(57)【要約】  ＮＥＯ２１８（３−ブロモ−２−オキソ−プロピオン酸４−イソプロペニル−シクロヘキサ−１−エンイルメチルエステル）（式Ｉ参照）は、二つの無関係の薬剤：３−ブロモピルベート（３−ＢＦ；がん細胞代謝を阻害するアルキル化剤）及びペリリルアルコール（ＰＯＨ；抗がん特性を有する天然モノテルペン）の共有結合縮合によって形成された新規分子である。ＮＢＯ２１８の合成方法、ＮＢＯ２１８を含む医薬組成物及びＮＢＯ２１８を用いるがんの治療方法も開示される。【化１】2020512280.tif 000007【選択図】図１
2020512280.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のもの：
【化１】
2020512280.tif 000006
（３−ブロモ−２−オキソ−プロピオン酸４−イソプロペニル−シクロヘキサ−１−エンイルメチルエステル）であるペリリルアルコール及び３−ブロモピルベートの複合体又は該複合体の薬学的に許容される塩。
【請求項２】
３−ブロモ−２−オキソ−プロピオン酸４−イソプロペニル−シクロヘキサ−１−エンイルメチルエステルを含む医薬組成物。
【請求項３】
薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
処置を必要とする患者でのがんの治療方法であって、当該患者に対して、治療上有効量の３−ブロモ−２−オキソ−プロピオン酸４−イソプロペニル−シクロヘキサ−１−エンイルメチルエステルを投与することを含む方法。
【請求項５】
前記がんが、肺がん、耳、鼻及び咽頭のがん、白血病、結腸がん、メラノーマ、膵臓がん、乳がん、前立腺がん、乳がん、造血系がん、子宮がん、基底細胞がん、胆道がん；膀胱がん；骨肉腫；乳がん；子宮頸がん；絨毛癌；結腸及び直腸がん；結合組織がん；消化系のがん；子宮内膜がん；食道がん；眼がん；頭頸部がん；胃がん；上皮内新生物；腎臓がん；喉頭がん；白血病、例えば急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病；肝臓がん；リンパ腫、例えばホジキン及び非ホジキンリンパ腫；骨髄腫；線維腫、神経芽細胞腫；口腔がん（例えば、口唇、下、口及び咽頭）；子宮がん；膵臓がん；前立腺がん；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；直腸がん；腎臓がん；呼吸器系のがん；肉腫；皮膚がん；胃がん；睾丸がん；甲状腺がん；子宮がん及び泌尿器系のがんからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
３−ブロモ−２−オキソ−プロピオン酸４−イソプロペニル−シクロヘキサ−１−エンイルメチルエステルの合成方法であって、
ａ）１，１−ジクロロジメチルエーテルをブロモピルビン酸と反応させて、３−ブロモピルビン酸クロライドを生成すること；及び
ｂ）３−ブロモピルビン酸クロライドをペリリルアルコールと反応させて、３−ブロモ−２−オキソ−プロピオン酸４−イソプロペニル−シクロヘキサ−１−エンイルメチルエステルを生成すること
を含む方法。
【請求項７】
１，１−ジクロロジメチルエーテルをブロモピルビン酸と反応させる前記段階を、約０〜約２０℃の温度で行う、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
３−ブロモピルビン酸クロライドをペリリルアルコールと反応させる前記段階を、約−１０〜約１０℃の温度で行う、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
３−ブロモピルビン酸クロライドをペリリルアルコールと反応させる前記段階を、重炭酸ナトリウム及びｎ−ヘプタンの存在下に行う、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
請求項６〜９のいずれか１項に記載の方法の生成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペリリルアルコールの３−ブロモピルベートとの新規な複合体、並びにがんの治療での当該化合物の使用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ペリリルアルコール（「ＰＯＨ」）は、モノテルペンであり、キャラウェー、ラベンダー及びライラックオイル、チェリー類、クランベリー類、セージ、スペアミント、セロリ種子、及びある種の他の植物の天然構成成分である［１］。このモノテルペンが、細胞培養での腫瘍細胞の増殖を阻害し、各種動物腫瘍モデルにおいて、がん予防及び治療活性を発揮し得たことを示す研究所見によって（［２］における詳細な参考文献を参照する）、この化合物に医学的関心が寄せられるようになった。それの作用機序には、Ｒａｓ腫瘍性タンパク質機能の阻害が関与すると考えられたが［３］、より最近の研究により、それの生物学的効果に介在する可能性がある別の細胞内標的、例えばテロメラーゼ［４］、ラパマイシンの哺乳動物標的（ｍＴＯＲ）［５，６］、及びナトリウム／カリウムアデノシントリホスファターゼ（Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰａｓｅ）［７］が明らかになってきた。本発明者ら自身の前臨床試験で、本発明者らは、ＰＯＨ誘発腫瘍細胞死の重要な要素としての小胞体（ＥＲ）ストレスを確認した［８］。
【０００３】
当初、がん患者でのＰＯＨの活性を調べる臨床試験はほとんど奏功せず、それは主として、全身活性に必要な極めて高い経口用量（グラム量）から生じる消化管毒性によるものである［９−１３］。他方、ＰＯＨは、鼻腔内吸入送達によって比較的低用量を与えた場合に有効かつ非常に良好に耐容された。即ち、再発性悪性神経膠腫患者でのＩ／ＩＩ相試験において、この別途経路によってＰＯＨを投与した場合に活性が高くなり、腫瘍サイズの退行があった［１４−１６］。これらの後者の試験で、４年以上にわたって治療を受けた患者であってもＰＯＨ治療の副作用はほとんど存在せず［１６］、それは、鼻腔内送達が、（ｉ）経口ＰＯＨの用量制限性制約を回避し、（ｉｉ）かなり低い全体用量で活性を発揮することを示していた。本発明者ら自身の前臨床試験において、本発明者らは、鼻腔内投与ＰＯＨが、薬剤耐性神経膠芽腫の頭蓋内マウスモデルでかなりの治療活性を発揮することを示した［８］。
【０００４】
３−ブロモピルベート（3-bromopyruvate）（３−ＢＰ、３−ブロモピルビン酸）は、３−ブロモピルビン酸のアルカリ型である。
【化１】
2020512280.tif 000003
【０００５】
それは、ピルベート（ピルビン酸）の合成ハロゲン化誘導体を代表するものであり、いくつかの細胞内代謝経路における主要な中間体である。３−ＢＰは、高反応性求電子アルキル化剤［１７］として作用し、システイン含有タンパク質におけるチオール基などの受容性標的のピルビン酸化を生じる［１８，１９］。例えば、解糖経路でのヘキソキナーゼＩＩ（ＨＫ−ＩＩ）［２０］及びグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）［２１，２２］、及びトリカルボン酸回路及びミトコンドリア呼吸でのコハク酸デヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）［２１］など、多くの酵素が、３−ＢＰの標的として認識されている。３−ＢＰによるこれらの酵素の阻害によって、細胞エネルギーの生産及びＡＴＰプールの欠乏を生じて、細胞死に至る［２３］。
【０００６】
３−ＢＰは、複数の前臨床モデルで抗がん活性を示している。それの抗がん作用機序は、エネルギー停止、反応性酸素ラジカルの産生、及び細胞内シグナル伝達の阻害の組み合わせからなると考えられる［１７，２４−２７］。この化合物の腫瘍特異性は、解糖経路におけるＨＫ−ＩＩ及びＧＡＰＤＨの腫瘍特異的上昇及びそれへの依存性によるものである（ワールブルク効果）［２０］。従って、これらの標的の阻害は、優先的に、腫瘍細胞に影響する。他の説明には、正常細胞と比較して腫瘍細胞でより高度に発現されると考えられるモノカルボン酸輸送体１（ＭＣＴ−１）［２８］などのピルベート−乳酸輸送体を介した３−ＢＰの腫瘍特異的取り込みなどがある［２９−３１］。
【０００７】
異種移植動物腫瘍モデルにおいて、３−ＢＰは、ウサギ［３２］、ラット［３３］及びマウス［３４］での肝細胞癌に対する治療効力を示した。調べた他のイン・ビボ腫瘍モデルは、ラットでの乳癌［３５］及びマウスでの自然発生膵臓癌［３６］、結腸癌［３７］、中皮腫［３８］及びリンパ腫［３９］であった。エアロゾル化した３−ＢＰにより、発癌物質ベンゾ（ａ）ピレンに曝露されたマウスの肺における腫瘍多様性及び腫瘍負荷が低下し［４０］、マイクロカプセル化３−ＢＰによって、同所性膵臓がんマウスモデルでの腫瘍進行が予防され［４１］、ウェハにより、ラット脳での神経膠腫療法のための３−ＢＰの局所頭蓋内送達が可能となった［４２］。さらに、３−ＢＰは、イン・ビトロ及びイン・ビボで、ある種の化学療法剤と併用した場合に、化学増感効果を示している（［２３］での参考文献参照）。
【０００８】
臨床使用に基づくと、３−ＢＰ治療を受けた患者の２症例の報告がある［２５，４３］。一つの研究では、線維層板型肝細胞癌の若い成人がん患者に、３−ＢＰによる反復治療を行い、それは、経カテーテル動脈化学塞栓（ＴＡＣＥ）法によって送達したものであり、良好に耐容された。その患者は最終的に死亡したが、予想よりかなり長く生存した［４３］。他方の患者は、ステージＩＶ転移性メラノーマを呈する２８歳男性であり、３−ＢＰの静脈注入を受けた。この治療は、毒性が非常に低いように見えたが、それの抗がん効力は低く、患者は最終的に死亡した［２５］。
【発明の概要】
【０００９】
本発明の１態様では、
ａ．下記のものであるペリリルアルコール及び３−ブロモピルベートの複合体：
【化２】
2020512280.tif 000004
［３−ブロモ−２−オキソ−プロピオン酸４−イソプロペニル−シクロヘキサ−１−エンイルメチルエステル］、又は
ｂ．それの薬学的に許容される塩
が提供される。
【００１０】
第２の実施形態集合において、本発明は、３−ブロモ−２−オキソ−プロピオン酸４−イソプロペニル−シクロヘキサ−１−エンイルメチルエステルを含む医薬組成物に関するものである。これらの実施形態の一部において、その医薬組成物はさらに、薬学的に許容される賦形剤を含む。
【００１１】
第３の実施形態集合において、本発明は、処置を必要とする患者でのがんの治療方法であって、当該患者に対して、治療上有効量の３−ブロモ−２−オキソ−プロピオン酸４−イソプロペニル−シクロヘキサ−１−エンイルメチルエステルを投与することを含む方法に関するものである。これらの実施形態の一部において、前記がんは、肺がん、耳、鼻及び咽頭のがん、白血病、結腸がん、メラノーマ、膵臓がん、乳がん、前立腺がん、乳がん、造血系がん、子宮がん、基底細胞がん、胆道がん；膀胱がん；骨肉腫；乳がん；子宮頸がん；絨毛癌；結腸及び直腸がん；結合組織がん；消化系のがん；子宮内膜がん；食道がん；眼がん；頭頸部がん；胃がん；上皮内新生物；腎臓がん；喉頭がん；急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病などの白血病；肝臓がん；ホジキン及び非ホジキンリンパ腫などのリンパ腫；骨髄腫；線維腫、神経芽細胞腫；口腔がん（例えば、口唇、下、口及び咽頭）；子宮がん；膵臓がん；前立腺がん；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；直腸がん；腎臓がん；呼吸器系のがん；肉腫；皮膚がん；胃がん；睾丸がん；甲状腺がん；子宮がん及び泌尿器系のがんからなる群から選択される。
【００１２】
第４の実施形態集合において、本発明は、３−ブロモ−２−オキソ−プロピオン酸４−イソプロペニル−シクロヘキサ−１−エンイルメチルエステルの合成方法であって、
１，１−ジクロロジメチルエーテルをブロモピルビン酸と反応させて、３−ブロモピルビン酸クロライドを形成すること；及び
３−ブロモピルビン酸クロライドをペリリルアルコールと反応させて、３−ブロモ−２−オキソ−プロピオン酸４−イソプロペニル−シクロヘキサ−１−エンイルメチルエステルを形成すること
を含む方法に関するものである。
【００１３】
これらの実施形態の一部において、１，１−ジクロロジメチルエーテルをブロモピルビン酸と反応させる前記段階は、約０〜約２０℃の温度で行う。一部の実施形態において、３−ブロモピルビン酸クロライドをペリリルアルコールと反応させる前記段階は、約−１０〜約１０℃の温度で行う。一部の実施形態において、３−ブロモピルビン酸クロライドをペリリルアルコールと反応させる前記段階は、重炭酸ナトリウム及びｎ−ヘプタンの存在下に行う。
【００１４】
第５の実施形態集合において、本発明は、前記第４の実施形態集合内の方法のいずれかによる方法の生成物に関するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、ＮＥＯ２１８、ペリリルアルコール（ＰＯＨ）及び３−ブロモ−ピルベート（３−ＢＰ）の化学構造を示す図である。ＮＥＯ２１８は、ＰＯＨを３−ＢＰに共有結合的に結合させることで得られる。
【図２】図２は、ＮＥＯ２１８及び３−ＢＰについての６種類の異なる細胞系のそれぞれにおけるＭＴＴアッセイから得られる細胞生存率−薬剤濃度のプロットを示す図である。
【図３】図３は、３−ＢＰ、ＮＥＯ２１８及び３−ＢＰ＋ＰＯＨについての４種類の異なる細胞系のそれぞれにおけるＭＴＴアッセイから得られる細胞生存率−薬剤濃度のプロットを示す図である。
【図４】図４パネル（ａ）〜（ｄ）は、３種類の細胞系のそれぞれにおける３−ＢＰ、ＮＥＯ２１８及び３−ＢＰ＋ＰＯＨのそれぞれについてのＬＤＨ放出／毒性−薬剤濃度のプロットを示し、パネル（ｅ）は固定濃度の３−ＢＰ及びＮＥＯ２１８についてのＬＤＨ放出／毒性−時間のプロットを示す図である。
【図５】図５は、コロニー形成アッセイ（ＣＦＡ）から得られた二つの細胞系のそれぞれにおける、３−ＢＰ、ＮＥＯ２１８及び３−ＢＰ＋ＰＯＨのそれぞれについてのコロニーパーセント−薬剤濃度のプロットを示す図である。
【図６】図６は、スタウロスポリン及びＮＥＯ２１８による治療の効果を比較する、３−ＢＰ及びＮＥＯ２１８で処理した３種類の細胞系におけるアポトーシスマーカーの存在についてのウェスタンブロット分析を示す図であり、左側パネルは濃度基準であり、右側パネルは時間基準である。
【図７】図７は、ｚＶＡＤを含む場合及び含まない場合のＮＥＯ２１８及び３−ＢＰの両方についての細胞生存率−薬剤濃度のプロットを示す図である。
【図８】図８は、未処理細胞、並びに３−ＢＰ、ＮＥＯ２１８及びスタウロスポリンで処理した細胞のアネキシンＶ及びＰＩについてのＦＡＣＳ分析の結果の時系列分析を示す図である。
【図９】図９左側パネルは、処理３時間後の結腸がん細胞における％ＡＴＰ含有率のヒストグラムであり；右側パネルは、ＮＥＯ２１８及び３−ＢＰについての％ＡＴＰ−薬剤濃度のプロットである。
【図１０】図１０は、ＮＡＣ及びＧＳＨを含む場合及び含まない場合のＮＥＯ２１８及び３−ＢＰについての細胞生存率−薬剤濃度のプロットを示す図である。
【図１１】図１１は、ピルベートを含む場合及び含まない場合のＮＥＯ２１８及び３−ＢＰについての細胞生存率−薬剤濃度のプロットを示す図である。
【図１２】図１２の上側パネルは、ＮＥＯ２１８及び３−ＢＰについてのＧＡＰＤＨ活性−薬剤濃度のプロットを示す図であり；下側パネルは、ＮＡＣを含む、ＧＳＨを含む、そしていずれも含まないＮＥＯ２１８及び３−ＢＰについてのＧＡＰＤＨ活性のヒストグラムを示す図である。
【図１３】図１３は、ＧＡＰＤＨタンパク質のアミノ配列（一文字コードで）を示す図であり、マークを施してシステイン残基の存在を示している。
【図１４】図１４は、ウェスタンブロットで示されたＭＣＴ１の相当する発現レベルにわたって並べた、いくつかの細胞系でのＮＥＯ２１８及び３−ＢＰのそれぞれについての細胞傷害性ＩＣ５０を示す図である。
【図１５】図１５は、異種移植マウスモデルでのＮＥＯ２１８及び３−ＢＰのそれぞれについての腫瘍サイズ−時間のプロットを示す図である。
【図１６】図１６Ａ〜１６Ｃ。ＭＣＴ−１発現は、３−ＢＰ化学感受性と相関している。次の確立されたヒト細胞系を用いた：（Ａ）ＨＣＴ１１６結腸癌；（Ｂ）ＬＮ２２９、Ｔ９８Ｇ、及びＵ２５１神経膠芽腫；（Ｃ）ＭＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＢＴＭ−１２、及びＴ４７Ｄ乳癌；及びＭＥ１６Ｃ正常乳腺上皮細胞（テロメラーゼで不死化）。棒グラフは、２４時間ＭＴＴアッセイによって求めた、３−ＢＰ（明灰色）又はＮＥＯ２１８（暗灰色）による薬剤処理の２４時間後の各細胞系についての細胞傷害性ＩＣ５０を示す図である。エラーバー付きのバーは、３以上の測定値を表し、エラーバーのないグラフは二つの独立の測定値の平均を示す。中央のパネルは、負荷対照としてアクチンを用いるウェスタンブロットによって求めた、各細胞系についてのＭＣＴ−１タンパク質レベルを示す図である。
【図１７】図１７Ａ〜１７Ｃ。３−ＢＰ及びＮＥＯ２１８は、異なる細胞傷害性効果を発揮する。ＨＣＴ１１６（ＭＣＴ−１陽性）及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＭＣＴ−１陰性）細胞を、３−ＢＰ（菱形）又はＮＥＯ２１８（円形）の濃度を上昇させながら処理した。（Ａ）ＭＴＴアッセイを２４時間後に行った。未処理細胞の生存率を１００％に設定した（ｎ＝３）。（Ｂ）ＬＤＨアッセイを、１６時間後に行った。未処理細胞によるＬＤＨ放出を１に設定した。相対的増加倍率を示している（ｎ＝３）。（Ｃ）４８時間の薬剤処理、それに続く無薬剤でさらに１０〜１４日後に形成された相対コロニー数を示している。未処理対照細胞からのコロニー数を１００％に設定した（二つの独立の実験からの平均を示している）。全ての場合で、細胞には対照としてビヒクルのみの投与も行った。しかしながら、いずれのアッセイも、未処理若しくはビヒクル処理細胞間に差は見せなかった。
【図１８】図１８Ａ〜１８Ｃ：３−ＢＰ＋ＰＯＨの混合は、複合体化ＮＥＯ２１８の高効力を模倣することができない。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、３−ＢＰ（菱形）、ＮＥＯ２１８（円形）、ＰＯＨ（正方形）、又は３−ＢＰのＰＯＨとの等モル比混合（三角形）で、その濃度を上昇させながら処理した。（Ａ）ＭＴＴアッセイを２４時間後に行った。未処理細胞の生存率を１００％に設定した（データ点は、二つの実験の平均である。）。（Ｂ）ＬＤＨアッセイを２４時間後に行った。未処理細胞によるＬＤＨ放出を１に設定した。相対的増加倍率を示している（二つの実験からの平均）。（Ｃ）代表的な写真は、最初の４８時間の薬剤処理後の代表的コロニー形成を示している。ＰＯＨと混合した３−ＢＰ（３−ＢＰ＋ＰＯＨ）による組み合わせ処理の全ての場合で、示した濃度は各個々の薬剤を指す。即ち、１００μＭ  ３−ＢＰ＋ＰＯＨは、１００μＭ  ３−ＢＰを１００μＭ  ＰＯＨと組み合わせたことを意味する。
【図１９】図１９Ａ〜１９Ｃ：ＭＣＴ−１ノックダウンは、３−ＢＰに対する細胞感受性に影響するが、ＮＥＯ２１８については影響しない。ＨＣＴ１１６細胞を、ＭＣＴ−１で標的化されるｓｉＲＮＡ（円形）、又はスクランブル対照（菱形）でトランスフェクションした。（Ａ）３−ＢＰ及びＮＥＯ２１８に対する細胞感受性をＭＴＴアッセイによって求めた。点線及び矢印は、ＩＣ５０におけるシフトを示す。留意すべき点として、３−ＢＰ処理細胞では右側に顕著なシフトがあり（左側パネル）、それに対して、ＮＥＯ２１８処理細胞では左側へのわずかなシフトがあった（右側パネル）。（Ｂ）ＭＣＴ−１タンパク質レベルのノックダウンを、負荷対照としてアクチンを用いるウェスタンブロット分析によって確認した。（Ｃ）ＭＣＴ−１ノックダウンも、免疫細胞化学によって、個々の細胞レベルで確認した。この二つの写真は同様に露出過剰として、ＭＣＴ−１レベルにおける顕著な差を強調したものである。
【図２０】図２０Ａ〜２０Ｃ：３−ＢＰ処理は、耐性細胞について、どれがＮＥＯ２１８に対して感受性のままであるかを選択するものである。（Ａ）薬剤処理なしで（親細胞；左パネル）、及び４０μＭ  ３−ＢＰによる高毒性４８時間処理からの２週間回復後（３−ＢＰ生存細胞；右パネル）のＨＣＴ１１６細胞の免疫染色。矢印は、他の点ではＭＣＴ−１陽性親群中の少数の見かけ上ＭＣＴ−１陰性細胞を示している。ＭＣＴ−１の既知の膜貫通部位と一致する、陽性細胞における細胞膜の優先的染色を述べる；３−ＢＰ生存細胞において、そのような染色は全く検出できなかった。（Ｂ）３−ＢＰ濃度を上昇させながらの細胞の４８時間処理２週間後のＭＣＴ−１発現レベルのウェスタンブロット分析。上記で示したＩＨＣ染色と一致して、４０μＭ  ３−ＢＰによって、ＭＣＴ−１タンパク質が喪失した。ＧＡＰＤＨを負荷対照として用いた。（Ｃ）ＭＴＴアッセイで、３−ＢＰ生存細胞の化学感受性を、親細胞と比較した。両方の群を、３−ＢＰ又はＮＥＯ２１８で、その濃度を上昇させながら処理した。未処理細胞の生存率を１００％に設定した（ｎ≧３±ＳＥ）。
【図２１】図２１Ａ〜２１Ｃ：３−ＢＰ及びＮＥＯ２１８は壊死を引き起こす。（Ａ）ビヒクル、３０μＭ  ３−ＢＰ、３０μＭ  ＮＥＯ２１８、又は１μＭスタウロスポリン（ＳＴＳ）による２、４又は８時間処理後のＨＣＴ１１６細胞のＦＡＣＳ分析。Ｙ軸はヨウ化プロピジウム（ＰＩ）標識を示し、ｘ軸はアネキシンＶ標識を示す。各正方形の上二つの象限は壊死細胞を示し、下側右の象限はアポトーシス細胞を示す。（Ｂ）アポトーシスマーカーのウェスタンブロット分析。上側部分では、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、各種時間点で、３０μＭ  ＮＥＯ２１８又は１μＭ  ＳＴＳで処理した。下側部分では、ＨＣＴ１１６細胞を、示した濃度の３−ＢＰ、ＮＥＯ２１８、又はＳＴＳで１６時間処理した。全ての場合で、細胞溶解物を調製し、確立されたアポトーシスマーカーである開裂ＰＡＲＰ、開裂（即ち、活性化）カスパーゼ７（ｃｌ．Ｃ−７）、及びリン酸化（即ち、活性）Ｈ２ＡＸに関して分析した。アクチンを、負荷対照として用いた。（Ｃ）ＨＣＴ１１６細胞を、５０μＭ  Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫで１時間前処理してから、３−ＢＰ又はＮＥＯ２１８で、それの濃度を上昇させながら加えた。２４時間後に、ＭＴＴアッセイによって、細胞生存率を求めた。データ点は、ｎ＝３からの平均である。
【図２２】図２２：３−ＢＰ及びＮＥＯ２１８は、細胞ＡＴＰプールを枯渇させる。ＨＣＴ１１６細胞を、４０μＭ  ３−ＢＰ又はＮＥＯ２１８で処理した。基準点として、細胞を、グルコース非含有培地で１００ｎＭにも曝露した。３時間後及び６時間後に、ＡＴＰレベルを求めた。未処理細胞におけるＡＴＰレベルを１００％に設定した（２６．６ｎｍｏｌ／１０６細胞に相当）。
【図２３】図２３Ａ〜２３Ｃ：追加の抗酸化剤は薬剤効果を遮断するが、加えたピルベートは異なる結果を生じる。（Ａ）ＨＣＴ１１６細胞を、１ｍＭ  ＮＡＣ、１ｍＭ  ＧＳＨ、又は５０ｍＭメチル−ピルベート（又はピルビン酸ナトリウム、これは同様の結果を生じた）の存在下又は非存在下に４０μＭ  ３−ＢＰ又はＮＥＯ２１８で処理した。細胞生存率を、２４時間後にＭＴＴアッセイによって求めた。（Ｂ）ＨＣＴ１１６細胞を、３０又は１００μＭ  ３−ＢＰ又はＮＥＯ２１８で処理した。３０分後、細胞溶解物を調製し、ＧＡＰＤＨ活性について分析した。（Ｃ）非薬剤処理ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞からの溶解物を、Ａで挙げた濃度でＮＡＣ又はＧＳＨの存在下又は非存在下に３−ＢＰ又はＮＥＯ２１８と混合した。１時間のインキュベーション後、ＧＡＰＤＨ活性を求めた。薬剤処理なしでのＧＡＰＤＨ活性を１００％に設定した（０．０６単位／分×１０６細胞に相当）。
【図２４】図２４Ａ〜２４Ｃ：ＮＥＯ２１８は、ＧＡＰＤＨ、ＧＳＨ及びＮＡＣと直接相互作用する。ＮＥＯ２１８の異なる標的との直接相互作用を、ＬＣ／ＭＳ分析によって分析した。（Ａ）精製ウサギＧＡＰＤＨタンパク質を、３−ＢＰ又はＮＥＯ２１８とともに１５分間インキュベートし、次にＬＣ／ＭＳ分析を行った。ＧＡＰＤＨタンパク質は、指定の位置で４個のシステイン（Ｃｙｓ）を含み、４個全てが３−ＢＰの場合はピルベート部分で、そしてＮＥＯ２１８の場合はピルベート−ペリリルアルコール部分（ｐｙｒによって示される）で修飾されていることが確認された。（Ｂ）質量／電荷（ｍ／ｚ）値を５２８〜５２９に制限したＮＥＯ２１８及びＧＳＨの反応生成物の抽出イオンクロマトグラム（ＸＩＣ）。そのクロマトグラム（挿入パネル）は、ＮＥＯ２１８及びＧＳＨの求核置換反応に相当する５２８．２０１（名目質量ピーク）の精密イオン質量を有する一価反応生成物の存在を示している。５２９．２０４のピークの位置及び相対的な大きさは、反応生成物の１３Ｃ同位体ピークに相当する。（Ｃ）ＮＡＣのＮＥＯ２１８との反応によって、イオンマップ（上側パネル）に示したいくつかの生成物が生じた。ｍ／ｚ５３９及び５４１の共溶出ツイン同位体が等しく分布しており（上側パネルにおける挿入図）、それを選択して、下側パネル中の二つのクロマトグラムに示したように、さらに分析した。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
二つの異なる分子、３−ブロモピルベート（３−ＢＰ）及びペリリルアルコール（ＰＯＨ）を共有結合的に連結させることで、新規な化学物質を合成した。この化合物は、本明細書において、ＮＥＯ２１８と称される場合がある。図１は、ＮＥＯ２１８の化学構造を示している。
【００１７】
本明細書では、下記の略称を用いる。
【００１８】
ｃ．３−ＢＰ：３−ブロモピルベート；
ｄ．Ｃ７：カスパーゼ７；
ｅ．Ｄｏｘ：ドキソルビシン；
ｆ．ＦＡＣＳ：蛍光活性化細胞分類；
ｇ．ＧＡＰＤＨ：グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ；
ｈ．ＧＳＨ：グルタチオン；
ｉ．ＩＣ５０：阻害濃度
ｊ．５０％；ＬＤＨ：乳酸デヒドロゲナーゼ；
ｋ．ＭＣＴ１：モノカルボン酸輸送体１；
ｌ．ＭＴＴ：３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド；
ｍ．ＮＡＣ：Ｎ−アセチル−システイン；
ｎ．ＮＥＯ２１８：３−ブロモ−２−オキソ−プロピオン酸４−イソプロペニル−シクロヘキサ−１−エンイルメチルエステル；
ｏ．ＰＡＲＰ：ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ；
ｐ．ＰＩ：ヨウ化プロピジウム；
ｑ．ＰＯＨ：ペリリルアルコール；
ｒ．ＳＴＳ：スタウロスポリン；及び
ｓ．ＴＭＺ：テモゾロマイド。
【００１９】
実施例１：ＰＯＨ−ブロモピルベート（３−ブロモ−２−オキソ−プロピオン酸４−イソプロペニル−シクロヘキサ−１−エンイルメチルエステル）の製造
【化３】
2020512280.tif 000005
【００２０】
１，１−ジクロロジメチルエーテル（２．５ｇ、２１．７４ｍｍｏｌ）を、温度を２０℃以下に維持しながら、固体ブロモピルビン酸（１）にゆっくり加えた。得られたスラリーをゆっくり加熱して５０℃とし、２．５時間攪拌した。得られた透明溶液を冷却し、過剰のジクロロジメチルエーテルを減圧下に濃縮して、９５％より高い収率で３−ブロモピルビン酸クロライド（２）を得た。
【００２１】
３−ブロモピルビン酸クロライド（２．０ｇ、１０．７８ｍｍｏｌ）を、温度を１０℃以下に維持しながら、ペリリルアルコール（３）（１．５ｇ、９．８５ｍｍｏｌ）、重炭酸ナトリウム（１１．９０ｍｍｏｌ）、及びｎ−ヘプタン（１８０ｍＬ）の冷混合物に加えた。混合物を１０℃で２０分間攪拌し、昇温させて室温とした。反応混合物を１８時間攪拌し、水で反応停止した（７５ｍＬ）。有機層を分離し、ブライン（７５ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水した。濾過した有機層を減圧下に濃縮し、カラムクロマトグラフィー［ＴｈｏｍｓｏｎシングルＳｔＥＰ  ４０ｇカラム、カラム寸法：直径１．５ｃｍ、長さ：３０ｃｍを使用］によって精製し、ヘキサンで溶離した。類似の分画を合わせ、減圧下に濃縮して、３−ブロモ−２−オキソ−プロピオン酸４−イソプロペニル−シクロヘキサ−１−エンイルメチルエステル（４）を淡黄色油状物として得た。重量：０．７（２４％）。％。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ１．４７（ｍ、１Ｈ）、１．７４（ｓ、３Ｈ）、１．８５（ｍ、３Ｈ）、２．０２（ｍ、２Ｈ）、２．１６（ｍ、４Ｈ）、３．８５（ｓ、２Ｈ）、４．５６（ｓ、２Ｈ）、４．７４（ｄ、２Ｈ）、５．８１（ｂｒｓ、１Ｈ）。
【００２２】
前臨床試験
一連の前臨床イン・ビトロ及びイン・ビボ実験を行って、ＮＥＯ２１８の強力な抗がん活性を特徴付けし、確立した。代表的な結果を下記で提供する。
【００２３】
イン・ビトロ腫瘍細胞評価
ＮＥＯ２１８の腫瘍細胞殺滅力を、イン・ビトロ短期ＭＴＴアッセイ（代謝活性を求めることで細胞の生存率を測定する）、ＬＤＨアッセイ（細胞死滅を示す漏出細胞膜の指標としての乳酸デヒドロゲナーゼの放出を測定）、及びコロニー形成アッセイ（ＣＦＡ、薬剤処理細胞の長期生存率及びそれらが子孫のコロニーを産む能力を求めるもの）によって特徴付けた。乳房のがん由来のいくつかの確立された細胞系を標的細胞として用い（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１；ＭＤＡ−ＭＢ−４６８；Ｔ４７Ｄ；ＭＣＦ７；ＭＣＦ７／Ｄｏｘ；ＢＴＢ１２）、脳（Ｔ９８Ｇ；Ｕ２５１）、卵巣（Ａ２７８０）、及び結腸（ＨＣＴ１１６）の細胞系も用いた。いずれの場合も、培養細胞を、２４時間又は４８時間にわたり、薬剤濃度を上昇させながら、それに曝露した。
【００２４】
異なるがん種からの細胞系を、３−ブロモピルベート（３−ＢＰ）又はＮＥＯ２１８の濃度を上昇させながら、それによって処理した。４８時間後、ＭＴＴアッセイによって、細胞生存率を測定した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＴ４７Ｄは乳がん細胞であり；Ｔ９８Ｇ及びＵ２５１は脳腫瘍（神経膠芽腫）細胞であり；ＨＣＴ１１６は結腸がん細胞であり；Ａ２７８０は子宮がん細胞である。図２は、ＭＴＴアッセイからの６種類の細胞系のそれぞれにおけるＮＥＯ２１８及び３−ＢＰについての細胞生存率−薬剤濃度プロットを示す。
【００２５】
図示のように、ＮＥＯ２１８は、全ての細胞系で、３−ＢＰより強力ながん細胞殺滅効果を発揮し、それのＩＣ５０は１５〜４０μＭの範囲であった。これらの細胞系のうちの４種類において、ＮＥＯ２１８と３−ＢＰの細胞傷害性の間に非常に大きい差異があったが、他の２種類では、小さな差しかなかった。図２は、ＮＥＯ２１８が３−ＢＰより大きい抗がん効果を有することを示している。
【００２６】
異なる腫瘍細胞系を、ＰＯＨと混合した３−ＢＰで処理し、その効果を、ＮＥＯ２１８の効果、並びに３−ＢＰ単独の効果と比較した。細胞を２４時間処理してから、ＭＴＴアッセイを行って、細胞生存率を測定した。
【００２７】
図３は、３−ＢＰ、ＮＥＯ２１８及び３−ＢＰ＋ＰＯＨについての、４種類の異なる細胞系のそれぞれにおけるＭＴＴアッセイで得られた細胞生存率−薬剤濃度のプロットを示している。全ての場合で、その二つの構成成分の混合は、ＮＥＯ２１８のかなり高い細胞傷害力を達成しなかった。むしろ、ＰＯＨを３−ＢＰに加えても、３−ＢＰ単独の場合と比べて傷害性の上昇はなかった。図３の下側パネルは、ＰＯＨ単独では強力な細胞傷害力は発揮されず、ＩＣ５０を達するには５００μＭ以上の濃度が必要であったことを示している。明らかに、ＮＥＯ２１８は、他のいずれの処理よりもかなり強力であった。これらの結果は、ＮＥＯ２１８の抗がん効果が、それの個々の成分を混合することで模倣され得ないという驚くべき所見に対するさらなる証拠を提供するものである。
【００２８】
３−ＢＰ、ＰＯＨ及び３−ＢＰ＋ＰＯＨと比較してＮＥＯ２１８が急速に細胞を殺滅する能力を、ＬＤＨ放出を細胞死の代替指標として用いるＬＤＨアッセイによって評価した。図４パネル（ａ〜ｄ）は、３種類の細胞系のそれぞれにおける、３−ＢＰ、ＮＥＯ２１８及び３−ＢＰ＋ＰＯＨのそれぞれについてのＬＤＨ放出／毒性−薬剤濃度のプロットを示すものであり、パネル（ｅ）は、固定濃度の３−ＢＰ及びＮＥＯ２１８についてのＬＤＨ放出／毒性−時間のプロットを示すものである。
【００２９】
図４において、パネル（ａ）及び（ｂ）は、ＮＥＯ２１８、３−ＢＰ、又はＰＯＨと混合した３−ＢＰの濃度を上昇させながらの、それによる乳がん細胞系の処理の結果を示している。パネル（ｃ）は、結腸がん細胞のＮＥＯ２１８又は３−ＢＰによる処理の結果を示している。パネル（ｄ）は、ＰＯＨの濃度を上昇させながらの、それによる二つの乳がん細胞系の処理の結果を示している。全ての場合ａ〜ｄにおいて、ＬＤＨの放出（細胞死のマーカーとして）を２４時間後に測定した。パネル（ｅ）は、ＮＥＯ２１８及び３−ＢＰ（個々に）による処理に応答したＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳がん細胞におけるＬＤＨ放出の時間経過を示している。
【００３０】
パネル（ａ〜ｂ）に示されたように、３−ＢＰのＰＯＨとの混合は、ＮＥＯ２１８のかなり高い毒性力に到達しない。ＨＣＴ１１６細胞では、パネル（ｃ）に示されたように、ＮＥＯ２１８及び３−ＢＰは同様の効力を発揮する。パネル（ｄ）に示されたように、ＰＯＨ自体は、細胞殺滅（即ち、ＬＤＨ放出）を達成するのにかなり高い濃度を必要とする。ＮＥＯ２１８の細胞傷害効果は、パネル（ｅ）に示されたように、薬剤処理開始後１時間という早い時点で検出することができ、細胞死の最大半量範囲には、８時間の前に到達する。
【００３１】
３−ＢＰ、ＰＯＨ及び３−ＢＰ＋ＰＯＨと比較した腫瘍細胞生存率及びコロニー形成に対するＮＥＯ２１８の効果を、コロニー形成アッセイ（ＣＦＡ）によって評価した。細胞６００個／培養ウェルを接種し、ＮＥＯ２１８、３−ＢＰ、３−ＢＰ＋ＰＯＨの混合、又はＰＯＨ単独の濃度を上昇させながら、それに曝露させた。２４時間後、全ての薬剤を細胞から除去し、新鮮な培地を加えた。１０〜１５日後、生存細胞が子孫のコロニーを形成しており、それを染色及びカウントした。全ての数字を、薬剤処理を全く受けなかった設定で形成されたコロニーの数（１００％に設定）と比較した。
【００３２】
図５は、ＣＦＡから得られた二つの細胞系のそれぞれにおける、３−ＢＰ、ＮＥＯ２１８及び３−ＢＰ＋ＰＯＨのそれぞれについてコロニーパーセント−薬剤濃度のプロットを示している。データは、ＮＥＯ２１８が細胞生存及びコロニー形成を強く防止し、ＩＣ５０が＜１０μＭであったことを示している。３−ＢＰはかなり効力が低く、３−ＢＰのＰＯＨとの混合によって、３−ＢＰ単独による処理の場合より阻害効果が高くなるわけではない。ＰＯＨ自体はかなり効果がなく、図５の下右パネルに示したように、１０００μＭまでの濃度でＩＣ５０に達しなかった。
【００３３】
結果を図２〜５によって表した全ての実験設定で、ＮＥＯ２１８による細胞の処理により、３−ＢＰによる処理より高い毒性が生じた。ＮＥＯ２１８のＩＣ５０（細胞生存を５０％だけ低下させる薬剤の能力）は、全ての細胞型で５〜３０μＭの範囲であり、３−ＢＰのＩＣ５０は１０〜２００μＭの範囲であった。注目すべき点として、細胞の一つの群が二つの薬剤に対する感受性において小さい差しか見せず、細胞の他方の群が非常に大きい差を示したという点で、明瞭な細胞型特異的な差があった。例えば、図２〜５に示されたように、ＮＥＯ２１８及び３−ＢＰのＩＣ５０は、ＨＣＴ１１６細胞と非常に類似していたが、全ての乳がん細胞はＮＥＯ２１８に対して感受性であったが、３−ＢＰに対して抵抗性であった。
【００３４】
個別には、３−ＢＰ及びＰＯＨはそれぞれ、細胞傷害能力を有する。しかしながら、驚くべきことに、ＮＥＯ２１８の細胞傷害能力が、図３〜５によって示したように、３−ＢＰ及びＰＯＨの細胞傷害力の合計より大きいことが認められており、これが当てはまらないことを示している。ＰＯＨ単独では、細胞傷害力は非常に低く、ＩＣ５０は全ての細胞で数百μＭである。ＰＯＨを３−ＢＰに加えること、即ち、細胞を３−ＢＰ＋ＰＯＨの混合に曝露しても、ＮＥＯ２１８のかなり高い効力に似せることはできず、これはＮＥＯ２１８の細胞傷害力がそれの構成部分の合計より大きいことを示している。
【００３５】
腫瘍細胞のパネルには、従来の化学療法剤に対して抵抗性であることが知られている二つの細胞系を含めた。例えば、Ｔ９８Ｇ神経膠芽腫細胞は、悪性神経膠腫患者に関しての化学療法ケアの現在の標準であるテモゾロマイド（ＴＭＺ）に対して抵抗性である［４４］。ＭＣＦ７／Ｄｏｘ乳がん細胞は、ドキソルビシン及びいくつかの他の薬剤に対して抵抗性であり；実際、それらは多剤耐性（ｍｄｒ）表現型を示す［４５］。薬剤耐性表現型であったとしても、両細胞型ともＮＥＯ２１８によって効果的に殺滅され、それは、Ｔ９８Ｇ細胞については図２に示され、ＭＣＦ７／Ｄｏｘ細胞に関しては図３及び５に示されている。従って、ＮＥＯ２１８が、非常に薬剤耐性であるがん細胞を効果的に死滅させることが明らかになった。
【００３６】
概して、細胞死の主たる機序は、アポトーシス及び壊死である。アポトーシス細胞死の確立されたマーカーは、カスパーゼ類の活性化であり、それはプロカスパーゼのそれの開裂（即ち、活性化）断片への変換によって明らかになり得る［４６］。さらなるマーカーは、ＰＡＲＰ（ポリ−（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ）のタンパク質分解開裂［４７］及び□−Ｈ２ＡＸタンパク質の出現［４８］である。これら全てのアポトーシス指標は、ウェスタンブロット分析によって検出することができる。
【００３７】
ＮＥＯ２１８がアポトーシスを誘発する能力を、一連の実験で評価した。３種類の異なる細胞系を、３−ＢＰ及びＮＥＯ２１８で処理した。薬剤処理細胞を回収し、細胞溶解物を、下記の３種類の確立されたアポトーシスマーカーの存在に関して、ウェスタンブロットによって分析した。
【００３８】
開裂カスパーゼ７（ｃｌ．Ｃ７）；
開裂（ｃｌ．）−全長（ｆ．ｌ．）ＰＡＲＰ；及び
γ−Ｈ２ＡＸの誘発（ＤＮＡ開裂を示す）。
【００３９】
ｃｌ．Ｃ７及びｃｌ．ＰＡＲＰの出現は、進行中のアポトーシスプロセスを示すものである。全ての場合で、溶解物について、対照としてのアクチンの存在も調べた。
【００４０】
２種類の乳がん細胞系（ＭＣＦ７及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１）及び１種類の結腸がん細胞系（ＨＣＴ１１６）を、ＮＥＯ２１８又は３−ＢＰの濃度を上昇させながら、それによって処理した。対照として、それらを、既知の強力なアポトーシス誘発剤であるスタウロスポリン（ＳＴＳ）でも処理した［４９］。アポトーシスマーカーの存在についてのウェスタンブロット分析を、図６の左側パネルに示している。ＳＴＳによる処理によって、アポトーシスマーカーの顕著な出現が生じるが、ＮＥＯ２１８又は３−ＢＰによる処理ではそれはない。
【００４１】
スタウロスポリン及びＮＥＯ２１８による細胞処理の時間経過の結果を、図６の右側パネルに示している。細胞のスタウロスポリンによる処理が、３種類全てのアポトーシスマーカーの顕著な誘発を引き起こすことが示されている（アポトーシスを引き起こす薬剤から予想されるように）。それと比較して、ＮＥＯ２１８は、これらの同じマーカーにほとんど影響せず、それは、ＮＥＯ２１８処理細胞における生物学的に関連するアポトーシスがないことをさらに裏付けるものである。従って、ＮＥＯ２１８が実質的にアポトーシスを回避することが明らかになっている。
【００４２】
ＮＥＯ２１８がアポトーシスを誘発する能力を、ＭＴＴアッセイを用いる一連の実験でさらに評価した。汎カスパーゼ阻害剤として作用する薬剤であるアポトーシス遮断剤ｚＶＡＤ（ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ）を用いた。ＨＣＴ１１６結腸がん細胞を、５０μＭ  ｚＶＡＤで又はそれを用いずに１時間処理し、次に、ＮＥＯ２１８又は３−ＢＰの濃度を上昇させながら、それによって処理した。それから２４時間後、細胞生存率を、ＭＴＴアッセイによって求めた。
【００４３】
図７は、ｚＶＡＤ存在下及び非存在下で、ＮＥＯ２１８（左側パネル）及び３−ＢＰ（右側パネル）の両方についての細胞生存率−薬剤濃度のプロットとしてのＭＴＴアッセイの結果を示している。細胞のｚＶＡＤによる前処理によって、ＮＥＯ２１８又は３−ＢＰによる細胞死誘発を防止せず、それは、これら２薬剤によって誘発される細胞死がカスパーゼ活性化などの代表的なアポトーシス機序に関与しなかったことを示しており、従って、ＮＥＯ２１８が実質的にアポトーシスを回避するという所見を裏付けるものである。
【００４４】
アポトーシス機序がＮＥＯ２１８によって誘発される細胞死において重要な役割を果たしたことを示す指標がない場合は、壊死を、可能な主要機序として調べた。非薬剤処理細胞（対照として）と比較して、薬剤処理細胞のアネキシンＶ染色（アポトーシスのマーカー）及びＰＩ（ヨウ化プロピジウム）染色（壊死のマーカー）を測定することで、アポトーシスと壊死細胞死の間の区別を行った。２、４若しくは８時間の処理後のＦＡＣＳ分析によって、アネキシンＶ及びＰＩの測定を行った。細胞をＮＥＯ２１８、３−ＢＰ、及びスタウロスポリン（個別に）によって処理し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ、壊死細胞死のマーカー）又はアネキシンＶ（アポトーシスのマーカー）の取り込みを蛍光活性化細胞分類によって求めた。
【００４５】
結果を、次のように図８に整理した：処理なし（最上列）、３−ＢＰ（第２列）、ＮＥＯ２１８（第３列）、及びスタウロスポリン（最下列）。各個々の四角形（４象限からなる）は、生存細胞（左下象限）、アポトーシス細胞（右下象限）、及び壊死細胞（左上及び右上象限）のパーセントを示している。
【００４６】
ＮＥＯ２１８（及び３−ＢＰ）は、ＰＩの活発な取り込みを生じたが、アネキシンＶの取り込みはほとんどなかった。逆に、スタウロスポリン処理によってアネキシンＶの取り込みが生じたが、ＰＩの取り込みはごくわずかであった。未処理細胞は、約９０％生存率を示している。ＮＥＯ２１８処理細胞及び３−ＢＰ処理細胞において、細胞の上側象限への大きさシフトがあり、それは、壊死が細胞死の主要なタイプであることを示している。対照的に、スタウロスポリン（既知のアポトーシス誘発剤）は細胞を右下に優先的にシフトさせ、それは、顕著なアポトーシスが主たるタイプの薬剤誘発細胞死であることを示している。従って、ＮＥＯ２１８は、実質的に壊死によって細胞死を引き起こす。
【００４７】
総合すると、これらの結果は、アポトーシスではなく壊死が、ＮＥＯ２１８による処理によって誘発される細胞死の主たる機序であることを示している。この結論は、細胞死の時間経過を観察することによってさらに裏付けられる。図８において、並びに図４（下側パネル）におけるＬＤＨ放出の時間経過において、ＮＥＯ２１８は、細胞死をかなり急速に、即ち１〜２時間以内に開始させる。急速な細胞死は、アポトーシス（通常、かなり遅い非常に組織化されたプロセスである）ではなく、壊死の徴候である。
【００４８】
ＮＥＯ２１８が壊死細胞死を引き起こすことが確認されたので、この結果の原因となり得る異なる主要事象を調べた。細胞内ＡＴＰプールの約３０％以下のレベル低下により、壊死細胞死が生じることが知られている［５３，５４］。これらの低ＡＴＰレベルでは、細胞は、必須の機能を維持することはできない。同様に、アポトーシスは、エネルギーを必要とする高度に組織化された「プログラムされた」プロセスであることから、これらの低ＡＴＰレベルもアポトーシスを防止し、代わりに、細胞は強制的に壊死することになる。従って、細胞エネルギーレベル、特にはＡＴＰ（アデノシン三リン酸、細胞内エネルギー移動の主要単位）の量に対するＮＥＯ２１８の効果を調べた。
【００４９】
ＨＣＴ１１６結腸がん細胞を、ＮＥＯ２１８、３−ＢＰ；ロテノン（呼吸鎖を遮断するミトコンドリア毒）；グルコースを含まない培地（「ｎｏ  ｇｌｕｃ」；解糖を遮断するため）；及び、無グルコースと組み合わせたロテノン（全ての細胞内ＡＴＰ産生を停止するため）で処理した。処理３時間後、市販のＡＴＰ検出アッセイキットを用いて、存在するＡＴＰの相対レベルを求めた。
【００５０】
結果を図９に示している。左側パネルは、未処理細胞の場合と比較した各処理経過から生じる％ＡＴＰ含有率のヒストグラムを示している。
【００５１】
右側パネルは、ＮＥＯ２１８及び３−ＢＰについての％ＡＴＰ−薬剤濃度のプロットである。
【００５２】
図９は、ＮＥＯ２１８又は３−ＢＰによる処理が細胞ＡＴＰプールのレベルを激減させ得ることを示している。このエネルギー消耗は、グルコース不在下でのロテノンによる細胞の処理によって達成される消耗と同様に有効であった。ロテノンはミトコンドリア呼吸の阻害剤であり；グルコースがないことで解糖流動が防止され；結果的に、細胞の増殖培地からのグルコース除去とロテノンの組み合わせによって、二つの中心的な細胞エネルギー産生経路である解糖及び呼吸の遮断に至るであろう。図９に示したように、ＮＥＯ２１８処理に応答したＡＴＰレベルの低下は、呼吸阻害と組み合わせた解糖の遮断によって引き起こされる効果と同様であり、それは、ＮＥＯ２１８によって引き起こされる強力なエネルギー消耗のベンチマークを提供するものである。この文脈で、ＮＥＯ２１８が、細胞エネルギーの効率的消耗を介して、壊死細胞死を誘発すると結論付けることができる。
【００５３】
細胞ストレス条件、特には酸化的ストレスは、既知の腫瘍細胞死の要因である。この側面を調べるため、二つの強力な抗酸化剤であるＮＡＣ（Ｎ−アセチル−システイン）及びＧＳＨ（グルタチオン）を用いて、それらがＮＥＯ２１８誘発細胞死を低下させ得るか否かを求めた。ＮＡＣは、アミノ酸であるシステインのＮ−アセチル誘導体であり；それは、アセトアミノフェン過量摂取を治療するのに用いられる医薬である［５０］。ＧＳＨは、全ての細胞によって産生さえるトリペプチドである［５１］。両方の化合物ともフリーラジカルを隔離することで、重要な細胞成分に対する損傷を防止する［５２］。
【００５４】
腫瘍細胞を、ＮＥＯ２１８又は３−ＢＰと組み合わせて、ＮＡＣ又はＧＳＨで処理した。ＨＣＴ１１６細胞を、５ｍＭ  ＮＡＣ又は１ｍＭ  ＧＳＨの存在下又は非存在下に、ＮＥＯ２１８及び３−ＢＰ（個別に）の濃度を上昇させながら、それによって処理した。２４時間後、細胞生存率をＭＴＴアッセイによって求めた。
【００５５】
図１０は、ＮＡＣ及びＧＳＨ存在下又は非存在下での、ＮＥＯ２１８及び３−ＢＰについての細胞生存率−薬剤濃度のプロットを示している。そのデータは、両方の抗酸化剤とも、ＮＥＯ２１８又は３−ＢＰによって誘発される細胞死を強力に防止したことを示している。実際、これら二つのラジカル捕捉剤のどちらの存在下でも、薬剤誘発細胞死は完全に防止された。これらの結果は、ＮＥＯ２１８（及び３−ＢＰ）がフリーラジカルの発生による細胞死を引き起こすという仮説と一致するものである。
【００５６】
３−ＢＰは、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ）の酵素活性を阻害することが知られており、それによって、解糖流動の阻害が生じる。ピルベート（ピルビン酸）は、いくつかの代謝経路における重要な中間体であり、解糖経路の最終産生物を代表するものである。結果的に、ピルベートの添加が、この効果をレスキューし、３−ＢＰの存在下での細胞生存度を保証するものと仮定された。
【００５７】
この仮説を調べるため、ＨＣＴ１１６細胞を、１０ｍＭピルベートの存在下又は非存在下で、ＮＥＯ２１８及び３−ＢＰ（個別に）の濃度を上昇させながら、それによって処理した。細胞の生存率を、ＭＴＴ細胞生存率アッセイによって２４時間後に求めた。
【００５８】
図１１は、ピルベート存在下及び非存在下での、ＮＥＯ２１８及び３−ＢＰについての細胞生存率−薬剤濃度のプロットを示している。３−ＢＰの場合、予想通り、過剰のピルベートが細胞死を完全に防止することができた。しかしながら、ＮＥＯ２１８の場合、ピルベートは、生存率に対して全く効果がなかった。即ち、この代謝産物は、ＮＥＯ２１８処理細胞をレスキューできなかった。このデータは、ＮＥＯ２１８が実質的にＧＡＰＤＨ機能を阻害することを示している。
【００５９】
無細胞系でのＧＡＰＤＨの酵素機能を阻害するＮＥＯ２１８の能力を調べた。細胞溶解物をＮＥＯ２１８及び３−ＢＰ（個別に）と１時間インキュベートし、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ）の酵素活性を求めた。ＮＥＯ２１８及び３−ＢＰの濃度上昇を行った。別個に、５０μＭ  ＮＥＯ２１８及び３−ＢＰをそれぞれ、１ｍＭ  ＮＡＣ又はＧＳＨとともに施した。ＧＡＰＤＨの酵素活性を、市販のＧＡＰＤＨ活性アッセイキットを用いて求めた。
【００６０】
図１２の上側パネルは、ＮＥＯ２１８及び３−ＢＰについてのＧＡＰＤＨ活性−薬剤濃度のプロットを示しており；下側パネルは、ＮＡＣ存在下、ＧＳＨ存在下、及びそのいずれも非存在下でのＮＥＯ２１８及び３−ＢＰについてのＧＡＰＤＨ活性のヒストグラムを示している。ＮＥＯ２１８及び３−ＢＰの両者とも、ＧＡＰＤＨ酵素活性の強力な阻害を引き起こしたが（上側パネル）、抗酸化剤ＮＡＣ又はＧＳＨの添加によって、ＧＡＰＤＨ活性の薬剤誘発阻害が効果的に防止された（下側パネル）。ＮＡＣ及びＧＳＨの保護効果は、極めて有意なものであった（星印：ｐ値＜０．０１）。そのデータは、ＮＥＯ２１８がＧＡＰＤＨ酵素活性を実質的に阻害することを示している。ＮＥＯ２１８（及び３−ＢＰ）は、細胞死誘発で有効であるＩＣ５０と同様であるＩＣ５０でＧＡＰＤＨを阻害した。ＮＡＣ又はＧＳＨを加えることで、ＮＥＯ２１８又は３−ＢＰによるＧＡＰＤＨ阻害が効果的に防止され、それは、これらの測定に用いられた無細胞系がフリーラジカルを発生させることができなかったはずであることから興味深いものであった。従って、ＮＡＣ及びＧＳＨが、損傷を与えるラジカルを抑制する以外の機序によって保護効果を発揮したことは事実であろう。
【００６１】
次に、そのタンパク質について、質量分析を行った。読み出し値の分析により、ピルビン酸化によって修飾された二つのシステイン残基（位置２４５及び２８２；楕円によって示されている）が明らかになった。他の二つのシステイン残基（位置１５０及び１５４；長方形によって示されている）は修飾されなかった。
【００６２】
精製ＧＡＰＤＨタンパク質３０μｇを、６０μＭ  ３−ＢＰとともに３７℃で１５分間、イン・ビトロでインキュベートした。次に、質量分析を用いて、３−ＢＰが酵素のアミノ酸配列に直接結合できたか否かを決定した。
【００６３】
図１３には、ＧＡＰＤＨタンパク質のアミノ配列（一文字コードで）を示しており、システイン残基の存在を示すマークが施してある。ＧＡＰＤＨに含まれる４種類のシステインのうちの二つが、修飾されていることが認められた。アミノ酸位置２４５及び２８２のシステインがピルビン酸化されていることが分かった。ＮＥＯ２１８が同じ結果を達成し得る可能性があり、従って、ＧＡＰＤＨがＮＥＯ２１８によるアルキル化の主要な標的を代表するものであり、ＮＥＯ２１８が細胞エネルギー産生を遮断する機序の少なくとも一部を代表すると結論付けられる。
【００６４】
ＮＥＯ２１８の効果の一部は３−ＢＰの効果と同様であったが、これら二つの薬剤間で認められた主要な差は、それらの細胞死誘発能力であった。ＮＥＯ２１８は低濃度で（ＩＣ５０：５〜３０μＭ）全ての腫瘍細胞種を死滅させたが、３−ＢＰは、それが一部の細胞種で同様に強力であったが、他の細胞種ではかなり高い濃度（＞２００μＭ）を必要としたという点で、明瞭な差異を示した。
【００６５】
３−ＢＰは、モノカルボン酸膜貫通輸送体（ＭＣＴ類）の一つを介して細胞に進入することが知られている［３１，５５］。異なる腫瘍細胞系におけるＭＣＴ１の発現レベルをウェスタンブロット分析によって求め、ＭＴＴアッセイによって得られた、同じ細胞のＮＥＯ２１８又は３−ＢＰによる処理に応答した細胞傷害性ＩＣ５０値と相関させた。
【００６６】
図１４は、いくつかの細胞系でのＮＥＯ２１８及び３−ＢＰのそれぞれにおける細胞傷害性ＩＣ５０を示しており、ウェスタンブロットで示したように、ＭＣＴ１の相当する発現レベルにわたって整列させている。
【００６７】
異なる腫瘍細胞は、かなり多様なＭＣＴ１発現レベルを示した。興味深いことに、低ＭＣＴ１レベルを有する細胞（ＭＣＦ７、２３１、Ｔ４７Ｄ、ＢＴＢ−１２）は３−ＢＰに対して抵抗性の細胞であり（即ち、ＩＣ５０＞３００μＭ）、高ＭＣＴ１レベルの細胞（ＭＥ１６Ｃ、４６８、ＨＣＴ１１６）は３−ＢＰ（ＩＣ５０＜１００μＭ）による殺滅に感受性の細胞であった。それと比較して、ＭＣＴ１発現レベルとは無関係に、全ての細胞が、ＮＥＯ２１８に対して非常に感受性であった（ＩＣ５０＜３５μＭ）。
【００６８】
ＭＣＴ１発現レベルのＮＥＯ２１８及び３−ＢＰに対する細胞の感受性とのこの位置合わせに基づくと、（３−ＢＰとは異なって）ＮＥＯ２１８が、細胞に進入し、細胞傷害力を発揮するのにＭＣＴ１による活発な取り込みを必要としないことが認められる。結果的に、ＮＥＯ２１８は、ＭＣＴ１発現に対して陽性であるものだけではく、全ての腫瘍型でそれの抗がん活性を示すと予想される。
【００６９】
次に、イン・ビボのＮＥＯ２１８の抗がん活性を調べた。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１トリプル陰性乳がん細胞を、ヌードマウス１２匹に皮下的に埋め込んだ。２週間後、ビヒクル（無薬剤）又はＮＥＯ２１８（５ｍｇ／ｋｇ）のいずれかによる処理のため、動物を２群に分けた。次に、ＮＥＯ２１８（又はビヒクル）を、第１日、第５日及び第９日に投与した（合計３用量、４日間隔）。腫瘍増殖を、第１日（＝処理開始）から第１３日（実験終了）まで３日ごとにキャリパーで測定した。
【００７０】
図１５は、ＮＥＯ２１８及び３−ＢＰのそれぞれについての腫瘍サイズ−時間のプロットを示している。それらのパネルは、各個々の動物における経時的な腫瘍増殖を示している。左側パネルはビヒクル投与を受けたマウス６匹での腫瘍増殖を示しており；右側パネルはＮＥＯ２１８によって処理された動物６匹での腫瘍増殖を示している。
【００７１】
図１５に示したように、ＮＥＯ２１８処理動物は、ビヒクル処理動物のほとんどが示した顕著な腫瘍増殖増加を示さなかった。ＮＥＯ２１８処理マウスにおいて、全ての動物における腫瘍体積は、実験終了（第１３日）後に２００ｍｍ３以下に留まった。比較として、ビヒクル処理動物６匹のうちの４匹が、２００ｍｍ３よりかなり大きい腫瘍サイズを有していた。ＮＥＯ２１８処理によって、この化合物を投与されなかった動物の群と比較して、腫瘍増殖が遅くなった。腫瘍増殖は完全に防止されなかったが、ＮＥＯ２１８は明らかな阻害効果を発揮しており、ＮＥＯ２１８により長期処理を行うと、さらに強い腫瘍阻害となるであろうと考えられる。ＮＥＯ２１８で処理されたマウスは、この化合物を非常に良好に耐容し、臓器毒性その他の副作用は、これらの動物において検出されなかった。
【００７２】
ＮＥＯ２１８は、イン・ビトロで、強力に薬剤耐性の変種を含むいくつかの異なる腫瘍細胞系で顕著な抗がん活性を示した。同様に、それは、皮下マウス腫瘍モデルで抗がん活性を示した。
【００７３】
３−ＢＰとは対照的に、ＮＥＯ２１８の抗がん活性は、膜横断輸送体ＭＣＴ１の存在に依存せず、見かけ上は、輸送機序なく細胞に進入することができる。従って、ＮＥＯ２１８は、ＭＣＴ１の有無とは無関係に、全ての腫瘍細胞種に対して活性である。
【００７４】
３−ＢＰに関してのＭＣＴ１への依存性（しかし、ＮＥＯ２１８に関しては無い）により、上記で提供の実験結果のいくつかが説明される。例えば、加えられたピルベートが３−ＢＰの細胞傷害効果から細胞をレスキューする能力（ＮＥＯ２１８の効果については無い）は、簡単な競争効果によって説明することができる。ピルベートは、ＭＣＴ１の基質である。従って、過剰のピルベートの存在下に、ＭＣＴ１は優先的にピルベートを取り込み、３−ＢＰを排除し；結果的に、３−ＢＰは細胞に進入せず、その細胞は生存する。対照的に、ＮＥＯ２１８はＭＣＴ１を必要とせず；従って、過剰のピルベートが存在しているにも拘わらず、それはなお、細胞に進入し、細胞傷害効果を発揮することができる。
【００７５】
ＮＥＯ２１８によって引き起こされる壊死細胞死は、ＧＡＰＤＨなどの代謝酵素の阻害に続発する細胞ＡＴＰプールの消耗によるものである。ＮＥＯ２１８（及び３−ＢＰ）のアルキル化特性に基づくと、ＧＡＰＤＨ以外の重要な代謝酵素がピルビン酸化されることで、同様に阻害される可能性が非常に高い。３−ＢＰの場合、多くの他の酵素が特異的標的として認識されており、例えばヘキソキナーゼＩＩ（ＨＫ−ＩＩ）［２０］及びコハク酸デヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）［２１］である。従って、ＮＥＯ２１８が、これらの同じ酵素にも、並びに別の確認されていない酵素にも影響することが考えられる。結果的な解糖の遮断により、ミトコンドリア呼吸阻害と組み合わせて、細胞ＡＰＴを効果的に消耗させ、細胞は壊死に至る。
【００７６】
二つの抗酸化剤ＮＡＣ及びＧＳＨが、ＮＥＯ２１８による処理時に細胞死から細胞を遮蔽することが示されたが、ＮＥＯ２１８によって誘発される細胞死に、重要な形でフリーラジカル産生が関与又は必要とされる可能性は低い。むしろ、求電子及び求核相互作用に基づくと、ＮＡＣ及びＧＳＨがＮＥＯ２１８及び３−ＢＰに直接結合して、完全に不活性であるＮＡＣ−ＮＥＯ２１８及びＧＳＨ−ＮＥＯ２１８複合体となる可能性がより高い。本質的に、ＮＡＣ（又はＧＳＨ）及びＮＥＯ２１８（又は３−ＢＰ）は互いに直接中和する。このモデルは、ＮＡＣ又はＧＳＨが、無細胞系を用いた場合にＧＡＰＤＨのＮＥＯ２１８による不活性化も防止し得るという所見によって裏付けられ、それは、ＮＡＣ及びＧＳＨによる保護が、あまり多くの量のフリーラジカルを生じさせることができない環境でも提供されることを示している。さらに、ＧＳＨが３−ＢＰと複合体を形成する能力が、最近、実験的に実証されている［５６］。
【００７７】
ＮＥＯ２１８の抗がん機能の機序を、下記のようにまとめることができる。ＮＥＯ２１８は腫瘍細胞に直接進入し、特異的な取り込み機序は必要としない。求核特性に基づき、それは多くの細胞内タンパク質における重要なシステイン残基をピルビン酸化することで、主要な代謝酵素の失活及び細胞エネルギー産生の遮断を生じる。結果的に生じるＡＴＰプールの枯渇により、細胞は壊死細胞死に至る。総合すると、解糖（ワールブルク効果）及び全体的エネルギー需要への依存性がより大きいために、これらの機序が、がん細胞で優先的に機能することで、ＮＥＯ２１８による治療の治療ウィンドウが提供される。
【００７８】
７．参考文献
［１］  Ｐ．Ｌ．  Ｃｒｏｗｅｌｌ，  Ｃ．Ｅ．  Ｅｌｓｏｎ，  Ｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄｓ，  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ，  ｉｎ：  Ｒ．Ｅ．Ｃ．  Ｗｉｌｄｍａｎ，  （Ｅｄ．），  Ｎｅｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｏｄｓ  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  ＦＬ，  ２００１．
［２］  Ｔ．Ｃ．  Ｃｈｅｎ，  Ｃ．Ｏ．  Ｆｏｎｓｅｃａ，  Ａ．Ｈ．  Ｓｃｈｏｅｎｔｈａｌ，  Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｐｅｒｉｌｌｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｆｏｒ  ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ａｍ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５  （２０１５）  １５８０−１５９３．
［３］  Ｃ．Ｏ．  ｄａ  Ｆｏｎｓｅｃａ，  Ｒ．  Ｌｉｎｄｅｎ，  Ｄ．  Ｆｕｔｕｒｏ，  Ｃ．Ｒ．  Ｇａｔｔａｓｓ，  Ｔ．  Ｑｕｉｒｉｃｏ−Ｓａｎｔｏｓ，  Ｒａｓ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｇｌｉｏｍａｓ：  ａ  ｓｔｒａｔｅｇｉｃ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｉｎｔｒａｎａｓａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｒｉｌｌｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ．  Ａｒｃｈ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｈｅｒ  Ｅｘｐ  （Ｗａｒｓｚ）  ５６  （２００８）  ２６７−２７６．
［４］  Ｔ．  Ｓｕｎｄｉｎ，  Ｄ．Ｍ．  Ｐｅｆｆｌｅｙ，  Ｄ．  Ｇａｕｔｈｉｅｒ，  Ｐ．  Ｈｅｎｔｏｓｈ，  Ｔｈｅ  ｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄ  ｐｅｒｉｌｌｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ９４  （２０１２）  ２６３９−２６４８．
［５］  Ｔ．  Ｓｕｎｄｉｎ，  Ｄ．  Ｐｅｆｆｌｅｙ，  Ｐ．  Ｈｅｎｔｏｓｈ，  ｅＩＦ４Ｅ−Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｍｐａｒｔｓ  ｐｅｒｉｌｌｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ  ａｎｄ  ｒａｐａｍｙｃｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ．  Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ３１９  （２０１３）  ２１０３−２１１２．
［６］  Ｔ．  Ｓｕｎｄｉｎ，  Ｄ．Ｍ．  Ｐｅｆｆｌｅｙ，  Ｐ．  Ｈｅｎｔｏｓｈ，  Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｈＴＥＲＴ−ｍＴＯＲ−ＲＡＰＴＯＲ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｂｙ  ａ  ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｅｒｉｌｌｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ  ａｎｄ  ｒａｐａｍｙｃｉｎ．  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３７５  （２０１３）  ９７−１０４．
［７］  Ｄ．Ｇ．  Ｇａｒｃｉａ，  Ｌ．Ｍ．  Ａｍｏｒｉｍ，  Ｍ．Ｖ．  ｄｅ  Ｃａｓｔｒｏ  Ｆａｒｉａ，  Ａ．Ｓ．  Ｆｒｅｉｒｅ，  Ｒ．Ｅ．  Ｓａｎｔｅｌｌｉ，  Ｃ．Ｏ．  Ｄａ  Ｆｏｎｓｅｃａ，  Ｔ．  Ｑｕｉｒｉｃｏ−Ｓａｎｔｏｓ，  Ｐ．  Ｂｕｒｔｈ，  Ｔｈｅ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｄｒｕｇ  ｐｅｒｉｌｌｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｉｓ  ａ  Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３４５  （２０１０）  ２９−３４．
［８］  Ｈ．Ｙ．  Ｃｈｏ，  Ｗ．  Ｗａｎｇ，  Ｎ．  Ｊｈａｖｅｒｉ，  Ｓ．  Ｔｏｒｒｅｓ，  Ｊ．  Ｔｓｅｎｇ，  Ｍ．Ｎ．  Ｌｅｏｎｇ，  Ｄ．Ｊ．  Ｌｅｅ，  Ａ．  Ｇｏｌｄｋｏｒｎ，  Ｔ．  Ｘｕ，  Ｎ．Ａ．  Ｐｅｔａｓｉｓ，  Ｓ．Ｇ．  Ｌｏｕｉｅ，  Ａ．Ｈ．  Ｓｃｈｏｅｎｔｈａｌ，  Ｆ．Ｍ．  Ｈｏｆｍａｎ，  Ｔ．Ｃ．  Ｃｈｅｎ，  Ｐｅｒｉｌｌｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｇｌｉｏｍａｓ．  Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  １１  （２０１２）  ２４６２−２４７２．
［９］  Ｇ．Ｒ．  Ｈｕｄｅｓ，  Ｃ．Ｅ．  Ｓｚａｒｋａ，  Ａ．  Ａｄａｍｓ，  Ｓ．  Ｒａｎｇａｎａｔｈａｎ，  Ｒ．Ａ．  ＭｃＣａｕｌｅｙ，  Ｌ．Ｍ．  Ｗｅｉｎｅｒ，  Ｃ．Ｊ．  Ｌａｎｇｅｒ，  Ｓ．  Ｌｉｔｗｉｎ，  Ｇ．  Ｙｅｓｌｏｗ，  Ｔ．  Ｈａｌｂｅｒｒ，  Ｍ．  Ｑｉａｎ，  Ｊ．Ｍ．  Ｇａｌｌｏ，  Ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｐｅｒｉｌｌｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ  （ＮＳＣ  ６４１０６６）  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  ｓｏｌｉｄ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６  （２０００）  ３０７１−３０８０．
［１０］  Ｇ．Ｈ．  Ｒｉｐｐｌｅ，  Ｍ．Ｎ．  Ｇｏｕｌｄ，  Ｒ．Ｚ．  Ａｒｚｏｏｍａｎｉａｎ，  Ｄ．  Ａｌｂｅｒｔｉ，  Ｃ．  Ｆｅｉｅｒａｂｅｎｄ，  Ｋ．  Ｓｉｍｏｎ，  Ｋ．  Ｂｉｎｇｅｒ，  Ｋ．Ｄ．  Ｔｕｔｓｃｈ，  Ｍ．  Ｐｏｍｐｌｕｎ，  Ａ．  Ｗａｈａｍａｋｉ，  Ｒ．  Ｍａｒｎｏｃｈａ，  Ｇ．  Ｗｉｌｄｉｎｇ，  Ｈ．Ｈ．  Ｂａｉｌｅｙ，  Ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｐｅｒｉｌｌｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ  ｆｏｕｒ  ｔｉｍｅｓ  ａ  ｄａｙ．  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６  （２０００）  ３９０−３９６．
［１１］  Ｊ．Ｒ．  Ｍｕｒｒｅｎ，  Ｇ．  Ｐｉｚｚｏｒｎｏ，  Ｓ．Ａ．  ＤｉＳｔａｓｉｏ，  Ａ．  ＭｃＫｅｏｎ，  Ｋ．  Ｐｅｃｃｅｒｉｌｌｏ，  Ａ．  Ｇｏｌｌｅｒｋａｒｉ，  Ｗ．  ＭｃＭｕｒｒａｙ，  Ｂ．Ａ．  Ｂｕｒｔｎｅｓｓ，  Ｔ．  Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ，  Ｘ．  Ｌｉ，  Ｐ．Ｔ．  Ｈｏ，  Ａ．  Ｓａｒｔｏｒｅｌｌｉ，  Ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｐｅｒｉｌｌｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  １  （２００２）  １３０−１３５．
［１２］  Ｇ．  Ｌｉｕ，  Ｋ．  Ｏｅｔｔｅｌ，  Ｈ．  Ｂａｉｌｅｙ，  Ｌ．Ｖ．  Ｕｍｍｅｒｓｅｎ，  Ｋ．  Ｔｕｔｓｃｈ，  Ｍ．Ｊ．  Ｓｔａａｂ，  Ｄ．  Ｈｏｒｖａｔｈ，  Ｄ．  Ａｌｂｅｒｔｉ，  Ｒ．  Ａｒｚｏｏｍａｎｉａｎ，  Ｈ．  Ｒｅｚａｚａｄｅｈ，  Ｊ．  ＭｃＧｏｖｅｒｎ，  Ｅ．  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，  Ｄ．  ＤｅＭｅｔｓ，  Ｇ．  Ｗｉｌｄｉｎｇ，  Ｐｈａｓｅ  ＩＩ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｐｅｒｉｌｌｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ  （ＮＳＣ  ６４１０６６）  ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ  ｄａｉｌｙ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇｓ  ２１  （２００３）  ３６７−３７２．
［１３］  Ｃ．Ｇ．  Ａｚｚｏｌｉ，  Ｖ．Ａ．  Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｋ．Ｋ．  Ｎｇ，  Ｌ．Ｍ．  Ｋｒｕｇ，  Ｄ．Ｒ．  Ｓｐｒｉｇｇｓ，  Ｗ．Ｐ．  Ｔｏｎｇ，  Ｅ．Ｒ．  Ｒｉｅｄｅｌ，  Ｍ．Ｇ．  Ｋｒｉｓ，  Ａ  ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｐｅｒｉｌｌｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ５１  （２００３）  ４９３−４９８．
［１４］  Ｃ．Ｏ．  ｄａ  Ｆｏｎｓｅｃａ，  Ｇ．  Ｓｃｈｗａｒｔｓｍａｎｎ，  Ｊ．  Ｆｉｓｃｈｅｒ，  Ｊ．  Ｎａｇｅｌ，  Ｄ．  Ｆｕｔｕｒｏ，  Ｔ．  Ｑｕｉｒｉｃｏ−Ｓａｎｔｏｓ，  Ｃ．Ｒ．  Ｇａｔｔａｓｓ，  Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｐｈａｓｅ  Ｉ／ＩＩ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｐｅｒｉｌｌｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｉｎｔｒａｎａｓａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｄｕｌｔｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｇｌｉｏｍａｓ．  Ｓｕｒｇ  Ｎｅｕｒｏｌ  ７０  （２００８）  ２５９−２６６．
［１５］  Ｃ．Ｏ．  ｄａ  Ｆｏｎｓｅｃａ，  Ｍ．  Ｓｉｍａｏ，  Ｉ．Ｒ．  Ｌｉｎｓ，  Ｒ．Ｏ．  Ｃａｅｔａｎｏ，  Ｄ．  Ｆｕｔｕｒｏ，  Ｔ．  Ｑｕｉｒｉｃｏ−Ｓａｎｔｏｓ，  Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｍｏｎｏｔｅｒｐｅｎｅ  ｐｅｒｉｌｌｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｕｐｏｎ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｒａｔｅ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ．  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １３７  （２０１１）  ２８７−２９３．
［１６］  Ｃ．Ｏ．  ｄａ  Ｆｏｎｓｅｃａ，  Ｒ．Ｍ．  Ｔｅｉｘｅｉｒａ，  Ｊ．Ｃ．  Ｓｉｌｖａ，  Ｄ．Ｅ．Ｓ．Ｄ．Ｇ．Ｆ．  Ｊ，  Ｏ．Ｃ．  Ｍｅｉｒｅｌｌｅｓ，  Ｊ．Ａ．  Ｌａｎｄｅｉｒｏ，  Ｔ．  Ｑｕｉｒｉｃｏ−Ｓａｎｔｏｓ，  Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｇｌｉｏｍａ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｐｅｒｉｌｌｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ．  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ３３  （２０１３）  ５６２５−５６３１．
［１７］  Ｍ．  Ｇｌｉｃｋ，  Ｐ．  Ｂｉｄｄｌｅ，  Ｊ．  Ｊａｎｔｚｉ，  Ｓ．  Ｗｅａｖｅｒ，  Ｄ．  Ｓｃｈｉｒｃｈ，  Ｔｈｅ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｇｅｎｔ  ３−ｂｒｏｍｏｐｙｒｕｖａｔｅ  ｈａｓ  ａ  ｓｈｏｒｔ  ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ  ａｔ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ４５２  （２０１４）  １７０−１７３．
［１８］  Ｍ．Ａ．  Ａｐｆｅｌ，  Ｂ．Ｈ．  Ｉｋｅｄａ，  Ｄ．Ｃ．  Ｓｐｅｃｋｈａｒｄ，  Ｐ．Ａ．  Ｆｒｅｙ，  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ．  Ｔｈｉａｍｉｎ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ３−ｂｒｏｍｏｐｙｒｕｖａｔｅ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２５９  （１９８４）  ２９０５−２９０９．
［１９］  Ｔ．  Ｂａｎａｓ，  Ｂ．  Ｇｏｎｔｅｒｏ，  Ｖ．Ｌ．  Ｄｒｅｗｓ，  Ｓ．Ｌ．  Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ｆ．  Ｍａｒｃｕｓ，  Ｒ．Ｇ．  Ｋｅｍｐ，  Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｈｉｏｌ  ｇｒｏｕｐｓ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｐｈｏｓｐｈｏｆｒｕｃｔｏ−１−ｋｉｎａｓｅ．  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ９５７  （１９８８）  １７８−１８４．
［２０］  Ｓ．Ｐ．  Ｍａｔｈｕｐａｌａ，  Ｙ．Ｈ．  Ｋｏ，  Ｐ．Ｌ．  Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，  Ｈｅｘｏｋｉｎａｓｅ−２  ｂｏｕｎｄ  ｔｏ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ：  ｃａｎｃｅｒ’ｓ  ｓｔｙｇｉａｎ  ｌｉｎｋ  ｔｏ  ｔｈｅ  ”Ｗａｒｂｕｒｇ  Ｅｆｆｅｃｔ”  ａｎｄ  ａ  ｐｉｖｏｔａｌ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｓｅｍｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  １９  （２００９）  １７−２４．
［２１］  Ａ．Ｐ．  Ｐｅｒｅｉｒａ  ｄａ  Ｓｉｌｖａ，  Ｔ．  Ｅｌ−Ｂａｃｈａ，  Ｎ．  Ｋｙａｗ，  Ｒ．Ｓ．  ｄｏｓ  Ｓａｎｔｏｓ，  Ｗ．Ｓ．  ｄａ−Ｓｉｌｖａ，  Ｆ．Ｃ．  Ａｌｍｅｉｄａ，  Ａ．Ｔ．  Ｄａ  Ｐｏｉａｎ，  Ａ．  Ｇａｌｉｎａ，  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｅｒｇｙ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｏｆ  ＨｅｐＧ２  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ３−ｂｒｏｍｏｐｙｒｕｖａｔｅ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ４１７  （２００９）  ７１７−７２６．
［２２］  Ｓ．  Ｇａｎａｐａｔｈｙ−Ｋａｎｎｉａｐｐａｎ，  Ｊ．Ｆ．  Ｇｅｓｃｈｗｉｎｄ，  Ｒ．  Ｋｕｎｊｉｔｈａｐａｔｈａｍ，  Ｍ．  Ｂｕｉｊｓ，  Ｊ．Ａ．  Ｖｏｓｓｅｎ，  Ｉ．  Ｔｃｈｅｒｎｙｓｈｙｏｖ，  Ｒ．Ｎ．  Ｃｏｌｅ，  Ｌ．Ｈ．  Ｓｙｅｄ，  Ｐ．Ｐ．  Ｒａｏ，  Ｓ．  Ｏｔａ，  Ｍ．  Ｖａｌｉ，  Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  （ＧＡＰＤＨ）  ｉｓ  ｐｙｒｕｖｙｌａｔｅｄ  ｄｕｒｉｎｇ  ３−ｂｒｏｍｏｐｙｒｕｖａｔｅ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ．  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２９  （２００９）  ４９０９−４９１８．
［２３］  Ｍ．Ｃ．  Ｓｈｏｓｈａｎ，  ３−Ｂｒｏｍｏｐｙｒｕｖａｔｅ：  ｔａｒｇｅｔｓ  ａｎｄ  ｏｕｔｃｏｍｅｓ．  Ｊ  Ｂｉｏｅｎｅｒｇ  Ｂｉｏｍｅｍｂｒ  ４４  （２０１２）  ７−１５．
［２４］  Ｓ．  Ｃａｒｄａｃｉ，  Ｅ．  Ｄｅｓｉｄｅｒｉ，  Ｍ．Ｒ．  Ｃｉｒｉｏｌｏ，  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａｅｒｏｂｉｃ  ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ：  ３−ｂｒｏｍｏｐｙｒｕｖａｔｅ  ａｓ  ａ  ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｄｒｕｇ．  Ｊ  Ｂｉｏｅｎｅｒｇ  Ｂｉｏｍｅｍｂｒ  ４４  （２０１２）  １７−２９．
［２５］  Ｓ．Ｍ．  Ｅｌ  Ｓａｙｅｄ，  Ｗ．Ｇ．  Ｍｏｈａｍｅｄ，  Ｍ．Ａ．  Ｓｅｄｄｉｋ，  Ａ．Ｓ．  Ａｈｍｅｄ，  Ａ．Ｇ．  Ｍａｈｍｏｕｄ，  Ｗ．Ｈ．  Ａｍｅｒ，  Ｍ．Ｍ．  Ｈｅｌｍｙ  Ｎａｂｏ，  Ａ．Ｒ．  Ｈａｍｅｄ，  Ｎ．Ｓ．  Ａｈｍｅｄ，  Ａ．Ａ．  Ａｂｄ−Ａｌｌａｈ，  Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｏｆ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｕｓｉｎｇ  ３−ｂｒｏｍｏｐｙｒｕｖａｔｅ：  ａ  ｃｏｎｃｉｓｅ  ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗ  ａｎｄ  ｃａｓｅ  ｓｔｕｄｙ．  Ｃｈｉｎ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ３３  （２０１４）  ３５６−３６４．
［２６］  Ｓ．  Ｇａｎａｐａｔｈｙ−Ｋａｎｎｉａｐｐａｎ，  Ｒ．  Ｋｕｎｊｉｔｈａｐａｔｈａｍ，  Ｊ．Ｆ．  Ｇｅｓｃｈｗｉｎｄ，  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｂｌｏｃｋｅｒ  ３−ｂｒｏｍｏｐｙｒｕｖａｔｅ：  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ．  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ３３  （２０１３）  １３−２０．
［２７］  Ｅ．Ｇ．  Ｋｏｎｓｔａｎｔａｋｏｕ，  Ｇ．Ｅ．  Ｖｏｕｔｓｉｎａｓ，  Ａ．Ｄ．  Ｖｅｌｅｎｔｚａｓ，  Ａ．Ｓ．  Ｂａｓｏｇｉａｎｎｉ，  Ｅ．  Ｐａｒｏｎｉｓ，  Ｅ．  Ｂａｌａｆａｓ，  Ｎ．  Ｋｏｓｔｏｍｉｔｓｏｐｏｕｌｏｓ，  Ｋ．Ｎ．  Ｓｙｒｉｇｏｓ，  Ｅ．  Ａｎａｓｔａｓｉａｄｏｕ，  Ｄ．Ｊ．  Ｓｔｒａｖｏｐｏｄｉｓ，  ３−ＢｒＰＡ  ｅｌｉｍｉｎａｔｅｓ  ｈｕｍａｎ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈｌｙ  ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  ｖｉａ  ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｄｅａｔｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ  ａｎｄ  ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ．  Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  １４  （２０１５）  １３５．
［２８］  Ａ．Ｐ．  Ｈａｌｅｓｔｒａｐ，  Ｍｏｎｏｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ．  Ｃｏｍｐｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ３  （２０１３）  １６１１−１６４３．
［２９］  Ｐ．  Ｄｅｌｌ’Ａｎｔｏｎｅ，  Ｔａｒｇｅｔｓ  ｏｆ  ３−ｂｒｏｍｏｐｙｒｕｖａｔｅ，  ａ  ｎｅｗ，  ｅｎｅｒｇｙ  ｄｅｐｌｅｔｉｎｇ，  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ａｇｅｎｔ．  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ５  （２００９）  ４９１−４９６．
［３０］  Ｆ．  Ｂａｌｔａｚａｒ，  Ｃ．  Ｐｉｎｈｅｉｒｏ，  Ｆ．  Ｍｏｒａｉｓ−Ｓａｎｔｏｓ，  Ｊ．  Ａｚｅｖｅｄｏ−Ｓｉｌｖａ，  Ｏ．  Ｑｕｅｉｒｏｓ，  Ａ．  Ｐｒｅｔｏ，  Ｍ．  Ｃａｓａｌ，  Ｍｏｎｏｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ  ａｓ  ｔａｒｇｅｔｓ  ａｎｄ  ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．  Ｈｉｓｔｏｌ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ  ２９  （２０１４）  １５１１−１５２４．
［３１］  Ｋ．  Ｂｉｒｓｏｙ，  Ｔ．  Ｗａｎｇ，  Ｒ．  Ｐｏｓｓｅｍａｔｏ，  Ｏ．Ｈ．  Ｙｉｌｍａｚ，  Ｃ．Ｅ．  Ｋｏｃｈ，  Ｗ．Ｗ．  Ｃｈｅｎ，  Ａ．Ｗ．  Ｈｕｔｃｈｉｎｓ，  Ｙ．  Ｇｕｌｔｅｋｉｎ，  Ｔ．Ｒ．  Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，  Ｊ．Ｅ．  Ｃａｒｅｔｔｅ，  Ｔ．Ｒ．  Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ，  Ｃ．Ｂ．  Ｃｌｉｓｈ，  Ｄ．Ｍ．  Ｓａｂａｔｉｎｉ，  ＭＣＴ１−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｏｆ  ａ  ｔｏｘｉｃ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｓ  ａｎ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｇｌｙｃｏｌｙｔｉｃ  ｔｕｍｏｒｓ．  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ４５  （２０１３）  １０４−１０８．
［３２］  Ｊ．Ｆ．  Ｇｅｓｃｈｗｉｎｄ，  Ｙ．Ｈ．  Ｋｏ，  Ｍ．Ｓ．  Ｔｏｒｂｅｎｓｏｎ，  Ｃ．  Ｍａｇｅｅ，  Ｐ．Ｌ．  Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，  Ｎｏｖｅｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｌｉｖｅｒ  ｃａｎｃｅｒ：  ｄｉｒｅｃｔ  ｉｎｔｒａａｒｔｅｒｉａｌ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｏｔｅｎｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ＡＴＰ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６２  （２００２）  ３９０９−３９１３．
［３３］  Ｙ．Ｈ．  Ｋｏ，  Ｂ．Ｌ．  Ｓｍｉｔｈ，  Ｙ．  Ｗａｎｇ，  Ｍ．Ｇ．  Ｐｏｍｐｅｒ，  Ｄ．Ａ．  Ｒｉｎｉ，  Ｍ．Ｓ．  Ｔｏｒｂｅｎｓｏｎ，  Ｊ．  Ｈｕｌｌｉｈｅｎ，  Ｐ．Ｌ．  Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，  Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｃａｎｃｅｒｓ：  ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｌｌ  ｃａｓｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ３−ｂｒｏｍｏｐｙｒｕｖａｔｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｔｏ  ｄｅｐｌｅｔｅ  ＡＴＰ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３２４  （２００４）  ２６９−２７５．
［３４］  Ｗ．  Ｋｉｍ，  Ｊ．Ｈ．  Ｙｏｏｎ，  Ｊ．Ｍ．  Ｊｅｏｎｇ，  Ｇ．Ｊ．  Ｃｈｅｏｎ，  Ｔ．Ｓ．  Ｌｅｅ，  Ｊ．Ｉ．  Ｙａｎｇ，  Ｓ．Ｃ．  Ｐａｒｋ，  Ｈ．Ｓ．  Ｌｅｅ，  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｈｅｘｏｋｉｎａｓｅ  ＩＩ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｉｎ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．  Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ６  （２００７）  ２５５４−２５６２．
［３５］  Ｍ．  Ｂｕｉｊｓ，  Ｊ．Ａ．  Ｖｏｓｓｅｎ，  Ｊ．Ｆ．  Ｇｅｓｃｈｗｉｎｄ，  Ｔ．  Ｉｓｈｉｍｏｒｉ，  Ｊ．Ｍ．  Ｅｎｇｌｅｓ，  Ｏ．  Ａｃｈａ−Ｎｇｗｏｄｏ，  Ｒ．Ｌ．  Ｗａｈｌ，  Ｍ．  Ｖａｌｉ，  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｉ−ｇｌｙｃｏｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ３−ｂｒｏｍｏｐｙｒｕｖａｔｅ  ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ  ｂｙ  ＦＤＧ  ｕｐｔａｋｅ  ｉｎ  ａ  ｒａｔ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇｓ  ２７  （２００９）  １２０−１２３．
［３６］  Ｘ．  Ｃａｏ，  Ｇ．  Ｊｉａ，  Ｔ．  Ｚｈａｎｇ，  Ｍ．  Ｙａｎｇ，  Ｂ．  Ｗａｎｇ，  Ｐ．Ａ．  Ｗａｓｓｅｎａａｒ，  Ｈ．  Ｃｈｅｎｇ，  Ｍ．Ｖ．  Ｋｎｏｐｐ，  Ｄ．  Ｓｕｎ，  Ｎｏｎ−ｉｎｖａｓｉｖｅ  ＭＲＩ  ｔｕｍｏｒ  ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ＨＳＰ９０  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ａｎｄ  ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｉｎ  ＲＩＰ１−Ｔａｇ２  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｔｕｍｏｒ  ｍｏｄｅｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ６２  （２００８）  ９８５−９９４．
［３７］  Ｊ．  Ｙｕｎ，  Ｃ．  Ｒａｇｏ，  Ｉ．  Ｃｈｅｏｎｇ，  Ｒ．  Ｐａｇｌｉａｒｉｎｉ，  Ｐ．  Ａｎｇｅｎｅｎｄｔ，  Ｈ．  Ｒａｊａｇｏｐａｌａｎ，  Ｋ．  Ｓｃｈｍｉｄｔ，  Ｊ．Ｋ．  Ｗｉｌｌｓｏｎ，  Ｓ．  Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ，  Ｓ．  Ｚｈｏｕ，  Ｌ．Ａ．  Ｄｉａｚ，  Ｊｒ．，  Ｖ．Ｅ．  Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ，  Ｃ．  Ｌｅｎｇａｕｅｒ，  Ｋ．Ｗ．  Ｋｉｎｚｌｅｒ，  Ｂ．  Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，  Ｎ．  Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓ，  Ｇｌｕｃｏｓｅ  ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ＫＲＡＳ  ｐａｔｈｗａｙ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２５  （２００９）  １５５５−１５５９．
［３８］  Ｐ．  Ｉｃａｒｄ，  Ｘ．Ｄ．  Ｚｈａｎｇ，  Ｅ．  Ｌｅｍｏｉｓｓｏｎ，  Ｍ．Ｈ．  Ｌｏｕｉｓ，  Ｓ．  Ａｌｌｏｕｃｈｅ，  Ｈ．  Ｌｉｎｃｅｔ，  Ｌ．  Ｐｏｕｌａｉｎ，  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ３−ｂｒｏｍｏｐｙｒｕｖａｔｅ  ｉｎ  ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａ：  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｓｔｕｄｉｅｓ．  Ｊ  Ｂｉｏｅｎｅｒｇ  Ｂｉｏｍｅｍｂｒ  ４４  （２０１２）  ８１−９０．
［３９］  Ｎ．Ｇ．  Ｓｃｈａｅｆｅｒ，  Ｊ．Ｆ．  Ｇｅｓｃｈｗｉｎｄ，  Ｊ．  Ｅｎｇｌｅｓ，  Ｊ．Ｗ．  Ｂｕｃｈａｎａｎ，  Ｒ．Ｌ．  Ｗａｈｌ，  Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ３−ｂｒｏｍｏｐｙｒｕｖａｔｅ  ｉｎ  ｔｒｅａｔｉｎｇ  ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ  ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｌｙｍｐｈｏｍａ．  Ｔｒａｎｓｌ  Ｒｅｓ  １５９  （２０１２）  ５１−５７．
［４０］  Ｑ．  Ｚｈａｎｇ，  Ｊ．  Ｐａｎ，  Ｐ．Ｅ．  Ｎｏｒｔｈ，  Ｓ．  Ｙａｎｇ，  Ｒ．Ａ．  Ｌｕｂｅｔ，  Ｙ．  Ｗａｎｇ，  Ｍ．  Ｙｏｕ，  Ａｅｒｏｓｏｌｉｚｅｄ  ３−ｂｒｏｍｏｐｙｒｕｖａｔｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｌｕｎｇ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｃａｕｓｉｎｇ  ｌｉｖｅｒ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｖ  Ｒｅｓ  （Ｐｈｉｌａ）  ５  （２０１２）  ７１７−７２５．
［４１］  Ｊ．  Ｃｈａｐｉｒｏ，  Ｓ．  Ｓｕｒ，  Ｌ．Ｊ．  Ｓａｖｉｃ，  Ｓ．  Ｇａｎａｐａｔｈｙ−Ｋａｎｎｉａｐｐａｎ，  Ｊ．  Ｒｅｙｅｓ，  Ｒ．  Ｄｕｒａｎ，  Ｓ．Ｃ．  Ｔｈｉｒｕｇａｎａｓａｍｂａｎｄａｍ，  Ｃ．Ｒ．  Ｍｏａｔｓ，  Ｍ．  Ｌｉｎ，  Ｗ．  Ｌｕｏ，  Ｐ．Ｔ．  Ｔｒａｎ，  Ｊ．Ｍ．  Ｈｅｒｍａｎ，  Ｇ．Ｌ．  Ｓｅｍｅｎｚａ，  Ａ．Ｊ．  Ｅｗａｌｄ，  Ｂ．  Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，  Ｊ．Ｆ．  Ｇｅｓｃｈｗｉｎｄ，  Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ３−ｂｒｏｍｏｐｙｒｕｖａｔｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０  （２０１４）  ６４０６−６４１７．
［４２］  Ｒ．Ｔ．  Ｗｉｃｋｓ，  Ｊ．  Ａｚａｄｉ，  Ａ．  Ｍａｎｇｒａｖｉｔｉ，  Ｉ．  Ｚｈａｎｇ，  Ｌ．  Ｈｗａｎｇ，  Ａ．  Ｊｏｓｈｉ，  Ｈ．  Ｂｏｗ，  Ｍ．  Ｈｕｔｔ−Ｃａｂｅｚａｓ，  Ｋ．Ｌ．  Ｍａｒｔｉｎ，  Ｍ．Ａ．  Ｒｕｄｅｋ，  Ｍ．  Ｚｈａｏ，  Ｈ．  Ｂｒｅｍ，  Ｂ．Ｍ．  Ｔｙｌｅｒ，  Ｌｏｃａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ−ｃｅｌｌ  ｇｌｙｃｏｌｙｔｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｉｎ  ｈｉｇｈ−ｇｒａｄｅ  ｇｌｉｏｍａ．  Ｎｅｕｒｏ  Ｏｎｃｏｌ  １７  （２０１５）  ７０−８０．
［４３］  Ｙ．Ｈ．  Ｋｏ，  Ｈ．Ａ．  Ｖｅｒｈｏｅｖｅｎ，  Ｍ．Ｊ．  Ｌｅｅ，  Ｄ．Ｊ．  Ｃｏｒｂｉｎ，  Ｔ．Ｊ．  Ｖｏｇｌ，  Ｐ．Ｌ．  Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，  Ａ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｓｔｕｄｙ  ”ｃａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔ”  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ”ｅｎｅｒｇｙ  ｂｌｏｃｋｅｒ”  ３−ｂｒｏｍｏｐｙｒｕｖａｔｅ  （３ＢＰ）  ａｓ  ａ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ａｇｅｎｔ：  ｆｒｏｍ  ｂｅｎｃｈ  ｓｉｄｅ  ｔｏ  ｂｅｄｓｉｄｅ．  Ｊ  Ｂｉｏｅｎｅｒｇ  Ｂｉｏｍｅｍｂｒ  ４４  （２０１２）  １６３−１７０．
［４４］  Ｈ．  Ｈｕａｎｇ，  Ｈ．  Ｌｉｎ，  Ｘ．  Ｚｈａｎｇ，  Ｊ．  Ｌｉ，  Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ  ｒｅｖｅｒｓｅｓ  ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｂｙ  ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＭＧＭＴ  ｉｎ  Ｔ９８Ｇ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  ＮＦ−ｋａｐｐａＢ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐａｔｈｗａｙ．  Ｏｎｃｏｌ  Ｒｅｐ  ２７  （２０１２）  ２０５０−２０５６．
［４５］  Ｂ．  Ｇｕｏ，  Ｄ．Ｊ．  Ｖｉｌｌｅｎｅｕｖｅ，  Ｓ．Ｌ．  Ｈｅｍｂｒｕｆｆ，  Ａ．Ｆ．  Ｋｉｒｗａｎ，  Ｄ．Ｅ．  Ｂｌａｉｓ，  Ｍ．  Ｂｏｎｉｎ，  Ａ．Ｍ．  Ｐａｒｉｓｓｅｎｔｉ，  Ｃｒｏｓｓ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｉｓｏｇｅｎｉｃ  ｄｒｕｇ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｂｒｅａｓｔ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｓｕｐｐｏｒｔ  ｒｅｃｅｎｔ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇ  ｔｈａｔ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ  ｍａｙ  ｂｅ  ｓｔｒｏｎｇｌｙ  ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ  ｂｙ  ｐｒｉｏｒ  ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ．  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｒｅａｔ  ８５  （２００４）  ３１−５１．
［４６］  Ｊ．Ｂ．  Ｄｅｎａｕｌｔ，  Ｇ．Ｓ．  Ｓａｌｖｅｓｅｎ，  Ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｃａｓｐａｓｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４１４  （２００８）  １９１−２２０．
［４７］  Ｄ．Ｗ．  Ｋｏｈ，  Ｔ．Ｍ．  Ｄａｗｓｏｎ，  Ｖ．Ｌ．  Ｄａｗｓｏｎ，  Ｍｅｄｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｂｙ  ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ）  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−１．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｓ  ５２  （２００５）  ５−１４．
［４８］  Ｘ．  Ｈｕａｎｇ，  Ｈ．Ｄ．  Ｈａｌｉｃｋａ，  Ｆ．  Ｔｒａｇａｎｏｓ，  Ｔ．  Ｔａｎａｋａ，  Ａ．  Ｋｕｒｏｓｅ，  Ｚ．  Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚ，  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｉｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｐｈａｓｅ  ａｎｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆ  ３８  （２００５）  ２２３−２４３．
［４９］  Ｒ．  Ｂｅｒｔｒａｎｄ，  Ｅ．  Ｓｏｌａｒｙ，  Ｐ．  Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，  Ｋ．Ｗ．  Ｋｏｈｎ，  Ｙ．  Ｐｏｍｍｉｅｒ，  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｏｍｍｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｂｙ  ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ．  Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ２１１  （１９９４）  ３１４−３２１．
［５０］  Ｊ．Ｌ．  Ｇｒｅｅｎ，  Ｋ．Ｊ．  Ｈｅａｒｄ，  Ｋ．Ｍ．  Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，  Ｄ．  Ａｌｂｅｒｔ，  Ｏｒａｌ  ａｎｄ  Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  Ａｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｃｅｔａｍｉｎｏｐｈｅｎ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ：  Ａ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｒｅｖｉｅｗ  ａｎｄ  Ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ．  Ｗｅｓｔ  Ｊ  Ｅｍｅｒｇ  Ｍｅｄ  １４  （２０１３）  ２１８−２２６．
［５１］  Ａ．  Ｐｏｍｐｅｌｌａ，  Ａ．  Ｖｉｓｖｉｋｉｓ，  Ａ．  Ｐａｏｌｉｃｃｈｉ，  Ｖ．  Ｄｅ  Ｔａｔａ，  Ａ．Ｆ．  Ｃａｓｉｎｉ，  Ｔｈｅ  ｃｈａｎｇｉｎｇ  ｆａｃｅｓ  ｏｆ  ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ，  ａ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｔａｇｏｎｉｓｔ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ６６  （２００３）  １４９９−１５０３．
［５２］  Ｎ．  ｖａｎ  Ｚａｎｄｗｉｊｋ，  Ｎ−ａｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ  （ＮＡＣ）  ａｎｄ  ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  （ＧＳＨ）：  ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，  ｗｉｔｈ  ｓｐｅｃｉａｌ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｔｏ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｕｐｐｌ  ２２  （１９９５）  ２４−３２．
［５３］  Ｙ．  Ｅｇｕｃｈｉ，  Ｓ．  Ｓｈｉｍｉｚｕ，  Ｙ．  Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ，  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ＡＴＰ  ｌｅｖｅｌｓ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｆａｔｅ  ｂｙ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５７  （１９９７）  １８３５−１８４０．
［５４］  Ｍ．  Ｌｅｉｓｔ，  Ｂ．  Ｓｉｎｇｌｅ，  Ａ．Ｆ．  Ｃａｓｔｏｌｄｉ，  Ｓ．  Ｋｕｈｎｌｅ，  Ｐ．  Ｎｉｃｏｔｅｒａ，  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ  （ＡＴＰ）  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ：  ａ  ｓｗｉｔｃｈ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｃｉｓｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ．  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８５  （１９９７）  １４８１−１４８６．
［５５］  Ｏ．  Ｑｕｅｉｒｏｓ，  Ａ．  Ｐｒｅｔｏ，  Ａ．  Ｐａｃｈｅｃｏ，  Ｃ．  Ｐｉｎｈｅｉｒｏ，  Ｊ．  Ａｚｅｖｅｄｏ−Ｓｉｌｖａ，  Ｒ．  Ｍｏｒｅｉｒａ，  Ｍ．  Ｐｅｄｒｏ，  Ｙ．Ｈ．  Ｋｏ，  Ｐ．Ｌ．  Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，  Ｆ．  Ｂａｌｔａｚａｒ，  Ｍ．  Ｃａｓａｌ，  Ｂｕｔｙｒａｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｍｏｎｏｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ＭＣＴ４  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ３−ｂｒｏｍｏｐｙｒｕｖａｔｅ．  Ｊ  Ｂｉｏｅｎｅｒｇ  Ｂｉｏｍｅｍｂｒ  ４４  （２０１２）  １４１−１５３．
［５６］  Ｉ．  Ｓａｄｏｗｓｋａ−Ｂａｒｔｏｓｚ，  Ｒ．  Ｓｚｅｗｃｚｙｋ，  Ｌ．  Ｊａｒｅｍｋｏ，  Ｍ．  Ｊａｒｅｍｋｏ，  Ｇ．  Ｂａｒｔｏｓｚ，  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ａｇｅｎｔ  ３−ｂｒｏｍｏｐｙｒｕｖｉｃ  ａｃｉｄ  ｆｏｒｍｓ  ａ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｗｉｔｈ  ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｐ  ６８  （２０１６）  ５０２−５０５．
【００７９】
純度
ＮＥＯ２１８の純度は、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）又は高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって分析することができる。ＮＥＯ２１８の純度を分析し、不純物の存在を確認する他の技術には、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法、質量分析（ＭＳ）、ＧＣ−ＭＳ、赤外分光法（ＩＲ）、及び薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）などがあるが、これらに限定されるものではない。キラル純度はキラルＧＣ又は旋光度の測定によって評価することができる。
【００８０】
ＮＥＯ２１８は、結晶化などの方法により、又はそれの固有の物理化学特性（例えば、溶解度又は極性）に従っての不純物からの分離により精製することができる。従って、ＮＥＯ２１８は、分取クロマトグラフィー、（分別）蒸留、又は（分別）結晶化などの当技術分野で公知の好適な分離技術によって分離することができる。
【００８１】
治療方法
本発明は、ＮＥＯ２１８を用いて、疾患、例えばがん若しくは他の神経系障害を治療する方法も提供する。ＮＥＯ２１８は単独で投与することができるか、放射線、外科処置又は化学療法剤と組み合わせて投与することができる。ＮＥＯ２１８はまた、抗ウィルス剤、抗炎症剤又は抗生物質と同時投与することもできる。それらの薬剤は、同時に又は順次に投与することができる。ＮＥＯ２１８は、他の活性剤の投与の前、途中又は後に投与することができる。
【００８２】
ＮＥＯ２１８は、放射線療法と併用することができる。１実施形態において、本発明は、腫瘍細胞、例えば悪性神経膠腫細胞を放射線によって処置する方法であって、当該細胞を有効量のＮＥＯ２１８で処理してから、放射線に曝露する方法を提供する。ＮＥＯ２１８処理は、放射線の前、途中及び／又は後に行うことができる。例えば、ＮＥＯ２１８は、放射線療法開始の１週間前に開始して連続的に投与することができ、放射線療法完了後２週間にわたって続けることができる。米国特許第５，５８７，４０２号及び同５，６０２，１８４号。
【００８３】
１実施形態において、本発明は、腫瘍細胞、例えば悪性神経膠腫細胞を化学療法によって処置する方法であって、当該細胞を有効量のＮＥＯ２１８で処理してから、化学療法に曝露する方法を提供する。ＮＥＯ２１８処置は、化学療法の前、途中及び／又は後に行うことができる。
【００８４】
ＮＥＯ２１８は、神経系がん、例えば悪性神経膠腫（例えば、星細胞腫、未分化星細胞腫、多形性神経膠芽腫）、網膜芽細胞腫、毛様細胞性星細胞腫（グレードＩ）、髄膜腫、転移性脳腫瘍、神経芽細胞腫、下垂体腺腫、頭蓋底髄膜腫、及び頭蓋底がんの治療に用いることができる。本明細書で使用される場合、「神経系腫瘍」という用語は、対象者が神経系細胞の悪性増殖を有する状態を指す。
【００８５】
ＮＥＯ２１８によって治療可能ながんには、肺がん、耳、鼻及び咽喉のがん、白血病、結腸がん、メラノーマ、膵臓がん、乳がん、前立腺がん、乳がん、造血系がん、子宮がん、基底細胞がん、胆道がん；膀胱がん；骨肉腫；乳がん；子宮頸がん；絨毛癌；結腸及び直腸がん；結合組織がん；消化系のがん；子宮内膜がん；食道がん；眼がん；頭頸部がん；胃がん；上皮内新生物；腎臓がん；喉頭がん；白血病、例えば急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病；肝臓がん；リンパ腫、例えばホジキン及び非ホジキンリンパ腫；骨髄腫；線維腫、神経芽細胞腫；口腔がん（例えば、口唇、下、口及び咽頭）；子宮がん；膵臓がん；前立腺がん；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；直腸がん；腎臓がん；呼吸器系のがん；肉腫；皮膚がん；胃がん；睾丸がん；甲状腺がん；子宮がん；泌尿器系のがん、並びに他の癌及び肉腫などがあるが、これらに限定されるものではない。米国特許第７，６０１，３５５号。
【００８６】
本発明は、ＣＮＳ障害、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、精神障害、精神病及び抑鬱などの一次性神経変性疾患（それらに限定されるものではない）の治療方法も提供する。治療は、ＮＥＯ２１８単独又はパーキンソン病、アルツハイマー病若しくは精神障害の治療に使用される現行の医薬と組み合わせての使用からなるものであることができる。
【００８７】
本発明は、免疫調節治療の前若しくは途中に有効量のＮＥＯ２１８に細胞を曝露する段階を含む、免疫調節療法応答を改善する方法も提供する。好ましい免疫調節剤は、サイトカイン類、そのようなインターロイキン類、リンホカイン類、モノカイン類、インターフェロン類及びケモカイン類である。
【００８８】
本発明の組成物は、吸入、鼻腔内、経口、経皮、眼内、腹腔内、静脈、ＩＣＶ、嚢内注射もしくは注入、皮下注射、インプラント、膣、舌下、尿道（例えば、尿道坐剤）、皮下、筋肉内、静脈内、直腸、舌下、粘膜、眼、脊髄、髄腔内、関節内、動脈、くも膜下、気管支及びリンパ投与など（これらに限定されるものではない）の当技術分野で公知の任意の方法によって投与することができる。吸入製剤は、ネブライザー又は類似の装置を用いて送達し得る；局所製剤は、ゲル、軟膏、クリーム、エアロゾルなどの形態であり；経皮製剤は、経皮貼付剤又はイオン導入法を介して投与され；鼻腔内製剤は、噴霧剤として又は滴剤で送達し得る。組成物は、錠剤、丸薬、カプセル、半固体、粉剤、持続放出製剤、液剤、懸濁液、エリキシル剤、エアロゾル、又は任意の他の適切な組成物の形態を取ることもできる。
【００８９】
そのような医薬組成物を調製するのに、ＮＥＯ２１８を、従来の医薬配合技術に従って、薬学的に許容される担体、補助剤及び／又は賦形剤と混合する。本発明の組成物に用い得る薬学的に許容される担体は、リン酸緩衝生理食塩水、水、並びに油／水又は水／油乳濁液などの乳濁液、及び種々の種類の湿潤剤などの任意の標準的な医薬担体を包含する。前記組成物はさらに、デンプン、セルロース、タルク、グルコース、乳糖、ショ糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルクなどの固体医薬賦形剤を含有し得る。液体及び半固体賦形剤は、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノール、及び石油、動物、植物又は合成起源のもの、例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの賦形剤を含む種々の油から選択される。液体担体、特に注射用溶液は、水、食塩水、デキストロース水溶液、及びグリコールを含む。担体、安定剤及び補助剤の例については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｅ．  Ｗ．  Ｍａｒｔｉｎ編（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  １８ｔｈ  ｅｄ．，１９９０）を参照。前記組成物はまた、安定剤及び保存剤を含み得る。
【００９０】
本明細書で使用される場合、「治療上有効量」という用語は、特定の障害若しくは疾患を治療するか、又は障害若しくは疾患を治療する薬理学的応答を得るのに十分な量である。投与の最も有効な手段及び投与量を決定する方法は、治療用に使用される組成、前記治療の目的、治療中の標的細胞、及び、治療中の対象者に応じて変動し得る。治療投与量は、安全及び有効性を最適化するように加減することができる。一回投与又は複数回投与は、治療担当医師によって選択される用量レベル及び様式で行うことができる。好適な製剤及び薬剤の投与方法は、当業者によって容易に決定し得る。例えば、前記組成物は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、又は、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇで投与される。本明細書に記載の化合物が別の薬剤又は治療と共に同時投与される場合、前記有効量は、薬剤が単独で使用される場合よりも少なくなることがある。
【００９１】
経皮製剤は、セルロース系媒体、例えば、メチルセルロース又はヒドロキシエチルセルロースのようチキソトロピー又はゲル状の担体中に活性薬剤を組み込むことによって調製することができ、得られた製剤を次いで着用者の肌で皮膚に接触して固定されるように作られた経皮装置に充填される。前記組成物がゲルの形態である場合、該組成物は、患者の膜、例えば、肩若しくは上腕と、又は上部胴体の皮膚、好ましくは、無傷の透明な、乾燥肌にすり込まれ、患者の血清中にＮＥＯ２１８の送達に十分な時間、その上に維持される。ゲル形態の本発明の組成物は、チューブ、小袋、又は計量ポンプ内に含まれる。そのようなチューブ又は小袋は、組成物の一単位用量、又は複数単位用量を含む。計量ポンプは、計量された組成物の一回投与分を分配することができる。
【００９２】
本発明はまた、鼻腔内投与のため、上記のような組成物を提供する。そのようなものとして、前記組成物はさらに透過促進剤を含み得る。Ｓｏｕｔｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｎａｓａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，  ２０００）。ＮＥＯ２１８は、溶液、乳濁液、懸濁液、滴剤などの液体の形態で、又は、粉末、ゲル、又は軟膏のような固体形態で鼻腔内に投与され得る。鼻腔内薬剤を送達するための装置は、当該分野で公知である。鼻内薬剤送達には、鼻腔内吸入器、鼻内噴霧装置、噴霧器、鼻噴霧ボトル、単位用量容器、ポンプ、点滴器、絞り出し瓶、噴霧器、定量吸入器（ＭＤＩ）、加圧用量吸入器、インサフレーター（Ｉｎｓｕｆｆｌａｔｏｒ）、及び双方向装置など（これらに限定されるものではない）の装置を用いて行い得る。前記経鼻送達装置は、鼻腔に正確な有効投与量を投与するよう計量し得る。経鼻送達装置は、単一単位量送達又は複数単位量送達用であり得る。特定の例では、Ｋｕｒｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｅｔｈｅｌｌ，  Ｗａｓｈ．）製のＶｉａＮａｓｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ａｔｏｍｉｚｅｒを、本発明で使用することができる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋｕｒｖｅｔｅｃｈ．ｃｏｍ）。ＮＥＯ２１８はまた、管、カテーテル、注射器、パックテール（ｐａｃｋｔａｉｌ）、綿球、鼻タンポンを介して、又は粘膜下注入によって送達することができる。米国特許公開第２００９０３２６２７５号、同２００９０２９１８９４号、同２００９０２８１５２２号、及び同２００９０３１７３７７号。
【００９３】
ＮＥＯ２１８は、標準的な手順を用いてエアロゾルとして製剤することができる。ＮＥＯ２１８は、溶媒を用いて又は無溶媒で製剤することができ、担体を用いて又は無担体で製剤することができる。その製剤は液剤であることができるか、１以上の界面活性剤を含む水系乳濁液であることができる。例えば、エアロゾル噴霧剤は、加圧容器から、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、炭化水素、圧縮空気、窒素、二酸化炭素、又は他の好適な気体などの適切な噴射剤を用いて発生させることができる。前記投与量単位は、計量された量を送達するバルブを提供することによって決定することができる。ポンプ噴霧ディスペンサーは、定量又は特定の粒子又は液滴サイズを有する用量を分配することができる。本明細書で用いる場合、「エアロゾル」という用語は、気体中の微粒子固体粒子又は液体の液滴の懸濁液を指す。具体的には、エアロゾルには、例えば、ＭＤＩ、ネブライザー若しくはミスト噴霧器のような任意の適切な装置で生成させることができるＮＥＯ２１８の液滴のガス媒介懸濁液などがある。エアロゾルには、空気その他のキャリアガス中に懸濁させた本発明の組成物の乾燥粉末組成物などもある。Ｇｏｎｄａ（１９９０）  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ６：２７３−３１３。Ｒａｅｂｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９２）  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２７：１４３−１５９。
【００９４】
ＮＥＯ２１８は、インサフレーターによって送達される微粒子などの形態の粉末として鼻腔に送達させることができる。ＮＥＯ２１８は、固体表面、例えば、担体に吸収さることができる。前記粉末又は微粒子は、乾燥空気分配型で投与することができる。前記粉末又は微粒子はインサフレーターの容器に保存することができる。別の形態として、粉末又は微粒子を、ゼラチンカプセル等のカプセル、又は経鼻投与に適した他の単一用量単位に充填することができる。
【００９５】
前記医薬組成物は、例えばゲル、軟膏、鼻用乳濁液、ローション、クリーム、鼻用タンポン、点滴器、又は生体接着性ストリップの形態で、鼻腔内に前記組成物を直接配置することによって、鼻腔に送達させることができる。ある種の実施形態では、例えば、吸収を促進するために、鼻腔内医薬組成物の滞留時間を延長することが望ましいことがあり得る。従って、当該医薬組成物は、任意に、生体接着性ポリマー、ガム（例えば、キサンタンガム）、キトサン（例えば、高精製カチオン性多糖体）、ペクチン（又は鼻粘膜に付与される場合、ゲルのように増粘又は乳化する炭水化物）、微粒子（例えば、デンプン、アルブミン、デキストラン、シクロデキストリン）、ゼラチン、リポソーム、カルバマー（ｃａｒｂａｍｅｒ）、ポリビニルアルコール、アルギン酸塩、アカシア、キトサン及び／又はセルロース（例えば、メチル又はプロピル；ヒドロキシル又はカルボキシ、カルボキシメチル又はヒドロキシプロピル）を用いて製剤することができる。
【００９６】
ＮＥＯ２１８を含有する組成物は、気道、すなわち、肺への経口吸入によって投与し得る。
【００９７】
吸入剤用の通常の送達系には、ネブライザー吸入器、乾燥粉末吸入器（ｄｒｙ  ｐｏｗｄｅｒ  ｉｎｈａｌｅｒ）（ＤＰＩ）、及び定量吸入器（ｍｅｔｅｒｅｄ−ｄｏｓｅ  ｉｎｈａｌｅｒ）（ＭＤＩ）などがある。
【００９８】
ネブライザー装置は、液体形態の治療剤を霧として噴霧させる高速空気流を生成する。前記治療剤は、溶液又は適切な粒径の粒子の懸濁液などの液体形態で製剤される。１実施形態では、前記粒子は微粉化される。「微粉化」という用語は、約１０μｍ未満の直径を有する粒子を約９０％以上有するものとして定義される。適切なネブライザー装置は、例えば、ＰＡＲＩ  ＧｍｂＨ社（Ｓｔａｒｎｂｅｒｇ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）によって市販されている。他のネブライザー装置には、Ｒｅｓｐｉｍａｔ  （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）及び、例えば、米国特許第７５６８４８０号及び６１２３０６８並びにＷＯ９７／１２６８７に開示のものなどがある。ＮＥＯ２１８は、水溶液又は液体懸濁液として、ネブライザー装置で使用するように製剤することができる。
【００９９】
ＤＰＩ装置は、代表的には、吸気中に患者の気流に分散させ得る自由流動性粉末の形態で治療薬を投与するものである。外部エネルギー源を使用するＤＰＩ装置を、本発明で使用することもできる。自由流動性粉末を得るために、治療剤は、好適な賦形剤（例えば、ラクトース）を用いて製剤することができる。乾燥粉末製剤は、例えば、約１μｍ〜１００μｍの粒径を有する乾燥ラクトースと、ＮＥＯ２１８の微粒化粒子とを乾式混合して、組み合わせることによって作ることができる。或いは、ＮＥＯ２１８は、賦形剤なしで製剤することができる。当該製剤は、乾燥粉末送達装置で使用するための乾燥粉末ディスペンサー内に、又は、吸入カートリッジ若しくはカプセル内に装填される。市販のＤＰＩ装置の例には、Ｄｉｓｋｈａｌｅｒ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ，  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ．，  Ｎ．Ｃ．）（例えば，米国特許第５０３５２３７号を参照する）；Ｄｉｓｋｕｓ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）（例えば，米国特許第６，３７８，５１９号を参照する）；Ｔｕｒｂｕｈａｌｅｒ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ．ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ，  Ｄｅｌ．），（参照、例えば，米国特許第４，５２４，７６９号）；及びＲｏｔａｈａｌｅｒ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）（例えば，米国特許第４３５３３６５号を参照する）。好適なＤＰＩのさらなる例は、米国特許第５４１５１６２号、同５２３９９９３号、及び同５７１５８１０号及びこれらの中の参考文献に記載されている。
【０１００】
ＭＤＩ装置は、代表的には、圧縮噴射ガスを使用して、計量された量の治療剤を吐出する。ＭＤＩ投与用製剤は、液化噴射剤中の有効成分の溶液又は懸濁液を含む。噴射剤の例には、１，１，１，２−テトラフルオロエタン（ＨＦＡ  １３４ａ）及び１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロ−ｎ−プロパン（ＨＦＡ  ２２７）等のヒドロフルオロアルカン（ＨＦＡ）、及びＣＣｌ３Ｆなどのクロロフルオロカーボンなどがある。ＭＤＩ投与用ＨＦＡ製剤のさらなる成分は、エタノール、ペンタン、水などの共溶媒類；及びトリオレイン酸ソルビタン、オレイン酸、レシチン、及びグリセリンなどの界面活性剤などがある（例えば、米国特許第５２２５１８３号、ＥＰ第０７１７９８７号、及びＷＯ９２／２２２８６号を参照）。当該製剤は、ＭＤＩ装置の一部を形成するエアロゾル・キャニスターに装填される。ＨＦＡ噴射剤と共に使用するように特別に開発されたＭＤＩ装置の例は、米国特許第６００６７４５号及び同６１４３２２７号で提供されている。吸入投与に適した好適な製剤及び装置を製造する方法の例については、米国特許第６２６８５３３号、同５９８３９５６号、同５８７４０６３号及び同６２２１３９８号、並びにＷＯ９９／５３９０１、ＷＯ００／６１１０８、ＷＯ９９／５５３１９及びＷＯ００／３０６１４を参照する。
【０１０１】
ＮＥＯ２１８は、吸入による送達のためにリポソーム又はマイクロカプセルに封入される。リポソームは脂質二重膜と水性の内部から構成される小胞である。当該脂質膜は、リン脂質から成り、その例には、レシチン及びリゾレシチン等のホスファチジルコリン；ホスファチジルセリン及びホスファチジルグリセロール等の酸性リン脂質；そしてホスファチジルエタノールアミン及びスフィンゴミエリンなどのスフィンゴリン脂質を含む。或いは、コレステロールを添加する。マイクロカプセルは、コーティング材料でコーティングされた粒子である。例えば、コーティング材料は、フィルム形成ポリマー、疎水性可塑剤、表面活性化剤及び／又は潤滑剤の窒素含有ポリマーとの混合物から成る。米国特許第６３１３１７６号及び同７５６３７６８号。
【０１０２】
ＮＥＯ２１８はまた、乳癌又は黒色腫のような局在癌の治療のための局所適用を介して、単独又は他の化学療法剤と組み合わせて使用することができる。ＮＥＯ２１８はまた、鎮痛薬の経皮送達用に麻薬又は鎮痛剤と組み合わせて使用することができる。
【０１０３】
本発明はまた眼内投与用に上述した組成物を提供する。従って、前記組成物はさらに透過促進剤を含むことができる。眼内投与のためには、本明細書に記載される組成物は、液剤、乳濁液、懸濁液などとして製剤することができる。眼球に化合物を投与するのに適した各種媒体が当技術分野で知られている。具体的な非限定的例には、米国特許第６２６１５４７号；同６１９７９３４号；同６０５６９５０号；同５８００８０７号；同５７７６４４５号；同５６９８２１９号；同５５２１２２２号；同５４０３８４１号；同５０７７０３３号；同４８８２１５０号；及び同４７３８８５１号に記載されている。
【０１０４】
ＮＥＯ２１８は、上記疾患の治療のために単独で又は他の薬剤と組み合わせて短期間又は長期間投与することができる。本発明の組成物は、哺乳動物、好ましくはヒトに投与することができる。哺乳動物には、マウス、ラット、ウサギ、サル、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、家畜、スポーツ動物、ペット、ウマ、及び霊長類などがあるが、これらに限定されるものではない。
【０１０５】
本発明はまた、がん細胞などの細胞を、有効量の本明細書に記載のＮＥＯ２１８と接触させる、イン・ビトロ、エクス・ビボ、又はイン・ビボでの細胞の増殖を阻害する方法も提供する。
【０１０６】
過剰増殖性細胞又は組織などの病的細胞又は組織は、有効量の本発明の組成物を前記細胞又は組織と接触させることによって治療することができる。がん細胞などの細胞は、原発性がん細胞、又は、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （ＡＴＣＣ）のような組織バンクから入手可能な培養細胞であることができる。その病的細胞は、全身がん、神経膠腫、髄膜腫、下垂体腺腫、又は全身がん、肺がん、前立腺がん、乳がん、造血がん又は卵巣がんからのＣＮＳ転移の細胞であることができる。前記細胞は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒト由来であることができる。米国特許公開第２００４／００８７６５１号。Ｂａｌａｓｓｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｉｎｔｅｒｎ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．  １０：７８５−７８８。Ｔｈｏｒｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００４）  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １２７：４８１〜４９６。Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００５）  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １３：９４３−９４７。Ｄａ  Ｆｏｎｓｅｃａ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００８）  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ７０：２５９２６７。Ｄａ  Ｆｏｎｓｅｃａ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００８）  Ａｒｃｈ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  Ｅｘｐ．  ５６：２６７−２７６。Ｈａｓｈｉｚｕｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００８）  Ｎｅｕｒｏｎｃｏｌｏｇｙ  １０：１１２−１２０。
【０１０７】
本発明の組成物のイン・ビトロ有効性は、当技術分野で公知の方法を用いて求めることができる。例えば、ＮＥＯ２１８及び／又は治療剤の細胞傷害性を、ＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド］細胞傷害性アッセイによって調べることができる。ＭＴＴアッセイは、代謝活性細胞によるテトラゾリウム塩であるＭＴＴの取り込みの原理に基づいたものであり、ＭＴＴは、代謝されて青色ホルマゾン産生物となり、それを分光的に読み取ることができる。Ｊ．  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６５：５５−６３，  １９８３。ＮＥＯ２１８及び／又は治療剤の細胞傷害性は、コロニー形成アッセイによって調べることができる。ＶＥＧＦ分泌及びＩＬ−８分泌の阻害についての機能アッセイを、ＥＬＩＳＡを介して行うことができる。ＮＥＯ２１８及び／又は治療剤による細胞周期の遮断は、標準的なヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色及びフローサイトメトリーによって調べることができる。浸潤阻害はＢｏｙｄｅｎチャンバーによって調べることができる。このアッセイにおいて、再生した基底膜である、Ｍａｔｒｉｇｅｌゲルの層を、走化性フィルター上にコーティングし、前記Ｂｏｙｄｅｎチャンバー中の細胞の移動に対する障壁として作用させる。浸潤能を持つ細胞のみが、Ｍａｔｒｉｇｅｌ障壁を通過することができる。他のアッセイには、細胞生存率アッセイ、アポトーシスアッセイ、及び形態学アッセイなどがあるが、これらに限定されるものではない。
【０１０８】
実施例２：モノカルボン酸輸送体１への細胞取り込み依存性がなく、３−ＢＰ抵抗性腫瘍細胞での活性を有する３−ブロモピルベートのペリリルアルコール−複合体化類縁体
略称：３−ＢＰ：３−ブロモピルベート；ＣＦＡ：コロニー形成アッセイ；ＧＡＰＤＨ：グリセルアルデヒド３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ；ＧＳＨ：グルタチオン；ＭＣＴ−１：モノカルボン酸輸送体１；ＮＡＣ：Ｎ−アセチルシステイン；ＮＥＯ２１８：３−ブロモピルベートに複合体化したペリリルアルコール；ＰＯＨ：ペリリルアルコール；ＲＯＳ：反応性酸素種；ＳＤＨ：コハク酸デヒドロゲナーゼ複合体。
【０１０９】
要約
抗がん剤３−ブロモピルベート（３−ＢＰ）は、エネルギー枯渇によって解糖系がん細胞を優先的に殺す解糖阻害剤と見なされている。しかしながら、それの細胞傷害活性は、膜横断モノカルボン酸輸送体１（ＭＣＴ−１）を介した細胞薬剤移入に依存しており、それは抗がん能力をＭＣＴ−１陽性腫瘍細胞に制限するものである。本発明者らは、ＮＥＯ２１８と称される３−ＢＰのＭＣＴ−１非依存性類縁体を作り、特性決定した。ＮＥＯ２１８は、３−ＢＰを、天然モノテルペンであるペリリルアルコール（ＰＯＨ）に共有結合的に結合させることで合成した。いずれかの化合物による処理に対する各種腫瘍細胞系の応答を、補充のピルベート又は抗酸化剤Ｎ−アセチル−システイン（ＮＡＣ）及びグルタチオン（ＧＳＨ）の存在下又は非存在下で特性決定した。グリセルアルデヒド３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）酵素活性に対する薬剤効果を、質量分析によって調べた。３−ＢＰ抵抗性の発生を、イン・ビトロのＭＣＴ−１陽性ＨＣＴ１１６結腸癌細胞で調べた。本発明者らの結果は、ＮＥＯ２１８が、（ｉ）それのシステイン残基の４個全てでＧＡＰＤＨピルビン酸化して、酵素活性を遮断し；（ｉｉ）細胞ＡＴＰ含有量を生命維持レベル以下に大きく低下させ、及び（ｉｉｉ）急速壊死を誘発したことを示している。興味深いことに、補充の抗酸化剤が、ＮＥＯ２１８並びに３−ＢＰの細胞傷害性活性を効果的に防止したが、補充のピルベートは細胞を３−ＢＰからのみ強力に保護したが、ＮＥＯ２１８からは保護しなかった。３−ＢＰとは異なり、ＮＥＯ２１８は、細胞ＭＣＴ−１状況とは無関係に、それの強力な細胞傷害活性を発揮した。ＭＣＴ−１陰性細胞の出現に基づくと、ＨＣＴ１１６細胞の３−ＢＰによる処理により、急速に抵抗性が発生した。これは、ＮＥＯ２１８には当てはまらず、非常に３−ＢＰ抵抗性の細胞がＮＥＯ２１８に対して強く感受性のままであった。従って、本発明者らはの試験は、腫瘍細胞が急速に３−ＢＰに対する抵抗性を発生させ、ＮＥＯ２１８をこの細胞防御を受けない優れた薬剤として提供する機序を確認するものである。さらに、本発明者らの結果は、補充の抗酸化剤の役割に関する既に発表されているモデルの別の解釈を提供するものである。反応性酸素種（ＲＯＳ）を失活させるのではなく、補充のＮＡＣ又はＧＳＨが３−ＢＰと直接相互作用することで、薬剤がＲＯＳ産生を誘発し得る前にその薬剤の細胞傷害能力を中和する。総合すると、本発明者らの試験は、３−ＢＰの細胞傷害性機序の新たな側面を導入するものであり、ＮＥＯ２１８を、この薬剤に対する主要な細胞防御機構を克服することができる類縁体と特徴付けるものである。
【０１１０】
１．緒言
３−ブロモピルベート（３−ＢＰ；３−ブロモピルビン酸）は、細胞傷害活性を有するピルベートの合成ハロゲン化誘導体である。それは、ある種のタンパク質のアルキル化剤として機能し、それに続くタンパク質ピルビン酸化により、酵素活性の阻害が生じる。最も良く説明されている３−ＢＰの標的タンパク質は、解糖経路におけるグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）であり［１，２］、それは、３−ＢＰの解糖阻害剤としての評価に寄与した［３−６］。腫瘍細胞は、正常細胞よりかなり大きく解糖に依存しており（ワールブルク効果）、３−ＢＰによって誘発される細胞死は、細胞エネルギープールの枯渇によるものであると考えられている［３，４，７］。この観点は、補充のピルベートが、細胞培養における３−ＢＰの細胞傷害効果に対して細胞を保護できることを示す実験によってさらに裏付けられた［８，９］。
【０１１１】
３−ＢＰの細胞取り込みには、モノカルボン酸輸送体１（ＭＣＴ−１）の存在が必要であり［１０］、それはカルボキシレート膜横断輸送体の比較的大きいファミリーの１構成員である［１１］。ＭＣＴ−１はプロトン連動輸送タンパク質であり、ほとんどの組織で発現され、短鎖モノカルボン酸に対する広い特異性を示す。解糖腫瘍細胞において、ＭＣＴ−１は、乳酸輸送を介して高解糖流動を支援し、プロトンの共輸送を介して細胞内ｐＨを維持する［１２］。研究により、多様な種類の腫瘍でのＭＣＴ−１の高度発現が示されており、それは、３−ＢＰの腫瘍特異的取り込みを患者において行える可能性があることを示すものであると解釈された。しかしながら、ＭＣＴ−１レベル低下のある腫瘍の例もある。ＭＣＴ−１が多くの健常組織で広く発現されるという一般的所見と併せて考えると、３−ＢＰの腫瘍選択性が容易に達成可能であるか否かについては若干議論の余地が残っている［１２］。
【０１１２】
３−ＢＰのいくつかの他の表現型の結果が、イン・ビトロで報告されている。ＧＡＰＤＨに加えて、細菌から真菌からヒトまでの多くの他の酵素が、３−ＢＰによって阻害されることが明らかになっており、それにはコハク酸デヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ；複合体ＩＩ）及びヘキソキナーゼＩＩなどがあるが［１３−２１］、後者に対する影響が、一貫して認められたわけではなかった［１，２２］。３−ＢＰは、細胞内グルタチオンの枯渇及びそれのミトコンドリア上の影響を介した酸化ストレスを引き起こして、反応性酸素種（ＲＯＳ）のレベルを上昇させることも報告されている［２２−２４］。さらに最近では、自食作用の刺激［２５］、小胞体ストレスの誘発［２６］、及び二つの主要な細胞内シグナル伝達経路であるＡｋｔ／ｍＴＯＲ及びＭＡＰキナーゼ経路の調節不全などの３−ＢＰのさらなる多面発現効果が報告されている［２７］。イン・ビボで、３−ＢＰが多くの動物腫瘍モデルで治療能力を示しているが［６−２８−３０］、肝臓毒性が認められている［３１］。同様に、３−ＢＰを患者に投与する二つの事例研究が行われており［３２，３３］、そのうちの一方［３３］で、肝細胞癌患者において好ましい応答が報告されている。注目すべき点として、２０１６年夏に、ドイツの診療所で、数名の患者が、３−ＢＰ投与を受けてから数日以内に死亡しており、この極めて不幸な結果において、３−ＢＰが、もしあれば、何らかの役割を果たしているか否かについて現在調査が行われている［３４］。
【０１１３】
ペリリルアルコール（ＰＯＨ）は、モノテルペンであり、キャラウェー、ラベンダー及びライラックオイル、チェリー類、クランベリー類、セージ、スペアミント、セロリ種子、及びある種の他の植物の天然構成成分である［３５］。この化合物はいくつかの前臨床がんモデルで有望な活性を示したが、臨床試験で用量制限腸毒性が明らかになったことが主たる理由で、臨床で使われることはなかった［３６］。しかしながら、最近のブラジルでのＩ／ＩＩ相臨床試験で、ＰＯＨの簡単な経鼻吸入が、再発性神経膠芽腫に対して有効であり、検出可能な毒性事象がないことが明らかになった［３７］。ＰＯＨの治療可能性に基づき、本発明者らは、ＰＯＨを３−ＢＰに共有結合的に結合させることで、恐らく３−ＢＰ抵抗性がん細胞に適用可能であろう本質的に高い抗がん活性を有する新規な治療性化合物が得られる可能性があると仮定した。ここで本発明者らは、本発明者らの研究からの結果を提供して、３−ＢＰと比較した、ＮＥＯ２１８と称されるこの新規な３−ＢＰ類縁体のイン・ビトロ抗がん活性の分子的および細胞的特性決定について詳細に説明する。
【０１１４】
２．材料及び方法
２．１．薬剤
３−ＢＰはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）から入手し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶かして、２００ｍＭストック液を調製した。ＮＥＯ２１８は、Ｎｏｒａｃ  Ｐｈａｒｍａ（Ａｚｕｓａ  ＣＡ）が製造したものであり、ＮｅＯｎｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．（ＮＴＩ，  Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ，  ＣＡ）によって提供され；それをＤＭＳＯ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｉｎｃ．，  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，  ＣＡ）に２００ｍＭで溶解させた。小分け試料を、凍結／解凍を行わずに１ヶ月まで−２０℃で保存した。カスパーゼプロテアーゼの触媒部位に不可逆的に結合する細胞浸透性汎カスパーゼ阻害剤であるＺ−ＶＡＤ−ＦＭＫ（カルボベンゾキシ−バリル−アラニル−アスパルチル−［Ｏ−メチル］−フルオロメチルケトン）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手し、ＤＭＳＯで調製した２０ｍＭストック液から用いた。ピルビン酸ナトリウム及びピルビン酸メチルも同様に、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。ピルビン酸メチルの方がより効果的にミトコンドリアに進入すると考えられているが、本発明者らの実験では、両方の形のピルベートが同様に効果的であった。
【０１１５】
２．２．細胞系および培養
次のヒト腫瘍細胞系：ＨＣＴ１１６結腸癌；ＬＮ２２９、Ｔ９８Ｇ、及びＵ２５１神経膠芽腫；ＭＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＢＴＭ−１２、及びＴ４７Ｄ乳癌を用いた。ＭＥ１６Ｃは、テロメラーゼで不死化した正常乳腺上皮細胞である。３７℃及び７％ＣＯ２雰囲気の加湿インキュベータ中、全ての細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ中で増殖させた。全ての細胞培養試薬が、ＵＳＣ／Ｎｏｒｒｉｓ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｎｃｅｒ  ＣｅｎｔｅｒのＣｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｒｅ  Ｌａｂによって提供され、Ｃｅｌｌｇｒｏ／ＭｅｄｉａＴｅｃｈ  （Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ）からの原料を用いて製造されたものであり；ＦＢＳはＯｍｅｇａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｔａｒｚａｎａ，  ＣＡ）から入手した。
【０１１６】
２．３．ＭＴＴアッセイ
メチルチアゾールテトラゾリウム（ＭＴＴ）アッセイは、既報の方法に従って行った［３８］。即ち、細胞を、２．０〜８．０×１０３細胞／ウェルで９６ウェルプレートに接種し、２４時間又は４８時間にわたり薬剤処理（又は溶媒単独）に曝露した。個々の実験において、各処理条件は三連で設定し、各実験は独立に数回繰り返した。
【０１１７】
２．４．コロニー形成アッセイ
細胞系（及びプレーティング効率）に応じて、２５０〜８００個の細胞を、６ウェルプレートの各ウェルに接種し、既報で詳細に説明された方法に従って処理した［３９］。１２〜１６日後、コロニー（＞５０細胞の群と定義される）を、１％メチレンブルー（メタノール中溶液）で４時間染色することで肉眼観察できるようにし、カウントした。実験は少なくとも１回繰り返したが、通常は異なる条件下でさらに高頻度で繰り返した。
【０１１８】
２．５．ＬＤＨアッセイ
細胞系に応じて、２０００〜４０００細胞／ウェルを、９６ウェルプレートに体積５０μＬで接種した。翌日、更なる培地５０μＬ中の薬剤を加えた。異なる時間点で（通常は、２４時間のインキュベーション後）、培地５０μＬを取り、製造者の取扱説明書に従ってＬＤＨ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｗａｌｔｈａｍ，  ＭＡ）で処理した。このキットは、赤色ホルマザン生成物を生じる酵素反応を用いて培地中の細胞外ＬＤＨを測定するものであり、それは分光測定的に測定することができる。吸光度を４９０ｎｍ及び６８０ｎｍで測定した。全てのＬＤＨレベルを未処理対照に正規化し、対照の倍率変化として提供した。
【０１１９】
２．６．フローサイトメトリー
Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８  Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ／Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いるフローサイトメトリーによって、細胞死の特性決定を行った。このキットは、アポトーシス細胞と反応する組換え緑色フルオロフォア複合化アネキシンＶ、及び生存及びアポトーシス細胞は非透過性であるが、死亡細胞を染色するＤＮＡ結合赤色蛍光ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を含む。異なる細胞群を、４８８ｎｍレーザー励起によるフローサイトメトリー時の緑色蛍光（アポトーシス細胞）、赤色蛍光（壊死／死亡細胞）、及び無蛍光（生存細胞）によって識別することができる。対照又は薬剤処理細胞は、製造者の取扱説明書に従って処理し、次にＵＳＣ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｃｏｒｅ  ＦａｃｉｌｉｔｙでＬＳＲ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，  ＣＡ）を用いて１００００個細胞／点のフローサイトメトリーを行った。
【０１２０】
２．７．ＡＴＰアッセイ
細胞のＡＴＰ含有量を、グリセロールのリン酸化を利用して、５７０ｎｍでの比色分析によって定量される生成物を発生させるＡＴＰ  Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ／Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ａｓｓａｙキット（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ  Ｉｎｃ．，  Ｍｉｌｐｉｔａｓ，  ＣＡ）によって測定した。約１×１０６細胞を、１０ｃｍ組織培養プレートで培養し、各種機関にわたって薬剤処理に曝露し、そして製造者の取扱説明書に従って処理した。全てのＡＴＰレベルを未処理対照に正規化し、対照のパーセントとして示した。
【０１２１】
２．８．ＧＡＰＤＨ活性アッセイ
ＧＡＰＤＨイン・ビトロの酵素活性を、Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ＧＡＰＤＨ  Ａｓｓａｙキット（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）によって測定した。このアッセイは、３−ホスホグリセリン酸、ＡＴＰ及びＧＡＰＤＨの存在下のβ−ＮＡＤＨのβ−ＮＡＤへの酸化に基づくものである。ＧＡＰＤＨ活性は、３４０ｎｍでの吸光度における経時的な低下（ΔＡ３４０ｎｍ／分）に比例するＮＡＤＨ酸化の速度を分析することで求められる。細胞１０万個を細胞溶解緩衝液１００μＬ中で溶解させ、上記成分とともにインキュベートした。１０分間にわたる吸光度変化を計算し、未処理対照に対して正規化した。データは、対照のパーセントとして示される。二種類の薬剤処理を行い、一方のアプローチでは、薬剤を増殖細胞に加え、通常の細胞培養条件下で３０分間経過させ；他方のアプローチでは、薬剤を細胞溶解物に加えて４℃で１時間経過させた。
【０１２２】
２．９．ＭＣＴ１ノックダウン
全てのｓｉＲＮＡ類は、Ｑｉａｇｅｎ，  Ｖａｌｅｎｃｉａ，  ＣＡから購入した。ＭＣＴ１発現をノックダウンするため、本発明者らは、ｓｉＲＮＡ  Ｈｓ＿ＳＬＣ１６Ａ１＿６（標的配列：５′−ＣＡＧＣＡＧＴＡＴＣＣＴＧＧＴＧＡＡＴＡＡ−３′）を用いた。非サイレンシング対照として、本発明者らは、いずれの既知哺乳動物遺伝子とも相同性を持たないＡｌｌＳｔａｒｓ陰性対照ｓｉＲＮＡを用いた。６ウェルプレートの細胞１０万個／ウェルを、ｊｅｔＰＲＩＭＥトランスフェクション試薬及び緩衝液（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ）を用いて５０ｎＭ  ｓｉＲＮＡでトランスフェクションした。２４時間後に培地を変え、トランスフェクションから７２時間後に細胞の実験を行った。
【０１２３】
２．１０．免疫ブロット
合計細胞溶解物を、既報の方法に従ってウェスタンブロット分析によって分析した［４０］。開裂カスパーゼ７及びＰＡＲＰに対する一次抗体を、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄａｎｖｅｒｓ，  ＭＡ）から入手し、アクチン（Ｃ−１１）及びＭＣＴ１（Ｈ−１）に対する抗体を、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，  ＣＡ）から入手した。いずれの抗体も製造者推奨の方法に従って用いたが、例外として、ＭＣＴ１検出の場合に、ポリアクリルアミドゲル上にサンプルを負荷する前に煮沸段階を省略した。全ての免疫ブロットは少なくとも１回繰り返して、結果の確認を行った。
【０１２４】
２．１１．免疫細胞化学
ＨＣＴ１１６細胞を、２４ウェルプレート中のカバーガラス上に１〜２×１０５細胞／ウェルで接種した。翌日、細胞をアセトン中で１０分間固定し、次にＳＥＡブロッキング緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で３０分間ブロッキングし、ＭＣＴ１抗体（１：５０；Ｈ１、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）と室温で終夜インキュベートした。二次抗体は、ビオチン化ウマ抗マウスＩｇＧ（１：２００；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，  ＣＡ）であった。細胞を、ヘマトキシリンで２０秒間対比染色し、次にＶｅｃｔａＭｏｕｎｔ  ＡＱ封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中でマウント（ｍｏｕｎｔ）した。
【０１２５】
２．１２．液体クロマトグラフィー−質量分析
ＬＣ／ＭＳ実験は、Ｅａｓｙ−ｎＬＣ  １０００システムに連結されたＱ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ（商標名）Ｈｙｂｒｉｄ  Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析装置で行った。分析カラムは、Ｃ１８カートリッジトラップカラム（５ｍｍ×３００μｍ（内径）、５μｍ粒子（孔経１００Å）を充填）と直列連結されたＣ１８  ＥＡＳＹ−Ｓｐｒａｙカラム（２５ｃｍ×７５μｍ（内径）、２μｍ粒子（孔経１００Å）を充填）であった。反応生成物を、流量３００ｎＬ／分及び１５０分勾配で分割した。溶媒Ａは、０．１％ギ酸含有１００％水であった。溶媒Ｂ含有率（０．１％ギ酸含有１００％アセトニトリル）を、１４０分以内で２〜４４％に上昇させた。次に、分割反応生成物を、３７５〜１７００ｍ／ｚのサーベイスキャン、２００ｍ／ｚで７００００の分解能、及び１ｅ６のＡＧＣターゲット（最大注入時間は６０ｍｓに設定した。）でのデータ依存性獲得モード下に分析した。サーベイスキャン後、２００ｍ／ｚで１７，５００の分解能、及び５ｅ４のＡＧＣターゲット（最大注入時間は６４ｍｓに設定した。）で正規化衝突エネルギー（ＮＣＥ）２７下に、トップ１０の生成物イオンをフラグメンテーションのために選択した。生質量分析データのデータ分析を、Ｘｃａｌｉｂｕｒ（商標名）及びＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃが開発したＰｒｏｔｅｏｍｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒソフトウェアを用いて行った。
【０１２６】
ＧＡＰＤＨとの相互作用：ウサギ筋肉からの精製ＧＡＰＤＨタンパク質（３０μｇ、１μｇ／μＬ）（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、６０μＭ  ３−ＢＰ又はＮＥＯ２１８の５０ｍＭ重炭酸アンモニウム中溶液とともに室温で１５分間インキュベートし、次にさらなる処理まで−２０℃で保存した。１０，０００ｇの力で３Ｋ遠心フィルターを用いて、試薬を除去した。次に、フィルターに５０ｍＭ重炭酸アンモニウム緩衝液１００μＬを加え、１０ｍＭ  ２−ヨードアセトアミドで１時間処理して、ＧＡＰＤＨ上で遊離システインをアルキル化した。消化を、合計比１／５０（トリプシン／ＧＡＰＤＨ）で２段階で行った。最初、トリプシンの半量を加え、フィルターを３０分ごとに渦攪拌しながら、混合物を３７℃で２時間インキュベートした。第２に、残りの量のトリプシンを加え、混合物を終夜インキュベートした。１６時間の消化後、１体積％ギ酸を加えることで、反応を停止した。反応混合物５μＬを、分析用のトラップカラムに負荷した。標的反応を動的修飾と定義することで、ＧＡＰＤＨトリプシンペプチド上の修飾システイン残基を確認した。
【０１２７】
ＧＳＨ及びＮＡＣとの相互作用：等モル濃度（体積５０μＬで１０ｍＭ）のＮＥＯ２１８及びＧＳＨ又はＮＡＣを、３７℃又は５０℃で１時間反応させた。反応混合物の小分けサンプルをトラップカラムに負荷してＬＣ／ＭＳ分析を行った。同位体分布及び強度（１３Ｃ同位体ピーク）と組み合わせた名目ｍ／ｚ値ピークによって、反応生成物を同定した。
【０１２８】
２．１３．統計解析
全てのパラメータデータを、スチュデントのｔ検定を用いて解析して、有意値を計算した。確率値（ｐ）＜０．０５を、統計的に有意と見なした。
【０１２９】
３．結果
３．１．細胞傷害力：新規な３−ＢＰ類縁体、ＮＥＯ２１８
イン・ビトロの３−ＢＰの細胞傷害効果がＭＣＴ−１の存在に依存することが報告されていることから、本発明者らは、試験で使用される各種腫瘍細胞系での３−ＢＰの細胞傷害性とともにＭＣＴ−１発現レベルを特性決定することで試験を開始した。本発明者らは、１種類の結腸癌細胞系（ＨＣＴ１１６）、３種類の神経膠芽腫細胞系（ＬＮ２２９、Ｔ９８Ｇ、Ｕ２５１）、４種類の乳がん細胞系（ＭＣＦ７、Ｔ４７Ｄ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８）、原発性乳がん細胞の一つの培養物（ＢＴＭ−１２）、及び正常乳房上皮細胞の確立された株（ＭＥ１６Ｃ）を含めた。１０種類全ての細胞系について、本発明者らは、ウェスタンブロット分析によるＭＣＴ−１タンパク質レベルとともにＭＴＴアッセイによってＩＣ５０（細胞群の５０％を殺す薬剤の濃度）を確立した。図１６Ａ〜１６Ｃにまとめたように、ＭＣＴ−１レベルは異なる細胞で大きく変わり、ＩＣ５０値もそうであった。しかしながら、二つの間には明瞭な相関があり：高ＭＣＴ−１レベルを有する細胞（ＨＣＴ１１６、Ｕ２５１、ＭＥ１６Ｃ、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８）は、それより低いＭＣＴ−１レベルを有する細胞（ＩＣ５０：１５０〜３００μＭ）よりかなり低いＩＣ５０（１５〜６０μＭ）を示した。これらの結果は、細胞の３−ＢＰに対する感受性には高ＭＣＴ−１発現レベルが必要であるという以前のデータと一致するものである。
【０１３０】
３−ＢＰの抗がん効果をさらに調べるため、本発明者らは、モノテルペンＰＯＨが３−ＢＰに共有結合的に複合体化した類縁体を作った。二つの永久的に縮合した抗がん化合物からなるこの新規なキメラをＮＥＯ２１８と称した（図１）。次に、本発明者らは、１０種類全ての細胞系についてＭＴＴアッセイを行って、ＮＥＯ２１２の細胞傷害活性を３−ＢＰと対照比較した。興味深いことに、ＮＥＯ２１８は、各及び全ての細胞系で同様に強力であり、ＭＣＴ−１発現レベルとは無関係に、ＩＣ５０は１５〜２５μＭの狭い範囲内であった（図１６Ａ〜１６Ｃ）。
【０１３１】
二つの薬剤間のこの明瞭な差を確認するため、本発明者らは、２種類のみの細胞系でさらなる細胞毒性アッセイを行い、３−ＢＰに対する高ＭＣＴ−１発現及び高感受性を代表するＨＣＴ１１６細胞を、３−ＢＰに対して非常に低いＭＣＴ−１発現及び非常に低い感受性を代表するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞と比較した。これらの細胞を、３−ＢＰ又はＮＥＯ２１８の濃度を上昇させながら、それによって処理し、薬剤効果をＭＴＴ短期毒性アッセイ、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出アッセイ、及び長期コロニー形成アッセイ（ＣＦＡ）によって定量した。結果を図１７Ａ〜１７Ｃに詳細に示しており、次のようにまとめることができる。すなわち、３−ＢＰは、ＨＣＴ１１６細胞では強い効力を発揮したが、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞ではごく小さな効力しか発揮せず、それは、３種類全てのアッセイで一貫して認められた。それと比較して、ＮＥＯ２１８は、３種類全てのアッセイで両細胞系で非常に強力であった。ＨＣＴ１１６細胞において、３−ＢＰ及びＮＥＯ２１８は、非常に類似の濃度で活性であり、半最大効果はＭＴＴ、ＬＤＨ、及びＣＦＡアッセイでそれぞれ、約１８μＭ、８μＭ、及び３μＭであった。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞において、ＮＥＯ２１８は同じ高効力を維持したが、３−ＢＰの有効濃度は非常に高くなり、３種類のアッセイにおいてそれぞれ約２２０μＭ、３５０μＭ、及び１３０μＭとなった（図１７Ａ〜１７Ｃ）。従って、実験評価手順とは無関係に、３−ＢＰ及びＮＥＯ２１８は、ＭＣＴ−１陽性細胞で同様に活性であり；しかしながら、ＭＣＴ−１陰性細胞では、３−ＢＰは顕著に活性が低かったが、ＮＥＯ２１８はそれの全細胞傷害力を発揮し続けた。
【０１３２】
ＮＥＯ２１８は、それぞれ抗がん能力を有することが知られている二つの個々の化合物の結合によって形成されたものであることから、本発明者らは次に、３−ＢＰとＰＯＨとの単なる混合がＮＥＯ２１８を模倣可能であるか否かを調べた。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、ＮＥＯ２１８、３−ＢＰ、ＰＯＨ、又は３−ＢＰ＋ＰＯＨの混合で処理し、ＭＴＴ、ＬＤＨ、及びＣＦＡアッセイによって分析した。前記のように、ＮＥＯ２１８は、これら全てのアッセイで非常に強力であったが、３−ＢＰはかなり活性が低かった（図１８Ａ〜１８Ｃ）。ＰＯＨ単独では、非常にごく弱い細胞傷害効果しか発揮せず、ＩＣ５０はミリモル濃度範囲に近いものであり、それは、この化合物の抗がん効果を分析した多くの他の試験と一致するものである。注目すべき点として、３−ＢＰ＋ＰＯＨの混合は、３−ＢＰ単独の場合を超える活性を持たなかった；即ち、ＰＯＨを３−ＢＰに加えても、細胞傷害性結果が３−ＢＰ単独の効果に勝るものまで高まることはなく（図１８Ａ〜１８Ｃ）、それは、３−ＢＰ類縁体の新規な生理化学特性を示すものであった。
【０１３３】
３．２．薬剤効果におけるＭＣＴ−１の役割
上記の結果は、ＮＥＯ２１８の細胞傷害効果がＭＣＴ−１の存在を必要としないことを示していた。この結論をさらにバリデーションするため、本発明者らは、ｓｉＲＮＡトランスフェクションを用いて、ＨＣＴ１１６細胞でＭＣＴ−１発現をノックダウンした。予想通り、ＭＣＴ−１発現のそのような低下により、３−ＢＰに対する顕著な抵抗性が生じ、ＩＣ５０は、２０μＭから６７μＭに３倍強上昇した（図１９Ａ）。それと比較して、ＮＥＯ２１８に対するＩＣ５０は上昇せず、１９μＭから１５μＭまでわずかに低下した。対照として、本発明者らは、ウェスタンブロット（図１９Ｂ）及び免疫組織化学（図１９Ｃ）によって、ＭＣＴ−１のｓｉＲＮＡ介在低下を確認した。
【０１３４】
ＨＣＴ１１６細胞を用いる本発明者らの毒性アッセイの一部で、本発明者らは、ＮＥＯ２１８による処理後ではなく３−ＢＰによる処理後に、用量−応答曲線の勾配は平らになったように思われることに気づき（例えば、図１７Ａ）、それは、他のものより３−ＢＰに対して抵抗性が高い細胞の小下位群の存在を示唆している。免疫組織化学によって個々の細胞をより厳密に調べて、本発明者らは、他のほとんどＭＣＴ−１陽性群の中で、少数の見かけ上ＭＣＴ−１陰性である細胞を検出した（図２０Ａ）。ＭＴＴアッセイで見かけの生存率を７５％低下させ（図１７Ａ）、ＣＦＡでコロニー形成を９９％遮断する濃度を代表する４０μＭでＨＣＴ１１６細胞を処理することで、この側面をさらに調べた。終夜３−ＢＰ処理後、ＨＣＴ１１６細胞を回収し、約２週間後に、細胞群は完全に回復した。本発明者らが３−ＢＰ生存細胞と呼ぶこれらの細胞をさらに分析した。興味深いことに、免疫組織化学（図２０Ａ）によっても、ウェスタンブロット（図２０Ｂ）によっても、これらの細胞でＭＣＴ−１発現は全く検出できなかった。３−ＢＰに対するそれらの感受性を分析した際に、本発明者らは、それらがこの化合物に対して顕著に抵抗性となったことを認め、ＩＣ５０は１００μＭより十分高く、図１６Ａ〜１６Ｃに示したＭＣＴ−１陰性細胞について実証されたＩＣ５０の範囲内であった。総合すると、これらの結果は、３−ＢＰ処理がＭＣＴ−１陰性細胞を効果的に選択し、それがその後に３−ＢＰ抵抗的に細胞群を急速に回復させることを示した。興味深いことに、ＮＥＯ２１８はそのような効果は全く持たなかった。一方において、ＨＣＴ１１６細胞を４０μＭ  ＮＥＯ２１８で処理すると生存細胞は全く残らず；他方、非常に３−ＢＰ抵抗性の３−ＢＰ生存細胞はＮＥＯ２１８に対する高い感受性を保持した（図２０Ｃ）。
【０１３５】
３．３．支配的タイプの細胞死としての壊死の確立
本発明者らは次に、薬剤誘発細胞死の特性決定を行い、特には、３−ＢＰ又はＮＥＯ２１８による細胞の処理に応答したアポトーシスと壊死との間を区別することを試みた。本発明者らは最初に、薬剤処理細胞のＦＡＣＳ分析を行って、アネキシンＶ陽性性（アポトーシスのマーカー）対ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）取り込み（壊死細胞のマーカー）を調べた。本発明者らは、アポトーシス細胞死の確立された陽性対照としてスタウロスポリン（ＳＴＳ）を用いた。図２１Ａで見られるように、ＳＴＳは予想通りに機能した：この薬剤で処理したＨＣＴ１１６細胞は、左下象限（＝完全生存細胞）から右下象限（＝アネキシンＶ陽性細胞）に移動してから、右上象限にゆっくり蓄積した（＝ＰＩ陽性、死亡細胞）。それと著しい対照をなすものとして、３−ＢＰ及びＮＥＯ２１８の両方の処理により、細胞は左下象限から右上象限に真っ直ぐ移動した。この効果は非常に急速であり、処理開始から２時間後という早い段階で検出可能であり；８時間の時点で、大半の細胞がＰＩ陽性であり（図２１Ａ）、それは、アポトーシスではなく壊死が優勢であることを示している。
【０１３６】
第２に、本発明者らは、アポトーシスの代表的なマーカー、具体的にはＰＡＲＰ（ポリ−ＡＤＰ−リボースポリメラーゼ）のタンパク質分解開裂、カスパーゼ７（Ｃ−７）の活性化、及びリン酸化ＨＡ２Ｘタンパク質の出現（□−ＨＡ２Ｘ、ＤＮＡの損傷及び分解を示す）を分析した。ＨＣＴ１１６及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、３−ＢＰ又はＮＥＯ２１８により、それらの個々の細胞傷害濃度で処理し、又はアポトーシス誘発の陽性対照としてのＳＴＳによって処理した。図２１Ｂは、ＳＴＳが、予想通り、ＰＡＲＰの明白な開裂、Ｃ−７の活性化、及び□−ＨＡ２Ｘの出現を誘発したことを示している。しかしながら、それと比較して、３種類全てのアポトーシスマーカーが、３−ＢＰ又はＮＥＯ２１８に対しては、あったとしてもごくわずかにしか応答しなかった。本発明者らは、強力な汎カスパーゼ阻害剤であるＺ−ＶＡＤ−ＦＭＫを含めることで、３−ＢＰ又はＮＥＯ２１８の細胞傷害効果に影響があり得るか否かも確認した。しかしながら、図２１Ｃに示したように、それは当てはまらなかった。即ち、カスパーゼ活性化の阻害は、その２薬剤の細胞傷害性ＩＣ５０に影響せず、それは、代表的なアポトーシス事象がなかったことを示している。
【０１３７】
アポトーシスは細胞エネルギーを必要とする活性プロセスであることが知られていることから、本発明者らは次に、薬剤処理後の細胞ＡＴＰレベルを確認した。評価基準として、本発明者らは、ロテノン（ミトコンドリア呼吸複合体Ｉ阻害剤）の存在下に、約２５％動作閾値以下へのＡＴＰレベル降下により壊死細胞死を引き起こすことが知られている培養条件であるグルコース欠乏培地（解糖を最小とするため）での細胞の培養も行った。ＨＣＴ１１６細胞を用いた図２２に示したように、そのような厳しい培養条件によって、実際に、急速なＡＴＰ枯渇、最初の３時間処理内での２５％閾値突破、及び６時間後の正常値の約１０％までのさらなる低下が生じた。顕著な類似点として、３−ＢＰ又はＮＥＯ２１８による細胞の処理により、ほぼ同一の結果となった（図２２）。総合すると、これらの結果は、重度の細胞エネルギーレベル欠乏に続発する、両化合物についての細胞死の支配的機序として壊死を提供するものである。
【０１３８】
３．４．薬剤誘発細胞傷害性の機序
３−ＢＰ及びＮＥＯ２１８の両方が細胞エネルギー産生の急速に致死的な終了を引き起こしたことが確認されて、本発明者らは次に、この効果の原因を確認する作業を開始した。過剰のピルベートの添加、又は抗酸化剤の補充によって、イン・ビトロで３−ＢＰの細胞傷害効果から細胞が保護できたことが、他の研究者によって報告されていた。従って、本発明者らは、これらの手掛かりを追求し、それらがＮＥＯ２１８にも同様に当てはまるか否かを調べた。ＨＣＴ１１６細胞を、ピルベート若しくは酸化防止剤（Ｎ−アセチルシステイン、ＮＡＣ、及びグルタチオン、ＧＳＨ）の存在下又は非存在下にＮＥＯ２１８又は３−ＢＰで処理し、細胞生存率を２４時間後に求めた。予想通り、３種類の細胞外添加された化合物のそれぞれが、３−ＢＰ毒性に対する強い保護を発揮することができた。しかしながら、ＮＥＯ２１８の場合、顕著な差があった。抗酸化剤処理によって、同様にＮＥＯ２１８に対して細胞が保護されたが、ピルベートを加えた場合は、保護は全くなかった（図２３Ａ）。（この効果の解釈に関しては「考察」を参照する。）。
【０１３９】
３−ＢＰがグリセルアルデヒド３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の阻害剤として報告されていたことから、本発明者らは次に、ＧＡＰＤＨ酵素活性を調べた。最初に、ＨＣＴ１１６細胞を３−ＢＰ又はＮＥＯ２１８で処理し、３０分後、細胞を溶解させて、ＧＡＰＤＨ活性の測定に供した。図２３Ｂに示したように、ＧＡＰＤＨ活性はいずれの化合物によっても大きく阻害され、ＩＣ５０は３０μＭよりやや低かった。第２に、ＧＡＰＤＨ活性に対する薬剤効果を、無細胞抽出物で確認し、その場合、薬剤は生存細胞に加えず、細胞溶解物に加えた。図２３Ｃに示したように、両方の化合物は同様に、これらの条件下で酵素ＧＡＰＤＨ活性を強力に低下させた。しかしながら、驚くべきことに、これらは無傷ミトコンドリアその他の細胞プロセスによるフリーラジカル生成の可能性がない無細胞反応条件であったが、酸化防止剤（ＮＡＣ又はＧＳＨ）の存在下に、この阻害効果は完全に防止された。この結果は、ＮＡＣ又はＧＳＨの保護効果が、従来のフリーラジカル種失活によるものではなかった可能性を示唆した。（ＮＡＣ及びＧＳＨによる細胞保護を説明する別のモデルに関しては「考察」を参照する。）
３−ＢＰの既知のアルキル化性に基づき、本発明者らは次に、３−ＢＰ及びＮＥＯ２１８がＧＡＰＤＨタンパク質を共有結合的にピルビン酸化できるか否かの疑問を扱った。ＧＡＰＤＨのアミノ酸配列は、４個のシステイン（ウサギでは、位置１５０、１５４、２４５、２８２）を含み、それらのチオール官能基は、求核付加の候補を代表するものである。本発明者らは、３−ＢＰ又はＮＥＯ２１８のいずれかとともに精製ウサギＧＡＰＤＨタンパク質をインキュベートし、得られた生成物を質量分析によって分析した。この分析によって、共有結合的に修飾されたシステインが明瞭に同定された。３−ＢＰとのインキュベーションの場合、４個のシステイン全てがピルベートの付加によって変わった；ＮＥＯ２１８とのインキュベーションの場合、同じ４個の残基が、ピルベート−ペリリルアルコール部分の結合を示した（図２４Ａ）。総合すると、上記の結果は、３−ＢＰ及びＮＥＯ２１８が、特に、酵素機能に最も必須であることが知られている［４１］活性部位Ｃｙｓ−１５０（ヒトＧＡＰＤＨにおけるＣｙｓ−１５２と等価）において、それのシステイン残基のアルキル化により、ＧＡＰＤＨ酵素活性の阻害を引き起こしたことを示した。
【０１４０】
本発明者らはまた、ＮＥＯ２１８（及び３−ＢＰ）が多くの他の標的を有する可能性があると考え、従って、ＧＳＨ及びＮＡＣとの直接相互作用の可能性も調べた。精製ＧＳＨ又はＮＡＣをイン・ビトロでＮＥＯ２１８と混合し、次に質量分析を行った。両方の抗酸化剤が、３−ＢＰ類縁体と容易に相互作用した。ＧＳＨ＋ＮＥＯ２１８の場合、その反応によって一つの支配的縮合生成物が生じ（図２４Ｂ）、それは不活性複合体を生じると考えられる求核置換反応と一致する。ＮＡＣ＋ＮＥＯ２１８の場合、多くの異なる反応生成物が得られ、主要生成物の一つをさらなる分析用に選択した。この生成物のクロマトグラムは、求核付加反応を示しており、ＮＥＯ２１８のブロミド残基が最終反応生成物構造から離れなかった可能性があるが（図２４Ｃ）、そうではあっても、ＮＡＣのＮＥＯ２１８との相互作用を明瞭に示している。他の反応生成物の特性決定は行わなかった。総合すると、これらの結果は、ＮＥＯ２１８とＧＳＨ又はＮＡＣとの間の直接相互作用を示している。この結果に基づくと、補充されたＧＳＨ又はＮＡＣが、主としてアルキル化性化合物の求電子性を消すことで、細胞をＮＥＯ２１８から（又は３−ＢＰから）保護するものと考えられる。
【０１４１】
４．考察
３−ＢＰは、肝臓がんについての抗がん剤として開発中であるが、それの詳細な作用機序は完全に明らかになっているわけではない。例えば、３−ＢＰによる細胞エネルギーレベルの低下は実証されているが、それがどのようにして生じるかについは完全にわかっているわけではない。ただし、３−ＢＰの実証されているＧＡＰＤＨ（又は恐らくはヘキソキナーゼ）阻害を介した解糖の遮断によるものであることが挙げられる場合が多い。多くの報告が、３−ＢＰ誘発細胞死の主要要素として酸化ストレスを挙げており、そして自食作用及び各種シグナル伝達経路も示唆されている。本発明者らは、３−ＢＰのＰＯＨ連結類縁体であるＮＥＯ２１８を作ったが、それはこれらの機序の一部の役割をさらに明らかにする上で非常に有用であることが分かった。さらに、この類縁体は、がん療法の文脈で関連のある新たな特徴を示した。
【０１４２】
３−ＢＰ及びＮＥＯ２１８の本発明者らによる比較イン・ビトロ分析により、重要な共通点、並びに興味深い相違が明らかになり、その相違は、３−ＢＰの細胞傷害機序についての理解を深める上での重要な手掛かりを提供するものであった。他の研究者らによる関連のある最近公開された研究からの結果と併せて、本発明者らの新たなデータに基づき、本発明者らは、３−ＢＰ作用の最新モデル（下記で詳細に説明する）を提案し、さらなる研究のための新たな材料として、それの類縁体であるＮＥＯ２１８を紹介しようと考える。
【０１４３】
３−ＢＰとＮＥＯ２１８の間の主要な相違は、それらの細胞への進入に関するものである。３−ＢＰが膜横断ＭＣＴ−１による能動輸送を介して細胞に進入することが実証されており［１０］、本発明者らは、このモデルを次のように確認した。（ｉ）調べた１０種類全ての細胞系において、３−ＢＰの細胞傷害性ＩＣ５０を、それらの個々のＭＣＴ−１タンパク質レベルと近接して並べた；即ち、高ＭＣＴ−１タンパク質レベルを有する細胞は、一貫して、低ＭＣＴ−１レベルを有する細胞よりかなり低いＩＣ５０を示した（図１６Ａ〜１６Ｃ）。（ｉｉ）ＭＣＴ−１のノックダウンにより、３−ＢＰによる殺滅に対する高い抵抗性が生じた（図１９Ａ〜１９Ｃ）。（ｉｉｉ）ＭＣＴ−１発現の欠如に関して選択したＨＣＴ−１１６細胞は３−ＰＢに対して非常に抵抗性であったが、ＭＣＴ−１陽性親細胞は非常に感受性であった（図２０Ａ〜２０Ｃ）。これらの結果を、次のようにＮＥＯ２１８と比較した。（ｉｖ）ＮＥＯ２１８は、ＭＣＴ−１発現レベルとは無関係に、同じ１０種類の細胞系で低濃度（１５〜２０μＭ）で同様に強力であった。（ｖ）ＮＥＯ２１８のＩＣ５０はＭＣＴ−１のノックダウン後には上昇しなかった（図１９Ａ〜１９Ｃ）。（ｖｉ）ＭＣＴ−１発現の欠如に関して選択したＨＣＴ−１１６細胞は、それらの親対応物と同等にＮＥＯ２１８に対して感受性であった（図２０Ａ〜２０Ｃ）。さらに、モル大過剰の補充ピルベート（既知のＭＣＴ−１基質）を加えることで、細胞は３−ＢＰから強力に保護されたが、ＮＥＯ２１８からは保護されなかった（図２３Ａ）。総合すると、これらのデータは、ＮＥＯ２１８がＭＣＴ−１非依存的に効果的に細胞に進入するという本発明者らのモデルを完全に裏付けるものである。拡散によるか別の能動輸送機序によるかとは無関係に、それの細胞取り込みの正確な形態についてはまだ解明されていない。ペリリルアルコールが脂質二重層との動的相互作用を発揮するという以前の所見［４２］を考慮すると、このモノテルペンの３−ＢＰへの共有結合的結合がキメラ化合物に親油性を与えることで、受容体非依存性膜相互作用が生じて、細胞進入が達成されると考えられるであろう。
【０１４４】
細胞取り込みは３−ＢＰとＮＥＯ２１８の間で非常に異なるが、これら二つの化合物が細胞死を引き起こす機序は同一であるように見える。即ち、一旦細胞内に入ると、いずれの化合物も、最初の主要段階としてタンパク質アルキル化により、同じ一連の事象を誘発するように見える。３−ＢＰのＧＡＰＤＨへの結合及びそれの活性の阻害についてはすでに報告されている［１，２，４３］。本発明者らは３−ＢＰ及びＮＥＯ２１８の両方によるＧＡＰＤＨ酵素活性の阻害を確認したが（図２３Ｂ、２３Ｃ）、本発明者らはさらに、ＧＡＰＤＨの一次アミノ酸配列内の４個全てのシステイン残基がアルキル化の標的であることを確認した（図２４Ａ）。ウサギタンパク質中のＣｙｓ−１５０（ヒト配列中のＣｙｓ−１５２に相当）は酵素機能に必須であることが知られていることから［４１］、ピルビン酸化が、３−ＢＰ及びＮＥＯ２１８がＧＡＰＤＨの阻害を達成する主要機序を代表すると結論付けることが妥当である。
【０１４５】
基本的に、システインはタンパク質中で最も本質的に求核性のアミノ酸であり、機能性システイン中のチオール側鎖がマイケル受容体型化学剤と容易に相互作用する（「マイケル反応」）ことが立証されている［４４］。従って、ＧＡＰＤＨシステインが３−ＢＰ及びＮＥＯ２１８の直接の標的であると確認されたことはさほど驚くべきことではなかった。しかしながら、当然の結果として、多くの他の細胞タンパク質の活性が、この種類の相互作用によって影響され得ることも示される。３−ＢＰ以外のチオール反応性求電子剤を用いる他の研究者による研究［４５，４６］により、そのような修飾に応答するシステインを有する＞５００種類（ほとんど同定されていない）のタンパク質が明らかになった。これらのタンパク質の全てが、あらゆる求電子剤によって一貫して修飾されたわけではないが、ある種のタンパク質ファミリーが他のものより感受性であり、特定のコア基が、調べた全ての求電子剤によって修飾されると思われた。３−ＢＰ及びＮＥＯ２１８の文脈で、ＧＡＰＤＨ以外の多くの他のタンパク質が標的となり、これらの薬剤の細胞傷害効果をもたらし得ると推定できると考えられる。実際、細菌から真菌からヒトまでの多くの他の酵素が、３−ＢＰによって阻害されることが示され［１３−２１］、その酵素には、トリカルボン酸回路を電子伝達鎖と連結する主要酵素であるコハク酸デヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）などがある［２，１９，４７］。
【０１４６】
非常に多数の可能な３−ＢＰ及びＮＥＯ２１８標的には、どれが薬剤誘発細胞死に関与するかという点に関しての疑問が生じる。他の研究者によって示され［２２，２４，４８］、さらにＮＥＯ２１８について本発明者らによって確認されたように（図２２）、３−ＢＰは細胞ＡＴＰプールの重度の枯渇を引き起こし、それは、細胞生存性を維持することができず、壊死に至るのが不可避であることが知られている条件である［４９−５１］。従って、３−ＢＰ及びＮＥＯ２１８の非常に多くの可能な標的の中で、これら二つの酵素の高活性がなければ、細胞は生存に十分なエネルギーを産生することができない可能性が高いことから、ＧＡＰＤＨ及びＳＤＨの同時阻害が顕著になる。補充のピルベートがＮＥＯ２１８誘発細胞死を超える上で完全に無効であるという本発明者らの所見は、ＧＡＰＤＨとともに、ＳＤＨの推定の重要性をさらに強調するものである（図２３Ａ）。これは、他の研究者による所見［８，９］、及び本発明者による所見（図２３Ａ）と著しい対照をなすものであり、補充のピルベートによって提供される３−ＢＰに対する強力な保護を示すものである。以前の解釈は、ピルベートが、欠落した解糖最終生成物を提供することで３−ＢＰ毒性を超える（即ち、ＧＡＰＤＨ阻害の結果を中和）ことを示唆したが、それに対して、本発明者らのＮＥＯ２１８との対照比較によると、（モル大過剰の）ピルベート添加によって、ＭＣＴ−１による細胞取り込みについての効果的競争により、３−ＢＰから細胞が保護されると推定される。さらに、増殖培地からのグルコースの完全な除去は、本発明者の試験で使用した腫瘍細胞の短期生存にほとんど影響せず、３−ＢＰ誘発細胞死を明瞭に模倣するわけではない（不図示）。他方、解糖及びミトコンドリア呼吸の同時阻害（グルコースの除去及びロテノンの同時添加による）は、３−ＢＰ及びＮＥＯ２１８によって引き起こされるＡＴＰ枯渇の急速な動力学に非常に類似している（図２２）。総合すると、本発明者らのモデル（他の研究者による所見と一致［４７，５２，５３］）は、３−ＢＰ及びＮＥＯ２１８によって誘発される細胞死の主要な初期トリガーとしてのＧＡＰＤＨ及びＳＤＨの強力な同時阻害を支持するものであるが、ただし、他の可能な標的の寄与があり得るし、まだ解明されていない。
【０１４７】
３−ＢＰ及びＮＥＯ２１８による細胞処理に応答したＧＡＰＤＨの阻害が、ＲＯＳによってさらに増悪する可能性がある。３−ＢＰは、細胞ＧＳＨレベルを低下させて、ＲＯＳレベルが高くなることが明らかになっている［２２，２３］。解糖ＧＡＰＤＨ活性は高ＲＯＳレベルによって阻害可能であることから［５４］、ピルビン酸化＋ＲＯＳによって開始される二面攻撃によってＧＡＰＤＨが停止される可能性が非常に高い。ピルビン酸化に加えて、ＡＴＰプールを生命維持レベル以下に枯渇させるために、ＲＯＳによるこの追加の抑制が必要か否かはまだ明らかになっていない。いくつかの既報の研究［８，２４，２５，５５］が、補充の抗酸化剤を使用し、３−ＢＰ誘発細胞死でのＲＯＳの役割を調べるための手段として、主としてＧＳＨ及びＮＡＣを加えており、３−ＢＰ及びＮＥＯ２１８の両方を用いて本発明者らが図２３Ａ〜２３Ｃで示しているものと同様の、３−ＢＰからの細胞の保護においていずれか一つが顕著に強力であることを認めている。この結果はＲＯＳの発生が実際に、３−ＢＰによる細胞死に介在する上で必須であることを示すものと解釈されていたが、本発明者らの結果はそれとは異なるものを示している。
【０１４８】
例えば、３−ＢＰ及びＮＥＯ２１８は、無細胞系でもＧＡＰＤＨ活性を阻害し、ＲＯＳは何らかの役割を果たすとは考えられず、ＧＳＨ又はＮＡＣの添加が、これらの条件でも保護的であることが証明された（図２３Ｃ）。さらに、ＧＡＰＤＨのシステインチオール基とのＮＥＯ２１８の強力な相互作用と同様に、ＬＣ／ＭＳ分析によって明らかなように（図２４Ａ〜２４Ｃ）、ＮＥＯ２１８は求核性ＧＳＨ及びＮＡＣとも直接相互作用した。本発明者らは、この質量分析に３−ＢＰを含めなかったが、他の研究者による最近の報告で、細胞の非存在下で、並びに赤血球及びＭＣＦ７細胞中で細胞内的に、ＧＳＨが３−ＢＰと直接相互作用することが示された［５６］。総合すると、これらの所見は、モル過剰の補充のＧＳＨ及びＮＡＣが３−ＢＰ／ＮＥＯ２１８に効果的に結合し、それを中和することで作用することで、最初にＲＯＳ産生を防止（上昇したＲＯＳレベルを二次的に失活させることによるのではなく）するというモデルを支持している。総合すると、３−ＢＰが、細胞内ＧＳＨプールの枯渇を介してＲＯＳレベルを上昇させることが明らかであるが［２２，２３，４３］（恐らくはミトコンドリア呼吸に対する効果による［５７］）、これらのＲＯＳが実際に薬剤誘発細胞死に必要であるか否か、又は主要な代謝酵素のピルビン酸介在の失活で十分である可能性があるか否かについては、まだ解明されていない。
【０１４９】
３−ＢＰ誘発細胞死の機序は、アポトーシス、ネクロトーシス又は壊死であると多様に報告されている（例えば、参考文献［２２，２４，２６，５８，５９］）。化学療法の文脈では、この区別は重要である。最近の総覧で指摘されているように［６０］、一部の一般に持たれている考えとは逆に、アポトーシスではなく壊死が、最も効果的な化学療法の好ましい細胞死形態であるに違いない。本発明者らは、アポトーシス事象についての陽性対照としてスタウロスポリンを含めて、異なる観点からこの問題に焦点を当てるのにかなり注意を払った。本発明者らはまた、ＭＣＴ−１陽性及び陰性細胞を用い、それによって、高３−ＢＰ濃度での事象が低濃度での事象と異なる可能性を調べることができた。
【０１５０】
本発明者らの全てのデータが高度に一貫しており、本発明者らの細胞系で３−ＢＰ及びＮＥＯ２１８の両方による圧倒的に支配的な機序として壊死を示しており、次の所見によってそれは裏付けられる。（ｉ）汎カスパーゼ阻害剤は、３−ＢＰ又はＮＥＯ２１８の細胞傷害性ＩＣ５０に対して全く影響しなかった（図２１Ｃ）。（ｉｉ）いくつかの確立されたアポトーシスのタンパク質マーカーは、あってもごく小さい薬剤処理への応答を示す（図２１Ｂ）。（ｉｉｉ）細胞膜の構造的完全性の喪失が、壊死の特徴であり［６１，６２］、膜非透過性色素（例えば、ヨウ化プロピジウム、ＰＩ）の細胞取り込み、又は細胞質内酵素（例えば、乳酸デヒドロゲナーゼ、ＬＤＨ）の細胞漏出によって実証することができる。本発明者らのＦＡＣＳ分析によって、ＰＩ陽性細胞のかなりの蓄積（図２１Ａ）及びＬＤＨの広範囲漏出（図１７Ａ−１７Ｃ）が示された。細胞膜完全性の喪失は、本発明者らによって観察され（図２２）、他の研究者によって報告されている［２２，２４，４８］重度のＡＴＰ枯渇によって誘発される細胞死と一致しており、それは、細胞質膜横断電気化学勾配の維持が非常にエネルギー依存性であり、それの喪失によって、必然的に細胞膨張及び膜破裂に至る（即ち、壊死）からである［６２］。（ｉｖ）急速な細胞死が、壊死細胞死の別の特徴である［６３］。本発明者らは、薬剤曝露の最初の２時間以内にＰＩ陽性性及びＬＤＨ放出を検出した（ＰＩに関しては図２１Ａを参照する；時間経過は、ＬＤＨに関しては示していない。）。（ｖ）あらゆる種類のプログラム事象が妨げられるはずであることを、ＡＴＰの重度の枯渇は既に示唆しているが、本発明者らは、ネクロトーシスとも称されるプログラムされた壊死［６４］を、薬剤誘発細胞死の可能な機序として調べた。細胞を、一般に使用されるネクロトーシス阻害剤であるネクロスタチン−１（Ｎｅｃ−１）の存在下に３−ＢＰ又はＮＥＯ２１８で処理した［６３］。しかしながら、薬剤誘発細胞傷害結果に対するＮｅｃ−１の効果は全く認めることができなかった（不図示）。
【０１５１】
本発明者らの試験において、本発明者らは、アポトーシス誘発の基準剤としてスタウロスポリンを含めており、それは、３−ＢＰ及びＮＥＯ２１８によって誘発される壊死事象とアポトーシス事象の間の詳細な区別に関して非常に有用であることが証明されている。例えば、アポトーシスの従来のマーカーを分析する本発明者らのウェスタンブロットにおいて（図２１Ｂ）、本発明者らは、薬剤処理後にかすかな陽性シグナルの出現を検出している。これらのブロットのより長い曝露によって、これらのシグナルがさらに大きく促進されたであろう（そして、広範囲のアポトーシスが示された可能性があった）と考えられるが、本発明者らのスタウロスポリン処理細胞との比較によって、これらのシグナルが正しい角度で見直され、アポトーシスプロセスの関与が、あるとしてもごくわずかであることが確認された。さらに、膜完全性の喪失（壊死の特徴）がアネキシンＶ取り込みを可能とするであろうことから、ＰＩ陽性でもあるアネキシンＶ陽性細胞がアポトーシス性ではなく、壊死性であることは、記憶しておくべき重要な点である。これは、本発明者らのＦＡＣＳ分析によって見事に例示されており（図２１Ａ）、スタウロスポリン処理細胞は最初に右下象限（アネキシンＶ陽性；ＰＩ陰性）に移動し、それから、右上象限（アネキシンＶ陽性；ＰＩ陽性）に移動する。それに比べ、３−ＢＰ又はＮＥＯ２１８で処理した細胞の大多数が右下象限には見られず、むしろ、左下から右上に直接移動する。総合すると、本発明者らの詳細な分析からのデータは、壊死が、本発明者らの試験で用いた腫瘍細胞系での３−ＢＰ及びそれの類縁体ＮＥＯ２１８によって誘発される細胞死の明らかに支配的な形態であることを実証している。しかしながら、留意すべき点として、３−ＢＰに応答した細胞型特異的細胞死プロセスが報告されていることから［２６］、他の細胞型が異なった形で応答する可能性があり得る。
【０１５２】
がん療法において、治療抵抗性の発生は、通常は罹患患者の予後が悪いことを意味する深刻な問題である。この文脈において、興味深いことに、高度に感受性のＨＣＴ１１６細胞の３−ＢＰ単独処理によって、３−ＢＰ抵抗性細胞の蓄積を生じ、その原因は明らかに、薬剤処理によってＭＣＴ−１陽性細胞が全滅したが処理開始前に既に細胞群中に存在していた少数のＭＣＴ−１陰性細胞は生存及び逃避できたためであることが認められた（図２０Ａ〜２０Ｃ）。患者におけるＭＣＴ−１陽性腫瘍組織がＭＣＴ−１陰性細胞のサブセットを有しているか否かは不明であるが、本発明者らの例は、ＭＣＴ−１発現の低下（図１９Ａ〜１９Ｃ）、又はＭＣＴ−１陰性腫瘍細胞下位集団の存在（図２０Ａ〜２０Ｃ）によって、臨床で治療抵抗性が生じる可能性があるという警告を提供するものである。しかしながら、興味深いことに、ＮＥＯ２１８に対する抵抗性上昇は観察されず、実際のところ、３−ＢＰ処理から生じた抵抗性細胞は、なおもＮＥＯ２１８に対して高度に応答性であり（図２０Ａ〜２０Ｃ）、それは、この類縁体のＭＣＴ−１非依存性機能をさらに強調するものである。
【０１５３】
５．結論
本発明者らの結果全体が、３−ＢＰ及びＮＥＯ２１８が細胞殺滅を行う分子活性が同じであるという結論と一致するものである。唯一認められた相違は、３−ＢＰが、細胞に進入するのにＭＣＴ−１による輸送を必要とするが、ＮＥＯ２１８はそれを必要としないという点である。しかしながら、一旦細胞内に入ると、３−ＢＰ及びＮＥＯ２１８は、次のように、同様の効力で、同じ一連の細胞傷害事象を誘発する。即ち、両剤とも、いくつかの主要な代謝酵素（ＧＡＰＤＨ、ＳＤＨ、及び恐らくは他の酵素）を急速にピルビン酸化することで、それらの活性を阻害する。即座の結果として、解糖及びミトコンドリア呼吸の両方が停止し、それによって、ＡＴＰレベルが生命維持レベル以下に急速に低下する。十分なＡＴＰが存在しないと、エネルギー依存性細胞機能は正常に機能しなくなることは実証されていることから［４９〜５１，６５〜６７］、細胞には、壊死以外の選択肢がなくなる。しかしながら、細胞がＭＣＴ−１をごくわずかしか発現しないか、全く発現しない場合、その細胞は、イン・ビトロで、低ないし中程度の濃度の３−ＢＰの細胞傷害効果から保護される。３−ＢＰによる将来的ながん療法を予測すれば、そのような細胞は、治療抵抗性を発生させ、患者における予後を不良なものとすると予想されるであろう。興味深いことに、このイン・ビトロ効果はＮＥＯ２１８では観察されず、それは、その薬剤の抗がん剤としての特徴の根拠を提供するものである。
【０１５４】
参考文献
［１］  Ｓ．  Ｇａｎａｐａｔｈｙ−Ｋａｎｎｉａｐｐａｎ，  Ｊ．Ｆ．  Ｇｅｓｃｈｗｉｎｄ，  Ｒ．  Ｋｕｎｊｉｔｈａｐａｔｈａｍ，  Ｍ．  Ｂｕｉｊｓ，  Ｊ．Ａ．  Ｖｏｓｓｅｎ，  Ｉ．  Ｔｃｈｅｒｎｙｓｈｙｏｖ，  Ｒ．Ｎ．  Ｃｏｌｅ，  Ｌ．Ｈ．  Ｓｙｅｄ，  Ｐ．Ｐ．  Ｒａｏ，  Ｓ．  Ｏｔａ，  Ｍ．  Ｖａｌｉ，  Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  （ＧＡＰＤＨ）  ｉｓ  ｐｙｒｕｖｙｌａｔｅｄ  ｄｕｒｉｎｇ  ３−ｂｒｏｍｏｐｙｒｕｖａｔｅ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ，  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，  ２９  （２００９）  ４９０９−４９１８．
［２］  Ａ．Ｐ．  Ｐｅｒｅｉｒａ  ｄａ  Ｓｉｌｖａ，  Ｔ．  Ｅｌ−Ｂａｃｈａ，  Ｎ．  Ｋｙａｗ，  Ｒ．Ｓ．  ｄｏｓ  Ｓａｎｔｏｓ，  Ｗ．Ｓ．  ｄａ−Ｓｉｌｖａ，  Ｆ．Ｃ．  Ａｌｍｅｉｄａ，  Ａ．Ｔ．  Ｄａ  Ｐｏｉａｎ，  Ａ．  Ｇａｌｉｎａ，  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｅｒｇｙ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｏｆ  ＨｅｐＧ２  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ３−ｂｒｏｍｏｐｙｒｕｖａｔｅ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，  ４１７  （２００９）  ７１７−７２６．
［３］  Ｓ．  Ｃａｒｄａｃｉ，  Ｅ．  Ｄｅｓｉｄｅｒｉ，  Ｍ．Ｒ．  Ｃｉｒｉｏｌｏ，  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａｅｒｏｂｉｃ  ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ：  ３−ｂｒｏｍｏｐｙｒｕｖａｔｅ  ａｓ  ａ  ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｄｒｕｇ，  Ｊ  Ｂｉｏｅｎｅｒｇ  Ｂｉｏｍｅｍｂｒ，  ４４  （２０１２）  １７−２９．
［４］  Ｍ．Ｃ．  Ｓｈｏｓｈａｎ，  ３−Ｂｒｏｍｏｐｙｒｕｖａｔｅ：  ｔａｒｇｅｔｓ  ａｎｄ  ｏｕｔｃｏｍｅｓ，  Ｊ  Ｂｉｏｅｎｅｒｇ  Ｂｉｏｍｅｍｂｒ，  ４４  （２０１２）  ７−１５．
［５］  Ｑ．  Ｔｒａｎ，  Ｈ．  Ｌｅｅ，  Ｊ．  Ｐａｒｋ，  Ｓ．Ｈ．  Ｋｉｍ，  Ｊ．  Ｐａｒｋ，  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  −  Ｒｅｖｉｓｉｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｗａｒｂｕｒｇ  Ｅｆｆｅｃｔｓ，  Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｒｅｓ，  ３２  （２０１６）  １７７−１９３．
［６］  Ｒ．Ｔ．  Ｗｉｃｋｓ，  Ｊ．  Ａｚａｄｉ，  Ａ．  Ｍａｎｇｒａｖｉｔｉ，  Ｉ．  Ｚｈａｎｇ，  Ｌ．  Ｈｗａｎｇ，  Ａ．  Ｊｏｓｈｉ，  Ｈ．  Ｂｏｗ，  Ｍ．  Ｈｕｔｔ−Ｃａｂｅｚａｓ，  Ｋ．Ｌ．  Ｍａｒｔｉｎ，  Ｍ．Ａ．  Ｒｕｄｅｋ，  Ｍ．  Ｚｈａｏ，  Ｈ．  Ｂｒｅｍ，  Ｂ．Ｍ．  Ｔｙｌｅｒ，  Ｌｏｃａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ−ｃｅｌｌ  ｇｌｙｃｏｌｙｔｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｉｎ  ｈｉｇｈ−ｇｒａｄｅ  ｇｌｉｏｍａ，  Ｎｅｕｒｏ  Ｏｎｃｏｌ，  １７  （２０１５）  ７０−８０．
［７］  Ｐ．  Ｄｅｌｌ’Ａｎｔｏｎｅ，  Ｔａｒｇｅｔｓ  ｏｆ  ３−ｂｒｏｍｏｐｙｒｕｖａｔｅ，  ａ  ｎｅｗ，  ｅｎｅｒｇｙ  ｄｅｐｌｅｔｉｎｇ，  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ａｇｅｎｔ，  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ，  ５  （２００９）  ４９１−４９６．
［８］  Ｓ．Ｍ．  Ｅｌ  Ｓａｙｅｄ，  Ｒ．Ｍ．  Ａｂｏｕ  Ｅｌ−Ｍａｇｄ，  Ｙ．  Ｓｈｉｓｈｉｄｏ，  Ｓ．Ｐ．  Ｃｈｕｎｇ，  Ｔ．  Ｓａｋａｉ，  Ｈ．  Ｗａｔａｎａｂｅ，  Ｓ．  Ｋａｇａｍｉ，  Ｋ．  Ｆｕｋｕｉ，  Ｄ−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｏｘｉｄａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｓ  ｇｌｉｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｇｌｙｃｏｌｙｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ３−ｂｒｏｍｏｐｙｒｕｖａｔｅ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，  １９  （２０１２）  １−１８．
［９］  Ｓ．Ｍ．  Ｅｌ  Ｓａｙｅｄ，  Ｒ．Ｍ．  Ｅｌ−Ｍａｇｄ，  Ｙ．  Ｓｈｉｓｈｉｄｏ，  Ｓ．Ｐ．  Ｃｈｕｎｇ，  Ｔ．Ｈ．  Ｄｉｅｍ，  Ｔ．  Ｓａｋａｉ，  Ｈ．  Ｗａｔａｎａｂｅ，  Ｓ．  Ｋａｇａｍｉ，  Ｋ．  Ｆｕｋｕｉ，  ３−Ｂｒｏｍｏｐｙｒｕｖａｔｅ  ａｎｔａｇｏｎｉｚｅｓ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｌａｃｔａｔｅ  ａｎｄ  ｐｙｒｕｖａｔｅ，  ｓｙｎｅｒｇｉｚｅｓ  ｗｉｔｈ  ｃｉｔｒａｔｅ  ａｎｄ  ｅｘｅｒｔｓ  ｎｏｖｅｌ  ａｎｔｉ−ｇｌｉｏｍａ  ｅｆｆｅｃｔｓ，  Ｊ  Ｂｉｏｅｎｅｒｇ  Ｂｉｏｍｅｍｂｒ，  ４４  （２０１２）  ６１−７９．
［１０］  Ｋ．  Ｂｉｒｓｏｙ，  Ｔ．  Ｗａｎｇ，  Ｒ．  Ｐｏｓｓｅｍａｔｏ，  Ｏ．Ｈ．  Ｙｉｌｍａｚ，  Ｃ．Ｅ．  Ｋｏｃｈ，  Ｗ．Ｗ．  Ｃｈｅｎ，  Ａ．Ｗ．  Ｈｕｔｃｈｉｎｓ，  Ｙ．  Ｇｕｌｔｅｋｉｎ，  Ｔ．Ｒ．  Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，  Ｊ．Ｅ．  Ｃａｒｅｔｔｅ，  Ｔ．Ｒ．  Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ，  Ｃ．Ｂ．  Ｃｌｉｓｈ，  Ｄ．Ｍ．  Ｓａｂａｔｉｎｉ，  ＭＣＴ１−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｏｆ  ａ  ｔｏｘｉｃ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｓ  ａｎ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｇｌｙｃｏｌｙｔｉｃ  ｔｕｍｏｒｓ，  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ，  ４５  （２０１３）  １０４−１０８．
［１１］  Ａ．Ｐ．  Ｈａｌｅｓｔｒａｐ，  Ｍｏｎｏｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ，  Ｃｏｍｐｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，  ３  （２０１３）  １６１１−１６４３．
［１２］  Ｆ．  Ｂａｌｔａｚａｒ，  Ｃ．  Ｐｉｎｈｅｉｒｏ，  Ｆ．  Ｍｏｒａｉｓ−Ｓａｎｔｏｓ，  Ｊ．  Ａｚｅｖｅｄｏ−Ｓｉｌｖａ，  Ｏ．  Ｑｕｅｉｒｏｓ，  Ａ．  Ｐｒｅｔｏ，  Ｍ．  Ｃａｓａｌ，  Ｍｏｎｏｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ  ａｓ  ｔａｒｇｅｔｓ  ａｎｄ  ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ，  Ｈｉｓｔｏｌ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ，  ２９  （２０１４）  １５１１−１５２４．
［１３］  Ｍ．  Ｂｒｏｃｋ，  Ｄ．  Ｄａｒｌｅｙ，  Ｓ．  Ｔｅｘｔｏｒ，  Ｗ．  Ｂｕｃｋｅｌ，  ２−Ｍｅｔｈｙｌｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ  ｌｙａｓｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｎｇｕｓ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ：  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｂｏｔｈ  ｅｎｚｙｍｅｓ，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，  ２６８  （２００１）  ３５７７−３５８６．
［１４］  Ｍ．Ｌ．  Ｆｏｎｄａ，  Ｒ．Ｆ．  ＤｅＧｒｅｌｌａ，  Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ｂｙ  ｂｒｏｍｏｐｙｒｕｖａｔｅ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，  ５６  （１９７４）  ４５１−４５８．
［１５］  Ｐ．Ｏ．  Ｇｏｅｔｈｅ，  Ｐ．Ｏ．  Ｎｙｍａｎ，  Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ  ｃａｒｂｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒａｓｅｓ  ｂｙ  ｂｒｏｍｏｐｙｒｕｖａｔｅ，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，  ２１  （１９７２）  １５９−１６４．
［１６］  Ｙ．Ｈ．  Ｋｏ，  Ｂ．Ａ．  ＭｃＦａｄｄｅｎ，  Ａｌｋｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ  ｌｙａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｂｙ  ３−ｂｒｏｍｏｐｙｒｕｖａｔｅ，  Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ，  ２７８  （１９９０）  ３７３−３８０．
［１７］  Ｐ．Ｍ．  Ａｌｌｉｅｌ，  Ｂ．  Ｇｕｉａｒｄ，  Ｒ．  Ｇｈｒｉｒ，  Ａ．Ｍ．  Ｂｅｃａｍ，  Ｆ．  Ｌｅｄｅｒｅｒ，  Ｂｒｏｍｏｐｙｒｕｖａｔｅ  ａｓ  ａｎ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｌａｂｅｌ  ｆｏｒ  Ｂａｋｅｒ’ｓ  ｙｅａｓｔ  ｆｌａｖｏｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｂ２．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｃｔｉｖｅ−ｓｉｔｅ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｏｍｅ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，  １２２  （１９８２）  ５５３−５５８．
［１８］  Ｓ．  Ｈａｎａｕ，  Ｍ．  Ｂｅｒｔｅｌｌｉ，  Ｆ．  Ｄａｌｌｏｃｃｈｉｏ，  Ｍ．  Ｒｉｐｐａ，  Ｂｒｏｍｏｐｙｒｕｖａｔｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｎｅａｒ  ｔｈｅ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ｏｆ  ｌａｍｂ  ｌｉｖｅｒ  ６−ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｎａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｉｎｔ，  ３７  （１９９５）  ７８５−７９３．
［１９］  Ｂ．Ｍ．  Ｓａｎｂｏｒｎ，  Ｎ．Ｔ．  Ｆｅｌｂｅｒｇ，  Ｔ．Ｃ．  Ｈｏｌｌｏｃｈｅｒ，  Ｔｈｅ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｃｃｉｎａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｂｙ  ｂｒｏｍｏｐｙｒｕｖａｔｅ，  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，  ２２７  （１９７１）  ２１９−２３１．
［２０］  Ｙ．Ｈ．  Ｋｏ，  Ｐ．Ｌ．  Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，  Ｊ．Ｆ．  Ｇｅｓｃｈｗｉｎｄ，  Ｇｌｕｃｏｓｅ  ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｂｂｉｔ  ＶＸ２  ｔｕｍｏｒ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｌｉｖｅｒ  ｃａｎｃｅｒ：  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｈｅｘｏｋｉｎａｓｅ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ，  １７３  （２００１）  ８３−９１．
［２１］  Ｚ．  Ｃｈｅｎ，  Ｈ．  Ｚｈａｎｇ，  Ｗ．  Ｌｕ，  Ｐ．  Ｈｕａｎｇ，  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｈｅｘｏｋｉｎａｓｅ  ＩＩ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ３−ｂｒｏｍｏｐｙｒｕｖａｔｅ，  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，  １７８７  （２００９）  ５５３−５６０．
［２２］  Ｄ．  Ｖａｌｅｎｔｉ，  Ｒ．Ａ．  Ｖａｃｃａ，  Ｌ．  ｄｅ  Ｂａｒｉ，  ３−Ｂｒｏｍｏｐｙｒｕｖａｔｅ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｒａｐｉｄ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｂｙ  ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｅｎｅｒｇｙ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，  ＧＳＨ  ｐｏｏｌ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｇｌｙｏｘａｌａｓｅ  ｓｙｓｔｅｍ，  Ｊ  Ｂｉｏｅｎｅｒｇ  Ｂｉｏｍｅｍｂｒ，  ４７  （２０１５）  ４９３−５０６．
［２３］  Ｅ．  Ｋｗｉａｔｋｏｗｓｋａ，  Ｍ．  Ｗｏｊｔａｌａ，  Ａ．  Ｇａｊｅｗｓｋａ，  Ｍ．  Ｓｏｓｚｙｎｓｋｉ，  Ｇ．  Ｂａｒｔｏｓｚ，  Ｉ．  Ｓａｄｏｗｓｋａ−Ｂａｒｔｏｓｚ，  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ３−ｂｒｏｍｏｐｙｒｕｖａｔｅ  ａｃｉｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｒｅｄｏｘ  ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｉｎ  ｎｏｎ−ｉｎｖａｓｉｖｅ  ＭＣＦ−７  ａｎｄ  ｉｎｖａｓｉｖｅ  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ，  Ｊ  Ｂｉｏｅｎｅｒｇ  Ｂｉｏｍｅｍｂｒ，  ４８  （２０１６）  ２３−３２．
［２４］  Ｊ．Ｚ．  Ｑｉｎ，  Ｈ．  Ｘｉｎ，  Ｂ．Ｊ．  Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ，  ３−Ｂｒｏｍｏｐｙｒｕｖａｔｅ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｎｅｃｒｏｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，  ３９６  （２０１０）  ４９５−５００．
［２５］  Ｑ．  Ｚｈａｎｇ，  Ｙ．  Ｚｈａｎｇ，  Ｐ．  Ｚｈａｎｇ，  Ｚ．  Ｃｈａｏ，  Ｆ．  Ｘｉａ，  Ｃ．  Ｊｉａｎｇ，  Ｘ．  Ｚｈａｎｇ，  Ｚ．  Ｊｉａｎｇ，  Ｈ．  Ｌｉｕ，  Ｈｅｘｏｋｉｎａｓｅ  ＩＩ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，  ３−ＢｒＰＡ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｂｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ＲＯＳ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ，  Ｇｅｎｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ，  ５  （２０１４）  １００−１１２．
［２６］  Ｓ．  Ｇａｎａｐａｔｈｙ−Ｋａｎｎｉａｐｐａｎ，  Ｊ．Ｆ．  Ｇｅｓｃｈｗｉｎｄ，  Ｒ．  Ｋｕｎｊｉｔｈａｐａｔｈａｍ，  Ｍ．  Ｂｕｉｊｓ，  Ｌ．Ｈ．  Ｓｙｅｄ，  Ｐ．Ｐ．  Ｒａｏ，  Ｓ．  Ｏｔａ，  Ｂ．Ｋ．  Ｋｗａｋ，  Ｒ．  Ｌｏｆｆｒｏｙ，  Ｍ．  Ｖａｌｉ，  ３−Ｂｒｏｍｏｐｙｒｕｖａｔｅ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｓｔｒｅｓｓ，  ｏｖｅｒｃｏｍｅｓ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ａｎｄ  ｃａｕｓｅｓ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ＨＣＣ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ，  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，  ３０  （２０１０）  ９２３−９３５．
［２７］  Ｅ．Ｇ．  Ｋｏｎｓｔａｎｔａｋｏｕ，  Ｇ．Ｅ．  Ｖｏｕｔｓｉｎａｓ，  Ａ．Ｄ．  Ｖｅｌｅｎｔｚａｓ，  Ａ．Ｓ．  Ｂａｓｏｇｉａｎｎｉ，  Ｅ．  Ｐａｒｏｎｉｓ，  Ｅ．  Ｂａｌａｆａｓ，  Ｎ．  Ｋｏｓｔｏｍｉｔｓｏｐｏｕｌｏｓ，  Ｋ．Ｎ．  Ｓｙｒｉｇｏｓ，  Ｅ．  Ａｎａｓｔａｓｉａｄｏｕ，  Ｄ．Ｊ．  Ｓｔｒａｖｏｐｏｄｉｓ，  ３−ＢｒＰＡ  ｅｌｉｍｉｎａｔｅｓ  ｈｕｍａｎ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈｌｙ  ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  ｖｉａ  ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｄｅａｔｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ  ａｎｄ  ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ，  Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ，  １４  （２０１５）  １３５．
［２８］  Ｍ．  Ｂｕｉｊｓ，  Ｊ．Ａ．  Ｖｏｓｓｅｎ，  Ｊ．Ｆ．  Ｇｅｓｃｈｗｉｎｄ，  Ｔ．  Ｉｓｈｉｍｏｒｉ，  Ｊ．Ｍ．  Ｅｎｇｌｅｓ，  Ｏ．  Ａｃｈａ−Ｎｇｗｏｄｏ，  Ｒ．Ｌ．  Ｗａｈｌ，  Ｍ．  Ｖａｌｉ，  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｉ−ｇｌｙｃｏｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ３−ｂｒｏｍｏｐｙｒｕｖａｔｅ  ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ  ｂｙ  ＦＤＧ  ｕｐｔａｋｅ  ｉｎ  ａ  ｒａｔ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ，  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇｓ，  ２７  （２００９）  １２０−１２３．
［２９］  Ｘ．  Ｃａｏ，  Ｇ．  Ｊｉａ，  Ｔ．  Ｚｈａｎｇ，  Ｍ．  Ｙａｎｇ，  Ｂ．  Ｗａｎｇ，  Ｐ．Ａ．  Ｗａｓｓｅｎａａｒ，  Ｈ．  Ｃｈｅｎｇ，  Ｍ．Ｖ．  Ｋｎｏｐｐ，  Ｄ．  Ｓｕｎ，  Ｎｏｎ−ｉｎｖａｓｉｖｅ  ＭＲＩ  ｔｕｍｏｒ  ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ＨＳＰ９０  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ａｎｄ  ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｉｎ  ＲＩＰ１−Ｔａｇ２  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｔｕｍｏｒ  ｍｏｄｅｌ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，  ６２  （２００８）  ９８５−９９４．
［３０］  Ｎ．Ｇ．  Ｓｃｈａｅｆｅｒ，  Ｊ．Ｆ．  Ｇｅｓｃｈｗｉｎｄ，  Ｊ．  Ｅｎｇｌｅｓ，  Ｊ．Ｗ．  Ｂｕｃｈａｎａｎ，  Ｒ．Ｌ．  Ｗａｈｌ，  Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ３−ｂｒｏｍｏｐｙｒｕｖａｔｅ  ｉｎ  ｔｒｅａｔｉｎｇ  ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ  ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｌｙｍｐｈｏｍａ，  Ｔｒａｎｓｌ  Ｒｅｓ，  １５９  （２０１２）  ５１−５７．
［３１］  Ｑ．  Ｚｈａｎｇ，  Ｊ．  Ｐａｎ，  Ｐ．Ｅ．  Ｎｏｒｔｈ，  Ｓ．  Ｙａｎｇ，  Ｒ．Ａ．  Ｌｕｂｅｔ，  Ｙ．  Ｗａｎｇ，  Ｍ．  Ｙｏｕ，  Ａｅｒｏｓｏｌｉｚｅｄ  ３−ｂｒｏｍｏｐｙｒｕｖａｔｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｌｕｎｇ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｃａｕｓｉｎｇ  ｌｉｖｅｒ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｖ  Ｒｅｓ  （Ｐｈｉｌａ），  ５  （２０１２）  ７１７−７２５．
［３２］  Ｓ．Ｍ．  Ｅｌ  Ｓａｙｅｄ，  Ｗ．Ｇ．  Ｍｏｈａｍｅｄ，  Ｍ．Ａ．  Ｓｅｄｄｉｋ，  Ａ．Ｓ．  Ａｈｍｅｄ，  Ａ．Ｇ．  Ｍａｈｍｏｕｄ，  Ｗ．Ｈ．  Ａｍｅｒ，  Ｍ．Ｍ．  Ｈｅｌｍｙ  Ｎａｂｏ，  Ａ．Ｒ．  Ｈａｍｅｄ，  Ｎ．Ｓ．  Ａｈｍｅｄ，  Ａ．Ａ．  Ａｂｄ−Ａｌｌａｈ，  Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｏｆ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｕｓｉｎｇ  ３−ｂｒｏｍｏｐｙｒｕｖａｔｅ：  ａ  ｃｏｎｃｉｓｅ  ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗ  ａｎｄ  ｃａｓｅ  ｓｔｕｄｙ，  Ｃｈｉｎ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，  ３３  （２０１４）  ３５６−３６４．
［３３］  Ｙ．Ｈ．  Ｋｏ，  Ｈ．Ａ．  Ｖｅｒｈｏｅｖｅｎ，  Ｍ．Ｊ．  Ｌｅｅ，  Ｄ．Ｊ．  Ｃｏｒｂｉｎ，  Ｔ．Ｊ．  Ｖｏｇｌ，  Ｐ．Ｌ．  Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，  Ａ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｓｔｕｄｙ  ”ｃａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔ”  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ”ｅｎｅｒｇｙ  ｂｌｏｃｋｅｒ”  ３−ｂｒｏｍｏｐｙｒｕｖａｔｅ  （３ＢＰ）  ａｓ  ａ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ａｇｅｎｔ：  ｆｒｏｍ  ｂｅｎｃｈ  ｓｉｄｅ  ｔｏ  ｂｅｄｓｉｄｅ，  Ｊ  Ｂｉｏｅｎｅｒｇ  Ｂｉｏｍｅｍｂｒ，  ４４  （２０１２）  １６３−１７０．
［３４］  Ｈ．  Ｆｅｌｄｗｉｓｃｈ−Ｄｒｅｎｔｒｕｐ，  Ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｄｒｕｇ  ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ  ａｆｔｅｒ  ｄｅａｔｈ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ａｔ  ａｎ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ｃｌｉｎｉｃ，  ＡＡＡＳ，  ｓｃｉｅｎｃｅｍａｇ．ｏｒｇ／ｎｅｗｓ／，  ２０１６．
［３５］  Ｐ．Ｌ．  Ｃｒｏｗｅｌｌ，  Ｃ．Ｅ．  Ｅｌｓｏｎ，  Ｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄｓ，  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ，  ｉｎ：  Ｒ．Ｅ．Ｃ．  Ｗｉｌｄｍａｎ  （Ｅｄ．）  Ｎｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｏｄｓ  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  ＦＬ，  ２００１，  ｐｐ．  ３１−５４．
［３６］  Ｔ．Ｃ．  Ｃｈｅｎ，  Ｃ．Ｏ．  Ｆｏｎｓｅｃａ，  Ａ．Ｈ．  Ｓｃｈｏｅｎｔｈａｌ，  Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｐｅｒｉｌｌｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｆｏｒ  ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ，  Ａｍ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，  ５  （２０１５）  １５８０−１５９３．
［３７］  Ｃ．Ｏ．  ｄａ  Ｆｏｎｓｅｃａ，  Ｒ．Ｍ．  Ｔｅｉｘｅｉｒａ，  Ｊ．Ｃ．  Ｓｉｌｖａ，  Ｄ．Ｅ．Ｓ．Ｄ．Ｇ．Ｆ．  Ｊ，  Ｏ．Ｃ．  Ｍｅｉｒｅｌｌｅｓ，  Ｊ．Ａ．  Ｌａｎｄｅｉｒｏ，  Ｔ．  Ｑｕｉｒｉｃｏ−Ｓａｎｔｏｓ，  Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｇｌｉｏｍａ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｐｅｒｉｌｌｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ，  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，  ３３  （２０１３）  ５６２５−５６３１．
［３８］  Ｔ．Ｃ．  Ｃｈｅｎ，  Ｗ．  Ｗａｎｇ，  Ｅ．Ｂ．  Ｇｏｌｄｅｎ，  Ｓ．  Ｔｈｏｍａｓ，  Ｗ．  Ｓｉｖａｋｕｍａｒ，  Ｆ．Ｍ．  Ｈｏｆｍａｎ，  Ｓ．Ｇ．  Ｌｏｕｉｅ，  Ａ．Ｈ．  Ｓｃｈｏｅｎｔｈａｌ，  Ｇｒｅｅｎ  ｔｅａ  ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ  ｉｎ  ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ  ｍｏｕｓｅ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｍｏｄｅｌｓ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ，  ３０２  （２０１１）．
［３９］  Ｔ．Ｃ．  Ｃｈｅｎ，  Ｈ．Ｙ．  Ｃｈｏ，  Ｗ．  Ｗａｎｇ，  Ｍ．  Ｂａｒａｔｈ，  Ｎ．  Ｓｈａｒｍａ，  Ｆ．Ｍ．  Ｈｏｆｍａｎ，  Ａ．Ｈ．  Ｓｃｈｏｅｎｔｈａｌ，  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ−ｐｅｒｉｌｌｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｅｘｈｉｂｉｔｓ  ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎｔｒａｃｒａｎｉａｌ  ｔｒｉｐｌｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  ｖｉｖｏ，  Ｍｏｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．，  １３  （２０１４）  １１８１−１１９３．
［４０］  Ｐ．  Ｐｙｒｋｏ，  Ｎ．  Ｓｏｒｉａｎｏ，  Ａ．  Ｋａｒｄｏｓｈ，  Ｙ．Ｔ．  Ｌｉｕ，  Ｊ．  Ｕｄｄｉｎ，  Ｎ．Ａ．  Ｐｅｔａｓｉｓ，  Ｆ．Ｍ．  Ｈｏｆｍａｎ，  Ｃ．Ｓ．  Ｃｈｅｎ，  Ｔ．Ｃ．  Ｃｈｅｎ，  Ａ．Ｈ．  Ｓｃｈｏｅｎｔｈａｌ，  Ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｂｙ  ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｎｏｎ−ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ａｎａｌｏｇ，  ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ  （ＤＭＣ），  ｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ，  Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ，  ５  （２００６）  １９．
［４１］  Ｃ．  Ｔｒｉｓｔａｎ，  Ｎ．  Ｓｈａｈａｎｉ，  Ｔ．Ｗ．  Ｓｅｄｌａｋ，  Ａ．  Ｓａｗａ，  Ｔｈｅ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＧＡＰＤＨ：  ｖｉｅｗｓ  ｆｒｏｍ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ，  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ，  ２３  （２０１１）  ３１７−３２３．
［４２］  Ｃ．Ｏ．  ｄａ  Ｆｏｎｓｅｃａ，  Ｈ．  Ｋｈａｎｄｅｌｉａ，  Ｍ．Ｄ．  Ｓａｌａｚａｒ，  Ａ．Ｈ．  Ｓｃｈｏｎｔｈａｌ，  Ｏ．Ｃ．  Ｍｅｉｒｅｌｅｓ，  Ｔ．  Ｑｕｉｒｉｃｏ−Ｓａｎｔｏｓ，  Ｐｅｒｉｌｌｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ：  Ｄｙｎａｍｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｌｉｐｉｄ  ｂｉｌａｙｅｒ  ａｎｄ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｉｎｈａｌａｔｉｏｎａｌ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｇｌｉｏｍａｓ，  Ｓｕｒｇ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｉｎｔ，  ７  （２０１６）  １．
［４３］  Ｅ．  Ｅｈｒｋｅ，  Ｃ．  Ａｒｅｎｄ，  Ｒ．  Ｄｒｉｎｇｅｎ，  ３−ｂｒｏｍｏｐｙｒｕｖａｔｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ，  ｄｅｐｌｅｔｅｓ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ，  ａｎｄ  ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｓ  ｔｈｅ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｒａｔ  ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ，  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ，  ９３  （２０１５）  １１３８−１１４６．
［４４］  Ｓ．  Ｋｒｉｓｈｎａｎ，  Ｒ．Ｍ．  Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｂ．  Ｔｉａｎ，  Ｒ．Ｄ．  Ｍｕｌｌｉｎｓ，  Ｍ．Ｐ．  Ｊａｃｏｂｓｏｎ，  Ｊ．  Ｔａｕｎｔｏｎ，  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ，  ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｍｉｃｈａｅｌ  ａｃｃｅｐｔｏｒｓ  ｇｕｉｄｅｄ  ｂｙ  ｋｉｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ，  Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ，  １３６  （２０１４）  １２６２４−１２６３０．
［４５］  Ｍ．Ｋ．  Ｄｅｎｎｅｈｙ，  Ｋ．Ａ．  Ｒｉｃｈａｒｄｓ，  Ｇ．Ｒ．  Ｗｅｒｎｋｅ，  Ｙ．  Ｓｈｙｒ，  Ｄ．Ｃ．  Ｌｉｅｂｌｅｒ，  Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｏｆ  ｔｈｉｏｌ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｉｌｅｓ，  Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ  Ｔｏｘｉｃｏｌ，  １９  （２００６）  ２０−２９．
［４６］  Ｅ．  Ｗｅｅｒａｐａｎａ，  Ｃ．  Ｗａｎｇ，  Ｇ．Ｍ．  Ｓｉｍｏｎ，  Ｆ．  Ｒｉｃｈｔｅｒ，  Ｓ．  Ｋｈａｒｅ，  Ｍ．Ｂ．  Ｄｉｌｌｏｎ，  Ｄ．Ａ．  Ｂａｃｈｏｖｃｈｉｎ，  Ｋ．  Ｍｏｗｅｎ，  Ｄ．  Ｂａｋｅｒ，  Ｂ．Ｆ．  Ｃｒａｖａｔｔ，  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｐｒｅｄｉｃｔｓ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｙｓｔｅｉｎｅｓ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｏｍｅｓ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ４６８  （２０１０）  ７９０−７９５．
［４７］  Ｄ．  Ｊａｒｄｉｍ−Ｍｅｓｓｅｄｅｒ，  Ｆ．  Ｍｏｒｅｉｒａ−Ｐａｃｈｅｃｏ，  ３−Ｂｒｏｍｏｐｙｒｕｖｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｉｎｈｉｂｉｔｓ  Ｔｒｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｙｃｌｅ  ａｎｄ  Ｇｌｕｔａｍｉｎｏｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ＨｅｐＧ２  Ｃｅｌｌｓ，  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，  ３６  （２０１６）  ２２３３−２２４１．
［４８］  Ｚ．  Ｔａｎｇ，  Ｓ．  Ｙｕａｎ，  Ｙ．  Ｈｕ，  Ｈ．  Ｚｈａｎｇ，  Ｗ．  Ｗｕ，  Ｚ．  Ｚｅｎｇ，  Ｊ．  Ｙａｎｇ，  Ｊ．  Ｙｕｎ，  Ｒ．  Ｘｕ，  Ｐ．  Ｈｕａｎｇ，  Ｏｖｅｒ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＧＡＰＤＨ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ａｓ  ａ  ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ３−ｂｒｏｍｏｐｙｒｕｖａｔｅ  ｐｒｏｐｙｌ  ｅｓｔｅｒ，  Ｊ  Ｂｉｏｅｎｅｒｇ  Ｂｉｏｍｅｍｂｒ，  ４４  （２０１２）  １１７−１２５．
［４９］  Ｙ．  Ｅｇｕｃｈｉ，  Ｓ．  Ｓｈｉｍｉｚｕ，  Ｙ．  Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ，  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ＡＴＰ  ｌｅｖｅｌｓ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｆａｔｅ  ｂｙ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，  ５７  （１９９７）  １８３５−１８４０．
［５０］  Ｍ．  Ｌｅｉｓｔ，  Ｂ．  Ｓｉｎｇｌｅ，  Ａ．Ｆ．  Ｃａｓｔｏｌｄｉ，  Ｓ．  Ｋｕｈｎｌｅ，  Ｐ．  Ｎｉｃｏｔｅｒａ，  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ  （ＡＴＰ）  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ：  ａ  ｓｗｉｔｃｈ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｃｉｓｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ，  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，  １８５  （１９９７）  １４８１−１４８６．
［５１］  Ｗ．Ｘ．  Ｚｏｎｇ，  Ｃ．Ｂ．  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，  Ｎｅｃｒｏｔｉｃ  ｄｅａｔｈ  ａｓ  ａ  ｃｅｌｌ  ｆａｔｅ，  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ，  ２０  （２００６）  １−１５．
［５２］  Ｐ．  Ｌｉｓ，  Ｐ．  Ｊｕｒｋｉｅｗｉｃｚ，  Ｍ．  Ｃａｌ−Ｂａｋｏｗｓｋａ，  Ｙ．Ｈ．  Ｋｏ，  Ｐ．Ｌ．  Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，  Ａ．  Ｇｏｆｆｅａｕ，  Ｓ．  Ｕｌａｓｚｅｗｓｋｉ，  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｙｅａｓｔ  ｇｅｎｏｍｅ  ｆｏｒ  ｅｎｅｒｇｅｔｉｃ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ａ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ  ａｇｅｎｔ  ３−ｂｒｏｍｏｐｙｒｕｖａｔｅ，  Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，  ７  （２０１６）  １０１５３−１０１７３．
［５３］  Ａ．  Ｐａｉａｒｄｉｎｉ，  Ａ．  Ｔｒａｍｏｎｔｉ，  Ｄ．  Ｓｃｈｉｒｃｈ，  Ｇ．  Ｇｕｉｄｕｃｃｉ，  Ｍ．Ｌ．  ｄｉ  Ｓａｌｖｏ，  Ａ．  Ｆｉａｓｃａｒｅｌｌｉ，  Ａ．  Ｇｉｏｒｇｉ，  Ｂ．  Ｍａｒａｓ，  Ｆ．  Ｃｕｔｒｕｚｚｏｌａ，  Ｒ．  Ｃｏｎｔｅｓｔａｂｉｌｅ，  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ３−ｂｒｏｍｏｐｙｒｕｖａｔｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ  ａｎｄ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｉｓｏｆｏｒｍｓ，  ｋｅｙ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ，  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，  １８６４  （２０１６）  １５０６−１５１７．
［５４］  Ｍ．  Ｒａｌｓｅｒ，  Ｍ．Ｍ．  Ｗａｍｅｌｉｎｋ，  Ａ．  Ｋｏｗａｌｄ，  Ｂ．  Ｇｅｒｉｓｃｈ，  Ｇ．  Ｈｅｅｒｅｎ，  Ｅ．Ａ．  Ｓｔｒｕｙｓ，  Ｅ．  Ｋｌｉｐｐ，  Ｃ．  Ｊａｋｏｂｓ，  Ｍ．  Ｂｒｅｉｔｅｎｂａｃｈ，  Ｈ．  Ｌｅｈｒａｃｈ，  Ｓ．  Ｋｒｏｂｉｔｓｃｈ，  Ｄｙｎａｍｉｃ  ｒｅｒｏｕｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｆｌｕｘ  ｉｓ  ｋｅｙ  ｔｏ  ｃｏｕｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ，  Ｊ  Ｂｉｏｌ，  ６  （２００７）  １０．
［５５］  Ｌ．Ｓ．  Ｉｈｒｌｕｎｄ，  Ｅ．  Ｈｅｒｎｌｕｎｄ，  Ｏ．  Ｋｈａｎ，  Ｍ．Ｃ．  Ｓｈｏｓｈａｎ，  ３−Ｂｒｏｍｏｐｙｒｕｖａｔｅ  ａｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｔｕｍｏｕｒ  ｃｅｌｌ  ｅｎｅｒｇｙ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｐｏｔｅｎｔｉａｔｏｒ  ｏｆ  ｐｌａｔｉｎｕｍ  ｄｒｕｇｓ，  Ｍｏｌ  Ｏｎｃｏｌ，  ２  （２００８）  ９４−１０１．
［５６］  Ｉ．  Ｓａｄｏｗｓｋａ−Ｂａｒｔｏｓｚ，  Ｒ．  Ｓｚｅｗｃｚｙｋ，  Ｌ．  Ｊａｒｅｍｋｏ，  Ｍ．  Ｊａｒｅｍｋｏ，  Ｇ．  Ｂａｒｔｏｓｚ，  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ａｇｅｎｔ  ３−ｂｒｏｍｏｐｙｒｕｖｉｃ  ａｃｉｄ  ｆｏｒｍｓ  ａ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｗｉｔｈ  ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ，  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｐ，  ６８  （２０１６）  ５０２−５０５．
［５７］  Ｌ．  Ｍａｃｃｈｉｏｎｉ，  Ｍ．  Ｄａｖｉｄｅｓｃｕ，  Ｒ．  Ｒｏｂｅｒｔｉ，  Ｌ．  Ｃｏｒａｚｚｉ，  Ｔｈｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｂｌｏｃｋｅｒｓ  ３−ｂｒｏｍｏｐｙｒｕｖａｔｅ  ａｎｄ  ｌｏｎｉｄａｍｉｎｅ：  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｂｉｏｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｂｒａｉｎ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ，  Ｊ  Ｂｉｏｅｎｅｒｇ  Ｂｉｏｍｅｍｂｒ，  ４６  （２０１４）  ３８９−３９４．
［５８］  Ｘ．  Ｇｕｏ，  Ｘ．  Ｚｈａｎｇ，  Ｔ．  Ｗａｎｇ，  Ｓ．  Ｘｉａｎ，  Ｙ．  Ｌｕ，  ３−Ｂｒｏｍｏｐｙｒｕｖａｔｅ  ａｎｄ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ  ｉｎｄｕｃｅ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ＭＧＣ−８０３  ｂｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｐａｔｈｗａｙ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，  ４７５  （２０１６）  ３７−４３．
［５９］  Ｘ．  Ｚｏｕ，  Ｍ．  Ｚｈａｎｇ，  Ｙ．  Ｓｕｎ，  Ｓ．  Ｚｈａｏ，  Ｙ．  Ｗｅｉ，  Ｘ．  Ｚｈａｎｇ，  Ｃ．  Ｊｉａｎｇ，  Ｈ．  Ｌｉｕ，  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ３−ｂｒｏｍｏｐｙｒｕｖａｔｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ，  Ｏｎｃｏｌ  Ｒｅｐ，  ３４  （２０１５）  １８９５−１９０４．
［６０］  Ｊ．  Ｚｈａｎｇ，  Ｘ．  Ｌｏｕ，  Ｌ．  Ｊｉｎ，  Ｒ．  Ｚｈｏｕ，  Ｓ．  Ｌｉｕ，  Ｎ．  Ｘｕ，  Ｄ．Ｊ．  Ｌｉａｏ，  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ，  ａｎｄ  ｔｈｅｎ  ｓｔｒｅｓｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ−ｌｉｋｅ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ，  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，  ｓｈｏｕｌｄ  ｂｅ  ｔｈｅ  ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｍｏｄｅ  ｆｏｒ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ：  ｃｌｅａｒａｎｃｅ  ｏｆ  ａ  ｆｅｗ  ｍｉｓｃｏｎｃｅｐｔｉｏｎｓ，  Ｏｎｃｏｓｃｉｅｎｃｅ，  １  （２０１４）  ４０７−４２２．
［６１］  Ｍ．Ｓ．  Ｊｕｒｋｏｗｉｔｚ−Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，  Ｒ．Ａ．  Ａｌｔｓｃｈｕｌｄ，  Ｃ．Ｍ．  Ｈｏｈｌ，  Ｊ．Ｄ．  Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ｊ．Ｓ．  ＭｃＤｏｎａｌｄ，  Ｔ．Ｄ．  Ｓｉｍｍｏｎｓ，  Ｌ．Ａ．  Ｈｏｒｒｏｃｋｓ，  Ｃｅｌｌ  ｓｗｅｌｌｉｎｇ，  ｂｌｅｂｂｉｎｇ，  ａｎｄ  ｄｅａｔｈ  ａｒｅ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｎ  ＡＴＰ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｆ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｄｕｒｉｎｇ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｈｙｐｏｘｉａ  ｉｎ  ａ  ｇｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  （ＲＯＣ−１），  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，  ５９  （１９９２）  ３４４−３５２．
［６２］  Ｓ．Ｌ．  Ｆｉｎｋ，  Ｂ．Ｔ．  Ｃｏｏｋｓｏｎ，  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，  ｐｙｒｏｐｔｏｓｉｓ，  ａｎｄ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ：  ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ  ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅａｄ  ａｎｄ  ｄｙｉｎｇ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ，  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ，  ７３  （２００５）  １９０７−１９１６．
［６３］  Ｐ．  Ｇｏｌｓｔｅｉｎ，  Ｇ．  Ｋｒｏｅｍｅｒ，  Ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｂｙ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ：  ｔｏｗａｒｄｓ  ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ，  ３２  （２００７）  ３７−４３．
［６４］  Ｗ．  Ｗｕ，  Ｐ．  Ｌｉｕ，  Ｊ．  Ｌｉ，  Ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ：  ａｎ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｆｏｒｍ  ｏｆ  ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ，  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｏｎｃｏｌ  Ｈｅｍａｔｏｌ，  ８２  （２０１２）  ２４９−２５８．
［６５］  Ｂ．  Ａｌｂｅｒｔｓ，  Ａ．  Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ｊ．  Ｌｅｗｉｓ，  Ｄ．  Ｍｏｒｇａｎ，  Ｍ．  Ｒａｆｆ，  Ｋ．  Ｒｏｇｅｒｔｓ，  Ｐ．  Ｗａｌｔｅｒ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，  ６ｔｈ  ｅｄ．，  Ｇａｒｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ２０１５．
［６６］  Ｃ．  Ｒｉｃｈｔｅｒ，  Ｍ．  Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ，  Ａ．  Ｃｏｓｓａｒｉｚｚａ，  Ｃ．  Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉ，  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ＡＴＰ  ｌｅｖｅｌ，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，  ３７８  （１９９６）  １０７−１１０．
［６７］  Ｈ．  Ｘｉ，  Ｊ．Ｃ．  Ｂａｒｒｅｄｏ，  Ｊ．Ｒ．  Ｍｅｒｃｈａｎ，  Ｔ．Ｊ．  Ｌａｍｐｉｄｉｓ，  Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｓｔｒｅｓｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ２−ｄｅｏｘｙｇｌｕｃｏｓｅ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ＡＭＰＫ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ＣａＭＫＫｂｅｔａ  ｌｅａｄｉｎｇ  ｔｏ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，  ８５  （２０１３）  １４６３−１４７７．
【０１５５】
本発明は、本明細書に記載の具体的な実施形態によって範囲を限定されるものではない。実際、本明細書に記載のものに加えて本発明の各種改変が、前記の説明及び添付の図面から、当業者には明らかになろう。そのような改変は、添付の特許請求の範囲に包含されるものである。
【０１５６】
前記の明細書は、当業者が本発明の実施できるようにするのに十分なものであると考えられる。本明細書で示され、説明されたものに加えて、本発明の各種改変が、前記の説明から当業者には明らかになるであろうし、添付の特許請求の範囲に包含される。補正証明書、特許出願文書、科学論文、政府報告書、ウェブサイト及び本明細書で引用の他の参考文献を含む各特許文書開示全体が、参照により、あらゆる点に関して全体が本明細書に組み込まれる。
【図１】
2020512280.tif 000008
【図２】
2020512280.tif 000009
【図３】
2020512280.tif 000010
【図４】
2020512280.tif 000011
【図５】
2020512280.tif 000012
【図６】
2020512280.tif 000013
【図７】
2020512280.tif 000014
【図８】
2020512280.tif 000015
【図９】
2020512280.tif 000016
【図１０】
2020512280.tif 000017
【図１１】
2020512280.tif 000018
【図１２】
2020512280.tif 000019
【図１３】
2020512280.tif 000020
【図１４】
2020512280.tif 000021
【図１５】
2020512280.tif 000022
【図１６】
2020512280.tif 000023
【図１７】
2020512280.tif 000024
【図１８】
2020512280.tif 000025
【図１９】
2020512280.tif 000026
【図２０】
2020512280.tif 000027
【図２１−１】
2020512280.tif 000028
【図２１−２】
2020512280.tif 000029
【図２２】
2020512280.tif 000030
【図２３】
2020512280.tif 000031
【図２４−１】
2020512280.tif 000032
【図２４−２】
2020512280.tif 000033
【国際調査報告】
2020512280.tif 000034
2020512280.tif 000035