(57)【要約】ガイド分子の化学合成が、それに関連する組成物および方法と共に開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＲＩＳＰＲシステムのための合成単分子ガイド分子であって、式：
【化１】
2020503049.tif 000170
の化学結合を含み、
式中：
Ｒ２’およびＲ３’は、それぞれ独立に、Ｈ、ＯＨ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ＮＨ２、ＳＨ、Ｓ−Ｒ’、またはＯ−Ｒ’であり、ここで、Ｒ’は、それぞれ独立に、保護基またはアルキル基であり、ここで、前記アルキル基は、任意選択により置換されてもよく；
ＬおよびＲは、それぞれ独立に、非ヌクレオチドリンカーであり；かつ
Ｂ１およびＢ２は、それぞれ独立に、核酸塩基である、合成単分子ガイド分子。
【請求項２】
Ｒ２’は、Ｈ、フルオロ、およびＯ−Ｒ’からなる群から選択され、ここで、Ｒ’は、保護基または任意選択により置換されたアルキル基である、請求項１に記載のガイド分子。
【請求項３】
式：
【化２】
2020503049.tif 000171
のものであり、
式中：
（Ｎ）ｃおよび（Ｎ）ｔ中のＮは、それぞれ独立に、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホノアセテート結合、チオホスホノアセテート結合、またはホスホロアミデート結合を介してその隣接ヌクレオチドにそれぞれ独立に結合したヌクレオチド残基、任意選択により修飾ヌクレオチド残基であり；
（Ｎ）ｃは、（Ｎ）ｔの５’領域に相補的または部分的に相補的であり、かつ前記（Ｎ）ｔの５’領域と二重鎖を形成する３’領域を含み；
ｃは、２０以上の整数であり；
ｔは、２０以上の整数であり；かつ
【化３】
2020503049.tif 000172
は、それぞれ独立に、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホノアセテート結合、チオホスホノアセテート結合、またはホスホロアミデート結合を表す、請求項１または２に記載のガイド分子。
【請求項４】
（Ｎ）ｃおよび（Ｎ）ｔ中のＮは、それぞれ独立に、リボヌクレオチド残基または糖修飾リボヌクレオチド残基である、請求項３に記載のガイド分子。
【請求項５】
（Ｎ）ｃまたは（Ｎ）ｔは、１つまたは複数のデオキシリボヌクレオチド残基を含む、請求項３または４に記載のガイド分子。
【請求項６】
（Ｎ）ｃまたは（Ｎ）ｔは、１つまたは複数の２’−Ｏ−メチル修飾リボヌクレオチド残基を含む、請求項３〜５のいずれか一項に記載のガイド分子。
【請求項７】
（Ｎ）ｃの５’末端における３つのヌクレオチドのそれぞれ、および／または（Ｎ）ｔの３’末端における３つのヌクレオチドのそれぞれは、ホスホロチオエート結合を介してその隣接ヌクレオチドに結合した２’−Ｏ−メチル修飾リボヌクレオチド残基を含む、請求項３〜６のいずれか一項に記載のガイド分子。
【請求項８】
ＬおよびＲは、それぞれ独立に、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレングリコール、およびポリプロピレングリコールからなる群から選択される部分を含む非ヌクレオチドリンカーである、請求項１〜７のいずれか一項に記載のガイド分子。
【請求項９】
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのためのものであり、かつ（Ｎ）ｃは、標的配列内の標的ドメインに完全にまたは部分的に相補的な標的ドメインを含む５’領域を含む、請求項３〜８のいずれか一項に記載のガイド分子。
【請求項１０】
（Ｎ）ｔは、１つまたは複数のステムループ構造を含む３’領域を含む、請求項３〜９のいずれか一項に記載のガイド分子。
【請求項１１】
Ｃａｓ９分子と相互作用し、かつＣａｓ９／ガイドリボ核タンパク質複合体の形成を媒介することができる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のガイド分子。
【請求項１２】
（Ｎ）ｃは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムからの反復の少なくとも一部を含む３’領域を含む、請求項３〜１１のいずれか一項に記載のガイド分子。
【請求項１３】
式：
【化４】
2020503049.tif 000173
のものであり、
式中：
Ｌ１およびＲ１は、それぞれ独立に、非ヌクレオチドリンカーであり；
Ｒ２は、それぞれ独立に、ＯまたはＳであり；
Ｒ３は、それぞれ独立に、Ｏ−またはＣＯＯ−であり；
ｐおよびｑは、それぞれ独立に、０〜６（両端を含む）の整数であり、かつｐ＋ｑは、０〜６（両端を含む）の整数であり；
ｕは、２〜２２（両端を含む）の整数であり；
ｓは、１〜１０（両端を含む）の整数であり；
ｘは、１〜３（両端を含む）の整数であり；
ｙは、＞ｘであり、かつ３〜５（両端を含む）の整数であり；
ｍは、１５以上の整数であり；
ｎは、３０以上の整数であり；
Ｎは、それぞれ独立に、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホノアセテート結合、チオホスホノアセテート結合、またはホスホロアミデート結合を介してその隣接ヌクレオチドにそれぞれ独立に結合したヌクレオチド残基、任意選択により修飾ヌクレオチド残基であり；かつ
Ｎ−−−−Ｎは、それぞれ独立に、２つの相補的なヌクレオチド、任意選択により水素結合で塩基対合した２つの相補的なヌクレオチドを表す、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のガイド分子。
【請求項１４】
ｐおよびｑは、それぞれ０である、請求項１３に記載のガイド分子。
【請求項１５】
ｕは、３〜２２（両端を含む）の整数である、請求項１３に記載のガイド分子。
【請求項１６】
式：
【化５】
2020503049.tif 000174
のものであり、式中：
ｕ’は、２〜２２（両端を含む）の整数であり；かつ
ｐ’およびｑ’は、それぞれ独立に、０〜４（両端を含む）の整数であり、かつｐ’＋ｑ’は、０〜４（両端を含む）の整数である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のガイド分子。
【請求項１７】
式：
【化６】
2020503049.tif 000175
のものであり、
式中：
ｕ’は、２〜２２（両端を含む）の整数であり；かつ
ｐ’およびｑ’は、それぞれ独立に、０〜４（両端を含む）の整数であり、かつｐ’＋ｑ’は、０〜４（両端を含む）の整数である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のガイド分子。
【請求項１８】
ｐ’およびｑ’は、それぞれ０である、請求項１４または１５に記載のガイド分子。
【請求項１９】
ｕ’は、３〜２２（両端を含む）の整数である、請求項１４または１５に記載のガイド分子。
【請求項２０】
Ｌ１は、−（ＣＨ２）Ｗ−であり、かつｗは、１〜２０（両端を含む）の整数である、請求項１３〜１９のいずれか一項に記載のガイド分子。
【請求項２１】
Ｒ１は、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｖ−であり、かつｖは、１〜１０（両端を含む）の整数である、請求項１３〜２０のいずれか一項に記載のガイド分子。
【請求項２２】
ｗは、６であり、かつｖは、４である、請求項２１に記載のガイド分子。
【請求項２３】
配列番号３６〜５６から選択される配列を含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のガイド分子。
【請求項２４】
ＣＲＩＳＰＲシステムのための合成単分子ガイド分子であって、式：
【化７】
2020503049.tif 000176
の化学結合を含み、
式中：
Ｒ２’およびＲ３’は、それぞれ独立に、Ｈ、ＯＨ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ＮＨ２、ＳＨ、Ｓ−Ｒ’、またはＯ−Ｒ’であり、ここで、Ｒ’は、それぞれ独立に、保護基またはアルキル基であり、ここで、前記アルキル基は、任意選択により置換されてもよく；
ＬおよびＲは、それぞれ独立に、非ヌクレオチドリンカーであり；かつ
Ｂ１およびＢ２は、それぞれ独立に、核酸塩基である、合成単分子ガイド分子。
【請求項２５】
Ｒ２’は、Ｈ、フルオロ、およびＯ−Ｒ’からなる群から選択され、ここで、Ｒ’は、保護基または任意選択により置換されたアルキル基である、請求項２４に記載のガイド分子。
【請求項２６】
式：
【化８】
2020503049.tif 000177
のものであり、
式中：
（Ｎ）ｃおよび（Ｎ）ｔ中のＮは、それぞれ独立に、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホノアセテート結合、チオホスホノアセテート結合、またはホスホロアミデート結合を介してその隣接ヌクレオチドにそれぞれ独立に結合したヌクレオチド残基、任意選択により修飾ヌクレオチド残基であり；
（Ｎ）ｃは、（Ｎ）ｔの５’領域に相補的または部分的に相補的であり、かつ前記（Ｎ）ｔの５’領域と二重鎖を形成する３’領域を含み；
ｃは、２０以上の整数であり；
ｔは、２０以上の整数であり；かつ
【化９】
2020503049.tif 000178
は、それぞれ独立に、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホノアセテート結合、チオホスホノアセテート結合、またはホスホロアミデート結合を表す、請求項２４または２５に記載のガイド分子。
【請求項２７】
（Ｎ）ｃおよび（Ｎ）ｔ中のＮは、それぞれ独立に、リボヌクレオチド残基または糖修飾リボヌクレオチド残基である、請求項２６に記載のガイド分子。
【請求項２８】
（Ｎ）ｃまたは（Ｎ）ｔは、１つまたは複数のデオキシリボヌクレオチド残基を含む、請求項２６または２７に記載のガイド分子。
【請求項２９】
（Ｎ）ｃまたは（Ｎ）ｔは、１つまたは複数の２’−Ｏ−メチル修飾リボヌクレオチド残基を含む、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載のガイド分子。
【請求項３０】
（Ｎ）ｃの５’末端における３つのヌクレオチドのそれぞれ、および／または（Ｎ）ｔの３’末端における３つのヌクレオチドのそれぞれは、ホスホロチオエート結合を介してその隣接ヌクレオチドに結合した２’−Ｏ−メチル修飾リボヌクレオチド残基を含む、請求項２６〜２９のいずれか一項に記載のガイド分子。
【請求項３１】
ＬおよびＲは、それぞれ独立に、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレングリコール、およびポリプロピレングリコールからなる群から選択される部分を含む非ヌクレオチド非ヌクレオチドリンカーである、請求項２４〜３０のいずれか一項に記載のガイド分子。
【請求項３２】
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのためのものであり、かつ（Ｎ）ｃは、標的配列内の標的ドメインに完全にまたは部分的に相補的な標的ドメインを含む５’領域を含む、請求項２６〜３１のいずれか一項に記載のガイド分子。
【請求項３３】
（Ｎ）ｔは、１つまたは複数のステムループ構造を含む３’領域を含む、請求項２６〜３２のいずれか一項に記載のガイド分子。
【請求項３４】
Ｃａｓ９分子と相互作用し、かつＣａｓ９／ガイドリボ核タンパク質複合体の形成を媒介することができる、請求項２４〜３３のいずれか一項に記載のガイド分子。
【請求項３５】
（Ｎ）ｃは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムからの反復の少なくとも一部を含む３’領域を含む、請求項２６〜３４のいずれか一項に記載のガイド分子。
【請求項３６】
式：
【化１０】
2020503049.tif 000179
のものであり、
式中：
Ｌ１およびＲ１は、それぞれ独立に、非ヌクレオチドリンカーであり；
Ｒ２は、それぞれ独立に、ＯまたはＳであり；
Ｒ３は、それぞれ独立に、Ｏ−またはＣＯＯ−であり；
ｐおよびｑは、それぞれ独立に、０〜６（両端を含む）の整数であり、かつｐ＋ｑは、０〜６（両端を含む）の整数であり；
ｕは、２〜２２（両端を含む）の整数であり；
ｓは、１〜１０（両端を含む）の整数であり；
ｘは、１〜３（両端を含む）の整数であり；
ｙは、＞ｘであり、かつ３〜５（両端を含む）の整数であり；
ｍは、１５以上の整数であり；
ｎは、３０以上の整数であり；
Ｎは、それぞれ独立に、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホノアセテート結合、チオホスホノアセテート結合、またはホスホロアミデート結合を介してその隣接ヌクレオチドにそれぞれ独立に結合したヌクレオチド残基、任意選択により修飾ヌクレオチド残基であり；かつ
Ｎ−−−−Ｎは、それぞれ独立に、２つの相補的なヌクレオチド、任意選択により水素結合で塩基対合した２つの相補的なヌクレオチドを表す、請求項２４〜３５のいずれか一項に記載のガイド分子。
【請求項３７】
式：
【化１１】
2020503049.tif 000180
のものであり、
式中：
ｕ’は、２〜２２（両端を含む）の整数であり；かつ
ｐ’およびｑ’は、それぞれ独立に、０〜４（両端を含む）の整数であり、かつｐ’＋ｑ’は、０〜４（両端を含む）の整数である、請求項２４〜３６のいずれか一項に記載のガイド分子。
【請求項３８】
式：
【化１２】
2020503049.tif 000181
【化１３】
2020503049.tif 000182
のものであり、
式中：
ｕ’は、２〜２２（両端を含む）の整数であり；かつ
ｐ’およびｑ’は、それぞれ独立に、０〜４（両端を含む）の整数であり、かつｐ’＋ｑ’は、０〜４（両端を含む）の整数である、請求項２４〜３６のいずれか一項に記載のガイド分子。
【請求項３９】
Ｌ１は、−（ＣＨ２）ｗ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｗ−ＮＨ−または−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｖ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｗ−であり；ｗは、それぞれ独立に、１〜２０であり；かつｖは、それぞれ独立に、１〜１０である、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載のガイド分子。
【請求項４０】
Ｒ１は、−（ＣＨ２）ｗ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｗ−または−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｖ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｗ−であり；ｗは、それぞれ独立に、１〜２０であり；かつｖは、それぞれ独立に、１〜１０である、請求項３６〜３９のいずれか一項に記載のガイド分子。
【請求項４１】
Ｌ１は、−（ＣＨ２）６−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）１−ＮＨ−であり、かつＲ１は、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）４−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）２−である、請求項４０に記載のガイド分子。
【請求項４２】
配列番号３５から選択される配列を含む、請求項２４〜４１のいずれか一項に記載のガイド分子。
【請求項４３】
請求項１〜４２のいずれか一項に記載の複数の合成ガイド分子を含む組成物であって、前記ガイド分子の約１０％未満は、参照ガイド分子配列に対して５’末端に切断を含む、組成物。
【請求項４４】
前記ガイド分子の少なくとも約９９％は、前記参照ガイド分子配列の対応する５’配列と１００％同一である前記ガイド分子のヌクレオチド１〜２０を含む５’配列を含む、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４５】
式：
【化１４】
2020503049.tif 000183
の、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のガイド分子またはその薬学的に許容される塩を含むか、または本質的にそれからなる組成物であって、式：
【化１５】
2020503049.tif 000184
の分子またはその薬学的に許容される塩を実質的に含まない、組成物。
【請求項４６】
式：
【化１６】
2020503049.tif 000185
の、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のガイド分子またはその薬学的に許容される塩を含むか、または本質的にそれからなる組成物であって、式：
【化１７】
2020503049.tif 000186
の分子またはその薬学的に許容される塩を実質的に含まない、組成物。
【請求項４７】
いかなる精製ステップにも供されていない、請求項４５または４６に記載の組成物。
【請求項４８】
式：
【化１８】
2020503049.tif 000187
の、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のガイド分子またはその薬学的に許容される塩を含むか、または本質的にそれからなる組成物であって、式：
【化１９】
2020503049.tif 000188
の分子またはその薬学的に許容される塩を実質的に含まず、
式中：
ａは、ｃと等しくなく；かつ／または
ｂは、ｔと等しくない、組成物。
【請求項４９】
式：
【化２０】
2020503049.tif 000189
の、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のガイド分子またはその薬学的に許容される塩を含むか、または本質的にそれからなる組成物であって、式：
【化２１】
2020503049.tif 000190
の分子またはその薬学的に許容される塩を実質的に含まず、
式中：
ａは、ｃと等しくなく；かつ／または
ｂは、ｔと等しくない、組成物。
【請求項５０】
ａは、ｃ未満であり、かつ／またはｂは、ｔ未満である、請求項４８または４９に記載の組成物。
【請求項５１】
いかなる精製ステップにも供されていない、請求項４８〜５０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５２】
前記ガイド分子とＣａｓ９またはＲＮＡガイドヌクレアーゼとの複合体を含む、請求項４５〜５１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５３】
前記ガイド分子は、溶液中または薬学的に許容される担体中に懸濁されている、請求項４５〜５２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５４】
（Ｎ）ｃは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムからの反復の少なくとも一部を含む３’領域を含む、請求項４５〜５３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５５】
式：
【化２２】
2020503049.tif 000191
の、請求項２４〜４２のいずれか一項に記載のガイド分子またはその薬学的に許容される塩を含むか、または本質的にそれからなる組成物であって、式：
【化２３】
2020503049.tif 000192
の分子またはその薬学的に許容される塩を実質的に含まず、
式中：
ａは、ｃと等しくなく；かつ／または
ｂは、ｔと等しくない、組成物。
【請求項５６】
式：
【化２４】
2020503049.tif 000193
の、請求項２４〜４２のいずれか一項に記載のガイド分子またはその薬学的に許容される塩を含むか、または本質的にそれからなる組成物であって、式：
【化２５】
2020503049.tif 000194
の分子またはその薬学的に許容される塩を実質的に含まず、
式中：
ａは、ｃと等しくなく；かつ／または
ｂは、ｔと等しくない、組成物。
【請求項５７】
式：
【化２６】
2020503049.tif 000195
の、請求項２４〜４２のいずれか一項に記載のガイド分子またはその薬学的に許容される塩を含むか、または本質的にそれからなる組成物であって、式：
【化２７】
2020503049.tif 000196
の分子またはその薬学的に許容される塩を実質的に含まず、
式中：
ａは、ｃと等しくなく；かつ／または
ｂは、ｔと等しくない、組成物。
【請求項５８】
式：
【化２８】
2020503049.tif 000197
の、請求項２４〜４２のいずれか一項に記載のガイド分子またはその薬学的に許容される塩を含むか、または本質的にそれからなる組成物であって、式：
【化２９】
2020503049.tif 000198
の分子またはその薬学的に許容される塩を実質的に含まず、
式中：
ａは、ｃと等しくなく；かつ／または
ｂは、ｔと等しくない、組成物。
【請求項５９】
ａは、ｃ未満であり、かつ／またはｂは、ｔ未満である、請求項５５〜５８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６０】
いかなる精製ステップにも供されていない、請求項５５〜５８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６１】
前記ガイド分子とＣａｓ９またはＲＮＡガイドヌクレアーゼとの複合体を含む、請求項５５〜６０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６２】
前記ガイド分子は、溶液中または薬学的に許容される担体中に懸濁されている、請求項５５〜６１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６３】
（Ｎ）ｃは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムからの反復の少なくとも一部を含む３’領域を含む、請求項５５〜６２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６４】
（ａ）ＣＲＩＳＰＲシステムのための合成単分子ガイド分子であって、式：
【化３０】
2020503049.tif 000199
のものまたはその薬学的に許容される塩であり、
式中：
（Ｎ）ｃおよび（Ｎ）ｔ中のＮは、それぞれ独立に、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホノアセテート結合、チオホスホノアセテート結合、またはホスホロアミデート結合を介してその隣接ヌクレオチドにそれぞれ独立に結合したヌクレオチド残基、任意選択により修飾ヌクレオチド残基であり；
（Ｎ）ｃは、（Ｎ）ｔの５’領域に相補的または部分的に相補的であり、かつ前記（Ｎ）ｔの５’領域と二重鎖を形成する３’領域を含み；
ｃは、２０以上の整数であり；
ｔは、２０以上の整数であり；
Ｂ１およびＢ２は、それぞれ独立に、核酸塩基であり；かつ
【化３１】
2020503049.tif 000200
は、それぞれ独立に、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホノアセテート結合、チオホスホノアセテート結合、またはホスホロアミデート結合を表す、合成単分子ガイド分子；ならびに
（ｂ）以下の１つまたは複数：
（ｉ）カルボジイミドまたはその塩；
（ｉｉ）イミダゾール、シアノイミダゾール、ピリジン、およびジメチルアミノピリジン、またはそれらの塩；および
（ｉｉｉ）式：
【化３２】
2020503049.tif 000201
の化合物またはその塩
を含み、式中、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立に、置換もしくは非置換アルキル、または置換もしくは非置換カルボシクリルである、組成物。
【請求項６５】
前記カルボジイミドは、ＥＤＣ、ＤＣＣ、またはＤＩＣである、請求項６４に記載の組成物。
【請求項６６】
ＣＲＩＳＰＲシステムのための合成単分子ガイド分子を含む組成物であって、式：
【化３３】
2020503049.tif 000202
のものまたはその薬学的に許容される塩であり、
式中：
（Ｎ）ｃおよび（Ｎ）ｔ中のＮは、それぞれ独立に、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホノアセテート結合、チオホスホノアセテート結合、またはホスホロアミデート結合を介してその隣接ヌクレオチドにそれぞれ独立に結合したヌクレオチド残基、任意選択により修飾ヌクレオチド残基であり；
（Ｎ）ｃは、（Ｎ）ｔの５’領域に相補的または部分的に相補的であり、かつ前記（Ｎ）ｔの５’領域と二重鎖を形成する３’領域を含み；
ｃは、２０以上の整数であり；
ｔは、２０以上の整数であり；
Ｂ１およびＢ２は、それぞれ独立に、核酸塩基であり；かつ
【化３４】
2020503049.tif 000203
は、それぞれ独立に、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホノアセテート結合、チオホスホノアセテート結合、またはホスホロアミデート結合を表し、
前記組成物は、式：
【化３５】
2020503049.tif 000204
の分子またはその薬学的に許容される塩を実質的に含まず、
式中：
ａ＋ｂは、ｃ＋ｔ−ｋであり、ここで、ｋは、１〜１０（両端を含む）の整数である、組成物。
【請求項６７】
ＣＲＩＳＰＲシステムのための合成単分子ガイド分子を含むか、または本質的にそれからなる組成物であって、式：
【化３６】
2020503049.tif 000205
のものまたはその薬学的に許容される塩であり、
式中：
（Ｎ）ｃおよび（Ｎ）ｔ中のＮは、それぞれ独立に、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホノアセテート結合、チオホスホノアセテート結合、またはホスホロアミデート結合を介してその隣接ヌクレオチドにそれぞれ独立に結合したヌクレオチド残基、任意選択により修飾ヌクレオチド残基であり；
（Ｎ）ｃは、（Ｎ）ｔの５’領域に相補的または部分的に相補的であり、かつ前記（Ｎ）ｔの５’領域と二重鎖を形成する３’領域を含み；
前記式中に示される２’−５’ホスホジエステル結合は、前記二重鎖における２つのヌクレオチド間にあり；
ｃは、２０以上の整数であり；
ｔは、２０以上の整数であり；
Ｂ１およびＢ２は、それぞれ独立に、核酸塩基であり；
Ｒ２’およびＲ３’は、それぞれ独立に、Ｈ、ＯＨ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ＮＨ２、ＳＨ、Ｓ−Ｒ’、またはＯ−Ｒ’であり、ここで、Ｒ’は、それぞれ独立に、保護基またはアルキル基であり、ここで、前記アルキル基は、任意選択により置換されてもよく；かつ
【化３７】
2020503049.tif 000206
は、それぞれ独立に、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホノアセテート結合、チオホスホノアセテート結合、またはホスホロアミデート結合を表す、組成物。
【請求項６８】
前記ガイド分子は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのためのものであり、かつ（Ｎ）ｃは、標的配列内の標的ドメインに完全にまたは部分的に相補的な標的ドメインを含む５’領域を含む、請求項６７に記載の組成物。
【請求項６９】
（Ｎ）ｔは、１つまたは複数のステムループ構造を含む３’領域を含む、請求項６７または６８に記載の組成物。
【請求項７０】
前記ガイド分子は、Ｃａｓ９分子と相互作用し、かつＣａｓ９／ガイド分子複合体の形成を媒介することができる、請求項６７〜６９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７１】
前記ガイド分子は、式：
【化３８】
2020503049.tif 000207
のものまたはその薬学的に許容される塩であり、
式中：
Ｚは、４〜６ヌクレオチド長、任意選択により４または６ヌクレオチド長であるヌクレオチドループを表し；
ｕは、０〜２２（両端を含む）の整数であり、任意選択により２であり；
ｓは、１〜１０（両端を含む）の整数であり、任意選択により４であり；
ｘは、１〜３（両端を含む）の整数であり、任意選択により２であり；
ｙは、＞ｘであり、かつ３〜５（両端を含む）の整数であり、任意選択により４であり；
ｍは、１５以上の整数であり；
ｎは、３０以上の整数であり；
Ｎ−−−−Ｎは、それぞれ独立に、２つの相補的なヌクレオチド、任意選択により水素結合で塩基対合した２つの相補的なヌクレオチドを表し、
前記式中に示される二重鎖領域における２つのヌクレオチド間の少なくとも１つのホスホジエステル結合は、２’−５’ホスホジエステル結合であり；かつ
Ｎは、それぞれ独立に、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホノアセテート結合、チオホスホノアセテート結合、またはホスホロアミデート結合を介してその隣接ヌクレオチドにそれぞれ独立に結合したヌクレオチド残基、任意選択により修飾ヌクレオチド残基である、請求項６７〜７０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７２】
前記２’−５’ホスホジエステル結合は、請求項７１に記載の式に示される前記バルジの５’に位置する２つのヌクレオチド間にある、請求項６７〜７１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７３】
前記２’−５’ホスホジエステル結合は、ヌクレオチドループＺの５’および請求項７１に記載の式に示される前記バルジの３’に位置する２つのヌクレオチド間にある、請求項６７〜７１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７４】
前記２’−５’ホスホジエステル結合は、ヌクレオチドループＺの３’および請求項７１に記載の式に示される前記バルジの５’に位置する２つのヌクレオチド間にある、請求項６７〜７１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７５】
前記２’−５’ホスホジエステル結合は、請求項７１に記載の式に示される前記バルジの３’に位置する２つのヌクレオチド間にある、請求項６７〜７１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７６】
前記ガイド分子の約１０％未満は、参照ガイド分子配列に対して５’末端に切断を含む、請求項４５〜７５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７７】
前記ガイド分子の少なくとも約９９％は、前記参照ガイド分子配列の対応する５’配列と１００％同一である前記ガイド分子のヌクレオチド１〜２０を含む５’配列を含む、請求項７６に記載の組成物。
【請求項７８】
ＣＲＩＳＰＲシステムのためのガイド分子の組成物であって、式：
【化３９】
2020503049.tif 000208
のガイド分子またはその薬学的に許容される塩から本質的になり、式中：
（Ｎ）ｃおよび（Ｎ）ｔ中のＮは、それぞれ独立に、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホノアセテート結合、チオホスホノアセテート結合、またはホスホロアミデート結合を介してその隣接ヌクレオチドにそれぞれ独立に結合したヌクレオチド残基、任意選択により修飾ヌクレオチド残基であり；
（Ｎ）ｃは、（Ｎ）ｔの５’領域に相補的または部分的に相補的であり、かつ前記（Ｎ）ｔの５’領域と二重鎖を形成する３’領域を含み；
ｃは、２０以上の整数であり；
ｔは、２０以上の整数であり；かつ
【化４０】
2020503049.tif 000209
は、それぞれ独立に、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホノアセテート結合、チオホスホノアセテート結合、またはホスホロアミデート結合を表し；
リンカーは、非ヌクレオチド化学結合であり；
Ｂ１およびＢ２は、それぞれ独立に、核酸塩基であり；かつ
Ｒ２’およびＲ３’は、それぞれ独立に、Ｈ、ＯＨ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ＮＨ２、ＳＨ、Ｓ−Ｒ’、またはＯ−Ｒ’であり、ここで、Ｒ’は、それぞれ独立に、保護基またはアルキル基であり、ここで、前記アルキル基は、任意選択により置換されてもよい、組成物。
【請求項７９】
式：
【化４１】
2020503049.tif 000210
のガイド分子またはその塩から本質的になり、式中：
ｐおよびｑは、それぞれ独立に、０〜６（両端を含む）の整数であり、かつｐ＋ｑは、０〜６（両端を含む）の整数であり；
ｕ’は、２〜２２（両端を含む）の整数であり；
ｍは、１５以上の整数であり；
ｎは、３０以上の整数であり；
Ｎ−−−−Ｎは、それぞれ独立に、２つの相補的なヌクレオチド、任意選択により水素結合で塩基対合した２つの相補的なヌクレオチドを表し；かつ
Ｎは、それぞれ独立に、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホノアセテート結合、チオホスホノアセテート結合、またはホスホロアミデート結合を介してその隣接ヌクレオチドにそれぞれ独立に結合したヌクレオチド残基、任意選択により修飾ヌクレオチド残基である、請求項７８に記載のガイド分子の組成物。
【請求項８０】
式：
【化４２】
2020503049.tif 000211
のガイド分子またはその塩から本質的になり、式中：
ｐおよびｑは、それぞれ独立に、０〜６（両端を含む）の整数であり、かつｐ＋ｑは、０〜６（両端を含む）の整数であり；
ｕ’は、２〜２２（両端を含む）の整数であり；
ｍは、１５以上の整数であり；
ｎは、３０以上の整数であり；
Ｎ−−−−Ｎは、それぞれ独立に、２つの相補的なヌクレオチド、任意選択により水素結合で塩基対合した２つの相補的なヌクレオチドを表し；かつ
Ｎは、それぞれ独立に、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホノアセテート結合、チオホスホノアセテート結合、またはホスホロアミデート結合を介してその隣接ヌクレオチドにそれぞれ独立に結合したヌクレオチド残基、任意選択により修飾ヌクレオチド残基である、請求項７８に記載のガイド分子の組成物。
【請求項８１】
式：
【化４３】
2020503049.tif 000212
【化４４】
2020503049.tif 000213
のガイド分子またはその塩から本質的になり、
式中：
Ｚは、４〜６ヌクレオチド長、任意選択により４または６ヌクレオチド長のヌクレオチドループを表し；
ｐおよびｑは、それぞれ独立に、０〜２（両端を含む）の整数であり、任意選択により０であり；
ｐ’は、０〜４（両端を含む）の整数であり、任意選択により０であり；
ｑ’は、０〜４（両端を含む）の整数であり、任意選択により２であり；
ｘは、１〜３（両端を含む）の整数であり、任意選択により２であり；
ｙは、＞ｘであり、かつ３〜５（両端を含む）の整数であり、任意選択により４であり；
ｕは、２〜２２（両端を含む）の整数であり、任意選択により２であり；
ｓは、１〜１０（両端を含む）の整数であり、任意選択により４であり；
ｍは、１５以上の整数であり；
ｎは、３０以上の整数であり；
Ｂ１およびＢ２は、それぞれ独立に、核酸塩基であり；
Ｎは、それぞれ独立に、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホノアセテート結合、チオホスホノアセテート結合、またはホスホロアミデート結合を介してその隣接ヌクレオチドにそれぞれ独立に結合したヌクレオチド残基、任意選択により修飾ヌクレオチド残基であり；
Ｎ１およびＮ２は、それぞれ独立に、ヌクレオチド残基であり；
Ｎ−−−−Ｎは、それぞれ独立に、２つの相補的なヌクレオチド、任意選択により水素結合で塩基対合した２つの相補的なヌクレオチドを表し；かつ
【化４５】
2020503049.tif 000214
は、それぞれ独立に、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホノアセテート結合、チオホスホノアセテート結合、またはホスホロアミデート結合を表す、請求項７８に記載のガイド分子の組成物。
【請求項８２】
ＣＲＩＳＰＲシステムのためのガイド分子の組成物であって、前記ガイド分子は、式：
【化４６】
2020503049.tif 000215
のものまたはその薬学的に許容される塩であり、式中：
（Ｎ）ｃおよび（Ｎ）ｔ中のＮは、それぞれ独立に、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホノアセテート結合、チオホスホノアセテート結合、またはホスホロアミデート結合を介してその隣接ヌクレオチドにそれぞれ独立に結合したヌクレオチド残基、任意選択により修飾ヌクレオチド残基であり；
（Ｎ）ｃは、（Ｎ）ｔの５’領域に相補的または部分的に相補的であり、かつ前記（Ｎ）ｔの５’領域と二重鎖を形成する３’領域を含み；
ｃは、２０以上の整数であり；
ｔは、２０以上の整数であり；かつ
【化４７】
2020503049.tif 000216
は、それぞれ独立に、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホノアセテート結合、チオホスホノアセテート結合、またはホスホロアミデート結合を表し；
リンカーは、非ヌクレオチド化学結合であり；
Ｂ１およびＢ２は、それぞれ独立に、核酸塩基であり；かつ
Ｒ２’およびＲ３’は、それぞれ独立に、Ｈ、ＯＨ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ＮＨ２、ＳＨ、Ｓ−Ｒ’、またはＯ−Ｒ’であり、ここで、Ｒ’は、それぞれ独立に、保護基またはアルキル基であり、ここで、前記アルキル基は、任意選択により置換されてもよく；
ここで、前記ガイド分子の約１０％未満は、参照ガイド分子配列に対して５’末端に切断を含み、
ここで、前記ガイド分子の少なくとも約９９％は、前記参照ガイド分子配列の対応する５’配列と１００％同一である前記ガイド分子のヌクレオチド１〜２０を含む５’配列を含む、組成物。
【請求項８３】
前記ガイド分子は、式：
【化４８】
2020503049.tif 000217
のものまたはその塩であり、式中：
ｐおよびｑは、それぞれ独立に、０〜６（両端を含む）の整数であり、かつｐ＋ｑは、０〜６（両端を含む）の整数であり；
ｕ’は、２〜２２（両端を含む）の整数であり；
ｍは、１５以上の整数であり；
ｎは、３０以上の整数であり；
Ｎ−−−−Ｎは、それぞれ独立に、２つの相補的なヌクレオチド、任意選択により水素結合で塩基対合した２つの相補的なヌクレオチドを表し；かつ
Ｎは、それぞれ独立に、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホノアセテート結合、チオホスホノアセテート結合、またはホスホロアミデート結合を介してその隣接ヌクレオチドにそれぞれ独立に結合したクレオチド残基、任意選択により修飾ヌクレオチド残基である、請求項８２に記載のガイド分子の組成物。
【請求項８４】
前記ガイド分子は、式：
【化４９】
2020503049.tif 000218
のものまたはその塩であり、式中：
ｐおよびｑは、それぞれ独立に、０〜６（両端を含む）の整数であり、かつｐ＋ｑは、０〜６（両端を含む）の整数であり；
ｕ’は、２〜２２（両端を含む）の整数であり；
ｍは、１５以上の整数であり；
ｎは、３０以上の整数であり；
Ｎ−−−−Ｎは、それぞれ独立に、２つの相補的なヌクレオチド、任意選択により水素結合で塩基対合した２つの相補的なヌクレオチドを表し；かつ
Ｎは、それぞれ独立に、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホノアセテート結合、チオホスホノアセテート結合、またはホスホロアミデート結合を介してその隣接ヌクレオチドにそれぞれ独立に結合したヌクレオチド残基、任意選択により修飾ヌクレオチド残基である、請求項８２に記載のガイド分子の組成物。
【請求項８５】
前記ガイド分子は、式：
【化５０】
2020503049.tif 000219
【化５１】
2020503049.tif 000220
のものまたはその塩であり、
式中：
Ｚは、４〜６ヌクレオチド長、任意選択により４または６ヌクレオチド長のヌクレオチドループを表し；
ｐおよびｑは、それぞれ独立に、０〜２（両端を含む）の整数であり、任意選択により０であり；
ｐ’は、０〜４（両端を含む）の整数であり、任意選択により０であり；
ｑ’は、０〜４（両端を含む）の整数であり、任意選択により２であり；
ｘは、１〜３（両端を含む）の整数であり、任意選択により２であり；
ｙは、＞ｘであり、かつ３〜５（両端を含む）の整数であり、任意選択により４であり；
ｕは、２〜２２（両端を含む）の整数であり、任意選択により２であり；
ｓは、１〜１０（両端を含む）の整数であり、任意選択により４であり；
ｍは、１５以上の整数であり；
ｎは、３０以上の整数であり；
Ｂ１およびＢ２は、それぞれ独立に、核酸塩基であり；
Ｎは、それぞれ独立に、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホノアセテート結合、チオホスホノアセテート結合、またはホスホロアミデート結合を介してその隣接ヌクレオチドにそれぞれ独立に結合したヌクレオチド残基、任意選択により修飾ヌクレオチド残基であり；
Ｎ１およびＮ２は、それぞれ独立に、ヌクレオチド残基であり；
Ｎ−−−−Ｎは、それぞれ独立に、２つの相補的なヌクレオチド、任意選択により水素結合で塩基対合した２つの相補的なヌクレオチドを表し；かつ
【化５２】
2020503049.tif 000221
は、それぞれ独立に、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホノアセテート結合、チオホスホノアセテート結合、またはホスホロアミデート結合を表す、請求項８２に記載のガイド分子の組成物。
【請求項８６】
ＣＲＩＳＰＲシステムのための単分子ガイド分子を合成する方法であって、
第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドとをアニールして、前記第１のオリゴヌクレオチドの３’領域と前記第２のオリゴヌクレオチドの５’領域との間に二重鎖を形成するステップであって、前記第１のオリゴヌクレオチドは、２’反応性基および３’反応性基の少なくとも一方である第１の反応性基を含み、前記第２のオリゴヌクレオチドは、５’反応性基である第２の反応性基を含む、ステップ；および
前記アニールされた第１および第２のオリゴヌクレオチドを、前記第１および第２の反応性基を介してコンジュゲートさせて、前記第１および第２のオリゴヌクレオチドを結合する共有結合を含む単分子ガイド分子を形成するステップ
を含む方法。
【請求項８７】
前記ガイド分子は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのためのものであり、かつ前記第１のオリゴヌクレオチドの５’領域は、標的配列内の標的ドメインに完全にまたは部分的に相補的な標的ドメインを含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記第２のオリゴヌクレオチドの３’領域は、１つまたは複数のステムループ構造を含む、請求項８６または８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記ガイド分子は、Ｃａｓ９分子と相互作用し、かつＣａｓ９／ガイド分子複合体の形成を媒介することができる、請求項８６〜８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
前記第１および第２の反応性基は、両方ともアミン部分を含み、かつ前記コンジュゲートさせるステップは、前記第１および第２の反応性基の前記アミン部分をカーボネート含有二官能性架橋剤で架橋して尿素結合を形成することを含む、請求項８６〜８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
前記カーボネート含有二官能性架橋剤は、ジスクシンイミジルカーボネート、ジイミダゾールカーボネート、またはビス−（ｐ−ニトロフェニル）カーボネートである、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記第１および第２のオリゴヌクレオチドのそれぞれの濃度は、１０μＭ〜１ｍＭの範囲である、請求項８６〜９１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
カーボネート含有二官能性架橋剤の濃度は、１ｍＭ〜１００ｍＭの範囲である、請求項９０〜９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
カーボネート含有二官能性架橋剤の濃度は、前記第１および第２のオリゴヌクレオチドのそれぞれの濃度よりも１００〜１，０００倍高い、請求項９０〜９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
前記コンジュゲートさせるステップは、７〜９の範囲のｐＨで行われる、請求項８６〜９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
前記コンジュゲートさせるステップは、共溶媒としてＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ＮＭＰ、ＤＭＡ、モルホリン、ピリジン、またはＭｅＣＮを用いて水中で行われる、請求項８６〜９５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
前記コンジュゲートさせるステップは、二価金属カチオンの存在下で行われる、請求項８６〜９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
前記コンジュゲートさせるステップは、０℃〜４０℃の範囲の温度で行われる、請求項８６〜９７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９９】
前記第１のオリゴヌクレオチドは、式：
【化５３】
2020503049.tif 000222
のものまたはその塩であり；かつ前記第２のオリゴヌクレオチドは、式：
【化５４】
2020503049.tif 000223
のものまたはその塩であり；
式中：
（Ｎ）ｃおよび（Ｎ）ｔ中のＮは、それぞれ独立に、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホノアセテート結合、チオホスホノアセテート結合、またはホスホロアミデート結合を介してその隣接ヌクレオチドにそれぞれ独立に結合したヌクレオチド残基、任意選択により修飾ヌクレオチド残基であり；
（Ｎ）ｃは、（Ｎ）ｔの５’領域に相補的または部分的に相補的であり、かつ前記（Ｎ）ｔの５’領域と二重鎖を形成する３’領域を含み；
ｃは、２０以上の整数であり；
ｔは、２０以上の整数であり；
Ｒ２’およびＲ３’は、それぞれ独立に、Ｈ、ＯＨ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ＮＨ２、ＳＨ、Ｓ−Ｒ’、またはＯ−Ｒ’であり、ここで、Ｒ’は、それぞれ独立に、保護基またはアルキル基であり、ここで、前記アルキル基は、任意選択により置換されてもよく；
ＬおよびＲは、それぞれ独立に、非ヌクレオチドリンカーであり；かつ
Ｂ１およびＢ２は、それぞれ独立に、核酸塩基であり；かつ
【化５５】
2020503049.tif 000224
は、それぞれ独立に、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホノアセテート結合、チオホスホノアセテート結合、またはホスホロアミデート結合を表す、請求項８６〜９８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
前記単分子ガイド分子は、式：
【化５６】
2020503049.tif 000225
のものまたはその塩である、請求項８６〜９９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０１】
前記単分子ガイド分子は、式：
【化５７】
2020503049.tif 000226
のものまたはその塩であり、
式中：
Ｌ１およびＲ１は、それぞれ独立に、非ヌクレオチドリンカーであり；
Ｒ２は、それぞれ独立に、ＯまたはＳであり；
Ｒ３は、それぞれ独立に、Ｏ−またはＣＯＯ−であり；
ｐおよびｑは、それぞれ独立に、０〜６（両端を含む）の整数であり、かつｐ＋ｑは、０〜６（両端を含む）の整数であり；
ｕは、２〜２２（両端を含む）の整数であり；
ｓは、１〜１０（両端を含む）の整数であり；
ｘは、１〜３（両端を含む）の整数であり；
ｙは、＞ｘであり、かつ３〜５（両端を含む）の整数であり；
ｍは、１５以上の整数であり；
ｎは、３０以上の整数であり；
Ｎは、それぞれ独立に、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホノアセテート結合、チオホスホノアセテート結合、またはホスホロアミデート結合を介してその隣接ヌクレオチドにそれぞれ独立に結合したヌクレオチド残基、任意選択により修飾ヌクレオチド残基であり；
Ｎ−−−−Ｎは、それぞれ独立に、２つの相補的なヌクレオチド、任意選択により水素結合で塩基対合した２つの相補的なヌクレオチドを表す、請求項８２〜９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０２】
前記単分子ガイド分子は、式：
【化５８】
2020503049.tif 000227
のものまたはその塩であり、式中、ｐ’およびｑ’は、それぞれ独立に、０〜４（両端を含む）の整数であり、かつｐ’＋ｑ’は、０〜４（両端を含む）の整数であり；かつｕ’は、２〜１４（両端を含む）の整数である、請求項８６〜１０１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０３】
前記単分子ガイド分子は、式：
【化５９】
2020503049.tif 000228
のものまたはその塩であり、式中、ｐ’およびｑ’は、それぞれ独立に、０〜４（両端を含む）の整数であり、かつｐ’＋ｑ’は、０〜４（両端を含む）の整数であり；かつｕ’は、２〜２２（両端を含む）の整数である、請求項８６〜１０１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０４】
ｐ’＝ｑ’であり、任意選択によりｐ’＝ｑ’＝０、ｐ’＝ｑ’＝１、またはｐ’＝ｑ’＝２である、請求項１０２または１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
Ｌ１は、−（ＣＨ２）Ｗ−であり、かつｗは、１〜２０である、請求項１０１〜１０４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０６】
Ｒ１は、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｖ−であり、かつｖは、１〜１０である、請求項１０１〜１０４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０７】
前記単分子ガイド分子は、式：
【化６０】
2020503049.tif 000229
のものまたはその塩であり、式中、ｐ’およびｑ’は、それぞれ独立に、０〜４（両端を含む）の整数であり、かつｐ’＋ｑ’は、０〜４（両端を含む）の整数であり；かつｕ’は、２〜１４（両端を含む）の整数である、請求項９９〜１０２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０８】
前記単分子ガイド分子は、式：
【化６１】
2020503049.tif 000230
のものまたはその塩であり、式中、ｐ’およびｑ’は、それぞれ独立に、０〜４（両端を含む）の整数であり、かつｐ’＋ｑ’は、０〜４（両端を含む）の整数であり；かつｕ’は、２〜１４（両端を含む）の整数である、請求項９９〜１０２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０９】
（ａ）前記第１の反応性基は、ブロモアセチル部分を含み、かつ前記第２の反応性基は、スルフヒドリル部分を含むか、または（ｂ）前記第１の反応性基は、スルフヒドリル部分を含み、かつ前記第２の反応性基は、ブロモアセチル部分を含み、および前記コンジュゲートさせるステップは、前記ブロモアセチル部分を前記スルフヒドリル部分と反応させてブロモアセチル−チオール結合を形成することを含む、請求項８６〜８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１０】
前記第１および第２のオリゴヌクレオチドのそれぞれの濃度は、１０μＭ〜１ｍＭの範囲である、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
前記コンジュゲートさせるステップは、７〜９の範囲のｐＨで行われる、請求項１０９または１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
前記コンジュゲートさせるステップは、アルゴン下で行われる、請求項１０９〜１１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１３】
前記コンジュゲートさせるステップは、キレート化試薬、任意選択によりエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、またはその塩の存在下で行われる、請求項１０９〜１１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１４】
前記コンジュゲートさせるステップは、０℃〜４０℃の範囲の温度で行われる、請求項１０９〜１１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１５】
（ａ）前記第１のオリゴヌクレオチドは、式：
【化６２】
2020503049.tif 000231
のものまたはその塩であり、かつ前記第２のオリゴヌクレオチドは、式：
【化６３】
2020503049.tif 000232
のものまたはその塩であるか；または
（ｂ）前記第１のオリゴヌクレオチドは、式：
【化６４】
2020503049.tif 000233
のものまたはその塩であり、かつ前記第２のオリゴヌクレオチドは、式：
【化６５】
2020503049.tif 000234
のものまたはその塩であり；
式中：
（Ｎ）ｃおよび（Ｎ）ｔ中のＮは、それぞれ独立に、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホノアセテート結合、チオホスホノアセテート結合、またはホスホロアミデート結合を介してその隣接ヌクレオチドにそれぞれ独立に結合したヌクレオチド残基、任意選択により修飾ヌクレオチド残基であり；
（Ｎ）ｃは、（Ｎ）ｔの５’領域に相補的または部分的に相補的であり、かつ前記（Ｎ）ｔの５’領域と二重鎖を形成する３’領域を含み；
ｃは、２０以上の整数であり；
ｔは、２０以上の整数であり；
Ｒ２’およびＲ３’は、それぞれ独立に、Ｈ、ＯＨ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ＮＨ２、ＳＨ、Ｓ−Ｒ’、またはＯ−Ｒ’であり、ここで、Ｒ’は、それぞれ独立に、保護基またはアルキル基であり、ここで、前記アルキル基は、任意選択により置換されてもよく；
ＬおよびＲは、それぞれ独立に、非ヌクレオチドリンカーであり；かつ
Ｂ１およびＢ２は、それぞれ独立に、核酸塩基であり；かつ
【化６６】
2020503049.tif 000235
は、それぞれ独立に、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホノアセテート結合、チオホスホノアセテート結合、またはホスホロアミデート結合を表す、請求項１０９〜１１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１６】
前記単分子ガイド分子は、式：
【化６７】
2020503049.tif 000236
のものまたはその塩である、請求項１０９〜１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１７】
前記単分子ガイド分子は、式：
【化６８】
2020503049.tif 000237
のものまたはその塩であり、
式中：
Ｌ１およびＲ１は、それぞれ独立に、非ヌクレオチドリンカーであり；
Ｒ２は、それぞれ独立に、ＯまたはＳであり；
Ｒ３は、それぞれ独立に、Ｏ−またはＣＯＯ−であり；
ｐおよびｑは、それぞれ独立に、０〜６（両端を含む）の整数であり、かつｐ＋ｑは、０〜６（両端を含む）の整数であり；
ｕは、２〜２２（両端を含む）の整数であり；
ｓは、１〜１０（両端を含む）の整数であり；
ｘは、１〜３（両端を含む）の整数であり；
ｙは、＞ｘであり、かつ３〜５（両端を含む）の整数であり；
ｍは、１５以上の整数であり；
ｎは、３０以上の整数であり；
Ｎは、それぞれ独立に、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホノアセテート結合、チオホスホノアセテート結合、またはホスホロアミデート結合を介してその隣接ヌクレオチドにそれぞれ独立に結合したヌクレオチド残基、任意選択により修飾ヌクレオチド残基であり；かつ
Ｎ−−−−Ｎは、それぞれ独立に、２つの相補的なヌクレオチド、任意選択により水素結合で塩基対合した２つの相補的なヌクレオチドを表す、請求項１０９〜１１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１８】
前記単分子ガイド分子は、式：
【化６９】
2020503049.tif 000238
のものまたはその塩であり、
式中、ｐ’およびｑ’は、それぞれ独立に、０〜４（両端を含む）の整数であり、かつｐ’＋ｑ’は、０〜４（両端を含む）の整数であり；かつｕ’は、２〜１４（両端を含む）の整数である、請求項１０９〜１１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１９】
前記単分子ガイド分子は、式：
【化７０】
2020503049.tif 000239
のものまたはその塩であり、
式中、ｐ’およびｑ’は、それぞれ独立に、０〜４（両端を含む）の整数であり、かつｐ’＋ｑ’は、０〜４（両端を含む）の整数であり；かつｕ’は、２〜２２（両端を含む）の整数である、請求項１０９〜１１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２０】
ｐ’＝ｑ’であり、任意選択によりｐ’＝ｑ’＝０、ｐ’＝ｑ’＝１、またはｐ’＝ｑ’＝２である、請求項１１８または１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
Ｌ１およびＲ１は、それぞれ独立に、−（ＣＨ２）Ｗ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｗ−ＮＨ−または−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｖ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｗ−であり：ｗは、それぞれ独立に、１〜２０であり；かつｖは、それぞれ独立に、１〜１０である、請求項１１７〜１２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２２】
前記単分子ガイド分子は、式：
【化７１】
2020503049.tif 000240
のものまたはその塩であり、式中、ｐ’およびｑ’は、それぞれ独立に、０〜４（両端を含む）の整数であり、かつｐ’＋ｑ’は、０〜４（両端を含む）の整数であり；かつｕ’は、２〜１４（両端を含む）の整数である、請求項１１５〜１２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２３】
（ａ）前記第１の反応性基は、２’または３’ヒドロキシル部分を含み、かつ前記第２の反応性基は、５’リン酸部分を含むか、または（ｂ）前記第１の反応性基は、５’リン酸部分を含み、かつ前記第２の反応性基は、２’または３’ヒドロキシル部分を含み、および前記コンジュゲーションさせるステップは、活性化剤の存在下で前記ヒドロキシル部分およびリン酸部分を反応させてホスホジエステル結合を形成することを含む、請求項８６〜８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２４】
前記活性化剤は、カルボジイミドまたはその塩である、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２５】
前記カルボジイミドは、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ、Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、もしくはＮ’，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、またはそれらの塩である、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２６】
前記コンジュゲートさせるステップは、活性化剤および安定化剤の存在下で前記ヒドロキシル部分およびリン酸部分を反応させることを含む、請求項１２３〜１２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２７】
前記安定化剤は、イミダゾール、シアノイミダゾール、ピリジン、もしくはジメチルアミノピリジン、またはそれらの塩である、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
前記第１および第２のオリゴヌクレオチドのそれぞれの濃度は、１０μＭ〜１ｍＭの範囲である、請求項１２３〜１２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２９】
前記活性化剤の濃度は、１ｍＭ〜１００ｍＭの範囲である、請求項１２３〜１２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３０】
前記活性化剤の濃度は、前記第１および第２のオリゴヌクレオチドのそれぞれの濃度よりも１００〜１，０００倍高い、請求項１２３〜１２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３１】
前記コンジュゲートさせるステップは、５〜９の範囲のｐＨで行われる、請求項１２３〜１３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３２】
前記コンジュゲートさせるステップは、二価金属カチオンの存在下で行われる、請求項１２３〜１３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３３】
前記コンジュゲートさせるステップは、０℃〜４０℃の範囲の温度で行われる、請求項１２３〜１３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３４】
前記第１のオリゴヌクレオチドは、式：
【化７２】
2020503049.tif 000241
のものまたはその塩であり；かつ前記第２のオリゴヌクレオチドは、式：
【化７３】
2020503049.tif 000242
のものまたはその塩であり；
式中：
（Ｎ）ｃおよび（Ｎ）ｔ中のＮは、それぞれ独立に、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホノアセテート結合、チオホスホノアセテート結合、またはホスホロアミデート結合を介してその隣接ヌクレオチドにそれぞれ独立に結合したヌクレオチド残基、任意選択により修飾ヌクレオチド残基であり；
（Ｎ）ｃは、（Ｎ）ｔの５’領域に相補的または部分的に相補的であり、かつ前記（Ｎ）ｔの５’領域と二重鎖を形成する３’領域を含み；
Ｂ１およびＢ２は、それぞれ独立に、核酸塩基であり；
ｃは、２０以上の整数であり；
ｔは、２０以上の整数であり；
Ｒ３’は、独立に、Ｈ、ＯＨ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ＮＨ２、ＳＨ、Ｓ−Ｒ’、またはＯ−Ｒ’であり、ここで、Ｒ’は、それぞれ独立に、保護基またはアルキル基であり、ここで、前記アルキル基は、任意選択により置換されてもよく；かつ
【化７４】
2020503049.tif 000243
は、それぞれ独立に、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホノアセテート結合、チオホスホノアセテート結合、またはホスホロアミデート結合を表す、請求項１２３〜１３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３５】
前記単分子ガイド分子は、式：
【化７５】
2020503049.tif 000244
のものまたはその薬学的に許容される塩である、請求項１２３〜１３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３６】
前記単分子ガイド分子は、式：
【化７６】
2020503049.tif 000245
のものまたはその薬学的に許容される塩であり、
式中：
Ｚは、４〜６ヌクレオチド長、任意選択により４または６ヌクレオチド長のヌクレオチドループを表し；
ｕは、２〜２２（両端を含む）の整数であり；
ｓは、１〜１０（両端を含む）の整数であり；
ｘは、１〜３（両端を含む）の整数であり；
ｙは、＞ｘであり、かつ３〜５（両端を含む）の整数であり；
ｍは、１５以上の整数であり；
ｎは、３０以上の整数であり；
Ｎは、それぞれ独立に、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホノアセテート結合、チオホスホノアセテート結合、またはホスホロアミデート結合を介してその隣接ヌクレオチドにそれぞれ独立に結合したヌクレオチド残基、任意選択により修飾ヌクレオチド残基であり；
Ｎ−−−−Ｎは、それぞれ独立に、任意選択により二重鎖領域に少なくとも１つの２’−５’ホスホジエステル結合を含む、２つの相補的なヌクレオチド、任意選択により水素結合で塩基対合した２つの相補的なヌクレオチドを表す、請求項１２３〜１３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３７】
請求項８６〜１３６のいずれか一項に記載の方法によって作製された複数のガイド分子を含む組成物であって、前記ガイド分子の約１０％未満は、参照ガイド分子配列に対して５’末端に切断を含む、組成物。
【請求項１３８】
前記ガイド分子の少なくとも約９９％は、前記参照ガイド分子配列の対応する５’配列と１００％同一である前記ガイド分子のヌクレオチド１〜２０を含む５’配列を含む、請求項１３７に記載の組成物。
【請求項１３９】
式：
【化７７】
2020503049.tif 000246
の、ＣＲＩＳＰＲシステムのための合成単分子ガイド分子またはその薬学的に許容される塩を含む組成物であって、前記合成単分子ガイド分子は、ホスホジエステル結合を形成するために、活性化剤の存在下において、
【化７８】
2020503049.tif 000247
またはそれらの塩間の反応を含むプロセスによって調製され、
式中：
（Ｎ）ｃおよび（Ｎ）ｔ中のＮは、それぞれ独立に、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホノアセテート結合、チオホスホノアセテート結合、またはホスホロアミデート結合を介してその隣接ヌクレオチドにそれぞれ独立に結合したヌクレオチド残基、任意選択により修飾ヌクレオチド残基であり；
（Ｎ）ｃは、（Ｎ）ｔの５’領域に相補的または部分的に相補的であり、かつ前記（Ｎ）ｔの５’領域と二重鎖を形成する３’領域を含み；
ｃは、２０以上の整数であり；
ｔは、２０以上の整数であり；
Ｂ１およびＢ２は、それぞれ独立に、核酸塩基であり；かつ
【化７９】
2020503049.tif 000248
は、それぞれ独立に、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホノアセテート結合、チオホスホノアセテート結合、またはホスホロアミデート結合を表す、組成物。
【請求項１４０】
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのための単分子ガイド分子を合成するためのオリゴヌクレオチドであって、式：
【化８０】
2020503049.tif 000249
のものまたはその塩であり、式中：
Ｒ２’およびＲ３’は、それぞれ独立に、Ｈ、ＯＨ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ＮＨ２、ＳＨ、Ｓ−Ｒ’、またはＯ−Ｒ’であり、ここで、Ｒ’は、それぞれ独立に、保護基またはアルキル基であり、ここで、前記アルキル基は、任意選択により置換されてもよく；
（Ｎ）ｃおよび（Ｎ）ｔ中のＮは、それぞれ独立に、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホノアセテート結合、チオホスホノアセテート結合、またはホスホロアミデート結合を介してその隣接ヌクレオチドにそれぞれ独立に結合したヌクレオチド残基、任意選択により修飾ヌクレオチド残基であり；
（Ｎ）ｃは、標的配列内の標的ドメインに完全にまたは部分的に相補的な標的ドメインを含む５’領域、およびＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムからの反復の少なくとも一部を含む３’領域を含み；
（Ｎ）ｔは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムからの抗反復の少なくとも一部を含む５’領域を含み；
ｃは、２０以上の整数であり；
ｔは、２０以上の整数であり；
ＬおよびＲは、それぞれ独立に、非ヌクレオチドリンカーであり；
Ｂ１およびＢ２は、それぞれ独立に、核酸塩基であり；かつ
【化８１】
2020503049.tif 000250
は、それぞれ独立に、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホノアセテート結合、チオホスホノアセテート結合、またはホスホロアミデート結合を表す、オリゴヌクレオチド。
【請求項１４１】
（Ｎ）ｃは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムからの反復の少なくとも一部を含む３’領域を含む、請求項１４０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４２】
（Ｎ）ｔは、１つまたは複数のステムループ構造を含む３’領域を含む、請求項１４０または１４１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４３】
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのための単分子ガイド分子を合成するためのオリゴヌクレオチド中間体であって、式：
【化８２】
2020503049.tif 000251
のものまたはその塩であり、式中：
Ｒ２’およびＲ３’は、それぞれ独立に、Ｈ、ＯＨ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ＮＨ２、ＳＨ、Ｓ−Ｒ’、またはＯ−Ｒ’であり、ここで、Ｒ’は、それぞれ独立に、保護基またはアルキル基であり、ここで、前記アルキル基は、任意選択により置換されてもよく；
（Ｎ）ｃおよび（Ｎ）ｔ中のＮは、それぞれ独立に、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホノアセテート結合、チオホスホノアセテート結合、またはホスホロアミデート結合を介してその隣接ヌクレオチドにそれぞれ独立に結合したヌクレオチド残基、任意選択により修飾ヌクレオチド残基であり；
（Ｎ）ｃは、標的配列内の標的ドメインに完全にまたは部分的に相補的な標的ドメインを含む５’領域、およびＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムからの反復の少なくとも一部を含む３’領域を含み；
（Ｎ）ｔは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムからの抗反復の少なくとも一部を含む５’領域を含み；
ｃは、２０以上の整数であり；
ｔは、２０以上の整数であり；
ＬおよびＲは、それぞれ独立に、非ヌクレオチドリンカーであり；
Ｂ１およびＢ２は、それぞれ独立に、核酸塩基であり；かつ
【化８３】
2020503049.tif 000252
は、それぞれ独立に、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホノアセテート結合、チオホスホノアセテート結合、またはホスホロアミデート結合を表す、オリゴヌクレオチド中間体。
【請求項１４４】
（Ｎ）ｔは、１つまたは複数のステムループ構造を含む３’領域を含む、請求項１４３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４５】
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのための単分子ガイド分子を合成するためのオリゴヌクレオチド中間体であって、式：
【化８４】
2020503049.tif 000253
のものまたはその薬学的に許容される塩であり、式中：
Ｒ２’およびＲ３’は、それぞれ独立に、Ｈ、ＯＨ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ＮＨ２、ＳＨ、Ｓ−Ｒ’、またはＯ−Ｒ’であり、ここで、Ｒ’は、それぞれ独立に、保護基またはアルキル基であり、ここで、前記アルキル基は、任意選択により置換されてもよく；
（Ｎ）ｃおよび（Ｎ）ｔ中のＮは、それぞれ独立に、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホノアセテート結合、チオホスホノアセテート結合、またはホスホロアミデート結合を介してその隣接ヌクレオチドにそれぞれ独立に結合したヌクレオチド残基、任意選択により修飾ヌクレオチド残基であり；
（Ｎ）ｃは、標的配列内の標的ドメインに完全にまたは部分的に相補的な標的ドメインを含む５’領域、およびＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムからの反復の少なくとも一部を含む３’領域を含み；
（Ｎ）ｔは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムからの抗反復の少なくとも一部を含む５’領域を含み；
ｃは、２０以上の整数であり；
ｔは、２０以上の整数であり；
ＬおよびＲは、それぞれ独立に、非ヌクレオチドリンカーであり；
Ｂ１およびＢ２は、それぞれ独立に、核酸塩基であり；かつ
【化８５】
2020503049.tif 000254
は、それぞれ独立に、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホノアセテート結合、チオホスホノアセテート結合、またはホスホロアミデート結合を表す、オリゴヌクレオチド中間体。
【請求項１４６】
（Ｎ）ｔは、１つまたは複数のステムループ構造を含む３’領域を含む、請求項１４５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４７】
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのための単分子ガイド分子を合成するための、アニールされた二重鎖を有する中間体を含む組成物であって、前記中間体は、式：
【化８６】
2020503049.tif 000255
のものまたはその塩であり、式中：
Ｌ１およびＲ１は、それぞれ独立に、非ヌクレオチドリンカーであり；
Ｒ２は、それぞれ独立に、ＯまたはＳであり；
Ｒ３は、それぞれ独立に、Ｏ−またはＣＯＯ−であり；
ｐおよびｑは、それぞれ独立に、０〜６（両端を含む）の整数であり、かつｐ＋ｑは、０〜６（両端を含む）の整数であり；
ｕは、２〜２２（両端を含む）の整数であり；
ｓは、１〜１０（両端を含む）の整数であり；
ｘは、１〜３（両端を含む）の整数であり；
ｙは、＞ｘであり、かつ３〜５（両端を含む）の整数であり；
ｍは、１５以上の整数であり；
ｎは、３０以上の整数であり；
Ｎは、それぞれ独立に、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホノアセテート結合、チオホスホノアセテート結合、またはホスホロアミデート結合を介してその隣接ヌクレオチドにそれぞれ独立に結合したヌクレオチド残基、任意選択により修飾ヌクレオチド残基であり；かつ
Ｎ−−−−Ｎは、それぞれ独立に、２つの相補的なヌクレオチド、任意選択により水素結合で塩基対合した２つの相補的なヌクレオチドを表す、組成物。
【請求項１４８】
ｐおよびｑは、それぞれ０である、請求項１４７に記載の組成物。
【請求項１４９】
ｕは、３〜２２の整数である、請求項１４７に記載の組成物。
【請求項１５０】
前記中間体は、式：
【化８７】
2020503049.tif 000256
のものまたはその塩である、請求項１４７〜１４９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５１】
前記中間体は、式：
【化８８】
2020503049.tif 000257
のものまたはその塩である、請求項１４７〜１４９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５２】
ｐ’およびｑ’は、それぞれ０である、請求項１５０または１５１に記載の組成物。
【請求項１５３】
ｕ’は、３〜２２の整数である、請求項１５０または１５１に記載の組成物。
【請求項１５４】
（Ｎ）ｍは、標的配列内の標的ドメインに完全にまたは部分的に相補的な標的ドメインを含む５’領域を含む、請求項１４７〜１５３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５５】
（Ｎ）ｎは、１つまたは複数のステムループ構造を含む３’領域を含む、請求項１４７〜１５４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５６】
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのための単分子ガイド分子を合成するためのオリゴヌクレオチドであって、式：
【化８９】
2020503049.tif 000258
のものまたはその塩であり、式中：
Ｒ２’およびＲ３’は、それぞれ独立に、Ｈ、ＯＨ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ＮＨ２、ＳＨ、Ｓ−Ｒ’、またはＯ−Ｒ’であり、ここで、Ｒ’は、それぞれ独立に、保護基またはアルキル基であり、ここで、前記アルキル基は、任意選択により置換されてもよく；
ＬおよびＲは、それぞれ独立に、非ヌクレオチドリンカーであり；
Ｂ１およびＢ２は、それぞれ独立に、核酸塩基であり；
（Ｎ）ｃおよび（Ｎ）ｔ中のＮは、それぞれ独立に、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホノアセテート結合、チオホスホノアセテート結合、またはホスホロアミデート結合を介してその隣接ヌクレオチドにそれぞれ独立に結合したヌクレオチド残基、任意選択により修飾ヌクレオチド残基であり；
（Ｎ）ｃは、（Ｎ）ｔの５’領域に完全にまたは部分的に相補的であり、かつ前記（Ｎ）ｔの５’領域と二重鎖を形成する３’領域を含み；
ｃは、２０以上の整数であり；
ｔは、２０以上の整数であり；かつ
【化９０】
2020503049.tif 000259
は、それぞれ独立に、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホノアセテート結合、チオホスホノアセテート結合、またはホスホロアミデート結合を表す、オリゴヌクレオチド。
【請求項１５７】
（Ｎ）ｃは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムからの反復の少なくとも一部を含む３’領域を含む、請求項１５６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５８】
（Ｎ）ｔは、１つまたは複数のステムループ構造を含む３’領域を含む、請求項１５６または１５７に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５９】
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのための単分子ガイド分子を合成するためのオリゴヌクレオチド中間体であって、式：
【化９１】
2020503049.tif 000260
のものまたはその塩であり、
式中：
Ｒ６およびＲ７は、それぞれ独立に、置換もしくは非置換アルキル、または置換もしくは非置換カルボシクリルであり；
（Ｎ）ｔは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムからの抗反復の少なくとも一部を含む５’領域を含み、ここで、（Ｎ）ｔ中のＮは、それぞれ独立に、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホノアセテート結合、チオホスホノアセテート結合、またはホスホロアミデート結合を介してその隣接ヌクレオチドにそれぞれ独立に結合したヌクレオチド残基、任意選択により修飾ヌクレオチド残基であり；
ｔは、２０以上の整数であり；
Ｂ２は、核酸塩基であり；かつ
【化９２】
2020503049.tif 000261
は、それぞれ独立に、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホノアセテート結合、チオホスホノアセテート結合、またはホスホロアミデート結合を表す、オリゴヌクレオチド中間体。
【請求項１６０】
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのための単分子ガイド分子を合成するための、アニールされた二重鎖を有する中間体を含む組成物であって、前記中間体は、式：
【化９３】
2020503049.tif 000262
のものまたはその塩であり、
式中：
Ｚは、４〜６ヌクレオチド長、任意選択により４または６ヌクレオチド長のヌクレオチドループを表し；
ｐおよびｑは、それぞれ独立に、０〜６（両端を含む）の整数であり、かつｐ＋ｑは、０〜６（両端を含む）の整数であり；
ｕは、２〜２２（両端を含む）の整数であり；
ｓは、１〜１０（両端を含む）の整数であり；
ｘは、１〜３（両端を含む）の整数であり；
ｙは、＞ｘであり、かつ３〜５（両端を含む）の整数であり；
ｍは、１５以上の整数であり；
ｎは、３０以上の整数であり；
Ｎは、それぞれ独立に、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホノアセテート結合、チオホスホノアセテート結合、またはホスホロアミデート結合を介してその隣接ヌクレオチドにそれぞれ独立に結合したヌクレオチド残基、任意選択により修飾ヌクレオチド残基であり；かつ
Ｎ−−−−Ｎは、それぞれ独立に、２つの相補的なヌクレオチド、任意選択により水素結合で塩基対合した２つの相補的なヌクレオチドを表す、組成物。
【請求項１６１】
（Ｎ）ｍは、標的配列内の標的ドメインに完全にまたは部分的に相補的な標的ドメインを含む５’領域を含む、請求項１６０に記載の組成物。
【請求項１６２】
（Ｎ）ｎは、１つまたは複数のステムループ構造を含む３’領域を含む、請求項１６０または１６１に記載の組成物。
【請求項１６３】
カルボジイミドもしくはその塩、ならびに／またはイミダゾール、シアノイミダゾール、ピリジン、およびジメチルアミノピリジン、あるいはそれらの塩をさらに含む、請求項１６０〜１６２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６４】
前記カルボジイミドは、ＥＤＣ、ＤＣＣ、またはＤＩＣである、請求項１６３に記載の組成物。
【請求項１６５】
カルボジイミドまたはその塩、およびイミダゾールまたはその塩を含む、請求項１６０〜１６４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６６】
式：
【化９４】
2020503049.tif 000263
の化合物であって、
式中：
（Ｎ）ｃおよび（Ｎ）ｔ中のＮは、それぞれ独立に、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホノアセテート結合、チオホスホノアセテート結合、またはホスホロアミデート結合を介してその隣接ヌクレオチドにそれぞれ独立に結合したヌクレオチド残基、任意選択により修飾ヌクレオチド残基であり；
（Ｎ）ｃは、（Ｎ）ｔの５’領域に完全にまたは部分的に相補的であり、かつ前記（Ｎ）ｔの５’領域と二重鎖を形成する３’領域を含み；
ｃは、２０以上の整数であり；
ｔは、２０以上の整数であり；かつ
【化９５】
2020503049.tif 000264
は、それぞれ独立に、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホノアセテート結合、チオホスホノアセテート結合、またはホスホロアミデート結合を表し；
ＬおよびＲは、それぞれ独立に、非ヌクレオチドリンカーであり；かつ
Ｂ１およびＢ２は、それぞれ独立に、核酸塩基である、化合物。
【請求項１６７】
式：
【化９６】
2020503049.tif 000265
の、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のガイド分子またはその薬学的に許容される塩を含むか、または本質的にそれからなる組成物であって、式：
【化９７】
2020503049.tif 000266
の分子、および／または、またはその薬学的に許容される塩を実質的に含まず、
式中：
（Ｎ）ｃおよび（Ｎ）ｔ中のＮは、それぞれ独立に、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホノアセテート結合、チオホスホノアセテート結合、またはホスホロアミデート結合を介してその隣接ヌクレオチドにそれぞれ独立に結合したヌクレオチド残基、任意選択により修飾ヌクレオチド残基であり；
（Ｎ）ｃは、（Ｎ）ｔの５’領域に完全にまたは部分的に相補的であり、かつ前記（Ｎ）ｔの５’領域と二重鎖を形成する３’領域を含み；
ｃは、２０以上の整数であり；
ｔは、２０以上の整数であり；かつ
【化９８】
2020503049.tif 000267
は、それぞれ独立に、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホノアセテート結合、チオホスホノアセテート結合、またはホスホロアミデート結合を表し；
ＬおよびＲは、それぞれ独立に、非ヌクレオチドリンカーであり；かつ
Ｂ１およびＢ２は、それぞれ独立に、核酸塩基である、組成物。
【請求項１６８】
式：
【化９９】
2020503049.tif 000268
の、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のガイド分子またはその薬学的に許容される塩を含むか、または本質的にそれからなる組成物であって、式：
【化１００】
2020503049.tif 000269
の分子、および／または、またはその薬学的に許容される塩を実質的に含まず、
式中：
（Ｎ）ｃおよび（Ｎ）ｔ中のＮは、それぞれ独立に、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホノアセテート結合、チオホスホノアセテート結合、またはホスホロアミデート結合を介してその隣接ヌクレオチドにそれぞれ独立に結合したヌクレオチド残基、任意選択により修飾ヌクレオチド残基であり；
（Ｎ）ｃは、（Ｎ）ｔの５’領域に完全にまたは部分的に相補的であり、かつ前記（Ｎ）ｔの５’領域と二重鎖を形成する３’領域を含み；
ｃは、２０以上の整数であり；
ｔは、２０以上の整数であり；かつ
【化１０１】
2020503049.tif 000270
は、それぞれ独立に、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホノアセテート結合、チオホスホノアセテート結合、またはホスホロアミデート結合を表し；
ＬおよびＲは、それぞれ独立に、非ヌクレオチドリンカーであり；かつ
Ｂ１およびＢ２は、それぞれ独立に、核酸塩基である、組成物。
【請求項１６９】
式：
【化１０２】
2020503049.tif 000271
の、ＣＲＩＳＰＲシステムのための合成単分子ガイド分子であって、
式中：
Ｎは、それぞれ独立に、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホノアセテート結合、チオホスホノアセテート結合、またはホスホロアミデート結合を介してその隣接ヌクレオチドにそれぞれ独立に結合したヌクレオチド残基、任意選択により修飾ヌクレオチド残基であり；かつ
Ｎ−−−−Ｎは、それぞれ独立に、２つの相補的なヌクレオチド、任意選択により水素結合で塩基対合した２つの相補的なヌクレオチドを表し、
【化１０３】
2020503049.tif 000272
は、それぞれ独立に、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホノアセテート結合、チオホスホノアセテート結合、またはホスホロアミデート結合を表し；
ｐおよびｑは、それぞれ０であり；
ｕは、２〜２２（両端を含む）の整数であり；
ｓは、１〜１０（両端を含む）の整数であり；
ｘは、１〜３（両端を含む）の整数であり；
ｙは、＞ｘであり、かつ３〜５（両端を含む）の整数であり；
ｍは、１５以上の整数であり；
ｎは、３０以上の整数であり；
リンカーは、非ヌクレオチド化学結合であり；
Ｂ１およびＢ２は、それぞれ独立に、核酸塩基であり；かつ
Ｒ２’およびＲ３’は、それぞれ独立に、Ｈ、ＯＨ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ＮＨ２、ＳＨ、Ｓ−Ｒ’、またはＯ−Ｒ’であり、ここで、Ｒ’は、それぞれ独立に、保護基またはアルキル基であり、ここで、前記アルキル基は、任意選択により置換されてもよい、合成単分子ガイド分子。
【請求項１７０】
Ｒ２’およびＲ３’は、それぞれ独立に、Ｈ、フルオロ、およびＯ−Ｒ’からなる群から選択され、ここで、Ｒ’は、保護基または任意選択により置換されたアルキル基である、請求項１６９に記載のガイド分子。
【請求項１７１】
Ｎは、それぞれ独立に、リボヌクレオチド残基または糖修飾リボヌクレオチド残基である、請求項１６９または１７０に記載のガイド分子。
【請求項１７２】
１つまたは複数のＮは、デオキシリボヌクレオチド残基である、請求項１６９〜１７１のいずれか一項に記載のガイド分子。
【請求項１７３】
１つまたは複数のＮは、２’−Ｏ−メチル修飾リボヌクレオチド残基である、請求項１６９〜１７２のいずれか一項に記載のガイド分子。
【請求項１７４】
（Ｎ）ｍの５’末端における３つのヌクレオチドのそれぞれ、および／または（Ｎ）ｎの３’末端における３つのヌクレオチドのそれぞれは、ホスホロチオエート結合を介してその隣接ヌクレオチドに結合した２’−Ｏ−メチル修飾リボヌクレオチド残基を含む、請求項１６９〜１７３のいずれか一項に記載のガイド分子。
【請求項１７５】
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのためのものであり、かつ（Ｎ）ｍは、標的配列内の標的ドメインに完全にまたは部分的に相補的な標的ドメインを含む５’領域を含む、請求項１６９〜１７４のいずれか一項に記載のガイド分子。
【請求項１７６】
（Ｎ）ｎは、１つまたは複数のステムループ構造を含む３’領域を含む、請求項１６９〜１７５のいずれか一項に記載のガイド分子。
【請求項１７７】
Ｃａｓ９分子と相互作用し、かつＣａｓ９／ガイドリボ核タンパク質複合体の形成を媒介することができる、請求項１６９〜１７６のいずれか一項に記載のガイド分子。
【請求項１７８】
（Ｎ）ｍは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムからの反復の少なくとも一部を含む３’領域を含む、請求項１６９〜１７７のいずれか一項に記載のガイド分子。
【請求項１７９】
（Ｎ‐‐‐Ｎ）ｕおよび（Ｎ‐‐‐Ｎ）ｓは、３つ以上のヌクレオチドの同一配列を含まない、請求項１６９〜１７８のいずれか一項に記載のガイド分子。
【請求項１８０】
（Ｎ‐‐‐Ｎ）ｕおよび（Ｎ‐‐‐Ｎ）ｓは、４つ以上のヌクレオチドの同一配列を含まない、請求項１７９に記載のガイド分子。
【請求項１８１】
（Ｎ‐‐‐Ｎ）ｓは、Ｎ’ＵＵＵ、ＵＮ’ＵＵ、ＵＵＮ’Ｕ、またはＵＵＵＮ’配列を含み、かつ（Ｎ‐‐‐Ｎ）ｕは、ＵＵＵＵ配列を含み、ここで、Ｎ’は、Ａ、Ｇ、またはＣである、請求項１８０に記載のガイド分子。
【請求項１８２】
Ｎ’は、Ａである、請求項１８１に記載のガイド分子。
【請求項１８３】
（Ｎ‐‐‐Ｎ）ｓの下部ステム配列は、ＵＵＵＵ配列を含み、かつ（Ｎ‐‐‐Ｎ）ｕは、Ｎ’ＵＵＵ、ＵＮ’ＵＵ、ＵＵＮ’Ｕ、またはＵＵＵＮ’配列を含み、ここで、Ｎ’は、Ａ、Ｇ、またはＣである、請求項１８０に記載のガイド分子。
【請求項１８４】
Ｎ’は、Ａである、請求項１８３に記載のガイド分子。
【請求項１８５】
式：
【化１０４】
2020503049.tif 000273
のものであり、
式中：
ｕ’は、２〜２２（両端を含む）の整数であり；かつ
ｐ’およびｑ’は、それぞれ０である、請求項１６９〜１８４のいずれか一項に記載のガイド分子。
【請求項１８６】
式：
【化１０５】
2020503049.tif 000274
のものまたはそのコバリアントであり、式中：
ｐ’およびｑ’は、それぞれ０であり；かつ
ｕ’は、０〜１５（両端を含む）の整数である、請求項１８５に記載のガイド分子。
【請求項１８７】
（Ｎ−−−−Ｎ）ｕ’は、式：
【化１０６】
2020503049.tif 000275
のものまたはそのコバリアントであり；
ここで、Ｂ１は、シトシン残基であり、かつＢ２は、グアニン残基である、請求項１８６に記載のガイド分子。
【請求項１８８】
（Ｎ−−−−Ｎ）ｕ’は、式：
【化１０７】
2020503049.tif 000276
のものまたはそのコバリアントであり；
ここで、Ｂ１は、グアニン残基であり、かつＢ２は、シトシン残基である、請求項１８６に記載のガイド分子。
【請求項１８９】
（Ｎ−−−−Ｎ）ｕ’は、式：
【化１０８】
2020503049.tif 000277
のものまたはそのコバリアントであり；
ここで、Ｂ１は、グアニン残基であり、かつＢ２は、シトシン残基である、請求項１８６に記載のガイド分子。
【請求項１９０】
式：
【化１０９】
2020503049.tif 000278
のものまたはそのコバリアントであり、式中：
ｐ’およびｑ’は、それぞれ０であり；かつ
ｕ’は、０〜１５（両端を含む）の整数である、請求項１８５に記載のガイド分子。
【請求項１９１】
（Ｎ−−−−Ｎ）ｕ’は、式：
【化１１０】
2020503049.tif 000279
のものまたはそのコバリアントであり；
ここで、Ｂ１は、シトシン残基であり、かつＢ２は、グアニン残基である、請求項１９０に記載のガイド分子。
【請求項１９２】
（Ｎ−−−−Ｎ）ｕ’は、式：
【化１１１】
2020503049.tif 000280
のものまたはそのコバリアントであり；
ここで、Ｂ１は、グアニン残基であり、かつＢ２は、シトシン残基である、請求項１９０に記載のガイド分子。
【請求項１９３】
（Ｎ−−−−Ｎ）ｕ’は、式：
【化１１２】
2020503049.tif 000281
のものまたはそのコバリアントであり；
ここで、Ｂ１は、グアニン残基であり、かつＢ２は、シトシン残基である、請求項１９０に記載のガイド分子。
【請求項１９４】
式：
【化１１３】
2020503049.tif 000282
のものであり、
式中：
ｕ’は、２〜２２（両端を含む）の整数であり；かつ
ｐ’およびｑ’は、それぞれ０である、請求項１６９〜１８４のいずれか一項に記載のガイド分子。
【請求項１９５】
式：
【化１１４】
2020503049.tif 000283
のものまたはそのコバリアントであり、
式中：
ｕ’は、０〜１９（両端を含む）の整数であり；かつ
ｐ’およびｑ’は、それぞれ０である、請求項１９４に記載のガイド分子。
【請求項１９６】
（Ｎ−−−−Ｎ）ｕ’は、式：
【化１１５】
2020503049.tif 000284
のものまたはそのコバリアントであり；
ここで、Ｂ１は、アデニン残基であり、かつＢ２は、ウラシル残基である、請求項１９５に記載のガイド分子。
【請求項１９７】
（Ｎ−−−−Ｎ）ｕ’は、式：
【化１１６】
2020503049.tif 000285
のものまたはそのコバリアントであり；
ここで、Ｂ１は、ウラシル残基であり、かつＢ２は、アデニン残基である、請求項１９５に記載のガイド分子。
【請求項１９８】
（Ｎ−−−−Ｎ）ｕ’は、式：
【化１１７】
2020503049.tif 000286
のものまたはそのコバリアントであり；
ここで、Ｂ１は、グアニン残基であり、かつＢ２は、シトシン残基である、請求項１９５に記載のガイド分子。
【請求項１９９】
式：
【化１１８】
2020503049.tif 000287
のものまたはそのコバリアントであり、
式中：
ｕ’は、０〜１９（両端を含む）の整数であり；かつ
ｐ’およびｑ’は、それぞれ０である、請求項１６９〜１８４のいずれか一項に記載のガイド分子。
【請求項２００】
（Ｎ−−−−Ｎ）ｕ’は、式：
【化１１９】
2020503049.tif 000288
のものまたはそのコバリアントであり；
ここで、Ｂ１は、アデニン残基であり、かつＢ２は、ウラシル残基である、請求項１９９に記載のガイド分子。
【請求項２０１】
（Ｎ−−−−Ｎ）ｕ’は、式：
【化１２０】
2020503049.tif 000289
のものまたはそのコバリアントであり；
ここで、Ｂ１は、ウラシル残基であり、かつＢ２は、アデニン残基である、請求項１９９に記載のガイド分子。
【請求項２０２】
（Ｎ−−−−Ｎ）ｕ’は、式：
【化１２１】
2020503049.tif 000290
のものまたはそのコバリアントであり；
ここで、Ｂ１は、グアニン残基であり、かつＢ２は、シトシン残基である、請求項１９９に記載のガイド分子。
【請求項２０３】
式：
【化１２２】
2020503049.tif 000291
のものであり、
式中：
Ｌ１およびＲ１は、それぞれ独立に、非ヌクレオチドリンカーであり；
Ｒ２は、それぞれ独立に、ＯまたはＳであり；
Ｒ３は、それぞれ独立に、Ｏ−またはＣＯＯ−である、請求項１６９〜１８４のいずれか一項に記載のガイド分子。
【請求項２０４】
式：
【化１２３】
2020503049.tif 000292
のものであり、式中：
ｕ’は、２〜２２（両端を含む）の整数であり；かつ
ｐ’およびｑ’は、それぞれ０である、請求項２０３に記載のガイド分子。
【請求項２０５】
式：
【化１２４】
2020503049.tif 000293
のものまたはそのコバリアントであり、式中：
ｐ’およびｑ’は、それぞれ０であり；かつ
ｕ’は、０〜１９（両端を含む）の整数である、請求項２０４に記載のガイド分子。
【請求項２０６】
（Ｎ−−−−Ｎ）ｕ’は、式：
【化１２５】
2020503049.tif 000294
のものまたはそのコバリアントであり；
ここで、Ｂ１は、シトシン残基であり、かつＢ２は、グアニン残基である、請求項２０５に記載のガイド分子。
【請求項２０７】
（Ｎ−−−−Ｎ）ｕ’は、式：
【化１２６】
2020503049.tif 000295
のものまたはそのコバリアントであり；
ここで、Ｂ１は、グアニン残基であり、かつＢ２は、シトシン残基である、請求項２０５に記載のガイド分子。
【請求項２０８】
（Ｎ−−−−Ｎ）ｕ’は、式：
【化１２７】
2020503049.tif 000296
のものまたはそのコバリアントであり；
ここで、Ｂ１は、グアニン残基であり、かつＢ２は、シトシン残基である、請求項２０５に記載のガイド分子。
【請求項２０９】
式：
【化１２８】
2020503049.tif 000297
のものまたはそのコバリアントであり、式中：
ｐ’およびｑ’は、それぞれ０であり；かつ
ｕ’は、０〜１９（両端を含む）の整数である、請求項２０３に記載のガイド分子。
【請求項２１０】
（Ｎ−−−−Ｎ）ｕ’は、式：
【化１２９】
2020503049.tif 000298
のものまたはそのコバリアントであり；
ここで、Ｂ１は、シトシン残基であり、かつＢ２は、グアニン残基である、請求項２０９に記載のガイド分子。
【請求項２１１】
（Ｎ−−−−Ｎ）ｕ’は、式：
【化１３０】
2020503049.tif 000299
のものまたはそのコバリアントであり；
ここで、Ｂ１は、グアニン残基であり、かつＢ２は、シトシン残基である、請求項２０９に記載のガイド分子。
【請求項２１２】
（Ｎ−−−−Ｎ）ｕ’は、式：
【化１３１】
2020503049.tif 000300
のものまたはそのコバリアントであり；
ここで、Ｂ１は、グアニン残基であり、かつＢ２は、シトシン残基である、請求項２０９に記載のガイド分子。
【請求項２１３】
式：
【化１３２】
2020503049.tif 000301
のものであり、式中：
ｕ’は、０〜２２（両端を含む）の整数であり；かつ
ｐ’およびｑ’は、それぞれ０である、請求項２０３に記載のガイド分子。
【請求項２１４】
式：
【化１３３】
2020503049.tif 000302
のものまたはそのコバリアントであり、
式中：
ｕ’は、０〜１９（両端を含む）の整数であり；かつ
ｐ’およびｑ’は、それぞれ０である、請求項２１３に記載のガイド分子。
【請求項２１５】
（Ｎ−−−−Ｎ）ｕ’は、式：
【化１３４】
2020503049.tif 000303
のものまたはそのコバリアントであり；
ここで、Ｂ１は、アデニン残基であり、かつＢ２は、ウラシル残基である、請求項２１４に記載のガイド分子。
【請求項２１６】
（Ｎ−−−−Ｎ）ｕ’は、式：
【化１３５】
2020503049.tif 000304
のものまたはそのコバリアントであり；
ここで、Ｂ１は、ウラシル残基であり、かつＢ２は、アデニン残基である、請求項２１４に記載のガイド分子。
【請求項２１７】
（Ｎ−−−−Ｎ）ｕ’は、式：
【化１３６】
2020503049.tif 000305
のものまたはそのコバリアントであり；
ここで、Ｂ１は、グアニン残基であり、かつＢ２は、シトシン残基である、請求項２１４に記載のガイド分子。
【請求項２１８】
式：
【化１３７】
2020503049.tif 000306
のものまたはそのコバリアントであり、
式中：
ｕ’は、０〜１９（両端を含む）の整数であり；かつ
ｐ’およびｑ’は、それぞれ０である、請求項２０３に記載のガイド分子。
【請求項２１９】
（Ｎ−−−−Ｎ）ｕ’は、式：
【化１３８】
2020503049.tif 000307
のものまたはそのコバリアントであり；
ここで、Ｂ１は、アデニン残基であり、かつＢ２は、ウラシル残基である、請求項２１８に記載のガイド分子。
【請求項２２０】
（Ｎ−−−−Ｎ）ｕ’は、式：
【化１３９】
2020503049.tif 000308
のものまたはそのコバリアントであり；
ここで、Ｂ１は、ウラシル残基であり、かつＢ２は、アデニン残基である、請求項２１８に記載のガイド分子。
【請求項２２１】
（Ｎ−−−−Ｎ）ｕ’は、式：
【化１４０】
2020503049.tif 000309
のものまたはそのコバリアントであり；
ここで、Ｂ１は、グアニン残基であり、かつＢ２は、シトシン残基である、請求項２１８に記載のガイド分子。
【請求項２２２】
請求項１６９〜２２１のいずれか一項に記載の複数の合成ガイド分子を含む組成物であって、前記ガイド分子の約１０％未満は、参照ガイド分子配列に対して５’末端に切断を含む、組成物。
【請求項２２３】
前記ガイド分子の少なくとも約９９％は、前記参照ガイド分子配列の対応する５’配列と１００％同一である前記ガイド分子のヌクレオチド１〜２０を含む５’配列を含む、請求項２２２に記載の組成物。
【請求項２２４】
５’から３’に：
第１のガイド分子断片であって、
標的ドメイン配列；
第１の下部ステム配列；
第１のバルジ配列；
第１の上部ステム配列
を含む第１のガイド分子断片；
非ヌクレオチド化学結合；ならびに
第２のガイド分子断片であって、
第２の上部ステム配列；
第２のバルジ配列；および
第２の下部ステム配列
を含む第２のガイド分子断片
を含み、
ここで、（ａ）前記第１の下部ステム配列中の少なくとも１つのヌクレオチドは、前記第２の下部ステム配列中のヌクレオチドと塩基対合し、かつ（ｂ）前記第１の上部ステム配列中の少なくとも１つのヌクレオチドは、前記第２の上部ステム配列中のヌクレオチドと塩基対合する、ガイド分子。
【請求項２２５】
（ｃ）前記ガイド分子は、前記第１および第２の上部ステム配列間にテトラループ配列を含まない、請求項２２４に記載のガイド分子。
【請求項２２６】
前記第１および／または第２の上部ステム配列は、４〜２２個（両端を含む）のヌクレオチドを含む、請求項２２４または２２５に記載のガイド分子。
【請求項２２７】
前記第１および第２のガイド分子断片間の二重鎖の形成のためのギブス自由エネルギー（ΔＧ）は、２つの第１のガイド分子断片間の二重鎖の形成のためのΔＧより小さいことを特徴とする、請求項２２４〜２２６のいずれか一項に記載のガイド分子。
【請求項２２８】
（ｉ）前記第１および第２の上部ステム配列間および（ｉｉ）前記第１および第２の下部ステム配列間の５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、または９５％超の塩基対合によって特徴付けられる、前記第１および第２のガイド分子断片間の二重鎖の形成のためのΔＧは、（ｉ）と（ｉｉ）との間の５０％未満、６０％未満、７０％未満、８０％未満、９０％未満、または９５％未満の塩基対合によって特徴付けられる二重鎖の形成のためのΔＧよりも小さい、請求項２２７に記載のガイド分子。
【請求項２２９】
前記非ヌクレオチド化学結合は、前記第１の上部ステム配列の３’末端またはその近傍の第１のヌクレオチドを前記第２の上部ステム配列の５’末端またはその近傍の第２のヌクレオチドと共有結合させる、請求項２２４または２２５に記載のガイド分子。
【請求項２３０】
前記第１および第２のヌクレオチドは、塩基対合している、請求項２２９に記載のガイド分子。
【請求項２３１】
前記第１および第２のヌクレオチドの塩基対合を含む、前記第１および第２のガイド分子断片間の二重鎖の形成のためのギブス自由エネルギー（ΔＧ）は、前記第１および第２のヌクレオチドが塩基対合していない、前記第１および第２のガイド分子断片間の二重鎖の形成のためのΔＧよりも小さい、請求項２２９に記載のガイド分子。
【請求項２３２】
前記非ヌクレオチド化学結合は、尿素を含む、請求項２２４〜２３１のいずれか一項に記載のガイド分子。
【請求項２３３】
請求項２２４〜２３２のいずれか一項に記載のガイド分子を含む組成物。
【請求項２３４】
前記組成物中のガイド分子の９０％超は、完全長ガイド分子であることを特徴とする、請求項２３３に記載の組成物。
【請求項２３５】
前記組成物中のガイド分子の８５％超は、同一の標的ドメイン配列を含むことを特徴とする、請求項２３３または２３４に記載の組成物。
【請求項２３６】
前記標的ドメイン配列は、所定の標的配列である、請求項２３３〜２３５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３７】
Ｃａｓ９タンパク質をさらに含み、前記ガイド分子および前記Ｃａｓ９タンパク質は、（ｘ）前記標的ドメイン配列に相補的な配列、および（ｙ）前記Ｃａｓ９タンパク質によって認識されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を含む標的核酸と相互作用することができる複合体を形成する、請求項２３３〜２３６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３８】
前記複合体は、前記標的核酸中に一本鎖または二本鎖の切断を形成する、請求項２３７に記載の組成物。
【請求項２３９】
前記複合体は、前記標的核酸または前記標的核酸と会合したタンパク質を化学的に修飾する、請求項２３７に記載の組成物。
【請求項２４０】
請求項２２４〜２３２のいずれか一項に記載のガイド分子を含むゲノム編集システム。
【請求項２４１】
治療に使用するための、請求項２２４〜２３２のいずれか一項に記載のガイド分子、請求項２３３〜２３９のいずれか一項に記載の組成物、または請求項２４０に記載のゲノム編集システム。
【請求項２４２】
医薬の製造に使用するための、請求項２２４〜２３２のいずれか一項に記載のガイド分子、請求項２３３〜２３９のいずれか一項に記載の組成物、または請求項２４０に記載のゲノム編集システム。
【請求項２４３】
エクスビボでの対象の細胞の改変に使用するための、請求項２２４〜２３２のいずれか一項に記載のガイド分子、請求項２３３〜２３９のいずれか一項に記載の組成物、または請求項２４０に記載のゲノム編集システム。
【請求項２４４】
インビボでの対象の細胞の改変に使用するための、請求項２２４〜２３２のいずれか一項に記載のガイド分子、請求項２３３〜２３９のいずれか一項に記載の組成物、または請求項２４０に記載のゲノム編集システム。
【請求項２４５】
細胞または対象において核酸を変化させる方法であって、請求項１〜４２、１６９〜２２１、もしくは２２４〜２３２のいずれか一項に記載のガイド分子、または請求項４３〜８５、１３７〜１３９、１４７〜１５５、１６１〜１６５、２２２、２２３、もしくは２３３〜２３９のいずれか一項に記載の組成物を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項２４６】
請求項１〜４２、１６９〜２２１、または２２４〜２３２のいずれか一項に記載の複数の合成分子ガイド分子から本質的になる組成物。
【請求項２４７】
請求項８６〜１３７のいずれか一項に記載の方法によって作製された複数のガイド分子および薬学的に許容される担体から本質的になる組成物。
【請求項２４８】
前記ガイド分子は、ＲＮＡに作用する酵素の基質として作用することができる、請求項８６〜１３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４９】
前記酵素は、逆転写酵素である、請求項２４８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年１２月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／４４１，０４６号明細書、および２０１７年４月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／４９２，００１号明細書の利益を主張するものであり、これらのそれぞれの開示は、それらの全体の参照により本明細書に援用される。
【０００２】
本開示は、標的核酸配列を編集するため、または標的核酸配列の発現を調節するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ関連方法および構成要素に関する。より詳細には、本開示は、合成ガイド分子、ならびに関連するシステム、方法、および組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化され、規則的に間隔があいた短い回文構造の繰り返し）は、ウィルス攻撃に対して防御するための適応免疫系として細菌および古細菌において進化した。ウィルスにさらされると、ウィルスＤＮＡの短いセグメントが、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に組み込まれる。ＲＮＡは、ウィルス配列を含むＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の一部から転写される。ウィルスゲノムに相補的な配列を含むそのＲＮＡは、ウィルスゲノム中の標的配列へのＣａｓ９またはＣｐｆ１などのＲＮＡガイドヌクレアーゼタンパク質の標的化を媒介する。次に、ＲＮＡガイドヌクレアーゼは、ウィルス標的を切断し、それによりウィルス標的をサイレンシングする。
【０００４】
最近、ＣＲＩＳＰＲシステムは真核細胞におけるゲノム編集に適応された。これらのシステムは、一般にタンパク質構成要素（ＲＮＡガイドヌクレアーゼ）および核酸構成要素（一般に、ガイド分子、ガイドＲＮＡ、または「ｇＲＮＡ」と呼ばれる）を含む。これらの２つの構成要素は、システムの２つの構成要素によって認識されるかまたはそれに相補的な特定の標的ＤＮＡ配列と相互作用し、任意選択により、例えば部位特異的ＤＮＡ切断によって標的配列を編集または改変する複合体を形成する。標的配列の編集または改変はまた、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同組換え修復（ＨＤＲ）などの細胞ＤＮＡ修復機構の動員も含み得る。
【０００５】
遺伝性疾患を処置する手段としてのＣＲＩＳＰＲシステムの価値は広く認識されているが、広い臨床応用を達成するためにこれらのシステムに基づく治療法についてある種の技術的課題に取り組まなければならない。とりわけ、高品質のＣＲＩＳＰＲシステムの構成要素のコスト効率の良い直接的な商業規模の合成が要望されている。
【０００６】
例えば、ほとんどのガイド分子は現在、２つの方法：インビトロ転写（ＩＶＴ）および化学合成のうちの一方によって合成される。ＩＶＴは、典型的にはＴ７ポリメラーゼなどの細菌ＲＮＡポリメラーゼによるＤＮＡテンプレートからのＲＮＡの転写を含む。現在、米国および海外の規制当局によって要求されている医薬品等の製造管理および品質管理に関する基準（ＧＭＰ）に従ったガイド分子のＩＶＴ製造は、費用がかかり、規模が限られ得る。さらに、ＩＶＴ合成は、すべてのガイドＲＮＡ配列に適しているとは限らない：Ｔ７ポリメラーゼは、５’グアニンで始まる配列を別の５’塩基で始まる配列よりも効率的に転写する傾向にあり、その構造が特定のガイド分子に存在するポリウラシルトラクトが続くステムループ構造を、転写を終結させるためのシグナルとして認識することができ、切断されたガイド分子の転写が起こる。
一方、化学合成は安価であり、より短いオリゴヌクレオチド（例えば、１００ヌクレオチド長未満）のためのＧＭＰ生産が容易に利用可能である。化学合成法は、例えば、本明細書のすべての目的のためにその全体が参照により本明細書に援用されるＢｅａｕｃａｇｅ  ａｎｄ  Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ，Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍ．２００１  Ｍａｙ；Ｃｈａｐｔｅｒ  ３：Ｕｎｉｔ  ３．３（Ｂｅａｕｃａｇｅ＆Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ）による文献を通じて説明されている。これらの方法は、典型的には所望の長さのオリゴヌクレオチド配列に達するまで活性ヌクレオチド単量体を段階的に添加することを含む。最も一般的に使用されている合成法（ホスホラミダイト法など）では、単量体が、オリゴヌクレオチドの５’末端に付加される。これらの単量体は、しばしば（例えばホスホラミダイトで）３’官能化され、例えば、以下の式Ｉ：
【化１】
2020503049.tif 000002
に従った５’保護基（４，４’ジメトキシトリチルなど）を含む。
式Ｉにおいて、ＤＭＴｒは、４，４’−ジメトキシトリチルであり、Ｒは、オリゴヌクレオチド合成条件に適合する基であり、その非限定的な例としては、Ｈ、Ｆ、Ｏ−アルキル、または保護されたヒドロキシル基が挙げられ、Ｂは、任意の適切な核酸塩基である（Ｂｅａｕｃａｇｅ＆Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ）。５’保護単量体の使用は、添加の各回の後に、５’保護基を除去してヒドロキシル基を残す脱保護ステップを必要とする。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｂｅａｕｃａｇｅ  ａｎｄ  Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ，Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍ．２００１  Ｍａｙ；Ｃｈａｐｔｅｒ  ３：Ｕｎｉｔ  ３．３（Ｂｅａｕｃａｇｅ＆Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
いかなる化学を利用しても、５’残基の段階的付加は定量的には起こらない；いくつかのオリゴヌクレオチドは、いくつかの残基の付加に「失敗する」であろう。これにより、所望のオリゴヌクレオチドを含むが、様々な残基を欠くより短いオリゴヌクレオチド（「ｎ−１種」と呼ばれるが、ｎ−２、ｎ−３など、ならびに他の切断種または欠失種を含み得る）で汚染されている合成生成物が得られる。ｎ−１種による汚染を最小限に抑えるために、多くの化学合成スキームは、段階的付加ステップと脱保護ステップとの間に「キャッピング」反応を含む。キャッピング反応において、非反応性部分が、５’保護基によって終端されていないそれらのオリゴヌクレオチドの５’末端に付加される；この非反応性部分は、単量体のオリゴヌクレオチドへのさらなる付加を防止し、約６０または７０塩基長のオリゴヌクレオチドの合成中にｎ−１汚染を許容可能な低レベルに低減するのに有効である。しかしながら、キャッピング反応もまた、定量的ではなく、単分子ガイドＲＮＡなどのより長いオリゴヌクレオチド中のｎ−１汚染を防止するのに効果がない可能性がある。他方、ＤＭＴ保護がカップリング反応中に失われ、より長いオリゴヌクレオチド（「ｎ＋１種」と呼ばれるが、ｎ＋２、ｎ＋３などを含み得る）が得られる場合がある。ｎ−１種および／またはｎ＋１種で汚染された単分子ガイドＲＮＡは、他の手段によって調製された完全長ガイドＲＮＡと同じようには作用しない可能性があり、治療における合成ガイドＲＮＡの使用を複雑にする恐れがある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本開示は、とりわけ、２つ以上のプレアニールされたガイド断片を架橋することを含む単分子ガイド分子を合成するための方法を提供することによって、最小のｎ−１種および／またはｎ＋１種、切断種、および他の汚染物質を有する高純度単分子ガイド分子のコスト効率の良い直接的な化学合成の必要性に対処する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される単分子ガイド分子は、５’末端に改善された配列忠実度を有し、不所望の標的外編集を低減している。また、ｎ−１および／またはｎ＋１汚染を実質的に含まない完全長単分子ガイド分子を含むか、または本質的にそれからなる組成物も本明細書で提供される。
【００１０】
本開示の特定の態様は、本明細書に記載の尿素に基づく架橋法で使用されるアミン官能化断片などのガイド断片がホモ多官能性（例えば、ホモ二官能性）である場合、ガイド断片のプレアニーリングが特に有用であり得るという認識を包含する。実際、ホモ多官能性ガイド断片をヘテロ二量体にプレアニーリングすることにより、不所望のホモ二量体の形成を低減することができる。したがって、本開示はまた、副生成物（例えば、ホモ二量体）を実質的に含まない完全長の単分子ガイド分子を含むか、または本質的にそれからなる組成物も提供する。
【００１１】
一態様では、本開示は、ＣＲＩＳＰＲシステムのための単分子ガイド分子を合成する方法に関し、この方法は：
第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドとをアニールして、第１のオリゴヌクレオチドの３’領域と第２のオリゴヌクレオチドの５’領域との間に二重鎖を形成するステップであって、第１のオリゴヌクレオチドは、２’反応性基および３’反応性基の少なくとも一方である第１の反応性基を含み、第２のオリゴヌクレオチドは、５’反応性基である第２の反応性基を含む、ステップ；および
アニールされた第１および第２のオリゴヌクレオチドを、第１および第２の反応性基を介してコンジュゲートさせて、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドとを結合する共有結合を含む単分子ガイドＲＮＡ分子を形成するステップ
を含む。
【００１２】
一態様では、本開示は、ＣＲＩＳＰＲシステムのための単分子ガイド分子に関する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される単分子ガイド分子は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのためのものである。
【００１３】
いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドの５’領域は、標的配列内の標的ドメイン（例えば、真核生物遺伝子内の標的配列）に完全にまたは部分的に相補的な標的ドメインを含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、第２のオリゴヌクレオチドの３’領域は、１つまたは複数のステムループ構造を含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される単分子ガイド分子は、Ｃａｓ９分子と相互作用し、かつＣａｓ９／ガイド分子複合体の形成を媒介することができる。
【００１６】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される単分子ガイド分子は、Ｃａｓ９またはＲＮＡガイドヌクレアーゼと複合体を形成している。
【００１７】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される単分子ガイド分子は、５’から３’に：
第１のガイド分子断片であって、
標的ドメイン配列；
第１の下部ステム配列；
第１のバルジ配列（ｂｕｌｇｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）；
第１の上部ステム配列
を含む第１のガイド分子断片；
非ヌクレオチド化学結合；ならびに
第２のガイド分子断片であって、
第２の上部ステム配列；
第２のバルジ配列；および
第２の下部ステム配列
を含む第２のガイド分子断片
を含み、
（ａ）第１の下部ステム配列中の少なくとも１つのヌクレオチドは、第２の下部ステム配列中のヌクレオチドと塩基対合し、（ｂ）第１の上部ステム配列中の少なくとも１つのヌクレオチドは、第２の上部ステム配列中のヌクレオチドと塩基対合する。
【００１８】
いくつかの実施形態では、単分子ガイド分子は、第１の上部ステム配列と第２の上部ステム配列との間にテトラループ配列を含まない。いくつかの実施形態では、第１および／または第２の上部ステム配列は、４〜２２個（両端を含む）のヌクレオチドを含む。
【００１９】
いくつかの実施形態では、単分子ガイド分子は、式：
【化２】
2020503049.tif 000003
の単分子ガイド分子であり、
式中、（Ｎ）ｃおよび（Ｎ）ｔ中のＮは、それぞれ独立に、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホノアセテート結合、チオホスホノアセテート結合、またはホスホロアミデート結合を介してその隣接ヌクレオチドにそれぞれ独立に結合したヌクレオチド残基、任意選択により修飾ヌクレオチド残基であり；
（Ｎ）ｃは、（Ｎ）ｔの５’領域に相補的または部分的に相補的であり、かつこの（Ｎ）ｔの５’領域と二重鎖を形成する３’領域を含み；
ｃは、２０以上の整数であり；
ｔは、２０以上の整数であり；
リンカーは、非ヌクレオチド化学結合であり；
Ｂ１およびＢ２は、それぞれ独立に、核酸塩基であり；
Ｒ２’およびＲ３’は、それぞれ独立に、Ｈ、ＯＨ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ＮＨ２、ＳＨ、Ｓ−Ｒ’、またはＯ−Ｒ’であり、
ここで、Ｒ’は、それぞれ独立に、保護基またはアルキル基であり、ここで、このアルキル基は、任意選択により置換されてもよく；
【化３】
2020503049.tif 000004
は、それぞれ独立に、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホノアセテート結合、チオホスホノアセテート結合、またはホスホロアミデート結合を表す。
【００２０】
いくつかの実施形態では、（Ｎ）ｃは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムからの反復の少なくとも一部を含む３’領域を含む。いくつかの実施形態では、（Ｎ）ｃは、標的配列内の標的ドメインに完全にまたは部分的に相補的な標的ドメインを含む３’領域を含む。いくつかの実施形態では、（Ｎ）ｔは、１つまたは複数のステム−ループ構造を含む３’領域を含む。
【００２１】
いくつかの実施形態では、単分子ガイド分子は、式：
【化４】
2020503049.tif 000005
の単分子ガイド分子であり、
式中：
Ｎは、それぞれ独立に、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホノアセテート結合、チオホスホノアセテート結合、またはホスホロアミデート結合を介してその隣接ヌクレオチドにそれぞれ独立に結合したヌクレオチド残基、任意選択により修飾ヌクレオチド残基であり；
Ｎ−−−−Ｎは、それぞれ独立に、２つの相補的なヌクレオチド、任意選択により水素結合で塩基対合した２つの相補的なヌクレオチドを表し；
ｐおよびｑは、それぞれ０であり；
ｕは、２〜２２（両端を含む）の整数であり；
ｓは、１〜１０（両端を含む）の整数であり；
ｘは、１〜３（両端を含む）の整数であり；
ｙは、＞ｘであり、かつ３〜５（両端を含む）の整数であり；
ｍは、１５以上の整数であり；かつ
ｎは、３０以上の整数である。
【００２２】
いくつかの実施形態では、ｕは、２〜２２（両端を含む）の整数であり；
ｓは、１〜８（両端を含む）の整数であり；
ｘは、１〜３（両端を含む）の整数であり；
ｙは、＞ｘであり、かつ３〜５（両端を含む）の整数であり；
ｍは、１５〜５０（両端を含む）の整数であり；かつ
ｎは、３０〜７０（両端を含む）の整数である。
【００２３】
いくつかの実施形態では、ガイド分子はテトラループを含まない（ｐおよびｑは、それぞれ０である）。いくつかの実施形態では、下部ステム配列および上部ステム配列は、４つ以上のヌクレオチドの同一の配列を含まない。いくつかの実施形態では、ｕは、３〜２２（両端を含む）の整数である。
【００２４】
いくつかの実施形態では、第１の反応性基および第２の反応性基は、それぞれアミノ基であり、かつコンジュゲートさせるステップは、第１および第２の反応性基のアミン部分をカーボネート含有二官能性架橋剤で架橋して尿素結合を形成することを含む。いくつかの実施形態では、第１の反応性基および第２の反応性基は、ブロモアセチル基およびスルフヒドリル基である。いくつかの実施形態では、第１の反応性基および第２の反応性基は、リン酸基およびヒドロキシル基である。
【００２５】
いくつかの実施形態では、単分子ガイド分子は、式：
【化５】
2020503049.tif 000006
の化学結合またはその薬学的に許容される塩を含み、式中、ＬおよびＲは、それぞれ独立に、非ヌクレオチド化学リンカーである。
【００２６】
いくつかの実施形態では、単分子ガイド分子は、式：
【化６】
2020503049.tif 000007
の化学結合またはその薬学的に許容される塩を含み、式中、ＬおよびＲは、それぞれ独立に、非ヌクレオチド化学リンカーである。
【００２７】
いくつかの実施形態では、単分子ガイド分子は、式：
【化７】
2020503049.tif 000008
のものまたはその薬学的に許容される塩であり、
ホスホジエステル結合を形成するために活性化剤の存在下での、
【化８】
2020503049.tif 000009
またはそれらの塩間の反応を含むプロセスによって調製される。
【００２８】
一態様では、本開示は、式：
【化９】
2020503049.tif 000010
の単分子ガイド分子またはその薬学的に許容される塩を含むか、または本質的にそれからなる、ＣＲＩＳＰＲシステムのためのガイド分子の組成物に関する。いくつかの実施形態では、ガイド分子の約１０％未満は、参照ガイド分子配列に対して５’末端に切断を含む。いくつかの実施形態では、ガイド分子の少なくとも約９９％は、参照ガイド分子配列の対応する５’配列と１００％同一であるガイド分子のヌクレオチド１〜２０を含む５’配列を含む。
【００２９】
いくつかの実施形態では、ガイド分子の組成物は、式：
【化１０】
2020503049.tif 000011
のガイド分子またはその薬学的に許容される塩を含むか、または本質的にそれからなり、
ここで、この組成物は、式：
【化１１】
2020503049.tif 000012
の分子またはその薬学的に許容される塩を実質的に含まない。
【００３０】
いくつかの実施形態では、この組成物は、式：
【化１２】
2020503049.tif 000013
のガイド分子またはその薬学的に許容される塩を含むか、または本質的にそれからなり、
ここで、この組成物は、式：
【化１３】
2020503049.tif 000014
の分子またはその薬学的に許容される塩を実質的に含まない。
【００３１】
いくつかの実施形態では、この組成物は、式：
【化１４】
2020503049.tif 000015
のガイド分子またはその薬学的に許容される塩を含むか、または本質的にそれからなり、
ここで、この組成物は、式：
【化１５】
2020503049.tif 000016
の分子またはその薬学的に許容される塩を実質的に含まず、
式中：
ａは、ｃと等しくなく；かつ／または
ｂは、ｔと等しくない。
【００３２】
いくつかの実施形態では、この組成物は、式：
【化１６】
2020503049.tif 000017
のガイド分子またはその薬学的に許容される塩を含むか、または本質的にそれからなり、
ここで、この組成物は、式：
【化１７】
2020503049.tif 000018
の分子またはその薬学的に許容される塩を実質的に含まず、
式中：
ａは、ｃと等しくなく；かつ／または
ｂは、ｔと等しくない。
【００３３】
いくつかの実施形態では、この組成物は、式：
【化１８】
2020503049.tif 000019
のガイド分子またはその薬学的に許容される塩を含むか、または本質的にそれからなり、
ここで、この組成物は、式：
【化１９】
2020503049.tif 000020
の分子を実質的に含まない。
【００３４】
いくつかの実施形態では、この組成物は、式：
【化２０】
2020503049.tif 000021
のガイド分子またはその薬学的に許容される塩を含むか、または本質的にそれからなり、
ここで、この組成物は、式：
【化２１】
2020503049.tif 000022
の分子を実質的に含まない。
【００３５】
いくつかの実施形態では、この組成物は、式：
【化２２】
2020503049.tif 000023
のガイド分子またはその薬学的に許容される塩を含むか、または本質的にそれからなり、
ここで、この組成物は、式：
【化２３】
2020503049.tif 000024
の分子またはその薬学的に許容される塩を実質的に含まず、
式中：
ａは、ｃと等しくなく；かつ／または
ｂは、ｔと等しくない。
【００３６】
いくつかの実施形態では、この組成物は、式：
【化２４】
2020503049.tif 000025
のガイド分子またはその薬学的に許容される塩を含むか、または本質的にそれからなり、
ここで、この組成物は、式：
【化２５】
2020503049.tif 000026
の分子またはその薬学的に許容される塩を実質的に含まず、
式中：
ａは、ｃと等しくなく；かつ／または
ｂは、ｔと等しくない。
【００３７】
いくつかの実施形態では、この組成物は、式：
【化２６】
2020503049.tif 000027
のガイド分子またはその薬学的に許容される塩を含むか、または本質的にそれからなり、
ここで、この組成物は、式：
【化２７】
2020503049.tif 000028
の分子またはその薬学的に許容される塩を実質的に含まず、
式中：
ａは、ｃと等しくなく；かつ／または
ｂは、ｔと等しくない。
【００３８】
いくつかの実施形態では、この組成物は、式：
【化２８】
2020503049.tif 000029
のガイド分子またはその薬学的に許容される塩を含むか、または本質的にそれからなり、
ここで、この組成物は、式：
【化２９】
2020503049.tif 000030
の分子またはその薬学的に許容される塩を実質的に含まず、
式中：
ａは、ｃと等しくなく；かつ／または
ｂは、ｔと等しくない。
【００３９】
いくつかの実施形態では、この組成物は、
（ａ）ＣＲＩＳＰＲシステムのための合成単分子ガイド分子であって、式：
【化３０】
2020503049.tif 000031
のものまたはその薬学的に許容される塩である、合成単分子ガイド分子；ならびに
（ｂ）１つまたは複数の：
（ｉ）カルボジイミドまたはその塩；
（ｉｉ）イミダゾール、シアノイミダゾール、ピリジン、およびジメチルアミノピリジン、またはそれらの塩；
（ｉｉｉ）式：
【化３１】
2020503049.tif 000032
の化合物、またはその塩
を含み、式中、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立に、置換もしくは非置換アルキル、または置換もしくは非置換炭素環式である。
【００４０】
いくつかの実施形態では、この組成物は、
ＣＲＩＳＰＲシステムのための合成単分子ガイド分子を含み、このガイド分子は、式：
【化３２】
2020503049.tif 000033
のものまたはその薬学的に許容される塩であり、式：
【化３３】
2020503049.tif 000034
の分子またはその薬学的に許容される塩を実質的に含まず、
式中：
ａ＋ｂは、ｃ＋ｔ−ｋであり、式中、ｋは、１〜１０である。
【００４１】
いくつかの実施形態では、この組成物は、ＣＲＩＳＰＲシステムのための合成単分子ガイド分子を含むか、または本質的にそれからなり、このガイド分子は、式：
【化３４】
2020503049.tif 000035
のものまたはその薬学的に許容される塩であり、
ここで、この式に示される２’〜５’ホスホジエステル結合は、（Ｎ）ｃの３’領域と（Ｎ）ｔの５’領域との間に形成された二重鎖における２つのヌクレオチド間である。
【００４２】
一態様では、本開示は、本明細書で提供される単分子ガイド分子を合成するための、および／または本明細書で提供される方法によって単分子ガイド分子を合成するためのオリゴヌクレオチドに関する。いくつかの実施形態では、このオリゴヌクレオチドは、式：
【化３５】
2020503049.tif 000036
のものまたはその塩である。
【００４３】
いくつかの実施形態では、このオリゴヌクレオチドは、式：
【化３６】
2020503049.tif 000037
のものまたはその塩である。
【００４４】
いくつかの実施形態では、このオリゴヌクレオチドは、式：
【化３７】
2020503049.tif 000038
のものまたはその塩である。
【００４５】
いくつかの実施形態では、組成物は、式：
【化３８】
2020503049.tif 000039
のアニールされた二重鎖を含むオリゴヌクレオチドまたはその塩を含む。
【００４６】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、式：
【化３９】
2020503049.tif 000040
のものまたはその塩である。
【００４７】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、式：
【化４０】
2020503049.tif 000041
のものまたはその塩である。
【００４８】
いくつかの実施形態では、組成物は、式：
【化４１】
2020503049.tif 000042
のアニールされた二重鎖を含むオリゴヌクレオチド、またはその塩である。
【００４９】
一態様では、本開示は、式：
【化４２】
2020503049.tif 000043
の化合物に関する。
【００５０】
一態様では、本開示は、本明細書で提供されるガイド分子または組成物を対象に投与することを含む、細胞または対象における核酸を改変する方法に関する。
【００５１】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、いかなる精製ステップにも供されていない。
【００５２】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、溶液または薬学的に許容される担体中に懸濁された単分子ガイドＲＮＡ分子を含む。
【００５３】
一態様では、本開示は、本明細書で提供されるガイド分子を含むゲノム編集システムに関する。いくつかの実施形態では、ゲノム編集システムおよび／またはガイド分子は、治療に使用するためのものである。いくつかの実施形態では、ゲノム編集システムおよび／またはガイド分子は、医薬品の製造に使用するためのものである。
【００５４】
添付の図面は、本開示の特定の態様および実施形態の包括的ではなく例示的で概略的な例を提供することを意図している。図面は、いかなる特定の理論またはモデルにも限定または拘束することを意図するものではなく、必ずしも縮尺通りではない。上記を限定することなく、核酸およびポリペプチドは、線状配列として、または概略的な２次元もしくは３次元構造として描くことができ；これらの描写は、それらの構造に関するいかなる特定のモデルまたは理論にも限定または拘束されるのではなく、例示を目的としている。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１Ａ】図１Ａは、本開示の特定の実施形態による例示的な架橋反応プロセスを示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、本開示の様々な実施形態による、第１および第２のガイド分子断片が互いに架橋されている位置（星が付けられている）を強調する例示的なＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ガイド分子を２次元概略図で示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、本開示の様々な実施形態による、第１および第２のガイド分子断片が互いに架橋されている位置（星が付けられている）を強調する例示的なＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ガイド分子を２次元概略図で示す。
【図２Ａ】図２Ａは、本開示の特定の実施形態による例示的な架橋反応プロセスにおけるステップを示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、本開示の特定の実施形態による例示的な架橋反応プロセスにおけるステップを示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、図２Ａおよび図２Ｂからの反応生成物を使用する例示的な架橋反応プロセスにおける追加のステップを示す。
【図３Ａ】図３Ａは、本開示の特定の実施形態による例示的な架橋反応プロセスを示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、本開示の特定の実施形態による例示的な架橋反応プロセスにおけるステップを示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、本開示の様々な実施形態による、第１および第２のガイド分子断片が互いに架橋されている位置を強調する例示的なＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ガイド分子を２次元概略図で示す。
【図３Ｄ】図３Ｄは、本開示の様々な実施形態による、第１および第２のガイド分子断片が互いに架橋されている位置を強調する例示的なＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ガイド分子を２次元概略図で示す。
【図４】図４は、本開示の特定の実施形態による合成単分子ガイド分子のＤＮＡ切断用量反応曲線を、商業的供給業者から得られたＩＶＴによって調製された、ライゲーションされていないアニールされたガイド分子断片およびガイド分子と比較して示す。ＤＮＡ切断を、本明細書に記載のＴ７Ｅ１アッセイによってアッセイした。グラフが示すように、コンジュゲートガイド分子は、ＩＶＴによって調製された単分子ガイド分子または合成単分子ガイド分子で観察されたものと一致する用量依存的にＨＥＫ２９３細胞における切断を支持した。アニールされた非コンジュゲートガイド分子断片は、同様の用量依存的であるが、低レベルの切断を支持したことに留意すべきである。
【図５ＡＢ】図５Ａは、代表的なイオンクロマトグラフを示し、図５Ｂは、実施例１のプロセスに従って尿素リンカーとコンジュゲートされたイオン交換精製ガイド分子のデコンボリューションされた質量スペクトルを示す。図５Ｃは、代表的なイオンクロマトグラフを示し、図５Ｄは、市販の合成単分子ガイド分子のデコンボリューションされた質量スペクトルを示す。質量スペクトルを、イオンクロマトグラフにおいて強調されたピークについて評価した。図５Ｅは質量スペクトルの拡大版を示す。市販の合成単分子ガイド分子の質量スペクトルは左側にあり（全質量に対して３４％の純度）、実施例１のプロセスに従って尿素リンカーとコンジュゲートされたガイド分子の質量スペクトルは右側にある（全質量に対して７２％の純度）。
【図５ＣＤ】同上。
【図５Ｅ】同上。
【図６ＡＢ】図６Ａは、尿素結合を含む合成単分子ガイド分子から作製された相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の５’末端からの各位置で個々の塩基および長さの変化が生じる頻度を表すプロットを示し、図６Ｂは、市販の合成単分子ガイド分子から作製された（すなわち、コンジュゲーションなしで調製された）ｃＤＮＡの５’末端からの各位置で個々の塩基および長さの変化が生じる頻度を表すプロットを示す。ボックスは、ガイド分子の２０ｂｐ標的ドメインを囲んでいる。図６Ｃは、チオエーテル結合を含む合成単分子ガイド分子から作製されたｃＤＮＡの５’末端からの各位置で個々の塩基および長さの変化が生じる頻度を表すプロットを示す。
【図６Ｃ】同上。
【図７Ａ】図７Ａおよび図７Ｂは、尿素結合を含む様々な合成単分子ガイド分子から作製された（図７Ａ）、および市販の合成単分子ガイド分子から作製された（すなわち、コンジュゲーションなしで調製された）（図７Ｂ）ｃＤＮＡの５’末端から数えて第１の４１位における内部配列長の変化（＋５から−５）を示すグラフである。
【図７Ｂ】同上。
【図８Ａ】図８Ａ〜図８Ｈは、本開示の様々な実施形態による特定の例示的なガイド分子の構造を２次元概略図で示す。塩基対形成が可能な相補的な塩基は、塩基間の１本の（Ａ−Ｕ対合またはＡ−Ｔ対合）水平線または２本の（Ｇ−Ｃ）水平線によって示される。非ワトソン−クリック対合が可能な塩基は、円と単一水平線によって示される。
【図８Ｂ】同上。
【図８Ｃ】同上。
【図８Ｄ】同上。
【図８Ｅ】同上。
【図８Ｆ】同上。
【図８Ｇ】同上。
【図８Ｈ】同上。
【図９Ａ】図９Ａ〜図９Ｄは、本開示の様々な実施形態による特定の例示的なガイド分子の構造を２次元概略図で示す。塩基対形成が可能な相補的な塩基は、塩基間の１本の（Ａ−Ｕ対合またはＡ−Ｔ対合）水平線または２本の（Ｇ−Ｃ）水平線によって示される。非ワトソン−クリック対合が可能な塩基は、円と単一水平線によって示される。
【図９Ｂ】同上。
【図９Ｃ】同上。
【図９Ｄ】同上。
【図１０Ａ】図１０Ａ〜図１０Ｄは、本開示の様々な実施形態による特定の例示的なガイド分子の構造を２次元概略図で示す。塩基対形成が可能な相補的な塩基は、塩基間の１本の（Ａ−Ｕ対またはＡ−Ｔ対）水平線または２本の（Ｇ−Ｃ）水平線によって示される。非ワトソン−クリック対合が可能な塩基は、円と単一水平線によって示される。
【図１０Ｂ】同上。
【図１０Ｃ】同上。
【図１０Ｄ】同上。
【図１１】図１１は、表１０からのコンジュゲートガイド分子を含む一連のリボ核タンパク質複合体を用いたＣＤ３４＋細胞におけるＤＮＡ切断のグラフを示す。野生型ヒト参照配列に対する挿入および欠失（インデル）率を定量するために次世代配列決定技術を用いて切断を評価した。実施例１に従って作製されたライゲーションされたガイド分子は、ＣＤ３４＋細胞におけるＤＮＡ切断を支持する。インデル率はステムループ長の増加と共に増加することがわかったが、ステムループ配列に隣接するＵ−Ａ交換の組み込み（ｇＲＮＡ  １Ｅ、１Ｆ、および２Ｄを参照）はその効果を軽減する。
【図１２Ａ】図１２Ａは、ｇＲＮＡ  １ＡのＴ１エンドヌクレアーゼ消化後の液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）トレースを示し、図１２Ｂは、４．５０分の保持時間でのピークの質量スペクトルを示す（Ａ３４：Ｇ３９）。特に、尿素結合を含む断片、Ａ−［ＵＲ］−ＡＡＵＡＧ（Ａ３４：Ｇ３９）が、ｍ／ｚ＝１１９０．７で、４．５０分の保持時間で検出された。
【図１２Ｂ】同上。
【図１３Ａ】図１３Ａは、主生成物（Ａ−２、３．２５分の保持時間）および微量生成物（Ａ−１、３．１４分の保持時間）の両方が存在する、尿素結合ガイド分子の未精製の組成物についてのＬＣ−ＭＳデータを示す。図１３Ａの微量成物（Ａ−１）は例示目的で濃縮されたものであり、典型的には実施例１の方法によるガイド分子の合成において最大１０％の収率で検出されることに留意されたい。図１３Ｂは、ピークＡ−２のデコンボリューションされた質量スペクトル（３．２５分の保持時間）を示し、図１３Ｃは、ピークＡ−１のデコンボリューションされた質量スペクトル（３．１４分の保持時間）を示す。質量分析による各ピークの分析は、両方の生成物が同じ分子量を有することを示した。
【図１３Ｂ】同上。
【図１３Ｃ】同上。
【図１４Ａ】図１４Ａは、実施例１０に記載のように化学修飾した後のガイド分子組成物についてのＬＣ−ＭＳデータを示す。主生成物（Ｂ−１、尿素）は、元の分析（３．２６分）と同じ保持時間を有するが、微量生成物（Ｂ−２、カルバメート）の保持時間は、遊離アミン部分の化学官能化と一致して、３．８６分にシフトした。図１４Ｂは、ピークＢ−２の質量スペクトルを示す（３．８６分の保持時間）。３．８６分におけるピーク（Ｍ＋１３４）の分析は、予測された官能化が起こったことを示す。
【図１４Ｂ】同上。
【図１５Ａ】図１５Ａは、主生成物（尿素）および化学修飾微量生成物（カルバメート）の両方を含む反応混合物のＴ１エンドヌクレアーゼでの消化後の断片混合物のＬＣ−ＭＳトレースを示す。尿素結合（Ｇ３５−［ＵＲ］−Ｃ３６）および化学修飾カルバメート結合（Ｇ３５−［ＣＡ＋ＰＡＡ］−Ｃ３６）の両方がそれぞれ、４．３１分および５．７７分の保持時間で検出された。図１５Ｂは、４．３１分でのピークの質量スペクトルを示し、ここで、ｍ／ｚ＝５３２．１３は［Ｍ−２Ｈ］２−に割り当てられ、図１５Ｃは、５．７７分でのピークの質量スペクトルを示し、ここで、ｍ／ｚ＝５９９．１５は［Ｍ−２Ｈ］２−に割り当てられている。図１５Ｄおよび図１５Ｅは、図１５Ｂからのｍ／ｚ＝５３２．１および図１５Ｃからのｍ／ｚ＝５９９．１のＬＣ／ＭＳ−ＭＳ衝突誘起解離（ＣＩＤ）実験を示す。図１５Ｄでは、典型的なａ−ｄイオンおよびｘ−ｚイオンが観察され、５’末端（ｍ／ｚ＝４８７．１および４６１．１）および３’末端（ｍ／ｚ＝６０３．１および５７７．１）からのＵＲ結合の両側のＭＳ／ＭＳ断片イオンが観察された。図１５Ｅでは、カルバメート結合５’末端（ｍ／ｚ＝５９５．２）およびＣＡ結合の３’末端（ｍ／ｚ＝６０３．１）からのＭＳ／ＭＳ断片イオンを含む２つのプロダクトイオンのみが観察された。
【図１５Ｂ】同上。
【図１５Ｃ】同上。
【図１５Ｄ】同上。
【図１５Ｅ】同上。
【図１６Ａ】図１６Ａは、２’−Ｈ修飾５’ガイド分子断片との反応のための粗反応混合物のＬＣ−ＭＳデータ（上側のスペクトル）を、同じ５’ガイド分子の非修飾型との反応のための粗反応混合物（下側のスペクトル）と比較して示す。２’−Ｈ修飾５’ガイド分子断片では、カルバメート副生成物の形成が観察されていない（上側のスペクトル）。対照的に、同じ５’ガイド分子断片の非修飾型（低スペクトル）との反応のための粗反応混合物は、主要尿素結合生成物（Ａ−２）と微量のカルバメート副生成物（Ａ−１）との混合物を含んでいた。実施例１０とは異なり、カルバメート副生成物は濃縮されておらず、したがって実施例１０の図１３Ａよりもはるかに低いレベルで検出されたことに留意されたい。図１６Ｂは、ピークＢのデコンボリューションされた質量スペクトル（３．１４分の保持時間、図１６Ａの上側のスペクトル）を示し、図１６Ｃは、ピークＡ−２のデコンボリューションされた質量スペクトル（３．４５分の保持時間、図１６Ａの下側のスペクトル）を示す。２’−Ｈ修飾５’ガイド分子断片（Ｂ）との反応の生成物の分析により、２’−ＯＨが２’−Ｈで置換された分子で予想されたように、（Ａ−２、非修飾尿素結合主生成物と比較して）Ｍ−１６が得られた（図１６Ｂおよび図１６Ｃを参照）。
【図１６Ｂ】同上。
【図１６Ｃ】同上。
【図１７Ａ】図１７Ａは、ｇＲＮＡ  １ＬのＴ１エンドヌクレアーゼ消化後のＬＣ−ＭＳトレースを示し、図１７Ｂは、４．６５分の保持時間でのピークの質量スペクトルを示す（Ａ３４：Ｇ３９）。特に、尿素結合を含む断片、Ａ−［ＵＲ］−ＡＡＵＡＧ（Ａ３４：Ｇ３９）が、ｍ／ｚ＝１１８２．７での４．６５分の保持時間で検出された。
【図１７Ｂ】同上。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
定義および略語
特段の記載がない限り、以下の用語のそれぞれは、このセクションにおいてその用語に関連する意味を有する。
【００５７】
不定冠詞「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、少なくとも１つの関連する名詞を指し、そして用語「少なくとも１つ」および「１つまたは複数」と互換的に使用される。例えば、「１つのモジュール」は、少なくとも１つのモジュール、または１つもしくは複数のモジュールを意味する。
【００５８】
接続詞「または」および「および／または」は、非排他的選言として互換的に使用される。
【００５９】
語句「〜から本質的になる」は、列挙された種は優勢な種であるが、他の種は、微量または対象組成物の構造、機能、または挙動に影響を及ぼさない量で存在し得ることを意味する。例えば、特定の種から本質的になる組成物は、一般にその種の９０％、９５％、９６％、またはそれ以上（質量またはモル濃度）を占めるであろう。
【００６０】
語句「分子を実質的に含まない」は、分子が、列挙された組成物中の主成分ではないことを意味する。例えば、分子を実質的に含まない組成物は、その分子が、組成物中に５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、または０．１％（質量またはモル濃度）未満であることを意味する。分子の量は、例えば実施例に記載されるように、様々な分析技術によって決定することができる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、特定の分子を実質的に含まず、分子は、ゲル電気泳動法によって決定されるように５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、または０．１％（質量またはモル濃度）未満である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、特定の分子を実質的に含まず、分子は、質量分析によって決定されるように５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、または０．１％（質量またはモル濃度）未満である。
【００６１】
「ドメイン」は、タンパク質または核酸のセグメントを説明するために使用される。特段の記載がない限り、ドメインは、任意の特定の機能的特性を有する必要はない。
【００６２】
用語「相補的」は、水素結合を介して安定な塩基対を形成することができるヌクレオチドの対を指す。例えば、Ｕは、Ａに相補的であり、Ｇは、Ｃに相補的である。当業者には理解されるように、特定の相補的なヌクレオチド対が水素結合塩基対合（例えば、ガイド分子二重鎖内）を介して結合しているかどうかは、文脈（例えば、周囲のヌクレオチドおよび化学結合）および外部条件（例えば、温度およびｐＨ）に依存し得る。したがって、相補的なヌクレオチドは必ずしも水素結合塩基対合を介して会合しているわけではないことを理解されたい。
【００６３】
「コバリアント（ｃｏｖａｒｉａｎｔ）」配列は、参照配列中の１つまたは複数のヌクレオチドの相補的なヌクレオチドでの置換により参照配列と異なる（例えば、１つまたは複数のＵは、Ａに置換され、１つまたは複数のＧは、Ｃに置換されるなど）。二重鎖を形成する２つの相補配列（例えば、ガイド分子の上部ステム）を含む領域に関連して使用される場合、用語「コバリアント」は、以下の表１に例示されるように参照二重鎖の２つの相補配列間に１つまたは複数のヌクレオチド交換（すなわち、１つまたは複数のＡ−Ｕ交換および／または１つまたは複数のＧ−Ｃ交換）を有する二重鎖を包含する。
【００６４】
【表１】
2020503049.tif 000044
【００６５】
いくつかの実施形態では、コバリアント配列は、参照配列と実質的に同じ特定のアニーリング反応のエネルギー有利性（ｅｎｅｒｇｅｔｉｃ  ｆａｖｏｒａｂｉｌｉｔｙ）を示し得る（例えば、本開示のガイド分子の文脈における二重鎖の形成）。本開示の他の部分に記載されているように、特定のアニーリング反応のエネルギー有利性は、経験的に測定してもよいし、または計算モデルを使用して予測してもよい。
【００６６】
「インデル」は、核酸配列中の挿入および／または欠失である。インデルは、本開示のゲノム編集システムによって形成される二本鎖切断などのＤＮＡ二本鎖切断の修復の産物であり得る。インデルは、最も一般的には、以下に記載されるＮＨＥＪ経路などの「誤りがちな」修復経路によって切断が修復されるときに形成される。
【００６７】
「遺伝子変換」とは、内因性相同配列（例えば、遺伝子アレイ内の相同配列）の組み込みによるＤＮＡ配列の改変を指す。「遺伝子修正」とは、外因性一本鎖または二本鎖ドナーテンプレートＤＮＡなどの外因性相同配列の組み込みによるＤＮＡ配列の改変を指す。遺伝子変換および遺伝子修正は、以下に記載されるようなＨＤＲ経路によるＤＮＡ二本鎖切断の修復の産物である。
【００６８】
インデル、遺伝子変換、遺伝子修正、および他のゲノム編集の結果は、典型的には配列決定（最も一般的には「次世代」または「合成による配列決定」方法であるが、サンガー配列決定は依然として使用することができる）によって評価され、すべての配列決定リードの中の目的の部位での数的変化（例えば、±１、±２、またはそれ以上の塩基）の相対頻度によって定量化される。配列決定のためのＤＮＡサンプルは、当技術分野において公知の様々な方法によって調製することができ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による目的の部位の増幅、Ｔｓａｉら（参考により本明細書に援用される、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３４（５）：４８３（２０１６））に記載のＧＵＩＤＥｓｅｑプロセスにおけるように二本鎖切断によって、または当技術分野において周知の他の手段によって作製されるＤＮＡ末端の捕捉を含み得る。ゲノム編集の結果はまた、Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｖｉｓｉｏｎ（Ｂａｇｎｅｕｘ、Ｆｒａｎｃｅ）によって市販されているＦｉｂｅｒＣｏｍｂ（商標）システムなどのインサイチューハイブリダイゼーション法によって、および当技術分野において公知のその他の適切な方法によって評価することもできる。
【００６９】
「Ａｌｔ−ＨＤＲ」、「代替相同組換え修復（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｒｅｐａｉｒ）」、または「代替ＨＤＲ」は、相同核酸（例えば、内在性相同配列、例えば、姉妹染色分体、または外来核酸、例えば、テンプレート核酸）を用いるＤＮＡ損傷の修復プロセスと互換的に使用される。Ａｌｔ−ＨＤＲは、プロセスが標準ＨＤＲとは異なる経路を利用し、かつ標準ＨＤＲメディエーター、ＲＡＤ５１、およびＢＲＣＡ２によって阻害できるという点で、標準ＨＤＲとは異なる。Ａｌｔ−ＨＤＲは、一本鎖またはニック相同核酸テンプレートの関与によっても区別されるが、標準的なＨＤＲは一般に二本鎖の相同なテンプレートを含む。
【００７０】
「標準ＨＤＲ」、「標準相同組換え修復」または「ｃＨＤＲ」は、相同核酸（例えば、内在性相同配列、例えば、姉妹染色分体、または外来核酸、例えば、テンプレート核酸）を用いるＤＮＡ損傷の修復プロセスを指す。標準ＨＤＲは、典型的には、ＤＮＡの少なくとも１つの一本鎖部分を形成する二本鎖切断における有意な切除のときに機能する。通常の細胞では、ｃＨＤＲは、典型的には、一連のステップ、例えば、切断の認識、切断の安定化、切除、一本鎖ＤＮＡの安定化、ＤＮＡクロスオーバー中間体（ＤＮＡ  ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）の形成、このクロスオーバー中間体の分解、およびライゲーションを含む。このプロセスは、ＲＡＤ５１およびＢＲＣＡ２を必要とし、相同核酸は典型的には二本鎖である。
【００７１】
特に断りのない限り、用語「ＨＤＲ」は、本明細書の用法では、標準ＨＤＲおよびａｌｔ−ＨＤＲの両方を包含する。
【００７２】
「非相同末端結合」または「ＮＨＥＪ」は、標準ＮＨＥＪ（ｃＮＨＥＪ）、およびマイクロ相同性媒介末端結合（ＭＭＥＪ）、一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）、および合成依存性マイクロ相同性媒介末端結合（ＳＤ−ＭＭＥＪ）を順に含む代替ＮＨＥＪ（ａｌｔＮＨＥＪ）を含む、ライゲーション媒介修復および／または非テンプレート媒介修復を指す。
【００７３】
「置換」または「置換された」は、分子（例えば、核酸またはタンパク質）の修飾に関して使用される場合、プロセスの制限を必要とせず、単に置換実体が存在することを示すにすぎない。
【００７４】
「対象」は、ヒトまたは非ヒト動物を意味する。ヒト対象は、あらゆる年齢（例えば、乳児、子供、若年成人、または成人）であり得、そして疾患に罹患していてもよいし、または遺伝子の改変を必要としていてもよい。あるいは、対象は、動物であってもよく、この用語には、哺乳動物、トリ、サカナ、爬虫類、両生類、より具体的には非ヒト霊長類、げっ歯類（マウス、ラット、ハムスターなど）、ウサギ、モルモット、イヌ、ネコなどが含まれるがこれらに限定されない。本開示の特定の実施形態では、対象は、家畜、例えばウシ、ウマ、ヒツジ、またはヤギである。特定の実施形態では、対象は家禽である。
【００７５】
「処置する」、「処置すること」、および「処置」は、疾患を阻害すること、すなわちその発症または進行を停止または防止すること；疾患を軽減する、すなわち病状を緩解させること；疾患の１つまたは複数の症状を緩和すること；疾患を治療することのうちの１つまたは複数を含む、対象（例えば、ヒト対象）の疾患の処置を意味する。
【００７６】
「予防する」、「予防すること」、および「予防」は、（ａ）疾患を回避または排除すること；（ｂ）病気に対する素因に影響を与えること；または（ｃ）疾患の少なくとも１つの症状の発症を予防または遅延させることを含む、哺乳動物、例えばヒトにおける疾患の予防を指す。
【００７７】
「キット」は、特定の目的のために利用することができる機能単位を共に構成する２つ以上の構成要素の任意の集合体を指す。（限定ではなく）例示として、本開示による１つのキットは、ＲＮＡガイドヌクレアーゼと複合体を形成する、またはそれと複合体を形成することができ、そして薬学的に許容される担体と共に（例えば、この中に懸濁された、またはこの中に懸濁できる）ガイドＲＮＡを含み得る。キットは、細胞または対象において所望のゲノム改変を引き起こす目的で、例えば、そのような細胞または対象に複合体を導入するために使用することができる。キットの構成要素は、一緒にパッケージングしてもよいし、または別々にパッケージングしてもよい。本開示によるキットはまた、例えば本開示の方法に従って、キットの使用を説明する使用説明書（ＤＦＵ）も任意選択により含む。ＤＦＵは、キットと共に物理的にパッケージングしてもよいし、または、例えば電子手段によってキットの使用者が利用できるようにしてもよい。
【００７８】
用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、「核酸分子」、「核酸配列」、および「オリゴヌクレオチド」は、ＤＮＡおよびＲＮＡにおける一連のヌクレオチド塩基（「ヌクレオチド」とも呼ばれる）を指し、２つ以上のヌクレオチドの任意の鎖を意味する。ポリヌクレオチド、ヌクレオチド配列、核酸などは、一本鎖または二本鎖のキメラ混合物または誘導体またはそれらの修飾型であり得る。それらは、例えば、分子の安定性、そのハイブリダイゼーションパラメータなどを改善するために、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格で修飾することができる。ヌクレオチド配列は、典型的には、タンパク質および酵素を産生するために細胞機構によって使用される情報を含むがこれらに限定されない遺伝子情報を有する。これらの用語は、一本鎖または二本鎖ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、任意の合成および遺伝子操作ポリヌクレオチド、ならびにセンスおよびアンチセンスポリヌクレオチドの両方を含む。これらの用語はまた、修飾された塩基を含む核酸も含む。
【００７９】
以下の表２に示されるように、従来のＩＵＰＡＣ命名法が、本明細書に提示されるヌクレオチド配列に使用される（参照により本明細書に援用される、Ｃｏｒｎｉｓｈ−Ｂｏｗｄｅｎ  Ａ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９８５  Ｍａｙ  １０；１３（９）：３０２１−３０も参照）。しかしながら、例えばガイド分子標的ドメインにおいて、配列がＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかによってコードされ得る場合、「Ｔ」は「チミンまたはウラシル」を意味することに留意すべきである。
【００８０】
【表２】
2020503049.tif 000045
【００８１】
用語「タンパク質」、「ペプチド」、および「ポリペプチド」は、ペプチド結合を介して互いに結合したアミノ酸の連続鎖を指すために互換的に使用される。この用語は、個々のタンパク質、互いに会合するタンパク質の群または複合体、ならびにそのようなタンパク質の断片または一部、変異体、誘導体、および類似体を含む。ペプチド配列は、左側のアミノ末端またはＮ末端から始まり、右側のカルボキシル末端またはＣ末端に進む従来の表記法を用いて本明細書に提示される。標準的な１文字または３文字の略語を使用することができる。
【００８２】
用語「変異体」は、参照実体と有意な構造的同一性を示すが、参照実体と比較して、１つまたは複数の化学部分の存在またはレベルにおいて参照実体とは構造的に異なるポリペプチド、ポリヌクレオチド、または小分子などの実体を指す。多くの実施形態では、変異体もまた、参照実体とは機能的に異なる。一般に、特定の実体が参照実体の「変異体」であると厳密に見なされるかどうかは、その参照実体との構造的同一性の程度に基づいている。
【００８３】
要約
本開示の特定の実施形態は、一般に、ガイド分子を合成するための方法に関し、この方法では、２つ以上のガイド断片が（ａ）互いにアニールされ、次いで（ｂ）適切な架橋化学を用いて架橋される。本発明者らは、ガイド断片を架橋する前にそれらを予備アニーリングするステップを含む方法が、架橋の効率を改善し、そしてホモ多官能性架橋剤が使用される場合でさえも、所望のヘテロ二量体生成物の形成を支持する傾向があることを見出した。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、架橋効率、および結果としての所望の反応生成物の収率における改善は、予備アニーリングによって達成される、アニールされていないホモ二量体と比較した、架橋基質としてのアニールされたヘテロ二量体の安定性の増大、および／またはホモ二量体を形成するために利用可能な遊離ＲＮＡ断片の画分の減少などによるものと考えられる。
【００８４】
ガイド断片を予備アニーリングすることを含む本開示の方法は、限定されるものではないが：本明細書に記載の尿素系架橋方法で使用されるアミン官能化断片のように断片がホモ多官能性（例えば、ホモ二官能性）である場合でも高収率の達成を可能にすること；不所望のホモ二量体および他の反応生成物の減少または不在が、次に下流での精製を単純化し得ること；ならびに架橋に使用される断片が完全長のガイド分子よりも短い傾向があるため、それらの断片は、完全長合成ガイド分子で観察されるよりも低いレベルのｎ−１種、切断種、ｎ＋１種、および他の汚染物質による汚染を示し得ることを含む多数の利点を有する。
【００８５】
予備アニーリングに関して、当業者であれば、アニールされた塩基のより長いトラクトがより短いトラクトよりも安定であり得、そして同様の長さの２つのトラクト間で、程度のより大きなアニーリングが、一般的により大きな安定に関連することを理解されよう。したがって、本開示の特定の実施形態では、断片は、断片間のアニーリングの程度を最大化するように、かつ／または官能化３’または５’末端をアニールされた塩基におよび／または互いに近接させるように設計される。
【００８６】
以下により詳細に論じられるように、特定の単分子ガイド分子、特に単分子Ｃａｓ９ガイド分子は、比較的大きなステムループ構造を特徴とする。例えば、図１Ｂおよび図１Ｃは、単分子Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）およびＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｇＲＮＡの２次元構造を示し、これらの図から、両方のｇＲＮＡが一般的に「バルジ」を有する比較的長いステムループ構造を含むことが明らかであろう。特定の実施形態では、合成ガイド分子は、このステムループ構造内の断片間の架橋を含む。これは、場合によっては、それぞれ３’末端および５’末端またはその近傍に相補的な領域を有する第１の断片と第２の断片を架橋することによって達成され；これらの断片の３’末端および５’末端は、例えば、以下の式ＩＩおよびＩＩＩ：
【化４３】
2020503049.tif 000046
に示されるように、架橋反応を促進するために官能化されている。
これらの式では、ｐおよびｑは、それぞれ独立に、０〜６であり、かつｐ＋ｑは、０〜６であり；ｍは、２０〜４０であり；ｎは、３０〜７０であり；−−−−は、それぞれ独立に、対応するヌクレオチド間の水素結合を表し；
【化４４】
2020503049.tif 000047
は、それぞれホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホノアセテート結合、チオホスホノアセテート結合、またはホスホロアミデート結合を表し；Ｎ−−−−Ｎは、独立に、２つの相補的なヌクレオチド、任意選択による水素結合で塩基対合した２つの相補的なヌクレオチドを表し；かつＦ１およびＦ２は、それらが架橋反応して２つのガイド断片を架橋できるように官能基をそれぞれ含む。例示的な架橋化学は、以下の表３に記載されている。
【００８７】
【表３】
2020503049.tif 000048
【００８８】
【表４】
2020503049.tif 000049
【００８９】
式ＩＩおよびＩＩＩは、ガイド分子反復−抗反復二重鎖（ｇｕｉｄｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｒｅｐｅａｔ−ａｎｔｉｒｅｐｅａｔ  ｄｕｐｌｅｘ）中の「テトラループ」構造内に位置する架橋剤（または「テトラループ」構造を置換する架橋剤）を示すが、架橋剤は、分子内のあらゆる場所、例えば、天然に存在するステムループおよびエンジニアリングされたステムループを含む、ガイド分子内に存在する任意のステムループ構造に位置し得ることを理解されたい。特に、本開示の特定の実施形態は、テトラループ構造を欠き、第１および第２の相補的な領域の末端に（例えば、第１の上部ステム領域の３’末端および第２の上部ステム領域の５’末端に）位置する架橋剤を含むガイド分子に関する。
【００９０】
式ＩＩおよびＩＩＩは、反復−抗反復二重鎖中に「テトラループ」構造を含んでもよいし（ｐ＞０およびｑ＞０）、または含まなくてもよい（ｐ＝０およびｑ＝０）ガイド分子を表す。本発明の一態様は、「テトラループ」を欠くガイド分子が、ごく近接して適切な配向にある官能化３’末端および５’末端を有する結果として、増強されたライゲーション効率を示し得るという認識である。
【００９１】
あるいは、またはさらに、本開示による架橋反応は、官能化３’末端および５’末端が安定的に互いに接近するようにこれらの官能化末端またはその近傍で配列にハイブリダイズする「スプリント」または一本鎖オリゴヌクレオチドを含み得る。
【００９２】
本発明の別の態様は、より長い二重鎖を有する（例えば、伸長した上部ステムを有する）ガイド分子が、より短い二重鎖を有するガイド分子と比較して増強されたライゲーション効率を示し得るという認識である。これらのより長い二重鎖構造は、本開示では「伸長二重鎖」と互換的に呼ばれ、（必ずしもそうとは限らないが）一般にガイド断片中の官能化ヌクレオチドの近傍に位置する。したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、以下の式ＶＩＩＩおよびＩＸ：
【化４５】
2020503049.tif 000050
のガイド分子を提供する。
【００９３】
式ＶＩＩＩおよびＩＸにおいて、ｐ’およびｑ’は、それぞれ独立に、０〜４（両端を含む）の整数であり、ｐ’＋ｑ’は、０〜４（両端を含む）の整数であり、ｕ’は、２〜２２（両端を含む）の整数であり、その他の変数は、式ＩＩおよびＩＩＩと同様に定義される。式ＶＩＩＩおよびＩＸは、任意選択により伸長された上部ステムを有する二重鎖、ならびに任意選択のテトラループ（すなわち、ｐおよびｑが０の場合）を示す。式ＶＩＩＩおよびＩＸのガイド分子は、より長い上部ステムから得られるライゲーション効率の増加のために有利であり得る。さらに、より長い上部ステムとテトラループの非存在との組み合わせは、ライゲーション反応のための反応性基Ｆ１およびＦ２の適切な配向を達成するために有益であり得る。
【００９４】
本発明の別の態様は、ガイド断片が、単一ガイド断片内および／または異なるガイド断片間に相補的な複数の領域を含み得るという認識に関する。例えば、本開示の特定の実施形態では、第１および第２のガイド断片は、相補的な上部ステム領域および下部ステム領域で設計され、完全にアニールされたときに、（ａ）第１および第２の官能基が、架橋反応に適した近傍における二重鎖上部ステム領域の末端に位置し、かつ／または（ｂ）ガイド分子とＲＮＡガイドヌクレアーゼとの間の複合体の形成を支持することができる第１のガイド断片と第２のガイド断片との間に二重鎖構造が形成される、ヘテロ二量体が生じる。しかしながら、第１および第２のガイド断片が互いに不完全にアニールする、または内部二重鎖もしくはホモ二量体を形成し、それによって（ａ）および／または（ｂ）が生じない可能性があり得る。一例として、野生型ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ配列に基づいたＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ガイド分子において、上部ステム領域が互いにアニーリングする所望のアニーリングではなく、上部ステム領域と下部ステム領域との間にアニーリングを含む不適切な「スタガード」ヘテロ二量体を生じさせ得る、下部および上部ステムにおけるポリＵトラクトまたはポリＡトラクトなどの複数の高度に相補的な配列が存在し得る。同様に、不所望の二重鎖が、ガイド断片の標的ドメイン配列と同じガイド断片または異なる断片の別の領域との間に形成される可能性があり、かつ誤対合が、誤対合以外は相補的な第１および第２のガイド断片の領域間で起こり得、不完全な二重鎖化、バルジ、および／または不対セグメントが生じる可能性がある。
【００９５】
ガイド断片間に形成され得るすべての起こり得る不所望の内部または分子間二重鎖構造を予測することは実際的ではないが、本発明者らは、いくつかの場合において、特定の誤対合または不所望の二重鎖の形成を減少または防止するために行われる改変が、架橋反応における所望のガイド分子生成物の収率に有意な影響を有する可能性があり、かつ／または同じ反応からの１つまたは複数の汚染種の減少をもたらし得ることを見出した。したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、ガイド断片の一次配列が、２つまたは特定の誤対合もしくは不所望の二重鎖を回避するように（例えば、第１のガイド断片と第２のガイド断片との間で２つの相補的なヌクレオチドを交換することによって）設計されたガイド分子および方法を提供する。例えば、上述の野生型Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ガイド断片の上部ステムにおけるＡ−Ｕ交換は、非同一のＵＵＵＵおよびＵＡＵＵ配列を含む第１のガイド断片、ならびに第１の断片の改変配列に相補的な配列、すなわちＡＡＡＡ配列およびＡＵＡＡ配列を含む第２のガイド断片をもたらすであろう。さらに広く見れば、ガイドは、配列変化、例えば、上部または下部ステムの２つの二重鎖部分間のヌクレオチド交換、上部または下部ステムにおける配列の挿入、欠失、もしくは置換、または二次構造の形成を減少または排除するように選択された位置におけるロックド核酸（ＬＮＡ）の組み込みのような構造的変化を包含し得る。
【００９６】
いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、本明細書に記載の二重鎖の伸長、配列の改変、および構造的改変は、誤対合または不所望の二重鎖の形成に対する所望の二重鎖の形成のエネルギー有利性を高めることによって所望の二重鎖の形成を促進し、かつ誤対合および不所望の二重鎖の形成を減少させると考えられる。特定のアニーリング反応のエネルギー有利性は、ギブス自由エネルギー（ΔＧ）によって表すことができ；負のΔＧ値は自発的反応に関連し、第１のアニーリング反応は、第１の反応のΔＧが第２の反応のΔＧよりも小さい（すなわち、よりマイナスである）と、第２の反応よりもエネルギー的に好ましい。ΔＧは、例えば、あらゆる目的のために参照により本明細書に援用されるＹｏｕ，Ｔａｔｏｕｒｏｖ  ａｎｄ  Ｏｗｃｚａｒｚｙ，“Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ  Ｄｅｔａｉｌｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ”Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ｖｏｌ．９５，Ｎｏ．７，ｐｐ．４７２−４８６（２０１１）に記載されているようにＮＭＲ、蛍光クエンチング、紫外吸光、熱量測定などを用いる、特定の二重鎖の熱安定性（融解挙動）に基づいて経験的に評価することができる（例えば、“Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ”ａｔ  ｐｐ．４７２−７３  ａｎｄ“Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ”ａｔ  ｐｐ．４７３−４７５を参照）。しかしながら、計算モデルを利用して正確な二重鎖化および選択された誤対合または不所望の二重鎖化反応の自由エネルギーを評価するためにガイド断片およびアニーリング反応を設計する場合により実用的であり得、このようなモデル化を実行するために、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，Ｉｏｗａ）が提供するｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍツールを含め、多数のツールが利用可能である。あるいは、またはさらに、熱力学的最近傍モデル（ＴＮＮ）を利用する多数のアルゴリズムが文献に記載されている。例えば、Ｔｕｌｐａｎ，Ａｎｄｒｏｎｅｓｃｕ  ａｎｄ  Ｌｅｇｅｒ，“Ｆｒｅｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｈｏｒｔ  ＤＮＡ  ｄｕｐｌｅｘ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｓ，”ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１１，Ｎｏ．１０５（２０１０）を参照されたい（ＴＮＮ  ｍｏｄｅｌｓならびにｔｈｅ  ＭｕｌｔｉＲＮＡＦｏｌｄ  ｐａｃｋａｇｅ，ｔｈｅ  Ｖｉｅｎｎａ  ｐａｃｋａｇｅおよびｔｈｅ  ＵＮＡＦｏｌｄ  ｐａｃｋａｇｅについて記載している１〜２頁の「背景技術」を参照）。他のアルゴリズムもまた、例えば、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．“Ａｎ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｍｏｎｔｅ  Ｃａｒｌｏ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｆｏｒ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ＤＮＡ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，”Ｊ．Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｖｏｌ．７，Ｎｏ．５（２００７）による文献に記載されている（このモデルについて記載している７１頁のセクション２を参照）。前述の文献は、それらの全体の参照によりあらゆる目的のためにそれぞれ本明細書に援用される。
【００９７】
式ＩＩおよびＩＩＩに示されている配置は、官能基が複数の炭素を含む連結基に位置している場合、特に有利であり得る。それほど大きくない架橋剤の場合は、官能化３’末端と５’末端との間の密接な並置を達成することが望ましいであろう。図３Ｃおよび図３Ｄは、ホスホジエステル結合を含むがこれに限定されない、より短いリンカーの使用に適した、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）およびＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｇＲＮＡの二重鎖部分を同定する。これらの位置は、一般に、断片間のアニーリングを可能にし、かつ架橋の前に官能化３’末端と５’末端が互いに直接隣接するようにこれらの末端を配置するように選択される。アニールされた残基のトラクト内に（隣接するのではなく）位置する例示的な３’および５’位置は、以下の式ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、およびＶＩＩ：
【化４６】
2020503049.tif 000051
【化４７】
2020503049.tif 000052
に示され、
Ｚは、４〜６ヌクレオチド長、任意選択により４または６ヌクレオチド長のヌクレオチドループを表し；ｐおよびｑは、それぞれ独立に、０〜２（両端を含む）の整数であり、任意選択により０であり；ｐ’は、０〜４（両端を含む）の整数であり、任意選択により０であり；ｑ’は、２〜４（両端を含む）の整数であり、任意選択により２であり；ｘは、０〜６（両端を含む）の整数であり、任意選択により２であり；ｙは、０〜６（両端を含む）の整数であり、任意選択により４であり；ｕは、０〜４（両端を含む）の整数であり、任意選択により２であり；ｓは、２〜６（両端を含む）の整数であり、任意選択により４であり；ｍは、２０〜４０（両端を含む）の整数であり；ｎは、３０〜７０（両端を含む）の整数であり；Ｂ１およびＢ２は、それぞれ独立に、核酸塩基であり；（Ｎ）ｍおよび（Ｎ）ｎ中のＮは、それぞれ独立にヌクレオチド残基であり：Ｎ１およびＮ２は、それぞれ独立にヌクレオチド残基であり；Ｎ−−−−Ｎは、独立に、２つの相補的なヌクレオチド、任意選択により水素結合で塩基対合した２つの相補的なヌクレオチドを表し；
【化４８】
2020503049.tif 000053
は、それぞれホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホノアセテート結合、チオホスホノアセテート結合、またはホスホロアミデート結合を表す。
【００９８】
本発明の別の態様は、式ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、またはＶＩＩのいずれかに示される配置が、架橋反応における副生成物を回避するため、およびホモ二量化なしにホモ二官能化反応を可能にするために有利であり得るという認識である。２つのヘテロ二量体鎖の予備アニーリングにより、反応性基が所望のカップリングに向けられ、ガイド分子中の他の潜在的反応性基との反応が回避される。
【００９９】
本発明の別の態様は、反応性基に近接したヒドロキシル基（例えば、第１の断片の３’末端の２’−ＯＨ）が修飾されて特定の副生成物の形成が回避されるのが好ましいという認識である。特に、以下に例示されるように、本発明者らは、アミン官能化断片が本明細書に記載される尿素系架橋方法において使用されるときにカルバメート副生成物が形成され得ることを見出した：
【化４９】
2020503049.tif 000054
【０１００】
したがって、特定の実施形態では、第１の断片の３’末端の２’−ＯＨは、カルバメート副生成物の形成を防止するために（例えば、Ｈ、ハロゲン、Ｏ−Ｍｅなどに）改変される。例えば、２’−ＯＨは、２’−Ｈに改変される：
【化５０】
2020503049.tif 000055
【０１０１】
次に架橋に目を向けると、架橋剤連結部分、官能基、および反応性基の選択にはいくつかの考慮事項が関連している。これらの中には、リンカーの大きさ、水溶液への溶解度、および生体適合性、ならびに官能基の反応性、架橋に最適な反応条件、および架橋に必要な任意の試薬、触媒などがある。
【０１０２】
一般に、リンカーの大きさおよび溶解度は、所望のＲＮＡ二次構造を保存または達成するため、およびガイド分子とＲＮＡガイドヌクレアーゼとの間の複合体の破壊または不安定化を回避するために選択される。これら２つの因子は、特定の長さを超える有機リンカーは水溶液に溶けにくい可能性があり、かつガイド分子内の周囲のヌクレオチドおよび／またはガイド分子と複合体を形成したＲＮＡガイドヌクレアーゼのアミノ酸と立体的に干渉し得る限りにおいて幾分関連している。
【０１０３】
様々なリンカーが、本開示の様々な実施形態における使用に適している。特定の実施形態は、ポリビニルエーテル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、およびそれらのコポリマーを含むがこれらに限定されない一般的な連結部分を利用する。いくつかの実施形態では、リンカーは使用されない。
【０１０４】
官能基に関しては、二官能性架橋剤がガイド断片の５’および３’末端を連結するために使用される実施形態では、連結されるべきガイド断片の３’または５’末端は、架橋剤の反応性基と反応する官能基で修飾される。一般に、これらの修飾は、アミン、スルフヒドリル、カルボキシル、ヒドロキシル、アルケン（例えば、末端アルケン）、アジド、および／または他の適切な官能基のうちの１つまたは複数を含む。多官能性（例えば、二官能性）架橋剤もまた、当技術分野において一般的に知られており、ヘテロ官能性またはホモ官能性のいずれでもよく、かつイソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、ＮＨＳエステル、塩化スルホニル、トシルエステル、トレシルエステル、アルデヒド、アミン、エポキシド、カーボネート（例えば、ビス（ｐ−ニトロフェニル）カーボネート）、アリールハライド、アルキルハライド、イミドエステル、カルボキシレート、アルキルホスフェート、無水物、フルオロフェニルエステル、ＨＯＢｔエステル、ヒドロキシメチルホスフィン、Ｏ−メチルイソ尿素、ＤＳＣ、ＮＨＳカルバメート、グルタルアルデヒド、活性二重結合、環状ヘミアセタール、ＮＨＳカーボネート、イミダゾールカルバメート、アシルイミダゾール、メチルピリジニウムエーテル、アズラクトン、シアネートエステル、環状イミドカーボネート、クロロトリアジン、デヒドロアゼピン、６−スルホ−シトシン誘導体、マレイミド、アジリジン、ＴＮＢチオール、エルマン試薬、過酸化物、ビニルスルホン、フェニルチオエステル、ジアゾアルカン、ジアゾアセチル、エポキシド、ジアゾニウム、ベンゾフェノン、アントラキノン、ジアゾ誘導体、ジアジリン誘導体、ソラレン誘導体、アルケン、フェニルボロン酸などを含むがこれらに限定されない任意の適切な官能基を含み得る。
【０１０５】
これらおよび他の架橋化学は当技術分野で公知であり、その全体の参照によりあらゆる目的のために本明細書に援用される、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓによって出版された、Ｇｒｅｇ  Ｔ．ＨｅｒｍａｎｓｏｎによるＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３ｒｄ  Ｅｄ．２０１３を含む文献に要約されている。
【０１０６】
本開示によって提供される方法によって合成されるガイド分子を含む組成物は、特定の実施形態では、ｎ−１種、切断種、ｎ＋１種、ガイド断片ホモ二量体、未反応官能化ガイド断片などを含む不所望の種による汚染が低レベルである、高純度の所望のガイド分子反応生成物を特徴とする。本開示の特定の実施形態では、合成ガイド分子を含む精製組成物は、組成物中に複数の種を含み得る（すなわち、ガイド分子が、質量またはモル濃度で、組成物中で最も一般的な種である）。あるいは、またはさらに、本開示の実施形態による組成物は、所望の長さ（例えば参照ガイド分子配列に対して５’末端での切断がない）および所望の配列（例えば、参照ガイド分子配列の５’配列を含む）を有するガイド分子を７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、および／または９９％以上含み得る。
【０１０７】
例えば、いくつかの実施形態では、本開示によるガイド分子を含む組成物（例えば、本明細書に記載の適切な架橋化学を用いて架橋された断片を含むガイド分子）は、参照ガイド分子配列に対して５’末端に切断を含むガイド分子を約２０％未満、１５％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、またはそれ未満含む。あるいは、またはさらに、本開示によるガイド分子を含む組成物（例えば、本明細書に記載の適切な架橋化学を用いて架橋された断片を含むガイド分子）は、参照ガイド分子配列の対応する５’配列と１００％同一である５’配列（例えば、ガイド分子のヌクレオチド１〜３０、１〜２５、または１〜２０を含むか、またはそれからなる５’配列）を有するガイド分子を少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％を含む。いくつかの実施形態では、組成物が、参照ガイド分子配列の対応する５’配列に対して１００％未満の同一性である５’配列を有するガイド分子を含み、そしてそのようなガイド分子が０．１％以上のレベルで存在する場合、そのようなガイド分子は、潜在的な標的外部位の標的ドメインを含まない。いくつかの実施形態では、本開示によるガイド分子を含む組成物は、（参照ガイド分子配列に対して）５’末端に切断を含まないガイド分子を少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上含み、かつそのようなガイド分子（すなわち、５’末端に切断を含まないそのようなガイド分子）は、参照ガイド分子配列の対応する５’配列と１００％同一である５’配列（例えば、ガイド分子のヌクレオチド１〜３０、１〜２５、または１〜２０を含むか、またはそれからなる５’配列）を少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％有し、そしてこの組成物が、参照ガイド分子配列の対応する５’配列に対して１００％未満の同一性である５’配列を有するガイド分子を含み、そしてそのようなガイド分子が０．１％以上のレベルで存在する場合、そのようなガイド分子は、潜在的な標的外部位の標的ドメインを含まない。いくつかの実施形態では、本開示によるガイド分子を含む組成物は、参照ガイド分子配列に対して５’末端に切断を含み、かつ許容可能なレベルの活性／有効性を示すガイド分子を約１０％未満含む。いくつかの実施形態では、本開示によるガイド分子を含む組成物は、（ｉ）参照ガイド分子配列の対応する５’配列と１００％同一である５’配列（例えば、ガイド分子のヌクレオチド１〜３０、１〜２５、１〜２０を含むか、またはそれからなる５’配列）を有する少なくとも約９９％のガイド分子を含み、かつ（ｉｉ）組成物が、参照ガイド分子配列の対応する５’配列に対して１００％未満の同一性である５’配列を有するガイド分子を含み、そしてそのようなガイド分子が０．１％以上のレベルで存在する場合、そのようなガイド分子は、潜在的な標的外部位の標的ドメインを含まず、組成物は、許容可能なレベルの特異性／安全性を示す。組成物の純度は、組成物中の全ガイド分子の（質量またはモル濃度による）割合として、組成物中の全ＲＮＡまたは全核酸の（質量またはモル濃度による）割合として、組成物中のすべての溶質の（質量による）割合として、および／または組成物の全質量の割合として表すことができる。
【０１０８】
本開示によるガイド分子を含む組成物の純度は、当技術分野において公知の任意の適切な手段によって評価される。例えば、所望のガイド分子種の相対存在量は、ゲル電気泳動法によって定性的または半定量的に評価することができる。あるいは、またはさらに、所望のガイド分子種の純度は、クロマトグラフィー（例えば、液体クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ、ガスクロマトグラフィー）、分光測定（例えば、飛行時間、セクターフィールド、四重極質量、イオントラップ、オービトラップ、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴、または他の技術に基づいても基づかなくてもよい質量分析）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法（例えば、可視、赤外線、または紫外線）、熱安定性法（例えば、示差走査熱量測定など）、配列決定法（例えば、テンプレート切り替えオリゴヌクレオチドを用いる）、およびそれらの組み合わせ（例えばクロマトグラフィー−質量分析など）によって評価される。
【０１０９】
本明細書で提供される合成ガイド分子は、任意の他のガイド分子（例えば、ｇＲＮＡ）と実質的に同じ様式で機能し、一般的には、（ａ）Ｃａｓ９などのＲＮＡガイドヌクレアーゼと複合体を形成すること、（ｂ）ガイド分子の標的化配列に相補的な領域およびＲＮＡ誘導性ヌクレアーゼによって認識されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む標的配列と相互作用すること、および任意選択により（ｃ）標的配列内またはそれに隣接したＤＮＡを、例えば、ガイド分子およびＲＮＡガイドヌクレアーゼを含む細胞内で機能するＤＮＡ修復経路によって修復され得るＤＮＡ二本鎖切断、一本鎖切断などを生じさせて改変することによって機能する。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のガイド分子、例えば本明細書に記載の方法を使用して作製されたガイド分子は、ＲＮＡに作用する酵素（例えば、逆転写酵素）の基質として作用することができる。理論に拘束されることを望むものではないが、本明細書に記載のガイド分子内に存在する架橋剤は、本開示の方法による予備アニーリングによって促進される反応性末端の密接な並置により、そのようなプロセッシブ酵素（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｅ  ｅｎｚｙｍｅ）に適合性であり得る。
【０１１１】
上記の例示的な実施形態は、２つのガイド断片からのガイド分子の構築に対する本明細書に記載の合成および架橋方法の適用に焦点を合わせた。しかしながら、本明細書に記載の方法は、様々な用途を有し、その多くは当業者に明らかであろう。これらの用途は、本開示の範囲内である。一例として、本開示の方法は、ガイド分子に対する異種配列の連結に利用することができる。異種配列には、あらゆる目的のために参照により本明細書に援用される、Ｃｏｔｔａ−Ｒａｍｕｓｉｎｏらによる国際公開第２０１７／１８０７１１号パンフレットに記載されているようなＤＮＡドナーテンプレートが含まれ得るがこれに限定されない（例えば、共有結合したテンプレート核酸、およびガイド分子の３’末端へのテンプレートのライゲーションを容易にするためのスプリントオリゴ（ｓｐｌｉｎｔ  ｏｌｉｇｏ）の使用を記載した、セクションＩ、２３頁“ｇＲＮＡ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ”を参照）。異種配列はまた、上記の国際公開第２０１７／１８０７１１号パンフレットのセクションＩにも記載されているように、ＭＳ２ループなどのペプチドＤＮＡまたはＲＮＡ結合ドメインによって認識される核酸配列も含み得る。
【０１１２】
この概略は、ガイド分子の合成に関連する特定の原理、およびそのようなガイド分子を含む組成物を例示するほんの一握りの例示的な実施形態に焦点を当ててきた。しかしながら、明確にするために、本開示は、記載されていないが当業者に明らかであろう改変および変形を包含する。それを念頭に置いて、以下の開示は、ゲノム編集システムの動作原理をより一般的に説明することを意図している。以下は限定として理解されるべきではなく、むしろ本開示と組み合わせて、本開示の範囲内であるさらなる実施および改変について当業者に知らせるゲノム編集システムの特定の原理の例示である。
【０１１３】
ゲノム編集システム
用語「ゲノム編集システム」は、ＲＮＡ誘導ＤＮＡ編集活性を有する任意のシステムを指す。本開示のゲノム編集システムは、天然起源のＣＲＩＳＰＲシステムに適合する少なくとも２つの構成要素：ガイド分子（例えば、ガイドＲＮＡまたはｇＲＮＡ）およびＲＮＡ誘導ヌクレアーゼを含む。これらの２つの構成要素は、特定の核酸配列と会合して、その核酸配列中またはその付近のＤＮＡを、例えば、一本鎖切断（ＳＳＢまたはニック）、二本鎖切断（ＤＳＢ）、および／または点突然変異の１つまたは複数を生じさせることによって編集することができる複合体を形成する。
【０１１４】
天然に存在するＣＲＩＳＰＲシステムは、２つのクラスおよび５つのタイプに進化的に分類され（参照により本明細書に援用される、Ｍａｋａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１１  Ｊｕｎ；９（６）：４６７−４７７（Ｍａｋａｒｏｖａ））、本開示のゲノム編集システムは、任意のタイプまたはクラスの天然に存在するＣＲＩＳＰＲシステムの構成要素を適合させることができ、本明細書に提示される実施形態は、一般にクラス２、およびＩＩ型またはＶ  ＣＲＩＳＰＲシステムによって実施され得る。ＩＩ型およびＶ型を包含するクラス２システムは、比較的大きなマルチドメインＲＮＡガイドヌクレアーゼタンパク質（例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１）、およびｃｒＲＮＡの標的（またはスペーサー）配列に相補的な特定の遺伝子座と会合し（すなわち、標的）、これを切断するリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する１つまたは複数のガイドＲＮＡ（例えば、ｃｒＲＮＡおよび任意選択によるｔｒａｃｒＲＮＡ）を特徴とする。本開示によるゲノム編集システムは、細胞ＤＮＡ配列を同様に標的として編集するが、天然に存在するＣＲＩＳＰＲシステムとは著しく異なる。例えば、本明細書に記載の単分子ガイド分子は天然には存在せず、そして本開示によるガイド分子およびＲＮＡガイドヌクレアーゼの両方は、任意の数の天然に存在しない修飾を組み込むことができる。
【０１１５】
ゲノム編集システムは、様々な方法で実施することができ（例えば、細胞または対象に投与または送達することができ）、かつ異なる実施は異なる用途に適し得る。例えば、ゲノム編集システムは、特定の実施形態では、タンパク質／ＲＮＡ複合体（リボ核タンパク質、またはＲＮＰ）として実施され、この複合体は、薬学的に許容される担体および／またはカプセル化剤、例えば脂質またはポリマー微粒子もしくはナノ粒子、ミセル、リポソームなどを任意選択により含む医薬組成物に含めることができる。特定の実施形態では、ゲノム編集システムは、上記のＲＮＡガイドヌクレアーゼおよびガイド分子構成要素（任意選択により、１つまたは複数の追加の構成要素を含む）をコードする１つまたは複数の核酸として実施され；特定の実施形態では、ゲノム編集システムは、そのような核酸を含む１つまたは複数のベクター、例えばアデノ随伴ウィルスなどのウィルスベクターとして実施され；特定の実施形態では、ゲノム編集システムは、前述のいずれかの組合せとして実施される。本明細書に記載の原理に従って動作する追加のまたは変更された実施は、当業者に明らかであり、本開示の範囲内である。
【０１１６】
本開示のゲノム編集システムは、単一の特定のヌクレオチド配列を標的としてもよいし、または２つ以上のガイド分子の使用によって２つ以上の特定のヌクレオチド配列を標的としてもよく、並列に編集することができることに留意すべきである。複数のガイド分子の使用は、本開示を通して「多重化」と呼ばれ、目的の複数の無関係の標的配列を標的化するために、または単一標的ドメイン内に複数のＳＳＢもしくはＤＳＢを形成するために、場合によっては、そのような標的ドメイン内で特定の編集を行うために利用することができる。例えば、参照により本明細書に援用される、Ｍａｅｄｅｒらによる国際公開第２０１５／１３８５１０号パンフレット（Ｍａｅｄｅｒ）には、潜在的なスプライス部位を生じさせ、これにより遺伝子の機能を低下または消失させるヒトＣＥＰ２９０遺伝子における点突然変異（Ｃ．２９９１＋１６５５Ａ〜Ｇ）を修正するためのゲノム編集システムが記載されている。Ｍａｅｄｅｒのゲノム編集システムは、点突然変異の両側の（すなわち、隣接する）配列を標的とする２つのガイドＲＮＡを利用して、突然変異に隣接するＤＳＢを形成する。これにより、突然変異を含む介在配列の欠失が促進され、それによって潜在的なスプライス部位が排除され、そして正常な遺伝子機能が回復する。
【０１１７】
別の例として、参照により本明細書に援用される、Ｃｏｔｔａ−Ｒａｍｕｓｉｎｏらによる国際公開第２０１６／０７３９９０号パンフレット（「Ｃｏｔｔａ−Ｒａｍｕｓｉｎｏ」）には、「二重ニッカーゼシステム（ｄｕａｌ−ｎｉｃｋａｓｅ  ｓｙｓｔｅｍ）」と呼ばれる配置であるＣａｓ９ニッカーゼ（Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｄ１０Ａなどの一本鎖ニックを生じさせるＣａｓ９）との組み合わせにおいて２つのｇＲＮＡを利用するゲノム編集システムが記載されている。Ｃｏｔｔａ−Ｒａｍｕｓｉｎｏの二重ニッカーゼシステムは、１つまたは複数のヌクレオチドによってオフセットされた目的の配列の反対側の鎖に２つのニックを生じさせるように構成され、これらのニックが結合して、オーバーハング（Ｃｏｔｔａ−Ｒａｍｕｓｉｎｏの場合は５’であるが、３’オーバーハングも可能である）を有する二本鎖切断を生じさせる。オーバーハングは、次に、いくつかの状況において相同組換え修復事象を促進し得る。そして、別の例として、Ｐａｌｅｓｔｒａｎｔらによる国際公開第２０１５／０７００８３号パンフレット（参照により本明細書に援用される、「Ｐａｌｅｓｔｒａｎｔ」）には、Ｃａｓ９をコードするヌクレオチド配列を標的とするｇＲＮＡ（「調節ＲＮＡ（ｇｏｖｅｒｎｉｎｇ  ＲＮＡ）」と呼ばれる）が記載され、ｇＲＮＡは、例えばいくつかのウィルスによって形質導入された細胞においてＣａｓ９の一過性の発現を可能にし、一過性の発現でない場合は構成的に発現させるであろう１つまたは複数のさらなるｇＲＮＡを含むゲノム編集システムに含めることができる。これらの多重化用途は、限定的ではなく例示的であることを意図しており、当業者であれば、他の多重化用途が一般に本明細書に記載のゲノム編集システムと適合性であることを理解するであろう。
【０１１８】
ゲノム編集システムは、場合によっては、ＮＨＥＪまたはＨＤＲなどの細胞ＤＮＡ二本鎖切断機構によって修復される二本鎖切断を形成することができる。これらの機構は、例えば、Ｄａｖｉｓ  ＆  Ｍａｉｚｅｌｓ，ＰＮＡＳ，１１１（１０）：Ｅ９２４−９３２，Ｍａｒｃｈ  １１，２０１４（Ｄａｖｉｓ）（Ａｌｔ−ＨＤＲを記載）；Ｆｒｉｔ  ｅｔ  ａｌ．ＤＮＡ  Ｒｅｐａｉｒ  １７（２０１４）８１−９７（Ｆｒｉｔ）（Ａｌｔ−ＮＨＥＪを記載）；およびＩｙａｍａ  ａｎｄ  Ｗｉｌｓｏｎ  ＩＩＩ，ＤＮＡ  Ｒｅｐａｉｒ（Ａｍｓｔ．）２０１３−Ａｕｇ；１２（８）：６２０−６３６（Ｉｙａｍａ）（一般に標準ＨＤＲおよびＮＨＥＪ経路を記載）による文献を通じて記載されている。
【０１１９】
ゲノム編集システムがＤＳＢを形成することによって機能する場合、そのようなシステムは、二本鎖切断修復の特定のモードまたは特定の修復結果を促進または容易にする１つまたは複数の構成要素を任意選択により含む。例えば、Ｃｏｔｔａ−Ｒａｍｕｓｉｎｏには、一本鎖オリゴヌクレオチド「ドナーテンプレート」が付加されているゲノム編集システムも記載され；ドナーテンプレートは、ゲノム編集システムによって切断される細胞ＤＮＡの標的領域に組み込まれ、そして標的配列の変化をもたらし得る。
【０１２０】
特定の実施形態では、ゲノム編集システムは、一本鎖または二本鎖の切断を引き起こすことなく、標的配列を改変するか、または標的配列内もしくはその近傍の遺伝子の発現を変更する。例えば、ゲノム編集システムは、ＤＮＡに作用する機能的ドメインに融合したＲＮＡガイドヌクレアーゼを含み得、それによって標的配列またはその発現を変更する。一例として、ＲＮＡガイドヌクレアーゼは、シチジンデアミナーゼ機能ドメインに結合（例えば、融合）することができ、かつ標的のＣからＡへの置換を生じさせることによって機能し得る。例示的なヌクレアーゼ／デアミナーゼ融合は、参照により本明細書に援用される、Ｋｏｍｏｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ５３３，４２０−４２４（１９  Ｍａｙ  ２０１６）（「Ｋｏｍｏｒ」）に記載されている。あるいは、ゲノム編集システムは、ｄｅａｄＣａｓ９（ｄＣａｓ９）などの切断不活性化（すなわち、「ｄｅａｄ」）ヌクレアーゼを利用することができ、細胞ＤＮＡの１つまたは複数の標的領域に安定した複合体を形成することによって機能することができ、それによって、ｍＲＮＡ転写、クロマチン再構築などを含むがこれらに限定されない標的領域を伴う機能を阻害する。
【０１２１】
ガイド分子
用語「ガイド分子」は、本明細書では、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１などのＲＮＡガイドヌクレアーゼと、細胞内のゲノムまたはエピソーム配列などの標的配列との特異的会合（または「標的化」）を促進する任意の核酸を指すために使用される。ガイド分子は、ＲＮＡ分子またはハイブリッドＲＮＡ／ＤＮＡ分子であり得る。ガイド分子は、単分子（単分子を含み、キメラとも呼ばれる）、またはモジュラー（２つ以上、典型的には２つのｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡなどの別々の分子を含み、通常は、例えば二重鎖化によって互いに会合している）であり得る。ガイド分子およびそれらの構成部分は、例えば、参照により本明細書に援用される、Ｂｒｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  ５６（２），３３３−３３９，Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２３，２０１４（Ｂｒｉｎｅｒ））およびＣｏｔｔａ−Ｒａｍｕｓｉｎｏの文献を通じて記載されている。
【０１２２】
細菌および古細菌において、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムは、一般に、Ｃａｓ９などのＲＮＡガイドヌクレアーゼタンパク質、外来配列に相補的な５’領域を含むＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、およびトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の３’領域に相補的であり、それと二重鎖を形成する５’領域を含む該ｃｒＲＮＡを含む。いかなる理論にも拘束されることを意図するものではないが、この二重鎖は、Ｃａｓ９／ガイド分子複合体の形成を促進し、その活性に必要であると考えられる。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムは、遺伝子編集における使用に適合されたため、１つの非限定的な例では、（その３’末端における）ｃｒＲＮＡの相補的な領域と（その５’末端における）ｔｒａｃｒＲＮＡの相補的な領域とを架橋する４つのヌクレオチド（例えば、ＧＡＡＡ）、「テトラループ」、または「リンカー」配列によってｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを単一の単分子またはキメラガイドＲＮＡに結合できることが見いだされた（すべてが参照により本明細書に援用される、Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１３  Ｆｅｂ  １５；３３９（６１２１）：８２３−８２６（“Ｍａｌｉ”）；Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３  Ｍａｒ；３１（３）：２３３−２３９（“Ｊｉａｎｇ”）；およびＪｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｕｇ．１７；３３７（６０９６）：８１６−８２１（“Ｊｉｎｅｋ”））。
【０１２３】
ガイド分子は、単分子またはモジュラーにかかわらず、編集が望ましい細胞のゲノム内のＤＮＡ配列などの標的配列内の標的ドメインに完全にまたは部分的に相補的な「標的ドメイン」を含む。標的ドメインは、文献においては、「ガイド配列」（参照により本明細書に援用される、Ｈｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３  Ｓｅｐ；３１（９）：８２７−８３２，（“Ｈｓｕ”））、「相補的な領域」（Ｃｏｔｔａ−Ｒａｍｕｓｉｎｏ）、「スペーサー」（Ｂｒｉｎｅｒ）、および総称としての「ｃｒＲＮＡ」（Ｊｉａｎｇ）を含むがこれに限定されない様々な名称で呼ばれている。与えられる名称にかかわらず、標的ドメインは、典型的には１０〜３０ヌクレオチド長であり、特定の実施形態では１６〜２４ヌクレオチド長（例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４ヌクレオチド長）であり、Ｃａｓ９ガイド分子の場合にはその５’末端またはその近傍にあり、Ｃｐｆ１ガイド分子の場合には３’末端またはその近傍にある。
【０１２４】
標的ドメインに加えて、ガイド分子は、典型的には（必ずしもではないが、以下で論じられるように）ガイド分子／Ｃａｓ９複合体の形成または活性に影響を及ぼし得る複数のドメインを含む。例えば、上述のように、ガイド分子の第１および第２の相補的なドメインによって形成された二重鎖構造（反復：抗反復二重鎖とも呼ばれる）は、Ｃａｓ９の認識（ＲＥＣ）ローブと相互作用し、かつＣａｓ９／ガイド分子複合体の形成を媒介し得る（共に参照により本明細書に援用される、Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １５６，９３５−９４９，Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２７，２０１４（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ  ２０１４）およびＮｉｓｈｉｍａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １６２，１１１３−１１２６，Ａｕｇｕｓｔ  ２７，２０１５（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ  ２０１５））。
【０１２５】
第１および第２の相補性ドメインと共に、Ｃａｓ９ガイド分子は、典型的にはインビボではヌクレアーゼ活性に関与するがインビトロでは必ずしも関与しない２つ以上のさらなる二重鎖領域を含む（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ  ２０１５）。第２の相補性ドメインの３’部分近傍の第１のステムループは、「近位ドメイン」、（Ｃｏｔｔａ−Ｒａｍｕｓｉｎｏ）「ステムループ１」（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ  ２０１４および２０１５）、および「ネクサス」（Ｂｒｉｎｅｒ）と様々に呼ばれる。１つまたは複数のさらなるステムループ構造は、一般的には、ガイド分子の３’末端近傍に存在し、その数は種によって異なり；Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｇＲＮＡは、典型的には（反復：抗反復二重鎖を含む合計４つのステムループ構造では）２つの３’ステムループを含み、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）および他の種は、（合計３つのステムループ構造では）唯１つを有する。種によって分類され保存されたステムループ構造（およびより一般的にはガイド分子構造）の説明は、Ｂｒｉｎｅｒに示されている。
【０１２６】
前述の説明は、Ｃａｓ９と共に使用するためのガイド分子に焦点を当ててきたが、これまでに説明したものとはいくつかの点で異なるガイド分子を利用する他のＲＮＡガイドヌクレアーゼが発見または発明された（または将来的に発見または発明され得る）ことを理解されたい。例えば、Ｃｐｆ１（「Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｅｌｌａ  １からのＣＲＩＳＰＲ」）は、機能するためにｔｒａｃｒＲＮＡを必要としない、最近見いだされたＲＮＡガイドヌクレアーゼである（参照により本明細書に援用される、Ｚｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｃｅｌｌ  １６３，７５９−７７１  Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２２，２０１５（Ｚｅｔｓｃｈｅ  Ｉ））。Ｃｐｆ１ゲノム編集システムで使用するためのガイド分子は、一般に、標的ドメインおよび相補性ドメイン（代わりに「ハンドル」とも呼ばれる）を含む。また、Ｃｐｆ１と共に使用するためのガイド分子において、標的ドメインは、通常は、Ｃａｓ９ガイド分子に関連して上述した５’末端ではなく、３’末端またはその近傍に存在する（ハンドルは、Ｃｐｆ１ガイド分子の５’末端またはその近傍にある）ことに留意されたい。
【０１２７】
しかしながら、当業者であれば、異なる原核生物種由来のガイド分子間、またはＣｐｆ１とＣａｓ９ガイド分子との間に構造的差異が存在し得るが、ガイド分子が動作する原理は一般的に一貫していることを理解するであろう。この動作の一貫性のために、ガイド分子は、広い意味でそれらの標的ドメイン配列によって定義することができ、当業者であれば、所与の標的ドメイン配列が、単分子もしくはキメラガイド分子を含む任意の適切なガイド分子、または１つまたは複数の化学修飾および／もしくは配列の改変（置換、追加のヌクレオチド、切断など）を含むガイド分子に組み込むことができることを理解するであろう。したがって、本開示における提示を簡潔にするために、ガイド分子はそれらの標的ドメイン配列に関してのみ記載され得る。
【０１２８】
より一般的には、当業者であれば、本開示のいくつかの態様が、複数のＲＮＡガイドヌクレアーゼを使用して実施することができるシステム、方法、および組成物に関することを理解するであろう。この理由から、特段の記載がない限り、ガイド分子という用語は、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１の特定の種と適合性であるガイド分子だけではなく、任意のＲＮＡガイドヌクレアーゼと共に使用することができる任意の適切なガイド分子（例えば、ｇＲＮＡ）を包含することを理解されるべきである。例示として、ガイド分子という用語は、特定の実施形態では、ＩＩ型もしくはＶ型ＣＲＩＳＰＲシステムなどのクラス２ＣＲＩＳＰＲシステムにおいて生じる任意のＲＮＡガイドヌクレアーゼ、またはそれに由来するかもしくはそれから作製されたＲＮＡガイドヌクレアーゼと共に使用するためのガイド分子を含み得る。
【０１２９】
架橋ガイド分子
本開示の特定の実施形態は、例えば、非ヌクレオチド化学結合を介して架橋されているガイド分子に関する。上記のように、結合の位置は、ガイド分子のステムループ構造内であり得る。いくつかの実施形態では、ガイド分子は含む。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、単分子ガイド分子は、５’から３’に：
第１のガイド分子断片であって、
標的ドメイン配列；
第１の下部ステム配列；
第１のバルジ配列；
第１の上部ステム配列
を含む第１のガイド分子断片；
非ヌクレオチド化学結合；ならびに
第２のガイド分子断片であって、
第２の上部ステム配列；
第２のバルジ配列；および
第２の下部ステム配列
を含む第２のガイド分子断片
を含み、
ここで、（ａ）第１の下部ステム配列中の少なくとも１つのヌクレオチドは、第２の下部ステム配列中のヌクレオチドと塩基対合し、かつ（ｂ）第１の上部ステム配列中の少なくとも１つのヌクレオチドは、第２の上部ステム配列中のヌクレオチドと塩基対合する。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、ガイド分子は、第１の上部ステム配列と第２の上部ステム配列との間にテトラループ配列を含まない。いくつかの実施形態では、第１および／または第２の上部ステム配列は、４〜２２個（両端を含む）のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、第１および／または第２の上部ステム配列は、１〜２２個（両端を含む）のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、第１および／または第２の上部ステム配列は、４〜２２個（両端を含む）のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、第１および第２の上部ステム配列は、８〜２２個（両端を含む）のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、第１および第２の上部ステム配列は、１２〜２２個（両端を含む）のヌクレオチドを含む。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、ガイド分子は、第１および第２のガイド分子断片間の二重鎖の形成のためのギブス自由エネルギー（ΔＧ）が、２つの第１のガイド分子断片間の二重鎖の形成のためのΔＧよりも小さいことを特徴とする。いくつかの実施形態では、（ｉ）第１および第２の上部ステム配列間および（ｉｉ）第１および第２の下部ステム配列間の５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、または９５％超の塩基対合によって特徴付けられる、第１および第２のガイド分子断片間の二重鎖の形成のためのΔＧは、（ｉ）と（ｉｉ）との間の５０％未満、６０％未満、７０％未満、８０％未満、９０％未満、または９５％未満の塩基対合によって特徴付けられる二重鎖の形成のためのΔＧよりも小さい。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、合成ガイド分子は、式：
【化５１】
2020503049.tif 000056
の合成ガイド分子であり、
式中、
（Ｎ）ｃおよび（Ｎ）ｔ中のＮは、それぞれ独立に、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホノアセテート結合、チオホスホノアセテート結合、またはホスホロアミデート結合を介してその隣接ヌクレオチドにそれぞれ独立に結合したヌクレオチド残基、任意選択により修飾ヌクレオチド残基であり；
（Ｎ）ｃは、（Ｎ）ｔの５’領域に相補的または部分的に相補的であり、かつそれと二重鎖を形成する３’領域を含み；
ｃは、２０以上の整数であり；
ｔは、２０以上の整数であり；
リンカーは、非ヌクレオチド化学結合であり；
Ｂ１およびＢ２は、それぞれ独立に、核酸塩基であり；
Ｒ２’およびＲ３’は、それぞれ独立に、Ｈ、ＯＨ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ＮＨ２、ＳＨ、Ｓ−Ｒ’、またはＯ−Ｒ’であり、ここで、Ｒ’は、それぞれ独立に、保護基またはアルキル基であり、ここで、アルキル基は、任意選択により置換されてもよく；かつ
【化５２】
2020503049.tif 000057
は、それぞれ独立に、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホノアセテート結合、チオホスホノアセテート結合、またはホスホロアミデート結合を表す。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、（Ｎ）ｔおよび（Ｎ）ｃの二重鎖領域は、表４に列挙された配列を含む。
【０１３５】
【表５】
2020503049.tif 000058
【０１３６】
【表６】
2020503049.tif 000059
【０１３７】
いくつかの実施形態では、ガイド分子は、式：
【化５３】
2020503049.tif 000060
のものであり、
式中、
Ｎ、Ｂ１、Ｂ２、Ｒ２’、Ｒ３’、リンカー、および
【化５４】
2020503049.tif 000061
は上記の通り定義され；かつ
Ｎ−−−−Ｎは、独立に、２つの相補的なヌクレオチド、任意選択により水素結合塩基対である２つの相補的なヌクレオチドを表し；
ｐおよびｑは、それぞれ独立に、０〜６（両端を含む）の整数であり、かつｐ＋ｑは、０〜６（両端を含む）の整数であり；
ｕは、２〜２２（両端を含む）の整数であり；
ｓは、１〜１０（両端を含む）の整数であり；
ｘは、１〜３（両端を含む）の整数であり；
ｙは、＞ｘであり、かつ３〜５（両端を含む）の整数であり；
ｍは、１５以上の整数であり；かつ
ｎは、３０以上の整数である。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、（Ｎ‐‐‐Ｎ）ｕおよび（Ｎ‐‐‐Ｎ）ｓは、３つ以上のヌクレオチドの同一配列を含まない。いくつかの実施形態では、（Ｎ‐‐‐Ｎ）ｕおよび（Ｎ‐‐‐Ｎ）ｓは、４つ以上のヌクレオチドの同一配列を含まない。いくつかの実施形態では、（Ｎ‐‐‐Ｎ）ｓは、Ｎ’ＵＵＵ、ＵＮ’ＵＵ、ＵＵＮ’Ｕ、またはＵＵＵＮ’配列を含み、（Ｎ‐‐‐Ｎ）ｕは、ＵＵＵＵ配列を含み、ここで、Ｎ’は、Ａ、Ｇ、またはＣである。いくつかの実施形態では、（Ｎ‐‐‐Ｎ）ｓは、ＵＵＵＵ配列を含み、（Ｎ‐‐‐Ｎ）ｕは、Ｎ’ＵＵＵ、ＵＮ’ＵＵ、ＵＵＮ’Ｕ、またはＵＵＵＮ’配列を含み、ここで、Ｎ’は、Ａ、Ｇ、またはＣである。いくつかの実施形態では、Ｎ’は、Ａである。いくつかの実施形態では、Ｎ’は、Ｇである。いくつかの実施形態では、Ｎ’は、Ｃである。
【０１３９】
いくつかの態様では、ガイド分子は、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）またはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９システムで使用されるｇＲＮＡに基づく。いくつかの実施形態では、ガイド分子は、式：
【化５５】
2020503049.tif 000062
のものであり、
式中：
ｕ’は、２〜２２（両端を含む）の整数であり；ｐ’およびｑ’は、それぞれ独立に、０〜６（両端を含む）の整数であり、ｐ’＋ｑ’は、０〜６（両端を含む）の整数である。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、ガイド分子は、式：
【化５６】
2020503049.tif 000063
のものまたはそのコバリアントである。いくつかの実施形態では、（Ｎ−−−−Ｎ）ｕ’は、式：
【化５７】
2020503049.tif 000064
のものまたはそのコバリアントである。いくつかの実施形態では、（Ｎ−−−−Ｎ）ｕ’は、式：
【化５８】
2020503049.tif 000065
（ここで、Ｂ１は、シトシン残基であり、Ｂ２は、グアニン残基である）のものまたはそのコバリアントである。いくつかの実施形態では、（Ｎ−−−−Ｎ）ｕ’は、式：
【化５９】
2020503049.tif 000066
（ここで、Ｂ１は、グアニン残基であり、Ｂ２は、シトシン残基である）のものまたはそのコバリアントである。いくつかの実施形態では、（Ｎ−−−−Ｎ）ｕ’は、式：
【化６０】
2020503049.tif 000067
（ここで、Ｂ１は、グアニン残基であり、Ｂ２は、シトシン残基である）のものまたはそのコバリアントである。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、ガイド分子は、式：
【化６１】
2020503049.tif 000068
のものまたはそのコバリアントである。いくつかの実施形態では、（Ｎ−−−−Ｎ）ｕ’は、式：
【化６２】
2020503049.tif 000069
【化６３】
2020503049.tif 000070
のものまたはそのコバリアントである。いくつかの実施形態では、（Ｎ−−−−Ｎ）ｕ’は、式：
【化６４】
2020503049.tif 000071
（ここで、Ｂ１は、アデニン残基であり、Ｂ２は、ウラシル残基である）のものまたはそのコバリアントである。いくつかの実施形態では、（Ｎ−−−−Ｎ）ｕ’は、式：
【化６５】
2020503049.tif 000072
（ここで、Ｂ１は、ウラシル残基であり、Ｂ２は、アデニン残基である）のものまたはそのコバリアントである。いくつかの実施形態では、（Ｎ−−−−Ｎ）ｕ’は、式：
【化６６】
2020503049.tif 000073
（ここで、Ｂ１は、グアニン残基であり、Ｂ２は、シトシン残基である）のものまたはそのコバリアントである。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、リンカーは、式：
【化６７】
2020503049.tif 000074
のリンカーであり、
式中：
Ｒ２は、それぞれ独立に、ＯまたはＳであり；
Ｒ３は、それぞれ独立に、Ｏ−またはＣＯＯ−であり；かつ
Ｌ１およびＲ１は、それぞれ非ヌクレオチド化学リンカーである。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、架橋ガイド分子の化学結合は、尿素を含む。いくつかの実施形態では、尿素を含むガイド分子は、式：
【化６８】
2020503049.tif 000075
のものであり、
式中、ＬおよびＲは、それぞれ独立に、非ヌクレオチドリンカーである。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、尿素を含むガイド分子は、式：
【化６９】
2020503049.tif 000076
のものである。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、尿素を含むガイド分子は、式：
【化７０】
2020503049.tif 000077
のものである。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、尿素を含むガイド分子は、式：
【化７１】
2020503049.tif 000078
のものである。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、尿素を含むガイド分子は、式：
【化７２】
2020503049.tif 000079
のものである。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、尿素を含むガイド分子は、実施例のセクションの表１０に列挙された配列のガイド分子であり、式中、［ＵＲ］は、尿素を含む非ヌクレオチド結合である。いくつかの実施形態では、［ＵＲ］は、核酸塩基Ｂ１およびＢ２を有する２つのヌクレオチド間の以下の結合：
【化７３】
2020503049.tif 000080
を示す。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、架橋ガイド分子の化学結合はチオエーテルを含む。いくつかの実施形態では、チオエーテルを含むガイド分子は、式：
【化７４】
2020503049.tif 000081
のものであり、式中、ＬおよびＲは、それぞれ独立に、非ヌクレオチドリンカーである。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、チオエーテルを含むガイド分子は、式：
【化７５】
2020503049.tif 000082
のものである。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、チオエーテルを含むガイド分子は、式：
【化７６】
2020503049.tif 000083
のものである。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、チオエーテルを含むガイド分子は、式：
【化７７】
2020503049.tif 000084
【化７８】
2020503049.tif 000085
のものである。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、チオエーテルを含むガイド分子は、式：
【化７９】
2020503049.tif 000086
のものである。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、尿素を含むガイド分子は、実施例のセクションの表９に列挙された配列のガイド分子であり、式中、［Ｌ］は、チオエーテル結合である。いくつかの実施形態では、［Ｌ］は、核酸塩基Ｂ１およびＢ２を有する２つのヌクレオチド間の以下の結合：
【化８０】
2020503049.tif 000087
を示す。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、本出願の任意の式において、Ｒ２’およびＲ３’は、それぞれ独立に、Ｈ、ＯＨ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ＮＨ２、ＳＨ、Ｓ−Ｒ’、またはＯ−Ｒ’であり、ここで、Ｒ’は、それぞれ独立に、保護基または任意選択により置換されたアルキル基である。いくつかの実施形態では、Ｒ２’およびＲ３’は、それぞれ独立に、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＮＨ２、またはＯ−Ｒ’であり、ここで、Ｒ’は、それぞれ独立に、保護基または任意選択により置換されたアルキル基である。いくつかの実施形態では、Ｒ２’およびＲ３’は、それぞれ独立に、Ｈ、フルオロ、およびＯ−Ｒ’であり、ここで、Ｒ’は、保護基または任意選択により置換されたアルキル基である。いくつかの実施形態では、Ｒ２’は、Ｈである。いくつかの実施形態では、Ｒ３’は、Ｈである。いくつかの実施形態では、Ｒ２’はハロゲンである。いくつかの実施形態では、Ｒ３’はハロゲンである。いくつかの実施形態では、Ｒ２’はフッ素である。いくつかの実施形態では、Ｒ３’はフッ素である。いくつかの実施形態では、Ｒ２’は、Ｏ−Ｒ’である。いくつかの実施形態では、Ｒ３’は、Ｏ−Ｒ’である。いくつかの実施形態では、Ｒ２’は、Ｏ−Ｍｅである。いくつかの実施形態では、Ｒ３’は、Ｏ−Ｍｅである。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、本出願の任意の式において、ｐおよびｑは、それぞれ独立に、０、１、２、３、４、５、または６である。いくつかの実施形態では、ｐおよびｑは、それぞれ独立に、２である。いくつかの実施形態では、ｐおよびｑは、それぞれ独立に、０である。いくつかの実施形態では、ｐ’およびｑ’は、それぞれ独立に、０、１、２、３、または４である。いくつかの実施形態では、ｐ’およびｑ’は、それぞれ独立に、２である。いくつかの実施形態では、ｐ’およびｑ’は、それぞれ独立に、０である。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、本出願の任意の式において、ｕは、２〜２２（両端を含む）の整数である。いくつかの実施形態では、ｕは、３〜２２（両端を含む）の整数である。いくつかの実施形態では、ｕは、４〜２２（両端を含む）の整数である。いくつかの実施形態では、ｕは、８〜２２（両端を含む）の整数である。いくつかの実施形態では、ｕは、１２〜２２（両端を含む）の整数である。いくつかの実施形態では、ｕは、０〜２２（両端を含む）の整数である。いくつかの実施形態では、ｕは、２〜１４（両端を含む）の整数である。いくつかの実施形態では、ｕは、４〜１４（両端を含む）の整数である。いくつかの実施形態では、ｕは、８〜１４（両端を含む）の整数である。いくつかの実施形態では、ｕは、０〜１４（両端を含む）の整数である。いくつかの実施形態では、ｕは、０〜４（両端を含む）の整数である。いくつかの実施形態では、本出願の任意の式において、ｕ’は、２〜２２（両端を含む）の整数である。いくつかの実施形態では、ｕ’は、３〜２２（両端を含む）の整数である。いくつかの実施形態では、ｕ’は、４〜２２（両端を含む）の整数である。いくつかの実施形態では、ｕ’は、８〜２２（両端を含む）の整数である。いくつかの実施形態では、ｕ’は、１２〜２２（両端を含む）の整数である。いくつかの実施形態では、ｕ’は、０〜２２（両端を含む）の整数である。いくつかの実施形態では、ｕ’は、２〜１４（両端を含む）の整数である。いくつかの実施形態では、ｕ’は、４〜１４（両端を含む）の整数である。いくつかの実施形態では、ｕ’は、８〜１４（両端を含む）の整数である。いくつかの実施形態では、ｕ’は、０〜１４（両端を含む）の整数である。いくつかの実施形態では、ｕ’は、０〜４の（両端を含む）整数である。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、本出願の任意の式において、Ｎは、独立に、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、または修飾デオキシリボヌクレオチドである。ヌクレオチド修飾は以下に論じられる。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、本出願の任意の式において、ｃは、２０以上の整数である。いくつかの実施形態では、ｃは、２０〜６０（両端を含む）の整数である。いくつかの実施形態では、ｃは、２０〜４０（両端を含む）の整数である。いくつかの実施形態では、ｃは、４０〜６０（両端を含む）の整数である。いくつかの実施形態では、ｃは、３０〜６０（両端を含む）の整数である。いくつかの実施形態では、ｃは、２０〜５０（両端を含む）の整数である。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、本出願の任意の式において、ｔは、２０以上の整数である。いくつかの実施形態では、ｔは、２０〜８０（両端を含む）の整数である。いくつかの実施形態では、ｔは、２０〜５０（両端を含む）の整数である。いくつかの実施形態では、ｔは、５０〜８０（両端を含む）の整数である。いくつかの実施形態では、ｔは、２０〜７０（両端を含む）の整数である。いくつかの実施形態では、ｔは、３０〜８０（両端を含む）の整数である。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、本出願の任意の式において、ｓは、１〜１０（両端を含む）の整数である。いくつかの実施形態では、ｓは、３〜９（両端を含む）の整数である。いくつかの実施形態では、ｓは、１〜８（両端を含む）の整数である。いくつかの実施形態では、ｓは、０〜１０（両端を含む）の整数である。いくつかの実施形態では、ｓは、２〜６（両端を含む）の整数である。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、本出願の任意の式において、ｘは、１〜３（両端を含む）の整数である。いくつかの実施形態では、ｘは、１である。いくつかの実施形態では、ｘは、２である。いくつかの実施形態では、ｘは、３である。いくつかの実施形態では、本出願の任意の式において、ｙは、ｘより大きい。いくつかの実施形態では、ｙは、３〜５（両端を含む）の整数である。いくつかの実施形態では、ｙは、３である。いくつかの実施形態では、ｙは、４である。いくつかの実施形態では、ｙは、５である。いくつかの実施形態では、ｘは、１であり、ｙは、３である。いくつかの実施形態では、ｘは、２であり、ｙは、４である。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、本出願の任意の式において、ｍは、１５以上の整数である。いくつかの実施形態では、ｍは、１５〜５０（両端を含む）の整数である。いくつかの実施形態では、ｍは、１６以上の整数である。いくつかの実施形態では、ｍは、１７以上の整数である。いくつかの実施形態では、ｍは、１８以上の整数である。いくつかの実施形態では、ｍは、１９以上の整数である。いくつかの実施形態では、ｍは、２０以上の整数である。いくつかの実施形態では、ｍは、２０〜４０（両端を含む）の整数である。いくつかの実施形態では、ｍは、３０〜５０（両端を含む）の整数である。いくつかの実施形態では、ｍは、１５〜３０（両端を含む）の整数である。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、本出願の任意の式において、ｎは、３０以上の整数である。いくつかの実施形態では、ｎは、３０〜７０（両端を含む）の整数である。いくつかの実施形態では、ｎは、３０〜６０（両端を含む）の整数である。いくつかの実施形態では、ｎは、４０〜７０（両端を含む）の整数である。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、本出願の任意の式において、Ｌ、Ｒ、Ｌ１、およびＲ１は、それぞれ独立に、非ヌクレオチドリンカーである。いくつかの実施形態では、Ｌ、Ｒ、Ｌ１、およびＲ１は、それぞれ独立に、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレングリコール、およびポリプロピレングリコールからなる群から選択される部分を含む。いくつかの実施形態では、Ｌ１およびＲ１は、それぞれ独立に、−（ＣＨ２）Ｗ−、−（ＣＨ２）Ｗ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｗ−ＮＨ−、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｖ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｗ−、または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｖ−、およびｗは、それぞれ１〜２０（両端を含む）の整数であり、ｖは、それぞれ１〜１０（両端を含む）の整数である。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、−（ＣＨ２）Ｗ−である。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、−（ＣＨ２）ｗ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｗ−ＮＨ−である。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｖ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｗ−である。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、−（ＣＨ２）６−である。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、−（ＣＨ２）６−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）１−ＮＨ−である。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）４−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）２−である。いくつかの実施形態では、Ｒ１は、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｖ−である。いくつかの実施形態では、Ｒ１は、−（ＣＨ２）Ｗ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｗ−ＮＨである。いくつかの実施形態では、Ｒ１は、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｖ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｗ−である。いくつかの実施形態では、Ｒ１は、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）４−である。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、−（ＣＨ２）６−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）１−ＮＨ−である。いくつかの実施形態では、Ｒ１は、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）４−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）２−である。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、−（ＣＨ２）６−であり、Ｒ１は、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）４−である。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、−（ＣＨ２）６−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）１−ＮＨ−であり、Ｒ１は、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）４−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）２−である。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、本出願の任意の式において、Ｒ２は、Ｏであり、いくつかの実施形態では、Ｒ２は、Ｓである。いくつかの実施形態では、Ｒ３は、Ｏ−であり、いくつかの実施形態では、Ｒ３は、ＣＯＯ−である。いくつかの実施形態では、Ｒ２は、Ｏであり、Ｒ３は、Ｏ−である。いくつかの実施形態では、Ｒ２は、Ｏであり、Ｒ３は、ＣＯＯ−である。いくつかの実施形態では、Ｒ２は、Ｓであり、Ｒ３は、Ｏ−である。いくつかの実施形態では、Ｒ２は、Ｓであり、Ｒ３は、ＣＯＯ−である。当業者であれば、Ｒ３は、プロトン化形態（ＯＨおよびＣＯＯＨ）でも存在し得ることを理解するであろう。本出願を通して、本発明者らは、脱プロトン化形態のＲ３およびプロトン化形態のＲ３の両方を包含するものとしている。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、本出願の任意の式において、Ｎ−−−−Ｎは、それぞれ独立に、２つの相補的なヌクレオチド、任意選択により水素結合で塩基対合した２つの相補的なヌクレオチドを表す。いくつかの実施形態では、すべてのＮ−−−−Ｎは、水素結合で塩基対合した２つの相補的なヌクレオチドを表す。いくつかの実施形態では、いくつかのＮ−−−−Ｎは、２つの相補的なヌクレオチドを表し、いくつかのＮ−−−−Ｎは、水素結合で塩基対合した２つの相補的なヌクレオチドを表す。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、本出願の任意の式において、Ｂ１およびＢ２は、それぞれ独立に、核酸塩基である。いくつかの実施形態では、Ｂ１は、グアニンであり、Ｂ２は、シトシンである。いくつかの実施形態では、Ｂ１は、シトシンであり、Ｂ２は、グアニンである。いくつかの実施形態では、Ｂ１は、アデニンであり、Ｂ２は、ウラシルである。いくつかの実施形態では、Ｂ１は、ウラシルであり、Ｂ２は、アデニンである。いくつかの実施形態では、Ｂ１およびＢ２は、相補的である。いくつかの実施形態では、Ｂ１およびＢ２は、相補的であり、水素結合を介して塩基対合する。いくつかの実施形態では、Ｂ１およびＢ２は、相補的であり、水素結合を介して塩基対合しない。いくつかの実施形態では、Ｂ１およびＢ２は、相補的ではない。
【０１６９】
ガイド分子の合成
本発明の別の態様は、単分子ガイド分子を合成する方法であり、この方法は：
第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドとをアニールして、第１のオリゴヌクレオチドの３’領域と第２のオリゴヌクレオチドの５’領域との間に二重鎖を形成するステップであって、第１のオリゴヌクレオチドは、２’反応性基および３’反応性基の少なくとも一方である第１の反応性基を含み、第２のオリゴヌクレオチドは、５’反応性基である第２の反応性基を含む、ステップ；および
アニールされた第１および第２のオリゴヌクレオチドを、第１および第２の反応性基を介してコンジュゲートさせて、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドとを結合する共有結合を含む単分子ガイド分子を形成するステップ
を含む。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、第１の反応性基および第２の反応性基は、上記の「要約」に列挙された官能基から選択される。いくつかの実施形態では、第１の反応性基および第２の反応性基は、それぞれ独立に、アミン部分、スルフヒドリル部分、ブロモアセチル部分、ヒドロキシル部分、またはリン酸部分である。いくつかの実施形態では、第１の反応性基および第２の反応性基は両方ともアミン部分である。いくつかの実施形態では、第１の反応性基は、スルフヒドリル部分であり、第２の反応性基は、ブロモアセチル部分である。いくつかの実施形態では、第１の反応性基は、ブロモアセチル部分であり、第２の反応性基は、スルフヒドリル部分である。いくつかの実施形態では、第１の反応性基はヒドロキシル部分であり、第２の反応性基はリン酸部分である。いくつかの実施形態では、第１の反応性基はリン酸部分であり、第２の反応性基はヒドロキシル部分である。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、コンジュゲートさせるステップは、１０μＭ〜１ｍＭの範囲の濃度の第１のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、コンジュゲートさせるステップは、１０μＭ〜１ｍＭの範囲の濃度の第２のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、第１または第２のヌクレオチドのいずれかの濃度は、１０μＭ、５０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、４００μＭ、６００μＭ、８００μＭ、または１ｍＭである。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、コンジュゲートさせるステップは、５．０〜９．０の範囲のｐＨを含む。いくつかの実施形態では、ｐＨは、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、または９．０である。いくつかの実施形態では、ｐＨは、６．０である。いくつかの実施形態では、ｐＨは、８．０である。いくつかの実施形態では、ｐＨは、８．５である。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、コンジュゲートさせるステップは、アルゴン下で行われる。いくつかの実施形態では、コンジュゲートさせるステップは、周囲雰囲気下で行われる。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、コンジュゲートさせるステップは水中で行われる。いくつかの実施形態では、コンジュゲートさせるステップは、共溶媒と共に水中で行われる。いくつかの実施形態では、共溶媒は、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ＮＭＰ、ＤＭＡ、モルホリン、ピリジン、またはＭｅＣＮである。いくつかの実施形態では、共溶媒は、ＤＭＳＯである。いくつかの実施形態では、共溶媒は、ＤＭＦである。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、コンジュゲートさせるステップは、０℃〜４０℃の範囲の温度で行われる。いくつかの実施形態では、温度は、０℃、４℃、１０℃、２０℃、２５℃、３０℃、３７℃、または４０℃である。いくつかの実施形態では、温度は、２５℃である。いくつかの実施形態では、温度は、４℃である。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、コンジュゲートさせるステップは、二価金属カチオンの存在下で行われる。いくつかの実施形態では、二価金属カチオンは、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｓｒ２＋、Ｂａ２＋、Ｃｒ２＋、Ｍｎ２＋、Ｆｅ２＋、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｕ２＋、またはＺｎ２＋である。いくつかの実施形態では、二価金属カチオンは、Ｍｇ２＋である。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、コンジュゲートさせるステップは、架橋試薬または架橋剤を含む（上記の「要約」を参照）。いくつかの実施形態では、架橋剤は多官能性であり、いくつかの実施形態では、架橋剤は二官能性である。いくつかの実施形態では、多官能性架橋剤は、ヘテロ官能性またはホモ官能性である。いくつかの実施形態では、架橋剤はカーボネートを含む。いくつかの実施形態では、カーボネート含有架橋剤は、ジスクシンイミジルカーボネート、ジイミダゾールカーボネート、またはビス−（ｐ−ニトロフェニル）カーボネートである。いくつかの実施形態では、カーボネート含有架橋剤はジスクシンイミジルカーボネートである。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、コンジュゲートさせるステップは、１ｍＭ〜１００ｍＭの範囲の濃度の二官能性架橋試薬を含む。いくつかの実施形態では、二官能性架橋試薬の濃度は、１ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、４０ｍＭ、６０ｍＭ、８０ｍＭ、または１００ｍＭである。いくつかの実施形態では、二官能性架橋剤の濃度は、第１および第２のオリゴヌクレオチドのそれぞれの濃度よりも１００〜１０００倍高い。いくつかの実施形態では、二官能性架橋試薬の濃度は、第１のオリゴヌクレオチドの濃度よりも１００倍、２００倍、４００倍、６００倍、８００倍、または１０００倍高い。いくつかの実施形態では、二官能性架橋試薬の濃度は、第２のオリゴヌクレオチドの濃度よりも１００倍、２００倍、４００倍、６００倍、８００倍、または１０００倍高い。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、コンジュゲートさせるステップはキレート試薬の存在下で行われる。いくつかの実施形態では、キレート試薬は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）またはその塩である。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、コンジュゲートさせるステップは活性化剤の存在下で行われる。いくつかの実施形態では、活性化剤は、カルボジイミドまたはその塩である。いくつかの実施形態では、カルボジイミドは、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ、Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、またはＮ、Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、またはそれらの塩である。いくつかの実施形態では、カルボジイミドは、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）またはその塩である。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、コンジュゲートさせるステップは、１ｍＭ〜１００ｍＭの範囲内の濃度の活性化剤を含む。いくつかの実施形態では、活性化剤の濃度は、１ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、４０ｍＭ、６０ｍＭ、８０ｍＭ、または１００ｍＭである。いくつかの実施形態では、活性化剤の濃度は、第１および第２のオリゴヌクレオチドのそれぞれの濃度よりも１００〜１０００倍高い。いくつかの実施形態では、活性化剤の濃度は、第１のオリゴヌクレオチドの濃度よりも１００倍、２００倍、４００倍、６００倍、８００倍、または１０００倍高い。いくつかの実施形態では、活性化剤の濃度は、第２のオリゴヌクレオチドの濃度よりも１００倍、２００倍、４００倍、６００倍、８００倍、または１０００倍高い。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、コンジュゲートさせるステップは安定化剤の存在下で行われる。いくつかの実施形態では、安定化剤は、イミダゾール、シアノイミダゾール、ピリジン、またはジメチルアミノピリジン、またはそれらの塩である。いくつかの実施形態では、安定化剤はイミダゾールである。いくつかの実施形態では、コンジュゲートさせるステップは、活性化剤と安定化剤の両方の存在下で行われる。いくつかの実施形態では、コンジュゲートさせるステップは、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）およびイミダゾール、またはそれらの塩の存在下で行われる。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、単分子ガイド分子を合成する方法は、上に開示された任意の式のガイド分子を生成する。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、単分子ガイド分子を合成する方法により、尿素リンカーを有するガイド分子が得られる。いくつかの実施形態では、第１の反応性基および第２の反応性基は両方ともアミンであり、第１および第２の反応性基は、カーボネート含有二官能性架橋試薬で架橋されて尿素リンカーを形成する。いくつかの実施形態では、カーボネート含有二官能性架橋試薬は、ジスクシンイミジルカーボネートである。いくつかの実施形態では、この方法は、式：
【化８１】
2020503049.tif 000088
の第１のオリゴヌクレオチドまたはその塩を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、式：
【化８２】
2020503049.tif 000089
の第２のオリゴヌクレオチドまたはその塩を含む。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、単分子ガイド分子を合成する方法により、チオエーテルリンカーを有するガイド分子が得られる。いくつかの実施形態では、第１の反応性基は、スルフヒドリル基であり、第２の反応性基は、ブロモアセチル基であるか、または第１の反応性基は、ブロモアセチル基であり、第２の反応性基は、スルフヒドリル基である。いくつかの実施形態では、第１の反応性基と第２の反応性基は、キレート剤の存在下で反応してチオエーテル結合を形成する。いくつかの実施形態では、第１の反応性基および第２の反応性基は、置換反応を受けてチオエーテル結合を形成する。いくつかの実施形態では、この方法は、式：
【化８３】
2020503049.tif 000090
の第１のオリゴヌクレオチドまたはその塩、および式：
【化８４】
2020503049.tif 000091
の第２のオリゴヌクレオチドまたはその塩を含むか；またはこの方法は、式：
【化８５】
2020503049.tif 000092
の第１のオリゴヌクレオチドまたはその塩、および式：
【化８６】
2020503049.tif 000093
の第２のオリゴヌクレオチドまたはその塩を含む。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、単分子ガイド分子を合成する方法により、ホスホジエステルリンカーを有するガイド分子が得られる。いくつかの実施形態では、第１の反応性基は、２’または３’ヒドロキシル基を含み、第２の反応性基は、５’リン酸部分を含む。いくつかの実施形態では、第１および第２の反応性基は、活性化剤の存在下でコンジュゲートされてホスホジエステルリンカーを形成する。いくつかの実施形態では、活性化剤は、ＥＤＣである。いくつかの実施形態では、この方法は、式：
【化８７】
2020503049.tif 000094
の第１のオリゴヌクレオチドまたはその塩；および
式：
【化８８】
2020503049.tif 000095
の第２のオリゴヌクレオチドまたはその塩を含む。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、単分子ガイド分子を合成する方法は、二重鎖領域に少なくとも１つの２’−５’ホスホジエステル結合を有する単分子ガイド分子を生成する。
【０１８８】
オリゴヌクレオチド中間体
本開示の特定の実施形態は、架橋合成ガイド分子の合成に有用であるオリゴヌクレオチド中間体に関する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド中間体は、尿素結合、チオエーテル結合、またはホスホジエステル結合を含むガイド分子の合成に有用である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド中間体はアニールされた二重鎖を含む。
【０１８９】
特定の実施形態では、オリゴヌクレオチド中間体は、尿素結合を含むガイド分子の合成に有用である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド中間体は、式：
【化８９】
2020503049.tif 000096
のオリゴヌクレオチド中間体である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド中間体は、式：
【化９０】
2020503049.tif 000097
のオリゴヌクレオチド中間体である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド中間体は、式：
【化９１】
2020503049.tif 000098
のオリゴヌクレオチド中間体である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド中間体は、式：
【化９２】
2020503049.tif 000099
のオリゴヌクレオチド中間体である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド中間体は、式：
【化９３】
2020503049.tif 000100
のオリゴヌクレオチド中間体である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド中間体は、式：
【化９４】
2020503049.tif 000101
のオリゴヌクレオチド中間体である。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド中間体は、チオエーテル結合を含むガイド分子の合成に有用である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド中間体は、式：
【化９５】
2020503049.tif 000102
のオリゴヌクレオチド中間体である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド中間体は、式：
【化９６】
2020503049.tif 000103
のオリゴヌクレオチド中間体である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド中間体は、式：
【化９７】
2020503049.tif 000104
のオリゴヌクレオチド中間体である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド中間体は、式：
【化９８】
2020503049.tif 000105
のオリゴヌクレオチド中間体である。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド中間体は、ホスホジエステル結合を含むガイド分子の合成に有用である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド中間体は、式：
【化９９】
2020503049.tif 000106
のオリゴヌクレオチド中間体であり、式中、Ｒ６およびＲ７は、それぞれ独立に、置換もしくは非置換アルキル、または置換もしくは非置換カルボシクリルである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド中間体は、式：
【化１００】
2020503049.tif 000107
のオリゴヌクレオチド中間体であり、式中、Ｚは、４〜６ヌクレオチド長、任意選択により４または６ヌクレオチド長であるヌクレオチドループを表す。
【０１９２】
本開示の特定の実施形態は、架橋反応において副生成物として形成されるオリゴヌクレオチド化合物に関する。これらのオリゴヌクレオチド化合物は、ガイド分子として有用であってもよいし、または有用でなくてもよい。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物は、式：
【化１０１】
2020503049.tif 000108
のオリゴヌクレオチド化合物である。
【０１９３】
化学的にコンジュゲートしたガイド分子の組成物
本開示の特定の実施形態は、上記の合成ガイド分子を含む組成物、および上記の方法によって生成された組成物に関する。いくつかの実施形態では、この組成物は、その中の９０％を超えるガイド分子が完全長ガイド分子であることを特徴とする。いくつかの実施形態では、この組成物は、その中の８５％を超えるガイド分子が同一の標的ドメイン配列を含むことを特徴とする。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、この組成物は、精製ステップに供されていない。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムのためのガイド分子の組成物は、式：
【化１０２】
2020503049.tif 000109
のガイド分子から本質的になる。いくつかの実施形態では、この組成物は、式：
【化１０３】
2020503049.tif 000110
のガイド分子またはその塩から本質的になる。いくつかの実施形態では、この組成物は、式：
【化１０４】
2020503049.tif 000111
のガイド分子またはその塩から本質的になる。いくつかの実施形態では、この組成物は、式：
【化１０５】
2020503049.tif 000112
【化１０６】
2020503049.tif 000113
のガイド分子またはその塩から本質的になる。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、この組成物は、合成ガイド分子の存在下または非存在下でオリゴヌクレオチド中間体（上記）を含む。いくつかの実施形態では、この組成物のオリゴヌクレオチド中間体は、式：
【化１０７】
2020503049.tif 000114
のオリゴヌクレオチド中間体であり、合成ガイド分子は、式：
【化１０８】
2020503049.tif 000115
の合成ガイド分子またはその薬学的に許容される塩である。いくつかの実施形態では、この組成物は、式：
【化１０９】
2020503049.tif 000116
の合成ガイド分子の存在下または非存在下において、式：
【化１１０】
2020503049.tif 000117
【化１１１】
2020503049.tif 000118
のアニールされた二重鎖を有するオリゴヌクレオチド中間体またはその塩を含む。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、この組成物中のオリゴヌクレオチド中間体は、式：
【化１１２】
2020503049.tif 000119
のものまたはその塩であり、合成ガイド分子は、式：
【化１１３】
2020503049.tif 000120
の合成ガイド分子である。いくつかの実施形態では、この組成物は、式：
【化１１４】
2020503049.tif 000121
の合成ガイド分子またはその塩の存在下または非存在下において、式：
【化１１５】
2020503049.tif 000122
【化１１６】
2020503049.tif 000123
【化１１７】
2020503049.tif 000124
【化１１８】
2020503049.tif 000125
のアニールされた二重鎖を有するオリゴヌクレオチド中間体を含む。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、この組成物のオリゴヌクレオチド中間体は、式：
【化１１９】
2020503049.tif 000126
のオリゴヌクレオチド中間体であり、または、かつ合成ガイド分子は、式：
【化１２０】
2020503049.tif 000127
の合成ガイド分子である。いくつかの実施形態では、この組成物は、式：
【化１２１】
2020503049.tif 000128
のアニールされた二重鎖を有するオリゴヌクレオチド中間体またはその塩を含む。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、この組成物は、ホモ二量体を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、ホモ二量体および／または副生成物を実質的に含まない組成物は、ホモ二官能性架橋試薬を含む方法を用いて合成されたガイド分子を含む。いくつかの実施形態では、ホモ二量体および／または副生成物を実質的に含まない組成物は、尿素結合を有するガイド分子を含む。いくつかの実施形態では、ガイド分子は、式：
【化１２２】
2020503049.tif 000129
のものまたはその薬学的に許容される塩であり、ここで、この組成物は、式：
【化１２３】
2020503049.tif 000130
の分子またはその薬学的に許容される塩を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、このガイド分子は、式：
【化１２４】
2020503049.tif 000131
のものまたはその薬学的に許容される塩であり、ここで、この組成物は、式：
【化１２５】
2020503049.tif 000132
の分子またはその薬学的に許容される塩を実質的に含まない。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、この組成物は、副生成物を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、この組成物は、尿素結合を含むガイド分子を含む。いくつかの実施形態では、この組成物は、式：
【化１２６】
2020503049.tif 000133
のガイド分子またはその薬学的に許容される塩を含み、ここで、この組成物は、式：
【化１２７】
2020503049.tif 000134
の分子を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、この組成物は、式：
【化１２８】
2020503049.tif 000135
のガイド分子またはその薬学的に許容される塩を含み、ここで、この組成物は、式：
【化１２９】
2020503049.tif 000136
の分子を実質的に含まない。
【０２００】
いくつかの実施形態では、この組成物は、副生成物を実質的に含む。いくつかの実施形態では、この組成物は、（ａ）式：
【化１３０】
2020503049.tif 000137
のものまたはその薬学的に許容される塩である、ＣＲＩＳＰＲシステムのための合成単分子ガイド分子；ならびに（ｂ）以下の１つまたは複数：（ｉ）カルボジイミドまたはその塩；（ｉｉ）イミダゾール、シアノイミダゾール、ピリジン、およびジメチルアミノピリジンまたはその塩；および（ｉｉｉ）式：
【化１３１】
2020503049.tif 000138
（式中、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立に、置換もしくは非置換アルキル、または置換もしくは非置換カルボシクリルである）の化合物またはその塩を含む。いくつかの実施形態では、カルボジイミドは、ＥＤＣ、ＤＣＣ、またはＤＩＣである。いくつかの実施形態では、この組成物は、ＥＤＣを含む。いくつかの実施形態では、この組成物はイミダゾールを含む。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、この組成物は、ｎ＋１種および／またはｎ−１種を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、この組成物は、参照ガイド分子配列に対して切断を含むガイド分子を約１０％、５％、２％、１％、または０．１％未満含む。いくつかの実施形態では、ガイド分子の少なくとも約８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％は、参照ガイド分子配列の対応する５’配列と１００％同一であるガイド分子のヌクレオチド１〜２０を含む５’配列を含む。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、この組成物は、式：
【化１３２】
2020503049.tif 000139
のガイド分子またはその薬学的に許容される塩を本質的に含み、
ここで、この組成物は、式：
【化１３３】
2020503049.tif 000140
の分子またはその薬学的に許容される塩を実質的に含まず、
ここで、ａは、ｃと等しくなく；かつ／またはｂは、ｔと等しくない。いくつかの実施形態では、この組成物は、式：
【化１３４】
2020503049.tif 000141
のガイド分子またはその薬学的に許容される塩を本質的に含み、
ここで、この組成物は、式：
【化１３５】
2020503049.tif 000142
の分子またはその薬学的に許容される塩を実質的に含まず、
ここで、ａは、ｃと等しくなく；かつ／またはｂは、ｔと等しくない。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、この組成物は、式：
【化１３６】
2020503049.tif 000143
のガイド分子またはその薬学的に許容される塩を本質的に含み、
ここで、この組成物は、式：
【化１３７】
2020503049.tif 000144
の分子またはその薬学的に許容される塩を実質的に含まず、
ここで、ａは、ｃと等しくなく；かつ／またはｂは、ｔと等しくない。いくつかの実施形態では、この組成物は、式：
【化１３８】
2020503049.tif 000145
のガイド分子またはその薬学的に許容される塩を本質的に含み、
ここで、この組成物は、式：
【化１３９】
2020503049.tif 000146
の分子またはその薬学的に許容される塩を実質的に含まず、
ここで、ａは、ｃと等しくなく；かつ／またはｂは、ｔと等しくない。いくつかの実施形態では、この組成物は、式：
【化１４０】
2020503049.tif 000147
のガイド分子またはその薬学的に許容される塩を本質的に含み、
ここで、この組成物は、式：
【化１４１】
2020503049.tif 000148
の分子またはその薬学的に許容される塩を実質的に含まず、
ここで、ａは、ｃと等しくなく；かつ／またはｂは、ｔと等しくない。いくつかの実施形態では、この組成物は、式：
【化１４２】
2020503049.tif 000149
のガイド分子またはその薬学的に許容される塩を本質的に含み、
ここで、この組成物は、式：
【化１４３】
2020503049.tif 000150
の分子またはその薬学的に許容される塩を実質的に含まず、
ここで、ａは、ｃと等しくなく；かつ／またはｂは、ｔと等しくない。いくつかの実施形態では、ａは、ｃ未満であり、かつ／またはｂは、ｔ未満である。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、この組成物は、式：
【化１４４】
2020503049.tif 000151
のガイド分子またはその薬学的に許容される塩を含み、ここで、この組成物は、式：
【化１４５】
2020503049.tif 000152
の分子またはその薬学的に許容される塩を実質的に含まず、
ここで、ａ＋ｂは、ｃ＋ｔ−ｋであり、ここで、ｋは、１〜１０（両端を含む）の整数である。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、この組成物は、ＣＲＩＳＰＲシステムのための合成単分子ガイド分子を含み、このガイド分子は、式：
【化１４６】
2020503049.tif 000153
のものまたはその薬学的に許容される塩であり、ここで、式中に示される２’−５’ホスホジエステル結合は、二重鎖における２つのヌクレオチド間にある。いくつかの実施形態では、ガイド分子は、式：
【化１４７】
2020503049.tif 000154
のものまたはその薬学的に許容される塩であり、ここで、式中に示される二重鎖領域における２つのヌクレオチド間の少なくとも１つのホスホジエステル結合は、２’−５’ホスホジエステル結合である。いくつかの実施形態では、２’−５’ホスホジエステル結合は、バルジの５’に位置する２つのヌクレオチド間にある。いくつかの実施形態では、２’−５’ホスホジエステル結合は、ヌクレオチドループＺの５’およびバルジの３’に位置する２つのヌクレオチド間にある。いくつかの実施形態では、２’−５’ホスホジエステル結合は、ヌクレオチドループＺの３’およびバルジの５’に位置する２つのヌクレオチド間にある。いくつかの実施形態では、２’−５’ホスホジエステル結合は、バルジの３’に位置する２つのヌクレオチド間にある。
【０２０６】
ガイド分子の設計
標的配列の選択および検証の方法ならびに標的外分析は、すでに、例えば、Ｍａｌｉ；Ｈｓｕ；Ｆｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４  Ｎａｔ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３２（３）：２７９−８４，Ｈｅｉｇｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４  Ｎａｔ  ｍｅｔｈｏｄｓ  １１（２）：１２２−３；Ｂａｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ３０（１０）：１４７３−５；ａｎｄ  Ｘｉａｏ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ３０（８）：１１８０−１１８２に記載されている。これらの参考文献のそれぞれは、参照により本明細書に援用される。非限定的な例として、ガイド分子の設計は、使用者の標的配列に対応する潜在的な標的配列の選択を最適化するため、例えばゲノムにわたる全標的外活性を最小化するためにソフトウェアツールの使用を伴い得る。標的外活性は切断に限定されないが、各標的外配列における切断効率は、例えば、実験的に導出された重み付けスキームを用いて予測することができる。これらおよび他のガイド選択方法は、Ｍａｅｄｅｒ  ａｎｄ  Ｃｏｔｔａ−Ｒａｍｕｓｉｎｏに詳細に記載されている。
【０２０７】
合成単分子ガイド分子におけるステムループ構造および化学結合の位置もまた設計することができる。本発明者らは、化学的コンジュゲート反応のライゲーション効率を予測するためにギブス自由エネルギー差（ΔＧ）を使用することの価値を認識していた。ΔＧの計算は、ＯｌｉｇｏＡｎａｌｙｚｅｒ（ｗｗｗ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ｃａｌｃ／ａｎａｌｙｚｅｒで入手可能）または同様のツールを使用して行われる。所望のアニールされた二重鎖を形成するためのヘテロ二量体化のΔＧと、２つの同一のオリゴヌクレオチドのホモ二量体化のΔＧとの比較により、化学的コンジュゲーションの実験結果を予測することができる。ヘテロ二量体化のΔＧがホモ二量体化のΔＧよりも小さい場合、ライゲーション効率は高いと予測される。この予測方法は、実施例ＸＸでさらに説明される。
【０２０８】
ガイド分子の修飾
ガイド分子の活性、安定性、または他の特徴は、特定の修飾を組み入れることによって変更することができる。一例として、一過性に発現または送達された核酸は、例えば細胞ヌクレアーゼによって分解しやすくすることができる。したがって、本明細書に記載のガイド分子は、ヌクレアーゼに対して安定性を導入する１つまたは複数の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含み得る。理論に拘束されることを望むものではないが、本明細書に記載の特定の修飾ガイド分子は、細胞に導入されたときに自然免疫応答の低下を示し得るとも考えられる。当業者であれば、外因性核酸、特にウィルスまたは細菌起源の外因性核酸に応答した、細胞、例えば哺乳動物細胞において一般的に観察される特定の細胞応答を認識しているであろう。サイトカインの発現および放出ならびに細胞死の誘導を含み得るそのような反応は、本明細書に提示される修飾によってすべて低減または排除することができる。
【０２０９】
このセクションで論じられる特定の例示的な修飾は、５’末端またはその近傍（例えば、５’末端の１〜１０、１〜５、１〜３、または１〜２ヌクレオチド以内）および／または３’末端またはその近傍（例えば、３’末端の１〜１０、１〜５、１〜３、または１〜２ヌクレオチド以内）を含むがこれらに限定されない、ガイド分子配列内の任意の位置に含まれ得る。場合によっては、修飾は、Ｃａｓ９ガイド分子の反復−抗反復二重鎖、Ｃａｓ９もしくはＣｐｆ１ガイド分子のステムループ構造、および／またはガイド分子の標的ドメインなどの機能的モチーフ内に位置する。
【０２１０】
一例として、ガイド分子の５’末端は、以下：
【化１４８】
2020503049.tif 000155
に示すように、真核生物のｍＲＮＡキャップ構造またはキャップ類似体（例えば、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップ類似体、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップ類似体、または３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇアンチリバースキャップ類似体（ＡＲＣＡ））を含み得る。キャップまたはキャップ類似体は、ガイド分子の化学的または酵素的合成中に含めることができる。
【０２１１】
同様の線に沿って、ガイド分子の５’末端は、５’三リン酸基を欠くことができる。例えば、インビトロ転写ガイド分子をホスファターゼ処理して（例えば、ウシ腸アルカリホスファターゼを使用して）５’三リン酸基を除去することができる。
【０２１２】
別の一般的な修飾は、ガイド分子の３’末端に、ポリＡトラクトと呼ばれる複数（例えば、１〜１０、１０〜２０、または２５〜２００）のアデニン（Ａ）残基を付加することを含む。ポリＡトラクトは、ポリアデノシンポリメラーゼ（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリ（Ａ）ポリメラーゼ）を使用して、化学合成または酵素合成中にガイド分子に付加することができる。
【０２１３】
ガイドＲＮＡは、３’末端Ｕリボースで修飾することができる。例えば、以下に示すように、Ｕリボースの２つの末端ヒドロキシル基を酸化してアルデヒド基にし、同時にリボース環の開口により修飾ヌクレオシドを得ることができる：
【化１４９】
2020503049.tif 000156
式中、「Ｕ」は非修飾または修飾ウリジンであり得る。
【０２１４】
３’末端Ｕリボースは、以下に示すように、２’３’環状リン酸で修飾することができる：
【化１５０】
2020503049.tif 000157
式中、「Ｕ」は非修飾または修飾ウリジンであり得る。
【０２１５】
ガイドＲＮＡは、例えば本明細書に記載の１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを組み込むことによって、分解に対して安定化され得る３’ヌクレオチドを含み得る。特定の実施形態では、ウリジンは、修飾ウリジン、例えば５−（２−アミノ）プロピルウリジン、および５−ブロモウリジン、または本明細書に記載の修飾ウリジンのいずれかで置換することができ；アデノシンおよびグアノシンは、例えば８位に修飾を有する修飾アデノシンおよび修飾グアノシン、例えば８−ブロモグアノシンで、または本明細書に記載の修飾アデノシンもしくは修飾グアノシンのいずれかで置換することができる。
【０２１６】
特定の実施形態では、糖修飾リボヌクレオチドをガイド分子に組み込むことができ、例えば、２’ＯＨ−基は、Ｈ、−ＯＲ、−Ｒ（ここで、Ｒは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、または糖であり得る）、ハロ、−ＳＨ、−ＳＲ（ここで、Ｒは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、または糖であり得る）、アミノ（ここで、アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸であり得る）；またはシアノ（−ＣＮ）から選択される基で置換される。特定の実施形態では、リン酸骨格は、例えばホスホロチオエート（ＰｈＴｘ）基を用いて、本明細書に記載されるように修飾することができる。特定の実施形態では、ガイド分子の１つまたは複数のヌクレオチドは、それぞれ独立に、例えば、２’−Ｆもしくは２’−Ｏ−メチル、アデノシン（Ａ）、２’−Ｆもしくは２’−Ｏ−メチル、シチジン（Ｃ）、２’−Ｆもしくは２’−Ｏ−メチル、ウリジン（Ｕ）、２’−Ｆもしくは２’−Ｏ−メチル、チミジン（Ｔ）、２’−Ｆもしくは２’−Ｏ−メチル、グアノシン（Ｇ）、２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン（Ｔｅｏ）、２’−Ｏ−メトキシエチルアデノシン（Ａｅｏ）、２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルシチジン（ｍ５Ｃｅｏ）、およびこれらの任意の組み合わせを含む２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル、または２’−フルオロ修飾などの２’−糖修飾を含むがこれに限定されない修飾または非修飾ヌクレオチドであり得る。
【０２１７】
ガイドＲＮＡはまた、２’ＯＨ基が、例えばＣ１〜６アルキレン架橋またはＣ１〜６ヘテロアルキレン架橋によって、同じリボース糖の４’炭素に結合され得る「ロックド」核酸（ＬＮＡ）を含み得る。任意の適切な部分を使用してそのような架橋を提供することができ、このような適切な部分は、メチレン、プロピレン、エーテル、またはアミノ架橋；Ｏ−アミノ（ここで、アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、またはポリアミノであり得る）、およびアミノアルコキシもしくはＯ（ＣＨ２）ｎ−アミノ（ここで、アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、またはポリアミノであり得る）を含むがこれらに限定されない。
【０２１８】
特定の実施形態では、ガイド分子は、多環式である修飾ヌクレオチド（例えば、トリシクロ；およびグリコール核酸（ＧＮＡ）（例えば、リボースがホスホジエステル結合に付着したグリコール単位によって置換されたＲ−ＧＮＡもしくはＳ−ＧＮＡ）などの「アンロックド」形態、またはトレオース核酸（リボースがα−Ｌ−トレオフラノシル−（３’→２’）で置換されたＴＮＡ））を含み得る。
【０２１９】
一般に、ガイド分子は、酸素を有する５員環である糖基リボースを含む。例示的な修飾ガイド分子としては、（例えば、硫黄（Ｓ）、セレン（Ｓｅ）、またはアルキレン、例えばメチレンもしくはエチレンでの）リボースにおける酸素の置換；（例えば、リボースをシクロペンテニルまたはシクロヘキセニルで置換するための）二重結合の付加；（例えば、シクロブタンまたはオキセタンの４員環を形成するための）リボースの環収縮；（例えば、追加の炭素またはヘテロ原子を有する６員環または７員環、例えば、無水ヘキシトール、アルトリトール、マンニトール、シクロヘキサニル、シクロヘキセニル、およびホスホラミデート骨格も有するモルホリノなどを形成するための）リボースの環拡大を挙げることができるが、これらに限定されない。糖類似体の変化の大部分は、２’位に局在しているが、４’位を含む他の部位は修飾されやすい。特定の実施形態では、ガイド分子は、４’−Ｓ、４’−Ｓｅ、または４’−Ｃ−アミノメチル−２’−Ｏ−Ｍｅ修飾を含む。
【０２２０】
特定の実施形態では、デアザヌクレオチド、例えば７−デアザ−アデノシンをガイド分子に組み込むことができる。特定の実施形態では、Ｏ−およびＮ−アルキル化ヌクレオチド、例えば、Ｎ６−メチルアデノシンをガイド分子に組み込むことができる。特定の実施形態では、ガイド分子における１つまたは複数またはすべてのヌクレオチドがデオキシヌクレオチドである。
【０２２１】
ガイド分子のヌクレオチドはまた、ホスホジエステル結合において修飾され得る。そのような修飾は、ホスホノアセテート、ホスホロチオエート、チオホスホノアセテート、またはホスホロアミデート結合を含み得る。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合を介してその隣接するヌクレオチドに結合され得る。さらに、ホスホジエステル結合に対する修飾は、ヌクレオチドに対する唯一の修飾であってもよいし、または上記の他のヌクレオチド修飾と組み合わせてもよい。例えば、修飾ホスホジエステル結合は、ヌクレオチドの糖基に対する修飾と組み合わせることができる。いくつかの実施形態では、５’または３’ヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合を介してその隣接ヌクレオチドに結合した２’−ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド残基を含む。
【０２２２】
ＲＮＡガイドヌクレアーゼ
本開示によるＲＮＡガイドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９などの天然に存在するクラス２  ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、およびＣｐｆ１、ならびにそれらから誘導されるまたは得られる他のヌクレアーゼを含むがこれらに限定されない。機能に関しては、ＲＮＡガイドヌクレアーゼは、（ａ）ガイド分子（例えば、ｇＲＮＡ）と相互作用する（例えば、それと複合体を形成する）ヌクレアーゼ；ならびに（ｂ）ガイド分子（例えば、ｇＲＮＡ）と共に、（ｉ）ガイド分子の標的ドメインに相補的な配列（例えば、ｇＲＮＡ）、および任意選択により（ｉｉ）以下により詳細に記載される「プロトスペーサー隣接モチーフ」または「ＰＡＭ」と呼ばれるさらなる配列を含むＤＮＡの標的領域と会合し、任意選択により切断または修飾するヌクレアーゼと定義される。以下の実施例が例示するように、たとえ同じＰＡＭ特異性または切断活性を共有する個々のＲＮＡガイドヌクレアーゼ間に差異が存在しても、ＲＮＡガイドヌクレアーゼを、それらのＰＡＭ特異性および切断活性によって広い意味で定義することができる。当業者であれば、本開示のいくつかの態様が、特定のＰＡＭ特異性および／または切断活性を有する任意の適切なＲＮＡ誘導ヌクレアーゼを用いて実施できるシステム、方法、および組成物に関することを理解されよう。このため、特に断りのない限り、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼという用語は、一般的な用語として理解するべきであり、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの特定のタイプ（例えば、Ｃａｓ９対Ｃｐｆｌ）、種（例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）対Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ））、またはバリエーション（例えば、完全長対切断または分割；自然発生のＰＡＭ特異性対遺伝子操作ＰＡＭ特異性など）に限定されない。
【０２２３】
ＰＡＭ配列は、その名称が、ガイド分子標的化ドメインに相補的な「プロトスペーサー」配列（または「スペーサー」）とのその配列関係に由来する。プロトスペーサー配列と共に、ＰＡＭ配列は、特定のＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ／ガイド分子の組み合わせの標的領域または配列を規定する。
【０２２４】
様々なＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、ＰＡＭとプロトスペーサーとの間に異なる配列関係を必要とし得る。一般に、Ｃａｓ９は、ガイド分子と比較して視覚化されたプロトスペーサーの３’であるＰＡＭ配列を認識する。
【０２２５】
一方、Ｃｐｆ１は、一般に、ガイド分子と比較して視覚化されたプロトスペーサーの５’であるＰＡＭ配列を認識する。
【０２２６】
ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、ＰＡＭおよびプロトスペーサーの特異的な配列の向きを認識することに加えて、特異的なＰＡＭ配列を認識することもできる。例えば、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９は、Ｎ残基がガイド分子標的化ドメインによって認識される領域のすぐ３’側にあるＮＮＧＲＲＴまたはＮＮＧＲＲＶのＰＡＭ配列を認識する。Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９は、ＮＧＧ  ＰＡＭ配列を認識する。そしてＦ．ノビシダ（Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ）Ｃｐｆｌは、ＴＴＮ  ＰＡＭ配列を認識する。ＰＡＭ配列は、様々なＲＮＡ誘導ヌクレアーゼで同定されており、新規なＰＡＭ配列を同定するための戦略は、Ｓｈｍａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  ６０，３８５−３９７，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ５，２０１５に記載されている。また、遺伝子操作ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、参照分子のＰＡＭ特異性とは異なるＰＡＭ特異性を有し得ることにも留意するべきである（例えば、遺伝子操作ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの場合、参照分子は、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼが由来する天然起源の変異体、または遺伝子操作ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼと最も高いアミノ酸配列相同性を有する天然起源の変異体であり得る）。
【０２２７】
ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、それらのＰＡＭ特異性に加えて、それらのＤＮＡ切断活性によって特徴付けることができ：天然起源のＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、典型的には標的核酸にＤＳＢを形成するが、ＳＳＢ（上記）Ｒａｎ＆Ｈｓｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １５４（６），１３８０−１３８９，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １２，２０１３（Ｒａｎ）、参照により本明細書に援用される）のみを生じさせるまたは全く切断しない遺伝子操作変異体が作製された。
【０２２８】
Ｃａｓ９
結晶構造は、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（Ｊｉｎｅｋ  ２０１４）、および単分子ガイドＲＮＡおよび標的ＤＮＡと複合体を形成しているＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９について決定されている（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ  ２０１４；Ａｎｄｅｒｓ  ２０１４；およびＮｉｓｈｉｍａｓ  ２０１５）。
【０２２９】
天然に存在するＣａｓ９タンパク質は、それぞれが特定の構造ドメインおよび／または機能ドメインを含む２つのローブ：認識（ＲＥＣ）ローブおよびヌクレアーゼ（ＮＵＣ）ローブを含む。ＲＥＣローブは、アルギニンに富む架橋ヘリックス（ＢＨ）ドメイン、および少なくとも１つのＲＥＣドメイン（例えば、ＲＥＣ１ドメインおよび任意選択によるＲＥＣ２ドメイン）を含む。ＲＥＣローブは、他の既知のタンパク質と構造的類似性を共有しておらず、このＲＥＣローブが独特の機能的ドメインであることを示している。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、突然変異分析は、ＢＨおよびＲＥＣドメインに対する特定の機能的役割を示唆し：ＢＨドメインは、ガイド分子：ＤＮＡ認識における役割を果たし、ＲＥＣドメインは、ガイド分子の反復：抗反復二重鎖と相互作用し、かつＣａｓ９／ガイド分子複合体の形成を媒介すると思われる。
【０２３０】
ＮＵＣローブは、ＲｕｖＣドメイン、ＨＮＨドメイン、およびＰＡＭ相互作用（ＰＩ）ドメインを含む。ＲｕｖＣドメインは、レトロウィルスインテグラーゼスーパーファミリーメンバーと構造的類似性を共有し、かつ標的核酸の非相補（すなわち、底部）鎖を切断する。ＲｕｖＣドメインは、２つ以上の分割ＲｕｖＣモチーフ（Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）およびＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）におけるＲｕｖＣ  Ｉ、ＲｕｖＣＩＩ、およびＲｕｖＣＩＩＩなど）から形成され得る。その一方、ＨＮＨドメインは、ＨＮＮエンドヌクレアーゼモチーフと構造的に類似しており、標的核酸の相補（すなわち、上部）鎖を切断する。ＰＩドメインは、その名前が示すようにＰＡＭ特異性に寄与する。
【０２３１】
Ｃａｓ９の特定の機能は、（必ずしも上記の特定のドメインによって完全に決定されるものではないが）上記の特定のドメインにリンクしているが、これらおよび他の機能は、他のＣａｓ９ドメインによって、またはいずれかのローブ上の複数のドメインによって媒介または影響され得る。例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９では、Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ  ２０１４に記載されているように、ガイド分子の反復：抗反復二重鎖がＲＥＣローブとＮＵＣローブとの間の溝に入り、そして二重鎖中のヌクレオチドがＢＨ、ＰＩ、およびＲＥＣドメイン中のアミノ酸と相互作用する。第２および第３のステムループ（ＲｕｖＣおよびＰＩドメイン）中のいくつかのヌクレオチドがそうであるように、第１のステムループ構造中のいくつかのヌクレオチドもまた、複数のドメイン（ＰＩ、ＢＨ、およびＲＥＣ１）中のアミノ酸と相互作用する。
【０２３２】
Ｃｐｆｌ
ｃｒＲＮＡおよび二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ標的（ＴＴＴＮ  ＰＡＭ配列を含む）と複合体を形成したアシダミノコッカス属（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）Ｃｐｆ１の結晶構造が、Ｙａｍａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（参照により本明細書に援用される、Ｃｅｌｌ．２０１６  Ｍａｙ  ５；１６５（４）：９４９−９６２（Ｙａｍａｎｏ））によって解明された。Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９のように、２つのローブ：ＲＥＣ（認識）ローブおよびＮＵＣ（ヌクレアーゼ）ローブを有する。ＲＥＣローブは、ＲＥＣ１およびＲＥＣ２ドメインを含み、いかなる既知のタンパク質構造とも類似性がない。一方、ＮＵＣローブは、３つのＲｕｖＣドメイン（ＲｕｖＣ−１、ＲｕｖＣ−ＩＩ、およびＲｕｖＣ−ＩＩＩ）およびＢＨドメインを含む。しかし、Ｃａｓ９とは対照的に、Ｃｐｆｌ  ＲＥＣローブは、ＨＮＨドメインを欠き、同様に既知のタンパク質構造と類似性を欠いた他のドメイン：構造的にユニークなＰＩドメイン、３つのＷｅｄｇｅ（ＷＥＤ）ドメイン（ＷＥＤ−１、ＷＥＤ−ＩＩ、およびＷＥＤ−ＩＩＩ）、およびヌクレアーゼ（Ｎｕｃ）ドメインを含む。
【０２３３】
Ｃａｓ９およびＣｐｆｌは、構造および機能の類似性を共有するが、特定のＣｐｆｌ活性は、いかなるＣａｓ９ドメインにも類似していない構造ドメインによって媒介されることを理解されたい。例えば、標的ＤＮＡの相補鎖の切断は、Ｃａｓ９のＨＮＨドメインと配列的および空間的に異なるＮｕｃドメインによって媒介されるようである。加えて、Ｃｐｆｌガイド分子の非標的部分（ハンドル）は、Ｃａｓ９ガイド分子における反復：アンチリピート二重鎖によって形成されるステムループ構造ではなく、偽ノット構造（ｐｓｅｕｄｏｋｎｏｔ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）をとる。
【０２３４】
ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの修飾
上記のＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、様々な用途において有用であり得る活性および特性を有するが、当業者であれば、ある場合には、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼもまた、切断活性、ＰＡＭ特異性、または他の構造的もしくは機能的特徴を変化させるために修飾できることを理解されよう。
【０２３５】
まず、切断活性を変化させる修飾については、ＮＵＣローブ内のドメインの活性を低下させるまたは排除する突然変異が上に記載されている。ＲｕｖＣドメイン、Ｃａｓ９  ＨＮＨドメイン、またはＣｐｆｌ  Ｎｕｃドメインで生じさせることができる例示的な突然変異は、ＲａｎおよびＹａｍａｎｏ、ならびにＣｏｔｔａ−Ｒａｍｕｓｉｎｏに記載されている。一般に、２つのヌクレアーゼドメインのうちの１つの活性を低減または排除する突然変異は、ニッカーゼ活性を有するＲＮＡ誘導ヌクレアーゼを生じさせるが、ニッカーゼ活性のタイプは、どのドメインが不活性化されるかによって異なることに留意するべきである。一例として、Ｃａｓ９のＲｕｖＣドメインの不活性化により、相補鎖または上鎖を切断するニッカーゼが生じる。
【０２３６】
他方、Ｃａｓ９  ＨＮＨドメインの不活性化により、底鎖または非相補鎖を切断するニッカーゼが生じる。
【０２３７】
天然に存在するＣａｓ９参照分子と比較したＰＡＭ特異性の変更は、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１５  Ｊｕｌ  ２３；５２３（７５６１）：４８１−５（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ  Ｉ）およびＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５  Ｄｅｃ；３３（１２）：１２９３−１２９８（Ｋｌｉｅｎｓｔｉｖｅｒ  ＩＩ））の両方についてＫｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒらにより記載されている。Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒらはまた、Ｃａｓ９の標的忠実度を改善する変更を記載している（Ｎａｔｕｒｅ，２０１６  Ｊａｎｕａｒｙ  ２８；５２９，４９０−４９５（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ  ＩＩＩ））。これらの参考文献のそれぞれは、参照により本明細書に援用される。
【０２３８】
ＲＮＡガイドヌクレアーゼは、Ｚｅｔｓｃｈｅら（参照により援用される、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５  Ｆｅｂ；３３（２）：１３９−４２（Ｚｅｔｓｃｈｅ  ＩＩ））およびＦｉｎｅら（参照により援用される、Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．２０１５  Ｊｕｌ  １；５：１０７７７（Ｆｉｎｅ））によって記載されているように、２つ以上の部分に分割されている。
【０２３９】
ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、特定の実施形態では、例えば、ガイド分子会合、標的およびＰＡＭ認識、および切断活性を維持しながらヌクレアーゼのサイズを減少させる１つまたは複数の欠失によって、サイズを最適化または切断することができる。特定の実施形態では、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、任意選択によりリンカーを用いて、別のポリペプチド、ヌクレオチド、または他の構造に共有結合または非共有結合で結合する。例示的な結合ヌクレアーゼおよびリンカーは、本明細書のすべての目的のために参照により援用されるＧｕｉｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３２，５７７−５８２（２０１４）に記載されている。
【０２４０】
ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼはまた、任意選択により、タグ、例えば、限定はしないが、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼタンパク質の核内への移動を容易にする核局在化シグナルを含む。特定の実施形態では、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、Ｃ末端および／またはＮ末端核局在化シグナルを組み込むことができる。核局在化配列は、当該技術分野で公知であり、Ｍａｅｄｅｒおよび他の箇所に記載されている。
【０２４１】
前述の修飾のリストは本質的に例示的であることを意図し、当業者であれば、本開示から、特定の用途において他の修飾が可能である、または望ましい場合があることを理解されよう。したがって、簡潔にするために、本開示の例示的なシステム、方法、および組成物は、特定のＲＮＡ誘導ヌクレアーゼを参照して提示されるが、使用されるＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、それらの作動原理を変更しないで修飾できることを理解するべきである。このような修飾は、本開示の範囲内である。
【０２４２】
ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードする核酸
ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆｌ、またはその機能的断片をコードする核酸が本明細書で提供される。ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードする例示的な核酸は、既に記載されている（例えば、Ｃｏｎｇ  ２０１３；Ｗａｎｇ  ２０１３；Ｍａｌｉ  ２０１３；Ｊｉｎｅｋ  ２０１２を参照）。
【０２４３】
場合によっては、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードする核酸は、合成核酸配列であり得る。例えば、合成核酸分子は、化学的に修飾することができる。特定の実施形態では、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡは、以下の特性のうちの１つまたは複数（例えば、すべて）を有し得る：このｍＲＮＡを、キャップする；ポリアデニル化する；ならびに５−メチルシチジンおよび／またはプソイドウリジンで置換することができる。
【０２４４】
合成核酸配列はまた、コドン最適化することもできる、例えば、少なくとも１つの非共通コドンまたはより一般的でないコドンが、共通コドンによって置換される。例えば、合成核酸は、最適化されたメッセンジャーｍＲＮＡの合成を誘導する、例えば、本明細書に記載される哺乳類発現系における発現に最適化することができる。コドン最適化Ｃａｓ９コード配列の例は、Ｃｏｔｔａ−Ｒａｍｕｓｉｎｏに示されている。
【０２４５】
加えて、または代替的に、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードする核酸は、核局在化配列（ＮＬＳ）を含み得る。核局在化配列は当該技術分野で公知である。
【０２４６】
候補分子の機能解析
候補ＲＮＡガイドヌクレアーゼ、誘導分子、およびそれらの複合体は、当技術分野で公知の標準的な方法によって評価することができる。例えば、Ｃｏｔｔａ−Ｒａｍｕｓｉｎｏを参照されたい。ＲＮＰ複合体の安定性は、以下に記載されるように、示差走査蛍光定量法によって評価することができる。
【０２４７】
示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）
ガイド分子およびＲＮＡガイドヌクレアーゼを含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体の熱安定性は、ＤＳＦを介して測定することができる。ＤＳＦ技術は、タンパク質の熱安定性を測定し、この安定性は、結合ＲＮＡ分子、例えばガイド分子の添加などの好ましい条件下で増加し得る。
【０２４８】
ＤＳＦアッセイは、任意の適切なプロトコルに従って実施することができ、かつ（ａ）ＲＮＰの形成のための最適条件を同定するために様々な条件（例えば、様々な化学量論比のガイド分子：ＲＮＡガイドヌクレアーゼタンパク質、異なる緩衝液など）を試験すること；ならびに（ｂ）ＲＮＰの形成または安定性を改善する修飾を同定するためにＲＮＡガイドヌクレアーゼおよび／またはガイド分子の修飾（例えば、化学修飾、配列の改変など）を試験することを含むがこれらに限定されない任意の適切な設定で利用することができる。ＤＳＦアッセイの１つの読み出しは、ＲＮＰ複合体の融解温度のシフトであり；比較的高いシフトは、ＲＮＰ複合体が、より低いシフトを特徴とする参照ＲＮＰ複合体と比較してより安定である（したがって、より大きな活性またはより有利な形成の動力学、分解の動力学、または他の機能的特徴を有し得る）ことを示唆する。ＤＳＦアッセイがスクリーニングツールとして展開される場合、閾値融解温度シフトを特定することができるため、結果は、閾値以上の融解温度シフトを有する１つまたは複数のＲＮＰである。例えば、閾値は、５〜１０℃（例えば、５°、６°、７°、８°、９°、１０°）以上であり得、結果は、閾値以上の融解温度シフトを特徴とする１つまたは複数のＲＮＰであり得る。
【０２４９】
ＤＳＦアッセイ条件の２つの非限定的な例を以下に説明する：
【０２５０】
ＲＮＰ複合体を形成するための最良の溶液を決定するために、水＋１０×ＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｃａｔ＃Ｓ−６６５０）中の固定濃度（例えば、２μＭ）のＣａｓ９を３８４ウェルプレートに分注する。次に、様々なｐＨの溶液中で希釈された等モル量のガイド分子、および塩が添加される。室温で１０分間インキュベートし、短時間の遠心分離してあらゆる気泡を除去いた後、  Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ  Ｍａｎａｇｅｒ  ソフトウェアと共に、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ３８４（商標）Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｃ１０００  Ｔｏｕｃｈ（商標）サーマルサイクラーを使用して、１０秒毎に１℃の温度増大で２０℃から９０℃への勾配が実行される。
【０２５１】
第２のアッセイは、上記アッセイ１からの最適緩衝液中で、様々な濃度のガイド分子と決まった濃度（例えば、２μＭ）のＣａｓ９を混合して、３８４ウェルプレート内で、（例えば、室温で１０分間）インキュベートすることからなる。等容積の最適緩衝液と１０×ＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号Ｓ−６６５０）が添加され、プレートは、Ｍｉｃｒｏｓｅａｌ（登録商標）Ｂ粘着剤（ＭＳＢ−１００１）で密封される。あらゆる気泡を除去するための短時間の遠心分離に続いて、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ  Ｍａｎａｇｅｒソフトウェアと共に、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ３８４（商標）Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｃ１０００  Ｔｏｕｃｈ（商標）サーマルサイクラーを使用して、１０秒毎に１℃の温度増大で２０℃から９０℃への勾配が実行される。
【０２５２】
ゲノム編集戦略
本開示の様々な実施形態では、上記のゲノム編集システムを使用して、細胞内のＤＮＡまたは細胞から得られたＤＮＡの標的領域で編集を行う（すなわち、改変する）。特定の編集を行うための様々な戦略が本明細書で説明され、これらの戦略は、一般に、所望の修復結果、個々の編集（例えば、ＳＳＢまたはＤＳＢ）の数および位置、ならびにそのような編集の標的部位に関して説明される。
【０２５３】
ＳＳＢまたはＤＳＢの形成を含むゲノム編集戦略は、（ａ）標的領域のすべてまたは一部の欠失；（ｂ）標的領域への挿入またはそのすべてまたは一部の置換；または（ｃ）標的領域のすべてまたは一部の中断を含む修復結果を特徴とする。この分類は、限定することを意図するものでも、どの特定の理論またはモデルに拘束することを意図するものでもなく、提示を簡潔にするためだけに提供される。当業者であれば、列挙された結果が相互に排他的ではなく、いくつかの修復が他の結果をもたらし得ることを理解されよう。特定の編集戦略または方法の説明は、特段の記載がない限り、特定の修復結果を必要とすると理解するべきではない。
【０２５４】
標的領域の置換は、一般に、例えば遺伝子修正または遺伝子変換、ＨＤＲ経路によって媒介される２つの修復結果を介した、標的領域内の既存の配列のすべてまたは一部の相同配列での置換を含む。ＨＤＲは、以下により詳細に記載されるように、一本鎖または二本鎖であり得るドナーテンプレートの使用によって促進される。一本鎖または二本鎖テンプレートは、外因性であり得、その場合は、遺伝子修正を促進するか、または内因性（例えば、細胞ゲノム内の相同配列）であり得、遺伝子変換を促進する。外因性テンプレートは、例えばＲｉｃｈａｒｄｓｏｎら（参照により援用される、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３４，３３９−３４４（２０１６），（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ））によって記載されているように、非対称オーバーハング（すなわち、ＤＳＢの部位に相補的なテンプレートの一部が、ドナーテンプレートの中心に位置するのではなく、３’または５’方向にオフセットしてもよい）を有し得る。テンプレートが一本鎖である場合、テンプレートは、標的領域の相補鎖（上部）または非相補鎖（底部）のいずれかに対応し得る。
【０２５５】
遺伝子変換および遺伝子修正は、場合によっては、ＲａｎおよびＣｏｔｔａ−Ｒａｍｕｓｉｎｏに記載されているように、標的領域内またはその周囲に１つまたは複数のニックを形成することによって促進される。場合によっては、二重ニッカーゼ戦略を使用して２つのオフセットＳＳＢを形成し、それにより、オーバーハング（例えば、５’オーバーハング）を有する単一ＤＳＢを形成する。
【０２５６】
標的配列のすべてまたは一部の中断および／または欠失は、様々な修復結果によって達成することができる。一例として、ＬＣＡ１０突然変異についてＭａｅｄｅｒに記載されているように、標的領域に隣接する２つ以上のＤＳＢを同時に生成し、続いてＤＳＢが修復されるときにこの標的領域が切除されることによって配列を欠失させることができる。別の例として、一本鎖オーバーハングを有する二本鎖切断の形成、これに続く修復前のオーバーハングのエキソヌクレアーゼプロセシングによって生成される欠失によって配列を中断することができる。
【０２５７】
１つの特定のサブセットの標的配列の中断は、標的配列内のインデルの形成によって媒介され、ここで、修復結果は、典型的にはＮＨＥＪ経路（Ａｌｔ−ＮＨＥＪを含む）によって媒介される。ＮＨＥＪは、そのインデル突然変異との関連のために「エラーが起こりやすい」修復経路と呼ばれる。しかしながら、場合によっては、ＤＳＢは、その周囲の配列を改変することなくＮＨＥＪによって修復され（いわゆる「完全な」または「傷のない」修復）；これは、一般に、ＤＳＢの両端が完全にライゲーションされることを必要とする。その一方、インデルは、一方または両方の鎖の一方または両方の遊離末端に対してヌクレオチドを付加および／または除去する、ライゲーションされる前の遊離ＤＮＡ末端の酵素処理から生じると考えられる。
【０２５８】
遊離ＤＳＢ末端の酵素処理は、本質的に確率論的であり得るため、インデル突然変異は変化しやすい傾向にあり、分布に沿って起こり、そして特定の標的部位、使用される細胞型、使用されるゲノム編集戦略などを含む様々な因子による影響を受け得る。それでも、インデル形成についての限られた一般論を得ることは可能であり：単一ＤＳＢの修復によって形成される欠失は、最も一般的には１〜５０ｂｐの範囲であるが、１００〜２００ｂｐを超え得る。単一ＤＳＢの修復によって形成された挿入は、より短くなる傾向にあり、しばしば，切断部位を直接取り囲む配列の短い重複を含む。しかしながら、大きな挿入を得ることが可能であり、これらの場合、挿入された配列は、しばしば、ゲノムの他の領域または細胞中に存在するプラスミドＤＮＡまで辿れた。
【０２５９】
インデル突然変異−およびインデルを生成するように構成されたゲノム編集システム−は、例えば、特定の最終配列の生成が必要ではない場合および／またはフレームシフト突然変異が許容される場合、標的配列を中断するのに有用である。これらはまた、所望の特定の配列が所与の部位でのＳＳＢまたはＤＳＢの修復から優先的に生じる傾向がある限り、特定の配列が好ましい設定で有用であり得る。インデル突然変異はまた、特定のゲノム編集システムおよびそれらの構成要素の活性を評価またはスクリーニングするための有用なツールである。これらおよび他の設定において、インデルは、（ａ）ゲノム編集システムと接触した細胞のゲノムにおけるそれらの相対的および絶対的頻度、ならびに（ｂ）未編集の配列に対する、例えば±１、±２、±３などの数値差の分布を特徴とし得る。一例として、リード発見の設定では、複数のガイド分子をスクリーニングして、制御された条件下でのインデル読み出しに基づいて、標的部位での切断を最も効率的に誘導するガイド分子を同定することができる。閾値頻度以上でインデルを生成するガイド、またはインデルの特定の分布を生成するガイドは、さらなる研究および開発のために選択することができる。インデルの頻度および分布は、例えばガイド分子を一定に保ち、そして他の特定の反応条件または送達方法を変更することによって、異なるゲノム編集システムの実施または製剤化および送達方法を評価するための読み出しとしても有用であり得る。
【０２６０】
多重化戦略
上で論じられた例示的な戦略は、単一ＤＳＢによって媒介される修復結果に焦点を当てているが、本開示によるゲノム編集システムは、同じ遺伝子座または異なる遺伝子座のいずれかで２つ以上のＤＳＢを生成するためにも利用することができる。複数のＤＳＢまたはＳＳＢの形成を含む編集の戦略は、例えばＣｏｔｔａ−Ｒａｍｕｓｉｎｏに記載されている。
【０２６１】
ドナーテンプレートの設計
ドナーテンプレートの設計は、文献、例えばＣｏｔｔａ−Ｒａｍｕｓｉｎｏに詳細に記載されている。一本鎖（ｓｓＯＤＮ）または二本鎖（ｄｓＯＤＮ）であり得るＤＮＡオリゴマードナーテンプレート（オリゴデオキシヌクレオチドまたはＯＤＮ）は、ＤＳＢのＨＤＲに基づく修復を容易にするために使用することができ、かつ標的ＤＮＡ配列への改変の導入、標的配列への新しい配列の挿入、または標的配列の完全な置換に特に有用である。
【０２６２】
一本鎖または二本鎖にかかわらず、ドナーテンプレートは、一般に、切断されるべき標的配列内またはその近傍の（例えば、隣接または近接した）ＤＮＡ領域と相同な領域を含む。これらの相同領域は、本明細書では「相同性アーム」と呼ばれ、以下に概略的に例示される：
［５’相同性アーム］−［置換配列］−［３’相同性アーム］
【０２６３】
相同性アームは、任意の適切な長さ（１つの相同性アームのみが使用される場合は０ヌクレオチドを含む）を有することができ、３’および５’相同性アームは、同じ長さを有し得る、または長さが異なり得る。適切な相同性アーム長の選択は、Ａｌｕ反復または他の非常に一般的な要素などの特定の配列との相同性またはマイクロホモロジーを回避したいという願望などの様々な因子による影響を受け得る。例えば、５’相同性アームを短くして配列反復要素を回避することができる。他の実施形態では、３’相同性アームを短くして配列反復要素を回避することができる。いくつかの実施形態では、５’および３’相同性アームの両方を短くして、特定の配列反復要素を含まないようにすることができる。加えて、いくつかの相同性アームの設計は、編集の効率を改善する、または所望の修復結果の頻度を高めることができる。例えば、参照により援用される、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３４，３３９−３４４（２０１６）（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ）は、一本鎖ドナーテンプレートの３’および５’相同性アームの相対的非対称性が修復率および／または結果に影響を与えることを見出した。
【０２６４】
ドナーテンプレート中の置換配列は、Ｃｏｔｔａ−Ｒａｍｕｓｉｎｏらを含む他の場所に記載されている。置換配列は、任意の適切な長さ（所望の修復結果が欠失である０ヌクレオチドを含む）であり得、そして典型的には、編集が望まれる細胞内の天然に存在する配列に対して１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の配列の改変を含む。１つの一般的な配列の改変は、処置が望まれる疾患または状態に関連する突然変異を修復するための天然に存在する配列の改変を含む。別の一般的な配列の改変は、置換配列が標的部位に組み込まれた後に標的部位の反復切断を低減または排除するために、ＳＳＢまたはＤＳＢを生成するために使用されるＲＮＡガイドヌクレアーゼのＰＡＭ配列またはガイド分子の標的ドメインに相補的であるか、またはそれをコードする１つまたは複数の配列の改変を含む。
【０２６５】
線状ｓｓＯＤＮが使用される場合、線状ｓｓＯＤＮは、（ｉ）標的核酸のニックの入った鎖にアニールする、（ｉｉ）標的核酸の無傷の鎖にアニールする、（ｉｉｉ）標的核酸のプラス鎖にアニールする、かつ／または（ｉｖ）標的核酸のマイナス鎖にアニールするように構成することができる。ｓｓＯＤＮは、任意の適切な長さ、例えば、約、少なくとも、または１５０〜２００ヌクレオチド以下（例えば、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００ヌクレオチド）を有し得る。
【０２６６】
テンプレート核酸はまた、ウィルスゲノムまたは環状二本鎖ＤＮＡ、例えばプラスミドなどの核酸ベクターであり得ることに留意されたい。ドナーテンプレートを含む核酸ベクターは、他のコード要素または非コード要素を含み得る。例えば、テンプレート核酸は、特定のゲノム骨格要素（例えば、ＡＡＶゲノムの場合には逆方向末端反復）、および任意選択によりガイド分子および／またはＲＮＡガイドヌクレアーゼをコードするさらなる配列を含むウィルスゲノムの一部として（例えば、ＡＡＶゲノムまたはレンチウィルスゲノム中で）送達することができる。特定の実施形態では、ドナーテンプレートは、同じガイド分子を使用して細胞ＤＮＡに形成された対応するＳＳＢまたはＤＳＢの修復に関与し得るドナーテンプレートの一方または両方の末端での遊離ＤＳＢの形成を容易にするために、１つまたは複数のガイド分子によって認識される標的部位に近接または隣接し得る。ドナーテンプレートとしての使用に適した例示的な核酸ベクターは、Ｃｏｔｔａ−Ｒａｍｕｓｉｎｏに記載されている。
【０２６７】
いかなる形式が使用されても、テンプレート核酸は、不所望の配列を回避するように設計することができる。特定の実施形態では、一方または両方の相同性アームを短くして、特定の配列反復要素、例えばＡｌｕ反復、ＬＩＮＥ要素などとの重複を回避することができる。
【０２６８】
標的細胞
本開示によるゲノム編集システムは、細胞を操作または改変するため、例えば標的核酸を編集または改変するために使用することができる。この操作は、様々な実施形態では、インビボまたはエクスビボで行うことができる。
【０２６９】
本開示の実施形態に従って様々な細胞型を操作または改変することができ、インビボ適用などのいくつかの場合には、複数の細胞型が、例えば本開示によるゲノム編集システムを複数の細胞型に送達することによって改変または操作される。しかしながら、他の場合には、操作または改変を、１つまたは複数の特定の細胞型に限定することが望ましいであろう。例えば、場合によっては、限定された分化能を有する細胞または最終分化細胞、例えば遺伝子型の改変により細胞表現型の変化が期待されるＭａｅｄｅｒの場合の光受容細胞などを編集するのに望ましいであろう。しかしながら、他の場合には、それほど分化していない多分化能または多能性の幹細胞または前駆細胞を編集することが望ましいであろう。例として、細胞は、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、造血幹細胞／前駆細胞（ＨＳＰＣ）、または所与の用途もしくは徴候に適切な細胞型に分化する他の幹細胞もしくは前駆細胞型であり得る。
【０２７０】
当然の結果として、改変または操作される細胞は、標的とされる細胞型および／または所望の編集結果に応じて分裂細胞または非分裂細胞と様々である。
【０２７１】
細胞がエクスビボで操作または改変される場合、細胞は直ちに使用（例えば、対象に投与）することもできるし、または後の使用のために維持または保存することもできる。当業者であれば、当技術分野において公知の任意の適切な方法を使用して、細胞を培養物中に維持する、または保存する（例えば、液体窒素中で凍結する）ことができることを理解されよう。
【０２７２】
ゲノム編集システムの実施：送達、製剤化、および投与経路
上で論じられたように、本開示のゲノム編集システムは、任意の適切な方法で実施することができ、これは、ＲＮＡガイドヌクレアーゼ、ガイド分子、および任意選択のドナーテンプレート核酸を含むがこれらに限定されないそのようなシステムの構成要素を、形質導入、発現、またはゲノム編集システムの導入をもたらし、かつ／または細胞、組織、もしくは対象において所望の修復結果をもたらす、任意の適切な形態または形態の組み合わせで送達、製剤化、または投与することができる。表５および表６は、ゲノム編集システムの実施のいくつかの非限定的な例を示す。しかしながら、当業者であれば、これらのリストが包括的ではなく、そして他の実施も可能であることを理解されよう。特に表５を参照すると、この表は、単一ガイド分子および任意選択のドナーテンプレートを含むゲノム編集システムのいくつかの例示的な実施を列挙する。しかしながら、本開示によるゲノム編集システムは、複数のガイド分子、複数のＲＮＡガイドヌクレアーゼ、およびタンパク質などの他の構成要素を組み込むことができ、当業者であれば、表に例示された原理に基づいて様々な実施が明らかであろう。表中、［Ｎ／Ａ］は、ゲノム編集システムが示された構成要素を含まないことを示す。
【０２７３】
【表７】
2020503049.tif 000158
【０２７４】
【表８】
2020503049.tif 000159
【０２７５】
表６は、本明細書中に記載されるように、ゲノム編集システムの構成要素のための様々な送達方法を要約する。ここでも同様に、列挙は、限定ではなく例示であるものとする。
【０２７６】
【表９】
2020503049.tif 000160
【０２７７】
ゲノム編集システムの核酸ベースの送達
本開示によるゲノム編集システムの様々な要素をコードする核酸は、当技術分野で公知の方法によって、または本明細書に記載されるように対象に投与するか、または細胞に送達することができる。例えば、ＲＮＡガイドヌクレアーゼをコードし、かつ／またはガイド分子をコードするＤＮＡ、ならびにドナーテンプレート核酸は、例えば、ベクター（例えば、ウィルスベクターまたは非ウィルスベクター）、非ベクターベースの方法（例えば、裸ＤＮＡまたはＤＮＡ複合体を使用する）、またはそれらの組み合わせによって送達することができる。
【０２７８】
ゲノム編集システムまたはその構成要素をコードする核酸は、例えばトランスフェクションまたはエレクトロポレーションによって裸ＤＮＡまたはＲＮＡとして細胞に直接送達することもできるし、または標的細胞（例えば、赤血球、ＨＳＣ）による取り込みを促進する分子（例えば、Ｎ−アセチルガラクトサミン）にコンジュゲートさせることもできる。表６に要約されたベクターなどの核酸ベクターも使用することができる。
【０２７９】
核酸ベクターは、ＲＮＡガイドヌクレアーゼ、誘導分子、および／またはドナーテンプレートなどのゲノム編集システムの構成要素をコードする１つまたは複数の配列を含み得る。ベクターはまた、タンパク質をコードする配列に会合される（例えば、その中に挿入されるかまたは融合される）、（例えば、核局在化、核小体局在化、またはミトコンドリア局在化のための）シグナルペプチドをコードする配列も含み得る。一例として、核酸ベクターは、１つまたは複数の核局在化配列（例えば、ＳＶ４０由来の核局在化配列）を含むＣａｓ９コード配列を含み得る。
【０２８０】
核酸ベクターはまた、任意の適切な数の調節／制御要素、例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化シグナル、コザックのコンセンサス配列、または内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含み得る。これらの要素は、当該技術分野において周知であり、Ｃｏｔｔａ−Ｒａｍｕｓｉｎｏに記載されている。
【０２８１】
本開示による核酸ベクターには、組換えウィルスベクターが含まれる。例示的なウィルスベクターは表６に記載されており、さらなる適切なウィルスベクターならびにそれらの使用および産生は、Ｃｏｔｔａ−Ｒａｍｕｓｉｎｏに記載されている。当技術分野で公知の他のウィルスベクターも使用することができる。さらに、ウィルス粒子を使用して、ゲノム編集システムの構成要素を核酸および／またはペプチドの形態で送達することができる。例えば、「空の」ウィルス粒子は、任意の適切なカーゴを含むように組み立てることができる。ウィルスベクターおよびウィルス粒子はまた、標的リガンドを組み込んで標的組織特異性を変更するためにエンジニアリングすることができる。
【０２８２】
ウィルスベクターに加えて、非ウィルスベクターを使用して、本開示によるゲノム編集システムをコードする核酸を送達することができる。非ウィルス核酸ベクターの１つの重要なカテゴリーはナノ粒子であり、ナノ粒子は、有機または無機であり得る。ナノ粒子は、当技術分野において周知であり、Ｃｏｔｔａ−Ｒａｍｕｓｉｎｏに要約されている。任意の適切なナノ粒子の設計を使用して、ゲノム編集システムの構成要素またはそのような構成要素をコードする核酸を送達することができる。例えば、有機（例えば、脂質および／またはポリマー）ナノ粒子は、本開示の特定の実施形態における送達媒体としての使用に適し得る。ナノ粒子製剤および／または遺伝子導入に使用するための例示的な脂質が表７に示され、表８に、遺伝子導入および／またはナノ粒子製剤に使用するための例示的なポリマーが列挙されている。
【０２８３】
【表１０】
2020503049.tif 000161
【０２８４】
【表１１】
2020503049.tif 000162
【０２８５】
非ウィルスベクターは、取り込みを改善するため、および／または特定の細胞型を選択的に標的にするために標的修飾を任意選択により含む。これらの標的修飾は、例えば、細胞特異的抗原、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、アプタマー、ポリマー、糖（例えば、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ））、および細胞透過性ペプチドを含み得る。そのようなベクターはまた、任意選択により、融合誘導性およびエンドソーム不安定化ペプチド／ポリマーを使用し、（例えば、カーゴのエンドソーム脱出を促進するために）酸誘発構造変化を受け、かつ／または、例えば細胞区画への放出のために刺激切断ポリマーを組み込む。例えば、還元性細胞環境で切断されるジスルフィド系カチオン性ポリマーを使用することができる。
【０２８６】
ある実施形態では、ゲノム編集システムの構成要素、例えば本明細書に記載のＲＮＡガイドヌクレアーゼ構成要素および／またはガイド分子構成要素以外の１つまたは複数の核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子）が送達される。特定の実施形態では、核酸分子は、ゲノム編集システムの１つまたは複数の構成要素と同時に送達される。特定の実施形態では、核酸分子は、ゲノム編集システムの１つまたは複数の構成要素が送達される（例えば、約３０分、１時間、２時間、３時間、６時間、９時間、１２時間、１日、２日、３日、１週間、２週間、または４週間未満）前または後に送達される。特定の実施形態では、核酸分子は、ゲノム編集システムの１つまたは複数の構成要素、例えば、ＲＮＡガイドヌクレアーゼ構成要素および／またはガイド分子構成要素が送達される手段とは異なる手段によって送達される。核酸分子は、本明細書に記載の任意の送達方法によって送達することができる。例えば、核酸分子は、ウィルスベクター、例えば組み込み不完全レンチウィルス（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）によって送達することができ、ＲＮＡガイドヌクレアーゼ分子構成要素および／またはガイド分子構成要素は、例えば、核酸（例えば、ＤＮＡ）に起因する毒性を低減できるようにエレクトロポレーションによって送達することができる。特定の実施形態では、核酸分子は、治療用タンパク質、例えば本明細書に記載のタンパク質をコードする。特定の実施形態では、核酸分子は、ＲＮＡ分子、例えば本明細書に記載のＲＮＡ分子をコードする。
【０２８７】
ＲＮＰおよび／またはゲノム編集システムの構成要素をコードするＲＮＡの送達
ＲＮＰ（ガイド分子とＲＮＡガイドヌクレアーゼとの複合体）および／またはＲＮＡガイドヌクレアーゼおよび／またはガイド分子をコードするＲＮＡは、いくつかがＣｏｔｔａ−Ｒａｍｕｓｉｎｏに記載されている当技術分野で公知の方法によって細胞内に送達するか、または対象に投与することができる。インビトロでは、ＲＮＡガイドヌクレアーゼをコードするＲＮＡおよび／またはガイド分子をコードするＲＮＡを、例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、一過性細胞圧縮または圧搾によって送達することができる（例えば、Ｌｅｅ  ２０１２を参照）。脂質媒介トランスフェクション、ペプチド媒介送達、ＧａｌＮＡｃまたは他のコンジュゲート媒介送達、およびそれらの組み合わせもまた、インビトロおよびインビボでの送達に使用することができる。
【０２８８】
インビトロでは、エレクトロポレーションによる送達は、細胞を、ドナーテンプレート核酸分子を用いてまたは用いずに、ＲＮＡガイドヌクレアーゼおよび／またはガイド分子をコードするＲＮＡと、カートリッジ、チャンバー、またはキュベット内で混合し、規定の持続時間および振幅の１つまたは複数の電気インパルスを加えることを含む。エレクトロポレーションのためのシステムおよびプロトコルは当技術分野で公知であり、任意の適切なエレクトロポレーションツールおよび／またはプロトコルを、本開示の様々な実施形態に関連して使用することができる。
【０２８９】
投与経路
ゲノム編集システム、またはそのようなシステムを用いて改変または操作された細胞は、局所的または全身的にかかわらず、任意の適切なモードまたは経路によって対象に投与することができる。全身投与様式には、経口経路および非経口経路が含まれる。非経口経路には、例えば、静脈内経路、骨髄内経路、動脈内経路、筋肉内経路、皮内経路、皮下経路、鼻腔内経路、および腹腔内経路が含まれる。全身投与される構成要素は、標的、例えば、ＨＳＣ、造血幹／前駆細胞、または赤血球前駆体または前駆細胞に合わせて変更するまたは製剤化することができる。
【０２９０】
局所投与様式には、例えば、骨梁骨への骨髄内注射または骨髄腔への大腿骨内注射、および門脈への注入が含まれる。特定の実施形態では、（全身アプローチと比較して）著しく少ない量の構成要素が、（例えば、静脈内に）全身投与される場合と比較して（例えば、骨髄に直接的に）局所投与される場合に効果を発揮し得る。局所投与方法は、治療有効量の構成要素を全身投与する場合に起こり得る潜在的に毒性の副作用の発生を低減または排除することができる。
【０２９１】
投与は、定期的なボーラス（例えば、静脈内）として、または内部レザバーもしくは外部レザバー（例えば、静脈内バッグもしくは埋め込みポンプ）からの連続的注入として提供してもよい。構成要素は、例えば、徐放性薬物送達装置からの連続的放出によって局所投与してもよい。
【０２９２】
さらに、構成要素は、長期間にわたる放出を可能にするように、製剤化してもよい。放出系は、生分解性材料、または組み込まれた構成要素を拡散によって放出する材料からなるマトリックスを含み得る。構成要素は、放出系内に均一または不均一に分布することができる。様々な放出系が有用であり得るが、特定の用途に必要な放出速度に応じて適切な系が選択される。非分解性および分解性放出系の双方を用いることができる。好適な放出系として、ポリマーおよびポリマーマトリックス、非ポリマーマトリックス、または無機および有機賦形剤および希釈剤、例えば、限定はしないが、炭酸カルシウムおよび糖（例えば、トレハロース）などが挙げられる。放出系は、天然または合成のいずれであってもよい。しかしながら、一般的に、信頼性および再現性が高く、しかもより明確な放出プロフィールを生み出すことから、合成放出系が好ましい。放出系材料は、様々な分子量を有する構成要素が、上記材料を介した拡散、またはその分解により放出されるように選択することができる。
【０２９３】
代表的な合成生分解性ポリマーとして、例えば、以下のものが挙げられる：ポリ（アミノ酸）およびポリ（ペプチド）などのポリアミド；ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、乳酸グリコール酸共重合体、およびポリ（カプロラクトン）などのポリエステル；ポリ（無水物）；ポリオルトエステル；ポリカーボネート；ならびにこれらの化学誘導体（化学基、例えば、アルキル、アルキレンの置換、付加、ヒドロキシル化、酸化、および当業者により常用的に実施されるその他の修飾）、それらのコポリマーおよび混合物。代表的な合成非生分解性ポリマーとして、例えば、以下のものが挙げられる：ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレングリコール）、およびポリ（テトラメチレンオキシド）などのポリエーテル；メチル、エチル、その他のアリキル、ヒドロキシエチルメタクリレート、アクリル酸およびメタクリル酸などのビニルポリマー−ポリアクレートおよびポリメタクリレート、ならびにポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、およびポリ（酢酸ビニル）などのその他；ポリ（ウレタン）；アルキル、ヒドロキシアルキル、エーテル、エステル、ニトロセルロース、および様々な酢酸セルロースなどのセルロースおよびその誘導体；ポリシロキサン；ならびにこれらの任意の化学誘導体（化学基、例えば、アルキル、アルキレンの置換、付加、ヒドロキシル化、酸化、および当業者により常用的に実施されるその他の修飾）、それらのコポリマーおよび混合物。
【０２９４】
また、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）ミクロスフェアも使用することができる。典型的に、ミクロスフェアは、乳酸およびグリコール酸のポリマーからなり、中空のスフェアを形成するような構造をしている。スフェアは、直径が約１５〜３０ミクロンであってよく、本明細書に記載される構成要素をロードすることができる。
【０２９５】
構成要素の多モードまたは差次的送達
本開示を考慮すると、本明細書に開示されるゲノム編集システムの異なる構成要素は、一緒にまたは別個に、かつ同時にまたは非同時に送達できることを当業者は理解するであろう。ゲノム編集システムの構成要素の別々および／または非同時の送達は、ゲノム編集システムの機能に対する時間的または空間的制御を提供して、それらの活性によって引き起こされる特定の効果を制限するのに特に望ましいであろう。
【０２９６】
異なるまたは差次的モードは、本明細書の用法では、例えば、ＲＮＡガイドヌクレアーゼ分子、ガイド分子、テンプレート核酸、またはペイロードなどの対象構成要素分子に、異なる薬力学または薬物動態特性を付与する送達モードを指す。例えば、これらの送達モードにより、例えば、選択したコンパートメント、組織、または臓器において、異なる組織分布、異なる半減期、または異なる時間的分布をもたらすことができる。
【０２９７】
例えば、細胞、または細胞の子孫において持続する核酸ベクターによる送達、例えば自立複製または細胞核酸への挿入による送達など、いくつかの送達モードは、構成要素のより持続的発現および存在をもたらす。例として、例えば、ＡＡＶまたはレンチウィルスなどのウィルスによる送達がある。
【０２９８】
一例として、ゲノム編集システムの構成要素、例えばＲＮＡガイドヌクレアーゼおよびガイド分子は、体、または特定の区画、組織、または器官に送達される構成要素の結果として生じる半減期または持続性が異なるモードによって送達することができる。特定の実施形態では、ガイド分子はそのようなモードによって送達することができる。ＲＮＡガイドヌクレアーゼ分子の構成要素は、持続性を低下させるまたは曝露を少なくするモードによって体内または特定の区画もしくは組織もしくは器官に送達することができる。
【０２９９】
より一般的には、特定の実施形態では、第１の送達モードを用いて、第１の構成要素を送達し、第２の送達モードを用いて、第２の構成要素を送達する。第１の送達モードは、第１の薬力学的または薬物動態特性を付与する。第１の薬力学的特性は、例えば、身体、コンパートメント、組織もしくは臓器における、構成要素、または構成要素をコードする核酸の分布、持続性、または曝露であってよい。第２の送達モードは、第２の薬力学的または薬物動態特性を付与する。第２の薬力学的特性は、例えば、身体、コンパートメント、組織もしくは臓器における、構成要素、または構成要素をコードする核酸の分布、持続性、または曝露であってよい。
【０３００】
特定の実施形態では、例えば、分布、持続性、または曝露などの第１の薬力学的または薬物動態特性は、第２の薬力学的または薬物動態特性より限定されている。
【０３０１】
特定の実施形態では、第１の送達モードは、例えば、分布、持続性、または曝露などの薬力学的または薬物動態特性を例えば、最小にするなど、最適化するように選択される。
【０３０２】
特定の実施形態では、第２の送達モードは、例えば、分布、持続性、または曝露などの薬力学的または薬物動態特性を例えば、最大にするなど、最適化するように、選択される。
【０３０３】
特定の実施形態では、第１の送達モードは、例えば、核酸、例えば、プラスミドもしくはウィルスベクター、例えば、ＡＡＶもしくはレンチウィルスなどの比較的持続的な要素の使用を含む。このようなベクターは比較的持続的であるため、それらから転写された産物も比較的持続的となる。
【０３０４】
特定の実施形態では、第２の送達モードは、比較的一過性の要素、例えば、ＲＮＡ分子またはタンパク質を含む。
【０３０５】
特定の実施形態では、第１の構成要素は、ガイド分子を含み、送達モードは、比較的持続的であり、例えば、ガイド分子は、プラスミドまたはウィルスベクター、例えば、ＡＡＶもしくはレンチウィルスから転写される。これらの遺伝子は、タンパク質産物をコードせず、ガイド分子は、単独で作用することができないため、これらの遺伝子の転写には生理学的結果がほとんどない。第２の構成要素であるＲＮＡガイドヌクレアーゼ分子は、例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質として、一過性様式で送達され、完全なＲＮＡガイドヌクレアーゼ分子／ガイド分子複合体は、短い期間だけ存在し、活性である。
【０３０６】
さらに、構成要素は、互いに補完して、安全性および組織特異性を高める異なる分子形態で、または異なる送達ベクターを用いて送達することができる。
【０３０７】
差次的送達モードの使用によって、性能、安全性および／または効率を高めることができ、例えば、最終的なオフターゲット修飾の可能性を低減することができる。細菌由来のＣａｓ酵素からのペプチドは、ＭＨＣ分子による細胞の表面に展示されるため、低持続性モードによる、例えばＣａｓ９分子などの免疫原性構成要素の送達は免疫原性を低減し得る。二部送達システムは、これらの問題を軽減し得る。
【０３０８】
差次的送達モードを用いて、異なっているが、オーバーラップする標的領域に構成要素を送達することができる。活性複合体の形成は、標的領域のオーバーラップの外側で最小にされる。したがって、特定の実施形態では、例えば、ガイド分子などの第１の構成要素は、第１の空間的（例えば、組織など）分布をもたらす第１の送達モードによって送達される。例えば、ＲＮＡガイドヌクレアーゼ分子などの第２の構成要素は、第２の空間的（例えば、組織など）分布をもたらす第２の送達モードによって送達される。特定の実施形態では、第１のモードは、リポソーム、例えばポリマーナノ粒子などのナノ粒子、および例えばウィルスベクターなどの核酸から選択される第１の要素を含む。第２のモードは、上記の群から選択される第２の要素を含む。特定の実施形態では、第１の送達モードは、例えば、細胞特異的受容体もしくは抗体などの第１の標的化要素を含み、第２の送達モードは、その要素を含まない。特定の実施形態では、第２の送達モードは、例えば、第２の細胞特異的受容体もしくは第２の抗体などの第２の標的化要素を含む。
【０３０９】
ＲＮＡガイドヌクレアーゼ分子をウィルス送達ベクター、リポソーム、またはポリマーナノ粒子で送達する場合、単一の組織を標的化することだけが望ましいと考えられるとき、複数の組織への送達および複数の組織での治療活性の可能性がある。二部送達系は、この課題を解決し、組織特異性を高めることができる。異なっているが、オーバーラップする組織屈性を有する別々の送達ビヒクル中にガイド分子とＲＮＡガイドヌクレアーゼ分子をパッケージする場合、双方のベクターによって標的化された組織には、完全に機能性の複合体だけが形成される。
【実施例】
【０３１０】
本開示の特定の原理は、以下の非限定的な実施例によって例示される。
【０３１１】
実施例１：ジスクシンイミジルカーボネートを用いたアミン官能化ガイド分子断片のコンジュゲーションのための例示的なプロセス
図１Ａに例示されているように、第１の５’ガイド分子断片（例えば、３４量体）は、３’末端における（Ｃ６）−ＮＨ２リンカーを用いて合成され、第２の３’ガイド分子断片（例えば、６６量体）は、５’末端におけるＴＥＧ−ＮＨ２リンカーを用いて合成される。２つのガイド分子断片を、１０ｍＭ  ホウ酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、および５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含むｐＨ８．５の緩衝液中で１：１のモル比で混合する。得られたガイド分子濃度は、約５０〜１００μＭである。２つのガイド分子断片をアニールし、続いてＤＭＦ中、ジスクシンイミジルカーボネート（ＤＳＣ）を添加する（２．５ｍＭの最終濃度）。反応混合物を短時間ボルテックスし、次いで室温で１時間混合し、続いて過剰のジスクシンイミジルカーボネートを除去し、そして陰イオン交換ＨＰＬＣ精製を行う。
【０３１２】
実施例２：チオール官能化ガイド分子断片のブロモアセチル官能化ガイド分子断片へのコンジュゲーションのための例示的なプロセス
図２Ａに例示されているように、第１の５’ガイド分子断片（例えば、３４量体）は、３’末端における（Ｃ６）−ＮＨ２リンカーを用いて合成される。第１の５’ガイド分子断片を、ｐＨ８．５の１００ｍＭ  ホウ酸緩衝液に懸濁する。ガイド分子濃度は、約１００μＭ〜１ｍＭである。ＤＭＳＯ（５０当量）中、０．２容量のスクシンイミジル−３−（ブロモアセトアミド）プロピオネート（ＳＢＡＰ）をガイド分子溶液に添加する。室温で３０分間混合した後、１０容量の１００ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を添加する。混合物を、１０，０００ＭＷ  Ａｍｉｃｏｎ上で１０倍以上濃縮する。この混合物を、（ａ）１０容量の水を添加すること、および（ｂ）１０，０００ＭＷ  Ａｍｉｃｏｎ上で１０倍以上濃縮することによってさらに処理する。ステップ（ａ）および（ｂ）を３回繰り返して、３’末端にブロモアセチル部分を有する第１の５’ガイド分子断片（例えば、３４量体）を得る。
【０３１３】
図２Ｂに例示されているように、第２の３’ガイド分子断片（例えば、６６量体）は、５’末端におけるＴＥＧ−ＮＨ２リンカーを用いて合成される。第２の３’ガイド分子断片を、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含むｐＨ８．５の１００ｍＭ  ホウ酸緩衝液に懸濁する。ガイド分子濃度は、約１００μＭ〜１ｍＭである。ＤＭＳＯ（５０当量）中、０．２容量のスクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）をガイド分子溶液に添加する。室温で１時間混合した後、１×ＰＢＳ中の１Ｍ  ジチオトレイトール（ＤＴＴ）を添加する。混合物中のＤＴＴの最終濃度は、２０ｍＭである。室温で３０分間混合した後、５Ｍ  ＮａＣｌを加えて混合物中、０．３Ｍ  ＮａＣｌの最終濃度にし、続いて３容量のエタノールを加える。この混合物を、（ａ）−２０℃に１５分間冷却すること；（ｂ）（好ましくは４℃で）１７，０００ｇで５分間遠心分離すること；（ｃ）上清を除去すること；（ｄ）残渣を０．３Ｍ  ＮａＣｌ（アルゴンでスパージした）に懸濁すること；および（ｅ）３容量のエタノールを加えることによってさらに処理する。ステップ（ａ）〜（ｅ）を３回繰り返す。得られたペレット（すなわち、５’末端にチオールを有する第２の３’ガイド分子断片）を真空下で乾燥させる。
【０３１４】
図２Ｃに例示されているように、５’末端にチオールを有する第２の３’ガイド分子断片（例えば、６６量体）を、２ｍＭ  ＥＤＴＡを含むｐＨ８の１００ｍＭ  リン酸緩衝液（アルゴンでスパージした）中に懸濁する。ガイド分子濃度は、約１００μＭ〜１ｍＭである。３’末端にブロモアセチル部分を有する第１の５’ガイド分子断片（例えば、３４量体）を水中に懸濁させる（第２の３’ガイド分子断片混合物の体積に対して約０．１の体積）。ガイド分子濃度は、約１００μＭ〜１ｍＭである。第１の５’ガイド分子断片混合物を、第２の３’ガイド分子断片混合物（アルゴンでスパージした）に添加する。反応混合物を室温で一晩混合し、続いて陰イオン交換ＨＰＬＣ精製を行う。
【０３１５】
実施例３：カルボジイミドを用いたリン酸ガイド分子断片の３’ヒドロキシルガイド分子断片へのコンジュゲーションのための例示的なプロセス
図３Ａおよび図３Ｂに例示されているように、第１の５’ガイド分子断片（例えば、３４量体）は、標準的なホスホロアミデート化学を用いて合成される。５’−リン酸を含む第２の３’ガイド分子断片（例えば、６６量体）も合成される。第１および第２のガイド分子断片を、カップリング緩衝液（１００ｍＭ  ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ｐＨ６、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および１０ｍＭ  ＺｎＣｌ２）中、１：１のモル比で混合する。２つのガイド分子断片をアニールし、続いて１００ｍＭ  １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）および９０ｍＭ  イミダゾールを添加する。反応混合物を４℃で１〜５日間混合し、続いて脱塩および陰イオン交換ＨＰＬＣ精製を行う。
【０３１６】
実施例４：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるガイド分子活性の評価
実施例２のプロセスに従ってコンジュゲートされたガイド分子の活性を、Ｔ７Ｅ１切断アッセイによりＨＥＫ２９３Ｔ細胞において評価した。明確にするために、この実施例で使用したすべてのガイド分子は、以下の表９に示されているように、同一の標的ドメイン配列、および実質的に類似したＲＮＡ骨格配列を含んでいた。表において、標的ドメイン配列は、「Ｎ」によって縮重配列として示される一方、２つのガイド分子断片間の架橋の位置は［Ｌ］によって示される。
【０３１７】
【表１２】
2020503049.tif 000163
【０３１８】
ＩＶＴによって生成された単分子ガイド分子、合成単分子ガイド分子（すなわち、コンジュゲーションなしで調製された）、または実施例２のブロモアセチル−チオールプロセスによってコンジュゲートされた合成単分子ガイド分子を様々に含む様々な濃度のリボ核タンパク質複合体を、リポフェクション（ＣＲＩＳＰＲ−Ｍａｘ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）によってＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入し、後にゲノムＤＮＡを回収した。切断は、市販のキット（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，Ｉｏｗａが販売するＳｕｒｖｅｙｏｒ（商標））を使用して、標準的なＴ７Ｅ１切断アッセイを用いて評価した。結果を図４に示す。
【０３１９】
結果が示すように、コンジュゲートガイド分子は、用量依存的にＨＥＫ２９３細胞における切断を支持し、これは、ＩＶＴによって生成された単分子ガイド分子または合成単分子ガイド分子を用いて観察されたものと一致していた。アニールされた非コンジュゲートガイド分子断片は、同様の用量依存的であるが、低レベルの切断を支持したことに留意すべきである。これらの結果は、本開示の方法に従ってコンジュゲートされたガイド分子が、ＩＶＴによって生成された単分子ガイド分子または合成単分子ガイド分子と実質的に同じ様式で高レベルのＤＮＡ切断を支持することを示唆する。
【０３２０】
実施例５：ゲル電気泳動法および質量分析によるガイド分子の純度の評価
実施例１のプロセスに従って尿素リンカーでコンジュゲートされたガイド分子の組成物の純度を、全イオン電流クロマトグラフィー（ｔｏｔａｌ  ｉｏｎ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）および質量分析法によって、市販の合成単分子ガイド分子（すなわち、コンジュゲーションなしで調製された）の組成物の純度と比較した。質量分析のために１００ｐｍｏｌの分析物を注入した。分析は、Ｗａｔｅｒｓ  ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣシステムを備えたＢｒｕｋｅｒ  ｍｉｃｒｏＴＯＦ−ＱＩＩ質量分析計でのＬＣ−ＭＳによって達成された。分離にはＴｈｅｒｍｏＤＮＡＰａｃ  Ｃ  １８カラムを使用した。結果を図５に示す。
【０３２１】
図５Ａは、代表的なイオンクロマトグラフを示し、図５Ｂは、実施例１のプロセスに従って尿素リンカーでコンジュゲートされたイオン交換精製ガイド分子のデコンボリューションされた質量スペクトルを示す。図５Ｃは、代表的なイオンクロマトグラフを示し、図５Ｄは、市販の合成単分子ガイド分子のデコンボリューションされた質量スペクトルを示す。質量スペクトルを、イオンクロマトグラフにおいて強調されたピークについて評価した。図５Ｅは、質量スペクトルの拡大版を示す。市販の合成単分子ガイド分子の質量スペクトルは左側にあり（全質量の３４％の純度）、実施例１のプロセスに従って尿素リンカーでコンジュゲートされたガイド分子の質量スペクトルは右側にある（全質量の７２％の純度）。
【０３２２】
実施例６：配列分析によるガイド分子の純度の評価
実施例１に記載したように、尿素結合でコンジュゲートされたガイド分子の組成物の純度を、実施例２に記載したように、市販の合成単分子ガイド分子（すなわち、コンジュゲーションなしで調製された）の組成物の純度、およびチオエーテル結合でコンジュゲートされたガイド分子の組成物の純度と比較した。ガイド分子のすべての組成物は、同じ所定のガイド分子配列に基づいていた。
【０３２３】
図６Ａは、尿素結合を含む合成単分子ガイド分子から生成された相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の５’末端からの各位置で個々の塩基および長さの変化が生じる頻度を表すプロットを示し、図６Ｂは、市販の合成単分子ガイド分子から生成された（すなわち、コンジュゲーションなしで調製された）ｃＤＮＡの５’末端から各位置で個々の塩基および長さの変化が生じる頻度を表すプロットを示す。ボックスは、ガイド分子の２０ｂｐの標的ドメインを取り囲んでいる。この実施例では、尿素結合を含むガイド分子は、市販の合成単分子ガイド分子（すなわち、ガイド分子の１０％未満が任意の所与の位置に欠失を含み、５％未満が任意の所与の位置に置換を含む）と比較して、標的ドメイン（ガイド分子の１％未満が任意の所与の位置に欠失を含み、ガイド分子の１％未満が任意の所与の位置に置換を含む）においてよりも高い配列忠実度をもたらした。
【０３２４】
図６Ｃは、チオエーテル結合を含む合成単分子ガイド分子から生成されたｃＤＮＡの５’末端からの各位置で個々の塩基および長さの変化が生じる頻度を表すプロットを示す。図６Ｃに示されているように、高レベルの５’配列忠実度が見られ、高レベルの配列忠実度および純度を有するガイド分子の組成物の生成を実証している。図６Ａ（尿素結合）および図６Ｃ（チオエーテル結合）における整列は、結合部位（３４位）における比較的高い頻度のミスマッチ／インデルの領域も示した。これらのデータは、本開示の方法によって合成されたガイド分子が、市販のガイド分子と比較して、欠失および置換の頻度が減少したことを示唆している。
【０３２５】
図７Ａおよび図７Ｂは、尿素結合を含む合成単分子ガイド分子（図７Ａ）および市販の合成単分子ガイド分子（すなわち、コンジュゲーションなしで調製された）（図７Ｂ）から生成されたｃＤＮＡの５’末端から数えて４１位における内部配列長の変化（＋５〜−５）を示すグラフである。図示されるように、尿素結合を含むガイド分子は、市販の合成単分子ガイド分子（すなわち、コンジュゲーションなしで調製された）と比較して、挿入／欠失の頻度および長さが減少した。
【０３２６】
実施例７：ＣＤ３４＋細胞におけるガイド分子活性の評価
実施例１のプロセスに従ってコンジュゲートされた尿素結合を有するガイド分子の活性を、次世代配列決定技術によってＣＤ３４＋細胞において評価した。この実施例で論じられるガイド分子は、以下の表１０ならびに図８Ａ〜図８Ｌ、図９Ａ〜図９Ｅ、および図１０Ａ〜図１０Ｄに示されているように、３つの標的ドメイン配列および様々なガイド分子骨格配列のうちの１つを含んでいた。２つのガイド分子断片間の尿素結合の位置は、表１０では［ＵＲ］で示され、図８Ａ〜図８Ｌ、図９Ａ〜図９Ｅ、および図１０Ａ〜図１０Ｄでは（Ｒ）で示されている。第１の２つの標的ドメイン配列を有するガイド分子（ｇＲＮＡ  １の後に文字が付けられて示されている、またはｇＲＮＡ  ２の後に文字が付けられて示されている）は、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｇＲＮＡ骨格に基づき、第３の標的ドメイン配列（ｇＲＮＡ  ３の後に文字が付けられて示されている）を有するガイド分子は、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｇＲＮＡ骨格に基づいていた。
【０３２７】
コンジュゲートガイド分子をｐＨ７．５の緩衝液に再懸濁し、融解し、そして再アニールし、次いでＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の懸濁液に添加して、５５μＭの完全に複合体化したリボ核タンパク質を含む溶液を得た。
【０３２８】
ヒトＣＤ３４＋細胞をカウントし、遠心分離してペレット化し、Ｐ３  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒに再懸濁し、次いでヒトＨＳＣ培地（ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）Ｓｅｒｕｍ−Ｆｒｅｅ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ，ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ，Ｃａｎａｄａ）で予め満たされた９６ウェルＮｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅ  Ｐｌａｔｅの各ウェルに分注して５０，０００細胞／ウェルを得た。上記のように完全に複合体化したリボ核タンパク質溶液を、Ｎｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅ  Ｐｌａｔｅの各ウェルに添加し、続いて穏やかに混合した。ヌクレオフェクションは、Ａｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で行った。ヌクレオフェクトした細胞を３７℃および５％ＣＯ２で７２時間インキュベートしてプラトーの編集を可能にした。次いで、製造業者の指示に従ってＤＮＡｄｖａｎｃｅ  ＤＮＡ単離キットを使用して、ヌクレオフェクトした細胞からゲノムＤＮＡを抽出した。野生型ヒト参照配列に対する挿入および欠失（インデル）率を定量するために、次世代配列決定技術を用いて切断を評価した。ＣＤ３４＋細胞において試験した表１０のｇＲＮＡの結果を図１１に示す。
【０３２９】
図１１の結果が示すように、実施例１に従って生成されたライゲーションされたガイド分子は、ＣＤ３４＋細胞におけるＤＮＡ切断を支持する。インデル率は、ステムループ長の増加と共に増加することが見出されたが、ステムループ配列に隣接するＵ−Ａ交換の組み込み（ｇＲＮＡ  １Ｅ、ｇＲＮＡ  １Ｆ、およびｇＲＮＡ  ２Ｄを参照）はその効果を軽減する。これらのデータは、より長いステムループ特徴を有する化学的にコンジュゲートされた合成単分子ガイド分子が、細胞内でより高レベルのＤＮＡ切断をもたらすことを示唆している。さらに、ＤＮＡ切断活性はライゲーション効率とは無関係であり、経験的に決定しなければならない。
【０３３０】
【表１３】
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【０３３１】
【表１４】
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【０３３２】
実施例８：ライゲーション効率の計算モデルの評価
実施例１に記載されている反応のライゲーション効率は、特定のガイド分子構造の適合性の１つの尺度である。実施例１における第１および第２のガイド分子断片の反応性官能基は同じ（アミン）であるため、競合ホモカップリングは潜在的な副生成物である。この実施例は、ライゲーション効率（すなわち、反応生成物中のヘテロカップリング生成物の百分率）が、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ｃａｌｃ／ａｎａｌｙｚｅｒで入手可能なＯｌｉｇｏＡｎａｌｙｚｅｒ  ３．１ツールを用いた、ヘテロカップリング反応の自由エネルギー差（ΔＧ２）と比較した、ホモカップリング反応の自由エネルギー差（ΔＧ１）の計算モデリングによって予測できるかどうかを評価した。この分析結果を表１１に示す。
【０３３３】
【表１５】
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【０３３４】
表１１に示されているように、ライゲーション効率（ゲル分析後のデンシトメトリーによって測定される）は、（例えば、ｇＲＮＡ  ２Ａおよび２Ｃと比較して）より好ましいライゲーション効率に対応するよりマイナスのΔＧ２−ΔＧ１値を有するほとんどの配列について十分に予測された。しかしながら、特定のガイド分子を形成するためのライゲーション効率は、常にΔＧ２−ΔＧ１値と相関するわけではなく（例えば、よりマイナスのΔＧ２−ΔＧ１値がより高いライゲーション効率をもたらさなかった場合のｇＲＮＡ  １Ｇを参照）、特定のガイド分子断片のコンジュゲーションのために修飾および実験が必要とされ得ることを示している。例えば、ｇＲＮＡ  １Ｇのライゲーション効率は、下部ステムの配列においてＵ−Ａ交換を実施することによって（ｇＲＮＡ  １Ｇのライゲーション効率をｇＲＮＡ  １Ｅのライゲーション効率と比較して）改善され、このＵ−Ａ交換は、ライゲーション前に２つのガイド分子断片の交互のアニーリングを防止するように設計されていた。
【０３３５】
実施例９：質量分析による尿素結合の特徴付け
尿素結合を含み、実施例１に記載されているように合成された化学的にコンジュゲートされたガイド分子を質量分析によって特徴付けた。合成、化学的ライゲーション、および精製の後、ｇＲＮＡ  １Ａ（表１０を参照）を、Ｔ１エンドヌクレアーゼを用いて一次配列中の各Ｇヌクレオチドの３’末端で断片に切断した。これらの断片を、ＬＣ−ＭＳを用いて分析した。特に、尿素結合を含む断片、Ａ−［ＵＲ］−ＡＡＵＡＧ（Ａ３４：Ｇ３９）が、保持時間４．５０分で、ｍ／ｚ＝１１９０．７で検出された（図１２Ａおよび図１２Ｂ）。この前駆体イオンのＬＣ／ＭＳ−ＭＳ分析により、ｇＲＮＡ  １Ａにおける尿素結合と一致する衝突誘起解離断片イオンが明らかになった。
【０３３６】
実施例１０：カルバメート副生成物の特徴付け
図１３Ａは、主生成物（Ａ−２、保持時間３．２５分）および微量生成物（Ａ−１、保持時間３．１４分）の両方が存在する尿素結合ガイド分子の未精製組成物のＬＣ−ＭＳデータを示す。本発明者らは、例示目的で、図１３Ａにおける微量生成物（Ａ−１）が、より高いパーセンテージのカルバメート微量生成物を含む陰イオン交換精製からの画分を組み合わせることによって濃縮されたことに注目している。副生成物は、典型的には、実施例１のプロセスによるガイド分子の合成において最大１０％の収率で検出される。質量分析による各ピークの分析は、両方の生成物が同じ分子量を有することを示した（図１３Ｂおよび図１３Ｃを参照）。
【０３３７】
これを考慮して、本発明者らは、以下のように、微量生成物が、３’ガイド分子断片の５’末端の５’−ＮＨ２と５’ガイド分子断片の３’末端の２’−ＯＨとの間の反応から生じるカルバメート副生成物であると仮定した：
【化１５１】
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【０３３８】
カルバメート副生成物の配分（ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ）をさらに確認するために、フェノキシ酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを用いる化学修飾を行った。基本的な化学原理は、微量生成物（カルバメート）のみが反応性求核中心（遊離アミン）を有し、したがって微量生成物のみが化学的に官能化されると予測する。したがって、尿素結合ガイド分子の粗組成物へのフェノキシ酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの添加により、主生成物（尿素）と化学修飾微量生成物（カルバメート）との混合物が生じるはずである：
【化１５２】
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【０３３９】
図１４Ａは、化学修飾後のガイド分子組成物のＬＣ−ＭＳデータを示す。主生成物（Ｂ−１、尿素）は、元の分析（３．２６分、図１３Ａ）と同じ保持時間を有する一方、微量生成物（Ｂ−１、カルバメート）の保持時間は、３．８６分にシフトし、これは、遊離アミン部分の化学的官能化に一致している。さらに、３．８６分でのピークの質量分析（Ｍ＋１３４）は、予測された官能化が起こったことを示す（図１４Ｂを参照）。これらの結果は、微量生成物が実際にカルバメート副生成物であることを示唆している。
【０３４０】
カルバメート副生成物の同一性をさらに確認するために、主生成物（尿素）と化学修飾微量成物（カルバメート）との混合物をリボヌクレアーゼＡで消化し（実施例９を参照）、これにより、一次配列中の各Ｇヌクレオチドの３’末端でガイド分子を切断した。次いで、断片をＬＣ−ＭＳによって分析し、尿素結合（Ｇ３５−［ＵＲ］−Ｃ３６）および化学修飾カルバメート結合（Ｇ３５−［ＣＡ＋ＰＡＡ］−Ｃ３６）の両方を検出した。図１５Ａは、４．３１分の保持時間での尿素結合および５．７７分の保持時間での化学修飾カルバメート結合を用いた断片混合物のＬＣ−ＭＳトレースを示す。図１５Ｂは、４．３１分におけるピークの質量スペクトルを示し、ｍ／ｚ＝５３２．１が［Ｍ−２Ｈ］２−に割り当てられ、図１５Ｃは、５．７７分におけるピークの質量スペクトルを示し、ｍ／ｚ＝５９９．１が［Ｍ−２Ｈ］２−に割り当てられる。質量スペクトルを、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ技術を用いてさらに分析した。ｍ／ｚ  ５３２．１、［Ｍ−２Ｈ］２−での尿素結合生成物のＬＣ−ＭＳ／ＭＳスペクトル（図１５Ｄ）は、オリゴヌクレオチド衝突誘起解離（ＣＩＤ）実験において観察される典型的なａ−ｄおよびｘ−ｚイオンを含む。さらに、５’末端（ｍ／ｚ＝４８７．１および４６１．１）および３’末端（ｍ／ｚ＝６０３．１および５７７．１）からのＵＲ結合の両側にＭＳ／ＭＳ断片イオンが観察された。対照的に、ｍ／ｚ  ５９９．１、［Ｍ−２Ｈ］２−における化学修飾カルバメート結合生成物のＬＣ−ＭＳ／ＭＳスペクトル（図１５Ｅ）では、カルバメート結合の５’末端（ｍ／ｚ＝５９５．２）およびカルバメート結合の３’末端（ｍ／ｚ＝６０３．１）からのＭＳ／ＭＳ断片イオンを含む２つの生成物イオンのみが観察された。
【０３４１】
実施例１１：単一生成物形成のためのヌクレオチド修飾
本発明者らは、実施例１０に記載のカルバメート副生成物の形成は、５’ガイド分子断片の３’末端のヌクレオチドにおける戦略的な２’修飾を介して防止することができると仮定した。例えば、５’ガイド分子断片の３’末端におけるヌクレオチド中の２’−ＯＨを２’−Ｈで置換すると、実施例１のプロセスによる尿素結合ガイド分子の合成が、カルバメート副生成物を含まない単一尿素結合生成物を生じさせると仮定した：
【化１５３】
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【０３４２】
図１６Ａは、２’−Ｈ修飾５’ガイド分子断片との反応での粗反応混合物（上部のスペクトル）のＬＣ−ＭＳデータを、同じ５’ガイド分子の非修飾型との反応での粗反応混合物（下部のスペクトル）と比較して示す。２’−Ｈ修飾５’ガイド分子断片ではカルバメート副生成物の形成は観察されない（上部のスペクトル）。対照的に、同じ５’ガイド分子断片の非修飾型との反応での粗反応混合物（下部のスペクトル）は、主尿素結合生成物（Ａ−２）と微量カルバメート副生成物（Ａ１）の混合物を含んでいた。実施例１０とは異なり、カルバメート副生成物は濃縮されず、したがって実施例１０の図１３Ａよりもはるかに低いレベルで検出されたことに留意されたい。さらに、２’−Ｈ修飾５’ガイド分子断片（Ｂ）との反応の生成物の質量分析により、２’−ＯＨが２’−Ｈで置き換えられた分子で予想されたように、（Ａ−２、非修飾尿素結合主生成物と比較して）Ｍ−１６が得られた（図１６Ｂおよび図１６Ｃを参照）。
【０３４３】
同じ２’−Ｈ修飾を含む表１０のｇＲＮＡ  １Ｌを用いて類似の実験を行った。２’−Ｈ修飾尿素結合ガイド分子の形成を、Ｔ１エンドヌクレアーゼ消化、これに続く質量分析によって確認した（実施例９を参照）。尿素結合を含む断片、（２’−Ｈ−Ａ）−［ＵＲ］−ＡＡＵＡＧ（Ａ３４：Ｇ３９）は、４．６５分の保持時間（図１７Ａ）で検出され、ｍ／ｚ＝１１８２．７であった（図１７Ｂ）。この前駆体イオンのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析により、２’−Ｈ修飾ヌクレオチドとの反応における尿素結合と一致する断片イオンが明らかになった。
【０３４４】
これらの結果は、５’ガイド分子断片の３’末端のヌクレオチドにおける２’−ＯＨ修飾により、カルバメート副生成物の形成を回避できることを示唆している。その結果、尿素連結ガイド分子が高純度で合成され、これは、コンジュゲートガイド分子を製造するプロセス全体を合理化する。
【０３４５】
参照による援用
本明細書で言及されるすべての出版物、特許、および特許出願は、あたかも個々の出版物、特許または特許出願が、具体的にそして個別に、参照により援用されると示されるかのように、その内容全体を参照により本明細書に援用する。矛盾する場合は、本明細書のあらゆる定義を含め、本出願が優先される。
【０３４６】
同等物
当業者は、単に通例の実験法を使用して、本明細書に記載される特定の実施形態の多くの同等物を認識し、または見極めることができるであろう。このような同等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【図１Ａ】
2020503049.tif 000310
【図１Ｂ】
2020503049.tif 000311
【図１Ｃ】
2020503049.tif 000312
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５ＡＢ】
2020503049.tif 000321
【図５ＣＤ】
2020503049.tif 000322
【図５Ｅ】
2020503049.tif 000323
【図６ＡＢ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図８Ｈ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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