(57)【要約】  本開示は、キメラ抗原受容体又は外因性Ｔ細胞受容体等の操作された抗原受容体をコードする核酸分子、及びＲＮＡ干渉分子等の阻害性核酸分子を提供する。本開示はさらに、核酸、ＤＮＡコンストラクト、ベクター、医薬組成物、遺伝子改変細胞、及び本発明の核酸分子を利用する治療方法に関する。
2020518276.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）操作された抗原受容体をコードする核酸配列を含む第１の発現カセットと；
（ｂ）阻害性核酸分子をコードする核酸配列を含む第２の発現カセットと；
（ｃ）５’相同性アームと；
（ｄ）３’相同性アームと；を含み、
前記５’相同性アーム及び前記３’相同性アームが、目的の遺伝子のヌクレアーゼ認識配列に隣接する染色体領域と相同性を有する、核酸分子。
【請求項２】
前記阻害性核酸分子がＲＮＡ干渉分子である、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
前記ＲＮＡ干渉分子が、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ヘアピンｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、前駆体ｍｉＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡ適合ｓｈＲＮＡである、請求項２に記載の核酸分子。
【請求項４】
前記ＲＮＡ干渉分子がｓｈＲＮＡである、請求項２又は３に記載の核酸分子。
【請求項５】
前記操作された抗原受容体がキメラ抗原受容体又は外因性Ｔ細胞受容体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項６】
前記ヌクレアーゼ認識配列が、操作されたメガヌクレアーゼ認識配列、ＴＡＬＥＮ認識配列、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）認識配列、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ認識配列、コンパクトＴＡＬＥＮ認識配列、又はメガＴＡＬ認識配列である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項７】
前記ヌクレアーゼ認識配列が操作されたメガヌクレアーゼ認識配列である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項８】
前記目的の遺伝子がヒトＴ細胞受容体アルファ定常領域遺伝子である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項９】
前記ヌクレアーゼ認識配列が配列番号１を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１０】
前記第１の発現カセットが、前記操作された抗原受容体の発現を駆動するプロモータを更に含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１１】
プロモータがＪｅＴプロモータである、請求項１０に記載の核酸分子。
【請求項１２】
前記第２の発現カセットが、前記阻害性核酸分子の発現を駆動するプロモータをさらに含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１３】
前記プロモータがＵ６プロモータである、請求項１２に記載の核酸分子。
【請求項１４】
前記第１の発現カセットが、前記操作された抗原受容体の翻訳を終結させるためのポリアデニル化シグナルを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１５】
前記第２の発現カセットが、前記阻害核酸の翻訳を終結させるための中央ポリプリントラクト及び中央ターミネータ配列（ｃＰＰＴ／ＣＴＳ）の配列を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１６】
前記第１の発現カセット及び前記第２の発現カセットが、前記核酸分子において同じ向きにある、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１７】
前記第１の発現カセット及び前記第２の発現カセットが、前記５’及び３’の相同性アームに対して５’から３’の向きにある、請求項１６に記載の核酸分子。
【請求項１８】
前記第１の発現カセットが、前記第２の発現カセットの５’上流にある、請求項１７に記載の核酸分子。
【請求項１９】
前記第２の発現カセットが、前記第１の発現カセットの５’上流にある、請求項１７に記載の核酸分子。
【請求項２０】
前記第１の発現カセット及び前記第２の発現カセットが、前記５’及び３’の相同性アームに対して３’から５’の向きにある、請求項１６に記載の核酸分子。
【請求項２１】
前記第１の発現カセットが、前記第２の発現カセットの５’上流にある、請求項２０記載の核酸分子。
【請求項２２】
前記第２の発現カセットが、前記第１の発現カセットの５’上流にある、請求項２０記載の核酸分子。
【請求項２３】
前記第１の発現カセット及び前記第２の発現カセットが、前記核酸分子において反対の向きにある、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項２４】
前記５’及び３’の相同性アームに対して、前記第１の発現カセットが３’から５’の向きであり、前記第２の発現カセットが５’から３’の向きである、請求項２３に記載の核酸分子。
【請求項２５】
前記第１の発現カセットが、前記第２の発現カセットの５’上流にある、請求項２４に記載の核酸分子。
【請求項２６】
前記第２の発現カセットが、前記第１の発現カセットの５’上流にある、請求項２４に記載の核酸分子。
【請求項２７】
前記５’及び３’の相同性アームに対して、前記第１の発現カセットが５’から３’の向きにあり、前記第２の発現カセットが３’から５’の向きにある、請求項２３に記載の核酸分子。
【請求項２８】
前記第１の発現カセットが、前記第２の発現カセットの５’上流にある、請求項２７に記載の核酸分子。
【請求項２９】
前記第２の発現カセットが、前記第１の発現カセットの５’上流にある、請求項２７に記載の核酸分子。
【請求項３０】
前記核酸分子が、前記第１の発現カセット及び前記第２の発現カセットに隣接する５’逆方向末端反復及び３’逆方向末端反復を更に含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項３１】
前記阻害性核酸分子が、ヒトベータ２ミクログロブリン、ＭＨＣクラスＩ分子の構成要素、又はＣＤ５２に対して阻害性である、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項３２】
前記阻害性核酸分子がベータ２ミクログロブリンに対する阻害性ｓｈＲＮＡであり、前記ｓｈＲＮＡが配列番号２〜配列番号４のいずれか１つを含む配列を有する、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項３３】
前記ｓｈＲＮＡが配列番号２を含む配列を有する、請求項３２に記載の核酸分子。
【請求項３４】
前記第１の発現カセット及び前記第２の発現カセットが、前記５’及び３’の相同性アームに対して３’から５’の向きにあり、前記第１の発現カセットが前記第２の発現カセットの５’上流にある、請求項３２又は請求項３３に記載の核酸分子。
【請求項３５】
前記第１の発現カセットが：
（ｉ）キメラ抗原受容体又は外因性Ｔ細胞受容体をコードする核酸配列と；
（ｉｉ）前記キメラ抗原受容体又は前記外因性Ｔ細胞受容体の発現を駆動するＪｅＴプロモータと；
（ｉｉｉ）ポリＡ配列と；を含み、
前記第２の発現カセットが：
（ｉｖ）前記ｓｈＲＮＡをコードする核酸配列と；
（ｖ）前記ｓｈＲＮＡの発現を駆動するＵ６プロモータと；
（ｖｉ）中央ポリプリントラクト及び中央ターミネータ配列（ｃＰＰＴ／ＣＴＳ）の配列と、を含む、請求項３４に記載の核酸分子。
【請求項３６】
前記５’及び３’相同性アームに対して、前記第１の発現カセットが３’から５’の向きにあり、前記第２の発現カセットが５’から３’の向きにあり、前記第１の発現カセットが前記第２の発現カセットの５’上流にある、請求項３２又は請求項３３に記載の核酸分子。
【請求項３７】
前記第１の発現カセットが：
（ｉ）キメラ抗原受容体又は外因性Ｔ細胞受容体をコードする核酸配列と；
（ｉｉ）前記キメラ抗原受容体又は前記外因性Ｔ細胞受容体の発現を駆動するＪｅＴプロモータと；
（ｉｉｉ）ポリＡ配列と；を含み、
前記第２の発現カセットが：
（ｉｖ）前記ｓｈＲＮＡをコードする核酸配列と；
（ｖ）ｓｈＲＮＡの発現を駆動するＵ６プロモータと；
（ｖｉ）前記中央ポリプリントラクト及び中央ターミネータ配列（ｃＰＰＴ／ＣＴＳ）の配列と、を含む、請求項３６に記載の核酸分子。
【請求項３８】
前記核酸分子が、前記第２の発現カセットの第１のコピー及び第２のコピーを含み、前記第１のコピー及び前記第２のコピーが同一であり、前記第１コピー及び前記第２コピーがタンデムであり、前記第１のコピーと前記第２のコピーが同じ向きである、請求項３７に記載の核酸分子。
【請求項３９】
請求項１〜３８のいずれか一項に記載の前記核酸分子を含む組換えＤＮＡコンストラクト。
【請求項４０】
前記組換えＤＮＡコンストラクトがウイルスベクターをコードする、請求項３９に記載の組換えＤＮＡコンストラクト。
【請求項４１】
前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項４０に記載の組換えＤＮＡコンストラクト。
【請求項４２】
前記ウイルスベクターが組換えＡＡＶベクターである、請求項４１に記載の組換えＤＮＡコンストラクト。
【請求項４３】
請求項１〜３８のいずれか一項に記載の前記核酸分子を含むウイルスベクター。
【請求項４４】
前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、又はＡＡＶベクターである、請求項４３に記載のウイルスベクター。
【請求項４５】
前記ウイルスベクターが組換えＡＡＶベクターである、請求項４４に記載のウイルスベクター。
【請求項４６】
請求項１〜３１のいずれか一項に記載の核酸分子を含む遺伝子改変真核細胞であって、前記操作された抗原受容体及び前記阻害核酸分子が前記遺伝子改変真核細胞で発現される、遺伝子改変真核細胞。
【請求項４７】
前記操作された抗原受容体がキメラ抗原受容体又は外因性Ｔ細胞受容体である、請求項４６に記載の遺伝子改変真核細胞。
【請求項４８】
前記核酸分子が、前記ヌクレアーゼ認識配列において前記遺伝子改変真核細胞のゲノムに挿入される、請求項４６又は請求項４７に記載の遺伝子改変真核細胞。
【請求項４９】
前記ヌクレアーゼ認識配列が、操作されたメガヌクレアーゼ認識配列、ＴＡＬＥＮ認識配列、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）認識配列、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ認識配列、コンパクトＴＡＬＥＮ認識配列、又はメガＴＡＬ認識配列である、請求項４６〜４８のいずれか一項に記載の遺伝子改変真核細胞。
【請求項５０】
前記ヌクレアーゼ認識配列が、操作されたメガヌクレアーゼ認識配列である、請求項４９に記載の遺伝子改変真核細胞。
【請求項５１】
前記目的の遺伝子がヒトＴ細胞受容体アルファ定常領域遺伝子である、請求項４６〜５０のいずれか一項に記載の遺伝子改変真核細胞。
【請求項５２】
前記ヌクレアーゼ認識配列が配列番号１を含む、請求項４６〜５１のいずれか一項に記載の遺伝子改変真核細胞。
【請求項５３】
内因性Ｔ細胞受容体の細胞表面発現が対照細胞と比較して低下している、請求項５１又は請求項５２に記載の遺伝子改変真核細胞。
【請求項５４】
前記阻害性核酸分子がヒトベータ２ミクログロブリンに対して阻害性である、請求項４６〜５３のいずれか一項に記載の遺伝子改変真核細胞。
【請求項５５】
前記遺伝子改変真核細胞が請求項３２〜３８のいずれか一項に記載の前記核酸分子を含む、請求項５４に記載の遺伝子改変真核細胞。
【請求項５６】
前記遺伝子改変真核細胞上のベータ２ミクログロブリンの細胞表面発現が、対照細胞上の細胞表面ベータ２ミクログロブリン発現と比較して１０％〜９５％低下している、請求項５４又は請求項５５に記載の遺伝子改変真核細胞。
【請求項５７】
前記遺伝子改変真核細胞上のベータ２ミクログロブリンの細胞表面発現が、対照細胞上の細胞表面ベータ２ミクログロブリン発現と比較して５０％〜９５％低下している、請求項５４〜５６のいずれか一項に記載の遺伝子改変真核細胞。
【請求項５８】
前記遺伝子改変真核細胞上のベータ２ミクログロブリンの細胞表面発現が、対照細胞上の細胞表面ベータ２ミクログロブリン発現と比較して７５％〜９５％低下している、請求項５４〜５７のいずれか一項に記載の遺伝子改変真核細胞。
【請求項５９】
前記遺伝子改変真核細胞上のベータ２ミクログロブリンの細胞表面発現が、対照細胞上の細胞表面ベータ２ミクログロブリン発現と比較して９０％〜９５％低下している、請求項５４〜５８のいずれか一項に記載の遺伝子改変真核細胞。
【請求項６０】
前記対照細胞が、細胞表面ベータ２ミクログロブリン発現を低下させるように遺伝子改変されていない、請求項５６〜５９のいずれか一項に記載の遺伝子改変真核細胞。
【請求項６１】
前記阻害性核酸分子が、ＭＨＣクラスＩ分子の構成要素に対して阻害性である、請求項４６〜５３のいずれか一項に記載の遺伝子改変真核細胞。
【請求項６２】
前記遺伝子改変真核細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現が、対照細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現と比較して１０％〜９５％低下している、請求項６１に記載の遺伝子改変真核細胞。
【請求項６３】
前記遺伝子改変真核細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現が、対照細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現と比較して５０％〜９５％低下している、請求項６２又は請求項６３に記載の遺伝子改変真核細胞。
【請求項６４】
前記遺伝子改変真核細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現が、対照細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現と比較して７５％〜９５％低下している、請求項６１〜６３のいずれか一項に記載の遺伝子改変真核細胞。
【請求項６５】
前記遺伝子改変真核細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現が、対照細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現と比較して９０％〜９５％低下している、請求項６１〜６４のいずれか一項に記載の遺伝子改変真核細胞。
【請求項６６】
前記対照細胞が、ＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現を低下させるように遺伝子改変されていない、請求項６２〜６５のいずれか一項に記載の遺伝子改変真核細胞。
【請求項６７】
前記遺伝子改変真核細胞が、対照細胞と比較した場合、内因性ＮＫ細胞殺傷の影響を受けにくく、前記遺伝子改変真核細胞が、対照細胞と比較した場合、被験体において持続性が延長されており、前記遺伝子改変真核細胞が、対照細胞と比較した場合、被験体において増強された拡大を示し、及び／又は前記遺伝子改変真核細胞の同種異系性が、対照細胞と比較した場合、低下されている、請求項５４〜６６のいずれか一項に記載の遺伝子改変真核細胞。
【請求項６８】
前記遺伝子改変真核細胞が遺伝子改変ヒトＴ細胞である、請求項４６〜６７のいずれか一項に記載の遺伝子改変真核細胞。
【請求項６９】
前記遺伝子改変真核細胞が遺伝子改変ヒトＴ細胞であり、前記操作された抗原受容体がキメラ抗原受容体又は外因性Ｔ細胞受容体である、請求項５４〜６７のいずれか一項に記載の遺伝子改変真核細胞。
【請求項７０】
前記阻害性核酸分子がヒトＣＤ５２に対して阻害性である、請求項４６〜５３のいずれか一項に記載の遺伝子改変真核細胞。
【請求項７１】
前記遺伝子改変真核細胞により発現される操作された抗原受容体をコードする核酸配列をそのゲノム中に含む遺伝子改変真核細胞であって、ここで、前記遺伝子改変真核細胞上のベータ２ミクログロブリンの細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ベータ２ミクログロブリン発現と比較して１０％〜９５％低下している、遺伝子改変真核細胞。
【請求項７２】
前記遺伝子改変真核細胞上のベータ２ミクログロブリンの細胞表面発現が、対照細胞上の細胞表面ベータ２ミクログロブリン発現と比較して５０％〜９５％低下している、請求項７１に記載の遺伝子改変真核細胞。
【請求項７３】
前記遺伝子改変真核細胞上のベータ２ミクログロブリンの細胞表面発現が、対照細胞上の細胞表面ベータ２ミクログロブリン発現と比較して７５％〜９５％低下している、請求項７１又は請求項７２に記載の遺伝子改変真核細胞。
【請求項７４】
前記遺伝子改変真核細胞上のベータ２ミクログロブリンの細胞表面発現が、対照細胞上の細胞表面ベータ２ミクログロブリン発現と比較して９０％〜９５％低下している、請求項７１〜７３のいずれか一項に記載の遺伝子改変真核細胞。
【請求項７５】
前記対照細胞が、ベータ２ミクログロブリンの細胞表面発現を低下させるように遺伝子改変されていない、請求項７１〜７４のいずれか一項に記載の遺伝子改変真核細胞。
【請求項７６】
前記遺伝子改変真核細胞が、そのゲノム中に、ベータ２ミクログロブリンに対して阻害性の阻害性核酸分子をコードする核酸配列を含む、請求項７１〜７５のいずれか一項に記載の遺伝子改変真核細胞。
【請求項７７】
遺伝子改変真核細胞であって、前記遺伝子改変真核細胞により発現される操作された抗原受容体をコードする核酸配列をそのゲノム中に含み、ここで、前記遺伝子改変真核細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現が、対照細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現と比較して１０％〜９５％低下している、遺伝子改変真核細胞。
【請求項７８】
前記遺伝子改変真核細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現が、対照細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現と比較して５０％〜９５％低下している、請求項７７に記載の遺伝子改変真核細胞。
【請求項７９】
前記遺伝子改変真核細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現が、対照細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現と比較して７５％〜９５％低下している、請求項７７又は請求項７８に記載の遺伝子改変真核細胞。
【請求項８０】
前記遺伝子改変真核細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現が、対照細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現と比較して９０％〜９５％低下している、請求項７７〜７９のいずれか一項に記載の遺伝子改変真核細胞。
【請求項８１】
前記対照細胞が、ＭＨＣクラスＩ分子の構成要素の細胞表面発現を低下させるように遺伝子改変されていない、請求項７７〜８０のいずれか一項に記載の遺伝子改変真核細胞。
【請求項８２】
前記遺伝子改変真核細胞が、そのゲノム中に、ＭＨＣクラスＩ分子の構成要素に対して阻害性の阻害性核酸分子をコードする核酸配列を含む、請求項７７〜８１に記載の遺伝子改変真核細胞。
【請求項８３】
前記ＭＨＣクラスＩ分子の構成要素がベータ２ミクログロブリンである、請求項８２に記載の遺伝子改変真核細胞。
【請求項８４】
前記阻害性核酸分子がＲＮＡ干渉分子である、請求項７６、８２、又は８３のいずれか一項に記載の遺伝子改変真核細胞。
【請求項８５】
前記ＲＮＡ干渉分子が、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ヘアピンｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、前駆体ｍｉＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡ適合ｓｈＲＮＡである、請求項８４に記載の遺伝子改変真核細胞。
【請求項８６】
前記ＲＮＡ干渉分子がｓｈＲＮＡである、請求項８４又は請求項８５に記載の遺伝子改変真核細胞。
【請求項８７】
前記操作された抗原受容体をコードする核酸配列が、前記阻害性核酸分子をコードする前記核酸配列とゲノム内の同じ位置に統合されている、請求項７６、又は８２〜８６のいずれか一項に記載の遺伝子改変真核細胞。
【請求項８８】
前記遺伝子改変真核細胞が、そのゲノム中に請求項１〜３１のいずれか一項に記載の前記核酸分子を含む、請求項８７に記載の遺伝子改変真核細胞。
【請求項８９】
前記遺伝子改変真核細胞が請求項３２〜３８のいずれか一項に記載の前記核酸分子を含む、請求項８７に記載の遺伝子改変真核細胞。
【請求項９０】
前記操作された抗原受容体をコードする核酸配列が、前記阻害性核酸分子をコードする前記核酸配列とは異なるゲノム内の位置に統合されている、請求項７６又は８２〜８６のいずれか一項に記載の遺伝子改変真核細胞。
【請求項９１】
前記遺伝子改変真核細胞が、対照細胞と比較した場合、内因性ＮＫ細胞殺傷の影響を受けにくく、前記遺伝子改変真核細胞が、対照細胞と比較した場合、被験体において持続性が延長されており、前記遺伝子改変真核細胞が、対照細胞と比較した場合、被験体において増強された拡大を示し、及び／又は前記遺伝子改変真核細胞の同種異系性が、対照細胞と比較した場合、低下されている、請求項７１〜９０のいずれか一項に記載の遺伝子改変真核細胞。
【請求項９２】
前記操作された抗原受容体がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又は外因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）である、請求項７１〜９１のいずれか一項に記載の遺伝子改変真核細胞。
【請求項９３】
前記遺伝子改変真核細胞が遺伝子改変されたヒトＴ細胞である、請求項７１〜９２のいずれか一項に記載の遺伝子改変真核細胞。
【請求項９４】
前記遺伝子改変ヒトＴ細胞がキメラ抗原受容体又は外因性Ｔ細胞受容体を発現する、請求項９３に記載の遺伝子改変真核細胞。
【請求項９５】
遺伝子改変真核細胞を産生する方法であって、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の前記核酸分子；及び
（ａ）前記ヌクレアーゼ認識配列に対して特異性を有する操作されたヌクレアーゼをコードする核酸であって、前記操作されたヌクレアーゼが前記細胞内で発現される、核酸；又は
（ｂ）前記ヌクレアーゼ認識配列に対して特異性を有する操作されたヌクレアーゼタンパク質、
を前記細胞に導入することを含み、
ここで、前記操作されたヌクレアーゼが、前記細胞のゲノム中の前記ヌクレアーゼ認識配列を認識して切断し、切断部位を生成し、
請求項１〜３８のいずれか一項に記載の前記核酸分子が前記切断部位で前記細胞のゲノムに挿入される、遺伝子改変真核細胞を産生する方法。
【請求項９６】
前記操作されたヌクレアーゼが、操作されたメガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、コンパクトＴＡＬＥＮ、又はメガＴＡＬである、請求項９５記載の方法。
【請求項９７】
前記操作されたヌクレアーゼが、操作されたメガヌクレアーゼである、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記ヌクレアーゼ認識配列がヒトＴ細胞受容体アルファ定常領域遺伝子内にある、請求項９５〜９７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９９】
前記ヌクレアーゼ認識配列が配列番号１を含む、請求項９５〜９８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
内因性Ｔ細胞受容体の細胞表面発現が対照細胞と比較して低下している、請求項９８又は請求項９９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０１】
前記操作されたヌクレアーゼをコードする前記核酸がｍＲＮＡである、請求項９５〜１００のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０２】
前記ｍＲＮＡが、前記操作されたヌクレアーゼと、少なくとも１つの追加のポリペプチド又は核酸分子とをコードするポリシストロニックｍＲＮＡである、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
請求項１〜３８のいずれか一項に記載の前記核酸分子が、ウイルスベクターを使用して前記細胞に導入される、請求項９５〜１０２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０４】
前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、又はＡＡＶベクターである、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記ウイルスベクターが組換えＡＡＶベクターである、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記ウイルスベクターが請求項４３〜４５のいずれか一項に記載の前記ウイルスベクターである、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０７】
請求項１〜３８のいずれか一項に記載の前記核酸分子が、組換えＤＮＡコンストラクトを使用して前記細胞に導入される、請求項９５〜１０２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０８】
前記組換えＤＮＡコンストラクトが請求項３９〜４２のいずれか一項に記載の前記組換えＤＮＡコンストラクトである、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
請求項１〜３８のいずれか一項に記載の前記核酸分子が、相同組換えにより前記切断部位で前記細胞のゲノムに挿入される、請求項９５〜１０８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１０】
前記阻害性核酸分子がヒトベータ２ミクログロブリンに対して阻害性である、請求項９５〜１０９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１１】
前記遺伝子改変真核細胞上のベータ２ミクログロブリンの細胞表面発現が、対照細胞上の細胞表面ベータ２ミクログロブリン発現と比較して１０％〜９５％低下している、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
前記遺伝子改変真核細胞上のベータ２ミクログロブリンの細胞表面発現が、対照細胞上の細胞表面ベータ２ミクログロブリン発現と比較して５０％〜９５％低下している、請求項１１０又は請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
前記遺伝子改変真核細胞でのベータ２ミクログロブリンの細胞表面発現が、対照細胞上の細胞表面ベータ２ミクログロブリン発現と比較して７５％から９５％低下している、請求項１１０〜１１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１４】
前記遺伝子改変真核細胞でのベータ２ミクログロブリンの細胞表面発現が、対照細胞上の細胞表面ベータ２ミクログロブリン発現と比較して９０％から９５％低下している、請求項１１０〜１１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１５】
前記対照細胞が、細胞表面ベータ２ミクログロブリン発現を低下させるように遺伝子改変されていない、請求項１１１〜１１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１６】
前記阻害性核酸分子がＭＨＣクラスＩ分子の構成要素に対して阻害性である、請求項９５〜１０９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１７】
前記遺伝子改変真核細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現が、対照細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現と比較して１０％〜９５％低下している、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
前記遺伝子改変真核細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現が、対照細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現と比較して５０％〜９５％低下している、請求項１１６又は請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
前記遺伝子改変真核細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現が、対照細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現と比較して７５％〜９５％低下している、請求項１１６〜１１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２０】
前記遺伝子改変真核細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現が、対照細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現と比較して９０％〜９５％低下する、請求項１１６〜１１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２１】
前記対照細胞が、ＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現を低下させるように遺伝子改変されていない、請求項１１７〜１２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２２】
前記操作された抗原受容体がキメラ抗原受容体又は外因性Ｔ細胞受容体である、請求項９５〜１２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２３】
前記遺伝子改変真核細胞がヒトＴ細胞である、請求項９５〜１２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２４】
前記遺伝子改変真核細胞が遺伝子改変ヒトＴ細胞であり、前記操作された抗原受容体がキメラ抗原受容体又は外因性Ｔ細胞受容体である、請求項１１０〜１２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２５】
前記阻害性核酸分子がヒトＣＤ５２に対して阻害性である、請求項９５〜１０９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２６】
請求項９５〜１２５のいずれか一項に記載の方法により作製された、遺伝子改変真核細胞。
【請求項１２７】
請求項１２４に記載の方法によって作製された遺伝子改変真核細胞。
【請求項１２８】
薬学的に許容可能な担体と、治療的有効量の請求項４６〜９４、１２６、又は１２７のいずれか一項に記載の前記遺伝子改変真核細胞とを含む医薬組成物。
【請求項１２９】
薬学的に許容可能な担体と、治療的に有効な量の請求項６９、９４、又は１２７のいずれか一項に記載の前記遺伝子改変真核細胞とを含む医薬組成物であって、ここで、前記遺伝子改変真核細胞が遺伝子改変ヒトＴ細胞であり、前記操作された抗原受容体がキメラ抗原受容体又は外因性Ｔ細胞受容体であり、前記遺伝子改変ヒトＴ細胞上のベータ２ミクログロブリンの細胞表面発現が、対照細胞上の細胞表面ベータ２ミクログロブリン発現と比較して１０％〜９５％、５０％〜９５％、７５％〜９５％、又は９０％〜９５％低下する、医薬組成物。
【請求項１３０】
薬学的に許容可能な担体と、治療的有効量の請求項６９、９４、又は１２７のいずれか一項に記載の前記遺伝子改変真核細胞とを含む医薬組成物であって、
ここで、前記遺伝子改変真核細胞が遺伝子改変ヒトＴ細胞であり、前記操作された抗原受容体がキメラ抗原受容体又は外因性Ｔ細胞受容体であり、
前記遺伝子改変ヒトＴ細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現が、対照細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現と比較して１０％〜９５％、５０％〜９５％、７５％〜９５％、又は９０％〜９５％低下する、医薬組成物。
【請求項１３１】
薬学的に許容可能な担体と、治療的有効量の請求項７０又は請求項１２６のいずれか一項に記載の前記遺伝子改変真核細胞とを含む医薬組成物であって、
ここで、前記遺伝子改変真核細胞が遺伝子改変ヒトＴ細胞であり、前記操作された抗原受容体がキメラ抗原受容体であり、
前記遺伝子改変ヒトＴ細胞上のＣＤ５２の細胞表面発現が、対照細胞上のＣＤ５２の細胞表面発現と比較して１０％〜９５％、５０％〜９５％、７５％〜９５％、又は９０％〜９５％低下する、医薬組成物。
【請求項１３２】
前記医薬組成物が、それを必要とする被験体の癌の治療における免疫療法用である、請求項１２８〜１３１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１３３】
免疫療法を使用して、それを必要とする被験体において疾患を治療する方法であって、
前記方法が、治療的有効量の請求項６９、９４、又は１２７のいずれか一項に記載の前記遺伝子改変真核細胞を前記被験体に投与することを含み；
ここで、前記遺伝子改変真核細胞が、キメラ抗原受容体又は外因性Ｔ細胞受容体を発現する遺伝子改変ヒトＴ細胞であり；
前記遺伝子改変ヒトＴ細胞上のベータ２ミクログロブリンの細胞表面発現が、対照細胞上の細胞表面ベータ２ミクログロブリン発現と比較して１０％〜９５％、５０％〜９５％、７５％〜９５％、又は９０％〜９５％低下する、免疫療法を使用して、それを必要とする被験体において疾患を治療する方法。
【請求項１３４】
前記遺伝子改変ヒトＴ細胞の内因性ＮＫ細胞殺傷が、細胞表面ベータ２ミクログロブリン発現を有さない遺伝子改変ヒトＴ細胞と比較した場合、前記被験体において低下している、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１３５】
前記被験体に請求項１２９に記載の前記医薬組成物が投与される、請求項１３３又は請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３６】
前記遺伝子改変ヒトＴ細胞が前記被験体に対して同種異系である、請求項１３３〜１３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３７】
前記遺伝子改変ヒトＴ細胞の持続性が、細胞表面ベータ２ミクログロブリン発現を有さない遺伝子改変ヒトＴ細胞と比較した場合、又は野生型レベルのベータ２ミクログロブリンの細胞表面発現を有する遺伝子改変ヒトＴ細胞と比較した場合、前記被験体において延長されている、請求項１３３〜１３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３８】
前記遺伝子改変ヒトＴ細胞の拡大が、細胞表面ベータ２ミクログロブリン発現を有さない遺伝子改変ヒトＴ細胞と比較した場合、又は野生型レベルのベータ２ミクログロブリンの細胞表面発現を有する遺伝子改変ヒトＴ細胞と比較した場合、前記被験体において増強されている、請求項１３３〜１３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３９】
前記遺伝子改変ヒトＴ細胞の同種異系性が、野生型レベルのベータ２ミクログロブリンの細胞表面発現を有する遺伝子改変ヒトＴ細胞と比較した場合、低下している、請求項１３３〜１３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４０】
免疫療法を使用して、それを必要とする被験体において疾患を治療する方法であって、前記方法が、治療的有効量の請求項６９、９４、又は１２７のいずれか一項に記載の前記遺伝子改変真核細胞を前記被験体に投与することを含み；
ここで、前記遺伝子改変真核細胞が、キメラ抗原受容体又は外因性Ｔ細胞受容体を発現する遺伝子改変ヒトＴ細胞であり；
ここで、前記遺伝子改変ヒトＴ細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現が、対照細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の発現と比較して１０％〜９５％、５０％〜９５％、７５％〜９５％、又は９０％〜９５％低下する、免疫療法を使用して、それを必要とする被験体において疾患を治療する方法。
【請求項１４１】
前記遺伝子改変ヒトＴ細胞の内因性ＮＫ細胞殺傷が、細胞表面ＭＨＣクラスＩ分子発現を有さない遺伝子改変ヒトＴ細胞と比較した場合、前記被験体において低下している、請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４２】
前記被験体に請求項１３０の前記医薬組成物が投与される、請求項１４０又は請求項１４１に記載の方法。
【請求項１４３】
前記遺伝子改変されたヒトＴ細胞が前記被験体に対して同種異系である、請求項１４０〜１４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４４】
前記遺伝子改変ヒトＴ細胞の持続性が、細胞表面ＭＨＣクラスＩ分子発現を有さない遺伝子改変ヒトＴ細胞と比較した場合、又は野生型レベルのＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現を有する遺伝子改変ヒトＴ細胞と比較した場合、前記被験体において延長されている、請求項１４０〜１４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４５】
前記遺伝子改変ヒトＴ細胞の拡大が、細胞表面ＭＨＣクラスＩ分子発現を有さない遺伝子改変ヒトＴ細胞と比較した場合、又は野生型レベルのＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現を有する遺伝子改変ヒトＴ細胞と比較した場合、前記被験体において増強されている、請求項１４０〜１４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４６】
前記遺伝子改変ヒトＴ細胞の同種異系性が、野生型レベルのＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現を有する遺伝子改変ヒトＴ細胞と比較した場合、低下している、請求項１４０〜１４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４７】
免疫療法を使用して、それを必要とする被験体において疾患を治療する方法であって、
前記方法が、治療的有効量の請求項７０又は請求項１２６のいずれか一項に記載の前記遺伝子改変真核細胞を前記被験体に投与することを含み；
ここで、前記遺伝子改変真核細胞が、キメラ抗原受容体及びＣＤ５２に対する阻害性核酸を発現する遺伝子改変ヒトＴ細胞であり；
前記遺伝子改変ヒトＴ細胞上のＣＤ５２の細胞表面発現が、対照細胞上の細胞表面ＣＤ５２発現と比較して１０％〜９５％、５０％〜９５％、７５％〜９５％、又は９０％〜９５％低下する、免疫療法を使用して、それを必要とする被験体において疾患を治療する方法。
【請求項１４８】
前記被験体に請求項１３１の前記医薬組成物が投与される、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１４９】
前記疾患が癌である、請求項１３３〜１４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５０】
前記癌が、癌腫、リンパ腫、肉腫、芽細胞腫、及び白血病の癌からなる群から選択される、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５１】
前記癌が、Ｂ細胞起源の癌、乳癌、胃癌、神経芽腫、骨肉腫、肺癌、黒色腫、前立腺癌、結腸癌、腎細胞癌腫、卵巣癌、横紋筋肉腫、白血病、及びホジキンリンパ腫からなる群から選択される、請求項１４９又は請求項１５０に記載の方法。
【請求項１５２】
前記Ｂ細胞起源の癌が、Ｂ系統の急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病、及びＢ細胞非ホジキンリンパ腫からなる群から選択される、請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５３】
操作された抗原受容体を含む遺伝子改変真核細胞の濃縮された集団を調製する方法であって、前記方法が、請求項７０又は請求項１２６に記載の前記遺伝子改変真核細胞、及び野生型レベルの細胞表面ＣＤ５２を発現する細胞を含む細胞集団を調製することを含み、ここで、前記遺伝子改変細胞上のＣＤ５２の細胞表面発現が、対照細胞上の細胞表面ＣＤ５２発現と比較して、１０％〜９５％、５０％〜９５％、７５％〜９５％、又は９０％〜９５％低下し、前記方法が以下：
（ａ）前記細胞集団を抗ＣＤ５２結合分子に複合化したビーズと接触させる工程であって、ここで、野生型レベルの細胞表面ＣＤ５２を発現する細胞は前記ビーズに結合され、前記遺伝子改変真核細胞は前記ビーズに結合していない工程、
（ｂ）前記細胞集団から前記ビーズを除去して、前記細胞の濃縮集団を産生する工程であって、ここで、前記細胞の濃縮集団が、前記遺伝子改変真核細胞について濃縮されている工程、
を含む、操作された抗原受容体を含む遺伝子改変真核細胞の濃縮された集団を調製する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、分子生物学及び組換え核酸技術の分野に関する。特に、本開示は、キメラ抗原受容体又は外因性Ｔ細胞受容体等の操作された抗原受容体をコードする核酸分子、及びＲＮＡ干渉分子等の阻害性核酸分子に関する。本開示はさらに、核酸、ＤＮＡコンストラクト、ウイルスベクター、医薬組成物、遺伝子改変細胞、及び本発明の核酸分子を利用する治療方法に関する。
【０００２】
提出された配列表に対する参照
ＥＦＳ−ＷＥＢによるテキストファイル
本出願には、ＥＦＳ−ＷｅｂによりＡＳＣＩＩ形式で提出された配列表が含まれており、その全体が参照することで本明細書の一部をなす。２０１８年５月８日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーの名前はＰ１０９０７００２３ＷＯ００−ＳＥＱ−ＭＪＴ．ＴＸＴであり、サイズは１８８５７９バイトである。
【背景技術】
【０００３】
Ｔ細胞養子免疫療法は、癌治療の有望なアプローチである。この戦略は、特定の腫瘍関連抗原に対する特異性を高めるために遺伝子改変された単離されたヒトＴ細胞を利用する。遺伝子改変には、抗原特異性をＴ細胞にグラフトするためのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又は外因性Ｔ細胞受容体の発現が含まれる場合がある。外因性Ｔ細胞受容体とは対照的に、ＣＡＲはモノクローナル抗体の可変ドメインから特異性を引き出す。したがって、ＣＡＲを発現するＴ細胞は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の非限定的な方法で腫瘍免疫反応性を誘導する。今日まで、Ｔ細胞養子免疫療法は、Ｂ細胞悪性腫瘍（例、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、及び慢性リンパ球性白血病）、多発性骨髄腫、神経芽腫、膠芽腫、進行性神経膠腫、卵巣癌、中皮腫、黒色腫、及び膵臓癌を含む多くの癌の臨床療法として利用されてきた。
【０００４】
癌治療としての潜在的な有用性にもかかわらず、養子免疫療法は、部分的には、宿主組織と同種異系ＣＡＲ  Ｔ細胞との間の同種反応性によって制限されてきた。同種反応性の原因の１つは、ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞表面に非宿主ＭＨＣクラスＩ分子が存在することである。ＭＨＣクラスＩ分子は、２つのポリペプチド鎖、α及びβで構成されている。ヒトでは、α鎖は３つのサブユニット、α１、α２、及びα３からなり、これらは第６染色体上の多型ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子によってコードされている。ＨＬＡ遺伝子座の多様性、及びコードされたα鎖サブユニットは、外来ＭＨＣクラスＩ分子を保有しているため、同種異系のＣＡＲ  Ｔ細胞を宿主免疫系によって外来細胞として見る可能性がある。その結果、患者に投与されたＣＡＲ  Ｔ細胞は、宿主の細胞傷害性Ｔ細胞によって認識され、殺傷される、宿主対移植片（ＨｖＧ）拒絶を受ける可能性がある。
【０００５】
ＭＨＣクラスＩ分子のβ鎖は、第１５染色体上の非多型ベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子（配列番号１）によってコードされるベータ２ミクログロブリンからなる。ベータ２ミクログロブリンは、α３サブユニットに非共有結合し、全てのＭＨＣクラスＩ分子に共通している。さらに、細胞表面でのＭＨＣクラスＩ分子の発現には、ベータ２ミクログロブリンとの結合が必要である。このように、ベータ２ミクログロブリンは、ＣＡＲ  Ｔ細胞でのＭＨＣクラスＩ分子の発現を抑制するための論理的なターゲットを表し、これにより、宿主の細胞傷害性Ｔ細胞に対して細胞が見えなくなり、同種反応性が低下する可能性がある。しかしながら、ベータ２ミクログロブリン発現の完全なノックアウトにより、細胞表面ＭＨＣクラスＩ分子が不足するため、ＮＫ細胞がＣＡＲ  Ｔ細胞を殺傷する可能性があり、これにより、ＮＫ細胞はそれらを非自己として認識し、細胞傷害性作用を開始し得る。
【０００６】
ＣＡＲ  Ｔ細胞に対する同種反応性の別の原因は、細胞表面での内因性Ｔ細胞受容体の発現である。Ｔ細胞受容体は典型的には、可変α鎖及びβ鎖、又は少数ではあるが可変γ鎖及びδ鎖からなる。Ｔ細胞受容体は、ＣＤ３を含むアクセサリタンパク質と複合体を形成し、細胞表面共受容体（ＣＤ４やＣＤ８等）と機能して、抗原提示細胞上のＭＨＣ分子に結合した抗原を認識する。同種異系ＣＡＲ  Ｔ細胞の場合、内因性Ｔ細胞受容体の発現は、患者への投与後に細胞に宿主ＭＨＣ抗原を認識させ、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の発症につながる可能性がある。
【０００７】
同種反応性を未然に防ぐため、臨床試験は主に自己ＣＡＲ  Ｔ細胞の使用に焦点を当て、ドナーのＴ細胞を単離し、遺伝子改変してキメラ抗原受容体を組み込んでから同じ被験体に再注入する。自己アプローチは、投与されたＣＡＲ  Ｔ細胞に免疫寛容を提供するが、このアプローチは、患者の癌が診断された後に患者特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞を産生するのに必要な時間と費用の両方によって制約される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、同種異系性の減少を示すが、同時に、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＮＫ細胞の死滅を回避する同種異系ＣＡＲ  Ｔ細胞の開発に対する必要性が当技術分野に存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一態様では、本発明は、以下：（ａ）操作された抗原受容体をコードする核酸配列を含む第１の発現カセットと；（ｂ）阻害性核酸分子をコードする核酸配列を含む第２の発現カセットと；（ｃ）５´相同性アームと；（ｄ）３´相同性アームと、を含み；ここで、５´相同性アーム及び３´相同性アームは、目的の遺伝子のヌクレアーゼ認識配列に隣接する染色体領域に対して相同性を有する、核酸分子を提供する。
【００１０】
いくつかの実施形態では、阻害性核酸分子はＲＮＡ干渉分子である。特定の実施形態では、ＲＮＡ干渉分子は、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ヘアピンｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、前駆体ｍｉＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡ適合ｓｈＲＮＡである。特定の実施形態では、ＲＮＡ干渉分子はｓｈＲＮＡである。
【００１１】
いくつかの実施形態では、操作された抗原受容体はキメラ抗原受容体である。他の実施形態では、操作された抗原受容体は外因性Ｔ細胞受容体である。
【００１２】
いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ認識配列は、操作されたメガヌクレアーゼ認識配列、ＴＡＬＥＮ認識配列、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）認識配列、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ認識配列、コンパクトＴＡＬＥＮ認識配列、又はメガＴＡＬ認識配列である。特定の実施形態では、ヌクレアーゼ認識配列は、操作されたメガヌクレアーゼ認識配列である。
【００１３】
いくつかの実施形態では、目的の遺伝子は目的の任意の遺伝子である。特定の実施形態では、目的の遺伝子は、ヒトＴ細胞受容体アルファ定常領域遺伝子である。特定の実施形態では、ヌクレアーゼ認識配列は、操作されたメガヌクレアーゼ認識配列である。特定の実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼ認識配列は、ヒトＴ細胞受容体アルファ定常領域遺伝子に配列番号１を含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、第１の発現カセットは、操作された抗原受容体の発現を駆動するプロモータを更に含む。特定の実施形態では、プロモータはＪｅＴプロモータである。
【００１５】
いくつかの態様では、第２の発現カセットは、阻害性核酸分子の発現を駆動するプロモータを更に含む。特定の実施形態では、プロモータはＵ６プロモータである。
【００１６】
いくつかの実施形態では、第１の発現カセットは、操作された抗原受容体の翻訳を終結させるためのポリアデニル化シグナルを含む。いくつかの実施形態では、第２の発現カセットは、阻害性核酸の翻訳を終結させるための中央ポリプリントラクト及び中央ターミネータ配列（ｃＰＰＴ／ＣＴＳ）の配列を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、第１の発現カセット及び第２の発現カセットは、核酸分子内で同じ向きにある。特定の実施形態では、第１の発現カセット及び第２の発現カセットは、５´及び３´の相同性アームに対して５´から３´の向きにある。いくつかのかかる実施形態では、第１の発現カセットは、第２の発現カセットの５´上流にある。他のかかる実施形態では、第２の発現カセットは、第１の発現カセットの５´上流にある。
【００１８】
いくつかの実施形態では、第１の発現カセット及び第２の発現カセットが核酸分子内で同じ向きにあり、第１の発現カセット及び第２の発現カセットは、５´及び３´の相同性アームに対して３´から５´の向きにある。いくつかのかかる実施形態では、第１の発現カセットは、第２の発現カセットの５´上流にある。他のかかる実施形態では、第２の発現カセットは、第１の発現カセットの５´上流にある。
【００１９】
いくつかの実施形態では、第１の発現カセット及び第２の発現カセットは、核酸分子内で反対の向きにある。いくつかのかかる実施形態では、第１の発現カセットは、５´及び３´の相同性アームに対して３´から５´の向きにあり、第２の発現カセットは５´から３´の向きにある。特定の実施形態では、第１の発現カセットは、第２の発現カセットの５´上流にある。他の実施形態では、第２の発現カセットは、第１の発現カセットの５´上流にある。
【００２０】
特定の実施形態では、第１の発現カセット及び第２の発現カセットは核酸分子内で反対の向きにあり、５´及び３´の相同性アームに対して第１の発現カセットは５´から３´の向きにあり、第２の発現カセットは３´から５´の向きにある。いくつかのかかる実施形態では、第１の発現カセットは、第２の発現カセットの５´上流にある。他のかかる実施形態では、第２の発現カセットは、第１の発現カセットの５´上流にある。
【００２１】
いくつかの実施形態では、核酸分子は、第２の発現カセットの複数のコピーを含む。いくつかのかかる実施形態では、コピーは同一である。さらなる実施形態では、コピーは、プロモータ、阻害性核酸分子のコード配列、及び阻害性核酸分子の翻訳を終結させるための（ｃＰＰＴ／ＣＴＳ）配列等の配列を含む。いくつかのかかる実施形態では、第２の発現カセットのコピーは、核酸分子内でタンデムであり、同じ向き又は反対の向きであってもよい。他のかかる実施形態では、コピーはタンデムでなくてもよく、同じ向き又は反対の向きでもよい。
【００２２】
いくつかの態様では、核酸分子は、第１の発現カセット及び第２の発現カセットに隣接する５´逆方向末端反復及び３´逆方向末端反復を更に含む。
【００２３】
いくつかの実施形態では、阻害性核酸分子は、ヒトベータ２ミクログロブリンに対して阻害性である。
【００２４】
いくつかの実施形態では、阻害性核酸分子は、ＭＨＣクラスＩ分子の構成要素に対して阻害性である。特定の実施形態では、阻害分子は、ＭＨＣクラスＩアルファ−１（α１）ドメイン、アルファ−２（α２）ドメイン、アルファ−３（α３）ドメイン、又はベータ２ミクログロブリンに対して阻害性である。
【００２５】
いくつかの態様では、阻害性核酸分子はヒトＣＤ５２に対して阻害性である。
【００２６】
特定の実施形態では、阻害性核酸分子は、ベータ２ミクログロブリンに対して阻害性のｓｈＲＮＡであり、ｓｈＲＮＡは、配列番号２〜配列番号４のいずれか１つを含む配列を有する。特定の実施形態では、ｓｈＲＮＡは配列番号２を含む配列を有する。いくつかのかかる実施形態では、第１の発現カセット及び第２の発現カセットは、５´及び３´の相同性アームに対して３´から５´向きにあり、第１の発現カセットは第２の発現カセットの５´上流にある。いくつかのかかる実施形態では、第１の発現カセットは：（ｉ）キメラ抗原受容体又は外因性Ｔ細胞受容体をコードする核酸配列と；（ｉｉ）キメラ抗原受容体又は外因性Ｔ細胞受容体の発現を駆動するＪｅＴプロモータと；（ｉｉｉ）ポリＡ配列とを含み；第２の発現カセットは、（ｉｖ）ｓｈＲＮＡをコードする核酸配列と；（ｖ）ｓｈＲＮＡの発現を駆動するＵ６プロモータと；（ｖｉ）中央ポリプリントラクト及び中央ターミネータ配列（ｃＰＰＴ／ＣＴＳ）の配列と、を含む。
【００２７】
特定の実施形態では、阻害性核酸分子は、ベータ２ミクログロブリンに対して阻害性のｓｈＲＮＡであり、ｓｈＲＮＡは、配列番号２〜配列番号４のいずれか１つを含む配列を有する。特定の実施形態では、ｓｈＲＮＡは配列番号２を含む配列を有する。いくつかのかかる実施形態では、５´及び３´相同性アームに対して、第１の発現カセットは３´から５´の向きにあり、第２の発現カセットは５´から３´の向きにあり、第１の発現カセットは第２の発現カセットの５´上流にある。いくつかのかかる実施形態では、第１の発現カセットは：（ｉ）キメラ抗原受容体又は外因性Ｔ細胞受容体をコードする核酸配列と；（ｉｉ）キメラ抗原受容体又は外因性Ｔ細胞受容体の発現を駆動するＪｅＴプロモータと；（ｉｉｉ）ポリＡ配列とを含み；第２の発現カセットは、（ｉｖ）ｓｈＲＮＡをコードする核酸配列と；（ｖ）ｓｈＲＮＡの発現を駆動するＵ６プロモータと；（ｖｉ）中央ポリプリントラクト及び中央ターミネータ配列（ｃＰＰＴ／ＣＴＳ）の配列と、を含む。いくつかのかかる実施形態では、核酸分子は、第２の発現カセットの第１のコピー及び第２のコピーを含み、第１のコピー及び第２のコピーは同一であり、第１のコピー及び第２のコピーはタンデムにあり、さらに第１のコピーと２番目のコピーは同じ向きにある。
【００２８】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載される本発明の任意の核酸分子を含む組換えＤＮＡコンストラクトを提供する。
【００２９】
いくつかの態様では、組換えＤＮＡコンストラクトはウイルスベクターをコードする。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。特定の実施形態では、ウイルスベクターは組換えＡＡＶベクターである。
【００３０】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載される本発明の任意の核酸分子を含むウイルスベクターを提供する。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。特定の実施形態では、ウイルスベクターは組換えＡＡＶベクターである。
【００３１】
別の態様では、本発明は、遺伝子改変真核細胞を産生する方法を提供し、該方法は、本明細書に記載される本発明の任意の核酸分子、及び（ａ）ヌクレアーゼ認識配列に対して特異性を有する操作されたヌクレアーゼをコードする核酸であって、該操作されたヌクレアーゼが細胞内で発現される、核酸又は（ｂ）ヌクレアーゼ認識配列に対して特異性を有する操作されたヌクレアーゼタンパク質を細胞に導入することを含み、ここで、該操作されたヌクレアーゼは、細胞のゲノム中のヌクレアーゼ認識配列を認識して切断し、切断部位を生成し、本発明の核酸分子は該切断部位で細胞のゲノムに挿入される。
【００３２】
上記方法のいくつかの実施形態では、遺伝子改変真核細胞はヒトＴ細胞である。
【００３３】
この方法のいくつかの実施形態では、操作されたヌクレアーゼは、操作されたメガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、コンパクトＴＡＬＥＮ、又はｍｅｇａＴＡＬである。上記方法の特定の実施形態では、操作されたヌクレアーゼは、操作されたメガヌクレアーゼである。
【００３４】
上記方法のいくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ認識配列は、ヒトＴ細胞受容体アルファ定常領域遺伝子内にある。
【００３５】
上記方法の特定の実施形態では、ヌクレアーゼ認識配列は、操作されたメガヌクレアーゼ認識配列である。特定の実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼ認識配列がヒトＴ細胞受容体アルファ定常領域内にあり、該ヌクレアーゼ認識配列は配列番号１を含む。
【００３６】
上記方法のいくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ認識配列がヒトＴ細胞受容体アルファ定常領域内にあり、内因性Ｔ細胞受容体の細胞表面発現は、対照細胞と比較して低下している。
【００３７】
この方法のいくつかの実施形態では、操作されたヌクレアーゼをコードする核酸はｍＲＮＡである。特定の実施形態では、ｍＲＮＡは、操作されたヌクレアーゼ及び少なくとも１つの追加のポリペプチド又は核酸分子をコードするポリシストロニックｍＲＮＡである。
【００３８】
この方法のいくつかの実施形態では、本明細書に記載される本発明の核酸分子は、ウイルスベクターを使用して細胞に導入される。上記方法の特定の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、又はＡＡＶベクターである。上記方法の特定の実施形態では、ウイルスベクターは、本明細書で前述した組換えＡＡＶベクター等の組換えＡＡＶベクターである。
【００３９】
この方法のいくつかの実施形態では、本明細書に記載される本発明の核酸分子は、組換えＤＮＡコンストラクトを使用して細胞に導入される。上記方法の特定の実施形態では、組換えＤＮＡコンストラクトは、本明細書で前述した組換えＤＮＡコンストラクトである。
【００４０】
上記方法のいくつかの実施形態では、本明細書に記載される本発明の核酸分子は、相同組換えにより細胞のゲノムの切断部位に挿入される。
【００４１】
この方法のいくつかの実施形態では、操作された抗原受容体はキメラ抗原受容体である。上記方法の他の実施形態では、操作された抗原受容体は外因性Ｔ細胞受容体である。
【００４２】
この方法のいくつかの実施形態では、阻害性核酸分子は、ヒトベータ２ミクログロブリンに対して阻害性である。上記方法の特定の実施形態では、ベータ２ミクログロブリンの細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ベータ２ミクログロブリン発現の約１％〜〜約５０％である。上記方法の他の実施形態では、ベータ２ミクログロブリンの細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ベータ２ミクログロブリン発現の約１％〜約２５％である。上記方法の他の実施形態では、ベータ２ミクログロブリンの細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ベータ２ミクログロブリン発現の約１％〜約１０％である。上記方法の他の実施形態では、ベータ２ミクログロブリンの細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ベータ２ミクログロブリン発現の約１％〜約５％である。上記方法の特定の実施形態では、対照細胞は、細胞表面ベータ２ミクログロブリン発現を低下させるように遺伝子改変されていない。
【００４３】
この方法のいくつかの実施形態では、阻害性核酸分子は、ヒトベータ２ミクログロブリンに対して阻害性である。上記方法の特定の実施形態では、ベータ２ミクログロブリンの細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ベータ２ミクログロブリン発現と比較して１０％〜９５％低下する。上記方法の他の実施形態では、ベータ２ミクログロブリンの細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ベータ２ミクログロブリン発現と比較して５０％〜９５％低下する。この方法の他の実施形態では、ベータ２ミクログロブリンの細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ベータ２ミクログロブリン発現と比較して７５％〜９５％低下する。上記方法の他の実施形態では、ベータ２ミクログロブリンの細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ベータ２ミクログロブリン発現と比較して９０％〜９５％低下する。上記方法の特定の実施形態では、対照細胞は、細胞表面ベータ２ミクログロブリン発現を低下させるように遺伝子改変されていない。
【００４４】
上記方法のいくつかの実施形態では、阻害性核酸分子は、ＭＨＣクラスＩ分子の構成要素に対して阻害性である。この方法の特定の実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現は、対照細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の発現の約１％〜約５０％である。上記方法の特定の実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現は、対照細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の発現の約１％〜約２５％である。上記方法の特定の実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現は、対照細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の発現の約１％〜約１０％である。この方法の特定の実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現は、対照細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の発現の約１％〜約５％である。上記方法の特定の実施形態では、対照細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現を低下させるように遺伝子改変されていない。
【００４５】
上記方法のいくつかの実施形態では、阻害性核酸分子は、ＭＨＣクラスＩ分子の構成要素に対して阻害性である。上記方法の特定の実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現は、対照細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の発現と比較して１０％〜９５％低下する。上記方法の特定の実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現は、対照細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の発現と比較して５０％〜９５％低下する。上記方法の特定の実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現は、対照細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の発現と比較して７５％〜９５％低下する。上記方法の特定の実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現は、対照細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の発現と比較して９０％〜９５％低下する。上記方法の特定の実施形態では、対照細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現を低下させるように遺伝子改変されていない。
【００４６】
上記方法のいくつかの態様では、阻害性核酸分子はヒトＣＤ５２に対して阻害性である。上記方法の特定の実施形態では、ＣＤ５２の細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ＣＤ５２発現の約１％〜約５０％である。上記方法の他の実施形態では、ＣＤ５２の細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ＣＤ５２発現の約１％〜約２５％である。上記方法の他の実施形態では、ＣＤ５２の細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ＣＤ５２発現の約１％〜約１０％である。上記方法の他の実施形態では、ＣＤ５２の細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ＣＤ５２発現の約１％〜約５％である。上記方法の特定の実施形態では、対照細胞は、ＣＤ５２の細胞表面発現を低下させるように遺伝子改変されていない。
【００４７】
上記方法のいくつかの態様では、阻害性核酸分子はヒトＣＤ５２に対して阻害性である。上記方法の特定の実施形態では、ＣＤ５２の細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ＣＤ５２発現と比較して１０％〜９５％低下する。上記方法の他の実施形態では、ＣＤ５２の細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ＣＤ５２発現と比較して５０％〜９５％低下する。この方法の他の実施形態では、ＣＤ５２の細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ＣＤ５２発現と比較して７５％〜９５％低下する。上記方法の他の実施形態では、ＣＤ５２の細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ＣＤ５２発現と比較して９０％〜９５％低下する。上記方法の特定の実施形態では、対照細胞は、ＣＤ５２の細胞表面発現を低下させるように遺伝子改変されていない。
【００４８】
別の態様では、本発明は、本明細書の上記の方法のいずれかによって作製された遺伝子改変真核細胞を提供する。
【００４９】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載される本発明の任意の核酸分子を含む遺伝子改変真核細胞を提供し、ここで、操作された抗原受容体及び阻害核酸分子は遺伝子改変真核細胞において発現される。
【００５０】
いくつかの実施形態では、遺伝子改変真核細胞は、遺伝子改変されたヒトＴ細胞である。
【００５１】
いくつかの実施形態では、本発明の核酸分子は、ヌクレアーゼ認識配列で遺伝子改変真核細胞のゲノムに挿入される。
【００５２】
いくつかの実施形態では、目的の遺伝子は、ヒトＴ細胞受容体アルファ定常領域遺伝子である。
【００５３】
いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ認識配列は、操作されたメガヌクレアーゼ認識配列、ＴＡＬＥＮ認識配列、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）認識配列、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ認識配列、コンパクトＴＡＬＥＮ認識配列、又はメガＴＡＬ認識配列である。特定の実施形態では、ヌクレアーゼ認識配列は、操作されたメガヌクレアーゼ認識配列である。
【００５４】
特定の実施形態では、ヌクレアーゼ認識配列がヒトＴ細胞受容体アルファ定常領域遺伝子内にあり、該ヌクレアーゼ認識配列は、配列番号１を含む操作されたメガヌクレアーゼ認識配列である。
【００５５】
いくつかの実施形態では、内因性Ｔ細胞受容体の細胞表面発現は、対照細胞と比較して低下している。
【００５６】
いくつかの実施形態では、阻害性核酸分子は、ヒトベータ２ミクログロブリンに対して阻害性である。特定の実施形態では、ベータ２ミクログロブリンの細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ベータ２ミクログロブリン発現の約１％〜約５０％である。他の実施形態では、ベータ２ミクログロブリンの細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ベータ２ミクログロブリン発現の約１％〜約２５％である。他の実施形態では、ベータ２ミクログロブリンの細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ベータ２ミクログロブリン発現の約１％〜約１０％である。他の実施形態では、ベータ２ミクログロブリンの細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ベータ２ミクログロブリン発現の約１％〜約５％である。特定の実施形態では、対照細胞は、細胞表面ベータ２ミクログロブリン発現を低減するように遺伝子改変されていない。
【００５７】
いくつかの実施形態では、阻害性核酸分子は、ヒトベータ２ミクログロブリンに対して阻害性である。特定の実施形態では、ベータ２ミクログロブリンの細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ベータ２ミクログロブリン発現と比較して１０％〜９５％低下する。他の実施形態では、ベータ２ミクログロブリンの細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ベータ２ミクログロブリン発現と比較して５０％〜９５％低下する。他の実施形態では、ベータ２ミクログロブリンの細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ベータ２ミクログロブリン発現と比較して７５％〜９５％低下する。他の実施形態では、ベータ２ミクログロブリンの細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ベータ２ミクログロブリン発現と比較して９０％〜９５％低下する。特定の実施形態では、対照細胞は、細胞表面ベータ２ミクログロブリン発現を低減するように遺伝子改変されていない。
【００５８】
いくつかの実施形態では、阻害性核酸分子は、ＭＨＣクラスＩ分子の構成要素に対して阻害性である。特定の実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現は、対照細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の発現の約１％〜約５０％である。特定の実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現は、対照細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の発現の約１％〜約２５％である。特定の実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現は、対照細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の発現の約１％〜約１０％である。特定の実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現は、対照細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の発現の約１％〜約５％である。特定の実施形態では、対照細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現を低下させるように遺伝子改変されていない。
【００５９】
いくつかの実施形態では、阻害性核酸分子は、ＭＨＣクラスＩ分子の構成要素に対して阻害性である。特定の実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現は、対照細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の発現と比較して１０％〜９５％低下する。特定の実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現は、対照細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の発現と比較して５０％〜９５％低下する。特定の実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現は、対照細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の発現と比較して７５％〜９５％低下する。特定の実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現は、対照細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の発現と比較して９０％〜９５％低下する。特定の実施形態では、対照細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現を低下させるように遺伝子改変されていない。
【００６０】
いくつかの態様では、阻害性核酸分子はヒトＣＤ５２に対して阻害性である。特定の実施形態では、ＣＤ５２の細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ＣＤ５２発現の約１％〜約５０％である。他の実施形態では、ＣＤ５２の細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ＣＤ５２発現の約１％〜約２５％である。他の実施形態では、ＣＤ５２の細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ＣＤ５２発現の約１％〜約１０％である。他の実施形態では、ＣＤ５２の細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ＣＤ５２発現の約１％〜約５％である。特定の実施形態では、対照細胞は、ＣＤ５２の細胞表面発現を低下させるように遺伝子改変されていない。
【００６１】
いくつかの態様では、阻害性核酸分子はヒトＣＤ５２に対して阻害性である。特定の実施形態では、ＣＤ５２の細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ＣＤ５２発現と比較して１０％〜９５％低下する。他の実施形態では、ＣＤ５２の細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ＣＤ５２発現と比較して５０％〜９５％低下する。他の実施形態では、ＣＤ５２の細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ＣＤ５２発現と比較して７５％〜９５％低下する。他の実施形態では、ＣＤ５２の細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ＣＤ５２発現と比較して９０％〜９５％低下する。特定の実施形態では、対照細胞は、ＣＤ５２の細胞表面発現を低下させるように遺伝子改変されていない。
【００６２】
別の態様では、本発明は、遺伝子改変真核細胞により発現される操作された抗原受容体をコードする核酸配列をそのゲノム中に含む遺伝子改変真核細胞を提供し、ここで、遺伝子改変真核細胞上のベータ２ミクログロブリンの細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ベータ２ミクログロブリン発現と比較して１０％〜９５％低下する。特定の実施形態では、遺伝子改変真核細胞上のベータ２ミクログロブリンの細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ベータ２ミクログロブリン発現と比較して５０％〜９５％低下する。特定の実施形態では、遺伝子改変真核細胞上のベータ２ミクログロブリンの細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ベータ２ミクログロブリン発現と比較して７５％〜９５％低下する。特定の実施形態では、遺伝子改変真核細胞上のベータ２ミクログロブリンの細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ベータ２ミクログロブリン発現と比較して９０％〜９５％低下する。特定の実施形態では、対照細胞は、ベータ２ミクログロブリンの細胞表面発現を低減するように遺伝子改変されていない。
【００６３】
いくつか実施形態では、ベータ２ミクログロブリンの細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ベータ２ミクログロブリン発現の約１％〜約５０％である。他の実施形態では、ベータ２ミクログロブリンの細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ベータ２ミクログロブリン発現の約１％〜約２５％である。他の実施形態では、ベータ２ミクログロブリンの細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ベータ２ミクログロブリン発現の約１％〜約１０％である。他の実施形態では、ベータ２ミクログロブリンの細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ベータ２ミクログロブリン発現の約１％〜約５％である。特定の実施形態では、対照細胞は、細胞表面ベータ２ミクログロブリン発現を低減するように遺伝子改変されていない。
【００６４】
特定の実施形態では、遺伝子改変真核細胞は、そのゲノム中に、ベータ２ミクログロブリンに対して阻害性の阻害性核酸分子をコードする核酸配列を含む。特定の実施形態では、阻害性核酸分子はＲＮＡ干渉分子である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ干渉分子は、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ヘアピンｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、前駆体ｍｉＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡ適合ｓｈＲＮＡである。特定の実施形態では、ＲＮＡ干渉分子はｓｈＲＮＡである。特定の実施形態では、ｓｈＲＮＡは配列番号２〜配列番号４のいずれか１つの配列を含む。特定の実施形態では、ｓｈＲＮＡは配列番号２の配列を含む。
【００６５】
いくつかの実施形態では、操作された抗原受容体をコードする核酸配列は、阻害性核酸分子をコードする核酸配列とゲノム内の同じ位置に統合されている。特定の実施形態では、遺伝子改変真核細胞は、そのゲノム中に、本発明の核酸分子を含む。
【００６６】
他の実施形態では、操作された抗原受容体をコードする核酸配列は、阻害性核酸分子をコードする核酸配列とは異なるゲノム内の位置に統合されている。
【００６７】
いくつかの実施形態では、遺伝子改変真核細胞は、対照細胞と比較した場合、内因性ＮＫ細胞殺傷の影響を受けにくく、対照細胞と比較した場合、被験体において持続性が延長されており、対照細胞と比較した場合、被験体において増強された拡大を示し、及び／又は対照細胞と比較した場合、同種異系性の低下を示す。
【００６８】
いくつかの実施形態では、操作された抗原受容体は、キメラ抗原受容体又は外因性Ｔ細胞受容体である。
【００６９】
いくつかの実施形態では、遺伝子改変真核細胞は、遺伝子改変されたヒトＴ細胞である。
【００７０】
特定の実施形態では、遺伝子改変真核細胞は遺伝子改変されたヒトＴ細胞であり、操作された抗原受容体はキメラ抗原受容体又は外因性Ｔ細胞受容体である。
【００７１】
別の態様では、本発明は、遺伝子改変真核細胞により発現される操作された抗原受容体をコードする核酸配列をそのゲノム中に含む遺伝子改変真核細胞を提供し、ここで、遺伝子改変真核細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現は、対照細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現と比較して１０％〜９５％低下する。特定の実施形態では、遺伝子改変真核細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現は、対照細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現と比較して５０％〜９５％低下する。特定の実施形態では、遺伝子改変真核細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現は、対照細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現と比較して７５％〜９５％低下する。特定の実施形態では、遺伝子改変真核細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現は、対照細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現と比較して９０％〜９５％低下する。特定の実施形態では、対照細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子の構成要素の細胞表面発現を低下させるように遺伝子改変されていない。
【００７２】
いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ＭＨＣクラスＩ分子発現の約１％〜約５０％である。他の実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ＭＨＣクラスＩ分子発現の約１％〜約２５％である。他の実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ＭＨＣクラスＩ分子発現の約１％〜約１０％である。他の実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ＭＨＣクラスＩ分子発現の約１％〜約５％である。特定の実施形態では、対照細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現を低下させるように遺伝子改変されていない。
【００７３】
特定の実施形態では、遺伝子改変真核細胞は、そのゲノム中に、ＭＨＣクラスＩ分子の構成要素に対して阻害性の阻害性核酸分子をコードする核酸配列を含む。特定の実施形態では、阻害分子は、ＭＨＣクラスＩアルファ−１（α１）ドメイン、アルファ−２（α２）ドメイン、アルファ−３（α３）ドメイン、又はベータ２ミクログロブリンに対して阻害性である。特定の実施形態では、阻害分子はベータ２ミクログロブリンに対して阻害性である。
【００７４】
特定の実施形態では、阻害性核酸分子はＲＮＡ干渉分子である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ干渉分子は、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ヘアピンｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、前駆体ｍｉＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡ適合ｓｈＲＮＡである。特定の実施形態では、ＲＮＡ干渉分子はｓｈＲＮＡである。
【００７５】
特定の実施形態では、阻害性核酸分子は、ベータ２ミクログロブリンに対して阻害性のｓｈＲＮＡであり、ｓｈＲＮＡは、配列番号２〜配列番号４のいずれか１つを含む配列を有する。特定の実施形態では、ｓｈＲＮＡは配列番号２を含む配列を有する。いくつかのかかる実施形態では、第１の発現カセット及び第２の発現カセットは、５´及び３´の相同性アームに対して３´から５´向きにあり、第１の発現カセットは第２の発現カセットの５´上流にある。いくつかのかかる実施形態では、第１の発現カセットは：（ｉ）キメラ抗原受容体又は外因性Ｔ細胞受容体をコードする核酸配列と；（ｉｉ）キメラ抗原受容体又は外因性Ｔ細胞受容体の発現を駆動するＪｅＴプロモータと；（ｉｉｉ）ポリＡ配列とを含み；第２の発現カセットは、（ｉｖ）ｓｈＲＮＡをコードする核酸配列と；（ｖ）ｓｈＲＮＡの発現を駆動するＵ６プロモータと；（ｖｉ）中央ポリプリントラクト及び中央ターミネータ配列（ｃＰＰＴ／ＣＴＳ）の配列と、を含む。
【００７６】
特定の実施形態では、阻害性核酸分子は、ベータ２ミクログロブリンに対して阻害性のｓｈＲＮＡであり、ｓｈＲＮＡは、配列番号２〜配列番号４のいずれか１つを含む配列を有する。特定の実施形態では、ｓｈＲＮＡは配列番号２を含む配列を有する。いくつかのかかる実施形態では、５´及び３´相同性アームに対して、第１の発現カセットは３´から５´の向きにあり、第２の発現カセットは５´から３´の向きにあり、第１の発現カセットは第２の発現カセットの５´上流にある。いくつかのかかる実施形態では、第１の発現カセットは：（ｉ）キメラ抗原受容体又は外因性Ｔ細胞受容体をコードする核酸配列と；（ｉｉ）キメラ抗原受容体又は外因性Ｔ細胞受容体の発現を駆動するＪｅＴプロモータと；（ｉｉｉ）ポリＡ配列とを含み；第２の発現カセットは、（ｉｖ）ｓｈＲＮＡをコードする核酸配列と；（ｖ）ｓｈＲＮＡの発現を駆動するＵ６プロモータと；（ｖｉ）中央ポリプリントラクト及び中央ターミネータ配列（ｃＰＰＴ／ＣＴＳ）の配列と、を含む。いくつかのかかる実施形態では、核酸分子は、第２の発現カセットの第１のコピー及び第２のコピーを含み、第１のコピー及び第２のコピーは同一であり、第１のコピー及び第２のコピーはタンデムにあり、さらに第１のコピーと２番目のコピーは同じ向きにある。
【００７７】
いくつかの実施形態では、操作された抗原受容体をコードする核酸配列は、阻害性核酸分子をコードする核酸配列とゲノム内の同じ位置に統合されている。特定の実施形態では、遺伝子改変真核細胞は、そのゲノム中に、本発明の核酸分子を含む。
【００７８】
他の実施形態では、操作された抗原受容体をコードする核酸配列は、阻害性核酸分子をコードする核酸配列とは異なるゲノム内の位置に統合されている。
【００７９】
いくつかの実施形態では、遺伝子改変真核細胞は、対照細胞と比較した場合、内因性ＮＫ細胞殺傷の影響を受けにくく、対照細胞と比較した場合、被験体において持続性が延長されており、対照細胞と比較した場合、被験体において増強された拡大を示し、及び／又は対照細胞と比較した場合、同種異系性の低下を示す。
【００８０】
いくつかの実施形態では、操作された抗原受容体は、キメラ抗原受容体又は外因性Ｔ細胞受容体である。
【００８１】
いくつかの実施形態では、遺伝子改変真核細胞は、遺伝子改変されたヒトＴ細胞である。
【００８２】
特定の実施形態では、遺伝子改変真核細胞は遺伝子改変されたヒトＴ細胞であり、操作された抗原受容体はキメラ抗原受容体又は外因性Ｔ細胞受容体である。
【００８３】
別の態様では、本発明は、薬学的に許容可能な担体と、治療有効量の本明細書で上に記載される遺伝子改変真核細胞とを含む、医薬組成物を提供する。
【００８４】
いくつかの特定の実施形態では、医薬組成物の遺伝子改変真核細胞は遺伝子改変ヒトＴ細胞であり、操作された抗原受容体はキメラ抗原受容体又は外因性Ｔ細胞受容体であり、ベータ２ミクログロブリンの細胞表面発現は対照細胞上の細胞表面ベータ２ミクログロブリン発現の約１％〜約５０％、約１％〜約２５％、約１％〜約１０％、又は約１％〜約５％である。
【００８５】
他の特定の実施形態では、医薬組成物の遺伝子改変真核細胞は遺伝子改変ヒトＴ細胞であり、操作された抗原受容体はキメラ抗原受容体又は外因性Ｔ細胞受容体であり、遺伝子改変ヒトＴ細胞上のベータ２ミクログロブリンの細胞表面発現は、対照細胞上のベータ２ミクログロブリンの細胞表面発現と比較して、１０％〜９５％、５０％〜９５％、７５％〜９５％、又は９０％〜９５％低下する。
【００８６】
いくつかの特定の実施形態では、医薬組成物の遺伝子改変真核細胞は遺伝子改変ヒトＴ細胞であり、操作された抗原受容体はキメラ抗原受容体又は外因性Ｔ細胞受容体であり、ＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現は対照細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現の約１％〜約５０％、約１％〜約２５％、約１％〜約１０％、又は約１％〜約５％である。
【００８７】
他の特定の実施形態では、医薬組成物の遺伝子改変真核細胞は遺伝子改変ヒトＴ細胞であり、操作された抗原受容体はキメラ抗原受容体又は外因性Ｔ細胞受容体であり、遺伝子改変ヒトＴ細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現は、対照細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現と比較して、１０％〜９５％、５０％〜９５％、７５％〜９５％、又は９０％〜９５％低下する。
【００８８】
他の特定の実施形態では、医薬組成物の遺伝子改変真核細胞は遺伝子改変ヒトＴ細胞であり、操作された抗原受容体はキメラ抗原受容体であり、ＣＤ５２の細胞表面発現は対照細胞上の細胞表面ＣＤ５２発現の約１％〜約５０％、約１％〜約２５％、約１％〜約１０％、又は約１％〜約５％である。
【００８９】
いくつかの実施形態では、医薬組成物の遺伝子改変真核細胞は遺伝子改変ヒトＴ細胞であり、操作された抗原受容体はキメラ抗原受容体又は外因性Ｔ細胞受容体であり、遺伝子改変ヒトＴ細胞上のＣＤ５２の細胞表面発現は、対照細胞上のＣＤ５２の細胞表面発現と比較して、１０％〜９５％、５０％〜９５％、７５％〜９５％、又は９０％〜９５％低下する。
【００９０】
特定の実施形態では、本発明の医薬組成物は、それを必要とする被験体の癌の治療における免疫療法用である。
【００９１】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載される複数の任意の遺伝子改変真核細胞を含む遺伝子改変真核細胞の集団を提供する。
【００９２】
いくつかの実施形態では、集団中の細胞の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は最大１００％が、本明細書に記載される遺伝子改変真核細胞である。
【００９３】
特定の実施形態では、集団の遺伝子改変真核細胞は、遺伝子改変ヒトＴ細胞若しくはそれに由来する細胞、又は遺伝子改変ＮＫ細胞若しくはそれに由来する細胞である。
【００９４】
特定の実施形態では、集団の遺伝子改変真核細胞は、細胞表面キメラ抗原受容体又は外因性Ｔ細胞受容体を含む。これらの実施形態のいくつかでは、キメラ抗原受容体又は外因性Ｔ細胞受容体は、腫瘍特異的抗原に対する特異性を有する細胞外リガンド結合ドメインを含む。
【００９５】
いくつかの実施形態では、集団の遺伝子改変真核細胞は、改変されていない対照細胞と比較した場合、内因性Ｔ細胞受容体の細胞表面発現を有さない。いくつかの実施形態では、集団の遺伝子改変真核細胞は、ベータ２ミクログロブリン、ＭＨＣクラスＩ分子、又はＣＤ５２の細胞表面発現が低下している。
【００９６】
別の態様では、本発明は、免疫療法を使用して、それを必要とする被験体の疾患を治療する方法を提供し、該方法は、本明細書に記載の遺伝子改変真核細胞を被験体に投与することを含み、ここで、遺伝子改変真核細胞は、キメラ抗原受容体又は外因性Ｔ細胞受容体を発現する遺伝子改変ヒトＴ細胞であり、遺伝子改変ヒトＴ細胞上のベータ２ミクログロブリンの細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ベータ２ミクログロブリン発現の約１％〜約５０％、約１％〜約２５％、約１％〜約１０％、又は約１％〜約５％である。
【００９７】
上記方法のいくつかの実施形態では、遺伝子改変ヒトＴ細胞上のベータ２ミクログロブリンの細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ベータ２ミクログロブリン発現と比較して１０％〜９５％、５０％〜９５％、７５％〜９５％、又は９０％〜９５％低下する。
【００９８】
上記方法のいくつかの実施形態では、被験体おいて、細胞表面ベータ２ミクログロブリン発現を有さない遺伝子改変ヒトＴ細胞と比較した場合、遺伝子改変ヒトＴ細胞の内因性ＮＫ細胞殺傷は低下する。
【００９９】
上記方法のいくつかの実施形態では、対照細胞と比較した場合、遺伝子改変ヒトＴ細胞上の細胞表面ベータ２ミクログロブリン発現が低下する、本明細書に記載される任意の医薬組成物が被験体に投与される。
【０１００】
上記方法のいくつかの実施形態では、遺伝子改変されたヒトＴ細胞は被験体に対して同種異系である。
【０１０１】
上記方法のいくつかの実施形態では、細胞表面ベータ２ミクログロブリン発現を有さない遺伝子改変ヒトＴ細胞と比較した場合、又は野生型レベルのベータ２ミクログロブリンの細胞表面発現を有する遺伝子改変ヒトＴ細胞と比較した場合、遺伝子改変ヒトＴ細胞の持続性は被験体において延長されている。
【０１０２】
上記方法のいくつかの実施形態では、細胞表面ベータ２ミクログロブリン発現を有さない遺伝子改変ヒトＴ細胞と比較した場合、又は野生型レベルのベータ２ミクログロブリンの細胞表面発現を有する遺伝子改変ヒトＴ細胞と比較した場合、遺伝子改変ヒトＴ細胞の拡大は被験体において増強されている。
【０１０３】
上記方法のいくつかの実施形態では、遺伝子改変ヒトＴ細胞の同種異系性は、野生型レベルのベータ２ミクログロブリンの細胞表面発現を有する遺伝子改変ヒトＴ細胞と比較した場合、低下している。
【０１０４】
上記方法のいくつかの実施形態では、疾患は癌である。
【０１０５】
上記方法のいくつかの実施形態では、癌は、癌腫、リンパ腫、肉腫、芽細胞腫、及び白血病の癌からなる群から選択される。上記方法の特定の実施形態では、癌は、Ｂ細胞起源の癌、乳癌、胃癌、神経芽腫、骨肉腫、肺癌、黒色腫、前立腺癌、結腸癌、腎細胞癌腫、卵巣癌、横紋筋肉腫、白血病、及びホジキンリンパ腫からなる群から選択される。上記方法の特定の実施形態では、Ｂ細胞起源の癌は、Ｂ系統の急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、及びＢ細胞非ホジキンリンパ腫からなる群から選択される。
【０１０６】
別の態様では、本発明は、免疫療法を使用して、それを必要とする被験体の疾患を治療する方法を提供し、該方法は、本明細書に記載の遺伝子改変真核細胞を被験体に投与することを含み、ここで、遺伝子改変真核細胞は、キメラ抗原受容体又は外因性Ｔ細胞受容体を発現する遺伝子改変ヒトＴ細胞であり、遺伝子改変ヒトＴ細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現は、対照細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現の約１％〜約５０％、約１％〜約２５％、約１％〜約１０％、又は約１％〜約５％である。
【０１０７】
上記方法のいくつかの実施形態では、遺伝子改変ヒトＴ細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現は、対照細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現と比較して１０％〜９５％、５０％〜９５％、７５％〜９５％、又は９０％〜９５％低下する。
【０１０８】
上記方法のいくつかの実施形態では、被験体おいて、ＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現を有さない遺伝子改変ヒトＴ細胞と比較した場合、遺伝子改変ヒトＴ細胞の内因性ＮＫ細胞殺傷は低下する。
【０１０９】
上記方法のいくつかの実施形態では、対照細胞と比較した場合に遺伝子改変ヒトＴ細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現が低下する、本明細書に記載される任意の医薬組成物が被験体に投与される。
【０１１０】
上記方法のいくつかの実施形態では、遺伝子改変されたヒトＴ細胞は被験体に対して同種異系である。
【０１１１】
上記方法のいくつかの実施形態では、細胞表面ＭＨＣクラスＩ分子発現を有さない遺伝子改変ヒトＴ細胞と比較した場合、又は野生型レベルのＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現を有する遺伝子改変ヒトＴ細胞と比較した場合、遺伝子改変ヒトＴ細胞の持続性は被験体において延長されている。
【０１１２】
上記方法のいくつかの実施形態では、細胞表面ＭＨＣクラスＩ分子発現を有さない遺伝子改変ヒトＴ細胞と比較した場合、又は野生型レベルのＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現を有する遺伝子改変ヒトＴ細胞と比較した場合、遺伝子改変ヒトＴ細胞の拡大は被験体において増強されている。
【０１１３】
上記方法のいくつかの実施形態では、遺伝子改変ヒトＴ細胞の同種異系性は、野生型レベルのＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現を有する遺伝子改変ヒトＴ細胞と比較した場合、低下している。
【０１１４】
上記方法のいくつかの実施形態では、疾患は癌である。
【０１１５】
上記方法のいくつかの実施形態では、癌は、癌腫、リンパ腫、肉腫、芽細胞腫、及び白血病の癌からなる群から選択される。上記方法の特定の実施形態では、癌は、Ｂ細胞起源の癌、乳癌、胃癌、神経芽腫、骨肉腫、肺癌、黒色腫、前立腺癌、結腸癌、腎細胞癌腫、卵巣癌、横紋筋肉腫、白血病、及びホジキンリンパ腫からなる群から選択される。上記方法の特定の実施形態では、Ｂ細胞起源の癌は、Ｂ系統の急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、及びＢ細胞非ホジキンリンパ腫からなる群から選択される。
【０１１６】
別の態様では、本発明は、免疫療法を使用して、それを必要とする被験体の癌患を治療する方法を提供し、該方法は、本明細書に記載の遺伝子改変真核細胞を被験体に投与することを含み、ここで、遺伝子改変真核細胞は、キメラ抗原受容体又は外因性Ｔ細胞受容体を発現する遺伝子改変ヒトＴ細胞であり、遺伝子改変ヒトＴ細胞上のＣＤ５２の細胞表面発現は、対照細胞上の細胞表面ＣＤ５２発現の１％〜５０％、１％〜２５％、１％〜１０％、又は１％〜５％である。
【０１１７】
上記方法のいくつかの実施形態では、遺伝子改変ヒトＴ細胞上のＣＤ５２の細胞表面発現は、対照細胞上のＣＤ５２の細胞表面発現と比較して１０％〜９５％、５０％〜９５％、７５％〜９５％、又は９０％〜９５％低下する。
【０１１８】
上記方法のいくつかの実施形態では、対照細胞と比較した場合に遺伝子改変ヒトＴ細胞上のＣＤ５２の細胞表面発現が低下される、本明細書に記載される医薬組成物が被験体に投与される。
【０１１９】
上記方法のいくつかの実施形態では、遺伝子改変されたヒトＴ細胞は被験体に対して同種異系である。
【０１２０】
上記方法のいくつかの実施形態では、癌は、癌腫、リンパ腫、肉腫、芽細胞腫、及び白血病の癌からなる群から選択される。上記方法の特定の実施形態では、癌は、Ｂ細胞起源の癌、乳癌、胃癌、神経芽腫、骨肉腫、肺癌、黒色腫、前立腺癌、結腸癌、腎細胞癌腫、卵巣癌、横紋筋肉腫、白血病、及びホジキンリンパ腫からなる群から選択される。上記方法の特定の実施形態では、Ｂ細胞起源の癌は、Ｂ系統の急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、及びＢ細胞非ホジキンリンパ腫からなる群から選択される。
【０１２１】
別の実施形態では、本発明は、操作された抗原受容体を含む遺伝子改変真核細胞の濃縮された集団を調製する方法を提供し、該方法は、本明細書に記載される遺伝子改変真核細胞、及び野生型レベルの細胞表面ＣＤ５２を発現する細胞を含む細胞集団を調製することを含み、ここで、遺伝子改変真核細胞上のＣＤ５２の細胞表面発現が、対照細胞と比較した場合に、約１％〜約５０％、約１％〜約２５％、約１％〜約１０％、又は約１％〜約５％であり、該方法が：（ａ）細胞集団を抗ＣＤ５２結合分子に複合化したビーズと接触させる工程であって、ここで、野生型レベルの細胞表面ＣＤ５２を発現する細胞はビーズに結合され、遺伝子改変真核細胞はビーズに結合していない工程、及び（ｂ）細胞集団からビーズを除去して、細胞の濃縮集団を産生する工程であって、ここで、細胞の濃縮集団が、遺伝子改変真核細胞について濃縮されている工程、を含む。
【０１２２】
上記方法のいくつかの実施形態では、遺伝子改変真核細胞上のＣＤ５２の細胞表面発現は、対照細胞と比較した場合、１０％〜９５％、５０％〜９５％、７５％〜９５％、又は９０％〜９５％低下する。
【０１２３】
この方法のいくつかの実施形態では、ビーズは磁気ビーズである。上記方法の特定の実施形態では、磁気ビーズは、磁気分離により細胞集団から除去される。
【０１２４】
上記方法のいくつかの実施形態では、濃縮された集団中の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は最大１００％の細胞が、遺伝子改変真核細胞である。
【０１２５】
上記方法のいくつかの実施形態では、遺伝子改変真核細胞はキメラ抗原受容体を発現する。上記方法の他の実施形態では、遺伝子改変真核細胞は外因性Ｔ細胞受容体を発現する。
【０１２６】
上記方法のいくつかの実施形態では、遺伝子改変真核細胞は、本明細書に記載される任意の遺伝子改変Ｔ細胞等の遺伝子改変されたヒトＴ細胞である。
【０１２７】
別の態様では、本開示は、医薬として使用するための本明細書に記載される遺伝子改変真核細胞を提供する。本開示はさらに、本明細書に記載される遺伝子改変真核細胞を必要とする被験体の疾患を治療するための医薬の製造における、本明細書に記載される遺伝子改変真核細胞の使用を提供する。かかる一実施形態では、医薬は癌の治療に有用である。
【０１２８】
本発明の前述及び他の態様並びに実施形態は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲を参照することにより、より完全に理解され得る。明確にするため、個別の実施形態に記載される本発明の特定の特徴は、単一の実施形態に組み合わせて提供されてもよい。実施形態の全て組み合わせは、本発明に特に包含され、あたかもそれぞれの全ての組み合わせが個別かつ明示的に開示されたかのように、本明細書に開示されている。逆に、簡潔にするため、単一の実施形態の文脈において記載される本発明の様々な特徴は、個別に又は任意の適切なサブコンビネーションで提供されてもよい。実施形態に挙げられる特徴の全てサブコンビネーションもまた本発明に特に包含され、あたかもそれぞれの全てのかかるサブコンビネーションが本明細書において個々にかつ明示的に開示されているかのように本明細書に開示される。本明細書に開示される本発明の各態様の実施形態は、必要な変更を加えて、本発明の他の各態様に適用される。
【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１】本発明の核酸分子の様々な実施形態の図を示す。ＪｅＴプロモータが、操作された抗原受容体の発現を駆動するプロモータの例として示される。Ｕ６プロモータが、阻害性核酸分子の発現を駆動するプロモータの例として示される。操作された抗原受容体の例として、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が示される。ｓｈＲＮＡが、阻害性核酸分子の例として示される。操作された抗原受容体の翻訳を終結させる配列の例として、ポリＡ配列が示されている。ｃＰＰＴ／ＣＴＳ配列が、阻害性核酸分子の翻訳を終結させる配列の例として示される。５´及び３´の相同性アームは、各コンストラクトの第１の発現カセット及び第２の発現カセットに隣接して示される。任意の５´及び３´の逆方向末端反復が、各コンストラクトにおいて更に示される。破線より上のコンストラクトは同じ向きの第１及び第２の発現カセットを有し、一方、破線より下のコンストラクトは反対の向きの第１及び第２の発現カセットを有する。
【図２Ａ−Ｌ】初代ヒトＴ細胞のＮＫ細胞殺傷を表すフロープロットを示す。示される比率は、各実験でのＮＫ細胞とＴ細胞の比（Ｅ：Ｔ）を表す。図２Ａは、２：１の比を使用するＢ２Ｍ＋Ｔ細胞のＮＫ細胞殺傷を示す。図２Ｂは、１：１の比を使用するＢ２Ｍ＋Ｔ細胞のＮＫ細胞殺傷を示す。図２Ｃは、０．５：１の比を使用するＢ２Ｍ＋Ｔ細胞のＮＫ細胞殺傷を示す。図２Ｄは、０：１の比を使用するＢ２Ｍ＋Ｔ細胞のＮＫ細胞殺傷を示す。図２Ｅは、２：１の比を使用するＢ２Ｍ−Ｔ細胞のＮＫ細胞殺傷を示す。図２Ｆは、１：１の比を使用したＢ２Ｍ−Ｔ細胞のＮＫ細胞殺傷を示す。図２Ｇは、０．５：１の比を使用するＢ２Ｍ−Ｔ細胞のＮＫ細胞殺傷を示す。図２Ｈは、０：１の比を使用するＢ２Ｍ−Ｔ細胞のＮＫ細胞殺傷を示す。図２Ｉは、２：１の比を使用するダウディクラスＩ陰性細胞のＮＫ細胞殺傷を示す。図２Ｊは、１：１の比を使用するダウディクラスＩ陰性細胞のＮＫ細胞殺傷を示す。図２Ｋは、０．５：１の比を使用するダウディクラスＩ陰性細胞のＮＫ細胞殺傷を示す。図２Ｌは、０：１の比を使用するダウディクラスＩ陰性細胞のＮＫ細胞殺傷を示す。
【図３】種々の比のＢ２Ｍ＋細胞及びＢ２Ｍ−細胞のＮＫ細胞殺傷を要約するチャートを示す。
【図４】３つの候補Ｂ２Ｍ  ｓｈＲＮＡによる初代ヒトＴ細胞のヒトＢ２Ｍのパーセンテージノックダウンを示す。
【図５Ａ−Ｄ】Ｋ５６２細胞又は模擬処理した初代ヒトＴ細胞のＮＫ細胞溶解又は同種異系細胞溶解を表すフロー図を示す。図５Ａは、Ｋ５６２細胞のＮＫ細胞溶解を示す。図５Ｂは、Ｋ５６２細胞の同種異系細胞溶解を示す。図５Ｃは、模擬処理した初代ヒトＴ細胞のＮＫ細胞溶解を示す。図５Ｄは、模擬処理した初代ヒトＴ細胞の同種異系細胞溶解を示す。
【図６Ａ−Ｄ】Ｂ２Ｍ  ｓｈＲＮＡで処理した初代ヒトＴ細胞のＮＫ細胞溶解又は同種異系細胞溶解を表すフロー図を示す。図６Ａは、ｓｈＲＮＡ２５４で処理した初代ヒトＴ細胞のＮＫ細胞溶解を示す。図６Ｂは、ｓｈＲＮＡ２５４で処理した初代ヒトＴ細胞の同種異系細胞溶解を示す。図６Ｃは、ｓｈＲＮＡ４７２で処理した初代ヒトＴ細胞のＮＫ細胞溶解を示す。図６Ｄは、ｓｈＲＮＡ４７２で処理した初代ヒトＴ細胞の同種異系細胞溶解を示す。
【図７Ａ−Ｆ】キメラ抗原受容体及びベータ２ミクログロブリンに対するｓｈＲＮＡをコードする様々な核酸分子コンストラクトの図を示す。図７Ａは、コンストラクト７００７（配列番号１８）を示す。図７Ｂは、コンストラクト７２１７（配列番号１９）を示す。図７Ｃは、コンストラクト７００８（配列番号２０）を示す。図７Ｄは、コンストラクト７２１８（配列番号２１）を示す。図７Ｅは、コンストラクト７００９（配列番号２２）を示す。図７Ｆは、コンストラクト７２１９（配列番号２３）を示す。
【図８】３つの異なる候補ＣＤ５２  ｓｈＲＮＡによる初代ヒトＴ細胞のヒトＣＤ５２のパーセンテージノックダウンを示す。
【図９Ａ−Ｃ】ｓｈＲＮＡを使用するＣＤ５２のノックダウン及びＣＤ５２磁気枯渇による初代ヒトＴ細胞のノックダウン集団の磁気濃縮を示す。図９Ａは、模擬形質導入されたＴ細胞を示す。図９Ｂは、ｓｈＲＮＡ−５６８レンチウイルスで形質導入されたＴ細胞を示す。図９Ｃは、ＣＤ５２磁気枯渇を受けたレンチウイルス−ｓｈＲＮＡ５６８形質導入細胞を示す。
【図１０Ａ−Ｈ】キメラ抗原受容体及びＣＤ５２に対するｓｈＲＮＡをコードする核酸分子コンストラクトの図を示す。図１０Ａは、ＣＡＲのみをコードするコンストラクト７００５（配列番号１０）を示す。図１０Ｂは、ＣＡＲのみをコードするコンストラクト７００２（配列番号１１）を示す。図１０Ｃは、コンストラクト７００４（配列番号１２）を示す。図１０Ｄは、コンストラクト７２０４（配列番号１３）を示す。図１０Ｅは、コンストラクト７０１３（配列番号１４）を示す。図１０Ｆは、コンストラクト７２１３（配列番号１５）を示す。図１０Ｇは、コンストラクト７０１４（配列番号１６）を示す。図１０Ｈは、コンストラクト７２１４（配列番号１７）を示す。
【図１１Ａ−Ｄ】異なる向きのＣＡＲ／ＣＤ５２  ｓｈＲＮＡコンストラクトを使用するＣＤ５２ノックダウンプロファイルを示す。図１１Ａは、ＣＡＲがＣＤ５２  ｓｈＲＮＡの不在下で発現される場合のＣＤ５２発現を示す。図１１Ｂは、７０１３コンストラクトを使用する場合のＣＤ５２発現を示す。図１１Ｃは、７００４コンストラクトを使用する場合のＣＤ５２発現を示す。図１１Ｄは、７０１４コンストラクトを使用する場合のＣＤ５２発現を示す。
【図１２Ａ−Ｃ】１つ以上のｓｈＲＮＡカセットを有するＣＡＲ／Ｂ２Ｍ  ｓｈＲＮＡコンストラクトを使用するＣＡＲ  Ｔ細胞に対するＢ２Ｍノックダウンを示す。図１２Ａは、Ｂ２Ｍ  ｓｈＲＮＡ（７００２−影付きの曲線）又は単一のＢ２Ｍ  ｓｈＲＮＡカセット（７００８−影なしの曲線）を発現しないＣＡＲ  Ｔ細胞におけるＢ２Ｍ発現を示す。図１２Ｂは、Ｂ２Ｍ  ｓｈＲＮＡ（７００２−影付き）又は２つのＢ２Ｍ  ｓｈＲＮＡカセット（７０２９−影なし）を発現しないＣＡＲ  Ｔ細胞におけるＢ２Ｍ発現を示す。図１２Ｃは、７００２、７００８、又は７０２９でエレクトロポレーションされた培養物からのＣＡＲ−／ＣＤ３＋（すなわち、編集されていない）集団におけるＢ２Ｍ発現を示す。
【図１３Ａ−Ｃ】対照ＣＡＲ陰性コンストラクト（７００２）、ＣＡＲ（７０５６）と共に３´から５´へのｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ構成で若しくはＣＡＲ（７０５９）と共に３´から５´／５´から３´のｔａｉｌ−ｔｏ−ｔａｉｌ構成で単一のｓｈＲＮＡ４７２コピーを発現するＣＡＲコンストラクト、又はＣＡＲ（７０６０）と共に３´から５´／５´から３´のｔａｉｌ−ｔｏ−ｔａｉｌ構成で２つのｓｈＲＮＡカセットコピーを発現するＣＡＲコンストラクトを発現させるため、直線化されたＤＮＡを用いてトランスフェクトしたＴ細胞上のベータ２ミクログロブリンの細胞表面発現を示す。図１３Ａは、７００２及び７０５６のコンストラクトを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞を示す。図１３Ｂは、７００２及び７０５９のコンストラクトを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞を示す。図１３Ｃは、７００２及び７０６０のコンストラクトを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞を示す。
【図１４Ａ−Ｄ】ＣＡＲと共に３´から５´のｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌの構成でｓｈＲＮＡ４７２の単一コピーを発現するコンストラクト７０５６を含むＡＡＶで形質導入されたＴ細胞上のベータ２ミクログロブリン発現又はＨＬＡ−Ａ、Ｂ、及びＣの発現（すなわち、ＭＨＣクラスＩ分子発現）を示す。図１４Ａは、対照培養物に由来するｓｈＲＮＡを発現していないメガヌクレアーゼ編集細胞と比較したＣＤ３−／ＣＡＲ＋細胞におけるＢ２Ｍ表面レベルを示す。図１４Ｂは、同じ培養物におけるＣＤ３−／ＣＡＲ＋対ＣＤ３＋／ＣＡＲ−集団のＢ２Ｍレベルを示す。図１４Ｃは、対照培養からｓｈＲＮＡを発現しないメガヌクレアーゼ編集細胞と比較したＣＤ３−／ＣＡＲ＋細胞におけるＨＬＡ−ＡＢＣ（すなわち、ＭＨＣクラスＩ分子）表面レベルを示す。図１４Ｄは、同じ培養物におけるＣＤ３−／ＣＡＲ＋対ＣＤ３＋／ＣＡＲ−集団のＨＬＡ−ＡＢＣレベルを示す。
【０１３０】
配列の簡単な説明
【０１３１】
配列番号１は、ＴＲＣ１−２認識配列の核酸配列を示す。
【０１３２】
配列番号２は、抗ベータ２ミクログロブリンｓｈＲＮＡ４７２の核酸配列を示す。
【０１３３】
配列番号３は、抗ベータ２ミクログロブリンｓｈＲＮＡ２５６の核酸配列を示す。
【０１３４】
配列番号４は、抗ベータ２ミクログロブリンｓｈＲＮＡ２５４の核酸配列を示す。
【０１３５】
配列番号５は、抗ＣＤ５２  ｓｈＲＮＡ５７２の核酸配列を示す。
【０１３６】
配列番号６は、抗ＣＤ５２  ｓｈＲＮＡ８７６の核酸配列を示す。
【０１３７】
配列番号７は、抗ＣＤ５２  ｓｈＲＮＡ５６８の核酸配列を示す。
【０１３８】
配列番号８は、抗ＣＤ５２  ｓｈＲＮＡ５６９の核酸配列を示す。
【０１３９】
配列番号９は、抗ＣＤ５２  ｓｈＲＮＡ５７１の核酸配列を示す。
【０１４０】
配列番号１０は、ＣＡＲ７００５コンストラクトの核酸配列を示す。
【０１４１】
配列番号１１は、ＣＡＲ７００２コンストラクトの核酸配列を示す。
【０１４２】
配列番号１２は、ＣＡＲ７００４コンストラクトの核酸配列を示す。
【０１４３】
配列番号１３は、ＣＡＲ７２０４コンストラクトの核酸配列を示す。
【０１４４】
配列番号１４は、ＣＡＲ７０１３コンストラクトの核酸配列を示す。
【０１４５】
配列番号１５は、ＣＡＲ７２１３コンストラクトの核酸配列を示す。
【０１４６】
配列番号１６は、ＣＡＲ７０１４コンストラクトの核酸配列を示す。
【０１４７】
配列番号１７は、ＣＡＲ７２１４コンストラクトの核酸配列を示す。
【０１４８】
配列番号１８は、ＣＡＲ７００７コンストラクトの核酸配列を示す。
【０１４９】
配列番号１９は、ＣＡＲ７２１７コンストラクトの核酸配列を示す。
【０１５０】
配列番号２０は、ＣＡＲ７００８コンストラクトの核酸配列を示す。
【０１５１】
配列番号２１は、ＣＡＲ７２１８コンストラクトの核酸配列を示す。
【０１５２】
配列番号２２は、ＣＡＲ７００９コンストラクトの核酸配列を示す。
【０１５３】
配列番号２３は、ＣＡＲ７２１９コンストラクトの核酸配列を示す。
【０１５４】
配列番号２４は、ＣＡＲ７０２９コンストラクトの核酸配列を示す。
【０１５５】
配列番号２５は、ＣＡＲ７０５６コンストラクトの核酸配列を示す。
【０１５６】
配列番号２６は、ＣＡＲ７０５９コンストラクトの核酸配列を示す。
【０１５７】
配列番号２７は、ＣＡＲ７０６０コンストラクトの核酸配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１５８】
１．１参照及び定義
（定義）
本明細書で参照される特許及び科学文献は、当業者が利用可能な知識を確立している。本明細書に引用される発行された米国特許、許可された出願、公開された外国出願、及びＧｅｎＢａｎｋデータベース配列を含む参考文献は、それぞれが具体的かつ個別に参照により組み込まれていることが示されているのと同程度に参照することで本明細書の一部をなす。
【０１５９】
本開示は、種々の形態で具体化され得て、本明細書に記載される実施形態に限定されると解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施形態は、この開示が十分かつ完全であり、本開示の範囲を当業者に完全に伝えるように提供されている。例えば、一実施形態に関して例示される特徴を他の実施形態に組み込むことができ、特定の実施形態に関して例示される特徴をその実施形態から削除することができる。さらに、本開示に照らして、本開示から逸脱しない本明細書で提案される実施形態に対する多数の変形及び追加が当業者には明らかであろう。
【０１６０】
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全て技術用語及び科学用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書の本開示の説明で使用される用語法は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、本開示を限定することを意図するものではない。
【０１６１】
本明細書で言及される全て出版物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照することでその全体が本明細書の一部をなす。
【０１６２】
本明細書で使用される場合、「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」、又は「その（ｔｈｅ）」は、１つ以上を意味する場合がある。例えば、「１つの」細胞は、単一の細胞又は複数の細胞を意味する。
【０１６３】
本明細書で使用される場合、別段の指定がない限り、「又は」という言葉は、「いずれか／又は」の排他的な意味ではなく、「及び／又は」の包括的な意味で使用される。
【０１６４】
「発現カセット」、「組換えＤＮＡコンストラクト」、「組換えコンストラクト」、「発現コンストラクト」、「キメラコンストラクト」、「コンストラクト」、及び「組換えＤＮＡ断片」という用語は、本明細書で互換的に使用され、核酸断片である。組換えコンストラクトは、自然界では一緒に見られない調節配列及びコード配列を含むがこれらに限定されない核酸断片の人工的な組み合わせを含む。例えば、組換えＤＮＡコンストラクトは、異なる供給源に由来する調節配列及びコード配列、又は同じ供給源に由来し、自然に見られるものとは異なる方法で配置された調節配列及びコード配列を含んでもよい。このようなコンストラクトを単独で使用してもよく、又はベクターと組み合わせて使用してもよい。
【０１６５】
本明細書で使用される「ベクター」又は「組換えＤＮＡベクター」は、所与の宿主細胞においてポリペプチドをコードする配列の転写及び翻訳が可能な複製システム及び配列を含むコンストラクトであってもよい。ベクターが使用される場合であれば、ベクターの選択は、当業者によく知られているように、宿主細胞を形質転換するために使用される方法に依存する。ベクターとしては、プラスミドベクター及び組換えレンチウイルス又は組換えＡＡＶベクター、又は本開示の共刺激ドメインをコードする遺伝子を標的細胞に送達するのに適した当技術分野で知られている任意の他のベクターが挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、本開示の単離されたヌクレオチド又は核酸配列のいずれかを含む宿主細胞を成功裡に形質転換、選択及び増殖するためにベクター上に存在しなければならない遺伝要素に精通している。
【０１６６】
また、本明細書で使用される「ベクター」はウイルスベクターを指す場合もある。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６７】
本明細書で使用される「動作可能に連結された」という用語は、２つ以上の要素間の機能的連結を意味することを意図している。例えば、本明細書に開示されるヌクレアーゼをコードする核酸配列と調節配列（例えば、プロモータ）との間の動作可能な連結は、ヌクレアーゼをコードする核酸配列の発現を可能にする機能的連結である。動作可能に連結された要素は、連続してもよく、又は非連続であってもよい。２つのタンパク質コード領域の連結を指すために使用される場合、動作可能に連結されることにより、コード領域が同じリーディングフレームにあることが意図される。
【０１６８】
本明細書で使用する「ＲＮＡ干渉」又は「ＲＮＡｉ」という用語は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を多様な範囲の生物及び細胞のタイプへの導入が相補的ｍＲＮＡの分解を引き起こす現象を指す。細胞では、長いｄｓＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒとして知られているリボヌクレアーゼによって、短い２１個〜２５個のヌクレオチドの低分子干渉ＲＮＡ、すなわちｓｉＲＮＡに切断される。その後、ｓｉＲＮＡはタンパク質成分とともにＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に集合し、その過程で一本鎖化される（ｕｎｗｉｎｄｉｎｇ）。活性化されたＲＩＳＣは、ｓｉＲＮＡアンチセンス鎖とｍＲＮＡとの間の塩基対相互作用により、相補的な転写物に結合する。結合したｍＲＮＡは切断され、ｍＲＮＡの配列特異的分解は遺伝子サイレンシングをもたらす。例えば、米国特許第６，５０６，５５９号明細書を参照されたい。
【０１６９】
本明細書で使用される「ｓｉＲＮＡ」という用語は、低分子干渉ＲＮＡ又はサイレンシングＲＮＡとしても知られる低分子干渉ＲＮＡを指す。ｓｉＲＮＡは、例えば、１８個〜３０個、２０個〜２５個、２１個〜２３個、又は２１個のヌクレオチド長の二本鎖ＲＮＡ分子であってもよい。本明細書で使用される「ｓｈＲＮＡ」は、ショートヘアピンＲＮＡであって、これはＲＮＡ干渉により遺伝子発現をサイレンシングするために使用することもできるタイトなヘアピンターンを作るＲＮＡの配列である。ｓｈＲＮＡは、Ｕ６プロモータに動作可能に連結されることにより発現し得る。ｓｈＲＮＡヘアピン構造は、細胞機構によって切断されてｓｉＲＮＡとなる。本明細書に開示されるｓｈＲＮＡは、標的タンパク質のｍＲＮＡのヌクレオチドの少なくとも１３ヌクレオチド、少なくとも１４ヌクレオチド、少なくとも１５ヌクレオチド、少なくとも１６ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも１８ヌクレオチド、少なくとも１９ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも２１ヌクレオチド、少なくとも２２ヌクレオチド、又は２３ヌクレオチドに相補的な配列を含み得る。
【０１７０】
本明細書で使用される「操作された抗原受容体」は、リガンド又は抗原（例えば、腫瘍特異的抗原）への刺激／結合時に細胞内に活性化シグナルを誘導するキメラ抗原受容体又は外因性Ｔ細胞受容体等、細胞に導入された外因性受容体を指す。
【０１７１】
本明細書で使用される「キメラ抗原受容体」又は「ＣＡＲ」は、抗原、又は他のリガンド若しくは分子に対する特異性を免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）にグラフトする操作された受容体を指す。キメラ抗原受容体は、典型的には、少なくとも細胞外リガンド結合ドメイン又は部分と、１つ以上のシグナル伝達ドメイン及び／又は共刺激ドメインを含む細胞内ドメインとを含む。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメイン又は部分は、モノクローナル抗体に由来する単鎖可変断片（ｓｃＦＶ）の形態であり、特定のエピトープ又は抗原に特異性を提供する（例えば、癌細胞、又は他の疾患を引き起こす細胞若しくは粒子等の細胞の表面に優先的に存在するエピトープ又は抗原）。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖはリンカー配列を介して付着している。いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、目的の任意の抗原又はエピトープに特異的である。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖはヒト化されている。いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体の細胞外ドメインは、Ｂリンパ球上の自己抗原特異的Ｂ細胞受容体によって認識される自己抗原を含み（Ｐａｙｎｅら（２０１６）Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．３５３（６２９５）：１７９−１８４参照）、抗体媒介自己免疫疾患の自己反応性Ｂリンパ球を特異的に標的として殺傷するようにＴ細胞に指示する。かかるＣＡＲは、キメラ自己抗体受容体（ＣＡＡＲ）と称されることがあり、本明細書に記載される１つ以上の共刺激ドメインのかかるＣＡＡＲへの組み込みが本開示に含まれる。
【０１７３】
キメラ抗原受容体の細胞外ドメインはまた、目的の抗原に対する天然に存在するリガンド、又は目的の抗原に結合する能力を保持する天然に存在するリガンドの断片を含んでもよい。
【０１７４】
細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞外ドメインの結合後に活性化シグナルを細胞に伝達する細胞質ドメインである。細胞内シグナル伝達ドメインは、当該分野で知られている目的の任意の細胞内シグナル伝達ドメインであってもよい。かかる細胞質シグナル伝達ドメインとしてはＣＤ３ζが挙げられるが、これに限定されない。
【０１７５】
また、いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、細胞外ドメインの結合後、細胞増殖、細胞生存、及び／又はサイトカイン分泌を促進する共刺激シグナルを伝達する、本明細書に記載されるもの等の１つ以上の細胞内共刺激ドメインも含む。本明細書で使用される「共刺激ドメイン」は、活性化時に細胞内増殖及び／又は細胞生存シグナルを伝達するポリペプチドドメインを指す。共刺激ドメインの活性化は、２つの共刺激ドメインポリペプチドのホモ二量体化に続いて起こる場合がある。活性化は、例えば、共刺激ドメインを含むコンストラクト（例えば、キメラ抗原受容体又は誘導性調節コンストラクト）の活性化後にも起こり得る。一般的には、共刺激ドメインは、膜貫通共刺激受容体、特に共刺激受容体の細胞内部分に由来し得る。かかる細胞内共刺激ドメインは、当技術分野で知られているもののいずれかであってもよく、限定されないが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、及びＣＤ８３、Ｎ１、Ｎ６と特異的に結合するリガンド、又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。
【０１７６】
本明細書で使用される「共刺激シグナル」は、細胞増殖、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞集団の拡大を促進し、細胞生存を促進し、サイトカインの分泌を調節し（例えば、アップレギュレートし又はダウンレギュレートし）、及び／又は他の免疫調節分子の産生及び／又は分泌を調節する、共刺激ドメインによって誘導される細胞内シグナルを指す。いくつかの実施形態では、２つの共刺激ドメインポリペプチドのホモ二量体化に続いて共刺激シグナルが誘導される。いくつかの実施形態では、共刺激シグナルは、共刺激ドメインを含むコンストラクト（例えば、キメラ抗原受容体又は誘導性調節コンストラクト）の活性化に続いて誘導される。
【０１７７】
キメラ抗原受容体は、ヒンジ又はスペーサー配列を介して細胞外リガンド結合ドメインに付着している膜貫通ドメインを含む、追加の構造要素を更に含んでもよい。膜貫通ドメインは、任意の膜結合タンパク質又は膜貫通タンパク質に由来し得る。例えば、膜貫通ポリペプチドは、Ｔ細胞受容体のサブユニット（すなわち、α、β、γ又はζ、ＣＤ３複合体を構成するポリペプチド）、ＩＬ２受容体ｐ５５（鎖）、ｐ７５（β鎖）又はγ鎖、Ｆｃ受容体のサブユニット鎖（例えば、Ｆｃγ受容体ＩＩＩ）、又はＣＤ８アルファ鎖等のＣＤタンパク質であってもよい。あるいは、膜貫通ドメインは合成であってもよく、ロイシン及びバリン等の主に疎水性残基を含んでもよい。
【０１７８】
ヒンジ領域とは、膜貫通ドメインを細胞外リガンド結合ドメインに連結するように機能するオリゴ又はポリペプチドを指す。例えば、ヒンジ領域は、最大３００個のアミノ酸、好ましくは１０個〜１００個のアミノ酸、最も好ましくは２５個〜５０個のアミノ酸を含み得る。ヒンジ領域は、ＣＤ８、ＣＤ４又はＣＤ２８の細胞外領域の全て若しくは一部、又は抗体定常領域の全て又は一部等、天然に存在する分子の全て又は一部に由来してもよい。あるいは、ヒンジ領域は、天然のヒンジ配列に対応する合成配列であってもよく、又は完全に合成されたヒンジ配列であってもよい。特定の例では、ヒンジドメインは、ヒトＣＤ８アルファ鎖、ＦｃｙＲｌｌｌａ受容体又はＩｇＧｌの一部を含む場合がある。
【０１７９】
本明細書で使用される「活性化」という用語は、検出可能なエフェクター機能を誘導するために十分に刺激された細胞（例えば、Ｔ細胞）の状態を指す。いくつかの実施形態では、活性化は、誘導されたサイトカイン産生及び／又は誘導された細胞増殖及び拡大に関連している。
【０１８０】
本明細書で使用される「外因性Ｔ細胞受容体」又は「外因性ＴＣＲ」は、その配列がＴＣＲを内因的に発現してもしなくてもよい免疫エフェクター細胞（例えば、ヒトＴ細胞）のゲノムに導入されるＴＣＲを指す。免疫エフェクター細胞上の外因性ＴＣＲの発現は、特定のエピトープ又は抗原（例えば、癌細胞、又は他の疾患を引き起こす細胞若しくは粒子の表面に優先的に存在するエピトープ又は抗原）に対する特異性を付与することができる。かかる外因性Ｔ細胞受容体は、アルファ鎖及びベータ鎖を含んでもよく、あるいは、ガンマ鎖及びデルタ鎖を含んでもよい。本発明において有用な外因性ＴＣＲは、目的の任意の抗原又はエピトープに対して特異性を有してもよい。
【０１８１】
本明細書で使用される場合、タンパク質に関して、「操作された」又は「組換え」という用語は、タンパク質をコードする核酸、及びタンパク質を発現する細胞又は生物に対する遺伝子工学技術の適用の結果として変更されたアミノ酸配列を有することを意味する。核酸に関して、「組換え」という用語は、遺伝子工学技術の適用の結果として変更された核酸配列を有することを意味する。遺伝子工学技術としては、ＰＣＲ及びＤＮＡクローニング技術、トランスフェクション、形質転換、その他の遺伝子導入技術、相同組換え、部位特異的突然変異誘発、及び遺伝子融合が挙げられるが、これらに限定されない。この定義によれば、天然に存在するタンパク質と同一のアミノ酸配列を有するが、異種宿主でのクローニング及び発現により産生されるタンパク質は、組換え体とは見なされない。
【０１８２】
本明細書で使用される「野生型」という用語は、所与の表現型の原因となる最も一般的な天然に存在するポリヌクレオチド又はポリペプチドの配列を指す。野生型の対立遺伝子又はポリペプチドが生物に正常な表現型を付与できるのに対し、突然変異体又は変異体の対立遺伝子又はポリペプチドは、場合によっては、表現型の変化を付与することができる。
【０１８３】
組換えタンパク質に関して本明細書で使用される「修飾」という用語は、参照配列（例えば、野生型配列又は天然配列）に対する組換え配列内のアミノ酸残基の挿入、欠失、又は置換を意味する。
【０１８４】
本明細書で使用される場合、「メガヌクレアーゼ」という用語は、１２塩基対を超える認識配列で二本鎖ＤＮＡに結合するエンドヌクレアーゼを指す。いくつかの実施形態では、本開示のメガヌクレアーゼの認識配列は２２塩基対である。メガヌクレアーゼは、Ｉ−ＣｒｅＩに由来するエンドヌクレアーゼであってもよく、例えばＤＮＡ結合特異性、ＤＮＡ切断活性、ＤＮＡ結合親和性、又は二量化特性に関して天然のＩ−ＣｒｅＩと比較して改変されたＩ−ＣｒｅＩの操作された変異体を指す場合がある。Ｉ−ＣｒｅＩのかかる改変された変異体を産生する方法は、当技術分野でよく知られている（例えば、国際公開第２００７／０４７８５９号明細書）。本明細書で使用されるメガヌクレアーゼは、ヘテロ二量体として二本鎖ＤＮＡに結合する。メガヌクレアーゼは、ペプチドリンカーを使用してＤＮＡ結合ドメインのペアが単一のポリペプチドにつながっている「単鎖メガヌクレアーゼ」であってもよい。「ホーミングエンドヌクレアーゼ」という用語は、「メガヌクレアーゼ」という用語と同義である。本開示のメガヌクレアーゼは、細胞、特にヒトＴ細胞で発現される場合、本明細書に記載の方法を使用して測定した場合細胞生存率への有害な影響又はメガヌクレアーゼ切断活性の著しい低下を観察することなく、細胞をトランスフェクトして３７℃で維持できるように実質的に非毒性である。
【０１８５】
本明細書で使用される場合、「単鎖メガヌクレアーゼ」という用語は、リンカーによってつなげられたヌクレアーゼサブユニットのペアを含むポリペプチドを指す。単鎖メガヌクレアーゼは：Ｎ末端サブユニット・リンカー・Ｃ末端サブユニットの構成を有する。２つのメガヌクレアーゼサブユニットは一般的にアミノ酸配列が同一ではなく、非同一のＤＮＡ配列を認識する。したがって、単鎖メガヌクレアーゼは通常、偽パリンドローム又は非パリンドロームの認識配列を切断する。単鎖メガヌクレアーゼは、実際には二量体ではないが、「単鎖ヘテロ二量体」又は「単鎖ヘテロ二量体メガヌクレアーゼ」と称される場合がある。明確にするために、特に明記しない限り、「メガヌクレアーゼ」という用語は、二量体又は単鎖メガヌクレアーゼを指す場合がある。
【０１８６】
本明細書で使用される「リンカー」という用語は、２つのメガヌクレアーゼサブユニットを単一のポリペプチドにつなげるために使用される外因性ペプチド配列を指す。リンカーは、天然タンパク質に見られる配列を有してもよく、又は天然タンパク質には見られない人工配列であってもよい。リンカーは柔軟性であって二次構造が欠けていてもよく、又は生理学的条件下で特定の三次元構造を形成する傾向を有してもよい。リンカーとしては、米国特許第８，４４５，２５１号明細書及び同第９，４３４，９３１号明細書に含まれるリンカーのいずれかが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８７】
本明細書で使用される「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」又は「ＺＦＮ」という用語は、制限エンドヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｓ１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ（ｍｕｎｇ  ｂｅａｎ  ｎｕｃｌｅａｓｅ）、膵臓ＤＮＡｓｅ  Ｉ、ミクロコッカスヌクレアーゼ、及び酵母ＨＯエンドヌクレアーゼを含むがこれらに限定されないエンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼに由来するヌクレアーゼドメインに融合したジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含むキメラタンパク質を指す。ジンクフィンガーヌクレアーゼの設計に有用なヌクレアーゼドメインとしては、ＦｏｋＩ、ＦｏＭ、及びＳｔｓＩの制限酵素を含むが、これらに限定されない、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼに由来するものが挙げられる。追加のＩＩ型制限エンドヌクレアーゼは、国際公開第２００７／０１４２７５号明細書に記載されており、その全体が参照することで本明細書の一部をなす。ジンクフィンガードメインの構造は、亜鉛イオンの配位により安定化される。１つ以上のジンクフィンガードメインを含むＤＮＡ結合タンパク質は、配列特異的にＤＮＡに結合する。ジンクフィンガードメインは、天然の配列であってもよく、又は合理的又は実験的な手段で再設計して、２塩基対〜１０塩基対離れた９塩基対のハーフサイト（ｈａｌｆ−ｓｉｔｅ）のペアを有する、長さが約１８塩基対の所定のＤＮＡ配列に結合するタンパク質を産生することもできる。例えば、各々がその全体を参照することで本明細書の一部をなす、米国特許第５，７８９，５３８号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，２００，７５９号の明細書、並びに国際公開第９５／１９４３１号、同第９６／０６１６６号、同第９８／５３０５７号、同第９８／５４３１１号、同第００／２７８７８号、同第０１／６０９７０号、同第０１／８８１９７号、及び同第０２／０９９０８４号の明細書を参照されたい。この操作されたタンパク質ドメインをＦｏｋＩヌクレアーゼ等のヌクレアーゼドメインに融合することにより、ゲノムレベルの特異性でＤＮＡ切断を標的にすることが可能である。標的部位、ジンクフィンガータンパク質、並びにジンクフィンガーヌクレアーゼの設計及び構築のための方法の選択は、当業者に知られており、米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号、同第２００５０２０８４８９号、同第２００５０６４４７４号、同第２００５００２６１５７号、同第２００６０１８８９８７号及び国際公開第０７／０１４２７５号の明細書に詳細に記載され、各々がそれらの全体が参照することで本明細書の一部をなす。ジンクフィンガーヌクレアーゼによる切断により、平滑末端又は可変長の５´オーバーハンド（ｏｖｅｒｈａｎｄ）（多くの場合、４塩基対）が生じる可能性がある。
【０１８８】
本明細書で使用される「ＴＡＬＥＮ」という用語は、制限エンドヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｓ１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、膵臓ＤＮＡｓｅ  Ｉ、ミクロコッカスヌクレアーゼ、及び酵母ＨＯエンドヌクレアーゼを含むがこれらに限定されないエンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼからのヌクレアーゼドメイン又はその活性部分に融合した複数のＴＡＬドメインリピートを含むＤＮＡ結合ドメインを含むエンドヌクレアーゼを指す。例えば、参照することでその全体が本明細書の一部をなす、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎら（２０１０）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１８６：７５７−７６１を参照されたい。ＴＡＬＥＮの設計に有用なヌクレアーゼドメインとしては、ＦｏｋＩ、ＦｏＭ、ＳｔｓＩ、ＨｈａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｎｏｄ、ＢｂｖＣＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩ、及びＡｌｗＩを含むがこれらに限定されないＩＩ型制限エンドヌクレアーゼに由来するものが挙げられる。追加のＩＩ型制限エンドヌクレアーゼは、国際公開第２００７／０１４２７５号明細書に記載されている。いくつかの態様では、ＴＡＬＥＮのヌクレアーゼドメインはＦｏｋＩヌクレアーゼドメイン又はその活性部分である。ＴＡＬドメインリピートは、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属の植物病原体による感染プロセスで使用されるＴＡＬＥ（転写活性化因子様エフェクター）ファミリーのタンパク質に由来し得る。ＴＡＬドメインリピートは、多様な１２番目と１３番目のアミノ酸を持つ３３個〜３４個のアミノ酸配列である。反復可変ジペプチド（ＲＶＤ：ｒｅｐｅａｔ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｉｐｅｐｔｉｄｅ）と称されるこれらの２つの位置は非常に可変的であり、特定のヌクレオチド認識と強い相関関係を示す。ＤＮＡ標的配列の各塩基対は、単一のＴＡＬリピートによって、ＲＶＤに起因する特異性と接触する。いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥＮは１６個〜２２個のＴＡＬドメインリピートを含む。ＴＡＬＥＮによるＤＮＡ切断には、非特異的な中央領域（すなわち、「スペーサー」）に隣接する２つのＤＮＡ認識領域が必要である。ＴＡＬＥＮに関する「スペーサー」という用語は、ＴＡＬＥＮを構成する各モノマーによって認識及び結合される２つの核酸配列を分離する核酸配列を指す。ＴＡＬドメインリピートは、天然に存在するＴＡＬＥタンパク質の天然配列であってもよく、又は合理的若しくは実験的手段で再設計して、所定のＤＮＡ配列に結合するタンパク質を産生することもできる（例えば、各々がその全体を参照することで本明細書の一部をなす、Ｂｏｃｈら（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６（５９５９）：１５０９−１５１２、及びＭｏｓｃｏｕ  ａｎｄ  Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６（５９５９）：１５０１を参照されたい）。特定の配列及びＲＶＤの例、並びに対応する標的ヌクレオチドを認識するためにＴＡＬＥＮを操作する方法については、米国特許出願公開第２０１１０１４５９４０号及び国際公開第２０１０／０７９４３０号の明細書も参照されたい。いくつかの実施形態では、各ヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）モノマーは、異なるＤＮＡ配列を認識するＴＡＬエフェクター配列に融合されてもよく、２つの認識部位が近接してい���場合にのみ、不活性モノマーが一緒になって機能性酵素を作り出す。
【０１８９】
本明細書で使用される「コンパクトＴＡＬＥＮ」という用語は、Ｉ−ＴｅｖＩホーミングエンドヌクレアーゼ、又はＭｍｅＩ、ＥｎｄＡ、Ｅｎｄ１、Ｉ−ＢａｓＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、Ｉ−ＴｗｏＩ、ＭｓｐＩ、ＭｖａＩ、ＮｕｃＡ、ＮｕｃＭ等が含まれるが、これらに限定されない米国特許出願第２０１３０１１７８６９号の表２に収載されているエンドヌクレアーゼのいずれか（その全体が参照することで本明細書の一部をなす）の任意の部分に任意の方向で融合した１つ以上のＴＡＬドメインリピートを有する、ＤＮＡ結合ドメインを含むエンドヌクレアーゼを指す。コンパクトＴＡＬＥＮはＤＮＡプロセッシング活性に二量体化を必要とせず、介在するＤＮＡスペーサーを持つ二重標的部位の必要性を軽減する。いくつかの実施形態では、コンパクトＴＡＬＥＮは１６個〜２２個のＴＡＬドメインリピートを含む。
【０１９０】
本明細書で使用する「ＣＲＩＳＰＲ」という用語は、Ｃａｓ９等のカスパーゼと、ゲノムＤＮＡの認識部位にハイブリダイズすることによりカスパーゼのＤＮＡ切断を指示するガイドＲＮＡとを含むカスパーゼに基づくエンドヌクレアーゼを指す。ＣＲＩＳＰＲのカスパーゼ構成要素は、ＲＮＡ誘導ＤＮＡエンドヌクレアーゼである。特定の実施形態では、カスパーゼはクラスＩＩ  Ｃａｓ酵素である。これらの実施形態のいくつかでは、カスパーゼは、Ｃａｓ９等のクラスＩＩ、ＩＩ型酵素である。他の実施形態では、カスパーゼは、Ｃｐｆ１等のクラスＩＩ、Ｖ型酵素である。ガイドＲＮＡは、定方向反復（ｄｉｒｅｃｔ  ｒｅｐｅａｔ）と、標的認識部位に相補的なガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系に関してスペーサーと称されることが多い）とを含む。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲは、ガイドＲＮＡ上に存在する定方向反復塩基配列（ｄｉｒｅｃｔ  ｒｅｐｅａｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（時にｔｒａｃｒメイト配列と称される）に（完全又は部分的に）相補的であるｔｒａｃｒＲＮＡ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ）を更に含む。特定の実施形態では、カスパーゼは、該酵素が標的ポリヌクレオチドの一本鎖を切断し、ニッカーゼとして機能し、標的ＤＮＡの一本鎖のみを切断する能力を欠くように、対応する野生型酵素に関して変異させることができる。ニッカーゼとして機能するカスパーゼ酵素の非限定的な例としては、ＲｕｖＣ  Ｉ触媒ドメイン内のＤ１０Ａ変異、又はＨ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、若しくはＮ８６３Ａの変異を有するＣａｓ９酵素が挙げられる。
【０１９１】
本明細書で使用される「メガＴＡＬ」という用語は、操作された配列特異的ホーミングエンドヌクレアーゼを有する転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合ドメインを含む単鎖ヌクレアーゼを指す。
【０１９２】
本明細書で使用される場合、「認識配列」という用語は、エンドヌクレアーゼによって結合及び切断されるＤＮＡ配列を指す。メガヌクレアーゼの場合、認識配列は、４塩基対で隔てられた逆向きの９塩基対の「ハーフサイト」のペアを含む。単鎖メガヌクレアーゼの場合、タンパク質のＮ末端ドメインは第１のハーフサイトに接触し、タンパク質のＣ末端ドメインは第２のハーフサイトに接触する。メガヌクレアーゼによる切断により、４塩基対の３´「オーバーハング」がもたらされる。「オーバーハング」又は「粘着末端」は、二本鎖ＤＮＡ配列のエンドヌクレアーゼ切断によってもたらすことができる短い一本鎖ＤＮＡセグメントである。Ｉ−ＣｒｅＩに由来するメガヌクレアーゼ及び単鎖メガヌクレアーゼの場合、オーバーハングは２２塩基対認識配列の１０塩基〜１３塩基を含む。コンパクトＴＡＬＥＮの場合、認識配列は、Ｉ−ＴｅｖＩドメインによって認識される第１のＣＮＮＮＧＮ配列と、それに続く長さ４塩基対〜１６塩基対の非特異的スペーサー、続いてＴＡＬエフェクタードメインによって認識される長さ１６ｂｐ〜２２ｂｐの第２の配列を含む（この配列は典型的には５´Ｔ塩基を有する）。コンパクトＴＡＬＥＮによる切断は２塩基対３´オーバーハングをもたらす。ＣＲＩＳＰＲの場合、認識配列は、ガイドＲＮＡが結合して直接切断するための配列であり、典型的には１６塩基対〜２４塩基対である。ガイド配列と認識配列との間の完全な相補性は、切断を行うために必ずしも必要ではない。ＣＲＩＳＰＲによる切断は、カスパーゼに応じて、平滑末端（クラスＩＩ、ＩＩ型カスパーゼ等）又はオーバーハング末端（クラスＩＩ、Ｖ型カスパーゼ等）をもたらすことができる。ＣｐｆＩカスパーゼが利用されるそれらの実施形態では、これを含むＣＲＩＳＰＲ複合体による切断は５´オーバーハングを生じ、特定の実施形態では、５ヌクレオチドの５´オーバーハングを生じる。各カスパーゼ酵素はまた、ガイドＲＮＡに相補的な認識配列の近くにＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）配列の認識も必要とする。正確な配列、ＰＡＭに対する長さの要件、及び標的配列からの距離は、カスパーゼ酵素によって異なるが、ＰＡＭは通常、標的／認識配列に近接する２塩基対〜５塩基対の配列である。特定のカスパーゼ酵素のＰＡＭ配列は当技術分野で知られており（例えば、各々が全体を参照することで本明細書の一部をなす、米国特許第８，６９７，３５９号及び米国特許出願公開第２０１６０２０８２４３号の明細書を参照されたい）、新規又は操作されたカスパーゼ酵素のＰＡＭ配列は、ＰＡＭ枯渇アッセイ（例えば、その全体が本明細書の一部をなす、Ｋａｒｖｅｌｉｓら（２０１７）Ｍｅｔｈｏｄｓ１２１−１２２：３−８を参照されたい）等、当技術分野で知られている方法を使用して識別され得る。ジンクフィンガーの場合、ＤＮＡ結合ドメインは典型的には、２塩基対〜１０塩基対離れた９塩基対の「ハーフサイト」のペアを含む１８ｂｐ認識配列を認識し、ヌクレアーゼによる切断は可変長（多くの場合、４塩基対）の平滑末端又は５´オーバーハングを作る。
【０１９３】
本明細書で使用される「標的部位」又は「標的配列」という用語は、ヌクレアーゼの認識配列を含む細胞の染色体ＤＮＡの領域を指す。
【０１９４】
本明細書で使用される「相同組換え」又は「ＨＲ」という用語は、修復テンプレートとして相同ＤＮＡ配列を使用して二本鎖ＤＮＡ切断が修復される天然の細胞プロセスを指す（例えば、Ｃａｈｉｌｌら（２００６），Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１１：１９５８−１９７６を参照されたい）。相同ＤＮＡ配列は、細胞に送達された内因性染色体配列又は外因性核酸であってもよい。
【０１９５】
本明細書で使用される「非相同末端結合」又は「ＮＨＥＪ」という用語は、２本の非相同ＤＮＡセグメントを直接つなぐことによって二本鎖ＤＮＡ切断が修復される天然の細胞プロセスを指す（例えば、Ｃａｈｉｌｌら（２００６），Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１１：１９５８−１９７６を参照されたい）。
【０１９６】
本明細書で使用される「低下した、減少した、軽減された」という用語は、疾患の症状若しくは重症度の任意の低下、又は癌細胞の増殖若しくは数の任意の減少を指す。いずれの場合も、かかる低下、減少、軽減は最大５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は最大１００％であり得る。したがって、「低下した、減少した、軽減された」という用語は、病状の部分的な軽減と完全な低下、減少、軽減の両方を包含する。
【０１９７】
本明細書で使用される「低下した」という用語はまた、適切な対照細胞と比較した場合のポリペプチドの細胞表面発現の低下を指す場合もある。本文脈において、低下は、発現が１００％低下されるポリペプチド発現のノックアウトとは異なる。むしろ、本発明では、低下とは、発現が減少するが完全には排除されていないことを示す。低下等は、例えば、ベータ２ミクログロブリン、ＭＨＣクラスＩ分子、又はＣＤ５２を低下させるように遺伝子改変されていない対照細胞とそれぞれ比較した場合の細胞表面ベータ２ミクログロブリン、ＭＨＣクラスＩ分子、又はＣＤ５２発現の低下であってもよい。発現の低下は、約１０％〜約９９％又はその中の任意の数又は範囲であってもよい。例えば、対照細胞と比較した場合、低下は約１０％〜９５％、約５０％〜約９５％、約７５％〜約９５％、又は約９０％〜約９５％であってもよい。低下は、対照細胞と比較した場合、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％であってもよい。
【０１９８】
本明細書で使用される「ＭＨＣクラスＩ分子」という用語は、非自己タンパク質のペプチド断片を提示する細胞表面に見られる主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）を指す。ＭＨＣクラスＩ分子は２つのポリペプチド鎖からなる。アルファ鎖は、アルファ−１（α１）ドメイン、アルファ−２（α２）ドメイン、及びアルファ−３（α３）ドメインと称される３つのポリペプチドからなる。α鎖は、α３ドメインを介して、ベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）からなるβ鎖に非共有結合される。アルファ鎖は多型であり、ＨＬＡ遺伝子（すなわち、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及びＨＬＡ−Ｃ）によってコードされているが、ベータ２ミクログロブリンは多型ではなく、Ｂ２Ｍ遺伝子によってコードされている。
【０１９９】
本明細書で使用される「ベータ２ミクログロブリン」という用語は、ＭＨＣクラスＩ分子のベータ鎖構成要素を指す。ヒトベータ２ミクログロブリンは、Ｂ２Ｍ遺伝子（例：ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ  ５６７）によってコードされる。ベータ２ミクログロブリンの発現は、細胞表面上のＭＨＣクラスＩ分子の集合と機能に必要である。
【０２００】
本明細書で使用される「ＣＤ５２」という用語は、分化抗原群５２とも称されるヒトＣＤ５２遺伝子（例えば、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ１０４３）によってコードされるポリペプチドを指す。
【０２０１】
本明細書で使用される「抗腫瘍活性」又は「抗腫瘍効果」という用語は、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞の数の減少、転移の数の減少、平均余命の延長、又は癌性状態に関連する様々な生理学的症状の改善によって現れ得る生物学的効果を指す。「抗腫瘍効果」はまた、第１に腫瘍の発生の予防における本開示の遺伝子改変細胞の能力によって現れ得る。
【０２０２】
「有効量」又は「治療有効量」という用語は、有益又は望ましい生物学的及び／又は臨床的結果をもたらすのに十分な量を指す。治療有効量は、治療用（例えば、遺伝子改変細胞、ＣＡＲ  Ｔ細胞等）の製剤又は組成物、疾患及びその重症度、並びに治療される被験体の年齢、体重、身体状態及び反応性に応じて変化する。特定の実施形態では、有効量の本明細書に開示される共刺激ドメインを含む細胞又は本明細書に開示される医薬組成物は、少なくとも１つの症状又は疾患の進行を軽減する。
【０２０３】
本明細書で使用する「治療する」又は「治療」という用語は、被験体が経験する疾患又は障害の少なくとも１つの兆候又は症状の頻度又は重症度を低下させることを意味する。
【０２０４】
本明細書で使用される「癌」という用語は、悪性の増殖又は腫瘍を引き起こす異常で制御されない細胞分裂を特徴とする任意の腫瘍性疾患（浸潤性にしろ転移性にしろ）を包含すると理解されるべきである。
【０２０５】
本明細書で使用される「癌腫」という用語は、上皮細胞で構成される悪性の増殖を指す。
【０２０６】
本明細書で使用される「白血病」という用語は、造血器官／系の悪性腫瘍を指し、一般的には、血液及び骨髄における白血球及びそれらの前駆体の異常な増殖及び発達を特徴とする。
【０２０７】
本明細書で使用される「肉腫」という用語は、胚性結合組織のような物質で構成され、一般に線維性、不均一又は均一な物質に埋め込まれた密に詰まった細胞で構成される腫瘍を指す。
【０２０８】
本明細書で使用される「黒色腫」という用語は、皮膚及び他の器官のメラニン細胞系から生じる腫瘍を指す。
【０２０９】
本明細書で使用される「リンパ腫」という用語は、リンパ球から発生する血液細胞腫瘍のグループを指す。
【０２１０】
本明細書で使用される「芽細胞腫」という用語は、前駆細胞又は芽細胞（未成熟又は胚組織）の悪性腫瘍によって引き起こされる癌のタイプを指す。
【０２１１】
本明細書で使用される「トランスフェクトされた」又は「形質転換された」又は「形質導入された」又は「ヌクレオフェクトされた」とは、外因性核酸が宿主細胞に移入又は導入されるプロセスを指す。「トランスフェクトされた」又は「形質転換された」又は「形質導入された」細胞は、外因性核酸で形質移入、形質転換又は形質導入された細胞である。細胞には、初代被験体細胞とその子孫が含まれる。
【０２１２】
本明細書で使用する「ヒトＴ細胞」又は「Ｔ細胞」は、ヒトドナーから単離されたＴ細胞を指す。ヒトＴ細胞及びそれに由来する細胞としては、培養で継代されていない単離Ｔ細胞、不死化せずに細胞培養条件下で継代及び維持されたＴ細胞、並びに不死化されて無期限に細胞培養条件下で維持され得るＴ細胞が挙げられる。
【０２１３】
本明細書で使用される「ヒトナチュラルキラー細胞」又は「ヒトＮＫ細胞」又は「ナチュラルキラー細胞」又は「ＮＫ細胞」とは、自然免疫系にとって重要な細胞傷害性リンパ球のタイプを指す。ＮＫ細胞が果たす役割は、脊椎動物の適応免疫応答における細胞傷害性Ｔ細胞の役割に類似している。ＮＫ細胞は、ウイルスに感染した細胞に迅速に反応し、腫瘍形成に反応し、感染後約３日で作用する。
【０２１４】
本明細書で使用される「対照」又は「対照細胞」とは、遺伝子改変細胞の遺伝子型又は表現型の変化を測定するための参照点を提供する細胞を指す。対照細胞は、例えば、以下：（ａ）野生型細胞、すなわち、遺伝子改変細胞をもたらした遺伝的変化の出発物質と同じ遺伝子型の細胞；（ｂ）遺伝子改変細胞と同じ遺伝子型の細胞であるが、ヌルコンストラクトで形質転換されている細胞（すなわち、目的の特性に影響を与えないコンストラクトを有する）；又は、（ｃ）遺伝子改変細胞と遺伝的に同一であるが、変更された遺伝子型又は表現型の発現を誘発する条件、刺激、又は更なる遺伝子改変に曝露されていない細胞、を含んでもよい。特定の実施形態では、対照細胞は、遺伝子改変細胞とその他の点では同一であるが、特定のポリペプチド（例えば、ベータ２ミクログロブリン、ＭＨＣクラスＩ分子、ＣＤ５２）の細胞表面発現を低下させるように遺伝子改変されていない。
【０２１５】
アミノ酸配列及び核酸配列の両方に関して本明細書で使用される場合、用語「パーセント同一性」、「配列同一性」、「パーセンテージ類似性」、「配列類似性」等は、整列したアミノ酸残基又はヌクレオチド間の類似性を最大化し、同一又は類似の残基又はヌクレオチドの数、残基又はヌクレオチドの総数、並びに配列アラインメントのギャップの存在及び長さの関数である、配列のアラインメントに基づく２つの配列の類似度の尺度を指す。標準パラメーターを使用して配列類似性を決定するため、様々なアルゴリズム及びコンピュータープログラムを使用することができる。本明細書で使用される場合、配列類似性は、アミノ酸配列用のＢＬＡＳＴｐプログラム及び核酸配列用のＢＬＡＳＴｎプログラムを使用して測定され、いずれもＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を通じて入手可能であって、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；Ｇｉｓｈ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｅｓ（１９９３），Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２；Ｍａｄｄｅｎら（１９９６），Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３  ８９−３４０２）；Ｚｈａｎｇら（２０００），Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．７（１−２）：２０３−１４に記載されている。本明細書で使用される場合、２つのアミノ酸配列のパーセント類似性は、ＢＬＡＳＴｐアルゴリズムの以下のパラメーター：ワードサイズ＝３；ギャップオープニングペナルティ＝−１１；ギャップ拡張ペナルティ＝−１；及びスコアリングマトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２に基づくスコアである。本明細書で使用される場合、２つの核酸配列のパーセント類似性は、ＢＬＡＳＴｎアルゴリズムの以下のパラメーター：ワードサイズ＝１１；ギャップオープニングペナルティ＝−５；ギャップ拡張ペナルティ＝−２；マッチリワード＝１；ミスマッチペナルティ＝−３に基づくスコアである。
【０２１６】
２つのタンパク質又はアミノ酸配列の修飾に関して本明細書で使用される場合、「に対応する」という用語は、第１のタンパク質の特定の修飾が第２のタンパク質の修飾と同じアミノ酸残基の置換であることを示すために使用され、２つのタンパク質が標準的な配列アラインメントに供される場合（例えば、ＢＬＡＳＴｐプログラムを使用する場合）、第１のタンパク質の修飾のアミノ酸位置は、第２のタンパク質の修飾のアミノ酸位置に対応する又はそれと整列する。したがって、第１のタンパク質の残基「Ｘ」のアミノ酸「Ａ」への修飾は、配列アラインメントにおいて残基Ｘと残基Ｙが互いに一致する場合、ＸとＹが異なる数である可能性があるという事実にもかかわらず、第２のタンパク質の残基「Ｙ」のアミノ酸「Ａ」への修飾に対応する。
【０２１７】
本明細書で使用される場合、変数の数値範囲の列挙は、その範囲内の値のいずれかに等しい変数で本開示が実施され得ると伝えることを意図している。したがって、本質的に不連続な変数の場合、変数は、その範囲の終点を含む数値範囲内の任意の整数値に等しい場合がある。同様に、本質的に連続的な変数の場合、変数は、その範囲の終点を含む数値範囲内の任意の実数値に等しい場合がある。例として、制限されずに、０〜２の間の値を持つと記載される変数は、該変数が本質的に不連続である場合、値０、１、又は２を取ることができ、該変数が本質的に連続している場合、値０．０、０．１、０．０１、０．００１、又は０以上２以下の任意の他の実数値を取ることができる。
【０２１８】
２．１  発明の原理
本開示は、細胞表面ベータ２ミクログロブリン、その結果ＭＨＣクラスＩ分子のノックダウンがＣＡＲ  Ｔ細胞等の遺伝子改変細胞の同種異系性を低下し得るという観察に一部基づいている。重要なことに、本発明者らは、ベータ２ミクログロブリン及びＭＨＣクラスＩ分子の不完全なノックダウン（すなわち、完全なノックアウトではなく、野生型発現の割合が低い）が、遺伝子改変細胞の同種異系性を低下させるだけでなく、Ｂ２Ｍ陰性の細胞を非自己として認識し、細胞傷害作用を誘導し得るＮＫ細胞による殺傷を劇的に低下するのに役立つことを発見した。
【０２１９】
本発明はまた、ＣＡＲをコードするコンストラクトがＣＤ５２に対するＲＮＡ干渉分子のコード配列を含む場合、ＣＡＲ陽性Ｔ細胞の集団が有利な陰性選択法により濃縮され得るという本発明者らの発見に一部基づいている。このようにして、ＣＤ５２陽性細胞を捕捉するため、ＣＡＲ  Ｔ細胞の集団を抗ＣＤ５２抗体に複合化したビーズと接触させることができる。ビーズ、したがってＣＤ５２陽性細胞の分離により、ＣＤ５２の細胞表面発現が低下したＣＡＲ陽性細胞の集団が濃縮される。
【０２２０】
したがって、キメラ抗原受容体等の操作された抗原受容体をコードする第１の発現カセットと、ＲＮＡ干渉分子等の阻害性核酸分子をコードする第２の発現カセットとを含む核酸分子が提供される。さらに、核酸分子には５´及び３´の相同性アームが隣接しており、操作されたヌクレアーゼによって産生される切断部位等の二本鎖切断での細胞のゲノムへの核酸の標的挿入が促進される。本発明の特定の実施形態では、阻害性核酸分子は、ＭＨＣクラスＩ分子の構成要素であるヒトベータ２ミクログロブリン、又はＣＤ５２に対するものであってもよい。
【０２２１】
さらに本明細書では、組換えＤＮＡコンストラクト及び核酸分子を含むウイルスベクター、核酸分子を含む遺伝子改変細胞、及びかかる細胞を含む医薬組成物が開示される。また、ベータ２ミクログロブリン、ＭＨＣクラスＩ分子、又はＣＤ５２の細胞表面発現が低下し、本発明の特定の核酸分子を発現する場合又は発現しない場合もある、操作された抗原受容体（例えば、ＣＡＲ又は外因性ＴＣＲ）を発現する遺伝子改変細胞も開示される。
【０２２２】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子改変細胞の投与は、本開示の遺伝子改変細胞によって標的とされ得る癌等の疾患の症状又は重症度を軽減する。
【０２２３】
また、本明細書に開示される遺伝子改変細胞及び薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を被験体に投与することを含む、それを必要とする被験体において癌を治療する免疫療法の方法も本明細書に開示される。かかる方法では、ＣＡＲが発現され、細胞表面ベータ２ミクログロブリン及び／又はＭＨＣクラスＩ分子が減少し、不完全なノックアウトが、細胞の同種異系性及びＮＫ細胞による細胞の死滅の両方の低下に結び付く。
【０２２４】
さらに、遺伝子改変細胞の濃縮集団を生産する方法が開示され、該方法では、ＲＮＡ干渉によりＣＡＲが発現され、細胞表面ＣＤ５２が減少し、ＣＤ５２発現が減少したＣＡＲ陽性細胞の陰性選択が可能になる。
【０２２５】
２．２  核酸分子
特定の実施形態では、本発明は、以下：（ａ）操作された抗原受容体をコードする核酸配列を含む第１の発現カセットと；（ｂ）阻害性核酸分子をコードする核酸配列を含む第２の発現カセットと；（ｃ）５´相同性アームと；（ｄ）３´相同性アームとを含む核酸分子を提供する。５´相同性アーム及び３´相同性アームは、適切な認識配列が存在する標的細胞内の任意の所望の遺伝子であってもよい、目的の遺伝子のヌクレアーゼ認識配列に隣接する染色体領域と相同性を有するように、任意の適切な長さで操作することができる。
【０２２６】
本発明の核酸分子は、任意の数の配向を有することができる。図１に示すいくつかの非限定的な例。特定の実施形態では、第１及び第２の発現カセットは同じ向きであってもよい。この方向は、相同性アームに対して５´から３´、又は３´から５´のいずれかである。いずれの場合でも、第１の発現カセットは第２のカセットの５´にあってもよく、又は第２のカセットは第１のカセットの５´にあってもよい。他の実施形態では、第１及び第２の発現カセットは、核酸分子内で異なる向きにあってもよい。例えば、第１の発現カセットは５´から３´に向けられてもよく、一方、第２の発現カセットは３´から５´に向けられてもよい。あるいは、第１の発現カセットは３´から５´に向けられてもよく、第２の発現カセットは５´から３´に向けられてもよい。
【０２２７】
発現カセットが反対の向きにある実施形態では、第１の発現カセットは３´から５´に向けられ、５´から３´に向けられる第２の発現カセットに対して５´に配置されるように、それらの発現カセットは「ｔａｉｌ−ｔｏ−ｔａｉｌ」構成で方向付けられる。同様のｔａｉｌ−ｔｏ−ｔａｉｌの実施形態では、第２の発現カセットは３´から５´に向けられ、５´から３´に向けられる第１の発現カセットに対して５´に配置される。
【０２２８】
発現カセットが反対の向きにある他の実施形態では、それらの発現カセットは「ｈｅａｄ−ｔｏ−ｈｅａｄ」構成で方向付けられる。第１の発現カセットは５´から３´に向けられ、３´から５´に向けられる第２の発現カセットに対して５´に配置される。同様のｈｅａｄ−ｔｏ−ｈｅａｄの実施形態では、第２の発現カセットは５´から３´に向けられ、３´から５´に向けられる第１の発現カセットに対して５´に配置される。
【０２２９】
いくつかの実施形態では、核酸分子は、第２の発現カセットの複数のコピーを含んでもよい。第２の発現カセットのコピーは同一であってもよく、又は互いに異なってもよい。いくつかの場合には、コピーは、プロモータ、阻害性核酸分子のコード配列、及び阻害性核酸分子の翻訳を終結させるための（ｃＰＰＴ／ＣＴＳ）配列等の配列を含んでもよい。第２の発現カセットのコピーは、核酸分子内で互いにタンデムであってもよく、同じ向き又は反対の向きであってもよい。あるいは、コピーはタンデムでなくてもよく、同じ向き又は反対の向きでもよい。
【０２３０】
核酸分子の発現カセットは、操作された抗原受容体及び／又は阻害性核酸分子の発現を駆動する様々なプロモータを含んでもよい。適切なプロモータの一例は、前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ配列である。このプロモータ配列は、それに制御可能に連結された任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動可能な強力な構成的プロモータ配列である。適切なプロモータの別の例は、伸長増殖因子−１α（ＥＦ−１α：Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ−１α）である。しかしながら、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモータ、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）プロモータ、ＭｏＭｕＬＶプロモータ、トリ白血病ウイルスプロモータ、エプスタインバーウイルス前初期プロモータ、ラウス肉腫ウイルスプロモータ等を含むが、これらに限定されない他の構成的プロモータ配列、同様にアクチンプロモータ、ミオシンプロモータ、ヘモグロビンプロモータ、クレアチンキナーゼプロモータ等を含むが、これらに限定されないヒト遺伝子プロモータも使用され得る。さらに、本開示は、構成的プロモータの使用に限定されるべきではない。誘導性プロモータも本開示の一部として企図される。誘導性プロモータの使用は、かかる発現が望まれる場合に制御可能に連結されるポリヌクレオチド配列の発現をオンにする、又は発現が望まれない場合に発現をオフにすることができる分子スイッチを提供する。誘導性プロモータの例としては、メタロチオニンプロモータ、グルココルチコイドプロモータ、プロゲステロンプロモータ、及びテトラサイクリンプロモータが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２３１】
合成プロモータも本開示の一部として企図される。例えば、特定の実施形態では、操作された抗原受容体の発現を駆動するプロモータはＪｅＴプロモータである（国際公開第２００２／０１２５１４号明細書を参照されたい）。
【０２３２】
いくつかの実施形態では、プロモータは、所望の結果に基づいて選択される。本明細書に開示されるポリヌクレオチドの発現のタイミング、位置及び／又はレベルを調節するために発現カセットに異なるプロモータを使用することにより、種々の用途を強化することができると認識されている。かかる発現コンストラクトは、必要に応じて、プロモータ調節領域（例えば、誘導性、構成的、環境的若しくは発生的に調節される、又は細胞若しくは組織特異的／選択的発現を付与するもの）、転写開始開始部位、リボソーム結合部位、ＲＮＡプロセシングシグナル、転写終結部位、及び／又はポリアデニル化シグナルを含んでもよい。
【０２３３】
ＲＮＡ干渉分子の発現を駆動するのに特に有用なプロモータは、当技術分野でよく知られており、Ｕ６又はＨ１等のｐｏｌ  ＩＩＩプロモータを含むが、これらに限定されない。
【０２３４】
核酸分子の５´及び３´の相同性アームは、ゲノム中のヌクレアーゼ認識配列の５´上流及び３´下流の対応する配列と配列相同性を有する。相同性アームは、ヌクレアーゼによって生成された切断部位への核酸分子の挿入を促進する。一般に、相同性アームは、少なくとも５０塩基対、好ましくは少なくとも１００塩基対、及び最大２０００塩基対以上の長さを持つことができ、ゲノム中のそれらの対応する配列に対して、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、又はそれ以上の配列相同性を持つことができる。
【０２３５】
遺伝子改変細胞における操作された抗原受容体（例えば、ＣＡＲ又は外因性Ｔ細胞受容体）の発現を評価するために、本発明の核酸分子は、任意に、コード化された細胞表面タンパク質の存在の検出に使用され得るエピトープを含んでもよい。本明細書に記載されるいくつかの例では、ＣＡＲコード配列は、抗ＣＤ３４抗体を使用する検出を可能にするＱＢｅｎｄ１０エピトープを含んでもよい（国際公開第２０１３／１５３３９１号明細書を参照されたい）。
【０２３６】
他の例では、発現カセットは選択可能なマーカー遺伝子若しくはレポーター遺伝子のいずれか、又はそれらの両方を含むことができ、ウイルスベクターによりトランスフェクト又は感染させようとする細胞集団からの発現細胞の同定及び選択を容易にする。他の態様では、選択可能なマーカーは、ＤＮＡの別々の断片上で保持され、同時トランスフェクション手順で使用され得る。選択可能なマーカーとレポーター遺伝子の両方に、宿主細胞での発現を可能にする適切な調節配列が隣接してもよい。有用な選択可能なマーカーとしては、例えば、抗生物質耐性遺伝子及び蛍光マーカー遺伝子が挙げられる。
【０２３７】
発現はまた、阻害性核酸配列により標的化されたポリペプチドのタンパク質発現を判断することにより評価され得る。例えば、ベータ２ミクログロブリン及びＣＤ５２の発現は、当技術分野で知られている多くの技術により細胞表面上で検出され得る。発現はまた、細胞表面ポリペプチドを発現する、又はその発現を欠く細胞の特定の集団を精製する陽性又は陰性の選択手順によって判断することもできる。
【０２３８】
本開示の核酸分子を含むベクターも本明細書で提供される。いくつかの態様では、核酸分子は、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス、又はコスミドを含むがこれらに限定されないベクターにクローニングされる。特に目的のベクターとしては、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、及び配列決定ベクターが挙げられる。
【０２３９】
他の実施形態では、本発明の核酸分子は、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター等のウイルスベクター上で提供される。ウイルスベクター技術は、当技術分野でよく知られており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、及び他のウイルス学及び分子生物学のマニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。一般に、適切なベクターは、少なくとも１つの生物で機能する複製起点、プロモータ配列、便利な制限エンドヌクレアーゼ部位、及び１つ以上の選択マーカーを含む（例えば、国際公開第０１／９６５８４号；同第０１／２９０５８号；及び米国特許第６，３２６，１９３号の明細書）。本発明の核酸が、ゲノムへのランダムな統合を促進し、相同組換えのために５´及び３´の相同アームの存在を必要としないウイルスベクターで提供される場合、本発明の核酸は、５´及び３´の相同性アームを伴わずに提供され得る。
【０２４０】
２．３  キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
本明細書では、操作された抗原受容体を発現する遺伝子改変細胞が提供される。いくつかの実施形態では、操作された抗原受容体はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。一般に、本開示のＣＡＲは、少なくとも細胞外ドメイン及び細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは、リガンド結合ドメイン又はリガンド結合部分とも称される標的特異的結合要素を含む。いくつかの実施形態では、細胞内ドメイン又は細胞質ドメインは、少なくとも１つの共刺激ドメインと、１つ以上のシグナル伝達ドメインとを含む。他の実施形態では、ＣＡＲはＣＤ３ζ等のシグナル伝達ドメインのみを含んでもよく、細胞は、細胞内で発現される別のコンストラクト上に１つ以上の共刺激ドメインを含んでもよい。
【０２４１】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、リガンド結合ドメイン又はリガンド結合部分とも称される細胞外の標的特異的結合要素を含む。リガンド結合ドメインの選択は、標的細胞の表面を定義するリガンドの種類及び数に依存する。例えば、リガンド結合ドメインは、特定の疾患状態に関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するように選択されてもよい。したがって、本開示のＣＡＲにおけるリガンド結合ドメインのリガンドとして作用し得る細胞表面マーカーの例としては、ウイルス、細菌及び寄生虫の感染症、自己免疫疾患、及び癌細胞に関連するものを挙げることができる。いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲは、腫瘍細胞上の抗原に特異的に結合する所望のリガンド結合部分を操作することにより、目的の腫瘍抗原を標的とするように操作される。本開示の文脈において、「腫瘍抗原」とは、癌等の特定の過剰増殖性障害に共通する抗原を指す。
【０２４２】
いくつかの態様では、ＣＡＲの細胞外リガンド結合ドメインは、目的の任意の抗原又はエピトープ、特に目的の任意の腫瘍抗原又はエピトープに特異的である。非限定的な例として、いくつかの実施形態では、標的の抗原は、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲバリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＬＬ−１、ジシアロガングリオシドＧＤ２、管上皮ムチン、ｇｐ３６、ＴＡＧ−７２、スフィンゴ糖脂質、神経膠腫関連抗原、Ｂ−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、サイログロブリン、ＲＡＧＥ−１、ＭＮ−ＣＡ  ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸内カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、Ｍ−ＣＳＦ、プロスターゼ、プロスターゼ特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＡ−ｌａ、ｐ５３、プロスタイン、ＰＳＭＡ、サバイビング（ｓｕｒｖｉｖｉｎｇ）及びテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、インスリン成長因子（ＩＧＦｌ）−１、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦＩ受容体、メソセリン、腫瘍特異的ペプチドエピトープを提示する主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子、５Ｔ４、ＲＯＲ１、Ｎｋｐ３０、ＮＫＧ２Ｄ、腫瘍間質抗原、フィブロネクチンの追加ドメインＡ（ＥＤＡ）及び追加ドメインＢ（ＥＤＢ）並びにテネイシンＣのＡｌドメイン（ＴｎＣ  Ａｌ）、並びに維芽細胞関連タンパク質（ｆａｐ）等の腫瘍関連表面抗原；ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）等の系統特異的又は組織特異的抗原、エンドグリン、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子、ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９、ＴＮＦＲＳＦ  １７）、ＣＳ１、又はＨＩＶ特異抗原（ＨＩＶ  ｇｐｌ２０等）等のウイルス特異表面抗原；ＥＢＶ特異抗原、ＣＭＶ特異抗原、Ｅ６又はＥ７腫瘍性タンパク質等のＨＰＶ特異抗原、ラッセウイルス特異抗原、インフルエンザウイルス特異抗原、同様にこれらの表面マーカーの任意の誘導体又はバリアントである。本開示の特定の実施形態では、リガンド結合ドメインはＣＤ１９に特異的である。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体の細胞外ドメインは、Ｂリンパ球上の自己抗原特異的Ｂ細胞受容体によって認識され得る自己抗原を更に含み（Ｐａｙｎｅら（２０１６）Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｖｏｌ．３５３（６２９５）：１７９−１８４を参照されたい）、抗体媒介自己免疫疾患の自己反応性Ｂリンパ球を特異的に標的として殺傷するようにＴ細胞に指示する。かかるＣＡＲは、キメラ自己抗体受容体（ＣＡＡＲ）と称されることがあり、本明細書に記載される１つ以上の共刺激ドメインのかかるＣＡＡＲへの組み込みが本開示に含まれる。
【０２４４】
いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体の細胞外ドメインは、目的の抗原に対する天然に存在するリガンド、又は目的の抗原に結合する能力を保持する天然に存在するリガンドの断片を含んでもよい。
【０２４５】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ヒンジ又はスペーサー配列を介して細胞外リガンド結合ドメイン又は自己抗原を細胞内シグナル伝達及び共刺激ドメインと連結する膜貫通ドメインを含む。膜貫通ドメインは、任意の膜結合タンパク質又は膜貫通タンパク質に由来し得る。例えば、膜貫通ポリペプチドは、Ｔ細胞受容体のサブユニット（すなわち、α、β、γ又はζ、ＣＤ３複合体を構成するポリペプチド）、ＩＬ２受容体ｐ５５（鎖）、ｐ７５（β鎖）又はγ鎖、Ｆｃ受容体のサブユニット鎖（例えば、Ｆｃγ受容体ＩＩＩ）、又はＣＤ８アルファ鎖等のＣＤタンパク質であってもよい。あるいは、膜貫通ドメインは合成であってもよく、ロイシン及びバリン等の主に疎水性残基を含んでもよい。特定の例では、膜貫通ドメインはＣＤ８α膜貫通ポリペプチドである。
【０２４６】
ヒンジ領域とは、膜貫通ドメインを細胞外リガンド結合ドメインに連結するように機能するオリゴ又はポリペプチドを指す。例えば、ヒンジ領域は、最大３００個のアミノ酸、好ましくは１０個〜１００個のアミノ酸、最も好ましくは２５個〜５０個のアミノ酸を含み得る。ヒンジ領域は、ＣＤ８、ＣＤ４又はＣＤ２８の細胞外領域の全て若しくは一部、又は抗体定常領域の全て又は一部等、天然に存在する分子の全て又は一部に由来してもよい。あるいは、ヒンジ領域は、天然のヒンジ配列に対応する合成配列であってもよく、又は完全に合成されたヒンジ配列であってもよい。特定の例では、ヒンジドメインは、ヒトＣＤ８アルファ鎖、ＦｃｙＲｌｌｌａ受容体又はＩｇＧｌの一部を含む場合がある。
【０２４７】
本開示のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲが置かれた細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも１つの活性化及び／又は増殖及び細胞生存の経路の活性化を担う。「エフェクター機能」という用語は、細胞の特殊な機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性、又はサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であってもよい。ＣＤ３ζ等の細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞外ドメインの結合に応答して細胞に活性化シグナルを提供することができる。検討されるように、活性化シグナルは、例えば細胞溶解活性又はサイトカイン分泌等の細胞のエフェクター機能を誘導することができる。
【０２４８】
ＣＡＲの細胞内ドメインには、細胞外ドメインの結合後に、細胞増殖、細胞生存、及び／又はサイトカイン分泌を促進するために共刺激シグナルを伝達する１つ以上の細胞内共刺激ドメインを含めることができる。かかる細胞内共刺激ドメインとしては、限定されないが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、及びＣＤ８３、Ｎ１、又はＮ６と特異的に結合するリガンド等の当技術分野で知られているもののいずれかが挙げられる。
【０２４９】
ＣＡＲは、任意の種類の癌細胞に特異的である。かかる癌としては、癌腫、リンパ腫、肉腫、芽細胞腫、白血病、Ｂ細胞起源の癌、乳癌、胃癌、神経芽腫、骨肉腫、肺癌、黒色腫、前立腺癌、結腸癌、腎細胞癌腫、卵巣癌、横紋筋肉腫、白血病、ホジキンリンパ腫が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、Ｂ細胞起源の癌としては、Ｂ系統の急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、及び多発性骨髄腫が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２５０】
２．４  組換えウイルスベクターを生産する方法
いくつかの実施形態では、本開示は、本開示の方法で使用するための組換えＡＡＶベクターを提供する。組換えＡＡＶベクターは、典型的には、ＨＥＫ−２９３等の哺乳動物細胞株で産生される。ウイルスのｃａｐ遺伝子及びｒｅｐ遺伝子はベクターから除去されて、自己複製を防ぎ、治療遺伝子（複数の場合もある）（例：エンドヌクレアーゼ遺伝子）を送達する余地を作ることから、これらをパッケージング細胞株にトランスで提供する必要がある。さらに、複製を支持するために必要な「ヘルパー」（例えば、アデノウイルス）構成要素を提供する必要がある（Ｃｏｔｓ  Ｄ，Ｂｏｓｃｈ  Ａ，Ｃｈｉｌｌｏｎ  Ｍ（２０１３）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１３（５）：３７０−８１）。多くの場合、組換えＡＡＶベクターは、細胞株に「ヘルパー」構成要素をコードする第１のプラスミド、ｃａｐ遺伝子及びｒｅｐ遺伝子を含む第２のプラスミド、並びにウイルスにパッケージングされるための介在ＤＮＡ配列を含むウイルスＩＴＲを含む第３のプラスミドを用いてトランスフェクションするトリプルトランスフェクションを使用して産生される。次いで、カプシドに包まれたゲノム（目的のＩＴＲ及び介在遺伝子（複数の場合もある）を含むウイルス粒子を、凍結融解サイクル、超音波処理、界面活性剤、又は当技術分野で知られている他の手段によって細胞から単離する。次いで、粒子は塩化セシウム密度勾配遠心分離又はアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製し、その後、細胞、組織、又はヒト患者等の生物に目的の遺伝子（複数の場合もある）を送達する。したがって、本明細書に記載される本発明の核酸分子を含む組換えＡＡＶベクターを産生する方法が本明細書に提供される。
【０２５１】
いくつかの実施形態では、遺伝子導入は、レンチウイルスベクターを介して達成される。他のレトロウイルスとは対照的に、レンチウイルスは、場合によっては、特定の非分裂細胞の形質導入に使用され得る。レンチウイルスベクターの非限定的な例としては、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ−１）、ＨＩＶ−２、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒトＴリンパ球好性ウイルス１（ＨＴＬＶ−１）、ＨＴＬＶ−２、又はウマ感染性貧血ウイルス（Ｅ１ＡＶ）等のレンチウイルスに由来するものが挙げられる。例えば、例えば、遺伝子ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、及びｎｅｆを削除し、ＨＩＶ病原性遺伝子を多重に減衰させることでレンチウイルスベクターを生成し、治療目的に対してベクターをより安全なものとした。レンチウイルスベクターは、当技術分野で知られており、Ｎａｌｄｉｎｉら（１９９６  ａｎｄ  １９９８）；Ｚｕｆｆｅｒｅｙら（１９９７）；Ｄｕｌｌら１９９８、米国特許第６，０１３，５１６号；及び同第５，９９４，１３６号の明細書）を参照されたい。いくつかの実施形態では、これらのウイルスベクターはプラスミド系又はウイルス系であり、外来核酸を統合するため、選択のため、及び宿主細胞への核酸の移入のための必須配列を保持するように構成される。既知のレンチウイルスは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（“ＡＴＣＣ”；１０８０１Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．２０１１０−２２０９）等の寄託機関又はコレクションから容易に入手できるか、又は一般的に利用可能な技術を使用して既知の供給源から単離され得る。
【０２５２】
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）からクローニングされたｇａｇ、ｐｏｌ、ｔａｔ、及びｒｅｖの遺伝子をコードする第１のプラスミドと、偽型ウイルス粒子に対して使用される水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ−Ｇ）に由来するエンベロープタンパク質をコードする第２のプラスミドを使用して調製される。ｐＣＤＨ−ＥＦ１−ＭＣＳベクター等のトランスファーベクターは、適切なプロモータと共に使用され得る。次いで、３つのプラスミド全てをレンチウイルス細胞（Ｌｅｎｔｉ−Ｘ−２９３Ｔ細胞等）にトランスフェクトし、次いで、適切なインキュベーション時間後にレンチウイルスを収集、濃縮、スクリーニングすることができる。したがって、本明細書に記載される本発明の核酸分子を含む組換えレンチウイルスベクターを産生するための方法が本明細書において記載される。
【０２５３】
２．５  遺伝子改変細胞
本明細書において、本明細書に記載される本発明の核酸分子を含むように遺伝子改変された細胞が提供される。さらに、本発明の特定の核酸分子を必ずしも含まないベータ２ミクログロブリン、ＭＨＣクラスＩ分子、及び／又はＣＤ５２の細胞表面発現が低下した遺伝子改変細胞（例えば、ＣＡＲ又は外因性ＴＣＲを発現するヒトＴ細胞）が提供される。
【０２５４】
本開示の異なるバリエーションにおいて、本発明の核酸分子は、遺遺伝子改変細胞のゲノム内に存在する、又は該細胞のゲノムに統合されない。特定の実施形態では、本発明の核酸分子は、操作されたヌクレアーゼによってもたらされる等の二本鎖切断によってもたらされる切断部位での標的挿入により細胞のゲノムに挿入される。核酸分子の第１及び第２の発現カセットに隣接する５´及び３´の相同性アームの存在は、核酸分子の切断部位への相同組換えを促進し、標的挿入をもたらす。
【０２５５】
核酸分子がゲノムに統合されていないいくつかの実施形態では、核酸分子は、遺伝子改変細胞、組換えＤＮＡコンストラクト、ｍＲＮＡ、ウイルスゲノム、又は細胞のゲノムに統合されていない他の核酸に存在し得る。
【０２５６】
特定の実施形態では、本発明の核酸分子を含む細胞、及び本発明の他の遺伝子改変細胞は、真核細胞である。特定の実施形態では、かかる細胞はＴ細胞又はＮＫ細胞、特にヒトのＴ細胞又はＮＫ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は初代Ｔ細胞又は初代ＮＫ細胞である。
【０２５７】
Ｔ細胞及びＮＫ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位の組織、腹水、胸水、脾臓組織、腫瘍を含む多くの供給源から取得され得る。本開示の特定の実施形態では、当技術分野で利用可能な任意の数のＴ細胞及びＮＫ細胞株を使用することができる。本開示のいくつかの実施形態では、Ｔ細胞及びＮＫ細胞は、当業者に知られている任意の数の技術を使用して、被験体から収集された血液単位から得られる。一実施形態では、個体の循環血液に由来する細胞は、アフェレーシスにより得られる。
【０２５８】
本明細書に開示される核酸分子を含む遺伝子改変細胞、及び本発明の他の遺伝子改変細胞は、細胞内でどのポリペプチドが減少するか、及び／又は阻害性核酸分子により標的化されるかによって多くの機能的特性を示すことができる。例えば、本発明のいくつかの遺伝子改変細胞では、ベータ２ミクログロブリンが減少する、又は阻害性核酸分子がヒトベータ２ミクログロブリンに対するものであり、細胞表面ベータ２ミクログロブリン発現が野生型発現のわずかな割合まで低下する。かかる遺伝子改変細胞は、内因性ＮＫ細胞殺傷の影響を受けにくく、被験体における持続時間を延長し、被験体において増強された拡大を示し、及び／又はＢ２Ｍの野生型レベルを有する細胞又は完全にＢ２Ｍ陰性の細胞よりも同種異系性が低下している。その結果、ベータ２ミクログロブリンが減少すると、ベータ２ミクログロブリンはそれらの集合及び機能に必要であるため、ＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現が低下する。したがって、同じ特性は、ＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現が低下した本発明の遺伝子改変細胞にも適用可能である。
【０２５９】
ＮＫ細胞殺傷に対する感受性は、本明細書で更に記載されているもの等、当技術分野で知られている方法によって決定され得る。ＮＫ細胞殺傷における低下は、対照細胞と比較した場合、約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６、９７％、９８％、９９％、又は最大１００％であってもよい。
【０２６０】
本発明の遺伝子改変細胞は、投与後に被験体内で拡大可能である。ここでは、拡大は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの増殖及び分裂に起因する細胞数の増加と見なされる。拡大の程度は、部分的には、細胞に対する被験体の反応に依存し、例えば、細胞が同種異系及び／又は非自己と識別される場合、被験体の免疫系は細胞の拡大能を低下させ、投与後の細胞の持続性を更に低下させ得る。したがって、いくつかの例では、本発明の遺伝子改変細胞は、対照細胞と比較した場合、約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、２００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、最大１０００％、又はそれ以上の被験体における拡大の増加を示し得る。ｉｎ  ｖｉｖｏでの拡大は、当該分野で知られている任意の方法により投与後に判断され得る。被験体における遺伝子改変細胞の持続時間は、例えば、当技術分野で知られている任意の方法によって被験体において検出され得る細胞の投与後時間の量と見なすことができる。いくつかの例では、本発明の遺伝子改変細胞は、対照細胞よりも、最大約１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、１年、又はそれ以上長い持続時間の増加を有するであろう。
【０２６１】
同種異系性は、本明細書で更に説明される方法等、当技術分野で知られている任意の方法によって判断され得る。本発明の遺伝子改変細胞は、対照細胞と比較した場合に約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％９４％、９５％、９６、９７％、９８％、９９％、又は最大１００％の同種異系性の低下を示し得る。
【０２６２】
２．６  遺伝子改変細胞を生産する方法
本開示は、本明細書に記載される本発明の核酸分子を含む遺伝子改変細胞を産生する方法を提供する。特定の実施形態では、核酸分子を含むように細胞を改変する方法が提供される。本開示の異なる態様では、核酸分子は細胞のゲノムに統合される、又は細胞のゲノムに統合されない。
【０２６３】
いくつかの実施形態では、核酸分子は、当該分野で知られている任意の技術を使用して細胞に導入される。特定の実施形態では、本明細書に開示される核酸分子を含むベクター又は発現カセットは、ウイルスベクターを使用して細胞に導入される。かかるベクターは当技術分野で知られており、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが含まれる（Ｖａｎｎｕｃｃｉ，ら（２０１３  Ｎｅｗ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３６：１−２２）で概説される）。本開示において有用な組換えＡＡＶベクターは、細胞へのウイルスの形質導入及び細胞へのヌクレアーゼ遺伝子の挿入、並びに特定の実施形態では細胞ゲノムへの挿入を可能にする任意の血清型を有し得る。特定の実施形態では、組換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ６、又はＡＡＶ８の血清型を有する。組換えＡＡＶベクターはまた、宿主細胞において二本鎖ＤＮＡ合成を必要としないように自己相補的であってもよい（ＭｃＣａｒｔｙら（２００１）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８：１２４８−５４）。
【０２６４】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸分子は、ＤＮＡの形態（例えば、環状又は直線化プラスミドＤＮＡ又はＰＣＲ産物）で、及び／又はウイルスベクターを介して細胞に送達される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸分子は、当技術分野で知られている方法を使用して、ナノ粒子に共有結合若しくは非共有結合されるか、又はかかるナノ粒子内にカプセル化される（Ｓｈａｒｍａら（２０１４）Ｂｉｏｍｅｄ  Ｒｅｓ  Ｉｎｔ．２０１４）。ナノ粒子は、その長さの尺度が１μｍ未満、好ましくは１００ｎｍ未満のナノスケール送達システムである。かかるナノ粒子は、金属、脂質、ポリマー、又は生体高分子で構成されるコアを使用して設計され得て、核酸分子の複数のコピーをナノ粒子コアに付着又はカプセル化することができる。これにより、各細胞に送達されるＤＮＡのコピー数が増加するため、細胞内発現が増加し、コードされた生成物が発現される可能性が最大になる。かかるナノ粒子の表面は、コアシェルナノ粒子を形成するため、ポリマー又は脂質（例えば、キトサン、カチオン性ポリマー、又はカチオン性脂質）で更に修飾されてもよく、その表面がペイロードの細胞送達及び取り込みを強化する追加機能を付与する（Ｊｉａｎら（２０１２）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．３３（３０）：７６２１−３０）。ナノ粒子はさらに、ナノ粒子を適切な細胞型に誘導し、及び／又は細胞取り込みの可能性を高めるために、標的分子に有利に結合され得る。かかる標的分子の例としては、細胞表面受容体に特異的な抗体及び細胞表面受容体の天然リガンド（又は天然リガンドの一部）が挙げられる。
【０２６５】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸分子は、リポソーム内にカプセル化され得るか、又はカチオン性脂質を使用して複合体化され得る（例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；Ｚｕｒｉｓら（２０１５）  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３：７３−８０；Ｍｉｓｈｒａら（２０１１）Ｊ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．２０１１：８６３７３４を参照されたい）。リポソーム及びリポプレックスの製剤は、ペイロードを分解から保護し、細胞の細胞膜との融合及び／又は細胞膜の破壊により細胞の取り込み及び送達効率を促進することができる。
【０２６６】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸分子は、ポリマー足場（例えば、ＰＬＧＡ）内にカプセル化され得るか、又はカチオン性ポリマー（例えば、ＰＥＩ、ＰＬＬ）を使用して複合化され得る（Ｔａｍｂｏｌｉら（２０１１）Ｔｈｅｒ  Ｄｅｌｉｖ．２（４）：５２３−５３６）。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸分子を、ミセルに自己集合する両親媒性分子と組み合わせることができる（Ｔｏｎｇら（２００７）Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．９（１１）：９５６−６６）。高分子ミセルは、凝集を防止し、電荷相互作用をマスクし、細胞外の非特異的相互作用を低減し得る親水性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）で形成されたミセルシェルを含む場合がある。
【０２６７】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸分子は、細胞への送達用のエマルジョンとして製剤化され得る。「エマルジョン」という用語は、水に混和しない相が水相と混合される際に、非極性残基（例えば、長い炭化水素鎖）を水から遠ざけ、極性頭部基を水に向ける疎水性力の結果として形成することができる脂質構造を含む、水中油型、油中水型、水中油中水型、又は油中水中油型の分散液又は液滴のいずれかを指すが、これらに限定されない。これらの他の脂質構造としては、単層、少層（ｐａｕｃｉｌａｍｅｌｌａｒ）、及び多層の脂質小胞、ミセル、及びラメラ相が挙げられるが、これらに限定されない。エマルジョンは、水相及び親油性相（典型的には、油及び有機溶媒を含む）で構成されている。エマルジョンには、１つ以上の界面活性剤も含まれることが頻繁にある。例えば、各々がその全体を参照することで本明細書の一部をなす、米国特許出願番号第２００２／００４５６６７号及び同第２００４／００４３０４１号の明細書、並びに米国特許第６，０１５，８３２号、同第６，５０６，８０３号、同第６，６３５，６７６号、及び同第６，５５９，１８９号の明細書に記載されるように、ナノエマルジョン製剤がよく知られている。
【０２６８】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸分子は、多機能ポリマーコンジュゲート、ＤＮＡデンドリマー、及びポリマーデンドリマーに共有結合により又は非共有結合的に付着され得る（Ｍａｓｔｏｒａｋｏｓら（２０１５）Ｎａｎｏｓｃａｌｅ．７（９）：３８４５−５６；Ｃｈｅｎｇら（２００８）Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．９７（１）：１２３−４３）。デンドリマーの生成は、ペイロードの容量及びサイズを制御でき、高いペイロード容量を提供することができる。さらに、複数の表面基の提示を活用して、安定性を改善し、非特異的な相互作用を減らすことができる。
【０２６９】
遺伝子を細胞に導入及び発現させる方法は、当技術分野で知られている。発現ベクターの文脈において、ベクターは、当該分野の任意の方法により、宿主細胞、例えば、哺乳動物、細菌、酵母、又は昆虫の細胞に容易に導入され得る。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的、又は生物学的な手段によって宿主細胞に移入され得る。ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する物理的方法としては、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、微粒子銃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション等が挙げられる。ベクター及び／又は外因性核酸を含む細胞を産生する方法は、当技術分野でよく知られている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照されたい。ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための好ましい方法は、リン酸カルシウムのトランスフェクションである。目的のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための生物学的方法としては、ＤＮＡ及びＲＮＡベクターの使用が挙げられる。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、ヒト細胞等の哺乳動物に遺伝子を挿入するため最も広く使用されている方法となった。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス等に由来してもよい。例えば、米国特許第５，３５０，６７４号及び同第５，５８５，３６２号の明細書を参照されたい。ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための化学的手段としては、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ等のコロイド分散系、及び水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含む脂質ベース系が挙げられる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで送達ビヒクルとして使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。
【０２７０】
２．７  医薬組成物
いくつかの実施形態では、本開示は、本開示の遺伝子改変細胞、又は遺伝子改変細胞の集団と、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を提供する。かかる医薬組成物は、既知の技術に従って調製され得る。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２１ｓｔｅｄ．２００５）を参照されたい。本開示による医薬製剤の製造において、細胞は典型的には薬学的に許容可能な担体と混合され、得られた組成物は被験体に投与される。担体は、もちろん、製剤中の他の成分と適合性があるという意味で許容可能でなければならず、被験体に有害であってはならない。いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、被験体の疾患の治療に有用な１つ以上の追加の薬剤を更に含む。追加の実施形態では、遺伝子改変細胞が遺伝子改変ヒトＴ細胞又はＮＫ細胞（又はそれに由来する細胞）である場合、本開示の医薬組成物は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞増殖及び生着を促進するサイトカイン（例えばＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、及び／又はＩＬ−２１）等の生体分子を更に含む。本開示の遺伝子改変細胞を含む医薬組成物を、追加の薬剤又は生体分子と同じ組成物で投与してもよく、又は代替的に別の組成物で同時投与してもよい。
【０２７１】
いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、Ｔ細胞養子免疫療法により標的化され得る任意の疾患状態の治療に有用である。特定の実施形態では、本開示の医薬組成物は、癌の治療における免疫療法として有用である。かかる癌としては、癌腫、リンパ腫、肉腫、芽細胞腫、白血病、Ｂ細胞起源の癌、乳癌、胃癌、神経芽腫、骨肉腫、肺癌、黒色腫、前立腺癌、結腸癌、腎細胞癌腫、卵巣癌、横紋筋肉腫、白血病、ホジキンリンパ腫が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、Ｂ細胞起源の癌としては、Ｂ系統の急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、及びＢ細胞非ホジキンリンパ腫が挙げられるが、これらに限定されない。本開示の医薬組成物及び医薬で治療され得る癌の非限定的な例は、Ｂ細胞起源の癌、神経芽腫、骨肉腫、前立腺癌、腎細胞癌腫、横紋筋肉腫、肝臓癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、乳癌、肺癌、皮膚又は眼内の悪性黒色腫、腎癌、子宮癌、卵巣癌、結腸直腸癌、結腸癌、直腸癌、肛門癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、精巣癌、子宮癌、卵管癌腫、子宮内膜癌腫、子宮頸癌腫、膣癌腫、外陰癌腫、非ホジキンリンパ腫、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、小児固形癌、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎臓又は尿管の癌、腎盂癌腫、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍（ｓｐｉｎａｌ  ａｘｉｓ  ｔｕｍｏｒ）、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮癌、アスベストによって誘発されるものを含む環境誘発癌、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性リンパ腫、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、免疫芽球性大細胞リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、菌状息肉腫、未分化大細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、及びこれらの癌の任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない、癌腫、リンパ腫、肉腫、黒色腫、芽細胞腫、白血病、及び胚細胞腫瘍である。特定の実施形態では、Ｂ細胞起源の癌としては、Ｂ細胞系の急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、前駆Ｂ  ＡＬＬ（小児適応症）、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、バーキットリンパ腫、及びＢ細胞非ホジキンリンパ腫が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２７２】
本開示の遺伝子改変細胞で癌を治療するこれらの実施形態のいくつかでは、遺伝子改変細胞が投与された被験体に、放射線、手術、又は化学療法剤等の追加の治療を更に適用する。
【０２７３】
本発明はさらに、本明細書に記載される複数の遺伝子改変細胞を含む遺伝子改変細胞の集団を提供する。かかる遺伝子改変細胞は、キメラ抗原受容体又は外因性Ｔ細胞受容体等の操作された抗原受容体をコードする核酸分子、及びＲＮＡ干渉分子等の阻害性核酸分子をそれらのゲノム中に含み得る。また、かかる遺伝子改変細胞は、キメラ抗原受容体又は外因性Ｔ細胞受容体等の操作された抗原受容体をコードする核酸分子をそれらのゲノム中に含むことができ、ベータ２ミクログロブリン、ＭＨＣクラスＩ分子、又はＣＤ５２の細胞表面発現が低下しており、必ずしも発明の特定の核酸分子を含まない。したがって、本発明の様々な実施形態では、遺伝子改変細胞の集団が提供され、該集団中の細胞の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は最大１００％が、本明細書に記載される遺伝子改変細胞である。
【０２７４】
２．８  遺伝子改変細胞の投与方法
本明細書に開示される別の態様は、それを必要とする被験体への本開示の遺伝子改変細胞の投与である。特定の実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物は、それを必要とする被験体に投与される。例えば、細胞表面キメラ抗原受容体又は外因性Ｔ細胞受容体を発現する、有効量の本発明の遺伝子改変細胞又は遺伝子改変細胞の集団を、疾患を有する被験体に投与することができる。特定の実施形態では、疾患は、Ｂ細胞起源の癌等の癌であってもよい。したがって、本開示はまた、哺乳動物にＣＡＲ  Ｔ細胞を投与する工程を含む、哺乳動物の標的細胞集団又は組織にＴ細胞媒介性免疫応答を提供する方法も提供し、ここで、ＣＡＲは、腫瘍抗原等の所定の標的と特異的に相互作用する細胞外リガンド結合ドメインと、ＣＤ３ζ等の少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメインと、任意に、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインとを含む。投与されたＣＡＲ  Ｔ細胞は、レシピエントにおいて増殖を抑え、数を減らし、標的細胞を殺傷することができる。抗体療法とは異なり、本開示の遺伝子改変細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで複製及び拡大することができ、その結果、疾患の持続的制御につながる可能性のある長期持続性がもたらされる。
【０２７５】
阻害性核酸分子がヒトベータ２ミクログロブリン又はＭＨＣクラスＩ分子の構成要素に対するものである例、又はベータ２ミクログロブリン若しくはＭＨＣクラスＩ分子が他の方法で低下している例では、かかるＣＡＲ  Ｔ細胞の拡大及び／又は持続性は、野生型レベルのベータ２ミクログロブリン若しくはＭＨＣクラスＩ分子を有するＣＡＲ  Ｔ細胞、又は細胞表面のベータ２ミクログロブリン若しくはＭＨＣクラスＩの発現を有さないＣＡＲ  Ｔ細胞と比較した場合、被験体において増強され得る。さらに、野生型レベルのベータ２ミクログロブリン及びＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現を有するＣＡＲ  Ｔ細胞と比較した場合、ＣＡＲ  Ｔ細胞の同種異系性を低下させることができる。これらの有利な特徴は、細胞表面のベータ２ミクログロブリン（及びその結果としてＭＨＣクラスＩ分子）が野生型発現のわずかな割合まで不完全に低下されることに起因し、これは、ＮＫ細胞の回避ではなく同種異系性の減少を可能とし、そうでない場合にはベータ２ミクログロブリン陰性細胞を標的とする。
【０２７６】
可能な投与経路の例としては、非経口（例えば、静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）、皮内、皮下（ＳＣ）、又は注入）投与が挙げられる。さらに、投与は、持続注入、又は単回若しくは複数回のボーラス投与によるものであってもよい。特定の実施形態では、薬剤の一方又は両方が、約１２時間、６時間、４時間、３時間、２時間、又は１時間未満の期間に亘って注入される。さらに他の実施形態では、注入は最初はゆっくり起こり、その後、経時的に増加する。
【０２７７】
いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子改変真核細胞又はその集団は、癌を治療する目的で腫瘍抗原を標的とする。かかる癌としては、癌腫、リンパ腫、肉腫、芽細胞腫、白血病、Ｂ細胞起源の癌、乳癌、胃癌、神経芽腫、骨肉腫、肺癌、黒色腫、前立腺癌、結腸癌、腎細胞癌腫、卵巣癌、横紋筋肉腫、白血病、ホジキンリンパ腫が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、癌及び障害としては、ｐｒｅ−Ｂ  ＡＬＬ（小児適応症）、成人ＡＬＬ、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、同種骨髄移植後のサルベージ等が含挙げられるが、これらに限定されない。これらのがんは、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、及び／又はＲＯＲ１を標的とするＣＡＲの組み合わせを使用して治療され得る。いくつかの非限定的な例では、本開示の遺伝子改変真核細胞又はその集団は、Ｂ細胞起源の癌、神経芽腫、骨肉腫、前立腺癌、腎細胞癌腫、横紋筋肉腫、肝臓癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、乳癌、肺癌、皮膚又は眼内の悪性黒色腫、腎癌、子宮癌、卵巣癌、結腸直腸癌、結腸癌、直腸癌、肛門癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、精巣癌、子宮癌、卵管癌腫、子宮内膜癌腫、子宮頸癌腫、膣癌腫、外陰癌、非ホジキンリンパ腫、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、小児固形癌、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎臓又は尿管の癌、腎盂癌腫、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍（ｓｐｉｎａｌ  ａｘｉｓ  ｔｕｍｏｒ）、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮癌、アスベストによって誘発されるものを含む環境誘発癌、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性リンパ腫、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、免疫芽球性大細胞リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、菌状息肉腫、未分化大細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、及びこれらの癌の任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない、癌腫、リンパ腫、肉腫、黒色腫、芽細胞腫、白血病、及び胚細胞腫瘍を標的とする。特定の実施形態では、Ｂ細胞起源の癌としては、Ｂ細胞系の急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、前駆Ｂ  ＡＬＬ（小児適応症）、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、及びＢ細胞非ホジキンリンパ腫が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２７８】
「有効量」又は「治療量」が示される場合、投与される本開示の組成物の正確な量は、年齢、体重、腫瘍サイズ（存在する場合）、感染又は転移の程度、及び患者（被験体）の状態の個人差を考慮して医師が決定することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される遺伝子改変細胞を含む医薬組成物は、それらの範囲内の全ての整数値を含む１０４細胞／ｋｇ体重〜１０９細胞／ｋｇ体重の投薬量で投与される。さらなる実施形態では、投与量は、それらの範囲内の全ての整数値を含めて、１０５細胞／ｋｇ体重〜１０６細胞／ｋｇ体重である。いくつかの実施形態では、細胞組成物はこれらの投与量で複数回投与される。細胞は、免疫療法で一般的に知られている注入技術を使用することにより投与され得る（例えば、ＲｏｓｅｎｂｅｒｇらＮｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ．３１９：１６７６，１９８８を参照されたい）。特定の患者に対する最適な投薬量及び治療計画は、疾患の徴候について患者をモニターし、それに応じて治療を調整することにより、医学の当業者によって容易に決定され得る。
【０２７９】
いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子改変細胞の投与は、標的の疾患又は状態の少なくとも１つの症状を軽減する。例えば、本開示の遺伝子改変細胞の投与は、Ｂ細胞起源の癌等の癌の少なくとも１つの症状を軽減することができる。Ｂ細胞起源の癌等の癌の症状は、当技術分野でよく知られており、既知の技術によって決定され得る。
【実施例】
【０２８０】
実験
この開示は、以下の実施例により更に説明されるが、これらの実施例は限定と解釈されるべきではない。当業者は、日常的な実験のみを使用して、本明細書に記載される特定の物質及び手順に対する多数の同等物を認識又は確認することができる。かかる同等物は、以下の実施例に続く特許請求の範囲に含まれることが意図される。
【０２８１】
実施例１  Ｂ２Ｍノックアウト初代ヒトＴ細胞のＮＫ細胞殺傷
１．方法及び材料
５％ウシ胎仔血清を添加したＸＶＩＶＯ−１５培地（Ｌｏｎｚａ）において、ＩＬ−２（Ｇｉｂｃｏ）の存在下で、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ抗ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、初代ヒトＴ細胞を３日間刺激した。４Ｄ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を使用して、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ４７９ヌクレアーゼをコードするＲＮＡをＴ細胞に導入した。ビオチン化抗ヒトＢ２Ｍ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）及びＢｉｏｔｉｎ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、残存するＢ２Ｍ＋細胞を磁気的に枯渇させる前に、細胞をＩＬ−２の存在下で６日間培養した。ＮＫ細胞を、ＣＤ５６陽性選択キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、同じドナーのＰＢＭＣサンプルから単離した。ダウディ細胞をＡＴＣＣから購入した。ダウディ細胞は本来Ｂ２Ｍ−であり、ＮＫ細胞溶解に非常に感受性であると報告されている。全ての標的細胞を１ｕＭ  ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で標識し、混合培養においてエフェクターと区別した。単離されたＮＫ細胞を、エフェクター：標的比２：１、１：１、０．５：１及び０：１で、自己Ｂ２Ｍ＋Ｔ細胞標的（ＮＫ細胞溶解に対する陰性対照）ダウディ標的（ＮＫ細胞溶解に対して陽性対照）、又は自己Ｂ２Ｍ  ＫＯ  Ｔ細胞標的（実験サンプル）のいずれかと混合した。共培養の２時間後に殺傷を評価した。ＮＫ細胞による殺傷を、ＣａｓｐＡＣＥ−ＶＡＤ−ＦＭＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で染色することにより測定した。
【０２８２】
２．結果
ＮＫ細胞は、自己Ｂ２Ｍ＋標的において薄暗いＶＡＤ−ＦＭＫシグナルのみを誘発し、活性カスパーゼによる低レベルのアポトーシス誘導を示す（図２Ａ〜図２Ｄ）。それに比べて、高いＶＡＤ−ＦＭＫシグナルがクラスＩ−ダウディ細胞の大部分で誘導され（７１％〜８３％、図２Ｉ〜図２Ｌ）、広範なカスパーゼカスケード活性化を示す。同様に、Ｂ２Ｍ−自己Ｔ細胞は、ＮＫの遭遇に応答して高いＶＡＤ−ＦＭＫシグナルを回復し（１９％〜４７％、図２Ｅ〜図２Ｈ）、これは、カスパーゼを介したアポトーシス誘導の指標である。これらの結果のグラフによる要約を図３に示す。
【０２８３】
３．結論
操作されたメガヌクレアーゼを使用した細胞表面Ｂ２Ｍの完全なノックアウトは、初代ヒトＴ細胞をＮＫ細胞の攻撃と殺傷に対して感作する。
【０２８４】
実施例２  Ｂ２Ｍに対する候補ｓｈＲＮＡの特性評価及び初代ヒトＴ細胞のＮＫ細胞殺傷に対するＢ２Ｍノックダウンの効果
１．材料及び方法
異なるＢ２Ｍターゲティング配列をコードする５つのＭｉｓｓｉｏｎ−ｓｈＲＮＡレンチウイルストランスファープラスミドを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。第２世代のレンチウイルスベクターを、Ｌｅｎｔｉ−Ｘ  ２９３Ｔ細胞（ＣｌｏｎＴｅｃｈ）とトリプルトランスフェクション法（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００−Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して社内で作製した。Ｔ細胞を、実施例１のようにＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ抗ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８で３日間刺激することにより、レンチウイルス形質導入用に調製した。形質導入を５μＭポリブレン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｔｃｈ）の存在下で行って、形質導入後４８時間で開始し、薬物添加後７２時間で終了して、ピューロマイシン（ＩｎＶｉｖｏＧｅｎ）で形質導入細胞を選択した。ノックダウンの程度を決定するため、Ｂ２Ｍ表面発現のフローサイトメトリー分析の前に、選択された細胞をＩＬ−２添加培地で５日間拡大させた。Ｂ２Ｍ  ｓｈＲＮＡを受け取った培養物は、ＮＫ及びＣＴＬの殺傷アッセイの標的として使用した。ＮＫ殺傷アッセイを、実施例１に記載されるように実施したが、Ｋ５６２細胞株をＮＫ細胞溶解の陽性対照として使用した。ＣＴＬ殺傷アッセイでは、標的細胞のドナーとは無関係のドナーからのＣＤ８＋Ｔ細胞を単離し、エフェクターとして使用した。ＮＫ殺傷アッセイを２時間実行し、ＣＴＬアッセイを６時間実行した。両方のアッセイについて、標的細胞を１ｕＭ  ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で標識し、ＣａｓｐＡＣＥ−ＶＡＤ−ＦＭＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して死滅を測定した。
【０２８５】
２．結果
Ｂ２Ｍ発現の干渉についてヒトＴ細胞で５つのｓｈＲＮＡをスクリーニングした。２つの配列は、サイトメトリー分析でＢ２Ｍの平均蛍光強度を低下しなかった（表示していない）。３つのｓｈＲＮＡ配列はＢ２Ｍ発現のＭＦＩを減少させ、配列２５４及び配列２５５はＭＦＩをおよそ５０％減少させ、配列４７２はＭＦＩをおよそ９５％減少させた（図４）。
【０２８６】
次に、変化したＢ２Ｍ発現を示す、ＣＴＬ及びＮＫの殺傷の標的を測定した。ＣＴＬではなく、ＮＫ細胞がクラスＩ欠損Ｋ５６２細胞でカスパーゼ活性化（ＶＡＤ−ＦＭＫシグナルで測定）を誘導した（４６％ｖｓ．５％−図５Ａ及び図５Ｂ）。逆に、ＣＴＬはミスマッチＢ２Ｍ＋Ｔ細胞においてカスパーゼ活性化を誘導し（３２％）、ＮＫ細胞はミスマッチＴ細胞のより頻度が低いシグナルを誘導した（１４％）（図５Ｃ及び図５Ｄ）。Ｂ２Ｍ抗原密度の５０％減少を示すＴ細胞標的では、ＮＫ細胞は標的の１７％でカスパーゼ活性を誘導したが、ミスマッチＣＴＬは標的の３６％で誘導した（図６Ａ及び図６Ｂ）。Ｂ２Ｍレベルの９５％ノックダウンを示すＴ細胞標的では、ＮＫ細胞は標的の１６％でカスパーゼ活性化を誘導したが、ミスマッチＣＴＬは標的の２０．８％で誘導した（図５Ｃ及び図５Ｄ）。
【０２８７】
３．結論
Ｂ２Ｍ発現は、ウイルスベクターによって送達されるｓｈＲＮＡを使用して効果的にノックダウンされ得る。カスパーゼ（ＶＡＤ−ＦＭＫ）活性を使用してＮＫ細胞又はＣＴＬによる標的細胞のアポトーシス誘導を測定すると、両方のＢ２Ｍノックダウンの標的が操作されていない標的と同じＶＡＤ−ＦＭＫ頻度を示し、Ｋ５６２標的よりも少ないＶＡＤ−ＦＭＫシグナルを示したことから、Ｂ２ＭノックダウンはＮＫ細胞溶解に対する標的の感受性を変化させないことが特定された。さらに、ｓｈＲＮＡ  ４７２群のＶＡＤ−ＦＭＫ＋標的の頻度が陽性対照で観察された頻度のおよそ半分であったことから、Ｂ２ＭノックダウンはＣＴＬ細胞溶解に対していくらかの保護を与える。実際、ノックダウンの程度とＮＫ細胞からのＣＴＬ活性に対する保護の程度との間には直接的な関係があった。
【０２８８】
実施例３  Ｂ２Ｍの細胞表面発現を減少させるためのｓｈＲＮＡを利用したＣＡＲ  Ｔ細胞の生産及び特性評価
１．材料及び方法
抗ＣＤ１９  ＣＡＲコード配列と、Ｂ２Ｍに対するｓｈＲＮＡとを含む多くのコンストラクトを調製した。これらは図７Ａ〜図７Ｆに示されており、配列番号１８〜配列番号２３で提供される。ＣＡＲコンストラクトの７００７及び７２１７（配列番号１８及び配列番号１９）は、同じ５´から３´方向のＣＡＲコード配列及びｓｈＲＮＡ４７２配列を含む。ＣＡＲコンストラクトの７００８及び７２１８（配列番号２０及び配列番号２１）は、３´から５´方向のＣＡＲコード配列、及び５´から３´方向（すなわち、ｔａｉｌ−ｔｏ−ｔａｉｌ）のｓｈＲＮＡ４７２配列を含む。ＣＡＲコンストラクトの７００９及び７２１９（配列番号２２及び配列番号２３）は、ＣＡＲコード配列と３´から５´方向のｓｈＲＮＡ４７２配列の両方を含む。ＣＡＲコード配列及びｓｈＲＮＡ４７２配列に隣接する５´及び３´の相同性アームは、ＴＲＡＣ遺伝子座のＴＲＣ１−２認識配列の上流及び下流の領域と相同性がある。
【０２８９】
ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＴＲＣ１−２認識配列で二本鎖切断を誘導し、Ｔ細胞のゲノムへのコンストラクトの標的挿入を促進するためのＴＲＣ１−２ｘ８７ＥＥをコードするｍＲＮＡの同時ヌクレオフェクションにより、上記のＣＡＲ／ｓｈＲＮＡコンストラクトの１つを含む組換えＡＡＶベクターで形質導入された初代ドナーヒトＴ細胞を使用して調製される。第１及び第２の発現カセットのどの方向が、細胞表面で最も一貫したレベルのＢ２Ｍノックダウンと共に、最も高い及び／又は最も一貫したＣＡＲ発現をもたらすかを判断するため、上記のようにベータ２ミクログロブリン発現を判定する。
【０２９０】
特定のコンストラクトで産生されたＣＡＲ  Ｔ細胞は、前述の同種異系性とＮＫ細胞殺傷の両方のアッセイで評価する。さらに、細胞の増殖／拡大及び細胞毒性の可能性の変化を判断するため、開示されるコンストラクトを使用して産生されたＣＡＲ  Ｔ細胞を、ＣＡＲ  Ｔ細胞が抗原に繰り返し曝露される、様々なストレス試験で評価する。開示されるコンストラクトを使用して産生されたＣＡＲ  Ｔ細胞はまた、動物において腫瘍細胞を排除する能力を判断し、ｉｎ  ｖｉｖｏで持続するそれらの能力を評価するため、ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍モデルで利用される。本明細書に記載される実施例に基づいて、細胞表面ベータ２ミクログロブリンのノックダウンが減少しているが不完全であるＣＡＲ  Ｔ細胞は、完全にＢ２Ｍ陰性であるＣＡＲ  Ｔ細胞と比較した場合、ｉｎ  ｖｉｖｏでより大きな持続性及び／又は増強された拡大を有し、ＮＫ細胞殺傷の影響を受けやすい可能性があると予想される。
【０２９１】
特定の研究では、ＴＣＲ陰性、ＣＡＲ陽性であり、Ｂ２Ｍの細胞表面発現が低下したＣＡＲ  Ｔ細胞が調製された。ＣＡＲ  Ｔ細胞は、プロモータ駆動ＣＡＲコード配列と、Ｔ２Ａエレメントと、１つ以上のプロモータ駆動Ｂ２Ｍ  ｓｈＲＮＡカセットとを含むドナーテンプレートを使用して調製された。この研究では、アフェレーシスサンプルを、健康で、情報が知らされ、補償されているドナーから採取し、製造業者の指示（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従ってＣＤ３陽性選択キットＩＩを使用してＴ細胞を濃縮した。Ｔ細胞を、５％ウシ胎仔血清及び１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−２（Ｇｉｂｃｏ）を添加したＸ−ＶＩＶＯ  １５培地（Ｌｏｎｚａ）でＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ  Ｔ細胞刺激装置（抗ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８−Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して活性化した。３日間の刺激の後、細胞を収集し、Ｌｏｎｚａ４Ｄ  ＮｕｃｌｅｏＦｅｃｔｏｒを使用して、以下の核酸種の混合物を用いて１ｅ６細胞のサンプルをエレクトロポレーションした。
・Ｔ細胞受容体アルファ定常領域遺伝子のエクソン１に二本鎖切断を生じるＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ１μｇ
・ＴＭＥＭ１７３（ＳＴＩＮＧ）に特異的な１００ｍＭ  ｓｉＲＮＡ１．５μｌ
・ドナーテンプレートを含む直線化プラスミドＤＮＡ  １μｇ
この実験では、Ｂ２Ｍ表面発現をノックダウンする能力について３つの異なるＣＡＲコンストラクトを分析した。３つのコンストラクトはいずれも、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥ結合部位（ＴＲＣ１−２認識部位と称される）に隣接するゲノム領域との相同性を使用して、Ｔ細胞受容体アルファ定常領域遺伝子座への標的挿入を指示し、いずれのコンストラクトもＣＤ３４エピトープタグ（検出用）を含むＣＡＲを発現する。コンストラクト７００２（配列番号１１）はｓｈＲＮＡ遺伝子をコードしない。コンストラクト７００８（配列番号２０）は、ｓｈＲＮＡ４７２の１つのコピーをコードする。コンストラクト７０２９（配列番号２４）は、このｓｈＲＮＡカセットの２つのコピーをコードする。各ｓｈＲＮＡカセットからの発現は、Ｕ６プロモータによって駆動される。
【０２９２】
５％ＦＢＳ及び３０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２を添加したＸ−ＶＩＶＯ１５培地で更に１０日間細胞培養を維持した。ヌクレオフェクション後４日、７日、１０日に培養物を採取し、ＣＤ３（抗ＣＤ３−ＢＶ７１１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ３４（抗ＣＤ３４−ＰＥ、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及びＢ２Ｍ（抗Ｂ２Ｍ−ＡＰＣ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）の表面発現について分析した。フローサイトメトリーのデータを、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＣｙｔｏＦＬＥＸ−ＬＸで取得した。
【０２９３】
２．結果
Ｂ２Ｍ表面レベルを、対照ＣＡＲコンストラクト（７００２）、又はＢ２Ｍ特異的ｓｈＲＮＡのコピーを１つ（７００８）若しくは２つ（７０２９）発現するＣＡＲコンストラクトでヌクレオフェクトしたサンプルで測定した（図１２）。７００２（対照）及び７００８（単一ｓｈＲＮＡ）を発現する細胞のＣＤ３−／ＣＤ３４＋集団を比較すると、７００８発現細胞はわずかに低いレベルの表面Ｂ２Ｍを示すことが観察された（図１２Ａ）。特に、コンストラクト７０２９（２つのｓｈＲＮＡコピー）でヌクレオフェクトした細胞は、対照細胞（７００２）の表面に提示されるＢ２Ｍの量のおよそ半分を示した（図１２Ｂ）。この観察は、ＣＤ３−／ＣＤ３４＋集団に特異的であったが、ＣＤ３−／ＣＤ３４−集団では観察されなかった（図１２Ｃ）。
【０２９４】
３．結論
事前にスクリーニングされたＢ２ＭターゲティングｓｈＲＮＡは、（Ｔ細胞受容体アルファ定常領域遺伝子座への標的挿入により）コンストラクトが送達された細胞の表面でＢ２Ｍ発現レベルをノックダウンすることができる。Ｂ２Ｍ転写産物が豊富にあるため、これらのデータは、単一のｓｈＲＮＡコピーが低レベルのＢ２Ｍノックダウンに十分である可能性があることを示唆するが、より顕著なノックダウンを達成するにはｓｈＲＮＡカセットの複数のコピーが必要となる可能性がある。
【０２９５】
実施例４  Ｂ２Ｍの細胞表面発現を減少させるためのｓｈＲＮＡを利用したＣＡＲ  Ｔ細胞の生産及び特性評価
１．材料及び方法
抗ＣＤ１９  ＣＡＲコード配列と、Ｂ２Ｍに対するｓｈＲＮＡとを含む多くのコンストラクトを調製した。これらは図７Ａ〜図７Ｆに示されており、配列番号１８〜配列番号２３で提供される。ＣＡＲコンストラクトの７００７及び７２１７（配列番号１８及び配列番号１９）は、同じ５´から３´方向のＣＡＲコード配列及びｓｈＲＮＡ４７２配列を含む。ＣＡＲコンストラクトの７００８及び７２１８（配列番号２０及び配列番号２１）は、３´から５´方向のＣＡＲコード配列、及び５´から３´方向（すなわち、ｔａｉｌ−ｔｏ−ｔａｉｌ）のｓｈＲＮＡ４７２配列を含む。ＣＡＲコンストラクトの７００９及び７２１９（配列番号２２及び配列番号２３）は、ＣＡＲコード配列と３´から５´方向のｓｈＲＮＡ４７２配列の両方を含む。ＣＡＲコンストラクトの７０５６、７０５９、及び７０６０には、Ｕ６−ｓｈＲＮＡ遺伝子カセットの改変バージョンが含まれている。コンストラクトの７００７〜７００９及び７２１７〜７２１９のＵ６プロモータとヘアピン配列との間に位置していたクローニング部位を除去した。コンストラクト７０５６は、ＣＡＲコード配列及び３´から５´方向のｓｈＲＮＡ４７２配列を含む。コンストラクト７０５６は、３´から５´方向のＣＡＲコード配列、及び５´から３´方向（ｔａｉｌ−ｔｏ−ｔａｉｌ）のｓｈＲＮＡ４７２配列を含む。コンストラクト７０６０は、３´から５´方向のＣＡＲコード配列、及び５´から３´方向のＵ６−ｓｈＲＮＡ４７２配列の２つのコピーを含む。ＣＡＲコード配列及びｓｈＲＮＡ４７２配列に隣接する５´及び３´の相同性アームは、Ｔ細胞受容体アルファ定常遺伝子座のＴＲＣ１−２認識配列の上流及び下流の領域と相同性がある。
【０２９６】
特定の研究では、ＴＣＲ陰性、ＣＡＲ陽性であり、Ｂ２Ｍの細胞表面発現が低下したＣＡＲ  Ｔ細胞が調製された。ＣＡＲ  Ｔ細胞は、プロモータ駆動ＣＡＲコード配列、及び１つ以上のプロモータ駆動Ｂ２Ｍ  ｓｈＲＮＡカセットを含むドナーテンプレートを使用して調製された。この研究では、アフェレーシスサンプルを、健康で、情報が知らされ、補償されているドナーから採取し、製造業者の指示（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従ってＣＤ３陽性選択キットＩＩを使用してＴ細胞を濃縮した。Ｔ細胞を、５％ウシ胎仔血清及び１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−２（Ｇｉｂｃｏ）を添加したＸ−ＶＩＶＯ  １５培地（Ｌｏｎｚａ）でＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ  Ｔ細胞刺激装置（抗ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８−Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して活性化した。３日間の刺激の後、細胞を収集し、Ｌｏｎｚａ  ４Ｄ  ＮｕｃｌｅｏＦｅｃｔｏｒを使用して、以下の核酸種の混合物を用いて１ｅ６細胞のサンプルをエレクトロポレーションした。
・Ｔ細胞受容体アルファ定常領域遺伝子のエクソン１に二本鎖切断を生じるＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ１μｇ
・ＴＭＥＭ１７３（ＳＴＩＮＧ）に特異的な１００ｍＭ  ｓｉＲＮＡ１．５μｌ
・ドナーテンプレートを含む直線化プラスミドＤＮＡ  １μｇ
この実験では、Ｂ２Ｍ表面発現をノックダウンする能力について、４つの異なるＣＡＲコンストラクトを分析した。４つのコンストラクトはいずれも、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥ認識部位に隣接するゲノム領域との相同性を使用して、Ｔ細胞受容体アルファ定常領域遺伝子座への標的挿入を指示し、いずれのコンストラクトもＣＤ３４エピトープタグ（検出用）を含むＣＡＲを発現する。コンストラクト７００２（配列番号１１）はｓｈＲＮＡ遺伝子をコードしない。コンストラクト７０５６（配列番号２５）はｓｈＲＮＡ４７２の１つのコピーをコードし、いずれのカセットも３´から５´方向（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ）にある。コンストラクト７０５９（配列番号２６）は、３´から５´方向のＣＡＲ発現カセット、及び５´から３´方向ｓｈＲＮＡ４７２カセット（ｔａｉｌ−ｔｏ−ｔａｉｌ）と共にこのｓｈＲＮＡカセットの１つのコピーをコードする。コンストラクト７０６０（配列番号２７）はコンストラクト７０５９と同じ向きであるが、ｓｈＲＮＡ４７２カセットの２つのコピーをコードする（ｔａｉｌ−ｔｏ−ｔａｉｌ）。各ｓｈＲＮＡカセットからの発現は、Ｕ６プロモータによって駆動される。細胞培養を、５％ＦＢＳ及び３０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２を添加したＸ−ＶＩＶＯ１５培地で更に最大１０日間維持した。ヌクレオフェクション後４日、７日、及び／又は１０日に培養物を採取し、ＣＤ３（抗ＣＤ３−ＢＶ７１１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ３４（抗ＣＤ３４−ＰＥ、又はＡＰＣ、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｂ２Ｍ（抗Ｂ２Ｍ−ＡＰＣ、又はＰＥ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、及び／又はＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ（クローンＷ６／３２、ＢＶ６０５）の表面発現について分析した。フローサイトメトリーのデータを、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＣｙｔｏＦＬＥＸ−ＬＸで取得した。
【０２９７】
２．結果
Ｂ２Ｍ表面レベルを、対照ＣＡＲコンストラクト（７００２）、又はｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ（７０５６）若しくはｔａｉｌ−ｔｏ−ｔａｉｌ（７０５９、７０６０）の構成のいずれかでＢ２Ｍ特異的ｓｈＲＮＡのコピーを１つ（７０５６又は７０５９）若しくは２つ（７０６０）発現するＣＡＲコンストラクトでヌクレオフェクトしたサンプルで測定した。Ｕ６プロモータとｓｈＲＮＡ配列との間の以前のコンストラクトに存在していた制限消化部位を、これらのｓｈＲＮＡ４７２ベクターから除去した。パリンドローム制限消化部位は、コンストラクトの有効性及びｓｈＲＮＡがＢ２Ｍをノックダウンする能力を妨害すると仮定された。
【０２９８】
７００２（対照）及び７０５６（単一ｓｈＲＮＡ）を発現する細胞のＣＤ３−／ＣＤ３４＋集団を比較すると、７０５６発現細胞はより低いレベルの表面Ｂ２Ｍを示すことが観察された（７７％ノックダウン）（図１３Ａ）。７０５９（単一コピー、ｔａｉｌ−ｔｏ−ｔａｉｌ）でヌクレオフェクトされた細胞は、７００２対照細胞（図１３Ｂ）と比較してＢ２Ｍの９０．１％ノックダウンを示し、一方７０６０ヌクレオフェクション（２コピー、ｔａｉｌ−ｔｏ−ｔａｉｌ）は、７００２対照と比較して９２％ノックダウンをもたらした（図１３Ｃ）。
【０２９９】
３．結論
事前にスクリーニングされたＢ２ＭターゲティングｓｈＲＮＡは、（Ｔ細胞受容体アルファ定常領域遺伝子座への標的挿入により）コンストラクトが送達された細胞の表面でＢ２Ｍ発現レベルをノックダウンすることができる。Ｕ６プロモータとヘアピン配列との間のクローニング部位を削除すると、Ｂ２Ｍのノックダウン効率が改善する。７００８（ｔａｉｌ−ｔｏ−ｔａｉｌ、１つのｓｈＲＮＡ４７２カセット−図１２Ａ）は最小限のＢ２Ｍノックダウンを支持し、７０５９（１つのカセット、ｔａｉｌ−ｔｏ−ｔａｉｌ−図１３Ｂ）は９０％超のノックダウンを支持する。ＣＤ５２特異的ｓｈＲＮＡを使用して観察されたように、ＣＡＲプロモータ及びｓｈＲＮＡプロモータが異なる方向に向けられている場合（ｔａｉｌ−ｔｏ−ｔａｉｌ構成）、優れたノックダウンが観察された。第２のｓｈＲＮＡ配列を追加しても、顕著な利点は得られなかった（９２％対９０．１％ノックダウン）。
【０３００】
実施例５  Ｂ２Ｍの細胞表面発現を減少させるためのｓｈＲＮＡを利用したＣＡＲ  Ｔ細胞の生産及び特性評価
１．材料及び方法
この研究では、アフェレーシスサンプルを、健康で、情報が知らされ、補償されているドナーから採取し、製造業者の指示（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従ってＣＤ３陽性選択キットＩＩを使用してＴ細胞を濃縮した。Ｔ細胞を、５％ウシ胎仔血清及び１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−２（Ｇｉｂｃｏ）を添加したＸ−ＶＩＶＯ１５培地（Ｌｏｎｚａ）でＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ  Ｔ細胞刺激装置（抗ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８−Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して活性化した。３日間の刺激の後、細胞を収集し、１ｅ６細胞のサンプルをＴ細胞受容体α定常遺伝子座のＴＲＣ１−２認識配列を認識して切断するＴＲＣ１−２Ｌ．１５９２メガヌクレアーゼをコードする１ｕｇのＲＮＡでエレクトロポレーションし、２５０００ウイルスゲノム／細胞のＭＯＩでコンストラクト７０５６と共にパッケージされたＡＡＶで形質導入した。
【０３０１】
細胞培養を、５％ＦＢＳ及び３０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２を添加したＸ−ＶＩＶＯ１５培地で更に最大１０日間維持した。ヌクレオフェクション後４日、７日、及び／又は１０日に培養物を採取し、ＣＤ３（抗ＣＤ３−ＰＥ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８に複合化された抗ＦＭＣ６３抗ＣＡＲクローンＶＭ１６）、Ｂ２Ｍ（抗Ｂ２Ｍ−ＡＰＣ、又はＰＥ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、並びにＨＬＡ−Ａ、Ｂ及びＣ（クローンＷ６／３２、ＢＶ６０５）の表面発現について分析した。フローサイトメトリーのデータを、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＣｙｔｏＦＬＥＸ−ＬＸで取得した。
【０３０２】
２．結果
Ｂ２Ｍ及びＨＬＡ−ＡＢＣのレベルを、コンストラクト７０５６を発現するサンプル及び対照集団で測定した。図１４Ａは、対照培養物に由来するｓｈＲＮＡを発現していないＴＲＡＣ編集細胞と比較したＣＤ３−／ＣＡＲ＋細胞のＢ２Ｍ表面レベルを示す。図１４Ｂは、同じ培養物におけるＣＤ３−／ＣＡＲ＋対ＣＤ３＋／Ｃ
ＡＲ−集団のＢ２Ｍレベルを示す。図１４Ｃ及び図１４Ｄは、ＨＬＡ−ＡＢＣ表面レベルの表示でそれぞれ同じ比較を行う。ＡＡＶ−７０５６で形質導入された細胞のＣＤ３−／ＣＡＲ＋画分は、対照集団と比較して９０％超減少したＢ２Ｍ及びＨＬＡ−ＡＢＣのレベルを示した。
【０３０３】
３．結論
事前にスクリーニングされたＢ２ＭターゲティングｓｈＲＮＡは、（Ｔ細胞受容体アルファ定常領域遺伝子座への標的挿入により）コンストラクトが送達された細胞の表面でＢ２Ｍ発現レベルをノックダウンすることができる。この効果は、ＣＡＲ＋集団（すなわち、ＴＲＡＣ遺伝子座への標的化された統合が起こった細胞）に特有である。この実験は、同じＡＡＶテンプレート上のＣＡＲ遺伝子とＴＲＡＣ遺伝子座に同時送達されたｓｈＲＮＡ４７２の単一コピーを使用して、Ｂ２Ｍを効率的にノックダウンできることを実証する。
【０３０４】
実施例６  初代ヒトＴ細胞におけるＣＤ５２に対する候補ｓｈＲＮＡの特性評価
１．材料及び方法
異なるＣＤ５２ターゲティング配列をコードする５つのＭｉｓｓｉｏｎ−ｓｈＲＮＡレンチウイルストランスファープラスミドを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。第２世代のレンチウイルスベクターを、Ｌｅｎｔｉ−Ｘ  ２９３Ｔ細胞（ＣｌｏｎＴｅｃｈ）とトリプルトランスフェクション法（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００−Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して社内で作製した。Ｔ細胞を、実施例１のようにＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ抗ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８で３日間刺激することにより、レンチウイルス形質導入用に調製した。形質導入を５μＭポリブレン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｔｃｈ）の存在下で行って、ＣＤ５２表面レベルのフローサイトメトリー分析の前にＩＬ−２補足培地で形質導入細胞を５日間拡大させた。ＣＤ５２Ｈｉ細胞の磁気枯渇において、下流の試みには不均一な集団が望ましいため、ピューロマイシンで細胞を選択しなかった。ｓｈＲＮＡ  ５６８をコードするレンチウイルスで形質導入された細胞をビオチン化抗ＣＤ５２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）で標識し、Ｂｉｏｔｉｎ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して磁気分離を行った。表面ＣＤ５２の分離後分析を実施した。
【０３０５】
２．結果
スクリーニングされた５つのｓｈＲＮＡ配列のうち、３つ（ｓｈＲＮＡ５６８、ｓｈＲＮＡ５７２、及びｓｈＲＮＡ８７６）がＣＤ５２の発現を干渉した。ＣＤ５２表面発現プロファイルを図８に示す。模擬形質導入Ｔ細胞（９Ａ）、ｓｈＲＮＡ−５６８レンチウイルスで形質導入されたＴ細胞（９Ｂ）、及びＣＤ５２磁気枯渇を受けたＬＶ−ｓｈＲＮＡ５６８形質導入細胞（９Ｃ）について、Ｔ細胞の表面に提示されるＣＤ５２のレベルを図９に示す。
【０３０６】
３．結論
細胞表面のＣＤ５２抗原密度は、ウイルスベクターにより送達されるｓｈＲＮＡを使用して減少させることができる。配列５６８は、最高度のＣＤ５２ノックダウンを示した。このｓｈＲＮＡ配列を使用するＣＤ５２のノックダウンは、非形質導入ＣＤ５２  Ｈｉ細胞の磁気的枯渇を可能にするのに十分であった。
【０３０７】
実施例７  異なる向きのＣＡＲ／ＣＤ５２コンストラクトを使用したＣＤ５２ノックダウンプロファイル
１．材料及び方法
実施例１に記載されるように、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ抗ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８を使用してＴ細胞を３日間刺激した。３日後、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥ  ｍＲＮＡ、ＳＴＩＮＧ  ｓｉＲＮＡ、及び異なるＣＡＲコンストラクトをコードする直線化ＡＡＶトランスファーベクター（図１０）を４−Ｄ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を使用してＴ細胞に送達した。ＣＤ３、ＣＡＲ（ＣＤ３４エピトープタグ付き）、及びＣＤ５２のフローサイトメトリー分析の前に、ＩＬ−２を添加した培地でヌクレオフェクションしたＴ細胞の培養を１０日間行った。
【０３０８】
２．結果
ＴＲＡＣ編集ＣＡＲ  Ｔ細胞での操作されていないレベルのＣＤ５２表面提示を実証するため、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥヌクレアーゼ及びｓｈＲＮＡ配列をコードしないＣＤ３４タグ付きＣＡＲコンストラクトを送達した。ＴＣＲ  ＫＯ細胞、ＴＣＲ  ＫＯ  ＣＡＲ＋細胞、及び編集されていない細胞のＣＤ５２レベルを、図１１Ａのヒストグラムに重ねて表示する。Ｕ６プロモータ制御ＣＤ５２  ｓｈＲＮＡをコードする３つのＣＡＲコンストラクトを、ＴＲＡＣ遺伝子座に統合された場合のＣＤ５２をノックダウンする能力について評価した。ＣＡＲ遺伝子とｓｈＲＮＡカセットの両方が順方向の場合、ＣＤ５２抗原密度はおよそ５０％減少する（図１１Ｃ；コンストラクト７００４）。ＣＡＲ遺伝子のみの転写方向を逆にすると（すなわち、ｔａｉｌ−ｔｏ−ｔａｉｌ構成）、表面に提示されるＣＤ５２の量がおよそ９５％減少し（図１１Ｂ；コンストラクト７０１３）するのに対し、ＣＡＲ遺伝子とＵ６−ｓｈＲＮＡエレメントの両方の方向を逆にすると、ＣＤ５２シグナルがおよそ９０％減少する（図１１Ｄ；コンストラクト７０１４）。
【０３０９】
３．結論
ＣＤ５２特異的ｓｈＲＮＡ配列５６８は、ＴＲＡＣ遺伝子座への標的挿入により１コピーのみが送達される場合、ＣＤ５２発現を干渉する可能性がある。ＣＡＲ遺伝子のみ（すなわち、ｔａｉｌ−ｔｏ−ｔａｉｌ構成）、又はＣＡＲとｓｈＲＮＡ遺伝子の両方の転写方向を変更すると、ターゲット遺伝子のノックダウンの効率に影響を与える可能性がある。ＣＡＲ遺伝子の向きのみを逆にすると、最も効率的なノックダウンをもたらした。
【０３１０】
４．更なる研究
抗ＣＤ１９  ＣＡＲコード配列及びＣＤ５２に対するｓｈＲＮＡを含む多くのコンストラクトを調製した。これらは図１０Ａ〜図１０Ｈに示されており、配列番号１０〜配列番号１７で提供される。上記のように、ＣＡＲコンストラクトの７００４（配列番号１２）、７０１３（配列番号１４）、及び７０１４（配列番号１６）を、ＣＡＲを発現しながらＣＤ５２発現を低下させる能力について以前に評価した。ＣＡＲコード配列及びｓｈＲＮＡ配列に隣接する５´及び３´の相同性アームは、ＴＲＡＣ遺伝子座のＴＲＣ１−２認識配列の上流及び下流の領域と相同性がある。
【０３１１】
追加の研究では、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＴＲＣ１−２認識配列で二本鎖切断を誘導し、Ｔ細胞のゲノムへのコンストラクトの標的挿入を促進するためのＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥをコードするｍＲＮＡの同時ヌクレオフェクションにより、上記のＣＡＲ／ｓｈＲＮＡコンストラクトの１つを含む組換えＡＡＶベクターで形質導入された一次ドナーヒトＴ細胞を使用して調製される。第１及び第２の発現カセットのどの方向が、細胞表面で最も一貫したレベルのＣＤ５２ノックダウンと共に、最も高い及び／又は最も一貫したＣＡＲ発現をもたらすかを判断するため、上記のようにＣＤ５２発現を判定する。
【０３１２】
特定のコンストラクトで産生されたＣＡＲ  Ｔ細胞は、前述の同種異系性とＮＫ細胞殺傷の両方のアッセイで評価する。さらに、細胞の増殖／拡大及び細胞毒性の可能性の変化を判断するため、開示されるコンストラクトを使用して産生されたＣＡＲ  Ｔ細胞を、ＣＡＲ  Ｔ細胞が抗原に繰り返し曝露される、様々なストレス試験で評価する。開示されるコンストラクトを使用して産生されたＣＡＲ  Ｔ細胞はまた、動物において腫瘍細胞を排除する能力を判断し、ｉｎ  ｖｉｖｏで持続するそれらの能力を評価するため、ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍モデルで利用される。本明細書に記載される実施例に基づいて、ＣＤ５２の細胞表面発現が低下したＣＡＲ  Ｔ細胞の有利な陰性選択により、ＣＡＲ  Ｔ細胞の濃縮集団をｉｎ  ｖｉｖｏで使用するために産生することができると予想される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
2020518276.tif 000005
【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
2020518276.tif 000007
【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図２Ｉ】
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【図２Ｊ】
2020518276.tif 000013
【図２Ｋ】
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【図２Ｌ】
2020518276.tif 000015
【図３】
2020518276.tif 000016
2020518276.tif 000017
【図４】
2020518276.tif 000018
【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
2020518276.tif 000020
【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
2020518276.tif 000022
【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
2020518276.tif 000024
【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
2020518276.tif 000026
【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
2020518276.tif 000030
【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図８】
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【図９Ａ】
2020518276.tif 000034
【図９Ｂ】
2020518276.tif 000035
【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
2020518276.tif 000039
【図１０Ｄ】
2020518276.tif 000040
【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１０Ｇ】
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【図１０Ｈ】
2020518276.tif 000044
【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
2020518276.tif 000048
【図１２Ａ】
2020518276.tif 000049
【図１２Ｂ】
2020518276.tif 000050
【図１２Ｃ】
2020518276.tif 000051
【図１３Ａ】
2020518276.tif 000052
【図１３Ｂ】
2020518276.tif 000053
【図１３Ｃ】
2020518276.tif 000054
【図１４】
2020518276.tif 000055
【配列表】
2020518276000001.app
【国際調査報告】
2020518276.tif 000056
2020518276.tif 000057
2020518276.tif 000058
2020518276.tif 000059