(57)【要約】  本発明は、特定のウイルスへの曝露及び特定のウイルスによる感染を検出するための組成物、方法、及びキットを提供する。具体的には、本発明は、ウイルスへの暴露及びウイルスによる感染の迅速で、差異的な血清学的検出を可能にする。特に、本発明は、ジカウイルス（ＺＩＫＶ）への曝露及びジカウイルス（ＺＩＫＶ）による感染の迅速な血清学的検出を可能にする。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジカウイルスに対する抗体と強く反応し、かつそれらに特異的である単離されたペプチドのコレクションであって、配列番号１〜１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのペプチドの全域で１残基シフトされたアミノ酸配列又はそれらの組み合わせを含む、単離されたペプチドのコレクション。
【請求項２】
前記ペプチドが、約６アミノ酸〜１２アミノ酸の長さの範囲である、請求項１に記載の単離されたペプチドのコレクション。
【請求項３】
前記単離されたペプチドの１以上が、リガンド、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、酵素、若しくは金属ナノ粒子若しくはナノシェルにコンジュゲートされるか又はビオチン化される、請求項１に記載の単離ペプチドのコレクション。
【請求項４】
前記単離されたペプチドの１以上が、固体支持体上に固定される、請求項１に記載の単離ペプチドのコレクション。
【請求項５】
ジカウイルスに対する抗体と強く反応し、かつそれらに特異的である単離されたペプチドのコレクションであって、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドの全域で１残基シフトされたアミノ酸配列を含む、単離されたペプチドのコレクション。
【請求項６】
前記ペプチドが、約６アミノ酸〜１２アミノ酸の長さの範囲である、請求項５に記載の単離されたペプチドのコレクション。
【請求項７】
前記単離されたペプチドの１以上が、リガンド、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、酵素、若しくは金属ナノ粒子若しくはナノシェルにコンジュゲートされるか又はビオチン化される、請求項５に記載の単離されたペプチドのコレクション。
【請求項８】
前記単離されたペプチドの１以上が、固体支持体上に固定される、請求項５に記載の単離されたペプチドのコレクション。
【請求項９】
アミノ酸配列の配列番号１４〜２２を含むペプチドを含む、請求項５に記載の単離されたペプチドのコレクション。
【請求項１０】
請求項１に記載の単離されたペプチドのコレクションを含むペプチドマイクロアレイ。
【請求項１１】
請求項５に記載の単離されたペプチドのコレクションを含むペプチドマイクロアレイ。
【請求項１２】
請求項９に記載の単離されたペプチドのコレクションを含むペプチドマイクロアレイ。
【請求項１３】
ペプチドマイクロアレイであって、前記ペプチドが、アミノ酸配列の配列番号１を含むペプチド；又はアミノ酸配列の配列番号２〜１３を含むペプチドからなる群から選択されるペプチド；又はアミノ酸配列の配列番号１を含むペプチドの全域で１残基シフトされたアミノ酸配列を含むペプチドのコレクション若しくはセット；又はアミノ酸配列の配列番号２〜１３を含むペプチドからなる群から選択される少なくとも１つのペプチドの全域で１残基シフトされたアミノ酸配列を含むペプチドのコレクション若しくはセットを含む、ペプチドマイクロアレイ。
【請求項１４】
配列番号１〜１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むジカウイルスに対する抗体と強く反応し、かつそれらに特異的である単離されたペプチド。
【請求項１５】
アミノ酸配列の配列番号１を含むジカウイルスに対する抗体と強く反応し、かつそれらに特異的である単離されたペプチド。
【請求項１６】
試料中のジカウイルスに対する抗体の血清学的検出のための方法であって、
ａ．前記ペプチド（複数可）への前記抗体（複数可）の結合を可能にするのに十分な条件下で、請求項１に記載のペプチドのコレクションと前記試料を接触させること；及び
ｂ．前記コレクション中の前記１以上のペプチドを含む抗体−ペプチド複合体の形成を検出すること
を含み、前記複合体の形成が、ジカ抗原のエピトープに対する抗体が前記試料中に存在するという指標である、方法。
【請求項１７】
前記試料が、対象からのものである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記対象が、ヒトの女性である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記対象が、妊娠しているか又は妊娠しようとしている、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記対象が、ジカウイルスワクチン又は免疫調節剤を投与されたことがある試験対象である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記対象が、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で血清反応陽性の結果を有した、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記試料が、鼻咽頭吸引液、血液、脳脊髄液、唾液、血清、血漿、尿、痰、気管支洗浄液、心嚢液、及び腹水からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記試料が、血清、血漿又は尿である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
前記試料が、医薬品及び治療薬の開発のために使用される細胞、細胞培養物、細胞培地並びに組成物からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
前記ペプチドのコレクションが、固体支持体に固定される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２６】
前記検出する工程が、ＥＬＩＳＡアッセイを行うことを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２７】
試料中のジカウイルスに対する抗体の血清学的検出のための方法であって、
ａ．前記ペプチド（複数可）への前記抗体（複数可）の結合を可能にするのに十分な条件下で、請求項５に記載のペプチドのコレクションと前記試料を接触させること；及び
ｂ．前記コレクション中の前記１以上のペプチドを含む抗体−ペプチド複合体の形成を検出すること
を含み、前記複合体の形成が、ジカ抗原のエピトープに対する抗体が前記試料中に存在するという指標である、方法。
【請求項２８】
前記試料が、対象からのものである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記対象が、ヒトの女性である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記対象が、妊娠しているか又は妊娠しようとしている、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記対象が、ジカウイルスワクチン又は免疫調節剤を投与されたことがある試験対象である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記対象が、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で血清反応陽性の結果を有した、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記試料が、鼻咽頭吸引液、血液、脳脊髄液、唾液、血清、血漿、尿、痰、気管支洗浄液、心嚢液、及び腹水からなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記試料が、血清、血漿又は尿である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記試料が、医薬品及び治療薬の開発のために使用される細胞、細胞培養物、細胞培地並びに組成物からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３６】
前記ペプチドのコレクションが、固体支持体に固定される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３７】
前記検出する工程が、ＥＬＩＳＡアッセイを行うことを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３８】
前記ペプチドのコレクションが、アミノ酸配列の配列番号１４〜２２を含むペプチドを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３９】
試料中のジカウイルスに対する抗体の血清学的検出のための方法であって、
ａ．前記ペプチド（複数可）への前記抗体（複数可）の結合を可能にするのに十分な条件下で、請求項１３に記載のペプチドマイクロアレイと前記試料を接触させること；及び
ｂ．前記コレクション中の前記１以上のペプチドを含む抗体−ペプチド複合体の形成を検出すること
を含み、前記複合体の形成が、ジカ抗原のエピトープに対する抗体が前記試料中に存在するという指標である、方法。
【請求項４０】
前記試料が、対象からのものである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記対象が、ヒトの女性である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記対象が、妊娠しているか又は妊娠しようとしている、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記対象が、ジカウイルスワクチン又は免疫調節剤を投与されたことがある試験対象である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記対象が、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で血清反応陽性の結果を有した、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
前記試料が、鼻咽頭吸引液、血液、脳脊髄液、唾液、血清、血漿、尿、痰、気管支洗浄液、心嚢液、及び腹水からなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
前記試料が、血清、血漿又は尿である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記試料が、医薬品及び治療薬の開発のために使用される細胞、細胞培養物、細胞培地並びに組成物からなる群から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４８】
前記ペプチドのコレクションが、固体支持体に固定される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４９】
前記検出する工程が、ＥＬＩＳＡアッセイを行うことを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項５０】
請求項１に記載の単離されたペプチドのコレクションを含むキット。
【請求項５１】
希釈剤及び緩衝液、標識コンジュゲート、特異的に結合した抗原又は抗体の検出のための他の試薬、他のシグナル発生試薬、コーティング試薬、捕捉試薬、洗浄試薬、及び使用のための説明書をさらに含む、請求項５０に記載のキット。
【請求項５２】
請求項５に記載の単離されたペプチドのコレクションを含むキット。
【請求項５３】
希釈剤及び緩衝液、標識コンジュゲート、特異的に結合した抗原又は抗体の検出のための他の試薬、他のシグナル発生試薬、コーティング試薬、捕捉試薬、洗浄試薬、及び使用のための説明書からなる群から選択される１以上の追加の成分をさらに含む、請求項５２に記載のキット。
【請求項５４】
請求項１３に記載のペプチドマイクロアレイを含むキット。
【請求項５５】
希釈剤及び緩衝液、標識コンジュゲート、特異的に結合した抗原又は抗体の検出のための他の試薬、他のシグナル発生試薬、コーティング試薬、捕捉試薬、洗浄試薬、及び使用のための説明書からなる群から選択される１以上の追加の成分をさらに含む、請求項５４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府支援の陳述
本発明は、ＮＩＨ認可番号Ｕ１９ＡＩ１０９７６１の下で政府の支援を受けて行った。そのため、米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ハイスループット血清学を用いるウイルスへの暴露の検出、特に、ジカウイルス（ＺＩＫＶ）への曝露の検出の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
ジカウイルス（ＺＩＫＶ）は、アフリカ、アジア、及びアメリカを含むいくつかの主要な大陸に影響を及ぼす蚊媒介性新興ウイルスであり、世界保健機関（ＷＨＯ）によって世界的な緊急事態とみなされている。ＺＩＫＶ感染症は、小頭症、頭蓋内石灰化、及び胎児脳破壊などが相次いで起こる重度の胎児脳の異常並びに眼の異常の原因として関連しているので、妊娠中の女性にとってリスクが高い（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら、２０１６）。また、ＺＩＫＶ感染症は、おそらくギラン・バレー症候群のリスクの増大を誘発する（Ｂｒｏｕｔｅｔら、２０１６）。
【０００４】
都市及び郊外の環境において、ＺＩＫＶは、ヒト−蚊−ヒトの伝染サイクルで伝染する。蚊の伝染に加えて、ＺＩＫＶが妊娠中に母親から胎児に伝染され得るという証拠が示されている。さらに、パートナーへの性的伝染も報告されている。最後に、輸血を介するＺＩＫＶの伝染は報告されていないが、この経路を介する他の関連するフラビウイルスの伝染を考慮すると、それが生じる可能性はある。
【０００５】
ジカウイルスは、デング熱ウイルス（ＤＥＮＶ）と密接に関連するフラビウイルスである。ＺＩＫＶ診断は、臨床症状及び疫学的関連に基づく場合が多い。ジカウイルス及びデング熱ウイルス、並びに他のウイルス、すなわち、西ナイルウイルス（フラビウイルス）及びチクングニアウイルス（アルファウイルス）感染症も、同様の臨床症状を示すことから、鑑別診断が難しい。ジカウイルス遺伝子産物の検出のための分子アッセイは、活性のある感染の診断に有用であるが、急性感染がクリアされた後に子宮での子供の発達に影響を及ぼす可能性がある歴史的感染症について洞察することはできない。現在の血清学的アッセイにおけるＺＩＫＶとＤＥＮＶ間の交差反応性は、感染症の有病率及び疾患との関連を調査する臨床診断並びに努力を混乱させる。実際、米国疾病管理予防センターは、現在のＺＩＫＶ  ＥＬＩＳＡで血清陽性と判明した全ての試料をプラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）で検証することを勧めている。ＰＲＮＴは、高価で、労働集約的であり、生きているウイルスを必要とするので、ＰＲＮＴは、臨床微生物検査室で実施することが困難である。
【０００６】
また、ＺＩＫＶ用のワクチンは、研究の最前線にある。これらのワクチンが開発されているので、そのようなワクチンの有効性を試験するための迅速で信頼性の高いアッセイが必要とされている。
【０００７】
したがって、ＺＩＫＶ曝露の診断のための、高感度で、特異的で、かつ安価なハイスループット血清学的アッセイが必要とされている。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、特定のウイルスへの曝露及び特定のウイルスによる感染を検出するための組成物、方法、装置、及びキットを提供する。具体的には、本発明は、ウイルスへの暴露及びウイルスによる感染の迅速で、差別的な血清学的検出を可能にする。特に、本発明は、ジカウイルス（ＺＩＫＶ）への曝露及びジカウイルス（ＺＩＫＶ）による感染の迅速な血清学的検出を可能にする。
【０００９】
ＺＩＫＶへの暴露、及びＺＩＫＶによる感染の検出のための組成物、方法、装置、及びキットは、単離された及び単離されない特異的ペプチドを含み、それはＺＩＫＶと強く反応し、ＺＩＫＶに特異的であり、すなわち、ＺＩＫＶに対する抗体の反応性で特異的なエピトープである。
【００１０】
１つのそのようなペプチドは、ＺＩＫＶのＮＳ２Ｂ領域で特定された。それは、回復期血清試料中のＺＩＫＶに９０％超特異的である。このペプチドは、アミノ酸配列：ＤＩＴＷＥＫＤＡＥＸＴＧＮＳＰＲＬＤＶＡ（式中、ＸはＶ又はＩである）（配列番号１）を有する。
【００１１】
したがって、本発明の一実施形態はペプチドであり、それはＺＩＫＶ抗体と反応し、ＺＩＫＶ抗体に対して特異的であり、アミノ酸配列：ＤＩＴＷＥＫＤＡＥＸＴＧＮＳＰＲＬＤＶＡ（式中、ＸはＶ又はＩである（配列番号１）を含む。
【００１２】
回復期血清試料中のＺＩＫＶ抗体と５０％超特異的である１２種の他のペプチドも、ＺＩＫＶプロテオームで特定された。
【００１３】
したがって、本発明のさらなる実施形態は、表２に記載のＺＩＫＶ抗体と反応し、ＺＩＫＶ抗体に特異的である１２種のペプチド（配列番号２〜１３）からなる群から選択されるペプチドである。
【００１４】
本発明のさらなる実施形態は、アミノ酸配列ＤＩＴＷＥＫＤＡＥＸＴＧＮＳＰＲＬＤＶＡ（式中、ＸはＶ又はＩである）（配列番号１）を含むペプチドの全域で１残基シフトされたアミノ酸配列を含むペプチド（すなわち、配列番号１４〜２２）のコレクション又はセットである。これらのコレクション又はセットは、６個のアミノ酸長、７個のアミノ酸長、８個のアミノ酸長、９個のアミノ酸長、１０個のアミノ酸長、１１個のアミノ酸長、及び最高で１２個のアミノ酸長を含むか若しくはそれらからなるペプチドを含むか、又はそれらからなり得る。
【００１５】
本発明のさらなる実施形態は、表２に記載のＺＩＫＶ抗体と反応し、ＺＩＫＶ抗体に特異的である１２種のペプチド（配列番号２〜１３）からなる群から選択される１以上のペプチドの全域で１残基シフトされたアミノ酸配列を含むペプチドのコレクション又はセットである。これらのコレクション又はセットは、６アミノ酸長、７アミノ酸長、８アミノ酸長、９アミノ酸長、１０アミノ酸長、１１アミノ酸長、及び最高で１２アミノ酸長を含むか若しくはそれらからなるペプチドを含むか、又はそれらからなり得る。
【００１６】
一実施形態において、ペプチドのコレクション又はセットは、ＺＩＫＶ抗体と反応し、ＺＩＫＶ抗体に特異的である１３種のペプチド（配列番号１〜１３）の全ての全域で１残基シフトされたアミノ酸配列を含むか又はそれらからなるペプチドの全てを含む。
【００１７】
これらの様々なペプチドのコレクション又はセットは、６アミノ酸長、７アミノ酸長、８アミノ酸長、９アミノ酸長、１０アミノ酸長、１１アミノ酸長、及び最高で１２アミノ酸長又はそれより多くを含むか若しくはそれらからなるペプチドを含むか、又はそれらからなり得る。
【００１８】
本発明で使用するペプチドの数は、２ペプチド〜数千、２ペプチド〜数万、２ペプチド〜数十万の範囲であり得る。
【００１９】
別の態様において、本発明は、本発明の２以上のペプチドを含む組成物を提供する。
【００２０】
別の態様において、本発明は、本発明のペプチドをコードする配列を含む核酸を提供する。加えて、本発明は、そのような核酸を含むベクター、及びそのようなベクターを含む宿主細胞を提供する。特定の実施形態において、ベクターは、シャトルベクターである。他の実施形態において、ベクターは、発現ベクター（例えば、細菌又は真核生物の発現ベクター）である。特定の実施形態において、宿主細胞は細菌細胞である。他の実施形態において、宿主細胞は真核細胞である。
【００２１】
非限定的な例において、ＺＩＫＶに対する抗体は任意の数の免疫検出技術を用いて検出されてよく、それらはウエスタンブロット、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、側方流動、ディップスティックタイプのアッセイ若しくはＳＮＡＰ試験、様々な種類の多重抗体検出技術、又は目的の抗体を検出するのに適切なそのようなアッセイの任意の改変型を含むが、これらに限定されない。ＺＩＫＶに対する患者の抗体は、ＩｇＧ又はＩｇＡ、又は他の免疫グロブリンのクラス若しくはサブタイプであり得る。
【００２２】
一実施形態において、免疫検出技術は、プログラム可能なペプチドアレイの形態である。
【００２３】
特定の実施形態において、本発明のペプチドは、固体支持体上に取り付けられるか、又は固定される。一実施形態において、本発明のペプチドは、金属ナノ層を介して固体支持体に取り付けられる。特定の実施形態において、固体支持体は、ビーズ（例えば、コロイド粒子、金属ナノ粒子又はナノシェル、又はラテックスビーズ）、側方流動免疫アッセイ装置（例えば、多孔質膜）内の流路、ブロット（例えば、ウエスタンブロット、スロットブロット、又はドットブロット）、分析ローター又は遠心ローター内の流路、又は管若しくはウェル（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ又はマイクロアレイに適するプレート中の）である。特定の実施形態において、本発明のペプチドは、単離された（例えば、合成の及び／又は精製された）ペプチドである。特定の実施形態において、本発明のペプチドは、リガンドにコンジュゲートされる。例えば、特定の実施形態において、ペプチドはビオチン化される。他の実施形態において、ペプチドは、ストレプトアビジン、アビジン、又はニュートラアビジンにコンジュゲートされる。他の実施形態において、ペプチドは、担体タンパク質（例えば、血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、又は免疫グロブリンのＦｃドメイン）にコンジュゲートされる。
【００２４】
本発明の特定の一実施形態は、ペプチドを含むペプチドマイクロアレイであり、ペプチドはＺＩＫＶ抗体と反応し、ＺＩＫＶ抗体に特異的である。いくつかの実施形態において、ペプチドマイクロアレイは、アミノ酸配列ＤＩＴＷＥＫＤＡＥＸＴＧＮＳＰＲＬＤＶＡ（式中、ＸはＶ又はＩである）（配列番号１）を含むペプチド；又は表２に記載の１２種のペプチド（配列番号２〜１３）からなる群から選択されるペプチド；又はアミノ酸配列ＤＩＴＷＥＫＤＡＥＸＴＧＮＳＰＲＬＤＶＡ（式中、ＸはＶ又はＩである）（配列番号１）を含むペプチドの全域で１残基シフトされたアミノ酸配列を含むペプチド（すなわち、配列番号１４〜２２）のコレクション若しくはセット；表２に記載の１２種のペプチドからなる群から選択される１以上のペプチドの全域で１残基シフトされたアミノ酸配列を含むペプチド（すなわち、配列番号２〜１３）のコレクション若しくはセット；又はそれらの組み合わせを含む。
【００２５】
別の態様において、本発明は装置を提供する。特定の実施形態において、装置は、免疫アッセイを行うのに有用である。例えば、特定の実施形態において、装置は、側方流動免疫アッセイ装置である。他の実施形態において、装置は、分析ローター又は遠心ローターである。他の実施形態において、装置は、管又は、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ又はマイクロアレイに適するプレート中のウェルである。さらに他の実施形態において、装置は、電気化学センサー、光センサー、又は光電子センサーである。
【００２６】
特定の実施形態において、装置は、本発明の少なくとも１つのペプチドを含む。他の実施形態において、装置は、本明細書に記載の本発明のペプチドのコレクション又はセットを含む。特定の実施形態において、ペプチドは、装置に取り付けられるか、又は固定される。
【００２７】
別の態様において、本発明は、ジカ抗原のエピトープに対する抗体を試料中で検出する方法を提供する。特定の実施形態において、本方法は、本発明の１以上のペプチドと試料を接触させること、及び上記ペプチドを含む抗体−ペプチド複合体の形成を検出することを含み、上記複合体の形成は、ジカ抗原のエピトープに対する抗体が上記試料中に存在するという指標である。特定の実施形態において、本方法は、本発明の異なるペプチドのコレクション又はセットと試料を接触させることを含む。特定の実施形態において、本方法は、本発明のペプチドの全てのコレクション又はセットと試料を接触させることを含む。
【００２８】
本発明のさらなる実施形態は、ＺＩＫＶへの暴露及び／又はＺＩＫＶによる感染の血清学的検出のための方法であって、アミノ酸配列ＤＩＴＷＥＫＤＡＥＸＴＧＮＳＰＲＬＤＶＡ（式中、ＸはＶ又はＩである）（配列番号１）を含むペプチド；又は表２に記載の１２種のペプチド（配列番号２〜１３）からなる群から選択されるペプチド；又はアミノ酸配列ＤＩＴＷＥＫＤＡＥＸＴＧＮＳＰＲＬＤＶＡ（式中、ＸはＶ又はＩである）（配列番号１）を含むペプチドの全域で１残基シフトされたアミノ酸配列を含むペプチド（すなわち、配列番号１４〜２２）のコレクション若しくはセット；又は表２に記載の１２種のペプチド（配列番号２〜１３）からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドの全域で１残基シフトされたアミノ酸配列を含むペプチドのコレクション若しくはセット；又はそれらの組み合わせを含むＺＩＫＶ抗体と反応し、ＺＩＫＶ抗体に特異的なペプチド又は複数のペプチドの使用を含む、方法である。
【００２９】
本発明のさらなる実施形態において、試料中のＺＩＫＶへの暴露及び／又はＺＩＫＶによる感染の血清学的検出のための方法は、アミノ酸配列ＤＩＴＷＥＫＤＡＥＸＴＧＮＳＰＲＬＤＶＡ（式中、ＸはＶ又はＩである）（配列番号１）を含むペプチド；又は表２に記載の１２種のペプチド（配列番号２〜１３）からなる群から選択されるペプチド；又はアミノ酸配列ＤＩＴＷＥＫＤＡＥＸＴＧＮＳＰＲＬＤＶＡ（式中、ＸはＶ又はＩである）（配列番号１）を含むペプチドの全域で１残基シフトされたアミノ酸配列を含むペプチド（すなわち、配列番号１４〜２２）のコレクション若しくはセット；又は表２に記載の１２種のペプチド（配列番号２〜１３）からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドの全域で１残基シフトされたアミノ酸配列を含むペプチドのコレクション若しくはセット；又はそれらの組み合わせを含むＺＩＫＶ抗体と反応し、ＺＩＫＶ抗体に特異的であるペプチド又は複数のペプチドと試料を接触させること、並びに試料中の抗ＺＩＫＶ抗体とペプチド若しくは複数のペプチドの間の結合を検出すること、を含む。
【００３０】
特定の実施形態において、コレクション若しくはセット中のペプチド又は各ペプチドは、単離された（例えば、合成の及び／又は精製された）ペプチドである。特定の実施形態において、ペプチド又はペプチドのコレクション若しくはセットは、固体支持体に取り付けられるか、又は固体支持体上に固定される。一実施形態において、ペプチド又はペプチドのコレクション若しくはセットは、金属（例えば、金）ナノ層を介して固体支持体に取り付けられる。特定の実施形態において、固体支持体は、ビーズ又は複数のビーズ（例えば、コロイド粒子、金属ナノ粒子又はナノシェル、又はラテックスビーズ）、側方流動免疫アッセイ装置（例えば、多孔質膜）内の流路、分析ローター又は遠心ローター内の流路、ブロット（例えば、ウエスタンブロット、スロットブロット、又はドットブロット）、又は管若しくはウェル（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ又はマイクロアレイに適するプレート中の）である。特定の実施形態において、固体支持体は、金属、ガラス、セルロース系材料（例えば、ニトロセルロース）、又はポリマー（例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ナイロン、又はポリスルホン）を含む。
【００３１】
本発明のさらなる実施形態は、ＺＩＫＶへの暴露及び／又はＺＩＫＶによる感染の血清学的検出のための方法であって、アミノ酸配列ＤＩＴＷＥＫＤＡＥＸＴＧＮＳＰＲＬＤＶＡ（式中、ＸはＶ又はＩである）（配列番号１）を含むペプチド；又は表２に記載の１２種のペプチド（配列番号２〜１３）からなる群から選択されるペプチド；又はアミノ酸配列ＤＩＴＷＥＫＤＡＥＸＴＧＮＳＰＲＬＤＶＡ（式中、ＸはＶ又はＩである）（配列番号１）を含むペプチドの全域で１残基シフトされたアミノ酸配列を含むペプチド（すなわち、配列番号１４〜２２）のコレクション若しくはセット；又は表２に記載の１２種のペプチド（配列番号２〜１３）からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドの全域で１残基シフトされたアミノ酸配列を含むペプチドのコレクション若しくはセット；又はそれらの組み合わせを含むＺＩＫＶ抗体と反応し、ＺＩＫＶ抗体に特異的であるペプチドを含むペプチドマイクロアレイの使用を含む、方法である。
【００３２】
本発明のさらなる実施形態において、試料中のＺＩＫＶへの曝露及び／又はＺＩＫＶによる感染の血清学的検出のための方法は、アミノ酸配列ＤＩＴＷＥＫＤＡＥＸＴＧＮＳＰＲＬＤＶＡ（式中、ＸはＶ又はＩである）（配列番号１）を含むペプチド；又は表２に記載の１２種のペプチド（配列番号２〜１３）からなる群から選択されるペプチド；又はアミノ酸配列ＤＩＴＷＥＫＤＡＥＸＴＧＮＳＰＲＬＤＶＡ（式中、ＸはＶ又はＩである）（配列番号１）を含むペプチドの全域で１残基シフトされたアミノ酸配列を含むペプチド（すなわち、配列番号１４〜２２）のコレクション若しくはセット；又は表２に記載の１２種のペプチド（配列番号２〜１３）からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドの全域で１残基シフトされたアミノ酸配列を含むペプチドのコレクション若しくはセット；又はそれらの組み合わせを含むＺＩＫＶ抗体と反応し、ＺＩＫＶ抗体に特異的であるペプチドを含むペプチドマイクロアレイと試料を接触させること、並びに試料中の抗ＺＩＫＶ抗体とマイクロアレイ中のペプチド又は複数のペプチドの間の結合を検出すること、を含む。
【００３３】
特定の実施形態において、検出する工程は、ＥＬＩＳＡアッセイを行うことを含む。他の実施形態において、検出する工程は、側方流動免疫アッセイを行うことを含む。他の実施形態において、検出する工程は、凝集アッセイを行うことを含む。他の実施形態において、検出する工程は、分析ローター又は遠心ローターで試料を回転させることを含む。他の実施形態において、検出する工程は、ウエスタンブロット、スロットブロット、又はドットブロットを用いて試料を分析することを含む。さらに他の実施形態において、検出する工程は、電気化学センサー、光センサー、又は光電子センサーを用いて試料を分析することを含む。特定の実施形態において、検出する工程は、波長シフトアッセイを行うことを含む。
【００３４】
いくつかの実施形態において、ペプチドは、アミノ酸配列の配列番号１〜１３からなる。
【００３５】
いくつかの実施形態において、アミノ酸配列ＤＩＴＷＥＫＤＡＥＸＴＧＮＳＰＲＬＤＶＡ（式中、ＸはＶ又はＩである）（配列番号１）を含むペプチドの全域で１残基シフトされたアミノ酸配列を含むペプチドのコレクション若しくはセットは、アミノ酸配列の配列番号１４〜２２を含むか又はそれらからなる１２ｍｅｒのペプチドを含む。
【００３６】
本発明はまた、ＺＩＫＶへの暴露及び／又はＺＩＫＶによる感染の血清学的検出のためのシステム並びにキットを含む。
【００３７】
本発明を説明する目的のために、図面には本発明の特定の実施形態が示される。しかしながら、本発明は、図面に示された実施形態の正確な配置及び手段に限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１Ａ】免疫反応性ペプチド（配列番号１）がＮＳ２Ｂ領域中のジカウイルスに特異的かつ特徴的な免疫反応性エピトープであり、アミノ酸配列ＤＩＴＷＥＫＤＡＥＶＴＧＮＳＰＲＬＤＶＡ（配列番号１）を含むペプチドの全域で１残基シフトされたペプチド（配列番号１４〜２２）のセットも、ジカウイルスに特異的かつ特徴的であることを示す棒グラフである。各試料についての各バーは、配列番号１４〜２２を表す。
【図１Ｂ】免疫反応性ペプチド（配列番号１）がＮＳ２Ｂ領域中のジカウイルスに特異的かつ特徴的な免疫反応性エピトープであり、ＮＳ２ｂエピトープのバリンからイソロイシンへの変異が反応性、特異性又は特徴的な特性に対して影響を及ぼさないことを示す棒グラフである。アミノ酸配列ＤＩＴＷＥＫＤＡＥＩＴＧＮＳＰＲＬＤＶＡ（配列番号１）を含むペプチドの全域で１残基シフトされたペプチド（配列番号１４〜２２）のセットも、ジカウイルスに特異的かつ特徴的である。各試料についての各バーは、配列番号１４〜２２を表す。
【図２】市販のＥＬＩＳＡアッセイと本発明のペプチド（配列番号１）を用いるＥＬＩＳＡアッセイの比較の結果を示すグラフである。グラフは、市販のＥＬＩＳＡ（右側のバー）及び本発明のペプチド（配列番号１）を用いるＥＬＩＳＡアッセイ（左側のバー）によって検出された既知のジカ陽性血清の割合を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
定義
本発明の文脈及び各用語が使用される特定の文脈内の本明細書で使用される用語は、一般に、当技術分野におけるそれらの通常の意味を有する。特定の用語は、本発明の方法及びその使用方法を説明する際に実施者に追加の指針を提供するために、以下又は本明細書の他の箇所で説明される。さらに、同じことを複数の方法で言うことができることを理解されたい。それ故に、別の言語及び同義語は、本明細書で説明される用語のいずれか１以上のために使用され得、用語が本明細書中で詳述又は説明されるか否かに特別な意味は置かれない。特定の用語の同義語が提供される。１以上の同義語の列挙は、他の同義語の使用を排除するものではない。本明細書で説明される任意の用語の例を含めて、本明細書の他の箇所での例の使用は、単なる例示であり、本発明の範囲及び意味又は任意の例示的な用語を決して限定するものではない。同様に、本発明は、その好ましい実施形態に限定されない。
【００４０】
本明細書で使用する用語「試料」は、抗体、特に、ＺＩＫＶに対する抗体を含有する又は含有することが推定される任意の物質を意味する。試料は、天然又は合成起源のものであり得、当業者に公知の任意の手段によって取得できる。試料は、血漿、血清、全血、脊髄液、精液、羊水、リンパ液、滑液、尿、涙、血球、器官、及び組織を含むが、これらに限定されない、対象から単離された組織又は体液の試料であり得る。試料は、研究試料、臨床試料、又は環境試料であり得る。試料はまた、輸血又は治療に使用される血液生成物であり得る。試料はまた、合成のものであり得、馴化培地、組換え細胞、及び細胞成分を含むがこれらに限定されないインビトロ細胞培養成分を含むが、これらに限定されない。
【００４１】
本明細書で使用する用語「対象」は、マウス、ラット、イヌ、モルモット、フェレット、ウサギ及び霊長類などの哺乳動物を含むが、これらに限定されない任意の生物を意味する。好ましい実施形態において、対象は、ヒト、ペット又は家畜動物である。
【００４２】
本出願で使用される用語「患者」は、ヒト対象を意味する。
【００４３】
本明細書で使用する用語「検出」、「検出する」、及び「検出すること」などは、本明細書では、その存在（ｐｒｅｓｅｎｃｅ）又は存在（ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ）を見出す手段を意味する。
【００４４】
本明細書で使用する用語「特定」、「特定する」、及び「特定すること」などは、対象からの試料中の特定のウイルス又は複数のウイルスへの曝露を認識することを意味する。
【００４５】
用語「ペプチド」は、２以上のアミノ酸の任意の配列を含む。本明細書に具体的に列挙されるペプチド配列は、左側にアミノ末端及び右側にカルボキシ末端で書かれている。
【００４６】
用語「アミノ酸」は、Ｄ型又はＬ型の天然アミノ酸（例えば、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｈｙｌ、Ｈｙｐ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びＶａｌ）、並びに非天然アミノ酸（例えば、ホスホセリン、ホスホスレオニン、ホスホチロシン、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、馬尿酸、オクタヒドロインドール−２−カルボン酸、スタチン、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、ペニシラミン、オルニチン、シトルリン、α−メチルアラニン、パラ−ベンゾイルフェニルアラニン、フェニルグリシン、プロパルギルグリシン、サルコシン、及びｔｅｒｔ−ブチルグリシン）の残基を含む。この用語はまた、従来のアミノ保護基（例えば、アセチルオキシカルボニル又はベンジルオキシカルボニル）を有する天然及び非天然アミノ酸、並びにカルボキシ末端が保護される（例えば、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、フェニル又はベンジルエステル又はアミドなどで）天然及び非天然アミノ酸を含む。
【００４７】
「抗原」（抗体作製からの）又は「免疫原」は、抗体の作製を促進し免疫応答を引き起こすことができる物質である。それらはまた、診断又は患者の選択又は特徴付けの目的のために使用できる。
【００４８】
抗体（免疫グロブリン（Ｉｇ）としても知られる）は、脊椎動物の血液又は他の体液中に見られるグロブリンタンパク質であり、細菌及びウイルスなどの異物を特定し中和するために免疫系によって使用される。これらは典型的には、各々２つの大きな重鎖及び２つの小さな軽鎖を有する基本的な構造単位で作られて、例えば、１つの単位を有するモノマー、２つの単位を有するダイマー又は５つの単位を有するペンタマーを形成する。抗体は、Ｂ細胞によって生成される。いくつかの異なる種類の抗体重鎖、及びいくつかの異なる種類の抗体が存在し、抗体はそれらが有する重鎖に基づいて異なるアイソタイプにグループ化される。５つの異なる抗体アイソタイプが哺乳類で知られており、それらは異なる役割を果たし、それらが出会うそれぞれ異なる種類の異物に対する適切な免疫応答を指示するのを助ける。
【００４９】
全ての抗体の一般的な構造は非常に類似しているが、タンパク質の先端の小領域は非常に可変であり、わずかに異なる先端構造を有する何百万の抗体が存在することを可能にする。この領域は、超可変領域として知られている。これらの変異体のそれぞれは、抗原として知られる異なる標的に結合できる。抗体のこの巨大な多様性は、免疫系が抗原の同じように広い多様性を認識するのを可能にする。抗体によって認識される抗原の部分は、「エピトープ」と呼ばれる。これらのエピトープは、誘導適合と呼ばれる高度に特異的な相互作用でそれらの抗体と結合し、これは、抗体が生物を構成する何百万もの異なる分子の中で適合抗原（複数可）中のそれらの特異的エピトープのみを特定し及び結合するのを可能にする。抗体による抗原の認識は、免疫系の他の部分による攻撃のために抗原をタグ付けする。抗体はまた、例えば、病原体が感染症を引き起こすのに必要とする病原体の一部に結合することによって、標的を直接中和することができる。抗体の生成は、体液性免疫系の主な機能である。
【００５０】
本明細書で使用する用語「単離された」などは、参照材料が通常見出される天然の環境で見出される成分を、材料が含まないことを意味する。特に、単離された生物材料は、細胞成分を含まない。単離されたペプチド又はタンパク質は、他のタンパク質又は核酸、又はその両方と結合し得、それらと細胞内で結合するか、又はそれが膜結合タンパク質である場合は細胞膜と結合する。単離された材料は、精製されてよいが、その必要はない。
【００５１】
本明細書で使用する用語「実質的に精製された」は、細胞物質（タンパク質、脂質、炭水化物、核酸）、培地、化学的前駆体、ペプチドの合成に使用される化学物質、又はそれらの組み合わせを実質的に含まない、ペプチドなどの分子を指す。実質的に精製されたペプチドは、細胞性物質、培地、他のポリペプチド、化学物質前駆体、及び／又はペプチドの合成に使用される化学物質の約４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、２％、又は１％以下を有する。したがって、ペプチドなどの、実質的に純粋な分子は、関心のある分子の乾燥重量で、少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％であり得る。
【００５２】
用語「約」又は「およそ」は、当業者によって決定される特定の値の許容誤差範囲内を意味し、それは値が測定又は決定される方法、すなわち、測定システムの限界、すなわち、医薬製剤などの特定の目的に要求される精度の程度に部分的に依存する。例えば、「約」は、当技術分野における実施あたり１以内又は１超の標準偏差内を意味し得る。あるいは、「約」は、所定の値の最高２０％、好ましくは最高で１０％、より好ましくは最高で５％、及びより好ましくは最高で１％の範囲を意味し得る。あるいは、特に生物システム又はプロセスに関して、この用語は、値の好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内の桁内を意味し得る。特定の値が明細書及び特許請求の範囲に記載されている場合、特に断りのない限り、特定の値の許容誤差範囲内を意味する用語「約」が想定されるべきである。
【００５３】
本発明は、対象の病原体の曝露歴をプロファイリングするための新しい血清学的アッセイプラットフォームを確立することにより、ＺＩＫＶの鑑別診断及び管理を強化する。
【００５４】
ポリメラーゼ連鎖反応及びハイスループットスクリーニングなどの技術における進歩が、過去２０年間で感度、特異性及び幅を劇的に改善した分子診断とは対照的に、血清学的方法は、ほとんど変わらないままであった。この遅れは、感染症の分布及び頻度の確立、薬剤の発見と疾患の関連の重要性の試験、及び病原体の発見における努力の集中における血清学の役割を考慮すると、重大である。本明細書に記載されるのは、特にＺＩＫＶの診断血清検査の第１の高感度で、公平で、高度に多重化されたプラットフォームである。このペプチドアレイベースのプラットフォームは、感染症による急性及び慢性疾患の疫学並びに病因を調査するための、並びにワクチン及び免疫調節薬に対する体液性応答を監視するための新たな戦略を可能にする。それは、側方流動免疫アッセイを含む確立された安価な代替プラットフォームで使用できる重要な有益ペプチドの迅速な選択のためのスクリーニングツールとしても機能する。そのような適用は、感染性疾病のレトロスペクティブな鑑別診断を可能にすること（原因物質の遺伝的足跡がもはや存在しない場合）、アウトブレイクの調査及び監視を容易にすることにより、臨床医学と公衆衛生の両方に実用的な有用性を有する。
【００５５】
これは、患者がもはや急性感染の証拠、例えば、ウイルス核酸を有しないが、胎児に影響を与えるか又は別の病気、例えば、ギラン・バレー症候群の原因である可能性があるＺＩＫＶ感染症を過去に有したことがあるようなＺＩＫＶによる感染において特に有用である。
【００５６】
本発明は、１残基シフトされる１２ｍｅｒのペプチド（例えば、残基１〜１２、２〜１３、３〜１４）のスライディングウィンドウでウイルスプロテオームをタイル表示する戦略を使用して開発されたアッセイである。目標は、ジカに特異的でかつ感受性があるペプチドを取得することであった。そのようなペプチドは、ＺＩＫＶ感染の確認された病歴を有する患者における抗体の検出に特異的で、かつ約８５％感受性である、ジカウイルスのＮＳ２Ｂ領域から得られた。同じタイリング戦略は、ＮＳ１及びエンベロープタンパク質を含むＺＩＫＶプロテオームの他の領域に対応するより短いペプチド（６、７、８、９又は１０個のアミノ酸長）を合成するために使用できる。
【００５７】
ＺＩＫＶ抗体に特異的で感受性のある単離ペプチド（ＺＩＫＶ反応性ペプチド）
本発明は、患者試料中のＺＩＫＶに対する抗体と強く反応し、それらに感受性である単離ペプチドを含む。これらのペプチドは、ＺＩＫＶに対する抗体の存在についてスクリーニングするための、かつ対象がＺＩＫＶによる感染及び／又はＺＩＫＶへの曝露を有したことがあるかどうかを決定するための、現在知られているか若しくは後に開発される、任意の種類の血清学的アッセイ又はプラットフォームで使用できる。これらのペプチドはまた、ワクチン及び免疫調節薬に対する体液性応答について試験し監視するためにも使用でき、したがってＺＩＫＶの治療及び予防薬の開発に有用である。
【００５８】
本発明の一実施形態は、登録番号ＺＩＫＶ＿ＡＹ６３２５３５＿ＡＡＶ３４１５１の１４２６〜１４３４でのＺＩＫＶのＮＳ２Ｂ領域において特定され、１４２６−ＤＩＴＷＥＫＤＡＥＶＴＧＮＳＰＲＬＤＶＡ−１４３４のアミノ酸配列（配列番号１）を有する単離ペプチドである。このペプチドは、実験例に示されるように特定され、ジカ回復期血清試料と９０％超特異的である。
【００５９】
さらに、いくつかのジカウイルスは、アミノ酸１４３９でのバリンがイソロイシンである変異、すなわち、１４２６−ＤＩＴＷＥＫＤＡＥＩＴＧＮＳＰＲＬＤＶＡ−１４３４（配列番号１）を有する。この変異を有するペプチドは、以下に示すように試験され、変異はペプチドアレイ又はＥＬＩＳＡの結果に影響を与えなかった（図１を参照されたい）。したがって、本明細書に記載されるように特定された単離ペプチドは、１０位にバリン又はイソロイシンのいずれかを有してよく、反応性及び特異性は依然として同じである。
【００６０】
本発明のさらなる実施形態は、アミノ酸配列ＤＩＴＷＥＫＤＡＥＸＴＧＮＳＰＲＬＤＶＡ（式中、ＸはＶ又はＩである）（配列番号１）を含むペプチドの全域で１残基シフトされたアミノ酸配列を含むペプチドのコレクション又はセットを含む。このコレクションは、６アミノ酸長、７アミノ酸長、８アミノ酸長、９アミノ酸長、１０アミノ酸長、１１アミノ酸長、及び最大１２アミノ酸長であるペプチドを含有してよい。
【００６１】
一実施形態において、セット又はコレクション内の各ペプチドは、１２アミノ酸長である。ペプチドのコレクションは、以下のアミノ酸配列：
ＤＩＴＷＥＫＤＡＥＸＴＧ  式中、ＸはＶ又はＩである（配列番号１４）；
ＩＴＷＥＫＤＡＥＸＴＧＮ  式中、ＸはＶ又はＩである（配列番号１５）；
ＴＷＥＫＤＡＥＸＴＧＮＳ  式中、ＸはＶ又はＩである（配列番号１６）；
ＷＥＫＤＡＥＸＴＧＮＳＰ  式中、ＸはＶ又はＩである（配列番号１７）；
ＥＫＤＡＥＸＴＧＮＳＰＲ  式中、ＸはＶ又はＩである（配列番号１８）；
ＫＤＡＥＸＴＧＮＳＰＲＬ  式中、ＸはＶ又はＩである（配列番号１９）；
ＤＡＥＸＴＧＮＳＰＲＬＤ  式中、ＸはＶ又はＩである（配列番号２０）；
ＡＥＸＴＧＮＳＰＲＬＤＶ  式中、ＸはＶ又はＩである（配列番号２１）；及び
ＥＸＴＧＮＳＰＲＬＤＶＡ  式中、ＸはＶ又はＩである（配列番号２２）；
を有するペプチドを含む。
【００６２】
本発明はまた、ジカ回復期血清試料と５０％超特異的である１２種の追加の単離ペプチドを含む。
【００６３】
これらの追加の単離ペプチドは、表２に列挙され、配列番号２〜１３を含む。
【００６４】
本発明の他の実施形態は、これらの１２種のペプチドの１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個又は全１２個の全域で１残基シフトされたアミノ酸配列を含むか若しくはそれらからなる単離ペプチドのコレクション又はセットを含む。これらのコレクション又はセットは、６アミノ酸長、７アミノ酸長、８アミノ酸長、９アミノ酸長、１０アミノ酸長、１１アミノ酸長、及び最高で１２アミノ酸長を含むか又はそれらからなる単離ペプチドを含むか、又はそれらからなり得る。
【００６５】
抗体が５〜９アミノ酸長の範囲の直鎖状ペプチド配列に結合し、かつ標的が追加のアミノ酸に隣接する場合に最も効率的に結合することを示す研究に基づき、１２個のアミノ酸のペプチドが好ましい（Ｂｕｕｓら、２０１２）。しかしながら、１２アミノ酸長未満、及び１２アミノ酸長超を含有するペプチドを使用できる。１３アミノ酸長、１４アミノ酸長、１５アミノ酸長、１６アミノ酸長、１７アミノ酸長、１８アミノ酸長、１９アミノ酸長、２０アミノ酸長、最高で２５アミノ酸長、最高で３０アミノ酸長、最高で３５アミノ酸長、最高で４０アミノ酸長、及び最高で５０アミノ酸長のペプチドを使用できる。
【００６６】
特定の実施形態において、本発明のペプチドは、合成化学によって生成される（すなわち、「合成ペプチド」）。他の実施形態において、本発明のペプチドは、生物学的に生成される。本発明の単離ペプチドは、例えば、キットの一部として、水中に、緩衝液中に、又は再構成用の乾燥形態で存在し得る。本発明の単離ペプチドは、薬学的に許容される塩の形態であり得る。本発明のペプチドと塩を形成できる適切な酸及び塩基は、当業者に周知であり、無機及び有機の酸並びに無機及び有機の塩基を含む。
【００６７】
特定の実施形態において、本発明のペプチドは改変される。本発明のペプチドは、熱及び／又は界面活性剤（例えば、ＳＤＳ）での変性などの様々な技術によって改変され得る。あるいは、本発明のペプチドは、１以上のさらなる部分との結合によって改変され得る。結合は、共有結合又は非共有結合であり得、例えば、リジン又はシステインなどの末端アミノ酸リンカー、化学的カップリング剤、又はペプチド結合を介するものであり得る。追加の部分は、例えば、リガンド、リガンド受容体、融合パートナー、検出標識、酵素、又はペプチドを固定化する基質であり得る。
【００６８】
本発明のペプチドは、ビオチン（例えば、システイン又はリジン残基を介して）、脂質分子（例えば、システイン残基を介して）、又は担体タンパク質（例えば、システイン又はリジン残基を介する、例えば、血清アルブミン、免疫グロブリンＦｃドメイン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ））などのリガンドにコンジュゲートされてよい。ビオチンなどのリガンドへの接着は、アビジン、ストレプトアビジン、ストレプトアビジンポリマー、又はニュートラアビジン（ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ）などのリガンド受容体を有するペプチドを結合するのに有用であり得る。アビジン、ストレプトアビジン、ストレプトアビジンポリマー、又はニュートラアビジンは、次に、シグナル伝達部分（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）若しくはアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）などの酵素、若しくは金属ナノ粒子若しくはナノシェル（例えば、金コロイド）などの可視化できる他の部分又は蛍光部分）、又は固体基板（例えば、ニトロセルロース膜）に連結され得る。あるいは、本発明のペプチドは、アビジン、ストレプトアビジン、ストレプトアビジンポリマー、又はニュートラアビジンなどのリガンド受容体に融合又は連結されてよく、それによってビオチン及び任意の部分（例えば、シグナル伝達部分）などの対応するリガンド又はそれに接着される固体基板とのペプチドの結合を促進する。他のリガンド−受容体の対の例は、当技術分野で周知であり、同様に使用できる。
【００６９】
本発明のペプチドは、精製を改善するため、宿主細胞においてペプチドの発現を増強するため、検出を支援するため、及びペプチドを安定化させるために使用できる融合パートナー（例えば、ペプチド又は他の部分）に融合されてよい。融合パートナーに適する化合物の例は、担体タンパク質（例えば、血清アルブミン、免疫グロブリンＦｃドメイン、ＫＬＨ）、及び酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、β−ガラクトシダーゼ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）を含む。融合は、ペプチド結合によって達成できる。例えば、本発明のペプチド及び融合パートナーは、融合タンパク質であり得、インフレームで直接融合され得るか、又はペプチドリンカーを含んでよい。
【００７０】
加えて、本発明のペプチドは、様々な既知の化学基又は分子のいずれかを含むように改変され得る。そのような改変は、グリコシル化、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、ポリエチレングリコールへの共有結合（例えば、ＰＥＧ化）、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、ユビキチン化、脂肪酸での修飾、及びアルギニル化などのアミノ酸からタンパク質への転移ＲＮＡ媒介性付加を含むが、これらに限定されない。アミノ酸の類似体（非天然アミノ酸を含む）及び置換された連結を有するペプチドも含まれる。本明細書に記載の配列のいずれかからなる本発明のペプチドは、記載の改変のいずれかによって改変され得る。そのようなペプチドは、依然として、アミノ酸を「含む」か、又はそれ「からなる」。
【００７１】
上述したような改変は、当業者に周知であり、科学文献に非常に詳細に記載されている。
【００７２】
ＺＩＫＶ反応性ペプチドをコードする配列を含む核酸
別の態様において、本発明は、本発明のペプチドをコードする配列を含む核酸を提供する。本発明の核酸は、一本鎖又は二本鎖であり得る。核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学的に合成されたＲＮＡ若しくはＤＮＡ、又はそれらの組み合わせであり得る。核酸は、タンパク質、脂質及び他のポリヌクレオチドなどの他の成分を含まないように精製できる。例えば、核酸は、５０％、７５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％精製できる。本発明の核酸は、本明細書に記載のペプチドをコードする。特定の実施形態において、核酸は、配列番号１〜２４の配列を有するペプチドをコードする。本発明の核酸は、リンカー、シグナル配列、ＴＭＲ輸送停止配列、膜貫通ドメイン、又はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ヒスチジンタグ、及びブドウ球菌のプロテインＡなどのタンパク質精製に有用なリガンドをコードする配列などの他のヌクレオチド配列を含んでよい。
【００７３】
発現制御配列に作動可能に連結されたポリヌクレオチドを調製し、宿主細胞中でそれらを発現させる方法は、当技術分野で周知である。例えば、米国特許第４，３６６，２４６号を参照されたい。ポリヌクレオチドの転写及び／又は翻訳を指示する１以上の発現制御エレメントに隣接又は近接して配置される場合に、本発明の核酸は作動可能に連結される。
【００７４】
したがって、例えば、本発明のペプチドは、従来の遺伝子工学的手法に従って、組換えにより生成できる。本発明の組換えペプチドを生成するために、ペプチドをコードする核酸が適切な発現系に挿入される。一般的に、選択されたペプチドをコードするポリヌクレオチド配列がペプチドの発現を可能にする発現制御配列に作動可能に連結される組換え分子又はベクターが、構築される。多くの種類の適切な発現ベクターは、当技術分野で知られており、例えば、細菌、ウイルス、酵母、真菌、昆虫又は哺乳動物発現系を含有するベクターを含む。そのような発現ベクターを取得し、使用する方法は周知である。本発明の組成物又は方法に使用される様々な分子生物学技術におけるガイダンスについては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング、実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ），最新版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｍｉｌｌｅｒら，遺伝子工学（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ），８：２７７−２９８（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，最新版），Ｗｕら、遺伝子バイオテクノロジーの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，最新版）、分子生物学の方法の組換え遺伝子発現プロトコル（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、６２巻、（Ｔｕａｎ編集、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，最新版）、及び分子生物学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），（Ａｕｓａｂｅｌら、編集）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（最新版）、及びそれらの中で引用される参考文献を参照されたい。
【００７５】
したがって、本発明はまた、本発明の核酸を含むベクター、及びそのようなベクターを含む宿主細胞を提供する。特定の実施形態において、ベクターはシャトルベクターである。他の実施形態において、ベクターは発現ベクター（例えば、細菌ベクター又は真核生物発現ベクター）である。特定の実施形態において、宿主細胞は細菌細胞である。他の実施形態において、宿主細胞は真核細胞である。
【００７６】
ＺＩＫＶ反応性ペプチドを使用するためのプラットフォーム、アッセイ及び装置
本発明のペプチド又は複数のペプチドを含む抗体−ペプチド複合体の形成を検出するための多数の異なる従来のアッセイがある。例えば、検出する工程は、ＥＬＩＳＡアッセイを行うこと、免疫蛍光アッセイを行うこと、側方流動免疫アッセイを行うこと、凝集アッセイを行うこと、波長シフトアッセイを行うこと、ウエスタンブロット、スロットブロット、若しくはドットブロットを行うこと、分析ローター若しくは遠心ローターにおいて試料を分析すること、又は電気化学センサー、光センサー、若しくは光電子センサーで試料を分析すること、を含んでよい。これらの異なるアッセイは、本明細書に記載されており、かつ／又は当業者に周知である。
【００７７】
したがって、本発明のペプチドは、ＥＬＩＳＡ、ルミネックス、ウェスタンブロットアッセイ、及びスポットペプチドアレイ、並びに後に開発されるそれらのプラットフォームを含むが、これらに限定されない抗体検出のための任意のアッセイ、フォーマット又はプラットフォームで使用できる。
【００７８】
本発明の特定の実施形態において、アッセイは、試料中の抗体（複数可）を固定化すること；本発明のペプチドを添加すること；及び、例えば、標識されているペプチドによって、又は標識結合パートナー（例えば、ストレプトアビジンＨＲＰ若しくはストレプトアビジン金コロイド複合体）又はペプチドを特異的に認識する標識抗体などの標識物質を添加することによって、ペプチドに結合した抗体の割合を検出すること、を含む。
【００７９】
他の実施形態において、アッセイは、本発明のペプチドを固定化すること；抗体を含有する試料を添加すること；及び、例えば、標識（例えば、金属ナノ粒子若しくは金属ナノシェル、蛍光標識、又は酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ））に直接又は間接的にコンジュゲートされた本発明の別のペプチドを添加することによって、又は結合パートナー若しくは試料抗体を特異的に認識する標識抗体（例えば、抗ヒトＩｇＧ抗体、又は抗ヒトＩｇＭ抗体）などの標識物質を添加することによって、ペプチドに結合した抗体の量を検出すること、を含む。
【００８０】
他の実施形態において、アッセイは、本発明のペプチドを固定化すること；抗体を含有する試料を添加すること；及び、例えば、試料抗体（例えば、抗ヒトＩｇＧ抗体、又は抗ヒトＩｇＭ抗体）を特異的に認識する第一の結合パートナーを添加すること、及びさらに、標識され上記第１の結合パートナーを認識する第２の結合パートナーを添加することによって、ペプチドに結合した抗体の量を検出すること、を含む。
【００８１】
さらに他の実施形態において、アッセイは、反応体が固定化されることなく、ペプチドと抗体含有試料を反応させること、その後、例えば、標識されているペプチドによって、又は標識結合パートナー（例えば、ストレプトアビジン−ＨＲＰ若しくはストレプトアビジン金コロイド複合体）又はペプチドを特異的に認識する標識抗体などの標識物質を添加することによって、抗体とペプチドの複合体の量を検出すること、を含む。
【００８２】
本発明のペプチドの固定化は、共有結合又は非共有結合のいずれかであり得、非共有結合固定化は、非特異的（例えば、マイクロタイターウェル中のポリスチレン表面への非特異的結合）であり得る。固体若しくは半固体の担体、支持体若しくは表面への特異的又は半特異的な結合は、固体若しくは半固体の担体、支持体若しくは表面へのその共有結合又は非共有結合を可能にする部分を有し、それと結合されるペプチドによって達成できる。例えば、この部分は、担体、支持体又は表面に接着される成分に対する親和性を有してよい。この場合、部分は、例えば、ペプチドのアミノ酸基に結合されるビオチン又はビオチニル基又はその類似体であり得、成分は、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、又はその類似体である。
【００８３】
適切な担体、支持体、及び表面は、金属ナノ層、ビーズ（例えば、磁性ビーズ、コロイド粒子又は金属ナノ粒子又はナノシェル、例えば、金コロイド、又はシリカ、ラテックス、ポリスチレン、ポリカーボネート、若しくはＰＤＶＦを含む粒子又はナノ粒子）、スチレン−ジビニルベンゼン、ヒドロキシル化スチレン−ジビニルベンゼンなどの共重合体のラテックス、ポリスチレン、カルボキシル化ポリスチレン、カーボンブラックのビーズ、非活性化又はポリスチレン又はポリ塩化ビニル活性化ガラス、エポキシ活性化多孔質磁性ガラス、ゼラチン又は多糖粒子又は他のタンパク質粒子、赤血球、モノクローナル抗体若しくはポリクローナル抗体又はそのような抗体のＦａｂ断片を含むが、これらに限定されない。
【００８４】
特異的抗体の検出のための抗原を用いる免疫アッセイのためのプロトコルは、当技術分野で周知である。例えば、従来のサンドイッチアッセイを使用でき、又は従来の競合的アッセイフォーマットを使用できる。
【００８５】
特異的結合アッセイを行うための装置、特に、免疫アッセイは、公知であり、本発明の方法における使用のために容易に適合させることができる。固相アッセイ装置は、マイクロタイタープレート、フロースルーアッセイ装置（例えば、側方流動免疫アッセイ装置）、ディップスティック、及び免疫キャピラリー又は免疫クロマトグラフの免疫アッセイ装置を含む。
【００８６】
本発明の実施形態において、固体若しくは半固体の表面又は担体は、マイクロタイターウェルの底又は壁、フィルタの表面又は膜（例えば、ニトロセルロース膜又はＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）膜）、中空糸、ビーズクロマトグラフィー媒体（例えば、アガロース若しくはポリアクリルアミドゲル）、磁気ビーズ、繊維性セルロースマトリックス、ＨＰＬＣマトリックス、ＦＰＬＣマトリックス、それに結合されるペプチドを有する分子が、液相中に溶解又は分散される場合にフィルタによって保持できるような大きさの分子を有する物質、ミセルを形成するか又はミセルの形成に関与できミセルを伴うことなく液相を変更又は交換できる物質、水溶性ポリマー、又は任意の他の適切な担体、支持体若しくは表面である。
【００８７】
本発明のいくつかの実施形態において、本発明のペプチドは、検出を可能にする適切な標識を備えている。単独で又は他の組成物若しくは化合物と共に、検出可能なシグナルを提供できる従来の標識が、使用され得る。適切な標識は、酵素（例えば、ＨＲＰ、β−ガラクトシダーゼ、又はアルカリホスファターゼ）、蛍光標識、放射性標識、着色ラテックス粒子、及び金属コンジュゲート標識（例えば、金属ナノ層、金属ナノ粒子コンジュゲート標識又は金属ナノシェルコンジュゲート標識）を含むが、これらに限定されない。適切な金属ナノ粒子又は金属ナノシェル標識は、金粒子、銀粒子、銅粒子、白金粒子、カドミウム粒子、複合粒子、金中空球体、金コーティングシリカナノシェル、及びシリカコーティング金シェルを含むが、これらに限定されない。検出可能な層に適する金属ナノ層は、金、銀、銅、及び白金などのカドミウム、亜鉛、水銀、並びに貴金属で構成されるナノ層を含む。
【００８８】
適切な検出方法は、比色アッセイを用いる、直接的又は間接的にタグ付けされた薬剤の検出（例えば、ＨＲＰ又はβ−ガラクトシダーゼ活性の検出）、光学顕微鏡、共焦点顕微鏡を含む免疫蛍光顕微鏡を用いる視覚的検査、又はフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）、オートラジオグラフィー（例えば、放射性標識剤の検出のため）、電子顕微鏡、免疫染色、若しくは細胞内分画などによる検出を含むが、これらに限定されない。一実施形態において、放射性元素（例えば、放射性アミノ酸）は、ペプチド鎖に直接組み込まれる。別の実施形態において、蛍光標識は、ビオチン／アビジン相互作用、又はフルオレセインコンジュゲート抗体などとの結合を介してペプチドと結合される。一実施形態において、抗体のための検出可能な特異的結合パートナーは、混合物に添加される。例えば、結合パートナーは、第１の抗体に結合する検出可能な二次抗体又は他の結合剤（例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、又はそれらの組み合わせ）であり得る。この二次抗体又は他の結合剤は、例えば、放射性、酵素、蛍光、発光、金属ナノ粒子又は金属ナノシェル（例えば、金コロイド）、又はアビジン／ビオチンシステムなどの他の検出可能な標識を用いて標識できる。別の実施形態において、結合パートナーは本発明のペプチドであり、それは西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ又は他のシグナル伝達部分などの酵素に直接的又は間接的にコンジュゲートできる。そのような実施形態において、検出可能なシグナルは、発色基質、蛍光発生基質、又は化学発光基質などの、検出可能なシグナルを生じる酵素の基質を添加することにより生成される。
【００８９】
本発明のいくつかの実施形態において、検出手順は、色変化について抗体−ペプチド複合体を視覚的に検査すること、又は物理化学的変化について抗体−ペプチド複合体を検査することを含む。物理化学的変化は、酸化反応又は他の化学反応で生じ得る。それらは、分光光度計などを用いて、目測で検出され得る。
【００９０】
１つのアッセイフォーマットは、側方流動免疫アッセイフォーマットである。ヒト又は動物の免疫グロブリンに対する抗体は、グラスファイバーパッド（試料適用パッド又はコンジュゲートパッド）上で乾燥され配置されるシグナルジェネレータ又はレポーター（例えば、金コロイド）で標識できる。診断用ペプチドは、ニトロセルロース又はＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）膜などの膜上に固定される。試料を試料添加パッドに添加すると（又はコンジュゲートパッドを通して流すと）、それは標識レポーターを溶解し、これが次いで、試料中の全ての抗体に結合する。得られた複合体は次いで、毛管作用によって次の膜（診断用ペプチド含有ＰＶＤＦ又はニトロセルロース）に輸送される。診断用ペプチドに対する抗体が存在する場合、それらは、膜上に露出された診断用ペプチドに結合し、それによりシグナル（例えば、見ることができるか又は視覚化できるバンド）を生じる。標識抗体又は第２の標識抗体に特異的なさらなる抗体を、対照シグナルを生成するために使用できる。
【００９１】
側方流動免疫アッセイの別のフォーマットは、リガンド（例えば、ビオチン）にコンジュゲートされ標識されたリガンド受容体（例えば、ストレプトアビジン金コロイド）と複合体形成した本発明のペプチド又は組成物を含む。標識ペプチド複合体は、試料添加パッド又はコンジュゲートパッド上に配置できる。本発明の抗ヒトＩｇＧ／ＩｇＭ抗体又は抗動物ＩｇＧ／ＩｇＭ抗体は、試験場所でＰＶＤＦのニトロセルロースなどの膜に固定される。試料が試料添加パッドに添加されると、試料中の抗体は標識されたペプチド複合体と反応し、その結果、本発明のペプチドに結合する抗体が間接的に標識されるようになる。試料中の抗体は次いで、毛管作用によって次の膜（診断用ペプチドを含有するＰＶＤＦ又はニトロセルロース）に輸送され、固定された抗ヒトＩｇＧ／ＩｇＭ抗体又は抗動物ＩｇＧ／ＩｇＭ抗体に結合する。試料抗体のいずれかが本発明の標識ペプチドに結合した場合、ペプチドと結合した標識は、試験場所で見るか又は視覚化できる。
【００９２】
血液生成物又は他の生理学的又は生物学的流体のスクリーニング用の別のアッセイは、酵素結合免疫吸着検定法、すなわち、ＥＬＩＳＡである。典型的にＥＬＩＳＡでは、本発明の単離ペプチド又はペプチドのコレクション若しくはセットは、直接又は捕捉マトリックス（例えば、抗体）を介してマイクロタイターウェルの表面に吸着される。表面上に残っている非特異的タンパク質結合部位は次いで、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、熱不活化正常ヤギ血清（ＮＧＳ）、又はＢＬＯＴＴＯ（防腐剤、塩、及び消泡剤も含有する脱脂粉乳の緩衝溶液）などの適切な薬剤でブロッキングされる。ウェルを次いで、特異的抗体を含有することが疑われる生体試料とインキュベートする。試料は、そのまま適用されるか、又はより頻繁には、ＢＳＡ、ＮＧＳ、又はＢＬＯＴＴＯなどのタンパク質を少量（０．１〜５．０重量％）含有する緩衝液中で通常、希釈できる。特異的結合が生じるのを可能にするのに十分な長さの時間インキュベートした後、ウェルを洗浄して未結合タンパク質を除去し、次いで、標準的な手順によって酵素又は他の標識にコンジュゲートされた最適濃度の適切な抗免疫グロブリン抗体とインキュベートし、ブロッキング緩衝液に溶解する。標識は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、及びグルコースオキシダーゼを含む、様々な酵素から選択できる。再び特異的結合が生じるのに十分な時間おき、次いでウェルを再び洗浄して未結合コンジュゲートを除去し、酵素に適する基質を添加する。発色させ、ウェルの内容物の光学密度を目視又は機器（適切な波長での測定）によって決定する。ＥＬＩＳＡアッセイを行うための条件は、当技術分野で周知である。
【００９３】
ＥＬＩＳＡの別の実施形態において、本発明のペプチド又はペプチドのコレクション若しくはセットは、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートなどの表面上に固定される。試料を次いで添加し、アッセイを上記のように進める。
【００９４】
さらに他の実施形態において、本発明のペプチド又はペプチドのコレクション若しくはセットを、ニトロセルロース紙上に電気ブロット又はドットブロットする。続いて、生物学的流体（例えば、血清又は血漿）などの試料を、ブロットされた抗原とインキュベートし、生物学的流体中の抗体を抗原（複数可）に結合させる。結合抗体を次いで、例えば、標準的な免疫酵素法によって、又は二次抗体若しくは他の抗体結合剤若しくはそれらの組み合わせに結合された金属ナノ粒子又はナノシェルを用いる可視化により検出できる。
【００９５】
任意の数の従来のタンパク質アッセイフォーマット、特に、免疫アッセイフォーマットは、対象中のジカ抗体の検出のために、本発明の単離ペプチド並びに本発明のペプチドのコレクション及びセットを利用するように設計され得ることが当業者によって理解されるべきである。したがって本発明は、特定のアッセイフォーマットの選択によって制限されず、当業者に公知であるアッセイフォーマットを包含すると考えられる。これまでのほとんどの血清学的検査は、一重ＥＬＩＳＡ、補体結合又は中和アッセイを用いて行われている。より最近では、同時に最高１００個の抗原標的（すなわち、１つの病原体に対して１００個の個々の病原体、１００個の個々の抗原標的、又はそれらのいくつかのバリエーション）に対処できるルミネックスベースのシステムが採用されている（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、２０１１）。さらに、大腸菌、出芽酵母、バキュロウイルス、又は無細胞共役転写−翻訳系においてインビトロで発現された組換えタンパク質をスポットしたアレイが確立されている（Ｖｉｇｉｌら、２０１０）。
【００９６】
本発明の１つの目標は、ＺＩＫＶ抗体検出のプロセスを自動化し、それを安価で迅速かつ正確にすること、並びに特定の病原体に対する体液性応答を厳密に特徴付けることよりも暴露そのものを検出することである。
【００９７】
これらの要件を満たす１つのアッセイは、プログラム可能なペプチドアレイである。
【００９８】
ＺＩＫＶに対する体液性免疫応答を測定でき、したがってＺＩＫＶへの曝露（又はワクチン中のその遺伝子産物）の検出を可能にするプログラム可能なアレイを作成及び検証するための１つの方法は、以下の：１）バイオインフォマティクス法を使用してウイルスペプチドを選択する；２）ＺＩＫＶの抗原に暴露されたヒト及び他の動物からの血清を使用して感度及び特異性についてアレイ上に印刷されたそれらのペプチドを試験する；３）エピトープ予測のために典型的に用いられるアルゴリズムの性能を調べる；４）アッセイの結果を使用して、より小さくより容易なプラットフォームで展開できるより小さくあまり包括的でないペプチドライブラリーを開発する；５）アッセイプロトコルを最適化及び検証する；並びに６）アッセイ分析を自動化するためのソフトウェアを開発する、工程を含む。
【００９９】
これらの工程を使用して、本発明のペプチドを作製した。
【０１００】
ペプチドアレイ容量は、ガラススライドごとに複数のアレイを印刷するために利用できる（１、３、８、又は１２種のアレイの構成を印刷できる）。
【０１０１】
したがって、本発明の一実施形態は、ＺＩＫＶ抗体と反応し、ＺＩＫＶ抗体に特異的なペプチドを含むペプチドマイクロアレイである。いくつかの実施形態において、ペプチドマイクロアレイは、アミノ酸配列ＤＩＴＷＥＫＤＡＥＸＴＧＮＳＰＲＬＤＶＡ（式中、ＸはＶ又はＩである）（配列番号１）を含むペプチド；又は表２に記載の１２種のペプチド（配列番号２〜１３）からなる群から選択されるペプチド；又はアミノ酸配列ＤＩＴＷＥＫＤＡＥＸＴＧＮＳＰＲＬＤＶＡ（式中、ＸはＶ又はＩである）（配列番号１）を含むペプチドの全域で１残基シフトされたペプチド（すなわち、配列番号１４〜２２）のコレクション若しくはセット；又は表２に記載の１２種のペプチド（配列番号２〜１３）からなる群から選択される少なくとも１つのペプチド全域で１残基シフトされたペプチドのコレクション若しくはセット；又はそれらの組み合わせを含む。
【０１０２】
本発明のさらなる実施形態は、アミノ酸配列（配列番号１４〜２）を含むペプチドのコレクション又はセットを含むペプチドマイクロアレイである。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、ペプチドアレイは、配列番号１〜１３のアミノ酸配列を含むか又はそれらからなるペプチドの全ての全域で１残基シフトされたアミノ酸配列を含む、ペプチドのセット又はコレクションを含む。
【０１０４】
ＺＩＫＶへの曝露の血清学的検出のための方法及びシステム
本発明は、単離された及び単離されない本発明の様々なペプチド並びにペプチドマイクロアレイを利用して、任意の試料中のＺＩＫＶの抗原、すなわち、ＺＩＫＶに対する抗体への暴露を検出するための方法並びにシステムを含む。
【０１０５】
適切な方法は典型的に、抗体を含有する可能性が高い体液又は組織の試料を受け取る又は取得すること（例えば、患者から）；特異的なペプチド−抗体複合体の形成（例えば、抗体へのペプチドの特異的結合）に有効な条件下で、本発明のペプチド又は複数のペプチドとアッセイされる試料を接触させること（例えば、インキュベートする又は反応させる）；並びに抗体−ペプチドの反応の存在について接触（反応）試料をアッセイすること（例えば、抗体−ペプチド複合体の量を決定する）、を含む。上昇した量の抗体−ペプチド複合体の存在は、対象がジカウイルスに曝露され、かつ感染したことを示す。ジカ抗原に対する抗体に「特異的に結合する」、その改変形態を含むペプチドは、抗体の検出を可能にする量で、かつ十分な時間の間、抗体と相互作用するか、又はそれとの物理的結合を形成するか若しくは物理的結合を受ける。
【０１０６】
それらが特異的に反応するように、ペプチド及び抗体を反応させるための条件は、当業者に周知である。例えば、免疫学における最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｃｏｌｉｇａｎら、編集、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ））を参照されたい。
【０１０７】
本発明のペプチド又は複数のペプチド及び試料抗体が、適切な媒体中で反応できるようになると、アッセイを行って抗体−ペプチド反応の有無を決定する。本明細書で論じたアッセイのいずれかを使用できる。
【０１０８】
本発明の方法及びシステムは、研究及び臨床設定においてＺＩＫＶの抗原に対する暴露を検出するために使用され得る。
【０１０９】
本方法で使用するための１つの試料は、生体試料である。生体試料は、鼻咽頭吸引液、血液、脳脊髄液、唾液、血清、血漿、尿、痰、気管支洗浄液、心嚢液、又は腹水、又は糞便などの固体を含むが、これらに限定されない対象の組織から又は対象の体液から取得され得る。好ましい生体試料は、血清、血漿及び尿である。対象は、ウシ、イヌ、ヒト、サル、マウス、ブタ、又はラットを含むが、これらに限定されない任意の動物、特に、脊椎動物、より具体的には、哺乳動物であり得る。一実施形態において、対象はヒトである。
【０１１０】
試料はまた、医薬品及び治療薬として使用するための、又は医薬品及び治療薬の開発のための細胞、細胞培養物、細胞培地、並びに組成物などの、研究試料、臨床試料、又は環境試料であり得る。
【０１１１】
追加の適用は、血液生成物のスクリーニング（例えば、感染性物質についての血液生成物のスクリーニング）の検出、生体防御、食品の安全性、環境汚染、法医学、及び遺伝的比較の研究を含むが、これらに限定されない。本発明はまた、医薬品及び治療薬の開発のために使用される細胞、細胞培養物、細胞培地並びに他の組成物においてウイルス抗体を検出するための方法並びにシステムを提供する。
【０１１２】
対象は、ＺＩＫＶの抗原に曝露されたことがあるか、ＺＩＫＶの抗原に曝露されている疑いがあるか、又はＺＩＫＶの抗原に曝露されたことがないと考えられ得る。一実施形態において、対象は女性であり、さらなる実施形態において、女性対象は、妊娠しているか、又は妊娠しようとしていてよい。一実施形態において、対象は、ＺＩＫＶ  ＥＬＩＳＡによって血清反応陽性であることが見出され得る。
【０１１３】
一実施形態において、対象は、ＺＩＫＶワクチン又は免疫調節剤を投与されたことがある、試験対象であり得る。
【０１１４】
本明細書に記載のシステム及び方法は、ＺＩＫＶに対する体液性免疫応答の検出及び測定を支持する。
【０１１５】
本発明の一実施形態は、任意の試料中で、ＺＩＫＶの抗原、すなわち、ＺＩＫＶに対する抗体への暴露を検出するためのシステムを提供する。システムは少なくとも１つのサブシステムを含み、サブシステムは本発明のペプチド若しくは複数のペプチド又は本発明のペプチドのコレクション若しくはセットを含み、それらはＺＩＫＶ抗体と反応性があり、かつＺＩＫＶ抗体に特異的であり、アミノ酸配列ＤＩＴＷＥＫＤＡＥＸＴＧＮＳＰＲＬＤＶＡ（式中、ＸはＶ又はＩである）（配列番号１）を含むペプチド；又は表２に記載の１２種のペプチド（配列番号２〜１３）からなる群から選択されるペプチド；又はアミノ酸配列ＤＩＴＷＥＫＤＡＥＸＴＧＮＳＰＲＬＤＶＡ（式中、ＸはＶ又はＩである）（配列番号１）を含むペプチドの全域で１残基シフトされたアミノ酸配列を含むペプチド（すなわち、配列番号１４〜２２）のコレクション若しくはセット；又は表２に記載の１２種のペプチド（配列番号２〜１３）からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドの全域で１残基シフトされたアミノ酸配列を含むペプチドのコレクション若しくはセット；又はそれらの組み合わせを含む。システムはまた、試料の調製；ペプチド（複数可）と試料中の任意のＺＩＫＶ抗体の結合；未結合試料の洗浄；並びに結合抗体又は複数の抗体の可視化及び／又は定量化、の目的のために追加のサブシステムを含んでよい。
【０１１６】
本発明のさらなる実施形態は、任意の試料中で、ＺＩＫＶの抗原、すなわち、ＺＩＫＶに対する抗体への暴露の検出のためのシステムを提供する。システムは少なくとも１つのサブシステムを含み、サブシステムは本発明のペプチド若しくは複数のペプチド又は本発明のペプチドのコレクション若しくはセットを含むペプチドマイクロアレイを含み、それらはＺＩＫＶ抗体と反応性があり、かつＺＩＫＶ抗体に特異的でありアミノ酸配列ＤＩＴＷＥＫＤＡＥＸＴＧＮＳＰＲＬＤＶＡ（式中、ＸはＶ又はＩである）（配列番号１）を含むペプチド；又は表２に記載の１２種のペプチド（配列番号２〜１３）からなる群から選択されるペプチド；又はアミノ酸配列ＤＩＴＷＥＫＤＡＥＸＴＧＮＳＰＲＬＤＶＡ（式中、ＸはＶ又はＩである）（配列番号１）を含むペプチドの全域で１残基シフトされたアミノ酸配列を含むペプチド（すなわち、配列番号１４〜２２）のコレクション若しくはセット；又は表２に記載の１２種のペプチド（配列番号２〜１３）からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドの全域で１残基シフトされたアミノ酸配列を含むペプチドのコレクション若しくはセット；又はそれらの組み合わせを含む。システムはまた、試料の調製；ペプチド（複数可）と試料中の任意のＺＩＫＶ抗体の結合；未結合試料の洗浄；並びに結合抗体又は複数の抗体の可視化及び／又は定量化、の目的のために追加のサブシステムを含んでよい。
【０１１７】
本発明は、任意の試料中で、ＺＩＫＶの抗原、すなわち、ＺＩＫＶに対する抗体への暴露を検出するための方法を提供し、方法は試料中のＺＩＫＶに対する抗体とペプチドが結合するのに十分な条件下で、アミノ酸配列ＤＩＴＷＥＫＤＡＥＸＴＧＮＳＰＲＬＤＶＡ（式中、ＸはＶ又はＩである）（配列番号１）を含むペプチド；又は表２に記載の１２種のペプチド（配列番号２〜１３）からなる群から選択されるペプチド；又はアミノ酸配列ＤＩＴＷＥＫＤＡＥＸＴＧＮＳＰＲＬＤＶＡ（式中、ＸはＶ又はＩである）（配列番号１）を含むペプチドの全域で１残基シフトされたアミノ酸配列を含むペプチド（すなわち、配列番号１４〜２２）のコレクション若しくはセット；又は表２に記載の１２種のペプチド（配列番号２〜１３）からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドの全域で１残基シフトされたアミノ酸配列を含むペプチドのコレクション若しくはセット；又はそれらの組み合わせを含む、ＺＩＫＶ抗体と反応性があり、かつＺＩＫＶ抗体に特異的である、本発明のペプチド若しくは複数のペプチド又は本発明のペプチドのコレクション若しくはセットと試料を接触させる工程；及びペプチドに対する任意の結合抗体又は複数の抗体を可視化及び／又は定量化する工程、を含む。本方法は必要に応じて、未結合の試料を洗浄する工程を含んでよい。
【０１１８】
本発明は、任意の試料中で、ＺＩＫＶの抗原、すなわち、ＺＩＫＶに対する抗体への暴露を検出するための方法を提供し、方法は試料中のＺＩＫＶに対する抗体とペプチドが結合するのに十分な条件下で、アミノ酸配列ＤＩＴＷＥＫＤＡＥＸＴＧＮＳＰＲＬＤＶＡ（式中、ＸはＶ又はＩである）（配列番号１）を含むペプチド；又は表２に記載の１２種のペプチド（配列番号２〜１３）からなる群から選択されるペプチド；又はアミノ酸配列ＤＩＴＷＥＫＤＡＥＸＴＧＮＳＰＲＬＤＶＡ（式中、ＸはＶ又はＩである）（配列番号１）を含むペプチドの全域で１残基シフトされたアミノ酸配列を含むペプチド（すなわち、配列番号１４〜２２）のコレクション若しくはセット；又は表２に記載の１２種のペプチド（配列番号２〜１３）からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドの全域で１残基シフトされたアミノ酸配列を含むペプチドのコレクション若しくはセット；又はそれらの組み合わせを含む、ＺＩＫＶ抗体と反応性があり、かつＺＩＫＶ抗体に特異的である、本発明のペプチド若しくは複数のペプチド又は本発明のペプチドのコレクション若しくはセットを含むペプチドマイクロアレイと試料を接触させる工程；及びペプチドに対する任意の結合抗体又は複数の抗体を可視化及び／又は定量化する工程、を含む。本方法は、必要に応じて、未結合の試料を洗浄する工程を含んでよい。
【０１１９】
本明細書で論じるか、又は当技術分野で公知の任意の検出方法は、結合抗体を可視化及び／又は定量化するために使用できる。
【０１２０】
本発明の一実施形態において、システム及び方法で使用するためのペプチドは、アミノ酸配列の配列番号１４〜２２を含むか、若しくはそれらからなるペプチドのコレクション又はセットを含む。
【０１２１】
本発明の一実施形態において、システム及び方法で使用するためのペプチドマイクロアレイは、アミノ酸配列の配列番号１４〜２２を含むか又はそれらからなるペプチドのコレクションを含む。
【０１２２】
キット
本発明はまた、本発明の方法を実施するための試薬及びキットを含む。これらの試薬及びキットは異なり得る。
【０１２３】
キットの１種の試薬は本発明のペプチド若しくは複数のペプチド又は本発明のペプチドのコレクション若しくはセットであり、それらはＺＩＫＶ抗体と反応性があり、かつＺＩＫＶ抗体に特異的であり、アミノ酸配列ＤＩＴＷＥＫＤＡＥＸＴＧＮＳＰＲＬＤＶＡ（式中、ＸはＶ又はＩである）（配列番号１）を含むペプチド；又は表２に記載の１２種のペプチド（配列番号２〜１３）からなる群から選択されるペプチド；又はアミノ酸配列ＤＩＴＷＥＫＤＡＥＸＴＧＮＳＰＲＬＤＶＡ（式中、ＸはＶ又はＩである）（配列番号１）を含むペプチドの全域で１残基シフトされたアミノ酸配列を含むペプチド（すなわち、配列番号１４〜２２）のコレクション若しくはセット；又は表２に記載の１２種のペプチド（配列番号２〜１３）からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドの全域で１残基シフトされたアミノ酸配列を含むペプチドのコレクション若しくはセット；又はそれらの組み合わせを含む。
【０１２４】
特定の実施形態において、ペプチドは、固体支持体に取り付けられるか、又は固体支持体上に固定される。いくつかの実施形態において、ペプチドは、金属ナノ層（例えば、カドミウム、亜鉛、水銀、金、銀、銅、又は白金のナノ層）を介して固体支持体上に取り付けられるか、又は固体支持体上に固定される。特定の実施形態において、固体支持体は、ビーズ（例えば、コロイド粒子又は金属ナノ粒子又はナノシェル）、側方流動免疫アッセイ装置の流路、分析ローター又は遠心ローター内の流路、管又はウェル（例えば、プレート中の）、又はセンサー（例えば、電気化学センサー、光センサー、又は光電子センサー）である。
【０１２５】
特定の種類のアッセイ用の試薬も、本発明のキット中に提供できる。したがって、キットは、ビーズ（例えば、凝集アッセイ又は側方流動アッセイに適する）の集団、又はプレート（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイに適するプレート）を含んでよい。他の実施形態において、キットは、側方流動免疫アッセイ装置、分析ローター又は遠心ローター、ウエスタンブロット、ドットブロット、スロットブロット、又は電気化学センサー、光センサー、又は光電子センサーなどの装置を含む。
【０１２６】
特定の一実施形態において、キットは本発明のペプチド若しくは複数のペプチド又は本発明のペプチドのコレクション若しくはセットを含むペプチドマイクロアレイを含み、それらはＺＩＫＶ抗体と反応性があり、かつＺＩＫＶ抗体に特異的であり、アミノ酸配列ＤＩＴＷＥＫＤＡＥＸＴＧＮＳＰＲＬＤＶＡ（式中、ＸはＶ又はＩである）（配列番号１）を含むペプチド；又は表２に記載の１２種のペプチド（配列番号２〜１３）からなる群から選択されるペプチド；又はアミノ酸配列ＤＩＴＷＥＫＤＡＥＸＴＧＮＳＰＲＬＤＶＡ（式中、ＸはＶ又はＩである）（配列番号１）を含むペプチドの全域で１残基シフトされたアミノ酸配列を含むペプチド（すなわち、配列番号１４〜２２）のコレクション若しくはセット；又は表２に記載の１２種のペプチド（配列番号２〜１３）からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドの全域で１残基シフトされたアミノ酸配列を含むペプチドのコレクション若しくはセット；又はそれらの組み合わせを含む。
【０１２７】
加えて、キットは、様々な希釈剤及び緩衝液、特異的に結合した抗原若しくは抗体の検出のための標識コンジュゲート又は他の薬剤（例えば、標識試薬）、並びに酵素基質、補因子及び色素原などの他のシグナル発生試薬を含んでよい。いくつかの実施形態において、キットは、標識試薬として、検出可能な標識（例えば、金属ナノ粒子、金属ナノシェル、金属ナノ層、フルオロフォア、着色ラテックス粒子、又は酵素）にコンジュゲートされた抗ヒトＩｇＧ／ＩｇＭ抗体を含む。他の実施形態において、キットは、標識試薬として、検出可能な標識（例えば、金属ナノ粒子、金属ナノシェル、金属ナノ層、フルオロフォア、着色ラテックス粒子、又は酵素）にコンジュゲートされたプロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ融合タンパク質、プロテインＬ、又はそれらの組み合わせを含む。さらに他の実施形態において、キットの標識試薬は、検出可能な標識（例えば、金属ナノ粒子、金属ナノシェル、金属ナノ層、フルオロフォア、着色ラテックス粒子、又は酵素）にコンジュゲートされた本発明のペプチドの第２コレクション又はセットである。ペプチドの第２コレクション又はセットは、ペプチドのコレクション又はセットと同じであるか、又は異なり得、必要に応じて固体支持体に取り付けられるか、又は固体支持体上に固定され得る。
【０１２８】
キットの他の構成要素は、当業者が容易に決定できる。そのような構成要素は、コーティング試薬、本発明のペプチドに特異的なポリクローナル捕捉抗体若しくはモノクローナル捕捉抗体、又は基準としてのこれらの抗原の精製若しくは半精製された抽出物、モノクローナル抗体検出抗体、検出可能な標識にコンジュゲートされた抗マウス抗体、抗イヌ抗体、抗ネコ抗体、抗ニワトリ抗体、若しくは抗ヒト抗体のうちの２種以上のカクテル、比色比較用の指標の図表、使い捨て手袋、汚染除去説明書、アプリケータースティック若しくは容器、試料準備カップ及びペプチド−抗体複合体の形成を可能にする反応媒体を構成するのに適切な緩衝液又は他の試薬を含み得る。
【０１２９】
そのようなキットは、ジカウイルスによる感染を診断するための臨床検査に、便利で効率的な方法を提供する。したがって、特定の実施形態において、キットはさらに説明書を含む。
【０１３０】
実施例
本発明は、本発明の好ましい実施形態をより完全に説明するために提示される以下の非限定的な実施例を参照することによってより良く理解され得る。これらは、決して、本発明の広い範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【０１３１】
実施例１−ＺＩＫＶ及び追加のウイルスからの１２ｍｅｒのペプチドの作製
ジカ（ＺＩＫＶ）、チクングニア（ＣＨＩＫＶ）、デング熱タイプ１〜４（ＤＥＮＶ  １〜４）、西ナイル（ＷＮＶ）、黄熱病（ＹＦＶ）、及びオロプーシェ（ＯＲＯＶ）のウイルスの全プロテオームを表すために、１２ｍｅｒのペプチドを選択した（表１）。
【０１３２】
【表１】
2020503279.tif 000003
【０１３３】
１２マーの使用は、３つの考慮事項：１）線状エピトープの抗体認識における主要決定要因及び文脈決定要因、２）プラットフォームの制約、並びに３）スポットペプチドアレイを用いる実験で得られた予備データ、を反映する。
【０１３４】
線状エピトープの抗体認識における主要決定要因及び文脈決定要因：
血清抗体は、５〜９個の範囲のアミノ酸の線状ペプチド配列を結合し（Ｂｕｕｓら、２０１２年）、標的に追加のアミノ酸が隣接している場合に最も効率的に結合する。
【０１３５】
プラットフォームの制約：
プラットフォームの現在の生成バージョンは、５〜１８個のアミノ酸のペプチドを最高で３００万個収容する。合成の忠実度は、１２マーについて９９％を超え；この長さを超えるとコストは劇的に増加し忠実度は大幅に低下する。
【０１３６】
予備データ：
スポットされた１２ｍｅｒのペプチドを用いて行った実験は、インフルエンザ、はしか、おたふく風邪及び風疹の予防接種を最近受けた人々が、スポットアレイ上の同族ペプチドによって検出できる血清抗体を有したことを裏付けた（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、２００２）。したがって、１２マーのペプチドは、血清抗体によって認識される単一の線状エピトープを示し得る。
【０１３７】
ＺＩＫＶ、ＣＨＩＫＶ、ＤＥＮＶ  １〜４、ＷＮＶ、ＹＦＶ及びＯＲＯＶのゲノム配列を、ＧｅｎＢａｎｋを含む公共データベースから抽出した。コード配列を用いて、１アミノ酸のオフセット及び１１アミノ酸のオーバーラップを有する個々のウイルスのプロテオームをタイル表示する１２アミノ酸のペプチドの組を設計した。
【０１３８】
パイロシーケンシングのために使用されるＲｏｃｈｅ  ＮｉｍｂｌｅＧｅｎ（ＮＧ）プラットフォーム及びＤＮＡを、ペプチドアレイプラットフォームのためにも使用できる。
【０１３９】
ペプチドのＮＧプラットフォームの使用のための理論的根拠は、以下の通りであった：１）ＮＧアレイは、スライド当たり１〜２４個の範囲の別々のアレイの様々な構成で印刷でき、したがって、異なる試料又はプロトコルを、低コストで制御データを同時に提供するように試験できる；２）ＮＧアレイは、７５ｍｍ×２５ｍｍ（３インチ×１インチ）のガラススライド上に印刷され、これは、標準的なスキャナの使用を可能にし、病理学及び微生物学研究室ですでに使用されているロボットを用いる自動化された臨床応用への移行を容易にする；かつ３）ＮＧプラットフォームは、業界で最高の機能密度を提供する。印刷プロセスは、本来の位置でペプチド合成を可能にするように適合されている。レーザー及び集束ミラーは、光活性化及び１ミクロンほどの小さな表面積中でのヌクレオチド又はアミノ酸のいずれかの正確な堆積を可能にする。
【０１４０】
特有のペプチド配列（１６５，４９８＋ランダム対照ペプチド）を、製造業者の説明書を用いてＲｏｃｈｅ−ＮｉｍｂｌｅＧｅｎアレイ上に印刷した。アレイを、スライドあたり１２個のサブアレイで印刷し、各々１７２，０００特徴の容量を有した。
【０１４１】
実施例２−ＺＩＫＶ抗体に特異的で感受性のあるペプチドの特定
免疫血清を、以下の３つの供給元：（１）米国ニューヨーク市保健精神衛生局：（２）ニカラグアの保健省；及び（３）Ｆｕｎｄａｃａｏオズヴァウド・クルスからの、ＺＩＫＶ、ＤＥＮＶ  １〜４、及びＣＨＩＫＶの自然感染の病歴を有するヒトから取得した。
【０１４２】
免疫血清を、ペプチドとインキュベートし、洗浄し、次いで蛍光標識二次抗体とインキュベートした。シグナルのスキャン後に、生データを、対応するペプチドの情報（すなわち、位置、配列）を含有するヒートマップに変換した。
【０１４３】
図１Ａは、単一のアルボウイルスアレイ上で試験した７種のヒト血清を示す。試料１〜４は、ニカラグアからのＤＥＮＶウイルス陽性血清であり、試料５は、健常対照からのものであり、試料６及び７は、ニカラグアからのＺＩＫＶウイルス陽性血清であった。試料を、ジカ  ＲＮＡが患者で検出された後の少なくとも３週間の時点で採取した。強い免疫反応性エピトープ（配列番号１）（４２６〜１４３４、ＮＳ２Ｂ−ＤＩＴＷＥＫＤＡＥＶＴＧＮＳＰＲＬＤＶＡ、登録番号ＺＩＫＶ＿ＡＡＶ３４１５１）の重複及び連続アミノ酸配列（配列番号１４〜２２）を有するペプチドを、棒グラフで表し（各試料について、配列番号１４〜２２の各ペプチドの１つ）、図１Ａの右側に示す。
【０１４４】
試験を、ＮＳ２ｂエピトープにおけるイソロイシン変異を有するペプチドを用いて行った場合、反応性、特異性又は差別的な特徴に何の影響も見られなかった。再び、７種のヒト血清を、単一アルボウイルスアレイ上で試験した。試料１〜４は、ニカラグアからのＤＥＮＶウイルス陽性血清であり、試料５は、健常対照からのものであり、試料６及び７は、ニカラグアからのＺＩＫＶウイルス陽性血清であった。試料を、ジカ  ＲＮＡが患者で検出された後少なくとも３週間の時点で採取した。強い免疫反応性エピトープ（配列番号１）（１４３０〜１４３８、ＮＳ２Ｂ−ＤＩＴＷＥＫＤＡＥＩＴＧＮＳＰＲＬＤＶＡ、登録番号ＺＩＫＶ＿ＡＭＤ６１７１１）の重複及び連続アミノ酸配列（配列番号１４〜２２）を有するペプチドを、棒グラフで表し（各試料について、配列番号１４〜２２の各ペプチドの１つ）、図１Ｂの右側に示す。
【０１４５】
アミノ酸配列ＤＩＴＷＥＫＤＡＥＸＴＧＮＳＰＲＬＤＶＡ（式中、Ｘはバリン又はイソロイシンである）（配列番号１）を有するＺＩＫＶのＮＳ２Ｂ領域において特定されたこの強い反応性のある特異的ペプチドは、ジカ回復期血清試料の９０％超において反応性であった（図１）。
【０１４６】
１２種の他のエピトープを、ジカ回復期血清試料の５０％超において反応性を有するジカウイルスプロテオームで特定した（表２）。
【０１４７】
【表２】
2020503279.tif 000004
【０１４８】
実施例３−ＺＩＫＡ  ＮＳ２ＢペプチドのＥＬＩＳＡ
ＺＩＫＶに強い反応性があり特異的であるペプチドアレイを用いた特異的ペプチドの選択に基づいて、ペプチドＤＩＴＷＥＫＤＡＥＶＴＧＮＳＰＲＬＤＶＡ（配列番号１）に対するペプチドＥＬＩＳＡを作製した。
【０１４９】
材料及び方法
Ｎ末端若しくはＣ末端上にビオチン又はＫＬＨを有するペプチドＤＩＴＷＥＫＤＡＥＶＴＧＮＳＰＲＬＤＶＡ（配列番号１）、例えば、ＡＧＤＩＴＷＥＫＤＡＥＶＴＧＮＳＰＲＬＤＶＡＬＤ｛Ｌｙｓ（ビオチン／ＫＬＨ）｝（配列番号２３）を合成した。ＥＬＩＳＡの感度を高めるために、Ｎ末端若しくはＣ末端上にビオチン標識又はＫＬＨを有するＤＩＴＷＥＫＤＡＥＶＴＧＮＳＰＲＬＤＶＡ（配列番号１）の２Ｘコンカテマーも作製し、例えば、コンカテマーペプチド配列はＡＧＤＩＴＷＥＫＤＡＥＶＴＧＮＳＰＲＬＤＶＡＬＤＥＡＧＤＩＴＷＥＫＤＡＥＶＴＧＮＳＰＲＬＤＶＡＬＤ｛Ｌｙｓ（ビオチン）／ＫＬＨ｝（配列番号２４）であった。
【０１５０】
ＥＬＩＳＡに使用したペプチド（ＥＬＩＳＡのために、リンカー又はスペーサーアミノ酸として下線を引いたアミノ酸を含めた）
【化１】
2020503279.tif 000005
【０１５１】
ジカＮＳ２ＢペプチドＥＬＩＳＡプロトコル：
事前吸着させたウサギ抗ヒトＩｇＧ  Ｈ＆Ｌ（抗ビオチン）を、密封された状態で９６ウェルＥＬＩＳＡプレート上にコーティングし、３７℃で一晩インキュベートした。次に、プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、２００μｌ／ウェルのブロッキング溶液を各ウェルに添加し、蓋をして室温で１時間インキュベートした。その後、プレートを再度ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。次の工程で、ジカ  Ｃ  ＴＥＲＭ  ＬＯＮＧ  Ｐ３又は２ＸＰ３をブロッキング溶液で希釈し、１００ｕｌ／ウェルを添加し、蓋をして９０分間３７℃でインキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。一次抗体（血清、血漿、ＣＳＦ又は尿）をブロッキング溶液で希釈し、２００μＬ／ウェルを添加し、適切であれば、連続希釈した。希釈した検体を含有し抗ビオチン捕捉抗体及び結合したジカペプチドでコーティングされたプレートを、３７℃で９０分間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した後、ヤギ抗ヒトＩｇＧ  ＨＲＰコンジュゲートを１：５０００希釈（１００μＬ／ウェル）で使用し、３７℃で９０分間インキュベートし、その後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。最後に、発色基質（Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ）及び停止溶液を添加し、プレートを４５０ｎｍで、プレートリーダー上で読み取った。
【０１５２】
ニカラグア、ブラジル、プエルトリコ、米国立衛生研究所及びニューヨーク市保健精神衛生局（ＮＹＣＤＯＨＭＨ）からの共同研究者を通じて、ＺＩＫＶ、ＤＥＮＶ  １〜４及びＣＨＩＫＶでの自然感染の病歴を有するヒト（帰国旅行者）からの血清をアッセイで使用した。
【０１５３】
結果
ペプチドアレイのスクリーニングは、確認されたＺＩＫＶ感染症を有する個体からの血清と８０％超の感度を有したジカのＮＳ２ｂ（ＤＩＴＷＥＫＤＡＥＶＴＧＮＳＰＲＬＤＶＡ（配列番号１）における特異的ペプチド配列の発見を可能にした。バイオインフォマティック分析は、このペプチドがデング熱ウイルスのＮＳ２ｂと有意な相同性を有しないことを確認した。その有用性は、捕捉抗体を介するマトリックスへの取り付けを容易にするための、アミノ末端又はカルボキシ末端でのビオチン標識した可溶性ペプチドの合成に基づくＥＬＩＳＡで確認された。最適化により、ＺＩＫＶについて９５．３％の感度及び９４．５％の特異性を有するジカ  ＮＳ２ｂ−ペプチドＥＬＩＳＡの設計が可能になった。
【０１５４】
また、ＮＳ２ｂ−ペプチドＥＬＩＳＡ及び市販のＥＬＩＳＡ（Ｅｕｒｏｉｍｍｕｎ）の性能を、ジカ患者からの急性期及び回復期の血清を用いて比較した。両方の血清で、ＮＳ２ｂ−ペプチドＥＬＩＳＡは、市販のＮＳ１  ＥＬＩＳＡよりも高い感度を有した（図２）。
【０１５５】
参考文献
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Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ２００２；８：２９５−３０１．
Ｖｉｇｉｌ  ｅｔ  ａｌ．  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２０１０；５：２４１−５１．  ＰＭＣ２８４１３９９
【図１Ａ】
2020503279.tif 000006
【図１Ｂ】
2020503279.tif 000007
【図２】
2020503279.tif 000008
【手続補正書】
【提出日】令和1年8月22日(2019.8.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2020503279000001.app
【国際調査報告】
2020503279.tif 000009
2020503279.tif 000010
2020503279.tif 000011
2020503279.tif 000012