物を浸潤させた。（Ａ）ＵＶ光下で蛍光を観察した。（Ｂ）浸潤させた葉のトリプリケートの蛍光領域を顕微鏡下で観察した。（Ｃ）トリプリケートから定量化した相対蛍光強度。完全長ＳＵＳＩＢＡ２イントロン２−５’−エクソン３と比較した２つの短縮ＳＵＳＩＢＡ２イントロン２−５’−エクソン３、ｐ３５Ｓ：ＧＦＰ、ＧＵＳ−ＧＦＰおよびアグロバクテリウムＡＧＬ１の有意差がアスタリスクで示されている（＊＊ｐ≦０．０１）。一元配置ＡＮＯＶＡを用いた（エラーバーはｓ．ｄ．を表す）。（Ａ）のバー＝７ｍｍ、（Ｂ）のバー＝１００μｍ。
【図４】様々な濃度で異所的に供給したスクロース（Ｓｕｃ）に応答したオオムギ葉でのフルクタンおよびデンプンの含有量を示す図である。フルクタン（Ａ）およびデンプン（Ｂ）含有量の変化が示されている。３つの独立した実験（ｎ＝３；実験１つ当たり２枚の葉）を実施し、各実験でテクニカルデュプリケートをフルクタンおよびデンプンの解析に用いた。フルクタンおよびデンプンのレベルの変化がそれぞれ５０ｍＭ  Ｓｕｃおよび８５ｍＭ  Ｓｕｃで検出された。オオムギ葉でのフルクタン合成およびデンプン合成の誘導閾値はそれぞれ、４０〜５０ｍＭのスクロースおよび７５〜８５ｍＭのスクロースであることが確認された。示されるように、標準偏差のバーは短かかった。スクロース処理試料とソルビトール（Ｓｏｒｂ）対照の間の有意差がアスタリスクで示されている（＊＊ｐ≦０．０１）。一元配置ＡＮＯＶＡを用いた（エラーバーはｓ．ｄ．を表す）。
【図５】オオムギでのデンプンとフルクタンの合成の調整におけるＳＵＳＩＢＡ１  ＴＦおよびＳＵＳＩＢＡ２  ＴＦの糖感知活性を示す図である。（Ａ）オオムギ第２染色体中のＳＵＳＩＢＡ配列の２つの選択的プロモーター、ＳＵＳＩＢＡ１プロモーター（ＳＵＳＩＢＡ１ｐ）とＳＵＳＩＢＡ２プロモーター（ＳＵＳＩＢＡ２ｐ）は、スクロース（Ｓｕｃ）濃度に対して異なる方法で応答する。Ｓｕｃ濃度が２５ｍＭを超えると、ＳＵＳＩＢＡ１ｐ活性の低下が起こり、４０ｍＭ  ＳｕｃでＳＵＳＩＢＡ２ｐが活性化される。ＳＵＳＩＢＡ１ｐ活性およびＳＵＳＩＢＡ２ｐ活性の発現は、最終的にそれぞれＳＵＳＩＢＡ２  ＴＦ（６２ｋＤ）およびＳＵＳＩＢＡ１（３０ｋＤ）ＴＦを生じる。ＳＵＳＩＢＡ１はフルクタン合成に関与する遺伝子に抑制因子として結合し、ＳＵＳＩＢＡ２はデンプン合成に関与する遺伝子に活性化因子として結合する。５０ｍＭ  Ｓｕｃ以上でのＳＵＳＩＢＡ１抑制の解除はフルクタン合成を開始し、８５ｍＭ  Ｓｕｃ以上でのＳＵＳＩＢＡ２のコグネイトシスエレメントへの結合はデンプン合成を刺激する。（Ｂ）Ｓｕｃレベルに応答したＳＵＳＩＢＡ１ｐ活性およびＳＵＳＩＢＡ２ｐ活性。ＳＵＳＩＢＡ１ｐおよびＳＵＳＩＢＡ２ｐをそれぞれＧＦＰレポーター遺伝子およびＢＦＰレポーター遺伝子に融合した。構築物を保有するアグロバクテリウムをオオムギ葉内に浸潤させ、次いでこれを様々なＳｕｃ濃度でインキュベートした。ＳＵＳＩＢＡ１ｐ：ＧＦＰの蛍光を４６０〜５００ｎｍの励起光で観察し、ＳＵＳＩＢＡ２ｐ：ＢＦＰの蛍光を３４０〜３８０ｎｍの励起光で観察した。ＧＵＳとＧＦＰの融合配列（ＧＵＳ：ＧＦＰ）を陰性対照に用いた。バー＝１００μｍ。
【図６】様々な濃度のスクロース（Ｓｕｃ）、フルクトース（Ｆｒｕ）およびグルコース（Ｇｌｃ）に応答したオオムギ葉中のフルクタンとデンプンの含有量およびＳＵＳＩＢＡ１、ＳＵＳＩＢＡ２、６−ＳＦＴおよびＳＢＥＩＩｂの転写産物とタンパク質のレベルを示す図である。（Ａ）フルクタン含有量。（Ｂ）デンプン含有量。（Ｃ）遺伝子発現レベルのｑＰＣＲ解析。（Ｄ）対応するタンパク質レベルのウエスタンブロット解析。フルクタン、デンプンおよびｑＰＣＲの解析には３つの独立した実験（ｎ＝３）を実施し、ウエスタンブロットには２つの独立した実験を実施した。一元配置ＡＮＯＶＡを用いた（糖処理試料とソルビトール対照の間で＊ｐ≦０．０５または＊＊ｐ≦０．０１であり、（Ａ）および（Ｂ）でのエラーバーはｓ．ｄ．を表し、短い）。
【図７】様々な糖で処理した後の葉でのグルコース（Ｇｌｃ）とフルクトース（Ｆｒｕ）の内因性レベルの変化およびトレハロース６−リン酸合成酵素（ＴＰＳ）活性とＴＰＳ様発現レベルの測定を示す図である。（Ａ）内因性Ｇｌｃ。（Ｂ）内因性Ｆｒｕ。（Ｃ）対応する試料中のオオムギＴＰＳ様の遺伝子発現レベル。（Ｄ）ＴＰＳの総活性。Ｓｕｃ（８５ｍＭ）および光で処理した葉の試料からのシロイヌナズナタンパク質抽出物を酵素アッセイの陽性対照に用いた。バイオロジカルトリプリケート（Ａ、Ｂ、Ｄ）および３つの独立した実験（Ｃ）を実施した（ｎ＝３）。一元配置ＡＮＯＶＡを用いた（ソルビトール（Ｓｏｒｂ）対照と比較した糖処理試料の増加については＊ｐ≦０．０５および＊＊ｐ≦０．０１であり、エラーバーはｓ．ｄ．を表す）。
【図８】ＳＵＳＩＢＡ１による６−ＳＦＴプロモーター活性の抑制を示す図である。（Ａ〜Ｄ）オオムギ細胞中のＳＵＳＩＢＡ１の核局在。ＳＵＳＩＢＡ１  ｃＤＮＡをＧＦＰに融合した。３５Ｓプロモーターによって駆動されるＧＦＰ単独（Ａ、Ｂ）またはＳＵＳＩＢＡ１：ＧＦＰ（Ｃ、Ｄ）を有するアグロバクテリウムを浸潤させた。（Ｅ〜Ｊ）６−ＳＦＴのＳＵＲＥａプロモーターエレメント、ＷボックスプロモーターエレメントおよびＳＰ８ａプロモーターエレメントに対するＳＵＳＩＢＡ１の結合活性。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてＤＮＡフラグメントプローブを［γ３２Ρ］−ΑΤΡで末端標識した。オリゴプローブは、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて一方の鎖を［γ３２Ρ］−ΑΤΡで末端標識し、オリゴの相補鎖とアニールさせた。（Ｅ）６−ＳＦＴプロモーター中の様々なエレメント。（Ｆ）（Ｅ）での５つのフラグメントに対するＳＵＳＩＢＡ１結合活性。ＳＵＳＩＢＡ１を過剰発現させ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から精製した。バンドの移動として示される結合活性が矢印で示されている。（Ｇ）６−ＳＦＴプロモーター中のエレメントの配列（配列番号７８、７９、６２〜６７）。ＳＰ８ａとＷボックスのコンセンサス配列に下線が施されている。（Ｈ）ＳＵＳＩＢＡ１の存在下（＋）または不在下（−）での（Ｇ）のエレメントのＥＭＳＡ。遊離ＤＮＡプローブの位置が示されている。（Ｉ）個々の設計エレメントの配列（配列番号６８〜７９）。コンセンサス配列と置き換わるようにＡストレッチ（下線部）を設計した。（Ｊ）ＳＵＳＩＢＡ１の存在下（＋）または不在下（−）での設計エレメントのＥＭＳＡ。（Ｋ〜Ｏ）アグロバクテリウムと６−ＳＦＴｐ：ＧＦＰ構築物およびｐ３５Ｓ：ＳＵＳＩＢＡ１構築物での同時浸潤。（Ｋ）６−ＳＦＴｐ：ＧＦＰを含むアグロバクテリウム。（Ｌ）６−ＳＦＴｐ：ＧＦＰを含むアグロバクテリウムとｐ３５Ｓ：ＷＲＩ１を含むアグロバクテリウムの混合物。ＷＲＩ１は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿２０２７０１を有しシロイヌナズナ由来のＳＵＳＩＢＡと無関係なＴＦ遺伝子である。（Ｍ）６−ＳＦＴｐ：ＧＦＰを含むアグロバクテリウムとｐ３５Ｓ：ＳＵＳＩＢＡ１を含むアグロバクテリウムの混合物。（Ｎ）浸潤領域でのＳＵＳＩＢＡ１の転写産物とタンパク質のレベル。挿入図は、生存アグロバクテリウム（左レーン）または熱殺菌したバックグラウンドアグロバクテリウム（右レーン）を浸潤させた領域でのタンパク質レベルに関するウエスタンブロット解析を示している。（Ｏ）浸潤領域でのＷＲＩ１転写産物レベル。ｑＰＣＲ解析には３つの独立した実験（ｎ＝３）を実施し、ウエスタンブロットには２つの独立した実験を実施した。（Ａ〜Ｄ）のバー＝５μｍ、（Ｋ〜Ｍ）のバー＝１００μｍ。一元配置ＡＮＯＶＡを用いた（エラーバーはｓ．ｄ．を表し、熱殺菌したバックグラウンドアグロバクテリウムと生存アグロバクテリウムとの間で＊＊ｐ≦０．０１である）。
【図９】ＳＵＳＩＢＡ１のａｓＯＤＮ阻害を示す図である。（Ａ）選択した５種類のａｓＯＤＮの配列アライメントであり、ＳＵＳＩＢＡ１プロモーターの部分と重複するＳＵＳＩＢＡ２  ｃＤＮＡの領域に対するもの１つ（ａｓＯＤＮ１）と、ＳＵＳＩＢＡ１  ｃＤＮＡおよびＳＵＳＩＢＡ２  ｃＤＮＡの領域に対するもの（ａｓＯＤＮ２〜５）である（配列番号３２〜３７、１１６〜１１９）。（Ｂ）選択した５種類のａｓＯＤＮでのａｓＯＤＮ阻害後のＳＵＳＩＢＡ１レベルおよびＳＵＳＩＢＡ２レベルに関するウエスタンブロット解析（上パネル）およびａｓＯＤＮ１または５でのＳＵＳＩＢＡ１阻害後の６−ＳＦＴレベルに関するウエスタンブロット解析（下パネル）。（Ｃ）ＳＵＳＩＢＡ１プロモーター領域に対するａｓＯＤＮ１での阻害後のＳＵＳＩＢＡ１プロモーター活性に関する解析。ａｓＯＤＮ１による阻害効率を１００ｍＭスクロースによるＳＵＳＩＢＡ１プロモーター活性の抑制と比較する（Ｓｕｃ；右側の上パネルおよび下パネル）。５０ｍＭ  Ｓｕｃを用いた対照および５０ｍＭ  Ｓｕｃ中のセンスＯＤＮ（ｓＯＤＮ）が含まれる（左側の上パネルおよび下パネル）。（Ｄ）５０ｍＭ  Ｓｕｃ中の蛍光標識ＯＤＮのオオムギ葉細胞内への取込み。２４時間のインキュベーション後の葉細胞の自家蛍光が示され（左パネル）、蛍光標識ＯＤＮ（白矢印）が見える（右パネル）。（Ｃ）のバー＝１００μｍ、（Ｄ）のバー＝５０μｍ。
【図１０】ＳＵＳＩＢＡ１およびＳＵＳＩＢＡ２をフルクタン合成およびデンプン合成のスクロース誘導閾値でアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ａｓＯＤＮ）阻害したときのオオムギ葉でのフルクタンおよびデンプンの含有量の変化を示す図である。（Ａ）４０ｍＭスクロースでＳＵＳＩＢＡ１を阻害した葉（Ｓｕｃ；左パネル）および５０ｍＭでＳＵＳＩＢＡ２を阻害した葉（右パネル）でのフルクタン含有量。（Ｂ）７５ｍＭ  ＳｕｃでＳＵＳＩＢＡ１を阻害した葉（左パネル）および８５ｍＭでＳＵＳＩＢＡ２を阻害した葉（右パネル）でのデンプン含有量。対応するＳＵＳＩＢＡ１およびＳＵＳＩＢＡ２に対するセンスＯＤＮでの処理を、統計解析の対照として用いた。３つの独立した実験（ｎ＝３）を実施した。Ｓｏｒｂ、ソルビトール。一元配置ＡＮＯＶＡを用いた（＊ｐ≦０．０５または＊＊ｐ≦０．０１であり、エラーバーはｓ．ｄ．を表す）。
【図１１】ａｓＯＤＮによりＳＵＳＩＢＡ１活性およびＳＵＳＩＢＡ２活性を阻害した後のオオムギ葉でのＳＵＳＩＢＡ１、ＳＵＳＩＢＡ２および６−ＳＦＴの転写産物とタンパク質のレベルの変化を示す図である。（Ａ）示されるスクロース（Ｓｕｃ）濃度でＳＵＳＩＢＡ１（左パネル）またはＳＵＳＩＢＡ２（右パネル）をａｓＯＤＮ阻害したときのＳＵＳＩＢＡ１、ＳＵＳＩＢＡ２および６−ＳＦＴの相対遺伝子発現レベルに関するｑＰＣＲ解析。（Ｂ）ａｓＯＤＮ阻害後の対応するタンパク質レベルに関するウエスタンブロット解析。スクロース（Ｓｕｃ）中のセンスＯＤＮ（ｓＯＤＮ）の対照と比較した阻害後の有意差がアスタリスクで示されている。ａｓＯＤＮ阻害およびｑＰＣＲ解析では３つの独立した実験を実施し（ｎ＝３）、ウエスタンブロット解析では２つの独立した実験を実施した。一元配置ＡＮＯＶＡを用いた（エラーバーはｓ．ｄ．を表し、＊＊ｐ≦０．０１である。）。Ｓｏｒｂ、ソルビトール。
【図１２】ａｓＯＤＮによるＳＵＳＩＢＡ１活性およびＳＵＳＩＢＡ２活性阻害後のオオムギ葉でのＳＵＳＩＢＡ１、ＳＵＳＩＢＡ２およびＳＢＥＩＩｂの転写産物とタンパク質のレベルの変化を示す図である。（Ａ）示されるスクロース（Ｓｕｃ）濃度でＳＵＳＩＢＡ１（左パネル）またはＳＵＳＩＢＡ２（右パネル）をａｓＯＤＮ阻害したときのＳＵＳＩＢＡ１、ＳＵＳＩＢＡ２およびＳＢＥＩＩｂの相対遺伝子発現レベルに関するｑＰＣＲ解析。（Ｂ）ａｓＯＤＮ阻害後の対応するタンパク質レベルに関するウエスタンブロット解析。スクロース（Ｓｕｃ）中のセンスＯＤＮ（ｓＯＤＮ）の対照と比較した阻害後の有意差がアスタリスクで示されている。ａｓＯＤＮ阻害およびｑＰＣＲ解析では３つの独立した実験を実施し（ｎ＝３）、ウエスタンブロット解析には２つの独立した実験を実施した。一元配置ＡＮＯＶＡを用いた（エラーバーはｓ．ｄ．を表し、＊＊ｐ≦０．０１である）。Ｓｏｒｂ、ソルビトール。
【図１３】種子フルクタン含有量の高いオオムギ変種および低いオオムギ変種の解析を示す図である。（Ａ）高フルクタン変種（変種１５５）および低フルクタン変種（変種１８１）中の開花後９日（ｄａｆ；左パネル）、変種１５５の様々な生育段階（中央パネル）および変種１５５の２４／１６℃（ｄ／ｎ）または１８／１０℃（ｄ／ｎ）の異なる栽培温度（右パネル）でのＳＵＳＩＢＡ１、ＳＵＳＩＢＡ２、６−ＳＦＴおよびＳＢＥＩＩｂの遺伝子発現レベルに関するｑＰＣＲ解析。（Ｂ）対応する変種、生育段階（Ｄｅｖ  ｓｔａｇｅ）および栽培温度（Ｇｒｏｗｔｈ  ｔｅｍｐ）についてのＳＵＳＩＢＡ１、ＳＵＳＩＢＡ２、６−ＳＦＴおよびＳＢＥＩＩｂのタンパク質レベルに関するウエスタンブロット解析。（Ｃ）対応する試料中のフルクタンおよびデンプンの含有量の解析。２つの試料間の有意差が各パネルにアスタリスクで示されている。一元配置ＡＮＯＶＡを用いた（エラーバーはｓ．ｄ．を表し、＊Ｐ≦０．０５または＊＊Ｐ≦０．０１である）。ｄ、昼；ｎ、夜。開花後９日および１２日（９ｄａｆ；１２ｄａｆ）の生育段階は穀類生育のＺａｄｏｋｓスケールでＺ７３〜Ｚ７５に対応する。フルクタンとデンプンの含有量およびｑＰＣＲの解析には、各バイオロジカルレプリケートに種子１０個を含むバイオロジカルトリプリケート（ｎ＝３）を用いた。ウエスタンブロット解析には２つの独立した実験を実施した。
【図１４】スクロース濃度に対するＳＵＳＩＢＡ１遺伝子、ＳＵＳＩＢＡ２遺伝子ならびにフルクタン（６−ＳＦＴ）遺伝子およびデンプン（ＳＢＥＩＩｂ）遺伝子の転写産物レベルおよびタンパク質レベルの応答を示す図である。（Ａ）スクロース（Ｓｕｃ）濃度に応答したＳＵＳＩＢＡ１、ＳＵＳＩＢＡ２、６−ＳＦＴおよびＳＢＥＩＩｂの相対発現レベルのｑＰＣＲ解析。（Ｂ）スクロース濃度に応答したＳＵＳＩＢＡ１、ＳＵＳＩＢＡ２、６−ＳＦＴおよびＳＢＥＩＩｂのタンパク質レベルのウエスタンブロット解析。Ｄａｆ、開花後日数；一元配置ＡＮＯＶＡを用いた（エラーバーはｓ．ｄ．を表す）。スクロース処理試料と１００ｍＭソルビトール（Ｓｏｒｂ）対照の間に有意差がある場合、＊ｐ≦０．０５および＊＊ｐ≦０．０１が示されている。糖誘導およびｑＰＣＲ解析（ｎ＝３）には３つの独立した実験を実施し、ウエスタンブロット解析には２つの独立した実験を実施した。
【図１５】オオムギシンク葉中のデンプン含有量ならびにＳＵＳＩＢＡ１遺伝子、ＳＵＳＩＢＡ２遺伝子、デンプン代謝遺伝子およびフルクタン代謝遺伝子の日周発現レベルを示す図である。（Ａ）オオムギシンク葉中のＳＵＳＩＢＡ１、ＳＵＳＩＢＡ２、ＳＢＥＩＩｂ、６−ＳＦＴ、６−ＦＥＨおよび１−ＦＥＨの相対発現レベルのｑＰＣＲ解析。（Ｂ）対応する試料中のデンプンおよびフルクタンの含有量。試料採取時点が示されており、明暗条件が月と太陽の記号をそれぞれ付した黒塗りのバーと白抜きのバーで示されている。一元配置ＡＮＯＶＡを用いた（エラーバーはｓ．ｄ．を表し、０５：００ａｍと比較して＊ｐ≦０．０５または＊＊ｐ≦０．０１である）。３つの独立した実験を実施した（ｎ＝３）。
【図１６】ＳＵＳＩＢＡ１抑制活性をＳＵＳＩＢＡ２糖応答活性と結び付けるＳＵＳＩＢＡ２プロモーターの遠位５’領域の特定を示す図である。（Ａ）ＳＵＳＩＢＡ２プロモーター活性の解析で、様々な長さのＳＵＳＩＢＡ２プロモーターを有する構築物およびＳＵＳＩＢＡ１過剰発現のための構築物をアグロインフィルトレーションに使用した。（Ｂ）ＳＵＳＩＢＡ２プロモーター活性。構築物をアグロバクテリウムに形質転換し、オオムギ葉内に浸潤させた。浸潤オオムギ葉を様々なスクロース濃度でインキュベートした。浸潤の３日後に顕微鏡下にて４６０〜５００ｎｍの波長で蛍光を観察した。（Ｃ）トリプリケートから相対蛍光強度を定量化した。構築物１と構築物１＋構築物３の間および構築物２と構築物２＋構築物３の間の有意差を解析し、アスタリスクで示した（＊＊ｐ≦０．０１または＊ｐ≦０．０５）。一元配置ＡＮＯＶＡを用いた（エラーバーはｓ．ｄ．を表す）。バー＝１００μｍ。３つの独立した実験を実施した（ｎ＝３）。
【図１７】ＳＵＳＩＢＡ２プロモーターに対するＳＵＳＩＢＡ１の抑制活性がＳＵＳＩＢＡ２自己促進活性を阻害することを示す図である。（Ａ、Ｂ）ＳＵＳＩＢＡ２発現のスクロース誘導閾値レベル前後（２５ｍＭ／４０ｍＭ）でのＳＵＳＩＢＡ１のアンチセンスＯＤＮ阻害または様々なＳｕｃ濃度でのＳＵＳＩＢＡ１の過剰発現／供給。ＳＵＳＩＢＡ１をａｓＯＤＮ阻害したとき（Ａ）またはＳＵＳＩＢＡ１を過剰発現させたとき（Ｂ）のＳＵＳＩＢＡ２転写産物レベルの変化をｑＰＣＲにより解析した。（Ｃ）ＳＵＳＩＢＡ１をａｓＯＤＮ阻害したときのＳＵＳＩＢＡ２自己促進活性。ＳＵＳＩＢＡ１のａｓＯＤＮ阻害後にＳＵＳＩＢＡ２を過剰発現させたときのＳＵＳＩＢＡ２転写産物レベルの変化をｑＰＣＲにより解析した。ａｓＳＵＳＩＢＡ１とｓＯＤＮの間（Ａ）、様々なスクロース濃度でのｐ３５Ｓ：ＳＵＳＩＢＡ１と対応するアグロバクテリウム対照の間（Ｂ）および４０ｍＭ  ＳｕｃでのアグロバクテリウムＡＧＬ１と４０ｍＭ  Ｓｕｃでの対応する処理の間（Ｃ）の有意差がアスタリスクで示されている（＊＊ｐ≦０．０１）。一元配置ＡＮＯＶＡを用いた（エラーバーはｓ．ｄ．を表す）。３つの独立した実験を実施した（ｎ＝３）。
【図１８】ＳＵＳＩＢＡ２プロモーター中のＷボックスに対するＳＵＳＩＢＡ１／ＳＵＳＩＢＡ２競合結合がＳＵＳＩＢＡ２発現を駆動することを示す図である。（Ａ）ＳＵＳＩＢＡ２プロモーターの遠位５’糖応答性領域から選択され、その領域のＷボックス（下線部）をカバーする短いオリゴ配列、およびＳＵＳＩＢＡ２プロモーターから無作為に選択されＷボックスを一切含まない同じ長さの対照オリゴ配列（配列番号１０８〜１１１）。両オリゴ配列を二本鎖オリゴヌクレオチドとしてデコイ捕捉およびＥＭＳＡ実験に使用した。オリゴの位置がＳＵＳＩＢＡ２プロモーター中に示される。（Ｂ）４０ｍＭ  Ｓｕｃでｐ３５Ｓ：ＳＵＳＩＢＡ１を含むアグロバクテリウムと二本鎖デコイオリゴを同時に浸潤させた後、ＳＵＳＩＢＡ２の転写産物レベルをｑＰＣＲにより解析した。浸潤させた葉を４０ｍＭ  Ｓｕｃでインキュベートした。浸潤およびインキュベーションの２日後に、ｑＰＣＲ解析を実施した。（Ｃ）ｐ３５Ｓ：ＳＵＳＩＢＡ２を含むアグロバクテリウムと二本鎖デコイオリゴを同時に浸潤させ、ＳＵＳＩＢＡ１をアンチセンス阻害した場合のＳＵＳＩＢＡ２の転写産物レベル。（Ｄ）１００ｍＭ  Ｓｕｃでｐ３５Ｓ：ＳＵＳＩＢＡ２のみまたは二本鎖デコイオリゴのみを含むアグロバクテリウムの浸潤後のＳＵＳＩＢＡ２の転写産物レベル。浸潤させた葉を解析前に１００ｍＭ  Ｓｕｃで２日間インキュベートした。ｐ３５Ｓ：ＳＵＳＩＢＡ１とデコイオリゴの間（Ｂ）、ｐ３５：ＳＵＳＩＢＡ２とデコイオリゴの間（Ｃ）およびｐ３５：ＳＵＳＩＢＡ２とデコイオリゴの間（Ｄ）の有意差を統計学的に解析し、アスタリスクで示した（＊＊ｐ≦０．０１）。一元配置ＡＮＯＶＡを用いた（エラーバーはｓ．ｄ．を表す）。３つの独立した実験を実施した（ｎ＝３）。（Ｅ）ＳＵＳＩＢＡ２プロモーター中のＷボックスに対するＳＵＳＩＢＡ２とＳＵＳＩＢＡ１の間の競合活性に関するＥＭＳＡ解析。ＳＵＳＩＢＡ２（左パネル）、ＳＵＳＩＢＡ１（中央パネル）および競合するＳＵＳＩＢＡ２とＳＵＳＩＢＡ１（右パネル）のＷボックスに対する結合活性のＥＭＳＡ。ＳＵＳＩＢＡ２およびＳＵＳＩＢＡ１を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に過剰発現させて精製し、２種類のオリゴで対抗した。競合活性アッセイでは、ＳＵＳＩＢＡ２（０．２μｇ）およびＳＵＳＩＢＡ１（０．２μｇ）の存在下（＋）または不在下（−）で、あるいはＳＵＳＩＢＡ２（０．２μｇ）の存在下でＳＵＳＩＢＡ１を漸増させて（０．０１２５μｇ、０．０２５μｇ、０．０５μｇ、０．１μｇおよび０．２μｇ）ＥＭＳＡを実施した。遊離ＤＮＡプローブの位置が示されている。
【図１９】ＳＵＳＩＢＡ２ｐ：ＧＦＰ構築物を用いる、ＳＵＳＩＢＡ１をasODN阻害したときのＳＵＳＩＢＡ２／ＳＵＳＩＢＡ２自己促進活性の蛍光解析を示す図である。（Ａ）ＳＵＳＩＢＡ２ｐ：ＧＦＰ構築物を図１７Ｃでの組合せと同時に浸潤させてＳＵＳＩＢＡ２プロモーター活性をモニターした。浸潤の３日後に顕微鏡下にて４６０〜５００ｎｍの波長で蛍光を観察した。（Ｂ）相対蛍光強度を定量化した。４０ｍＭ  ＳｕｃでのアグロバクテリウムＡＧＬ１と４０ｍＭ  Ｓｕｃでの対応する処理の間の有意差がアスタリスクで示されている（＊ｐ≦０．０５）。一元配置ＡＮＯＶＡを用いた（エラーバーはｓ．ｄ．を表す）。３つの独立した実験を実施した（ｎ＝３）。バー＝１００μｍ。
【図２０】ＳＵＳＩＢＡ２ｐ：ＧＦＰ構築物を用いる、ＳＵＳＩＢＡ２プロモーター活性に対するＳＵＳＩＢＡ１の抑制活性におけるＷボックスの役割の蛍光解析を示す図である。（Ａ）ＳＵＳＩＢＡ２ｐ：ＧＦＰ構築物を図１８Ｂでの組合せと同時に浸潤させてＳＵＳＩＢＡ２プロモーター活性をモニターした。浸潤の３日後に顕微鏡下にて４６０〜５００ｎｍの波長で蛍光を観察した。（Ｂ）相対蛍光強度を定量化した。ｐ３５Ｓ：ＳＵＳＩＢＡ１とデコイオリゴの間の有意差を統計学的に解析し、アスタリスクで示した（＊＊ｐ≦０．０１）。一元配置ＡＮＯＶＡを用いた（エラーバーはｓ．ｄ．を表す）。３つの独立した実験を実施した（ｎ＝３）。バー＝１００μｍ。
【図２１】ＳＵＳＩＢＡ２ｐ：ＧＦＰ構築物を用いる、ＳＵＳＩＢＡ１を阻害したときのＳＵＳＩＢＡ２／ＳＵＳＩＢＡ２自己促進活性におけるＷボックスの役割の蛍光解析を示す図である。（Ａ）ＳＵＳＩＢＡ２ｐ：ＧＦＰ構築物を図１８Ｃでの組合せと同時に浸潤させてＳＵＳＩＢＡ２プロモーター活性をモニターした。浸潤の３日後に顕微鏡下にて４６０〜５００ｎｍの波長で蛍光を観察した。（Ｂ）相対蛍光強度を定量化した。ｐ３５Ｓ：ＳＵＳＩＢＡ２とデコイオリゴの間の有意差を統計学的に解析し、アスタリスクで示した（＊＊ｐ≦０．０１）。一元配置ＡＮＯＶＡを用いた（エラーバーはｓ．ｄ．を表す）。３つの独立した実験を実施した（ｎ＝３）。バー＝１００μｍ。
【図２２】ＳＵＳＩＢＡ１プロモーター活性の解析を示す図である。（Ａ）ＳＵＳＩＢＡ１プロモーター活性の解析におけるアグロインフィルトレーションのための様々な長さのＳＵＳＩＢＡ１プロモーターの構築物。（Ｂ）ＳＵＳＩＢＡ１プロモーター活性。構築物をアグロバクテリウムに形質転換し、オオムギ葉内に浸潤させた。浸潤させたオオムギ葉を様々なスクロース濃度でインキュベートした。浸潤の３日後に顕微鏡下にて４６０〜５００ｎｍの波長で蛍光を観察した。（Ｃ）トリプリケートから相対蛍光強度を定量化した。構築物１と構築物３の間および構築物２と構築物３の間の有意差を統計学的に解析し、アスタリスクで示した（＊＊ｐ≦０．０１）。一元配置ＡＮＯＶＡを用いた（エラーバーはｓ．ｄ．を表す）。３つの独立した実験を実施した（ｎ＝３）。バー＝１００μｍ。
【図２３】ＳＵＳＩＢＡ１プロモーター上の糖応答性シス配列および対応するトランス活性の特定を示す図である。（Ａ）糖応答性シス配列および考え得るトランス活性を特定するための戦略。ＳＵＳＩＢＡ１プロモーター中で特定した糖応答性領域を６種類のデコイオリゴ配列の設計に用いた。解析のために、デコイ１〜３をカバーする１つのＤＮＡフラグメント（フラグメント１）および非糖応答性領域をカバーする対照ＤＮＡフラグメント（フラグメント２）を制限酵素ＸｂａＩおよびＢｓｔＸＩにより作製した。（Ｂ）６種類のデコイオリゴの個々の配列（配列番号８０〜９１）。（Ｃ）様々なデコイオリゴを浸潤させ様々なスクロース濃度でインキュベートした後のＳＵＳＩＢＡ１の転写産物レベル。（Ｄ）様々な糖濃度で処理した葉からの核タンパク質抽出物のＥＭＳＡ。ＥＭＳＡ解析においてフラグメント１および２（左パネル）ならびにデコイオリゴ２および３（右パネル）を使用した。核タンパク質抽出物の不在下（−）または存在下（＋）でＥＭＳＡを実施した。遊離プローブの位置が示されている。バンドの移動として示される結合活性が矢印で示されている。（Ｃ）には、デコイオリゴとＨ２Ｏ、５０ｍＭ  Ｓｕｃまたは１００ｍＭ  Ｓｕｃの間の有意差がアスタリスクで示されている（＊＊ｐ≦０．０１）。一元配置ＡＮＯＶＡを用いた（エラーバーはｓ．ｄ．を表す）。デコイオリゴ捕捉およびｑＰＣＲ解析では３つの独立した実験を実施した（ｎ＝３）。
【図２４】ＳＵＳＩＢＡ１ｐ：ＧＦＰ構築物を用いる、デコイオリゴ２、３および６のＳＵＳＩＢＡ１の糖応答活性に対する影響の蛍光解析を示す図である。（Ａ〜Ｃ）図２３ＣでのようにＳＵＳＩＢＡ１ｐ：ＧＦＰ構築物をデコイオリゴ２、３および６と同時に浸潤させて、ＳＵＳＩＢＡ１プロモーター活性をモニターした。浸潤させた葉を様々なＳｕｃ濃度でインキュベートした。浸潤およびインキュベーションの３日後に顕微鏡下にて４６０〜５００ｎｍの波長で蛍光を観察した。（Ｄ）相対蛍光強度を定量化した。デコイ３と比較したＳＵＳＩＢＡ１ｐ：ＧＦＰ、デコイ２およびデコイ６の有意差を統計学的に解析し、アスタリスクで示した（＊＊ｐ≦０．０１）。一元配置ＡＮＯＶＡを用いた（エラーバーはｓ．ｄ．を表す）。バー＝１００μｍ。
【図２５】ＳＵＳＩＢＡ１プロモーター配列の解析および高フルクタン変種（変種１５５）と低フルクタン変種（変種１８１）の間で確認されたトランス活性を示す図である。（Ａ）オオムギ変種１５５（高フルクタン含有変種）および１８１（低フルクタン含有変種）からＰＣＲにより単離しシーケンシングした２つのＳＵＳＩＢＡ１プロモーターの略図。（Ｂ）特定された糖応答性シス配列を含む糖応答性領域由来のフラグメント（フラグメント１；図２３Ａも参照されたい）および対照フラグメント（フラグメント２；図２３Ａも参照されたい）をＥＭＳＡ解析に使用した。（Ｃ）２種類の変種の９ｄａｆ種子から単離した核タンパク質抽出物のＥＭＳＡ。核タンパク質抽出物の不在下（−）または存在下（＋）でＥＭＳＡを実施した。遊離プローブの位置が示されている。バンドの移動として示される結合活性が矢印で示されている。
【図２６】オオムギでの協調的なデンプンとフルクタンの合成を制御する糖感知競合転写因子結合システムを示す図である。糖応答活性化因子−抑制因子であるＳＵＳＩＢＡ２  ＴＦ−ＳＵＳＩＢＡ１  ＴＦ対がスクロース／グルコース／フルクトース（Ｓｕｃ／Ｇｌｃ／Ｆｒｕ）シグナル伝達を介してオオムギ中の協調的なデンプンとフルクタンを調整する。糖のレベルが低いとき（Ａ）、動員された転写因子／複合体（疑問符を付したボール）がＳＵＳＩＢＡ１プロモーターの糖応答性配列に結合し、ＳＵＳＩＢＡ１発現を活性化する。ＳＵＳＩＢＡ１の高発現は、ＳＵＳＩＢＡ２プロモーターのＷボックスに結合してＳＵＳＩＢＡ２の結合を妨げかつフルクタン遺伝子プロモーター（６−ＳＦＴプロモーターなど）のシスエレメントに結合するＳＵＳＩＢＡ１の高レベルをもたらし、ＳＵＳＩＢＡ２遺伝子およびフルクタン遺伝子の発現を抑制し、その結果として、糖のレベルが低い時のデンプンとフルクタンの合成量および含有量が低くなる。糖が高レベルに増加すると（Ｂ）、転写因子／複合体のレベルが低下し、糖が増加し続けると最終的にはゼロまで低下する。転写因子／複合体がＳＵＳＩＢＡ１プロモーターの糖応答性配列に結合しなければ、ＳＵＳＩＢＡ１の発現は低い。ＳＵＳＩＢＡ１の低発現は、フルクタン遺伝子の高発現およびＳＵＳＩＢＡ２発現の漸進的な増大をもたらす。ＳＵＳＩＢＡ２はそれ自身のプロモーターＷボックスに結合し、自身の発現を増強する。Ｗボックスに結合するＳＵＳＩＢＡ２が増えると、ＳＵＳＩＢＡ２転写産物の産生も増大する。このような正の自己調節はＳＵＳＩＢＡ２の高発現およびデンプンの高合成をもたらす。このように、高い糖レベルにて、デンプンとフルクタンの合成量および含有量が高くなる。
【図２７】オオムギ、コムギおよびコメの３種類の作物種のＳＵＳＩＢＡ２の第二イントロン（ＳＵＳＩＢＡ１プロモーターの主要部分）の系統学的データの解析を示す図である。オオムギＳＵＳＩＢＡ２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＣ２６９４８３またはＫＴ２９０５５９）、コムギＳＵＳＩＢＡ２オルソログ（ＴａＳＵＳＩＢＡ２、Ｓｃａｆｆｏｌｄ  ＴＧＡＣｖ１＿ｓｃａｆｆｏｌｄ＿１１４５３５＿２ＡＳ：ｈｔｔｐ：／／ｅｎｓｅｍｂｌ．ｇｒａｍｅｎｅ．ｏｒｇ／の１９，４５７−２７，６２５）およびコメＳＵＳＩＢＡ２オルソログ（ＯｓＳＵＳＩＢＡ２、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＰ０１４９６３．１）の第二イントロン配列を、ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １２のプログラムによる解析に用いた。
【図２８】オオムギＳＵＳＩＢＡ２遺伝子のエクソン２のヌクレオチド配列（配列番号９８）とコメＳＵＳＩＢＡ２様遺伝子のエクソン２のヌクレオチド配列（配列番号１０１）とを比較する図である。
【図２９】オオムギＳＵＳＩＢＡ２遺伝子のエクソン３のヌクレオチド配列（配列番号９９）とコメＳＵＳＩＢＡ２様遺伝子のエクソン３のヌクレオチド配列（配列番号１０２）とを比較する図である。
【図３０】オオムギＳＵＳＩＢＡ２遺伝子のイントロン２のヌクレオチド配列（配列番号１００）とコメＳＵＳＩＢＡ２様遺伝子のイントロン２のヌクレオチド配列（配列番号１０３）とを比較する図である。
【図３１】オオムギの穂が長いとＳＵＳＩＢＡ２レベルが高く、短いとＳＵＳＩＢＡ１が高いことを示す図である。図は、変種ＳＬＵ７（１５５）とＫＶＬ１１１３（１９９）の雑種オオムギの子孫の短いタイプ（Ａ）および長いタイプ（Ｂ）のオオムギ穂を示す。
【図３２】開花前２日での生育中の短い穂（左）および長い穂（右）中のＳＵＳＩＢＡ１およびＳＵＳＩＢＡ２の相対発現レベルを示す図である。短い穂と長い穂の間の統計学的差が＊＊（Ｐ＜０．０１）で示されている。
【図３３】Ｆ２子孫中の個々の植物のフルクタン含有量を示す図である。様々な数（最大３０個）の子孫種子をフルクタン含有量の解析に用いた。１５５、１９９、２２４および２３５の親種子５個または６個を対照に用いた。子孫種子では、個々の種子のフルクタン含有量に大きなばらつきがみられた。♀１９９×♂２３５植物２７について乾燥重量（ＤＷ）当たり１０％を上回る、ならびに♀２２４×♂１５５植物２７、♀２２４×♂１９９植物６および♀２２４×♂１９９植物２７について約１０％の最大フルクタン含有量が記録された。低フルクタン含有量および高フルクタン含有量と相関する子孫の丸い種子および平らな種子の表現型形質が事前に観察された。
【図３４】♀２２４×♂１５５ハダカムギおよび♀２２４×♂１９９ハダカムギ（ファイトトロンで最も高フルクタンの２系統）のホモ接合型Ｆ４子孫中のフルクタン含有量を示す図である。最も高いフルクタン含有量（１３％超）は、ファイトトロン条件下で♀２２４×♂１５５の系統と関連した。
【図３５】親およびＦ２子孫における植物体の高さ、植物体当たりの穂数、植物体当たりの粒数および千粒重の表現型形質を示す図である。
【図３６】Ｆ２子孫の丸い種子および平らな種子でのフルクタンとベータグルカンの平均含有量。Ａ．親種子、丸い子孫種子（Ｒ）および平らな子孫種子（Ｆ）の表現型形質。Ｂ．Ｆ２子孫の丸い種子および平らな種子の平均フルクタン含有量。Ｃ．Ｆ２子孫の丸い種子および平らな種子における平均ベータグルカン含有量。いずれの子孫でも、高いフルクタンおよびベータグルカン含有量は、平らな種子の形質と相関し、フルクタン含有量とベータグルカン含有量の間に強い相関がみられた。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
詳細な説明
本諸実施形態は、全般的には植物材料、具体的には炭水化物産生が制御された植物材料に関する。
【００１６】
諸実施形態の植物材料は、炭水化物の産生が制御されるよう設計され、具体的には、炭水化物を野生型植物材料より上昇したまたは高いレベルで産生するよう設計され得る。
【００１７】
糖は、光合成を介して太陽エネルギーを地球上の生命体に不可欠な化学エネルギーに伝達するのに重要なエネルギー運搬体である。高等植物では、糖はバイオマス合成の基礎となる基質材料であるばかりでなく、多数の代謝経路のシグナル伝達分子でもある。炭水化物合成は通常、糖を介する。糖のレベルおよび利用可能性に応じ、高等植物は、様々な戦略を用いて、生長、生育および繁殖のエネルギー要求を満たす短期間の、すなわち数分以内、中期間の、すなわち数時間以内および長期間の、すなわち数日〜数年のエネルギー供給のためのエネルギーの貯蔵において様々な炭水化物を合成する。
【００１８】
フルクタン、一時的なデンプンおよび貯蔵デンプンは、様々なエネルギー供給形態からみた炭水化物の例である。これらは、オオムギ、コムギ、エンバクおよび多数の飼料草などの温帯性イネ科を含む多数の流動植物（ｆｌｏｗｉｎｇ  ｐｌａｎｔ）で産生される。
【００１９】
フルクトース重合体であるフルクタンおよびグルコース重合体であるデンプンの合成には通常、糖が介在する。しかし、どのように植物が糖のレベルを感知し、フルクタン合成および／またはデンプン合成などの様々な炭水化物合成を調整するかは、ほとんど明らかにされていない。
【００２０】
本明細書で示す通り、オオムギでは、フルクタンとデンプンの合成は糖のレベルによって上手く調節されている。この糖が介在する炭水化物合成は、高度な遺伝子システムによって厳密に制御されており、この遺伝子システムは、糖のレベルを感知しフルクタンとデンプンの合成を調整するのに、２種類の選択的プロモーターを用いて、配列は重複しているが機能が逆である２種類の転写因子、オオムギ１糖シグナル伝達（ＳＵＳＩＢＡ１）およびＳＵＳＩＢＡ２を生じる。
【００２１】
本明細書に提供される実験データは、ＳＵＳＩＢＡ１が負または抑制性の活性を有するのに対し、ＳＵＳＩＢＡ２は正または誘導性の作用を有することを示す。オオムギでは、２種類の選択的プロモーター、ＳＵＳＩＢＡ１プロモーター（ＳＵＳＩＢＡ１ｐ）およびＳＵＳＩＢＡ２プロモーター（ＳＵＳＩＢＡ２ｐ）からの、同一の配列を有するが５’末端の長さが異なるこれらの２種類の転写因子（ＴＦ）遺伝子の糖応答性の発現が、フルクタンとデンプンの合成を時空間的に制御する正反対の、すなわち陰陽の糖感知システムを生じる。
【００２２】
ＳＵＳＩＢＡ１ｐは、本明細書にさらに詳細に示す通り、植物ゲノムのＳＵＳＩＢＡ２遺伝子内にある内部プロモーターであり、保有遺伝子ＳＵＳＩＢＡ２によりコードされる産物ＳＵＳＩＢＡ２のものとは異なる機能を有するタンパク質ＳＵＳＩＢＡ１の発現をもたらす。
【００２３】
陰陽システムの中心部では、ＳＵＳＩＢＡ２ｐの糖応答性領域中のＷボックスに対するＳＵＳＩＢＡ１  ＴＦとＳＵＳＩＢＡ２  ＴＦの競合的結合が、ＳＵＳＩＢＡ１活性とＳＵＳＩＢＡ２活性の自己調節を示す内部適応機序としての役割を果たす。ＳＵＳＩＢＡ１ｐは、低い糖レベルでトランス活性化因子が結合する、糖応答性活性化領域を含む（図２６Ａを参照されたい）。このトランス活性化因子または複合体の結合がＳＵＳＩＢＡ１発現を活性化し誘導する。ＳＵＳＩＢＡ１の高発現は、ＳＵＳＩＢＡ２と競合してＳＵＳＩＢＡ２ｐ中のＷボックスに結合するＳＵＳＩＢＡ１の高レベルをもたらす。これはＳＵＳＩＢＡ２の発現を効果的に阻害する。糖のレベルが上昇すると、トランス活性化因子またはトランス活性化複合体のレベルが低下する。ＳＵＳＩＢＡ１ｐ中の糖応答性活性化領域へのトランス活性化因子または複合体の結合がないと、ＳＵＳＩＢＡ１の発現は低い（図２６Ｂを参照されたい）。ＳＵＳＩＢＡ１の発現が低いと、ＳＵＳＩＢＡ２ｐ中のＷボックスの結合に関して競合するＳＵＳＩＢＡ２が生じ、それによりＳＵＳＩＢＡ２の発現が高くなる。ＳＵＳＩＢＡ２はそれ自体のプロモーター中のＷボックスに結合し、それによりそれ自体の発現を増大させる。
【００２４】
オオムギでは、ＳＵＳＩＢＡ１は、スクロース：フルクタン−６−フルクトシルトランスフェラーゼ（６−ＳＦＴ）プロモーター、スクロース：スクロース１−フルクトシルトランスフェラーゼ（１−ＳＳＴ）プロモーターなどのフルクタン遺伝子プロモーター中の糖応答性エレメント（ＳＵＲＥ）、Ｗボックスエレメントおよび／またはＳＰ８エレメントなどのシスエレメントにも結合し、フルクタン遺伝子の発現を阻害する、すなわち、ＳＵＳＩＢＡ１はオオムギのフルクタン合成の抑制因子である。その結果、低い糖レベルで（図２６Ａ）、フルクタンおよびまたデンプンの合成量および含有量が低くなる。
【００２５】
ＳＵＳＩＢＡ２はしたがって、デンプン合成の活性化因子として作用し、オオムギイソアミラーゼ（ＩＳＯ１）プロモーターおよびデンプン分枝酵素ＩＩ（ＳＢＥＩＩ）プロモーターなどのデンプン遺伝子プロモーター中の糖応答性（ＳＵＲＥ）エレメントなどのシスエレメントに結合する。その結果、高い糖レベルで（図２６Ｂ）、デンプンおよびまたフルクタンの合成量および含有量が高くなる。
【００２６】
このことは、デンプンの産生量が多い、またはデンプンとフルクタンの産生量が多いオオムギ植物材料を得るために、植物材料は高い糖レベルを有し、かつ／またはＳＵＳＩＢＡ１の発現を欠くか、その発現が抑制されているべきであることを意味する。
【００２７】
ＳＵＳＩＢＡ２遺伝子に対応する型の遺伝子はオオムギ以外の植物、例えば、コメ（ＯｓＳＵＳＩＢＡ２様遺伝子）、コムギ（ＴａＳＵＳＩＢＡ２様遺伝子）、エンバク（ＡｓＳＵＳＩＢＡ２様遺伝子）、トウモロコシ（ＺｍＳＵＳＩＢＡ２様遺伝子）、ライムギ（ＳｃＳＵＳＩＢＡ２様遺伝子）、ヤマカモジグサおよびその他のイネ科草本にも存在する。以降、この対応するＳＵＳＩＢＡ２型は、ＳＵＳＩＢＡ２様転写因子をコードするＳＵＳＩＢＡ２様遺伝子と称される。ＳＵＳＩＢＡ２様転写因子をコードするヌクレオチド配列、例えばＳＵＳＩＢＡ２様遺伝子は、本明細書で一般にＳＵＳＩＢＡ２様プロモーター（ＳＵＳＩＢＡ２様ｐ）と称されるプロモーターの転写制御下にある。ＳＵＳＩＢＡ２様タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、本明細書でＳＵＳＩＢＡ１様ｐと称される、ＳＵＳＩＢＡ１様転写因子をコードするヌクレオチド配列のプロモーターを含む。ＳＵＳＩＢＡ１様ｐは少なくとも部分的に、ＳＵＳＩＢＡ２様遺伝子のイントロンに存在するのが好ましい。特定の実施形態では、ＳＵＳＩＢＡ１様ｐは、イントロン／エクソンプロモーターであり、すなわち、少なくとも部分的にＳＵＳＩＢＡ２様遺伝子のイントロンに存在し、少なくとも部分的にＳＵＳＩＢＡ２様遺伝子のエクソンに存在する。ＳＵＳＩＢＡ１様ｐは、ＳＵＳＩＢＡ１様遺伝子などのＳＵＳＩＢＡ１様転写因子をコードするヌクレオチド配列の転写を制御する。
【００２８】
一実施形態では、ＳＵＳＩＢＡ２様遺伝子は、遺伝子のコード配列、すなわちエクソンに関してオオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）ＳＵＳＩＢＡ２遺伝子（ＨｖＳＵＳＩＢＡ２）と少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％または少なくとも８０％の配列同一性を有するのが好ましい。
【００２９】
上記のものに加えて、またはこれに代えて、ＳＵＳＩＢＡ１様遺伝子は、コード配列に関してオオムギＳＵＳＵＢＡ１遺伝子（ＨｖＳＵＳＩＢＡ１）と少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％または少なくとも８０％の配列同一性を有するのが好ましい。
【００３０】
オオムギのＳＵＳＩＢＡ２部分的ゲノム配列はＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号ＫＴ２９０５５９およびＫＴ２９０５６０で寄託されており、コメのＳＵＳＩＢＡ２様部分的ゲノム配列はＧｅｎＢａｎｋでアクセッション番号ＡＰ０１４９６３．１として確認できる。
【００３１】
オオムギのＳＵＳＩＢＡ２（ＨｖＳＵＳＩＢＡ２）とコメのＳＵＳＩＢＡ２様（ＯｓＳＵＳＩＢＡ２様）のエクソン２およびエクソン３の配列アライメントを図２８および２９に示す。ＨｖＳＵＳＩＢＡ１ｐのエクソン部分は、ＨｖＳＵＳＩＢＡ２のエクソン３のヌクレオチド番号１からヌクレオチド番号３７８に及ぶ。これに対応して、ＯｓＳＵＳＩＢＡ１様ｐのエクソン部分は、ＯｓＳＵＳＩＢＡ２様のエクソン３のヌクレオチド番号１からヌクレオチド番号３８１に及ぶ。
【００３２】
図３０は、ＨｖＳＵＳＩＢＡ２遺伝子とＯｓＳＵＳＩＢＡ２様遺伝子のイントロン２の配列アライメントを示す。ＨｖＳＵＳＩＢＡ２イントロン２は、糖抑制領域とそれに続く活性化領域を有するＨｖＳＵＳＩＢＡ１のイントロン部分を含む。これに対応して、ＯｓＳＵＳＩＢＡ２様のイントロン２は、糖抑制領域とそれに続く活性化領域を有するＯｓＳＵＳＩＢＡ１ｐのイントロン部分を含む。ＯｓＳＵＳＩＢＡ１ｐの糖抑制領域はＨｖＳＵＳＩＢＡ１ｐの糖抑制領域より長く、またはＯｓＳＵＳＩＢＡ１ｐの糖抑制領域の前に、ＨｖＳＵＳＩＢＡ２のイントロン２に存在せずかついかなる対応物もないヌクレオチド配列（図３０のヌクレオチド番号１から４０９まで）がある。
【００３３】
ＨｖＳＵＳＩＢＡ２とＯｓＳＵＳＩＢＡ２様のエクソン１は、ｗｅｂソフトウェアのＣｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａによって求められる８５％の配列同一性を有する。ＨｖＳＵＳＩＢＡ２とＯｓＳＵＳＩＢＡ２様のエクソン２およびエクソン３について対応する配列同一性値は、それぞれ８０％および８１％である。
【００３４】
ＨｖＳＵＳＩＢＡ１ｐとＯｓＳＵＳＩＢＡ１様ｐの活性化領域および糖抑制領域の配列同一性は、それぞれ５２％および５０％である。
【００３５】
ＨｖＳＵＳＩＢＡ２転写因子は以下のアミノ酸配列（配列番号１０４）：
【化１】
2020512008.tif 000003
を有する。
【００３６】
ＯｓＳＵＳＩＢＡ２様転写因子は以下のアミノ酸配列（配列番号１０５）：
【化２】
2020512008.tif 000004
を有する。
【００３７】
ＨｖＳＵＳＩＢＡ２転写因子とＯｓＳＵＳＩＢＡ２様転写因子の配列アライメントを下に示す：
【化３】
2020512008.tif 000005
【００３８】
ＨｖＳＵＳＩＢＡ１転写因子は以下のアミノ酸配列（配列番号１０６）：
【化４】
2020512008.tif 000006
を有する。
【００３９】
ＯｓＳＵＳＩＢＡ１様転写因子は以下のアミノ酸配列（配列番号１０７）：
【化５】
2020512008.tif 000007
を有する。
【００４０】
ＨｖＳＵＳＩＢＡ１転写因子とＯｓＳＵＳＩＢＡ１様転写因子の配列アライメントを下に示す：
【化６】
2020512008.tif 000008
【００４１】
本明細書で使用されるヌクレオチド配列または核酸配列という用語は、核酸分子の５’末端〜３’末端のヌクレオチドのポリマーまたは配列を指し、ｃＤＮＡ、ＤＮＡのフラグメントまたは部分、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、例えば化学合成したＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ｍＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡを含むＤＮＡまたはＲＮＡ分子を含み、そのいずれも一本鎖または二本鎖であり得る。
【００４２】
プロモーターは、プロモーターと作動可能に結合されるヌクレオチド配列、すなわちコード配列、の転写を制御または調節するヌクレオチド配列である。コード配列はポリペプチドおよび／または機能性ＲＮＡをコードし得る。プロモーターは通常、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの結合部位を含み転写開始を指令するヌクレオチド配列を指す。プロモーターは一般に、対応するコード配列のコード領域の開始部位に対し５’側、すなわち上流にみられる。プロモーター領域は、遺伝子発現の調節因子として作用する他のエレメントを含み得る。プロモーターとしては、例えば、恒常的プロモーター、誘導性プロモーター、一時的に調節されるプロモーター、発生的に調節されるプロモーター、化学的に調節されるプロモーター、組織選択的プロモーターおよび／または組織特異的プロモーターが挙げられる。
【００４３】
本明細書で使用される、作動可能に連結されるまたは作動可能に結合されるは、示されるエレメントが機能的に相互に関連し、一般的には物理的にも関連していることを意味する。したがって、作動可能に連結される、または作動可能に結合されるという用語は、機能的に関連する単一核酸分子上のヌクレオチド配列を指す。したがって、第二イントロンのヌクレオチド配列と作動可能に連結される第一のヌクレオチド配列は、第一のヌクレオチド配列が第二イントロンのヌクレオチド配列と機能的に関連する位置にある状態を意味する。例えば、プロモーターがヌクレオチド配列の転写または発現を生じさせる、すなわち、ヌクレオチド配列がプロモーターの転写制御下にある場合、そのプロモーターはヌクレオチド配列と作動可能に結合される。当業者には、制御配列、例えばプロモーターは、制御配列がヌクレオチド配列の発現を指令する限り、それと作動可能に結合されるヌクレオチド配列と隣接している必要はないことが理解されよう。したがって、例えば、プロモーターとヌクレオチド配列の間に、翻訳されないが転写される介在配列が存在してもよく、ヌクレオチド配列はそれでもなお、作動可能に連結されており、プロモーターの転写制御下にあると言える。
【００４４】
本明細書で使用される内在性という用語は、ヌクレオチド配列に関して使用される場合、それが存在する植物材料のゲノムの一部として天然に存在するヌクレオチド配列を指す。内在性ヌクレオチド配列は、本明細書では天然のヌクレオチド配列と称されることがある。
【００４５】
ゲノムヌクレオチド配列は、植物材料のゲノム中、好ましくは植物材料の染色体中に存在するヌクレオチド配列を指す。
【００４６】
野生型のゲノムヌクレオチド配列は、植物材料中に天然に存在する非改変ゲノムヌクレオチド配列を指す。これは、植物材料のゲノムから野生型のゲノムヌクレオチド配列の一部を除去することなどによって改変されたゲノムヌクレオチド配列と比較される。
【００４７】
植物材料は、一実施形態では植物体である。別の実施形態では、植物材料は植物細胞、すなわち、複数のこのような植物細胞を含む、植物の細胞である。植物材料は、さらなる実施形態では、植物組織または植物器官であり、特に限定されないが、表皮；基本組織；木部もしくは師部を含む維管束組織；頂端分裂組織、側部分裂組織もしくは介在分裂組織などの分裂組織；例えば柔組織、厚角組織、厚壁組織もしくは表皮を含む単純永久組織、例えば木部、師部、特殊組織もしくは分泌組織を含む複雑永久組織などの永久組織を含む。植物材料は、さらに別の実施形態では、植物の種子である。
【００４８】
配列同一性は、２つのヌクレオチド配列または２つのペプチド配列もしくはタンパク質配列の間の配列類似性を指す。類似性は、最適に整列される２つのヌクレオチド配列、ペプチド配列またはタンパク質配列がヌクレオチドまたはアミノ酸のアライメントウィンドウ全体を通して不変である程度を指す。同一性は、特に限定されないが、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ（１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．編）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７）；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１）に記載されているものを含む既知の方法によって容易に算出できる。配列比較では通常１つの配列が、それに対し被験配列が比較される、参照配列としての役割を果たす。配列比較アルゴリズムを用いる場合、被験配列と参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じてサブシーケンス座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムが、指定したプログラムパラメータに基づき参照配列に対する被験配列（１つまたは複数）のパーセント配列同一性を算出する。比較ウィンドウを整列させるのに最適な配列アライメントは当業者に周知であり、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのローカルホモロジーアルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのホモロジーアライメントアルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの類似性検索法などのツールによって、ならびに任意選択で、ＧＣＧ（登録商標）Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ（登録商標）（Ａｃｃｅｌｒｙｓ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）の一部として入手可能なＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡなどのこれらのアルゴリズムをコンピュータで実行することによって実施され得る。被験配列と参照配列の整列されたセグメントの同一性の割合は、整列された２つの配列に共通する同一のヌクレオチドまたはアミノ酸の数を参照配列セグメント、すなわち、参照配列全体またはそれより短い参照配列の特定部分のヌクレオチドまたはアミノ酸の総数で除した商である。パーセント配列同一性は、同一性の割合に１００を乗じたもので表される。
【００４９】
諸実施形態の一態様は、植物材料中で活性なプロモーターの転写制御下でＳＵＳＩＢＡ２転写因子またはＳＵＳＩＢＡ２様転写因子をコードするゲノムヌクレオチド配列を含む、植物材料に関する。ＳＵＳＩＢＡ２転写因子またはＳＵＳＩＢＡ２様転写因子をコードするゲノムヌクレオチド配列は、ＳＵＳＩＢＡ２転写因子またはＳＵＳＩＢＡ２様転写因子をコードする野生型のゲノムヌクレオチド配列のイントロンに存在するＳＵＳＩＢＡ１プロモーターまたはＳＵＳＩＢＡ１様プロモーターの活性化領域の少なくとも一部分を欠く。
【００５０】
したがって、諸実施形態では、ＳＵＳＩＢＡ２遺伝子またはＳＵＳＩＢＡ２様遺伝子などのＳＵＳＩＢＡ２転写因子またはＳＵＳＩＢＡ２様転写因子をコードするゲノムヌクレオチド配列は、本来であれば野生型のＳＵＳＩＢＡ２遺伝子またはＳＵＳＩＢＡ２様遺伝子のイントロンに存在するＳＵＳＩＢＡ１ｐまたはＳＵＳＩＢＡ１様の活性化領域の少なくとも一部分を欠く。活性化領域の少なくとも一部分が存在しないことは、いかなるトランス活性化因子またはトランス活性化複合体も効率的に活性化領域に結合できず、それによりＳＵＳＩＢＡ１ｐまたはＳＵＳＩＢＡ１様ｐを効率的に活性化できないことを意味する。その結果、植物材料中の糖のレベルとは関係なく、植物材料中でＳＵＳＩＢＡ１転写因子またはＳＵＳＩＢＡ１様転写因子が全く産生されないか、ごく少量のみ産生される。植物材料中にＳＵＳＩＢＡ１転写因子またはＳＵＳＩＢＡ１様転写因子が存在しない、または少量存在することは、今度は、ＳＵＳＩＢＡ２転写因子またはＳＵＳＵＢＡ２様転写因子が、ＳＵＳＩＢＡ２ｐまたはＳＵＳＩＢＡ２様ｐ、より詳細にはＳＵＳＩＢＡ２ｐまたはＳＵＳＩＢＡ２様ｐ中の少なくとも１つのＷボックスへの結合に関してＳＵＳＩＢＡ１転写因子またはＳＵＳＩＢＡ１様転写因子との競合に勝つことを意味する。次いでこのことが、ＳＵＳＩＢＡ２ｐまたはＳＵＳＩＢＡ２様ｐの活性化およびＳＵＳＩＢＡ２転写因子またはＳＵＳＩＢＡ２様転写因子のさらなる産生を引き起こす。植物材料中の高レベルのＳＵＳＩＢＡ２転写因子またはＳＵＳＩＢＡ２様転写因子および低レベルのＳＵＳＩＢＡ１転写因子またはＳＵＳＩＢＡ１様転写因子は、植物材料中のデンプン産生を誘導するか、または植物材料中のデンプンとフルクタンの産生を誘導する。
【００５１】
諸実施形態の植物材料はそれにより、植物材料中の糖のレベルとは関係なく、すなわち、糖のレベルが低い場合でも、図２６Ｂに示す状態である。
【００５２】
ＳＵＳＩＢＡ１ｐまたはＳＵＳＩＢＡ１様ｐの活性化領域の少なくとも一部分が欠如している、または存在しないことにより、ＳＵＳＩＢＡ１遺伝子またはＳＵＳＩＢＡ１様遺伝子の発現が抑制され、それによりＳＵＳＩＢＡ１転写因子またはＳＵＳＩＢＡ１様転写因子のレベルが低くなると、ＳＵＳＩＢＡ２遺伝子またはＳＵＳＩＢＡ２様遺伝子の発現が増大し、それによりＳＵＳＩＢＡ２転写因子またはＳＵＳＩＢＡ２様転写因子のレベルが高くなる。次いで、ＳＵＳＩＢＡ２転写因子またはＳＵＳＩＢＡ２様転写因子が植物材料中のデンプン合成に関与する遺伝子を活性化する。これに対応して、植物材料がフルクタン合成も可能である場合、ＳＵＳＩＢＡ１転写因子またはＳＵＳＩＢＡ１様転写因子のレベルが低いことは、ＳＵＳＩＢＡ１転写因子またはＳＵＳＩＢＡ１様転写因子が植物材料でのフルクタン合成に関与する遺伝子を抑制しないことを意味する。
【００５３】
諸実施形態の植物材料はそれにより、高デンプンの植物材料または高デンプンかつ高フルクタンの植物材料である。
【００５４】
ＳＵＳＩＢＡ１ｐまたはＳＵＳＩＢＡ１様ｐの活性化領域の少なくとも一部分は、一実施形態では、ＳＵＳＩＢＡ２転写因子またはＳＵＳＩＢＡ２様転写因子をコードする野生型のゲノムヌクレオチド配列から欠失される。この欠失およびそれによるＳＵＳＩＢＡ１ｐまたはＳＵＳＩＢＡ１様ｐの活性化領域の一部分の不在の結果、植物材料は、ＳＵＳＩＢＡ２転写因子またはＳＵＳＩＢＡ２様転写因子をコードし、ＳＵＳＩＢＡ１ｐまたはＳＵＳＩＢＡ１様ｐの活性化領域の少なくとも一部分を欠く、ゲノムヌクレオチド配列を含む。したがって、好ましい実施形態では、植物材料は、ＳＵＳＩＢＡ１ｐまたはＳＵＳＩＢＡ１様ｐの活性化領域のそのような部分を全く含まない。
【００５５】
特定の実施形態では、ＳＵＳＩＢＡ１ｐまたはＳＵＳＩＢＡ１様ｐの活性化領域の少なくとも一部分は、クラスター化された規則的な間隔の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）を介するＳＵＳＩＢＡ２転写因子またはＳＵＳＩＢＡ２様転写因子をコードする野生型のゲノム配列からの欠失により欠失される。
【００５６】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、ＲＮＡ誘導型Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと、編集される特定の配列にそれを方向付けるガイドＲＮＡとを発現することを含む、ＤＮＡ切断法である。Ｃａｓ９が標的配列を切断すると、植物細胞は、元の配列を相同なＤＮＡで置き換えることによって損傷を修復する。適切な相同性を有する追加の鋳型を導入することにより、Ｃａｓ９を用いてこれまでになく単純な方法で遺伝子を欠失させる、付加する、または改変することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９はしたがって、植物材料においてＳＵＳＩＢＡ２転写因子またはＳＵＳＩＢＡ２様転写因子をコードする野生型のゲノム配列からＳＵＳＩＢＡ１ｐまたはＳＵＳＩＢＡ１様ｐの活性化領域の少なくとも一部分を効率的に欠失させる技術である。
【００５７】
ＳＵＳＩＢＡ１ｐまたはＳＵＳＩＢＡ１様ｐの活性化領域の少なくとも一部分をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介して欠失させることは、ＳＵＳＩＢＡ１遺伝子またはＳＵＳＩＢＡ１様遺伝子を発現しない、またＳＵＳＩＢＡ１遺伝子またはＳＵＳＩＢＡ１様遺伝子の発現が抑制された植物材料を作製するのに好ましい技術の１つであり、諸実施形態はこれに限定されない。当該技術分野で公知であり、植物材料のゲノムヌクレオチド配列を除去する、または欠失させるのに用いることができるその他の技術および手技も別法として用いることができる。例えば、プロモーター欠失を用いて、ＳＵＳＩＢＡ２転写因子またはＳＵＳＩＢＡ２様転写因子をコードするが、本来であればヌクレオチド配列（ＳＵＳＩＢＡ２遺伝子またはＳＵＳＩＢＡ２様遺伝子）のイントロンに存在するＳＵＳＩＢＡ１ｐまたはＳＵＳＩＢＡ１様の活性化領域の少なくとも一部分を欠くヌクレオチド配列を生成または作製することが可能である。得られた構築物を次いで、植物材料内にアグロインフィルトレートできる。
【００５８】
アグロインフィルトレーションは、植物生物学で植物材料に遺伝子の発現を誘導するのに用いられる方法の１つである。この方法では、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の懸濁液が直接注入または真空浸潤によって植物材料内に導入されるか、支持体上で植物材料と会合され、その後細菌が所望の作製されたヌクレオチド配列を、Ｔ−ＤＮＡの移送を介して植物材料内に移送する。
【００５９】
第一段階は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の菌株へのヌクレオチド配列の導入である。次いで、その菌株を液体培養で増殖させ、得られた細菌を洗浄し、適切な緩衝溶液中に懸濁させる。注入には、次いでこの溶液をシリンジに入れる。シリンジの先端を葉などの植物材料の裏面に押し付けると同時に、葉の反対側に穏やかに対圧を加える。アグロバクテリウム懸濁液を次いで、気孔を通して、または場合によっては葉の裏面に入れた小さな切込みを通して、葉の内部の空隙内に注入する。
【００６０】
真空浸潤は、アグロバクテリウムを植物組織の深部に導入するまた別の方法である。この方法では、葉ディスク、葉または植物全体を溶液の入ったビーカーに浸し、ビーカーを真空チャンバ内に置く。次いで真空をかけ、葉内の細胞間隙の空気を、気孔を通して追い出す。真空を開放すると、圧力差によってアグロバクテリウム懸濁液が気孔を通して葉の葉肉組織内に入る。これにより、所与の葉のほぼ全部の細胞を細菌と接触させることができる。
【００６１】
アグロバクテリウムは植物材料の内部に入った後、細胞間隙内にとどまり、Ｔｉプラスミド由来Ｔ−ＤＮＡの一部であるヌクレオチド配列を高コピー数で植物細胞内に移送する。一実施形態では、ＳＵＳＩＢＡ２転写因子またはＳＵＳＩＢＡ２様転写因子をコードするゲノムヌクレオチド配列はゲノム内在性ヌクレオチド配列である。特定の実施形態では、ゲノム内在性ヌクレオチド配列は植物材料の染色体中に存在する。したがって、諸実施形態では、ＳＵＳＩＢＡ１ｐまたはＳＵＳＩＢＡ１様ｐの活性化領域の少なくとも一部分はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介する欠失などによって、好ましくは植物材料の染色体中に存在するゲノム内在性ヌクレオチド配列から欠失されている。
【００６２】
一実施形態では、ＳＵＳＩＢＡ１ｐまたはＳＵＳＩＢＡ１様ｐの活性化領域の一部分は、ＳＵＳＩＢＡ２転写因子またはＳＵＳＩＢＡ２様転写因子をコードするヌクレオチド配列から欠失される。このような場合、欠失される部分は、それにトランス活性化因子またはトランス活性化複合体が結合する活性化領域の小領域または配列に対応するよう選択されるのが好ましい。したがって、この小領域または配列の欠失は、トランス活性化因子またはトランス活性化複合体のＳＵＳＩＢＡ１ｐまたはＳＵＳＩＢＡ１様ｐの活性化領域への結合を阻害するか、少なくとも有意に低下させる。
【００６３】
別の実施形態では、活性化領域がヌクレオチド配列から欠失される。この実施形態では、ＳＵＳＩＢＡ２転写因子またはＳＵＳＩＢＡ２様転写因子をコードするゲノムヌクレオチド配列は、ＳＵＳＩＢＡ１ｐまたはＳＵＳＩＢＡ１様ｐの活性化領域を欠く。この活性化領域全体の除去はしたがって、ＳＵＳＩＢＡ１ｐまたはＳＵＳＩＢＡ１様ｐへのトランス活性化因子またはトランス活性化複合体の結合を効率的に阻害する。
【００６４】
オオムギのＳＵＳＩＢＡ１の活性化領域を下に示す（配列番号９２）：
【化７】
2020512008.tif 000009
【００６５】
コメのＳＵＳＩＢＡ１様ｐの対応する活性化領域を下に示す（配列番号９３）：
【化８】
2020512008.tif 000010
【００６６】
コムギのＳＵＳＩＢＡ１様ｐの対応する活性化領域を下に示す（配列番号１１２）：
【化９】
2020512008.tif 000011
【００６７】
野生型のＳＵＳＩＢＡ１ｐまたはＳＵＳＩＢＡ１様ｐは通常、活性化領域に加えて糖抑制領域を含む。一実施形態では、ＳＵＳＩＢＡ２転写因子またはＳＵＳＩＢＡ２様転写因子をコードするゲノムヌクレオチド配列は、ＳＵＳＩＢＡ２転写因子またはＳＵＳＩＢＡ２様転写因子をコードする野生型のゲノムヌクレオチド配列のイントロンに存在するＳＵＳＩＢＡ１ｐまたはＳＵＳＩＢＡ１様ｐの糖抑制領域の少なくとも一部分も欠く。
【００６８】
したがって、ＳＵＳＩＢＡ１ｐまたはＳＵＳＩＢＡ１様ｐは一実施形態では、２つの制御エレメント、すなわち、活性化領域および糖抑制領域を含む。これらの２つの制御エレメントは、イントロンに対応するＳＵＳＩＢＡ２転写因子またはＳＵＳＩＢＡ２様転写因子をコードするヌクレオチド配列の一部分に存在する。これらの制御エレメントはしたがって、ＳＵＳＩＢＡ１ｐまたはＳＵＳＩＢＡ１様ｐのイントロン部分の一部である。上記の通り、ＳＵＳＩＢＡ１ｐまたはＳＵＳＩＢＡ１様ｐは、ＳＵＳＩＢＡ２転写因子またはＳＵＳＩＢＡ２様転写因子をコードするヌクレオチド配列のエクソンに存在するエクソン部分も含む。
【００６９】
一実施形態では、ＳＵＳＩＢＡ１ｐまたはＳＵＳＩＢＡ１様ｐの糖抑制領域の一部分がＳＵＳＩＢＡ２転写因子またはＳＵＳＩＢＡ２様転写因子をコードするヌクレオチド配列から欠失される。別の実施形態では、糖抑制領域がヌクレオチド配列から欠失される。
【００７０】
糖抑制領域またはその少なくとも一部分の欠失は、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介する欠失または別の技術、例えば活性化領域に関して上に記載したものなどを用いて実施できる。
【００７１】
ＳＵＳＩＢＡ１ｐまたはＳＵＳＩＢＡ１様ｐの糖抑制領域の一部分または全体の欠失は、ＳＵＳＩＢＡ１ｐまたはＳＵＳＩＢＡ１様ｐの活性化領域の一部分または全体の欠失に加えられる。
【００７２】
一実施形態では、ＳＵＳＩＢＡ２転写因子またはＳＵＳＩＢＡ２様転写因子をコードするゲノムヌクレオチド配列は、ＳＵＳＩＢＡ１ｐまたはＳＵＳＩＢＡ１様ｐのｉ）活性化領域の少なくとも一部分、ｉｉ）活性化領域全体、ｉｉｉ）活性化領域の少なくとも一部分と糖抑制領域の少なくとも一部分、ｉｖ）活性化領域の少なくとも一部分と糖抑制領域全体、ｖ）活性化領域全体と糖抑制領域の少なくとも一部分またはｖｉ）活性化領域全体と糖抑制領域全体を欠く。
【００７３】
オオムギのＳＵＳＩＢＡ１ｐの糖抑制領域を下に示す（配列番号９４）：
【化１０】
2020512008.tif 000012
【００７４】
コメのＳＵＳＩＢＡ１様ｐの対応する糖抑制領域を下に示す（配列番号９５）：
【化１１】
2020512008.tif 000013
【００７５】
コムギのＳＵＳＩＢＡ１様ｐの対応する糖抑制領域を下に示す（配列番号１１３）：
【化１２】
2020512008.tif 000014
【００７６】
コメの糖抑制領域は、オオムギの対応する糖抑制領域と高い配列同一性を有する第二イントロンの後続部分と、オオムギには存在しない第一の先行部分とを含む。
【００７７】
ＳＵＳＩＢＡ１ｐまたはＳＵＳＩＢＡ１様ｐの活性化領域および糖抑制領域はともに、ＳＵＳＩＢＡ２遺伝子またはＳＵＳＩＢＡ２様遺伝子のイントロンに存在する。一実施形態では、このイントロンはＳＵＳＩＢＡ２遺伝子またはＳＵＳＩＢＡ２様遺伝子から欠失される。したがって、この実施形態では、ＳＵＳＩＢＡ２転写因子またはＳＵＳＩＢＡ２様転写因子をコードするゲノムヌクレオチド配列は、ＳＵＳＩＢＡ１ｐまたはＳＵＳＩＢＡ１様ｐの活性化領域と糖抑制領域とを含むイントロンを欠く。特定の実施形態では、ＳＵＳＩＢＡ２転写因子またはＳＵＳＩＢＡ２様転写因子をコードするゲノムヌクレオチド配列はイントロン２を欠く。
【００７８】
一実施形態では、ＳＵＳＩＢＡ２転写因子またはＳＵＳＩＢＡ２様転写因子をコードするゲノムヌクレオチド配列は、ＳＵＳＩＢＡ１ｐまたはＳＵＳＩＢＡ１様ｐのイントロン部分を欠く。オオムギでは、イントロン２は活性化領域と糖抑制領域とからなり、すなわち、ＨｖＳＵＳＩＢＡ１ｐのイントロン部分がイントロン２を占める。例えばコメの対応するイントロン２は、オオムギの対応する領域と高い配列同一性を有する活性化領域と糖抑制領域とを含む。しかし、コメのイントロン２は、オオムギの活性化領域と高い配列同一性を有する活性化領域に先行するヌクレオチド配列も含む。この先行ヌクレオチド配列は、コメのさらに大きい活性化領域の一部であり、コメのＳＵＳＩＢＡ１様ｐ内のまた別の領域を構成するか、ＳＵＳＩＢＡ１様ｐの一部を形成しないものであり得る。したがって、一実施形態では、イントロンはＳＵＳＩＢＡ１様ｐのイントロン部分以外のヌクレオチド配列（１つまたは複数）を含み得る。このような実施形態では、イントロンは、ＳＵＳＩＢＡ１様ｐのイントロン部分、好ましくは活性化領域および糖抑制領域と、少なくとも１つの他のヌクレオチド配列とからなる。この実施形態では、ＳＵＳＩＢＡ１ｐまたはＳＵＳＩＢＡ１様ｐのイントロン部分がＳＵＳＩＢＡ２転写因子またはＳＵＳＩＢＡ２様転写因子をコードする野生型のゲノムヌクレオチド配列から欠失される。このことは、イントロン部分の欠失後、ＳＵＳＩＢＡ２転写因子またはＳＵＳＩＢＡ２様転写因子をコードするゲノムヌクレオチド配列は、イントロン部分がイントロン２の配列全体を占めている場合はイントロン２を欠き、またはイントロン部分がイントロン２の配列全体の一部分を占めている場合はイントロン２の一部分を欠き得ることを意味する。
【００７９】
オオムギのＳＵＳＩＢＡ１ｐのヌクレオチド配列を下に示す（配列番号９６）。ヌクレオチド配列の下線を施した部分は、ＳＵＳＩＢＡ２遺伝子のイントロン２に存在するＳＵＳＩＢＡ１ｐの一部に対応する。ヌクレオチド配列の下線を施したイタリック体の部分は活性化領域に対応するのに対し、ヌクレオチド配列の下線を施した太字の部分は糖抑制領域に対応する。ヌクレオチド配列の残りの部分は、ＳＵＳＩＢＡ２遺伝子のエクソン３に存在するＳＵＳＩＢＡ１ｐの一部分に対応する。
【化１３】
2020512008.tif 000015
【００８０】
コメのＳＵＳＩＢＡ１様ｐのヌクレオチド配列を下に示す（配列番号９７）。ヌクレオチド配列の下線を施した部分は、ＳＵＳＩＢＡ２様遺伝子のイントロン２に存在するＳＵＳＩＢＡ１様ｐの一部に対応する。ヌクレオチド配列の下線を施したイタリック体の部分は活性化領域に対応するのに対し、ヌクレオチド配列の下線を施した太字の部分は糖抑制領域に対応する。先行ヌクレオチド配列を、下線を施した太字のイタリック体部分で示す。ヌクレオチド配列の残りの部分は、ＳＵＳＩＢＡ２様遺伝子のエクソン３に存在するＳＵＳＩＢＡ１様ｐの一部分に対応する。
【化１４】
2020512008.tif 000016
【００８１】
一実施形態では、植物材料はコメ（アジアイネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）またはアフリカイネ（Ｏｒｙｚａ  ｇｌａｂｅｒｒｉｍａ））植物材料である。このようなコメ植物材料の非限定的な例としては、コメ植物体、コメ植物細胞、コメ組織およびコメ種子が挙げられる。その場合、ゲノムヌクレオチド配列は、ＳＵＳＩＢＡ２様転写因子（ＯｓＳＵＳＩＢＡ２様ＴＦ）をコードする野生型のゲノムヌクレオチド配列のイントロンに存在するＳＵＳＩＢＡ１様ｐ（ＯｓＳＵＳＩＢＡ１様ｐ）の活性化領域の少なくとも一部分を欠くＳＵＳＩＢＡ２様転写因子（ＯｓＳＵＳＩＢＡ２様ＴＦ）をコードするのが好ましい。
【００８２】
別の実施形態では、植物材料はイネ科植物材料である。このようなイネ科植物材料の非限定的な例としては、イネ科植物体、イネ科細胞、イネ科組織およびイネ科種子が挙げられる。このようなイネ科植物材料の好ましい例は、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）植物材料、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｓｐｐ．）植物材料、エンバク（Ａｖｅｎａ  ｓａｔｉｖａ）植物材料、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌ）植物材料およびトウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）植物材料を含む。
【００８３】
諸実施形態の少なくともいくつかの植物材料は、制御された炭水化物合成、例えばデンプン合成の上昇またはデンプンとフルクタン合成の上昇を示すにとどまらない。植物材料は、低メタン放出を含む他の有益な特性をさらに有し得る。コメでのＨｖＳＵＳＩＢＡ２転写因子の発現はと、高デンプン合成だけでなく、低メタン放出および根圏メタン生成菌レベルの低下ももたらすことが示されている［３］。しかし、［３］に開示されているコメ変種は、オオムギＳＢＥＩＩｂプロモーターと作動可能に連結されたオオムギＳＵＳＩＢＡ２転写因子のコード配列を含むトランスジェニックコメ変種である。得られるトランスジェニックコメ変種はこのため、オオムギＳＵＳＩＢＡ２転写因子（ＨｖＳＵＳＩＢＡ２  ＴＦ）をコードするトランスジェニック型の非ゲノムヌクレオチド配列と、コメＳＵＳＩＢＡ２様転写因子（ＯｓＳＵＳＩＢＡ２様ＴＦ）をコードするゲノム内在性ヌクレオチド配列とを含む。このコメＳＵＳＩＢＡ２様転写因子（ＯｓＳＵＳＩＢＡ２様ＴＦ）をコードするゲノム内在性ヌクレオチド配列は、活性化領域と糖抑制領域とを含むコメＳＵＳＩＢＡ１様プロモーター（ＯｓＳＵＳＩＢＡ１様ｐ）の配列全体を含む。
【００８４】
上記のトランスジェニックコメ変種とは明らかに対照的に、諸実施形態の植物材料は好ましくはトランスジェニック材料を一切含まない。明らかに対照的に、そのＳＵＳＩＢＡ２転写因子またはＳＵＳＩＢＡ２様転写因子をコードするゲノム内在性ヌクレオチド配列は、ＳＵＳＩＢＡ１ｐまたはＳＵＳＩＢＡ１様ｐの活性化領域の少なくとも一部分の欠失によって改変される。このことは、［３］のトランスジェニックコメ変種とは明らかに対照的に、諸実施形態の植物材料は好ましくは、ＳＵＳＩＢＡ１転写因子またはＳＵＳＩＢＡ１様転写因子を一切産生できないか、この転写因子を微量産生できるのみである。トランスジェニックコメ変種［３］はコメＳＵＳＩＢＡ１様転写因子の内在性プロモーターおよびコード配列を含み、そのため、この転写因子を相当量産生し得る。
【００８５】
諸実施形態の植物材料はＳＵＳＩＢＡ１転写因子またはＳＵＳＩＢＡ１様転写因子の産生がほとんど欠くため、先行技術のトランスジェニックコメに比してはるかに大量のデンプンまたはデンプンとフルクタンを産生し得る。さらに、諸実施形態の植物材料は、［３］のトランスジェニックコメ変種について記載した通り、低メタン放出という有益な特性を有し得る。特にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介するＳＵＳＩＢＡ１ｐまたはＳＵＳＩＢＡ１様ｐの活性化領域の少なくとも一部分の欠失を用いる、諸実施形態のさらなる利点は、遺伝子組換え生物（ＧＭＯ）と見なされない植物材料である。したがって、一実施形態では、植物材料は非ＧＭＯ植物材料である。
【００８６】
実施例
連続的炭水化物合成は、植物の個体生育および繁殖過程での生長および生育のためのエネルギー供給を確保することによる植物の生存にとって重要である。デンプンおよびフルクタンは、多数の顕花植物においてもヒトの消費にとっても重要な２つの炭水化物である。協調的なデンプンとフルクタンの合成を理解することは、どのように植物が光合成産物を配分し生存のために様々な炭水化物合成を優先させるかを解明するのに役立つばかりでなく、食糧の安全および品質生産のための農業での穀物の改善に利益をもたらす可能性もある。２つの選択的プロモーター、１つのイントロン／エクソンを用いて、オオムギの単一の遺伝子から、配列は重複しているが、スクロース／グルコース／フルクトースシグナル伝達を介して糖を感知する際の機能が逆である２種類の転写因子を生じさせるシステムを本明細書に報告する。このシステムは、一方のプロモーターで糖制御トランス活性を感知し、他方のプロモーターでの競合的な転写因子結合による協調的なデンプンとフルクタンの合成をシステム全体として調整するのに自己調節機序を用いる。このマルチタスクシステムは、多様な用途に合わせてデンプンとフルクタンの量を調節したイネ科草本の形質の育種に利用できる。異なる機能を有するタンパク質が生じる、ホスト遺伝子中のイントロン／エクソンにまたがるプロモーターの発見が、植物ゲノムの複雑性に寄与する。
【００８７】
植物において、糖はその生育および生長を媒介するうえで重要である。糖を介する植物の生育は、短時間、短期間および長期間にわたってエネルギーおよび材料を供給する戦略のための重要な過程である、糖を介する連続的炭水化物合成を含む。しかし、光合成産物を効率的に利用するために糖が連続的炭水化物合成を調節する仕組みは明らかにされていない。デンプンおよびフルクタンは、それぞれグルコースおよびフルクトースの重合体であり、多数の顕花植物において重要な２つの炭水化物である。デンプンは植物界によくみられるものであり、フルクタンは３６０００種を超える植物または双子葉植物および単子葉植物をともに含む被子植物の１２％超にみられる。双子葉植物では、キク科、例えばタンポポ、チョウセンアザミおよびチコリ；キキョウ科、例えばイトシャジン；ならびにムラサキ科、例えばワスレナグサなどの５つの主要な科がフルクタンを産生し、単子葉植物でも、ユリ科、例えばニワシロユリ；ヒガンバナ科、例えばタマネギ；ならびに多数の作物、例えば、オオムギ、コムギ、エンバクおよび多数の飼料イネ科草本を含む重要な温帯性イネ科などの５つの主要な科がフルクタンを合成する。植物の生育過程で、デンプンは比較的長期間のエネルギー供給形態としての役割を果たし、フルクタンは迅速に利用できるエネルギー源としての役割を果たす。重要なことに、両炭水化物ともヒトの消費に対する需要が高い。デンプンは、現在および将来の食糧安全保障の鍵となる要因であり、世界の年間生産量はほぼ３０億トンにのぼり、そのほとんどは穀物由来であり、経済的重要性は計り知れない。多くのイネ科草本の生長生育の過程および生殖生育の初期段階で産生されるフルクタンは、登熟および穀粒収量ならびに乾燥ストレスおよび寒冷ストレス耐性に不可欠である。いくつかのイネ科品種は、高レベルのフルクタンを予備の炭水化物として成熟種子の中に蓄える。このような種子フルクタンは、例えばヒト消化管ミクロビオームに良い影響を及ぼす機能的低カロリー食品成分として、食糧および食糧以外の用途に広範囲にわたって使用され得る。しかし、どのように植物がデンプンとフルクタンの合成などの炭水化物合成を調整および配分して、生育および生長のための光合成産物の貯蔵および使用を最適化するのかは、現時点であまり理解されていない。ここでは、植物の糖シグナル伝達ネットワークにおけるモデルシステムとしてオオムギ中のデンプンおよびフルクタン合成を用いて、２つの選択的プロモーターから同一の配列を有するが５’末端の長さが異なる、２種類の転写因子（ＴＦ）バリアントの糖応答性発現による単一遺伝子からの自己調節機序が逆の糖感知システムを生じる。このシステムは、内部プロモーターでトランス活性を感知することにより糖を検知しかつ、全体としてシステムにおいて、他方のプロモーター上の競合的な転写因子結合により協調的なフルクタンおよびデンプン合成を制御する。
【００８８】
温帯性イネ科草本の収穫高、炭水化物組成、登熟および非生物的ストレス耐性などの重要な形質の背景にある機序を説明する配列関連情報は、マーカー支援選択および合成生物学によって作物生産性を増大させる取組みにとって極めて重要である。
【００８９】
本明細書に報告する通り、オオムギ第２染色体では、単一コピーの配列がオオムギ（ＳＵＳＩＢＡ）ＴＦでの糖シグナル伝達に関する２種類の大きさのバリアント、すなわち、３０ｋＤのＵＳＩＢＡ１および６２ｋＤのＳＵＳＩＢＡ２をコードしている（図１Ａ、１Ｂ、２、３Ａ〜３Ｃ）。ＳＵＳＩＢＡ１のプロモーターとＳＵＳＩＢＡ２のプロモーター（ＳＵＳＩＢＡ１ｐおよびＳＵＳＩＢＡ２ｐ）は異なる濃度のスクロースに応答する（図５Ａ、５Ｂ）。ＳＵＳＩＢＡ１はフルクタンの合成を直接抑制する抑制因子としての役割を果たすのに対し、ＳＵＳＩＢＡ２はデンプンの合成を促進する活性化因子である。興味深いのは、ＳＵＳＩＢＡ２の発現がＳＵＳＩＢＡ１／ＳＵＳＩＢＡ２のＳＵＳＩＢＡ２プロモーターとの競合的結合によって制御されており、これがデンプンとフルクタンを協調的に合成する自己調節システムをもたらすことである。
【００９０】
結果
デンプンとフルクタンの合成は異なる開始設定点でのスクロースの異所性供給に応答する
シンク葉でのデンプンとフルクタンの合成は、ｉｎ  ｖｉｖｏでスクロース（Ｓｕｃ）の利用可能性が高い場合に、または糖の異所性供給によって誘導される（図４Ａ、４Ｂ）。スクロース処理したオオムギ葉でのデンプンとフルクタンの誘導は異なる設定点、すなわち、フルクタンについて５０ｍＭ  Ｓｕｃ、デンプンについて８５ｍＭ  Ｓｕｃで開始された（図４Ａ、４Ｂ）。さらに、デンプンとフルクタンの含有量は供給したスクロースのレベルとよく相関した（図４Ａ、４Ｂ）。これらの観察結果から、デンプンとフルクタンの合成の連続的誘導を媒介する糖シグナル伝達経路の性質に関する疑問が浮上する。
【００９１】
ＳＵＳＩＢＡ１およびＳＵＳＩＢＡ２はおそらくスクロース／グルコース／フルクトースシグナル伝達を介して糖を感知する
多くのＳｕｃシグナル伝達経路では、ＳｕｃそのものではなくＧｌｃ、Ｆｒｕおよび／またはトレハロース６−Ｐ（Ｔ６Ｐ）が一次メッセンジャーとしての役割を果たすことがわかっている。最近、ヘキソースがオオムギ種子でオリゴフルクタン合成およびワタで細胞分化を調節している可能性があることが示唆された。同じモル濃度のＳｕｃ、ＦｒｕおよびＧｌｃをオオムギシンク葉に塗布し、フルクタンおよびデンプンの蓄積に対する効果を検討した（図６Ａおよび６Ｂ）。図のように、フルクタンおよびデンプンの蓄積の誘導は、それぞれＳｕｃ濃度５０ｍＭ以上および８５ｍＭ以上で観察された（図４Ａ、４Ｂも参照されたい）。８５ｍＭではＧｌｃもデンプン蓄積を誘導したが、Ｆｒｕは誘導しなかった。ＧｌｃもＦｒｕも５０ｍＭではフルクタン蓄積を誘導しなかったが、８５ｍＭでは誘導した。転写産物およびタンパク質のレベルを検討したところ、Ｆｒｕ処理試料とＧｌｃ処理試料がＳｕｃ処理試料と同じ傾向、すなわち、ＳＵＳＩＢＡ１／ＳＵＳＩＢＡ１のレベル低下と、ＳＵＳＩＢＡ２／ＳＵＳＩＢＡ２ならびにフルクタン合成（６−ＳＦ／６−ＳＦＴ）およびデンプン合成（ＳＢＥＩＩｂ／ＳＢＥＩＩｂ）のための転写産物／酵素の増大を示すことが明らかになった（図６Ｃおよび６Ｄ）。Ｓｕｃ処理試料中の内因性のＦｒｕおよびＧｌｃのレベルはＦｒｕ処理試料およびＧｌｃ処理試料中より高かった（図７Ａおよび７Ｂ）。内因性のＦｒｕおよびＧｌｃのレベルは糖処理試料中のフルクタンおよびデンプンの蓄積と相関した（図６Ａおよび６Ｂならびに図７Ａおよび７Ｂ）。液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ／ＭＳ）解析では、Ｔ６Ｐレベルは全般的に低く、いずれの試料でも陽性に検出できなかったのに対し、５ｎｇ（１１９ｐｍｏｌ）のＴ６Ｐ標準品は明確なシグナルを与えた。この観察結果は、Ｓｕｃ処理、Ｆｒｕ処理およびＧｌｃ処理でＴＰＳ様転写産物レベル（図７Ｃ）および総トレハロース６−リン酸合成酵素（ＴＰＳ）活性（図７Ｄ）の増大がみられないことによって裏付けられた。
【００９２】
ＳＵＳＩＢＡ２はＳＵＳＩＢＡ１のイントロン／エクソンプロモーターを保有する
デンプンとフルクタンの合成におけるＳＵＳＩＢＡ１  ＴＦとＳＵＳＩＢＡ２  ＴＦの機能および相互作用を明らかにするため、ＳＵＳＩＢＡ１の起源ならびにＳＵＳＩＢＡ１ｐのアイデンティティーおよび配列を最初に検討した。プローブとしてＳＵＳＩＢＡ２  ｃＤＮＡを用いて開花後（ｄａｆ）１０日のオオムギ胚乳ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、ＳＵＳＩＢＡ２  ｃＤＮＡの３’末端と同一のクローンを少数得たが、この段階でのＳＵＳＩＢＡ１発現は低かった（図１Ｃおよび１Ｄ）。オオムギ葉の全ＲＮＡを用いた５’−ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）で、３つのアンプリコンが得られた（図１Ａ）。配列解析から、このアンプリコンがＳＵＳＩＢＡ２  ｃＤＮＡの一部と同一であることがわかった。最も長い１４４８ｎｔのｃＤＮＡ（アンプリコン３）は、ＳＵＳＩＢＡ２のＣ末端側の２８１アミノ酸と同一の２８１アミノ酸ペプチドに対応し、推定分子量は約３０ｋＤであった（図１Ｂ）。オオムギの葉および胚乳組織のノーザンブロット解析およびウエスタンブロット解析で、１．５ｋｂのＳＵＳＩＢＡ１転写産物および３０ｋＤのタンパク質産物の存在を確認した（図１Ｃおよび１Ｄ）。ＳＵＳＩＢＡ１ｐを単離するため、オオムギゲノムからＳＵＳＩＢＡ２のイントロン２およびエクソン３の５’末端の一部をＰＣＲ増幅した。増幅した完全長領域、イントロン２またはエクソン３の５’末端の一部を次いで、ＧＦＰレポーター遺伝子に融合した。様々な構築物を含むアグロバクテリアを用いてオオムギ葉を浸潤した。完全長領域では３５Ｓプロモーターと同程度の強い活性がみられた（図３Ｃ）のに対し、エクソン３の５’末端では弱い活性がみられた（図３Ｃ）。イントロン２、陰性対照（ＧＵＳ：ＧＦＰ）および構築物を含まないアグロバクテリアではレポーター遺伝子活性が一切みられなかった（図３Ｃ）。単離した完全長領域がＳＵＳＩＢＡ１の機能的プロモーターであると結論づけられた。
【００９３】
スクロースレベルに対するＳＵＳＩＢＡ１ｐとＳＵＳＩＢＡ２ｐの差次的応答を示すため、オオムギ葉にＳＵＳＩＢＡ１ｐ：ＧＦＰ構築物およびＳＵＳＩＢＡ２ｐ：ＢＦＰ構築物を含むアグロバクテリアを浸潤させ、葉を様々なスクロース濃度で処理した。ＳＵＳＩＢＡ１およびＳＵＳＩＢＡ２について、プロモーター活性とスクロース濃度の間にそれぞれ直接的な負の相関および正の相関が明確であった（図５Ｂ）。陰性対照のＧＵＳ：ＧＦＰからは蛍光は検出されなかった。
【００９４】
フルクタン合成の調節におけるＳＵＳＩＢＡ１の役割
ＳＵＳＩＢＡ１ｐを特定した後、ＳＵＳＩＢＡ１がフルクタン合成に関与している可能性を検討した。ＳＵＳＩＢＡ１の核内局在をＳＵＳＩＢＡ１：ＧＦＰ融合構築物のアグロバクテリウム浸潤によって確認し、これは、ＳＵＳＩＢＡ１がＧＦＰを核にうまく標的化し得ることを明らかにした（図８Ａ〜８Ｄ）。電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を用いて、ＳＵＳＩＢＡ１とオオムギのフルクタン合成の鍵酵素をコードする６−ＳＦＴのプロモーターの間のｉｎ  ｖｉｔｒｏの相互作用を検討した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に過剰発現させて精製したＳＵＳＩＢＡ１を用い、既に記載されている［１］通りにＥＭＳＡを実施した（図８Ｅ〜８Ｊ）。ＷＲＫＹタンパク質の特徴と一致して、ＳＵＳＩＢＡ２  ＴＦがＷボックスＤＮＡシスエレメントに結合することが示された。ＳＵＳＩＢＡ２活性をさらに解析し、ＳＵＳＩＢＡ２  ＴＦはＳＵＲＥａにも結合するが、ＳＰ８ａシスエレメントには結合しないことがわかった。６−ＳＦＴプロモーターを検討し、２種類のＳＵＲＥａエレメント、３種類のＷボックスエレメントおよび１種類のＳＰ８ａエレメントを同定した（図８Ｅ）。制限酵素ＢｓｔＸＩ、ＰｖｕｌｌおよびＳｐｅｌの様々な組合せを用いて、完全長プロモーター（フラグメント１）を４つのフラグメント（フラグメント２〜５、図８Ｅ）に分割した。ＥＭＳＡは、ＳＵＳＩＢＡ１は１つまたは複数のシスエレメントを含むフラグメント１〜４に結合できるが、いずれのエレメントも含まないフラグメント５には結合できないことを示した（図８Ｆ）。このことは、ＳＵＳＩＢＡ１がＳＵＲＥａおよびＷボックスおよび／またはＳＰ８ａを結合できる可能性があることを示唆した。個々のエレメントに対して構築したオリゴヌクレオチドプローブ（図８Ｇ）を用いたＥＭＳＡは、ＳＵＳＩＢＡ１が実際に各エレメントを結合できることを明らかにした（図８Ｈ）。結合活性の特異性を確認するために、エレメント配列（図８Ｉ）を設計し、ＳＵＳＩＢＡ１の結合を試験した。ＥＭＳＡは、エレメント配列をＡストレッチで置き換えると、ＳＵＳＩＢＡ１結合活性が消失することを示し（図８Ｊ）、このことは、ＳＵＳＩＢＡ１がｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ＳＵＲＥａエレメント、ＷボックスエレメントおよびＳＰ８ａエレメントに結合することによって６−ＳＦＴプロモーターと相互作用でき、Ｗボックスに強く結合することを示している。設計したエレメント配列、すなわち、ＳＰ８ａ  Ｍ、ＷボックスＭおよびＳＵＲＥａ  Ｍ４に対するＳＵＳＩＢＡ１の結合活性がみられなかったことはまた、アッセイシステムでのＥＭＳＡの信頼性を示した（図８Ｊ）。
【００９５】
ＳＵＳＩＢＡ１と６−ＳＦＴプロモーターの間のｉｎ  ｖｉｖｏ相互作用の証拠を得るため、６−ＳＦＴｐ：ＧＦＰをｐ３５Ｓ：ＳＵＳＩＢＡ１と同時に浸潤し、ＳＵＳＩＢＡ１の６−ＳＦＴプロモーター活性に対する影響をモニターした（図８Ｋ〜８Ｏ）。６−ＳＦＴｐ：ＧＦＰ構築物は単独でも無関係の植物転写因子（ＷＲＩ１）と同時に浸潤しても、１００ｍＭ  Ｓｕｃの環境下で６−ＳＦＴプロモーター活性に何ら効果を及ぼすことはなかった（図８Ｋおよび８Ｌ）。これとは対照的に、ｐ３５Ｓ：ＳＵＳＩＢＡ１と同時に浸潤した６−ＳＦＴｐ：ＧＦＰでは６−ＳＦＴプロモーター活性が消失した（図８Ｍ）。浸潤領域でのＳＵＳＩＢＡ１タンパク質のｄｅ  ｎｏｖｏ産生を確認するため、ｐ３５Ｓ：ＳＵＳＩＢＡ１を含む生存アグロバクテリウム細胞と死アグロバクテリウム細胞を用い、対照としてｐ３５Ｓ：ＷＲＩ１を使用して、浸潤領域でのＳＵＳＩＢＡ１転写産物およびタンパク質のレベルを比較した（図８Ｎおよび８Ｏ）。予想通り、生存アグロバクテリウム細胞での浸潤は浸潤死細胞バックグラウンドよりはるかに高いＳＵＳＩＢＡ１転写産物およびタンパク質のレベルを与え、対照ＷＲＩ１の転写産物レベルについても同じであった（図８Ｎおよび８Ｏ）。
【００９６】
ここまでの結果は、ＳＵＳＩＢＡ１が６−ＳＦＴ活性を抑制することによってフルクタン合成を調節できることを示唆した。このシナリオの決定的証拠を得るため、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ａｓＯＤＮ）阻害によりＳＵＳＩＢＡ１ノックダウン実験を実施した。ａｓＯＤＮ阻害戦略は、遺伝子機能の診断ツールとしての信頼性が高く、配列類似性の高い遺伝子を識別できることに基づき選択された。標的配列に応じて、典型的なａｓＯＤＮ阻害の手順を、活性なプロモーター部位でのＲＮアーゼＨ誘導転写産物切断および／または三重ＤＮＡ鎖形成により進める。ＳＵＳＩＢＡ１配列はＳＵＳＩＢＡ２の３’部分と重複しているため、ＳＵＳＩＢＡ２に影響を及ぼさずにＳＵＳＩＢＡ１を阻害するのは困難であった。このため、既に記載されているプロトコル［２］に従い、５種類のａｓＯＤＮ（図９Ａ）を設計し、ＳＵＳＩＢＡ１およびＳＵＳＩＢＡ２に対するそれらの阻害効率を試験した。ａｓＯＤＮのうちａｓＯＤＮ１およびａｓＯＤＮ５の２種類は、ＳＵＳＩＢＡ１タンパク質およびＳＵＳＩＢＡ２タンパク質の産生から判断して、ＳＵＳＩＢＡ１活性に対して優れた阻害を示したが、ＳＵＳＩＢＡ２活性に対してはそうではなかった（図９Ｂ、上パネル）。ＳＵＳＩＢＡ１とＳＵＳＩＢＡ２の同じ配列領域での所与のＯＤＮの異なる阻害効率は、その領域でのＲＮＡ二次構造、例えばステムが異なり、それがａｓＯＤＮ結合を妨げるためである可能性がある。ａｓＯＤＮ１とａｓＯＤＮ５をその６−ＳＦＴタンパク質レベルに対する効果に基づきさらに比較し、ＳＵＳＩＢＡ２のコード領域およびＳＵＳＩＢＡ１のプロモーター配列にマッピングされるａｓＯＤＮ１が、ａｓＯＤＮ阻害実験に最良の候補であることを確認した（図９Ｂ、下パネル）。ａｓＯＤＮ１がＳＵＳＩＢＡ１ｐ活性に干渉することを確認するため、スクロース処理したオオムギ葉にＳＵＳＩＢＡ１ｐ：ＧＦＰとａｓＯＤＮ１またはセンスＯＤＮ（ｓＯＤＮ）を同時に浸潤させた。その結果は、ＳＵＳＩＢＡ１ｐ活性がａｓＯＤＮ１によって効率的に阻害されたことを明らかにした（図９Ｃ）。蛍光標識したＯＤＮを用いて、オオムギ葉の細胞によるａｓＯＤＮの効率的な取り込みを示した（図９Ｄ）。ＳＵＳＩＢＡ１に対してはａｓＯＤＮ１、ＳＵＳＩＢＡ２に対しては既に記載されているａｓＯＤＮ［２］（表１でＳｕ２アンチセンス１と称される）をフルクタンおよびデンプン合成のスクロース誘導閾値（閾値については図４Ａ、４Ｂを参照されたい）で用いて、フルクタンの抑制因子としてのＳＵＳＩＢＡ１の役割およびＳＵＳＩＢＡ２がデンプンの活性化因子であることを確認した（図１０Ａ、１０Ｂ、１１Ａ、１１Ｂ、１２Ａ、１２Ｂ）。
【００９７】
ＳＵＳＩＢＡ１とＳＵＳＩＢＡ２は分子的拮抗システムを構成する
ＳＵＳＩＢＡ１がフルクタン合成の抑制因子であり、ＳＵＳＩＢＡ２がデンプン合成の活性化因子であるという見解を、より自然な条件で、すなわち、高い種子フルクタン含有量および低い種子フルクタン含有量を有する様々なオオムギ変種で（図１３Ａ、１３Ｂ）、スクロース誘導実験で（図１４Ａ、１４Ｂ）、およびデンプンおよびフルクタン蓄積の日内変動（図１５Ａ、１５Ｂ）において、ＳＵＳＩＢＡ１およびＳＵＳＩＢＡ２の発現レベルとフルクタンおよびデンプンの含有量の相関を評価することによりさらに検証した。総合的な結果は、ＳＵＳＩＢＡ１活性とフルクタン含有量の間の負の相関、およびＳＵＳＩＢＡ２活性とデンプン含有量の間の正の相関を示した。ＳＵＳＩＢＡ１とＳＵＳＩＢＡ２はこれにより、分子的拮抗システムを構成した。
【００９８】
デンプンとフルクタンの合成を司る複雑なシステムがデンプンおよびフルクタンの蓄積とどのように相関しているかを検討するため、オオムギ葉中のデンプンおよびフルクタンのレベルを１６時間／８時間の昼夜サイクルでモニターした（図１５Ａ、１５Ｂ）。点灯後、ＳＵＳＩＢＡ２の発現が増大し、これがデンプン合成遺伝子（例えば、ＳＢＥＩＩｂ）の発現を刺激し、一日の終わりにデンプンの高蓄積量をもたらした（図１５Ｂ）。注目すべきことに、ＳＵＳＩＢＡ１発現が低下して６−ＳＦＴ発現が解放され増大した（図１５Ａ）が、明期にフルクタン蓄積はみられなかった（図１５Ｂ）。妥当な説明として、フルクタン合成の誘導と分解の増大が釣り合っていたことが考えられる。この仮説を検証するため、フルクタン分解酵素をコードする１−ＦＥＨおよび６−ＦＥＨの遺伝子の発現レベルを検討した。図１５Ａに示されるように、６−ＳＦＴの活性の後に１−ＦＥＨおよび６−ＦＥＨの活性がみられた。このことは、フルクタン代謝の動態はオオムギにおけるシンク葉生育の重要な構成要素であることを示唆した。
【００９９】
ＳＵＳＩＢＡ２プロモーター中のＷボックスへのＳＵＳＩＢＡ２とＳＵＳＩＢＡ１による競合的結合は拮抗システムおよびＳＵＳＩＢＡ２発現を駆動する
拮抗システムが確認されたことにより、２つの選択的プロモーターの差次的活性および拮抗システムが実行される仕組みに関して疑問が生じた。この疑問には、プロモーター欠失、ａｓＯＤＮ阻害、二本鎖デコイオリゴＴＦ捕捉、浸潤による過剰発現、ＤＮＡシーケンシングおよびＥＭＳＡを含む一連の方法により対処した。様々な長さのＳＵＳＩＢＡ２プロモーターをＧＦＰレポーター遺伝子に融合し、オオムギ葉内にアグロインフィルトレーションしたところ、完全長プロモーターは予想通り、スクロース濃度に応答したのに対し、５’末端の２５％が欠如した短縮プロモーターには応答が全くまたはほとんどみられなかった（図１６Ａ〜１６Ｃ）。この観察結果は、糖応答性配列がＳＵＳＩＢＡ２プロモーターの遠位５’末端に位置することを示唆した。完全長型のＳＵＳＩＢＡ２ｐ：ＧＦＰと３５ｐ：ＳＵＳＩＢＡ１の同時浸潤もまたＳＵＳＩＢＡ２プロモーター活性を実質的に消失し（図１６Ｂおよび１６Ｃ）、ＳＵＳＩＢＡ１がＳＵＳＩＢＡ２プロモーターの遠位の５’領域に結合することによってＳＵＳＩＢＡ２活性を抑制することを示唆する。この見解は、４０ｍＭ  ＳｕｃではＳＵＳＩＢＡ１をａｓＯＤＮで阻害してもＳＵＳＩＢＡ２発現に変化がみられなかった図１１Ａ、１１Ｂに示される結果と一致しないように思われる。４０ｍＭ  Ｓｕｃでは、ＳＵＳＩＢＡ１発現が既に低下しており、ＳＵＳＩＢＡ１力価をさらに低下させることによるＳＵＳＩＢＡ２活性の抑制解除は顕著でないという仮説を立てた。しかし、ＳＵＳＩＢＡ２発現のスクロース誘導閾値（２５ｍＭ／４０ｍＭ）の低い側にあたる２５ｍＭ  ＳｕｃでのａｓＯＤＮによるＳＵＳＩＢＡ１の阻害によるＳＵＳＩＢＡ２発現の活性化（図１７Ａ）およびＳＵＳＩＢＡ１の過剰発現がある場合またはない場合に様々なＳｕｃレベルでのＳＵＳＩＢＡ２発現の活性化（図１７Ｂ）は、ＳＵＳＩＢＡ１がＳＵＳＩＢＡ２発現の抑制因子としての役割を果たしていることを明白に示唆した。興味深いことに、ＳＵＳＩＢＡ１が阻害されたとき、ＳＵＳＩＢＡ２の供給／過剰発現がＳＵＳＩＢＡ２発現を促進でき、このことは、ＳＵＳＩＢＡ１が低いときにＳＵＳＩＢＡ２／ＳＵＳＩＢＡ２は自己促進活性を有し、または自己促進活性がＳＵＳＩＢＡ１抑制活性によって阻害されることを示唆している（図１７Ｃ、１９Ａ、１９Ｂ）。前のＥＭＳＡ実験（図８Ｅ〜８Ｊ）から、ＳＵＳＩＢＡ１がＷボックスモチーフに効率的に結合できることが示された。ＳＵＳＩＢＡ２プロモーターの糖応答性遠位５’末端でのＷボックスの探索はＷボックスを明らかにした。デコイオリゴＴＦ捕捉技術を用いて、ＳＵＳＩＢＡ２プロモーターから無作為に選択したＷボックスをカバーするデコイオリゴおよびＷボックスを含まない対照デコイオリゴを設計した（図１８Ａ）。デコイオリゴをｐ３５Ｓ：ＳＵＳＩＢＡ１と同時に浸潤させたところ、ＷボックスデコイオリゴはＳＵＳＩＢＡ１による糖応答性ＳＵＳＩＢＡ２発現の抑制を打ち消し（図１８Ｂ、２０Ａ、２０Ｂ）、ＳＵＳＩＢＡ２プロモーター中のＷボックスがＳＵＳＩＢＡ１抑制因子のコグネイト結合部位であることを示唆した。Ｗボックスは下流遺伝子のＳＵＳＩＢＡ２活性化の標的でもある。ＳＵＳＩＢＡ１とＳＵＳＩＢＡ２がＳＵＳＩＢＡ２プロモーター中のＷボックスに関して競合するという仮説が立てられる。この仮説を裏付けて、４０ｍＭ  ＳｕｃでのＳＵＳＩＢＡ２過剰発現は、ＳＵＳＩＢＡ１の阻害時にＳＵＳＩＢＡ２発現を増強でき（図１７Ｃ、１９Ａ、１９Ｂ）、低ＳＵＳＩＢＡ１発現のバックグラウンドでＳＵＳＩＢＡ２を標的とするＷボックスデコイオリゴ捕捉は、ＳＵＳＩＢＡ２発現に対するＳＵＳＩＢＡ２の正の作用を大幅に低下させた（図１８Ｃ、１８Ｄ、２１Ａ、２１Ｂ）。低ＳＵＳＩＢＡ１発現は、高Ｓｕｃ濃度（１００ｍＭ、図１８Ｄ）またはａｓＯＤＮ阻害（図１７Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｂ、２１Ａ、２１Ｂ）によってもたらされた。内在性ＳＵＳＩＢＡ２のみをカバーするが構築物配列はカバーしないＳＵＳＩＢＡ２  ｍＲＮＡ５’末端に特異的なプライマーによって解析したところ、１００ｍＭ  Ｓｕｃではｐ３５Ｓ：ＳＵＳＩＢＡ２構築物の浸潤は内因性ＳＵＳＩＢＡ２発現を有意に増大させないことが観察され、これはおそらく高Ｓｕｃ濃度およびＳＵＳＩＢＡ２の外来性導入による活性化の重複性のためである（図１８Ｄ）。
【０１００】
プローブにＳＵＳＩＢＡ２  Ｗボックスデコイオリゴを用いると、ＳＵＳＩＢＡ１はＳＵＳＩＢＡ２のＷボックスへの結合活性を効果的に阻害できたことを示すＥＭＳＡ実験により、Ｗボックス競合の概念のさらなる証拠が得られた（図１８Ｅ）。
【０１０１】
ＳＵＳＩＢＡ１プロモーターのシス配列および対応するトランス活性は拮抗システムの糖センサーを構成する
ＳＵＳＩＢＡ１が糖依存性の様式でＳＵＳＩＢＡ２発現の制御に果たす役割が発見されたことから、ＳＵＳＩＢＡ１が糖を感知する機序が極めて重要になる。この疑問に対処するため、ＳＵＳＩＢＡ２に関して上に記載したものと同じ戦略を用いてＳＵＳＩＢＡ１プロモーターを詳細に分析した。プロモーター欠失実験は、糖応答性配列はＳＵＳＩＢＡ１プロモーターの１７７ｂｐ長の５’末端領域に位置するはずであり、この領域が欠失するとＳＵＳＩＢＡ１プロモーターの糖応答活性が完全に消失することを示した（図２２Ａ〜２２Ｃ）。さらに、イントロンプロモーター配列全体の欠失は、ＳＵＳＩＢＡ１のプロモーター活性全体を有意に低下し、このことは、図３Ａ〜３Ｃに示される結果と一致している。１７７ｂｐ長領域内の糖応答性エレメントを絞り込むため、デコイ捕捉戦略を用い、領域を６つのデコイオリゴに分割した（図２３Ａおよび２３Ｂ）。オオムギ葉内への浸潤後、デコイ２および３は、解析のためのＳＵＳＩＢＡ１発現バックグラウンドに許容される低レベルおよび中レベルの糖でＳＵＳＩＢＡ１発現を有意に低下できた（図２３Ｃ、２４Ａ、２４Ｂ）。ＳＵＳＩＢＡ１の糖応答活性に関与する対応するトランス因子を解析するため、様々なＳｕｃ濃度で処理したオオムギ葉の核タンパク質抽出物をデコイ２および３をカバーするＤＮＡフラグメント、１７７ｂｐ長領域の外側にある対照フラグメント（図２３Ａ）ならびにデコイ２および３とともにＥＭＳＡ実験で使用した（図２３Ｄ）。ＥＭＳＡは、フラグメント１およびデコイ２に結合できるが、フラグメント２およびデコイ３には結合できないトランス因子活性を可視化した。この因子は、その活性がＳＵＳＩＢＡ１発現と相関したことから、正の調節因子であるように思われた。デコイ２の配列を詳細に検討し、それが特定された糖抑制性エレメント（ＳＲＥ）に類似したＴＴＡＴＣモチーフを含むことがわかった。
【０１０２】
２種類の異なるオオムギ遺伝子型、高フルクタン品種１５５および低フルクタン品種１８１を用いたＥＭＳＡ実験により、ＳＵＳＩＢＡ１  １７７ｂｐ長５’プロモーター配列および検出されたコグネイトトランス因子のフルクタン合成における重要性が裏付けられた（図２５Ａ〜２５Ｃ）。シーケンシングのデータおよびＥＭＳＡの結果は、オオムギのフルクタン含有量の決定因子としてのトランス因子活性の役割を裏付ける（図２５Ａ〜２５Ｃ）。
【０１０３】
オオムギ中で協調的なデンプンおよびフルクタン合成を調整する分子機序が明らかになった。この調節回路は、相互に連動するＳＵＳＩＢＡ１  ＴＦ遺伝子とＳＵＳＩＢＡ２  ＴＦ  遺伝子によって実行される２つの逆の機能（拮抗システム）を備える（図２６Ａ、２６Ｂ）。このシステムの核となる部分では、ＳＵＳＩＢＡ２プロモーターの糖応答性領域中のＷボックスへの２種類のＴＦの競合的結合が、拮抗システムの自己調節のための内部適応機序としての役割を果たしている。結果は、システムで全体としてＳＵＳＩＢＡ１／ＳＵＳＩＢＡ２の競合的結合が、糖レベルがフルクタン合成に必要な糖レベルより高くなるまでデンプン合成を遅らせるのに重要な役割を果たすことを示唆する（図４Ａ、４Ｂ）。より高い糖レベルは、デンプン合成をアップレギュレートするためのＳＵＳＩＢＡ２発現を促進することにおいてＳＵＳＩＢＡ２の漸進的発現およびＷボックスへの結合を可能にする、より少ないＳＵＳＩＢＡ１ないしＳＵＳＩＢＡ１のない状態を作り出す。トランス因子がＳＵＳＩＢＡ１プロモーターのイントロンプロモーターエレメントに活性化因子として動員され、複雑な糖シグナル伝達経路での最終的な糖センサーとしての役割を果たす。結果は、デンプンとフルクタンの合成の調節機序の誘導が、光合成産物（Ｓｕｃ）の細胞内移入によって惹起され、Ｇｌｃ／Ｆｒｕシグナル伝達によって媒介されることも示唆し、一方でＴ６Ｐは実験条件下では関与していないように思われた（図６Ａ〜６Ｄ、７Ａ〜７Ｄ）。より高い糖濃度（すなわち、８５ｍＭ超）の条件下および光のある状態での調節におけるＴ６Ｐの役割の可能性を除外できない。Ｇｌｃ処理（８５ｍＭ）試料中の高いデンプン蓄積量（図６Ａおよび６Ｂ）は、Ｇｌｃがデンプン合成経路での中心的代謝産物であることに帰せられるのではないかと思われる。本明細書で示されたオオムギシンク器官でのフルクタン代謝の動態（図１５Ａ、１５Ｂ）は、供給源とシンク器官でのＳｕｃおよびヘキソースのプール量のバランスを取ること、または浸透圧を調節してシンク組織へのＳｕｃの荷下しを制御することの必要性を示すものと思われる。
【０１０４】
温帯性イネ科草本におけるデンプンとフルクタンの合成の制御に関して本明細書で提唱する糖感知競合転写因子結合モデル（図２６Ａ、２６Ｂ）は、例えばオオムギおよびコムギの品種のデンプンおよびフルクタンのレベルを特定の食糧用途、飼料用途および工業用途に合うよう変化させるためのマーカー支援選択または遺伝子導入による育種プログラムに用いることが可能である。遺伝子導入またはゲノム編集技術によってトランス活性を阻害する、またはＳＵＳＩＢＡ１イントロンプロモーター配列を欠失させることにより、フルクタンとデンプンの含有量を同時に増大させることも可能である。系統学的データの解析は、ＳＵＳＩＢＡ２の第二イントロンのイントロン配列またはＳＵＳＩＢＡ１プロモーターの主要部分が３種類の重要な作物種、すなわちオオムギ、コムギおよびコメ、特にオオムギとコムギの間で保存されていることを示す（図２７）。糖制御ＳＵＳＩＢＡ１／ＳＵＳＩＢＡ２拮抗システムは、デンプンおよびその他の炭水化物の合成を調節するために作物種に存在するものと思われる。コメはフルクタンを蓄積しないことから、この種でデンプン以外にどのような炭水化物がシステムによって調節されるのかを明らかにする必要がある。
【０１０５】
本明細書で採用した研究ツールとしてのアグロインフィルトレーションの単子葉植物への応用は、穀類およびイネ科草本の遺伝子機能に関する理解を深めるのに極めて有望なものである。また、本明細書で示される通り、アグロインフィルトレーション、デコイオリゴ捕捉およびａｓＯＤＮ法の組み合わせは、遺伝子およびプロモーターの機能の解析のために植物生物学において用いられる技術の有用性を大幅に増大する。
【０１０６】
保有遺伝子（ＳＵＳＩＢＡ２）にコードされる産物とは異なる機能を有するタンパク質を発現させる植物ゲノム中の内部プロモーター（ＳＵＳＩＢＡ１ｐ）は、それが遺伝子のアノテーション、遺伝子の機能および産物の予測ならびにノックアウト表現型の解釈に影響を及ぼす点で、植物ゲノミクスに対して重要な意義を有すると言える。
【０１０７】
長いオオムギの穂は高いＳＵＳＩＢＡ２レベルと関連し、短い穂は高ＳＵＳＩＢＡ１と関連する
穀類はヒトにとって最も重要な食糧資源であり、穀類収穫高は世界の食糧安全保障の点で最も関心がもたれている問題である。穀類収穫高は穂数、穂の大きさおよび千粒重などの複数の因子に左右される。穂の大きさは穀類収穫高を決める鍵因子の１つである。これまでに、オオムギの抑制因子型転写因子をコードする遺伝子中の変異は二条オオムギから六条オオムギを生じることが報告されている。六条オオムギは理論上、収穫高が二条オオムギの３倍である。しかし、何が穀類の垂直寸法での穂長を決定するのかを明らかにすることは未だ困難である。
【０１０８】
ＳＵＳＩＢＡ２は貯蔵組織でのシンク強度を増大させ得るので、ＳＵＳＩＢＡ２は登熟期に生育中の穂へとさらに多くのスクロースを向かわせることによって穂長を増大させ粒数を増加させるものと思われる。生育中の穂、すなわち生育中の接合子が利用できる糖が増えれば、既に結実した種子を救済し、それが登熟期に生育中の穂で生育不良になるのを防ぐことができる。オオムギ変種１５５（またはＳＬＵ７）と１９９（またはＫＶＬ１１１３）を交雑した子孫では、短い穂（８〜１０ｃｍ）と長い穂（１３〜１５ｃｍ）の２つのタイプのオオムギ穂が生じた（図３１を参照されたい）。受粉前後、すなわち卵受精時の生育中の穂の遺伝子発現を慎重に検討したところ、ＳＵＳＩＢＡ２の発現が高いと必ず穂が長くなることがわかった（図３２の下パネル）。この現象から直ちに、ＳＵＳＩＢＡ２が穂の長さの遺伝的決定因子であるのかどうかという重要で興味深い疑問が浮上した。
【０１０９】
オオムギの糖シグナル伝達経路を長年にわたって検討することにより、オオムギＳＵＳＩＢＡ２遺伝子が第２染色体上に位置することがわかった。ＳＵＳＩＢＡ２遺伝子座は、２つの選択的プロモーターを用いて２種類の転写因子ＳＵＳＩＢＡ１およびＳＵＳＩＢＡ２を産生する（図２６Ａ、２６Ｂを参照されたい）。ＳＵＳＩＢＡ１プロモーターは第二イントロンとＳＵＳＩＢＡ２の第三エクソンの５’末端に位置する。このため、ＳＵＳＩＢＡ１はＳＵＳＩＢＡ２のＣ末端側のほぼ半分である。ＳＵＳＩＢＡ１はＳＵＳＩＢＡ２の抑制因子であり、ＳＵＳＩＢＡ２の自己活性化発現を阻害する。ＳＵＳＩＢＡ１プロモーターおよびＳＵＳＩＢＡ２プロモーターは差異的に糖に応答する。糖のレベルが低いとき、糖に制御される未同定のアクター型タンパク質複合体がＳＵＳＩＢＡ１発現を促進する。ＳＵＳＩＢＡ１はＳＵＳＩＢＡ２プロモーターに結合する。ＳＵＳＩＢＡ１の発現が高いとＳＵＳＩＢＡ２発現が阻害される。糖が高いとき、糖に制御される活性化活性が低下され、ＳＵＳＩＢＡ１発現が低下する。ＳＵＳＩＢＡ１発現の低下はＳＵＳＩＢＡ２発現を徐々に解放する。糖が常時高いとき、ＳＵＳＩＢＡ１が少なくなるとＳＵＳＩＢＡ２の発現が高くなる。レベルが上昇したＳＵＳＩＢＡ２は、ＳＵＳＩＢＡ１との競合結合を介してそれ自身の遺伝子プロモーターに結合し、デンプン遺伝子などの下流遺伝子をアップレギュレートするためにそれ自体の発現を自己促進する。
【０１１０】
材料および方法
植物材料および生長条件
オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）変種Ｇｏｌｄｅｎ  Ｐｒｏｍｉｓｅ、ＳＬＵ７（変種１５５）およびＫＶＬ３０１（変種１８１）の種子をそれぞれ北欧遺伝子バンク、スウェーデン農業科学大学（ＳＬＵ）およびデンマーク王立獣医科・農科大学（ＫＶＬ）から入手した。Ｇｏｌｄｅｎ  Ｐｒｏｍｉｓｅを２２℃、１６時間の明期、１８℃、８時間の暗期、相対湿度７０％、光強度４００μｍｏｌ／（ｍ２・ｓ）で、ＳＬＵ７およびＫＶＬ３０１をそれぞれ２４℃／１６℃および１８℃／１０℃で栽培した。これ以外の栽培条件は既に記載されている条件［６］と同様であった。オオムギの生育段階をＺａｄｏｋｓスケール［１８］に従い、または生育中の種子については開花後日数（ｄａｆ）従ってモニターした。４週齢のオオムギ実生の第二葉を糖誘導、ａｓＯＤＮ阻害およびその他の実験に用いた。
【０１１１】
オリゴヌクレオチド
この研究に使用したオリゴヌクレオチドを表１に挙げる。これらはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（セントルイス、ミズーリ州、米国）から購入した。
【０１１２】
分子クローニングおよびｃＤＮＡライブラリースクリーニング
ＧＦＰ、ＢＦＰおよびＧＵＳを含むプラスミドを記載されている通り［１、７］に入手した。シロイヌナズナＷＲＩ１をＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿２０２７０１から増幅した。分子クローニングの方法はいずれも記載されている通り［１、２、４、８］であり、５’−ＲＡＣＥをＧｅｎｅ  Ｒａｃｅ（登録商標）コアキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバッド、カリフォルニア州、米国）により製造業者のマニュアルに従い実施した。ｃＤＮＡライブラリースクリーニングを記載されている通り［１、８］に実施した。
【０１１３】
スクロース誘導およびａｓＯＤＮ阻害
スクロース誘導およびａｓＯＤＮ阻害に関する実験は既に報告されている通り［１、２、４、５、９］であった。簡潔に述べれば、オオムギ植物体を暗所で２４時間置いて糖を枯渇させた後、実験に用いた。４週齢実生の先端部の第二葉を切り離し、ＯＤＮを加えて、または加えずに様々な濃度のスクロースでインキュベートした。スクロース誘導には、水およびソルビトールを対照として用いた。ａｓＯＤＮ阻害には、センスＯＤＮを対照に用いた。
【０１１４】
アグロインフィルトレーション
アグロインフィルトレーションを、公開されている双子葉植物用のプロトコル［１０］をわずかに修正したものに従い実施した。４週齢植物の実生を暗所に２４時間置いて糖を枯渇させた。先端部の第二葉を、同じＯＤ濃度へと様々な溶液中に懸濁した構築物含有アグロバクテリウムＡＧＬ１に浸潤させて、記載される通り形質転換効率が等しくなるよう［１０］アグロインフィルトレーション条件を最適化した。浸潤後、様々な溶液を用いて、または用いずに葉または植物体を暗所でさらに４８時間インキュベートした後ｑＰＣＲ解析を実施するか、または７２時間インキュベートした後ＵＶ光および顕微鏡下で、ＧＦＰについては４６０〜５００ｎｍ、ＢＦＰについては３４０〜３８０ｎｍの波長で観察した。様々な配列をレポーター遺伝子に融合し、アグロバクテリウムに形質転換し、オオムギ葉内に浸潤させた。
【０１１５】
デコイオリゴ捕捉アッセイ
オリゴデオキシヌクレオチドデコイを、オリゴヌクレオチドを１４ｍＭトリス−ＨＣＩ、ｐＨ８．０および７ｍＭ  ＭｇＣｌ２中でアニールさせることにより作製した後、オオムギ葉内への浸潤のため作業濃度２５μΜに希釈した。
ｑＰＣＲ転写産物の解析のために、浸潤の４８時間後に浸潤領域を用いてＲＮＡを単離した。蛍光顕微鏡解析のために、浸潤の７２時間後に浸潤領域を用いた。
【０１１６】
ノーザンブロット解析およびウエスタンブロット解析
ノーザンブロット解析およびウエスタンブロット解析を、記載されている通り［１］に実施した。ノーザン解析にはＳＵＳＩＢＡ２のｃＤＮＡをプローブとして使用し、ウエスタンブロット解析には、Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｃａｒｒａｓｃｏ博士の厚意によるオオムギ６−ＳＦＴに対する抗体を使用した。同じ負荷量からのブロット上のクーマシーで染色したタンパク質および免疫反応バンドの典型的な全体プロファイルを図６Ｄに示す。ＳＵＳＩＢＡ１とＳＵＳＩＢＡ２のウエスタンブロット解析は、完全長ＳＵＳＩＢＡ２ペプチドに対する抗体のＳＵＳＩＢＡ１に対する交差反応がＳＵＳＩＢＡ２に対するものより弱かったため、同じブロット上で実施する代わりに異なるブロット上で実施した。
【０１１７】
ｑＰＣＲ解析
定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を、既に記載されている通り［２、１１］に実施した。ＳＵＳＩＢＡ１の相対発現レベルを、同じハウスキーピング遺伝子（または参照遺伝子）を用いて、ＳＵＳＩＢＡ１＋２のデルタＣｔ値からＳＵＳＩＢＡ２のデルタＣｔ値を減じることにより、すなわち、ＳＵＳＩＢＡ１のデルタＣｔ値＝ＳＵＳＩＢＡ１＋２のデルタＣｔ値−ＳＵＳＩＢＡ２のデルタＣｔ値により算出した。
【０１１８】
顕微鏡法
蛍光顕微鏡法および共焦点顕微鏡法は記載されている通り［２］であった。ソフトウェアＩｍａｇｅＪ［１９］で相対蛍光強度を測定した。
【０１１９】
核タンパク質単離
オオムギ葉を０ｍＭ、５０ｍＭおよび１００ｍＭのＳｕｃで２日間処理し、核タンパク質を既に記載されている通り［１２］に単離した。変種１５５および１８１の９ｄａｆ種子の核タンパク質を同じプロトコルに従い単離した。
【０１２０】
ＥＭＳＡ
電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）実験を、既に記載されている通り［１、１２］に実施した。簡潔に述べれば、過剰発現したＳＵＳＩＢＡ１タンパク質およびＳＵＳＩＢＡ２タンパク質を精製するか、またはオオムギ核タンパク質を単離し、ＥＭＳＡに使用した。ＰＮＫ（Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ）を用いてＤＮＡフラグメントプローブを［γ３２Ρ］で末端標識した。オリゴプローブは、ＰＮＫを用いて一方の鎖を［γ３２Ρ］で末端標識し、１４ｍＭトリス（ｐＨ８．０）および７ｍＭ  ＭｇＣｌ２でオリゴの相補鎖とアニールさせた。大きいＤＮＡフラグメントにはアガロースゲルを使用し、オリゴヌクレオチドフラグメントにはポリアクリルアミドゲルを使用した。競合アッセイには、０．２μｇの過剰産生されたＳＵＳＩＢＡ２を０．０１２５μｇ、０．０２５μｇ、０．０５μｇ、０．１μｇおよび０．２μｇで過剰産生されたＳＵＳＩＢＡ１を漸増させて結合反応に加えてインキュベートした。６％のポリアクリルアミドゲルを使用し、１６０Ｖの定電圧をかけた。
【０１２１】
実験デザイン、統計解析およびバイオインフォマティック解析
製造業者のプロトコル（Ｍｅｇａｚｙｍｅ社、ブレイ、ウィックロー州、アイルランド）に従い、テクニカルデュプリケートを用いたデンプンとフルクタンの解析を除き、バイオロジカルトリプリケートおよびテクニカルトリプリケートを用いた。解析には一元配置ＡＮＯＶＡ［１３］およびバイオインフォマティクス［１１］の方法を用いた。系統樹をＤＮＡＳＴＡＲ  ｌａｓｅｒｇｅｎｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １２のプログラムにより作製した。
【０１２２】
フルクタン、デンプン、Ｇｌｃ、ＦｒｕおよびＴ６Ｐの測定
フルクタン、デンプンならびに内因性のフルクトースおよびグルコースを、記載されている通り［２、１１］に、またＭｅｇａｚｙｍｅ社（ブレイ、ウィックロー州、アイルランド）製のキットに提供されているプロトコルに従い抽出し解析した。内因性トレハロース６−リン酸を、既に記載されているプロトコル［１４］に正確に従い単離し、既に記載されている通り［１５］に液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ／ＭＳ）により解析した。ＬＣ／ＭＳ解析は、Ａｍａｚｏｎ  Ｓｐｅｅｄ  ＥＴＤイオントラップ質量分析計（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社、ブレーメン、ドイツ）と連動させたＡｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣで実施した。分離を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（米国）製の２．６μｍサイズ粒子のＡｃｃｕｃｏｒｅ−１５０−ＨＩＬＩＣ−Ａｍｉｄｅカラム（２．１×１５０ｍｍ）を用い２５℃で試みた。標準品および抽出物の両方について流速を２００μｌ／分に維持し、注入体積２０μｌを用いた。移動相は記載されている通り［１５］であった。イオントラップ質量分析計を、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）を用いてネガティブモードで操作し、質量スペクトルをｍ／ｚ５０〜５００のスキャン範囲にわたって取得した。
【０１２３】
トレハロース６−リン酸合成酵素アッセイ
トレハロース６−リン酸合成酵素アッセイを、最初の反応時間および温度をそれぞれ１２０分および２５℃に設定した以外は既に記載されている通り［１６］に実施した。酵素活性は、第二の反応でＮＡＤＨの３４０ｎｍでの１分当たりの吸光度減少によって示される。
【０１２４】
【表１】
2020512008.tif 000017
2020512008.tif 000018
2020512008.tif 000019
2020512008.tif 000020
【０１２５】
材料および方法
オオムギ変種
これまでに２５３種類のオオムギ変種が収集されている。そのうち、１２変種が様々な解析で詳細に特徴付けされている［２２］。その１２変種から４変種（１５５、１９９、２２４および２３５）をこの高種子フルクタンオオムギに関する試験での交雑用に選択した。
【０１２６】
植物の栽培
植物の栽培には、ＳＬＵにある最新のファイトロトン（ｐｈｙｔｒｏｔｏｎ）を本明細書および［２２］に既に記載されている通りに使用した。
【０１２７】
分子生物学
交雑後の子孫のスクリーニングには、ＤＮＡプローブとしてＳＵＳＩＢＡ１およびＳＵＳＩＢＡ２の配列を用い、タンパク質プローブとしてＳＵＳＩＢＡ１およびＳＵＳＩＢＡ２、ＳＢＥＩＩｂおよび６−ＳＦＴ［１］に対する抗体を用いた。ｑＰＣＲ、ウエスタンブロット、顕微鏡観察などの他の実験については、本明細書に記載した通りに実施した。
【０１２８】
炭水化物の解析
フルクタンおよびβ−グルカンの解析を公開されているプロトコル［１１、２０、２１、２２］に従い実施した。
【０１２９】
オオムギの交雑
オオムギ変種の間のＳＵＳＩＢＡ１発現レベルの遺伝的変異をスクリーニングし、ＳＵＳＩＢＡ１の発現レベルが異なる系統を多数得た。このうち、変種１５５および１９９がＳＵＳＩＢＡ１の発現が低い変種であり、ＳＵＳＩＢＡ１発現が高く、フルクタン加水分解活性が低い変種２２４および２３５との交雑に選択した。この変種の交雑は、低ＳＵＳＩＢＡ１発現および低フルクタン加水分解活性が子孫に遺伝するかどうかを検証するために実施した。変種をファイトトロンで栽培し、既に記載されている交雑技術［２３］に従い交雑に用いた。交雑後の子孫系統をスクリーニングの様々な解析に用いた。
【０１３０】
結果
オオムギ種子生育期に分子マーカーとして陰陽システムを用いてフルクタン合成活性を追跡し、マーカー遺伝子として２種類の加水分解酵素遺伝子、１−ＦＥＨおよび６−ＦＥＨを用いてフルクタン加水分解活性をモニターした。初期段階（開花後９日）で合成活性が高いことおよび後期段階（開花後２２日）で加水分解活性が低いことに着目した。１２種類のオオムギ変種から、初期段階での合成活性が高い２変種（変種１５５および１９９）および後期段階での加水分解活性が低い２変種（変種２２４および２３５）が特定された。この４変種を交雑に用いて種子フルクタン含有量を増大させた。この考え方は、高い合成活性と低い加水分解活性を組み合わせて種子生育期のフルクタン蓄積を増大させるというものであった。交雑後のＦ１子孫では、相対的にフルクタン含有量の高い子孫を５個体選択してフルクタン含有量形質の分離を追跡した。その５個体の子孫は♀１９９×♂１５５、♀１５５×♂１９９、♀２２４×♂１５５、♀２２４×♂１９９および♀１９９×♂２３５であった。選択した子孫は種子生育期に、生育段階を経るに従い、特に後期段階の開花後２２日および成熟種子中にますます多くのフルクタンを蓄積し（図３３）、このことは、変種２２４および２３５の低い加水分解活性が子孫に伝わり、それにより蓄積量が親１５５および１９９より高くなることを示唆する。子孫がホモ接合体である場合、♀２２４×♂１５５ハダカムギ、♀２２４×♂１９９ハダカムギの系統で種子フルクタン含有量が最も高く、個々の植物のフルクタン含有量は乾燥重量（ＤＷ）当たり最大１３％であり、千粒重（ＴＫＷ）は影響を受けないことが観察された（図３４および３５）。スクリーニングでは、子孫に２つのタイプの種子、すなわち、丸い種子と平らな種子が観察された（図３６Ａ）。平均種子フルクタン含有量を測定したところ、高いフルクタン含有量は平らな種子の表現型と相関した（図３６Ｂ、３６Ｃ）。興味深いのは、平らな種子中の高フルクタン含有量は、高β−グルカン含有量と強く相関したことであり、このことは、陰陽システムがβ−グルカン合成を制御している可能性を示唆している（図３６）。
【０１３１】
収穫高と関係のある他の形質についても検討した。重要なことに、平らな種子中の高いフルクタンおよびβ−グルカン含有量は、ＴＫＷが変種１５５と比較してわずかに高いものの、植物体の高さ、穂数、粒数およびＴＫＷといった形質に影響を及ぼさなかった（図３５）。
【０１３２】
オオムギ変種１５５と１９９を交雑した子孫では、短い穂（８〜１０ｃｍ）と長い穂（１３〜１５ｃｍ）の２つのタイプのオオムギ穂が観察された（図３１）。受粉前後（卵受精時）の生育中の穂の遺伝子発現を慎重に検討したところ、ＳＵＳＩＢＡ２の高発現およびＳＵＳＩＢＡ１の低発現は長い穂と常に関連することが示唆された（図３２）。ＳＵＳＩＢＡ２が穂の長さの遺伝的決定因子であり、陰陽システムがオオムギの穂長を調節しているのではないかという仮説が導かれる。この仮説は、ＳＵＳＩＢＡ２の機能および、ＳＵＳＩＢＡ２が貯蔵組織のシンク強度を増大させることができ登熟期に生育中の穂にさらに多くのスクロースを向かわせることによって穂長を増大させ粒数を増加させ得るということに基づく。［２４］で示唆されるように、生育中の接合子を含む生育中の穂への利用できる糖が増えれば、既に結実した種子を救済し、それらが登熟期に生育中の穂で生育不良になるのを防ぐことができる。
【０１３３】
上記の実施形態は本発明のいくつかの実例であると理解するべきである。当業者には、本発明の範囲を逸脱することなく諸実施形態に様々な修正、組合せおよび変更を施し得ることが理解されよう。特に、技術的に可能な場合、様々な実施形態の様々な部分的解決法を他の構成で組み合させることができる。ただし、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって定められる。
【０１３４】
参考文献
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２４．Ｔｕｎｃｅｌ  ａｎｄ  Ｏｋｉｔａ，Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ  ２０１３，２１１：５２−６０
【図１】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図８−６】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１８−４】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図１９−３】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２０−３】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２２−３】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２３−３】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２４−３】
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【図２４−４】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９−１】
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【図２９−２】
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【図３０−１】
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【図３０−２】
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【図３０−３】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５−１】
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【図３５−２】
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【図３６−１】
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【図３６−２】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年11月27日(2019.11.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2020512008000001.app
【国際調査報告】
2020512008.tif 000101
2020512008.tif 000102
2020512008.tif 000103
2020512008.tif 000104