(57)【要約】  記載するのは、治療用細胞移植片を調製するために使用することができるマクロカプセル及びバリア、治療用細胞をカプセル化する方法、並びに疾患の治療におけるカプセル化細胞の使用方法である。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の治療用細胞を包含するマクロカプセルを含む組成物であって、マクロカプセルが少なくとも1つのバリアを含み、バリアが、
(a)硫酸セルロース、及びグルコマンナン若しくはグルコマンナン硫酸、又は
(b)アルギン酸ナトリウム
を含む、組成物。
【請求項２】
治療用細胞がインスリン産生細胞である、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
第2のバリアをさらに含む、請求項1又は2に記載の組成物。
【請求項４】
第2のバリアが、硫酸セルロース、及びグルコマンナン又はグルコマンナン硫酸を含む、請求項3に記載の組成物。
【請求項５】
第2のバリアが、グルコマンナン又はグルコマンナン硫酸を含まない、請求項3に記載の組成物。
【請求項６】
マクロカプセルの直径が少なくとも1.5mmである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
マクロカプセルの直径が少なくとも2.0mmである、請求項1〜6のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
アルギン酸ナトリウムが、二価陽イオンのバリウム(BaCl2)又はカルシウム(CaCl2)と重合される、請求項1〜7のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
硫酸セルロースがポリ(ジアリルジメチルアンモニウムクロリド)(pDADMAC)と重合された、請求項1〜7のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
マクロカプセルがpDADMACとの重合後にポリメチレン-co-グアニジン(PMCG)で洗浄された、請求項9に記載の組成物。
【請求項１１】
マクロカプセルが少なくとも約11cmの長さである、請求項1〜10のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
マクロカプセルが1cm当たり少なくとも細胞約50,000個を含有する、請求項1〜11のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
マクロカプセルが円筒形である、請求項1〜12のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
複数の治療用細胞を包含するマクロカプセルを含む組成物であって、マクロカプセルが少なくとも第1のバリア及び第2のバリアを含み、第1のバリアが第2のバリア内に包含され、マクロカプセルが少なくとも1.5mmの直径を有する、組成物。
【請求項１５】
マクロカプセルの直径が少なくとも2.0mmである、請求項14に記載の組成物。
【請求項１６】
治療用細胞がインスリン産生細胞である、請求項14又は15に記載の組成物。
【請求項１７】
第2のバリアが、硫酸セルロース、及びグルコマンナン又はグルコマンナン硫酸を含む、請求項14〜16のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
第1及び第2のバリアの両方が、硫酸セルロース及びグルコマンナン硫酸を含む、請求項14〜17のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
硫酸セルロースがpDADMACと重合された、請求項17又は18に記載の組成物。
【請求項２０】
マクロカプセルがpDADMACとの重合後にPMCGで洗浄された、請求項19に記載の組成物。
【請求項２１】
第2のバリアが、グルコマンナン又はグルコマンナン硫酸を含まない、請求項14〜16のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
第1のバリアがアルギン酸ナトリウムを含む、請求項14〜17のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
アルギン酸ナトリウムが二価陽イオンのバリウム(BaCl2)又はカルシウム(CaCl2)と重合される、請求項22に記載の組成物。
【請求項２４】
マクロカプセルが少なくとも約11cmの長さである、請求項14〜23のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
マクロカプセルが1cm当たり少なくとも細胞約50,000個を含有する、請求項14〜24のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
マクロカプセルが円筒形である、請求項14〜25のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７】
複数の治療用細胞を包含するマクロカプセルを含む組成物であって、マクロカプセルが円筒形状及び少なくとも1.5mmの直径を含む、組成物。
【請求項２８】
マクロカプセルが少なくとも第1のバリア及び第2のバリアを含み、第1のバリアが第2のバリア内に包含される、請求項27に記載の組成物。
【請求項２９】
第1のバリアが、
(a)硫酸セルロース、及びグルコマンナン若しくはグルコマンナン硫酸、又は
(b)アルギン酸ナトリウム
を含む、請求項28に記載の組成物
【請求項３０】
第2のバリアが、硫酸セルロース、及びグルコマンナン又はグルコマンナン硫酸を含む、請求項28又は29に記載の組成物。
【請求項３１】
治療用細胞がインスリン産生細胞である、請求項27〜30のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３２】
マクロカプセルが少なくとも約11cmの長さである、請求項27〜31のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３３】
マクロカプセルが1cm当たり少なくとも細胞約50,000個を含有する、請求項27〜32のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３４】
複数の治療用細胞を包含する非接着性マクロカプセルを形成する方法であって、
a.pDADMACと重合された硫酸セルロースを含むバリア中に複数の治療用細胞をカプセル化するステップ、
b.バリアをPMCGで洗浄するステップであって、PMCGが、硫酸セルロースの非結合硫酸基に結合することによりバリアをコーティングするステップ
を含み、
非接着性マクロカプセルが形成される、方法。
【請求項３５】
pDADMACと重合された硫酸セルロースを含む第2のバリア中に非接着性マクロカプセルをカプセル化するステップ、及びPMCGで第2のバリアを洗浄するステップをさらに含み、PMCGが、硫酸セルロースの非結合硫酸基に結合することによりバリアをコーティングし、二重バリアの非接着性マクロカプセルが形成される、請求項34に記載の方法。
【請求項３６】
それを必要とする被験者において糖尿病を治療する方法であって、治療用細胞を包含するマクロカプセルを含む組成物を、糖尿病を有する被験者中に移植するステップを含み、マクロカプセルが少なくとも第1のバリア及び第2のバリアを含み、第1のバリアが第2のバリア内に包含され、マクロカプセルが少なくとも1.5mmの直径を有する、方法。
【請求項３７】
被験者が成人である、請求項36に記載の方法。
【請求項３８】
被験者が小児である、請求項36に記載の方法。
【請求項３９】
被験者がI型糖尿病を有する、請求項36〜38のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
被験者がII型糖尿病を有する、請求項36〜38のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
治療用細胞がインスリン産生細胞である、請求項36に記載の方法。
【請求項４２】
第2のバリアが、硫酸セルロース、及びグルコマンナン又はグルコマンナン硫酸を含む、請求項36〜41のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
第1及び第2のバリアの両方が、硫酸セルロース、及びグルコマンナン又はグルコマンナン硫酸を含む、請求項36〜42のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
第2のバリアが、グルコマンナン又はグルコマンナン硫酸を含まない、請求項36〜41のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
組成物がグルコマンナンゲルをさらに含む、請求項44に記載の方法。
【請求項４６】
第1のバリアがアルギン酸ナトリウムを含む、請求項36〜41のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
組成物を被験者の網又は腹膜腔中に移植する、請求項36〜45のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
それを必要とする被験者において糖尿病を治療する際の使用のための、請求項1〜31のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４９】
糖尿病の治療のための医薬の製造における、請求項1〜31のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、2017年4月6日に出願された米国仮出願第62/482,413号に対して35 U.S.C.§119(e)の下で優先権を主張し、その内容全体を参照により本明細書中に組み入れる。
【０００２】
本開示は、一般的に、細胞移植及び治療用細胞のカプセル化の分野に関する。治療用細胞をカプセル化するためのマクロカプセル、治療用細胞をカプセル化する方法、及び糖尿病などの疾患を治療するための関連する使用方法を記載する。
【背景技術】
【０００３】
以下の論述を、読者が本開示を理解するのを助けるために提供するが、それに対する先行技術を記載又は構成することを認めるものではない。
【０００４】
糖尿病及びインスリン
真性糖尿病(即ち、糖尿病)は、ホルモンインスリンを産生する又はそれに応答する身体の能力が損なわれ、炭水化物の異常な代謝並びに血液及び尿中のグルコースレベルの上昇をもたらす疾患である。この疾患はいくつかのサブタイプに細分され、或いは、1型真性糖尿病、インスリン依存性真性糖尿病(IDDM)、若年発症成人型糖尿病(MODY)、成人潜在性糖尿病(LADA)、不安定型糖尿病、痩せ型糖尿病、1.5型、2型、3型、肥満関連糖尿病、妊娠糖尿病、及びこの分野で受け入れられている他の命名法として記載される。
【０００５】
一般的に、インスリン依存性糖尿病を有する被験者は、外因性インスリンを投与して血中グルコースを十分に低下させる必要がある。インスリン非依存性の被験者は、インスリンへの感受性又はグルコースの排出を高める薬物のクラスを含む医薬的介入により、血中グルコースが十分に低下しうる。インスリン依存性糖尿病を有する被験者は、その疾患が1型、MODY、LADA、不安定型、痩せ型、1.5型、2型、3型、肥満関連糖尿病、又はそれらの任意の組合せとして分類されているか否かを問わず、インスリン産生細胞を被験者に移植する細胞置換治療から利益を得うる。
【０００６】
I型糖尿病は通常、小児及び若年成人で診断され、以前は若年性糖尿病として公知であった。糖尿病を有する人々の5〜10%だけがこの形態の疾患を有する。成人型糖尿病はこの疾患の最も一般的な形態であり、インスリン産生ベータ細胞の障害若しくは破壊、インスリン抵抗性の発生、又はインスリン産生ベータ細胞の障害及びインスリン抵抗性の発生の両方に起因して生じる。糖尿病は、遺伝的要因及び環境的要因の組合せに起因して、非肥満の成人及び小児に生じうる。肥満の成人及び小児では、膵臓は血中グルコースを制御するために余分なインスリンを作ろうと試みることがあるが、しかし、経時的に血中グルコースを正常レベルに保持及び維持することができなくなる。身体はまた、産生されるインスリンへの感受性が低下することがある。インスリン分泌ベータ細胞の長時間の過剰活動は、ベータ細胞の機能障害及び死に導きうる。
【０００７】
糖尿病の症状は、被験者の血中グルコースがどれだけ増減するかによって変動する。一部の人々、特に前糖尿病又は非インスリン依存性糖尿病の人々は、最初は症状を経験しないこともある。I型糖尿病では、症状は急速に現れる傾向があり、より重度である。
【０００８】
I型及びII型糖尿病の徴候及び症状の一部は、口渇の増加、頻尿、極度の空腹感、原因不明の体重減少、尿中のケトンの存在(ケトンは、利用可能な十分なインスリンがない場合に起こる筋肉及び脂肪の分解の副産物である)、疲労、過敏性、霧視、回復の遅い痛み、頻繁な感染症、例えば歯茎又は皮膚感染症及び膣感染症を含むが、これらに限定されない。
【０００９】
カプセル化細胞
免疫正常ヒト宿主内での外来細胞の生存を可能にする半透性バリア内に細胞をカプセル化するためのシステムを作製することは、生物医学研究の長年の目標であった(Weir, Diabetologia, 56(7):1458-61 (2013))。この目標を達成するために、カプセル化バリアは、ガス、栄養素、及び廃棄物の通過を可能にしなければならないが、しかし、バリアは、免疫破壊のために細胞を標的化する免疫細胞及びそのエフェクター分子にも不浸透性でなければならない。バリアはまた、炎症、線維症、又は異物に対する他の宿主防御を刺激することを避けなければならない。
【００１０】
公開された科学文献において報告されている最も主要なバリア材料は、炭水化物ポリマーのアルギン酸ナトリウム及び硫酸セルロースである(例えば、Tuch et al., Diabetes Care, 32(10):1887-9 (2009);Basta et al., Diabetes Care, 34(11):2406-9 (2011);Loehr et al., Pharmaceutics, 6(3):447-66 (2014)を参照のこと)。
【００１１】
アルギン酸ナトリウムは、カルシウム又はバリウムなどの二価陽イオンの存在下でゲル様マトリックスを形成する。アルギン酸ナトリウムのマトリックスは、多孔性を減少させるために、ポリ-L-リジン又はポリ-L-オルニチンの層により頻繁に補われる。
【００１２】
硫酸セルロースは、コポリマーポリ(ジアリルジメチルアンモニウムクロリド)(pDADMAC)と複合体化して膜を形成することができる。アルギン酸ナトリウム及び硫酸セルロースも組み合わせて使用されており、アルギン酸及び硫酸ナトリウムと混合されたバリアを形成する(Wang et al., Transplantation, 85(3):331-7 (2008);Weber et al., J. Biotechnol. 114(3):315-26 (2004))。
【００１３】
細胞生存
長期間(即ち、少なくとも6カ月間)にわたり免疫正常宿主の身体内での外来細胞の生存及び機能を可能にするこれらのバリアに関する報告はほとんどない。Tuch, Basta, Loehr, Ma(Designing a retrievable and scalable cell encapsulation device for potential treatment of type 1 diabetes, PNAS | Published online December 26, 2017)を参照のこと。一般的に、カプセル化細胞が限られた時間を超えて機能することができないのは、少なくとも部分的にバリアを横切る不良な酸素拡散に起因し、細胞機能の死若しくは障害又はバリア周囲の線維組織の蓄積に導く。この問題に対処するために、1つのグループは、彼らがアルギン酸への宿主マクロファージの付着を減少させると主張するトリアゾール類似体を含む共有結合化学基により修飾されたアルギン酸の形態を産生した(Vegas et al., Nat. Biotechnol., 34(3):345-52 (2016)を参照のこと)。このグループは、修飾アルギン酸のマイクロカプセルを生産したが、これによって、胚性幹細胞から由来するヒトのインスリン分泌細胞が、腹膜腔への移植後6カ月まで糖尿病マウスにおいて血中グルコースを下げることが可能になった(Vegas et al., Nat. Med., 22(3):306-11 (2016)。
【００１４】
回収性
マイクロカプセルの主要な欠点は、移植が患者にとって安全上のリスクになる場合、又は移植片が機能しなくなって交換する必要がある場合、それらを宿主から完全に回収できないことである。一般的に、治療のために安全で実用的であると見なされるためには、ヒトの治療用途が意図される移植片を回収可能にすべきであることが、この分野により受け入れられている。
【００１５】
実用的な治療用量
別のグループは、長い管状構造を作製するための織られたナイロン糸の表面に接着したアルギン酸で構成されるデバイスを記載した(Ma(Designing a retrievable and scalable cell encapsulation device for potential treatment of type 1 diabetes. PNAS | Published online December 26, 2017)を参照のこと)。アルギン酸の一部が織糸から剥離しない限り、この形状は腹膜腔への移植後に回収可能であると報告されている。別のグループは、回収可能である皮下移植用の平面マクロカプセル化デバイスを報告した(D'AMOUR 2015, STEM CELLS TRANSLATIONALMEDICINE 2015;4:1-9を参照のこと)。これらのデバイスは、しかし、治療用細胞を含有するための容量が限られていることにより損なわれる。記載されたデバイスを使用して治療用量をヒト患者に送達することは実用的ではないだろう。例えば、体重60kgのインスリン依存性糖尿病患者を治療するための細胞の治療用量は6億個の細胞である(Bruni 2015 Bruni A, et al. Diabetes Metab Syndr Obes. 2014 Jun 23;7:211-23)。記載された管状デバイスは、その治療用量を含有させるためには60メートルの長さが必要であろう。60kgの糖尿病患者は、治療用量を受けるために、40の記載された平面マクロカプセル化デバイスを必要とするであろう。
【００１６】
インスリン放出動態
膵臓は、インスリン及び他の膵臓ホルモンの速い全身分布を達成する高度に血管形成された器官である。膵臓内の各島は微小血管に近接している。膵臓循環は、膵臓ホルモンの主な作用部位である肝臓にもつながっている。健康な膵臓は、したがって、グルコース変動の数分以内に正常な血中グルコースを回復することができる。腹膜腔に移植されたデバイスは宿主の血管系への近接性を欠くため、循環への遅いインスリン放出及び長期間の高血糖に導く(Ma(Designing a retrievable and scalable cell encapsulation device for potential treatment of type 1 diabetes. PNAS | Published online December 26, 2017)。ヒトの皮膚は血管新生が不良であり、肝臓への近接性も欠く。結果として、皮下移植は膵臓ホルモンの迅速な全身循環を可能にし、長期の高血糖に導くとは予想されていない。定期的な高血糖は、糖尿病の罹患率の主な一因である。
【００１７】
このように、移植細胞の長期生存を支持することが可能で、回収可能であり、いずれも一般的に、具体的には糖尿病の治療のために分泌ホルモンの迅速な分布を提供することができるカプセル化バリアが当技術分野において依然として必要とされている。本開示はそれらのニーズを満たす。
【発明の概要】
【００１８】
本明細書中に記載するのは、治療用細胞移植片を調製するために使用することができるマクロカプセル化バリア、治療用細胞をカプセル化する方法、及び疾患の治療におけるカプセル化細胞の使用方法である。マクロカプセル化細胞は宿主から回収可能であり、実際的な容量において治療用量の細胞を含有することが可能であり、分泌ホルモンの迅速な分布を可能にする。
【００１９】
一態様では、本開示は、複数の治療用細胞を包含するマクロカプセルを含む組成物を提供し、マクロカプセルは少なくとも1つのバリアを含み、バリアは硫酸セルロース及びグルコマンナン又はグルコマンナン硫酸を含む。別の態様では、本開示は、複数の治療用細胞を包含するマクロカプセルを含む組成物を提供し、マクロカプセルは少なくとも1つのバリアを含み、バリアはアルギン酸ナトリウムを含む。
【００２０】
別の態様では、本開示は、複数の治療用細胞を包含するマクロカプセルを含む組成物を提供し、マクロカプセルは少なくとも第1のバリア及び第2のバリアを含み、第1のバリアは第2のバリア内に包含され、マクロカプセルは少なくとも1.5mmの直径を有する。
【００２１】
別の態様では、本開示は、複数の治療用細胞を包含するマクロカプセルを含む組成物を提供し、マクロカプセルは、円筒形状及び少なくとも1.5mmの直径を含む。
【００２２】
一部の実施形態では、治療用細胞は膵島細胞などのインスリン産生細胞である。
【００２３】
一部の実施形態では、第1のバリアは硫酸セルロース及びグルコマンナン又はグルコマンナン硫酸を含みうるが、一部の実施形態では、第1のバリアはアルギン酸ナトリウムを含みうる。一部の実施形態では、アルギン酸ナトリウムは二価陽イオンバリウム(BaCl2)又はカルシウム(CaCl2)と重合される。
【００２４】
一部の実施形態では、組成物は第2のバリアをさらに含みうる。例えば、一部の実施形態では、第2のバリアは硫酸セルロース及びグルコマンナン又はグルコマンナン硫酸を含みうる。一部の実施形態では、第2のバリアはグルコマンナン又はグルコマンナン硫酸を含まない。一部の実施形態では、第1及び第2のバリアの両方が、硫酸セルロース及びグルコマンナン又はグルコマンナン硫酸を含む。
【００２５】
一部の実施形態では、マクロカプセルの直径は、少なくとも約1.5mm、少なくとも約1.6mm、少なくとも約1.7mm、少なくとも約1.8mm、少なくとも約1.9mm、少なくとも約2.0mm、少なくとも約2.1mm、少なくとも約2.2mm、少なくとも約2.3mm、少なくとも約2.4mm、又は少なくとも約2.5mmである。
【００２６】
一部の実施形態では、硫酸セルロースはポリ(ジアリルジメチルアンモニウムクロリド)(pDADMAC)と重合させた。例えば、一部の実施形態では、マクロカプセルは、pDADMACとの重合後にポリメチレン-co-グアニジン(PMCG)で洗浄した。
【００２７】
一部の実施形態では、マクロカプセルは円筒形である。
【００２８】
一部の実施形態では、複数の円筒形マクロカプセルを一端で連結する。
【００２９】
別の態様では、本開示は、複数の治療用細胞を包含する非接着性マクロカプセルを形成する方法であって、pDADMACと重合された硫酸セルロースを含むバリア中に複数の治療用細胞をカプセル化するステップ、バリアをPMCGで洗浄するステップであって、PMCGが、硫酸セルロースの非結合硫酸基に結合することによりバリアをコーティングする、ステップを含み、非接着性マクロカプセルが形成される、方法を提供する。
【００３０】
一部の実施形態では、方法は、pDADMACと重合された硫酸セルロースを含む第2のバリア中に非接着性マクロカプセルをカプセル化するステップ、及びPMCGで第2のバリアを洗浄するステップをさらに含み、PMCGが、硫酸セルロースの非結合硫酸基に結合することによりバリアをコーティングし、二重バリアの非接着性マクロカプセルが形成される。
【００３１】
別の態様では、本開示は、それを必要とする被験者において糖尿病を治療する方法であって、治療用細胞を包含するマクロカプセルを含む組成物を、糖尿病を有する被験者中に移植するステップを含み、マクロカプセルが少なくとも第1のバリア及び第2のバリアを含み、第1のバリアが第2のバリア内に包含され、マクロカプセルが少なくとも1.5mmの直径を有する、方法を提供する。
【００３２】
開示する方法の一部の実施形態では、被験者は成人であるが、一部の実施形態では、被験者は小児である。開示する方法の一部の実施形態では、被験者はI型糖尿病を有するが、一部の実施形態では、被験者はII型糖尿病を有する。
【００３３】
一部の実施形態では、各マクロカプセルは、少なくとも約10cmの長さ、少なくとも約11cmの長さ、又は少なくとも12cmの長さ、又は少なくとも13cmの長さ、又は少なくとも14cmの長さ、又は少なくとも15cmの長さ、又は少なくとも16cmの長さ、又は少なくとも17cmの長さ、又は少なくとも18cmの長さ、又は少なくとも19cmの長さ、又は少なくとも20cmの長さである。
【００３４】
一部の実施形態では、マクロカプセルは、1cm当たり少なくとも細胞約50,000個、1cm当たり少なくとも細胞約60,000個、1cm当たり少なくとも細胞約70,000個、1cm当たり少なくとも細胞約80,000個、1cm当たり少なくとも細胞約90,000個、1cm当たり少なくとも細胞約1000,000個を含有する。
【００３５】
一部の実施形態では、開示するマクロカプセルは端と端を連結してもよい。
【００３６】
開示する方法の一部の実施形態では、組成物を被験者の大網(greater omentum)又は腹膜腔(peritoneal cavity)中に移植する。例えば、組成物を網(omentum)に固定するか、又は網嚢(omentum pouch)中に移植してもよい。
【００３７】
それを必要とする被験者において糖尿病を治療する際の使用のための、前述の態様又は実施形態のいずれか1つに従った組成物。
【００３８】
糖尿病の治療のための医薬の製造における前述の態様又は実施形態のいずれか1つに従った組成物の使用。
【００３９】
以下の詳細な説明は例示的かつ説明的であり、本発明のさらなる説明を提供することを意図する。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１Ａ】マクロカプセルを示す。(A)硫酸セルロース及びコンニャクグルコマンナンで構成される球状マクロカプセルの明視野画像。内部カプセルは、治療用細胞の複数のクラスターを含有する。元の画像の100×拡大。
【図１Ｂ】マクロカプセルを示す。(B)40×拡大での移植3週間後に正常ラットから除去されたヒト抗原染色マクロカプセルの免疫蛍光。マクロカプセルの表面には、接着した宿主細胞又は炎症若しくは線維症のエビデンスはない。
【図１Ｃ】マクロカプセルを示す。(C)24×拡大での、コンニャクグルコマンナン硫酸では形成されないが、他の点では(B)に示すマクロカプセルと同一であるマクロカプセル。コンニャクグルコマンナン硫酸なしで形成されたマクロカプセルには、マクロカプセルの周囲に宿主細胞の過剰増殖が認められ、マクロカプセル内に生きたヒト細胞は認められない。
【図１Ｄ】マクロカプセルを示す。(D)円筒形マクロカプセルの明視野画像。内部カプセルはアルギン酸ヒドロゲルで構成され、治療用細胞の複数のクラスターを含有する。外部カプセルは内部カプセルに密接に接着しており、硫酸セルロース及びコンニャクグルコマンナンで構成される。
【図２】アルギン酸ナトリウムから形成された内部カプセル並びに硫酸セルロース及びコンニャクグルコマンナン硫酸から形成された外部カプセルで構成される二重層マクロカプセルを示す。このマクロカプセルは非球形状である。
【図３】20kDaデキストラン粒子に対するマクロカプセルの透過性を示す。コンニャクグルコマンナン又はコンニャクグルコマンナン硫酸を硫酸セルロースの膜中に組み込むことによって、膜の透過性を増加させることができる。コンニャクグルコマンナン硫酸なしで形成されたマクロカプセルでは、20kDaの蛍光ナノ粒子がマクロカプセルの内部を通過することはできない(A)。マクロカプセルの内部はリンス後に蛍光性ではない。コンニャクグルコマンナン硫酸で形成されたマクロカプセルは、20kDaの蛍光ナノ粒子をマクロカプセルの内部に通過させる(B)。マクロカプセルの内部はリンス後に蛍光性である。
【図４】糖尿病ラットにおける血中グルコースの調節を示す。正常なSprague-Dawleyラットは、0日目にストレプトゾトシンの注射により糖尿病になり、血中グルコース濃度の迅速な上昇に導いた。動物を健康に保つために、徐放インスリンペレットを13日目に皮膚下に移植した。67日目にインスリンペレットを除去し、インスリン産生細胞を含有するマクロカプセルを網に外科的に移植した。血中グルコース濃度は制御されたままであった。
【図５】げっ歯類からのマクロカプセルの外植片を示す。糖尿病ラットへの移植3週間後に、マクロカプセルを含有する網嚢を除去した。(A)は嚢での十分な血管形成を示す。(B)及び(C)は、外植片内のマクロカプセルがインスリン発現細胞を含有することを示す免疫蛍光分析を表す。(B)及び(C)は、マクロカプセルの表面に宿主細胞の付着又は炎症及び線維症のエビデンスがないことを示す。
【図６】げっ歯類からのマクロカプセルの外植片を示す。(A)網から形成された嚢内の球状マクロカプセルを、糖尿病ラットへの移植3週間後で外植した。マクロカプセルは、透明な網の膜内の球体として見える。膜は、マクロカプセルに近接した微小血管の密なネットワークを示す。(B、C)円筒形マクロカプセルを、糖尿病マウスへの移植3週間後で外植した。マクロカプセルは宿主の網に接着していた。網からの血管系は、マクロカプセルに近接して明らかである。
【図７】マクロカプセルによって、移植された異種細胞の生存が可能になることを示す。治療用ヒト細胞のクラスターは、生細胞(緑)及び死細胞(赤)の蛍光インジケーターで染色することにより細胞生存率について評価した。細胞のクラスターは、正常な免疫正常マウスへの移植前(A)、9日後(B)及び47日後(C)に等しく生存可能である。
【図８】移植6カ月後での外植マクロカプセルの周囲の、網から生じる膜を示す。(A)膜は薄く、細胞化しており、コラーゲンを含有する。元の拡大は400×である。(B)マクロカプセルは、移植6カ月後にインスリン発現細胞を含有する。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本明細書中に記載するのは、治療用細胞移植片において使用することができるマクロカプセル化組成物、カプセル化治療用細胞を調製する方法、及びそれを必要とする被験者における疾患の治療の際などでの関連する使用方法である。
【００４２】
カプセル化細胞の生存は、バリア膜の免疫保護により、及び膜を横切る生体分子の拡散特性により影響を受ける。移植片の長期的な有効性は、移植片バリアの物理的完全性及び移植片の生体適合性、又は炎症、線維症、及び宿主の他の異物反応の低刺激、並びに酸素拡散、カプセル化細胞の密度、及び宿主内の生着位置に依存する。細胞の治療用量を実際に送達する能力は、治療用細胞の添加密度に依存する。分泌因子を迅速に分布させる能力は、宿主内の生着位置及び宿主の血管系への近位接続を形成する能力に依存する。
【００４３】
本開示は、細胞を免疫正常宿主に移植した後6カ月間超にわたりカプセル化細胞の生存及び機能を可能にする硫酸セルロースから形成された新規マクロカプセル組成物を記載する。本開示は、生きている宿主からのカプセル回収を促進する新規マクロカプセル形状をさらに記載する。開示するカプセル化バリアは、硫酸セルロースに加えて、炭水化物ポリマーのコンニャクグルコマンナン又はコンニャクグルコマンナン硫酸を含むことができ、これらは、バリア多孔性を制御し、線維症を制限するのに役立つ。本開示はまた、治療用細胞の高密度の移植及び生着を可能にする直径が1.5mmを上回る新規マクロカプセル二重バリア膜設計を提供する。本開示はまた、非球状マクロカプセルの形成を提供する。さらに、開示するマクロカプセルを調製する方法は、膜の機械的特性を改善するためにポリメチレン-co-グアニジン(PMCG)を含む逐次重合ステップを含みうる。開示する材料及び技術を使用して形成されたマクロカプセルは、カプセル化細胞を被験者に移植することにより、例えば、大網への、又は大網から外科的に形成された嚢、若しくはそのような細胞ベースの治療のために一般に使用される他の移植部位中への付着により、完全に免疫正常被験者において糖尿病を治療するために使用することができる。
【００４４】
I.定義
本明細書中で使用する用語「約」は、当業者により理解され、それが使用される文脈に応じてある程度変動するであろう。用語が使用される文脈を考えると、当業者には明らかでない用語の使用がある場合、「約」は、特定の用語のプラス又はマイナス10%までを意味する。
【００４５】
本明細書中で使用する「マクロカプセル」は、治療用細胞をカプセル化するためのポリマーベースの組成物を指す。マクロカプセルの正確なサイズ及び形状は特に限定せず、マクロカプセルを作製するために使用される方法及び材料により決定されうる。さらに、開示するマクロカプセルは、治療用細胞をカプセル化するポリマーの1つを上回る層(即ち、バリア又は膜)を含んでもよい。
【００４６】
本明細書中で使用する用語「バリア」又は「膜」は、少なくとも1つのポリマーで構成されるマクロカプセルの層を指す。用語「バリア」及び「膜」は、本開示を通して互換的に使用されうる。
【００４７】
本明細書中で使用する用語「ヒドロゲル」は、カルシウム又はバリウムなどの二価陽イオンとのイオン結合により一緒に結合されたアルギン酸などの炭水化物ポリマーの凝集体により作製された多孔質マトリックスを指す。
【００４８】
本明細書中で使用する「長期」は、細胞ベースの治療/移植において使用される外来治療用細胞の生存及び機能に関して使用される場合、少なくとも6カ月又はそれを超える期間を意味する。
【００４９】
本明細書中で使用する語句「治療有効量」は、細胞が移植される特定の薬理学的効果を提供する、即ち、インスリンを産生して血中グルコースを調節する、被験者に移植されたカプセル化細胞の量を意味する。カプセル化細胞の治療有効量は、そのような濃度が当業者により治療有効量であると見なされたとしても、所与の被験者において糖尿病を治療する際に必ずしも有効ではないことを強調する。便宜上だけ、例示的な量を以下に示す。
【００５０】
当業者は、特定の被験者を治療するために必要な標準的な慣行に従ってそのような量を調整することができる。治療有効量は、移植部位、被験者の年齢及び体重、並びに/又は被験者の疾患の重症度、被験者の食事、及び/又は被験者の健康全般を含む被験者の状態に基づいて変動しうる。
【００５１】
糖尿病に関して本明細書中で使用する用語「治療」又は「治療する」は、糖尿病の1つ以上の症状若しくは併存疾患、例えば高血糖症及び低血糖症、心臓病、腎疾患、肝疾患、網膜症、神経障害、非治癒性潰瘍、歯周病を軽減、寛解、若しくは排除すること、血中グルコースを調節するための外因性インスリンへの被験者の依存を低下させること、外因性インスリンを使用せずに被験者の血中グルコースを調節すること、被験者のグリコシル化ヘモグロビンの割合、若しくはHbA1Cレベルを低下させること、及び/又は他の医薬的介入、例えばインスリン増感剤、グルコース排出促進剤、及び当技術分野において公知の他の治療モダリティへの被験者の依存を低下させることの1つ以上を指す。
【００５２】
用語「個体」、「被験者」、及び「患者」は、本明細書中で互換的に使用し、任意の個々の哺乳動物被験者(例えばウシ、イヌ、ネコ、ウマ、又はヒト)を指す。
【００５３】
II.新規のマクロカプセル及びバリア
本明細書中に開示するのは、膵島細胞又は他のインスリン産生細胞などの治療用細胞をカプセル化するための新規のマクロカプセル及びバリアである。開示するバリアは、従来のカプセル化技術と比べてカプセルの構造的完全性を改善させ、従来のカプセル化技術と比べて透過性を改善させてカプセル化細胞への分子の受動拡散を増加させ、線維症の発生を低下させ、カプセルの製造を促進させる材料の新規組合せを含み、開示するマクロカプセルは、カプセル化細胞の生存を増加させ、線維症の発生を低下させ、移植片への宿主の血管系の動員を促進させ、宿主への移植及び宿主からの回収を促進させ、大型哺乳動物に治療用量を送達させる固有の構造的特徴を持つ。
【００５４】
インスリン産生細胞などの細胞をカプセル化する従来の手段は、一般的に、アルギン酸カプセル、硫酸セルロースカプセル、又はヒドロゲルを含み、それらの各々を本明細書中で簡単に論じる。
【００５５】
インスリン産生細胞をカプセル化するために使用されてきた従来のアルギン酸カプセルは、カルシウム又はバリウムなどの二価陽イオンの存在下でインスリン産生細胞の周囲のアルギン酸ナトリウムの重合により形成される。これによって、インスリン産生細胞がその場で固定されたヒドロゲルが形成される。これらのヒドロゲルカプセルの性能を改善させる試みには、以下が含まれる:細胞付着を低下させるためのアルギン酸の修飾、カプセルをポリ-L-リジン又はポリ-L-オルニチンなどの合成ポリマーでコーティングして透過性を低下させること、マンヌロン又はグルロンのモノマー残基の比率を調整して生体適合性を改善すること、及びクエン酸ナトリウム中でリンスしてカプセルの中心を液化すること。
【００５６】
インスリン産生細胞をカプセル化するために使用されてきた従来の硫酸セルロースカプセルは、硫酸セルロースとポリ(ジアリルジメチルアンモニウムクロリド)(pDADMAC)の重合を通じて形成される。これらのカプセルは、中空コアを囲む柔軟な膜で構成されているという点でアルギン酸ヒドロゲルとは異なる。これらのカプセルは、容易に圧縮できるため、アルギン酸ヒドロゲルよりも脆弱である。これらのカプセルは製造が困難である。なぜなら、新たに作製されたカプセルの表面にある未反応のpDADMACが、接触しうる他のカプセルと不可逆的に重合するためである。
【００５７】
従来のアルギン酸ヒドロゲル及び硫酸セルロースカプセルは、直径が一般的に600マイクロメートル以下のマイクロカプセルである。表面積の体積に対する比が大きく、ガス及び分子のより速い拡散を可能にするため、小さなカプセルがより大きなカプセルよりも好ましいことが一般的に受け入れられている。
【００５８】
これらの従来のマイクロカプセルが動物宿主内に移植された後、マクロファージ及び線維芽細胞を含む宿主細胞がカプセルの表面に接着する。これらの細胞は、数週間にわたって、外来カプセルの周囲に線維性プラークを構成する細胞外マトリックスタンパク質を沈着させる。これらの線維症は、カプセル内の細胞への及び細胞からの拡散を阻害し、機能の喪失及び細胞死に導く。
【００５９】
従来のマイクロカプセルとは対照的に、開示するマクロカプセルは、宿主マクロファージ及び線維芽細胞の動員及び接着の劇的な低下、ひいては線維性プラークの沈着の低下を示す。この特性は、硫酸セルロース/pDADMAC、コンニャクグルコマンナン、又はコンニャクグルコマンナン硫酸の高い生体適合性、並びにマクロカプセルのサイズ及び形状のユニークな組合せの結果である。これらのカプセル内の細胞は、したがって、長期間、又は少なくとも6か月間生存して機能することができる。
【００６０】
従来のマイクロカプセルとは対照的に、開示するマクロカプセルは、大網に付着させることができる。大網への付着によって、大網からマクロカプセルへの宿主の血管系の動員が促進される。網血管系への近接によって、分泌因子の迅速な全身分布が可能になる。
【００６１】
開示するマクロカプセルは、pDADMACとの重合に先立ち、抗炎症特性及び抗凝固特性を有する炭水化物ポリマーを硫酸セルロースと混合することにより形成される少なくとも1つのバリアを含むことができる。抗炎症性抗凝固剤の存在によって、宿主細胞の動員及び接着並びに線維症の形成が低下する。このプロセスはまた、バリア膜の透過性を増加させ、必須生体分子への膜の拡散を可能にする。コンニャクグルコマンナン又はコンニャクグルコマンナン硫酸はそのような炭水化物ポリマーの非限定的な例である。他の例はヘパリン硫酸及びコンドロイチン硫酸である。
【００６２】
グルコマンナン(即ち、コンニャクグルコマンナン)は、コンニャク植物(コンニャク(Amorphophallus konjac))の根から収穫された中性多糖類である。グルコマンナン硫酸は、グルコースモノマーの遊離ヒドロキシル基への硫酸基の化学的付加により形成することができる。このプロセスは、例えば、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、又はイオン性溶媒のクラスの1つなどの適切な溶媒中の硫酸ピリジンの存在下でのエステル化により達成することができる。グルコマンナン硫酸ポリマーは、硫酸セルロースと同様の粘度を有し、低濃度では硫酸セルロース/pDADMACマクロカプセルの形成を阻害しない。グルコマンナンの修飾形態は当技術分野において公知であり(例えば、Reddy et al., Asian-Australas J. Anim. Sci., 17(2): 259-62 (2004);Chen et al., Immunol Invest., 38(7):561-71 (2009)を参照のこと)、このように、本開示の目的のために、「グルコマンナン」は修飾又は非修飾グルコマンナンを指すことができる。
【００６３】
さらに、グルコマンナン及びグルコマンナン硫酸は抗凝固特性を有する。本明細書中に示すように、細胞カプセル化マクロカプセルへのグルコマンナンの取り込みによって、線維症の沈着が減少する。これは、マクロカプセルの硫酸セルロース膜と混合した場合、線維症の形成を低下させるグルコマンナンの最初の実証である。さらに、グルコマンナンは、硫酸セルロース/pDADMAC膜の多孔性を増加させるという追加の利益を提供し、マクロカプセルバリアを通じた少なくとも20kDaの分子の受動拡散を可能にする。
【００６４】
したがって、一部の実施形態では、開示するマクロカプセルは、硫酸セルロース及びグルコマンナンを含む少なくとも1つのバリア層を含む。一部の実施形態では、開示するマクロカプセルは、硫酸セルロース及びグルコマンナンを含む少なくとも2つのバリア層を含む。
【００６５】
さらに、当技術分野では、高密度の細胞の周囲にマクロカプセルを形成することは困難であることが認識されている。高密度では、細胞及び細胞クラスターが膜を通過し、バリアの完全性が損なわれる。高密度の細胞が、少ない容量で少ない治療量の細胞の移植を可能にするために好ましい。高密度の細胞は、カプセル化ポリマー溶液1ミリリットル当たり200万個超の細胞である。
【００６６】
例えば、従来の硫酸セルロースカプセルは、600μm以下の直径を有し、pDADMACにより重合された硫酸セルロースの単一膜で形成される(例えば、Stiegler et al., Transplant Proc., 38(9):3026-30 (2006)を参照のこと)。細胞密度が増加すると、重合ステップ中に細胞が重合膜内に留まる確率も増加する。これが発生すると、膜に欠陥が生じ、免疫保護バリアの失敗の原因になる。
【００６７】
従来のカプセルは、細胞及び液体硫酸セルロース又は液体アルギン酸の混合物を重合浴中に滴下することにより形成させる。細胞は液滴全体に均等に分布する。したがって、より高い密度によって、カプセルの表面上に細胞が曝露される確率が増加する。本明細書中に記載する円筒形状は、細胞及び液体アルギン酸の混合物を、液内平滑断端シリンジ針(submerged blunt-end syringe needle)を通して重合浴中に押し出すことにより形成させる。シリンジ針を通して流れる液体の動態は、形成される円筒の中心に向かって細胞が濃縮されることを示す。したがって、細胞がカプセルの表面に曝露される確率を低くして、高密度の細胞をこの形状内にカプセル化することができる。これらの固定細胞の周囲に形成された第2のバリアにより、カプセルの表面に細胞が曝露される可能性が実質的に排除される。
【００６８】
開示するマクロカプセルは二重バリア構造を含み、少なくとも約1.5mmの直径を有する。この設計により、マクロカプセルの機械的完全性が確保され、インビボでのマクロカプセルの長期安定性の増加に寄与する。さらに、マクロカプセルのサイズにより、高密度の治療用細胞のカプセル化が可能になる。
【００６９】
高密度の治療用細胞は、直径1.5mm以上のマクロカプセル内にカプセル化されうる。一部の実施形態では、開示するマクロカプセルは、アルギン酸を含む第1のバリアで構成されうる。一部の実施形態では、開示するマクロカプセルは、pDADMACと重合された硫酸セルロースを含む第1のバリアで構成されうる。第1のバリアは、ポリメチレン-co-グアニジン(PMCG)でリンスすることができる。その後、硫酸セルロース及び、場合により、グルコマンナン又はグルコマンナン硫酸を含む第2のバリアを第1のバリアの周囲に形成させ、場合により、その後、PMCGでリンスし、このように、二重バリアマクロカプセルを形成することができる。第1のバリアは治療用細胞を直接包含するため、細胞及び/又は細胞破片からの干渉なしに第2のバリアを形成することができる。さらに、第2のバリアは、マクロカプセルが移植された後に宿主に直接接触する唯一のバリアである。
【００７０】
一部の実施形態では、開示するマクロカプセルは、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は少なくとも3つのバリアを含む。マクロカプセルを構成するバリアは、同じ又は異なる材料を含んでもよい。例えば、バリアは硫酸セルロース；硫酸セルロース及びグルコマンナン；硫酸セルロース及びグルコマンナン硫酸；アルギン酸ナトリウム；硫酸セルロース及びアルギン酸ナトリウム；アルギン酸ナトリウム及びグルコマンナン硫酸、並びに/又は硫酸セルロース、アルギン酸ナトリウム、及びグルコマンナン硫酸から形成されてもよい。一部の実施形態では、外部バリアだけがグルコマンナン又はグルコマンナン硫酸を含む。なぜなら、マクロカプセルのこの層だけが移植後に宿主と直接相互作用するためである。グルコマンナン又はグルコマンナン硫酸の代わりに使用することができる他のポリマーは、ヘパリン硫酸及びコンドロイチン硫酸である。
【００７１】
一部の実施形態では、開示するマクロカプセルは、直径が少なくとも1.5mmである。例えば、開示するマクロカプセルは、約1.5mm、約1.6mm、約1.7mm、約1.8mm、約1.9mm、約2.0mm、約2.1mm、約2.2mm、約2.3mm、又は約2.4 mmの直径を有しうる。直径1.5 mm以上により、宿主への移植後の線維症の形成の減少がもたらされる。
【００７２】
一部の実施形態では、開示するマクロカプセルは、少なくとも10cmの長さである。例えば、開示するマクロカプセルは、少なくとも約10cm、少なくとも約11cm、少なくとも約12cm、少なくとも約13cm、少なくとも約14cm、少なくとも約15cm、少なくとも約16cm、少なくとも約17cm、少なくとも約18cm、少なくとも約19cm、少なくとも約20cm又はそれを超える長さを有しうる。十分な長さのマクロカプセルを有することにより、マクロカプセルを除去する必要がある事象において、被験者からマクロカプセルをより簡単に回収することができる(即ち、回収性が増加する)。
【００７３】
開示するマクロカプセルのサイズ及び構造により、また、マクロカプセルが治療的に有用な細胞の数を包含することが可能になる。例えば、開示するマクロカプセルは、1cm当たり少なくとも細胞約50,000個、1cm当たり少なくとも細胞約60,000個、1cm当たり少なくとも細胞約70,000個、1cm当たり少なくとも細胞約80,000個、1cm当たり少なくとも細胞約90,000個、又は1cm当たり少なくとも細胞約1000,000個以上を含有しうる。
【００７４】
より多くの細胞が必要とされる一部の例では、開示するマクロカプセルは、端と端を連結するか、又は一緒に織り込まれうる。
【００７５】
一部の実施形態では、開示するマクロカプセルは球状ではない。好ましい形状は円筒管である。円筒管は少なくとも1mmの直径を有し、長さに制限はない。円筒管は、生きている宿主からのカプセルの回収を促進しながら十分な拡散を可能にするために、高い表面積の体積に対する比を有する。少数の管は、多数の球状マクロカプセルよりも取り外しが簡単である。硫酸セルロース又は硫酸セルロース及びグルコマンナン若しくはグルコマンナン硫酸で構成される第2のバリアは、円筒管の物理的完全性を増強し、このように回収性を改善させる。
【００７６】
球状カプセルは、細胞及び液体硫酸セルロース又は液体アルギン酸の混合物を重合浴中に滴下することにより形成させる。細胞は液滴全体に均等に分布する。したがって、より高い密度によって、カプセルの表面上に細胞が曝露される確率が増加する。本明細書中に記載する円筒形状は、細胞及び液体アルギン酸の混合物を、液内平滑断端シリンジ針を通して重合浴中に押し出すことにより形成させる。シリンジ針を通して流れる液体の動態は、形成される円筒の中心に向かって細胞が濃縮されることを示す。したがって、細胞がカプセルの表面に曝露される確率を低くして、高密度の細胞をこの形状内にカプセル化することができる。これらの固定細胞の周囲に形成された第2のバリアにより、カプセルの表面に細胞が曝露される可能性が実質的に排除される。
【００７７】
一部の実施形態では、基材は、ストリップの並置又は反対側に複数の管状マクロカプセルの付着を可能にする長方形ストリップの形状を有する。一部の実施形態では、基材は円形であり、付着の中心点から放射状に広がる複数の管状マクロカプセルの付着を可能にする。一部の実施形態では、基材の形状は、基材を宿主の組織に付着させるために縫合糸を通すために有用なタブを有する。一部の実施形態では、基材は、基材を宿主の組織に付着させるための2つ以上のタブを有する。
【００７８】
III.開示するマクロカプセルを調製する方法
本明細書中に開示するのは、インスリン産生細胞などの治療用細胞をカプセル化するためのマクロカプセルをより効率的に形成する方法である。
【００７９】
多量の治療用細胞を硫酸セルロースの溶液中に、1ミリリットル当たり細胞200万個の密度に懸濁する。硫酸セルロース/細胞混合物を、重合剤pDADMACを含有する緩衝溶液中に滴下する。液滴、ひいてはマクロカプセルのサイズは、液滴発生装置を使用して慎重に制御することができる。このカプセルは内部カプセルを表す。このプロセスにより、球状カプセルが産生されうる。
【００８０】
一部の実施形態では、治療用細胞は、アルギン酸ナトリウムの溶液中に1ml当たり細胞200万個の密度に懸濁し、カルシウム又はバリウムなどの二価陽イオンを含有する緩衝重合浴中に滴下する。このプロセスにより、球状ヒドロゲルが産生されうる。
【００８１】
一部の実施形態では、治療用細胞をアルギン酸ナトリウムの溶液中に1ml当たり細胞200万個の密度に懸濁し、内径が1.5mmの平滑断端針又は医療グレード管を有するシリンジ中に装填する。針又は管の先端を、カルシウム又はバリウムなどの二価陽イオンを含有する緩衝重合浴中に浸す。アルギン酸/治療用細胞混合物を重合浴中に注入して、円筒管の形態のヒドロゲルを産生する。注入速度は、シリンジポンプを使用して慎重に制御することができる。
【００８２】
硫酸セルロースで構成される球状内部カプセル、アルギン酸ナトリウムで構成される球状内部カプセル、又はアルギン酸ナトリウムで構成される円筒管をpDADMACの溶液中に浸漬し、蒸留水中で簡単にリンスする。内部カプセルを次に、硫酸セルロース及びグルコマンナンの溶液中に浸して外部カプセルを形成する。
【００８３】
或いは、硫酸セルロースで構成される球状内部カプセル、アルギン酸ナトリウムで構成される球状内部ヒドロゲル、又はアルギン酸ナトリウムで構成される円筒管を硫酸セルロース及びグルコマンナンの溶液中に浸漬する。内部カプセル又は管をpDADMACの溶液中に落として外部カプセルを形成する。
【００８４】
pDADMACと重合された硫酸セルロースを含むマクロカプセルは、pDADMACを含有する重合緩衝液をリンスして落とした後に接触させた場合、互いに強く接着する公知の傾向を有する。これにより、マクロカプセルの凝集体又は分離されると物理的に損傷するマクロカプセルがもたらされる。
【００８５】
本明細書中で開示するように、この凝集は、各マクロカプセルバリアの重合後にポリメチレン-co-グアニジン(PMCG)を用いた逐次洗浄ステップにおいて加えることにより最小化又は排除することができる。例えば、pDADMACとの硫酸セルロースの重合後、PMCGで逐次洗浄することにより、マクロカプセル間の接着が排除され、物理的に無傷の個々のマクロカプセルが産生される。PMCG重合は、加えて、マクロカプセルバリアの破裂強度を増加させるという利益を提供する。
【００８６】
PMCGは、以前は、膜の形成の間に不可欠なポリマーとしてのみ使用されてきた(Wang et al., Transplantation, 85(3): 331-7 (2008))。対照的に、本明細書中に記載するマクロカプセル設計は、膜の不可欠な部分としてPMCGを用いず、しかし、代わりに、硫酸セルロースの曝露された非結合硫酸基に結合してそれを占めるコーティング材料として用いる。
【００８７】
このように、一部の実施形態では、硫酸セルロースを含むマクロカプセルを調製する方法は、pDADMACとの重合後にPMCGでマクロカプセルを洗浄するステップを含む。1つを上回るバリアを含むマクロカプセルを調製する場合、方法は、その後の各バリアの重合後の逐次的なPMCG洗浄ステップを含むことができる。
【００８８】
カプセルが完全に調製された後、マクロカプセルをリンスして、細胞培養培地に戻すことができる。
【００８９】
マクロカプセルは、マクロカプセルを手術用メッシュと接触させて配置することにより、手術用メッシュ片に接着することができる。ある量の硫酸セルロースを加えて、接触しているマクロカプセル及び手術用メッシュの部分を覆う。或いは、ある量の硫酸セルロース及びグルコマンナンを加えて、接触しているマクロカプセル及び手術用メッシュの部分を覆う。pDADMACの重合溶液を加えて、マクロカプセル及び手術用メッシュを一緒に結合させる。
【００９０】
IV.治療方法
上記のように、本明細書中に記載するマクロカプセルは、治療用細胞(例えば、膵島細胞又はインスリン産生細胞)をカプセル化することができ、したがって、開示するマクロカプセルは、それを必要とする被験者において糖尿病を治療する方法において有用である。一部の実施形態では、被験者は、インスリン依存性糖尿病を有するヒト被験者である。
【００９１】
方法は一般的に、本明細書中に開示するマクロカプセル中にカプセル化された治療有効量のインスリン産生細胞を、それを必要とする被験者中に移植するステップを含む。このように、一部の実施形態では、方法は、少なくとも2つのバリアを含み、少なくとも1.5mmの直径を有するマクロカプセル中にカプセル化された治療有効量のインスリン産生細胞を、それを必要とする個体中に移植するステップを含む。一部の実施形態では、方法は、外部バリアが(i)硫酸セルロース及びグルコマンナン若しくはグルコマンナン硫酸又は(ii)アルギン酸ナトリウムで構成される少なくとも1つのバリアを含むマクロカプセル中にカプセル化された治療有効量のインスリン産生細胞を、それを必要とする個体に移植するステップを含む。一部の実施形態では、方法は、アルギン酸の内部カプセル並びに硫酸セルロース及びグルコマンナン硫酸の外部カプセルで構成される円筒管の形状に形成されたマクロカプセル中にカプセル化された治療有効量のインスリン産生細胞を、それを必要とする個体中に移植するステップを含む。
【００９２】
一部の実施形態では、方法は、約1年に1回、2年毎に1回、3年毎に1回、4年毎に1回、5年毎に1回又はそれ超、開示するマクロカプセル中にカプセル化された治療有効量のインスリン産生細胞を、それを必要とする個体中に移植するステップを含む。一部の実施形態では、移植された細胞は、移植後少なくとも6カ月間にわたり生存する。したがって、一部の実施形態では、被験者は1つの移植だけを必要としうる。一部の実施形態では、移植は、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、又は18カ月毎に1回、1、2、3、4、若しくは5年又はそれを超える毎に1回、或いは被験者が再発性の高血糖を有するか、又は糖尿病状態に戻るまで交換する必要がありうる。
【００９３】
一部の実施形態では、カプセル化された細胞を被験者の大網に移植する。大網(greater omentum)(great omentum、omentum majus、gastrocolic omentum、epiploon、又はcaulとしても公知である)は、胃から垂れ下がって胃の大湾から戻って伸展し、後腹壁に到達する前に横行結腸に上る内臓腹膜の大きなエプロン状の襞である。このように、カプセル化細胞は、網から外科的に形成された嚢中に移植してもよい。
【００９４】
一部の実施形態では、カプセル化細胞は被験者の網に付着している。一部の実施形態では、カプセル化細胞は、網から嚢を形成することなく網に移植されうる。
【００９５】
一部の実施形態では、カプセル化細胞を腹膜腔中に移植する。一部の実施形態では、カプセル化細胞を腹膜腔中に移植して、網に固定する。一部の実施形態では、カプセル化細胞を網嚢中に移植する。一部の実施形態では、マクロカプセルは円筒管であり、一部の実施形態では、カプセル化細胞は、円筒管の一端が網に固定された腹膜腔中に移植する。
【００９６】
カプセル化細胞の例示的な用量は、治療されている個体のサイズ及び健康状態に従って変動しうる。例えば、一部の実施形態では、開示するマクロカプセル中にカプセル化された細胞の例示的な移植片は、体重1kg当たり500万個から1000万個の細胞を含みうる。開示するマクロカプセルは、治療有効量の細胞、例えば、1cm当たり少なくとも細胞約50,000個、1cm当たり少なくとも細胞約60,000個、1cm当たり少なくとも細胞約70,000個、1cm当たり少なくとも細胞約80,000個、1cm当たり少なくとも細胞約90,000個細胞/cm、又は1cm当たり少なくとも細胞約1000,000個以上をカプセル化することが可能である。
【００９７】
さらに、開示する治療方法は、カプセル化された治療用細胞に加えて、第2の治療薬の投与を追加で含むことができる。例えば、一部の実施形態では、追加の治療化合物には、インスリン注射、メトホルミン、スルホニル尿素、メグリチニド、チアゾリジンジオン、DPP-4阻害剤、GLP-1受容体アゴニスト、及びSGLT2阻害剤が含まれうるが、これらに限定されない。
【００９８】
開示するマクロカプセルの移植を含む特定の治療レジメンは、それらが所定の患者の転帰を改善するか否かに従って評価してもよく、それが被験者の血中グルコースレベルを安定化若しくは正常化するのに役立ち、又は糖尿病に関連付けられる症状若しくは併存疾患(低血糖のエピソード、グリコシル化ヘモグロビンレベル(HbA1Cレベル)の上昇、心疾患、網膜症、神経障害、腎疾患、肝疾患、歯周病、及び非治癒性潰瘍を含むが、これらに限定されない)のリスク若しくは発生を低下させることを意味する。
【００９９】
このように、本開示の目的のために、望ましい臨床結果を含む1つ以上の有益な又は望ましい結果を得た場合、被験者を治療する。例えば、有益な又は望ましい臨床結果には、以下の1つ以上が含まれるが、これらに限定されない:糖尿病に起因する1つ以上の症状の減少、糖尿病に苦しむ人々の生活の質の増加、糖尿病を治療するために必要な他の医薬の用量の減少、糖尿病に関連付けられる合併症の遅延若しくは予防、及び/又は個人の生存期間の延長。
【０１００】
さらに、本方法の被験者は一般的に糖尿病を有する被験者であるが、患者の年齢は限定しない。開示する方法は、全ての年齢群及びコホートにわたる糖尿病を治療するために有用である。このように、一部の実施形態では、被験者は小児の被験者でありうるが、他の実施形態では、被験者は成人の被験者でありうる。
【０１０１】
当業者は、本開示が目的を実行し、言及する目的及び利点、並びにそれらに固有の目的及び利点を得るために十分に適合されることを容易に理解するであろう。その中の改変及び他の使用を当業者は思い浮かべるであろう。これらの改変は本開示の精神内に包含される。以下の実施例を、本発明を例証するために与える。しかし、本発明をこれらの実施例の特定の条件又は詳細に限定しないことを理解されたい。
【実施例】
【０１０２】
[実施例1]
マクロカプセル化細胞の形成及びテスト
セルロースの硫酸化:セルロースは、Zhang et al., Cellulose, 17:427-435 (2010)により使用された方法と同様に硫酸化した。簡単には、セルロースを無水ジメチルホルムアミド(DMF)中に懸濁し、DMF/無水酢酸/クロロスルホン酸の溶液とゆっくりと混合し、50℃で5時間にわたり撹拌した。混合物を次に、エタノール中の無水酢酸ナトリウムの飽和溶液中に注いだ。沈殿物を遠心分離し、エタノール中の4%酢酸ナトリウムで洗浄した。沈殿物を収集し、室温で15時間にわたり1Mエタノール性水酸化ナトリウムと混合した。酢酸/エタノールの50/50混合物でpHを8に調整した。沈殿物をエタノールで洗浄し、DI水中に溶解した。溶液を0.45umフィルターを通して濾過し、DI水中で透析し、凍結乾燥した。
【０１０３】
グルコマンナンの硫酸化:グルコマンナンをジメチルスルホキシドの溶液中に懸濁した。硫酸ピリジンをグルコマンナン溶液に滴下し、反応物を60℃まで2時間にわたり上昇させた。反応物を室温に冷却し、水酸化ナトリウム溶液でpHを8に調整した。グルコマンナン硫酸をエタノールで沈殿させ、水中に再懸濁した。この溶液を蒸留水に対して48時間にわたり透析し、45umフィルターを通して濾過した。
【０１０４】
グルコース感知インスリン発現細胞の分化:geltrex(Life Technology)でコーティングされた組織培養皿上のE8培地(Life Technology)中で培養された幹細胞株(SR1423)を、0.5mM EDTAへの曝露により基材から剥離し、10nM Rhoキナーゼ阻害剤(Y-27632、Sigma)を添加したE8培地中の懸濁培養皿に移した。培養皿を、37℃及び6%CO2の加湿組織培養インキュベーター内で70〜90RPMで回転するオービタルシェーカーに一晩置いた。形成されたクラスターをオービタルシェーカーから取り出し、収集し、0.2%ヒト血清アルブミン、0.5X N2サプリメント(Life Technology)、0.5X B27サプリメント(Life Technology)、1Xペニシリン/ストレプトマイシン(VWR)、Activin A(100ng/ml)、及びWortmannin(1nM)を含有するDMEM中に再懸濁した。培養培地は3日間又は4日間にわたり毎日交換した。クラスターを収集し、0.2%ヒト血清アルブミン、0.5X B27サプリメント、0.5Xインスリン-トランスフェリン-セレンサプリメント(VWR)、1Xペニシリン/ストレプトマイシン(VWR)、レチノイン酸(2uM)、KGF(50ng/ml)、ノギン(50ng/ml)、及びシクロパミン(250nM)を含有するRPMI/F12の50/50溶液中に再懸濁した。培地を4日間にわたり毎日交換した。クラスターを収集し、グルコース(8mMまで)、0.5%ヒト血清アルブミン、0.5Xインスリン-トランスフェリン-セレンサプリメント、1X N2サプリメント、1Xペニシリン/ストレプトマイシン、KGF(50ng/ml)、ノギン(50ng/ml)、及びEGF(50ng/ml)を添加したDMEM低グルコース中に再懸濁した。培地を4日間にわたり隔日に交換した。クラスターを収集し、グルコース(8mMまで)、0.5%ヒト血清アルブミン、0.5Xインスリン-トランスフェリン-セレンサプリメント、1X N2サプリメント、1Xペニシリン/ストレプトマイシン、ノギン(50ng/ml)、EGF(50ng/ml)、GSiXXI(1uM)、Alk5i(10uM)、及びT3(1uM)を添加したDMEM低グルコース中に再懸濁した。培地を4日間にわたり隔日に交換した。クラスターを収集し、グルコース(8mMまで)、0.5%ヒト血清アルブミン、0.5Xインスリン-トランスフェリン-セレンサプリメント、1X N2サプリメント、1Xペニシリン/ストレプトマイシン、ベタセルリン(20ng/ml)、レチノイン酸(100nM)、Alk5i(10uM)、及びT3(1uM)を添加したDMEM低グルコース中に再懸濁した。培地を4日間にわたり隔日に交換した。クラスターを収集し、グルコース(8mMまで)、0.5%ヒト血清アルブミン、0.5Xインスリン-トランスフェリン-セレンサプリメント、1X N2サプリメント、1Xペニシリン/ストレプトマイシン、1X Glutamax(Life Technology)、ニコチンアミド(10mM])BMP4(10ng/ml)、Alk5i(10uM)、及びT3(1uM)を添加したCMRL 1066中に再懸濁した。
【０１０５】
細胞のカプセル化:1,00,000個以上のグルコース感知インスリン発現細胞で構成される細胞集団を、130mM NaCl、10mM 3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸(MOPS)(pH7.4)中に1ml当たり細胞200万個の密度を達成するように1.8%硫酸セルロース/0.1%グルコマンナンの容量中に懸濁した。硫酸セルロース/グルコマンナン/細胞混合物をポリエチレンで構成される非粘着表面に移し、1%ポリ(ジアリルジメチルアンモニウムクロリド)(pDADMAC)、130mM NaCl、10mM 3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸(MOPS)(pH7.4)の撹拌溶液中に滴下した。接触時、硫酸セルロースはpDADMACと重合し、直径2mmを上回る球状マクロカプセルの形態で細胞の周囲に膜を形成する。マクロカプセルを広口ピペットで収集し、0.3%ポリ(メチレンコグアニジン)(pMCG)(pH7.4)を含有するpDADMAC、130mM NaCl、10mM MOPSの溶液に移した。マクロカプセルを収集し、130mM NaCl、10mM MOPS(pH7.4)で2回リンスした。マクロカプセルを収集し、pDADMACの1%溶液と混合し、2分間にわたり撹拌した。マクロカプセルを収集し、蒸留水中で短時間リンスした。マクロカプセルを次に、130mM NaCl、10mM MOPS(pH7.4)中の1.8%硫酸セルロース/0.1%グルコマンナンの溶液中に2分間にわたり浸した。マクロカプセルを収集し、130mM NaCl、10mM MOPS、及び0.3%ポリ(メチレンコグアニジン)(pMCG)(pH7.4)の溶液中に移した。最後に、マクロカプセルを130mM NaCl、10mM MOPS(pH7.4)の溶液中で4回リンスし、培養培地に移し、37℃及び6%CO2の加湿インキュベーター中でインキュベートした。
【０１０６】
このプロセスにより、インスリン発現細胞を含有する内膜及び内膜に密接に関連付けられる外膜で構成されるマクロカプセルが形成された(図1A)。グルコマンナンで形成された膜により表面への宿主細胞の蓄積が制限され、それにより線維症が阻害される(図1)。
【０１０７】
別の例では、1,000,000個以上のグルコース感知インスリン発現細胞で構成される細胞集団を、1ml当たり細胞200万個の密度を達成するように、130mM NaCl、10mM 3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸(MOPS)(pH7.4)中の2%アルギン酸ナトリウムの容量中に懸濁した。アルギン酸/細胞混合物を内径1mmのシリンジに移し、20mM BaCl、10mM MOPS、100mMマンニトール(pH7.4)の浴中に分注し、円筒管の形態でヒドロゲルを作製した。管形状マクロカプセルを広口ピペットで収集し、130mM NaCl、10mM MOPS(pH7.4)で2回リンスした。マクロカプセルを収集し、pDADMACの1%溶液と混合し、2分間にわたり撹拌した。マクロカプセルを収集し、蒸留水中で短時間リンスした。マクロカプセルを次に、130mM NaCl、10mM MOPS(pH7.4)中の1.8%硫酸セルロース/0.1%グルコマンナン硫酸の溶液中に2分間にわたり浸した。最後に、マクロカプセルを130mM NaCl、10mM MOPS(pH7.4)の溶液中で4回リンスし、培養培地に移し、37℃及び6%CO2の加湿インキュベーター中でインキュベートした(図1及び2)。
【０１０８】
カプセル透過性。マクロカプセルの透過性を、定められた分子量のFITC結合デキストランポリマーの存在下で1時間にわたりインキュベートすることにより決定した。1時間後、デキストラン溶液をマクロカプセルの外側からリンスした。カプセル膜全体に受動的に拡散することができたFITC-デキストランは、リンスの間にカプセル内に残り、蛍光を発する。グルコマンナンを伴わない硫酸セルロースから形成された二重層マクロカプセルは、20kDaデキストランに対して透過性ではなかった。硫酸セルロース及びグルコマンナンの混合物から形成された二重層マクロカプセルは、20kDaのFITC-デキストランに対して透過性であったが、70kDaのデキストランに対しては透過性ではなかった(図3)。
【０１０９】
インスリン依存性糖尿病のラットモデル:少なくとも8週齢及び少なくとも200gの体重の免疫正常Sprague-Dawleyラットを2〜6時間にわたり絶食させ、尾静脈中に静脈内経由で60〜65mg/kgのストレプトゾトシンを投与した。3日間連続の非空腹時グルコースレベル>300mg/dlが実証された場合、動物を糖尿病とみなした。インスリン徐放性ペレット(Linplant;Linshin、カナダ、スカボロー)の皮下移植により高血糖が確認された後、グルコースレベルは安定した。尾穿刺又は外側伏在静脈を介して一滴の血液を収集することによりグルコースをモニターし、携帯型グルコース計に適用した。
【０１１０】
ラットへのカプセル/細胞の移植。上腹部において腹部正中線の皮膚切開を行った。腹壁をテント状にし、腹直筋の正中線で鋭利に切開した。腹部にアクセスし、網を単離して体外に取り出した。球状マクロカプセルをゲルフォームの2枚の薄いシートの間に置き、網の中心に置いた。網の単離部分の角を移植片の上に折り畳んで嚢を作製し、次に縫合により閉じた。網嚢を腹腔中に戻し、外科用ステープルを使用して腹部切開部、続いて皮膚を縫合した。
【０１１１】
ラットの腹膜への非球状管形状カプセルの移植。真皮及び腹壁を通して腹部切開を行った。管形状マクロカプセルが広口ピペットに導入した。ピペットを腹膜腔中に導入し、マクロカプセルをゆっくりと排出した。腹壁と真皮を縫合により閉じた。
【０１１２】
ラットの網に固定された非球状管形状カプセルの移植。真皮及び腹壁を通して腹部切開を行った。網の一部を体外に取り出した。マクロカプセルに付着された手術用メッシュ片を網上に置いた。縫合糸によりメッシュを網に連結した。管形状マクロカプセル及び体外に取り出した網の部分を腹膜中に戻した。腹壁と真皮を縫合により閉じた。
【０１１３】
血中グルコースの調節:ストレプトゾトシンでの治療により糖尿病になった免疫正常ラットは、インスリン発現細胞を含有するマクロカプセルの網移植後に正常血糖を回復した(図4)。
【０１１４】
マクロカプセルの外植片:ケタミンによる鎮静とそれに続く塩化カリウムの心臓内注射によりラットを安楽死させた。マクロカプセルを含有する網嚢を切除した。或いは、網への円筒形マクロカプセルの付着をハサミで切断し、マクロカプセルを除去した。外植片の形態及び血管新生のエビデンスを撮影した(図6)。外植片をPBS中でリンスし、Live/Dead細胞染色キット(Biovision)を使用して、製造者の指示に従って生存細胞及び死細胞について染色した(図7)。外植マクロカプセルを4%ホルマリン中で保存した。マクロカプセルを最適な切断温度化合物(OCT)中に埋め込み、凍結し、クライオトームで10umの厚さで切片にした。切片を顕微鏡スライドに適用し、標準的な免疫組織化学技術を使用して、インスリン及びコラーゲン1の発現について染色した。マクロカプセルは、マクロカプセルの表面に接着した薄い膜だけを示した(図8A)。マクロカプセルには、生存可能なインスリン発現細胞のクラスターが含有された(図8B;図5も参照のこと)。
【０１１５】
[実施例2]
開示するカプセル化細胞での糖尿病の治療
この実施例には、本明細書中に記載するマクロカプセル化細胞を使用して、ヒト成人においてI型糖尿病を治療する方法を例証する。
【０１１６】
インスリン依存性糖尿病の成人ヒト被験者は、開示するマクロカプセル化膵島細胞を含む治療有効量の組成物を含む移植片を、被験者の網に固定した網嚢中、又は腹膜腔中に受ける。被験者を血中グルコースレベルについて評価する。被験者を、治療有効数のマクロカプセル化細胞の移植後にモニターし、被験者の血中グルコースレベルが安定していることを確認する。被験者を、グリコシル化ヘモグロビン、及び糖尿病の併存疾患について経時的にさらにスクリーニングする。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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