(57)【要約】  本開示は、ゲノムフラグメントのマルチプレックス末端タギング増幅に使用するゲノムＤＮＡの収集のための方法を提供する。
2020522243.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノムＤＮＡを、ライブラリー中の各トランスポソームが２つのトランスポゼースと２つのトランスポゾンＤＮＡを有しているトランスポソームのライブラリーと接触させること、ここで、各トランスポゾンＤＮＡは、トランスポゼース結合部位及びプライマー結合部位配列を含んでおり、前記プライマー結合部位配列は、前記トランスポソームライブラリーの他のメンバーのプライマー結合部位と異なっており、前記トランスポソームのライブラリーが、前記ゲノムＤＮＡに沿って並んだ複数の標的位置に結合し、トランスポゼースは、前記ゲノムＤＮＡを、ゲノムＤＮＡフラグメントライブラリーを表す複数の二本鎖ゲノムＤＮＡフラグメントに切断し、各二本鎖ゲノムＤＮＡフラグメントは、自身の各末端に、固有であり、かつ、相違するプライマー結合部位配列を有する、
前記トランスポゾンＤＮＡと前記ゲノムＤＮＡフラグメントとの間のギャップを修復して、各末端に独自及び／又は相違するプライマー結合部位配列を有する二本鎖ゲノムＤＮＡフラグメント伸長産物のライブラリーを形成すること、及び
前記二本鎖ゲノムＤＮＡフラグメント伸長産物を増幅してアンプリコンを作製すること、
を含む、ＤＮＡ増幅方法。
【請求項２】
前記アンプリコンをシークエンシングすることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記トランスポソームのライブラリー内の各トランスポソームは、２つの相違するプライマー結合部位配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記トランスポソームのライブラリー内の各トランスポソームは、前記トランスポソームの各トランスポゾン上に２つの同じプライマー結合部位配列を含み、該プライマー結合部位配列は、前記トランスポソームのライブラリーの他のトランスポソーム中のプライマー結合部位配列とは異なっている、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ゲノムＤＮＡは、単一の細胞から得られた全ゲノムＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記トランスポゼースはＴｎ５トランスポゼース、Ｍｕトランスポゼース、Ｔｎ７トランスポゼース、又はＩＳ５トランスポゼースである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記トランスポゾンＤＮＡは、二本鎖である１９ｂｐのＴｎｐ結合部位と、オーバーハングとを含み、前記オーバーハングはオーバーハングの５’末端に独自及び／又は相違するプライマー結合部位配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記二本鎖フラグメントに結合したトランスポゼースは、ギャップフィリング及び前記二本鎖ゲノムＤＮＡフラグメントの伸長の前に、前記二本鎖フラグメントから除去される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ゲノムＤＮＡは胎児細胞から得られたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ゲノムＤＮＡは癌細胞から得られたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ゲノムＤＮＡは循環腫瘍細胞から得られたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ゲノムＤＮＡは単一の胎児細胞から得られたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ゲノムＤＮＡは単一の癌細胞から得られたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ゲノムＤＮＡは単一の循環腫瘍細胞から得られたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ゲノムＤＮＡは、単一の細胞又は少量の試料からのクロマチンコンフォーメーションキャプチャの産物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ゲノムＤＮＡは、単一の細胞又は微量の試料から得られた未変性の、又は固定したクロマチンである、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記独自かつ相違するプライマー結合部位配列は特異的ＰＣＲプライマー結合部位である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記トランスポソームのライブラリーは１〜１００種類の独自かつ相違するプライマー結合部位配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記トランスポソームのライブラリーは１〜１０種類の独自かつ相違するプライマー結合部位配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記トランスポソームのライブラリーは５〜５０種類の独自かつ相違するプライマー結合部位配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記トランスポソームのライブラリーは３０〜１００種類の独自かつ相違するプライマー結合部位配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記トランスポソームのライブラリーは１５〜２５種類の独自かつ相違するプライマー結合部位配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記トランスポソームのライブラリーは１００〜１，０００種類の独自かつ相違するプライマー結合部位配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記トランスポソームのライブラリーは１，０００〜１０，０００種類の独自かつ相違するプライマー結合部位配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記トランスポソームのライブラリーは１０，０００〜１００，０００種類の独自かつ相違するプライマー結合部位配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記相違するプライマー結合部位配列同士は直交性（orthogonal）である、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
各末端にトランスポゼース結合配列と同じプライミング部位配列を有する標的二本鎖ＤＮＡを第１の一本鎖と第２の一本鎖に分けること、
前記トランスポゼース結合部位に対して相補的である第１の配列及び前記プライミング部位配列に対して非相補的である第２の配列を有する第１のプライマーを、前記第１の鎖にアニーリングすること、
前記トランスポゼース結合部位に対して相補的である第１の配列及び前記プライミング部位配列に対して相補的である第２の配列を有する第２のプライマーを、前記第２の鎖にアニーリングすること、
前記第１の鎖に沿って前記第１のプライマーを伸長し、前記第２の鎖に沿って前記第２のプライマーを伸長すること、及び
伸長産物を増幅して、各末端に独自及び／又は相違するプライミング部位配列を有する二本鎖ＤＮＡアンプリコンを作製すること、
を含む、各末端に独自及び／又は相違するプライミング部位配列を有する二本鎖ＤＮＡアンプリコンを作製する方法。
【請求項２８】
各末端に相違するプライミング部位を有する二本鎖核酸配列の２本の鎖を増幅する方法であって、
前記二本鎖核酸配列を第１の鎖と第２の鎖に分けること、
前記第２の鎖が存在しない状態で前記第１の鎖を増幅して第１の鎖のアンプリコンを作製すること、
前記第１の鎖が存在しない状態で前記第２の鎖を増幅して第２の鎖のアンプリコンを作製すること、
前記第１の鎖のアンプリコンをシークエンシングすること、及び
前記第２の鎖のアンプリコンをシークエンシングすること、
を含む方法。
【請求項２９】
前記第１の鎖及び前記第２の鎖の３’末端と、前記第１の鎖及び前記第２の鎖の３’末端に対して相補的であるプライミング領域、及び第１のアダプター配列を含むプライマー群とをアニーリングし、ＤＮＡポリメラーゼにより相補鎖を合成し、過剰な前記プライマー群をエクソヌクレアーゼにより除去すること、
合成された、前記第１の鎖及び前記第２の鎖の前記相補鎖の３’末端と、前記第１の鎖及び前記第２の鎖の３’末端に対して相補的であるプライミング領域、及び第２のアダプター配列を含むプライマー群とをアニーリングし、ＤＮＡポリメラーゼにより相補鎖を合成し、過剰な前記プライマー群をエクソヌクレアーゼにより除去すること、
前記第１のアダプター配列及び前記第２のアダプター配列にアニーリングするプライマー群を使用するＰＣＲにより前記標的配列を増幅して、前記第１の鎖と前記第２の鎖についてのアンプリコンを作製すること、
前記アンプリコンをシークエンシングして、前記第１の鎖を前記第２の鎖から区別すること、
をさらに含み、
ここで、前記第１の鎖の第１の末端は、前記第１のアダプターでタグ付けされており、前記第１の鎖の第２の末端は、前記第２のアダプターでタグ付けされており、また、前記第２の鎖の第１の末端は前記第２のアダプターでタグ付けされており、前記第２の鎖の第２の末端は前記第１のアダプターでタグ付けされている、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
クロマチンコンフォーメーションキャプチャは二倍体試料からのものであり、かつ、キャプチャされたクロマチン接触それぞれのハプロタイプ情報が決定される、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の情報
本願は２０１７年５月２３日に出願された米国特許仮出願第６２／５０９９８１号からの優先権を主張し、該米国特許仮出願は、その全体が、全ての目的のために参照により本明細書に取り込まれる。
【０００２】
政府権利についての声明
本発明は米国国立衛生研究所の助成番号ＣＡ１８６６９３の政府支援を得てなされた。合衆国政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
配列表
本願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含んでおり、該配列表は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。当該ＡＳＣＩＩコピーは２０１８年５月２３日に作成され、０１０４９８＿０１１０３＿ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、４，９７１バイトのサイズを有する。
【０００４】
本発明の分野
本発明の実施形態は、概して、シングルセルゲノムシークエンシング、例えば単一細胞から得たＤＮＡのシークエンシングのための方法と組成物に関する。
【背景技術】
【０００５】
関連技術の説明
細胞間でのばらつき及び集団不均一性が重要な役割を果たす研究分野、例えば腫瘍増殖、幹細胞リプログラミング、胚発生等の研究分野ではシングルセルゲノムシークエンシングが実施可能であることが重要である。シングルセルゲノムシークエンシングはシークエンシング対象の細胞試料が貴重又は希少であるとき、又は微量であるときにも重要である。微量でありうるゲノムＤＮＡの初期の増幅は、正確なシングルセルゲノムシークエンシングにとって重要なことである。
【０００６】
マルチプルディスプレースメント増幅法（ＭＤＡ）は、当技術分野において、単一細胞から得たゲノムＤＮＡに対して、シークエンシング及び他の分析の前に用いられる一般的な方法である。この方法では、強力な鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを利用した伸長をランダムプライマーアニーリングの後に行う。単一の細胞から得た元のゲノムＤＮＡがカスケード様に指数関数的に増幅されて、高分岐ＤＮＡ構造体が形成される。単一の細胞からのゲノムＤＮＡを増幅する別の方法がＺｏｎｇ，  Ｃ．，  Ｌｕ，  Ｓ．，  Ｃｈａｐｍａｎ，  Ａ．Ｒ．，及びＸｉｅ，  Ｘ．Ｓ．著、（２０１２年）Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｃｏｐｙ−ｎｕｍｂｅｒ  ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ誌、第３３８巻、１６２２〜１６２６頁に記載されており、この文献はマルチプルアニーリング／ルーピング・ベース増幅サイクル（ＭＡＬＢＡＣ）を記載している。当技術分野において知られている別の方法は縮重オリゴヌクレオチドプライムドＰＣＲ、あるいはＤＯＰ−ＰＣＲである。単一細胞のゲノムＤＮＡについて用いられる他のいくつかの方法にはＣｈｅｕｎｇ，  Ｖ．Ｇ．及びＳ．Ｆ．  Ｎｅｌｓｏｎ著、Ｗｈｏｌｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｉｍｅｒ  ａｌｌｏｗｓ  ｈｕｎｄｒｅｄｓ  ｏｆ  ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ  ｔｏ  ｂｅ  ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ  ｏｎ  ｌｅｓｓ  ｔｈａｎ  ｏｎｅ  ｎａｎｏｇｒａｍ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ誌、１９９６年、第９３巻（第２５号）：１４６７６〜９頁、Ｔｅｌｅｎｉｕｓ，  Ｈ．ら著、Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｐｒｉｍｅｄ  ＰＣＲ：  ｇｅｎｅｒａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ＤＮＡ  ｂｙ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｐｒｉｍｅｒ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ誌、１９９２年、第１３巻（第３号）：７１８〜２５頁、Ｚｈａｎｇ，  Ｌ．ら著、Ｗｈｏｌｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌ：  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ誌、１９９２年、第８９巻（第１３号）：５８４７〜５１頁、Ｌａｏ，  Ｋ．，  Ｎ．Ｌ．  Ｘｕ，及びＮ．Ａ．  Ｓｔｒａｕｓ，  Ｗｈｏｌｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｓｉｎｇｌｅ−ｐｒｉｍｅｒ  ＰＣＲ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ誌、２００８年、第３巻（第３号）：３７８〜８２頁、Ｄｅａｎ，  Ｆ．Ｂ．ら著、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ誌、２００２年、第９９巻（第８号）：５２６１〜６頁、Ｌａｇｅ，  Ｊ．Ｍ．ら著、Ｗｈｏｌｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｓｍａｌｌ  ＤＮＡ  ｓａｍｐｌｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｈｙｐｅｒｂｒａｎｃｈｅｄ  ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｒｒａｙ−ＣＧＨ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ誌、２００３年、第１３巻（第２号）：２９４〜３０７頁、Ｓｐｉｔｓ，  Ｃ．ら著、Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｗｈｏｌｅ−ｇｅｎｏｍｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ誌、２００６年、第２７巻（第５号）：４９６〜５０３頁、Ｇｏｌｅ，  Ｊ．ら著、Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｎａｎｏｌｉｔｅｒ  ｍｉｃｒｏｗｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ誌、２０１３年、第３１巻（第１２号）：１１２６〜３２頁、Ｊｉａｎｇ，  Ｚ．ら著、Ｇｅｎｏｍｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ｓｐｅｒｍ  ｕｓｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ誌、２００５年、第３３巻（第１０号）：ｅ９１頁、Ｗａｎｇ，  Ｊ．ら著、Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  Ｄｅ  Ｎｏｖｏ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒａｔｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｐｅｒｍ．Ｃｅｌｌ誌、２０１２年、第１５０巻（第２号）：４０２〜１２頁、Ｎｉ，  Ｘ．，  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｏｐｙ  ｎｕｍｂｅｒ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ａｍｏｎｇ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．ＰＮＡＳ誌、２０１３年、第１１０巻、２１０８２〜２１０８８頁、Ｎａｖｉｎ，  Ｎ．，  Ｔｕｍｏｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｉｎｆｅｒｒｅｄ  ｂｙ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ誌、２０１１年、第４７２巻（第７３４１号）：９０〜９４頁、Ｅｖｒｏｎｙ，  Ｇ．Ｄ．ら著、Ｓｉｎｇｌｅ−ｎｅｕｒｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｌ１  ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｂｒａｉｎ．Ｃｅｌｌ誌、２０１２年、第１５１巻（第３号）：４８３〜９６頁、及びＭｃＬｅａｎ，  Ｊ．Ｓ．ら著、Ｇｅｎｏｍｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ  ｒｅｃｏｖｅｒｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  ｂｉｏｆｉｌｍ  ｉｎ  ａ  ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｓｉｎｋ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅ���ｌ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｐｌａｔｆｏｒｍ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ誌、２０１３年、第２３巻（第５号）：８６７〜７７頁が挙げられる。全ゲノム増幅の種々の態様についての方法が国際公開第２０１２／１６６４２５号パンフレット、米国特許第７７１８４０３号、米国特許出願公開第２００３／０１０８８７０号、及び米国特許第７４０２３８６号に報告されている。
【０００７】
ＤＮＡ増幅の応用によっては、インビトロトランスポジションが使用されている。このような方法では、標的ＤＮＡはフラグメント化とタグ付加とを同時に受けて、下流処理のために所望のＤＮＡ配列のタグを付けたフラグメントが作製される。ライブラリー調製方法としては、インビトロトランスポジションはＩｌｌｕｍｉｎａ社のネクストエラ・テクノロジー（米国特許出願公開第２０１１／０２８７４３５号）において用いられ、ＤＮＡのフラグメント化及び次世代シークエンシング向けの適切な配列のタグの各フラグメントへの付加を同時に行っている。単一細胞のゲノム及びエピゲノムを研究するためのツールとして、インビトロトランスポジションは、クロマチンへの近づきやすさをプロファイリングするためにＢｕｅｎｒｏｓｔｒｏらにより（Ｂｕｅｎｒｏｓｔｒｏ，  Ｊ．  Ｄ．，  Ｗｕ，  Ｂ．，  Ｌｉｔｚｅｎｂｕｒｇｅｒ，  Ｕ．  Ｍ．，  Ｒｕｆｆ，  Ｄ．，  Ｇｏｎｚａｌｅｓ，  Ｍ．  Ｌ．，  Ｓｎｙｄｅｒ，  Ｍ．  Ｐ．・・（中略）・・及びＧｒｅｅｎｌｅａｆ，  Ｗ．  Ｊ．著、（２０１５年）Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ誌、第５２３巻（第７５６１号）、４８６〜４９０頁）、三次元染色体構造を研究するためにＲａｍａｎｉらにより（Ｒａｍａｎｉ，  Ｖ．，  Ｄｅｎｇ，  Ｘ．，  Ｑｉｕ，  Ｒ．，  Ｇｕｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｋ．  Ｌ．，  Ｓｔｅｅｍｅｒｓ，  Ｆ．  Ｊ．，  Ｄｉｓｔｅｃｈｅ，  Ｃ．  Ｍ．・・（中略）・・及びＳｈｅｎｄｕｒｅ，  Ｊ．著、（２０１７年）Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  Ｈｉ−Ｃ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ誌、第１４巻（第３号）、２６３〜２６６頁）、そしてシングルセルゲノムを増幅して直接的にシークエンシングライブラリーにするためにＺａｈｎらにより（Ｚａｈｎ，  Ｈ．，  Ｓｔｅｉｆ，  Ａ．，  Ｌａｋｓ，  Ｅ．，  Ｅｉｒｅｗ，  Ｐ．，  ＶａｎＩｎｓｂｅｒｇｈｅ，  Ｍ．，  Ｓｈａｈ，  Ｓ．  Ｐ．，・・（中略）・・及びＨａｎｓｅｎ，  Ｃ．  Ｌ．著、（２０１７年）Ｓｃａｌａｂｌｅ  ｗｈｏｌｅ−ｇｅｎｏｍｅ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ誌、２０１７年）使用されている。しかしながら、これらの方法はどれも、元の標的核酸の約５０％を喪失してしまう。これは、これ以降Ａ及びＢと表示する２種類のトランスポゾン配列がタグ付加に使用されるために生じる。すなわち、トランスポゾンＡとＢがタグとして標的ＤＮＡに付加された後では、各フラグメントの２つの末端にＡ−Ａ、Ｂ−Ｂ、Ａ−Ｂ、又はＢ−Ａというタグが付加されたフラグメントである４種類の異なるＤＮＡフラグメントが生成し得る。全転移産物のうちの５０％を占めるＡ−Ｂ又はＢ−Ａというタグを付加されたフラグメントだけがＰＣＲ増幅又はペアエンドシークエンシングに適している。全フラグメントのうちの残りの５０％はＡ−Ａ又はＢ−Ｂというタグが付加されており、失われる。そのような損失率は、例えば移植前遺伝的スクリー��ングに使用される単一細胞といった、希少な、独特な、又は貴重な単一細胞試料など、ＤＮＡの量が限られた試料の場合には明らかに望ましくなく、また、許容不可能な場合もある。他の転移法が国際公開第２０１６／０７３６９０号パンフレットに記載されている。しかしながら、当該方法も、偏った転移に起因する前記５０％の損失を減少させない。
【０００８】
したがって、増幅損失がより少ない、少量のゲノムＤＮＡ、例えば単一細胞又は小さな細胞集団からのゲノムＤＮＡを増幅するさらなる方法が求められている。
【発明の概要】
【０００９】
本開示は複数のトランスポソームを使用するゲノムＤＮＡフラグメント化のための方法を提供し、ここで前記複数のトランスポソームの各メンバーは、それぞれプライミング部位配列を有する２つのトランスポゾン核酸配列を含んでいる。１つの態様によると、前記トランスポソームの各トランスポゾン核酸配列のプライミング部位配列は同じである。１つの態様によると、前記トランスポソームの各トランスポゾン核酸配列のプライミング部位配列は相違する。１つの態様によると、前記複数のトランスポソームの各メンバーは「独自の」及び／又は「相違する」プライミング部位配列を含み得る。１つの態様によると、前記複数のトランスポソームの各メンバーは、そのトランスポソーム内の各トランスポゾンにつき１つずつとなるように、独自及び／又は相違する２つのプライミング部位配列を含み得る。このようにすれば、それぞれのトランスポソームに付随しており、トランスポソーム同士を区別するために使用され得る独自のプライマー結合部位配列（又は独自及び／又は相違する２つのプライミング部位配列）を有する複数のトランスポソームからなるセットが提供される。言い換えると、一つのトランスポソーム内の複数のトランスポゾンのプライマー結合部位配列同士は同じでもよく、又は相違する若しくは非同一であってもよい。標的核酸配列に結合し、フラグメントを作製するために使用される２つの隣り合うトランスポソーム内のトランスポソームのプライマー結合部位配列同士は非同一であり、例えば高い確率で非同一である。これらトランスポゾンは、トランスポソーム内の各トランスポゾンが相違するプライミング部位配列を有している限りにおいて、マルチプレックストランスポゾンと称される場合がある。トランスポソームのライブラリー中のプライミング部位は、各トランスポソームが当該トランスポソームセット内の他のトランスポソーム内の他のプライミング部位と相違する又は非同一である又は独自であるプライミング部位を有する限り、マルチプレックスプライミング部位と称される場合がある。１つの態様によると、前記方法は、隣り合うトランスポソームが相違するプライマー結合部位配列を有するように、ライブラリー又は複数のトランスポソームからの複数のトランスポソームを標的核酸配列に沿って結合させるステップを含む。このようにすれば、フラグメント化部位のそれぞれの末端は、相違するプライマー結合部位配列によりタグ付けされることになる。これは、トランスポソームがその２つのトランスポゾンＤＮＡの各々について同じプライマー結合部位配列を有するか、あるいはトランスポソームがその２つのトランスポゾンＤＮＡの各々について相違するプライマー結合部位配列を有するかとは関係なく、達成可能である。このように本明細書に記載されるマルチプレックス末端タギング増幅法は複数のプライミング配列を使用して２つの末端で相違する配列がタグ付けされた標的ＤＮＡフラグメントを作製する。前記マルチプレックス末端タギング増幅法は、一つのトランスポソーム内の２つのトランスポゾン配列が同じであっても異なっていても、２つの隣り合うトランスポソーム同士、すなわちフラグメント配列を形成するように直接隣り合うトランスポソーム同士が相違するトランスポゾンプライマー結合部位配列を担持している限り実施可能であり、この場合前記フラグメントは各末端に相違するプライマー結合部位配列を有する。
【００１０】
１つの態様によると、ゲノム核酸配列、例えば単一細胞のゲノム核酸配列をフラグメント化し、タグ付けするためにトランスポジション法を使用する際に、複数のトランスポソームからなるセットにおいてマルチプレックスプライミング部位配列を使用することにより損失率が低下した。本明細書における教示によると、反応混合物中にＮ個の異なるトランスポゾン配列が存在するとき、すなわち独自のプライミング部位配列の数がＮであるとき、一つのＤＮＡフラグメントが同じトランスポゾン配列でタグ付けされる確率、すなわち損失率は１／Ｎである。したがって、本開示は独自のプライミング部位配列の数、すなわち数Ｎを変更してその損失率を制御するための方法を提供する。例えば、ヒトの単一細胞から得られたＤＮＡについて使用される２０種類の異なるトランスポゾン配列が存在するとき、損失率は１／２０、すなわち５％である。
【００１１】
複数のフラグメントを作製する本明細書に記載される方法はトランスポソームのセットを用い、ここで、トランスポソームセットの各メンバーは１つ又は２つの相違するプライマー結合部位配列を有し、かつ、トランスポソームセットの各メンバーは、前記トランスポソームセットの他のメンバー各々と比べて独自又は異なっている１つ又は２つのプライミング結合部位を有する、例えば高い確率で有する。このようにして、フラグメント化プロセス中にフラグメント群の隣り合う末端を相違する及び／又は独自の末端バーコード配列でバーコード標識して、独自のバーコード配列（プライミング部位配列）を各末端上に有するフラグメントを作製する。このようにして、フラグメント化プロセス中に、高い確率で、フラグメントの反対端を相違する及び／又は独自の末端バーコード配列でバーコード標識して、相違するバーコード配列（プライミング部位配列）を各末端上に有するフラグメントを作製する。このようにして、フラグメント化プロセス中に、フラグメントの２つの反対端を相違する及び／又は独自の末端バーコード配列でバーコード標識して、独自のバーコード配列（プライミング部位配列）を各末端上に有するフラグメントを作製する。１つの態様によると、トランスポソームのトランスポゼースにより切断された部位のゲノムＤＮＡの各末端に独自のバーコード配列が挿入又は接続されているゲノムＤＮＡフラグメントを水性媒体中で作製するためにトランスポソームライブラリーが使用される。各トランスポソームは、前記セット、複数、又はライブラリーにおける他のトランスポソームメンバーと比べて１つ又は２つの相違する及び／又は独自のプライミング部位配列を有しているので、各フラグメントは各末端上に独自のプライミング部位配列（バーコード配列）を有することになる。本開示は、本明細書に記載されるトランスポソームライブラリーを使用してゲノムＤＮＡを複数のフラグメントに、例えば５以上のフラグメント、１０以上のフラグメント、１００以上のフラグメント、１０００以上のフラグメント、１０，０００以上のフラグメント、１００，０００以上のフラグメント、１，０００，０００以上のフラグメント、又は１０，０００，０００以上のフラグメントに、フラグメント化することも想定している。１つの態様によると、トランスポソームライブラリーは、独自及び／又は相違するプライマー結合部位配列の数に応じて、５〜１０のタイプ又は種類のトランスポソームメンバー、１０〜１００のタイプ又は種類のトランスポソームメンバー、１００以上のタイプ又は種類のトランスポソームメンバー、１０００以上のタイプ又は種類のトランスポソームメンバー、１０，０００以上のタイプ又は種類のトランスポソームメンバー、１００，０００以上のタイプ又は種類のトランスポソームメンバー、１，０００，０００以上のタイプ又は種類のトランスポソームメンバー、又は１０，０００，０００以上のタイプ又は種類のトランスポソームメンバー、又は５〜５０のタイプ又は種類のトランスポソームメンバーを含む。
【００１２】
１つの態様によると、各トランスポソームは２つのトランスポゼースと２つのトランスポゾンＤＮＡを含む。各トランスポソームの２つのトランスポゾンＤＮＡの各々は、トランスポゼース結合部位とプライマー結合部位配列とを含む。１つの態様によると、各トランスポゾンＤＮＡは、単一のトランスポゼース結合部位と独自のプライマー結合部位配列とを含む。それぞれのトランスポゾンＤＮＡは、トランスポゼース結合部位においてトランスポゼースに結合するそれぞれ別個の核酸である。前記トランスポソームは、それぞれ自分のトランスポゾンＤＮＡに結合している２つの別個のトランスポゼースからなるダイマーである。該ダイマーはそれぞれのトランスポゾン上に同じプライマー結合部位配列を有していてもよいし、それぞれのトランスポゾン上に相違するプライマー結合部位配列を有していてもよい。１つの態様によると、前記トランスポソームは２つの別個かつ個別のトランスポゾンＤＮＡを含み、ここでそれぞれのトランスポゾンＤＮＡはそれぞれ自分の対応するトランスポゼースに結合している。１つの態様によると、前記トランスポソームは２つのみのトランスポゼースと２つのみのトランスポゾンＤＮＡを含む。１つの態様によると、前記トランスポソームの一部としての２つのトランスポゾンＤＮＡは、それぞれ自分の対応するトランスポゼースに結合している、別々、個々、又は非関連のトランスポゾンＤＮＡである。
【００１３】
１つの態様によると、前記ライブラリーの各トランスポソームメンバーは独自かつ相違するプライミング部位配列を含む。前記トランスポソームの各トランスポゾンＤＮＡ上には、同一の、独自かつ相違するプライミング部位配列が存在してもよいし、前記トランスポソームの各トランスポゾンＤＮＡ上に、異なる、独自かつ相違するプライミング部位配列が存在していてもよい。このようにすれば、各トランスポソームは、独自かつ相違するプライミング部位配列を含み、該プライミング部位配列は、独自であり、前記トランスポソームライブラリー内の他のあらゆるトランスポソームのプライミング部位配列とは相違する。１つの態様によると、前記トランスポソームライブラリーは、他のトランスポソームメンバーと同じプライミング部位配列を有するトランスポソームメンバーを含んでいてもよいが、ただしその確率は比較的に小さい、又はわずかな確率であるものとする。このようなやり方において、前記トランスポソームライブラリーは、調製済みのトランスポソームコレクションのサブセットであって、独自かつ相違するプライミング部位配列を有するトランスポソームだけが含まれるサブセットであると考えることもできるが、これは、フラグメント切断部位がそれぞれ相違するプライミング部位配列を有するようにゲノムＤＮＡをフラグメント化することが目標であるからである。フラグメント切断部位がそれぞれ相違するプライミング部位配列を有するようにゲノムＤＮＡをフラグメント化するという目標は、隣り合うトランスポソームがそれぞれ独自かつ相違するプライミング部位配列を有している場合に達成され得ること、ただし各トランスポソームにおける２つのトランスポゾンは同じプライミング部位配列を有していてもよいこと、が理解されるべきである。フラグメント切断部位がそれぞれ相違するプライミング部位配列を有するようにゲノムＤＮＡをフラグメント化するという目標は、隣り合うトランスポソームがそれぞれ２つの独自かつ相違するプライミング部位配列を有し、各トランスポソームにおけるそれぞれのトランスポゾンが独自かつ相違するプライミング部位配列を有している場合に達成され得ることが理解されるべきである。
【００１４】
トランスポソームライブラリーの調製に起因して、わずかな数の切断部位が同じプライミング部位配列を有していてもよいことを理解されたい。例えば、所与のライブラリー調製方法について、同じプライミング部位配列を有する複数のトランスポソーム分子が存在する事態は数学的には起こりうるが、相違するプライミング部位配列の数が実際に標的ゲノムに挿入されることになるトランスポソーム分子の数を著しく超えるようにライブラリーを調製する。１つの態様によると、前記トランスポソームライブラリーは、同一の２つのプライミング部位配列を有する、すなわちプライミング部位配列同士が同一又は同じであるトランスポソームメンバーを含んでいてもよいが、このプライミング部位配列は、前記トランスポソームライブラリーのトランスポソームメンバー群の他のあらゆるトランスポゾンＤＮＡと比べると独自のものである。そのようなトランスポソームライブラリーを作製するため、トランスポゼースと独自のプライミング部位配列を含むトランスポゾンＤＮＡとを混合することにより、それぞれのトランスポソームメンバーを別々に作製する。その後、全てのトランスポソームメンバーを混合して前記トランスポソームライブラリーを形成する。
【００１５】
１つの態様によると、全てのトランスポゾン配列をトランスポゼースと共に混合してトランスポソームを形成することによりトランスポソームライブラリーを調製する。この方法では、大半のトランスポソームが相違するトランスポゾン配列を有しているが、トランスポソーム同士が同じトランスポゾン配列を担持しているチャンスは１／Ｎである。トランスポソームライブラリーを作製する別の方法によると、各種類のトランスポゾン配列を別々にトランスポゼースと混合し、その後、全てのトランスポソームを混合してトランスポソームライブラリーを形成する。この方法では全てのトランスポソームが同じトランスポゾン配列を有することになる。
【００１６】
１つの態様によると、独自及び／又は相違するプライミング部位配列の数は５〜５０、１０〜５０、１５〜４５、２０〜４０、又は１〜１，０００、１〜１０，０００、１〜１００，０００、１〜１，０００，０００、又は１〜１０，０００，０００である。１つの態様によると、ゲノムＤＮＡ中の切断部位の数は、トランスポソームの濃度によって決定又は調整され、濃度が高いほど切断部位の数が多くなり、濃度が低いほど切断部位の数が少なくなる。１つの態様によると、トランスポソーム及び付随する相違する及び／又は独自のプライミング部位配列の数は、実質的に全ての切断部位の２つの相違する及び／又は独自のプライミング部位配列を有するように選択される。１つの態様によると、切断部位の９０％超が２つの相違する及び／又は独自のプライミング部位配列を有している、切断部位の９５％超が２つの相違する及び／又は独自のプライミング部位配列を有している、切断部位の９６％が２つの相違する及び／又は独自のプライミング部位配列を有している、切断部位の９７％が２つの相違する及び／又は独自のプライミング部位配列を有している、切断部位の９８％が２つの相違する及び／又は独自のプライミング部位配列を有している、切断部位の９９％が２つの相違する及び／又は独自のプライミング部位配列を有している、切断部位の９９．５％が２つの相違する及び／又は独自のプライミング部位配列を有している、又は切断部位の１００％が２つの相違する及び／又は独自のプライミング部位配列を有している。
【００１７】
その後、ゲノムＤＮＡを切断するために前記トランスポソームライブラリーが使用され、各トランスポソームが各トランスポゾンＤＮＡ中のプライミング部位配列を切断部位の末端に挿入又は結合する。隣り合うトランスポソームが、相互に比べると独自かつ相違するプライミング部位配列を有している場合、切断部位は各末端に独自かつ相違するプライミング部位配列を有することになる；すなわち、挿入されたプライミング部位配列が相違することになる。このやり方においては、隣り合うトランスポソーム同士が、相互に比べると独自かつ相違するプライミング部位配列を有する限りにおいて、前記トランスポソームライブラリーにより作製された複数の、又は大半の、又は実質的に全てのフラグメントが、当該フラグメントの各末端上に、すなわち両末端上に、相違する及び／又は独自のプライミング部位配列を有する。その後、各フラグメントからトランスポゼースを除去することができ、その後に、例えばポリメラーゼ伸長ステップによるギャップフィリングステップが続く。その後、生じた二本鎖核酸フラグメント配列を例えばマルチプレックスＰＣＲ増幅を用いて増幅することができる。その後、フラグメントをシークエンシングし、ゲノムＤＮＡの配列を決定することができる。
【００１８】
１つの態様によると、前記トランスポソームのトランスポゾンＤＮＡは、フラグメントに取り付けることが可能な特異的なプライマー配列又は転写プロモーター配列などの増幅法を容易にする配列を含むことができ、それにより、当業者に知られている方法を用いてＰＣＲ又はＲＮＡ転写などによりそれらのフラグメントをシークエンシングの前に増幅することができる。本開示はそれらのフラグメントを増幅するための様々な増幅法を想定しており、前記アンプリコンをシークエンシングするための様々なシークエンシング方法は、特定の増幅法又はシークエンシング方法に限定されないことを理解されたい。
【００１９】
本開示の実施形態は、核酸のマルチプレックス末端タギング増幅法に関し、核酸としては、例えば、ゲノムＤＮＡが挙げられ、その例としては少量のゲノムＤＮＡ又は限られた量のＤＮＡが挙げられ、その例としては単一の細胞若しくは同じ細胞種の複数の細胞から得られた１つ若しくは複数のゲノム配列、又は個体若しくは基材から得られた組織試料、液体試料、若しくは血液試料から得られた１つ又は複数のゲノム配列が挙げられる。本開示のある態様によると、本明細書に記載される方法は単一の反応混合物を含む単一のチューブ内で実施可能である。本開示のある態様によると、前記核酸試料は単一の細胞から得られた未精製又は未処理の溶解物の中に存在するものであってもよい。本明細書において開示される方法の対象となる核酸は、本明細書に記載される様々な条件下で様々な試薬と接触させられるのに先だってカラム精製等により精製される必要は無い。本明細書に記載される方法は、単一細胞の全ゲノムを実質的及び均一にカバーすることの助けになるように損失率、すなわち元の標的核酸の喪失を抑え、ハイスループットシークエンシング用の増幅ＤＮＡを生産する。
【００２０】
本発明の実施形態は概してＤＮＡフラグメントを作製するための方法と組成物に関するものであり、フラグメントとしては、例えば、単一細胞の全ゲノムに由来するＤＮＡフラグメントが挙げられ、当該ＤＮＡフラグメントは、その後、当業者に知られ、本明細書に記載される増幅法とシークエンシング法に供されてもよい。ある態様によると、本明細書に記載される核酸フラグメントの作製方法はトランスポソームライブラリーを利用する。１つの態様によると、トランスポソームの一部としてのトランスポゼースは、二本鎖ゲノムＤＮＡフラグメントのセットを作製するために使用される。ある態様によると、トランスポゼースはトランスポゾンＤＮＡに結合し、互いに接触する（例えば反応容器又は反応体積内に配置される）と二量体化する能力を有し、トランスポソームと称されるトランスポゼース／トランスポゾンＤＮＡ複合体ダイマーを形成する。トランスポソームにおける各トランスポゾンＤＮＡは、二本鎖トランスポゼース結合部位並びに第１核酸配列を含み、第１核酸配列は、プライミング部位配列及び所望により転写プロモーター部位などの機能性配列を含む。第１核酸配列は一本鎖伸長（ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）の形態をとってよい。前記トランスポソームライブラリーの各トランスポソームは、前記トランスポソームライブラリーの残りのメンバー各々のプライミング部位配列とは異なる、独自かつ相違するプライミング部位配列を含む。１つの態様によると、前記トランスポソームライブラリーの各トランスポソームは、前記トランスポソームライブラリーの残りのメンバー各々のプライミング部位配列とは異なる２つの独自かつ相違するプライミング部位配列を含む。
【００２１】
前記トランスポソームは、二本鎖核酸に沿って並んだ標的配列に、例えば二本鎖ゲノムＤＮＡに沿って並んだ標的位置に、ランダムに結合する能力を有し、該トランスポソームと該二本鎖ゲノムＤＮＡを含む複合体を形成する。トランスポソーム内のトランスポゼースは、１つのトランスポゼースが上の鎖を切断し、１つのトランスポゼースが下の鎖を切断することで、二本鎖ゲノムＤＮＡを切断する。トランスポソーム中のトランスポゾンＤＮＡのそれぞれは、切断部位のそれぞれの末端において二本鎖ゲノムＤＮＡに結合される；すなわち、トランスポソームにおける１つのトランスポゾンＤＮＡが左手側の切断部位に接続され、トランスポソームにおける他方のトランスポゾンＤＮＡが右手側の切断部位に接続される。前記トランスポソームのトランスポゾンＤＮＡ同士がそれぞれ相違するプライマー結合部位配列を有しているとき、左手側の切断部位と右手側の切断部位とは、相違しかつ独自のバーコード配列、すなわちプライミング部位配列で「バーコード標識」される。トランスポソームのトランスポゾンＤＮＡ同士がそれぞれ同じプライミング部位配列を有しているとき、左手側の切断部位と右手側の切断部位とは同じバーコード配列、すなわちプライミング部位配列で「バーコード標識」されている。フラグメントを作製するために使用される隣り合うトランスポソームがそれぞれ相違しかつ独自のプライミング部位配列を有しているとき、生じたフラグメントはその各末端上に相違しかつ独自のプライミング部位を有することとなる。ある態様によると、複数のトランスポゼース／トランスポゾンＤＮＡ複合体ダイマー、すなわち複数のトランスポソームが、例えば、二本鎖ゲノムＤＮＡに沿って並んだ対応する複数の標的位置に結合し、そして該二本鎖ゲノムＤＮＡを複数の二本鎖フラグメントに切断するが、ここで各二本鎖フラグメントはその各末端に接続された相違するバーコード配列を有するトランスポゾンＤＮＡを有する。
【００２２】
１つの態様によると、トランスポゾンＤＮＡは二本鎖ゲノムＤＮＡに結合しており、ゲノムＤＮＡの一方の鎖とトランスポゾンＤＮＡの一方の鎖との間に一本鎖ギャップが存在する。１つの態様によると、そのギャップを埋め、かつ、前記二本鎖ゲノムＤＮＡと前記二本鎖トランスポゾンＤＮＡとの間を二本鎖で接続するためにギャップ伸長が実施される。１つの態様によると、トランスポゼース結合部位とプライミング部位配列を含む核酸配列が二本鎖フラグメントの各末端に接続している。ある態様によると、トランスポゼースは二本鎖フラグメントの各末端に接続しているトランスポゾンＤＮＡに結合する。１つの態様によると、トランスポゼースは二本鎖ゲノムＤＮＡフラグメントの各末端に接続しているトランスポゾンＤＮＡから除去される。
【００２３】
本開示の１つの態様によると、二本鎖ゲノムＤＮＡフラグメントの各末端に結合している相違するプライミング部位配列を含むトランスポゾンＤＮＡを有している前記二本鎖ゲノムＤＮＡフラグメントは、次にギャップフィリングを施され、トランスポゾンＤＮＡをテンプレートとして使用して伸長される。したがって、前記二本鎖ゲノムＤＮＡフラグメントと、二本鎖ゲノムＤＮＡの各末端に存在する相違するプライミング部位配列を含む二本鎖トランスポゾンＤＮＡとを含む二本鎖核酸伸長産物が作製される。
【００２４】
この段階で、前記ゲノムＤＮＡフラグメント及び各末端に存在する相違するプライミング部位配列を含む前記二本鎖核酸伸長産物は、当業者に知られている方法を使用して増幅することができ、これにより前記ゲノムＤＮＡフラグメント及び各末端に存在する前記相違するプライミング部位のアンプリコンを作製することができる。増幅のためにＰＣＲプライマー配列と試薬を使用することができる。本明細書に記載されるトランスポゾンは、ＲＮＡ転写物の作製のためのＲＮＡポリメラーゼ結合部位も含んでよく、ＲＮＡ転写物は、その後、線形増幅のためにｃＤＮＡに逆転写してもよい。前記ゲノムＤＮＡフラグメントを含み、かつ、相違するプライミング部位配列を各末端に含む前記二本鎖核酸伸長産物は、増幅試薬と混合することができ、その後、当業者に知られている方法を用いて、前記二本鎖ゲノム核酸フラグメントを増幅して前記二本鎖ゲノム核酸フラグメントのアンプリコンを作製してもよい。
【００２５】
前記アンプリコンは、その後、さらなる分析の前に収集及び／又は精製することができる。当業者に知られている方法を用いて前記アンプリコンをシークエンシングすることができる。シークエンシングされたところで配列をコンピューター分析してゲノムＤＮＡを同定することができる。
【００２６】
本開示の実施形態はＤＮＡをマルチプレックス末端タギングの使用により増幅する方法に関し、前記ＤＮＡは少量のゲノムＤＮＡ又は限られた量のＤＮＡであって、例えば、単一の細胞又は同じ細胞種の複数の細胞から得られた、又は個体若しくは基材から得られた組織試料、液体試料、若しくは血液試料から得られた１つ又は複数のゲノム配列である。本開示のある態様によると、本明細書に記載される方法は、相違しかつ独自の配列を各末端に有するフラグメントを作製するために単一のチューブ内で実施可能であり、前記フラグメントは、その後、増幅し、当業者に知られているハイスループットシークエンシングプラットフォームを用いてシークエンシングされる。
【００２７】
本明細書に記載されるトランスポソームフラグメント化・バーコード標識方法は少量又は限られた量のＤＮＡの増幅及びその後のシークエンシングに有用である。本明細書に記載される方法は、腫瘍及び神経集団などの高度に非均質な細胞集団を特徴とする生物系又は組織試料において、特に、用途を有する。本明細書に記載される方法は、遺伝的に不均質な組織（例えば癌）、希少で貴重な試料（例えば胚性幹細胞）、及び非分裂性細胞（例えば神経細胞）等を含む様々な起源のＤＮＡ物質、並びに当業者に知られているシークエンシングプラットフォーム及び遺伝子型判定方法を利用することができる。
【００２８】
本開示のある実施形態のさらなる特徴及び利点は、実施形態についての以下の説明及び図面、並びに特許請求の範囲からより充分に明らかになる。
【００２９】
本発明の前述の特徴及び利点並びにその他の特徴及び利点は、例示的な実施形態についての以下の詳細な説明を添付図面と併せてとらえることにより、さらに充分に理解される。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】５’伸長が直鎖状であるトランスポゾンＤＮＡの構造を模式的に示す。Ｔは二本鎖トランスポゼース結合部位であり、Ｍは伸長鎖の一末端に存在するマルチプレックスプライミング部位である。
【図２】トランスポゼース及びトランスポゾンＤＮＡがトランスポソームを自発的に形成することの概括的な実施形態を模式的に示す。前記形成は、小滴内又は他の形成用媒体内で生じ得る。トランスポソームの形成前において、それぞれのトランスポゾンは、異なる模様で表されている、相違しかつ独自のプライミング部位配列を有している。トランスポソームの形成後に、該トランスポソームにおける各トランスポゾンは、異なる模様で表される、相違しかつ独自のプライミング部位配列を有している。
【図３Ａ】トランスポソームのゲノムＤＮＡへの結合、フラグメントへの切断、並びにトランスポゼース結合部位（黒色）及び各トランスポソームの各トランスポゾン上に位置する独自かつ相違するプライミング部位配列を含むトランスポゾンＤＮＡの付加又は挿入を表す模式図である。それら独自かつ相違するプライミング部位配列は、それぞれのトランスポソーム内に異なる模様で表されている。
【図３Ｂ】トランスポソームのゲノムＤＮＡへの結合、フラグメントへの切断、並びにトランスポゼース結合部位（黒色）及び当該トランスポソームを代表する独自かつ相違するプライミング部位配列を含むトランスポゾンＤＮＡの付加又は挿入を表す模式図である。すなわち、同じ、独自かつ相違するプライミング部位配列がトランスポソームの各トランスポゾン上に存在しており、これらは各トランスポソーム内に同じ模様で表されている。それぞれのトランスポソーム間で相違するプライミング部位配列は異なる模様で表されている。
【図４】ゲノムＤＮＡ、トランスポゼース結合部位、及び伸長産物の各末端上に存在する独自かつ相違するプライミング部位配列を含む核酸伸長産物を形成するための、トランスポゼースの除去及びギャップフィリングの模式図である。
【図５】図４のフラグメントのマルチプレックスＰＣＲ増幅を示す模式図である。
【図６】誤プライミングを介したデファクトマルチプレックス化方法を示す図である。
【図７】一ヌクレオチド変異（ＳＮＶ）の真陽性と偽陽性との間の区別を示す模式図である。
【図８】本明細書に記載されるマルチプレックス末端タギング増幅法における２本のＤＮＡ鎖（ワトソン鎖とクリック鎖）の別々の分析を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
ある実施形態又はある実施形態の特徴の実施は、特に断りがない限り、当技術分野における通常のスキルの範囲内である分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ等の従来技術を用いてもよい。そのような技術は文献中に充分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ、及びＭａｎｉａｔｉｓ著、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、第２版（１９８９年）、ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ（Ｍ．  Ｊ．  Ｇａｉｔ編、１９８４年）、ＡＮＩＭＡＬ  ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥ  （Ｒ．  Ｉ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７年）、ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社）、ＧＥＮＥ  ＴＲＡＮＳＦＥＲ  ＶＥＣＴＯＲＳ  ＦＯＲ  ＭＡＭＭＡＬＩＡＮ  ＣＥＬＬＳ（Ｊ．  Ｍ．  Ｍｉｌｌｅｒ及びＭ．  Ｐ．  Ｃａｌｏｓ編、１９８７年）、ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（Ｄ．  Ｍ．  Ｗｅｉｒ及びＣ．  Ｃ．  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編）、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．  Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｒ．  Ｂｒｅｎｔ、Ｒ．  Ｅ．  Ｋｉｎｇｓｔｏｎ、Ｄ．  Ｄ．  Ｍｏｏｒｅ、Ｊ．  Ｇ．  Ｓｉｅｄｍａｎ、Ｊ．  Ａ．  Ｓｍｉｔｈ、及びＫ．  Ｓｔｒｕｈｌ編、１９８７年）、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（Ｊ．  Ｅ．  Ｃｏｌｉｇａｎ、Ａ．  Ｍ．  Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ、Ｄ．  Ｈ．  Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｅ．  Ｍ．  Ｓｈｅｖａｃｈ、及びＷ．  Ｓｔｒｏｂｅｒ編、１９９１）、ＡＮＮＵＡＬ  ＲＥＶＩＥＷ  ＯＦ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、並びにＡＤＶＡＮＣＥＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹなどの雑誌中の研究論文を参照されたい。本明細書において言及される全ての特許、特許出願、及び刊行物（以上に記載されたもの、以下に記載されたものの両方）は、参照により本明細書に取り込まれる。
【００３２】
本明細書において使用される核酸化学、生化学、遺伝学、及び分子生物学の用語と記号は、当分野の標準的な学術論文と教科書、例えば、Ｋｏｒｎｂｅｒｇ及びＢａｋｅｒ著、ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、第２版（Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ社、ニューヨーク、１９９２年）、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版（Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ社、ニューヨーク、１９７５年）、Ｓｔｒａｃｈａｎ及びＲｅａｄ著、Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第２版（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ社、ニューヨーク、１９９９年）、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（オックスフォード大学出版局、ニューヨーク、１９９１年）、  Ｇａｉｔ編、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ社、オックスフォード、１９８４年）等におけるものに従う。
【００３３】
本発明は、部分的には、（ＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ等から）核酸フラグメントテンプレートを作製する方法の発見に基づいており、該方法は、トランスポゼース又はトランスポソームを使用して。（ゲノムＤＮＡなどの）元の核酸配列又は出発核酸配列をフラグメント化し、そして切断部位又はフラグメント化部位のそれぞれの末端に相違するプライミング部位配列を結合し、これによりフラグメントセットの各メンバーが２つの独自かつ相違するプライミング部位配列を有しているフラグメントセットを作製する。それらの核酸フラグメントテンプレートを増幅してアンプリコンを作製する。それらの核酸フラグメントテンプレートのアンプリコンを収集し、シークエンシングしてもよい。それらの収集されたアンプリコンは、ゲノムＤＮＡなどの元の核酸のフラグメントのアンプリコンのライブラリーを形成する。
【００３４】
１つの態様によると、溶解した単一細胞から得られるゲノム核酸などのゲノムＤＮＡを得る。ゲノムＤＮＡを二本鎖フラグメントに切断するために複数のトランスポソーム、又はトランスポソームのライブラリーを使用する。該複数のトランスポソームにおける、又は該ライブラリーにおける各トランスポソームは、トランスポゾンＤＮＡに結合したトランスポゼースのダイマーである。すなわち、各トランスポソームは、２つの別々のトランスポゾンＤＮＡを含む。トランスポソームにおける各トランスポゾンＤＮＡは、トランスポゼース結合部位とプライマー結合部位配列を含む。該プライマー結合部位配列は、当該トランスポソームに特有のものである。１つの態様によると、トランスポソームの各トランスポゾンのプライミング部位配列は、特有及び／又は相違するものとすることができる。１つの態様によると、１つのトランスポソームにおけるそれぞれのトランスポゾンのプライミング部位配列同士は同じものとしてもよい。１つの態様によると、トランスポソームの大部分が相違するプライミング部位配列を有する２つのトランスポゾンＤＮＡを有し、トランスポソームのわずかな部分のみが同じプライミング部位配列を有する２つのトランスポゾンＤＮＡを有する。１つの態様によると、各トランスポソームメンバーにおける２つのトランスポゾンＤＮＡのプライミング部位配列は同じであってもよいが、異なるトランスポソームメンバーからのトランスポゾンＤＮＡの１つ又は複数のプライミング部位配列は独自かつ相違する。
【００３５】
１つの態様によると、トランスポソームの各トランスポゾンＤＮＡのプライミング部位配列は独自かつ相違する。１つの態様によると、トランスポソームのトランスポゾンＤＮＡの１つ又は複数のプライミング部位配列は独自であり、前記複数のトランスポソーム又はトランスポソームの前記ライブラリーにおける残りのメンバーとは相違する。１つの態様によると、前記複数のトランスポソーム、又はトランスポソームの前記ライブラリーにおける各トランスポソームは、前記複数のトランスポソーム又はトランスポソームの前記ライブラリーにおける残りのメンバーと異なっている、前記トランスポソーム自身の独自かつ相違するプライミング部位配列を有しており、前記複数のトランスポソーム又はトランスポソームの前記ライブラリーにおける残りのメンバーと異なっている２つの独自かつ相違するプライミング部位配列を有していてもよい。トランスポゾンＤＮＡは、各切断部位又はフラグメント化部位において、各二本鎖フラグメントの上側の鎖と下側の鎖に結合する。プライミング部位配列が各トランスポゾンＤＮＡについて異なっていてよいため、切断部位又はフラグメント化部位には相違するプライミング部位配列がタグ付けされる。プライミング部位配列が各トランスポゾンＤＮＡについて同じであってもよいため、切断部位又はフラグメント化部位に同じプライミング部位配列がタグ付けされている。フラグメントを生成するために使用される隣り合うトランスポソーム同士について、それぞれのトランスポソームに付随するプライマー結合部位配列が相違する場合、フラグメントは、フラグメントのそれぞれの末端に相違するプライミング部位配列を有する。したがって、該フラグメントは２つの独自かつ相違するプライミング部位配列を有することになる。各トランスポソームは該トランスポソームに付随して該トランスポソーム自身の独自及び／又は相違するプライミング部位配列を有しており（また、該トランスポソームに付随して２つの独自及び／又は相違するプライミング部位配列を有していてもよい）、また、多数の切断部位又はフラグメント化部位を作製するためにトランスポソームライブラリーが使用されるため、各切断部位又はフラグメント化部位はその切断部位のいずれの末端にも、相違しかつ独自のプライミング部位配列が結合しており、各フラグメントは、フラグメントの各末端に相違する及び／又は独自のプライミング部位配列を有することとなる。したがって、前記ライブラリーのトランスポソームにより元の核酸配列に由来する多数のフラグメントが作製され、ここで各フラグメントはフラグメントの各末端に非類似のプライミング部位配列を有する。その後、それらの二本鎖フラグメントはギャップを埋めるように処理される。それらのフラグメントはＰＣＲ増幅用のプライマー配列、ＤＮＡポリメラーゼ、及びヌクレオチドなどの適切な増幅試薬を用いて増幅され、そして当業者に知られている方法を用いてシークエンシングされる。
【００３６】
本明細書に記載されるトランスポゼース法を用いて作製されたＤＮＡフラグメントテンプレートは当業者に知られている方法を用いてマイクロ液滴内で増幅することができる。マイクロ液滴は油相と水相との乳化物として形成してもよい。乳化物は連続的な油相内に水性液滴、又は隔離された水性体積を含んでいてもよい。エマルジョン全ゲノム増幅法は、単一細胞ゲノムの均一な増幅のために、油相中の小体積水性液滴を使用して各フラグメントを互いから隔離すると記載される。各フラグメントを該フラグメント自身の液滴又は隔離された水性反応体積に分配することにより、各液滴は、ＤＮＡ増幅の飽和に到達することができる。その後、各液滴内のアンプリコンが解乳化により合体し、それにより単一細胞の全ゲノムの全てのフラグメントの均一な増幅が得られる。
【００３７】
ある態様ではＰＣＲを用いて増幅が達成される。ＰＣＲは、上流プライマーと下流プライマーからなる一対のプライマー又は一組のプライマー及びＤＮＡポリメラーゼなどの重合触媒、典型的には熱安定性ポリメラーゼ酵素、を使用して、標的ポリヌクレオチドの複製コピーが作製される反応である。ＰＣＲの方法は当技術分野において周知であり、例えばＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら著（１９９１年）ＰＣＲ  １：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（オックスフォード大学出版局のＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）内に教示されている。Ｍｕｌｌｉｓ（米国特許第４６８３１９５号、第４６８３２０２号、及び第４９６５１８８号）の「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）という用語はクローニング又は精製を行わずに標的配列のセグメントの濃度を上昇させる方法を指す。標的配列を増幅させるためのこのプロセスには、所望の標的配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーと増幅試薬を提供すること、及びその後にポリメラーゼ（例えばＤＮＡポリメラーゼ）の存在下で熱サイクルを精緻な順序で行うことが含まれる。プライマーは、二本鎖標的配列におけるそれぞれの鎖（「プライマー結合配列」）に対して相補的である。増幅を達成するために、二本鎖標的配列は変性され、その後、プライマーがそれぞれ標的分子内の自身に相補的な配列にアニーリングする。アニーリング後、ポリメラーゼによってそれらのプライマーから鎖を伸長して、新しい相補鎖対を形成する。変性ステップ、プライマーアニーリングステップ、及びポリメラーゼ伸長ステップを多数回反復することができ（すなわち、変性、アニーリング、及び伸長が１回の「サイクル」を構成するとして、多数の「サイクル」が存在し得る）、所望の標的配列の増幅セグメントを高濃度で得ることができる。所望の標的配列の増幅セグメントの長さは、プライマー同士の互いに対する相対的な位置によって決定され、したがって、この長さは制御可能なパラメーターである。このプロセスの反復性の特徴から、この方法は「ポリメラーゼ連鎖反応」（以後、「ＰＣＲ」）と称され、前記標的配列は「ＰＣＲ増幅された」と称される。
【００３８】
ＰＣＲにより、いくつかの異なる方法（例えば、標識プローブを使用するハイブリダイゼーション、ビオチン化プライマーの取り込みとその後のアビジン−酵素複合体による検出、増幅フラグメントへの３２Ｐ標識されたｄＣＴＰ又はｄＡＴＰなどのデオキシヌクレオチド三リン酸の取り込み）により検出可能なレベルまで、ゲノムＤＮＡ内の特定の標的配列の単一コピーを増幅することが可能である。ゲノムＤＮＡに加え、任意のオリゴヌクレオチド配列又はポリヌクレオチド配列も適切なプライマー分子セットを使用して増幅可能である。とりわけ、各マイクロ液滴内においてＰＣＲプロセス自体で作製された増幅フラグメントは、それら自体が後続のＰＣＲ増幅に適した効率的なテンプレートである。ＰＣＲを実施するための方法とキットは当技術分野において周知である。ＰＣＲ又は遺伝子クローニングなど、ポリヌクレオチドの複製コピーを作製する全てのプロセスは、本明細書において、集合的に、複製と称される。プライマーは、サザンブロット分析又はノーザンブロット分析などのハイブリダイゼーション反応におけるプローブとして用いることもできる。
【００３９】
「増幅」又は「増幅する」という表現は特定のポリヌクレオチドの追加コピー又は複数コピーが形成される過程をいう。増幅にはＰＣＲ、ライゲーション増幅（又はライゲース連鎖反応、すなわちＬＣＲ）などの方法、及び他の増幅方法が含まれる。これらの方法は公知であり、当技術分野において広く実施されている。例えば、（ＰＣＲについては）米国特許第４６８３１９５号及び第４６８３２０２号、及びＩｎｎｉｓら著、「ＰＣＲ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  ａ  ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社（１９９０年）、並びに（ＬＣＲについては）Ｗｕら著（１９８９年）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ誌、第４巻：５６０〜５６９頁を参照されたい。一般的に、ＰＣＲ法は（ｉ）ＤＮＡ試料（又はライブラリー）内の特定の遺伝子に対するプライマーの配列特異的ハイブリダイゼーション、（ｉｉ）これに引き続く、複数ラウンドのアニーリング、伸長、及び変性を伴う、ＤＮＡポリメラーゼを使用する増幅、及び（ｉｉｉ）ＰＣＲ産物からの、正しいサイズのバンドの選抜、から構成される遺伝子増幅方法をいう。使用されるプライマーは重合を開始するために充分な長さと適切な配列を有するオリゴヌクレオチドである。すなわち、各プライマーは、増幅すべきゲノム座位の各鎖に対して相補的となるように特異的に設計されている。
【００４０】
増幅反応を実施するための試薬とハードウエアは市販されている。特定の遺伝子領域からの配列を増幅するのに有用なプライマーは、当該標的領域又はその隣接領域の配列に対して相補的であるか、又は該配列に特異的にハイブリダイズすることが好ましく、当業者に知られている方法を用いて調製可能である。増幅により生成された核酸配列を直接シークエンシングすることができる。
【００４１】
２本の一本鎖ポリヌクレオチドの間でハイブリダイゼーションがアンチパラレル配向で起こるとき、当該反応は「アニーリング」と称され、それらのポリヌクレオチドは「相補的」であると言われる。以下の場合に、二本鎖ポリヌクレオチドは別のポリヌクレオチドに対して相補的又は相同となりうる：条件とは、第１のポリヌクレオチドの鎖のうちの１本と第２のポリヌクレオチドの鎖のうちの１本との間でハイブリダイゼーションが起こり得ることである。相補性又は相同性（１つのポリヌクレオチドが別のポリヌクレオチドと相補的である程度）は、一般的に受け入れられている塩基対形成規則に従って、比較対象の鎖における互いに水素結合を形成すると予想される塩基の割合として定量可能である。
【００４２】
「ＰＣＲ産物」、「ＰＣＲフラグメント」、及び「増幅産物」という用語は変性、アニーリング、及び伸長からなるＰＣＲステップが２サイクル以上完了した後の生じた化合物の混合物を指す。これらの用語は１つ又は複数の標的配列の１つ又は複数のセグメントの増幅があった場合を包含する。
【００４３】
「増幅試薬」という用語はプライマー、核酸テンプレート、及び増幅酵素を除く増幅に必要な試薬（デオキシリボヌクレオチド三リン酸、バッファー等）を指しうる。典型的には、反応容器（試験管、マイクロウェル等）中に他の反応成分と共に増幅試薬を入れる。増幅方法には当業者に知られているＰＣＲ法が含まれ、それぞれ全体が参照により本明細書に取り込まれる以下の文献に記載のローリングサークル増幅（Ｂｌａｎｃｏら著、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．誌、第２６４巻、８９３５〜８９４０頁、１９８９年）、高分岐ローリングサークル増幅（Ｌｉｚａｒｄら著、Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ誌、第１９巻、２２５〜２３２頁、１９９８年）、及びループ介在等温増幅（Ｎｏｔｏｍｉら著、Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．誌、第２８巻、ｅ６３頁、２０００年）も含まれる。
【００４４】
エマルジョンＰＣＲのため、「油中水」混合物を激しく振盪又は撹拌して数百万のミクロンサイズの水性コンパートメントを生成することによりエマルジョンＰＣＲ反応液を作製する。油相及び水相を振盪又は撹拌することによりエマルジョンを作製するための装置をマイクロフルイディクスチップに取り付けてもよい。あるいは、ある油を水相と混合することにより、又は油相に水相を導入することにより自発的に水性液滴を形成させてもよい。増幅されるＤＮＡライブラリーは乳化の前に限界希釈した状態で混合される。コンパートメントサイズ（すなわちマイクロ液滴サイズ）、マイクロ液滴の量、増幅対象のＤＮＡフラグメントライブラリーの作製された限界希釈、の組み合わせを用いて、平均でたった１ＤＮＡ分子を含有するコンパートメントが生成される。マイクロ液滴形成ステップ又は乳化ステップの間に作製される水性コンパートメントのサイズに応じて、同一のチューブ内でマイクロリットル当たり最大で３×１０９種の個別のＰＣＲ反応を同時に実施することができる。本質的には、乳化物中の小さな水性コンパートメントであるマイクロ液滴のそれぞれが、マイクロＰＣＲリアクターを形成する。エマルジョン中のコンパートメントの平均サイズは、乳化条件に応じて、直径でサブミクロン〜１００ミクロン超の範囲、又は１ピコリットル〜１０００ピコリットルの範囲、又は１ナノリットル〜１０００ナノリットルの範囲、又は１ピコリットル〜１ナノリットルの範囲、又は１ピコリットル〜１０００ナノリットルの範囲である。
【００４５】
それぞれ参照により本明細書に取り込まれる英国特許出願第２２０２３２８号及びＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ８９／０１０２５に記載されるような他の増幅方法を本開示に従って用いてもよい。前者の出願では、ＰＣＲに類似する、テンプレート及び酵素に依存する合成に「修飾」プライマーが使用される。該プライマーは、キャプチャー部分（例えばビオチン）及び／又はディテクター部分（例えば酵素）による標識により修飾されうる。後者の出願では、試料に過剰量の標識プローブが付加される。標的配列の存在下で、該プローブが結合し、触媒作用的に切断される。切断後に、前記標的配列は無傷の状態で放出され、これに過剰なプローブが結合する。標識プローブの切断は、標的配列の存在のシグナルとなる。
【００４６】
他の適切な増幅方法には「ＲＡＣＥ」及び「片側ＰＣＲ」（それぞれ参照により本明細書に取り込まれるＦｒｏｈｍａｎ、「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９９０年）が含まれる。本開示に従ってＤＮＡを増幅するために、２つ（又はそれ以上）のオリゴヌクレオチドを、生じる「ジオリゴヌクレオチド」の配列を有する核酸の存在下で、ライゲーションし、それにより該ジオリゴヌクレオチドを増幅することに基づく方法を用いてよい（Ｗｕら著、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ誌、第４巻：５６０〜５６９頁、１９８９年；参照により本明細書に取り込まれる）。
【００４７】
ある態様によると、例示的なトランスポゾン系としては、Ｔｎ５トランスポゼース、Ｍｕトランスポゼース、Ｔｎ７トランスポゼース、又はＩＳ５トランスポゼース等が挙げられる。他の有用なトランスポゾン系が当業者に知られており、Ｔｎ３トランスポゾン系（Ｍａｅｋａｗａ，  Ｔ．，  Ｙａｎａｇｉｈａｒａ，  Ｋ．，及びＯｈｔｓｕｂｏ，  Ｅ．著、（１９９６年）、Ａ  ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  Ｔｎ３  ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ誌、第１巻、１００７〜１０１６頁参照）、Ｔｎ７トランスポゾン系（Ｃｒａｉｇ，  Ｎ．Ｌ．著、（１９９１年）、Ｔｎ７：  ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ．Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．誌、第５巻、２５６９〜２５７３頁参照）、Ｔｎ１０トランスポゾン系（Ｃｈａｌｍｅｒｓ，  Ｒ．，  Ｓｅｗｉｔｚ，  Ｓ．，  Ｌｉｐｋｏｗ，  Ｋ．，及びＣｒｅｌｌｉｎ，  Ｐ．著、（２０００年）、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｔｎ１０．Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ誌、第１８２巻、２９７０〜２９７２頁参照）、Ｐｉｇｇｙｂａｃトランスポゾン系（Ｌｉ，  Ｘ．，  Ｂｕｒｎｉｇｈｔ，  Ｅ．Ｒ．，  Ｃｏｏｎｅｙ，  Ａ．Ｌ．，  Ｍａｌａｎｉ，  Ｎ．，  Ｂｒａｄｙ，  Ｔ．，  Ｓａｎｄｅｒ，  Ｊ．Ｄ．，  Ｓｔａｂｅｒ，  Ｊ．，  Ｗｈｅｅｌａｎ，  Ｓ．Ｊ．，  Ｊｏｕｎｇ，  Ｊ．Ｋ．，  ＭｃＣｒａｙ，  Ｐ．Ｂ．，  Ｊｒ．ら著、（２０１３年）、ＰｉｇｇｙＢａｃ  ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ  ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ誌、第１１０巻、Ｅ２２７９〜２２８７頁参照）、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ｂｅａｕｔｙトランスポゾン系（Ｉｖｉｃｓ，  Ｚ．，  Ｈａｃｋｅｔｔ，  Ｐ．Ｂ．，  Ｐｌａｓｔｅｒｋ，  Ｒ．Ｈ．，及びＩｚｓｖａｋ，  Ｚ．著、（１９９７年）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ，  ａ  Ｔｃ１−ｌｉｋｅ  ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  ｆｒｏｍ  ｆｉｓｈ，  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ誌、第９１巻、５０１〜５１０頁参照）、Ｔｏｌ２トランスポゾン系（Ｋａｗａｋａｍｉ，  Ｋ．著、（２００７年）、Ｔｏｌ２：  ａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｖｅｃｔｏｒ  ｉｎ  ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｓ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．誌、第８巻、増刊第１号、Ｓ７頁参照）が挙げられる。
【００４８】
増幅対象のＤＮＡは、単一の細胞又は小さな細胞集団から得てもよい。本明細書に記載される方法により、任意の種又は生物からのＤＮＡを反応混合物中で増幅することができ、例えば単一の反応容器の中で行われる単一の反応混合物中で増幅することができる。１つの態様では、本明細書に記載される方法には、あらゆる起源からのＤＮＡを配列非依存的に増幅することが含まれ、前記ＤＮＡとしては、ヒトＤＮＡ、動物ＤＮＡ、植物ＤＮＡ、酵母ＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、真核生物ＤＮＡ、及び原核生物ＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４９】
１つの態様によると、単一細胞全ゲノム増幅、シークエンシング、及びアッセンブリーの方法が提供され、該方法は、それぞれトランスポゾンＤＮＡに結合しているＴｎ５トランスポゼースと単一の細胞からの二本鎖ゲノムＤＮＡを接触させることを含み、ここで、トランスポゾンＤＮＡは、二本鎖である１９ｂｐのトランスポゼース（Ｔｎｐ）結合部位と、独自かつ相違するプライミング部位配列を含む第１核酸配列とを含み、トランスポソームと称されるトランスポゼース／トランスポゾンＤＮＡ複合体ダイマーを形成する。第１核酸配列は、一本鎖伸長（ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）の形態であってもよい。１つの態様によると、第１核酸配列は５’オーバーハングなどのオーバーハングであってもよく、該オーバーハングは、独自かつ相違するプライミング部位配列を含む。前記オーバーハングは、所望により、他の機能性配列を含んでもよい。前記オーバーハングは、プライミング部位配列、又は所望により他の機能性配列を含むために適切な、任意の長さのオーバーハングであってもよい。前記トランスポソームは二本鎖ゲノムＤＮＡに沿って並んだ複数の標的位置に結合し、前記二本鎖ゲノムＤＮＡを複数の二本鎖フラグメントに切断し、各二本鎖フラグメントはＴｎｐ結合部位により上側の鎖に結合している第１複合体と、Ｔｎｐ結合部位により下側の鎖に結合している第２複合体を有する。各二本鎖フラグメントの５’末端には、トランスポゾン結合部位が結合しており、したがってプライマー結合部位と共にトランスポゾンＤＮＡが結合している。１つの態様によると、Ｔｎ５トランスポゼースは前記複合体から取り除かれる。前記二本鎖フラグメントをトランスポゾンＤＮＡに沿って伸長して、二本鎖伸長産物の各末端に非類似又は相違又は独自のプライミング部位配列を有する二本鎖伸長産物を生じる。１つの態様によると、Ｔｎ５トランスポゼース結合部位の前記二本鎖ゲノムＤＮＡフラグメントへの結合により生じうるギャップは、修復可能である。ギャップが修復された二本鎖伸長産物を増幅試薬と混合し、前記二本鎖ゲノムＤＮＡフラグメントを増幅する。各末端に非類似又は相違又は独自のプライミング部位配列（バーコード配列として機能し得る）を含むアンプリコンは、例えば、当業者に知られているハイスループットシークエンシング方法を用いてシークエンシングされる。
【００５０】
特定の態様では実施形態は特定の部位の表出を減少させない実質的に全ゲノムの増幅、シークエンシング、及びアッセンブリー（本明細書において「全ゲノム増幅」と規定する）のための方法に関する。特定の実施形態では、全ゲノム増幅は、ゲノムライブラリーの実質的に全てのフラグメント、又はゲノムライブラリーの全てのフラグメントの増幅を含む。さらなる特定の実施形態では、「実質的に全体の」又は「実質的に全ての」という表現はゲノム中の全ての配列の約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、又は約９９％を指す。
【００５１】
１つの態様によると、ＤＮＡ試料は、検査対象となる、ゲノムＤＮＡ、マイクロダイセクションされた染色体ＤＮＡ、酵母人工染色体（ＹＡＣ）ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、コスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、Ｐ１由来人工染色体（ＰＡＣ）ＤＮＡ、又は細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、クロロプラストＤＮＡ、法医学試料ＤＮＡ、又は他の天然起源若しくは人工起源のＤＮＡである。別の好ましい実施形態では、ＤＮＡ試料は、哺乳類ＤＮＡ、植物ＤＮＡ、酵母ＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、又は原核生物ＤＮＡである。さらに別の好ましい実施形態では、ＤＮＡ試料はヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、げっ歯類、鳥類、魚類、エビ、植物、酵母、ウイルス、又は細菌から得られたものである。ＤＮＡ試料はゲノムＤＮＡであることが好ましい。
【００５２】
ある例示的な態様によると、増幅、シークエンシング、及びアッセンブリーのための核酸フラグメントを所望に応じて作製するためにトランスポジションシステムを使用する。１つの態様によると、相違するプライミング部位配列を有するトランスポゾンＤＮＡが挿入された二本鎖ゲノムＤＮＡフラグメントへとゲノムＤＮＡをフラグメント化するためにトランスポジションシステムを使用する。図１に示されるように、トランスポゾンＤＮＡは、二本鎖であるトランスポゼース結合部位、及び独自かつ相違するプライミング部位配列Ｍを含む。二本鎖であるトランスポゼース結合部位は、プライミング部位配列を含む一本鎖オーバーハングに（共有結合等により）連結又は接続されている、１９ｂｐの二本鎖のＴｎ５トランスポゼース（Ｔｎｐ）結合部位であってもよく、前記連結又は接続は、例えば、前記オーバーハングの一末端におけるものである。前記トランスポゾンＤＮＡは、トランスポゼースを用いてフラグメントを形成しつつ、単一細胞のゲノムＤＮＡに挿入される。トランスポゼースの除去及びギャップフィリングの後に、フラグメントの各末端に非類似又は相違又は独自のプライミング部位配列を有する前記ゲノムＤＮＡフラグメントをＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド、及び増幅試薬と共にプライマーを使用して増幅し、単一細胞の全ゲノムをＰＣＲ増幅する。
【００５３】
ある態様によると、単一細胞からのＤＮＡなどの少量のＤＮＡを増幅するとき、単一細胞から得ることができる、増幅前の少量（約６ｐｇ）のゲノムＤＮＡを最大限に利用するために、ＤＮＡカラム精製ステップを実施しない。細胞溶解物又はその他の非純粋な状態から直接的にＤＮＡを増幅することができる。したがって、ＤＮＡ試料は非純粋、未精製、又は未単離であってよい。したがって、本方法の態様によれば、増幅のためのゲノムＤＮＡを最大化することができ、他の方法−すなわち非マルチプレックス方法−のように各末端上に同じプライミング部位配列を有するフラグメント群に起因する損失を低下させることができる。追加の態様によると、本明細書に記載される方法はＰＣＲ以外の増幅方法を利用してもよい。
【００５４】
１つの態様によると、図２に概説されているように、トランスポゼース（Ｔｎｐ、灰色の円）と、異なる模様のオーバーハング配列により表される独自かつ相違するプライミング部位配列をそれぞれ有するトランスポゾンＤＮＡとを混合して、複数のトランスポソームを形成する。各トランスポソームは２つの相違しかつ独自のプライミング部位配列を有する。各トランスポソームは、当該複数のトランスポソームの中の他のトランスポソームのそれぞれと比べて、２つの相違しかつ独自のプライミング部位配列を有する。
【００５５】
図３Ａに示されるように、トランスポソームライブラリー中のトランスポソームは、ダイマーとして、標的である単一細胞ゲノムＤＮＡを無作為に捕捉する、又はその他のやり方で単一細胞ゲノムＤＮＡに無作為に結合する。示されているトランスポソームは、１、２、３と番号付けされているが、トランスポソームメンバーの数は所望の用途に応じてより多くすることができる。相違する及び／又は独自のプライマー結合部位配列を有するトランスポゾンの代表的な数は５〜５０である。各トランスポソームには２つの独自及び／又は相違するプライミング部位配列が含まれている。例えば、トランスポソーム１が２つの独自及び／又は相違するプライミング部位配列を含み、トランスポソーム２が２つの独自及び／又は相違するプライミング部位配列を含み、トランスポソーム３が２つの独自及び／又は相違するプライミング部位配列を含む、等々である。独自及び／又は相違するプライミング部位配列は、トランスポソームの各トランスポゾンＤＮＡ中に存在する。トランスポソーム内のトランスポゼースは、１つのトランスポゼースが上側の鎖を切断し１つのトランスポゼースが下側の鎖を切断することでゲノムＤＮＡを切断して、ゲノムＤＮＡフラグメントを作製する。複数のトランスポソームにより複数のゲノムＤＮＡフラグメントが作製される。こうして、切断部位又はフラグメント化部位の各末端に、トランスポゾンＤＮＡダイマーからの１つのトランスポゾンＤＮＡが結合する。すなわち、トランスポソーム１からの１つのトランスポゾンＤＮＡが左手側の切断部位に結合し、トランスポソーム１からの他方のトランスポゾンＤＮＡが右手側の切断部位に結合する。トランスポソームライブラリーは核酸をフラグメントに切断するので、各フラグメントは、フラグメントの各末端に非類似のプライミング部位配列を有することになる。これは２つの例示的なフラグメントによって表わされ、ここでは、上側のフラグメントが一方の末端上に独自かつ相違するプライミング部位配列１を有し、他方の末端上に独自かつ相違するプライミング部位配列２を有している。同様に、下側のフラグメントは、一方の末端上に独自かつ相違するプライミング部位配列２を有し、他方の末端上に独自かつ相違するプライミング部位配列３を有している。示されるように、前記２つのフラグメントの間の切断部位はトランスポソーム２によって作られており、左手側切断部位（すなわち、図３Ａの上側のフラグメントの右側を見る）は独自かつ相違するプライミング部位配列２を有する１つのトランスポゾンを含み、右手側切断部位（すなわち、図３Ａの下側のフラグメントの左側を見る）は独自かつ相違するプライミング部位配列２を含む（ここで「２」は、トランスポソーム２を指している）。
【００５６】
図３Ｂに示されるように、トランスポソームライブラリー中のトランスポソームは、ダイマーとして、標的である単一細胞ゲノムＤＮＡを無作為に捕捉する、又はその他のやり方で単一細胞ゲノムＤＮＡに無作為に結合する。示されているトランスポソームは、１、２、３と番号付けされているが、トランスポソームメンバーの数は所望の用途に応じてより多くすることができる。相違する及び／又は独自のプライマー結合部位配列を有するトランスポゾンの代表的な数は５〜５０である。各トランスポソームには、同じ独自及び／又は相違するプライミング部位配列が、当該トランスポソームの各トランスポゾンのところで含まれている。例えば、トランスポソーム１は各トランスポゾンのところに同じプライマー結合部位配列を含み、トランスポソーム２は各トランスポゾンのところに同じプライマー結合部位配列を含み、トランスポソーム３は各トランスポゾンのところに同じプライマー結合部位配列を含む、等々である。しかしながら、各トランスポソームには独自かつ相違するプライマー結合部位が付随しており、それぞれのトランスポソームには、トランスポソームライブラリーの他のメンバーと比べて相違するプライマー結合部位が付随している。トランスポソーム内のトランスポゼースは、１つのトランスポゼースが上側の鎖を切断し、１つのトランスポゼースが下側の鎖を切断することでゲノムＤＮＡを切断して、ゲノムＤＮＡフラグメントを作製する。複数のトランスポソームにより複数のゲノムＤＮＡフラグメントが作製される。こうして、切断部位又はフラグメント化部位の各末端に、トランスポゾンＤＮＡダイマーからの１つのトランスポゾンＤＮＡが結合する。すなわち、トランスポソーム１からの１つのトランスポゾンＤＮＡが左手側の切断部位に結合し、トランスポソーム１からの他方のトランスポゾンＤＮＡが右手側の切断部位に接続する。トランスポソームライブラリーは核酸をフラグメントに切断し、また、核酸に結合しフラグメントを作製する隣り合うトランスポソームはそれぞれ相違するプライマー結合部位配列を有するので、各フラグメントはフラグメントの各末端に非類似のプライミング部位配列を有することになる。これは２つの例示的なフラグメントによって表わされ、ここでは、上側のフラグメントが一方の末端上に独自かつ相違するプライミング部位配列１を有し、他方の末端上に独自かつ相違するプライミング部位配列２を有している。同様に、下側のフラグメントは、一方の末端上に独自かつ相違するプライミング部位配列２（上側のフラグメントの右端上のものと同じプライマー結合部位配列である）を有し、他方の末端上に独自かつ相違するプライミング部位配列３を有している。示されるように、前記２つのフラグメントの間の切断部位はトランスポソーム２によって作られており、左手側切断部位（すなわち、図３Ｂの上側のフラグメントの右側）は独自かつ相違するプライミング部位配列２を有する１つのトランスポゾンを含み、右手側切断部位（すなわち、図３Ｂの下側のフラグメントの左側を見る）は独自かつ相違するプライミング部位配列２を含む（ここで「２」は、トランスポソーム２を指している）。したがって、トランスポソームが各トランスポゾン上に同じプライマー結合部位配列を有している場合であっても、前記方法により、フラグメントの各末端に相違するプライミング部位配列を有するフラグメントが生じる。
【００５７】
図４に例示されるように、ゲノムＤＮＡのフラグメント化は転移／挿入部位の両末端にギャップを残す。このギャップは任意の長さであってよいが、例示としては、９塩基のギャップである。結果としては、上側の鎖の５’位にトランスポゾンＤＮＡ  Ｔｎｐ結合部位が結合し、下側の鎖の５’位にトランスポゾンＤＮＡ  Ｔｎｐ結合部位が結合したゲノムＤＮＡフラグメントとなっている。トランスポゾンＤＮＡの結合又は挿入により生じたギャップが示されている。図４に示されているように、転移の後には、トランスポゼースが除去され、そして、ギャップを修復し、元々トランスポゾンＤＮＡ内に設計されている一本鎖オーバーハングの相補鎖を作製するために、ギャップ伸長が行われる。
【００５８】
図５にさらに示されているように、図４に示されているフラグメントをマルチプレックスＰＣＲ増幅の対象としてアンプリコンを作製する。
【００５９】
特定のＴｎ５トランスポジションシステムが報告されており、当業者にとって利用可能である。全ての目的のためにそれぞれ全体が参照により本明細書に取り込まれる、Ｇｏｒｙｓｈｉｎ，  Ｉ．Ｙ．及びＷ．Ｓ．  Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ著、Ｔｎ５  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ誌、１９９８年、第２７３巻（第１３号）：７３６７〜７４頁、Ｄａｖｉｅｓ，  Ｄ．Ｒ．ら著、Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｎ５  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ誌、２０００年、第２８９巻（第５４７６号）：７７〜８５頁、Ｇｏｒｙｓｈｉｎ，  Ｉ．Ｙ．ら著、Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌ  ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｌｅａｓｅｄ  Ｔｎ５  ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ誌、２０００年、第１８巻（第１号）：９７〜１００頁、及びＳｔｅｉｎｉｇｅｒ−Ｗｈｉｔｅ，  Ｍ．，  Ｉ．  Ｒａｙｍｅｎｔ，及びＷ．Ｓ．  Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ著、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  Ｔｎ５  ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ誌、２００４年、第１４巻（第１号）：５０〜７頁を参照されたい。ＤＮＡライブラリーの調製及び他の用途のための、Ｔｎ５トランスポジションシステムを利用するキットが知られている。全ての目的のためにそれぞれ全体が参照により本明細書に取り込まれる、Ａｄｅｙ，  Ａ．ら著、Ｒａｐｉｄ，  ｌｏｗ−ｉｎｐｕｔ，  ｌｏｗ−ｂｉａｓ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｈｏｔｇｕｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｂｙ  ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ．Ｇｅｎｏｍｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ誌、２０１０年、第１１巻（第１２号）：Ｒ１１９頁、Ｍａｒｉｎｅ，  Ｒ．ら著、Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｈｏｔｇｕｎ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｎａｎｏｇｒａｍ  ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ＤＮＡ．Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ誌、２０１１年、第７７巻（第２２号）：８０７１〜９頁、Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ，  Ｎ．Ｊ．ら著、Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈ−ｑｕａｌｉｔｙ  ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐｉｃｏｇｒａｍ  ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ＤＮＡ．Ｇｅｎｏｍｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ誌、２０１２年、第２２巻（第１号）：１２５〜３３頁、Ａｄｅｙ，  Ａ．及びＪ．  Ｓｈｅｎｄｕｒｅ著、Ｕｌｔｒａ−ｌｏｗ−ｉｎｐｕｔ，  ｔａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  ｗｈｏｌｅ−ｇｅｎｏｍｅ  ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．  Ｇｅｎｏｍｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．���０１２年、第２２巻（第６号）：１１３９〜４３頁、Ｐｉｃｅｌｌｉ，  Ｓ．ら著、Ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ＲＮＡ−ｓｅｑ  ｆｒｏｍ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｓｍａｒｔ−ｓｅｑ２．Ｎａｔｕｒｅ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ誌、２０１４年、第９巻（第１号）：１７１〜８１頁、及びＢｕｅｎｒｏｓｔｒｏ，  Ｊ．Ｄ．ら著、Ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｔｉｖｅ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｆｏｒ  ｆａｓｔ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｏｐｅｎ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ，  ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ誌、第２０１３年を参照されたい。それぞれ全体が参照により本明細書に取り込まれるＷＯ９８／１００７７、ＥＰ２５２７４３８、及びＥＰ２３７６５１７も参照されたい。市販のトランスポジションキットはＮＥＸＴＥＲＡの名称で販売されており、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社から入手可能である。
【００６０】
本明細書において使用される「ゲノム」という用語は、個体、細胞、又はオルガネラに担持される集合的な遺伝子セットとして定義される。本明細書において使用される「ゲノムＤＮＡ」という用語は、個体、細胞、又はオルガネラに担持される集合的な遺伝子セットの一部又は全体を含むＤＮＡ材料として定義される。
【００６１】
本明細書において、「ヌクレオシド」という用語は、リボース糖又はデオキシリボース糖に共有結合したプリン塩基又はピリミジン塩基を有する分子を指す。例示的なヌクレオシドとしては、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、及びチミジンが挙げられる。さらなる例示的なヌクレオシドとしては、イノシン、１−メチルイノシン、シュードウリジン、５，６−ジヒドロウリジン、リボチミジン、２Ｎ−メチルグアノシン、及び２，２Ｎ，Ｎ−ジメチルグアノシン（「希少」ヌクレオシドとも称される）が挙げられる。「ヌクレオチド」という用語は、糖部分にエステル結合で結合している１つ又は複数のリン酸基を有するヌクレオシドを指す。例示的なヌクレオチドとしては、ヌクレオシド一リン酸、ヌクレオシド二リン酸、及びヌクレオシド三リン酸が挙げられる。「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、及び「核酸分子」という用語は、本明細書において互換的に使用され、５’炭素原子と３’炭素原子との間のホスホジエステル結合により連結された任意の長さの、デオキシリボヌクレオチドでもリボヌクレオチドでもよいヌクレオチドのポリマーを指す。ポリヌクレオチドは任意の三次元構造をとることができ、既知又は未知の任意の機能を実行することができる。以下のものは、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子又は遺伝子フラグメント（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴ、又はＳＡＧＥタグ）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソーマルＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体などの修飾ヌクレオチドを含むことができる。前記用語は二本鎖分子と一本鎖分子の両方も指す。別の指定又は要求が無い限り、ポリヌクレオチドを含む本発明の実施形態はどれも、二本鎖形態、並びに二本鎖形態を構成することが既知又は予想されている２本の相補的一本鎖形態のうちの各々、を包含する。ポリヌクレオチドは４種類のヌクレオチド塩基の特定の配列から構成され、前記４種類のヌクレオチド塩基は、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）であり、ただしポリヌクレオチドがＲＮＡであるときにはチミンの代わりにウラシル（Ｕ）となる。したがって、ポリヌクレオチド配列という用語は、ポリヌクレオチド分子をアルファベットで表したものである。このアルファベット表記は、ＣＰＵを有するコンピューター内のデータベースに入力することができ、ファンクショナルゲノミクス及びホモロジーサーチなどのバイオインフォマティクス用途に使用することができる。
【００６２】
「ＤＮＡ」、「ＤＮＡ分子」、及び「デオキシリボ核酸分子」という用語はデオキシリボヌクレオチドのポリマーを指す。ＤＮＡは、自然により（例えば、ＤＮＡ複製により）合成することができる。ＲＮＡは、転写後修飾することができる。ＤＮＡは化学的に合成することもできる。ＤＮＡは一本鎖（すなわちｓｓＤＮＡ）又は多重鎖（例えば二本鎖、すなわちｄｓＤＮＡ）とすることができる。
【００６３】
「ヌクレオチド類似体」、「改変ヌクレオチド」、及び「修飾ヌクレオチド」という用語は非典型的ヌクレオチドを指し、これには非天然リボヌクレオチド又は非天然デオキシリボヌクレオチドなどがある。ある例示的な実施形態では、ヌクレオチド類似体は、ヌクレオチドの特定の化学的特性を変更しながらも、ヌクレオチド類似体の意図された機能を実行する能力を依然保持するように、いずれかの位置で変更を受けている。誘導体化され得るヌクレオチドの位置の例としては、５位、例えば５−（２−アミノ）プロピルウリジン、５−ブロモウリジン、５−プロピンウリジン、５−プロペニルウリジン等；６位、例えば６−（２−アミノ）プロピルウリジン等；アデノシン及び／又はグアノシンの８位、例えば８−ブロモグアノシン、８−クロログアノシン、８−フルオログアノシン等、が挙げられる。ヌクレオチド類似体としては、デアザヌクレオチド、例えば７−デアザ−アデノシン；Ｏ−修飾ヌクレオチド及びＮ−修飾ヌクレオチド（例えば、アルキル化ヌクレオチド、例えばＮ６−メチルアデノシン、又は当技術分野において知られたその他の修飾）；及びＨｅｒｄｅｗｉｊｎ著、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．誌、２０００年８月、第１０巻（第４号）：２９７〜３１０頁に記載されるものなど、その他の複素環修飾ヌクレオチド類似体、も挙げられる。
【００６４】
ヌクレオチド類似体はヌクレオチドの糖部分に修飾を含んでいてもよい。例えば、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、ＣＯＯＲ、又はＯＲから選択される基であって、Ｒが置換型又は非置換型のＣ１−Ｃ６アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール等である基によって２’ＯＨ基を置き換えてもよい。他の可能な修飾としては、米国特許第５８５８９８８号及び第６２９１４３８号に記載される修飾が挙げられる。
【００６５】
ヌクレオチドのリン酸基も変更してよく、例えばリン酸基の酸素のうちの１つ又は複数の酸素を硫黄で置換（例えば、ホスホロチオエート）するか、又は、ヌクレオチドの意図された機能をヌクレオチドが実行することを可能にするその他の置換を行うことでそのような変更をしてもよく、その例としては、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ著、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．誌、２０００年４月、第１０巻（第２号）：１１７〜２１頁、Ｒｕｓｃｋｏｗｓｋｉら著、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．誌、２０００年１０月、第１０巻（第５号）：３３３〜４５頁、Ｓｔｅｉｎ著、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．誌、２００１年１０月、第１１巻（第５号）：３１７〜２５頁、Ｖｏｒｏｂｊｅｖら著、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．誌、２００１年４月、第１１巻（第２号）：７７〜８５頁、及び米国特許第５６８４１４３号等に記載されたものが挙げられる。上で参照した修飾のうちいくつかのもの（例えば、リン酸基修飾）は、例えば、前記類似体を含むポリヌクレオチドのインビボ又はインビトロにおける加水分解の速度を低下させる。
【００６６】
「インビトロ」という用語は当技術分野で理解されている意味を有しており、例えば精製された試薬又は抽出物、例えば細胞抽出物に関係することを意味する。「インビボ」という用語も当技術分野で理解されている意味を有しており、例えば生細胞、例えば不死化細胞、初代細胞、細胞株、及び／又は生物体内の細胞に関係することを意味する。
【００６７】
本明細書において、「相補的」及び「相補性」という用語は、塩基対形成規則により関連付けられる複数のヌクレオチド配列を指すときに用いられる。例えば、５’−ＡＧＴ−３’という配列は５’−ＡＣＴ−３’という配列に対して相補的である。相補性は部分的又は全体的であり得る。部分的な相補性は、１つ又は複数の核酸塩基が塩基対形成規則によればマッチングしていないときに生じる。核酸同士の全体的な相補性又は完全相補性は、全ての核酸塩基がどれも、塩基対形成規則において別の塩基とマッチングしているときに生じる。核酸鎖間の相補性の程度は核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率と強度に対して著しい影響を有する。
【００６８】
「ハイブリダイゼーション」という用語は、相補的な核酸の対合を指す。ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション強度（すなわち、核酸同士の結合の強度）は核酸間の相補性の程度、関係する条件のストリンジェンシー、形成されるハイブリッドのＴｍ、及びそれらの核酸内のＧ：Ｃ比率などの因子に影響される。自身の構造内に相補的な核酸の対合を含む単一の分子は「自己ハイブリダイズ」していると称される。
【００６９】
「Ｔｍ」という用語は核酸の融点を指す。該融点は二本鎖核酸分子の集団が一本鎖へと半分解離する温度である。核酸のＴｍを計算するための式は当技術分野において周知である。標準的な参考文献に示されているように、Ｔｍ値の簡単な推定値は、核酸が１ＭのＮａＣｌ水溶液内に存在するときにはＴｍ＝８１．５＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）という式により計算することができる（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ内のＡｎｄｅｒｓｏｎ及びＹｏｕｎｇ著、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（１９８５年）を参照されたい）。他の参考文献には、Ｔｍの計算のために配列的特徴と共に構造的特徴をも考慮する、より洗練された計算法が含まれる。
【００７０】
「ストリンジェンシー」という用語は核酸のハイブリダイゼーションを実施する温度、イオン強度、及び有機溶媒などの他の化合物の存在という条件を指す。
【００７１】
核酸ハイブリダイゼーションに関連して使用されるとき、「低ストリンジェンシー条件」は、約５００ヌクレオチドの長さのプローブを使用する場合には、５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌのＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌのＮａＨ２ＰＯ４（Ｈ２Ｏ）、及び１．８５ｇ／ｌのＥＤＴＡ、ｐＨはＮａＯＨで７．４に調節）、０．１％ＳＤＳ、５×デンハルト試薬（５０×デンハルトは５００ｍｌ当たり５ｇのフィコール（タイプ４００；Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、５ｇのＢＳＡ（フラクションＶ；Ｓｉｇｍａ社）を含む）、及び１００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中において４２℃で結合又はハイブリダイゼーションさせ、その後、５×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳを含む溶液中において４２℃で洗浄すること、と同等の条件を含む。
【００７２】
核酸ハイブリダイゼーションに関連して使用されるとき、「中ストリンジェンシー条件」は、約５００ヌクレオチドの長さのプローブを使用する場合には、５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌのＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌのＮａＨ２ＰＯ４（Ｈ２Ｏ）、及び１．８５ｇ／ｌのＥＤＴＡ、ｐＨはＮａＯＨで７．４に調節）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト試薬、及び１００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中において４２℃で結合又はハイブリダイゼーションさせ、その後、１．０ｘＳＳＰＥ、１．０％ＳＤＳを含む溶液中において４２℃で洗浄すること、と同等の条件を含む。
【００７３】
核酸ハイブリダイゼーションに関連して使用されるとき、「高ストリンジェンシー条件」は、約５００ヌクレオチドの長さのプローブを使用する場合には、５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌのＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌのＮａＨ２ＰＯ４（Ｈ２Ｏ）、及び１．８５ｇ／ｌのＥＤＴＡ、ｐＨはＮａＯＨで７．４に調節）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト試薬、及び１００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中において４２℃で結合又はハイブリダイゼーションさせ、その後、０．１ｘＳＳＰＥ、１．０％ＳＤＳを含む溶液中において４２℃で洗浄すること、と同等の条件を含む。
【００７４】
ある例示的な実施形態では、細胞を特定し、その後で単一の細胞又は複数の細胞を単離する。本開示の範囲内の細胞には、ＤＮＡ含量の理解が有用であると当業者が考える任意の種類の細胞が含まれる。本開示に係る細胞には、あらゆる種類の癌細胞、肝細胞、卵母細胞、胚、幹細胞、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、神経細胞、赤血球、メラニン細胞、星状細胞、生殖細胞、オリゴデンドロサイト、腎細胞等が含まれる。１つの態様によると、本発明の方法は単一細胞からの細胞ＤＮＡを使用して実施される。複数の細胞には、約２〜約１，０００，０００細胞、約２〜約１０細胞、約２〜約１００細胞、約２〜約１，０００細胞、約２〜約１０，０００細胞、約２〜約１００，０００細胞、約２〜約１０細胞、又は約２〜約５細胞が含まれる。
【００７５】
本明細書に記載される方法によって処理される核酸はＤＮＡであってよく、核酸は、例えばヒト試料などの、任意の有用な起源から得られたものであってよい。特定の実施形態では、二本鎖ＤＮＡ分子は、ゲノム、例えばヒト由来の試料から得られたゲノム、を含むものとさらに規定される。試料はヒトからのあらゆる試料であってよく、例えば血液、血清、血漿、脳脊髄液、頬擦過物、乳頭吸引液、生検試料、精液（射精液と称すこともある）、尿、糞便、毛包、唾液、汗、免疫沈降された又は物理的に単離されたクロマチン等である。特定の実施形態では、試料は単一細胞を含む。特定の実施形態では、試料は単一細胞のみを含む。
【００７６】
特定の実施形態では、増幅され、収集された、試料由来の核酸分子は、診断情報又は予後情報を提供する。例えば、調製された、試料由来の核酸分子は、ゲノムコピー数及び／又はゲノム配列情報、アレル変異情報、癌の診断、出生前診断、父系情報、疾患診断、検出、モニタリング、及び／又は治療情報、配列情報等を提供しうる。
【００７７】
本明細書において、「単一細胞」は１つの細胞を指す。本明細書に記載される方法において有用な単一細胞は、関心のある組織から、又は生検試料、血液試料、若しくは細胞培養物から得ることができる。また、特定の器官、組織、腫瘍、新生物等からの細胞を、本明細書に記載される方法で取得及び使用することができる。さらに、一般的に言って、任意の集団の細胞を本方法に使用することができ、その例としては、細菌又は酵母などの、原核又は真核の単細胞生物の集団がある。当技術分野において知られている標準的な方法を用いて単一細胞懸濁液を得ることができ、その例としては、組織試料中の細胞を接続するタンパク質を消化するためにトリプシン又はパパインを酵素学的に使用する、又は培養物中の接着細胞を解離させる、又は試料中の細胞を機械的な分離させることが挙げられる。単一細胞を個々に処理することができる任意の適切な反応容器に単一細胞を配置することができる。例えば、単一のウェルにそれぞれの単一細胞が配置されるように、９６ウェルプレートの中に単一細胞を配置することができる。
【００７８】
単一細胞を操作するための方法が当技術分野において知られており、当該方法としては、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、フローサイトメトリー（Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ著、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ誌、第７６巻：１４５３〜５５頁、１９７９年）、マイクロマニュピレーション、及び半自動化細胞ピッキング装置（例えば、Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ社のＱｕｉｘｅｌｌ（商標）細胞トランスファーシステム）の使用が挙げられる。個々の細胞は、例えば、位置、形態、又はレポーター遺伝子の発現などの顕微鏡観察により検出可能な特徴に基づいて個別に選択することができる。また、濃度勾配遠心分離とフローサイトメトリーを組み合わせて、単離又は選別の効率を上げることもできる。
【００７９】
所望の細胞が特定されたところで、当業者に知られている方法を用いて該細胞を溶解し、ＤＮＡを含む細胞含有物を放出させる。その細胞含有物を容器又は収集用容積内に収容する。本発明のいくつかの態様では、細胞を溶解することにより細胞からゲノムＤＮＡなどの細胞含有物を放出させることができる。例えば細胞を加熱することにより、又は界面活性剤若しくは他の化学的方法を使用することにより、又はこれらを組み合わせることにより溶解を達成することができる。しかしながら、当技術分野において知られている任意の適切な溶解方法を用いることができる。例えば、Ｔｗｅｅｎ−２０の存在下で細胞を７２℃で２分間にわたって加熱することは、細胞を溶解するために充分である。あるいは、細胞を水中で１０分間、６５℃に加熱する（Ｅｓｕｍｉら著、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ誌、第６０巻（第４号）：４３９〜５１頁（２００８年））、又は０．５％のＮＰ−４０を補充したＰＣＲバッファーＩＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）の中で９０秒間、７０℃に加熱する（Ｋｕｒｉｍｏｔｏら著、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ誌、第３４巻（第５号）：ｅ４２頁（２００６年））ことができ、あるいは、細胞溶解は、プロテイナーゼＫなどのプロテアーゼを使用して、若しくはグアニジンイソチオシアネートなどのカオトロピック塩を使用することにより（米国特許出願公開第２００７／０２８１３１３号）達成することができる。反応ミックスを細胞溶解物に添加できるようにして、細胞溶解物に、直接、本明細書に記載される方法によるゲノムＤＮＡの増幅を実施することができる。あるいは、当業者に知られている方法を用いて細胞溶解物を２つ以上の体積に、例えば２つ以上の容器、チューブ、又は領域に分けることができ、それぞれの容積である容器、チューブ、又は領域の中に細胞溶解物の一部が含まれるようにすることができる。その後、各容器、チューブ、又は領域に含まれるゲノムＤＮＡは、本明細書に記載される方法又は当業者に知られている方法により増幅してもよい。
【００８０】
本発明において使用される核酸は天然又は非天然の塩基を含むこともできる。これに関し、天然デオキシリボ核酸はアデニン、チミン、シトシン、及びグアニンからなる群より選択される１つ又は複数の塩基を有することができ、リボ核酸はウラシル、アデニン、シトシン、又はグアニンからなる群より選択される１つ又は複数の塩基を有することができる。天然骨格を有しているか類似体構造を有しているかは置いておいて、核酸に含めることができる例示的な非天然塩基としては、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニン、５−メチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、２−アミノアデニン、６−メチルアデニン、６−メチルグアニン、２−プロピルグアニン、２−プロピルアデニン、２−チオウラシル、２−チオチミン、２−チオシトシン、１５−ハロウラシル、１５−ハロシトシン、５−プロピニルウラシル、５−プロピニルシトシン、６−アゾウラシル、６−アゾシトシン、６−アゾチミン、５−ウラシル、４‐チオウラシル、８−ハロアデニン又は８−ハログアニン、８−アミノアデニン又は８−アミノグアニン、８−チオールアデニン又は８−チオールグアニン、８−チオアルキルアデニン又は８−チオアルキルグアニン、８−ヒドロキシルアデニン又は８−ヒドロキシルグアニン、５−ハロ置換ウラシル又は５−ハロ置換シトシン、７‐メチルグアニン、７−メチルアデニン、８−アザグアニン、８−アザアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、３−デアザグアニン、３−デアザアデニン等が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態は、米国特許第５６８１７０２号に概括されているように、非特異的ハイブリダイゼーションを抑制するために核酸中にイソシトシン及びイソグアニンを利用することができる。
【００８１】
本明細書において、「プライマー」という用語は、一般的には、天然でも合成でもよいオリゴヌクレオチドであって、ポリヌクレオチドテンプレートと二重鎖を形成すると核酸合成の開始点として作用し（例えばシークエンシングプライマー）、伸長二重鎖が形成されるように自身の３’末端から前記テンプレートに沿って鎖伸長されることができるオリゴヌクレオチドを含む。その伸長過程の間に付加されるヌクレオチドの配列は、テンプレートポリヌクレオチドの配列によって決まる。通常、プライマーはＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。プライマーは通常３〜３６ヌクレオチドの範囲の長さを有し、また５〜２４ヌクレオチドの範囲の長さを有し、また１４〜３６ヌクレオチドの範囲の長さを有する。本発明の範囲内のプライマーには直交性（orthogonal）プライマー、増幅プライマー、構築プライマー（constructions primer）等が含まれる。プライマーペアは、目的の配列、又は目的の配列セットの両側に隣接し得る。プライマー及びプローブの配列は縮重又は疑似縮重していてよい。本発明の範囲内のプライマーは、標的配列に隣接して結合する。「プライマー」は、短ポリヌクレオチド、通常は遊離３’−ＯＨ基を有する短ポリヌクレオチドであって、関心のある試料中に存在する可能性がある標的又はテンプレートに当該標的とのハイブリダイゼーションにより結合し、その後、当該標的に対して相補的であるポリヌクレオチドの重合を促進する短ポリヌクレオチドと考えうる。本発明のプライマーは１７〜３０ヌクレオチドの範囲のヌクレオチドから構成される。１つの態様ではプライマーは少なくとも１７ヌクレオチド、あるいは少なくとも１８ヌクレオチド、あるいは少なくとも１９ヌクレオチド、あるいは少なくとも２０ヌクレオチド、あるいは少なくとも２１ヌクレオチド、あるいは少なくとも２２ヌクレオチド、あるいは少なくとも２３ヌクレオチド、あるいは少なくとも２４ヌクレオチド、あるいは少なくとも２５ヌクレオチド、あるいは少なくとも２６ヌクレオチド、あるいは少なくとも２７ヌクレオチド、あるいは少なくとも２８ヌクレオチド、あるいは少なくとも２９ヌクレオチド、あるいは少なくとも３０ヌクレオチド、あるいは少なくとも５０ヌクレオチド、あるいは少なくとも７５ヌクレオチド、あるいは少なくとも１００ヌクレオチドである。
【００８２】
「増幅」又は「増幅する」という表現は、特定のポリヌクレオチドの追加コピー又は複数コピーが形成されるプロセスをいう。
【００８３】
本明細書に記載される方法により増幅されたＤＮＡは、当業者に知られている方法を用いてシークエンシング及び解析してもよい。目的の核酸配列の配列決定は、当技術分野において知られている様々なシークエンシング方法を用いて行うことができ、以下の方法が挙げられるがこれらに限定されない：シークエンシング・バイ・ハイブリダイゼーション（ＳＢＨ）、シークエンシング・バイ・ライゲーション（ＳＢＬ）（Ｓｈｅｎｄｕｒｅら著（２００５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ誌、第３０９巻：１７２８頁）、定量的増分蛍光ヌクレオチド付加シークエンシング（ＱＩＦＮＡＳ）、段階的ライゲーション及び切断、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、分子ビーコン、ＴａｑＭａｎレポータープローブ消化、パイロシークエンシング、蛍光インサイチュシークエンシング（ＦＩＳＳＥＱ）、ＦＩＳＳＥＱビーズ（米国特許第７４２５４３１号）、ウォブルシークエンシング（ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ０５／２７６９５号）、マルチプレックスシークエンシング（２００８年２月６日に出願された米国特許出願第１２／０２７０３９号、Ｐｏｒｒｅｃａら著、（２００７年）Ｎａｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ誌、第４巻：９３１頁）、ポリメライズドコロニー（ＰＯＬＯＮＹ）シークエンシング（米国特許第６４３２３６０号、第６４８５９４４号、及び第６５１１８０３号、及びＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ０５／０６４２５）、ナノグリッドローリングサークルシークエンシング（ＲＯＬＯＮＹ）（２００８年５月１４日に出願された米国特許出願第１２／１２０５４１号）、アレル特異的オリゴライゲーションアッセイ（例えば、オリゴライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）、ライゲーションされた直鎖状プローブ及びローリングサークル増幅（ＲＣＡ）リードアウトを使用する単一テンプレート分子ＯＬＡ、ライゲーションされたパッドロックプローブ、及び／又はライゲーションされた環状パッドロックプローブ及びローリングサークル増幅（ＲＣＡ）リードアウトを使用する単一テンプレート分子ＯＬＡ）等。ハイスループットシークエンシング法、例えばＲｏｃｈｅ  ４５４プラットフォーム、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｓｏｌｅｘａプラットフォーム、ＡＢ−ＳＯＬｉＤプラットフォーム、Ｈｅｌｉｃｏｓプラットフォーム、Ｐｏｌｏｎａｔｏｒプラットフォーム等のようなプラットフォームを使用するハイスループットシークエンシング法を利用することもできる。様々な光学ベースのシークエンシング技術が当技術分野において知られている（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら著（１９９８年）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．誌、第８巻：７６９〜７６頁、Ｋｗｏｋ著、（２０００年）Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ誌、第１巻：９５〜１００頁、及びＳｈｉ著、（２００１年）Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．誌、第４７巻：１６４〜１７２頁）。
【００８４】
増幅されたＤＮＡは任意の適切な方法によりシークエンシングすることができる。特に、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＳＯＬｉＤシークエンシング技術又はＩｌｌｕｍｉｎａ社のＧｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒなどのハイスループットスクリーニング法を用いて増幅済みＤＮＡをシークエンシングすることができる。本発明の１つの態様では、増幅されたＤＮＡをショットガンシークエンシングすることができる。リードの数は少なくとも１０，０００、少なくとも１００万、少なくとも１０００万、少なくとも１億、少なくとも１０億とすることができる。別の態様ではリードの数は１０，０００〜１００，０００、又はあるいは１００，０００〜１００万、又はあるいは１００万〜１０００万、又はあるいは１０００万〜１億、又はあるいは１億〜１０億とすることができる。「リード」はシークエンシング反応により得られる、ある長さの連続的な核酸配列である。
【００８５】
「ショットガンシークエンシング」は、非常に大量のＤＮＡ（全ゲノムなど）をシークエンシングするために使用される方法を指す。この方法では、最初に、シークエンシング対象のＤＮＡを、個別にシークエンシングすることが可能な比較的に小さいフラグメントに細断する。その後、これらのフラグメントの配列をそれらの重複する配列に基づいて元の順序に再構成することにより完全な配列を得る。そのＤＮＡの「細断」は制限酵素消化又は機械的剪断などの、多種多様な技術を用いて実行され得る。重複する配列の整列は、典型的には、適切にプログラムされたコンピューターにより行われる。ｃＤＮＡライブラリーをショットガンシークエンシングする方法とプログラムは当技術分野において周知である。
【００８６】
前記増幅方法とシークエンシング方法は、診断アッセイ、予後アッセイ、薬理ゲノミクス、及び治験モニタリングを予後判定（予測）目的のために用いることにより個体を予防処置する予測医学の分野で有用である。したがって、本発明の１つの態様は、個体が、障害及び／又は疾患を発症するリスクにあるがどうか判定するために、ゲノムＤＮＡを決定する診断アッセイに関する。そのようなアッセイを予防目的又は予測目的に使用することにより、障害及び／又は疾患の発症の前に個体を予防処置することができる。したがって、ある例示的な実施形態では、本明細書に記載される発現プロファイリング法のうちの１つ又は複数の方法を用いて１種類又は複数種類の疾患及び／又は障害を診断及び／又は予後判定する方法が提供される。
【００８７】
本明細書において、「生体試料」という用語は、対象から分離された組織、細胞、体液、及びそれらの単離物、並びに、対象の内部に存在する組織、細胞、及び体液を含むが、これらに限定されないものとする。
【００８８】
ある実施形態では、本明細書に記載される１つ又は複数のゲノムＤＮＡ配列を含む電子装置可読性媒体が提供される。本明細書において、「電子装置可読性媒体」とは、電子装置が、直接、読み込み及びアクセスすることができるデータ又は情報を保存、保持、又は格納するための任意の適切な媒体を指す。そのような媒体には、フロッピーディスク、ハードディスク記憶媒体、及び磁気テープなどの磁気記憶媒体；コンパクトディスクなどの光学記憶媒体；ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、及びＥＥＰＲＯＭ等の電子記憶媒体；一般的ハードディスク、並びに磁気／光学記憶媒体などのこれらカテゴリーのハイブリッド、が含まれ得るが、これらに限定されない。前記媒体は、本明細書に記載される１つ又は複数の発現プロファイルが媒体上に記録されるように適合又は構成されている。
【００８９】
本明細書において、「電子装置」という用語は、データ又は情報を記憶するように構成又は適合されている、任意の適切な演算若しくは処理装置又はその他の装置、を含むものとする。本発明と共に使用するのに適切な電子装置の例には、スタンドアロン演算装置；ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、ワイドエリアネットワーク（ＷＡＮ）インターネット、イントラネット、及びエクストラネットなどのネットワーク；パーソナルデジタルアシスタント（ＰＤＡ）、携帯電話、ページャー等の電子機器；並びにローカル処理システム及び分散型処理システムが挙げられる。
【００９０】
本明細書において、「記憶」とは、電子装置可読性媒体上に情報を保存又はコードする処理を指す。当業者は、容易に、公知の媒体に情報を記録するための現在公知の方法のうちの任意の方法を採用して、本明細書に記載される１つ又は複数の発現プロファイルを含む製品を作製することができる。
【００９１】
様々なソフトウェアプログラム及びフォーマットを使用して、本発明のゲノムＤＮＡ情報を電子装置可読性媒体上に保存することができる。例えば、核酸配列をＷｏｒｄＰｅｒｆｅｃｔ及びＭｉｃｒｏＳｏｆｔ  Ｗｏｒｄなどの市販のソフトウェアのフォーマットとした文書処理テキストファイルの中に表すことが可能であり、又はデータベースアプリケーション、例えばＤＢ２、Ｓｙｂａｓｅ、Ｏｒａｃｌｅなどのデータベースアプリケーションに保存されるＡＳＣＩＩファイルの形式で表すことができ、また、他の形式で表すこともできる。本明細書に記載される１つ又は複数の発現プロファイルを記憶させた媒体を得る又は作成するために、任意の数のデータプロセッサー構造化フォーマット（例えば、テキストファイル又はデータベース）を用いてよい。
【００９２】
これまでに説明してきた本発明の実施形態は本発明の原理の応用のうちのいくつかを単に例示したものであることを理解されたい。当業者は、本明細書においてなされた教示に基づいて、本発明の真髄と範囲から逸脱することなく多数の改変を行うことができる。本出願を通して引用された全ての参考文献、特許、及び特許出願公開の内容は、その全体が、全ての目的のために参照により本明細書に取り込まれる。
【００９３】
以下の実施例は本発明の代表例として記載される。本願明細書、図面、及び添付の特許請求の範囲を考慮すれば、これらの実施形態及び他の同等の実施形態は明らかなものとなるため、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものと解釈されてはならない。
【実施例】
【００９４】
実施例Ｉ
全般的なプロトコル
以下の全般的なプロトコルは全ゲノム増幅に有用である。単一細胞を溶解バッファー中で溶解する。本明細書に記載の、相違しかつ独自のプライマー結合部位配列（又はそれぞれ２つの相違しかつ独自のプライマー結合部位配列）をそれぞれ有する複数のトランスポソームを含むトランスポソームライブラリー、及びトランスポジションバッファーを細胞溶解物に添加し、それをよく混合し、５５℃で１０分間にわたってインキュベートする。トランスポジション後に１ｍｇ／ｍｌのプロテアーゼを添加して、単一細胞のゲノムＤＮＡに結合したトランスポゼースを除去する。Ｑ５  ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、ＰＣＲ反応バッファー、及びプライマーを反応混合物に添加し、それを７２℃に１０分間加熱して、トランスポゾン挿入により生成したギャップを修復する。５〜２５サイクルのＰＣＲ反応を実施して、単一細胞のゲノムＤＮＡを増幅する。増幅産物を、ハイスループットディープシークエンシング等によるさらなる分析のために精製する。
【００９５】
実施例ＩＩ
細胞溶解
以下のように、レーザーダイセクション顕微鏡（ＬＭＤ−６５００、Ｌｅｉｃａ社）を使用して細胞を選択し、培養皿から切り出し、そして入れる。細胞をメンブレン被覆培養皿に播種し、１０×の対物レンズ（Ｌｅｉｃａ社）を使用する明視野顕微鏡観察を用いて観察する。そして、ＵＶレーザーを使用して個々に選択した細胞の周りの膜を切断し、細胞がＰＣＲチューブのキャップの中に入るようする。このチューブを軽く遠心分離にかけて、前記細胞をチューブの底に落とす。このＰＣＲチューブの側面に３〜５μｌの溶解バッファー（３０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ＰＨ７．８、２ｍＭのＥＤＴＡ、２０ｍＭのＫＣｌ、０．２％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５００μｇ／ｍｌのＱｉａｇｅｎプロテアーゼ）を添加し、スピンダウンする。次に、この捕捉した細胞を、ＰＣＲ機器により５０℃３時間、７５℃３０分間という温度スケジュールを用いて、熱により溶解させる。あるいは、ＥＤＴＡと１０〜５０００μｇ／ｍＬの濃度のＱＩＡＧＥＮプロテアーゼ（ＱＩＡＧＥＮ社）などのプロテアーゼを含む低塩濃度溶解バッファーの中に、単一細胞をマウスピペットにより入れる。インキュベーション条件は、使用するプロテアーゼにより変える。ＱＩＡＧＥＮプロテアーゼの場合は、インキュベーションは、３７〜５５℃で１〜４時間となる。それから、プロテアーゼを８０℃まで加熱して不活化処理し、さらに、フッ化４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニル塩酸塩（ＡＥＢＳＦ）又はフッ化フェニルメタンスルホニル（ＰＭＳＦ）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）などの特定のプロテアーゼ阻害剤により不活化する。得られた細胞溶解物は、−８０℃で保存する。
【００９６】
実施例ＩＩＩ
トランスポジション
１〜１００ｍＭのＭｇ２＋を含み、所望により１〜１００ｍＭのＭｎ２＋又はＣｏ２＋又はＣａ２＋を加えて含むバッファー系の中に、単一細胞の溶解物とトランスポソームライブラリーを混合し、３７〜５５℃で５〜２４０分間インキュベートする。その反応体積は、細胞溶解物の体積に応じて変える。反応に加えられるトランスポソームライブラリーの量は、所望のフラグメント化サイズに応じて容易に調整可能である。ＥＤＴＡを使用し、所望によりＥＧＴＡ又はその他のイオン用キレート剤を使用して、Ｍｇ２＋をキレート化することにより、転移反応を停止する。所望により、前記混合物に、短い二本鎖ＤＮＡを校正用核酸（ｓｐｉｋｅ−ｉｎ）として添加することが可能である。残留トランスポソームは３７〜５５℃で１０〜６０分間、１〜５００μｇ／ｍＬの終濃度でプロテアーゼ消化（例えばＱＩＡＧＥＮプロテアーゼ）することにより不活化される。その後、前記プロテアーゼを、熱及び／又はプロテアーゼ阻害剤（例えばＡＥＢＳＦ）により不活化する。
【００９７】
実施例ＩＶ
ギャップフィリング
転移及びトランスポゼースの除去の後に、Ｍｇ２＋、ｄＮＴＰミックス、プライマー、及び熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｄｅｅｐｖｅｎｔ  ｅｘｏ−ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社））を含むＰＣＲ反応混合物を前記溶液に適切な温度で適切な時間にわたって加え、転移反応により残された９ｂｐギャップを埋める。ギャップフィリングのインキュベーション温度とインキュベーション時間は、使用する特定のＤＮＡポリメラーゼに依存する。反応後に、所望により、加熱及び／又はプロテアーゼ処理（例えば、ＱＩＡＧＥＮプロテアーゼ）により前記ＤＮＡポリメラーゼを不活化する。プロテアーゼを使用した場合は、その後、プロテアーゼを熱及び／又はプロテアーゼ阻害剤により不活化する。
【００９８】
実施例Ｖ
ＤＮＡフラグメントの増幅
１つの態様によれば、当業者に知られている一般的な方法を用いてＤＮＡフラグメントを増幅する。プライマー結合部位を有するＤＮＡフラグメントを含む上記実施例で得られたギャップフィリングされた二本鎖産物を、水性媒体中のＰＣＲ反応試薬に添加する。そして、その水性媒体をＰＣＲ条件に供し、各ＤＮＡフラグメントをＰＣＲ増幅する。
【００９９】
実施例ＶＩ
ＤＮＡフラグメントアンプリコンのシークエンシング
１つの態様によれば、当業者に知られている方法を用いて前記フラグメントをシークエンシングし、コンピューター可読メモリーにそれらの配列を保存する。そして、当業者に知られている方法（ソフトウェア方法など）を用いて配列を比較し、ゲノム配列へとアセンブルすることができる。
【０１００】
実施例ＶＩＩ
２０種類の相違するトランスポゾンＤＮＡを含むトランスポソームライブラリーを用いる単一ＢＪ細胞の全ゲノム増幅
前記トランスポゾン配列の構成は、図１に示されているように、二本鎖であるＴｎ５トランスポゼース結合部位（Ｔ）と、マルチプレックスプライミング部位（Ｍ）として機能する一本鎖５’オーバーハングとを含む。それぞれの種類のトランスポゾン配列は、同じＴ領域を有するが、Ｍ領域が相違する。２０種類のトランスポゾン配列からなるトランスポゾン混合物のプールを作製するために、それぞれの種類のトランスポゾン配列を等モルで、ｐＨ＝８の１０ｍＭＴｒｉｓ、５０ｍＭのＮａＣｌ、及び１ｍＭのＥＤＴＡを含むバッファーの中で混合する。トランスポソーム複合体へとアセンブルするために、前記２０種類のトランスポゾンプールを、Ｔｎ５トランスポゼースと等モル比率で混合し、室温で３０分間にわたってインキュベートする（図２）。
【０１０１】
単一ＢＪ細胞をＦＡＣＳで選別して、ｐＨ＝８の２０ｍＭＴｒｉｓ、２０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ１００、１５ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＥＤＴＡ、及び１ｍｇ／ｍｌのＱｉａｇｅｎプロテアーゼを含む３μｌの溶解バッファーに加える。そして、それらの細胞を５０℃で３時間にわたってインキュベートし、次に７０℃で３０分間にわたってインキュベートする。次に、得られた細胞溶解物に１００ｎＭのトランスポソームを添加し、マグネシウムの終濃度を５ｍＭにして転移反応混合物を５５℃で１０分間にわたってインキュベートする。トランスポゼースを除去した後に、ゲノムＤＮＡは数百万の小ＤＮＡフラグメントへと切断され、ここで各フラグメントの各末端には２０種類のトランスポゾン配列のうちの１つがタグ付けされている（図３Ａ）。このように、トランスポソームライブラリーは、本明細書に記載の相違する及び／又は独自のプライマー結合部位配列を２０種類含んでもよく、また、トランスポソームライブラリーのメンバーは数百万のメンバー数に近づきうる。ＤＮＡフラグメントの両末端に同じトランスポゾン配列がタグ付けされる確率は、１／２０＝５％である。次に、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１×ＮＥＢ  Ｑ５反応バッファー、各１２５ｎＭの２０種類のプライマー、及び０．０２Ｕ／μＬのＱ５  ＤＮＡポリメラーゼを含むＤＮＡポリメラーゼ反応混合物を添加し、７２℃で３分間インキュベートして、転移により残されたギャップを埋める（図４）。そして、図５に示されているように、９８℃で３０秒、６５℃で１分間、７２℃で２分間というサイクルのＰＣＲ反応を１５サイクル実施して、標的ゲノムＤＮＡを増幅する。そして、増幅産物をＺｙｍｏ  ＤＮＡ精製カラムにより精製する。
【０１０２】
しかしながら、Ｍ部位の数Ｎと配列には制限がある。マルチプレックスＰＣＲの場合のように、プライマー間のランダムアニーリングが起こる可能性があり、プライマー配列の数（Ｎ）が増えると、また、プライマー濃度が上昇すると、その可能性は上昇する。したがって、Ｎ種類のＭ部位に特異的なプライマー同士がプライマーダイマーを形成しないように、Ｍについては直交性（orthogonal）配列を選択する必要がある。
【０１０３】
当業者はマルチプレックスＰＣＲの研究から直交性（orthogonal）プライマー配列を（したがって、Ｍ部位の配列を）容易に見つけ出すことができるが、２０種類のトランスポゾン配列それぞれの転移の可能性ができるだけ等しいことを確認する必要がある。例えば、トランスポゾン配列Ａが標的ＤＮＡに挿入される可能性が、他の全ての配列の挿入可能性よりも約４０倍高い場合、ＤＮＡフラグメントの両末端にＡ−Ａを有する確率は、Ｎ＝２０について、約（４０／（４０＋Ｎ−１））２＝４６％になる。これにより、４６％という損失率になることが予期され、５０％の損失率を避けるという元々の意図にほぼ背いている。一様な挿入性向を有する直交性（orthogonal）を達成するために、当業者は、トランスポゾンと共に使用される直交性（orthogonal）プライマー結合部位配列を設計することができる。例えば、以下の２０種類のトランスポゾンプライマー結合部位配列は、直交性（orthogonal）を満たしている。当業者は、このようなプライミング部位配列セットを他にも数多く設計することができ、以下の２０種類のトランスポゾンプライミング部位配列は、どのような意味においても限定を意図したものではないことを理解されたい。配列を以下に示す（５’から３’へ）。
トランスポゾンＡ：ＡＧＡＡＧＣＣＧＴＧＴＧＣＣＧＧＴＣＴＡ（配列番号１）、
トランスポゾンＢ：ＡＴＣＧＴＧＣＧＧＡＣＧＡＧＡＣＡＧＣＡ（配列番号２）、
トランスポゾンＣ：ＡＡＴＣＣＴＡＧＣＡＣＣＧＧＴＴＣＧＣＣ（配列番号３）、
トランスポゾンＤ：ＡＣＧＴＧＴＴＧＣＡＧＧＴＧＣＡＣＴＣＧ（配列番号４）、
トランスポゾンＥ：ＡＣＡＣＣＡＣＡＣＧＧＣＣＴＡＧＡＧＴＣ（配列番号５）、
トランスポゾンＦ：ＴＧＧＡＣＡＡＴＣＡＣＧＣＧＡＣＣＡＧＣ（配列番号６）、
トランスポゾンＧ：ＴＣＡＴＣＴＡＡＣＧＣＧＣＡＣＣＧＴＧＣ（配列番号７）、
トランスポゾンＨ：ＴＴＣＧＴＣＧＧＣＴＣＴＣＴＣＧＡＡＣＣ（配列番号８）、
トランスポゾンＩ：ＴＧＧＴＧＧＡＧＣＧＴＧＣＡＧＡＣＴＣＴ（配列番号９）、
トランスポゾンＪ：ＴＡＴＣＴＴＣＣＴＧＣＧＣＡＧＣＧＧＡＣ（配列番号１０）、
トランスポゾンＫ：ＣＴＧＡＣＧＴＧＴＧＡＧＧＣＧＣＴＡＧＡ（配列番号１１）、
トランスポゾンＬ：ＣＣＡＴＣＡＴＣＣＡＡＣＣＧＧＣＴＴＣＧ（配列番号１２）、
トランスポゾンＭ：ＣＡＣＧＡＧＡＡＧＣＣＧＴＣＣＧＣＴＴＡ（配列番号１３）、
トランスポゾンＮ：ＣＧＴＡＣＧＴＧＣＡＡＣＡＣＴＣＣＧＣＴ（配列番号１４）、
トランスポゾンＯ：ＣＴＴＧＧＴＣＡＧＧＣＧＡＧＡＡＧＣＡＣ（配列番号１５）、
トランスポゾンＰ：ＧＧＣＧＴＧＡＴＣＡＧＴＧＣＧＴＧＧＡＴ（配列番号１６）、
トランスポゾンＱ：ＧＡＧＣＧＴＴＴＧＧＴＧＡＣＣＧＣＣＡＴ（配列番号１７）、
トランスポゾンＲ：ＧＣＣＴＧＣＧＧＴＣＣＡＴＴＧＡＣＣＴＡ（配列番号１８）、
トランスポゾンＳ：ＧＴＡＡＧＣＣＡＣＴＣＣＡＧＣＧＴＣＡＣ（配列番号１９）、
トランスポゾンＴ：ＧＡＴＣＴＧＴＴＧＣＧＣＧＴＣＴＧＧＴＧ（配列番号２０）。
【０１０４】
マルチプレックス末端タギング及び増幅用のトランスポゾン配列の上記組合せを使用して、単一細胞ＤＮＡを次世代シークエンシング用のシークエンシングライブラリーへと調製することができる。単一ＢＪ細胞６個をＩｌｌｕｍｉｎａシークエンシングプラットフォーム上でシャローシークエンシング（細胞当たり８．３Ｇｂの平均データ量を使用）することにより、５６％の平均全ゲノムカバレッジが達成された（表１）。単一ＢＪ細胞４個をディープシークエンシング（１細胞当たりＨｉＳｅｑ４０００レーン１つ）することにより、７９％の平均カバレッジが達成された。ＳＮＶの検出はこれらの細胞では非常に正確であり、偽陰性率は７０％であり、偽陽性率は８×１０−７／ｂｐである。下の表１は、単一細胞をマルチプレックス末端タギング増幅（ＭＥＴＡ）により増幅したものの、シャローシークエンシング後の全ゲノムカバレッジを示している。
【０１０５】
【表１】
2020522243.tif 000003
【０１０６】
実施例ＶＩＩＩ
事実上のマルチプレックス化のためのミスプライミング方法
トランスポゾン配列の組合せを注意深く選択してもなお、異なる配列のトランスポゾンの間に系統的な挿入の偏りが存在することは珍しいことではない。例えば、実施例ＶＩＩの２０種類の配列の組合せについては、ある特定の単一細胞のデータに偏りが見られ、最も多い配列と最も少ない配列の頻度は最大で１０倍異なる場合があり、その結果、損失率は既に５０％未満ではあるものの、理論的に予測される１／２０よりは高い値となる。
【０１０７】
事実上のマルチプレックス化を達成するための「誤プライミング」についての方法が提供される。図６に示されるように、両末端に同じ配列がタグ付けされたＤＮＡフラグメントに対しては、融解後に、異なる配列を有するプライマーが結合する可能性があり、それにより伸長後に両末端に相違する配列を有する新しいフラグメントが生じる。完全に特異的なプライマーのアニーリング（「適正プライミング」）は部分的に特異的なプライマーのアニーリングよりも好ましいので、部分的に特異的なプライマーのアニーリング（「誤プライミング」）は典型的には可能性が低い（したがって、従来の方法では５０％の損失）。しかしながら、各Ｍ部位がＴ部位に比べて短くなるように設計されると、好ましいことに誤プライミングは適正プライミング並びに自己ループ形成と競合し得る。Ｎが２よりも大きい場合、（各プライマーが同じ濃度で反応混合物に加えられると仮定すれば）完全に特異的なプライマーよりも、部分的に特異的なプライマーの方が多く存在することになり、そのことは誤プライミングの可能性を増加させ、事実上のマルチプレックス化を達成することに役立つ。
【０１０８】
また、Ｍ部位がＴに比べて相対的に短くなるようにＴ部位にユニバーサル配列を加えることができる。Ｍ部位がＴに比べて相対的に短いことは、誤プライミングを助ける。誤プライミングの速度論上の有利さをさらに増加させるため、（例えば、濃度がより低いトランスポソーム混合物を加えることにより）挿入長を増加させることもでき、それによりフラグメントへ平均的により長くなり、自己ループ形成が誤プライミングと競合する可能性が減少する。
【０１０９】
したがって、当業者はプライマーの濃度、Ｍ部位の長さ、ユニバーサルＴ部位の長さ、及び挿入長を調整することにより、事実上のマルチプレックス化のために誤プライミングと適正プライミングとの間のバランスに到達することができ、それによりＤＮＡの損失を最小限にすることができる。
【０１１０】
実施例ＩＸ
シークエンシング及び挿入部位のアラインメントによる変異体検出のための、増幅アーティファクトのフィルタリングによる除去
核酸のマルチプレックス末端タギング増幅は偽陰性を最小限にすることに加え、遺伝的変異の偽陽性検出を最小限にするという利点も提供する。近年、Ｃｈｅｎら及びＤｏｎｇらにより偽陽性検出が減ってきたが、数百又は数千のＳＮＶが残っている（Ｃｈｅｎ，  Ｃ．，  Ｘｉｎｇ，  Ｄ．，  Ｔａｎ，  Ｌ．，  Ｌｉ，  Ｈ．，  Ｚｈｏｕ，  Ｇ．，  Ｈｕａｎｇ，  Ｌ．，及びＸｉｅ，  Ｘ．  Ｓ．著、（２０１７年）Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｗｈｏｌｅ−ｇｅｎｏｍｅ  ａｎａｌｙｓｅｓ  ｂｙ  Ｌｉｎｅａｒ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｖｉａ  Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  （ＬＩＡＮＴＩ）．Ｓｃｉｅｎｃｅ誌、第３５６巻（第６３３４号）、１８９〜１９４頁、Ｄｏｎｇ，  Ｘ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｌ．，  Ｍｉｌｈｏｌｌａｎｄ，  Ｂ．，  Ｌｅｅ，  Ｍ．，  Ｍａｓｌｏｖ，  Ａ．  Ｙ．，  Ｗａｎｇ，  Ｔ．，及びＶｉｊｇ，  Ｊ．著、（２０１７年）Ａｃｃｕｒａｔｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｉｎ  ｗｈｏｌｅ−ｇｅｎｏｍｅ−ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ誌）。さらに偽陽性をゼロ近くまで減らすために、変異体検出の方法が提供される。
【０１１１】
図７は、核酸のマルチプレックス末端タギング増幅によりＳＮＶ偽陽性の特定がどのようにして可能であるかを示している。マルチプレックス末端タギング増幅を用いた増幅ＤＮＡのシークエンシング後に、同じゲノム領域にアラインメントされ、かつ、両末端のＭ配列（「バーコード」）がリード間で同じであるリードをグループ化する（図７の例ではＭ配列がＭ１及びＭ２で表される）。同じグループに属する複数のリード内でＳＮＶがそれらリードの５０％以下で検出される場合、該ＳＮＶはアーティファクトと考えられ、フィルタリングにより除去されるべきである。真のＳＮＶ陽性は、原理上は、複数のリードの１００％に存在するはずであるからである。本明細書に記載されるマルチプレックス末端タギング増幅法によれば、各増幅分子が両末端にバーコード、すなわち相違する及び／又は独自のプライマー結合部位配列を含有することが確実であるので、バーコードマッチング及び参照ゲノムへのアラインメントの両方を用いて、シークエンシングリードをグループ化することができる。
【０１１２】
類似のスキームを、構造的変異（ＳＶ）の偽陽性を特定するために用いることができる。ここでは、シークエンシングリードのグループ化は両末端のバーコード及び対応するＤＮＡ配列ではなく、１つのバーコード及び該バーコードの隣のＴ部位に隣接する標的ＤＮＡ配列に基づき得る。このようにすれば、ＰＣＲの間にキメラアーティファクトが生じる場合、他のリードと（２つのバーコードではなく）１つのバーコードがリード間で同じであり、該同じバーコードの隣のＴ部位に隣接するＤＮＡ配列がリード間で同じであるリードは、グループ内のリードの５０％以下である。他方、ＳＶの真陽性が存在するときには、該真陽性を有する元のＤＮＡフラグメントは、両末端のバーコードがリード間で同じであり、かつ、各バーコードの隣のＴ部位に隣接するＤＮＡ配列が同じである分子のグループへと増幅されることになる。このため、先に述べたように１つのバーコードとその近傍の標的ＤＮＡ配列に基づいてシークエンシングリードがグループ化される場合、真のキメラ陽性と偽のキメラ陽性を区別することができる。結果として、マルチプレックス末端タギング増幅により、遺伝的変異の正確な検出のために、損失を最小限にすることで偽陰性が減少するだけでなく、偽陽性を排除することも可能になる。
【０１１３】
実施例Ｘ
正確な変異体検出のための、ＤＮＡ分子の両方の鎖の個別分析
単一細胞内のゲノム変異体の正確な検出は、早期の癌診断と着床前遺伝スクリーニングにとって重要である。しかしながら、既存の全ゲノム増幅（ＷＧＡ）法は多数の偽陽性（ＦＰ）を作り出してしまう。例えば、細胞溶解中のシトシン及びアデニンの脱アミノ化とＷＧＡ中のＤＮＡポリメラーゼエラーにより、ＦＰ一ヌクレオチド変異（ＳＮＶ）が作成され、一方でＷＧＡ中のキメラ形成によりＦＰ構造的変異（ＳＶ）が作成される。線形増幅（Ｃｈｅｎ，  Ｃ．，  Ｘｉｎｇ，  Ｄ．，  Ｔａｎ，  Ｌ．，  Ｌｉ，  Ｈ．，  Ｚｈｏｕ，  Ｇ．，  Ｈｕａｎｇ，  Ｌ．，及びＸｉｅ，  Ｘ．  Ｓ．著、（２０１７年）Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｗｈｏｌｅ−ｇｅｎｏｍｅ  ａｎａｌｙｓｅｓ  ｂｙ  Ｌｉｎｅａｒ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｖｉａ  Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  （ＬＩＡＮＴＩ）．Ｓｃｉｅｎｃｅ誌、第３５６巻（第６３３４号）、１８９〜１９４頁）、又は穏やかな溶解条件（Ｄｏｎｇ，  Ｘ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｌ．，  Ｍｉｌｈｏｌｌａｎｄ，  Ｂ．，  Ｌｅｅ，  Ｍ．，  Ｍａｓｌｏｖ，  Ａ．  Ｙ．，  Ｗａｎｇ，  Ｔ．，及びＶｉｊｇ，  Ｊ．著、（２０１７年）Ａｃｃｕｒａｔｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｉｎ  ｗｈｏｌｅ−ｇｅｎｏｍｅ−ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ誌）によりＦＰが最近の研究で減少しているが、数百又は数千のＦＰが残っている。同一ファミリーの細胞のシークエンシング（Ｚｏｎｇ，  Ｃ．，  Ｌｕ，  Ｓ．，  Ｃｈａｐｍａｎ，  Ａ．  Ｒ．，及びＸｉｅ，  Ｘ．  Ｓ．著、（２０１２年）Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｃｏｐｙ−ｎｕｍｂｅｒ  ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ誌、第３３８巻（第６１１４号）、１６２２〜１６２６頁）によりさらにＦＰを減らすことができるが、例えばヒト脳神経細胞の場合（Ｌｏｄａｔｏ，  Ｍ．  Ａ．，  Ｗｏｏｄｗｏｒｔｈ，  Ｍ．  Ｂ．，  Ｌｅｅ，  Ｓ．，  Ｅｖｒｏｎｙ，  Ｇ．  Ｄ．，  Ｍｅｈｔａ，  Ｂ．  Ｋ．，  Ｋａｒｇｅｒ，  Ａ．，  ．．．及びＬｕｑｕｅｔｔｅ，  Ｌ．  Ｊ．著、（２０１５年）Ｓｏｍａｔｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｉｎｇｌｅ  ｈｕｍａｎ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｔｒａｃｋｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｈｉｓｔｏｒｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ誌、第３５０巻（第６２５６号）、９４〜９８頁）のようにインビトロで目的の細胞が分裂できないときには、同一ファミリーの細胞を得ることはできない。本明細書に記載される方法では、各ＤＮＡ分子の２本の鎖を別々に分析し、各変異体が両方の鎖から観察されることを要件とすることにより、これらのＦＰを除去することができる。ＦＰが両方の鎖の同じ場所、かつ、同じパターンで生じる可能性は低い（例えば、シトシン脱アミノ化のＦＰ  ＳＮＶは相補鎖上のグアニンに対応し、グアニンは脱アミノ化しにくい）ので、各ＤＮＡ分子の２本の分子を別々に分析する方法によりＦＰはほぼゼロになる。
【０１１４】
１つの態様によれば、二本鎖ＤＮＡ分子の２本の鎖を物理的又は実質的に互いに分離することができ、各変異体は両方の鎖から観察するものとする。ＦＰが両方の鎖の同じ場所、かつ、同じパターンで生じる可能性は低い（例えば、シトシン脱アミノ化のＦＰ  ＳＮＶは相補鎖上のグアニンに対応し、グアニンは脱アミノ化しにくい）ので、二本鎖ＤＮＡ分子の各鎖を別々に増幅する本方法により、ＦＰはほぼゼロになる。１つの態様によれば、２本の鎖を別々に増幅でき、シークエンシングすることができるかぎり、任意の全ゲノムシークエンシング方法を使用することができる。特定の例としては、複数のチューブにピペット操作により分注することで、第１サイクルのＰＣＲの後にＭＥＴＡ反応、すなわちマルチプレックス末端タギング増幅、を分割すること、複数ステップのＰＣＲにより２本の鎖を実質的に分離すること、又はアルカリ変性の後にＭＤＡ反応を複数のチューブに分割すること、が挙げられる。感度については、試料が等体積のＮ個のコンパートメントに物理的に分割され、ＷＧＡ法が各鎖についてＰという損失確率を有すると仮定すると、理論的な偽陰性率は１−（１−Ｐ）２（１−Ｎ−１）である。偽陰性は、（１）２本の鎖が同じコンパートメントに入ること、及び／又は（２）どちらかの鎖の損失、によって引き起こされる。
【０１１５】
この用途について、本明細書に記載されるマルチプレックス末端タギング増幅プロトコルのＰＣＲ増幅は３ステージに分けられる（図８参照）。最初の２ステージの各々は、ＭＥＴＡ  ＰＣＲプライマーのうちの１セットのみを含み、かつ、単一のＰＣＲサイクルを含む。ここで、第１ステージではＡｄｐ１プライマーが用いられ、第２ステージではＡｄｐ２プライマーが用いられる。Ａｄｐ１プライマー及びＡｄｐ２プライマーは、２つの部分を含み、それら部分のうちの１つはＡｄｐ１配列又はＡｄｐ２配列であり、もう一方はＭＥＴＡトランスポゾンＤＮＡのプライミング部位配列に結合することができるプライミング領域である。第３ステージは、両方のアダプターを標的とする２つのプライマー（例えば、標準Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＰＣＲプライマー）を含む。このようにすれば、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンサーから得られる最終的な配列は、元のＤＮＡ分子の鎖の情報を保持することになり、正確な変異体（バリアント）検出にその情報を使用することができる。１つの態様によれば、Ａｄｐ１配列とＡｄｐ２配列は、Ｉｌｌｕｍｉｎａのシークエンシングライブラリーアダプター配列のうちの一部であってもよい。
【０１１６】
実施例ＸＩ
マルチプレックス末端タギング増幅を用いる高感度クロマチンコンフォーメーションキャプチャ（ＭＥＴＡ−Ｃ；二倍体細胞向けにはＤｉｐ−Ｃとしても知られる）、及びハプロタイプインピュテーションのためのその付属アルゴリズム
本明細書に記載される方法は、マルチプレックス末端タギング増幅を用いる高感度クロマチンコンフォーメーションキャプチャ（ＭＥＴＡ−Ｃ）、及び二倍体細胞に適用されたときの二倍体クロマチンコンフォーメーションキャプチャ（Ｄｉｐ−Ｃ）、及びハプロタイプインピュテーションのためのその付属アルゴリズムについてのものである。入力するものがクロマチンコンフォーメーションキャプチャ（３Ｃ）（Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｊ．，  Ｒｉｐｐｅ，  Ｋ．，  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｍ．，及びＫｌｅｃｋｎｅｒ，  Ｎ．著、（２００２年）、Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ誌、第２９５巻（第５５５８号）、１３０６〜１３１１頁）又はＨｉ−Ｃ（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ−Ａｉｄｅｎ，  Ｅ．，  Ｖａｎ  Ｂｅｒｋｕｍ，  Ｎ．  Ｌ．，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  Ｌ．，  Ｉｍａｋａｅｖ，  Ｍ．，  Ｒａｇｏｃｚｙ，  Ｔ．，  Ｔｅｌｌｉｎｇ，  Ａ．，  ．．．及びＳａｎｄｓｔｒｏｍ，  Ｒ．著、（２００９年）Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｌｏｎｇ−ｒａｎｇｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｆｏｌｄｉｎｇ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ誌、第３２６巻（第５９５０号）、２８９〜２９３頁）などの関連のアッセイの成果であるとき、本明細書に記載されるマルチプレックス末端タギング増幅法（ＭＥＴＡ）は単一の細胞又は少量の試料の中のクロマチンのコンフォーメーションを検出することができる。このＭＥＴＡの改変はＭＥＴＡ−Ｃと称され、９細胞の単一ＧＭ１２８７８細胞において細胞当たり７×１０５〜２×１０６クロマチン接触を検出したものであり、既存の方法（Ｎａｇａｎｏ，  Ｔ．，  Ｌｕｂｌｉｎｇ，  Ｙ．，  Ｓｔｅｖｅｎｓ，  Ｔ．  Ｊ．，  Ｓｃｈｏｅｎｆｅｌｄｅｒ，  Ｓ．，  Ｙａｆｆｅ，  Ｅ．，  Ｄｅａｎ，  Ｗ．，  ．．．  及びＦｒａｓｅｒ，  Ｐ．  著、（２０１３年）、Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  Ｈｉ−Ｃ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｃｅｌｌ−ｔｏ−ｃｅｌｌ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｎａｔｕｒｅ誌、第５０２巻（第７４６９号）、５９〜６４頁、Ｎａｇａｎｏ，  Ｔ．，  Ｌｕｂｌｉｎｇ，  Ｙ．，  Ｖａｒｎａｉ，  Ｃ．，  Ｄｕｄｌｅｙ，  Ｃ．，  Ｌｅｕｎｇ，  Ｗ．，  Ｂａｒａｎ，  Ｙ．，  ．．．  及びＴａｎａｙ，  Ａ．著、（２０１６年）、Ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ  ａｔ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ．ｂｉｏＲｘｉｖ誌、０９４４６６頁、Ｓｔｅｖｅｎｓ，  Ｔ．  Ｊ．，  Ｌａｎｄｏ，  Ｄ．，  Ｂａｓｕ，  Ｓ．，  Ａｔｋｉｎｓｏｎ，  Ｌ．  Ｐ．，  Ｃａｏ，  Ｙ．，  Ｌｅｅ，  Ｓ．  Ｆ．，  ．．．  及びＣｒａｍａｒｄ，  Ｊ．著、（２０１７年）、３Ｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｇｅｎｏｍｅｓ  ｓｔｕｄｉｅｄ  ｂｙ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  Ｈｉ−Ｃ．Ｎａｔｕｒｅ誌、第５４４巻（第７６４８号）、５９〜６４頁、Ｆｌｙａｍｅｒ，  Ｉ．  Ｍ．，  Ｇａｓｓｌｅｒ，  Ｊ．，  Ｉｍａｋａｅｖ，  Ｍ．，  Ｂｒａｎｄａ（ａの文字はチルダ）ｏ，  Ｈ．  Ｂ．，  Ｕｌｉａｎｏｖ，  Ｓ．  Ｖ．，  Ａｂｄｅｎｎｕｒ，  Ｎ．，  ．．．及びＴａｃｈｉｂａｎａ−Ｋｏｎｗａｌｓｋｉ，  Ｋ．著、（２０１７年）、Ｓｉｎｇｌｅ−ｎｕｃｌｅｕｓ  Ｈｉ−Ｃ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｕｎｉｑｕｅ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｒｅｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ａｔ  ｏｏｃｙｔｅ−ｔｏ−ｚｙｇｏｔｅ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ誌、第５４４巻（第７６４８号）１１０〜１１４頁）よりも高感度である。
【０１１７】
機能的な細胞のほとんどは二倍体である。二倍体細胞に適用されるとき、本明細書に記載される方法は、クロマチン接触の統計学的特性を利用して各接触のハプロタイプ情報をインピュテーションにより補完する。各接触について、そのハプロタイプを決定するために、近傍の接触のハプロタイプを使用するアルゴリズムが提供される。例えば、１本の染色体上の位置ｘ（ｂｐ（塩基対）により表した位置）と別の染色体上の位置ｙを結合させる接触についてそのハプロタイプを決定するのに、（｜ｘ’−ｘ｜０．５＋｜ｙ’−ｙ｜０．５）２≦１０Ｍｂである同じ染色体対の位置ｘ’と位置ｙ’を結合させる全ての接触を用いてもよい。前記アルゴリズム（Ｄｉｐ−Ｃアルゴリズムと称す）は、次に、３Ｄ構造案を反復して生成し、これらの構造を使用してハプロタイプをインピュテーションによりさらに補完する。例えば、各接触について、生じる３Ｄ上の距離が最小になるようにハプロタイプが選択される。このアルゴリズムを９個のＧＭ１２８７８単一細胞に適用し、接触の大多数についてハプロタイプをインピュテーションにより補完し、それにより２０ｋｂの解像度で３Ｄゲノム構造を得た。
【０１１８】
実施例ＸＩＩ
マルチプレックス末端タギング増幅を用いるオープンクロマチンの高感度検出（ＭＥＴＡＴＡＣ）
本明細書に記載される方法はマルチプレックス末端タギング及び増幅を用いるオープンクロマチンの高感度検出（ＭＥＴＡＴＡＣ）に対するものである。入力される材料がＡＴＡＣ−Ｓｅｑ（Ｂｕｅｎｒｏｓｔｒｏ，  Ｊ．  Ｄ．，  Ｇｉｒｅｓｉ，  Ｐ．  Ｇ．，  Ｚａｂａ，  Ｌ．  Ｃ．，  Ｃｈａｎｇ，  Ｈ．  Ｙ．，及びＧｒｅｅｎｌｅａｆ，  Ｗ．  Ｊ．著、（２０１３年）、Ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｔｉｖｅ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｆｏｒ  ｆａｓｔ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｏｐｅｎ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ，  ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ誌、第１０巻（第１２号）、１２１３〜１２１８頁）のように未変性の細胞核又は固定した細胞核であるとき、マルチプレックス末端タギング及び増幅により単一の細胞又は少量の試料の中のオープンクロマチンを検出することができる。このＭＥＴＡの改変はＭＥＴＡＴＡＣと称され、１８個の単一ＧＭ１２８７８細胞において細胞当たり全オープンクロマチン領域の６％〜３３％を検出したものであり、既存の方法（Ｂｕｅｎｒｏｓｔｒｏ，  Ｊ．  Ｄ．，  Ｗｕ，  Ｂ．，  Ｌｉｔｚｅｎｂｕｒｇｅｒ，  Ｕ．  Ｍ．，  Ｒｕｆｆ，  Ｄ．，  Ｇｏｎｚａｌｅｓ，  Ｍ．  Ｌ．，  Ｓｎｙｄｅｒ，  Ｍ．  Ｐ．，  ．．．及びＧｒｅｅｎｌｅａｆ，  Ｗ．  Ｊ．著、（２０１５年）Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ誌、第５２３巻（第７５６１号）、４８６〜４９０頁、Ｃｕｓａｎｏｖｉｃｈ，  Ｄ．  Ａ．，  Ｄａｚａ，  Ｒ．，  Ａｄｅｙ，  Ａ．，  Ｐｌｉｎｅｒ，  Ｈ．  Ａ．，  Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ，  Ｌ．，  Ｇｕｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｋ．  Ｌ．，  ．．．及びＳｈｅｎｄｕｒｅ，  Ｊ．著、（２０１５年）、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ  ｂｙ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｎｄｅｘｉｎｇ．Ｓｃｉｅｎｃｅ誌、第３４８巻（第６２３７号）、９１０〜９１４頁）よりも高感度である。
【０１１９】
実施例ＸＩＩＩ
キット
本開示に記載された増幅方法に必要な材料及び試薬は一緒にキットにまとめてもよい。本開示のキットは、概して、請求項に記載の方法の実施に必要なトランスポソーム（トランスポゼース酵素とトランスポゾンＤＮＡからなる）、ヌクレオチド、及びＤＮＡポリメラーゼを少なくとも含み、必要に応じてプライマーセットも含む。好ましい実施形態では、本キットはＤＮＡ試料からＤＮＡを増幅するための説明書も含む。例示的なキットとしては、全ゲノムＤＮＡの増幅に使用するのに適切なキットがある。各場合において、本キットは、それぞれ個々の試薬、酵素、又は反応物質のための別個の容器を有していることが好ましい。各薬品は、一般的には、それらのそれぞれの容器の中に適切に分注されているものとする。本キットの容器は、一般的には、少なくとも１本のバイアル又はテストチューブを含むものとする。それらの試薬を入れ、分注するフラスコ、ボトル、及び他の格納手段でもよい。本キットにおけるそれら個々の容器は、市販用にきつく閉じ込められた状態を維持されることが好ましい。適切なより大きい容器としては、所望のバイアルを中に保持するための射出成型又はブロー成型されたプラスチック容器が挙げられる。本キットには説明書が備えられることが好ましい。
【０１２０】
実施例ＸＩＶ
実施形態
本開示は、
・ゲノムＤＮＡを、ライブラリー中の各トランスポソームが２つのトランスポゼースと２つのトランスポゾンＤＮＡを有しているトランスポソームのライブラリーと接触させること、ここで
各トランスポゾンＤＮＡは、トランスポゼース結合部位及びプライマー結合部位配列を含んでおり、
前記プライマー結合部位配列は、前記トランスポソームライブラリーの他のメンバーのプライマー結合部位と異なっており、
前記トランスポソームのライブラリーが、前記ゲノムＤＮＡに沿って並んだ複数の標的位置に結合し、トランスポゼースは、前記ゲノムＤＮＡを、ゲノムＤＮＡフラグメントライブラリーを表す複数の二本鎖ゲノムＤＮＡフラグメントに切断し、各二本鎖ゲノムＤＮＡフラグメントは、自身の各末端に、固有であり、かつ、相違するプライマー結合部位配列を有する、
・前記トランスポゾンＤＮＡと前記ゲノムＤＮＡフラグメントとの間のギャップを修復して、各末端に独自及び／又は相違するプライマー結合部位配列を有する二本鎖ゲノムＤＮＡフラグメント伸長産物のライブラリーを形成すること、及び
・前記二本鎖ゲノムＤＮＡフラグメント伸長産物を増幅してアンプリコンを作製すること、
を含む、ＤＮＡ増幅方法を記載する。
１つの態様によると、前記方法は、前記アンプリコンをシークエンシングすることをさらに含む。１つの態様によると、前記トランスポソームのライブラリー内の各トランスポソームは２つの相違するプライマー結合部位配列を含む。１つの態様によると、前記トランスポソームのライブラリー内の各トランスポソームは、前記トランスポソームの各トランスポゾン上に２つの同じプライマー結合部位配列を含み、該プライマー結合部位配列は、前記トランスポソームのライブラリーの他のトランスポソーム中のプライマー結合部位配列とは異なっている。１つの態様によると、前記ゲノムＤＮＡは単一の細胞から得られた全ゲノムＤＮＡである。１つの態様によると、前記トランスポゼースはＴｎ５トランスポゼース、Ｍｕトランスポゼース、Ｔｎ７トランスポゼース、又はＩＳ５トランスポゼースである。１つの態様によると、前記トランスポゾンＤＮＡは二本鎖である１９ｂｐのＴｎｐ結合部位とオーバーハングとを含み、前記オーバーハングはオーバーハングの５’末端に独自かつ相違するプライマー結合部位配列を含む。１つの態様によると、前記二本鎖フラグメントに結合したトランスポゼースは、ギャップフィリング及び二本鎖ゲノムＤＮＡフラグメントの伸長の前に、前記二本鎖フラグメントから除去される。１つの態様によると、前記ゲノムＤＮＡは胎児細胞から得られたものである。１つの態様によると、前記ゲノムＤＮＡは癌細胞から得られたものである。１つの態様によると、前記ゲノムＤＮＡは循環腫瘍細胞から得られたものである。１つの態様によると、前記ゲノムＤＮＡは単一の胎児細胞から得られたものである。１つの態様によると、前記ゲノムＤＮＡは単一の癌細胞から得られたものである。１つの態様によると、前記ゲノムＤＮＡは単一の循環腫瘍細胞から得られたものである。１つの態様によると、前記ゲノムＤＮＡは単一の細胞又は少量の試料からのクロマチンコンフォーメーションキャプチャの産物である。１つの態様によると、前記ゲノムＤＮＡは単一の細胞又は微量の試料から得られた未変性の、又は固定したクロマチンである。１つの態様によると、前記独自及び／又は相違するプライマー結合部位配列は特異的ＰＣＲプライマー結合部位である。１つの態様によると、前記トランスポソームのライブラリーは１〜１００種類の独自及び／又は相違するプライマー結合部位配列を含む。１つの態様によると、前記トランスポソームのライブラリーは１〜１０種類の独自及び／又は相違するプライマー結合部位配列を含む。１つの態様によると、前記トランスポソームのライブラリーは５〜５０種類の独自及び／又は相違するプライマー結合部位配列を含む。１つの態様によると、前記トランスポソームのライブラリーは３０〜１００種類の独自及び／又は相違するプライマー結合部位配列を含む。１つの態様によると、前記トランスポソームのライブラリーは１５〜２５種類の独自及び／又は相違するプライマー結合部位配列を含む。１つの態様によると、前記トランスポソームのライブラリーは１００〜１，０００種類の独自及び／又は相違するプライマー結合部位配列を含む。１つの態様によると、前記トランスポソームのライブラリーは１，０００〜１０，０００種類の独自及び／又は相違するプライマー結合部位配列を含む。１つの態様によると、前記トランスポソームのライブラリーは１０，０００〜１００，０００種類の独自及び／又は相違するプライマー結合部位配列を含む。１つの態様によると、前記相違するプライマー結合部位配列同士は直交性（orthogonal）である。
【０１２１】
本開示は、
各末端にトランスポゼース結合配列と同じプライミング部位配列を有する標的二本鎖ＤＮＡを第１の一本鎖と第２の一本鎖に分けること、
前記トランスポゼース結合部位に対して相補的である第１の配列及び前記プライミング部位配列に対して非相補的である第２の配列を有する第１のプライマーを、前記第１の鎖にアニーリングすること、
前記トランスポゼース結合部位に対して相補的である第１の配列及び前記プライミング部位配列に対して相補的である第２の配列を有する第２のプライマーを、前記第２の鎖にアニーリングすること、
前記第１の鎖に沿って前記第１のプライマーを伸長し、前記第２の鎖に沿って前記第２のプライマーを伸長すること、及び
伸長産物を増幅して、各末端に独自及び／又は相違するプライミング部位配列を有する二本鎖ＤＮＡアンプリコンを作製すること、
を含む、各末端に独自及び／又は相違するプライミング部位配列を有する二本鎖ＤＮＡアンプリコンを作製する方法、について説明している。
【０１２２】
本開示は、各末端に相違するプライミング部位を有する二本鎖核酸配列の２本の鎖を増幅する方法であって、
前記二本鎖核酸配列を第１の鎖と第２の鎖に分けること、
前記第２の鎖が存在しない状態で前記第１の鎖を増幅して第１の鎖のアンプリコンを作製すること、
前記第１の鎖が存在しない状態で前記第２の鎖を増幅して第２の鎖のアンプリコンを作製すること、
前記第１の鎖のアンプリコンをシークエンシングすること、及び
前記第２の鎖のアンプリコンをシークエンシングすること、
を含む方法を提供する。
１つの態様によると、前記方法は、
前記第１の鎖及び前記第２の鎖の３’末端と、前記第１の鎖及び前記第２の鎖の３’末端に対して相補的であるプライミング領域、及び第１のアダプター配列を含むプライマー群とをアニーリングし、ＤＮＡポリメラーゼにより相補鎖を合成し、過剰な前記プライマー群をエクソヌクレアーゼにより除去すること、
合成された、前記第１の鎖及び前記第２の鎖の前記相補鎖の３’末端と、前記第１の鎖及び前記第２の鎖の３’末端に対して相補的であるプライミング領域、及び第２のアダプター配列を含むプライマー群とをアニーリングし、ＤＮＡポリメラーゼにより相補鎖を合成し、過剰な前記プライマー群をエクソヌクレアーゼにより除去すること、
前記第１のアダプター配列及び前記第２のアダプター配列にアニーリングするプライマー群を使用するＰＣＲにより前記標的配列を増幅して、前記第１の鎖と前記第２の鎖についてのアンプリコンを作製すること、
前記アンプリコンをシークエンシングして、前記第１の鎖を前記第２の鎖から区別すること、
をさらに含み、
ここで、前記第１の鎖の第１の末端は、前記第１のアダプターでタグ付けされており、前記第１の鎖の第２の末端は、前記第２のアダプターでタグ付けされており、また、前記第２の鎖の第１の末端は前記第２のアダプターでタグ付けされており、前記第２の鎖の第２の末端は前記第１のアダプターでタグ付けされている。１つの態様によると、クロマチンコンフォーメーションキャプチャは二倍体試料からのものであり、かつ、キャプチャされたクロマチン接触それぞれのハプロタイプ情報が決定される。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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