(57)【要約】本発明は、抗腫瘍Ｔ細胞の増殖方法を提供し、ａ）被験体のがんに関連することが知られているか、又は疑われる少なくとも１つの変異アミノ酸を含むアミノ酸配列、又は被験体のがん細胞で発現することが知られているか、又は疑われる変異又は非変異アミノ酸配列を含む、１つ以上の密接に関連する腫瘍新生抗原コンストラクトを有する貪食可能な粒子を提供する工程と；ｂ）生存可能な抗原提示細胞を提供する工程と；ｃ）前記抗原提示細胞によって前記粒子の貪食作用が可能になる条件下で、前記粒子と前記抗原提示細胞とを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させる工程と；ｄ）被験体からの生存可能なＴ細胞を含むＴ細胞サンプルを提供する工程と；ｅ）前記抗原提示細胞によって提示された抗原に応答して抗腫瘍Ｔ細胞の特異的活性化を可能にする条件下で、前記Ｔ細胞サンプルと、前記粒子と接触した前記抗原提示細胞とを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させる工程とを含む。本発明はまた、本明細書で定義される腫瘍新生抗原コンストラクトを提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗腫瘍Ｔ細胞の増殖方法であって、
ａ）被験体のがんに関連することが知られているか、又は疑われる少なくとも１つの変異アミノ酸を含むアミノ酸配列、又は被験体のがん細胞で発現することが知られているか、又は疑われる変異又は非変異アミノ酸配列を含む、１つ以上の密接に関連する腫瘍新生抗原コンストラクトを有する貪食可能な粒子を提供する工程と；
ｂ）生存可能な抗原提示細胞を提供する工程と；
ｃ）前記抗原提示細胞によって前記粒子の貪食作用が可能になる条件下で、前記粒子と前記抗原提示細胞とを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させる工程と；
ｄ）被験体からの生存可能なＴ細胞を含むＴ細胞サンプルを提供する工程と；
ｅ）前記抗原提示細胞により提示された抗原に応答して抗腫瘍Ｔ細胞の特異的活性化を可能にする条件下で、前記Ｔ細胞サンプルと、前記粒子と接触した前記抗原提示細胞とを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させる工程と
を含む、方法。
【請求項２】
工程（ａ）の関連ポリペプチドコンストラクトを有する粒子が滅菌洗浄に供され、関連ポリペプチドコンストラクトを有する無菌粒子、好ましくは関連ポリペプチドを有する滅菌粒子をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｇ）前記Ｔ細胞サンプルから粒子を除去する工程、及び／又は
（ｈ）前記Ｔ細胞サンプルからの粒子及び抗原提示細胞を除去する工程
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記粒子が常磁性特性、好ましくは超常磁性特性を有する、請求項１乃至請求項３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
（ｇ）磁石又は磁場によって前記Ｔ細胞サンプルから粒子を除去する工程をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記抗原提示細胞が前記被験体からのものである、請求項１乃至請求項５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記腫瘍新生抗原コンストラクトは、１つ以上の共有結合ペプチドを含み、該１つ以上の共有結合ペプチドは、被験体のがんに関連することが知られているか、又は疑われる少なくとも１つの変異アミノ酸を含むアミノ酸配列を含む、請求項１乃至請求項６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記腫瘍新生抗原コンストラクトは、１つ以上の共有結合ペプチドを含み、該１つ以上の共有結合ペプチドは、被験体のがんで発現することが知られているか、又は疑われる変異アミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記腫瘍新生抗原コンストラクトは３つ以上の共有結合ペプチド（例えば、３つ、４つ又は５つの共有結合ペプチド）を含む、請求項７又は請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記腫瘍新生抗原コンストラクトの各ペプチドが１０〜２５個のアミノ酸を含む、請求項７乃至請求項９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
２つ以上の腫瘍新生抗原コンストラクトが前記粒子と密接に関連し、各腫瘍新生抗原コンストラクトが同じポリペプチド配列を有するか、又は異なるポリペプチド配列を有する、請求項１乃至請求項１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記被験体が哺乳動物、特にヒトである、請求項１乃至請求項１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記方法で増殖した抗腫瘍Ｔ細胞は、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項１乃至請求項１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｔ細胞サンプルがＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、請求項１乃至請求項１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｔ細胞サンプルが腫瘍、好ましくは腫瘍内のリンパ管に由来する、請求項１乃至請求項１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗原提示細胞が食細胞、例えば樹状細胞である、請求項１乃至請求項１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記がんが固形がん、例えば乳がん、結腸がん、肝臓がん、肺がん（非小細胞及び小細胞）、肺カルチノイド腫瘍、膵臓がん、前立腺がん、卵巣がん及び膀胱がんから選択されるがんである、請求項１乃至請求項１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記粒子が、５．６μｍ未満、好ましくは４μｍ未満、より好ましくは３μｍ未満、さらにより好ましくは０．５乃至２μｍ、又は最も好ましくは約１μｍの最大寸法を有する、請求項１乃至請求項１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記粒子が実質的に球形である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記滅菌洗浄又は変性洗浄が、関連ポリペプチドを有する粒子を、少なくともｐＨ１３、より好ましくは少なくともｐＨ１４、最も好ましくは少なくともｐＨ１４．３などの高ｐＨにさらすことを含む、又は、前記滅菌洗浄は、関連ポリペプチドを有する粒子を、例えばｐＨ２未満、好ましくはｐＨ１未満の低ｐＨにさらすことを含む、請求項２乃至請求項１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記滅菌洗浄又は変性洗浄が、関連ポリペプチドを有する粒子を、例えば少なくとも９０℃、より好ましくは少なくとも９２℃、最も好ましくは少なくとも９５℃などの高温にさらすことを含む、請求項２乃至請求項２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記滅菌洗浄又は変性洗浄は、関連ポリペプチドを有する粒子を、少なくとも５Ｍ、６Ｍ、７Ｍ又は８Ｍなどの十分な濃度の尿素又は塩酸グアニジンなどの滅菌剤／変性剤にさらすことを含む、請求項２乃至請求項２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記滅菌洗浄により、前記粒子が無菌になり、より好ましくは該粒子が滅菌になる、請求項２乃至請求項２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記粒子がポリマー粒子、好ましくはポリスチレン粒子である、請求項３乃至請求項２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
１つ以上の腫瘍新生抗原コンストラクトが前記粒子に共有結合している、請求項１乃至請求項２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
１つ以上の腫瘍新生抗原コンストラクトが、金属キレートを介して前記粒子に結合している、請求項１乃至請求項２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗原提示細胞及び前記Ｔ細胞サンプルが同じ被験体に由来し、より好ましくは同じ血液サンプルに由来する、請求項１乃至請求項２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗原提示細胞及び前記Ｔ細胞サンプルが、同じ被験体のＰＢＭＣサンプルに由来する、請求項１乃至請求項２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記洗浄された粒子、前記抗原提示細胞及び前記Ｔ細胞サンプルが同時に接触される、請求項１乃至請求項２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
（ｆ）例えば、抗腫瘍Ｔ細胞活性化の程度を関連する参照と比較することにより、参照と比較してサンプル中の抗腫瘍Ｔ細胞活性化の程度が高いことは、１つ以上の腫瘍新生抗原決定基がサンプル中の抗腫瘍Ｔ細胞活性化をもたらすという結論を示す、前記Ｔ細胞サンプル中の抗腫瘍Ｔ細胞活性化の程度を決定する工程
をさらに含む、請求項１乃至請求項２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記Ｔ細胞サンプル中の抗腫瘍Ｔ細胞活性化の程度を決定することは、前記サンプル中の活性化Ｔ細胞の割合を決定することを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記Ｔ細胞サンプル中の抗腫瘍Ｔ細胞活性化の程度の決定が、ＥＬＩＳｐｏｔ又はＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔ技術を使用して実施される、請求項３０又は請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
請求項１乃至請求項３２のいずれか一項に記載の方法により産生される抗腫瘍Ｔ細胞を含む組成物。
【請求項３４】
前記抗腫瘍Ｔ細胞がＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
被験体のがんの治療に使用するための請求項３３又は請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
請求項１乃至請求項３２のいずれか一項に記載の方法により産生された抗
腫瘍Ｔ細胞を被験体に投与することを含む、被験体におけるがんの治療方法。
【請求項３７】
請求項１乃至請求項３２のいずれか一項に記載の方法によって産生された、被験体のがんの治療のための抗腫瘍Ｔ細胞の使用。
【請求項３８】
被験体のがんに関連することが知られているか、又は疑われる少なくとも１つの変異アミノ酸を含むアミノ酸配列、及び任意で、被験体のがん細胞で発現することが知られているか、又は疑われる変異又は非変異アミノ酸配列を含む、腫瘍新生抗原コンストラクトであって、
好ましくは、腫瘍新生抗原コンストラクトのがんに関連することが知られているか、又は疑われる少なくとも１つの変異アミノ酸を含む各アミノ酸配列は、５〜５０個のアミノ酸、好ましくは１０〜２５個のアミノ酸を含む；そして好ましくは、それぞれ任意に存在する、腫瘍新生抗原コンストラクトの被験体のがん細胞で発現することが知られているか、又は疑われる変異又は非変異アミノ酸配列は、５〜５０個のアミノ酸、好ましくは１０〜２５個のアミノ酸を含む、腫瘍新生抗原コンストラクト。
【請求項３９】
２つ以上の共有結合ペプチド（例えば、３つ、４つ、５つ、又は６つの共有結合ペプチド）を含み、各ペプチドは被験体のがんに関連することが知られているか、又は疑われる少なくとも１つの変異アミノ酸を含むアミノ酸配列、又は被験体のがん細胞で発現することが知られているか、又は疑われる変異又は非変異アミノ酸配列を含み（好ましくは、被験体のがんに関連していることが知られているか、又は疑われる少なくとも１つの変異アミノ酸を含むアミノ酸配列を含む各ペプチド）、そして、前記ペプチドは直接結合されているか、スペーサー部分を介して結合されている、請求項３８に記載の腫瘍新生抗原コンストラクト。
【請求項４０】
前記ペプチドはスペーサー部分を介して結合され、スペーサー部分において前記スペーサー部分は１〜１５個のアミノ酸（好ましくは１〜５個のアミノ酸）の短い配列であり、好ましくは前記スペーサー部分はモチーフＶＶＲを含み（例えば、前記スペーサー部分は配列ＶＶＲを有する）、又は前記スペーサー部分はモチーフＧＧＳを含む（例えば、前記スペーサー部分は配列ＧＧＳを有する）、請求項３９に記載の腫瘍新生抗原コンストラクト。
【請求項４１】
腫瘍新生抗原コンストラクトは３つの共有結合ペプチドを含み、好ましくは各ペプチドは、被験体のがんに関連することが知られているか、又は疑われる少なくとも１つの変異アミノ酸を含むアミノ酸配列を含む、請求項３９又は請求項４０に記載の腫瘍新生抗原コンストラクト。
【請求項４２】
腫瘍新生抗原コンストラクトの被験体のがんに関連することが知られているか、又は疑われる少なくとも１つの変異アミノ酸を含む各アミノ酸配列は、非腫瘍細胞の配列と比較して配列中に単一の置換変異アミノ酸を有し、そして変異アミノ酸のＣ末端に隣接するアミノ酸の数は８個、９個、１０個、１１個又は１２個のアミノ酸であり、変異アミノ酸のＮ末端に隣接するアミノ酸の数は８個、９個、１０個、１１個、又は１２個のアミノ酸である、請求項３８乃至請求項４１のいずれか一項に記載の腫瘍新生抗原コンストラクト。
【請求項４３】
１つ以上の密接に関連する腫瘍新生抗原コンストラクトを有する、常磁性又は超常磁性の貪食可能な粒子であって、
前記腫瘍新生抗原コンストラクトは、被験体のがんに関連することが知られているか、又は疑われる少なくとも１つの変異アミノ酸を含むアミノ酸配列、又は被験体のがん細胞で発現することが知られているか、又は疑われる変異又は非変異アミノ酸配列を含むか、又は
前記腫瘍新生抗原コンストラクトは、請求項３８乃至請求項４２のいずれか一項で定義される腫瘍新生抗原コンストラクトである貪食可能な粒子。
【請求項４４】
前記粒子は、５．６μｍ未満、好ましくは４μｍ未満、より好ましくは３μｍ未満、さらにより好ましくは０．５μｍ〜２μｍ、又は最も好ましくは約１μｍの最大寸法を有し、及び／又は、前記粒子は実質的に球形である、請求項４３に記載の常磁性又は超常磁性の貪食可能な粒子。
【請求項４５】
前記腫瘍新生抗原決定基が前記粒子に共有結合している、請求項４３又は請求項４４に記載の常磁性又は超常磁性の貪食可能な粒子。
【請求項４６】
請求項４３乃至請求項４５のいずれか一項に記載の常磁性又は超常磁性の貪食可能な粒子と、Ｔ細胞集団の増殖に使用するのに適した試薬とを含むキット。
【請求項４７】
常磁性又は超常磁性の貪食可能な粒子、ペプチドを貪食可能な粒子に連結するための連結試薬、及びＴ細胞集団の増殖に使用するのに適した試薬を含むキット。
【請求項４８】
腫瘍新生抗原コンストラクトを設計するための説明書、及び／又は１つ以上の腫瘍新生抗原性コンストラクト、及び／又は１つ以上の新生抗原エピトープ、及び必要に応じて、腫瘍新生抗原コンストラクト、例えば異なるクローニング及び発現条件用に調整された、すぐに使用可能なベクターを生成するための試薬をさらに含む、請求項４７に記載のキット。
【請求項４９】
工程（ｅ）の後（好ましくは工程（ｅ）の直後、又は存在する場合は、工程（ｆ）の直後）に：
ａ１）被験体のがんに関連することが知られているか、又は疑われる少なくとも１つの変異アミノ酸を含むアミノ酸配列、又は被験体のがん細胞で発現することが知られているか、又は疑われる変異又は非変異アミノ酸配列を含む、１つ以上の密接に関連する腫瘍新生抗原コンストラクトを有する第２の貪食可能な粒子を提供する工程と；
ｂ１）第２の生存可能な抗原提示細胞を提供する工程と；
ｃ１）前記抗原提示細胞によって前記粒子の貪食作用が可能になる条件下で、前記第２の粒子と前記第２の抗原提示細胞とを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させる工程と；そして
ｅ１）前記抗原提示細胞によって提示された抗原に応答する抗腫瘍Ｔ細胞の特異的活性化を可能にする条件下で、前記Ｔ細胞サンプルと、前記第２の粒子と接触した前記第２の抗原提示細胞とを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させる工程と
をさらに含む、請求項１乃至請求項３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
工程（ａ１）における１つ以上の腫瘍新生抗原コンストラクトを有する第２の貪食可能な粒子は、工程（ａ）における１つ以上の腫瘍新生抗原コンストラクトを有する貪食可能な粒子と同じである；及び／又は工程（ｂ１）の第２の生存可能な抗原提示細胞は、工程（ｂ）の生存可能な抗原提示細胞と同じである、請求項４９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗腫瘍Ｔ細胞の増殖方法、及び特にがんの治療において、本発明の方法に従って産生される抗腫瘍Ｔ細胞の組成物及び使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
適応免疫系は、より一般的な様式で応答する自然免疫系とは対照的に、生物が遭遇する様々な病原体又は細胞に損傷を与える挑戦に特異的に適応し、応答することが可能な免疫系の一部を構成する。適応系は、体液性免疫（すなわち、Ｂ細胞によって分泌される抗体）と、Ｔ細胞媒介性免疫の両方を含む。適応免疫系の特異性は、Ｂ細胞及びＴ細胞で発現するＢ細胞受容体及びＴ細胞受容体にある。遺伝子断片を混合する複雑なシステムによって、身体は、ほぼ無限の多様なＢ細胞及びＴ細胞を生成し、それぞれの細胞が、特定のタンパク質又はペプチドに特異的な受容体を発現する。
【０００３】
Ｔ細胞は、適応免疫系の主要な部分を形成するリンパ球であり、細胞媒介性免疫において中心的な役割を果たす。定義されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）は、細胞表面で発現し、それぞれの受容体が、ＭＨＣ（主要組織適合性複合体）分子において提示される一つの抗原由来ペプチドを認識する。細胞免疫反応において、それぞれ固有の機能を有する数種類のＴ細胞が存在する。
【０００４】
異なる機能を有する２種類の主なＴ細胞が存在する。ＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔ細胞は、細胞上のＭＨＣクラスＩ受容体（ヒトでは、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩと呼ばれる）上に提示されるペプチドに結合する。全ての有核細胞は、ＨＬＡクラスＩを発現する。提示されたペプチドが、外来のもの（ほとんどの場合、ウイルス感染の兆候であることが最も多い）であると考えられる場合、細胞傷害性Ｔ細胞は、グランザイムＢ又はパーフォリンのいずれかのタンパク質によって細胞を死滅させる。ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）は、表面マーカーＣＤ４を発現し、死滅させるのではなく、むしろ細胞間の炎症誘発シグナル、時には阻害シグナルの両方を増強するタンパク質であるサイトカインの分泌によって免疫反応を指揮する。Ｔヘルパー細胞の別の重要な機能は、Ｂ細胞のクラススイッチ、例えば、ＩｇＭを分泌するＢ細胞からＩｇＧを分泌する細胞へのクラススイッチを誘発することであり、抗原に対する体液性免疫反応が高める。
【０００５】
Ｔヘルパー細胞は、そのＴＣＲによって、いわゆる抗原提示細胞（ＡＰＣ）又は内皮細胞上で特異的に発現する受容体であるＭＨＣ−ＩＩ（ヒトでは、ＨＬＡクラスＩＩと呼ばれる）上に提示された対応するペプチドに結合する。Ｔ細胞活性化は、Ｔｈ−ＡＰＣ相互作用が起こる微小環境と、ＡＰＣ上で発現するいわゆる共刺激分子の種類に依存する。Ｔヘルパー細胞は、異なるＴｈサブセット、例えば、炎症誘発性のＴｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７細胞又は制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）と呼ばれる阻害Ｔヘルパー細胞型に分化することができる。制御されない免疫系は有害であり、組織の損傷及び自己免疫を引き起こす場合があるため、後者のサブセットは、免疫反応を制御するために非常に重要である。
【０００６】
がん治療のための免疫学的アプローチが知られている。例えば、黒色腫、肺がん、膀胱がん、胃腸がんの治療における、免疫活性化のチェックポイントを標的とするモノクローナル抗体の使用にすでに多くの成功がある。異なるモノクローナル抗体には異なる作用メカニズムがあるが、それらはすべて抗腫瘍（又は「腫瘍反応性」）Ｔ細胞の活性化と増殖をもたらす。
【０００７】
Ｔ細胞は多くの場合、免疫介在性がん治療の最終エフェクターであるため、抗腫瘍Ｔ細
胞を直接使用する戦略が開発されてきた。１つのアプローチは適応細胞移植（ＡＣＴ、ａｄａｐｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）であり、Ｔ細胞は体外で増殖され、がんを有する被験体に大量に再注入される。このアプローチは、例えば、Ｋｌｅｂａｎｏｆｆ
ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１６，２２，２６−３６で議論されている。
【０００８】
本分野では、いくつかの成功があった。例えば、進行大腸がん（ａｄｖａｎｃｅｄ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ）患者が養子免疫療法プロトコルを使用して治療された研究は、Ｋａｒｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｓｕｒｇ  Ｏｎｃｏｌ．，２０１０，１７（７）：１７４７−５７によって報告された。治療は、腫瘍を自然に排出する最初のリンパ節（センチネルリンパ節（ｓｅｎｔｉｎｅｌ  ｎｏｄｅ））から術中に単離された自己腫瘍反応性リンパ球の単離及びｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増殖に基づいていた。センチネルリンパ節獲得リンパ球が収集され、活性化され、自己腫瘍抽出物に対して増殖され、輸血として戻された。毒性の副作用やその他の有害作用は観察されなかった。肝転移及び肺転移のある４人の患者で疾患の完全な又は顕著な退縮が起こり、１２人の患者が部分的な退縮又は安定した疾患を示した。用量依存反応の相関があり、ステージＩＶの患者は０．８年の対照患者と比較して２．６年の有意に長い生存期間を示したことがわかった。新たに単離されたセンチネルリンパ節獲得リンパ球を増殖させ、合併症なく安全に患者に輸血することが可能であると結論付けられた。
【０００９】
しかし、現在の方法を用いて適応細胞移植で使用するのに十分な抗腫瘍Ｔ細胞を得るのは困難である：腫瘍浸潤リンパ球を増殖するためには、がんの外科的切除が必要である。これは侵襲的な手順である。さらに、得られた細胞はわずかであり、腫瘍からの免疫抑制機構のためにしばしば無反応（反応不顕性的（ａｎｅｒｇｉｃ））である。これにより、十分な増殖を得るために長い期間が必要になる場合がある（数か月）。
【００１０】
腫瘍浸潤リンパ球を使用して適応細胞移植の使用を制限する実用性を克服するために、遺伝子組換えＴ細胞が開発された。遺伝子組換えＴ細胞は、抗原受容体を導入するか、「キメラ抗原受容体」と呼ばれる合成認識構造をＴ細胞に導入することにより、Ｔ細胞特異性を患者のがんに遺伝的にリダイレクトすることで取得できる。遺伝子組換えＴ細胞は血液がんの治療に成功しているが、固形がんの治療に対する遺伝子組換えＴ細胞の安全性と選択性には改善が必要である。国際公開第２０１６／０５３３３９号（アメリカ合衆国、保健福祉省長官代理）は、がん特異的変異によってコードされる変異アミノ酸配列に対して抗原特異性を有するＴ細胞を単離する方法を開示している。この方法は、下記手順を含む：患者のがん細胞の核酸中の１つ以上の遺伝子を同定し、各遺伝子は、変異アミノ酸配列をコードするがん特異的変異を含む；患者の自己ＡＰＣを誘導して、変異アミノ酸配列を提示する；患者の自己Ｔ細胞を、変異アミノ酸配列を提示する自己ＡＰＣと共培養する；そして、自己Ｔ細胞を選択する。選択工程では、（ａ）変異アミノ酸配列を提示する自己ＡＰＣと共培養され、（ｂ）主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子で提示される変異アミノ酸配列に対して抗原特異性を有する自己Ｔ細胞を選択する必要がある。この主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子は、がん特異的変異によってコードされる変異アミノ酸配列に対して抗原特異性を有する単離されたＴ細胞を提供する患者に発現されるものである。それらの細胞が選択されると、フィーダーＰＢＭＣ（例えば、照射された同種ＰＢＭＣ）、インターロイキン（ＩＬ）−２、及びＯＫＴ３抗体とともに培養することにより、それらが増殖されることが開示されている。
【００１１】
患者の自己ＡＰＣを誘発して変異アミノ酸配列を提示するために、国際公開第２０１６／０５３３３９号は、遊離ペプチド又はヌクレオチドコンストラクトとともにパルスを使用して、細胞に新生抗原（又は新生抗原コード材料）を導入することを教示している。遊離ペプチドとのパルスは、細胞のサイトゾル（細胞内液）に新生抗原を導入する。
【００１２】
したがって、良好な安全性及び選択性を有し、臨床状況で実際に使用できる、がんの治療での使用に適した抗腫瘍Ｔ細胞を提供する改善された方法が依然として必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、抗腫瘍Ｔ細胞の増殖方法を提供し、以下の工程を含む：
ａ）被験体のがんに関連することが知られているか、又は疑われる少なくとも１つの変異アミノ酸を含むアミノ酸配列、又は被験体のがん細胞で発現することが知られているか、又は疑われる変異又は非変異アミノ酸配列を含む、１つ以上の密接に関連する腫瘍新生抗原コンストラクトを有する貪食可能な粒子を提供する工程と；
ｂ）生存可能な抗原提示細胞を提供する工程と；
ｃ）前記抗原提示細胞によって前記粒子の貪食作用が可能になる条件下で、前記粒子と前記抗原提示細胞とを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させる工程と；
ｄ）被験体からの生存可能なＴ細胞を含むＴ細胞サンプルを提供する工程と；
ｅ）前記抗原提示細胞によって提示された抗原に応答して抗腫瘍Ｔ細胞の特異的活性化を可能にする条件下で、前記Ｔ細胞サンプルと、前記粒子と接触した前記抗原提示細胞とを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させる工程と
を含む。
【００１４】
本発明者らは、驚くべきことに、密接に関連する腫瘍新生抗原コンストラクトを有する貪食可能な粒子が、抗原提示細胞によって内在化できること、腫瘍新生抗原コンストラクトがそれらの細胞の表面に提示され、そして粒子／ＡＰＣ混合物の存在下で培養中のＴ細胞の増殖をもたらすことができることを発見した。貪食可能な粒子の使用は、腫瘍新生抗原コンストラクトの驚くほど高い取り込みとプロセシングをもたらす。
【００１５】
抗原提示細胞と組み合わせて、密接に関連する１つ以上の腫瘍新生抗原コンストラクトを有する貪食可能な粒子を使用し、そして粒子／抗原提示細胞をがんを有する被験体のＴ細胞サンプルに暴露することにより、抗腫瘍Ｔ細胞の大幅な増殖を達成できる。一般的に、複数の粒子、例えば１００から１×１０７個の粒子（以下でさらに詳細に説明するように、すべてが同じ種であっても、異なっていてもよい）が使用される。
【００１６】
この方法は、腫瘍新生抗原コンストラクトの配列を制御することができ、そして一つの粒子に複数の腫瘍新生抗原コンストラクトを含めることもできるため、特に効果的である。例えば、１つ以上の異なる新生抗原エピトープを含む異なる腫瘍新生抗原コンストラクトを粒子に付着させることができる。粒子のこの多重化能力により、複数のエピトープによる刺激が可能になり、Ｔ細胞の増殖が最大化される。
【００１７】
貪食可能な粒子の使用により、大量の腫瘍新生抗原コンストラクトが細胞に入り、細胞表面に提示されることもまた、可能になる。本発明による単一の貪食可能な粒子は、典型的には、それに関連する０．５から１００万個の腫瘍新生抗原コンストラクトを有する。これは、貪食可能な粒子を内在化させたＡＰＣ上の新生抗原の高レベルの表面発現をもたらす。
【００１８】
驚くべきことに、貪食可能な粒子の使用は、腫瘍新生抗原コンストラクトを抗原提示細胞に高度に無菌且つ純粋な形で提示することも可能にする。例えば、貪食可能な粒子は、発熱物質などの汚染物質の除去を可能にするのに特に効果的である。
【００１９】
特定の理論に拘束されることを望まないが、密接に関連する腫瘍新生抗原コンストラクトを有する貪食可能な粒子は、ファゴソームへの貪食作用により、抗原提示細胞によって
内在化されるため、特に効果的であると考えられる。次に、腫瘍新生抗原コンストラクトはファゴソームにある粒子から切断され、腫瘍新生抗原コンストラクトの断片は主要組織適合性（ＭＨＣ）クラスＩＩ経路を介して抗原提示細胞の表面に提示され、そしてＭＨＣクラスＩＩ分子によって細胞表面に提示される。また、これは抗原がＡＰＣ上に提示される唯一のプロセスではなく、腫瘍新生抗原コンストラクトの一部の断片はクロスプレゼンテーション（ｃｒｏｓｓ−ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ、交差提示）として知られているプロセスで、主要組織適合性（ＭＨＣ）クラスＩ経路を介して、抗原提示細胞の表面上にも提示され得、そしてＭＨＣクラスＩ分子によって細胞表面に提示され得るとも考えられている。したがって、腫瘍新生抗原コンストラクトの断片は主にＭＨＣクラスＩＩ経路を介してＡＰＣ上に提示されると予想されるが、一部はＭＨＣクラスＩ経路を介して提示されることが予想されるため、本発明は両方の経路をさまざまな程度に活用する。
【００２０】
抗原がＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示されると、通常、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋
Ｔ細胞としても知られる）を活性化する。ヘルパーＴ細胞は他の細胞種を直接殺すのではなく、Ｂ細胞のクラススイッチを誘導してＢ細胞が抗体を作るのを助け、他のＴ細胞種の増殖を刺激するサイトカインの分泌によって免疫応答を調整する。これは、本発明の方法に従って活性化されたＴ細胞の集団は、増殖しそして患者に投与されると、免疫応答がゆっくりと始まり（したがって、ほとんど副作用がない）、長時間持続効果を有するという利点があり、そして、免疫システム全体を利用することにより（例えば、腫瘍細胞を直接攻撃することしかできないＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔ細胞のみを活性化するのではない）、さまざまな方法でがんを標的にすることができることを意味する。これは、抗原が遊離ペプチド、又はペプチドを発現するヌクレオチドコンストラクトとして提供される場合に起こると予想されるものとは対照的である。そのような抗原は、ＡＰＣのサイトゾルに取り込まれ、ＭＨＣクラスＩ分子によるＭＨＣクラスＩ経路のみを介して細胞表面に新生抗原が提示されることが予想される。これは、次に、主にＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔ細胞の活性化をもたらす。
【００２１】
本発明の治療方法では、患者自身の免疫系が利用され、刺激される。それは、Ｔ細胞を投与する前に、内因性Ｔ細胞の化学誘発性枯渇が必要ないことを意味する。したがって、この方法は、特定の同等の代替方法よりも副作用が少ない。
【００２２】
さらに、最初のターゲティングの後、Ｔヘルパー細胞に由来するメモリーＴ細胞は循環し続け、新生抗原を発現しているがん細胞が体内に残っている限り、又は同じがんが再発した場合、迅速かつ効果的な二次免疫応答を開始することができる。
【００２３】
したがって、本発明の方法に従って増殖したＴ細胞の集団は、増殖しそして患者に投与されると、もともと活性化されたＴ細胞から派生したメモリーＴ細胞のため、投与された元のＴ細胞が死んだ後でも機能し続けられる。
【００２４】
本発明の方法はまた、１つ以上の密接に関連する腫瘍新生抗原コンストラクトを有する貪食可能な粒子を、無菌且つ純粋な形で迅速に調製することができ、その後増殖をすぐに開始及び完了することができるため、増殖Ｔ細胞を非常に迅速に生成することができる。治療の成功は、被験体のがんがＴ細胞を投与したときと、サンプルを被験体から採取したときと本質的に同じであることに依存しているため、これは重要である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、Ｔ細胞活性化に対する粒径の影響を示す。オボアルブミン感作マウスの脾細胞を用いた増殖アッセイ（チミジン取り込み）。５．６μｍ、１μｍ、及び０．２μｍの直径の異なるサイズの粒子に連結したオボアルブミンの比較である。Ｐ値はスチューデントのｔ検定を使用して決定され、ｐ＜０．０５が見出されたときに記載された。ひげ線はＳＤを示す。
【図２Ａ】図２は、新生抗原ペプチドＮＡ１−９をともなう刺激によるＴ細胞の増殖を示す。図２Ａは、培養中の細胞数の経時変化を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、％ＣＤ４＋／総Ｔ細胞を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ＣＤ４におけるＴ−ｂｅｔ発現を示す。
【図２Ｄ】、
【図２Ｅ】図２Ｄは、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるグランザイムＢとパーフォリンの発現を示す。
【図３】図３は、新生抗原コンストラクトをともなう刺激によるＴ細胞の増殖を示す。Ｔ細胞（小さい四角）、ＣＤ４＋Ｔ細胞の総数（大きい四角）、及び増殖中のＣＤ４＋細胞（円）におけるの割合を示す。
【図４Ａ】図４は、新生抗原コンストラクトをともなう刺激によるＴ細胞の増殖を示す。図４Ａは、培養中の細胞数の経時変化を示す（赤線：パーソナライズされたペプチド、ピンク及びオレンジ線：同じタンパク質で予測される変異（ＮＡ１、３、４及び５）を持つ予測ペプチドのコントロール培養）。
【図４Ｂ】図４Ｂは、％ＣＤ４＋／総Ｔ細胞を示す。
【図４Ｃ−１】、
【図４Ｃ−２】、
【図４Ｃ−３】、
【図４Ｃ−４】、
【図４Ｃ−５】、及び
【図４Ｃ−６】図４Ｃは、ＣＤ４  Ｔ細胞に対してＢａｒｎｅｓ−Ｈｕｔ  Ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ  Ｎｅｉｇｈｂｏｒ  Ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ（Ｂａｒｎｅｓ−Ｈｕｔ確率的近傍埋め込み）（ＢＨ−ＳＮＥ）アルゴリズムを使用して実行された分析を視覚化したものであり、サンプル内のすべての細胞は、選択されたマーカーのセット：ＣＤ２８、ＣＤ５７、Ｔ−ｂｅｔ、ＧＡＴＡ−３、パーフォリン（Ｐｅｒｆｏｒｉｎ）、グランザイム  Ｂ（Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ）（ＧＺＢ）、Ｋｉ−６７及びＰＤ−１による発現強度の類似性により、２次元マップにクラスター化される。
【図５Ａ】図５Ａは、抗原連結粒子と３７℃で１８時間インキュベートした後の、３つのサイズ（４．５μｍ、２．８μｍ、又は１μｍ）の細胞内貪食抗原連結粒子を含むＰＢＭＣの共焦点顕微鏡画像である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、手動カウントにより評価した、３７℃で１８時間のインキュベーション後のＰＢＭＣにおける２つのサイズ（４．５μｍ又は２．８μｍ）の抗原連結粒子の取り込みを示すグラフである。
【図５Ｃ】図５Ｃは、体積計算（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定を使用して計算）により評価した、３７℃で１８時間のインキュベーション後のＰＢＭＣにおける３つのサイズ（４．５μｍ、２．８μｍ又は１μｍ）の抗原連結粒子の取り込みを示すグラフである。
【図６Ａ】図６Ａは、実施例３ａ（ｉｖ）のＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイで評価された、非刺激細胞と比較した、３つのサイズ（４．５μｍ、２．８μｍ又は１μｍ）の抗原連結粒子で刺激されたＣＭＶ感受性の健康なドナー（ｎ＝２）からのＰＢＭＣにおけるＩＦＮγ産生レベルの相対的な増加を示すグラフである。
【図６Ｂ】図６Ｂは、実施例３ａ（ｉｖ）のＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイで評価された、非刺激細胞と比較した、３つのサイズ（４．５μｍ、２．８μｍ又は１μｍ）の抗原連結粒子で刺激されたＣＭＶ感受性の健康なドナー（ｎ＝１）からのＰＢＭＣにおけるＩＬ２２産生レベルの相対的な増加を示すグラフである。
【図６Ｃ】図６Ｃは、実施例３ａ（ｉｖ）のＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイで評価された、非刺激細胞と比較した、３つのサイズ（４．５μｍ、２．８μｍ又は１μｍ）の抗原連結粒子で刺激されたＣＭＶ感受性の健康なドナー（ｎ＝１）からのＰＢＭＣにおけるＩＬ１７産生レベルの相対的な増加を示すグラフである。
【図６Ｄ】図６Ｄは、実施例３ａ（ｉｖ）のＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイで評価された、非刺激細胞と比較した、３つのサイズ（４．５μｍ、２．８μｍ又は１μｍ）の抗原連結粒子で刺激されたＣＭＶ感受性の健康なドナー（ｎ＝１）からのＰＢＭＣにおけるＩＦＮγとＩＬ１７のデュアルサイトカイン産生の相対的な増加を示すグラフである。
【図６Ｅ】図６Ｅは、実施例３ａ（ｉｖ）のＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイで評価された、非刺激細胞と比較した、３つのサイズ（４．５μｍ、２．８μｍ又は１μｍ）の抗原連結粒子で刺激されたＣＭＶ感受性の健康なドナー（ｎ＝１）からのＰＢＭＣにおけるＩＬ２２とＩＬ１７のデュアルサイトカイン産生の相対的な増加を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
定義
エンドトキシンは、例えばリポポリサッカライド（ＬＰＳ）のように、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）などのグラム陰性菌の外側の細胞壁に見られる共有結合した脂質及び多糖サブユニットを含む。
【００２７】
ＣＤ４＋Ｔ細胞（又はＴヘルパー細胞、又はＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞）は、サイトカイン分泌を介して免疫応答を調整する細胞である。それらは、Ｂ細胞の抗体クラススイッチの刺激、細胞傷害性Ｔ細胞の増殖、又は食細胞の増強など、他の免疫細胞を抑制又は増強することができる。それらは、ＡＰＣ上のＭＨＣクラスＩＩを介した抗原提示により活性化され、特定の抗原内の約１５のアミノ酸のストレッチ（いわゆるＴ細胞エピトープ）に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する。
【００２８】
ＣＤ８＋Ｔ細胞（又は細胞傷害性Ｔ細胞）は、腫瘍細胞、感染細胞又は損傷した細胞を殺す細胞である。それらはＣＤ４＋Ｔ細胞とは異なり、活性化にＡＰＣを必要としない。それらのＴ細胞受容体は、すべての有核細胞で発現するタンパク質であるＭＨＣクラスＩによって提示される抗原由来ペプチド（約７〜１０、例えば８アミノ酸長）を認識する。
【００２９】
抗原特異的Ｔ細胞の活性化は、共刺激と組み合わせて、ＴＣＲと、ＭＨＣ（ＨＬＡ）分子上に提示される定義されたペプチドとの相互作用を必要とするプロセスである。
【００３０】
抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、通常、細胞外生物又はタンパク質、すなわち抗原を貪食するか、又は内在化し、処理後、ＭＨＣクラスＩＩ上の抗原由来ペプチドを、ＣＤ４＋Ｔ細胞に提示する細胞である樹状細胞（ＤＣ）、Ｂ細胞又はマクロファージである。血液中において、単球は最も豊富な抗原提示細胞である。
【００３１】
貪食可能な粒子は、免疫系の細胞、特に単球によって貪食され得る粒子として定義される。
【００３２】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、全血の密度勾配遠心分離によって調製されたヒト血液の画分である。ＰＢＭＣ画分は主に、赤血球、顆粒球、及び血漿が除去されたリンパ球（７０〜９０％）と単球（１０〜３０％）で構成される。単球は、ＰＢＭＣサンプルの細胞数の１０〜２０％、例えば１０〜１５％を占める場合がある。
【００３３】
腫瘍新生抗原は、免疫系によって異物として認識される可能性のあるペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列の腫瘍誘発性変化である。
【００３４】
変異アミノ酸を含むアミノ酸配列は、被験体の非腫瘍細胞中の配列と比較して、変化をともなう被験体の腫瘍細胞中のペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列である。変異アミノ酸は、点突然変異であり得る：例えば、アミノ酸の挿入又は欠失、又はタンパク質又はペプチドの配列中の異なるアミノ酸に対する単一のアミノ酸の置換。状況によっては、２
つ以上の変異アミノ酸が連続して存在する場合がある。突然変異は、フレームシフト突然変異であり得る。
【００３５】
詳細な説明
本発明は、以下により詳細に開示されるように、抗腫瘍Ｔ細胞の増殖のための方法及び手段、ならびに本発明の方法に従って産生される抗腫瘍Ｔ細胞の組成物及び使用を提供する。
【００３６】
貪食可能な粒子とその特性：
粒子は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって貪食可能である。ＡＰＣは、多くの異なる材料及び形状の粒子を貪食できる。したがって、貪食作用を可能にするために、粒子のサイズを選択する必要がある。サイズが小さすぎる粒子は、特定のＡＰＣによる貪食作用を引き起こさない場合がある。サイズが大きすぎる粒子は、細胞に適合しない可能性があるため、特定のＡＰＣによって貪食できない場合がある。
【００３７】
好ましくは、本発明の方法で使用する粒子は、５．６μｍ未満、好ましくは４μｍ未満、より好ましくは３μｍ未満、例えば２．５μｍ未満、２μｍ未満又は１．５μｍ未満の最大寸法を有し得る。好ましくは、本発明の方法で使用する粒子は、０．００１μｍより大きく、好ましくは０．００５μｍより大きく、好ましくは０．０１μｍより大きく、好ましくは０．０５μｍより大きく、好ましくは０．１μｍより大きく、より好ましくは０．２μｍよりも大きく、さらに好ましくは０．５μｍよりも大きい最大寸法を有し得る。好ましくは、本発明の粒子は、０．１〜５．６μｍ、好ましくは０．２〜５．６μｍ、好ましくは０．５〜５．６μｍ、好ましくは０．１〜４μｍ、好ましくは０．５〜４μｍ、より好ましくは０．１〜３μｍ、より好ましくは０．５〜３μｍ、さらにより好ましくは０．１〜２．５μｍ、さらにより好ましくは０．５〜２．５μｍ、さらにより好ましくは０．２〜２μｍ、さらにより好ましくは０．５〜２μｍ、より好ましくは１〜２μｍの間隔で最大寸法を有し、又は例えば約１μｍ、約１．５μｍ又は約２μｍ（好ましくは約１μｍ）の最大寸法を有する。粒子は実質的に球形であってもよく、その場合、寸法は直径を指す。好ましくは、粒子は実質的に球形である。
【００３８】
本発明による好ましい粒子サイズは、貪食作用により細胞に入るのに十分大きいが、複数の粒子が貪食作用により同じ細胞に入ることができるほど小さい。複数の貪食粒子を持つことは、ＡＰＣ細胞が異なるファゴソームのいくつかの粒子から同時にペプチドを取得できることを意味し、したがってＭＨＣクラスＩＩ経路を介した細胞表面での新生抗原の発現を最大化する。
【００３９】
一般に、バクテリアのサイズに近いサイズは、ＡＰＣによる完全な貪食作用を促進する。完全な貪食作用は、ＡＰＣによる良好な抗原分解と、その後のＭＨＣクラスＩＩを介したＴ細胞への良好な提示につながる。最適なサイズは、すでに現在の発明者によって調査されている（実施例３ａ及び実施例３ｂ、図１、図５Ａ−図５Ｃ、及び図６Ａ−図６Ｅを参照）。
【００４０】
特定の好ましい実施形態では、粒子は常磁性特性、又はさらにより好ましくは超常磁性特性を有する。常磁性又は超常磁性粒子は、磁石を使用してＴ細胞から完全に分離できる。重要なのは、内部化粒子を含むＡＰＣは、磁石を使用してＴ細胞から分離することもできる。これにより、インキュベーション混合物からＴ細胞を迅速に分離することができる。次に、すべての粒子が除去されたことを分かった上で、Ｔ細胞を患者に投与することができる。したがって、本発明は、Ｔ細胞を増殖させる、特に安全な方法を提供する。
【００４１】
常磁性粒子はまた、腫瘍新生抗原コンストラクトが関連する粒子の滅菌及び／又は変性
を促進する。洗浄については、以下でさらに詳しく説明する。洗浄中、粒子は磁石によって収集及び／又は保持される。カラムに粒子を保持する（常磁性であるかどうかにかかわらず）か、重力又は遠心分離によって粒子を沈降させるなど、他の手段で洗浄を実行することもできる。
【００４２】
超常磁性粒子の例は、ＤｙｎａｂｅａｄｓTM（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。それらは、例えばＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２７０カルボン酸、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２７０アミン、及びＤｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅカルボン酸など、さまざまな機能化可能な形態で利用できる。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅカルボン酸は、均一に分布した磁性材料を有する高度に架橋されたポリスチレンで構成された均一で単一なサイズを有する、超常磁性粒子である。該粒子は、グリシジルエーテルの親水性層でさらにコーティングされ、その内部に酸化鉄が隠されている。次に、粒子の表面にカルボン酸基が導入される。
【００４３】
超常磁性粒子の他の例には、カプセル化されたカルボキシル化Ｅｓｔａｐｏｒ(R)（エスタポール）超常磁性ミクロスフェア（Ｍｅｒｃｋ  Ｃｈｉｍｉｅ  Ｓ．Ａ．Ｓ．）及びＳｅｒａ−Ｍａｇ  ＳｐｅｅｄＢｅａｄｓ（親水性）カルボキシレート修飾磁性粒子（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＵＫ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）が含まれる。カプセル化されたカルボキシル化Ｅｓｔａｐｏｒ(R)（エスタポール）超常磁性ミクロスフェアはコアシェル構造で作られている。超常磁性酸化鉄材料（〜４０％）はポリスチレンフィルムでカプセル化され、表面の成分を妨害しない。Ｓｅｒａ−Ｍａｇ  ＳｐｅｅｄＢｅａｄｓ（親水性）カルボキシレート修飾磁性粒子は、均一サイズの磁性粒子であり、マグネタイトの第２層（合計〜６０％を構成する２層）の特徴を持つ。その結果、Ｓｅｒａ−Ｍａｇ  ＳｐｅｅｄＢｅａｄｓは磁場に非常にすばやく反応して、サスペンションから素早く完全に分離する。それらはカリフラワー状の表面を持ち、粒子の全体的な表面積と結合能力を増大する。
【００４４】
抗原ポリペプチドと粒子の結合
腫瘍新生抗原コンストラクトは、粒子から解離することなく、以下で議論されるように滅菌及び変性洗浄を実施可能な方法で粒子に結合する。
【００４５】
ポリペプチドを粒子に結合する１つの方法を実施例１に示す。しかし、結合の正確な方法は、本発明の方法にとって重要ではない。好ましくは、ポリペプチドは粒子に共有結合される（例えば、ポリペプチドのアミン基又はカルボン酸基と粒子の表面のカルボン酸基又はアミン基との間のアミド結合を介する）。あるいは、候補抗原ポリペプチドは、金属キレートを介して粒子に結合していてもよい。例えば、イミノ二酢酸などの金属キレート配位子と結合した粒子は、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｏ２＋又はＦｅ３＋などの金属イオンと結合することができる。これらの金属キレートは、同様に例えばヒスチジン又はシステインを含むタンパク質及びペプチドを強い強度で結合することができる。従って、金属キレートを有する粒子は、ストリンジェントな洗浄により結合ペプチド／タンパク質中のＬＰＳ及び他の汚染成分の量を減らすことが可能な方法で、ペプチド／タンパク質を非共有結合的に吸着することができる。
【００４６】
粒子は、ポリマー、ガラス又はセラミック材料を含んでもよい（例えば、粒子はポリマー粒子、ガラス粒子又はセラミック粒子であってもよい）。好ましくは、粒子は、ポリスチレンなどの合成芳香族ポリマー、又はポリエチレンなどの別のポリマーを含む。粒子は、多糖ポリマー、例えばアガロースを含んでもよい。好ましくは、本発明の粒子は、多糖ポリマーを含まない（そして、好ましくは、多糖ポリマー粒子又は炭水化物ベースの粒子ではない）。好ましくは、本発明の粒子はポリスチレン又はポリエチレン粒子であり、より好ましくは、ポリスチレン粒子である。好ましくは、本発明の粒子は単分散粒子（すな
わち、均一なサイズの粒子）である。
好ましくは、粒子は常磁性であり、より好ましくは超常磁性である。
【００４７】
腫瘍新生抗原コンストラクト
腫瘍新生抗原コンストラクトは、被験体のがん細胞で発現することが知られているか、又は疑われる２つ以上の腫瘍新生抗原及び／又は少なくとも１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドである。好ましくは、腫瘍新生抗原コンストラクトは、被験体のがん細胞で発現することが知られているか、又は疑われる２つ以上の腫瘍新生抗原及び／又は変異アミノ酸配列を含む。腫瘍新生抗原コンストラクトは、１つ以上の共有結合ペプチドを含み、１つ以上の共有結合ペプチドは、好ましくは、被験体のがんに関連することが知られているか、又は疑われる少なくとも１つの変異アミノ酸を含むアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、１つ以上の共有結合ペプチドは、被験体のがん細胞で発現することが知られているか、又は疑われる少なくとも１つのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を含む。被験体のがん細胞で発現することが知られているか、又は疑われるアミノ酸配列は、腫瘍が存在する組織又は器官によって発現することが知られているか、又は疑われるアミノ酸配列であり得る。アミノ酸配列は変異していても、変異していなくてもよい。好ましくは、変異している。被験体のがんに関連することが知られているか、又は疑われる少なくとも１つの変異アミノ酸を含むアミノ酸配列（又は、変異しているかどうかにかかわらず、被験体のがん細胞で発現することが知られているか、又は疑われる少なくとも１つのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を含む）は「新生抗原エピトープ」と呼ばれることもある。
【００４８】
好ましくは、変異アミノ酸は置換アミノ酸である（すなわち、非腫瘍細胞のタンパク質又はペプチドのアミノ酸が腫瘍細胞における異なるアミノ酸に置換される）。あるいは、変異アミノ酸は、配列から削除されたアミノ酸であってもよい（すなわち、非腫瘍細胞と比較して腫瘍細胞のタンパク質／ペプチドに削除された）；又は、変異アミノ酸は、配列に挿入されたアミノ酸であってもよい（すなわち、非腫瘍細胞と比較して腫瘍細胞のタンパク質／ペプチドに新しいアミノ酸が追加された）。
【００４９】
腫瘍新生抗原コンストラクトの新生抗原エピトープは、被験体のがんに関連していることが知られているか、又は疑われる変異タンパク質／ペプチド（又は突然変異遺伝子）を選択することによって設計され得る；該タンパク質又はペプチドの配列（又は遺伝子の発現から生じるタンパク質／ペプチド）に変異アミノ酸を配置する；そして、変異アミノ酸を含む該タンパク質／ペプチドの一部を選択し、変異アミノ酸のＣ末端及びＮ末端にいくつかの隣接するアミノ酸を加える。特定の好ましい実施形態では、非腫瘍細胞のタンパク質又はペプチド配列と比較して、タンパク質又はペプチドの配列に単一の変異アミノ酸が存在する。より好ましくは、非腫瘍細胞のタンパク質又はペプチド配列と比較して、タンパク質又はペプチドの配列に単一の置換された変異アミノ酸が存在する。
【００５０】
好ましくは、変異アミノ酸のＣ末端に隣接するアミノ酸の数は、少なくとも５個、好ましくは少なくとも８個、例えば８、９、１０、１１又は１２個のアミノ酸である。
好ましくは、変異アミノ酸のＮ末端に隣接するアミノ酸の数は、少なくとも５個、好ましくは少なくとも８個、例えば８、９、１０、１１又は１２個のアミノ酸である。変異アミノ酸のＣ末端及びＮ末端に隣接するアミノ酸の数は、同じでも異なっていてもよく、好ましくは同じ数である。
【００５１】
特定の実施形態では、１つ以上の共有結合ペプチドは、被験体のがん細胞で発現することが知られているか、又は疑われる少なくとも１つのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を含む。被験体のがん細胞で発現することが知られているか、又は疑われるアミノ酸配列は、腫瘍が存在する組織又は器官によって発現することが知られているか、又は疑われるアミノ酸配列であり得る。アミノ酸配列は変異していても、変異していなくてもよい。好ま
しくは、アミノ酸配列は変異している。
【００５２】
腫瘍新生抗原コンストラクトが２つ以上の共有結合ペプチドを含む実施形態では、好ましくは各共有結合ペプチドは、被験体のがんに関連することが知られているか、又は疑われる少なくとも１つの変異アミノ酸を含むアミノ酸配列（すなわち、新生抗原エピトープ）を含む。あるいは、腫瘍新生抗原コンストラクトが２つ以上の共有結合ペプチドを含む実施形態では、好ましくは腫瘍新生抗原コンストラクトは、以下を含む。つまり、被験体のがんに関連することが知られているか、又は疑われる少なくとも１つの変異アミノ酸を含むアミノ酸配列（すなわち、新生抗原エピトープ）を含む少なくとも１つのペプチド、及び被験体のがん細胞で発現することが知られているか、又は疑われるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を含む少なくとも１つのペプチドを含む。
【００５３】
腫瘍新生抗原コンストラクトが２つ以上の共有結合したペプチドを含む実施形態では、ペプチドは直接連結されていても、スペーサー部分を介して連結されていてもよい。スペーサー部分は、アミノ酸の短い配列、例えば１〜１５個のアミノ酸、好ましくは１〜１０個のアミノ酸、より好ましくは１〜５個のアミノ酸（例えば１、２、３、４又は５個のアミノ酸）であってもよい。好ましくは、スペーサー部分はモチーフＶＶＲを含む。一実施形態では、スペーサー部分は配列ＶＶＲを有する。別の実施形態では、スペーサー部分はモチーフＶＶＲを含まず、例えば、スペーサー部分は配列ＶＶＲを持たない。別の実施形態では、スペーサー部分はモチーフＧＧＳを含み、例えば、スペーサー部分は配列ＧＧＳを有する。別の実施形態では、ペプチドは直接結合している（すなわち、スペーサー部分が存在しない、例えばアミノ酸スペーサー部分が存在しない）。
【００５４】
好ましい実施形態では、腫瘍新生抗原コンストラクトは、２個以上の共有結合ペプチド、より好ましくは３個以上の共有結合ペプチド（例えば、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個の共有結合ペプチド、好ましくは３個、４個、５個又は６個の共有結合ペプチド、より好ましくは３個、４個又は５個の共有結合ペプチド）。好ましくは、結合ペプチドはそれぞれスペーサー部分を介して結合されている。各リンカー部分は同じでも、異なっていてもよい。被験体のがんに関連することが知られているか、又は疑われる少なくとも１つの変異アミノ酸を含むアミノ酸配列をそれぞれ含む、３個の共有結合ペプチドが特に効果的であることがわかった。
【００５５】
２個の結合ペプチドを含む腫瘍新生抗原コンストラクトの構造は次のとおりであり得る：
−［エピトープ配列１］−［リンカー部分］−［エピトープ配列２］。
【００５６】
３個の結合ペプチドを含む腫瘍新生抗原コンストラクトの構造は次のとおりであり得る：
−［エピトープ配列１］−［リンカー部分］−［エピトープ配列２］−［リンカー部分］−［エピトープ配列３］。
【００５７】
４個の結合ペプチドを含む腫瘍新生抗原コンストラクトの構造は次のとおりであり得る：
−［エピトープ配列１］−［リンカー部分］−［エピトープ配列２］−［リンカー部分］−［エピトープ配列３］−［リンカー部分］−［エピトープ配列４］。
【００５８】
５個の結合ペプチドを含む腫瘍新生抗原コンストラクトの構造は次のとおりであり得る：
−［エピトープ配列１］−［リンカー部分］−［エピトープ配列２］−［リンカー部分］−［エピトープ配列３］−［リンカー部分］−［エピトープ配列５］。
【００５９】
ｎ個の結合ペプチドを含む腫瘍新生抗原コンストラクトの構造は次のとおりであり得る：
−［エピトープ配列１］−［リンカー部分］−［エピトープ配列２］−［リンカー部分］−［エピトープ配列３］．．．−［リンカー部分］−［エピトープ配列ｎ］。
【００６０】
好ましい実施形態において、腫瘍新生抗原コンストラクトの各ペプチドは、５個〜５０個のアミノ酸、より好ましくは５個〜３０個のアミノ酸、より好ましくは８個〜３０個のアミノ酸、最も好ましくは１０個〜２５個のアミノ酸、例えば１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、又は２５個のアミノ酸を含む。特に好ましい一実施形態では、腫瘍新生抗原コンストラクトの各ペプチドは、１７個〜２５個のアミノ酸を含み、例えば、変異アミノ酸に加えて、該変異アミノ酸のＣ末端及びＮ末端にある８個〜１２個アミノ酸（好ましくは１０個のアミノ酸）を含む。
【００６１】
粒子が２つ以上の腫瘍新生抗原コンストラクトと関連している実施形態では、各腫瘍新生抗原コンストラクトは同じポリペプチド配列を有してもよく、又は異なるポリペプチド配列を有してもよい。例えば、第１の腫瘍新生抗原コンストラクトは、１つ以上の共有結合ペプチド（例えば、１つ以上の新生抗原エピトープ）を含み得、そして第２の腫瘍新生抗原コンストラクトは、１つ以上の異なる共有結合ペプチド（例えば、第１の腫瘍新生抗原コンストラクトの新生抗原エピトープに対する１つ以上の異なる新生抗原エピトープ）を含み得る。
【００６２】
腫瘍新生抗原コンストラクトは、少なくとも２０個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも３０個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも４０個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも５０個のアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも６０個のアミノ酸を含み得る。腫瘍新生抗原コンストラクトは、１５０個未満のアミノ酸、好ましくは１３０個未満のアミノ酸、より好ましくは１００個未満のアミノ酸、さらにより好ましくは８５個未満のアミノ酸、さらにより好ましくは７５個未満のアミノ酸を含み得る。
【００６３】
本発明は、１個以上の腫瘍新生抗原コンストラクトを粒子に関連付けることを可能にする。腫瘍新生抗原コンストラクトは、１つ以上の新生抗原エピトープを含んでもよい。粒子上のいくつかの新生抗原エピトープの使用は、抗がんＴ細胞の増殖の機会を増やす。ＡＰＣによって提示される断片よりも大きい抗原ポリペプチドはまた、各抗原の多種多様なエピトープが提示されることも保証する。
【００６４】
本発明は、単一の腫瘍新生抗原コンストラクトを所与の粒子に関連付けること、又は複数の異なる新生抗原コンストラクトを所与の粒子に関連付けることを可能にする。１つ以上の同じ腫瘍新生抗原コンストラクトに関連する粒子は、同じ粒子種であると見なされる。１つ以上の異なる腫瘍新生抗原コンストラクトに関連する粒子は、異なる粒子種であると見なされる。
【００６５】
一般に、１００個〜１×１０９個、例えば１００個〜１×１０８個、例えば１００個〜１×１０７個の粒子が所与の増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｒｕｎ）、例えば１０００個〜１×１０７個の粒子で使用される。例えば、粒子濃度とＡＰＣセル濃度の比率は、１０００：１〜１：１０の範囲である。比率は、粒子のサイズに応じて最適化できる。例えば、断面積が１μｍの粒子の場合、比率は５０：１から２：１、例えば２５：１から５：１、例えば１５：１から７：１、例えば１０：１の範囲であり得る。
【００６６】
粒子は同種の集団であってもよく、すなわち、粒子はすべて同じ粒子種であってもよい
。あるいは、粒子は異種の集団であってもよく、すなわち、粒子集団は複数の粒子種を含んでいてもよい。例えば、工程ａ）はさらに、それに密接に関連する１つ以上の腫瘍新生抗原コンストラクトを有する、貪食可能な粒子の第２種を提供することを含む：該腫瘍新生抗原コンストラクトは、被験体のがんに関連することが知られているか、又は疑われる少なくとも１つの変異アミノ酸を含むアミノ酸配列、又は該被験体のがん細胞に発現することが知られているか、又は疑われる変異又は非変異アミノ酸配列を含み、そして、第２の粒子に関連する腫瘍新生抗原コンストラクトの配列は、第１の粒子に関連する腫瘍新生抗原コンストラクトの配列とは異なる。場合により第３、場合により第４、場合により第５、場合により第６、場合により第７、場合により第８、及び場合により第ｎ（ｎは５０までの任意の整数）種の貪食可能な粒子が提供され得、それらの各々は、それに密接に関連する１つ以上の腫瘍新生抗原コンストラクトを有する。ここで、腫瘍新生抗原コンストラクトは、被験体のがんに関連することが知られているか、又は疑われる少なくとも１つの変異アミノ酸、又は被験体のがん細胞で発現することが知られているか、又は疑われる変異又は非変異アミノ酸配列を含むアミノ酸配列を含み、そして第ｎ種の粒子に関連する腫瘍新生抗原コンストラクトの配列は、他種の粒子に関連する腫瘍新生抗原コンストラクトの配列とは異なる。
【００６７】
したがって、本発明の方法では、第１の腫瘍新生抗原コンストラクトに関連する第１の粒子（第１種の粒子）を、第２の腫瘍新生抗原コンストラクトに関連する第２の粒子（第２種の粒子）と組み合わせて使用することができ、ここで第１及び第２の腫瘍新生抗原コンストラクトは異なる配列を有する（例えば、第１の腫瘍新生抗原コンストラクトは、第２の腫瘍新生抗原コンストラクトと比較して１つ以上の異なる新生抗原エピトープを含み；そして好ましくは、第１の腫瘍新生抗原コンストラクトは、第２の腫瘍新生抗原コンストラクトと比較して、すべて異なる新生抗原エピトープを含む）。
【００６８】
さらなる粒子のタイプも使用され得、例えば３種以上の粒子（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、１９、２０、２５、３０、４０、又は５０種）が使用され得る。好ましくは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２種の粒子が使用され得、より好ましくは、２、３、４、５、６、７、又は８種の粒子が使用され得る（例えば、４、５、又は６種の粒子）。複数種の粒子が使用される実施形態では、各種の粒子は、他種の粒子に関連する腫瘍新生抗原コンストラクトとは異なる配列を有する、それに関連する腫瘍新生抗原コンストラクトを有する（例えば、各種の粒子は、他種の粒子に関連する腫瘍新生抗原コンストラクトと比較して、１つ以上の異なる新生抗原エピトープを含む腫瘍新生抗原コンストラクトを有し；そして好ましくは、各種の粒子は、他種の粒子に関連する腫瘍新生抗原コンストラクトと比較して、すべて異なる新生抗原エピトープを有する、それに関連する腫瘍新生抗原構築物を有する）。複数種の粒子が使用される実施形態では、各粒子上の腫瘍新生抗原コンストラクトは、上記のように１つ以上の新生抗原エピトープを含む、上述したコンストラクトである。好ましくは、各種の粒子に関連する腫瘍新生抗原コンストラクトは、２個以上の共有結合ペプチド、より好ましくは３個以上の共有結合ペプチド（例えば、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の共有結合ペプチド、好ましくは３、４、５、又は６個の共有結合ペプチド、より好ましくは３、４又は５個の共有結合ペプチド）を有し、各ペプチドは、被験体のがんに関連することが知られているか、又は疑われる少なくとも１つの変異アミノ酸を含むアミノ酸配列を含む（より好ましくは、それぞれが新生抗原エピトープである）。好ましくは、結合ペプチドはそれぞれスペーサー部分を介して連結されている。各リンカー部分は同じでも、異なっていてもよい。
【００６９】
最も好ましくは、各種の粒子に関連する腫瘍新生抗原コンストラクトは３つの共有結合ペプチドを有し、各ペプチドは、被験体のがんに関連することが知られているか、又は疑われる少なくとも１つの変異アミノ酸を含むアミノ酸配列を含む（より好ましくは、それ
ぞれが新生抗原エピトープである）。そのような実施形態では、好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２種の粒子が使用され、より好ましくは４、５又は６、さらにより好ましくは５種の粒子が使用される。
【００７０】
ＡＰＣによる抗原の分解は均一なプロセスではない。これにより、各抗原の多種多様なエピトープが提示される。したがって、腫瘍新生抗原コンストラクトがＡＰＣによって分解されると、提示されるエピトープの多様性がさらに増加する。ＡＰＣの貪食作用経路を利用し、各腫瘍の新生抗原コンストラクトが１つ以上の新生抗原エピトープを有する可能性と、単一粒子上に１つ以上の腫瘍新生抗原コンストラクトを使用する可能性とを組み合わせることにより、Ｔ細胞の増殖が促進される。それは、より多くの抗腫瘍Ｔ細胞にエピトープを提供する可能性が高められたためである。
【００７１】
新生抗原コンストラクトの被験体のがんに関連することが知られているか、又は疑われる少なくとも１つの変異アミノ酸を含むアミノ酸配列を含むペプチドは、被験体のがんに存在することが知られている変異配列であり得る。例えば、突然変異データ（全エキソームとホットスポット分析の両方）又はがんタイプの抗原プロファイル知られている場合がある；例えば、特定のがんの突然変異データプロファイルは、ＣＯＳＭＩＣデータベースなどのデータベースに含まれている（ｈｔｔｐ：／／ｃａｎｃｅｒ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｃｏｓｍｉｃよりアクセス可能）。次いで、抗原プロファイル中の変異抗原が標的にされ得る。すなわち、腫瘍新生抗原コンストラクト中の１つ以上のペプチドは、抗原プロファイル中に少なくとも１つの変異アミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有するように設計され得る。
【００７２】
腫瘍新生抗原コンストラクトの被験体のがんに関連することが知られているか、又は疑われる少なくとも１つの変異アミノ酸を含むアミノ酸配列を含むペプチドは、腫瘍又は腫瘍が存在する組織で発現することが知られている配列であり得る。そのようなものとして、特定のがん、又はがんが位置する特定の組織又は器官に特異的な抗原を選択することができる。制限された組織又は器官で発現するタンパク質／ペプチドに関する情報を提供する、ＥＢＩ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｔｌａｓ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｇｘａ／ｈｏｍｅ）などのデータベースが利用可能である。次いで、特定の組織で発現したタンパク質に固有のペプチドが、標的にされ得る。
【００７３】
あるいは（又はさらに）、がんのがん細胞のＤＮＡ配列を確立され得、したがってがん細胞の突然変異が推定される。次いで、変異配列が、標的にされ得る。すなわち、腫瘍新生抗原コンストラクト中の１つ以上のペプチドは、がん細胞中に変異アミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有するように設計され得る。
【００７４】
特定の好ましい実施形態では、Ｔ細胞サンプルは治療を受けている被験体に由来し、各腫瘍新生抗原コンストラクトの１つ以上のペプチドの配列は被験体に由来する（特に、被験体のがん細胞の腫瘍抗原プロファイル及び／又はＤＮＡ配列に由来する）。好ましくは、ＡＰＣもまた、被験体に由来する。別の実施形態では、Ｔ細胞サンプルは被験体由来であり得、ＡＰＣは被験体に由来し、そして各腫瘍新生抗原コンストラクトの各ペプチドの配列は、被験体が有するがんの同じ種の変異配列のライブラリーに由来し得る。
【００７５】
抗原提示細胞（ＡＰＣ）及びＴ細胞サンプル
本発明の背景において、ＡＰＣは、単球／マクロファージ又は樹状細胞などの専門的な抗原提示細胞である。ＡＰＣは、初代細胞又は不死化細胞であり得る。好ましくは、抗原提示細胞は食細胞であり、より好ましくは単球又は樹状細胞である。
【００７６】
ＡＰＣは、Ｔ細胞が反応できる抗原特異的コンテキスト（ＭＨＣ制限）でＴ細胞に抗原
を提示できるように、Ｔ細胞サンプルのＴ細胞と適合する必要がある。ＡＰＣ及びＴ細胞サンプルは、好ましくは同じ種から得られ、ＭＨＣ受容体に関してドナーが適合している。ただし、異なる種の遺伝子組み換えＡＰＣの使用も想定されている。より好ましくは、ＡＰＣ及びＴ細胞サンプルは同じ被験体から得られる。抗原提示細胞とＴ細胞サンプルが同じ被験体に由来する場合、ＡＰＣとＴ細胞の間のミスマッチの可能性は回避される。
【００７７】
抗原提示細胞及びＴ細胞サンプルは、同じ血液サンプルに由来してもよく、これは実用的な観点から有利である。抗原提示細胞及びＴ細胞サンプルは、同じ被験体のＰＢＭＣサンプルに由来してもよい。末梢血サンプルからＰＢＭＣを取得することは、同時に同じ被験体からＡＰＣとＴ細胞の両方に便利なソースを提供する標準プロトコルである。
【００７８】
ＰＢＭＣサンプルは、新鮮な状態で使用するか、凍結された状態で使用する場合がある。凍結細胞を使用する可能性は、流通の観点から非常に実用的な利点がある。
【００７９】
Ｔ細胞サンプルは、腫瘍、好ましくは腫瘍内のリンパ管に由来してもよい。さらにより好ましくは、Ｔ細胞サンプルは、センチネルリンパ節（すなわち、腫瘍流入領域リンパ節（ｔｕｍｏｒ  ｄｒａｉｎｉｎｇ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅｓ））に由来し得る。
【００８０】
Ｔ細胞サンプルは、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方を含むＰＢＭＣ全体、精製されたＴ細胞集団、又は特定のＴ細胞集団が枯渇したＰＢＭＣを含み得る。好ましくは、Ｔ細胞サンプルはＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方を含む。
【００８１】
好ましくは、本発明の方法で増殖される抗腫瘍Ｔ細胞は、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞である。抗腫瘍ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞は、抗腫瘍応答を調整（ｏｒｃｈｅｓｔｒａｔｅ）することができる。ＣＤ８＋Ｔ細胞は腫瘍を攻撃することができる。したがって、混合Ｔ細胞応答は有益であり得る。本明細書に記載の実施例には、本発明の方法で増殖した抗腫瘍Ｔ細胞の大部分がＣＤ４＋ヘルパー細胞であるといういくつかの証拠がある。
【００８２】
方法の詳細工程
本発明は、抗腫瘍Ｔ細胞の増殖方法を提供する。本発明の方法はｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施される。好ましくは、被験体は哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。工程（ｅ）は、好ましくは１日から８週間、好ましくは３日から８週間、好ましくは１週間から６週間、より好ましくは１週間から４週間続く。本発明の方法は、工程（ａ）の前に工程（ａ’）：貪食可能な粒子を提供し、１つ以上の腫瘍新生抗原コンストラクトを貪食可能な粒子に密接に結合させる工程、をさらに含み得る。
【００８３】
本発明の方法の一実施形態では、１つ以上の密接に関連する腫瘍新生抗原コンストラクトを有する粒子、抗原提示細胞及びＴ細胞サンプルを同じ容器内で同時に接触させることができる。別の実施形態において、１つ以上の密接に関連する腫瘍新生抗原コンストラクトを有する粒子、及び抗原提示細胞が最初に接触され、続いてＴ細胞サンプルが添加される。別の実施形態において、抗原提示細胞及びＴ細胞サンプルは単一のサンプル中にあり、１つ以上の密接に関連する腫瘍新生抗原コンストラクトを有する粒子がＴ細胞／抗原提示細胞サンプルに添加される。
【００８４】
本発明の方法の一実施形態では、Ｔ細胞サンプルを粒子と接触した抗原提示細胞と接触させる工程（ｇ）は、Ｔ細胞サンプルに対して、低用量のＩＬ−２を添加することをさらに含む。例えば、１．２５Ｕ／ｍｌより大きく（例えば、１．２５Ｕ／ｍｌ、２．５Ｕ／ｍｌ、５Ｕ／ｍｌ、又は５０Ｕ／ｍｌ）、好ましくは２．５Ｕ／ｍｌ、５Ｕ／ｍｌ、又は５０Ｕ／ｍｌより大きい。抗原特異的Ｔ細胞の増殖は、ＩＬ−２が同時に存在する場合、
抗原提示細胞の存在下で起こる。ＩＬ−２は、Ｔ細胞のエフェクターＴ細胞及びメモリーＴ細胞への分化を促進する。抗原特異的Ｔ細胞の増殖に続いて、抗原提示細胞は、例えば磁気分離により、増殖したＴ細胞集団から除去され得る。
【００８５】
本発明の方法の別の実施形態では、Ｔ細胞サンプルを粒子と接触した抗原提示細胞と接触させる工程（ｇ）は、Ｔ細胞サンプルに対して、ＩＬ−２及び／又はＩＬ−７及び／又はＩＬ−１５を添加することをさらに含む。例えば、Ｔ細胞サンプルに対して、低用量のＩＬ−２、例えば、１．２５Ｕ／ｍｌより大きく（例えば、１．２５Ｕ／ｍｌ、２．５Ｕ／ｍｌ、５Ｕ／ｍｌ、又は、５０Ｕ／ｍｌ）、好ましくは２．５Ｕ／ｍｌ、５Ｕ／ｍｌ、又は５０Ｕ／ｍｌより大きいＩＬ−２を添加し、そして任意にＩＬ−７及び／又はＩＬ−１５を添加する。
【００８６】
本発明の方法の一実施形態において、各工程（すなわち、工程（ａ）〜（ｅ）、ならびに存在する場合、さらなる工程）では、いずれの工程においても、抗ＣＤ３抗体及び／又は抗ＣＤ２８抗体は添加されない。特に、工程（ｄ）又は（ｅ）（又は、存在する場合、工程（ｅ１）、（ｆ）、（ｇ）又は（ｈ））中に、抗ＣＤ３抗体及び／又は抗ＣＤ２８抗体は添加されない。本発明の方法の一実施形態では、各工程（すなわち、工程（ａ）〜（ｅ）、ならびに存在する場合、さらなる工程）において、各工程の条件は抗ＣＤ３抗体及び／又は抗ＣＤ２８抗体を含まない。特に、工程（ｄ）及び（ｅ）、並びに存在する場合、工程（ｅ１）、（ｆ）、（ｇ）又は（ｈ））では、各工程のＴ細胞サンプルは、抗ＣＤ３抗体及び／又は抗ＣＤ２８抗体を含まない。抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体は、Ｔ細胞を無差別に刺激し、目的の抗原に特異的ではないＴ細胞、並びに他のＴ細胞の増殖を引き起こす。
【００８７】
本発明の好ましい実施形態では、方法は、工程（ｅ）（又は工程（ｅ１））中、又は後に抗原特異的Ｔ細胞を分離又は単離する工程を含まない。より具体的には、Ｔ細胞サンプル中の抗原提示細胞によって提示された抗原に応答して活性化されたＴ細胞を、活性化されていないＴ細胞サンプル中のＴ細胞から分離又は単離する工程はない。それは、本発明の方法が、提示される抗原に特異的な、必要とされるＴ細胞のみの増殖をもたらすからである。本発明の方法の工程（ｅ）において、Ｔ細胞サンプル中の抗原提示細胞によって提示される抗原に応答して活性化されていないＴ細胞は、プロセス中に死ぬであろう。そのため、分離又は分離工程は不要である。
【００８８】
洗浄
好ましくは、Ｔ細胞サンプルを関連するペプチドを有する粒子と接触した抗原提示細胞と接触させる工程における条件は、無菌（ａｓｅｐｔｉｃ）、より好ましくは滅菌（ｓｔｅｒｉｌｅ）である。粒子の使用により、関連ペプチドを有する粒子の滅菌が可能になり、より特には、粒子に関連する新生抗原コンストラクトの損失又は破壊なしにすべての病原体を除去できるように、過酷な滅菌条件の使用が可能になる。
【００８９】
そのようなものとして、特定の好ましい実施形態では、本発明の方法は、工程（ａ）の前（及び該当する場合、工程（ａ’）の後）：（ａ’’）において、粒子に密接に関連する腫瘍新生抗原コンストラクトを滅菌洗浄（ｓｔｅｒｉｌｉｓｉｎｇ  ｗａｓｈ）させることにより、被験体に有害な物質の除去をもたらすことも含み得る。滅菌洗浄は、変性洗浄でもある。
【００９０】
特定の好ましい実施形態では、本発明の方法は、工程（ａ）の前（及び該当する場合、工程（ａ’）の後）：（ａ’’’）において、粒子に密接に関連する腫瘍新生抗原コンストラクトを変性洗浄させることにより、後続の工程（すなわち、工程（ａ）〜工程（ｅ）、又は存在する場合、工程（ａ）〜工程（ｆ）；工程（ａ）〜工程（ｇ）又は工程（ａ）
〜工程（ｈ））に干渉しない程度にエンドトキシンのレベルが低くなることも含み得る。
【００９１】
工程（ａ’’）及び／又は工程（ａ’’’）を含むそのような実施形態では、滅菌洗浄又は変性洗浄は、関連ポリペプチドコンストラクトを有する粒子を、例えば少なくともｐＨ１２、好ましくは少なくともｐＨ１３、より好ましくは少なくともｐＨ１４、最も好ましくは少なくともｐＨ１４．３のような、高ｐＨにさらすことを含み得る。あるいは、変性洗浄は、関連ポリペプチドコンストラクトを有する粒子を、例えばｐＨ３未満、より好ましくはｐＨ２未満、最も好ましくはｐＨ１未満のような低ｐＨにさらすことを含み得る。
【００９２】
工程（ａ’’）及び／又は工程（ａ’’’）を含むそのような実施形態では、滅菌洗浄又は変性洗浄は、関連ポリペプチドコンストラクトを有する粒子を、少なくとも９０℃、好ましくは少なくとも９２℃、より好ましくは少なくとも９５℃、例えば少なくとも１００℃又は少なくとも１１０℃などの高温にさらすことを、さらに又は代替的に含み得る。滅菌洗浄又は変性洗浄はまた、関連ポリペプチドコンストラクトを有する粒子を、少なくとも５Ｍ、６Ｍ、７Ｍ又は８Ｍなどの十分な濃度の尿素又は塩酸グアニジンなどの変性剤にさらすことを、さらに又は代替的に含み得る。
【００９３】
滅菌洗浄は、粒子及び関連ポリペプチドコンストラクトをアルカリ、好ましくは強アルカリ、例えば少なくとも０．１Ｍ、０．５Ｍ、１Ｍ、２Ｍ、３Ｍ、４Ｍ、５Ｍ、６Ｍ、７Ｍ又は８Ｍのアルカリにさらすことを含み得る。特定の好ましい実施形態では、滅菌洗浄は、粒子及び関連ポリペプチドコンストラクトを少なくとも１Ｍの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、好ましくは少なくとも２ＭのＮａＯＨにさらすことを含み得る。使用され得る他のアルカリには、水酸化リチウム（ＬｉＯＨ）、水酸化カリウム（ＫＯＨ）、水酸化ルビジウム（ＲｂＯＨ）、水酸化セシウム（ＣｓＯＨ）、水酸化マグネシウム（Ｍｇ（ＯＨ）２）、水酸化カルシウム（Ｃａ（ＯＨ）２）、水酸化ストロンチウム（Ｓｒ（ＯＨ）２）、及び水酸化バリウム（Ｂａ（ＯＨ）２）が含まれるが、これらに限定されない。
【００９４】
滅菌洗浄は、粒子及び関連ポリペプチドコンストラクトを酸、好ましくは強酸、例えば少なくとも０．１Ｍ、０．５Ｍ、１Ｍ、２Ｍ、３Ｍ、４Ｍ、５Ｍ、６Ｍ、７Ｍ又は８Ｍの酸にさらすことを含み得る。特定の好ましい実施形態では、滅菌洗浄は、粒子及び関連ポリペプチドコンストラクトを少なくとも１Ｍの塩酸（ＨＣｌ）、好ましくは少なくとも２ＭのＨＣｌにさらすことを含み得る。使用され得る他の酸には、ヨウ化水素酸（ＨＩ）、臭化水素酸（ＨＢｒ）、過塩素酸（ＨＣｌＯ４）、硝酸（ＨＮＯ３）及び硫酸（Ｈ２ＳＯ４）が含まれるが、これらに限定されない。
【００９５】
好ましい実施形態では、滅菌洗浄により、粒子及び関連ポリペプチドコンストラクトが無菌（ａｓｅｐｔｉｃ）になり、より好ましくは、粒子及び関連ポリペプチドコンストラクトが滅菌（ｓｔｅｒｉｌｅ）になる。本明細書で定義されるように、無菌（ａｓｅｐｔｉｃ）は、疾患を引き起こす細菌又は他の生きた微生物が存在しない。本明細書で定義されるように、滅菌（ｓｔｅｒｉｌｅ）は、細菌又は他の生きた微生物が存在しない。
【００９６】
好ましい実施形態では、変性洗浄は、エンドトキシンの最終濃度が１００ｐｇ／ｍｌ未満、好ましくは５０ｐｇ／ｍｌ未満、より好ましくは２５ｐｇ／ｍｌ未満、最も好ましくは１０ｐｇ／ｍｌ未満であるような、エンドトキシン量をもたらす。
【００９７】
調製物が生きた微生物で汚染されている場合、細胞培養の後続の工程が損なわれる可能性がある。したがって、本発明の好ましい方法では、工程（ａ）の関連ポリペプチドコンストラクトを有する粒子は、その後の工程を妨害しない程度の微生物及び妨害しない程度に低いエンドトキシンレベルをもたらす滅菌洗浄にかけられている。
【００９８】
滅菌洗浄の特定の方法は、本発明の文脈では重要ではない。例えば、滅菌洗浄は、粒子及び関連ポリペプチドコンストラクトを高ｐＨ、低ｐＨ、高温、滅菌／変性剤又はそれらの組み合わせにさらすことを含み得る。好ましくは、滅菌洗浄は、粒子及び関連ポリペプチドコンストラクトを高ｐＨ、又は８Ｍ尿素又は６Ｍグアニジン−ＨＣｌなどの強力な滅菌／変性剤にさらすことを含む。最も好ましくは、滅菌洗浄は、粒子及び関連ポリペプチドコンストラクトを少なくとも１３．０、より好ましくは少なくとも１４．０、最も好ましくは少なくとも１４．３の高ｐＨにさらすことを含む。好ましくは、変性は、粒子及び関連ポリペプチドコンストラクトを１〜５Ｍ、好ましくは１〜３Ｍ、より好ましくは１．５〜２．５Ｍ、最も好ましくは２Ｍの強アルカリ、例えばＮａＯＨ又はＫＯＨ、好ましくはＮａＯＨで洗浄することを含み得る。
【００９９】
滅菌洗浄の特別な利点は、粒子と関連ポリペプチドコンストラクトを含む調製物が単一工程で滅菌及び変性されるように条件を選択できることである。特に、高ｐＨ洗浄（例えば、ｐＨ＞１４）は、調製物を便利に、同時にかつ迅速に滅菌し、そしてエンドトキシンを除去するのに効果的な変性洗浄を実現することができる。
【０１００】
滅菌洗浄は、１回の洗浄、又は２回、３回、４回又は５回の洗浄などの複数回の洗浄を含んでもよい。変性洗浄は、１回の洗浄、又は２回、３回、４回又は５回の洗浄などの複数回の洗浄を含んでもよい。
【０１０１】
Ｔ細胞活性化の程度の決定
工程（ｅ）の後、本発明の方法は、工程（ｆ）：Ｔ細胞サンプル中の抗腫瘍Ｔ細胞活性化の程度を決定する工程、をさらに含み得る。例えば、抗腫瘍Ｔ細胞活性化の程度を関連する参照と比較することにより、参照と比較してサンプル中の抗腫瘍Ｔ細胞活性化のより高い程度は、１つ以上の腫瘍新生抗原決定基（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）が、サンプル中の抗腫瘍Ｔ細胞活性化をもたらすという結論を示す。Ｔ細胞サンプル中の抗腫瘍Ｔ細胞活性化の程度の決定は、サンプル中の活性化されたＴ細胞の割合を決定することを含み得る。Ｔ細胞サンプル中の抗腫瘍Ｔ細胞活性化の程度の決定は、ＥＬＩＳｐｏｔ又はＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔ技術を使用して実施することができる。
【０１０２】
この方法は、Ｔ細胞活性化の程度を関連する参照と比較する工程を含み得、それにより、参照と比較してサンプル中のＴ細胞活性化のより高い程度は、候補抗原がサンプル中の抗原特異的Ｔ細胞活性化をもたらすという結論に導く。参照は「活性化」を定義するために重要であるため、参照サンプルと比較して活性化の程度を定義することが好ましい。参照サンプルは、例えば、腫瘍又は腫瘍流入領域リンパ節サンプルを分析するときの正常組織からのサンプルであり得る。参照サンプルを使用して、診断／予後の結論の閾値を設定し、そして抗原特異的な陽性、すなわち活性化、又は陰性、すなわちダウンレギュレーションを決定する。
【０１０３】
Ｔ細胞サンプル中のＴ細胞活性化の程度を決定することは、サンプル中の活性化Ｔ細胞の割合、すなわちサンプル中の総Ｔ細胞に対する活性化Ｔ細胞の数を決定することを含み得る。参照サンプル中の活性化細胞の割合に対する活性化細胞の割合は、Ｔ細胞活性化の規模の尺度を提供する。好ましくは、各分析において、個々のサンプルにおける自発的活性化のレベル（「バックグラウンド活性化レベル」）は、抗原なしでインキュベートされたサンプル、すなわちネガティブコントロールで決定される。バックグラウンドの活性化は、分析で補正される場合があり；つまり、活性化の割合は、ネガティブコントロールに対する活性化の割合が差し引かれる正味の値で計算されてもよい。
【０１０４】
ＥＬＩＳｐｏｔ、Ｆｌｕｏｒｏｓｐｏｔ、フローサイトメトリーによるサイトカインの細胞内染色、ＦＡＳＣＩＡ、増殖アッセイ（チミジン取り込み、ＣＦＳＥ又はＢｒｄＵ染色など）、ＭＨＣ−Ｉ又はＭＨＣ−ＩＩテトラマーによる特異的ＴＣＲ検出、及び分泌サイトカインのＥＬＩＳＡ又はＬｕｍｉｎｅｘ分析を含む、抗原特異的Ｔ細胞活性化の決定に適した方法がいくつか存在する。
【０１０５】
ＥＬＩＳｐｏｔ技術を使用すると、刺激に応答した細胞による特定のサイトカインの放出を直接検出することができる。細胞を膜に播種し、サイトカイン分泌細胞の数を測定する。測定するサイトカインに応じて、マクロファージやＴ細胞の活性化などのさまざまな変数を測定することができる。ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔはＥＬＩＳｐｏｔ技術に基づいており、いくつかの異なる分泌サイトカインの同時読み取りを可能にする。これにより、細胞活性化のより正確で微妙な推定が可能になる。これらの方法はどちらも、Ｔ細胞活性化を測定する迅速かつ簡単な方法を提供する。好ましくは、Ｔ細胞サンプルにおけるＴ細胞活性化の程度の決定は、ＥＬＩＳｐｏｔ／ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔ技術又は増殖アッセイ（すなわち、チミジン取り込み）を使用して実行され得る。Ｔ細胞サンプル中のＴ細胞活性化の程度の決定は、例えばＥＬＩＳｐｏｔ又はＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイにより、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン１７（ＩＬ−１７）、インターロイキン２２（ＩＬ−２２）又はそれらの組み合わせの分泌によって応答する抗原提示細胞と接触したＴ細胞の割合を決定することを含み得る。特定の疾患又は状態を分析するために、Ｔ−ｒｅｇサイトカインなど他の関連分析物（サイトカインの組み合わせ）が使用され得る。
【０１０６】
任意の追加活性化工程
本発明の特定の実施形態では、該方法は、工程（ｅ）の後（例えば、工程（ｅ）の直後、又は工程（ｆ）の直後、又は工程（ｇ）の直後；好ましくは工程（ｅ）の直後又は工程（ｆ）の直後）に：
ｅ１）Ｔ細胞サンプルを、抗原提示細胞により提示される抗原に応答する抗腫瘍Ｔ細胞の特異的活性化を可能にする条件下で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで第２の粒子と接触した第２の抗原提示細胞と接触させる
工程をさらに含む。
【０１０７】
工程（ｅ１）は、Ｔ細胞の活性化及び刺激（「再刺激」）の第２ラウンドとして有利に機能する。したがって、工程（ｅ１）は「再刺激」工程と呼ばれる場合がある。工程（ｅ１）は、例えば、１〜４週間、より好ましくは２〜３週間続き得る。
【０１０８】
好ましくは、本発明の特定の実施形態では、該方法は、工程（ｅ）の後
（例えば、工程（ｅ）の直後、又は工程（ｆ）の直後、又は工程（ｇ）の直後、好ましくは工程（ｅ）の直後又は工程（ｆ）の直後）に：
ａ１）被験体のがんに関連することが知られているか、又は疑われる少なくとも１つの変異アミノ酸を含むアミノ酸配列、又は被験体のがん細胞で発現することが知られているか、又は疑われる変異又は非変異アミノ酸配列を含む、１つ以上の密接に関連する腫瘍新生抗原コンストラクトを有する第２の貪食可能な粒子を提供する工程と；
ｂ１）第２の生存可能な抗原提示細胞を提供する工程と；
ｃ１）抗原提示細胞によって粒子の貪食作用を可能にする条件下で、第２の粒子と第２の抗原提示細胞とを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させる工程と；そして
ｅ１）抗原提示細胞によって提示される抗原に応答する抗腫瘍Ｔ細胞の特異的活性化を可能にする条件下で、Ｔ細胞サンプルと、第２の粒子と接触した第２の抗原提示細胞とを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させる工程と
をさらに含む。
【０１０９】
工程（ｅ１）（又は、存在する場合、工程（ａ１）〜（ｅ１））は、好ましくは、Ｔ細胞サンプルの増殖率（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｒａｔｅ）が低下するときに、工程（ｅ）及び／又は（ｆ）及び／又は（ｇ）の後に実行される。好ましくは、工程（ｅ）は２〜４週間続き（工程（ｅ）中のＴ細胞サンプルの増殖率が低下すると予想される場合）、そして工程（ｅ１）（又は、存在する場合、工程（ａ１）〜（ｅ１））は工程（ｅ）の後に実行される。
【０１１０】
工程（ｅ１）が工程（ｆ）の後に続く実施形態では、該方法は、（ｆ１）：例えば、関連する参照に対する抗腫瘍Ｔ細胞活性化の程度を比較することにより、Ｔ細胞サンプル中の抗腫瘍Ｔ細胞活性化の程度を決定する工程をさらに含み得る。それにより参照と比較してサンプル中の抗腫瘍Ｔ細胞活性化のより高い程度は、１つ以上の腫瘍新生抗原決定基がサンプル中の抗腫瘍Ｔ細胞活性化をもたらすという結論を示す。
【０１１１】
工程（ｅ１）が工程（ｇ）の後に続く実施形態では、方法はさらに（ｇ１）：粒子及び抗原提示細胞を、増殖したＴ細胞サンプルから除去する工程を含み得る。
【０１１２】
１つ以上の密接に関連する腫瘍新生抗原コンストラクトを有する第２の貪食可能な粒子は、工程（ａ）の１つ以上の密接に関連する腫瘍新生抗原コンストラクトを有する貪食可能な粒子と同じであっても、異なっていてもよい。好ましくは、同じである。
【０１１３】
第２の生存可能な抗原提示細胞は、工程（ｂ）の生存可能な抗原提示細胞と同じであってもよく、異なっていてもよい。好ましくは、同じである。
【０１１４】
粒子の除去
工程（ｅ）の後（及び該当する場合、工程（ｆ）及び／又は（ｅ１）の後）、本発明の方法はさらに、工程（ｇ）Ｔ細胞サンプルから粒子を除去する工程；及び／又は工程（ｈ）Ｔ細胞サンプルから粒子及び抗原提示細胞を除去する工程を含み得る。
【０１１５】
粒子が常磁性又は超常磁性粒子である本発明の実施形態において、有利には、粒子及び内在化粒子を有するいずれの抗原提示細胞は、例えば、増殖したＴ細胞サンプルを被験体に輸血する前に、磁石又は磁場を使用してＴ細胞サンプルから完全に除去することができる。そのようなものとして、本発明の方法の最後のＴ細胞サンプルは、増殖したＴ細胞と、飲み込まれた粒子を持たないいずれの抗原提示細胞のみを含む。したがって、本発明の特定の好ましい実施形態では、粒子は常磁性又は超常磁性であり、工程（ｇ）は、磁石又は磁場によってＴ細胞サンプルから粒子を除去することを含む。工程（ｇ）で粒子を除去すると、内在化粒子を含む抗原提示細胞も除去される。典型的に、粒子（及び内在化粒子を有する抗原提示細胞）が工程（ｇ）又は（ｈ）で除去されると、内在化粒子を有する抗原提示細胞は死滅する。
【０１１６】
治療法
本発明の方法は、抗腫瘍Ｔ細胞を提供する。抗腫瘍Ｔ細胞は、被験体のがんの治療に有用である。本発明は、本発明の方法を使用して得られたＴ細胞を被験体に投与する、がんの治療方法を提供する。Ｔ細胞は、工程（ｅ）の後（又は、該当する場合、工程（ｆ）又は（ｇ）の後）に取得された細胞である。増殖したＴ細胞は、静脈内、動脈内、くも膜下腔内、又は腹腔内に投与することができる。
【０１１７】
がんは、あらゆる形態の固形がんであり得る。本発明による固形がんは、臓器に由来する組織の異常な塊である。固形がんには通常、嚢胞や液体領域が含まれない。固形がんは悪性の場合がある。さまざまな種類の固形がんは、それらを形成する細胞の種類に応じて命名される。固形がんの種類には、肉腫、がん腫、及びリンパ腫が含まれる。
【０１１８】
本発明は、本発明の方法により産生された抗腫瘍Ｔ細胞を含む組成物を提供する。例えば、組成物は、ＣＤ４＋ヘルパー細胞及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞、例えばＣＤ４＋ヘルパー細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞の混合物を含んでもよい。例えば、一実施形態では、混合物は、主にＣＤ４＋ヘルパー細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞も含んでもよい。
【０１１９】
本発明はまた、被験体のがんの治療に使用するための、本発明の方法により産生される抗腫瘍Ｔ細胞を含む組成物を提供する。
【０１２０】
本発明はまた、本発明の方法により産生された抗腫瘍Ｔ細胞を被験体に投与することを含む、被験体におけるがんの治療方法を提供する。
【０１２１】
本発明はまた、被験体のがんの治療のための、本発明の方法により産生された抗腫瘍Ｔ細胞の使用を提供する。
【０１２２】
固形がんの例には、副腎がん、肛門がん、未分化大細胞リンパ腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、胆管がん、膀胱がん、脳／ＣＮＳ腫瘍、乳がん、子宮頸がん、結腸がん、子宮内膜がん、食道がん、ユーイング腫瘍、眼がん、胆嚢がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ｇｉｓｔ）、妊娠性絨毛性疾患、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、血管内大Ｂ細胞リンパ腫、腎臓がん、喉頭及び下咽頭がん、肝臓がん、肺がん（非小細胞及び小細胞）、肺カルチノイド腫瘍リンパ腫様肉芽腫症、悪性中皮腫、鼻腔及び副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、結節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、口腔及び中咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、陰茎がん、下垂体腫瘍、原発浸出性リンパ腫、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫、皮膚がん（基底及び扁平上皮細胞、黒色腫及びメルケル細胞）、小腸がん、胃がん、精巣がん、胸腺がん、甲状腺がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、及びウィルムス腫瘍が含まれる。本発明のＴ細胞は、固形がんの治療に特に有効である。したがって、本発明の被験体は固形がんを有する場合がある。本発明のＴ細胞は、肛門がん、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、結腸がん、肝臓がん、肺がん（非小細胞及び小細胞）、肺カルチノイド腫瘍、卵巣がん、膵臓がん、陰茎がん、前立腺がん、胃がん、精巣がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がんからなる群から選択される固形がんの治療に特に有効であり、そしてさらに特には乳がん、結腸がん、肝臓がん、肺がん（非小細胞及び小細胞）、肺カルチノイド腫瘍、膵臓がん、前立腺がん、卵巣がん、及び膀胱がんの治療に有効である。
【０１２３】
本発明のＴ細胞は、転移性固形がんの治療にも特に有効である。転移性がんは、原発部位から身体の１つ以上の異なる領域に広がっているがんである。
【０１２４】
あるいは、がんは、あらゆる形態の血液悪性腫瘍であり得る。本発明による血液悪性腫瘍は、骨髄又はリンパ系などの血液形成組織の細胞で始まるがんの形態である。多くの血液悪性腫瘍では、正常な血液細胞の発達プロセスが、異常なタイプの血液細胞の無制御の成長により中断される。血液がんの例には、白血病、リンパ腫、骨髄腫、及び骨髄異形成症候群が含まれる（リンパ腫は固形がんと血液悪性腫瘍の両方に分類される場合がある）。
【０１２５】
血液悪性腫瘍の例には、急性好塩基球性白血病、急性好酸球性白血病、急性赤芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性巨核芽球性白血病、急性単球性白血病、成熟を伴う急性骨髄芽球性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄性樹状細胞白血病、急性骨髄性白血病、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、侵攻性ＮＫ細胞白血病、未分化大細胞リンパ腫、及び形質細胞腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病、Ｂ細胞白血病
、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、慢性特発性骨髄線維症、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄単球性白血病、慢性好中球性白血病、髄外、有毛細胞白血病、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、血管内大型Ｂ細胞リンパ腫、ケーラー病、リンパ腫様肉芽腫症、肥満細胞白血病、多発性骨髄腫、骨髄腫、結節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、形質細胞白血病、原発性滲出性リンパ腫、及びワルデンシュトレームマクログロブリン血症が含まれる。
【０１２６】
１つの好ましい実施形態では、本発明の方法を使用して得られたＴ細胞が被験体のがんの治療、又は被験体のがんの治療方法に使用される場合、前記被験体は、本発明の方法を使用して得られたＴ細胞の投与前１週間以内に（好ましくは投与前４週間以内に）体内の免疫細胞の数を低下させるいずれの化学療法も投与されていない。
【０１２７】
本発明の利点は、本発明の方法により産生される抗腫瘍Ｔ細胞による反復治療が、新生抗原を認識するメモリーＴ細胞が枯渇した場合、又はＴ細胞が標的とする元の新生抗原とは異なる新生抗原が腫瘍上に存在するようにがんが進化した場合にのみ必要とされることである。その場合、そしてがんが最初のＴ細胞治療に対して耐性になる場合、本発明の方法によって産生される抗腫瘍Ｔ細胞を含むさらなる組成物を投与することにより、治療を再度実施することができる。ここで、工程（ａ）において、貪食可能な粒子は、前回の治療でＴ細胞を産生するために使用された腫瘍新生抗原コンストラクトと比較して、それに密接に関連する異なる腫瘍新生抗原コンストラクトを有する。例えば、新生抗原コンストラクトは異なる配列を有する。例えば、第１の抗腫瘍Ｔ細胞組成物を作製するために前回の方法で使用された貪食可能な粒子と密接に関連する腫瘍新生抗原コンストラクトと比較して、１つ以上の異なる新生抗原エピトープを含み；又は、新生抗原コンストラクトは、第１の抗腫瘍Ｔ細胞組成物を作製するために前回の方法で使用された貪食可能な粒子と密接に関連する腫瘍新生抗原コンストラクトと比較して、すべての異なる新生抗原エピトープを含む。例えば、２回目の治療での新生抗原エピトープは、例えばその時点では腫瘍内でまだ発達していたため、最初の治療では存在しなかったエピトープである。
【０１２８】
本発明はまた、被験体におけるがんの治療に使用するための、本発明の方法により産生される抗腫瘍Ｔ細胞を含む組成物を提供する。ここで、抗腫瘍Ｔ細胞を含む組成物の被験体への投与後に、被験体は、組成物の投与後Ｘ日で本発明の方法により産生される抗腫瘍Ｔ細胞に由来する新生抗原特異的Ｔ細胞（例えば、メモリーＴ細胞）の存在についてモニターされる。ここで、Ｘは約７日、１４日、２１日、２８日、３０日、３５日、４２日、４９日、５６日、６０日、９０日、１２０日、１５０日、１８０日、３００日、及び／又は３６５日であり；場合により、被験体に本発明の方法により産生されたさらなる抗腫瘍Ｔ細胞を投与する。
【０１２９】
本発明はまた、本発明の方法により産生された抗腫瘍Ｔ細胞を被験体に投与することを含み、さらに組成物の投与後Ｘ日で、本発明の方法により産生される抗腫瘍Ｔ細胞に由来する新生抗原特異的Ｔ細胞（例えば、メモリーＴ細胞）の存在についてモニタリングすることを含む、被験体のがんの治療方法を提供する。ここで、Ｘは約７日、１４日、２１日、２８日、３０日、３５日、４２日、４９日、５６日、６０日、９０日、１２０日、１５０日、１８０日、３００日、及び／又は３６５日であり；場合により、本発明の方法により産生されたさらなる抗腫瘍Ｔ細胞を投与する。
【０１３０】
本発明はまた、本発明に従って産生される第１の抗腫瘍Ｔ細胞組成物で予めに治療された被験体における再発がんの治療に使用するための、本発明の方法により産生される抗腫瘍Ｔ細胞を含む組成物を提供する。ここで、該組成物は、本発明の方法により産生される抗腫瘍Ｔ細胞を含む。ここで、工程（ａ）において、貪食可能な粒子と密接に関連する腫瘍新生抗原コンストラクトは、本発明に従って産生される第１の抗腫瘍Ｔ細胞組成物を作
製する方法で使用される貪食可能な粒子と密接に関連する腫瘍新生抗原コンストラクトと異なる配列を有する。例えば、工程（ａ）において、貪食可能な粒子と密接に関連する腫瘍新生抗原コンストラクトは、本発明に従って産生された第１の抗腫瘍Ｔ細胞組成物を作製する方法で使用される、貪食可能な粒子と密接に関連する腫瘍新生抗原コンストラクトと比較して、１つ以上の異なる新生抗原エピトープを含む；そして好ましくは、工程（ａ）において、貪食可能な粒子と密接に関連する腫瘍新生抗原コンストラクトは、本発明に従って産生された第１の抗腫瘍Ｔ細胞組成物を作製する方法で使用される、貪食可能な粒子と密接に関連する腫瘍新生抗原コンストラクトと比較して、すべての異なる新生抗原エピトープを含む。
【０１３１】
本発明はまた、本発明に従って産生された第１の抗腫瘍Ｔ細胞組成物で予めに治療された被験体における再発がんの治療方法を提供し、この方法は、本発明の方法で産生された抗腫瘍Ｔ細胞を被験体に投与することを含む。ここで、工程（ａ）において、貪食可能な粒子と密接に関連する腫瘍新生抗原コンストラクトは、本発明に従って産生された第１の抗腫瘍Ｔ細胞組成物を作製する方法で使用される、貪食可能な粒子と密接に関連する腫瘍新生抗原コンストラクトと異なる配列を有する。例えば、工程（ａ）において、貪食可能な粒子と密接に関連する腫瘍新生抗原コンストラクトは、本発明に従って産生された第１の抗腫瘍Ｔ細胞組成物を作製する方法で使用される、貪食可能な粒子と密接に関連する腫瘍新生抗原コンストラクトと比較して、１つ以上の異なる新生抗原エピトープを含む；そして好ましくは、工程（ａ）において、貪食可能な粒子と密接に関連する腫瘍新生抗原コンストラクトは、本発明に従って産生された第１の抗腫瘍Ｔ細胞組成物を作製する方法で使用される、貪食可能な粒子と密接に関連する腫瘍新生抗原コンストラクトと比較して、すべての異なる新生抗原エピトープを含む。
【０１３２】
本発明の粒子：
本発明はさらに、１つ以上の密接に関連する腫瘍新生抗原コンストラクトを有する、常磁性又は超常磁性の貪食可能な粒子を提供し、該腫瘍新生抗原コンストラクトは、被験体のがんに関連することが知られているか、又は疑われる少なくとも１つの変異アミノ酸を含むアミノ酸配列を含む。
【０１３３】
好ましくは、本発明の粒子は、５．６μｍ未満、好ましくは４μｍ未満、より好ましくは３μｍ未満、例えば２．５μｍ未満、２μｍ未満又は１．５μｍ未満の最大寸法を有し得る。好ましくは、本発明の方法で使用する粒子は、０．００１μｍよりも大きく、好ましくは０．００５μｍよりも大きく、好ましくは０．０１μｍよりも大きく、好ましくは０．０５μｍよりも大きく、好ましくは０．１μｍよりも大きく、より好ましくは０．２μｍよりも大きく、さらにより好ましくは０．５μｍよりも大きい最大寸法を有し得る。好ましくは、望ましくは本発明の粒子は、０．１〜５．６μｍの間隔で、好ましくは０．２〜５．６μｍの間隔で、好ましくは０．５〜５．６μｍの間隔で、好ましくは０．１〜４μｍの間隔で、好ましくは０．５〜４μｍの間隔で、より好ましくは０．１〜３μｍの間隔で、より好ましくは０．５〜３μｍの間隔で、さらにより好ましくは０．１〜２．５μｍの間隔で、さらにより好ましくは０．５〜２．５μｍの間隔で、さらにより好ましくは０．２〜２μｍの間隔で、さらにより好ましくは０．５〜２μｍの間隔で、より好ましくは１〜２μｍの間隔で、又は例えば約１μｍの間隔で、約１．５μｍの間隔で、又は約２μｍの間隔で（好ましくは約１μｍの間隔で）、最大寸法を有する。好ましくは、粒子は実質的に球体である。
【０１３４】
好ましくは、腫瘍新生抗原コンストラクトは、本発明の粒子に共有結合している。例えば、ポリペプチドは、ポリペプチドのアミン基又はカルボン酸基と、粒子の表面上のカルボン酸基又はアミン基との間のアミド結合により結合され得る。
【０１３５】
あるいは、候補抗原ポリペプチドは、金属キレートを介して粒子に結合していてもよい。
【０１３６】
例えば、イミノ二酢酸などの金属キレート配位子と結合した粒子は、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｏ２＋又はＦｅ３＋などの金属イオンと結合することができる。これらの金属キレートは、同様に、例えばヒスチジン又はシステインを含むタンパク質及びペプチドを強い強度で結合することができる。したがって、金属キレートを有する粒子は、ストリンジェント洗浄（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ  ｗａｓｈ）により結合ペプチド／タンパク質中のＬＰＳ及び他の汚染成分の量を減らすことが可能な方法で、ペプチド／タンパク質を非共有結合的に吸着することができる。
【０１３７】
本発明による粒子は、ポリマー、ガラス又はセラミック材料を含んでもよい（例えば、粒子はポリマー粒子、ガラス粒子又はセラミック粒子であってもよい）。好ましくは、粒子は、ポリスチレンなどの合成芳香族ポリマー、又はポリエチレンなどの別のポリマーを含む。粒子は、多糖ポリマー、例えばアガロースを含んでもよい。好ましくは、本発明の粒子は多糖ポリマーを含まない（そして好ましくは、多糖ポリマー粒子ではない）。好ましくは、本発明の粒子はポリスチレン又はポリエチレン粒子であり、より好ましくはポリスチレン粒子である。好ましくは、本発明の粒子は単分散粒子（すなわち、均一なサイズの粒子）である。
【０１３８】
本発明のキット
本発明はさらに、本発明の常磁性又は超常磁性の貪食可能な粒子（すなわち、１つ以上の密接に関連する腫瘍新生抗原コンストラクトを有する、常磁性又は超常磁性の貪食可能な粒子。ここで、該腫瘍新生抗原コンストラクトは、被験体のがんに関連することが知られているか、又は疑われる少なくとも１つの変異アミノ酸を含むアミノ酸配列を含む。）、及びＴ細胞集団の増殖に使用するのに適した試薬を含むキットを提供する。該キットは、ＩＬ−２などのＴ細胞集団の増殖を支援する試薬をさらに含んでもよい。任意に、ＩＬ−７及び／又はＩＬ−１５も含んでもよい。該キットは、本発明の粒子を滅菌するための試薬をさらに含んでもよい。
【０１３９】
好ましくは、該キットは抗ＣＤ３抗体及び／又は抗ＣＤ２８抗体を含まない。
【０１４０】
本発明はさらに、常磁性又は超常磁性の貪食可能な粒子、ペプチドを貪食可能な粒子に連結するための連結試薬、及びＴ細胞集団の増殖に使用するのに適した試薬を含むキットを提供する。
【０１４１】
該キットは、腫瘍新生抗原コンストラクトを設計するための説明書をさらに含んでもよい。該キットはさらに、腫瘍新生抗原コンストラクト、例えば異なるクローニング及び発現条件用に調整されたすぐに使用可能なベクターを生成するための試薬を含んでもよい。該キットは、さらに、又はあるいは、１つ以上の腫瘍新生抗原コンストラクトを含んでもよく、例えば、１つ以上の特定のがんに対する腫瘍新生抗原コンストラクトのライブラリーを含んでもよい。該キットは、１つ以上の新生抗原エピトープを含んでもよい。例えば、１つ以上の特定のがんに対する新生抗原エピトープのライブラリーを含んでもよい。該キットは、新生抗原エピトープ（及び任意で、１つ以上のスペーサー部分）から腫瘍新生抗原コンストラクトを生成するための説明書及び／又は試薬を含んでもよい。
【０１４２】
該キットは、ＩＬ−２などのＴ細胞集団の増殖を支援する試薬をさらに含んでもよい。任意に、ＩＬ−７及び／又はＩＬ−１５も含んでもよい。該キットは、本発明の粒子を滅菌するための試薬をさらに含んでもよい。
【０１４３】
好ましくは、該キットは抗ＣＤ３抗体及び／又は抗ＣＤ２８抗体を含まない。
【０１４４】
好ましくは、該キットは、キットが使用されるとき、例えば本発明の方法で使用されるとき、抗ＣＤ３抗体及び／又は抗ＣＤ２８抗体を加えないという指示を含む。該キットはまた、Ｔ細胞が増殖する前にＴ細胞サンプル中の活性化Ｔ細胞を分離しないという指示を含んでもよい。
【実施例】
【０１４５】
実施例１：粒子へのポリペプチド連結
ポリペプチドは、遊離カルボン酸基を含む常磁性粒子に共有連結した。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＭｙＯｎｅＴＭカルボン酸（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を粒子として使用した（直径１μｍの球体）。連結手順は、製造元のプロトコル（ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）及びＥＤＣ（エチルカルボジイミド）を使用した２段階手順）に従って実行された。
【０１４６】
ＭＥＳ緩衝液（２５ｍＭ  ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）、ｐＨ６）で粒子を２回洗浄した。次に、ＭＥＳ緩衝液中の５０ｍｇ／ｍｌ  ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）及び５０ｍｇ／ｍｌ  ＥＤＣ（Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド）を粒子に添加し、室温で３０分間インキュベートしたことにより、カルボン酸基が活性化された。粒子を磁石で収集し、上清を除去し、そして粒子をＭＥＳ緩衝液で２回洗浄した。タンパク質をＭＥＳ緩衝液で１ｍｇ／ｍｌの濃度まで希釈し、合計１００ｕｇとし、粒子に加え、そして室温で１時間インキュベートした。粒子を磁石で収集し、上清を除去して、そしてタンパク質濃度測定用に保存した。未反応の活性化カルボン酸基を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４で１５分間クエンチした。次に、粒子をＰＢＳ  ｐＨ７．４で洗浄し、−８０℃で保存した。
【０１４７】
粒子に連結したタンパク質の量を測定するために、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡタンパク質アッセイキット、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、連結前及び連結後の上清中のタンパク質のタンパク質濃度を測定した。ＢＣＡアッセイは、製造元のプロトコルに従って使用された。
【０１４８】
連結の成功を確認するために、ビシンコニン酸、ＢＣＡ、タンパク質アッセイを使用して、連結の前後のタンパク質濃度を測定した。いくつかのポリペプチドを試験し、１ｍｇ粒子あたり平均４８．７μｇ（平均：４８．７、ＳＤ：２０．５、Ｎ＝１０）を連結した。製造元の説明書によれば、１ｍｇ粒子あたり５０μｇのポリペプチドを連結することができ、この実施例で行われた連結の効率が高かったことを示している。
【０１４９】
実施例２：洗浄
粒子は、大腸菌で産生された組換えタンパク質と連結された。粒子を３種類の異なる洗浄バッファー、２Ｍ  ＮａＯＨ  ｐＨ１４．３、８Ｍ尿素又は６Ｍグアニジン（グアニジン−ＨＣｌ）のいずれかで、すべて室温の滅菌水で洗浄するか、又はＰＢＳで９５℃でインキュベートした。粒子を緩衝液に懸濁し、４分間振盪し、磁石で収集し、そして上清を除去した。これを３回繰り返した。熱処理された粒子をＰＢＳ  ｐＨ７．４に入れ、９５℃の加熱ブロックに５分間入れた後、磁石で収集し、そして上清を除去した。これを３回繰り返した。次いで、粒子を滅菌ＰＢＳで３回洗浄して、残った洗浄緩衝液を除去した。
【０１５０】
４つの異なる洗浄条件がテストされた：（ａ）高ｐＨ（２Ｍ  ＮａＯＨ  ｐＨ１４．３）、（ｂ）加熱（９５°Ｃ）及び滅菌／変性剤（（ｃ）８Ｍ尿素及び（ｄ）６Ｍ塩酸グアニジン）。洗浄後、粒子に関連したポリペプチドは粒子に関連したままであった。
【０１５１】
実施例３ａ：貪食可能な粒子に適した粒子サイズの特定
チミジンの取り込みを伴う増殖アッセイを使用して、抗原特異的Ｔ細胞活性化に対する粒子サイズの影響をテストした。オボアルブミン（ＯＶＡ）免疫化マウスに由来する脾細胞を、異なるサイズのＯＶＡ連結粒子で刺激して、抗原特異的増殖を測定した。
【０１５２】
表面にカルボン酸を有する直径５．６μｍ、１μｍ及び０．２μｍの常磁性粒子を、実施例１のプロトコルに従って、オボアルブミン又はウシ血清アルブミンと連結させた。
【０１５３】
抗原特異的Ｔ細胞活性化を刺激する粒子の有効性をテストするために、増殖アッセイ（３Ｈチミジン取り込み）を使用した。細胞濃度に関連する粒子濃度は、５．６μｍ粒子では１：１、１μｍ粒子では１０：１、そして０．２μｍ粒子では５００：１であった。細胞とのインキュベーション中の総タンパク質濃度は、５．６μｍ、１μｍ及び０．２μｍについてそれぞれ１２５ｎｇ／ｍｌ、１６０ｎｇ／ｍｌ及び１６０ｎｇ／ｍｌと計算された。増殖アッセイは次のように実行された。
【０１５４】
オボアルブミン感作マウスの脾細胞を用いたチミジン取り込みによる増殖アッセイ。刺激として、ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ(R)（登録商標）ＭｙＯｎｅTMカルボン酸）に連結したオボアルブミン（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）とＢＳＡ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）を使用した。水酸化アルミニウムに吸着した１００μｇのオボアルブミン（Ｓｉｇｍａ）を毎月注射することにより、マウスをオボアルブミンに免疫した。最初の注射から３ヶ月後、マウスを殺し、脾臓を採取した。Ｔｈｕｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．２００９年、Ａｌｌｅｒｇｙ  ６４：９１９に記載されるように、脾細胞を標準的な手順で調製した。
【０１５５】
細胞を、オボアルブミン連結ビーズ又はＢＳＡ連結ビーズ（細胞あたり１０ビーズ）のいずれかとともに、ｃＲＰＭＩ中で５日間インキュベートした。すべての細胞を、３７℃で６％ＣＯ２を含む加湿雰囲気で６日間インキュベートした。インキュベーションの最後の１８時間に、１つの３Ｃｉ／ウェル［３Ｈ］チミジンを細胞培養物に添加した。刺激されたトリプリケートから得られた１分あたりの平均カウント（ｃｐｍ）を非刺激細胞からの平均ｃｐｍ値で除算し、刺激指数（ＳＩ）として表した。ＳＩ値が２．０以上（≧２）になると、一般的に正と見なされる。
【０１５６】
図１に見られるように、直径が０．２μｍのＯＶＡ粒子とインキュベートした細胞は、４．１の平均ＳＩ（９５％ＣＩで２．４〜５．８、Ｐ＝０．００７）で増殖の増加を示した。直径が１μｍのＯＶＡ粒子とインキュベートした細胞は、８．４の平均ＳＩ（９５％ＣＩで６．１〜１０．６、Ｐ＜０．００５）で増殖の増加を示した。直径が５．６μｍのＯＶＡ粒子とインキュベートした細胞は、増殖を刺激することができず、平均ＳＩは１．１であった（９５％ＣＩで０．４〜２．７、Ｐ＝０．８７６）。
【０１５７】
これらの結果は、異なるサイズの粒子に連結した抗原が細胞増殖を刺激できることを示している。約１μｍの直径を有する粒子は、細胞刺激に関して最も効率的であると思われるが、０．２μｍのサイズまでの粒子は依然として機能する。直径が５．６μｍに近づくと、粒子は完全に細胞を刺激し損ねるが、１μｍより大きなサイズの粒子も機能すると予測することは理にかなっている。バクテリアのサイズに似ているため、１μｍが最適なサイズであると想定するのが妥当である。私たちの免疫システムは、このサイズの微生物／粒子を貪食して反応するように進化した。正常な抗原提示細胞は、１０μｍ〜１５μｍの範囲のサイズを有する。
【０１５８】
実施例３ｂ：異なる粒子サイズの抗原連結粒子の比較及びＴ細胞の活性化及び増殖におけるそれらの有効性の比較
（ｉ）抗原連結した貪食可能な粒子の調製：
３種類のサイズの異なる常磁性ポリスチレンの貪食可能な粒子が使用された。
−直径１μｍ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅカルボン酸、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、
−直径２．８μｍ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２７０カルボン酸、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）及び
−直径４．５μｍ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−４５０エポキシ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）。
【０１５９】
貪食可能な粒子を、製造元の説明書に従って、抗原（サイトメガロウイルスタンパク質ＰＰ６５）と連結した。エンドトキシンを除去するために、すべての貪食可能な粒子を０．７５Ｍ水酸化ナトリウム緩衝液で５回洗浄し、その後滅菌ＰＢＳに再懸濁した。
【０１６０】
（ｉｉ）抗原連結した貪食可能な粒子のインキュベーション：
健康なドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、標準的なフィコールベースの密度勾配遠心分離によって単離し、抗原と連結した貪食可能な粒子（以下、「抗原連結粒子」と称する）とともに、４８ウェルプレートで、１，０００，０００個細胞／ｍｌの濃度である５００，０００個細胞／ウェル、３７°Ｃ、５％ＣＯ２の条件で、１８時間培養した。抗原連結粒子の濃度は、総表面積に基づいて均等化された（抗原連結粒子の表面に結合しているため、抗原量の代替マーカー）。これは、サンプル中の総ＰＭＢＣの数に基づいて、１μｍ粒子では１０抗原連結粒子／ＰＢＭＣ、２．８μｍ粒子では１．４抗原連結粒子／ＰＢＭＣ、そして４．５μｍ粒子では０．５抗原連結粒子／ＰＢＭＣに相当した。
【０１６１】
【表１】
2020524514.tif 000003
【０１６２】
（ｉｉｉ）取り込みの評価：
インキュベーション後、共焦点顕微鏡を使用して、貪食された抗原連結粒子の数を手動でカウントした。８つのセルをカウントして、平均及び標準偏差の値を取得した。図５Ａには、共焦点顕微鏡による細胞内に貪食された抗原連結粒子を有する代表的な細胞の画像が示されている。黒い破線は細胞の輪郭を示す。白い線は、細胞内抗原連結粒子全体の寸法を示している。
【０１６３】
この方法は、粒子が小さすぎて正確にカウントできないため、１μｍの抗原連結粒子には適用できなかった。１μｍの抗原連結粒子の量を評価するために、すべての貪食された抗原連結粒子の総体積を測定し、６０％の充填密度を想定し、総体積に基づいて個々の抗原連結粒子の量を逆算した。この方法は、２．８μｍの抗原連結粒子（手動でカウントされた９．１抗原連結粒子／細胞ｖｓ推定１１．９抗原連結粒子／細胞）及び４．５μｍの抗原連結粒子（手動でカウントされた３．１抗原連結粒子／細胞ｖｓ推定２．４抗原連結粒子／細胞）についてかなり正確であることが証明されており、したがって、同様に１μｍの抗原連結粒子の量を正確に推定するものと想定され得る。
【０１６４】
抗原連結粒子の取り込みが図５Ｂ及び図５Ｃに示される。図５Ｂは、手動カウント（ビーズタイプごとに８個の細胞がカウントされた）によって評価された、各細胞に取り込ま
れた抗原連結粒子の数を示している。手動カウント法を使用して、４．５μｍの抗原連結粒子の細胞あたりの貪食された抗原連結粒子の数は、３．１（±１．１）であることがわかった。２．８μｍの抗原連結粒子の場合、９．１（±２．２）であった。この方法を使用して、１μｍの抗原連結粒子の数をカウントすることはできなかった。
【０１６５】
図５Ｃは、体積計算（ビーズタイプごとに３個のセルが測定された）によって評価された各セルに取り込まれた抗原連結粒子の数を示している（＊ｐ＜０．０５  ＊＊ｐ＜０．０１  ＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定を使用して計算された）。体積計算法を使用して、４．５μｍの抗原連結粒子の細胞あたりの貪食された抗原連結粒子の数は２．４（±１．１）であることがわかった。２．８μｍの抗原連結粒子の場合、１１．９（±３．２）であった。１μｍの抗原連結粒子の場合、２０３．７（±２１．９）であった。
【０１６６】
体積計算法によって評価されるように、各細胞に取り込まれた抗原連結粒子の数に基づいて、貪食された総表面積、ひいては抗原の総量が計算された。取り込まれた表面積は、１μｍの抗原連結粒子に対して６３９．６（±６８．９）μｍ２、２．８μｍの抗原連結粒子に対して２９３．１（±７９．３）μｍ２、そして４．５μｍの抗原連結粒子に対して１５０．７（±６７．０）μｍ２と計算された。これらのデータを以下の表２に示す。
【０１６７】
【表２】
2020524514.tif 000004
【０１６８】
（ｉｖ）Ｔ細胞の刺激の評価
Ｔ細胞を刺激し、したがってそれらの増殖を促進する抗原連結粒子の能力は、ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイ（Ｍａｂｔｅｃｈ、スウェーデン）を使用してＰＢＭＣからのＩＦＮγ、ＩＬ２２及びＩＬ１７Ａの放出を測定することにより評価した。ＣＭＶ感受性の健康なドナー（ｎ＝２）からのＰＢＭＣ（２５０，０００／ウェル）を抗原連結粒子で３回刺激した。抗原連結粒子の濃度を、総表面積に基づいて前述のように均等化した：１０  １μｍの抗原連結粒子／細胞、１．４  ２．８μｍの抗原連結粒子／細胞及び０．５  ４．５μｍの抗原連結粒子／細胞。
【０１６９】
【表３】
2020524514.tif 000005
【０１７０】
細胞を３７℃、５％ＣＯ２の条件で４４時間インキュベートした。プレートは製造元の説明書に従って開発され、自動化されたＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔリーダーで読み取られた。ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔについて報告されたデータは、抗原連結粒子で刺激されていない場合のスポット番号よりも上の、抗原連結粒子で細胞が刺激された場合のスポット番号である。
【０１７１】
ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイで評価したＩＦＮγ産生のレベルを図６Ａに示す。抗原粒子間にほとんど違いがないことがわかる。
【０１７２】
ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイで評価したＩＬ２２及びＩＬ１７の産生レベルを図６Ｂ及び図６Ｃに示す。１μｍの抗原連結粒子が、より大きな抗原連結粒子よりも有意に高いＩＬ２２及びＩＬ１７産生を一つの個体で引き起こしたことがわかり、ＩＬ２２に関して他の個体でも同様の傾向が見られる。
【０１７３】
ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイで評価されたデュアルサイトカイン産生のレベルを図６Ｄ及び図６Ｅに示す。１μｍの抗原連結粒子は、より大きな抗原連結粒子よりも１μｍの抗原連結粒子で刺激された場合、１人の健康なドナーに対して有意に高いデュアルサイトカイン放出（ＩＦＮγ＋ＩＬ１７及びＩＬ２２γ＋ＩＬ１７）を引き起こしたことがわかる。
【０１７４】
これらの実験でのサイトカイン放出は、Ｔ細胞増殖の代用として機能する。一般に、ＩＦＮγはＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｔｈ１サブクラス）及びＣＤ８＋Ｔ細胞によって産生される。ＩＬ１７及びＩＬ２２は、主に炎症誘発性Ｔｈ１７  ＣＤ４＋Ｔ細胞によって産生される。そのような炎症誘発性である細胞は、腫瘍の根絶を助けることが示されている。このデータは、追加の炎症誘発性Ｔｈ１７  ＣＤ４＋Ｔ細胞及び、それほど明確ではないが、未だ炎症誘発性の、Ｔ細胞を産生する二重サイトカインの活性化とそれの増殖を引き起こすという追加の利点と共に、１μｍのビーズが活性化して、Ｔｈ１  ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞を他のビーズと同程度に増殖させることを示唆している。
【０１７５】
実施例４：パイロット研究
本発明の方法を利用するパイロット研究が行われた：
（ｉ）膀胱がんにおける新生抗原標的の同定
膀胱がんは高い突然変異率を示し、免疫系によって潜在的に非自己と認識される可能性のある多数の新生抗原を発現している。したがって、本発明者らは、免疫療法のためにＴ細胞を増殖するために使用され得る潜在的な新生抗原の大きなリポジトリを含む突然変異データベースをマイニングすることにより、新生抗原及びＴ細胞標的として適した腫瘍多型を調査した。
【０１７６】
ＣＯＳＭＩＣデータベース［２７８９９５７８］には、全エキソームシーケンシングとホットスポット分析の両方の４７５４移行上皮がんの突然変異データが含まれている。本発明者らは、膀胱がん（ＵＢＣ）に焦点を合わせ、単一のアミノ酸変化をもたらす１５の最も一般的な突然変異を選択し、したがって、新生抗原としての資格を得た。本発明者らはまた、キナーゼ、成長因子受容体及び細胞周期タンパク質などの腫瘍病因に関連することが知られている遺伝子の多型にも注目した。選択された１５の突然変異だけで、ＣＯＳＭＩＣで見つかった膀胱がんの突然変異の７３％をカバーしている。ネオペプチド（Ｎｅｏ−ｐｅｐｔｉｄｅｓ）は、変異アミノ酸に加えて、変異アミノ酸のＣ末端とＮ末端に隣接する１０個のアミノ酸を設計し、２１アミノ酸のペプチドをもたらした。新生抗原コンストラクトを設計するために、３つの新生抗原配列に２つのＶＶＲスペーサーが並べられた。なぜなら、ＶＶＲモチーフは、ヒト白血球抗原提示の工程として、翻訳後リソソームのカテプシンＳによって切断されるためである。
【０１７７】
別の方法として、免疫療法の追加の多型と新しい標的を同定するために、ＵＢＣ患者の腫瘍の全ゲノムシーケンスが実行される。腫瘍のＲＮＡシーケンスが行われることで、多型を運ぶ転写物の存在を確認することができる。多重反応モニタリング（ＭＲＭ）質量分析遷移（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ）を使用して、タンパク質レベルで最も一般的な新生抗原の発現、個々の免疫療法に使用される新生抗原を調整するために、患者を迅速にスキャンする。
【０１７８】
（ｉｉ）組換え新生抗原の産生
組換えタンパク質産生のための非常に効率的なプロトコルが開発された。合成遺伝子は、設計され、購入され、そしてさまざまなクローニング条件と発現条件に合わせて調整された、すぐに使用できるベクターにサブクローニングされる。新生抗原は大腸菌で発現され、Ｎｉ−ＩＭＡＣクロマトグラフィーで精製され、純度とエンドトキシンレベルをテストした後、Ｄｙｎａｂｅａｄｓに連結することにより効率的な抗原提示のために準備される。確立された方法論的プラットフォームにより、組換えタンパク質のクローニングと発現を数週間以内に実行することができる。
【０１７９】
（ｉｉｉ）新生抗原によるＴ細胞の活性化と増殖
上記のように、９つの新生抗原がバイオインフォマティクス的に同定された。設計された新生抗原は、ＦＧＦＲ３やｐ５３などの報告された膀胱がん関連変異を宿す遺伝子に基づいていた。３つの新生抗原を含むコンストラクトを使用したパイロット実験では、本発明者らは、新生抗原アプローチの有効性を実証するＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔにより膀胱がん患者の血液からＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞を同定することができた。
【０１８０】
膀胱がんを患っている同じ患者について、予測された新生抗原ペプチドＮＡ１−９を使用してＴ細胞の活性化を行った。ＮＡ１、３、５、７、及び８に応答する増殖が見られた。図２Ａは、培養中の細胞数の経時変化を示している（ＰＢ＝末梢血）。図２Ａの矢印は、再刺激の時間を示す（すなわち、Ｔ細胞サンプルが、抗原提示細胞によって提示された抗原に応答して抗腫瘍Ｔ細胞の特異的活性化を可能にする条件下で、貪食可能な粒子と接触した抗原提示細胞の２番目のバッチと接触した時間）。図２Ｂは、％ＣＤ４＋／総Ｔ細胞を示している。図２ＣはＣＤ４でのＴ−ｂｅｔ発現を示し、図２ＤはＣＤ８＋Ｔ細胞でのグランザイムＢとパーフォリンの発現を示している。
【０１８１】
増殖したＴ細胞は、転写因子Ｔｂｅｔと高レベルのエフェクター分子パーフォリン及びグランザイムＢ（ＧＺＢ）を発現する。
【０１８２】
本発明の方法は、配列決定された腫瘍データが利用可能であった播種性結腸がんを有する患者からの細胞にも使用されてきた。患者はｐ５３に２つの多型を示し、１つは既知であり、もう１つは新規であった。患者はＰＩＫ３ＣＡの突然変異も示した。患者の腫瘍データの特定の突然変異に基づいて、腫瘍新生抗原コンストラクトが設計され、発現され、精製された。新生抗原コンストラクトは細胞の増殖に使用され、新生抗原の特異的応答をもたらした。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が培養に使用された。図３は、Ｔ細胞（小さい四角）、ＣＤ４＋Ｔ細胞の総数（大きい四角）、及び増殖前と増殖中にＴサンプル中の増殖ＣＤ４＋細胞（円）におけるの割合を示す。図４Ａは、培養中の細胞数の経時変化を示す（赤線はパーソナライズされたペプチドを示し、ピンクとオレンジ線は同じタンパク質で予測される変異（ＮＡ１、３、４及び５）を持つ予測ペプチドのコントロール培養を示す）。図４Ｂは、％ＣＤ４＋／総Ｔ細胞を示す。図４Ａ及び図４Ｂの矢印は、再刺激の時間を示す（すなわち、Ｔ細胞サンプルが、抗原提示細胞によって提示された抗原に応答して抗腫瘍Ｔ細胞の特異的活性化を可能にする条件下で、貪食可能な粒子と接触した抗原提
示細胞の２番目のバッチと接触した時間）。図４Ｃは、ＣＤ４  Ｔ細胞に対してＢａｒｎｅｓ−Ｈｕｔ  Ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ  Ｎｅｉｇｈｂｏｒ  Ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ（ＢＨ−ＳＮＥ）アルゴリズムを使用して実行された分析を視覚化したものであり、サンプル内のすべての細胞は、選択されたマーカーのセット、ここでは、ＣＤ２８、ＣＤ５７、Ｔ−ｂｅｔ、ＧＡＴＡ−３、パーフォリン、グランザイムＢ（ＧＺＢ）、Ｋｉ−６７及びＰＤ−１による発現強度の類似性により、２次元マップにクラスター化される。
【０１８３】
増殖マーカーＫｉ６７の発現とＴ細胞の数は増殖において増加し、抗腫瘍活性の重要なマーカー、例えばＴｂｅｔ、パーフォリン、及びグランザイムＢなどの発現は１４日間の培養期間にわたってＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞の両方で増加した。ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合はＣＤ４＋Ｔ細胞の約１０％に減少したが、ＣＤ８＋細胞の総数は増加した。
【０１８４】
シーケンスデータの受信から増殖した細胞の分析までの全プロセスは、４〜５週間で完了され得る。
【０１８５】
これらの結果は、調整されたＴｈ１新生抗原応答があったことを示す。したがって、本発明者らは、予測された及び配列検証された新生抗原を設計し、Ｔ細胞の活性化及び増殖に使用できることを実証した。
【図１】
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【図２Ａ】
2020524514.tif 000007
【図２Ｂ】
2020524514.tif 000008
【図２Ｃ】
2020524514.tif 000009
【図２Ｄ】
2020524514.tif 000010
【図２Ｅ】
2020524514.tif 000011
【図３】
2020524514.tif 000012
【図４Ａ】
2020524514.tif 000013
【図４Ｂ】
2020524514.tif 000014
【図４Ｃ−１】
2020524514.tif 000015
【図４Ｃ−２】
2020524514.tif 000016
【図４Ｃ−３】
2020524514.tif 000017
【図４Ｃ−４】
2020524514.tif 000018
【図４Ｃ−５】
2020524514.tif 000019
【図４Ｃ−６】
2020524514.tif 000020
【図５Ａ】
2020524514.tif 000021
【図５Ｂ】
2020524514.tif 000022
【図５Ｃ】
2020524514.tif 000023
【図６Ａ】
2020524514.tif 000024
【図６Ｂ】
2020524514.tif 000025
【図６Ｃ】
2020524514.tif 000026
【図６Ｄ】
2020524514.tif 000027
【図６Ｅ】
2020524514.tif 000028
【国際調査報告】
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2020524514.tif 000031
2020524514.tif 000032
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