(57)【要約】本発明は、全セルフリーＤＮＡ（例えば移植対象からのもの）の量を評価するための方法および組成物に関する。本明細書において提供される方法および組成物は、対象における感染、心停止および死亡を含む移植の後の合併症のリスクを決定するために用いることができる。
2020524519.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
移植対象からの試料を評価する方法であって、
（ａ）対象からの試料中の全ｃｆ−ＤＮＡの量を決定すること、ここで、対象は、移植合併症を有するか、これを有することが疑われるか、これを既に有しているか、またはこれを有するリスクがある；ならびに
（ｂ）全ｃｆ−ＤＮＡの量を報告および／または記録すること
を含む、前記方法。
【請求項２】
（ｃ）全ｃｆ−ＤＮＡの量を、全ｃｆ−ＤＮＡの閾値または少なくとも１つの前の全ｃｆ−ＤＮＡ量と比較すること
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｄ）全ｃｆ−ＤＮＡの閾値および／または少なくとも１つの前の全ｃｆ−ＤＮＡ量と比較して決定した全ｃｆ−ＤＮＡの量に基づいて、対象が、移植合併症を有すること、または移植合併症のリスクが増大しているものと決定すること、
をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
移植対象を評価する方法であって、
（ａ）対象からの試料中の全ｃｆ−ＤＮＡの量を得ること、ここで、対象は、移植合併症を有するか、これを有することが疑われるか、これを既に有しているか、またはこれを有するリスクがある；
（ｂ）全ｃｆ−ＤＮＡの量を、全ｃｆ−ＤＮＡの閾値および／または少なくとも１つの前の全ｃｆ−ＤＮＡ量と比較すること；ならびに
（ｃ）全ｃｆ−ＤＮＡの閾値および／または少なくとも１つの前の全ｃｆ−ＤＮＡ量と比較して決定された全ｃｆ−ＤＮＡの量に基づいて、対象のための処置またはモニタリングレジメンを決定すること
を含む、前記方法。
【請求項５】
全ｃｆ−ＤＮＡの閾値および／または少なくとも１つの前の全ｃｆ−ＤＮＡ量と比較して決定された全ｃｆ−ＤＮＡの量に基づいて、対象を、移植合併症を有するものとして、または移植合併症を有するリスクが増大しているものとして、分類することをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
対象が、機械的サポートを受けているかまたはこれを必要としている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
対象が、移植合併症を有すると決定されている、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前に対象に適用された１つ以上のさらなる検査により、対象が移植合併症を有すると決定されたか、または対象に対する１つ以上のさらなる検査を行うことをさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ドナー特異的ｃｆ−ＤＮＡの量を決定または比較することなく、評価または決定が行われる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
移植合併症が、心停止、感染または死亡である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
全ｃｆ−ＤＮＡ量が、レポートにおいて提供される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
また対象からの試料中のものであった少なくとも１つの前の全ｃｆ−ＤＮＡの量も含むレポートにおいて、量が提供される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
全ｃｆ−ＤＮＡ量が、データベースにおいて記録される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
データベースがまた、対象からの試料中のものであった少なくとも１つの前の全ｃｆ−ＤＮＡの量を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法であって、全ｃｆ−ＤＮＡの量が、
（ａ）複数の単一ヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ）標的について、試料またはその一部に対して、少なくとも２組のプライマーペアにより、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）定量アッセイなどの増幅ベースの定量アッセイを行うこと、ここで、各々のプライマーペアは、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、ここで、少なくとも２組のプライマーペアのうちの一方は、プライマー中に、ＳＮＶ標的の一方のアレルと比較して３’の最後から２番目にミスマッチを含むが、該ＳＮＶ標的の別のアレルと比較して３’の二重のミスマッチは含まず、該ＳＮＶ標的の一方のアレルを特異的に増幅し、少なくとも２組のプライマーペアの他方は、該ＳＮＶ標的の他方のアレルを特異的に増幅する、ならびに
（ｂ）結果に基づいて全ｃｆ−ＤＮＡの量を評価すること
により決定されるかまたは得られる、前記方法。
【請求項１６】
ドナーの遺伝子型が既知である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ドナーの遺伝子型が不明である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
全ｃｆ−ＤＮＡの量は、増幅ベースの定量アッセイを用いて決定するかまたは得られる、１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
増幅ベースの定量アッセイが、定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
全ｃｆ−ＤＮＡの量が、配列決定、例えばハイスループットな配列決定または次世代配列決定を用いて決定するかまたは得ることができる、１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
８または９ｎｇ／ｍＬまたはそれより多い量が、心停止または死亡のリスクを表す、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
２０ｎｇ／ｍＬまたはそれより多い量が、感染または増大した感染のリスクの存在を表す、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
少なくとも１つの量が、臓器移植の後４、５、６、７または８日以内に対象から採取された試料において決定される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
閾値よりも高いか、および／またはより早い時点からの量と比較して増大した全ｃｆ−ＤＮＡの量が、増大したリスク、または増大中のリスクを表す、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
閾値よりも低いか、および／またはより早い時点からの量と比較して低下した全ｃｆ−ＤＮＡの量が、低下したリスク、または低下中のリスクを表す、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
モニタリングレジメンを決定することは、対象において全ｃｆ−ＤＮＡの量を経時的にもしくはその後の時点において決定すること、または対象にかかるモニタリングを示唆することを含む、請求項４〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
対象を、１ヵ月ごと、または２ヵ月ごとに評価する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
対象を、６ヵ月まで、８ヵ月まで、１０ヵ月まで、または１年までにわたり評価する、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
閾値、またはより早い時点からの量と比較して全ｃｆ−ＤＮＡの量が増大する場合、試料採取の間の時間が短縮される、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
全ｃｆ−ＤＮＡのさらなる量を、記録または報告する、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
さらなる量が、レポートにおいて報告される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
さらなる量が、データベースにおいて記録される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
モニタリングレジメンを決定することが、対象を評価するために、１つ以上のさらなる検査を使用すること、またはこれの使用を示唆することを含む、請求項４〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
処置レジメンを決定することが、対象のための処置を選択または示唆することを含む、請求項４〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
処置レジメンを決定することが、対象を処置することを含む、請求項４〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
処置が、本明細書において提供される処置のいずれか１つを含む、請求項４〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
処置レジメンを決定することが、処置についての情報を対象に提供することを含む、請求項４〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
処置が、抗感染処置である、請求項４〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
処置が、抗拒絶処置である、請求項４〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
処置が、心停止処置である、請求項４〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
試料が、血液、血漿または血清試料である、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
血液試料が、血漿試料である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
移植対象が、心臓移植対象である、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１７年６月２０日に出願された米国仮出願番号６２／５２２，５３３、２０１７年１０月１５日に出願された米国仮出願番号６２／５７２，５５６に対する、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９下における優先権の利益を主張し、これらの各々の全内容は、本明細書において参照として組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
発明の分野
本発明は、移植対象からの試料中の全セルフリー核酸の量を評価するための方法および組成物に関する。かかる量は、移植に関連する１つ以上の合併症のリスクを決定するために用いることができる。本発明はさらに、移植合併症のリスクの評価のために、多重最適化ミスマッチ増幅（multiplexed optimized mismatch amplification：ＭＯＭＡ）などのアッセイ、および／または配列決定技術を用いて、全セルフリーデオキシリボ核酸（ｃｆ−ＤＮＡ）の量を評価するための方法および組成物に関する。
【発明の概要】
【０００３】
発明の要旨
本開示は、少なくとも部分的に、臓器移植などの移植の後の合併症のリスクが、全セルフリーＤＮＡの量と相関しているという驚くべき発見に基づく。試料中の全セルフリーＤＮＡを定量するための多様な手段のいずれか１つを用いて、感染、心停止および死亡を含む移植合併症のリスクを決定すること、ならびにこれを経時的にモニタリングすることができる。
【０００４】
本明細書において提供されるのは、かかる決定に関する方法、組成物およびキットである。方法、組成物、またはキットは、それぞれ、本明細書において提供される方法、組成物、またはキットのいずれか１つであってよく、これは、例または図面のもののいずれか１つを含む。
【０００５】
提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法は、対象から試料を得ることをさらに含む。
一態様において、本明細書において提供される方法についての態様のいずれか１つは、提供される組成物、キットまたはレポートのいずれか１つについての態様であってよい。一態様において、本明細書において提供される組成物、キットまたはレポートについての態様のいずれか１つは、本明細書において提供される方法のいずれか１つについての態様であってよい。
【０００６】
一側面において、本明細書において提供される量の１つ以上を含む、レポートまたはデータベースが提供される。
一側面において、本明細書において提供される方法のうちのいずれか１つが提供される。本明細書において提供される方法のうちのいずれか１つの一態様において、特定のリスクまたは合併症の指標である量は、本明細書において記載されるカットポイントまたはその範囲のいずれか１つである。本明細書において提供される方法のうちのいずれか１つの一態様において、試料を得るための時間は、本明細書において記載される時間のいずれか１つである。本明細書において提供される方法のいずれか１つの一態様において、対象は、本明細書において記載される対象のいずれか１つである。
【０００７】
一側面において、全セルフリーＤＮＡおよび／もしくはドナー特異的セルフリーＤＮＡの量または本明細書において提供される分析の方法のいずれか１つに基づいて、対象を処置する、対象のための処置レジメンを決定する、または対象に対する処置についての情報を提供する方法が提供される。かかる方法のいずれか１つの一態様において、方法は、対象を処置するステップ、または対象に対する処置についての情報を提供するステップを含む。処置の方法のいずれか１つの一態様において、処置は、本明細書において提供される処置のいずれか１つであってよい。処置の方法のいずれか１つの一態様において、処置は、本明細書において提供される状態のいずれか１つのためのものである。その例は、本明細書において提供されるか、さもなければ当業者に公知である。
一側面において、本明細書において提供される方法のいずれか１つは、心臓移植対象などの移植対象を処置する方法であってよい。
【０００８】
添付の図面は、原寸において描写されることは意図されていない。図面は、単なる説明であり、本開示の実施可能用件のために必要とされるものではない。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、ＭＯＭＡプライマーの例示的な非限定的な図を提供する。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイにおいて、ＳＮＶ  Ａを含む配列の伸長が起こることが期待され、これはＳＮＶ  Ａの検出がもたらし、これはその後定量することができる。しかし、ＳＮＶ  Ｂの伸長は、二重ミスマッチに起因して起こらないと期待される。
【図２】図２は、これによりいくつかの態様を作動させることができるコンピューターシステムの例を説明する。
【図３】図３は、異なる試料の全セルフリーＤＮＡ（ｃｆ−ＤＮＡ）、および対象が試料採取の時点において感染のための処置を受けていたか否かを表すグラフである。
【図４】図４は、異なる試料の全セルフリーＤＮＡ（ｃｆ−ＤＮＡ）、および各々の対象が心停止に至った（１）か否か（０）を表すグラフである。
【図５】図５は、異なる試料の全セルフリーＤＮＡ（ｃｆ−ＤＮＡ）、および各々の対象が死亡したか（１）または生存したか（０）を表すグラフである。
【００１０】
【図６】図６は、各々の対象からの最後の試料（Ｎ＝８８）を用いた、感染についてのカットポイント（閾値）の実験による決定を示すグラフである。
【図７】図７は、機械的サポートを受けている対象を除外した全ｃｆ−ＤＮＡ（Ｎ＝２９２）を用いた、感染についてのカットポイント（閾値）の実験による決定を示すグラフである。
【図８】図８は、２９８の試料からの全ｃｆ−ＤＮＡを用いた、心停止についてのカットポイント（閾値）の実験による決定を示すグラフである。
【図９】図９は、２９２の試料からの全ｃｆ−ＤＮＡを用いた、心停止についてのカットポイント（閾値）の実験による決定を示すグラフである。機械的サポートを受けている対象からの試料は、分析から除外した。
【図１０】図１０は、２９８の試料からの全ｃｆ−ＤＮＡを用いた、死亡についてのカットポイント（閾値）の実験による決定を示すグラフである。
【００１１】
【図１１】図１１は、全ｃｆ−ＤＮＡを用いた、死亡についてのカットポイント（閾値）の実験による決定を示すグラフである。機械的サポートを受けている対象からの試料は、分析から除外した。
【図１２】図１２は、各々の対象からの最後の試料からの全ｃｆ−ＤＮＡ（Ｎ＝８８）を用いた、死亡についてのカットポイント（閾値）の実験による決定を示すグラフである。
【図１３】図１３は、２９８の試料からの全ｃｆ−ＤＮＡを用いた、感染についてのカットポイント（閾値）の実験による決定を示すグラフである。
【図１４】図１４は、各々の対象の最後の試料からの全ｃｆ−ＤＮＡ（Ｎ＝８８）を用いた、心停止についてのカットポイント（閾値）の実験による決定を示すグラフである。
【図１５】図１５は、８５の試料からの全ｃｆ−ＤＮＡを用いた、死亡についてのカットポイント（閾値）の実験による決定を示す表である。
【００１２】
【図１６】図１６は、８５の試料からの全ｃｆ−ＤＮＡを用いた、死亡についてのカットポイント（閾値）の実験による決定を示す、図９１の結果のグラフ表示である。
【図１７】図１７は、８５の試料からの全ｃｆ−ＤＮＡを用いた、心停止についてのカットポイント（閾値）の実験による決定を示す表である。
【図１８】図１８は、８５の試料からの全ｃｆ−ＤＮＡを用いた、心停止についてのカットポイント（閾値）の実験による決定を示す、図９３の結果のグラフ表示である。
【図１９】図１９は、２９２の試料からの全ｃｆ−ＤＮＡを用いた、感染（すなわち、対象が試料採取の時点において感染のための処置を受けていたか否か）についてのカットポイント（閾値）の実験による決定を示す表である。
【図２０】図２０は、２９２の試料からの全ｃｆ−ＤＮＡを用いた、感染（すなわち、対象が試料採取の時点において感染のための処置を受けていたか否か）についてのカットポイント（閾値）の実験による決定を示す、図９５の結果のグラフ表示である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
発明の詳細な説明
全セルフリーＤＮＡ（全ｃｆ−ＤＮＡ）は、移植合併症と相関し、結果として、対象を評価および／またはモニタリングするために用いることができることを見出した。合併症として、これらに限定されないが、感染、心停止および／または死亡が挙げられる。したがって、本開示の側面は、少なくとも部分的に、移植合併症またはそれに関連するリスクを評価または決定するために、試料中の全ｃｆ−ＤＮＡを定量する方法に関する。いくつかの態様において、対象は、機械的サポート（例えば人工呼吸器）を受けていてもよく、本明細書において提供される方法のいずれか１つによりモニタリングすることができる。
【００１４】
本明細書において用いられる場合、「セルフリーＤＮＡ」（または「ｃｆ−ＤＮＡ」）とは、対象の細胞の外側に、例えば血液、血漿、血清、尿などにおいて存在するＤＮＡである。いかなる特定の理論または機序によっても拘束されることは望まないが、ｃｆ−ＤＮＡは、例えば細胞のアポトーシスを介して、細胞から放出されると考えられる。「セルフリーＤＮＡ」（または「ｃｆ−ＤＮＡ」）とは、細胞の外側、例えば対象の血液、血漿、血清、尿などにおいて存在するＤＮＡである。「全セルフリーＤＮＡ」（または「全ｃｆ−ＤＮＡ」）は、試料中に存在するｃｆ−ＤＮＡの量であって、移植レシピエントからの試料を評価する場合、ドナーおよびレシピエントの両方のｃｆ−ＤＮＡを含み得る。本明細書において用いられる場合、本明細書において提供される組成物および方法は、全セルフリーＤＮＡの量、および対象の移植に関連する合併症リスクを決定するために用いることができる。
【００１５】
本明細書において提供されるのは、全ｃｆ−ＤＮＡを測定するために用いることができる方法および組成物であって、これは、したがって、対象の移植に関連する合併症のリスクを評価するために用いることができる。本明細書において用いられる場合、「移植」は、レシピエントの損傷を受けたかまたは欠損している臓器または組織を置き換えることを目的として、ドナーからレシピエントに臓器または組織を移動することを指す。本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つは、臓器または組織の移植を受けた対象からの試料に対して用いてもよい。いくつかの態様において、移植は、心臓移植である。
【００１６】
重要なことに、全ｃｆ−ＤＮＡの量は、移植合併症のリスクを評価または決定するために用いることができる。移植合併症として、心停止、感染および死亡が挙げられる。本明細書において提供される場合、方法のいずれか１つを用いて、移植合併症を有するか、またはこれを有することが疑われる対象を評価することができる。.本明細書において用いられる場合、「有することが疑われる」とは、それにより対象が特定の状態、例えば移植合併症を有する可能性が存在すると医師が信じる対象を指す。本明細書において提供される方法のいずれか１つの一態様において、対象は、移植合併症を有するもの、または移植合併症を有する可能性が存在すると医師が信じるものであってよい。いくつかの態様において、移植合併症を有していたか、またはこれを有するリスクがある対象を評価するために、方法のいずれか１つを用いることができる。対象は、症状（および／またはその不在）に基づいて、移植合併症を有することが疑われるか、これを有していたことが決定されているか、またはこれを有する可能性もしくはリスクを有することが決定されているものであってよい。しかし、いくつかの態様において、対象は、１つ以上の他の検査に基づいて、移植合併症を有することが疑われるか、これを有していたことが決定されているか、またはこれを有する可能性もしくはリスクを有することが決定されているものである。かかる態様において、本明細書において提供される方法は、かかる知見を確認するか、またはかかる対象を状態の悪化または改善についてモニタリングするために用いることができる。
【００１７】
対象は、１つ以上の全ｃｆ−ＤＮＡの量を決定するかまたはこれを得ることにより、評価することができる。全ｃｆ−ＤＮＡの量は、本明細書において別の場所で提供されるものなどの実験技術を用いて決定することができる。「得ること」とは、本明細書において用いられる場合、それによりそれぞれの情報または材料を得ることができる任意の方法を指す。したがって、それぞれの情報は、実験方法により得ることができる。それぞれの材料は、いくつかの態様において、多様な実験または研究方法を用いて作製、設計などを行うことができる。それぞれの情報または材料はまた、レポートなどの情報、または材料を与えられるかまたはこれを提供されることにより得ることができる。いくつかの態様において、材料は、商業的手段を通して（すなわち、購入することにより）与えられるかまたは提供されてもよい。
【００１８】
ｃｆ−ＤＮＡなどの核酸の量および移植条件との相関を決定する能力に起因して、本明細書において提供される方法および組成物は、対象を評価するために用いることができる。したがって、拒絶の合併症を改善するかまたは悪化させるリスクを、かかる対象において決定することができる。「リスク」とは、本明細書において提供される場合、対象における任意の望ましくない状態の存在または不在または進行、またはかかる状態の存在または不在または進行の可能性の増大を指す。本明細書において提供される場合、「リスクの増大」とは、対象における任意の望ましくない状態の存在または進行、またはかかる状態の存在または進行の可能性の増大を指す。本明細書において提供される場合、「リスクの低下」とは、対象における任意の望ましくない状態または進行の不在、またはかかる状態の存在または進行（または不在または非進行の可能性の増大）の可能性の低下を指す。
【００１９】
本明細書において提供される場合、移植合併症の早期検出またはモニタリングは、処置を容易にし、臨床成績を改善し得る。上述のとおり、提供される方法のいずれか１つは、移植合併症を有するか、またはこれを有することが疑われる対象に対して行うことができる。かかる方法は、対象を、処置と共に、または処置することなく、経時的にモニタリングするために用いることができる。さらに、かかる方法は、処置または治療の選択、投与および／またはモニタリングを補助することができる。したがって、本明細書において提供される方法は、処置またはモニタリングのレジメンを決定するために用いることができる。対象は、本明細書において提供される対象のいずれか１つであってよい。本明細書において提供される方法のいずれか１つの一態様において、対象は、機械的サポートを受けているもの、または機械的サポートの必要があるものである。
【００２０】
「処置レジメンを決定すること」、本明細書において用いられる場合、対象の処置の行為のコースの決定を指す。本明細書において提供される方法のいずれか１つの一態様において、処置レジメンを決定することは、対象に提供されるべき適切な治療に関する適切な治療または情報を決定することを含む。本明細書において提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、決定することは、対象に対する適切な治療に関して適切な治療または情報を提供することを含む。本明細書において用いられる場合、処置または治療またはモニタリングに関する情報は、書面の形態または電子形態において提供されてもよい。いくつかの態様において、情報は、コンピューター可読の指示として提供されてもよい。いくつかの態様において、情報は、口頭で提供されてもよい。
【００２１】
処置は、決定される合併症リスクに基づいて示される任意の処置を含む。一態様において、処置は、心停止処置である。心停止処置として、例えば、血圧の医薬、不随意神経系遮断薬、および抗不整脈剤が挙げられる。さらに、対象を冠動脈カテーテルで処置しても、および／または心臓除細動器（cardioverter-defibrillator）を移植してもよい。
【００２２】
別の態様において、処置は、感染のための処置であってよい。いくつかの態様において、感染を処置するための治療として、細菌、真菌および／またはウイルス感染を処置するための治療が挙げられる。かかる治療は、抗生物質を含む。他の例として、これらに限定されないが、抗アメーバ薬、アミノグリコシド、駆虫剤、抗真菌剤、アゾール抗真菌剤、エキノカンディン、ポリエン、ジアリールキノリン、ヒドラジド誘導体、ニコチン酸誘導体、リファマイシン誘導体、ストレプトマイシス誘導体、抗ウイルス剤、ケモカイン受容体アンタゴニスト、インテグラーゼ鎖伝達阻害剤（integrase strand transfer inhibitor）、ノイラミニダーゼ阻害剤、ＮＮＲＴＩ、ＮＳ５Ａ阻害剤、ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）、プロテアーゼ阻害剤、プリンヌクレオシド、カルバペネム、セファロスポリン、グリシルサイクリン（glycylcycline）、抗らい薬（leprostatic）、リンコマイシン誘導体、マクロライド誘導体、ケトライド、マクロライド、オキサゾリジノン抗生物質、ペニシリン、ベータ−ラクタマーゼ阻害剤、キノロン、スルホンアミド、およびテトラサイクリンが挙げられる。
【００２３】
抗拒絶反応治療として、例えば免疫抑制剤が挙げられる。免疫抑制剤として、これらに限定されないが、以下が挙げられる：副腎皮質ステロイド（例えば、プレドニゾロンまたはヒドロコルチゾン）、糖質コルチコイド、細胞分裂阻害剤、アルキル化剤（例えば、ナイトロジェンマスタード（シクロホスファミド）、ニトロソウレア、白金化合物、シクロホスファミド（Cytoxan））、代謝拮抗薬（例えば、メトトレキサートなどの葉酸アナログ、アザチオプリンおよびメルカプトプリンなどのプリン、ピリミジンアナログ、およびタンパク質合成阻害剤）、細胞傷害性抗生物質（例えば、ダクチノマイシン、アントラサイクリン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ミトラマイシン）、抗体（例えば、抗ＣＤ２０、抗ＩＬ−１、抗ＩＬ−２Ｒアルファ、抗Ｔ細胞または抗ＣＤ−３モノクローナルおよびポリクローナル、例えばAtgamおよびサイモグロブリン）、イムノフィリンに作用する薬物、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス、インターフェロン、オピオイド、ＴＮＦ結合タンパク質、ミコフェノール酸、フィンゴリモドおよびミリオシン。いくつかの態様において、抗拒絶反応治療は、血液移植（blood transfer）または骨髄移植を含む。治療はまた、静脈内注射用流体（intravenous fluid）、抗生物質、外科的排膿法、早期目標指向型治療（early goal directed therapy：EGDT）、昇圧剤、ステロイド、活性化タンパク質Ｃ、ドロトレコギンアルファ（活性化型）、酸素および臓器不全のための適切なサポートを含んでもよい。これは、腎不全における血液透析、肺機能不全における人工呼吸、血液製剤の輸血、ならびに循環不全における薬物および輸液療法を含んでもよい。適切な栄養を確保すること（好ましくは経腸栄養により、しかし必要な場合には非経口栄養により）もまた、長期の疾病の間には特に含まれ得る。他の関連する治療は、インスリンならびに深部静脈血栓症および胃潰瘍を予防するための医薬を含んでもよい。
他の治療は、当業者に公知である。
【００２４】
処置または治療の投与は、当該分野において公知の任意の方法により達成することができる（例えば、Harrison’s Principle of Internal Medicine, McGraw Hill Inc.を参照）。好ましくは、処置または治療の投与は、治療有効量において起こる。投与は、局所性または全身性であってよい。投与は、非経口（例えば、静脈内、皮下、または皮内）または経口であってよい。投与の様々な経路のための組成物は、当該分野において公知である（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences by E. W. Martinを参照）。
【００２５】
処置および臨床経過は、本明細書において提供されるように決定される対象の状態、および／または対象の関連する期待される結果により決定することができる。例えば、全ｃｆ−ＤＮＡの量が８ｎｇ／ｍＬ以上である場合、対象は、上記のもののような治療により処置されるか、またはそれに関連する情報を提供されることができる。
【００２６】
「モニタリングのレジメンを決定すること」とは、本明細書において用いられる場合、対象における状態を経時的にモニタリングするために行為のコースを決定することを指す。本明細書において提供される方法のいずれか１つの一態様において、モニタリングのレジメンを決定することは、経時的に、またはその後の時点において、対象におけるＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡおよび／または全ｃｆ−ＤＮＡの量を決定するため、またはかかるモニタリングを対象に提案するための、行為の適切なコースを決定することを含む。このことは、臨床状態におけるバリエーションの測定を可能にし得るか、および／または、正常値または基線レベルの計算（ならびにそれらとの比較）を可能にし得る。本明細書において提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様においてモニタリングのレジメンを決定することは、対象から試料を得るタイミングおよび／もしくは頻度を決定すること、ならびに／またはＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡおよび／または全ｃｆ−ＤＮＡの量を決定するかもしくはこれを得ることを含む。
【００２７】
本明細書において提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、全ｃｆ−ＤＮＡは、なるべく早く、移植手術の４日後には検出してよい。他の態様において、全ｃｆ−ＤＮＡは、移植の後５、６、７または８日以内またはそれより後に定量してもよい。対象の全ｃｆ−ＤＮＡレベルをモニタリングするために、試料は、１ヵ月ごと、２ヵ月ごと、またはそれより頻繁な間隔で、６ヵ月まで、８ヵ月まで、１０ヵ月まで、１２ヵ月まで、またはそれより長く、採取してもよい。全ｃｆ−ＤＮＡのレベルの増大がリスクの増大と相関することが見出されたことから、対象の全ｃｆ−ＤＮＡが複数の時点の間で増大することが見出された場合、医師は、当該対象はより頻繁な試料採取をうけるべきであることを決定することができる。対象が、複数の時点の間で全ｃｆ−ＤＮＡのレベルが低下していることが見出された場合、医師は、より頻度の低い試料採取が十分であることを決定することができる。モニタリングのタイミングおよび／または頻度はまた、１つ以上の閾値との比較によっても決定することができる。例えば、全ｃｆ−ＤＮＡの量が、８ｎｇ／ｍＬ（または本明細書において提供される閾値のいずれか１つ）と等しいかまたはこれより多いか、および／または増加している場合、より頻繁な試料採取が必要であり得、一方、全ｃｆ−ＤＮＡの量が、８ｎｇ／ｍＬ（または本明細書において提供される閾値のいずれか１つ）未満であるか、および／または増加していない場合、より頻度が低い試料採取が必要とされ得る。一般に、より高いかまたは増大中の全ｃｆ−ＤＮＡの量を有する対象は、より近いモニタリングおよびより頻繁な試料採取を必要とする。本明細書において提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、各々の量および時点は、レポートにおいて、またはデータベースにおいて、記録することができる。
【００２８】
本明細書において提供されるような値のいずれか１つ以上によるレポートがまた、一側面において提供される。レポートは、口頭、書面（またはハードコピー）、または電子形態におけるもの、例えば可視化または表示することができる形態におけるものであってよい。好ましくは、レポートは、試料中の全ｃｆ−ＤＮＡなどの全核酸の量を提供する。いくつかの態様において、レポートは、対象からの試料中の全ｃｆ−ＤＮＡなどの全核酸の量を経時的に提供する。
【００２９】
いくつかの態様において、量は、データベース中にあるか、またはデータベース中に入力される。一側面において、かかる値を有するデータベースが提供される。量から、医師は、対象の処置またはモニタリングの必要性を評価することができる。したがって、本明細書において提供される方法のいずれか１つにおいて、方法は、１つより多くの時点において対象における核酸の量を評価することを含んでもよい。かかる評価は、本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つにより行うことができる。
【００３０】
本明細書において用いられる場合、「量」とは、任意の定量的値を指し、絶対量または相対量において示され得る。さらに、量は、合計量、頻度、比、パーセンテージなどであってもよい。本明細書において用いられる場合、「レベル」という用語は、「量」の代わりに用いることができるが、同じ型の値を指すことが意図される。一般に、別段に提供されない限り、本明細書において提供される量は、試料中の全ｃｆ−ＤＮＡを表す。
【００３１】
いくつかの態様において、本明細書において提供される方法のいずれか１つは、リスクが増大または低下した対象を同定するために、全核酸の量を閾値と、または１つ以上の前の量と比較することを含んでもよい。本明細書において提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、閾値と、または１つ以上の前の量と比較して全核酸の量が高い対象は、リスクが増大したものとして同定される。本明細書において提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、閾値と、または１つ以上の前の量と比較して全核酸の量が低いか同様の対象は、リスクが低下したか増大していないものとして同定される。
【００３２】
「閾値」または「閾値」または「カットポイント」とは、本明細書において用いられる場合、状態の存在もしくは不在、またはリスクの存在もしくは不在の指標でとなる、任意の予め決定されたレベルまたはレベルの範囲を指す。閾値は、多様な形態をとってよい。それは、中央値または平均値などの単一のカットオフ値であってもよい。それは、例えば１つの規定群におけるリスクが、別の規定群におけるリスクの二倍となる場合などには、閾値は、比較群に基づいて確立してもよい。それは、例えば、検査集団を、等分に（または不等分に）群に、低リスク群、中リスク群および高リスク群に、または四分位に（最も低い四分位は、最も低いリスクを有する対象であり、最も高い四分位は、最も高いリスクを有する対象である）分ける場合には、閾値は、範囲であってもよい。閾値は、選択された特定の集団に依存し得る。例えば、見かけ上健常な集団は、異なる「正常」範囲を有するであろう。別の例として、閾値を、状態もしくはリスクが存在する前に、または処置の経過の後に、基線値から決定することができる。かかる基線は、それについて検査がなされているリスクまたは状態と相関しない、対象における正常または他の状態の指標となり得る。いくつかの態様において、閾値は、検査されている対象の基線値であってよい。したがって、選択された予め決定された値は、対象が該当するカテゴリーを考慮し得る。当業者は、慣用的な実験のみを用いて、適切な範囲およびカテゴリーを選択することができる。本明細書において提供される方法のいずれか１つの閾値は、本明細書において提供される閾値のいずれか１つ、例えば例または図面におけるものであってよい。
【００３３】
本明細書において提供される閾値は、対象における移植合併症のリスクを決定するために用いることができる。したがって、測定される全ｃｆ−ＤＮＡの量が、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ｎｇ／ｍＬと等しいかまたはこれより高い場合、対象は、合併症のリスクが高いと決定され得る。例えば、８または９ｎｇ／ｍＬと等しいかまたはこれより高い量は、心停止の指標であり得る。別の例として、２０ｎｇ／ｍＬ以上の量は、感染の指標の指標であり得る。決定は、本明細書において提供されるような比較のいずれか１つに基づいて、かかる合併症の他の指標を用いてまたはこれを用いずに、行うことができる。
【００３４】
閾値はまた、処置および／またはモニタリングの決定を行うための比較のために用いることができる。例えば、全ｃｆ−ＤＮＡの量が、本明細書において提供される閾値の１つよりも高いか、および／または経時的に増大している場合、さらなるモニタリングが示され得る。さらなる例として、量が、本明細書において提供される閾値のいずれか１つよりも高い場合、対象の処置が示され得る。量が、本明細書において提供される閾値のいずれか１つよりも高い場合、対象のさらなる検査（生検などによるもの）が示され得る。
【００３５】
したがって、本明細書において提供される方法のいずれか１つは、対象を評価するためのさらなる検査、または対象にかかるさらなる検査を提案する（またはかかるさらなる検査についての情報を提供する）ステップをさらに含んでもよい。さらなる検査は、本明細書において提供される方法のいずれか１つであってよい。さらなる検査は、適宜、本明細書において提供されるかまたは当該分野において他に公知の他の方法のいずれか１つであってよい。さらなる検査の型は、対象の状態に依存し、および／または十分に当業者の決定能力の範囲内である。
感染が疑われる対象のための例示的なさらなる検査として、これらに限定されないが、血液検査、尿検査、咽喉スワブおよび脊椎穿刺が挙げられる。
【００３６】
例示的な対象のためのさらなる検査として、これらに限定されないが、心エコー、冠動脈造影、血管内超音波検査（ＩＶＵＳ）、生検（例えば、心内膜心筋生検）、負荷心エコー、ＣＴ冠動脈造影、冠血流予備比評価（造影心エコー）、負荷心筋血流シンチグラフィー、ポジトロン断層撮影（ＰＥＴ）走査、ならびにＢＮＰおよび／またはトロポニンなどの血清バイオマーカーの測定が挙げられる。
【００３７】
全ｃｆ−ＤＮＡの量は、多数の方法により決定することができる。いくつかの態様において、かかる方法は、配列決定に基づく方法である。例えば、全ｃｆ−ＤＮＡは、試料のＤＮＡを分析して複数の遺伝子座を同定することにより測定することができ、遺伝子座の各々のアレルを決定してもよく、決定されたアレルに基づいてインフォーマティブな遺伝子座を選択してもよい。本明細書において用いられる場合、「遺伝子座」とは、核酸中のヌクレオチドの位置、例えば、染色体上または遺伝子中のヌクレオチドの位置を指す。本明細書において用いられる場合、「インフォーマティブな遺伝子座」とは、対象の遺伝子型がメジャーアレルについてホモ接合型であり、一方、ドナーの遺伝子型がマイナーアレルについてホモ接合型またはヘテロ接合型である遺伝子座を指す。本明細書において用いられる場合、「マイナーアレル」とは、ある遺伝子座について核酸の集団において頻度がより低いアレルを指す。いくつかの態様において、マイナーアレルは、ドナーの核酸中での当該遺伝子座におけるヌクレオチド同一性である。一方、「メジャーアレル」とは、集団においてより頻繁なアレルを指す。いくつかの態様において、メジャーアレルは、対象の核酸中での当該遺伝子座におけるヌクレオチド同一性である。
【００３８】
いくつかの態様において、インフォーマティブな遺伝子座およびアレルは、対象の核酸およびドナーの核酸の前の遺伝子型判定に基づいて決定することができる。例えば、レシピエントおよびドナーの遺伝子型を比較して、インフォーマティブな遺伝子座を、あるヌクレオチド同一性についてレシピエントがホモ接合型であり、異なるヌクレオチド同一性についてドナーがヘテロ接合型またはホモ接合型である遺伝子座として同定することができる。遺伝子型判定のための方法は、当該分野において周知であり、本明細書においてさらに記載される。この例において、マイナーおよびメジャーアレルは、インフォーマティブな遺伝子座における各々のアレルの相対量を決定することにより同定してもよく、および／または、ドナーＤＮＡ（マイナーアレル）およびレシピエントＤＮＡ（メジャーアレル）中のインフォーマティブな遺伝子座におけるヌクレオチド同一性として同定してもよい。したがって、提供される方法は、レシピエントおよびドナーを遺伝子型判定するステップ、またはかかる遺伝子型を得るかまたはこれらを提供されるステップを、さらに含んでもよい。
【００３９】
ＤＮＡは、任意の好適な次世代のまたはハイスループットな配列決定および／または遺伝子型判定の技術を用いて分析することができる。次世代のおよびハイスループットな配列決定および／または遺伝子型判定の技術の例として、これらに限定されないが、大規模並列シグネチャー配列決定（massively parallel signature sequencing：MPSS）、ポロニーシークエンシング（polony sequencing）、４５４パイロシークエンシング、Illumina（Solexa）シークエンシング、SOLiDシークエンシング、イオン半導体シークエンシング、ＤＮＡナノボールシークエンシング、ヘリスコープ（heliscope）単分子シークエンシング、単分子リアルタイム（SMRT）シークエンシング、MassARRAY（登録商標）、およびDigital Analysis of Selected Regions（DANSR（商標））が挙げられる（例えば、 Stein RA（２００８年９月１日）、「Next-Generation Sequencing Update」、Genetic Engineering & Biotechnology News 28(15)；Quail, Michael; Smith, Miriam E; Coupland, Paul; Otto, Thomas D; Harris, Simon R; Connor, Thomas R; Bertoni, Anna; Swerdlow, Harold P; Gu, Yong（２０１２年１月１日）、「A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion torrent, pacific biosciences and illumina MiSeq sequencers」、BMC Genomics 13(1): 341；Liu, Lin; Li, Yinhu; Li, Siliang; Hu, Ni; He, Yimin; Pong, Ray; Lin, Danni; Lu, Lihua; Law, Maggie（２０１２年１月１日）、「Comparison of Next-Generation Sequencing Systems」、Journal of Biomedicine and Biotechnology 2012: 1-11；Qualitative and quantitative genotyping using single base primer extension coupled with matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry（MassARRAY（登録商標））、Methods Mol Biol. 2009;578:307-43; Chu T, Bunce K, Hogge WA, Peters DG. A novel approach toward the challenge of accurately quantifying fetal DNA in maternal plasma. Prenat Diagn 2010;30:1226-9；およびSuzuki N, Kamataki A, Yamaki J, Homma Y. Characterization of circulating DNA in healthy human plasma. Clinica chimica acta; International Journal of Clinical Chemistry 2008;387:55-8 を参照）。
【００４０】
一態様において、全ｃｆ−ＤＮＡを決定するための方法のいずれか１つは、米国公開番号２０１５−００８６４７７−Ａ１の方法のいずれか１つであってよく、かかる方法は、その全体において本明細書において参考として援用される。
全ｃｆ−ＤＮＡの量はまた、ＭＯＭＡアッセイにより決定することができる。一態様において、全ｃｆ−ＤＮＡを決定するための方法のいずれか１つは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１６／１７６６６２Ａ１の方法のいずれか１つであってよく、かかる方法は、その全体において本明細書において参考として援用される。
【００４１】
複数のＳＮＶ標的について全ｃｆ−ＤＮＡを決定することができる。「複数のＳＮＶ標的」とは、各々の標的について少なくとも２つのアレルが存在する、１つより多くのＳＮＶ標的を指す。いくつかの態様において、各々のＳＮＶ標的が、両アレル型であることが期待され、ＳＮＶ標的の各々のアレルに対して特異的なプライマーペアを用いて各々のアレルの核酸を特異的に増幅し、ここで、特異的アレルの核酸が試料中に存在する場合には、増幅が起こる。
【００４２】
本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つの一態様において、ＳＮＶ標的に対する１つ以上のプライマーペアは、ＳＮＶ標的がインフォーマティブであろうという知識に基づいて（遺伝子型の知識などにより）、予め選択することができる。本明細書において提供される方法のいずれか１つの他の態様においては、ドナーの遺伝子型が不明である。かかる場合の一態様においては、ドナー遺伝子型は、期待値最大化法により推測することができる。一例として、既知のレシピエント遺伝子型を用いて、レシピエントにおいてホモ接合型であると知られている標的を選択することができる。任意の混入物がドナー特異的核酸に起因し得、結果として生じるアッセイのコレクションは、三峰性分布；非インフォーマティブなアッセイ、半インフォーマティブなアッセイおよび完全にインフォーマティブなアッセイからなるであろう。十分な数のレシピエントホモ接合型アッセイにより、ドナーの完全インフォーマティブなアッセイの存在を推測することができる。
【００４３】
本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つの別の態様において、複数のＳＮＶ標的に対するプライマーペアを、少なくとも１つ（またはより多くの）がインフォーマティブであり得る可能性のために選択することができる。かかる態様において、本明細書において提供される方法のいずれか１つにおいて、ＳＮＶ標的のパネルに対するプライマーペアを用いる。いくつかの態様において、ＳＮＶ標的のパネルは、少なくとも３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５またはそれより多くの可能な標的のパネルである。
【００４４】
本明細書において用いられる場合、「インフォーマティブなＳＮＶ標的」とは、本明細書において提供されるようなプライマーによる増幅が起こるものであり、その結果は、インフォーマティブである。「インフォーマティブな結果」とは、本明細書において提供される場合、試料中の全核酸のレベルを定量するために用いることができる結果である。いくつかの態様においては、全核酸の量は、メジャーおよびマイナーアレルの量により決定することができる。
【００４５】
ＭＯＭＡアッセイにおける使用のためのプライマーを得てもよく、本明細書において提供される方法のいずれか１つは、ＰＣＲアッセイなどの増幅ベースの定量アッセイを行うための１つ以上のプライマーペアを得るステップを含んでもよい。一般に、プライマーは、核酸の量を定量することにおけるそれらの使用を促進するユニークな特性を有する。例えば、プライマーペアのフォワードプライマーは、３’ヌクレオチド（例えば、最後から２番目の３’ヌクレオチド）においてミスマッチを有していてもよい。提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、このミスマッチは、３’ヌクレオチドにおけるものであるが、ＳＮＶの位置に隣接している。提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、ＳＮＶの位置に対して相対的なプライマーのミスマッチの配置を、図１において示す。一般に、かかるフォワードプライマーは、３’ミスマッチを有していても、ＰＣＲ反応などの増幅反応において増幅生成物を生成し（好適なリバースプライマーと組み合わせて）、それにより、それぞれのＳＮＶによる核酸の増幅と、結果としてその検出を可能にする。特定のＳＮＶが存在しない場合、かつＳＮＶ標的の他のアレルに関して二重ミスマッチが存在する場合、増幅生成物は、一般に、生成されないであろう。好ましくは、本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、各々のＳＮＶ標的に対して、それにより各々のアレルの特異的な増幅が他のアレルの増幅を伴うことなく起こり得るプライマーペアを得る。「特異的増幅」とは、別の核酸の実質的な増幅を伴わない、またはバックグラウンドもしくはノイズより高い別の核酸配列の増幅を伴わない、標的の特異的アレルの増幅を指す。いくつかの態様において、特異的な増幅は、特異的アレルの増幅のみをもたらす。
【００４６】
本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、両アレル型である各々のＳＮＶ標的に対して、２つのプライマーペアが存在し、各々が、２つのアレルのうちの一方に対して特異的であり、したがって、それが増幅すべきアレルに関して単一のミスマッチ、およびそれが増幅すべきではないアレル（これらのアレルの核酸が存在する場合）に関して二重ミスマッチを有する。本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、ミスマッチプライマーは、フォワードプライマーである。本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、各々のＳＮＶ標的に対する２つのプライマーペアのリバースプライマーは、同じである。
【００４７】
これらの概念は、本明細書において提供される方法および組成物のいずれか１つについて、プライマーペアの設計において用いることができる。フォワードおよびリバースプライマーは、鋳型の特異的な遺伝子座のフラグメントを増幅させるために、反対の鎖（例えばセンス鎖およびアンチセンス鎖）に結合するように設計されることが理解されるべきである。プライマーペアのフォワードおよびリバースプライマーは、例えば本開示によるＳＮＶ標的のアレルの存在を検出するために、任意の好適なサイズの核酸フラグメントを増幅するように設計することができる。本明細書において提供される方法のいずれか１つは、本明細書において記載されるような１つ以上のプライマーペアを得るための１つ以上のステップを含んでもよい。
【００４８】
本明細書において記載されるプライマーペアは、ＰＣＲアッセイなどの多重増幅ベースの定量アッセイにおいて用いてもよいことが理解されるべきである。したがって、本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、プライマーペアは、ＰＣＲ反応において他のプライマーペアと適合可能であるように設計される。例えば、プライマーペアは、ＰＣＲ反応において、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５などの他のプライマーペアと適合可能であるように、設計されてもよい。本明細書において用いられる場合、ＰＣＲ反応におけるプライマーペアは、それらが同じＰＣＲ反応においてそれらの標的を増幅することができる場合に、「適合可能である」。いくつかの態様において、プライマーペアは、当該プライマーペアが、同じＰＣＲ反応において多重化された場合に、それらの標的ＤＮＡを増幅することを、１％以下、２％以下、３％以下、４％以下、５％以下、１０％以下、１５％以下、２０％以下、２５％以下、３０％以下、３５％以下、４０％以下、４５％以下、５０％以下、または６０％以下、阻害される場合に、適合可能である。プライマーペアは、限定されないが、プライマーダイマーの形成および別のプライマーペアを妨害し得る鋳型上のオフターゲット部位への結合を含む多数の理由のために、適合可能ではない場合がある。したがって、本開示のプライマーペアは、他のプライマーペアとのダイマーの形成を防止するか、またはオフターゲット結合部位の数を限定するように設計されていてもよい。多重ＰＣＲアッセイにおける使用のためのプライマーを設計するための例示的な方法は、当該分野において公知であるか、本明細書において別段に記載される。
【００４９】
いくつかの態様において、本明細書において記載されるプライマーペアは、全核酸の量を定量するために、ＰＣＲアッセイなどの多重増幅ベースの定量アッセイにおいて用いられる。したがって、本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、プライマーペアは、潜在的に非二倍体であるゲノム領域を検出するために設計されたプライマーペアを除外して、二倍体であるゲノム領域を検出するために設計される。本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、本開示により用いられるプライマーペアは、既知のコピー数が可変の領域であるリピートマスク領域（repeat-masked region）、または非二倍体であり得る他のゲノム領域を検出しない。
【００５０】
本明細書において提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、増幅ベースの定量的アッセイは、任意の定量的アッセイであって、それにより核酸が増幅され、核酸の量を決定することができるようなものである。かかるアッセイは、それにより、本明細書において記載されるようなＭＯＭＡプライマーにより核酸が増幅され、定量されるものを含む。かかるアッセイは、単純な増幅および検出、ハイブリダイゼーション技術、電気泳動などの分離技術、次世代配列決定法などを含む。
【００５１】
本明細書において提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、ＰＣＲは、定量ＰＣＲであり、これは、核酸の量を決定することができることを意味する。定量ＰＣＲとして、リアルタイムＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、TAQMAN（商標）などが挙げられる。本明細書において提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、ＰＣＲは、「リアルタイムＰＣＲ」である。かかるＰＣＲは、増幅プロセスがなお進行している間に、液相において反応動態学をモニタリングすることができるＰＣＲ反応を指す。従来のＰＣＲと対照的に、リアルタイムＰＣＲは、増幅反応において、リアルタイムで、同時に検出または定量する能力を提供する。特異的な色素からの蛍光強度の増大に基づいて、増幅がプラトーに達する前であっても、標的の濃度を決定することができる。
【００５２】
複数のプローブの使用は、単一プローブリアルタイムＰＣＲの能力を拡大することができる。多重リアルタイムＰＣＲは、複数のプローブベースのアッセイを用い、ここで、各々のアッセイがユニークな蛍光色素で標識された特異的プローブを有していてよく、これにより、各々のアッセイについて観察される色が異なるものとなる。リアルタイムＰＣＲ機器は、異なる色素から生成される蛍光を区別することができる。異なるプローブは、各々がユニークな発光スペクトルを有する異なる色素で標識することができる、スペクトルシグナルは、別々の光学素子により収集され、一連のフィルターセットを通過して、検出器のアレイにより収集される。行列代数により実験データをデコンボリューションする（deconvolute）ために、色素間のスペクトルのオーバーラップは、純粋な色素のスペクトルを用いて補正してもよい。
【００５３】
プローブは、本開示の方法のために、特に定量ステップを含む方法のために、有用であり得る。本明細書において提供される方法のいずれか１つは、ＰＣＲアッセイの実施においてプローブの使用を含んでもよく、一方、本明細書において提供される組成物またはキットのいずれか１つは、１つ以上のプローブを含んでもよい。重要なことに、本明細書において提供される方法のいずれか１つ以上のいくつかの態様において、ＰＣＲ定量アッセイの１つ以上または全てにおけるプローブは、ミスマッチプライマーと同じ鎖上にあり、反対の鎖上にはない。ＰＣＲ反応においてプローブをそのように組み込むことにおいて、さらなるアレル特異的な区別を提供することができることを見出した。
【００５４】
一例として、TAQMAN（商標）プローブは、FAM（商標）またはVIC（登録商標）色素標識を５’末端に、副溝結合剤（ＭＧＢ）非蛍光消光剤（ＮＦＱ）を３’末端に有する、加水分解プローブである。TAQMAN（商標）プローブの原理は、一般に、相補的プローブ結合領域へのハイブリダイゼーションおよびフルオロフォアベースの検出の間に二重標識TAQMAN（商標）プローブを切断するために、Taq（登録商標）ポリメラーゼの５’−３’エクソヌクレアーゼ活性に依存する。TAQMAN（商標）プローブは、定量ＰＣＲ反応の対数ステージの間の定量的測定における検出の特異度を増大することができる。
【００５５】
ＰＣＲ系は、一般に、そのシグナルが、反応におけるＰＣＲ生成物の量に対して直接比例して増大する、蛍光色素またはレポーターの検出および定量に依存する。例えば、最も単純かつ最も経済的な形式において、そのレポーターは、二本鎖ＤＮＡに特異的な色素SYBR（登録商標）Green（Molecular Probes）であってよい。SYBR（登録商標）Greenは、二本鎖ＤＮＡの副溝に結合する色素である。SYBR（登録商標）Green色素が二本鎖ＤＮＡに結合すると、蛍光強度が増大する。より多くの二本鎖アンプリコンが生成されるにつれ、SYBR（登録商標）Green 色素シグナルは増大するであろう。
【００５６】
本明細書において提供されるＰＣＲ条件は、本明細書において記載される方法のいずれか１つに従って機能するために、改変または最適化してもよいことが、理解されるべきである。典型的には、ＰＣＲ条件は、用いられる酵素、標的鋳型および／またはプライマーに基づく。いくつかの態様において、ＰＣＲ反応の１つ以上のコンポーネントが、改変または最適化される。最適化することができるＰＣＲ反応のコンポーネントの非限定的な例として、鋳型ＤＮＡ、プライマー（例えば、フォワードプライマーおよびリバースプライマー）、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）、ポリメラーゼ、マグネシウム濃度、バッファー、プローブ（例えばリアルタイムＰＣＲを行う場合）、バッファー、および反応容積が挙げられる。
【００５７】
前述の態様のいずれかにおいて、熱安定性ポリメラーゼを含む任意のＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡヌクレオチドのＤＮＡ鎖への重合を触媒する酵素）を利用することができる。好適なポリメラーゼ酵素は、当業者には公知であり、E. coli ＤＮＡポリメラーゼ、E. coli ＤＮＡポリメラーゼＩのKlenowフラグメント、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ５  ＤＮＡポリメラーゼ、Klenowクラスのポリメラーゼ、Taqポリメラーゼ、Pfu ＤＮＡポリメラーゼ、Ventポリメラーゼ、バクテリオファージ29、REDTaq（商標）ゲノムＤＮＡポリメラーゼ、またはシーケナーゼを含む。例示的なポリメラーゼとして、これらに限定されないが、Bacillus stearothermophilusのpol I、Thermus aquaticus（Taq）pol I、Pyrccoccus furiosus（Pfu）、Pyrococcus woesei（Pwo）、Thermus flavus（Tfl）、Thermus thermophilus（Tth）、Thermus litoris（Tli）およびThermotoga maritime（Tma）が挙げられる。これらの酵素、これらの酵素の改変されたバージョン、および酵素の組み合わせは、Roche、Invitrogen、Qiagen、StratageneおよびApplied Biosystemsを含むベンダーから市販されている。代表的な酵素として、PHUSION（登録商標）（New England Biolabs、Ipswich、MA）、Hot MasterTaq（商標）（Eppendorf）、PHUSION（登録商標）Mpx（Finnzymes）、PyroStart（登録商標）（Fermentas）、KOD（EMD Biosciences）、Z-Taq（TAKARA）、およびCS3AC/LA（KlenTaq、University City、MO）が挙げられる。
【００５８】
塩およびバッファーは、当業者が精通しているものを含み、これは、それぞれ、ＭｇＣｌ２、ならびにＴｒｉｓ−ＨＣｌおよびＫＣｌを含むものを含む。典型的には、Taq ＤＮＡポリメラーゼにとって１．５〜２．０ｎＭのマグネシウムが最適であるが、最適マグネシウム濃度は、鋳型、バッファー、ＤＮＡおよびｄＮＴＰに依存し得る。なぜならば、各々が、マグネシウムをキレートする可能性を有するからである。マグネシウムの濃度［Ｍｇ２＋］が低すぎる場合、ＰＣＲ生成物が形成されない可能性がある。マグネシウム［Ｍｇ２＋］が高すぎる場合、望ましくないＰＣＲ生成物が観察される場合がある。いくつかの態様において、マグネシウム濃度は、マグネシウム濃度を０．１ｍＭまたは０．５ｍＭの増加において約５ｍＭまで補充することにより、最適化することができる。
【００５９】
本開示に従って用いられるバッファーは、界面活性剤、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ならびに当業者が精通している他のものなどの添加物を含んでもよい。ヌクレオチドは、一般に、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、およびデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）などのデオキシリボヌクレオシド三リン酸であって、これらはまた、標的核酸の増幅のために適切な量で反応に添加される。いくつかの態様において、１つ以上のｄＮＴＰ（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）の濃度は、約１０μＭ〜約５００μＭであり、これは、ＰＣＲ反応において生成されるＰＣＲ生成物の長さおよび数に依存し得る。
【００６０】
いくつかの態様において、ＰＣＲ反応において用いられるプライマーの濃度を、改変または最適化してもよい。いくつかの態様において、ＰＣＲ反応中のプライマー（例えばフォワードまたはリバースプライマー）の濃度は、例えば、約０．０５μＭ〜約１μＭであってよい。特定の態様において、各々のプライマーの濃度は、約１ｎＭ〜約１μＭである。本開示に従うプライマーは、ＰＣＲ反応において同じまたは異なる濃度で用いてもよいことが、理解されるべきである。例えば、プライマーペアのフォワードプライマーを０．５μＭの濃度で用いてもよく、当該プライマーペアのリバースプライマーを０．１μＭで用いてもよい。プライマーの濃度は、これらに限定されないが、プライマーの長さ、ＧＣ含有量、純度、標的ＤＮＡとのミスマッチまたはプライマーダイマーを形成する可能性を含む要因に基づき得る。
【００６１】
いくつかの態様において、ＰＣＲ反応の熱プロフィールを、改変または最適化する。ＰＣＲの熱プロフィールの改変の非限定的な例として、変性の温度および持続時間、アニーリングの温度および持続時間、ならびに伸長時間が挙げられる。
ＰＣＲ反応溶液の温度は、変性状態、アニーリング状態、および伸長状態の間で、予め決定されたサイクルの数にわたり、連続的に周回され得る。実際の時間および温度は、酵素、プライマー、および標的に依存的であり得る。任意の所与の反応について、変性状態、ある態様においては、約７０℃〜約１００℃の範囲であり得る。加えて、アニーリングの温度および時間は、プライマーが標的核酸中の特定の遺伝子座に結合する特異度および効率に影響を及ぼし得、特定のＰＣＲ反応について重要であり得る。任意の所与の反応について、アニーリング状態は、ある態様においては、約２０℃〜約７５℃の範囲であり得る。いくつかの態様において、アニーリング状態は、約４６℃〜６４°Ｃであり得る。ある態様において、アニーリング状態は、室温（例えば、約２０℃〜約２５℃）において行うことができる。
【００６２】
伸長の温度および時間はまた、アレル生成物の収率に影響を及ぼし得る。所与の酵素について、伸長状態は、ある態様においては、約６０℃〜約７５℃の範囲であり得る。
ＰＣＲアッセイからのアレルの量の定量は、本明細書において提供されるように行うことができるか、別段に当業者には明らかであろう。一例として、一貫性および強力な定量のために、増幅のトレースを分析する。サイクルの閾値をインプット核酸（例えばＤＮＡ）の量に換算するために、内部標準を用いてもよい。アレルの量は、性能（performant）アッセイの平均として計算することができ、遺伝子型について補正することができる。
試料中の全セルフリーＤＮＡを決定するための他の方法は、当該分野において公知である。本明細書において提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、全セルフリーＤＮＡは、RNase Pを標的として用いて、TAQMAN（商標）リアルタイムＰＣＲにより決定される。
【００６３】
本明細書において提供される方法のいずれか１つは、対象から得られた試料から全フリーＤＮＡなどの核酸を抽出することを含んでもよい。かかる抽出は、当該分野において公知の任意の方法を用いて、または本明細書において別段に提供されるように、行うことができる（例えば、 Current Protocols in Molecular Biology 、最新版を参照、またはQIAamp循環用核酸キットまたは他の適切な市販のキット）。血液からセルフリーＤＮＡを単離するための例示的な方法を記載する。ＥＤＴＡまたはＤＴＡなどの抗凝固剤を含む血液を、対象から採取する。ｃｆ−ＤＮＡを含む血漿を、血液中に存在する細胞から分離する（例えば、遠心分離またはろ過により）。任意の残留する細胞を血漿から取り除くために、任意の二次的な分離を行ってもよい（例えば、第２の心分離またはろ過ステップ）。次いで、当該分野において公知の任意の方法を用いて、例えば市販のキット（Qiagenにより製造されるものなど）を用いて、ｃｆ−ＤＮＡを抽出する。ｃｆ−ＤＮＡを抽出するための他の例示的な方法は、当該分野において公知である（例えば、 Cell-Free Plasma DNA as a Predictor of Outcome in Severe Sepsis and Septic Shock. Clin. Chem. 2008, v. 54, p. 1000-1007；Prediction of MYCN Amplification in Neuroblastoma Using Serum DNA and Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction. JCO 2005, v. 23, p.5205-5210；Circulating Nucleic Acids in Blood of Healthy Male and Female Donors. Clin. Chem. 2005, v. 51, p.1317-1319；Use of Magnetic Beads for Plasma Cell-free DNA Extraction: Toward Automation of Plasma DNA Analysis for Molecular Diagnostics. Clin. Chem. 2003, v. 49, p. 1953-1955；Chiu RWK, Poon LLM, Lau TK, Leung TN, Wong EMC, Lo YMD. Effects of blood-processing protocols on fetal and total DNA quantification in maternal plasma. Clin Chem 2001;47:1607-1613；およびSwinkels et al.  Effects of Blood-Processing Protocols on Cell-free DNA Quantification in Plasma. Clinical Chemistry, 2003, vol. 49, no. 3, 525-526 を参照）。
【００６４】
本明細書において提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、プレ増幅ステップを行う。かかる増幅の例示的な方法は、以下のとおりであり、かかる方法は、本明細書において提供される方法のいずれか１つにおいて含まれ得る。約１５ｎｇのセルフリー血漿ＤＮＡを、Ｑ５  ＤＮＡポリメラーゼを用いて、約１３の標的により、ＰＣＲにおいて増幅し、ここで、プールされたプライマーは、合計で４ｕＭであった。試料は、約２５サイクルを経る。反応は、合計で２５ｕｌである。増幅後、試料を、AMPUREビーズクリーンアップ、ビーズ精製、または単純にExoSAP-IT（商標）またはZymoを含むいくつかのアプローチを用いて、クリーンアップしてもよい。
【００６５】
本明細書において用いられる場合、対象からの試料は、生物学的試料であってよい。かかる生物学的試料の例として、全血、血漿、血清、尿などが挙げられる。いくつかの態様において、さらなる核酸、例えば標準物の、試料への添加を行ってもよい。
別の側面において、本明細書において提供されるような１つ以上のプライマーペアを含む組成物およびキットが提供される。ＰＣＲアッセイなどのアッセイを行うための他の試薬もまた、組成物またはキット中に含まれていてもよい。
【００６６】
本発明の多様な側面は、単独で、組み合わせて、または前述のものにおいて記載される態様においては具体的には議論されていない多様な配置において用いてもよく、したがって、それらの適用において、前述の説明において記載される、または図面において説明されるコンポーネントの詳細および配置に限定されない。例えば、一態様において記載される側面は、他の態様において記載される側面と、任意の様式において組み合わせることができる。
また、本発明の態様は、そのうちの一例が提供されている１つ以上の方法として実行してもよい。方法の一部として行われる行為は、任意の好適な方法において指令することができる。したがって、説明されたものとは異なる順序において行為が行われる態様が構築されてもよく、これは、いくつかの行為を、それが説明的態様においては連続的な行為として示されるものであっても、同時に行うことを含んでもよい。
【００６７】
通常の用語、例えば「第１」、「第２」、「第３」などの、請求の範囲において請求項の要素を修飾するための使用は、それ自体によっては、１つの請求項の要素の、別の要素に対するいかなる優先順位、先行もしくは順序、または方法の行為が行われる時間的順序を暗示しない。かかる用語は、単に、ある名称を有する１つの請求項の要素を、（当該通常の用語の使用がなければ）同じ名称を有する別の要素と区別するための標識として用いられる。
本明細書において用いられる語法および用語法は、記載を目的とするものであり、限定するものとしてみなされるべきではない。「含むこと（including）」、「含むこと（comprising）」、「有すること（having）」、「含むこと（containing）」、「含むこと（involving）」、およびこれらのバリエーションの使用は、その後に列記される項目およびさらなる項目を包含することを意図される。
【００６８】
本発明のいくつかの態様を詳細に説明したことを考慮すれば、当業者には、多様な改変および改善が容易に想起されるであろう。かかる改変および改善は、本発明の精神および範囲の内であることが意図される。したがって、前述の記載は、単なる例であり、限定するものとして意図されるものではない。以下の記載は、本明細書において提供される方法の例を提供する。
【００６９】
例
例１−コンピューターにより実行される態様の例
いくつかの態様において、上記の診断技術は、対象について試料を（例えば経時的に）分析し、試料中の核酸（セルフリーＤＮＡなど）を測定し、試料中の核酸（セルフリーＤＮＡなど）を測定し、および試料のうちの１つ以上に基づいて結果（診断結果など）をもたらすために、１つ以上のソフトウェア設備を実行する１つ以上のコンピューター処理デバイスを介して、実装することができる。図２は、いくつかの態様が作動することができるコンピューターシステムの例を説明するが、態様は、図２において説明される型の系により作動することに限定されないことが、理解されるべきである。
【００７０】
図２のコンピューターシステムは、対象８０２、および対象８０６から試料８０６を得ることができる医師８０４を含む。前述のものから理解されるであろうが、試料８０６は、対象８０２における核酸（セルフリーＤＮＡなど）の存在を測定するために用いてもよい、対象８０２についての生物材料の任意の好適な試料であってよく、これは、血液試料を含む。試料８０６を、分析デバイス８０８に提供することができ、当業者は前述のものから理解するであろうが、これが、全核酸（セルフリーＤＮＡなど）の量を決定する（推定することを含む）ために、試料８０８を分析する。説明を容易にするために、分析デバイス８０８を単一のデバイスとして表すが、分析デバイス８０８は任意の好適な形態をとってよく、いくつかの態様においては複数のデバイスとして実装されてもよいことが、理解されるべきである。試料８０６および／または対象８０２中の核酸（セルフリーＤＮＡなど）の量を決定するために、分析デバイス８０８は、上記の技術のいずれを行ってもよく、任意の特定の分析を行うことに限定されない。分析デバイス８０８は、ソフトウェアにおいて実装される分析設備を実行するための１つ以上のプロセッサーを含んでもよく、これは、他のハードウェアを作動させるプロセッサーを駆動して、他のハードウェアにより行われたタスクの結果を受け取って分析の全結果（これは試料８０６および／または対象８０２中の核酸（セルフリーＤＮＡなど）の量であってもよい）を決定することができる。分析設備は、デバイス８０８のメモリーなどの１つ以上のコンピューター可読ストレージ媒体中に記憶されていてもよい。他の態様において、本明細書において記載される試料を分析するための技術は、部分的にまたは完全に、Application Specific Integrated Circuits（ＡＳＩＣ）などの１つ以上の特別な目的のコンピューターコンポーネントにおいて、またはソフトウェア実装の代わりとなり得る任意の他の好適なコンピューターコンポーネントの形態を通して、実装してもよい。
【００７１】
いくつかの態様において、医師８０４は、試料８０６を分析デバイス８０８に直接提供してもよく、および対象８０２から試料８０６を得ることに加えてデバイス８０８を操作してもよく、一方、他の態様においては、デバイス８０８は、医師８０４および対象８０２から地理的に離れて位置していてもよく、試料８０６は、分析デバイス８０８の位置に輸送されるか、別段に移されてもよい。試料８０６は、いくつかの態様においては、試料８０６および／または対象８０２について、試料８０６が得られた日付および／または時間についての識別子、または試料８０６を記載または同定する他の情報と一緒に（例えば、任意の好適なインターフェースを介して入力される）、分析デバイス８０８に提供することができる。
【００７２】
分析デバイス８０８は、いくつかの態様において、試料８０６に対して行われた分析の結果を、コンピューター処理デバイス８１０に提供するように設計されていてもよい。デバイス８１０は、データストア８１０Ａを含んでもよく、これは、データベースまたは他の好適なデータストアとして実装することができる。コンピューター処理デバイス８１０は、いくつかの態様においては、１つ以上のサーバーとして実装してもよく、これは、１つ以上の物理的計算機および／またはクラウドサービスプロバイダーなどの分散コンピューティングプラットフォームの仮想計算機を含む。他の態様において、デバイス８１０は、デスクトップまたはラップトップのパーソナルコンピューター、スマートモバイルフォン、タブレットコンピューター、特別な目的のハードウェアデバイス、または他のコンピューター処理デバイスとして、実装してもよい。
【００７３】
いくつかの態様において、分析デバイス８０８は、その分析の結果を、１つ以上の有線および／または無線の、ローカルおよび／または広域のコンピューターコミュニケーションネットワーク（インターネットを含む）を介して、デバイス８１０に伝達することができる。分析の結果は、任意の好適なプロトコルを用いて伝達することができ、試料８０６および／または対象８０２についての、試料８０６が得られた日付および／または時間についてのまたは試料８０６が得られた日付および／または時間についての識別子などの、試料８０６を記載または同定する情報と一緒に伝達することができる。
【００７４】
コンピューター処理デバイス８１０は、ソフトウェアにおいて実装される診断設備を実行するための１つ以上のプロセッサーを含んでもよく、これは、本明細書において記載される診断技術を行うためのプロセッサーを駆動することができる。診断設備は、デバイス８１０のメモリーなどの１つ以上のコンピューター可読ストレージ媒体に記録されていてもよい。他の態様において、本明細書において記載される試料を分析するための技術は、部分的にまたは完全に、Application Specific Integrated Circuits（ＡＳＩＣ）などの１つ以上の特別な目的のコンピューターコンポーネントにおいて、またはソフトウェア実装の代わりとなり得る任意の他の好適なコンピューターコンポーネントの形態を通して、実装してもよい。
【００７５】
診断設備は、分析の結果および試料８０６を記載または同定する情報を受け取ってもよく、その情報をデータストア８１０Ａにおいて記録してもよい。情報は、対象８０２についての前の試料に関する情報が先に受け取られており、診断設備により記録されている場合などにおいては、対象８０２についての他の情報と関連づけてデータストア８１０Ａにおいて記録することができる。複数の試料に関する情報は、対象８０２についての識別子などの共通の識別子を用いて、関連づけることができる。いくつかの場合において、データストア８１０Ａは、複数の異なる対象についての情報を含んでもよい。
【００７６】
診断設備はまた、対象８０２についての診断を決定するために、ユーザーの入力により同定される特定の対象８０２についての１つ以上の試料８０６の分析の結果を分析するために、作動させることができる。診断は、対象８０２が特定の状態を有するか、これを有し得るか、または将来的にこれを発症し得るリスクの結論であってよい。診断設備は、特定の試料８０６について決定された核酸（セルフリーＤＮＡなど）の量を、１つ以上の閾値と比較することによるもの、または試料８０６について経時的に決定された核酸（セルフリーＤＮＡなど）の量の経時的な変化を、１つ以上の閾値と比較することによるものを含む、上記の多様な例のいずれかを用いて、診断を決定することができる。例えば、診断設備は、１つ以上の試料８０６についての全核酸（セルフリーＤＮＡなど）の量を閾値と比較することにより、対象８０２にとっての状態のリスクを決定することができる。閾値との比較に基づいて、診断設備は、対象８０２にとっての状態のリスクの指標である出力をもたらすことができる。
【００７７】
前述のものから理解されるであろうが、いくつかの態様において、診断設備は、核酸（セルフリーＤＮＡなど）の量を比較することができる異なる閾値を用いて、設計することができる。異なる閾値は、例えば、異なる人口統計学的な群（年齢、性別、人種、経済的なクラス、既往歴における特定の手順／状態／その他の存在もしくは不在、または他の人口統計学的なカテゴリー）、異なる状態、および／または他のパラメーターもしくはパラメーターの組み合わせに対応し得る。かかる態様において、診断設備は、コンピューター処理デバイス８１０のメモリーにおいて記録された異なる閾値を用いて、それに対して核酸（セルフリーＤＮＡなど）の量を比較すべき閾値を選択するように設計することができる。選択は、したがって、人工統計学的群に基づいて閾値が異なる態様においては、対象８０２についての人工統計学的情報に基づいたものであってよく、これらの場合においては、対象８０２についての人工統計学的情報は、診断設備に提供されても、あるいは、対象８０２についての識別子を用いて、診断設備により（別のコンピューター処理デバイス、もしくはデータストア８１０Ａと同じであっても異なっていてもよいデータストアから、または任意の他の好適なソースから）検索されてもよい。選択は、さらに、または代替的に、リスクを決定すべき状態に基づいたものであってよく、診断設備は、リスクを決定する前に、入力として条件を受け取り、リスクの決定が基づく閾値を選択するために当該条件を用いてもよい。診断設備は、複数の閾値が支持される態様において、任意の特定の様式において閾値を選択することに限定されないことが、理解されるべきである。
【００７８】
いくつかの態様において、診断設備は、対象８０２についてのリスクの診断および／または診断のための基礎を含むユーザーインターフェースをユーザーに提示するために出力するように設計することができる。診断についての基礎は、例えば、対象８０２についての１つ以上の試料８０６において検出された核酸（セルフリーＤＮＡなど）の量を含んでもよい。いくつかの態様において、ユーザーインターフェースは、上で議論された結果、値、量、グラフなどの例のうちのいずれを含んでもよい。それらは、経時的な結果、値、量などを含んでもよい。例えば、いくつかの態様において、ユーザーインターフェースは、本明細書において提供される図面のいずれか１つにおいて示されるものと類似のグラフを取り込んでもよい。かかる場合において、いくつかの場合においては、グラフの異なる領域がグラフにおいて提示されるデータの分析からもたらされ得る異なる診断にどのように対応し得るかをユーザーに示すために、グラフに注釈をつけてもよい。例えば、グラフ表示されたデータを分析を決定するために比較することができる閾値を、グラフ上に組付け（impose）してもよい。
【００７９】
グラフ（特に線および／または網掛けを有するもの）を含むユーザーインターフェースは、ユーザーに、核酸（セルフリーＤＮＡなど）の量に基づいて対象８０２のリスクを決定するために、他のユーザーインターフェースを通して提供され得るものよりもはるかにより直観的であり、かつレビューがより早いインターフェースを提供する。しかし、態様は、任意の特定のユーザーインターフェースにより実装されることに限定されないことが、理解されるべきである。
【００８０】
いくつかの態様において、診断設備は、診断またはユーザーインターフェースを、対象８０２および／または医師（医師８０４または別の医師であってよい）により操作され得る１つ以上の他のコンピューター処理デバイス８１４（デバイス８１４Ａ、８１４Ｂを含む）に出力することができる。診断設備は、診断および／またはユーザーインターフェースを、ネットワーク８１２を介してデバイス８１４に伝達することができる。
【００８１】
本明細書において記載される原理に従って作動する技術は、任意の好適な様式において実装することができる。上の議論に含まれるのは、核酸（セルフリーＤＮＡなど）の量の分析に基づいて状態のリスクを決定する多様なプロセスのステップおよび行為を示す、一連のフローチャートである。上で議論されるプロセッシングおよび決定のブロックは、これらの多様なプロセスを実行するアルゴリズム中に含まれ得るステップおよび行為を代表する。これらのプロセスに由来するアルゴリズムは、統合されたソフトウェアとして実装することができ、１つ以上の専用プロセッサーまたは多目的プロセッサーの操作を指揮することは、デジタル信号処理（ＤＳＰ）回路または特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）などの機能的に等価な回路として実装してもよく、または任意の他の好適な様式において実装してもよい。態様が、任意の特定のシンタックス、または任意の特定の回路もしくは任意の特定のプログラミング言語の作動、またはプログラミング言語の型に限定されないことが、理解されるべきである。むしろ、当業者は、本明細書において記載される技術の型を行う特定の装置のプロセッシングを実施するために、回路を製造するため、またはコンピューターソフトウェアアルゴリズムを実装するために、上の記載を使用することができる。本明細書において別段に示されない限り、上記のステップおよび／または行為の特定の配列は、実装することができるアルゴリズムの単なる説明であって、本明細書において記載される原理の実装および態様において異なっていてもよいことが、理解されるべきである。
【００８２】
したがって、いくつかの態様において、本明細書において記載される技術は、アプリケーションソフトウェア、システムソフトウェア、ファームウェア、ミドルウェア、埋め込みコード、または任意の他の好適な型のコンピューターコードを含むソフトウェアとして実装された、コンピューターにより実行可能な指示において、具体化することができる。かかるコンピューターにより実行可能な指示は、多数の好適なプログラミング言語および／またはプログラミングもしくはスクリプトツールのうちのいずれかを用いて記述することができ、また、フレームワークまたは仮想計算機上で実行される、実行可能なマシン原語コードまたは中間コードとしてコンパイルすることができる。
【００８３】
本明細書において記載される技術をコンピューターにより実行可能な指示として具体化する場合、これらのコンピューターにより実行可能な指示は、任意の好適な様式において実装することができ、これは、これらの技術に従って作動するアルゴリズムの実行を完了するために、各々が１つ以上の作動を提供する多数の機能設備を含む。「機能設備」は、インスタンス化されている場合であっても、１つ以上のコンピューターと統合されてこれにより実行される場合、当該１つ以上のコンピューターに特定の演算子（operational role）を実行させる、コンピューターシステムの構造的コンポーネントである。機能設備は、全ソフトウェアエレメントの一部であってもよい。例えば、機能設備は、プロセスの関数として、別個のプロセスとして、または任意の他の好適なプロセッシングの単位として、実装することができる。本明細書において記載される技術が複数の機能設備として実装される場合、各々の機能設備は、それ自体の方法において実装することができる；全てが同じ方法で実装される必要はない。加えて、これらの機能設備は、適宜、並行しておよび／または連続的に実行することができ、それらが実行中のコンピューター上の共用メモリーを用いて、メッセージパッシングプロトコルを用いて、または任意の他の好適な方法において、互いに情報を受け渡すことができる。
【００８４】
一般に、機能設備は、特定のタスクを行う、または特定の抽象データ型を実装する、ルーチン、プログラム、オブジェクト、コンポーネント、データ構造などを含む。典型的には、機能設備の機能性は、それらが作動する系において所望されるように、組み合わせるかまたは分散させることができる。いくつかの実装において、本明細書における技術を実施する１つ以上の機能設備は、一緒になって、完全なソフトウェアパッケージを形成することができる。これらの機能設備は、代替的態様において、他の無関係な機能設備および／またはプロセスと相互作用するように、ソフトウェアプログラムアプリケーションを実装するために、適応させることができる。
【００８５】
いくつかの例示的な機能設備は、１つ以上のタスクを実施するために、本明細書において記載してきた。しかし、記載されるタスクの機能設備および部門は、単に、本明細書において記載される例示的な技術を実装することができる機能設備の型を説明するものであって、態様は、任意の特定の機能設備の数、部門、または型において実装されることに限定されないことが、理解されるべきである。いくつかの実装において、全ての機能性は、単一の機能設備において実装することができる。また、いくつかの実装において、本明細書において記載される機能設備のうちのいくつかは、他のものと共に、またはこれらとは別に（すなわち、単一の単位として、または別々の単位として）実装してもよく、あるいはこれらの機能設備のうちのいくつかは、実装されなくともよいことが、理解されるべきである。
【００８６】
本明細書において記載される技術を実装する（１つ以上の機能設備として、または任意の他の様式において実装される場合）、コンピューターにより実行可能な指示は、いくつかの態様において、媒体に機能性を提供するために、１つ以上のコンピューター可読媒体上でコード化されていてもよい。コンピューター可読媒体として、ハードディスクドライブなどの磁気媒体、コンパクトディスク（ＣＤ）もしくはデジタルバーサタイルディスク（ＤＶＤ）などの光学媒体、永続的もしくは非永続的ソリッドステートメモリー（例えば、フラッシュメモリー、磁気ＲＡＭなど）、または任意の他の好適なストレージ媒体が挙げられる。かかるコンピューター可読媒体は、任意の好適な様式において実装することができ、これは、コンピューター処理デバイスの一部としてのもの、またはスタンドアローンの別のストレージ媒体としてのものを含む。本明細書において用いられる場合、「コンピューター可読媒体」（また「コンピューター可読ストレージ媒体」とも称される）とは、有体ストレージ媒体を指す。有体ストレージ媒体は、非一過性であり、少なくとも１つの物理的な構造的コンポーネントを有する。「コンピューター可読媒体」において、本明細書において用いられる場合、少なくとも１つの物理的な構造的コンポーネントは、情報が埋め込まれた媒体を作成するプロセス、その上に情報を記録するプロセス、または情報を有する媒体をコード化する任意の他のプロセスの間に、何らかの方法において変更することができる、少なくとも１つの物理的特性を有する。例えば、コンピューター可読媒体の物理的構造の一部の磁化状態は、記録プロセスの間に変更することができる。
【００８７】
全てではないがいくつかの、技術がコンピューターにより実行可能な指示として具体化され得る実装において、これらの指示は、任意の好適なコンピューターシステムにおいて作動する１つ以上の好適なコンピューター処理デバイス上で実行することができ、これは、 図２の例示的なコンピューターシステムを含むか、または１つ以上のコンピューター処理デバイス（または１つ以上のコンピューター処理デバイスの１つ以上のプロセッサー）を、コンピューターにより実行可能な指示を実行するようにプログラムすることができる。コンピューター処理デバイスまたはプロセッサーは、コンピューター処理デバイスまたはプロセッサーにアクセス可能な様式において、例えばデータストア（例えば、オンチップキャッシュまたは命令レジスター、バスを介してアクセス可能なコンピューター可読ストレージ媒体など）において、指示が記録される場合、指示を実行するようにプログラムすることができる。これらのコンピューターにより実行可能な指示を含む機能設備は、単一の多目的のプログラム可能なデジタルコンピューター処理デバイス、処理能力を共有して本明細書において記載される技術を共同で実施する２つ以上の多目的コンピューター処理デバイスの同調系、本明細書において記載される技術を実行することに特化した単一コンピューター処理デバイスまたはコンピューター処理デバイスの同調系（共同設置されているか、または地理的に分散したもの）、本明細書において記載される技術を実施するための１つ以上のField-Programmable Gate Array（ＦＰＧＡ）、または任意の他の好適な系と統合されて、その作動を指揮することができる。
【００８８】
回路および／またはコンピューターにより実行可能な指示において技術が実装される態様を記載してきた。いくつかの態様は、少なくとも１つの例が提供されている方法の形態におけるものであってよいことが、理解されるべきである。方法の一部として行われる行為は、任意の好適な方法において順序付けることができる。したがって、説明されたものと異なる順序において行為が行われる態様を構築することができ、これは、説明的態様においては連続的な行為として示されたものであっても、いくつかの行為が同時に行われることを含んでもよい。前述のデバイス、系、態様、方法、技術、アルゴリズム、媒体、ハードウェア、ソフトウェア、インターフェース、プロセッサー、ディスプレイ、ネットワーク、入力、出力、またはこれらの任意の組み合わせを含む前述のもののいずれか１つは、本明細書において他の側面において提供される。
【００８９】
例２−全セルフリーＤＮＡ（ｃｆ−ＤＮＡ）の移植合併症との相関
移植レシピエントの全ｃｆ−ＤＮＡを、上記の方法を用いて定量した。全ｃｆ−ＤＮＡと様々な移植合併症との間の相関を試験して、グラフによる結果を、図３〜１４において表す。
死亡結果分析の統計学を、以下の表１において表す。
表１．死亡結果の統計学のまとめ
【表１】
2020524519.tif 000003
【００９０】
例３−全セルフリーＤＮＡ（ｃｆ−ＤＮＡ）の移植合併症との相関
心臓移植レシピエントから、移植、任意の拒絶のための処置、再入院の時点周辺において、および生検および／または脈管障害の前に、プロスペクティブに血液試料を採取した。Ｃｆ−ＤＮＡを定量した。全ｃｆ−ＤＮＡと様々な移植合併症との間の相関を試験し、表およびグラフによる結果を、図１５〜２０において提示する。生検および脈管障害、ならびに心停止、死亡、および感染のための処置の結果は、１５ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍＬ）のカットポイントにおいてｃｆ−ＤＮＡレベルと相関した。８８人のレシピエントからの２９８の試料を分析した。＞１５ｎｇ／ｍＬのＣｆ−ＤＮＡは、死亡［ｐ＜０．００１、ＯＲ：２０．１０（９５％ＣＩ：３．５５〜１１３．６９）］、感染のための処置［ｐ０．００６、ＯＲ：３．５０（９５％ＣＩ：１．３６〜９．０３）］と強力に関連した。全循環ｃｆ−ＤＮＡは、死亡および採血時の感染のための処置と強力に感染した。
【図１】
2020524519.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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