(57)【要約】本開示は、酵母におけるカンナビノイドの生成に関する。一態様において、１つまたはそれを超えるＧＰＰ生成遺伝子、および必要に応じて、１つまたはそれを超えるＧＰＰ経路遺伝子；２つまたはそれを超えるオリベトール酸生成遺伝子；１つまたはそれを超えるカンナビノイド前駆体またはカンナビノイド生成遺伝子；１つまたはそれを超えるヘキサノイルＣｏＡ生成遺伝子、ならびに少なくとも５％の乾燥重量の脂肪酸または脂肪を含む遺伝的に改変された酵母が提供される。
2020530308.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）１つまたはそれを超えるＧＰＰ生成遺伝子、および必要に応じて、１つまたはそれを超えるＧＰＰ経路遺伝子；
（ｂ）２つまたはそれを超えるオリベトール酸生成遺伝子；
（ｃ）１つまたはそれを超えるカンナビノイド前駆体またはカンナビノイド生成遺伝子；
（ｄ）１つまたはそれを超えるヘキサノイルＣｏＡ生成遺伝子、ならびに
（ｅ）少なくとも５％の乾燥重量の脂肪酸または脂肪
を含む、遺伝的に改変された酵母。
【請求項２】
前記１つまたはそれを超えるＧＰＰ生成遺伝子が、
ａ）変異ファルネシル二リン酸シンターゼ；
ｂ）Ｋ１９７Ｅ置換を含む変異Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＥＲＧ２０；
ｃ）Ｆ９６ＷおよびＮ１２７Ｗ置換を含む二重変異Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＥＲＧ２０；
ｄ）Ｋ１８９Ｅ置換を含む変異Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＥＲＧ２０；
ｅ）Ｆ８８ＷおよびＮ１１９Ｗ置換を含む二重変異Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＥＲＧ２０；
ｆ）配列番号１〜４のいずれか１つに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｇ）配列番号１〜４のいずれか１つに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチド；または
ｈ）（ａ）〜（ｇ）の任意の組み合わせ
のうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の酵母。
【請求項３】
前記１つまたはそれを超えるＧＰＰ生成遺伝子が、ＧＰＰ経路遺伝子から選択される、請求項１に記載の酵母。
【請求項４】
前記ＧＰＰ経路遺伝子が、
ａ）ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧＲ）；
ｂ）切断型ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ（ｔＨＭＧＲ）；
ｃ）配列番号５〜６のいずれか１つに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｄ）配列番号５〜６のいずれか１つに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチド；または
ｅ）（ａ）〜（ｄ）の任意の組み合わせ
から選択される、請求項３に記載の酵母。
【請求項５】
前記２つまたはそれを超えるオリベトール酸生成遺伝子が、（ａ）〜（ｄ）のうちの少なくとも１つおよび（ｅ）〜（ｈ）のうちの少なくとも１つを含み；
ここで、（ａ）〜（ｄ）は、
ａ）オリベトールシンターゼ（ＯＬＳ）；
ｂ）配列番号７に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｃ）配列番号７に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチド；または
ｄ）（ａ）〜（ｃ）の任意の組み合わせ
を含み；
（ｅ）〜（ｈ）は、
ｅ）オリベトール酸シクラーゼ（ＯＡＣ）；
ｆ）配列番号８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｇ）配列番号８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチド；または
ｈ）（ｅ）〜（ｇ）の任意の組み合わせ
を含む、前記請求項のいずれかに記載の酵母。
【請求項６】
前記１つまたはそれを超えるカンナビノイド前駆体またはカンナビノイド生成遺伝子が、
ａ）可溶性芳香族プレニルトランスフェラーゼ；
ｂ）カンナビゲロール酸シンターゼ（ＣＢＧＡＳ）；
ｃ）配列番号９〜１２のいずれか１つに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｄ）配列番号９〜１２のいずれか１つに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチド；または
ｅ）（ａ）〜（ｅ）の任意の組み合わせ
のうちの少なくとも１つを、単独で、または
ｆ）テトラヒドロカンナビノール酸シンターゼ（ＴＨＣＡＳ）；
ｇ）カンナビジオール酸シンターゼ（ＣＢＤＡＳ）；
ｈ）カンナビクロメン酸シンターゼ（ＣＢＣＡＳ）；
ｉ）配列番号１３〜１５のいずれか１つに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｊ）配列番号１３〜１５のいずれか１つに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチド；もしくは
ｋ）（ｆ）〜（ｊ）の任意の組み合わせ
のうちの少なくとも１つと組み合わせて、含む、前記請求項のいずれか１項に記載の酵母。
【請求項７】
前記可溶性芳香族プレニルトランスフェラーゼが、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ＣＬ１９０株由来のＮｐｈＢである、請求項６に記載の酵母。
【請求項８】
前記１つまたはそれを超えるヘキサノイルＣｏＡ生成遺伝子が、
ａ）ヘキサノイルＣｏＡシンターゼ；
ｂ）ＨｅｘＡおよびＨｅｘＢ；
ｃ）ＳｔｃＪおよびＳｔｃＫ；
ｄ）変異ＦＡＳ１および変異ＦＡＳ２；
ｅ）配列番号１６に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび配列番号１７に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｆ）配列番号１６に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドおよび配列番号１７に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチド；
ｇ）配列番号１８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび配列番号１９に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｈ）配列番号１８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドおよび配列番号１９に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチド；
ｉ）配列番号２０に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび配列番号２１に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｊ）配列番号２０に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドおよび配列番号２１に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチド；または
ｋ）（ａ）〜（ｊ）の任意の組み合わせ
のうちの少なくとも１つを含む、前記請求項のいずれか１項に記載の酵母。
【請求項９】
前記変異ＦＡＳ１遺伝子および前記変異ＦＡＳ２遺伝子が、
ａ）ＦＡＳ１  Ｉ３０６ＡおよびＦＡＳ２  Ｇ１２５０Ｓ；
ｂ）ＦＡＳ１  Ｉ３０６Ａ、Ｍ１２５１ＷおよびＦＡＳ２  Ｇ１２５０Ｓ；または
ｃ）ＦＡＳ１  Ｉ３０６Ａ、Ｒ１８３４ＫおよびＦＡＳ２  Ｇ１２５０Ｓ
から選択される遺伝的改変を含む、請求項８に記載の酵母。
【請求項１０】
前記酵母が、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、少なくとも２０％、少なくとも２１％、少なくとも２２％、少なくとも２３％、少なくとも２４％または少なくとも２５％の乾燥重量の脂肪酸または脂肪を含む、前記請求項のいずれか１項に記載の酵母。
【請求項１１】
前記酵母が、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、少なくとも２０％、少なくとも２１％、少なくとも２２％、少なくとも２３％、少なくとも２４％または少なくとも２５％の乾燥重量の脂肪酸または脂肪を生成するように遺伝的に改変されている、前記請求項のいずれか１項に記載の酵母。
【請求項１２】
前記酵母が、脂肪酸または脂肪の生成を増加させる遺伝的改変をさらに含む、請求項１１に記載の酵母。
ａ）脂肪酸または脂肪の生成を増加させる前記遺伝的改変が、デルタ−９ステアロイルＣｏＡデサチュラーゼ（ＳＣＤ）；
ｂ）配列番号２２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｃ）配列番号２２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチド
ｄ）アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ１）；
ｅ）配列番号２３に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｆ）配列番号２３に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチド；
ｇ）ジアシルグリセリドアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡ１）；
ｈ）配列番号２４に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｉ）配列番号２４に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチド；または
ｊ）（ａ）〜（ｊ）の任意の組み合わせ
のうちの少なくとも１つを含む、請求項１２に記載の酵母。
【請求項１３】
前記酵母が、油性である、前記請求項のいずれか１項に記載の酵母。
【請求項１４】
前記酵母が、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ属、Ｙａｒｒｏｗｉａ属、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ属およびＴｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属から選択される、請求項１２に記載の酵母。
【請求項１５】
前記酵母が、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｔａｒｋｅｙ、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓまたはＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓである、前記請求項のいずれか１項に記載の酵母。
【請求項１６】
少なくとも１つのカンナビノイドまたはカンナビノイド前駆体を生成する方法であって、前記方法は、前記少なくとも１つのカンナビノイドまたはカンナビノイド前駆体を生成するのに十分な培養条件下および時間にわたって、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の酵母を炭水化物源と接触させる工程を含む、方法。
【請求項１７】
前記少なくとも１つのカンナビノイドまたはカンナビノイド前駆体が、ＣＢＧＡ、ＴＨＣＡ、ＣＢＤＡまたはＣＢＣＡを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１７または１８に記載の方法を用いて生成される、カンナビノイド前駆体、カンナビノイドまたはそれらの組み合わせ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権書類
本願は、２０１７年７月１２日に出願された“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｅｒｐｅｎｅｓ  ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄｓ  ｉｎ  ｙｅａｓｔｓ”というタイトルの米国特許仮出願第６２５３１８２７号について優先権を主張し、その内容は、その全体が参照により本明細書に援用される。
【０００２】
本開示は、酵母におけるカンナビノイドの生成に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
カンナビノイドは、神経伝達物質の放出などの広範囲の生理学的挙動を調節するようにカンナビノイドレセプターおよび他の標的分子に対して作用する化学物質の一般的な１クラスである。カンナビノイドは、天然に、ヒトにおいて産生され（内在性カンナビノイドと呼ばれる）、Ｃａｎｎａｂｉｓ  ｓａｔｉｖａをはじめとしたいくつかの植物種によっても産生される（フィトカンナビノイドと呼ばれる）。カンナビノイドは、いくつかの有益な医学的効果／治療効果を有すると示されているので、様々な疾患用の医薬品として使用するために、製薬業界による活発な研究領域となっている。
【０００４】
現在、医薬用または他の用途のカンナビノイドの生成は、化学合成、またはこれらのカンナビノイドを産生している植物、例えば、Ｃ．ｓａｔｉｖａからのカンナビノイドの抽出によって行われている。現行のカンナビノイド生成方法には欠点がいくつかある。様々なカンナビノイドの化学合成は、天然に存在する植物からのカンナビノイドの抽出と比べて、コストのかかるプロセスである。また、カンナビノイドの化学合成には、環境的に優しくない化学物質の使用が必要であり、このことは、それらの生成に対するさらなるコストと考えることができる。さらに、様々なカンナビノイドの合成化学的生成は、Ｃ．ｓａｔｉｖａなどの植物から抽出されたものと比べて薬理学的活性が低いと分類されている。化学的に合成されたカンナビノイドには欠点があるが、この生成方法には、最終産物が高度に純粋な単一のカンナビノイドであるという利点がある。この純度レベルは、薬学的用途にとって好ましい。植物抽出物に基づくカンナビノイド生成が、ＦＤＡの承認を受けておらず、合成化合物だけが承認されているという事実が、製薬業界が要求する純度レベルを反映している。
【０００５】
カンナビノイドの合成化学的生成とは対照的に、カンナビノイドを生成するために現在用いられている他の方法は、これらの化学物質を天然に産生している植物におけるカンナビノイドの生成であり、このために最も使用されている植物は、Ｃ．ｓａｔｉｖａである。この方法では、Ｃ．ｓａｔｉｖａ植物が栽培され、開花サイクル中に、その植物において、様々なカンナビノイドが天然に産生される。その植物を収穫し、医薬目的でカンナビノイドをその植物自体から直接、様々な方法において摂取し得るか、またはその植物からカンナビノイドを抽出し得る。Ｃ．ｓａｔｉｖａ植物からカンナビノイドを抽出する方法は複数ある。これらの方法のすべてが、通常、カンナビノイドを含むＣ．ｓａｔｉｖａ植物を、カンナビノイドを化学溶液中で選択的に可溶化する該化学溶液の中に入れる工程を含む。これを行うために用いられる様々な化学溶液があり、例えば、ヘキサン、冷水抽出法、ＣＯ２抽出法などである。次いで、すでに種々のカンナビノイドをすべて含んでいるこの化学溶液を、過剰な植物材料を残して、取り出すことができる。次いで、そのカンナビノイド含有溶液を、使用するためにさらに処理することができる。
【０００６】
Ｃ．ｓａｔｉｖａなどの植物におけるカンナビノイドの自然な産生および抽出には、欠点がいくつかある。Ｃ．ｓａｔｉｖａが産生するカンナビノイドは、数多く存在するので、抽出プロセスを用いたとき、植物において同一のカンナビノイドプロファイルを再現することが難しいことが多い。さらに、植物の成長にばらつきがあると、その植物自体におけるカンナビノイドのレベルが異なって、再現性のある抽出が難しくなる。異なるカンナビノイドプロファイルは、異なる薬学的効果をもたらすことになり、それは、医薬品にとって望ましくない。さらに、Ｃ．ｓａｔｉｖａ抽出物からのカンナビノイドの抽出は、カンナビノイドの混合物を生成し、高度に純粋な単一の薬学的化合物を生成しない。多くのカンナビノイドが、似た構造であるので、これらの混合物を高レベルに精製することは難しく、最終産物のカンナビノイド汚染をもたらす。
【０００７】
したがって、改善されたカンナビノイド生成方法を提供する必要がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
要旨
この要旨は、下記の詳細な説明においてさらに記載される概念の選択を簡単に紹介するために提供される。この要旨は、特許請求される主題の重要な特徴または不可欠な特徴を特定するとも意図されていないし、特許請求される主題の範囲を限定するために用いられるとも意図されていない。特許請求される主題の他の特徴、詳細、有用性および利点は、添付の図面に図示された態様および添付の特許請求の範囲において定義された態様を含む、以下に記載される詳細な説明から明らかになる。
【０００９】
本開示の第１の態様によると、
（ａ）１つまたはそれを超えるＧＰＰ生成遺伝子、および必要に応じて、１つまたはそれを超えるＧＰＰ経路遺伝子；
（ｂ）２つまたはそれを超えるオリベトール酸（ｏｌｉｖｅｔｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）生成遺伝子；
（ｃ）１つまたはそれを超えるカンナビノイド前駆体またはカンナビノイド生成遺伝子；
（ｄ）１つまたはそれを超えるヘキサノイルＣｏＡ生成遺伝子、ならびに
（ｅ）少なくとも５％の乾燥重量の脂肪酸または脂肪
を含む遺伝的に改変された酵母が提供される。
【００１０】
ある特定の実施形態において、１つまたはそれを超えるＧＰＰ生成遺伝子は、
ａ）変異ファルネシル二リン酸シンターゼ；
ｂ）Ｋ１９７Ｅ置換を含む変異Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＥＲＧ２０；
ｃ）Ｆ９６ＷおよびＮ１２７Ｗ置換を含む二重変異Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＥＲＧ２０；
ｄ）Ｋ１８９Ｅ置換を含む変異Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＥＲＧ２０；
ｅ）Ｆ８８ＷおよびＮ１１９Ｗ置換を含む二重変異Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＥＲＧ２０；
ｆ）配列番号１〜４のいずれか１つに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｇ）配列番号１〜４のいずれか１つに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチド；または
ｈ）（ａ）〜（ｇ）の任意の組み合わせ
のうちの少なくとも１つを含む。
【００１１】
ある特定の実施形態において、１つまたはそれを超えるＧＰＰ生成遺伝子は、ＧＰＰ経路遺伝子から選択される。ある特定の実施形態において、ＧＰＰ経路遺伝子は、
ａ）ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧＲ）；
ｂ）切断型ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ（ｔＨＭＧＲ）；
ｃ）配列番号５〜６のいずれか１つに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｄ）配列番号５〜６のいずれか１つに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチド；または
ｅ）（ａ）〜（ｄ）の任意の組み合わせ
から選択される。
【００１２】
ある特定の実施形態において、２つまたはそれを超えるオリベトール酸生成遺伝子は、（ａ）〜（ｄ）のうちの少なくとも１つおよび（ｅ）〜（ｈ）のうちの少なくとも１つを含み、ここで、（ａ）〜（ｄ）は、
ａ）オリベトールシンターゼ（ｏｌｉｖｅｔｏｌ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）（ＯＬＳ）；
ｂ）配列番号７に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｃ）配列番号７に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチド；または
ｄ）（ａ）〜（ｃ）の任意の組み合わせ
を含み、
（ｅ）〜（ｈ）は、
ｅ）オリベトール酸シクラーゼ（ＯＡＣ）；
ｆ）配列番号８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｇ）配列番号８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチド；または
ｈ）（ｅ）〜（ｇ）の任意の組み合わせ
を含む。
【００１３】
ある特定の実施形態において、１つまたはそれを超えるカンナビノイド前駆体またはカンナビノイド生成遺伝子は、
ａ）可溶性芳香族プレニルトランスフェラーゼ；
ｂ）カンナビゲロール酸シンターゼ（ＣＢＧＡＳ）；
ｃ）配列番号９〜１２のいずれか１つに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｄ）配列番号９〜１２のいずれか１つに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチド；または
ｅ）（ａ）〜（ｅ）の任意の組み合わせ
のうちの少なくとも１つを、単独で、または
ｆ）テトラヒドロカンナビノール酸シンターゼ（ＴＨＣＡＳ）；
ｇ）カンナビジオール酸シンターゼ（ＣＢＤＡＳ）；
ｈ）カンナビクロメン酸シンターゼ（ＣＢＣＡＳ）；
ｉ）配列番号１３〜１５のいずれか１つに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｊ）配列番号１３〜１５のいずれか１つに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチド；または
ｋ）（ｆ）〜（ｊ）の任意の組み合わせ
のうちの少なくとも１つと組み合わせて、含む。
【００１４】
ある特定の実施形態において、可溶性芳香族プレニルトランスフェラーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ＣＬ１９０株由来のＮｐｈＢである。
【００１５】
ある特定の実施形態において、１つまたはそれを超えるヘキサノイルＣｏＡ生成遺伝子は、
ａ）ヘキサノイルＣｏＡシンターゼ；
ｂ）ＨｅｘＡおよびＨｅｘＢ；
ｃ）ＳｔｃＪおよびＳｔｃＫ；
ｄ）変異ＦＡＳ１および変異ＦＡＳ２；
ｅ）配列番号１６に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび配列番号１７に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｆ）配列番号１６に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドおよび配列番号１７に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチド；
ｇ）配列番号１８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび配列番号１９に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｈ）配列番号１８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドおよび配列番号１９に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチド；
ｉ）配列番号２０に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび配列番号２１に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｊ）配列番号２０に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドおよび配列番号２１に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチド；または
ｋ）（ａ）〜（ｊ）の任意の組み合わせ
のうちの少なくとも１つを含む。
【００１６】
ある特定の実施形態において、変異ＦＡＳ１遺伝子および変異ＦＡＳ２遺伝子は、ＦＡＳ１  Ｉ３０６ＡおよびＦＡＳ２  Ｇ１２５０Ｓ；ＦＡＳ１  Ｉ３０６Ａ、Ｍ１２５１ＷおよびＦＡＳ２  Ｇ１２５０Ｓ；またはＦＡＳ１  Ｉ３０６Ａ、Ｒ１８３４ＫおよびＦＡＳ２  Ｇ１２５０Ｓから選択される遺伝的改変を含む。
【００１７】
ある特定の実施形態において、上記酵母は、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、少なくとも２０％、少なくとも２１％、少なくとも２２％、少なくとも２３％、少なくとも２４％または少なくとも２５％の乾燥重量の脂肪酸または脂肪を含む。
【００１８】
ある特定の実施形態において、上記酵母は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、少なくとも２０％、少なくとも２１％、少なくとも２２％、少なくとも２３％、少なくとも２４％または少なくとも２５％の乾燥重量の脂肪酸または脂肪を生成するように遺伝的に改変されている。
【００１９】
ある特定の実施形態において、上記酵母はさらに、脂肪酸または脂肪の生成を増加させる遺伝的改変を含む。ある特定の実施形態において、脂肪酸または脂肪の生成を増加させる遺伝的改変は、
ａ）デルタ−９ステアロイルＣｏＡデサチュラーゼ（ＳＣＤ）；
ｂ）配列番号２２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｃ）配列番号２２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチド；
ｄ）アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ１）；
ｅ）配列番号２３に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｆ）配列番号２３に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチド
ｇ）ジアシルグリセリドアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡ１）；
ｈ）配列番号２４に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｉ）配列番号２４に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチド；または
ｊ）（ａ）〜（ｉ）の任意の組み合わせ
のうちの少なくとも１つを含む。
【００２０】
ある特定の実施形態において、上記酵母は、油性である。ある特定の実施形態において、上記酵母は、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ属、Ｙａｒｒｏｗｉａ属、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ属およびＴｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属から選択される。上記酵母が、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｔａｒｋｅｙ、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓまたはＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓである、前記請求項のいずれか１項に記載の酵母。
【００２１】
本開示の第２の態様によると、少なくとも１つのカンナビノイドまたはカンナビノイド前駆体を生成する方法が提供され、その方法は、少なくとも１つのカンナビノイドまたはカンナビノイド前駆体を生成するのに十分な培養条件下および時間にわたって、本開示の酵母を炭水化物源と接触させる工程を含む。
【００２２】
ある特定の実施形態において、少なくとも１つのカンナビノイドまたはカンナビノイド前駆体は、ＣＢＧＡ、ＴＨＣＡ、ＣＢＤＡまたはＣＢＣＡを含む。
【００２３】
本開示の第２の態様によると、請求項１７または１８に記載の方法を用いて生成される、カンナビノイド前駆体、カンナビノイドまたはそれらの組み合わせが提供される。
【００２４】
本開示の実施形態を、添付の図面に照らして考察する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、カンナビノイド合成経路の図である。
【００２６】
【図２−１】図２は、非酵素的工程を含むカンナビノイド合成経路の図である。
【図２−２】図２は、非酵素的工程を含むカンナビノイド合成経路の図である。
【００２７】
【図３】図３は、酵母細胞組織化（yeast  cell  organisation）の高レベルスキームである。
【００２８】
【図４】改変前および改変後の、Ｙ．Ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの油含有量。薄い色の円形の領域は、写真上の油を示している（矢印を参照のこと）。ａｄ９変異体（右の像）は、野生型Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ（左の像）よりも多くの油を蓄積している。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
実施形態の説明
定義
以下の定義は、以下に記載される説明において使用される特定の用語に対して提供される。
【００３０】
本明細書および特許請求の範囲において使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを指示しない限り、複数の言及を含む。例えば、用語「カンナビノイド前駆体（ａ  ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）」は、前駆体の混合物をはじめとした、複数の前駆体を含む。用語「ポリヌクレオチド（ａ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」は、複数のポリヌクレオチドを含む。
【００３１】
本明細書中で使用されるとき、用語「含む」は、組成物および方法が、列挙されているエレメントを含み、他のエレメントを排除しないことを意味すると意図されている。「〜から本質的になる」は、その組み合わせにとって本質的に重要な他のエレメントを排除することを意味するものとする。したがって、生成されたカンナビノイドから本質的になる組成物は、単離方法および精製方法に由来する微量の夾雑物、ならびに薬学的に許容され得るキャリア（例えば、リン酸緩衝食塩水、保存剤など）を排除しない。「〜からなる」は、他の成分の微量エレメントより多くを排除すること、および生成されたカンナビノイドに対する実質的な方法工程を排除することを意味するものとする。これらの移行用語の各々によって定義される実施形態は、本発明の範囲内である。
【００３２】
用語「約」または「およそ」は、当業者が決定するような特定の値に対して許容され得る範囲内であることを意味するが、その許容され得る範囲は、その値がどのように測定または決定されるか、例えば、測定システムの限界に部分的に左右される。例えば、「約」は、所与の値の最大２０％、好ましくは、最大１０％、より好ましくは、最大５％、より好ましくは、なおも最大１％の範囲を意味し得る。あるいは、特に、生体系または生物学的プロセスに関しては、その用語は、ある値の１桁以内、好ましくは、５倍以内、より好ましくは、２倍以内を意味し得る。特に明記しない限り、用語「約」は、特定の値に対して許容され得る誤差範囲内（例えば、±１〜２０％、好ましくは、±１〜１０％、より好ましくは、±１〜５％）を意味する。
【００３３】
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限との間に入る各値、およびその明記された範囲内の他の任意の明記された値またはその明記された範囲内に入る値は、本発明に包含されると理解される。これらのより狭い範囲の上限および下限は、独立して、そのより狭い範囲内に含められてよく、明記された範囲内の任意の具体的に除外される限度次第で、それらもまた本発明に包含される。明記された範囲が、一方または両方の限界を含む場合、それらの含められる両方の限界のどちらかを排除した範囲も、本発明に含められる。
【００３４】
本明細書中で使用されるとき、用語「ポリヌクレオチド」と「核酸分子」とは、任意の長さのヌクレオチドの重合体形態のことを指すために交換可能に使用される。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドおよび／またはそれらのアナログを含み得る。ヌクレオチドは、任意の３次元構造を有してよく、既知または未知の任意の機能を発揮し得る。用語「ポリヌクレオチド」は、例えば、一本鎖、二本鎖および三本鎖のらせん分子、遺伝子または遺伝子フラグメント、エキソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス分子、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、アプタマー、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマーを含む。核酸分子は、修飾された核酸分子（例えば、修飾された塩基、糖および／またはヌクレオチド間リンカーを含むもの）も含み得る。
【００３５】
本明細書中で使用されるとき、用語「ペプチド」とは、２つまたはそれを超えるサブユニットアミノ酸、アミノ酸アナログまたはペプチド模倣物の化合物のことを指す。それらのサブユニットは、ペプチド結合または他の結合によって（例えば、エステル、エーテルなどとして）連結され得る。
【００３６】
本明細書中で使用されるとき、用語「アミノ酸」とは、天然アミノ酸および／または非天然アミノ酸もしくは合成アミノ酸（グリシンおよびＤまたはＬ光学異性体の両方を含む）ならびにアミノ酸アナログおよびペプチド模倣物のことを指す。ペプチド鎖が短い場合、３つまたはそれを超えるアミノ酸のペプチドは、通常、オリゴペプチドと呼ばれる。ペプチド鎖が長い（例えば、約１０アミノ酸超である）場合、そのペプチドは、通常、ポリペプチドまたはタンパク質と呼ばれる。用語「タンパク質」は、用語「ポリペプチド」を包含するが、「ポリペプチド」は、全長未満のタンパク質であり得る。
【００３７】
本明細書中で使用されるとき、「発現」とは、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写され、かつ／またはペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質に翻訳されるプロセスのことを指す。ポリヌクレオチドが、ゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、ゲノムＤＮＡから転写されたｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。
【００３８】
本明細書中で使用されるとき、「転写制御下」または「作動可能に連結された」とは、発現制御エレメントとコード配列とが適切に近位にあることによって制御されるポリヌクレオチド配列の発現（例えば、転写または翻訳）のことを指す。１つの態様において、発現制御配列が、ＤＮＡ配列の転写を制御し、調節するとき、そのＤＮＡ配列は、その発現制御配列と「作用的に連結されている」。
【００３９】
本明細書中で使用されるとき、「コード配列」は、適切な発現制御配列の制御下に置かれているとき、転写およびポリペプチドに翻訳される配列である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシル）末端の翻訳停止コドンによって決まる。コード配列には、原核生物の配列、真核生物のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核生物（例えば、酵母または哺乳動物）のＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、およびさらには合成ＤＮＡ配列も含み得るが、これらに限定されない。ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列は、通常、コード配列に対して３’に配置されている。
【００４０】
本明細書中で使用されるとき、２つのコード配列またはそれらの相補的な配列が、同じアミノ酸配列をコードする場合、それらの配列は、互いに「対応する」。
【００４１】
本明細書中で使用されるとき、「シグナル配列」は、小胞体移行配列のことを表す。この配列は、そのシグナル配列と連結している（例えば化学結合を介して）ポリペプチドを、小胞体の小胞コンパートメントに方向付けるように、エキソサイトーシス性／エンドサイトーシス性のオルガネラに入るように、細胞の小胞コンパートメントに送達されるように、または細胞表面に送達されてそのポリペプチドを分泌するように、細胞と情報交換するシグナルペプチドをコードする。このシグナル配列は、時折、タンパク質の成熟の際に、細胞によって切り取られる。シグナル配列は、原核生物および真核生物に固有の種々のタンパク質と関連した状態で見られ得る。
【００４２】
本明細書中で使用されるとき、「ハイブリダイゼーション」とは、１つまたはそれを超えるポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合によって安定化された複合体を形成する反応のことを指す。水素結合は、ワトソン−クリック塩基対形成によって、フーグスティーン結合によって、または他の任意の配列特異的様式で、生じ得る。その複合体は、二重鎖構造を形成している２本の鎖、多重鎖複合体を形成している３本もしくはそれを超える鎖、自己ハイブリダイズしている１本鎖、またはこれらの任意の組み合わせを含み得る。ハイブリダイゼーション反応は、より広範なプロセスにおける１工程（例えば、ＰＣＲ反応の開始）、またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素的切断を構成し得る。
【００４３】
本明細書中で使用されるとき、別の配列に対してある特定のパーセンテージ（例えば、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％）の「配列同一性」を有するポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドもしくはポリペプチド領域）は、当該分野における通例のソフトウェアプログラムを用いて最大限にアラインメントされたとき、そのパーセンテージの塩基（またはアミノ酸）が、２つの配列を比較した際に同じであることを意味する。
【００４４】
ヌクレオチドの少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、好ましくは、少なくとも約８０％、最も好ましくは、少なくとも約９０または９５％が、規定の長さのＤＮＡ配列にわたって一致するとき、２つの配列は、「実質的に相同」または「実質的に類似」である。同様に、ポリペプチドの少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約６６％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、好ましくは、少なくとも約８０％、最も好ましくは、少なくとも約９０または９５％のアミノ酸残基が、規定の長さのポリペプチド配列にわたって一致するとき、２つのポリペプチド配列は、「実質的に相同」または「実質的に類似」である。実質的に相同の配列は、配列データバンクにおいて利用可能な標準的なソフトウェアを用いてそれらの配列を比較することによって同定することができる。実質的に相同の核酸配列も、例えば、特定のシステムに対して定義されるストリンジェントな条件下の、サザンハイブリダイゼーション実験において同定することができる。適切なハイブリダイゼーション条件の定義は、当該分野の技術範囲内である。例えば、ストリンジェントな条件は、４２℃の５×ＳＳＣおよび５０％ホルムアミドにおけるハイブリダイゼーション、ならびに６０℃の０．１×ＳＳＣおよび０．１％ドデシル硫酸ナトリウムにおける洗浄であり得る。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のさらなる例としては、約２５℃〜約３７℃のインキュベーション温度；約６×ＳＳＣ〜約１０×ＳＳＣのハイブリダイゼーション緩衝液濃度；約０％〜約２５％のホルムアミド濃度；および約６×ＳＳＣの洗浄溶液が挙げられる。中程度のハイブリダイゼーション条件の例としては、約４０℃〜約５０℃のインキュベーション温度；約９×ＳＳＣ〜約２×ＳＳＣの緩衝液濃度；約３０％〜約５０％のホルムアミド濃度；および約５×ＳＳＣ〜約２×ＳＳＣの洗浄溶液が挙げられる。高ストリンジェンシー条件の例としては、約５５℃〜約６８℃のインキュベーション温度；約１×ＳＳＣ〜約０．１×ＳＳＣの緩衝液濃度；約５５％〜約７５％のホルムアミド濃度；および約１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣまたは脱イオン水の洗浄溶液が挙げられる。一般に、ハイブリダイゼーションのインキュベーション時間は、１回、２回またはそれを超える洗浄工程を伴う５分〜２４時間であり、洗浄のインキュベーション時間は、約１、２、または１５分である。ＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸緩衝液である。他の緩衝系を用いるＳＳＣの等価物も使用できると理解される。類似度は、配列決定によって検証され得るが、好ましくは、問題の特定のドメインに適したアッセイを用いて機能（例えば、エンドソームコンパートメントへの輸送能など）によって追加的または選択的に検証される。
【００４５】
用語「パーセント（％）配列類似性」、「パーセント（％）配列同一性」などは、一般に、共通の進化的起源を共有する場合もあり、共有しない場合もある、核酸分子の異なるヌクレオチド配列間またはポリペプチドのアミノ酸配列間の同一性または対応の程度のことを指す（Ｒｅｅｃｋら、前出を参照のこと）。配列同一性は、いくつかの公的に利用可能な配列比較アルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＤＮＡ  Ｓｔｒｉｄｅｒ、ＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＧＣＧ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ７，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）など）のいずれかを用いて決定することができる。
【００４６】
２つのアミノ酸配列間または２つの核酸分子間のパーセント同一性を決定するために、それらの配列は、最適な比較目的のためにアラインされる。２つの配列間のパーセント同一性は、それらの配列が共有する同一の位置の数の関数（すなわち、パーセント同一性＝同一の位置の数／位置（例えば、重複する位置）の総数×１００）である。１つの実施形態において、２つの配列は、同じ長さであるか、またはほぼ同じ長さである。２つの配列間のパーセント同一性は、ギャップを許容して、またはギャップを許容せずに、下記に記載される技法と類似の技法を用いて決定することができる。パーセント配列同一性の計算では、通常、正確な一致がカウントされる。
【００４７】
２つの配列間のパーセント同一性の決定は、数学アルゴリズムを用いて達成することができる。２つの配列の比較のために利用される数学アルゴリズムの非限定的な例は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９３，９０：５８７３−５８７７におけるように改変された、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９０，８７：２２６４のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９０；２１５：４０３のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を行うことにより、本発明の配列に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いてＢＬＡＳＴタンパク質検索を行うことにより、本発明のタンパク質配列に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的でギャップありのアラインメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９７，２５：３３８９に記載されているように、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用することができる。あるいは、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを用いることにより、分子間の距離関係を検出する反復検索を行うことができる。Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）前出を参照のこと。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを利用するとき、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトのパラメータを使用することができる。ワールドワイドウェブ上のｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／を参照のこと。
【００４８】
配列の比較に利用される数学アルゴリズムの別の非限定的な例は、Ｍｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，ＣＡＢＩＯＳ  １９８８；４：１  １−１７のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用するとき、ＰＡＭ１２０重み付き残基表（ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ）、１２というギャップ長ペナルティ（ｇａｐ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｅｎａｌｔｙ）、および４というギャップペナルティ（ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ）を使用することができる。
【００４９】
好ましい実施形態において、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２行列またはＰＡＭ２５０行列のいずれか、１６、１４、１２、１０、８、６または４というギャップ重みおよび１、２、３、４、５または６という長さ重みを用いる、ＧＣＧソフトウェアパッケージ内のＧＡＰプログラム（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ；ワールドワイドウェブ上のａｃｃｅｌｒｙｓ．ｃｏｍにおいて入手可能）に組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９７０，４８：４４４−４５３）を用いて決定される。なおも別の好ましい実施形態において、２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰ行列、４０、５０、６０、７０または８０というギャップ重み、および１、２、３、４、５または６という長さ重みを用いる、ＧＣＧソフトウェアパッケージ内のＧＡＰプログラムを用いて決定される。特に好ましいパラメータセット（およびある分子が、本発明の配列同一性または配列相同性の限界であるかを決定するために、どのパラメータを適用すべきかについて従事者が予測できない場合に使用できるもの）は、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２スコア行列を、１２というギャップオープンペナルティ、４というギャップ伸長ペナルティ（ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｄ  ｐｅｎａｌｔｙ）および５というフレームシフトギャップペナルティとともに用いるものである。
【００５０】
パーセント同一性を決定できる方法の別の非限定的な例は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ３０，ｓｅｃｔｉｏｎ  ７．７．１８，表７．７．１に記載されているソフトウェアプログラムなどのソフトウェアプログラムの使用によるものである。好ましくは、デフォルトのパラメータをアラインメントのために使用する。好ましいアラインメントプログラムは、デフォルトのパラメータを使用したＢＬＡＳＴである。特に、好ましいプログラムは、以下のデフォルトのパラメータを使用したＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰである：遺伝暗号＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両鎖；カットオフ＝６０；期待値＝１０；行列＝ＢＬＯＳＵＭ６２；説明＝５０個の配列；ソート＝高スコア；データベース＝非冗長、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ翻訳＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレス：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴで見ることができる。
【００５１】
本明細書中に記載される特性の統計解析は、標準的な検定、例えば、ｔ検定、ＡＮＯＶＡまたはカイ二乗検定によって行われ得る。代表的には、ｐ＝０．０５（５％）、より好ましくは、ｐ＝０．０１、ｐ＝０．００１、ｐ＝０．０００１、ｐ＝０．０００００１のレベルまで、統計的有意性が測定される。
【００５２】
ドメイン配列の「保存的に改変されたバリアント」も、提供され得る。特定の核酸配列に関して、保存的に改変されたバリアントとは、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸のことを指すか、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一の配列のことを指す。詳細には、１つまたはそれを超える選択された（またはすべての）コドンの３番目の位置が、混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を作製することによって、縮重コドン置換を行うことができる（Ｂａｔｚｅｒら、１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１；Ｏｈｔｓｕｋａら、１９８５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、１９９４，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８）。
【００５３】
野生型タンパク質の「生物学的に活性なフラグメント」、「生物学的に活性な形態」、「生物学的に活性な等価物」および「機能的誘導体」という用語は、活性の検出に適したアッセイを用いて測定したとき、野生型タンパク質の生物学的活性と少なくとも実質的に等しい（例えば、有意に異ならない）生物学的活性を有する。
【００５４】
本明細書中で使用されるとき、用語「単離された」または「精製された」は、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはそれらのフラグメントが通常、自然状態で会合している、細胞性の構成成分および他の種類の構成成分から分離されたこと（またはそれらを実質的に含まないこと）を意味する。当業者に明らかであるように、天然に存在しないポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはそれらのフラグメントは、それをその天然に存在する対応物と区別するために「単離」を必要としない。「実質的に含まない」または「実質的に精製された」は、集団の少なくとも５０％、好ましくは、少なくとも７０％、より好ましくは、少なくとも８０％、さらにより好ましくは、少なくとも９０％が、それらが自然状態で会合している成分（component）を含まないことを意味する。
【００５５】
核酸が細胞の内部に導入されたとき、その細胞は、「形質転換された」か、「形質導入された」か、または「トランスフェクトされた」。ＤＮＡの形質転換は、細胞のゲノムを構成している染色体ＤＮＡにインテグレート（共有結合的に連結）されてもよいし、インテグレートされなくてもよい。例えば、ポリヌクレオチドは、プラスミドなどのエピソームエレメント上に維持され得るか、または安定に形質転換された細胞は、ポリヌクレオチドが、染色体の複製によって娘細胞に遺伝されるように染色体にインテグレートされた細胞である。この安定性は、細胞が、形質転換されたポリヌクレオチドを含む娘細胞の集団で構成される細胞株またはクローンを確立する能力によって実証される。「クローン」は、有糸分裂による単一の細胞または共通の祖先に由来する細胞の集団である。「細胞株」は、多くの世代（例えば、少なくとも約１０世代）にわたってインビトロにおいて安定に成長できる初代細胞のクローンである。
【００５６】
「ベクター」は、自己複製するか否かを問わず、細胞を形質転換またはトランスフェクトするために使用できる、プラスミドおよびウイルスおよび任意のＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を含む。
【００５７】
本明細書中で使用されるとき、「遺伝的改変」とは、細胞の正常なヌクレオチドに対する任意の付加、欠失もしくは破壊、および／または酵母への異種配列の付加（ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ）のことを指す。遺伝的改変を達成できるいずれの方法も、本発明の趣旨および範囲内である。当該分野で認められている方法としては、ウイルス媒介性の遺伝子導入、リポソーム媒介性の移入、形質転換、トランスフェクションおよび形質導入が挙げられる。
【００５８】
本発明の実施は、別段示されない限り、当該分野の技術範囲内である、従来の分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡ技法を用いる。そのような技法は、文献において十分に説明されている。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｆｒｉｔｓｃｈ＆Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅ  ＩおよびＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編，１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編，１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編，１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｉ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編，１９８４）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編，１９８６）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）を参照のこと。
【００５９】
別段定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者が通常理解している意味と同じ意味を有する。本明細書中で言及されるすべての刊行物が、今説明している発明と関連して使用され得るデバイス、製剤および方法を記載および開示する目的で、参照により援用される。
遺伝的に改変された酵母株
【００６０】
少なくとも１つのカンナビノイドまたはカンナビノイド前駆体の生成をもたらす１つまたはそれを超える遺伝的改変を含む遺伝的に改変された酵母、およびそれらを作製するための方法が、本明細書中に開示される。本開示の酵母は、例えば、単純糖源から様々なカンナビノイドを生成し得、ここで、酵母にとって利用可能な主炭素源は、糖（グルコース、ガラクトース、フルクトース、スクロース、ハチ蜜、糖蜜、粗糖など）である。酵母の遺伝子操作は、適切な酵素を生成する様々な遺伝子の挿入、および／または所望の化合物を生成するための酵母における天然の代謝経路の変更を含む。酵母の遺伝子操作によって、これらの代謝経路が、これらの酵母に導入され得、Ｃ．ｓａｔｉｖａ植物において生成されるのと同じ代謝産物が、その酵母によって生成され得る。この方法の利点は、いったん酵母が操作されると、カンナビノイドの生成が低コストになり、信頼できること、ならびに生物および遺伝的操作に応じて、特定のカンナビノイドだけが生成されるか、またはサブセットだけが生成されることである。その酵母には、単一のカンナビノイドまたは選択されたいくつかのカンナビノイドだけしか存在しないので、カンナビノイドの精製は、簡単である。そのプロセスは、合成的生成よりも環境的に優しい持続可能なプロセスである。
【００６１】
カンナビノイドを生成するための高レベル生合成経路を図１に示す。その経路は、ポリケチドシンターゼ（ＯＬＳ）およびオリベトール酸（ｏｌｉｖｔｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）シクラーゼ（ＯＡＣ）の作用による、ヘキサノイルＣｏＡからポリケチドであるオリベトール酸（ＯＡ）への変換から始まる。次いで、ＯＡは、芳香族プレニルトランスフェラーゼによって、モノテルペンゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）を用いてプレニル化され、カンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）になる。最後に、カンナビジオール酸シンターゼ（ＣＢＤＡＳ）を介してＣＢＧＡを環化することによって、カンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）が生成されるか、またはテトラヒドロカンナビノール酸シンターゼ（ＴＨＣＡＳ）によってＣＢＧＡからテトラヒドロカンナビノール酸（ｔｅｔｔｒａｈｙｄｒｏｃａｎｎａｂｉｎｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）（ＴＨＣＡ）が生成されるか、またはカンナビクロメン酸シンターゼ（ＣＢＣＡＳ）によってＣＢＧＡからカンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ）が生成される。
【００６２】
非酵素的修飾のための生成経路を図２に示す。
【００６３】
これまでに、酵母においてカンナビノイドを生成しようとする試みが複数行われた。現時点では、収率が極端に低いために、合理的な生成価格に到達することはできていない。本発明者らは、収率を高めることができる方法を確認した。
【００６４】
本発明者らは、酵母における油の生成と、理論上最大のカンナビノイド生成との間に関連を確立した。この予想外の関連に基づいて、（１）本発明者らは、従来の酵母におけるカンナビノイドの生成の代わりに、少なくとも５％の乾燥重量の脂肪酸または脂肪を有する酵母（例えば、油性酵母、例えば、Ｙ．Ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）を使用することを提唱する；（２）本発明者らは、操作された酵母において油の生成レベルを高めるさらなる遺伝的改変を行うことも提唱する；（３）カンナビノイド生成経路のさらなる遺伝子を、カンナビノイド中間体を生成する副経路の遺伝子（例えば、ＮｐｈＢなど）と組み合わせて付加する；（４）例えば、ＥＲＧ２０を遺伝的に変異させることおよび／または副経路の等価な遺伝子を使用することによって、ＧＰＰの生成を増加させる；（５）カンナビノイド生成経路において使用するための、脂肪酸経路からの化合物の生成を増加させる、例えば、ＡＣＣ１を過剰発現させることによってマロニルＣｏＡの生成を増加させる。
【００６５】
カンナビノイドは、水溶液への溶解度が限定的である。しかし、カンナビノイドは、脂質、油または脂肪のような疎水性液体においては高い溶解度を有する。疎水性媒体が、制限されるかまたは完全に除去される場合、ＣＢＧＡは、可溶化されず、その後のカンナビノイドシンテターゼにとっての利用可能性が限定される。一例として、論文（Ｚｉｒｐｅｌら、２０１５）において、精製されたＴＨＣＡシンターゼは、ＣＢＧＡをＴＨＣＡに変換することがほぼ不可能であることが示された。同じ論文において、その著者らは、未精製の酵母溶解産物が、はるかに効率的にＣＢＧＡを変換することを実証した。その著者らは、ＣＢＧＡが脂質画分に溶解されたことも実証した。別の論文（Ｌａｎｇｅら、２０１６）において、その著者らは、無細胞プロセスの改善という次の一歩に踏み出した。その著者らは、有機疎水性相および水相を用いる二相反応を使用した。その著者らは、ＣＢＧＡからのＴＨＣＡの高収率を実証した。その著者らは、ＣＢＧＡが有機相に溶解されることを見出した。その著者らは、ＴＨＣＡが有機相に戻ることも実証した。ゆえに、本発明者らは、合成の成功には疎水性相が必要であり、カンナビノイドは、たいてい有機相に存在するという結論を下すことができる。
【００６６】
酵母細胞の高レベルスキームを図３に示す。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｋ．ｐｈａｆｆｉｉ、Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓのような従来の酵母では、主な脂質塊は、脂質膜に沈着している。これらのタイプの酵母は、油性体をほとんど有しない。このような場合では、生成されるカンナビノイドはいずれも、この膜に溶解する。カンナビノイドが多くすぎると、膜が不安定になり、細胞死を引き起こす。糖含有量が多く、窒素供給がない最良の条件では、これらの酵母は、最高２〜３％の乾燥重量の油（すなわち、脂肪および脂肪酸）を有し得ることが報告された。
【００６７】
Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａのような、従来のものではない酵母がいくつかある。天然型のＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａは、最大１７％の乾燥重量の油を有し得る。主な油の塊は、油性体内に位置する。そのような油性体に溶解されたカンナビノイドは、膜不安定性を引き起こさない。結果として、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａは、かなり高いカンナビノイド生成レベルを有することができる。いくつかの研究が、脂質含有量を乾燥質量の８０％超にできる、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａについての改変を実証した（Ｑｉａｏら、２０１５）。図４は、Ｑｉａｏら、２０１５からの引用であり、改変型Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ対野生型Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおける油含有量の差を示している。３つの遺伝子改変という最小セットを使用した。
【００６８】
ゆえに、本発明者らは、カンナビノイドが、酵母において油含有量のあるパーセンテージまで生成され得ることを提唱する。これは、ある相関関係を与えるものであり、すなわち、油が多くなるほど、カンナビノイドの生成が多くなることを意味する。
【００６９】
ある総括論文（Ａｎｇｅｌａら、２０１７）は、カンナビノイドの有望な生産者として、種々のタイプの酵母を解析した。表１は、Ａｎｇｅｌａら、２０１７の中の要約表から改作したものであり、その論文において、その著者らは、４つの酵母タイプを種々のパラメータによって比較した。しかし、その著者らは、油含有量、生成の理論上の最大限度、および生成のための物品の最小コストを完全に無視した。１番右の２列は、油の最大量を乾燥重量に対するパーセンテージとして示しており、また、その油の中にわずか１％のカンナビノイドが存在する場合の生成コストを示している。１番下の行は、本開示の改変されたＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの実施形態を示している。最後に、Ａｎｇｅｌａら、２０１７の著者らは、アセチルＣｏＡプールの操作が最適化の可能性を有すると考えた；＋。しかしながら、本発明者らは、ＹＬが、改変なしで高濃度のアセチルＣｏＡを有することを見出した。
【００７０】
ゆえに、本発明者らは、生成の土台として油性酵母を使用することを提唱する。
【表１】
2020530308.tif 000003
表１は、Ｃａｒｖａｌｈｏ，Ａｎｇｅｌａら、“Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｆｏｒ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄｓ．”ＦＥＭＳ  ｙｅａｓｔ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  １７．４（２０１７）．１から作り替えたものである。＋＋＋，多くの刊行物が利用可能であり、十分確立されている；＋＋，刊行物が利用可能であり、最適化の可能性がある；＋、最初の刊行物が利用可能であるが、まだ確立されていない／機能しない；−，不可能；「空欄」，まだ報告がない。
【００７１】
カンナビノイドの経路は、複数の刊行物に記載されている。本発明者らは、最近の論文（Ｚｉｒｐｅｌら、２０１７；Ｐｏｕｌｏｓ  ａｎｄ  Ｆａｒｎｉａ  ２０１６；Ａｎｇｅｌａら、２０１７）などから提案されたすべての改変を使用できる。本発明者らは、以前に報告されている（Ｚｉｒｐｅｌら、２０１７）、ＣＢＧＡシンターゼをＮｐｈＢ遺伝子で置き換えるような生合成経路に対する改変を使用できる。
【００７２】
カンナビノイドおよびテルペンの生成に関する複数の論文に記載されているように、本発明者らも、ＧＰＰの生成を増加させる変異を提唱する。例えば、１つの方法は、カンナビノイド合成経路において必要なＧＰＰの量を増加させるために、変異ＥＲＧ２０遺伝子を使用することである（Ｚｈａｏら、２０１６；ＺＨＵＡＮＧ  ｎ．ｄ．；Ｋａｍｐｒａｎｉｓ  ａｎｄ  Ｍａｋｒｉｓ  ２０１２）。
【００７３】
酵母と比べて、植物のポリケチドおよびテルペン生合成の間には、重要な差がいくつか存在する。酵母は、ＴＨＣＡの生成に必要な酵素および脂肪酸の多くを含まない。さらに、酵母は、ＴＨＣＡの前駆体であるカンナビゲロール酸の生成に必要な化学物質であるゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）を高レベルで発現しない。しかし、遺伝子操作によって、それらの必要な酵素の多くを付加することができ、ＧＰＰの生成を増加させることができる。酵母におけるカンナビノイドの生成に必要な酵素を付加するために、本発明者らは、カンナビノイド生合成経路において不可欠な遺伝子で酵母を形質転換した。
【００７４】
したがって、第１の態様において、（ａ）１つまたはそれを超えるＧＰＰ生成遺伝子、および必要に応じて、１つまたはそれを超えるＧＰＰ経路遺伝子；（ｂ）２つまたはそれを超えるオリベトール酸生成遺伝子；（ｃ）１つまたはそれを超えるカンナビノイド前駆体またはカンナビノイド生成遺伝子；（ｄ）１つまたはそれを超えるヘキサノイルＣｏＡ生成遺伝子、および（ｅ）少なくとも５％の乾燥重量の脂肪酸または脂肪を含む遺伝的に改変された酵母が提供される。
【００７５】
本開示の遺伝子は、内在性であっても、異種であってもよく、本開示の遺伝子の機能を保持するホモログを含む。当業者が認識するように、ホモログは、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列のアラインメントによって同定され得る。ある特定の実施形態において、遺伝的に改変された酵母は、本開示の配列番号と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；本開示の配列番号と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％  少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一のポリペプチド；またはその両方を含む。一般的なカンナビノイド合成タンパク質（例えば、ＣＢＤＡＳ）のバリアントは、ＣＢＧＡを環化してＣＢＤＡを生成する能力を保持している。例えば、一般的なカンナビノイド合成タンパク質（例えば、ＣＢＤＡＳ）のバリアントは、ＣＢＧＡを環化してＣＢＤＡを生成する能力を、元の配列と比べて、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または少なくとも約１００％の有効性で保持していなければならない。好ましい実施形態において、一般的なカンナビノイドタンパク質（例えば、ＣＢＤＡＳ）のバリアントは、その一般的なカンナビノイドタンパク質の改善されたバリアントが、ＣＢＧＡを環化してＣＢＤＡを生成する際に、改善されたバリアントが由来する配列と比べて、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％またはおよび１５０％超、改善された活性を有するという点において、その改善されたバリアントが由来する配列よりも改善された活性を有する。
【００７６】
本開示の遺伝子は、任意の好適なプロモーターの制御下に存在し得る。多くの天然のプロモーターが、例えばＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａに対して、利用可能であり、翻訳伸長因子ＥＦ−１アルファ、アシルＣｏＡ：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、アセチルＣｏＡ−カルボキシラーゼ１、ＡＴＰクエン酸リアーゼ２、脂肪酸シンターゼサブユニットベータ、脂肪酸シンターゼサブユニットアルファ、イソクエン酸リアーゼ１、ＰＯＸ４脂肪酸アシルコエンザイムＡオキシダーゼ（POX4  fatty-acyl  coenzyme  A  oxidase）、ＺＷＦ１グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、サイトゾルの（ｇｙｔｏｓｏｌｉｃ）ＮＡＤＰ特異的イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼおよびＴＥＦイントロンの遺伝子からの天然のプロモーターが利用可能である（Ｗｏｎｇら、２０１７）。任意の好適なターミネーターを使用してもよい。短い合成ターミネーターが特に好適であり、容易に利用可能である。例えば、ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら、２０１６を参照のこと。
【００７７】
当業者が認識するように、遺伝子発現の増加は、遺伝子産物の活性の増加をもたらし得る。ある特定の実施形態において、遺伝子の過剰発現は、酵母において遺伝子産物の活性を約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約１００％、約１０５％、約１１０％、約１１５％、約１２０％、約１２５％、約１３０％、約１３５％、約１４０％、約１４５％、約１５０％、約１５５％、約１６０％、約１６５％、約１７０％、約１７５％、約１８０％、約１８５％、約１９０％、約９５％または約２００％増加させ得る。
【００７８】
上に記載されたように、ある特定の実施形態において、上記酵母は、少なくとも５％の乾燥重量の脂肪酸または脂肪を含む。したがって、その酵母は、油性であり得る。任意の油性酵母が好適であり得るが、特に、好適な酵母は、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ属、Ｙａｒｒｏｗｉａ属、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ属およびＴｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属から選択され得る。ある特定の実施形態において、その酵母は、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｔａｒｋｅｙ、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓまたはＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓである。その酵母は、天然に油性であり得る。したがって、ある特定の実施形態において、その酵母は、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、少なくとも２０％、少なくとも２１％、少なくとも２２％、少なくとも２３％、少なくとも２４％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％または少なくとも８０％の乾燥重量の脂肪酸または脂肪を含む。その酵母は、より多くの脂肪酸または脂肪を蓄積または生成するようにも遺伝的に改変され得る。したがって、ある特定の実施形態において、その酵母は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、少なくとも２０％、少なくとも２１％、少なくとも２２％、少なくとも２３％、少なくとも２４％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％または少なくとも８０％の乾燥重量の脂肪酸または脂肪を生成するように遺伝的に改変されている。
ＧＰＰ生成遺伝子
【００７９】
ＧＰＰは、変異ファルネシル二リン酸シンターゼを発現することによって、酵母において生成され得る。酵母では通常、ファルネシル二リン酸シンターゼＥＲＧ２０は、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）とジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰ）とを縮合して、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）をもたらし、次いで、２分子のＧＰＰを縮合して、フェラニルピロリン酸（ＦＰＰ）をもたらす。しかしながら、ＥＲＧ２０は、ＧＰＰの大部分をＦＰＰに変換するので、低レベルのＧＰＰしか残らない。カンナビノイドの商業規模での生産のためには、より多くのＧＰＰが必要とされる。したがって、ＦＰＰを生成する能力が低下しているかまたは生成する能力がない変異ＥＲＧ２０を用いることにより、ＧＰＰの生成を増加させ得る。ＧＰＰの生成を増加させる２セットの変異が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて同定された。第１の変異は、Ｋ１９７Ｅの置換であり、第２の変異は、Ｆ９６ＷおよびＮ１２７Ｗの二重置換である。当業者が容易に認識するように、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＥＲＧ２０とＹ．ｌｙｐｏｌｙｔｉｃａ由来のＥＲＧ２０との間に相同性が高いことに起因して、等価な変異が、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ由来のＥＲＧ２０に導入され得る。Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおいて、第１の変異は、Ｋ１８９Ｅの置換であり、第２の変異は、Ｆ８８ＷおよびＮ１１９Ｗの二重置換である。Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＥＲＧ２０（Ｋ１８９Ｅ）への導入によって、ＧＰＰの生成が増加するが、成長は、野生型酵母と比べてわずかに遅い。Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＥＲＧ２０（Ｆ８８ＷおよびＮ１１９Ｗ）への導入によって、高レベルのＧＰＰを有し、迅速に成長するクローンがもたらされる。Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａおよびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの遺伝子の配列が本明細書中に示されるが、しかしながら、当業者は、相同遺伝子も適している場合があることを理解するはずである。ＥＲＧ２０ホモログの例は、表２に示されている。したがって、ある特定の実施形態において、１つまたはそれを超えるＧＰＰ生成遺伝子は、変異ファルネシル二リン酸シンターゼ；Ｋ１９７Ｅ置換を含む変異Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＥＲＧ２０；Ｆ９６ＷおよびＮ１２７Ｗ置換を含む二重変異Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＥＲＧ２０；Ｋ１８９Ｅ置換を含む変異Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＥＲＧ２０；またはＦ８８ＷおよびＮ１１９Ｗ置換を含む二重変異Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＥＲＧ２０；またはそれらの組み合わせを含む。本明細書中に記載される配列番号に対して、実線の下線によって変異が示されている。ある特定の実施形態において、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＥＲＧ２０（Ｋ１９７Ｅ）は、配列番号１に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＥＲＧ２０（Ｋ１９７Ｅ）は、配列番号１に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００��の配列同一性を有するポリペプチドを含む。ある特定の実施形態において、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＥＲＧ２０（Ｆ９６ＷおよびＮ１２７Ｗ）は、配列番号２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＥＲＧ２０（Ｆ９６ＷおよびＮ１２７Ｗ）は、配列番号２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。等価なＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａのアミノ酸配列を配列番号３および４に示す。ある特定の実施形態において、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＥＲＧ２０（Ｋ１８９Ｅ）は、配列番号３に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＥＲＧ２０（Ｋ１８９Ｅ）は、配列番号３に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。ある特定の実施形態において、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＥＲＧ２０（Ｆ８８ＷおよびＮ１１９Ｗ）は、配列番号４に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＥＲＧ２０（Ｆ８８ＷおよびＮ１１９Ｗ）は、配列番号４に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。
【００８０】
ＧＰＰタンパク質（例えば、ＥＲＧ２０）のバリアントは、例えば、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）とジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰ）とを縮合してゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）にする能力を保持しているが、ＧＰＰをＦＰＰにする活性は低下している。例えば、ＧＰＰタンパク質（例えば、ＥＲＧ２０）のバリアントは、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）とジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰ）とを縮合してゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）にする能力を、元の配列と比べて少なくとも約少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または少なくとも約１００％の有効性で保持しているが、ＧＰＰをＦＰＰに縮合する能力は、それが由来する配列と比べて少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％（ヌル変異）低下している。
【化１】
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【表２】
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【００８１】
高レベルのＧＰＰ生成は、十分なメバロネート生成に依存している。ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧＲ）は、ＨＭＧ−ＣｏＡおよびＮＡＤＰＨからのメバロネートの生成を触媒する。ＨＭＧＲは、酵母のＧＰＰ経路における律速段階である。したがって、ＨＭＧＲの過剰発現は、その経路を介した流入を増加させ得、ＧＰＰの生成を増加させ得る。ＨＭＧＲは、ＧＰＰ経路遺伝子である。他のＧＰＰ経路遺伝子としては、ＧＰＰ経路に関わっている遺伝子が挙げられ、それらの遺伝子の生成物は、ＧＰＰを直接生成するか、またはＧＰＰ経路の中間体、例えば、ＥＲＧ１０、ＥＲＧ１３、ＥＲＧ１２、ＥＲＧ８、ＥＲＧ１９、ＩＤＩ１またはＥＲＧ２０を生成する。Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ由来のＨＭＧＲ１配列は、９９９アミノ酸（ａａ）（配列番号５）からなり、その最初の５００ａａは、複数の膜貫通ドメインおよびシグナル調節のための応答エレメントを有している。残りの４９９Ｃ末端残基は、触媒ドメインおよびＮＡＤＰＨ結合領域を含む。切断型ＨＭＧＲ１（ｔＨｍｇＲ）は、Ｎ末端の５００ａａを欠失させることによって生成された（Ｇａｏら、２０１７）。ｔＨＭＧＲは、そのＮ末端のドメインによって媒介される自己分解を回避することができるので、細胞質において安定化しており、ＧＰＰ経路を介した流入を増加させる。そのＮ末端の５００ａａは、配列番号５において破線の下線で示されている。そのＮ末端の５００ａａは、配列番号６では欠失している。ある特定の実施形態において、１つまたはそれを超えるＧＰＰ経路遺伝子は、ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧＲ）；切断型ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ（ｔＨＭＧＲ）；またはそれらの組み合わせを含む。Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ遺伝子の配列が、本明細書中に示されるが、しかしながら、当業者は、相同遺伝子も適している場合があることを理解するはずである。ＨＭＧＲホモログの例は、表３に示されている。ある特定の実施形態において、ＨＭＧＲは、配列番号５に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、ＨＭＧＲは、配列番号５に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。ある特定の実施形態において、ｔＨｍｇＲは、配列番号６に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、ｔＨｍｇＲは、配列番号６に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。
【００８２】
ＧＰＰ生成およびＧＰＰ経路遺伝子は、例えば、構成的ＴＥＦイントロンプロモーターまたは天然のプロモーター（Ｗｏｎｇら、２０１７）および合成された短ターミネーター（Ｃｕｒｒａｎら、２０１５）を用いて、発現され得る。ＧＰＰ生成の増加は、リナロールシンターゼをコードする単一の異種遺伝子を過剰発現させ、次いで、例えば、比色（ｃｏｌｏｒｉｍｅｎｔｒｉｃ）アッセイ（Ｇｈｏｒａｉ  ２０１２）を用いて、リナロールの生成を決定することによって決定することができる。ＧＰＰ生成の増加は、少なくとも０．５ｍｇ／Ｌ、０．７ｍｇ／Ｌ、０．９ｍｇ／Ｌ、または好ましくは、少なくとも約１ｍｇ／Ｌというリナロール濃度によって示され得る。
【化２】
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【化３】
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【表３−１】
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【表３−２】
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オリベトール酸生成遺伝子
【００８３】
オリベトール酸（ＯＡ）の生成には、基質ヘキサノイルＣｏＡおよび３分子のマロニルＣｏＡが必要であり、マロニルＣｏＡ分子は、酵母では、アセチルＣｏＡからＡＣＣ１によって天然に生成される。オリベトール酸の生成には、マロニルＣｏＡとヘキサノイルＣｏＡとの縮合およびその後の環化のために２つの酵素が必要である。このプロセスには、テトラケチドシンターゼであるオリベトール酸シンターゼ（ｏｌｉｖｅｔｏｌｉｃ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）（ＯＳ）、およびポリケチドシクラーゼであるオリベトール酸シクラーゼ（ＯＡＣ）が必要である。ある特定の実施形態において、２つまたはそれを超えるオリベトール酸生成遺伝子は、オリベトールシンターゼ（ＯＬＳ）およびオリベトール酸シクラーゼ（ＯＡＣ）を含む。Ｃａｎｎａｂｉｓ  ｓａｔｉｖａの遺伝子配列が本明細書中に示されるが、しかしながら、当業者は、相同遺伝子も適している場合があることを理解するはずである。ある特定の実施形態において、ＯＬＳは、配列番号７に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、ＯＬＳは、配列番号７に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。ある特定の実施形態において、ＯＡＣは、配列番号８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、ＯＡＣは、配列番号８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。
【００８４】
ＯＡタンパク質（例えば、ＯＡＣ）のバリアントは、例えば、基質として直鎖状ペンチルテトラ−β−ケチドＣｏＡのＣ２−Ｃ７アルドール環化を触媒してＯＡを生成する能力を保持している。例えば、ＯＡタンパク質（例えば、ＯＡＣ）のバリアントは、基質として直鎖状ペンチルテトラ−β−ケチドＣｏＡのＣ２−Ｃ７アルドール環化を触媒してＯＡを生成する能力を、元の配列と比べて、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または少なくとも約１００％の有効性で保持していなければならない。好ましい実施形態において、ＯＡタンパク質（例えば、ＯＡＣ）のバリアントは、その一般的なカンナビノイドタンパク質の改善されたバリアントが、基質として直鎖状ペンチルテトラ−β−ケチドＣｏＡのＣ２−Ｃ７アルドール環化を触媒してＯＡを生成する際に、改善されたバリアントが由来する配列と比べて、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％またはおよび１５０％超、改善された活性を有するという点において、そのバリアントが由来する配列よりも改善された活性を有する。
【００８５】
ＯＡ生成遺伝子であるＯＬＳおよびＯＡＣは、例えば、構成的ＴＥＦイントロンプロモーターまたは天然のプロモーター（Ｗｏｎｇら、２０１７）および合成された短ターミネーター（Ｃｕｒｒａｎら、２０１５）を用いて、発現され得る。ＯＡ生成の増加は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）または液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ／ＭＳ）を用いて決定され得る。酵母は、ＯＡを内因的に生成しないので、ＯＡの存在は、ＯＬＳおよびＯＡＳが機能していることを示す。
【化４】
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カンナビノイド前駆体またはカンナビノイド生成遺伝子
【００８６】
カンナビノイドであるテトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）、カンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）およびカンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ）の生成は、芳香族プレニルトランスフェラーゼによるＧＰＰを用いたＯＡのプレニル化でＣＢＧＡになり、および次いで、ＣＢＤＡＳ、ＴＨＣＡＳまたはＣＢＣＡＳによるそれぞれＣＢＤＡ、ＴＨＣＡまたはＣＢＣＡになることを含む。
【００８７】
酵母は、天然にはＣＢＧＡを生成しないので、ＣＢＧＡは、ＣＢＧＡシンターゼ、例えば、Ｃ．ｓａｔｉｖａ由来の膜結合型ＣＢＧＡシンターゼ（ＣＢＧＡＳ）の異種発現によって形成され得る。ＣＢＧＡＳは、ゲラニルピロリン酸オリベトール酸ゲラニルトランスフェラーゼとしても知られており、それらには、ＣｓＰＴ１、ＣｓＰＴ３およびＣｓＰＴ４といったいくつかの形態がある。ある特定の実施形態において、１つまたはそれを超えるカンナビノイド前駆体またはカンナビノイド生成遺伝子は、可溶性芳香族プレニルトランスフェラーゼ；カンナビゲロール酸シンターゼ（ＣＢＧＡＳ）；またはそれらの組み合わせを、単独で、またはカンナビノイド生成遺伝子：テトラヒドロカンナビノール酸シンターゼ（ＴＨＣＡＳ）；カンナビジオール酸シンターゼ（ＣＢＤＡＳ）；カンナビクロメン酸シンターゼ（ＣＢＣＡＳ）；またはそれらの任意の組み合わせと組み合わせて、含む。Ｃａｎｎａｂｉｓ  ｓａｔｉｖａの遺伝子であるＣＢＧＡＳ、ＴＨＣＡＳ、ＣＢＤＡＳおよびＣＢＣＡＳの配列が本明細書中に示されるが、しかしながら、当業者は、相同遺伝子も適している場合があることを理解するはずである。
【００８８】
ある特定の実施形態において、ＣＢＧＡシンターゼは、配列番号９に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、ＣＢＧＡシンターゼは、配列番号１０に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、ＣＢＧＡシンターゼは、配列番号１１に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、ＣＢＧＡシンターゼは、配列番号９、１０または１１に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。ＣＢＧＡは、可溶性芳香族プレニルトランスフェラーゼの異種発現によっても形成され得る。ある特定の実施形態において、可溶性芳香族プレニルトランスフェラーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ＣＬ１９０株由来のＮｐｈＢ（すなわち、野生型ＮｐｈＢ）である（Ｂｏｎｉｔｚら、２０１１；Ｋｕｚｕｙａｍａら、２００５；Ｚｉｒｐｅｌら、２０１７）。ある特定の実施形態において、可溶性芳香族プレニルトランスフェラーゼは、Ｑ１６１Ａ置換の変異を含むＮｐｈＢである。ＮｐｈＢ（Ｑ１６１Ａ）は、野生型ＮｐｈＢよりも多いＣＢＧＡを生成する（Ｍｕｎｔｅｎｄａｍ  ２０１５）。野生型ＮｐｈＢは、１５％のＣＢＧＡおよび８５％の別の副産物を生成する。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ＣＬ１９０株の遺伝子ＮｐｈＢの配列が本明細書中に示されるが、しかしながら、当業者は、相同遺伝子も適している場合があることを理解するはずである。ある特定の実施形態において、ＮｐｈＢは、配列番号１２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、ＮｐｈＢは、配列番号１２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。
【００８９】
カンナビノイド前駆体またはカンナビノイド生成タンパク質のバリアント（例えば、ＮｐｈＢ（Ｑ１６１Ａ））は、ゲラニル基を芳香族基質に結合させる（例えば、ＯＡおよびＧＰＰをＣＢＧＡに変換する）能力を保持している。例えば、カンナビノイド前駆体またはカンナビノイド生成タンパク質のバリアント（例えば、ＮｐｈＢ（Ｑ１６１Ａ））は、ゲラニル基を芳香族基質に結合させる（例えば、ＯＡおよびＧＰＰをＣＢＧＡに変換する）能力を、元の配列と比べて、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または少なくとも約１００％の有効性で保持していなければならない。好ましい実施形態において、カンナビノイド前駆体またはカンナビノイド生成タンパク質のバリアント（例えば、ＮｐｈＢ（Ｑ１６１Ａ））は、その一般的なカンナビノイドタンパク質の改善されたバリアントが、ゲラニル基を芳香族基質に結合させる（例えば、ＯＡおよびＧＰＰをＣＢＧＡに変換する）際に、改善されたバリアントが由来する配列と比べて、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％またはおよび１５０％超、改善された活性を有するという点において、そのバリアントが由来する配列よりも改善された活性を有する。
【００９０】
カンナビノイド前駆体またはカンナビノイド生成遺伝子であるＣＢＧＡＳ、可溶性芳香族プレニルトランスフェラーゼ、ＣＢＧＡＳ、ＴＨＣＡＳ、ＣＢＤＡＳおよびＣＢＣＡＳは、例えば、構成的ＴＥＦイントロンプロモーターまたは天然のプロモーター（Ｗｏｎｇら、２０１７）および合成された短ターミネーター（Ｃｕｒｒａｎら、２０１５）を用いて発現され得る。１つまたはそれを超えるカンナビノイド前駆体またはカンナビノイドの生成は、種々の方法を用いて決定され得る。例えば、それらの前駆体のすべてが、酵母細胞において利用可能である場合、ＴＨＣＡなどのそれらの生成物の存在が、ＨＰＬＣまたはガスクロマトグラフィー（ＧＣ）を用いて決定され得る。あるいは、カンナビノイド合成経路の一部だけしか存在しない場合は、カンナビノイドは存在しないことから、遺伝子および前駆体を添加することによって、１つまたはそれを超える遺伝子の活性を確かめることができる。例えば、ＣＢＧＡＳ活性を確かめるために、ＯＡおよびＧＰＰが、粗細胞溶解産物に添加される。ＣＢＣＡＳ、ＴＨＣＡＳまたはＣＢＤＡＳ活性を確かめる場合は、ＣＢＧＡが、粗細胞溶解産物に添加される。粗溶解産物または精製タンパク質を使用してもよい。さらに、疎水性基質（例えば、ＣＢＧＡ）を可溶化し、インサイチュでの生成物の取り出しを可能にするために、水相／有機相の二液相の仕組みを使用する必要があり得る。
【化５】
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【化６】
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【００９１】
ＣＢＧＡの生成は、酵母におけるＣ．ｓａｔｉｖａ由来の多くのカンナビノイドの生成の最初の工程である。いったんＣＢＧＡが生成されると、ＣＢＧＡを他の多くのカンナビノイド（ＣＢＤＡ、ＴＨＣＡ、ＣＢＣＡなど）に変化させるために、単一のさらなる酵素的工程が必要になる。酸性の形態のカンナビノイドは、医薬品として使用できることもあるし、酸性のカンナビノイドは、使用するために中性の形態に変化されることもあり、例えば、カンナビジオール（ＣＢＤ）は、脱炭酸を介してＣＢＤＡから生成される。得られたカンナビノイド生成物は、広範囲の健康問題を扱うするために製薬業界／栄養補助食品業界において使用される。テトラヒドロカンナビノール酸シンターゼ（ＴＨＣＡＳ）、カンナビジオール酸シンターゼ（ＣＢＤＡＳ）およびカンナビクロメン酸シンターゼ（ＣＢＣＡＳ）の遺伝子は、Ｃ．ｓａｔｉｖａに由来し得るが、しかしながら、当業者は、相同遺伝子も適している場合があることを理解するはずである。ある特定の実施形態において、ＴＨＣＡＳは、配列番号１３に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、ＴＨＣＡＳは、配列番号１３に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。ある特定の実施形態において、ＣＢＤＡＳは、配列番号１４に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、ＣＢＤＡＳは、配列番号１４に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。ある特定の実施形態において、ＣＢＣＡＳは、配列番号１５に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、ＣＢＣＡＳは、配列番号１５に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。したがって、ある特定の実施形態において、１つまたはそれを超えるカンナビノイド前駆体またはカンナビノイド生成遺伝子は、可溶性芳香族プレニルトランスフェラーゼ、カンナビゲロール酸シンターゼ（ＣＢＧＡＳ）、テトラヒドロカンナビノール酸シンターゼ（ＴＨＣＡＳ）、カンナビジオール酸シンターゼ（ＣＢＤＡＳ）およびカンナビクロメン酸シンターゼ（ＣＢＣＡＳ）を含む。
【化７】
2020530308.tif 000013
ヘキサノイルＣｏＡ生成遺伝子
【００９２】
Ｃ．ｓａｔｉｖａにおけるカンナビノイド生成の経路の最初の工程は、ヘキサノイルＣｏＡシンテターゼによるヘキサン酸（単純な脂肪酸）からヘキサノイルＣｏＡへの変換から始まる。酵母におけるカンナビノイド生成のために、ヘキサノイルＣｏＡは、ヘキサノイルＣｏＡシンターゼであるＨｅｘＡおよびＨｅｘＢまたはＳｔｃＪおよびＳｔｃＫまたは変異ＦＡＳ１および２の発現によって生成され得る。酵母は、天然にはヘキサノイルＣｏＡを生成しない。ＨｅｘＡおよびＨｅｘＢ遺伝子は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ  ＳＵ−１由来のヘキサン酸シンターゼ（ＨｅｘＳ）のアルファ（ｈｅｘＡ）およびベータ（ｈｅｘＢ）サブユニットをコードする（Ｈｉｔｃｈｍａｎら、２００１）。ＳｔｃＪおよびＳｔｃＫ遺伝子は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来であり、酵母様ＦＡＳタンパク質をコードする（Ｂｒｏｗｎら、１９９６）。当業者が理解するように、多くの真菌は、ヘキサン酸シンターゼ遺伝子または脂肪酸シンターゼ遺伝子を有し、これらは、ＤＮＡの配列決定および本明細書中に開示される公知の遺伝子との配列アラインメントによって容易に同定され得る。同様に、当業者は、種々の生物における相同遺伝子も適している場合があることを理解するはずである。ＨｅｘＡおよびＨｅｘＢホモログの例は、表４および５に示されている。ＦＡＳ１およびＦＡＳ２ホモログの例は、表６および７に示されている。内在性酵母遺伝子であるＦＡＳ１（脂肪酸シンターゼサブユニットベータ）およびＦＡＳ２（脂肪酸シンターゼサブユニットアルファ）は、脂肪酸シンターゼＦＡＳを形成し、これは、アセチルＣｏＡ、マロニルＣｏＡおよびＮＡＤＰＨからの長鎖脂肪酸の形成を触媒する。変異ＦＡＳは、ヘキサン酸などの短鎖脂肪酸を生成する。いくつかの異なる変異の組み合わせによって、ヘキサン酸の生成が可能になる。それらの変異としては、ＦＡＳ１  Ｉ３０６ＡおよびＦＡＳ２  Ｇ１２５０Ｓ；ＦＡＳ１  Ｉ３０６ＡおよびＦＡＳ２  Ｇ１２５０ＳおよびＭ１２５１Ｗ；およびＦＡＳ１  Ｉ３０６Ａ、Ｒ１８３４ＫおよびＦＡＳ２  Ｇ１２５０Ｓが挙げられる（Ｇａｊｅｗｓｋｉら、２０１７）。変異ＦＡＳ２および変異ＦＡＳ１は、任意の好適なプロモーターの制御下において発現され得、そのプロモーターとしては、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａのアルコールデヒドロゲナーゼＩＩプロモーターが挙げられるがこれに限定されない。あるいは、ゲノムのＦＡＳ２およびＦＡＳ１が、例えば、相同組換えまたはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ゲノム編集技術を用いて、直接変異され得る。
【００９３】
したがって、ある特定の実施形態において、ＨｅｘＡは、配列番号１６に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、ＨｅｘＡは、配列番号１６に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。ある特定の実施形態において、ＨｅｘＢは、配列番号１７に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、ＨｅｘＢは、配列番号１７に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。ある特定の実施形態において、ＳｔｃＪは、配列番号１８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、ＳｔｃＪは、配列番号１８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。ある特定の実施形態において、ＳｔｃＫは、配列番号１９に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、ＳｔｃＫは、配列番号１９に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。ある特定の実施形態において、ＦＡＳ２は、配列番号２０に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび上で定義された変異の組み合わせのうちの１つを含む。ある特定の実施形態において、ＦＡＳ２は、配列番号２０に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドおよび上で定義された変異の組み合わせのうちの１つを含む。ある特定の実施形態において、ＦＡＳ１は、配列番号２１に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび上で定義された変異の組み合わせのうちの１つを含む。ある特定の実施形態において、ＦＡＳ１は、配列番号２１に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドおよび上で定義された変異の組み合わせのうちの１つを含む。
【００９４】
ヘキサノイルＣｏＡ生成タンパク質のバリアントは、アセチルＣｏＡ、マロニルＣｏＡおよびＮＡＤＰＨからの長鎖脂肪酸の形成を触媒する能力を保持している。例えば、ヘキサノイルＣｏＡ生成タンパク質のバリアントは、アセチルＣｏＡ、マロニルＣｏＡおよびＮＡＤＰＨからの長鎖脂肪酸の形成を触媒する能力を、元の配列と比べて、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または少なくとも約１００％の有効性で保持していなければならない。好ましい実施形態において、ヘキサノイルＣｏＡ生成タンパク質のバリアントは、その一般的なカンナビノイドタンパク質の改善されたバリアントが、アセチルＣｏＡ、マロニルＣｏＡおよびＮＡＤＰＨからの長鎖脂肪酸の形成を触媒する際に、改善されたバリアントが由来する配列と比べて、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％またはおよび１５０％超、改善された活性を有するという点において、そのバリアントが由来する配列よりも改善された活性を有する。
【００９５】
ヘキサノイルＣｏＡシンターゼであるＨｅｘＡおよびＨｅｘＢ、ＳｔｃＪおよびＳｔｃＫまたは変異ＦＡＳ１および２は、例えば、構成的ＴＥＦイントロンプロモーターまたは天然のプロモーター（Ｗｏｎｇら、２０１７）および合成された短ターミネーター（Ｃｕｒｒａｎら、２０１５）を用いて発現され得る。酵母におけるヘキサノイルＣｏＡの生成は、酵母細胞から抽出されたヘキサノイルＣｏＡの濃度を、ＬＣ−ＭＳを用いて直接測定することによって決定され得る。
【化８】
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【化９】
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【化１０】
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【化１１】
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【化１２】
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【表４】
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【表５−１】
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【表５−２】
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【表６】
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【表７−１】
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【表７−２】
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脂肪酸生成遺伝子および脂肪生成遺伝子
【００９６】
酵母における脂肪酸および脂肪の生成は、脂質生合成経路における律速遺伝子を発現させることによって増加し得る。Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａは、天然にアセチルＣｏＡを生成する。ＡＣＣ１の過剰発現は、マロニルＣｏＡの量を増加させ、これは、脂肪酸生成の第一段階である。ある特定の実施形態において、脂肪酸または脂肪の生成の増加をもたらす１つまたはそれを超える遺伝的改変は、デルタ−９ステアロイルＣｏＡデサチュラーゼ（ＳＣＤ）、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ１）およびジアシルグリセリドアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡ１）を含む。天然のＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ遺伝子の配列が本明細書中に示されるが、しかしながら、当業者は、相同遺伝子も適している場合があることを理解するはずである。ＤＧＡ１ホモログの例が、表８に示されている。ある特定の実施形態において、ＳＣＤは、配列番号２２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、ＳＣＤは、配列番号２２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。ある特定の実施形態において、ＡＣＣ１は、配列番号２３に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、ＡＣＣ１は、配列番号２３に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。ある特定の実施形態において、ＤＧＡ１は、配列番号２４に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、ＤＧＡ１は、配列番号２４に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。
【００９７】
ＳＣＤ、ＡＣＣ１およびＤＧＡ１は、天然のまたはより強力なプロモーターによって駆動される遺伝子の追加のコピーを付加することによって、酵母において過剰発現され得る。あるいは、天然のプロモーターは、当業者が認識するように、より強力なプロモーター（例えば、ＴＥＦｉｎ、ｈｐ４ｄ、ｈｐ８ｄなど）によって置換されてもよい。ＳＣＤ、ＡＣＣ１およびＤＧＡ１の過剰発現は、定量的ＰＣＲ、マイクロアレイまたは次世代シーケンシング技術（例えば、ＲＮＡ−ｓｅｑ）によって決定され得る。あるいは、上昇した酵素レベルの生成物が、脂肪酸生成の増加であり得る。脂肪酸生成は、化学滴定、温度滴定、分光測定法による金属−脂肪酸複合体の測定、酵素的方法、または脂肪酸結合タンパク質を用いて決定され得る。
【００９８】
脂肪酸および脂肪生成タンパク質（例えば、ＡＣＣ１）のバリアントは、アセチルＣｏＡおよび炭酸水素塩からマロニルＣｏＡを生成する能力を保持している。例えば、脂肪酸および脂肪生成タンパク質（例えば、ＡＣＣ１）のバリアントは、アセチルＣｏＡおよび炭酸水素塩からマロニルＣｏＡを生成する能力を、元の配列と比べて、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または少なくとも約１００％の有効性で保持していなければならない。好ましい実施形態において、脂肪酸および脂肪生成タンパク質（例えば、ＡＣＣ１）のバリアントは、その一般的なカンナビノイドタンパク質の改善されたバリアントが、改善されたバリアントが由来する配列と比べて、アセチルＣｏＡおよび炭酸水素塩からマロニルＣｏＡを生成する際に、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％またはおよび１５０％超、改善された活性を有するという点において、そのバリアントが由来する配列よりも改善された活性を有する。
【化１３】
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【化１４】
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【化１５】
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【表８】
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【００９９】
本開示の第２の態様において、少なくとも１つのカンナビノイドまたはカンナビノイド前駆体を生成する方法が提供され、その方法は、少なくとも１つのカンナビノイドまたはカンナビノイド前駆体を生成するのに十分な培養条件下および時間にわたって、本開示の酵母を炭水化物源と接触させる工程を含む。
【０１００】
詳細には、少なくとも１つのカンナビノイドまたはカンナビノイド前駆体を生成するための培養条件の例としては、バッチプロセスおよびフェドバッチプロセスまたは連続様式での反復フェドバッチプロセスが挙げられるが、これらに限定されない。少なくとも１つのカンナビノイドまたはカンナビノイド前駆体を生成するために使用され得る炭素源としては、糖および炭水化物（例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、デンプン、キシロースおよびセルロース）；油および脂肪（例えば、ダイズ油、ヒマワリ油、ヒマシ油、ヤシ油、鶏脂および牛脂）；脂肪酸（例えば、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸およびリノール酸）；アルコール（例えば、グリセロールおよびエタノール）；および有機酸（例えば、グルコン酸、酢酸、リンゴ酸およびピルビン酸）が挙げられ得るが、これらに限定されない。これらの物質は、単独で、または混合物として、使用され得る。本開示において使用され得る窒素源としては、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、コーンスティープリカー、脱脂大豆粕、および尿素または無機化合物（例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウム）が挙げられ得るが、これらに限定されない。これらの窒素源もまた、単独で、または混合物として、使用され得る。本開示において使用され得るリン源としては、リン酸二水素カリウムもしくはリン酸水素二カリウムまたは対応するナトリウム含有塩が挙げられ得るが、これらに限定されない。さらに、培養培地は、成長に必要であり得る金属塩（例えば、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄）を含み得る。最後に、上に記載された物質に加えて、アミノ酸およびビタミンなどの必須の成長因子が使用され得る。そのような種々の培養方法は、例えば、文献（Ｊａｍｅｓ  Ｍ．Ｌｅｅによる“Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”，Ｐｒｅｎｔｉｃｅ−Ｈａｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎｓ，ｐｐ  １３８−１７６）に開示されている。
【０１０１】
培養培地のｐＨを調整するために、塩基性化合物（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたはアンモニア）または酸性化合物（例えば、リン酸または硫酸）が、好適な様式で培養培地に加えられ得る。さらに、気泡の形成を抑制するために脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を使用してもよい。ある特定の実施形態において、培養培地は、好気状態で維持され、したがって、酸素または酸素含有ガス（例えば、空気）が、培養培地中に注入され得る。培養培地の温度は、通常、２０℃〜３５℃、好ましくは、２５℃〜３２℃であり得るが、条件に応じて変更されてもよい。最大量の所望のカンナビノイド前駆体またはカンナビノイドが生成されるまで、培養は継続され得、それは、一般に、５時間〜１６０時間以内に達成され得る。カンナビノイド前駆体またはカンナビノイドは、培養培地に放出され得るか、または酵母細胞内に含まれ得る。
【０１０２】
少なくとも１つのカンナビノイドまたはカンナビノイド前駆体を生成するための本開示の方法は、微生物または培地から少なくとも１つのカンナビノイドまたはカンナビノイド前駆体を回収する工程を含み得る。当該分野で公知の方法（例えば、遠心分離、濾過、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化、ＨＰＬＣなど）を、微生物または培養物から少なくとも１つのカンナビノイドまたはカンナビノイド前駆体を回収するための方法に使用してよいが、その方法は、それらに限定されない。回収工程は、精製プロセスを含み得る。詳細には、一晩培養した後、１Ｌの培養物を遠心分離によってペレットにし、再懸濁し、ＰＢＳで洗浄し、ペレットにする。それらの細胞を、化学的方法もしくは機械的方法またはそれらの方法の組み合わせによって溶解する。機械的方法としては、フレンチプレスもしくはガラスビーズミリングまたは他の標準的な方法が挙げられ得る。化学的方法としては、酵素的な細胞溶解、溶媒による細胞溶解または界面活性剤に基づく細胞溶解が挙げられ得る。カンナビノイドの液−液抽出は、カンナビノイドが高度に可溶性であり、その溶媒が水と混和性でない、適切な化学溶媒を用いて行われる。例としては、ヘキサン、酢酸エチルおよびシクロヘキサン、好ましくは、直鎖もしくは分枝鎖アルカン鎖（Ｃ５−Ｃ８）またはその混合物を含む溶媒が挙げられる。
【０１０３】
ある特定の実施形態において、少なくとも１つのカンナビノイドまたはカンナビノイド前駆体は、ＣＢＧＡ、ＴＨＣＡ、ＣＢＤＡまたはＣＢＣＡを含む。１つまたはそれを超えるカンナビノイド前駆体またはカンナビノイドの生成は、本明細書中に記載されるような種々の方法を用いて決定され得る。ＣＢＤＡを解析するためのプロトコル例は、以下のとおりである。
１．真空下でサンプルから溶媒を除去する
２．乾燥したサンプルを１００ｕＬの乾燥ヘキサンまたは乾燥酢酸エチルに再懸濁する
３．２０ｕＬのＮ−メチル−Ｎ−（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド（ＭＳＴＦＡ）を加える
４．短時間、混合する
５．溶液を１０〜１５分間、６０℃に加熱する
６．ＧＣ−ＭＳ法
ａ．装置Ａｇｉｌｅｎｔ  ６８９０−５９７５  ＧＣ−ＭＳ（モデル番号：Ａｇｉｌｅｎｔ  １９０９１Ｓ−４３３）
ｂ．カラムＨＰ−５ＭＳ  ５％フェニルメチルシロキサン
ｃ．オーブン：
ｉ．開始温度：１００℃（オン）最高温度：３００℃
ｉｉ．開始時間：３．００分  平衡化時間：０．５０分
ｉｉｉ．勾配：
＃速度、終温度、終時間
１−３０．００  ２８０  １．００
２−７０．００  ３００  ５．００
３−０．０（オフ）
ｉｖ．後温度（Ｐｏｓｔ  ｔｅｍｐ）：０℃
ｖ．後時間（Ｐｏｓｔ  ｔｉｍｅ）：０．００分
ｖｉ．ラン時間：１５．２９分
【０１０４】
本開示の第３の態様において、第２の態様の方法を用いて生成されたカンナビノイド前駆体、カンナビノイドまたはそれらの組み合わせが提供される。ある特定の実施形態において、少なくとも１つのカンナビノイドまたはカンナビノイド前駆体は、ＣＢＧＡ、ＴＨＣＡ、ＣＢＤＡまたはＣＢＣＡを含む。
【実施例】
【０１０５】
実施例１：ベクター構築および形質転換
Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａエピソームプラスミドは、セントロメア、開始点および細菌複製骨格を含む。これらの領域に対するフラグメントを、Ｔｗｉｓｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅが合成し、それをクローニングして、エピソーム親ベクターｐＢＭ−ｐａを作製した。Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ、Ｇｏｌｄｅｎ  ｇａｔｅアセンブリ、ライゲーション、または配列およびライゲーション非依存的クローニング（ＳＬＩＣ）によって、プラスミドを構築した。Ｗｉｚａｒｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ精製キットを製造者のプロトコル（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）に従って使用して、細菌（大腸菌）および酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）からのゲノムＤＮＡの単離を行った。合成遺伝子を、ＧｅｎｅＧｅｎｉｅまたはＧｅｎｓｃｒｉｐｔ（ＵＳＡ）を用いてコドン最適化し、ＴｗｉｓｔＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した遺伝子フラグメントからアセンブルした。操作されたＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ株はすべて、対応するプラスミドを形質転換することによって構築された。すべての遺伝子発現カセットが、ＴＥＦイントロンプロモーターおよび合成された短ターミネーターを用いて構築された。最大６つの発現カセットを、ＳＬＩＣを介してエピソーム発現ベクターにクローニングした。
【０１０６】
大腸菌のミニプレップを、Ｚｙｐｐｙ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて行った。大腸菌株の形質転換を、Ｍｉｘ  ＆  Ｇｏ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（Ｚｙｍｏ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＵＳＡ）を用いて行った。エピソーム発現プラスミドによるＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの形質転換を、Ｚｙｍｏｇｅｎ  Ｆｒｏｚｅｎ  ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて行い、選択的プレートに広げた。線状化カセットによるＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの形質転換を、ＬｉＯＡｃ法を用いて行った。簡潔には、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ株を、グリセロールストックから直接１０ｍｌのＹＰＤ培地に接種し、一晩成長させ、ＯＤ６００が９〜１５になった時点において、１，０００ｇでの３分間の遠心分離によって回収した。細胞を滅菌水で２回洗浄した。細胞を、各形質転換に対して別個の微量遠心管に分注し、遠沈し、１．０ｍｌの１００ｍＭ  ＬｉＯＡｃに再懸濁した。細胞を、３０℃で６０分間、振盪しながらインキュベートし、遠沈し、９０ｕｌの１００ｍＭ  ＬｉＯＡｃに再懸濁し、氷上に置いた。各形質転換混合物に線状化ＤＮＡ（１〜５ｍｇ）を１０ｕｌの総体積で加えた後、２５ｕｌの５０ｍｇ／ｍｌの煮沸サケ精子ＤＮＡを加えた。細胞を、３０℃で１５分間、振盪しながらインキュベートした後、７２０μｌのＰＥＧ緩衝液（５０％ＰＥＧ８０００、１００ｍＭ  ＬｉＯＡｃ，ｐＨ＝６．０）および４５μｌの２Ｍジチオトレイトールを加えた。細胞を３０℃で６０分間、振盪しながらインキュベートし、３９℃のウォーターバス内で１０分間、熱ショックを与え、遠沈し、１ｍｌの滅菌水に再懸濁した。細胞（２００μｌ）を適切な選択プレートに蒔いた。
実施例２：酵母培養条件
【０１０７】
大腸菌ＤＨ１０Ｂ株を、クローニングおよびプラスミド増殖に使用した。プラスミド増殖のために、ＤＨ１０Ｂを、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンが補充されたＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ  Ｂｒｏｔｈ中で一定の振盪を行いながら３７℃で成長させた。Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  Ｗ２９株を、すべての実験に対する基礎株として使用した。Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａを、一定の撹拌を行いながら３０℃で培養した。大規模スクリーニングにおいて使用されるＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの培養物（２ｍｌ）を、振盪恒温器内で２５０ｒｐｍの速度にて１〜３日間成長させ、より大きな培養液量を、５０ｍｌフラスコ内で振盪するか、またはバイオリアクターにおいて発酵した。
【０１０８】
コロニーのスクリーニングおよび細胞の増殖に向けて、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａを、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、２０ｇ／Ｌペプトンおよび２０ｇ／Ｌグルコースを含むＹＰＤ液体培地、または２０ｇ／Ｌの寒天を加えたＹＰＤ寒天プレートにおいて成長させた。培地には、適切に、選択のために、１５０〜３００ｍｇ／ＬのハイグロマイシンＢまたは２５０〜５００ｍｇ／Ｌのノーセオスリシン（ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）が補充されることが多かった。カンナビノイド生成株の場合、脂質蓄積を促進するために、０．１〜１ｇ／Ｌ酵母エキスを含む改変ＹＰＤ培地を使用し、代替窒素源として０．２ｇ／Ｌおよび５ｇ／Ｌの硫酸アンモニウムを補充することが多かった。
【０１０９】
実施例３：カンナビノイド単離
【０１１０】
振盪フラスコ実験またはバイオリアクターからのＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ培養物をペレットにし、アセトニトリル中でホモゲナイズした後、１５分間、氷上でインキュベートする。遠心分離（１３，１００ｇ、４℃、２０分）の後、上清を濾過し（０．４５μｍ，ナイロン）、ＨＰＬＣ−ＤＡＤによって解析する。生成物の定量は、２２５ｎｍにおけるＵＶ−クロマトグラムのピーク面積積分値に基づく。ＣＢＧＡおよびＴＨＣＡに対して検量線を作成する。すべての化合物の同一性を、各サンプルの質量およびタンデム質量スペクトルを、陽イオン化モードを用いるＢｒｕｋｅｒ  ｃｏｍｐａｃｔＴＭＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦによって解析された共溶出標準と比較することによって、確認することができる。
実施例４：遺伝子の組み合わせ
【０１１１】
実施形態１：Ｆ８８ＷおよびＮ１１９Ｗ置換を含むＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＥＲＧ２０；ｔＨＭＧＲ；ＯＬＳ：ＯＡＣ；ＣＢＧＡＳ；ＴＨＣＡＳ；ＨｅｘＡおよびＨｅｘＢ。
【０１１２】
実施形態２：Ｆ８８ＷおよびＮ１１９Ｗ置換を含むＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＥＲＧ２０；ＨＭＧＲ；ＯＬＳ：ＯＡＣ；ＮｐｈＢ  Ｑ１６１Ａ；ＴＨＣＡＳ；ＦＡＳ１  Ｉ３０６Ａ、Ｍ１２５１ＷおよびＦＡＳ２  Ｇ１２５０Ｓ。
【０１１３】
実施形態３：Ｋ１９７Ｅ置換を含むＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＥＲＧ２０；ＯＬＳ：ＯＡＣ；ＮｐｈＢ  Ｑ１６１Ａ；ＣＢＤＡＳ；ＳｔｃＪおよびＳｔｃＫ。
【０１１４】
実施形態４：Ｋ１８９Ｅ置換を含むＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＥＲＧ２０；ＨＭＧＲ；ＯＬＳ：ＯＡＣ；ＣＢＧＡＳ；ＣＢＣＡＳ；ＨｅｘＡおよびＨｅｘＢ。
【０１１５】
実施形態５：Ｋ１８９Ｅ置換を含むＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＥＲＧ２０；ｔＨＭＧＲ；ＯＬＳ：ＯＡＣ；ＣＢＧＡＳ；ＣＢＤＡＳ；ＳｔｃＪおよびＳｔｃＫ。
【０１１６】
本開示の遺伝的に改変された酵母は、カンナビノイド前駆体およびカンナビノイドの生成を可能にする。その酵母における少なくとも５％の乾燥重量の脂肪酸または脂肪の蓄積は、原形質膜から外れたカンナビノイド前駆体およびカンナビノイドに対して貯蔵場所を提供する。これにより、原形質膜におけるカンナビノイド前駆体およびカンナビノイドの蓄積が減少し、膜不安定化が低減し、細胞死の機会が低下する。Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａなどの油性酵母は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの酵母の場合の２〜３％と比べて、８０％の乾燥重量を超える脂肪酸または脂肪（例えば、脂質）の含有量を有するように操作され得る。したがって、カンナビノイド前駆体およびカンナビノイドの生成は、油性酵母、特に、高い脂肪酸または脂肪（例えば、脂質）含有量を有するように操作された油性酵母においてかなり多くなり得る。
【０１１７】
本明細書および以下の特許請求の範囲の全体にわたって、文脈が別段要求しない限り、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などの変化形は、明記された整数または整数群を含むことを意味しているが、他の任意の整数または整数群を排除しないことも意味していると理解される。
【０１１８】
本明細書における任意の従来技術への言及は、そのような従来技術が共通の一般知識の一部を形成しているというあらゆる形の提案の自認でもないし、そのように解釈されるべきでない。
【０１１９】
本開示は、その使用が、記載された特定の用途に限定されないことを当業者は十分に理解する。本開示は、本明細書中に記載または図示された特定のエレメントおよび／または特徴に関して、その好ましい実施形態に限定されない。本開示は、開示された単数または複数の実施形態に限定されないが、以下の特許請求の範囲によって示されるおよび定義されるような本開示の範囲から逸脱することなく、数多くの再編成、改変および置換が可能であることが十分に理解される。
参考文献
【化１６】
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【化１７】
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【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2020530308.tif 000037