(57)【要約】自己免疫疾患、炎症性疾患、がん、神経炎症性障害、及び神経変性疾患を含む、セマフォリン４Ｄ（ＳＥＭＡ４Ｄ）の病理に関連する疾患を治療するための組成物及び方法が提供される。2020518248.tif 000007
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、セマフォリン４Ｄ（ＳＥＭＡ４Ｄ）に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であって、
前記ＶＨが、それぞれ配列番号２、配列番号３、及び配列番号４と同一、またはＨＣＤＲのうちの１つ、２つ、もしくは３つすべてにおける１つ、２つ、３つ、もしくは４つのアミノ酸置換を除いて同一のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＨＣＤＲ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、且つ
前記ＶＬが、それぞれ配列番号６、配列番号７、及び配列番号８と同一、またはＬＣＤＲのうちの１つ、２つ、もしくは３つすべてにおける１つ、２つ、３つ、もしくは４つのアミノ酸置換を除いて同一のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＬＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、
前記抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３が、それぞれ配列番号２、配列番号３、及び配列番号４と同一のアミノ酸配列を含み、且つ前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が、それぞれ配列番号６、配列番号７、及び配列番号８と同一のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体またはその断片。
【請求項３】
前記ＶＨが、フレームワーク領域（ＨＦＷ）ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３、及びＨＦＷ４をさらに含み、且つ前記ＶＬが、フレームワーク領域（ＬＦＷ）ＬＦＷ１、ＬＦＷ２、ＬＦＷ３、及びＬＦＷ４をさらに含む、請求項１または２に記載の抗体またはその断片。
【請求項４】
前記フレームワーク領域が、ヒト抗体に由来する、請求項３に記載の抗体またはその断片。
【請求項５】
前記フレームワーク領域が、非ヒト抗体に由来する、請求項３に記載の抗体またはその断片。
【請求項６】
前記ＶＨが、配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
【請求項７】
前記ＶＬが、配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
【請求項８】
前記ＶＨが配列番号１のアミノ酸配列を含み、且つ前記ＶＬが配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
【請求項９】
重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、セマフォリン４Ｄ（ＳＥＭＡ４Ｄ）に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であって、
前記ＶＨが、配列番号１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む、前記抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１０】
前記ＶＬが、配列番号５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の抗体またはその断片。
【請求項１１】
重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、セマフォリン４Ｄ（ＳＥＭＡ４Ｄ）に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であって、
前記ＶＬが、配列番号５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む、前記抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１２】
前記ＶＬが、配列番号５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の抗体またはその断片。
【請求項１３】
重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、セマフォリン４Ｄ（ＳＥＭＡ４Ｄ）に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であって、
前記ＶＨが、配列番号１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含み、且つ
前記ＶＬが、配列番号５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む、前記抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１４】
前記ＶＨが配列番号１のアミノ酸配列を含み、且つ前記ＶＬが配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の抗体またはその断片。
【請求項１５】
前記ＶＨのＣ末端に融合されている重鎖定常領域またはその断片をさらに含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
【請求項１６】
前記重鎖定常領域またはその断片が、ヒト重鎖定常領域である、請求項１５に記載の抗体またはその断片。
【請求項１７】
前記重鎖定常領域またはその断片が、ヒトＩｇＧ４定常領域である、請求項１６に記載の抗体またはその断片。
【請求項１８】
前記重鎖定常領域またはその断片が、非ヒト重鎖定常領域である、請求項１５に記載の抗体またはその断片。
【請求項１９】
前記重鎖定常領域またはその断片が、マウスＩｇＧ１定常領域である、請求項１８に記載の抗体またはその断片。
【請求項２０】
前記ＶＬのＣ末端に融合されている軽鎖定常領域またはその断片をさらに含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
【請求項２１】
前記軽鎖定常領域またはその断片が、ヒト軽鎖定常領域である、請求項２０に記載の抗体またはその断片。
【請求項２２】
前記軽鎖定常領域またはその断片が、ヒトラムダ軽鎖定常領域である、請求項２１に記載の抗体またはその断片。
【請求項２３】
前記軽鎖定常領域またはその断片が、非ヒト軽鎖定常領域である、請求項２０に記載の抗体またはその断片。
【請求項２４】
前記軽鎖定常領域またはその断片が、マウスラムダ軽鎖定常領域である、請求項２３に記載の抗体またはその断片。
【請求項２５】
Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、またはジスルフィド結合Ｆｖ断片（ｓｄＦｖ）である、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
【請求項２６】
多重特異性である、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
【請求項２７】
ヒトＳＥＭＡ４Ｄ、マウスＳＥＭＡ４Ｄ、ラットＳＥＭＡ４Ｄ、または非ヒト霊長類ＳＥＭＡ４Ｄに特異的に結合することができる、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
【請求項２８】
前記非ヒト霊長類ＳＥＭＡ４Ｄが、カニクイザルＳＥＭＡ４ＤまたはマーモセットＳＥＭＡ４Ｄである、請求項２７に記載の抗体またはその断片。
【請求項２９】
前記抗体またはその断片が、５００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、５０．０ｎＭ以下、４０．０ｎＭ以下、３０．０ｎＭ以下、２０．０ｎＭ以下、１０．０ｎＭ以下、９．０ｎＭ以下、８．０ｎＭ以下、７．０ｎＭ以下、６．０ｎＭ以下、５．０ｎＭ以下、４．０ｎＭ以下、３．０ｎＭ以下、２．０ｎＭ以下、１．０ｎＭ以下、０．５０ｎＭ以下、０．１０ｎＭ以下、０．０５０ｎＭ以下、０．０１ｎＭ以下、０．００５ｎＭ以下、または０．００１ｎＭ以下の解離定数ＫＤを特徴とする親和性でＳＥＭＡ４Ｄに特異的に結合し、前記ＳＥＭＡ４Ｄが、ヒトＳＥＭＡ４Ｄ、マウスＳＥＭＡ４Ｄ、カニクイザルＳＥＭＡ４Ｄ、マーモセットＳＥＭＡ４Ｄ、またはそれらの組み合わせである、請求項２７または２８に記載の抗体またはその断片。
【請求項３０】
ＳＥＭＡ４ＤのＳＥＭＡ４Ｄ受容体への結合を阻害することができる、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
【請求項３１】
前記ＳＥＭＡ４Ｄ受容体が、プレキシン−Ｂ１、プレキシン−Ｂ２、ＣＤ７２、またはそれらの組み合わせである、請求項３０に記載の抗体またはその断片。
【請求項３２】
ヒト対象への投与時に抗抗体免疫応答を最少限にしか引き起こさないかまたは引き起こさない、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
【請求項３３】
前記抗体またはその断片に融合またはコンジュゲートされている異種部分をさらに含む、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
【請求項３４】
前記異種部分が、ポリペプチド、細胞傷害剤、治療剤、プロドラッグ、脂質、糖質、核酸、検出可能な標識、ポリマー、またはそれらの組み合わせを含む、請求項３３に記載の抗体またはその断片。
【請求項３５】
前記ポリペプチドが、結合分子、酵素、サイトカイン、リンホカイン、ホルモンペプチド、またはそれらの組み合わせを含む、請求項３４に記載の抗体またはその断片。
【請求項３６】
前記細胞傷害剤が、放射性核種、生物毒素、酵素活性がある毒素、またはそれらの組み合わせを含む、請求項３４に記載の抗体またはその断片。
【請求項３７】
前記検出可能な標識が、酵素、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、放射性標識、またはそれらの組み合わせを含む、請求項３４に記載の抗体またはその断片。
【請求項３８】
請求項１〜３７のいずれか一項に記載の抗体またはその断片と、キャリアとを含む、組成物。
【請求項３９】
請求項１〜３７のいずれか一項に記載の抗体もしくはその断片またはそのサブユニットをコードする１つまたは複数の核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組み合わせ。
【請求項４０】
前記抗体またはその断片のＶＨをコードする核酸配列を含む、請求項３９に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組み合わせ。
【請求項４１】
前記抗体またはその断片のＶＬをコードする核酸配列を含む、請求項３９に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組み合わせ。
【請求項４２】
前記抗体またはその断片のＶＨをコードする核酸配列と、前記抗体またはその断片のＶＬをコードする核酸配列とを含む、請求項３９に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組み合わせ。
【請求項４３】
前記ＶＨをコードする核酸配列と前記ＶＬをコードする核酸配列とが同一のベクター上に位置する、請求項４２に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組み合わせ。
【請求項４４】
請求項４３に記載のベクター。
【請求項４５】
前記ＶＨをコードする核酸配列と前記ＶＬをコードする核酸配列とが別々のベクター上に位置する、請求項４２に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組み合わせ。
【請求項４６】
請求項４５に記載のベクター。
【請求項４７】
前記抗体またはその断片の発現を可能にする遺伝因子をさらに含む、請求項４４または４６に記載のベクター。
【請求項４８】
請求項３９〜４３もしくは４５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドの組み合わせを含むか、または請求項４４もしくは４６に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項４９】
請求項１〜３７のいずれか一項に記載の抗体またはその断片を製造する方法であって、
請求項４８に記載の宿主細胞を培養することと、前記抗体またはその断片を回収することとを含む、前記方法。
【請求項５０】
ヒト対象においてＳＥＭＡ４Ｄを中和する方法であって、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の抗体もしくはその断片または請求項３８に記載の組成物を前記ヒト対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項５１】
前記ヒト対象が、自己免疫疾患もしくは障害、炎症性疾患もしくは障害、がん、神経炎症性疾患もしくは障害、神経変性疾患もしくは障害、またはそれらの組み合わせについて治療を必要とする、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記神経炎症性疾患または障害が、多発性硬化症である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記神経変性疾患または障害が、脳卒中、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ダウン症候群、運動失調、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、ＨＩＶ関連の認知障害、ＣＮＳループス、軽度認知障害、またはそれらの組み合わせである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記自己免疫疾患または前記炎症性疾患が関節炎である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
前記自己免疫疾患または前記炎症性疾患が関節リウマチである、請求項５４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、全体として参照によって本明細書に組み入れられる２０１７年５月５日に出願された米国仮特許出願第６２／５０１，９８１号の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
背景
ＣＤ１００としても知られるセマフォリン４Ｄ（ＳＥＭＡ４Ｄ）は、セマフォリン遺伝子ファミリーに属する膜貫通タンパク質である。ＳＥＭＡ４Ｄはホモ二量体として細胞表面で発現するが、細胞の活性化の際、ＳＥＭＡ４Ｄはタンパク分解による切断を介して細胞表面から放出され、タンパク質の可溶性形態であり、生物学的に活性もあるｓＳＥＭＡ４Ｄを生成することができる。Ｓｕｚｕｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：１５９−１６７（２００３）；Ｋｉｋｕｔａｎｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：１７−２３（２００８）（非特許文献1）を参照のこと。
【０００３】
ＳＥＭＡ４Ｄは、脾臓、胸腺及びリンパ節を含むリンパ系臓器、ならびに脳及び腎臓のような非リンパ系臓器にて高レベルで発現する。リンパ系臓器では、ＳＥＭＡ４Ｄは休止Ｔ細胞上では豊富に発現するが、休止Ｂ細胞及びたとえば、樹状細胞（ＤＣ）のような抗原提示細胞（ＡＰＣ）では弱く発現するにすぎない。しかしながら、その発現は種々の免疫学的な刺激による活性化に続いてこれらの細胞では上方調節される。免疫細胞からの可溶性ＳＥＭＡ４Ｄの放出も細胞の活性化によって高められる。
【０００４】
ＳＥＭＡ４Ｄは特定のがんの発生に関与しており（Ｃｈ’ｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ，１１０：１６４−７２（２００７）（非特許文献2）；Ｃａｍｐｏｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，５：１５２７−３５（２０１３）（非特許文献3）；Ｋａｔｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．１０２：２０２９−３７（２０１１）（非特許文献4））、幾つかの報告は、この影響のメカニズムの１つが腫瘍血管新生の促進におけるＳＥＭＡ４Ｄの役割であることを示唆している（Ｃｏｎｒｏｔｔｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０５：４３２１−４３２９（２００５）（非特許文献5）；Ｂａｓｉｌｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２：３４８８８−３４８９５（２００７）（非特許文献6）；Ｓｉｅｒｒａ，ｅｔ．ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０５：１６７３（２００８）（非特許文献7）；Ｚｈｏｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，１５：３９１−４０７（２０１２）（非特許文献8））。腫瘍の増殖及び転移は、腫瘍細胞、間質及び免疫浸潤、ならびに内皮細胞及び脈管構造の間でのクロストークの複雑な過程を伴う。ＳＥＭＡ４Ｄは多種多様な腫瘍型で過剰発現し、腫瘍微小環境に動員された炎症性細胞によっても産生される。最近の研究は、ＳＥＭＡ４Ｄが腫瘍間質を構成する様々な細胞型の移動、生存、分化及び組織化にて役割を担うことを示唆している（Ｅｖａｎｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．３：６８９−７０１（２０１５）（非特許文献9））。
【０００５】
ＳＥＭＡ４Ｄは、神経変性疾患、自己免疫疾患、脱髄疾患、及びがんに関与する。中枢神経系（ＣＮＳ）では、ＳＥＭＡ４Ｄは、たとえば、浸潤している免疫細胞及び乏突起膠細胞前駆細胞で発現し、その受容体は、たとえば、ニューロン、乏突起膠細胞、星状細胞、及び内皮細胞で発現する（Ｏｋｕｎｏ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８４：１４９９−１５０６（２０１０）（非特許文献10））。ＳＥＭＡ４Ｄは、軸索誘導分子として役立つことができ（Ｓｗｉｅｒｃｚ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，３５：５１−６３（２００２）（非特許文献11））、他の活性の間でＧＡＢＡ作動性及びグルタミン酸作動性のシナプスの発達に介在することができる（Ｐａｒａｄｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，５３：２１７−２３２（２００７）（非特許文献12））。
【０００６】
ＳＥＭＡ４Ｄはまた、ニューロン及び乏突起膠細胞前駆細胞の移動及び分化、ＣＮＳの炎症ならびに神経変性にて役割を担うことが示されている。たとえば、ＳＥＭＡ４Ｄ欠損マウスは実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の発生に抵抗性であり（Ｋｕｍａｎｏｇｏｈ，Ａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１３：６２１−６３１（２０００）（非特許文献13））、ＳＥＭＡ４Ｄの遮断はＥＡＥにおけるミクログリア活性化及び神経炎症を抑制することができる（Ｏｋｕｎｏ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８４：１４９９−１５０６（２０１０）（非特許文献14））。同様に、内皮細胞のＳＥＭＡ４Ｄ刺激は炎症誘発性サイトカインＩＬ−８の産生をもたらすことができる（Ｙａｎｇ，ＹＨ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，６：ｅ２５８２６（２０１１）（非特許文献15））。
【０００７】
最近の出版物は、がん及び神経炎症性／神経変性疾患の双方の治療における抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体またはその抗原結合断片）の有効性を実証している。たとえば、抗ＳＥＭＡ４Ｄ抗体であるＶＸ１５／２５０３による最近のフェーズＩ臨床試験は、固形腫瘍の治療における安全性及び有効性を実証した。たとえば、Ｐａｔｎａｉｋ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２２：８２７−８３６（２０１６）（非特許文献16）及びＳｏｕｔｈｗｅｌｌ，ＡＬ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ７６：４６−５６（２０１５）（非特許文献17）を参照のこと。しかしながら、たとえば、結合特性、免疫原性及び／または効力に関して改変された及び／または改善された特性を持つ追加の抗ＳＥＭＡ４Ｄ抗体に対するニーズが残っている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｓｕｚｕｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：１５９−１６７（２００３）；Ｋｉｋｕｔａｎｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：１７−２３（２００８）
【非特許文献２】Ｃｈ’ｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ，１１０：１６４−７２（２００７）
【非特許文献３】Ｃａｍｐｏｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，５：１５２７−３５（２０１３）
【非特許文献４】Ｋａｔｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．１０２：２０２９−３７（２０１１）
【非特許文献５】Ｃｏｎｒｏｔｔｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０５：４３２１−４３２９（２００５）
【非特許文献６】Ｂａｓｉｌｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２：３４８８８−３４８９５（２００７）
【非特許文献７】Ｓｉｅｒｒａ，ｅｔ．ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０５：１６７３（２００８）
【非特許文献８】Ｚｈｏｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，１５：３９１−４０７（２０１２）
【非特許文献９】Ｅｖａｎｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．３：６８９−７０１（２０１５）
【非特許文献１０】Ｏｋｕｎｏ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８４：１４９９−１５０６（２０１０）
【非特許文献１１】Ｓｗｉｅｒｃｚ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，３５：５１−６３（２００２）
【非特許文献１２】Ｐａｒａｄｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，５３：２１７−２３２（２００７）
【非特許文献１３】Ｋｕｍａｎｏｇｏｈ，Ａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１３：６２１−６３１（２０００）
【非特許文献１４】Ｏｋｕｎｏ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８４：１４９９−１５０６（２０１０）
【非特許文献１５】Ｙａｎｇ，ＹＨ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，６：ｅ２５８２６（２０１１）
【非特許文献１６】Ｐａｔｎａｉｋ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２２：８２７−８３６（２０１６）
【非特許文献１７】Ｓｏｕｔｈｗｅｌｌ，ＡＬ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ７６：４６−５６（２０１５）
【発明の概要】
【０００９】
概要
本開示は、セマフォリン４Ｄ（ＳＥＭＡ４Ｄ）の病理に関連する疾患（たとえば、自己免疫疾患、炎症性疾患、がん、神経炎症性疾患、及び神経変性疾患）を治療するための組成物及び方法を提供する。本明細書で説明されている本開示の態様によれば、ＳＥＭＡ４Ｄに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片が提供される。本明細書で説明されている本開示の他の態様によれば、ＳＥＭＡ４Ｄに特異的に結合し、且つＳＥＭＡ４Ｄ活性を中和する抗体または抗原結合断片の有効量を対象に投与することを含む、自己免疫疾患、炎症性疾患、がん、神経炎症性疾患及び神経変性疾患の対象を治療する方法が提供される。
【００１０】
特定の態様では、ＳＥＭＡ４Ｄに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ここで、ＶＨは、それぞれ配列番号２、配列番号３、及び配列番号４と同一のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＨＣＤＲ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含むか、またはＨＣＤＲのうちの１つ、２つ、または３つすべてにおける１つ、２つ、３つ、または４つのアミノ酸置換を除いてそれと同一のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＨＣＤＲ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、ＶＬは、それぞれ配列番号６、配列番号７、及び配列番号８と同一のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＬＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含むか、またはＬＣＤＲのうちの１つ、２つ、または３つすべてにおける１つ、２つ、３つ、または４つのアミノ酸置換を除いてそれと同一のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＬＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
【００１１】
特定の態様では、抗ＳＥＭＡ４Ｄ抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ配列番号２、配列番号３、及び配列番号４と同一のアミノ酸配列を含むＶＨ相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、且つそれぞれ配列番号６、配列番号７、及び配列番号８と同一のアミノ酸配列を含むＶＬ相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
【００１２】
特定の態様では、抗ＳＥＭＡ４Ｄ抗体またはその抗原結合断片は、フレームワーク領域（ＨＦＷ）ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３、及びＨＦＷ４を含むＶＨと、フレームワーク領域（ＬＦＷ）ＬＦＷ１、ＬＦＷ２、ＬＦＷ３、及びＬＦＷ４を含むＶＬとを含む。特定の態様では、フレームワーク領域はヒト抗体または非ヒト抗体に由来することができる。
【００１３】
特定の態様では、抗ＳＥＭＡ４Ｄ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＶＨを含む。特定の態様では、抗ＳＥＭＡ４Ｄ抗体またはその抗原結合断片は配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。特定の態様では、抗ＳＥＭＡ４Ｄ抗体またはその抗原結合断片はそれぞれ配列番号１のアミノ酸配列及び配列番号５を含むＶＨ及びＶＬを含む。
【００１４】
特定の態様では、本明細書で提供される抗ＳＥＭＡ４Ｄ抗体またはその抗原結合断片のＶＨは、配列番号１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。特定の態様では、本明細書で提供される抗ＳＥＭＡ４Ｄ抗体またはその抗原結合断片のＶＬは、配列番号５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。特定の態様では、ＶＨは、配列番号１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むことができ、且つＶＬは、配列番号５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むことができる。
【００１５】
特定の態様では、本明細書で提供される抗ＳＥＭＡ４Ｄ抗体またはその断片は、ＶＨのＣ末端に融合される重鎖定常領域またはその断片を含む。特定の態様では、重鎖定常領域またはその断片は、ヒトの重鎖定常領域である。特定の態様では、重鎖定常領域またはその断片は、ヒトＩｇＧ４の定常領域であることができる。特定の態様では、重鎖定常領域またはその断片は、非ヒト定常領域である。特定の態様では、重鎖定常領域またはその断片は、マウスＩｇＧ１の定常領域である。特定の態様では、抗ＳＥＭＡ４Ｄ抗体またはその断片は、ＶＨとＶＬとを含み、その際、軽鎖定常領域またはその断片はＶＬのＣ末端に融合される。特定の態様では、本明細書で提供される抗ＳＥＭＡ４Ｄ抗体またはその断片は、ＶＬのＣ末端に融合される軽鎖定常領域またはその断片を含む。特定の態様では、軽鎖定常領域は、ヒト軽鎖定常領域、たとえば、ヒトのラムダまたはカッパ軽鎖定常領域である。特定の態様では、軽鎖定常領域は、非ヒト軽鎖定常領域、たとえば、マウスのラムダ軽鎖定常領域である。
【００１６】
特定の態様では、本明細書で提供される抗ＳＥＭＡ４Ｄ抗体またはその断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、またはジスルフィド結合Ｆｖ断片（ｓｄＦｖ）であることができる。特定の態様では、抗ＳＥＭＡ４Ｄ抗体またはその断片は多重特異性、たとえば、二重特異性であることができる。
【００１７】
特定の態様では、本明細書で提供される抗ＳＥＭＡ４Ｄ抗体またはその断片は、ヒトＳＥＭＡ４Ｄ、マウスＳＥＭＡ４Ｄ、ラットＳＥＭＡ４Ｄ、及び／または非ヒト霊長類ＳＥＭＡ４Ｄ、たとえば、カニクイザルＳＥＭＡ４Ｄ及び／またはマーモセットＳＥＭＡ４Ｄに特異的に結合することができる。特定の態様では、本明細書で提供される抗ＳＥＭＡ４Ｄ抗体またはその断片は、５００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、５０．０ｎＭ以下、４０．０ｎＭ以下、３０．０ｎＭ以下、２０．０ｎＭ以下、１０．０ｎＭ以下、９．０ｎＭ以下、８．０ｎＭ以下、７．０ｎＭ以下、６．０ｎＭ以下、５．０ｎＭ以下、４．０ｎＭ以下、３．０ｎＭ以下、２．０ｎＭ以下、１．０ｎＭ以下、０．５０ｎＭ以下、０．１０ｎＭ以下、０．０５０ｎＭ以下、０．０１ｎＭ以下、０．００５ｎＭ以下、または０．００１ｎＭ以下の解離定数ＫＤを特徴とする親和性でＳＥＭＡ４Ｄ、たとえば、ヒトＳＥＭＡ４Ｄ、マウスＳＥＭＡ４Ｄ、ラットＳＥＭＡ４Ｄ、及び／または非ヒト霊長類ＳＥＭＡ４Ｄ、たとえば、カニクイザルＳＥＭＡ４Ｄ及び／またはマーモセットＳＥＭＡ４Ｄに結合することができる。
【００１８】
特定の態様では、本明細書で提供される抗ＳＥＭＡ４Ｄ抗体またはその断片は、ＳＥＭＡ４ＤがＳＥＭＡ４Ｄ受容体、たとえば、プレキシン−Ｂ１、プレキシン−Ｂ２、ＣＤ７２、またはそれらの組み合わせに結合するのを阻害することができる。
【００１９】
特定の態様では、抗ＳＥＭＡ４Ｄ抗体またはその断片は、対象への投与の際、最少限の抗抗体免疫応答を引き起こすか、またはそれを引き起こさない。
【００２０】
特定の態様では、抗ＳＥＭＡ４Ｄ抗体またはその断片は、それに融合またはコンジュゲートされている異種部分を含む。特定の態様では、異種部分は、たとえば、ポリペプチド、細胞傷害剤、治療剤、プロドラッグ、脂質、糖質、核酸、検出できる標識、ポリマーまたはそれらの組み合わせであることができる。特定の態様では、異種部分には、結合分子、酵素、サイトカイン、リンホカイン、ホルモンペプチド、またはそれらの組み合わせを挙げることができる。別の態様では、異種部分には、放射性核種、生物毒素、酵素活性がある毒素、またはそれらの組み合わせを挙げることができる。別の態様では、異種部分には、酵素、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、放射性標識またはそれらの組み合わせを挙げることができる。
【００２１】
特定の態様では、本開示は、本明細書で提供される抗ＳＥＭＡ４Ｄ抗体またはその断片とキャリアとを含む医薬組成物を提供する。
【００２２】
特定の態様では、本開示は、抗ＳＥＭＡ４Ｄ抗体またはその断片をコードする１つまたは複数の核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組み合わせを提供する。別の態様では、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組み合わせは、抗ＳＥＭＡ４Ｄ抗体またはその断片のＶＨをコードする核酸配列を含む。別の態様では、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組み合わせは、抗ＳＥＭＡ４Ｄ抗体またはその断片のＶＬをコードする核酸配列を含む。別の態様では、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組み合わせは、抗ＳＥＭＡ４Ｄ抗体またはその断片のＶＨとＶＬとをコードする核酸配列を含む。さらに別の態様では、本開示は、抗ＳＥＭＡ４Ｄ抗体またはその断片をコードする１つまたは複数の核酸配列を含むポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。別の態様では、本開示は、ベクターを含む宿主細胞を提供する。別の態様では、本開示は、抗ＳＥＭＡ４Ｄ抗体またはその断片を製造する方法を提供する。
【００２３】
提供される方法の特定の態様では、抗ＳＥＭＡ４Ｄ抗体または抗原結合断片は、ヒト対象においてＳＥＭＡ４Ｄを中和する。
【００２４】
本明細書で説明されている態様によれば、本開示は、ＳＥＭＡ４Ｄに特異的に結合し、且つＳＥＭＡ４Ｄの活性を中和する抗体またはその抗原結合断片の有効量を対象に投与することを含む、自己免疫疾患もしくは障害、炎症性疾患もしくは障害、がん、神経炎症性疾患もしくは障害、神経変性疾患もしくは障害、またはそれらの組み合わせの対象を治療する方法を提供する。特定の態様では、神経炎症性疾患または障害は多発性硬化症である。特定の態様では、神経変性疾患または障害は、脳卒中、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ダウン症候群、運動失調、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、ＨＩＶ関連の認知障害、ＣＮＳループス、軽度認知障害、またはそれらの組み合わせである。特定の態様では、自己免疫疾患または炎症性疾患は関節炎である。特定の態様では、自己免疫疾患または炎症性疾患は関節リウマチである。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１Ａは、ＥＬＩＳＡによって測定したとき、ヒトＳＥＭＡ４Ｄに対するＭＡｂＤ２５１７及びＭＡｂＶＸ１５／２５０３（双方ともＰＢＳにて作成した）の結合を比較する図である。図１Ｂは、ＥＬＩＳＡによって測定したとき、カニクイザルＳＥＭＡ４Ｄに対するＭＡｂＤ２５１７及びＭＡｂＶＸ１５／２５０３（双方ともＰＢＳにて作成した）の結合を比較する図である。図１Ｃは、ＥＬＩＳＡによって測定したとき、マーモセットＳＥＭＡ４Ｄに対するＭＡｂＤ２５１７及びＭＡｂＶＸ１５／２５０３（双方ともＰＢＳにて作成した）の結合を比較する図である。図１Ｄは、ＥＬＩＳＡによって測定したとき、マウスＳＥＭＡ４Ｄに対するＭＡｂＤ２５１７及びＭＡｂＶＸ１５／２５０３（双方ともＰＢＳにて作成した）の結合を比較する図である。
【図２Ａ】ＭＡｂＶＸ１５／２５０３と比較したときのＭＡｂＤ２５１７の、ヒトＳＥＭＡ４Ｄが２９３ＰＬＸＮＢ１細胞に結合するのを阻止する能力を示す図である。
【図２Ｂ】ＭＡｂＶＸ１５／２５０３と比較したときのＭＡｂＤ２５１７の、カニクイザルＳＥＭＡ４Ｄが２９３ＰＬＸＮＢ１細胞に結合するのを阻止する能力を示す図である。
【図２Ｃ】ＭＡｂＶＸ１５／２５０３と比較したときのＭＡｂＤ２５１７の、マウスＳＥＭＡ４Ｄが２９３ＰＬＸＮＢ１細胞に結合するのを阻止する能力を示す図である。
【図２Ｄ】ＭＡｂＶＸ１５／２５０３と比較したときのＭＡｂＤ２５１７の、ラットＳＥＭＡ４Ｄが２９３ＰＬＸＮＢ１細胞に結合するのを阻止する能力を示す図である。
【図３Ａ】対照マウスＩｇＧ１／２Ｂ８またはキメラ抗体ＭＡｂＤ２５８５（１０ｍｇ／ｋｇ，ＩＰ，毎週×５）のいずれかで処理したＢａｌｂ／ｃマウスにおける腫瘍体積の測定値を示す図である。
【図３Ｂ】対照マウスＩｇＧ１／２Ｂ８またはキメラ抗体ＭＡｂＤ２５８５のいずれかで処理したＢａｌｂ／ｃマウスの生存期間を示す図である。
【図３Ｃ】対照マウスＩｇＧ１／２Ｂ８またはキメラ抗体ＭＡｂＤ２５８５のいずれかで処理したＢａｌｂ／ｃマウスにおける腫瘍退縮の頻度を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
詳細な説明
定義
用語「ａ」または「ａｎ」の実体は、その実体の１以上を指し；たとえば、「結合分子」は１以上の結合分子を表すように理解されることが言及されるべきである。そのようなものとして、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１以上の」及び「少なくとも１」は本明細書では相互交換可能に使用することができる。
【００２７】
さらに、「及び／または」は、本明細書で使用される場合、他の有無にかかわらず、２つの特定された特徴または成分のそれぞれの具体的な開示として解釈されるべきである。従って、用語「及び／または」が「Ａ及び／またはＢ」のような語句で使用されるとき、「Ａ及びＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）及び「Ｂ」（単独）を含むように意図される。同様に、用語「及び／または」が、たとえば、「Ａ、Ｂ及び／またはＣ」のような語句で使用されるとき、以下の実施形態：Ａ、Ｂ及びＣ；Ａ、ＢまたはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）、Ｂ（単独）、ならびにＣ（単独）のそれぞれを包含するように意図される。
【００２８】
特に定義されない限り、本明細書で使用される専門用語及び科学用語は、本開示が関係する当該技術の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。たとえば、ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ−Ｓｈｏｗ，２ｎｄ  ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；Ｔｈｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；及びｔｈｅ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓは当業者に本開示で使用されている用語の多くの一般的な辞書を提供する。
【００２９】
単位、接頭辞、及び記号は、国際単位系（ＳＩ）が受け入れた形態で示される。数的範囲は、範囲を定義する数を含む。指示されない限り、アミノ酸配列は、アミノ方向からカルボキシ方向に左から右に記述される。本明細書で提供される見出しは、種々の態様または本開示の態様の限定ではなく、それは全体として本明細書を参照することよって得ることができる。従って、直後に定義される用語は、全体として明細書を参照してさらに完全に定義される。
【００３０】
実施形態が言語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を用いて記載される場合は必ず、用語「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」及び／または「から本質的に成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」で記載される別の類似の実施形態も提供される。
【００３１】
アミノ酸は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会によって推奨されている一般に知られる３文字記号または１文字記号によって本明細書で言及される。ヌクレオチドは同様に一般に受け入れられている１文字コードによって言及される。
【００３２】
本明細書で使用されるとき、用語「がん」及び「がん性の」は、細胞の集団が無秩序な細胞増殖を特徴とする哺乳類における生理的状態を指す、または記載する。がんは、たとえば、固形腫瘍もしくは固形悪性腫瘍、または血液癌もしくは血液悪性腫瘍として分類することができる。双方の型は転移として遠隔部に移動することができる。固形腫瘍は、たとえば、肉腫、癌腫、黒色腫またはそれらの転移として分類することができる。
【００３３】
「腫瘍」及び「新生物」は、本明細書で使用されるとき、過剰な細胞の成長または増殖から生じる、前癌病変を含む良性（非がん性）または悪性（がん性）の組織の塊を指す。特定の実施形態では、本明細書に記載されている腫瘍は、ＳＥＭＡ４Ｄ受容体、たとえば、プレキシン−Ｂ１、プレキシン−Ｂ２、及び／もしくはＣＤ７２を発現し、かつ／またはＳＥＭＡ４Ｄを発現することができる。
【００３４】
本明細書で使用されるとき、用語「ポリペプチド」は、単一の「ポリペプチド」と同様に複数の「ポリペプチド」を包含するように意図され、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）によって線状に連結された単量体（アミノ酸）の分子化合物を指す。用語「ポリペプチド」は、２以上のアミノ酸の鎖（単数）または鎖（複数）を指し、生成物の特定の長さを指さない。従って、２以上のアミノ酸の鎖（単数）または鎖（複数）を指すのに使用されるペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」または他の用語は、「ポリペプチド」の定義の範囲内に含まれ、用語「ポリペプチド」は、これらの用語のいずれかの代わりにまたはそれと相互交換可能に使用することができる。用語「ポリペプチド」は、限定しないで、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、及び既知の保護基／ブロッキング基、タンパク分解による切断、または天然に存在しないアミノ酸による修飾による誘導体化を含むポリペプチドの発現後修飾の生成物を指すようにも意図される。ポリペプチドは生物起源に由来することができ、または組換え技術によって生産することができるが、必ずしも指定された核酸配列から翻訳されない。それは化学合成を含めてどんな方法でも生成することができる。
【００３５】
本明細書で開示されているようなポリペプチドは、約３以上、５以上、１０以上、２０以上、２５以上、５０以上、７５以上、１００以上、２００以上、５００以上、１，０００以上、または２，０００以上のアミノ酸のサイズであることができる。ポリペプチドは、必ずしもそのような構造を有さないが、定義された三次元構造を有することができる。定義された三次元構造を持つポリペプチドは折り畳まれたと呼ばれ、定義された三次元構造を持たないが、むしろ多くの異なる構造を採用することができるポリペプチドは折り畳まれないと呼ばれる。本明細書で使用されるとき、用語、糖タンパク質は、アミノ酸、たとえば、セリンまたはアスパラギンの酸素含有側鎖または窒素含有側鎖を介してタンパク質に連結される少なくとも１つの糖質部分に結合したタンパク質を指す。
【００３６】
「単離された」ポリペプチドまたはその断片、変異体、もしくは誘導体によって、自然環境にないポリペプチドが意図される。特定のレベルの精製は要求されない。たとえば、単離されたポリペプチドはネイティブまたは天然の環境から取り出すことができる。宿主細胞で発現する組換え産生されたポリペプチド及びタンパク質は、好適な技法によって分離され、分画され、または部分的にもしくは実質的に精製されているネイティブまたは組換えのポリペプチドと同様に本明細書で開示されているように単離されたと見なされる。
【００３７】
本明細書で使用されるとき、用語「天然に存在しないポリペプチド」またはその文法的な変形は、判定者または行政機関または裁判機関によって「天然に存在する」と判定されもしくは解釈されているまたは判定されもしくは解釈されてもよいポリペプチドの形態を明白に排除するが、単に排除するに過ぎない条件付き定義である。
【００３８】
本明細書で開示されている他のポリペプチドは、前述のポリペプチドの断片、誘導体、類似体または変異体、及びそれらの組み合わせである。本明細書で開示されているような用語「断片」、「変異体」、「誘導体」、及び「類似体」には、たとえば、抗原に特異的に結合する相当するネイティブの抗体またはポリペプチドの特性の少なくとも一部を保持するポリペプチドが含まれる。ポリペプチドの断片には、本明細書のどこか他で議論されている特異的な抗体断片に加えて、たとえば、タンパク分解断片と同様に欠失断片が挙げられる。たとえば、ポリペプチドの変異体には、上記に記載されているような断片、及びアミノ酸の置換、欠失または挿入のせいで変化したアミノ酸配列を持つポリペプチドも挙げられる。特定の態様では、変異体は天然に存在することができない。天然に存在しない変異体は当該技術で既知の変異誘発法を用いて生産することができる。変異体ポリペプチドは、保存的なまたは非保存的なアミノ酸の置換、欠失または付加を含むことができる。誘導体は、元々のポリペプチドに見いだされない追加の特徴を示すように変えられているポリペプチドである。例には融合タンパク質が挙げられる。変異体ポリペプチドは本明細書では「ポリペプチド類似体」とも呼ばれ得る。本明細書で使用されるとき、ポリペプチドの「誘導体」は機能的な側基の反応によって化学的に誘導体化された１以上のアミノ酸を有する主題のポリペプチドを指すこともできる。「誘導体」として挙げられるのはまた、２０の標準アミノ酸の１以上の誘導体を含有するそれらペプチドである。たとえば、プロリンを４−ヒドロキシプロリンで置換することができ；リシンを５−ヒドロキシリシンで置換することができ；ヒスチジンを３−メチルヒスチジンで置換することができ；セリンをホモセリンで置換することができ；及びリシンをオルニチンで置換することができる。
【００３９】
「保存的アミノ酸置換」は、１つのアミノ酸が類似の側鎖を有する別のアミノ酸で置き換えられるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸のファミリーは、塩基性側鎖（たとえば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（たとえば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（たとえば、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（たとえば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（たとえば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（たとえば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含めて当該技術で定義されている。たとえば、チロシンに代わるフェニルアラニンの置換は保存的置換である。特定の実施形態では、本開示のポリペプチド及び抗体の配列における保存的置換は、そのアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたは抗体の、結合分子が結合する抗原への結合を無効にはしない。抗原結合を解消しないヌクレオチド及びアミノ酸の保存的置換を同定する方法は当該技術で周知である（たとえば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：１１８０−１，１８７（１９９３）；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１２（１０）：８７９−８８４（１９９９）；及びＢｕｒｋｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：．４１２−４１７（１９９７）を参照のこと）。
【００４０】
用語「ポリヌクレオチド」は、単数の核酸と同様に複数の核酸を包含するように意図され、単離された核酸の分子または構築物、たとえば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ｃＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、従来のホスホジエステル結合または従来ではない結合（たとえば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見いだされるアミド結合）を含むことができる。用語「核酸」または「核酸配列」はポリヌクレオチドに存在する任意の１以上の核酸セグメント、たとえば、ＤＮＡまたはＲＮＡの断片を指す。
【００４１】
「単離された」核酸またはポリヌクレオチドによって、天然環境から分離されている核酸またはポリヌクレオチドの形態が意図される。たとえば、ベクターに含有されるポリペプチドをコードするゲル精製したポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドは「単離されている」と見なされる。また、クローニングのための制限部位を有するように操作されているポリヌクレオチドセグメント、たとえば、ＰＣＲ産物は「単離されている」と見なされる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例には、異種宿主細胞で維持される組換えポリヌクレオチドまたは、たとえば、緩衝液もしくは生理食塩水のようなネイティブではない溶液における（部分的にまたは実質的に）精製されたポリヌクレオチドが挙げられる。単離されたＲＮＡ分子には、ポリヌクレオチドのインビボまたはインビトロでのＲＮＡ転写物が挙げられ、その際、転写物は自然界で見いだされるものではない。単離されたポリヌクレオチドまたは核酸にはさらに、合成で製造されたそのような分子が挙げられる。加えて、ポリヌクレオチドまたは核酸は、たとえば、プロモーター、リボソーム結合部位または転写ターミネーターのような調節要素であることができ、またはそれを含むことができる。
【００４２】
本明細書で使用されるとき、用語「天然に存在しないポリヌクレオチド」またはその文法的な変形は、判定者または行政機関または裁判機関によって「天然に存在する」と判定されもしくは解釈されているまたは判定されもしくは解釈されてもよい核酸またはポリヌクレオチドの形態を明白に排除するが、単に排除するに過ぎない条件付き定義である。
【００４３】
本明細書で使用されるとき、「コーディング領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンから成る核酸の部分である。「停止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡまたはＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないが、それはコーディング領域の一部であると見なすことができ、しかし、隣接配列、たとえば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、等はコーディング領域の一部ではない。２以上のコーディング領域は、たとえば、単一ベクターでの単一ポリヌクレオチド構築物にて、または、たとえば、別々の（異なる）ベクターでの別々のポリヌクレオチド構築物にて存在することができる。さらに、ベクターは、単一のコーディング領域を含有することができ、または２以上のコーディング領域を含むことができ、たとえば、単一のベクターが免疫グロブリン重鎖可変領域と免疫グロブリン軽鎖可変領域とを別々にコードすることができる。加えて、ベクター、ポリヌクレオチドまたは核酸は、別のコーディング領域に融合しているまたは融合していない異種のコーディング領域を含むことができる。異種のコーディング領域には限定しないで、特定された要素またはモチーフ、たとえば、分泌シグナルペプチドまたは異種の機能性ドメインをコードするものが挙げられる。
【００４４】
特定の実施形態では、ポリヌクレオチドまたは核酸はＤＮＡである。ＤＮＡの場合、ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは普通、１以上のコーディング領域と操作可能に結合されたプロモーター及び／または他の転写もしくは翻訳の制御要素を含むことができる。操作可能な結合は、遺伝子産物の発現を調節配列の影響下または制御下に置くような方法で、遺伝子産物、たとえば、ポリペプチドのためのコーディング領域を１以上の調節配列と結合する場合である。プロモーター機能の誘導が所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写を生じるならば、且つ２つのＤＮＡ断片間の結合の性質が遺伝子産物の発現を指図する発現調節配列の能力を妨害しなければ、または転写されるＤＮＡ鋳型の能力を妨害しなければ、２つのＤＮＡ断片（たとえば、ポリペプチドのコーディング領域とそれに結合するプロモーター）は「操作可能に結合されている」。従って、プロモーターがポリペプチドをコードする核酸の転写を達成することができたのであれば、プロモーター領域はその核酸と操作可能に結合されていることになる。プロモーターは、所定の細胞にてＤＮＡの実質的な転写を指図する細胞特異的なプロモーターであることができる。プロモーターに加えて他の転写制御要素、たとえば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終結シグナルはポリヌクレオチドと操作可能に結合されて細胞特異的な転写を指図することができる。
【００４５】
種々の転写制御領域が当業者に知られている。これらには限定しないで、たとえば、サイトメガロウイルス（イントロンＡと併せて、前初期プロモーター）、サルウイルス４０（初期プロモーター）及びレトロウイルス（たとえば、ラウス肉腫ウイルス）に由来するプロモーター及びエンハンサーのセグメントのような、しかし、これらに限定されない脊椎動物細胞で機能する転写制御領域が挙げられる。他の転写制御領域には、たとえば、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギβグロビンのような脊椎動物遺伝子に由来するもの、ならびに真核細胞で遺伝子発現を制御することができる他の配列が挙げられる。追加の好適な転写制御領域には、組織特異的なプロモーター及びエンハンサー、ならびにリンホカイン誘導性のプロモーター（たとえば、インターフェロンまたはインターロイキンによって誘導できるプロモーター）が挙げられる。
【００４６】
同様に、種々の翻訳制御要素が当業者に知られている。これらには、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終結のコドン、ならびにピコルナウイルスに由来する要素（特にＣＩＴＥ配列とも呼ばれる内部リボソーム進入部位またはＩＲＥＳ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４７】
他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、たとえば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、またはリボソームＲＮＡの形態であることができる。
【００４８】
ポリヌクレオチド及び核酸のコーディング領域は、本明細書で開示されているようなポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指図する、分泌ペプチドまたはシグナルペプチドをコードする追加のコーディング領域と結合することができる。シグナル仮説によれば、哺乳類細胞によって分泌されるタンパク質は、粗面小胞体を横切る成長しているタンパク質鎖の排出がいったん開始されると成熟タンパク質から切断されるシグナルペプチドまたは分泌リーダー配列を有する。当業者は、脊椎動物細胞から分泌されるポリペプチドがポリペプチドのＮ末端に融合されているシグナルペプチドを有することができ、それは完全なまたは「完全長」のポリペプチドから切断されてポリペプチドの分泌された形態または「成熟」形態を生じることを承知している。特定の実施形態では、ネイティブのシグナルペプチド、たとえば、免疫グロブリン重鎖または軽鎖のシグナルペプチド、またはそれに操作可能に結合されるポリペプチドの分泌を指図する能力を保持するその配列の機能的誘導体が使用される。あるいは、異種哺乳類のシグナルペプチド、またはその機能的誘導体を使用することができる。たとえば、野生型リーダー配列をヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）またはマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列で置き換えることができる。
【００４９】
本明細書で開示されるのは、特定の結合分子または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体である。完全サイズの抗体を具体的に言及しない限り、用語「結合分子」は、完全サイズの抗体、ならびにそのような抗体の抗原に結合するサブユニット、断片、変異体、類似体、または誘導体、たとえば、抗体分子に類似した様式で抗原に結合するが異なる足場を使用する、操作された抗体分子または断片を包含する。
【００５０】
本明細書で使用されるとき、用語「結合分子」は、その最も広い意味で、受容体、たとえば、エピトープまたは抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。本明細書にさらに記載されているように、結合分子は、本明細書に記載されている１以上の「抗原結合ドメイン」を含むことができる。結合分子の非限定例は抗体または抗原特異的結合を保持するその断片である。
【００５１】
本明細書で使用されるとき、用語「結合ドメイン」または「抗原結合ドメイン」は、エピトープに特異的に結合するのに必要で且つ十分な結合分子の領域を指す。たとえば、「Ｆｖ」、たとえば、抗体の可変重鎖及び可変軽鎖は２つの別々のポリペプチドサブユニットまたは単鎖として「結合ドメイン」であると見なされる。他の結合ドメインには限定しないで、ラクダ種に由来する抗体の可変重鎖（ＶＨＨ）、またはフィブロネクチンの足場で発現する６つの免疫グロブリン相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。本明細書に記載されているような「結合分子」は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２以上の「抗原結合ドメイン」を含むことができる。
【００５２】
用語「抗体」及び「免疫グロブリン」は、本明細書では相互交換可能に使用することができる。抗体（または本明細書で開示されているようなその断片、変異体、もしくは誘導体）は、少なくとも重鎖の可変領域（ラクダ種について）または少なくとも重鎖及び軽鎖の可変領域を含む。脊椎動物系の基本的な免疫グロブリンの構造は相対的によく理解されている。たとえば、Ｈａｒｌｏｗ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９８８）を参照のこと。特に述べられない限り、用語「抗体」は、抗体の小さな抗原結合断片から完全サイズの抗体に及ぶどんなものでも、たとえば、２本の完全な重鎖と２本の完全な軽鎖を含むＩｇＧ抗体、４本の完全な重鎖と４本の完全な軽鎖とを含み、且つ任意でＪ鎖及び／または分泌成分を含むＩｇＡ抗体、または１０もしくは１２本の完全な重鎖と１０もしくは１２本の完全な軽鎖とを含み、且つ任意でＪ鎖を含むＩｇＭ抗体を包含する。
【００５３】
以下でさらに詳細に議論するように、用語「免疫グロブリン」は、生化学的に区別することができる種々の広いクラスのポリペプチドを含む。当業者は、重鎖がそれらの間での幾つかのサブクラス（たとえば、γ１〜γ４またはα１〜α２）と共にガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）として分類されることを十分に理解するであろう。それは、それぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧまたはＩｇＥとして抗体の「クラス」を決定するこの鎖の性質である。免疫グロブリンのサブクラス（アイソタイプ）、たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、等は、よく特徴付けられており、機能的な特殊化を付与することが知られている。これらのクラス及びアイソタイプのそれぞれの修飾された型は、本開示から見て技量のある熟練者には容易に認識でき、従って本開示の範囲内にある。
【００５４】
軽鎖は、カッパまたはラムダ（κ、λ）のいずれかとして分類される。各重鎖は、カッパ軽鎖またはラムダ軽鎖のいずれかと結合することができる。一般に、軽鎖及び重鎖は互いに共有結合し、２つの重鎖の「尾」部は、免疫グロブリンがハイブリドーマ、Ｂ細胞、または遺伝子操作された宿主細胞のいずれかによって生成される場合、共有ジスルフィド結合または非共有結合によって互いに結合される。重鎖では、アミノ酸配列は、Ｙ形状の分岐した末端でのＮ末端から各鎖の底でのＣ末端までである。特定の抗体、たとえば、ＩｇＧ抗体の基本構造は、ジスルフィド結合を介して共有結合して本明細書では「Ｈ２Ｌ２」構造とも呼ばれる「Ｙ」構造を形成する２つの重鎖サブユニット及び２つの軽鎖サブユニットを含む。
【００５５】
軽鎖及び重鎖は双方とも、構造的な且つ機能的な相同性の領域に分けられる。用語「定常」及び「可変」は機能的に使用される。この点で、可変軽鎖（ＶＬ）部分と可変重鎖（ＶＨ）部分双方の可変領域は抗原認識及び特異性を決定する。逆に、軽鎖（ＣＬ）及び重鎖（ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３）の定常領域は、たとえば、分泌、経胎盤移動性、Ｆｃ受容体結合、補体結合、等のような生物学的特性を付与する。慣例により、定常領域の番号付けは、それらが抗体の抗原結合部位またはアミノ末端から遠くなるにつれて増える。Ｎ末端部分は可変領域であり、Ｃ末端部分は定常領域であり；ＣＨ３（ＩｇＭの場合ＣＨ４）及びＣＬのドメインは実際それぞれ重鎖及び軽鎖のカルボキシ末端を含む。
【００５６】
上記で示したように、可変領域（すなわち、「結合ドメイン」）は、結合分子が抗原上のエピトープを選択的に認識し、特異的に結合できるようにする。すなわち、結合分子、たとえば、抗体のＶＬ領域とＶＨ領域、または相補性決定領域（ＣＤＲ）のサブセットが一緒になって三次元の抗原結合部位を規定する可変領域を形成する。さらに具体的には、抗原結合部位は、ＶＨ鎖及びＶＬ鎖のそれぞれにおける３つのＣＤＲによって規定される。特定の抗体は、さらに大きな構造を形成する。たとえば、ＩｇＡは、すべてジスルフィド結合を介して共有結合する２つのＨ２Ｌ２単位とＪ鎖と分泌成分とを含む分子を形成することができ、ＩｇＭは、ジスルフィド結合を介して共有結合する５または６のＨ２Ｌ２単位と任意でＪ鎖とを含む五量体または六量体の分子を形成することができる。
【００５７】
抗体の抗原結合ドメインに存在する６つの「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、抗体が水性環境ではその三次元配置を前提としているので、特異的に配置されて結合ドメインを形成するアミノ酸の短い不連続の配列である。「フレームワーク」領域と呼ばれる、結合ドメインにおけるアミノ酸の残りは、少ない分子間可変性を示す。フレームワーク領域は大部分βシート構造を採用し、ＣＤＲは接続するループを形成し、場合によってはβシート構造の一部を形成する。従って、フレームワーク領域は、鎖間非共有結合性相互作用によって正しい方向性でＣＤＲを配置することを提供する足場を形成するように作用する。配置されたＣＤＲによって形成される結合ドメインは、免疫反応性抗原上のエピトープに対する表面相補性を規定する。この相補性表面が抗体のその同族エピトープへの非共有結合を促進する。それらは種々の異なる方法で定義されているので、ＣＤＲ及びフレームワーク領域をそれぞれ構成するアミノ酸は、所与の重鎖または軽鎖の可変領域について当業者によって容易に同定され得る（全体として参照によって本明細書に組み入れられる “Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”Ｋａｂａｔ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，（１９８３）；ならびにＣｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ，ＪＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−９１７（１９８７）を参照のこと）。
【００５８】
当該技術の範囲内で使用され及び／または受け入れられている用語の定義が２以上ある場合、本明細書で使用される用語の定義は、それとは反対に明白に述べられない限り、そのような意味すべてを含むように意図される。具体例は、重鎖及び軽鎖のポリペプチド双方の可変領域内で見いだされる不連続の抗原結合部位を記載するための用語「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）の使用である。これらの特定の領域は、たとえば、参照によって本明細書に組み入れられるＫａｂａｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ，ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９８３）によって及びＣｈｏｔｈｉａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）によって記載されている。Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの定義は、互いに対して比べると、アミノ酸の重複またはサブユニットを含む。にもかかわらず、抗体のＣＤＲまたはその変異体を指すためのいずれかの定義（または当業者に既知の他の定義）の適用は、特に指示されない限り、本明細書で定義され、使用されるような用語の範囲内にあるように意図される。上記引用文献のそれぞれによって定義されたようなＣＤＲを包含する適当なアミノ酸を比較として表１にて以下に示す。特定のＣＤＲを包含する正確なアミノ酸番号は、ＣＤＲの配列及びサイズに応じて変化するであろう。当業者は、抗体の可変領域アミノ酸配列を前提としてどのアミノ酸が特定のＣＤＲを構成するのかを日常的に決定することができる。
【００５９】
（表１）ＣＤＲの定義１
2020518248.tif 000003
１表１におけるＣＤＲの定義すべての番号付けは、Ｋａｂａｔ，ｅｔ  ａｌ．（以下を参照のこと）によって示された番号付けの慣例に従う。
【００６０】
免疫グロブリンの可変領域は、ＣＤＲを含む可変領域のセグメントを同定するためのＩＭＧＴ情報システム（ｗｗｗ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／）（ＩＭＧＴ（登録商標）／Ｖ−Ｑｕｅｓｔ）を用いて解析することもできる。たとえば、Ｂｒｏｃｈｅｔ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．，ＮｕｃｌＡｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３６：Ｗ５０３−５０８（２００８）を参照のこと。
【００６１】
Ｋａｂａｔ，ｅｔ  ａｌ．は、どんな抗体にも適用できる可変領域配列についての番号付け方式も定義した。当業者は、配列自体を超える実験データを当てにしないで「Ｋａｂａｔの番号付け」のこの方式を任意の可変領域配列に明確に割り当てることができる。本明細書で使用されるとき、「Ｋａｂａｔの番号付け」は、Ｋａｂａｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ，ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９８３）によって示された番号付け方式を指す。しかしながら、Ｋａｂａｔの番号付け方式の使用が明白に言及されない限り、本開示におけるアミノ酸配列すべてには連続的な番号付けが使用される。
【００６２】
結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体、単鎖抗体、エピトープ結合断片、たとえば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＬ領域またはＶＨ領域を含む断片、Ｆａｂ発現ライブラリによって作られる断片が挙げられるが、これらに限定されない。ｓｃＦｖ分子は当該技術で既知であり、米国特許第５，８９２，０１９号に記載されている。本開示によって包含される免疫グロブリンまたは抗体の分子は、免疫グロブリン分子の任意の型（たとえば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）、またはサブクラスであることができる。
【００６３】
「特異的に結合する」によって、結合分子（たとえば、抗体またはその断片、変異体、もしくは誘導体）が抗原結合ドメインを介してエピトープに結合し、結合が抗原結合ドメインとエピトープの間でのいくらかの相補性を必然的に伴うことを一般的に意味する。この定義によれば、結合分子が無作為で無関係なエピトープに結合するよりも素早くその抗原結合ドメインを介してエピトープに結合する場合、結合分子は、そのエピトープに「特異的に結合する」と言われる。用語「特異的に」は、それによって特定の結合分子が特定のエピトープに結合する相対的親和性を限定するのに本明細書で使用される。たとえば、結合分子「Ａ」は結合分子「Ｂ」よりも所与のエピトープについて高い特異性を有すると考えられることができ、または結合分子「Ａ」はそれが関連するエピトープ「Ｄ」について有するよりも高い特異性でエピトープ「Ｃ」に結合すると言われ得る。
【００６４】
本明細書で開示されている結合分子（たとえば、抗体またはその断片、変異体、もしくは誘導体）は、５×１０−２秒−１、１０−２秒−１、５×１０−３秒−１、１０−３秒−１、５×１０−４秒−１、１０−４秒−１、５×１０−５秒−１、または１０−５秒−１、５×１０−６秒−１、１０−６秒−１、５×１０−７秒−１、または１０−７秒−１以下のオフ速度（ｋ（オフ））で標的抗原に結合すると言われ得る。
【００６５】
本明細書で開示されている結合分子（たとえば、抗体またはその断片、変異体、もしくは誘導体）は、１０３Ｍ−１秒−１、５×１０３Ｍ−１秒−１、１０４Ｍ−１秒−１、５×１０４Ｍ−１秒−１、１０５Ｍ−１秒−１、５×１０５Ｍ−１秒−１、１０６Ｍ−１秒−１、または５×１０６Ｍ−１秒−１、または１０７Ｍ−１秒−１以上のオン速度（ｋ（オン））で標的抗原に結合すると言われ得る。
【００６６】
結合分子（たとえば、抗体またはその断片、変異体、もしくは誘導体）は、それが参照抗体または抗原結合断片の所与のエピトープへの結合をある程度阻止する程度に優先的にそのエピトープに結合するならば、参照抗体または抗原結合断片のそのエピトープへの結合を競合して阻害すると言われる。競合阻害は、当該技術で既知の方法、たとえば、競合ＥＬＩＳＡアッセイによって判定することができる。結合分子は、参照抗体または抗原結合断片の所与のエピトープへの結合を少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％または少なくとも５０％競合して阻害すると言われ得る。
【００６７】
本明細書で使用されるとき、用語「親和性」は、たとえば、免疫グロブリン分子の１以上の結合ドメインとの個々のエピトープの結合の強さの評価基準を指す。たとえば、Ｈａｒｌｏｗ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９８８）、ページ２７−２８を参照のこと。本明細書で使用されるとき、用語「結合活性」は、結合ドメインの集団と抗原との間での複合体の全体的な安定性を指す。たとえば、Ｈａｒｌｏｗのページ２９−３４を参照のこと。結合活性は、集団における個々の結合ドメインの特定のエピトープとの親和性と免疫グロブリン及び抗原の価数との双方に関係する。たとえば、二価のモノクローナル抗体と高度に反復するエピトープ構造を持つ抗原、たとえば、ポリマーとの間の相互作用は、高い結合活性の１つである。二価のモノクローナル抗体と細胞表面上に高密度で存在する受容体との間での相互作用も高い結合活性のものである。
【００６８】
本明細書で開示されているような結合分子または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体は、その交差反応性という点でも記載され、または特定され得る。本明細書で使用されるとき、用語「交差反応性」は、１つの抗原に特異的な結合分子（たとえば、抗体またはその断片、変異体、もしくは誘導体）の第２の抗原と反応する能力；２つの異なる抗原性物質間の関連性の評価基準を指す。従って、結合分子は、それがその形成を誘導したもの以外のエピトープに結合すれば、交差反応性である。交差反応性のエピトープは一般に、誘導性エピトープと同じ相補性の構造的特徴の多数を含有し、場合によっては、元々のものより実際上手く嵌め合わせすることができる。
【００６９】
結合分子（たとえば、抗体またはその断片、変異体、もしくは誘導体）は、抗原に対するその結合親和性という点でも記載または特定され得る。たとえば、結合分子は、５×１０−２Ｍ以下、１０−２Ｍ以下、５×１０−３Ｍ以下、１０−３Ｍ以下、５×１０−４Ｍ以下、１０−４Ｍ以下、５×１０−５Ｍ以下、１０−５Ｍ以下、５×１０−６Ｍ以下、１０−６Ｍ以下、５×１０−７Ｍ以下、１０−７Ｍ以下、５×１０−８Ｍ以下、１０−８Ｍ以下、５×１０−９Ｍ以下、１０−９Ｍ以下、５×１０−１０Ｍ以下、１０−１０Ｍ以下、５×１０−１１Ｍ以下、１０−１１Ｍ以下、５×１０−１２Ｍ以下、１０−１２Ｍ以下、５×１０−１３Ｍ以下、１０−１３Ｍ以下、５×１０−１４Ｍ以下、１０−１４Ｍ以下、５×１０−１５Ｍ以下、または１０−１５Ｍ以下の解離定数またはＫＤで抗原に結合することができる。
【００７０】
単鎖抗体または他の結合ドメインを含む抗体断片は、単独で存在することができ、または以下：ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３またはＣＨ４、Ｊ鎖または分泌成分の１以上との組み合わせで存在することができる。可変領域のヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、またはＣＨ４のドメイン、Ｊ鎖または分泌成分の１以上との任意の組み合わせを含むことができる抗原結合断片もまた含められる。結合分子（たとえば、抗体またはその抗原結合断片）は、鳥類及び哺乳類を含む任意の動物起源に由来することができる。抗体は、ヒト、マウス、ロバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ラマ、ウマまたはニワトリの抗体であることができる。別の実施形態では、可変領域は、起源がコンドリクトイド（ｃｏｎｄｒｉｃｔｈｏｉｄ）（例えば、サメ由来）であり得る。本明細書で使用されるとき、「ヒト」抗体には、ヒトの免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体が含まれ、且つヒトの免疫グロブリンライブラリから単離された、または１以上のヒト免疫グロブリンに関して遺伝子導入された動物から単離された抗体が含まれ、場合によっては、上記及び、たとえば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ，ｅｔ  ａｌ．による米国特許第５，９３９，５９８号に記載されているように内在性の免疫グロブリンを発現することができることもあるが、そうでないこともある。
【００７１】
本明細書で使用されるとき、用語「重鎖サブユニット」には、免疫グロブリン重鎖に由来するアミノ酸配列が含まれ、重鎖サブユニットを含む結合分子（たとえば、抗体）は、ＶＨ領域、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ（たとえば、上部、中部及び／または下部ヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、またはそれらの変異体または断片の少なくとも１つを含む。たとえば、結合分子（たとえば、抗体またはその断片、変異体、もしくは誘導体）は、ＶＨ領域に加えて、ＣＨ１ドメイン；ＣＨ１ドメインとヒンジとＣＨ２ドメイン；ＣＨ１ドメインとＣＨ３ドメイン；ＣＨ１ドメインとヒンジとＣＨ３ドメイン；またはＣＨ１ドメインとヒンジドメインとＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインを含むことができる。特定の態様では、結合分子（たとえば、抗体またはその断片、変異体、もしくは誘導体）は、ＶＨ領域に加えて、ＣＨ３ドメインとＣＨ４ドメイン；またはＣＨ３ドメインとＣＨ４ドメインとＪ鎖を含むことができる。さらに、本開示で使用するための結合分子は、特定の定常領域部分（たとえば、ＣＨ２ドメインの全部または一部）を欠くことができる。これらのドメイン（たとえば、重鎖サブユニット）は、それらが元々の免疫グロブリン分子からアミノ酸配列で異なるように修飾できることが、当業者によって理解されるであろう。
【００７２】
結合分子（たとえば、抗体またはその断片）の重鎖サブユニットは、異なる免疫グロブリン分子に由来するドメインを含むことができる。たとえば、ポリペプチドの重鎖サブユニットは、ＩｇＧ１分子に由来するＣＨ１ドメインとＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域とを含むことができる。別の例では、重鎖サブユニットは、ＩｇＧ１分子にある程度及びＩｇＧ３分子にある程度由来するヒンジ領域を含むことができる。別の例では、重鎖サブユニットは、ＩｇＧ１分子にある程度及びＩｇＧ４分子にある程度由来するキメラヒンジ領域を含むことができる。
【００７３】
本明細書で使用されるとき、用語「軽鎖サブユニット」は、免疫グロブリン軽鎖に由来するアミノ酸配列を含む。軽鎖サブユニットは、ＶＬまたはＣＬ（たとえば、ＣκまたはＣλ）ドメインの少なくとも一方を含む。
【００７４】
結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）は、それらが認識し、特異的に結合する抗原のエピトープまたは一部という点で記載されまたは特定され得る。抗体の抗原結合ドメインと特異的に相互作用する標的抗原の一部は、「エピトープ」または「抗原決定基」である。標的抗原は、単一のエピトープまたは少なくとも２つのエピソードを含むことができ、抗原のサイズ、構造及び種類に応じてどんな数のエピトープも含むことができる。
【００７５】
前に示したように、種々の免疫グロブリンクラスの定常領域のサブユニット構造及び三次元配置は周知である。本明細書で使用されるとき、用語「ＶＨ領域」には免疫グロブリン重鎖のアミノ末端可変領域が含まれ、用語「ＣＨ１ドメイン」には免疫グロブリン重鎖の第１（最もアミノ末端側）の定常領域ドメインが含まれる。ＣＨ１ドメインは、ＶＨ領域に隣接し、典型的な免疫グロブリン重鎖分子のヒンジ領域に対してアミノ末端側にある。
【００７６】
本明細書で使用されるとき、用語「ＣＨ２ドメイン」には、従来の番号付け規定を用いてＩｇＧ抗体のほぼアミノ酸２４４からアミノ酸３６０まで伸びる重鎖分子の一部が含まれる（Ｋａｂａｔ番号付け方式：アミノ酸２４４〜３６０；ＥＵ番号付け方式：アミノ酸２３１〜３４０；Ｋａｂａｔ，ＥＡ．ｅｔ  ａｌ．ｏｐ．ｃｉｔを参照のこと）。ＣＨ３ドメインは、ＣＨ２ドメインからＩｇＧ分子のＣ末端まで伸び、およそ１０８のアミノ酸を含む。特定の免疫グロブリンクラス（たとえば、ＩｇＭ）は、ＣＨ４領域をさらに含む。
【００７７】
本明細書で使用されるとき、用語「ヒンジ領域」は、ＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインに連結する重鎖分子の一部を含む。このヒンジ領域は、およそ２５のアミノ酸を含み、柔軟性があるので、２つのＮ末端抗原結合領域が独立して動けるようにする。
【００７８】
本明細書で使用されるとき、用語「ジスルフィド結合」は、２つのイオウ原子の間で形成される共有結合を含む。アミノ酸システインは、第２のチオール基とジスルフィド結合またはジスルフィド架橋を形成することができるチオール基を含む。特定のＩｇＧ分子では、ＣＨ１領域とＣＬ領域は、ジスルフィド結合によって連結され、２つの重鎖は、Ｋａｂａｔ番号付け方式を用いて２３９及び２４２（ＥＵ番号付け方式では２２６位または２２９位）に相当する位置で２つのジスルフィド結合によって連結される。
【００７９】
本明細書で使用されるとき、用語「キメラ抗体」は、免疫反応性の領域または部位が第１の種から得られまたはそれに由来し、定常領域（インタクト、一部である、または修飾され得る）が第２の種から得られる抗体を指す。一部の実施形態では、標的に結合する領域または部位は非ヒト起源（たとえば、マウスまたは霊長類）に由来し、定常領域はヒトに由来する。
【００８０】
用語「多重特異性抗体」または「二重特異性抗体」は、単一抗体分子内で２以上の異なるエピトープに対する結合ドメインを有する抗体を指す。標準の抗体構造に加えて他の結合分子は、２つの結合特異性によって構築することができる。二重特異性または多重特異性の抗体によるエピトープ結合は、同時または順次であることができる。トリオーマ及びハイブリッドハイブリドーマは、二重特異性抗体を分泌することができる細胞株の２つの例である。二重特異性抗体は、組換え手段によって構築することもできる（Ｓｔｒｏｈｌｅｉｎ及びＨｅｉｓｓ，Ｆｕｔｕｒｅ  Ｏｎｃｏｌ．６：１３８７−９４（２０１０）；Ｍａｂｒｙ及びＳｎａｖｅｌｙ，ＩＤｒｕｇｓ．１３：５４３−９（２０１０））。二重特異性抗体はジアボディであることもできる。
【００８１】
本明細書で使用されるとき、用語「操作された抗体」は、重鎖及び軽鎖のいずれかまたは双方における可変領域がＣＤＲまたはフレームワーク領域のいずれかにおける１以上のアミノ酸の少なくとも部分的な置き換えによって変えられる抗体を指す。特定の態様では、既知の特異性の抗体に由来するＣＤＲ全体を異種抗体のフレームワーク領域に移植することができる。代替のＣＤＲは、フレームワーク領域が由来する抗体と同じクラスまたはさらにサブクラスの抗体に由来することができるが、ＣＤＲは、たとえば、異なる種の抗体からの異なるクラスの抗体に由来することもできる。既知の特異性の非ヒト抗体に由来する１以上の「ドナー」ＣＤＲがヒト重鎖または軽鎖のフレームワーク領域に移植される操作された抗体は、本明細書では「ヒト化抗体」と呼ばれる。特定の態様では、すべてというわけではないＣＤＲがドナーの可変領域に由来する完全なＣＤＲで置き換えられ、なおかつ、ドナーの抗原結合能をレシピエントの可変領域にさらに移すことができる。たとえば、米国特許第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、同第５，６９３，７６２号、及び同第６，１８０，３７０号で示された説明を考えると、機能的な操作された抗体またはヒト化抗体を得ることは、日常の実験を行うことによってまたは試行錯誤によって当業者の力量の十分に範囲内であろう。
【００８２】
本明細書で使用されるとき、用語「操作された」には、合成手段による（たとえば、組換え法、インビトロでのペプチド合成による、ペプチドの酵素カップリングもしくは化学カップリングまたはこれらの技法の幾つかの組み合わせによる）核酸分子またはポリペプチド分子の操作が含まれる。
【００８３】
本明細書で使用されるとき、用語「連結される」、「融合される」、もしくは「融合」または他の文法的同等物は、相互交換可能に使用することができる。これらの用語は、化学的結合または組換え手段を含む任意の手段によって２以上の要素または成分が一緒に連結されることを指す。「インフレーム融合」は、元々のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の翻訳リーディングフレームを維持する方法で連続するさらに長いＯＲＦを形成する、２以上のポリヌクレオチドのＯＲＦの連結を指す。従って、組換え融合タンパク質は、元々のＯＲＦ（そのセグメントは、自然界では普通そのように連結されない）によってコードされるポリペプチドに相当する２以上のセグメントを含有する単一のタンパク質である。リーディングフレームは、融合されたセグメント全体にわたってこうして連続性にされるが、セグメントは、たとえば、インフレームのリンカー配列によって物理的にまたは空間的に分離することができる。たとえば、免疫グロブリン可変領域のＣＤＲをコードするポリヌクレオチドはインフレームで融合されることができるが、「融合された」ＣＤＲが連続するポリペプチドの一部として同時翻訳される限り、少なくとも１つの免疫グロブリンフレームワーク領域または追加のＣＤＲ領域をコードするポリヌクレオチドによって分離することができる。
【００８４】
ポリペプチドの文脈で、「直鎖状配列」または「配列」は、配列にて互いに隣接するアミノ酸がポリペプチドの一次構造で連続しているアミノ末端からカルボキシル末端の方向でのポリペプチドにおけるアミノ酸の順序である。ポリペプチドの別の部分に対して「アミノ末端側」または「Ｎ末端側」にあるポリペプチドの部分は、一連のポリペプチド鎖にて前に来るその部分である。同様に、ポリペプチドの別の部分に対して「カルボキシ末端側」または「Ｃ末端側」にあるポリペプチドの部分は、一連のポリペプチド鎖にて後に来るその部分である。たとえば、典型的な抗体では、可変領域は定常領域に対して「Ｎ末端側」にあり、定常領域は可変領域に対して「Ｃ末端側」にある。
【００８５】
用語「発現」は、本明細書で使用されるとき、遺伝子が生化学物質、たとえば、ポリペプチドを生産する過程を指す。過程には、非限定的に、遺伝子のノックダウン、ならびに一過性発現及び安定的発現の双方を含む細胞内での遺伝子の機能的存在の操作が含まれる。それには限定しないで、遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）への転写及びそのようなｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳が含まれる。最終的な所望の産物が生化学物質であるならば、発現にはその生化学物質及び任意の前駆体の生成が含まれる。遺伝子の発現は「遺伝子産物」をもたらす。本明細書で使用されるとき、遺伝子産物は、遺伝子の転写によって生じる核酸、たとえば、メッセンジャーＲＮＡ、または転写物から翻訳されるポリペプチドであることができる。本明細書に記載されている遺伝子産物にはさらに、転写後修飾、たとえば、ポリアデニル化を伴った核酸、または翻訳後修飾、たとえば、メチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットとの会合、タンパク分解性切断、等を伴ったポリペプチドが含まれる。
【００８６】
本明細書で使用されるとき、用語「抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子」は、ＳＥＭＡ４Ｄに特異的に結合する分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）を指す。たとえば、天然に存在する抗体のような完全サイズの抗体に具体的に言及しない限り、用語「抗ＳＥＭＡ４Ｄ抗体」は、完全サイズの抗体、及びそのような抗体の抗原結合断片、及びそのような抗体の、抗原に結合する断片、類似体、または誘導体、たとえば、天然に存在する抗体または免疫グロブリン分子または操作された抗体分子または抗体分子に類似する様式で抗原に結合する断片を包含する。
【００８７】
たとえば、「治療すること」または「治療」または「治療すること」または「緩和すること」または「緩和すること」のような用語は、存在する診断された病状または障害の症状を治癒させる、減速する、減らす、及び／またはその進行を止めるまたは遅くする治療方策を指す。たとえば、「予防する」、「予防」、「回避する」、「阻止」等のような用語は、診断されていない標的とされる病状または障害の発生を防ぐ予防上のまたは予防的な方策を指す。従って、「治療を必要とする者」は、すでに障害がある者；障害を有し易い者；及び障害が予防されるべきである者を含むことができる。本明細書で使用されるとき、たとえば、「治療法から利益が得られる対象」及び「治療を必要とする動物」のような語句には、本明細書に記載されているような治療法の投与から利益が得られる哺乳類対象のような対象が含まれる。
【００８８】
用語「治療上有効な量」は、対象または哺乳類にて疾患または障害を「治療する」のに有効な抗体、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、有機小分子、または他の薬剤の量を指す。
【００８９】
「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳類」によって、診断、予後診断または治療法が所望される対象、特に哺乳類対象を意味する。哺乳類対象には、ヒト、家畜、産業用動物、及び動物園動物、スポーツ用動物またはペット動物、たとえば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ブタ、ウシ、クマ、等が挙げられる。
【００９０】
標的ポリペプチドの説明−ＳＥＭＡ４Ｄ
本明細書で使用されるとき、用語「セマフォリン４Ｄ」、「ＳＥＭＡ４Ｄ」、及び「ＳＥＭＡ４Ｄポリペプチド」は、「ＳＥＭＡ４Ｄ」及び「Ｓｅｍａ４Ｄ」のように相互交換可能に使用される。特定の実施形態では、ＳＥＭＡ４Ｄは、細胞の表面上で発現し、細胞によって分泌される。別の実施形態では、ＳＥＭＡ４Ｄは、膜に結合される。別の実施形態では、ＳＥＭＡ４Ｄは、可溶性、たとえば、ｓＳＥＭＡ４Ｄである。別の実施形態では、ＳＥＭＡ４Ｄは、完全サイズのＳＥＭＡ４Ｄまたはその断片、またはＳＥＭＡ４Ｄ変異体ポリペプチドを含むことができ、その際、ＳＥＭＡ４Ｄの断片またはＳＥＭＡ４Ｄ変異体ポリペプチドは、完全サイズＳＥＭＡ４Ｄの機能的特性の一部または全部を保持する。
【００９１】
完全サイズのヒトＳＥＭＡ４Ｄタンパク質は、１５０ｋＤａの２本のポリペプチド鎖から成るホモ二量体の膜貫通タンパク質である。ＳＥＭＡ４Ｄは、細胞表面受容体のセマフォリンファミリーに属し、ＣＤ１００とも呼ばれる。ヒト及びマウス双方のＳＥＭＡ４Ｄ／Ｓｅｍａ４Ｄは、その膜貫通形態からタンパク分解で切断されて１２０ｋＤａの可溶性形態を生成し、２つのＳｅｍａ４Ｄアイソフォームを生じる（Ｋｕｍａｎｏｇｏｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１１６：３４６４（２００３））。セマフォリンは、ニューロンとその標的との間で正確な接続を確立するのに重要な役割を担う軸索誘導因子として元々定義された可溶性及び膜結合性のタンパク質から成る。構造的にクラスＩＶのセマフォリンと見なされるＳＥＭＡ４Ｄは、アミノ末端側のシグナル配列とそれに続く１７の保存されたシステイン残基を含有する特徴的な「Ｓｅｍａ」ドメインとＩｇ様ドメインとリシンが豊富な区間と疎水性膜貫通領域と細胞質尾部とから成る。
【００９２】
ＳＥＭＡ４Ｄポリペプチドには、約１３アミノ酸のシグナル配列とそれに続く約５１２アミノ酸のセマフォリンドメインと約６５アミノ酸の免疫グロブリン様（Ｉｇ様）ドメインと１０４アミノ酸のリシンが豊富な区間と約１９アミノ酸の疎水性膜貫通領域と１１０アミノ酸の細胞質尾部とが含まれる。細胞質尾部におけるチロシンリン酸化のためのコンセンサス部位は、ＳＥＭＡ４Ｄのチロシンキナーゼとの予測された関連を支持している（Ｓｃｈｌｏｓｓｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．（１９９５），Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ  Ｔｙｐｉｎｇ  Ｖ，（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）。
【００９３】
ＳＥＭＡ４Ｄは、少なくとも３つの機能的な受容体、プレキシン−Ｂ１、プレキシン−Ｂ２及びＣＤ７２を有することが知られている。プレキシン−Ｂ１は、非リンパ系組織で発現し、ＳＥＭＡ４Ｄに対して高親和性（１ｎＭ）の受容体であることが示されている（Ｔａｍａｇｎｏｎｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，９９：７１−８０（１９９９））。プレキシン−Ｂ１のシグナル伝達のＳＥＭＡ４Ｄによる刺激は、ニューロンの成長円錐の崩壊を誘導し、且つ乏突起膠細胞の突起伸長崩壊及びアポトーシスを誘導することが示されている（Ｇｉｒａｕｄｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２：１２４６−１２５５（２００４）；Ｇｉｒａｕｄｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，ＮｅｕｒｏＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄ．７：２０７−２１６（２００５））。ＳＥＭＡ４Ｄに結合した後、プレキシン−Ｂ１のシグナル伝達は、Ｒ−Ｒａｓの不活性化を媒介し、インテグリンが介在する細胞外マトリクスへの結合の低下及びＲｈｏＡの活性化をもたらし、細胞骨格の再編成による細胞崩壊をもたらす（Ｋｒｕｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．６：７８９−８００（２００５）；Ｐａｓｔｅｒｋａｍｐ，ＴＲＥＮＤＳ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１５：６１−６４（２００５））。プレキシン−Ｂ２はＳＥＭＡ４Ｄに対して中程度の親和性を有し、最近の報告は、プレキシン−Ｂ２が角化細胞上で発現し、ＳＥＭＡ４Ｄ陽性γδＴ細胞を活性化して上皮修復に寄与することを示している（Ｗｉｔｈｅｒｄｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３７：３１４−２５（２０１２））。
【００９４】
リンパ系組織では、ＣＤ７２は低親和性（３００ｎＭ）のＳＥＭＡ４Ｄ受容体として利用される（Ｋｕｍａｎｏｇｏｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１３：６２１−６３１（２０００））。Ｂ細胞及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）はＣＤ７２を発現し、抗ＣＤ７２抗体は、たとえば、ＣＤ４０が誘導するＢ細胞応答の増強及びＣＤ２３のＢ細胞からの遊離のようなｓＳＥＭＡ４Ｄと同様の効果の多数を有する。ＣＤ７２は、多くの阻害性受容体と会合することができるチロシンホスファターゼＳＨＰ−１を動員することによってＢ細胞応答の負の調節因子として作用すると考えられている。ＳＥＭＡ４ＤのＣＤ７２との相互作用は、ＳＨＰ−１の解離及びこの負の活性化シグナルの喪失を生じる。ＳＥＭＡ４ＤはインビトロでＴ細胞の刺激及びＢ細胞の凝集や生存を促進することが示されている。ＳＥＭＡ４Ｄを発現している細胞またはｓＳＥＭＡ４Ｄの添加は、インビトロでＣＤ４０が誘導するＢ細胞の増殖及び免疫グロブリンの産生を増強し、インビボで抗体反応を加速する（Ｉｓｈｉｄａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：１０２７−１０３４（２００３）；Ｋｕｍａｎｏｇｏｈ及びＨ．Ｋｕｋｕｔａｎｉ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２．６７０−６７６（２００１））。ｓＳＥＭＡ４Ｄは、共刺激分子の上方調節及びＩＬ−１２分泌の増大を含む、ＣＤ４０が誘導するＤＣの成熟を増強する。加えて、ｓＳＥＭＡ４Ｄは免疫細胞の移動を阻害することができ、それはブロッキング抗ＳＥＭＡ４Ｄマウス抗体を加えることによって元に戻すことができる（Ｅｌｈａｂａｚｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：４３４１−４３４７（２００１）；Ｄｅｌａｉｒｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：４３４８−４３５４（２００１））。
【００９５】
Ｓｅｍａ４Ｄは、脾臓、胸腺及びリンパ節を含むリンパ系臓器、ならびに脳、心臓及び腎臓のような非リンパ系臓器にて高レベルで発現する。リンパ系臓器では、Ｓｅｍａ４Ｄは、休止Ｔ細胞にて豊富に発現するが、休止Ｂ細胞及び樹状細胞（ＤＣ）のような抗原提示細胞（ＡＰＣ）では弱く発現するにすぎない。
【００９６】
細胞の活性化は、ＳＥＭＡ４Ｄの表面発現および可溶性ＳＥＭＡ４Ｄ（ｓＳＥＭＡ４Ｄ）の生成を増やす。ＳＥＭＡ４Ｄの発現パターンは、それが免疫系にて重要な生理的役割および病的な役割を担うことを示唆している。ＳＥＭＡ４Ｄは、Ｂ細胞の活性化、凝集及び生存を促進し；ＣＤ４０が誘導する増殖及び抗体産生を高め；Ｔ細胞依存性の抗原に対する抗体反応を高め；Ｔ細胞の増殖を増やし；樹状細胞の成熟及びＴ細胞を刺激する能力を増強することが示され；脱髄及び軸索変性に直接関与する（Ｓｈｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１３：６３３−６４２（２０００）；Ｋｕｍａｎｏｇｏｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：１１７５−１１８１（２００２）；及びＷａｔａｎａｂｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：４３２１−４３２８（２００１））。
【００９７】
ヒト抗ＳＥＭＡ４Ｄ抗体
本開示は、それぞれ配列番号１及び配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）に関係するまたはそれと同一であるＶＨ及びＶＬを持つ抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子、たとえば、抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）を提供する。特定の態様では、提供される結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）は完全にヒトのものである。
【００９８】
特定の態様では、本明細書で提供されている抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）は、それぞれ配列番号１及び配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬの領域を持つ参照抗ＳＥＭＡ４Ｄ抗体分子のＶＨ及びＶＬの領域と少なくとも約８０％、約８５％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬの領域を有する。
【００９９】
特定の態様では、抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）は、ＳＥＭＡ４Ｄのその受容体、たとえば、プレキシン−Ｂ１、プレキシン−Ｂ２、またはＣＤ７２との相互作用を阻害することができる。特定の態様では、抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）は、ＳＥＭＡ４Ｄが介在するプレキシン−Ｂ１のシグナル伝達を阻害することができる。
【０１００】
特定の態様では、抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）は、配列番号１のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域（ＶＨ）と配列番号５のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域（ＶＬ）とを含む参照抗体がＳＥＭＡ４Ｄに結合するのを競合して阻害する。特定の態様では、抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む参照抗体と同じＳＥＭＡ４Ｄエピトープに結合する。特定の態様では、抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）のＶＨは、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、且つＶＬは３つのＣＤＲ：ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ＣＤＲは、ＣＤＲの１以上における少なくとも１、２、３、４、５または６つの単一の保存的なアミノ酸置換を除いて、それぞれアミノ酸配列、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、及び配列番号８を含む。特定の態様では、ＣＤＲはそれぞれアミノ酸配列、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、及び配列番号８を含む。
【０１０１】
特定の態様では、抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）のＶＨは、配列番号１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含み、且つ抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）のＶＬは、配列番号５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。特定の態様では、ＶＨは配列番号１のアミノ酸配列を含み、且つＶＬは配列番号５のアミノ酸配列を含む。
【０１０２】
本明細書で提供されるのはまた、本明細書に記載されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体をコードするポリペプチド、たとえば、本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子、たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体を作製するのに使用するためのそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドを含むベクター、及びそのようなベクターまたはポリヌクレオチドを含む宿主細胞である。
【０１０３】
抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）の好適な生物学的活性がある変異体が本開示によって提供され、本明細書で提供される方法に従って、または当業者に周知の方法に従って作製し、使用することができる。そのような変異体は、本明細書で提供される参照抗ＳＥＭＡ４Ｄ抗体の特定の所望の結合特性を保持する。抗体の変異体を作製する方法は、一般に当該技術で利用できる。
【０１０４】
変異誘発及びヌクレオチド配列の変更のための方法は当該技術で周知である。たとえば、参照によって本明細書に組み入れられるＷａｌｋｅｒ及びＧａａｓｔｒａ，ｅｄｓ．（１９８３），Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：４８８−４９２（１９８５）；Ｋｕｎｋｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２（１９８７）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）；米国特許第４，８７３，１９２号；及びその中で引用されている参考文献を参照のこと。対象とするポリペプチドの生物活性に影響を与えない適当なアミノ酸置換に関するガイダンスは、全体として参照によって本明細書に組み入れられるＤａｙｈｏｆｆ，ｅｔ  ａｌ．（１９７８），ｉｎ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．），ｐｐ．３４５−３５２のモデルに見いだすことができる。Ｄａｙｈｏｆｆ，ｅｔ  ａｌ．のモデルは、受容点突然変異（ＰＡＭ）アミノ酸類似性マトリクス（ＰＡＭ２５０マトリクス）を使用して好適な保存的アミノ酸置換を決定する。特定の態様では、たとえば、１つのアミノ酸を類似の特性を有する別のアミノ酸と交換することのような保存的置換が使用される。Ｄａｙｈｏｆｆ，ｅｔ  ａｌ．のモデルのＰＡＭ２５０マトリクスによって教示されるような保存的アミノ酸置換の例には、Ｇｌｙ⇔Ａｌａ、Ｖａｌ⇔Ｉｌｅ⇔Ｌｅｕ、Ａｓｐ⇔Ｇｌｕ、Ｌｙｓ⇔Ａｒｇ、Ａｓｎ⇔Ｇｌｎ、及びＰｈｅ⇔Ｔｒｐ⇔Ｔｙｒが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０５】
抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、対象とするポリペプチド）の変異体の構築において、変異体が所望の特性（たとえば、細胞の表面上で発現したまたは細胞によって分泌されたＳＥＭＡ４Ｄ、たとえば、ヒトＳＥＭＡ４Ｄ、非ヒト霊長類ＳＥＭＡ４Ｄ（たとえば、カニクイザル、マーモセット、及び／またはアカゲザルのＳＥＭＡ４Ｄ）及び齧歯類ＳＥＭＡ４Ｄ（たとえば、マウス及び／またはラットのＳＥＭＡ４Ｄ）に特異的に結合することができる特性）を持ち続けるように修飾が行われ、ここで、結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）は、本明細書に記載されているようなＳＥＭＡ４Ｄ結合活性、受容体遮断活性、または中和活性を有する。特定の態様では、変異体ポリペプチドをコードするＤＮＡで行われた突然変異はリーディングフレームを維持し、二次ｍＲＮＡ構造を生じ得る相補性領域を作り出さない。ＥＰ特許出願公開第７５，４４４号を参照のこと。
【０１０６】
抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）の結合特異性及び／または結合活性を測定する方法には、競合結合アッセイを含む標準の結合アッセイ、Ｔ細胞またはＢ細胞による免疫グロブリンの分泌をモニターするアッセイ、Ｔ細胞の増殖アッセイ、アポトーシスのアッセイ、ＥＬＩＳＡアッセイ、等が挙げられるが、これらに限定されない。たとえば、そのすべてが参照によって本明細書に組み入れられるＷＯ９３／１４１２５；Ｓｈｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１３：６３３−６４２（２０００）；Ｋｕｍａｎｏｇｏｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：１１７５−１１８１（２００２）；Ｗａｔａｎａｂｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：４３２１−４３２８（２００１）；Ｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，９７：３４９８−３５０４（２００１）；及びＧｉｒａｕｄｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２：１２４６−１２５５（２００４）にて開示されているそのようなアッセイを参照のこと。
【０１０７】
本明細書で開示されている定常領域、ＣＤＲ、ＶＨ領域またはＶＬ領域を含む特定のポリペプチドが別のポリペプチドと少なくとも約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、またはさらに約１００％同一であるかどうかを本明細書で議論する場合、当該技術で既知の方法及びコンピュータープログラム／ソフトウェアを用いて％同一性を決定することができる。比較のための配列の最適な配置比較は、たとえば、局地的相同性アルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２−４８９（１９８１）によって、大域的配列比較アルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）によって、類似性方法の検索（Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４（１９８８）；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−４０２（１９９７）によって、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実施（たとえば、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．におけるＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ，及びＢＬＡＳＴ）によって、通常、初期設定を用いて、または手動のアルゴリズム及び目視検査（たとえば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），１９９４を参照のこと）によって実施することができる。
【０１０８】
本開示の目的で、パーセント配列同一性は、１２のギャップ開放ペナルティ及び２のギャップ伸長ペナルティ、６２のＢＬＯＳＵＭマトリクスによる検索を用いたＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎの相同性検索アルゴリズムを用いて決定することができる。変異体は、たとえば、わずか１〜１５のアミノ酸残基、わずか１〜１０のアミノ酸残基、たとえば、６〜１０、わずか５、わずか４、３、２、または１のアミノ酸残基で参照の抗ＳＥＭＡ４Ｄ抗体（たとえば、本明細書で提供されているＭＡｂ２５１７）とは異なることができる。
【０１０９】
特定の態様では、本開示は、ＳＥＭＡ４Ｄに特異的に結合する抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体を提供し、当該抗体またはその断片はＶＨ及びＶＬを含む。特定の態様では、ＶＨは、それぞれ配列番号２、配列番号３、及び配列番号４と同一の、または相補性決定領域（ＨＣＤＲ）の１、２、または３すべてにおける１、２、３、４、５、または６つのアミノ酸置換を除いてそれと同一のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＨＣＤＲ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む。特定の態様では、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、それぞれ配列番号２、配列番号３、及び配列番号４と同一のアミノ酸配列を含む。特定の態様では、ＶＬは、それぞれ配列番号６、配列番号７、及び配列番号８と同一の、または相補性決定領域（ＬＣＤＲ）の１、２、または３すべてにおける１、２、３、４、５、または６つのアミノ酸置換を除いてそれと同一のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＬＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。特定の態様では、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号６、配列番号７、及び配列番号８と同一のアミノ酸配列を含む。特定の態様では、ＶＨはさらに、フレームワーク領域（ＨＦＷ）ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３及びＨＦＷ４を含み、且つＶＬはさらに、フレームワーク領域（ＬＦＷ）ＬＦＷ１、ＬＦＷ２、ＬＦＷ３及びＬＦＷ４を含む。特定の態様では、フレームワーク領域はヒト抗体に由来する。特定の態様では、たとえば、抗体が非ヒトモデル系で使用されるべきである場合、フレームワーク領域は、非ヒト抗体、たとえば、マウス抗体に由来する。特定の態様では、ＶＨは配列番号１のアミノ酸配列を含む。特定の態様では、ＶＬは配列番号５のアミノ酸配列を含む。
【０１１０】
特定の態様では、本開示は、ＶＨ及びＶＬを含む、セマフォリン４Ｄ（ＳＥＭＡ４Ｄ）に特異的に結合する抗体、たとえば、完全ヒト抗体、または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体を提供する。特定の態様では、ＶＨは、配列番号１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む。特定の態様では、ＶＬは、配列番号５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む。特定の態様では、ＶＨは、配列番号１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含み、且つＶＬは、配列番号５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む。特定の態様では、ＶＨは配列番号１のアミノ酸配列を含み、且つＶＬは配列番号５のアミノ酸配列を含む。特定の態様では、ＶＨ及びＶＬは完全にヒトのものである。
【０１１１】
特定の態様では、本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ抗体、または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体は、ヒトＳＥＭＡ４Ｄ、齧歯類ＳＥＭＡ４Ｄ、たとえば、マウスＳＥＭＡ４Ｄ及び／またはラットＳＥＭＡ４Ｄ、及び／または非ヒト霊長類ＳＥＭＡ４Ｄ、たとえば、カニクイザルＳＥＭＡ４Ｄ及び／またはマーモセットＳＥＭＡ４Ｄに特異的に結合することができる。
【０１１２】
特定の態様では、抗体またはその断片、変異体、もしくは誘導体はさらに、ＶＨのＣ末端に融合されている重鎖定常領域またはその断片、変異体、もしくは誘導体を含む。重鎖定常領域またはその断片は、任意の種に由来することができるが、特定の態様では、重鎖定常領域またはその断片、変異体、もしくは誘導体は、ヒト重鎖定常領域、たとえば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、もしくはＩｇＭの定常領域であるか、またはそれに由来する。特定の態様では、重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ４の定常領域またはその断片、変異体、もしくは誘導体である。特定の態様では、たとえば、提供されている抗ＳＥＭＡ４Ｄ抗体またはその断片が非ヒトモデル系で使用されるべきである場合、重鎖定常領域またはその断片は、非ヒト重鎖定常領域、たとえば、マウスＩｇＧの定常領域のようなマウス重鎖定常領域であることができる。
【０１１３】
特定の態様では、抗体またはその断片、変異体、もしくは誘導体は、ＶＬのＣ末端に融合されている軽鎖定常領域またはその断片、変異体、もしくは誘導体をさらに含む。軽鎖定常領域またはその断片は、任意の種に由来することができるが、特定の態様では、軽鎖定常領域またはその断片は、ヒト軽鎖定常領域、たとえば、ヒトのカッパまたはラムダ定常領域に由来する。特定の態様では、軽鎖定常領域またはその断片、変異体、もしくは誘導体は、ヒトのラムダ軽鎖定常領域である、またはそれに由来する。特定の態様では、軽鎖定常領域はヒトのラムダ定常領域である。特定の態様では、たとえば、提供されている抗ＳＥＭＡ４Ｄ抗体またはその断片が非ヒトモデル系で使用されるべきである場合、軽鎖定常領域またはその断片は、非ヒト軽鎖定常領域、たとえば、マウスのラムダ定常領域のようなマウスの軽鎖定常領域であることができる。
【０１１４】
特定の態様では、本開示は、上記に記載されているようなＶＨ及びＶＬの領域を含む抗ＳＥＭＡ４Ｄ抗体断片を提供する。特定の態様では、断片は、たとえば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、またはジスルフィド結合されたＦｖ断片（ｓｄＦｖ）であることができる。
【０１１５】
特定の態様では、本開示によって提供される抗ＳＥＭＡ４Ｄ抗体またはその断片、変異体、もしくは誘導体は、多重特異性、たとえば、二重特異性であることができる。本明細書で提供されているようなＳＥＭＡ４Ｄ抗体の結合特性に加えて、本明細書で提供されているような多重特異性抗体またはその断片は、追加のＳＥＭＡ４Ｄエピトープに結合することができ、または他の無関係なエピトープに結合することができる。
【０１１６】
特定の態様では、本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ抗体またはその断片は、５００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、５０．０ｎＭ以下、４０．０ｎＭ以下、３０．０ｎＭ以下、２０．０ｎＭ以下、１０．０ｎＭ以下、９．０ｎＭ以下、８．０ｎＭ以下、７．０ｎＭ以下、６．０ｎＭ以下、５．０ｎＭ以下、４．０ｎＭ以下、３．０ｎＭ以下、２．０ｎＭ以下、１．０ｎＭ以下、０．５０ｎＭ以下、０．１０ｎＭ以下、０．０５０ｎＭ以下、０．０１ｎＭ以下、０．００５ｎＭ以下、または０．００１ｎＭ以下の解離定数ＫＤを特徴とする結合親和性でＳＥＭＡ４Ｄ、たとえば、ヒトＳＥＭＡ４Ｄ、マウスＳＥＭＡ４Ｄ、カニクイザルＳＥＭＡ４Ｄ、マーモセットＳＥＭＡ４Ｄ、またはそれらの組み合わせに特異的に結合することができる。抗体またはその断片のＳＥＭＡ４Ｄに対するＫＤを測定する方法及び装置、たとえば、ＢＩＡＣＯＲＥは当業者に周知である。
【０１１７】
特定の態様では、本開示によって提供されている抗ＳＥＭＡ４Ｄ抗体またはその断片は、ＳＥＭＡ４ＤがＳＥＭＡ４Ｄ受容体（たとえば、プレキシン−Ｂ１、プレキシン−Ｂ２、及び／またはＣＤ７２）に結合するのを阻害することができる。
【０１１８】
特定の態様では、本明細書で提供されている抗ＳＥＭＡ４Ｄ抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体は完全にヒトのものであり、ヒト対象への投与の際、最少限の抗抗体免疫応答を引き出す、またはそれを引き出さない。対象において抗抗体免疫応答を測定する方法は当該技術で周知である。たとえば、Ｄａｒｗｉｓｈ，ＩＡ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．２：２１７−２３５（２００６）を参照のこと。
【０１１９】
多くの方法で抗ＳＥＭＡ４Ｄ抗体の定常領域を変異させてエフェクター機能を変えることができる。たとえば、Ｆｃ受容体への抗体結合を最適化するＦｃの突然変異を開示している米国特許第６，７３７，０５６Ｂ１号及び米国特許出願公開第２００４／０１３２１０１Ａ１号を参照のこと。
【０１２０】
本明細書で提供されている特定の抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体またはその断片、変異体、もしくは誘導体）では、当該技術で既知の技法を用いてＦｃ部分を変異させてエフェクター機能を調節する、たとえば、高めるまたは低めることができる。たとえば、定常領域ドメインの欠失または不活化（点突然変異または他の手段を介した）は、循環している修飾された抗体のＦｃ受容体結合を減らすことができ、それによって腫瘍の局在化を増やす。他の場合では、本開示に一致する定常領域の修飾は、補体結合を調節するので、血清半減期を増やすまたは減らすことができる。定常領域のさらに他の修飾を用いて高い抗原特異性及び抗体柔軟性のせいで増強された局在化を可能にするジスルフィド結合またはオリゴ糖の部分を修飾することができる。得られる生理的なプロファイル、生体利用効率及び修飾の他の生化学的効果、たとえば、腫瘍の局在化、生体分布、及び血清半減期は、過度の実験を行うことなく周知の免疫学的技法を用いて容易に測定し、定量することができる。
【０１２１】
本明細書で提供されている抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体またはその断片）には、たとえば、共有結合がその同族エピトープに抗体が特異的に結合するのを妨げないように任意の種類の分子を抗体に共有結合することによって修飾される誘導体が含まれる。たとえば、しかし、限定のつもりではなく、抗体誘導体には、たとえば、既知の保護基／ブロッキング基、タンパク分解性切断、細胞性リガンドまたは他のタンパク質への結合、等によるグリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、誘導体化によって修飾されている抗体が含まれる。特異的な化学切断、アセチル化、ホルミル化、等を含むが、これらに限定されない既知の技法によって多くの化学修飾のいずれかを行うことができる。さらに、誘導体は、１以上の非古典的なアミノ酸を含有することができる。
【０１２２】
「保存的なアミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の電荷を持つ側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられるものである。類似の電荷を持つ側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該技術で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（たとえば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（たとえば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（たとえば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（たとえば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（たとえば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（たとえば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジ）を持つアミノ酸が挙げられる。あるいは、突然変異は、たとえば、飽和変異誘発によって、コーディング配列の全部または一部に沿って無作為に導入することができ、得られた変異体を生物活性について選抜して活性（たとえば、抗ＳＥＭＡ４Ｄポリペプチドに結合する能力、ＳＥＭＡ４Ｄのその受容体との相互作用を阻止する能力、または対象（たとえば、がん患者）における転移を抑制する、遅らせる、もしくは減らす能力）を保持する変異体を同定することができる。
【０１２３】
たとえば、抗体分子のフレームワーク領域にのみ、またはＣＤＲ領域にのみ突然変異を導入することは可能である。導入された突然変異は、サイレント突然変異または中立ミスセンス突然変異であることができ、すなわち、抗体の抗原に結合する能力に影響を有さない、またはほとんど有さない。これらの型の突然変異は、コドン使用頻度を最適化するまたはハイブリドーマの抗体産生を改善するのに有用であることができる。あるいは、非中立のミスセンス突然変異は、抗体の抗原に結合する能力を変えることができる。当業者は、たとえば、抗原結合で変化なしまたは結合活性で変化（たとえば、抗原結合活性における改善または抗体特異性における変化）のような所望の特性を持つ変異体分子を設計し、調べることができる。変異誘発に続いて、コードされたタンパク質を日常的に発現させ、本明細書に記載されている技法を用いて、または当該技術で既知の技法を日常的に改変することによって、コードされたタンパク質の機能的活性及び／または生物活性（たとえば、ＳＥＭＡ４Ｄポリペプチドの少なくとも１つのエピトープを免疫特異的に結合する能力）を決定することができる。
【０１２４】
特定の態様では、本明細書で提供されている抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体またはその断片）は、なくとも１つの最適化された相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むことができる。「最適化されたＣＤＲ」によって、最適化されたＣＤＲを含む抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子に付与される結合親和性及び／または抗ＳＥＭＡ４Ｄ活性を改善するようにＣＤＲが修飾され、最適化されることが意図される。「抗ＳＥＭＡ４Ｄ活性」または「ＳＥＭＡ４Ｄ遮断活性」には、１以上のＳＥＭＡ４Ｄ活性を調節する、たとえば、低下させる、除去する、減らす、または阻止する活性を挙げることができる。非限定のＳＥＭＡ４Ｄ活性には、Ｂ細胞の活性化、凝集及び生存；ＣＤ４０が誘導する増殖及び抗体産生；Ｔ細胞依存性抗原に対する抗体反応；Ｔ細胞または他の免疫細胞の増殖；樹状細胞の成熟；脱髄及び軸索変性；多能性神経前駆細胞及び／または乏突起膠細胞のアポトーシス；内皮細胞移動の誘導；自然発生の単球の移動の阻害；腫瘍細胞の増殖または転移の促進；細胞表面のプレキシン−Ｂ１または他の受容体への結合；または可溶性ＳＥＭＡ４ＤもしくはＳＥＭＡ４Ｄ＋細胞の表面で発現するＳＥＭＡ４Ｄに関連する他の活性が挙げられる。特定の実施形態では、抗ＳＥＭＡ４Ｄ活性には、原発腫瘍細胞の増殖及び腫瘍転移の抑制、遅延、もしくは低減と組み合わせて、または原発腫瘍細胞の増殖及び腫瘍転移とは無関係に腫瘍転移を抑制する、遅延させる、または低減する能力が挙げられる。抗ＳＥＭＡ４Ｄ活性は、固形腫瘍及びリンパ腫を含む特定の種類のがん、自己免疫疾患、中枢神経系（ＣＮＳ）及び末梢神経系（ＰＮＳ）の炎症性疾患を含む炎症性疾患、神経変性疾患、移植拒絶、及び侵襲性血管新生を含むが、これらに限定されない、ＳＥＭＡ４Ｄの発現に関連する疾患の発生率または重症度の低下にも帰することができる。
【０１２５】
抗ＳＥＭＡ４Ｄ抗体をコードするポリヌクレオチド
本開示はまた、本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）をコードする１つまたは複数の核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド、または２以上のポリヌクレオチドを提供する。
【０１２６】
一態様では、本開示は、本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体またはその断片、変異体、もしくは誘導体）またはそのサブユニット（たとえば、重鎖サブユニットもしくはその断片、または軽鎖サブユニットもしくはその断片）をコードする１つまたは複数の核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組み合わせを提供する。
【０１２７】
特定の態様では、本明細書で提供されているようなポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組み合わせは、抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体またはその断片、変異体、もしくは誘導体）のＶＨをコードする核酸配列を含む。特定の態様では、本明細書で提供されているようなポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組み合わせは、抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体またはその断片、変異体、もしくは誘導体）のＶＬをコードする核酸配列を含む。特定の態様では、本明細書で提供されているようなポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組み合わせは、抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体またはその断片、変異体、もしくは誘導体）のＶＨをコードする核酸配列とＶＬをコードする核酸配列とを含む。特定の態様では、ＶＨをコードする核酸配列とＶＬをコードする核酸配列とは同一のベクターに置かれる。そのようなベクターが本開示によって提供される。特定の態様では、ＶＨをコードする核酸配列とＶＬをコードする核酸配列とは別々のベクターに置かれる。そのようなベクターも本開示によって提供される。本開示によって提供されるベクターはさらに、抗体またはその断片の発現を可能にする遺伝因子を含むことができる。たとえば、プロモーター、ポリアデニル化配列、及びエンハンサーなどそのような遺伝因子は、本明細書のどこかほかに記載されている。本開示はさらに、本明細書で提供されているポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組み合わせ、及び／または本明細書で提供されているベクター（単数）及び／またはベクター（複数）を含む宿主細胞を提供する。
【０１２８】
提供されるのはまた、本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ抗体またはその断片、変異体、もしくは誘導体を生産する方法であり、その際、方法は、本明細書で提供されているような宿主細胞を培養することと、抗体またはその断片を回収することとを含む。
【０１２９】
特定の態様では、本開示は、抗ＳＥＭＡ４Ｄ抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体、またはそのサブユニットをコードする１つまたは複数の核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド、または２以上のポリヌクレオチドを提供し、その際、抗体はＶＨ及びＶＬを含み、ＶＨは、それぞれ配列番号２、配列番号３、及び配列番号４と同一の、または相補性決定領域（ＨＣＤＲ）の１、２、または３すべてにおける１つ、２つ、３つ、または４つのアミノ酸置換を除いて同一のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＨＣＤＲ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、ＶＬは、それぞれ配列番号６、配列番号７、及び配列番号８と同一の、または相補性決定領域（ＬＣＤＲ）の１、２、または３すべてにおける１つ、２つ、３つ、または４つのアミノ酸置換を除いて同一のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＬＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
【０１３０】
特定の態様では、本開示は、抗ＳＥＭＡ４Ｄ抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体、またはそのサブユニットをコードする１つまたは複数の核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド、または２以上のポリヌクレオチドを提供し、その際、抗体はＶＨ及びＶＬを含み、ＶＨは、配列番号１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む。
【０１３１】
上記に記載されているポリヌクレオチドのいずれかはさらに、たとえば、本明細書のどこか他に記載されているような重鎖または軽鎖の定常領域またはその断片、コードされたポリヌクレオチドの分泌を指図するシグナルペプチド、または本明細書に記載されているような他の異種ポリペプチドをコードする追加の核酸配列を含むことができる。また、本明細書のどこか他で詳細に記載されているように、本開示は、上記に記載されているポリヌクレオチドの１以上を含む組成物を含む。
【０１３２】
一実施形態では、本開示は、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとを含む組成物を含み、第１のポリヌクレオチドは、本明細書に記載されているようなＶＨをコードする核酸配列を含み、第２のポリヌクレオチドは、本明細書に記載されているようなＶＬをコードする。
【０１３３】
本開示はまた、どこか他に記載されているような本明細書で提供されているポリヌクレオチドの断片も含む。さらに、提供されるのは、本明細書に記載されているような融合ポリペプチド、Ｆａｂ断片、及び他の誘導体をコードするポリヌクレオチドである。
【０１３４】
本開示によって提供されるポリヌクレオチドは、当該技術で既知の方法によって作製するまたは製造することができる。たとえば、抗体の核酸配列が既知であれば、化学合成されたオリゴヌクレオチドから抗体をコードするポリヌクレオチドを構築することができ（たとえば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１７：２４２（１９９４）に記載されているように）、それには手短には、抗体をコードする配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドを重ね合わせることと、これらオリゴヌクレオチドのアニーリングとライゲーションと、その後のライゲーションしたオリゴヌクレオチドのＰＣＲによる増幅という合成が関与する。
【０１３５】
あるいは、本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）をコードするポリヌクレオチドは、好適な供給源に由来する核酸配列から生成することができる。特定の抗体をコードするポリヌクレオチドを含有するクローンは利用できないが、抗体分子の配列が既知であるならば、抗体をコードする核酸は化学的に合成することができ、または配列の３’及び５’末端とハイブリット形成できる合成プライマーを用いたＰＣＲ増幅によって、もしくは抗体もしくは他の抗ＳＥＭＡ４Ｄ抗体をコードするｃＤＮＡライブラリに由来する、たとえば、ｃＤＮＡクローンを同定するための特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いたクローニングによって好適な供給源（たとえば、抗体のｃＤＮＡライブラリ、または抗体もしくは他の抗ＳＥＭＡ４Ｄ抗体を発現する組織または細胞、たとえば、抗体を発現するように選択されたハイブリドーマ細胞から生成されるｃＤＮＡライブラリ、またはそれから単離される核酸、たとえば、ポリＡ＋ＲＮＡ）から得ることができる。ＰＣＲによって生成される増幅された核酸はその後、当該技術で周知の方法を用いて複製できるクローニングベクターにクローニングすることができる。
【０１３６】
抗ＳＥＭＡ４Ｄ抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体のヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配列がいったん決定されると、ヌクレオチド配列の操作についての当該技術で周知の方法、たとえば、組換えＤＮＡ法、部位特異的変異誘発、ＰＣＲ、等（たとえば、双方とも全体として参照によって本明細書に組み入れられるＳａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄ．；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）及びＡｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９８），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ）に記載されている技法を参照のこと）を用いてそのヌクレオチド配列を操作して、たとえば、アミノ酸の置換、欠失及び／または挿入を作り出す様々なアミノ酸配列を有する抗体を生成することができる。
【０１３７】
抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）をコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組み合わせは、未修飾のＲＮＡまたはＤＮＡまたは修飾されたＲＮＡまたはＤＮＡであることができるポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドで構成することができる。たとえば、抗ＳＥＭＡ４Ｄ抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組み合わせは、一本鎖及び二本鎖のＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖のＲＮＡ、一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖、さらに通常、二本鎖または一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であることができるＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリット分子で構成することができる。加えて、抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）をコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組み合わせは、ＲＮＡまたはＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡの双方を含む三本鎖領域で構成することができる。抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）をコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組み合わせは、１以上の修飾された塩基または安定性もしくは他の理由で修飾されたＤＮＡもしくはＲＮＡの主鎖も含有することができる。「修飾された」塩基には、たとえば、トリチル化された塩基及びイノシンのような稀な塩基が挙げられる。種々の修飾をＤＮＡ及びＲＮＡに対して行うことができるので、「ポリヌクレオチド」は、化学的、酵素的、または代謝的に修飾された形態を包含する。
【０１３８】
免疫グロブリン（たとえば、免疫グロブリン重鎖の一部または軽鎖の一部）に由来するポリペプチドの非天然変異体をコードする単離されたポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組み合わせは、１以上のアミノ酸の置換、付加または欠失がコードされるタンパク質に導入されるように１以上のヌクレオチドの置換、付加または欠失を免疫グロブリンのヌクレオチド配列に導入することによって作り出すことができる。突然変異は、標準の技法、たとえば、部位特異的変異誘発及びＰＣＲが介在する変異誘発によって導入することができる。特定の態様では、１以上の非必須アミノ酸残基にて保存的なアミノ酸置換を行うことができる。
【０１３９】
融合タンパク質及び抗体コンジュゲート
本明細書のどこか他で詳細に議論されているように、本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）はさらに、Ｎ末端もしくはＣ末端で異種ポリペプチドに組換えで融合することができ、またはポリペプチドもしくは他の異種部分に化学的にコンジュゲートすることができる（共有結合及び非共有結合のコンジュゲートを含む）。たとえば、抗ＳＥＭＡ４Ｄ抗体は、検出アッセイにて標識として有用な分子及び異種ポリペプチド、薬剤、放射性核種、または毒素のようなエフェクター分子に組換えで融合するまたはコンジュゲートすることができる。たとえば、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０８４９５；ＷＯ９１／１４４３８；ＷＯ８９／１２６２４；米国特許第５，３１４，９９５号；及びＥＰ３９６，３８７を参照のこと。特定の態様では、異種部分は、ポリペプチド、細胞傷害剤、治療剤、プロドラッグ、脂質、糖質、核酸、検出可能な標識、ポリマーまたはそれらの組み合わせであることができる。例となる異種ポリペプチドには限定しないで、結合分子、酵素、サイトカイン、リンホカイン、ホルモンペプチド、またはそれらの組み合わせが挙げられる。例となる細胞傷害剤には限定しないで、放射性核種、生物毒素、酵素活性がある毒素、またはそれらの組み合わせが挙げられる。例となる検出可能な標識には限定しないで、酵素、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、放射性標識またはそれらの組み合わせが挙げられる。
【０１４０】
本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）は、結合分子がＳＥＭＡ４Ｄに結合するのを共有結合が妨げないように、たとえば、任意の種類の部分を抗体に共有結合することによって修飾される誘導体を含むことができる。たとえば、ただし、限定目的ではなく、抗体の誘導体は、たとえば、既知の保護基／ブロッキング基、タンパク分解性切断、細胞性リガンドまたは他のタンパク質への結合、等によるグリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、誘導体化によって修飾することができる。特定の化学切断、アセチル化、ホルミル化、等を含むが、これらに限定されない既知の技法によって多くの化学修飾のいずれかを実施することができる。さらに、誘導体は、１以上の非古典的なアミノ酸を含有することができる。
【０１４１】
本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）は、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合、たとえば、ペプチド同配体によって互いに連結されたアミノ酸で構成することができ、２０の遺伝子がコードするアミノ酸以外のアミノ酸を含有することができる。たとえば、本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）は、天然のプロセス、たとえば、翻訳後プロセッシングによって、または当該技術で周知である化学修飾法によって修飾することができる。そのような修飾は、基礎教科書、さらに詳細なモノグラフ、及び多くの研究文献で十分に説明されている。修飾は、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖及びアミノ末端またはカルボキシル末端を含む抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子におけるどこでも、または糖質のような部分で発生することができる。また、所与の抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子は、多くの種類の修飾を含有することができる。抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子は、たとえば、ユビキチン化の結果分岐することができ、それらは、分岐の有無にかかわらず、環状であることができる。環状分岐鎖の及び分岐鎖環状の抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子は、翻訳後天然のプロセスから生じることができ、合成法によって作製することができる。修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタミンの形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカーの形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパク分解性プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレン化（ｓｅｌｅｎｏｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化、たとえば、アルギニル化及びユビキチン化のような転移ＲＮＡが介在するタンパク質へのアミノ酸の付加が挙げられる（たとえば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ＮＹ；２ｎｄ  ｅｄ．（１９９３）；Ｊｏｈｎｓｏｎ，ｅｄ．（１９８３）Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ），ｐｇｓ．１−１２；Ｓｅｉｆｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １８２：６２６−６４６  （１９９０）；Ｒａｔｔａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３：４８−６２（１９９２）を参照のこと）。
【０１４２】
本開示はまた、本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）と、異種ポリペプチドとを含む融合タンパク質も提供する。抗体が融合される異種ポリペプチドは、機能のために有用であることができ、ＳＥＭＡ４Ｄポリペプチドを発現している細胞を標的とするのに有用である。ポリペプチドのインビボでの半減期を増やすために、または当該技術で既知の方法を用いた免疫アッセイで使用するために、本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）を１以上の異種ポリペプチドまたは他の部分に融合するまたはコンジュゲートすることができる。たとえば、一実施形態では、ＰＥＧまたはヒト血清アルブミンを本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子に融合して、またはコンジュゲートしてそのインビボでの半減期を増やすことができる。Ｌｅｏｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，１６：１０６（２００１）；Ａｄｖ．ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５４：５３１（２００２）；またはＷｅｉｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ，３０：５１２（２００２）を参照のこと。
【０１４３】
さらに、本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）を、たとえば、ペプチドのような１以上のマーカー配列に融合してその精製または検出を円滑にすることができる。特定の実施形態では、マーカーのアミノ酸配列は、とりわけ、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ）で提供されたタグのようなヘキサヒスチジンペプチドであり、その多くは市販されている。Ｇｅｎｔｚ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：８２１−８２４（１９８９）に記載されているように、たとえば、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の都合の良い精製を提供する。精製に有用な他のペプチドタグには、インフルエンザ血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに相当する「ＨＡ」タグ（Ｗｉｌｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，３７：７６７（１９８４））及び「ｆｌａｇ」タグが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４４】
融合タンパク質は、当該技術で周知である方法を用いて調製することができる（たとえば、米国特許第５，１１６，９６４号及び同第５，２２５，５３８号を参照のこと）。融合が行われる正確な部位は、融合タンパク質の分泌または結合の特性を最適化するように経験的に選択することができる。次いで融合タンパク質をコードするＤＮＡで発現用の宿主細胞に形質移入する。
【０１４５】
本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）は、非コンジュゲート形態で使用することができ、または、たとえば、分子の治療特性を改善し、標的の検出を円滑にするために、または患者の画像化もしくは治療のために種々の分子の少なくとも１つにコンジュゲートすることができる。本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）は、精製の前にまたは後で、または精製を行うときに標識することができ、またはコンジュゲートすることができる。
【０１４６】
特に、本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）は、治療剤、プロドラッグ、細胞傷害剤、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生物反応調節因子、医薬剤またはＰＥＧにコンジュゲートすることができる。
【０１４７】
当業者は、コンジュゲートを、コンジュゲートされる選択された作用物質に応じて種々の技法を用いて構築することもできることを十分に理解するであろう。たとえば、ビオチンとのコンジュゲートは、たとえば、ビオチンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルのようなビオチンの活性化エステルと結合するポリペプチドを反応させることによって調製される。同様に、蛍光マーカーとのコンジュゲートは、カップリング剤、たとえば、本明細書でリストにされたものの存在下にて、またはイソチオシアネート、たとえば、フルオレセインイソチオシアネートとの反応によって調製することができる。本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）のコンジュゲートは、類似の方法で調製することができる。
【０１４８】
本開示はさらに、診断剤または治療剤とコンジュゲートした本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）を包含する。そのような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子を診断に用いて、たとえば、臨床検査手順の一部として疾患の発症または進行をモニターし、たとえば、所与の治療投薬計画及び／または予防投薬計画の有効性を判定することができる。たとえば、検出は、抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子を検出可能な物質とカップリングさせることによって円滑にすることができる。検出可能な物質の例には、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、種々のポジトロン放出断層撮影を生かすポジトロン放出金属、及び非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。たとえば、本開示に従って診断として使用するために抗体にコンジュゲートすることができる金属イオンについては、米国特許第４，７４１,９００号を参照のこと。好適な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；好適な補欠分子族複合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンが挙げられ；好適な蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリスリンが挙げられ；発光物質の例には、ルミノールが挙げられ；生物発光物質の例にはルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリンが挙げられ；好適な放射性物質の例には１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、９０Ｙ、または９９Ｔｃが挙げられる。
【０１４９】
本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）は、たとえば、細胞毒素、治療剤または放射性金属イオンのような治療用部分にコンジュゲートすることができる。細胞毒素または細胞傷害剤には細胞に有害である作用物質が挙げられる。
【０１５０】
本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）はまた、化学発光化合物にそれをカップリングすることによって検出可能に標識することもできる。その後、化学発光でタグ付けされた抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子の存在は、化学反応の経過の間に生じる発光の存在を検出することによって判定される。特に有用な化学発光標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、芳香族（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、及びシュウ酸エステルである。
【０１５１】
本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）を検出可能に標識することができる方法の１つは、それを酵素に結合し、結合した生成物を酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）にて使用することによる（Ｖｏｌｌｅｒ，Ａ．，“Ｔｈｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）”，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．；Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｈｏｒｉｚｏｎｓ，２：１−７（１９７８）；Ｖｏｌｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．３１：５０７−５２０（１９７８）；Ｂｕｔｌｅｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：４８２−５２３（１９８１）；Ｍａｇｇｉｏ，ｅｄ．（１９８０），Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．；Ｉｓｈｉｋａｗａ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（１９８１），Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（Ｋｇａｋｕ  Ｓｈｏｉｎ，Ｔｏｋｙｏ）。抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子に結合される酵素は、たとえば、分光光度、蛍光測定または目視の手段によって検出できる化学部分を生じるような方法で適当な基質、たとえば、発色性基質と反応するであろう。抗体を検出可能に標識するのに使用することができる酵素には、リンゴ酸脱水素酵素、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコール脱水素酵素、アルファ−グリセロリン酸脱水素酵素、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、グルコアミラーゼ及びアセチルコリンエステラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、検出は、酵素のために発色性基質を採用する比色法によって達成することができる。検出はまた、同様に調製した標準との比較で基質の酵素反応の程度を目視で比較することによって達成することもできる。
【０１５２】
検出はまた、種々の他の免疫アッセイを用いて達成することもできる。たとえば、抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子を放射性に標識することによって、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）の使用を介して結合分子を検出することが可能である。放射性同位元素は、ガンマカウンター、シンチレーションカウンター、またはオートラジオグラフィを含むが、これらに限定されない手段によって検出することができる。
【０１５３】
本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）は、ランタニドシリーズの１５２Ｅｕまたはその他のような蛍光放出金属を用いて検出可能に標識することもできる。これらの金属は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような金属キレート剤を用いて結合分子に結合することができる。
【０１５４】
本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子に種々の部分をコンジュゲートする技法は当業者によって周知である。
【０１５５】
抗体ポリペプチドの発現
本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）の軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡ配列は、周知の方法に従って逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼを用いて同時にまたは別々に作製することができる。公開された重鎖及び軽鎖のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列に基づいたコンセンサス定常領域プライマーによって、またはさらに特異的なプライマーによってＰＣＲを開始することができる。上記で議論したように、ＰＣＲを用いて抗体の軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡクローンを単離することもできる。この場合、コンセンサスプライマーまたはたとえば、マウス定常領域プローブのようなさらに大きな相同性プローブによってライブラリを選抜することができる。
【０１５６】
ＤＮＡ、通常プラスミドＤＮＡは、当該技術で既知の技法を用いて細胞から単離し、たとえば、本明細書のどこか他で提供されている組換えＤＮＡ法に関する参考文献にて詳細に示された標準の周知の技法に従って、制限マッピングし、配列決定することができる。
【０１５７】
本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）を提供するための単離された遺伝物質の操作に続いて、結合分子をコードするポリヌクレオチドを、所望の量の抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子を産生させるのに使用することができる１以上の宿主細胞への導入のために発現ベクターに挿入することができる。
【０１５８】
抗ＳＥＭＡ４Ｄ抗体またはその断片、誘導体または類似体、たとえば、抗体の重鎖または軽鎖の組換え発現は、抗体をコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組み合わせを含有する１以上の発現ベクターの構築を必要とする。抗体分子または抗体の重鎖または軽鎖またはその一部（たとえば、重鎖または軽鎖の可変領域を含有する）をコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組み合わせがいったん得られると、抗体分子の産生のためのベクターは、当該技術で周知の技法を用いた組換えＤＮＡ技術によって作製することができる。従って、抗体をコードする核酸配列を含有するポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組み合わせを発現させることによってタンパク質を調製する方法が本明細書に記載されている。当業者に周知である方法を用いて、抗体のコーディング配列と適当な転写制御シグナルと翻訳制御シグナルとを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、たとえば、インビトロでの組換えＤＮＡ法、合成法、及びインビボでの遺伝子組換えが挙げられる。従って、本開示は、プロモーターに操作可能に連結された、本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子、たとえば、抗体、またはその重鎖または軽鎖または重鎖可変領域または軽鎖可変領域をコードする核酸配列を含む複製可能なベクターを提供する。そのようなベクターは、抗体の重鎖及び／または軽鎖の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含むことができ（たとえば、ＰＣＴ公開ＷＯ８６／０５８０７；ＰＣＴ公開ＷＯ８９／０１０３６；及び米国特許第５，１２２，４６４号を参照のこと）、抗体の可変領域は、重鎖または軽鎖全体の発現のためにそのようなベクターにクローニングすることができる。
【０１５９】
用語「ベクター」または「発現ベクター」は、宿主細胞にて所望の遺伝子を導入し、発現させるための媒体として本開示に従って使用されるベクターを意味するのに本明細書で使用される。当業者に知られているように、そのようなベクターは、たとえば、プラスミド、ファージ、及びウイルス、たとえば、レトロウイルスから容易に選択することができる。一般に、本開示に適合するベクターは、選択マーカー、所望の遺伝子のクローニングを円滑にするための適当な制限部位及び真核細胞または原核細胞に侵入する及び／またはそこで複製する能力を含むであろう。
【０１６０】
多くの発現ベクター系を採用することができる。たとえば、ベクターのクラスの１つは、たとえば、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウィルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶまたはＭＯＭＬＶ）またはＳＶ４０ウイルスのような動物ウイルスに由来するＤＮＡ要素を利用する。他には内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）を持つポリシストロン系の使用が含まれる。さらに、その染色体にＤＮＡを組み込んでいる細胞は、形質移入された宿主細胞の選択を可能にする１以上のマーカーを導入することによって選択することができる。マーカーは、栄養要求性の宿主に対する原栄養、殺生物剤耐性（たとえば、抗生剤）または銅のような重金属に対する耐性を提供することができる。選択可能なマーカー遺伝子は、発現するＤＮＡ配列に直接連結されることができ、または同時形質転換によって同一細胞に導入されることができる。ｍＲＮＡの最適な合成には追加の要素も必要とされ得る。これらの要素には、シグナル配列、スプライスシグナル、ならびに転写プロモーター、エンハンサー、及び終結シグナルを挙げることができる。
【０１６１】
特定の態様では、クローニングした可変領域の核酸分子を、上記で議論したように合成した重鎖及び軽鎖の定常領域の遺伝子と共に発現ベクターに挿入することができる。当然、真核細胞で発現を引き出すことができる発現ベクターを使用することができる。好適なベクターの例には、プラスミドｐｃＤＮＡ３、ｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦ１／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ−ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＶＡＸ１、及びｐＺｅｏＳＶ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．から入手できる）、及びプラスミドｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．から入手できる）が挙げられるが、これらに限定されない。一般に、好適に高いレベルの免疫グロブリン重鎖及び軽鎖を発現するものについて多くの形質転換された細胞を選抜することは、たとえば、ロボットシステムによって実施することができる日常の実験である。
【０１６２】
さらに一般的に、本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）の単量体サブユニットをコードするベクターまたはＤＮＡ配列がいったん調製されると、発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することができる。プラスミドの宿主細胞への導入は、当業者に周知の種々の技法によって達成することができる。これらには、形質移入（電気泳動及びエレクトロポレーションを含む）、原形質融合、リン酸カルシウム沈殿、エンベロープを持つＤＮＡによる細胞融合、微量注入、及びインタクトなウイルスによる感染が挙げられるが、これらに限定されない。Ｒｉｄｇｗａｙ（１９８８），“Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ”ｉｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓｅｄ．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ及びＤｅｎｈａｒｄｔ（Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．），Ｃｈａｐｔｅｒ  ２４．２，ｐｐ．４７０−４７２を参照のこと。通常、プラスミドの宿主への導入はエレクトロポレーションによる。発現構築物を内部に持つ宿主細胞は、軽鎖及び重鎖の産生に適する条件下で増殖させ、重鎖及び／または軽鎖のタンパク質合成及び構築についてアッセイすることができる。例となるアッセイ技法には、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）、または蛍光活性化細胞選別解析（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学法、等が挙げられる。
【０１６３】
従来の技法によって発現ベクターで宿主細胞に形質移入することができ、次いで、形質移入された細胞を従来の技法によって培養し、本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）を産生させることができる。従って、本開示は、プロモーター、たとえば、異種プロモーターに操作可能に連結された本明細書で提供されているような抗体またはその重鎖または軽鎖をコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組み合わせを含有する宿主細胞を含む。二本鎖抗体の発現についての特定の実施形態では、重鎖及び軽鎖の双方をコードするベクターは、以下で詳述するように、結合分子全体の発現及び構築のために宿主細胞にて同時発現させることができる。
【０１６４】
本明細書で使用されるとき、「宿主細胞」は、組換えＤＮＡ技法を用いて構築され、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドをコードするベクターを内部に持つ細胞を指す。組換え宿主からの抗体に単離についてのプロセスの記載では、用語「細胞」及び「細胞培養物」は相互交換可能に使用されて、明瞭に特定されない限り、抗体の供給源を示す。言い換えれば、「細胞」からのポリペプチドの回収は、全細胞の遠心分離から、または培地と浮遊させた細胞の双方を含有する細胞培養物からのいずれかを意味することができる。
【０１６５】
種々の宿主・発現ベクター系を利用して、本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）を発現させることができる。そのような宿主・発現系は、対象とするコーディング配列が産生され、続いて精製され得る媒体を表すが、また適当なヌクレオチドコーディング配列で形質転換または形質移入されるとその場で本明細書で提供されているような抗体分子を発現することができる細胞も表す。これらには、抗体のコーディング配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡの発現ベクターで形質転換された細菌（たとえば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ.ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のような微生物；抗体のコーディング配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（たとえば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｐｉｃｈｉａ）；抗体のコーディング配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（たとえば、バキュロウイルス）で感染させた昆虫細胞系；抗体のコーディング配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（たとえば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）で感染させた、もしくは組換えプラスミド発現ベクター（たとえば、Ｔｉプラスミド）で形質転換した植物細胞系；または哺乳類細胞のゲノムに由来するプロモーター（たとえば、メタロチオネインプロモーター）もしくは哺乳類ウイルスに由来するプロモーター（たとえば、アデノウィルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、またはヒトサイトメガロウイルス前初期プロモーター）を含有する組換え発現構築物を内部に持つ哺乳類細胞系（ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＬＫ、２９３、３Ｔ３の細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の態様では、特に組換え抗体分子全体の発現のための、たとえば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのような細菌細胞または真核細胞を組換え抗体分子の発現に使用することができる。たとえば、ベクターと併せたチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）のような哺乳類細胞は、抗体にとって有効な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，４５：１０１（１９８６）；Ｃｏｃｋｅｔｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：２（１９９０））。
【０１６６】
タンパク質の発現に使用される宿主細胞株は、哺乳類起源のものであることができる。例となる宿主細胞株には、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）、ＤＧ４４及びＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣株、ＤＨＦＲマイナス）、ＨｅＬａ（ヒト子宮頸癌）、ＣＶＩ（サル腎臓株）、ＣＯＳ（ＳＶ４０Ｔ抗原を持つＣＶＩの誘導体）、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ（幼若ハムスター腎臓）、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）、ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓株）、ＳＰ２／Ｏ（マウス骨髄腫）、Ｐ３．ｔｉｍｅｓ．６３−Ａｇ３．６５３（マウス骨髄腫）、ＢＦＡ−ｌｃｌＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）及び２９３（ヒト腎臓）が挙げられるが、これらに限定されない。宿主細胞株は通常、商業サービスであるアメリカンティッシューカルチャーコレクションまたは公開された参考文献から入手できる。
【０１６７】
加えて、挿入された配列の発現を調節するまたは所望の特定の方法で遺伝子産物を修飾し、処理する宿主細胞株を選択することができる。タンパク質産物のそのような修飾（たとえば、グリコシル化）及び処理（たとえば、切断）は、タンパク質の機能に重要であることができる。様々な宿主細胞がタンパク質及び遺伝子産物の翻訳後の処理及び修飾について特徴的で且つ特異的なメカニズムを有する。適当な細胞株または宿主系を選択して発現する外来タンパク質の正しい修飾及び処理を確保することができる。この目的で、一次転写物の適正なプロセッシング、遺伝子産物のグリコシル化及びリン酸化のための細胞機構を持つ真核宿主細胞を使用することができる。
【０１６８】
組換えタンパク質の長期の高収率の産生のために安定した発現を使用することができる。たとえば、抗体分子を安定して発現する細胞株を操作することができる。ウイルスの複製開始点を含有する発現ベクターを使用するのではなく、適当な発現制御要素（たとえば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位、等）によって制御されたＤＮＡと選択可能なマーカーとで宿主細胞を形質転換することができる。外来ＤＮＡの導入に続いて、操作した細胞を強化培地で１〜２日間増殖させることができ、次いで選択培地に交換する。組換えプラスミドにおける選択可能なマーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞がプラスミドをその染色体に安定して組み込めるようにし、増殖させてその後クローニングされ、細胞株に増やされ得る増殖巣を形成できるようにする。この方法を有利に用いて抗体分子を安定して発現する細胞株を操作することができる。
【０１６９】
抗体分子の発現レベルは、ベクターの増幅によって高めることができる（概説については、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ及びＨｅｎｔｓｃｈｅｌ（１９８７），“Ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｇｅｎｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｌｏｎｅｄ  Ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ），Ｖｏｌ．３を参照のこと）。抗体を発現するベクター系におけるマーカーが増幅可能である場合、宿主細胞の培養物に存在する阻害剤のレベルの上昇は、マーカー遺伝子のコピー数を増やすであろう。増幅された領域は抗体遺伝子と関連するので、抗体の産生も増えるであろう（Ｃｒｏｕｓｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２５７（１９８３））。
【０１７０】
インビトロでの産生は、規模拡大で大量の所望のポリペプチドが得られるようにする。組織培養条件下での哺乳類細胞の培養のための技法は、当該技術で既知であり、それには、たとえば、エアリフト反応器もしくは連続スターラー反応器における均質浮遊培養、または、たとえば、中空繊維、マイクロカプセル、アガロースマイクロビーズもしくはセラミックカートリッジにおける不動化細胞培養もしくは捕捉細胞培養が挙げられる。必要であれば及び／または所望であれば、たとえば、合成ヒンジ領域ポリペプチドの生合成の後で、または本明細書に記載されているＨＩＣクロマトグラフィー工程に先立ってもしくはそれに続いて、ポリペプチドの溶液を普通のクロマトグラフィー法、たとえば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セルロースでのクロマトグラフィー、または（免疫）アフィニティークロマトグラフィーによって精製することができる。
【０１７１】
本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）をコードする核酸分子はまた、たとえば、昆虫、細菌または酵母または植物の細胞のような非哺乳類細胞で発現させることもできる。容易に核酸を取り込む細菌には、たとえば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉまたはＳａｌｍｏｎｅｌｌａの株のようなＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、及びＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｈｔｉｌｉｓのようなＢａｃｉｌｌａｃｅａｅ；Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、及びＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのメンバーが挙げられる。細菌で発現する場合、異種ポリペプチドは通常、封入体の一部になることがさらに十分に理解されるであろう。封入体を単離し、精製し、次いで機能的分子に構築することができる。抗体の四価形態が所望である場合、サブユニットは次いで四価の抗体に自己集合することができる（ＷＯ０２／０９６９４８Ａ２）。
【０１７２】
細菌系では、発現する抗体分子について意図される使用に応じて多くの発現ベクターを有利に選択することができる。たとえば、大量のそのようなタンパク質が生産されるべきである場合、抗体分子の医薬組成物の生成については、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を指図するベクターが望ましくてもよい。
【０１７３】
原核生物に加えて、真核微生物も使用することができる。多くの他の株、たとえば、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓが一般的に利用できるが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたは普通のパン屋の酵母が、真核微生物の間で最も一般的に使用されている。
【０１７４】
昆虫系では、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が通常、外来遺伝子を発現させるためのベクターとして使用される。そのウイルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞で増殖する。抗体のコーディング配列を個々にウイルスの非必須領域（たとえば、ポリヘドリン遺伝子）にクローニングし、ＡｃＮＰＶプロモーター（たとえば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に置くことができる。
【０１７５】
本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）がいったん組換え発現すると、免疫グロブリン分子の精製について当該技術で既知の方法によって、たとえば、クロマトグラフィー（たとえば、イオン交換クロマトグラフィー、特にプロテインＡに対する親和性による、及びサイズ選別カラムクロマトグラフィー）、遠心分離、差別的溶解度によって、またはタンパク質の精製についての他の標準的な技法によってそれを精製することができる。あるいは、本明細書で提供されているような抗体の親和性を高める方法は、米国特許出願公開第２００２０１２３０５７Ａ１号にて開示されている。
【０１７６】
治療用抗ＳＥＭＡ４Ｄ抗体を用いた治療方法
本開示は、ＳＥＭＡ４Ｄの病理に関連する疾患または障害を有する対象を治療するための本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）の使用の方法を提供する。
【０１７７】
以下の議論は、ＳＥＭＡ４Ｄ、たとえば、ヒト、マウスまたはヒトとマウスのＳＥＭＡ４Ｄを特異的に結合することができ、且つＳＥＭＡ４Ｄを中和する活性を有する本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）による種々の疾患及び障害の診断方法及び治療に言及する。
【０１７８】
一態様では、本開示は、本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）をヒト対象に投与することを含む、ヒト対象においてＳＥＭＡ４Ｄを中和する方法を提供する。特定の態様では、ヒト対象は、自己免疫疾患もしくは障害、炎症性疾患もしくは障害、がん、神経炎症性疾患もしくは障害、神経変性疾患もしくは障害、またはそれらの組み合わせの治療を必要としている。特定の態様では、神経炎症性疾患もしくは障害は多発性硬化症である。特定の態様では、神経変性疾患もしくは障害は、脳卒中、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ダウン症候群、運動失調、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、ＨＩＶ関連の認知障害、ＣＮＳループス、軽度認知障害、またはそれらの組み合わせである。特定の態様では、自己免疫疾患または炎症性疾患は、関節炎、たとえば、関節リウマチ、アテローム性硬化症（たとえば、全体として参照によって本明細書に組み入れられるＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／０５４６２８号を参照のこと）、または骨粗鬆症のような骨変性疾患（たとえば、全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第９，４４７，１９１号を参照のこと）である。
【０１７９】
一態様では、治療には、本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）の対象への適用もしくは投与、または対象に由来する単離された組織もしくは細胞株への適用もしくは投与が含まれ、その際、対象は、疾患、疾患の症状、または疾患に罹りやすい傾向を有する。別の態様では、治療には、本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）を含む医薬組成物の、疾患、疾患の症状または疾患に罹りやすい傾向を有する対象への、または患者に由来する組織もしくは細胞株への適用または投与も含まれる。
【０１８０】
一態様では、本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）は、がんの治療、たとえば、種々の悪性及び非悪性の腫瘍の治療に有用であることができる。「抗腫瘍活性」によって、悪性細胞の増殖もしくは蓄積の速度の低下、従って存在する腫瘍のもしくは治療の間に生じる腫瘍における増殖速度の低下、及び／または存在する新生物（腫瘍）細胞もしくは新しく形成される新生物細胞の破壊、従って治療の間での腫瘍の全サイズの低下が意図される。たとえば、本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）による治療法は、生理的応答を引き出すことができ、たとえば、血管新生の低下または腫瘍微小環境へのＣＴＬの移動を引き出すことができる。本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）によってがんを治療する方法は、たとえば、全体として参照によって本明細書に組み入れられるＰＣＴ公開第ＷＯ２０１４／２０９８０２号［組み合わせ免疫療法］にて見いだすことができる。
【０１８１】
一態様では、本開示は、薬物として使用するための、特に、がんの治療もしくは予防で使用するための、または前がんの状態または病変で使用するための本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）を提供する。
【０１８２】
別の態様では、本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）は、自己免疫疾患または炎症性疾患の治療で有用であることができる。別の態様では、本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）は、神経炎症性疾患または神経変性疾患の治療で有用であることができる。神経炎症性疾患または神経変性疾患を治療する方法は、たとえば、その内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられるＰＣＴ公開第ＷＯ２０１３／０５５９２２号［ＢＢＢ］、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／０６１３３０号［ＨＤ］、及びＰＣＴ公開第ＷＯ２０１３／１７０２２１号［神経発生／脳卒中］にて見いだすことができる。
【０１８３】
本明細書で提供されている方法によれば、本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）を用いて悪性ヒト細胞に関する肯定的な治療反応を促進することができる。がんの治療に関して「肯定的な治療反応」によって、これらの結合分子（たとえば、抗体またはその断片）の抗腫瘍活性に関連する疾患での改善、及び／または疾患に関連する症状での改善が意図される。すなわち、抗増殖効果、さらなる腫瘍増生の阻止、腫瘍サイズの低下、腫瘍血管形成の減少、がん細胞の数の減少、及び／または疾患に関連する１以上の症状の減少を観察することができる。従って、たとえば、疾患における改善は、完全奏効として特徴づけることができる。「完全奏効」によって、以前の異常な放射線検査、骨髄及び脳脊髄液（ＣＳＦ）の正常化と共に臨床的に検出できる病気の非存在が意図される。あるいは、疾患における改善は、部分奏効であると分類することができる。「部分奏効」によって、新しい病変の非存在下で、且つ少なくとも１ヵ月間持続する測定可能な全腫瘍量（すなわち、対象に存在する腫瘍細胞の数）での少なくとも約５０％の低下が意図される。そのような奏効は、測定可能な腫瘍にのみ適用できる。
【０１８４】
本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）はまた、炎症性疾患及び免疫系の欠損または障害の治療でも使用することができる。炎症性疾患は、炎症及び組織破壊またはそれらの組み合わせを特徴とする。「抗炎症活性」によって、炎症の軽減または予防が意図される。「炎症性疾患」には、免疫応答の開始事象または標的に、たとえば、同種抗原、異種抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、未知の抗原またはアレルゲンを含む非自己抗原が含まれる場合の炎症性の免疫介在プロセスが含まれる。一実施形態では、炎症性疾患は、末梢神経系または中枢神経系の炎症性障害である。別の実施形態では、炎症性疾患は、関節の炎症性障害である。
【０１８５】
さらに、用語「炎症性疾患」には「自己免疫疾患」が含まれる。本明細書で使用されるとき、用語「自己免疫」は一般に、「自己」抗原が関与する炎症性の免疫介在プロセスを包含すると理解される。自己免疫疾患では、自己抗原が宿主の免疫応答を誘発する。自己免疫疾患は、自己寛容の正常状態からの逸脱である、自己抗原（自家抗原）に対して向けられた不適当な免疫応答から生じ得る。一般に、細胞傷害分子としてまたは免疫複合体として作用する抗体（特に、しかし、専らではなく、ＩｇＧ抗体）は、その多くが消耗性であり、命を脅かすことができる種々の自己免疫疾患の主要なメディエーターである。
【０１８６】
一実施形態では、本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）を用いて多発性硬化症（ＭＳ）を治療することができる。散在性硬化症または散在性脳脊髄炎としても知られるＭＳは、免疫系が中枢神経系を攻撃し、脱髄をもたらす自己免疫状態である。多発性硬化症の名称は、神経系で生じる瘢痕（硬化、プラークまたは病変とも呼ばれる）を指す。ＭＳの病変には一般に、小脳の脳室、脳幹、脳幹神経節及び脊髄、及び視神経に近接する白質領域が含まれる。ＭＳは、髄鞘を作り出し、維持することに関与する細胞である乏突起膠細胞の破壊を生じる。ＭＳは、ミエリンの薄化または完全な喪失を生じ、疾患の進行につれて軸索の横断面の薄化または完全な喪失を生じる。
【０１８７】
神経学的な症状はＭＳによって異なる場合があり、当該疾患は身体障害及び認知障害に進むことが多い。ＭＳは幾つかの形態を取り、新しい症状は、個別の罹患（再発形態）または時間をかけてゆっくりと蓄積すること（進行性形態）で発生する。罹患の間で、症状は完全になくなり得るが、特に疾患の進行につれて永続的な神経損傷が生じることが多い。
【０１８８】
本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）を用いたＳＥＭＡ４Ｄの中和を用いて幾つかの異なるメカニズムを介してＭＳの重症度を軽減することができ、たとえば、抗ＳＥＭＡ４Ｄモノクローナル抗体は、ＣＮＳ抗原に対する二次的な免疫応答を軽減することによってＳＥＭＡ４Ｄによる免疫系の成熟及び活性化を阻止し、再発の比率を減らすことができ、且つ抗ＳＥＭＡ４Ｄモノクローナル抗体は、ＣＮＳにおける乏突起膠細胞のアポトーシスへの介在における可溶性ＳＥＭＡ４Ｄの効果を遮断することができ、脱髄を減らすことによって疾患の重症度を軽減することができる。
【０１８９】
一態様では、本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）を用いて関節炎を治療することができる。関節炎は関節の炎症性疾患であり、それは免疫系が関節を攻撃する自己免疫状態によって引き起こされ得る。特定の実施形態では、関節炎は、変形性関節症、痛風性関節炎、強直性脊椎炎、乾癬関節炎、反応性関節炎、関節リウマチ、小児発症関節リウマチ、感染性関節炎、炎症性関節炎、敗血症性関節炎、変性関節炎、破壊性関節炎、及びライム関節炎から成る群から選択される。一実施形態では、関節炎は関節リウマチ（ＲＡ）である。
【０１９０】
本開示は、本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子を対象に投与することによって関節炎を治療するまたは予防する方法を含む。本明細書で提供されているような方法は、関節炎、たとえば、関節リウマチに関連する疼痛、腫脹またはこわばりを軽減することができる。本開示はまた、関節の性能、機能及び健康を改善する方法も指向する。本開示の一部の実施形態では、治療は、関節炎重症度スコアの低下、関節炎の重症度／曲線下面積の低下、関節炎に関連する組織病理パラメーター（炎症、パンヌス、軟骨損傷及び骨損傷）の低下、血清アラキドン酸レベルの低下、または抗コラーゲン抗体の低下を生じる。特定の実施形態では、有益なまたは所望の臨床成績には、関節炎に関連する症状の緩和；関節炎の予防；関節炎の発症における遅延；集団における関節炎の低い発生率；関節炎に関連する状態の程度の低下；関節炎に関連する状態、障害または疾患の状況の安定化（たとえば、悪化しない）；関節炎に関連する状態、障害または疾患の発症の遅延またはその進行の減速；検出できようと検出できまいと、関節炎に関連する状態、障害または疾患の状況の改善、関節炎に関連する状態、障害または疾患の寛解（部分的であれ、または全体的であれ）；あるいは関節炎に関連する状態、障害または疾患の向上または改善が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９１】
本明細書で提供されている方法を用いて関節炎を有する個体または関節炎を発症するリスクがある個体を治療することができる。従って、一部の実施形態では、本開示は、正常な関節、境界領域の関節炎関節またはまさに関節炎の関節を有する対象を治療する方法を提供し、該方法は、本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子を本明細書に記載されているような対象に投与することを含む。一部の実施形態では、本明細書で提供されている方法を用いて対象の余生の間、慢性関節炎を治療することができる。
【０１９２】
本明細書で提供されているような方法によれば、本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）を用いて自己免疫疾患及び／または炎症性疾患の治療または予防に関して肯定的な治療反応を促進することができる。自己免疫疾患及び／または炎症性疾患に関して「肯定的な治療反応」によって、これらの抗体の抗炎症活性、抗血管新生活性、抗アポトーシス活性、等に関連した疾患の改善、及び／または疾患に関連した症状の改善が意図される。すなわち、抗増殖効果、ＳＥＭＡ４Ｄを発現している細胞のさらなる増殖の阻止、炎症性サイトカイン、接着分子、プロテアーゼ、免疫グロブリン（ＳＥＭＡ４Ｄを担う細胞がＢ細胞である場合）、それらの組み合わせ、等の分泌の低下を含むが、これらに限定されない炎症反応の低下、抗炎症性タンパク質の産生の増加、自己反応性細胞の数の減少、免疫寛容の増大、自己反応性細胞の生き残りの抑制、アポトーシスの減少、内皮細胞の移動の減少、自然発生の単球の移動の増加、ｓＳＥＭＡ４ＤまたはＳＥＭＡ４Ｄ発現細胞の刺激が介在する１以上の症状の軽減及び／または減少を観察することができる。そのような肯定的な治療反応は、投与の経路に限定されず、ドナー、ドナーの組織（たとえば、臓器潅流）、宿主、それらの組み合わせ、等への投与を含むことができる。
【０１９３】
ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ，クロマトグラフィー、等によって検出可能な変化を含むが、これらに限定されない臨床反応は、たとえば、磁気共鳴画像診断（ＭＲＩ）走査、Ｘ線画像診断、コンピューター断層撮影（ＣＴ）走査、フローサイトメトリーまたは蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）解析、組織学、肉眼的病理及び血液検査のようなスクリーニング法を用いて評価することができる。これらの肯定的な治療反応に加えて、本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）による治療法を受けている対象は、疾患に関連する症状における改善の有益な効果を経験することができる。
【０１９４】
本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）を、外科手術または外科的処置；免疫調節療法；放射線療法；任意で自己骨髄移植と併用した化学療法、または他のがん治療法を含むが、これらに限定されない少なくとも１つのがん治療法との併用で使用することができ、その際、追加のがん治療法は、抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片）による治療法に先立って、その最中に、それに続いて投与される。従って、併用療法が、化学療法、放射線療法、他の抗がん抗体療法、小分子に基づくがん治療法、またはワクチン／免疫療法に基づくがん治療法と同様に別の治療剤との併用での本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片）の投与を含む場合、本明細書で提供されているような方法は、別々の製剤もしくは単一の医薬製剤を用いた同時投与、または及びいずれかの順での連続投与を包含する。
【０１９５】
本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）を、有用であることが知られている、または自己免疫疾患及び炎症性疾患の治療で使用されているもしくは現在使用中である作用物質または作用物質の組み合わせを含む、自己免疫疾患及び炎症性疾患のための既知の治療法との併用で使用することができる。従って、併用療法が別の治療剤の投与との併用で抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子の投与を含む場合、本明細書で提供されている方法は、別々の製剤もしくは単一の医薬製剤を用いた同時投与、及びいずれかの順での連続投与を包含する。一部の実施形態では、本明細書に記載されている抗ＳＥＭＡ４Ｄ抗体は、免疫抑制薬または抗炎症薬との併用で投与され、その際、抗体及び治療剤は、いずれかの順で逐次投与することができ、または同時に（すなわち、付随してまたは同じ時間枠の範囲内で）投与することができる。
【０１９６】
特定の態様では、本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）を単独でまたは免疫抑制剤との併用で用いて関節リウマチを治療する及び／または予防することができる。上記で議論したように、治療の有効性は、任意の手段を用いて評価することができ、それには、米国リウマチ学会の基準、欧州リウマチ学会の基準または他の基準によって定義された臨床反応により測定される有効性が挙げられるが、これらに限定されない。たとえば、Ｆｅｌｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｒｈｅｕｍ．３８：７２７−３５（１９９５）及びｖａｎ  Ｇｅｓｔｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．３９：３４−４０（１９９６）を参照のこと。
【０１９７】
さらに他の態様では、本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）を単独で、または免疫抑制剤との併用で使用し、多発性硬化症を治療する及び／または予防することができる。
【０１９８】
本開示のさらなる態様は、臨床検査手順の一部として組織におけるタンパク質のレベルを診断上モニターして、たとえば、所与の治療計画の有効性を判定するための、本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）の使用である。たとえば、検出は、検出可能な物質に抗体を結合させることによって円滑にすることができる。検出可能な物質の例には、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、及び放射性物質が挙げられる。好適な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；好適な補欠分子族複合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンが挙げられ；好適な蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリスリンが挙げられ；発光物質の例には、ルミノールが挙げられ；生物発光物質の例にはルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリンが挙げられ；好適な放射性物質には１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、または３Ｈが挙げられる。
【０１９９】
ＶＩＩＩ．医薬組成物及び投与方法
本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）を調製し、それを必要とする対象にそれを投与する方法は当業者に周知であり、当業者によって容易に決定される。抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子の投与の経路は、たとえば、経口、非経口、吸入による、または局所である。用語、非経口には本明細書で使用されるとき、たとえば、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸、または膣での投与が含まれる。投与のこれらの形態全てが本開示の範囲内にあるとして熟考される一方で、投与のための形態の例は、注射、特に静脈内または動脈内の注射または点滴のための溶液である。普通、注射用の好適な医薬組成物は、緩衝液（たとえば、酢酸、リン酸またはクエン酸緩衝液）、界面活性剤（たとえば、ポリソルベート）、任意で安定剤（たとえば、ヒトアルブミン）、等を含むことができる。しかしながら、本明細書の教示に適合する他の方法では、本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）は、不利益な状態、たとえば、固形腫瘍の部位に直接送達することができ、それによって病んだ組織の治療剤への曝露を増やす。
【０２００】
本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）は、ＳＥＭＡ４Ｄが介在する疾患、たとえば、がん、自己免疫疾患、中枢神経系（ＣＮＳ）及び末梢神経系（ＰＮＳ）の炎症性疾患を含む炎症性疾患、神経変性疾患及び侵襲性血管新生のインビボでの治療のために薬学上有効な量で投与することができる。この点で、開示されている結合分子は投与を円滑にし、活性剤の安定性を助長するように製剤化できることが十分に理解されるであろう。特定の態様では、本明細書で提供されているような医薬組成物は、薬学上許容できる、非毒性で無菌のキャリア、たとえば、生理食塩水、非毒性の緩衝液、保存剤、等を含むことができる。本出願の目的で、コンジュゲートされているまたはコンジュゲートされていない本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）の薬学上有効な量は、標的への有効な結合を達成し、且つ、たとえば、疾患もしくは障害の症状を改善するまたは物質もしくは細胞を検出する利益を達成するのに十分な量を意味する。
【０２０１】
本開示で使用される医薬組成物は、たとえば、イオン交換剤、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンのような血清タンパク質、たとえば、リン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウムのような緩衝液物質、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または電解質、たとえば、プロタミン硫酸、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三珪酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレンポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコール及び羊毛脂を含む薬学上許容できるキャリアを含む。
【０２０２】
非経口投与のための調製物には限定しないで、無菌の水性または非水性の溶液、懸濁液及びエマルションが挙げられる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、たとえば、オリーブ油のような植物油及び、たとえば、オレイン酸エチルのような注射用有機エステルである。水性キャリアには、たとえば、水、生理食塩水及び緩衝化培地を含むアルコール性／水性の溶液、エマルションまたは懸濁液が挙げられる。薬学上許容できるキャリアには、０．０１〜０．１Ｍ、たとえば、０．０５Ｍのリン酸緩衝液または０．８％の生理食塩水が挙げられるが、これらに限定されない。他の一般的な非経口媒体には、リン酸ナトリウム溶液、リンガーのデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸加リンガー液または固定油が挙げられる。静脈内媒体には流体及び栄養補充剤、電解質補充剤、たとえば、リンガーのデキストロースに基づくもの、等が挙げられる。保存剤及び他の添加剤は、たとえば、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性気体、等も存在することができる。
【０２０３】
特定の態様では、注射用途に好適な医薬組成物には、無菌の水溶液（水溶性の場合）または分散液及び無菌の注射用の溶液もしくは分散液の即時調製のための無菌の粉末が含まれる。そのような場合、組成物は無菌でなければならず、容易な注射針通過性が存在する程度に流動性であるべきである。それは製造及び保存の条件下で安定であるべきであり、且つたとえば、細菌または真菌のような微生物の混入活動に対して保護することができる。キャリアは、たとえば、水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液状ポリエチレングリコール、等）及びそれらの好適な混合物を含有する溶媒または分散媒であることができる。たとえば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散液の場合必要とされる粒度の維持によって、及び界面活性剤の使用によって適正な流動性を維持することができる。本明細書で開示されている治療法で使用するのに好適な製剤はＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．），１６ｔｈ  ｅｄ．（１９８０）に記載されている。
【０２０４】
微生物の活動の防止は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、たとえば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール、等によって達成することができる。特定の態様では、等張剤、たとえば、糖、多価アルコール、たとえば、マンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを組成物に含めることができる。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅らせる作用物質、たとえば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物に含めることによってもたらすことができる。
【０２０５】
どんな場合でも、無菌の注射用溶液は、必要に応じて本明細書で列挙されている成分１つまたは成分の組み合わせと共に、活性化合物（たとえば、それ自体または他の活性剤との併用で、本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体））を必要量で適当な溶媒に組み込むことと、その後の濾過滅菌によって調製することができる。一般に、分散液は、基本的な分散媒と上記で列挙されたものに由来する必要とされる他の成分とを含有する無菌媒体に活性化合物を組み込むことによって調製される。無菌の注射用溶液の調製のための無菌粉末の場合、調製方法は真空乾燥及び凍結乾燥を含むことができ、それによって有効成分に加えた以前無菌濾過したその溶液に由来する追加の所望の成分の粉末が得られる。注射用製剤は、当該技術で既知の方法に従って処理され、たとえば、アンプル、バッグ、ビン、注射器またはバイアルのような容器に充填され、無菌条件下で密封される。さらに、製剤は、たとえば、米国特許出願第０９／２５９，３３７号に記載されたもののようなキットの形態で包装され、販売される。そのような製造物品は、関連する組成物が疾患もしくは障害を患っている対象または疾患もしくは障害に罹り易い対象を治療するのに有用であることを示すラベルまたは添付文書を有することができる。
【０２０６】
非経口製剤は、単回ボーラス用量、点滴用量、または負荷ボーラス用量に続く維持用量であることができる。これらの組成物は、特定の固定されたまたは変動する間隔で、たとえば、１日１回、または「必要に応じて」基準で投与することができる。
【０２０７】
本開示によって提供される特定の医薬組成物は、たとえば、カプセル剤、錠剤、水性懸濁液または水溶液を含む許容できる剤形で経口投与することができる。特定の医薬組成物は、鼻内噴霧または吸入によって投与することもできる。そのような組成物は、生理食塩水にて溶液として調製することができ、ベンジルアルコール、または他の好適な保存剤、生体利用効率を高める吸収促進剤及び／または他の従来の可溶化剤または分散剤を採用する。
【０２０８】
キャリア物質と組み合わせて単回剤形を生じることができる、本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）の量は、治療される宿主及び投与の特定の方式に応じて変化するであろう。組成物は、単回用量、複数回用量として、または点滴にて確立された時間にわたって投与することができる。投薬計画を調整して最適で所望の反応（たとえば、治療反応または予防反応）を提供することもできる。
【０２０９】
本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）は、治療効果を生じるのに十分な量で前述の治療方法に従ってヒトまたは他の動物に投与することができる。本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）は、既知の技法に従って従来の薬学上許容できるキャリアまたは希釈剤と抗体を組み合わせることによって調製される従来の剤形でヒトまたは他の動物に投与することができる。薬学上許容できるキャリアまたは希釈剤の形態及び特徴は、組み合わせられるべきである有効成分の量、投与の経路及び他の周知の可変のものによって指示されることが当業者によって認識されるであろう。
【０２１０】
「治療上有効な用量または量」または「有効量」によって、投与されると治療される疾患を持つ患者の治療に関して肯定的な治療反応をもたらす本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）の量が意図される。
【０２１１】
たとえば、がん；自己免疫疾患、たとえば、関節炎、多発性硬化症、中枢神経系（ＣＮＳ）及び末梢神経系（ＰＮＳ）の炎症性疾患を含む炎症性疾患；神経変性疾患；及び侵襲性血管新生のようなＳＥＭＡ４Ｄが介在する疾患の治療について本明細書で提供されているような組成物の治療上有効な用量は、投与の手段、標的部位、患者の生理的状態、患者がヒトであるか動物であるか、投与される他の薬物、治療が予防的であるか治療的であるかを含む多くの様々な因子に応じて変化する。普通、患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳類を含む非ヒト哺乳類も治療することができる。治療投与量は、当業者に既知の日常的な方法を用いて設定され、安全性及び有効性を最適化することができる。
【０２１２】
投与される本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）の量は、過度の実験を行うことなく当業者によって容易に決定される。投与の方式及び抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子の各量に影響を及ぼす因子には、疾患の重症度、病歴、及び治療を受ける個体の年齢、身長、体重、健康状態及び身体状態が挙げられるが、これらに限定されない。同様に、投与される抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子の量は、投与の方式及び対象がこの作用物質の単回投与を受けるのか、または複数回投与を受けるのかに左右されるであろう。
【０２１３】
本開示はまた、たとえば、関節炎、多発性硬化症、ＣＮＳ及びＰＮＳの炎症性疾患を含む自己免疫疾患及び／または炎症性疾患、神経変性疾患またはがんを治療するための薬物の製造における抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）の使用も提供する。
【０２１４】
本開示はまた、たとえば、関節炎、多発性硬化症、ＣＮＳ及びＰＮＳの炎症性疾患を含む自己免疫疾患及び／または炎症性疾患、神経変性疾患またはがんを治療するための薬物の製造における抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）の使用も提供し、その際、薬物は、少なくとも１つの他の治療法で前治療されている対象で使用される。「前治療された」または「前治療」によって、抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子を含む薬物を受け入れるのに先立って対象が１以上の他の治療を受けている（たとえば、少なくとも１つの他の治療法で治療されている）ことが意図される。「前治療された」または「前治療」には、本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）を含む薬物による治療の開始に先立って２年以内に、１８ヵ月以内に、１年以内に、６ヵ月以内に、２ヵ月以内に、６週以内に、１ヵ月以内に、４週以内に、３週以内に、２週以内に、１週以内に、６日以内に、５日以内に、４日以内に、３日以内に、２日以内に、またはさらに１日以内に、少なくとも１つの他の治療法で治療された対象が含まれる。対象が前の治療法（単数）または治療法（複数）による前治療に対するレスポンダーであったことは必要ではない。従って、抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子を含む薬物を受け入れる対象は、前の治療法に対してまたは前治療が複数の治療法を構成する前の治療法の１以上に対して応答できたこともありうるし、または応答できなかった（たとえば、がんは難治性だった）こともありうる。本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）を含む薬物を受け入れるのに先立って対象が前治療を受け入れた可能性がある他のがん治療法の例には、外科手術；放射線療法；任意で自己骨髄移植と組み合わせた化学療法；他の抗癌モノクローナル抗体療法；小分子に基づくがん治療法；ワクチン／免疫療法に基づくがん治療法；ステロイド療法；他のがん治療法；またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１５】
ＩＸ．診断
本開示はさらに、たとえば、特定の種類のがん、自己免疫疾患、たとえば、関節炎、多発性硬化症、中枢神経系（ＣＮＳ）及び末梢神経系（ＰＮＳ）の炎症性疾患を含む炎症性疾患、神経変性疾患、及び侵襲性血管新生のようなＳＥＭＡ４Ｄが介在する疾患の診断の間に有用な診断法を提供するが、それには、個体に由来する組織または他の細胞または体液にてＳＥＭＡ４Ｄのタンパク質または転写物の発現レベルを測定することと、正常な組織または体液における標準のＳＥＭＡ４Ｄの発現レベルと測定された発現レベルを比較することとが含まれ、それによって標準と比べた発現レベルの上昇が障害を示す。
【０２１６】
本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）を使用し、当業者に既知の従来の免疫組織学的方法を用いて生体試料にてＳＥＭＡ４Ｄタンパク質のレベルをアッセイすることができる（たとえば、Ｊａｌｋａｎｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８５）；Ｊａｌｋａｎｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６（１９８７）を参照のこと）。ＳＥＭＡ４Ｄタンパク質の発現を検出するのに有用な他の抗体に基づく方法には、免疫アッセイ、たとえば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降法またはウエスタンブロッティングが挙げられる。好適なアッセイは、本明細書のどこか他にさらに詳細に記載されている。
【０２１７】
「ＳＥＭＡ４Ｄポリペプチドの発現レベルをアッセイすること」によって、第１の生体試料にて直接（たとえば、絶対的タンパク質レベルを測定するまたは推定することによって）または相対的に（たとえば、第２の生体試料における疾患関連のポリペプチドのレベルと比べることによって）ＳＥＭＡ４Ｄポリペプチドのレベルを定性的にまたは定量的に測定することまたは推定することが意図される。特定の態様では、第１の生体試料におけるＳＥＭＡ４Ｄポリペプチドの発現レベルを測定し、または推定し、標準のＳＥＭＡ４Ｄポリペプチドのレベルと比較することができ、標準は、障害を有さない個体から得られる第２の生体試料から採取され、または標準は、障害を有さない個体の集団に由来するレベルを平均することによって決定される。当該技術で十分に理解されているように、いったん「標準」のＳＥＭＡ４Ｄポリペプチドのレベルが知られると、比較のための標準として繰り返しそれを使用することができる。
【０２１８】
「生体試料」によって、ＳＥＭＡ４Ｄを潜在的に発現する個体、細胞株、組織培養物、または細胞の他の供給源から得られる任意の生体試料が意図される。哺乳類から組織生検及び体液を得る方法は当該技術で周知である。
【０２１９】
Ｘ．免疫アッセイ
本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）を当該技術で既知の方法によって免疫特異的な結合についてアッセイすることができる。使用することができる免疫アッセイには、ほんの数例を挙げれば、たとえば、ウエスタンブロット、放射性免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体固定アッセイ、免疫放射測定アッセイ、蛍光免疫アッセイ、プロテインＡ免疫アッセイのような技法を用いた競合及び非競合のアッセイ系が挙げられるが、これらに限定されない。そのようなアッセイは日常的であり、当該技術で周知である（たとえば、全体として参照によって本明細書に組み入れられるＡｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ，（１９９４），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ），Ｖｏｌ．１を参照のこと）。例となる免疫アッセイは以下で手短かに記載されている（ただし、限定の目的では意図されない）。
【０２２０】
本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）を、ＳＥＭＡ４Ｄタンパク質またはその保存された変異体またはペプチド断片の原位置での検出のために、免疫蛍光、免疫電子顕微鏡または非免疫アッセイのように組織学的に採用することができる。原位置での検出は、患者から組織学的検体を取り出し、標識された抗ＳＥＭＡ４Ｄ抗体またはその抗原結合断片をそれに適用する、たとえば、生体試料上に標識抗体（または断片）を重ね合わせることによって達成することができる。そのような手順の使用を介して、ＳＥＭＡ４Ｄタンパク質または保存された変異体またはペプチド断片の存在だけでなく、調べた組織におけるその分布も決定することが可能である。本開示を用いて、当業者は、そのような原位置検出を達成するために多種多様な組織学的方法（たとえば、染色法）のいずれかを改変することができることを容易に理解するであろう。
【０２２１】
本明細書で提供されているような抗ＳＥＭＡ４Ｄ結合分子（たとえば、抗体または抗原に結合するその断片、変異体、もしくは誘導体）の所与のロットの結合活性は、周知の方法に従って決定することができる。当業者は、日常の実験を採用することによって各決定についての有効であり且つ最適なアッセイ条件を決定することができるであろう。
【０２２２】
抗体・抗原の相互作用の親和性を測定するのに利用できる種々の方法があるが、速度定数を決定する方法は相対的に少ない。方法のほとんどは抗体または抗原を標識することを当てにするが、それは日常の測定を必然的に複雑にし、測定された量に不確実性を導入する。
【０２２３】
ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）で実施されるような表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）は抗体・抗原相互作用も親和性を測定する従来の方法を超えて多くの利点：（ｉ）抗体または抗原のいずれかを標識する必要がない；（ｉｉ）前もって抗体を精製する必要がなく、細胞の培養上清をそのまま使用することができる；（ｉｉｉ）異なるモノクローナル抗体の相互作用の迅速で半定量的な比較を可能にするリアルタイム測定が可能になり、多くの評価目的に十分である；（ｉｖ）一連の様々なモノクローナル抗体を同一条件下で容易に比較できるように二重特異性の表面を再生することができる；（ｖ）分析手順は完全に自動化され、ユーザーの介入なしで広範な測定を実施することができる；を提供している。ＢＩＡａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，バージョンＡＢ（１９９８年再版），ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）コード番号ＢＲ−１００１−８６；ＢＩＡｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，バージョンＡＢ（１９９８年再版），ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）コード番号ＢＲ−１００１−８４。ＳＰＲに基づく結合試験は、結合ペアの一方のメンバーがセンサー表面に不動化されることを必要とする。不動化された結合相手はリガンドと呼ばれる。溶液中の結合相手は検体と呼ばれる。場合によっては、リガンドは、捕捉分子と呼ばれる別の不動化された分子への結合を介して間接的に表面に連結される。ＳＰＲ反応は、検体が結合するまたは解離するにつれての検出器表面での質量濃度の変化を反映する。
【０２２４】
ＳＰＲに基づいて、リアルタイムＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）測定は、相互作用が発生するにつれてそれを直接モニターする。その技法は、動態パラメーターの測定に上手く適合している。比較親和性ランキングは実施し易く、速度定数及び親和性定数の双方は、センサーグラムのデータに由来することができる。
【０２２５】
検体をリガンド表面にわたって別個のパルスで注入する場合、得られるセンサーグラムは、３つの必須相：（ｉ）試料注入の間での検体のリガンドとの会合；（ｉｉ）試料注入の間での、検体結合の速度が複合体からの解離によって均衡が保たれる平衡状態または定常状態；（ｉｉｉ）緩衝液の流れの間での表面からの検体の解離に分けることができる。
【０２２６】
会合相及び解離相は、検体・リガンド相互作用の動態に関する情報を提供する（Ｋａ及びＫｄ、複合体形成及び解離の速度、Ｋｄ／Ｋａ＝ＫＤ）。平衡相は、検体・リガンド相互作用の親和性（ＫＤ）に関する情報を提供する。
【０２２７】
ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアは、数値積分法及び全域適合アルゴリズムの双方を用いて曲線適合のための総合手段を提供する。データの好適な分析によって、相互作用についての分離速度及び親和性定数は、単純なＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）での検討から得ることができる。この技法によって測定できる親和性の範囲は、ｍＭからｐＭに及んで非常に広い。
【０２２８】
エピトープ特異性は、モノクローナル抗体の重要な特徴である。ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）によるエピトープマッピングは、放射性免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡまたは他の表面吸着法を用いた従来の技法とは対照的に、標識または精製抗体を必要とせず、幾つかのモノクローナル抗体の配列を用いた複数部位特異性試験を可能にする。さらに、多くの分析を自動的に処理することができる。
【０２２９】
一対での結合実験は、同一抗原に同時に結合する２つのＭＡｂの能力を調べる。別々のエピトープに対するＭＡｂは独立して結合するのに対して、同一エピトープまたは密接に関連するエピトープに対するＭＡｂは、互いの結合を妨害するであろう。ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）によるこれらの結合実験は実施し易い。
【０２３０】
たとえば、第１のＭＡｂに結合する捕捉分子を使用し、それに続いて抗原及び第２のＭＡｂを順次添加することができる。センサーグラムは、（１）どれだけ多くの抗原が第１のＭＡｂに結合するか、（２）表面に連結した抗原にどの程度第２のＭＡｂが結合するか、（３）第２のＭＡｂが結合しなければ、一対での試験の順を逆にすることが結果を変えるかどうか、を明らかにするであろう。
【０２３１】
ペプチド阻害は、エピトープマッピングに使用される別の技法である。この方法は、一対での抗体結合試験を補完することができ、抗原の一次配列が知られる場合、機能的エピトープを構造的特徴に関連付けることができる。ペプチドまたは抗原断片を不動化された抗原に対する様々なＭＡｂの結合の阻害について調べる。所与のＭＡｂの結合を妨害するペプチドは、そのＭＡｂによって定義されるエピトープに構造的に関係すると推測される。
【０２３２】
本開示は、特に指示されない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ及び免疫学の従来の技法を採用し、それらは当該技術の技量の範囲内にある。そのような技法は文献にて完全に説明されている。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（２ｎｄ  ｅｄ．；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．（１９９２），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ）；Ｄ．  Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｄ．，（１９８５），ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ；Ｇａｉｔ，ｅｄ．（１９８４），Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；Ｍｕｌｌｉｓ，ｅｔ  ａｌ．米国特許第４，６８３，１９５号；Ｈａｍｅｓ及びＨｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；Ｈａｍｅｓ及びＨｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４）  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，（１９８７），Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，（Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ），（１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ（１９８４），Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｍｉｌｌｅｒ及びＣａｌｏｓ  ｅｄｓ．（１９８７），Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｗｕ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４  ａｎｄ  １５５；Ｍａｙｅｒ及びＷａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．（１９８７），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｌｏｎｄｏｎ）；Ｗｅｉｒ及びＢｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，（１９８６），Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＶ；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８６）；ならびにｉｎ  Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９８９），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．）を参照のこと。
【０２３３】
抗体操作の一般原理は、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，ｅｄ．（１９９５），Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，（２ｎｄ  ｅｄ．；Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ）に示されている。タンパク質操作の一般原理は、Ｒｉｃｋｗｏｏｄ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９５），Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇ．）に示されている。抗体及び抗体・ハプテン結合の一般原理は、Ｎｉｓｏｎｏｆｆ，（１９８４），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，（２ｎｄ  ｅｄ．；Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．）；及びＳｔｅｗａｒｄ，（１９８４），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｔｈｅｉｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，（Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）に示されている。さらに、当該技術で既知の且つ具体的に記載されていない免疫学における常法は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｓｔｉｔｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９４），Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，（８ｔｈ  ｅｄ；Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎ．）ならびにＭｉｓｈｅｌｌ及びＳｈｉｉｇｉ（ｅｄｓ）（１９８０），Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，ＮＹ）のように進めることができる。
【０２３４】
免疫学の一般原理を説明する標準の参考文献には、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｋｌｅｉｎ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｓｅｌｆ−Ｎｏｎｓｅｌｆ  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ，（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９８２））；Ｋｅｎｎｅｔｔ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（１９８０），Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）；Ｃａｍｐｂｅｌｌ，（１９８４）“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”ｉｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ｂｕｒｄｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）；Ｇｏｌｄｓｂｙ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（２０００），Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（４ｔｈ  ｅｄ．；Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，ＮＹ）；Ｒｏｉｔｔ，ｅｔ  ａｌ．（２００１），Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（６ｔｈ  ｅｄ．；Ｌｏｎｄｏｎ：Ｍｏｓｂｙ）；Ａｂｂａｓ，ｅｔ  ａｌ．（２００５），Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（５ｔｈ  ｅｄ．；Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）；Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ及びＤｕｂｅｌ，（２００１），Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ，（２００１），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｌｅｗｉｎ，（２００３），Ｇｅｎｅｓ  ＶＩＩＩ（Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ，２００３）；Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（１９８８），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｄｖｅｋｓｌｅｒ，（２００３），ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）が挙げられる。
【０２３５】
上記で引用された参考文献のすべて、ならびに本明細書で引用された参考文献すべては、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
【０２３６】
以下の実施例は、説明目的で提供されるのであって、限定目的ではない。
【実施例】
【０２３７】
実施例１：完全ヒト抗ＳＥＭＡ４Ｄモノクローナル抗体ＭＡｂ  Ｄ２５１７の生成
以下の方法によって完全ヒト抗ＳＥＭＡ４Ｄモノクローナル抗体Ｄ２５１７を生成した。全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許出願第２０１３−０２８８９２７−Ａ１号に記載された方法に従って完全ヒト抗体のライブラリをワクシニアウイルスで生成し、ＳＥＭＡ４Ｄへの結合について選抜した。競合ＥＬＩＳＡによって合計９６の抗体を９つの異なるエピトープ群にビン分けした。マウス抗体ＭＡｂ７６及びＭＡｂ６７、及びマウスＩｇＧ対照を用いて、Ｊｕｒｋａｔ細胞上のヒトＳＥＭＡ４Ｄのネイティブ形態へのヒト抗体の競合結合を評価した。ＭＡｂ７６及びＭＡｂ６７はヒトＳＥＭＡ４Ｄの既知のエピトープに結合し、いずれかとの競合は機能性を示す。ＦＡＣＳ緩衝液（１×ＰＢＳ＋０．０５％ＢＳＡ＋２ｍＭのＥＤＴＡ）中での１００ｕＬと２００，０００個の細胞にて５ｕｇ／ｍＬでのＭＡｂ７６、ＭＡｂ６７、またはマウスＩｇＧ対照と共に氷上でＪｕｒｋａｔ細胞を３０分間予備インキュベートした。これは、結合エピトープを遮断するマウス抗体の結合を飽和させた。ヒト試験抗体及び対照抗体を１ｕｇ／ｍＬで、二次試薬であるヤギ抗ヒトＦｃ−Ｄｙｌｉｇｈｔ６４９抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  ４９６−１７０）と共に氷上で３０分間予備インキュベートした。マウスＩｇＧ抗体とのＪｕｒｋａｔ細胞のインキュベートに続いて、細胞を洗浄し、試験抗体／二次複合体の混合物と共に氷上で３０分間インキュベートした。その後、細胞を２００ｕＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、ＰＩを伴ったＰＢＳ／１％ＢＳＡ及び０．５％パラホルムアルデヒドの固定溶液２５０ｕＬに再浮遊させた。再浮遊に続いて、ＦＡＣＳ  ＣＡＮＴＯＩＩでのフローサイトメトリーによって細胞を解析した。ＰＩ陰性の集団にゲートをかけ、Ｄｙｌｉｇｈｔ６４９のシフトを記録し、評価した。無関係なマウスＩｇＧと共に予備インキュベートしたＪｕｒｋａｔ細胞へのヒト抗体の結合と比べて結合のパーセント阻害を算出した。
【０２３８】
以前特徴付けたマウス抗ＳＥＭＡ４Ｄ抗体６７−２及び７６−１を交差遮断するその能力によるさらなる特徴付けについてＭＡｂ  Ｃ２３０５を選択した。たとえば、その開示が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第８，４９６，９３８号を参照のこと。
【０２３９】
ＭＡｂ  Ｃ２３０５のＶＨをコードするポリヌクレオチドを、ヒトガンマ４重鎖定常領域のコーディング配列を含有する哺乳類の発現ベクターにクローニングして完全長の重鎖を作り出した。ＭＡｂ  Ｃ２３０５のＶＬをコードするポリヌクレオチドを、ヒトラムダ定常領域のコーディング配列を有する哺乳類の発現ベクターにクローニングして完全長の軽鎖を作り出した。重鎖及び軽鎖を含有する発現ベクターでＣＨＯ−Ｓ細胞に同時形質移入した。産生されたモノクローナル抗体が細胞から分泌され、３〜６日間の発現期間の後、それを回収した。得られたＭＡｂを、プロテインＡクロマトグラフィー用いて精製し、特徴付けた。得られた完全ヒトＭＡｂ（ＭＡｂ  Ｃ２３０５）は、フローサイトメトリー及びＥＬＩＳＡによってＳＥＭＡ４Ｄに特異的であることが明らかにされ、ＳＥＭＡ４Ｄへの結合についてマウスＭＡｂ６７−２と競合できることが示された。ＭＡｂ  Ｃ２３０５の機能的活性を、以下の実施例３の方法に従って受容体遮断アッセイにてさらに評価した。受容体遮断は観察されたが、比較基準として使用したヒト化ＭＡｂ２５０３（米国特許第８，４９６，９３８号、ＶＸ１５／２５０３とも呼ばれる）のそれよりも低いレベルだった。
【０２４０】
ＭＡｂ  Ｃ２３０５を完全に配列決定し、次いで親和性の改善のために操作した。重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）を標準の部位特異的変異誘発法に供し、米国特許出願公開第２０１３−０２８８９２７−Ａ１号に記載された方法に従って軽鎖ライブラリを用いて新しい完全ヒト軽鎖可変領域（ＶＬ）を同定した。これらの変更から、改善された親和性を持つＭＡｂであるＭＡｂ  Ｄ２５１７をリード抗体として選択した。ＭＡｂ  Ｄ２５１７をクローニングし、構築し、ラムダ軽鎖を持つ完全ヒトＩｇＧ４抗体として発現させた。ＭＡｂ  Ｄ２５１７のＶＨ、ＶＬ及びＣＤＲの配列を表２に提示する。
【０２４１】
（表２）ＭＡｂ  Ｄ２５１７の配列
2020518248.tif 000004
【０２４２】
実施例２：ＭＡｂ  Ｄ２５１７の結合特性
以下のように、ＢＩＡＣＯＲＥアッセイによってＭＡｂ  Ｄ２５１７の結合特性を決定した。双方ともＰＢＳにて処方した抗体、ならびに比較抗体ＶＸ１５／２５０３を低密度でのヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃを伴ったセンサーに捕捉させ、次いで０〜２５ｎｍの抗原濃度範囲でマーモセットのＳＥＭＡ４Ｄ−Ｈｉｓを捕捉された抗体上に流した。結果を表３に示す。ＳＥＭＡ４Ｄに対するＭＡｂ  Ｄ２５１７の親和性は、ＶＸ１５／２５０３の親和性に類似していた。
【０２４３】
（表３）ＢＩＡＣＯＲＥアッセイの結果
2020518248.tif 000005
【０２４４】
ＭＡｂ  Ｄ２５１７のヒト、マウス、マーモセット及びカニクイザルのＳＥＭＡ４Ｄに結合する能力を、以下の方法を用いてＥＬＩＳＡによって決定した。Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉｓｏｒｐＣウェルＥＬＩＳＡプレートを、１×ＰＢＳで処方したＣＤ１００−Ｈｉｓの１００μＬ／ウェルで一晩被覆した。一晩のインキュベートに続いて、プレートを洗浄し、その後、ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ＋０．２５％Ｔｗｅｅｎ２０によって２００ｕＬ／ウェルにて室温で少なくとも１時間ブロックした。追加の洗浄の後、１００μｌ／ウェルの希釈したＭＡｂ（１００ｎｇ／ｍＬ）をＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに加え、それを室温で２時間インキュベートし、次いで洗浄した。次に、１００μｌ／ウェルの１：１０，０００ヤギ抗ヒトＦｃ（Ｊａｃｋｓｏｎカタログ＃１０９−０３５−０９８ロット１１８４６０）を各ウェルに加え、ＥＬＩＳＡプレートを室温で１時間インキュベートした。次いでプレートを洗浄し、１００ｕＬ／ウェルのＴＭＢ基質で１５分間発色させた。１００ｕＬ／ウェルの２Ｎ硫酸を用いて検出反応を止め、プレートリーダーを用いて４５０〜５７０ｎｍの波長にてプレートを読み取った。
【０２４５】
結果を図１Ａ（ヒトＳＥＭＡ４Ｄ）、図１Ｂ（マーモセットＳＥＭＡ４Ｄ）、図１Ｃ（カニクイザルＳＥＭＡ４Ｄ）、及び図１Ｄ（マウスＳＥＭＡ４Ｄ）に示す。
【０２４６】
実施例３：ＭＡｂ  Ｄ２５１７は、ＳＥＭＡ４Ｄがその受容体に結合するのを阻止する
種々の種に由来するＳＥＭＡ４Ｄが、その受容体プレキシンＢ１に結合するのを阻止するＭＡｂ  Ｄ２５１７の能力を、以下のように調べた。
【０２４７】
ＭＡｂ  Ｄ２５１７及びＭＡｂ  ＶＸ１５／２５０３を酢酸緩衝液で処方した。ＳＥＭＡ４Ｄ−Ｈｉｓ複合体（ヒト、カニクイザル、マウス、またはラットのＳＥＭＡ４Ｄ）が２９３ＰＬＸＮＢ１細胞に結合するのを阻止する抗体の能力について、３つ組の希釈シリーズで抗体を比較した。９６穴プレートにて抗体すべてを１．５μｇ／ｍＬから８８ｎｇ／ｍＬまで希釈し、０．８ｕｇ／ｍＬの適当なＳＥＭＡ４Ｄ−Ｈｉｓと１：１で組み合わせ、４℃で一晩インキュベートした。
【０２４８】
翌日、９６穴プレートにて抗体／ＳＥＭＡ４Ｄ−Ｈｉｓ複合体または対照を２．５×１０５個の２９３ＰＬＸＮＢ１細胞に加え、４℃で３０分間結合を生じさせた。洗浄の後、細胞を抗６×Ｈｉｓ−ＡＰＣで染色し（４℃で３０分間）、洗浄し、ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩでのフローサイトメトリーによって解析した。結果を図２Ａ〜２Ｄに示す。ＥＣ５０値を曲線から算出し、表４に示す。
【０２４９】
（表４）ＳＥＭＡ４Ｄのその受容体への結合の阻止についてのＥＣ５０値（ｎＭ）
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【０２５０】
実施例４：腫瘍モデルにおけるＭＡｂ  Ｄ２５１７のマウスのキメラ同等物の試験
ＭＡｂ  Ｄ２５１７のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列（配列番号１及び配列番号５）を、マウスのＩｇＧ１とラムダ定常領域を発現しているベクターに挿入し、キメラ抗体ＭＡｂ  Ｄ２５８５を作った。その抗体をＣＨＯ−Ｓ細胞で発現させ、実施例１で説明したように精製した。
【０２５１】
６〜８週齢のＢａｌｂ／ｃメスマウス（ｎ＝１２）に３０，０００個のＴｕｂｏ.Ａ５乳癌細胞をマウスの乳腺脂肪体にて皮下で移植した。対照のマウスＩｇＧ１／２Ｂ８.１Ｅ７または抗ＳＥＭＡ４Ｄキメラ抗体ＭＡｂ  Ｄ２５８５による処理は、播種の７日後に開始した（１０ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ、毎週×５）。移植の１１日後に開始してノギスで週２回腫瘍を測定した。腫瘍体積が８００ｍｍ３に達すると動物を屠殺した。
【０２５２】
ノギスによって腫瘍増殖を測定し、測定値を用い、ｗ＝腫瘍の幅、さらに小さな測定値、及びｌ＝ｍｍでの長さである式（ｗ２×ｌ）／２を用いて腫瘍体積を算出した。平均腫瘍体積及び腫瘍体積＝８００ｍｍ３までの時間として定義されるＫａｐｌａｎ・Ｍｅｉｅｒの生存曲線をそれぞれ図３Ａ及び図３Ｂに示す。統計的解析はそれぞれ、平均腫瘍体積については二元分散分析（ＡＮＯＶＡ）（ｐ＜０．０５）を、生存についてはログランク分析（ｐ＜０．１）を用いて実施し、それらは統計的に有意だった。
【０２５３】
Ｔｕｂｏ腫瘍モデルにおける腫瘍退縮の頻度も測定したが、図３Ｃにそれを示す。退縮は、少なくとも２回の連続した測定値について＜５０ｍｍ３を測定する腫瘍として定義される触診可能な腫瘍の欠如である。キメラ抗体ＭＡｂ  Ｄ２５８５による処理は、Ｔｕｂｏ担癌マウスにて退縮の数を増やした。キメラ抗体ＭＡｂ  Ｄ２５８５で処理したマウス群における退縮の数は、Ｆｉｓｈｅｒの正確検定によって決定されたように、対照Ｉｇと比べて統計的に有意だった（ｐ＝０．０１）。
【０２５４】
本開示の幅広さ及び範囲は、上述の例となる実施形態のいずれによっても限定されるべきではないが、添付の特許請求の範囲及びそれと同等のことに従ってのみ定義されるべきである。
【図１】
2020518248.tif 000008
【図２Ａ】
2020518248.tif 000009
【図２Ｂ】
2020518248.tif 000010
【図２Ｃ】
2020518248.tif 000011
【図２Ｄ】
2020518248.tif 000012
【図３Ａ】
2020518248.tif 000013
【図３Ｂ】
2020518248.tif 000014
【図３Ｃ】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年1月7日(2020.1.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2020518248000001.app
【国際調査報告】
2020518248.tif 000016
2020518248.tif 000017