(57)【要約】本明細書では、血液脳関門を通過して作用物質を輸送するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、前記作用物質は、神経変性疾患を治療するための治療標的に結合する。本明細書に記載されるように、前記作用物質は、トランスフェリン受容体に結合するタンパク質に連結されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療標的に結合する作用物質を、哺乳動物の血液脳関門（ＢＢＢ）を通過して輸送するための方法であって、
約４００ｎＭ〜約２μＭの親和性でトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に結合するタンパク質に前記ＢＢＢを曝露することを含み、前記タンパク質が、前記作用物質に連結されており、かつ、連結された前記作用物質を、前記ＢＢＢを通過して輸送する、前記方法。
【請求項２】
前記作用物質への脳曝露時間が延長される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記治療標的が神経変性疾患に関与している、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
約４００ｎＭ〜約２μＭの親和性でＴｆＲに結合するタンパク質を哺乳動物に投与することを含み、前記タンパク質が、神経変性疾患に関与している治療標的に結合する作用物質に連結されており、それにより前記作用物質への前記哺乳動物の脳の曝露時間が延長される、前記神経変性疾患を治療するための方法。
【請求項５】
前記タンパク質が、より強い親和性で前記ＴｆＲに結合する参照タンパク質に連結された作用物質と比較して前記作用物質への脳曝露時間を延長する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
脳曝露が、時間に対する前記作用物質の脳中濃度のプロットの曲線下面積（ＡＵＣ）を測定することによって判定される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記タンパク質が、より強い親和性で前記ＴｆＲに結合する参照タンパク質に連結された作用物質と比較して、前記哺乳動物における治療有効濃度での前記作用物質への脳曝露時間を延長する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記参照タンパク質が、約５０ｎＭの親和性またはこれよりも強い親和性で前記ＴｆＲに結合する、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＴｆＲが霊長類ＴｆＲである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記霊長類ＴｆＲがヒトＴｆＲである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記タンパク質が前記ＴｆＲアピカルドメインに結合する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記タンパク質が、約４２０ｎＭ〜約１．５μＭの親和性で前記ＴｆＲに結合する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記タンパク質が、約６００ｎＭ〜約１．５μＭの親和性で前記ＴｆＲに結合する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記作用物質の治療有効濃度が、前記哺乳動物における神経変性疾患の１つ以上の症状を治療する濃度である、請求項７〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記神経変性疾患が、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記作用物質が抗体可変領域を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記作用物質が抗体フラグメントを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記作用物質がＦａｂまたはｓｃＦＶを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記タンパク質が、ＴｆＲに結合することができる非天然結合部位を含む改変Ｆｃポリペプチドである、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記タンパク質が、ＴｆＲに特異的に結合する抗体可変領域を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記タンパク質が抗体フラグメントを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記タンパク質がＦａｂまたはｓｃＦＶを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記治療標的が、β−セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）タンパク質、タウタンパク質、骨髄細胞で発現する誘発受容体２（ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｏｎ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ  ２：ＴＲＥＭ２）タンパク質、及びα−シヌクレインタンパク質からなる群から選択される、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記治療標的がＢＡＣＥ１であり、かつ、前記タンパク質に連結された場合の前記作用物質が、前記参照タンパク質に連結された場合と比較して、前記哺乳動物の脳内に存在するアミロイドβタンパク質（Ａβ）の量をより長時間にわたって減少させる、請求項５〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記作用物質に連結された前記タンパク質が、薬学的に許容される担体の一部として投与される、請求項４〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１８年２月１５日出願の国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１８３７１、２０１７年１１月８日出願の米国特許仮出願第６２／５８３，３１４号、及び２０１７年８月１０日出願の米国特許仮出願第６２／５４３，６５８号に基づく優先権を主張するものであり、当該出願の開示内容をあらゆる目的でそれらの全容にわたって本明細書に参照により援用するものである。
【発明の概要】
【０００２】
【図面の簡単な説明】
【０００３】
【図１】野生型マウスにおけるＣＨ３Ｃポリペプチドの薬物動態学（ＰＫ）分析を示す。すべてのポリペプチド−Ｆａｂ融合体は、より速いクリアランスを示したＣＨ３Ｃ．３．２−５を除き、野生型Ｆｃ−Ｆａｂ融合体（すなわち、抗ＲＳＶ抗体であるＡｂ１２２、及び抗ＢＡＣＥ１抗体であるＡｂ１５３）と同等のクリアランスを示した。
【図２】マウスの脳組織における薬物動態学／薬力学（ＰＫ／ＰＤ）データを示す。キメラｈｕＴｆＲヘテロ接合体マウス（ｎ＝４／群）に４２ｍｇ／ｋｇのＡｂ１５３または一価ＣＨ３Ｃ．３５．Ｎ１６３（「ＣＨ３Ｃ．３５．Ｎ１６３＿ｍｏｎｏ」として示される）のいずれかを静脈内投与し、野生型マウス（ｎ＝３）に５０ｍｇ／ｋｇのコントロールヒトＩｇＧ１（「ｈｕＩｇＧ１」として示される）を静脈内投与した。棒グラフは平均±ＳＤを表す。
【図３Ａ】抗ＢＡＣＥ１＿Ａｂ１５３、ＣＨ３Ｃ３５．２１：Ａｂ１５３、ＣＨ３Ｃ３５．２０：Ａｂ１５３、またはＣＨ３Ｃ３５：Ａｂ１５３ポリペプチド融合体の単回の５０ｍｇ／ｋｇの全身注射後のｈＴｆＲアピカル＋／＋ノックイン（ＫＩ）マウスの血漿中のｈｕＩｇＧ１濃度を示す（平均±ＳＥＭ、ｎ＝５／群）。
【図３Ｂ】抗ＢＡＣＥ１＿Ａｂ１５３、ＣＨ３Ｃ３５．２１：Ａｂ１５３、ＣＨ３Ｃ３５．２０：Ａｂ１５３、またはＣＨ３Ｃ３５：Ａｂ１５３ポリペプチド融合体の単回の５０ｍｇ／ｋｇの全身注射後のｈＴｆＲアピカル＋／＋ノックイン（ＫＩ）マウスの脳ライセート中のｈｕＩｇＧ１濃度を示す（平均±ＳＥＭ、ｎ＝５／群）。
【図３Ｃ】抗ＢＡＣＥ１＿Ａｂ１５３、ＣＨ３Ｃ３５．２１：Ａｂ１５３、ＣＨ３Ｃ３５．２０：Ａｂ１５３、またはＣＨ３Ｃ３５：Ａｂ１５３ポリペプチド融合体の単回の５０ｍｇ／ｋｇの全身注射後のｈＴｆＲアピカル＋／＋ＫＩマウスの脳ライセート中の内因性マウスＡβの濃度を示す（平均±ＳＥＭ、ｎ＝５／群）。
【図３Ｄ】抗ＢＡＣＥ１＿Ａｂ１５３、ＣＨ３Ｃ３５．２１：Ａｂ１５３、ＣＨ３Ｃ３５．２０：Ａｂ１５３、またはＣＨ３Ｃ３５：Ａｂ１５３ポリペプチド融合体の単回の５０ｍｇ／ｋｇの全身注射後のｈＴｆＲアピカル＋／＋ＫＩマウスの脳ライセート中のアクチンに対して正規化した脳ＴｆＲタンパク質のウェスタンブロットによる定量化を示す（平均±ＳＥＭ、ｎ＝５／群）。
【図４Ａ】抗ＢＡＣＥ１＿Ａｂ１５３、ＣＨ３Ｃ．３５．２３：Ａｂ１５３、またはＣＨ３Ｃ．３５．２３．３：Ａｂ１５３ポリペプチド融合体の単回の５０ｍｇ／ｋｇの全身注射後のｈＴｆＲアピカル＋／＋ＫＩマウスの血漿中のｈｕＩｇＧ１濃度を示す（平均±ＳＥＭ、ｎ＝５／群）。
【図４Ｂ】抗ＢＡＣＥ１＿Ａｂ１５３、ＣＨ３Ｃ．３５．２３：Ａｂ１５３、またはＣＨ３Ｃ．３５．２３．３：Ａｂ１５３ポリペプチド融合体の単回の５０ｍｇ／ｋｇの全身注射後のｈＴｆＲアピカル＋／＋ＫＩマウスの脳ライセート中のｈｕＩｇＧ１濃度を示す（平均±ＳＥＭ、ｎ＝５／群）。
【図４Ｃ】抗ＢＡＣＥ１＿Ａｂ１５３、ＣＨ３Ｃ．３５．２３：Ａｂ１５３、またはＣＨ３Ｃ．３５．２３．３：Ａｂ１５３ポリペプチド融合体の単回の５０ｍｇ／ｋｇの全身注射後のｈＴｆＲアピカル＋／＋ＫＩマウスの脳ライセート中の内因性マウスＡβの濃度を示す（平均±ＳＥＭ、ｎ＝５／群）。
【図４Ｄ】抗ＢＡＣＥ１＿Ａｂ１５３、ＣＨ３Ｃ．３５．２３：Ａｂ１５３、またはＣＨ３Ｃ．３５．２３．３：Ａｂ１５３ポリペプチド融合体の単回の５０ｍｇ／ｋｇの全身注射後のｈＴｆＲアピカル＋／＋ＫＩマウスの脳ライセート中のアクチンに対して正規化した脳ＴｆＲタンパク質のウェスタンブロットによる定量化を示す（平均±ＳＥＭ、ｎ＝４／群）。
【図５】ｈＴｆＲアピカル＋／＋ＫＩマウスにおける操作されたＴｆＲ結合ポリペプチドのｈＴｆＲ親和性と、経時的な脳曝露との間の関係を示す。ドットは、ｈＴｆＲアピカル＋／＋ＫＩマウスにおける５０ｍｇ／ｋｇの単回投与後の異なるＡＴＶ親和性バリアントの累積経時的脳曝露（ＡＵＣ）を示す。ポリペプチドの脳濃度（ｈｕＩｇＧ１により測定される）を、投与後の様々な日（１〜１０日の範囲）で計算した。データは、各実験で各群ｎ＝４〜５匹のマウスを用いた３つの独立した試験の要約を示している。
【図６】ｈＴｆＲアピカル＋／＋ＫＩマウスにおける操作されたＴｆＲ結合ポリペプチドのｈＴｆＲ親和性と、最大脳中濃度との間の関係を示す。ドットは、５０ｍｇ／ｋｇの単回投与後の投与１日後に測定した異なるポリペプチド親和性バリアントの最大脳中濃度を示す。データは、各試験で各群ｎ＝４〜５匹のマウスを用いた３つの独立した実験の要約を示している。
【図７】ｈＴｆＲアピカル＋／＋ＫＩマウスにおける操作されたＴｆＲ結合ポリペプチドのｈＴｆＲ親和性と、ポリペプチドの血漿中濃度に対する脳中濃度の比との間の関係を示す。ドットは、５０ｍｇ／ｋｇの単回投与後の投与１日後に測定した異なるポリペプチド親和性バリアントの血漿中濃度に対する最大脳中濃度の比を示す。データは、各実験で各群ｎ＝４〜５匹のマウスを用いた３つの独立した試験の要約を示している。
【発明を実施するための形態】
【０００４】
詳細な説明
Ｉ．序論
本発明は、疾患の治療のために、ＴｆＲ結合ポリペプチド及びタンパク質に連結された治療用物質を、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過して輸送することに関する。本発明は、ＢＢＢを通過して治療用物質を輸送するうえで望ましいＴｆＲ結合親和性が、治療用物質の標的と、及び疾患の治療における有効性をもたらす作用機序とに依存するという発見に一部基づくものである。詳細には、比較的低いＴｆＲ親和性を有するポリペプチド及びタンパク質では、Ｃｍａｘは低くなるがクリアランスは遅くなり、そのため、曝露時間が長くなることが見出された。
【０００５】
抗ＢＡＣＥ１物質及び抗タウ物質（例えば、アルツハイマー病の治療用）及び抗αシヌクレイン物質（例えば、パーキンソン病の治療用）ならびに他のものなどの阻害抗体をはじめとする阻害物質を含む、いくつかの療法では、投与ウインドウにわたって治療用物質への長期的又は持続的な脳曝露を実現することは、半減期が短くかつ／またはターンオーバーが速い（例えば、タウ、αシヌクレイン）標的を含む標的を完全に嵌入するために望ましく、かつＡβ（やはり短い半減期を有する）の産生を低減させるためにＢＡＣＥ１活性の阻害を持続させることが望ましい。治療用物質への長期的又は持続的な脳曝露を実現するのに、４００〜２，０００ｎＭの範囲のＴｆＲ親和性を有するポリペプチド及びタンパク質を使用することが特に有用である。
【０００６】
ＩＩ．定義
本明細書で使用する場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」には、内容によってそうでない旨が明確に示されない限り、複数の指示対象が含まれる。したがって、例えば、「ポリペプチド」と言った場合、２つ以上のそのような分子を含み得る、といった具合である。
【０００７】
本明細書で使用する場合、「約」及び「およそ」なる用語は、数値または範囲において特定される量を修飾して用いられる場合、その数値、及び例えば±２０％、±１０％、または±５％といった、当業者には周知のその値からの妥当な偏差が、記載される値の想定される意味の範囲内にあることを示す。
【０００８】
本発明に関連して使用する場合の「トランスフェリン受容体」または「ＴｆＲ」とは、トランスフェリン受容体タンパク質１のことを指す。ヒトトランスフェリン受容体１のポリペプチド配列は、配列番号６に記載されている。他の種由来のトランスフェリン受容体タンパク質１の配列も知られている（例えば、チンパンジー、アクセッション番号ＸＰ＿００３３１０２３８．１；アカゲザル、ＮＰ＿００１２４４２３２．１；イヌ、ＮＰ＿００１００３１１１．１；ウシ、ＮＰ＿００１１９３５０６．１；マウス、ＮＰ＿０３５７６８．１；ラット、ＮＰ＿０７３２０３．１；及びニワトリ、ＮＰ＿９９０５８７．１）。「トランスフェリン受容体」なる用語には、トランスフェリン受容体タンパク質１の染色体座の遺伝子によってコードされる例示的な参照配列、例えばヒト配列の対立遺伝子バリアントも包含される。完全長のトランスフェリン受容体タンパク質は、短いＮ末端細胞内領域、膜貫通領域、及び大きな細胞外ドメインを含んでいる。細胞外ドメインは、プロテアーゼ様ドメイン、螺旋状ドメイン、及びアピカルドメインの３つのドメインによって特徴付けられる。ヒトトランスフェリン受容体１のアピカルドメイン配列は配列番号４に記載されている。
【０００９】
本明細書で使用する場合、「Ｆｃポリペプチド」なる用語は、構造ドメインとしてＩｇフォールドを特徴とする、天然に存在する免疫グロブリンの重鎖ポリペプチドのＣ末端領域を指す。Ｆｃポリペプチドは、少なくともＣＨ２ドメイン及び／またはＣＨ３ドメインを含む定常領域配列を含み、ヒンジ領域の少なくとも一部を含むことができる。一般に、Ｆｃポリペプチドは可変領域を含まない。
【００１０】
「改変Ｆｃポリペプチド」とは、野生型の免疫グロブリン重鎖Ｆｃポリペプチド配列と比較して少なくとも１つの変異、例えば置換、欠失、または挿入を有するが、天然のＦｃポリペプチドの全体のＩｇフォールドまたは構造を保持している、Ｆｃポリペプチドを指す。
【００１１】
本明細書で使用する場合の「ＣＨ３ドメイン」及び「ＣＨ２ドメイン」なる用語は、免疫グロブリンの定常領域ドメインポリペプチドのことを指す。ＩｇＧ抗体に関連して、ＣＨ３ドメインポリペプチドとは、ＥＵ番号付けスキームに従って番号付けした場合に約３４１位〜約４４７位のアミノ酸のセグメントのことを指し、ＣＨ２ドメインポリペプチドとは、ＥＵ番号付けスキームに従って番号付けした場合に約２３１位〜約３４０位のアミノ酸のセグメントのことを指す。ＣＨ２及びＣＨ３ドメインポリペプチドは、ＩＭＧＴ（ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ）番号付けスキームによって番号付けすることもでき、その場合、ＩＭＧＴ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｃｈａｒｔの番号付け（ＩＭＧＴウェブサイト）に従えば、ＣＨ２ドメインの番号付けは１〜１１０であり、ＣＨ３ドメインの番号付けは１〜１０７である。ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、免疫グロブリンのＦｃ領域の一部である。ＩｇＧ抗体に関連して、Ｆｃ領域とは、ＥＵ番号付けスキームに従って番号付けした場合に、約２３１位〜約４４７位までのアミノ酸のセグメントのことを指す。本明細書で使用する場合、「Ｆｃ領域」なる用語は、抗体のヒンジ領域の少なくとも一部も含み得る。例示的なヒンジ領域配列は、配列番号５に記載されている。
【００１２】
「可変領域」なる用語は、生殖細胞系列の可変（Ｖ）遺伝子、多様性（Ｄ）遺伝子、または連結（Ｊ）遺伝子から誘導され（定常（Ｃμ及びＣδ）遺伝子セグメントからは誘導されない）、抗体に抗原と結合するためのその特異性を与える抗体重鎖または軽鎖内のドメインのことを指す。一般的に抗体可変領域は、３個の超可変「相補性決定領域」を間に挟んだ４個の保存された「フレームワーク」領域で構成されている。
【００１３】
ＣＨ３及びＣＨ２ドメインに関して「野生型」、「天然」、及び「天然に存在する」なる用語は、本明細書では、天然に存在する配列を有するドメインのことを指して用いられる。
【００１４】
本発明に関連して、突然変異体ポリペプチドまたは突然変異体ポリヌクレオチドに関して「突然変異体」なる用語は、「バリアント」と互換的に用いられる。所定の野生型（例えば、ＣＨ３またはＣＨ２ドメイン）参照配列に関するバリアントは、天然に存在する対立遺伝子バリアントを含むことができる。「天然に存在しない」（例えばＣＨ３またはＣＨ２）ドメインとは、自然界で細胞内に存在せず、かつ、天然ドメイン（例えば、ＣＨ３ドメインまたはＣＨ２ドメイン）のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの遺伝子改変によって、例えば遺伝子操作技術または突然変異導入法を用いて生成される、バリアントドメインまたは突然変異体ドメインのことを指す。「バリアント」は、野生型に対して少なくとも１つのアミノ酸変異を含むあらゆるドメインを含む。突然変異は、置換、挿入、及び欠失を含み得る。
【００１５】
本明細書で使用する場合の「結合親和性」なる用語は、２個の分子間、例えばポリペプチドの１個の結合部位とポリペプチドが結合する標的、例えばＴｆＲとの間の非共有結合相互作用の強さのことを指す。したがって、例えば、この用語は、特に示されるかまたは文脈から明らかでない限り、ポリペプチドとその標的との間の１：１の相互作用のことを指す場合がある。結合親和性は、解離速度定数（ｋｄ、時間−１）を結合速度定数（ｋａ、時間−１Ｍ−１）で割ったもののことを指す平衡解離定数（ＫＤ）を測定することにより定量化することができる。ＫＤは、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）システムなどの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法（例えば、下記実施例３に述べる方法を用いる）；ＫｉｎＥｘＡ（登録商標）などのカイネティック排除アッセイ；及びバイオレイヤー干渉法（例えば、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標） Ｏｃｔｅｔ（登録商標）プラットフォームを使用）を使用して、複合体形成及び解離の速度論を測定することによって求めることができる。本明細書で使用する場合、「結合親和性」には、ポリペプチドとその標的と間の１：１の相互作用を反映したもののように正式な結合親和性だけでなく、強い結合を反映しうるＫＤが計算された見かけ上の親和性も含まれる。
【００１６】
本明細書で使用する場合、本明細書に記載される操作されたＴｆＲ結合ポリペプチド、ＴｆＲ結合ペプチド、またはＴｆＲ結合抗体について言及する際、標的に、例えばＴｆＲに「特異的に結合する」または「選択的に結合する」なる用語は、操作されたＴｆＲ結合ポリペプチド、ＴｆＲ結合ペプチド、またはＴｆＲ結合抗体が、構造的に異なる標的に結合するよりも、より強いアフィニティー、より強いアビディティー、及び／またはより長い持続時間で標的に結合する結合反応のことを指す。典型的な実施形態では、操作されたＴｆＲ結合ポリペプチド、ＴｆＲ結合ペプチド、またはＴｆＲ結合抗体は、同じ親和性アッセイ条件下でアッセイした場合に無関係の標的と比較して特定の標的、例えばＴｆＲに対して少なくとも５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍、１００倍、１，０００倍、１０，０００倍、またはそれよりも高い親和性を有する。本明細書で使用する場合の特定の標的（例えば、ＴｆＲ）「特異的結合」、「に特異的に結合する」、または「に対して特異的である」なる用語は、例えば、結合する標的に対する平衡解離定数ＫＤが例えば、１０−４Ｍ以下、例えば、１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、または１０−１２Ｍである分子によって示されうる。いくつかの実施形態では、操作されたＴｆＲ結合ポリペプチド、ＴｆＲ結合ペプチド、またはＴｆＲ結合抗体は、種間で保存されている（例えば、種間で構造的に保存されている）、例えば、非ヒト霊長類とヒトとの間で保存されている（例えば、非ヒト霊長類とヒトとの間で構造的に保存されている）ＴｆＲのエピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、操作されたＴｆＲ結合ポリペプチド、ＴｆＲ結合ペプチド、またはＴｆＲ結合抗体は、ヒトＴｆＲにだけ結合することができる。
【００１７】
「アミノ酸」なる用語は、天然に存在するアミノ酸及び合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体のことを指す。
【００１８】
天然に存在するアミノ酸とは、遺伝子コードによってコードされるもの、及び、例えばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、及びＯ−ホスホセリンなどの後で修飾されたアミノ酸である。「アミノ酸類似体」とは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基に結合したα炭素を有する、化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。かかる類似体は、修飾されたＲ基（例えばノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造を保持している。「アミノ酸模倣体」とは、アミノ酸の一般的化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様に機能する化合物のことを指す。
【００１９】
天然に存在するα−アミノ酸としては、これらに限定されるものではないが、アラニン（Ａｌａ）、システイン（Ｃｙｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、アルギニン（Ａｒｇ）、リシン（Ｌｙｓ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、プロリン（Ｐｒｏ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、バリン（Ｖａｌ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、及びこれらの組み合わせが挙げられる。天然に存在するα−アミノ酸の立体異性体としては、これらに限定されるものではないが、Ｄ−アラニン（Ｄ−Ａｌａ）、Ｄ−システイン（Ｄ−Ｃｙｓ）、Ｄ−アスパラギン酸（Ｄ−Ａｓｐ）、Ｄ−グルタミン酸（Ｄ−Ｇｌｕ）、Ｄ−フェニルアラニン（Ｄ−Ｐｈｅ）、Ｄ−ヒスチジン（Ｄ−Ｈｉｓ）、Ｄ−イソロイシン（Ｄ−Ｉｌｅ）、Ｄ−アルギニン（Ｄ−Ａｒｇ）、Ｄ−リシン（Ｄ−Ｌｙｓ）、Ｄ−ロイシン（Ｄ−Ｌｅｕ）、Ｄ−メチオニン（Ｄ−Ｍｅｔ）、Ｄ−アスパラギン（Ｄ−Ａｓｎ）、Ｄ−プロリン（Ｄ−Ｐｒｏ）、Ｄ−グルタミン（Ｄ−Ｇｌｎ）、Ｄ−セリン（Ｄ−Ｓｅｒ）、Ｄ−スレオニン（Ｄ−Ｔｈｒ）、Ｄ−バリン（Ｄ−Ｖａｌ）、Ｄ−トリプトファン（Ｄ−Ｔｒｐ）、Ｄ−チロシン（Ｄ−Ｔｙｒ）、及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【００２０】
本明細書では、アミノ酸は、それらの一般的に知られる３文字記号によるか、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会により推奨される１文字記号で呼称される。
【００２１】
「ポリペプチド」及び「ペプチド」なる用語は、本明細書では一本鎖中のアミノ酸残基のポリマーを呼称するうえで互換的に使用される。かかる用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学模倣体であるようなアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマー及び天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用される。アミノ酸ポリマーは、全体がＬ−アミノ酸から構成されてもよいか、全体がＤ−アミノ酸から構成されてもよいか、またはＬアミノ酸とＤアミノ酸との混合物から構成されてもよい。
【００２２】
本明細書で使用する場合の「タンパク質」とは、ポリペプチド、または一本鎖ポリペプチドの二量体（すなわち２個）もしくは多量体（すなわち３個以上）のことを指す。タンパク質の一本鎖ポリペプチド同士は、例えばジスルフィド結合のような共有結合、または非共有結合性相互作用によって結合することができる。
【００２３】
「保存的置換」、「保存的変異」、または「保存的に改変されたバリアント」なる用語は、あるアミノ酸の、類似の特性を有するものとして分類され得る別のアミノ酸による置換をもたらす変化のことを指す。このようにして定義される保存的アミノ酸のグループのカテゴリーの例としては、Ｇｌｕ（グルタミン酸またはＥ）、Ａｓｐ（アスパラギン酸またはＤ）、Ａｓｎ（アスパラギンまたはＮ）、Ｇｌｎ（グルタミンまたはＱ）、Ｌｙｓ（リシンまたはＫ）、Ａｒｇ（アルギニンまたはＲ）、及びＨｉｓ（ヒスチジンまたはＨ）を含む「荷電／極性基」；Ｐｈｅ（フェニルアラニンまたはＦ）、Ｔｙｒ（チロシンまたはＹ）、Ｔｒｐ（トリプトファンまたはＷ）、及び（ヒスチジンまたはＨ）を含む「芳香族基」；ならびに、Ｇｌｙ（グリシンまたはＧ）、Ａｌａ（アラニンまたはＡ）、Ｖａｌ（バリンまたはＶ）、Ｌｅｕ（ロイシンまたはＬ）、Ｉｌｅ（イソロイシンまたはＩ）、Ｍｅｔ（メチオニンまたはＭ）、Ｓｅｒ（セリンまたはＳ）、Ｔｈｒ（スレオニンまたはＴ）、及びＣｙｓ（システインまたはＣ）を含む「脂肪族基」を挙げることができる。各グループ内にサブグループを特定することもできる。例えば、荷電または極性アミノ酸のグループは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、及びＨｉｓからなる「正に荷電したサブグループ」、Ｇｌｕ及びＡｓｐからなる「負に荷電したサブグループ」、ならびにＡｓｎ及びＧｌｎからなる「極性サブグループ」を含むサブグループに更に分割することができる。別の例では、芳香族または環状基を、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、及びＴｒｐからなる「窒素環サブグループ」、ならびにＰｈｅ及びＴｙｒからなる「フェニルサブグループ」を含むサブグループに更に分割することができる。更に別の例では、脂肪族基を、例えば、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、及びＡｌａからなる「脂肪族非極性サブグループ」、ならびにＭｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、及びＣｙｓからなる「脂肪族弱極性サブグループ」などのサブグループに更に分割することができる。保存的変異のカテゴリーの例としては、上記のサブグループ内のアミノ酸のアミノ酸置換、例えば、これらに限定されるものではないが、正電荷を維持できるようにＬｙｓをＡｒｇに、またはその逆；負電荷を維持できるようにＧｌｕをＡｓｐに、またはその逆；遊離−ＯＨを維持できるようにＳｅｒをＴｈｒに、またはその逆；遊離−ＮＨ２を維持できるようにＧｌｎをＡｓｎに、またはその逆が挙げられる。いくつかの実施形態では、例えば活性部位において疎水性アミノ酸を天然に存在する疎水性アミノ酸に置換することで疎水性が保たれる。
【００２４】
２個以上のポリペプチド配列に関連した「同一」または「同一性」％なる用語は、配列比較アルゴリズムを用いて、またはマニュアルアラインメント及び目視による検査により測定した場合に比較ウインドウ、または指定された領域にわたって最大の一致となるように比較及びアラインした場合に特定の領域にわたって同じであるか、または例えば、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％もしくはそれ以上一致しているアミノ酸残基の特定の割合（％）を有する２個以上の配列またはサブ配列のことを指す。
【００２５】
ポリペプチドの配列比較では、一般的に１つのアミノ酸配列が、候補配列を比較する参照配列の役割を果たす。例えば、視覚的アラインメントまたは既知のアルゴリズムを用いた公開されているソフトウェアを使用するなど、当業者に利用可能な様々な方法を用いてアラインメントを行って最大のアラインメントを得ることができる。かかるプログラムとしては、ＢＬＡＳＴプログラム、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ．）、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）が挙げられる。最大のアラインメントを得るためにアラインメントで用いられるパラメータは、当業者によって決めることができる。本出願の目的におけるポリペプチド配列の配列比較では、デフォルトのパラメータを用いて２個のタンパク質配列をアラインするためのＢＬＡＳＴＰアルゴリズムの標準タンパク質ＢＬＡＳＴを用いる。
【００２６】
あるポリペプチド配列中の所定のアミノ酸残基の特定に関連して使用される場合、「〜に対応する」、「〜を基準として決められる」、または「〜を基準として番号付けされる」なる用語は、所定のアミノ酸配列を特定の参照配列と最大限アラインして比較した場合にその参照配列の残基の位置を指す。したがって、例えば、改変されたＦｃポリペプチド中のアミノ酸残基は、その残基が、配列番号１と最適にアラインされた場合に配列番号１中のそのアミノ酸とアラインする際に配列番号１のアミノ酸に「対応する」。参照配列とアラインされるポリペプチドは、参照配列と同じ長さである必要はない。
【００２７】
本明細書で互換的に使用される「対象」、「個人」、及び「患者」なる用語は、これらに限定されるものではないが、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類（例えば、ラット、マウス、及びモルモット）、ウサギ、ウシ、ブタ、ウマ、及び他の哺乳動物種を含む哺乳動物のことを指す。一実施形態では、患者はヒトである。
【００２８】
「治療」、「治療する」、及びこれに類する用語は、本明細書では、所望の薬理学的及び／または生理学的作用を得ることを一般的に意味して用いられる。「治療する」または「治療」は、軽減、寛解、患者の生存率の改善、生存期間もしくは生存率の増大、症状の消失または傷害、疾患、もしくは状態を患者にとってより耐容できるものとすること、変性もしくは低下の速度の遅延、または患者の物理的もしくは精神的な健康の改善などのあらゆる客観的もしくは主観的なパラメータを含む、傷害、疾患、または状態の治療もしくは改善における奏功のあらゆる兆候のことを指す場合がある。症状の治療または改善は、客観的または主観的なパラメータに基づいたものであってよい。治療の効果は、治療を受けていない個人または個人の集団と、または治療前もしくは治療期間の異なる時点において同じ患者と比較することができる。
【００２９】
「薬学的に許容される賦形剤」とは、これらに限定されないが、バッファー、担体、または防腐剤などの、ヒトまたは動物における使用に生物学的または薬理学的に適合した非活性医薬成分のことを指す。
【００３０】
本明細書で使用する場合、作用物質の「治療量」、「治療有効量」、または「治療有効濃度」とは、対象における疾患の徴候または症状を治療する作用物質の量または濃度である。
【００３１】
「投与する」なる用語は、作用物質、化合物、または組成物を生物学的作用が望ましい部位に送達する方法のことを指す。これらの方法は、これらに限定されるものではないが、局所投与、非経口投与、静脈内投与、皮内投与、筋肉内投与、髄腔内投与、結腸投与、直腸投与、または腹腔内投与が挙げられる。一実施形態では、本明細書に記載される組成物は静脈内投与される。
【００３２】
ＩＩＩ．  治療方法
Ａ．神経変性疾患の治療のための方法
一態様では、本発明は、治療標的（例えば、神経変性疾患に関与している治療標的）に結合する（例えば、特異的に結合する）作用物質（例えば、治療用物質）を、哺乳動物の血液脳関門（ＢＢＢ）を通過して輸送するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、約４００ｎＭ〜約２μＭの親和性でトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に結合する（例えば、特異的に結合する）ポリペプチドまたはタンパク質にＢＢＢを曝露することを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはタンパク質は作用物質に連結されており、かつ、連結された作用物質を、ＢＢＢを通過して輸送する。いくつかの実施形態では、作用物質への脳曝露時間が延長される（例えば、参照物質と比較して）。
【００３３】
別の態様では、本発明は、神経変性疾患を治療するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、約４００ｎＭ〜約２μＭの親和性でＴｆＲに結合する（例えば、特異的に結合する）ポリペプチドまたはタンパク質を哺乳動物に投与することを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはタンパク質は、神経変性疾患に関与している治療標的に結合する（例えば、特異的に結合する）作用物質（例えば、治療用物質）に連結されており、それにより作用物質への哺乳動物の脳の曝露時間が延長される。適している神経変性疾患の非限定的な例としては、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【００３４】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはタンパク質は、約４００ｎＭ、５００ｎＭ、６００ｎＭ、７００ｎＭ、８００ｎＭ、９００ｎＭ、１μＭ、１．１μＭ、１．２μＭ、１．３μＭ、１．４μＭ、１．５μＭ、１．６μＭ、１．７μＭ、１．８μＭ、１．９μＭ、または２μＭの親和性でＴｆＲに結合（例えば、特異的に結合）する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはタンパク質は、約４２０ｎＭ〜約１．５μＭまたは６００ｎＭ〜１．５μＭの親和性でＴｆＲに結合する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはタンパク質は、約４２０ｎＭの親和性でＴｆＲに結合する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはタンパク質は、約６２０ｎＭの親和性でＴｆＲに結合する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはタンパク質は、約７５０ｎＭの親和性でＴｆＲに結合する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはタンパク質は、約８２０ｎＭの親和性でＴｆＲに結合する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはタンパク質は、約１，１００ｎＭの親和性でＴｆＲに結合する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはタンパク質は、約１，４４０ｎＭの親和性でＴｆＲに結合する。
【００３５】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはペプチド（例えば、作用物質に連結されたもの）は、より強い親和性でＴｆＲに結合する（例えば、特異的に結合する）参照ポリペプチドまたはタンパク質に連結された作用物質と比較して、哺乳動物において治療有効濃度（例えば、神経変性疾患の１つ以上の徴候または症状を治療するうえで充分な濃度）の作用物質への脳曝露時間を延長する。
【００３６】
いくつかの実施形態では、脳曝露時間（例えば、作用物質への）は、参照と比較して、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．７５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約５倍、またはそれ以上延長される。
【００３７】
いくつかの実施形態では、脳曝露は、脳曝露（例えば、脳内の作用物質の濃度）を時間の関数として、曲線下面積（ＡＵＣ）を計算することによって定量化される。増加したＡＵＣは、脳曝露が増大または延長されたことを示しうる。いくつかの実施形態では、治療有効濃度の作用物質への脳曝露の持続時間が延長される。
【００３８】
いくつかの実施形態では、参照ポリペプチドまたはペプチドは、約４００ｎＭ、約３５０ｎＭ、約３００ｎＭ、約２５０ｎＭ、約２００ｎＭ、約１５０ｎＭ、約１００ｎＭ、もしくは約５０ｎＭの親和性、またはそれよりも強い親和性でＴｆＲに結合する（例えば、特異的に結合する）。いくつかの実施形態では、参照ポリペプチドまたはタンパク質は、約５０ｎＭの親和性またはそれよりも強い親和性でＴｆＲに結合する。
【００３９】
非限定的な例として、治療標的は、β−セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）タンパク質、タウタンパク質、骨髄細胞で発現する誘発受容体２（ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｏｎ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ  ２：ＴＲＥＭ２）タンパク質、またはα−シヌクレインタンパク質とすることができる。いくつかの実施形態では、治療標的はＢＡＣＥ１であり、かつ、このタンパク質に連結された場合の作用物質（例えば、治療用物質）は、参照タンパク質に連結された場合と比較して、哺乳動物の脳内に存在するアミロイドβタンパク質（Ａβ）の量をより長時間にわたって減少させる。
【００４０】
いくつかの実施形態では、哺乳動物は霊長類（例えば、ヒト）である。いくつかの実施形態では、ヒトは、神経疾患（例えば、神経変性疾患）の治療を要する患者である。いくつかの実施形態では、患者は神経疾患の１つ以上の徴候または症状を有する。
【００４１】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはタンパク質は、霊長類ＴｆＲに結合する（例えば、特異的に結合する）。いくつかの実施形態では、霊長類ＴｆＲはヒトＴｆＲである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはタンパク質は、ＴｆＲアピカルドメインに結合する。
【００４２】
いくつかの実施形態では、作用物質（例えば、治療用物質）は、操作されたＴｆＲ結合ポリペプチドに連結される。いくつかの実施形態では、操作されたＴｆＲ結合ポリペプチドは、ポリペプチドがトランスフェリン受容体に特異的に結合することを可能とする改変を有するＣＨ３またはＣＨ２ドメインを含む。適切な操作されたＴｆＲ結合ポリペプチドの非限定的な例を、下記セクションＩＶに記載する。いくつかの実施形態では、作用物質は、表１または表２に記載される操作されたＴｆＲ結合ポリペプチドに連結される。いくつかの実施形態では、作用物質は、ＣＨ３Ｃ．３５．２３、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．３、及びＣＨ３Ｃ．３５．２３．４からなる群から選択される操作されたＴｆＲ結合ポリペプチドに連結される。
【００４３】
いくつかの実施形態では、作用物質（例えば、治療用物質）は、ＴｆＲ結合ペプチドに連結される。いくつかの実施形態では、ＴｆＲ結合ポリペプチドは、アミノ酸約５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個の長さを有する短鎖ペプチドである。適切なペプチド（すなわち、望ましい範囲内の親和性でＴｆＲに結合するもの）を作製、スクリーニング、及び同定するための方法は、当該技術分野では周知のものである。例えば、負の選択と正の選択の交互のラウンドを用いるファージディスプレイ手法を用いて適切なペプチドを同定することができる。この手法は、例えば、その全容をあらゆる目的で本明細書によって援用さるＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００１）２６８：２００４−２０１２に記載されている。
【００４４】
いくつかの実施形態では、作用物質（例えば、治療用物質）は、ＴｆＲ結合抗体に連結される。適切なＴｆＲ結合ポリペプチドの非限定的な例は、約４８０ｎＭの親和性を有する、中国特許出願公報番号ＣＮ１０１２４５１０７Ａに開示されるＨ６７抗体である。
【００４５】
いくつかの実施形態では、タンパク質は、ＴｆＲに特異的に結合する抗体可変領域を含む。いくつかの例では、タンパク質は抗体フラグメントを含む。いくつかの例では、タンパク質はＦａｂまたはｓｃＦｖを含む。
【００４６】
いくつかの実施形態では、作用物質（例えば、治療用物質）は、抗体可変領域を含む。いくつかの実施形態では、作用物質は抗体フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、作用物質はＦａｂまたはｓｃＦＶを含む。
【００４７】
いくつかの実施形態では、作用物質（例えば、治療用物質）はＦａｂを含み、ポリペプチドはＦｃ形式であり（ヒンジまたは部分的ヒンジ領域を含みうる）、したがって、トランスフェリン受容体結合Ｆｃ−Ｆａｂ融合体を生成する。いくつかの実施形態では、Ｆｃ−Ｆａｂ融合体（例えば、改変ＣＨ２またはＣＨ３ドメインポリペプチドを含む）は二量体のサブユニットである。いくつかの実施形態では、二量体はヘテロ二量体である。いくつかの実施形態では、二量体はホモ二量体である。いくつかの実施形態では、二量体は、トランスフェリン受容体に結合する１個のポリペプチドを含む（すなわち、トランスフェリン受容体との結合について一価である）。いくつかの実施形態では、二量体は、トランスフェリン受容体に結合する第２のポリペプチドを含む。第２のポリペプチドは、Ｆｃ−Ｆａｂ融合体中に存在する同じ改変ＣＨ３ドメインポリペプチド（または改変ＣＨ２ドメインポリペプチド）を含むことにより二価の結合ホモ二量体を与えてもよいか、または第２の改変ＣＨ３ドメインポリペプチド（または改変ＣＨ２ドメインポリペプチド）が第２のトランスフェリン受容体結合部位を与えてもよい。いくつかの実施形態では、二量体は、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドまたは改変ＣＨ２ドメインポリペプチドを含む第１のサブユニットと、どちらもトランスフェリン受容体に結合しないＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む第２のサブユニットとを含む。
【００４８】
いくつかの実施形態では、作用物質（例えば、Ｆａｂフラグメント）は、ポリペプチドまたはタンパク質に連結されており、かつタウタンパク質（例えば、ヒトタウタンパク質）またはそのフラグメントに結合する。いくつかの実施形態では、作用物質は、リン酸化タウタンパク質、非リン酸化タウタンパク質、タウタンパク質のスプライスアイソフォーム、Ｎ末端が切断されたタウタンパク質、Ｃ末端が切断されたタウタンパク質、及び／またはそれらのフラグメントに結合することができる。
【００４９】
いくつかの実施形態では、作用物質（例えば、Ｆａｂフラグメント）は、ポリペプチドまたはタンパク質に連結されており、かつβ−セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）タンパク質（例えば、ヒトＢＡＣＥ１タンパク質）またはそのフラグメントに結合する。いくつかの実施形態では、作用物質は、ＢＡＣＥ１タンパク質の１つ以上のスプライスアイソフォームまたはそのフラグメントに結合することができる。
【００５０】
いくつかの実施形態では、作用物質（例えば、Ｆａｂフラグメント）は、ポリペプチドまたはタンパク質に連結されており、かつ骨髄細胞で発現する誘発受容体２（ＴＲＥＭ２）タンパク質（例えば、ヒトＴＲＥＭ２タンパク質）またはそのフラグメントに結合する。
【００５１】
いくつかの実施形態では、作用物質（例えば、Ｆａｂフラグメント）は、ポリペプチドまたはタンパク質に連結されており、かつα−シヌクレインタンパク質（例えば、ヒトα−シヌクレインタンパク質）またはそのフラグメントに結合する。いくつかの実施形態では、作用物質は、モノマー性α−シヌクレイン、オリゴマー性α−シヌクレイン、α−シヌクレインフィブリル、可溶性α−シヌクレイン、及び／またはこれらのフラグメントに結合することができる。
【００５２】
Ｂ．更なる実施形態及びリンカー
ポリペプチド（例えば、下記で更に説明する改変ＣＨ３またはＣＨ２ドメインポリペプチド）は、Ｆｃ領域の別のドメインと連結することができる。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドをＣＨ２ドメインと連結することができるが、これは、天然に存在するＣＨ２ドメイン、または通常はＣＨ２ドメインのＣ末端にあるバリアントＣＨ２ドメインであってよい。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ２ドメインポリペプチドをＣＨ３ドメインと連結することができるが、これは、天然に存在するＣＨ３ドメイン、または通常はＣＨ３ドメインのＮ末端にあるバリアントＣＨ３ドメインであってよい。いくつかの実施形態では、ＣＨ３ドメインに連結された改変ＣＨ２ドメインを含むポリペプチド、またはＣＨ２ドメインに連結された改変ＣＨ３ドメインを含むポリペプチドは、抗体の部分的または完全なヒンジ領域を更に含むことにより、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドまたは改変ＣＨ２ドメインポリペプチドが、部分的または完全なヒンジ領域を有するＦｃ領域の一部となるような形式をもたらす。ヒンジ領域は、いずれの免疫グロブリンサブクラスまたはアイソタイプからのものであってもよい。例示的な免疫グロブリンのヒンジの１つとして、ＩｇＧヒンジ領域、例えば、ＩｇＧ１ヒンジ領域、例えば、ヒトＩｇＧ１ヒンジアミノ酸配列
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がある。
【００５３】
尚も他の実施形態では、操作されたＴｆＲ結合ポリペプチド、ＴｆＲ結合ペプチド、またはＴｆＲ結合抗体は、タンパク質の精製に有用なペプチドまたはタンパク質、例えば、ポリヒスチジン、エピトープタグ、例えばＦＬＡＧ、ｃ−Ｍｙｃ、ヘマグルチニンタグなど、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ、ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ、またはマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）と融合させることができる。場合により、操作されたＴｆＲ結合ポリペプチド、ＴｆＲ結合ペプチド、またはＴｆＲ結合抗体と融合されたペプチドまたはタンパク質は、第Ｘａ因子またはトロンビンの切断部位のようなプロテアーゼ切断部位を含むことができる。
【００５４】
本発明の方法では、作用物質（例えば、治療用物質）は、ポリペプチドまたはタンパク質（例えば、操作されたＴｆＲ結合ポリペプチド、ＴｆＲ結合ペプチド、またはＴｆＲ結合抗体）に連結される。リンカーは、ポリペプチドまたはタンパク質に作用物質を連結するのに適したいずれのリンカーであってもよい。いくつかの実施形態では、連結は酵素によって切断可能なものである。特定の実施形態では、連結は中枢神経系に存在する酵素によって切断可能なものである。
【００５５】
いくつかの実施形態では、リンカーはペプチドリンカーである。ペプチドリンカーは、作用物質（例えば治療用物質）とポリペプチドまたはタンパク質との互いに対する回転を可能とし、かつ／またはプロテアーゼによる消化に対して耐性を有するように構成することができる。いくつかの実施形態では、リンカーは、例えば、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａなどのアミノ酸を含む柔軟なリンカーであってよい。かかるリンカーは、周知のパラメータを用いて設計することができる。例えば、リンカーは、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリピートのような繰り返し配列を有することができる。
【００５６】
異なる実施形態において、作用物質（例えば、治療用物質）のポリペプチドまたはタンパク質（例えば、操作されたＴｆＲ結合ポリペプチド、ＴｆＲ結合ペプチド、またはＴｆＲ結合抗体）への連結は、周知の化学架橋試薬及びプロトコールを用いて実現することができる。例えば、当業者には周知の、ポリペプチドまたはタンパク質を対象となる作用物質と架橋するうえで有用な多くの化学架橋剤が存在する。例えば、架橋剤は、分子を段階的に連結するために使用することができるヘテロ二官能性架橋剤である。ヘテロ二官能性架橋剤は、タンパク質を結合するためのより特異的な連結方法の設計を可能とし、それにより、ホモタンパク質ポリマーのような不要な副反応の発生を低減するものである。
【００５７】
前記作用物質（例えば、治療用物質）は、トランスフェリン受容体に対するポリペプチドまたはタンパク質の結合を作用物質が妨げない限り、ポリペプチドまたはタンパク質のＮ末端またはＣ末端領域に連結することができ、ポリペプチドまたはタンパク質（例えば、操作されたＴｆＲ結合ポリペプチド、ＴｆＲ結合ペプチド、またはＴｆＲ結合抗体）の任意の領域に結合させることができる。
【００５８】
Ｃ．結合親和性、脳中濃度、及び脳曝露の測定
いくつかの実施形態では、ＴｆＲ結合ポリペプチドの親和性は一価の形式で測定することができる。他の実施形態では、親和性は、例えば、ポリペプチド−Ｆａｂ融合タンパク質を含む二量体として、二価の形式で測定することができる。
【００５９】
結合親和性、結合速度論、及び交差反応性を分析するための方法は当該技術分野では周知のものである。これらの方法としては、これらに限定されるものではないが、固相結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ）、免疫沈降法、表面プラズモン共鳴（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））、速度論的排除アッセイ（ｋｉｎｅｔｉｃ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ａｓｓａｙ）（例えば、ＫｉｎＥｘＡ（登録商標））、フローサイトメトリー、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）、バイオレイヤー干渉法（例えば、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｉｎｃ．，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ））、及びウェスタンブロット分析が挙げられる。いくつかの実施形態では、結合親和性及び／または交差反応性を調べるためにＥＬＩＳＡが用いられる。いくつかの実施形態では、結合親和性、結合速度論、及び／または交差反応性を調べるために表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）が用いられる。いくつかの実施形態では、結合親和性、結合速度論、及び／または交差反応性を調べるために速度論的排除アッセイが用いられる。いくつかの実施形態では、結合親和性、結合速度論、及び／または交差反応性を調べるためにバイオレイヤー干渉法が用いられる。
【００６０】
結合親和性（例えば、ＴｆＲに対する）を決定するための方法の非限定的な１つの例を下記実施例３で述べるが、この実施例ではＢｉｃａｏｒｅ（商標）器具を使用した表面プラズモン共鳴によって親和性を測定している。この方法では、対象とする操作されたＴｆＲ結合ポリペプチド、ＴｆＲ結合ペプチド、またはＴｆＲ結合抗体をセンサーチップ上に捕捉し、ＴｆＲの連続希釈液をセンサーチップ上に特定の流速（例えば、３０μＬ／分）及び温度（例えば、室温）で注入する。指定の会合時間及び解離時間（例えば、それぞれ４５秒及び１８０秒）を用いて分析した後、センサーチップを再生する。コントロール（例えば、無関係なＩｇＧを同様の濃度で用いる）から測定された反応を減じることによって結合反応を補正し、ソフトウェアを使用して平衡反応を濃度に対してフィッティングすることによって安定状態の親和性を求めることができる。
【００６１】
脳内及び／または血漿中の作用物質（例えば、操作されたＴｆＲ結合ポリペプチドに、ＴｆＲ結合ペプチドに、またはＴｆＲ結合抗体に連結されたもの）の濃度は、例えば、ヒトトランスフェリン受容体（ｈＴｆＲ）ノックインマウスモデルを用いて測定することができる。かかるモデルを用いることで、例えば、最大脳中濃度（Ｃｍａｘ）及び／または脳曝露を測定及び／または比較して、例えばＣｍａｘが増大するかどうか、及び／または脳曝露時間が延長されるかどうかを判定することができる。ヒトアピカルＴｆＲ（ｈＴｆＲアピカル＋／＋）マウスノックインモデルの作出については、下記実施例２で述べる。適切なモデルを作出するため、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用してマウスＴｆｒｃ遺伝子（例えば、インビボの発現が内因性プロモーターの制御下にある）内でヒトＴｆｒｃアピカルドメインを発現するマウスを作製することができる。詳細には、Ｃａｓ９、シングルガイドＲＮＡ、及びドナーＤＮＡ（例えば、マウスで発現させるためにコドン最適化されたヒトアピカルドメインのコーディング配列）をマウス胚に（例えば、前核注入により）導入することができる。次に、胚を偽妊娠雌に移植することができる。胚を移植した雌の子孫からのファウンダー雄を野生型の雌と交配してＦ１ヘテロ接合体マウスを作出することができる。次に、Ｆ１世代のヘテロ接合体マウスの交配によってホモ接合体マウスを作出することができる。
【００６２】
作用物質（例えば、操作されたＴｆＲ結合ポリペプチドに、ＴｆＲ結合ペプチドに、またはＴｆＲ結合抗体に連結されたもの）の脳及び／または血漿中濃度または曝露の評価のために、連結された作用物質をマウスモデル（例えば、ｈＴｆＲアピカル＋／＋）に投与することができる。適切な時間の後にマウスから血漿試料を得た後、血管系を適切な溶液で灌流することができる。灌流後、脳（またはその一部）を抽出し、ホモジナイズしてから溶解することができる。血漿及び／または脳ライセート中の作用物質濃度を当業者には周知の常法を用いて測定することができる。ノックインマウスモデルに所定範囲の用量を投与することにより、標準曲線を作成することができる。ノックインマウスモデルに、異なる操作されたＴｆＲ結合ポリペプチド、ＴｆＲ結合ペプチド、またはＴｆＲ結合抗体（例えば、異なるＴｆＲ親和性を有するもの）に連結された作用物質、または参照ポリペプチドもしくはタンパク質（例えば、対象とするポリペプチドまたはタンパク質よりも強いＴｆＲに対する親和性を有するもの）に連結された作用物質を投与することにより、作用物質への脳曝露及び／または脳内の作用物質のＣｍａｘ値に対する操作されたＴｆＲ結合ポリペプチド、ＴｆＲ結合ペプチド、またはＴｆＲ結合抗体の効果に関する比較を行うことができる。
【００６３】
Ｄ．医薬組成物
本発明で使用するための製剤を調製するためのガイダンスは、当業者には周知の医薬品及び製剤用の任意の数のハンドブックにみることができる。
【００６４】
いくつかの実施形態では、作用物質（例えば、治療用物質）に連結されたポリペプチドまたはタンパク質を薬学的に許容される担体または賦形剤の一部として投与する。薬学的に許容される担体には、生理学的適合性を有し、活性剤の活性を好ましくは妨げない、または他の形で阻害しないあらゆる溶媒、分散媒、またはコーティングが含まれる。様々な薬学的に許容される賦形剤が周知である。
【００６５】
いくつかの実施形態では、担体は、静脈内、髄腔内、脳室内、筋肉内、経口、腹腔内、経皮、局所、または皮下投与に適したものである。薬学的に許容される担体は、例えば組成物を安定させるかまたはポリペプチドの吸収を増大もしくは減少させる作用を有する１つ以上の生理学的に許容される化合物を含むことができる。生理学的に許容される化合物としては、例えば、グルコース、スクロース、またはデキストランなどの炭水化物、アスコルビン酸またはグルタチオンなどの酸化防止剤、キレート剤、低分子量タンパク質、活性剤のクリアランスもしくは加水分解を低減する組成物、または賦形剤もしくは他の安定化剤及び／または緩衝剤を挙げることができる。他の薬学的に許容される担体及びそれらの製剤も当該技術分野で利用可能である。
【００６６】
本明細書に記載される医薬組成物は、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠製造、乳化、カプセル化、封入、または凍結乾燥プロセスにより、当業者には周知の方法で製造することができる。以下の方法及び賦形剤はあくまで例示的なものであり、いかなる意味でも限定的なものではない。
【００６７】
経口投与のために、作用物質（例えば、治療用物質）に連結されたポリペプチドまたはタンパク質を、当該技術分野では周知の薬学的に許容される担体と組み合わせることによって製剤化することができる。かかる担体は、化合物を、治療される患者によって経口摂取される、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、エマルション、親油性及び親水性懸濁液、液剤、ゲル、シロップ剤、スラリー剤、及び懸濁液などとして製剤化することを可能とする。経口用の医薬製剤は、ポリペプチドを、固体賦形剤と混合し、得られた混合物を場合に応じて粉砕し、必要に応じて適切な助剤を加えた後、顆粒の混合物を処理して錠剤または糖衣コアを得ることによって得ることができる。適切な賦形剤としては、例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖類などの充填剤；例えばトウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、及び／またはポリビニルピロリドンなどのセルロース調製物が挙げられる。必要に応じて、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸、もしくはアルギン酸ナトリウムなどのその塩などの崩壊剤を加えることができる。
【００６８】
作用物質（例えば、治療用物質）に連結されたポリペプチドまたはタンパク質は、注射により、例えばボーラス注射または連続注入により非経口投与されるように製剤化することができる。注射用には、ポリペプチドを植物油または同様の油類、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸またはプロピレングリコールのエステルなどの水性または非水性溶媒中に、必要に応じて、可溶化剤、等張化剤、懸濁化剤、乳化剤、安定化剤、及び防腐剤などの従来の添加剤と共に、溶解、懸濁、または乳化することによってポリペプチドを製剤として配合することができる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、水溶液、好ましくはハンクス液、リンゲル液、または生理学的食塩水のような生理学的適合性を有するバッファー中に配合することができる。注射用の製剤は、単位剤形、例えば、防腐剤が添加されたアンプル中、または複数用量容器中で与えることができる。組成物は、油性または水性溶媒中の懸濁液、溶液、またはエマルションの形態を取ることができ、懸濁化剤、安定化剤、及び／または分散剤などの配合剤を含むことができる。
【００６９】
一般的に、インビボ投与に使用される医薬組成物は無菌である。滅菌処理は、例えば、熱滅菌、蒸気滅菌、滅菌濾過、または放射線照射などの当該技術分野では周知の方法によって行うことができる。
【００７０】
ＩＶ．操作されたトランスフェリン受容体結合ポリペプチド
このセクションでは、トランスフェリン受容体に結合し、かつ血液脳関門（ＢＢＢ）を通過して輸送されることが可能である、操作されたポリペプチドの非限定的な例について述べる。
【００７１】
いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドは、ポリペプチドがトランスフェリン受容体に特異的に結合することを可能とするような改変を有するＣＨ３またはＣＨ２ドメインを含む。かかる改変は、ＣＨ３またはＣＨ２ドメインの表面に存在するアミノ酸の特定のセットに導入される。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３またはＣＨ２ドメインを含むポリペプチドは、トランスフェリン受容体のアピカルドメイン内のエピトープに特異的に結合する。
【００７２】
当業者には、例えばＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤなどの他の免疫グロブリンアイソタイプのＣＨ２及びＣＨ３ドメインを、これらのドメイン内で上記に述べたセット（ｉ）〜（ｖｉ）に対応するアミノ酸を特定することにより同様に改変することができることが理解される。改変は、例えば、非ヒト霊長類、サル、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ブタ、ニワトリなどの他の種に由来する免疫グロブリンからの対応するドメインに行うこともできる。
【００７３】
ＣＨ３トランスフェリン受容体結合ポリペプチド
いくつかの実施形態では、改変されるドメインはＩｇＧのＣＨ３ドメインのようなヒトＩｇのＣＨ３ドメインである。ＣＨ３ドメインは、いずれのＩｇＧのサブタイプ、すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４から得られるものであってもよい。ＩｇＧ抗体に関連して、ＣＨ３ドメインとは、ＥＵ番号付けスキームに従って番号付けした場合に、約３４１位〜約４４７位までのアミノ酸のセグメントのことを指す。トランスフェリン受容体結合のためのアミノ酸位置の対応するセットを特定する目的でのＣＨ３ドメイン内の位置は、特に指定されない限り、配列番号３を基準として決められるか、または配列番号１のアミノ酸１１４〜２２０を基準として決められる。置換もまた、配列番号１を基準として決められ、すなわち、あるアミノ酸は、配列番号１の対応する位置のアミノ酸に対して置換であるとみなされる。配列番号１は、部分的なヒンジ領域の配列であるＰＣＰをアミノ酸１〜３として含んでいる。配列番号１を基準としたＣＨ３ドメイン内の位置の番号付けは、これらの最初の３個のアミノ酸を含む。
【００７４】
上記に述べたように、改変することができるＣＨ３ドメインの残基のセットは、本明細書では配列番号１を基準として番号付けされる。例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のＣＨ３ドメインなどの任意のＣＨ３ドメインは、配列番号１の記載される位置の残基に対応する残基の１つ以上のセットにおいて、改変、例えばアミノ酸置換を有することができる。配列番号１の任意の特定の位置に対応するＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４の配列のそれぞれの位置は容易に決めることができる。
【００７５】
一実施形態では、トランスフェリン受容体に特異的に結合する改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、トランスフェリン受容体のアピカルドメインと、完全長のヒトトランスフェリン受容体配列（配列番号６）の２０８位を含むエピトープにおいて結合するが、この位置は、配列番号４に記載されるヒトトランスフェリン受容体アピカルドメイン配列の１１位に対応している。配列番号４は、ヒトトランスフェリン受容体１のユニプロテイン（ｕｎｉｐｒｏｔｅｉｎ）配列Ｐ０２７８６（配列番号６）のアミノ酸１９８〜３７８に対応している。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、トランスフェリン受容体のアピカルドメインと、完全長のヒトトランスフェリン受容体配列（配列番号６）の１５８、１８８、１９９、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、及び／または２９４位を含むエピトープにおいて結合する。改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、受容体に対するトランスフェリンの結合をブロックまたは他の形で阻害することなくトランスフェリン受容体に結合し得る。いくつかの実施形態では、トランスフェリンのＴｆＲに対する結合は、実質的に阻害されない。いくつかの実施形態では、トランスフェリンのＴｆＲに対する結合は、約５０％未満（例えば、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、または約５％未満）阻害される。いくつかの実施形態では、トランスフェリンのＴｆＲに対する結合は、約２０％未満（例えば、約１９％未満、約１８％未満、約１７％未満、約１６％未満、約１５％未満、約１４％未満、約１３％未満、約１２％未満、約１１％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満）阻害される。このような結合特異性を示す例示的なＣＨ３ドメインポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１１４〜２２０を基準として決めた場合に１５３、１５７、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１８６、１８８、１８９、及び１９４位にアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。
【００７６】
ＣＨ３トランスフェリン受容体結合セット（ｉ）：１５３、１５７、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１８６、１８８、１８９、及び１９４
いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１５３位、１５７位、１５９位、１６０位、１６１位、１６２位、１６３位、１８６位、１８８位、１８９位、及び１９４位を含むアミノ酸位置の1セット（セットｉ）において１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、または１１個の置換を含む。これらの位置に導入することができる例示的な置換を表１及び表２に示す。
【００７７】
いくつかの実施形態では、トランスフェリン受容体に特異的に結合する改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、以下のような配列番号１に対する置換を有する少なくとも１つの位置を含む。すなわち、１５３位のＧｌｕ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＧｌｎ、１５７位のＬｅｕ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、またはＶａｌ、１５９位のＬｅｕ、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ａｓｎ、Ｖａｌ、またはＰｈｅ、１６０位のＶａｌ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、または酸性アミノ酸、１６１位のＴｒｐ、１６２位の脂肪族アミノ酸、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＡｓｎ、１６３位のＧｌｙ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、またはＴｈｒ、１８６位の酸性アミノ酸、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、またはＨｉｓ、１８８位のＧｌｕ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、またはＡｒｇ、１８９位のＴｈｒ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、または酸性アミノ酸、及び／または、１９４位の芳香族アミノ酸、Ｈｉｓ、またはＬｙｓ。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、上記のセット中の位置の１つ以上において特定のアミノ酸の保存的置換、例えば、同じ電荷に基づくグループ、疎水性に基づくグループ、側鎖の環構造に基づくグループ（例えば、芳香族アミノ酸）、またはサイズに基づくグループ、及び／または極性かまたは非極性かによるグループの中のアミノ酸を含む。したがって、例えば、Ｉｌｅが１５７位、１５９位、及び／または１８６位に存在してよい。いくつかの実施形態では、１６０位、１８６位、及び１８９位のうちの１つ、２つ、またはそれぞれにおける酸性アミノ酸はＧｌｕである。他の実施形態では、１６０位、１８６位、及び１８９位のうちの１つ、２つ、またはそれぞれにおける酸性アミノ酸はＡｓｐである。
【００７８】
いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１６４位及び１６５位を含む位置に１個または２個の置換を更に含む。いくつかの実施形態では、１６４位にＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、またはＰｈｅが存在してよい。いくつかの実施形態では、１６５位にＧｌｎ、Ｐｈｅ、またはＨｉｓが存在してよい。
【００７９】
更なる実施形態では、改変ＣＨ３ドメインは以下、すなわち、１８７位がＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、またはＰｒｏ、１９７位がＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、またはＬｙｓ、及び１９９位がＳｅｒ、Ｔｒｐ、またはＧｌｙ、から選択される１つ、２つ、または３つの位置を更に含む。
【００８０】
ＣＨ３トランスフェリン受容体結合セット（ｉｉ）：１１８、１１９、１２０、１２２、２１０、２１１、２１２、及び２１３
いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、１１８位、１１９位、１２０位、１２２位、２１０位、２１１位、２１２位、及び２１３位からなるアミノ酸位置の1セット（セットｉｉ）において少なくとも３個または少なくとも４個、一般的には５個、６個、７個、または８個の置換を含む。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、２１０位にＧｌｙを、２１１位にＰｈｅを、かつ／または２１３位にＡｓｐを含む。いくつかの実施形態では、２１３位にＧｌｕが存在してよい。特定の実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、以下の位置に少なくとも１つの置換を含む。すなわち、１１８位にＰｈｅまたはＩｌｅ、１１９位にＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、またはＬｙｓ、１２０位にＴｙｒ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、またはＡｓｐ、１２２位にＴｈｒ またはＡｌａ、２１０位にＧｌｙ、２１１位にＰｈｅ、２１２位にＨｉｓ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、またはＰｈｅ、または２１３位にＡｓｐ。いくつかの実施形態では、１１８位、１１９位、１２０位、１２２位、２１０位、２１１位、２１２位、及び２１３位のうちの２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つすべてがこのパラグラフで指定される置換を有する。いくつかの実施形態では、改変CH3ドメインポリペプチドは、上記のセット中の位置の１つ以上において特定のアミノ酸の保存的置換、例えば、同じ電荷に基づくグループ、疎水性に基づくグループ、側鎖の環構造に基づくグループ（例えば、芳香族アミノ酸）、またはサイズに基づくグループ、及び／または極性かまたは非極性かによるグループの中のアミノ酸を含んでもよい。
【００８１】
いくつかの実施形態では、改変ＣＨ３ドメインポリペプチドは、同一性％が１１８位、１１９位、１２０位、１２２位、２１０位、２１１位、２１２位、及び２１３位のセットを含まないことを条件として、配列番号１のアミノ酸１１４〜２２０と少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有する。
【００８２】
ＣＨ２トランスフェリン受容体結合ポリペプチド
いくつかの実施形態では、改変されるドメインはＩｇＧのＣＨ２ドメインのようなヒトＩｇのＣＨ２ドメインである。ＣＨ２ドメインは、いずれのＩｇＧのサブタイプ、すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４から得られるものであってもよい。ＩｇＧ抗体に関連して、ＣＨ２ドメインとは、ＥＵ番号付けスキームに従って番号付けした場合に、約２３１位〜約３４０位までのアミノ酸のセグメントのことを指す。トランスフェリン受容体結合のためのアミノ酸位置の対応するセットを特定する目的でのＣＨ２ドメイン内の位置は、配列番号２を基準として決められるか、または配列番号１のアミノ酸４〜１１３を基準として決められる。置換もまた、配列番号１を基準として決められ、すなわち、あるアミノ酸は、配列番号１の対応する位置のアミノ酸に対して置換であるとみなされる。配列番号１は、部分的なヒンジ領域の配列であるＰＣＰをアミノ酸１〜３として含んでいる。これら３個の残基はＦｃ領域の一部ではないが、配列番号１を基準としたＣＨ２ドメイン内の位置の番号付けは、これらの最初の３個のアミノ酸を含む。
【００８３】
上記に述べたように、改変することができるＣＨ２ドメインの残基のセットは、本明細書では配列番号１を基準として番号付けされる。例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のＣＨ２ドメインなどの任意のＣＨ２ドメインは、配列番号１の記載される位置の残基に対応する残基の１つ以上のセットにおいて、改変、例えばアミノ酸置換を有することができる。配列番号１の任意の特定の位置に対応するＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４の配列のそれぞれの位置は容易に決定することができる。
【００８４】
一実施形態では、トランスフェリン受容体に特異的に結合する改変ＣＨ２ドメインポリペプチドは、トランスフェリン受容体のアピカルドメイン内のエピトープに結合する。ヒトトランスフェリン受容体アピカルドメイン配列は、配列番号４に記載されており、これはヒトトランスフェリン受容体１のユニプロテイン配列Ｐ０２７８６のアミノ酸１９８〜３７８に対応している。改変ＣＨ２ドメインポリペプチドは、受容体に対するトランスフェリンの結合をブロックまたは他の形で阻害することなくトランスフェリン受容体に結合しうる。いくつかの実施形態では、トランスフェリンのＴｆＲに対する結合は、実質的に阻害されない。いくつかの実施形態では、トランスフェリンのＴｆＲに対する結合は、約５０％未満（例えば、約４５％、約４０％、約３５％、約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、または約５％未満）阻害される。いくつかの実施形態では、トランスフェリンのＴｆＲに対する結合は、約２０％未満（例えば、約１９％未満、約１８％未満、約１７％未満、約１６％未満、約１５％未満、約１４％未満、約１３％未満、約１２％未満、約１１％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満）阻害される。
【００８５】
ＣＨ２トランスフェリン受容体結合セット（ｉｉｉ）：４７、４９、５６、５８、５９、６０、６１、６２、及び６３
いくつかの実施形態では、改変ＣＨ２ドメインポリペプチドは、４７位、４９位、５６位、５８位、５９位、６０位、６１位、６２位、及び６３位を含むアミノ酸位置の１セット（セットｉｉｉ）において少なくとも３個または少なくとも４個、一般的には５個、６個、７個、８個、または９個の置換を含む。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ２ドメインポリペプチドは、６０位にＧｌｕを、かつ／または６１位にＴｒｐを含む。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ２ドメインポリペプチドは、以下の位置の少なくとも１つの置換、すなわち、４７位にＧｌｕ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、またはＴｒｐ、４９位にＩｌｅ、Ｖａｌ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、またはＴｙｒ、５６位にＡｓｐ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ａｓｎ、またはＰｈｅ、５８位にＡｒｇ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、またはＧｌｙ、５９位にＴｙｒ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、またはＶａｌ、６０位にＧｌｕ、６１位にＴｒｐまたはＴｙｒ、６２位にＧｌｎ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、またはＡｓｐ、または、６３位にＬｅｕ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、またはＶａｌを含む。いくつかの実施形態では、４７位、４９位、５６位、５８位、５９位、６０位、６１位、６２位、及び６３位のうちの２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、または９つすべてがこのパラグラフで指定される置換を有する。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ２ドメインポリペプチドは、上記のセット中の位置の１つ以上において特定のアミノ酸の保存的置換、例えば、同じ電荷に基づくグループ、疎水性に基づくグループ、側鎖の環構造に基づくグループ（例えば、芳香族アミノ酸）、またはサイズに基づくグループ、及び／または極性かまたは非極性かによるグループの中のアミノ酸を含んでもよい。
【００８６】
いくつかの実施形態では、改変ＣＨ２ドメインポリペプチドは、同一性％が４７位、４９位、５６位、５８位、５９位、６０位、６１位、６２位、及び６３位のセットを含まないことを条件として、配列番号１のアミノ酸４〜１１３と少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有する。
【００８７】
ＣＨ２トランスフェリン受容体結合セット（ｉｖ）：３９、４０、４１、４２、４３、４４、６８、７０、７１、及び７２
いくつかの実施形態では、改変ＣＨ２ドメインポリペプチドは、３９位、４０位、４１位、４２位、４３位、４４位、６８位、７０位、７１位、及び７２位を含むアミノ酸位置の１セット（セットｉｖ）において少なくとも３個または少なくとも４個、一般的には５個、６個、７個、８個、９個、または１０個の置換を含む。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ２ドメインポリペプチドは、４３位にＰｒｏを、６８位にＧｌｕを、かつ／または７０位にＴｙｒを含む。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ２ドメインポリペプチドは、以下の位置の少なくとも１つの置換、すなわち、３９位のＰｒｏ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、またはＡｓｐ、４０位のＧｌｎ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、またはＴｙｒ、４１位のＴｈｒ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、またはＬｅｕ、４２位のＰｒｏ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、またはＡｓｐ、４３位のＰｒｏ、Ｖａｌ、またはＰｈｅ、４４位のＴｒｐ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、またはＧｌｕ、６８位のＧｌｕ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、またはＴｒｐ、７０位のＴｙｒ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、またはＡｓｐ、７１位のＴｈｒ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、またはＶａｌ、及び、７２位のＴｙｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、またはＰｒｏを含む。いくつかの実施形態では、３９位、４０位、４１位、４２位、４３位、４４位、６８位、７０位、７１位、及び７２位のうちの２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０個すべてがこのパラグラフで指定される置換を有する。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ２ドメインポリペプチドは、上記のセット中の位置の１つ以上において特定のアミノ酸の保存的置換、例えば、同じ電荷に基づくグループ、疎水性に基づくグループ、側鎖の環構造に基づくグループ（例えば、芳香族アミノ酸）、またはサイズに基づくグループ、及び／または極性かまたは非極性かによるグループの中のアミノ酸を含んでもよい。
【００８８】
いくつかの実施形態では、改変ＣＨ２ドメインポリペプチドは、同一性％が３９位、４０位、４１位、４２位、４３位、４４位、６８位、７０位、７１位、及び７２位のセットを含まないことを条件として、配列番号１のアミノ酸４〜１１３と少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有する。
【００８９】
ＣＨ２トランスフェリン受容体結合セット（ｖ）：４１、４２、４３、４４、４５、６５、６６、６７、６９、及び７３
いくつかの実施形態では、改変ＣＨ２ドメインポリペプチドは、４１位、４２位、４３位、４４位、４５位、６５位、６６位、６７位、６９位、及び７３位を含むアミノ酸位置の１セット（セットｖ）において少なくとも３個または少なくとも４個、一般的には５個、６個、７個、８個、９個、または１０個の置換を含む。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ２ドメインポリペプチドは、以下の位置の少なくとも１つの置換、すなわち、４１位のＶａｌまたはＡｓｐ、４２位のＰｒｏ、Ｍｅｔ、またはＡｓｐ、４３位のＰｒｏ またはＴｒｐ、４４位のＡｒｇ、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、またはＴｈｒ、４５位のＭｅｔ、Ｔｙｒ、またはＴｒｐ、６５位のＬｅｕまたはＴｒｐ、６６位のＴｈｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、またはＬｙｓ、６７位のＳｅｒ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、またはＬｅｕ、６９位のＨｉｓ、Ｌｅｕ、またはＰｒｏ、または、７３位のＶａｌまたはＴｒｐを含む。いくつかの実施形態では、４１位、４２位、４３位、４４位、４５位、６５位、６６位、６７位、６９位、及び７３位のうちの２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０個すべてがこのパラグラフで指定される置換を有する。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ２ドメインポリペプチドは、上記のセット中の位置の１つ以上において特定のアミノ酸の保存的置換、例えば、同じ電荷に基づくグループ、疎水性に基づくグループ、側鎖の環構造に基づくグループ（例えば、芳香族アミノ酸）、またはサイズに基づくグループ、及び／または極性かまたは非極性かによるグループの中のアミノ酸を含んでもよい。
【００９０】
いくつかの実施形態では、改変ＣＨ２ドメインポリペプチドは、同一性％が４１位、４２位、４３位、４４位、４５位、６５位、６６位、６７位、６９位、及び７３位のセットを含まないことを条件として、配列番号１のアミノ酸４〜１１３と少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有する。
【００９１】
ＣＨ２トランスフェリン受容体結合セット（ｖｉ）：４５、４７、４９、９５、９７、９９、１０２、１０３、及び１０４
いくつかの実施形態では、改変ＣＨ２ドメインポリペプチドは、４５位、４７位、４９位、９５位、９７位、９９位、１０２位、１０３位、及び１０４位を含むアミノ酸位置の１セット（セットｖｉ）において少なくとも３個または少なくとも４個、一般的には５個、６個、７個、８個、または９個の置換を含む。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ２ドメインは、１０３位にＴｒｐを含む。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ２ドメインポリペプチドは、以下の位置の少なくとも１つの置換、すなわち、４５位のＴｒｐ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、またはＡｌａ；４７位のＴｒｐまたはＧｌｙ；４９位のＴｙｒ、Ａｒｇ、またはＧｌｕ；９５位のＳｅｒ、Ａｒｇ、またはＧｌｎ；９７位のＶａｌ、Ｓｅｒ、またはＰｈｅ；９９位のＩｌｅ、Ｓｅｒ、またはＴｒｐ；１０２位のＴｒｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、またはＡｓｐ；１０３位のＴｒｐ；及び、１０４位のＳｅｒ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、またはＶａｌを含む。いくつかの実施形態では、４５位、４７位、４９位、９５位、９７位、９９位、１０２位、１０３位、及び１０４位のうちの２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、または９つすべてがこのパラグラフで指定される置換を有する。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ２ドメインポリペプチドは、上記のセット中の位置の１つ以上において特定のアミノ酸の保存的置換、例えば、同じ電荷に基づくグループ、疎水性に基づくグループ、側鎖の環構造に基づくグループ（例えば、芳香族アミノ酸）、またはサイズに基づくグループ、及び／または極性かまたは非極性かによるグループの中のアミノ酸を含んでもよい。
【００９２】
いくつかの実施形態では、改変ＣＨ２ドメインポリペプチドは、同一性％が４５位、４７位、４９位、９５位、９７位、９９位、１０２位、１０３位、及び１０４位のセットを含まないことを条件として、配列番号１のアミノ酸４〜１１３と少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有する。
【００９３】
Ｖ．Ｆｃ領域内の更なる変異
本発明の方法で使用される作用物質に連結されたポリペプチド（例えば、トランスフェリン受容体に結合するように改変され、かつＢＢＢを通る輸送を開始することができる）はまた、例えば、血清安定性を高めるため、エフェクター機能を調節するため、グリコシル化に影響を及ぼすため、ヒトにおける免疫原性を低下させるため、及び／または、ポリペプチドのノブ・アンド・ホール型のヘテロ二量化を可能とするためなど、更なる変異を含んでもよい。
【００９４】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、対応する野生型Ｆｃ領域（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のＦｃ領域）と少なくとも約７５％、少なくとも約７６％、少なくとも約７７％、少なくとも約７８％、少なくとも約７９％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列の同一性を有する。
【００９５】
ポリペプチドは、例えば、グリコシル化に影響を及ぼすため、血清半減期を長くするため、またはＣＨ３ドメインについては、改変ＣＨ３ドメインを含むポリペプチドのノブ・アンド・ホール型のヘテロ二量化を可能とするためなど、アミノ酸の指定されたセットの外側に導入される他の変異を有してもよい。一般的に、この方法では、第１のポリペプチドの界面に突起（「ノブ」）を、第２のポリペプチドの界面に対応した穴（「ホール」）を導入することで、突起が穴の中に位置してヘテロ二量体の形成を促し、ホモ二量体の形成を妨げることができることを伴う。突起は、第１のポリペプチドの界面の小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）に置換することによって形成される。突起と同じ、または同様の大きさの相補的な穴が、大きなアミノ酸側鎖をより小さなもの（例えば、アラニンまたはスレオニン）に置換することによって第２のポリペプチドの界面に形成される。このような更なる変異は、トランスフェリン受容体に対する改変ＣＨ３またはＣＨ２ドメインの結合に負の影響を及ぼさないポリペプチド内の位置に導入される。
【００９６】
二量体化のためのノブ・アンド・ホール型のアプローチの例示的な一実施形態では、二量体化しようとする第１のＦｃポリペプチドサブユニットの、配列番号１の１３９位に対応する位置が、天然のスレオニンの代わりにトリプトファンを有し、二量体の第２のＦｃポリペプチドサブユニットが、配列番号１の１８０位に対応する位置に天然のチロシンの代わりにバリンを有する。Ｆｃポリペプチドの第２のサブユニットは、配列番号１の１３９位に対応する位置の天然のスレオニンがセリンに置換され、配列番号１の１４１位に対応する位置の天然のロイシンがアラニンに置換される置換を更に含んでもよい。
【００９７】
ポリペプチドは、ヘテロ二量体化のための他の改変、例えば、自然に帯電しているＣＨ３−ＣＨ３界面内の接触残基の静電的操作、または疎水性パッチ改変を含むように操作することもできる。
【００９８】
いくつかの実施形態では、血清半減期を延長するための改変を導入することができる。例えば、いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、配列番号１の２５位に対応する位置にＴｙｒを、配列番号１の２７位に対応する位置にＴｈｒを、配列番号１の２９位に対応する位置にＧｌｕを含むＣＨ２ドメインを含む。
【００９９】
いくつかの実施形態では、変異、例えば置換を、配列番号１を基準として決めた場合の１７〜３０位、５２〜５７位、８０〜９０位、１５６〜１６３位、及び２０１〜２０８位のうちの１つ以上に導入する。いくつかの実施形態では、配列番号１を基準として決めた場合の２４位、２５位、２７位、２８位、２９位、８０位、８１位、８２位、８４位、８５位、８７位、１５８位、１５９位、１６０位、１６２位、２０１位、２０６位、２０７位、または２０９位に１つ以上の変異を導入する。いくつかの実施形態では、配列番号１を基準として決めた場合の２５位、２７位、及び２９位のうちの１つ、２つ、または３つに変異を導入する。いくつかの実施形態では、変異は、配列番号１を基準として番号付けした場合のＭ２５Ｙ、Ｓ２７Ｔ、及びＴ２９Ｅである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、変異Ｍ２５Ｙ、Ｓ２７Ｔ、及びＴ２９Ｅを更に含む。いくつかの実施形態では、配列番号１を基準として決めた場合の２０１位及び２０７位の１つまたは２つに変異を導入する。いくつかの実施形態では、変異は、配列番号１を基準として番号付けした場合のＭ２０１Ｌ及びＮ２０７Ｓである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、Ｍ２０１Ｌを伴うかまたは伴わずに変異Ｎ２０７Ｓを更に含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、配列番号１を基準として番号付けした場合のＴ８０位、Ｅ１５３位、及びＮ２０７位の１つ、２つ、または３つすべてに置換を含む。いくつかの実施形態では、変異はＴ８０Ｑ及びＮ２０７Ａである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、変異Ｔ８０Ａ、Ｅ１５３Ａ、及びＮ２０７Ａを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、配列番号１を基準として番号付けした場合のＴ２３位及びＭ２０１位に置換を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、変異Ｔ２３Ｑ及びＭ２０１Ｌを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、配列番号１を基準として番号付けした場合のＭ２０１位及びＮ２０７位に置換を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、置換Ｍ２０１Ｌ及びＮ２０７Ｓを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、Ｎ２０７ＳまたはＮ２０７Ａの置換を含む。
【０１００】
Ｆｃエフェクター機能
いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域（例えば、改変ＣＨ２またはＣＨ３ドメインを含む）はエフェクター機能を有する（すなわち、Ｆｃ領域は、エフェクター機能を媒介するエフェクター細胞で発現するＦｃ受容体に結合する際にある特定の生物学的機能を誘導する能力を有する）。エフェクター細胞としては、これらに限定されるものではないが、単核球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、好酸球、マスト細胞、血小板、Ｂ細胞、大顆粒リンパ球、ランゲルハンス細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及び細胞傷害性Ｔ細胞が挙げられる。
【０１０１】
抗体エフェクター機能の例としては、これらに限定されるものではないが、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞介在性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞介在性食作用（ＡＤＣＰ）、細胞表面受容体のダウンレギュレーション（例えば、Ｂ細胞受容体）、及びＢ細胞活性化が挙げられる。エフェクター機能は抗体クラスによって異なり得る。例えば、天然のヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ３抗体は、免疫系細胞上に存在する適切なＦｃ受容体に結合する際にＡＤＣＣ及びＣＤＣ活性を誘発することができ、天然のヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４は、免疫細胞上に存在する適切なＦｃ受容体に結合する際にＡＤＣＰ機能を誘発することができる。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、エフェクター機能を低下させる更なる改変を含むことができる。あるいは、いくつかの実施形態では、ポリペプチド（例えば、改変ＣＨ２またはＣＨ３ドメインを含む）は、エフェクター機能を高める更なる改変を含むことができる。
【０１０３】
エフェクター機能を調節する例示的なＦｃポリペプチド変異としては、これらに限定されるものではないが、ＣＨ２ドメイン内の置換、例えば、配列番号１の７及び８位に対応する位置における置換が挙げられる。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ２ドメイン内の置換は、配列番号１の７及び８位のＡｌａを含む。いくつかの実施形態では、改変ＣＨ２ドメイン内の置換は、配列番号１の７及び８位のＡｌａ、ならびに１０２位のＧｌｙを含む。
【０１０４】
エフェクター機能を調節する更なるＦｃポリペプチド変異としては、これらに限定されるものではないが、２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９位における１つ以上の置換を含む（ＥＵ番号付けスキームでは、配列番号１を基準として番号付けした場合に１１、３８、４２、４３、７０、１００、及び１０２位に相当する）。例示的な置換（ＥＵ番号付けスキームで番号付けした場合）には以下のものが含まれる。すなわち、３２９位は、プロリンがグリシンもしくはアルギニンに置換されたまたはＦｃのプロリン３２９とＦｃγＲＩＩＩのトリプトファン残基Ｔｒｐ８７及びＴｒｐ１１０との間に形成されるＦｃ／Ｆｃγ受容体界面を壊すだけの充分な大きさを有するアミノ酸残基に置換された変異を有することができる。更なる例示的な置換は、Ｓ２２８Ｐ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ、及びＰ３３１Ｓを含む。複数の置換が存在してもよく、例えば、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域のＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ、ヒトＩｇＧ４のＦｃ領域のＳ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅ、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域のＬ２３４Ａ及びＧ２３７Ａ、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＧ２３７Ａ、ヒトＩｇＧ２のＦｃ領域のＶ２３４Ａ及びＧ２３７Ａ、ヒトＩｇＧ４のＦｃ領域のＬ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、及びＥ３１８Ａ、ならびにヒトＩｇＧ４のＦｃ領域のＳ２２８Ｐ及びＬ２３６Ｅが挙げられる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＡＤＣＣを調節する１つ以上のアミノ酸置換、例えば、ＥＵ番号付けスキームに従う、Ｆｃ領域の２９８、３３３、及び／または３３４位の置換を有することができる。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、ＡＤＣＣを増大または減少させる１つ以上のアミノ酸置換を有してもよいか、またはＣ１ｑ結合及び／またはＣＤＣを変化させる変異を有してもよい。
【０１０６】
更なる変異を含む例示的なポリペプチド
ポリペプチドは、ノブ変異（例えば、配列番号１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｗ）、ホール変異（例えば、配列番号１を基準として番号付けした場合のＴ１３９Ｓ、Ｌ１４１Ａ、及びＹ１８０Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、配列番号１を基準として番号付けした場合のＬ７Ａ、Ｌ８Ａ、及び／またはＰ１０２Ｇ（例えば、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ））、及び／または血清安定性を高める変異（例えば、（ｉ）配列番号１を基準として番号付けした場合のＭ２５Ｙ、Ｓ２７Ｔ、及びＴ２９Ｅ、または（ｉｉ）配列番号１を基準として番号付けした場合の、Ｍ２０１Ｌを伴うかまたは伴わないＮ２０７Ｓ）を含む更なる変異を含むことができる。
【実施例】
【０１０７】
ＶＩ．実施例
本発明を、特定の実施例によってより詳細に説明する。以下の実施例はあくまで例示の目的で示されるものにすぎず、本発明をいかなる形でも限定しようとするものではない。当業者には、実質的に同じ結果が得られるように変更または改変することができる様々な重要でないパラメータが容易に認識されよう。用いられる数値（例えば、量、温度など）に関して精度を確実とするべく努力に努めてはいるが、ある程度の実験的誤差及び偏差は存在し得る。本発明の実施では、特に断らない限りは、当該技術分野の技術の範囲内で、タンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術、及び薬理学の従来の方法を用いている。かかる技術は文献に充分な説明がなされている。更に、当業者には、特定のライブラリーに適用される操作のための方法は、本明細書に記載される他のライブラリーにも適用できることが明らかなはずである。
【０１０８】
実施例１  ＣＨ３Ｃバリアントの薬物動態学的／薬力学的特性分析
本実施例では、マウスの血漿中及び脳組織中でのＣＨ３Ｃバリアントポリペプチドの薬物動態学的／薬力学的（ＰＫ／ＰＤ）特性分析について述べる。詳細には、抗ＢＡＣＥ１物質は、脳内でより低いＣｍａｘ値を示したが、ＴｆＲに対する親和性が弱いポリペプチドに連結された場合に、ＴｆＲに対する親和性がより強いポリペプチドと比較して時間の経過とともにより高い脳中濃度を示しかつ時間の経過とともにより高いＡβの阻害を示したことが、本実施例によって示される（例えば、図３Ｂ、３Ｃ、４Ｂ、及び４Ｃを参照）。
【０１０９】
野生型マウス血漿中でのＣＨ３Ｃバリアントの薬物動態
ポリペプチド−Ｆａｂ融合体はヒトＴｆＲにのみ結合しマウスＴｆＲには結合しないことから、ＴｆＲ介在性クリアランスを有さないモデルにおけるインビボ安定性を示すために野生型マウスでいくつかのＣＨ３Ｃバリアントの薬物動態学（ＰＫ）が試験された。実験計画を下記表３に示す。６〜８週齢のＣ５７Ｂｌ６マウスに静脈内投与し、表３に示される時点において顎下瀉血により生存中瀉血が行われた。血液をＥＤＴＡ血漿チューブに採取し、１４，０００ｒｐｍで５分間遠心した後、血漿を後の分析用に単離した。
【０１１０】
（表３）ＰＫ実験計画
2020530465.tif 000003
【０１１１】
マウスにおいてＡｂ１２２は正常なＰＫを有する抗ＲＳＶコントロールとして使用した。マウスにおいてＡｂ１５３は正常なＰＫを有する抗ＢＡＣＥ１コントロールとして使用した。この実験では、Ａｂ１５３のＦａｂアームを各ポリペプチドに融合した。
【０１１２】
マウス血漿中のポリペプチド濃度を、ジェネリックのヒトＩｇＧアッセイ（ＭＳＤ（登録商標）ヒトＩｇＧキット＃Ｋ１５０ＪＬＤ−４）を製造者の指示に従って使用して定量した。要約すると、予めコーティングしたプレートをＭＳＤ（登録商標）Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ａで３０分間ブロッキングした。血漿試料を、Ｈａｍｉｌｔｏｎ（登録商標）ＮＩＭＢＵＳリキッドハンドリング装置を使用して１：２，５００で希釈し、ブロッキングしたプレートに２つ組で加えた。投与溶液も同じプレート上で分析して適正な用量を確認した。標準曲線として０．７８〜２００ｎｇ／ｍＬのＩｇＧを、４パラメータロジスティック回帰を用いてフィッティングした。図１及び表４は、これらのデータの分析結果を示す。大幅に速いクリアランス及び短い半減期を有していたＣＨ３Ｃ．３．２−５を除き、ＣＨ３Ｃポリペプチドバリアントのすべてが、標準Ａｂ１２２と同等のクリアランス及び半減期値を有していた。興味深い点として、このバリアントはＣＨ３Ｃ．３．２−１９（Ｎ１６３Ｄ）の点変異体であり、後者は正常なＰＫプロファイルを有していた。
【０１１３】
（表４）ＣＨ３Ｃポリペプチド−Ｆａｂ融合体のＰＫパラメータ
2020530465.tif 000004
【０１１４】
野生型マウス脳組織における一価ＣＨ３Ｃ．３５．Ｎ１６３のＰＫ／ＰＤの評価
マウスＴｆｒｃ遺伝子内でヒトＴｆｒｃアピカルドメインを発現するトランスジェニックマウスを、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を用いて作製した。得られたキメラＴｆＲを内因性プロモーターの制御下にて、インビボで発現させた。
【０１１５】
キメラｈＴｆＲアピカル＋／＋ヘテロ接合体マウス（ｎ＝４／群）に４２ｍｇ／ｋｇのＡｂ１５３または一価ＣＨ３Ｃ．３５．Ｎ１６３のいずれかを静脈内投与し、野生型マウス（ｎ＝３）に５０ｍｇ／ｋｇのコントロールヒトＩｇＧ１を静脈内投与した。マウスにおいてＡｂ１５３は正常なＰＫを有するコントロールとして使用した。すべてのマウスを投与２４時間後にＰＢＳで灌流した。灌流に先立ち、血液をＥＤＴＡ血漿チューブ中に心穿刺により採取し、１４，０００ｒｐｍで５分間遠心した。次いで、後のＰＫ及びＰＤ分析用に血漿を単離した。灌流後の脳を摘出し、脳半球を分離して組織重量の１０倍のＰＢＳ中、１％ＮＰ−４０（ＰＫ用）または５Ｍ  ＧｕＨＣｌ（ＰＤ用）中でホモジナイズした。
【０１１６】
図２は、脳のＰＫ実験の結果を示す。取り込みは、一価ＣＨ３Ｃ．３５．Ｎ１６３のグループで、Ａｂ１５３及びコントロールヒトＩｇＧ１グループよりも大きかった。
【０１１７】
ｈＴｆＲアピカル＋／＋マウスにおけるポリペプチド−Ｆａｂ融合体の脳及び血漿のＰＫＰＤ：ＣＨ３Ｃ．３５．２１、ＣＨ３Ｃ．３５．２０、ＣＨ３Ｃ．３５、ＣＨ３Ｃ．３５．２３、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．３
ＰＫ及び脳での取り込みに対するＴｆＲ結合親和性の影響を評価するため、Ｂｉａｃｏｒｅによって測定されるアピカルヒトＴｆＲに対する結合親和性の異なる抗ＢＡＣＥ１  Ａｂ１５３及び操作されたＴｆＲ結合ポリペプチド融合体（ＣＨ３Ｃ．３５．２１：Ａｂ１５３、ＣＨ３Ｃ．３５．２０：Ａｂ１５３、ＣＨ３Ｃ．３５：Ａｂ１５３融合体）を作製した。ヒトＴｆＲに対するＣＨ３Ｃ．３５．２１：Ａｂ１５３、ＣＨ３Ｃ．３５．２０：Ａｂ１５３、ＣＨ３Ｃ．３５：Ａｂ１５３融合体の結合親和性はそれぞれ、１００ｎＭ、１７０ｎＭ、及び６２０ｎＭである。ｈＴｆＲアピカル＋／＋マウスノックインマウスに、５０ｍｇ／ｋｇのＡｂ１５３または各ポリペプチド−Ｆａｂ融合体を全身投与し、血漿ＰＫ及び脳ＰＫＰＤを投与の１、３、及び７日後に評価した。脳及び血漿ＰＫＰＤ分析を上記のセクションで述べたようにして行った。末梢組織でのＴｆＲの発現により、ＣＨ３Ｃ．３５．２１：Ａｂ１５３、ＣＨ３Ｃ．３５．２０：Ａｂ１５３、及びＣＨ３Ｃ．３５：Ａｂ１５３融合体は、Ａｂ１５３単独と比較して血漿中のより速やかなクリアランスを示したが、これは、標的介在性のクリアランスと一致し、インビボでのＴｆＲ結合を示すものである（図３Ａ）。印象的な点として、ＣＨ３Ｃ．３５．２１：Ａｂ１５３、ＣＨ３Ｃ．３５．２０：Ａｂ１５３、及びＣＨ３Ｃ．３５：Ａｂ１５３融合体の脳中濃度は、Ａｂ１５３と比較して有意に増大し、同じ時点におけるＡｂ１５３がわずかに約３ｎＭであったのと比較して投与後１日目に３０ｎｍよりも高い最大脳中濃度が得られた（図３Ｂ）。ＣＨ３Ｃ．３５．２１：Ａｂ１５３、ＣＨ３Ｃ．３５．２０：Ａｂ１５３、及びＣＨ３Ｃ．３５：Ａｂ１５３融合体の脳曝露の増大は、Ａｂ１５３を投与したマウスにおけるＡβレベルと比較して、マウスの脳で約５５〜６０％低い内因性のマウスＡβレベルをもたらした（図３Ｃ）。ＣＨ３Ｃ．３５．２１：Ａｂ１５３、ＣＨ３Ｃ．３５．２０：Ａｂ１５３、及びＣＨ３Ｃ．３５：Ａｂ１５３融合体の濃度が脳で高い状態に保たれた一方でより低い脳Ａβレベルは維持され、７日目までに曝露が低減された場合のＡｂ１５３で処置したマウスと同様のレベルに戻った。経時的な脳曝露の低下は、ＣＨ３Ｃ．３５．２１：Ａｂ１５３、ＣＨ３Ｃ．３５．２０：Ａｂ１５３、及びＣＨ３Ｃ．３５：Ａｂ１５３融合体の末梢曝露の低下と相関しており、インビボでの明確なＰＫ／ＰＤの関係を示した（図３Ａと３Ｃとを比較）。更に、全体の脳のＴｆＲレベルは、この単回の高用量の投与後にＡｂ１５３処理マウスとポリペプチド−Ｆａｂ融合体処理マウスとで同等であり、脳におけるＴｆＲ発現に対して、ポリペプチド−Ｆａｂ融合体の脳曝露の増大が有意な影響を及ぼさないことを示している（図３Ｄ）。
【０１１８】
操作されたＴｆＲ結合ポリペプチド−Ｆａｂ融合体のより広い親和性範囲でのＰＫと脳での取り込みとの関係を更に評価するため、ｈＴｆＲとの結合についてより広い親和性範囲を有する更なる融合体を作製した。ヒトＴｆＲに対するＣＨ３Ｃ．３５．２３：Ａｂ１５３及びＣＨ３Ｃ．３５．２３．３：Ａｂ１５３融合体の結合親和性は、それぞれ４２０ｎＭ及び１４４０ｎＭである。ｈＴｆＲアピカル＋／＋ノックインマウスに上記に述べたように投与を行った。血漿のＰＫ及び脳のＰＫＰＤを投与の１、４、７、及び１０日後に評価した。ポリペプチド−Ｆａｂ融合体の末梢でのＰＫはｈＴｆＲ親和性に依存しており、より親和性の高いＣＨ３Ｃ．３５．２３：Ａｂ１５３融合体は、大幅に低い親和性を有するＣＨ３Ｃ．３５．２３．３：Ａｂ１５３融合体と比較してより速やかなクリアランスを示した（図４Ａ）。ＣＨ３Ｃ．３５．２３：Ａｂ１５３及びＣＨ３Ｃ．３５．２３．３：Ａｂ１５３融合体はいずれも、Ａｂ１５３単独と比較して有意に高い脳曝露を有し、ＣＨ３Ｃ．３５．２３：Ａｂ１５３は投与後１日目に脳内で約３６ｎＭに達した（図４Ｂ）。血漿中濃度が同様であったにもかかわらず、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．３：Ａｂ１５３融合体のこの最大の脳での取り込みは、ＣＨ３．３５．２３：Ａｂ１５３融合体の脳での取り込みよりも低く、これは恐らくは後者の融合体のｈＴｆＲに対する親和性が約３．５倍低いことによるものと考えられる。興味深い点として、親和性のより低い融合体が１０日目までにより持続した末梢曝露を与えたことから、その脳曝露も親和性のより高いＣＨ３Ｃ．３５．２３：Ａｂ１５３融合体よりも高かった。このことは、親和性のより低い操作されたＴｆＲ結合ポリペプチド−Ｆａｂ融合体では脳Ｃｍａｘはより低いがＰＫは経時的により持続するというトレードオフを示している。抗ＢＡＣＥ１単独と比較して、Ａβ４０の有意に低い濃度が、抗ＢＡＣＥ１ポリペプチド融合体を投与したマウスの脳で観察された（図４Ｃ）。このＡβ４０低下の持続時間は、脳におけるｈｕＩｇＧ１曝露の経時的なレベルと一致していた（図４Ｂ）。印象的な点として、ＣＨ３Ｃ．３５：Ａｂ１５３融合体を投与したマウスは、単回投与の７〜１０日後まで持続的な脳のＡβ４０の低下を示した。全体的な脳のＴｆＲレベルは、ＣＨ３Ｃ．３５：Ａｂ１５３融合体に対してＡｂ１５３を投与したマウス間で投与後１日目に同等であった（図４Ｄ）。これらのデータは共に、操作されたＴｆＲ結合ポリペプチド融合体が抗ＢＡＣＥ１の脳曝露を増大させることにより単回投与後に脳のＡβ４０を有意に低下させ得ることを示すものである。
【０１１９】
実施例２  ＴｆＲ結合ポリペプチド親和性の選択
本実施例では、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に対するＴｆＲ結合ポリペプチドの親和性と、もたらされる、ＴｆＲ結合ポリペプチドに連結された治療用物質への脳曝露との間の関係について述べる。
【０１２０】
図５は、治療用物質への脳曝露（時間に対する脳濃度の曲線下面積（ＡＵＣ）により評価される）は、治療用物質をＴｆＲに対する親和性が比較的低いポリペプチドに連結した場合に最大であったことを示している。詳細には、脳曝露は、治療用物質をＴｆＲに対する親和性が約２５０ｎＭよりも弱いポリペプチドに連結した場合に大幅に延びた。
【０１２１】
図６に示されるように、脳内のより低い最高血中濃度（Ｃｍａｘ）が、治療用物質をＴｆＲに対する親和性が比較的弱いポリペプチドに連結した場合に観察された。詳細には、脳のＣｍａｘ値は、ＴｆＲ結合ポリペプチドが約２５０ｎＭよりも低い親和性を有する場合に有意に低かった。
【０１２２】
図７は、ＴｆＲに対して一連の親和性を有するポリペプチドに連結された場合の治療用物質の血漿中濃度に対する脳中Ｃｍａｘの比を示す。
【０１２３】
方法
ｈＴｆＲアピカル＋／＋ＫＩの作製
ノックイン／ノックアウトマウスの作製のための方法は文献に公開されており、当業者には周知のものである。要約すると、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を用いてマウスＴｆｒｃ遺伝子内でヒトＴｆｒｃアピカルドメインを発現するｈＴｆＲアピカル＋／＋ＫＩマウスを作製し、得られたキメラＴｆＲを内因性プロモーターの制御下にてインビボで発現させた。本明細書においてその全容を参照により援用される国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１８３０２に記載されるように、Ｃ５７Ｂｌ６マウスを使用して単一細胞胚に前核マイクロインジェクションした後、偽妊娠雌に胚移植することにより、ヒトアピカルＴｆＲマウス系統のノックインを作製した。詳細には、Ｃａｓ９、シングルガイドＲＮＡ、及びドナーＤＮＡを胚に導入した。ドナーＤＮＡは、マウスで発現させるためにコドン最適化されたヒトアピカルドメインコーディング配列を含んだ。アピカルドメインコーディング配列には、左側及び右側のホモロジーアームを隣接させた。ドナー配列は、アピカルドメインが４番目のマウスエクソンの後に挿入され、３末端に９番目のエクソンが直接隣接するように設計した。胚を移植した雌の子孫からのファウンダー雄を野生型の雌と交配してＦ１ヘテロ接合体マウスを作出した。次に、Ｆ１世代のヘテロ接合体マウスの交配によってホモ接合体マウスを作出した。
【０１２４】
マウスＰＫＰＤ
ＰＫ／ＰＤの評価のために、ｈＴｆＲアピカル＋／＋ ＫＩマウスに５０ｍｇ／ｋｇで尾静脈注射により１回全身投与した。灌流に先立ち、血液をＥＤＴＡ血漿チューブに心穿刺により採取し、１４，０００ｒｐｍで５分間遠心した。次いで、後のＰＫ／ＰＤ分析用に血漿を単離した。灌流後の脳を摘出し、脳半球を分離して組織重量の１０倍のＰＢＳ中、１％ＮＰ−４０（ＰＫ用）または５Ｍ  ＧｕＨＣｌ（ＰＤ用）中でホモジナイズした。
【０１２５】
マウス血漿及び脳ライセート中の抗体濃度を、ジェネリックのヒトＩｇＧアッセイ（ＭＳＤ  ヒトＩｇＧキット＃Ｋ１５０ＪＬＤ）を製造者の指示にしたがって使用して定量した。要約すると、プレコートしたプレートをＭＳＤ  Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ａで３０分間ブロッキングした。血漿試料を、Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｎｉｍｂｕｓリキッドハンドリング装置を使用して１：１０，０００で希釈し、ブロッキングしたプレートに２つ組で加えた。脳試料を１％NP-40溶解バッファー中でホモジナイズし、ライセートをＰＫ分析用に１：１０に希釈した。投与溶液も同じプレート上で分析して適正な用量を確認した。標準曲線として０．７８〜２００ｎｇ／ｍＬのＩｇＧを、４パラメータロジスティック回帰を用いてフィッティングした。
【０１２６】
実施例３  Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）を用いたＣＨ３Ｃバリアントの結合の特性分析
組換えＴｆＲアピカルドメインのクローンバリアントの親和性をＢｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００装置を使用して表面プラズモン共鳴により測定した。Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）シリーズＳ  ＣＭ５のセンサーチップを抗ヒトＦａｂとともに固定化した（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅより販売されるヒトＦａｂ捕捉キット）。５μｇ／ｍＬのポリペプチド−Ｆａｂ融合体を各フローセル上に１分間捕捉させ、ヒトまたはカニクイザルアピカルドメインの連続３倍希釈液を流速３０μＬ／分で室温において注入した。各試料を４５秒間の結合及び３分間の解離により分析した。それぞれの注入後、１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．１）を用いてチップを再生した。結合応答を、無関連のＩｇＧを同様の密度で捕捉させたフローセルからのＲＵを引くことによって補正した。Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖ３．１．を用いて平衡状態の応答を濃度に対してフィッティングすることによって、安定状態の親和性を得た。
【０１２７】
組換えＴｆＲ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のクローンバリアントの親和性を求めるため、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）シリーズＳ  ＣＭ５センサーチップをストレプトアビジンとともに固定化した。ビオチン化したヒトまたはカニクイザルＴｆＲのＥＣＤを各フローセル上に１分間捕捉させ、各クローンバリアントの連続３倍希釈液を流速３０μＬ／分で室温において注入した。各試料を４５秒間の結合及び３分間の解離により分析した。結合応答を、同様の密度でＴｆＲ  ＥＣＤを有さないフローセルからのＲＵを引くことによって補正した。Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖ３．１．を用いて平衡状態の応答を濃度に対してフィッティングすることによって、安定状態の親和性を得た。
【０１２８】
結合親和性を表５に要約する。親和性は安定状態のフィッティングにより得た。
【０１２９】
（表５）更なるＣＨ３Ｃバリアントの結合親和性
2020530465.tif 000005
【０１３０】
更なるＣＨ３ＣバリアントのＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．２．１、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１、ＣＨ３Ｃ．３５．Ｓ４１３、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．３．１、ＣＨ３Ｃ．３５．Ｎ３９０．１、及びＣＨ３Ｃ．３５．２３．６．１を作製し、ヒトＴｆＲに対するそれらの結合親和性を上記に述べたものと同じプロトコールにしたがって測定した。ＣＨ３Ｃ．３５．２０．１．１、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．２．１、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．１．１、ＣＨ３Ｃ．３５．Ｓ４１３、ＣＨ３Ｃ．３５．２３．３．１、ＣＨ３Ｃ．３５．Ｎ３９０．１、及びＣＨ３Ｃ．３５．２３．６．１の結合親和性は、それぞれ６２０ｎＭ、６９０ｎＭ、７５０ｎＭ、１７００ｎＭ、１９００ｎＭ、２０００ｎＭ、及び２１００ｎＭである。
【０１３１】
本明細書に述べられる実施例及び実施形態はあくまで例示的な目的のものに過ぎず、これらを考慮することでさまざまな改変または変更が当業者に示唆され、かかる改変及び変更は本出願の趣旨及び範囲、ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれるものであることが理解されよう。本明細書に引用される配列アクセッション番号の配列をここに参照によって援用する。
【０１３２】
（表１）CH3Cレジスターの位置及び変異
2020530465.tif 000006
【０１３３】
（表２）CH3C.35.21に関するレジスター内の許容される多様性の探索及びホットスポット位置
2020530465.tif 000007
【０１３４】
非公式の配列一覧表
2020530465.tif 000008
【図１】
2020530465.tif 000009
【図２】
2020530465.tif 000010
【図３Ａ】
2020530465.tif 000011
【図３Ｂ】
2020530465.tif 000012
【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
2020530465.tif 000014
【図４Ａ】
2020530465.tif 000015
【図４Ｂ】
2020530465.tif 000016
【図４Ｃ】
2020530465.tif 000017
【図４Ｄ】
2020530465.tif 000018
【図５】
2020530465.tif 000019
【図６】
2020530465.tif 000020
【図７】
2020530465.tif 000021
【手続補正書】
【提出日】令和2年4月9日(2020.4.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2020530465000001.app
【国際調査報告】
2020530465.tif 000022
2020530465.tif 000023
2020530465.tif 000024