(57)【要約】本発明は、80％より多いコアフコシル化を含むグリコシル化された参照抗体と比較して、T細胞活性化の増強をもたらす抗体に関し、その際、T細胞活性化は、Fc#RIIIaへの結合の増強を特徴とする抗体によってもたらされる。前記抗体は、グリコシル化されているが、本質的にコアフコシル化が十分ではない。【特許請求の範囲】
【請求項１】
80％より多いコアフコシル化を含むグリコシル化された参照抗体と比較して、増強されたT細胞活性化をもたらす、抗体。
【請求項２】
参照抗体をCHOdhfr-(ATCC番号CRL-9096)から得ることができる、請求項1記載の抗体。
【請求項３】
グリコシル化されていない参照抗体と比較して、増強されたT細胞活性化をもたらす、請求項1記載の抗体。
【請求項４】
T細胞活性化が、FcγRIIIaへの結合の増強を特徴とする抗体によってもたらされる、請求項1記載の抗体。
【請求項５】
グリコシル化されているが、本質的にコアフコシル化が十分ではない、請求項1〜4のいずれか一項記載の抗体。
【請求項６】
グリコシル化がヒトグリコシル化である、請求項5記載の抗体。
【請求項７】
参照抗体のグリコシル化がヒトグリコシル化である、請求項1記載の抗体。
【請求項８】
0％〜80％フコシル化されている、請求項5〜7のいずれか一項記載の抗体。
【請求項９】
細胞株NM-H9D8-E6(DSM ACC 2807)、NM-H9D8-E6Q12(DSM ACC 2856)、またはそれらに由来する細胞もしくは細胞株から得ることができる、請求項8記載の抗体。
【請求項１０】
抗体が、1つまたは複数の配列変異を含み、該抗体のFcγRIIIaへの結合が、非変異抗体と比較して増加している、請求項1記載の抗体。
【請求項１１】
EU命名法に基づくS238D、S239D、I332E、A330L、S298A、E333A、L334A、G236A、およびL235Vより選択される1つまたは複数の配列変異を含む、請求項10記載の抗体。
【請求項１２】
T細胞活性化が、樹状細胞の成熟化ならびに/または共刺激分子および成熟化マーカーの発現を伴う、前記請求項のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１３】
T細胞活性化が、CD25、CD69、および/またはCD137の発現に基づいて検出可能である、前記請求項のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１４】
PD-L1抗体である、前記請求項のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１５】
二機能性単特異性抗体である、請求項14記載の抗体。
【請求項１６】
三機能性二重特異性抗体である、請求項14または15記載の抗体。
【請求項１７】
がん抗原にさらに結合する、請求項14〜16のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１８】
がん抗原がTA-MUC1である、請求項17記載の抗体。
【請求項１９】
Fc領域を含む、請求項14〜18のいずれか一項記載の抗体。
【請求項２０】
TA-MUC1抗体である、請求項1〜13のいずれか一項記載の抗体。
【請求項２１】
二機能性単特異性抗体である、請求項20記載の抗体。
【請求項２２】
三機能性二重特異性抗体である、請求項20または21記載の抗体。
【請求項２３】
免疫チェックポイントタンパク質にさらに結合する、請求項20〜22のいずれか一項記載の抗体。
【請求項２４】
免疫チェックポイントタンパク質がPD-L1である、請求項23記載の抗体。
【請求項２５】
Fc領域を含む、請求項20〜24のいずれか一項記載の抗体。
【請求項２６】
PD-L1に結合する単鎖Fv領域を含む、請求項22〜25のいずれか一項記載の抗体。
【請求項２７】
TA-MUC1に結合するVHドメインおよびVLドメインを含む、請求項22〜26のいずれか一項記載の抗体。
【請求項２８】
単鎖Fv領域が、軽鎖の定常ドメインまたはFc領域のCH3ドメインに結合している、請求項25〜27記載の抗体。
【請求項２９】
治療法において使用するための、前記請求項のいずれか一項記載の抗体。
【請求項３０】
T細胞を活性化するための方法において使用するための、請求項1〜28のいずれか一項記載の抗体。
【請求項３１】
T細胞の活性化が、がん疾患、炎症性疾患、ウイルス感染症、および自己免疫疾患の治療のためである、請求項30記載の使用のための抗体。
【請求項３２】
がん疾患が、肺がん、腎臓がん、膀胱がん、胃腸がん、皮膚がん、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、および前立腺がんを含む、黒色腫、癌腫、リンパ腫、肉腫、および中皮腫より選択される、請求項30または31記載の使用のための抗体。
【請求項３３】
炎症性疾患が、炎症性腸疾患(IBD)、骨盤内炎症性疾患(PID)、虚血性脳卒中(IS)、アルツハイマー病、喘息、尋常性天疱瘡、皮膚炎/湿疹より選択される、請求項30または31記載の使用のための抗体。
【請求項３４】
ウイルス感染症が、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、単純ヘルペスウイルス(HSV)、エプスタイン・バーウイルス(EBV)、インフルエンザウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)、B型肝炎ウイルス(HBV)、C型肝炎ウイルス(HCV)より選択される、請求項30または31記載の使用のための抗体。
【請求項３５】
自己免疫疾患が、糖尿病(DM)、I型、多発性硬化症(MS)、全身性エリテマトーデス(SLE)、関節リウマチ(RA)、白斑、乾癬および乾癬性関節炎、アトピー性皮膚炎(AD)、強皮症、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変、ギラン・バレー症候群、グレーブス病、セリアック病、自己免疫性肝炎、強直性脊椎炎(AS)より選択される、請求項30または31記載の使用のための抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、80％より多いコアフコシル化を含むグリコシル化された参照抗体と比較して増強されたT細胞活性化をもたらす抗体に関する。さらに、この抗体は、グリコシル化されていない参照抗体と比較して増強されたT細胞活性化をもたらし、その際、T細胞活性化は、FcγRIIIaへの増強された結合を特徴とする抗体によってもたらされる。前記抗体は、グリコシル化されているが、本質的にコアフコシル化が十分ではない。
【背景技術】
【０００２】
背景
免疫チェックポイントタンパク質阻害
分化クラスター274(CD274)またはB7ホモログ1(B7-H1)としても公知のプログラム死リガンド1(PD-L1)は、ヒトにおいてCD274遺伝子にコードされているタンパク質であり、免疫チェックポイントタンパク質を指す。
【０００３】
これは、T細胞およびB細胞、樹状細胞(DC)、マクロファージ、間葉系幹細胞、ならびに骨髄由来マスト細胞などの免疫細胞において構成的に発現されている(Yamazaki et al., 2002, J. Immunol. 169: 5538-45（非特許文献1）)。Keir et al. (2008), Annu. Rev. Immunol. 26: 677-704（非特許文献2）によれば、PD-L1は、角膜、肺、血管上皮、肝非実質細胞、間葉系幹細胞、膵島、胎盤合胞体栄養細胞、ケラチン生成細胞などの幅広い非造血細胞においても発現され得る。さらに、PD-L1の上方調節が、いくつかの細胞型において該細胞の活性化後に実現される。組織自己免疫疾患、同種移植、および他の疾患状態の間に免疫系を抑制する際に、主要な役割はPD-L1が持っているとされた。
【０００４】
PD-L1は、プログラム死-1受容体(PD-1)(CD279)に結合し、これにより、T細胞活性化を調節する重要な負の共刺激シグナルが提供される。PD-1は、T細胞、B細胞、ナチュラルキラーT細胞、活性化単球、およびDCなどあらゆる種類の免疫細胞において発現され得る。PD-1は、活性化されたヒトCD4+T細胞およびCD8+T細胞、B細胞、ならびに骨髄性細胞によって発現されるが、刺激されていないCD4+T細胞およびCD8+T細胞、B細胞、ならびに骨髄性細胞によっては発現されない。さらに、PD-L1への結合に加えて、PD-1はまた、そのリガンド結合パートナーPD-L2(B7-DC、CD273)にも結合する。PD-1は、CD28およびCTLA-4に関係しているが、ホモ二量体化を可能にする膜近位システインを欠いている。
【０００５】
一般に、PD-1へのPD-L1の結合により、CD8+T細胞の増殖を減少させる阻害シグナルが伝達される。
【０００６】
PD-L1はまた、B7.1(CD80)の結合パートナーとみなされてもいる(Butte et al., 2007, Immunity 27: 111-22（非特許文献3）)。化学的架橋の研究から、PD-L1およびB7.1がそれらのIgV様ドメインを介して相互作用できることが示唆されている。さらに、B7.1-PD-L1相互作用は、阻害シグナルをT細胞に誘導することもできる。
【０００７】
T細胞がPD-L1に対する公知のあらゆる受容体がない(すなわち、PD-1およびB7.1がない)場合、T細胞増殖はもはや減らない。言い換えると、PD-L1とT細胞表面のその受容体PD-1との結合が減ると、T細胞受容体を介した、IL-2産生およびT細胞増殖の活性化が起こる。したがって、PD-L1は、B7.1またはPD-1のいずれかを介して、T細胞を阻害する際に特有の役割を果たしている。
【０００８】
がん細胞も、同様にPD-L1を上方調節し、それによってがんが宿主の免疫系を回避することを可能にし得る。PD-L1は、限定されるわけではないが、癌腫、肉腫、リンパ腫および白血病、胚細胞腫瘍、ならびに芽細胞腫を含む様々な異なるがんタイプにおいて発現される。ホスファターゼ・テンシン・ホモログ(PTEN)、すなわちホスファチジルイノシトール3-キナーゼ(PI3K)およびAktシグナル伝達を改変する細胞ホスファターゼの減少または阻害により、がんにおける転写後PD-L1発現が増大した(Parsa et al., 2007, Nat. Med. 13: 84-88（非特許文献4）)。
【０００９】
特に、がん治療のため(例えば腫瘍免疫)および急性または慢性の感染症に対するT細胞免疫の増強は、PD-L1シグナル伝達の阻害と強い関連がある。
【００１０】
したがって、がんに対する治療的処置として、治療法においてがん細胞を標的とすることができる、PD-L1/PD-1軸(例えば、抗PD-L1もしくは抗PD-1)またはPD-L1/CD80相互作用を標的とする特異的抗体を適用することが一般的であり、これは非常に有望であり臨床的に証明された概念である。
【００１１】
ADCC活性およびADCP活性
抗体依存性細胞障害(ADCC)および抗体依存性細胞媒介性食作用(ADCP)などの細胞性細胞障害エフェクター機能をもたらす能力は、抗体の抗腫瘍効力の増強を可能にするための有望な手段である。
【００１２】
通常、IgGクラス抗体の場合、ADCCおよびADCPは、Fc領域が特異的ないわゆるFcγ受容体(FcγR)と結合することによってもたらされる。ヒトでは3つのクラスの受容体がある:FcγRI(CD64)、アイソフォームFcγRIIa、FcγRIIb、およびFcγRIIcを含むFcγRII(CD32)、ならびにアイソフォームFcγRIIIaおよびFcγRIIIbを含むFcγRIII(CD16)。いずれのFcγRも、IgG Fc表面の同じ領域に結合し、それらの親和性が異なるにすぎず、FcγRIが高い親和性を有しており、FcγRIIおよびFcγRIIIが低い親和性を有している。したがって、最適化されたFcγR親和性を有する抗体は、より優れた機能性を得て、より優れた細胞性抗腫瘍効果を治療法においてもたらし得る。
【００１３】
ADCCは、抗体が、そのFab領域によって標的細胞抗原に結合し、エフェクター細胞表面のFc受容体へのFc部分の結合によってエフェクター細胞を動員し、その結果、IFN-γのようなサイトカインならびに標的細胞に侵入し細胞死を促進するパーフォリンおよびグランザイムを含む細胞障害性顆粒を放出する、メカニズムである。特に、標的とするがん細胞に対してADCC活性をもたらす際にFcγRIIIaが最も重要な役割を果たしていることが判明した。
【００１４】
Fc領域のオリゴ糖構造の改変(Fc N-グリコシル化)が、Fc受容体への抗体の結合に主に影響し、ADCC活性を増強するための確立されたアプローチであることが、文献から公知である。一般に、グリコシル化それ自体およびグリコフォームの変化が、IgG抗体の生物学的機能に影響を及ぼすことによって重要な役割を果たすことが公知である。
【００１５】
通常、グリコシル化抗体は、CH2ドメイン中のEU命名法に基づく保存された各アスパラギン297(N297)の位置に2つのN結合型オリゴ糖を含み得る。典型的には、抗体の各N297に結合しているN-グリカンは、複合型のものでよいが、高マンノース型またはハイブリッド型のN-グリカンが抗体の各N297に連結されてもよい。複合型N-グリコシル化は、バイセクティングN-アセチルグルコサミンおよびコアフコース(抗体に結合しているN-アセチルグルコサミンにα-1,6連結され得る)の存在/非存在の違いがあるマンノシル-キトビオースコア(Man3GlcNAc2-Asn)を特徴とし得る。さらに、複合型N-グリコシル化は、ガラクトース部分およびシアル酸部分によってアンテナが任意で延長される、マンノシル-キトビオースコア(Man3GlcNAc2-Asn)に連結されたアンテナ型N-アセチルグルコサミンを特徴とし得る。さらに、アンテナ型のフコースおよび/またはN-アセチルガラクトサミンも、同様にアンテナの延長部の一部分であってよい。
【００１６】
がん細胞は、「腫瘍関連ムチン1エピトープTA-MUC1」を上方調節するため、ADCC活性は一般に、TA-MUC1陽性がん細胞を標的とする抗体の適用によるがん療法において重要な役割を果たす。
【００１７】
TA-MUC1はがん細胞表面に存在するが正常細胞表面に存在しないか、かつ/または腫瘍細胞表面に存在する場合にのみ、宿主の血液循環中の抗体はTA-MUC1に接近できるが、正常細胞表面に存在する場合には接近できない。TA-MUC1を標的とすることにより、腫瘍中への特異的な方向付けおよび蓄積が実現する。TA-MUC1の過剰発現は、結腸がん、乳がん、卵巣がん、肺がん、および膵がんとしばしば関連している。
【００１８】
T細胞活性化の増強
T細胞が、活性化された抗原提示細胞(APC)の表面のペプチド:MHC複合体の形態の特異的抗原に初めて出会うと、ナイーブT細胞が活性化される。最も重要な抗原提示細胞は、非常に特殊な樹状細胞(DC)であり、抗原を取り込み提示することによって機能する。組織樹状細胞は、感染部位で抗原を取り込み、先天性免疫応答の一環として活性化される。次いで、これらは局所リンパ組織に移動し、再循環T細胞に抗原を提示するのに非常に効果的である細胞へと成熟する。これらの成熟樹状細胞の特徴付けは、ナイーブT細胞をエフェクターT細胞に活性化する際に抗原と協同する共刺激分子として公知である表面分子に基づく。
【００１９】
DCによってT細胞に提示されるペプチド抗原(例えば、細胞内および細胞外)に応じて、異なるT細胞が活性化される。細胞外ペプチドは、MHCクラスII分子によって細胞表面に運ばれ、CD4 T細胞に対して提示される。とりわけ、TH1およびTH2と呼ばれる2つの主要タイプのエフェクターT細胞が、それから分化する。細胞内抗原は、MHCクラスI分子によって細胞表面に運ばれ、CD8 T細胞に対して提示される。細胞障害性T細胞に分化した後、それらは、がん細胞のような感染した標的細胞を死滅させる。(Janeway et al., 2001, “Immunobiology: The Immune System in Health and Disease”, Garland Science, 5th edition（非特許文献5）)。したがって、がん療法およびまた他の疾患において、T細胞活性化は重要な役割を果たす。
【００２０】
本発明の目的は、様々な治療用途に使用され得る改良された抗体を提供することである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】Yamazaki et al., 2002, J. Immunol. 169: 5538-45
【非特許文献２】Keir et al. (2008), Annu. Rev. Immunol. 26: 677-704
【非特許文献３】Butte et al., 2007, Immunity 27: 111-22
【非特許文献４】Parsa et al., 2007, Nat. Med. 13: 84-88
【非特許文献５】Janeway et al., 2001, “Immunobiology: The Immune System in Health and Disease”, Garland Science, 5th edition
【発明の概要】
【００２２】
本発明は、80％より多いコアフコシル化を含むグリコシル化された抗体と比較して増強されたT細胞活性化をもたらす抗体を提供し、参照抗体は、好ましくはCHOdhfr-(ATCC番号CRL-9096)から得ることができる。特に、本発明は、80％より多いコアフコシル化を含むグリコシル化された抗体と比較して増強されたT細胞活性化をもたらす、本質的にコアフコシル化が十分ではないグリコシル化抗体を想定し得る。好ましくは、本発明の抗体は、0％〜80％フコシル化されていてよい。
【００２３】
本発明の抗体は、グリコシル化されていない参照抗体と比較しても、増強されたT細胞活性化をもたらし得る。さらに、本発明の該T細胞活性化は、FcγRIIIaへの増強された結合を特徴とする本発明の抗体によってもたらされ得る。
【００２４】
本発明はまた、前記グリコシル化がヒトグリコシル化である抗体も包含し得る。さらに、80％より多いコアフコシル化を含む参照抗体のグリコシル化は、ヒトグリコシル化であってもよい。
【００２５】
さらに、本発明は、細胞株NM-H9D8-E6(DSM ACC 2807)、NM-H9D8-E6Q12(DSM ACC 2856)、またはそれらに由来する細胞もしくは細胞株から得ることができる可能性がある抗体も企図し得る。本発明の抗体はまた、1つまたは複数の配列変異も含み得、その場合、好ましくは、該抗体のFcγRIIIaへの結合は、非変異抗体と比較して増加している。さらに、本発明は、EU命名法に基づくS238D、S239D、I332E、A330L、S298A、E333A、L334A、G236A、およびL235Vより選択される1つまたは複数の配列変異を含む可能性がある本発明の抗体も提供し得る。
【００２６】
本発明はさらに、T細胞活性化が、樹状細胞の成熟化ならびに/または共刺激分子および成熟化マーカーの発現を伴う可能性があり、かつ該T細胞活性化が、CD25、CD69、および/またはCD137発現によって検出可能である可能性がある、本発明の抗体も企図し得る。
【００２７】
本発明は、好ましくはPD-L1抗体である抗体を提供し得る。本発明の該PD-L1抗体は、二機能性単特異性抗体または三機能性二重特異性抗体であってよい。三機能性二重特異性抗体である場合、該PD-L1抗体は、好ましくはTA-MUC1であるがん抗原にさらに結合することができる。さらに、本発明の該PD-L1抗体は、Fc領域も含み得る。
【００２８】
本発明は、好ましくはTA-MUC1抗体である本発明の抗体を提供し得る。該TA-MUC1抗体は、二機能性単特異性抗体または三機能性二重特異性抗体であってよい。三機能性二重特異性抗体である場合、該TA-MUC1抗体は、好ましくはPD-L1である免疫チェックポイントタンパク質にさらに結合することができる。さらに、本発明の該TA-MUC1抗体は、Fc領域、およびPD-L1に結合する単鎖Fv領域を含み得る。さらに、該TA-MUC1抗体は、TA-MUC1に結合するVHドメインおよびVLドメインも含み得る。該TA-MUC1抗体の単鎖Fv領域は、軽鎖の定常ドメインまたはFc領域のCH3ドメインに結合されてよい。
【００２９】
本発明は、治療法において使用するための、本発明の抗体、単特異性もしくは二重特異性のPD-L1抗体、および/または単特異性もしくは二重特異性のTA-MUC1抗体を提供し得る。さらに、本発明は、T細胞を活性化するための方法において使用するための、抗体、単特異性もしくは二重特異性のPD-L1抗体、および/または単特異性もしくは二重特異性のTA-MUC1抗体も提供し得る。さらに、本発明は、T細胞の活性化が、好ましくは、がん疾患、炎症性疾患、ウイルス感染症、および自己免疫疾患の治療のためである、本発明の抗体も包含し得る。特に、がん疾患は、肺がん、腎臓がん、膀胱がん、胃腸がん、皮膚がん、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、および前立腺がんを含む、黒色腫、癌腫、リンパ腫、肉腫、および中皮腫より選択され得る。さらに、炎症性疾患は、炎症性腸疾患(IBD)、骨盤内炎症性疾患(PID)、虚血性脳卒中(IS)、アルツハイマー病、喘息、尋常性天疱瘡、皮膚炎/湿疹より選択され得る。ウイルス感染症は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、単純ヘルペスウイルス(HSV)、エプスタイン・バーウイルス(EBV)、インフルエンザウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)、B型肝炎ウイルス(HBV)、C型肝炎ウイルス(HCV)より選択され得る。さらに、自己免疫疾患は、糖尿病(DM)、I型、多発性硬化症(MS)、全身性エリテマトーデス(SLE)、関節リウマチ(RA)、白斑、乾癬および乾癬性関節炎、アトピー性皮膚炎(AD)、強皮症、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変、ギラン・バレー症候群、グレーブス病、セリアック病、自己免疫性肝炎、強直性脊椎炎(AS)より選択され得る。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】コアフコシル化の測定。単特異性PDL-GEX Fuc-および二重特異性PM-PDL-GEX Fuc-は、単特異性PDL-GEX H9D8および二重特異性PM-PDL-GEX H9D8と比較して、コアフコシル化が減少している。単特異性抗体PDL-GEX H9D8およびPDL-GEX Fuc-ならびに二重特異性抗体PM-PDL-GEX H9D8およびPM-PDL-GEX Fuc-のコアフコシル化N-グリカンの相対的モル量が、本明細書で示される。単特異性PDL-GEX H9D8および二重特異性PM-PDL-GEX H9D8は、それぞれ92％および91％のコアフコシル化N-グリカンを含み、したがって、正常フコシル化と呼ばれる。単特異性PDL-GEX Fuc-および二重特異性PM-PDL-GEX Fuc-は、ごく低比率のコアフコシル化N-グリカン、好ましくはPDL-GEX Fuc-の場合は4％、PM-PDL-GEX Fuc-の場合は1％しか含まず、したがって、フコース減少と呼ばれる。このことは、実施例1で説明される。
【図２】フコース減少抗体および正常フコシル化抗体の妨害能力。フコース減少抗PD-L1 hIgG1およびフコース減少二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1は、それらの正常フコシル化対応物と比較して同程度の妨害能力を示す: (A)PD-1結合の濃度依存的妨害が4種の変種すべてについて検出され、PD-L1/PD-1ブロッキングELISAにおいて、正常な抗PD-L1 hIgG1とフコース減少抗PD-L1 hIgG1(PDL-GEX-H9D8およびPDL-GEX-Fuc-)の間、および正常な二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1とフコース減少二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1(PM-PDL-GEX-H9D8およびPM-PDL-GEX-Fuc-)の間で、それぞれ差異は検出されなかった。二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1の阻害のわずかな低減は、おそらく、抗PD-L1 hIgG1が抗PD-L1 scFv型に変わることに起因する。(B)試験された4種の変種すべて(PDL-GEX-H9D8、PDL-GEX-Fuc-、PM-PDL-GEX-H9D8、およびPM-PDL-GEX-Fuc)は、PD-L1とCD80の相互作用の効果的な阻害を示し、グリコシル化変種間(フコース減少対正常フコシル化)で明らかな差異は検出されなかった。このことは、実施例2で説明される。
【図３】TA-MUC1への結合能力。フコース減少二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1および正常フコシル化二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1(PM-PDL-GEX Fuc-およびPM-PDL-GEX-H9D8)はどちらも、同程度のTA-MUC1結合を示す。予想されるとおり、単特異性抗PD-L1(PDL-GEX H9D8)は、乳がん細胞株ZR-75-1に対して結合を示さない。このことは、実施例3で説明される。
【図４】FcyRIIIaへの結合能力。抗PD-L1 hIgG1および二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1のフコース減少変種は、正常フコシル化変種と比較して、FcyRIIIaへの結合の増加を示す:抗PD-L1 hIgG1および二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1の異なるフコシル化変種の比較が、本明細書で示される。フコース減少抗PD-L1(PDL-GEX Fuc-)は、正常フコシル化抗PD-L1 hIgG1(PDL-GEX H9D8)と比較してEC50値が減少していることから、正常フコシル化変種と比較してフコース減少変種のFcγRIIIaへの結合が約5倍に増強されていることが実証されている。二重特異性フコース減少抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1および二重特異性正常フコシル化抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1は、同じ実験で比較されなかったが、正常フコシル化参照抗体と比較した相対効力(参照抗体のEC50/試験抗体のEC50)を計算することによって定量的に比較された。二重特異性正常フコシル化抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1(PM-PDL-GEX H9D8)の場合、相対効力は1.9と定められた。一方、二重特異性フコース減少抗PD-L1/TA-MUC-1 hIgG1(PM-PDL-GEX Fuc-)の相対効力は、10.4と定められた。このことから、FcγRIIIaへの結合もまた、正常フコシル化対応物(PM-PDL-GEX H9D8)と比較して、フコース減少変種(PM-PDL-GEX Fuc-)の場合に約5倍に増強されている。このことは、実施例4で説明される。
【図５】TA-MUC+およびPD-L1+腫瘍細胞に対するADCC活性の測定。フコース減少抗PD-L1 hIgG1およびフコース減少二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1は、それらの正常フコシル化対応物と比較して、TA-MUC+およびPD-L1+腫瘍細胞の死滅の増加を示す: (A)FcγRIIIaへの結合の増加が原因で、フコース減少二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1(PM-PDL-GEX Fuc-)は、高レベルのTA-MUC1およびほんのわずかなレベルのPD-L1を発現する乳がん細胞株ZR-75-1に対して、正常フコシル化二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1(PM-PDL-GEX-H9D8)と比較して強く増強されたADCC活性を示す。これらの標的細胞は最小限のPD-L1を発現する/PD-L1を発現しないため、単特異性抗PD-L1抗体(PDL-GEX Fuc-およびPDL-GEX H9D8)は、予想されるとおり、ADCCを示さない。前立腺がん細胞株DU-145は、PD-L1を強く発現し(B)、中程度のTA-MUC1発現を有する(C)。(D)フコース減少抗PD-L1(PDL-GEX Fuc-)およびフコース減少二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1(PM-PDL-GEX Fuc-)は、それらの正常フコシル化対応物と比較して、PD-L1陽性腫瘍細胞に対する強く増強されたADCCをもたらす。二重特異性型のADCC作用がそれらの対応する単特異性抗PD-L1 hIgG1と比較して少し低減しているのは、おそらく、抗PD-L1 hIgG1が抗PD-L1 scFv型に変わることに起因する。このことは、実施例5で説明される。
【図６】PD-L1+ PBMCに対するADCC活性の測定。フコース減少抗PD-L1 hIgG1およびフコース減少二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1は、PD-L1+PBMCに対してADCC作用を示さない。驚くべきことに、フコース減少抗PD-L1(PDL-GEX-Fuc-)およびフコース減少二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1(PM-PDL-GEX-Fuc-)によってB細胞(A)および単球(B)に対してもたらされるADCC作用は検出されなかった。対照的に、陽性対照Gazyvaro(登録商標)は、初代B細胞およびダウディ細胞の両方の死滅を誘導する。単球については、陽性対照としてのスタウロスポリンが、単球およびTHP-1対照細胞の死滅を誘導する。このことは、実施例6で説明される。
【図７】PD-1/PD-L1遮断の測定。フコース減少二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1および正常フコシル化二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgGは、細胞ベースのPD-1/PD-L1遮断バイオアッセイ法において、同等の結果を示す。PD-L1/PD-1ブロックELISAによれば、フコース減少(PM-PDL-GEX Fuc-)および正常フコシル化(PM-PDL-GEX H9D8)二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1の両方について、PD-1/PD-L1ブレイクの同程度の用量依存的放出が検出された(図1を参照されたい)。予想されるとおり、ニボルマブは陽性対照として有効であった。このことは、実施例7で説明される。
【図８】MLRにおけるIL-2の測定。フコース減少二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1および正常フコシル化二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1ならびにフコース減少抗PD-L1 hIgG1は、同種異系混合リンパ球反応(MLR)において、同程度のIL-2を誘導する。(A)フローサイトメトリーによってmoDCの表現型を解析する典型的な実験。MoDCは、共刺激分子CD80およびCD86、DCマーカーCD209、ならびにMHCクラスII表面受容体HLA-DRを発現した。さらに、moDCは、CD16(FcγRIII)およびCD274(PD-L1)も発現することが判明した。(B)フコース減少二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1(PM-PDL-GEX Fuc-)および正常フコシル化二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1(PM-PDL-GEX H9D8)ならびにフコース減少抗PD-L1 hIgG1(PDL-GEX Fuc-)が同程度の量のIL-2を誘導したことから、IL-2分泌に対する脱フコシル化の影響は検出されなかった。このことは、実施例8で説明される。
【図９】T細胞活性化の測定。フコース減少抗PD-L1 hIgG1およびフコース減少二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1は、正常フコシル化対応物およびFcyR結合能力がない/弱い抗PD-L1抗体と比較して、増大したT細胞活性化を示す。同種異系MLRにおいて異なる3名の健常志願者((A)=ドナー1、(B)=ドナー2、および(C)=ドナー3)に由来する単離T細胞を用いて得られる結果から、フコース減少抗PD-L1 hIgG1(PDL-GEX Fuc-)およびフコース減少二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1(PM-PDL-GEX Fuc-)が、それらの正常フコシル化単特異性抗PD-L1 hIgG1(PDL-GEX H9D8)対応物および正常フコシル化二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1(PM-PDL-GEX H9D8)対応物と比較して、また、FcyR結合能力がない/弱い抗PD-L1抗体(アテゾリズマブ)と比較して、増強されたT細胞活性化を誘導することが実証されている。このことは、実施例9で説明される。
【図１０】単離T細胞および全PBMCを用いるMLRにおけるT細胞活性化の測定。フコース減少抗PD-L1 hIgG1およびフコース減少二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1は、単離T細胞および全PBMCを用いるMLRにおいて、正常フコシル化対応物およびFcyR結合能力がない/弱い抗PD-L1と比較して、増大したT細胞活性化を示す。フローサイトメトリー解析により、MLRにおける応答細胞としてT細胞(A、B)またはPBMC(C、D)のいずれかを用いて、CD3+CD8+細胞におけるCD25およびCD137の発現に基づいて測定した場合、フコース減少単特異性抗PD-L1 hIgG1(PDL-GEX Fuc-)およびフコース減少二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1(PM-PDL-GEX Fuc-)が、正常フコシル化単特異性抗PD-L1 hIgG1(PDL-GEX H9D8)、二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1(PM-PDL-GEX H9D8)と比較して、ならびにFcyR結合能力がない/弱い抗PD-L1(アテゾリズマブ)と比較して、より強いCD8 T細胞活性化を誘導することが示されている。さらに、moDCをPBMCと共に培養すると、CD25(E)およびCD137(F)の発現に基づいて測定した場合、フコース減少単特異性PDL-GEX Fuc-およびフコース減少二重特異性PM-PDL-GEX Fuc-が原因で、CD4 T細胞活性化(CD3+CD8-細胞、故にCD4 T細胞)が増大し、これは、単離T細胞を用いるMLRで先に観察されていなかった。このことは、実施例10で説明される。
【図１１】T細胞におけるCD69発現の測定。フコース減少抗PD-L1 hIgG1およびフコース減少二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1はまた、T細胞におけるCD69発現も増大させる。フローサイトメトリー解析により、フコース減少単特異性抗PD-L1 hIgG1(PDL-GEX Fuc-)およびフコース減少二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1(PM-PDL-GEX Fuc-)が、正常フコシル化単特異性抗PD-L1 hIgG1(PDL-GEX H9D8)および正常フコシル化二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1(PM-PDL-GEX H9D8)と比較して、CD8 T細胞における強いCD69発現を誘導することが示されている。このことは、実施例11で説明される。
【図１２】FcyRおよびT細胞活性化のためのその非常に重要な役割。moDCおよび単離T細胞を用いるこの同種異系MLRによって、FcyR結合が、フコース減少抗PD-L1抗体によるT細胞活性化の増大のために非常に重要な役割を果たしていることが示される。フコース減少抗PD-L1 hIgG1(PDL-GEX Fuc-)によって増大されたT細胞活性化は、無関係な特異性を有する別のフコース減少抗体(ブロックと名付けられる)(その抗原はMLR中に存在していない)の添加により、正常フコシル化抗PD-L1 hIgG1(PDL-GEX H9D8)またはFcyR結合能力がない/弱い非グリコシル化抗PD-L1 hIgG1(アテゾリズマブ)と同等のレベルまで阻害された。このことは、実施例12で説明される。
【図１３】樹状細胞の成熟化の測定。脱フコシル化抗PD-L1 hIgG1の存在下では、樹状細胞は、正常フコシル化抗PD-L1 hIgG1の場合と比較して、より成熟した表現型を示す。フコース減少抗PD-L1 hIgG1(PDL-GEX Fuc-)の存在下では、moDCは、正常フコシル化抗PD-L1 hIgG1(PDL-GEX H9D8)の場合と比較して、少ないCD14発現(A)を示す。対照的に、CD16(FcγRIII)(B)ならびに共刺激分子CD40(C)およびCD86(E)、ならびにDCマーカーCD83(D)は、正常フコシル化抗PD-L1 hIgG1と比較して、フコース減少抗PD-L1 hIgG1の存在下の方が、より高いレベルで発現された。このことは、実施例13で説明される。
【図１４】細胞障害に基づいて測定される、T細胞活性化。PDL-GEX Fuc-を用いてT細胞を活性化した結果、PDL-GEX H9D8、アテゾリズマブ、および培地対照(培地対照=試験抗体を添加しないMLR後のT細胞)と比較して、細胞障害が増大した。この効果は、2名の異なる健常志願者((A)=ドナー2、(B)=ドナー3、図9で使用されたのと同じドナーを指す)に由来するT細胞を用いて示された。このことは、実施例14で説明される。
【図１５】様々な量のコアフコシル化を含む抗PD-L1 hIgG1を用いたT細胞活性化。CD8+ T細胞におけるCD137(A)およびCD25(B)の発現に基づいて測定したところ、PDL-GEXによるT細胞の活性化は、コアフコシル化の量に依存していた。培地およびアテゾリズマブ(TECENTRIQ)は、対照としての機能を果たした。このことは、実施例15で説明される。
【図１６】Fc部分に変異を有する抗PD-L1抗体の同程度の抗原結合。PDL-GEX H9D8(非変異)と、3つのアミノ酸変更、すなわちEU命名法に基づくS239D、I332E、およびG236AをFc部分に含むPDL-GEX H9D8 mut1と、5つのアミノ酸変更、すなわちEU命名法に基づくL235V、F243L、R292P、Y300L、およびP396Lを含むPDL-GEX H9D8 mut2との間で、PD-L1結合の明らかな差異は観察されなかった。このことは、実施例16で説明される。
【図１７】Fc部分に変異を有する抗PD-L1抗体の、増加したFcyRIIIa結合。PM-PDL-GEX H9D8 mut1およびPM-PDL-GEX H9D8 mut2は、非変異PDL-GEX H9D8と比較して増加したFcyRIIIa結合を示し、これは、より低い有効濃度への移動によって可視化された。このことは、実施例17で説明される。
【図１８】Fc部分に変異を有する抗PD-L1抗体の、増大したT細胞活性化。PM-PDL-GEX mut1およびPDL-GEX mut2は、PDL-GEX H9D8(非変異)と比較して、増大したT細胞活性化を示すことから、脱フコシル化抗PD-L1抗体(PDL-GEX Fuc-)を用いることによって、またはFcyRIIIaへの結合の増強をもたらす配列変異を含む抗PD-L1抗体を用いることによって、T細胞活性化の増強を実現できることが実証される。このことは、実施例18で説明される。
【図１９】増殖によって可視化された、脱フコシル化抗PD-L1抗体が原因で増強されたT細胞活性化。脱フコシル化抗PD-L1抗体(PDL-GEX Fuc-)は、正常フコシル化抗PD-L1抗体(PDL-GEX H9D8)と比較して、および非グリコシル化抗PD-L1(アテゾリズマブ)と比較して、増加したCD8 T細胞増殖を示す。このことは、実施例19で説明される。
【図２０】がん細胞の存在下でのT細胞活性化の増強。脱フコシル化抗PD-L1(PDL-GEX Fuc-)および脱フコシル化二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1抗体(PM-PDL-GEX Fuc-)を、MLRにおいてがん細胞の存在下でT細胞活性化を誘導する能力について比較した。しかし、PDL-GEX Fuc-およびPM-PDL-GEX Fuc-による活性化の強化が、試験したすべてのがん細胞株の存在下で観察された。このことは、実施例20で説明される。
【図２１】PDL-GEX CDR変異体は、非変異対応物と比較して、同程度の結合能力および妨害能力を示す。(A)PD-L1に結合するVHドメインのCDR中に様々な変異を有するフコース減少PDL-GEX、例えば:PDL-GEX Fuc- CDRmut a(SEQ ID NO: 60+SEQ ID NO: 68)、PDL-GEX Fuc- CDRmut b(SEQ ID NO: 62+SEQ ID NO: 69)、PDL-GEX Fuc- CDRmut c(SEQ ID NO: 63+SEQ ID NO: 70)、PDL-GEX Fuc- CDRmut d(SEQ ID NO: 64)、PDL-GEX Fuc- CDRmut e(SEQ ID NO: 65+SEQ ID NO: 71)、PDL-GEX Fuc- CDRmut f(SEQ ID NO: 66+SEQ ID NO: 72)、PDL-GEX Fuc- CDRmut g(SEQ ID NO: 63+SEQ ID NO: 72)、PDL-GEX Fuc- CDRmut h(SEQ ID NO: 67+SEQ ID NO: 74)、PDL-GEX Fuc- CDRmut i(SEQ ID NO: 63+SEQ ID NO: 68)もまた、PD-L1発現Du-145細胞およびフローサイトメトリー解析を用いた場合、非変異PDL-GEX Fuc-と同程度のPD-L1結合能力を示す。(B)フコース減少PDL-GEXのCDR変異体(Aを参照されたい)はまた、PD-L1/PD1ブロッキングELISAを用いた場合は、非変異PDL-GEX Fuc-と同程度の妨害能力を示す。このことは、実施例21で説明される。
【図２２】PM-PDL-GEX CDR変異体は、非変異対応物と比較して、同程度の結合能力および妨害能力を示す。(A)PD-L1に結合するscFv領域のVHドメインのCDR中に様々な変異を有するフコース減少PM-PDL-GEX、例えば、PM-PDL-GEX Fuc- CDRmut a(SEQ ID NO: 64)またはPM-PDL-GEX Fuc- CDRmut b(SEQ ID NO: 66+SEQ ID NO: 72)は、PD-L1抗原ELISAを用いた場合、非変異PM-PDL-GEX Fuc-と同程度のPD-L1結合能力を示す。(B)フコース減少PM-PDL-GEXのCDR変異体はまた、PD-L1/PD1ブロッキングELISAを用いた場合は、非変異PM-PDL-GEX Fuc-と同程度の妨害能力を示す。(C)VHドメインのCDR中に様々な変異を有するフコース減少PM-PDL-GEXは、TA-MUC1発現T-47Dおよびフローサイトメトリー解析を用いた場合、非変異 PM-PDL-GEX Fuc-と同程度のTA-MUC1結合能力を示す。このことは、実施例22で説明される。
【図２３】PM-PDL-GEX CDR変異体は、非変異対応物と同程度の、CD8 T細胞の増強された活性化を示す。PD-L1に結合するscFv 領域のVH ドメインのCDR中に様々な変異を有するフコース減少PM-PDL-GEX、例えば、PM-PDL-GEX Fuc- CDRmut a(SEQ ID NO: 64)またはPM-PDL-GEX Fuc- CDRmut b(SEQ ID NO: 66+SEQ ID NO: 72)は、非変異PM-PDL-GEX Fuc-と同程度の、増強されたCD8 T細胞活性化(CD8 T細胞のCD25+細胞)を示す。CDRが変異したPM-PDL-GEX H9D8変種は、非変異PM-PDL-GEX H9D8と同程度に、CD8 T細胞を活性化した。このことは、実施例23で説明される。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
発明の詳細な説明
本発明の解決法を以下に説明し、添付の実施例において例証し、図に例示し、特許請求の範囲で示す。
【００３２】
本発明は、80％より多いコアフコシル化を含むグリコシル化された参照抗体と比較して、本質的にコアフコシル化が十分ではなく、増強されたT細胞活性化をもたらす、グリコシル化抗体を提供する。
【００３３】
本発明の抗体は、フコース減少単特異性抗PD-L1 hIgG1およびフコース減少二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1とみなすことができ、これらは、好ましくは、細胞株NM-H9D8-E6 (DSM ACC 2807)、NM-H9D8-E6Q12 (DSM ACC 2856)、またはそれらに由来する細胞もしくは細胞株から得ることができる。単特異性フコース減少抗体および二重特異性フコース減少抗体は、Fc領域およびFc領域に結合した複合型N結合型糖鎖を含み得、その際、Fc領域に結合している複合型N結合型糖鎖全体において、フコース減少抗体に対する1,6-コア-フコースの含有量は、0％〜80％である。
【００３４】
好ましくは、本発明の宿主細胞は、無血清条件下で増殖し、本発明の前記フコース減少単特異性抗体およびフコース減少二重特異性抗体を産生する、1つの細胞、複数の細胞、または細胞株NM-H9D8-E6(DSM ACC 2807)および/もしくはNM-H9D8-E6Q12(DSM ACC 2856)であってよい。また、以下では、無血清条件下で増殖する細胞であって、前記フコース減少単特異性抗体およびフコース減少二重特異性抗体をコードする核酸がこれらの細胞に導入され得、かつ前記フコース減少単特異性抗体およびフコース減少二重特異性抗体が無血清条件下で単離され得る、細胞が好ましい可能性がある。
【００３５】
単特異性フコース減少抗体とは、好ましくは、抗PDL1-GEX Fuc-(略語: PDL-GEX-Fuc-)を指し、二重特異性フコース減少抗体とは、二重特異性PankoMab-抗PDL1-GEX Fuc-(略語: PM-PDL-GEX-Fuc-)を指す。この名称は同義的に使用することができる。
【００３６】
本発明の単特異性フコース減少抗体および二重特異性フコース減少抗体を試験し、コアフコシル化、PD-L1妨害能力、FcγRIIIaへの結合、TA-MUC1および/またはPD-L1を発現する細胞への結合、ADCC活性、ならびにT細胞活性化に関して、参照抗体と比較した。参照抗体として、正常フコシル化単特異性抗PDL-GEX(略語:PDL-GEX-H9D8)および正常フコシル化二重特異性抗PM-PDL-GEX(略語:PM-PDL-GEX H9D8)を使用した。これらは、80％より多いコアフコシル化を含むようにグリコシル化されており、好ましくは、CHOdhfr-(ATCC番号CRL-9096)から得ることができる。やはり、この名称は同義的に使用することができる。
【００３７】
最初に、単特異性抗体PDL-GEX H9D8およびPDL-GEX Fuc-ならびに二重特異性抗体PM-PDL-GEX H9D8およびPM-PDL-GEX Fuc-のN-グリコシル化を、HILIC-UPLC-HiResQToF MSMSによって解析した。単特異性抗体PDL-GEX H9D8およびPDL-GEX Fuc-ならびに二重特異性抗体PM-PDL-GEX H9D8およびPM-PDL-GEX Fuc-のコアフコシル化N-グリカンの相対的モル量が、図1に示されている。
【００３８】
正常グリコシル化単特異性PDL-GEX H9D8および二重特異性PM-PDL-GEX H9D8は、80％より多いコアフコシル化N-グリカン(コアフコシル化)を含み得る。本発明は、好ましくは80％より多く100％より少ないコアフコシル化N-グリカンを含む正常グリコシル化抗体を想定する。本発明の正常グリコシル化抗体は、好ましくは、約81％〜100％、85％〜95％のフコシル化N-グリカンまたは90％〜95％のフコシル化N-グリカンを含み得る。本発明の正常フコシル化抗体は、PDL-GEX H9D8抗体の場合、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％より多いか、またはさらに100％のフコシル化N-グリカン、好ましくは約92％のコアフコシル化N-グリカンを含み得、PM-PDL-GEX H9D8の場合、好ましくは約91％のコアフコシル化N-グリカンを含み得る。したがって、80％より多いコアフコシル化N-グリカンを有するこれらの抗体は、正常フコシル化抗体に当てはまり得る。
【００３９】
フコース減少単特異性PDL-GEX Fuc-および二重特異性PM-PDL-GEX Fuc-は、ごく低比率のコアフコシル化N-グリカンしか含まない。本発明は、好ましくは0％〜80％フコシル化されているフコース減少抗体を提供する。本発明のフコース減少抗体は、好ましくは、約0％〜80％、0％〜75％、0％〜70％、0％〜65％、0％〜60％、0％〜55％、0％〜50％、0％〜45％、0％〜40％、0％〜35％、0％〜30％、0％〜25％、0％〜20％、0％〜15％、0％〜10％、または10％〜50％、15％〜50％、20％〜50％、25％〜50％、30％〜50％、35％〜50％、40％〜50％、45％〜50％、または1％〜20％、1％〜15％、1％〜10％、1％〜5％、または5％〜30％、5％〜20％、5％〜15％、または4％〜80％、4％〜75％、4％〜70％、4％〜65％、4％〜60％、4％〜55％、4％〜50％、4％〜45％、4％〜40％、4％〜35％、4％〜30％、4％〜25％、4％〜20％、4％〜15％、4％〜10％のフコシル化N-グリカンを含み得る。本発明のフコース減少抗体は、好ましくは、0％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20.0％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、40％、41％、42％、43％、44％、45.0％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61.0％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、またはさらに80％のフコシル化N-グリカンを含み得る。より好ましくは、本発明のフコース減少抗体は、5％未満のフコシル化N-グリカンを含み得る。最も好ましくは、PDL-GEX Fuc-抗体の場合は約4％のフコシル化N-グリカンであり、PM-PDL-GEX Fuc-抗体の場合は約1％のフコシル化N-グリカンである。したがって、0％〜80％フコシル化されているこれらの抗体は、フコース減少抗体に当てはまり得る。さらに、単特異性フコース減少抗体および二重特異性フコース減少抗体は、ATCC番号CRL-9096 (CHOdhfr-)において発現される場合にそれから単離された同じ量の抗体と比較して、少なくとも5％少ない値のフコシル化を有する可能性がある。
【００４０】
さらに、2種の異なる競合ELISAを本発明で適用して、抗PD-L1抗体およびそのscFv領域によってTA-MUC1に結合しPD-L1に結合することができる抗体が、PD-L1とその結合相手であるPD-1およびCD80との相互作用を阻害する能力を解析した。
【００４１】
第一に、PD-L1/PD-1ブロッキングELISAにおいて、フコース減少PDL-GEX Fuc-およびフコース減少二重特異性PM-PDL-GEX Fuc-を、それらの正常フコシル化対応物であるPDL-GEX H9D8およびPM-PDL-GEX H9D8と比較した。試験された4種の変種すべてにおいて、PD-1結合の濃度依存的な妨害が検出された。正常な単特異性抗PD-L1 hIgG1とフコース減少単特異性抗PD-L1 hIgG1の間、および正常な二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1とフコース減少二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1の間で、それぞれ差異は検出されなかった(図2A)。
【００４２】
第二に、関連するブロッキングELISAを前述したように開発し、ただし、PD-1の代わりにCD80リガンドを使用した。試験された4種の変種すべては、PD-L1とCD80の相互作用の効果的な阻害を示し、グリコシル化変種間(フコース減少対正常フコシル化)で明らかな差異は検出されなかった(図2B)。結論として、フコース減少抗体は、それらの正常フコシル化対応物と比較して、同程度の妨害能力を示す。
【００４３】
これらの結果は、PD-1/PD-L1遮断バイオアッセイ法(Promega)によって確認された。このバイオアッセイ法は、PD-1/PD-L1相互作用を妨害するように設計された抗体の効力を測定するのに使用できる生物発光細胞ベースのアッセイ法である。フコース減少二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1および正常フコシル化二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgGは、細胞ベースのPD-1/PD-L1遮断バイオアッセイ法において、同等の結果を示す(図7)。
【００４４】
これに加えて、VHドメインのCDR中に様々な変異を有するフコース減少PDL-GEXもまた、非変異PDL-GEX Fuc-と同程度のPD-L1結合能力を示し得ることも、さらに示された。フコース減少PDL-GEXの変異体はまた、非変異PDL-GEX Fuc-と同程度の妨害能力も示し得る。好ましくは、VHドメインのCDR中に変異を含む単特異性PD-L1抗体を含む:すなわち、(VHドメインのCDR1中のKabat番号付与に基づく29位にフェニルアラニンからイソロイシンへの変異を有する)SEQ ID NO: 60および(VHドメインのCDR2中のKabat番号付与に基づく52位にセリンからトレオニンへの変異を有する)SEQ ID NO: 68に示すアミノ酸配列を有するもの、または(VHドメインのCDR1中のKabat番号付与に基づく26位にグリシンからアラニンへの変異を有する)SEQ ID NO: 62および(VHドメインのCDR2中のKabat番号付与に基づく49位にアラニンからグリシンへの変異を有する)SEQ ID NO: 69に示すアミノ酸配列を有するもの、または(VHドメインのCDR1中のKabat番号付与に基づく34位にイソロイシンからメチオニンへの変異を有する)SEQ ID NO: 63および(VHドメインのCDR2中のKabat番号付与に基づく51位にイソロイシンからロイシンへの変異を有する)SEQ ID NO: 70に示すアミノ酸配列を有するもの、または(VHドメインのCDR1中のKabat番号付与に基づく26位にグリシンからアラニンへの変異を有し、かつKabat番号付与に基づく31位にアスパラギン酸からグルタミン酸への変異を有する)SEQ ID NO: 64に示すアミノ酸配列を有するもの、または(VHドメインのCDR1中のKabat番号付与に基づく31位にアスパラギン酸からグルタミン酸への変異を有する)SEQ ID NO: 65および(VHドメインのCDR2中のKabat番号付与に基づく63位にバリンからロイシンへの変異を有する)SEQ ID NO: 71に示すアミノ酸配列を有するもの、または(VHドメインのCDR1中のKabat番号付与に基づく28位にトレオニンからセリンへの変異を有する)SEQ ID NO: 66および(VHドメインのCDR2中のKabat番号付与に基づく62位にセリンからトレオニンへの変異を有する)SEQ ID NO: 72に示すアミノ酸配列を有するもの、または(VHドメインのCDR1中のKabat番号付与に基づく34位にイソロイシンからメチオニンへの変異を有する)SEQ ID NO: 63および(VHドメインのCDR2中のKabat番号付与に基づく62位にセリンからトレオニンへの変異を有する)SEQ ID NO: 72に示すアミノ酸配列を有するもの、または(VHドメインのCDR1中のKabat番号付与に基づく32位にセリンからトレオニンへの変異を有する)SEQ ID NO: 67および(VHドメインのCDR2中のKabat番号付与に基づく56位にセリンからトレオニンへの変異を有する)SEQ ID NO: 74に示すアミノ酸配列を有するもの、または(VHドメインのCDR1中のKabat番号付与に基づく34位にイソロイシンからメチオニンへの変異を有する)SEQ ID NO: 63および(VHドメインのCDR2中のKabat番号付与に基づく52位にセリンからトレオニンへの変異を有する)SEQ ID NO: 68に示すアミノ酸配列を有するもの(図21Aおよび21B)。
【００４５】
これらのデータから、PD-L1を発現する細胞を標的とすることは、本発明のフコース減少および正常フコシル化の単特異性抗体および二重特異性抗体を用いて、かつ/または本発明の該抗体のVHドメイン中に様々なCDR変異を有するフコース減少単特異性抗体を用いて達成できることが、明らかになる。
【００４６】
これに加えて、フコース減少抗体を、腫瘍細胞において発現されるTA-MUC1への結合に関してさらに特徴付けるために、正常フコシル化およびフコース減少の、二重特異性PM-PDL-GEX H9D8およびPM-PDL-GEX Fuc-の結合特性をフローサイトメトリーによって解析した。TA-MUC1発現は強いがPD-L1発現は最小限のみまたは発現しない乳がん細胞株ZR-75-1を用いて、TA-MUC1結合を測定した。フコース減少二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1および正常フコシル化二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1はどちらも、同程度のTA-MUC1結合を示した(図3)。
【００４７】
これに加えて、PD-L1に結合するscFv領域のVHドメインのCDR中に様々な変異を有するフコース減少PM-PDL-GEX、好ましくは、(VHドメインのCDR1中のKabat番号付与に基づく26位にグリシンからアラニンへの変異を有し、Kabat番号付与に基づく31位にアスパラギン酸からグルタミン酸への変異を有する)SEQ ID NO: 64に示すアミノ酸配列を有するもの、または(VHドメインのCDR1中のKabat番号付与に基づく28位にトレオニンからセリンへの変異を有する)SEQ ID NO: 66および(VHドメインのCDR2中のKabat番号付与に基づく62位にセリンからトレオニンへの変異を有する)SEQ ID NO: 72に示すアミノ酸配列を有するものが、非変異PM-PDL-GEXと同程度のPD-L1結合能力、同程度のPD-L1/PD1相互作用妨害能力、および同程度のTA-MUC1結合能力を示し得ることも、さらに示された(図22A、22B、および22C)。
【００４８】
これらのデータから、TA-MUC1を発現する腫瘍細胞を標的とすることは、本発明のフコース減少二重特異性抗体および正常フコシル化二重特異性抗体を用いて、かつ/または本発明の該抗体の、PD-L1に結合するscFv領域のVHドメイン中に様々なCDR変異を有するフコース減少二重特異性抗体、好ましくは、上記に示したようにSEQ ID NO: 64に示すアミノ酸配列を有するもの、またはSEQ ID NO: 66および72に示すアミノ酸配列を有するものを用いて達成できることが、明らかになる。
【００４９】
上記の知見に加えて、単特異性抗PD-L1 hIgG1および二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1のフコース減少変種の主な差異は、正常フコシル化変種と比較して増加した、FcyRIIIaへの結合であることも判明した。FcγRIIIaへの抗体Fc部分の結合を分子レベルで特徴付けるために、Perkin Elmerのビーズベースの技術(AlphaScreen(登録商標))を用いる新しいアッセイ法を開発した。フコース減少PDL-GEX Fuc-は、正常フコシル化PDL-GEX H9D8と比較してEC50値が減少していることから、正常フコシル化変種と比較してフコース減少変種のFcγRIIIaへの結合が約5倍に増強されていることが実証されている。
【００５０】
二重特異性のフコース減少抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1および正常フコシル化抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1は、同じ実験で比較されなかったが、正常フコシル化参照抗体と比較した相対効力を計算することによって定量的に比較された。相対効力とは、参照抗体のEC50を試験抗体のEC50で割った値を指す。二重特異性正常フコシル化PM-PDL-GEX H9D8の場合、相対効力は1.9と定められた。一方、二重特異性フコース減少PM-PDL-GEX Fuc-の相対効力は、10.4と定められた。このことから、FcγRIIIaへの結合は、正常フコシル化対応物と比較して、フコース減少変種の場合に約5倍に増強されている(図4)。
【００５１】
さらに、フコース減少抗体と正常フコシル化抗体の別の差異も判明した。フコース減少単特異性抗PD-L1 hIgG1およびフコース減少二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1は、正常フコシル化対応物と比較して、TA-MUC+およびPD-L1+腫瘍細胞の死滅の増加を示す。
【００５２】
まず第一に、高レベルのTA-MUC1およびほんのわずかなレベルのPD-L1を発現する乳がん細胞株ZR-75-1に対するADCCを解析した。予想されるとおり、FcγRIIIaへの結合の増加が原因で、フコース減少二重特異性PM-PDL-GEX Fuc-は、正常フコシル化二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1と比較して、強く増強されたADCC活性を示した(図5A)。このデータから、フコース減少二重特異性PM-PDL-GEX Fuc-抗体を添加することによってTA-MUC1+がん細胞に対するADCCを増強できることが示唆される。
【００５３】
第二に、PD-L1を強く発現し中程度のTA-MUC1発現を有する前立腺がん細胞株DU-145を、同様にPD-L1+ 腫瘍細胞の死滅をさらに調査するために使用した。フコース減少単特異性PDL-GEX Fuc-およびフコース減少二重特異性PM-PDL-GEX Fuc-は、それらの正常フコシル化対応物と比較して、PD-L1陽性腫瘍細胞に対する強く増強されたADCCをもたらすことが、やはり判明した(図5D)。このデータから、フコース減少単特異性PDL-GEX Fuc-抗体およびフコース減少二重特異性PM-PDL-GEX Fuc-抗体を添加することによってPD-L1+がん細胞に対するADCCを増強できることが示唆される。
【００５４】
PD-L1は、もっぱら腫瘍細胞においてだけでなく、様々な免疫細胞、例えば単球またはB細胞においても発現されることが報告されている。フコース減少単特異性抗PD-L1およびフコース減少二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1は、それらの正常フコシル化対応物と比較して、腫瘍細胞に対して大きく増大したADCC作用を示すため、PD-L1+免疫細胞に対するADCCもこれらがもたらすことが予想され得る。単球およびB細胞はPD-L1を発現することが説明されているため、両方の免疫細胞集団を、潜在的な標的細胞としてFACSベースのADCCアッセイ法において解析した。
【００５５】
驚くべきことに、フコース減少単特異性抗PD-L1およびフコース減少二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1によってB細胞および単球などの免疫細胞に対してもたらされるADCC作用は検出されなかった(図6Aおよび6B)。
【００５６】
さらに、実施例8で説明される実験から、フコース減少二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1および正常フコシル化二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1ならびにフコース減少抗PD-L1 hIgG1は、同種異系混合リンパ球反応(MLR)において、同程度のIL-2を誘導することが示されている(図8B)。
【００５７】
混合リンパ球反応(MLR)は、PD-L1発現抗原提示細胞によるPD-1発現T細胞の抑制にPD-L1遮断抗体が与える影響を解析するために確立された機能アッセイ法である。このアッセイ法は、刺激物としての別のドナーに由来する単球由来樹状細胞(moDC)(=同種異系MLR)に対する、応答物としての1名のドナーに由来するT細胞の応答を測定する。
【００５８】
本発明者らはまた、驚くべきことに、フコース減少単特異性抗PD-L1 hIgG1およびフコース減少二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1が、同種異系混合リンパ球反応(MLR)において測定した場合に、正常フコシル化対応物および別の参照抗体としての「アテゾリズマブ」と呼ばれる抗PD-L1抗体と比較して増強されたT細胞活性化を示し得ることも発見した(図9A、9B、および9C)。したがって、同種異系混合リンパ球反応(MLR)において測定した場合に、80％より多いコアフコシル化を含むグリコシル化された参照抗体と比較して増強されたT細胞活性化をもたらす抗体も、本発明に含まれる。
【００５９】
試験抗体(1μg/ml試験抗体)の存在下でのmoDCおよび単離T細胞を用いる同種異系MLRのCD8 T細胞(CD3+CD8+細胞)を、フローサイトメトリーにより、CD25の発現を介して活性化について解析した。異なるドナーに由来するT細胞を用いて得られた結果から、フコース減少PDL-GEX Fuc-およびフコース減少二重特異性PM-PDL-GEX Fuc-が、正常フコシル化単特異性PDL-GEX H9D8および正常フコシル化二重特異性PM-PDL-GEX H9D8と比較して、またアテゾリズマブのような別の抗PD-L1抗体と比較して、増強されたT細胞活性化を誘導し得ることが実証される。「アテゾリズマブ」と呼ばれるこの後者の参照抗体は、FcyR結合能力がないか、または弱い可能性があり、グリコシル化されていない。フコース減少抗PD-L1に起因する、正常フコシル化抗PD-L1と比較して増大したT細胞活性化は、図14においても確認された。フコース減少抗PD-L1に起因するT細胞活性化の増大により、機能性に利点が生じるかどうかを解析するために、PDL-GEX H9D8、PDL-GEX Fuc-、およびアテゾリズマブの非存在下または存在下で同種異系MLRにおいて活性化されたT細胞を採取し、その後、それらの細胞障害能力をユウロピウム放出アッセイ法によって測定した。
【００６０】
ブロッキングELISA(実施例2を参照されたい)、PD-1/PD-L1遮断バイオアッセイ法(実施例7を参照されたい)、およびIL-2分泌(実施例8を参照されたい)においては、グリコシル化変種間の差異が認められなかったため、フコース減少抗PD-L1抗体およびフコース減少抗PD-L1/TA-MUC1抗体がT細胞活性化の増大を誘導し得るということは意外である。フコース減少単特異性抗PD-L1 hIgG1およびフコース減少二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1に起因するT細胞活性化の増大は、異なるドナーのT細胞を用いて観察され、やはり、意外な効果であると予想される。
【００６１】
CD8 T細胞は、抗腫瘍応答において非常に重要な役割を果たし、がん細胞を直接的に死滅させる能力を有している細胞障害性T細胞に相当するため、フコース減少単特異性抗PD-L1 hIgG1およびフコース減少二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1がCD8 T細胞活性化の増強を誘導し得るというこの知見は重要である。フコース減少単特異性PD-L1抗体ならびにPD-L1およびTA-MUC1に結合できるフコース減少二重特異性抗体による処置後、T細胞活性化の増大が、がん疾患、炎症性疾患、ウイルス感染症、および自己免疫疾患の間に起こり得る。
【００６２】
脱フコシル化抗PD-L1抗体および脱フコシル化二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1抗体に起因するT細胞活性化の増強はまた、MLRにおいて、HSC-4、ZR-75-1、Ramosがん細胞などのがん細胞の存在下でも観察され得ることが、さらに示された(図20)。
【００６３】
本発明は、(i)80％より多いコアフコシル化を含むグリコシル化された参照PD-L1抗体(例えばPDL-GEX-H9D8)と比較して、および(ii)グリコシル化されていない参照抗体(例えばアテゾリズマブ)と比較して、増強されたT細胞活性化をもたらす単特異性PD-L1抗体(例えばPDL-GEX Fuc-)を提供し得る。さらに、本発明は、そのscFv領域によってTA-MUC1およびPD-L1に結合することができ、(i)TA-MUC1およびPD-L1に結合することができ、80％より多いコアフコシル化を含むグリコシル化された参照抗体(例えばPM-PDL-GEX-H9D8)と比較して、増強されたT細胞活性化をもたらす、二重特異性抗体(例えばPM-PDL-GEX Fuc-)も提供し得る。
【００６４】
別の同種異系MLRでは、単離T細胞またはPBMCを、試験抗体の存在下でmoDCと共に培養した。フローサイトメトリー解析により、MLRにおける応答細胞としてT細胞(図10Aおよび10B)または末梢血単核細胞(PBMC)(図10Cおよび10D)のいずれかを用いて、CD3+CD8+細胞におけるCD25およびCD137の発現に基づいて測定した場合、PDL-GEX Fuc-および PM-PDL-GEX Fuc-が、正常フコシル化単特異性抗PD-L1 hIgG1または二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1と比較して、およびアテゾリズマブのような抗PD-L1 hIgG1と比較して、より強いCD8+ T細胞活性化を誘導したことが示されている。さらに、moDCをPBMCと共に培養すると、CD25(図10E)およびCD137(図10F)の発現に基づいて測定した場合、フコース減少単特異性PDL-GEX Fuc-およびフコース減少二重特異性PM-PDL-GEX Fuc-が原因で、CD4 T細胞活性化(CD3+CD8-細胞、故にCD4 T細胞)が増大し、これは、単離T細胞を用いるMLRでは以前に観察されていなかった。興味深いことに、単離T細胞の代わりに、NK細胞を含むPBMCを使用すると、NK細胞またはPD-L1+細胞に対する潜在的なNK細胞を介したADCC作用がT細胞活性化に対して不利な影響を与えないことが示される。
【００６５】
上記の知見を完成するために、脱フコシル化抗PD-L1抗体(PDL-GEX Fuc-)が原因で増強されたT細胞活性化を、増殖によって可視化してもよい。PDL-GEX Fuc-抗体は、正常フコシル化抗PD-L1抗体(PDL-GEX H9D8)と比較して、および非グリコシル化抗PD-L1(アテゾリズマブ)と比較して、CD8 T細胞の増殖の増加を示し得る(図19)。
【００６６】
さらに、フコース減少抗PD-L1 hIgG1(PDL-GEX Fuc-)およびフコース減少二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1(PM-PDL-GEX Fuc-)がまた、それらの正常フコシル化対応物と比較して、T細胞におけるCD69発現を増大させ得るという別の同種異系MLRでの知見によって、これらのデータは確認され、さらに拡大適用された(図11)。CD25およびCD137に加えて、CD69は、単特異性フコース減少抗体および/または二重特異性フコース減少抗体による処置後に誘導される、より強い他の活性化マーカーである。
【００６７】
さらに、本発明は、CD25、CD69、および/またはCD137の発現レベルに基づいてT細胞活性化が検出可能であり得ることも開示する。CD137および/またはCD25の発現レベルに基づいて検出可能にT細胞を活性化するとは、この文脈または本明細書の別の箇所で、測定された全CD8+ T細胞に対して少なくとも8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、もしくは60％、または8％〜60％、8％〜55％、8％〜50％、8％〜45％、8％〜40％、8％〜35％、8％〜30％、8％〜25％、8％〜24％、8％〜23％、8％〜22％、8％〜21％、8％〜20％、8％〜19％、8％〜18％、8％〜17％、8％〜16％、8％〜15％のCD137+ T細胞および/またはCD25+ T細胞が検出されることを意味する。好ましくは、CD25の発現レベルに基づいて検出可能にT細胞を活性化するとは、この文脈で、測定された全CD8+ T細胞に対して8％〜25％、8％〜24％、8％〜23％、8％〜22％、8％〜21％、または8％〜20％のCD25+ T細胞が検出されることを意味する。好ましくは、CD137の発現レベルに基づいて検出可能にT細胞を活性化するとは、この文脈で、測定された全CD8+ T細胞に対して8％〜20％、8％〜19％、8％〜18％、8％〜17％、8％〜16％、8％〜15％のCD137+ T細胞が検出されることを意味する。全CD8+T細胞に対して少なくとも8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、もしくは60％、または8％〜60％、8％〜55％、8％〜50％、8％〜45％、8％〜40％、8％〜35％、8％〜30％、8％〜25％、8％〜24％、8％〜23％、8％〜22％、8％〜21％、8％〜20％、8％〜19％、8％〜18％、8％〜17％、8％〜16％、8％〜15％のCD137+ T細胞および/またはCD25+ T細胞の前記活性化は、本発明の抗体を用いることによって実現され、これらの抗体は、0％〜80％、0％〜75％、0％〜70％、0％〜65％、0％〜60％、0％〜55％、0％〜50％、0％〜45％、0％〜40％、0％〜35％、0％〜30％、0％〜25％、0％〜20％、0％〜15％、0％〜10％、0％〜5％フコシル化されており、好ましくは4％〜80％、4％〜75％、4％〜70％、4％〜65％、4％〜60％、4％〜55％、4％〜50％、4％〜45％、4％〜40％、4％〜35％、4％〜30％、4％〜25％、4％〜20％、4％〜15％、4％〜10％フコシル化されているか、または5％未満フコシル化されており、最も好ましくは4％フコシル化されている(図15)。全CD8+ T細胞に対して少なくとも15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、または60％のCD137+ T細胞および/またはCD25+ T細胞の前記活性化は、本発明の抗体を用いることによって実現され、これらの抗体は、0％〜80％、0％〜75％、0％〜70％、0％〜65％、0％〜60％、0％〜55％、0％〜50％、0％〜45％、0％〜40％、0％〜35％、0％〜30％、0％〜25％、0％〜20％、0％〜15％、0％〜10％、0％〜5％フコシル化されている、好ましくは4％〜80％、4％〜75％、4％〜70％、4％〜65％、4％〜60％、4％〜55％、4％〜50％、4％〜45％、4％〜40％、4％〜35％、4％〜30％、4％〜25％、4％〜20％、4％〜15％、4％〜10％フコシル化されているか、または5％未満フコシル化されており、最も好ましくは4％フコシル化されており、本明細書の別の箇所で示すように、PD-L1に結合する(scFv領域の)VHドメインのCDR中に変異を有している。通常、例��ば、実施例15で説明するような混合試験のために、100,000個のT細胞が使用される。通常、T細胞は、CD4+ T細胞(CD4)およびCD8+ T細胞(CD8)、ならびに少量のナチュラルキラーT細胞(NKT)を含む。使用されるCD8+ T細胞の量は、全T細胞(CD45+CD3+)のうちのCD8+ T細胞(CD45+CD3+CD8+)の量に関して先行技術からの参照文献を適用することによって実現することができ、好ましくは36％である。36％というこの好ましい百分率の量を用いる場合、例えば、測定された全CD8+ T細胞に対して少なくとも8％のCD137+ T細胞および/またはCD25+ T細胞とは、例えば、少なくとも2880個のCD137+ T細胞および/またはCD25+ T細胞を有していることを意味する(Valiathan et al., 2014, Immunobiology 219, 487-496)。必要に応じて変更を加えて、同じことが、上記に挙げた他のパーセント値にも当てはまる。
【００６８】
特異的および増強されたT細胞活性化がどのように誘導され得るかを調査するために、moDCおよび単離T細胞を用いる別の同種異系MLRを実施して、フコース減少抗PD-L1抗体を用いるT細胞活性化の増大にFcyRが非常に重要な役割を果たしている可能性があることを示した。したがって、T細胞活性化の増大は、FcyR結合能力、好ましくはFcyRIIIa結合能力と関連がある、したがってFc-N-グリコシル化と間接的に関係しているとみなすことができる。
【００６９】
フコース減少抗PD-L1 hIgG1(PDL-GEX Fuc-)によって増大されたT細胞活性化は、無関係な特異性を有する別のフコース減少抗体(ブロックと名付けられる)の添加により、正常フコシル化抗PD-L1 hIgG1(PDL-GEX H9D8)または非グリコシル化抗PD-L1 hIgG1(アテゾリズマブ)と同等のレベルまで阻害された(図12)。
【００７０】
実施例12で説明されるこの実験は、フコース減少抗PD-L1抗体の適用によるT細胞活性化の増大に対するFcγR全般の重要な役割を実証し得る。単特異性抗PD-L1および二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1のフコース減少変種が、それらの正常フコシル化対応物と比較してFcyRIIIaへの結合の増加を示し得ることが実施例4から公知であるため、増強されたT細胞活性化に特異的受容体FcyRIIIaが関与し得るというのには、なおさら説得力がある。その結果として、T細胞活性化は、FcyRI(CD64)、アイソフォームFcyRIIa、FcyRIIb、FcyRIIcを含むFcyRII(CD32)、またはアイソフォームFcyRIIIaもしくはFcyRIIIbを含むFcyRIII(CD16)への増強された結合を介して、好ましくは、FcyRIIIaへの増強された結合を介して、もたらされ得る。
【００７１】
最終的に、明細書の別の箇所で示す、PD-L1に結合するscFv領域のVHドメイン中に様々なCDR変異を有するフコース減少二重特異性抗体、好ましくは、(VHドメインのCDR1中のKabat番号付与に基づく26位にグリシンからアラニンへの変異を有し、Kabat番号付与に基づく31位にアスパラギン酸からグルタミン酸への変異を有する)SEQ ID NO: 64に示すアミノ酸配列を有するもの、または(VHドメインのCDR1中のKabat番号付与に基づく28位にトレオニンからセリンへの変異を有する)SEQ ID NO: 66および(VHドメインのCDR2中のKabat番号付与に基づく62位にセリンからトレオニンへの変異を有する)SEQ ID NO: 72に示すアミノ酸配列を有するものが、非変異PM-PDL-GEX Fuc-と同程度の、増強されたCD25 T細胞活性化をさらに示し得る(図23)。これらのデータから、本発明のフコース減少二重特異性抗体および/またはPD-L1に結合するscFv領域のVHドメイン中に様々なCDR変異を有するフコース減少二重特異性抗体、好ましくは、SEQ ID NO: 64に示すアミノ酸配列を有するもの、またはSEQ ID NO: 66および72に示すアミノ酸配列を有するものもまた、80％より多いコアフコシル化を含むグリコシル化された参照抗体と比較して、T細胞活性化を増強し得ることが、明らかになる。
【００７２】
グリコ最適化抗体を用いてT細胞を活性化することは、T細胞活性化と関連し得るあらゆる種類の疾患にとって非常に有望なアプローチであるため、本発明は、本発明の抗体を提供することによって、先行技術を確実に質的に向上させる。
【００７３】
既に考察したように、Fc領域のグリコシル化によってFcyRを媒介としたエフェクター機能を増大させるための代替アプローチとして、Fc操作によってFc領域の親和性を高めることに労力が集中されてきた。
【００７４】
通常、抗体医薬開発は、抗原標的への結合を担当している、抗体の上部を操作することに焦点を合わせている。しかし、Genentech、Xencor、またはMedImmuneなどの異なる所在地の研究者は、抗体の天然の免疫機能を担当している、該抗体のFc領域の操作に焦点を合わせることによるアプローチを取っている。Fc領域内のいくつかの変異、Fcエフェクター機能を増強するために標的とされるアミノ酸選択物が、Fc受容体の結合の増強、したがって、細胞障害活性(例えばADCCおよび/またはADCP)の増強にも、直接的または間接的に関係していることが確認された。Genentechの研究者は、変異S239D/A330L/I332Eを同定し(Lazar et al., 2006, “Engineered antibody Fc variants with enhanced effector function”, PNAS 103, 4005-4010およびShields et al., 2001, “High Resolution Mapping of the Binding Site on Human IgG1 for FcγRI, FcγRII, FcγRIII, and FcRn and Design of IgG1 Variants with Improved Binding to the FcγR”, J. Biol. Chem. 276, 6591-6604)、MedImmuneは、変異F243Lを同定し(Stewart et al., 2011, “A variant human IgG1-Fc mediates improved ADCC”, Protein Engineering, Design and Selection 24, 671-678)、XencorはG236Aを同定した(Richards et al, 2008, “Optimization of antibody binding to FcγRIIa enhances macrophage phagocytosis of tumor cells”, Mol Cancer Ther 7, 2517-2527)。
【００７５】
Lazar et al. (2006)によれば、一重変異体S239DおよびI332E、二重変異体S239D/I332E、ならびに三重変異体S239D/I332E/A330Lを含む様々な変種が構築、発現、精製され、FcyR親和性についてスクリーニングされた。これらの変種、特に、A330LとS239D/I332Eの組合せは、特異的なFcyRIIIa受容体への結合の有意な増強を示す。二重(S239D/I332E)変異体を含む変種もまた、特異的なFcyRIIIa受容体への結合の有意な増加を提供する。S239D/I332E変種およびS239D/I332E/A330L変種はまた、実質的なADCC増強も提供する。
【００７６】
本発明は、FcyRIIIaへの抗体の結合が非変異抗体と比較して増加している可能性がある、1つまたは複数の配列変異を含む抗体を含み得る。これらの配列変異は、EU命名法に基づくS238D、S239D、I332E、A330L、S298A、E333A、L334A、G236A、L235V、F243L、R292P、Y300L、V305I、およびP396Lより選択され得、この番号付与は、Kabatにおいて見られるようなEU指標に従う。上記に挙げたものからの1つまたは複数の配列変異を含む本発明の抗体は、単特異性PD-L1抗体またはそのscFv領域によってTA-MUC1に結合しPD-L1に結合することができる二重特異性抗体であってよい。さらに、本発明はまた、そのscFv領域によってPD-L1に結合しTA-MUC1に結合することができ、かつ上記に挙げたものからの1つまたは複数の配列変異を含む、二重特異性抗体も想定し得る。脱フコシル化されていないが1つまたは複数の配列変異を含む本発明の抗体は、変異のない参照抗体と比較して、T細胞活性化を増強し得る。上記に挙げた配列変異より選択される一重変異、または上記に挙げた任意の配列変異より選ばれる二重、三重、四重、五重の変異は、FcyRsへの、好ましくはFcγRIIIaへの結合の増加を、したがって、T細胞活性化の増強をもたらし得る。特定の態様において、それらのFc部分に三重変異G236A/S239D/I332EまたはそれらのFc部分に五重変異L235V/F243L/R292P/Y300L/P396Lを含む本発明の抗体が、好ましい可能性がある。三重変異G236A/S239D/I332Eまたは五重変異L235V/F243L/R292P/Y300L/P396Lを含む本発明の抗体は、正常フコシル化単特異性PD-L1抗体またはそのscFv領域によってTA-MUC1に結合しPD-L1に結合することができる正常フコシル化二重特異性抗体であってよく、これは、増加したFcγRIIIa結合、したがって増強されたT細胞活性化を提示し得る。本発明は、そのscFv領域によってPD-L1に結合しTA-MUC1に結合することができ、三重変異G236A/S239D/I332Eおよび五重変異L235V/F243L/R292P/Y300L/P396Lを含む二重特異性抗体をさらに含み得、これは、増加したFcγRIIIa結合、したがって増強されたT細胞活性化を提示し得る。
【００７７】
2種の正常フコシル化抗PD-L1抗体、すなわちKabat番号付与に基づく、抗体のFc部分に3つのアミノ酸変化S239D、I332E、およびG236Aを含む第1の抗体(PDL-GEX H9D8 mut1)ならびにKabat番号付与に基づく、抗体のFc部分に5つのアミノ酸変化:L235V、F243L、R292P、Y300L、およびP396Lを含む第2の抗体(PDL-GEX H9D8 mut2)が、それらの非変異対応物(PDL-GEX H9D8)と同等の抗原結合を示すにもかかわらず(図16)、これらの抗原が、FcyRIIIa結合の増加(図17)およびT細胞活性化の増大(図18)を示すことが、はっきりと示された。したがって、全CD8+ T細胞に対して少なくとも15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、または60％のCD137+ T細胞および/またはCD25+ T細胞の前記活性化は、本発明の抗体を用いることによって実現され、これらの抗体は、Fc部分に三重変異 G236A/S239D/I332EまたはFc部分に五重変異L235V/F243L/R292P/Y300L/P396Lを含む。
【００７８】
本発明は、Fcグリコシル化が十分ではなく、したがってグリコシル化されておらず、かつ前記配列変異のうちの1つもしくは複数、または上記に挙げた任意の配列変異より選ばれる任意の二重、三重、四重、五重の変異を含み、配列変異が、FcγRIIIaへの結合の増加を、したがって、T細胞活性化の増強をもたらし得る、抗体をさらに含み得る。
【００７９】
これを要約すると、前記PD-L1抗体(PDL-GEX Fuc-)は、(i)FcyRIIIa結合がないか、または弱いPD-L1抗体(例えばアテゾリズマブ)および(ii)正常なFcyRIIIa結合を有するPD-L1抗体(PDL-GEX-H9D8)と比較して、免疫細胞のFcyR、好ましくはFcyRIIIaへの結合の増強を介して、T細胞活性化を増強することができ得ることが、本発明から現在公知である。そのscFv領域によってTA-MUC1に結合しPD-L1に結合することができる前記抗体(PM-PDL-GEX Fuc-)は、そのscFv領域によってTA-MUC1に結合しPD-L1に結合することができ(PM-PDL-GEX-H9D8)、正常なFcyRIIIa結合を有する抗体と比較して、免疫細胞のFcyR、好ましくはFcyRIIIaへの結合の増強を介して、T細胞活性化を増強することができ得ることもまた、本発明から公知である。必要に応じて変更を加えて、同じことが、FcyRIおよび/またはFcyRIIにも当てはまる。
【００８０】
言い換えると、前記のグリコシル化され本質的に脱フコシル化されたPD-L1抗体は、(i)非グリコシル化PD-L1抗体(例えばアテゾリズマブ)および(ii)グリコシル化され正常にフコシル化されたPD-L1抗体(PDL-GEX-H9D8)と比較して、免疫細胞のFcyR、好ましくはFcyRIIIaへの結合の増強を介して、T細胞活性化を増強することができ得る。本発明は、そのscFv領域によってTA-MUC1に結合しPD-L1に結合することができるグリコシル化され正常にフコシル化された抗体(PM-PDL-GEX-H9D8)と比較して、免疫細胞のFcyR、好ましくはFcyRIIIaへの結合の増強を介してT細胞活性化を増強することができ得る、そのscFv領域によってTA-MUC1に結合しPD-L1に結合することができるグリコシル化され本質的に脱フコシル化された抗体(PM-PDL-GEX-H9D8)を、さらに企図し得る。
【００８１】
さらに、本発明者らは、脱フコシル化抗PD-L1 hIgG1の存在下では、樹状細胞は、正常フコシル化抗PD-L1 hIgG1抗体の場合と比較して、より成熟した表現型を示すことを発見した。これは、フローサイトメトリーを用いて、様々なマーカーの発現に基づいて実証された。CD16(FcγRIII)ならびに共刺激分子CD40およびCD86、ならびにDCマーカーCD83は、正常フコシル化抗PD-L1 hIgG1と比較して、脱フコシル化抗PD-L1 hIgG1の存在下の方が、より高いレベルで発現された(図13B、13C、13D、および13E)。
【００８２】
実施例13で説明されるこの実験は、フコース減少抗PD-L1 hIgG1がDCの成熟化状態に対してプラスの作用を有する可能性があり、引き換えにT細胞を活性化してT細胞活性化の測定の助けとなる可能性があることを示す。したがって、T細胞活性化は、樹状細胞の成熟化ならびに/または共刺激分子(例えばCD40、CD86など)およびCD83のような成熟化マーカーの発現を伴うとみなしてよい。
【００８３】
DCのFcγRIIIa依存性の成熟化を介して増強されたT細胞応答は、DC上のFcγR、好ましくはFcγRIIIaへのFc領域の増強された結合を特徴とする本発明の抗体を用いて測定され得る。
【００８４】
このために、かつPD-L1抗体および/またはそのscFv領域によってTA-MUC1に結合しPD-L1に結合することができる抗体を用いてT細胞活性化を増強する観点から、本発明は、治療法において使用するための、本明細書において説明するPD-L1抗体ならびに/または本明細書において説明する、そのscFv領域によってTA-MUC1に結合しPD-L1に結合することができる抗体も、さらに包含し得る。特に、本発明は、T細胞を活性化するための方法において使用するための、本明細書において説明するPD-L1抗体、ならびに/または本明細書において説明する、そのscFv領域によってTA-MUC1に結合しPD-L1に結合することができる抗体も、さらに包含し得る。T細胞の活性化は、がん疾患、炎症性疾患、ウイルス感染症、および自己免疫疾患の治療のためであり得る。好ましくは、T細胞活性化は、がん疾患の治療のために有用である。
【００８５】
がん疾患は、胸腺がん、ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫、胸膜の悪性孤在性線維性腫瘍(MSFT)、陰茎がん、肛門がん、甲状腺がん、頭頸部扁平上皮がん(HNSC)、非小細胞肺がん(NSCLC)、小細胞肺がん(SCLC)、外陰がん(扁平上皮がん)、膀胱がん、子宮頸がん、非黒色腫皮膚がん、(後)腹膜がん、黒色腫、消化管間質腫瘍(GIST)、悪性胸膜中皮腫、腎細胞がん(RCC)、腎臓がん、肝細胞がん(HCC)、食道および食道胃移行部のがん、肝外胆管腺がん、男性生殖器悪性腫瘍、小腸悪性腫瘍、肉腫、膵臓腺がん、胃がん(胃腺がん)、乳がん、結腸直腸がん(CRC)、悪性中皮腫、メルケル細胞がん、扁平上皮がん、進行癌腫、前立腺がん、卵巣がん、子宮内膜がん、尿路上皮がん(UCC)、肺がんより選択され得る。好ましくは、がん疾患は、肺がん、腎臓がん、膀胱がん、胃腸がん、皮膚がん、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、および前立腺がんを含む、黒色腫、癌腫、リンパ腫、肉腫、および中皮腫より選択され得、最も好ましくは、がん疾患は、乳がんであってよい。
【００８６】
さらに、本発明は、がん疾患、炎症性疾患、ウイルス感染症、および自己免疫疾患における治療用途向けの医薬を製造するための、本発明の抗体、好ましくは、PD-L1抗体および/またはそのscFv領域によってTA-MUC1に結合しPD-L1に結合することができる抗体の使用も想定し得る。さらに、本発明は、T細胞を活性化するための医薬を製造するための、本発明の抗体、好ましくは、PD-L1抗体および/またはそのscFv領域によってTA-MUC1に結合しPD-L1に結合することができる抗体の使用も包含し得る。
【００８７】
そのうえ、本発明は、それを必要とする対象に、前記抗体、好ましくは、PD-L1抗体および/またはそのscFv領域によってTA-MUC1に結合しPD-L1に結合することができる抗体の有効量を投与する段階を含む、対象においてT細胞を活性化する方法も含み得る。
【００８８】
本発明は、対象においてT細胞を活性化するための方法において使用するための、本発明の抗体もさらに企図し得る。本発明の抗体は、がん疾患および/または炎症性疾患および/またはウイルス感染症および/または自己免疫疾患に罹患している対象に投与され得る。対象は、本明細書において定義される任意の対象、好ましくは、ヒト対象であってよい。対象は、好ましくは、本発明の抗体の投与を必要としている。好ましくは、対象は、トリを含む動物であってよい。動物は、ラット、ウサギ、ブタ、マウス、ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、およびヒトを含む哺乳動物であってよい。最も好ましくは、対象はヒトである。1つの態様において、対象は成人である。
【００８９】
定義:
用語「グリコシル化」は、抗体のFc領域のCH2ドメイン中のEU命名法に基づく保存された各アスパラギン297(Asn297/N297)の位置の、2つのN結合型オリゴ糖を意味する。本明細書において、グリコシル化されており、本質的にコアフコシル化が十分ではない、単特異性PD-L1抗体およびそのscFv領域によってTA-MUC1に結合しPD-L1に結合することができる二重特異性抗体(例えば、PDL-GEX-Fuc-およびPM-PDL-GEX Fuc-などのフコース減少抗体)のグリコシル化、ならびに80％より多いコアフコシル化を含む正常グリコシル化抗体(例えば、PDL-GEX-H9D8およびPM-PDL-GEX H9D8などの正常フコシル化抗体)のグリコシル化は、好ましくは、ヒトグリコシル化を意味する。
【００９０】
用語「ヒトグリコシル化」は、Fc領域のCH2ドメイン中の各N297の位置に2つのN結合型オリゴ糖を有する、公知のFc-N-グリコシル化を意味する。本発明のグリコシル化抗体が含むN結合型オリゴ糖の一般的構造は、複合型であってよく、次のように説明される:バイセクティングN-アセチルグルコサミンおよび最も内側のコアL-フコース(Fuc)(N-アセチルグルコサミンにα-1.6連結され得る)の存在/非存在の差異を有する、マンノシル-キトビオースコア(Man3GlcNAc2-Asn)。さらに、複合型N-グリコシル化は、ガラクトース部分およびシアル酸部分によってアンテナが任意で延長される、マンノシル-キトビオースコア(Man3GlcNAc2-Asn)に連結されたアンテナ型N-アセチルグルコサミンを特徴とし得る。本発明の最も内側のコアL-フコースは、N結合型オリゴ糖構造のN-アセチルグルコサミン(GlcNac)にα-1.6連結され得る。
【００９１】
用語「N結合型オリゴ糖」は、Fc領域に結合したN結合型糖鎖/N-グリカンを意味し、より具体的には、この用語は、Fc領域の両方のCH2ドメインに結合している、好ましくは、Fc領域の両方のCH2ドメインの各N297に結合している、N結合型糖鎖/N-グリカンを意味する。まとめると、本発明は、2つのN結合型オリゴ糖を含む。
【００９２】
用語「正常グリコシル化抗体」は、Fc領域のCH2ドメイン中の各N297の位置に2つのN結合型オリゴ糖を含み、したがってグリコシル化されている、抗体を意味する。さらに、本発明の正常グリコシル化抗体は、80％より多いα-1,6-コアフコシル化も含み得る。したがって、本発明の正常グリコシル化抗体は、正常にフコシル化されているグリコシル化抗体を意味し得る。本明細書において、正常グリコシル化抗体は、前記参照抗体として使用され得る、二機能性単特異性PDL-GEX-H9D8および三機能性二重特異性PM-PDL-GEX H9D8を意味し得る。これに関連して、本発明の正常グリコシル化抗体は、CHOdhfr-(ATCC番号CRL-9096)から得ることができる可能性がある。
【００９３】
用語「非グリコシル化抗体」は、FcyR結合能力、好ましくはFcyRIIIa結合能力がないか、または弱く、したがってT細胞活性化が低減している可能性がある抗PD-L1抗体を、そのような抗体が単特異性であるか二重特異性であるかに関係なく、意味し得る。非グリコシル化抗体は、Fc領域のCH2ドメイン中の各N297の位置に2つのN結合型オリゴ糖を含まず、したがってグリコシル化されていない。好ましくは、Roche社の抗体「アテゾリズマブ」が、グリコシル化されていない前記参照抗体として使用され得る。この抗体は、当業者に公知である。普通、アテゾリズマブの非グリコシル化は、EU命名法に基づく、アスパラギンからアラニンへのアミノ酸配列の改変(aa297)に起因する。
【００９４】
用語「グリコシル化されていない」はまた、用語「アグリコシル化されている」または「アグリコシル化」のようなその名詞と同義的に使用され得る。
【００９５】
用語「正常グリコシル化抗体」は、正常なFcyR結合能力、好ましくはFcyRIIIa結合能力を有し、したがって正常なT細胞活性化を有する可能性がある抗体を、そのような抗体が単特異性であるか二重特異性であるかに関係なく、意味し得る。本発明の正常フコシル化抗体は、グリコシル化されていて、Fc領域に結合した2つのN結合型糖鎖を有しており、その際、Fc領域に結合している複合型N結合型糖鎖全体において、1,6-コア-フコースの含有量は、80％より多くてよい。本発明の正常フコシル化抗体は、80％より多く100％より少ないコアフコシル化N-グリカンを含み得る。本発明の正常グリコシル化抗体は、好ましくは、約81％〜100％、85％〜95％のフコシル化N-グリカンまたは90％〜95％のフコシル化N-グリカンを含み得る。本発明の正常フコシル化抗体は、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％より多いか、またはさらに100％のフコシル化N-グリカンを含み得る。好ましくは、用語「正常フコシル化抗体」は、用語「80％より多いコアフコシル化を含む、グリコシル化された抗体」を意味し得るか、または用語「グリコシル化された正常フコシル化抗体」を意味し得る。本明細書において、正常フコシル化抗体は、二機能性単特異性PDL-GEX-H9D8抗体および三機能性二重特異性PM-PDL-GEX H9D8抗体を意味し得る。
【００９６】
用語「フコース減少抗体」は、増大したFcyR結合能力、好ましくはFcyRIIIa結合能力を有し、したがって増強されたT細胞活性化を有する可能性がある抗体を、そのような抗体が単特異性であるか二重特異性であるかに関係なく、意味し得る。本発明のフコース減少抗体は、Fc領域のCH2ドメイン中の各N297の位置に2つのN結合型オリゴ糖を含み、したがってグリコシル化されている。さらに、本発明のフコース減少抗体は、0％〜80％のα-1,6-コアフコシル化も含み得る。特に、本発明のフコース減少抗体は、Fc領域およびFc領域に結合した2つの複合型N結合型糖鎖を含み、その際、Fc領域に結合している複合型N結合型糖鎖全体において、1,6-コア-フコースの含有量は、0％〜80％であってよい。本発明のフコース減少抗体は、好ましくは、約0％〜70％、0％〜60％、0％〜50％、0％〜40％、0％〜30％、0％〜20％、0％〜10％、または10％〜50％、15％〜50％、20％〜50％、25％〜50％、30％〜50％、35％〜50％、40％〜50％、45％〜50％、または1％〜20％、1％〜15％、1％〜10％、1％〜5％、または5％〜30％、5％〜20％、5％〜15％のフコシル化N-グリカンを含み得る。本発明のフコース減少抗体は、好ましくは、0％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20.0％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、40％、41％、42％、43％、44％、45.0％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61.0％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、またはさらに80％のフコシル化N-グリカンを含み得る。本発明のフコース減少抗体は、フコースが減少しているグリコシル化抗体を意味し得る。本明細書において、本発明のフコース減少抗体は、二機能性単特異性PDL-GEX-Fuc-抗体および三機能性二重特異性PM-PDL-GEX Fuc-抗体を意味し得る。
【００９７】
用語「フコースが減少した」は、Fc領域のCH2ドメイン中の保存された各アミノ酸アスパラギンN297に結合している、マンノシル-キトビオースコア(Man3GlcNAc2-Asn)の一部分である第1のN-アセチルグルコサミン(GlcNac)に結合している、α-1,6-コアフコースの含有量の減少を意味する。この用語はまた、用語「脱フコシル化されている/本質的に脱フコシル化されている」またはその名詞、例えば「脱フコシル化」と同義的に使用され得る。用語「フコースが減少した」はまた、用語「本質的にコアフコシル化が十分ではない」と同義的に使用され得る。フコース減少抗体はまた、本発明の観点からは、グリコ最適化抗体とみなされ得る。
【００９８】
用語「本質的にコアフコシル化が十分ではない」は、フコースが減少している/脱フコシル化されている抗体、またはFc領域に結合したN結合型糖鎖を有しているグリコシル化された抗体であって、Fc領域に結合している複合型N結合型糖鎖全体において、α-1,6-コアフコースの含有量が、0％〜80％であり得る抗体に対して使用され得る。言い換えると、この抗体は、0％〜80％フコシル化されていてよい。
【００９９】
用語「コアフコシル化N-グリカン」は、コアフコシル化されている、複数の抗体のN-グリカンを意味する。複数の抗体の全N-グリカンの分子量に対するコアフコシル化N-グリカンのモル量は、80％より多いか、または0％〜80％であり得る。本発明の正常フコシル化抗体について説明されているように、80％より多いコアフコシル化N-グリカン含有量は、好ましくは、複数の抗体から測定され、その際、複数の抗体の全N-グリカンの分子量の80％より多くが、コアα1,6-フコシル化されていてよい。本発明のフコース減少抗体について説明されているように、0％〜80％のコアフコシル化N-グリカン含有量もまた、好ましくは、複数の抗体から測定されてよく、その際、複数の抗体のN-グリカンの分子量の0％〜80％が、コアα1,6-フコシル化されていてよい。N-グリカンのコアフコシル化は、実施例1で測定される。フコースの追加または減少は、ヒトにおいてFUT8遺伝子にコードされる酵素であるα-(1,6)-フコシルトランスフェラーゼ(FUT8)によって触媒され得る。
【０１００】
用語「コアフコース」または「コアフコシル化されている」は、Fc領域のCH2ドメイン中の保存された各アミノ酸アスパラギンN297に結合している、マンノシル-キトビオースコア(Man3GlcNAc2-Asn)の一部分である第1のN-アセチルグルコサミン(GlcNac)であるα-1,6の位置で結合している、単糖フコースを意味する。
【０１０１】
用語「α-1,6-コアフコースの含有量」は、Fc領域のCH2ドメイン中の保存された各アミノ酸アスパラギンN297に結合している、マンノシル-キトビオースコア(Man3GlcNAc2-Asn)の一部分である第1のN-アセチルグルコサミン(GlcNac)に結合している、コアフコースの量を意味する。Fc領域に結合している複合型N結合型糖鎖全体において、α-1,6-コアフコースの含有量は、本発明の正常フコシル化抗体の場合に80％より多くてよいか、または本発明のフコース減少抗体の場合に0％〜80％であってよい。α-1,6-コアフコースの含有量は、好ましくは、複数の抗体に基づいて決定され得る。好ましくは、α-1,6-コアフコースの含有量、すなわち、複数の抗体に関してのN-グリカンのα-1,6-コアフコースの含有量は、HILIC-UPLC-HiResQToF MSMSによって解析され得る(実施例1を参照されたい)。
【０１０２】
当技術分野において周知であるとおり、「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域中に位置している少なくとも1つのエピトープ認識部位を介して標的(エピトープ)に特異的に結合することができる免疫グロブリン分子である。本明細書において使用される用語「抗体」は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、ならびに必要とされる特異性を有する抗原結合断片を含む抗体部分を含む融合タンパク質および必要とされる特異性を有する抗原結合部位または断片(エピトープ認識部位)を含む他の任意の改変された立体配置の抗体を含む、それらの(天然に存在するまたは合成の)断片または変種を含み得る。抗体断片または抗体の例示的な例には、dAb、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、単鎖Fv(scFv)、κ軽鎖の定常ドメインまたは重鎖のCH3ドメインに結合された単鎖Fv(scFv)、ダイアボディ、およびミニボディが含まれ得る。本明細書において言及される場合、本発明の抗体はまた、複数の抗体を含む組成物であってもよい。
【０１０３】
抗体は、ジスルフィド結合によって連結されている2本の重(H)鎖および2本の軽(L)鎖から構成される。抗体は、抗原に結合することができるFab(断片、抗原結合)領域および補体活性化またはFc受容体への結合などのエフェクター機能を指定するFc(断片、結晶性)領域に、機能的に分けられる。
【０１０４】
用語「複数の抗体」は、好ましくはグリカン解析に必要とされる量、好ましくは15μgの抗体を意味する。
【０１０５】
本発明の抗体は、ヒト化抗体(またはその抗原結合変種もしくは断片)であってよい。用語「ヒト化抗体」は、非ヒト抗体に由来する最小限の配列を含む抗体を意味する。一般に、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン(「レシピエント抗体」)に接ぎ合わせられた、マウス、ラット、ウサギ、またはヒト以外の霊長類などの非ヒト種に由来する免疫グロブリン(「ドナー抗体」)の超可変領域に由来する残基を含む、ヒト免疫グロブリンである。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(FR)残基は、対応する非ヒト残基で置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体中にもドナー抗体中にも見出されない残基を含んでもよい。これらの改変は、抗体の性能をさらに改良するために施される。一般に、ヒト化抗体は、すべてまたは実質的にすべての超可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、すべてまたは実質的にすべてのFRがヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも1つ、および典型的には2つの可変ドメインの実質的にすべてを含み得る。ヒト化抗体はまた、任意で、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部分(Fc)、典型的にはヒト免疫グロブリンのものも含み得る。
【０１０６】
抗体は、単特異性抗体であってよい。用語「単特異性の」は、単一のエピトープまたは抗原決定基と反応する、好ましくは特異的に反応する、任意の同種の抗体またはその抗原結合領域を意味する。同じ抗原に対する親和性をすべてが有する抗体;1つの抗原もしくは1つのエピトープに特異的である抗体;または1つのタイプの細胞もしくは組織に特異的である抗体は、すべて「単特異性抗体」に当てはまり得る。用語「単特異性抗体」はまた、この用語が従来理解されているとおり、「MoAb」とも略されるモノクローナル抗体も意味し得る。しかし、単特異性抗体はまた、モノクローナル抗体についてそうされるように共通の生殖細胞からそれらを作製する以外の方法によっても、作製され得る。しかし、本明細書において使用される用語「単特異性抗体」は、天然の、改変された、または合成の同種抗体を意味してよく、ハイブリッド抗体またはキメラ抗体を含むことができる。特に、本発明の単特異性抗体は、好ましくは、免疫チェックポイントタンパク質に結合するVHドメインおよびVLドメインを含み、好ましくは、該免疫チェックポイントタンパク質はPD-L1である。したがって、本発明の単特異性抗体は、PD-L1抗体を含み得る。本発明はさらに、好ましくはTA-MUC1であるがん抗原に結合するVHドメインおよびVLドメインを含む抗体も想定し得る。したがって、本発明の単特異性抗体は、TA-MUC1抗体も含み得る。
【０１０７】
本発明において、PD-L1に結合する単特異性抗体に言及する場合、該抗体は、SEQ ID NO: 40およびSEQ ID NO: 50に示されるアミノ酸配列を有している。本明細書において、SEQ ID NO: 40は、該PD-L1抗体の重鎖を指すのに対し、SEQ ID NO: 50は、該PD-L1抗体の軽鎖を指す。本発明はまた、各ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 40およびSEQ ID NO: 50のいずれか1つに対して少なくとも50％の配列同一性を有する可能性があるポリペプチド鎖を含む、PD-L1に結合する抗体を含み得る。PD-L1に結合する抗体は、各ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 40およびSEQ ID NO: 50のいずれか1つに対して少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、または少なくとも99％の配列同一性を有する可能性があるポリペプチド鎖を含み得る。本発明は、SEQ ID NO: 40に対して少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、または少なくとも99％の配列同一性を有する、PD-L1に結合することができる重鎖、およびSEQ ID NO: 50に対して少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、または少なくとも99％の配列同一性を有する軽鎖を含む、PD-L1に結合する抗体を想定し得る。
【０１０８】
さらに、本発明はまた、SEQ ID NO: 41〜49およびSEQ ID NO: 50に示されるアミノ酸配列のいずれか1つを有する、PD-L1に結合する抗体を含み得る。本明細書において、SEQ ID NO: 41〜49は、抗体のVHドメインのCDR中に様々な変異を有する、本発明のPD-L1に結合する抗体の変異重鎖を指す。
【０１０９】
本発明はまた、SEQ ID NO: 51〜59およびSEQ ID NO: 18に示されるアミノ酸配列を有する、抗体のVHドメインのCDR中に様々な変異を有する、PD-L1に結合する抗体を含み得る。本明細書において、SEQ ID NO: 51〜59は、抗体のVHドメインのCDR中に様々な変異を有する、本発明のPD-L1に結合する抗体の変異VHドメインを指す。
【０１１０】
抗体のVHドメインのCDR中に様々な変異を有する本発明の抗体は、以下のVH CDRを含み得る:好ましくはPD-L1への結合を与える、SEQ ID NO: 60およびSEQ ID NO: 68に示されるアミノ酸配列を有するVH CDR、または好ましくはPD-L1への結合を与える、SEQ ID NO: 62およびSEQ ID NO: 69に示されるアミノ酸配列を有するVH CDR、または好ましくはPD-L1への結合を与える、SEQ ID NO: 63およびSEQ ID NO: 70に示されるアミノ酸配列を有するVH CDR、または好ましくはPD-L1への結合を与える、SEQ ID NO: 64に示されるアミノ酸配列を有するVH CDR、または好ましくはPD-L1への結合を与える、SEQ ID NO: 65およびSEQ ID NO: 71に示されるアミノ酸配列を有するVH CDR、または好ましくはPD-L1への結合を与える、SEQ ID NO: 66およびSEQ ID NO: 72に示されるアミノ酸配列を有するVH CDR、または好ましくはPD-L1への結合を与える、SEQ ID NO: 63およびSEQ ID NO: 72に示されるアミノ酸配列を有するVH CDR、または好ましくはPD-L1への結合を与える、SEQ ID NO: 67およびSEQ ID NO: 74に示されるアミノ酸配列を有するVH CDR、または好ましくはPD-L1への結合を与える、SEQ ID NO: 63およびSEQ ID NO: 68に示されるアミノ酸配列を有するVH CDR、または好ましくはPD-L1への結合を与える、SEQ ID NO: 61に示されるアミノ酸配列を有するVH CDR、または好ましくはPD-L1への結合を与える、SEQ ID NO: 73に示されるアミノ酸配列を有するVH CDR、または好ましくはPD-L1への結合を与える、SEQ ID NO: 75に示されるアミノ酸配列を有するVH CDR。
【０１１１】
用語「二重特異性抗体」は、本発明において、(配列情報に基づいて)2つの異なる抗原結合領域を有している抗体と理解され得る。これは、異なる標的結合を意味することができるが、1つの標的中の異なるエピトープへの結合もまた含む。特に、本発明の二重特異性抗体は、好ましくは、TA-MUC1に結合することができ、さらに、好ましくはPD-L1である免疫チェックポイントタンパク質に結合することができる。さらに、本発明はまた、好ましくはPD-L1に結合することができ、さらに、好ましくはTA-MUC1であるがん抗原に結合することができる、抗体も提供し得る。本発明はまた、免疫細胞上の別の分子にさらに結合する抗PD-L1抗体も企図してよく、したがって、PD-L1に結合することができ、さらに、免疫細胞上の別の分子に結合することができる抗体を有する。
【０１１２】
通常、本発明は、SEQ ID NO: 13(もしくはSEQ ID NO: 37)およびSEQ ID NO: 14ならびに/またはSEQ ID NO: 15およびSEQ ID NO: 16(もしくはSEQ ID NO: 38)に示されるアミノ酸配列を有する、TA-MUC1に結合しPD-L1にさらに結合する、二重特異性抗体を想定する。本明細書において、SEQ ID NO: 13(またはSEQ ID NO: 37)は、軽鎖を指し、PD-L1に結合するscFv領域が該軽鎖の定常ドメインに結合しているのに対し、SEQ ID NO: 14は、抗体の重鎖を指す。SEQ ID NO: 15は重鎖を指し、PD-L1に結合するscFv領域がFc領域のCH3ドメインに結合しているのに対し、SEQ ID NO: 16(またはSEQ ID NO: 38)は、抗体の軽鎖を指す。scFv領域が軽鎖の定常ドメインに結合しておりPD-L1に結合することができる、scFv領域に結合している軽鎖(SEQ ID NO: 13またはSEQ ID NO: 37)と重鎖(SEQ ID NO: 14)とを含む二重特異性抗体が、本発明において好まれる可能性がある。本発明はまた、SEQ ID NO: 13(またはSEQ ID NO: 37)に記載の、PD-L1に結合することができるscFv領域に結合している2本の軽鎖およびSEQ ID NO: 14に記載の2本の重鎖を有する抗体を含み得る。
【０１１３】
本発明はまた、各ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 13(またはSEQ ID NO: 37)およびSEQ ID NO: 14ならびにSEQ ID NO: 15およびSEQ ID NO: 16(またはSEQ ID NO: 38)のいずれか1つに対して少なくとも50％の配列同一性を有する可能性があるポリペプチド鎖を含む、抗体も含み得る。本発明の抗体は、各ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 13(またはSEQ ID NO: 37)およびSEQ ID NO: 14ならびにSEQ ID NO: 15およびSEQ ID NO: 16(またはSEQ ID NO: 38)のいずれか1つに対して少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、または少なくとも99％の配列同一性を有する可能性がある、ポリペプチド鎖を含み得る。本発明は、SEQ ID NO: 13(またはSEQ ID NO: 37)に対して少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、または少なくとも99％の配列同一性を有する、PD-L1に結合することができるscFv領域に結合した軽鎖、およびSEQ ID NO: 14に対して少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、または少なくとも99％の配列同一性を有する重鎖を含む、抗体を想定し得る。本発明はさらに、SEQ ID NO: 13(またはSEQ ID NO: 37)に対して少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、または少なくとも99％の配列同一性を有する、PD-L1に結合することができるscFv領域に結合した2本の軽鎖、およびSEQ ID NO: 14に対して少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、または少なくとも99％の配列同一性を有する2本の重鎖を有する、抗体も企図し得る。本発明はまた、SEQ ID NO: 15に対して少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、または少なくとも99％の配列同一性を有する、PD-L1に結合することができるscFv領域に結合した重鎖、およびSEQ ID NO: 16(またはSEQ ID NO: 38)に対して少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、または少なくとも99％の配列同一性を有する軽鎖を含む、抗体も含み得る。本発明はさらに、SEQ ID NO: 15に対して少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、または少なくとも99％の配列同一性を有する、PD-L1に結合することができるscFv領域に結合した2本の重鎖、およびSEQ ID NO: 16(またはSEQ ID NO: 38)に対して少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、または少なくとも99％の配列同一性を有する2本の軽鎖を有する、抗体も企図し得る。各ポリペプチド鎖がSEQ ID NO: 13(またはSEQ ID NO: 37)およびSEQ ID NO: 14ならびにSEQ ID NO: 15およびSEQ ID NO: 16(またはSEQ ID NO: 38)のいずれか1つに対して少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、または少なくとも99％の配列同一性を有する可能性があるポリペプチド鎖を含む本発明の抗体はまた、PD-L1およびTA-MUC1に結合することもでき得る。
【０１１４】
scFv領域のVHドメインのCDR中に様々な変異を有する、そのscFv領域によってTA-MUC1に結合しPD-L1に結合する二重特異性抗体が、本発明において扱われる場合、該抗体はまた、SEQ ID NO: 76〜79およびSEQ ID NO: 14に示されるアミノ酸配列のいずれか1つを有する可能性がある。本明細書において、SEQ ID NO: 76〜79は、軽鎖を指し、その際、PD-L1に結合するscFv領域は、PD-L1に結合するscFv領域のVHドメインのCDR中に様々な変異を含む、そのscFv領域によってTA-MUC1に結合しPD-L1に結合する二重特異性抗体の該軽鎖の定常ドメインに結合している。好ましくは、scFv領域のVHドメインのCDR中に様々な変異を有する、そのscFv領域によってTA-MUC1に結合しPD-L1に結合する該二重特異性抗体は、SEQ ID NO: 77またはSEQ ID NO: 78に示されるアミノ酸配列を有する。
【０１１５】
scFv領域のVHドメインのCDR中に様々な変異を有する、そのscFv領域によってTA-MUC1に結合しPD-L1に結合する二重特異性抗体であって、該抗体がまた、SEQ ID NO: 80〜83およびSEQ ID NO: 16(またはSEQ ID NO: 38)に示されるアミノ酸配列のいずれか1つを有する可能性がある、二重特異性抗体もまた、本発明によって含まれる。本明細書において、SEQ ID NO: 80〜83は、重鎖を指し、その際、PD-L1に結合するscFv領域は、PD-L1に結合するscFv領域のVHドメインのCDR中に様々な変異を含む、そのscFv領域によってTA-MUC1に結合しPD-L1に結合する二重特異性抗体のFc領域のCH3ドメインに結合している。
【０１１６】
用語「非変異抗体」は、EU命名法に基づくS238D、S239D、I332E、A330L、S298A、E333A、L334A、G236A、L235V、F243L、R292P、Y300L、V305I、およびP396Lより選択される1つまたは複数の配列変異を含んではならない、抗体を意味する。好ましくは、非変異抗体は、三重変異G236A/S239D/I332Eおよび五重変異L235V/F243L/R292P/Y300L/P396Lを含んではならない。
【０１１７】
用語「Fab領域」は、1本の完全な軽鎖ならびに1本の重鎖の可変ドメインおよびCH1ドメインからなる断片、すなわち抗原結合領域を意味する。しかし、Fab領域はまた、VHドメインおよびVLドメインから構成される可変断片(Fv)ならびに軽鎖の定常ドメイン(CL)およびCH1ドメインから構成される定常断片(Fb)に分けることもできる。
【０１１８】
用語「Fc領域」は、抗体の2本の重鎖の第2の定常ドメイン(CH2)および第3の定常ドメイン(CH3)からなる断片、すなわち結晶性領域を意味する。Fc領域は、補体活性化またはFc受容体への結合などのエフェクター機能を指定する。
【０１１９】
用語「scFv領域」は、重鎖の可変ドメイン(VHドメイン)および軽鎖の可変ドメイン(VLドメイン)を含む単鎖断片可変領域という用語を意味する。scFv領域は、リンカー、好ましくはGSリンカーによって、前記抗体の軽鎖の定常ドメインに(C末端融合)または該抗体のFc領域のCH3ドメインに(C末端融合)、対称的に結合されてよい。scFv領域は、リンカーによって、前記抗体の軽鎖の定常ドメインまたはFc領域のCH3ドメインのいずれかに結合される。リンカーは、原則的に、任意の数のアミノ酸および任意のアミノ酸配列を有してよい。リンカーは、少なくとも3個、5個、8個、10個、15個、または20個のアミノ酸、好ましくは少なくとも5個のアミノ酸を含み得る。さらに、リンカーは、50個未満または40個、35個、30個、25個、20個未満のアミノ酸、好ましくは45個未満のアミノ酸を含み得る。特に、リンカーは、5〜20個のアミノ酸、好ましくは5個のアミノ酸を含み得る。好ましくは、リンカーは、グリシン残基およびセリン残基からなってよい。グリシンおよびセリンは、2対1、3対1、4対1、または5対1の比(グリシン残基の数対セリン残基の数)で、リンカー中に存在してよい。例えば、リンカーは、4個のグリシン残基とそれに続く1個のセリン残基からなる配列、および特に、この配列の1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つの繰り返しを含み得る。このアミノ酸配列の2つの繰り返しからなるリンカーは、(GGGGS)2を指してよく、このアミノ酸配列の4つの繰り返しからなるリンカーは、(GGGGS)4を指してよく、このアミノ酸配列の6つの繰り返しからなるリンカーは、(GGGGS)6を指す。特に、このアミノ酸配列の4つの繰り返しからなるリンカー(GGGGS)4が、好ましい可能性がある。scFv領域を軽鎖の定常ドメインまたは重鎖のCH3ドメインに結合するリンカーは、GSリンカーであってよい。さらに、リンカーは、ヒトにおいて免疫原性能力を示さないか、またはごくわずかしか示さない配列、好ましくは、ヒト配列または天然に存在する配列である配列を含んでもよい。その結果として、リンカーおよび隣接したアミノ酸は、免疫原性能力を示さないか、またはごくわずかしか示さない可能性がある。
【０１２０】
さらに、scFv領域は、好ましくは、GSリンカー、好ましくは4GSリンカーによって連結されている1つのVH ドメイン(SEQ ID NO: 17)および1つのVLドメイン(SEQ ID NO: 18)からなる。本発明の抗体は、該抗体の軽鎖の定常ドメインまたは該抗体のFc領域のCH3ドメインのいずれかに両方とも結合されている、2つのscFv領域を有してよい。PD-L1に結合するscFv領域のVHドメインのCDR中に様々な変異を含む、そのscFv領域によってTA-MUC1に結合しPD-L1に結合する二重特異性抗体が本発明において扱われる場合、SEQ ID NO: 51〜59に示されるアミノ酸配列のいずれか1つを好ましくは有する1つの変異VHドメインおよびSEQ ID NO: 18に示される1つの非変異VLドメインからなるscFv領域もまた、本発明によって含まれ得る。
【０１２１】
scFv領域は、遺伝子操作されていてよいが、未改変配列もまた、scFv領域を形成させるのに使用され得る。scFv領域は、定常領域の除去にもかかわらず、元の親抗体の一価の抗原結合特性を再現する。
【０１２２】
本発明の該抗体は、好ましくはPD-L1である免疫チェックポイントタンパク質に結合する単鎖Fv領域を含み得る。これらの単鎖Fv領域は、軽鎖の定常ドメインまたはFc領域のCH3ドメインに結合されてよい。本発明の抗体は、好ましくはPD-L1への結合を与える、SEQ ID NO: 1〜6に示されるアミノ酸配列を有する下記のVHドメインCDRおよびVLドメインCDRを含み得る。SEQ ID NO: 1〜3は、scFv領域のVHドメインCDRを指し得るのに対し、SEQ ID NO: 4〜6は、scFv領域のVLドメインCDRを指し得る:
2020512382.tif 000002
(PD-L1結合部位のVHドメイン中のCDR1)、
2020512382.tif 000003
(PD-L1結合部位のVHドメイン中のCDR2)、
2020512382.tif 000004
(PD-L1結合部位のVHドメイン中のCDR3)、
2020512382.tif 000005
(PD-L1結合部位のVLドメイン中のCDR1)、
2020512382.tif 000006
(PD-L1結合部位のVLドメイン中のCDR2)、
2020512382.tif 000007
(PD-L1結合部位のVLドメイン中のCD3)。
【０１２３】
本発明はまた、PD-L1に結合することができるscFv領域のVHドメインCDR1が、SEQ ID NO: 1と比較して1個、2個、3個、4個、または5個の変異を有する可能性がある抗体も、含み得る。さらに、本発明は、PD-L1に結合することができるscFv領域のVHドメインCDR2が、SEQ ID NO: 2と比較して1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、または9個の変異を有する可能性がある抗体も、含み得る。さらに、本発明は、PD-L1に結合することができるscFv領域のVHドメインCDR3が、SEQ ID NO: 3と比較して1個、2個、3個、4個、または5個の変異を有する可能性がある抗体も、企図し得る。さらに、本発明は、scFv領域のVHドメインフレームワーク領域1が、SEQ ID NO: 21のフレームワーク領域1と比較して1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、または12個の変異を有する可能性がある抗体も、想定し得る。さらに、本発明は、scFv領域のVHドメインフレームワーク領域2が、SEQ ID NO: 22のフレームワーク領域2と比較して1個、2個、3個、4個、5個、または6個の変異を有する可能性がある抗体も、想定し得る。さらに、本発明は、scFv領域のVHドメインフレームワーク領域3が、SEQ ID NO: 23のフレームワーク領域3と比較して1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、または16個の変異を有する可能性がある抗体も、想定し得る。本発明は、scFv領域のVHドメインフレームワーク領域4が、SEQ ID NO: 24のフレームワーク領域4と比較して1個、2個、3個、4個、または5個の変異を有する可能性がある抗体を、想定し得る。本発明はまた、PD-L1に結合することができるscFv領域のVLドメインCDR1が、SEQ ID NO: 4と比較して1個、2個、3個、4個、または5個の変異を有する可能性がある抗体も、想定し得る。本発明は、SEQ ID NO: 5と比較して、PD-L1に結合することができるscFv領域のVLドメインCDR2中に1個、2個、または3個の変異を有する抗体を、含み得る。本発明はまた、SEQ ID NO: 6と比較して、scFv領域のVLドメインCDR3中に1個、2個、3個、または4個の変異を有する抗体も、包含し得る。さらに、本発明は、scFv領域のVLドメインフレームワーク領域1が、SEQ ID NO: 25のフレームワーク領域1と比較して1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、または11個の変異を有する可能性がある抗体も、想定し得る。さらに、本発明は、scFv領域のVLドメインフレームワーク領域2が、SEQ ID NO: 26のフレームワーク領域2と比較して1個、2個、3個、4個、5個、6個、または7個の変異を有する可能性がある抗体も、想定し得る。さらに、本発明は、scFv領域のVLドメインフレームワーク領域3が、SEQ ID NO: 27のフレームワーク領域3と比較して1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、または16個の変異を有する可能性がある抗体も、想定し得る。本発明は、scFv領域のVLドメインフレームワーク領域4が、SEQ ID NO: 28のフレームワーク領域4と比較して1個、2個、3個、4個、または5個の変異を有する可能性がある抗体も、想定し得る。前記変異を有する1つまたは複数のVHドメインCDRおよびVLドメインCDRを有する本発明の抗体もまた、PD-L1への結合を与え得る。さらに、本発明はまた、がん抗原、好ましくはTA-MUC1に結合することができ得る、scFv領域のVHドメインCDRおよびVLドメインCDRを含む抗体も、企図し得る。
【０１２４】
scFv領域のVHドメインのCDR中に様々な変異を有する、そのscFv領域によってTA-MUC1に結合しPD-L1に結合する二重特異性抗体が本発明において扱われる場合、該抗体は、好ましくはPD-L1への結合を与える以下のVH CDRを好ましくは含み得る:本明細書の別の箇所で示すような、VHドメインのCDR1中のKabat番号付与に基づく26位にグリシンからアラニンへの変異を有し、かつVHドメインのCDR1中のKabat番号付与に基づく31位にアスパラギン酸からグルタミン酸への変異を有するSEQ ID NO: 64、
またはVHドメインのCDR1中のKabat番号付与に基づく28位にトレオニンからセリンへの変異を有するSEQ ID NO: 66、およびVHドメインのCDR2中のKabat番号付与に基づく62位にセリンからトレオニンへの変異を有するSEQ ID NO: 72。
【０１２５】
用語「VHドメインおよびVLドメイン」は、本発明の抗体のFab領域の重鎖の可変ドメインおよび軽鎖の可変ドメインを意味し得る。scFv領域の重鎖の可変ドメインおよび軽鎖の可変ドメインが本発明において扱われる場合、用語「scFv領域のVHドメインおよびVLドメイン」が使用され得る。
【０１２６】
本発明の抗体の前記VHドメイン(SEQ ID NO: 19)およびVLドメイン(SEQ ID NO: 20またはSEQ ID NO: 39)は、好ましくはTA-MUC1であるがん抗原に結合することができ得る。したがって、本発明の二重特異性抗体は、好ましくはTA-MUC1に結合するVHドメインおよびVLドメインを含み得る。本発明の抗体は、好ましくはTA-MUC1への結合を与える、SEQ ID NO: 7〜12に示されるアミノ酸配列を有する下記のVHドメインCDRおよびVLドメインCDRを含み得る。SEQ ID NO: 7〜9は、VHドメインCDRを指し得るのに対し、SEQ ID NO: 10〜12は、VLドメインCDRを指し得る:
2020512382.tif 000008
(TA-MUC1結合部位のVHドメイン中のCDR1)、
2020512382.tif 000009
(TA-MUC1結合部位のVHドメイン中のCDR2)、
2020512382.tif 000010
(TA-MUC1結合部位のVHドメイン中のCDR3)、
2020512382.tif 000011
(TA-MUC1結合部位のVLドメイン中のCDR1)、
2020512382.tif 000012
(TA-MUC1結合部位のVLドメイン中のCDR2)。
2020512382.tif 000013
(TA-MUC1結合部位のVLドメイン中のCDR3)。
【０１２７】
本発明はまた、VHドメインCDR1領域が、SEQ ID NO: 7と比較して1個、2個、または3個の変異を有する可能性がある抗体も、含み得る。さらに、本発明は、VHドメインCDR2が、SEQ ID NO: 8と比較して1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、または9個の変異を有する可能性がある抗体も、含み得る。さらに、本発明は、VHドメインCDR3が、SEQ ID NO: 9と比較して1個、2個、または3個の変異を有する可能性がある抗体も、企図し得る。さらに、本発明は、VHドメインフレームワーク領域1が、SEQ ID NO: 29のフレームワーク領域1と比較して1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、または15個の変異を有する可能性がある抗体も、想定し得る。さらに、本発明は、VHドメインフレームワーク領域2が、SEQ ID NO: 30のフレームワーク領域2と比較して1個、2個、3個、4個、5個、6個、または7個の変異を有する可能性がある抗体も、想定し得る。さらに、本発明は、VHドメインフレームワーク領域3が、SEQ ID NO: 31のフレームワーク領域3と比較して1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、または16個の変異を有する可能性がある抗体も、想定し得る。本発明は、VHドメインフレームワーク領域4が、SEQ ID NO: 32のフレームワーク領域4と比較して1個、2個、3個、4個、または5個の変異を有する可能性がある抗体も、想定し得る。
【０１２８】
本発明はまた、VLドメインCDR1が、SEQ ID NO: 10と比較して1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、または8個の変異を有する可能性がある抗体も、想定し得る。本発明は、SEQ ID NO: 11と比較して、VLドメインCDR2中に1個、2個、または3個の変異を有する抗体を、含み得る。本発明はまた、SEQ ID NO: 12と比較して、VLドメインCDR3中に1個、2個、3個、または4個の変異を有する抗体も、包含し得る。さらに、本発明は、VLドメインフレームワーク領域1が、SEQ ID NO: 33のフレームワーク領域1と比較して1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、または11個の変異を有する可能性がある抗体も、想定し得る。さらに、本発明は、VLドメインフレームワーク領域2が、SEQ ID NO: 34のフレームワーク領域2と比較して1個、2個、3個、4個、5個、6個、または7個の変異を有する可能性がある抗体も、想定し得る。さらに、本発明は、VLドメインフレームワーク領域3が、SEQ ID NO: 35のフレームワーク領域3と比較して1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、または16個の変異を有する可能性がある抗体も、想定し得る。本発明は、VLドメインフレームワーク領域4が、SEQ ID NO: 36のフレームワーク領域4と比較して1個、2個、3個、4個、5個、または6個の変異を有する可能性がある抗体も、想定し得る。
【０１２９】
さらに、前記変異を有する1つまたは複数のVHドメインCDRおよびVLドメインCDRを有する本発明の抗体はまた、TA-MUC1への結合を与え得る。本発明はまた、免疫チェックポイントタンパク質、好ましくはPD-L1に結合することができ得る、VHドメインCDRおよびVLドメインCDRを含む抗体も、企図し得る。
【０１３０】
用語「フレームワーク領域」は、VHドメインおよびVLドメイン中またはscFv領域のVHドメインおよびVLドメイン中のいずれかの、CDRの前および後ろの、ならびにCDRの間に挟まれた、アミノ酸領域を意味する。
【０１３１】
用語「CDR」は、相補性決定領域を意味し、B細胞によって作り出された免疫グロブリン(抗体)中または免疫グロブリンに結合された単鎖Fv領域中のそれぞれ軽(VL)鎖および重(VH)鎖の可変ドメイン上に各3個あり、抗原への結合に関与している、β鎖の可変ループを意味する。別段の定めがない限り、本開示のCDR配列は、Maass 2007 (Journal of Immunological Methods 324 (2007) 13-25)による定義に従う。CDRを定義するための他の基準もまた存在し、例えば、Sequences of Proteins of immunological Interest, US Department of Health and Human Services (1991), eds. Kabat et al.に記載されているKabat CDRに従う定義がある。抗原結合部位を特徴付けるための別の基準は、Chothiaによって説明されている超可変ループに言及するものである(例えば、Chothia, et al. (1992); J. Mol. Biol. 227:799-817;およびTomlinson et al. (1995) EMBO J. 14:4628-4638を参照されたい)。さらに別の基準は、Oxford MolecularのAbM抗体モデリングソフトウェアによって使用されているAbM定義である。一般に、例えば、Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. In: Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. and Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg)を参照されたい。MaassのCDR定義を基準にして説明される態様は、代わりに、Kabat CDR、Chothia超可変ループ、またはAbM定義によるループを基準とするなど、説明した同様の関係を用いて実践できることが、理解されよう。
【０１３２】
用語「変異」は、置換、挿入、および/または欠失を意味する。変異は、VHドメインおよびVLドメインのCDR中ならびに/またはVHドメインおよびVLドメインの対応するフレームワーク領域中に存在してよい。変異はまた、scFv領域のVHドメインおよびVLドメインのCDR中ならびに/またはscFv領域のVHドメインおよびVLドメインの対応するフレームワーク領域中に存在してもよい。
【０１３３】
用語「GSリンカー」は、グリシン(Gly/G)残基およびセリン(Ser/S)残基のストレッチを含むペプチドリンカーまたは配列を意味する。GSリンカーは、5個、10個、15個、20個、25個、または25個より多いアミノ酸、好ましくは5個のアミノ酸を含み得る。主に、一般的な(G4S)4リンカーリピート(本明細書において4GSリンカー
2020512382.tif 000014
と呼ばれる)または(G4S)6リンカーペプチド(本明細書において6GSリンカー
2020512382.tif 000015
と呼ばれる)が、抗体中で使用され得る。通常、4GSリンカーは、scFv領域のVHドメインを軽鎖の定常ドメインに結合させることができるか、またはscFv領域のVHドメインを該抗体のFc領域のCH3ドメインに結合させることができる。6GSリンカーは、VH-リンカー-VLの配置を有するように、VHドメインをscFv領域のVLドメインに結合させることができる。本明細書において、本発明の二重特異性正常フコシル化抗体および二重特異性フコース減少抗体は、4GSリンカーを含み得る。第1の4GSリンカーは、scFv領域のVHドメインを、軽鎖の定常ドメインまたは該抗体のFc領域のCH3ドメインのいずれかに結合させることができ、他の4GSリンカーは、VH-リンカー-VLの配置を有するように、VHドメインをscFv領域のVLドメインに結合させることができる。
【０１３４】
用語「二機能性単特異性抗体」は、Fc領域が、FcyR受容体、好ましくはFcyRIIIaに結合することができ、VHドメインおよびVLドメインが、免疫チェックポイントタンパク質に結合することができ、好ましくは該免疫チェックポイントタンパク質がPD-L1である、本発明の抗体を意味し得る。本発明はまた、FcyR受容体、好ましくはFcyRIIIaに結合するFc領域ならびにがん抗原に結合するVHドメインおよびVLドメインを含む抗体も含み得、好ましくは、該がん抗原はTA-MUC1である。
【０１３５】
用語「三機能性二重特異性抗体」は、Fc領域が、FcyR受容体、好ましくはFcyRIIIaに結合することができ、VHドメインおよびVLドメインが、がん抗原に結合することができ、好ましくは該がん抗原がTA-MUC1である、本発明の抗体を意味し得る。さらに、TA-MUC1に結合することができる前記三機能性二重特異性抗体は、免疫チェックポイントタンパク質に結合することができる単鎖Fv領域をさらに有する可能性があり、好ましくは該免疫チェックポイントタンパク質はPD-L1である。TA-MUC1に結合することができ、かつそのscFv領域によってPD-L1に結合することができる前記三機能性二重特異性抗体は、本発明によって好まれる可能性がある。用語「三機能性二重特異性抗体」はまた、Fc領域が、FcyR受容体、好ましくはFcyRIIIaに結合することができ、VHドメインおよびVLドメインが、免疫チェックポイントタンパク質に結合することができ、好ましくは該免疫チェックポイントタンパク質がPD-L1である、本発明の抗体も意味し得る。さらに、PD-L1に結合することができる三機能性二重特異性抗体は、がん抗原に結合することができる単鎖Fv領域をさらに有する可能性があり、好ましくは該がん抗原はTA-MUC1である。
【０１３６】
用語「PM-PDL-GEX」は、二重特異性PankoMab抗PDL1-GEX抗体または抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1抗体とも呼ばれる、PD-L1特異性と組み合わせられたPankoMab抗体を意味する。PM-PDL-GEX抗体は、Glycotope GmbHによって開発されている。本明細書において、PD-L1特異性を有するPankoMab抗体は、三機能性二重特異性である。さらに、PankoMab抗PD-L1-GEX抗体のscFv領域としての抗PD-L1部分は、拮抗的作用を含み得る。
【０１３７】
用語「PankoMab」は、ムチン-1の腫瘍特異的エピトープ(TA-MUC1)を認識して、それが腫瘍MUC1エピトープと非腫瘍MUC1エピトープとを識別することを可能にする、ヒト化モノクローナル抗体を意味する。これは、Glycotope GmbHによって開発されている。本発明のPankoMab抗体は、がん抗原、好ましくはTA-MUC1に結合することができ、PD-L1特異性と組み合わせられており、したがって、そのscFv領域によって免疫チェックポイントタンパク質、好ましくはPD-L1に結合することができる。
【０１３８】
用語「グリコ最適化抗体」は、そのFc領域中のオリゴ糖のグリコシル化が改変されている抗体を意味する。本明細書において、用語「グリコ最適化された」は、オリゴ糖構造のα-1,6位置における脱フコシル化を意味する。グリコ最適化は、FcyRIII、好ましくはFcyRIIIaへの結合の増加によって抗腫瘍T細胞応答をさらに増大させる機会を与える。したがって、グリコ最適化抗体は、FcyRを有する免疫細胞の寄与により、腫瘍細胞を直接的に死滅させ、PD-L1+免疫抑制細胞を枯渇させる能力を有している。
【０１３９】
用語「免疫チェックポイントタンパク質」は、免疫応答を調節する、抗炎症性または炎症誘発性いずれかの、免疫系中のタンパク質分子を意味する。これらは、シグナル(共刺激分子)を大きくするか、またはシグナルを小さくするかのいずれかによって、免疫応答の正確な機能をモニターする。A2AR、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、BTLA、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、PD-1、PD-L1、TIM-3、VISTA(タンパク質)などの阻害性(抗炎症性)免疫チェックポイントタンパク質、ならびにCD27、CD40、OX40、GITR、およびCD137(4-1BB)などの炎症誘発性免疫チェックポイントタンパク質がある。本発明は、阻害性免疫チェックポイントタンパク質を好む可能性がある。本明細書において、免疫チェックポイントタンパク質は、好ましくはPD-L1を指す。
【０１４０】
用語「がん抗原」は、がん細胞中で産生される抗原性物質を意味する。がん抗原は、がん細胞中で比較的豊富であることから、特定のがん細胞を同定する際に有用である。ある種のがんは、ある種のがん抗原を豊富に有している。がん関連抗原にはHER2、EGFR、VEGF、TA-MUC1、PSAが含まれ得るが、それらに限定されるわけではない。本明細書において、がん抗原は、好ましくはTA-MUC1を指す。用語「腫瘍抗原」を同義的に使用することができる。
【０１４１】
用語「に由来する」または「それらに由来する」は、用語「から生ずる/それらから生ずる」または「から得られる/それらから得られる」と同義的に使用され得る。例えば、ある細胞または細胞株は、本発明において言及する別の細胞または細胞株から生じ得る。
【０１４２】
本明細書において使用される場合、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」は、文脈において特に別段の指示がない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「１つの試薬」への言及は、そのような様々な試薬の1つまたは複数を含み、「その方法」への言及は、修正され得るか、または本明細書において説明する方法の代わりに使用され得る、当業者に公知の同等の段階および方法への言及を含む。
【０１４３】
別段の定めがない限り、要素の系列の前にある用語「少なくとも」は、その系列中の全要素を指すと理解すべきである。当業者は、ごく普通の実験法を用いるだけで、本明細書において説明する本発明の個々の態様に対する多くの等価物を認識するか、または確認することができる。このような等価物は、本発明によって包含されると意図される。
【０１４４】
用語「および/または」は、本明細書において使用される場合はいつでも、「および」、「または」、および「該用語によって連結される要素のすべてまたは他の任意の組合せ」の意味を含む。
【０１４５】
用語「より少ない/未満」または次に「より多い」は、名数を含まない。例えば、「20より少ない」とは、示された数より少ないことを意味する。同様に、「より多い」または「を上回る」とは、示された数より多いか、または上回ることを意味し、例えば、「80％より多い」は、80％という示された数より多いか、または上回ることを意味する。
【０１４６】
本明細書およびそれに続く特許請求の範囲の全体を通して、文脈において特に指示がない限り、「含む(comprise)」という単語、ならびに「comprises」および「comprising」などの変形は、記載した整数もしくは段階、または整数もしくは段階のグループを包含するが、他の整数および段階、ならびに整数および段階のグループのどれも除外しないことを意味するものと理解される。本明細書において使用される場合、用語「含む(comprising)」の代わりに、用語「含有する(containing)」もしくは「含む(including)」、または時には、本明細書において使用される場合、用語「有する(having)」を用いることができる。本明細書において使用される場合、「からなる(consisting of)」は、指定されていない任意の要素、段階、または成分を除外する。
【０１４７】
用語「含む(including)」は、「含むが、限定されない(including but not limited to)」を意味する。「含む」および「含むが、限定されない」は、同義的に使用される。
【０１４８】
本発明は、本明細書において説明する特定の方法論、プロトコール、材料、試薬、および物質などに限定されず、したがって変化できることを理解すべきである。本明細書において使用される専門用語は、特定の態様を説明する目的のためにすぎず、特許請求の範囲によってのみ定義される本発明の範囲を限定することは意図されない。
【０１４９】
本明細書の本文を通して引用したすべての刊行物(すべての特許、特許出願、科学的出版物、取扱い説明書などを含む)は、前述であるか後述であるかを問わず、全体が参照により本明細書に組み入れられる。本明細書における何事も、以前の発明によるそのような開示に本発明が先行する権利がないことを認めるものとして解釈されるべきではない。参照により組み入れられる資料が本明細書と矛盾するか、または一致しない範囲では、本明細書が任意のそのような資料に優先する。
【０１５０】
本明細書において引用する文書および特許文書すべての内容は、その全体が参照により組み入れられる。
【０１５１】
本発明およびその利点のより良い理解は、例示を目的として提供されるにすぎない以下の実施例から得られる。これらの実施例は、本発明の範囲を限定することを決して意図しない。
【実施例】
【０１５２】
以下に、実施例を参照して、本発明をより詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明を限定することを意図しない。
【０１５３】
実施例1:単特異性PDL-GEX Fuc-および二重特異性PM-PDL-GEX Fuc-は、単特異性PDL-GEX H9D8および二重特異性PM-PDL-GEX H9D8と比較して、コアフコシル化が減少している
単特異性PDL-GEX Fuc-および二重特異性PM-PDL-GEX Fuc-は、ごく低比率のコアフコシル化N-グリカンしか含まず、したがって、フコース減少と呼ばれる(図1)。
【０１５４】
Fc N-グリコシル化が、Fc受容体への抗体の結合に主に影響し、したがってADCCをもたらすための役割を果たすことが、文献で考察されている。単特異性抗体PDL-GEX H9D8およびPDL-GEX Fuc-ならびに二重特異性抗体PM-PDL-GEX H9D8およびPM-PDL-GEX Fuc-のN-グリコシル化を、HILIC-UPLC-HiResQToF MSMS(hydrophilic interaction ultra-performance chromatography coupled to high resolution quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry)によって解析した。
【０１５５】
簡単に説明すると、抗体をRapiGest SF(登録商標)(Waters Inc.)およびトリス-(2-カルボキシエチル)ホスフィンによって変性させた(120分、95℃)。N-グリカンをRapid PNGase F(登録商標)によって遊離させ(10分、55℃、Waters Inc.)、続いて、ジメチルホルムアミドに溶かしたRapiFluor MS(登録商標)試薬を用いて室温で5分間、蛍光タグ化した。タグ化されたグリカンを精製するために、μElution Plate(HILIC SPE)を使用した。標識されたN-グリカンを、蛍光検出器を含む超高性能クロマトグラフィー装置(I-Class、Waters Inc.)を用いてHILIC相(UPLC BEH GLYCAN 1.7 150 mm、Waters Inc.)において分離した。RapiGest SF(登録商標)でタグ化されたN-グリカンは、励起波長265nmおよび発光波長425nmで検出した。グリカン定量のために蛍光シグナルを使用した。蛍光検出器に続けて、高分解能質量分析計(Impact HD、Bruker Daltonik GmbH)を連結した。前駆物質を一連の断片質量と組み合わせることにより、グリカン構造の明瞭な同定が可能になった。
【０１５６】
実施例2:フコース減少抗PD-L1 hIgG1およびフコース減少二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1は、それらの正常フコシル化対応物と比較して、同程度の妨害能力を示す
フコース減少抗PD-L1 hIgG1およびフコース減少二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1は、PD-L1/PD-1妨害およびPD-L1/CD80妨害に関して同程度の妨害能力を示す。
【０１５７】
2種の異なる競合ELISAを開発して、抗PD-L1抗体がPD-L1とその結合相手であるPD-1およびCD80との相互作用を阻害する能力を解析した。PD-L1/PD-1ブロッキングELISAは、PD-1とPD-L1の間の妨害状況を示すことにより、最も適切なELISAとみなされる。Fcタグ化ヒトPD-L1(tebu-bio/BPS bioscience)をMaxisorp 96ウェルプレートの表面に塗った。洗浄およびブロッキングの後、抗PD-L1 hIgG1または二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1の段階希釈物の存在下で一定濃度のビオチン標識ヒトPD-1(tebu-bio/BPS bioscience)を添加し、それによって、PD-1への結合を得るために競合させた。洗浄後、PD-1への結合を、ストレプトアビジン-PODおよびTMBを用いて検出した。結果として、抗PD-L1抗体によるPD-1とPD-L1との相互作用の阻害が高レベルであるほど、結果として生じる450nmでのODは低い。
【０１５８】
最初に、PD-L1/PD-1ブロッキングELISAにおいて、フコース減少抗PD-L1 hIgG1(PDL-GEX Fuc-)およびフコース減少二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1(PM-PDL-GEX Fuc-)をそれらの正常フコシル化対応物(PDL-GEX H9D8およびPM-PDL-GEX H9D8)と比較した(図2A)。試験された4種の変種すべてについて、PD-1結合の濃度依存的な妨害が検出された。
【０１５９】
さらに、関連するブロッキングELISAを前述したように開発し、ただし、PD-1 CD80リガンドの代わりに、PD-L1の別の機能的に関連するリガンドを使用した(図2B)。
【０１６０】
実施例3:フコース減少二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1および正常フコシル化二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1は、同程度のTA-MUC1結合を示す
フコース減少二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1および正常フコシル化二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1は、同程度のTA-MUC1結合を示した。予想されるとおり、単特異性抗PD-L1 (PDL-GEX H9D8)は、細胞株ZR-75-1に対して結合を示さなかった(図3)。
【０１６１】
ヒトTA-MUC1を発現する腫瘍細胞への、フコース減少二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1および正常フコシル化二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1(PM-PDL-GEX H9D8およびPM-PDL-GEX Fuc-)の結合特性をフローサイトメトリーによって解析した。TA-MUC1発現は強いがPD-L1発現は最小限のみまたは発現しない乳がん細胞株ZR-75-1を用いて、TA-MUC1結合を測定した。簡単に説明すると、標的細胞を採取し、段階希釈物中の指定の抗体と共にインキュベートした。その後、細胞を洗浄し、4℃、暗所で、AF488とコンジュゲートされたヤギ抗hIgG二次抗体と共にインキュベーションした。フローサイトメトリーによって細胞を解析した。
【０１６２】
実施例4:抗PD-L1 hIgG1および二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1のフコース減少変種は、正常フコシル化変種と比較して、FcyRIIIaへの結合の増加を示す
フコース減少抗PD-L1(PDL-GEX Fuc-)は、正常フコシル化抗PD-L1 hIgG1(PDL-GEX H9D8)と比較してEC50値が減少していることから、正常フコシル化変種と比較してフコース減少変種のFcγRIIIaへの結合が約5倍に増強されていることが実証されている。一方、二重特異性フコース減少抗PD-L1/TA-MUC-1 hIgG1(PM-PDL-GEX Fuc-)の相対効力は、10.4と定められた。このことから、二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1についても、FcγRIIIaへの結合は、正常フコシル化対応物と比較して、フコース減少変種の場合に約5倍に増強されている(図4)。
【０１６３】
抗体依存性細胞障害(ADCC)の誘導は、1つの部位において標的抗原に結合し、他の部位においてエフェクター細胞上のFcγIIIa受容体へのそのFc部分の結合を介してエフェクター細胞を動員する、抗体に関連している。hIgG1の脱フコシル化により、FcγRIIIaへの親和性が高くなり、それによって、各抗原を発現する腫瘍細胞に対する、ヒト末梢血単核細胞によって媒介されるADCCが強くなると予想される。
【０１６４】
FcγRIIIaへの抗体Fc部分の結合を分子レベルで特徴付けるために、Perkin Elmerのビーズベースの技術(AlphaScreen(登録商標))を用いる新しいアッセイ法を開発した。(GlycotopeによりGEX-H9D8細胞株において組換えによって作製された)組換えヒトFcγRIIIaの細胞外ドメインをこのアッセイ法で使用した。Hisタグ化FcγRIIIaを、Niキレートドナービーズを用いて捕捉した。試験抗体およびウサギ抗マウス結合アクセプタービーズは、FcγRIIIaへの結合を得るために競合する。FcγRIIIaがウサギ抗マウスアクセプタービーズのみと相互作用する場合、ドナービーズおよびアクセプタービーズは極めて近づき、その結果、レーザー励起すると化学発光による発光が起こる。最大シグナルに達する。FcγRIIIaに結合する試験抗体がアクセプタービーズと競合する場合、最大シグナルは濃度依存的に減少する。520〜620nmで測定することによって化学発光を定量した。結果として、濃度依存的なS字形の用量反応曲線が得られた。この曲線は、上部の平坦域、下部の平坦域、勾配、およびEC50に基づいて定められる。EC50は、FcγRIIIaへの最大結合の50％に必要とされる有効抗体濃度に等しい。
【０１６５】
実施例5:フコース減少抗PD-L1 hIgG1およびフコース減少二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1は、それらの正常フコシル化対応物と比較して、TA-MUC+およびPD-L1+腫瘍細胞の死滅の増加を示す
フコース減少二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1(PM-PDL-GEX Fuc-)は、高レベルのTA-MUC1およびほんのわずかなレベルのPD-L1を発現する乳がん細胞株ZR-75-1に対して、正常フコシル化二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1と比較して強く増強されたADCC活性を示した。フコース減少抗PD-L1(PDL-GEX Fuc-)およびフコース減少二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1(PM-PDL-GEX Fuc-)は、それらの正常フコシル化対応物と比較して、前立腺がん細胞株DU-145のようなPD-L1陽性腫瘍細胞に対する強く増強されたADCCをもたらした。
【０１６６】
腫瘍細胞に対するADCCをもたらす能力を、ユウロピウム放出アッセイ法を用いて解析した。簡単に説明すると、エレクトロポレーションによって標的細胞にユウロピウム(Eu2+)を導入し、試験抗体の存在下、30:1のE:T比で5時間、FcyRIIIaをトランスフェクトされたNK細胞株と共にインキュベートした。上清へのユウロピウム放出(抗体を媒介とした細胞死を示す)を、蛍光プレートリーダーを用いて定量した。標的細胞をトリトンX-100と共にインキュベーションすることによって最大放出を実現し、自発的放出は、標的細胞のみを含み抗体もエフェクター細胞も含まない試料において測定した。細胞障害率は、次のように計算した:溶解率(％)=[(実験による放出-自発的放出)/(最大放出-自発的放出)]×100。
【０１６７】
まず第一に、高レベルのTA-MUC1およびほんのわずかなレベルのPD-L1を発現する乳がん細胞株ZR-75-1に対するADCCを解析した(図5A、実施例3を参照されたい)。
【０１６８】
第二に、PD-L1を強く発現し中程度のTA-MUC1発現を有する前立腺がん細胞株DU-145に対するADCCを解析した(図5Bおよび5C)。PD-L1およびTA-MUC1の発現は、PDL-GEX H9D8およびTA-MUC1特異的抗体をそれぞれ用いるフローサイトメトリーにより解析し、蛍光色素で標識された二次抗体を用いて検出した。
【０１６９】
第三に、フコース減少抗PD-L1 hIgG1およびフコース減少二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1をそれらの正常フコシル化対応物と比較して用いることによって、前立腺がん細胞株DU-145に対するADCCを再び解析した(図5D)。
【０１７０】
実施例6:フコース減少抗PD-L1 hIgG1およびフコース減少二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1は、PD-L1+ PBMCに対してADCC作用を示さない
フコース減少抗PD-L1およびフコース減少二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1によってB細胞(図6A)および単球(図6B)に対してもたらされるADCC作用は検出されなかった。
【０１７１】
PD-L1は、もっぱら腫瘍細胞においてだけでなく、様々な免疫細胞、例えば単球またはB細胞においても発現されることが報告されている。フコース減少抗PD-L1およびフコース減少二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1は、それらの正常フコシル化対応物と比較して、腫瘍細胞に対して大きく増大したADCC作用を示すため、PD-L1+免疫細胞に対するADCCもこれらがもたらすことが予想され得る。
【０１７２】
単球およびB細胞はPD-L1を発現することが説明されており、したがって、両方の免疫細胞集団を、潜在的な標的細胞としてFACSベースのADCCアッセイ法において解析した。簡単に説明すると、B細胞および単球を、磁気活性化細胞選別(MACS)によるネガティブ選択によって95％を超える純度まで、PBMCから単離した。市販の抗CD20 mAb(Gazyvaro(登録商標)、Roche)を、B細胞およびヒトバーキットリンパ腫細胞株ダウディにおいて陽性対照として使用した。単球の場合、スタウロスポリンが、単離された単球およびヒト白血病単核球細胞株THP-1において陽性対照としての機能を果たした。B細胞、単球、または陽性対照細胞株を、37℃で20分間、カルセイン-AMで標識し、続いて洗浄した。その後、細胞を96ウェル丸底プレートに播種し、フコース減少抗PD-L1 hIgG1またはフコース減少二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1を様々な濃度で添加した。FcγRIIIaをトランスフェクトしたNK細胞株をエフェクター細胞として使用した。37℃で合計4時間のインキュベーション期間の後、細胞を7-AADで染色し、フローサイトメトリーによって解析した。
【０１７３】
実施例7:フコース減少二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1および正常フコシル化二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1は、細胞ベースのPD-1/PD-L1遮断バイオアッセイ法において、同等の結果を示す
PD-L1/PD-1ブロックELISAによれば、脱フコシル化二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1(PM-PDL-GEX Fuc-)および正常フコシル化二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1(PM-PDL-GEX H9D8)の両方について、PD-1/PD-L1ブレイクの同程度の用量依存的放出が検出された(実施例1を参照されたい)。予想どおり、ニボルマブは陽性対照として有効であった(図7)。
【０１７４】
PD-1/PD-L1遮断バイオアッセイ法(Promega)は、PD-1/PD-L1相互作用を妨害するように設計された抗体の効力を測定するのに使用できる生物発光細胞ベースのアッセイ法である。このアッセイ法は、2種の遺伝子操作された細胞株からなる:
i  ルシフェラーゼレポーター遺伝子を含む、PD-1陽性の応答細胞(Jurkat T細胞)
ii  PD-L1陽性刺激物CHO-K1細胞
PD-1/PD-L1相互作用が原因で、応答細胞におけるTCRシグナル伝達および結果として生じるNFATを介したルシフェラーゼ活性が阻害される。この阻害は、PD-1またはPD-L1のいずれかを妨害する抗体の存在下で逆転されて、発光読み取り装置で検出できる発光シグナルを生じることができる。
【０１７５】
実施例8:フコース減少二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1および正常フコシル化二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1ならびにフコース減少抗PD-L1 hIgG1は、同種異系混合リンパ球反応(MLR)において、同程度のIL-2を誘導する
フコース減少二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1(PM-PDL-GEX Fuc-)および正常フコシル化二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1(PM-PDL-GEX H9D8)ならびにフコース減少抗PD-L1 hIgG1(PDL-GEX Fuc-)が同程度の量のIL-2を誘導したことから、IL-2分泌に対する脱フコシル化の影響は検出されなかった。
【０１７６】
混合リンパ球反応(MLR)は、PD-L1発現抗原提示細胞によるPD-1発現T細胞の抑制にPD-L1遮断抗体が与える影響を解析するために確立された機能アッセイ法である。このアッセイ法は、刺激物としての別のドナーに由来する単球由来樹状細胞(moDC)に対する、応答物としてのあるドナーに由来するT細胞(単離されたT細胞またはPBMCのいずれか)の応答(=同種異系MLR)を測定する。
【０１７７】
簡単に説明すると、磁気活性化細胞選別を用いるネガティブ選択によってバフィコートから単球を単離し、次いで、IL-4およびGM-CSFを7日間用いて、moDCに分化させた。次いで、フローサイトメトリーによってmoDCの表現型を解析した(図8A)。
【０１７８】
さらに、分化後、1:10の刺激物/応答物比で、moDCを単離T細胞と共に培養した。3日後、IL-2 ELISA(Affimetryx eBioscience)のために上清を採取した(図8B)。
【０１７９】
実施例9:フコース減少抗PD-L1 hIgG1およびフコース減少二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1は、正常フコシル化対応物およびFcyR結合能力がない/弱い抗PD-L1抗体と比較して、増大したT細胞活性化を示す
フコース減少抗PD-L1 hIgG1(PDL-GEX Fuc-)およびフコース減少二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1(PM-PDL-GEX Fuc-)は、同種異系MLRにおいて、正常フコシル化抗PD-L1 hIgG1(PDL-GEX H9D8)および正常フコシル化二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1(PM-PDL-GEX H9D8)と比較して、ならびにFcyR結合能力がない/弱い抗PD-L1抗体(アテゾリズマブ)と比較して、増強されたT細胞活性化を誘導する。
【０１８０】
1μg/ml試験抗体の存在下でのmoDCおよび3名の異なるドナー(図9A、9B、および9C)に由来する単離T細胞を用いる同種異系MLRのCD8 T細胞(CD3+CD8+細胞)を、フローサイトメトリーにより、CD25の発現を介して活性化について5日目に解析した。抗体を添加しないMLRは、陰性対照としての機能を果たした。
【０１８１】
ブロッキングELISA(実施例2を参照されたい)、PD-1/PD-L1遮断バイオアッセイ法(実施例7を参照されたい)、およびIL-2分泌(実施例8を参照されたい)においては、グリコシル化変種間の差異が認められなかったため、フコース減少抗PD-L1抗体およびフコース減少抗PD-L1/TA-MUC1抗体がT細胞活性化の増大を誘導したということは意外である。フコース減少抗PD-L1 hIgG1およびフコース減少二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1に起因するT細胞活性化の増大は、異なるドナーのT細胞を用いて観察され、一般的効果であると予想される。
【０１８２】
CD8 T細胞は、抗腫瘍応答において非常に重要な役割を果たし、がん細胞を直接的に死滅させる能力を有している細胞障害性T細胞に相当するため、フコース減少単特異性抗PD-L1(PDL-GEX Fuc-)およびフコース減少二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1(PM-PDL-GEX Fuc-)がCD8 T細胞活性化の増強を誘導するというこの知見は重要である。
【０１８３】
実施例10:フコース減少抗PD-L1 hIgG1およびフコース減少二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1は、単離T細胞および全PBMCを用いるMLRにおいて、正常フコシル化対応物およびFcyR結合能力がない/弱い抗PD-L1と比較して、増大したT細胞活性化を示す
MLRにおける応答細胞としてT細胞またはPBMCのいずれかを用いて、CD3+CD8+細胞におけるCD25およびCD137の発現に基づいて測定した場合、フコース減少抗PD-L1 hIgG1(PDL-GEX Fuc-)およびフコース減少二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1(PM-PDL-GEX Fuc-)が、正常フコシル化抗PD-L1 hIgG1(PDL-GEX H9D8)、二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1(PM-PDL-GEX H9D8)と比較して、ならびにFcyR結合能力がない/弱い抗PD-L1(アテゾリズマブ)と比較して、より強いCD8 T細胞活性化を誘導した。
【０１８４】
さらに、moDCをPBMCと共に培養すると、CD25およびCD137の発現に基づいて測定した場合、CD4 T細胞活性化(CD3+CD8-細胞、故にCD4 T細胞)がさらに増大し、これは、単離T細胞を用いるMLRでは以前に観察されていなかった。単離T細胞の代わりに、NK細胞を含むPBMCを使用すると、NK細胞またはPD-L1+細胞に対する潜在的なNK細胞を介したADCC作用がT細胞活性化に対して不利な影響を与えないことが示される。
【０１８５】
ある同種異系MLRにおいて、単離T細胞またはPBMCを、1μg/ml試験抗体の存在下でmoDCと共に5日間培養した。抗体を添加しないMLRは、陰性対照としての機能を果たした。次いで、CD8 T細胞活性化を、単離T細胞を用いるMLR(図10Aおよび10B)の場合およびPBMCを用いるMLR(図10Cおよび10D)の場合の、CD8 T細胞におけるCD25およびCD137の発現に基づいて測定した。CD4 T細胞活性化もまた、PBMCを用いるMLR(図10Eおよび10F)の場合の、CD4 T細胞におけるCD25およびCD137の発現に基づいて測定した。
【０１８６】
実施例11:フコース減少抗PD-L1 hIgG1およびフコース減少二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1はまた、T細胞におけるCD69発現も増大させる
フコース減少抗PD-L1 hIgG1(PDL-GEX Fuc-)およびフコース減少二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1(PM-PDL-GEX Fuc-)は、正常フコシル化抗PD-L1 hIgG1(PDL-GEX H9D8)および正常フコシル化二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1 hIgG1(PM-PDL-GEX H9D8)と比較して、CD8 T細胞における強いCD69発現を誘導する(図11)。
【０１８７】
1μg/ml試験抗体の存在下での単離T細胞およびmoDCを用いる同種異系MLRのD8 T細胞(CD3+D8+細胞)を、CD69発現についてフローサイトメトリーによって5日目に解析した。抗体を添加しないMLRは、陰性対照としての機能を果たした。CD69は、CD25およびCD137のほかの付加的な活性化マーカーである。
【０１８８】
実施例12:FcyRは、PD-L1の妨害を介するT細胞活性化のために非常に重要な役割を果たす
この同種異系MLRは、フコース減少抗PD-L1抗体によるT細胞活性化の増大のためにFcyR結合が非常に重要な役割を果たしていることを示す。フコース減少抗PD-L1 hIgG1(PDL-GEX Fuc-)によって増大されたT細胞活性化は、無関係な特異性を有する別のフコース減少抗体(ブロックと名付けられる)(その抗原はMLR中に存在していない)の添加により、正常フコシル化抗PD-L1 hIgG1(PDL-GEX H9D8)またはFcyR結合能力がない/弱い非グリコシル化抗PD-L1 hIgG1(アテゾリズマブ)と同等のレベルまで阻害された(図12)。
【０１８９】
moDCおよび単離T細胞を用いるこの同種異系MLRにおいて、無関係な特異性を有するフコース減少抗体(ブロックと呼ばれる)は、フコース減少抗PD-L1 hIgG1と比較して10倍多い濃度で添加され、したがって、FcyRへのフコース減少抗PD-L1 hIgG1の結合を妨害する。この実験は、フコース減少抗PD-L1抗体に起因するT細胞活性化の増大に対するFcγRの重要な役割を実証する。
【０１９０】
実施例13:脱フコシル化抗PD-L1 hIgG1の存在下では、樹状細胞は、正常フコシル化抗PD-L1 hIgG1の場合と比較して、より成熟した表現型を示す
フコース減少抗PD-L1 hIgG1(PDL-GEX Fuc-)の存在下では、moDCは、正常フコシル化抗PD-L1 hIgG1(PDL-GEX H9D8)の場合と比較して、少ないCD14発現を示した。対照的に、CD16(FcγRIII)ならびに共刺激分子CD40およびCD86、ならびにDCマーカーCD83は、正常フコシル化抗PD-L1 hIgG1と比較して、フコース減少抗PD-L1 hIgG1の存在下の方が、より高いレベルで発現された。
【０１９１】
5日目に、このMLRのMoDCを、CD14(図13A)、CD16(図13B)、CD40(図13C)、CD86(図13E)、およびCD83(図13D)などの異なるマーカーの表面発現についてフローサイトメトリーによって解析した。
【０１９２】
本実施例は、フコース減少抗PD-L1 hIgG1抗体がDCの成熟化状態に対してプラスの作用を有することを示す。
【０１９３】
実施例14:正常フコシル化抗PDL1 hIgG1およびフコース減少抗PDL1 hIgG1の細胞障害性に基づいて測定される、T細胞活性化
フコース減少抗PD-L1に起因するT細胞活性化の増大により、機能性に利点が生じるかどうかを解析するために、PDL-GEX H9D8、PDL-GEX Fuc-、およびアテゾリズマブ(1μg/ml)の非存在下または存在下で、実施例9で示したのと同じの異なるドナーに由来する同種異系MLRにおいて活性化されたT細胞を採取し、その後、それらの細胞障害能力をユウロピウム放出アッセイ法によって測定した。簡単に説明すると、標的細胞としてのがん細胞株ZR-75-1にエレクトロポレーションによってユウロピウム(Eu2+)を導入し、50:1のE:T比で5時間、採取したT細胞と共にインキュベートした(E:T比=エフェクター:標的比、エフェクター=T細胞、標的=ZR-75-1)。上清へのユウロピウム放出(標的細胞の溶解を示す)を、蛍光プレートリーダーを用いて定量した。細胞障害は、刺激されていないT細胞(同種異系moDCによる刺激を受けていないT細胞)と比較した変化倍率として示される。
【０１９４】
PDL-GEX Fuc-を用いてT細胞を活性化した結果、PDL-GEX H9D8、アテゾリズマブ、および培地対照(培地対照=試験抗体を添加しないMLR後のT細胞)と比較して、細胞障害が増大した(図14)。
【０１９５】
実施例15:様々な量のコアフコシル化を有するフコース減少抗PD-L1 hIgG1(PDL-GEX Fuc-)を用いることによるT細胞活性化の検出
PDL-GEX Fuc-のコアフコシル化の最も有望な量を見出すために、89％のコアフコシル化N-グリカンを有するPDL-GEX H9D8を、4％のコアフコシル化N-グリカンを有するPDL-GEXと混合して、様々な量のコアフコシル化をシミュレートする。抗体またはもっと正確に言えば抗体混合物を、刺激物としての別のドナーに由来する単球由来樹状細胞(moDC)に対する、応答物としての1名のドナーの単離T細胞を用いるMLRアッセイ法において、T細胞活性化について試験した。読取り値は、CD8+ T細胞におけるCD25およびCD137の発現であった(図15)。
【０１９６】
実施例16:Fc部分に変異を有する抗PD-L1抗体の、それらの非変異対応物と同程度の抗原結合
それらのFc部分に変異を有する2種の正常フコシル化抗PD-L1抗体を作製した。第一に、3つのアミノ酸変更:EU命名法に基づくS239D、I332E、およびG236Aを有する抗PD-L1抗体(PDL-GEX H9D8 mut1と呼ばれる)。第二に、5つのアミノ酸変更:EU命名法に基づくL235V、F243L、R292P、Y300L、およびP396Lを有する抗PD-L1抗体(PDL-GEX H9D8 mut2と呼ばれる)。
【０１９７】
PDL-GEX H9D8 mut1およびPDL-GEX H9D8 mut2を、抗原ELISAにおいて非変異PDL-GEX H8D8と比較して、PD-L1へのそれらの結合について試験した。したがって、ヒトPD-L1をMaxisorp 96ウェルプレートの表面に塗った。洗浄およびブロッキング後、試験抗体の段階希釈物を添加した。洗浄後、試験抗体の結合を、PODを結合させた二次抗体およびTMBを用いて測定した。
【０１９８】
PDL-GEX H9D8とPDL-GEX H9D8 mut1とPDL-GEX H9D8 mut2との間で、PD-L1結合の明らかな差異は観察されなかった(図16)。
【０１９９】
実施例17:Fc部分に変異を有する抗PD-L1抗体の、それらの非変異対応物と比較して増加したFcyRIIIa結合
FcγRIIIaへの抗体Fc部分の結合を、実施例4で説明したPerkin Elmerのビーズベースの技術(AlphaScreen(登録商標))を用いて解析した。FcγRIIIaが試験抗体のFc部分と相互作用する場合、シグナルは濃度依存的に減少する。
【０２００】
PM-PDL-GEX H9D8 mut1およびPM-PDL-GEX H9D8 mut2は、非変異PDL-GEX H9D8と比較して増加したFcyRIIIa結合を示し、これは、より低い有効濃度への移動によって可視化された(図17)。
【０２０１】
実施例18:Fc部分に変異を有する抗PD-L1抗体の、それらの非変異対応物と比較して増大したT細胞活性化
正常フコシル化Fc変異PDL-GEX H9D8 mut1および正常フコシル化Fc変異PDL-GEX H9D8 mut2のT細胞活性化を、正常フコシル化非変異PDL-GEX H9D8および脱フコシル化非変異PDL-GEX Fuc-と比較して、実施例9で説明した同種異系MLRにおいて測定した。
【０２０２】
PM-PDL-GEX mut1およびPDL-GEX mut2は、PDL-GEX H9D8と比較して、増大したT細胞活性化を示したことから、脱フコシル化抗PD-L1抗体(PDL-GEX Fuc-)を用いることによって、またはFcyRIIIaへの結合の増強をもたらす配列変異を含む抗PD-L1抗体を用いることによって、T細胞活性化の増強を実現できることが実証された(図18)。
【０２０３】
実施例19:脱フコシル化抗PD-L1抗体によって増強されたT細胞活性化は、増殖によっても可視化される
MLRにおけるCD8 T細胞の増殖を、フローサイトメトリー解析によって測定されるカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE)希釈に基づいて、5日目に測定した。したがって、細胞をCFSEで標識した。増殖性の細胞は、細胞分裂が原因で減少したCFSEシグナルを示す。
【０２０４】
脱フコシル化抗PD-L1抗体(PDL-GEX Fuc-)は、正常フコシル化抗PD-L1抗体(PDL-GEX H9D8)と比較して、および非グリコシル化抗PD-L1(アテゾリズマブ)と比較して、CD8 T細胞の増殖の増加を示した(図19)。
【０２０５】
実施例20:がん細胞の存在下で観察される、脱フコシル化抗PD-L1抗体および脱フコシル化二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1抗体に起因するT細胞活性化の増強
脱フコシル化抗PD-L1(PDL-GEX Fuc-)および脱フコシル化二重特異性抗PD-L1/TA-MUC1抗体(PM-PDL-GEX Fuc-)を、MLRにおいてがん細胞の存在下でT細胞活性化を誘導する能力について比較した。したがって、様々ながん細胞株をMLRに添加した(T細胞:moDC:がん細胞の比=100:10:1)。
【０２０６】
CD8 T細胞におけるCD25発現の測定により、HSC-4およびZR-75-1の存在はCD8 T細胞活性化に対して明らかな影響を有していなかったのに対し、Ramos細胞はいくらかの抑制性の影響を有しているらしいことが明らかになった。しかし、PDL-GEX Fuc-およびPM-PDL-GEX Fuc-による活性化の強化が、試験したすべてのがん細胞株の存在下で観察された(図20)。
【０２０７】
実施例21:PDL-GEX CDR変異体は、非変異対応物と比較して、同程度の結合能力および妨害能力を示す
PDL-GEX Fuc-の様々なCDR変異体:
PDL-GEX Fuc- CDRmut a(SEQ ID NO: 60+SEQ ID NO: 68)
PDL-GEX Fuc- CDRmut b(SEQ ID NO: 62+SEQ ID NO: 69)
PDL-GEX Fuc- CDRmut c(SEQ ID NO: 63+SEQ ID NO: 70)
PDL-GEX Fuc- CDRmut d(SEQ ID NO: 64)
PDL-GEX Fuc- CDRmut e(SEQ ID NO: 65+SEQ ID NO: 71)
PDL-GEX Fuc- CDRmut f(SEQ ID NO: 66+SEQ ID NO: 72)
PDL-GEX Fuc- CDRmut g(SEQ ID NO: 63+SEQ ID NO: 72)
PDL-GEX Fuc- CDRmut h(SEQ ID NO: 67+SEQ ID NO: 74)
PDL-GEX Fuc- CDRmut i(SEQ ID NO: 63+SEQ ID NO: 68)
を作製し、I)PD-L1を発現するDU-145およびフローサイトメトリー解析を用いて、それらのPD-L1結合能力について、ならびにII)実施例2で説明したPD-L1/PD-1ブロッキングELISAにおいて、それらの妨害能力について、試験した。CDR変異体はすべて、非変異PDL-GEX Fuc-と比較して、同程度の結合および妨害を示した(図21Aおよび21B)。
【０２０８】
実施例22:PM-PDL-GEX CDR変異体は、非変異対応物と比較して、同程度の結合能力および妨害能力を示す
PM-PDL-GEX Fuc-の様々なCDR変異体:
PM-PDL-GEX Fuc- CDRmut a(SEQ ID NO: 64)
PM-PDL-GEX Fuc- CDRmut b(SEQ ID NO: 66+SEQ ID NO: 72)
を作製し、以下の様々なアッセイ法で試験した:
(I)それらのPD-L1結合能力については、PD-L1抗原ELISAを使用。したがって、ヒトPD-L1をMaxisorp 96ウェルプレートの表面に塗った。洗浄およびブロッキング後、試験抗体の段階希釈物を添加した。洗浄後、試験抗体の結合を、PODを結合させた二次抗体およびTMBを用いて測定した(図22A)。
(II)それらの妨害能力については、実施例2で説明したPD-L1/PD-1ブロッキングELISA(図22B)。
(III)それらのTA-MUC1結合能力については、TA-MUC1発現T-47Dおよびフローサイトメトリー解析を使用(図22C)。
【０２０９】
CDR部分の変異は、PD-L1へのPM-PDL-GEX結合、PD-L1/PD1相互作用の妨害、およびTA-MUC1結合に対する明らかな影響を有していなかった。
【０２１０】
実施例23:PM-PDL-GEX CDR変異体は、非変異対応物と同程度の、CD8 T細胞の増強された活性化を示す
PM-PDL-GEX H9D8およびPM-PDL-GEX Fuc-の様々なCDR変異体:
PM-PDL-GEX H9D8 CDRmut a(SEQ ID NO: 64)
PM-PDL-GEX H9D8 CDRmut b(SEQ ID NO: 66+SEQ ID NO: 72)
PM-PDL-GEX Fuc- CDRmut a(SEQ ID NO: 64)
PM-PDL-GEX Fuc- CDRmut b(SEQ ID NO: 66+SEQ ID NO: 72)、
を作製し、実施例9で説明した同種異系MLRにおいてT細胞を活性化する能力について試験した。CDRが変異したPM-PDL-GEX Fuc-変種は、非変異PM-PDL-GEX Fuc-と同程度に、CD8 T細胞(CD8 T細胞のCD25+細胞)を活性化した。CDRが変異したPM-PDL-GEX H9D8変種は、非変異PM-PDL-GEX H9D8と同程度に、CD8 T細胞を活性化した(図23)。
【図１】
2020512382.tif 000016
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
2020512382.tif 000023
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
2020512382.tif 000029
【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2020512382.tif 000048
2020512382.tif 000049
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