(57)【要約】  本開示は、眼疾患を治療、予防、またはその重症度を軽減するための方法を提供する。本開示の方法は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニスト（例えば、アフリベルセプト）と組み合わせた抗ＡＰＬＮＲ抗体などのＡＰＬＮＲアンタゴニストを含む治療組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。【選択図】図９Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管性眼疾患または障害を治療するための方法であって、
治療的に有効な量のＡＰＬＮＲアンタゴニストを、それを必要とする対象に投与することと、
前記対象に、治療的に有効な量の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニストを投与することと、を含む、方法。
【請求項２】
前記眼疾患または障害が、糖尿病性網膜症、増殖型糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、加齢性黄斑変性、網膜血管新生、網膜中心静脈閉塞、網膜静脈分枝閉塞、ポリープ状脈絡膜血管症、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、変性近視（近視ＣＮＶ）、血管新生緑内障、および未熟児網膜症からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記眼疾患または障害が、加齢性黄斑変性である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記眼疾患または障害が、糖尿病性黄斑浮腫である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
網膜血管形成を阻害する方法であって、
治療的に有効な量のＡＰＬＮＲアンタゴニストを、それを必要とする対象に投与することと、
前記対象に、治療的に有効な量の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニストを投与することと、を含む、方法。
【請求項６】
網膜血管新生を阻害する方法であって、
治療的に有効な量のＡＰＬＮＲアンタゴニストを、それを必要とする対象に投与することと、
前記対象に、治療的に有効な量の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニストを投与することと、を含む、方法。
【請求項７】
脈絡膜血管新生を阻害する方法であって、治療的に有効な量のＡＰＬＮＲアンタゴニストを、それを必要とする対象に投与することと、
前記対象に、治療的に有効な量の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニストを投与することと、を含む、方法。
【請求項８】
血管の再生を改善し、異常な血管新生を低減する方法であって、
治療的に有効な量のＡＰＬＮＲアンタゴニストを、それを必要とする対象に投与することと、
前記対象に、治療的に有効な量の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニストを投与することと、を含む、方法。
【請求項９】
網膜の血管再生を促進する方法であって、
治療的に有効な量のＡＰＬＮＲアンタゴニストを、それを必要とする対象に投与することと、
前記対象に、治療的に有効な量の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニストを投与することと、を含む、方法。
【請求項１０】
網膜血管の均一な再生を促進する方法であって、
治療的に有効な量のＡＰＬＮＲアンタゴニストを、それを必要とする対象に投与することと、
前記対象に、治療的に有効な量の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニストを投与することと、を含む、方法。
【請求項１１】
網膜における血管の伸長を改善する方法であって、
治療的に有効な量のＡＰＬＮＲアンタゴニストを、それを必要とする対象に投与することと、
前記対象に、治療的に有効な量の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニストを投与することと、を含む、方法。
【請求項１２】
網膜における均一な血管の成長を促進する方法であって、
治療的に有効な量のＡＰＬＮＲアンタゴニストを、それを必要とする対象に投与することと、
前記対象に、治療的に有効な量の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニストを投与することと、を含む、方法。
【請求項１３】
網膜の血管の組織化を改善する方法であって、
治療的に有効な量のＡＰＬＮＲアンタゴニストを、それを必要とする対象に投与することと、
前記対象に、治療的に有効な量の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニストを投与することと、を含む、方法。
【請求項１４】
前記対象が、糖尿病性網膜症、増殖型糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、加齢性黄斑変性、網膜血管新生、網膜中心静脈閉塞、網膜静脈分枝閉塞、ポリープ状脈絡膜血管症、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、変性近視（近視ＣＮＶ）、血管新生緑内障、および未熟児網膜症からなる群から選択される、眼疾患または障害と診断されている、請求項５〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記眼疾患または障害が、加齢性黄斑変性である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記眼疾患または障害が、糖尿病性黄斑浮腫である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＡＰＬＮＲアンタゴニストが、抗ＡＰＬＮＲ抗体またはその抗原結合断片を含み、前記抗体またはその抗原結合断片が、ヒトＡＰＬＮＲに特異的に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２／７および１３／１８からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列対を含む参照抗体と、ヒトアペリン受容体（ＡＰＬＮＲ）との結合について競合し、前記抗体またはその抗原結合断片が、ヒトＡＰＬＮＲと特異的に結合する、請求項２に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２／７および１３／１８からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列対を含む参照抗体と同じＡＰＬＮＲ上のエピトープと結合し、前記抗体またはその抗原結合断片が、ヒトＡＰＬＮＲに特異的に結合する、請求項２または３に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗体または抗原結合断片が、（ａ）配列番号２および１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）と、（ｂ）配列番号７および１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）のＣＤＲと、を含む、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗体または抗原結合断片が、それぞれ、配列番号３−４−５−８−９−１０および１４−１５−１６−１９−２０−２１からなる群から選択されるＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３ドメインを含む、請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗体または抗原結合断片が、（ａ）配列番号２および１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）と、（ｂ）配列番号７および１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）と、を含む、請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗体または抗原結合断片が、配列番号２／７および１３／１８からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対の前記重鎖および軽鎖のＣＤＲを含む、請求項２〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記抗体または抗原結合断片が、配列番号２／７および１３／１８からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、請求項２〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２／７のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項２６】
前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１３／１８のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗体または抗原結合断片が、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４重鎖定常領域を有するヒト抗体である、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗体またはその抗原結合断片が、ＡＰＬＮＲとアペリンとの相互作用を遮断する、請求項２〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記抗体またはその抗原結合断片が、ＡＰＬＮＲとアペリンとの相互作用を遮断し、競合結合アッセイにおいて少なくとも５０％の結合阻害を示す、請求項２〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記抗体またはその抗原結合断片が、ＡＰＬＮＲとアペリンとの相互作用を遮断しないか、または部分的にのみ遮断する、請求項２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＶＥＧＦアンタゴニストが、ＶＥＧＦ受容体系キメラ分子（ＶＥＧＦトラップ）を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＶＥＧＦトラップが、ＶＥＧＦＲ１の１つ以上の免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメインと、ＶＥＧＦＲ２の１つ以上のＩｇ様ドメインと、多量体化ドメインと、を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＶＥＧＦトラップが、ＶＥＧＦＲ１のＩｇ様ドメイン２と、ＶＥＧＦＲ２のＩｇ様ドメイン３と、多量体化ドメインと、を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＶＥＧＦトラップが、アフリベルセプトである、請求項１８に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＶＥＧＦアンタゴニストが、配列番号２３のアミノ酸２７〜４５７からなる２つのポリペプチドの二量体からなる、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
血管性眼疾患または障害を治療するための組成物であって、
治療的に有効な量のＡＰＬＮＲアンタゴニストと、
治療的に有効な量の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニストと、
好適な担体、賦形剤または希釈剤と、を含む、組成物。
【請求項３７】
前記ＡＰＬＮＲアンタゴニストが、抗ＡＰＬＮＲ抗体またはその抗原結合断片を含み、前記抗体またはその抗原結合断片が、ヒトＡＰＬＮＲに特異的に結合する、請求項７４に記載の組成物。
【請求項３８】
前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２／７および１３／１８からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列対を含む参照抗体と、ヒトアペリン受容体（ＡＰＬＮＲ）との結合について競合し、前記抗体またはその抗原結合断片が、ヒトＡＰＬＮＲと特異的に結合する、請求項７５に記載の組成物。
【請求項３９】
前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２／７および１３／１８からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列対を含む参照抗体と同じＡＰＬＮＲ上のエピトープと結合し、前記抗体またはその抗原結合断片が、ヒトＡＰＬＮＲに特異的に結合する、請求項７５または７６に記載の組成物。
【請求項４０】
前記抗体または抗原結合断片が、（ａ）配列番号２および１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）と、（ｂ）配列番号７および１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）のＣＤＲと、を含む、請求項７５〜７７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４１】
前記抗体または抗原結合断片が、それぞれ、配列番号３−４−５−８−９−１０および１４−１５−１６−１９−２０−２１からなる群から選択されるＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３ドメインを含む、請求項７５〜７８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４２】
前記抗体または抗原結合断片が、（ａ）配列番号２および１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）と、（ｂ）配列番号７および１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）と、を含む、請求項７５〜７９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４３】
前記抗体または抗原結合断片が、配列番号２／７および１３／１８からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対の前記重鎖および軽鎖のＣＤＲを含む、請求項７５〜８０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４４】
前記抗体または抗原結合断片が、配列番号２／７および１３／１８からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、請求項７５〜８１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４５】
前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２／７のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、請求項８２に記載の組成物。
【請求項４６】
前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１３／１８のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、請求項８２に記載の組成物。
【請求項４７】
前記抗体またはその抗原結合断片が、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４重鎖定常領域を有するヒト抗体である、請求項８３または８４に記載の組成物。
【請求項４８】
前記ＶＥＧＦアンタゴニストが、ＶＥＧＦ受容体系キメラ分子（ＶＥＧＦトラップ）を含む、請求項７４〜８５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４９】
前記ＶＥＧＦトラップが、ＶＥＧＦＲ１の１つ以上の免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメインと、ＶＥＧＦＲ２の１つ以上のＩｇ様ドメインと、多量体化ドメインと、を含む、請求項８６に記載の組成物。
【請求項５０】
前記ＶＥＧＦトラップが、ＶＥＧＦＲ１のＩｇ様ドメイン２と、ＶＥＧＦＲ２のＩｇ様ドメイン３と、多量体化ドメインと、を含む、請求項８７に記載の組成物。
【請求項５１】
前記ＶＥＧＦトラップが、アフリベルセプトである、請求項８８に記載の組成物。
【請求項５２】
前記ＶＥＧＦアンタゴニストが、配列番号２３のアミノ酸２７〜４５７からなる２つのポリペプチドの二量体を含む、請求項７４〜８９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５３】
前記眼疾患または障害が、糖尿病性網膜症、増殖型糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、加齢性黄斑変性、網膜血管新生、網膜中心静脈閉塞、網膜静脈分枝閉塞、ポリープ状脈絡膜血管症、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、変性近視（近視ＣＮＶ）、血管新生緑内障、および未熟児網膜症からなる群から選択される、請求項７４〜９０のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表
この出願は、２０１８年５月４日に作成され、１６，８４３バイトを含むファイル１０３５４ＷＯ０１−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ．ｔｘｔとしてコンピュータ可読形式で提出された配列表を参照により組み込む。
【０００２】
本開示は、血管性眼疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象に、特に、アペリン受容体アンタゴニストおよび血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニストを投与することによる方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
血管性眼疾患は、昨今の老年人口における失明の主な原因である。これらの疾患は、網膜内に成長する異常な「漏出性」の血管によって特徴付けられ得る。この対象集団の２つの最大の原因は、糖尿病性網膜症および滲出型加齢性黄斑変性である。
【０００４】
糖尿病性網膜症（ＤＲ）は、米国における視覚障害の主要な原因である（非特許文献１、非特許文献２）。糖尿病性網膜症は、基底膜の肥厚化に伴って始まる微小血管の代償不全から生じ（非特許文献３）、最終的に血管閉塞および血管新生に進行する（非特許文献４）。糖尿病を有する４０歳以上の対象の約２８％がＤＲを有し、４．４％が視覚を脅かすＤＲを有すると推定されている（非特許文献５）。糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）はＤＲの症状であり、若年および中年の成人における視力喪失の最も頻繁な原因である（非特許文献１、非特許文献２）。
【０００５】
加齢黄斑変性（ＡＭＤ）は、先進国での５０歳以上の人々における、重度の視力喪失の主な原因である。近年、抗血管形成剤の導入により、ＡＭＤの治療において大幅な進歩が得られており、血管新生ＡＭＤを有する対象に顕著な視覚回復の希望がもたらされている（非特許文献６）。
【０００６】
プレプロアペリンは、ヒトＣＮＳおよび末梢組織、例えば、肺、心臓、および乳腺において発現される７７アミノ酸のタンパク質である。アペリンペプチドの様々なサイズのＣ末端断片を含むペプチドは、Ｇタンパク質共役受容体、ＡＰＪ受容体（現在はＡＰＬＮＲとして知られている）を活性化することが示された（非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０）。多数の研究は、アペリンペプチドおよび類似体が、内皮依存性血管拡張などのＡＰＪ受容体（ＡＰＬＮＲ）との相互作用を通じて心血管および血管形成作用を伝達することを示す（非特許文献１１）。
【０００７】
アペリンシステムは、病態生理学的な血管形成において役割を果たすために出現する。研究は、アペリンが低酸素誘発性網膜血管形成に関与し得ることを示している（非特許文献１２）。いくつかの報告において、特定の組成物は、病理学的血管形成を遮断することが可能なＡＰＬＮＲ阻害剤などで、アペリン／ＡＰＪ経路（例えば、特許文献１を参照されたい）を阻害することにより血管形成を阻害し得、したがって網膜における血管新生化の阻害に有用である（非特許文献１３）。そのため、アペリンを介したシグナル伝達の干渉は、増殖型糖尿病性網膜症（非特許文献１４、非特許文献１５、非特許文献１６）の早期予防においても有益であり得る。さらに最近では、アペリンが未熟児網膜症（非特許文献１７）のメカニズムに関与づけられている。
【０００８】
抗血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）療法（例えば、アフリベルセプト）は、血管新生ＡＭＤおよびＤＭＥのための標準的なケア治療である。これらの対象集団におけるアフリベルセプトの有効性と安全性は、十分に特徴付けられている（非特許文献１８）。しかしながら、ＡＭＤにおいて、対象のおよそ９５％がそれらの視力を維持していたが、対象のおよそ３０％のみが１年で最高矯正視力（ＢＣＶＡ）において１５文字以上の改善を達成した。ＤＭＥにおいて、治療成果を改善する可能性も存在する。アフリベルセプトおよびラニビズマブで見られるように、ＤＭＥによる視力喪失を伴う対象の５０％未満が、１年および２年以上で１５文字以上の改善を達成している。ラニビズマブの研究における増殖性網膜症の臨床的な証拠は、ラニビズマブの３年間の毎月の治療を受けた対象の最大７．２％で発生し、最大３．２％の対象は視覚障害になる可能性のある治療様式（非特許文献１９）である汎網膜光凝固を必要とした。
【０００９】
アペリン／ＡＰＬＮＲおよびＶＥＧＦの両方が、血管形成および血管発達の既知の要因であるが、血管形成の促進において２つのシグナル伝達経路が相互作用するメカニズムは完全には理解されていない。特に、これらの経路は網膜血管の形成に関与されることが知られており、様々な研究により、アペリンおよびＶＥＧＦは、正および負のフィードバック効果を有することが報告されており、一方の発現の増加が他方の発現に寄与できるか、または一方の拮抗作用が他方の発現を抑制する（非特許文献２０）。
【００１０】
ラニビズマブおよびアフリベルセプトなどの抗ＶＥＧＦ療法の硝子体内（ＩＶＴ）の送達は、脈絡網膜疾患に対する有効性と安全性が実証されている。しかしながら、血管透過性、血管新生、およびその他の血管機能不全に寄与する多数の追加要因が存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第７，７３６，６４６号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ９１：１４６４−１４７４
【非特許文献２】Ｍｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  １０５：９９８−１００３
【非特許文献３】Ｒｕｇｇｉｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｔａｂ．２３：３０−４２
【非特許文献４】Ｐｏｒｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ４５：１６１７−１６３４
【非特許文献５】Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，ＪＡＭＡ  ３０４：６４９−６５６
【非特許文献６】Ｋｅａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｓｕｒｖ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．５７：３８９−４１４
【非特許文献７】Ｈａｂａｔａ，ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １４５２：２５−３５
【非特許文献８】Ｈｏｓｏｙａ，ｅｔ  ａｌ．，２０００，ＪＢＣ，２７５（２８）：２１０６１−６７
【非特許文献９】Ｌｅｅ，ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  ７４：３４−４１
【非特許文献１０】Ｍｅｄｈｕｒｓｔ，ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  ８４：１１６２−１１７２
【非特許文献１１】Ｔａｔｅｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｒｅｇｕｌ  Ｐｅｐｔ  ９９：８７−９２
【非特許文献１２】Ｋａｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｉ  ３０：２１８２−２１８７
【非特許文献１３】Ｋｏｊｉｍａ，Ｙ．  ａｎｄ  Ｑｕｅｒｔｅｒｍｏｕｓ，Ｔ．，２００８，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ  ２８：１６８７−１６８８
【非特許文献１４】Ｔａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｔｈａｍｏｌ  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ５１：４２３７−４２４２
【非特許文献１５】Ｄｕ，ＪＨ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．２０１４  Ｄｅｃ  １８；７（６）：９６８−７３
【非特許文献１６】Ｌｕ，Ｑ．ｅｔ  ａｌ．，２０１３，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ８（７）：ｅ６９７０３
【非特許文献１７】Ａｌｉ  ＹＦ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．２０１７  Ｆｅｂ  ２１；１１：３８７−３９２
【非特許文献１８】Ｄｉｘｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ  １８：１５７３−８０
【非特許文献１９】Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  １０：２０１３−２２
【非特許文献２０】Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｖｉｓｉｏｎ，２０：１１２２−１１３１
【発明の概要】
【００１３】
一態様において、本発明は、対象における血管性眼疾患または障害の少なくとも１つの症状または兆候を治療、予防または改善するための方法を提供する。方法は、それを必要とする対象に、ＡＰＬＮＲアンタゴニストを含む、薬学的組成物の治療的に有効な量を投与することを含む。特定の実施形態において、ＡＰＬＮＲアンタゴニストは、例えば、ＶＥＧＦアンタゴニストを含む薬学的組成物の治療的に有効な量の投与により、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニストと組み合わせて投与される。
【００１４】
特定の実施形態において、眼疾患または障害は、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、加齢性黄斑変性、網膜血管新生、網膜中心静脈閉塞、網膜静脈分枝閉塞、ポリープ状脈絡膜血管症、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、変性近視（近視ＣＮＶ）、血管新生緑内障、および未熟児網膜症からなる群から選択される。
【００１５】
別の態様において、本発明は、対象の網膜血管形成を阻害するための方法を提供する。方法は、それを必要とする対象に、ＶＥＧＦアンタゴニストと組み合わせたＡＰＬＮＲアンタゴニストを含む薬学的組成物の治療的に有効な量を投与することを含む。いくつかの実施形態において、網膜血管形成は、血管性眼疾患または障害に関連している。
【００１６】
別の態様において、本発明は、網膜血管新生（例えば、血管形成に関連する眼疾患または障害を有する対象において）を阻害するための方法を提供する。方法は、それを必要とする対象に、ＶＥＧＦアンタゴニストと組み合わせたＡＰＬＮＲアンタゴニストを含む、薬学的組成物の治療的に有効な量を投与することを含む。
【００１７】
別の態様において、本発明は、対象の脈絡膜血管新生を阻害するための方法を提供する。方法は、それを必要とする対象に、ＶＥＧＦアンタゴニストと組み合わせたＡＰＬＮＲアンタゴニストを含む、薬学的組成物の治療的に有効な量を投与することを含む。
【００１８】
別の態様において、本発明は、対象の血管の再生を改善し、異常な血管新生を低減するための方法を提供する。方法は、それを必要とする対象に、ＶＥＧＦアンタゴニストと組み合わせたＡＰＬＮＲアンタゴニストを含む薬学的組成物の治療的に有効な量を投与することを含む。
【００１９】
別の態様において、本発明は、網膜の血管再生の促進を必要とする対象において、それを行うための方法を提供する。方法は、それを必要とする対象に、治療的に有効な量のＡＰＬＮＲアンタゴニストを投与することと、対象に、治療的に有効な量の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニストを投与することとを含む。
【００２０】
別の態様において、本発明は、網膜血管の均一な再成長の促進を必要とする対象において、それを行うための方法を提供する。方法は、それを必要とする対象に、治療的に有効な量のＡＰＬＮＲアンタゴニストを投与することと、対象に、治療的に有効な量の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニストを投与することとを含む。
【００２１】
別の態様において、本発明は、網膜における血管の伸長の改善を必要とする対象において、それを行うための方法を提供する。方法は、それを必要とする対象に、治療的に有効な量のＡＰＬＮＲアンタゴニストを投与することと、対象に、治療的に有効な量の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニストを投与することとを含む。
【００２２】
別の態様において、本発明は、網膜における均一な血管の成長の促進を必要とする対象において、それを行うための方法を提供する。方法は、それを必要とする対象に、治療的に有効な量のＡＰＬＮＲアンタゴニストを投与することと、対象に、治療的に有効な量の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニストを投与することとを含む。
【００２３】
別の態様において、本発明は、網膜の血管の組織化の改善を必要とする対象において、それを行うための方法を提供する。方法は、それを必要とする対象に、治療的に有効な量のＡＰＬＮＲアンタゴニストを投与することと、対象に、治療的に有効な量の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニストを投与することとを含む。
【００２４】
上記または本明細書で論じられる方法のうちのいずれかにおいて、対象は、眼疾患または障害と診断されている個体であり得る。いくつかの事例において、眼疾患または障害は、糖尿病性網膜症、増殖型糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、加齢性黄斑変性、網膜血管新生、網膜中心静脈閉塞、網膜静脈分枝閉塞、ポリープ状脈絡膜血管症、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、変性近視（近視ＣＮＶ）、血管新生緑内障、および未熟児網膜症からなる群から選択される。いくつかの事例において、眼疾患または障害は、加齢黄斑変性である。いくつかの事例において、眼疾患または障害は、糖尿病性黄斑浮腫である。いくつかの事例において、眼疾患または障害は、未熟児網膜症である。いくつかの事例において、眼疾患または障害は、増殖型糖尿病性網膜症である。
【００２５】
本開示の方法または組成物の状況下で使用することができる例示的なＡＰＬＮＲアンタゴニストとしては、ＡＰＬＮＲの小分子化学阻害剤、またはペプチド、ペプチド模倣物、および抗体などのＡＰＬＮＲを標的とする生物学的製剤が含まれる。特定の実施形態において、ＡＰＬＮＲアンタゴニストは、ＡＰＬＮＲおよびアペリンの相互作用を遮断する。
【００２６】
特定の実施形態に従って、ＡＰＬＮＲアンタゴニストは、ＡＰＬＮＲアンタゴニストと結合し、ＡＰＬＮＲシグナル伝達を阻害する抗体または抗原結合タンパク質である。特定の実施形態において、抗ＡＰＬＮＲ抗体または抗原結合タンパク質は、配列番号２または１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）と、配列番号７または１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）の軽鎖ＣＤＲと、を含む。特定の実施形態において、抗ＡＰＬＮＲ抗体または抗原結合タンパク質は、Ｈ２ａＭ９２３２Ｎ（またはＨ４Ｈ９２３２Ｎ）およびＨ１Ｍ９２０７Ｎからなる群から選択される、抗ＡＰＬＮＲ抗体の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【００２７】
上記または本明細書で論じられる方法または組成物のうちのいずれかにおいて、ＡＰＬＮＲアンタゴニストは、抗ＡＰＬＮＲ抗体またはその抗原結合断片を含み得、抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＡＰＬＮＲに特異的に結合する。いくつかの事例において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２／７および１３／１８からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列対を含む参照抗体と、ヒトアペリン受容体（ＡＰＬＮＲ）との結合について競合し、抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＡＰＬＮＲと特異的に結合する。いくつかの事例において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２／７および１３／１８からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列対を含む参照抗体と同じＡＰＬＮＲ上のエピトープと結合し、抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＡＰＬＮＲに特異的に結合する。いくつかの事例において、抗体または抗原結合断片は、（ａ）配列番号２および１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）と、（ｂ）配列番号７および１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）のＣＤＲと、を含む。いくつかの事例において、抗体または抗原結合断片は、それぞれ、配列番号３−４−５−８−９−１０および１４−１５−１６−１９−２０−２１からなる群から選択されるＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３ドメインを含む。いくつかの事例において、抗体または抗原結合断片は、（ａ）配列番号２および１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）と、（ｂ）配列番号７および１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）と、を含む。いくつかの事例において、抗体または抗原結合断片は、配列番号２／７および１３／１８からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対の重鎖および軽鎖のＣＤＲを含む。いくつかの事例において、抗体または抗原結合断片は、配列番号２／７および１３／１８からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む。
【００２８】
上記または本明細書で論じられる方法または組成物のうちのいずれか１つの一実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２／７のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む。
【００２９】
上記または本明細書で論じられる方法または組成物のうちのいずれか１つの一実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１３／１８のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む。
【００３０】
上記または本明細書で論じられる方法または組成物のうちのいずれか１つにおいて、抗体または抗原結合断片は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４重鎖定常領域を有するヒト抗体であり得る。一実施形態において、重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１である。一実施形態において、重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ４である。
【００３１】
上記または本明細書で論じられる方法または組成物のうちのいずれか１つの様々な実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、ＡＰＬＮＲとアペリンとの相互作用を遮断する。いくつかの事例において、抗体またはその抗原結合断片は、ＡＰＬＮＲとアペリンとの相互作用を遮断し、競合結合アッセイにおいて少なくとも５０％の結合阻害を示す。他の実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、ＡＰＬＮＲとアペリンとの相互作用を遮断しないか、または部分的にのみ遮断する。
【００３２】
本開示の組成物および方法において、ＡＰＬＮＲアンタゴニストと組み合わせて使用され得るＶＥＧＦアンタゴニストは、抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、ラニビズマブ）、小分子ＶＥＧＦ阻害剤（例えば、スネチニブ）、およびＶＥＧＦ阻害融合タンパク質（「ＶＥＧＦトラップ」）を含む。本開示の治療の方法において、ＡＰＬＮＲアンタゴニストと組み合わせて使用され得るＶＥＧＦアンタゴニストの例は、ＶＥＧＦ阻害融合タンパク質である、アフリベルセプトである（例えば、米国特許第７，０８７，４１１号を参照されたい）。
【００３３】
上記または本明細書で論じられる方法または組成物のうちのいずれか１つにおいて、ＶＥＧＦアンタゴニストは、ＶＥＧＦ受容体系キメラ分子（ＶＥＧＦトラップ）を含む。いくつかの事例において、ＶＥＧＦトラップは、ＶＥＧＦＲ１の１つ以上の免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメイン、ＶＥＧＦＲ２の１つ以上のＩｇ様ドメイン、および多量体化ドメインを含む。いくつかの事例において、ＶＥＧＦトラップは、ＶＥＧＦＲ１のＩｇ様ドメイン２、ＶＥＧＦＲ２のＩｇ様ドメイン３、および多量体化ドメインを含む。いくつかの事例において、ＶＥＧＦトラップは、アフリベルセプトまたはそのバイオシミラー分子である。いくつかの事例において、ＶＥＧＦアンタゴニストは、配列番号２３のアミノ酸２７〜４５７からなる２つのポリペプチドの二量体からなる。
【００３４】
別の態様では、本開示は、治療的に有効な量のＡＰＬＮＲアンタゴニスト、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む、薬学的組成物を提供する。特定の実施形態において、薬学的組成物は、ＶＥＧＦアンタゴニストをさらに含む。
【００３５】
様々な実施形態において、本開示は、ヒトを含む対象の眼疾患または障害を治療するための薬剤の製造におけるＶＥＧＦアンタゴニストと組み合わせたＡＰＬＮＲアンタゴニストの使用、または上記または本明細書で論じられる方法のうちのいずれかの他の目的を実行するために提供する。上記または本明細書で論じられる全ての方法は、眼疾患もしくは障害、または列挙される方法の他の目的の治療のためのＡＰＬＮＲアンタゴニストおよびＶＥＧＦアンタゴニストの使用として具体化されることができる。他の実施形態は、上記または本明細書で論じられる方法において使用するためのＡＰＬＮＲアンタゴニストおよびＶＥＧＦアンタゴニストを含む。
【００３６】
別の態様において、本発明は、血管性眼疾患または障害を治療するための組成物を提供し、組成物は、治療的に有効な量のＡＰＬＮＲアンタゴニストと、治療的に有効な量の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニストと、好適な担体、賦形剤または希釈剤と、を含む。組成物の様々な実施形態において、ＡＰＬＮＲアンタゴニストまたはＶＥＧＦアンタゴニストは、上記または本明細書で論じられるとおりであり得る。
【００３７】
他の実施形態は、後述の詳細な説明の精査から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１Ａ】Ｐ２〜Ｐ５で全身的（ＩＰ）に治療されたマウスの網膜の代表的な顕微鏡写真、および計算された血管面積のグラフである。剰余な血管面積は、未治療の網膜と比較して、αアペリンＲ（抗ＡＰＬＮＲ抗体Ｈ２ａＭ９２３２Ｎ）で治療された（２５ｍｇ／ｋｇで２３％、ｐ＜０．０５）網膜において有意に小さかった。網膜内皮細胞は、ＧＳレクチンＩで染色された。画像は、２０倍（定量化のために）および４０倍で撮影された。統計分析は、スチューデントＴ検定で行われた。全身的な注入を介したアペリンＲの選択的阻害は、Ｐ５仔の発達中の網膜における正常な血管の伸長を遅延させた。２５ｍｇ／ｋｇの用量では、アペリンＲを遮断すると血管の伸長をわずかに阻害する。
【図１Ｂ】Ｐ２〜Ｐ５で全身的（ＩＰ）に治療されたマウスの網膜の代表的な顕微鏡写真、および計算された血管面積のグラフである。剰余な血管面積は、未治療の網膜と比較して、αアペリンＲ（抗ＡＰＬＮＲ抗体Ｈ２ａＭ９２３２Ｎ）で治療された（２５ｍｇ／ｋｇで２３％、ｐ＜０．０５）網膜において有意に小さかった。網膜内皮細胞は、ＧＳレクチンＩで染色された。画像は、２０倍（定量化のために）および４０倍で撮影された。統計分析は、スチューデントＴ検定で行われた。全身的な注入を介したアペリンＲの選択的阻害は、Ｐ５仔の発達中の網膜における正常な血管の伸長を遅延させた。２５ｍｇ／ｋｇの用量では、アペリンＲを遮断すると血管の伸長をわずかに阻害する。
【図２Ａ】Ｐ２〜Ｐ５で全身的（ＩＰ）に治療されたマウスの網膜の代表的な顕微鏡写真、および計算された血管面積のグラフである。剰余な血管面積は、未治療の網膜と比較して、αアペリンＲで治療された（５０ｍｇ／ｋｇで３５％、ｐ＜０．００５）網膜において有意に小さかった。網膜内皮細胞は、ＧＳレクチンＩで染色された。画像は、２０倍（定量化のために）および４０倍で撮影された。統計分析は、スチューデントＴ検定で行われた。全身的な注入を介したアペリンＲの選択的阻害は、Ｐ５仔の発達中の網膜における正常な血管の伸長を遅延させた。用量が５０ｍｇ／ｋｇの用量に増加することにより、標的化アペリンＲは網膜血管の伸長をさらに遅延する。
【図２Ｂ】Ｐ２〜Ｐ５で全身的（ＩＰ）に治療されたマウスの網膜の代表的な顕微鏡写真、および計算された血管面積のグラフである。剰余な血管面積は、未治療の網膜と比較して、αアペリンＲで治療された（５０ｍｇ／ｋｇで３５％、ｐ＜０．００５）網膜において有意に小さかった。網膜内皮細胞は、ＧＳレクチンＩで染色された。画像は、２０倍（定量化のために）および４０倍で撮影された。統計分析は、スチューデントＴ検定で行われた。全身的な注入を介したアペリンＲの選択的阻害は、Ｐ５仔の発達中の網膜における正常な血管の伸長を遅延させた。用量が５０ｍｇ／ｋｇの用量に増加することにより、標的化アペリンＲは網膜血管の伸長をさらに遅延する。
【図３Ａ】Ｐ２〜Ｐ５で全身的（ＩＰ）に治療されたマウスの網膜の代表的な顕微鏡写真、および計算された血管面積のグラフである。この盲検研究において、５０  ｍｇ／ｋｇのαアペリンＲは、Ｆｃで治療された対照と比較して、血管の成長を２９．８％（ｐ＜０．０００１）減少させた。網膜内皮細胞は、ＧＳレクチンＩで染色された。画像は、２０倍（定量化のために）および４０倍で撮影された。統計分析は、スチューデントＴ検定で行われた。全身的な注入を介したアペリンＲの選択的阻害は、Ｐ５仔の発達中の網膜における正常な血管の伸長を遅延する。
【図３Ｂ】Ｐ２〜Ｐ５で全身的（ＩＰ）に治療されたマウスの網膜の代表的な顕微鏡写真、および計算された血管面積のグラフである。この盲検研究において、５０  ｍｇ／ｋｇのαアペリンＲは、Ｆｃで治療された対照と比較して、血管の成長を２９．８％（ｐ＜０．０００１）減少させた。網膜内皮細胞は、ＧＳレクチンＩで染色された。画像は、２０倍（定量化のために）および４０倍で撮影された。統計分析は、スチューデントＴ検定で行われた。全身的な注入を介したアペリンＲの選択的阻害は、Ｐ５仔の発達中の網膜における正常な血管の伸長を遅延する。
【図４Ａ】Ｐ２〜Ｐ５で全身的（ＩＰ）に治療されたマウスの網膜の代表的な顕微鏡写真、および計算された血管面積のグラフである。剰余な血管面積は、単一試薬でのαアペリンＲ（５０ｍｇ／ｋｇで３１％、ｐ＜０．００１）またはアフリベルセプト単独（５０ｍｇ／ｋｇで４３％、ｐ＜０．００５）と比較して、組み合わせ（αアペリンＲ＋アフリベルセプト）（５０ｍｇ／ｋｇで６２％、ｐ＜０．０００１）において有意に小さかった。網膜内皮細胞は、ＧＳレクチンＩで染色された。用量および相関的な血管新生化された面積への影響を記録する。画像は、２０倍（定量化のために）および４０倍で撮影された。統計分析は、事後テューキー検定を伴う一元配置分散分析を用いて行われた。全身的および硝子体内投与（図５Ａおよび５Ｂを参照されたい）の両方において、αアペリンＲおよびアフリベルセプトの併用療法は、正常な発達中の網膜血管構造の退縮をもたらした。全身的な注入を介してアペリンＲおよびＶＥＧＦＡの両方を遮断することは、アペリンＲまたはＶＥＧＦＡ単独を遮断することと比較して、血管の伸長を妨げるのにより効果的である。このモデルにおいて、併用治療により、血管面積はαアペリンＲと比較して４６％（ｐ＜０．０００５）、アフリベルセプトと比較して３２％（ｐ＜０．００１）さらに低減された。
【図４Ｂ】Ｐ２〜Ｐ５で全身的（ＩＰ）に治療されたマウスの網膜の代表的な顕微鏡写真、および計算された血管面積のグラフである。剰余な血管面積は、単一試薬でのαアペリンＲ（５０ｍｇ／ｋｇで３１％、ｐ＜０．００１）またはアフリベルセプト単独（５０ｍｇ／ｋｇで４３％、ｐ＜０．００５）と比較して、組み合わせ（αアペリンＲ＋アフリベルセプト）（５０ｍｇ／ｋｇで６２％、ｐ＜０．０００１）において有意に小さかった。網膜内皮細胞は、ＧＳレクチンＩで染色された。用量および相関的な血管新生化された面積への影響を記録する。画像は、２０倍（定量化のために）および４０倍で撮影された。統計分析は、事後テューキー検定を伴う一元配置分散分析を用いて行われた。全身的および硝子体内投与（図５Ａおよび５Ｂを参照されたい）の両方において、αアペリンＲおよびアフリベルセプトの併用療法は、正常な発達中の網膜血管構造の退縮をもたらした。全身的な注入を介してアペリンＲおよびＶＥＧＦＡの両方を遮断することは、アペリンＲまたはＶＥＧＦＡ単独を遮断することと比較して、血管の伸長を妨げるのにより効果的である。このモデルにおいて、併用治療により、血管面積はαアペリンＲと比較して４６％（ｐ＜０．０００５）、アフリベルセプトと比較して３２％（ｐ＜０．００１）さらに低減された。
【図５Ａ】Ｐ４〜Ｐ６で硝子体内（ＩＶＴ）の注入を介して治療されたマウスの網膜の代表的な顕微鏡写真、および計算された血管面積のグラフである。剰余な血管面積は、単一試薬でのαアペリンＲ（５μｇで４３％、ｐ＜０．０００１）またはアフリベルセプト単独（５μｇで６５％、ｐ＜０．０００１）と比較して、組み合わせ（αアペリンＲ＋アフリベルセプト）（５μｇで６８％、ｐ＜０．０００１）において有意に小さかった。網膜内皮細胞は、ＧＳレクチンＩで染色された。用量および相関的な血管新生化された面積への影響を記録する。画像は、２０倍（定量化のために）および４０倍で撮影された。統計分析は、事後テューキー検定を伴う一元配置分散分析を用いて行われた。全身的および硝子体内投与の両方において、αアペリンＲおよびアフリベルセプトの併用療法は、正常な発達中の網膜血管構造の退縮をもたらす。硝子体内の注入を介してアペリンＲおよびＶＥＧＦＡの両方を遮断することは、アペリンＲまたはＶＥＧＦＡのみを遮断することと比較して、血管の伸長を妨げるのにさらに効果的である。ＩＶＴにおいて、併用治療により、血管面積はαアペリンＲと比較して５０％（ｐ＜０．０００５）、アフリベルセプトと比較して３４％（ｐ＜０．００１）さらに低減された。
【図５Ｂ】Ｐ４〜Ｐ６で硝子体内（ＩＶＴ）の注入を介して治療されたマウスの網膜の代表的な顕微鏡写真、および計算された血管面積のグラフである。剰余な血管面積は、単一試薬でのαアペリンＲ（５μｇで４３％、ｐ＜０．０００１）またはアフリベルセプト単独（５μｇで６５％、ｐ＜０．０００１）と比較して、組み合わせ（αアペリンＲ＋アフリベルセプト）（５μｇで６８％、ｐ＜０．０００１）において有意に小さかった。網膜内皮細胞は、ＧＳレクチンＩで染色された。用量および相関的な血管新生化された面積への影響を記録する。画像は、２０倍（定量化のために）および４０倍で撮影された。統計分析は、事後テューキー検定を伴う一元配置分散分析を用いて行われた。全身的および硝子体内投与の両方において、αアペリンＲおよびアフリベルセプトの併用療法は、正常な発達中の網膜血管構造の退縮をもたらす。硝子体内の注入を介してアペリンＲおよびＶＥＧＦＡの両方を遮断することは、アペリンＲまたはＶＥＧＦＡのみを遮断することと比較して、血管の伸長を妨げるのにさらに効果的である。ＩＶＴにおいて、併用治療により、血管面積はαアペリンＲと比較して５０％（ｐ＜０．０００５）、アフリベルセプトと比較して３４％（ｐ＜０．００１）さらに低減された。
【図６Ａ】Ｐ１２〜Ｐ１６で全身的（ＩＰ）に治療されたＯＩＲマウスの網膜の代表的な顕微鏡写真、および計算された無血管面積のグラフである。剰余な無血管面積は、Ｆｃ（対照）の網膜と比較して、αアペリンＲ（２９％、ｐ＜０．０５）およびアフリベルセプト（２７．５％、ｐ＜０．０１）の網膜において有意に小さかった。αアペリンＲ（６７％、ｐ＜０．０００１）およびアフリベルセプト（９４％、ｐ＜０．０００５）で治療された試料において、Ｆｃと比較して血管新生房が有意に低減していることに注目されたい。網膜内皮細胞は、ＧＳレクチンＩで染色された。画像は、２０倍（無血管領域の定量化）および４０倍（異常血管新生領域の定量化）で撮影された。統計分析は、スチューデントＴ検定で行われた。全身的な注入を介したアペリンＲおよびＶＥＧＦＡの阻害の両方は、網膜血管の再成を促進し、異常な血管新生が減少する。
【図６Ｂ】Ｐ１２〜Ｐ１６で全身的（ＩＰ）に治療されたＯＩＲマウスの網膜の代表的な顕微鏡写真、および計算された無血管面積のグラフである。剰余な無血管面積は、Ｆｃ（対照）の網膜と比較して、αアペリンＲ（２９％、ｐ＜０．０５）およびアフリベルセプト（２７．５％、ｐ＜０．０１）の網膜において有意に小さかった。αアペリンＲ（６７％、ｐ＜０．０００１）およびアフリベルセプト（９４％、ｐ＜０．０００５）で治療された試料において、Ｆｃと比較して血管新生房が有意に低減していることに注目されたい。網膜内皮細胞は、ＧＳレクチンＩで染色された。画像は、２０倍（無血管領域の定量化）および４０倍（異常血管新生領域の定量化）で撮影された。統計分析は、スチューデントＴ検定で行われた。全身的な注入を介したアペリンＲおよびＶＥＧＦＡの阻害の両方は、網膜血管の再成を促進し、異常な血管新生が減少する。
【図７Ａ】Ｐ１２〜Ｐ１６で硝子体内に治療された酸素誘発性網膜症（ＯＩＲ）マウスの網膜の代表的な顕微鏡写真、および計算された無血管面積のグラフである。剰余な無血管面積は、Ｆｃ対照と比較して、αアペリンＲにおいて低減され（２７．５％、ｐ＜０．０５）、アフリベルセプトにおいて増加された（３２％、ｐ＜０．０００１）。αアペリンＲにおける血管新生房の有意な低減（６０％、ｐ＜０．０００１）、およびアフリベルセプト試料の房の完全な消失に注目されたい。網膜内皮細胞は、ＧＳレクチンＩで染色された。用量および相関的な血管新生化された面積への影響を記録する。画像は、２０倍（無血管領域の定量化）および４０倍（異常血管新生領域の定量化）で撮影された。統計分析は、事後テューキー検定を伴う一元配置分散分析を用いて行われた。全身的（図６Ａおよび６Ｂを参照されたい）および硝子体内投与の両方において、アペリンＲの選択的阻害は、網膜血管の再生を促進し、ＯＩＲマウスの血管新生を減少させる。硝子体内の注入を介したアペリンＲの阻害は、血管の再生を改善し、異常な血管新生を低減させ、一方でＶＥＧＦＡ阻害は、血管の再生を抑制し、血管新生を完全に停止する。
【図７Ｂ】Ｐ１２〜Ｐ１６で硝子体内に治療された酸素誘発性網膜症（ＯＩＲ）マウスの網膜の代表的な顕微鏡写真、および計算された無血管面積のグラフである。剰余な無血管面積は、Ｆｃ対照と比較して、αアペリンＲにおいて低減され（２７．５％、ｐ＜０．０５）、アフリベルセプトにおいて増加された（３２％、ｐ＜０．０００１）。αアペリンＲにおける血管新生房の有意な低減（６０％、ｐ＜０．０００１）、およびアフリベルセプト試料の房の完全な消失に注目されたい。網膜内皮細胞は、ＧＳレクチンＩで染色された。用量および相関的な血管新生化された面積への影響を記録する。画像は、２０倍（無血管領域の定量化）および４０倍（異常血管新生領域の定量化）で撮影された。統計分析は、事後テューキー検定を伴う一元配置分散分析を用いて行われた。全身的（図６Ａおよび６Ｂを参照されたい）および硝子体内投与の両方において、アペリンＲの選択的阻害は、網膜血管の再生を促進し、ＯＩＲマウスの血管新生を減少させる。硝子体内の注入を介したアペリンＲの阻害は、血管の再生を改善し、異常な血管新生を低減させ、一方でＶＥＧＦＡ阻害は、血管の再生を抑制し、血管新生を完全に停止する。
【図８Ａ】Ｐ１２〜Ｐ１６で全身的に治療されたＯＩＲマウスの網膜の代表的な顕微鏡写真（２０倍）、および計算された無血管面積のグラフである。併用治療での再成率は各薬剤単独と同様であり、血管の再生は、ｈＦｃ治療された対照の網膜と比較して改善され、治療群間で無血管領域において有意な変化（ｐ＜０．０００５）が存在した。
【図８Ｂ】Ｐ１２〜Ｐ１６で全身的に治療されたＯＩＲマウスの網膜の代表的な顕微鏡写真（２０倍）、および計算された無血管面積のグラフである。併用治療での再成率は各薬剤単独と同様であり、血管の再生は、ｈＦｃ治療された対照の網膜と比較して改善され、治療群間で無血管領域において有意な変化（ｐ＜０．０００５）が存在した。
【図９Ａ】Ｐ１２〜Ｐ１６で全身的に治療されたＯＩＲマウスの網膜の代表的な顕微鏡写真（４０倍）、および計算された異常な血管面積のグラフである。併用治療は、アフリベルセプトと比較して剪定された血管がわずかであり、抗ＡＰＬＮＲおよびＦｃ対照と比較して異常な血管新生がわずかであることを示す（図９Ａ）。図９Ｂは、治療群間で異常な血管面積に有意な変化が存在したことを示す（ｐ＜０．０００５）。異常な血管面積は、Ｆｃ対照と比較して、抗ＡＰＬＮＲを用いた場合（＊＊＊、ｐ＜０．０００５）と、アフリベルセプトを用いた場合（＊＊＊  ｐ＜０．００５）と、組み合わせを用いた場合（＊＊＊、ｐ  ＜０．０００５）とにおいて、有意に低減され、かつ異常な血管面積は、抗ＡＰＬＮＲ治療群と比較して、併用治療群においてさらに有意に低減された（＊、ｐ＜０．０５）
【図９Ｂ】Ｐ１２〜Ｐ１６で全身的に治療されたＯＩＲマウスの網膜の代表的な顕微鏡写真（４０倍）、および計算された異常な血管面積のグラフである。併用治療は、アフリベルセプトと比較して剪定された血管がわずかであり、抗ＡＰＬＮＲおよびＦｃ対照と比較して異常な血管新生がわずかであることを示す（図９Ａ）。図９Ｂは、治療群間で異常な血管面積に有意な変化が存在したことを示す（ｐ＜０．０００５）。異常な血管面積は、Ｆｃ対照と比較して、抗ＡＰＬＮＲを用いた場合（＊＊＊、ｐ＜０．０００５）と、アフリベルセプトを用いた場合（＊＊＊  ｐ＜０．００５）と、組み合わせを用いた場合（＊＊＊、ｐ  ＜０．０００５）とにおいて、有意に低減され、かつ異常な血管面積は、抗ＡＰＬＮＲ治療群と比較して、併用治療群においてさらに有意に低減された（＊、ｐ＜０．０５）
【図１０】実施例７において血管面積および血管長を計算するために使用された、画像処理および測定技術の代表である。「起源の画像」は、図９Ａにおいて示された４０倍の顕微鏡写真である。
【図１１Ａ】Ｐ１２〜Ｐ１６で全身的に治療されたＯＩＲマウスの網膜の顕微鏡写真（４０倍）および計算された血管面積のグラフから、血管の組織化および均一性を示す代表的な処理された画像である。図１１Ａに示すように、抗ＡＰＬＮＲ抗体とアフリベルセプトとの組み合わせは、抗ＡＰＬＮＲ単独と比較して、より組織化され均一な網膜血管を生成し、アフリベルセプト単独と比較して、散在がより少ない（剪定された血管がわずかである）。図１１Ｂは、治療群間で血管面積において有意な変化が存在した（ｐ＜０．０００５）ことを示す。血管面積は、Ｆｃ対照と比較して、抗ＡＰＬＮＲを用いた場合で有意に増加され（＊＊＊、ｐ＜０．０００５）、アフリベルセプト（＊＊＊、ｐ＜０．００５）、および併用治療（＊、ｐ  ＜０．０５）を用いた場合で低減された。血管面積は、抗ＡＰＬＮＲと比較して、アフリベルセプトを用いた場合（＃＃＃＃、ｐ＜０．０００５）、および組み合わせを用いた場合（＃＃＃＃、ｐ＜０．０００５）で有意に低減された。対照的に、血管面積は、アフリベルセプトと比較して、併用治療で有意に増加した（＆＆＆、ｐ＜０．００５）。
【図１１Ｂ】Ｐ１２〜Ｐ１６で全身的に治療されたＯＩＲマウスの網膜の顕微鏡写真（４０倍）および計算された血管面積のグラフから、血管の組織化および均一性を示す代表的な処理された画像である。図１１Ａに示すように、抗ＡＰＬＮＲ抗体とアフリベルセプトとの組み合わせは、抗ＡＰＬＮＲ単独と比較して、より組織化され均一な網膜血管を生成し、アフリベルセプト単独と比較して、散在がより少ない（剪定された血管がわずかである）。図１１Ｂは、治療群間で血管面積において有意な変化が存在した（ｐ＜０．０００５）ことを示す。血管面積は、Ｆｃ対照と比較して、抗ＡＰＬＮＲを用いた場合で有意に増加され（＊＊＊、ｐ＜０．０００５）、アフリベルセプト（＊＊＊、ｐ＜０．００５）、および併用治療（＊、ｐ  ＜０．０５）を用いた場合で低減された。血管面積は、抗ＡＰＬＮＲと比較して、アフリベルセプトを用いた場合（＃＃＃＃、ｐ＜０．０００５）、および組み合わせを用いた場合（＃＃＃＃、ｐ＜０．０００５）で有意に低減された。対照的に、血管面積は、アフリベルセプトと比較して、併用治療で有意に増加した（＆＆＆、ｐ＜０．００５）。
【図１２Ａ】Ｐ１２〜Ｐ１６で全身的に治療されたＯＩＲマウスの網膜の顕微鏡写真（４０倍）からの血管の密度、および計算された血管長を示す代表的な処理された画像である。図１２Ａにおいて示されるように、抗ＡＰＬＮＲ抗体とアフリベルセプトとの組み合わせは、抗ＡＰＬＮＲ（より高い密度）またはアフリベルセプト（より低い密度）単独と比較して、中間密度の網膜血管を生成した。図１２Ｂは、治療群間の血管長において有意な変化が存在したことを示す（ｐ＜０．０００５）。血管長は、抗ＡＰＬＮＲと比較して、アフリベルセプトを用いた場合（＃＃＃＃、ｐ＜０．０００５）、および組み合わせを用いた場合（＃＃＃＃、ｐ＜０．０００５）で有意に低減された。対照的に、血管長は、アフリベルセプトと比較して、併用治療で有意に増加した（＆＆＆、ｐ＜０．００５）。
【図１２Ｂ】Ｐ１２〜Ｐ１６で全身的に治療されたＯＩＲマウスの網膜の顕微鏡写真（４０倍）からの血管の密度、および計算された血管長を示す代表的な処理された画像である。図１２Ａにおいて示されるように、抗ＡＰＬＮＲ抗体とアフリベルセプトとの組み合わせは、抗ＡＰＬＮＲ（より高い密度）またはアフリベルセプト（より低い密度）単独と比較して、中間密度の網膜血管を生成した。図１２Ｂは、治療群間の血管長において有意な変化が存在したことを示す（ｐ＜０．０００５）。血管長は、抗ＡＰＬＮＲと比較して、アフリベルセプトを用いた場合（＃＃＃＃、ｐ＜０．０００５）、および組み合わせを用いた場合（＃＃＃＃、ｐ＜０．０００５）で有意に低減された。対照的に、血管長は、アフリベルセプトと比較して、併用治療で有意に増加した（＆＆＆、ｐ＜０．００５）。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本開示が説明される前に、説明される特定の方法および実験条件が変動し得るため、本開示が、そのような方法および条件に制限されないことが理解されるべきである。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、本発明の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、限定することを企図するものではないことも理解されるべきである。
【００４０】
別段定義されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は全て、本開示の属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で使用される場合、用語「約」は、特定の列挙された数値に関して使用されるとき、その値が列挙された値から１％以下だけ変動し得ることを意味する。例えば、本発明で使用する場合、表現「約１００」は、９９および１０１、ならびにその間の全値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４など）を含む。
【００４１】
本明細書に説明されるものと類似のまたは等価の任意の方法および材料を本開示の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料をこれから説明する。本明細書で言及される特許、出願、および非特許刊行物は全て、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００４２】
本発明および本開示は、部分的には、ＡＰＬＮＲアンタゴニストとＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、抗ＡＰＬＮＲ抗体とＶＥＧＦトラップ）との組み合わせという予想外な発見は、ＡＰＬＮＲアンタゴニストまたはＶＥＧＦアンタゴニストのいずれかの単独で観察されるよりも、対照の網膜においてより組織化され、かつ整然とした中密度の血管再生を生成することができる。
【００４３】
定義
本明細書で使用される「アペリン受容体」、「ＡＰＬＮＲ」、「アペリンＲ」、「ＡＰＪ受容体」などの表現は、ＭＥＥＧＧＤＦＤＮＹＹＧＡＤＮＱＳＥＣＥＹＴＤＷＫＳＳＧＡＬＩＰＡＩＹＭＬＶＦＬＬＧＴＴＧＮＧＬＶＬＷＴＶＦＲＳＳＲＥＫＲＲＳＡＤＩＦＩＡＳＬＡＶＡＤＬＴＦＶＶＴＬＰＬＷＡＴＹＴＹＲＤＹＤＷＰＦＧＴＦＦＣＫＬＳＳＹＬＩＦＶＮＭＹＡＳＶＦＣＬＴＧＬＳＦＤＲＹＬＡＩＶＲＰＶＡＮＡＲＬＲＬＲＶＳＧＡＶＡＴＡＶＬＷＶＬＡＡＬＬＡＭＰＶＭＶＬＲＴＴＧＤＬＥＮＴＴＫＶＱＣＹＭＤＹＳＭＶＡＴＶＳＳＥＷＡＷＥＶＧＬＧＶＳＳＴＴＶＧＦＶＶＰＦＴＩＭＬＴＣＹＦＦＩＡＱＴＩＡＧＨＦＲＫＥＲＩＥＧＬＲＫＲＲＲＬＬＳＩＩＶＶＬＶＶＴＦＡＬＣＷＭＰＹＨＬＶＫＴＬＹＭＬＧＳＬＬＨＷＰＣＤＦＤＬＦＬＭＮＩＦＰＹＣＴＣＩＳＹＶＮＳＣＬＮＰＦＬＹＡＦＦＤＰＲＦＲＱＡＣＴＳＭＬＣＣＧＱＳＲＣＡＧＴＳＨＳＳＳＧＥＫＳＡＳＹＳＳＧＨＳＱＧＰＧＰＮＭＧＫＧＧＥＱＭＨＥＫＳＩＰＹＳＱＥＴＬＶＶＤ（配列番号２２）として表されるアミノ酸配列を有するヒトＡＰＬＮＲタンパク質、または配列番号２２と実質的に類似したアミノ酸配列を指す。本明細書におけるタンパク質、ポリペプチド、およびタンパク質断片への全ての言及は、非ヒト種（例えば、「マウスＡＰＬＮＲ」、「サルＡＰＬＮＲ」など）由来であると明確に特定されない限り、それぞれのタンパク質、ポリペプチド、またはタンパク質断片のヒト型を指すことを意図している。
【００４４】
本明細書で使用する「ＡＰＬＮＲに結合する抗体または抗原結合断片」または「抗ＡＰＬＮＲ抗体」は、ＡＰＬＮＲタンパク質の断片に結合する免疫グロブリン分子、抗体およびその抗原結合断片を含む。ＡＰＬＮＲ分子は、天然ＡＰＬＮＲタンパク質、ならびに例えば、単量体および二量体ＡＰＬＮＲ構築物などの組換えＡＰＬＮＲタンパク質バリアントを含む。実施形態において、ＡＰＬＮＲまたはその抗原結合断片と結合する抗体は、ＡＰＬＮＲアンタゴニストである。
【００４５】
本明細書で使用される「アンタゴニスト」という用語は、部分的に、アゴニスト（例えば、内因性リガンド）と同じ部位または同じ部位の近くで受容体と結合する部分を指し、これは通常、受容体の活性形によって開始されるが、細胞内応答を活性化せず、それにより、アゴニストまたは部分的アゴニストによる細胞内応答を阻害または中和する。アンタゴニストという用語は、部分的に、受容体アゴニストと結合し、それにより、その同種受容体との相互作用からアゴニストを隔離する部分も指し得る。アゴニストと結合するアンタゴニストの例は、ＶＥＧＦトラップなどのリガンドトラップである。いくつかの事例において、アンタゴニストは、アゴニストまたは部分的アゴニストの非存在下で、基準の細胞内応答を減少しない。アンタゴニストは、必ずしも競合的結合阻害剤として作用する必要は無いが、アゴニストを隔離するか、間接的に下流効果を調節することで機能する。
【００４６】
本明細書で使用されるＡＰＬＮＲアンタゴニストという用語は、アゴニスト（例えば、アペリン）と同じ部位または同じ部位の近くでＡＰＬＮＲ受容体と結合する部分を指し得、これは通常、受容体の活性形によって開始されるが、細胞内応答を活性化せず、それにより、ＡＰＬＮＲの細胞内応答を阻害または中和する。実施形態において、ＡＰＬＮＲアンタゴニストは、ＡＰＬＮＲと結合する抗体またはその抗原結合断片である。ＡＰＬＮＲアンタゴニストの例は、２０１５年５月２８日に公開された国際特許公開第ＷＯ２０１５０７７４９１号に見出すことができ、その全体が参照により本明細書に詳細に組み込まれる。他のＡＰＬＮＲアンタゴニストは、小分子およびペプチドなどの他の生物学的存在を含むことができる。
【００４７】
「免疫グロブリン」（Ｉｇ）という用語は、１対の軽（Ｌ）鎖と１対の重（Ｈ）鎖との２対のポリペプチド鎖からなる構造的に関連する糖タンパク質のクラスを指し、４つ全てがジスルフィド結合によって相互接続され得る。免疫グロブリンの構造は十分に特徴付けられている。例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ  ｅｄ．Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））の実例を参照されたい。
【００４８】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、特定の抗原（例えば、ＡＰＬＮＲ）と特異的に結合するか、またはこれと相互作用する、少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む任意の抗原結合分子または分子複合体を意味する。「抗体」という用語は、本明細書に記載されるとおり、ジスルフィド結合によって相互接続された２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖の４つのポリペプチド鎖を含む免疫グロブリン分子と、その多量体（例えば、ＩｇＭ）と、１つ以上の重鎖の断片または１つ以上の軽鎖の断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２またはｓｃＦｖ断片）を含む免疫グロブリン分子と、を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲまたはＶＨと略される）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲまたはＶＬと略される）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ１）を含む。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される、より保存された領域が点在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変領域へとさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順でアミノ末端からカルボキシ末端へと配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなる。本開示の異なる実施形態において、抗ＡＰＬＮＲ抗体（またはその抗原結合部分）のＦＲは、ヒト生殖系列配列と同一であり得、または天然にもしくは人工的に修飾され得る。アミノ酸コンセンサス配列は、２つ以上のＣＤＲの並列分析に基づいて定義され得る。
【００４９】
本明細書で使用される「抗体」という用語はまた、完全抗体分子の抗原結合断片を含む。本明細書で使用される抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合断片」という用語、およびこれらに類するものは、任意の天然に生じる、酵素処理で入手可能な、合成の、または遺伝子操作された、抗原を特異的に結合して複合体を形成するポリペプチドもしくは糖タンパク質を含む。抗体の抗体結合断片は、例えば、抗体可変ドメインおよび場合により定常ドメインをコードするＤＮＡの操作および発現に関連するタンパク質消化技術または組換え遺伝子操作技術などの任意の適切な標準的技術を用いて、完全抗体分子から誘導され得る。かかるＤＮＡは既知であり、および／または例えば市販の供給源、ＤＮＡライブラリー（例えばファージ−抗体ライブラリーを含む）から容易に入手可能であるか、または合成することができる。ＤＮＡは、例えば、１つ以上の可変ドメインおよび／もしくは定常ドメインを好適な配置へと配置するか、またはコドンを導入し、システイン残基を創造し、アミノ酸を修飾、付加、もしくは欠失などするために、化学的に、または分子生物学技術を使用することによって配列決定および操作され得る。かかる技術は、完全な抗体分子に由来する抗原結合断片を含む任意の抗体融合分子を合成するためにも使用され得る。
【００５０】
抗体結合断片の非限定例は、（ｉ）Ｆａｂ断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）Ｆｄ断片、（ｉｖ）Ｆｖ断片、（ｖ）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、（ｖｉ）ｄＡｂ断片、および（ｖｉｉ）抗体の超可変領域（例えば、ＣＤＲ３ペプチドなどの単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））を模倣するアミノ酸残基、または拘束ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４ペプチドからなる最小認識単位を含む。ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ（例えば、一価ナノボディ、二価ナノボディなど）、小型モジュール型免疫医薬品（ＳＭＩＰ）、およびサメ可変ＩｇＮＡＲドメインなどの他の操作された分子も、本明細書で使用する「抗原結合断片」という表現に包含される。
【００５１】
抗体の抗原結合断片は、典型的には、少なくとも１つの可変ドメインを含むであろう。可変ドメインは、任意のサイズまたはアミノ酸組成物であり得、概して、１つ以上のフレームワーク配列に隣接しているかまたは１つ以上のフレームワーク配列とインフレームである少なくとも１つのＣＤＲを含む。ＶＬドメインと結合したＶＨドメインを有する抗体結合断片において、ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、任意の好適な配置で互いに対して配置され得る。例えば、可変領域は二量体であり、ＶＨ−ＶＨ、ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＬ二量体を含み得る。あるいは、抗体の抗原結合断片は、単量体のＶＨドメインまたはＶＬドメインを含み得る。
【００５２】
特定の実施形態では、抗体の抗原結合断片は、少なくとも１つの定常ドメインに共有結合された少なくとも１つの可変ドメインを含み得る。本開示の抗体の抗原結合断片に見出すことができる可変および定常ドメインの非限定的で例示的な構成は、（ｉ）ＶＨ−ＣＨ１、（ｉｉ）ＶＨ−ＣＨ２、（ｉｉｉ）ＶＨ−ＣＨ３、（ｉｖ）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２、（ｖ）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３、（ｖｉ）ＶＨ−ＣＨ２−ＣＨ３、（ｖｉｉ）ＶＨ−ＣＬ、（ｖｉｉｉ）ＶＬ−ＣＨ１、（ｉｘ）ＶＬ−ＣＨ２、（ｘ）ＶＬ−ＣＨ３、（ｘｉ）ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２、（ｘｉｉ）ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３、（ｘｉｉｉ）ＶＬ−ＣＨ２−ＣＨ３、および（ｘｉｖ）ＶＬ−ＣＬを含む。先に列挙した例示的な配置のうちのいずれかを含む、可変ドメインおよび定常ドメインの任意の配置では、可変ドメインおよび定常ドメインは、互いに直接連結され得るか、または完全ヒンジ領域もしくは部分的ヒンジ領域もしくはリンカー領域によって連結され得るかのいずれかであり得る。ヒンジ領域は、単一のポリペプチド分子において隣接する可変ドメインおよび／または定常ドメイン間の可撓性または半可撓性の結合をもたらす少なくとも２つの（例えば、５、１０、１５、２０、４０、６０またはそれより多数の）アミノ酸からなり得る。そのうえ、本開示の抗体の抗原結合断片は、互いとおよび／または１つ以上の単量体ＶＨドメインもしくはＶＬドメインと非共有結合性会合している（例えば、ジスルフィド結合（複数可）によって）、先に列挙した可変ドメイン配置および定常ドメイン配置のいずれかのホモ二量体またはヘテロ二量体（または他の多量体）を含み得る。
【００５３】
完全抗体分子と同様に、抗体結合断片は、単一特異性または多重特異性（例えば、二重特異性）であり得る。抗体の多重特異性抗原結合断片は、典型的には、少なくとも２つの異なる可変ドメインを含むことになっており、各可変ドメインは、別個の抗原へまたは同じ抗原上の異なるエピトープへ特異的に結合することができる。本明細書に開示される例示的な二重特異性抗体フォーマットを含む任意の多重特異性抗体フォーマットは、当該技術分野で利用可能な通例の技術を使用して、本開示の抗体の抗原結合断片との関連で使用に適合し得る。
【００５４】
「抗体融合タンパク質」という語句は、本明細書に記載の抗体または抗原結合断片を含むように操作されている本開示の抗体に由来する組換えポリペプチドおよびタンパク質を含む。ペプチド成分は、ペプチドリンカーの有無にかかわらず、抗体の軽鎖または重鎖のＮ末端またはＣ末端のいずれかで抗ＡＰＬＮＲ抗体または抗原結合断片と融合され得る。本明細書で使用される「〜と融合される」という語句は、２つ以上の配列を組み合わせることにより作製されるキメラ遺伝子の発現により形成されるポリペプチドを意味し（ただし、これに限定されない）、通常、２つの遺伝子が１つの連続したポリペプチドをコードするように、２つの遺伝子とフレーム内で１つの遺伝子を発現ベクターにクローニングする。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および制限エンドヌクレアーゼのクローニングなどの組換えクローニング技術は、当技術分野で周知である。組換え技術によって作製されることに追加して、ポリペプチドの一部は、化学反応、またはカスタムポリペプチドを作製するための当技術分野で知られている他の手段によって互いに「〜と融合される」ことができる。
【００５５】
いくつかの実施形態において、抗体融合タンパク質の成分またはアミノ酸は、リンカー（または「スペーサー」）ペプチドによって分離されている。かかるペプチドリンカーは、当該技術分野で周知であり（例えば、ポリグリシンまたはＧｌｙ−Ｓｅｒリンカー）、典型的には、抗体融合タンパク質の成分の一方または両方の適切な折りたたみを可能にする。リンカーは、融合タンパク質の成分の柔軟な接合領域を提供し、分子の２つの末端の独立した移動を可能にし、２つの部分のそれぞれの適切な機能を保持するうえで重要な役割を果たし得る。したがって、接合領域は、２つの部分を一緒に組合せるリンカーとして機能する場合があり、スペーサーとして、２つの部分のそれぞれが独自の生物学的構造を形成し、他の部分に干渉しないことを可能にする。さらに、接合部領域は、対象の免疫系によって異物として認識されないであろう、換言すれば免疫原性と考慮されないであろうエピトープを創造しなければならない。リンカーの選択は、融合タンパク質の結合活性、延いては生物活性上で影響を有し得る。（Ｈｕｓｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ，１９８８，ＰＮＡＳ，８５：１６：５８７９−８３、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ＆  Ｂａｔｅｓ，１９９８，ＰＮＡＳ  ９５（１１）：５９２９−３４、およびＡｒａｉ，ｅｔ  ａｌ．２００１，ＰＥＤＳ，１４（８）：５２９−３２、Ｃｈｅｎ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ６５：１３５７−１３６９を参照されたい）。一実施形態において、アペリンペプチドは、１つ以上のペプチドリンカーを介して、抗体またはその抗原結合断片の軽鎖または重鎖のＣ末端またはＮ末端に接続される。
【００５６】
本開示の抗体は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）または抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）を介して機能し得る。「補体依存性細胞傷害」（ＣＤＣ）は、補体の存在下における本開示の抗体による抗原発現細胞の溶解を指す。「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」（ＡＤＣＣ）は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）が標的細胞上の結合抗体を認識し、それによって標的細胞の溶解をもたらす、細胞媒介性反応を指す。ＣＤＣおよびＡＤＣＣは、当技術分野において周知であり利用可能なアッセイを用いて測定することができる。（例えば、米国特許第５，５００，３６２号および第５，８２１，３３７号、ならびにＣｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９８  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９５：６５２−６５６を参照されたい）。抗体の定常領域は、補体を固定して細胞依存性細胞傷害性を媒介する抗体の能力において重要である。したがって、抗体のアイソタイプは、その抗体が細胞傷害性を媒介することが望ましいかに基づいて選択され得る。
【００５７】
別の態様において、抗体の所望の薬物動態特性に影響を及ぼすことなく、正常なＦｃエフェクター機能の全て、一部、または全く活性化しないように、抗体はＦｃドメインで操作され得る。したがって、改変されたＦｃ受容体結合化を有する操作されたＦｃドメインを伴う抗体は、副作用の減少を有し得る。したがって、一実施形態において、タンパク質は、キメラまたはそうでなければ修飾されたＦｃドメインを含む。キメラＦｃドメインの例については、２０１４年８月７日に公開された、国際公開第ＷＯ２０１４／１２１０８７  Ａ１号を参照されたい。
【００５８】
本明細書で使用される「ＥＣ５０」または「ＥＣ５０」という用語は、半分の最大有効濃度を指し、例えば、特定された暴露時間後の基準と最大との間の細胞応答のような、応答を誘発するリガンドの濃度を含む。ＥＣ５０は本質的に、その最大効果の５０％が観察されるリガンドの濃度を表す。したがって、細胞シグナル伝達に関して、増加された受容体活性は、ＥＣ５０値の低減、すなわち半分の最大有効濃度値で観察される（より大きな応答を生成するために必要なリガンドがより少ない）。
【００５９】
本明細書で使用される「ＩＣ５０」または「ＩＣ５０」という用語は、細胞応答の半分の最大阻害濃度を指す。換言すると、生物学的または生化学的受容体機能の阻害における特定の一部（例えば、タンパク質、化合物、または分子）の有効性の尺度であり、アッセイは、一定の生物学的プロセスを阻害するのに必要なかかる一部の量を定量化する。したがって、細胞シグナル伝達に関して、より大きな阻害活性は、ＩＣ５０値が低減されると観察される。
【００６０】
血管性眼疾患または障害を治療または改善する方法
本開示は、対象における血管性眼疾患または障害の少なくとも１つの症状または兆候を治療、予防または改善するための方法を含む。本開示のこの態様による方法は、それを必要とする対象に、ＡＰＬＮＲアンタゴニストを含む、薬学的組成物の治療的に有効な量を投与することを含む。いくつかの実施形態において、ＡＰＬＮＲアンタゴニストは皮下、静脈内、または硝子体内に投与される。実施形態において、ＡＰＬＮＲアンタゴニストは、ＶＥＧＦアンタゴニストと組み合わせて投与される。いくつかの実施形態において、ＡＰＬＮＲアンタゴニストは、ＶＥＧＦアンタゴニストと組み合わせて硝子体内投与される。いくつかの実施形態において、ＡＰＬＮＲアンタゴニストは、ＶＥＧＦアンタゴニストと単一組み合わせの投与製剤として投与される。いくつかの実施形態において、ＡＰＬＮＲアンタゴニストは、ＶＥＧＦアンタゴニストと組み合わせて投与され、ＡＰＬＮＲアンタゴニストは、静脈内に投与され、ＶＥＧＦアンタゴニストは、硝子体内に投与される。ＶＥＧＦアンタゴニストは、ＡＰＬＮＲアンタゴニストの前、後または同時に投与され得る。
【００６１】
本発明は、部分的に、ＶＥＧＦおよびアペリン／ＡＰＬＮＲ経路の両方に対して指向される拮抗作用の組み合わせが、眼の不要な病理学的血管新生化に有益な影響を及ぼすことができるという出願人の発見に基づく。特に、出願人は、かかる組み合わせを使用して、増殖型糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、および加齢黄斑変性を含む糖尿病性網膜症などの状態を治療または予防できることを発見している。ＡＰＬＮＲのアンタゴニストの追加は、ＶＥＧＦ経路の拮抗作用が飽和している場合に、ＶＥＧＦ拮抗作用の抗血管形成効果を改善できる。
【００６２】
本明細書で使用される「治療」、「治療する」などの用語は、一時的または永続的のどちらかで症状の原因を排除する、または血管新生性の眼疾患または障害の症状の出現を予防または遅延させる、症状を軽減することを意味する。特定の実施形態において、本方法は、網膜血管形成、血管新生、血管漏出、中心窩の中心から５００μｍ以内の網膜の肥厚、隣接する網膜の肥厚を伴う中心窩の中心から５００μｍ以内の硬く黄色い滲出物、および網膜の肥厚の少なくとも１つの円板面積、中心窩の中心から１つ円板の直径内である、霧視、飛蚊症、コントラストの喪失、二重視、および最終的な視覚の喪失のうちのいずれかの一部を含むがこれらに限定されない、少なくとも１つの症状または適応症の治療または改善に有用である。ＡＭＤまたはＤＭＥなどの血管性眼疾患を治療するための方法の状況下では、用語は、治療の開始から、対照が早期治療糖尿病性網膜症研究（ＥＤＴＲＳ）の視力表で１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）の文字を獲得することを示す。特定の実施形態において、用語は、治療の開始から、１５文字以上の視力喪失が対象において予防されることを意味する。
【００６３】
本明細書で使用される「予防」、「予防する」などの用語は、血管性眼疾患の症状、徴候または合併症の発展を予防することを意味する。ＡＭＤまたはＤＭＥなどの血管性眼疾患を治療するための方法の状況下において、用語は、治療の開始から、中程度または重度の視力喪失が対象において予防されることを意味する。
【００６４】
本明細書で使用する「血管性眼疾患または障害」とは、眼内の血管に影響を及ぼす眼疾患または障害を指す。疾患は、異常な血管形成（新しい血管の形成）または血管の閉塞もしくは妨害による原因であり得る。本明細書で使用される用語は、血管形成に関連する眼疾患または障害を含む。用語は、糖尿病性網膜症（増殖型糖尿病性網膜症を含む）、糖尿病性黄斑浮腫、加齢性黄斑変性、網膜血管新生、網膜中心静脈閉塞、網膜静脈分枝閉塞、ポリープ状脈絡膜血管症、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、変性近視（近視ＣＮＶ）、血管新生緑内障、および未熟児網膜症からなる群から選択される眼疾患または障害を含むが、これらに限定されない。特定の実施形態において、「血管新生眼疾患または障害」という用語は、「血管形成に関連する眼疾患または障害」と互換的に使用され得る。
【００６５】
特定の実施形態において、本開示は、対象における血管形成に関連する眼疾患または障害の少なくとも１つの症状または兆候を治療、予防、または改善する方法を含み、疾患または障害は、病理学的血管新生、糖尿病性網膜症（増殖型糖尿病性網膜症を含む）糖尿病性黄斑浮腫、加齢黄斑変性、網膜血管新生、ポリープ状脈絡膜血管症、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、変性近視（近視ＣＮＶ）、血管新生緑内障、および未熟児網膜症からなる群から選択される。特定の実施形態において、ＡＰＬＮＲアンタゴニストの投与は、例えば、酸素誘発性網膜症（ＯＩＲ）において、網膜の正常な血管再生も促進する。
【００６６】
本明細書で使用される「糖尿病性黄斑浮腫」（ＤＭＥ）は、糖尿病（１型または２型）を有する人々に影響を与える深刻な眼の状態を指す。黄斑浮腫は、網膜内の血管が黄斑に漏出し、眼の黄斑の上または下（網膜の黄色の中心領域）に体液およびタンパク質の沈着物が集まり、それが原因で肥厚および腫脹する（浮腫）場合に発生する。腫脹は、黄斑が眼球の後ろの網膜の中心近くであるため、人の中心視野を歪め得る。ＤＭＥの腫瘍な症状は、霧視、飛蚊症、コントラストの喪失、二重視力、および最終的な視覚の喪失を含むが、これらに限定されない。ＤＭＥの病態は、通常、網膜内の水の動きを妨げ、網膜組織に体液が蓄積することを可能にする血液網膜関門の破壊、および網膜肥厚の存在を特徴とする。ＤＭＥは現在、標準化されたチャートで読むことができる最小の文字、疾患の徴候を確認するための散瞳検査、光干渉断層撮影（ＯＣＴ）またはフルオレセイン血管造影（ＦＡ）および眼圧測定などの画像検査、目の内側の圧力を測定する器具で決定する視力試験からなる目の検査中に診断される。以下の研究、光干渉断層撮影（ＯＣＴ）、フルオレセイン血管造影、およびカラーステレオ眼底撮影は、治療法を決定するために、さらに実施される。ＤＭＥは、限局性およびびまん性の２つの主なカテゴリに概括的に特徴付けできる。限局性ＤＭＥは、黄斑内の十分な黄斑血流を伴う分離する明確な漏出の特定の領域によって特徴付けられる。びまん性ＤＭＥは、黄斑を取り囲む毛細血管床全体の漏出に起因し、目の内側の血液網膜関門の破壊から生じる。限局性およびびまん性に追加して、ＤＭＥは、臨床治験の所見に基づいて、臨床的に重要な黄斑浮腫（ＣＳＭＥ）、非ＣＳＭＥおよび中心窩を伴う中心性病変を有するＣＳＭＥ（ＣＳＭＥ−ＣＩ）に分類される。本開示は、ＤＭＥの上記で言及されたカテゴリを治療する方法を含む。
【００６７】
本明細書で使用される加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）は、黄斑として知られる網膜の小さな中心部分が悪化した際の深刻な眼の状態を指す。湿潤型ＡＭＤは、黄斑下部の脈絡膜からの異常な血管の成長により特徴付けられる。これは、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）と呼ばれる。これらの血管は、網膜に血液および体液を漏出し、直線が波状に見える視覚の歪み、ならびに盲点および中心視力の喪失を引き起こす。これらの異常な血管は、最終的に瘢痕化して、中心視力の永久的な喪失につながる。ＡＭＤの症状は、視覚の中心内での暗いぼやけた領域、および色覚の低下または変化を含む。ＡＭＤは、慣例の眼の検査で検出できる。黄斑変性の最も一般的な初期徴候の１つは、網膜または色素の凝集の下に極めて小さな黄色の沈着物であるドルーゼンが存在することである。
【００６８】
本明細書で使用する「未熟児網膜症」（ＲＯＰ）は、水晶体後線維増殖症およびテリー症候群としても知られており、低出生体重および若い妊娠年齢の未熟児に影響を与える状態を指す。未熟児の網膜症は、正常な網膜血管の発達が完全な妊娠期間の前の出生によって中断され、網膜血管の異常な発達をもたらす場合に発生する。状態が進行する場合、瘢痕組織の成長は、網膜剥離および視力障害または視力喪失をもたらすことができる。ＲＯＰの病因は、血管閉塞期および血管増殖期の２つの別々の段階を伴う。正常な網膜血管の成長は、高酸素環境への曝露の結果として、第１の段階において遅延され、一方、第２の段階は、血管新生における急速な増加、それに続く網膜剥離を含む。冷却療法またはレーザー光凝固による無血管網膜の除去は、ＲＯＰのための主要な治療法と見なされており、抗ＶＥＧＦ療法（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体）が研究されている。これらの治療選択肢にもかかわらず、状態は生涯にわたる視覚障害の主な原因であり続け、発生率は２０年以上にわたって比較的一定のままである。
【００６９】
本明細書で使用される糖尿病性網膜症（ＤＲ）は、長期の高血糖症に関連する網膜微小血管系の慢性進行性疾患である。ＤＲは、糖尿病の最も一般的な微小血管の合併症であり、糖尿病の有病率が世界中で増加し続けているため、世界的に急増している問題である。本明細書で使用される増殖性ＤＲ（ＰＤＲ）は、視力を脅かすＤＲの合併症であり、網膜、視神経乳頭、または前眼部における異常な新しい血管の発達により特徴付けされる。ＰＤＲはＤＲの進行期であり、低酸素および血管新生促進増殖因子の発現によって駆動され、網膜前方の空間に突出する新しい血管の異常な形成を刺激する。網膜血管新生は、硝子体出血または牽引性網膜剥離を引き起こす場合に、断絶する視力の喪失をもたらすことができる。レーザー光凝固は、長年にわたるＰＤＲの治療のための標準とされており、より最近の治療は、抗ＶＥＧＦ（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体）およびステロイド剤を用いた眼内治療、ならびに硝子体網膜手術を含む。これらの治療の進歩にもかかわらず、満たされていない治療ニーズが残存し、特に非侵襲的、非破壊的およびより長い持続の治療選択肢である。
【００７０】
本明細書で使用される「それを必要とする対象」という表現は、血管新生に関連する眼疾患または障害の１つ以上の症状または兆候を示す、および／または診断されたヒトまたは非ヒト哺乳動物を意味する。「それを必要とする対象」という用語は、例えば、治療前に、例えば、網膜血管形成、血管新生、血管漏出、中心窩の中心から５００μｍ以内の網膜の肥厚、隣接する網膜の肥厚を伴う中心窩の中心から５００μｍ以内の硬く黄色い滲出物、および網膜の肥厚の少なくとも１つの円板面積、中心窩の中心から１つ円板の直径内である、霧視、飛蚊症、コントラストの喪失、二重視、および最終的な視覚の喪失などの血管新生眼疾患のうちの１つ以上の兆候を示す（または示している）対象をさらに含み得る。
【００７１】
本開示の状況下において、「それを必要とする対象」は、糖尿病性網膜症（増殖型糖尿病性網膜症を含む）、糖尿病性黄斑浮腫、加齢性黄斑変性、網膜血管新生、網膜中心静脈閉塞、網膜静脈分枝閉塞、ポリープ状脈絡膜血管症、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、変性近視（近視ＣＮＶ）、血管新生緑内障、および未熟児網膜症からなる群から選択される血管性眼疾患または障害を有するヒトまたは非ヒト哺乳動物をさらに含む。
【００７２】
本開示の状況下において、「それを必要とする対象」は、ＤＭＥもしくはＡＭＤに対してより感受性の高い集団のサブセットを含み得、またはＤＭＥ関連もしくはＡＭＤ関連のバイオマーカー、またはＲＯＰもしくはＰＤＲに関連するバイオマーカーのレベルの上昇を示し得る。例えば、「それを必要とする対象」には、１０年以上糖尿病に罹患している対象、または頻繁に高い血糖値または空腹時の高い血糖値を有する対象が含まれ得る。特定の実施形態において、「それを必要とする対象」という用語は、ＡＰＬＮＲアンタゴニストおよび／またはＶＥＧＦアンタゴニストの投与前または投与時に、糖尿病と診断されているもしくは診断された対象を含む。特定の実施形態において、「それを必要とする対象」という用語は、ＡＰＬＮＲアンタゴニストおよび／またはＶＥＧＦアンタゴニストの投与前または投与時に、５１歳以上である対象を含む。いくつかの実施形態において、「それを必要とする対象」という用語は、喫煙者である対象、または高血圧または高コレステロールを有する対象を含む。
【００７３】
本開示は、それを必要とする対象に、ＶＥＧＦアンタゴニストと組み合わせたＡＰＬＮＲアンタゴニストを含む、薬学的組成物の治療的に有効な量を投与することを含む、血管性眼疾患の重症度を治療、予防または軽減するための方法を含み、薬学的組成物は、例えば、特定の治療的投薬レジメンの一部として、複数用量で対象に投与される。例えば、治療的投薬レジメンは、約１日に１回、２日毎に１回、３日毎に１回、４日毎に１回、５日毎に１回、６日毎に１回、１週毎に１回、２週毎に１回、３週毎に１回、４週毎に１回、１ヶ月毎に１回、２ヶ月毎に１回、３ヶ月毎に１回、４ヶ月毎に１回、またはそれ以下の頻度の回数で対象に複数用量の薬学的組成物を投与することを含み得る。特定の実施形態において、治療的投薬レジメンは、１日１回、または１日２回、またはそれ以上の回数で対象に複数用量の薬学的組成物を投与することを含み得る。
【００７４】
本開示は、対象における血管漏出を阻害、または減少、または抑制するための方法を含む。特定の実施形態において、本開示のこの態様に従う方法は、対象の眼内の血管漏出を減少または阻害するために、ＶＥＧＦアンタゴニストと組み合わせたＡＰＬＮＲアンタゴニストを含む、薬学的組成物の１回用量を対象に投与することを含む。特定の実施形態では、血管漏出は、ＶＥＧＦアンタゴニスト単独を投与されている対象と比較して、３週超、４週超、８週超、または１０週超で阻害される。
【００７５】
本開示の方法は、特定の実施形態従って、ＶＥＧＦアンタゴニストと組み合わせたＡＰＬＮＲアンタゴニストを含む、薬学的組成物の治療的に有効な量を対象に投与することを含む。特定の実施形態において、ＡＰＬＮＲアンタゴニストは、黄斑への漏出を阻止するためのレーザー治療を含む、療法と組み合わせて投与され得る。本明細書で使用される「〜と組み合わせて」という語句は、ＡＰＬＮＲアンタゴニストを含む薬学的組成物が、ＶＥＧＦアンタゴニストの投与と同時に、その直前、または直後に対象に投与されることを意味する。本明細書で使用される「〜と組み合わせて」という語句は、ＡＰＬＮＲアンタゴニストを含む薬学的組成物が、当該ＶＥＧＦアンタゴニストの投与と同時に、その直前、または直後に対象に投与されることを意味する。特定の実施形態において、ＶＥＧＦアンタゴニストは、ＡＰＬＮＲアンタゴニストとの共製剤として投与される。関連される態様において、本開示は、ＡＰＬＮＲアンタゴニストを含む薬学的組成物の治療的に有効な量を対象に投与して、ＶＥＧＦアンタゴニスト単独の投与と比較して、より大きな治療効果または相乗効果を提供することを含む、方法を含む。対象は、硝子体内に投与されたＶＥＧＦアンタゴニストの治療レジメンを受けていてもよい。いくつかの実施形態において、ＡＰＬＮＲアンタゴニストは、この治療レジメンに追加され、ＶＥＧＦアンタゴニストの１回以上の硝子体内への注入を減少させ得るか、または継続的な硝子体内への注入の間隔を増加させ得る。
【００７６】
本開示の方法は、血管性眼疾患と診断されているか、または血管性眼疾患に苦しむリスクのある対象の血管性眼疾患を治療または予防するのに有用である。一般に、本開示の方法は、治療レジメンの開始から３６週以内に（「０週目」に投与される一次用量で）、例えば、６週目の終わりまで、１２週目の終わりまで、１８週目の終わりまで、２４週目の終わりまでなどにおいて有効性を実証する。ＡＭＤおよびＤＭＥなどの血管形成性眼疾患を治療する方法の状況下では、「有効性」とは、治療の開始から、対象は、早期治療糖尿病性網膜症研究（ＥＴＤＲＳ）の視力表で１０以下の文字を失うことを表すことを意味する。特定の実施形態において、「有効性」とは、治療の開始の時点からＥＴＤＲＳ表の１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１以上）の文字の獲得を意味する。
【００７７】
例えば、治療的投薬レジメンは、約１日に１回、２日毎に１回、３日毎に１回、４日毎に１回、５日毎に１回、６日毎に１回、１週毎に１回、２週毎に１回、３週毎に１回、４週毎に１回、１ヶ月毎に１回、２ヶ月毎に１回、３ヶ月毎に１回、４ヶ月毎に１回、またはそれ以下の頻度の回数で対象に複数用量の薬学的組成物を投与することを含み得る。特定の実施形態において、治療的投薬レジメンは、１日１回、または１日２回、またはそれ以上の回数で対象に複数用量の薬学的組成物を投与することを含み得る。
【００７８】
ＡＰＬＮＲアンタゴニスト
本開示は、それを必要とする対象に、ＡＰＬＮＲアンタゴニストを含む、薬学的組成物の治療的に有効な量を投与することを含む、対象における血管性眼疾患または障害の少なくとも１つの症状または兆候を治療、予防または改善するための方法を含む。ＡＰＬＮＲアンタゴニストは、抗体またはその抗原結合断片、アペリン受容体シグナル伝達経路の小分子阻害剤、およびアペリン受容体シグナル伝達経路のペプチド阻害剤を含む。例示的なＡＰＬＮＲの小分子阻害剤またはアンタゴニストは、米国特許公開第ＵＳ２０１４／０００５１８号およびＵＳ２０１５／０１２５４５９号、ならびに国際特許公開第ＷＯ２００４０８１１９８号および第ＷＯ２０１５１４０２９６号に見出すことができる。例示的なペプチド阻害剤またはＡＰＬＮＲのアンタゴニストは、米国特許第９，５９３，１５３号および第７，７３６，６４６号、ならびに国際特許公開第ＷＯ２００４０８１１９８号に見出すことができる。他のＡＰＬＮＲアンタゴニストは、ＭＭ５４、ＭＭ０７、Ｎ−アルファ−アセチル−ノナ−Ｄ−アルギニンアミドアセテート（ＡＬＸ４０−４Ｃ）、ＭＬ２２１、変異体アペリン−１３（Ｆ１３Ａ）、４−オキソ−６−（（ピリミジン−２−イルチオ）メチル）−４Ｈ−ピラン−３−イル−４−ニトロベンゾエート（Ｍｌ２２１）、およびＥ３３９−３Ｄ６を含む。
【００７９】
ＡＰＬＮＲアンタゴニストは、２０１５年５月５日に公開された国際特許公第ＷＯ２０１５／０７７４９１号において開示された抗体の群から選択される抗体またはその抗原結合断片が含まれ、その全体および米国特許第９，４９３，５５４号に詳細に組み込まれる。いくつかの実施形態において、抗体は、Ｈ２ａＭ９２３２Ｎ、Ｈ４Ｈ９２３２Ｎ、またはＨ１Ｍ９２０７Ｎである。一実施形態において、抗ＡＰＬＮＲ抗体は、Ｈ４Ｈ９２３２Ｎである。
【００８０】
ＡＰＬＮＲアンタゴニストは、配列番号２および１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそれに実質的に類似の配列を含む群から選択される、抗体またはその抗原結合断片を含む。
【００８１】
ＡＰＬＮＲアンタゴニストは、配列番号７および１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそれに実質的に類似の配列を含む、抗体またはその抗原結合断片を含む。
【００８２】
特定の実施形態に従って、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１および６（例えば、Ｈ１Ｍ９２０７Ｎ）、ならびに配列番号１２および１７（例えば、Ｈ２ａＭ９２３２ＮまたはＨ４Ｈ９２３２Ｎ）の核酸配列によってコードされる重鎖および軽鎖ＣＤＲ配列を含む。
【００８３】
本開示の特定の非限定的で例示的な抗体および抗原結合断片は、それぞれ、配列番号３−４−５−８−９−１０（例えば、Ｈ１Ｍ９２０７Ｎ）、および配列番号１４−１５−１６−１９−２０−２１（例えば、Ｈ２ａＭ９２３２ＮまたはＨ４Ｈ９２３２Ｎ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３ドメインを含む。Ｈ２ａＭ９２３２ＮおよびＨ４Ｈ９２３２Ｎと指定された抗体は、同一ヒト可変領域（ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ）を共有している。Ｈ２ａＭ９２３２Ｎは、ネズミ科ＩｇＧ２ａ重鎖定常領域を含み、一方でＨ４Ｈ９２３２Ｎは、ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域を含む。
【００８４】
ＡＰＬＮＲアンタゴニストは、配列番号２／７および１３／１８からなる群から選択される、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）配列対を含む、抗体またはその抗原結合断片を含む。
【００８５】
ＡＰＬＮＲアンタゴニストは、配列番号５および１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）ドメイン、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそれに実質的に類似の配列、ならびに配列番号１０および２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）ドメイン、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそれに実質的に類似の配列を含む抗体またはその抗原結合断片を含む。
【００８６】
特定の実施形態において、ＡＰＬＮＲアンタゴニストは、配列番号５／１０および１６／２１からなる群から選択されるＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対を含む、抗体またはその抗原結合断片を含む。
【００８７】
ＡＰＬＮＲアンタゴニストは、配列番号３および１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）ドメイン、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそれに実質的に類似の配列、配列番号４および１５からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）ドメイン、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそれに実質的に類似の配列、配列番号８および１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）ドメイン、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそれに実質的に類似の配列、ならびに配列番号９および２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）ドメイン、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそれに実質的に類似の配列を含む抗体またはその抗原結合断片を含む。
【００８８】
特定の非限定的で例示的な抗ＡＰＬＮＲ抗体は、ＡＰＬＮＲに特異的に結合する抗体または抗体の抗原結合断片を含み、抗体または抗原結合断片は、配列番号２／７および１３／１８からなる群から選択される重鎖および軽鎖可変領域（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）配列内に含まれる重鎖および軽鎖ＣＤＲドメインを含む。
【００８９】
ＨＣＶＲアミノ酸配列およびＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを同定するための方法および技術は、当該技術分野において周知であり、それらを使用して、本明細書に開示される特定のＨＣＶＲアミノ酸配列および／またはＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを同定することができる。ＣＤＲの境界を同定するために使用可能な例示的な規則には、例えば、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、およびＡｂＭ定義が含まれる。一般的にいえば、Ｋａｂａｔ定義は、配列の可変性に基づいており、Ｃｈｏｔｈｉａ定義は、構造ループ領域の位置に基づいており、ＡｂＭ定義は、ＫａｂａｔのアプローチとＣｈｏｔｈｉａのアプローチとの間の折衷案である。例えば、Ｋａｂａｔ，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，」Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）、Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７−９４８、およびＭａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：９２６８−９２７２を参照されたい。抗体内のＣＤＲ配列を同定するために、公開データベースも利用可能である。
【００９０】
本開示は、配列番号２および１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖（ＨＣＶＲ）、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそれに実質的に類似の配列を含む、抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００９１】
本開示は、配列番号７および１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖（ＬＣＶＲ）、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそれに実質的に類似の配列を含む、抗体または抗体の抗原結合断片をさらに提供する。
【００９２】
本開示は、ＨＣおよびＬＣ（ＨＣ／ＬＣ）アミノ酸配列対を含む、抗体またはその抗原結合断片をさらに提供する。
【００９３】
特定の実施形態に従って、抗体またはその抗原結合断片は、抗体Ｈ１Ｍ９２０７ＮまたはＨ２ａＭ９２３２Ｎ（またはＨ４Ｈ９２３２Ｎ）の核酸配列によってコードされる重鎖および軽鎖ＣＤＲ配列を含む。
【００９４】
本開示は、修飾されたグリコシル化パターンを有する抗ＡＰＬＮＲ抗体を含む。いくつかの用途において、望ましくないグリコシル化部位を除去するための修飾、または例えば、抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）機能を増大させるためのフコース部分を欠失している抗体は有用であり得る（Ｓｈｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．２００２，ＪＢＣ  ２７７：２６７３３を参照されたい）。他の応用において、ガラクトシル化の修飾は、補体依存性細胞障害作用（ＣＤＣ）を修飾するために行うことができる。
【００９５】
例えば、本開示は、例えば、ＷＯ２０１５／０７７４９１の実施例５、８、９または１１に定義されているアッセイ形式、または実質的に同様のアッセイを使用して、細胞系の遮断または阻害バイオアッセイで測定した場合に、約２０ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約９００ｐＭ未満、約８００ｐＭ未満、約７００ｐＭ未満、約６００ｐＭ未満、約５００ｐＭ未満、約４００ｐＭ未満、約３５０ｐＭ未満、約３００ｐＭ未満、約２５０ｐＭ未満、約２００ｐＭ未満、約１５０ｐＭ未満、約１００ｐＭ未満、約未満９０ｐＭ、約８０ｐＭ未満、約７０ｐＭ未満、約６０ｐＭ未満、約５０ｐＭ未満、約４０ｐＭ未満、約３０ｐＭ未満、約２０ｐＭ未満、または約１０ｐＭ未満のＩＣ５０を有するヒトＡＰＬＮＲを発現する細胞におけるアペリン媒介シグナル伝達を遮断または阻害するそのＡＰＬＮＲアンタゴニストを含む。
【００９６】
本開示は、ＡＰＬＮＲが誘発されるｐＥＲＫアッセイで測定した場合に、約５０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、約２０ｎＭ未満、約１５ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約９００ｐＭ未満、約８００ｐＭ未満、約７００ｐＭ未満、約６００ｐＭ未満、約５００ｐＭ未満、約４００ｐＭ未満、または約３００ｐＭ未満のＩＣ５０を有するアペリンの存在下においてｐＥＲＫのＡＰＬＮＲ媒介の割合を阻害するＡＰＬＮＲアンタゴニストを含む。
【００９７】
しかしながら、他の実施形態において、本開示の特定のＡＰＬＮＲアンタゴニストは、ＡＰＬＮＲ媒介シグナル伝達を阻害または減衰する能力を有するにもかかわらず、ＡＰＬＮＲとアペリンとの相互作用を遮断しないか、または部分的にのみ遮断する。かかる抗体およびその抗原結合断片は、本明細書では「間接的遮断剤」と呼ばれ得る。理論に拘束されることなく、開示の間接的遮断剤は、ＡＰＬＮＲのＮ末端リガンド結合ドメインと重複しない、または部分的にのみ重複するエピトープでＡＰＬＮＲと結合することにより機能すると考えられており、しかしそれにもかかわらず、ＡＰＬＮＲ／アペリン相互作用を直接的に遮断することなく、ＡＰＬＮＲ媒介シグナル伝達に干渉する。
【００９８】
本開示は、高い親和性および／または特異的な可溶性ＡＰＬＮＲ分子に結合するＡＰＬＮＲアンタゴニストを含む。例えば、本開示は、例えば、ＷＯ２０１５／０７７４９１における実施例４に定義されるアッセイ形式を使用して、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）アッセイにより測定される場合に、約２０を超える結合比でＡＰＬＮＲと結合する抗体および抗体の抗原結合断片を含む。特定の実施形態において、本開示の抗体または抗原結合断片は、例えば、ＦＡＣＳ、または実質的に同様のアッセイにより測定される場合に約１５超、約２０超、約１００超、約２００超、約３００超、約４００超、約５００超、約１０００超、約１５００超、または約２０００超の結合比でＡＰＬＮＲに結合する。
【００９９】
本開示は、例えば、周知であるＢＩＡｃｏｒｅ（商標）アッセイ形式、または実質的に同様のアッセイを使用して、２５℃または３７℃での表面プラズモン共鳴により測定される場合に、約１０分を超える解離半減期（ｔ１／２）でＡＰＬＮＲと特異的に結合する抗ＡＰＬＮＲ抗体およびその抗原結合断片を含む。
【０１００】
本開示の抗体は、上述の生物学的特徴の１つ以上、またはそれらの何らかの組み合わせを有することができる。本開示の抗体の他の生物学的特徴は、本明細書で機能する実施例を含む本開示の精査から当業者に明らかであろう。
【０１０１】
抗ＡＰＬＮＲ抗体は、抗体が由来した対応する生殖系列配列と比較して、重鎖および軽鎖可変ドメインのフレームワーク領域および／またはＣＤＲ領域において１つ以上のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失を含み得る。このような変異は、本明細書に開示されるアミノ酸配列を、例えば、公共の抗体配列データベースから入手可能な生殖系列配列と比較することによって容易に確認することができる。本開示は、本明細書に開示するアミノ酸配列のいずれかに由来する抗体およびその抗原結合断片を含み、１つ以上のフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内の１つ以上のアミノ酸は、抗体が由来した生殖系列配列の対応する残基（複数可）へ、または別のヒト生殖系列配列の対応する残基（複数可）へ、または対応する生殖系列残基（複数可）の保存的アミノ酸置換へ変異する（このような配列変化はまとめて、「生殖系列変異」と本明細書で呼ばれる）。当業者は、本明細書に開示する重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列から出発して、１つ以上の個々の生殖系列変異またはこれらの組み合わせを含む多数の抗体および抗体結合断片を容易に産生することができる。特定の実施形態において、ＶＨおよび／またはＶＬドメイン内のフレームワークおよび／またはＣＤＲ残基のうちの全てが、抗体が由来した元の生殖系列配列において見出される残基へと再び変異する。他の実施形態において、ある特定の残基のみが元の生殖系列配列へと変異し戻され、例えば、変異した残基はＦＲ１の最初の８個のアミノ酸内に、もしくは変異した残基はＦＲ４の最後の８個のアミノ酸内に認められ、または変異した残基は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３内にのみ認められる。他の実施形態において、フレームワークおよび／またはＣＤＲ残基（複数可）の１つ以上は、異なる生殖系列配列（すなわち、抗体が本来由来した生殖系列配列とは異なる生殖系列配列）の対応する残基（複数可）へ変異する。さらに、本開示の抗体は、フレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内に２つ以上の生殖系列変異の任意の組み合わせを含有してもよく、例えば、特定の個々の残基は、特定の生殖系列配列の対応する残基へ変異するのに対し、元の生殖系列配列とは異なる特定の他の残基は、維持されるか、または異なる生殖系列配列の対応する残基へ変異する。一度取得されると、１つ以上の生殖系列変異を含有する抗体および抗原結合断片は、結合特異性の改善、結合親和性の増大、アンタゴニストまたはアゴニストの生物学的特性の改善または亢進（場合により得る）、免疫原性の低下などの１つ以上の所望の特性について容易に試験することができる。この一般的な様式で得られた抗体および抗原結合断片は、本開示に包含される。
【０１０２】
本開示は、１つ以上の保存的置換を有する本明細書に開示するＨＣＶＲアミノ酸配列、ＬＣＶＲアミノ酸配列、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかの変異体を含む抗ＡＰＬＮＲ抗体をさらに含む。例えば、本開示は、本明細書に開示するＨＣＶＲアミノ酸配列、ＬＣＶＲアミノ酸配列、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかに対して、例えば１０個以下、８個以下、６個以下または４個以下などの保存的アミノ酸置換を有するＨＣＶＲアミノ酸配列、ＬＣＶＲアミノ酸配列、および／またはＣＤＲアミノ酸配列を有する抗ＡＰＬＮＲ抗体を含む。
【０１０３】
「エピトープ」という用語は、パラトープとして既知の抗体分子の可変領域における特異的抗原結合部位と相互作用する抗原決定基を指す。単一の抗原は、１つ超のエピトープを有し得る。したがって、異なる抗体は、抗原上の異なる領域へ結合し得、異なる生物学的効果を有し得る。エピトープは、立体配座または線状のいずれかであり得る。立体配座エピトープは、直鎖状ポリペプチド鎖の異なるセグメントから空間的に並置されたアミノ酸によって産生される。直鎖状エピトープは、ポリペプチド鎖中の隣接するアミノ酸残基によって産生されるものである。特定の状況において、エピトープは、抗原上の糖類、ホスホリル基、またはスルホニル基の部分を含み得る。
【０１０４】
「実質的な同一性」または「実質的に同一である」という用語は、核酸またはその断片を指す場合、別の核酸（またはその相補鎖）との適切なヌクレオチド挿入または欠失と最適に整列した場合、以下に考察するように、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＧａｐなど、配列同一性の任意の周知のアルゴリズムによって測定される場合に、ヌクレオチド塩基の少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％のヌクレオチド配列同一性があることを示す。参照核酸分子と実質的な同一性を有する核酸分子は、特定の場合では、参照核酸分子によってコードされるポリペプチドと同じまたは実質的に類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。
【０１０５】
ポリペプチドへ適用される場合、「実質的な類似性」または「実質的に類似の」との用語は、２つのペプチド配列が、既定のギャップ重みを用いてプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適に整列した場合、少なくとも９５％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９８％または９９％の配列同一性を共有する。好ましくは、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換だけ異なる。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を備えた側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されたものである。概して、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させないであろう。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換だけ互いに異なる場合、配列同一性の割合または類似性の程度は、置換の保存的性質を補正するために上向きに調整してもよい。この調整を行うための手段は、当業者に周知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＰｅａｒｓｏｎ（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３３１を参照されたい。類似の化学的特性を備えた側鎖を有するアミノ酸の基の例としては、（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン、（２）脂肪族−ヒドロキシル側鎖：セリンおよびトレオニン、（３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン、（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン、（５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、およびヒスチジン、（６）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸、ならびに（７）含硫側鎖：システインおよびメチオニンが挙げられる。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、およびアスパラギン−グルタミンである。あるいは、保存的置換とは、参照により本明細書に組み込まれるＧｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．１９９２  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１４４３−１４４５に開示されるＰＡＭ２５０対数尤度行列において正値を有する任意の変化である。「適度に保存的な」置換とは、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて負以外の値を有する任意の変化である。
【０１０６】
ポリペプチドに対する配列類似性は、配列同一性とも呼ばれ、典型的には配列分析ソフトウェアを用いて測定される。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む種々の置換、欠失および他の修飾へ割り当てられた類似の測定値を用いて類似の配列と一致させる。例えば、ＧＣＧソフトウェアは、異なる種の生物由来の相同ポリペプチドのような密接に関連するポリペプチド間の、または野生型タンパク質とその変異タンパク質の間の配列相同性または配列同一性を決定するための既定パラメータと共に使用することができるＧａｐおよびＢｅｓｔｆｉｔなどのプログラムを含有する。例えば、ＧＣＧ第６．１版を参照されたい。ポリペプチド配列は、ＧＣＧ第６．１版におけるプログラムである、既定パラメータまたは推奨パラメータを備えたＦＡＳＴＡを使用して比較することもできる。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）は、問い合わせ配列と検索配列の間の最良重複の領域の整列およびパーセント配列同一性を提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９４）上述）。本開示の配列を、異なる生物由来の多数の配列を含有するデータベースと比較する場合の別の好ましいアルゴリズムは、既定パラメータを使用するコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０およびＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−４０２を参照されたい。
【０１０７】
本開示は、本明細書に記載される特定の例示的な抗体（例えば、Ｈ１Ｍ９２０７Ｎ、およびＨ２ａＭ９２３２Ｎ、およびＨ４Ｈ９２３２Ｎ）のうちのいずれかと同じエピトープに結合する抗ＡＰＬＮＲ抗体をさらに含む。同様に、本開示は、ＡＰＬＮＲとの結合について本明細書に記載の特定の例示的な抗体（例えば、Ｈ１Ｍ９２０７Ｎ、およびＨ２ａＭ９２３２Ｎ、およびＨ４Ｈ９２３２Ｎ）のうちのいずれかと競合する抗ＡＰＬＮＲ抗体をさらに含む。
【０１０８】
当該技術分野で即知であり、本明細書に例示される通例の方法を使用することによって、抗体が参照抗ＡＰＬＮＲ抗体と同じエピトープに結合するか、または結合について参照抗ＡＰＬＮＲ抗体と競合するかを容易に決定することができる。例えば、試験抗体が本開示の参照抗ＡＰＬＮＲ抗体と同じエピトープに結合するかを決定するために、参照抗体はＡＰＬＮＲタンパク質と結合させておく。次に、ＡＰＬＮＲと結合する試験抗体の能力を評価する。試験抗体が、参照抗ＡＰＬＮＲ抗体との飽和結合後にＡＰＬＮＲへ結合することができる場合、この試験抗体は参照抗ＡＰＬＮＲ抗体とは異なるエピトープへ結合すると結論づけることができる。その一方で、試験抗体が、参照抗ＡＰＬＮＲ抗体との飽和結合後にＡＰＬＮＲ分子と結合できない場合に、試験抗体は、本開示の参照抗ＡＰＬＮＲ抗体によって結合したエピトープと同じエピトープへ結合し得る。次に、試験抗体の結合の観察された欠失が、実際に、参照抗体と同じエピトープへの結合によるものであるか、それとも立体遮断（または別の現象）が、観察された結合の欠失の原因であるのかを確認するために、さらなる通例の実験（例えば、ペプチド変異および結合分析）を実施することができる。この種の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＢＩＡｃｏｒｅ、フローサイトメトリー、または当該技術分野で利用可能な任意の他の定量的もしくは定性的な抗体結合アッセイを用いて行うことができる。本開示の特定の実施形態によると、例えば、１、５、１０、２０、または１００倍過剰の一方の抗体が、競合的結合アッセイ（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０：１４９５−１５０２を参照されたい）で測定した場合に、少なくとも５０％、しかし好ましくは７５％、９０％、さらに９９％で他の抗体の結合を阻害する場合に、２つの抗体は、同じ（または重複する）エピトープに結合する。代替的に、一方の抗体の結合を減少または排除する抗原における本質的に全てのアミノ酸変異が、もう一方の抗体の結合を減少または排除する場合、２つの抗体は、同じエピトープと結合するとみなされる。一方の抗体の結合を減少または排除するアミノ酸変異のサブセットのみが他方の結合を減少または排除する場合に、２つの抗体は「重複エピトープ」を有するとみなされる。
【０１０９】
抗体が参照抗ＡＰＬＮＲ抗体と結合について競合する（または結合について交差競合する）かを決定するために、上記に記載される結合方法論を２つの向きで実施する。第１の向きでは、参照抗体を飽和条件下でＡＰＬＮＲタンパク質と結合させておいた後、ＡＰＬＮＲ分子との試験抗体の結合を評価する。第２の向きにおいて、試験抗体を飽和条件下でＡＰＬＮＲと結合させておいた後、ＡＰＬＮＲとの参照抗体の結合を評価する。両方の向きにおいて、第１の（飽和している）抗体のみがＡＰＬＮＲと結合することができる場合に、試験抗体および参照抗体はＡＰＬＮＲとの結合について競合すると結論づけられる。当業者によって認識されるように、参照抗体との結合について競合する抗体は、必ずしも参照抗体と同一のエピトープと結合するわけではないが、重複しているまたは隣接しているエピトープと結合することによって、参照抗体の結合を立体的に遮断し得る。
【０１１０】
本開示の特定の実施形態において、本開示の抗ＡＰＬＮＲ抗体は、ヒト抗体である。「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含むことが企図される。本開示のヒト抗体は、例えば、ＣＤＲ、特にＣＤＲ３における、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的変異誘発によってまたはインビボでの体細胞変異によって導入された変異）によってコードされないアミノ酸残基を含み得る。しかしながら、本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、別の哺乳類種（例えば、マウス）の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列へと移植された抗体を含むことを意図するものではない。様々な実施形態において、本明細書で論じられる抗体は、ＩｇＧ重鎖定常領域を有するヒト抗体である。いくつかの事例において、抗体は、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプの重鎖定常領域を有する。
【０１１１】
本開示の抗体は、いくつかの実施形態において、組換えヒト抗体であり得る。本明細書で使用される「組換えヒト抗体」という用語は、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現される抗体などの組換え手段によって調製、発現、作製、または単離されたその全てのヒト抗体（後述）、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体（後述）、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：６２８７−６２９５）、またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む任意の他の手段によって調製、発現、作製、または単離された抗体を含むことを意図する。かかる組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する。しかしながら、特定の実施形態において、かかる組換えヒト抗体は、インビトロ変異誘発（または、ヒトＩｇ配列についてトランスジェニック動物が使用される場合は、インビボ体細胞変異誘発）を受け、したがって、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列に由来し関連してはいるが、インビボでヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然には存在し得ない配列である。
【０１１２】
ヒト抗体は、ヒンジの不均一性に関連する２つの形態で存在することができる。第１の形態において、免疫グロブリン分子は、二量体が鎖間重鎖ジスルフィド結合によって一緒に保持されている約１５０〜１６０ｋＤａの安定な四本鎖構築物を含む。第２の形態において、二量体は鎖間ジスルフィド結合を介して連結されておらず、共有結合した軽鎖および重鎖からなる約７５〜８０ｋＤａの分子が形成される（半抗体）。これらの形態は、親和性精製後でさえも分離することが極めて困難とされている。
【０１１３】
様々な無傷のＩｇＧアイソタイプにおける第２の形態の出現頻度は、抗体のヒンジ領域アイソタイプに関連する構造上の相違によるが、それに限定されない。ヒトＩｇＧ４ヒンジのヒンジ領域における１つのアミノ酸置換により、ヒトＩｇＧ１ヒンジを用いて典型的に観察されるレベルにまで第２の形態の出現を有意に減少させることができる（Ａｎｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３０：１０５）。本開示は、ヒンジ、ＣＨ２またはＣＨ３領域に１つ以上の変異を有する抗体を包含し、例えば産生において、所望の抗体形態の収率を改善するのに望ましい場合がある。
【０１１４】
本開示の抗体は、単離された抗体であり得る。本明細書で使用される「単離された抗体」は、同定された抗体、およびその天然環境の少なくとも１つの成分から分離および／または回収された抗体を意味する。例えば、生物の少なくとも１つの成分から、または抗体が天然に存在するかもしくは天然に産生される組織または細胞から分離または除去された抗体は、本開示の目的のための「単離された抗体」である。単離された抗体は、組換え細胞内の原位置の抗体をさらに含む。単離された抗体は、少なくとも１つの精製または単離工程を受けている抗体である。ある特定の実施形態によると、単離された抗体は他の細胞性物質および／または化学物質を実質的に含まなくてもよい。
【０１１５】
本開示は、抗ＡＰＬＮＲ抗体の中和および／または遮断を含む。本明細書で使用される「中和」または「遮断」抗体は、ＡＰＬＮＲと結合する抗体を指すことを意図しており、（ｉ）ＡＰＬＮＲまたはＡＰＬＮＲ断片とＡＰＬＮＲ受容体成分（例えば、アペリンペプチドなど）との間の相互作用を妨げる、および／または（ｉｉ）ＡＰＬＮＲの少なくとも１つの生物学的機能の阻害をもたらす。ＡＰＬＮＲの中和または遮断抗体によって引き起こされる阻害は、阻害が好適なアッセイを使用して検出可能である限り、完全である必要はない。
【０１１６】
ＶＥＧＦアンタゴニスト
本明細書で使用される「ＶＥＧＦアンタゴニスト」は、ＶＥＧＦと結合または相互作用し、ＶＥＧＦのその受容体（ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２）との結合を阻害し、および／またはＶＥＧＦの生物学的シグナル伝達および活性を阻害する任意の薬剤である。ＶＥＧＦアンタゴニストは、ＶＥＧＦと天然のＶＥＧＦ受容体との間の相互作用を干渉する分子を含み、例えば、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ受容体と結合し、ＶＥＧＦとＶＥＧＦ受容体との間の相互作用を防止または妨害する。特定の例示的なＶＥＧＦアンタゴニストとしては、抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、ラニビズマブ［ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）］）、抗ＶＥＧＦ受容体抗体（例えば、抗ＶＥＧＦＲ１抗体、抗ＶＥＧＦＲ２抗体など）、ＶＥＧＦの小分子阻害剤（例えば、スニチニブ）、ならびに、アフリベルセプトおよびジブアフリベルセプトなどのＶＥＧＦ受容体系のキメラ分子またはＶＥＧＦを阻害する融合タンパク質（本明細書では「ＶＥＧＦ−トラップ」とも呼ばれる）が含まれる。ＶＥＧＦトラップの他の例は、ＡＬＴ−Ｌ９、Ｍ７１０、ＦＹＢ２０３、およびＣＨＳ−２０２０である。ＶＥＧＦトラップの追加の例は、米国特許第７，０７０，９５９号、第７，３０６，７９９号、第７，３７４，７５７号、第７，３７４，７５８号、第７，５３１，１７３号、第７，６０８，２６１号、第５，９５２，１９９号、第６，１００，０７１号、第６，３８３，４８６号、第６，８９７，２９４号、および第７，７７１，７２１号に記載されており、参照により本明細書に詳細に組み込まれる。追加のＶＥＧＦ阻害剤および／またはアンタゴニストには、小分子阻害剤である、パゾパニブ、ソラフェニブ、アキシチニブ、ポナチニブ、レゴラフェニブ、カボザンチニブ、バンデタニブ、カボザンチニブ、およびレンバチニブ、ならびにＶＥＧＦを阻害する抗体である、ベバシズマブ、およびラムシルマブ、またはそのバイオシミラー分子が含まれる。
【０１１７】
ＶＥＧＦ受容体系のキメラ分子には、ＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ１とも呼ばれる）および／またはＶＥＧＦＲ２（Ｆｌｋ１またはＫＤＲとも呼ばれる）などのＶＥＧＦ受容体の２つ以上の免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメインを含むキメラポリペプチドが含まれ、かつ多量体化ドメイン（例えば、２つ以上のキメラポリペプチドの多量体化（例えば、二量体化）を促進するＦｃドメイン）を含み得る。例示的なＶＥＧＦ受容体系のキメラ分子は、ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）（アフリベルセプトとしても即知である；製品名ＥＹＬＥＡ（登録商標）として市販されている）と呼ばれる分子である。特定の実施形態において、アフリベルセプトは、ＭＶＳＹＷＤＴＧＶＬＬＣＡＬＬＳＣＬＬＬＴＧＳＳＳＧＳＤＴＧＲＰＦＶＥＭＹＳＥＩＰＥＩＩＨＭＴＥＧＲＥＬＶＩＰＣＲＶＴＳＰＮＩＴＶＴＬＫＫＦＰＬＤＴＬＩＰＤＧＫＲＩＩＷＤＳＲＫＧＦＩＩＳＮＡＴＹＫＥＩＧＬＬＴＣＥＡＴＶＮＧＨＬＹＫＴＮＹＬＴＨＲＱＴＮＴＩＩＤＶＶＬＳＰＳＨＧＩＥＬＳＶＧＥＫＬＶＬＮＣＴＡＲＴＥＬＮＶＧＩＤＦＮＷＥＹＰＳＳＫＨＱＨＫＫＬＶＮＲＤＬＫＴＱＳＧＳＥＭＫＫＦＬＳＴＬＴＩＤＧＶＴＲＳＤＱＧＬＹＴＣＡＡＳＳＧＬＭＴＫＫＮＳＴＦＶＲＶＨＥＫＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号２３）として表されるアミノ酸配列を含む。
【０１１８】
本開示の薬学的製剤内に含まれるＶＥＧＦアンタゴニストの量は、製剤の所望の特定の特性、ならびに製剤が使用されることを意図する特定の状況および目的に応じて変動し得る。特定の実施形態において、薬学的製剤は、５±０．７５ｍｇ／ｍＬ〜１５０±２２．５ｍｇ／ｍＬのＶＥＧＦアンタゴニスト、１０±１．５ｍｇ／ｍＬ〜１００±１５．０ｍｇ／ｍＬのＶＥＧＦアンタゴニスト、２０±３ｍｇ／ｍＬ〜８０±１２ｍｇ／ｍＬのＶＥＧＦアンタゴニスト、３０±４．５ｍｇ／ｍＬ〜７０±１０．５ｍｇ／ｍＬのＶＥＧＦアンタゴニスト、または４０±６．０ｍｇ／ｍＬのＶＥＧＦアンタゴニストを含む、液体製剤である。例えば、本開示の製剤は、約２０ｍｇ／ｍＬ、約３０ｍｇ／ｍＬ、約４０ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ、または約６０ｍｇ／ｍＬのＶＥＧＦアンタゴニストを含む。
【０１１９】
本開示の方法は、それを必要とする対象に、ＶＥＧＦアンタゴニストを含む治療組成物を投与することを含む。
【０１２０】
治療用製剤および投与
本開示は、ヒトＡＰＬＮＲと特異的に結合する、抗ＡＰＬＮＲ抗体などの少なくとも１つのＡＰＬＮＲアンタゴニスト、またはその抗原結合断片を含む、薬学的製剤を提供する。特定の他の実施形態に従って、本開示は、追加の治療剤を含む、薬学的製剤を提供する。本開示は、例えば、少なくとも１つのＡＰＬＮＲアンタゴニストを含む薬学的製剤と併せて使用するための、少なくとも１つのＶＥＧＦアンタゴニストを含む、薬学的製剤をさらに提供する。
【０１２１】
本開示の薬学的組成物は、好適な担体、賦形剤、および改善された移動、送達、耐性などをもたらす他の薬剤と共に製剤化される。多数の好適な製剤が、製薬化学者全員に知られている処方集：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡにおいて見出すことができる。これらの製剤には、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、ベシクル（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡなど）を含有する脂質（カチオン性またはアニオン性）、ＤＮＡ複合体、無水吸収ペースト、水中油エマルションおよび油中水エマルション、エマルションカーボワックス（種々の分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、ならびにカーボワックスを含有する半固体混合物が含まれる。Ｐｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．”Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”ＰＤＡ，１９９８，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  ５２：２３８−３１１も参照されたい。
【０１２２】
対象に投与されるヒトＡＰＬＮＲと特異的に結合する抗ＡＰＬＮＲ抗体またはその抗原結合断片などのＡＰＬＮＲアンタゴニストの用量は、対象の年齢と体格、標的疾患、状態、投与経路などに応じて異なる。好ましい用量は、典型的には体重または体表面積に従って計算される。状態または疾患を治療するためにＡＰＬＮＲアンタゴニストが使用される場合は、通常、体重の約０．０１〜約５０ｍｇ／ｋｇの単回用量で本開示の抗体を静脈内に投与することが有益であり得る。他の事例において、ＡＰＬＮＲアンタゴニストを硝子体内に、例えば、体重の約０．０１〜約５０ｍｇ／ｋｇの濃度で投与することが有益であり得る。状態の重症度に応じて、治療の頻度および期間を調整することができる。抗ＡＰＬＮＲ抗体のようなＡＰＬＮＲアンタゴニストを投与するための有効投与量およびスケジュールは経験的に決定することができ、例えば、対象の経過を定期的な評価によってモニタリングし、それに応じて用量を調整することができる。さらに、投与量の種間スケーリングは、当該技術分野において周知の方法を用いて実施することができる（例えば、Ｍｏｒｄｅｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｒｅｓ．８：１３５１）。
【０１２３】
ＶＥＧＦアンタゴニストの用量は、対象の年齢および体格、標的疾患、状態、投与経路などに応じて変わり得る。好ましい用量は、典型的には体重または体表面積に従って計算される。状態または疾患を治療するためにＶＥＧＦアンタゴニストが使用される場合は、通常、体重の約０．０１〜約５０ｍｇ／ｋｇの単回用量で本開示の抗体を静脈内に投与することが有益であり得る。他の事例において、ＶＥＧＦアンタゴニストを硝子体内に、例えば、体重の約０．０１〜約５０ｍｇ／ｋｇの濃度で投与することが有益であり得る。状態の重症度に応じて、治療の頻度および期間を調整することができる。ＶＥＧＦアンタゴニストを投与するための有効投与量およびスケジュールは経験的に決定することができ、例えば、対象の経過を定期的な評価によってモニタリングし、それに応じて用量を調整することができる。種々の送達系が既知であり、本開示の薬学的組成物を投与するために使用することができ、例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセルにおける封入、変異ウイルスを発現することのできる組換え細胞、受容体媒介性エンドサイトーシスである（例えば、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２を参照されたい）。導入方法には、皮内経路、経皮経路、筋肉内経路、腹腔内経路、静脈内経路、硝子体内経路、皮下経路、鼻腔内経路、硬膜外経路および経口経路が含まれるが、これらに限定されない。組成物は、例えば、注入もしくはボーラス注射による、上皮もしくは粘膜皮膚内層（例えば、口腔粘膜、直腸および腸の粘膜など）を通じての吸収による任意の簡便な経路によって投与され得、他の生物学的に活性のある薬剤と共に投与され得る。投与は、全身的または局所的であり得る。
【０１２４】
本開示は、対象にＡＰＬＮＲアンタゴニストを投与することを含む、方法を含み、ＡＰＬＮＲアンタゴニストは、薬学的組成物内に含まれる。特定の実施形態において、薬学的組成物は、ＶＥＧＦアンタゴニストをさらに含む。代替の実施形態において、ＡＰＬＮＲアンタゴニストおよびＶＥＧＦアンタゴニストは、それぞれ、それ自体の別々の薬学的投薬製剤であり得る。本開示の薬学的組成物は、好適な担体、賦形剤、および好適な移動、送達、耐性などをもたらす他の薬剤と共に製剤化され得る。多数の好適な製剤が、製薬化学者全員に知られている処方集：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，米国ペンシルバニア州において見出すことができる。これらの製剤には、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、脂質（カチオン性またはアニオン性）含有ベシクル（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）など）、ＤＮＡ抱合体、無水吸収ペースト、水中油エマルションおよび油中水エマルション、エマルションカーボワックス（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、ならびにカーボワックスを含有する半固体混合物が含まれる。Ｐｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．”Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”ＰＤＡ（１９９８）Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  ５２：２３８−３１１も参照されたい。
【０１２５】
本明細書で使用される「薬学的製剤」という表現は、ヒトまたは非ヒト動物への治療的投与に好適である、活性成分または１つ以上の追加の不活性成分と組み合わせた場合の、少なくとも１つの活性成分（例えば、ヒトまたは非ヒト動物に生物学的効果を発揮できる小分子、高分子、化合物など）と、少なくとも１つの不活性成分との組み合わせを意味する。本明細書で使用される「製剤」という用語は、特に明記しない限り「薬学的製剤」を意味する。
【０１２６】
本開示の薬学的製剤内に含まれる、抗ＡＰＬＮＲ抗体またはその抗原結合断片のような抗ＡＰＬＮＲアンタゴニストの量は、製剤の所望の特定の特性、ならびに製剤が使用されることを意図する特定の状況および目的に応じて変動し得る。特定の実施形態において、薬学的製剤は、５±０．７５ｍｇ／ｍＬ〜１５０±２２．５ｍｇ／ｍＬの抗体、７．５±１．１２５ｍｇ／ｍＬ〜１４０±２１ｍｇ／ｍＬの抗体、１０±１．５ｍｇ／ｍＬ〜１３０±１９．５ｍｇ／ｍＬの抗体、１０±１．５ｍｇ／ｍＬの抗体、２０±３ｍｇ／ｍＬの抗体、６０±９ｍｇ／ｍＬの抗体、または１２０±１８ｍｇ／ｍＬの抗体を含む、液体製剤であり得る。例えば、本開示の製剤は、ヒトＡＰＬＮＲと特異的に結合する約１０ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ、約４０ｍｇ／ｍＬ、約６０ｍｇ／ｍＬ、約８０ｍｇ／ｍＬ、約１００ｍｇ／ｍＬ、約１２０ｍｇ／ｍＬ、もしくは約１４０ｍｇ／ｍＬの抗体またはその抗原結合断片を含み得る。
【０１２７】
特定の実施形態において、薬学的製剤は、５±０．７５ｍｇ／ｍＬ〜１００±１５ｍｇ／ｍＬのＶＥＧＦアンタゴニストを含み得る、液体製剤である。例えば、本開示の製剤は、約５ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ、約１５ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ、約２５ｍｇ／ｍＬ、約３０ｍｇ／ｍＬ、約３５ｍｇ／ｍＬ、約４０ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ、約６０ｍｇ／ｍＬ、約７０ｍｇ／ｍＬ、約８０ｍｇ／ｍＬ、約９０ｍｇ／ｍＬ、または約１００ｍｇ／ｍＬのアフリベルセプトなどのＶＥＧＦアンタゴニストを含む。
【０１２８】
特定の実施形態において、薬学的製剤は、約５ｍｇ／ｍＬ〜約１５０ｍｇ／ｍＬのＡＰＬＮＲアンタゴニスト、および約５〜１００ｍｇ／ｍＬのＶＥＧＦアンタゴニストを含む安定的な液体共製剤である。
【０１２９】
本開示の薬学的製剤は、１つ以上の賦形剤を含む。本明細書で使用される「賦形剤」という用語は、所望の粘稠度、粘度または安定化効果を提供するために製剤に追加される任意の非治療剤を意味する。
【０１３０】
本開示の状況下で使用できるＶＥＧＦアンタゴニストを含む例示的な製剤は、例えば米国特許第７，５３１，１７３号および第７，６０８，２６１号に開示される。本開示の状況下で使用できるＡＰＬＮＲアンタゴニストを含む例示的な薬学的組成物は、例えば、米国特許出願公開第２０１３／０１８６７９７号に開示される。本開示の状況下で使用できるＡＰＬＮＲアンタゴニストを含む例示的な薬学的組成物は、例えば、国際特許公開第ＷＯ２０１６／０８５７５０号および米国特許出願公開第ＵＳ２０１１／００２７２８６号に開示される。
【０１３１】
併用療法
本開示の方法は、特定の実施形態に従って、ＶＥＧＦアンタゴニストと組み合わせてＡＰＬＮＲアンタゴニストを対象に投与することを含む。本明細書で使用される「〜と組み合わせて」という表現は、ＶＥＧＦアンタゴニストが、ＡＰＬＮＲアンタゴニストを含む薬学的組成物の前、後、またはそれと同時に投与されることを意味する。「〜と組み合わせて」という用語は、抗ＡＰＬＮＲ抗体およびＶＥＧＦアンタゴニストの連続投与または同時投与をさらに含む。例えば、ＡＰＬＮＲアンタゴニストを含む薬学的組成物の「前」に投与される場合は、ＶＥＧＦアンタゴニストを含む薬学的組成物の投与の約７２時間よりも前、約７２時間前、約６０時間前、約４８時間前、約３６時間前、約２４時間前、約１２時間前、約１０時間前、約８時間前、約６時間前、約４時間前、約２時間前、約１時間前、約３０分前、約１５分前、または約１０分前に投与され得る。ＡＰＬＮＲアンタゴニストを含む薬学的組成物の「後」に投与される場合は、ＶＥＧＦアンタゴニストを含む薬学的組成物の投与の約１０分後、約１５分後、約３０分後、約１時間後、約２時間後、約４時間後、約６時間後、約８時間後、約１０時間後、約１２時間後、約２４時間後、約３６時間後、約４８時間後、約６０時間、約７２時間後、または約７２時間後に投与され得る。ＡＰＬＮＲアンタゴニストを含む薬学的組成物と「同時」に投与することは、ＶＥＧＦアンタゴニストが、ＡＰＬＮＲアンタゴニストを含む薬学的組成物の投与から５分に満たないうちに（前、後、または同時に）別々の投薬形態で対象に投与されるか、または、ＡＰＬＮＲアンタゴニストおよびＶＥＧＦアンタゴニストを含む単一の組み合わせ投与製剤として対象に投与されることを意味する。
【０１３２】
併用療法には、ＡＰＬＮＲアンタゴニストおよびＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、アフリベルセプト、ＶＥＧＦトラップ、例えば、米国特許第７，０８７，４１１号（本明細書では「ＶＥＧＦ阻害性融合タンパク質」とも呼ばれる）、抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、ラニビズマブなど）、ＶＥＧＦ受容体の小分子キナーゼ阻害剤（例えば、スニチニブ、ソラフェニブまたはパゾパニブ）などが含まれる。
【０１３３】
用語は、糖尿病性網膜症（増殖型糖尿病性網膜症を含む）、糖尿病性黄斑浮腫、加齢性黄斑変性、網膜血管新生、網膜中心静脈閉塞、網膜静脈分枝閉塞、ポリープ状脈絡膜血管症、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、変性近視（近視ＣＮＶ）、血管新生緑内障、および未熟児網膜症からなる群から選択される眼疾患または障害の少なくとも１つの症状または兆候を治療または改善するために、追加的または相乗的な活性のためにＶＥＧＦアンタゴニストと組み合わせてＡＰＬＮＲアンタゴニストを投与することを含む。
【０１３４】
容器および投与方法
種々の送達系が既知であり、本開示の薬学的組成物を投与するために使用することができ、例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセルにおける封入、変異ウイルスを発現することのできる組換え細胞、受容体媒介性エンドサイトーシスである（例えば、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２を参照されたい）。投与方法には、皮内経路、経皮経路、筋肉内経路、腹腔内経路、静脈内経路、硝子体内経路、皮下経路、鼻腔内経路、硬膜外経路および経口経路が含まれるが、これらに限定されない。組成物は、例えば、注入もしくはボーラス注射による、上皮もしくは粘膜皮膚内層（例えば、口腔粘膜、直腸および腸の粘膜など）を通じての吸収による任意の簡便な経路によって投与され得、他の生物学的に活性のある薬剤と共に投与され得る。
【０１３５】
眼疾患の治療のために、本開示の薬学的製剤は、例えば、点眼剤、結膜下注入、結膜下インプラント、硝子体内注入、硝子体内インプラント、テノン嚢下注入、またはテノン嚢下インプラントによって投与され得る。
【０１３６】
本開示の薬学的組成物は、標準的な針および注射器を用いて皮下にまたは静脈内に送達することができる。加えて、皮下送達に関して、ペン送達デバイスは、本開示の薬学的組成物を送達する上での適用を容易に有する。このようなペン送達デバイスは、再利用可能または使い捨て可能であり得る。再利用可能なペン送達デバイスは、概して、薬学的組成物を含有する交換可能なカートリッジを利用する。一度、カートリッジ内の薬学的組成物が全て投与され、カートリッジが空になると、この空のカートリッジは容易に廃棄することができ、薬学的組成物を含有する新しいカートリッジと容易に交換することができる。次に、ペン送達デバイスは再利用することができる。使い捨てのペン送達デバイスにおいて、交換可能なカートリッジは存在しない。むしろ、使い捨てペン送達デバイスは、このデバイス内の貯蔵器の中に保持された薬学的組成物が事前に充填されている。一度、貯蔵器が薬学的組成物に関して空になると、デバイス全体が廃棄される。
【０１３７】
特定の状況において、薬学的組成物は、徐放系で送達することができる。一実施形態において、ポンプを使用することができる。別の実施形態において、ポリマー材料を使用することができ、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），１９７４，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａを参照されたい。さらに別の実施形態において、徐放系を組成物の標的の近傍に配置することができ、それによって全身用量のほんの一部のみが必要となる（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，１９８４，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，ｓｕｐｒａ，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５−１３８を参照のこと）。他の徐放系は、Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：１５２７−１５３３による総説で論じられている。
【０１３８】
注入可能な調製物には、静脈内注入、皮下注入、皮内注入、および筋肉内注入、点滴注入などのための投薬形態が含まれ得る。これらの注入可能な調製物は、既知の方法により調製され得る。例えば、注入可能な調製物は、例えば、注入用に従来どおり使用される滅菌水性媒体または油性媒体中に上述の抗体またはその塩を溶解、懸濁または乳化させることによって調製され得る。注入用水性媒体としては、例えば、生理食塩水、グルコース含有等張液、および他の補助剤などがあり、これらは、アルコール（例えば、エタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤［例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（水素化ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０モル）付加物）］などの適切な可溶化剤と組み合わせて使用してもよい。油性媒体として、例えば、ゴマ油、ダイズ油などが使用され、ベンジルベンゾエート、ベンジルアルコールなどの可溶化剤と組み合わせて使用してもよい。このように調製された注射は、好ましくは適切なアンプルに充填される。
【０１３９】
有益なことに、上記に記載される経口または非経口での使用のための薬学的組成物は、有効成分の用量に適合するのに好適な単位用量の投薬形態へと調製される。単位用量におけるこのような投薬形態には、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル剤）、坐剤などが含まれる。
【０１４０】
本開示の薬学的製剤は、医薬品および他の治療組成物の保存または投与に好適な任意の容器内に含まれ得る。例えば、薬学的製剤は、バイアル、アンプル、注射器、カートリッジ、ボトル、またはＩＶバッグなどの規定された容積を有する、密封および滅菌されたプラスチックまたはガラス容器内に含まれ得る。例えば、透明および不透明（例えば、こはく色）のガラスまたはプラスチックバイアルを含む、異なる種類のバイアルを使用して、本開示の製剤を収容することができる。同様に、任意の種類の注射器を使用して、本開示の薬学的製剤を収容または投与することができる。
【０１４１】
本開示の薬学的製剤は、「通常のタングステン」注射器または「低タングステン」注射器内に含まれ得る。当業者には理解されるように、ガラス製注射器の製造プロセスは、一般的に、ガラスに穴を開け、液体を注射器から引き出され、排出されることができる穴を作製するように機能する高温タングステン棒の使用を含む。このプロセスにより、注射器の内面に微量のタングステンの堆積がもたらされる。その後の洗浄およびその他の処理ステップを使用して、シリンジ内のタングステンの量を減少させることができる。本明細書で使用される「通常のタングステン」という用語は、注射器が十億分の５００（ｐｐｂ）以上のタングステンを含むことを意味する。「低タングステン」という用語は、注射器が５００ｐｐｂ未満のタングステンを含むことを意味する。例えば、本開示による低タングステンシリンジは、約４９０、４８０、４７０、４６０、４５０、４４０、４３０、４２０、４１０、３９０、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０未満、またはそれよりも少ないｐｐｂのタングステンを含むことができる。
【０１４２】
注射器で使用されるゴム製プランジャ、およびバイアルの開口部を閉じるために使用されるゴム製ストッパは、注射器またはバイアルの医薬内容物の汚染を防ぐため、またはそれらの安定性を維持するために被覆され得る。したがって、本開示の薬学的製剤は、特定の実施形態によれば、被覆されたプランジャを含む注射器内、または被覆されたゴム栓で密封された注射器内に含まれ得る。例えば、プランジャまたはストッパは、フルオロカーボン膜で被覆され得る。本開示の薬学的製剤を含むバイアルおよび注射器と共に使用するのに好適な被覆されたストッパまたはプランジャの例は、例えば、米国特許第４，９９７，４２３号、第５，９０８，６８６号、第６，２８６，６９９号、第６，６４５，６３５号、第７，２２６，５５４において言及されており、その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。本開示の状況下で使用できる特定の例示的な被覆されたゴム製ストッパおよびプランジャは、Ｗｅｓｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｌｉｏｎｖｉｌｌｅ、Ｐａ．）から入手可能な商品名「ＦｌｕｒｏＴｅｃ（登録商標）」で市販されている。ＦｌｕｒｏＴｅｃ（登録商標）は、薬物がゴム表面に付着するのを最小限に抑えるか、または防止するために使用されるフルオロカーボンコーティングの例である。
【０１４３】
本開示の特定の実施形態によれば、薬学的製剤は、フルオロカーボン被覆されたプランジャを含む、低タングステン注射器内に含まれ得る。
【０１４４】
薬学的製剤は、注入（例えば、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内など）、または経皮、粘膜、鼻、肺もしくは経口投与などの腸管外経路によって対象に投与されることができる。多数の再利用可能なペンまたは自動注入器の送達デバイスを使用して、本開示の薬学的製剤を皮下送達することができる。例としては、ＡＵＴＯＰＥＮ（商標）（Ｏｗｅｎ  Ｍｕｍｆｏｒｄ，Ｉｎｃ．，Ｗｏｏｄｓｔｏｃｋ，ＵＫ）、ＤＩＳＥＴＲＯＮＩＣ（商標）ｐｅｎ（Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｅｒｇｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＨＵＭＡＬＯＧ  ＭＩＸ  ７５／２５（商標）ｐｅｎ、ＨＵＭＡＬＯＧ（商標）ｐｅｎ、ＨＵＭＡＬＩＮ  ７０／３０（商標）ｐｅｎ（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄ）、ＮＯＶＯＰＥＮ（商標）Ｉ，ＩＩおよびＩＩＩ（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＮＯＶＯＰＥＮ  ＪＵＮＩＯＲ（商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＢＤ（商標）ｐｅｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，Ｎ．Ｊ．）、ＯＰＴＩＰＥＮ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ  ＰＲＯ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ  ＳＴＡＲＬＥＴ（商標）、およびＯＰＴＩＣＬＩＫ（商標）（ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が含まれるが、これらに限定されない。本開示の薬学的組成物の皮下送達での用途を有する使い捨てペンまたは自動注入器の送達デバイスの例としては、ＳＯＬＯＳＴＡＲ（商標）ｐｅｎ（ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ）、ＦＬＥＸＰＥＮ（商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）、およびＫＷＩＫＰＥＮ（商標）（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ＳＵＲＥＣＬＩＣＫ（商標）自動注入器（Ａｍｇｅｎ，Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ，Ｃａｌｉｆ．）、ＰＥＮＬＥＴ（商標）（Ｈａｓｅｌｍｅｉｅｒ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＥＰＩＰＥＮ（Ｄｅｙ，Ｌ．Ｐ．）およびＨＵＭＩＲＡ（商標）ｐｅｎ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，Ｉｌｌ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４５】
本開示の薬学的製剤を送達するための微量注入器の使用もまた、本明細書において企図される。本明細書で使用される「微量注入器」という用語は、長期間（例えば、約１０、１５、２０、２５、３０分以上）にわたって量の多い（例えば、最大約２．５ｍＬ以上）治療製剤をゆっくりと投与するように設計された皮下送達デバイスを意味する。例えば、米国特許第６，６２９，９４９号、米国特許第６，６５９，９８２号、およびＭｅｅｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ４６：１０７−１１６（１９９６）を参照されたい。微量注入器は、高濃度（例えば、約１００、１２５、１５０、１７５、２００、またはそれ以上のｍｇ／ｍＬ）、または粘性溶液に含まれる、量の多い治療用タンパク質の送達に特に有益である。
【０１４６】
一実施形態において、薬学的製剤は、生理的に許容される溶液を含むＩＶバッグにおいて製剤が希釈されるように、ＩＶ点滴を介して投与される。一実施形態において、薬学的組成物は、静脈内輸液バッグ中の調合された滅菌製剤であり、薬物の単回投与量が、１００ｍＬ、２５０ｍＬ（または点滴静注送達に好適な他の同様の量）の生理的緩衝液内（例えば、０．９％生理食塩水）に希釈される。いくつかの実施形態において、輸液バッグは、ポリ塩化ビニル（例えば、ＶＩＡＦＬＥＸ，Ｂａｘｔｅｒ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，Ｉｌｌ．）で作製されている。いくつかの実施形態において、輸液バッグは、ポリオレフィン（ＥＸＣＥＬ  ＩＶ  Ｂａｇｓ，Ｂｒａｕｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｃ．，Ｂｅｔｈｌｅｈｅｍ，Ｐａ．）で作製されている。
【０１４７】
投与レジメン
本開示は、約１週に４回、約１週毎に２回、約１週毎に１回、約２週毎に１回、約３週毎に１回、約４週毎に１回、約５週毎に１回、約６週毎に１回、約８週毎に１回、約１２週毎に１回、もしくはそれよりも少ない治療応答が達成される限りの頻度での投与頻度で、抗ＡＰＬＮＲ抗体またはその抗原結合断片などのＡＰＬＮＲアンタゴニストを含む薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法を含む。特定の実施形態において、方法は、約１週に４回、約１週毎に２回、約１週毎に１回、約２週毎に１回、約３週毎に１回、約４週毎に１回、約５週毎に１回、約６週毎に１回、約８週毎に１回、約９週毎に１回、約１２週毎に１回、もしくはそれよりも少ない治療応答が達成される限りの頻度での投与頻度で、抗ＡＰＬＮＲ抗体またはその抗原結合断片などのＡＰＬＮＲアンタゴニストおよびＶＥＧＦアンタゴニストを含む、薬学的組成物の投与を伴う。
【０１４８】
本開示の特定の実施形態によれば、抗ＡＰＬＮＲ抗体、またはその抗原結合断片などのＡＰＬＮＲアンタゴニストおよびＶＥＧＦアンタゴニストの複数用量は、定義された時間経過にわたって対象に投与され得る。本開示のこの態様による方法は、抗ＡＰＬＮＲ抗体またはその抗原結合断片などのＡＰＬＮＲアンタゴニストおよびＶＥＧＦアンタゴニストの複数用量を対象に連続的に投与することを含む。本明細書で使用する場合、「連続的に投与する」とは、抗ＡＰＬＮＲ抗体またはその抗原結合断片などのＡＰＬＮＲアンタゴニストおよびＶＥＧＦアンタゴニストの各用量が、異なる時点、例えば、所定の間隔（例えば、数時間、数日間、数週間または数か月間）によって分けられた異なる日に対象へ投与されることを意味する。本開示は、抗ＡＰＬＮＲ抗体またはその抗原結合断片などのＡＰＬＮＲアンタゴニスト、およびＶＥＧＦアンタゴニストの単一の一次用量、それに続いて、抗ＡＰＬＮＲ抗体またはその抗原結合断片などのＡＰＬＮＲアンタゴニスト、およびＶＥＧＦアンタゴニストの１回以上の二次用量、ならびに任意で、それに続いて、抗ＡＰＬＮＲ抗体またはその抗原結合断片などのＡＰＬＮＲアンタゴニスト、およびＶＥＧＦアンタゴニストの１回の三次用量を対象に連続的に投与することを含む、方法を含む。
【０１４９】
本開示の特定の実施形態によれば、抗ＡＰＬＮＲ抗体またはその抗原結合断片などのＡＰＬＮＲアンタゴニスト、およびＶＥＧＦアンタゴニストを含む共製剤の複数用量は、定義された時間経過にわたって対象に投与され得る。本開示のこの態様による方法は、抗ＡＰＬＮＲ抗体またはその抗原結合断片などのＡＰＬＮＲアンタゴニストおよびＶＥＧＦアンタゴニストを含む共製剤の複数用量を対象に連続的に投与することを含む。本明細書で使用される「連続的投与する」とは、ＶＥＧＦアンタゴニストと組み合わせたＡＰＬＮＲアンタゴニストの各用量が、所定の間隔（例えば、数時間、数日間、数週間または数ヶ月間）により隔てられた異なる時点、例えば、異なる日に対象に投与されることを意味する。本開示は、ＡＰＬＮＲアンタゴニストおよびＶＥＧＦアンタゴニストを含む共製剤の単一の一次用量、それに続いて、共製剤化されたＡＰＬＮＲアンタゴニストおよびＶＥＧＦアンタゴニストの１回以上の二次用量、ならびに任意で、それに続いて、共製剤化されたＡＰＬＮＲアンタゴニストおよびＶＥＧＦアンタゴニストの１回以上の三次用量を対象に連続的に投与することを含む、方法を含む。
【０１５０】
「一次用量」、「二次用量」、および「三次用量」という用語は、投与の時系列を指す。したがって、「一次用量」とは、治療レジメンの開始時に投与される用量（「基準用量」とも称する）であり、「二次用量」とは、一次用量後に投与される用量であり、「三次用量」とは、二次用量後に投与される用量である。一次用量、二次用量、および三次用量は全て、同じ量のＡＰＬＮＲアンタゴニスト（またはＡＰＬＮＲアンタゴニストおよびＶＥＧＦアンタゴニストを含む共製剤）を含み得るが、一般には投与頻度の点から互いに異なり得る。しかし、特定の実施形態において、一次用量、二次用量および／または三次用量に含まれる量は、治療経過の間、互いに異なる（例えば、適宜上下に調整される）。ある特定の実施形態において、１回以上（例えば、１回、２回、３回、４回、または５回）の用量が治療レジメンの開始時において「負荷用量」として投与され、続いてより低い頻度に基づいて投与される後続用量（例えば、「維持用量」）が投与される。例えば、ＡＰＬＮＲアンタゴニスト（またはＡＰＬＮＲアンタゴニストおよびＶＥＧＦアンタゴニストを含む共製剤）は、約６ｍｇの負荷用量、それに続いて１回以上の維持用量で眼疾患または障害を有する対象に投与され得る。
【０１５１】
本開示の一例示的な実施形態において、各二次用量および／または三次用量は、直前の用量の１〜１４（例えば、１、１と１／２、２、２と１／２、３、３と１／２、４、４と１／２、５、５と１／２、６、６と１／２、７、７と１／２、８、８と１／２、９、９と１／２、１０、１０と１／２、１１、１１と１／２、１２、１２と１／２、１３、１３と１／２、１４、１４と１／２、またはそれ以上）週間後に投与される。本明細書で使用する「直前の用量」との語句は、複数回投与の系列において、用量の介入をせずに系列中の次の用量の投与前に対象に投与されるＡＰＬＮＲアンタゴニスト（またはＡＰＬＮＲアンタゴニストとＶＥＧＦアンタゴニストを含む共製剤）の用量を意味する。
【０１５２】
本開示のこの態様による方法は、任意の回数の二次および／または三次用量の抗ＡＰＬＮＲアンタゴニスト（またはＡＰＬＮＲアンタゴニストおよびＶＥＧＦアンタゴニストを含む共製剤）を対象に投与することを含み得る。例えば、ある特定の実施形態において、単回の二次用量のみが対象に投与される。他の実施形態において、２回以上（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回またはそれ以上）の二次用量が対象に投与される。同様に、ある特定の実施形態において、単回の三次用量のみが対象に投与される。他の実施形態において、２回以上（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回またはそれ以上）の三次用量が対象に投与される。
【０１５３】
複数回の二次用量を伴う実施形態において、各二次用量は他の二次用量と同じ頻度で投与され得る。例えば、各二次用量は、直前の用量の１〜２週間後に対象に投与され得る。同様に、複数回の三次用量を含む実施形態において、各三次用量は他の三次用量と同じ頻度で投与され得る。例えば、各三次用量は、直前の用量の２〜４週間後に対象に投与され得る。あるいは、二次用量および／または三次用量が対象へ投与される頻度は、治療レジメンの経過にわたって変動し得る。投与頻度はまた、臨床検査後の個々の対象の必要性に応じて、医師によって治療過程の間に調整され得る。
【０１５４】
本開示は、ＤＭＥ、ＡＭＤ、ＲＯＰ、またはＰＤＲを治療するための対象へのＡＰＬＮＲアンタゴニストおよびＶＥＧＦアンタゴニストの連続投与を含む、方法を含む。いくつかの実施形態において、本方法は、１回以上の用量のＡＰＬＮＲアンタゴニスト、続いて１回以上の用量のＶＥＧＦアンタゴニストを投与することを含む。特定の実施形態において、本方法は、単回投与のＶＥＧＦアンタゴニスト、続いて１回以上の用量のＡＰＬＮＲアンタゴニストを投与することを含む。
【実施例】
【０１５５】
以下の実施例は、本開示の方法および組成物をどのように作製および使用するかに関する完全な開示および説明を当業者に提供するために提示されており、本発明者らがそれらの開示とみなすことの範囲を限定することを企図するものではない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関して正確性を確保するための努力はなされたが、いくつかの実験上の誤差および偏差が考慮されるべきである。別段示されない限り、部分は重量部分であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気圧またはそれに近い圧力である。
【０１５６】
実施例１
本開示の選択する抗ＡＰＬＮＲ抗体のインビボ特性を評価するために、眼血管構造におけるＡＰＬＮＲ媒介血管形成を遮断するそれらの能力を測定した。
【０１５７】
網膜血管発達（ＲＶＤ）モデルを使用して、混合背景系統（７５％Ｃ５７ＢＬ６および２５％Ｓｖ１２９）であり、マウスＡＰＬＮＲの代わりにヒトＡＰＬＮＲの発現がホモ接合であるマウス仔（ヒト化ＡＰＬＮＲマウス）の正常な発達中の網膜における血管の伸長に対する拮抗性の抗ＡＰＬＮＲ抗体の効果を評価した。
【０１５８】
ヒト化（Ｈｕ）アペリンＲマウスは、２５ｍｇ／ｋｇおよび５０ｍｇ／ｋｇの抗アペリン受容体抗体（αＡＲ；Ｈ２ａＭ９２３２Ｎ）を出生後（Ｐ）２日目に全身的（ＩＰ）に注入された。試薬は、実験者の先入観を防ぐために盲検化され、溶液Ａおよび溶液Ｂとしてラベル化された。出生後５日目に組織試料を収集し、４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳで固定した。固定した組織試料（網膜内皮細胞）をＰＢＳで洗浄し、続いて０．２５％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００に１％ＢＳＡを含む１ｘＰＢＳで１：２００に希釈したＧＳレクチンＩ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，＃ＦＬ−１１０１）で染色し、２５℃で一晩、網膜血管構造を可視化した。翌日、染色された試料をＰＢＳで数回濯ぎ、スライド上に平らに乗せ、続いてＰｒｏｌｏｎｇ  Ｇｏｌｄ（（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃Ｐ３６９３０）を使用してカバーガラスを乗せた。画像は、落射蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ８０）を使用して２０倍の倍率で撮影した。網膜における血管新生化された面積を、拡張されたＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ６を使用して、このアッセイから取得した画像から測定した。網膜の血管面積の測定および統計分析が完了してようやく、試料の同一性を明らかにした。
【０１５９】
図１Ａおよび１Ｂは、Ｐ２〜Ｐ５で全身的に治療されたマウスの網膜の代表的な顕微鏡写真、および計算された血管面積のグラフである（画像は定量化のための２０倍、および４０倍であり、統計分析は、スチューデントＴ検定で行われた）。
【０１６０】
剰余な血管面積は、未治療の網膜と比較して、αアペリンＲ（２５ｍｇ／ｋｇで２３％、ｐ＜０．０５）の網膜において有意に小さかった。全身的な注入を介したアペリンＲの選択的阻害は、Ｐ５仔の発達中の網膜における正常な血管の伸長を遅延させた。２５ｍｇ／ｋｇの用量では、アペリンＲを遮断すると血管の伸長をわずかに阻害する。
【０１６１】
実施例２
ＲＶＤモデルにおける後続の実験は、最多の用量で実施例１と類似的に行われ、盲検化された審査者によって分析された。簡単に言えば、仔は、５０ｍｇ／ｋｇのＦｃ（対照）またはαＡＲをＩＰ注入された。図２Ａおよび２Ｂは、Ｐ２〜Ｐ５で全身的に治療されたマウスの網膜の代表的な顕微鏡写真、および計算された血管面積のグラフである。剰余な血管面積は、未治療の網膜と比較して、αアペリンＲ（５０ｍｇ／ｋｇで３５％、ｐ＜０．００５）の網膜において有意に小さかった。網膜内皮細胞は、ＧＳレクチンＩで染色した。画像は、２０倍（定量化のために）および４０倍で撮影した。統計分析は、スチューデントＴ検定で行った。全身的な注入を介したアペリンＲの選択的阻害は、Ｐ５仔の発達中の網膜における正常な血管の伸長を遅延させた。用量が５０ｍｇ／ｋｇの用量に増加することにより、標的化アペリンＲは網膜血管の伸長をさらに遅延する。
【０１６２】
実施例３
ＲＶＤモデルでの後続の実験（実施例１と類似的に実施された）において、Ｐ２  Ｈｕ仔は、５０ｍｇ／ｋｇのＦｃ、αＡＲ、またはアフリベルセプト、または組み合わせ（αＡＲおよびアフリベルセプト）をＩＰ注入され、Ｐ５で収集された。図３Ａおよび３Ｂは、Ｐ２〜Ｐ５で全身的に治療されたマウスの網膜の代表的な顕微鏡写真、および計算された血管面積のグラフである。この盲検研究において、５０ｍｇ／ｋｇのαアペリンＲは、Ｆｃで治療された対照と比較して、血管の成長を２９．８％（ｐ＜０．０００１）減少させた。網膜内皮細胞は、ＧＳレクチンＩで染色された。画像は、２０倍（定量化のために）および４０倍で撮影された。統計分析は、スチューデントＴ検定で行われた。全身的な注入を介したアペリンＲの選択的阻害は、Ｐ５仔の発達中の網膜における正常な血管の伸長を遅延する。
【０１６３】
実施例４
ＲＶＤモデルでの別の実験（実施例１と類似的に実施された）において、Ｐ４  Ｈｕの仔は、５μｇのＦｃ、αＡＲ、またはアフリベルセプト、または組み合わせ（αＡＲおよびアフリベルセプト）を硝子体内（ＩＶＴ）注入され、Ｐ６で収集された。図４Ａおよび４Ｂは、Ｐ２〜Ｐ５で全身的に治療されたマウスの網膜の代表的な顕微鏡写真、および計算された血管面積のグラフである。剰余な血管面積は、単一試薬でのαアペリンＲ（５０ｍｇ／ｋｇで３１％、ｐ＜０．００１）またはアフリベルセプト単独（５０ｍｇ／ｋｇで４３％、ｐ＜０．００５）と比較して、組み合わせ（αアペリンＲ＋アフリベルセプト）（５０ｍｇ／ｋｇで６２％、ｐ＜０．０００１）において有意に小さかった。網膜内皮細胞は、ＧＳレクチンＩで染色された。用量および相関的な血管新生化された面積への影響を記録する。画像は、２０倍（定量化のために）および４０倍で撮影された。統計分析は、事後テューキー検定を伴う一元配置分散分析を用いて行われた。全身的および硝子体内投与（以下の実施例５を参照されたい）の両方において、αアペリンＲおよびアフリベルセプトの併用療法は、正常な発達中の網膜血管構造の退縮をもたらした。全身的な注入を介してアペリンＲおよびＶＥＧＦＡの両方を遮断することは、アペリンＲ単独またはＶＥＧＦＡ単独を遮断することと比較して、血管の伸長を妨げるのにより効果的である。
【０１６４】
Ｐ２にαＡＲを注入することにより、血管の伸長は、Ｐ５で２５ｍｇ／ｋｇで２３％（ｎ＝６眼／群、ｐ＜０．０５）、５０ｍｇ／ｋｇで３５％（ｎ＝６眼／群、ｐ＜０．００５）減少された。盲検研究において、Ｆｃ対照と比較して血管の伸長において、２９％（１群あたりｎ＝５眼、ｐ＜０．０００１）の低減を伴う観察を確認することできた。
【０１６５】
ＩＰおよびＩＶＴ注入後のアペリンＲおよびＶＥＧＦＡの併用阻害は、血管の伸長を５０ｍｇ／ｋｇで６２％（１群あたりｎ＝４眼、ｐ＜０．０００１）、および５μｇで６８％（ｎ＝４眼／群、ｐ＜０．０００１）、有意に制限した。アフリベルセプト単独では、血管の伸長において５０ｍｇ／ｋｇで４３％の減少（ｎ＝４眼／群、ｐ＜０．００１）、および５μｇで６５％の減少（ｎ＝３眼／群、ｐ＜０．００５）をもたらした。また、αＡＲ単独では、血管の伸長において５０ｍｇ／ｋｇで３１％の減少（ｎ＝４眼／群  ｐ＜０．００１）、および５μｇで４３％の減少（ｎ＝４眼／群、ｐ＜０．００５）をもたらした。
【０１６６】
実施例５
別のＲＶＤ実験において、マウスは、ＩＶＴでαアペリンＲ（Ｈ２ａＭ９２３２Ｎ）（５μｇ）、アフリベルセプト（５μｇ）、またはαアペリンＲとアフリベルセプトとの組み合わせ（混合物）で治療された。図５Ａおよび５Ｂは、Ｐ４〜Ｐ６で硝子体内に注入されたマウスの網膜の代表的な顕微鏡写真、および計算された血管面積のグラフである。剰余な血管面積は、単一試薬でのαアペリンＲ（５μｇで４３％、ｐ＜０．０００１）またはアフリベルセプト単独（５μｇで６５％、ｐ＜０．０００１）と比較して、組み合わせ（αアペリンＲ＋アフリベルセプト）（５μｇで６８％、ｐ＜０．０００１）において有意に小さかった。用量および相関的な血管新生化された面積への影響を記録する。画像は、２０倍（定量化のために）および４０倍で撮影された。統計分析は、事後テューキー検定を伴う一元配置分散分析を用いて行われた。全身的および硝子体内投与の両方において、αアペリンＲおよびアフリベルセプトの併用療法は、正常な発達中の網膜血管構造の退縮をもたらす。硝子体内の注入を介してアペリンＲおよびＶＥＧＦＡの両方を遮断することは、アペリンＲまたはＶＥＧＦＡのみを遮断することと比較して、血管の伸長を妨げるのにさらに効果的である。
【０１６７】
実施例６
酸素誘発性虚血性網膜症（ＯＩＲ）のネズミ科モデルは、重要な血管形成誘導因子であるＶＥＧＦ（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．１９９４  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ３５：１０１−１１１、Ｎｅｅｌｙ  ｅｔ  ａｌ．１９９８  ＡｍＪ．Ｐａｔｈｏｌ  １５３：６６５−６７０、Ｓａｉｎｔ−Ｇｅｎｉｅｚ  ｅｔ  ａｌ．２００４  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ４８：１０４５−１０５８）の上昇された発現に関連する病理学的血管形成のよく特徴付けられたモデルであり、したがって多様な疾患状態（Ｆｅｒｒａｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．２００５  Ｎａｔｕｒｅ  ４３８：９６７−９７４）に関連する、病理学的血管形成に関連する。
【０１６８】
酸素誘発性虚血性網膜症（ＯＩＲ）における網膜血管の成長、血管異常体の形成、および網膜灌流に対する抗ＡＰＬＮＲ抗体の効果を決定するために調査が試みられた。
【０１６９】
アペリン／ＡＰＬＮＲシグナル伝達が病理学的血管形成だけでなく、通常の発達中に役割を果たすかを判断するために、ＯＩＲモデルが利用された。ＯＩＲモデルにおいて、Ｐ６での高酸素へのマウス仔の曝露は、網膜中心部の毛細血管の急速な消失をもたらす。Ｐ１１で室内気に戻った後、無血管領域は重度の低酸素状態になり、これが血管の硝子体への異所性の成長および異常な動静脈シャントの形成によって特徴付けされる広範で異常な血管新生を誘発し（網膜上血管「房」）、網膜の中心部は、長期間にわたって大部分が無血管のままである。
【０１７０】
Ｃ５７／Ｂｌ６マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）が使用され、ＯＩＲにおける網膜の血管新生に対するＶＥＧＦトラップまたは中和ＡＰＬＮＲ抗体の効果を研究する。ＯＩＲは、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．１９９４（前掲）によって開発された方法に従って生成された。簡単に言えば、ヒト化マウスの仔が、Ｐ６で高酸素環境（７５％Ｏ２）に配置され、Ｐ１１で室内気に戻された。高酸素への暴露は、網膜中心部における急速な血管閉塞を誘発する。マウスが室内気に戻されると（Ｐ１１）、網膜の中心部からの血管の喪失が重度の低酸素／虚血をもたらし、これが病理学的血管の変化を刺激する。仔は、Ｐ１２で５０ｍｇ／ｋｇのＦｃ（対照）、αアペリンＲ、またはアフリベルセプトを全身的に注入され、Ｐ１６で収集された。網膜内皮細胞は、ＧＳレクチンＩで染色された。
【０１７１】
図６Ａおよび６Ｂは、Ｐ１２〜Ｐ１６で全身的に治療されたＯＩＲマウスの網膜の代表的な顕微鏡写真、および計算された無血管面積のグラフである。剰余な無血管面積は、Ｆｃ（対照）の網膜と比較して、αアペリンＲ（２９％、ｐ＜０．０５）およびアフリベルセプト（２７．５％、ｐ＜０．０１）の網膜において有意に小さかった。αアペリンＲ（６７％、ｐ＜０．０００１）およびアフリベルセプト（９４％、ｐ＜０．０００５）で治療された試料において、Ｆｃと比較して血管新生房が有意に低減していることに注目されたい。網膜内皮細胞は、ＧＳレクチンＩで染色された。画像は、２０倍（無血管領域の定量化）および４０倍（異常血管新生領域の定量化）で撮影された。統計分析は、事後テューキー検定を伴う一元配置分散分析を用いて行われた。全身的および硝子体内投与の両方において、アペリンＲの選択的阻害は、網膜血管の再生を促進し、ＯＩＲマウスの血管新生を減少させる。全身的な注入を介したアペリンＲおよびＶＥＧＦＡの阻害は、網膜血管の再成を促進し、異常な血管新生が減少する。
【０１７２】
ＯＩＲマウスは、Ｐ１２で５μｇのＦｃ、αＡＲ、またはアフリベルセプトをＩＶＴ注入され、Ｐ１６で収集されたことを除いて、ＯＩＲマウスは、上記の調査と類似的に治療された。図７Ａおよび７Ｂは、Ｐ１２〜Ｐ１６で硝子体内に治療されたＯＩＲマウスの網膜の代表的な顕微鏡写真、および計算された無血管面積のグラフである。無血管面積は、Ｆｃ対照と比較して、αアペリンＲにおいて低減され（２７．５％、ｐ＜０．０５）、アフリベルセプトにおいて増加された（３２％、ｐ＜０．０００１）。αアペリンＲにおける血管新生房の有意な低減（６０％、ｐ＜０．０００１）、およびアフリベルセプト試料の房の完全な消失に注目されたい。網膜内皮細胞は、ＧＳレクチンＩで染色された。画像は、２０倍（無血管領域の定量化）および４０倍（異常血管新生領域の定量化）で撮影された。統計分析は、事後テューキー検定を伴う一元配置分散分析を用いて行われた。全身的および硝子体内投与の両方において、アペリンＲの選択的阻害は、網膜血管の再生を促進し、ＯＩＲマウスの血管新生を減少させる。硝子体内の注入を介したアペリンＲの阻害は、血管の再生を改善し、異常な血管新生を低減させ、一方でＶＥＧＦＡ阻害は、血管の再生を抑制し、血管新生を完全に停止する。
【０１７３】
ＯＩＲモデルにおいて、αＡＲおよびアフリベルセプトは、血管の再成長を促進することができた。仔がＯＩＲ  Ｐ１２でＩＰ注入された場合、αＡＲおよびアフリベルセプトは、Ｐ１６でそれぞれ血管面積を２９％および２７％（ｎ＝６眼／群、ｐ＜０．０５）、血管新生を６９％および９４％（ｎ＝６眼／群、ｐ＜０．０００１）有意に減少させた。ＩＶＴ投与により、アフリベルセプトは血管の再成長を３０％減少させ（ｎ＝４眼／群、ｐ＜０．０００１）、全ての血管新生を排除した一方で、αＡＲは血管の再成長を３０％促進し（ｎ＝４眼／群、ｐ＜０．０５）、血管新生を６０％減少させる（ｎ＝４眼／群、ｐ＜０．０００１）ことができた。
【０１７４】
実施例７において論じられるように、ＡＰＬＮＲアンタゴニストと例えば、アフリベルセプトのようなＶＥＧＦトラップとの組み合わせも病理学的血管新生を退行させ、ＯＩＲモデルにおいて正常な血管再生を促進させた。したがって、この組み合わせは、未熟児網膜症を含む様々な眼疾患において見られる病理学的血管新生を治療することが期待される。
【０１７５】
実施例７
さらなる生体内実験において、実施例６で上述されたＯＩＲモデルが使用され、血管再生の組織化および密度を評価する。簡単に言えば、ヒト化マウスの仔が、Ｐ６で高酸素環境（７５％Ｏ２）に配置され、Ｐ１１で室内気に戻された。高酸素への暴露は、網膜中心部における急速な血管閉塞を誘発する。マウスが室内気に戻されると（Ｐ１１）、網膜の中心部からの血管の喪失が重度の低酸素／虚血をもたらし、これが病理学的血管の変化を刺激する。仔は、Ｐ１２で５０ｍｇ／ｋｇのＦｃ（対照）、αＡＰＬＮＲ（Ｈ４Ｈ９２３２Ｎ）、もしくはアフリベルセプト（ＶＥＧＦトラップ）、または２５ｍｇ／ｋｇのαＡＰＬＮＲとアフリベルセプトとの組み合わせを全身的に注入され、Ｐ１６で収集された。網膜内皮細胞は、ＧＳレクチンＩで染色された。
【０１７６】
図８Ａおよび８Ｂは、Ｐ１２〜Ｐ１６で全身的に治療されたＯＩＲマウスの網膜の代表的な顕微鏡写真（２０倍）、および計算された無血管面積のグラフである。併用療法での再成率は各薬剤単独と同様であり、そのため、血管の再成はｈＦｃで治療された対照の網膜と比較して全ての治療条件で改善され、併用療法は平均無血管面積がわずかに、より低減されることを示している。図８Ｂは、治療群間で無血管領域に有意な変化が存在したことを示す（ｐ＜０．０００５）。血管面積は、Ｆｃ対照と比較して、抗ＡＰＬＮＲ抗体（＊＊、ｐ＜０．０５）、ＶＥＧＦトラップ（＊＊＊、ｐ＜０．００５）、および組み合わせ（＊＊＊、ｐ＜０．０５）で有意に低減された。統計分析は、事後テューキー検定を伴う一元配置分散分析を用いて行われた。
【０１７７】
図９Ａおよび９Ｂは、Ｐ１２〜Ｐ１６で全身的に治療されたＯＩＲマウスの網膜の代表的な顕微鏡写真（４０倍）、および計算された異常な血管面積のグラフである。併用治療は、ＶＥＧＦトラップと比較して剪定された血管がわずかであり、抗ＡＰＬＮＲおよびＦｃ対照と比較して異常な血管新生がわずかであることを示す（図９Ａ）。図９Ｂは、治療群間で異常な血管面積に有意な変化が存在したことを示す（ｐ＜０．０００５）。異常な血管面積は、Ｆｃ対照と比較して、抗ＡＰＬＮＲ（＊＊＊、ｐ＜０．０００５）、ＶＥＧＦトラップ（＊＊＊、ｐ＜０．００５）、および組み合わせ（＊＊＊、ｐ＜０．０００５）で有意に低減された。異常な血管面積は、抗ＡＰＬＮＲ治療群と比較して、併用治療群においてさらに有意に低減された（＊、ｐ＜０．０５）。統計分析は、事後テューキー検定を伴う一元配置分散分析を用いて行われた。
【０１７８】
図１０は、血管面積および血管長を計算するために使用された、画像処理および測定技術の代表である。「起源の画像」は、図９Ａにおいて示された４０倍の顕微鏡写真である。「閾値画像」および「二値画像」は、以下の図１１Ａ、１１Ｂ、１２Ａ、および１２Ｂに関連してより詳細に論じられる。
【０１７９】
図１１Ａおよび１１Ｂは、Ｐ１２〜Ｐ１６で全身的に治療されたＯＩＲマウスの網膜の顕微鏡写真（４０倍）および計算された血管面積のグラフから、血管の組織化および均一性を示す代表的な処理された画像である。図１１Ａに示すように、抗ＡＰＬＮＲ抗体とＶＥＧＦトラップとの組み合わせは、抗ＡＰＬＮＲ単独と比較して、より組織化され均一な網膜血管を生成し、ＶＥＧＦトラップ単独と比較して、散在がより少ない（剪定された血管がわずかである）。図１１Ｂは、治療群間で血管面積において有意な変化が存在した（ｐ＜０．０００５）ことを示す。血管面積は、Ｆｃ対照と比較して、抗ＡＰＬＮＲを用いた場合で有意に増加され（＊＊＊、ｐ＜０．０００５）、ＶＥＧＦトラップ（＊＊＊、ｐ＜０．００５）、および併用治療（＊、ｐ＜０．０５）を用いた場合で低減された。血管面積は、抗ＡＰＬＮＲと比較して、ＶＥＧＦトラップを用いた場合（＃＃＃＃、ｐ＜０．０００５）、および組み合わせを用いた場合（＃＃＃＃、ｐ＜０．０００５）で有意に低減された。対照的に、血管面積は、ＶＥＧＦトラップと比較して、併用治療で有意に増加した（＆＆＆、ｐ＜０．００５）。統計分析は、事後テューキー検定を伴う一元配置分散分析を用いて行われた。
【０１８０】
図１２Ａおよび１２Ｂは、Ｐ１２〜Ｐ１６で全身的に治療されたＯＩＲマウスの網膜の顕微鏡写真（４０倍）からの血管の密度、および計算された血管長を示す代表的な処理された画像である。図１２Ａにおいて示されるように、抗ＡＰＬＮＲ抗体とＶＥＧＦトラップとの組み合わせは、抗ＡＰＬＮＲ（より高い密度）またはＶＥＧＦトラップ（より低い密度）単独と比較して、中間密度の網膜血管を生成した。図１２Ｂは、治療群間の血管長において有意な変化が存在したことを示す（ｐ＜０．０００５）。血管長は、抗ＡＰＬＮＲと比較して、ＶＥＧＦトラップを用いた場合（＃＃＃＃、ｐ＜０．０００５）、および組み合わせを用いた場合（＃＃＃＃、ｐ＜０．０００５）で有意に低減された。対照的に、血管長は、ＶＥＧＦトラップと比較して、併用治療で有意に増加した（＆＆＆、ｐ＜０．００５）。統計分析は、事後テューキー検定を伴う一元配置分散分析を用いて行われた。
【０１８１】
図８Ａ〜１２Ｂで示され、上記で論じられたように、Ｆｃ対照と比較して、抗ＡＰＬＮＲ抗体とＶＥＧＦトラップとの組み合わせは血管再生を促進し、無血管面積の低減をもたらす。さらに、併用治療は、抗ＡＰＬＮＲ抗体またはＶＥＧＦトラップ単独治療と比較して、病理学的血管新生を阻害し、血管面積および血管長に中間的な効果を生じさせ、特に、併用治療は、ＶＥＧＦトラップ治療と比較して主要な血管間の微小血管の成長を促進し、抗ＡＰＬＮＲ抗体治療と比較して血管の組織化および均一性を改善する。
【０１８２】
本開示は、本明細書に記載された特定の実施形態によって範囲が限定されるべきではない。実際、本明細書に記載されたものに加えて本開示の様々な修正は、前述の記載および添付の図から当業者には明らかであろう。かかる修正は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが企図されている。
【図１Ａ】
2020518641.tif 000003
【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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