(57)【要約】  本明細書で胎盤接着性細胞と称される組織培養プラスチック接着性の胎盤接着性細胞、例えば胎盤幹細胞を使用して、リンパ浮腫およびリンパ浮腫に関連する障害を処置する方法が本明細書で提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リンパ浮腫またはリンパ浮腫によって引き起こされる疾患もしくは障害を有する個体を処置する方法であって、治療有効量の胎盤接着性細胞を前記個体に投与することを含み、前記治療有効量は、前記投与の前の個体と比較して、前記個体における前記リンパ浮腫またはリンパ浮腫によって引き起こされる疾患もしくは障害の１つまたは複数の症状または続発症を低減または改善するのに十分な量である、方法。
【請求項２】
前記リンパ浮腫またはリンパ浮腫によって引き起こされる疾患もしくは障害の前記１つまたは複数の症状または続発症が、一方もしくは両方の脚の一部もしくは全ての腫れ、一方もしくは両方の腕の一部もしくは全ての腫れ、腕もしくは脚のだるさもしくは緊張、脚もしくは腕の非圧痛性の痘痕状浮腫、腕もしくは脚における動きの制限もしくは動きを制限される感覚、腕もしくは脚における痛みもしくは不快感、皮内もしくは皮下の感染、蜂巣炎、リンパ管炎、リンパ漏、罹患した腕もしくは脚の皮膚の紅斑、陽性のシュテンマーサイン、ならびに／または罹患した腕もしくは脚の皮膚の硬化および／もしくは肥厚化である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記リンパ浮腫が、静脈不全、心不全、睡眠時無呼吸、または腎不全によって引き起こされるものまたはそれに関連するものではない、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記リンパ浮腫またはリンパ浮腫によって引き起こされる疾患もしくは障害の前記１つまたは複数の症状または続発症が、感染である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記感染が、膿痂疹に付随して起こる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記リンパ浮腫またはリンパ浮腫によって引き起こされる疾患もしくは障害の前記１つまたは複数の症状または続発症が、再発性丹毒後肬贅症（ｅｌｅｐｈａｎｔｉａｓｉｓ  ｎｏｓｔｒａ  ｖｅｒｒｕｃｏｓａ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記リンパ浮腫が、脂肪性浮腫に属するリンパ浮腫である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記リンパ浮腫が、部分的にまたは全体に、乳がんの手術によって引き起こされる、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記リンパ浮腫が、ステージ０のリンパ浮腫である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記リンパ浮腫が、ステージ１のリンパ浮腫である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記リンパ浮腫が、ステージ２のリンパ浮腫である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記リンパ浮腫が、ステージ３のリンパ浮腫である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記胎盤接着性細胞が、フローサイトメトリーによって検出可能な、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋およびＣＤ２００＋である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記胎盤接着性細胞が、骨形成または軟骨形成細胞の１つまたは複数の特徴を有する細胞に分化する能力を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記胎盤接着性細胞が、加えて、フローサイトメトリーおよび／またはＲＴ−ＰＣＲによって検出可能な、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＣＤ８０−、ＣＤ８６−、ＣＤ１３３−、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱ−、ＳＳＥＡ３−、ＳＳＥＡ４−、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ７３＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ＋、ＰＤＬ１＋、ＡＢＣ−ｐ＋、および／またはＯＣＴ−４＋の１つまたは複数である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記胎盤接着性細胞が、フローサイトメトリーによって検出可能な、ＣＤ３４−、ＣＤ４５−、ＣＤ１０＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋およびＣＤ２００＋である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記胎盤接着性細胞が、フローサイトメトリーによって検出可能な、ＣＤ３４−、ＣＤ４５−、ＣＤ１０＋、ＣＤ８０−、ＣＤ８６−、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋およびＣＤ２００＋である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記胎盤接着性細胞が、フローサイトメトリーによって検出可能な、ＣＤ３４−、ＣＤ４５−、ＣＤ１０＋、ＣＤ８０−、ＣＤ８６−、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋およびＣＤ２００＋であり、加えてＣＤ２９＋、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ５４＋、ＳＨ３＋またはＳＨ４＋の１つまたは複数である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記胎盤接着性細胞が、フローサイトメトリーによって検出可能な、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ７３＋、ＣＤ８０−、ＣＤ８６−、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋、およびＣＤ２００＋である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋およびＣＤ２００＋の胎盤接着性細胞が、加えて、ＣＤ１１７−、ＣＤ１３３−、ＫＤＲ−（ＶＥＧＦＲ２−）、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ＋、ＨＬＡ−ＤＰ、ＤＱ、ＤＲ−、もしくはプログラム細胞死−１リガンド（ＰＤＬ１）＋の１つまたは複数、またはそれらのあらゆる組合せである、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
前記胎盤接着性細胞が、フローサイトメトリーによって検出可能な、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ７３＋、ＣＤ８０−、ＣＤ８６−、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ１１７−、ＣＤ１３３−、ＣＤ２００＋、ＫＤＲ−（ＶＥＧＦＲ２−）、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ＋、ＨＬＡ−ＤＰ、ＤＱ、ＤＲ−、またはプログラム細胞死−１リガンド（ＰＤＬ１）＋である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記胎盤接着性細胞が、加えて、フローサイトメトリーによって検出可能な、ＡＢＣ−ｐ＋であるか、またはＲＴ−ＰＣＲによって決定可能な、ＯＣＴ−４＋（ＰＯＵ５Ｆ１＋）である、請求項１３から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記胎盤接着性細胞が、加えて、フローサイトメトリーによって決定可能な、ＳＳＥＡ３−またはＳＳＥＡ４−であり、ＳＳＥＡ３は、ステージ特異的胎児抗原３であり、ＳＳＥＡ４は、ステージ特異的胎児抗原４である、請求項１３から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記胎盤接着性細胞が、等しい数の骨髄由来間葉系幹細胞より検出可能に高いレベルで１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＡＣＴＧ２、ＡＤＡＲＢ１、ＡＭＩＧＯ２、ＡＲＴＳ−１、Ｂ４ＧＡＬＴ６、ＢＣＨＥ、Ｃ１１ｏｒｆ９、ＣＤ２００、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ４Ａ２、ＣＰＡ４、ＤＭＤ、ＤＳＣ３、ＤＳＧ２、ＥＬＯＶＬ２、Ｆ２ＲＬ１、ＦＬＪ１０７８１、ＧＡＴＡ６、ＧＰＲ１２６、ＧＰＲＣ５Ｂ、ＩＣＡＭ１、ＩＥＲ３、ＩＧＦＢＰ７、ＩＬ１Ａ、ＩＬ６、ＩＬ１８、ＫＲＴ１８、ＫＲＴ８、ＬＩＰＧ、ＬＲＡＰ、ＭＡＴＮ２、ＭＥＳＴ、ＮＦＥ２Ｌ３、ＮＵＡＫ１、ＰＣＤＨ７、ＰＤＬＩＭ３、ＰＫＰ２、ＲＴＮ１、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＳＴ３ＧＡＬ６、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＳＬＣ１２Ａ８、ＴＣＦ２１、ＴＧＦＢ２、ＶＴＮ、およびＺＣ３Ｈ１２Ａの１つまたは複数であり、前記骨髄由来間葉系幹細胞は、前記単離された胎盤接着性細胞が受けた継代数に等しい回数の培養における継代を受けている、請求項１３から２１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．分野
本明細書では、胎盤接着性細胞と称される組織培養プラスチック接着性の胎盤接着性細胞、例えば胎盤幹細胞を使用して、リンパ浮腫およびリンパ浮腫に関連する障害を処置する方法が提供される。
【背景技術】
【０００２】
２．背景
胎盤は、特に魅力的な幹細胞源である。哺乳類胎盤は豊富であり、通常は医療廃棄物として廃棄されるため、これらは、かけがえのない医学的に有用な幹細胞源の代表である。このような単離された胎盤幹細胞、胎盤幹細胞の集団、およびそれを使用して、リンパ浮腫およびリンパ浮腫を処置することによって処置可能な疾患または障害を処置する方法が本明細書で提供される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許第８，６３７，４０９号
【特許文献２】米国特許第７，３１１，９０４号
【特許文献３】米国特許第７，３１１，９０５号
【特許文献４】米国特許第７，４６８，２７６号
【特許文献５】米国特許公開公報第２００７／０２７５３６２号
【特許文献６】米国特許公開公報第２００７／０１９００４２号
【特許文献７】米国特許第５，３７２，５８１号
【特許文献８】米国特許第５，４１５，６６５号
【特許文献９】米国特許第７，１４７，６２６号
【特許文献１０】米国特許第７，０４５，１４８号
【特許文献１１】米国特許第７，２５５，７２９号
【特許文献１２】米国特許公開公報第２００４／００４８７９６号
【特許文献１３】特許出願第１２／５４６，５５６号
【特許文献１４】米国特許出願第１２／６２２，３５２号
【特許文献１５】米国特許第４，７９８，８２４号
【特許文献１６】米国特許第５，５５２，２６７号
【特許文献１７】米国特許出願公開第２００４／００４８７９６号
【特許文献１８】米国特許公開公報第２００２／００２２６７６号
【特許文献１９】米国特許第６，３５５，６９９号
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】ボスティアン（Ｂｏｓｔｉａｎ）およびベッツ（Ｂｅｔｔｓ），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１７３，７８７，（１９７８）
【非特許文献２】カマーチ（Ｋａｍａｒｃｈ），１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，１５１：１５０−１６５
【非特許文献３】アリカメッツ（Ａｌｌｉｋｍｅｔｓ）ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８（２３）：５３３７−９（１９９８）
【非特許文献４】サウサード（Ｓｏｕｔｈａｒｄ）ら，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ４９（２）：２５１−２５７（１９９０）
【非特許文献５】ゴーデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）
【非特許文献６】サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ（１９８９）
【非特許文献７】アンセス（Ａｎｓｅｔｈ）ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，７８（１−３）：１９９−２０９（２００２）
【非特許文献８】ワン（Ｗａｎｇ）ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２４（２２）：３９６９−８０（２００３）
【非特許文献９】ゴッセン（Ｇｏｓｓｅｎ）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５５４７−５５５１，１９９２
【非特許文献１０】ホシマル（Ｈｏｓｈｉｍａｒｕ）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１５１８−１５２３，１９９６
【非特許文献１１】リュー（Ｌｉｕ）ら，２０１４，Ｃｌｉｎ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３（ｅ１４）
【非特許文献１２】フランキ（Ｆｒａｎｃｋｉ）ら，２０１５．Ｊ．Ｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．１５：９０１−９１５
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
３．概要
組織培養プラスチック接着性の胎盤接着性細胞、例えば胎盤接着性細胞（以下のセクション５．３に記載される胎盤接着性細胞）の投与を含む、対象、例えばヒト対象においてリンパ管形成を誘導する方法が本明細書で提供される。
【０００６】
具体的な実施形態において、リンパ浮腫またはリンパ浮腫を処置することによって処置可能な疾患もしくは障害を有する個体を処置する方法であって、リンパ浮腫または前記疾患または障害の１つまたは複数の症状の検出可能な向上に十分な量および時間で、治療有効量の組織培養プラスチック接着性の胎盤接着性細胞、例えば胎盤接着性細胞（以下のセクション５．３に記載される胎盤接着性細胞）を個体に投与することを含む、方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、本方法は、一方もしくは両方の脚の一部もしくは全ての腫れ、一方もしくは両方の腕の一部もしくは全ての腫れ、腕もしくは脚のだるさもしくは緊張、脚もしくは腕の非圧痛性の痘痕状浮腫（ｐｉｔｔｅｄ  ｅｄｅｍａ）、腕もしくは脚における動きの制限もしくは動きを制限される感覚、腕もしくは脚における痛みもしくは不快感、皮内もしくは皮下の感染、蜂巣炎、リンパ管炎、リンパ漏、膿痂疹、罹患した腕もしくは脚の皮膚の紅斑、陽性のシュテンマーサイン、または罹患した腕もしくは脚の皮膚の硬化および／もしくは肥厚化などの、リンパ浮腫に関連するまたはリンパ浮腫によって引き起こされる症状または続発症の１つまたは複数の、前記胎盤接着性細胞の投与前の個体と比較した向上に十分な量および時間で、胎盤接着性細胞を前記個体に投与することを含む。ある特定の実施形態において、リンパ浮腫は、ステージ０、ステージ１、ステージ２、またはステージ３のリンパ浮腫である。ある特定の他の実施形態において、リンパ浮腫は、脂肪性浮腫に属する。
【０００７】
ある特定の実施形態において、胎盤接着性細胞の投与によって処置される浮腫は、静脈不全、心不全、睡眠時無呼吸、または腎不全によって引き起こされる浮腫またはそれに関連する浮腫ではない。
【０００８】
ある特定の実施形態では、対象においてリンパ管形成を誘導する、および／または対象においてリンパ浮腫またはリンパ浮腫を処置することによって処置可能な疾患もしくは障害を処置する胎盤接着性細胞の能力は、対象におけるＬＹＶＥ−１（リンパ管内皮ヒアルロナン受容体−１）の発現レベルの測定によって確認される。
【０００９】
リンパ管形成を誘導する方法および本明細書に記載される処置方法の別の具体的な実施形態において、胎盤接着性細胞は、注射によって、例えばリンパ浮腫に罹患した肢への注射によって、個体に投与される。別の具体的な実施形態において、胎盤接着性細胞は、筋肉内に投与される。
【００１０】
リンパ管形成を誘導する方法および本明細書に記載される処置方法の別の具体的な実施形態において、胎盤接着性細胞は、静脈内注入によって個体に投与される。具体的な実施形態において、前記静脈内注入は、約１から約８時間にわたる静脈内注入である。
【００１１】
リンパ管形成を誘導する方法および本明細書に記載される処置方法の他の具体的な実施形態において、胎盤接着性細胞は、皮下、皮内、動脈内、クモ膜下、または腹腔内に投与されるか、または胎盤接着性細胞を含むマトリックスまたは足場の前記個体への埋め込みによって投与される。
【００１２】
リンパ管形成を誘導する方法および本明細書に記載される処置方法のある特定の実施形態において、約１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９、または１×１０１０個の胎盤接着性細胞が個体に投与される。ある特定の実施形態において、１×１０４から１×１０５、１×１０５から１×１０６、１×１０６から１×１０７、１×１０７から１×１０８、１×１０８から１×１０９、または１×１０９から１×１０１０個の胎盤接着性細胞が個体に投与される。
【００１３】
リンパ管形成を誘導する方法および本明細書に記載される処置方法の別の具体的な実施形態において、前記胎盤接着性細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０回以下の集団倍加で増殖されている。別の具体的な実施形態において、前記胎盤接着性細胞は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０回、またはおよそそれらの回数、またはそれより多くの回数で継代された前記細胞の培養物からのものである。
【００１４】
リンパ管形成を誘導する方法および本明細書に記載される処置方法の別の実施形態において、前記胎盤接着性細胞は、低温保存されており、対象に投与される前に融解されている。
【００１５】
具体的な実施形態において、リンパ管形成を誘導する方法および本明細書に記載される処置方法に従って使用される胎盤接着性細胞は、組織培養プラスチックに接着し、フローサイトメトリーによって検出可能な、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋およびＣＤ２００＋である。ある特定の実施形態において、胎盤接着性細胞は、骨形成または軟骨形成細胞に分化する能力を有する。別の実施形態において、前記胎盤接着性細胞は、組織培養プラスチックへの接着性を有し、フローサイトメトリーによって検出可能な、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋およびＣＤ２００＋であり、骨形成または軟骨形成細胞、例えば骨細胞または軟骨細胞の特徴の１つまたは複数の特徴を有する細胞に分化する能力を有する。他の実施形態において、胎盤接着性細胞は、加えて、神経系細胞または神経原性細胞の１つまたは複数の特徴、例えばニューロンの特徴；グリア細胞の１つまたは複数の特徴、例えばグリアまたは星状細胞の特徴；脂肪細胞系の細胞の１つまたは複数の特徴、例えば脂肪細胞の特徴；膵臓細胞の１つまたは複数の特徴；および／または心細胞の１つまたは複数の特徴を有する細胞に分化する能力を有する。
【００１６】
ある特定の実施形態において、リンパ管形成を誘導する方法および本明細書に記載される処置方法に従って使用される胎盤接着性細胞は、フローサイトメトリーおよび／またはＲＴ−ＰＣＲによって検出可能な、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋およびＣＤ２００＋、ならびにＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＣＤ８０−、ＣＤ８６−、ＣＤ１３３−、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱ−、ＳＳＥＡ３−、ＳＳＥＡ４−、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ７３＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ＋、ＰＤＬ１＋、ＡＢＣ−ｐ＋、および／またはＯＣＴ−４＋の１つまたは複数である。別の実施形態において、前記胎盤接着性細胞は、フローサイトメトリーによって検出可能な、ＣＤ３４−、ＣＤ４５−、ＣＤ１０＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋およびＣＤ２００＋である。別の実施形態において、前記胎盤接着性細胞は、フローサイトメトリーによって検出可能な、ＣＤ３４−、ＣＤ４５−、ＣＤ１０＋、ＣＤ８０−、ＣＤ８６−、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋およびＣＤ２００＋である。別の実施形態において、前記胎盤接着性細胞は、フローサイトメトリーによって検出可能な、ＣＤ３４−、ＣＤ４５−、ＣＤ１０＋、ＣＤ８０−、ＣＤ８６−、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋およびＣＤ２００＋であり、加えてＣＤ２９＋、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ５４＋、ＳＨ３＋またはＳＨ４＋の１つまたは複数である。別の実施形態において、前記胎盤接着性細胞は、フローサイトメトリーによって検出可能な、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ７３＋、ＣＤ８０−、ＣＤ８６−、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋、およびＣＤ２００＋である。
【００１７】
ある特定の実施形態において、リンパ管形成を誘導する方法および本明細書に記載される処置方法に従って使用される胎盤接着性細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋およびＣＤ２００＋胎盤接着性細胞であり、加えて、ＣＤ１１７−、ＣＤ１３３−、ＫＤＲ−（ＶＥＧＦＲ２−）、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ＋、ＨＬＡ−ＤＰ、ＤＱ、ＤＲ−、もしくはプログラム細胞死（プログラム死）−１リガンド（ＰＤＬ１）＋の１つまたは複数、またはそれらのあらゆる組合せである。別の具体的な実施形態において、前記胎盤接着性細胞は、フローサイトメトリーによって検出可能な、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ７３＋、ＣＤ８０−、ＣＤ８６−、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ１１７−、ＣＤ１３３−、ＣＤ２００＋、ＫＤＲ−（ＶＥＧＦＲ２−）、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ＋、ＨＬＡ−ＤＰ、ＤＱ、ＤＲ−、またはプログラム細胞死−１リガンド（ＰＤＬ１）＋である。
【００１８】
ある特定の実施形態において、リンパ管形成を誘導する方法および本明細書に記載される処置方法に従って使用される胎盤接着性細胞は、フローサイトメトリーによって検出可能な、ＡＢＣ−ｐ＋であるか、もしくは加えてＡＢＣ−ｐ＋であるか、または例えばＲＴ−ＰＣＲによって決定可能な、ＯＣＴ−４＋（ＰＯＵ５Ｆ１＋）であり、ＡＢＣ−ｐは、胎盤特異的なＡＢＣ輸送体タンパク質（乳がん耐性タンパク質（ＢＣＲＰ）およびミトキサントロン耐性タンパク質（ＭＸＲ）としても公知）である。別の実施形態において、本明細書に記載される胎盤接着性細胞のいずれかは、加えて、例えばフローサイトメトリーによって決定可能な、ＳＳＥＡ３−またはＳＳＥＡ４−であり、ＳＳＥＡ３は、ステージ特異的胎児抗原３であり、ＳＳＥＡ４は、ステージ特異的胎児抗原４である。別の実施形態において、本明細書に記載される胎盤接着性細胞のいずれかは、加えて、ＳＳＥＡ３−およびＳＳＥＡ４−である。
【００１９】
ある特定の実施形態において、リンパ管形成を誘導する方法および本明細書に記載される処置方法に従って使用される胎盤接着性細胞は、加えて、ＭＨＣ−Ｉ＋（例えば、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ＋）、ＭＨＣ−ＩＩ−（例えば、ＨＬＡ−ＤＰ、ＤＱ、ＤＲ−）またはＨＬＡ−Ｇ−の１つまたは複数である。別の実施形態において、本明細書に記載される胎盤接着性細胞のいずれかは、加えて、ＭＨＣ−Ｉ＋（例えば、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ＋）、ＭＨＣ−ＩＩ−（例えば、ＨＬＡ−ＤＰ、ＤＱ、ＤＲ−）およびＨＬＡ−Ｇ−のそれぞれである。
【００２０】
ある特定の実施形態において、リンパ管形成を誘導する方法および本明細書に記載される処置方法に従って使用される胎盤接着性細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋細胞であり、加えてＣＤ２９＋、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ８０−、ＣＤ８６−、ＳＨ３＋またはＳＨ４＋の１つまたは複数である。別の実施形態において、胎盤接着性細胞は、加えて、ＣＤ４４＋である。別の実施形態において、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤接着性細胞は、加えて、ＣＤ１３＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ６２Ｅ−、ＣＤ６２Ｌ−、ＣＤ６２Ｐ−、ＳＨ３＋（ＣＤ７３＋）、ＳＨ４＋（ＣＤ７３＋）、ＣＤ８０−、ＣＤ８６−、ＣＤ９０＋、ＳＨ２＋（ＣＤ１０５＋）、ＣＤ１０６／ＶＣＡＭ＋、ＣＤ１１７−、ＣＤ１４４／ＶＥ−カドヘリンｌｏｗ、ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４−、ＣＤ１３３−、ＯＣＴ−４＋、ＳＳＥＡ３−、ＳＳＥＡ４−、ＡＢＣ−ｐ＋、ＫＤＲ−（ＶＥＧＦＲ２−）、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ＋、ＨＬＡ−ＤＰ、ＤＱ、ＤＲ−、ＨＬＡ−Ｇ−、もしくはプログラム細胞死−１リガンド（ＰＤＬ１）＋の１つまたは複数、またはそれらのあらゆる組合せである。別の実施形態において、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤接着性細胞は、加えて、ＣＤ１３＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４／ＩＣＡＭ＋、ＣＤ６２Ｅ−、ＣＤ６２Ｌ−、ＣＤ６２Ｐ−、ＳＨ３＋（ＣＤ７３＋）、ＳＨ４＋（ＣＤ７３＋）、ＣＤ８０−、ＣＤ８６−、ＣＤ９０＋、ＳＨ２＋（ＣＤ１０５＋）、ＣＤ１０６／ＶＣＡＭ＋、ＣＤ１１７−、ＣＤ１４４／ＶＥ−カドヘリンｄｉｍ、ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４−、ＣＤ１３３−、ＯＣＴ−４＋、ＳＳＥＡ３−、ＳＳＥＡ４−、ＡＢＣ−ｐ＋、ＫＤＲ−（ＶＥＧＦＲ２−）、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ＋、ＨＬＡ−ＤＰ、ＤＱ、ＤＲ−、ＨＬＡ−Ｇ−、およびプログラム細胞死−１リガンド（ＰＤＬ１）＋である。
【００２１】
本明細書で開示された方法の他の実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、ＣＤ２００＋およびＨＬＡ−Ｇ−；ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、およびＣＤ２００＋；ＣＤ２００＋およびＯＣＴ−４＋；ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋およびＨＬＡ−Ｇ−；ＣＤ７３＋およびＣＤ１０５＋；もしくはＯＣＴ−４＋；またはそれらのあらゆる組合せである。
【００２２】
本明細書で開示された方法のある特定の実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０＋、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、ＳＨ４＋、ＳＳＥＡ３−、ＳＳＥＡ４−、ＯＣＴ−４＋、ＭＨＣ−Ｉ＋またはＡＢＣ−ｐ＋の１つまたは複数であり、ＡＢＣ−ｐは、胎盤特異的なＡＢＣ輸送体タンパク質（乳がん耐性タンパク質（ＢＣＲＰ）およびミトキサントロン耐性タンパク質（ＭＸＲ）としても公知）である。別の実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０＋、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、ＳＨ４＋、ＳＳＥＡ３−、ＳＳＥＡ４−、およびＯＣＴ−４＋である。別の実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、およびＳＨ４＋である。別の実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、ＳＨ４＋およびＯＣＴ−４＋である。別の実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０＋、ＭＨＣ−１＋、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、ＳＨ４＋である。別の実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、ＯＣＴ−４＋およびＡＢＣ−ｐ＋である。別の実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、ＳＨ４＋およびＯＣＴ−４＋である。別の実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、ＯＣＴ−４＋、ＣＤ３４−、ＳＳＥＡ３−、およびＳＳＥＡ４−である。具体的な実施形態において、前記ＯＣＴ−４＋、ＣＤ３４−、ＳＳＥＡ３−、およびＳＳＥＡ４−細胞は、加えて、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３４−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０＋、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、およびＳＨ４＋である。別の実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、ＯＣＴ−４＋およびＣＤ３４−であり、ＳＨ３＋またはＳＨ４＋のいずれかである。別の実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、ＣＤ３４−であり、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０＋、またはＯＣＴ−４＋のいずれかである。ある特定の実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋およびＣＤ２００＋である。
【００２３】
本明細書に記載される方法で使用される胎盤接着性細胞の上記の特徴のいずれかのある特定の実施形態において、細胞マーカー（例えば、表面抗原分類または免疫原性マーカー）の発現は、フローサイトメトリーによって決定可能である。ある特定の他の実施形態において、細胞マーカーの発現は、ＲＴ−ＰＣＲによって決定可能である。
【００２４】
ある特定の実施形態において、リンパ管形成を誘導する方法および本明細書に記載される処置方法に従って使用される胎盤接着性細胞、例えば、ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋細胞は、等しい数の骨髄由来間葉系幹細胞（間葉幹細胞）より検出可能に高いレベルで１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＡＣＴＧ２、ＡＤＡＲＢ１、ＡＭＩＧＯ２、ＡＲＴＳ−１、Ｂ４ＧＡＬＴ６、ＢＣＨＥ、Ｃ１１ｏｒｆ９、ＣＤ２００、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ４Ａ２、ＣＰＡ４、ＤＭＤ、ＤＳＣ３、ＤＳＧ２、ＥＬＯＶＬ２、Ｆ２ＲＬ１、ＦＬＪ１０７８１、ＧＡＴＡ６、ＧＰＲ１２６、ＧＰＲＣ５Ｂ、ＩＣＡＭ１、ＩＥＲ３、ＩＧＦＢＰ７、ＩＬ１Ａ、ＩＬ６、ＩＬ１８、ＫＲＴ１８、ＫＲＴ８、ＬＩＰＧ、ＬＲＡＰ、ＭＡＴＮ２、ＭＥＳＴ、ＮＦＥ２Ｌ３、ＮＵＡＫ１、ＰＣＤＨ７、ＰＤＬＩＭ３、ＰＫＰ２、ＲＴＮ１、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＳＴ３ＧＡＬ６、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＳＬＣ１２Ａ８、ＴＣＦ２１、ＴＧＦＢ２、ＶＴＮ、およびＺＣ３Ｈ１２Ａの１つまたは複数であり、前記骨髄由来間葉系幹細胞は、前記単離された胎盤接着性細胞が受けた継代数に等しい回数の培養における継代を受けている。ある特定の実施形態において、前記１つまたは複数の遺伝子の前記発現は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、または例えばＵ１３３−Ａマイクロアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を使用するマイクロアレイ分析によって決定される。別の実施形態において、前記単離された胎盤接着性細胞は、６０％ＤＭＥＭ−ＬＧ（例えばＧｉｂｃｏより）および４０％ＭＣＤＢ−２０１（例えばＳｉｇｍａより）；２％ウシ胎児血清（例えばＨｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｓ．より）；１×インスリン−トランスフェリン−セレニウム（ＩＴＳ）；１×リノール酸−ウシ血清アルブミン（ＬＡ−ＢＳＡ）；１０−９Ｍデキサメタゾン（例えばＳｉｇｍａより）；１０−４Ｍアスコルビン酸２−リン酸（例えばＳｉｇｍａより）；上皮増殖因子１０ｎｇ／ｍＬ（例えばＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓより）；および血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ−ＢＢ）１０ｎｇ／ｍＬ（例えばＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓより）を含む培地中で、約３から約３５回の集団倍加で、例えばおよそ約３から約３５回の集団倍加で培養した場合、前記１つまたは複数の遺伝子を発現する。別の実施形態において、前記単離された胎盤接着性細胞は、６０％ＤＭＥＭ−ＬＧ（例えばＧｉｂｃｏより）および４０％ＭＣＤＢ−２０１（例えばＳｉｇｍａより）；２％ウシ胎児血清（例えばＨｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｓ．より）；１×インスリン−トランスフェリン−セレニウム（ＩＴＳ）；１×リノール酸−ウシ血清アルブミン（ＬＡ−ＢＳＡ）；１０−９Ｍデキサメタゾン（例えばＳｉｇｍａより）；１０−４Ｍアスコルビン酸２−リン酸（Ｓｉｇｍａ）；上皮増殖因子１０ｎｇ／ｍＬ（例えばＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓより）；および血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ−ＢＢ）１０ｎｇ／ｍＬ（例えばＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓより）を含む培地中で、約３から約３５回の集団倍加培養した場合、前記１つまたは複数の遺伝子を発現する。
【００２５】
ある特定の実施形態において、リンパ管形成を誘導する方法および本明細書に記載される処置方法に従って使用される胎盤接着性細胞は、ＣＤ２００およびＡＲＴＳ１（１型腫瘍壊死因子のアミノペプチダーゼレギュレーター）；ＡＲＴＳ−１およびＬＲＡＰ（白血球由来アルギニンアミノペプチダーゼ）；ＩＬ６（インターロイキン−６）およびＴＧＦＢ２（トランスフォーミング増殖因子、ベータ２）；ＩＬ６およびＫＲＴ１８（ケラチン１８）；ＩＥＲ３（前初期応答３）、ＭＥＳＴ（中胚葉特異的転写物ホモログ）およびＴＧＦＢ２；ＣＤ２００およびＩＥＲ３；ＣＤ２００およびＩＬ６；ＣＤ２００およびＫＲＴ１８；ＣＤ２００およびＬＲＡＰ；ＣＤ２００およびＭＥＳＴ；ＣＤ２００およびＮＦＥ２Ｌ３（核内因子（赤血球由来２）様３）；またはＣＤ２００およびＴＧＦＢ２を、等しい数の骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）より検出可能に高いレベルで発現し、前記骨髄由来間葉系幹細胞は、前記単離された胎盤接着性細胞が受けた継代数に等しい回数の培養における継代を受けている。他の実施形態において、胎盤接着性細胞は、ＡＲＴＳ−１、ＣＤ２００、ＩＬ６およびＬＲＡＰ；ＡＲＴＳ−１、ＩＬ６、ＴＧＦＢ２、ＩＥＲ３、ＫＲＴ１８およびＭＥＳＴ；ＣＤ２００、ＩＥＲ３、ＩＬ６、ＫＲＴ１８、ＬＲＡＰ、ＭＥＳＴ、ＮＦＥ２Ｌ３、およびＴＧＦＢ２；ＡＲＴＳ−１、ＣＤ２００、ＩＥＲ３、ＩＬ６、ＫＲＴ１８、ＬＲＡＰ、ＭＥＳＴ、ＮＦＥ２Ｌ３、およびＴＧＦＢ２；またはＩＥＲ３、ＭＥＳＴおよびＴＧＦＢ２を、等しい数の骨髄由来間葉系幹細胞ＢＭ−ＭＳＣより検出可能に高いレベルで発現し、前記骨髄由来間葉系幹細胞は、前記単離された胎盤接着性細胞が受けた継代数に等しい回数の培養における継代を受けている。
【００２６】
ヒト細胞が使用される場合、遺伝子記号は、全体にわたり、ヒト配列を指し、当業者に周知の通り、代表的な配列は、文献またはＧｅｎＢａｎｋで見出すことができる。配列に対するプローブは、公開された形で入手可能な配列によって、または商業的な供給源を介して、例えば、特異的なＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブまたはＴＡＱＭＡＮ（登録商標）血管新生アレイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、パーツ番号４３７８７１０）を介して決定することができる。
【００２７】
様々な実施形態において、本明細書で開示された方法において有用な前記単離された胎盤接着性細胞、例えば胎盤幹細胞または胎盤複能性細胞は、細胞の集団中に含有され、その細胞の、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％が、前記単離された胎盤接着性細胞である。ある特定の他の実施形態において、前記細胞の集団中の胎盤接着性細胞は、母体の遺伝子型を有する細胞を実質的に含まず、例えば、前記集団中の胎盤接着性細胞の、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％が胎児の遺伝子型を有し、すなわち胎児起源である。ある特定の他の実施形態において、前記胎盤接着性細胞を含む細胞の集団は、母体の遺伝子型を有する細胞を実質的に含まず、例えば、前記集団中の細胞の、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％が胎児の遺伝子型を有し、すなわち胎児起源である。ある特定の他の実施形態において、前記胎盤接着性細胞を含む細胞の集団は、母体の遺伝子型を有する細胞を含み、例えば、前記集団中の細胞の、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％が母体の遺伝子型を有し、すなわち母体起源である。
【００２８】
本明細書における胎盤接着性細胞（例えば、胎盤接着性細胞）の実施形態のいずれかの実施形態において、胎盤接着性細胞は、胚様体の形成を可能にする条件下で前記集団が培養される場合、例えば増殖条件下で培養される場合、前記単離された胎盤接着性細胞を含む胎盤接着性細胞の集団における１つまたは複数の胚様体の形成を促進する）。
【００２９】
ある特定の実施形態において、本明細書で提供される方法において有用な胎盤接着性細胞は、免疫学的局在法によって検出可能な場合、４から２１日にわたり１から１００ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦに曝露した後、ＣＤ３４を発現しない。具体的な実施形態において、前記胎盤接着性細胞は、組織培養プラスチックへの接着性を有する。別の具体的な実施形態において、前記細胞の集団は、例えばＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）などの基材上で、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、上皮性増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）または塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）などの血管新生因子の存在下で培養される場合、新芽または管状の構造を形成する。
【００３０】
ある特定の実施形態において、リンパ管形成を誘導する方法および本明細書に記載される処置方法に従って使用される胎盤接着性細胞は、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＩＬ−８、ＭＣＰ−３、ＦＧＦ２、フォリスタチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＥＧＦ、ＥＮＡ−７８、ＧＲＯ、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＴＩＭＰ−２、ｕＰＡＲ、またはガレクチン−１の１つもしくは複数または全てを、例えば１つまたは複数の細胞が増殖する培養培地に分泌する。別の実施形態において、胎盤接着性細胞は、低酸素状態下（例えば、約５％Ｏ２未満）で、酸素正常条件下（例えば、約２０％または約２１％Ｏ２）と比較して増加したレベルのＣＤ２０２ｂ、ＩＬ−８および／またはＶＥＧＦを発現する。
【００３１】
ある特定の実施形態において、リンパ管形成を誘導する方法および本明細書に記載される処置方法に従って使用される胎盤接着性細胞は、内皮細胞の集団において、前記胎盤由来の接着性細胞と接触させて、新芽または管状の構造の形成をもたらすことができる。具体的な実施形態において、例えば胎盤のコラーゲンまたはＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）などの基材中またはその上で、例えばＩ型ならびにＩＶ型コラーゲンなどの細胞外マトリックスタンパク質、および／または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、上皮性増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）もしくは塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）などの血管新生因子の存在下で少なくとも４日間培養される場合、胎盤由来の血管新生細胞は、ヒト内皮細胞と共培養されて、新芽または管状の構造を形成するか、または内皮細胞の新芽を支持する。
【００３２】
ある特定の実施形態において、リンパ管形成を誘導する方法および本明細書に記載される処置方法で使用される胎盤接着性細胞は、ヒトである。
【００３３】
ある特定の実施形態において、リンパ管形成を誘導する方法および本明細書に記載される処置方法に従って使用される胎盤接着性細胞は、レシピエントにとって自己である。
ある特定の実施形態において、リンパ管形成を誘導する方法および本明細書に記載される処置方法に従って使用される胎盤接着性細胞は、レシピエントにとって異種である。
【００３４】
本明細書で提供される方法において有用な胎盤接着性細胞の細胞表面、分子および遺伝子マーカーは、以下のセクション５．３で詳細に記載される。
【００３５】
ある特定の実施形態において、リンパ管形成を誘導する方法および本明細書に記載される処置方法に従って使用される胎盤接着性細胞、前記単離された胎盤接着性細胞は、前記個体に１回投与される。別の具体的な実施形態において、前記単離された胎盤接着性細胞は、２回またはそれより多くの別々の投与で前記個体に投与される。別の具体的な実施形態において、前記投与は、前記個体１キログラム当たり、約１×１０４から１×１０５個の間の単離された胎盤接着性細胞、例えば胎盤接着性細胞を投与することを含む。別の具体的な実施形態において、前記投与は、前記個体１キログラム当たり、約１×１０５から１×１０６個の間の単離された胎盤接着性細胞を投与することを含む。別の具体的な実施形態において、前記投与は、前記個体１キログラム当たり、約１×１０６から１×１０７個の間の単離された胎盤接着性細胞を投与することを含む。別の具体的な実施形態において、前記投与は、前記個体１キログラム当たり、約１×１０７から１×１０８個の間の単離された胎盤接着性細胞を投与することを含む。他の具体的な実施形態において、前記投与は、前記個体１キログラム当たり、約１×１０６から約２×１０６個の間の単離された胎盤接着性細胞；前記個体１キログラム当たり、約２×１０６から約３×１０６個の間の単離された胎盤接着性細胞；前記個体１キログラム当たり、約３×１０６から約４×１０６個の間の単離された胎盤接着性細胞；前記個体１キログラム当たり、約４×１０６から約５×１０６個の間の単離された胎盤接着性細胞；前記個体１キログラム当たり、約５×１０６から約６×１０６個の間の単離された胎盤接着性細胞；前記個体１キログラム当たり、約６×１０６から約７×１０６個の間の単離された胎盤接着性細胞；前記個体１キログラム当たり、約７×１０６から約８×１０６個の間の単離された胎盤接着性細胞；前記個体１キログラム当たり、約８×１０６から約９×１０６個の間の単離された胎盤接着性細胞；または前記個体１キログラム当たり、約９×１０６から約１×１０７個の間の単離された胎盤接着性細胞を投与することを含む。別の具体的な実施形態において、前記投与は、前記個体１キログラム当たり、約１×１０７から約２×１０７個の間の単離された胎盤接着性細胞を前記個体に投与することを含む。別の具体的な実施形態において、前記投与は、前記個体１キログラム当たり、約１．３×１０７から約１．５×１０７個の間の単離された胎盤接着性細胞を前記個体に投与することを含む。別の具体的な実施形態において、前記投与は、前記個体１キログラム当たり、約３×１０７個までの単離された胎盤接着性細胞を前記個体に投与することを含む。具体的な実施形態において、前記投与は、約５×１０６から約２×１０７個の間の単離された胎盤接着性細胞を前記個体に投与することを含む。別の具体的な実施形態において、前記投与は、約２０ミリリットルの溶液中の約１５０×１０６個の単離された胎盤接着性細胞を前記個体に投与することを含む。
【００３６】
具体的な実施形態において、前記投与は、約５×１０６から約２×１０７個の間の単離された胎盤接着性細胞を前記個体に投与することを含み、前記細胞は、１０％のデキストラン、例えばデキストラン−４０、５％のヒト血清アルブミン、および任意選択で免疫抑制剤を含む溶液に含有される。
【００３７】
別の具体的な実施形態において、前記投与は、約５×１０７から３×１０９個の間の単離された胎盤接着性細胞を静脈内投与することを含む。具体的な実施形態において、前記投与は、約９×１０８個の単離された胎盤接着性細胞または約１．８×１０９個の単離された胎盤接着性細胞を静脈内投与することを含む。別の具体的な実施形態において、前記投与は、約５×１０６から１×１０８個の間の単離された胎盤接着性細胞を皮下投与することを含む。別の具体的な実施形態において、前記投与は、約９×１０６個の単離された胎盤接着性細胞を皮下投与することを含む。
【００３８】
本明細書で提供される方法で使用される胎盤接着性細胞は、ある特定の実施形態において、血管新生を促進する１種または複数のタンパク質を産生するように遺伝子操作されていてもよい。ある特定の実施形態において、血管新生を促進する前記タンパク質は、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）（例えば、ＶＥＧＦＤ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）（例えば、ＦＧＦ２）、アンギオゲニン（ＡＮＧ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、上皮由来好中球活性化タンパク質７８（ＥＮＡ−７８）、フォリスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、増殖制御発癌遺伝子（ｏｎｇｏｇｅｎｅ）タンパク質（ＧＲＯ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、ＩＬ−８、レプチン、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、ＭＣＰ−３、血小板由来増殖因子サブユニット（ｓｕｂｍｕｎｉｔ）Ｂ（ＰＤＧＦＢ）、ランテス、トランスフォーミング増殖因子ベータ１（ＴＧＦ−β１）、トロンボポイエチン（ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｔｅｉｎ）（Ｔｐｏ）、メタロプロテイナーゼ組織阻害剤１（ＴＩＭＰ１）、ＴＩＭＰ２、および／またはウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）の１つまたは複数である。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
４．図面の簡単な説明
【図１】胎盤由来の接着性細胞による選択された血管新生タンパク質の分泌を示す図である。
【図２】ヒト内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の管形成に対する胎盤由来の接着性細胞の馴化培地の血管新生作用を示す図である。
【図３】ヒト内皮細胞の移動に対する胎盤由来の接着性細胞の馴化培地の血管新生作用を示す図である。
【図４】ヒト内皮細胞の増殖に対する胎盤由来の接着性細胞の馴化培地の作用を示す図である。
【図５】ＨＵＶＥＣおよび胎盤由来の接着性細胞の管形成を示す図である。
【図６】低酸素および酸素正常条件下での胎盤由来の接着性細胞によるＶＥＧＦおよびＩＬ−８の分泌を示す図である。
【図７】ニワトリ（ｃｈｉｃｋ）漿尿膜血管新生モデルにおける血管新生に対する胎盤接着性細胞の陽性の作用を示す図である。ｂＦＧＦ：塩基性線維芽細胞増殖因子（陽性対照）。ＭＤＡＭＢ２３１：血管新生乳がん細胞株（陽性対照）。Ｙ軸：血管形成の程度。
【図８】ニワトリ漿尿膜血管新生モデルにおける血管新生に対する胎盤接着性細胞の陽性の作用の馴化培地（上清）を示す図である。ｂＦＧＦ：塩基性線維芽細胞増殖因子（陽性対照）。ＭＤＡＭＢ２３１：血管新生乳がん細胞株（陽性対照）。Ｙ軸：血管形成の程度。
【図９Ａ】ｄｂ／ｄｂマウスでの片側後肢虚血（ＨＬＩ）モデルにおいて、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤接着性細胞は、動脈形成を強化することを示す図であって、結紮後の１４、２８および４２日におけるレーザードップラー分析（ｎ＝９）。平均±ｓ．ｅ．ｍ．＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１を示す。Ｎ＝動物の数。
【図９Ｂ】ｄｂ／ｄｂマウスでの片側後肢虚血（ＨＬＩ）モデルにおいて、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤接着性細胞は、動脈形成を強化することを示す図であって、ＨＬＩ後の４２日における大腿部におけるＣＤ３１＋血管の定量（ｎ＝４）。平均±ｓ．ｅ．ｍ．＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１を示す。Ｎ＝動物の数。
【図９Ｃ】ｄｂ／ｄｂマウスでの片側後肢虚血（ＨＬＩ）モデルにおいて、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤接着性細胞は、動脈形成を強化することを示す図であって、ＨＬＩ後の４２日における大腿部におけるαＳＭＡ＋血管の定量（ｎ＝４）。平均±ｓ．ｅ．ｍ．＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１を示す。Ｎ＝動物の数。
【図９Ｄ】ｄｂ／ｄｂマウスでの片側後肢虚血（ＨＬＩ）モデルにおいて、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤接着性細胞は、動脈形成を強化することを示す図であって、ＨＬＩ後の４２日における大腿部におけるαＳＭＡ＋血管のサイズ分布（ｎ＝４）。平均±ｓ．ｅ．ｍ．＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１を示す。Ｎ＝動物の数。
【図９Ｅ】ｄｂ／ｄｂマウスでの片側後肢虚血（ＨＬＩ）モデルにおいて、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤接着性細胞は、動脈形成を強化することを示す図であって、ＨＬＩ後の４、２８および４２日における肢の機能の半定量的評価（ｎ＝９）。平均±ｓ．ｅ．ｍ．＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１を示す。Ｎ＝動物の数。
【図９Ｆ】ｄｂ／ｄｂマウスでの片側後肢虚血（ＨＬＩ）モデルにおいて、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤接着性細胞は、動脈形成を強化することを示す図である。平均±ｓ．ｅ．ｍ．＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１を示す。Ｎ＝動物の数。
【図１０Ａ】ｄｂ／ｄｂマウスでの片側ＨＬＩモデルにおいて、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤接着性細胞は、Ｍ２マクロファージの分化を促進することを示す図であって、ＨＬＩ後の７、１４および２８日におけるＣＤ６８＋マクロファージの定量（ｎ＝４）。平均±ｓ．ｅ．ｍ．＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００５；＊＊＊＊、ｐ＜０．００１を示す。Ｎ＝動物の数。
【図１０Ｂ】ｄｂ／ｄｂマウスでの片側ＨＬＩモデルにおいて、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤接着性細胞は、Ｍ２マクロファージの分化を促進することを示す図であって、ＨＬＩ後の７、１４および２８日におけるＣＤ６８＋Ａｒｇ１＋マクロファージの定量（ｎ＝４）。
【図１０Ｃ−Ｅ】ｄｂ／ｄｂマウスでの片側ＨＬＩモデルにおいて、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤接着性細胞は、Ｍ２マクロファージの分化を促進することを示す図であって、ＬＰＳ、ＩＬ−４および胎盤接着性細胞との４８時間の共培養の前および後における、ヒトマクロファージのＣＤ２０６（１０Ｃ）、ＨＬＡ−Ｉ（１０Ｄ）、およびＣＤ８０（１０Ｅ）表面表現型。平均±ｓ．ｅ．ｍ．＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００５；＊＊＊＊、ｐ＜０．００１を示す。Ｎ＝動物の数。
【図１１Ａ】ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤接着性細胞が媒介する動脈形成はＴ細胞依存性であることを示す図であって、野生型（ＷＴ）およびＨＬＩモデルのヌードＢａｌｂ／ｃマウス（ＷＴ：ｎ＝１５；ヌード：ｎ＝９）におけるＨＬＩ後の１４、２８および４２日におけるレーザードップラー分析。平均±ｓ．ｅ．ｍ．＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００５；＊＊＊＊、ｐ＜０．００１を示す。Ｎ＝動物の数。
【図１１Ｂ】ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤接着性細胞が媒介する動脈形成はＴ細胞依存性であることを示す図であって、ＨＬＩ後の４２日における大腿部におけるＣＤ３１＋血管の定量（ｎ＝５）。平均±ｓ．ｅ．ｍ．＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００５；＊＊＊＊、ｐ＜０．００１を示す。Ｎ＝動物の数。
【図１１Ｃ】ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤接着性細胞が媒介する動脈形成はＴ細胞依存性であることを示す図であって、ＨＬＩ後の４２日における大腿部におけるαＳＭＡ＋血管の定量（ｎ＝５）。平均±ｓ．ｅ．ｍ．＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００５；＊＊＊＊、ｐ＜０．００１を示す。Ｎ＝動物の数。
【図１１Ｄ】ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤接着性細胞が媒介する動脈形成はＴ細胞依存性であることを示す図であって、Ｔ細胞再構成ヌードＢａｌｂ／ｃ  ＨＬＩモデルマウスにおけるＨＬＩ後の７、１４、２１、２８および３５日におけるレーザードップラー分析（ｎ＝１２）。平均±ｓ．ｅ．ｍ．＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００５；＊＊＊＊、ｐ＜０．００１を示す。Ｎ＝動物の数。
【図１２Ａ】ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤接着性細胞によって誘導されたＭ２マクロファージの分化はＴ細胞依存性であることを示す図であって、ＨＬＩ後の７日における大腿部におけるＣＤ６８＋総マクロファージの定量（ｎ＝５）。平均±ｓ．ｅ．ｍ．＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００５を示す。Ｎ＝動物の数。
【図１２Ｂ】ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤接着性細胞によって誘導されたＭ２マクロファージの分化はＴ細胞依存性であることを示す図であって、ＨＬＩ後の７日における大腿部におけるＣＤ６８＋Ａｒｇ１＋Ｍ２マクロファージの定量（ｎ＝５）。平均±ｓ．ｅ．ｍ．＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００５を示す。Ｎ＝動物の数。
【図１３Ａ】ｄｂ／ｄｂマウスでの両側ＨＬＩモデルにおいて、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤接着性細胞は、全身性の動脈形成作用を有することを示す図であって、第１および第２の損傷した後肢におけるレーザードップラー分析（ｎ＝１３）。平均±ｓ．ｅ．ｍ．＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００５を示す。Ｎ＝動物の数。
【図１３Ｂ】ｄｂ／ｄｂマウスでの両側ＨＬＩモデルにおいて、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤接着性細胞は、全身性の動脈形成作用を有することを示す図であって、Ｘ線血管撮影法に基づく血管の定量（ｎ＝５）。平均±ｓ．ｅ．ｍ．＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００５を示す。Ｎ＝動物の数。
【図１３Ｃ−Ｄ】ｄｂ／ｄｂマウスでの両側ＨＬＩモデルにおいて、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤接着性細胞は、全身性の動脈形成作用を有することを示す図であって、代表的なＸ線血管撮影写真。
【図１３Ｅ】ｄｂ／ｄｂマウスでの両側ＨＬＩモデルにおいて、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤接着性細胞は、全身性の動脈形成作用を有することを示す図であって、第１の傷害後の６４日における大腿部におけるＣＤ３１＋血管の定量（媒体：ｎ＝９；胎盤接着性細胞：ｎ＝１３）。平均±ｓ．ｅ．ｍ．＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００５を示す。Ｎ＝動物の数。
【図１３Ｆ】ｄｂ／ｄｂマウスでの両側ＨＬＩモデルにおいて、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤接着性細胞は、全身性の動脈形成作用を有することを示す図であって、第１の傷害後の６４日における大腿部におけるαＳＭＡ＋血管の定量（媒体：ｎ＝９；胎盤接着性細胞：ｎ＝１３）。平均±ｓ．ｅ．ｍ．＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００５を示す。Ｎ＝動物の数。
【図１３Ｇ】ｄｂ／ｄｂマウスでの両側ＨＬＩモデルにおいて、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤接着性細胞は、全身性の動脈形成作用を有することを示す図であって、第１の傷害後の６４日における大腿部におけるαＳＭＡ＋大血管のサイズ分布（媒体：ｎ＝９；胎盤接着性細胞：ｎ＝１３）。平均±ｓ．ｅ．ｍ．＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００５を示す。Ｎ＝動物の数。
【図１３Ｈ】ｄｂ／ｄｂマウスでの両側ＨＬＩモデルにおいて、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤接着性細胞は、全身性の動脈形成作用を有することを示す図であって、第１および第２の損傷した後肢におけるレーザードップラー分析（ｎ＝１８）。平均±ｓ．ｅ．ｍ．＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００５を示す。Ｎ＝動物の数。
【図１３Ｉ】ｄｂ／ｄｂマウスでの両側ＨＬＩモデルにおいて、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤接着性細胞は、全身性の動脈形成作用を有することを示す図であって、Ｘ線血管撮影法に基づく血管の定量（ｎ＝５）。平均±ｓ．ｅ．ｍ．＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００５を示す。Ｎ＝動物の数。
【図１３Ｊ】ｄｂ／ｄｂマウスでの両側ＨＬＩモデルにおいて、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤接着性細胞は、全身性の動脈形成作用を有することを示す図であって、第２の傷害後の７日におけるＣＤ６８＋Ａｒｇ１＋マクロファージの定量（ｎ＝４）。平均±ｓ．ｅ．ｍ．＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００５を示す。Ｎ＝動物の数。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
５．詳細な説明
５．１  定義
本明細書で使用される場合、用語「約」は、述べられた数値に対して言及される場合、述べられていた数値のプラスまたはマイナス１０％以内の値を示す。
【００４１】
本明細書で使用されるように、用語「血管新生」は、本明細書に記載される胎盤由来の接着性細胞に対して述べられる場合、細胞が血管または血管様の新芽を形成できること、または細胞が、別の細胞の集団、例えば内皮細胞において、血管新生（例えば、血管または血管様構造の形成）を促進することができることを意味する。
【００４２】
用語「血管新生」は、本明細書で使用される場合、これらに限定されないが、内皮細胞の活性化、移動、増殖、マトリックスのリモデリングおよび細胞の安定化を含む血管形成のプロセスを指す。
【００４３】
本明細書で使用される場合、用語「〜由来（の）」は、何かから単離されているかまたはそれ以外の方法で精製されていることを意味する。例えば、胎盤由来の接着細胞は、胎盤から単離されている。用語「〜由来（の）」は、組織、例えば胎盤から直接的に単離された細胞から培養される細胞、および初代単離物から培養または拡張された細胞を包含する。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「免疫学的局在法」は、例えばフローサイトメトリー、蛍光活性化細胞分類法、磁気セルソーティング、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、免疫組織化学的方法、または同種のもので、免疫タンパク質、例えば抗体またはその断片を使用する、化合物、例えば細胞マーカーの検出を意味する。
【００４５】
用語「ＳＨ２」は、本明細書で使用される場合、細胞マーカーＣＤ１０５上のエピトープと結合する抗体を指す。したがってＳＨ２＋と称される細胞は、ＣＤ１０５＋である。
【００４６】
本明細書で使用される場合、用語「ＳＨ３」および「ＳＨ４’」は、細胞マーカーＣＤ７３上に提示されるエピトープと結合する抗体を指す。したがって、ＳＨ３＋および／またはＳＨ４＋と称される細胞は、ＣＤ７３＋である。
【００４７】
胎盤は、その中で発達する胎児の遺伝子型を有するが、妊娠中において母体の組織とも緊密に物理的接触している。したがって、用語「胎児の遺伝子型」は、本明細書で使用される場合、胎児の遺伝子型、例えば、胎児を身ごもっていた母親の遺伝子型とは異なり、本明細書に記載されるようにして単離された特定の胎盤接着性細胞を得た胎盤に関連する胎児の遺伝子型を意味する。用語「母体の遺伝子型」は、本明細書で使用される場合、胎児を身ごもっていた母親の遺伝子型、例えば、本明細書に記載されるようにして単離された特定の胎盤接着性細胞を得た胎盤に関連する胎児を身ごもっていた母親の遺伝子型を意味する。
【００４８】
本明細書で使用される場合、用語「単離された細胞」、例えば、「単離された胎盤細胞」、「単離された胎盤幹細胞」などは、幹細胞の由来となる組織、例えば胎盤の他の異なる細胞から実質的に分離されている細胞を意味する。幹細胞に天然に付随する細胞、例えば非幹細胞、または異なるマーカープロファイルを提示する幹細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または少なくとも９９％が、例えば幹細胞の収集および／または培養中に幹細胞から除去される場合、細胞は「単離されている」。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「複能性」は、細胞を指す場合、細胞が、必ずしも全てではないがいくつかのタイプの体細胞に、または全てではないがいくつかのタイプの体細胞の特徴を有する細胞に、または３つの胚葉のうち１種または複数の細胞に分化する能力を有することを意味する。ある特定の実施形態において、例えば、以下のセクション５．３に記載されるように、神経原性、軟骨形成および／または骨形成細胞の特徴を有する細胞に分化する能力を有する単離された胎盤細胞（胎盤接着性細胞）は、複能性細胞である。
【００５０】
用語「単離された細胞の集団」は、本明細書で使用される場合、細胞の集団の由来となる組織、例えば胎盤の他の細胞から実質的に分離された細胞の集団を意味する。
【００５１】
用語「胎盤接着性細胞」は、本明細書で使用される場合、初代単離物として、または初代培養後の継代数に関係なく培養細胞のいずれかとして、哺乳類の胎盤から単離される組織培養プラスチック接着性の細胞を意味し、例えば、以下のセクション５．３に記載される胎盤接着性細胞である。しかしながら、用語「胎盤接着性細胞」は、本明細書で使用される場合、栄養膜、栄養膜細胞層、合胞栄養芽層（ｓｙｎｃｉｔｉｏｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ）、血管芽細胞、血管芽細胞、胚性生殖細胞、胚性幹細胞、胚盤胞の内部細胞塊から得られた細胞、または後期胚の生殖巣堤から得られた細胞、例えば、胚性生殖細胞を指さず、本明細書で提供される方法で使用される胎盤接着性細胞は、それらではない。本明細書に記載される胎盤接着性細胞、例えば胎盤接着性細胞はまた、その開示が参照によりその全体が組み入れられる「羊膜由来の血管新生細胞（Ａｍｎｉｏｎ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  Ｃｅｌｌｓ）」という名称の特許文献１に記載の羊膜由来の接着性細胞でもない。細胞が、幹細胞の特性、例えば、１つまたは複数のタイプの幹細胞に関連するマーカーまたは遺伝子発現プロファイル；培養中に少なくとも１０〜４０回複製する能力、および３つの胚葉の１つまたは複数の分化細胞の特徴を示す細胞に分化する能力を示す場合、その細胞は「幹細胞」とみなされる。本明細書において別段の規定がない限り、用語「胎盤」は、臍帯を含む。本明細書で開示された単離された胎盤接着性細胞は、ある特定の実施形態において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて分化条件下で分化するか、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて分化するか、またはその両方である。
【００５２】
本明細書で使用される場合、特定のマーカーがバックグラウンドを超えて検出可能である場合、胎盤細胞はそのマーカーに関して「陽性」である。特定のマーカーの検出は、例えば、抗体の使用、またはマーカーをコードする遺伝子もしくはｍＲＮＡの配列に基づくオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーのいずれかによって達成することができる。例えば、ＣＤ７３は胎盤接着性細胞においてバックグラウンドより多い検出可能な量で（例えばアイソタイプ対照と比較して）検出可能であるため、胎盤細胞は、例えばＣＤ７３に関して陽性である。また、マーカーが、細胞を少なくとも１つの他の細胞型から区別するのに使用できる場合、または細胞によって提示または発現される場合に細胞を選択したりまたは単離したりするのに使用できる場合、細胞はそのマーカーに関して陽性でもある。例えば抗体媒介性検出の文脈において、「陽性」は、特定の細胞表面マーカーが存在することを示す場合、そのマーカーに特異的な抗体、例えば蛍光標識された抗体を使用してマーカーを検出できることを意味し、「陽性」はまた、例えば血球計算器において、バックグラウンドを超えて検出可能なシグナルを産生する量でマーカーを表示する細胞も指す。例えば、細胞がＣＤ２００に特異的な抗体で検出可能に標識されており、抗体からのシグナルが、対照（例えば、バックグラウンドまたはアイソタイプ対照）のシグナルより検出可能に高い場合、細胞は、「ＣＤ２００＋」である。逆に言えば、同じ文脈における「陰性」は、対照（例えば、バックグラウンドまたはアイソタイプ対照）と比較して、そのマーカーに特異的な抗体を使用しても細胞表面マーカーが検出可能ではないことを意味する。例えば、細胞が、対照（例えば、バックグラウンドまたはアイソタイプ対照）より大きい程度に、ＣＤ３４に特異的な抗体で再現性よく検出可能に標識されていない場合、細胞は、「ＣＤ３４−」である。抗体を使用して検出されない、または検出不可能なマーカーは、類似の方式で、適切な対照を使用して、陽性であるかまたは陰性であるかが決定される。例えばＲＴ−ＰＣＲ、スロットブロットなどのＲＮＡを検出する方法によって決定される場合、細胞または細胞の集団からのＲＮＡで検出されるＯＣＴ−４  ＲＮＡの量が、バックグラウンドより多く検出可能である場合、その細胞または細胞の集団は、ＯＣＴ−４＋であると決定することができる。本明細書において別段の規定がない限り、表面抗原分類（「ＣＤ」）マーカーは、抗体を使用して検出される。ある特定の実施形態において、ＲＴ−ＰＣＲを使用してＯＣＴ−４ｍＲＮＡが検出可能である場合、ＯＣＴ−４が存在すると決定され、細胞は「ＯＣＴ−４＋」である。
【００５３】
本明細書で使用される場合、「低い」という表示は、フローサイトメトリーで検出可能なマーカーの発現に対して述べられる場合、試験された細胞の１０％未満でマーカーが発現されること、または例えばフローサイトメトリーにおいて、マーカーに起因する可能性がある蛍光が、バックグラウンドより１ｌｏｇ未満であることを意味する。
【００５４】
「処置する」は、本明細書で使用される場合、疾患、障害または状態、またはそれらのあらゆるパラメーターもしくは症状の、改善、向上、重症度の軽減、または時間経過の低減を含む。
【００５５】
５．２  リンパ浮腫およびリンパ浮腫によって引き起こされる疾患または障害の処置
リンパ浮腫またはリンパ浮腫によって引き起こされる疾患もしくは障害を処置する方法であって、有効量の接着性の胎盤接着性細胞、例えば、以下のセクション５．３に記載される胎盤接着性細胞を投与することを含む、方法が本明細書で提供される。胎盤接着性細胞は、リンパ系における、内皮細胞および内皮細胞集団、ならびに上皮細胞および上皮細胞集団の増殖を支持することができる。
【００５６】
ある特定の実施形態において、本方法は、一方もしくは両方の脚の一部もしくは全体の腫れ、一方もしくは両方の腕の一部もしくは全体の腫れ、腕もしくは脚のだるさもしくは緊張、脚もしくは腕の非圧痛性の痘痕状浮腫、腕もしくは脚における動きの制限もしくは動きを制限される感覚、腕もしくは脚における痛みもしくは不快感、皮内もしくは皮下の感染、蜂巣炎、リンパ管炎、リンパ漏、膿痂疹、罹患した腕もしくは脚の皮膚の紅斑、陽性のシュテンマーサイン、または罹患した腕もしくは脚の皮膚の硬化および／もしくは肥厚化などの、リンパ浮腫に関連するまたはリンパ浮腫によって引き起こされる症状または続発症の１つまたは複数の、前記胎盤接着性細胞の投与前の個体と比較した向上に十分な量および時間で、胎盤接着性細胞を前記個体に投与することを含む。ある特定の実施形態において、リンパ浮腫は、ステージ０、ステージ１、ステージ２、またはステージ３のリンパ浮腫である。ある特定の他の実施形態において、リンパ浮腫は、脂肪性浮腫に属する。
【００５７】
リンパ浮腫のステージ：リンパ浮腫は、一般的に、４つのステージで進行する。ステージ０において、タンパク質が皮下に蓄積し始め、罹患した肢または領域において、局所的な水分の蓄積とそれに付随するだるさまたは疲労の感覚を引き起こす。ステージ１のリンパ浮腫において、足および／または手（体から最も遠くにある肢の一部）が腫れ始め、腫れぼったい外観を呈する；くぼみまたは「圧痕」が明らかになる場合がある；皮膚を指で押した場合でも小さい穴の形が残る。これは、「圧痕性浮腫」として知られている。このステージで、浮腫は、日中と比較して夜間で低減することがあり、罹患した肢を上にあげることにより、浮腫が低減する可能性がある。ステージ２のリンパ浮腫では、肢の腫れがスポンジのような硬さになり、圧痕は、ステージ１と比較して低減するかまたはなくなる。リンパ浮腫は、上にあげても応答しない。この段階での腫れは、皮下の線維形成および瘢痕組織に関連するかまたはそれによって引き起こされる。リンパうっ滞性象皮病としても公知のステージ３において、罹患した肢は、かなり腫れた状態になる。皮膚は、典型的には、乾燥して剥がれ落ちやすくなり、過角化症および硬化が進行する。皮膚から体液が漏れることがあり、体液が充填された疱疹が形成されることもあり、経膚感染がよく起こる。
【００５８】
接着性の胎盤接着性細胞、またはこのような細胞を含む治療用組成物の、それを必要とするリンパ浮腫を有する個体への投与は、例えば、移植、埋め込み（例えば、細胞そのものまたはマトリックスと細胞との組合せの一部としての細胞の）、注射（例えば、疾患または状態を有する部位に直接、例えば、心筋梗塞を起こした個体の心臓における虚血性部位に直接）、点滴、カテーテルを介した送達、または細胞療法を提供するための当業界において公知の他のあらゆる手段によって達成することができる。
【００５９】
一実施形態において、治療用細胞組成物は、それを必要とする個体に提供され、例えば個体における１つまたは複数の部位に注射によって提供される。具体的な実施形態において、治療用細胞組成物は、心腔内注射によって、例えば心臓における虚血領域に提供される。他の具体的な実施形態において、細胞は、心臓の表面上に注射されるか、隣接する領域に注射されるか、またはより離れた領域にも注射される。好ましい実施形態において、細胞は、罹患したまたは損傷した領域にホーミングさせることができる。
【００６０】
胎盤接着性細胞は、細胞が治療上の有益と予想されるあらゆるときに、リンパ浮腫を有する個体に投与することができる。ある特定の実施形態において、例えば、本発明の胎盤接着性細胞または治療用組成物は、リンパ浮腫の診断から、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４時間以内に、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０日以内に、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ヶ月以内に、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２年以内に投与される。
【００６１】
また、リンパ浮腫の処置で使用するためのキットも本明細書で提供される。キットは、例えば薬学的に許容される担体と混合することによって薬学的に許容される形態で調製できる、胎盤接着性細胞を含む治療用細胞組成物、およびアプリケーターを使用説明書と共に提供する。理想的には、キットは、野外または枕元で、例えば医師の診察室で使用することができる。
【００６２】
具体的な実施形態において、本明細書で提供される処置方法は、胎盤接着性細胞、例えば胎盤接着性細胞を含む治療用組成物を、リンパ浮腫を有する患者に投与することを含み、治療用細胞組成物は、マトリックス−細胞複合体として投与される。ある特定の実施形態において、マトリックスは、少なくとも細胞を含む、足場、好ましくは生体吸収性足場である。
【００６３】
この目的を達成するために、リンパ管形成経路に沿って幹細胞または前駆細胞の分化を刺激する１つまたは複数の因子と接触させた、例えば、それの存在下でインキュベートまたは培養した胎盤接着性細胞の集団がさらに本明細書で提供される。このような因子としては、これらに限定されないが、増殖因子、ケモカイン、サイトカイン、細胞生成物、脱メチル化剤などの因子、およびリンパ管形成経路または系統に沿って例えば幹細胞の分化を刺激することがその時点でわかっているかまたは後で決定される他の因子が挙げられる。
【００６４】
ある特定の実施形態において、胎盤接着性細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、脱メチル化剤、ＢＭＰ（骨形成タンパク質）、ＦＧＦ（線維芽細胞増殖因子）、Ｗｎｔ因子タンパク質、ヘッジホッグタンパク質、および／または抗Ｗｎｔ因子の少なくとも１種を含む因子の存在下で細胞を培養することによってリンパ管形成経路または系統に沿って分化させてもよい。
【００６５】
胎盤接着性細胞およびこのような細胞の集団は、リンパ浮腫またはリンパ浮腫の症状もしくは後遺症を有する個体に、治療的または予防的に提供することができる。
【００６６】
ある特定の実施形態において、治療有効量の、胎盤接着性細胞、例えば胎盤接着性細胞を含む細胞の集団中の胎盤接着性細胞が、個体に投与される。具体的な実施形態において、集団は、約５０％の胎盤接着性細胞を含む。別の具体的な実施形態において、集団は、実質的に均一な胎盤接着性細胞の集団である。他の実施形態において、集団は、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の胎盤接着性細胞を含む。
【００６７】
胎盤接着性細胞は、細胞および別の治療剤、例えば、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インターロイキン１８（ＩＬ−８）、抗血栓剤（例えば、ヘパリン、ヘパリン誘導体、ウロキナーゼ、またはＰＰａｃｋ（デキストロフェニルアラニンプロリンアルギニンクロロメチルケトン）、抗トロンビン化合物、血小板受容体アンタゴニスト、抗トロンビン抗体、抗血小板受容体抗体、アスピリン、ジピリダモール、プロタミン、ヒルジン、プロスタグランジン阻害剤、および／または血小板阻害剤）、抗アポトーシス剤（例えば、エリスロポイエチン（Ｅｐｏ）、Ｅｐｏ誘導体もしくは類似体、またはそれらの塩、トロンボポイエチン（Ｔｐｏ）、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、またはカスパーゼ阻害剤）、抗炎症剤（例えば、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤、スタチン、ＩＬ−６阻害剤、ＩＬ−１阻害剤、ペミロラスト、トラニラスト、レミケード、シロリムス、および／または非ステロイド系抗炎症性化合物（例えば、アセチルサリチル酸、イブプロフェン、テポキサリン、トルメチン、またはスプロフェン））、免疫抑制剤または免疫調節剤（例えば、カルシニューリン阻害剤、例えばシクロスポリン、タクロリムス、ｍＴＯＲ阻害剤、例えばシロリムスまたはエベロリムス；増殖抑制剤、例えばアザチオプリンおよび／またはミコフェノール酸モフェチル；コルチコステロイド、例えば、プレドニゾロンまたはヒドロコルチゾン；モノクローナル抗ＩＬ−２Ｒα受容体抗体などの抗体、バシリキシマブ、ダクリズマブ（Ｄａｃｌｉｚｕｍａ）、ポリクローナル抗Ｔ細胞抗体、例えば抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）、抗リンパ球グロブリン（ＡＬＧ）、および／またはモノクローナル抗Ｔ細胞抗体ＯＫＴ３）、および／または抗酸化剤（例えば、プロブコール；ビタミンＡ、Ｃおよび／またはＥ、補酵素Ｑ−１０、グルタチオン、Ｌシステイン、Ｎ−アセチルシステイン、または抗酸化剤誘導体、前述のもののいずれかの類似体もしくは塩）を含む治療用組成物の形態で個体に投与されてもよい。ある特定の実施形態において、胎盤接着性細胞を含む治療用組成物は、１種または複数の追加の細胞型、例えば、成体の細胞（例えば、線維芽細胞または内胚葉細胞）、幹細胞および／または前駆細胞をさらに含む。このような治療剤および／または１種または複数の追加のタイプの細胞は、個々に、または２種またはそれより多くのこのような化合物または薬剤と組み合わせて、それらを必要とする個体に投与することができる。
【００６８】
ある特定の実施形態において、処置しようとする個体は、哺乳動物である。具体的な実施形態において、処置しようとする個体は、ヒトである。
【００６９】
５．３  単離された胎盤接着性細胞および単離された胎盤細胞集団
循環系の疾患または障害を有する個体の処置において有用な、単離された胎盤接着性細胞、例えば胎盤接着性細胞は、胎盤またはそれらの一部から入手可能な、組織培養基材に接着し、複能性細胞または幹細胞の特徴を有するが栄養膜ではない細胞である。ある特定の実施形態において、本明細書で開示された方法において有用な単離された胎盤接着性細胞は、非胎盤細胞型に分化する能力を有する。
【００７０】
本明細書で開示された方法において有用な単離された胎盤接着性細胞は、胎児または母体起源のいずれでもよい（すなわち、それぞれ胎児または母親のいずれかの遺伝子型を有していてもよい）。好ましくは、単離された胎盤接着性細胞および単離された胎盤接着性細胞集団は、胎児起源である。成句「胎児起源」または「非母体起源」は、本明細書で使用される場合、単離された胎盤接着性細胞または単離された胎盤接着性細胞集団が、胎児に付随する、すなわち胎児の遺伝子型を有する臍帯または胎盤構造から得られることを示す。本明細書で使用される場合、語句「母体起源」は、細胞または細胞の集団が、母親に関連する胎盤の構造、例えば、母体の遺伝子型を有する胎盤の構造から得られることを示す。単離された胎盤接着性細胞、例えば胎盤接着性細胞、または単離された胎盤接着性細胞を含む細胞の集団は、もっぱら胎児または母体起源の単離された胎盤接着性細胞を含んでいてもよいし、または胎児および母体起源の両方の単離された胎盤接着性細胞の混成の集団を含んでいてもよい。単離された胎盤接着性細胞、および単離された胎盤接着性細胞を含む細胞の集団は、以下で論じられる形態学的な、マーカーの、および培養物の特徴により同定および選択することができる。ある特定の実施形態において、胎盤接着性細胞のいずれか、例えば本明細書に記載される胎盤幹細胞または胎盤複能性細胞は、レシピエント、例えば循環系の疾患または障害を有する個体にとって自己である。ある特定の他の実施形態において、胎盤接着性細胞のいずれか、例えば本明細書に記載される胎盤幹細胞または胎盤複能性細胞は、レシピエント、例えば循環系の疾患または障害を有する個体にとって異種である。
【００７１】
５．３．１  物理的および形態学的な特徴
本明細書に記載される単離された胎盤接着性細胞は、初代培養または細胞培養で培養される場合、組織培養基材、例えば、組織培養容器表面（例えば、組織培養プラスチック）に接着するか、または細胞外マトリックスまたはリガンド、例えばラミニン、コラーゲン（例えば、天然または変性）、ゼラチン、フィブロネクチン、オルニチン、ビトロネクチン、および細胞外膜タンパク質（例えば、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（ＢＤ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌａｂｗａｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、Ｍａｓｓ．））などでコーティングされた組織培養表面に接着する。培養中の単離された胎盤接着性細胞は、全体的に線維芽細胞様であり、中央の細胞本体から伸長する多数の細胞質内プロセスにより星のような外観を呈する。しかしながら、単離された胎盤接着性細胞はこのようなプロセスを線維芽細胞より多く示すため、このような胎盤接着性細胞は、同じ条件下で培養された線維芽細胞と形態学的に区別することができる。形態学的には、単離された胎盤接着性細胞はさらに、造血幹細胞とも区別することができるが、これは、造血幹細胞は、培養中、より曲線的であるかまたは丸石のような形態を全体的に呈するためである。
【００７２】
ある特定の実施形態において、本明細書で開示された方法において有用な単離された胎盤接着性細胞は、増殖培地で培養される場合、胚様体様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ−ｌｉｋｅ  ｂｏｄｙ）を発生させる。胚様体様体は、増殖中の単離された胎盤接着性細胞の接着層の上面で成長できる隣接していない細胞の凝集塊である。用語「胚様体様」は、細胞の凝集塊が、胚様体、すなわち胚幹細胞の培養物から成長する細胞の凝集塊に似ているために使用される。単離された胎盤接着性細胞の増殖培養中に胚様体様体を発生させることができる増殖培地としては、例えば、ＤＭＥＭ−ＬＧ（例えば、Ｇｉｂｃｏから）；２％ウシ胎児血清（例えば、Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｓ．から）；１×インスリン−トランスフェリン−セレニウム（ＩＴＳ）；１×リノール酸−ウシ血清アルブミン（ＬＡ−ＢＳＡ）；１０−９Ｍデキサメタゾン（例えば、Ｓｉｇｍａから）；１０−４Ｍアスコルビン酸２−ホスフェート（例えば、Ｓｉｇｍａから）；上皮増殖因子１０ｎｇ／ｍＬ（例えば、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから）；および血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ−ＢＢ）１０ｎｇ／ｍＬ（例えば、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから）を含む培地が挙げられる。
【００７３】
５．３．２  細胞表面、分子および遺伝子マーカー
本明細書で開示された方法、例えば循環系の疾患または障害の処置方法において有用な、単離された胎盤接着性細胞、例えば単離された複能性胎盤接着性細胞または単離された胎盤幹細胞、およびこのような単離された胎盤接着性細胞の集団は、複能性細胞または幹細胞の特徴を有し、幹細胞を含む細胞または細胞の集団を同定および／または単離するのに使用できる複数のマーカーを発現する、組織培養プラスチック接着性のヒト胎盤接着性細胞である。ある特定の実施形態において、胎盤接着性細胞は、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、リンパ管形成性である。本明細書に記載される単離された胎盤接着性細胞および胎盤細胞集団（すなわち、２つまたはそれより多くの単離された胎盤接着性細胞）としては、胎盤またはそのあらゆる部分（例えば、柔毛膜、胎盤絨毛叢など）から直接得られた胎盤接着性細胞および胎盤細胞を含有する細胞集団が挙げられる。また単離された胎盤細胞集団としては、培養中の（すなわち、２以上の）単離された胎盤接着性細胞の集団、および容器、例えばバッグ中の集団も挙げられる。本明細書に記載される単離された胎盤接着性細胞は、骨髄由来間葉細胞、脂肪由来間葉系幹細胞、または臍帯血、胎盤血もしくは末梢血液から得られた間葉細胞ではない。本明細書に記載される方法および組成物において有用な胎盤細胞、例えば、複能性胎盤細胞および胎盤接着性細胞が本明細書に記載されており、例えば、特許文献２；特許文献３；および特許文献４；ならびに特許文献５に記載されており、これらの開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる。
【００７４】
ある特定の実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、単離された胎盤複能性細胞である。一実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、フローサイトメトリーによって検出可能な、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋およびＣＤ２００＋である。別の具体的な実施形態において、単離されたＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋およびＣＤ２００＋胎盤接着性細胞は、神経系の表現型を有する細胞、骨形成性の表現型を有する細胞、および／または軟骨形成性の表現型を有する細胞に分化する可能性を有する。別の具体的な実施形態において、単離されたＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋胎盤接着性細胞は、加えて、ＣＤ２００＋である。別の具体的な実施形態において、単離されたＣＤ２００＋胎盤接着性細胞は、加えて、フローサイトメトリーによって検出可能な、ＣＤ４５−またはＣＤ９０＋である。別の具体的な実施形態において、単離されたＣＤ２００＋胎盤接着性細胞は、加えて、フローサイトメトリーによって検出可能な、ＣＤ４５−およびＣＤ９０＋である。別の具体的な実施形態において、単離されたＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋およびＣＤ２００＋胎盤接着性細胞は、加えて、フローサイトメトリーによって検出可能な、ＣＤ４５−またはＣＤ９０＋である。別の具体的な実施形態において、単離されたＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋およびＣＤ２００＋胎盤接着性細胞は、加えて、フローサイトメトリーによって検出可能な、ＣＤ４５−およびＣＤ９０＋であり、すなわち細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋およびＣＤ２００＋、ＣＤ１０５＋およびＣＤ２００＋である。別の具体的な実施形態において、前記ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋およびＣＤ２００＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋細胞は、加えて、ＣＤ８０−およびＣＤ８６−である。
【００７５】
ある特定の実施形態において、前記胎盤接着性細胞は、フローサイトメトリーまたはＲＴ−ＰＣＲによって検出可能な、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋およびＣＤ２００＋であり、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＣＤ８０−、ＣＤ８６−、ＣＤ１３３−、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱ−、ＳＳＥＡ３−、ＳＳＥＡ４−、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ７３＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ＋、ＰＤＬ１＋、ＡＢＣ−ｐ＋、および／またはＯＣＴ−４＋の１つまたは複数である。他の実施形態において、上述されるＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋細胞のいずれかは、加えて、ＣＤ２９＋、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ５４＋、ＳＨ３＋またはＳＨ４＋の１つまたは複数である。別の具体的な実施形態において、細胞は、加えて、ＣＤ４４＋である。別の具体的な実施形態において、細胞は、加えて、ＣＤ４４＋である。上記の単離されたＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋およびＣＤ２００＋胎盤接着性細胞のいずれかの別の具体的な実施形態において、細胞は、加えて、ＣＤ１１７−、ＣＤ１３３−、ＫＤＲ−（ＶＥＧＦＲ２−）、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ＋、ＨＬＡ−ＤＰ、ＤＱ、ＤＲ−、もしくはプログラム細胞死−１リガンド（ＰＤＬ１）＋の１つまたは複数、またはそれらのあらゆる組合せである。
【００７６】
別の実施形態において、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋胎盤接着性細胞は、加えて、ＣＤ１３＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ６２Ｅ−、ＣＤ６２Ｌ−、ＣＤ６２Ｐ−、ＳＨ３＋（ＣＤ７３＋）、ＳＨ４＋（ＣＤ７３＋）、ＣＤ８０−、ＣＤ８６−、ＣＤ９０＋、ＳＨ２＋（ＣＤ１０５＋）、ＣＤ１０６／ＶＣＡＭ＋、ＣＤ１１７−、ＣＤ１４４／ＶＥ−カドヘリンｌｏｗ、ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４−、ＣＤ２００＋、ＣＤ１３３−、ＯＣＴ−４＋、ＳＳＥＡ３−、ＳＳＥＡ４−、ＡＢＣ−ｐ＋、ＫＤＲ−（ＶＥＧＦＲ２−）、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ＋、ＨＬＡ−ＤＰ、ＤＱ、ＤＲ−、ＨＬＡ−Ｇ−、もしくはプログラム細胞死−１リガンド（ＰＤＬ１）＋の１つまたは複数、またはそれらのあらゆる組合せである。他の実施形態において、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋細胞は、加えて、ＣＤ１３＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４／ＩＣＡＭ＋、ＣＤ６２Ｅ−、ＣＤ６２Ｌ−、ＣＤ６２Ｐ−、ＳＨ３＋（ＣＤ７３＋）、ＳＨ４＋（ＣＤ７３＋）、ＣＤ８０−、ＣＤ８６−、ＣＤ９０＋、ＳＨ２＋（ＣＤ１０５＋）、ＣＤ１０６／ＶＣＡＭ＋、ＣＤ１１７−、ＣＤ１４４／ＶＥ−カドヘリンｌｏｗ、ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４−、ＣＤ２００＋、ＣＤ１３３−、ＯＣＴ−４＋、ＳＳＥＡ４−、ＳＳＥＡ４−、ＡＢＣ−ｐ＋、ＫＤＲ−（ＶＥＧＦＲ２−）、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ＋、ＨＬＡ−ＤＰ、ＤＱ、ＤＲ−、ＨＬＡ−Ｇ−、およびプログラム細胞死−１リガンド（ＰＤＬ１）＋である。
【００７７】
別の具体的な実施形態において、本明細書に記載される胎盤接着性細胞のいずれかは、加えて、フローサイトメトリーによって検出可能な、ＡＢＣ−ｐ＋であり、またはＲＴ−ＰＣＲによって決定可能な、ＯＣＴ−４＋（ＰＯＵ５Ｆ１＋）であり、ＡＢＣ−ｐは、胎盤特異的なＡＢＣ輸送体タンパク質（乳がん耐性タンパク質（ＢＣＲＰ）およびミトキサントロン耐性タンパク質（ＭＸＲ）としても公知）であり、ＯＣＴ−４は、オクタマー−４タンパク質（ＰＯＵ５Ｆ１）である。別の具体的な実施形態において、本明細書に記載される胎盤接着性細胞のいずれかは、加えて、フローサイトメトリーによって決定可能な、ＳＳＥＡ３−またはＳＳＥＡ４−であり、ＳＳＥＡ３は、ステージ特異的胎児抗原３であり、ＳＳＥＡ４は、ステージ特異的胎児抗原４である。別の具体的な実施形態において、本明細書に記載される胎盤接着性細胞のいずれかは、加えて、ＳＳＥＡ３−およびＳＳＥＡ４−である。
【００７８】
別の具体的な実施形態において、本明細書に記載される胎盤接着性細胞のいずれかは、加えて、ＭＨＣ−Ｉ＋（例えば、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ＋）、ＭＨＣ−ＩＩ−（例えば、ＨＬＡ−ＤＰ，ＤＱ，ＤＲ−）またはＨＬＡ−Ｇ−の１つまたは複数である。別の具体的な実施形態において、本明細書に記載される胎盤接着性細胞のいずれかは、加えて、ＭＨＣ−Ｉ＋（例えば、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ＋）、ＭＨＣ−ＩＩ−（例えば、ＨＬＡ−ＤＰ，ＤＱ，ＤＲ−）およびＨＬＡ−Ｇ−の１つまたは複数である。
【００７９】
また、単離された胎盤接着性細胞の集団、または本明細書で開示された方法および組成物において有用な、単離された胎盤接着性細胞を含む、例えば単離された胎盤接着性細胞が濃縮されている、細胞集団、例えば胎盤接着性細胞集団も本明細書で提供される。好ましくは単離された胎盤接着性細胞を含む細胞集団であり、ここで細胞集団は、例えば、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％の単離されたＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋およびＣＤ３４−胎盤接着性細胞を含み、すなわち、前記集団中の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％の細胞が、単離されたＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋およびＣＤ３４−胎盤接着性細胞である。具体的な実施形態において、単離されたＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋胎盤接着性細胞は、加えて、ＣＤ２００＋である。別の具体的な実施形態において、単離されたＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤接着性細胞は、加えて、フローサイトメトリーによって検出可能な、ＣＤ９０＋またはＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態において、単離されたＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤接着性細胞は、加えて、フローサイトメトリーによって検出可能な、ＣＤ９０＋およびＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態において、上述される単離されたＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋胎盤接着性細胞のいずれかは、加えて、ＣＤ２９＋、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ５４＋、ＳＨ３＋またはＳＨ４＋の１つまたは複数である。別の具体的な実施形態において、単離されたＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋胎盤接着性細胞、または単離されたＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤接着性細胞は、加えて、ＣＤ４４＋である。上記の単離されたＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋胎盤接着性細胞を含む細胞集団のいずれかの具体的な実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、加えて、ＣＤ１３＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ６２Ｅ−、ＣＤ６２Ｌ−、ＣＤ６２Ｐ−、ＳＨ３＋（ＣＤ７３＋）、ＳＨ４＋（ＣＤ７３＋）、ＣＤ８０−、ＣＤ８６−、ＣＤ９０＋、ＳＨ２＋（ＣＤ１０５＋）、ＣＤ１０６／ＶＣＡＭ＋、ＣＤ１１７−、ＣＤ１４４／ＶＥ−カドヘリンｌｏｗ、ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４−、ＣＤ２００＋、ＣＤ１３３−、ＯＣＴ−４＋、ＳＳＥＡ３−、ＳＳＥＡ４−、ＡＢＣ−ｐ＋、ＫＤＲ−（ＶＥＧＦＲ２−）、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ＋、ＨＬＡ−ＤＰ，ＤＱ，ＤＲ−、ＨＬＡ−Ｇ−、またはプログラム細胞死−１リガンド（ＰＤＬ１）＋、またはそれらの１つまたは複数のあらゆる組合せである。別の具体的な実施形態において、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋細胞は、加えて、ＣＤ１３＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４／ＩＣＡＭ＋、ＣＤ６２Ｅ−、ＣＤ６２Ｌ−、ＣＤ６２Ｐ−、ＳＨ３＋（ＣＤ７３＋）、ＳＨ４＋（ＣＤ７３＋）、ＣＤ８０−、ＣＤ８６−、ＣＤ９０＋、ＳＨ２＋（ＣＤ１０５＋）、ＣＤ１０６／ＶＣＡＭ＋、ＣＤ１１７−、ＣＤ１４４／ＶＥ−カドヘリンｌｏｗ、ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４−、ＣＤ２００＋、ＣＤ１３３−、ＯＣＴ−４＋、ＳＳＥＡ３−、ＳＳＥＡ４−、ＡＢＣ−ｐ＋、ＫＤＲ−（ＶＥＧＦＲ２−）、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ＋、ＨＬＡ−ＤＰ，ＤＱ，ＤＲ−、ＨＬＡ−Ｇ−、およびプログラム細胞死−１リガンド（ＰＤＬ１）＋である。
【００８０】
ある特定の実施形態において、本明細書に記載される方法および組成物において有用な単離された胎盤接着性細胞は、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０＋、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、ＳＨ４＋、ＳＳＥＡ３−、ＳＳＥＡ４−、ＯＣＴ−４＋、およびＡＢＣ−ｐ＋の１つもしくは複数または全てであり、前記単離された胎盤接着性細胞は、胎盤組織を物理的におよび／または酵素により破壊することにより得られる。具体的な実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、ＯＣＴ−４＋およびＡＢＣ−ｐ＋である。別の具体的な実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、ＯＣＴ−４＋およびＣＤ３４−であり、前記単離された胎盤接着性細胞は、以下の特徴：ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０＋、ＳＨ３＋、ＳＨ４＋、ＳＳＥＡ４−、およびＳＳＥＡ４−の少なくとも１つを有する。別の具体的な実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、ＯＣＴ−４＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０＋、ＳＨ３＋、ＳＨ４＋、ＳＳＥＡ３−、およびＳＳＥＡ４−である。別の実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、ＯＣＴ−４＋、ＣＤ３４−、ＳＳＥＡ４−、およびＳＳＥＡ４−である。別の具体的な実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、ＯＣＴ−４＋およびＣＤ３４−であり、ＳＨ２＋またはＳＨ３＋のいずれかである。別の具体的な実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、ＯＣＴ−４＋、ＣＤ３４−、ＳＨ２＋、およびＳＨ３＋である。別の具体的な実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、ＯＣＴ−４＋、ＣＤ３４−、ＳＳＥＡ３−、およびＳＳＥＡ４−であり、ＳＨ２＋またはＳＨ３＋のいずれかである。別の具体的な実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、ＯＣＴ−４＋およびＣＤ３４−である、ＳＨ２＋またはＳＨ３＋のいずれかであり、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０＋、ＳＳＥＡ３−、またはＳＳＥＡ４−の少なくとも１つである。別の具体的な実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、ＯＣＴ−４＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０＋、ＳＳＥＡ３−、およびＳＳＥＡ４−であり、ＳＨ２＋またはＳＨ３＋のいずれかである。
【００８１】
別の実施形態において、本明細書で開示された方法および組成物において有用な単離された胎盤接着性細胞は、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、ＳＨ４＋およびＯＣＴ−４＋である。別の具体的な実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ４５−、ＳＳＥＡ４−、またはＳＳＥＡ４−である。別の実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、ＳＨ４＋、ＳＳＥＡ４−およびＳＳＥＡ４−である。別の具体的な実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、ＳＨ４＋、ＳＳＥＡ３−およびＳＳＥＡ４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０＋、ＯＣＴ−４＋、ＣＤ３４−またはＣＤ４５−である。
【００８２】
別の実施形態において、本明細書で開示された方法および組成物において有用な単離された胎盤接着性細胞は、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３４−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０＋、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、およびＳＨ４＋であり、前記単離された胎盤接着性細胞は、加えて、ＯＣＴ−４＋、ＳＳＥＡ４−またはＳＳＥＡ４−の１つまたは複数である。
【００８３】
ある特定の実施形態において、本明細書で開示された方法および組成物において有用な単離された胎盤接着性細胞は、ＣＤ２００＋またはＨＬＡ−Ｇ−である。具体的な実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、ＣＤ２００＋およびＨＬＡ−Ｇ−である。別の具体的な実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、加えて、ＣＤ７３＋およびＣＤ１０５＋である。別の具体的な実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、加えて、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−またはＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、加えて、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−およびＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態において、前記幹細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＣＤ７３＋およびＣＤ１０５＋である。別の具体的な実施形態において、前記単離されたＣＤ２００＋またはＨＬＡ−Ｇ−胎盤接着性細胞は、胚様体様体の形成を可能にする条件下での、単離された胎盤接着性細胞を含む胎盤接着性細胞集団における胚様体様体の形成を容易にする。別の具体的な実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、幹細胞または複能性細胞ではない胎盤接着性細胞から単離される。別の具体的な実施形態において、前記単離された胎盤接着性細胞は、これらのマーカーを提示しない胎盤接着性細胞から単離される。
【００８４】
別の実施形態において、本明細書に記載される方法および組成物において有用な細胞集団は、ＣＤ２００＋、ＨＬＡ−Ｇ−胎盤接着性細胞を含む細胞の集団、例えば、ＣＤ２００＋、ＨＬＡ−Ｇ−胎盤接着性細胞を豊富に含む細胞の集団である。具体的な実施形態において、前記集団は、胎盤接着性細胞集団である。様々な実施形態において、前記細胞集団中の細胞の、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％は、単離されたＣＤ２００＋、ＨＬＡ−Ｇ−胎盤接着性細胞である。好ましくは、前記細胞集団中の細胞の少なくとも約７０％は、単離されたＣＤ２００＋、ＨＬＡ−Ｇ−胎盤接着性細胞である。より好ましくは、前記細胞の少なくとも約９０％、９５％、または９９％は、単離されたＣＤ２００＋、ＨＬＡ−Ｇ−胎盤接着性細胞である。細胞集団の具体的な実施形態において、前記単離されたＣＤ２００＋、ＨＬＡ−Ｇ−胎盤接着性細胞はまた、ＣＤ７３＋およびＣＤ１０５＋でもある。別の具体的な実施形態において、前記単離されたＣＤ２００＋、ＨＬＡ−Ｇ−胎盤接着性細胞はまた、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−またはＣＤ４５−でもある。別の具体的な実施形態において、前記単離されたＣＤ２００＋、ＨＬＡ−Ｇ−胎盤接着性細胞はまた、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＣＤ７３＋およびＣＤ１０５＋でもある。別の実施形態において、前記細胞集団は、胚様体様体の形成を可能にする条件下で培養される場合、１つまたは複数の胚様体様体を産生する。別の具体的な実施形態において、前記細胞集団は、幹細胞ではない胎盤接着性細胞から単離される。別の具体的な実施形態において、前記単離されたＣＤ２００＋、ＨＬＡ−Ｇ−胎盤接着性細胞は、これらのマーカーを提示しない胎盤接着性細胞から単離される。
【００８５】
別の実施形態において、本明細書に記載される方法および組成物において有用な単離された胎盤接着性細胞は、ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、およびＣＤ２００＋である。別の具体的な実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、ＨＬＡ−Ｇ−である。別の具体的な実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−またはＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−およびＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、およびＨＬＡ−Ｇ−である。別の具体的な実施形態において、単離されたＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、およびＣＤ２００＋胎盤接着性細胞は、胚様体様体の形成を可能にする条件下で集団が培養される場合、単離された胎盤接着性細胞を含む胎盤接着性細胞集団における１つまたは複数の胚様体様体の形成を容易にする。別の具体的な実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、単離された胎盤接着性細胞ではない胎盤接着性細胞から単離される。別の具体的な実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、これらのマーカーを提示しない胎盤接着性細胞から単離される。
【００８６】
別の実施形態において、本明細書に記載される方法および組成物において有用な細胞集団は、単離されたＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤接着性細胞を含む、例えばそれらが濃縮されている細胞集団である。様々な実施形態において、前記細胞集団中の細胞の、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％は、単離されたＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤接着性細胞である。別の実施形態において、前記細胞集団中の少なくとも約７０％の前記細胞は、単離されたＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤接着性細胞である。別の実施形態において、前記細胞集団中の細胞の、少なくとも約９０％、９５％または９９％は、単離されたＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤接着性細胞である。前記集団の具体的な実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、ＨＬＡ−Ｇ−である。別の具体的な実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、加えて、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−またはＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、加えて、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−およびＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、加えて、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、およびＨＬＡ−Ｇ−である。別の具体的な実施形態において、前記細胞集団は、胚様体様体の形成を可能にする条件下で培養される場合、１つまたは複数の胚様体様体を産生する。別の具体的な実施形態において、前記胎盤接着性細胞集団は、幹細胞ではない胎盤接着性細胞から単離される。別の具体的な実施形態において、前記胎盤接着性細胞集団は、これらの特徴を提示しない胎盤接着性細胞から単離される。
【００８７】
ある特定の他の実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０＋、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、ＳＨ４＋、ＳＳＥＡ３−、ＳＳＥＡ４−、ＯＣＴ−４＋、ＨＬＡ−Ｇ−またはＡＢＣ−ｐ＋の１つまたは複数である。具体的な実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０＋、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、ＳＨ４＋、ＳＳＥＡ３−、ＳＳＥＡ４−、およびＯＣＴ−４＋である。別の具体的な実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、およびＳＨ４＋である。別の具体的な実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、ＳＨ４＋およびＯＣＴ−４＋である。別の具体的な実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０＋、ＨＬＡ−Ｇ−、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、ＳＨ４＋である。別の具体的な実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、ＯＣＴ−４＋およびＡＢＣ−ｐ＋である。別の具体的な実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、ＳＨ４＋およびＯＣＴ−４＋である。別の実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、ＯＣＴ−４＋、ＣＤ３４−、ＳＳＥＡ３−、およびＳＳＥＡ４−である。具体的な実施形態において、前記単離されたＯＣＴ−４＋、ＣＤ３４−、ＳＳＥＡ３−、およびＳＳＥＡ４−胎盤接着性細胞は、加えて、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３４−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０＋、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、およびＳＨ４＋である。別の実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、ＯＣＴ−４＋およびＣＤ３４−であり、ＳＨ３＋またはＳＨ４＋のいずれかである。別の実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、ＣＤ３４−であり、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０＋、またはＯＣＴ−４＋のいずれかである。
【００８８】
別の実施形態において、本明細書に記載される方法および組成物において有用な単離された胎盤接着性細胞は、ＣＤ２００＋およびＯＣＴ−４＋である。具体的な実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、ＣＤ７３＋およびＣＤ１０５＋である。別の具体的な実施形態において、前記単離された胎盤接着性細胞は、ＨＬＡ−Ｇ−である。別の具体的な実施形態において、前記単離されたＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋胎盤接着性細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−またはＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態において、前記単離されたＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋胎盤接着性細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−およびＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態において、前記単離されたＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋胎盤接着性細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋およびＨＬＡ−Ｇ−である。別の具体的な実施形態において、単離されたＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋胎盤接着性細胞は、胚様体様体の形成を可能にする条件下で集団が培養される場合、単離された細胞を含む胎盤接着性細胞集団によって、１つまたは複数の胚様体様体の産生を容易にする。別の具体的な実施形態において、前記単離されたＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋胎盤接着性細胞は、幹細胞ではない胎盤接着性細胞から単離される。別の具体的な実施形態において、前記単離されたＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋胎盤接着性細胞は、これらの特徴を提示しない胎盤接着性細胞から単離される。
【００８９】
別の実施形態において、本明細書に記載される方法および組成物において有用な細胞集団は、ＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋胎盤接着性細胞を含む、例えばそれらが濃縮されている細胞集団である。様々な実施形態において、前記細胞集団中の細胞の、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％は、単離されたＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋胎盤接着性細胞である。別の実施形態において、前記細胞の少なくとも約７０％は、前記単離されたＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋胎盤接着性細胞である。別の実施形態において、前記細胞集団中の細胞の、少なくとも約８０％、９０％、９５％、または９９％は、前記単離されたＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋胎盤接着性細胞である。単離された集団の具体的な実施形態において、前記単離されたＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋胎盤接着性細胞は、加えて、ＣＤ７３＋およびＣＤ１０５＋である。別の具体的な実施形態において、前記単離されたＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋胎盤接着性細胞は、加えて、ＨＬＡ−Ｇ−である。別の具体的な実施形態において、前記単離されたＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋胎盤接着性細胞は、加えて、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−およびＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態において、前記単離されたＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋胎盤接着性細胞は、加えて、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋およびＨＬＡ−Ｇ−である。別の具体的な実施形態において、細胞集団は、胚様体様体の形成を可能にする条件下で培養される場合、１つまたは複数の胚様体様体を産生する。別の具体的な実施形態において、前記細胞集団は、単離されたＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋胎盤接着性細胞ではない胎盤接着性細胞から単離される。別の具体的な実施形態において、前記細胞集団は、これらのマーカーを提示しない胎盤接着性細胞から単離される。
【００９０】
別の実施形態において、本明細書に記載される方法および組成物において有用な単離された胎盤接着性細胞は、ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋およびＨＬＡ−Ｇ−である。別の具体的な実施形態において、単離されたＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋およびＨＬＡ−Ｇ−胎盤接着性細胞は、加えて、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−またはＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態において、単離されたＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ｇ−胎盤接着性細胞は、加えて、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−およびＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態において、単離されたＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ｇ−胎盤接着性細胞は、加えて、ＯＣＴ−４＋である。別の具体的な実施形態において、単離されたＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ｇ−胎盤接着性細胞は、加えて、ＣＤ２００＋である。別の具体的な実施形態において、単離されたＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ｇ−胎盤接着性細胞は、加えて、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＯＣＴ−４＋およびＣＤ２００＋である。別の具体的な実施形態において、単離されたＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ｇ−胎盤接着性細胞は、胚様体様体の形成を可能にする条件下で集団が培養される場合、前記細胞を含む胎盤接着性細胞集団における胚様体様体の形成を容易にする。別の具体的な実施形態において、前記単離されたＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ｇ−胎盤接着性細胞は、単離されたＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ｇ−胎盤接着性細胞ではない胎盤接着性細胞から単離される。別の具体的な実施形態において、前記単離されたＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ｇ−胎盤接着性細胞は、これらのマーカーを提示しない胎盤接着性細胞から単離される。
【００９１】
別の実施形態において、本明細書に記載される方法および組成物において有用な細胞集団は、単離されたＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋およびＨＬＡ−Ｇ−胎盤接着性細胞を含む、例えばそれらが濃縮されている細胞集団である。様々な実施形態において、前記細胞集団中の細胞の、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％は、単離されたＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ｇ−胎盤接着性細胞である。別の実施形態において、前記細胞集団中の細胞の少なくとも約７０％は、単離されたＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ｇ−胎盤接着性細胞である。別の実施形態において、前記細胞集団中の細胞の、少なくとも約９０％、９５％または９９％は、単離されたＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ｇ−胎盤接着性細胞である。上記の集団の具体的な実施形態において、前記単離されたＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ｇ−胎盤接着性細胞は、加えて、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−またはＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態において、前記単離されたＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ｇ−胎盤接着性細胞は、加えて、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−およびＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態において、前記単離されたＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ｇ−胎盤接着性細胞は、加えて、ＯＣＴ−４＋である。別の具体的な実施形態において、前記単離されたＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ｇ−胎盤接着性細胞は、加えて、ＣＤ２００＋である。別の具体的な実施形態において、前記単離されたＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ｇ−胎盤接着性細胞は、加えて、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＯＣＴ−４＋およびＣＤ２００＋である。別の具体的な実施形態において、前記細胞集団は、ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ｇ−胎盤接着性細胞ではない胎盤接着性細胞から単離される。別の具体的な実施形態において、前記細胞集団は、これらのマーカーを提示しない胎盤接着性細胞から単離される。
【００９２】
別の実施形態において、本明細書に記載される方法および組成物において有用な単離された胎盤接着性細胞は、ＣＤ７３＋およびＣＤ１０５＋であり、胚様体様体の形成を可能にする条件下で集団が培養される場合、前記ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋細胞を含む単離された胎盤接着性細胞集団における１つまたは複数の胚様体様体の形成を容易にする。別の具体的な実施形態において、前記単離されたＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋胎盤接着性細胞は、加えて、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−またはＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態において、前記単離されたＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋胎盤接着性細胞は、加えて、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−およびＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態において、前記単離されたＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋胎盤接着性細胞は、加えて、ＯＣＴ−４＋である。別の具体的な実施形態において、前記単離されたＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋胎盤接着性細胞は、加えて、ＯＣＴ−４＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−およびＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態において、前記単離されたＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋胎盤接着性細胞は、前記細胞ではない胎盤接着性細胞から単離される。別の具体的な実施形態において、前記単離されたＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋胎盤接着性細胞は、これらの特徴を提示しない胎盤接着性細胞から単離される。
【００９３】
別の実施形態において、本明細書に記載される方法および組成物において有用な細胞集団は、ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋である単離された胎盤接着性細胞を含む、例えばそれらが濃縮されている細胞集団であり、胚様体様体の形成を可能にする条件下で集団が培養される場合、前記細胞を含む単離された胎盤接着性細胞集団における１つまたは複数の胚様体様体の形成を容易にする。様々な実施形態において、前記細胞集団中の細胞の、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％は、前記単離されたＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋胎盤接着性細胞である。別の実施形態において、前記細胞集団中の細胞の少なくとも約７０％は、前記単離されたＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋胎盤接着性細胞である。別の実施形態において、前記細胞集団中の細胞の、少なくとも約９０％、９５％または９９％は、前記単離されたＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋胎盤接着性細胞である。上記の集団の具体的な実施形態において、前記単離されたＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋胎盤接着性細胞は、加えて、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−またはＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態において、前記単離されたＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋胎盤接着性細胞は、加えて、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−およびＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態において、前記単離されたＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋胎盤接着性細胞は、加えて、ＯＣＴ−４＋である。別の具体的な実施形態において、前記単離されたＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋胎盤接着性細胞は、加えて、ＣＤ２００＋である。別の具体的な実施形態において、前記単離されたＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋胎盤接着性細胞は、加えて、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＯＣＴ−４＋およびＣＤ２００＋である。別の具体的な実施形態において、前記細胞集団は、前記単離されたＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋胎盤接着性細胞ではない胎盤接着性細胞から単離される。別の具体的な実施形態において、前記細胞集団は、これらのマーカーを提示しない胎盤接着性細胞から単離される。
【００９４】
別の実施形態において、本明細書に記載される方法および組成物において有用な単離された胎盤接着性細胞は、ＯＣＴ−４＋であり、胚様体様体の形成を可能にする条件下で培養される場合、前記細胞を含む単離された胎盤接着性細胞集団において１つまたは複数の胚様体様体の形成を容易にする。具体的な実施形態において、前記単離されたＯＣＴ−４＋胎盤接着性細胞は、加えて、ＣＤ７３＋およびＣＤ１０５＋である。別の具体的な実施形態において、前記単離されたＯＣＴ−４＋胎盤接着性細胞は、加えて、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、またはＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態において、前記単離されたＯＣＴ−４＋胎盤接着性細胞は、加えて、ＣＤ２００＋である。別の具体的な実施形態において、前記単離されたＯＣＴ−４＋胎盤接着性細胞は、加えて、ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、およびＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態において、前記単離されたＯＣＴ−４＋胎盤接着性細胞は、ＯＣＴ−４＋胎盤接着性細胞ではない胎盤接着性細胞から単離される。別の具体的な実施形態において、前記単離されたＯＣＴ−４＋胎盤接着性細胞は、これらの特徴を提示しない胎盤接着性細胞から単離される。
【００９５】
別の実施形態において、本明細書に記載される方法および組成物において有用な細胞集団は、ＯＣＴ−４＋である単離された胎盤接着性細胞を含む、例えばそれらが濃縮されている細胞集団であり、胚様体様体の形成を可能にする条件下で集団が培養される場合、前記細胞を含む単離された胎盤接着性細胞集団における１つまたは複数の胚様体様体の形成を容易にする。様々な実施形態において、前記細胞集団中の細胞の、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％は、前記単離されたＯＣＴ−４＋胎盤接着性細胞である。別の実施形態において、前記細胞集団中の細胞の少なくとも約７０％は、前記単離されたＯＣＴ−４＋胎盤接着性細胞である。別の実施形態において、前記細胞集団中の細胞の、少なくとも約８０％、９０％、９５％または９９％は、前記単離されたＯＣＴ−４＋胎盤接着性細胞である。上記の集団の具体的な実施形態において、前記単離されたＯＣＴ−４＋胎盤接着性細胞は、加えて、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−またはＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態において、前記単離されたＯＣＴ−４＋胎盤接着性細胞は、加えて、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−およびＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態において、前記単離されたＯＣＴ−４＋胎盤接着性細胞は、加えて、ＣＤ７３＋およびＣＤ１０５＋である。別の具体的な実施形態において、前記単離されたＯＣＴ−４＋胎盤接着性細胞は、加えて、ＣＤ２００＋である。別の具体的な実施形態において、前記単離されたＯＣＴ−４＋胎盤接着性細胞は、加えて、ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、およびＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態において、前記細胞集団は、前記細胞ではない胎盤接着性細胞から単離される。別の具体的な実施形態において、前記細胞集団は、これらのマーカーを提示しない胎盤接着性細胞から単離される。
【００９６】
別の実施形態において、本明細書に記載される方法および組成物において有用な単離された胎盤接着性細胞は、単離されたＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ＋、ＣＤ４５−、ＣＤ１３３−およびＣＤ３４−胎盤接着性細胞である。別の実施形態において、本明細書に記載される方法および組成物において有用な細胞集団は、単離された胎盤接着性細胞を含む細胞集団であり、前記単離された細胞の集団中の細胞の少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％は、単離されたＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ＋、ＣＤ４５−、ＣＤ１３３−およびＣＤ３４−胎盤接着性細胞である。具体的な実施形態において、前記単離された胎盤接着性細胞または単離された胎盤細胞の集団は、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ＋、ＣＤ４５−、ＣＤ１３３−およびＣＤ３４−胎盤接着性細胞ではない胎盤接着性細胞から単離される。別の具体的な実施形態において、前記単離された胎盤接着性細胞は、非母体起源である。別の具体的な実施形態において、前記単離された胎盤接着性細胞集団は、母体の要素を実質的に含まず、例えば、前記単離された胎盤接着性細胞集団中の前記細胞の、少なくとも約４０％、４５％、５−０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、９０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％が非母体起源である。
【００９７】
別の実施形態において、本明細書に記載される方法および組成物において有用な単離された胎盤接着性細胞は、単離されたＣＤ１０＋、ＣＤ１３＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ４５−、ＣＤ１１７およびＣＤ１３３−胎盤接着性細胞である。別の実施形態において、本明細書に記載される方法および組成物において有用な細胞集団は、単離された胎盤接着性細胞を含む細胞集団であり、前記細胞集団中の細胞の、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％は、単離されたＣＤ１０＋、ＣＤ１３＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ４５−、ＣＤ１１７−およびＣＤ１３３−胎盤接着性細胞である。具体的な実施形態において、前記単離された胎盤接着性細胞または単離された胎盤接着性細胞の集団は、前記単離された胎盤接着性細胞ではない胎盤接着性細胞から単離される。別の具体的な実施形態において、前記単離されたＣＤ１０＋、ＣＤ１３＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ４５−、ＣＤ１１７−およびＣＤ１３３−胎盤接着性細胞は、非母体起源であり、すなわち胎児の遺伝子型を有する。別の具体的な実施形態において、前記単離された胎盤接着性細胞集団の前記細胞の、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、９０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％は、非母体起源である。別の具体的な実施形態において、前記単離された胎盤接着性細胞または単離された胎盤接着性細胞の集団は、これらの特徴を提示しない胎盤接着性細胞から単離される。
【００９８】
別の実施形態において、本明細書に記載される方法および組成物において有用な単離された胎盤接着性細胞は、単離されたＣＤ１０−、ＣＤ３３−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、およびＣＤ１１７−胎盤接着性細胞である。別の実施形態において、本明細書に記載される方法および組成物において有用な細胞集団は、単離された胎盤接着性細胞を含む、例えばそれが濃縮されている細胞集団であり、前記細胞集団中の細胞の、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％は、単離されたＣＤ１０−、ＣＤ３３−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、およびＣＤ１１７−胎盤接着性細胞である。具体的な実施形態において、前記単離された胎盤接着性細胞または単離された胎盤接着性細胞の集団は、前記細胞ではない胎盤接着性細胞から単離される。別の具体的な実施形態において、前記単離された胎盤接着性細胞は、非母体起源である。別の具体的な実施形態において、前記細胞集団中の前記細胞の、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、９０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％は、非母体起源である。別の具体的な実施形態において、前記単離された胎盤細胞または単離された胎盤細胞の集団は、これらのマーカーを提示しない胎盤接着性細胞から単離される。
【００９９】
別の実施形態において、本明細書に記載される方法および組成物において有用な単離された胎盤接着性細胞は、単離されたＣＤ１０−、ＣＤ１３−、ＣＤ３３−、ＣＤ４５−、およびＣＤ１１７−胎盤接着性細胞である。別の実施形態において、本明細書に記載される方法および組成物において有用な細胞集団は、単離されたＣＤ１０−、ＣＤ１３−、ＣＤ３３−、ＣＤ４５−、およびＣＤ１１７−胎盤接着性細胞を含む、例えばそれらが濃縮されている細胞集団であり、前記集団中の細胞の、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％は、ＣＤ１０−、ＣＤ１３−、ＣＤ３３−、ＣＤ４５−、およびＣＤ１１７−胎盤接着性細胞である。具体的な実施形態において、前記単離された胎盤接着性細胞または単離された胎盤接着性細胞の集団は、前記細胞ではない胎盤接着性細胞から単離される。別の具体的な実施形態において、前記単離された胎盤接着性細胞は、非母体起源である。別の具体的な実施形態において、前記細胞集団中の前記細胞の、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、９０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％は、非母体起源である。別の具体的な実施形態において、前記単離された胎盤接着性細胞または単離された胎盤接着性細胞の集団は、これらの特徴を提示しない胎盤接着性細胞から単離される。
【０１００】
別の実施形態において、本明細書に記載される方法および組成物において有用な単離された胎盤接着性細胞は、ＨＬＡ  Ａ、Ｂ、Ｃ＋、ＣＤ４５−、ＣＤ３４−、およびＣＤ１３３−であり、加えて、ＣＤ１０＋、ＣＤ１３＋、ＣＤ３８＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋および／またはＨＬＡ−Ｇ−であり、および／またはＣＤ１１７陰性である。別の実施形態において、本明細書に記載される方法において有用な細胞集団は、単離された胎盤接着性細胞を含む細胞集団であり、前記集団中の細胞の、少なくとも約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または約９９％は、ＨＬＡ  Ａ、Ｂ、Ｃ−、ＣＤ４５−、ＣＤ３４−、ＣＤ１３３−であり、加えて、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ２００陽性であり、および／またはＣＤ１１７および／またはＨＬＡ−Ｇ陰性である単離された胎盤接着性細胞である。具体的な実施形態において、前記単離された胎盤接着性細胞または単離された胎盤接着性細胞の集団は、前記細胞ではない胎盤接着性細胞から単離される。別の具体的な実施形態において、前記単離された胎盤接着性細胞は、非母体起源である。別の具体的な実施形態において、前記細胞集団中の前記細胞の、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、９０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％は、非母体起源である。別の具体的な実施形態において、前記単離された胎盤接着性細胞または単離された胎盤接着性細胞の集団は、これらのマーカーを提示しない胎盤接着性細胞から単離される。
【０１０１】
別の実施形態において、本明細書に記載される方法および組成物において有用な単離された胎盤接着性細胞は、抗体結合によって決定可能な、ＣＤ２００＋およびＣＤ１０＋であり、抗体結合およびＲＴ−ＰＣＲの両方によって決定可能な、ＣＤ１１７−である、単離された胎盤接着性細胞である。別の実施形態において、本明細書に記載される方法および組成物において有用な単離された胎盤接着性細胞は、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９−、ＣＤ５４＋、ＣＤ２００＋、ＨＬＡ−Ｇ−、ＭＨＣクラスＩ＋およびβ−２−ミクログロブリン＋である、単離された胎盤接着性細胞、例えば胎盤幹細胞または複能性胎盤細胞である。別の実施形態において、本明細書に記載される方法および組成物において有用な単離された胎盤接着性細胞は、少なくとも１つの細胞マーカーの発現が間充織幹細胞（例えば、骨髄由来間充織幹細胞）の場合より少なくとも２倍高い胎盤接着性細胞である。別の具体的な実施形態において、前記単離された胎盤接着性細胞は、非母体起源である。別の具体的な実施形態において、前記細胞集団中の前記細胞の、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、９０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％は、非母体起源である。
【０１０２】
別の実施形態において、本明細書に記載される方法および組成物において有用な単離された胎盤接着性細胞は、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４／ＩＣＡＭ＋、ＣＤ６２Ｅ−、ＣＤ６２Ｌ−、ＣＤ６２Ｐ−、ＣＤ８０−、ＣＤ８６−、ＣＤ１０３−、ＣＤ１０４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ１０６／ＶＣＡＭ＋、ＣＤ１４４／ＶＥ−カドヘリンｌｏｗ、ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４−、β２−ミクログロブリンｌｏｗ、ＭＨＣ−ＩＶ、ＨＬＡ−Ｇｌｏｗ、および／またはＰＤＬ１ｌｏｗの１つまたは複数である、単離された胎盤接着性細胞、例えば胎盤幹細胞または胎盤複能性細胞である。具体的な実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、少なくともＣＤ２９＋およびＣＤ５４＋である。別の具体的な実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、少なくともＣＤ４４＋およびＣＤ１０６＋である。別の具体的な実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、少なくともＣＤ２９＋である。
【０１０３】
別の実施形態において、本明細書に記載される方法および組成物において有用な細胞集団は、単離された胎盤接着性細胞を含み、前記細胞集団中の細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％は、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４／ＩＣＡＭ＋、ＣＤ６２−Ｅ−、ＣＤ６２−Ｌ−、ＣＤ６２−Ｐ−、ＣＤ８０−、ＣＤ８６−、ＣＤ１０３−、ＣＤ１０４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ１０６／ＶＣＡＭ＋、ＣＤ１４４／ＶＥ−カドヘリンｄｉｍ、ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４−、β２−ミクログロブリンｄｉｍ、ＨＬＡ−Ｉｄｉｍ、ＨＬＡ−ＩＩ−、ＨＬＡ−Ｇｄｉｍ、および／またはＰＤＬ１ｄｉｍの１つまたは複数である単離された胎盤接着性細胞である。別の具体的な実施形態において、前記細胞集団中の細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％は、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４／ＩＣＡＭ＋、ＣＤ６２−Ｅ−、ＣＤ６２−Ｌ−、ＣＤ６２−Ｐ−、ＣＤ８０−、ＣＤ８６−、ＣＤ１０３−、ＣＤ１０４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ１０６／ＶＣＡＭ＋、ＣＤ１４４／ＶＥ−カドヘリンｄｉｍ、ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４−、β２−ミクログロブリンｄｉｍ、ＨＬＡ−Ｉｄｉｍ、ＭＨＣ−ＩＩ−、ＨＬＡ−Ｇｄｉｍ、およびＰＤＬ１ｄｉｍである。
【０１０４】
別の実施形態において、本明細書に記載される方法および組成物において有用な単離された胎盤接着性細胞は、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０＋、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、ＳＨ４＋、ＳＳＥＡ３−、ＳＳＥＡ４−、ＯＣＴ−４＋、およびＡＢＣ−ｐ＋の１つもしくは複数または全てである単離された胎盤接着性細胞であり、ＡＢＣ−ｐは、胎盤特異的なＡＢＣ輸送タンパク質（また、乳がん耐性タンパク質（ＢＣＲＰ）およびミトキサントロン耐性タンパク質（ＭＸＲ）としても公知である）であり、前記単離された胎盤接着性細胞は、臍帯血を引き出し、潅流して、残留した血液を除去した、哺乳類、例えばヒトの胎盤を潅流することにより得られる。
【０１０５】
上記の特徴のいずれかの別の具体的な実施形態において、細胞マーカー（例えば、表面抗原分類または免疫原性マーカー）の発現は、フローサイトメトリーによって決定可能であり、別の具体的な実施形態において、上記マーカーの発現は、ＲＴ−ＰＣＲによって決定可能である。
【０１０６】
遺伝子プロファイリングから、単離された胎盤接着性細胞、および単離された胎盤接着性細胞集団は、他の細胞、例えば間葉系幹細胞、例えば骨髄由来間葉系幹細胞と区別できることが確認される。本明細書に記載される単離された胎盤接着性細胞は、１つまたは複数の遺伝子の発現に基づき例えば間葉系幹細胞と区別することができ、これらの遺伝子の発現は、単離された胎盤接着性細胞、またはある特定の単離された臍帯幹細胞において、骨髄由来間葉系幹細胞と比較してより有意に高い。特定には、本明細書で提供される処置の方法において有用な単離された胎盤接着性細胞は、１つまたは複数の遺伝子の発現に基づき間葉系幹細胞からと区別することができ、これらの遺伝子の発現は、単離された胎盤接着性細胞において、等しい数の骨髄由来間葉系幹細胞の場合より有意に高く（すなわち、少なくとも２倍高く）、ここで１つまたは複数の遺伝子は、等しい条件下で細胞を成長させる場合、ＡＣＴＧ２、ＡＤＡＲＢ１、ＡＭＩＧＯ２、ＡＲＴＳ−１、Ｂ４ＧＡＬＴ６、ＢＣＨＥ、Ｃ１１ｏｒｆ９、ＣＤ２００、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ４Ａ２、ＣＰＡ４、ＤＭＤ、ＤＳＣ３、ＤＳＧ２、ＥＬＯＶＬ２、Ｆ２ＲＬ１、ＦＬＪ１０７８１、ＧＡＴＡ６、ＧＰＲ１２６、ＧＰＲＣ５Ｂ、ＨＬＡ−Ｇ、ＩＣＡＭ１、ＩＥＲ３、ＩＧＦＢＰ７、ＩＬ１Ａ、ＩＬ６、ＩＬ１８、ＫＲＴ１８、ＫＲＴ８、ＬＩＰＧ、ＬＲＡＰ、ＭＡＴＮ２、ＭＥＳＴ、ＮＦＥ２Ｌ３、ＮＵＡＫ１、ＰＣＤＨ７、ＰＤＬＩＭ３、ＰＫＰ２、ＲＴＮ１、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＳＴ３ＧＡＬ６、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＳＬＣ１２Ａ８、ＴＣＦ２１、ＴＧＦＢ２、ＶＴＮ、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、または前述のもののいずれかの組合せである。例えば、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる特許文献５を参照されたい。ある特定の具体的な実施形態において、前記１つまたは複数の遺伝子の前記発現は、例えばＲＴ−ＰＣＲまたはマイクロアレイ分析により、例えば、Ｕ１３３−Ａマイクロアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を使用して決定される。別の具体的な実施形態において、ＤＭＥＭ−ＬＧ（例えば、Ｇｉｂｃｏから）；２％ウシ胎児血清（例えば、Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｓ．から）；１×インスリン−トランスフェリン−セレニウム（ＩＴＳ）；１×リノール酸−ウシ血清アルブミン（ＬＡ−ＢＳＡ）；１０〜９Ｍのデキサメタゾン（例えば、Ｓｉｇｍａから）；１０〜４Ｍのアスコルビン酸２−ホスフェート（例えば、Ｓｉｇｍａから）；１０ｎｇ／ｍＬの上皮増殖因子（例えば、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから）；および１０ｎｇ／ｍＬの血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ−ＢＢ）（例えば、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから）を含む培地中で、数回の集団倍加、例えば約３から約３５回の集団倍加で培養される場合、前記単離された胎盤接着性細胞は、前記１つまたは複数の遺伝子を発現する。別の具体的な実施形態において、単離された胎盤細胞に特異的な、または単離された臍帯細胞特異的な遺伝子は、ＣＤ２００である。
【０１０７】
これらの遺伝子に特異的な配列は、ＧｅｎＢａｎｋにおいて、２００８年３月現在、受託番号ＮＭ＿００１６１５（ＡＣＴＧ２）、ＢＣ０６５５４５（ＡＤＡＲＢ１）、（ＮＭ＿１８１８４７（ＡＭＩＧＯ２）、ＡＹ３５８５９０（ＡＲＴＳ−１）、ＢＣ０７４８８４（Ｂ４ＧＡＬＴ６）、ＢＣ００８３９６（ＢＣＨＥ）、ＢＣ０２０１９６（Ｃ１１ｏｒｆ９）、ＢＣ０３１１０３（ＣＤ２００）、ＮＭ＿００１８４５（ＣＯＬ４Ａ１）、ＮＭ＿００１８４６（ＣＯＬ４Ａ２）、ＢＣ０５２２８９（ＣＰＡ４）、ＢＣ０９４７５８（ＤＭＤ）、ＡＦ２９３３５９（ＤＳＣ３）、ＮＭ＿００１９４３（ＤＳＧ２）、ＡＦ３３８２４１（ＥＬＯＶＬ２）、ＡＹ３３６１０５（Ｆ２ＲＬ１）、ＮＭ＿０１８２１５（ＦＬＪ１０７８１）、ＡＹ４１６７９９（ＧＡＴＡ６）、ＢＣ０７５７９８（ＧＰＲ１２６）、ＮＭ＿０１６２３５（ＧＰＲＣ５Ｂ）、ＡＦ３４００３８（ＩＣＡＭ１）、ＢＣ０００８４４（ＩＥＲ３）、ＢＣ０６６３３９（ＩＧＦＢＰ７）、ＢＣ０１３１４２（ＩＬ１Ａ）、ＢＴ０１９７４９（ＩＬ６）、ＢＣ００７４６１（ＩＬ１８）、（ＢＣ０７２０１７）  ＫＲＴ１８、ＢＣ０７５８３９（ＫＲＴ８）、ＢＣ０６０８２５（ＬＩＰＧ）、ＢＣ０６５２４０（ＬＲＡＰ）、ＢＣ０１０４４４（ＭＡＴＮ２）、ＢＣ０１１９０８（ＭＥＳＴ）、ＢＣ０６８４５５（ＮＦＥ２Ｌ３）、ＮＭ＿０１４８４０（ＮＵＡＫ１）、ＡＢ００６７５５（ＰＣＤＨ７）、ＮＭ＿０１４４７６（ＰＤＬＩＭ３）、ＢＣ１２６１９９（ＰＫＰ−２）、ＢＣ０９０８６２（ＲＴＮ１）、ＢＣ００２５３８（ＳＥＲＰＩＮＢ９）、ＢＣ０２３３１２（ＳＴ３ＧＡＬ６）、ＢＣ００１２０１（ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５）、ＢＣ１２６１６０またはＢＣ０６５３２８（ＳＬＣ１２Ａ８）、ＢＣ０２５６９７（ＴＣＦ２１）、ＢＣ０９６２３５（ＴＧＦＢ２）、ＢＣ００５０４６（ＶＴＮ）、およびＢＣ００５００１（ＺＣ３Ｈ１２Ａ）で見出すことができる。
【０１０８】
ある特定の具体的な実施形態において、前記単離された胎盤接着性細胞は、ＡＣＴＧ２、ＡＤＡＲＢ１、ＡＭＩＧＯ２、ＡＲＴＳ−１、Ｂ４ＧＡＬＴ６、ＢＣＨＥ、Ｃ１１ｏｒｆ９、ＣＤ２００、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ４Ａ２、ＣＰＡ４、ＤＭＤ、ＤＳＣ３、ＤＳＧ２、ＥＬＯＶＬ２、Ｆ２ＲＬ１、Ｆ１１１０７８１、ＧＡＴＡ６、ＧＰＲ１２６、ＧＰＲＣ５Ｂ、ＨＬＡ−Ｇ、ＩＣＡＭ１、ＩＥＲ３、ＩＧＦＢＰ７、ＩＬ１Ａ、ＩＬ６、ＩＬ１８、ＫＲＴ１８、ＫＲＴ８、ＬＩＰＧ、ＬＲＡＰ、ＭＡＴＮ２、ＭＥＳＴ、ＮＦＥ２Ｌ３、ＮＵＡＫ１、ＰＣＤＨ７、ＰＤＬＩＭ３、ＰＫＰ２、ＲＴＮ１、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＳＴ３ＧＡＬ６、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＳＬＣ１２Ａ８、ＴＣＦ２１、ＴＧＦＢ２、ＶＴＮ、およびＺＣ３Ｈ１２Ａのそれぞれを、等しい条件下で細胞を成長させる場合、等しい数の骨髄由来間葉系幹細胞より検出できる程度に高いレベルで発現する。
【０１０９】
具体的な実施形態において、胎盤接着性細胞は、ＣＤ２００およびＡＲＴＳ１（１型腫瘍壊死因子のアミノペプチダーゼレギュレーター）；ＡＲＴＳ−１およびＬＲＡＰ（白血球由来アルギニンアミノペプチダーゼ）；ＩＬ６（インターロイキン−６）およびＴＧＦＢ２（トランスフォーミング増殖因子、ベータ２）；ＩＬ６およびＫＲＴ１８（ケラチン１８）；ＩＥＲ３（前初期応答３）、ＭＥＳＴ（中胚葉特異的転写物相同体）およびＴＧＦＢ２；ＣＤ２００およびＩＥＲ３；ＣＤ２００およびＩＬ６；ＣＤ２００およびＫＲＴ１８；ＣＤ２００およびＬＲＡＰ；ＣＤ２００およびＭＥＳＴ；ＣＤ２００およびＮＦＥ２Ｌ３（核内因子（赤血球由来２）様３）；またはＣＤ２００およびＴＧＦＢ２を、等しい数の骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）より検出できる程度に高いレベルで発現し、前記骨髄由来間葉系幹細胞は、培養中、前記単離された胎盤接着性細胞が受けた継代回数に等しい継代回数を受けている。他の具体的な実施形態において、胎盤接着性細胞は、ＡＲＴＳ−１、ＣＤ２００、ＩＬ６およびＬＲＡＰ；ＡＲＴＳ−１、ＩＬ６、ＴＧＦＢ２、ＩＥＲ３、ＫＲＴ１８およびＭＥＳＴ；ＣＤ２００、ＩＥＲ３、ＩＬ６、ＫＲＴ１８、ＬＲＡＰ、ＭＥＳＴ、ＮＦＥ２Ｌ３、およびＴＧＦＢ２；ＡＲＴＳ−１、ＣＤ２００、ＩＥＲ３、ＩＬ６、ＫＲＴ１８、ＬＲＡＰ、ＭＥＳＴ、ＮＦＥ２Ｌ３、およびＴＧＦＢ２；またはＩＥＲ３、ＭＥＳＴおよびＴＧＦＢ２を、等しい数の骨髄由来間葉系幹細胞ＢＭ−ＭＳＣより検出できる程度に高いレベルで発現し、前記骨髄由来間葉系幹細胞は、培養中、前記単離された胎盤接着性細胞が受けた継代回数に等しい継代回数を受けている。
【０１１０】
上記で述べた遺伝子の発現は、標準的な技術により評価することができる。例えば、遺伝子の配列に基づくプローブを、従来の技術によって個々に選択して構築することができる。遺伝子の発現は、例えば、遺伝子の１つまたは複数に対するプローブを含むマイクロアレイ、例えば、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのＧＥＮＥＣＨＩＰ（登録商標）ヒトゲノムＵ１３３Ａ２．０アレイ、またはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのＧＥＮＥＣＨＩＰ（登録商標）ヒトゲノムＵ１３３プラス２．０（サンタクララ、カリフォルニア州）で評価することができる。これらの遺伝子の発現は、特定のＧｅｎＢａｎｋ受託番号の配列が修正されている場合でも、修正された配列に特異的なプローブは周知の標準的な技術を使用して容易に生成できるため、評価することができる。
【０１１１】
これらの遺伝子の発現レベルは、単離された胎盤接着性細胞集団の同一性を確認するのに使用すること、細胞集団を、少なくとも複数の単離された胎盤接着性細胞を含むと同定するのに使用することなどが可能である。同一性が確認されている単離された胎盤接着性細胞の集団は、クローン性であってもよく、例えば、単一の単離された胎盤細胞から拡張された単離された胎盤接着性細胞集団、または幹細胞の混成集団、例えば、複数の単離された胎盤接着性細胞から拡張された単離された胎盤接着性細胞を単独で含む細胞集団、または本明細書に記載されるような単離された胎盤接着性細胞と少なくとも１つの他のタイプの細胞とを含む細胞集団であってもよい。
【０１１２】
これらの遺伝子の発現レベルは、単離された胎盤接着性細胞集団を選択するのに使用することができる。例えば、細胞、例えば、クローン的に拡張した細胞の集団は、上記で列挙した遺伝子の１つまたは複数の発現が、その細胞集団からのサンプル中で等価な間葉系幹細胞集団より有意に高い場合に選択することができる。このような選択は、複数の単離された胎盤細胞集団からの集団の選択、その同一性が公知ではない複数の細胞集団からの集団などの選択であってもよい。
【０１１３】
単離された胎盤接着性細胞は、例えば間充織幹細胞対照における前記１つまたは複数の遺伝子における発現レベル、例えば、等しい数の骨髄由来間葉系幹細胞における前記１つまたは複数の遺伝子の発現のレベルと比較した場合の、１つまたは複数のこのような遺伝子の発現レベルに基づき選択することができる。一実施形態において、等しい数の間葉系幹細胞を含むサンプル中の前記１つまたは複数の遺伝子の発現レベルが、対照として使用される。別の実施形態において、対照は、ある特定の条件下で試験された単離された胎盤接着性細胞の場合、前記条件下での間葉系幹細胞における前記１つまたは複数の遺伝子の発現レベルを表す数値である。
【０１１４】
ある特定の実施形態において、本明細書で提供される方法において有用な胎盤接着性細胞（例えばｐｌａｃｅｎｔａｌ  ａｄｈｅｒｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ（登録商標））は、免疫学的局在法によって検出可能な場合、４から２１日にわたり１から１００ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦに曝露した後、ＣＤ３４を発現しない。具体的な実施形態において、前記胎盤接着性細胞は、組織培養プラスチックへの接着性を有する。別の具体的な実施形態において、前記細胞の集団は、例えばＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）などの基材上で、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、上皮性増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）または塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）などのリンパ管形成因子の存在下で培養される場合、新芽または管状の構造を形成するように内皮細胞を誘導する。
【０１１５】
別の態様において、本明細書で提供される胎盤接着性細胞、細胞の集団、例えば、胎盤接着性細胞の集団、または前記単離された細胞の集団中の細胞の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％が胎盤接着性細胞である細胞の集団は、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＩＬ−８、ＭＣＰ−３、ＦＧＦ２、フォリスタチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＥＧＦ、ＥＮＡ−７８、ＧＲＯ、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＴＩＭＰ−２、ｕＰＡＲ、またはガレクチン−１の１つもしくは複数または全てを、例えば１つまたは複数の細胞が増殖する培養培地に分泌する。別の実施形態において、胎盤接着性細胞は、低酸素状態下（例えば、約５％０２未満）で、酸素正常条件下（例えば、約２０％または約２１％０２）と比較して増加したレベルのＣＤ２０２ｂ、ＩＬ−８および／またはＶＥＧＦを発現する。
【０１１６】
別の実施形態において、本明細書に記載される胎盤接着性細胞のいずれかまたは胎盤接着性細胞を含む細胞の集団は、内皮細胞の集団において、前記胎盤由来の接着性細胞と接触させて、新芽または管状の構造の形成をもたらすことができる。具体的な実施形態において、胎盤接着性細胞は、ヒト内皮細胞と共培養されて、それにより、例えば胎盤のコラーゲンまたはＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）などの基材中またはその上で、Ｉ型およびＩＶ型コラーゲンなどの細胞外マトリックスタンパク質、ならびに／または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、上皮性増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）もしくは塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）などの血管新生因子の存在下で少なくとも４日間培養される場合、新芽または管状の構造を形成するか、または内皮細胞の新芽の形成を支持する。別の実施形態において、本明細書に記載される胎盤由来の接着細胞を含む細胞集団のいずれかは、血管新生因子、例えば血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、またはインターロイキン−８（ＩＬ−８）を分泌し、それによって、例えばＩおよびＩＶ型コラーゲンなどの細胞外マトリックスタンパク質の存在下で、例えば胎盤のコラーゲンまたはＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）などの基材中またはその上で培養される場合、ヒト内皮細胞の芽または管状構造の形成を誘導することができる。
【０１１７】
別の実施形態において、上記の胎盤由来の接着性細胞（胎盤接着性細胞）を含む細胞の集団のいずれかは、血管新生因子を分泌する。具体的な実施形態において、細胞の集団は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、および／またはインターロイキン−８（ＩＬ−８）を分泌する。他の具体的な実施形態において、胎盤接着性細胞を含む細胞の集団は、１つまたは複数の血管新生因子を分泌し、それによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの創傷治癒アッセイにおいて、ヒト内皮細胞の移動を誘導する。他の具体的な実施形態において、胎盤由来の接着細胞を含む細胞集団は、ヒト内皮細胞、内皮前駆細胞、筋細胞または筋原細胞の成熟、分化または増殖を誘導する。
【０１１８】
本明細書に記載される単離された胎盤接着性細胞は、初代培養で、または例えばＤＭＥＭ−ＬＧ（Ｇｉｂｃｏ）、２％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、１×インスリン−トランスフェリン−セレニウム（ＩＴＳ）、１×リノール酸（ｌｅｎｏｌｅｎｉｃ−ａｃｉｄ）−ウシ−血清−アルブミン（ＬＡ−ＢＳＡ）、１０〜９Ｍのデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）、１０４Ｍのアスコルビン酸２−ホスフェート（Ｓｉｇｍａ）、１０ｎｇ／ｍｌの上皮増殖因子（ＥＧＦ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１０ｎｇ／ｍｌの血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ−ＢＢ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、および１００Ｕのペニシリン／１０００Ｕのストレプトマイシンを含む培地中での増殖中に、上記の特徴（例えば、細胞表面マーカーおよび／または遺伝子発現プロファイルの組合せ）を提示する。
【０１１９】
本明細書で開示された胎盤接着性細胞のいずれかのある特定の実施形態において、細胞は、ヒトである。本明細書で開示された胎盤接着性細胞のいずれかのある特定の実施形態において、細胞マーカーの特徴または遺伝子発現の特徴は、ヒトマーカーまたはヒト遺伝子である。
【０１２０】
前記単離された胎盤接着性細胞または単離された胎盤接着性細胞を含む細胞集団の別の具体的な実施形態において、前記細胞または集団は、拡張されており、例えば、少なくとも、約、または最大で、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０回、またはそれより多く継代されているか、または少なくとも、約、または最大で、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０回の集団倍加で増殖されている。前記単離された胎盤接着性細胞または単離された胎盤接着性細胞を含む細胞集団の別の具体的な実施形態において、前記細胞または集団は、初代単離物である。本明細書で開示される単離された胎盤接着性細胞、または単離された胎盤接着性細胞を含む細胞集団の別の具体的な実施形態において、前記単離された胎盤接着性細胞は、胎児起源である（すなわち胎児の遺伝子型を有する）。
【０１２１】
ある特定の実施形態において、前記単離された胎盤接着性細胞は、増殖培地中で、すなわち、例えば増殖培地中で培養される間に増殖を促進するように配合された培地中で培養される間、分化しない。別の具体的な実施形態において、前記単離された胎盤接着性細胞は、増殖するためにフィーダー層を必要としない。別の具体的な実施形態において、前記単離された胎盤接着性細胞は、培養中、フィーダー層の非存在下で、単にフィーダー細胞層の欠如のために分化しない。
【０１２２】
別の実施形態において、本明細書に記載される方法および組成物において有用な細胞は、単離された胎盤接着性細胞であり、複数の前記単離された胎盤接着性細胞は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性アッセイにより評価された場合、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）陽性である。このようなアッセイは、当業界において公知である（例えば、非特許文献５を参照）。具体的な実施形態において、前記ＡＬＤＨアッセイは、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性のマーカーとしてＡＬＤＥＦＬＵＯＲ（登録商標）（Ａｌｄａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、アシュランド、オレゴン州）を使用する。具体的な実施形態において、前記複数は、前記細胞集団中の細胞の約３％から約２５％の間である。別の実施形態において、単離された臍帯細胞、例えば単離された複能性臍帯細胞の集団が本明細書で提供され、複数の前記単離された臍帯細胞は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性のインジケーターとしてＡＬＤＥＦＬＵＯＲ（登録商標）を使用するアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性アッセイにより評価された場合、アルデヒドデヒドロゲナーゼ陽性である。具体的な実施形態において、前記複数は、前記細胞集団中の細胞の約３％から約２５％の間である。別の実施形態において、前記単離された胎盤接着性細胞または単離された臍帯細胞の集団は、ほぼ同じ数の細胞を有し、同じ条件下で培養された骨髄由来間葉系幹細胞の集団より、少なくとも３倍、または少なくとも５倍高いＡＬＤＨ活性を示す。
【０１２３】
本明細書に記載の単離された胎盤接着性細胞を含む細胞の集団のいずれかのある特定の実施形態において、前記細胞の集団中の胎盤接着性細胞は、母体の遺伝子型を有する細胞を実質的に含まず、例えば、前記集団中の胎盤接着性細胞の少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％が、胎児の遺伝子型を有する。本明細書に記載の単離された胎接着性盤細胞を含む細胞の集団のいずれかのある特定の他の実施形態において、前記胎盤接着性細胞を含む細胞の集団は、母体の遺伝子型を有する細胞を実質的に含まず、例えば、前記集団中の細胞の少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％が、胎児の遺伝子型を有する。
【０１２４】
上記の単離された胎盤接着性細胞または単離された胎盤接着性細胞の細胞集団のいずれかの具体的な実施形態において、前記集団中の細胞、または少なくとも細胞の約９５％または約９９％の核型は、正常である。上記の胎盤接着性細胞または細胞集団のいずれかの別の具体的な実施形態において、細胞、または細胞集団中の細胞は、非母体起源である。
【０１２５】
上記のマーカーの組合せのいずれかを有する単離された胎盤接着性細胞または単離された胎盤接着性細胞集団は、あらゆる比率で組み合わせることができる。上記の単離された胎盤細胞集団のいずれか２つ以上を組み合わせて、単離された胎盤細胞集団を形成することができる。例えば、単離された胎盤接着性細胞の集団は、上述したマーカーの組合せの１つによって定義された第１の単離された胎盤接着性細胞集団、および上述したマーカーの組合せの別のものによって定義された第２の単離された胎盤接着性細胞集団を含んでいてもよく、前記第１および第２の集団は、約１：９９、２：９８、３：９７、４：９６、５：９５、１０：９０、２０：８０、３０：７０、４０：６０、５０：５０、６０：４０、７０：３０、８０：２０、９０：１０、９５：５、９６：４、９７：３、９８：２、または約９９：１の比率で組み合わされる。同様の様式で、上述した単離された胎盤接着性細胞または単離された胎盤接着性細胞集団のいずれか３つ、４つ、５つまたはそれより多くを組み合わせることができる。
【０１２６】
本明細書に記載される方法および組成物において有用な単離された胎盤接着性細胞は、例えば胎盤組織の破壊により得ることができ、この破壊は、酵素による消化（５．４．３章を参照）または潅流（５．４．４章を参照）を用いてもよいし、または用いなくてもよい。例えば、単離された胎盤接着性細胞集団は、臍帯血を引き出し、潅流して、残留した血液を除去した哺乳類胎盤を潅流するステップ；前記胎盤を潅流溶液で潅流するステップ；および前記潅流溶液を収集するステップであって、潅流後の前記潅流溶液は、単離された胎盤接着性細胞を含む胎盤接着性細胞集団を含む、ステップ；および前記細胞集団から複数の前記単離された胎盤接着性細胞を単離するステップを含む方法に従って産生することができる。具体的な実施形態において、潅流溶液は、臍帯静脈と臍帯動脈の両方を通過して、それが胎盤から滲出した後に収集される。別の具体的な実施形態において、潅流溶液は、臍帯静脈を通過して臍帯動脈から収集されるか、または臍帯動脈を通過して臍帯静脈から収集される。
【０１２７】
様々な実施形態において、胎盤の潅流から得られた細胞の集団内に含有される単離された胎盤接着性細胞は、前記胎盤接着性細胞の集団の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または少なくとも９９．５％である。別の具体的な実施形態において、潅流によって収集された単離された胎盤接着性細胞は、胎児の細胞および母体の細胞を含む。別の具体的な実施形態において、潅流によって収集された単離された胎盤接着性細胞は、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または少なくとも９９．５％が胎児細胞である。
【０１２８】
別の具体的な実施形態において、本明細書に記載されるように、潅流により収集された単離された胎盤接着性細胞集団を含む組成物であって、前記組成物は、単離された胎盤接着性細胞を収集するのに使用される潅流溶液の少なくとも一部を含む、組成物が本明細書で提供される。
【０１２９】
本明細書に記載される単離された胎盤接着性細胞の単離された集団は、組織を破壊する酵素で胎盤組織を消化して、細胞を含む胎盤接着性細胞集団を得ること、および前記胎盤接着性細胞の残りから複数の胎盤接着性細胞を単離すること、または実質的に単離することによって産生することができる。胎盤の全体またはそのいずれか一部を消化して、本明細書に記載される単離された胎盤接着性細胞を得ることができる。具体的な実施形態において、例えば、前記胎盤組織は、胎盤全体、羊膜、柔毛膜、羊膜と柔毛膜の組合せ、または前述のもののいずれかの組合せであってもよい。他の具体的な実施形態において、組織を破壊する酵素は、トリプシンまたはコラゲナーゼである。様々な実施形態において、胎盤を消化することから得られた細胞の集団内に含有される単離された胎盤接着性細胞は、前記胎盤接着性細胞集団の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または少なくとも９９．５％である。
【０１３０】
上述した胎盤接着性細胞の単離された集団、および単離された胎盤接着性細胞の集団は、一般的に、約１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０、１×１０１１個またはそれより多くの、少なくともそれらの個数の、またはそれらの個数以下の、単離された胎盤接着性細胞を含んでいてもよい。本明細書に記載される処置方法において有用な単離された胎盤接着性細胞の集団は、例えばトリパンブルー排除によって決定可能な、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の生存可能な単離された胎盤接着性細胞を含む。
【０１３１】
５．３．３  培養における増殖
本明細書のセクション５．３に記載される単離された胎盤接着性細胞の増殖は、いずれの哺乳類細胞の場合と同様に、増殖のために選択された特定の培地に一部依存する。最適な条件下で、単離された胎盤接着性細胞は、典型的には、約１日で数が２倍になる。培養の間、本明細書に記載される単離された胎盤接着性細胞は、培養中の基材に、例えば組織培養容器（例えば、組織培養皿プラスチック、フィブロネクチンでコーティングしたプラスチック、および同種のもの）の表面に接着して、単分子層を形成する。
【０１３２】
本明細書に記載される単離された胎盤接着性細胞を含む胎盤接着性細胞の集団は、適切な条件下で培養される場合、胚様体を形成することができ、すなわち、細胞の３次元クラスターが接着性細胞層の頂上で増殖する。胚様体内の細胞は、ごく早期の幹細胞に関連するマーカー、例えば、ＯＣＴ−４、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ３およびＳＳＥＡ４を発現することができる。胚様体内の細胞は、典型的には、本明細書に記載される単離された胎盤接着性細胞のように培養基材への接着性を有さないが、培養の間は接着性細胞に付着したままになる傾向がある。接着性の単離された胎盤接着性細胞の非存在下で胚様体が形成されないため、胚様体細胞は、生存能について接着性の単離された胎盤接着性細胞に依存している。したがって接着性の単離された胎盤接着性細胞は、接着性の単離された胎盤接着性細胞を含む胎盤接着性細胞の集団における１つまたは複数の胚様体の増殖を促進する。理論に制限されることは望まないが、胚様体の細胞は、接着性の単離された胎盤接着性細胞上でも、胚性幹細胞が細胞のフィーダー層上で増殖するのと同等に多く増殖すると考えられる。
【０１３３】
５．４  単離された胎盤細胞を得る方法
５．４．１  幹細胞収集組成物
さらに、上記の５．３章に記載される胎盤接着性細胞、例えば単離された胎盤接着性細胞を収集および単離する方法が本明細書において提供される。一般的に、このような細胞は、哺乳類胎盤から、生理的に許容できる溶液、例えば細胞収集組成物を使用して得られる。例示的な細胞収集組成物は、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｍｅｄｉｕｍ  ｆｏｒ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇ  Ｐｌａｃｅｎｔａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ  Ｏｒｇａｎｓ」という表題の関連する特許文献６で詳細に記載されており、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０１３４】
細胞収集組成物は、細胞、例えば本明細書に記載される単離された胎盤接着性細胞の収集および／または培養に好適なあらゆる生理的に許容できる溶液、例えば、塩類溶液（例えば、リン酸緩衝塩類溶液、クレブス溶液、改変クレブス溶液、イーグル溶液、０．９％ＮａＣｌなど）、培養培地（例えば、ＤＭＥＭ、Ｈ．ＤＭＥＭなど）、および同種のものを含んでいてもよい。
【０１３５】
細胞収集組成物は、収集時間から培養時間まで、単離された胎盤接着性細胞を保存する傾向がある、すなわち、単離された胎盤接着性細胞が乾燥しないようにする、または単離された胎盤接着性細胞の死を遅延させる、細胞集団中の死亡する単離された胎盤接着性細胞の数を低減する等の１つまたは複数の要素を含んでいてもよい。このような要素は、例えば、アポトーシス阻害剤（例えば、カスパーゼ阻害剤またはＪＮＫ阻害剤）；血管拡張剤（例えば、硫酸マグネシウム、抗高血圧薬、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、副腎皮質刺激ホルモン、コルチコトロピン放出ホルモン、ニトロプルシドナトリウム、ヒドララジン、アデノシン三リン酸、アデノシン、インドメタシンまたは硫酸マグネシウム、ホスホジエステラーゼ阻害剤など）；壊死阻害剤（例えば、２−（１Ｈ−インドール−３−イル）−３−ペンチルアミノ−マレイミド、ピロリジンジチオカルバメート、またはクロナゼパム）；ＴＮＦ−α阻害剤；および／または酸素運搬ペルフルオロカーボン（例えば、ペルフルオロオクチルブロミド、ペルフルオロデシルブロミドなど）であり得る。
【０１３６】
細胞収集組成物は、１つまたは複数の組織分解酵素、例えば、メタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、ＲＮアーゼ、またはＤＮアーゼ、または同種のものを含んでいてもよい。このような酵素としては、これらに限定されないが、コラゲナーゼ（例えば、コラゲナーゼＩ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶ、クロストリジウム・ヒストリチカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）由来のコラゲナーゼなど）；ディスパーゼ、サーモリシン、エラスターゼ、トリプシン、ＬＩＢＥＲＡＳＥ、ヒアルロニダーゼ、および同種のものが挙げられる。
【０１３７】
細胞収集組成物は、殺菌的または静菌的に有効な量の抗生物質を含んでいてもよい。ある特定の非限定的な実施形態において、抗生物質は、マクロライド（例えば、トブラマイシン）、セファロスポリン（例えば、セファレキシン、セフラジン、セフロキシム、セフプロジル、セファクロル、セフィキシムまたはセファドロキシル）、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、ペニシリン（例えば、ペニシリンＶ）またはキノロン（例えば、オフロキサシン、シプロフロキサシンまたはノルフロキサシン）、テトラサイクリン、ストレプトマイシンなどである。特定の実施形態において、抗生物質は、グラム（＋）および／またはグラム（−）細菌、例えば、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）などに対して活性である。一実施形態において、抗生物質は、ゲンタマイシンであり、例えば、培養培地中約０．００５％から約０．０１％（ｗ／ｖ）である。細胞収集組成物はまた、以下の化合物の１つまたは複数：アデノシン（約１ｍＭから約５０ｍＭ）；Ｄ−グルコース（約２０ｍＭから約１００ｍＭ）；マグネシウムイオン（約１ｍＭから約５０ｍＭ）；２０，０００ダルトンより大きい分子量を有する巨大分子、一実施形態において、内皮の完全性および細胞の生存能を維持するのに十分な量で存在するもの（例えば、合成または天然に存在するコロイド、多糖類、例えば約２５ｇ／ｌから約１００ｇ／ｌ、または約４０ｇ／ｌから約６０ｇ／ｌで存在するデキストランまたはポリエチレングリコールなど）；抗酸化剤（例えば、約２５μＭから約１００μＭで存在する、ブチルヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルエン、グルタチオン、ビタミンＣまたはビタミンＥ）；還元剤（例えば、約０．１ｍＭから約５ｍＭで存在するＮ−アセチルシステイン）；細胞へのカルシウム侵入を予防する薬剤（例えば、約２μＭから約２５μＭで存在するベラパミル）；ニトログリセリン（例えば、約０．０５ｇ／Ｌから約０．２ｇ／Ｌ）；抗凝血剤、一実施形態において、残留した血液の凝固の予防を助けるのに十分な量で存在する抗凝血剤（例えば、約１０００ユニット／ｌから約１００，０００ユニット／ｌの濃度で存在するヘパリンまたはヒルジン）；またはアミロライド含有化合物（例えば、約１．０μＭから約５μＭで存在する、アミロライド、エチルイソプロピルアミロライド、ヘキサメチレンアミロライド、ジメチルアミロライドまたはイソブチルアミロライド）を含んでいてもよい。
【０１３８】
５．４．２  胎盤の収集および取り扱い
一般的に、ヒト胎盤は、出産後に排除された直後に回収される。好ましい実施形態において、胎盤は、インフォームドコンセントの後、および患者の完全な病歴を把握し、胎盤と関連付けた後に、患者から回収される。好ましくは、病歴は、分娩後も継続する。このような病歴は、それに続く胎盤または胎盤から回収された単離された胎盤接着性細胞の使用と連携させるのに使用することができる。例えば、単離されたヒト胎盤接着性細胞は、病歴を考慮して、胎盤に関連する乳児のための、または乳児の親、兄弟もしくは他の親族のための個別化薬に使用することができる。
【０１３９】
単離された胎盤接着性細胞の回収の前に、臍帯血および胎盤血は、好ましくは除去される。ある特定の実施形態において、分娩後、胎盤中の臍帯血が回収される。胎盤は、従来の臍帯血回収プロセスに供することができる。典型的には、針またはカニューレを使用して、重力の助けによって胎盤放血させる（例えば、アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）、特許文献７；ヘッセル（Ｈｅｓｓｅｌ）ら、特許文献８を参照）。通常、針またはカニューレを臍帯静脈中に置き、胎盤を穏やかに揉んで胎盤からの臍帯血の引き出しを助けることができる。このような臍帯血回収は商業的に実行することもでき、例えば、ＬｉｆｅＢａｎｋ  ＵＳＡ、Ｃｅｄａｒ  Ｋｎｏｌｌｓ、Ｎ．Ｊ．である。好ましくは、臍帯血回収中の組織の破壊が最小化されるように、胎盤は、さらなる操作を用いずに重力により引き出される。
【０１４０】
典型的には、胎盤は、例えば潅流または組織解離による臍帯血の回収および幹細胞の収集のために、分娩または出産室から別の場所、例えば実験室に輸送される。胎盤は、好ましくは、断熱された滅菌輸送デバイス（胎盤の温度を２０〜２８℃の間に維持する）で、例えば、滅菌ジップロックプラスチックバッグ中に近位の臍帯を固定して胎盤を置き、次いでこれを断熱容器中に置くことにより輸送される。別の実施形態において、胎盤は、実質的にその開示が参照により本明細書に組み入れられる係属中の特許文献９に記載されるような臍帯血収集キットで輸送される。好ましくは、胎盤は、分娩後４から２４時間で実験室に届けられる。ある特定の実施形態において、近位の臍帯は、臍帯血回収の前に、盤状胎盤（ｐｌａｃｅｎｔａｌ  ｄｉｓｃ）への挿入部の、好ましくは４〜５ｃｍ（センチメートル）以内に固定される。他の実施形態において、近位の臍帯は、臍帯血回収の後、ただしさらなる胎盤加工の前に固定される。
【０１４１】
胎盤は、細胞収集の前に、滅菌条件下で、室温または５℃から２５℃の温度のいずれかで貯蔵することができる。胎盤は、胎盤を潅流して全ての残留した臍帯血を除去する前の、４から２４時間の期間にわたり、４８時間まで、または４８時間より長く、貯蔵してもよい。一実施形態において、胎盤は、排除後、約０時間から約２時間の間に収穫される。胎盤は、好ましくは、抗凝血剤溶液中で、５℃から２５℃の温度で、貯蔵される。好適な抗凝血剤溶液は当業界において周知である。例えば、ヘパリンまたはワルファリンナトリウムの溶液を使用することができる。好ましい実施形態において、抗凝血剤溶液は、ヘパリンの溶液（例えば、１：１０００溶液中、１％ｗ／ｗ）を含む。放血された胎盤は、好ましくは胎盤接着性細胞を収集する前の３６時間以下で貯蔵される。
【０１４２】
哺乳類胎盤またはその部分は、上述したようにひとたび一般的に収集され調製されたら、あらゆる当業界公知の方式で処理することができ、例えば、潅流または破壊することにより、例えば１つまたは複数の組織を破壊する酵素で消化することにより、単離された胎盤接着性細胞を得ることができる。
【０１４３】
５．４．３  胎盤組織の物理的な破壊および酵素消化
一実施形態において、幹細胞は、臓器の一部または全ての物理的な破壊によって、哺乳類胎盤から収集される。例えば、胎盤またはその部分を、例えば、粉砕する、剪断する、細かく刻む、さいの目に切る、切り刻む、ほぐす等することができる。次いで組織を培養して、単離された胎盤接着性細胞の集団を得ることができる。典型的には、例えば、培養培地、塩類溶液、または幹細胞収集組成物（セクション５．４．１および以下を参照）を使用して、胎盤組織を破壊する。
【０１４４】
胎盤は、物理的な破壊および／または酵素消化ならびに幹細胞の回収の前に要素に切り分けることができる。単離された胎盤接着性細胞は、羊膜、柔毛膜、臍帯、胎盤絨毛叢の全てまたは一部、または胎盤全体を含むそれらのいずれかの組合せから得ることができる。好ましくは、単離された胎盤接着性細胞は、羊膜および柔毛膜を含む胎盤組織から得られる。典型的には、単離された胎盤接着性細胞は、小さいブロックの胎盤組織の破壊、例えば、体積が約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または約１０００立方ミリメートルの胎盤組織のブロックの破壊により得ることができる。破壊方法が、例えばトリパンブルー排除によって決定可能な、前記臓器中の細胞の複数、より好ましくは大部分、より好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％を生存可能なままにするという条件で、あらゆる物理的な破壊方法を使用することができる。
【０１４５】
単離された接着性胎盤接着性細胞は、一般的に、排除後の最初の３日以内のいつでも、ただし好ましくは排除後約８時間から約１８時間の間に、胎盤またはその一部から収集することができる。
【０１４６】
具体的な実施形態において、破壊された組織は、単離された胎盤接着性細胞の増殖に好適な組織培養培地中で培養される（例えば、胎盤接着性細胞、例えば胎盤接着性細胞の培養を記載する以下のセクション５．５を参照）。
【０１４７】
別の具体的な実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、物理的な胎盤組織の破壊によって収集され、物理的な破壊としては、１つまたは複数の組織消化酵素の使用によって達成できる酵素消化が挙げられる。また胎盤またはその部分を物理的に破壊し、１つまたは複数の酵素で消化してもよく、次いで得られた材料を細胞収集組成物中に浸すか、またはそれに混合してもよい。
【０１４８】
好ましい細胞収集組成物は、１つまたは複数の組織を破壊する酵素を含む。胎盤組織を破壊するのに使用できる酵素としては、パパイン、デオキシリボヌクレアーゼ、セリンプロテアーゼ、例えばトリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、ディスパーゼまたはエラスターゼなどが挙げられる。セリンプロテアーゼは、血清中のアルファ２ミクログロブリンによって阻害される場合があるため、消化に使用される培地は通常、無血清である。細胞回収効率を増加させるために、ＥＤＴＡおよびＤＮアーゼが酵素消化手順において一般的に使用される。粘性の消化物中への細胞の捕獲が回避されるように、消化されるものを好ましくは希釈する。
【０１４９】
組織消化酵素のあらゆる組合せを使用することができる。トリプシンを使用する消化のための典型的な濃度としては、０．１％から約２％のトリプシン、例えば約０．２５％のトリプシンが挙げられる。プロテアーゼは、組み合わせて使用してもよく、すなわち２つ以上のプロテアーゼを同じ消化反応で使用してもよく、または胎盤接着性細胞、例えば胎盤幹細胞および複能性胎盤細胞を遊離させるために逐次的に使用してもよい。例えば、一実施形態において、胎盤またはその部分は、最初に、適切な量のコラゲナーゼＩで、約１から約２ｍｇ／ｍｌで、例えば３０分間消化され、それに続いてトリプシンで、約０．２５％の濃度で、例えば１０分間、３７℃で消化される。セリンプロテアーゼは、好ましくは、他の酵素の使用後に連続して使用することができる。
【０１５０】
別の実施形態において、幹細胞収集組成物を用いて幹細胞を単離する前に、キレート化剤、例えば、エチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を、幹細胞を含む幹細胞収集組成物に、またはその中で組織が破壊および／または消化される溶液に添加することによって、組織をさらに破壊することもできる。
【０１５１】
消化後、消化されたものを例えば培養培地で３回洗浄し、洗浄した細胞を培養フラスコに植え付ける。次いで細胞を示差的な接着により単離し、例えば生存能、細胞表面マーカー、分化、および同種のものに関して特徴付ける。
【０１５２】
胎盤全体または胎盤の部分が胎児の細胞と母体の細胞の両方を含む（例えば、胎盤の部分が柔毛膜または絨毛叢を含む場合）単離された胎盤接着性細胞は、胎児源と母体源の両方に由来する胎盤接着性細胞の混合物を含むことができると理解されると予想される。胎盤の部分が母体の細胞（例えば、羊膜）を含まないかごく少数しか含まない場合、それから単離された胎盤接着性細胞は、ほぼ胎児の胎盤接着性細胞（すなわち、胎児の遺伝子型を有する胎盤接着性細胞）のみを含むと予想される。
【０１５３】
胎盤細胞、例えば、上記の５．３章に記載される胎盤接着性細胞は、示差的なトリプシン処理（以下の５．３．５章を参照）、それに続く１つまたは複数の新しい培養容器中における新鮮な増殖培地中での培養、任意選択でそれに続く第２の示差的なトリプシン処理工程によって、破壊された胎盤組織から単離することができる。
【０１５４】
５．４．４．胎盤の潅流
胎盤細胞、例えば、上記の５．３章に記載される胎盤接着性細胞はまた、哺乳類胎盤の潅流によっても得ることができる。哺乳類の胎盤を潅流して胎盤接着性細胞を得る方法は、例えば、それぞれの開示がこの参照によりそれらの全体が開示に組み入れられる、ハリリ（Ｈａｒｉｒｉ）、特許文献１０および特許文献１１、ならびに特許文献５および特許文献６で開示されている。
【０１５５】
胎盤細胞は、潅流溶液として例えば細胞収集組成物を使用する、例えば胎盤の血管系を介した潅流によって収集することができる。一実施形態において、哺乳類胎盤は、臍帯動脈および臍帯静脈のいずれかまたはその両方に潅流溶液を通過させることによって潅流される。胎盤を通る潅流溶液の流動は、例えば胎盤への重力流を使用して達成することができる。好ましくは、ポンプ、例えば蠕動ポンプを使用して、潅流溶液を胎盤に押し通す。臍帯静脈に、例えば、滅菌接続器具、例えば滅菌管材料などに接続された、カニューレ、例えばＴＥＦＬＯＮ（登録商標）またはプラスチックカニューレを挿入することができる。滅菌接続器具は、潅流マニホールドに接続される。
【０１５６】
潅流の準備において、胎盤は、好ましくは、胎盤の最も高い地点に臍帯動脈および臍帯静脈が配置されるような方式で方向付けられる（例えば、吊り下げられる）。潅流流体を胎盤の血管系および周囲の組織を通過させることによって、胎盤を潅流することができる。また、臍帯静脈への潅流流体の通過および臍帯動脈からの収集、または臍帯動脈への潅流流体の通過および臍帯静脈からの収集によっても、胎盤を潅流することができる。
【０１５７】
一実施形態において、例えば、臍帯動脈および臍帯静脈は、例えばフレキシブルなコネクターを介して潅流溶液のリザーバに接続されているピペットに、同時に接続される。潅流溶液は、臍帯静脈および動脈に注入される。潅流溶液は、血管壁からおよび／またはそれを通過して胎盤の周囲組織に滲出し、妊娠中に母親の子宮に付着していた胎盤の表面から好適な開放血管に収集される。また潅流溶液を、臍帯の開口部を介して導入し、母体の子宮壁との境界面である胎盤の壁中の開口部から流動または浸透させてもよい。この方法は、「受け皿（ｐａｎ）」方法と称することができ、それにより収集される胎盤細胞は、典型的には胎児の細胞と母体の細胞との混合物である。
【０１５８】
別の実施形態において、潅流溶液は、臍帯静脈を通過し、臍帯動脈からから収集されるか、または臍帯動脈を通過し、臍帯静脈から収集される。この方法は、「閉回路」方法と称することができ、それにより収集される胎盤細胞は、典型的にはほぼ胎児のみである。
【０１５９】
受け皿方法、すなわちそれによって潅流液が胎盤の母体側から滲出した後に収集される方法を使用する潅流は、胎児の細胞と母体の細胞との混合物を生じることが理解されると予想される。結果として、この方法によって収集された細胞は、胎児起源と母体起源の両方の、混成の胎盤接着性細胞集団、例えば胎盤幹細胞または複能性胎盤細胞を含み得る。対照的に、閉回路方法で胎盤の血管系のみを通る潅流、すなわちそれによって潅流流体が１または２つの胎盤の血管を通過して残りの血管のみを通って収集される潅流は、ほぼ胎児起源の胎盤接着性細胞の集団のみの収集がもたらされる。
【０１６０】
閉回路潅流方法は、一実施形態において、以下のように実行することができる。出産後約４８時間以内に産後の胎盤を得る。臍帯を固定し、クランプ上で切断する。臍帯は、捨ててもよいし、または例えば臍帯幹細胞を回収するために加工したり、および／またはバイオマテリアル産生のために臍帯膜を加工したりすることもできる。羊膜は、潅流中に保持されていてもよいし、または例えば指での鈍的剥離を使用して柔毛膜から分離されてもよい。羊膜が潅流の前に柔毛膜から分離される場合、羊膜は、例えば、捨ててもよいし、または例えば、酵素消化によって幹細胞を得るために、または例えば羊膜バイオマテリアル、例えばその開示が参照によりその全体が本明細書に組み入れられる特許文献１０に記載のバイオマテリアルを産生するために加工されてもよい。全ての目に見える血餅や残留した血液を例えば滅菌ガーゼを使用して胎盤からクリーニングした後、例えば臍帯膜を部分的に切断して臍帯の断面を露出させることによって、臍帯血管を露出させる。血管を確認して、例えば各血管の切断端部末端を通って閉じたワニ口クランプを進めることによって開く。次いで潅流デバイスまたは蠕動ポンプに接続された器具、例えばプラスチック管材料を、胎盤動脈のそれぞれに挿入する。ポンプは、目的に好適な、例えば蠕動ポンプであり得る。次いで、滅菌収集リザーバ、例えば血液バッグ、例えば２５０ｍＬ収集バッグなどに接続されたプラスチック管材料は、胎盤静脈に挿入される。代替として、ポンプに接続された管材料が胎盤静脈に挿入され、収集リザーバへの管は、胎盤動脈の一方または両方に挿入される。次いで胎盤を、所定体積の潅流溶液、例えば、約７５０ｍｌの潅流溶液で潅流する。次いで潅流液中の細胞を、例えば遠心分離によって収集する。ある特定の実施形態において、胎盤を潅流溶液、例えば１００〜３００ｍＬの潅流溶液で潅流して、潅流の前に残留した血液を除去し、胎盤接着性細胞、例えば胎盤幹細胞および／または複能性胎盤細胞を収集する。別の実施形態において、胎盤を潅流溶液で潅流せずに、潅流の前に残留した血液を除去し、胎盤接着性細胞を収集する。
【０１６１】
一実施形態において、近位の臍帯は、潅流中固定され、より好ましくは、盤状胎盤（ｐｌａｃｅｎｔａｌ  ｄｉｓｃ）への臍帯の挿入部の４〜５ｃｍ（センチメートル）以内に固定される。
【０１６２】
放血プロセス中における哺乳類胎盤からの潅流流体の第１の収集物は、一般的に、臍帯血および／または胎盤の血液の残留した赤血球で着色されている。潅流流体は、潅流が進むにつれてより無色になり、残留した臍帯血細胞は胎盤から洗い落とされる。一般的に３０から１００ｍｌ（ミリリットル）の潅流流体が、初期に胎盤を放血させるのに十分であるが、観察された結果に応じてそれより多いまたは少ない潅流流体を使用してもよい。
【０１６３】
胎盤接着性細胞を単離するのに使用される潅流液体の体積は、収集しようとする細胞の数、胎盤のサイズ、単一の胎盤から作製しようとする収集物の数などに応じて様々であり得る。様々な実施形態において、潅流液体の体積は、５０ｍＬから５０００ｍＬ、５０ｍＬから４０００ｍＬ、５０ｍＬから３０００ｍＬ、１００ｍＬから２０００ｍＬ、２５０ｍＬから２０００ｍＬ、５００ｍＬから２０００ｍＬ、または７５０ｍＬから２０００ｍＬであり得る。典型的には、胎盤は、放血後、７００〜８００ｍＬの潅流液体で潅流される。
【０１６４】
胎盤は、数時間または数日にわたり複数回潅流することができる。胎盤を複数回潅流しようとする場合、無菌条件下において容器または他の好適な入れ物中で維持または培養して、抗凝血剤（例えば、ヘパリン、ワルファリンナトリウム、クマリン、ビスヒドロキシクマリン）含有または非含有の、および／または抗微生物剤（例えば、β−メルカプトエタノール（０．１ｍＭ）；抗生物質、例えばストレプトマイシン（例えば、４０〜１００μｇ／ｍｌで）、ペニシリン（例えば、４０Ｕ／ｍｌで）、アンホテリシンＢ（例えば、０．５μｇ／ｍｌで）など）含有または非含有の、細胞収集組成物、または標準的な潅流溶液（例えば、リン酸緩衝塩類溶液（「ＰＢＳ」）などの通常の塩類溶液）で潅流してもよい。一実施形態において、潅流および潅流液の収集前の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、もしくは２４時間、または２もしくは３日間またはそれより多くの日数にわたり胎盤が維持または培養されるように、単離された胎盤は、所定期間にわたり潅流液を収集せずに維持または培養される。潅流された胎盤は、１または複数の追加の回、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４時間またはそれより長い時間維持して、２回目に、例えば７００〜８００ｍＬの潅流流体で潅流してもよい。胎盤は、１、２、３、４、５回またはそれより多く、例えば１、２、３、４、５または６時間毎に１回潅流することができる。好ましい実施形態において、胎盤の潅流および潅流溶液、例えば細胞収集組成物の収集は、回収した有核細胞の数が細胞１００個／ｍｌ未満に落ちるまで繰り返される。異なるタイムポイントでの潅流液はさらに、時間依存的な細胞、例えば幹細胞の集団を回収するために個々に加工することができる。異なるタイムポイントからの潅流液はまた、プールすることもできる。好ましい実施形態において、胎盤接着性細胞は、排除後の約８時間から約１８時間の間の１つの時点または複数の時点で収集される。
【０１６５】
潅流は、好ましくは、前記溶液で潅流されておらず、胎盤接着性細胞を得るための別段の処置（例えば、組織の破壊、例えば酵素消化による）がなされていない哺乳類胎盤から入手可能な数より有意に多くの胎盤接着性細胞の収集をもたらす。この状況において、「より有意に多く」は、少なくとも１０％より多いことを意味する。潅流は、例えば胎盤またはその一部を培養した培養培地から分離可能な胎盤接着性細胞の数より有意に多くの胎盤接着性細胞を生じる。
【０１６６】
胎盤細胞は、１つまたは複数のプロテアーゼまたは他の組織を破壊する酵素を含む溶液での潅流によって胎盤から単離することができる。具体的な実施形態において、胎盤またはその部分（例えば、羊膜、羊膜および柔毛膜、胎盤小葉もしくは絨毛叢、臍帯、または前述のもののいずれかの組合せ）を２５〜３７℃にして、２００ｍＬの培養培地中の１つまたは複数の組織を破壊する酵素と共に３０分インキュベートする。潅流液からの細胞を収集し、４℃にして、５ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭジチオスレイトールおよび２ｍＭベータ−メルカプトエタノールを含む冷たい阻害剤混合物で洗浄する。数分後に冷たい（例えば、４℃の）幹細胞収集組成物で胎盤接着性細胞を洗浄する。
【０１６７】
５．４．５  胎盤細胞の単離、ソーティング、および特徴付け
単離された胎盤接着性細胞、例えば上記の５．３章に記載される細胞は、潅流により得られたか、または物理的な破壊、例えば酵素消化により得られたかにかかわらず、最初に、Ｆｉｃｏｌｌ勾配遠心分離によって他の細胞から精製することができる（すなわち、それから単離することができる）。このような遠心分離は、遠心分離速度などに関してどのような標準的なプロトコールに従っていてもよい。一実施形態において、例えば、胎盤から収集された細胞を、５０００×ｇで１５分、室温での遠心分離によって潅流液から回収し、それにより例えば混入している死細胞片および血小板から細胞を分離する。別の実施形態において、胎盤潅流液を約２００ｍｌに濃縮し、穏やかにＦｉｃｏｌｌ上に層化して、約１１００×ｇで２０分、２２℃で遠心分離し、さらなる加工のために低密度の細胞の境界層を収集する。
【０１６８】
細胞ペレットは、新鮮な幹細胞収集組成物、または細胞の維持、例えば、幹細胞の維持に好適な培地、例えば、２Ｕ／ｍｌヘパリンおよび２ｍＭのＥＤＴＡ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、Ｎ．Ｙ．）を含有するＩＭＤＭ無血清培地に再懸濁することができる。総単核細胞画分は、例えば、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ｎｙｃｏｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａ、Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）を製造元の推奨された手順に従って使用して単離することができる。
【０１６９】
潅流または消化により得られた胎盤細胞は、例えば、さらに、または最初に、例えば０．２％ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  Ｍｏ．）を含む０．０５％トリプシン溶液を使用する示差的なトリプシン処理によって単離することができる。単離された胎盤接着性細胞は、組織培養プラスチック接着性であり、典型的には約５分以内にプラスチック表面から取り外されるため、示差的なトリプシン処理が可能であり、それに対して他の接着性集団は、典型的には２０〜３０分より長いインキュベーションを必要とする。取り外された胎盤接着性細胞は、例えばトリプシン中和溶液（Ｔｒｙｐｓｉｎ  Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ；ＴＮＳ、Ｃａｍｂｒｅｘ）を使用するトリプシン処理およびトリプシン中和後、収穫することができる。接着細胞単離の一実施形態において、例えば細胞約５〜１０×１０６個のアリコートを、数々のＴ−７５フラスコ、好ましくはフィブロネクチンでコーティングしたＴ７５フラスコのそれぞれ中に入れる。このような実施形態において、細胞を市販の間充織幹細胞増殖培地（ＭＳＣＧＭ）（Ｃａｍｂｒｅｘ）で培養して、組織培養インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）中に入れることができる。１０から１５日後、ＰＢＳで洗浄することによって非接着細胞をフラスコから除去する。次いでＰＢＳをＭＳＣＧＭで交換する。様々な接着細胞タイプの存在について、特定には線維芽細胞様細胞のクラスターの同定および拡張について、フラスコを、好ましくは毎日検査することができる。
【０１７０】
哺乳類胎盤から収集された細胞の数およびタイプは、例えば、例えばフローサイトメトリー、セルソーティング、免疫細胞化学（例えば、組織特異的なまたは細胞−マーカー特異的な抗体での染色）、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）、磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）などの標準的な細胞検出技術を使用して形態および細胞表面マーカーの変化を測定することによって、光学または共焦点顕微鏡法を使用する細胞の形態の検査によって、および／または例えばＰＣＲおよび遺伝子発現プロファイリングなどの当業界において周知の技術を使用して遺伝子発現の変化を測定することによってモニターすることができる。これらの技術はまた、１つまたは複数の特定のマーカーに関して陽性である細胞を同定するのにも使用することができる。例えば、ＣＤ３４に対する抗体を使用して、上記技術を使用して、細胞が検出可能な量のＣＤ３４を含むのかどうかを決定することができ、含む場合、細胞はＣＤ３４＋である。同様に、細胞が、ＲＴ−ＰＣＲによって検出するのに十分なＯＣＴ−４  ＲＮＡを産生するか、または成体細胞より有意に多くのＯＣＴ−４  ＲＮＡを産生する場合、その細胞は、細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ３４などのＣＤマーカー）に対するＯＣＴ−４＋抗体であり、幹細胞特異的遺伝子、例えばＯＣＴ−４などの配列は当業界において周知である。
【０１７１】
胎盤細胞、特にＦｉｃｏｌｌ分離、示差的な接着、またはそれら両方の組合せによって単離された細胞は、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）を使用してソートされてもよい。蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）は、細胞などの粒子を、粒子の蛍光特性に基づいて分離するための周知の方法である（非特許文献２）。個々の粒子の蛍光性部分のレーザー励起は、混合物からの陽性および陰性粒子の電磁気分離を可能にする小さい電荷を生じる。一実施形態において、細胞表面マーカー特異的な抗体またはリガンドは、別個の蛍光標識で標識される。細胞をセルソーターを介して処理することにより、使用される抗体に結合するそれらの能力に基づいて細胞の分離が可能になる。ＦＡＣＳでソートされた粒子は、分離およびクローニングを容易にするために、９６−ウェルまたは３８４−ウェルプレートの個々のウェルに直接堆積させることができる。
【０１７２】
１つのソーティングスキームにおいて、胎盤からの細胞、例えば胎盤接着性細胞は、マーカーＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＯＣＴ−４および／またはＨＬＡ−Ｇの１つまたは複数の発現に基づきソートされる。これは、培養中のそれらの接着特性に基づきこのような細胞を選択するための手順と共に達成することができる。例えば、組織培養プラスチックへの接着の選択は、マーカー発現に基づきソーティングの前または後に達成することができる。一実施形態において、例えば、細胞はまず、それらのＣＤ３４発現に基づきソートされ、ＣＤ３４−細胞が保持されて、加えてＣＤ２００＋およびＨＬＡ−Ｇ−であるＣＤ３４−細胞が、全ての他のＣＤ３４−細胞から分離される。別の実施形態において、胎盤からの細胞は、それらのマーカーＣＤ２００および／またはＨＬＡ−Ｇの発現に基づきソートされ、例えば、ＣＤ２００を提示しＨＬＡ−Ｇが欠如した細胞が、さらなる使用のために単離される。具体的な実施形態において、例えばＣＤ２００を発現し、および／または例えばＨＬＡ−Ｇがない細胞は、それらのＣＤ７３および／もしくはＣＤ１０５、または抗体ＳＨ２、ＳＨ３もしくはＳＨ４によって認識されるエピトープの発現、またはＣＤ３４、ＣＤ３８もしくはＣＤ４５の発現の欠如に基づきさらにソートすることができる。例えば、別の実施形態において、胎盤接着性細胞は、ＣＤ２００、ＨＬＡ−Ｇ、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ３４、ＣＤ３８およびＣＤ４５の発現またはそれらの欠如によってソートされ、ＣＤ２００＋、ＨＬＡ−Ｇ−、ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−およびＣＤ４５−である胎盤接着性細胞が、さらなる使用のために他の胎盤接着性細胞から単離される。
【０１７３】
ソートされた胎盤接着性細胞の上記実施形態のいずれかの具体的な実施形態において、ソーティング後に残存する細胞集団中の細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％が、前記単離された胎盤接着性細胞である。胎盤細胞は、上記の５．３章に記載されるマーカーのいずれかの１つまたは複数によってソートすることができる。
【０１７４】
具体的な実施形態において、例えば、（１）組織培養プラスチックに接着性であり、（２）ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−およびＣＤ１０５＋である胎盤接着性細胞が、他の胎盤接着性細胞からソートされる（すなわち、それから単離される）。別の具体的な実施形態において、（１）組織培養プラスチックに接着性であり、（２）ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋およびＣＤ２００＋である胎盤接着性細胞が、他の胎盤接着性細胞からソートされる（すなわち、それから単離される）。別の具体的な実施形態において、（１）組織培養プラスチックに接着性であり、（２）ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ４５−、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋およびＣＤ２００＋である胎盤接着性細胞が、他の胎盤接着性細胞からソートされる（すなわち、それから単離される）。
【０１７５】
胎盤接着性細胞のヌクレオチド配列ベースの検出に関して、本明細書に列挙したマーカーの配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋまたはＥＭＢＬなどの公開された形で利用可能なデータベースで容易に入手可能である。
【０１７６】
胎盤接着性細胞、例えば胎盤幹細胞または複能性胎盤細胞の抗体媒介性検出およびソーティングに関して、特定のマーカーに特異的なあらゆる抗体が、細胞の検出およびソーティング（例えば、蛍光活性化セルソーティング）に好適なあらゆるフルオロフォアまたは他の標識と組み合わせて使用することができる。特異的なマーカーに対する抗体／フルオロフォアの組合せとしては、これらに限定されないが、ＨＬＡ−Ｇ（Ｓｅｒｏｔｅｃ、ローリー、ノースカロライナ州より入手可能）、ＣＤ１０（ＢＤ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、サンノゼ、カリフォルニア州より入手可能）、ＣＤ４４（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、サンノゼ、カリフォルニア州より入手可能）、およびＣＤ１０５（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、ミネアポリス、ミネソタ州より入手可能）に対するフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）コンジュゲートモノクローナル抗体；  ＣＤ４４、ＣＤ２００、ＣＤ１１７、およびＣＤ１３に対するフィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲートモノクローナル抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）；  ＣＤ３３およびＣＤ１０に対するフィコエリトリン−Ｃｙ７（ＰＥＣｙ７）コンジュゲートモノクローナル抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）；  ＣＤ３８に対するアロフィコシアニン（ＡＰＣ）コンジュゲートストレプトアビジンおよびモノクローナル抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）；およびビオチン化ＣＤ９０（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）が挙げられる。使用できる他の抗体としては、これらに限定されないが、ＣＤ１３３−ＡＰＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、ＫＤＲ−ビオチン（ＣＤ３０９、Ａｂｃａｍ）、サイトケラチンＫ−Ｆｉｔｃ（ＳｉｇｍａまたはＤａｋｏ）、ＨＬＡ  ＡＢＣ−Ｆｉｔｃ（ＢＤ）、ＨＬＡ  ＤＲ、ＤＱ、ＤＰ−ＰＥ（ＢＤ）、β−２−ミクログロブリン−ＰＥ（ＢＤ）、ＣＤ８０−ＰＥ（ＢＤ）およびＣＤ８６−ＡＰＣ（ＢＤ）が挙げられる。使用できる他の抗体／標識の組合せとしては、これらに限定されないが、ＣＤ４５−ＰｅｒＣＰ（ペリジニン（ｐｅｒｉｄｉｎ）クロロフィルタンパク質）；ＣＤ４４−ＰＥ；ＣＤ１９−ＰＥ；ＣＤ１０−Ｆ（フルオレセイン）；ＨＬＡ−Ｇ−Ｆおよび７−アミノ−アクチノマイシン−Ｄ（７−ＡＡＤ）；ＨＬＡ−ＡＢＣ−Ｆ；および同種のものが挙げられる。この列挙は全てを網羅したわけではなく、他の供給元からの他の抗体も商業的に利用可能である。
【０１７７】
本明細書で提供される単離された胎盤接着性細胞は、ＣＤ１１７またはＣＤ１３３に関して、例えば、フィコエリトリン−Ｃｙ５（ＰＥ  Ｃｙ５）コンジュゲートストレプトアビジンと、ＣＤ１１７またはＣＤ１３３に対するビオチンコンジュゲートモノクローナル抗体とを使用してアッセイすることができる。しかしながら、このシステムを使用して、細胞は、比較的高いバックグラウンドのために、ＣＤ１１７またはＣＤ１３３それぞれに関して陽性のように見える可能性がある。
【０１７８】
単離された胎盤接着性細胞は、単一のマーカーに対する抗体で標識して、検出および／ソートすることができる。また胎盤細胞は、異なるマーカーに対する複数の抗体で同時に標識することもできる。
【０１７９】
別の実施形態において、磁気ビーズを使用して、細胞を分離することができる。細胞は、磁気ビーズ（直径０．５〜１００μｍ）と結合するそれらの能力に基づいて粒子を分離するための方法である磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）技術を使用してソートすることができる。磁気マイクロスフェアに、特定の細胞表面分子またはハプテンを特異的に認識する抗体の共有結合による付加などの様々な有用な改変を行ってもよい。次いでビーズを細胞と混合して、結合を可能にする。次いで細胞を磁場に通過させて、特異的な細胞表面マーカーを有する細胞を分離する。一実施形態において、次いでこれらの細胞を単離して、追加の細胞表面マーカーに対する抗体にカップリングされた磁気ビーズと再混合することができる。細胞を磁場に再度通過させて、両方の抗体に結合した細胞を単離する。次いでこのような細胞を希釈して、別々のプレート、例えばクローン単離のためのマイクロタイタープレートなどに移すことができる。
【０１８０】
単離された胎盤接着性細胞はまた、細胞形態学および増殖特徴に基づいて特徴付けおよび／またはソートすることもできる。例えば、単離された胎盤接着性細胞は、培養中、例えば線維芽細胞様の外観を有するとして特徴付けることができ、および／または線維芽細胞様の外観に基づき選択することができる。単離された胎盤接着性細胞はまた、胚様体を有するとして特徴付けることもでき、および／または胚様体を形成するそれらの能力に基づき選択することもできる。一実施形態において、例えば、培養中、形状が線維芽細胞様であり、ＣＤ７３およびＣＤ１０５を発現し、１つまたは複数の胚様体を産生する胎盤接着性細胞が、他の胎盤接着性細胞から単離される。別の実施形態において、培養中１つまたは複数の胚様体を産生するＯＣＴ−４＋胎盤接着性細胞が、他の胎盤接着性細胞から単離される。
【０１８１】
別の実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、コロニー形成単位アッセイによって同定および特徴付けすることができる。コロニー形成単位アッセイは一般的に当業界で公知であり、例えばＭＥＳＥＮＣＵＬＴ（商標）培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ）などである。
【０１８２】
単離された胎盤接着性細胞は、生存能、増殖可能性、および寿命に関して、例えばトリパンブルー排除アッセイ、フルオレセイン二酢酸取り込みアッセイ、ヨウ化プロピジウム取り込みアッセイ（生存能を評価するため）；およびチミジン取り込みアッセイ、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）細胞増殖アッセイ（増殖を評価するため）などの当業界において公知の標準的な技術を使用して評価することができる。寿命は、当業界において周知の方法によって、例えば長期の培養で集団倍加の最大回数を決定することによって決定することができる。
【０１８３】
単離された胎盤接着性細胞、例えば上記の５．３章に記載される単離された胎盤接着性細胞はまた、当業界において公知の他の技術、例えば、所望の細胞の選択的な成長（陽性選択）、不要な細胞の選択的な破壊（陰性選択）；例えばダイズ凝集素を用いた場合のような混成の集団中の示差的な細胞の凝集力に基づく分離；凍結融解手順；濾過；従来のおよびゾーン遠心分離；遠心水簸（対向流遠心分離（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｓｔｒｅａｍｉｎｇ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ））；単位重力分離；向流分配；電気泳動などを使用して、他の胎盤接着性細胞から分離することもできる。
【０１８４】
５．５  単離された胎盤細胞の培養
５．５．１  培養培地
単離された胎盤接着性細胞、または単離された胎盤接着性細胞の集団、または胎盤接着性細胞が生じる細胞もしくは胎盤組織は、細胞培養を開始したりまたは植え付けたりするのに使用することができる。細胞は、一般的に、コーティングされていない滅菌組織培養容器、またはラミニン、コラーゲン（例えば、天然または変性）、ゼラチン、フィブロネクチン、オルニチン、ビトロネクチン、ポリリシン、ＣＥＬＬＳＴＡＲＴ（商標）、および／または細胞外膜タンパク質（例えば、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（ＢＤ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌａｂｗａｒｅ、ベッドフォード、マサチューセッツ州））、または他の好適な生体分子または合成模倣剤などの細胞外マトリックスまたはリガンドでコーティングされた滅菌組織培養容器のいずれかに移される。
【０１８５】
単離された胎盤接着性細胞は、当業界において細胞、例えば幹細胞の培養に許容できると認められているあらゆる培地中およびあらゆる条件下で培養することができる。好ましくは、培養培地は、血清を含む。単離された胎盤接着性細胞は、例えば、ＩＴＳ（インスリン−トランスフェリン−セレニウム）、ＬＡ＋ＢＳＡ（リノール酸−ウシ血清アルブミン）、デキサメタゾンＬ−アスコルビン酸、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＩＧＦ−１、およびペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ−ＬＧ（ダルベッコ改変必須培地、低グルコース）／ＭＣＤＢ２０１（ニワトリ線維芽細胞基礎培地）；１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ−ＨＧ（高グルコース）；１５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ−ＨＧ；１０％ＦＢＳ、１０％ウマ血清、およびヒドロコルチゾンを含むＩＭＤＭ（イスコフ改変ダルベッコ培地）；１％から２０％のＦＢＳ、ＥＧＦ、およびヘパリンを含むＭ１９９；１０％のＦＢＳ、ＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）およびゲンタマイシンを含むα−ＭＥＭ（最小必須培地）；１０％のＦＢＳ、ＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）およびゲンタマイシンを含むＤＭＥＭなどの中で培養することができる。
【０１８６】
胎盤接着性細胞を培養するのに使用できる他の培地としては、ＤＭＥＭ（高または低グルコース）、イーグル基礎培地、ハムＦ１０培地（Ｆ１０）、ハムＦ−１２培地（Ｆ１２）、イスコフ改変ダルベッコ培地、間葉系幹細胞増殖培地（ＭＳＣＧＭ）、ライボビッツＬ−１５培地、ＭＣＤＢ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＲＰＭＩ１６４０、アドバンストＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）、ＤＭＥＭ／ＭＣＤＢ２０１（Ｓｉｇｍａ）、およびＣＥＬＬ−ＧＲＯ  ＦＲＥＥが挙げられる。
【０１８７】
培養培地には、例えば、血清（例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、好ましくは約２〜１５％（ｖ／ｖ）；ウマ科動物（ウマ）血清（ＥＳ）；ヒト血清（ＨＳ））；ベータ−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、好ましくは約０．００１％（ｖ／ｖ）；１つまたは複数の増殖因子、例えば、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、およびエリスロポイエチン（ＥＰＯ）；Ｌ−バリンなどのアミノ酸；ならびに微生物汚染を制御するための１つまたは複数の抗生物質および／または抗真菌剤、例えば、ペニシリンＧ、硫酸ストレプトマイシン、アンホテリシンＢ、ゲンタマイシン、およびナイスタチンなどの１つまたは複数の要素を、単独で、または組み合わせてのいずれかで補充することができる。
【０１８８】
単離された胎盤接着性細胞は、標準的な組織培養条件で、例えば、組織培養皿またはマルチウェルプレートで培養することができる。単離された胎盤接着性細胞はまた、懸滴方法を使用して培養することもできる。この方法において、単離された胎盤接着性細胞を約５ｍＬの培地中に細胞約１×１０４個／ｍＬで懸濁して、組織培養容器の蓋の内部に、例えば、１００ｍＬペトリ皿の内部に、１滴または複数滴の培地を置く。液滴は、例えば単一の液滴でもよいし、または例えばマルチチャネルピペッターからの複数の液滴でもよい。蓋を慎重に逆転させて、培養皿雰囲気中の含水量を維持するのに十分な体積の液体、例えば滅菌ＰＢＳを含有する培養皿底部の上に置き、幹細胞を培養する。
【０１８９】
一実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、単離された胎盤接着性細胞における未分化の表現型を維持するのに作用する化合物の存在下で培養される。具体的な実施形態において、化合物は、置換３，４−ジヒドロピリミド（ｄｉｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｉｍｏｌ）［４，５−ｄ］ピリミジンである。別の具体的な実施形態において、化合物は、以下の化学構造を有する化合物である：
【０１９０】
【化１】
2020512970.tif 000002
化合物は、例えば約１μＭから約１０μＭの間の濃度で、単離された胎盤接着性細胞、または単離された胎盤接着性細胞の集団と接触させることができる。
【０１９１】
５．５．２  胎盤細胞の拡張および増殖
胎盤細胞または単離された胎盤接着性細胞の集団が単離されたら（例えば、胎盤細胞または胎盤接着性細胞の集団が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて幹細胞または幹細胞の集団が通常付随する胎盤接着性細胞の少なくとも５０％から分離されたら）、細胞または細胞の集団をｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖および拡張することができる。例えば、単離された胎盤接着性細胞の集団は、組織培養容器、例えば培養皿、フラスコ、マルチウェルプレート、または同種のものの中で、細胞が７０〜９０％密集度に増殖するのに十分な時間にわたり、すなわち、細胞およびそれらの後代が組織培養容器の培養表面積の７０〜９０％を占有するまで培養することができる。
【０１９２】
単離された胎盤接着性細胞は、培養容器中に細胞増殖を可能にする密度で植え付けることができる。例えば、細胞は、低密度（例えば、細胞約１，０００から約５，０００個／ｃｍ２）から高密度（例えば、１ｃｍ２当たり細胞約５０，０００個またはそれより多く）に植え付けてもよい。好ましい実施形態において、細胞は、空気中約０から約５パーセント体積のＣＯ２の存在下で培養される。一部の好ましい実施形態において、細胞は、空気中約２から約２５パーセントのＯ２、好ましくは空気中約５から約２０パーセントＯ２で培養される。細胞は、好ましくは約２５℃から約４０℃で、好ましくは３７℃で培養される。細胞は、好ましくはインキュベーター中で培養される。培養培地は、静止であってもよいし、または例えばバイオリアクターを使用して撹拌されてもよい。胎盤細胞、例えば胎盤幹細胞または胎盤複能性細胞は、好ましくは、低い酸化的ストレス下で（例えば、グルタチオン、アスコルビン酸、カタラーゼ、トコフェロール、Ｎ−アセチルシステイン、または同種のものを添加して）増殖される。
【０１９３】
１００％未満の、例えば７０％から９０％の密集度が達成されたら、細胞を継代してもよい。例えば、細胞は、当業界において周知の技術を使用して、酵素処置、例えばトリプシン処理して、それらを組織培養表面から分離することができる。ピペッティングによって細胞を除去して細胞を数えた後、約１０，０００〜１００，０００個／ｃｍ２の細胞が、新鮮な培養培地を含有する新しい培養容器に継代される。典型的には、新しい培地は、単離された胎盤接着性細胞を除去した培地と同じタイプの培地である。単離された胎盤接着性細胞は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、または２０回、またはそれより多くの回数、少なくともそれらの回数、またはそれら以下の回数で継代することができる。
【０１９４】
５．５．３  単離された胎盤細胞集団
また、本明細書に記載される方法および組成物において有用な、単離された胎盤接着性細胞集団、例えば上記の５．３章に記載される単離された胎盤接着性細胞集団も本明細書で提供される。単離された胎盤接着性細胞の集団は、１つまたは複数の胎盤から直接的に単離することができ、すなわち細胞集団は、単離された胎盤接着性細胞を含む胎盤接着性細胞集団であってもよく、単離された胎盤接着性細胞は、潅流液から得られるかもしくは潅流液中に含有され、または破壊された胎盤組織、例えば胎盤組織の消化されたもの（すなわち、胎盤またはその部分の酵素消化により得られた細胞の収集物）から得られるかもしくはその中に含有される。また本明細書に記載される単離された胎盤接着性細胞を培養および拡張して、単離された胎盤接着性細胞集団を産生することもできる。また単離された胎盤接着性細胞を含む胎盤接着性細胞集団を培養および拡張して、胎盤細胞集団を産生することもできる。
【０１９５】
本明細書で提供される処置の方法において有用な胎盤細胞集団は、単離された胎盤接着性細胞、例えば本明細書の５．３章に記載されたような単離された胎盤接着性細胞を含む。様々な実施形態において、胎盤細胞集団中の細胞の、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％は、単離された胎盤接着性細胞である。すなわち単離された胎盤接着性細胞集団は、例えば、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もの単離された胎盤接着性細胞ではない細胞を含んでいてもよい。
【０１９６】
本明細書に記載される方法および組成物において有用な単離された胎盤細胞集団は、例えば、酵素消化から得たのかまたは潅流から得たのかにかかわらず、特定のマーカーおよび／または特定の培養のまたは形態学的な特徴を発現する単離された胎盤接着性細胞を選択することによって産生することができる。一実施形態において、例えば、（ａ）基材に接着し、（ｂ）ＣＤ２００を発現し、ＨＬＡ−Ｇの発現が欠如している胎盤接着性細胞を選択すること；および前記細胞を他の細胞から単離して、細胞集団を形成することによって細胞集団を産生する方法が本明細書で提供される。別の実施形態において、細胞集団は、ＣＤ２００を発現し、ＨＬＡ−Ｇの発現が欠如している胎盤接着性細胞を選択すること、および前記細胞を他の細胞から単離して、細胞集団を形成することによって産生される。別の実施形態において、細胞集団は、（ａ）基材に接着し、（ｂ）ＣＤ７３、ＣＤ１０５、およびＣＤ２００を発現する胎盤接着性細胞を選択すること；および前記細胞を他の細胞から単離して、細胞集団を形成することによって産生される。別の実施形態において、細胞集団は、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、およびＣＤ２００を発現する胎盤接着性細胞を同定すること、および前記細胞を他の細胞から単離して、細胞集団を形成することによって産生される。別の実施形態において、細胞集団は、（ａ）基材に接着し、（ｂ）ＣＤ２００およびＯＣＴ−４を発現する胎盤接着性細胞を選択すること；および前記細胞を他の細胞から単離して、細胞集団を形成することによって産生される。別の実施形態において、細胞集団は、ＣＤ２００およびＯＣＴ−４を発現する胎盤接着性細胞を選択すること、および前記細胞を他の細胞から単離して、細胞集団を形成することによって産生される。別の実施形態において、細胞集団は、（ａ）基材に接着し、（ｂ）ＣＤ７３およびＣＤ１０５を発現し、（ｃ）前記集団が胚様体様体の形成を可能にする条件下で培養される場合、前記幹細胞を含む胎盤接着性細胞集団における１つまたは複数の胚様体様体の形成を容易にする胎盤接着性細胞を選択すること；および前記細胞を他の細胞から単離して、細胞集団を形成することによって産生される。別の実施形態において、細胞集団は、ＣＤ７３およびＣＤ１０５を発現し、前記集団が胚様体様体の形成を可能にする条件下で培養される場合、前記幹細胞を含む胎盤接着性細胞集団における１つまたは複数の胚様体様体の形成を容易にする胎盤接着性細胞を選択すること、および前記細胞を他の細胞から単離して、細胞集団を形成することによって産生される。別の実施形態において、細胞集団は、（ａ）基材に接着し、（ｂ）ＣＤ７３およびＣＤ１０５を発現し、ＨＬＡ−Ｇの発現が欠如している胎盤接着性細胞を選択すること；および前記細胞を他の細胞から単離して、細胞集団を形成することによって産生される。別の実施形態において、細胞集団は、ＣＤ７３およびＣＤ１０５を発現し、ＨＬＡ−Ｇの発現が欠如している胎盤接着性細胞を選択すること、および前記細胞を他の細胞から単離して、細胞集団を形成することによって産生される。別の実施形態において、細胞集団を産生する方法は、（ａ）基材に接着し、（ｂ）ＯＣＴ−４を発現し、（ｃ）前記集団が胚様体様体の形成を可能にする条件下で培養される場合、前記幹細胞を含む胎盤接着性細胞集団における１つまたは複数の胚様体様体の形成を容易にする胎盤接着性細胞を選択すること；および前記細胞を他の細胞から単離して、細胞集団を形成することを含む。別の実施形態において、細胞集団は、ＯＣＴ−４を発現し、前記集団が胚様体様体の形成を可能にする条件下で培養される場合、前記幹細胞を含む胎盤接着性細胞集団における１つまたは複数の胚様体様体の形成を容易にする胎盤接着性細胞を選択すること、および前記細胞を他の細胞から単離して、細胞集団を形成することによって産生される。
【０１９７】
別の実施形態において、細胞集団は、（ａ）基材に接着し、（ｂ）ＣＤ１０およびＣＤ１０５を発現し、ＣＤ３４を発現しない胎盤接着性細胞を選択すること；および前記細胞を他の細胞から単離して、細胞集団を形成することによって産生される。別の実施形態において、細胞集団は、ＣＤ１０およびＣＤ１０５を発現し、ＣＤ３４を発現しない胎盤接着性細胞を選択すること、および前記細胞を他の細胞から単離して、細胞集団を形成することによって産生される。別の実施形態において、細胞集団は、（ａ）基材に接着し、（ｂ）ＣＤ１０、ＣＤ１０５、およびＣＤ２００を発現し、ＣＤ３４を発現しない胎盤接着性細胞を選択すること；および前記細胞を他の細胞から単離して、細胞集団を形成することによって産生される。別の実施形態において、細胞集団は、ＣＤ１０、ＣＤ１０５、およびＣＤ２００を発現し、ＣＤ３４を発現しない胎盤接着性細胞を選択すること、および前記細胞を他の細胞から単離して、細胞集団を形成することによって産生される。別の具体的な実施形態において、細胞集団は、（ａ）基材に接着し、（ｂ）ＣＤ１０、ＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＣＤ２００を発現し、ＣＤ３４およびＣＤ４５を発現しない胎盤接着性細胞を選択すること；および前記細胞を他の細胞から単離して、細胞集団を形成することによって産生される。別の具体的な実施形態において、細胞集団は、ＣＤ１０、ＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＣＤ２００を発現し、ＣＤ３４およびＣＤ４５を発現しない胎盤接着性細胞を選択すること、および前記細胞を他の細胞から単離して、細胞集団を形成することによって産生される。
【０１９８】
上記の５．３章に記載されるマーカーの組合せのいずれかを有する胎盤接着性細胞を含む細胞集団の選択物は、類似の様式で単離してもよいし、または入手してもよい。
【０１９９】
上記実施形態のいずれかにおいて、単離された細胞集団の選択は、加えて、ＡＢＣ−ｐ（胎盤特異的なＡＢＣ輸送タンパク質；例えば非特許文献３を参照）を発現する胎盤接着性細胞を選択することを含んでいてもよい。本方法はまた、例えば間充織幹細胞に特異的な少なくとも１つの特徴、例えばＣＤ４４の発現、ＣＤ９０の発現、または前述のものの組合せの発現を示す細胞を選択することを含んでいてもよい。
【０２００】
上記の実施形態において、基材は、その上で細胞、例えば単離された胎盤接着性細胞の培養および／または選択を達成することができるあらゆる表面であり得る。典型的には、基材は、プラスチック、例えば、組織培養皿またはマルチウェルプレートプラスチックである。組織培養プラスチックは、生体分子、例えば、ラミニンまたはフィブロネクチンでコーティングされていてもよい。
【０２０１】
細胞、例えば単離された胎盤接着性細胞は、細胞選択の分野において公知のあらゆる手段によって、胎盤細胞集団に関して選択することができる。例えば、細胞は、１つまたは複数の細胞表面マーカーに対する抗体または抗体（複数）を使用して、例えば、フローサイトメトリーまたはＦＡＣＳで選択することができる。選択は、抗体を磁気ビーズと共に使用して達成することができる。ある特定の幹細胞に関連するマーカーに特異的な抗体は、当業界において公知である。例えば、ＯＣＴ−４に対する抗体（Ａｂｃａｍ、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）、ＣＤ２００（Ａｂｃａｍ）、ＨＬＡ−Ｇ（Ａｂｅａｍ）、ＣＤ７３（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、サンディエゴ、カリフォルニア州）、ＣＤ１０５（Ａｂｅａｍ；ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ソーコ、メイン州）など。また他のマーカーに対する抗体も、商業的に入手可能であり、例えば、ＣＤ３４、ＣＤ３８およびＣＤ４５は、例えば、ＳｔｅｍＣｅｌｌ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓまたはＢｉｏＤｅｓｉｇｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌより入手可能である。
【０２０２】
単離された胎盤細胞集団は、幹細胞ではない胎盤接着性細胞、または胎盤接着性細胞ではない細胞を含んでいてもよい。
【０２０３】
本明細書に記載される胎盤由来の接着細胞を含む単離された細胞集団は、第２の細胞型、例えば胎盤由来の接着細胞ではない胎盤接着性細胞、または例えば胎盤接着性細胞ではない細胞を含んでいてもよい。例えば、単離された胎盤由来の接着細胞の集団は、第２のタイプの細胞の集団を含んでいてもよく、例えば第２のタイプの細胞の集団と組み合わせてもよく、前記第２のタイプの細胞は、例えば、胚幹細胞、血液細胞（例えば、胎盤血、胎盤血細胞、臍帯血、臍帯血細胞、末梢血液、末梢血液細胞、胎盤血、臍帯血、または末梢血液由来の有核細胞など）、血液から単離された幹細胞（例えば、胎盤血、臍帯血または末梢血液から単離された幹細胞）、胎盤の潅流液由来の有核細胞、例えば、胎盤の潅流液由来の総有核細胞；臍帯幹細胞、血液由来有核細胞の集団、骨髄由来間葉系間質細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、骨髄由来造血幹細胞、未加工の骨髄、成体（体性）幹細胞、組織内に含有される幹細胞の集団、培養細胞、例えば培養された幹細胞、完全に分化した細胞（例えば、軟骨細胞、線維芽細胞、羊膜細胞、骨芽細胞、筋肉細胞、心細胞など）の集団、周皮細胞などである。具体的な実施形態において、胎盤由来の接着細胞を含む細胞集団は、臍帯由来の胎盤幹細胞または幹細胞を含む。第２のタイプの細胞が血液または血液細胞であるある特定の実施形態において、細胞集団から赤血球が除去されている。
【０２０４】
具体的な実施形態において、第２のタイプの細胞は、造血幹細胞である。このような造血幹細胞は、例えば、未処理の胎盤血、臍帯血または末梢血液内；胎盤血、臍帯血または末梢血液由来の総有核細胞中；単離された胎盤血、臍帯血または末梢血液由来のＣＤ３４＋細胞の集団中；未処理の骨髄中；骨髄由来の総有核細胞中；単離された骨髄由来のＣＤ３４＋細胞の集団中などに含有されていてもよい。
【０２０５】
別の実施形態において、単離された胎盤由来の接着細胞の集団は、血管系由来の複数の成体または前駆細胞と組み合わされる。様々な実施形態において、細胞は、内皮細胞、内皮前駆細胞、筋細胞、心筋細胞、周皮細胞、血管芽細胞、筋原細胞または心筋芽細胞である。
【０２０６】
別の実施形態において、第２の細胞型は、胚幹細胞に関連する多能性および機能のマーカーを発現させるために培養中に操作された、非胚細胞タイプである。
【０２０７】
上記の単離された胎盤由来の接着細胞の集団の具体的な実施形態において、胎盤由来の接着細胞および第２のタイプの細胞のいずれかまたは両方は、意図された細胞のレシピエントに対して、自己であるかまたは同種である。
【０２０８】
別の具体的な実施形態において、組成物は、胎盤由来の接着細胞、および胚幹細胞を含む。別の具体的な実施形態において、組成物は、胎盤由来の接着細胞および間葉系間質または幹細胞、例えば、骨髄由来の間葉系間質または幹細胞を含む。別の具体的な実施形態において、組成物は、骨髄由来造血幹細胞を含む。別の具体的な実施形態において、組成物は、胎盤由来接着細胞および造血前駆細胞、例えば、骨髄、胎児血、臍帯血、胎盤血、および／または末梢血液由来の造血前駆細胞を含む。別の具体的な実施形態において、組成物は、胎盤由来の接着細胞および体性幹細胞を含む。より具体的な実施形態において、前記体性幹細胞は、神経幹細胞、肝幹細胞、膵臓の幹細胞、内皮の幹細胞、心臓の幹細胞、または筋肉の幹細胞である。
【０２０９】
他の具体的な実施形態において、第２のタイプの細胞は、前記集団中の細胞の、約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、もしくは５０％、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、もしくは５０％、または１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、もしくは５０％以下を構成する。他の具体的な実施形態において、前記組成物中の胎盤接着性細胞は、前記組成物中の細胞の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％または９０％を構成する。他の具体的な実施形態において、胎盤由来の接着細胞は、前記集団中の細胞の、約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、もしくは４５％、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、もしくは４５％、または１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、もしくは４５％以下を構成する。
【０２１０】
単離された胎盤由来の接着細胞の集団中の細胞は、別のタイプの複数の細胞と、例えば幹細胞集団と、各集団中の総有核細胞の数を比較して、約１００，０００，０００：１、５０，０００，０００：１、２０，０００，０００：１、１０，０００，０００：１、５，０００，０００：１、２，０００，０００：１、１，０００，０００：１、５００，０００：１、２００，０００：１、１００，０００：１、５０，０００：１、２０，０００：１、１０，０００：１、５，０００：１、２，０００：１、１，０００：１、５００：１、２００：１、１００：１、５０：１、２０：１、１０：１、５：１、２：１、１：１、１：２、１：５、１：１０、１：１００、１：２００、１：５００、１：１，０００、１：２，０００、１：５，０００、１：１０，０００、１：２０，０００、１：５０，０００、１：１００，０００、１：５００，０００、１：１，０００，０００、１：２，０００，０００、１：５，０００，０００、１：１０，０００，０００、１：２０，０００，０００、１：５０，０００，０００、または約１：１００，０００，０００の比率で組み合わせることができる。単離された胎盤由来の接着細胞の集団中の細胞は同様に、複数の細胞型の複数の細胞と組み合わせることができる。
【０２１１】
他の実施形態において、本明細書に記載される胎盤接着性細胞、例えば上述した胎盤接着性細胞の集団は、骨形成性胎盤接着性細胞（ＯＰＡＣ）、例えば、２００９年８月２４日付けで出願された「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｏｎｅ  Ｄｅｆｅｃｔｓ  Ｗｉｔｈ  Ｐｌａｃｅｎｔａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ」という表題の特許文献１３に記載されるＯＰＡＣと組み合わされるか、または羊膜由来の血管新生細胞（ＡＭＤＡＣ）、例えば、「Ａｍｎｉｏｎ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  Ｃｅｌｌｓ」という表題の特許文献１４に記載されるＡＭＤＡＣと組み合わされ、これらの開示は、その全体が参照により組み入れられる。
【０２１２】
５．６  胎盤細胞バンクの産生
産後の胎盤から単離された細胞、例えば上記のセクション５．３に記載される単離された胎盤接着性細胞は、例えばロットのセットを産生するための様々な異なる方法で培養することができ、ここでロットは、単離された胎盤接着性細胞の個別に投与可能な用量のセットである。このようなロットは、例えば、胎盤潅流液からの細胞、または酵素消化された胎盤組織からの細胞から得ることができる。複数の胎盤から得られた胎盤接着性細胞のロットのセットは、例えば長期貯蔵のために、単離された胎盤接着性細胞のバンクに入れることができる。一般的に、組織培養プラスチック接着性の胎盤接着性細胞を胎盤材料の初期培養物から得て、種培養物を形成し、これを制御された条件下で拡張して、およそ同数の倍加により細胞の集団を形成する。ロットは、好ましくは単一の胎盤の組織由来であるが、複数の胎盤の組織由来であってもよい。
【０２１３】
一実施形態において、胎盤細胞のロットは、以下のようにして得られる。まず胎盤組織を、例えば細かく切り刻むことによって破壊し、好適な酵素、例えばトリプシンまたはコラゲナーゼで消化する（上記のセクション５．４．３を参照）。胎盤組織は、好ましくは、例えば、単一の胎盤からの羊膜全体、柔毛膜全体、またはその両方を含むが、羊膜または柔毛膜のいずれかの一部のみを含んでいてもよい。消化された組織を、例えば約１〜３週間、好ましくは約２週間培養する。非接着性細胞の除去後、形成された高密度のコロニーを、例えばトリプシン処理によって収集する。これらの細胞を収集し、便利な体積の培養培地に再懸濁し、次いで拡張培養物に植え付けるのに使用する。拡張培養物は、別個の細胞培養器具、例えばＮＵＮＣ（商標）によるＣｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｙのあらゆる配置であり得る。細胞は、例えば、細胞１×１０３、２×１０３、３×１０３、４×１０３、５×１０３、６×１０３、７×１０３、８×１０３、９×１０３、１×１０４、１×１０４、２×１０４、３×１０４、４×１０４、５×１０４、６×１０４、７×１０４、８×１０４、９×１０４、または１０×１０４個／ｃｍ２で拡張培養物に植え付けられるようなあらゆる程度にさらに分割することができる。好ましくは、各拡張培養物に植え付けるために、細胞約１×１０３から約１×１０４個／ｃｍ２が使用される。拡張培養物の数は、細胞が得られる特定の胎盤に応じてそれより多い数でもよいし、または少ない数でもよい。
【０２１４】
拡張培養物は、培養物中の細胞の密度がある特定の値、例えば細胞約１×１０５個／ｃｍ２に到達するまで増殖させる。細胞は、この時点で、収集して低温保存するか、または上述したような新しい拡張培養に継代するかのいずれでもよい。細胞は、使用前に、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０回継代することができる。集団倍加の累積回数の記録は、好ましくは、拡張培養中に維持される。培養物から細胞は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８もしくは４０回の倍加、または６０回までの倍加で拡張することができる。しかしながら、好ましくは、集団倍加の回数は、細胞の集団を個々の用量に分割する前、約１５から約３０回である。細胞は、拡張プロセスにわたり連続的に培養してもよいし、または拡張中の１つまたは複数の時点で凍結してもよい。
【０２１５】
個々の用量に使用される細胞は、後の使用のために、凍結することができ、例えば低温保存することができる。個々の用量は、例えば、１ｍｌ当たり約１００万から約５０００万個の細胞を含んでいてもよいし、合計で約１０６から約１０１０個の間の細胞を含んでいてもよい。
【０２１６】
それゆえに、一実施形態において、胎盤細胞バンクは、ヒト産後胎盤からの初代培養胎盤接着性細胞を第１の複数回の集団倍加で拡張すること；前記胎盤接着性細胞を低温保存して、マスター細胞バンクを形成すること；マスター細胞バンクから複数の胎盤接着性細胞を第２の複数回の集団倍加で拡張すること；前記胎盤接着性細胞を低温保存して、実用細胞バンクを形成すること；実用細胞バンクから複数の胎盤接着性細胞を第３の複数回の集団倍加で拡張すること；および前記胎盤接着性細胞を、集合的に胎盤細胞バンクを構成する個々の用量で低温保存することを含む方法によって作製することができる。任意選択で、前記第３の複数回の集団倍加からの複数の胎盤接着性細胞は、第４の複数回の集団倍加で拡張し、集合的に胎盤細胞バンクを構成する個々の用量で低温保存することができる。
【０２１７】
別の具体的な実施形態において、前記初代培養胎盤接着性細胞は、胎盤潅流液からの胎盤接着性細胞を含む。別の具体的な実施形態において、前記初代培養胎盤接着性細胞は、消化された胎盤組織からの胎盤接着性細胞を含む。別の具体的な実施形態において、前記初代培養胎盤接着性細胞は、胎盤潅流液からの、および消化された胎盤組織からの胎盤接着性細胞を含む。別の具体的な実施形態において、前記胎盤細胞の初代培養中の前記胎盤接着性細胞の全ては、同じ胎盤に由来する。別の具体的な実施形態において、本方法は、前記実用細胞バンクからの前記複数の前記胎盤接着性細胞から、ＣＤ２００＋またはＨＬＡ−Ｇ−胎盤接着性細胞を選択して、個々の用量を形成する工程をさらに含む。別の具体的な実施形態において、前記個々の用量は、約１０４から約１０５個の胎盤接着性細胞を含む。別の具体的な実施形態において、前記個々の用量は、約１０５から約１０６個の胎盤接着性細胞を含む。別の具体的な実施形態において、前記個々の用量は、約１０６から約１０７個の胎盤接着性細胞を含む。別の具体的な実施形態において、前記個々の用量は、約１０７から約１０８個の胎盤接着性細胞を含む。別の具体的な実施形態において、前記個々の用量は、約１０８から約１０９個の胎盤接着性細胞を含む。別の具体的な実施形態において、前記個々の用量は、約１０９から約１０１０個の胎盤接着性細胞を含む。
【０２１８】
好ましい実施形態において、胎盤が得られるドナー（例えば、母親）は、少なくとも１つの病原体に関して試験される。母親が試験された病原体に関して陽性と試験されたら、その胎盤からのロット全体が廃棄される。このような試験は、胎盤細胞ロットの産生中、例えば拡張培養中のあらゆる時点で実行することができる。存在が試験される病原体としては、これらに限定されないが、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、Ｅ型肝炎、ヒト免疫不全ウイルス（ＩおよびＩＩ型）、サイトメガロウイルス、ヘルペスウイルス、および同種のものを挙げることができる。
【０２１９】
５．７  胎盤細胞の保存
単離された胎盤接着性細胞、例えば上記のセクション５．３に記載される単離された胎盤接着性細胞は、保存することができ、すなわち、長期間の貯蔵を可能にする条件下、または例えばアポトーシスまたは壊死による細胞死を阻害する条件下に置くことができる。
【０２２０】
胎盤細胞は、例えば、その開示が参照によりその全体が本明細書に組み入れられる関連する特許文献６に記載されるように、アポトーシス阻害剤、壊死阻害剤および／または酸素運搬ペルフルオロカーボンを含む組成物を使用して保存することができる。一実施形態において、本明細書に記載される方法および組成物において有用な細胞の集団を保存する方法は、前記細胞の集団を、アポトーシス阻害剤および酸素運搬ペルフルオロカーボンを含む細胞収集組成物と接触させることを含み、前記アポトーシス阻害剤は、アポトーシス阻害剤と接触させていない細胞の集団と比較して、細胞の集団においてアポトーシスを低減または予防するのに十分な量および時間で存在する。具体的な実施形態において、前記アポトーシス阻害剤は、カスパーゼ阻害剤である。別の具体的な実施形態において、前記アポトーシス阻害剤は、ＪＮＫ阻害剤である。別の具体的な実施形態において、前記ＪＮＫ阻害剤は、前記細胞の分化または増殖をモジュレートしない。別の実施形態において、前記細胞収集組成物は、前記アポトーシス阻害剤および前記酸素運搬ペルフルオロカーボンを、別個の相中に含む。別の実施形態において、前記細胞収集組成物は、前記アポトーシス阻害剤および前記酸素運搬ペルフルオロカーボンを、エマルジョン中に含む。別の実施形態において、細胞収集組成物は加えて、乳化剤、例えばレシチンを含む。別の実施形態において、前記アポトーシス阻害剤および前記ペルフルオロカーボンは、細胞を接触させるときに、約０℃から約２５℃の間である。別の具体的な実施形態において、前記アポトーシス阻害剤および前記ペルフルオロカーボンは、細胞を接触させるときに、約２℃から１０℃の間、または約２℃から約５℃の間である。別の具体的な実施形態において、前記接触は、前記細胞の集団の輸送中に実行される。別の具体的な実施形態において、前記接触は、前記細胞の集団の凍結および融解中に実行される。
【０２２１】
胎盤接着性細胞の集団は、例えば、前記細胞の集団を、アポトーシス阻害剤および臓器保存化合物と接触させることを含み、前記アポトーシス阻害剤は、アポトーシス阻害剤と接触させていない細胞の集団と比較して、細胞の集団においてアポトーシスを低減または予防するのに十分な量および時間で存在する、方法によって保存することができる。具体的な実施形態において、臓器保存化合物は、ＵＷ溶液（特許文献１５に記載される；ＶｉａＳｐａｎとしても公知；非特許文献４も参照）またはスターン（Ｓｔｅｒｎ）ら、特許文献１６に記載される溶液であり、これらの開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる。別の実施形態において、前記臓器保存化合物は、ヒドロキシエチルデンプン、ラクトビオン酸、ラフィノース、またはそれらの組合せである。別の実施形態において、細胞収集組成物は加えて、２つの相中、またはエマルジョンとしてのいずれかで酸素運搬ペルフルオロカーボンを含む。
【０２２２】
本方法の別の実施形態において、胎盤接着性細胞は、潅流中に、アポトーシス阻害剤および酸素運搬ペルフルオロカーボン、臓器保存化合物、またはそれらの組合せを含む細胞収集組成物と接触させる。別の実施形態において、前記細胞は、組織破壊、例えば酵素消化のプロセス中に接触させる。別の実施形態において、胎盤接着性細胞は、潅流による収集後、または組織破壊、例えば酵素消化による収集後に前記細胞収集化合物と接触させる。
【０２２３】
典型的には、胎盤細胞の収集、濃縮および単離中に、低酸素症および機械的応力による細胞ストレスを最小化するかまたはなくすことが好ましい。それゆえに、本方法の別の実施形態において、細胞または細胞の集団は、収集、濃縮または単離中に、前記保存中に６時間未満、低酸素状態に曝露され、ここで低酸素状態は、正常な血液酸素濃度より低い酸素濃度である。別の具体的な実施形態において、前記細胞の集団は、前記保存中に２時間未満、前記低酸素状態に曝露される。別の具体的な実施形態において、前記細胞の集団は、収集、濃縮または単離中に、１時間未満、または３０分未満、前記低酸素状態に曝露されるか、または低酸素状態に曝露されない。別の具体的な実施形態において、前記細胞の集団は、収集、濃縮または単離中に剪断応力に曝露されない。
【０２２４】
胎盤細胞は、小さい容器、例えばアンプルで、例えば低温保存培地中で低温保存することができる。好適な低温保存培地としては、これらに限定されないが、例えば増殖培地などの培養培地、または細胞凍結培地、例えば市販の細胞凍結培地、例えば、Ｃ２６９５、Ｃ２６３９またはＣ６０３９（Ｓｉｇｍａ）が挙げられる。低温保存培地は、好ましくは、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を、約２％から約１５％（ｖ／ｖ）、例えば約１０％（ｖ／ｖ）の濃度で含む。低温保存培地は、追加の薬剤、例えばメチルセルロースおよび／またはグリセロールを含んでいてもよい。胎盤細胞は、好ましくは、低温保存中に約１℃／分で冷却される。好ましい低温保存温度は、約−８０℃から約−１８０℃、好ましくは約−１２５℃から約−１４０℃である。低温保存された細胞は、使用のために融解する前に液体窒素に移すことができる。一部の実施形態において、例えば、アンプルが約−９０℃に達したら、それらは液体窒素貯蔵エリアに移される。低温保存はまた、速度制御された冷凍庫を使用して行うこともできる。低温保存された細胞は、好ましくは、約２５℃から約４０℃の温度で、好ましくは約３７℃の温度に融解させる。
【０２２５】
５．８  単離された胎盤細胞を含む組成物
本明細書に、例えば５．３章に記載される胎盤接着性細胞は、本明細書に記載される方法および組成物で使用するための、あらゆる生理的に許容できるまたは医学的に許容できる化合物、組成物またはデバイスと組み合わせることができる。本明細書で提供される処置方法において有用な組成物は、本明細書に記載される胎盤接着性細胞のいずれか１つまたは複数を含んでいてもよい（上記のセクション５．３を参照）。ある特定の実施形態において、組成物は、医薬的に許容できる担体中の、医薬的に許容できる組成物、例えば胎盤接着性細胞を含む組成物である。
【０２２６】
ある特定の実施形態において、単離された胎盤接着性細胞を含む組成物は、加えて、マトリックス、例えば、脱細胞化したマトリックスまたは合成マトリックスを含む。別の具体的な実施形態において、前記マトリックスは、３次元の足場である。別の具体的な実施形態において、前記マトリックスは、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、フィブロネクチン、ペクチン、オルニチン、またはビトロネクチンを含む。別のまたは具体的な実施形態において、マトリックスは、羊膜または羊膜由来のバイオマテリアルである。別の具体的な実施形態において、前記マトリックスは、細胞外膜タンパク質を含む。別の具体的な実施形態において、前記マトリックスは、合成化合物を含む。別の具体的な実施形態において、前記マトリックスは、生物活性化合物を含む。別の具体的な実施形態において、前記生物活性化合物は、増殖因子、サイトカイン、抗体、または５，０００ダルトン未満の有機分子である。
【０２２７】
別の実施形態において、本明細書で提供される処置の方法において有用な組成物は、前述の胎盤接着性細胞のいずれか、または前述の胎盤接着性細胞集団のいずれかによって馴化した培地を含む。
【０２２８】
５．８．１  低温保存した単離された胎盤細胞
本明細書に記載される方法および組成物において有用な単離された胎盤細胞集団は、その後の使用のために、保存することができ、例えば、低温保存することができる。細胞、例えば幹細胞などの低温保存方法は当業界において周知である。単離された胎盤細胞集団は、個体に容易に投与可能な形態で調製することができ、例えば、単離された胎盤細胞集団は、医学的用途に好適な容器内に含有される。このような容器は、例えば、シリンジ、滅菌プラスチックバッグ、フラスコ、ジャー、またはそれから単離された胎盤細胞集団を容易に分配することができる他の容器であり得る。例えば、容器は、血液バッグ、またはレシピエントへの液体の静脈内投与に好適な他のプラスチックの医学的に許容できるバッグであり得る。ある特定の実施形態において、容器は、組み合わされた細胞集団の低温保存を可能にするものである。
【０２２９】
低温保存した単離された胎盤細胞集団は、単一のドナー由来の、または複数のドナー由来の単離された胎盤細胞を含んでいてもよい。単離された胎盤細胞集団は、意図したレシピエントに対して完全にＨＬＡ適合であってもよいし、または部分的にまたは完全にＨＬＡ不適合であってもよい。
【０２３０】
したがって、一実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、本明細書に記載される方法において、容器中の組織培養プラスチック接着性の胎盤細胞集団を含む組成物の形態で使用することができる。具体的な実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、低温保存される。別の具体的な実施形態において、容器は、バッグ、フラスコ、またはジャーである。別の具体的な実施形態において、前記バッグは、滅菌プラスチックバッグである。別の具体的な実施形態において、前記バッグは、例えば静脈内注入による前記単離された胎盤細胞集団の静脈内投与に好適であるか、それを可能にするか、またはそれを容易にする。バッグは、単離された胎盤接着性細胞と１つまたは複数の他の溶液、例えば薬物とが投与の前または投与中に混合されるように相互連結された、複数の内腔または区画を含んでいてもよい。別の具体的な実施形態において、組成物は、組み合わされた細胞集団の低温保存を容易にする１つまたは複数の化合物を含む。別の具体的な実施形態において、前記単離された胎盤細胞集団は、生理的に許容できる水溶液中に含有される。別の具体的な実施形態において、前記生理的に許容できる水溶液は、０．９％のＮａＣｌ溶液である。別の具体的な実施形態において、前記単離された胎盤細胞集団は、前記細胞集団のレシピエントに対してＨＬＡ適合の胎盤接着性細胞を含む。別の具体的な実施形態において、前記組み合わされた細胞集団は、前記細胞集団のレシピエントに対して少なくとも部分的にＨＬＡ不適合の胎盤接着性細胞を含む。別の具体的な実施形態において、前記単離された胎盤接着性細胞は、複数のドナー由来である。
【０２３１】
ある特定の実施形態において、容器中の単離された胎盤接着性細胞は、単離されたＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋胎盤接着性細胞であり、前記細胞は、低温保存されており、容器内に含有される。具体的な実施形態において、前記ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋胎盤接着性細胞はまた、ＣＤ２００＋でもある。別の具体的な実施形態において、前記ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤接着性細胞はまた、ＣＤ４５−またはＣＤ９０＋でもある。別の具体的な実施形態において、前記ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤接着性細胞はまた、ＣＤ４５−およびＣＤ９０＋でもある。別の具体的な実施形態において、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋胎盤接着性細胞は、加えて、ＣＤ１３＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ６２Ｅ−、ＣＤ６２Ｌ−、ＣＤ６２Ｐ−、ＳＨ３＋（ＣＤ７３＋）、ＳＨ４＋（ＣＤ７３＋）、ＣＤ８０−、ＣＤ８６−、ＣＤ９０＋、ＳＨ２＋（ＣＤ１０５＋）、ＣＤ１０６／ＶＣＡＭ＋、ＣＤ１１７−、ＣＤ１４４／ＶＥ−カドヘリンｄｉｍ、ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４−、ＣＤ２００＋、ＣＤ１３３−、ＯＣＴ−４＋、ＳＳＥＡ４−、ＳＳＥＡ４−、ＡＢＣ−ｐ＋、ＫＤＲ−（ＶＥＧＦＲ２−）、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ＋、ＨＬＡ−ＤＰ，ＤＱ，ＤＲ−、ＨＬＡ−Ｇ−、またはプログラム細胞死−１リガンド（ＰＤＬ１）＋、またはそれらのあらゆる組合せの１つまたは複数である。別の具体的な実施形態において、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋胎盤接着性細胞は、加えて、ＣＤ１３＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４／ＩＣＡＭ＋、ＣＤ６２Ｅ−、ＣＤ６２Ｌ−、ＣＤ６２Ｐ−、ＳＨ３＋（ＣＤ７３＋）、ＳＨ４＋（ＣＤ７３＋）、ＣＤ８０−、ＣＤ８６−、ＣＤ９０＋、ＳＨ２＋（ＣＤ１０５＋）、ＣＤ１０６／ＶＣＡＭ＋、ＣＤ１１７−、ＣＤ１４４／ＶＥ−カドヘリンｄｉｍ、ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４＋、ＣＤ２００＋、ＣＤ１３３−、ＯＣＴ−４＋、ＳＳＥＡ３−、ＳＳＥＡ４−、ＡＢＣ−ｐ＋、ＫＤＲ−（ＶＥＧＦＲ２−）、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ＋、ＨＬＡ−ＤＰ、ＤＱ、ＤＲ−、ＨＬＡ−Ｇ−、およびプログラム細胞死−１リガンド（ＰＤＬ１）＋である。
【０２３２】
ある特定の他の実施形態において、上記で述べた単離された胎盤接着性細胞は、単離されたＣＤ２００＋、ＨＬＡ−Ｇ−胎盤接着性細胞であり、前記細胞は、低温保存されており、容器内に含有される。別の実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、低温保存されており、容器内に含有されるＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋細胞である。別の実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、低温保存されており、容器内に含有されるＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋幹細胞である。別の実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、低温保存されており、容器内に含有されるＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋細胞であり、前記単離された胎盤接着性細胞は、胚様体様体の形成を可能にする条件下で胎盤接着性細胞集団と共に培養される場合、１つまたは複数の胚様体様体の形成を容易にする。別の実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、低温保存されており、容器内に含有されるＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ｇ−細胞である。別の実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、低温保存されており、容器内に含有されるＯＣＴ−４＋胎盤接着性細胞であり、前記細胞は、胚様体様体の形成を可能にする条件下で胎盤接着性細胞集団と共に培養される場合、１つまたは複数の胚様体様体の形成を容易にする。
【０２３３】
別の具体的な実施形態において、上記で述べた単離された胎盤接着性細胞は、フローサイトメトリーによって検出可能な、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋およびＣＤ１０５＋である胎盤幹細胞または胎盤複能性細胞（例えば、胎盤接着性細胞）である。別の具体的な実施形態において、単離されたＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋胎盤接着性細胞は、神経系の表現型を有する細胞、骨形成性の表現型を有する細胞、または軟骨形成性の表現型を有する細胞に分化する能力を有する。別の具体的な実施形態において、単離されたＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋胎盤接着性細胞は、加えて、ＣＤ２００＋である。別の具体的な実施形態において、単離されたＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋胎盤接着性細胞は、加えて、フローサイトメトリーによって検出可能な、ＣＤ９０＋またはＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態において、単離されたＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋胎盤接着性細胞は、加えて、フローサイトメトリーによって検出可能な、ＣＤ９０＋またはＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態において、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤接着性細胞は、加えて、フローサイトメトリーによって検出可能な、ＣＤ９０＋またはＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態において、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋細胞は、加えて、フローサイトメトリーによって検出可能な、ＣＤ９０＋およびＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態において、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ４５−細胞は、加えて、フローサイトメトリーによって検出可能な、ＣＤ８０−およびＣＤ８６−である。別の具体的な実施形態において、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋細胞は、加えて、ＣＤ２９＋、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ８０−、ＣＤ８６−、ＳＨ３＋またはＳＨ４＋の１つまたは複数である。別の具体的な実施形態において、細胞は、加えて、ＣＤ４４＋である。上記の単離されたＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋胎盤接着性細胞のいずれかの具体的な実施形態において、細胞は、加えて、ＣＤ１１７−、ＣＤ１３３−、ＫＤＲ−（ＶＥＧＦＲ２−）、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ＋、ＨＬＡ−ＤＰ，ＤＱ，ＤＲ−、および／またはＰＤＬ１＋の１つまたは複数である。
【０２３４】
前述の低温保存した単離された胎盤接着性細胞のいずれかの具体的な実施形態において、前記容器は、バッグである。様々な具体的な実施形態において、前記容器は、約、少なくとも、または最大で、１×１０６個の前記単離された胎盤接着性細胞、５×１０６個の前記単離された胎盤接着性細胞、１×１０７個の前記単離された胎盤接着性細胞、５×１０７個の前記単離された胎盤接着性細胞、１×１０８個の前記単離された胎盤接着性細胞、５×１０８個の前記単離された胎盤接着性細胞、１×１０９個の前記単離された胎盤接着性細胞、５×１０９個の前記単離された胎盤接着性細胞、１×１０１０個の前記単離された胎盤接着性細胞、または５×１０１０個の前記単離された胎盤接着性細胞を含む。前述の低温保存した集団のいずれかの他の具体的な実施形態において、前記単離された胎盤接着性細胞は、約、少なくとも、または最大で５回、最大で１０回、最大で１５回、または最大で２０回継代されている。前述の低温保存した単離された胎盤接着性細胞のいずれかの別の具体的な実施形態において、前記単離された胎盤接着性細胞は、前記容器内で拡張される。
【０２３５】
ある特定の実施形態において、胎盤由来の接着性細胞の単回単位用量は、様々な実施形態において、約１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０、１×１０１１個またはそれより多くの、少なくともそれらの個数の、またはそれらの個数以下の胎盤由来の接着性細胞を含んでいてもよい。ある特定の実施形態において、本明細書で提供される医薬組成物は、５０％またはそれより多くの生存可能な細胞を含む（すなわち、集団中の細胞の少なくとも５０％が、機能的であるかまたは生きている）胎盤由来の接着細胞の集団を含む。好ましくは、集団中の細胞の少なくとも６０％が、生存可能である。より好ましくは、医薬組成物中の集団中の細胞の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％が、生存可能である。
【０２３６】
５．８．２  遺伝子操作された胎盤細胞
胎盤接着性細胞が、血管新生に関連する、または血管新生を促進する組換えまたは外因性サイトカインを産生するように遺伝子操作されている、胎盤接着性細胞、例えば、上記のセクション５．３に記載される胎盤複能性細胞もしくは胎盤接着性細胞のいずれか、またはこのような胎盤接着性細胞を含む医薬組成物がさらに本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、血管新生を促進する前記タンパク質は、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）（例えば、ＶＥＧＦＤ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）（例えば、ＦＧＦ２）、アンギオゲニン（ＡＮＧ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、上皮由来好中球活性化タンパク質７８（ＥＮＡ−７８）、フォリスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、増殖制御発癌遺伝子タンパク質（ＧＲＯ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、ＩＬ−８、レプチン、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、ＭＣＰ−３、血小板由来増殖因子サブユニットＢ（ＰＤＧＦＢ）、ランテス、トランスフォーミング増殖因子ベータ１（ＴＧＦ−β１）、トロンボポイエチン（Ｔｐｏ）、メタロプロテイナーゼ組織阻害剤１（ＴＩＭＰ１）、ＴＩＭＰ２、および／またはウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）の１つまたは複数である。
【０２３７】
例えばレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ポリエチレングリコール、または当業者公知の他の方法で細胞を遺伝子操作するための方法を使用することができる。これらは、細胞中で核酸分子を輸送し発現する発現ベクターを使用することを含む。（非特許文献５を参照）。ベクターＤＮＡは、従来の形質転換またはトランスフェクション技術により原核または真核細胞に導入することができる。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするための好適な方法は、非特許文献６、および他の実験教本に見出すことができる。
【０２３８】
胎盤細胞、例えば上記のセクション５．３に記載される胎盤接着性細胞は、ウイルス移行、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡウイルスベクター、例えばレトロウイルス（レンチウイルスを含む）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、シンドビスウイルス、およびウシパピローマウイルスの使用など；化学的移行、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクションおよびＤＥＡＥデキストラントランスフェクション方法など；例えば、ＤＮＡをローディングした膜小胞、例えばリポソーム、赤血球ゴースト、およびプロトプラストを使用する膜融合移行；または物理的な移行技術、例えばマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、または裸のＤＮＡの移行などの方法によって、細胞に、ＤＮＡまたはＲＮＡ、例えば目的のタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを導入することによって遺伝子改変されていてもよい。胎盤接着性細胞は、外因性ＤＮＡの挿入によって、または細胞のゲノムのセグメントの外因性ＤＮＡでの置換によって遺伝子改変することができる。外因性ＤＮＡ配列の挿入は、例えば、相同組換えによって、または宿主細胞ゲノムへのウイルス統合によって、またはプラスミド発現ベクターおよび核局在化配列を使用して、細胞に、特にその核にＤＮＡを取り込むことによって達成することができる。ＤＮＡは、ある特定の化学物質／薬物、例えばテトラサイクリンを使用する目的のタンパク質の発現の陽性または陰性誘導を可能にする１つまたは複数のプロモーターを含んでいてもよく、プロモーターは、他の実施形態において、構成的プロモーターであってもよい。
【０２３９】
リン酸カルシウムトランスフェクションを使用して、例えば目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含有するプラスミドＤＮＡを細胞に導入することができる。ある特定の実施形態において、ＤＮＡを塩化カルシウムの溶液と合わせ、次いでリン酸緩衝化溶液に添加する。沈殿が形成されたら、溶液を培養細胞に直接添加する。ＤＭＳＯまたはグリセロールでの処理を使用して、トランスフェクション効率を向上させることができ、安定な形質転換体のレベルは、ビスヒドロキシエチルアミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）を使用して向上させることができる。リン酸カルシウムトランスフェクション系は、市販されている（例えば、ＰＲＯＦＥＣＴＩＯＮ（登録商標）、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．、マディソン、ウィスコンシン州）。ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションも使用することができる。
【０２４０】
また単離された胎盤接着性細胞は、マイクロインジェクションによって遺伝子操作されてもよい。ある特定の実施形態において、光学顕微鏡下でガラス製マイクロピペットを細胞の核に導き、ＤＮＡまたはＲＮＡを注射する。
【０２４１】
また胎盤細胞は、エレクトロポレーションを使用して遺伝子改変されてもよい。ある特定の実施形態において、ＤＮＡまたはＲＮＡを培養細胞の懸濁液に添加し、ＤＮＡ／ＲＮＡ−細胞懸濁液を２つの電極間に置き、電気パルスに供して、膜を通る孔の出現によって認められる細胞の外膜の一時的な透過化を引き起こす。
【０２４２】
細胞を遺伝学的に改変するためのＤＮＡまたはＲＮＡのリポソーム送達は、任意選択でジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）またはジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を含むカチオン性リポソーム、を使用して実行することができる。他の市販の送達系としては、ＥＦＦＥＣＴＥＮＥ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ）、ＤＯＴＡＰ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、ＦＵＧＥＮＥ  ６（商標）（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、およびＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）が挙げられる。
【０２４３】
ウイルスベクターを使用して、胎盤接着性細胞を、例えば標的遺伝子、ポリヌクレオチド、アンチセンス分子、またはリボザイム配列の細胞への送達によって遺伝学的に変更することができる。レトロウイルスベクターは、急速に分裂する細胞を形質導入するのに効果的であるが、非分裂細胞にＤＮＡを効果的に移動させるための多数のレトロウイルスベクターも同様に開発されている。レトロウイルスベクターのためのパッケージング細胞株が当業者公知である。ある特定の実施形態において、レトロウイルスＤＮＡベクターは、第１のＬＴＲがＳＶ４０プロモーターに対して５’に配置され、ＳＶ４０プロモーターが、マルチクローニング部位にクローニングされた標的遺伝子配列、それに続いて３’における第２のＬＴＲに作動的に連結されるように、２つのレトロウイルスＬＴＲを含有する。レトロウイルスＤＮＡベクターが形成されたら、これを、これまでに記載されたようにして、リン酸カルシウム媒介トランスフェクションを使用してパッケージング細胞株に移す。ウイルス産生からおよそ４８時間後、その時点で標的遺伝子配列を含有するウイルスベクターを回収する。レンチウイルスベクター、組換えヘルペスウイルス、アデノウイルスベクター、またはアルファウイルスベクターを使用して細胞をトランスフェクトする方法は、当業界において公知である。
【０２４４】
標的細胞のトランスフェクションまたは形質導入の成功は、当業者公知の技術において遺伝子マーカーを使用して実証することができる。例えば、オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）の緑色蛍光タンパク質が、遺伝子改変された造血細胞の同定および追跡に有効なマーカーであることが示されている。代替の選択可能マーカーとしては、β−Ｇａｌ遺伝子、短縮型神経成長因子受容体、または薬物選択可能マーカー（これらに限定されないが、ＮＥＯ、ＭＴＸ、またはハイグロマイシンなど）が挙げられる。
【０２４５】
５．８．３  医薬組成物
単離された胎盤接着性細胞、例えば胎盤接着性細胞の集団、または単離された胎盤接着性細胞を含む細胞の集団は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの、例えば、本明細書で提供される処置方法での使用のための医薬組成物に製剤化することができる。このような医薬組成物は、薬学的に許容される担体、例えば塩類溶液、またはｉｎ  ｖｉｖｏでの投与のための他の容認された生理的に許容できる溶液中に、単離された胎盤接着性細胞の集団、または単離された胎盤接着性細胞を含む細胞の集団を含む。本明細書に記載される単離された胎盤接着性細胞を含む医薬組成物は、本明細書の他所に記載される単離された胎盤細胞集団または単離された胎盤接着性細胞のいずれか、またはそれらのいずれかの組合せを含んでいてもよい。医薬組成物は、胎児の、母体の、または胎児および母体両方の単離された胎盤接着性細胞を含んでいてもよい。本明細書で提供される医薬組成物は、単一の個体または胎盤から、または複数の個体または胎盤から得られた、単離された胎盤接着性細胞をさらに含んでいてもよい。
【０２４６】
本明細書で提供される医薬組成物は、あらゆる数の単離された胎盤接着性細胞を含んでいてもよい。例えば、単離された胎盤接着性細胞の単回単位用量は、様々な実施形態において、約１×１０×５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０、１×１０１１個またはそれより多くの、少なくともそれらの個数の、またはそれらの個数以下の単離された胎盤接着性細胞を含んでいてもよい。
【０２４７】
本明細書で提供される医薬組成物は、５０％またはそれより多くの生存可能な細胞を含む細胞の集団を含む（すなわち、集団中の細胞の少なくとも５０％が、機能的であるかまたは生きている）。好ましくは、集団中の細胞の少なくとも６０％が、生存可能である。より好ましくは、医薬組成物中の集団中の細胞の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％が、生存可能である。
【０２４８】
本明細書で提供される医薬組成物は、例えば生着を促進する１つまたは複数の化合物（例えば、抗Ｔ細胞受容体抗体、免疫抑制剤、または同種のもの）；安定剤、例えばアルブミン、デキストラン４０、ゼラチン、ヒドロキシエチルデンプン、プラズマライト（ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ）、および同種のものを含んでいてもよい。
【０２４９】
注射用溶液として製剤化される場合、一実施形態において、医薬組成物は、約１％から１．５％のＨＳＡおよび約２．５％デキストランを含む。好ましい実施形態において、医薬組成物は、５％ＨＳＡおよび１０％デキストランを含み、任意選択で免疫抑制剤、例えばサイクロスポリンＡを例えば１０ｍｇ／ｋｇで含む溶液中、１ミリリットル当たり約５×１０６個の細胞から１ミリリットル当たり約２×１０７個の細胞を含む。
【０２５０】
他の実施形態において、医薬組成物、例えば溶液は、複数の細胞、例えば単離された胎盤接着性細胞、例えば胎盤幹細胞または複能性胎盤細胞を含み、前記医薬組成物は、１ミリリットル当たり約１．０±０．３×１０６個から１ミリリットル当たり約５．０±１．５×１０６個の間の細胞を含む。他の実施形態において、医薬組成物は、１ミリリットル当たり約１．５×１０６個から１ミリリットル当たり約３．７５×１０６個の間の細胞を含む。他の実施形態において、医薬組成物は、１ｍＬ当たり約１×１０６個から１ｍＬ当たり約５０×１０６個の間の細胞、１ｍＬ当たり約１×１０６個から１ｍＬ当たり約４０×１０６個の間の細胞、１ｍＬ当たり約１×１０６個から１ｍＬ当たり約３０×１０６個の間の細胞、１ｍＬ当たり約１×１０６個から１ｍＬ当たり約２０×１０６個の間の細胞、１ｍＬ当たり約１×１０６個から約１５×１ｍＬ当たり１０６個の間の細胞、または１ｍＬ当たり約１×１０６個から１ｍＬ当たり約１０×１０６個の間の細胞を含む。ある特定の実施形態において、医薬組成物は、目に見える細胞凝集塊を含まない（すなわち、大きい細胞凝集塊を含まない）か、またはこのような目に見える凝集塊を実質的に含まない。本明細書で使用される場合、「大きい細胞凝集塊」は、拡大せずに目に見える、例えば肉眼で見える細胞の集合体を意味し、一般的に約１５０ミクロンより大きい細胞集合体を指す。一部の実施形態において、医薬組成物は、約２．５％、３．０％、３．５％、４．０％、４．５％、５．０％、５．５％、６．０％、６．５％、７．０％、７．５％、８．０％、８．５％、９．０％、９．５％または１０％のデキストラン、例えばデキストラン−４０を含む。具体的な実施形態において、前記組成物は、約７．５％から約９％のデキストラン−４０を含む。具体的な実施形態において、前記組成物は、約５．５％のデキストラン−４０を含む。ある特定の実施形態において、医薬組成物は、約１％から約１５％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む。具体的な実施形態において、医薬組成物は、約１％、２％、３％、４％、５％、６５、７５、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％または１５％のＨＳＡを含む。具体的な実施形態において、前記細胞は、低温保存および融解されている。別の具体的な実施形態において、前記細胞は、７０μＭから１００μＭのフィルターに通過させて濾過されている。別の具体的な実施形態において、前記組成物は、目に見える細胞凝集塊を含まない。別の具体的な実施形態において、前記組成物は、細胞１０６個当たり約２００個より少ない細胞凝集塊を含み、前記細胞凝集塊は、顕微鏡、例えば光学顕微鏡下でのみ目に見える。別の具体的な実施形態において、前記組成物は、細胞１０６個当たり約１５０個より少ない細胞凝集塊を含み、前記細胞凝集塊は、顕微鏡、例えば光学顕微鏡下でのみ目に見える。別の具体的な実施形態において、前記組成物は、細胞１０６個当たり約１００個より少ない細胞凝集塊を含み、前記細胞凝集塊は、顕微鏡、例えば光学顕微鏡下でのみ目に見える。
【０２５１】
具体的な実施形態において、医薬組成物は、１ミリリットル当たり約１．０±０．３×１０６個の細胞、約５．５％デキストラン−４０（ｗ／ｖ）、約１０％ＨＳＡ（ｗ／ｖ）、および約５％ＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）を含む。
【０２５２】
他の実施形態において、医薬組成物は、１０％デキストラン−４０を含む溶液中に、複数の細胞、例えば複数の単離された胎盤接着性細胞を含み、医薬組成物は、１ミリリットル当たり約±０．３×１０６個から１ミリリットル当たり約５．０±１．５×１０６個の間の細胞を含み、前記組成物は、肉眼で見える細胞凝集塊を含まない（すなわち、大きい細胞凝集塊を含まない）。一部の実施形態において、医薬組成物は、１ミリリットル当たり約１．５×１０６個から１ミリリットル当たり約３．７５×１０６個の間の細胞を含む。具体的な実施形態において、前記細胞は、低温保存および融解されている。別の具体的な実施形態において、前記細胞は、７０μｍから１００μｍのフィルターを通過させて濾過されている。別の具体的な実施形態において、前記組成物は、細胞１０６個当たり約２００個より少ない極小の細胞凝集塊（すなわち、拡大しないと目に見えない細胞凝集塊）を含む。別の具体的な実施形態において、医薬組成物は、細胞１０６個当たり約１５０個より少ない極小の細胞凝集塊を含む。別の具体的な実施形態において、医薬組成物は、細胞１０６個当たり約１００個より少ない極小の細胞凝集塊を含む。別の具体的な実施形態において、医薬組成物は、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、もしくは２％未満のＤＭＳＯ、または１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、もしくは０．１％未満のＤＭＳＯを含む。
【０２５３】
さらに、細胞を含む組成物であって、前記組成物は、本明細書で開示された方法の１つによって産生される、組成物が本明細書において提供される。例えば、一実施形態において、医薬組成物は、細胞を含み、医薬組成物は、胎盤接着性細胞、例えば胎盤幹細胞または複能性胎盤細胞を含む溶液を濾過して、濾過された細胞を含有する溶液を形成すること；例えば低温保存の前に、濾過された細胞を含有する溶液を第１の溶液で、１ミリリットル当たり約１から５０×１０６、１から４０×１０６、１から３０×１０６、１から２０×１０６、１から１５×１０６、または１から１０×１０６個の細胞に希釈すること；および得られた濾過された細胞を含有する溶液を、デキストランを含むがヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含まない第２の溶液で希釈して、前記組成物を産生することを含む方法によって産生される。ある特定の実施形態において、前記希釈は、１ミリリットル当たり約１５×１０６個の細胞以下への希釈である。ある特定の実施形態において、前記希釈は、１ミリリットル当たり約１０±３×１０６個の細胞以下への希釈である。ある特定の実施形態において、前記希釈は、１ミリリットル当たり約７．５×１０６個の細胞以下への希釈である。他のある特定の実施形態において、濾過された細胞を含有する溶液が、希釈前に１ミリリットル当たり約１５×１０６個未満の細胞を含む場合、濾過は、任意選択である。他のある特定の実施形態において、濾過された細胞を含有する溶液が、希釈前に、１ミリリットル当たり約１０±３×１０６個未満の細胞を含む場合、濾過は、任意選択である。他のある特定の実施形態において、濾過された細胞を含有する溶液が、希釈前に、１ミリリットル当たり約７．５×１０６個未満の細胞を含む場合、濾過は、任意選択である。
【０２５４】
具体的な実施形態において、細胞は、第１の希釈溶液での前記希釈から前記第２の希釈溶液での前記希釈の間、低温保存される。別の具体的な実施形態において、第１の希釈溶液は、デキストランおよびＨＳＡを含む。第１の希釈溶液または第２の希釈溶液中のデキストランは、あらゆる分子量を有するデキストランであってもよく、例えば約１０ｋＤａから約１５０ｋＤａの分子量を有するデキストランであってもよい。一部の実施形態において、前記第１の希釈溶液または前記第２の溶液中の前記デキストランは、約２．５％、３．０％、３．５％、４．０％、４．５％、５．０％、５．５％、６．０％、６．５％、７．０％、７．５％、８．０％、８．５％、９．０％、９．５％または１０％デキストランである。別の具体的な実施形態において、前記第１の希釈溶液または前記第２の希釈溶液中のデキストランは、デキストラン−４０である。別の具体的な実施形態において、前記第１の希釈溶液および前記第２の希釈溶液中のデキストランは、デキストラン−４０である。別の具体的な実施形態において、前記第１の希釈溶液中の前記デキストラン−４０は、５．０％のデキストラン−４０である。別の具体的な実施形態において、前記第１の希釈溶液中の前記デキストラン−４０は、５．５％のデキストラン−４０である。別の具体的な実施形態において、前記第２の希釈溶液中の前記デキストラン−４０は、１０％のデキストラン−４０である。別の具体的な実施形態において、ＨＳＡを含む前記溶液中の前記ＨＳＡは、１から１５％のＨＳＡである。別の具体的な実施形態において、ＨＳＡを含む前記溶液中の前記ＨＳＡは、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％または１５％のＨＳＡである。別の具体的な実施形態において、ＨＳＡを含む前記溶液中の前記ＨＳＡは、１０％のＨＳＡである。別の具体的な実施形態において、前記第１の希釈溶液は、ＨＳＡを含む。別の具体的な実施形態において、前記第１の希釈溶液中の前記ＨＳＡは、１０％のＨＳＡである。別の具体的な実施形態において、前記第１の希釈溶液は、凍結防止剤を含む。別の具体的な実施形態において、前記凍結防止剤は、ＤＭＳＯである。別の具体的な実施形態において、前記第２の希釈溶液中の前記デキストラン−４０は、約１０％のデキストラン−４０である。別の具体的な実施形態において、前記細胞を含む組成物は、約７．５％から約９％のデキストランを含む。別の具体的な実施形態において、医薬組成物は、１ミリリットル当たり約１．０±０．３×１０６個の細胞から１ミリリットル当たり約５．０±１．５×１０６個の細胞を含む。別の具体的な実施形態において、医薬組成物は、１ミリリットル当たり約１．５×１０６個の細胞から１ミリリットル当たり約３．７５×１０６個の細胞を含む。
【０２５５】
別の実施形態において、医薬組成物は、（ａ）低温保存の前に、胎盤接着性細胞を含む細胞を含有する溶液、例えば胎盤幹細胞または複能性胎盤細胞を濾過して、濾過された細胞を含有する溶液を産生すること；（ｂ）濾過された細胞を含有する溶液中の細胞を、１ミリリットル当たり約１から５０×１０６個、１から４０×１０６個、１から３０×１０６個、１から２０×１０６個、１から１５×１０６個、または１から１０×１０６個の細胞で低温保存すること；（ｃ）細胞を融解すること；および（ｄ）濾過された細胞を含有する溶液を、デキストラン−４０溶液で約１：１から約１：１１（ｖ／ｖ）に希釈することを含む方法によって作製される。ある特定の実施形態において、ステップ（ａ）の前に細胞の数が１ミリリットル当たり細胞約１０±３×１０６個未満である場合、濾過は、任意選択である。別の具体的な実施形態において、ステップ（ｂ）における細胞は、１ミリリットル当たり約１０±３×１０６個の細胞で低温保存される。別の具体的な実施形態において、ステップ（ｂ）における細胞は、約５％から約１０％のデキストラン−４０およびＨＳＡを含む溶液中で低温保存される。ある特定の実施形態において、ステップ（ｂ）における前記希釈は、１ミリリットル当たり約１５×１０６個の細胞以下への希釈である。
【０２５６】
別の実施形態において、医薬組成物は、（ａ）１０％ＨＳＡを含む５．５％デキストラン−４０溶液中に、胎盤接着性細胞、例えば胎盤幹細胞または複能性胎盤細胞を懸濁して、細胞を含有する溶液を形成すること；（ｂ）細胞を含有する溶液を、７０μｍフィルターを介して濾過すること；（ｃ）細胞を含有する溶液を、５．５％デキストラン−４０、１０％ＨＳＡ、および５％ＤＭＳＯを含む溶液で、１ミリリットル当たり約１から５０×１０６個、１から４０×１０６個、１から３０×１０６個、１から２０×１０６個、１から１５×１０６個、または１から１０×１０６個の細胞に希釈すること；（ｄ）細胞を低温保存すること；（ｅ）細胞を融解すること；および（ｆ）細胞を含有する溶液を１０％デキストラン−４０で１：１から１：１１（ｖ／ｖ）に希釈することを含む方法によって作製される。ある特定の実施形態において、ステップ（ｃ）における前記希釈は、１ミリリットル当たり約１５×１０６個の細胞以下への希釈である。ある特定の実施形態において、ステップ（ｃ）における前記希釈は、細胞約１０±３×１０６個／ｍＬ以下への希釈である。ある特定の実施形態において、ステップ（ｃ）における前記希釈は、細胞約７．５×１０６個／ｍＬ以下への希釈である。
【０２５７】
別の実施形態において、細胞を含む組成物は、（ａ）複数の細胞を遠心分離して、細胞を収集するステップ；（ｂ）５．５％デキストラン−４０に細胞を再懸濁するステップ；（ｃ）細胞を遠心分離して、細胞を収集するステップ；（ｄ）１０％ＨＳＡを含む５．５％デキストラン−４０溶液に細胞を再懸濁するステップ；（ｅ）細胞を、７０μｍフィルターを介して濾過するステップ；（ｆ）細胞を、５．５％デキストラン−４０、１０％ＨＳＡ、および５％ＤＭＳＯで、細胞１ミリリットル当たり約１から５０×１０６、１から４０×１０６、１から３０×１０６、１から２０×１０６、１から１５×１０６、または１から１０×１０６個に希釈するステップ；（ｇ）細胞を低温保存するステップ；（ｈ）細胞を融解するステップ；および（ｉ）細胞を１０％のデキストラン−４０で１：１から１：１１（ｖ／ｖ）に希釈するステップを含む方法によって作製される。ある特定の実施形態において、ステップ（ｆ）における前記希釈は、１ミリリットル当たり約１５×１０６個の細胞以下への希釈である。ある特定の実施形態において、ステップ（ｆ）における前記希釈は、約１０±３×１０６個／ｍＬの細胞以下への希釈である。ある特定の実施形態において、ステップ（ｆ）における前記希釈は、約７．５×１０６個／ｍＬの細胞以下への希釈である。他のある特定の実施形態において、細胞の数が１ミリリットル当たり細胞約１０±３×１０６個未満である場合、濾過は、任意選択である。
【０２５８】
組成物、例えば、本明細書に記載される単離された胎盤接着性細胞を含む医薬組成物は、本明細書に記載される単離された胎盤接着性細胞のいずれかを含んでいてもよい。
【０２５９】
細胞生成物の投与に好適な他の注射製剤が使用されてもよい。
【０２６０】
一実施形態において、医薬組成物は、実質的または完全に非母体起源である、すなわち胎児の遺伝子型を有する、例えば、少なくとも約９０％、９５％、９８％、９９％または約１００％が非母体起源である、単離された胎盤接着性細胞を含む。例えば、一実施形態において、医薬組成物は、単離された胎盤接着性細胞の集団を含み、該単離された胎盤接着性細胞の集団は、ＣＤ２００＋およびＨＬＡ−Ｇ−；ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、およびＣＤ２００＋；ＣＤ２００＋およびＯＣＴ−４＋；ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋およびＨＬＡ−Ｇ−；ＣＤ７３＋およびＣＤ１０５＋であり、前記胎盤接着性細胞の集団が胚様体の形成を可能にする条件下で培養される場合、単離された胎盤細胞の前記集団を含む胎盤接着性細胞の集団において１つまたは複数の胚様体の形成を促進するか；またはＯＣＴ−４＋であり、前記胎盤接着性細胞の集団が胚様体の形成を可能にする条件下で培養される場合、単離された胎盤細胞の前記集団を含む胎盤接着性細胞の集団において１つまたは複数の胚様体の形成を促進するか；または前述の組合せであり、前記単離された胎盤接着性細胞の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％が、非母体起源である。別の実施形態において、医薬組成物は、単離された胎盤接着性細胞の集団を含み、該単離された胎盤接着性細胞の集団は、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋およびＣＤ３４−；ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋およびＣＤ３４−；ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋、ＣＤ３４−およびＣＤ９０＋またはＣＤ４５−の少なくとも１つ；ＣＤ１０＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋、ＣＤ３４−およびＣＤ４５−；ＣＤ１０＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋、ＣＤ３４−およびＣＤ４５−；ＣＤ２００＋およびＨＬＡ−Ｇ−；ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、およびＣＤ２００＋；ＣＤ２００＋およびＯＣＴ−４＋；ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋およびＨＬＡ−Ｇ−；ＣＤ７３＋およびＣＤ１０５＋であり、前記胎盤接着性細胞の集団が胚様体の形成を可能にする条件下で培養される場合、前記単離された胎盤接着性細胞を含む胎盤接着性細胞の集団において１つまたは複数の胚様体の形成を促進するか；ＯＣＴ−４＋であり、前記胎盤接着性細胞の集団が胚様体の形成を可能にする条件下で培養される場合、前記単離された胎盤接着性細胞を含む胎盤細胞の集団において１つまたは複数の胚様体の形成を促進するか；またはＣＤ１１７−、ＣＤ１３３−、ＫＤＲ−、ＣＤ８０−、ＣＤ８６−、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ＋、ＨＬＡ−ＤＰ、ＤＱ、ＤＲ−、および／またはＰＤＬ１＋の１つまたは複数であるか；または前述の組合せであり、前記単離された胎盤接着性細胞の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％が、非母体起源である。具体的な実施形態において、医薬組成物は加えて、胎盤から得られたものではない幹細胞を含む。
【０２６１】
本明細書で提供される組成物、例えば医薬組成物中の単離された胎盤接着性細胞は、単一のドナー由来、または複数のドナー由来の胎盤接着性細胞を含んでいてもよい。単離された胎盤接着性細胞は、意図されたレシピエントに対して完全にＨＬＡ適合であってもよいし、または部分的または完全にＨＬＡ不適合であってもよい。
【０２６２】
５．８．４  単離された胎盤細胞を含むマトリックス
さらに、胎盤細胞または単離された胎盤接着性細胞の集団を含むマトリックス、ヒドロゲル、足場、および同種のものを含む組成物が本明細書において提供される。このような組成物は、液体懸濁液中の細胞の代わりに、またはそれに加えて使用することができる。
【０２６３】
本明細書に記載される単離された胎盤接着性細胞は、天然マトリックス、例えば羊膜材料などの胎盤のバイオマテリアル上に植え付けることができる。このような羊膜材料は、例えば、哺乳類胎盤から直接切り出された羊膜；固定または加熱処理された羊膜、実質的に乾燥した（すなわち、＜２０％Ｈ２Ｏ）羊膜、絨毛膜、実質的に乾燥した絨毛膜、実質的に乾燥した羊膜および絨毛膜、ならびに同種のものであり得る。その上に単離された胎盤接着性細胞を植え付けることができる好ましい胎盤のバイオマテリアルは、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み入れられるハリリ（Ｈａｒｉｒｉ）、特許文献１７に記載される。
【０２６４】
本明細書に記載される単離された胎盤接着性細胞は、例えば注射に好適なヒドロゲル溶液に懸濁することができる。このような組成物に好適なヒドロゲルとしては、自己集合ペプチド、例えばＲＡＤ１６などが挙げられる。一実施形態において、細胞を含むヒドロゲル溶液は、例えばモールド中で硬化させて、埋め込みのための細胞を分散させたマトリックスを形成することができる。このようなマトリックス中の単離された胎盤接着性細胞はまた、埋め込み前に細胞が有糸分裂によって拡張されるように培養することもできる。ヒドロゲルは、例えば、水分子を封じ込めてゲルを形成する３次元の開放格子構造を作り出すために、共有結合、イオン結合、または水素結合を介して架橋された有機ポリマー（天然または合成）である。ヒドロゲルを形成する材料としては、例えばアルギネートおよびそれらの塩などの多糖類、ペプチド、ポリホスファジン（ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｚｉｎｅ）、およびイオン架橋されたポリアクリレート、または例えばそれぞれ温度またはｐＨによって架橋されたポリエチレンオキシド−ポリプロピレングリコールブロックコポリマーなどのブロックポリマーが挙げられる。一部の実施形態において、ヒドロゲルまたはマトリックスは、生分解性である。
【０２６５】
一部の実施形態において、製剤は、ｉｎ  ｓｉｔｕにおいて重合性のゲルを含む（例えば、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる特許文献１３；非特許文献７；非特許文献８を参照）。
【０２６６】
一部の実施形態において、ポリマーは、例えば水、緩衝化された塩溶液、または電荷を有する側基またはその１価イオン性塩を有する水性アルコール溶液などの水溶液中で、少なくとも部分的に可溶性である。カチオンと反応できる酸性側基を有するポリマーの例は、ポリ（ホスファゼン）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、アクリル酸とメタクリル酸とのコポリマー、ポリ（酢酸ビニル）、およびスルホン化ポリマー、例えばスルホン化ポリスチレンなどである。アクリル酸またはメタクリル酸とビニルエーテル単量体またはポリマーとの反応によって形成された酸性側基を有するコポリマーも、使用することができる。酸性基の例は、カルボン酸基、スルホン酸基、ハロゲン化（好ましくは、フッ素化）アルコール基、フェノール系ＯＨ基、および酸性ＯＨ基である。
【０２６７】
具体的な実施形態において、マトリックスは、フェルトであり、これは、生体吸収性材料、例えばＰＧＡ、ＰＬＡ、ＰＣＬコポリマーもしくはブレンド、またはヒアルロン酸から作製されるマルチフィラメントヤーンで構成することができる。ヤーンは、クリンピング、カッティング、カーディングおよびニードリングからなる標準的な繊維加工技術を使用してフェルトになる。別の好ましい実施形態において、本発明の細胞は、複合構造であり得る発泡体の足場上に植え付けられる。加えて３次元フレームワークを、例えば修復、置き換え、または増大させようとする体内の具体的な構造などの有用な形状に成形することができる。使用できる足場の他の例としては、不織布マット、多孔質発泡体、または自己集合ペプチドが挙げられる。不織布マットは、グリコール酸と乳酸との合成吸収性コポリマー（例えば、ＰＧＡ／ＰＬＡ）（ＶＩＣＲＹＬ、Ｅｔｈｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．、サマービル、ニュージャージー州）で構成される繊維を使用して形成することができる。フリーズドライまたは凍結乾燥などのプロセスによって形成された例えばポリ（ε−カプロラクトン）／ポリ（グリコール酸）（ＰＣＬ／ＰＧＡ）コポリマーで構成される発泡体（例えば、特許文献１９を参照）も、足場として使用することができる。
【０２６８】
本明細書に記載される単離された胎盤接着性細胞またはそれらの共培養物は、３次元フレームワークまたは足場上に植え付けて、ｉｎ  ｖｉｖｏで埋め込むことができる。このようなフレームワークは、いずれか１つまたは複数の増殖因子、細胞、薬物または例えば組織形成を刺激する他の要素と組み合わせて埋め込むことができる。
【０２６９】
使用できる足場の例としては、不織布マット、多孔質発泡体、または自己集合ペプチドが挙げられる。不織布マットは、グリコール酸と乳酸との合成吸収性コポリマー（例えば、ＰＧＡ／ＰＬＡ）で構成される繊維（ＶＩＣＲＹＬ、Ｅｔｈｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．、Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ、Ｎ．Ｊ．）を使用して形成することができる。例えばフリーズドライまたは凍結乾燥などのプロセスによって形成された例えばポリ（ε−カプロラクトン）／ポリ（グリコール酸）（ＰＣＬ／ＰＧＡ）コポリマーで構成される発泡体（例えば、特許文献１９を参照）も、足場として使用することができる。
【０２７０】
別の実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、フェルト上に植え付けてもよいし、またはフェルトと接触させてもよく、このようなフェルトは、例えばＰＧＡ、ＰＬＡ、ＰＣＬコポリマーもしくはブレンド、またはヒアルロン酸などの生体吸収性材料から作製されるマルチフィラメントヤーンで構成することができる。
【０２７１】
本明細書で提供される単離された胎盤接着性細胞は、別の実施形態において、複合構造であり得る発泡体の足場上に植え付けることができる。このような発泡体の足場は、有用な形状、例えば修復、置き換えまたは増大させようとする体内の具体的な構造の部分の形状などに成形することができる。一部の実施形態において、フレームワークは、例えば０．１Ｍ酢酸で処理され、続いて細胞の付着を強化するために、細胞の植え付けの前にポリリシン、ＰＢＳ、および／またはコラーゲン中でインキュベートされる。細胞の付着または増殖および組織の分化を向上させるために、マトリックスの外部表面を、例えば、マトリックスを血漿でコーティングすること、または１つまたは複数のタンパク質（例えば、コラーゲン、弾性線維、細網線維）、糖タンパク質、グリコサミノグリカン（例えば、ヘパリン硫酸、コンドロイチン−４−硫酸、コンドロイチン−６−硫酸、デルマタン硫酸、ケラチン硫酸など）、細胞マトリックス、ならびに／または例えば、これらに限定されないが、ゼラチン、アルギネート、寒天、アガロース、および植物ゴムなどの他の材料を付加することによって改変することができる。
【０２７２】
一部の実施形態において、足場は、それを非血栓形成性にする材料を含むか、またはそれで処理される。これらの処理および材料も、内皮増殖、移動、および細胞外マトリックス堆積を促進および維持する可能性がある。これらの材料および処理の例としては、これらに限定されないが、天然材料、例えばラミニンおよびＩＶ型コラーゲンなどの基底膜タンパク質、例えばＥＰＴＦＥなどの合成材料、ならびにセグメント化ポリウレタン尿素シリコーン、例えばＰＵＲＳＰＡＮ（商標）（Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、Ｃａｌｉｆ．）などが挙げられる。足場はまた、例えばヘパリンなどの抗血栓剤を含んでいてもよく、足場はまた、単離された胎盤接着性細胞での植え付けの前に、表面電荷を変更するように処理することもできる（例えば、血漿でのコーティング）。
【０２７３】
本明細書で提供される胎盤接着性細胞（例えば、胎盤接着性細胞）はまた、生理的に許容できるセラミック材料の上に植え付けてもよいし、またはそれと接触させてもよく、このような材料としては、これらに限定されないが、リン酸モノ、ジ、トリ、アルファ−トリ、ベータ−トリ、およびテトラカルシウム、ヒドロキシアパタイト、フルオロアパタイト、硫酸カルシウム、フッ化カルシウム、酸化カルシウム、炭酸カルシウム、リン酸マグネシウムカルシウム、生物学的に活性なガラス、例えばＢＩＯＧＬＡＳＳ（登録商標）、およびそれらの混合物などが挙げられる。現在市販されている多孔質生体適合性セラミック材料としては、ＳＵＲＧＩＢＯＮＥ（登録商標）（ＣａｎＭｅｄｉｃａ  Ｃｏｒｐ．、Ｃａｎａｄａ）、ＥＮＤＯＢＯＮ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ  Ｆｒａｎｃｅ、Ｆｒａｎｃｅ）、ＣＥＲＯＳ（登録商標）（Ｍａｔｈｙｓ，ＡＧ、Ｂｅｔｔｌａｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ならびに石灰化コラーゲン骨移植製品、例えばＨＥＡＬＯＳ（商標）（ＤｅＰｕｙ，Ｉｎｃ．、Ｒａｙｎｈａｍ、Ｍａｓｓ．）およびＶＩＴＯＳＳ（登録商標）、ＲＨＡＫＯＳＳ（商標）、およびＣＯＲＴＯＳＳ（登録商標）（Ｏｒｔｈｏｖｉｔａ、Ｍａｌｖｅｒｎ、Ｐａ．）などが挙げられる。フレームワークは、天然および／または合成材料の混合物、ブレンドまたは複合材料であってもよい。
【０２７４】
一実施形態において、単離された胎盤接着性細胞は、細胞約０．５×１０６から約８×１０６個／ｍＬで、好適な足場上に植え付けてもよいし、または好適な足場と接触させてもよい。
【０２７５】
５．９  不死化胎盤細胞株
増殖を促進する遺伝子、すなわち、増殖を促進するタンパク質の産生および／または活性を外来因子によって調節できるように、適切な条件下でトランスフェクトされた細胞の増殖を促進するタンパク質をコードする遺伝子を含有するあらゆる好適なベクターでトランスフェクトすることによって、哺乳類胎盤接着性細胞、例えば胎盤接着性細胞を条件的に不死化することができる。好ましい実施形態において、増殖を促進する遺伝子は、例えば、これらに限定されないが、ｖ−ｍｙｃ、Ｎ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｃ、ｐ５３、ＳＶ４０ラージＴ抗原、ポリオーマラージＴ抗原、Ｅ１ａアデノウイルスまたはヒトパピローマウイルスのＥ７タンパク質などの腫瘍遺伝子である。
【０２７６】
増殖を促進するタンパク質の外部の調節は、増殖を促進する遺伝子を、外部から調節可能なプロモーター、例えばトランスフェクトされた細胞の温度または細胞と接触する培地の組成を改変することによってその活性を制御することができるプロモーターの制御下に置くことによって達成することができる。一実施形態において、テトラサイクリン（ｔｅｔ）調節性遺伝子発現系を採用することができる（非特許文献９；非特許文献１０を参照）。ｔｅｔの非存在下で、このベクター内のｔｅｔ調節性転写活性化因子（ｔＴＡ）は、ｐｈＣＭＶ＊１、ｔｅｔオペレーター配列に融合したヒトサイトメガロウイルス由来の最小プロモーターからの転写を強く活性化する。ｔＴＡは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）のトランスポゾン−１０由来ｔｅｔ耐性オペロンのリプレッサー（ｔｅｔＲ）と、単純疱疹ウイルスのＶＰ１６の酸性ドメインとの融合タンパク質である。低い非毒性の濃度のｔｅｔ（例えば、０．０１〜１．０μｇ／ｍＬ）は、ｔＴＡによって転写促進をほぼ完全に壊滅する。
【０２７７】
一実施形態において、ベクターは、選択可能マーカー、例えば薬剤耐性を付与するタンパク質をコードする遺伝子をさらに含有する。細菌のネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏＲ）は、本発明の方法で採用され得るこのようなマーカーの１つである。ｎｅｏＲを有する細胞は、例えば増殖培地への１００〜２００μｇ／ｍＬのＧ４１８の添加などの当業者公知の手段によって選択することができる。
【０２７８】
トランスフェクションは、これに限定されないが、レトロウイルス感染などの当業者公知の様々な手段のいずれかによって達成することができる。一般的に、細胞培養は、ベクターのためのプロデューサー細胞株から収集された馴化培地とＮ２サプリメントを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２との混合物と共にインキュベートすることによってトランスフェクトすることができる。例えば、上述したように調製された胎盤細胞培養物は、１容量部の馴化培地および２容量部のＮ２サプリメントを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２中の約２０時間のインキュベーションにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで例えば５日後に、感染させることができる。次いで選択可能マーカーを有するトランスフェクトされた細胞を上述したように選択することができる。
【０２７９】
トランスフェクション後、増殖を許容する、例えば、２４時間中に細胞の少なくとも３０％の倍加を可能にする表面上で、培養物を継代する。好ましくは、基材は、ポリオルニチン（１０μｇ／ｍＬ）および／またはラミニン（１０μｇ／ｍＬ）でコーティングされた組織培養プラスチック、ポリリシン／ラミニン基材またはフィブロネクチンで処理した表面からなるポリオルニチン／ラミニン基材である。次いで培養物に、増殖培地を３〜４日ごとに供給し、ここで増殖培地は、１つまたは複数の増殖促進因子が補充されていてもよいし、または補充されていなくてもよい。増殖促進因子は、培養物が５０％未満の密集度であるときに増殖培地に添加してもよい。
【０２８０】
条件的不死化胎盤細胞株は、８０〜９５％の密集度のときに、例えばトリプシン処理などによる標準的な技術を使用して継代することができる。およそ２０回の継代まで、一部の実施形態において、選択（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子を含有する細胞の場合、Ｇ４１８の添加による）を維持することが、有益である。細胞はまた、長期間貯蔵のために液体窒素中で凍結されてもよい。
【０２８１】
クローン細胞株は、上述したように調製された条件的不死化ヒト胎盤細胞株から単離することができる。一般的に、このようなクローン細胞株は、限界希釈などによる標準的な技術を使用して、またはクローニングリングを使用して単離して、拡張することができる。クローン細胞株は、一般的に、上述したように供給および継代することができる。
【０２８２】
条件的不死化ヒト胎盤細胞株は、クローン性であってもよいが、必ずしもクローン性でなくてもよく、一般的に、分化を促進する培養条件下で増殖を促進するタンパク質の産生および／または活性を抑制することによって分化するように誘導することができる。例えば、増殖を促進するタンパク質をコードする遺伝子が、外部から調節可能なプロモーターの制御下にある場合、条件、例えば培地の温度または組成は、増殖を促進する遺伝子の転写を抑制するように改変することができる。上記で論じられたテトラサイクリン調節性遺伝子発現系の場合、分化は、増殖を促進する遺伝子の転写を抑制するためのテトラサイクリンの添加によって達成することができる。一般的に、４〜５日での１μｇ／ｍＬのテトラサイクリンが、分化を開始させるのに十分である。さらなる分化を促進するために、追加の薬剤が、増殖培地に含まれていてもよい。
【０２８３】
５．１０  キット
別の態様において、循環系の疾患または障害を有する個体の処置に好適なキットであって、残りのキット内容物から分離された容器中に、組織培養プラスチック接着性の複能性胎盤接着性細胞、例えば、胎盤幹細胞または胎盤複能性細胞、例えば、上記のセクション５．３に記載される細胞（胎盤接着性細胞）、および使用説明書を含む、キットが本明細書で提供される。好ましくは、胎盤接着性細胞は、薬学的に許容される溶液中に、例えば、病巣内投与に好適な溶液または静脈内投与に好適な溶液中に提供される。ある特定の実施形態において、胎盤幹細胞または胎盤複能性細胞は、本明細書に記載されるＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋胎盤接着性細胞、例えば、ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤接着性細胞またはＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ４５−、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤接着性細胞のいずれかである。
【０２８４】
ある特定の実施形態において、キットは、個体への胎盤接着性細胞の送達を促進する１つまたは複数の要素を含む。例えば、ある特定の実施形態において、キットは、個体への胎盤接着性細胞の病巣内送達を促進する要素を含む。このような実施形態において、キットは、例えば、個体への細胞の送達に好適なシリンジおよび針、および同種のものを含んでいてもよい。このような実施形態において、胎盤接着性細胞は、バッグ中のキットに、または１つまたは複数のバイアルに含有されていてもよい。ある特定の他の実施形態において、キットは、個体への胎盤接着性細胞の静脈内または動脈内送達を促進する要素を含む。このような実施形態において、胎盤接着性細胞は、例えば、ボトルまたはバッグ（例えば、約１．５Ｌまでの細胞を含む溶液を含有することができる血液バッグまたは類似のバッグ）中に含有されていてもよく、キットは加えて、個体への細胞の送達に好適な管材料および針を含む。
【０２８５】
加えて、キットは、個体における痛みまたは炎症を低減する１つまたは複数の化合物（例えば、鎮痛薬、ステロイド性または非ステロイド性抗炎症化合物、または同種のもの）を含んでいてもよい。キットはまた、抗細菌性または抗ウイルス性化合物（例えば、１つまたは複数の抗生物質）、個体における不安を低減する化合物（例えば、アルプラゾラム（ａｌａｐｒａｚｏｌａｍ））、個体における免疫応答を低減する化合物（例えば、サイクロスポリンＡ）、抗ヒスタミン剤（ジフェンヒドラミン、ロラタジン、デスロラタジン、クエチアピン、フェキソフェナジン、セチリジン、プロメタジン、クロルフェニラミン（ｃｈｌｏｒｅｐｈｅｎｉｒａｍｉｎｅ）、レボセチリジン、シメチジン、ファモチジン、ラニチジン、ニザチジン、ロキサチジン、ラフチジン、または同種のもの）を含んでいてもよい。
【０２８６】
加えて、キットは、使い捨て用品、例えば、滅菌拭き取り繊維、使い捨ての紙用品、グローブ、または同種のものを含んでいてもよく、これらは、送達のための個体の準備を容易にしたり、または胎盤接着性細胞投与の結果としての個体における感染の見込みを低減したりする。
【実施例】
【０２８７】
６．実施例
６．１  実施例１：胎盤由来の接着性細胞の表現型の特徴付け
この実施例は、胎盤接着性細胞（ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞、胎盤接着性細胞とも称される）による血管新生因子の分泌を実証する。
【０２８８】
胎盤由来の接着性細胞の血管新生の効力の評価のためのセクレトームプロファイリング
ＭｕｌｉｔｐｌｅｘＢｅａｄアッセイ：６回の継代における胎盤由来の接着性細胞を、増殖培地中に等しい細胞数でプレーティングし、４８時間後に馴化培地を収集した。血清、血漿、および細胞／組織培養上清を含む様々なマトリックスにおける血管新生バイオマーカーの測定を可能にするアッセイである、磁気ビーズベースのマルチプレックスアッセイ（Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ  Ｐｒｏ（商標）、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＣＡ）を使用して、細胞馴化培地中の複数の血管新生サイトカイン／増殖因子の同時定性分析を実行した。これらの９６−ウェルプレートフォーマットのビーズベースのアッセイの原理は、捕獲サンドイッチイムノアッセイに類似している。所望の血管新生標的に対して向けられた抗体は、内部染色されたビーズに共有結合でカップリングされる。カップリングされたビーズは、血管新生の標的を含有するサンプルと反応することができる。一連の洗浄によって未結合のタンパク質を除去した後、異なるエピトープに特異的なビオチン化検出抗体を反応に添加する。その結果、血管新生の標的の周りに抗体のサンドイッチが形成される。次いでストレプトアビジン−ＰＥを添加して、ビーズ表面上のビオチン化検出抗体に結合させる。簡単に言えば、マルチプレックスアッセイを製造元の説明書に従って実行し、馴化培地中のそれぞれの血管新生増殖因子の量を評価した。
【０２８９】
ＥＬＩＳＡ：細胞馴化培地中の単一の血管新生サイトカイン／増殖因子の定量分析を、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ミネアポリス、ミネソタ州）からの市販のキットを使用して実行した。簡単に言えば、ＥＬＩＳＡアッセイを製造元の説明書に従って実行し、馴化培地中のそれぞれの血管新生増殖因子の量を評価した。
【０２９０】
図１に、胎盤接着性細胞による様々な血管新生タンパク質の分泌のレベルを示す。
【０２９１】
【表１】
2020512970.tif 000003
【０２９２】
別の実験で、胎盤接着性細胞は、アンギオポイエチン−１、アンギオポイエチン−２、ＰＥＣＡＭ−１（ＣＤ３１；血小板内皮細胞接着分子）、ラミニンおよびフィブロネクチンも分泌することを確認した。
【０２９３】
６．２  実施例２：胎盤細胞の機能的な特徴付け
この実施例は、血管新生および分化能力に関連する胎盤接着性細胞（ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞、胎盤接着性細胞とも称される）の異なる特徴を実証する。
【０２９４】
６．２．１  胎盤接着性細胞の血管新生の効力の評価のためのＨＵＶＥＣの管形成
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、３日間にわたりＥＧＭ−２培地（Ｃａｍｂｒｅｘ、イーストラザフォード、ニュージャージー州）中での３回またはそれ未満の継代で二次培養し、およそ７０％〜８０％の密集度で回収した。ＨＵＶＥＣを基礎培地／抗生物質（ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ））で１回洗浄し、同じ培地に所望の濃度で再懸濁した。ＨＵＶＥＣを、調製から１時間以内に使用した。ヒト胎盤コラーゲン（ＨＰＣ）を、１０ｍＭのＨＣｌ（ｐＨ２．２５）中で１．５ｍｇ／ｍＬの濃度にし、これを緩衝液でｐＨ７．２に中和し、使用されるまで氷上で維持した。ＨＰＣを、細胞４０００個／μＬの最終的な細胞濃度でＨＵＶＥＣ懸濁液と合わせた。得られたＨＵＶＥＣ／ＨＰＣ懸濁液を、３μＬ／ウェルで、即座にピペットで９６−ウェルプレートに取った（プレートの外周は、蒸発を回避するために滅菌ＰＢＳで前もって充填されていなければならない。条件１つ当たりｎ＝５）。ＨＵＶＥＣの液滴を、コラーゲンが重合できるように、培地の添加なしで３７℃および５％ＣＯ２で７５〜９０分間インキュベートした。「乾式」インキュベーションが終わったら、各ウェルを、２００μＬの馴化胎盤接着性細胞培地（ｎ＝２つの細胞株）または対照培地（例えば、陰性対照としてＤＭＥＭ／Ｆ１２、および陽性対照としてＥＧＭ−２）で穏やかに充填し、３７℃および５％ＣＯ２で２０時間インキュベートした。６回の継代で胎盤接着性細胞を増殖培地中に４〜６時間インキュベートすることによって馴化培地を調製し、付着させ塗り広げた後、培地を２４時間にわたりＤＭＥＭ／Ｆ１２に交換した。インキュベーション後、ＨＵＶＥＣの液滴を乱さずにウェルから培地を除去し、ウェルをＰＢＳで１回洗浄した。次いでＨＵＶＥＣの液滴を１０秒かけて固定し、Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｋ細胞染色キットを使用して１分間染色し、その後滅菌水で３回濯いだ。染色した液滴を空気乾燥させ、ＺｅｉｓｓのＳｔｅＲｅｏ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｖ８顕微鏡を使用して各ウェルの画像を獲得した。次いでコンピューターソフトウェアパッケージＩｍａｇｅＪおよび／またはＭａｔＬａｂを使用して画像を分析した。画像を、カラーから８ビットのグレースケール画像に変換し、閾値処理して白黒画像に変換した。次いで粒子分析機構を使用して画像を分析して、カウント（個々の粒子の数）、合計面積、平均サイズ（個々の粒子の）、およびアッセイ中の内皮管形成の量に匹敵する面積比を含むピクセル密度データを得た。
【０２９５】
馴化培地は、管形成の誘導によって実証されたように、内皮細胞に血管新生作用を発揮した（図２を参照）。
【０２９６】
６．２．２  ＨＵＶＥＣ移動アッセイ
この実験は、胎盤由来の接着性細胞の血管新生能力を実証した。ＨＵＶＥＣを、フィブロネクチン（ＦＮ）でコーティングされた１２−ウェルプレート中で単分子層の密集度に増殖させ、単分子層を１ｍＬのプラスチックピペットチップで「創傷を与え」、ウェルにわたり無細胞ラインを作り出した。増殖の３日後に胎盤接着性細胞から得られた無血清馴化培地（ＥＢＭ２；Ｃａｍｂｒｅｘ）と共に「創傷を与えた」細胞をインキュベートすることによって、ＨＵＶＥＣの移動を試験した。細胞非含有のＥＢＭ２培地を、対照として使用した。１５時間後、倒立顕微鏡を使用して無細胞領域への細胞移動を記録した（ｎ＝３）。次いで、コンピューターソフトウェアパッケージＩｍａｇｅＪおよび／またはＭａｔＬａｂを使用して写真を分析した。画像を、カラーから８ビットのグレースケール画像に変換し、閾値処理して白黒画像に変換した。次いで粒子分析機構を使用して画像を分析して、カウント（個々の粒子の数）、合計面積、平均サイズ（個々の粒子の）、およびアッセイ中の内皮の移動量に匹敵する面積比を含むピクセル密度データを得た。初期に記録した創傷ラインのサイズに対する細胞移動の程度をスコア付けし、結果を細胞１×１０６個に正規化した。
【０２９７】
胎盤由来の接着性細胞によって分泌された栄養因子は、細胞移動の誘導によって実証されたように、内皮細胞に血管新生作用を発揮した（図３）。
【０２９８】
別の実験で、ＨＵＶＥＣを、２４ウェル−プレートの底部で、ＥＧＭ２中で一晩定着させて培養し、続いてＥＢＭ中で半日飢餓状態にした。同時に、培地で培養された胎盤接着性細胞を融解させ、トランスウェル（８μＭ）中で一晩培養した。ＥＣ飢餓後、馴化無血清ＤＭＥＭを、一晩の増殖のためにトランスウェルを伴ってＥＣ上に移した。各実験には４つの複製を含め、ＰｒｏｍｅｇａのＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏアッセイで２４時間後の増殖を評価した。ＥＢＭ−２培地を陰性対照として使用し、ＥＧＭ−２を陽性対照として使用した。エラーバーは、分析の複製（ｎ＝３）の平均標準偏差を示す。
【０２９９】
胎盤接着性細胞によって分泌された栄養因子は、ＨＵＶＥＣ増殖の指標であるＨＵＶＥＣ細胞数の増加をもたらした。図４を参照されたい。
【０３００】
６．２．３  胎盤由来の接着性細胞の血管新生の効力の評価のための管形成
胎盤接着性細胞を、ＶＥＧＦ非含有の増殖培地中またはＶＥＧＦ含有のＥＧＭ２−ＭＶ中のいずれかで増殖させて、全般的に細胞の血管新生の効力に加えて細胞の分化能へのＶＥＧＦの作用を評価した。ＨＵＶＥＣを、管形成の対照細胞として、ＥＧＭ２−ＭＶ中で増殖させた。細胞を、それぞれの培地中で、それらが７０〜８０％の密集度に達するまで４から７日間培養した。冷（４℃）ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）溶液（５０Ａ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を１２−ウェルプレートのウェルに分配し、プレートを３７℃で６０分インキュベートして、溶液をゲル状にした。胎盤接着性細胞およびＨＵＶＥＣ細胞をトリプシン処理し、適切な培地（ＶＥＧＦ含有および非含有）に再懸濁し、１００μＬの希釈した細胞（細胞１から３×１０４個）をＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）含有ウェルのそれぞれに添加した。重合ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）上の細胞を、０．５から１００ｎｇのＶＥＧＦの存在または非存在下で、３７℃で４から２４時間、５％ＣＯ２インキュベーターに置いた。インキュベーション後、標準的な光学顕微鏡法を使用して、管形成の兆候に関して細胞を評価した。
【０３０１】
胎盤接着性細胞は、ＶＥＧＦの非存在下で最小の管形成を示したが、ＶＥＧＦでの刺激を介して管状の構造を形成するように誘導／分化した。図５を参照されたい。
【０３０２】
６．２．４  胎盤由来の接着性細胞の血管新生の効力の評価のための低酸素応答性
内皮細胞および／または内皮前駆体の血管新生の機能を評価するために、低酸素および酸素正常条件下で血管新生増殖因子を分泌するその能力に関して、細胞を評価することができる。低酸素状態下での培養は通常、内皮細胞または内皮前駆細胞のいずれかによる血管新生増殖因子の分泌の増加を誘導し、これは、馴化培地中で測定することができる。胎盤由来の接着性細胞を、その標準的な増殖培地中に等しい細胞数でプレーティングし、およそ７０〜８０％の密集度に増殖した。その後、細胞の培地を無血清培地（ＥＢＭ−２）に交換し、正常酸素圧（２１％Ｏ２）または低酸素（１％Ｏ２）条件下で２４時間インキュベートした。馴化培地を収集し、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓからの市販のＥＬＩＳＡキットを使用して血管新生増殖因子の分泌を分析した。ＥＬＩＳＡアッセイを製造元の説明書に従って実行し、馴化培地中のそれぞれの血管新生増殖因子の量（ＶＥＧＦおよびＩＬ−８）を細胞１×１０６個に正規化した。
【０３０３】
胎盤由来の接着性細胞は、低酸素状態下で様々な血管新生増殖因子の分泌の上昇を示した。図６を参照されたい。
【０３０４】
６．２．５  胎盤接着性細胞の馴化培地に対するＨＵＶＥＣ応答
胎盤接着性細胞を、６０％ＤＭＥＭ−ＬＧ（Ｇｉｂｃｏ）；４０％ＭＣＢＤ−２０１（Ｓｉｇｍａ）；２％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｓ）、１×インスリン−トランスフェリン−セレニウム（ＩＴＳ）；１０ｎｇ／ｍＬリノール酸−ウシ血清アルブミン（ＬＡ−ＢＳＡ）；１ｎ−デキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）；１００μＭアスコルビン酸２−リン酸（Ｓｉｇｍａ）；１０ｎｇ／ｍＬ上皮増殖因子（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）；および１０ｎｇ／ｍＬ血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ−ＢＢ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含有する増殖培地中で４８時間培養し、次いで無血清培地中で追加の４８時間培養した。胎盤接着性細胞培養物からの馴化培地を収集し、これを使用して、血清飢餓ＨＵＶＥＣを５、１５、および３０分刺激した。その後ＨＵＶＥＣを溶解させ、ＢＤ（商標）ＣＢＡ（Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｓｓａｙ）細胞シグナル伝達フレックスキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で、血管新生経路のシグナル伝達において役割を果たすことがわかっているリンタンパク質に関して染色した。胎盤接着性細胞は、ＨＵＶＥＣにおける、ＡＫＴ−１（これは、アポトーシスプロセスを阻害する）、ＡＫＴ−２（これは、インスリンシグナル伝達経路における重要なシグナル伝達タンパク質である）、およびＥＲＫ１／２細胞増殖経路の強い活性化剤であることが見出された。これらの結果はさらに、胎盤接着性細胞の血管新生能力を実証する。
【０３０５】
６．３  実施例３：胎盤接着性細胞による血管新生の誘導
この実施例は、ニワトリ漿尿膜（ＣＡＭ）を使用したｉｎ  ｖｉｖｏでのアッセイにおいて、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤接着性細胞が、上記の実施例１に記載されたように血管新生を促進することを実証する。
【０３０６】
２つの別個のＣＡＭアッセイを実行した。第１のＣＡＭアッセイにおいて、胎盤接着性細胞の異なる調製物からの無傷細胞ペレットを評価した。第２のＣＡＭアッセイにおいて、異なる胎盤接着性細胞調製物の上清を評価した。線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を陽性対照として使用し、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳がん細胞を参照として使用し、媒体および培地対照を陰性対照として使用した。研究のエンドポイントは、全ての処置および対照グループの血管密度を決定することであった。
【０３０７】
６．３．１  胎盤接着性細胞を使用したＣＡＭアッセイ
上記の実施例１に記載されたように調製し低温保存した胎盤接着性細胞を使用した。胎盤接着性細胞を投与のために融解させ、ＣＡＭに投与された細胞の数を決定した。
【０３０８】
研究設計：各グループが１０個の胎芽を含む５つのグループを研究に含めた。表２に、研究の設計を記載する。
【０３０９】
【表２】
2020512970.tif 000004
【０３１０】
ＣＡＭアッセイ手順：新鮮な有精卵を、標準的な卵インキュベーター中で、３７℃で３日間インキュベートした。３日目に滅菌条件下で卵を割り、胎芽を２０個の１００ｍｍプラスチックプレートに置き、底部の棚に水のリザーバを備えた胎芽インキュベーター中で、３７℃で培養した。インキュベーター中の湿度が一定に維持されるように、水のリザーバに小さいポンプを使用して空気を連続的にバブリングした。６日目に、各ＣＡＭ上に滅菌シリコン「Ｏ」リングを置き、次いで、滅菌フード中で、胎盤接着性細胞を、培地／ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）混合物（１：１）４０μＬ当たり細胞７．６９×１０５個の密度で各「Ｏ」リングに送達した。表２に、投与につき使用された細胞の数および各細胞調製物に添加された培地の量を記載する。媒体対照胎芽は、４０μＬの媒体（ＰＢＳ／ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）、１：１）を受け、陽性対照は、４０μＬのＤＭＥＭ培地／ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）混合物（１：１）中の１００ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを受け、培地対照は、４０μＬのＤＭＥＭ培地単独を受けた。各投与が完了した後、胎芽をインキュベーターに戻した。８日目に、胎芽をインキュベーターから取り出し、室温で維持しながら、画像捕獲システムを１００×の倍率で使用して各「Ｏ」リング下で血管密度を決定した。
【０３１１】
ＣＡＭ上の処置部位に存在する血管の数を示すために、計算上の数値である０から５、または指数関数的な数値である１から３２を使用した血管新生スコア付けシステムによって、血管密度を測定した。より高いスコアの数値は、より高い血管密度を示し、一方で０は血管新生がないことを示した。それぞれ個々の実験につき、その部位で記録されたスコアを対照サンプルから得られた平均スコアで割ることを使用して、各投与部位における阻害パーセントを計算した。その用量に関して８〜１０個の胎芽から得られた全ての結果をプールすることによって、所与の化合物の各用量の阻害パーセントを計算した。
【０３１２】
【表３】
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【０３１３】
結果：図７に血管密度スコアの結果を示す。結果は、明らかに、胎盤接着性細胞懸濁液、または１００ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ、またはＭＤＡＭＢ２３１乳がん細胞懸濁液で処理したニワトリ漿尿膜の血管密度スコアが、媒体対照ＣＡＭのスコアと比較して統計学的に有意に高いことを示す（Ｐ＜０．００１、スチューデントの「ｔ」検定）。胎盤接着性細胞（陰性対照）を培養するために使用された培地は、血管密度に対してまったく作用を有さなかった。さらに、胎盤接着性細胞調製物の血管密度の誘導は、多少のばらつきを示したが、このばらつきは統計学的に有意ではなかった。
【０３１４】
６．３．２  胎盤接着性細胞上清を使用したＣＡＭアッセイ
第２のＣＡＭアッセイに、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞および胎盤接着性細胞からの上清サンプルを上述したように使用した。ｂＦＧＦおよびＭＤＡ−ＭＢ−２３１上清を、陽性対照として使用し、培地および媒体を陰性対照として使用した。
【０３１５】
研究設計：各グループが１０個の胎芽を含む５つのグループを研究に含めた。表４に、研究の設計を記載する。
【０３１６】
【表４】
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【０３１７】
ＣＡＭアッセイ手順：アッセイ手順は、上記のセクション５．３．１に記載したのと同じであった。唯一の差は、各幹細胞調製物からの上清またはＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞からの上清を、試験材料として使用したことであった。投与のために、各上清をＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（体積で１：１）と混合し、４０μＬの混合物を各胎芽に投与した。
【０３１８】
結果：血管密度スコア（図８を参照）は、各幹細胞調製物の上清による血管形成の誘導が異なっていたことを示す。胎盤接着性細胞からの上清サンプルは、血管誘導への有意な作用を示し、それぞれＰ＜０．０１、Ｐ＜０．００１、およびＰ＜０．０２（スチューデントの「ｔ」検定）であった。予想通りに、陽性対照ｂＦＧＦも、上記の第１のＣＡＭアッセイからわかるように血管形成の有力な誘導を示した（Ｐ＜０．００１、スチューデントの「ｔ」検定）。しかしながら、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳がん細胞からの上清は、媒体対照と比較して有意な血管形成への誘導を示さなかった。これまでに示したように、培養培地単独では、まったく作用を有さなかった。
【０３１９】
６．４  実施例４：内皮および筋肉細胞への胎盤接着性細胞の全身性作用
６．４．１材料および方法
研究設計：レーザードップラー血液フロー分析および行動試験には、グループ１つ当たり少なくとも９匹のマウスのサンプルサイズを使用し、Ｘ線血管撮影法には、グループ１つ当たり４から５匹のマウスのサンプルサイズを使用し、組織学的な評価には、グループ１つ当たり４から５匹のマウスのサンプルサイズを使用した。動物をランダムに実験グループに割り当て、実験者を実験グループの正体に対して盲検化し、一方でこの研究において複数のエンドポイントを試験した。異常値を排除せず、全ての収集されたデータを統計分析に使用した。
【０３２０】
マウス：Ｄｂ／ｄｂマウス（１０〜１１週齢）およびＢａｌｂ／ｃ、野生型および無胸腺ヌードマウス（１０から１２週齢）を、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒｓ（ボストン，マサチューセッツ州、米国）から購入した。全ての動物実験は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）およびＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ（ＡＡＡＬＡＣ）のガイドラインに適合していた。
【０３２１】
胎盤接着性細胞およびヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）の調製：ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤接着性細胞を、実施例１および非特許文献１１に記載されたように、正常な満期産から得られたヒト胎盤組織の機械的なおよび酵素による消化によって調製した。胎盤接着性細胞を、商標付きの培地中での６回の継代まで拡張し、その後、これまでに記載されたようにしてｉｎ  ｖｉｖｏでの研究に使用した（非特許文献１２）。ＨＤＦ細胞をＬｏｎｚａ（ウォーカーズビル、メリーランド州、米国）から得て、これを製造元の説明書に従って培養により拡張した。
【０３２２】
後肢虚血（ＨＬＩ）のマウスモデル：ｄｂ／ｄｂマウスでの片側ＨＬＩモデルにおいて、右大腿動脈を２ヶ所（大腿深動脈の近位）で結紮し、結紮糸の間を横方向に切開した。媒体、ＨＤＦ（細胞３×１０４個）、または胎盤接着性細胞（細胞３×１０４個）を、結紮後の２４時間に、筋肉内の２つの部位、すなわち外科創傷の近位および遠位側（各部位に２５μｌ、マウス１匹当たり合計５０μｌ）に投与した。ｄｂ／ｄｂマウスでの両側ＨＬＩモデルにおいて、右大腿動脈を２ヶ所（大腿深動脈の遠位）で結紮し、結紮糸の間を横方向に切開した。動物を、結紮後の４８時間に、媒体、ＶＥＧＦ（３．３μｇ／動物；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州、米国）または胎盤接着性細胞（細胞５×１０４個）で処置した。右後肢の大腿動脈の結紮および横方向への切開の２３日後、左後肢に、２回目の傷害、大腿動脈の結紮（大腿深動脈の近位）を実行した。
【０３２３】
Ｔ細胞再構成実験において、ＣＤ４＋Ｔ細胞を野生型Ｂａｌｂ／ｃマウスの脾臓から単離し、５×１０６個のＣＤ４＋Ｔ細胞を、無胸腺ヌードＢａｌｂ／ｃレシピエントマウスの静脈内に移した。ＣＤ４＋Ｔ細胞移植の２週間後、レシピエントマウスを片側ＨＬＩに供し、続いて２４時間後に媒体または胎盤接着性細胞（細胞５×１０４個）処置に供した。
【０３２４】
血流の測定：ベースライン時に、手術の直後に、および連続的に６週間にわたり、目的の領域（ふくらはぎの領域）にわたる繰り返しの後肢血流測定を、非接触型のレーザードップラーを使用して得た。片側ＨＬＩモデルにおいて、血流は、各タイムポイントにおける右（虚血）から左（正常）肢における血流の比率として表される。両側結紮モデルにおいて、血流は、ＨＬＩ傷害前のベースライン時における血流に対する特定のタイムポイントでの後肢における血流の比率として表される。
【０３２５】
血管撮影法：マウスをケタミン／キシラジンで麻酔した。近位大動脈および下大静脈の結紮の後、大動脈に硫酸バリウム溶液（２．５ｍｌ）を注入し、造影剤が充填された血管の数を、Ｘ線レントゲンアッセイを使用して決定した。血管撮影写真の造影剤が充填された血管とグリッド線との交差の定量は、放射線不透過性色素で充填されたグリッド上のブロックの数と定義されるアンギオスコアとして提示される。
【０３２６】
組織学および免疫組織化学：後四肢筋を除去し、ＨＯＰＥ（Ｈｅｐｅｓ−グルタミン酸緩衝媒介有機溶媒保護作用）固定剤（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ、ウォーリントン、ペンシルベニア州）中で固定し、パラフィンに包埋した。パラフィンブロックを３０分かけて２０℃に冷却し、マイクロトームを使用して厚さ５μｍに薄片化した。２つの連続する薄片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色することにより筋肉の解剖学的構造を可視化し、形態学的な変化に関して顕微鏡で評価した。免疫染色のために、まず大腿部筋肉の薄片を、ＰＢＳ中の１０％ウマ・ロバ血清２×カゼインで、室温で３０分ブロッキングし、次いで一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートし、二次抗体と共に室温で３０分インキュベートした。一次抗体について、ラット抗ＣＤ３１（１：１００、Ａｂｃａｍ、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、米国）、ウサギ抗αＳＭＡ（１：１００、Ａｂｃａｍ）、ラット抗ＣＤ６８（１：１００、ＡＢＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ、ローリー、ノースカロライナ州、米国）、およびヤギ抗アルギナーゼ１（１：１００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ダラス、テキサス州、米国）を使用した。適切な二次抗体は、ヤギ抗ラットＩｇＧコンジュゲートＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８（１：５００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、カリフォルニア州、米国）、ヤギ抗ウサギＩｇＧ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４（１：５００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ニワトリ抗ラットＩｇＹコンジュゲートＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８（１：５００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびロバ抗ヤギＩｇＧコンジュゲートＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４（１：５００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含んでいた。核染色のために、６００ｎＭのＤＡＰＩ溶液（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州、米国）を適用した。免疫組織化学画像を、画像捕獲およびアーカイブ化のためのＮＩＳエレメントソフトウェアを備えたＰＣに連結された高解像度デジタルカメラＮｉｋｏｎ  ＤＸＭ１２００Ｆを備えたＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅの顕微鏡モデルＥ８００を用いて捕獲した。血管密度および形態測定分析のために、１つの処置グループ当たり４から５つの代表的な動物のそれぞれからの３つの薄片を評価した。各薄片内で、３つのオーバーラップしないフィールドをランダムに選択し、２０×の倍率でデジタルで捕獲した。測定された平均断面積は０．３５ｍｍ２／フィールドであった。
【０３２７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのヒトマクロファージの分化：ヒト単球を、ＣＤ１４＋磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）を使用して血液から単離した。単球を、１００ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦが補充されたＲＰＭＩ１６４０培地中で、１００ｃｍ培養皿プレーティングし、７〜８日間培養し、Ｍ０マクロファージを誘導した。その後細胞をＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）で回収し、６ウェルプレートに細胞５×１０５個／ウェルでプレーティングした。アッセイ対照として、選択ウェルを１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳまたは２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４で４８時間処理して、マクロファージをそれぞれＭ１およびＭ２に分極させた。Ｍ０マクロファージをＲＰＭＩ１６４０培地で培養し続けた。胎盤接着性細胞を、トランスウェル中で、Ｍ０マクロファージと１：１の比率で共培養した。４８時間の処理後、マクロファージをＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）で回収し、フローサイトメトリーによってＣＤ２０６、ＣＤ８０およびＨＬＡ−Ｉの平均蛍光強度（ＭＦＩ）に関して分析した。
【０３２８】
フローサイトメトリー：フローサイトメトリー染色のための全ての抗体を、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、サンノゼ、カリフォルニア州、米国）から購入した。マクロファージをＦＡＣＳ洗浄緩衝液（２％ＦＢＳを含むＰＢＳ）で洗浄し、４℃で３０分インキュベートすることによって抗体で標識した。フローサイトメトリー分析をＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で実行した。データをＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で獲得し、ＦｌｏｗＪｏフローサイトメトリーソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ、アシュランド、オレゴン州、米国）を使用して分析した。
【０３２９】
統計的分析：データは、平均±ＳＥＭとして表される。全てのｅｘ  ｖｉｖｏ研究において。統計的有意性を、両側スチューデント「ｔ」検定によって決定した。Ｐ値＜０．０５を統計学的に有意とみなした。繰り返しの測定による二元分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるマウスのグループ間の差を分析した。処理に関連する有意な作用が観察されたとき（ＡＮＯＶＡ；Ｐ＜０．０５）、ペアワイズ最小有意差（ＬＳＤ）事後分析を実行した。
【０３３０】
流入領域リンパ節細胞の調製および分析：ｄｂ／ｄｂマウスで実行された片側ＨＬＩ実験において、大腿動脈の結紮および横方向への切開後の３、７または１４日目に、鼠径部のｄＬＮを収集した。ＯｃｔｏＭＡＣＳディソシエーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）を製造元の説明書に基づき使用した機械的な解離によって、ｄＬＮからの単一細胞懸濁液を得た。遺伝子発現およびサイトカイン産生を測定するために、ｄＬＮ細胞を、ＰＭＡ／イオノマイシンを含む不完全ＲＰＭＩ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）でそれぞれ２および２４時間刺激した。ＭｉｌｌｉｐｏｒｅのマウスＭＡＰサイトカイン／ケモカイン磁気ビーズパネル（ＭＣＹＴＭＡＧ−７０Ｋ−ＰＸ３２）を使用して上清を分析した。
【０３３１】
定量ＰＣＲ分析：遺伝子発現のために、マウス用の個々のＴａｑｍａｎ遺伝子発現アッセイを、Ｇａｔａ３、Ｔｂｅｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に使用した。相対的な遺伝子発現を、ＧＡＰＤＨ発現を使用して正規化し、変化倍率を、２−ΔΔＣｔ方法を使用して計算した。
【０３３２】
ｄｂ／ｄｂマウスのＨＬＩモデルにおける流入領域リンパ節細胞の移植：ｄＬＮ細胞移植実験において、ｄｂ／ｄｂマウスの右後肢における大腿動脈の片側結紮および横方向への切開によって、ＨＬＩを作り出し、動物を、ＨＬＩの２４時間後に、媒体、ＨＤＦ（細胞５×１０４個）または胎盤接着性細胞（細胞５×１０４個）で処置した。処置の１４日後、動物を殺し、これらのドナー動物から鼠径部のｄＬＮを単離した。ｄＬＮ細胞（細胞１×１０６個／動物）を、２４時間前に片側ＨＬＩに供されたレシピエントマウスの筋肉内に投与した。血流をレーザードップラーによって測定し、ＣＤ３１＋またはαＳＭＡ＋血管の密度を免疫組織化学によって決定した。
【０３３３】
６．４．２  結果
ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤接着性細胞は血液潅流および側副血管形成を向上させる。
媒体で処置したマウスにおいて、損傷を受けた肢の血流は、ＨＬＩ後、急速に１０％未満に低下し、１４および４２日目にそれぞれおよそ２０％および３５％に回復した。胎盤接着性細胞処置は、媒体と比較して、２８日目に血流を有意に向上させた（図９Ａ）。ヒト皮膚線維芽細胞細胞（ＨＤＦ）は、ヒト細胞株対照として使用されたが、これは、検査したいずれの時点でも媒体と比較して血流を向上させなかったことから、胎盤接着性細胞によって誘導された動脈形成は非特異的な異種反応によって引き起こされる修復によるものではいことが示唆される。またＸ線血管撮影法からも、胎盤接着性細胞で処置した動物は、媒体またはＨＤＦ処置動物より多くの数の血管を有していたことが示された（図９Ｂ）。
【０３３４】
４２日目における上肢筋（四頭筋および内転筋）の組織学的な分析から、胎盤接着性細胞は、媒体およびＨＤＦと比較して平滑筋アルファアクチン（αＳＭＡ）＋血管の数を有意に増加させることが解明された（図９Ｃ）。αＳＭＡ＋血管のサイズ分布分析から、胎盤接着性細胞は、小血管（＜１００μｍ）の数に加えて大血管（１００〜３００μｍおよび＞３００μｍ）も増加させることが示された示した（図９Ｄ）。胎盤接着性細胞処置および側副血管発達の時間経過をよりよく理解するために、３、１４および４２日目からの上肢筋を、αＳＭＡおよび内皮マーカーＣＤ３１に関して組織学的に検査した。３日目に、胎盤接着性細胞で処置した動物と媒体で処置した動物との間でＣＤ３１＋またはαＳＭＡ＋血管密度における差はなかった。しかしながら、胎盤接着性細胞は、１４および４２日目に、ＣＤ３１＋またはαＳＭＡ＋血管密度を、媒体処置した動物の上記密度よりおよそ３倍高く増加させた（図９Ｅ〜Ｆ）。さらに、胎盤接着性細胞は、損傷を受けた肢において、筋線維再生の顕著な特徴である中心に核が配置された筋線維の数を増加させたことから、胎盤接着性細胞処置は、血液潅流において向上をもたらしたことに加えて、筋肉修復も強化したことが示唆される。
【０３３５】
ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤接着性細胞はＭ２表現型へのマクロファージの分化をモジュレートする
胎盤接着性細胞によって強化された動脈形成が、虚血性障害中に免疫応答の要素のモジュレーションに関連する可能性があるのかどうかを理解するために、ｄｂ／ｄｂマウスの上肢虚血組織における、それぞれそれらのＣＤ６８およびアルギナーゼ１（Ａｒｇ１）の発現による全浸潤性マクロファージおよびＭ２様マクロファージの表現型および組織密度を分析した。７日目において、胎盤接着性細胞で処置したまたは媒体で処置した動物において、ＣＤ６８＋の全マクロファージの数における有意差は検出されなかった。ＣＤ６８＋マクロファージの数は、媒体で処置した動物において、７日目の１０４±２０．４／ｍｍ２から１４日目の８±２．３／ｍｍ２に劇的に減少したが、それに対して胎盤接着性細胞で処置した動物では、より有意に多い数（４６±８．３／ｍｍ２）のＣＤ６８＋マクロファージが１４日目まで持続した（図１０Ａ）。さらに、胎盤接着性細胞処置は、７日目および１４日目の両方で、ＣＤ６８＋Ａｒｇ１＋Ｍ２様マクロファージの密度を、媒体対照グループと比較して有意に増加させた（図１０Ｂ）。
【０３３６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＭ２表現型へのヒトマクロファージの分化を促進する胎盤接着性細胞の能力を分析した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から誘導されたＭ０マクロファージを、トランスウェルプレート中で胎盤接着性細胞と共に４８時間培養した。胎盤接着性細胞との共培養の後、Ｍ０マクロファージは、ＩＬ−４によって誘導されたＭ２マクロファージの検出に類似したＣＤ２０６発現の有意な増加を示した（図１０Ｃ）。さらに、ＨＬＡ−Ｉ（図１０Ｄ）およびＣＤ８０（図１０Ｅ）の発現もＩＬ−４によって誘導されたＭ２マクロファージに類似しており、ＬＰＳによって誘導されたＭ１マクロファージで検出されたレベルより有意に低いレベルであった（図１０Ｄ〜Ｅ）。
【０３３７】
Ｔ細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤接着性細胞が媒介する動脈形成およびＭ２表現型へのマクロファージのモジュレーションにおいて重要な役割を果たす
上記の観察された結果におけるＴ細胞の役割を評価するために、片側ＨＬＩに供されたＢａｌｂ／ｃ野生型およびヌードマウスにおける胎盤接着性細胞の動脈形成作用を検査した。胎盤接着性細胞は、２８日目に、野生型マウスにおいて血流を有意に増加させたが、ヌードマウスでは胎盤接着性細胞によって血流は向上しなかった（図１１Ａ）。組織学的な分析から、ヌードマウスにおける媒体と比較して、胎盤接着性細胞は、ＣＤ３１＋（図１１Ｂ）またはαＳＭＡ＋（図１１Ｃ）血管密度を増加させることができなかったことが確認された。胎盤接着性細胞が媒介する動脈形成におけるＴ細胞の要件をさらに確認するために、Ｔ細胞再構成されたヌードマウスのＨＬＩモデルにおける胎盤接着性細胞の効能を評価した。レーザードップラー分析から、胎盤接着性細胞は、これらの動物において２１日目から３５日目にかけて血流を有意に強化したことが示され（図１１Ｄ）、これは、ヌードマウスにおいて、Ｔ細胞再構成が胎盤接着性細胞の効能を回復させたを示す。さらに、胎盤接着性細胞処置は、野生型およびＴ細胞再構成されたヌードマウスにおける媒体と比較して、ＨＬＩの７日後に、ＣＤ６８＋Ａｒｇ１＋Ｍ２様マクロファージの数を有意に増加させたが、ヌードマウスでは作用はなかった。（図１２Ａおよび１２Ｂ）。
【０３３８】
追加の実験を実行して、機能的なＴ細胞応答に対する胎盤接着性細胞の作用の相関的なバイオマーカーを、胎盤接着性細胞処置後の虚血組織に流れるリンパ節における機能的なＴ細胞表現型の変化を分析することによって同定した。簡単に言えば、胎盤接着性細胞処置は、サイトカインの誘導およびＴｈ２応答の遺伝子発現シグネチャーに関連し、ＨＬＩモデルにおいて、得られた流入領域リンパ節細胞が、筋肉内投与後に胎盤接着性細胞の動脈形成促進性の作用を繰り返したことが、データから実証された。
【０３３９】
総合すると、これらのデータから、Ｔ細胞は、虚血組織において、胎盤接着性細胞が媒介する動脈形成および胎盤接着性細胞によって誘導されたＭ２マクロファージの分化にとって重要であり、動脈形成促進性のリンパ球表現型およびＴｈ２型応答のバイオマーカーの誘導と相関することが示される。
【０３４０】
ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤接着性細胞処置は全身性の動脈形成をもたらす
これらのデータから、Ｔ細胞およびマクロファージの免疫修飾は、胎盤接着性細胞が媒介する動脈形成の基礎となる主要なメカニズムであることが解明される。胎盤接着性細胞が、虚血性障害に応答してＭ２マクロファージのスキューイングを介した全身性の動脈形成作用をもたらすことができるかどうかを評価するために、第１のＨＬＩ傷害の２３日後および第１の損傷した後肢への細胞注射の２１日後に、第２のＨＬＩを反対側の後肢に施した両側ＨＬＩモデルを発育させた。第２のＨＬＩのタイミングは、第１の損傷を受けた肢を完全ではないが十分に回復させ、細胞のｉｎ  ｖｉｖｏにおける持続性の事前に特徴付けられた持続時間に基づいて、胎盤接着性細胞がもはや動物に存在しなくなるのを確実にした（非特許文献１２）。
【０３４１】
第１の損傷を受けた肢において、手術後４８時間に注射された胎盤接着性細胞は、媒体と比較して、１４日目から６４日目にかけて血流を有意に増加させた。驚くべきことに、これらの動物は、第２の反対側の傷害においても３５日目（第２のＨＬＩの１４日後）から６４日目にかけて有意に向上した血流を実証したが、血流の回復の程度は、第１の損傷を受けた肢の回復の程度より弱かった（図１３Ａ）。血管撮影法から、胎盤接着性細胞は、両方の損傷を受けた肢で血管の数を増加させたことが確認された（図１３Ｂ〜Ｄ）。組織学的な分析から、胎盤接着性細胞は、両方の損傷を受けた肢の虚血組織において、ＣＤ３１＋、αＳＭＡ＋血管密度およびαＳＭＡ＋大血管を増加させたことが示された（それぞれ図１３Ｅ〜Ｇ）。両側ＨＬＩモデルにおける胎盤接着性細胞とＶＥＧＦとの動脈形成性の効能も比較した。細胞の投与は、両方の損傷を受けた肢における血流およびアンギオスコアを有意に増加させたが、それに対してＶＥＧＦの作用は、それが注射された第１の損傷を受けた肢に限定された（図１３Ｈ〜Ｉ）。ＣＤ６８＋Ａｒｇ１＋Ｍ２様マクロファージは、胎盤接着性細胞で処置した動物において、ＨＬＩの７日後に第２の損傷を受けた肢で、媒体またはＶＥＧＦで処置した動物と比較してより有意に高かった（図１３Ｊ）。これは、第２の損傷を受けた肢における動脈形成が、第１の損傷を受けた肢と同じメカニズムを共有することを示す。
【０３４２】
６．５  実施例５：胎盤接着性細胞はリンパ管形成を誘導する
ＬＹＶＥ−１（リンパ管内皮のヒアルロナン受容体−１）は、リンパ管に特徴的なタンパク質であり、リンパ管を血管と区別するのに使用することができる。ｄｂ／ｄｂマウスを上述したようにＨＬＩに供し、２４時間後、同側後肢に、およそ５０，０００個のＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤接着性細胞または媒体を注射した。免疫組織化学的検査のために、鼠径部の流入領域リンパ節を３および１４日目に収集した。胎盤接着性細胞を受けたマウスは、媒体で処置したマウスと比較して、流入領域リンパ節におけるＬＹＶＥ−１発現の増加を実証し、これは、内皮細胞活性およびリンパ管形成の増加を示す。
【０３４３】
均等物：
本発明の開示は、本明細書に記載される具体的な実施形態によって範囲が限定されないものとする。実際に、当業者には、記載されたものに加えて、本明細書で提供される主題の様々な改変が、前述の説明および添付の図面から明らかになると予想される。このような改変は、添付の特許請求の範囲内に含まれるものとする。
【０３４４】
様々な刊行物、特許および特許出願が本明細書に引用されており、これらの開示は、参照によりそれらの全体が組み入れられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ−Ｅ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ−Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１３Ｇ】
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【図１３Ｈ】
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【図１３Ｉ】
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【図１３Ｊ】
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【国際調査報告】
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