(57)【要約】本開示は、ヒト表皮角化細胞を培養するための方法に関する。角化細胞が、異種由来物質非含有の化学的に規定された細胞培養培地中で、α４鎖またはα５鎖を含むラミニンでコーティングされたプレート上で培養される場合、それらは、インビトロで効率的に拡大する。角化細胞を培養するために有用な細胞培養キットがまた、熱傷または慢性的な創傷の処置のために、このような細胞を使用するための方法と同様に、本明細書で記載される。
2020518262.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
角化細胞を拡大するための方法であって、該方法は、
角化細胞を、α４鎖またはα５鎖を含むラミニンでコーティングされた基材上にプレートする工程、
を包含する方法。
【請求項２】
前記α４鎖またはα５鎖を含むラミニンは、ラミニン−４１１、ラミニン−４２１、ラミニン−５１１、またはラミニン−５２１のうちの少なくとも１つである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記角化細胞を、異種由来物質非含有の細胞培養培地中で培養する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
新しく単離された角化細胞を、前記基材上にプレートする工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記角化細胞を、約０．７×１０５／ｃｍ２〜約１．２×１０５／ｃｍ２の密度で前記基材上にプレートする工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記角化細胞を、約３０℃〜約４０℃の温度で前記基材上で培養する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記角化細胞を、約５％  ＣＯ２〜約１５％  ＣＯ２を含む雰囲気中で培養する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記角化細胞を周期的に解離し、継代する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記角化細胞の継代は、１  細胞〜約１．５×１０４  細胞／ｃｍ２の密度に達した際に起こる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記基材は、ラミニン−５１１およびラミニン−４２１の両方でコーティングされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ラミニン−５１１  対  ラミニン−４２１重量比は、１５：１〜１：１５である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
角化細胞を拡大するためのシステムであって、該システムは、
ラミニン−４１１、ラミニン−４２１、ラミニン−５１１、またはラミニン−５２１を含む基材；および
細胞培養培地、
を含むシステム。
【請求項１３】
前記細胞培養培地は、異種由来物質非含有である、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１４】
前記細胞培養培地は、いかなる動物血清をも含まない、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１５】
前記システムは、いかなるフィーダー細胞をも含まない、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１６】
前記基材は、ラミニン−５１１およびラミニン−４２１の両方を含む、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１７】
角化細胞をインビトロで拡大するための細胞培養キットであって、該キットは、
ラミニン−４１１、ラミニン−４２１、ラミニン−５１１、またはラミニン−５２１のコーティングを有する細胞培養基材；および
無血清細胞培養培地、
を含むキット。
【請求項１８】
患者の熱傷による創傷を処置するための方法であって、該方法は、
該患者のドナー部位から採取した角化細胞を、ラミニン−４１１、ラミニン−４２１、ラミニン−５１１、またはラミニン−５２１でコーティングされた基材上にプレートする工程；
該角化細胞を該基材上で拡大する工程；および
該熱傷による創傷を、該基材からの該角化細胞で覆う工程、
を包含する方法。
【請求項１９】
患者の慢性的な創傷を処置するための方法であって、該方法は、
該患者のドナー部位から採取した角化細胞を、ラミニン−４１１、ラミニン−４２１、ラミニン−５１１、またはラミニン−５２１でコーティングされた基材上にプレートする工程；
該角化細胞を該基材上で拡大する工程；および
該創傷を、該基材からの該角化細胞で覆う工程、
を包含する方法。
【請求項２０】
上皮のみが傷ついた、および／または上皮欠損が傷害の構成要素である場合を含む、ヒト身体における任意の傷害または状態を処置するための方法であって、該方法は、
該患者のドナー部位から採取した角化細胞を、ラミニン−４１１、ラミニン−４２１、ラミニン−５１１、またはラミニン−５２１でコーティングされた基材上にプレートする工程；
該角化細胞を、該基材上で拡大する工程；および
該上皮欠損を、該基材からの該角化細胞で覆う工程、
を包含する方法。
【請求項２１】
前記ヒト身体における傷害または状態は、眼、膀胱、口腔、または腸にある、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１７年５月５日に出願された米国仮特許出願番号第６２／５０１，９９２号に基づく優先権を主張しており、この仮特許出願は、参考として全体が本明細書によって援用される。
【背景技術】
【０００２】
背景
本開示は、ヒト表皮角化細胞を培養するための方法に関する。これらの角化細胞は、次いで、重度熱傷、軽度熱傷、および慢性的な創傷を処置するためのような治療において使用され得る。これらの培養細胞の他の潜在的な治療適用は、上皮のみが傷ついたか、または上皮下構成要素もまた損傷した場合を含む、ヒト身体において（例えば、眼、膀胱、口腔、腸などにおいて）任意の上皮の傷害または状態の処置に関するものであり得る。上記方法を実施するためのキットもまた開示される。非常に一般的に、角化細胞は、ラミニン−４１１、ラミニン−４２１、ラミニン−５１１、および／またはラミニン−５２１の基材上で培養され、フィーダー細胞の助けなしでインビトロでの角化細胞生存を支持するために、無血清培地に曝される。
【０００３】
熱傷による傷害は、未だに極めて重大な臨床上の問題である。なぜなら全体表面積（ＴＢＳＡ）の４０％を超えると、自己ドナー部位が創傷閉鎖のための一次カバーを提供するには不十分になるからである。この問題を克服するために開発された１つの技術は、自家培養上皮移植片（ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ａｕｔｏｇｒａｆｔｓ）（ＣＥＡ）の使用である。この方法は、３〜４週間の期間以内に完全な創傷被覆のために多量の培養上皮を得るために、小さな皮膚生検からの皮膚の表皮角化細胞の単離および連続的拡大を包含する。自己の培養ヒト上皮での大きな熱傷による創傷の恒久的な被覆の報告以来、この技術は、頻繁に救命措置である、重度熱傷を処置するために全世界で成功裡に使用されている。
【０００４】
重度熱傷処置のためにヒト表皮角化細胞を培養するためのこの現在の至適基準（ｇｏｌｄ  ｓｔａｎｄａｒｄ）プロトコルは、いくつかの動物由来生成物（例えば、ウシ血清およびフィーダー細胞としてのマウス３Ｔ３線維芽細胞）の使用を要する。このような製品は、今日の細胞療法環境において共通する臨床品質基準を満たさない。マウス細胞の存在は、ヒト細胞培養物を動物病原体および免疫原性薬剤へと曝露するというリスクをもつ。さらに、培養培地中で使用されるウシ胎仔血清（ＦＢＳ）は、規定されておらず、バッチ間で変動がある。
【０００５】
この問題を克服するために、無血清で異種由来物質非含有の細胞培養培地が、角化細胞培養のために開発された。しかし、これらのシステムは、未だ最適ではなく、重度熱傷欠損の臨床適用において何も使用されていない。無血清角化細胞増殖培地を使用して、照射した３Ｔ３フィーダー細胞を使用せずに角化細胞を培養することは、フィーダー細胞によって支持された角化細胞と比較して、角化細胞の増殖能力を保存できなかったことが示されている。
【０００６】
３Ｔ３フィーダー細胞および動物由来血清の助けなしに、インビトロで角化細胞生存および拡大を支持するための方法を開発することは望ましい。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
簡単な要旨
本開示は、ヒト表皮角化細胞を培養するための方法を提供する。次いで、これらの角化細胞は、それほど重度でない熱傷および慢性的な創傷を処置および管理するような治療において使用され得る。より詳細には、本開示はまた、完全に異種由来物質非含有のかつ完全にヒトの方法においてヒト表皮角化細胞を培養するための新規なシステムを記載する。純粋なラミニンマトリクス（例えば、ＬＮ−５１１および／またはＬＮ−４２１）および化学的に規定された無血清培地を使用することによって、この方法は、フィーダー細胞および異種由来構成要素（ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）の助けなしに、成人患者細胞において３０程度の集団倍加で、インビトロで角化細胞生存を支持する。さらなる局面において、本開示は、角化細胞を培養するためのキットを提供する。
【０００８】
ＦＡＣＳ分析および免疫蛍光染色から、このシステムにおいて増殖した細胞は、角化細胞基底マーカー（ｂａｓａｌ  ｍａｒｋｅｒ）ＫＲＴ５、ＫＲＴ１４、ＫＲＴ１５、ＩＴＧＡ６、およびＩＴＧＢ１を発現することが確認される。分化マーカーＫＲＴ１およびＫＲＴ１０は、正常に後の継代において発現される。種々の時点で行われるリアルタイム定量的ＰＣＲ分析（ｑＰＣＲ）は、増大する継代にわたって角化細胞の基底プロフィールおよび分化プロフィールを示す。
【０００９】
いくつかの局面において、本開示は、ラミニン−４１１（ＬＮ−４１１）、ラミニン−４２１（ＬＮ−４２１）、ラミニン−５１１（ＬＮ−５１１）、またはラミニン−５２１（ＬＮ−５２１）の基質上に角化細胞をプレートすること、およびその細胞を、細胞培養培地を使用して培養することを記載する。言い換えると、その基材において使用されるラミニンは、α４鎖またはα５鎖を含む。特定の実施形態において、その細胞培養培地は、異種由来物質非含有である。その細胞は、プレートする前にトリプシンＥＤＴＡを用いて継代され得る。
【００１０】
特定の局面において、上記細胞培養培地は、基礎培地である。いくつかの実施形態によれば、その基礎培地は、インスリンおよび化学的に規定された増殖補充物を含む。他の成分は、ヒト上皮増殖因子（ｈＥＧＦ）；ヒドロコルチゾン；ならびに抗生物質および／または抗真菌剤（例えば、ゲンタマイシンまたはアンホテリシンＢ）を含み得る。上記インスリンは、組換えヒトインスリンであり得る。さらなる実施形態において、上記基礎培地は、エピネフリンおよびトランスフェリンをさらに含む。
【００１１】
いくつかの実施形態において、新たに単離した角化細胞は、約１×１０５／ｃｍ２の密度で上記基材上にプレートされ得る。具体的局面において、角化細胞は、約５％  ＣＯ２〜約１５％  ＣＯ２を含む雰囲気中で培養される。上記角化細胞は、約３０℃〜約４０℃の温度で培養され得る。
【００１２】
他の実施形態において、上記角化細胞は、約３０℃〜約４０℃の温度でトリプシン処理され得る。特定の実施形態において、角化細胞は、約４分間〜約１２分間の期間にわたってトリプシン処理される。より具体的な実施形態において、角化細胞は、約６分間〜約１０分間の期間にわたってトリプシン処理される。さらなる特定の実施形態において、角化細胞は、約１×１０４  細胞／ｃｍ２の密度に達した際に継代される。
【００１３】
ラミニン−４１１、ラミニン−４２１、ラミニン−５１１、および／またはラミニン−５２１を含む基材ならびに細胞培養培地を含む、角化細胞を維持するためのシステムがまた、開示される。特定の局面において、上記細胞培養培地は、異種由来物質非含有(ｘｅｎｏ-ｆｒｅｅ)である。他の局面において、上記細胞培養培地は、動物血清を含まない。
【００１４】
本開示はまた、角化細胞をインビトロで培養するためのキットを記載する。上記キットは、ラミニン−４１１、ラミニン−４２１、ラミニン−５１１、および／またはラミニン−５２１のコーティングを有する細胞培養プレート；ならびに細胞培養培地を含み、ここで上記細胞培養培地は、無血清である。
【００１５】
患者の熱傷による創傷を処置するための方法がまた、本明細書で開示される。上記患者のドナー部位から採取した角化細胞は、ラミニン−４１１、ラミニン−４２１、ラミニン−５１１、および／またはラミニン−５２１でコーティングされた基材上にプレートされる。上記角化細胞は、上記基材上で拡大される。上記基材からの角化細胞は、次いで、上記熱傷による創傷を覆うために使用される。
【００１６】
患者の慢性的な創傷を処置するための方法がまた、本明細書で提供される。上記患者のドナー部位から採取した角化細胞は、ラミニン−４１１、ラミニン−４２１、ラミニン−５１１、および／またはラミニン−５２１でコーティングされた基材上にプレートされる。上記角化細胞は、上記基材上で拡大される。次いで、上記基材からの角化細胞は、上記創傷を覆うために使用される。
【００１７】
上皮のみが傷ついたおよび／または上皮欠損が傷害の構成要素である場合を含む、ヒト身体において任意の傷害または状態を処置するための方法がまた、本明細書で開示される。上記患者のドナー部位から採取した角化細胞は、ラミニン−４１１、ラミニン−４２１、ラミニン−５１１、および／またはラミニン−５２１でコーティングされた基材上にプレートされる。上記角化細胞は、上記基材上で拡大される。次いで、上記基材からの角化細胞は、上記上皮欠損を覆うために使用される。
【００１８】
熱傷による創傷、慢性的な創傷、および他の上皮欠損の処置のための角化細胞の使用がまた、本明細書で開示される。望ましくは、上記角化細胞は、ラミニン−４１１、ラミニン−４２１、ラミニン−５１１、および／またはラミニン−５２１でコーティングされた基材上にプレートされ、拡大される。
【００１９】
本開示のこれらおよび他の非限定的な特性は、以下でより詳細に開示される。
【００２０】
特許または特許出願ファイルは、少なくとも１枚のカラー仕上げの図面を含む。カラー図面付きのこの特許または特許出願公報の写しは、請求および必要な費用の支払いをすれば、当局によって提供される。
【００２１】
以下は、図面の簡単な説明であり、これは、本明細書で開示される例示的実施形態を例証する目的で示され、限定する目的で示されるのではない。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１−１】図１Ａ〜１Ｊは、種々のラミニンマトリクス上で培養され、ラミニンを含まない陰性コントロール基材および角化細胞を３Ｔ３線維芽細胞とともに共培養した陽性コントロール基材と比較した、新たに単離されたヒト表皮角化細胞の一連の画像である。新たに単離されたヒト表皮角化細胞を、ＫＧＭ−ＣＤ培地中で、ＬＮ−４１１、ＬＮ−４２１、ＬＮ−５１１、ＬＮ−５２１、ＬＮ−１１１、ＬＮ−３３２、およびコーティングなしの組織培養ディッシュ（陰性コントロール）上で培養した。７日目に画像を撮った。スケールバー＝１００マイクロメートル（μｍ）。図１Ａは、陰性コントロール（コーティングなし）である。図１Ｂは、陽性コントロール（３Ｔ３）である。図１Ｃは、ＬＮ−１１１のみを有する基材である。図１Ｄは、ＬＮ−３３２のみを有する基材である。図１Ｅは、ＬＮ−４１１のみを有する基材である。図１Ｆは、ＬＮ−４２１のみを有する基材である。図１Ｇは、ＬＮ−５１１のみを有する基材である。図１Ｈは、ＬＮ−５２１のみを有する基材である。図１Ｉは、ＬＮ−４２１およびＬＮ−５２１を１０：１比率（ｗ／ｗ／）で含む基材である。図１Ｊは、ＬＮ−４２１およびＬＮ−５２１を１：１０（ｗ／ｗ／）で含む基材である。
【図１−２】同上。
【００２３】
【図２−１】図２Ａ〜２Ｄは、従来のＲｈｅｉｎｗａｌｄ  ＆  Ｇｒｅｅｎの方法（Ｃｅｌｌ，  ６，  ３３１−３４３（１９７５）に記載されるように３Ｔ３マウス線維芽細胞とともに共培養した（３Ｔ３と表示））と比較して、ＬＮ−５１１およびＬＮ−４２１上で培養した角化細胞の増殖速度を示す一連のグラフである。種々の年齢の個体から得た角化細胞を培養した。コンフルエントになった際に、細胞を採取し、計数し、それらが老化に達するまで継代した。集団倍加を、ＰＤ＝３．３２×ｌｏｇ（採取した細胞数／播種した細胞数）として計算した。図２Ａ〜２Ｃに関しては、ｙ軸は、０から３０まで１０ずつ増大して延びており、ｘ軸は、０日間から７０日間まで１０ずつ増大して延びている。図２Ａは、３Ｔ３に関する。図２Ｂは、ＬＮ−５１１に関する。図２Ｃは、ＬＮ−４２１に関する。
【００２４】
図２Ｄは、ＬＮ−４１１（丸）、ＬＮ−４２１（菱形）、ＬＮ−５１１（三角形）、またはＬＮ−５２１（四角形）上で培養した角化細胞の累積集団倍加の数を示すグラフである。ｙ軸は、０から２０まで５ずつ増大して延びており、ｘ軸は、０日間から６０日間まで１０ずつ増大して延びている。ＬＮ−５１１およびＬＮ−４２１の線は、ＬＮ−４１１またはＬＮ−５２１より多くの集団倍加を有する。
【図２−２】同上。
【００２５】
【図３−１】図３Ａ〜３Ｄは、角化細胞前駆細胞の時間依存性ｑＰＣＲ発現プロフィールおよび分化マーカーを示す一連のグラフである。角化細胞を、ラミニンでコーティングされたシステムで培養したか、または３Ｔ３とともに共培養した。コンフルエントになった際に、細胞を採取し、ＲＮＡをｑＰＣＲ分析のために単離した。各グラフは、１０継代にわたってＧＡＰＤＨに対して正規化した上記マーカーのｍＲＮＡ相対的発現をプロットする。丸は、ＬＮ−５１１に関し、三角形は、ＬＮ−４２１に関し、四角形は、３Ｔ３に関する。値は、継代１（Ｐ１）、継代４（Ｐ４）、継代７（Ｐ７）、および継代１０（Ｐ１０）に関して示される。図３Ａは、ＫＲＴ５に関する。図３Ｂは、ＫＲＴ１４に関する。図３Ｃは、ＫＲＴ１に関する。図３Ｄは、ＫＲＴ１０に関する。
【図３−２】同上。
【００２６】
【図４−１】図４Ａ〜４Ｎは、角化細胞前駆細胞マーカー（ＫＲＴ５、ＫＲＴ１４、ＫＲＴ１５、ｐ６３）および分化マーカー（ＩＶＬ、ＫＲＴ１、ＫＲＴ１０）の一連の免疫蛍光画像である。角化細胞を、ＬＮ−５１１またはＬＮ−４２１のいずれかでコーティングされた基材上で培養した。初期の継代（Ｐ１）で、その細胞を固定し、特異的角化細胞マーカーで免疫染色し、ＤＡＰＩで対比染色した。初期の継代（Ｐ１）での角化細胞は、通常の基底細胞マーカー（ＫＲＴ５およびＫＲＴ１４）および低い分化マーカー（ＫＲＴ１およびＫＲＴ１０）を発現した。
【００２７】
図４Ａは、ＬＮ−５１１で、ＫＲＴ５に関する。図４Ｂは、ＬＮ−５１１で、ＫＲＴ１４に関する。図４Ｃは、ＬＮ−５１１で、ＫＲＴ１５に関する。図４Ｄは、ＬＮ−５１１で、ｐ６３に関する。図４Ｅは、ＬＮ−５１１で、ＩＶＬに関する。図４Ｆは、ＬＮ−５１１で、ＫＲＴ１０に関する。図４Ｇは、ＬＮ−５１１で、ＫＲＴ１に関する。図４Ｈは、ＬＮ−４２１で、ＫＲＴ５に関する。図４Ｉは、ＬＮ−４２１で、ＫＲＴ１４に関する。図４Ｊは、ＬＮ−４２１で、ＫＲＴ１５に関する。図４Ｋは、ＬＮ−４２１で、ｐ６３に関する。図４Ｌは、ＬＮ−４２１で、ＩＶＬに関する。図４Ｍは、ＬＮ−４２１で、ＫＲＴ１０に関する。図４Ｎは、ＬＮ−４２１で、ＫＲＴ１に関する。
新たに単離されたヒト表皮角化細胞（継代０）を、ＬＮ−５１１、ＬＮ−４２１の上でプレートするか、または３Ｔ３線維芽細胞フィーダー細胞とともに共培養する（Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ  ＆  Ｇｒｅｅｎの方法）かのいずれかを行った。コンフルエントに達した後に、細胞を集め、基底／前駆細胞マーカー（ＫＲＴ５、ＫＲＴ１４、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＢ１、およびＫＲＴ１５）および分化マーカー（ＫＲＴ１、ＫＲＴ１０）に関してＦＡＣＳ分析に供した。
【図４−２】同上。
【００２８】
【図５】図５は、結果を示す棒グラフである。ｙ軸は、陽性細胞の％（すなわち、そのマーカーを発現する）を示し、０から１２０％まで２０％ずつ増大して延びている。そのマーカーは、ｘ軸上に示され、左から右に、ＫＲＴ５、ＫＲＴ１４、ＫＲＴ１５、ＩＴＧＺ６、ＩＴＧＢ１、ＫＲＴ１、およびＫＲＴ１０が並んでいる。各マーカーに関して、左側のバーは、３Ｔ３基材であり、中央のバーは、ＬＮ−５１１基材であり、右側のバーは、ＬＮ−４２１である。
【００２９】
【図６−１】図６Ａは、ラミニン遺伝子ならびに基底マーカー遺伝子および分化角化細胞マーカー遺伝子の発現レベルを伴うヒートマップである（生物学的複製にわたって平均し、１００万あたりの転写物（ＴＰＭ）のｌｏｇ１０として表した）。
【００３０】
図６Ｂは、３Ｔ３共培養、ＬＮ−４２１およびＬＮ−５１１上で増殖している角化細胞におけるインテグリンおよびケラチン遺伝子の発現レベルを示すヒートマップである（生物学的複製にわたって平均し、１００万あたりの転写物（ＴＰＭ）のｌｏｇ１０として表した）。全てのサンプルにわたって１より大きいＴＰＭの合計を有する遺伝子のみを示す。「完全」法を使用して、遺伝子を階層的にクラスター化した。
【００３１】
図６Ｃは、３Ｔ３細胞上で増殖している角化細胞に対して比較した場合、ＬＮ−４２１およびＬＮ−５１１上で増殖している角化細胞における機能的にアップレギュレーションしたプロセスおよびダウンレギュレーションしたプロセスを示すチャートである。機能的富化を、Ｇｅｎｅ  Ｓｅｔ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＧＳＥＡ）によって計算した。ＮＥＳ（正規化富化スコア）は、その富化の強度を表す。有意でないプロセスは、「ＮＳ」で示される。全ての他のプロセスは、有意に富化される（偽発見率（ｆａｌｓｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｒａｔｅ）（ＦＤＲ）＜０．０５）。
【図６−２】同上。
【００３２】
【図７】図７Ａ〜７Ｃは、ＬＮ−４２１、ＬＮ−５１１の上で予め増殖させるか、または３Ｔ３とともに共培養するかのいずれかであった角化細胞を播種した脱表皮化真皮（ｄｅ−ｅｐｉｄｅｒｍａｌｉｓｅｄ  ｄｅｒｍｉｓ）（ＤＥＤ）の染色の断面である。図７Ａは、３Ｔ３とともに予め共培養した角化細胞での断面である。図７Ｂは、ＬＮ−５１１上で予め増殖させた角化細胞での断面である。図７Ｃは、ＬＮ−４２１上で予め増殖させた角化細胞での断面である。
【００３３】
【図８】図８Ａ〜８Ｃは、３Ｔ３共培養システム上で増殖させたヒト角化細胞との比較での、ＬＮ−５１１またはＬＮ−４２１上で培養したヒト角化細胞のインビボ移植である。組織を、移植の８日後に採取した。凍結切片をＨ＆Ｅ染色で染色した。図８Ａは、３Ｔ３とともに予め共培養したヒト角化細胞から得られたインビボ移植片のＨ＆Ｅ染色である。図８Ｂは、ＬＮ−４２１上で予め培養したヒト角化細胞から得られたインビボ移植片のＨ＆Ｅ染色である。図８Ｃは、ＬＮ−５１１上で予め培養したヒト角化細胞から得られたインビボ移植片のＨ＆Ｅ染色である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
詳細な説明
本明細書で開示される組成物および方法のより完全な理解は、添付の図面を参照することによって得られ得る。これらの図面は、本開示を示す便宜および容易さに基づいて模式的に示されるに過ぎず、従って、例示的な実施形態の範囲を規定するまたは限定することは意図されない。
【００３５】
特定の用語が明確さのために以下の説明において使用されるが、これらの用語は、図面における例証に関して選択される実施形態の特定の構造に言及するに過ぎないことが意図され、本開示の範囲を規定するまたは限定することは意図されない。図面および以下に続く詳細な説明において、類似の番号指定は、類似の機能の構成要素に言及することは、理解されるべきである。
【００３６】
単数形「１つの、ある（ａ）」、「１つの、ある（ａｎ）」、および「上記、この、その（ｔｈｅ）」は、状況が明らかに別のことを規定しなければ、複数形への言及を含む。
【００３７】
本明細書および請求項において使用される場合、用語「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」実施形態および「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」実施形態を含み得る。用語「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」、「含む、包含する（ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ））」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「し得る、できる（ｃａｎ）」、「含む、含有する（ｃｏｎｔａｉｎ（ｓ））」およびこれらのバリエーションは、本明細書で使用される場合、挙げられた成分／工程の存在を要求しかつ他の成分／工程の存在を許容する、開放系の移行句、用語、または文言であることが意図される。しかし、このような記載は、その挙げられた成分／工程のみの存在を、これらから生じ得るいかなる不純物とともに許容し、他の成分／工程を排除する、その列挙された成分／工程「からなる」および「から本質的になる」として組成物またはプロセスを記載しているとも解釈されるべきである。
【００３８】
本出願の明細書および請求項における数値は、その値を決定するために、有効数字の同じ数に下げられる場合に同じである数値範囲、および述べられた値から、本出願に記載されるタイプの従来の測定技術の実験誤差未満が異なる数値範囲を含むことが理解されるべきである。
【００３９】
本明細書で開示される全ての範囲は、その記載されるエンドポイントの両端を含み、独立して組み合わせ可能である（例えば、「２〜１０（ｆｒｏｍ  ２  ｔｏ  １０）」という範囲は、そのエンドポイントの両端である２および１０、ならびに中間にある値の全てを含む）。
【００４０】
用語「約（ａｂｏｕｔ）」とは、その値の基本的な機能を変化させることなく変動し得る任意の数値範囲を含むために使用され得る。範囲とともに使用される場合、「約」はまた、その２つのエンドポイントの絶対値によって規定される範囲を開示する。例えば、約２〜約４はまた、「２〜４」の範囲を開示する。用語「約」は、その示された数字の±１０％をいい得る。
【００４１】
本明細書で考察される全ての刊行物、特許、および特許出願は、それらの全体において参考として援用される。
【００４２】
本開示に関連し得るいくつかの周知の参考文献としては、以下が挙げられる：  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）；  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  １８５，  ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｄ．  Ｇｏｅｄｄｅｌ，  １９９１．  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆ．）；  「Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  （Ｍ．  Ｐ．  Ｄｅｕｔｓｈｃｅｒ，  ｅｄ．，  （１９９０）  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．）；  ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  （Ｉｎｎｉｓ，  ｅｔ  ａｌ．  １９９０．  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆ．）；  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：  Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄ．  （Ｒ．  Ｉ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ．  １９８７．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．）；  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  ｐｐ．  １０９−１２８，  ｅｄ．  Ｅ．  Ｊ．  Ｍｕｒｒａｙ，  Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，  Ｃｌｉｆｔｏｎ，  Ｎ．Ｊ．）；  ｏｒ  ｔｈｅ  Ａｍｂｉｏｎ  １９９８  Ｃａｔａｌｏｇ  （Ａｍｂｉｏｎ，  Ａｕｓｔｉｎ，  Ｔｅｘ．）。
【００４３】
角化細胞は、ケラチンを生成する表皮細胞である。角化細胞は、表皮（皮膚の最も外層）における優勢な細胞であり、そこで見出される細胞のうちの９０％を構成する。皮膚の基底層（ｂａｓａｌ  ｌａｙｅｒ）（基底層（ｓｔｒａｔｕｍ  ｂａｓａｌｅ））において見出されるそれら角化細胞は、ときおり「基底細胞（ｂａｓａｌ  ｃｅｌｌ）」または「基底角化細胞（ｂａｓａｌ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）」といわれる。角化細胞の主要機能は、環境ダメージ（例えば、病原性細菌、真菌、寄生動物、およびウイルス、熱、ＵＶ照射および水分喪失による）に対するバリアの形成である。病原体が、表皮の上側の層に一旦侵入し始めたら、角化細胞は、炎症促進性メディエーター、特に、ケモカインを生成することによって反応し得る。
【００４４】
インビトロで培養される初代細胞（例えば、角化細胞）の細胞表現型の喪失の１つの主な理由は、通常の細胞−マトリクス相互作用の欠如である。インビボでは、大部分の組織化された細胞（例えば、ヒト表皮角化細胞）は、基底膜（ｂａｓｅｍｅｎｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）（ＢＭ）または基底板（ｂａｓａｌ  ｌａｍｉｎａ）として公知の空間マトリクスにかたく繋がれている。そのＢＭは、いくつかの特異的な構成要素（例えば、コラーゲンＩＶ、プロテオグリカン、およびラミニンタンパク質）を含む。そのラミニンは、特有のＢＭ構成要素であり、これは、多くのアイソフォームで存在する（≧１６）。あるアイソフォームは極めて遍在性である一方で、他のアイソフォームは、非常に細胞タイプ特異的である。そのラミニンアイソフォーム、ＬＮ−５１１およびＬＮ−５２１は、大部分の胚性および成体の基底膜の重要な構成要素であり、発生において重要な役割を有する。これら２つのアイソフォームは、その両方が皮膚の下にあるＢＭに位置し、角化細胞、幹細胞接着、増殖、移動を促進すること、およびおそらくは、皮膚の幹細胞集団において未分化の表現型の維持に寄与することが示されている。
【００４５】
ラミニンは、基底板に主に存在するヘテロトリマー糖タンパク質のファミリーである。それらは、一方の側で隣り合う細胞レセプターとの結合相互作用を介して、および他のラミニン分子もしくは他のマトリクスタンパク質（例えば、コラーゲン、ニドゲンまたはプロテオグリカン）への結合によって機能する。そのラミニン分子はまた、細胞の挙動および機能に強く影響を及ぼし得る重要なシグナル伝達分子である。ラミニンは、細胞／組織表現型を維持するにあたって、ならびに組織修復および発生において細胞増殖および分化を促進するにあたって、両方において重要である。
【００４６】
ラミニンは、大きな、マルチドメインのタンパク質であり、共通する構造組織化を伴う。そのラミニン分子は、種々のマトリクスおよび細胞相互作用機能を、１つの分子へと統合する。
【００４７】
ラミニンタンパク質分子は、１つのα鎖サブユニット、１つのβ鎖サブユニット、および１つのγ鎖サブユニットを含み、全て、コイルドコイルドメインを通じてトリマーの状態に一緒に結合している。その１２の公知のラミニンサブユニット鎖は、天然の組織において少なくとも１５のトリマーラミニンタイプを形成し得る。そのトリマーラミニン構造内に、他のラミニンおよび基底板分子に向かう結合活性を有する同定可能なドメイン、ならびに膜結合レセプターがある。例えば、ドメインＶＩ、ＩＶｂ、およびＩＶａは、球状構造を形成し、ドメインＶ、ＩＩＩｂ、およびＩｌＩａ（これらは、システインリッチＥＧＦ様エレメントを含む）は、ロッド様構造を形成する。その３つの鎖のドメインＩおよびＩＩは、三重鎖のコイルドコイル構造（ロングアーム）の形成に関与する。
【００４８】
５つの異なるα鎖、３つのβ鎖および３つのγ鎖が存在し、これらは、ヒト組織において、少なくとも１５の異なる組み合わせにおいて見出されている。これらの分子は、それらの歴史的発見に基づいて、ラミニン−１〜ラミニン−１５と称されるが、代替の命名法は、それらの鎖組成に基づいてそのアイソフォームを記載する（例えば、α１鎖、β１鎖およびγ１鎖を含むラミニン−１１１（以前はラミニン−１と称されていた））。ラミニンの４つの構造的に規定されたファミリーグループが同定されている。５つの同定されたラミニン分子の第１のグループは、全て、β１鎖およびγ１鎖を共有し、それらのα鎖組成（α１〜α５鎖）によって変わる。５つの同定されたラミニン分子（ラミニン−５２１を含む）の第２のグループは、全て、β２鎖およびγ１鎖を共有し、繰り返すが、それらのα鎖組成によって変動する。同定されたラミニン分子の第３のグループは、１つの同定されたメンバー、ラミニン−３３２を有し、α３β３γ２という鎖組成を有する。同定されたラミニン分子の第４のグループは、１つの同定されたメンバー、ラミニン−２１３を有し、新たに同定されたγ３鎖を有する（α２β１γ３）。
【００４９】
本開示の方法は、一般に、角化細胞を培養し、それらの拡大を促進することに関する。特に、上記方法は、純粋なラミニンマトリクス上で角化細胞を培養することを企図する。さらに、本明細書で開示される培養システムは、完全に異種由来物質非含有であることが企図される。
【００５０】
接着性細胞は、代表的には、生存および再生するために２つのことを要求する：（１）その細胞の構造的支持を提供する基材またはコーティング；および（２）その細胞への栄養を提供する細胞培養培地である。その基材またはコーティング（１）は、代表的には、容器（例えば、ペトリ皿）において、またはマルチウェルプレートのウェルにおいて、層として形成される。その接着性細胞がプレートされるその基材またはコーティングは、ラミニンを含むことが特に企図される。
【００５１】
一般に、本開示の細胞培養基材は、任意の有効なラミニンを含み得、ここでその有効性は、角化細胞がその基材上で生存し得るか否かによって決定される。その基材が、任意の１つの特定のラミニン（すなわち、１つの単一のラミニン）を含むことが具体的に企図されるが、他の成分が、その基材の中に存在してもよい。特定の実施形態において、そのラミニンは、ラミニン−５１１（ＬＮ−５１１）、ラミニン−５２１（ＬＮ−５２１）、ラミニン−４１１（ＬＮ−４１１）またはラミニン−４２１（ＬＮ−４２１）である。
【００５２】
他の特定の実施形態において、その基材は、２つの特定のラミニン、すなわち、ＬＮ−５１１、ＬＮ−５２１、ＬＮ−４１１、および／またはＬＮ−４２１のうちのいずれか２つの組み合わせを含み得る。特定の実施形態において、２つの特定のラミニンのその組み合わせは、ＬＮ−５１１およびＬＮ−４２１である。その基材におけるＬＮ−５１１  対  ＬＮ−４２１の重量比は、１：１５〜１５：１、または１：１０〜１０：１の範囲に及び得る。
【００５３】
本明細書で使用される場合、用語「ラミニン−５２１（Ｌａｍｉｎｉｎ−５２１）」とは、α５鎖、β２鎖およびγ１鎖を一緒に結合することによって形成されるタンパク質をいう。この用語は、組換えラミニン−５２１および天然に存在する供給源に由来するヘテロトリマーラミニン−５２１の両方を包含すると解釈されるべきである。
【００５４】
本明細書で使用される場合、用語「ラミニン−５１１（Ｌａｍｉｎｉｎ−５１１）」とは、α５鎖、β１鎖およびγ１鎖を一緒に結合することによって形成されるタンパク質をいう。この用語は、組換えラミニン−５１１および天然に存在する供給源に由来するヘテロトリマーラミニン−５１１の両方を包含すると解釈されるべきである。
【００５５】
本明細書で使用される場合、用語「ラミニン−４２１（Ｌａｍｉｎｉｎ−４２１）」とは、α４鎖、β２鎖およびγ１鎖を一緒に結合することによって形成されるタンパク質をいう。この用語は、組換えラミニン−４２１および天然に存在する供給源に由来するヘテロトリマーラミニン−４２１の両方を包含すると解釈されるべきである。
【００５６】
本明細書で使用される場合、用語「ラミニン−４１１（Ｌａｍｉｎｉｎ−４１１）」とは、α４鎖、β１鎖およびγ１鎖を一緒に結合することによって形成されるタンパク質をいう。この用語は、組換えラミニン−４１１および天然に存在する供給源に由来するヘテロトリマーラミニン−４１１の両方を包含すると解釈されるべきである。
【００５７】
そのラミニンは、無傷のタンパク質またはタンパク質フラグメントであり得る。用語「無傷の（ｉｎｔａｃｔ）」とは、α鎖、β鎖、およびγ鎖のドメインの全てから構成され、その３本の鎖が、ヘテロトリマー構造を形成するために一緒に結合されているタンパク質に言及する。そのタンパク質は、別個の鎖、フラグメント、または機能的ドメインに分解されていない。用語「鎖（ｃｈａｉｎ）」は、そのラミニンタンパク質のα鎖、β鎖、またはγ鎖の全体に言及する。用語「フラグメント（ｆｒａｇｍｅｎｔ）」とは、別の分子またはレセプターへの結合活性を有する１個、２個、または３個の機能的ドメインを含む任意のタンパク質フラグメントをいう。しかし、鎖は、各鎖が３個より多くのこのようなドメインを有することから、フラグメントと見做されるべきではない。同様に、無傷のラミニンタンパク質は、フラグメントと見做されるべきではない。機能的ドメインの例としては、ドメインＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、およびＧドメインが挙げられる。
【００５８】
その細胞培養基材は、細胞培養培地と組み合わせて使用される。本開示の細胞培養培地は、インビトロで角化細胞を培養するために特に適している。代表的には、細胞培養培地は、分化を阻害しかつ増殖を改善するために、多数のおよび多量の種々の増殖因子ならびにサイトカインを含む。
【００５９】
非常に一般的に、本開示の細胞培養培地は、液相を含む化学的に規定された無血清培地である。以下の表１は、本開示の細胞培養培地に存在し得る種々のこのような成分の列挙、およびその成分が存在する場合には、その最小濃度および最大濃度を含む。その値は、指数表記で表される。例えば、「４．１Ｅ−０１」は、４．１×１０−０１として解釈されるべきである。
【表１−１】
2020518262.tif 000003
【表１−２】
2020518262.tif 000004
【表１−３】
2020518262.tif 000005
【表１−４】
2020518262.tif 000006
【００６０】
その細胞培養培地の液相は、水、血清、またはアルブミンであり得る。
【００６１】
上記の表１で列挙された成分または構成要素の多くは、必ずしも必要ではないか、または低濃度で使用され得る。
【００６２】
その細胞培養培地は、インスリンまたはインスリン代用物を含み得ることが企図される。同様に、その細胞培養培地は、トランスフェリンまたはトランスフェリン代用物を含み得る。しかし、いくつかの具体的な実施形態において、その細胞培養培地は、（１）インスリンもしくはインスリン代用物、または（２）トランスフェリンもしくはトランスフェリン代用物、またはこれら２つの構成要素の任意の組み合わせを含まなくてもよいことが企図される。
【００６３】
他の細胞培養培地は、増殖因子（例えば、インターロイキン−１β（ＩＬ−１βまたはカタボリン）、インターロイキン−６（ＩＬ６）、または色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）を含み得ることに注意すべきである。このような増殖因子は、本開示の細胞培養培地に存在しなくてもよい。
【００６４】
使用され得る１つの具体的な細胞培養培地は、基礎培地である。基礎培地は、いかなる特別の栄養素補充物をも要求しない、微生物のうちの多くのタイプの増殖を促進する補充されていない培地である。特定の実施形態において、その基礎培地は、Ｌｏｎｚａから市販されている角化細胞増殖培地−化学的に規定（ＫＧＭ−ＣＤ）基礎培地である。
【００６５】
その基礎培地は、インスリンおよび増殖補充物を含み得る。そのインスリンは、組換えヒトインスリンであり得る。その基礎培地に存在するさらなる成分は、ヒト上皮増殖因子（ｈＥＧＦ）；ヒドロコルチゾン；抗生物質および／もしくは抗真菌剤（例えば、ゲンタマイシンまたはアンホテリシンＢ）；ならびに成長ホルモン（例えば、エピネフリンおよびトランスフェリン）を含み得る。
【００６６】
ＬＮ−４２１またはＬＮ−５１１のいずれかの基材および基礎培地を含むシステムは、完全に化学的に規定された環境およびフィーダー細胞または動物血清またはアポトーシスのいかなるインヒビターもなしの異種由来物質非含有条件において、角化細胞を支持するために極めて十分に機能する。フィーダー細胞の例としては、マウス線維芽細胞またはヒト皮膚線維芽細胞が挙げられる。
【００６７】
細胞培養培地は、完全に規定されかつ異種由来物質非含有であることが企図される。その培地はまた、いかなる分化インヒビターも、分化誘導因子も、アポトーシスインヒビターも、または動物血清をも欠いているべきである。分化誘導因子の例としては、Ｎｏｇｇｉｎまたは角化細胞増殖因子が挙げられる。
【００６８】
ラミニン基材と本開示の細胞培養培地との組み合わせは、ヒト角化細胞を効率的に支持し得る細胞培養システムを生じる。ラミニンおよび最小量の栄養素が、本質的に要求される全てである。この細胞培養培地と組み合わせて使用されるラミニンは、ＬＮ−５１１またはＬＮ−４２１のいずれかであることが特に企図される。
【００６９】
いくつかの実施形態における細胞培養システムは、その基材の中にＬＮ−４１１、ＬＮ−４２１、ＬＮ−５１１、またはＬＮ−５２１のうちの少なくとも１つを含み、フィーダー細胞および動物血清を使用する従来の方法によって示されるより長く、ヒト角化細胞を維持する。
【００７０】
以下の実施例は、本開示をさらに例証する目的のものである。その実施例は例証に過ぎず、本開示に従って作製されるデバイスを、その中で示される材料、条件、またはプロセスパラメーターに限定することは意図されない。
【実施例】
【００７１】
初代角化細胞単離
【００７２】
ヒト表皮角化細胞（ＨＥＫ）を、健康な被験体の形成外科手術からの手術廃棄物から、これらのドナーからのインフォームド・コンセントおよびＳｉｎｇａｐｏｒｅ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌの倫理委員会からの倫理審査による承認を得て、単離した。簡潔には、最大４ｃｍ２  組織を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｌｏｎｚａ）中で洗浄し、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ）中の１０ｍＬの２．５ｍｇ／ｍＬ  Ｄｉｓｐａｓｅ  ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ）の中でインキュベートし、一晩４℃において静置した。翌日、表皮を手術用ピンセット（ｆｉｎｅ  ｆｏｒｃｅｐｓ）で真皮から機械的に分離し、０．０５％  トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（Ｇｉｂｃｏ）中で１５分間、３７℃においてインキュベートした。細胞が解離した際に、トリプシン活性を、その溶液を３容積の新鮮なＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）で希釈することによって低減した。次いで、角化細胞を、遠心分離を通じて集め、角化細胞増殖培地−化学的に規定（ＫＧＭ−ＣＤ）（Ｌｏｎｚａ）中に再懸濁した。
【００７３】
初代角化細胞培養
【００７４】
６ウェル組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，  Ｃｏｓｔａｒ）を、４℃において２．５μｇ／ｃｍ２の滅菌ＬＮ−１１１、ＬＮ−３３２、ＬＮ−４１１、ＬＮ−４２１、ＬＮ−５１１またはＬＮ−５２１（ＢｉｏＬａｍｉｎａ  ＡＢ）で一晩コーティングした。新たに単離されたヒト表皮角化細胞を、予めコーティングされたプレートに、最初は密度９×１０４／ｃｍ２において播種し、ＫＧＭ−ＣＤ（Ｌｏｎｚａ）中、３７℃、１０％  ＣＯ２で培養した。コントロールプレートに関しては、ヒト表皮角化細胞を、Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ  ＆  Ｇｒｅｅｎの方法に従って培養するか、またはコーティングされていないプレート上で培養するかのいずれかであった。簡潔には、新たに単離されたＨＥＫ（９×１０４／ｃｍ２）を、完全ＦＡＤ培地：１０％  ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、５μｇ／ｍＬ  インスリン（Ｉｎｓｕｌａｔａｒｄ（登録商標））、０．１８ｍＭ  アデニン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、０．４μｇ／ｍＬ  ヒドロコルチゾン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、２ｎＭ  トリヨードサイロニン（Ｓｉｇｍａ）、０．１ｎＭ  コレラ毒素（Ｓｉｇｍａ）、１０ｎｇ／ｍＬ  上皮増殖因子（Ｕｐｓｔａｔｅ）、および１００  ＩＵ／ｍＬ−１００μｇ／ｍＬ  ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を補充した、ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）およびＨａｍ’ｓ  Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）培地（３：１比）中、致死的に照射した（６０Ｇｙ）３Ｔ３−Ｊ２線維芽細胞のフィーダー層上で培養した。コンフルエントになった際に、無血清システムの中のＨＥＫ培養物を、ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ（Ｇｉｂｃｏ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して８〜１６分間、３７℃でトリプシン処理した一方で、コントロールプレート上のＨＥＫ培養物を、０．０５％  トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）で５分間、３７℃でトリプシン処理した。コンフルエント未満の初代培養物を、１×１０４  細胞／ｃｍ２において連続的に継代した。累積集団倍加の数を、以下の式を使用して計算した：ＰＤ＝（ｌｏｇ  Ｎ／Ｎ０）／ｌｏｇ２（ここでＮは、各継代で得られた細胞の総数を表し、Ｎ０は、実験開始時にプレートした細胞数を表す）。
【００７５】
定量的ＰＣＲ分析
【００７６】
種々の継代におけるＨＥＫ細胞の全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、製造業者の説明書に従って精製した。その収量を、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ−２０００分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって決定した。定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析のために、ｃＤＮＡを、ＴａｑＭａｎ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）を使用して、製造業者の説明書に従って２０μＬ反応混合物中の５００ｎｇの全ＲＮＡから合成した。リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲを、ｉＱ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒ  ｍｉｘ（ＢｉｏＲａｄ）および目的の遺伝使用のプライマーを含むアッセイミックス中で、合成したｃＤＮＡで行った。ＧＡＰＤＨを、正規化コントロールとして使用した。
【００７７】
ＦＡＣＳ分析
【００７８】
細胞を種々の継代で集め、単一細胞懸濁物を、Ｆｉｘａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｅｄｉｕｍ  Ａ；  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で１５分間、室温において固定し、ＦＡＣＳ緩衝液（１×ＰＢＳ中０．５％  ＢＳＡ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）で洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中の５％  ヤギ血清でブロッキングし、Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｅｄｉｕｍ  Ｂ；  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中の一次抗体で１５分間、室温において免疫染色し、ＦＡＣＳ緩衝液中の１％  ヤギ血清中で希釈した二次抗体で検出した。蛍光色素結合体化抗体に関して、固定した細胞を、Ｍｅｄｉｕｍ  Ｂ中で希釈した抗体およびヒトＦｃＲブロッキング試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，  １：５０）とともに、３０分間、室温でインキュベートした。染色した細胞をＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、ＦＡＣＳ分析（ＭＡＣＳＱｕａｎｔ  ＶＹＢ，  Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）に供した。データを、ＭＡＣＳＱｕａｎｔｉｆｙ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）ソフトウェアを使用して分析した。
【００７９】
器官型培養
【００８０】
グリセロール保存した同種異系皮膚（ＥＵＲＯ  ＳＫＩＮ  ＢＡＮＫ，  ＥＡ  Ｂｅｖｅｒｗｉｊｋ，  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄ）の表皮を、急速凍結および融解の数回のサイクルの後に機械的に除去した。次いで、この脱表皮化真皮（ＤＥＤ）を２×２ｃｍ平方に切断し、その真皮の細網側に、１ｃｍ直径のステンレス鋼リングの助けを借りて、５×１０５  ヒト皮膚線維芽細胞を播種した。その翌日、各ＤＥＤを裏返し、ラミニン上でまたはＲ＆Ｇシステムでのいずれかで増殖させた２×１０５  ＨＥＫ細胞を、個々のＤＥＤ上で別個にＣＦＡＤ培地中、７日間播種した。その後、培養物を空気−液体界面に１４日間持ち上げて、層状にした。次いで、各サンプルを、凍結切片化のために処理し、Ｈ＆Ｅ染色で染色した。
【００８１】
ＲＮＡ配列決定（ＲＮＡ−ｓｅｑ）データの生成
【００８２】
成人患者由来角化細胞を、３Ｔ３共培養（ｎ＝２）において、またはＬＮ−４２１（ｎ＝４）もしくはＬＮ−５１１（ｎ＝３）コーティング上で、のいずれかで別個に増殖させた。さらに、皮膚全体をまた単離した（ｎ＝３）。ＲＮＡを、培養プレートまたは皮膚全体のいずれかからｍｉｃｒｏＲＮＡ精製キット（Ｎｏｒｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｋ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で製造業者のガイドラインに従って単離した。ＲＮＡｓｅｑライブラリーを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｔｒｕ−Ｓｅｑ  Ｓｔｒａｎｄｅｄ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを使用して、Ｒｉｂｏ−Ｚｅｒｏ  Ｇｏｌｄキットプロトコルで、製造業者の説明書（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，  ＵＳＡ）に従って調製した。ライブラリーをＡｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ）で検証し、希釈し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｓｔａｔｉｏｎを使用してＩｌｌｕｍｉｎａフローセルに適用した。配列決定を、Ｄｕｋｅ−ＮＵＳ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＦａｃｉｌｉｔｙにあるＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ２０００配列決定機で、ペアエンド１００ｂｐリードオプションで行った。
【００８３】
ＲＮＡ−ｓｅｑリードを、質について評価し、ｈｇ３８（Ｅｎｓｅｍｂｌ  Ｇｅｎｅ  ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ  ｂｕｉｌｄ  ７９）に対してＳＴＡＲ  ２．５．２ｂを使用して整列させ、ＲＳＥＭ  １．２．３１を使用して定量した。培養したサンプルにおいて平均して４３００万のリードをマッピングし、皮膚全体からのサンプルにおいて平均して１億１３３０万が、得られた。遺伝子註釈を、Ｒ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｂｉｏｍａＲｔ  ２．３０．０を使用して、Ｅｎｓｅｍｂｌバージョン７９（ｈｇ３８）から引き出した。リボソーム遺伝子（Ｅｎｓｅｍｂｌ遺伝子バイオタイプ「ｒＲＮＡ」）およびミトコンドリア遺伝子を除去した（合計で５８４遺伝子）。小さな非コードＲＮＡ遺伝子「ＲＮ７ＳＬ１」および「ＲＮ７ＳＬ２」を除去した。なぜならそれらの高発現レベルに起因して、それらは遺伝子発現分布のアウトライアーだったからである。遺伝子数を、Ｒ関数ｒｏｕｎｄによって丸めた。予備フィルタリング工程を追加し、その中で、１より大きい計数を有する遺伝子のみを、全てのサンプルにわたって合計したときに維持した。
【００８４】
ＲＮＡ−ｓｅｑデータ分析
【００８５】
差次的発現分析および機能的富化を使用して、３つの培養法：３Ｔ３共培養、ＬＮ−４２１およびＬＮ−５１１を比較した。差次的発現分析を、ＤＥＳｅｑ２  １．１４．１で行った。ＤＥＳｅｑ２を、Ｗａｌｄ検定を使用してペアワイズで実行し、技術的複製を折りたたみ（ｃｏｌｌａｐｓｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ）、患者効果を調節した（すなわち、共変数「Ｐａｔｉｅｎｔ＿ＩＤ」をモデルに追加した）。３つのペアワイズ比較を行い、ＬＮ−４２１サンプルを３Ｔ３に対して、ＬＮ−５１１を３Ｔ３に対して、およびＬＮ−５１１をＬＮ−４２１に対して、比較した。ＤＥＳｅｑ２結果関数では、そのａｌｐｈａパラメーターを０．０５に設定し、パラメーターの残りをデフォルトとして放置した。Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ  ＆  Ｈｏｃｈｂｅｒｇ（ＢＨ）調節したｐ値＜０．０５である場合、遺伝子を、有意に差次的に発現される（ＤＥ）と見做した。
【００８６】
その差次的発現結果の機能富化分析を、Ｇｅｎｅ  Ｓｅｔ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＧＳＥＡ）ソフトウェア２−２．２．２で行った。ＤＥＳｅｑ２出力に含まれる全ての遺伝子を、ＨＧＮＣシンボルにマッピングし、その相当するＤＥＳｅｑ２出力Ｗａｌｄ統計値（すなわち、ｌｏｇ２倍数変化の推定値をその標準誤差で除算したもの）によってランク付けした。ＧＳＥＡを実行して、Ｈａｌｌｍａｒｋ遺伝子セットの過剰提示（すなわち、十分に規定された生物学的状態またはプロセスを表す註釈付き遺伝子セットの群の集合体から導出された一貫して発現された遺伝子シグナチャー）を評価した。Ｈａｌｌｍａｒｋ遺伝子セットを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  Ｄａｔａｂａｓｅ遺伝子セット５．１から得た。ＧＳＥＡを１０，０００順列（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）での古典的なプレランクモード（ｐｒｅ−ｒａｎｋ  ｍｏｄｅ）で実行して、偽発見率（ＦＤＲ）を評価した。そのＧＳＥＡの実行において、最大遺伝子セットサイズを５，０００に設定し、最小クラスターサイズを１０に設定した。遺伝子セットを、ＦＤＲ＜０．０５である場合に富化されたと見做した。
【００８７】
選択された遺伝子の発現レベルの可視化
【００８８】
１００万あたりの転写物（ＴＰＭ）を、低く発現された電子を除去することによって予めフィルタにかけた（すなわち、ＴＰＭを、全サンプルにわたって合計し、１より大きいＴＰＭを有する遺伝子のみを維持した）。ＴＰＭレベルを記録し（加算および１のオフセットの後）、Ｒ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｌｉｍｍａ  ３．３０．１３からの関数ｒｅｍｏｖｅＢａｔｃｈＥｆｆｅｃｔを使用して、患者効果について調節した。
【００８９】
培養表皮皮膚等価物の調製
【００９０】
透明なフィブリンマットを、２ｍＬまたは５ｍＬのＴＩＳＳＥＥＬキット（Ｂａｘｔｅｒ）を使用して、クリーンベンチの中で調製した。そのキットからのフィブリノゲンを、その推奨される再構成より２倍高く、１ｍＭの塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）を含む１．１％  塩化ナトリウム溶液（ＮａＣｌ）を使用して希釈した；この溶液を、その後、等容積においてそのキットによって提供されるトロンビンと混合し、１．１％  ＮａＣｌおよび１ｍＭ  ＣａＣｌ２溶液を使用して、３  ＩＵ／ｍＬに希釈した。上記の混合した溶液を、１０×１０ｃｍ２  ディッシュへと均一に分与し、室温において完全な重合のために１０〜１５分間静置し、使用するまで４℃において貯蔵した。そのフィブリンマット上でＨＥＫを培養する間に線維素溶解を防止するために、アプロチニン（Ｔｒａｓｙｌｏｌ，  Ｂａｙｅｒ）を、各供給時に、最終濃度１５０  ｋＩＵ／ｍＬになるように培養培地中に添加した。移植のために、フィブリンマットを、２．５μｇ／ｃｍ２のＬＮ−５１１またはＬＮ−４２１のいずれかでコーティングし、４℃で一晩インキュベートしたか、または致死的にγ照射した３Ｔ３−Ｊ２線維芽細胞とともに播種し、３７℃で一晩インキュベートした。次いで、ＨＥＫを、１０，０００細胞／ｃｍ２において翌日播種し、コンフルエントになるまで増殖させた。手術当日に、全ての移植片をそれぞれの無血清培地（ラミニンサンプルに関してはＫＧＭ−ＣＤおよび３Ｔ３共培養サンプルに関しては新しいＤＭＥＭ）で２回洗浄した。
【００９１】
ヌードマウス上へのヒト表皮移植片の移植
【００９２】
動物研究を、ＳｉｎｇＨｅａｌｔｈ動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）から承認されたプロトコルで行った。８〜１０週齢のヌード無胸腺ＢＡＬＢ／ｃ  ｎｕ／ｎｕマウスを、Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｒｅ（ＡＲＣ，  Ｐｅｒｔｈ，  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から購入し、皮膚移植片レシピエントとして使用した。マウスを収容し、ＳｉｎｇＨｅａｌｔｈ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＳＥＭＣ）において特定病原体がいない条件下で維持した。全てのマウスを実験手順前に少なくとも１週間、それらの環境に慣らした。
【００９３】
手術当日に、その日の朝に（または少なくとも手術の１時間前に）およびその日の最後の別のときに開始して、マウスをブプレノルフィン（１ｍｇ／ｋｇ）で２回処置した。クリーンベンチの中で、マウスに、５％  イソフルランを使用して個々にチャンバに入れて麻酔をかけた。維持のために、そのマウスを、手術手順用のマスクを通して吸入させることによって、２％  イソフルランに供した。Ｂａｒｒａｎｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，  ９１，  ３１５−３１８（１９８８）によって開発された方法に従って、フラップ手順（ｆｌａｐ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）を行った。簡潔には、そのマウスの背側皮膚表面を、アルコール消毒綿で２回、感染防止のために清拭した。２×２ｃｍ２の矩形のフラップをはさみで切開し、持ち上げた。そのフラップより僅かに大きいＳａｆｅｔａｃ  ｆｏａｍ（Ｍｅｐｉｌｅｘ  Ｌｉｔｅ  ｄｒｅｓｓｉｎｇ）のシートを、粘着性の側を下面にしてその動物の皮膚の下に挿入した。その後、フィブリン上の培養ヒト表皮皮膚等価物（細胞表面を下側に露出）を、Ｍｅｐｉｌｅｘ包帯の上に、細胞を保護するために、２層の不活性Ｓｉｌｏｎ−ＴＳＲ包帯をその間に挿入して置いた。その移植片を１滴の無血清培地で湿らせた後に、フラップをその移植片の上に適所に戻して重ね、切開を、非吸収性６−０縫合糸で閉じて保護し、移植片を適所に固定した。
【００９４】
その移植片を採取するために、その動物をＣＯ２吸入で屠殺した。次いで、その移植片を採取し、４％  緩衝化パラホルムアルデヒド中で固定してパラフィン包埋するか、または液体窒素中で急速凍結するかのいずれかを行った。次いで、５μｍの切片を集め、ヘマトキシリンおよびエオシン染色または免疫染色のいずれかのために処理した。
【００９５】
実験データの統計分析
【００９６】
データを、３〜７個の異なる患者サンプルの平均±ＳＥＭとして提示する。種々の時点での相対的ｍＲＮＡ発現および表面マーカータンパク質発現の差異を、一元配置ＡＮＯＶＡで評価し、Ｔｕｋｅｙの事後検定を使用して多重比較のために較正した。全てのグラフおよび統計分析を、Ｐｒｉｓｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ７．０（ＧｒａｐｈＰａｄ）によって生成した。差異を、ｐ＜０．０５において有意と見做した。
【００９７】
一般的な組織培養法
【００９８】
１２ウェル組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ）を、４℃において、ラミニンの製造業者の説明書（ＢｉｏＬａｍｉｎａ  ＡＢ）に従って、密度２μｇ／ｃｍ２の滅菌ＬＮ−４１１、ＬＮ−４２１、ＬＮ−５１１、およびＬＮ−５２１で一晩コーティングした。他の場合には、６ウェル組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，  Ｃｏｓｔａｒ）を、４℃において、２．５μｇ／ｃｍ２の滅菌ＬＮ−１１１、ＬＮ−３３２、ＬＮ−４１１、ＬＮ−４２１、ＬＮ−５１１またはＬＮ−５２１（ＢｉｏＬａｍｉｎａ  ＡＢ）で一晩コーティングした。
【００９９】
ヒト表皮角化細胞サンプルを、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄し、１０ｍＬの、ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中２．５ｍｇ／ｍＬ  Ｄｉｓｐａｓｅ  ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ）の中で一晩４℃においてインキュベートした。翌日、表皮を手術用ピンセットで真皮から機械的に分離し、０．０５％  トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）中で、３７℃において１５分間インキュベートした。細胞を解離した際に、トリプシン活性を、その溶液を３容積の新鮮なＤＭＥＭで希釈することによって低減した。次いで、角化細胞を、遠心分離を通じて集め、角化細胞増殖培地−化学的に規定（ＫＧＭ−ＣＤ）（Ｌｏｎｚａ）中に再懸濁した。
【０１００】
新たに単離されたヒト表皮角化細胞を、予めコーティングしたプレート（およびコントロールプレート）上に、最初は密度０．９×１０５〜１×１０５  細胞／ｃｍ２において播種し、ＫＧＭ−ＣＤ中、３７℃、１０％  ＣＯ２で培養した。
【０１０１】
コントロールプレートに関しては、ヒト表皮角化細胞は、Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ  ＆  Ｇｒｅｅｎの方法に従って培養するか、またはコーティングされていないプレート上で培養するかのいずれかであった。簡潔には、新たに単離されたＨＥＫ（９×１０４／ｃｍ２）を、完全ＦＡＤ培地：１０％  ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、５μｇ／ｍＬ  インスリン（Ｉｎｓｕｌａｔａｒｄ（登録商標））、０．１８ｍＭ  アデニン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、０．４μｇ／ｍＬ  ヒドロコルチゾン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、２ｎＭ  トリヨードサイロニン（Ｓｉｇｍａ）、０．１ｎＭ  コレラ毒素（Ｓｉｇｍａ）、１０ｎｇ／ｍＬ  上皮増殖因子（Ｕｐｓｔａｔｅ）、および１００  ＩＵ／ｍＬ−１００μｇ／ｍＬ  ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を補充した、ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）およびＨａｍ’ｓ  Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）培地（３：１比）中、致死的に照射した（６０Ｇｙ）３Ｔ３−Ｊ２線維芽細胞のフィーダー層上で培養した。
【０１０２】
コンフルエントになった際に、その細胞を、ＴｒｙｐＬＥＳｅｌｅｃｔ（Ｇｉｂｃｏ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用することによって、８〜１６分間、３７℃においてトリプシン処理した。その後、その角化細胞を、密度１×１０４  細胞／ｃｍ２において慣用的に継代した。累積集団倍加の数を、以下の式を使用して計算した：ＰＤ＝（ｌｏｇ  Ｎ／Ｎ０）／ｌｏｇ２（ここでＮは、各継代で得られた細胞の総数を表し、Ｎ０は、実験開始時にプレートした細胞数を表す）。
【０１０３】
実施例１
ヒト皮膚サンプルを、Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌからの同意を得て、ドナーから得た。簡潔には、サンプルをＯＣＴ媒体中に包埋し、５μｍ（マイクロメートル）切片において凍結切片を作製し、個々のラミニンアイソフォーム免疫蛍光染色およびＤＡＰＩでの対比染色に供した。
【０１０４】
ヒト皮膚基底膜でのラミニンアイソフォーム染色は、ラミニンα１、α３、α５、β１、β２、β３、γ１、およびγ２アイソフォームに関して陽性を示した。ラミニンα２およびα４アイソフォームは、基底膜に存在しなかったが、ラミニンα４は、血管上で陽性染色された。ラミニンγ３アイソフォームは、非特異的染色を示した。これらの結果は、ＬＮ−３３２、ＬＮ−５１１、およびＬＮ−５２１が表皮下基底膜において発現されたことを示す。
【０１０５】
実施例２
次に、皮膚分節切片において発現されるラミニンアイソフォームのｍＲＮＡ発現レベルを、リアルタイムＰＣＲを通じて得た。ラミニンα３、α５、β１、β２、β３、β４、γ１、およびγ２アイソフォームは、陽性に発現された。
【０１０６】
実施例３
上記の方法を使用して調製され、新たに単離されたヒト表皮角化細胞を、ラミニン基材（ＬＮ−３３２、ＬＮ−４１１、ＬＮ−４２１、ＬＮ−５１１、ＬＮ−５２１）上で培養した。ＬＮ−１１１基材、およびいかなるラミニンコーティングもなしの組織培養ディッシュを、陰性コントロールとして供した。３Ｔ３線維芽細胞とともに共培養した角化細胞を、陽性コントロールとして使用した。次いで、細胞を、ＫＧＭ−ＣＤ基礎培地中で培養した。ラミニン上の全てのＨＥＫ培養を、Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ  ＆  Ｇｒｅｅｎの３Ｔ３フィーダー層を使用するいかなる初期の拡大もなしに、動物性のものがなく規定されたＫＧＭ−ＣＤ細胞培養システムにおいて行った。
【０１０７】
図１Ａ〜１Ｊに示されるように、ＬＮ−４１１、ＬＮ−４２１、ＬＮ−５１１、またはＬＮ−５２１上で培養したヒト角化細胞は、コントロール基材上で培養したそれら角化細胞と比較して、より良好に事が運んでいた。陰性コントロール（コーティングなし）、ＬＮ−１１１、およびＬＮ−３３２上で培養した細胞は、生き延びなかった。対照的に、角化細胞は、ＬＮ−４１１、ＬＮ−４２１、ＬＮ−５１１、およびＬＮ−５２１、ならびに陽性コントロール（３Ｔ３）上に付着および増殖できた。ＬＮ−４１１およびＬＮ−４２１上で培養した角化細胞はコロニーを形成した一方で、ＬＮ−５１１およびＬＮ−５２１上で培養したものは、個々の実体として付着し増殖するようであった。ＬＮ−４２１およびＬＮ−５１１の両方を組み合わせて培養した角化細胞は、十分に増殖した。
【０１０８】
角化細胞を計数し、ＬＮ−５１１、ＬＮ−４２１、および陽性コントロール上で培養した角化細胞の増殖速度を、図２Ａ〜２Ｃに示されるようにグラフ化した。集団倍加を、ＰＤ＝３．３２×ｌｏｇ（採取した細胞数／播種した細胞数）として計算した。これらのグラフは、ＬＮ−５１１およびＬＮ−４２１が、角化細胞増殖およびコロニー形成能力を支持できたことを示す。個々には、ＬＮ−５１１およびＬＮ−４２１は、ＬＮ−５２１およびＬＮ−４１１と比較して、長期間培養において角化細胞をより良好に維持できた。これは、図２Ｄにおいて、それらそれぞれの累積集団倍加に反映される。
【０１０９】
実施例４
ＬＮ−５１１およびＬＮ−４２１上で培養した角化細胞の遺伝的安定性を試験するために、角化細胞の核型決定を、早期（継代１）および長期培養（継代９）において行った。３Ｔ３とともに共培養した角化細胞を、それぞれの継代におけるコントロールとして使用した。ＬＮ−５１１およびＬＮ−４２１上で培養した角化細胞は、継代１および継代９の両方において、正常な核型決定を示し、観察可能な転座または染色体変化は存在しなかった。
【０１１０】
実施例５
定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を、ＬＮ−５１１またはＬＮ−４２１のいずれかのラミニン基材上にプレートしたヒト表皮角化細胞で行った。ｑＰＣＲを、３Ｔ３コントロール基材と比較して、角化細胞前駆細胞マーカー（ＫＲＴ５、ＫＲＴ１４）および分化マーカー（ＫＲＴ１、ＫＲＴ１０）の発現プロフィールを観察するために、継代１、継代４、継代７、および継代１０において行った。
【０１１１】
図３Ａ〜３Ｄにおいて示されるように、前駆細胞マーカーおよび分化マーカーの相対的発現のｑＰＣＲ発現プロフィールを、１０継代にわたってＧＡＰＤＨに対して正規化した。全体的に、ＬＮ−５１１（丸）またはＬＮ−４２１（三角形）のいずれかの上で培養した角化細胞の各基底／分化マーカーの発現プロフィールは、コントロール基材（３Ｔ３、四角形）と類似の傾向を示した。初期の継代では、ＬＮ−５１１およびＬＮ−４２１の両方の上で増殖された角化細胞は、ＫＲＴ５およびＫＲＴ１４を高度に発現した。分化マーカー発現の始まりは、継代７の後に開始し、ここでＫＲＴ１およびＫＲＴ１０は、徐々に増大した。
【０１１２】
初期の継代（Ｐ１）では、ＬＮ−５１１またはＬＮ−４２１基材上で培養した細胞を固定し、特異的角化細胞マーカーで免疫染色し、ＤＡＰＩで対比染色した。これらは、  図４Ａ〜４Ｎで示される。初期の継代（Ｐ１）での角化細胞は、正常な基底細胞マーカー（ＫＲＴ５、ＫＲＴ１４、ＫＲＴ１５、ｐ６３）および低い分化マーカー（ＩＶＬ、ＫＲＴ１０、ＫＲＴ１）を発現した。
【０１１３】
実施例４
コンフルエントに達した後、細胞を集め、前駆細胞マーカー（ＫＲＴ５、ＫＲＴ１４、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＢ１、およびＫＲＴ１５）または分化マーカー（ＫＲＴ１、ＫＲＴ１０）に関して蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）分析に供した。これを、ＬＮ−５１１もしくはＬＮ−４２１のいずれかのラミニン基材上でプレートしたか、または３Ｔ３線維芽細胞フィーダー細胞とともに共培養した細胞について行った。
【０１１４】
図５は、各基材上での各マーカーに関する結果を示すグラフである。そのＦＡＣＳ分析は、ＬＮ−５１１またはＬＮ−４２１のいずれかの上で培養した角化細胞が、コントロール（３Ｔ３）と匹敵する、高レベルの基底マーカー（９０％陽性を超える）および低発現の分化マーカーを発現することを示した。この結果は、これらの基底マーカーおよび転写因子ｐ６３（これは、角化細胞増殖を調節することが公知であり、ヒト皮膚において角化細胞の発生および維持のために必要とされる）の免疫染色によって別個に確認された。
【０１１５】
実施例５
ＬＮ−４２１、ＬＮ−５１１上でおよび３Ｔ３共培養システムを使用して増殖されたＨＥＫのトランスクリプトームを、ＲＮＡ配列決定（ＲＮＡ−ｓｅｑ）によって調査した。その結果を、図６Ａ〜６Ｃに示す。
【０１１６】
図６Ａおよび図６Ｂに示されるように、基底マーカーおよび分化マーカーは、異なる３つの培養システムにおいて類似の発現レベルを示した。これは、その試験したプラットフォーム上で増殖させた細胞が全て前駆細胞であることを確認した。全体的に、ＬＮ−４２１およびＬＮ−５１１上で増殖させた角化細胞は、類似のトランスクリプトームプロフィールを示した（Ｓｐｅａｒｍａｎのランク付けされた相関は０．９９および６０のみの差次的に発現された遺伝子（偽発見率、ＦＤＲ＜０．０５））。
【０１１７】
より多くの差異が、その２つのラミニン上で増殖させた角化細胞のトランスクリプトームと、３Ｔ３共培養システムを使用して増殖させた細胞のトランスクリプトームプロフールとを比較する場合に見出された（３Ｔ３共培養とそれぞれ比較した場合に、ＬＮ−５１１およびＬＮ−４２１上で増殖させた角化細胞の間でＳｐｅａｒｍａｎのランク付けされた相関は０．９４および０．９５で、７，６９４および７，５８７の差次的に発現された遺伝子）。これは、図６Ｃに示される。ＬＮ−４２１またはＬＮ−５１１上で増殖させた角化細胞では、顕著なダウンレギュレーション（ＦＤＲ＜１０−６）は、「上皮間葉転換」およびいくつかの炎症促進性経路（例えば、「インターフェロンα応答」、「インターフェロンγ応答」および「ＮＦＫＢを介するＴＮＦＡシグナル伝達」）に関与する遺伝子について観察された。炎症促進性経路は、線維芽細胞と共培養した場合に、ヒト皮膚角化細胞においてアップレギュレートされることが公知である。ダウンレギュレーションはまた、いくつかの発生経路に関与する遺伝子において観察された（例えば、それぞれ、ＬＮ−４２１  ＦＤＲ＝９×１０−６およびＬＮ−５１１  ＦＤＲ＝１×１０−４の「ＴＧＦβシグナル伝達」、ならびにそれぞれ、ＬＮ−４２１  ＦＤＲ＝４×１０−４およびＬＮ−５１１  ＦＤＲ＝１×１０−２の「ＷＮＴβカテニンシグナル伝達」）。これらの角化細胞はまた、他の細胞プロセスの中でも、「ＭＹＣ標的」および細胞周期（すなわち、「Ｅ２Ｆ標的」および「ＧＭ２チェックポイント」）の強力なアップレギュレーション（ＦＤＲ＜１０−６）を示した。ＭＹＣは、角化細胞接着および増殖を調節することが示された。まとめると、このデータは、ＬＮ−５１１およびＬＮ−４２１上で増殖させた角化細胞のトランスクリプトームが、３Ｔ３共培養システムを使用して増殖させた細胞より炎症性が少なく、より大きな増殖特徴を示すようであったことを示唆する。
【０１１８】
実施例６
グリセロール保存した同種異系皮膚（ＥＵＲＯ  ＳＫＩＮ  ＢＡＮＫ，  ＥＡ  Ｂｅｖｅｒｗｉｊｋ，  Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）の表皮を、急速凍結および融解の数サイクルの後に、機械的に除去した。次いで、この脱表皮化真皮（ＤＥＤ）を２ｃｍ×２ｃｍ平方へと切断し、その真皮の細網側に、１ｃｍ直径のステンレス鋼リングの助けを借りて、５×１０５  ヒト皮膚線維芽細胞を播種した。その翌日、各ＤＥＤを裏返し、ＬＮ−４２１、ＬＮ−５１１上で予め増殖させるか、または３Ｔ３とともに共培養するかのいずれかを行った第２の角化細胞培養物を、ｃＦＡＤ培養培地中の各ＤＥＤ上に、２×１０５  細胞で播種した。そのｃＦＡＤ培養培地は、１０％  ウシ胎仔血清、５μｇ／ｍＬ  インスリン、０．１８ｍＭ  アデニン、０．４μｇ／ｍＬ  ヒドロコルチゾン、０．１ｎＭ  コレラ毒素、２ｎＭ  トリヨードサイロニン、１０ｎｇ／ｍＬ  上皮増殖因子、および５０  ＩＵ／ｍＬ  ペニシリン−ストレプトマイシンを含む、３：１の比のＤＭＥＭおよびＨａｍ’ｓ  Ｆ１２の混合物であった。培養物を、この培地中に７日間浸漬して増殖させ、次いで、それらを、空気−液体界面に１４日間持ち上げて、層状にした。各サンプルを、凍結切片化のために処理した。凍結した切片を５μｍ厚に切断し、Ｈ＆Ｅ染色で染色した。
【０１１９】
得られた断面を、図７Ａ〜７Ｃに示す。このインビトロ機能アッセイは、ＬＮ−５１１およびＬＮ−４２１上で培養した角化細胞が、従来のＲｈｅｉｎｗａｌｄ  ＆  Ｇｒｅｅｎの方法に匹敵する、厚みのある正常な層状になった表皮を形成し得ることを示した。
【０１２０】
実施例７
これらのインビトロ結果をさらに検証するために、これらの細胞の機能性を、Ｂａｒｒａｎｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，  ９１，  ３１５−３１８  （１９８８）によって記載されるとおりのフラップ移植法を使用することによって、インビボでさらに調査した。この方法は、移植片生存を評価するために、およびレシピエント動物の表皮に由来する移植片によって生成されるヒト表皮間を区別するために、適している。なぜならそれは、従来の移植片と比較して、移植片収縮を最小限にするからである。移植後１４日間、ＬＮ−５１１、ＬＮ−４２１上で培養されるか、または３Ｔ３共培養を使用するかのいずれかであった角化細胞によって生成したヒト表皮を、採取し、切片にし、ヘマトキシリン／エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色および免疫染色の両方によって特徴づけた。
【０１２１】
Ｈ＆Ｅ染色から、ＬＮ−５１１またはＬＮ−４２１のいずれかの上で培養したＨＥＫは、完全に層状になった表皮層をインビボで生成できることを明らかにした。図８Ａ〜８Ｃを参照のこと。その形成された表皮がヒト起源のものであって、宿主に由来するものではないことを示すために、その切片を、抗ヒトＫｕ８０核染色抗体で免疫染色した。次に、基底マーカーおよび分化マーカーの免疫蛍光染色から、ＬＮ−５１１またはＬＮ−４２１のいずれかの上で培養した角化細胞は、インビボで正常に層状になることを明らかにした。絶え間ないラミニンγ２鎖発現は、ＬＮ−５１１およびＬＮ−４２１の両方の上で生成されたヒト表皮の基底層の下で観察された。これは、これらの移植したＨＥＫが、ＢＭタンパク質（同様に、上皮ラミニン、ＬＮ−３３２）を分泌し、機能的な表皮層を形成したことを示唆する。
【０１２２】
概要
本開示は、異種由来物質非含有の完全に規定されたシステムにおいてヒト表皮角化細胞を培養するための方法を提供する。無血清培地中でヒト表皮角化細胞を培養および増殖させるための現行の方法は、それらを集め、特徴づける前に、細胞生存のためにフィーダーシステムにおける最初の拡大を要求する。しかし、これらの方法は、角化細胞増殖を長期間培養において維持できない（すなわち、５回の継代未満の細胞が代表的には特徴付けにおいて使用される）。本開示で記載される方法は、３Ｔ３フィーダーシステムを使用することによる最初の拡大を経ることなく、異種由来物質非含有の完全に規定されたシステムにおいて角化細胞のより一貫したかつ強い拡大を可能にする。
【０１２３】
図１Ａ〜１Ｊを参照すると、ＬＮ−５１１またはＬＮ−４２１のいずれかを有する基材上で培養した角化細胞が、ラミニン、ＬＮ−４１１、またはＬＮ−５２１のない基材上で培養したそれら角化細胞より大きく効率的に増殖した。
【０１２４】
図５を参照すると、ＬＮ−４２１およびＬＮ−５１１上で増殖された角化細胞は、コントロールと比較して、高レベルの基底マーカーおよび低発現の分化マーカーを有した。それによって、化学的に規定された異種由来物質非含有の基礎培地中、ＬＮ−４２１またはＬＮ−５１１上で角化細胞を培養することは、それらの増殖能力を保ちながら、動物細胞を含む培養において角化細胞を増殖させる代替であり得ることを意味する。従って、この特定のシステムは、任意のヒト細胞培養物を動物病原体に曝す危険性を低減し、その培養した細胞生成物が、あまり重度でない熱傷および慢性的な創傷の管理において安全に使用されることを可能にする。なぜならそのシステムは、異種由来物質非含有で、かつ完全に規定されているからである。
【０１２５】
さらに、上記で開示される方法を使用して増殖された表皮角化細胞は、分化マーカーは７回目の（７）継代後に出現し始めるが、少なくとも１０継代にわたって維持され得、それによって、現行の方法が支持し得る代表的な５回の（５）継代を上回って改善する。
【０１２６】
これらの方法は、培養された治療用細胞製品（これは、安全性の懸念に起因して、重大な熱傷の症例および重篤な視力喪失にのみ現在は制限されている）が、軽度の熱傷および慢性的な創傷の管理において安全に使用されることを可能にする。これらの細胞製品はまた、少なくとも１つの上皮欠損を有するヒト身体において（例えば、眼、膀胱、口腔、腸などにおいて）任意の傷害または状態を処置するために潜在的に使用され得る。さらに、ドナー部位に病的状態を引き起こすことなく、培養された移植片での創傷被覆の可能性が存在し、それによって、このような患者のクオリティー・オブ・ライフが改善される。
【０１２７】
本開示は、例示的実施形態に言及して記載されてきた。明らかに、改変および変更が、前述の詳細な説明を読んで理解した際に想起される。本開示は、添付の請求項またはその均等物の範囲内にある限りにおいて、全てのこのような改変および変更を含むと解釈されることが意図される。
【図１−１】
2020518262.tif 000007
【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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