(57)【要約】本明細書において、インビボキナーゼスクリーニングによって同定された転移促進キナーゼを標的としたキナーゼ阻害剤を投与することによる、脳転移を処置するための方法を提供する。2020530467.tif 000007
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌を有する対象における脳転移を阻害するための方法であって、
該方法が、有効量のキナーゼ阻害剤を対象へ投与する工程を含み、該キナーゼ阻害剤が、ADCK4、BTK、CAMK4、CDK5、CDK5R1、CLK3、LIMK2、PAK4、PMVK、PRKACB、PRKACG、PRKCI、TSSK6、およびZC3HC1からなる群より選択されるキナーゼを標的とする、前記方法。
【請求項２】
癌が乳癌である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
乳癌がトリプルネガティブ乳癌としてさらに定義される、請求項2記載の方法。
【請求項４】
癌が肺癌である、請求項1記載の方法。
【請求項５】
処置前に対象が脳転移を有することが未知であった、請求項1記載の方法。
【請求項６】
処置前に対象が1つまたは複数の脳転移を有することが既知であった、請求項1記載の方法。
【請求項７】
対象がヒトである、請求項1記載の方法。
【請求項８】
キナーゼ阻害剤がCDK5またはLIMK2を標的とする、請求項1記載の方法。
【請求項９】
キナーゼ阻害剤がCDK5を標的とする、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
キナーゼ阻害剤がLIMK2を標的とする、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
キナーゼ阻害剤がsiRNAまたはmiRNAである、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
キナーゼ阻害剤が選択的薬理学的阻害剤である、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
CDK5のキナーゼ阻害剤が、ディナシクリブ、ビス-インドールインディルビン、(S)-CR8、ケンパウロン、PHA-793887、AT7519、ロスコビチン、ミルシクリブ（milciclib）、SNS-032、またはオロモウシンである、請求項9記載の方法。
【請求項１４】
LIMK2のキナーゼ阻害剤が、BMS-5、Pyr-1、またはT56-LIMKiである、請求項10記載の方法。
【請求項１５】
BTKのキナーゼ阻害剤が、イブルチニブ、アカラブルチニブ、ONO-4059、スペブルチニブ、BGB-3111、またはHM71224である、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
CAMK4のキナーゼ阻害剤がKN-93である、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
MAP2K7のキナーゼ阻害剤がDTP3である、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
PMVKのキナーゼ阻害剤が、CDDD_1633、CSDDD_2260、CSDDD_2419、またはルテオリンである、請求項1記載の方法。
【請求項１９】
PRKCIのキナーゼ阻害剤が、リドーラまたはRXDX-108である、請求項1記載の方法。
【請求項２０】
キナーゼ阻害剤を脳へ直接送達する、請求項1〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
キナーゼ阻害剤を、経口的に、局所的に、静脈内に、腹腔内に、筋肉内に、内視鏡的に、経皮的に、皮下に、局部的に、または直接注射によって投与する、請求項1〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
キナーゼ阻害剤を静脈内投与する、請求項1〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
キナーゼ阻害剤を髄腔内または鼻腔内投与する、請求項1〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
少なくとも第2の治療剤を投与する工程をさらに含む、請求項1〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
第2の治療剤が、化学療法、放射線療法、遺伝子療法、手術、ホルモン療法、抗血管新生療法、またはサイトカイン療法である、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
第2の治療剤が、放射線療法、化学療法、免疫療法、および／または代謝調節である、請求項24記載の方法。
【請求項２７】
第2の治療剤をキナーゼ阻害剤と同時に投与する、請求項24記載の方法。
【請求項２８】
第2の治療剤をキナーゼ阻害剤に連続して投与する、請求項24記載の方法。
【請求項２９】
癌を有する対象における脳転移を処置するための方法であって、
該方法が、有効量のキナーゼ阻害剤と少なくとも第2の抗癌剤とを組み合わせてその必要がある対象へ投与する工程を含み、該キナーゼ阻害剤が、PCTK1、SPHK1、FRK、MAPK12、ERK5、MAP2K7、UCK2、DAK、およびPRKCDからなる群より選択されるキナーゼを標的とする、前記方法。
【請求項３０】
癌が乳癌である、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
乳癌がトリプルネガティブ乳癌としてさらに定義される、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
癌が肺癌である、請求項29記載の方法。
【請求項３３】
処置前に対象が脳転移を有することが未知であった、請求項1記載の方法。
【請求項３４】
処置前に対象が1つまたは複数の脳転移を有することが既知であった、請求項29記載の方法。
【請求項３５】
対象がヒトである、請求項29記載の方法。
【請求項３６】
キナーゼ阻害剤が、PCTK1、SPHK1、MAPK12、またはCDK5を標的とする、請求項29記載の方法。
【請求項３７】
キナーゼ阻害剤がPCTK1を標的とする、請求項29記載の方法。
【請求項３８】
キナーゼ阻害剤がSPHK1を標的とする、請求項29記載の方法。
【請求項３９】
キナーゼ阻害剤がMAPK12を標的とする、請求項29記載の方法。
【請求項４０】
MAPK12のキナーゼ阻害剤が、SB 203580、ドラマピモド（doramapimod）、またはLY2228820である、請求項29記載の方法。
【請求項４１】
PCTK1のキナーゼ阻害剤が、インディルビンE804、ダブラフェニブ、またはレバスチニブ（rebastinib）である、請求項29記載の方法。
【請求項４２】
PCTK1のキナーゼ阻害剤がレバスチニブである、請求項29記載の方法。
【請求項４３】
SPHK1のキナーゼ阻害剤が、BML-258、SKI III、SKI 5C、MP A08、SKI 178、PF-543、フィンゴリモド、またはサフィンゴールである、請求項29記載の方法。
【請求項４４】
SPHK1のキナーゼ阻害剤が、フィンゴリモドまたはサフィンゴールである、請求項29記載の方法。
【請求項４５】
CDK5のキナーゼ阻害剤が、ディナシクリブ、PHA-793887、AT7519、CYC-065、またはDCAM-422である、請求項29記載の方法。
【請求項４６】
CDK5のキナーゼ阻害剤が、CYC-065またはDCAM-422である、請求項29記載の方法。
【請求項４７】
ERK5のキナーゼ阻害剤が、ERK5-IN-1、BIX 02189、XMD17-109、またはXMD 8-92である、請求項29記載の方法。
【請求項４８】
FRKのキナーゼ阻害剤が、ダサチニブ、モテサニブ、ドラマピモド、ペリチニブ（pelitinib）、ソラフェニブ、バンデタニブ、カネルチニブ、またはイマチニブである、請求項29記載の方法。
【請求項４９】
PAK4のキナーゼ阻害剤が、PF-3758309、LCH-7749944、グラウカルビノン、KY-04031、KY-04045、1-フェナントリル-テトラヒドロイソキノリン誘導体、(-)-β-ヒドラスチン、Inka1、GL-1196、またはGNE-2861である、請求項29記載の方法。
【請求項５０】
UCK2のキナーゼ阻害剤が、フラボカワインBまたはアルピネチンである、請求項29記載の方法。
【請求項５１】
キナーゼ阻害剤を、経口的に、局所的に、静脈内に、腹腔内に、筋肉内に、内視鏡的に、経皮的に、皮下に、局部的に、または直接注射によって投与する、請求項29〜51のいずれか一項記載の方法。
【請求項５２】
キナーゼ阻害剤を静脈内投与する、請求項29〜51のいずれか一項記載の方法。
【請求項５３】
キナーゼ阻害剤を髄腔内または鼻腔内投与する、請求項29〜51のいずれか一項記載の方法。
【請求項５４】
第2の治療剤が、化学療法、放射線療法、遺伝子療法、手術、ホルモン療法、抗血管新生療法、またはサイトカイン療法である、請求項29〜51のいずれか一項記載の方法。
【請求項５５】
第2の治療剤が、放射線療法、化学療法、免疫療法、および／または代謝調節である、請求項29〜51のいずれか一項記載の方法。
【請求項５６】
第2の治療剤をキナーゼ阻害剤と同時に投与する、請求項29〜51のいずれか一項記載の方法。
【請求項５７】
第2の治療剤をキナーゼ阻害剤に連続して投与する、請求項29〜51のいずれか一項記載の方法。
【請求項５８】
対象における転移を阻害するための方法であって、
対照と比較した場合に、ADCK4、BTK、CAMK4、CDK5、CDK5R1、CLK3、DAK、FRK、LIMK2、MAP2K7、MAPK12、MAPK7、PAK4、PCTK1、PMVK、PRKACB、PRKACG、PRKCD、PRKCI、SPHK1、TSSK6、UCK2、およびZC3HC1からなる群より選択される少なくとも2個のキナーゼの活性が増加していると同定された対象へ、キナーゼ阻害剤を投与する工程を含む、前記方法。
【請求項５９】
増加した活性が、増加した発現レベル、翻訳後修飾、または細胞内局在化の結果である、請求項58記載の方法。
【請求項６０】
増加した活性が、増加した発現レベルによって測定される、請求項59記載の方法。
【請求項６１】
対象が乳癌または肺癌を有する、請求項58記載の方法。
【請求項６２】
転移が脳転移としてさらに定義される、請求項58記載の方法。
【請求項６３】
対象が、対照と比較して、ADCK4、BTK、CAMK4、CDK5、CDK5R1、CLK3、DAK、FRK、LIMK2、MAP2K7、MAPK12、MAPK7、PAK4、PCTK1、PMVK、PRKACB、PRKACG、PRKCD、PRKCI、SPHK1、TSSK6、UCK2、およびZC3HC1からなる群より選択される少なくとも5個のキナーゼの活性が増加していると同定される、請求項58記載の方法。
【請求項６４】
対象が、対照と比較して、ADCK4、BTK、CAMK4、CDK5、CDK5R1、CLK3、DAK、FRK、LIMK2、MAP2K7、MAPK12、MAPK7、PAK4、PCTK1、PMVK、PRKACB、PRKACG、PRKCD、PRKCI、SPHK1、TSSK6、UCK2、およびZC3HC1からなる群より選択される少なくとも15個のキナーゼの発現が増加していると同定される、請求項58記載の方法。
【請求項６５】
対象が、対照と比較して、ADCK4、BTK、CAMK4、CDK5、CDK5R1、CLK3、DAK、FRK、LIMK2、MAP2K7、MAPK12、MAPK7、PAK4、PCTK1、PMVK、PRKACB、PRKACG、PRKCD、PRKCI、SPHK1、TSSK6、UCK2、およびZC3HC1からなる群より選択される少なくとも20個のキナーゼの発現が増加していると同定される、請求項58記載の方法。
【請求項６６】
癌を有する対象における脳転移を処置するための有効量のキナーゼ阻害剤を含む組成物であって、該キナーゼ阻害剤が、ADCK4、BTK、CAMK4、CDK5、CDK5R1、CLK3、LIMK2、PAK4、PMVK、PRKACB、PRKACG、PRKCI、TSSK6、およびZC3HC1からなる群より選択されるキナーゼを標的とする、前記組成物。
【請求項６７】
癌を有する対象における脳転移を処置するための有効量のキナーゼ阻害剤および抗癌剤を含む組成物であって、該キナーゼ阻害剤が、PCTK1、SPHK1、FRK、MAPK12、ERK5、MAP2K7、UCK2、DAK、およびPRKCDからなる群より選択されるキナーゼを標的とする、前記組成物。
【請求項６８】
癌が乳癌である、請求項66または67記載の組成物。
【請求項６９】
乳癌がトリプルネガティブ乳癌としてさらに定義される、請求項66または67記載の方法。
【請求項７０】
癌が肺癌である、請求項66または67記載の方法。
【請求項７１】
対象が、処置前に脳転移を有することが未知であった、請求項66または67記載の方法。
【請求項７２】
対象が、処置前に1つまたは複数の脳転移を有することが既知であった、請求項66または67記載の方法。
【請求項７３】
対象がヒトである、請求項66または67記載の方法。
【請求項７４】
少なくとも第2の抗癌剤を投与する工程をさらに含む、請求項66記載の方法。
【請求項７５】
第2の抗癌剤が、化学療法、放射線療法、遺伝子療法、手術、ホルモン療法、抗血管新生療法、またはサイトカイン療法である、請求項67または74記載の方法。
【請求項７６】
第2の治療剤が、放射線療法、化学療法、免疫療法、または代謝調節である、請求項67または74記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2018年8月11日に出願された米国仮出願第62/544,597号の優先権の恩典を主張し、この全内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
背景
本発明は、国立衛生研究所によって与えられた補助金番号R01 CA112567およびR01 CA184836の下で政府支援によって成された。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
1．分野
本発明は、一般に、分子生物学および医学の分野に関する。より具体的には、本発明は、癌、特に脳転移の処置のためにキナーゼを標的とする方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
2．関連技術の説明
脳転移は何百万人の癌患者を冒し、原発性脳腫瘍の10倍を超える。主な腫瘍性疾患（例えば、黒色腫、肺癌、乳癌、および結腸癌）は脳転移の高い発生率を有する。脳転移の診断後の1年生存率は20%未満である。最近になって、標的癌療法の進歩（例えば、トラスツズマブ、T-DMl）が、全身性疾患のよりよい制御を通して患者の生存を延ばした。しかし、患者が後に再発を有する場合、患者は、増加していく割合（例えば30%超）で脳転移を発症し、好結果の標的療法のこの時代において新たな課題を示している。現在の治療選択肢は、脳転移を有する患者については限定的かつ単に対症的である。
【０００５】
酵素の大きなファミリーを構成する、キナーゼは、タンパク質基質へのATPのγ-リン酸の転移を触媒する。可逆的リン酸化は、細胞シグナル伝達プロセスにおいて最重要な役割を果たし、キナーゼおよびホスファターゼによって調節される。従って、キナーゼは、無数のシグナル伝達プロセスの重要な媒介物質である。異常なキナーゼ活性は、癌ならびに代謝障害、免疫学的障害、神経系障害、および他の障害に関係している。結果として、キナーゼは、ヒト疾患についての薬物標的の重要なクラスとして浮上した。
【０００６】
多くのキナーゼが、癌細胞シグナル伝達ネットワークの中心である。多くの努力によって、著しい臨床的有効性を有する様々な癌促進キナーゼに対するいくつかのFDA認可阻害剤の開発が成功した。これらの癌促進キナーゼは、トラスツズマブ(ErbB2)、ラパチニブ(ErbB2およびEGFR)、イマチニブ(BCR-Abl)、ゲフィチニブ(EGFR)、イブルチニブ(BTK)、およびベムラフェニブ(BRAF)を含む、多くの疾患設定における確実な薬物標的であることが判明した。しかし、大抵の既存のキナーゼ阻害剤は原発腫瘍中の標的に基づいて開発され；転移特異的な、特に脳転移特異的な、ドラッガブル分子標的を同定するための努力は成されてこなかった。従って、様々な癌促進キナーゼに対する現在のFDA認可阻害剤は、原発腫瘍の阻害において著しい臨床的有効性を有し得るが、それらは、脳転移の阻害においては有効性をほとんどまたは全く示さない。従って、脳転移の増え続ける臨床的課題に取り組むために、そのドライバーを同定しそしてそれらを治療的に標的とし、脳転移を有する患者の生存を延ばしそして生活の質を改善する、満たされていない必要性がある。
【発明の概要】
【０００７】
概要
第1の態様において、本開示は、癌を有する対象における脳転移を阻害するための方法であって、方法が、有効量のキナーゼ阻害剤を対象へ投与する工程を含み、キナーゼ阻害剤が、ADCK4、BTK、CAMK4、CDK5、CDK5R1、CLK3、LIMK2、PAK4、PMVK、PRKACB、PRKACG、PRKCI、TSSK6、およびZC3HC1からなる群より選択されるキナーゼを標的とする、方法を提供する。いくつかの局面において、対象はヒトである。ある局面において、キナーゼ阻害剤はsiRNAまたはmiRNAである。他の局面において、キナーゼ阻害剤は選択的薬理学的阻害剤である。
【０００８】
いくつかの局面において、癌は乳癌である。特定の局面において、乳癌はトリプルネガティブ乳癌としてさらに定義される。他の局面において、癌は肺癌である。
【０００９】
ある局面において、対象は、処置前には脳転移を有することが未知であった。他の局面において、対象は、処置前には1つまたは複数の脳転移を有することが既知であった。
【００１０】
いくつかの局面において、キナーゼ阻害剤はCDK5またはLIMK2を標的とする。ある局面において、CDK5のキナーゼ阻害剤は、ディナシクリブ、ビス-インドールインディルビン、(S)-CR8、ケンパウロン、PHA-793887、AT7519、ロスコビチン、ミルシクリブ（milciclib）、SNS-032、またはオロモウシンである。いくつかの局面において、LIMK2のキナーゼ阻害剤は、BMS-5、Pyr-1、またはT56-LIMKiである。
【００１１】
いくつかの局面において、BTKのキナーゼ阻害剤は、イブルチニブ、アカラブルチニブ、ONO-4059、スペブルチニブ、BGB-3111、またはHM71224である。ある局面において、CAMK4のキナーゼ阻害剤はKN-93である。いくつかの局面において、MAP2K7のキナーゼ阻害剤はDTP3である。いくつかの局面において、PMVKのキナーゼ阻害剤は、CDDD_1633、CSDDD_2260、CSDDD_2419、またはルテオリンである。いくつかの局面において、PRKCIのキナーゼ阻害剤は、リドーラまたはRXDX-108である。
【００１２】
いくつかの局面において、キナーゼ阻害剤を、経口的に、局所的に、静脈内に、腹腔内に、筋肉内に、内視鏡的に、経皮的に、皮下に、局部的に、または直接注射によって投与する。具体的な局面において、キナーゼ阻害剤を静脈内投与する。特定の局面において、キナーゼ阻害剤を脳へ直接送達する。いくつかの局面において、キナーゼ阻害剤を髄腔内または鼻腔内投与する。
【００１３】
追加の局面において、方法は、少なくとも第2の治療剤を投与する工程をさらに含む。いくつかの局面において、第2の治療剤は、化学療法、放射線療法、遺伝子療法、手術、ホルモン療法、抗血管新生療法、またはサイトカイン療法である。特定の局面において、第2の治療剤は、放射線療法、化学療法、免疫療法、および／または代謝調節である。いくつかの局面において、第2の治療剤をキナーゼ阻害剤と同時に投与する。ある局面において、第2の治療剤をキナーゼ阻害剤に連続して投与する。
【００１４】
別の態様において、癌を有する対象における脳転移を処置するための方法であって、方法が、有効量のキナーゼ阻害剤と少なくとも第2の抗癌剤とを組み合わせてその必要がある対象へ投与する工程を含み、キナーゼ阻害剤が、PCTK1、SPHK1、FRK、MAPK12、ERK5、MAP2K7、UCK2、DAK、およびPRKCDからなる群より選択されるキナーゼを標的とする、方法を提供する。いくつかの局面において、癌は乳癌である。特定の局面において、乳癌はトリプルネガティブ乳癌としてさらに定義される。他の局面において、癌は肺癌である。いくつかの局面において、対象は、処置前には脳転移を有することが未知であった。他の局面において、対象は、処置前には1つまたは複数の脳転移を有することが既知であった。いくつかの局面において、対象はヒトである。
【００１５】
特定の局面において、キナーゼ阻害剤は、PCTK1、SPHK1、MAPK12、またはCDK5を標的とする。いくつかの局面において、MAPK12のキナーゼ阻害剤は、SB 203580、ドラマピモド（doramapimod）、またはLY2228820である。ある局面において、PCTK1のキナーゼ阻害剤は、インディルビンE804、ダブラフェニブ、またはレバスチニブ（rebastinib）である。特定の局面においてPCTK1のキナーゼ阻害剤はレバスチニブである。いくつかの局面において、SPHK1のキナーゼ阻害剤は、BML-258、SKI III、SKI 5C、MP A08、SKI 178、PF-543、フィンゴリモド、またはサフィンゴールである。特定の局面において、SPHK1のキナーゼ阻害剤は、フィンゴリモドまたはサフィンゴールである。いくつかの局面において、CDK5のキナーゼ阻害剤は、ディナシクリブ、PHA-793887、AT7519、CYC-065、ロスコビチン、またはDCAM-422である。特定の局面において、CDK5のキナーゼ阻害剤は、CYC-065またはDCAM-422である。
【００１６】
いくつかの局面において、ERK5のキナーゼ阻害剤は、ERK5-IN-1、BIX 02189、XMD17-109、またはXMD 8-92である。ある局面において、FRKのキナーゼ阻害剤は、ダサチニブ、モテサニブ、ドラマピモド、ペリチニブ（pelitinib）、ソラフェニブ、バンデタニブ、カネルチニブ、またはイマチニブである。ある局面において、PAK4のキナーゼ阻害剤は、PF-3758309、LCH-7749944、グラウカルビノン、KY-04031、KY-04045、1-フェナントリル-テトラヒドロイソキノリン誘導体、(-)-β-ヒドラスチン、Inka1、GL-1196、またはGNE-2861である。いくつかの局面において、UCK2のキナーゼ阻害剤は、フラボカワインBまたはアルピネチンである。
【００１７】
ある局面において、キナーゼ阻害剤を、経口的に、局所的に、静脈内に、腹腔内に、筋肉内に、内視鏡的に、経皮的に、皮下に、局部的に、または直接注射によって投与する。特定の局面において、キナーゼ阻害剤を静脈内投与する。いくつかの局面において、キナーゼ阻害剤を、脳への直接投与のためなど、髄腔内または鼻腔内投与する。
【００１８】
いくつかの局面において、第2の治療剤は、化学療法、放射線療法、遺伝子療法、手術、ホルモン療法、抗血管新生療法、またはサイトカイン療法である。特定の局面において、第2の治療剤は、放射線療法、化学療法、免疫療法、および／または代謝調節である。いくつかの局面において、第2の治療剤をキナーゼ阻害剤と同時に投与する。他の局面において、第2の治療剤をキナーゼ阻害剤に連続して投与する。
【００１９】
さらなる態様において、対象における転移を阻害するための方法であって、対照と比較した場合に、ADCK4、BTK、CAMK4、CDK5、CDK5R1、CLK3、DAK、FRK、LIMK2、MAP2K7、MAPK12、MAPK7、PAK4、PCTK1、PMVK、PRKACB、PRKACG、PRKCD、PRKCI、SPHK1、TSSK6、UCK2、およびZC3HC1からなる群より選択される少なくとも2個のキナーゼの活性が増加していると同定された対象へ、キナーゼ阻害剤を投与する工程を含む、方法を提供する。特定の局面において、増加した活性は、増加した発現レベル、翻訳後修飾、または細胞内局在化の結果である。ある局面において、増加した活性は、増加した発現レベルによって測定される。いくつかの局面において、対象は乳癌または肺癌を有する。特定の局面において、転移は脳転移としてさらに定義される。
【００２０】
いくつかの局面において、対象は、対照と比較して、ADCK4、BTK、CAMK4、CDK5、CDK5R1、CLK3、DAK、FRK、LIMK2、MAP2K7、MAPK12、MAPK7、PAK4、PCTK1、PMVK、PRKACB、PRKACG、PRKCD、PRKCI、SPHK1、TSSK6、UCK2、およびZC3HC1からなる群より選択される少なくとも5個のキナーゼ（例えば、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、または23個のキナーゼ）の活性が増加していると同定される。ある局面において、対象は、対照と比較して、ADCK4、BTK、CAMK4、CDK5、CDK5R1、CLK3、DAK、FRK、LIMK2、MAP2K7、MAPK12、MAPK7、PAK4、PCTK1、PMVK、PRKACB、PRKACG、PRKCD、PRKCI、SPHK1、TSSK6、UCK2、およびZC3HC1からなる群より選択される少なくとも15個のキナーゼの発現が増加していると同定される。いくつかの局面において、対象は、対照と比較して、ADCK4、BTK、CAMK4、CDK5、CDK5R1、CLK3、DAK、FRK、LIMK2、MAP2K7、MAPK12、MAPK7、PAK4、PCTK1、PMVK、PRKACB、PRKACG、PRKCD、PRKCI、SPHK1、TSSK6、UCK2、およびZC3HC1からなる群より選択される少なくとも20個のキナーゼの発現が増加していると同定される。
【００２１】
別の態様において、癌を有する対象における脳転移を処置するための有効量のキナーゼ阻害剤を含む組成物であって、キナーゼ阻害剤が、ADCK4、BTK、CAMK4、CDK5、CDK5R1、CLK3、LIMK2、PAK4、PMVK、PRKACB、PRKACG、PRKCI、TSSK6、およびZC3HC1からなる群より選択されるキナーゼを標的とする、組成物を提供する。
【００２２】
癌を有する対象における脳転移を処置するための有効量のキナーゼ阻害剤および抗癌剤を含む組成物であって、キナーゼ阻害剤が、PCTK1、SPHK1、FRK、MAPK12、ERK5、MAP2K7、UCK2、DAK、およびPRKCDからなる群より選択されるキナーゼを標的とする、組成物を本明細書においてさらに提供する。
【００２３】
上記態様のある局面において、キナーゼ阻害剤は、ディナシクリブ、ビス-インドールインディルビン、(S)-CR8、ケンパウロン、PHA-793887、AT7519、ロスコビチン、ミルシクリブ、SNS-032、オロモウシン、BMS-5、Pyr-1、T56-LIMKi、イブルチニブ、アカラブルチニブ、ONO-4059、スペブルチニブ、BGB-3111、HM71224、DTP3、CDDD_1633、CSDDD_2260、CSDDD_2419、ルテオリン、リドーラまたはRXDX-108、SB 203580、ドラマピモド、LY2228820、インディルビンE804、ダブラフェニブ、レバスチニブ、BML-258、SKI III、SKI 5C、MP A08、SKI 178、PF-543、フィンゴリモド、サフィンゴール、フィンゴリモド、サフィンゴール、ディナシクリブ、PHA-793887、AT7519、CYC-065、DCAM-422、CYC-065またはDCAM-422、ERK5-IN-1、BIX 02189、XMD17-109、XMD 8-92、ダサチニブ、モテサニブ、ドラマピモド、ペリチニブ、ソラフェニブ、バンデタニブ、カネルチニブ、イマチニブ、PF-3758309、LCH-7749944、グラウカルビノン、KY-04031、KY-04045、1-フェナントリル-テトラヒドロイソキノリン誘導体、(-)-β-ヒドラスチン、Inka1、GL-1196、GNE-2861、フラボカワインBまたはアルピネチンである。
【００２４】
上記態様のいくつかの局面において、癌は乳癌である。ある局面において、乳癌はトリプルネガティブ乳癌としてさらに定義される。いくつかの局面において、癌は肺癌である。ある局面において、対象は、処置前には脳転移を有することが未知であった。他の局面において、対象は、処置前には1つまたは複数の脳転移を有することが既知であった。いくつかの局面において、対象はヒトである。
【００２５】
ある局面において、方法は、少なくとも第2の抗癌剤を投与する工程を含む。いくつかの局面において、第2の抗癌剤は、化学療法、放射線療法、遺伝子療法、手術、ホルモン療法、抗血管新生療法、またはサイトカイン療法である。特定の局面において、第2の治療剤は、放射線療法、化学療法、免疫療法、または代謝調節である。
【００２６】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかとなるであろう。しかし、詳細な説明および具体例は、本発明の好ましい態様を示すが、単に例示のために与えられることが理解されるべきであり、何故ならば、本発明の精神および範囲内の様々な変更および改変がこの詳細な説明から当業者に明らかとなるためである。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
図面は、本明細書の一部を形成し、本発明のある局面をさらに示すために含まれる。本発明は、本明細書に示される具体的な態様の詳細な説明と組み合わせて図面の1つまたは複数を参照することによって、よりよく理解され得る。
【図１】脳転移成長のドライバーについてのインビボキノームスクリーニングの略図である。ルシフェラーゼ、GFP、および最大24のキナーゼのプールを安定発現するMDA-MB-231親細胞(231p)(231p.ルシフェラーゼ.GFP)を、TdTomatoおよびエンプティーpWZL-Neo-Myr-Flag-DESTベクターを発現する231p細胞(231p.TdTomato)と混合した。細胞を3:1比のキナーゼプール:ベクターで混合し、2 x 106個の細胞をヌードマウスの頸動脈中へ注入した。動物が神経症状を示し、それらの頭部がIVISによって極度にルシフェラーゼ陽性と決定されると、マウスを犠牲にし、GFP陽性に基づいて解剖顕微鏡を使用して脳病巣を単離した。病巣の一部分を直接RNA抽出へ供し、一方、残りを解離し、細胞を継代0としてインビトロで培養した。gDNAを回収された細胞から抽出し、キナーゼベクター配列を標的化PCRによって増幅した。このDNAをMiSeqによって配列決定し、インビボ選択の定量的読み出しを得た。
【図２】インビボ選択後の相対的配列濃縮の例である。インビボ選択前および後のキナーゼ配列リードカウントの比較は、インビボで大部分の配列のかなりの消失を実証し、それらのキナーゼの顕著な正の選択が「ヒット」と見なされた。カバレッジプロットはMiSeq Reporterで作成された。
【図３】インビボでのキナーゼ過剰発現駆動脳転移成長の確認である。インビボイメージングシステム(IVIS)を使用し、ルシフェラーゼ発現癌細胞によって発生された発光シグナルを定量化した。0日目に動物1匹当たり1 x 105個の細胞を注入し、ルシフェラーゼシグナルを1日目に対して正規化した。(A)CDK5-、PCTK1-、MAPK12-、およびMARK4-過剰発現脳転移成長と対応のベクター対照との比較は、MARK4を除いた全てのキナーゼが脳転移の確認されたドライバーであることを示す。(B)SPHK1-過剰発現癌細胞とベクター対照細胞との比較は、SPHK1が実際に脳転移成長を増強することを示す。
【図４】MDA-MB-231中のキナーゼ過剰発現は実験的脳転移モデル中における生存を有意に短縮する。キナーゼ過剰発現細胞または対応のベクター細胞が注入されたマウスを、それらの脳転移特異的生存について比較した。(A)PCTK1過剰発現は、128日間の期間中央値から60日間へ生存を短縮した。生存曲線は、Mantel-Coxログランク検定に従って有意な差(p=0.0004)があった。(B)SPHK1過剰発現は、131日間の期間中央値から102.5日間へ生存を短縮した。(C)CDK5過剰発現は、128日間の期間中央値から70日間へ生存を短縮した。
【図５】PCTK1ノックダウンはHCC1954Br実験的脳転移モデル中において死を有意に遅らせる。(A)頸動脈内注入前のPCTK1のshRNA媒介ノックダウン効率を示すウェスタンブロット。(B)1 x 105個の細胞が注入されたヌードマウスの生存解析は、PCTK1ノックダウンが生存中央値を57.5日間から91日間へ延長することを示す。
【図６】SPHK1ノックダウンはMDA-MB-435実験的脳転移モデル中において死を有意に遅らせる。(A)頸動脈内注入前のSPHK1のshRNA媒介ノックダウン効率を示すウェスタンブロット。(B)1 x 105個の細胞が注入されたヌードマウスの生存解析は、SPHK1ノックダウンが生存中央値を57.5日間から77日間へ延長することを示す。
【図７】MAPK12ノックダウンは4T1実験的脳転移モデルにおいて初期段階で脳転移成長を有意に遅らせる。(A)頸動脈内注入前のMAPK12のshRNA媒介ノックダウン効率を示すウェスタンブロット。(B)MAPK12ノックダウン癌細胞とベクター対照細胞との比較は、MAPK12ノックダウンが脳転移成長を遅らせることを示す。(C)4T1細胞が注入されたBALB/cマウスの生存解析は、MAPK12ノックダウンが生存中央値を15日間から19日間へ延長することを示す。生存曲線は、Mantel-Coxログランク検定に従って有意な差(p=0.02)があった。
【図８】CDK5ノックダウンは低酸素条件においてインビトロで細胞増殖を減少させ、CD8 T細胞依存様式でEO771実験的脳転移モデルにおいて死を有意に遅延させる。(A)EO771細胞中のCDK5のshRNA媒介ノックダウン効率を示すウェスタンブロット。(B)MTTアッセイは、ベクター対照細胞と比較した場合、低酸素条件でのCDK5ノックダウン細胞におけるインビトロ細胞増殖の有意な減少を実証した。(C)EO771細胞が注入されたC57BL/6マウスの生存解析は、CDK5ノックダウンが生存中央値を19日間から23.5日間へ延長することを示す。(D)対照またはCDK5ノックダウンEO771細胞のいずれかが注入されたC57BL/6マウスの生存解析は、αCD8抗体を使用してCD8-T細胞を枯渇させた場合、これらの2つの群間でマウス生存の有意差がないことを示す。
【図９】EO771細胞中のCDK5ノックダウンはそれらをロスコビチンに対してより低感受性にし、T細胞細胞傷害性に対してより高感受性にする。(A)EO771細胞中のCDK5ノックダウンが、対照細胞と比較して、それらを、CDK5阻害剤であるロスコビチンに対してより低感受性にすることを実証する細胞生存性曲線。(B)細胞傷害性T細胞殺傷アッセイは、E0771細胞中のCDK5ノックダウンが、EO771対照細胞と比較して、活性化T細胞細胞傷害性に対してより感受性であることを示した。T細胞は、腫瘍細胞との共培養前に、CD3/CD28抗体(100 ng/mL)およびIL-2(10 ng/mL)によって活性化した。
【図１０】LIMK2過剰発現は低酸素条件においてインビトロで細胞増殖を促進する。(A)MDA-MB-231細胞中のLIMK2の過剰発現効率を示すウェスタンブロット。(B)MTTアッセイは、ベクター対照細胞と比較して、LIMK2が過剰発現される場合、低酸素条件においてインビトロ細胞増殖の有意な増加を実証した。
【図１１】LKB1過剰発現は正常酸素および低酸素条件の両方においてインビトロで細胞増殖を促進する。(A)MDA-MB-231細胞中のLKB1の過剰発現効率を示すウェスタンブロット。(B)LKB1が過剰発現されたMDA-MB-231細胞は、MTTアッセイにおいて示されたように、ベクター対照細胞と比較した場合、正常酸素条件においてインビトロ細胞増殖の有意な増加を実証した。(C)LKB1が過剰発現されたMDA-MB-231細胞は、MTTアッセイにおいて示されたように、ベクター対照細胞と比較した場合、低酸素条件においてインビトロ細胞増殖の有意な増加を実証した。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
例示的な態様の説明
キナーゼのドラッガビリティを利用することによる脳転移の処置における使用について脳転移のドライバーキナーゼを同定するために、本研究は、乳癌脳転移を促進し、脳転移の有効な阻害についての治療標的として役立ち得る新規のキナーゼを発見するために、ヒトキノームの無作為のインビボスクリーニングを行った。現在利用可能なキナーゼ標的は、細胞培養皿中において癌細胞増殖を促進することにおけるそれらの役割によって同定されたが、今回同定されたキナーゼは、動物中における脳転移のドライバーを特異的に探す機能的インビボスクリーニングから生じた。従って、本方法によって同定された標的は、特異的に脳転移の成長において役割を果たす。
【００２９】
具体的には、354-キナーゼライブラリーを、MDA-MB-231ヒトトリプルネガティブ乳癌細胞株中において、各々、21キナーゼの17プールへ分割し、結果として生じた細胞をヌードマウスの頸動脈中へ注入し、実験的脳転移を誘発した。これらのキナーゼのうちのいくつかのプールは、231ベクター対照細胞と比較して、脳転移特異的死を劇的に増加させた。次世代シーケンシング(NGS)および遺伝子解析は、これらの攻撃的な脳転移が、インビボで、あるキナーゼで高められたことを同定した。これらの努力は、ADCK4(COQ8B)、BTK、CAMK4、CDK5、CDK5R1、CLK3、DAK、FRK、LIMK2、MAP2K7、MAPK12(p38γ)、MAPK7(ERK5)、PAK4、PCTK1、PMVK、PRKACB、PRKACG、PRKCD、PRKCI、SPHK1、TSSK6、UCK2、およびZC3HC1を含む、20を超える脳転移促進キナーゼを明らかにした（表1）。
【００３０】
これらのキナーゼをさらに試験するために、キナーゼの一部を遺伝的にノックダウンし、脳転移の阻害のためにこれらの同定された脳転移ドライバーキナーゼを標的とすることの効果を試験した。実際に、上位ヒットの一部をノックダウンすることは、実験的脳転移を阻害し、脳転移を有するマウスの生存を有意に延ばした。具体的には、PCTK1、SPHK1、MAPK12、およびCDK5のような、キナーゼのノックダウンは、細胞増殖を減少させ、ヒト癌細胞モデルおよび実験的脳転移の4T1マウス乳房腫瘍モデルの初期段階における脳転移成長を遅らせた。
【００３１】
脳転移を阻害するためにスクリーニングにおいて同定されたこれらのキナーゼの一部を標的とすることの有効性もまた、実験的脳転移マウスモデル中におけるキナーゼの過剰発現によって本研究においてアッセイした。CDK5、PCTK1、MAPK12、LIMK2、およびSPHK1の過剰発現は、脳転移成長を増加させた。特に、SPHK1、PCTK1、LIMK2およびCDK5のような、キナーゼの過剰発現は、実験的脳転移マウスモデル中における生存を短縮した。従って、本明細書におけるスクリーニングにおいて同定されたキナーゼは、乳癌脳転移のような脳転移の阻害のために、標的とされ得る。
【００３２】
従って、ある態様において、本開示は、脳転移の有効な阻害のためにキノームスクリーニングから同定された脳転移駆動キナーゼを標的とする方法を提供する。本明細書において同定されたキナーゼは、遺伝学的阻害剤、化学的阻害剤、免疫学的阻害剤、および代謝阻害剤を含む阻害剤によって、標的とされ得る。キナーゼ阻害剤は、脳転移についての現在の標準治療、例えば、放射線療法、化学療法、免疫療法、および代謝調節と組み合わせて使用され得る。
【００３３】
I．定義
明細書において使用される場合、「1つの（a）」または「1つの（an）」は1つまたは複数を意味し得る。特許請求の範囲において使用される場合、「含む」という単語と共に使用される場合は、「1つの（a）」または「1つの（an）」という単語は1つまたは1つを超えることを意味し得る。
【００３４】
特許請求の範囲における用語「または」の使用は、本開示は選択肢および「および／または」のみを指す定義をサポートするが、選択肢のみを指すように明示的に示されない限りまたは選択肢が互いに排他的でない限り、「および／または」を意味するために使用される。本明細書において使用される場合、「別の」は、少なくとも第2またはそれ以上のものを意味し得る。用語「約」、「実質的に」および「およそ」は、一般に、記載の値プラスマイナス5%を意味する。
【００３５】
本明細書において使用される場合、用語「患者」または「対象」は、生きている哺乳動物生物、例えば、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモット、またはそれらのトランスジェニック種を指す。ある態様において、患者または対象は霊長動物である。ヒト患者の非限定的な例は、成人、年少者、幼児および胎児である。
【００３６】
疾患または状態の「処置工程」または処置は、疾患の徴候または症状を緩和しようとして、1つまたは複数の薬物を患者へ投与することを含み得る、プロトコルを実行することを指す。処置の望ましい効果は、疾患進行速度の減少、疾患状態の改善もしくは軽減、および寛解または予後の好転を含む。緩和は、疾患または状態の徴候または症状の出現の前、ならびにそれらの出現の後に、行うことができる。従って、「処置工程」または「処置」は、疾患または望ましくない状態の「予防工程」または「予防」を含み得る。さらに、「処置工程」または「処置」は、徴候または症状の完全な緩和を必要とせず、治癒を必要とせず、具体的には、患者に対してわずかな効果しか有さないプロトコルを含む。
【００３７】
用語「有効な」、その用語が明細書および／または特許請求の範囲において使用される場合、所望の、期待される、または意図される結果を達成するために適切であることを意味する。「有効量」、「治療有効量」または「薬学的有効量」は、化合物で対象または患者を処置する文脈において使用される場合、疾患を処置または予防するために対象または患者へ投与されると、疾患のそのような処置または予防をもたらすために十分な量である、化合物の量を意味する。
【００３８】
「予防」または「予防工程」は、(1)疾患のリスクがあり得かつ／または疾患の素因を有し得るが、疾患の病理または症状のいずれもまたは全てをまだ経験していないかまたは示していない対象または患者において疾患の発症を阻止すること、ならびに／あるいは、(2)疾患のリスクがあり得かつ／または疾患の素因を有し得るが、疾患の病理または症状のいずれもまたは全てをまだ経験していないかまたは示していない対象または患者において疾患の病理または症状の発症を遅らせることを含む。
【００３９】
本明細書において一般に使用される場合、「薬学的に許容される」は、正しい医学的判断の範囲内で、合理的なベネフィット／リスク比に見合った過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症無しでヒトおよび動物の組織、器官、および／または体液と接触しての使用に適している、化合物、材料、組成物、および／または投薬形態を指す。
【００４０】
「薬学的に許容される塩」は、上記に定義されるような薬学的に許容され、かつ、所望の薬理学的活性を有する、本明細書に開示される化合物の塩を意味する。そのような塩としては、塩化水素酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などのような無機酸で；または、1,2-エタンジスルホン酸、2-ヒドロキシエタンスルホン酸、2-ナフタレンスルホン酸、3-フェニルプロピオン酸、4,4′-メチレンビス(3-ヒドロキシ-2-エン-1-カルボン酸)、4-メチルビシクロ[2.2.2]オクタ-2-エン-1-カルボン酸、酢酸、脂肪族モノ-およびジカルボン酸、脂肪族硫酸、芳香族硫酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、炭酸、桂皮酸、クエン酸、シクロペンタンプロピオン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルタミン酸、グリコール酸、ヘプタン酸、ヘキサン酸、ヒドロキシナフトエ酸、乳酸、ラウリル硫酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ムコン酸、o-(4-ヒドロキシベンゾイル)安息香酸、シュウ酸、p-クロロベンゼンスルホン酸、フェニル置換アルカン酸、プロピオン酸、p-トルエンスルホン酸、ピルビン酸、サリチル酸、ステアリン酸、コハク酸、酒石酸、第三級ブチル酢酸、トリメチル酢酸などのような有機酸で形成される酸付加塩が挙げられる。薬学的に許容される塩としてはまた、存在する酸性プロトンが無機または有機塩基と反応することができる場合に形成され得る塩基付加塩が挙げられる。許容される無機塩基としては、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アルミニウムおよび水酸化カルシウムが挙げられる。許容される有機塩基としては、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、N-メチルグルカミンなどが挙げられる。本発明の任意の塩の部分を形成する特定の陰イオンまたは陽イオンは、塩が全体として薬理学的に許容される限り、重要ではないことが認識されるべきである。薬学的に許容される塩ならびにそれらの調製および使用方法の追加の例は、Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, and Use (P. H. Stahl & C. G. Wermuth eds., Verlag Helvetica Chimica Acta, 2002)に示されている。
【００４１】
「薬学的に許容される担体」、「薬物担体」、または単に「担体」は、化学剤の運搬、送達および／または輸送に関与する、有効成分薬剤と共に製剤化される薬学的に許容される物質である。薬物担体は、例えば、薬物バイオアベイラビリティを調節し、薬物代謝を減少させ、かつ／または薬物毒性を低減するための制御放出技術を含む、薬物の送達および有効性を改善するために使用され得る。いくつかの薬物担体は、特定の標的部位への薬物送達の有効性を増加させ得る。担体の例としては、リポソーム、ミクロスフェア（例えば、ポリ(乳酸-コ-グリコール酸)から作製されたもの）、アルブミンミクロスフェア、合成ポリマー、ナノ繊維、タンパク質-DNA複合体、タンパク質コンジュゲート、赤血球、ビロソーム、およびデンドリマーが挙げられる。
【００４２】
「阻害剤」または「アンタゴニスト」は、キナーゼのような、所与の標的の活性を低下させるかまたは阻害する化合物である。
【００４３】
本明細書において使用される場合、用語「プロテインキナーゼ」または「キナーゼ」は、その通常の意味に従って使用され、アミノ酸残基、例えばタンパク質上のアミノ酸残基、またはアミノアルコールのリン酸化のような、高エネルギーリン酸供与分子から特異的基質へのリン酸基の転移を触媒することができる酵素を指す。典型的に、特定のセリン、トレオニン、またはチロシン残基がリン酸化される。従って、プロテインキナーゼは、セリンプロテインキナーゼ、トレオニンプロテインキナーゼ、およびチロシンプロテインキナーゼを包含する。「プロテインキナーゼの阻害剤」または「キナーゼ阻害剤」は、プロテインキナーゼの活性を低下させる化合物または剤である。いくつかの態様において、「キナーゼ阻害剤」は、プロテインキナーゼへ結合することによってプロテインキナーゼの活性を低下させる化合物である。従って、「キナーゼ阻害剤」は、競合または非競合様式で酵素の活性を阻害することができる。
【００４４】
「対照」または「対照実験」は、その通常の意味に従って使用され、実験の対象または試薬が、実験の手順、試薬、または変数の省略を除いて並列実験において同様に扱われる実験を指す。いくつかの場合において、対照は、実験効果の評価における比較の基準として使用される。
【００４５】
「接触」は、その通常の意味に従って使用され、少なくとも2つの異なる種（例えば、生体分子を含む化合物、または細胞）が、反応する、相互作用するまたは物理的に触れるために十分に近くなることを可能にするプロセスを指す。しかし、結果として生じる反応生成物は、添加された試薬間の反応から直接、または反応混合物中において生成され得る1つもしくは複数の添加された試薬由来の中間体から、生成され得ることが理解されるべきである。用語「接触」は、阻害剤をキナーゼと共にインキュベートすることを含む。
【００４６】
本明細書において定義される場合、キナーゼ-阻害剤相互作用に関して用語「阻害」、「阻害する」、「阻害すること」などは、阻害剤の非存在下でのキナーゼの活性と比べてキナーゼの活性に悪影響を与えること（例えば、減少させること）を意味する。従って、阻害は、少なくとも一部分、刺激を部分的にもしくは完全に遮断すること、活性化を減少させる、妨げる、もしくは遅らせること、またはシグナル伝達を不活性化する、鈍らせる、もしくはダウンレギュレートすることを含む。同様に、「阻害剤」は、例えば、結合することによって、キナーゼ活性を阻害する、刺激を部分的にもしくは完全に遮断する、活性化を減少させる、妨げる、もしくは遅らせる、またはシグナル伝達を不活性化する、鈍らせる、もしくはダウンレギュレートする、化合物である。
【００４７】
「選択的」によって、所与のキナーゼについての親和性が、他のキナーゼについての親和性と比べて、少なくとも5倍〜10倍、好ましくは25倍、より好ましくは100倍、さらに好ましくは150倍より高いことが意図される。
【００４８】
本明細書において使用される場合、句「ATP結合ポケット」は、ATPに結合するキナーゼの活性部位を指す。ATPが結合するキナーゼの活性部位は、ATP分子またはATP競合阻害剤と相互作用することができ、かつまたは、これらへ結合することができる、アミノ酸残基のセットである。
【００４９】
本明細書において使用される場合、用語「変異」は、非天然（例えば、非野生型）アミノ酸配列を有するキナーゼを指す。変異キナーゼは、典型的に、組換え（例えば、操作）キナーゼである。下記に記載されるようないくつかの態様において、変異キナーゼは、ゲートキーパーアミノ酸位でシステイン残基置換を有する。本明細書において使用される場合、用語「未変異」は、変異（例えば、システイン残基がゲートキーパーアミノ酸位の代わりに用いられている）が存在しない対応のキナーゼ（例えば、天然または野生型配列）を指す。従って、いくつかの場合において、未変異は、野生型または天然キナーゼを指す。いくつかの他の場合において、対応のキナーゼは、類似しているが異なる置換を有する別の組換えキナーゼである。
【００５０】
「転移」は、身体の他の部分への原発腫瘍由来の癌細胞の播種に起因する、原発腫瘍場所とは異なる、癌細胞の領域である。原発腫瘤の診断時に、対象は、転移の存在についてモニタリングされてもよい。転移は、最もしばしば、特有の症状のモニタリングに加えて、磁気共鳴映像法(MRI)スキャン、コンピュータ断層撮影法(CT)スキャン、血液および血小板カウント、肝臓機能研究、胸部X線ならびに骨スキャンの単独使用または併用によって検出される。「検出可能な」転移は、磁気共鳴映像法、コンピュータ断層撮影法または陽電子放射断層法によって識別可能であり得る細胞のクラスターである。ある非限定的な態様において、転移細胞のクラスターは少なくとも約1 x 107個の細胞を含み得る。ある態様において、検出可能な転移は、約5 mmまたは約10 mmより大きなサイズを有する細胞のクラスターを含み得る。
【００５１】
用語「小分子」は、当技術分野の用語であり、約1000未満の分子量または約500未満の分子量である分子を含む。一態様において、小分子は、ペプチド結合を排他的に含まない。別の態様において、小分子はオリゴマーではない。活性についてスクリーニングされ得る例示的な小分子化合物としては、ペプチド、ペプチド模倣物、核酸、炭水化物、有機小分子（例えば、ポリケチド）（Cane et al., 1998）、および天然産物抽出ライブラリーが挙げられるが、これらに限定されない。別の態様において、化合物は、小さく、有機的な非ペプチド性化合物である。さらなる態様において、小分子は、生合成によるものではない。
【００５２】
II．標的キナーゼ
ある態様において、本開示は、本研究のインビボキナーゼスクリーニングによって転移促進キナーゼ（表1）として同定されたキナーゼの阻害剤を投与することによって、脳転移のような、転移を処置する（例えば、阻害するまたは減少させる）方法を提供する。処置は、転移、特に脳転移の発生を阻害するために、原発腫瘍を有する対象において行われ得る。他の局面において、対象は、脳転移のような、転移性腫瘍と診断され得、処置は、例えば、少なくとも10%、特に20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、または100%、脳転移を減少させる。
【００５３】
転移促進キナーゼのレベルを低下させ得る、キナーゼ阻害剤のような、治療剤としては、当技術分野において一般に知られているもの、例えば、アンチセンス核酸、shRNA、siRNA、小分子、ポリペプチド、抗体または抗体の断片、ポリヌクレオチド、多糖類を含む炭水化物、脂質、薬物、ならびにそれらの模倣物、誘導体、および組み合わせが挙げられる。特定の局面において、キナーゼは、特定のキナーゼについて選択的なキナーゼ阻害剤によって阻害される。表1中の各キナーゼについての例示的な選択的キナーゼ阻害剤が本明細書に開示されるが、当技術分野において公知の任意の選択的キナーゼ阻害剤が、本方法のために使用されてもよい。
【００５４】
（表１）NGSシーケンシングによって決定されたインビボで濃縮されたキナーゼ配列
2020530467.tif 000003
【００５５】
A．PCTK1(CDK16)
サイクリン依存性キナーゼ16(CDK16)とも呼ばれる、セリン/トレオニン-プロテインキナーゼPCTAIRE-1(PCTK1)遺伝子は、小胞媒介輸送プロセスおよびエキソサイトーシスにおいて役割を果たすキナーゼをコードする。それはまた、ニューロン分化および樹状突起発達を調節する。PCTK1は、RNAiおよび／またはPCTK1について選択的な薬理学的阻害剤によって阻害され得る。例えば、本方法において使用され得るPCTK1について選択的な一つの阻害剤は、インディルビンE804またはその類似体である（Hoessel et al., 1999; Cweik et al., 2015；参照により両方とも本明細書に組み入れられる）。阻害剤は、H結合相互作用を介してヒンジ領域と相互作用することによってATP部位へ結合する。PCTK1を阻害するために使用され得る他の阻害剤としては、I型キナーゼ阻害剤、例えば、トリアゾロ-ジアミン化合物Cdk1/2阻害剤III、アルステルパウロン、2-シアノエチル、インディルビンE804およびアミノピリミジニル化合物Cdk2/9阻害剤が挙げられる。CDK2阻害剤、例えば、オキシンドールGW300657XおよびGW416981X、ならびにピラゾロ[1,5-b]ピリダジン化合物GW779439Xもまた、PCTK1の阻害のために使用され得る。
【００５６】
特定の局面において、ダブラフェニブまたはレバスチニブがPCTK1の阻害のために使用される。レバスチニブは、BCR-ABLならびに薬剤耐性ゲートキーパー突然変異ABLを阻害するために開発された多重標的化II型キナーゼ阻害剤である。ダブラフェニブは、進行性黒色腫における臨床使用について認可された突然変異BRAFV600EのATP競合I型阻害剤である。一つの具体的な局面において、PCTK1の阻害剤はレバスチニブである。
【００５７】
インディルビンE804は以下の方法によって合成され得る。簡潔には、窒素下での無水メタノール(70 mL)中の酢酸インドキシル2 (5.00 g, 28.5 mmol)の溶液へ、イサチン1 (4.20 g, 28.8 mmol)および炭酸ナトリウム(6.50 g, 61.3 mmol)を添加する。30分間の撹拌および24時間の静置後、スラリーを濾過し、冷メタノールおよび冷水で洗浄する。得られたインディルビン3 (2.50 g, 9.5 mmol)およびヒドロキシルアミン塩酸塩(1.7g, 24.7 mmol)を、1.5時間、ピリジン(60 mL)中において一緒に還流する。続いて、混合物を塩化水素酸の1M溶液(100 mL)中へ注ぐ。赤色/橙色沈殿物を濾別し、1M水酸化ナトリウム(70 mL)中に再溶解し、1M塩化水素酸(150 mL)で再沈殿させる。粗生成物を濾過し、乾燥させ、そしてエタノール/水(7:2)から再結晶し、鮮やかな赤色/橙色結晶として生成物が得られる。最後に、インディルビン-3’-オキシミン4 (55.4 mg, 0.20 mmol)および4-ブロモブタン-1,2-ジオール5 (40.1 mg, 0.24 mmol)を、無水ジメチルホルムアミド(1.5 mL)中に溶解する。ここへトリエチルアミン(33μL, 0.24 mmol)を添加した。反応物を窒素下で4時間撹拌し、その後、溶媒を真空中で除去し、粗褐色オイルが生成され、これをカラムクロマトグラフィーによって精製し、生成物が赤色固体(36 mg, 41 %収率)として得られる。
【００５８】
B．SPHK1
スフィンゴシンキナーゼ(SPHK1)は、細胞増殖および生存を促進し、S1P/セラミドレオスタットを調節する重要な酵素である。SPHKの非アイソザイム特異的阻害剤、例えば、L-スレオ-ジヒドロスフィンゴシン(サフィンゴール)およびN,N-ジメチルスフィンゴシン(DMS)が、本方法において使用され得る。いくつかの局面において、SPHK1は、米国特許第8,372,888号に記載されるようなBML-258、米国特許出願公開第20080167352号に記載されるような3-(4-クロロ-フェニル)-アダマンタン-1-カルボン酸 (ピリジン-4-イルメチル)-アミド、[(2R)-1-[[4-[[3-(ベンゼンスルホニルメチル)-5-メチルフェノキシ]メチル]フェニル]メチル]ピロリジン-2-イル]メタノール(PF-543)、スフィンゴシンキナーゼ阻害剤2 (SKI II; 4-[[4-(4-クロロフェニル)-2-チアゾリル]アミノ]フェノール)、SKI 5C (CAY10621)、N,N-ジメチルスフィンゴシン((2S,3R,4E)-2-(ジメチルアミノ)-4-オクタデセン-1,3-ジオール)、MP A08 (4-メチル-N-[2-[[[2-[[(4-メチルフェニル)スルホニル]アミノ]フェニル]イミノ]メチル]フェニル]ベンゼンスルホンアミド)、SKI 178 (N'-(1-(3,4-ジメトキシフェニル)エチリデン)-3-(4-メトキシフェニル)-1H-ピラゾール-5-カルボヒドラジド)、またはそれらの類似体、誘導体もしくは薬学的に許容される塩によって阻害される。特定の局面において、SPHK1の阻害剤はフィンゴリモド(Gilenya)またはサフィンゴールである。
【００５９】
C．MAPK12(p38γ)
細胞外シグナル調節キナーゼ6(ERK6)またはストレス活性化プロテインキナーゼ3(SAPK3)としても公知の、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ12(MAPキナーゼ12)は、ヒトにおいてMAPK12遺伝子によってコードされる酵素である。マイトジェン活性化プロテインキナーゼファミリーのメンバーの活性化は、細胞外シグナルの伝達のための主要な機構である。ストレス活性化プロテインキナーゼは、MAPキナーゼの1つのサブクラスである。この遺伝子によってコードされるタンパク質は、筋芽細胞から筋管への分化中にシグナル伝達物質として機能する。MAPK12は、SB 203580、ドラマピモド(BIRB 796)、LY2228820、または当技術分野において公知のMAPK12の他の阻害剤によって阻害され得る。
【００６０】
D．CDK5およびCDK5R1
細胞分裂プロテインキナーゼ5は、ヒトにおいてCDK5遺伝子によってコードされる酵素である。CDK5は、脳の適切な発達のために必要とされ、活性化されるために、CDK5はCDK5R1またはCDK5R2と会合しなければならない。CDK5またはCDK5R1は、ディナシクリブ(SCH727965)、ビス-インドールインディルビン、(S)-CR8、ケンパウロン、PHA-793887、AT7519、ロスコビチン(セリシクリブ、CYC202)、ミルシクリブ(PHA-848125)、SNS-032(BMS-387032)、またはオロモウシンによって、本方法において阻害され得る。特定の局面において、CDK5の阻害剤はCYC-065またはDCAM-422である。
【００６１】
E．LIMK2
LIMキナーゼ2(LIMK2)はアクチン細胞骨格の調節因子である。LIMK2は、アクチン脱重合因子(ADF)ファミリーのメンバーである、コフィリンをリン酸化し、従って不活性化する。LIMK2の例示的な阻害剤としては、BMS-5(CAS No. 1338247-35-0)、Pyr-1(LIMNIB)、ダムナカンタール、Par-3、T56-LIMKi、およびLX7101が挙げられるが、これらに限定されない。LX7101は、眼内圧の調節に関連するキナーゼである、LIMドメインキナーゼ2(LIMK2)の、ピロロピリミジン系の局所送達される阻害剤である。
【００６２】
F．ADCK4(COQ8B)
コエンザイムQ8B(COQ8B)またはAarFドメイン含有プロテインキナーゼ4(ADCK4)は、好気性細胞呼吸についての脂溶性電子輸送体である。ADCK4は、当技術分野において公知のRNAiまたは阻害剤によって阻害され得る。
【００６３】
G．BTK
チロシン-プロテインキナーゼBTKとしても公知のブルトンチロシンキナーゼ(BtkまたはBTK)は、ヒトにおいてBTK遺伝子によってコードされる酵素である。BTKは、B細胞発生において役割を果たすキナーゼである。B細胞受容体(BCR)および肥満細胞上のFCER1の結合によって活性化されるシグナル伝達経路におけるBTKの機能は、十分に確立されている。ヒトにおけるBTKの機能的突然変異は、プロ-およびプレ-B細胞段階間での遮断を伴うB細胞発生の欠陥によって特徴付けられる原発性免疫不全症をもたらす。BTKの例示的な阻害剤としては、イブルチニブ(PCI-32765)、アカラブルチニブ、ONO-4059、スペブルチニブ(AVL-292、CC-292)、BGB-3111、およびHM71224が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６４】
H．CAMK4
カルシウム/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼIV型は、ヒトにおいてCAMK4遺伝子によってコードされる酵素である。この遺伝子の産物は、セリン/トレオニンプロテインキナーゼファミリー、およびCa2+/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼサブファミリーに属する。この酵素は、リンパ球、ニューロンおよび雄性生殖細胞における転写調節に関与している限定的な組織分布を伴う多機能性セリン/トレオニンプロテインキナーゼである。CAMK4の例示的な阻害剤は、KN-93 (N-[2-[[[3-(4-クロロフェニル)-2-プロペニル]メチルアミノ]メチル]フェニル]-N-(2-ヒドロキシエチル)-4-メトキシベンゼンスルホンアミド)である。
【００６５】
I．CLK3
CDC様キナーゼ3(CLK3)は、スプライシング因子のセリン/アルギニンリッチ(SR)ファミリーの核内分布を調節する核二重特異性キナーゼである。CLK3の例示的な阻害剤はKH-CB19である。使用され得る他の阻害剤としては、R547、A-674563、NVP-TAE684、およびAT-7519が挙げられる。
【００６６】
J．DAK
トリオキナーゼ/FMNシクラーゼまたはジヒドロキシアセトンキナーゼ2ホモログ(DAK)は、ヒトにおいてDAK遺伝子によってコードされる酵素である。DAKは、ジヒドロキシアセトンをリン酸化し、さらに、FADからのリボフラビン4',5'-ホスフェート（akaサイクリンFMN）の形成を触媒する。DAKは、当技術分野において公知のRNAiまたは阻害剤によって阻害され得る。
【００６７】
K．ERK5(MAPK7)
MAPキナーゼ7およびERK5としても公知のマイトジェン活性化プロテインキナーゼ7は、MAPキナーゼファミリーのメンバーである。MAPキナーゼは、複数の生化学的シグナルについての統合点として作用し、増殖、分化、転写調節および発生のような多種多様の細胞プロセスに関与する。このキナーゼは、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ5(MAP2K5/MEK5)によって特異的に活性化される。それは、受容体チロシンキナーゼおよびGタンパク質共役受容体を含む、様々な受容体分子の下流のシグナル伝達プロセスに関与する。細胞外シグナルに応答して、このキナーゼは細胞核へトランスロケートし、ここで、それは、種々の転写因子をリン酸化し、そして活性化することによって、遺伝子発現を調節する。ERK5の例示的な阻害剤としては、ERK5-IN-1 (11-シクロペンチル-2-[[2-エトキシ-4-[[4-(4-メチル-1-ピペラジニル)-1-ピペリジニル]カルボニル]フェニル]アミノ]-5,11-ジヒドロ-5-メチル-6H-ピリミド[4,5-b][1,4]ベンゾジアゼピン-6-オン)、BIX 02189、XMD17-109、およびXMD 8-92が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６８】
L．FRK(PTK5)
Fyn関連キナーゼ(FRK)はプロテインキナーゼのTYRファミリーに属する。このチロシンキナーゼは、核タンパク質であり、細胞周期のG1およびS期中に機能し、増殖を抑制し得る。FRKの例示的な阻害剤としては、チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、ダサチニブ、モテサニブ(A1VIG-706)、ドラマピモド(BIRB 796)、ペリチニブ(EKB-569)、ソラフェニブ、バンデタニブ、カネルチニブ(CI-1033)およびイマチニブ(STI-571)が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
M．MAP2K7(MKK7/GADD45b)
MAPキナーゼキナーゼ7またはMKK7としても公知の、二重特異性マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ7は、ヒトにおいてMAP2K7遺伝子によってコードされる酵素である。このタンパク質は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼファミリーのメンバーである。MKK7は、炎症性サイトカイン、および環境ストレスに対する細胞応答を媒介するシグナル伝達に関与する。MAP2K7は、DTP3 ((R)-2-((R)-2-アセトアミド-3-(4-ヒドロキシフェニル)プロパンアミド)-N-((R)-1-アミノ-1-オキソ-3-フェニルプロパン-2-イル)-5-グアニジノペンタンアミドトリフルオロアセテート)によって阻害され得る。
【００７０】
N．PAK4
セリン/トレオニン-プロテインキナーゼPAK4は、セリン/トレオニンキナーゼのPAKファミリーの6つのメンバーのうちの1つである。PAK4は、細胞質の細胞内ドメインおよび核に局在化する。PAK4は、細胞骨格リモデリング、表現型シグナル伝達および遺伝子発現を調節し、指向性運動性、浸潤、転移、および増殖に影響を与える。PAK4は、PF-3758309、LCH-7749944、グラウカルビノン、KY-04031、KY-04045、1-フェナントリル-テトラヒドロイソキノリン誘導体、(-)-β-ヒドラスチン、Inka1、GL-1196、GNE-2861、ならびにマイクロRNA、例えば、miR-145、miR-433、およびmiR-126によって阻害され得る。
【００７１】
O．PMVK
ホスホメバロン酸キナーゼ(PMVK)はメバロン酸経路中にあり、それは、5-ジホスホメバロン酸への5-ホスホメバロン酸の変換を触媒し、これは、イソプレノイド生合成のメバロン酸経路中の第5段階である。PMVKは、CSDDD_1633 (1,4-ビス((2-((γ1-オキシダニル)ジオキソ-γ6-スルファニル)-4-メチルフェニル)アミノ)-5,8-ジヒドロキシ-4a,9a-ジヒドロアントラセン-9,10-ジオン)、CSDDD_2260 (2,2'-((4-((2-(γ1-オキシダニル)-2-オキソエチル)チオ)-[1,1'-ビフェニル]-2,6-ジイル)ビス(スルファンジイル))ジアセテート、CSDDD_2419 ((E)-4-((2,4-ジヒドロキシフェニル)ジアゼニル)-5-メチルナフタレン-2,7-ジスルホネート)またはルテオリン（参照により本明細書に組み入れられる、Boonsri et al., 2013に記載される）の投与によって阻害され得る。
【００７２】
P．PRKACBおよびPRKACG
cAMP依存性プロテインキナーゼ触媒サブユニットベータ(PRKACB)は、様々な細胞機能についてのシグナル伝達分子である。cAMPは、種々の標的タンパク質のリン酸化を通してシグナルを伝達する、プロテインキナーゼA(PKA)を活性化することによってその効果を発揮する。PKAの不活性ホロ酵素は、2つの調節サブユニットおよび2つの触媒サブユニットから構成される四量体である。cAMPは、4つのcAMPへ結合された調節サブユニットの二量体および2つの遊離単量体触媒サブユニットへの不活性ホロ酵素の解離を引き起こす。AMP依存性プロテインキナーゼ触媒サブユニットガンマ(PRKACG)は、マクロファージ中のCCR5経路およびギャップジャンクション中のシグナリングにおいて役割を果たす。PRKACBまたはPRKACGは、当技術分野において公知のRNAiまたは阻害剤によって阻害され得る。
【００７３】
Q．PRKCIおよびPRKCD
プロテインキナーゼCイオタ型(PRKCI)およびプロテインキナーゼCデルタ型(PRKCD)は、セリン/トレオニンプロテインキナーゼのプロテインキナーゼC(PKC)ファミリーのメンバーである。PKCファミリーは、少なくとも8つのメンバーを含み、これらは差次的に発現され、多種多様の細胞プロセスに関与する。このプロテインキナーゼは、カルシウム非依存性かつリン脂質依存性である。それは、ホルボールエステルまたはジアシルグリセロールによって活性化されない。このキナーゼは小さなGTPアーゼRAB2との直接的相互作用によって小胞小管クラスター(VTC)へ動員され得、ここで、このキナーゼはグリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素(GAPD/GAPDH)をリン酸化し、初期分泌経路中の微小管動態において役割を果たす。このキナーゼは、薬物誘発アポトーシスに対するBCL-ABL媒介耐性のために必要であることがわかり、従って、薬物誘発アポトーシスから白血病細胞を保護する。これらのキナーゼについての例示的な阻害剤としては、プロテインキナーゼ阻害剤、例えば、ビスインドリルマレイミドII、カルホスチンC、ジヒドロスフィンゴシン、およびLY 333531塩酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。具体的な局面において、PRKCIの阻害剤はリドーラ(オーラノフィン)またはRXDX-108である。
【００７４】
R．TSSK6
精巣特異的セリンキナーゼ6(TSSK6)。コードされるキナーゼは、広い発現パターンを有するが、生殖能力に対する効果に起因して精巣特異的と記載される。TSSK6は、当技術分野において公知のRNAiまたは阻害剤によって阻害され得る。
【００７５】
S．UCK2
ウリジン-シチジンキナーゼ2(UCK2)は、それぞれ、ウリジン一リン酸(UMP)およびシチジン一リン酸(CMP)へのウリジンおよびシチジンのリン酸化を触媒する。これは、RNAおよびDNA合成に必要なピリミジンヌクレオシド三リン酸の産生における第1段階である。いくつかの局面において、UCK2の阻害剤はフラボカワインBまたはアルピネチンである（Malami et al., 2016）。
【００７６】
T．ZC3HC1
ジンクフィンガーC3HC型タンパク質1(ZC3HC1)としても公知の、ALKの核相互作用パートナー(NIPA)は、核細胞内位置中に排他的に発現されるが、多くの組織および細胞タイプにおいて普遍的に発現される。NIPAは、有糸分裂へのエントリーの調節に関与するskp1カリンF-ボックス(SCF)型ユビキチンE3リガーゼ(SCFNIPA)複合タンパク質である。ZC3HC1は、当技術分野において公知のRNAiまたは阻害剤によって阻害され得る。
【００７７】
U．RNA干渉
いくつかの態様において、キナーゼは、siRNAまたはmiRNAのような、RNA干渉によって阻害され得る。RNAは、siRNA、shRNA、プラスミド、mRNA、miRNA、またはncRNA、特にsiRNAまたはmiRNA治療薬であり得る。miRNAは、miRNA模倣体、またはmiRNA前駆体であり得る。RNAのサイズは、100ヌクレオチド長未満、例えば、75ヌクレオチド長未満、特に50ヌクレオチド長未満であり得る。例えば、RNAは、約10〜100ヌクレオチド、例えば20〜50ヌクレオチド、特に10〜20、15〜25、20〜30、25〜35、30〜40、または45〜50ヌクレオチドの長さを有し得る。
【００７８】
RNAは修飾されていても修飾されていなくてもよい。RNAは、1つまたは複数のヌクレオチドの変更を含み得る。そのような変更は、例えばRNAの末端へのまたは内部における（RNAの1つもしくは複数のヌクレオチドでの）、非ヌクレオチド物質の付加を含み得る。ある局面において、RNA分子は3'-ヒドロキシル基を含有する。本開示のRNA分子中のヌクレオチドはまた、非天然ヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含む、非標準ヌクレオチドを含み得る。二本鎖オリゴヌクレオチドは、修飾骨格、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、または当技術分野において公知の他の修飾骨格を含有し得るか、または非天然ヌクレオシド間結合を含有し得る。siRNAの追加の修飾（例えば、2'-O-メチルリボヌクレオチド、2'-デオキシ-2'-フルオロリボヌクレオチド、「ユニバーサル塩基」ヌクレオチド、5-C-メチルヌクレオチド、1つまたは複数のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および逆位デオキシ脱塩基残基組込み（inverted deoxyabasic residue incorporation））は、米国特許出願公開第20040019001号および米国特許第6,673,611号（これらの各々は参照によりその全体が組み入れられる）において見られ得る。まとめると、上述されるそのような変更された核酸またはRNAは全て、修飾siRNAと呼ばれる。
【００７９】
好ましくは、RNAiは、少なくとも10%、20%、30%、または40%、より好ましくは少なくとも50%、60%、または70%、さらにより好ましくは少なくとも75%、80%、90%、95%またはそれ以上、タンパク質の発現を減少させることができる。
【００８０】
本明細書に記載される方法または組成物において使用されるようなsiRNAは、記載のキナーゼについてのNCBI Reference SequenceによってコードされるmRNA配列に相補的である部分を含み得る。態様において、siRNAは二本鎖部分（デュプレックス）を含む。態様においてsiRNAは20〜25ヌクレオチド長である。態様において、siRNAは、一方または両方の鎖上に、独立して、1つまたは2つのヌクレオチド3′オーバーハングを有する、19-21コアRNAデュプレックスを含む。態様において、オーバーハングはUUである。siRNAは、5′リン酸化されてもされなくてもよく、効能および／またはヌクレアーゼ分解に対する耐性を改善するために当技術分野における公知の修飾のいずれかで修飾されてもよい。非限定的な態様において、siRNAが投与され得、その結果、それは1つまたは複数の細胞中へトランスフェクトされる。一態様において、siRNAは、第1鎖および第2鎖を含む二本鎖RNAを含み得、ここで、RNAの1つの鎖は、遺伝子のRNA転写物の一部分に80、85、90、95または100%相補的である。
【００８１】
一態様において、本開示のsiRNAの一本鎖コンポーネントは、14〜50ヌクレオチド長である。別の態様において、siRNAの一本鎖コンポーネントは、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、または28ヌクレオチド長である。さらに別の態様において、本開示のsiRNAの一本鎖コンポーネントは、21ヌクレオチド長である。さらに別の態様において、本開示のsiRNAの一本鎖コンポーネントは、22ヌクレオチド長である。さらに別の態様において、本開示のsiRNAの一本鎖コンポーネントは、23ヌクレオチド長である。一態様において、本開示のsiRNAは28〜56ヌクレオチド長である。
【００８２】
III．処置方法
個体における癌の進行、特に癌転移を処置するかまたは遅らせるための方法であって、有効量のキナーゼ阻害剤、例えば、本開示において同定された転移促進キナーゼについての阻害剤（表1）を個体へ投与する工程を含む方法を、本明細書に提供する。本開示のある態様は、転移促進キナーゼの阻害剤の投与を伴う、対象にける疾患を処置または予防する方法に関する。疾患は、対象に影響を与え得る任意の疾患であり得る。特定の態様において、疾患は過剰増殖性疾患である。より特定の態様において、疾患は癌である。
【００８３】
いくつかの態様において、治療有効量の表1のキナーゼの阻害剤で対象を処置する工程を含む、対象の脳内の転移性癌細胞の増殖および／または生存を阻害するための方法を提供する。ある態様において、対象における脳腫瘍または転移性脳腫瘍が表1のキナーゼの阻害剤での処置から治療的利益を受けるかどうかを決定する方法であって、例えば、対象中の、例えば該対象の血液中の、該キナーゼの発現を測定することによる方法を提供する。
【００８４】
癌は、固形腫瘍、転移性癌、または非転移性癌であり得る。ある態様において、癌は、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、結腸、食道、胃腸、歯茎、頭部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、頸部、卵巣、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌、または子宮に由来し得る。ある態様において、癌はヒト卵巣癌または乳癌である。さらに、癌は、具体的には、以下の組織学的タイプのものであり得るが、これらに限定されない：新生物、悪性：癌腫；癌腫、未分化；巨細胞および紡錘細胞癌；小細胞癌；乳頭癌；扁平上皮癌；リンパ上皮癌；基底細胞癌；毛質性上皮腫；移行上皮癌；乳頭状移行上皮癌；腺癌；ガストリノーマ、悪性；胆管癌；肝細胞癌；複合肝細胞癌胆管癌；索状腺癌；腺様嚢胞癌；線腫様ポリープの腺癌；腺癌、家族性大腸ポリポーシス；固形癌；癌腫様腫瘍、悪性；気管支肺胞腺癌；乳頭状腺癌；色素嫌性癌；好酸性癌；好酸性腺癌；塩基性癌；明細胞腺癌；顆粒細胞癌；濾胞状腺癌；乳頭濾胞状腺癌；非封入硬化性癌；副腎皮質癌；子宮内膜様癌；皮膚付属器癌；アポクリン腺癌；皮脂腺癌；耳垢腺癌；粘膜表皮腺癌；嚢胞腺癌；乳頭状嚢胞腺癌；乳頭状漿液嚢胞腺癌；粘液性嚢胞腺癌；粘液腺癌；印環細胞癌；浸潤性導管癌；髄様癌；小葉癌；炎症性癌；ページェット病、乳腺；腺房細胞癌；腺扁平上皮癌；扁平上皮化生随伴腺癌；胸腺腫、悪性；卵巣間質腫、悪性；卵胞膜細胞腫、悪性；顆粒膜細胞腫、悪性；男性胚細胞腫、悪性；セルトリ細胞癌；ライディヒ細胞腫瘍、悪性；脂質細胞腫瘍、悪性；傍神経節腫、悪性；乳房外傍神経節腫、悪性；クロム親和性細胞腫；血管球血管肉腫；悪性黒色腫；メラニン欠乏性黒色腫；表在拡大性黒色腫；巨大色素性母斑の悪性黒色腫；類上皮細胞黒色腫；青色母斑、悪性；肉腫；線維肉腫；線維性組織球腫、悪性；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胎児性横紋筋肉腫；胞巣状横紋筋肉腫；間質性肉腫；混合腫瘍、悪性；ミューラー混合腫瘍；腎芽細胞腫；肝芽細胞腫；癌肉腫；間葉細胞腫、悪性；ブレンナー腫瘍、悪性；葉状腫瘍、悪性；滑膜肉腫；中皮腫、悪性；未分化胚細胞腫；胎児性癌；奇形腫、悪性；卵巣甲状腺腫、悪性；絨毛上皮腫；中腎腫、悪性；血管肉腫；血管内皮腫、悪性；カポジ肉腫；血管外皮細胞腫、悪性；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍皮質骨肉腫；軟骨肉腫；軟骨芽細胞腫、悪性；間葉性軟骨肉腫；骨巨細胞腫瘍；ユーイング肉腫；歯性腫瘍、悪性；エナメル芽細胞歯牙肉腫；エナメル芽細胞腫、悪性；エナメル芽細胞線維肉腫；松果体腫、悪性；脊索腫；神経膠腫、悪性；脳室上皮腫；星状細胞腫；原形質性星状細胞腫；原線維性星状細胞腫；星状芽細胞腫；膠芽細胞腫；乏突起神経膠腫；乏突起神経膠芽細胞腫；原始神経外胚葉；小脳肉腫；神経節芽細胞腫；神経芽腫；網膜芽腫；嗅神経腫瘍；髄膜腫、悪性；神経線維肉腫；神経鞘腫、悪性；顆粒細胞腫、悪性；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキン側肉芽腫；悪性リンパ腫、小リンパ球性；悪性リンパ腫、大細胞、びまん性；悪性リンパ腫、濾胞性；菌状息肉腫；他の特定の非ホジキンリンパ腫；悪性組織球症；多発性骨髄腫；肥満細胞肉腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；形質細胞白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞性白血病；骨髄性白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；肥満細胞白血病；巨核芽球性白血病；骨髄性肉腫；およびヘアリーセル白血病。それにもかかわらず、本開示はまた、非癌性疾患（例えば、真菌感染症、細菌感染症、ウイルス感染症、および／または神経変性疾患）を処置するために使用され得ることも認識される。
【００８５】
本処置方法が有用である腫瘍は、固形腫瘍または血液学的腫瘍において見られるもののような、任意の悪性細胞タイプを含む。例示的な固形腫瘍としては、膵臓、結腸、盲腸、胃、脳、頭部、頸部、卵巣、腎臓、喉頭、肉腫、肺、膀胱、黒色腫、前立腺および乳房からなる群より選択される器官の腫瘍が挙げられ得るが、これらに限定されない。例示的な血液学的腫瘍としては、骨髄の腫瘍、TまたはB細胞悪性腫瘍、白血病、リンパ腫、芽細胞腫、骨髄腫などが挙げられる。本明細書に提供される方法を使用して処置され得る癌のさらなる例としては、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、および肺扁平上皮癌を含む）、腹膜癌、胃癌または胃癌（gastric or stomach cancer）（胃腸癌および胃腸間質癌を含む）、膵臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌または腎癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、種々のタイプの頭頸部癌、および黒色腫が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８６】
本方法についてのキナーゼ阻害剤は、過剰発現されたキナーゼのレベルを低下させることができ、当技術分野において一般に知られているもの、例えば、抗体、アンチセンス、shRNA、siRNA、または小分子阻害剤を含む。投与は、注射、例えば、静脈内、髄腔内、筋肉内または皮下、鼻腔内、および経口によって行われ得る。多くの場合において、特に既に検出された脳転移の場合において、血液脳関門を通過する治療用組成物の使用、またはこの要件を回避する投与（例えば、髄腔内もしくは鼻腔内）が望ましい。治療薬の全身および脳利用可能性の両方を提供する処置の組み合わせも使用され得る。
【００８７】
治療有効量の治療剤は、非経口投与、例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、胸骨内、または関節内注射、または注入を含む、多数の経路によって投与することができる。特定の局面において、治療剤は、脳のような、転移の部位へ直接、または血液脳関門を通過する方法によって、例えば、髄腔内にもしくは鼻腔内に、投与される。いくつかの局面において、治療剤は、全身に、および脳のような、転移の部位へ直接、投与される。
【００８８】
キナーゼ阻害剤の治療有効量は、処置される対象において所望の効果を達成する量である。例えば、これは、進行を阻害するために、もしくは癌の退行を引き起こすために必要な、または癌によって引き起こされる症状を軽減することができる、キナーゼ阻害剤の量であり得る。
【００８９】
キナーゼ阻害剤は、疾患と一致する処置レジメンにおいて、例えば、疾患状態を改善するために1日から数日にわたって単一もしくは数回の用量で、または、疾患進行を阻害しそして疾患再発を予防するために長期間にわたって周期的用量で、投与され得る。製剤中に用いられる正確な用量はまた、投与経路、および疾患または障害の重篤度に依存し、実行者の判断および各患者の状況に従って決定さるべきである。キナーゼ阻害剤の治療有効量は、処置される対象、病気の重症度およびタイプ、ならびに投与様式に依存するだろう。キナーゼ阻害剤の厳密な量は、対象の年齢、体重、性別、および生理的状態に基づいて当業者によって容易に決定される。有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系から誘導される用量反応曲線から推定することができる。
【００９０】
A．薬学的組成物
本明細書に記載される方法の一部は、本開示において同定された転移促進キナーゼの阻害剤を含む組成物の薬学的有効量の投与を伴う方法に関する。
【００９１】
薬学的活性物質についての媒体および剤の使用は当技術分野において周知である。任意の従来の媒体または剤が活性成分と不適合である場合を除いて、治療用組成物におけるその使用が意図される。補助的な活性成分もまた組成物中へ組み入れられ得、これらは下記においてより詳細に議論される。ヒト投与について、調製物は、好ましくは、FDA Office of Biologics基準によって要求されるような無菌性、発熱性、一般的安全性および純度基準を満たす。
【００９２】
本開示は、注射のための、または下記においてより詳細に議論されるような任意の他の経路による適用のための、滅菌溶液である組成物を使用する方法を意図する。当業者は、注射または任意の他の経路による適用のための滅菌溶液を作製するための技術に精通しているだろう。滅菌注射剤は、当業者によく知られている様々な他の成分と共に適切な溶媒中に活性化合物を必要量で組み入れることによって調製される。
【００９３】
組成物の製剤は投与経路に依存して異なり得る。水溶液中の非経口投与について、例えば、溶液は適切に緩衝化されるべきであり、液体希釈物は、先ず十分な食塩水またはグルコースで等張にされる。これに関連して、用いられ得る滅菌水性媒体は、本開示を考慮して当業者に公知であろう。
【００９４】
静脈内もしくは筋肉内注射のような、非経口投与用に製剤化された化合物に加えて、他の薬学的に許容される形態としては、埋め込み可能な薬物送達デバイスによる投与用の製剤、および任意の他の形態が挙げられる。本開示において、鼻用溶液もしくはスプレー、エアロゾルまたは吸入剤を使用することもできる。
【００９５】
経口製剤は、例えば、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような、通常用いられる賦形剤を含む。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性製剤または散剤の形態を取る。当業者は、経口製剤の調製についての周知の技術に精通しているだろう。
【００９６】
ある態様において、薬学的組成物は、少なくとも約0.1重量%の活性剤を含む。組成物は、例えば、約0.01%を含み得る。他の態様において、薬学的組成物は、組成物の重量の約2%〜約75%、または組成物の重量で約25%〜約60%、例えば、その中において誘導できる任意の範囲を含む。
【００９７】
薬学的組成物は、1つまたは複数の成分の酸化を遅らせるために様々な抗酸化剤を含み得る。さらに、微生物の作用の防止は、パラベン（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールまたはそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない、様々な抗細菌剤および抗真菌剤のような、保存剤によってもたらされ得る。組成物は、製造および貯蔵条件下で安定している場合があり、細菌および真菌のような、微生物の汚染作用に対して保存され得る。外毒素汚染は、安全レベルで最小限に、例えば、0.5 ng未満/mgタンパク質に維持されるべきであることが、理解されるだろう。
【００９８】
組成物が液体形態である態様において、担体は、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、脂質（例えば、トリグリセリド、植物油、リポソーム）およびそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない、溶媒または分散媒であり得る。多くの場合において、例えば、糖類、塩化ナトリウムまたはそれらの組み合わせのような、等張剤を含むことが好ましいだろう。
【００９９】
他の態様において、本開示において、鼻用溶液もしくはスプレー、エアロゾルまたは吸入剤が使用されてもよい。鼻用溶液は、点滴薬またはスプレーで鼻腔へ投与されるように設計された水溶液であり得る。
【０１００】
滅菌注射剤は、上記に列挙される様々な他の成分と共に適切な溶媒中にナノ粒子を必要量で組み入れ、必要に応じて、続いて滅菌することによって調製される。
【０１０１】
2．投与経路
製剤化されると、キナーゼ阻害剤は、投薬製剤と適合する様式で、治療的に有効であるような量で、投与される。
【０１０２】
キナーゼ阻害剤は、当業者に公知の任意の方法を使用して対象へ投与することができる。例えば、ナノ粒子を含む組成物の薬学的有効量は、静脈内に、脳内に、頭蓋内に、髄腔内に、黒質もしくは黒質の領域中に、皮内に、動脈内に、腹腔内に、病巣内に、気管内に、鼻腔内に、局所的に、筋肉内に、腹腔内に、皮下に、経口的に、局所的に、局所に、吸入（例えば、エアロゾル吸入）、注射、注入、持続注入、標的細胞を直接浸す局所灌流、カテーテルを介して、洗浄を介して、クリームで、脂質組成物（例えば、リポソーム）で、または、当業者に公知であろう他の方法または前述のものの任意の組み合わせによって、投与され得る（Remington’s, 1990）。特定の態様において、組成物は、薬物送達デバイスを使用して対象へ投与される。
【０１０３】
3．投薬量
キナーゼ阻害剤の薬学的有効量は、意図される目的、例えば、細胞死の阻害に基づいて決定される。処置数および用量の両方に従う、投与される量は、処置される対象、対象の状態、望まれる保護、および投与経路に依存する。治療剤の正確な量はまた、実行者の判断に依存し、各個体に特有である。
【０１０４】
例えば、治療剤の用量は、1用量当たり、約0.0001ミリグラム〜約1.0ミリグラム、または約0.001ミリグラム〜約0.1ミリグラム、または約0.1ミリグラム〜約1.0ミリグラム、またはさらには約10ミリグラムなどであり得る。複数の用量を投与することもできる。いくつかの態様において、用量は少なくとも約0.0001ミリグラムである。さらなる態様において、用量は少なくとも約0.001ミリグラムである。なおさらなる態様において、用量は少なくとも0.01ミリグラムである。なおさらなる態様において、用量は少なくとも約0.1ミリグラムである。より特定の態様において、用量は少なくとも1.0ミリグラムであり得る。さらにより特定の態様において、用量は少なくとも10ミリグラムであり得る。さらなる態様において、用量は少なくとも100ミリグラムまたはそれ以上である。
【０１０５】
他の非限定的な例において、用量はまた、1投与当たり、約1マイクログラム/kg/体重から、約5マイクログラム/kg/体重、約10マイクログラム/kg/体重、約50マイクログラム/kg/体重、約100マイクログラム/kg/体重、約200マイクログラム/kg/体重、約350マイクログラム/kg/体重、約500マイクログラム/kg/体重、約1ミリグラム/kg/体重、約5ミリグラム/kg/体重、約10ミリグラム/kg/体重、約50ミリグラム/kg/体重、約100ミリグラム/kg/体重、約200ミリグラム/kg/体重、約350ミリグラム/kg/体重、約500ミリグラム/kg/体重、約1000 mg/kg/体重またはそれ以上まで、およびその中において誘導できる任意の範囲を含み得る。本明細書に列挙される数から誘導できる範囲の非限定的な例において、上述の数に基づいて、約5 mg/kg/体重〜約100 mg/kg/体重、約5マイクログラム/kg/体重〜約500ミリグラム/kg/体重などの範囲を投与することができる。
【０１０６】
用量は当業者によって決定される通りに繰り返すことができる。従って、本明細書に記載される方法のいくつかの態様において、単一用量が意図される。他の態様において、複数回の用量が意図される。1つを超える用量が対象へ投与される場合、用量間の時間間隔は、当業者に決定されるような任意の時間間隔であり得る。例えば、用量間の時間間隔は、約1時間〜約2時間、約2時間〜約6時間、約6時間〜約10時間、約10時間〜約24時間、約1日〜約2日、約1週間〜約2週間、またはそれ以上、または任意のこれらの記載の範囲内で誘導できる任意の時間間隔であり得る。
【０１０７】
ある態様において、方法は、患者への薬学的組成物の連続供給を提供し得る。これは、カテーテル留置、続いて治療剤の連続投与によって達成され得る。投与は、術中または術後であり得る。
【０１０８】
B．併用処置
本開示のある態様は、疾患の処置または予防のための1つまたは複数の療法の第2形態を提供する。例えば、疾患は、癌などの、過剰増殖性疾患であり得る。
【０１０９】
療法の第2形態は、癌の処置または予防に適用することができる1つまたは複数の第2の薬理学的剤の投与であり得る。第2療法が薬理学的剤である場合、それは、キナーゼ阻害剤の投与前に、投与と同時に、または投与後に、投与され得る。
【０１１０】
キナーゼ阻害剤および第2療法の投与間の間隔は、当業者によって決定されるような間隔であり得る。例えば、間隔は数分間から数週間であり得る。剤が別々に投与される態様において、各治療剤が対象に対して有利に組み合わされた効果を依然として発揮することができるように、長期間が各送達時の間に失効しないことを一般に確実にするだろう。例えば、治療剤間の間隔は、互いの約12時間〜約24時間、より好ましくは、互いの約6時間〜約12時間以内であり得る。いくつかの状況において、処置のための期間は延長されてもよく、しかし、ここで、それぞれの投与間で数日（2、3、4、5、6または7）から数週間（1、2、3、4、5、6、7または8）は無効になる。いくつかの態様において、第2の治療剤の投与のタイミングは、ナノ粒子に対する対象の反応に基づいて決定される。
【０１１１】
様々な組み合わせが用いられ得る。下記の例について、キナーゼ阻害剤組成物は「A」であり、抗癌療法は「B」である：
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【０１１２】
患者に対する本開示の任意の化合物または療法の投与は、存在する場合には剤の毒性を考慮に入れて、かかる化合物の投与のための一般的なプロトコルに従う。従って、いくつかの態様において、併用療法に起因する毒性をモニタリングする工程がある。処置サイクルは繰り返され得ることが、予想される。様々な標準的治療、ならびに外科的介入が、記載される療法と組み合わせて適用され得ることも意図される。
【０１１３】
具体的な局面において、標準的治療は、化学療法、放射線療法、免疫療法、外科的療法または遺伝子療法を含み、本明細書に記載されるような、遺伝子発現の阻害剤療法、抗癌療法、または遺伝子発現の阻害剤療法および抗癌療法の両方と組み合わせて用いられてもよいことが意図される。
【０１１４】
1．化学療法
使用され得る化学療法剤の例には、アルキル化剤、例えば、チオテパおよびシクロホスファミド：スルホン酸アルキル、例えば、ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファン；アジリジン、例えば、ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、およびウレドーパ；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスフォラミド、トリエチレンチオホスフォラミド、およびトリメチロロメラミンを含む、エチレンイミンおよびメチラメラミン；アセトゲニン（特に、ブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトテシン（合成アナログトポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；CC-1065（そのアゾゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成アナログを含む）；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン1およびクリプトフィシン8）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成アナログ、KW-2189およびCB1-TM1を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンジスタチン；ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド（cholophosphamide）、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノブエンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、およびウラシルマスタード；ニトロソウレア、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムヌスチン；抗生剤、例えば、エンジイン抗生剤（例えば、カリチアマイシン、特に、カリチアマイシンガンマlIおよびカリチアマイシンオメガI1）；ダイネマイシンAを含む、ダイネマイシン；ビスホスホネート、例えば、クロドロネート；エスペラマイシン；ならびにネオカルチノスタチン発色団および関連する色素タンパク質エンジイン抗生剤発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウトラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、2-ピロリノ-ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えば、マイトマイシンC、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、およびゾルビシン；抗代謝物質、例えば、メトトレキサートおよび5-フルオロウラシル（5-FU）；葉酸アナログ、例えば、デノプテリン、プテロプテリン、およびトリメトレキサート；プリンアナログ、例えば、フルダラビン、6-メルカプトプリン、チアミプリン、およびチオグアニン；ピリミジンアナログ、例えば、アンシタビン、アザシチジン、6-アザウリジン、カルモファー、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、およびフロックスウリジン；アンドロゲン、例えば、カルステロン、ドロナノ���ンプロピオナート（dronanolone propionate）、エピチオスタノール、メピチオスタン、およびテストラクトン；抗副腎薬、例えば、ミトタンおよびトリロスタン；葉酸補充物質、例えば、フロリン酸（frolinic acid）；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エルフォルミチン；エリプチニウムアセテート；エポチロン；エトグルシッド；ガリウムニトレート；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシノイド、例えば、メイタンシンおよびアンサミトシン；ミトグアゾン；ミトキサトロン；モピダンモール；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；2-エチルヒドラジド；プロカルバジン；PSK多糖複合体；ラゾキサン；リゾキシンン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；2,2',2”-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特に、T-2毒素、ベラクリンA、ロリジンA、およびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ara-C」）；シクロホスファミド；タキソイド、例えば、パクリタキセルおよびドセタキセルゲムシタビン；6-チオグアニン；メルカプトプリン；プラチナ配位錯体、例えば、シスプラチン、オキサリプラチン、およびカルボプラチン；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド（VP-16）；イフォスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼロダ；イバンドロナート；イリノテカン（例えば、CPT-11）；トポイソメラーゼ阻害剤RFS 2000；ジフルオロメチルオルニチン（DMFO）；レチノイド、例えば、レチノイン酸；カペシタビン；カルボプラチン、プロカルバジン、プリコマイシン、ゲムシタビエン、ナベルビン、ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、トランスプラチナ、ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が含まれる。
【０１１５】
2．放射線療法
DNA損傷を引き起こし、かつ幅広く用いられている他の因子は、γ線、X線として一般的に知られているもの、および／または腫瘍細胞に対する放射性同位体の指向性送達を含む。DNA損傷因子の他の形態、例えば、マイクロ波、陽子ビーム照射、ならびにUV照射も意図される。これらの因子の全ては、DNAに対して、DNAの前駆体に対して、DNAの複製および修復に対して、ならびに染色体の集合および維持に対して、広範囲の損傷に影響を与える可能性が高い。X線についての線量範囲は、長期間（3〜4週間）についての50〜200レントゲンの1日線量から、2000〜6000レントゲンの単一線量までの範囲にわたる。放射性同位体についての線量範囲は、広く異なり、同位体の半減期、放出された放射線の強度および種類、ならびに新生物細胞による取込みに依存する。
【０１１６】
3．免疫療法
当業者は、免疫療法が、本態様の方法と組み合わせてまたは連動させて用いられ得ることを理解するだろう。癌処置の文脈において、免疫療法は、一般的に、癌細胞を標的とし、それを破壊するために、免疫エフェクター細胞および分子を使用することに依存する。リツキシマブ（RITUXAN（登録商標））は、その一例である。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面上にあるいくつかのマーカーに特異的な抗体であり得る。抗体単独を療法のエフェクターとして使用することもでき、または、抗体が、細胞殺傷に実際に作用する他の細胞を動員してもよい。抗体はまた、薬物または毒素（化学療法剤、放射性核種、リシンA鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）にコンジュゲートされ、標的化剤として機能することができる。あるいは、エフェクターは、直接的または間接的に腫瘍細胞標的と相互作用する表面分子を有するリンパ球であり得る。様々なエフェクター細胞は、細胞傷害性T細胞およびNK細胞を含む。
【０１１７】
抗体-薬物コンジュゲート（ADC）は、細胞を殺傷する薬物に共有結合したモノクローナル抗体（MAb）を含み、併用療法において使用され得る。このアプローチは、Mabのそれらの抗原標的に対する高い特異性と、高度に強力な細胞傷害性薬物とを組み合わせており、ペイロード（薬物）を豊富なレベルの抗原と共に腫瘍細胞に送達する「武装した」MAbをもたらす。薬物を標的指向して送達することはまた、正常組織中への薬物の曝露を最小限にし、毒性の軽減および治療指標の改善をもたらす。例示的なADC薬物としては、ADCETRIS（登録商標）（ブレンツキシマブベドチン）およびKADCYLA（登録商標）（トラスツズマブエムタンシンまたはT-DM1）が挙げられる。
【０１１８】
免疫療法の一局面において、腫瘍細胞は、標的指向を施すことのできる、即ち、他の細胞の大部分において存在しない、いくつかのマーカーを有する必要がある。多くの腫瘍マーカーが存在し、これらのいずれもが、本態様の文脈における標的指向に好適であり得る。一般的な腫瘍マーカーは、CD20、癌胎児性抗原、チロシナーゼ（p97）、gp68、TAG-72、HMFG、Sialyl Lewis抗原、MucA、MucB、PLAP、ラミニン受容体、erb B、およびp155を含む。免疫療法の代替的な局面は、抗癌効果と免疫刺激効果とを組み合わせることである。サイトカイン、例えば、IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、ガンマ-IFN、ケモカイン、例えば、MIP-1、MCP-1、IL-8、および増殖因子、例えば、FLT3リガンドを含む、免疫刺激分子も存在する。
【０１１９】
免疫療法の例には、免疫アジュバント、例えば、マイコバクテリウムボビス、熱帯熱マラリア原虫、ジニトロクロロベンゼン、および芳香族化合物；サイトカイン療法、例えば、インターフェロンα、β、およびγ、IL-1、GM-CSF、およびTNF；遺伝子療法、例えば、TNF、IL-1、IL-2、およびp53；ならびにモノクローナル抗体、例えば、抗CD20、抗ガングリオシドGM2、および抗p185が含まれる。1つまたは複数の抗癌療法が本明細書に記載の抗体療法と共に使用され得ることが意図される。
【０１２０】
いくつかの態様において、免疫療法は、免疫チェックポイント阻害剤であり得る。免疫チェックポイントは、シグナル（例えば、共刺激分子）を強くするか、またはシグナルを弱くする。免疫チェックポイント妨害により標的とされ得る阻害性免疫チェックポイントは、アデノシンA2A受容体（A2AR）、B7-H3（CD276としても知られている）、BおよびTリンパ球減衰剤（BTLA）、細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4（CTLA-4、CD152としても知られている）、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ（IDO）、キラー細胞免疫グロブリン（KIR）、リンパ球活性化遺伝子-3（LAG3）、プログラム死1（PD-1）、T細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン3（TIM-3）、ならびにT細胞活性化のVドメインIg抑制剤（VISTA）を含む。特に、免疫チェックポイント阻害剤は、PD-1系および／またはCTLA-4を標的とする。
【０１２１】
免疫チェックポイント阻害剤は、薬物、例えば、小分子、リガンドもしくは受容体の組換え形態であることができ、または特に、抗体、例えば、ヒト抗体である。免疫チェックポイントタンパク質またはそのアナログの公知の阻害剤が用いられてもよく、特に、キメラ、ヒト化、またはヒト形態の抗体が用いられてもよい。当業者に分かるであろうように、代替的および／または等価な名称が、本開示において言及された特定の抗体のために使用されてもよい。かかる代替的および／または等価な名称は、本明細書の文脈において互換的である。例えば、ランブロリズマブは、代替的および等価な名称であるMK-3475およびペンブロリズマブとしても公知であることが知られている。
【０１２２】
いくつかの態様において、PD-1結合アンタゴニストは、PD-1のそのリガンド結合パートナーに対する結合を阻害する分子である。具体的な局面において、PD-1リガンド結合パートナーは、PDL1および／またはPDL2である。別の態様において、PDL1結合アンタゴニストは、PDL1のその結合パートナーに対する結合を阻害する分子である。具体的な局面において、PDL1結合パートナーは、PD-1および／またはB7-1である。別の態様において、PDL2結合アンタゴニストは、PDL2のその結合パートナーに対する結合を阻害する分子である。具体的な局面において、PDL2結合パートナーは、PD-1である。アンタゴニストは、抗体、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、またはオリゴペプチドであり得る。
【０１２３】
いくつかの態様において、PD-1結合アンタゴニストは、抗PD-1抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体）である。いくつかの態様において、抗PD-1抗体は、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、およびCT-011からなる群より選択される。いくつかの態様において、PD-1結合アンタゴニストは、イムノアドヘシン（例えば、定常領域（例えば、免疫グロブリン配列のFc領域）に融合したPDL1またはPDL2の細胞外またはPD-1結合部分を含むイムノアドヘシン）である。いくつかの態様において、PD-1結合アンタゴニストは、AMP-224である。MDX-1106-04、MDX-1106、ONO-4538、BMS-936558、およびOPDIVO（登録商標）としても知られているニボルマブは、使用され得る抗PD-1抗体である。MK-3475、Merck 3475、ランブロリズマブ、KEYTRUDA（登録商標）、およびSCH-900475としても知られているペンブロリズマブは、例示的な抗PD-1抗体である。hBATまたはhBAT-1としても知られているCT-011も、抗PD-1抗体である。B7-DCIgとしても知られているAMP-224は、PDL2-Fc融合可溶性受容体である。
【０１２４】
本明細書において提供される方法において、標的とされ得る別の免疫チェックポイントは、CD152としても知られている、細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4（CTLA-4）である。ヒトCTLA-4の完全なcDNA配列は、Genbankアクセッション番号L15006を有する。CTLA-4は、T細胞の表面上で見出され、抗原提示細胞の表面上のCD80またはCD86に結合されると、「オフ」スイッチとして作用する。CTLA4は、ヘルパーT細胞の表面上で発現され、阻害性シグナルをT細胞に伝達する、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。CTLA4は、T細胞共刺激タンパク質、CD28に類似しており、両分子は、抗原提示細胞上のそれぞれB7-1およびB7-2とも呼ばれるCD80およびCD86に結合する。CTLA4は、阻害性シグナルをT細胞に伝達し、一方で、CD28は、刺激性シグナルを伝達する。細胞内CTLA4は、調節性T細胞においても見出され、それらの機能にとって重要であり得る。T細胞受容体およびCD28を介するT細胞活性化は、CTLA-4、B7分子についての阻害性受容体の発現増大に至る。
【０１２５】
いくつかの態様において、免疫チェックポイント阻害剤は、抗CTLA-4抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、もしくはキメラ抗体）、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、またはオリゴペプチドである。
【０１２６】
本方法において使用するのに好適な抗ヒトCTLA-4抗体（またはそれらに由来するVHおよび／もしくはVLドメイン）は、当技術分野において周知の方法を用いて作製することができる。あるいは、当技術分野において認識される抗CTLA-4抗体を使用することができる。例示的な抗CTLA-4抗体は、イピリムマブ（10D1、MDX-010、MDX-101、およびYervoy（登録商標）としても知られている）またはその抗原結合断片およびバリアントである。他の態様において、抗体は、イピリムマブの重鎖および軽鎖CDRまたはVRを含む。従って、一態様において、抗体は、イピリムマブのVH領域のCDR1、CDR2、およびCDR3ドメイン、ならびにイピリムマブのVL領域のCDR1、CDR2、およびCDR3ドメインを含む。別の態様において、抗体は、上記の抗体と同じCTLA-4上のエピトープとの結合および／またはそれらへの結合について競合する。別の態様において、抗体は、上記の抗体と少なくとも約90%の可変領域アミノ酸配列同一性（例えば、イピリムマブと少なくとも約90%、95%、または99%の可変領域同一性）を有する。
【０１２７】
4．手術
癌を有する人のおよそ60%は、予防的、診断的または病期分類的、治療的、および緩和的手術を含む、ある種の手術を受ける。治療的手術は、癌組織の全てまたは一部が物理的に除去されるか、切除されるか、および／または破壊される切除術を含み、また他の療法、例えば、本態様の処置、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法、および／または代替療法と併用することができる。腫瘍切除術は、腫瘍の少なくとも一部の物理的除去を指す。腫瘍切除術に加えて、手術による処置は、レーザー手術、冷凍外科手術、電気手術、および顕微鏡制御された手術（モース手術）を含む。
【０１２８】
癌細胞、組織、または腫瘍の一部または全ての切除では、体内に腔が形成されてもよい。処置は、さらなる抗癌療法を用いる領域の灌流、直接注入、または局所適用により成し遂げることができる。かかる治療は、例えば、1、2、3、4、5、6もしくは7日ごとに、または1、2、3、4および5週ごとに、または1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、もしくは12ヶ月ごとに繰り返すことができる。これらの処置は、用量を変化させたものであってもよい。
【０１２９】
5．他の剤
処置の治療効果を改善するために本態様の特定の局面と組み合わせて他の剤を用いてもよいことが意図される。これらのさらなる剤には、細胞表面受容体およびGAPジャンクションの上方制御に作用する剤、細胞増殖抑制剤および分化剤、細胞接着の阻害剤、過剰増殖細胞のアポトーシス誘導剤への感受性を増大させる剤、または他の生物学的剤が含まれる。GAPジャンクションの数を高めることによる細胞内シグナリングの増大は、隣接する過剰増殖細胞集団に対する抗過剰増殖効果を増大し得る。他の態様において、細胞増殖抑制剤または分化剤は、処置の抗過剰増殖効果を改善するために本態様の特定の局面と組み合わせて用いることができる。細胞接着の阻害剤は、本態様の効果を改善するために意図される。細胞接着阻害剤の例は、接着斑キナーゼ（FAK）阻害剤およびロバスタチンである。
【０１３０】
IV．キット
態様の様々な局面において、治療剤ならびに／または他の治療剤および送達剤を含有するキットが想定される。いくつかの態様において、本態様は、本態様のキナーゼ阻害剤組成物の調製および／または投与のためのキットを意図する。キットは、本態様の薬学的組成物のいずれかを含有する1つまたは複数の密封されたバイアルを含み得る。キットは、例えば、キナーゼ阻害剤、ならびに、本態様の成分を調製、製剤化および／もしくは投与するための、または本発明の方法の1つもしくは複数の工程を行うための試薬を含み得る。いくつかの態様において、キットはまた、好適な容器を含み得、これは、キットの成分と反応しない容器、例えば、エッペンドルフチューブ、アッセイプレート、注射器、ボトル、またはチューブである。容器はプラスチックまたはガラスのような滅菌可能な材料から作られ得る。
【０１３１】
キットは、本明細書に記載される方法の手順工程を概説する指示書をさらに含み得、これは、本明細書に記載されるのと実質的に同じ手順に従うか、または当業者に公知である。指示情報は、コンピュータを使用して実行されると、薬学的有効量の治療剤を送達する実際または仮想手順を表示する機械可読指示を含有するコンピュータ可読媒体中にあり得る。
【実施例】
【０１３２】
V．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を実証するために含まれる。当業者であれば、後に続く実施例において開示された技術は、本発明の実施において十分に機能することが本発明者により見出された技術を示し、従って、その実施のための好ましいモードを構成するものとして考慮することができることを理解するべきである。しかし、当業者であれば、本開示に照らして、開示される特定の態様において多数の変更を加えることができること、そして本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様または類似する結果を依然として得ることができることを理解するべきである。
【０１３３】
実施例1−ドライバーキナーゼスクリーニング
キナーゼ過剰発現スクリーニングを、脳転移の新規のドライバーを特定するためにインビボで行った（図1）。アッセイを、キナーゼが脳転移の成長を増強するかどうかを決定するために行った。スクリーニングされた17のキナーゼプールのうち、14がマウス生存を少なくとも20%減少させた。
【０１３４】
スクリーニングを行うために、活性化キナーゼオープンリーディングフレーム(ORF)をコードするレトロウイルスプラスミドを、MDA-MB-2131トリプルネガティブ乳癌親細胞(231p)中に安定的に過剰発現させ、細胞を免疫不全マウスの頸動脈中へ注入した。ルシフェラーゼ、GFP、および最大24のキナーゼのプールを発現するMDA-MB-231親細胞(231p.ルシフェラーゼ.GFP)を、TdTomatoおよびエンプティーpWZL-Neo-Myr-Flag-DESTベクターを発現する231p細胞(231p.TdTomato)と混合した。細胞を3:1比のキナーゼプール:ベクターで混合し、2 x 106個の細胞をヌードマウスの頸動脈中へ注入した。
【０１３５】
動物が神経症状を示し、それらの頭部がIVISによって極度にルシフェラーゼ陽性と決定されると、マウスを犠牲にし、GFP陽性に基づいて解剖顕微鏡を使用して脳病巣を単離した。病巣の一部分を直接RNA抽出へ供し、一方、残りを解離し、細胞を継代0としてインビトロで培養した。gDNAを回収された細胞から抽出し、キナーゼベクター配列を標的化PCRによって増幅した。このDNAをMiSeqによって配列決定し、インビボ選択の定量的読み出しを得た。
【０１３６】
腫瘍細胞を急成長中の脳転移から単離し、どのキナーゼが脳転移の加速成長の原因であるかを決定するために、次世代シーケンシング(NGS)を行い、インビボで濃縮される24のキナーゼが同定された（表1）。ヒト癌における不均一性をシミュレートするためにプールされた過剰発現フォーマットでスクリーニングを行ったため、次に、濃縮によって同定された個々のキナーゼが、インビボ機能獲得実験的脳転移アッセイを使用して、脳転移の成長を実際に加速し得ることを確認した。
【０１３７】
新たに同定されたキナーゼの一部を、ルシフェラーゼ標識MDA-MB-231親細胞中において単独で過剰発現させた。キナーゼ過剰発現脳転移の成長を、ベクター対照細胞と比べて解析した（図3）。インビボイメージングシステム(IVIS)を使用し、ルシフェラーゼ発現癌細胞によって発生された発光シグナルを定量化した。0日目に動物1匹当たり1 x 105個の細胞を注入し、ルシフェラーゼシグナルを1日目に対して正規化した。CDK5、PCTKI、MAPK12、LIMK2およびSPHKは全て脳転移の成長を有意に増強し、一方、MARK4は有意な成長有利性をもたらさなかった（即ち、単一のキナーゼとして機能的打撃をもたらさなかった）ことが確認された。
【０１３８】
キナーゼ過剰発現細胞または対応のベクター細胞が注入されたマウスを、それらの脳転移特異的生存について比較した。PCTK1過剰発現は、128日間の期間中央値から60日間へ生存を短縮した（図4A）。生存曲線は、Mantel-Coxログランク検定に従って有意な差(p=0.0004)があった。SPHK1過剰発現は、131日間の期間中央値から102.5日間へ生存を短縮した（図4B）。CDK5過剰発現は、128日間の期間中央値から70日間へ生存を短縮した（図4C）。
【０１３９】
脳転移成長の新たに同定されたキナーゼドライバーの治療ポテンシャルを試験するために、遺伝子のうちの4つ、PCTK.1、SPHK.l、およびCDK5に対して機能喪失実験的脳転移アッセイを行った。PCTKlについて、PCTKl遺伝子を、攻撃的な脳転移を形成しかつ高い内因性PCTKI発現を有するHER2陽性株である、HCC1954.Br脳要求株中においてshRNAによって安定的にノックダウンした。PCTKlノックダウンHCC1954.Br細胞および対照shRNA形質導入HCC1954.Br細胞を、それぞれ、ヌードマウスへ頸動脈内注入し、マウスの2つの群を生存について比較した。PCTKlノックダウン群は、ベクター対照shRNA群と比べて57.5日間から91日間へ有意に延長された生存期間中央値を有した（図5B）。
【０１４０】
SPHK.lについて、高い内因性SPHKl発現を有するため、高悪性度の脳転移性株MDA-MB-435を選択した。SPHK.lの安定的なshRNA媒介ノックダウン後、SPHK.lノックダウン細胞が注入されたマウスを、対照MDA-MB-435細胞が注入されたマウスと比べて実験的脳転移駆動死について比較した。実際に、SPHKlノックダウンは、対照と比べて、マウス生存中央値を57.5日間から77日間へ延長した（図6B）。従って、脳転移ドライバーキナーゼのうちの2つ、PCTKIおよびSPHKlを標的とすることは、脳転移を有効に阻害し、脳転移を有するマウスの生存を延ばすことが、明確に実証された。
【０１４１】
さらに、MAPK12ノックダウンは、4T1実験的脳転移モデルにおいて初期段階で脳転移成長を有意に遅らせることが分かった。MAPK12ノックダウン癌細胞とベクター対照細胞との比較は、MAPK12ノックダウンが脳転移成長を遅らせたことを示した（図7B）。インビボイメージングシステム(IVIS)を使用し、ルシフェラーゼ発現癌細胞によって発生された発光シグナルを定量化した。Balb/c免疫担当マウスモデルにおいて動物1匹当たり1 x 105個の細胞を注入した。(C)4T1細胞が注入されたBALB/cマウスの生存解析は、MAPK12ノックダウンが生存中央値を15日間から19日間へ延長したことを示した（図7C）。
【０１４２】
さらに、CDK5ノックダウンは、低酸素条件においてインビトロで細胞増殖を減少させ、CD8 T細胞依存様式でEO771実験的脳転移モデルにおいて死を有意に遅らせた。MTTアッセイは、ベクター対照細胞と比較した場合、低酸素条件でのCDK5ノックダウン細胞におけるインビトロ細胞増殖の有意な減少を実証した（図8B）。EO771細胞が注入されたC57BL/6マウスの生存解析は、CDK5ノックダウンが生存中央値を19日間から23.5日間へ延長したことを示した（図8C）。対照またはCDK5ノックダウンEO771細胞のいずれかが注入されたC57BL/6マウスの生存解析は、αCD8抗体を使用してCD8-T細胞を枯渇させた場合、これらの2つの群間でマウス生存の有意差がなかったことを示し、これは、CDK5駆動脳転移が、免疫系、特に適応性T細胞コンパートメントを通じて部分的に媒介されることを示唆している（図8D）。
【０１４３】
EO771細胞中のCDK5ノックダウンは、それらを、ロスコビチンに対してより低感受性にし、T細胞細胞傷害性に対してより高感受性にした。EO771細胞中のCDK5ノックダウンは、対照細胞と比較して、それらを、CDK5阻害剤であるロスコビチンに対してより低感受性にした（図9A）。細胞傷害性T細胞殺傷アッセイは、E0771細胞中のCDK5ノックダウンが、EO771対照細胞と比較して、活性化T細胞細胞傷害性に対してより感受性であったことを示した（図9B）。T細胞は、腫瘍細胞との共培養前に、CD3/CD28抗体(100 ng/mL)およびIL-2(10 ng/mL)によって活性化した。
【０１４４】
最後に、LIMK2過剰発現は、低酸素条件においてインビトロで細胞増殖を促進した。MTTアッセイは、ベクター対照細胞と比較して、LIMK2が過剰発現された場合、低酸素条件においてインビトロ細胞増殖の有意な増加を実証した（図10B）。LKB1が過剰発現されたMDA-MB-231細胞は、MTTアッセイにおいて示されたように、ベクター対照細胞と比較した場合、低酸素条件においてインビトロ細胞増殖の有意な増加を実証した（図11B）。
【０１４５】
従って、スクリーニングによって同定されたキナーゼの阻害は、脳転移関連死を有意に遅らせ、脳転移についての有効な治療標的である。
【０１４６】
本明細書において開示され、特許請求される方法の全ては、本開示に照らして、過度の実験を行うことなく、構築および実施することができる。本発明の組成物および方法は、好ましい態様に関連して説明されてきたが、当業者には、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書において記載された方法および工程、または方法の工程の順序に変更が適用されてもよいことが、明らかであろう。より具体的には、化学的および生理学的に関連するある特定の剤が本明細書に記載の剤の代わりに用いられ得、一方、同じまたは同様の結果が達成されるであろうことが、明らかであろう。当業者に明らかである全てのかかる同様の置換および修飾は、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の精神、範囲、および概念の範囲内であるとみなされる。
【０１４７】
参考文献
以下の参考文献は、本明細書に示された参考文献を補足する例示的な手順的なまたは他の詳細を提供する程度まで、参照により本明細書に具体的に組み入れられる。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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