(57)【要約】  本発明は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）をコードすることができるアデノウイルスベクターに関するものであり、該ＶＬＰは、不活性型免疫抑制性ドメイン（ＩＳＤ）を提示する。本発明のワクチンは、ＣＤ４  Ｔ細胞またはＣＤ８  Ｔ細胞によって開始される応答経路のうちの両方のいずれかに由来する改善された免疫応答を示す。
2020531053.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）エンベロープ蛋白質またはその免疫原性部分をコードする、疾患の予防および／または治療における使用のための核酸分子であって、前記蛋白質のＩＳＤが、前記ＩＳＤを不活性にする突然変異を含有する、核酸分子。
【請求項２】
好ましくはアデノウイルスベクター、より好ましくは、哺乳動物アデノウイルス型、ヒトアデノウイルス型、チンパンジーアデノウイルス血清型、またはゴリラアデノウイルス血清型に由来するアデノウイルスベクターであるベクターであって、前記ヒトアデノウイルスベクターが、Ｄ群ベクター、ヒトアデノウイルス血清型Ａｄ５、ヒトアデノウイルス血清型Ａｄ１９ａ、ヒトアデノウイルス血清型Ａｄ２６、またはチンパンジーアデノウイルス血清型に由来し、かつ前記アデノウイルスベクターが、アデノウイルス，血清型５（Ａｄ５）またはアデノウイルス，血清型１９（Ａｄ１９）である、請求項１記載の使用のための、請求項１記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項３】
前記ベクターが、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）をコードし、前記ＶＬＰが、不活性型免疫抑制性ドメイン（ＩＳＤ）を有する内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）エンベロープ蛋白質またはその免疫原性部分を提示する、請求項２記載の使用のための、請求項２記載のベクター。
【請求項４】
疾患の予防および／または治療における使用のための、請求項３記載のベクターの発現産物を含む、蛋白質。
【請求項５】
疾患の予防および／または治療における使用のための、請求項１から３までのいずれか１項記載の核酸分子もしくはベクターを含む、または請求項４記載の蛋白質を含む、ワクチン。
【請求項６】
前記疾患が、癌、より好ましくは、ＥＲＶ発現癌、さらにより好ましくは、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、リンパ腫、黒色腫、白血病、肉腫、大腸癌、精巣癌、肺癌、および肝癌から選択される、請求項５記載の使用のための、請求項１から５までのいずれか１項記載の核酸分子、ベクター、蛋白質、またはワクチン。
【請求項７】
前記ＩＳＤは、前記アミノ酸の少なくとも１つが異なるアミノ酸と交換されたＬＡＮＱＩＮＤＬＲＱＴＶＩＷ（配列番号１）、ＬＡＳＱＩＮＤＬＲＱＴＶＩＷ（配列番号２）、ＬＱＮＲＲＧＬＤＬＬＴＡＥＫＧＧＬ（配列番号３）、ＬＱＮＲＲＡＬＤＬＬＴＡＥＲＧＧＴ（配列番号４）、ＬＱＮＲＲＧＬＤＭＬＴＡＡＱＧＧＩ（配列番号５）、ＹＱＮＲＬＡＬＤＹＬＬＡＡＥＧＧＶ（配列番号６）またはＮＳＱＳＳＩＤＱＫＬＡＮＱＩＮＤＬＲＱＴ（配列番号４９）を有する、請求項６記載の使用のための、請求項１から６までのいずれか１項記載の核酸分子、ベクター、またはワクチン。
【請求項８】
前記ＩＳＤの上流または下流の１０アミノ酸領域における前記アミノ酸の少なくとも１つが、異なるアミノ酸と交換された、請求項７記載の使用のための、請求項１から７までのいずれか１項記載の核酸分子、ベクター、またはワクチン。
【請求項９】
前記ＥＲＶ蛋白質が、ヒト内在性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）蛋白質またはその免疫原性部分であり、前記ＨＥＲＶが、ＨＥＲＶ−Ｋ、ＨＥＲＶ−Ｈ、ＨＥＲＶ−Ｗ、ＨＥＲＶ−ＦＲＤ、およびＨＥＲＶ−Ｅからなる群のうちで選択され、かつ前記ＨＥＲＶ−Ｋが、ＨＥＲＶ−Ｋ１０８（＝ＥＲＶＫ−６）、ＥＲＶＫ−１９、ＨＥＲＶ−Ｋ１１５（＝ＥＲＶＫ−８）、ＥＲＶＫ−９、ＨＥＲＶ−Ｋ１１３、ＥＲＶＫ−２１、ＥＲＶＫ−２５、ＨＥＲＶ−Ｋ１０２（＝ＥＲＶＫ−７）、ＨＥＲＶ−Ｋ１０１（＝ＥＲＶＫ−２４）、およびＨＥＲＶ−Ｋ１１０（＝ＥＲＶＫ−１８）からなる群のうちで選択され、ＨＥＲＶ−Ｈが、ＨＥＲＶ−Ｈ１９（＝ＨＥＲＶ−Ｈ＿２ｑ２４．３）、およびＨＥＲＶ−Ｈ＿２ｑ２４．１からなる群のうちで選択され、ＨＥＲＶ−ＷがＥＲＶＷ−１（＝シンシチン１）として選択され、かつＨＥＲＶ−ＦＲＤがＥＲＶＦＲＤ−１（＝シンシチン２）として選択される、請求項８記載の使用のための、請求項１から８までのいずれか１項記載の核酸分子、ベクターまたはワクチン。
【請求項１０】
前記アデノウイルスベクターの蛋白質産物には、ｇａｇ蛋白質、２Ａペプチド、およびエンベロープ蛋白質（Ｅｎｖ）が含まれ、前記Ｅｎｖ蛋白質が、表面単位（ｇｐ７０）、開裂部位、および膜貫通単位（ｐ１５Ｅ）を含み、前記膜貫通単位（ｐ１５Ｅ）が、融合ペプチド、免疫抑制性ドメイン（ＩＳＤ）、膜貫通アンカー、および細胞質尾部を含み、かつｐ１５Ｅもしくはその免疫原性部分が、アデノウイルスカプシド蛋白質ｐＩＸに連結され、かつ／または前記アデノウイルスベクターによってコードされた前記シグナルペプチドが、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ由来のシグナルペプチド（ＬｕｃＳＰ）と交換され、かつ／または前記アデノウイルスベクターによってコードされた前記膜貫通アンカーおよび前記細胞質尾部が、インフルエンザＡ型ウイルス赤血球凝集素Ｈ３Ｎ２由来の前記膜貫通ドメインおよび細胞質尾部（ＨＡ−ＴＭＣＴ）と交換される、請求項９記載の使用のための、請求項３から８までのいずれか１項記載のベクター、または請求項１から９までのいずれか１項記載のワクチン。
【請求項１１】
前記アデノウイルスベクターを用いて前記患者を初回免疫した少なくとも５日間後に、請求項１から１０までのいずれか１項記載のワクチンで追加免疫するステップを含む、癌の予防および／または治療における使用のための、請求項１から１０までのいずれか１項記載のワクチン。
【請求項１２】
アデノウイルスベクター由来の前記ＶＬＰとは異なる、前記ウイルスによってコードされたＶＬＰが、改変型Ｖａｃｃｉｎａ  Ａｎｋａｒａ（ＭＶＡ）に由来するＶＬＰである、アデノウイルスベクター由来の前記ＶＬＰとは異なる、ウイルスによってコードされたＶＬＰを用いて、前記ワクチンに対する前記患者の曝露の５日間以上後に前記患者を後治療するステップを含む、癌の予防および／または治療における使用のための、請求項１から１１までのいずれか１項記載のワクチン。
【請求項１３】
ＧａｇおよびＥＲＶエンベロープ蛋白質（Ｅｎｖ）を接続する前記未処置のゲノム構造が、機能的リンカーによって置き換えられており、前記リンカーが、好ましくはｐ２Ａである、Ｇａｇ蛋白質および前記Ｅｎｖまたはその免疫原性部分をコードする核酸分子。
【請求項１４】
請求項１３記載の核酸分子によってコードされた、ＶＬＰ。
【請求項１５】
疾患の予防および／または治療における使用のための、請求項１３記載の核酸分子または請求項１４記載のＶＬＰ。
【請求項１６】
前記ＥＲＶが、ＨＥＲＶ−Ｋ，好ましくはＨＥＲＶ−Ｋ  １１３である、請求項１５記載の使用のための、請求項１記載の核酸分子、請求項１４記載のＶＬＰ、または請求項１５記載のＶＬＰ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、疾患の予防および／または治療における使用のためのワクチンに関する。特に、疾患は、内在性レトロウイルスに由来する可能性があり、すなわち、癌などである。本発明のワクチンは特に、真核細胞においてウイルス様粒子を形成することができるウイルスに関する。本発明のある特定の実施形態において、ウイルスによってコードされたウイルス様粒子（ＶＥ−ＶＬＰ）は、内在性レトロウイルスに対する免疫原性応答を発達させるために患者の体内において産生される。
【背景技術】
【０００２】
１００年超も前、癌の発達は、免疫系と密に関係しているという見解がなされ、今日、規則的な基盤を基にして、免疫系が癌を生じるのを防御することは十分に確立されている。その一方で、悪性細胞は、免疫監視を回避し、悪性細胞が致命的な能力を展開するための戦略の元となる。
【０００３】
免疫細胞は、腫瘍細胞を検出および殺滅することができるが、この系は、癌により世界中で年間ほぼ９００万件の死亡から明白なように、必ずしも機能的であるとは限らない。腫瘍細胞に対する特異的免疫応答を誘導するための予防接種アプローチは、癌免疫療法において比較的古いトピックであるが、なおも開発下にあり、まさに近年、関連する結果を得られ始めた。１つの予防接種戦略は、減弱した腫瘍細胞、例えば、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）をしばしば分泌する照射された自家腫瘍または同種腫瘍細胞株を用いた予防接種を包含する。いずれの場合においても、注射された材料は、実際の腫瘍において存在しそうである癌抗原を包含する。他の予防接種戦略には、特異的免疫応答を誘導するペプチドまたは蛋白質の投与が含まれる。これらの抗原は、アジュバントとの組み合わせにおいて直接注射されるか、またはＤＮＡプラスミドもしくはウイルスベクターによってコードされるかのいずれかである。
【０００４】
免疫療法アプローチは常に改善中であるが、広範に作用しかつ非常に効率的なワクチンはまだない。このことに対する詳しい理由とは、すでに説明されている腫瘍細胞による免疫抑制である。
【０００５】
内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）は、遠い祖先におけるレトロウイルスによる古代の感染の証拠である。感染の際、ウイルスＲＮＡをプロウイルスＤＮＡへと逆転写させ、これがホストゲノム内へと組み込まれた。結局はプロウイルスをゲノム株の細胞内へと組み込み、遺伝性となり、内在性レトロウイルスを生じた。何百万年にもわたって、ウイルスＤＮＡを後世に残し、集団に固定された。今日、どのヒトゲノムも、約８％の内在性レトロウイルスＤＮＡからなるが、これらは、前者のレトロウイルスのまさに遺物である。突然変異、欠失および挿入により、レトロウイルス遺伝子のほとんどは不活性となり、ゲノムから完全に失われた。今日、機能的な完全長の内在性レトロウイルスは、ヒトにはもう存在しない。しかしながら、ＥＲＶは、異なる機能的蛋白質を用いて宿主ゲノム内へといくつものコピーを組み込むことをもたらす複製過程を経験した。したがって、いくつかの場合において、相同ＥＲＶの程度はなおもウイルス粒子を産生する能力を有する。ヒトＥＲＶのＫ型（ＨＥＲＶ−Ｋ、ＨＭＬ２）は、ヒトゲノムにおいて最も近年獲得されたＥＲＶのうちの１つであり、このファミリーのメンバーは、ほぼすべてのウイルス蛋白質について完全長のオープンリーディングフレームを残したままであった。
【０００６】
異なる研究は、ＥＲＶ発現と癌の発達および進行との間の関係を強調してきた。ヒト腫瘍におけるＥＲＶの検出は、新たな予防接種戦略の見通しのある抗癌療法における新たな分野を開いた。ヒトＥＲＶ（ＨＥＲＶ）についての顕著な例は、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、リンパ腫、黒色腫、白血病および肉腫と関係しているＫ型ＨＥＲＶ（ＨＥＲＶ−Ｋ）である。さらなる例は、大腸癌において発現するＨＥＲＶ−Ｈ、ならびに精巣癌、卵巣癌、乳癌、リンパ腫および白血病におけるシンシチン１である。
【０００７】
ＥＲＶ蛋白質の発現が発達中の腫瘍の原因であるのかまたは結果であるのかを決定することは必ずしも容易ではない。それにもかかわらず、癌細胞内の条件がＥＲＶの発現を可能にすることは公知である。腫瘍細胞内での低メチル化の一般的な状態は、健常細胞においてＤＮＡメチル化によって通常不活性にされたＥＲＶ遺伝子の活性化を促進する（Ｄｏｗｎｅｙ，Ｒ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  Ｋ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ：Ｉｎｎｏｃｅｎｔ  ｂｙｓｔａｎｄｅｒ  ｏｒ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ  ａｃｃｏｍｐｌｉｃｅ？  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，２０１５．１３７（６）：ｐ．１２４９〜１２５７．およびＧｉｍｅｎｅｚ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｓｔｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ｄｅｄｉｃａｔｅｄ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｓｅｌｆ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ＨＥＲＶ−Ｗ  ｆａｍｉｌｙ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｒｅａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｉｎ  ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｕｐｏｎ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２０１０．３８（７）：ｐ．２２２９〜２２４６。また、外来性因子は、ＥＲＶ発現を促進することができる。ヒトＥＲＶの活性化は例えば、ウイルス感染により観察された。ＨＥＲＶ−Ｗ発現は、インフルエンザおよび単純ヘルペスウイルス感染後に検出された（Ｎｅｌｌａｋｅｒ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  Ｗ  ｆａｍｉｌｙ  ｂｙ  ｖｉｒａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００６．３：ｐ．４４）のに対し、ＨＥＲＶ−Ｋは、エプスタイン・バーウイルス感染後に存在していた（Ｓｕｔｋｏｗｓｋｉ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ  ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  ＨＥＲＶ−Ｋ１８  ｔｈａｔ  ｅｎｃｏｄｅｓ  ａ  ｓｕｐｅｒａｎｔｉｇｅｎ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２００１．１５（４）：ｐ．５７９〜５８９）。ＥＲＶ発現をもたらす機序にもかかわらず、癌細胞は、これらの蛋白質の活性化を、選択的圧力によって維持しており、このことは、腫瘍におけるＥＲＶの有益な効果を示している（Ｌｅｏｎｇ，Ｓ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｙ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，１９８８．４８（１７）：ｐ．４９５４〜４９５８。）
【０００８】
ヒト腫瘍がＥＲＶ蛋白質と関係しているだけでなく、マウス癌細胞もＥＲＶを発現している。このことは、腫瘍進行に及ぼすＥＲＶの効果を試験し、ＥＲＶターゲティング療法アプローチを検査するための完全なモデル生体を提供している。１つのＥＲＶモデルは、黒色腫と関係したレトロウイルス（ＭｅｌＡＲＶ）であり、これは、マウスゲノム中に存在するマウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）のプロウイルスから生じる。ほとんどの近交系マウス系は、１つまたは２つの不活性ＭｕＬＶコピーを含有している（Ｌｉ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｓｉｔｅｓ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｅｌａｎｏｍａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，１９９９．７３（１１）：ｐ．９１７８〜９１８６。）しかしながら、ＡＫＲマウス系は、ゲノム内に３つの挿入を有しており、自然発生リンパ腫の頻繁な発生率を生じる生涯において早期のＭｕＬＶの高い産生を特徴とする。Ｃ５７ＢＬ／６のような他のマウス系は、生涯において後期にのみＭｕＬＶ粒子を自然発生的に産生する。いくつかの他のマウス癌モデルは、ヒトＥＲＶと類似して、ＭｕＬＶ／ＭｅｌＡＲＶを同様に発現する。
【０００９】
ウイルス宿主の免疫系は、感染に対する天然の防御機序であるので、多くのウイルス、特にレトロウイルスは、この監視を逃れるための戦略を発展させてきた。異なるウイルス科中でみることができる１つの機序［Ｄｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開第２０１３／０５００４８号］は、異なるレベルで免疫系の抑制を生じるエンベロープ蛋白質（Ｅｎｖ）における免疫抑制性ドメインの発達である。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＣＤ８  Ｔ細胞または調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞を含む免疫細胞は、ＩＳＤを含有するウイルスによって影響を及ぼされることができる［Ｓｃｈｌｅｃｈｔ−Ｌｏｕｆ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）］。
【００１０】
多くのＥＲＶは、免疫抑制性ドメイン（ＩＳＤ）を有する蛋白質を含有しており、このようなドメインはまた、ＭｅｌＡＲＶ  Ｅｎｖ蛋白質において認めることができる（Ｓｃｈｌｅｃｈｔ−Ｌｏｕｆ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ａｎ  ｉｍｍｕｎｅ  ｅｓｃａｐｅ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｅｎｃｒｙｐｔｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｏｎｃｏｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，２０１０．１０７（８）：ｐ．３７８２〜３７８７、およびＭａｎｇｅｎｅｙ，Ｍ．ａｎｄ  Ｔ．Ｈｅｉｄｍａｎｎ，Ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ａ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｅｓｃａｐｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，１９９８．９５（２５）：ｐ．１４９２０〜１４９２５．）。Ｅｎｖを形質導入した腫瘍細胞は、追加の外来性抗原にもかかわらずより迅速に成長した。この観察は、Ｅｎｖ蛋白質によって仲介される局所的な免疫抑制効果によって説明された。ＩＳＤは、マクロファージ、ＮＫ細胞およびＴ細胞などの阻害によって示されるように、先天免疫系および適応免疫系の両方に影響している（Ｌａｎｇ，Ｍ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｐ１５Ｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｔｕｍｏｕｒ  ｇｒｏｗｔｈ．Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９５．１０２（３）：ｐ．４６８〜４７５）。さらに、調節性Ｔ細胞サブセットに及ぼす効果が示唆されてきており、それが他の免疫細胞を順に抑制する（Ｍａｎｇｅｎｅｙ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００５．６５（７）：ｐ．２５８８〜２５９１）。ＩＳＤによる免疫抑制の詳細な機序は、まだ完全には理解されていないが、効果は、ＩＳＤ内でＣＫＳ−１７ペプチドによって大部分が仲介されるように見える。ＣＫＳ−１７は、大部分がサイトカイン発現を変化させることによって、免疫系に及ぼす多様な効果を有する（Ｈａｒａｇｕｃｈｉ，Ｓ．，Ｒ．Ａ．Ｇｏｏｄ，ａｎｄ  Ｎ．Ｋ．Ｄａｙ−Ｇｏｏｄ，Ａ  ｐｏｔｅｎｔ  ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ：ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ａｎｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ，２００８．４１（１）：ｐ．４６〜５５．）。
【００１１】
ＥＲＶ発現腫瘍細胞を標的とするための第１の治療アプローチのうちの１つは、モノクローナル抗体の投与を含んでいた。したがって、ＨＥＲＶ−Ｋ  Ｅｎｖを標的とする抗体は、乳癌細胞株の腫瘍成長を低減させることができた。Ｗａｎｇ−Ｊｏｈａｎｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．は、抗ＨＥＲＶ−Ｋ  Ｅｎｖモノクローナル抗体の観察された効果が、癌細胞周期の変化およびアポトーシスの上昇によって仲介されることを示した。Ｗａｎｇ−Ｊｏｈａｎｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｗａｎｇ−Ｊｏｈａｎｎｉｎｇ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ−Ｋ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｂｒｅａｓｔ  ｔｕｍｏｒｓ．Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ，２０１２．１０４（３）：ｐ．１８９〜２１０）によって検査されていないこのような抗体の別の考えられ得る効果は、免疫抑制の予防であり得る。ＭｅｌＡＲＶ  Ｅｎｖのように、ＨＥＲＶ−Ｋ  Ｅｎｖ蛋白質は、ＩＳＤを含有し、免疫調節機能を有する（Ｍｏｒｏｚｏｖ，Ｖ．Ａ．，Ｖ．Ｌ．Ｄａｏ  Ｔｈｉ，ａｎｄ  Ｊ．Ｄｅｎｎｅｒ，Ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ−−Ｋ（ＨＥＲＶ−Ｋ）  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２０１３．８（８）：ｐ．ｅ７０３９９）。Ｗａｎｇ−Ｊｏｈａｎｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．によって検査されたアプローチは、免疫不全無胸腺マウスにおける異種移植片腫瘍を含んでいた。したがって、ＨＥＲＶ−Ｋの効果は、ＮＫ細胞などの先天免疫細胞に影響するのみであり得る。
【００１２】
ＥＲＶを標的とすることによって腫瘍を根絶するのを助けることができる適応免疫応答の別の部分は、Ｔ細胞を含む。例えば、ＩＬ−２との組み合わせにおいてＭｕＬＶ  Ｅｎｖエピトープに対する養子免疫細胞移入したＴ細胞は、黒色腫の肺への転移を根絶することができた（Ｙａｎｇ，Ｊ．Ｃ．ａｎｄ  Ｄ．Ｐｅｒｒｙ−Ｌａｌｌｅｙ，Ｔｈｅ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ａｎ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｍｕｒｉｎｅ  ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  ｉｓ  ａ  ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｕｒｉｎｅ  ｔｕｍｏｒｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，２０００．２３（２）：ｐ．１７７〜１８３）。同様の実験は、ＨＥＲＶ−Ｋについてヒト化マウスモデルにおいて実施された。Ｔ細胞を遺伝子修飾して、癌細胞上のＨＥＲＶ−Ｋ  Ｅｎｖを認識するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をＴ細胞表面上に発現させた。細胞毒性ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、腫瘍細胞を溶解することができ、転移および腫瘍の成長を防止した。
【００１３】
抗体またはＴ細胞の直接的注射に加えて、より実用的で、安価で、かつ効率的な戦略とは、予防接種による免疫応答の誘導である。単純なアプローチは、ウイルスによってコードされた抗原を用いた予防接種である。しかしながら、この方法は、ＤＣがまず、単離および培養された後に、規定されたＨＬＡ制限ペプチドでパルス化されマウスまたは患者へと再注射されなければならないので、むしろ厄介である。
【００１４】
より簡潔なワクチン戦略は、組換えアデノウイルスによってコードされているウイルス様粒子（ＶＬＰ）上での免疫系に対する抗原（例えば、ウイルスエンベロープ蛋白質）の提示である（図１）。これらの粒子は、ウイルス核酸を含有しておらず、それゆえ、非感染性である。それにもかかわらず、ＶＬＰは、非常に免疫原性があり、示された蛋白質は、自然な流れで提示される。例えば、ＶＬＰ内に組み込まれたウイルスＥｎｖ蛋白質は、ウイルス様表面上に提示され、これが正確な折りたたみおよび立体配座を促進する。強力な免疫原性の利点に加えて、ＶＬＰを用いた予防接種戦略は、実用的な利点も含む。したがって、ＶＬＰは、たった１つのまたは数個の蛋白質から構築されるので、産生するのが比較的容易であり、産生は、細胞培養物中で実施されることができる。
【００１５】
ウイルスまたはウイルス関連疾患（例えば、ＥＲＶ発現癌）に対して予防接種するために、全Ｅｎｖ蛋白質を免疫系に対して理想的に示して、完全蛋白質標的に対する免疫応答を確保すべきである。しかしながら、Ｅｎｖ蛋白質は、ＩＳＤを含有するので、ワクチン自体は、免疫抑制能を有しており、免疫かアプローチにとって望ましくない。この欠点を回避するために、突然変異をＩＳＤ内へ導入して、免疫抑制を防止するのと同時に、標的蛋白質の天然の立体配座を維持した。
【００１６】
ウイルス蛋白質のＩＳＤにおける不活性化している突然変異を検査した最初のもののうちの１つは、Ｓｃｈｌｅｃｈｔ−Ｌｏｕｆ  ｅｔ  ａｌ．であった［Ｓｃｈｌｅｃｈｔ−Ｌｏｕｆ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）］。免疫抑制性シンシチンと非免疫抑制性シンシチン１との間の比較試験［Ｍａｎｇｅｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）］に基づいて、Ｓｃｈｌｅｃｈｔ−Ｌｏｕｆ  ｅｔ  ａｌ．は、Ｅｎｖ蛋白質の一般的な構造および機能性を切除することなく、ＩＳＤの活性を不能にする突然変異を特定した。この突然変異戦略を他のウイルス起源（例えば、ＨＴＬＶおよびＸＭＲＶ）の蛋白質に適用し、フレンドマウス白血病ウイルス（Ｆ−ＭＬＶ）についてより広範に検査した。この試験は、ＩＳＤによるＮＫ細胞およびＴ細胞の両方の抑制を明らかにしただけでなく、Ｅｎｖ蛋白質において突然変異したＩＳＤを含んでいる生の弱毒化Ｆ−ＭＬＶウイルスが野生型ＩＳＤ配列を有する同じウイルスに対するワクチンとして機能することも示した。防御は、抗体レベルの上昇およびＦ−ＭＬＶエピトープに対するＴ細胞応答によった。彼らの発見は最終的には、ヒト前立腺癌および慢性疲労症候群と関連付けられてきた異種指向性マウス白血病ウイルス関連ウイルス（ＸＭＲＶ）に焦点を当てた特許出願国際公開第２０１１／０９２１９９号において明らかにされた。この故、国際公開第２０１１／０９２１９９号は、具体的にはＸＭＲＶにおけるＩＳＤ突然変異、および予防接種戦略のためのこのようなＩＳＤ突然変異を受けたウイルスの利用に関する。
【００１７】
ＩＳＤ突然変異の別の適用は、特許出願国際公開第２０１４／１９５５１０号において説明された。この場合、ウイルスによる免疫抑制を低下させると同時に、その天然の立体配座をなおも維持するために、ＩＳＤの突然変異がネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）において導入された。国際公開第２０１４／１９５５１０号は、特異的な突然変異が、ＭＢＰに結合した、または植え付けた腫瘍細胞において形質導入されたＦＩＶ  Ｅｎｖ蛋白質に対する抗体応答を、予防接種アプローチにおいて投与するときに上昇させたことを説明している。したがって、国際公開第２０１４／１９５５１０号は、ＦＩＶ  ＥｎｖのＩＳＤにおける突然変異およびＦＩＶまたは他のレンチウイルスによる感染に対する予防接種アプローチにおけるこのような突然変異した蛋白質の使用に関する。
【００１８】
ウイルスＥｎｖ蛋白質におけるより広範な範囲のＩＳＤ突然変異を取り扱う別のアプローチは、特許出願国際公開第２０１３／０５００４８号において説明されている。特に、国際公開第２０１３／０５００４８号は、エンベロープ付きのＲＮＡウイルスにおけるＩＳＤをまず特定した後、これらのドメインを突然変異させて、予防接種中の免疫抑制を低下させることによって抗原を生成することに関する。ＩＳＤ特定戦略は、４つのパラメータに基づいており、該パラメータとは、１）エンベロープ付きのＲＮＡウイルスの融合蛋白質内にペプチドが位置すること、２）ペプチドが膜と相互作用することができること、３）ペプチドの一次構造（配列）における高度の相同性が、ウイルスの目、科、亜科、属、または種内のいずれかに存在すること、４）所与の立体配座における融合蛋白質の表面の位置が、３次元構造または抗体染色によって明らかにされる、免疫抑制性ドメインの特色であること、である。関心対象のウイルスＥｎｖにおける潜在的なＩＳＤの特定の後、免疫抑制機能を確認し、その後、突然変異をＩＳＤ内に導入し、少なくとも２５％の免疫抑制の低減を確認した。全体として、国際公開第２０１３／０５００４８号は、エンベロープ付きのＲＮＡウイルスにおけるＩＳＤの特定、ＩＳＤの突然変異したペプチドの生成、およびワクチンとしての該ペプチドの利用、ならびに抗体の生成を説明している。
【００１９】
アデノウイルスベクター中にコードされかつウイルスカプシドの表面上での同時抗原提示の重要性は、Ｂａｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．［Ｂａｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）］によって示された。Ｂ細胞受容体を交差連結するのを助ける規則正しい構造で抗原を提示する利点は、すでに公知である。しかしながら、ＧａｇならびにＥｎｖサブユニットであるｇｐ７０およびｐ１５Ｅなどの異なるＦ−ＭＬＶ蛋白質をコードすることによって、アデノウイルスカプシド蛋白質ｐＩＸ上にこのような抗原を同時に提示しながら、Ｂａｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．は、コードされかつカプシドに提示された抗原の組み合わせのみが機能的抗体のレベルを上昇させることができることを示した。この観察に起因して、アデノウイルスカプシド上の提示がＢ細胞受容体を架橋するために役立つ一方で、コードされた抗原がＢ細胞の親和性の成熟を促進する必須のＣＤ４＋  Ｔ細胞応答に必要とされるという事実を得た。この予防接種戦略を用いて、Ｂａｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．は、負荷後のＦ−ＭＬＶのウイルス量を低減させることができた。しかしながら、標的抗原に対するＣＤ８＋  Ｔ細胞応答の上昇の兆候は観察することができなかった。
【００２０】
Ｓｈｏｊｉ  ｅｔ  ａｌ．は主として、アデノウイルス系ＨＩＶワクチンの最適化に焦点を当てた。コドン最適化戦略および多様なプロモーターの使用にも関わらず、Ｓｈｏｊｉ  ｅｔ  ａｌ．は、開裂可能なフリン部位（Ｆ２Ａ）を介して連結された、アデノウイルス中のＧａｇおよびＥｎｖ蛋白質を同時にコードした。このことによって、両蛋白質の同時発現が可能となり、したがってＧａｇ系ＶＬＰの原位置での形成が可能となった。Ｓｈｏｊｉ  ｅｔ  ａｌ．の研究において、この設定は、ＶＬＰの原位置での形成を促進しなかった他の提示戦略と比較して最高の免疫応答を示した［Ｓｈｏｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２］。
【００２１】
Ｄｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．２０１１（米国特許出願公開第２０１１／０３０５７４９号明細書）は、ＶＬＰ系レトロウイルスＨＩＶワクチンを製造し、ＩＳＤが突然変異したＨＩＶエンベロープ蛋白質の免疫原性上昇を実証した。ＶＬＰ免疫原を製造し、生体外で精製した。
【００２２】
米国特許出願公開第２０１２／１８９６４７号明細書は、野生型エンベロープ蛋白質の膜貫通サブユニットの免疫抑制性ドメインの突然変異から結果として生じる突然変異したエンベロープ蛋白質に関する。米国特許出願公開第２００９／３２４５５３号明細書は、定方向ターゲティングにおよびウイルス粒子と他の細胞膜との制御された融合に適用可能なキメラポリトロープウイルスエンベロープポリペプチドに関する。
【００２３】
加えて、Ｈｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．［Ｈｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４］による公表は、ＨＥＲＶ−Ｋ１１３のコドン最適化版がＣＭＶプロモーター下で発現したとき、ウイルス集合体の種類および形態が変化したことを説明している。特に、ＶＬＰは、細胞表面で保持されており、Ｅｎｖを欠失していた。
【００２４】
ウイルスＥｎｖ蛋白質においてＩＳＤを突然変異させ、かつアデノウイルスを用いてウイルス抗原をコードしかつ提示する先の戦略にもかかわらず、ＩＳＤの突然変異を採用する過去の予防接種戦略は、ウイルス感染を予防することを専ら目的としていた［Ｓｃｈｌｅｃｈｔ−Ｌｏｕｆ  ｅｔ  ａｌ．２０１０、国際公開第２０１１／０９２１９９号、国際公開第２０１４／１９５５１０号、米国特許出願公開第２０１１／０３０５７４９号、国際公開第２０１４／１９５５１０号］。それゆえ、自己抗原に対する寛容を破壊する必要性がなおもある。その上、ウイルス様粒子の原位置合成の系は、ＨＩＶ  Ｅｎｖおよびマラリア抗原について以前使用されたことがある［Ｌｕｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）、Ｓｏｈｊｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）、Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）、Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ  ＆  Ｈｏｌｓｔ（２０１６）、Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）］が、原位置で合成されたＶＬＰ上での、ＩＳＤが突然変異したＥＲＶ  Ｅｎｖの提示については使用されたことがない。その上、Ｈｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．による知見を考慮して、ＶＬＰ、特にＨＥＲＶ−Ｋ  ＶＬＰの製造を可能にする効率的な系についての必要性もある。
【００２５】
本発明は、内在性レトロウイルスによって生じる疾患の予防および／または治療に有効なワクチンを製造することを目的とする。本発明のワクチンは、ＣＤ４  Ｔ細胞またはＣＤ８  Ｔ細胞によって始まる応答経路の両方のうちのいずれかに由来する改善された免疫応答を示す。
発明の概要
本発明は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）をコードすることができるアデノウイルスベクターを含む、疾患の予防および／または治療における使用のためのワクチンに関するものであり、該ＶＬＰは、不活性型免疫抑制性ドメイン（ＩＳＤ）を提示する。
【００２６】
ＨＩＶ、バキュロウイルス、レンチウイルスおよびアデノウイルスを含む、ＶＬＰを製造するためのいくつかのウイルスベクターは、ワクチンの開発において使用される。本発明者らは、不活性型ＩＳＤを有するＥＲＶをコードするアデノウイルスベクターが、驚くべきことに、例えば、不活性型ＩＳＤと組み合わされたときのＨＩＶベクターよりも良好に挙動することを示す。したがって、本発明は、腫瘍における免疫抑制の促進を結果として生じる予期せぬ高い免疫応答を用意する。
【００２７】
アデノウイルスベクターのうちのいかなるものも、本発明において満足に挙動することが期待されるが、それは目下、アデノウイルスベクターが哺乳動物アデノウイルス型、ヒトアデノウイルス型、チンパンジーアデノウイルス型、またはゴリラアデノウイルス型に由来するときに最良の結果が取得されることになるという選択肢である。ヒトアデノウイルスベクターは、少なくとも５２の異なる血清型、例えば、１、２、５、１９、２８、３５、および４０型で存在する。ヒトアデノウイルスが選択されるとき、ヒトアデノウイルスベクターは、Ｄ群ベクター、ヒトアデノウイルス血清型Ａｄ５、ヒトアデノウイルス血清型Ａｄ１９ａ、ヒトアデノウイルス血清型Ａｄ２６、またはチンパンジーアデノウイルス血清型に由来する。本発明者らは、良好な前臨床免疫化結果により、本発明のワクチンベクターのための出発点としてアデノウイルス５型（Ａｄ５）を使用した。Ａｄ５が標的蛋白質に対する十分な強力な免疫応答を誘導する理由は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）内への効率的な輸送によるだけでなく、先天免疫を刺激するベクター自体のアジュバント特性にもよる。加えて、ＩＦＮ、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５およびＴＮＦ−αのような免疫刺激性サイトカインの転写および放出が誘導される。これらのサイトカインは、免疫系において重要な役割を有しており、適応免疫応答の細胞のための活性化因子として機能する。Ａｄ５の詳しい利点は、導入遺伝子発現を防止するであろうことから、ベクターに対する免疫応答が強過ぎないことである。Ａｄ５は、適応免疫応答をなおも活性化させながら、導入遺伝子発現を可能にするレベルにまで先天免疫を平衡状態にする。組換えアデノウイルス血清型２８および組換えアデノウイルス血清型３５が感染し、組換えアデノウイルス血清型５と比較してより効率的にヒトおよびマウスの両方の樹状細胞の試験管内成熟化および活性化をもたらすことを示した、Ｍａｔｔｈｅｗ  Ｊ．Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１２；１８８：６１０９〜６１１８）による公表に関して、Ａｄ５は本明細書で報告される実験における所望の応答を示すことは予期されていなかった。加えて、組換えアデノウイルス血清型２８および組換えアデノウイルス血清型３５が、ｒＡｄ５および偽感染対照と比較して、単球などの抗原提示細胞のアポトーシスを上昇させることは、Ｍａｔｔｈｅｗ  Ｊ．Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ（Ｖａｃｃｉｎｅ  ３２（２０１４）７１７〜７２４）による別の論文において示されている。
【００２８】
免疫抑制性ドメイン（ＩＳＤ）は、自然感染と同様の、ＥＲＶ活性化によって誘導される腫瘍促進炎症性環境を同時に保有しながら、腫瘍に対して抗腫瘍免疫応答を平衡状態にする機序とみることができる。ＩＳＤは、マクロファージ、ＮＫ細胞およびＴ細胞などを阻害することにより、先天および適応免疫系の両方に影響を及ぼしている。しかしながら、ＩＳＤによる免疫抑制の詳細な機序は、今なお完全には理解されていない。本発明によって実証されるように、ＩＳＤの不活性化は、この応答をかなり上昇させる。
【００２９】
ＩＳＤセグメントは、１つ以上のアミノ酸の突然変異または欠失によって不活性化されていてもよい。不活性化が突然変異によって実施される場合、アミノ酸のうちの１つ以上は他の１９の天然アミノ酸のうちから通常選択される異なるアミノ酸と交換される。欠失の場合、ＩＳＤ領域におけるアミノ酸のうちのいずれか１つ以上は欠失していてもよい。当業者は、どのアミノ酸を交換して、場合により初回試行の査定を経て、満足のいく免疫応答に至らせるかについての適切な知識および経験を有することになる。
【００３０】
本発明のある特定の実施形態において、ＩＳＤは、アミノ酸のうちの少なくとも１つを欠失させたまたは異なるアミノ酸と交換した、ペプチド配列ＬＡＮＱＩＮＤＬＲＱＴＶＩＷ（配列番号１）、ＬＡＳＱＩＮＤＬＲＱＴＶＩＷ（配列番号２）、ＬＱＮＲＲＧＬＤＬＬＴＡＥＫＧＧＬ（配列番号３）、ＬＱＮＲＲＡＬＤＬＬＴＡＥＲＧＧＴ（配列番号４）、ＬＱＮＲＲＧＬＤＭＬＴＡＡＱＧＧＩ（配列番号５）、またはＹＱＮＲＬＡＬＤＹＬＬＡＡＥＧＧＶ（配列番号６）を有する。元のものとは異なるアミノ酸が天然アミノ酸から選択されることが好ましい。本出願の例において使用されるＡｄ５においてコードされたＥＲＶのＩＳＤセグメントは、次のアミノ酸配列、すなわちＬＱＮＲＲＧＬＤＬＬＦＬＫＥＧＧＬ（配列番号７）を有する。ＩＳＤは、アミノ酸配列において１つ以上の突然変異を実施することによって不活性化されることができる。単一のアミノ酸を交換することは現に適切であり、すなわち、本発明において好ましく使用されるＩＳＤは、次の配列、すなわちＬＱＮＲＲＧＬＤＬＬＦＬＫＲＧＧＬ（配列番号８）を有する。
【００３１】
ＩＳＤセグメントの上流または下流の領域における１つ以上のアミノ酸を交換することは好ましいかもしれない。この突然変異は、感染するウイルスがなおも機能することができるように、ドメインの構造を保存するよう企図された代償性突然変異である。図３に示す具体的な実施形態において、ＩＳＤ領域に隣接する第３のアミノ酸は、Ａ→Ｆ突然変異で交換される。
【００３２】
本発明により不活性化されることになるＩＳＤについて、免疫抑制能は、元のＩＳＤによって実施される免疫抑制と比較して７０％以上低減することを必要とする。本発明の好ましい実施形態において、ＩＳＤは、元のＩＳＤによって実施される免疫抑制と比較して９０％以上など、９５％以上など、９９％以上など、８０％以上不活性化される。
【００３３】
本発明は、身体の免疫系に対して抗原を提示するための一般的なプラットフォームを提供する。したがって、原則として、免疫応答を上げることが望ましいいかなる種類の蛋白質についてのコード化も、アデノウイルスベクター内に組み込むことができる。本発明の好ましい態様において、抗原は、内在性レトロウイルスエンベロープ蛋白質（ＥＲＶ  Ｅｎｖ）またはこのような蛋白質に由来する免疫原性蛋白質である。ウイルスによってコードされたウイルス様粒子のワクチンは、ＥＲＶ  Ｅｎｖを、適応免疫系の細胞に抗原を提示する樹状細胞（ＤＣ）へと指向することが概して考えられている。ＭＨＣクラスＩ上での提示は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の活性化および増殖を誘導する。ＥＲＶ  Ｅｎｖの抗原に特異的なこれらの細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、腫瘍に浸潤して、個々の抗原を提示する細胞を殺滅させる。専門的な抗原提示細胞（ＡＰＣ）によるＭＨＣクラスＩＩ上での抗原の提示は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞を活性化し、該ＣＤ４＋  Ｔ細胞がその後、Ｂ細胞を共活性化する。循環中のＥＲＶ  Ｅｎｖ標的蛋白質またはＶＬＰ上に提示された抗原に遭遇する活性化型Ｂ細胞は、ＥＲＶ  Ｅｎｖに特異的な抗体を放出する。これらの抗体は、癌細胞上の該抗体の標的を結合して、悪性細胞の破壊および食作用を誘導することができる。このように、ＥＲＶ特異的抗体は、腫瘍の成長および転移を防止するためのベールである。腫瘍細胞の再獲得した免疫原性は、異なる腫瘍結合抗原および腫瘍特異的抗原を認識する１セットの多様な腫瘍特異的Ｔ細胞のプライミングが可能である。この新たにプライミングされかつ増量したＣＴＬは、腫瘍に浸潤して、悪性細胞を殺滅させる。
【００３４】
本発明のワクチンは原則として、いくつかの哺乳動物種を免疫化するために使用することができるが、実際、マウスモデルにおいて開発されてきており、本発明の好ましい態様におけるＥＲＶ蛋白質は、ヒト内在性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）蛋白質またはその免疫原性部分である。どのヒトゲノムも、約８％の内在性レトロウイルスＤＮＡからなると概算されてきた。しかしながら、内在性レトロウイルスＤＮＡのほとんどは、先のレトロウイルスの残存物に過ぎない。ＥＲＶは、遠い祖先において古代にレトロウイルスに感染したという証拠である。感染の際、ウイルスＲＮＡは、プロウイルスＤＮＡへと逆転写され、これが宿主ゲノム内へと組み込まれた。結局、プロウイルスは、生殖細胞系の細胞内へと組み込まれ、遺伝性となり、内在性レトロウイルスを生じるもととなった。何百万年にもわたって、ウイルスＤＮＡは後世へと伝わり、集団内に固定された。そのことは、ヒトゲノムの大部分がアデノウイルスベクターの抗原コード部分として使用されることができることに従っている。現に、ＨＥＲＶは好ましくは、ＨＥＲＶ−Ｋ、ＨＥＲＶ−Ｈ、ＨＥＲＶ−Ｗ、ＨＥＲＶ−ＦＲＤ、およびＨＥＲＶ−Ｅからなる群のうちで選択される。より具体的には、ＨＥＲＶ−Ｋは、ＨＥＲＶ−Ｋ１０８（＝ＥＲＶＫ−６）、ＥＲＶＫ−１９、ＨＥＲＶ−Ｋ１１５（＝ＥＲＶＫ−８）、ＥＲＶＫ−９、ＨＥＲＶ−Ｋ１１３、ＥＲＶＫ−２１、ＥＲＶＫ−２５、ＨＥＲＶ−Ｋ１０２（＝ＥＲＶＫ−７）、ＨＥＲＶ−Ｋ１０１（＝ＥＲＶＫ−２４）、ＨＥＲＶ−Ｋ１１０（＝ＥＲＶＫ−１８）からなる群のうちで選択されることができ、ＨＥＲＶ−Ｈは、ＨＥＲＶ−Ｈ１９（＝ＨＥＲＶ−Ｈ＿２ｑ２４．３）、ＨＥＲＶ−Ｈ＿２ｑ２４．１からなる群のうちで選択されることができ、ＨＥＲＶ−Ｗは、ＥＲＶＷ−１（＝シンシチン１）として選択されることができ、かつＨＥＲＶ−ＦＲＤは、ＥＲＶＦＲＤ−１（＝シンシチン２）として選択されることができる。
【００３５】
アデノウイルスベクターは、コードされたＥＲＶ蛋白質を免疫系に提示して、適切な免疫学的応答を立てることができるように構築される。本発明の適切な態様において、ＥＲＶ蛋白質エピトープまたはその免疫原性部分は、膜貫通ドメインとＩＳＤとの間に位置づけられる。
【００３６】
本明細書で報告する実験は、Ａｄ５だけでなく別のアデノウイルス血清型、すなわちＡｄ１９においても、アデノウイルスによってコードされたＩＳＤ突然変異型ＨＥＲＶ−Ｋ  ＶＬＰの適用を示す（実施例１５〜実施例１７を参照されたい）。すでに、ＨＥＲＶ−Ｋは、癌の発現と関係づけられており、ＨＩＶと類似の試験管内活性を有する機能的エンベロープＩＳＤドメインを含有することが示されている（Ｍｏｒｏｚｏｖ  ｅｔ  ａｌ．２０１３）。マウスでは、ＨＥＲＶ−Ｋは外来抗原であり、同様のＩＳＤドメイン活性を用いて、ＩＳＤ突然変異は演繹的には、免疫応答を亢進するはずである可能性はなかった。しかしながら、驚くべきことに、ＩＳＤ突然変異には、ＨＥＲＶ−Ｋ  Ｅｎｖ  ｐ１５ＥおよびＳＵドメイン蛋白質に向けての抗体応答、Ｔ細胞応答および抗癌防御を高めることが発見された。ＨＥＲＶ−Ｋにおける突然変異は、ウイルス科がＩＳＤ配列において異なるので、ＭｅｌＡＲＶについて本明細書に開示するものとは異なっている。しかしながら、本明細書に提供する情報および普遍的な一般的な知識に基づいて、当業者は、他のウイルス科においてもＩＳＤを不活性化する適切な突然変異を特定することができる。本明細書で使用するＨＥＲＶ−Ｋ突然変異は、ウイルスの感染力およびＨＥＲＶ−ＫとＨＩＶ−１との間の部位特異的保存を保存するよう示されたＨＩＶにおけるＩＳＤ突然変異によってもたらされた（Ｍｏｒｏｚｏｖ  ｅｔ  ａｌ  ２０１２）。ベクターをトランスフェクトした細胞の分析の際、ＨＥＲＶ−Ｋ突然変異の細胞内発現および細胞表面発現の上昇が認められ（実施例１５および図２４を参照されたい）、このことは、免疫原性の上昇を説明するために、かつＶＬＰを形成することができてもできなくてもよい何らかの遺伝子発現プラットフォームおよびコンストラクトを用いて、ＨＥＲＶ−ＫファミリーＥｎｖ蛋白質においてＩＳＤ突然変異をなすための追加の機構上の理論的根拠を提供するために寄与することができる。
【００３７】
したがって、本発明は、ＥＲＶエンベロープ蛋白質またはその免疫原性部分をコードする核酸分子にも関し、この中で、該蛋白質のＩＳＤは、ＩＳＤを不活性にする突然変異を含有する。好ましくは、ＥＲＶは、ヒト内在性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）であり、より好ましくはＨＥＲＶは、ＨＥＲＶ−Ｋである。ＩＳＤにおける突然変異がＱ５２５をアラニンと置き換え、それにより突然変異を受けたＩＳＤの配列がＮＳＱＳＳＩＤＱＫＬＡＮＡＩＮＤＬＲＱＴ（配列番号５０）（ＮＳＱＳＳＩＤＱＫＬＡＮＱＩＮＤＬＲＱＴ（配列番号４９）の代わり）となることがさらに好ましい。異なる配列を用いたＩＳＤにおける対応する突然変異も想定されることは理解される。さらなる好ましい実施形態において、核酸分子はアデノウイルスベクター内に含まれる。より好ましくは、アデノウイルスベクターは、アデノウイルスベクター１９型（Ａｄ１９）である。この核酸を含んでいるアデノウイルスベクターがＶＬＰをコードすることはさらに好ましい。本発明はさらに、該核酸分子または該ベクターによってコードされた蛋白質に関する。この核酸分子、ベクターまたはコードされた蛋白質は、疾患の治療または予防において使用されることになっており、疾患は好ましくは癌である。治療されることになっている癌は、対応するＥＲＶを発現する癌である。好ましくは、治療は、「初回免疫−追加免疫−投与計画」を含み、このなかで、まず、アデノウイルスまたは核酸分子を用いた初回免疫が投与された後、より後期のＭＶＡウイルス、アデノウイルスまたはＤＮＡ追加免疫の投与が行われる。好ましくは、追加免疫は、ＭＶＡ追加免疫である。初回免疫および追加免疫についての異なるタイミングが想定される。特に、最少残存病変に罹患している癌患者では、初回免疫と追加免疫との間の長い間隔が可能である。好ましい投与計画では、追加免疫は、初回免疫の４〜８週間後に投与される。
【００３８】
本発明によるワクチンの好ましい態様において、アデノウイルスベクターの蛋白質産物には、ｇａｇ蛋白質、２Ａペプチド、およびエンベロープ蛋白質（Ｅｎｖ）が含まれる。さらに、Ｅｎｖ蛋白質は、表面単位（ｇｐ７０）、開裂部位、および膜貫通単位（ｐ１５Ｅ）を含むことができる。加えて、膜貫通単位（ｐ１５Ｅ）は、融合ペプチド、免疫抑制性ドメイン（ＩＳＤ）、膜貫通アンカー、および細胞質尾部を含むことができる。
【００３９】
ワクチンの免疫抑制を改善するために、ｐ１５Ｅまたはその免疫原性部分がアデノウイルスカプシド蛋白質ｐＩＸに連結されることは適切であるかもしれない。このことを達成するために、ｐ１５ＥをｐＩＸのＣ末端へＮ末端で融合させた。ｐＩＸの非常に規則正しい構造およびアデノウイルス表面上のその結合抗原は、Ｂ細胞受容体を架橋するのを助ける。別の利点として、ｐＩＸは通常、三量体として提示され、天然の三量体形態において結合型ｐ１５Ｅ抗原を提示するのを同様に助け得る。この修飾は、ＣＤ１マウスにおける特異的抗体の誘導を上昇させることが示された。
【００４０】
本発明のある特定の態様において、アデノウイルスベクターによってコードされたシグナルペプチドは、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ由来のシグナルペプチド（ＬｕｃＳＰ）と交換される。このシグナルペプチドは、グルコシル化状態を変化させずに蛋白質の細胞外膜への輸送を上昇させる。したがって、このシグナルペプチドを天然の配列の代わりに含むことは、直接向かうものにより合成された蛋白質の膜への移動を有し、該蛋白質は該膜においてＶＬＰ内へと組み込まれる。
【００４１】
本発明の別の態様において、膜貫通アンカーおよびアデノウイルスベクターによってコードされた細胞質尾部は、インフルエンザＡ型ウイルス赤血球凝集素由来の膜貫通ドメインおよび細胞質尾部と交換される。挿入は、細胞表面上およびＶＬＰ上での組換え蛋白質の発現を上昇させ、このことは、強くかつ幅広い抗体応答を結果として生じる。好ましい実施形態において、膜貫通ドメインおよびアデノウイルスベクターによってコードされた細胞質尾部は、インフルエンザＡ型ウイルス赤血球凝集素Ｈ３Ｎ２由来の膜貫通ドメインおよび細胞質尾部（ＨＡ−ＴＭＣＴ）と交換される。
【００４２】
本発明の別の態様において、三量体化配列は、シグナルペプチドに隣接して提供される。三量体化配列は、蛋白質に付加されて、自然な提示を容易にすることができる。好ましい態様において、三量体化配列はＧＣＮ４である。
【００４３】
アデノウイルスベクターの蛋白質産物は通常、ｇａｇ蛋白質を含み、ｇａｇ蛋白質は、外来性レトロウイルスｇａｇ蛋白質または内在性レトロウイルスｇａｇ蛋白質である。
【００４４】
アデノウイルスベクターは通常、ウイルス様粒子の産生のために細胞を必要とする。したがって、アデノウイルスベクターは細胞を感染させ、ＶＬＰのための構成要素を産生する。本発明のある特定の態様において、ＶＬＰは、単離された細胞株内で産生される。適切な例としては、Ｓｆ９細胞、ベロ細胞、ＨｅＬａ細胞などが挙げられる。しかしながら、ＶＬＰが、アデノウイルスベクターによって感染した患者の身体の細胞内で産生されることは現に所望される。この産生はまた、ウイルスによってコードされたウイルス様粒子（ＶＥ−ＶＬＰ）と称され、ＶＬＰの産生のための中間的な宿主が回避されるという利点を有する。
【００４５】
本発明はまた、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の形成が可能である標的蛋白質をコードする核酸コンストラクトに関し、標的蛋白質は、免疫抑制性ドメイン（ＩＳＤ）を含み、該ＩＳＤは不活性である。
【００４６】
本発明は、癌の予防および／または治療に特に適している。本発明によって治療される癌の種類は、特に制限されておらず、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、リンパ腫、黒色腫、白血病、肉腫、大腸癌、精巣癌、卵巣癌、乳癌、リンパ腫、肺癌、および肝癌を含む。
【００４７】
ある特定の条件下で、初回免疫−追加免疫投与計画を用いて患者を治療することは有利であり得る。したがって、本発明の実施形態のうちの１つにおいて、癌の予防および／治療におけるワクチンの使用は、先に開示したワクチンを用いた追加免疫の少なくとも５日前に先の核酸コンストラクトを用いて患者を初回免疫するステップを含む。
【００４８】
本発明はまた、アデノウイルスベクターに由来するＶＬＰとは異なるウイルスによってコードされたＶＬＰを用いて、先に開示したワクチンについて患者の曝露の５日以上後に患者を後治療するステップを含む、先に開示したワクチンに対する癌の予防および／または治療における使用のためのワクチンに関する。ある特定の実施形態において、アデノウイルスベクターに由来するＶＬＰとは異なるウイルスをコードしたＶＬＰは、改変型Ｖａｃｃｉｎａ  Ａｎｋａｒａ（ＭＶＡ）に由来するＶＬＰである。
【００４９】
さらに、ＣＭＶプロモーターの下でコドンを最適化したＨＥＲＶ−Ｋ１１３に関して、Ｈｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１４によって報告されたものとは対照的に、使用される発現カセット、すなわち、強力なプロモーターの下で再度Ｇａｇを用いた１：１の比において発現したＥｎｖを用いたＧａｇ−ｐ２Ａ−Ｅｎｖは、細胞膜での保持を結果として生じなかった。代わりに、（Ｈｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．によって報告された結果とはこれもまた対照的に、Ｅｎｖも含有したＶＬＰが発現した。このことは、Ｇａｇ−ｐ２Ａ−Ｅｎｖを用いた遺伝子プラットフォームが、ｐ２ａ（または対応する機能的リンカー）を有さないコンストラクトと比較してより良好に実施することを示している。
【００５０】
したがって、本発明はさらに、Ｇａｇ蛋白質とＥＲＶエンベロープ蛋白質（Ｅｎｖ）またはその免疫原性部分とをコードする核酸分子に関し、ＧａｇおよびＥｎｖを接続する未処置のゲノム構造は、機能的リンカーによって置き換えられている。好ましくは、該機能的リンカーはｐ２Ａである。言い換えれば、本発明はまた、Ｇａｇ機能的リンカー−Ｅｎｖ発現カセット、好ましくはＧａｇ−ｐ２Ａ−Ｅｎｖカセットを含む核酸分子に関する。好ましくは、ＥＲＶは、ＨＥＲＶ−Ｋである。より好ましくは、ＥＲＶは、ＨＥＲＶ−Ｋ１１３である。ＨＥＲＶ−Ｋ配列は、ＨＥＲＶ−Ｋコンセンサス塩基配列、より好ましくは、コドンを最適化したコンセンサス塩基配列である。さらにより好ましくは、ＨＥＲＶ−Ｋのコドンを最適化したコンセンサス塩基配列は、次のアミノ酸配列（配列番号５５）である。
【００５１】
【化１−１】
2020531053.tif 000003
【００５２】
【化１−２】
2020531053.tif 000004
【００５３】
ＨＥＲＶ−ＫがそのＩＳＤ（先の配列において下線を付しかつ太字で印刷されている）において突然変異を含有することはさらに好ましい。このような突然変異を含有する特に好ましい配列を配列番号４８に示す。
【００５４】
核酸分子がアデノウイルスベクターであることはさらに好ましい。核酸が遺伝子ワクチンとして、特に疾患、好ましくは癌の予防および／または治療において使用されることができることが想定される。あるいは核酸分子はまた、ＶＬＰ、特にＨＥＲＶ−Ｋ  ＶＬＰを試験管内で製造するために使用されることができる。結果として生じたＶＬＰを次に、免疫療法において、特に疾患、好ましくは癌の予防および／または治療において使用されることができる。この脈絡においても、処置されるべき癌がＥＲＶを発現する癌であることは理解される。
【００５５】
加えて、本発明はまた、Ｇａｇ蛋白質とＥＲＶエンベロープ蛋白質（Ｅｎｖ）またはその免疫原性部分とをコードする核酸分子によってコードされたＶＬＰに関し、ＧａｇおよびＥｎｖを接続する未処置のゲノム構造は、機能的リンカーによって置き換えられている。好ましくは、該機能的リンカーはｐ２Ａである。ＥＲＶがＨＥＲＶ−Ｋであることはさらに好ましい。より好ましくは、ＥＲＶはＨＥＲＶ−Ｋ１１３である。好ましくは、該ＶＬＰは、Ｈｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．によって説明される方法により製造されるＨＥＲＶ−Ｋ１１３  ＶＬＰと比較して多量のＥｎｖを含有する。先に記載したとおり、免疫療法におけるこのようなＶＬＰの使用が想定される。その上、本発明は、疾患の予防および／または治療における使用のための核酸分子またはＶＬＰに関する。疾患は癌であることが好ましい。癌が、対応するＥＲＶを発現する癌であることは理解される。
【００５６】
本開示の次の詳細な部分において、態様、実施形態および実施は、図面において示される例となる実施形態に関してより詳細に説明されることとなる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１は、ウイルスベクターによってコードされたウイルス様粒子の機序を開示する。ウイルスＧａｇおよびＥｎｖ蛋白質についてコードする組換えアデノウイルス（Ａｄ５）を含むワクチン。注射の際、Ａｄ５は、細胞を感染させ、コードされた蛋白質の発現を誘導する。ＧａｇおよびＥｎｖは、両蛋白質の等モル濃度の発現だけでなく、翻訳の際の分離も確保する、自己開裂可能なペプチド（ｐ２Ａ）を介して結合する。構造蛋白質Ｇａｇは単独で、細胞膜の出芽およびウイルス様粒子（ＶＬＰ）の形成を誘導するのに十分である。ＶＬＰ形成の間、Ｅｎｖは、Ｇａｇと会合して、放出されたＶＬＰ内へと組み込まれる。したがって、Ａｄ５ベクターを用いた予防接種は、ＶＬＰの表面上の標的蛋白質Ｅｎｖを免疫系に提示するＶＬＰの産生を誘導する。
【図２】図２は、ＭｕＬＶ／ＭｅｌＡＲＶエンベロープ蛋白質の模式的構造を示す。エンベロープ蛋白質（Ｅｎｖ）は、２つのサブユニットからなる。（左）膜貫通サブユニットｐ１５Ｅ（ＴＭ）は、細胞膜内に固定されており、免疫抑制性ドメイン（ＩＳＤ）および融合ペプチドを含有している。ｐ１５Ｅは、ジスルフィド架橋を介して表面サブユニットｇｐ７０（ＳＵ）へ共有結合している。ｐ１５Ｅおよび特にＩＳＤは、ｇｐ７０によって遮蔽されている。（右）蛋白質サブユニットは、プロセシング中に開裂し、膜へ輸送される前駆体蛋白質として発現している。図面は、Ｍａｎｇｅｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ  ２００７から改良されている。
【図３】図３は、ワクチンによってコードされたＭｅｌＡＲＶ  Ｅｎｖ（ｐ１５Ｅ）のＩＳＤにおける突然変異を示す。ｐ１５ＥのＩＳＤにおける２つのアミノ酸を突然変異させて、免疫抑制機序を不活性化させた。したがって、次のアミノ酸変化、すなわちＥ１４→Ｒ１４およびＡ２０→Ｆ２０を行った。
【図４】図４は、７６８ｔｅｔおよび捕獲ｐＢＧＨのベクターマップを示す。関連する遺伝子を有するＤＮＡベクターである７６８ｔｅｔ（Ａ）および捕獲ｐＢＧＨ（Ｂ）である。プラスミド内に存在する追加の遺伝子は、ベクターマップには示されていない。標的蛋白質をまず発現ベクター７６８ｔｅｔ（Ａ）内へとクローン化する。標的蛋白質を含む発現カセットをその後、ヒトＡｄ５（ｈＡｄ５）ゲノムベクターである捕獲ｐＢＧＨ（Ｂ）内へと、相同組換えによってクローン化して、産生細胞株内で組換えウイルスを産生させた。
【図５】図５は、組換えＡｄ５産生のためのステップを開示する。スキームは、標的蛋白質の捕獲ｐＢＧＨ内へのクローン化後のウイルス産生の過程を示す。組換えＡｄ５の産生には、組換えウイルスを含有する「ウイルス溶解物」、「３日間溶解物」および「大規模溶解物」を生じる連続したステップが含まれる。
【図６】図６：ｐ１５Ｅ特異的抗体応答のＥＬＩＳＡ分析に使用したペプチド。矢印によって「ＴＭ（ｐ１５Ｅ）」とされたＭｅｌＡＲＶ  Ｅｎｖの領域をペプチドとして合成し、予防接種したマウス由来の血清試料のＥＬＩＳＡ分析に使用した。
【図７Ａ】図７：ＣＤ１マウスにおけるＡｄ５−ＭｅｌＡＲＶ−ＩＳＤによって誘導された抗体応答。（Ａ）予防接種したＣＤ１マウスの血清中のｐ１５Ｅ特異的抗体（予防接種タイムラインＩＶ）。マウスにまず、ＭｅｌＡＲＶ、ＭｅｌＡＲＶ−ＩＳＤまたはＧＦＰについてコードするＤＮＡを予防接種した（グラフの下に記載）後、異なるＡｄ５追加免疫を行った（凡例）。追加免疫に使用したワクチンは、Ａｄ５−ＭｅｌＡＲＶ（暗灰色）、Ａｄ５−ＭｅｌＡＲＶ−ＩＳＤ（明灰色）またはＡｄ５−ＧＦＰ（白色）であった。ｐ１５Ｅに結合している抗体をＥＬＩＳＡによって分析した。棒は、ＳＥを用いたＬＥＶ７６対照血清に対する平均吸光度を示す。試料サイズは、各群ｎ＝５とした。
【図７Ｂ】（Ｂ）Ｂ１６Ｆ１０−ＧＰ特異的抗体。Ｂ１６Ｆ１０−ＧＰ細胞を（Ａ）についてのものと同じマウスの血清とともにインキュベートした。フローサイトメトリーを用いて、マウスＩｇＧに対するＡＰＣ結合二次抗体で結合抗体を検出した。各ワクチン群の平均蛍光強度を平均としてＳＥＭと共に提示している。星印は、群間の有意差を示しており、＊（Ｐ≦０．０５）、＊＊（Ｐ≦０．０１）、＊＊＊（Ｐ≦０．００１）とした。
【図８Ａ】図８：Ａｄ−ＭｅｌＡＲＶ−ＩＳＤを予防接種したＣ５７ＢＬ／６マウスにおける抗体応答および転移計数。予防接種タイムラインＩＩＩによる初回免疫−追加免疫投与計画において、マウスにＤＮＡ−ＭｅｌＡＲＶおよびＡｄ５−ＭｅｌＡＲＶ（ＤＮＡ＋Ａｄ５−ＭｅｌＡＲＶ）またはＤＮＡ−ＭｅｌＡＲＶ−ＩＳＤおよびＡｄ５−ＭｅｌＡＲＶ−ＩＳＤ（ＤＮＡ＋Ａｄ５−ＭｅｌＡＲＶ−ＩＳＤ）を予防接種した。（Ａ）Ｂ１６Ｆ１０−ＧＰ細胞に対する癌特異的抗体の結合。腫瘍細胞に特異的な予防接種したマウスの血清中の抗体を、マウスＩｇＧに対するＡＰＣ結合二次抗体を用いたフローサイトメトリーによって分析した。棒は、各群における結合抗体の平均蛍光強度を示す。
【図８Ｂ】（Ｂ）ｐ１５Ｅに結合している抗体をＥＬＩＳＡによって分析した。値は、各群の平均をＳＥＭとともに示す。
【図８Ｃ】（Ｃ）予防接種したマウスにＢ１６Ｆ１０−ＧＰを静脈内負荷し、肺転移を１４日後に分析した。横線は、各群における転移の平均数を示す。群は、ｎ＝７（ＤＮＡ＋Ａｄ５−ＭｅｌＡＲＶ）またはｎ＝８（ＤＮＡ＋Ａｄ５−ＭｅｌＡＲＶ−ＩＳＤ）のマウスを含む。
【図９】図９：Ｂａｌｂ／ＣマウスにおけるＡｄ５−ＭｅｌＡＲＶ−ＩＳＤによって誘導されたＴ細胞応答のＥＬＩＳＰＯＴ解析。Ａｄ５（Ａｄ５−ＭｅｌＡＲＶまたはＡｄ５−ＭｅｌＡＲＶ−ＩＳＤ）による単回の予防接種の２１日後に、Ｂａｌｂ／Ｃマウスの脾臓を分離した。脾細胞をＡＨ１で刺激し、活性型免疫細胞をＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおけるＩＦＮγ産生によって検出した。結果を１０６個の脾細胞あたりのスポット（ＩＦＮγ産生細胞）数として計算した。棒は、各群におけるスポットの平均数（ｎ＝５９）をＳＥＭとともに示す。星印は、ＰＢＳ対照に対する有意差を示し、＊（Ｐ≦０．０５）、＊＊（Ｐ≦０．０１）、＊＊＊（Ｐ≦０．００１）である。
【図１０Ａ】Ｂａｌｂ／ＣマウスにおけるＡｄ５−ＭｅｌＡＲＶ−ＩＳＤによって誘導されたＴ細胞応答のＩＣＳ解析。図９におけるのと同じ脾細胞を、ＡＨ１による刺激の際の細胞内染色（ＩＣＳ）によるＴ細胞内でのサイトカインＩＦＮγおよびＴＮＦαの産生について解析した。図面は、脾臓全体における活性化型（ＣＤ４４＋）、ＩＦＮγまたはＴＮＦα産生ＣＤ８＋  Ｔ細胞の総数を示す。（Ａ）ＩＦＮγ陽性ＣＤ８＋  Ｔ細胞。
【図１０Ｂ】（Ｂ）ＴＮＦα陽性ＣＤ８＋  Ｔ細胞。
【図１０Ｃ】（Ｃ）各マウスにおけるＩＦＮγ産生ＣＤ８＋  Ｔ細胞の積分幾何平均を、ＩＦＮγ＋細胞の平均蛍光強度を乗じたＩＦＮγ＋  ＣＤ８＋  Ｔ細胞数から計算した。
【図１０Ｄ】（Ｄ）二重陽性ＣＤ８＋  Ｔ細胞。横線は各群の平均を示す。星印は、群間の有意差を示し、＊（Ｐ≦０．０５）、＊＊（Ｐ≦０．０１）、＊＊＊（Ｐ≦０．００１）である。
【図１１】図１１：Ａｄ５−ＭｅｌＡＲＶ対Ａｄ５−ＭｅｌＡＲＶ−ＩＳＤを予防接種したＣＤ１マウスにおけるＡｄ５特異的抗体の力価。予防接種タイムラインＩＶにより、ＣＤ１マウスにＡｄ５−ＭｅｌＡＲＶまたはＡｄ５−ＭｅｌＡＲＶ−ＩＳＤを予防接種した。ＥＬＩＳＡプレートをＡｄ５粒子でコーティングすることによって、Ａｄ５特異的抗体について血清をＥＬＩＳＡによって分析した。各マウスからの血清を１：２の連続希釈において検査して、抗体力価を取得した。陽性結果についてのカットオフ値は、背景のＯＤ４５０の４倍とした。棒は、各群の平均力価をＳＥＭとともに示す。群は、ｎ＝５のマウスを含有していた。星印は、群間の有意差を示し、＊（Ｐ≦０．０５）、＊＊（Ｐ≦０．０１）、＊＊＊（Ｐ≦０．００１）である。
【図１２】図１２：アデノウイルスｐＩＸ蛋白質上に提示されたｐ１５Ｅのアミノ酸配列からの抜粋。全配列を配列表：ｐＩＸ−ｐ１５Ｅ（配列番号５１；ｐＩＸ−ｐ１５Ｅ−ＩＳＤ（配列番号５２）、ｐＩＸ−ｐ１５Ｅ−切端−Ｃあり（配列番号５３）、ｐＩＸ−ｐ１５Ｅ−切端−Ｃなし（配列番号５４）に表す。
【図１３Ａ】組換えｐＩＸを提示するアデノウイルスベクターの特徴づけ。（Ａ）組換えｐＩＸをコードするｐｃＤＮＡ３−ｐＩＸ−タグリンカー−ｘｘｘプラスミドをＨＥＫ２９３細胞内へとトランスフェクトし、正確な発現を確認した。トランスフェクトした細胞の細胞溶解物を、抗ｐＩＸ抗体を用いたウェスタンブロット法によって分析した。ライン１）ｐＩＸ−ｐ１５Ｅ、ライン２）ｐＩＸ−ｐ１５Ｅ−ＩＳＤ、ライン３）ｐＩＸ−ｐ１５Ｅ＿切端−Ｃあり、ライン４）ｐＩＸ−ｐ１５Ｅ＿切端−Ｃなし、ラインＧＦＰ  ｐＩＸ−ＧＦＰ。
【図１３Ｂ】（Ｂ）産生されかつ精製されたウイルスを、抗ｐＩＸ抗体を用いたウェスタンブロット法によって組換えｐＩＸの積分について分析した。ラインの番号は、Ａｄ５ベクター上に提示された（Ａ）におけるのと同じｐＩＸ改変を表すのに対し、ライン
【数１】
2020531053.tif 000005
は、ｐＩＸ改変されていない未処置のＡｄ５を表す。
【図１４Ａ】Ａｄ５−ｐＩＸを予防接種されたＣＤ１マウスにおける抗体応答。（Ａ）ｐＩＸが改変されたＡｄ５ワクチン（縞状の棒）をＣＤ１マウスにおいて検査し（予防接種タイムラインＩＶ）、改変されていない対応物（プレーンの棒）と比較した。アデノウイルス（未処置または組換えｐＩＸを提示するＡｄ５−ＭｅｌＡＲＶまたはＡｄ５−ＭｅｌＡＲＶ−ＩＳＤ）を、ＤＮＡ−ＭｅｌＡＲＶまたはＤＮＡ−ＭｅｌＡＲＶ−ＩＳＤのいずれかを用いて、ＤＮＡ初回免疫予防接種の基本に関して検査した。ＧＦＰを予防接種したマウスは、陰性対照として機能した。ＭｅｌＡＲＶ  Ｅｎｖ膜貫通サブユニットｐ１５Ｅのペプチドに対する抗体の結合を４５０ｎｍで評価し、標準的なＬＥＶ７６対照血清の吸光度に対して正規化した。
【図１４Ｂ】（Ｂ）（Ａ）におけるのと同じ血清試料を、Ｂ１６Ｆ１０−ＧＰ癌細胞に対する結合について分析した。フローサイトメトリーを用いて、マウスＩｇＧに対するＡＰＣ結合二次抗体により結合抗体を検出し、平均蛍光強度によって定量した。ＬＥＶ７６対照血清および二次抗体のみ（２．Ａｂのみ）はそれぞれ、陽性対照および陰性対照として機能した。棒は、各群（ｎ＝５）の平均をＳＥＭとともに示す。星印は、群間の有意差を示し、＊（Ｐ≦０．０５）、＊＊（Ｐ≦０．０１）、＊＊＊（Ｐ≦０．００１）である。
【図１５】図１５：Ａｄ５−ＭｅｌＡＲＶ＿ｐＩＸ−ｐ１５Ｅを予防接種したＣ５７ＢＬ／６マウスにおける抗体応答および転移計数。予防接種タイムラインＶにより、Ａｄ５−ＭｅｌＡＲＶ＿ｐＩＸ−ｐ１５Ｅまたはこのウイルスの未処置版（Ａｄ５−ＭｅｌＡＲＶ）をマウスに予防接種した。ＧＦＰを予防接種したマウスは、陰性対照として機能した。（Ａ）予防接種したマウスにおけるＢ１６Ｆ１０−ＧＰ腫瘍細胞に対する抗体応答をフローサイトメトリーによって分析した。ＬＥＶ７６対照血清は、陽性対照として含めた。二次抗体のみ（２．Ａｂのみ）とともにインキュベートした腫瘍細胞は、陰性対照として機能した。（Ｂ）ｐ１５Ｅ特異的抗体応答をＥＬＩＳＡにより分析した。４５０ｎｍにおいて測定された吸光度をＬＥＶ７６対照血清に対して正規化した。（Ａ）および（Ｂ）における各群は、ｎ＝５のマウスを含んでいた。示された値は、ＳＥＭとともにある各群の平均である。（Ｃ）Ｂ１６Ｆ１０−ＧＰ細胞による負荷の際の予防接種したマウスにおける腫瘍転移の数。横線は、各群の平均を示す。（Ｄ）Ｂ１６Ｆ１０−ＧＰ特異的抗体と転移計数との間の相関。（Ｅ）ｐ１５Ｅ特異的抗体および転移計数の相関。陰性対照（ＧＦＰ対照）は、相関の計算において含めなかった。
【図１６】図１６：ワクチン改善戦略：ＶＬＰ上の提示を改善するための機能的ドメインを有するキメラＭｅｌＡＲＶ  Ｅｎｖ蛋白質。２つの改変したワクチンを、完全長のＭｅｌＡＲＶ  Ｅｎｖ（Ａｄ５−ＬｕｃＳＰ＿ＭｅｌＡＲＶ＿Ｈａ−ＴＭＣＴ）またはｐ１５Ｅ単独（Ａｄ５−ＬｕｃＳＰ＿ＧＣＮ４＿ｐ１５Ｅ＿Ｈａ−ＴＭＣＴ）のいずれかを用いて産生した。Ａｄ５−ＬｕｃＳＰ＿ＭｅｌＡＲＶ＿Ｈａ−ＴＭＣＴにおいて、ＭｅｌＡＲＶ  Ｅｎｖの未処置のシグナルペプチドをルシフェラーゼシグナルペプチド（ＬｕｃＳＰ）について交換した。さらに、未処置の膜貫通ドメインおよび細胞質尾部（ＴＭＣＴ）を、インフルエンザＡ型ウイルス赤血球凝集素Ｈ３Ｎ２の対応する配列（ＨＡ−ＴＭＣＴ）について変化させた。Ａｄ５−ＬｕｃＳＰ＿ＧＣＮ４＿ｐ１５Ｅ＿ＨＡ−ＴＭＣＴにおいて、ｐ１５Ｅのみを完全長のＥｎｖ蛋白質の代わりにコードした。ｐ１５Ｅは同様に、ＨＡ−ＴＭＣＴを含有しており、ＬｕｃＳＰをＮ末端に付加した。加えて、三量体化配列（ＧＣＮ４）を含めた。
【図１７】図１７：キメラＭｅｌＡＲＶ  Ｅｎｖ蛋白質をコードする組換えＡｄ５による感染の際の細胞におけるＭｅｌＡＲＶ  Ｅｎｖの発現。改変型ＭｅｌＡＲＶ  Ｅｎｖ配列（Ａｄ５−ＬｕｃＳＰ＿ＭｅｌＡＲＶ＿Ｈａ−ＴＭＣＴおよびＡｄ５−ＬｕｃＳＰ＿ＧＣＮ４＿ｐ１５Ｅ＿Ｈａ−ＴＭＣＴ）を用いたワクチンウイルスを、感染したベロ細胞上での標的蛋白質の発現について検査した。結果を比較するために、Ａｄ５−ＭｅｌＡＲＶおよびＡｄ５−ＭｅｌＡＲＶ−ＩＳＤを同様に含めた。ベロ細胞に改変型ウイルスを感染させ、細胞上での標的蛋白質の発現をＭｅｌＡＲＶ  Ｅｎｖに対する多様な抗体：（Ａ）１９Ｆ８（抗ｐ１５Ｅ、ＩＳＤを標的）、（Ｂ）４Ｆ５（抗ｐ１５Ｅ）、（Ｃ）ＭＭ２−９Ｂ６（抗ｇｐ７０）、（Ｄ）ＭＭ２−３Ｃ６（抗ｇｐ７０）、（Ｅ）ＭＭ２−９Ａ３（抗ｇｐ７０）を用いて分析した。感染細胞に対する抗体の結合をフローサイトメトリーによって個々の蛍光結合二次抗体を用いて検出した。棒（ｎ＝１）は、蛍光結合抗体によって誘起される平均蛍光強度を表す。
【図１８】図１８：キメラＭｅｌＡＲＶ  ＥｎｖをコードするＡｄ５に感染した細胞内での標的蛋白質の発現およびＶＬＰ放出の分析（ウェスタンブロット法）：ベロ細胞を改変型ウイルスに感染させた。細胞溶解物および放出したＶＬＰを標的蛋白質の発現について、多様な抗体：（Ａ）抗ｐ２Ａ（ＭｅｌＡＲＶ  Ｇａｇ）、（Ｂ）４Ｆ５（抗ｐ１５Ｅ）、（Ｃ）ＭＭ２−９Ｂ６（抗ｇｐ７０）を用いたウェスタンブロット法によって分析した。追加的に、感染した細胞の上清をウェスタンブロット法によって、ｐ１５Ｅ（４Ｆ５）（Ｄ）およびｇｐ７０（ＭＭ２−９Ｂ６）（Ｅ）の分泌について分析した。ライン１）Ａ５ｄ−ＭｅｌＡＲＶ、ライン２）Ａｄ５−ＭｅｌＡＲＶ−ＩＳＤ、ライン３）Ａｄ５−ＬｕｃＳＰ＿ＧＣＮ４＿ｐ１５Ｅ＿Ｈａ−ＴＭＣＴ、ライン４）Ａｄ５−ＬｕｃＳＰ＿ＭｅｌＡＲＶ＿Ｈａ−ＴＭＣＴ、ライン
【数２】
2020531053.tif 000006
陰性対照ウイルス。期待されたバンドのサイズを表６に列挙する。
【図１９】図１９：キメラＭｅｌＡＲＶ  ＥｎｖをコードするＡｄ５に感染した細胞における標的蛋白質の発現およびＶＬＰ放出の分析（ＥＬＩＳＡ）：ベロ細胞をプロトタイプおよび改変型のウイルスに感染させた：ライン１）Ａ５ｄ−ＭｅｌＡＲＶ、ライン２）Ａｄ５−ＭｅｌＡＲＶ−ＩＳＤ、ライン３）Ａｄ５−ＬｕｃＳＰ＿ＧＣＮ４＿ｐ１５Ｅ＿Ｈａ−ＴＭＣＴ、ライン４）Ａｄ５−ＬｕｃＳＰ＿ＭｅｌＡＲＶ＿Ｈａ−ＴＭＣＴ、ライン
【数３】
2020531053.tif 000007
陰性対照ウイルス。ＥＬＩＳＡプレートを感染ベロ細胞からの細胞溶解物、上清（ＳＮ）または精製されたＶＬＰでコーティングした。ＭｅｌＡＲＶ  Ｅｎｖ蛋白質およびＧａｇ蛋白質の存在を、一次抗体（抗ｐ２Ａ、ＭＭ２−９Ｂ６、４Ｆ５および１９Ｆ８）の結合によって検出した。（Ａ）抗ｐ２Ａ抗体は、Ｇａｇの発現を示した。（Ｂ）ＭＭ２−９Ｂ６結合は、ＭｅｌＡＲＶ  Ｅｎｖ表面サブユニットｇｐ７０の発現を可視化した。（Ｃ）（Ｄ）４Ｆ５および１９Ｆ８（ＩＳＤ結合）は、膜貫通サブユニットｐ１５Ｅへ結合した。
【図２０】図２０：ＨＩＶ  ＩＳＤ抗体との比較を示す。
【図２１】図２１：ＨＩＶ  ＩＳＤ−Ｔ細胞についての比較を示し、図中、
【化２】
2020531053.tif 000008
である。
【図２２】図２２：ワクチン設計を改善するために従った戦略：ワクチンにおいてコードされたＨＥＲＶ−Ｋ  Ｅｎｖ蛋白質のＩＳＤドメイン（ｐ１５Ｅ）における点突然変異。グルタミン（Ｑ）（「Ａｄ１９＿ＨＥＲＶ−Ｋ」を参照されたく、コード配列を配列番号４３に示す）をアラニン（Ａ）へ突然変異させて（「ＨＥＲＶ−Ｋ−ＩＳＤ」、コード配列を配列番号４４に示す）、免疫抑制効果に介在するＩＳＤドメインを不活性化させた。図面は、（Ｍａｎｇｅｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．２００７）から改変した。
【図２３】図２３：ウイルスをトランスフェクトされた細胞のＳＮおよび細胞溶解物からのＨＥＲＶ−Ｋ  Ｅｎｖ蛋白質のおよびＧａｇ蛋白質（ＶＬＰ）の検出。Ａｄ１９＿ＨＥＲＶ−Ｋ  ＷＴ／ＩＳＤ突然変異体をトランスフェクトしたＡ５４９細胞およびベロ細胞のＳＮおよび細胞溶解物における機能的Ｇａｇ蛋白質（Ａ）およびＥｎｖ蛋白質（Ｂ）の存在は、正方形の囲みによって強調されている。およそ９０、８０および４０ｋＤａの分子質量は、次表において示すようにそれぞれ８０、９０、８０、および４２ｋＤａの、ＨＥＲＶ−Ｋ  Ｇａｇ、ＨＥＲＶ−Ｋ  Ｅｎｖ完全長未加工前駆体（シグナルペプチドありおよびなし）、およびＨＥＲＶ−Ｋ  ｐ１５Ｅ（ＴＭ、Ｅｎｖ）の報告された値と等価であった。
【表１−１】
2020531053.tif 000009
【表１−２】
2020531053.tif 000010
その上、Ａｄ５＿ＭｅｌＡＲＶ＿Ｇａｇ蛋白質（６５ｋＤａ）はまた、両細胞株（Ａ１およびＡ２）の細胞溶解物およびＳＮにおいて検出され、ＨＥＲＶ−Ｋ蛋白質およびＭｅｌＡＲＶ  Ｇａｇ蛋白質の両方が、同じウサギポリクローナル抗ｐ２Ａ抗体によって認識されることができることを意味した。
【図２４】図２４：Ａｄ１９＿ＨＥＲＶ−Ｋ＿野生型／ＩＳＤ突然変異体トランスフェクションの際の細胞表面内部および細胞表面上でのＨＥＲＶ−Ｋ  Ｅｎｖの発現。ＨＥＲＶ−１８１１抗体を使用して、Ａ５４９感染細胞の細胞内および細胞表面上の両方でＨＥＲＶ−Ｋ  Ｅｎｖ蛋白質の産生および存在を示した。Ａｄ１９＿ＨＥＲＶ−Ｋ  Ｅｎｖ野生型（中間的な灰色透明）感染細胞／ＩＳＤ突然変異体（暗灰色透明）感染細胞は、多量のＨＥＲＶ−Ｋ  Ｅｎｖを発現したのに対し、ＨＥＲＶ−Ｋ  ＥｎｖについてコードするＡｄ５ベクターに感染した細胞（非常に明灰色透明）は、より低い標的蛋白質発現を示し、Ａｄ１９トランスフェクションがＡｄ５のトランスフェクションよりも効率的である可能性があることを示唆した。Ａｄ１９ベクターによってコードされた無関係抗原に感染した細胞（明灰色）は、非感染細胞（暗灰色）と一致しており、したがって、いかなるシグナルも示さなかった。
【図２５】図２５：Ｂａｌｂ／ＣマウスにおけるＡｄ１９＿ＨＥＲＶ−Ｋによって誘起されるＣＤ８＋  Ｔ細胞応答のＩＣＳ解析。図面は、各マウス脾臓内に含有されるＴＮＦα分泌活性化型（ＣＤ４４＋）ＣＤ８＋  Ｔ細胞の総数を示す。（Ａ）異なるアデノウイルスワクチン（初回免疫−追加免疫）後に非追加免疫
【数４】
2020531053.tif 000011
およびＭＶＡ＿Ｅｎｖ追加免疫投与計画により免疫化したマウスからのＩＦＮγ陽性ＣＤ８＋  Ｔ細胞の数。（Ｂ）ＩＦＮγおよびＴＮＦα二重陽性ＣＤ８＋  Ｔ細胞の百分率。（Ｃ）ＩＦＮγ陽性ＣＤ８＋  Ｔ細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）。星印（＊）は、有意差を示し、＊（Ｐ≦０．０５）、＊＊（Ｐ≦０．０１）、＊＊＊（Ｐ≦０．００１）である。
【図２６】図２６：治療用予防接種を受けている腫瘍負荷したマウスの生存曲線。本発明者らのＡｄ１９＿ＨＥＲＶ−Ｋ野生型／ＩＳＤ突然変異体ワクチン（中間的な灰色および暗灰色）が腫瘍の成長および転移を低減させまたは予防する有効性を、ＨＥＲＶ−Ｋ  Ｅｎｖ標的蛋白質を発現するＲＥＮＣＡ細胞を負荷したＢＡＬＢ／Ｃマウスにおいて検査した。本発明者らのワクチンを、ＨＥＲＶ−Ｋを発現しない無関係ワクチン（黒色）、および標的蛋白質を発現しないＭＶＡワクチン（明灰色）と比較した。４０日後（最終エンドポイント）で安楽死させたマウスの肺を、肺への転移の進行に関して盲検順位分類した。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒの概算式を用いて、予防接種したマウスの異なる群の生存を解析した。異なる統計検定（対数順位、ＷｉｌｃｏｘｏｎおよびＴａｒｏｎｅ−Ｗａｒｅ）生存曲線を比較し、ｐ値が０．０５未満のとき、有意（＊）とみなした。
【図２７】図２７：ゲート処理戦略。矢印のついた黒色のゲートは、どの集団が次のプロットをゲート処理するために使用されたかを示す。この図面は、アデノウイルス系ワクチン（初回免疫＋ＭＶＡ  Ｅｎｖ（追加免疫）で免疫化したＢＡＬＢ／ｃマウスからの陽性結果から作成された。
【図２８】図２８：ヒト乳癌組織（Ｈ８４１）のＨＥＲＶ−Ｋ染色。組織試料をヒト乳房腫瘍から取得した。該試料を４μｍに薄片化し、（Ａ）非免疫化マウス（採血前血清）ならびに（Ｂ）Ａｄ１９＿ＨＥＲＶ−Ｋ＿ＩＳＤ（８週間後）およびＭＶＡ＿Ｅｎｖ（２か月後）の予防接種投与計画を用いて追加免疫したＡｄ５＿ＨＥＲＶ−Ｋ＿Ｅｎｖから取得した、１：１０００希釈した一次抗体で染色した。１：５００希釈したビオチン標識した抗マウス二次抗体をその後用いて、癌細胞をヘマトキシリン／エオシンで最終的に染色した。ＨＥＲＶ−Ｋ特異的染色（暗灰色）を、予防接種したマウスからの高力価ＨＥＲＶ−Ｋ抗体が、ＨＥＲＶ−Ｋ標的蛋白質を発現する癌組織を染色することができることを確証する右側組織スライドにおいて、明確に可視化した。
【図２９】図２９：トランスフェクトした細胞から分泌したＶＬＰの形態特性。Ａ５４９細胞に、Ｇａｇ＿ｐ２Ａ＿Ｅｎｖ蛋白質についてコードするＡｄ１９＿ＨＥＲＶ−Ｋ  ＩＳＤ突然変異体をトランスフェクトした。細胞を２４時間後に固定し、放出されたＶＬＰ（およそ１００ｎｍの円）を、透過型電子顕微鏡を用いて観察した。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
以下に、配列の個々の要素が次のとおり示される未処置の配列を示す。
【００５９】
シグナルペプチド
表面サブユニット
膜貫通サブユニット
免疫抑制性ドメイン（ＩＳＤ／ＩＳＤ）＊
膜貫通ドメイン
細胞質尾部
【００６０】
本発明は、免疫抑制性ドメインにおけるアミノ酸のうちの１、２またはそれより多数が別の天然アミノ酸と交換された以下に記載の配列を網羅する。
【００６１】
１．Ｅｎｖ蛋白質についてのアミノ酸配列（配列番号９）：
【化３】
2020531053.tif 000012
を有するＨＥＲＶ−Ｋ１０８（＝ＥＲＶＫ−６）、およびアミノ酸配列（配列番号１０）：
【化４】
2020531053.tif 000013
を有するＧａｇ蛋白質
２．Ｅｎｖ蛋白質についてのアミノ酸配列（配列番号１１）：
【化５−１】
2020531053.tif 000014
【化５−２】
2020531053.tif 000015
を有するＥＲＶＫ−１９、およびアミノ酸配列（配列番号１２）：
【化６】
2020531053.tif 000016
を有するＧａｇ蛋白質
３．Ｅｎｖ蛋白質についてのアミノ酸配列（配列番号１３）：
【化７】
2020531053.tif 000017
を有するＨＥＲＶ−Ｋ１１５（ＥＲＶＫ−８）、およびＧａｇ蛋白質は、アミノ酸配列（配列番号１４）：
【化８】
2020531053.tif 000018
を有する
４．Ｅｎｖ蛋白質のアミノ酸配列（配列番号１５）：
【化９】
2020531053.tif 000019
と、Ｇａｇ蛋白質のアミノ酸配列（配列番号１６）：
【化１０】
2020531053.tif 000020
とを有するＥＲＶＫ−９
５．Ｅｎｖ蛋白質のアミノ酸配列（配列番号１７）：
【化１１】
2020531053.tif 000021
と、Ｇａｇ蛋白質のアミノ酸配列（配列番号１８）：
【化１２−１】
2020531053.tif 000022
【化１２−２】
2020531053.tif 000023
とを有するＨＥＲＶ−Ｋ１１３
６．Ｅｎｖ蛋白質のアミノ酸配列（配列番号１９）：
【化１３】
2020531053.tif 000024
を有し、Ｅｎｖ蛋白質のアミノ酸配列（配列番号２０）：
【化１４】
2020531053.tif 000025
を有するＥＲＶＫ−２１
７．Ｅｎｖ蛋白質のアミノ酸配列（配列番号２１）：
【化１５−１】
2020531053.tif 000026
【化１５−２】
2020531053.tif 000027
を有するＥＲＶＫ−２５
８．Ｅｎｖ蛋白質のアミノ酸配列（配列番号２２）：：
【化１６】
2020531053.tif 000028
を有する、およびＧａｇ蛋白質のアミノ酸配列（配列番号２３）：
【化１７】
2020531053.tif 000029
を有するＨＥＲＶ−Ｋ１０２＝ＥＲＶＫ−７
９．Ｅｎｖ蛋白質のアミノ酸配列（配列番号２４）：
【化１８】
2020531053.tif 000030
を有する、およびＧａｇ蛋白質のアミノ酸配列（配列番号２５）：
【化１９】
2020531053.tif 000031
を有するＨＥＲＶ−Ｋ１０１＝ＥＲＶＫ−２４
１０．Ｅｎｖ蛋白質のアミノ酸配列（配列番号２６）：
【化２０】
2020531053.tif 000032
を有するＨＥＲＶ−Ｋ１１０＝ＥＲＶＫ−１８
１１．Ｅｎｖ蛋白質のアミノ酸配列（配列番号２７）：
【化２１】
2020531053.tif 000033
を有するＨＥＲＶ−Ｈ１９＝ＨＥＲＶ−Ｈ＿２ｑ２４．３
１２．Ｅｎｖ蛋白質のアミノ酸配列（配列番号２８）：
【化２２−１】
2020531053.tif 000034
【化２２−２】
2020531053.tif 000035
を有する、およびＧａｇ蛋白質のアミノ酸配列（配列番号２９）のアミノ酸配列：
【化２３】
2020531053.tif 000036
を有するＨＥＲＶ−Ｈ_２ｑ２４．１
１３．Ｅｎｖ蛋白質のアミノ酸配列（配列番号３０）：
【化２４】
2020531053.tif 000037
を有するＨＥＲＶ−Ｗ＝ＥＲＶＭ−１＝シンシチン１
１４．Ｅｎｖ蛋白質のアミノ酸配列（配列番号３１）：
【化２５】
2020531053.tif 000038
を有するＨＥＲＶ−ＦＲＤ＝ＥＲＶＦＲＤ−１＝シンシチン２
１５．Ｅｎｖ蛋白質のアミノ酸配列（配列番号３２および３３）：
【化２６】
2020531053.tif 000039
を有する、およびＧａｇ蛋白質のアミノ酸配列（配列番号３４〜３８）：
【化２７】
2020531053.tif 000040
を有するＨＥＲＶ−Ｅ
１６．Ｅｎｖ蛋白質のアミノ酸配列（配列番号３３９）：
【化２８】
2020531053.tif 000041
を有する、およびＧａｇ蛋白質のアミノ酸配列（配列番号４０）：
【化２９】
2020531053.tif 000042
を有するＨＥＲＶ−Ｅ
【００６２】
ＨＥＲＶ−Ｋについての標的癌は、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、リンパ腫、黒色腫、白血病および肉腫である。ＨＥＲＶ−Ｈについての標的癌は、大腸癌である。ＨＥＲＶ−Ｗについての標的癌は、精巣癌、卵巣癌、乳癌、リンパ腫および白血病であり、ＨＥＲＶ−Ｅについての標的癌は、肺癌および肝癌である。
【実施例】
【００６３】
以下に示される材料および方法は、後続の実施例について共通である。
【００６４】
プロトタイプのワクチン（ＤＮＡ−ＭｅｌＡＲＶおよびＡｄ５−ＭｅｌＡＲＶ）は、強力なヒトサイトメガロウイルス前初期プロモーター（ＣＭＶプロモーター）の下で遺伝子ＭｅｌＡＲＶｇａｇ＿ｐ２Ａ＿ｅｎｖをコードするＤＮＡプラスミド（７６８ｔｅｔ）またはアデノウイルス５型（Ａｄ５）からなった。この遺伝子は、自己開裂可能なペプチドｐ２Ａを介して連結されたＭｅｌＡＲＶ蛋白質ＧａｇおよびＥｎｖを同時に発現した。Ｇａｇがウイルス様粒子（ＶＬＰ）の形成を誘導したのに対し、標的蛋白質Ｅｎｖは、形成するＶＬＰ内へと組み込まれた。
【００６５】
さらに、腫瘍細胞内で発現するヒト内在性レトロウイルスＫ型（ＨＥＲＶ−ＫまたはＨＭＬ−２）のエンベロープ（Ｅｎｖ）蛋白質を標的とするようワクチンを設計し、細胞免疫応答および液性免疫応答の誘導ならびに抗癌有効性について検査した。
【００６６】
設計されたワクチンは、ＤＮＡプラスミド（７６８ｔｅｔ）、アデノウイルス５型（Ａｄ５）、またはアデノウイルス１９型（Ａｄ１９ａ）のいずれかを含み、これらの各々は、群特異的抗原（Ｇａｇ）およびＥｎｖ遺伝子（ＨＥＲＶ−ＫＧａｇ＿ｐ２Ａ＿Ｅｎｖ）を強力なヒトサイトメガロウイルス前初期プロモーター（ＣＭＶプロモーター）の下でコードする。これら２つの蛋白質は、自己開裂可能なペプチドｐ２Ａをリンカーと同時に発現し、該リンカーは、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）形成に関与するＧａｇ蛋白質と会合したままである。Ｅｎｖ蛋白質は、形成するＶＬＰへ組み込まれ、標的として機能して特異的免疫応答を生じる。
【００６７】
免疫応答の誘導に関してワクチンを改善するためにワクチンによってコードされたＭｅｌＡＲＶ  ＥｎｖにおけるＩＳＤの不活性化型突然変異を調製して、ワクチン自体による免疫抑制効果を防止した。２つの点突然変異をＥｎｖ膜貫通サブユニットｐ１５Ｅの配列において誘導した。ＩＳＤの１４−位のグルタミン酸をアルギニンと置換し、２０−位のアラニンをフェニルアラニンと交換した（図３）。
【００６８】
ＨＥＲＶ−Ｋワクチンにおいて、ワクチンによって誘導される免疫応答を、ＨＥＲＶ−Ｋ  Ｅｎｖ蛋白質の膜貫通（ＴＭ）サブユニット、すなわちｐ１５Ｅの免疫抑制性ドメイン（ＩＳＤ）において点突然変異を導入することによって亢進した。この修飾は、ＩＳＤの５２−位におけるグルタミンとアラニンとの置き換えを包含していた（Ｓｃｈｌｅｃｈｔ−Ｌｏｕｆ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）（図２２を参照されたい）。この変化は、ワクチン自体が免疫抑制効果を生じるのを防止するために、ドメインの不活性化を惹起した。
【００６９】
細胞培養
種々の細胞株を異なる実験において使用した。細胞株はすべて、３７℃で、加湿雰囲気中で５％ＣＯ２で維持した。
【００７０】
ＨＥＫ２９３：ＨＥＫ２９３は、ヒト胚腎培養物から生じるが、共有されたアデノウイルス５型（Ａｄ５）ＤＮＡを用いた形質転換によって作製した［ＡＴＣＣ．２９３［ＨＥＫ−２９３］．［２０１７年６月８日引用］、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｌｇｃｓｔａｎｄａｒｄｓ−ａｔｃｃ．ｏｒｇ／Ｐｒｏｄｕｃｔｓ／Ａｌｌ／ＣＲＬ−１５７３．ａｓｐｘ？ｇｅｏ＿ｃｏｕｎｔｒｙ＝ｄｅから入手可能。］。この細胞株の利点には、容易な成長および効率的なトランスフェクションが含まれる。別の利点は、Ａｄ５  Ｅ１遺伝子の発現である［Ｋｏｖｅｓｄｉ，Ｉ．ａｎｄ  Ｓ．Ｊ．Ｈｅｄｌｅｙ，Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｐｒｏｄｕｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｖｉｒｕｓｅｓ，２０１０．２（８）：ｐ．１６８１−７０３。］。複製が欠損している組換えＡｄ５ワクチンが通常、投与され、このことは該ワクチンが、Ｅ１のようなウイルス複製にとって必須の遺伝子において欠失していることを意味する。この場合、欠失している遺伝子は、ウイルス産生の間、外部に提供されなければならない。ＨＥＫ２９３細胞は、複製を要する蛋白質を提供し、それゆえ、ウイルス産生の間、産生細胞として使用されることができる［Ｋｏｖｅｓｄｉ，Ｉ．ａｎｄ  Ｓ．Ｊ．Ｈｅｄｌｅｙ，Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｐｒｏｄｕｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｖｉｒｕｓｅｓ，２０１０．２（８）：ｐ．１６８１−７０３。］。本実験では、１０％熱失活ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ピルビン酸Ｎａ（１ｍＭ）およびペニシリン＋ストレプトアビジン（Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）を補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中でＨＥＫ２９３細胞を維持した。
【００７１】
ＨＥＫ２９３＿Ｔ−ＲＥｘ＿アデノウイルス毒素産生（Ａｖｔｏｘｉｃ）（アデノウイルス毒素産生細胞）：アデノウイルス毒性産生細胞は、改変されたＨＥＫ２９３細胞であり、これを用いて、ウイルス産生中のＡｄ５によりコードされた組換え蛋白質の発現を防止する。これらの組換え蛋白質の発現を阻害することは必要とされており、その理由は、コードされた標的蛋白質のうちの一部がＨＥＫ２９３細胞に対して毒性であり、ウイルス産生に干渉するからである［Ｃｏｔｔｉｎｇｈａｍ，Ｍ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｃａｓｓｅｔｔｅｓ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ，２０１２．１０９（３）：ｐ．７１９〜２８。］。ＨＥＫ細胞を２つのステップで改変して、異なる蛋白質抑制機序を含めた。第一の機序には、Ｔ−ＲＥｘ系による抑制が含まれていた［Ｆｉｓｈｅｒ，Ｔ．Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ−Ｔ−ＲＥｘ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ．２０１１［２０１７年６月８日引用］、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｄｋ／ｅｎ／ｈｏｍｅ／ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ／ｐｒｏｔｅｉｎｓ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ−ｉｓｏｌａｔｉｏｎ−ａｎｄ−ａｎａｌｙｓｉｓ／ｐｒｏｔｅｉｎ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ−ｐｒｏｔｏｃｏｌ／ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ−ｕｓｉｎｇ−ｔｈｅ−ｔｒｅｘ−ｓｙｓｔｅｍ．ｈｔｍｌから入手可能］。Ｔ−ＲＥｘ−２９３細胞を遺伝子改変して、テトラサイクリン抑制因子蛋白質（Ｔｅｔ抑制因子）を発現させ、これが、Ｔｅｔオペレーターに結合して抑制する。このことは、強力なＣＭＶプロモーターの制御下で組換え標的蛋白質の発現をもたらす。
【００７２】
Ｔ−ＲＥｘ系が標的蛋白質の発現を防止する上で完全には有効でないので、Ｔ−ＲＥｘ−２９３細胞株をＳｉｒｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ（Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によってさらに改変した。新たな細胞株ＨＥＫ２９３＿Ｔ−ＲＥｘ＿アデノウイルス毒素発生（アデノウイルス毒素発生細胞）は、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を発現し、これは、標的蛋白質と一緒に転写されるｐ２ＴＳと呼ばれる伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）配列を標的とする。ｓｈＲＮＡは、ｐ２ＴＳ含有ｍＲＮＡの分解を生じ、したがって、組換え蛋白質のさらなる抑制を生じる。アデノウイルス毒素発生細胞を、１０％熱失活ＦＢＳ、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ピルビン酸Ｎａ（１ｍＭ）およびＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを補充したＤＭＥＭ中に維持した。
【００７３】
ＨＥＫ２９３（ＣＣＳ）−ｓｈｍｉｒ−ｐＩＸ＿２２１−ピューロ（ｐＩＸ−細胞）：ｐＩＸ−細胞は、ウイルスカプシド蛋白質ｐＩＸ上に抗原を提示するＡｄ５−ｐＩＸウイルスの産生に使用される改変型ＨＥＫ２９３細胞である。天然ｐＩＸ蛋白質は、ＨＥＫ２９３細胞において発現するアデノウイルスＥ１遺伝子によってコードされる。ウイルス粒子内への未処置のｐＩＸの組込みを防止し、かつ組換えｐＩＸの組込みを容易にするために、ＨＥＫ２９３によりコードされたｐＩＸを、ｐＩＸ細胞内でｓｈＲＮＡ発現によって抑制した。ウイルス産生中のｓｈＲＮＡの転写をドキシサイクリンによって誘導した。加えて、ピューロマイシンによるｓｈＲＮＡ発現細胞の選択を可能にするピューロマイシンＮ−アセチル−トランスフェラーゼ（ＰＡＣ）をコードするｐａｃ遺伝子を細胞に形質導入した。したがって、１０％熱失活ＦＢＳ、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ピルビン酸Ｎａ（１ｍＭ）、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐおよび０．５μｇ／ｍＬピューロマイシンを補充したＤＭＥＭ中で細胞を維持した。
【００７４】
Ｂ１６Ｆ１０−ＧＰ：Ｂ１６細胞株は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス系から生じるマウス黒色腫細胞株である［ＡＴＣＣ．Ｂ１６−Ｆ１０.［２０１７年６月８日引用］、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｌｇｃｓｔａｎｄａｒｄｓ−ａｔｃｃ．ｏｒｇ／Ｐｒｏｄｕｃｔｓ／Ａｌｌ／ＣＲＬ−６４７５．ａｓｐｘ？ｇｅｏ＿ｃｏｕｎｔｒｙ＝ｄｅから入手可能］。Ｂ１６Ｆ１０は、より増殖性があり、かつＣ５７ＢＬ／６マウスにおける転移を分析するために頻繁に使用される変異体である。マウス内へのＢ１６細胞の静脈内注射後、肺への転移について１０回連続選択によって該変異体を取得した［Ｆｉｄｌｅｒ，Ｉ．Ｊ．，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｃｃｅｓｓｉｖｅ  ｔｕｍｏｕｒ  ｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．Ｎａｔ  Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌ，１９７３．２４２（１１８）：ｐ．１４８−９．、Ｆｉｄｌｅｒ，Ｉ．Ｊ．ａｎｄ  Ｇ．Ｌ．Ｎｉｃｏｌｓｏｎ，Ｏｒｇａｎ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｆｏｒ  ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｎｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  Ｂ１６  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｖａｒｉａｎｔ  ｔｕｍｏｒ  ｌｉｎｅｓ．Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ，１９７６．５７（５）：ｐ．１１９９〜２０２。］。本実験において使用される細胞株Ｂ１６Ｆ１０−ＧＰは、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の糖蛋白質の免疫優性エピトープ（ＧＰ３３−４１）を追加的に発現する［Ｐｒｅｖｏｓｔ−Ｂｌｏｎｄｅｌ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｕｍｏｒ−Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  Ｅｘｈｉｂｉｔｉｎｇ  Ｈｉｇｈ  Ｅｘ  Ｖｉｖｏ  Ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｆａｉｌ  ｔｏ  Ｐｒｅｖｅｎｔ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ｔｕｍｏｒ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９８．１６１（５）：ｐ．２１８７〜２１９４。］。１０％熱失活ＦＢＳ、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ピルビン酸Ｎａ（１ｍＭ）およびＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを補充したＤＭＥＭ中で細胞を維持した。
【００７５】
ＣＴ２６：ＣＴ２６は、Ｂａｌｂ／Ｃマウス系由来のマウス結腸癌細胞株であり、Ａｎｄｅｒｓ  Ｅｌｍ  Ｐｅｄｅｒｓｅｎ博士から取得した。この細胞株を使用して、マウスにおける原発腫瘍成長を検査した［ＡＴＣＣ．ＣＴ２６．ＷＴ．［２０１７年６月８日引用］、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｌｇｃｓｔａｎｄａｒｄｓ−ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ａｌｌ／ＣＲＬ−２６３８．ａｓｐｘ？ｇｅｏ＿ｃｏｕｎｔｒｙ＝ｄｅ＃ｇｅｎｅｒａｌｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎから入手可能］。１０％熱失活ＦＢＳ、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ピルビン酸Ｎａ（１ｍＭ）およびＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを補充したＲｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ培地（ＲＰＭＩ）中で細胞を維持した。
【００７６】
４Ｔ１−Ｌｕｃ：４Ｔ１は、Ｂａｌｂ／Ｃマウス系から生じるマウス乳癌細胞株である。マウスの乳房脂肪片内へ注射すると、細胞は、肺、肝臓、リンパ節および脳へ転移する原発腫瘍を形成する［ＡＴＣＣ．４Ｔ１．［２０１７年８月４日引用］、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｌｇｃｓｔａｎｄａｒｄｓ−ａｔｃｃ．ｏｒｇ／Ｐｒｏｄｕｃｔｓ／Ａｌｌ／ＣＲＬ−２５３９．ａｓｐｘ？ｇｅｏ＿ｃｏｕｎｔｒｙ＝ｄｅ＃ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓから入手可能］。細胞株にルシフェラーゼレポーター蛋白質（Ｌｕｃ）を安定してトランスフェクトした。１０％熱失活ＦＢＳ、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ピルビン酸Ｎａ（１ｍＭ）およびＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを補充したＲＰＭＩ中で細胞を維持した。
【００７７】
ベロ細胞：ベロ細胞は、アフリカミドリザル（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ａｅｔｈｉｏｐｓ）由来の霊長類腎細胞株［ＡＴＣＣ．Ｖｅｒｏ．［２０１７年６月８日引用］、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｌｇｃｓｔａｎｄａｒｄｓ−ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ａｌｌ／ＣＣＬ−８１．ａｓｐｘ？ｇｅｏ＿ｃｏｕｎｔｒｙ＝ｄｅ＃ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓから入手可能］である。この細胞株は、新たなビリオンの支持的産生なしでヒトＡｄ５感染によって非常に導入可能であり、それゆえ、Ａｄ５−ワクチンによる蛋白質発現およびＶＬＰ放出を分析するのに使用した。１０％熱失活ＦＢＳ、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ピルビン酸Ｎａ（１ｍＭ）およびＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを補充したＤＭＥＭ中で細胞を維持した。
【００７８】
Ａ５４９細胞は、ウイルストランスフェクションを提供するのに適したヒト肺上皮細胞である。それゆえ、ＶＬＰ産生のための関心対象の配列を含有するアデノウイルストランスフェクションのためにＡ５４９細胞を用いた。ウェスタンブロット（ＷＢ）技術を経てＶＬＰの分泌を分析し、蛍光標示式細胞分取法（ＦＡＣＳ）を用いて細胞表面におけるＶＬＰの存在を検出し、電子顕微鏡（ＥＭ）を用いて可視化した。これらの細胞を、１０％熱失活ＦＢＳ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、およびピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）を補充したＨａｍのＦ−１２培地のＫａｉｇｈｎの変法物（ＨａｍのＦ−１２Ｋ培地）中で維持した。
【００７９】
Ｇａｇ蛋白質およびＥｎｖ蛋白質を発現するＲｅｎｃａ細胞。Ｒｅｎｃａ細胞は、マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）腎上皮細胞である。該細胞は、ｂａｌｂ／Ｃマウスにおける腎腺癌に由来する。腫瘍の成長および進行は、ヒト腎細胞癌において観察されるものに正確に類似しており、特に肝臓および肺への自発転移を模倣している。次の例において使用される細胞は、Ｂａｒｂａｒａ  Ｓｈｎｉｅｒｌｅ博士教授（Ｌａｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって親切に提供された。次の例のうちの一部において、ヒト内在性レトロウイルスＫ型（ＨＥＲＶ−Ｋ）Ｅｎｖ蛋白質またはＧａｇ蛋白質を発現させるために、細胞を改変した。このことによって、マウスにおけるＨＥＲＶ−Ｋ蛋白質を発現する腫瘍が誘導され、ＥＲＶ蛋白質を発現するヒト癌に向けられた本発明者らの新規の予防接種戦略を検査するための適切なマウスモデルを創出するのが可能となった。これらの細胞を、ｐＨ７．２における１０％熱失活ＦＢＳ、２０×１０６ＩＵ／Ｌ  Ｐｅｎおよび５ｇ／Ｌ  Ｓｔｒｅｐ、２．９ｇ／Ｌ  Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ならびに３．７ｇ／Ｌピルビン酸ナトリウム（１ｍｍ）を補充したＲｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ培地（ＲＰＭＩ−１６４０）中で維持した。
【００８０】
ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）の初代培養物は、ウイルス培養に広範に使用されている。Ｊｅｎｓ  Ｔｏｆｔ，Ｌｏｈｍａｎｎ（Ｄｅｎｍａｒｋ）製の１１日齢のニワトリ卵を使用して、（Ｓｔａｉｂ  ｅｔ  ａｌ．２００４）からのプロトコルにより、ＣＥＦ培養物を調製した。この場合、ＣＥＦ細胞を、ＨＥＲＶ−Ｋ  ＥｎｖおよびＧａｇ外来抗原についてコードする改変型Ｖａｃｃｉｎａ  Ｖｉｒｕｓ  Ａｎｋａｒａ（ＭＶＡ）の産生のために使用した。この特異的な型の細胞を用いて作業するための理由は、ＭＶＡ複製が鳥類細胞に限定されているからであり、哺乳動物細胞の大部分においてＭＶＡが再生せず、この目的に適していないことを意味している（Ａｌｔｅｎｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１４）。ＣＥＦ細胞を、３．７ｇ／Ｌピルビン酸ナトリウム、１０％熱失活ＦＢＳ、および１％（ｖ／ｖ）抗生物質−抗真菌薬（ＧｉｂｃｏＴＭ，１５２４００６２）を補充したＲＰＭＩからなるＣＥＦ培地中で培養した。
【００８１】
ベビーハムスター腎線維芽細胞（ＢＨＫ−２１細胞）は元々、ベビーシリアゴールデンハムスター腎細胞（Ｍｅｓｏｃｒｉｃｅｔｕｓ  ａｕｒａｔｕｓ）に由来した。以下の例において使用される具体的な細胞株は、Ａｌｌａｎ  Ｒａｎｄｒｕｐ  Ｔｈｏｍｓｅｎ教授（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）によって供給された。ＢＨＫ−１２細胞をＭＶＡ  ＥｎｖおよびＧａｇの滴定に使用し、その理由は、該細胞がＭＶＡ複製を可能にする数少ない細胞株のうちの１つであることが公知だからである。該細胞を、３．７ｇ／Ｌピルビン酸ナトリウム、１０％熱失活ＦＢＳ、および１％（ｖ／ｖ）抗生物質−抗真菌薬（ＧｉｂｃｏＴＭ，１５２４００６２）を補充したＲＰＭＩからなるＣＥＦ培地中で維持した。
【００８２】
プラスミドコンストラクト
組換えアデノウイルスを作製するために、標的蛋白質を改変型アデノウイルスベクター捕獲ｐＢＧＨへとクローン化した。このベクターは、Ｅ１遺伝子およびＥ３遺伝子に欠失があるＡｄ５ゲノムを含有する。さらに、該ベクターは、ＣＭＶプロモーターおよび３’ポリアデニル化（ポリＡ）尾部を必要とし、かつＴｅｔオペレーターの下で組換えタンパク質を発現するベクター７６８ｔｅｔに対する相同領域を含有する（図４）［Ｂｅｃｋｅｒ，Ｔ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｕｓｅ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｆｏｒ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，１９９４．４３  Ｐｔ  Ａ：ｐ．１６１〜８９。］。それゆえ、標的蛋白質をまず、７６８ｔｅｔ内へとサブクローニング、ＰＣＲクローニングまたはＧｉｂｓｏｎアセンブリによって挿入し、その後、相同組換え（図５）を介して捕獲ｐＢＧＨ内へとクローン化した（図４）。アデノウイルスのｐＩＸ改変のために、標的蛋白質を共通の発現ベクターｐｃＤＮＡ３内へとクローン化し、該発現ベクターは、ｐＩＸおよびリンカー配列（ＦＬＡＧタグを含有）に続いて制限部位を追加的にコードして、関心対象の遺伝子（ｐｃＤＮＡ３＿ｐＩＸ＿タグリンカー＿ｘｘｘ、ｘｘｘ＝標的抗原）を挿入した。発現ベクターを産生細胞内へとトランスフェクトして、これらの細胞内での組換えｐＩＸの発現を誘導した。使用した異なるプラスミドコンストラクトを表１に列挙する。
【００８３】
【表２−１】
2020531053.tif 000043
【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【００８４】
クローン化
異なるクローン化戦略を使用して、アデノウイルスワクチンの製造および検査のための新たなＤＮＡコンストラクトを構築した。
【００８５】
サブクローニング
サブクローニングのために、標的ＤＮＡ配列をあるプラスミド（ドナーベクター）から別のプラスミド（標的ベクター）へと移した。ドナーおよび標的ベクターを、ライゲーション部位において制限消化を介して切断した。再ライゲーションを防止するために、標的ベクターを、ＤＮＡの５’末端および３’末端で脱リン酸化を触媒するウシ腸管アルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）で処理した。消化したＤＮＡを、ＧｅｌＧｒｅｅｎ色素（＃４１００４，Ｂｉｏｔｉｕｍ）を含有する１％アガロースゲル上で分離した。所望のＤＮＡバンドを切り出し、ＤＮＡ内容物を、Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ．Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｄ２５００；ＯＭＥＧＡ  ｂｉｏ−ｔｅｋ）を用いて抽出した。簡潔には、ゲルを１容積結合緩衝液（ＸＰ２）中に溶解し、ＨｉＢｉｎｄ（登録商標）ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｃｏｌｕｍｎ上に負荷した。２回洗浄した後、カラムを乾燥させ、ＤＮＡを溶離緩衝液中で２回溶離した。
【００８６】
精製後、ベクターおよび挿入物を１：３の化学量論比で混合した。２つのＤＮＡ断片のライゲーションを、Ｉｎｓｔａｎｔ  Ｓｔｉｃｋｙ−ｅｎｄ  Ｌｉｇａｓｅ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｍ０３７０；Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を用いて触媒した。ライゲートした産物をＸＬ１−Ｂｌｕｅ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（＃２００２４９，Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）内へと形質転換した。形質転換のために、ＤＮＡを細菌懸濁液へ添加し、氷上で１０分間インキュベートした。その後、細胞を４２℃で４５秒間の熱ショックによって透過性にした。氷上で２分間のインキュベーション後、Ｓｕｐｅｒ  Ｏｐｔｉｍａｌ  Ｂｒｏｔｈ培地（ＳＯＣ培地）を添加し、細菌を３７℃で１時間振盪させながらインキュベートした。細菌懸濁液を、個々の抗生物質を含有するＬｙｓｏｇｅｎｙブロス培地（ＬＢ培地）アガープレート上で画線し、３７℃で一晩インキュベートした。
【００８７】
正確なコンストラクトについてスクリーニングするために、いくつかの細菌コロニーをミニプラスミド調製物について増大させた（以下の「０  ＤＮＡ調製物」を参照されたい）。単離されたプラスミドＤＮＡを制限消化によって切断し、ゲル電気泳動法によって分析した。
【００８８】
ＨＥＲＶ−Ｋコンストラクト（および対応する対照）のために、サブクローニングを実施して、関心対象の配列を含有するＤＮＡコンストラクト（ＤＮＡ＿ＩＳＤ突然変異体＿ｃｏＨＥＲＶ−Ｋ−Ｐ２ＴＳおよびＤＮＡ＿ｃｏＨＥＲＶ−Ｋ−Ｐ２ＴＳ）を、アクセプタープラスミド７６８（ＴｅｔＯ）−ＳＯ−ａｌｂ−ＣＩＤＲ内へと挿入した。これを行うために、挿入物およびアクセプターをまず、ＰＩＲ１およびＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞、ならびにカナマイシン選択マーカーおよびアンピシリン選択マーカーをそれぞれ用いて増幅した。コンストラクトはすべて、ＸｂａＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｒ０１４５）およびＳｗａＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｒ０６０４）をＮＥＢｕｆｆｅｒ（商標）３．１（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂ７２０３）と一緒に３７℃で１時間３０分使用して消化し、その理由は、ＮＥＢｕｆｆｅｒ３．１を用いるとＸｂａＩ酵素の活性が７５％に過ぎないからである。ＤＮＡを、１％アガロースゲル＋ＧｅｌＧｒｅｅｎ色素を用いた電気泳動法（１００Ｖ、２００Ａ、１時間）によって分離した。挿入物を含有するバンドおよび７６８（ＴｅｔＯ）を含有するバンドを切り出し、製造元の指針に従ってＥ．Ｚ．Ｎ．Ａ．（登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｏｍｅｇａ  ｂｉｏ−ｔｅｋ，Ｄ２５００）を用いて精製し、２０μＬの超純水（ＵＰＷ）中に溶離した。
【００８９】
コンストラクトをライゲートするために、４０ｎｇのアクセプターベクターおよび１２０ｎｇの各挿入物を、瞬間粘着末端リガーゼマスターミックス（２×）の１：２希釈物とともに３７℃で１５〜３０分間インキュベートした。ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞を用いて形質転換を行い、ミニ調製を用いてＤＮＡを取得した（以下に説明するとおり）。次に、検査切断を実施して、関心対象の配列がアクセプターベクター内へと適切に挿入されたかどうかを証明した。もしそうなら、新たな形質転換およびミディ調製（以下に説明するとおり）を実施して、より高濃度のＤＮＡを取得した。
【００９０】
ＰＣＲクローニング
サブクローニングとは対照的に、ＰＣＲクローニングは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）における挿入物の生成を特徴とする。標的配列を、特異的伸長プライマーを用いてドナーベクターからＰＣＲを介して増幅して、酵素制限部位を挿入する。プライマーをＴＡＧ  Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎに注文し、テンプレートおよびＰｆｕＵｌｔｒａ  ＩＩ  Ｈｏｔｓｔａｒｔｅｒ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（＃６００８５０，Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）と混合した。ＰＣＲを９５℃で２分間インキュベートすることによって開始して、Ｔａｑポリメラーゼを活性化させ、ＤＮＡテンプレートの完全な変性を促進した。初回のステップに続いて、９５℃での変性、６０℃でのアニーリングおよび７２℃でのＤＮＡ伸長を３０周期とした。ＰＣＲは、最終ステップを７２℃で３分間で完了して、ＤＮＡ伸長を終了する。
【００９１】
ＤＮＡを反応混合物からＥ．Ｚ．Ｎ．Ａ．Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｄ２５００；ＯＭＥＧＡ  ｂｉｏ−ｔｅｋ）プロトコル「酵素反応からの精製（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）」を用いて単離した。残余のゲノムＤＮＡを除去するために、精製されたＰＣＲ産物を、メチル化ＤＮＡを切断する酵素であるＤｐｎＩ（Ｒ０１７６，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）で処理した。ＤＮＡを、特異的制限部位での酵素消化に供し、Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ．Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製した。標的ベクターの消化およびライゲーションを、すでに説明したサブクローニングプロトコルにより実施した。
【００９２】
ＨＥＲＶ−Ｋコンストラクト（および対応する対照）の文脈において、相同組換えを用いて続行するために、ＨＥＲＶ−Ｋ  野生型／ＩＳＤ突然変異体配列の内側に含有されるＮｏｔＩ部位は、除去されなければならず、それにより、ＮｏｔＩはその後、プラスミドを正確に線状化するために使用されることができ、適切な組換えが可能であった。これを行うために、先に説明したサブクローニング手順から取得したいずれの配列（７６８（ＴｅｔＯ）−ＳＰ−ａｌｂ−ＣＳＰ−ＨＥＲＶ−Ｋ  野生型／ＩＳＤ突然変異体）も、ＮＥＢｕｆｆｅｒ（商標）３．１（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂ７２０３）と一緒にＸｂａＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｒ０１４５）およびＢｓｐＥＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｒ０５４０）を用いて３７℃で１．５時間切断し、ＧｅｌＧｒｅｅｎ色素を含有する１％アガロースゲル上での電気泳動法によって分離した。取り出されるべきＮｏｔＩ部位を含有するＤＮＡバンドを消化し、Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ．（登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて溶離した。
【００９３】
ＰＣＲ反応に使用した順方向プライマーは、ＨＥＲＶ−Ｋ  Ｅｎｖ配列の３’末端で、具体的にはＢｓｐＥＩ制限部位（５’−ＣＣＣＧＴＧＴＣＣＧＧＡＣＣＴＧＡＧ−３’、配列番号４５）でアニーリングしていたのに対し、逆方向プライマーは、ＨＥＲＶ−Ｋ  Ｅｎｖ配列の５’末端で、ＸｂａＩ制限部位（５’−ＧＴＴＣＴＡＧＡＣＴＴＧＴＣＣＴＧＡＡＴＴＴＴＣＴＧＧＴＴＡ−３’、（配列番号４６）でアニーリングしていた。逆方向プライマーは、ＮｏｔＩ部位における修飾を除去するために、該修飾を含有していた。プライマーをＴＡＧ  Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ  Ａ／Ｓ（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）から取得した。
【００９４】
１０ｎｇのテンプレートＤＮＡ（１ｎｇ／μＬ）、１０μＭの各プライマーおよび１：２希釈のＰｆｕＵｌｔｒａ  ＩＩ  Ｈｏｔｓｔａｒｔ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，６００８５０）を使用して、各ＤＮＡコンストラクトについて反応混合物を調製した。ＰＣＲ反応は、初回変性ステップ（９５℃、５分）、次いで、変性ステップ（９５℃、３０秒）、アニーリングステップ（５８℃、２５秒）、および最終伸長ステップ（７２℃、４５秒）を含む、３５周期のループからなった。最終的に、最後の伸長ステップを実施し（７２℃、１０分）、試料を４℃で保存した。
【００９５】
ＰＣＲ産物をアクセプタープラスミドと一緒にゲル電気泳動法によって分離し、所望のバンドを収集し、先に本明細書の「サブクローニング」の節において説明したとおり加工し、それゆえ、７６８（ＴｅｔＯ）−ＨＥＲＶ−Ｋ−Ｇａｇ−ｐ２Ａ−Ｅｎｖ野生型コンストラクトおよびＩＳＤ突然変異体コンストラクトを取得し、該コンストラクトは、それらの配列中にもはやＮｏｔＩ酵素についての制限部位を含有していなかった。
【００９６】
Ｇｉｂｓｏｎアセンブリ
Ｇｉｂｓｏｎアセンブリを使用して、いくつかのＤＮＡ断片を１つのコンストラクトへ組み込んだ。断片を伸長ＰＣＲによって増幅して、標的ベクターと相同のオーバーハングを付加した。ＰＣＲ産物をＰＣＲクローニングについて説明したとおり処理および精製した。標的ベクターを挿入部位での制限消化を介して開環した。断片をアセンブリするために、開環した標的ベクターおよび精製した挿入物を１：３の化学量論比で混合し、５０℃で１時間、Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｅ２６１１、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）とともにインキュベートした。Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘにおける３つの鍵となる酵素は、アセンブリを促進した。エキソヌクレアーゼは、ＤＮＡを断片の５’末端から取り出し、相同領域において他の断片とアニールする一本鎖の３’オーバーハングを創生する。ヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼによって残余の間隙中へと挿入される。最終的に、ＤＮＡリガーゼは、アセンブリしたＤＮＡにおいてニックを接合する。先に説明したクローン化技術と同様に、アセンブリしたＤＮＡを細菌内へと形質転換した後、正確なコンストラクトについてスクリーニングした。
【００９７】
組換えアデノウイルスゲノムを生成するための相同組換え
アデノウイルスゲノム（Ａｄ５）内への標的遺伝子の挿入を、Ｅ．ｃｏｌｉにおける相同組換えによって実施した。相同領域を有する７６８ｔｅｔから標的ベクターまでの挿入物（標的遺伝子）を、制限消化を介して切り出し、ゲル電気泳動法によって精製した。アクセプターベクターである捕獲ｐＢＧＨ（Ａｄ５ゲノム）を同様に、制限消化によって線状化した。再ライゲーションを防止するために、切断ベクターをＣＩＰ処理へ供した（サブクローニングを参照されたい）。その後、ベクター−ＤＮＡをエタノール沈殿によって精製した。簡潔には、ＤＮＡを０．３Ｍ酢酸ナトリウムおよび７０％エタノール中に沈殿させ、−８０℃で２０分間凍結させ、１６．０００ｇで１５分間（４℃）遠心分離した。ペレットを７０％エタノール中で洗浄し、さらに５分間遠心分離した。室温（ＲＴ）で乾燥させた後、ＤＮＡを水中に再懸濁した。さらなる再ライゲーションを防止するために、アデノシンオーバーハングを、ＴｅｍｐａｓｅホットスタートＤＮＡポリメラーゼ（＃２３０３０６、Ａｍｐｌｉｑｏｎ）を用いて生成した。その後、ＤＮＡを、フェノールクロロホルム抽出を介して精製した。この目的のために、フェノールクロロホルムを反応混合物へ添加した後、１６．０００ｇで１０分間遠心分離した。上部の水相を新たな反応チューブへ移し、ＤＮＡを先に説明したとおり、エタノール沈殿によって抽出した。
【００９８】
ベクターおよび挿入物を相同組換えによって組み込むために、両方の成分を１：３の化学量論比で混合し、電気穿孔受容能力を持つＢＪ５１８３細胞へ添加した。細菌を電気穿孔キュベット（＃１６５２０８６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）へ移し、遺伝子パルサー機（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）内での２５μＦＤ、２．５ｋＶおよび２００Ωでの電気穿孔法によって透過性にした。電気穿孔後、細胞をＳＯＣ培地中に移し、熱ショックプロトコルにおいて説明したとおりさらに処理した（「サブクローニング」を参照されたい）。
【００９９】
次のプラスミドをＳｉｒｉｏｎ  ｂｉｏｔｅｃｈによって提供した。
【０１００】
ｃＤＮＡ＿ＨＥＲＶ−Ｋ（Ｇａｇ＿ｐ２Ａ＿Ｅｎｖ）
ｃＤＮＡ＿ＨＥＲＶ−Ｋ（Ｇａｇ＿ｐ２Ａ＿Ｅｎｖ−（Ｑ６Ａ）ＩＳＤ−突然変異体）。
【０１０１】
同じコンストラクトだがＡｄ１９ａベクターによってコードされたものもＳｉｒｉｏｎによって提供された。
【０１０２】
ｃＤＮＡコンストラクトを増幅し、ワクチンとして使用されることができる上述の配列についてコードするＡｄ５ベクターを取得する究極的な目的のクローン化戦略のために、ＤＮＡワクチンおよび挿入物ベクターとして使用した。具体的には、ｈＡｄ５（および対応する対照）においてコードされたＨＥＲＶ−Ｋコンストラクトについて、関心対象の遺伝子を、Ｅ１遺伝子およびＥ３遺伝子における欠失を有するヒトＡｄ５ゲノムをコードするｐＢＧＨプラスミド内へとクローン化した。導入遺伝子をＥ１の代わりに、関心対象の遺伝子をコードする７６８ｔｅｔプラスミドを用いた相同組換えによって挿入した。この戦略を選択したが、その理由は、制限消化およびライゲーションを用いた従来のクローン化が非常に有効ではなく、ｐＢＧＨベクターが、３８ｋｂｐを超える非常に大きなプラスミドであるからである。
【０１０３】
７６８ｔｅｔとｐＢＧＨ捕獲プラスミドとの間の相同組換えをＥ．ｃｏｌｉにおいて実施した。捕獲ベクターは、関心対象の遺伝子によって置き換えられることになる挿入物として緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）を含有していた。
【０１０４】
ヒトＡｄ５ゲノムについてコードするｐＢＧＨプラスミドが大き過ぎて（＜３８ｋｂｐ）、制限酵素消化を使用して所望のコンストラクトを挿入する通常のクローン化戦略を取ることができないので、相同組換えを使用して、Ｅ１の代わりにｐＢＧＨプラスミドを挿入した。
【０１０５】
まず、ｐＢＧＨアクセプターベクターを、ＳｗａＩ酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ，Ｒ０６０４）を３７℃で２時間用いて線状化した。その間、７６８（ＴｅｔＯ）−ＨＥＲＶ−Ｋ−Ｇａｇ−ｐ２Ａ−Ｅｎｖ野生型およびＩＳＤ突然変異体をＮｏｔＩ酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ，Ｒ３１８９）で１時間消化した。反応産物を、ＧｅｌＧｒｅｅｎを含有する１％アガロースゲル中での電気泳動法によって分離した。組換えに必要とされる相同領域によって隣接されたＨＥＲＶ−Ｋ配列をゲルから回収し、ＤＮＡを、製造元の指針に従って、Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ．（登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｏｍｅｇａ  ｂｉｏ−ｔｅｋ，Ｄ２５００）を用いて単離し、ＵＰＷ中に溶離した。
【０１０６】
ｐＢＧＨを消化した後、３’末端および５’末端の両方を、Ｃａｌｆ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（３０分、３７℃、Ｍ０２９０）を用いてリン酸化して、再ライゲーションを防止した。次に、ベクターは、０．３Ｍ酢酸ナトリウムおよび７０％（ｖ／ｖ）エタノール中でのエタノール沈殿を−８０℃で２０分間受けた。直後に、試料を遠心分離し（１５分、４℃、１６，０００ｇ）、ペレットを７０％（ｖ／ｖ）エタノールで洗浄した。ベクターは、さらなる遠心分離（５分、４℃、１６，０００ｇ）を受け、結果として生じたペレットをＲＴで乾燥させておき、最終的にはＵＰＷ中で再懸濁した。
【０１０７】
ｐＢＧＨベクターのさらなる再ライゲーションを防止するために、Ｔｅｍｐａｓｅ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｐｌｉｑｏｎ，Ａ２３０３０６）で７２℃で３０分間処理し、これはアデノシンオーバーハングを付加した。フェノール／クロロホルムを添加し、遠心分離して（１０分、４℃、１６，０００ｇ）、ＤＮＡを精製し、次にＤＮＡを含有している上部の水相を微量遠心チューブへ移した。ＤＮＡは、以前と同様にエタノール沈殿を受けて、ＤＮＡをさらに精製し、このＤＮＡをＵＰＷ中へと希釈した。
【０１０８】
プラスミドはすべて、溶離緩衝液ではなく水中で保存したが、その理由は含塩量が電気穿孔法の効率性に干渉するからである。ｐＢＧＨベクターおよびＨＥＲＶ−Ｋ野生型／ＩＳＤ突然変異体挿入物を１：３のモル比で、電気穿孔受容能力を持つＢＪ５１８３細胞（Ａｇｉｌｅｎｔ，２００１５４）と一緒に合わせた。次に、この混合物を電気穿孔キュベット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，１６５２０８６）へと移し、これを用いて、２５μＦＤ、２．５ｋＶおよび２００Ωで遺伝子パルサー機（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で細胞を透過性にした。その後、ＳＯＣ培地を添加して、形質転換後のＥ．ｃｏｌｉ受容能力保持細胞を回収した。次に、該細胞を振盪中のインキュベーターで３７℃で１時間インキュベートした。最終的に、この混合物を、カナマイシンを含有するＬＢアガープレート上へ播種し、３７℃で一晩インキュベートした。
【０１０９】
相同組換えが適切に実施されたことを確認するために、ＤＮＡを本明細書でいかに説明するようなミニ調製を用いて単離した。次に、このＤＮＡを制限酵素を用いて消化し、ＧｅｌＧｒｅｅｎ色素を含有する１％アガロースゲル中で分離した。ｐＢＧＨおよび挿入物についての正確な大きさに対応するバンドを切り出し、Ｅ．ｃｏｌｉ内へと形質転換し、最終的にこのＤＮＡを、後述のとおりミディ調製を経て再度単離した。
【０１１０】
ＤＮＡ調製
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）形質転換
形質転換のため、化学的に受容能力を持つＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  Ｓｕｐｅｒｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ，２００２３６）およびＯｎｅ  Ｓｈｏｔ（商標）ＰＩＲ１  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃ１０１０１０）を使用した。２０μＬの後者を１０ｎｇのプラスミドＤＮＡと一緒にまとめて混合し、氷上で３分間維持した。その後、この混合物にＷａｔｅｒｂａｔｈ  ＴＷ８０（Ｊｕｌａｂｏ）で４２℃で４５秒間熱ショックを与え、再度氷上で３分間置いた。直後に、２００μＬのＣａｔａｂｏｌｉｔｅ抑制（ＳＯＣ）培地（２０ｇトリプトン、５ｇ酵母抽出物、０．５８ｇ  ＮａＣｌ、０．１９ｇ  ＫＣｌ、３．９６ｇグルコースおよび５．０４ｇ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）含有の２００μＬのＳｕｐｅｒ  Ｏｐｔｉｍａｌ  Ｂｒｏｔｈを試料へ添加し、これを振盪中のインキュベーター内へ入れ、３７℃で１時間置いた。最終ステップは、本発明者らのプラスミドが耐性を有する、対応する抗生物質（アンピシリン（Ａｍｐ）：１００μｇ／ｍＬ、カナマイシン（Ｋａｎ）：５０μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢアガープレート上へ試料を播種することからなり、Ｅ．ｃｏｌｉアガープレート（Ｂｉｎｄｅｒ）についてはインキュベーター内へ入れ３７℃で一晩置いた。
【０１１１】
アガロースゲル電気泳動法
形質転換が正確に実施されたかどうかをチェックするために、ＤＮＡを精製されたコンストラクトを、臭化エチジウムまたはＧｅｌＧｒｅｅｎ（商標）色素（Ｂｉｏｔｉｕｍ，４１００４）を含有する１％（ｗ／ｖ）アガロースゲル上で泳動して、紫外（ＵＶ）光の下でＤＮＡを可視化することができた。１×ローディング緩衝液（６×）を試料へ添加し、この試料をサイズマーカーＧｅｎｅＲｕｌｅｒ  １ｋｂ  Ｐｌｕｓ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＳＭ１３３１）と一緒にゲルへ負荷した。使用する緩衝液は、トリス−酢酸−エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（ＴＡＥ）緩衝液（４．８６ｇ／Ｌ  Ｔｒｉｚｍａ（登録商標）塩基、０．３７ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＥＤＴＡ・２Ｈ２Ｏ、および０．１１％（ｖ／ｖ）酢酸、ｐＨ＝８．３）とした。電気泳動法を１２０Ｖで１時間、電気泳動用電源ＥＰＳ３５０１ＸＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて実施した。
【０１１２】
ミニ調製
クローン化後の正確なコンストラクトについてスクリーニングするために、ＤＮＡの小規模増幅を実施した。細菌コロニーを３ｍＬまたは５ｍＬのＬＢ培地（関心対象のプラスミドにおける耐性遺伝子によって対応する抗生物質Ａｍｐ１００μｇ／ｍＬまたはＫａｎ５０μｇ／ｍＬを含有）内へと移し、３７℃で一晩生育させた。プラスミドＤＮＡの単離を、Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ．（登録商標）Ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ  Ｉ（Ｄ６９４３，Ｏｍｅｇａ  ｂｉｏ−ｔｅｋ）を用いて実施した。簡潔には、細菌を遠心分離によってペレットにし、ＲＮアーゼ含有溶液Ｉ（再懸濁緩衝液）中で再懸濁した。溶液ＩＩ（溶解緩衝液）を添加してＤＮＡを細胞から放出した。反応を終止させ、ゲノムＤＮＡを細胞デブリとともに沈殿させるために、溶液ＩＩＩ（中和緩衝液）を添加した。沈殿物を遠心分離によってペレットにし、上清をＨｉＢｉｎｄ（登録商標）ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｃｏｌｕｍｎへと移した。遠心分離によってＤＮＡをカラム膜へ結合させ、かつＨＢ緩衝液を添加した後、カラムをＤＮＡ洗浄緩衝液で２回洗浄し、その後乾燥させた。最終的に、プラスミドＤＮＡを溶離緩衝液中に溶離させた。
【０１１３】
ミディ調製
より多量かつより精製されたＤＮＡ収量を得るために、１００ｍＬのＬＢ培地（ここでも適切な抗生物質を含有）中で一晩生育させたＥ．ｃｏｌｉから、ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ（登録商標）Ｘｔｒａ  Ｍｉｄｉキット（＃７４０４１０，ＡＨ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いてミディ調製を行った。原理は、細菌を再懸濁および溶解することで出発するミニ調製と同様であった。中和後、溶解物を、平衡化したＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ（登録商標）Ｘｔｒａ  Ｃｏｌｕｍｎ上に負荷し、平衡化緩衝液で洗浄した。残余の細胞デブリを含有する挿入されたカラムフィルターを取り出し、カラムを洗浄緩衝液で洗浄した。ＤＮＡを溶離緩衝液中に溶離し、その後、イソプロパノール中で沈殿させた。沈殿したＤＮＡを遠心分離によってペレットにし、７０％エタノールで洗浄した。追加の遠心分離ステップの後、上清を取り出し、ＤＮＡペレットをＲＴで乾燥させた。ＤＮＡを１００μＬの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）中にまたはＥ．Ｚ．Ｎ．Ａ．（登録商標）Ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔからの１００μＬの溶離緩衝液で再構成して、濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）２０００で決定した。
【０１１４】
２．６  ウイルス作製
異なるウイルスを本実験で作製および検査した（表２）。通常の組換えアデノウイルスに加えて、表面上に組換えｐＩＸを提示するＡｄ５ベクターが検査され、異なる手順で作製されなければならなかった。
【０１１５】
【表３−１】
2020531053.tif 000047
【表３−２】
2020531053.tif 000048
【表３−３】
2020531053.tif 000049
【０１１６】
改変型ＩＳＤを有するＭｅｌＡＲＶ  Ｅｎｖ蛋白質の配列
Ｅｎｖ蛋白質は、次の配列（配列番号４１）を有する。
【０１１７】
【化３０】
2020531053.tif 000050
【０１１８】
配列は、ＩＳＤ配列における灰色の背景文字において元のＥからＲへと、および灰色によってまた標識されるＩＳＤの外側の第３のアミノ酸においてＡからＦへと交換することによって改変されている。
【０１１９】
組換えＡｄ５生成
Ａｄ５生成の出発点は、アデノウイルスゲノムプラスミド捕獲ｐＢＧＨである。プラスミドは、感染性Ａｄ５粒子の形成に必要とされる遺伝子をすべて含有しているが、遺伝子Ｅ１およびＥ３が欠失している。Ｅ１は、ウイルス複製に必要とされ、代わりに、産生細胞株ＨＥＫ２９３／アデノウイルス毒素産生によって提供される（Ｋｏｖｅｓｄｉ，Ｉ．ａｎｄ  Ｓ．Ｊ．Ｈｅｄｌｅｙ，Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｐｒｏｄｕｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｖｉｒｕｓｅｓ，２０１０．２（８）：ｐ．１６８１〜７０３）。Ｅ３は、ウイルス産生に非必須の遺伝子であり、該ゲノム内で欠失しており、組換え標的遺伝子のための空間を創生する。捕獲クローン化の過程（「０  組換えアデノウイルスゲノムを生成するための相同組換え」を参照されたい）で、これらの標的遺伝子は、相同組換えを介してベクター内へと挿入される。標的蛋白質を捕獲ｐＢＧＨ内へクローン化することおよび後続のウイルス産生の過程を図５に要約する。
【０１２０】
アデノウイルス毒素産生細胞を組換え捕獲ｐＢＧＨベクターに感染させた。この目的のため、細胞をＴ７５培養フラスコへと播種し、５０〜７０％培養密度まで生育させた。ベクターＤＮＡをＰＩ−ＳｃｅＩ緩衝液中でＰＩ−ＳｃｅＩ（＃Ｒ０６９６Ｓ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を用いた３７℃で１時間の制限消化によって線状化した。その後、フェノールクロロホルム精製を「捕獲クローン化」において説明したとおり実施し、ＤＮＡをＯｐｔｉＭＥＭ（＃１１０５８−０２１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に溶解した。ＤＮＡ溶液の一部を１％アガロースゲル上に負荷し、プラスミドの正確な切断を確認した。残余のＤＮＡをポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と、１：３のＤＮＡ：ＰＥＩ比で混合した。ＲＴで１５分間インキュベートした後、混合物をアデノウイルス毒素産生細胞へ滴下して添加した。トランスフェクトした細胞を正常細胞培養条件下でインキュベートした（「エラー！参考文献の元が見当たらない。細胞培養」を参照されたい）が、培地は１６時間後およびその後２〜３日ごとに交換した。細胞溶解物が剥離細胞によって明白と視認することができたとき（２〜３週間後）、溶解した細胞を含有する細胞培地（「ウイルス溶解物」と呼ぶ）を収集し、−８０℃で保存した。
【０１２１】
次のステップにおいて、細胞を「ウイルス溶解物」に再感染させて、「３日間溶解物」を取得した。この目的のため、アデノシン毒素産生細胞を６ウェルプレート内で、７０％培養密度まで生育させ、ウェルからウェルへと「ウイルス溶解物」の１：１０連続希釈で感染させた。感染３日後、最も希釈した完全に溶解したウェルの上清を収穫し、−８０℃で凍結させた。このウイルス試料を「３日間溶解物」と呼んだ。
【０１２２】
このウイルスを大規模で産生するために（「大規模溶解物」）、アデノシン毒素産生細胞を４つのＮｕｎｃ（商標）Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｔｒｅａｔｅｄ  ＴｒｉｐｌｅＦｌａｓｋｓ（商標）（５００ｃｍ２）（＃１３２９１３、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）内へと播種した。細胞が７０％培養密度に到達したとき、フラスコを１５０μＬの「３日間溶解物」に感染させた。細胞の完全な溶解後（およそ３日間）、上清を収穫し、−８０℃で凍結させた。
【０１２３】
組換えＡｄ５精製
ウイルス精製の第１のステップにおいて、収穫した大規模溶解物へ０．５％のＩｇｅｐａｌ  ＣＡ−６３０（＃５６７４１、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した。ＲＴで１０分間のインキュベーションの間、界面活性剤は、残存する細胞の破壊および培地中へのウイルス含有物の放出を生じた。細胞残渣を除去するために、溶解物を１２１８６ｇで４℃で２０分間遠心分離した。上清を回収し、容積の半分を２０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）＋２．５Ｍ  ＮａＣｌ溶液として添加し、次いで、４℃で一晩緩徐に振盪させた。このステップの間、上清中のウイルスを沈殿させ、これは、次のステップにおいてウイルスの濃縮を可能にした。沈殿したウイルスを１２１８６ｇで２０分間の遠心分離によってペレットにした。ウイルスペレットを５ｍＬの冷リン酸塩類緩衝液（ＰＢＳ）中で再懸濁し、１５ｍＬのファルコンチューブへ移した。この試料を７８４ｇで５分間遠心分離して、残存する細胞残渣を除去した。上清を新品の１５ｍＬファルコンチューブへ移し、先の遠心分離ステップを、完全には除去することができない細胞残遺物の少量のペレットしかチューブ内に存在しなくなるまで数回反復した。ウイルス含有上清にほとんどの飽和ＣｓＣｌ溶液を添加して、１．３４ｇ／ｍＬの最終密度に到達した。結果として生じる溶液を超遠心分離チューブ（＃３４２４１３、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）へと移し、その後密封し、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｔｉ  ７０．１ロータにおいて２５７，３００ｇで一晩遠心分離した。明確に視認できるウイルスバンドを針および注射器で抽出し、平衡化したＰＤ−１９脱塩カラム（＃１７−０８５１−０１、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に負荷した。フロースルー画分を７０％グリセロール中に回収し、グリセロール終濃度は１０％であった。最大ウイルス濃度（最大濁度）の画分をプールし、分注し、−８０℃で保存した。ウイルスの分注物を解凍して凍結するのは２回までとした。
【０１２４】
ｐＩＸ上で抗原を提示する組換えＡｄ５ベクターの生成および精製
Ａｄ５−ｐＩＸウイルスの生成を、通常の組換えＡｄ５ウイルスとは異なる戦略を用いて実施した。産生細胞株は、先に説明したＨＥＫ２９３（ＣＣＳ）−ｓｈｍｉｒ−ｐＩＸ＿２２１−ピューロ細胞株（ｐＩＸ細胞）とした。ｐＩＸ細胞を１７５ｃｍ２フラスコ内へ播種し（ウイルス１つにつき４つのフラスコ）、７０％培養密度まで生育させた。組換えｐＩＸ蛋白質を生成するために、細胞に、ｐＩＸを遺伝子融合によって組換え蛋白質にカップリングさせたｐｃＤＮＡ３＿ｐＩＸプラスミドをトランスフェクトした。ドキシサイクリンを培地に添加（０．５μｇ／ｍＬ）した後、トランスフェクトし、このことは、未処置のｐＩＸの翻訳を阻害するｐＩＸ特異的ｓｈＲＮＡの転写を誘導した。細胞培養用培地をトランスフェクションの１８時間後に交換し、ドキシサイクリンを再度添加した。その後、細胞に５ＭＯＩ（感染多重度）の個々の基部アデノウイルス（関心対象の組換え蛋白質についてコードするアデノウイルス）を感染させた。ウイルスの複製は、ウイルスの細胞変性効果が視認できるまで、通常の培養条件下で４８時間行わせた。細胞を収集し、７５０ｇで１０分間の遠心分離によってペレットにした。ペレットを０．５％デオキシコール酸ナトリウム含有ＰＢＳ中で再懸濁し、ＲＴで３０分間インキュベートして、細胞を分解し、ウイルスを放出した。産生細胞株からのゲノムＤＮＡを消化するために、０．２Ｍ  ＭｇＣｌ２および０．０５ｍｇ／ｍＬ  ＤＮＡｓｅ  Ｉ（Ａ３７７８、ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ）を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。細胞デブリを３０００ｇで１５分間の遠心分離によって除去し、ＣｓＣｌをウイルス含有上清に添加して、終濃度を１．３４ｇ／ｍＬとした。ウイルスをＡｄ５精製について先に説明したとおり、ＣｓＣｌ勾配において超遠心分離した。抽出したウイルスバンドを透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ，３００ｋＤａ，＃１３１４５０，Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＣＥ  Ｔｕｂｉｎｇ）へ移し、ＰＢＳ中で４℃で一晩透析した。最終的に、ウイルスを１０％グリセロール中で分注し、−８０℃で保存した。
【０１２５】
ウイルス滴定
実験の再現性のため、精製されたウイルスを滴定して、１ｍＬあたりの感染単位数（ＩＦＵ／ｍＬ）を取得した。平底△処理した表面の９６ウェルプレートをポリリジンで１５分間コーティングし、ＰＢＳで３回洗浄した。ＨＥＫ２９３細胞をウェル中へ、１００μＬの培地中の５×１０４個の細胞濃度で播種した。ウイルスを培地中で１０倍連続希釈で希釈し、１：５０の希釈で出発した。５０μＬの希釈因子５×１０４〜５×１０７を９６ウェルプレート中の細胞懸濁液へ二つ組で添加した。感染細胞を通常の細胞培養条件下で４８時間インキュベートした。培地を除去した後、ウェルをＲＴで乾燥させ、細胞を冷メタノールで−２０℃で１０分間固定した。その後、ウェルを、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳで３回洗浄した。ウイルス感染細胞を検出するために、抗Ａｄ５ヘキソン抗体（１Ｅ１１、＃ｓｃ−５１７４６、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をＰＢＳ＋ＢＳＡ中に１：１０００の希釈で添加し、３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳ＋ＢＳＡで３回洗浄した後、ＰＢＳ＋ＢＳＡ中に１：５００希釈した、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合したマウス免疫グロブリンに対する二次抗体（＃Ｐ０４４７、Ｄａｋｏ）を、ウェル中で３７℃で１時間インキュベートした。残余抗体を洗い出し、ウイルスプラークを３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）基質を用いてＲＴで１０分間可視化した。
【０１２６】
ウイルスの力価を決定するために、適切な希釈のプラークを２０倍の倍率の顕微鏡下で計数した。およそ１００個のプラークが検出されるまで、いくつかの視界を各ウェルにおいて計数した。１ｍＬあたりのＩＦＵの最終数を、次式を用いて計算した。
【０１２７】
【数５】
2020531053.tif 000051
【０１２８】
【数６】
2020531053.tif 000052
＝１視野あたりの平均プラーク数（計数されたプラーク総数／計数された視野）、ＶＦ＝２０倍の倍率での１ウェルあたりの視野数（５２．７視野／ウェル）、ＤＦ＝計数されたウェルにおけるウイルスの希釈因子（例えば、５００，０００×）、Ｗ＝１ｍＬのウイルス希釈物あたりの感染ウェル数（１０００μＬ／ｍＬ／５０μＬ／ウェル＝２０ウェル／ｍＬ）、Ｐ＝プラーク数。
【０１２９】
追加の品質管理として、１ｍＬ当たりの感染単位の測定された濃度（ＩＦＵ／ｍＬ）をウイルス粒子（ＶＰ）計数と比較した。ＶＰ／ｍＬをＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）２０００を用いて、２６０ｎｍにおける吸光度を測定することによって決定した。１単位の吸光度は、１０１２ＶＰ／ｍＬの濃度に相当する。ＩＦＵ／ｍＬとＶＰ／ｍＬとの比は、ウイルスの生存度を示し、理想／典型比は１：３０〜１：１００であった。
【０１３０】
組換えＡｄ５からのゲノムＤＮＡ精製
組換えアデノウイルスからのＤＮＡの単離を実施して、アデノウイルスゲノムへの組換え遺伝子の正確な挿入を確認した。ＤＮＡをＧｅｎＥｌｕｔｅ（商標）Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｇ１Ｎ７０、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で、改変プロトコルを用いて抽出した。この目的のため、１００μＬの精製されたウイルス試料を１００μＬの再懸濁溶液と混合した。プロテイナーゼＫおよび溶解溶液Ｃを添加した後、７０℃で１０分間インキュベートした。９６％エタノールを添加した後、溶液を、調製された上に負荷した。その後のステップは、元のプロトコルに従ったが、２回の洗浄ステップおよびその後のカラムの乾燥があった。ウイルスＤＮＡを溶離溶液中に溶離した。ウイルスの質的確保のため、ＤＮＡを配列決定のために送付して（ＧＥＮＥＷＩＺ  ＵＫ  Ｌｔｄ．）、相同組換えの領域における突然変異を除外した。加えて、ウイルスＤＮＡを制限酵素で切断して、ゲル電気泳動法によって正確なバンドの大きさを確認した。
【０１３１】
ＶＬＰの生成および精製
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の生成および精製を主として、ＶＬＰをコードするワクチンの機能性を検査するために行った。１×１０７個の細胞密度で１７５ｃｍ２培養フラスコ内へ播種し、２時間インキュベートして付着させておいたベロ細胞において、ＶＬＰ生成を検査した。その後、細胞に５０ＭＯＩのＡｄ５（５×１０８個のＩＦＵ／フラスコ）を５時間感染させた。培地を除去した後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、無血清培地中で４８時間インキュベートした。上清（ＳＮ）を２８２ｇで１０分間遠心分離し、０．４５μＭの膜で濾過して、細胞混入物を除去した。開口３２ｍＬ肉厚チューブ（＃３５５６３１、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いたＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｔｉ  ７０ロータにおいて８２．７００ｇで２０％スクロースクッションを経てペレットにすることによって、ＶＬＰを精製した。ＳＮを除去し、ペレットを１００μＬのＰＢＳ（１６０×元の濃度）中で再懸濁した。
【０１３２】
ＨＥＲＶ−Ｋ−Ｇａｇ−ｐ２Ａ−Ｅｎｖ野生型（ＷＴ）／ＩＳＤ突然変異体についてコードするＡｄｖワクチンを、ＶＬＰを生成することができる機能的蛋白質へと翻訳し、細胞溶解物を感染細胞から生成し、ＶＬＰを細胞培養上清（ＳＮ）から精製した。
【０１３３】
ベロ細胞株、Ａ５４９細胞株、およびＨＥＫ２９３細胞株を使用して、ＶＬＰを生成および精製した。１０×１０６個のベロ細胞、１０×１０６個のＡ５４９細胞または１０×１０５個のＨＥＫ２９３細胞を１日後にＴ１７５（１７５ｃｍ２）フラスコにおいてまたはＴ２５（２５ｃｍ２）フラスコにおいて播種し、ＨＥＫ細胞の場合、対応する培地を含有していた。２時間後、関心対象の本発明者らの配列（表２ｂを参照されたい）についてコードする異なるウイルスベクターを、所与の感染についてのビリオン／細胞の数を示す５０または２０（ＨＥＫ２９３）の感染多重度（ＭＯＩ）を用いて細胞に感染させた。５時間後、ｐＨ７．４で８ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、０．２ｇ／Ｌ  ＫＣｌ、１．１５ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．２ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４を含有するリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）で細胞を２回洗浄した。次に、培地を対応する細胞培地と交換したが、ＦＢＳ非含有とした。細胞を最適な維持条件内で４８時間、またはＨＥＫ２９３細胞を用いるときは１６時間インキュベートした。
【０１３４】
その後、細胞培養物からＶＬＰを取得するために、２つの異なる手順に従った。その一方で、細胞により分泌されるＶＬＰを生成および分析するために、ＳＮを維持した。その一方で、細胞を溶解して、細胞内へと含有されたＶＬＰを分析した。
【０１３５】
第１の手順について、細胞を１２０００ｒｐｍで１０分間４℃で遠心分離し、上清を０．４５μｍ膜（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，１６５５５）で濾過して、細胞不純物を除去した。１３．５ｍＬのＳＮを、開口３２ｍＬ肉厚超遠心分離チューブ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、３５５６３１）の中のＰＢＳ中に溶解した２０％（ｗ／ｖ）スクロース３ｍＬに滴下して添加した。チューブを等容積について秤量し、Ｔｉ７０ロータ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、３３７９２２）内へ入れ、これを８２．７００ｇ、４℃、２．５時間に設定した超遠心分離へと導入した。終了すると、ＳＮを注意深く除去し、残余のペレットを１００μＬ  ＰＢＳ中で再懸濁し、−２０℃で保存した。
【０１３６】
第２の手順は、冷ＰＢＳ洗浄の第１のステップからなった。次に、１０ｍＬの冷ＰＢＳをこのフラスコに添加し、細胞を機械的に掻把した。４ｍＬを１５ｍＬコニカルチューブへと移し、４℃、１２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ＳＮを廃棄し、７μＬ／ｍＬプロテアーゼ阻害薬カクテル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐ８３４０）を有する１３００μＬのＮＰ４０細胞溶解緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＦＮＮ００２１）を含有する混合物を各チューブに添加した。次に、チューブを氷上で３０分間放置しておいたが、Ｓｈａｋｅｒ  Ｖｏｒｔｅｘ  ３（ＩＫＡ）を用いて１０分間ごとにボルテックスした。最終的に、チューブを４℃、１３．０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、細胞デブリを除去し、ＳＮを新たなチューブへ移し、−２０℃で保存した。
【０１３７】
【表４】
2020531053.tif 000053
【０１３８】
ＭＶＡ生成および滴定
ＭＶＡの生成、精製および滴定のための手順は、Ｓｔａｉｂ  ｅｔ  ａｌ．２００４によって説明される指針を用いて実施した。この実験を実施するのに使用されるＨＥＲＶ−Ｋ  ＧａｇまたはＥｎｖ蛋白質シード溶解物を発現する出発ＭＶＡは、Ｂａｒｂａｒａ  Ｓｃｈｎｉｅｒｌｅ博士教授（Ｌａｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって提供された。１７５ｃｍ２フラスコを用いて大規模にＭＶＡを生じる前に、ウイルスの量をこれもまた１７５ｃｍ２フラスコを用いて小規模で増量し、いずれの場合もＣＥＦ細胞で播種した。
【０１３９】
この場合、ＭＶＡ滴定をＢＨＫ−２１細胞において実施した。１：１０００希釈した一次ポリクローナルウサギ抗ワクシニアウイルス（ＢｉｏＲａｄ、９５０３−２０５７）および１：５００希釈した二次ＨＲＰ結合ポリクローナルヤギ抗ウサギＩｇ抗体（Ｄａｋｏ、Ｐ０４４８）を用いて、感染細胞を検出した。力価（ＩＦＵ／ｍＬ）を決定するために、染色した病巣の数をおよそ２０〜１００ウイルス病巣／ウェルの希釈試料に関して計数し、精確性を最大限にした。
【０１４０】
動物実験
６〜８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス、Ｂａｌｂ／Ｃマウス、およびＣＤ１マウスをＴａｃｏｎｉｃ（Ｃ５７ＢＬ／６）またはＥｎｖｉｇｏ（Ｂａｌｂ／ＣおよびＣＤ１）から取得した。マウスを１週間順化させておいた後、実験を開始した。実験はすべて、国の動物実験検査官（デンマーク語で動物実験検査官（Ｄｙｒｅｆｏｒｓｏｇｓｔｉｌｓｙｎｅｔ））によって承認された国の指針および実験プロトコルにより実施した。
【０１４１】
血清試料の分離
血清試料を取得するために、全血量のおよそ１０％をマウスから顔面静脈をＧｏｌｄｅｎｒｏｄ  ｌａｎｃｅｔを用いて穿刺することによって採取した。
【０１４２】
あるいはマウスの最終出血（完全出血）のために、動物に１０ｇマウスあたり１００μＬの用量の、ＰＢＳ中の１ｍｇ／ｍＬキシラジンおよび１０ｍｇ／ｍＬケタミンを腹腔内（ｉ．ｐ．）注射して麻酔した。顔面静脈を穿刺することによって血液の最大量を採取し、マウスをその後頸椎脱離によって安楽死させた。
【０１４３】
ＨＥＲＶ−Ｋ実験において、全血心穿刺のために、マウスにイソフルラン全身麻酔をかけた。直後に、イソフルランを継続して供給する顔用マスクを着けてマウスを上向きにし、心穿刺を１ｍＬ注射器へ接続したＧ２７針を用いて実施した。およそ８００〜１０００μＬを収集し、マウスをその後、頸椎脱離によって安楽死させた。
【０１４４】
あるいはマウスにイソフルラン全身麻酔をかけた。このマウスを次に、不随意反射について検査し、何も示さないことを確認した後でのみ、最大血液量を片目から、具体的には眼窩洞を経て収集した。次に、マウスを優しく頸椎脱離することによって即時に安楽死させた。
【０１４５】
血液試料を４℃で一晩保存して、凝固させておき、血球を血清から、８００ｇで１０分間の２回の遠心分離によって除去した。次に、血清を−２０℃で保存した。
【０１４６】
注射：静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内
異なる注射手順を実施した。静脈内（ｉ．ｖ．）注射については、マウスを加温チャンバ内で加温し、表在性静脈血流を増大させた。最大２００μＬを尾静脈内へ注射した。ＨＥＲＶ−Ｋ関連実験において、１０６個のＲＬＺ  Ｇａｇ細胞およびＥｎｖ細胞（Ｂ．Ｓｃｈｎｉｅｒｌｅ由来）を含有する１００μＬの容積をマウスへ静脈内注射して、肺への転移を誘発させた。
【０１４７】
足裏（ｆ．ｐ．）への皮下（ｓ．ｃ．）注射をイソフルラン麻酔下で、３０μＬを足裏の皮膚の下に注射することによって実施した。ＨＥＲＶ−Ｋ実験については、この種類の注射を使用して、１０６個のＲＬＺ  Ｇａｇ細胞およびＥｎｖ細胞（Ｂ．Ｓｃｈｎｉｅｒｌｅ由来）を注射し（１００μＬで）、マウスにおける皮下腫瘍を成長させ、ＨＥＲＶ−Ｋ  Ｅｎｖを発現するマウス腫瘍モデルを確立した。
【０１４８】
筋肉内（ｉ．ｍ．）注射については、最大６０μＬ量を大腿筋へと注射した。
【０１４９】
ＨＥＲＶ−Ｋ実験の脈絡において、関心対象のワクチンを用いてマウスを免疫化（初回免疫）および追加免疫するために、この種類の注射を主として使用した（以下の表２ｃを参照されたい）。マウス１匹あたり５０μＬを、アデノウイルスまたはＭＶＡの予防接種／追加免疫それぞれのために使用した。注射を大腿筋で、鎮痛および筋弛緩の両方を付与するイソフルラン麻酔下で実施した。
【０１５０】
【表５】
2020531053.tif 000054
【０１５１】
５００μＬまでを腹腔内へ投与することによって、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射を実施した。
【０１５２】
予防接種
５回の異なる予防接種試行をマウスにおいて実施した。
【０１５３】
予防接種タイムラインＩ。Ｂａｌｂ／Ｃマウスを２回のＤＮＡ予防接種からなる初回免疫−追加免疫投与計画において予防接種した後、１回のＡｄ５予防接種を行い、またはＤＮＡもしくはＡｄ５のいずれか単独を行った。対照として、マウスにＰＢＳを注射した。Ａｄ５の予防接種の４週間後、血液試料を回収し、脾臓を数匹のマウスから分離した。その後、マウスにＣＴ２６腫瘍細胞を右腹側部に皮下負荷し、腫瘍成長を測定した。
【０１５４】
予防接種タイムラインＩＩ。Ｂａｌｂ／ＣマウスにＣＴ２６腫瘍細胞を皮下負荷した。マウスに負荷２日後（ｄ．２  ｐ．ｃ．）または負荷５日後のいずれかで（あらかじめＤＮＡで初回免疫）、Ａｄ５−ＭｅｌＡＲＶを予防接種した。加えて、１つの群にはｄ．２  ｐ．ｃ．で予防接種し、その後、腫瘍が触知可能になる（ｄ．８  ｐ．ｃ．）とすぐに、抗ＰＤ１抗体の４回注射を行った。対照群として、マウスにＰＢＳまたは抗ＰＤ１のみを注射した。
【０１５５】
予防接種タイムラインＩＩＩ。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに初回免疫−追加免疫投与計画で２回のＤＮＡ−ＭｅｌＡＲＶ注射により予防接種した後にＡｄ５予防接種を行った。血液試料を最後の予防接種の３週間後に採取し、マウスに２×１０５のＢ１６Ｆ１０−ＧＰ細胞を静脈内負荷した。肺における転移数を負荷の２週間後に決定した。
【０１５６】
予防接種タイムラインＩＶ。ＣＤ１マウスにまずＭｅｌＡＲＶｇａｇ＿ｐ２Ａ＿ｅｎｖ（ＤＮＡ−ＭｅｌＡＲＶ）またはＩＳＤ突然変異版ＭｅｌＡＲＶｇａｇ＿ｐ２Ａ＿ｅｎｖ＿ＩＳＤ（ＤＮＡ−ＭｅｌＡＲＶ−ＩＳＤ）についてコードするＤＮＡプラスミドを予防接種した。ＤＮＡ初回免疫に続いて、Ａｄ５−ＭｅｌＡＲＶまたはＡｄ５−ＭｅｌＡＲＶ−ＩＳＤのいずれかを用いたアデノウイルス予防接種を行った。血液試料を予防接種の４週間後に行い、血清抗体について分析した。
【０１５７】
予防接種タイムラインＶ：Ｃ５７ＢＬ／６マウスにアデノウイルスＡｄ５−ＭｅｌＡＲＶ＿ｐＩＸ−ｐ１５ＥまたはＡｄ５−ＭｅｌＡＲＶのいずれかを２回予防接種した。Ａｄ５−ＧＦＰを対照として使用した。その後、血液試料を採取し、マウスに２×１０５個のＢ１６Ｆ１０−ＧＰ細胞を静脈内負荷した。肺を負荷２週間後に分離し、転移について分析した。
【０１５８】
ＤＮＡ予防接種のために、５０μＬトリス／ＰＢＳ（１４２ｍＭ）中の５０μｇＤＮＡを筋肉内注射した。アデノウイルスを３０μＬ  ＰＢＳ中の２×１０８ＩＦＵで足裏へと注射した。ｐＩＸ改変型ウイルスを含む実験（ワクチンタイムラインＩＶおよびＶ）において、６０μＬＰＢＳ中の１０１０個のウイルス粒子を筋肉内注射した。ｐＩＸウイルスがより低濃度であることにより、足裏への少量の注射は可能ではなかった。
【０１５９】
別の実験には、腫瘍負荷マウスにおける抗ＰＤ１抗体（ＲＭＰ１−１４、＃ＢＥ０１４６、ＢｉｏＸＣｅｌｌ）の投与が含まれた（「０  腫瘍負荷」を参照されたい）。抗ＰＤ１を２００μＬＰＢＳ中の２００μｇ抗体とともに腹腔内注射で投与した。処置を、皮下成長している腫瘍が触知可能になった腫瘍負荷８日後に開始した。マウスに４回、４日間ごとに注射した（腫瘍負荷の８、１２、１６および２０日後）（Ｋｉｍ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｍｏｕｓｅ  ｃａｎｃｅｒｓ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｔｏ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｂｙ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍｙｅｌｏｉｄ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，２０１４．１１１（３２）：ｐ．１１７７４〜９およびＳｈｉｎｄｏ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ４−１ＢＢ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＰＤ−１  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｔｕｍｏｒ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２０１５．３５（１）：ｐ．１２９〜３６。
【０１６０】
ＨＥＲＶ−Ｋ実験において、Ａｄｖおよび／またはＭＶＡ追加免疫を、ＡｄｖまたはＤＮＡワクチンを用いた初回免疫（０日後）のおよそ４週間後または８週間後に実施した。血液試料を初回免疫予防接種の前および後（１４日後）の両方で採取した。また、マウスからＭＶＡ／Ａｄｖ／ＤＮＡ追加免疫の１４日後および２８日後に採血した。予防接種したマウスの液性応答（ＨＥＲＶ−Ｋ  Ｅｎｖに対する抗体の産生）を分析するために、血液試料を使用した。その上、マウスをＭＶＡ追加免疫１０日後に安楽死させ、細胞免疫応答（ＣＤ８＋  Ｔ  ＨＥＲＶ−Ｋ  Ｅｎｖ特異的Ｔ細胞の生成）を検査した。
【０１６１】
新規の予防接種戦略の治療効果を検査するために、単回用量のワクチンのみを腫瘍負荷１０日後に付与した。
【０１６２】
腫瘍負荷
Ｂ１６Ｆ１０−ＧＰ細胞の生体内での転移を評価するために、培養細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ベルセン中で３７℃で１５分間インキュベートすることによって脱離させた。細胞をその後２８２ｇで遠心分離し、ＰＢＳで洗浄して、ＰＢＳ中の２×１０＾６個／ｍＬの濃度まで希釈した。１００μＬ  ＰＢＳ中の２×１０＾５個の細胞をマウスの尾静脈内へと静脈内注射し、その結果として、肺における腫瘍の転移が生じた。負荷したマウスを１４日後に安楽死させた。肺を分離し、ＰＢＳ中の２％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）の溶液中で一晩固定した後、ＰＢＳ中で４℃で保存した。転移を解剖用顕微鏡下で肺表面上の黒色結節として計数した。試料を盲検化し、転移を少なくとも２名によって計数した。ＣＴ２６腫瘍の原発成長を分析するために、ＣＴ２６細胞をＢ１６Ｆ１０−ＧＰ細胞について説明したとおり調製し、ＰＢＳ中の５×１０＾５個の細胞の右大腿部における皮下注射は結果として、注射部位における腫瘍の形成を生じた。腫瘍の大きさを長さおよび幅において週３回測定した。腫瘍量を長さ×幅２×０，５２３６として決定した（Ｊａｎｉｋ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｅｓｔｒｏｎｅ−Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｈｏｒｍｏｎｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＧＲ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍａｍｍａｒｙ  Ｔｕｍｏｒｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９７５．３５（１２）：ｐ．３６９８〜３７０４）。腫瘍がいかなる側部においても１６ｍｍを超過したか、壊死性創傷が生じたか、またはマウスの可動性が顕著に低減したとき、マウスを安楽死させた。腫瘍の測定の間、異なる予防接種群を盲検化して、偏向のある評価を防止した。
【０１６３】
ＣＴ２６負荷に加えて、Ｂａｌｂ／Ｃマウスに１００μＬ  ＰＢＳ中の２．５×１０＾４個の４Ｔ１−Ｌｕｃ細胞を胸部乳房脂肪部へと注射した。６週間後の腫瘍形成を可視化するために、マウスにルシフェリン（１０ｇのマウスにつき１．５ｍｇ）を腹腔内注射し、注射１２分後にＩＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ生体内撮像システムを用いて撮像した。ＩＶＩＳ撮像を、Ａｎｄｒｅｅａ−Ｃｏｒｎｅｌｉａ  ＵｄｒｅａおよびＭｅｌａｎｉｅ  Ｓｃｈｗｅｒｄｔｆｅｇｅｒによって実施した。
【０１６４】
生体内でのＲＬＺ  Ｇａｇ細胞およびＥｎｖ細胞の腫瘍成長および転移を分析するために、細胞を６０〜８０％培養密度まで培養した。いったん所望の培養密度に到達すると、ＲＬＺ細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、ベルセンを３７℃で１５分間添加して、細胞を脱離させた。その後、細胞を２８２ｇでスピンダウンし、ＰＢＳを用いて洗浄し、最終的にはＰＢＳ中へと１０７個／ｍＬまで希釈した。どのマウスにも１０６個／１００μＬを肺への転移については静脈内注射し、皮下腫瘍については皮下注射した。肺への転移を評価するために、マウスを０、７および１４日後、ならびにその後２日間ごとに秤量した。マウスが数日以内に約１５〜２０％の体重を喪失した場合、安楽死させた。終了についてのエンドポイントは、腫瘍負荷４０日後に設定した。皮下腫瘍に罹患しているマウスを静脈内負荷したマウスと同じ時点でチェックし、腫瘍が１６ｍｍ径を超過したとき安楽死させた。
【０１６５】
皮下腫瘍および肺の両方を分離し、ｐＨ＝７．２の４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）およびリン酸緩衝液０．０１ｍｏｌ／Ｌ中へ浸漬し（Ｒｉｇｓｈｏｓｐｉｔａｌｅｔ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、４℃で保存した。試料を加工し、予防接種したマウス由来の高力価血清を用いたＨＥＲＶ−Ｋ  Ｅｎｖ特異的染色について組織を分析した。
【０１６６】
ウェスタンブロット法
ｐＩＸ−蛋白質の検出のために、細胞溶解物（約１０μｇ）または精製されたウイルス（１０１０個のウイルス粒子）を、ＤＤＴを含有する６×ＳＤＳ負荷緩衝液と混合し、９５℃で５分間加熱した。ＭｅｌＡＲＶ蛋白質の発現を示すために、細胞溶解物（５μｇ）、細胞上清（１５μｇ）および精製されたＶＬＰ（約２μｇ）を同様にＤＤＴ含有負荷緩衝液と混合したが、試料を加熱しなかった。この混合物をＮｕＰＡＧＥ（商標）４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇｅｌ（＃ＮＰ０３２２、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）に負荷し、１５０ＶでＭＯＰＳ緩衝液中で１時間泳動した。ゲル中の蛋白質含有量を湿式転移系においてニトロセルロース膜へ３０Ｖで１時間転写した。
【０１６７】
その後、膜をトリス緩衝塩類溶液＋トゥイーン２０（ＴＢＳ−Ｔ）中の５％脱脂乳で１時間ブロッキングした。その後、膜をＴＢＳ−Ｔで１０分間、振盪器上で３回洗浄し、（ＴＢＳ−Ｔ＋３％脱脂乳中の）希釈した一次抗体（表３）とともに４℃で一晩インキュベートした。以下の３回の洗浄ステップ後に、ＴＢＳ−Ｔ中のＨＲＰ結合二次抗体を添加し、膜をＲＴで１時間インキュベートした。結合していない二次抗体を洗い出し、ＬｕｍｉＧＬＯ  Ｒｅｓｅｒｖｅ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（５４−６１−００または５４−７１−０２）を用いて標的蛋白質をＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＬＡＳ  ４０００において可視化した。
【０１６８】
【表６−１】
2020531053.tif 000055
【表６−２】
2020531053.tif 000056
【０１６９】
ＨＥＲＶ−Ｋ関連実験において、蛋白質レベルでのＶＬＰ発現を、ＷＢ技術を経て分析した。試料の等しい負荷を保障するために、ＶＬＰ（ＳＮ）および細胞溶解物の両方の蛋白質濃度を、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ビシンコニン酸（ＢＣＡ）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，２３２２５）を製造元の指針により使用して測定した。ジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含有する６×ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）負荷緩衝液を、異なる試料へ添加し、これを９５℃のブロックヒーターＳＢＨ１３０ＤＣ（Ｓｔｕａｒｔ）に５分間入れた。その後、５μｇの蛋白質、および７μＬのＲｕｎＢｌｕｅ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  Ｍａｒｋｅｒ（Ｅｘｐｅｄｅｏｎ、ＮＸＡ０５１６０）をＮｕＰＡＧＥ（商標）４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇｅｌ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＮＰ０３２２）へと、ＮｕＰＡＧＥ（商標）ＭＯＰＳ  ＳＤＳ  Ｒｕｎｎｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＮＰ０００１）と一緒に負荷した。試料を１８０Ｖで４５分間のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分離した。
【０１７０】
その後、試料を０．４５μｍニトロセルロースブロット法用膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、１６２０１１５）へ３０Ｖで４５分間転写した。このステップのために、２０％エタノール含有転写緩衝液（３．７５ｇ／Ｌ  Ｔｒｉｚｍａ（登録商標）塩基、１８．１ｇ／Ｌグリシン、ｐＨ８．５）を使用した。
【０１７１】
非特異的結合を防止するために、膜を室温（ＲＴ）で１時間、トゥイーン含有トリス緩衝塩類溶液（ＴＢＳ−Ｔ）（６．０６ｇ／Ｌ  Ｔｒｉｚｍａ（登録商標）塩基、８．７６ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、０．２５％（ｖ／ｖ）トゥイーン−２０、ｐＨ７．６）中の５％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳を用いてブロッキングした。その後、膜をＴＢＳ−Ｔで１０分間洗浄し、対応する一次抗体（表３ａを参照されたい）をＴＢＳ−Ｔ中の３％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳中で用いて、振盪器ＣＥＲＴＯＭＡＴ（登録商標）ＭＯ  ＩＩ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）上で４℃で一晩（ｏ／ｎ）インキュベートした。
【０１７２】
【表７】
2020531053.tif 000057
【０１７３】
その後、膜をＴＢＳ−Ｔで１０分間、３回洗浄した。次に、これをＴＢＳ−Ｔ中に希釈した対応する二次抗体（表３ｂを参照されたい）とともにＲＴで１時間インキュベートした。
【０１７４】
【表８】
2020531053.tif 000058
【０１７５】
次に、膜をＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した（各回１０分間）。ペルオキシダーゼ化学発光基質（ＫＰＬ、５４−１６−００）をＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  Ｌａｓ  ４０００カメラ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）における蛋白質の検出のために使用した。
【０１７６】
酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）
予防接種したマウスにおけるＭｅｌＡＲＶ特異的抗体の検出のために、ＢＳＡに結合したＭｅｌＡＲＶ  Ｅｎｖサブユニットｐ１５ＥのペプチドをＳｃｈａｆｅｒ−Ｎ（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）から購入した。
【０１７７】
【表９】
2020531053.tif 000059
【０１７８】
ＭａｘｉＳｏｒｐ平底プレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を１ウェルにつき１００μＬのペプチド溶液（ＰＢＳ中２μｇ／ｍＬ）で４℃で一晩コーティングし、その後、洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋２．０７％ＮａＣｌ＋０．１％トゥイーン−２０）で２回洗浄した。ウェルを希釈緩衝液（ＰＢＳ＋２．０７％ＮａＣｌ＋０．１％トゥイーン−２０）で３７℃で２時間ブロッキングし、洗浄緩衝液で１回洗浄し、希釈マウス血清（希釈緩衝液中で１：５０）とともに３７℃で３時間インキュベートした。２回洗浄した後、ペプチドにより結合された血清抗体をＨＲＰ結合ヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体（Ｄａｋｏ、Ｐ０４４７）とともに１：２０００希釈で３７℃で２時間インキュベートした。追加の２回の洗浄ステップの後、１００μＬのＴＭＢ  ＰＬＵＳ２（Ｋｅｍ−Ｅｎ−Ｔｅｃ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、４３９５Ａ）を添加し、ＲＴで８分間インキュベートした。反応を１００μＬの０．２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４で終止させ、４５０ｎｍの光学密度を測定することによって定量した。
【０１７９】
マウス血清におけるＡｄ５特異的抗体の検出を、ＥＬＩＳＡプレートを熱失活Ａｄ５で５×１０９個のウイルス粒子／ｍＬでコーティングすること（３０分間、５６℃）によって実施した。本アッセイを先に説明したとおり実施したが、ＲＴで１時間のブロッキングおよび抗体結合についてはより短いインキュベーション時間とした。一次抗体は、１：２００で出発する１：２の連続希釈において希釈されたマウス血清とした。
【０１８０】
感染ベロ細胞の細胞溶解物、上清、および精製されたＶＬＰにおけるＭｅｌＡＲＶ蛋白質の検出を、ＥＬＩＳＡプレートを個々の試料でコーティングすることによって達成した。細胞溶解物をＰＢＳ（１００μＬ）中で１：２希釈し、上清を未希釈のまま適用し（１００μＬ）、精製されたＶＬＰは、ＰＢＳ（５０μＬ）中で１：２５希釈した。検出は、抗ｐ２Ａ（１：５００）、ＭＭ２−９Ｂ６（１：１００）、４Ｆ５（１：１００）、および１９Ｆ８（１：１００）を一次抗体として用いて、かつ表３において述べられた二次抗体を用いて上述のものと同じ手順を用いて達成された。
【０１８１】
フローサイトメトリー
ＨＥＲＶ−Ｋ関連実験において、ＦＡＣＳを用いて、予防接種したマウス由来の活性化型免疫細胞の細胞外マーカーおよび細胞内マーカーの両方、ならびに感染Ａ５４９細胞の表面上でのＨＥＲＶ−Ｋ  Ｅｎｖ蛋白質の存在を検出した。細胞選別に使用される機械は、フローサイトメーターＢＤ  ＬＳＲ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とした。
【０１８２】
次の緩衝液をＦＡＣＳに使用した。
【０１８３】
【表１０】
2020531053.tif 000060
【０１８４】
血清抗体を用いた細胞外染色
非ＨＥＲＶ−Ｋ実験において、癌細胞に対する血清抗体の結合を検出するために、フローサイトメトリーを実施した。Ｂ１６Ｆ１０−ＧＰ細胞またはＣＴ２６細胞を再懸濁し、丸底９６ウェルプレート中に１ウェルあたり４×１０５個で播種した。プレートを７８４ｇで３分間（４℃）遠心分離して、ウェルの底部に細胞を固定した。プレートを上下逆転させて弾くことによって、培地を除去し、マウス血清を１：５０の希釈で含有する５０μＬの蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）培地（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋０．１％ＮａＮ３）中に細胞を再懸濁した。４℃で２０分間のインキュベーション後、プレートを７８４ｇで３分間（４℃）遠心分離し、培地を除去した。細胞を２００μＬの洗浄培地（ＰＢＳ＋０．１％ＮａＮ３）で２回洗浄し、１；１００希釈したマウス免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）に対する蛍光標識した二次抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ＿ＡＰＣ、＃４０５３０８、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を含有する５０μＬのＦＡＣＳ培地中で再懸濁した。細胞を４℃で２０分間インキュベートし、洗浄緩衝液で２回洗浄し、２００μＬのＰＦＡ溶液（ＰＢＳ中１％）中で４℃で１５分間固定した。細胞をＦＡＣＳ培地中で２回再懸濁し、ＢＤ  ＬＳＲ  ＩＩ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒにおいて蛍光について分析した。
【０１８５】
感染ベロ細胞の表面上のＭｅｌＡＲＶ  Ｅｎｖの検出を、異なるエピトープに対するモノクローナル抗体を用いるのと同じプロトコルで実施した（表５）。二次抗体は、抗マウスＩｇＧ＿ＡＰＣ（１：１００）またはヤギ抗マウスＩｇＭ重鎖＿ＲＰＥ（１：１００、Ａ１０６８９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とした。
【０１８６】
さらに、この技術を実施して、ＨＥＲＶ−Ｋ野生型およびＨＥＲＶ−Ｋ  ＩＳＤ突然変異体導入遺伝子（Ｓｉｒｉｏｎ）についてコードするＡｄ１９ベクターに基づいた新たなワクチン戦略を特徴づけ、かつ異なるアデノウイルスベクター（Ａｄ１９対Ａｄ５）の使用を比較した。表面染色を用いて、フローサイトメトリーによる感染Ａ５４９細胞の表面上のＨＥＲＶ−Ｋ  Ｅｎｖ蛋白質の存在を検出した。
【０１８７】
３×１０６個のＡ５４９細胞を１５ｍＬのＨａｍのＦ−１２Ｋ培地中の７５ｃｍ２フラスコ内へと播種し、３７℃で２時間インキュベートした。各フラスコを５０ＭＯＩの次のウイルス（１．５×１０８ＩＦＵ／フラスコ）で感染させた。
【０１８８】
Ａｄ５−（ＴｅｔＯ）−ＣＭＶ−ＳＩＶｇａｇ＿ｐ２Ａ＿ＨＥＲＶ−Ｋ１０８ｅｎｖ＿Ｐ２ＴＳ
Ａｄ１９ａ（ＩＩ）−（ＴｅｔＯ）−ＣＭＶ−ＩＳＤ突然変異体＿ＭｅｌＡＲＶ−Ｐ２ＴＳ
Ｓｉｒｉｏｎ製のＡｄ１９ａ（ＩＩ）−（ＴｅｔＯ）−ＣＭＶ−ｃｏＨＥＲＶ−Ｋ−Ｐ２ＴＳ
Ｓｉｒｉｏｎ製のＡｄ１９ａ（ＩＩ）−（ＴｅｔＯ）−ＣＭＶ−ＩＳＤ突然変異体＿ｃｏＨＥＲＶ−Ｋ−Ｐ２ＴＳ
【０１８９】
次に、該ウイルスを３７℃で５時間インキュベートした後、培地をＨａｍのＦ−１２Ｋ  ＦＢＳ非含有培地と交換した。次に、細胞を３７℃で４８時間インキュベートした。
【０１９０】
細胞をＬＡＦベンチの内側で氷上で維持した。培地を吸引し、細胞を冷ＰＢＳで注意深く洗浄し、冷ＰＢＳで掻把した後、遠心分離（４℃、７８４ｇ、３分）によって細胞を分離した。細胞をＰＢＳ中に再懸濁し、丸底９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１６３３２０）中へと分配した。プレートを遠心分離し（４℃、７８４ｇ、３分）、プレートを弾くことによってＳＮを除去した。ＨＥＲＶ−Ｋ  Ｅｎｖ蛋白質のｐ１５Ｅ（ＴＭ）ドメインに対して指向する２μｇ／ｍＬのマウスモノクローナル（ＩｇＧ）一次抗体（Ａｕｓｔｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，ＨＥＲＭ−１８１１−５）を含有する５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液中で細胞を４℃で２０分間再懸濁した。その後、細胞をＦＡＣＳ洗浄緩衝液（１５０μＬの第１の容積の後２００μＬを使用）で洗浄し、３回遠心分離した（４℃、７８４ｇ、３分）。プレートを１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液とともにインキュベートして、この中にはヤギ抗マウスＩｇＧ  ＡＰＣ二次抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，４０５３０８）の１：１００希釈物があらかじめ添加されていた。プレートに４℃で２０分間の遮光されたインキュベーションを行った。細胞を遠心分離し（４℃、７８４ｇ、３分）、２００μＬのＦＡＣＳ洗浄緩衝液で３回洗浄した。その後、プレートを２００μＬの１％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）（Ｒｉｇｓｈｏｓｐｉｔａｌｅｔ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）中で４℃で１５分間、遮光しながらインキュベートした。その後、プレートを遠心分離し（４℃、７８４ｇ、３分）、１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、再度遠心分離した（４℃、７８４ｇ、３分）。プレートを最終的に２００μＬ中で再懸濁し、暗所で４℃で一晩保存した。翌日、細胞の蛍光を、フローサイトメーターＢＤ  ＬＳＲ  ＩＩを用いて分析し、ＦｌｏｗＪｏ  １０（ＦｌｏｗＪｏ  ＬＬＣ）を用いてデータを加工および解析した。
【０１９１】
刺激された非細胞の細胞内染色（ＩＣＳ）
マウスを予防接種の３〜４週間後に安楽死させ、脾臓を分離した。摘出された脾臓をＨＡＮＫＳ  Ｂ．Ｓ．Ｓ．へ移し、滅菌ネットを経てマッシュ状にし、単一細胞の懸濁液を取得した。完全ＲＰＭＩ中での遠心分離および再懸濁の後、脾細胞の濃度を決定し、必要とされる濃度へ細胞を希釈した。
【０１９２】
脾細胞を丸底９６ウェルプレートへと２．５×１０６個の細胞／ウェルで入れた。細胞を７８４ｇで３分間遠心分離し、３μＭのモネンシン（経路阻害薬）および１μｇ／ｍＬのペプチド（ＡＨ１）を含有する完全ＲＰＭＩ（＋５０μＭの２−メルカプトエタノール）中で再懸濁したのに対し、陰性対照はペプチドを受容していなかった。その後、細胞を３７℃で５時間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ培地（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋０．１％ＮａＮ３＋３μＭモネンシン）中で洗浄した後、細胞を、ＦＡＣＳ培地中で１：１００希釈した蛍光標識した表面抗体（抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＣＤ４４、抗Ｂ２２０）とともに４℃で２０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳ＋３μＭモネンシンで２回洗浄し、１％ＰＦＡ中で４℃で１５分間固定した。ＦＡＣＳ培地中で洗浄した後、細胞をＰＢＳ中の０．５％サポニンでＲＴで１０分間透過性にした。細胞内抗体（抗ＩＦＮγ、抗ＴＮＦα）をＰＢＳ＋０．５％サポニン中の１：１０希釈で添加し、４℃で２０分間インキュベートした。細胞を２回洗浄し、最終的にはＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋０．１％ＮａＮ３中に再懸濁した。細胞の蛍光をＢＤ  ＬＳＲ  ＩＩ  Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒにおいて分析した。フローサイトメトリーデータの解析を添付の図５に示す。
【０１９３】
【表１１−１】
2020531053.tif 000061
【表１１−２】
2020531053.tif 000062
【表１１−３】
2020531053.tif 000063
【０１９４】
ＨＥＲＭ−Ｋ関連実験において、脾細胞ＩＣＳを実施して、予防接種したマウス由来の特異的細胞応答を評価した。本実験を実施することができるよう、Ｃ５７ＢＬ／６マウス系およびＢＡＬＢ／Ｃマウス系の両方の８〜１０アミノ酸からなった異なる強力な結合（ＳＢ）のＨＥＲＶ−Ｋペプチドをあらかじめ、ＨＥＲＶ−Ｋ予防接種マウスのＣＤ８＋  Ｔ細胞を刺激する能力について検査した。ＨＥＲＶ−Ｋ  Ｅｎｖ配列の１９２位におけるＢＡＬＢ／ｃ  １０マーペプチド（ＴＹＨＭＶＳＧＭＳＬ、配列番号４７）のみが応答を付与した。それゆえ、Ｐ−ＨＫＥと命名されたこのペプチド、Ｅｎｖ  ＩＳＤにおいて突然変異を含有する改良されたＡｄ１９ワクチンと一緒に使用して、ＨＥＲＶ−Ｋ  ＥｎｖについてコードするＡｄ５ベクターおよびＡｄ１９ベクターを用いて免疫化したＢＡＬＢ／ｃマウスの脾細胞を刺激した。
【０１９５】
【表１２−１】
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【表１２−２】
2020531053.tif 000065
【０１９６】
異なるベクターを含有する異なるワクチンの有効性および挿入物改善戦略を比較する目的で、Ａｄ５およびＡｄ１９  ＨＥＲＶ−Ｋ／ＩＳＤ突然変異体予防接種（初回免疫）マウスを本実験に使用した。マウスをＭＶＡベクターによる追加免疫の１０日後に安楽死させ、脾臓を５ｍＬのＨａｎｋのＢＳＳ培地中に回収した。単一の細胞の懸濁液を取得する目的で、滅菌したネットであるＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）７０μｍ細胞ストレイナ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＣＬＳ４３１７５１）で脾臓をマッシュした。その後、細胞数を計数して、所望の量の細胞個数／ウェルを播種し、細胞個数／脾臓の総数を提供して、脾臓１個あたりのＩＦＮγ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞およびＩＦＮγ  ＣＤ４＋  Ｔ細胞の絶対数を後で計算した。
【０１９７】
およそ３×１０６個／ウェルの細胞を丸底９６ウェルプレート内へ播種し、これを遠心分離し（４℃、７８４ｇ、３分間）、ＲＰＭＩ培地中に懸濁した。これまでに記載のＨＥＲＶ−Ｋ  Ｅｎｖの１０マーの、Ｐ−ＨＫＥと名付けられたペプチドＴＹＨＭＶＳＧＭＳＬ（配列番号４７）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解して、濃度を４００ｎｇ／μＬにした。次に、これを再度ＰＢＳ中に溶解して濃度を１００ｎｇ／μＬにし、最終的にはＲＰＭＩを先の希釈物に添加して、６．６７ｎｇ／μＬの濃度を取得した。Ｐ−ＨＫＥペプチドを添加する前に、サイトカインが細胞を出るのを防止するために、５０μＬの蛋白質輸送阻害薬モネンシン（３μＭ）をウェルへ添加した。加えて。３０μＬ／ウェルの上述のＰ−ＨＫＥペプチドを、刺激したウェルに添加して、Ｔ細胞サイトカイン産生を誘導した。ウェルの残りは、いかなるペプチドも受容しなかったが、刺激した試料と同じ濃度のＤＭＳＯだけは受容し、陰性対照として使用した。細胞を３７℃で５時間インキュベートした。
【０１９８】
インキュベーション時間の後、細胞を遠心分離し（４℃、７８４ｇ、３分）、モネンシン（３μＭ）を含有する１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。モネンシン（３μＭ）を含有するＦＡＣＳ緩衝液中に、表面抗体（ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５−ＣＤ８、ＦＩＴＣ−ＣＤ４、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ（商標）−Ｂ２２０、ＡＰＣ／Ｃｙ７−ＣＤ４４）を１：１００希釈した。脾細胞を５０μＬの先の溶液で再懸濁し、１：１０希釈した抗体を含有する５０μＬのＦＡＣＳ／モネンシン（３μＭ）、すなわちＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５−ＣＤ８、ＦＩＴＣ−ＣＤ４、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ（商標）−ＣＤ８、ＡＰＣ／Ｃｙ７−ＣＤ８、ＡＰＣ−ＣＤ８、ＰＥ／Ｃｙ７−ＣＤ８を、補正をするために使用した。プレートを４℃、暗所で２０分間インキュベートした。ウェルを３μＭモネキシン含有の１００μＬのＰＢＳで２回洗浄した。次に、１００μＬのＰＢＳ／モネキシン（３μＭ）を１００μＬのＰＦＡ（２％）と一緒に添加して、細胞を４℃の間に暗所で固定した。細胞を再度ＦＡＣＳ／モネキシン（３μＭ）を用いて２回洗浄し、２０℃（暗所）で１０分間、ＯＢＳ中の１５０μＬの０．５％サポニンで再懸濁した。いったん細胞を透過性にすると、細胞内抗体（ＡＰＣ−ＩＦＮγ、ＰＥ／Ｃｙ７−ＴＮＦα）を０．５％サポニン／ＰＢＳ中で１：１００希釈し、５０μＬをウェルに添加し、プレートを４℃、暗所で１０分間インキュベートした。細胞を１％ＢＳＡおよび０．１％ＮａＮ３を含有するＰＢＳで洗浄し、最終的には、同じ緩衝液２００μＬ中で再懸濁した。プレートを４℃で一晩維持した。
【０１９９】
加えて、Ａ５４９トランスフェクト細胞の細胞内染色を実施して、細胞の内側のＨＥＲＶ−Ｋ  Ｅｎｖ蛋白質の存在を確証した。この場合、産生（そして細胞膜への分泌ではない）を評価した。後者のプロトコルに続いて、４℃で暗所でＰＢＳ中に希釈した１５０μＬの０．５％（ｗ／ｖ）サポニン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、４７０３６）とともに行う１０分間のインキュベーションステップを付加した。この余分なステップは、細胞膜を透過性にするために必要とされる。抗体も０．５％サポニン中へと希釈した。
【０２００】
ゲート処理戦略
ＦｌｏｗＪｏ１０（ＦｌｏｗＪｏ  ＬＬＣ）を使用して、細胞外染色およびＩＣ  ＦＡＣＳ染色からのデータを解析した（図２７を参照されたい）。まず、細胞を順方向スキャッタ（ＦＳＣ）−ＨおよびＦＳＣ−Ａにおいてプロットし。ゲート処理した。このゲートを使用して、側部スキャッタ（ＳＳＣ）−ＡおよびＦＳＣ−Ａのプロットにおけるリンパ球集団を分離した。後者の集団をＣＤ８＋  ＣＤ４−細胞について、その後ＣＤ８＋  Ｂ２２０細胞をゲート処理して、ＣＤ８＋  Ｔ細胞集団を取得し、ＣＤ４＋  Ｔ−細胞およびＢ細胞（Ｂ２２０マーカー）の両方を解析から除去する（Ｃｏｆｆｍａｎ  ＆  Ｗｅｉ
ｓｓｍａｎ  １９８１）。次に、細胞をＣＤ８＋  ＣＤ４４＋  Ｔ細胞についてゲート処理し、活性化型ＣＤ８＋  Ｔ細胞のみを取得した。これらを、ＩＦＮγ＋  ＣＤ４４＋細胞についてさらにゲート処理したが、これらはいずれも、Ｔ細胞活性化に対する結果として発現したマーカーである。その上、ＩＦＮγは、活性化型ＣＤ８＋  Ｔ細胞にとって、ＴＮＦαサイトカインと比較したとき、より高い感受性のマーカーであることは公知である（Ｂａｄｏｖｉｎａｃ  ＆  Ｈａｒｔｙ  ２０００）、（Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２００４）。加えて、ＣＤ８＋  ＣＤ４４＋  Ｔ細胞をＩＦＮγ＋  ＴＮＦα＋  細胞についてゲート処理し、その理由は、多重のサイトカインを産生するＣＤ４＋  Ｔ細胞がより高いレベルの活性、活性化を有し、記憶細胞となることが公知であるからである（Ｋａｎｎａｎｇａｎａｔ  ｅｔ  ａｌ．２００７）。
【０２０１】
ＩＦＮγ＋  ＣＤ４４＋  Ｂ２２０−  ＣＤ８＋  Ｔ細胞の絶対数を概算するために、リンパ球のうちのＩＦＮγ＋  ＣＤ４４＋  Ｂ２２０−  ＣＤ８＋  Ｔ細胞の％に脾臓あたりのリンパ球の数を乗じた。加えて、ＩＦＮγ＋  ＣＤ８＋の二重陽性（ＩＦＮγ＋  ＴＮＦα＋）細胞の％を、ＩＦＮγ＋  ＴＮＦα＋  細胞をＩＦＮγ＋  ＴＮＦα＋  およびＩＦＮγ＋  ＴＮＦα−細胞の合計で除することで計算した。
【０２０２】
酵素結合ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（ＥＬＩＳＰＯＴ）
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを実施して、抗原特異的Ｔ細胞を検出した。本実験において使用されるペプチドはＡＨ１（ＳＰＳＹＶＹＨＱＦ）としたが、これはＭｅｌＡＲＶ  Ｅｎｖサブユニットｇｐ７０内に位置するＢａｌｂ／Ｃマウスにおける公知のＨ２−Ｌｄ制限Ｔ細胞エピトープである、（Ｈｕａｎｇ，Ａ．Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ  ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｃｌａｓｓ  Ｉ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｏｆ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｃｏｌｏｎ  ｔｕｍｏｒ  ｄｅｒｉｖｅｓ  ｆｒｏｍ  ａｎ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，１９９６．９３（１８）：ｐ．９７３０〜５）。
【０２０３】
予防接種したマウスの脾細胞を、ＩＣＳについて説明したとおり調製した。
【０２０４】
本アッセイを、マウスＩＦＮ−γ  Ｔ細胞ＥＬＩＳＰＯＴキット（ＣＴ３１７−ＰＲ５、Ｕ−ＣｙＴｅｃｈ）を用いて実施した。簡潔には、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）９６ウェルプレートの膜（ＭＳＩＰ  Ｓ４５１０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を７０％エタノールで活性化し、その後、抗マウスＩＦＮ−γ抗体で一晩コーティングした。コーティング抗体を除去し、膜をブロッキングした後、脾細胞を、１μｇ／ｍＬ  ＡＨ１を含有する完全ＲＰＭＩ培地中で２×１０＾５個の細胞／ウェルで播種した。対照として、脾細胞を非刺激のままにしておくかまたは強力なＴ細胞活性化因子コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）（２μｇ／ｍＬ）で刺激した。通常の細胞培養条件下での４８時間のインキュベーション後、細胞を取り出し、ウェルを洗浄し、その後、ＩＦＮ−γを標的とするビオチン化検出抗体とともにインキュベートした。ストレプトアビジン−ＨＲＰ複合体を添加し、ＩＦＮ−γスポットをＡＥＣ基質溶液を用いて可視化した。スポットをＣＴＬ  ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ分析装置を用いて計数した。
【０２０５】
陽性対照（対照血清ＬＥＶ７６）
陽性対照血清ＬＥＶ７６を、マウス血清試料のフローサイトメトリーおよびＥＬＩＳＡ分析のための標準物質として使用した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスがＭｅｌＡＲＶ  Ｅｎｖに対して予防接種され、Ｂ１６Ｆ１０−ＧＰ肺への転移からの防御を示した初期のパイロット試験からＬＥＶ７６血清は生じている。したがって、この血清における抗体応答は、腫瘍負荷から防御することが潜在的にできるレベルと対応しており、それゆえ、うまくいく抗体応答のための参照値として機能した。加えて、ＬＥＶ７６対照血清を使用して、異なる実験間の比較が可能となった。
【０２０６】
統計分析
統計分析はすべて、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（第５．０３版）を用いて実施した。群を対応のない両側Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を用いて比較した。有意性を星印によって示す。＊（Ｐ≦０．０５）、＊＊（Ｐ≦０．０１）、＊＊＊（Ｐ≦０．００１）。予防接種したマウスの異なる群を比較するとき、結果を各群の平均として平均の標準誤差（ＳＥＭ）とともに示す。
【０２０７】
Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ概算式を使用して、マウス生存曲線を比較した。この検定は、所与の処置後の時間にわたって生存している対象の分率を測定する。有意な結果を星印（＊）で示し、＊（Ｐ≦０．０５）、＊＊（Ｐ≦０．０１）、＊＊＊（Ｐ≦０．００１）とした。
【０２０８】
応答間の相関を評価するために、Ｓｐｅａｒｍａｎ補正を使用した後、Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ法によってｐ値を調整した。
【０２０９】
実施例１
ワクチンによりコードされた免疫抑制性ドメイン（ＩＳＤ）における突然変異
改善の第１の戦略として、２つの点突然変異をＭｅｌＡＲＶ  Ｅｎｖの配列中に導入して、免疫抑制性ドメイン（ＩＳＤ）を不活性化した（図３）。これらの特異的な突然変異をマウス白血病ウイルスについてＳｃｈｌｅｃｈｔ−Ｌｏｕｆ  ｅｔ  ａｌ．によって以前検査および分析した（Ｓｃｈｌｅｃｈｔ−Ｌｏｕｆ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ａｎ  ｉｍｍｕｎｅ  ｅｓｃａｐｅ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｅｎｃｒｙｐｔｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｏｎｃｏｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，２０１０．１０７（８）：ｐ．３７８２〜７）。ＭｅｌＡＲＶ  Ｅｎｖのこの改変版についてコードするウイルスは、Ａｄ５−ＭｅｌＡＲＶ−ＩＳＤと呼ばれる。
【０２１０】
ＣＤ１マウスにおける抗体応答に及ぼすＡｄ５−ＭｅｌＡＲＶ−ＩＳＤの効果
非近交系ＣＤ１マウスをＤＮＡ−ＭｅｌＡＲＶまたはＤＮＡ−ＭｅｌＡＲＶ−ＩＳＤで初回免疫し、その後、予防接種タイムラインＩＶにより、ＡＤ５−ＭｅｌＡＲＶまたはＡｄ５−ＭｅｌＡＲＶ−ＩＳＤのいずれかで追加免疫した。アデノウイルス予防接種の４週間後、血液試料を回収し、ＥＬＩＳＡによって分析した。
【０２１１】
図７Ａに示されるように、ｐ１５Ｅ特異的抗体は、Ａｄ５−ＭｅｌＡＲＶ−ＩＳＤ接種マウスにおいて増加した。特に、ＤＮＡ−ＭｅｌＡＲＶ−ＩＳＤとＡｄ５−ＭｅｌＡＲＶ−ＩＳＤとの組み合わせ（棒Ｄ）は、ＬＥＶ７６対照血清に匹敵する高い抗体応答を生じた。
【０２１２】
加えて、Ａｄ５−ＭｅｌＡＲＶ（棒Ａおよび棒Ｃ）およびＡｄ５−ＭｅｌＡＲＶ−ＩＳＤ（棒Ｂおよび棒Ｄ）による予防接種は、ＧＦＰ対照（棒Ｅ）と比較して腫瘍細胞特異的抗体のレベルを増大させた（図７Ｂ）。しかしながら、Ａｄ５−ＭｅｌＡＲＶ−ＩＳＤは、Ａｄ５−ＭｅｌＡＲＶよりも有意に低いレベルの腫瘍結合抗体を誘導した（棒Ａ対棒Ｂ、棒Ｃ対棒Ｄもだが有意ではなかった）。
【０２１３】
ｐ１５Ｅ結合抗体およびＢ１６Ｆ１０−ＧＰ結合抗体の両レベルは、ＤＮＡ−ＭｅｌＡＲＶ−ＩＳＤによる初回免疫が、ＤＮＡ−ＭｅｌＡＲＶ初回免疫マウスと比較して抗体応答を概して上昇させることを示唆したが、これらの結果は有意ではなかった。
【０２１４】
実施例２
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける抗体応答および転移に及ぼすＡｄ５−ＭｅｌＡＲＶ−ＩＳＤの効果
予防接種タイムラインＩＩＩによりＣ５７ＢＬ／６マウスに予防接種および負荷した。マウスは、ＤＮＡ−ＭｅｌＡＲＶまたはＤＮＡ−ＭｅｌＡＲＶ−ＩＳＤのいずれかの後、個々のアデノウイルスを受けた。抗体応答の解析で、ＭｅｌＡＲＶ−ＩＳＤがＢ１６Ｆ１０−ＧＰ細胞特異的抗体のレベルをわずかに上昇させることが明らかとなった（図８Ａ）。しかしながら、上昇は有意ではなく、ＰＢＳを接種したマウスの背景をわずかに上回った。図８Ｂに示すように、ｐ１５Ｅに特異的な抗体に及ぼす効果は観察されなかった。腫瘍細胞結合抗体に対応して、転移は、ＭｅｌＡＲＶ−ＩＳＤ接種したマウスにおいてわずかに低減したが、有意差はなかった（図８Ｃ）。
【０２１５】
実施例３
Ｂａｌｂ／ＣマウスにおけるＴ細胞応答に及ぼすＡｄ５−ＭｅｌＡＲＶ−ＩＳＤの効果
抗体応答に加えて、Ｔ細胞の初回免疫および活性化に及ぼすＡｄ５−ＭｅｌＡＲＶ−ＩＳＤの効果を解析した。ＥＬＩＳＰＯＴ（図９）およびＩＣＳ（図１０）のいずれも、Ａｄ５−ＭｅｌＡＲＶと比較してＡｄ５−ＭｅｌＡＲＶ−ＩＳＤを接種したマウスにおいてＡＨ１特異的Ｔ細胞のレベルの上昇を示した。ＩＣＳによって観察されるように、二重陽性ＩＦＮγ＋  ＴＮＦα＋  ＣＤ８＋  Ｔ細胞は、未処置の形態と比較してＡｄ５−ＭｅｌＡＲＶ−ＩＳＤ接種したマウスにおいて有意に上昇していた。また、ＩＦＮγ＋細胞の積分幾何平均（ＩＧＭ）は、未処置のＡｄ５−ＭｅｌＡＲＶに対して有意差を示す。ＩＧＭは、陽性細胞の数を平均蛍光強度と組み合わせ、したがって、活性化された免疫細胞の量も考慮している。ＴＮＦαのＩＧＭはなおも有意ではなかった（データ非表示）。
【０２１６】
実施例４
免疫抑制に及ぼすＡｄ５−ＭｅｌＡＲＶ／Ａｄ５−ＭｅｌＡＲＶ−ＩＳＤの効果
Ａｄ５−ＭｅｌＡＲＶ−ＩＳＤの免疫応答の上昇に潜む機序を解析するために、ワクチンによる免疫抑制を分析した。Ａｄ５−ＭｅｌＡＲＶまたはＡｄ５−ＭｅｌＡＲＶ−ＩＳＤを接種したマウスの、図７にあるのと同じマウス血清を、ＥＬＩＳＡによるウイルスベクターに対する免疫応答について分析した。ＩＳＤ不活性化ＭｅｌＡＲＶ  Ｅｎｖワクチン（Ａｄ５−ＭｅｌＡＲＶ−ＩＳＤ）は、ＭｅｌＡＲＶ  Ｅｎｖの未処置版（機能的ＩＳＤを有するＡｄ５−ＭｅｌＡＲＶ）と比較してＡｄ５結合抗体の力価の有意な上昇を示した。
【０２１７】
実施例５
アデノウイルスベクターのカプシド蛋白質ｐＩＸ上での抗原提示
防御抗体応答を上昇させる試みで、ｐ１５Ｅをすでに検査したアデノウイルスワクチン上のアデノウイルスカプシド蛋白質ｐＩＸへ連結させた。検査された異なるコンストラクトを図１２に示す。未処置のｐ１５Ｅ（膜貫通サブユニットおよび細胞質尾部を除外）をｐＩＸ（１）またはそれに代わるものとしてＩＳＤ突然変異版（２）のいずれかに付加した。加えて、追加のシステインを提示した（３）かまたは提示しなかった（４）かのいずれかで、ＩＳＤに対して切断型のｐ１５Ｅのバリアントを検査した。ウイルスベクターのコアは、提示されたｐ１５Ｅと一致しており、すなわち、ｐＩＸ−ｐ１５ＥについてはＡｄ５−ＭｅｌＡＲＶ、ｐＩＸ−ｐ１５Ｅ−ＩＳＤについてはｐＩＸ−ｐ１５Ｅ−切端−ＣありおよびｐＩＸ−ｐ１５Ｅ−切端−Ｃなし、ならびにＡｄ５−ＭｅｌＡＲＶ−ＩＳＤであった。
【０２１８】
カプシド蛋白質ｐＩＸに及ぼすｐ１５Ｅを示すＡｄ５ベクターの特徴づけ
新たなｐＩＸプラスミドコンストラクト（ｐｃＤＮＡ３−ｐＩＸ−タグリンカー―ｘｘｘ、ｘｘｘ＝ｐ１５Ｅ抗原）を、ＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトすることによって組換えｐＩＸの正確な発現について検査した。トランスフェクトした細胞の溶解物を図１３Ａの抗ｐＩＸ抗体を用いたウェスタンブロット法によって分析した。４つのコンストラクトはすべて、切断型ｐ１５Ｅ版について期待されたより低いバンドで組換えｐＩＸの発現を示した（ライン３および４）。ｐＩＸに連結したＧＦＰは、約５０ｋＤａのより高いバンドを有する陽性対照として使用した。組換えｐＩＸのウイルスベクター内への組込みを確証するために、精製されたウイルスを、図１３Ｂの抗ｐＩＸ抗体を用いたウェスタンブロット法によって分析した。未処置のｐＩＸバンド（約１０ｋＤａ）の隣で、コンストラクトはすべて、組換えｐＩＸの発現を示した。未改変Ａｄ５
【数７】
2020531053.tif 000066
の陰性対照は、未処置のｐＩＸバンドのみを呈した。バンド強度は、ＩｍａｇｅＪソフトウエア（第１．５１ｎ版）を用いて定量されたが、組換えｐＩＸの百分率は、エラー！参考文献の元が見当たらないに示されている。
【０２１９】
【表１３】
2020531053.tif 000067
【０２２０】
実施例６
ＣＤ１マウスにおけるｐＩＸ改変したウイルスによって誘導される抗体応答の分析
ＣＤ１マウスに予防接種タイムラインＩＸにより、ＤＮＡ初回免疫（ＤＮＡ−ＭｅｌＡＲＶまたはＤＮＡ−ＭｅｌＡＲＶ−ＩＳＤ）に続いてアデノウイルス追加免疫（通常ウイルス対ｐＩＸ改変型）を用いて予防接種した。血清をＥＬＩＳＡによってｐ１５Ｅ特異的抗体について分析した図１４Ａ。ＥＬＩＳＡに使用したｐ１５Ｅペプチド配列は、ｐＩＸ改変の切断型板には含まれていなかったので、Ａｄ５−ＭｅｌＡＲＶ＿ｐＩＸ−ｐ１５ＥおよびＡｄ５−ＭｅｌＡＲＶ−ＩＳＤ＿ｐＩＸ−ｐ１５Ｅ−ＩＳＤのみがこの設定において査定されることができた。ほとんどの場合、ｐＩＸ上でのｐ１５Ｅの提示は、ｐ１５Ｅ特異的抗体（Ａ対Ｂ、Ｃ対Ｄ、Ｅ対Ｆ）のレベルを上昇させた。しかしながら、これらの比較において、唯一の有意差は、ＤＮＡ−ＭｅｌＡＲＶ＋Ａｄ５−ＭｅｌＡＲＶ（Ａ対Ｂ）について観察された。ＤＮＡ−ＭｅｌＡＲＶ−ＩＳＤ＋Ａｄ５−ＭｅｌＡＲＶ−ＩＳＤ（Ｇ対Ｈ）の場合、ｐＩＸ−ｐ１５Ｅ−ＩＳＤの提示は、非改変型ワクチンと比較して悪化した効果および有意に低下した抗体応答を有していた。加えて、Ｂ１６Ｆ１０−ＧＰ細胞に対する血清抗体の結合を分析した（図１４Ｂ）。ｐＩＸ上での未処置のｐ１５Ｅの提示は、腫瘍細胞に対する抗体応答に影響しなかった。その一方で、Ａｄ５−ＭｅｌＡＲＶ−ＩＳＤ＿ｐＩＸ−ｐ１５Ｅ−ＩＳＤは、ＩＳＤ突然変異型ＭｅｌＡＲＶ  Ｅｎｖにより低減するＢ１６Ｆ１０−ＧＰ特異的抗体の欠失を収縮することができた（図７と比較されたい）。
【０２２１】
実施例７
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける抗体応答および転移に及ぼすＡｄ５−ＭｅｌＡＲＶ＿ｐＩＸ−ｐ１５Ｅの効果
ｐＩＸ改変型ウイルスＡｄ５−ＭｅｌＡＲＶ＿ｐＩＸ−ｐ１５ＥをＣ５７ＢＬ／６マウスにおける抗体応答および転移からの防御についてのパイロット試験において検査した。マウスに予防接種タイムラインＶにより、２回予防接種および負荷した。図１５Ａおよび１５Ｂに示すように、ワクチンはＢ１６Ｆ１０−ＧＰ細胞（１５Ａ）にもｐ１５Ｅ（図１５Ｂ）にも抗体応答を有意に上昇させなった。また、転移数は、予防接種によって有意に低下しなかった（図１５Ｃ）。しかしながら、腫瘍細胞特異的抗体と転移計数との間に相関は検出されなかった（図１５Ｄ）が、ｐ１５Ｅ特異的抗体のレベルと転移数との間に有意な負の相関が観察された（図１５Ｅ）。
【０２２２】
実施例８
（より天然の立体配座において）量だけでなく質に関してもＶＬＰ上でのＭｅｌＡＲＶ  Ｅｎｖの提示を改善する試みにおいて、機能的ドメインを未処置の配列へ適用した。これらの改変を完全長のＭｅｌＡＲＶ  Ｅｎｖにだけでなく、ｐ１５Ｅ単独へも適用した（図１６）。この改変には、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ（ＬｕｃＳＰ）からのシグナルペプチド、インフルエンザＡ型ウイルス赤血球凝集素Ｈ３Ｎ２（ＨＡ−ＴＭＣＴ）由来の膜貫通ドメインおよび細胞質尾部、ならびに三量体化配列（ＧＣＮ４）が含まれた（図１６）。キメラＥｎｖ蛋白質またはｐ１５Ｅ蛋白質をＳＩＶのうちのＧａｇ蛋白質と共コードした。
【０２２３】
キメラＭｅｌＡＲＶ  Ｅｎｖまたはｐ１５Ｅをコードするワクチンの特徴づけ
改変型ワクチンをマウスで検査しなかったが、アデノウイルスからの発現を感染ベロ細胞においてフローサイトメトリーによって検査した（図１７）。本実験は、蛋白質の発現を示すだけでなく、該蛋白質の標的エピトープに関する抗ＭｅｌＡＲＶ  Ｅｎｖのいくつかも特徴とする。１９Ｆ８（図１７Ａ）および４Ｆ５（図１７Ｂ）の両方が、未処置のワクチン（Ａｄ５−ＭｅｌＡＲＶおよびＡｄ５−ＭｅｌＡＲＶ−ＩＳＤ）と比較してＭｅｌＡＲＶ  Ｅｎｖおよびｐ１５Ｅの改変版に対する非常に高い結合を示した。Ａｄ５−ＬｕｃＳＰ＿ＧＣＮ４＿ｐ１５Ｅ＿ＨＡ−ＴＭＣＴに対する結合は、同様に観察されることができたので、本実験は、両抗体が、膜貫通サブユニットｐ１５Ｅを結合することを示す。さらに、Ａｄ５−ＭｅｌＡＲＶ−ＩＳＤ感染細胞に対する１９Ｆ８の結合は観察されなかったのに対し、明確なシグナルが４Ｆ５に対して検出され、ＩＳＤを１９Ｆ８の標的エピトープとして確認した。ＭＭ２抗体はいずれもｐ１５Ｅコンストラクトに対する結合を示さなかったが、３つの抗体がすべて、表面サブユニットｇｐ７０に対して指向することを実証した。ＭＭ２−９Ｂ６（図１７Ｃ）およびＭＭ２−３Ｃ６（図１７Ｄ）は、Ａｄ５−ＭｅｌＡＲＶ感染細胞およびＡｄ５−ＬｕｃＳＰ＿ＭｅｌＡＲＶ＿ＨＡ−ＴＭＣＴ感染細胞に対する抗体の等しく強力な結合で、同様の特性を示した。その一方で、Ａｄ５−ＭｅｌＡＲＶ−ＩＳＤ感染細胞は、非常に低い抗体結合を示した。ＭＭ２−９Ａ３（図１７Ｅ）の特性は、同様であるが、例外は、Ａｄ５−ＭｅｌＡＲＶ感染細胞がＡｄ５−ＬｕｃＳＰ＿ＭｅｌＡＲＶ＿ＨＡ−ＴＭＣＴ感染細胞よりも抗体結合性が低かったことは例外である。
【０２２４】
新たなコンストラクトが感染の際に標的蛋白質を産生および提示する能力についても新たなコンストラクトを検査した。感染ベロ細胞の溶解物および精製されたＶＬＰをウェスタンブロットによって分析した（図１８）。抗ｐ２Ａ抗体の結合（図１８Ａ）は、ＭｅｌＡＲＶ  Ｇａｇ（ライン１および２）およびＳＩＶ  Ｇａｇ（ライン３および４）発現を溶解物およびＶＬＰの両方において示すバンドを示した。図１８Ｂに示すように、ｐ１５Ｅ（４Ｆ５により結合）は、Ａｄ５−ＭｅｌＡＲＶ感染細胞の溶解物（ライン１）においてのみ検出され、ｐ１５Ｅに対応する低いバンド約２０ｋＤａと、７０ｋＤのより高いバンドとを有しており、完全長のＥｎｖ（ｇｐ７０＋ｐ１５Ｅ）を示した。完全長Ｅｎｖはまた、Ａｄ５−ＭｅｌＡＲＶ−ＩＳＤ（ライン２）についても検出可能であるのに対し、単一のｐ１５Ｅバンドは視認できなかった。Ａｄ５−ＭｅｌＡＲＶに誘導されたＶＬＰにおいてのみ、ｐ１５Ｅおよび完全長のＥｎｖが検出可能であった。他の弱いバンドは、異なるコンストラクトについて存在していたが、どの蛋白質に対してそれらが対応するかは明確ではない。
【０２２５】
４Ｆ５と類似の結果は図１８Ｃに示されており、その中で、ｇｐ７０はＭＭ２−９Ｂ６によって可視化された。Ａｄ５−ＭｅｌＡＲＶにより誘導されたＶＬＰ（ライン１）のみが、ＭＭ２−９Ｂ６で検出されるｇｐ７０を提示した。
【０２２６】
細胞分解物に加えて、感染細胞の上清を分析して蛋白質が分泌されているかどうかを調べた（図１８Ｄ，Ｅ）。上清中のｐ１５Ｅ（４Ｆ５によって結合）（図１８Ｄ）は、Ａｄ５−ＭｅｌＡＲＶについてのみ検出可能であり（ライン１）、上清中のＶＬＰによるのかもしれなかった。ＭＭ２−９Ｂ６（図Ｅ）は、その一方で、Ａｄ５−ＭｅｌＡＲＶ−ＩＳＤ感染細胞（ライン２）が、異なる大きさの複合体として検出される多量のｇｐ７０を放出することを明らかにした（図１８Ｅ）。対照的に、Ａｄ５−ＭｅｌＡＲＶは、少量のｇｐ７０の放出を誘導した（ライン１）。
【０２２７】
新たな改変されたＭｅｌＡＲＶ  Ｅｎｖ蛋白質（ライン３および４）のいずれもが、非変性条件下での細胞表面上での検出可能な発現にもかかわらず、溶解物、上清または精製されたＶＬＰにおける蛋白質の発現を示さなかった。
【０２２８】
ウェスタンブロット分析における新たなコンストラクトについてのバンドの非存在により、仮定は、合成された蛋白質がニトロセルロース膜へ結合することができないというものであった。それゆえ、ＥＬＩＳＡ分析をＥＬＩＳＡプレートを用いて実施し、細胞溶解物、上清またはＶＬＰでコーティングした（図１９）。期待されるように、抗ｐ２Ａによって検出されるＧａｇ蛋白質は、試料全部において存在していた（図１９Ａ）。対照的に、ＭｅｌＡＲＶ  Ｅｎｖ  ｇｐ７０（ＭＭ２−９Ｂ６によって結合）は、ＡＤ５−ＭｅｌＡＲＶ感染細胞のＶＬＰにおいてのみ検出された（ライン１）が、改変型ＭｅｌＡＲＶウイルスに感染した細胞においては検出されなかった（図１９Ｂ）。 同様の結果は、ｐ１５Ｅ発現について観察された（４Ｆ５および１９Ｆ８によって結合）（図１９Ｃ，Ｄ）。Ａｄ５−ＭｅｌＡＲＶ（ライン１）は、膜貫通サブユニットの高発現を誘導し、これは、ＶＬＰへとうまく組み込まれた。その一方で、Ａｄ５−ＭｅｌＡＲＶ−ＩＳＤ（ライン２）については、ほとんどの蛋白質が試料のいずれにおいても検出されなかった。改変型ワクチン（ライン３および４）は、ｐ１５Ｅの発現およびＶＬＰ組込みをある程度まで誘導したが、未処置のＭｅｌＡＲＶ  Ｅｎｖワクチンよりも非常に低レベルであった（図１９Ｃ、Ｄ）。
【０２２９】
実施例９（比較）
次のコンストラクトを使用して、ｂａｌｂ／ｃマウスを免疫化した；ＨＩＶ  Ｂ  ｇａｇ  Ｐ２Ａ  ＣｏｎＢ  ｇｐ１４０  Ｇ／ＣＤ（野生型）、ＨＩＶ  Ｂ  ｇａｇ  Ｐ２Ａ  ＣｏｎＢ  ｇｐ１４０  Ｇ／ＣＤ  ＩＳＤ＃４（Ｙ７５Ｇ）、ＨＩＶ  Ｂ  ｇａｇ  Ｐ２Ａ  ＣｏｎＢ  ｇｐ１４０  Ｇ／ＣＤ  ＩＳＤ＃１９（Ｌ７０Ｑ）、ＨＩＶ  Ｂ  ｇａｇ  Ｐ２Ａ  ＣｏｎＢ  ｇｐ１４０   Ｇ／ＣＤ  Ｇ１９Ｒｄｂ（Ｇ８３Ｋ，Ｓ８８Ｆ）。抗体応答をＨＩＶ  ＣｏｎＢ  ｇｐ１４０野生型蛋白質に対する免疫化の４週間後（ｄ．２８−図２０Ａ）および７週間後（ｄ．４９−図２０Ｂ）に分析した。ＩｉＧＰ−Ｐ２Ａ−ＩＦＮａｌｐｈａ４およびＨＩＶ  Ｂ  ｇａｇ  Ｐ２Ａ  ＣｏｎＢ  ｇｐ１４０  Ｇ／ＣＤ（野生型）（４２０Ｂ）は、Ｉ型インターフェロン誘導性応答のための対照群として機能する。
【０２３０】
次のコンストラクトを用いて、ｃ５７／ｂｌ６マウスまたはｃ５７／ｂｌ６ＩＦＮ−ｇノックアウトマウスを免疫化した。アデノウイルスは、ＨＩＶ  Ｂ  クレイド  ｇａｇ  ｐ２Ａに続いて、Ｂクレイドコンセンサス塩基配列（ＨＩＶ  Ｂ  ｇａｇ  Ｐ２Ａ  ＣｏｎＢ  ｇｐ１４０  Ｇ／ＣＤ）のｇｐ１４０配列（野生型）およびＨＩＶ  Ｂ  ｇａｇ  Ｐ２Ａ  ＣｏｎＢ  ｇｐ１４０  Ｇ／ＣＤ  ＩＳＤ＃１９（Ｌ７０Ｑ）をコードした。抗体応答をＨＩＶ  ＣｏｎＢ  ｇｐ１４０  ＣＦ蛋白質に対する免疫化の４週間後に決定した（ｄ．２６−図２０Ｃ）。
【０２３１】
実施例１０
次のコンストラクトを使用して、ｂａｌｂ／ｃマウスを免疫化した。ＨＩＶ  Ｂ  ｇａｇ  Ｐ２Ａ  ＣｏｎＢ  ｇｐ１４０  Ｇ／ＣＤ（野生型）、ＨＩＶ  Ｂ  ｇａｇ  Ｐ２Ａ  ＣｏｎＢ  ｇｐ１４０  Ｇ／ＣＤ  ＩＳＤ＃４（Ｙ７５Ｇ）、ＨＩＶ  Ｂ  ｇａｇ  Ｐ２Ａ  ＣｏｎＢ  ｇｐ１４０  Ｇ／ＣＤ  ＩＳＤ＃１９（Ｌ７０Ｑ）、ＨＩＶ  Ｂ  ｇａｇ  Ｐ２Ａ  ＣｏｎＢ  ｇｐ１４０  Ｇ／ＣＤ  Ｇ１９Ｒｄｂ（Ｇ８３Ｋ，Ｓ８８Ｆ）。免疫化の４か月後（ｄ．１１４）、マウスを、Ｇａｇ遺伝子（ＭＡ（ｐ１７，マトリックス）（ペプチド１〜３１）、ＣＡ（ｐ２４、カプシド）（ペプチド３２〜８９）、ｐ２、ＮＣ（ヌクレオカプシド）、ｐ１、およびｐ６を網羅する単一のプール（ペプチド９０〜１２４）、ｇｐ１２０（１）（ペプチド１〜６２）、ｇｐ１２０（２）（ペプチド６３〜１２４）、ｇｐ４１（ペプチド１２５〜２１１）を網羅するペプチドのプールに対するＴ細胞応答について分析した。
【０２３２】
実施例１１
ＢＡＬＢ／ｃマウスにＭＶＡ発現ｇａｇ、ｅｎｖ、ｇａｇ＋ｅｎｖ、ＶＥ−ＶＬＰまたはアデノウイルス発現ｇａｇ−ｅｎｖもしくはｇａｇ＋ｅｎｖＩＳＤ突然変異体ＶＥ−ＶＬＰ、およびこれらの組み合わせのいずれかを予防接種し、９アミノ酸長のペプチドを結合する推定ＭＨＣに向けて、ＥＬＩＳＰＯＴまたは細胞内サイトカイン染色を用いて測定される。
【０２３３】
特にアデノウイルスベクターにおけるｇａｇ＋ｅｎｖまたはｇａｇ＋ｅｎｖＩＳＤ変異体ＶＥＶＬＰは、Ｔ細胞応答の誘導において既に説明されたＭＶＡベクターを、より性能が優れているように強く期待されている。
【０２３４】
実施例１２：
ＢＡＬＢ／ｃマウスに、ＶＥ−ＶＬＰとしてｇａｇ、ｅｎｖ、ｇａｇ＋ｅｎｖ、ｇａｇ＋ｅｎｖＩＳＤ突然変異体を発現するＭＶＡ、またはｇａｇ−ｅｎｖもしくはｇａｇ＋ｅｎｖＩＳＤ突然変異体ＶＥＶＬＰを発現するアデノウイルスのいずれか、およびこれらの組み合わせを予防接種し、ＨＥＲＶ−Ｋｃｏｎの膜貫通ドメインｐ１５Ｅの細胞外部分の配列に由来するペプチド応答を測定する。
【０２３５】
ｇａｇ−ｅｎｖまたはｇａｇ＋ｅｎｖＩＳＤ突然変異体ＶＥＶＬＰベクターは、Ｔ細胞応答の誘導においてすでに説明されたＭＶＡベクターより性能が優れているように期待されている。
【０２３６】
実施例１３
動物に、ＨＥＲＶｃｏｎ−ｇａｇおよびＨＥＲＶｃｏｎ−ｅｎｖをそれぞれ発現するＲＥＮＣＡ腎癌細胞を皮下負荷する。その後、動物に、ｇａｇ、ｅｎｖ、ｇａｇ＋ｅｎｖ、ｇａｇ＋ｅｎｖＩＳＤ突然変異体をＶＥ−ＶＬＰとして発現するＭＶＡ、またはｇａｇ−ｅｎｖもしくはｇａｇ＋ｅｎｖＩＳＤ突然変異体ＶＥＶＬＰを発現するアデノウイルスのいずれか、およびこれらの組み合わせを予防接種し、腫瘍の成長をモニターする。
【０２３７】
腫瘍制御は、両細胞株において腫瘍の成長を独特に制御することができるＶＥ−ＶＬＰワクチンおよびｇａｇ−ｅｎｖＶＥＶＬＰワクチンを用いて改善されると期待される。
【０２３８】
実施例１４
動物にそれぞれＨＥＲＶｃｏｎ−ｇａｇおよびＨＥＲＶｃｏｎ−ｅｎｖを発現するＲＥＮＣＡ腎癌細胞を静脈内負荷する。その後、動物に、ｇａｇ、ｅｎｖ、ｇａｇ＋ｅｎｖ、ｇａｇ＋ｅｎｖＩＳＤ突然変異体をＶＥ−ＶＬＰとして発現するＭＶＡまたはｇａｇ−ｅｎｖもしくはｇａｇ＋ｅｎｖＩＳＤ突然変異体ＶＥＶＬＰを発現するアデノウイルスのいずれか、およびこれらの組み合わせを予防接種し、腫瘍の成長を生体解剖によってモニターし、腫瘍負荷の３０日後に転移を計数する。
【０２３９】
腫瘍制御は、両細胞株の腫瘍成長を独特に制御することができるＶＥ−ＶＬＰワクチンおよびｇａｇ−ｅｎｖＶＥＶＬＰワクチンを用いて改善されることが期待される。
【０２４０】
実施例１５
先行実施例において説明された免疫療法戦略に関する翻訳の研究に関して、形質導入された細胞におけるＶＬＰ形成をもたらすよう企図された（Ｍｕｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２９９３）、コンセンサス塩基配列ヒト内在性レトロウイルスＫ型（ＨＥＲＶ−Ｋ）エンベロープ（Ｅｎｖ）蛋白質および群特異的抗原（Ｇａｇ）蛋白質についてコードするアデノウイルスベクター（Ａｄ５／Ａｄ１９ａ）（Ｄｅｗａｎｎｉｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．２００６）を用いて、ワクチンのヒト関連版を設計した。予防接種戦略を改善するために、ＨＥＲＶ−Ｋ  Ｅｎｖ蛋白質のｐ１５Ｅサブユニット中に含有されるＩＳＤは、単一の点突然変異によって不活性化される（図２２を参照されたい）が、その選択は、Ｍｏｒｏｚｏｖ  ｅｔ  ａｌ．２０１２およびＨＥＲＶ−ＫとＨＩＶとの間の保存に基づいていた（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｕｙｌ  ２０１２）（Ｄｅｗａｎｎｉｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．２００５）。
【０２４１】
ＨＥＲＶ−Ｋ  Ｇａｇ−ｐ２Ａ−ＥｎｖＩＳＤ突然変異体は、アミノ酸配列（配列番号４８）を有していた。
【０２４２】
【化３１−１】
2020531053.tif 000068
【化３１−２】
2020531053.tif 000069
【０２４３】
これらのワクチンを、ＢＡＬＢ／ｃマウス、Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびＣＤ１マウスにおける免疫原性について検査し、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてＨＥＲＶ−Ｋ  Ｅｎｖ標的蛋白質を発現するマウス腎癌（ＲｅｎｃａまたはＲＬＺ）細胞を負荷して、マウス生存曲線によって測定されるようなこれらの効率を試験した。免疫応答を、細胞応答および液性応答を誘導する能力について査定し、ＩＮＦγ＋  ＣＤ８＋  Ｔ細胞の存在（ＦＡＣＳ分析による）、ならびにＤＮＡ／Ａｄｖ−ＨＥＲＶ−Ｋ野生型／ＩＳＤワクチンで免疫化しＭＶＡ  Ｅｎｖで追加免疫したマウスにおけるＨＥＲＶ−Ｋ  Ｅｎｖ標的蛋白質に対する特異的抗体（ＥＬＩＳＡによって検出）について検査した。
【０２４４】
Ａｄ１９−ＨＥＲＶ−Ｋ野生型ワクチンおよびＩＳＤ突然変異を含有するその改善板を、Ｇａｇ＿ｐ２Ａ＿Ｅｎｖ  ＨＥＲＶ−Ｋ    Ａｄｖコード蛋白質によって形成されたＶＬＰの発現を誘導する能力について検査および比較した。免疫応答を遮断する中和抗体（ＮＡｂ）をもたらすヒトにおける既存の免疫は、Ａｄ５ベクターを使用する欠点となる可能性がある。その上、Ａｄ１９ベクターは、異なる種類の細胞を形質導入する点でよりうまくいくことが公知である（Ｋｉｅｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１８）。それゆえ、異なるアデノウイルスベクター（Ａｄ１９対Ａｄ５）の利用も解析および比較される。
【０２４５】
新規の戦略の機能性を分析する目的のために、ワクチンをＨＥＲＶ−Ｋ  ＧａｇおよびＥｎｖ標的蛋白質の誘導について分析した。それゆえ、ＶＬＰの産生および分泌を、関心対象の異なる配列を含有する異なるウイルス系ワクチンでトランスフェクトしたベロ細胞株およびＡ５４９細胞株において検査した（図２３を参照されたい）。上述のトランスフェクトされた細胞株由来の上清（ＳＮ）および細胞溶解物を、ウェスタンブロット（ＷＢ）によってＨＥＲＶ−Ｋ  Ｇａｇ蛋白質およびＥｎｖ蛋白質の存在について検査した。ｐ１５Ｅ（ＴＭ）およびｇｐ７０（ＳＵ）に対するモノクローナル抗体であるＨＥＲＭ−１８１１−５およびＨＥＲＭ−１８２１−５を特異的に使用して、ＨＥＲＶ−Ｋ  Ｅｎｖドメインを検出したのに対し、ポリクローナルウサギ抗ｐ２Ａ抗体を使用して、ｐ２Ａに連結されたＧａｇ蛋白質を検出した。ＨＲＰ結合二次抗体を検出のために採用した。
【０２４６】
ＷＢの結果は、Ａｄ１９＿ＨＥＲＶ−Ｋ  野生型／ＩＳＤ突然変異体でトランスフェクトしたベロ細胞およびＡ５４９細胞のＳＮおよび細胞溶解物の両方においてＨＥＲＶ−Ｋ  Ｇａｇ＿ｐ２Ａ蛋白質、およびＨＥＲＶ−Ｋ  Ｅｎｖ蛋白質の存在を示した。Ａｄ１９＿ＨＥＲＶ−Ｋ  ＩＳＤ突然変異体によりトランスフェクトされた細胞に由来するＧａｇ蛋白質およびＥｎｖ蛋白質の両方のより高い発現（図２３の行２および行８に示されている）は、Ａｄ１９＿ＨＥＲＶ−Ｋ＿野生型ワクチンおよびＡｄ５＿ＨＥＲＶ−Ｋ＿Ｅｎｖワクチンと比較したとき、改変型プロトタイプワクチンの高い機能性およびより優れた能力を示唆している。その上、Ａｄ１９＿ＨＥＲＶ−Ｋをトランスフェクトされたベロ細胞のＳＮにおけるＧａｇ蛋白質およびＥｎｖ蛋白質の非存在は、対応する試料のＶＬＰ精製後に取得された低濃度の蛋白質により説明されることができた。
【０２４７】
ＨＥＲＶ−Ｋ    Ｅｎｖ標的蛋白質の発現をさらに確認するために、Ａ５４９細胞にＶＬＰによりコードされたアデノウイルスワクチンをトランスフェクトした（図２４を参照されたい）。感染の４８時間後、細胞を一次抗ＨＥＲＶ−Ｋ  Ｅｎｖ抗体（ＨＥＲＭ−１８１１）とともにインキュベートし、その後、先の固定および透過性処理ありでおよびなしでヤギ抗マウスＩｇＧ  ＡＰＣ二次抗体で標識した。結合した抗体の細胞内および細胞外の蛍光、ならびにそれゆえ、感染細胞の内部および外部のＨＥＲＶ−Ｋ  Ｅｎｖの発現をＦＡＣＳにより分析した。本結果は、Ａｄ５と比較してＡｄ１９ベクターを用いると、より良好なトランスフェクション効率を示唆しており、その理由は、両方が同じ標的蛋白質についてコードされているが、Ａｄ１９を用いるとより高いシグナルが検出されたからである。Ａｄ１９＿ＨＥＲＶＫ野生型ワクチンおよびＩＳＤ突然変異体ワクチンを比較すると、より大きな細胞表面シグナルおよび類似の細胞内シグナルが、Ａｄ１９＿ＨＥＲＶ−Ｋ＿ＩＳＤ突然変異体トランスフェクト細胞から検出され、このことは、突然変異した配列の改善された細胞表面選択を示す。
【０２４８】
構造蛋白質Ｇａｇの生成およびそれに続くＥｎｖ  ＨＥＲＶ−Ｋの放出を視覚的に確認するために、Ａ５４９細胞に５０ＭＯＩのＡｄ１９＿ＨＥＲＶ−Ｋ＿ＩＳＤ突然変異体を感染させ、感染２４時間後および４８時間後に固定した。次に、発芽および分泌型ＶＬＰを電子顕微鏡によって検出し（図２９を参照されたい）、ワクチンがＨＥＲＶ−Ｋ  ＧａｇおよびＥｎｖ標的蛋白質を発現することが完全にできることを示し、分泌型ＶＬＰ内へと組み込まれていた。
【０２４９】
実施例１６
Ａｄ１９＿ＨＥＲＶ−Ｋ野生型／ＩＳＤ突然変異体ワクチンによって誘導されるＴ細胞応答を検査するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＰ−ＨＫＥ（配列ＴＹＨＭＶＳＧＭＳＬを有するＨＥＲＶ−Ｋ  Ｅｎｖの１０マーのペプチド）に対するＴリンパ球応答を分析した。Ｐ−ＨＫＥはＭＨＣクラスＩ束縛エピトープであるので、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の活性化、したがって、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるペプチド刺激後のインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）および腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）サイトカインの分泌を、ＦＡＣＳを用いてサイトカインの細胞内染色（ＩＣＳ）によって測定した。
【０２５０】
ＢＡＬＢ／ｃマウスにＨＥＲＶ−Ｋ蛋白質についてコードする異なるベクター（Ａｄ５／Ａｄ１９／ＭＶＡ）からなる種々のワクチンを初回免疫した。それに続いて、該マウスの半分がＭＶＡ  Ｅｎｖ追加免疫を受け、初回免疫化投与計画によって誘起された細胞応答が増大することができたかどうかを検査した。ＭＶＡ追加免疫の１０日間後にマウスを安楽死させ、Ｐ−ＨＫＥ刺激の際に、ＦＡＣＳによって脾細胞を分析した（図２５を参照されたい）。Ａｄ１９＿ＨＥＲＶ−Ｋ＿野生型／ＩＳＤ突然変異体ワクチンを受ける群は、追加免疫（ＭＶＡ−Ｅｎｖ）および非追加免疫
【数８】
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の両方の投与計画において、ＩＮＦγを分泌するより多数の特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞を示した。その上、アデノウイルス毒素産生ワクチンすべてによって誘起される細胞応答は、ＭＶＡ追加免疫投与計画後に増大するように見える。この追加免疫は、採用されるワクチン間の差を強調するように見え、特にＩＦＮγ／ＴＮＦα  ＣＤ８＋  Ｔ細胞の比を試験するときにそうであり、改善されたアデノウイルス毒素産生ワクチン（Ａｄ１９＿ＨＥＲＶ−Ｋ＿ＩＳＤ突然変異体）を受容したマウスの群において有意な優れた割合であった。このことは、関心対象の配列についてコードするＡｄ１９ベクターが、Ａｄ５ベクターおよびＭＶＡベクターと比較したとき、初回免疫−追加免疫投与計画における関連するＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を誘導するのに最も適していることを示唆した。加えて、本結果は、ＭＶＡベクターが、ＨＥＲＶ−Ｋ  Ｅｎｖ標的蛋白質に対する細胞毒性Ｔ細胞応答を増大させるために追加免疫投与計画において使用されることができることを示唆した。これらの結果はまとめて、ＨＥＲＶ−Ｋ  Ｅｎｖ発現腫瘍細胞に対するＩＦＮγ＋ＣＤ８＋  Ｔ細胞特異的応答を上昇させる特に効率的な予防接種計画が、好ましくはＨＥＲＶ−Ｋ＿Ｇａｇ＿ｐ２Ａ＿Ｅｎｖ−ＩＳＤ突然変異体蛋白質についてコードするＡｄ１９ベクターによる免疫化、および追加免疫投与計画に関しては、ＨＥＲＶ−Ｋ＿Ｅｎｖ蛋白質についてコードするＭＶＡベクターによる免疫化からなるであろうことを示した。
【０２５１】
実施例１７
ワクチンの有効性を検査および比較するために、マウスに負荷し、その後予防接種し、腫瘍の進行と相関のあるマウスの生存を格付けした（図２６を参照されたい）。本実験のために、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、ＨＥＲＶ−Ｋ  Ｅｎｖを発現するＲＥＮＣＡ細胞を静脈内負荷した。腫瘍負荷の１０日後、マウスにＭＶＡ  Ｅｎｖ、Ａｄ１９＿ＨＥＲＶ−Ｋ野生型／ＩＳＤ突然変異体、および対照としての無関係ワクチンを接種した。本実験は、（Ｋｒａｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．Ａｕｇ  ３０；８（８）：ｅ７２７５６）に基づいており、注射４０日後に転移性腫瘍量をスコア化するよう企図したが、動物は縦断的に秤量し、何らかの物理的、行動的、もしくは身体的変化が動物において観察された場合、または体重減少が１０％を超えた場合、マウスを安楽死させた。マウスをいったん屠殺すると、肺を収穫し、４％ＰＦＡ中で保存して、転移の存在についてさらに分析した。特筆すべきことに、体重減少により屠殺した動物はすべて、実質的な大きな腫瘍量を有していた。予期せぬことに、有意な死亡率を本実験の実施中に記録し、生存曲線を確立して、異なる群間で比較した。このことは、既に報告されたものと比較してＲＥＮＣＡ−ＨＥＲＶ−Ｋ腫瘍のより迅速な進行を示した。このむしろ厳密な腫瘍負荷モデルの下で、Ａｄ１９＿ＨＥＲＶ−Ｋ＿ＩＳＤ突然変異体ワクチンを受けているマウスは、対照と比較して平均余命の有意な延長を示した。３つの異なる統計学的検定（対数順位、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ、およびＴａｒｏｎｅ−Ｗａｒｅ）は、有意なｐ値（０．０３７、０．０４６および０．０４０）を示した。このことは、Ａｄ１９＿ＨＥＲＶ−Ｋ＿ＩＳＤ突然変異体ワクチンが、抗体およびＣＤ８＋  Ｔ細胞応答の増大を示す上述の結果と一致して、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける肺腫瘍の進行および転移を遅延させることを示唆した。他のワクチンはいずれも生存時間を延長しなかった。
【０２５２】
実施例１８
ヒトの系においても本知見をさらに確証するために、組織試料をヒト乳房腫瘍から取得した。４μｍに薄片化し、非免疫化マウス（出血前血清）から取得した１：１０００希釈した一次抗体で染色し、Ａｄ５＿ＨＥＲＶ−Ｋ＿Ｅｎｖで初回免疫したマウスは、Ａｄ１９＿ＨＥＲＶ−Ｋ＿ＩＳＤ（８週間後）およびＭＶＡ＿Ｅｎｖ（２か月後）の予防接種投与計画で追加免疫を受けた。図２８に示されるように、予防接種したマウス由来のＨＥＲＶ−Ｋ抗体は、ＨＥＲＶ−Ｋ標的蛋白質を発現する癌組織を染色することができる。
【０２５３】
種々の態様および実施は、本明細書の種々の実施形態とともに説明されてきた。しかしながら、開示された実施形態に対する他の変法は、請求された対象を実行する上で、図面、本開示、および添付の特許請求の範囲の研究から、当業者によって理解されおよび成し遂げられることができる。特許請求の範囲において、「を含んでいる」という語は、他の要素またはステップを除外しておらず、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」は、複数を除外していない。単一のプロセッサまたは他の単位は、特許請求の範囲において列挙されているいくつかの項目の機能を満たすことができる。ある特定の手段が相互に異なる独立した特許請求の範囲において列挙されているという単なる事実は、測定されるこれらの組み合わせが有利となるために使用されることができないことを示してはいない。コンピュータプログラムは、他のハードウェアと一緒にまたはその一部として光記憶媒体またはソリッドステートの媒体などの適切な媒体に保存／分配することができるが、インターネットまたは他の有線もしくは無線の通信システムを介するなどの他の形態でも分配されることができる。
【０２５４】
特許請求の範囲において使用される参照符号は、範囲を限定するものとして解釈されてはならない。
【０２５５】
配列は、ＷＩＰＯ規格ＳＴ．２５により、明細書の主要本体においておよび別個の配列表において開示される。具体的な数値で指定された配列番号は、明細書の主要本体において、および別個の配列表において同じでなければならない。例として、配列番号１は、明細書の主要本体および別個の配列表の両方において同じ配列を規定しなければならない。明細書の主要本体における配列の定義と別個の配列表との間に矛盾がある場合（明細書の主要本体中の配列番号１が、別個の配列表において配列番号２に誤って対応している場合）、特に具体的な実施形態の適用における具体的な配列に対する参照は、適用の主要本体における配列に対する参照として理解されるものとし、別個の配列表に対する参照としてではない。言い換えれば、明細書の主要本体における配列の定義／指定が別個の配列表を、明細書、例、図面、および特許請求の範囲を含む適用の主要本体において開示される配列およびその指定に修正することによって解決されるものとする。
【０２５６】
特許項目
１．ウイルス様粒子（ＶＬＰ）をコードすることができるアデノウイルスベクターを含む、疾患の予防および／または治療における使用のためのワクチンであって、該ＶＬＰが、不活性型免疫抑制性ドメイン（ＩＳＤ）を提示する、ワクチン。
【０２５７】
２．癌の予防および／または治療のためである、項目１記載のワクチン。
【０２５８】
３．該ＩＳＤは、該アミノ酸の少なくとも１つが欠失しているかまたは異なるアミノ酸と交換されたＬＡＮＱＩＮＤＬＲＱＴＶＩＷ（配列番号１）、ＬＡＳＱＩＮＤＬＲＱＴＶＩＷ（配列番号２）、ＬＱＮＲＲＧＬＤＬＬＴＡＥＫＧＧＬ（配列番号３）、ＬＱＮＲＲＡＬＤＬＬＴＡＥＲＧＧＴ（配列番号４）、ＬＱＮＲＲＧＬＤＭＬＴＡＡＱＧＧＩ（配列番号５）、またはＹＱＮＲＬＡＬＤＹＬＬＡＡＥＧＧＶ（配列番号６）を有する、項目１または２記載のワクチン。
【０２５９】
４．元とは異なるアミノ酸が、天然アミノ酸のうちで選択される、項目３記載のワクチン。
【０２６０】
５．該ＩＳＤの上流または下流の１０アミノ酸領域における該アミノ酸の少なくとも１つが、異なるアミノ酸と交換された、項目１から４までのいずれか１項記載のワクチン。
【０２６１】
６．該ＶＬＰがさらに、内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）エンベロープ蛋白質またはその免疫原性部分を提示している、項目１から５までのいずれか１項記載のワクチン。
【０２６２】
７．該ＥＲＶエンベロープ蛋白質が、ヒト内在性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）蛋白質またはその免疫原性部分である、項目１から６までのいずれか１項記載のワクチン。
【０２６３】
８．該ＨＥＲＶが、ＨＥＲＶ−Ｋ、ＨＥＲＶ−Ｈ、ＨＥＲＶ−Ｗ、ＨＥＲＶ−ＦＲＤ、およびＨＥＲＶ−Ｅからなる群のうちで選択される、項目１から７までのいずれか１項記載のワクチン。
【０２６４】
９．該ＨＥＲＶ−Ｋが、ＨＥＲＶ−Ｋ１０８（＝ＥＲＶＫ−６）、ＥＲＶＫ−１９、ＨＥＲＶ−Ｋ１１５（＝ＥＲＶＫ−８）、ＥＲＶＫ−９、ＨＥＲＶ−Ｋ１１３、ＥＲＶＫ−２１、ＥＲＶＫ−２５、ＨＥＲＶ−Ｋ１０２（＝ＥＲＶＫ−７）、ＨＥＲＶ−Ｋ１０１（＝ＥＲＶＫ−２４）、およびＨＥＲＶ−Ｋ１１０（＝ＥＲＶＫ−１８）からなる群のうちで選択され、ＨＥＲＶ−Ｈが、ＨＥＲＶ−Ｈ１９（＝ＨＥＲＶ−Ｈ＿２ｑ２４．３）、およびＨＥＲＶ−Ｈ＿２ｑ２４．１からなる群のうちで選択され、ＨＥＲＶ−ＷがＥＲＶＷ−１（＝シンシチン１）として選択され、かつＨＥＲＶ−ＦＲＤがＥＲＶＦＲＤ−１（＝シンシチン２）として選択される、項目１から８までのいずれか１項記載のワクチン。
【０２６５】
１０．該アデノウイルスベクターが、哺乳動物アデノウイルス型、ヒトアデノウイルス型、チンパンジーアデノウイルス型、またはゴリラアデノウイルス型に由来する、項目１から９までのいずれか１項記載のワクチン。
【０２６６】
１１．該ヒトアデノウイルスベクターが、Ｄ群ベクター、ヒトアデノウイルス血清型Ａｄ５、ヒトアデノウイルス血清型Ａｄ１９ａ、ヒトアデノウイルス血清型Ａｄ２６、またはチンパンジーアデノウイルス血清型に由来する、項目１から１０までのいずれか１項記載のワクチン。
【０２６７】
１２．該アデノウイルスベクターが、アデノウイルス，血清型５（Ａｄ５）である、項目１から１１までのいずれか１項記載のワクチン。
【０２６８】
１３．該アデノウイルスベクターの蛋白質産物には、ｇａｇ蛋白質、２Ａペプチド、およびエンベロープ蛋白質（Ｅｎｖ）が含まれる、項目１から１２までのいずれか１項記載のワクチン。
【０２６９】
１４．該ｇａｇ蛋白質が、外来性レトロウイルスｇａｇ蛋白質または内在性レトロウイルスｇａｇ蛋白質である、項目１から１３までのいずれか１項記載のワクチン。
【０２７０】
１５．該Ｅｎｖ蛋白質が、表面単位（ｇｐ７０）、開裂部位、および膜貫通単位（ｐ１５Ｅ）を含む、項目１から１４までのいずれか１項記載のワクチン。
【０２７１】
１６．膜貫通単位（ｐ１５Ｅ）が、融合ペプチド、免疫抑制性ドメイン（ＩＳＤ）、膜貫通アンカー、および／または細胞質尾部を含む、項目１から１５までのいずれか１項記載のワクチン。
【０２７２】
１７．ｐ１５Ｅまたはその免疫原性部分が、アデノウイルスカプシド蛋白質ｐＩＸに連結されている、項目１から１６までのいずれか１項記載のワクチン。
【０２７３】
１８．該アデノウイルスベクターによってコードされた該シグナルペプチドが、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ由来のシグナルペプチド（ＬｕｃＳＰ）と交換された、項目１から１７までのいずれか１項記載のワクチン。
【０２７４】
１９．該アデノウイルスベクターによってコードされた該膜貫通アンカーおよび該細胞質尾部が、インフルエンザＡ型ウイルス赤血球凝集素Ｈ３Ｎ２由来の該膜貫通ドメインおよび細胞質尾部と交換された、項目１から１８までのいずれか１項記載のワクチン。
【０２７５】
２０．該アデノウイルスベクターによってコードされた該膜貫通アンカーおよび該細胞質尾部が、インフルエンザＡ型ウイルス赤血球凝集素Ｈ３Ｎ２由来の該膜貫通ドメインおよび細胞質尾部（ＨＡ−ＴＭＣＴ）と交換された、項目１から１９までのいずれか１項記載のワクチン。
【０２７６】
２１．三量体化配列が、該シグナルペプチドに隣接して提供される、項目１から２０までのいずれか１項記載のワクチン。
【０２７７】
２２．該三量体化配列が、ＧＣＮ４である、項目１から２１までのいずれか１項記載のワクチン。
【０２７８】
２３．該ＶＬＰが、ｇａｇ蛋白質を含む、項目１から２２までのいずれか１項記載のワクチン。
【０２７９】
２４．該ｇａｇ蛋白質が、外来性レトロウイルスｇａｇ蛋白質または内在性レトロウイルスｇａｇ蛋白質である、項目１〜２３のいずれか１項記載のワクチン。
【０２８０】
２５．該ＶＬＰが、該アデノウイルスベクターによって感染させられた患者の身体の細胞内で産生された、項目１から２４までのいずれか１項記載のワクチン。
【０２８１】
２６．該ＶＬＰが、単離された哺乳動物細胞内で産生される、項目１から２５までのいずれか１項記載のワクチン。
【０２８２】
２７．ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を形成することができる標的蛋白質をコードする核酸コンストラクトであって、該標的蛋白質が免疫抑制性ドメイン（ＩＳＤ）を含み、該ＩＳＤが不活性である、核酸コンストラクト。
【０２８３】
２８．該ＩＳＤは、該アミノ酸の少なくとも１つが欠失しているかまたは異なるアミノ酸と交換されたＬＡＮＱＩＮＤＬＲＱＴＶＩＷ（配列番号１）、ＬＡＳＱＩＮＤＬＲＱＴＶＩＷ（配列番号２）、ＬＱＮＲＲＧＬＤＬＬＴＡＥＫＧＧＬ（配列番号３）、ＬＱＮＲＲＡＬＤＬＬＴＡＥＲＧＧＴ（配列番号４）、ＬＱＮＲＲＧＬＤＭＬＴＡＡＱＧＧＩ（配列番号５）、またはＹＱＮＲＬＡＬＤＹＬＬＡＡＥＧＧＶ（配列番号６）を有する、項目２７記載の核酸コンストラクト。
【０２８４】
２９．元とは異なるアミノ酸が、天然アミノ酸のうちで選択される、項目２７または２８記載の核酸コンストラクト。
【０２８５】
３０．該ＩＳＤの上流または下流の１０アミノ酸領域における該アミノ酸の少なくとも１つが、異なるアミノ酸と交換された、項目２７または２８記載の核酸コンストラクト。
【０２８６】
３１．該ＶＬＰがさらに、内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）エンベロープ蛋白質またはその免疫原性部分を提示している、項目２７から３０までのいずれか１項記載の核酸コンストラクト。
【０２８７】
３２．該ＥＲＶエンベロープ蛋白質が、ヒト内在性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）蛋白質またはその免疫原性部分である、項目２７から３１までのいずれか１項記載の核酸コンストラクト。
【０２８８】
３３．該ＨＥＲＶが、ＨＥＲＶ−Ｋ、ＨＥＲＶ−Ｈ、ＨＥＲＶ−Ｗ、ＨＥＲＶ−ＦＲＤ、およびＨＥＲＶ−Ｅからなる群のうちで選択される、項目２７から３２までのいずれか１項記載の核酸コンストラクト。
【０２８９】
３４．該ＨＥＲＶ−Ｋが、ＨＥＲＶ−Ｋ１０８（＝ＥＲＶＫ−６）、ＥＲＶＫ−１９、ＨＥＲＶ−Ｋ１１５（＝ＥＲＶＫ−８）、ＥＲＶＫ−９、ＨＥＲＶ−Ｋ１１３、ＥＲＶＫ−２１、ＥＲＶＫ−２５、ＨＥＲＶ−Ｋ１０２（＝ＥＲＶＫ−７）、ＨＥＲＶ−Ｋ１０１（＝ＥＲＶＫ−２４）、およびＨＥＲＶ−Ｋ１１０（＝ＥＲＶＫ−１８）からなる群のうちで選択され、ＨＥＲＶ−Ｈが、ＨＥＲＶ−Ｈ１９（＝ＨＥＲＶ−Ｈ＿２ｑ２４．３）、およびＨＥＲＶ−Ｈ＿２ｑ２４．１からなる群のうちで選択され、ＨＥＲＶ−ＷがＥＲＶＷ−１（＝シンシチン１）として選択され、かつＨＥＲＶ−ＦＲＤがＥＲＶＦＲＤ−１（＝シンシチン２）として選択される、項目２７から３３までのいずれか１項記載の核酸コンストラクト。
【０２９０】
３５．該アデノウイルスベクターが、哺乳動物アデノウイルス型、ヒトアデノウイルス型、チンパンジーアデノウイルス型、またはゴリラアデノウイルス型に由来する、項目２７から３４までのいずれか１項記載の核酸コンストラクト。
【０２９１】
３６．該ヒトアデノウイルスベクターが、Ｄ群ベクター、ヒトアデノウイルス血清型Ａｄ５、ヒトアデノウイルス血清型Ａｄ１９ａ、ヒトアデノウイルス血清型Ａｄ２６、またはチンパンジーアデノウイルス血清型に由来する、項目２７から３５までのいずれか１項記載の核酸コンストラクト。
【０２９２】
３７．該アデノウイルスベクターが、アデノウイルス，血清型５（Ａｄ５）である、項目２７から３６までのいずれか１項記載の核酸コンストラクト。
【０２９３】
３８．該アデノウイルスベクターの蛋白質産物には、ｇａｇ蛋白質、２Ａペプチド、およびエンベロープ蛋白質（Ｅｎｖ）が含まれる、項目２７から３７までのいずれか１項記載の核酸コンストラクト。
【０２９４】
３９．該ｇａｇ蛋白質が、外来性レトロウイルスｇａｇ蛋白質または内在性レトロウイルスｇａｇ蛋白質である、項目２７から３８までのいずれか１項記載の核酸コンストラクト。
【０２９５】
４０．該Ｅｎｖ蛋白質が、表面単位（ｇｐ７０）、開裂部位、および膜貫通単位（ｐ１５Ｅ）を含む、項目２７から３９までのいずれか１項記載の核酸コンストラクト。
【０２９６】
４１．該膜貫通単位（ｐ１５Ｅ）が、融合ペプチド、免疫抑制性ドメイン（ＩＳＤ）、膜貫通アンカー、および／または細胞質尾部を含む、項目２７から４０までのいずれか１項記載の核酸コンストラクト。
【０２９７】
４２．ｐ１５Ｅまたはその免疫原性部分が、アデノウイルスカプシド蛋白質ｐＩＸに連結されている、項目２７から４１までのいずれか１項記載の核酸コンストラクト。
【０２９８】
４３．該アデノウイルスベクターによってコードされた該シグナルペプチドが、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ由来のシグナルペプチド（ＬｕｃＳＰ）と交換された、項目２７から４２までのいずれか１項記載の核酸コンストラクト。
【０２９９】
４４．該アデノウイルスベクターによってコードされた該膜貫通アンカーおよび該細胞質尾部が、インフルエンザＡ型ウイルス赤血球凝集素Ｈ３Ｎ２由来の該膜貫通ドメインおよび細胞質尾部と交換された、項目２７から４３までのいずれか１項記載の核酸コンストラクト。
【０３００】
４５．該アデノウイルスベクターによってコードされた該膜貫通アンカーおよび該細胞質尾部が、インフルエンザＡ型ウイルス赤血球凝集素Ｈ３Ｎ２由来の該膜貫通ドメインおよび細胞質尾部（ＨＡ−ＴＭＣＴ）と交換された、項目２７から４４までのいずれか１項記載の核酸コンストラクト。
【０３０１】
４６．三量体化配列が、該シグナルペプチドに隣接して提供される、項目２７から４５までのいずれか１項記載の核酸コンストラクト。
【０３０２】
４７．該三量体化配列が、ＧＣＮ４である、項目２７から４６までのいずれか１項記載のワクチン。
【０３０３】
４８．項目２７から４７までのいずれか１項記載の核酸コンストラクトの発現産物を含む、蛋白質。
【０３０４】
４９．項目２７から４７までのいずれか１項記載の核酸コンストラクトを含む、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【０３０５】
５０．癌の予防および／または治療における使用のための、項目１から２７までのいずれか１項記載のワクチン。
【０３０６】
５１．請求項２７から４７までのいずれか１項記載の核酸コンストラクトを用いて該患者を初回免疫した少なくとも５日間後に、項目１から２６までのいずれか１項記載のワクチンで追加免疫するステップを含む、癌の予防および／または治療における使用のための、項目１から２７までのいずれか１項記載のワクチン。
【０３０７】
５２．アデノウイルスベクター由来の該ＶＬＰとは異なる、ウイルスによってコードされたＶＬＰを用いて、項目１から２６までのいずれか１項記載のワクチンに対する該患者の曝露の５日間以上後に該患者を後治療するステップを含む、癌の予防および／または治療における使用のための、項目１から２６までのいずれか１項記載のワクチン。
【０３０８】
５３．アデノウイルスベクター由来の該ＶＬＰとは異なる該ウイルスによってコードされたＶＬＰが、改変型Ｖａｃｃｉｎａ  Ａｎｋａｒａ（ＭＶＡ）に由来するＶＬＰである、項目５２に記載のワクチン。
【０３０９】
５４．ウイルス様粒子（ＶＬＰ）をコードすることができるウイルスベクターを含み、該ＶＬＰが、不活性型免疫抑制性ドメイン（ＩＳＤ）を提示する、疾患の予防および／または治療における使用のための、ワクチン。
【０３１０】
５５．該ウイルスベクターが、改変型Ｖａｃｃｉｎａ  Ａｎｋａｒａ（ＭＶＡ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、またはレンチウイルスに由来する、請求項５４記載のワクチン。
【０３１１】
５６．項目１から２６までのいずれか１項記載のワクチンの投与を含む、癌の予防および／または治療のための、方法。
【０３１２】
５７．項目２７から４７までのいずれか１項記載の核酸を用いて該患者を初回免疫した少なくとも５日間後に、項目１から２６までのいずれか１項記載のワクチンで追加免疫するステップを含む、癌の予防および／または治療のための、方法。
【０３１３】
５８．アデノウイルスベクター由来の該ＶＬＰとは異なる、ウイルスによってコードされたＶＬＰを用いて、項目１から２０までのいずれか１項記載のワクチンに対する該患者の曝露の５日以上後に該患者を後治療するステップを含む、癌の予防および／または治療のための、方法。
【０３１４】
５９．アデノウイルスベクター由来の該ＶＬＰとは異なる、該ウイルスによってコードされたＶＬＰが、改変型Ｖａｃｃｉｎａ  Ａｎｋａｒａ（ＭＶＡ）に由来するＶＬＰである、項目５８記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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