(57)【要約】  本願発明は、血液凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の免疫原性を低減する際の使用のための、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）に結合可能なトランケート型フォン・ウィルブランド因子（ＶＷＦ）を含む組換えポリペプチドに関するものであり、ここでは、前記組換えポリペプチドおよび血液凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質は、血液凝固障害を患う対象に共投与される。本発明はさらに、前記使用のための医薬組成物およびキットに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の免疫原性を低減する際の使用のための、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）に結合可能なトランケート型フォン・ウィルブランド因子（ＶＷＦ）を含む組換えポリペプチドであって、該組換えポリペプチドおよび血液凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質は、血液凝固障害を患う対象に共投与される、前記組換えポリペプチド。
【請求項２】
ＦＶＩＩＩの免疫原性の低減は、ＦＶＩＩＩに対する対象の体液性免疫応答の低減、具体的にはＦＶＩＩＩに対する阻害抗体の力価および／もしくは頻度の低下、ならびに／またはＦＶＩＩＩに対する細胞媒介性免疫応答の低減を含む、請求項１に記載の使用のための組換えポリペプチド。
【請求項３】
好ましくは参照治療と比較すると、投与後のＦＶＩＩＩの免疫原性の低減は、共投与された組換えポリペプチドの存在下、対象の抗原提示細胞（ＡＰＣ）内へのＦＶＩＩＩの取り込みの低減によって達成されるかまたは該低減を伴うものであり、前記参照治療は、組換えポリペプチドの共投与なく前記ＦＶＩＩＩが投与されることを除いて、前記治療と同一である、請求項１〜２のいずれか１項に記載の使用のための組換えポリペプチド。
【請求項４】
組換えポリペプチドおよびＦＶＩＩＩの共投与に続いて、内部移行されたＦＶＩＩＩを有する対象のＡＰＣの一部は、参照治療と比較すると１．１分の１以下、１．２分の１以下、１．３分の１以下、１．４分の１以下、１．５分の１以下、２分の１以下、３分の１以下、４分の１以下、５分の１以下、または１０分の１以下に低減され、前記参照治療は、組換えポリペプチドの共投与なく前記ＦＶＩＩＩが投与されることを除いて、前記治療と同一である、請求項３に記載の組換えポリペプチド。
【請求項５】
ＡＰＣ内へのＦＶＩＩＩ取り込み阻害能を表す共投与された組換えポリペプチドのＩＣ５０値（単量体のモル濃度に基づく計算）は、完全長ＶＷＦのそれぞれのＩＣ５０値と比較すると中等度にのみ増加され、好ましくは共投与された組換えポリペプチドのＩＣ５０値は、完全長ＶＷＦのＩＣ５０値を３倍以下、２．５倍以下、２．４倍以下、２．３倍以下、２．２倍以下、２．１倍以下、２．０倍以下、１．８倍以下、１．５倍以下、１．３倍以下、１．２倍以下、または１．１倍以下超過する、請求項３または４に記載の使用のための組換えポリペプチド。
【請求項６】
ＡＰＣ内へのＦＶＩＩＩ取り込み阻害能を表す共投与された組換えポリペプチドのＩＣ５０値（単量体のモル濃度に基づく計算）は、完全長ＶＷＦのそれぞれのＩＣ５０値と比較すると同一であるかそれどころか低減されるかのどちらかであり、好ましくは共投与された組換えポリペプチドのＩＣ５０値は、完全長ＶＷＦのＩＣ５０値と比較すると１．２分の１以下、１．５分の１以下、２分の１以下、２．５分の１以下、または３分の１以下に低減される、請求項３または４に記載の使用のための組換えポリペプチド。
【請求項７】
参照治療と比較すると、組換えポリペプチドの投与後のＦＶＩＩＩの免疫原性の低減は、組換えポリペプチドの存在下、対象の抗原提示細胞（ＡＰＣ）によるＦＶＩＩＩペプチドのＭＨＣクラスＩＩ型抗原提示の消滅によって達成されるかまたは該低減を伴うものであり、前記参照治療は、組換えポリペプチドの投与なく前記ＦＶＩＩＩが投与されることを除いて、前記治療と同一であり、対象の抗原提示細胞（ＡＰＣ）によるＦＶＩＩＩペプチドのＭＨＣクラスＩＩ型抗原提示は、好ましくは１．５分の１以下、２．０分の１以下、２．５分の１以下、３．０分の１以下、３．５分の１以下、または４．０分の１以下に消滅、すなわち低減される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用のための組換えポリペプチド。
【請求項８】
対象は、以前にＦＶＩＩＩを用いて治療されていない対象である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用のための組換えポリペプチド。
【請求項９】
対象は、ＦＶＩＩＩに対する免疫反応、具体的にはＦＶＩＩＩに対する阻害抗体という特徴を有する免疫反応を発生するリスクを有するおよび／または発生することが予想される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用のための組換えポリペプチド。
【請求項１０】
組換えポリペプチドおよびＦＶＩＩＩは、血液凝固障害を患う対象の予防的または治療的な治療のために共投与される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用のための組換えポリペプチド。
【請求項１１】
ＦＶＩＩＩの免疫原性の低減は、ＦＶＩＩＩに対する阻害抗体の力価の低下という特徴を有し、好ましくはＦＶＩＩＩに対する阻害抗体の力価は、参照治療後の対象におけるＦＶＩＩＩ抗体の力価と比較すると少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、または少なくとも８０％低減され、前記参照治療は、前記組換えポリペプチドの共投与なく前記ＦＶＩＩＩが投与されることを除いて、前記治療と同一である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用のための組換えポリペプチド。
【請求項１２】
ＦＶＩＩＩの免疫原性の低減は、対象集団におけるＦＶＩＩＩに対する阻害抗体の頻度の低下という特徴を有し、好ましくはＦＶＩＩＩに対する阻害抗体の頻度は、参照治療後の対象集団におけるＦＶＩＩＩ抗体の頻度と比較すると少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、または少なくとも８０％低減され、前記参照治療は、前記組換えポリペプチドの共投与なく前記ＦＶＩＩＩが投与されることを除いて、前記治療と同一である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の使用のための組換えポリペプチド。
【請求項１３】
組換えポリペプチドは、二量体として、好ましくはホモ二量体として投与される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の使用のための組換えポリペプチド。
【請求項１４】
共投与される組換えポリペプチドのＦＶＩＩＩに対するモル比は、少なくとも２：１、少なくとも３：１、少なくとも４：１、少なくとも５：１、少なくとも６：１、少なくとも８：１、少なくとも１０：１、少なくとも１５：１、少なくとも２０：１、少なくとも２５：１、少なくとも５０：１、少なくとも７０：１、少なくとも８０：１、少なくとも１００：１、または少なくとも１５０：１である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の使用のための組換えポリペプチド。
【請求項１５】
対象は、ヒト対象であり、血液凝固障害は、好ましくは血友病Ａである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の使用のための組換えポリペプチド。
【請求項１６】
前記ポリペプチドは、静脈内に、皮下に、皮内に、経口的に、経皮的に、鼻腔内に、腹腔内に、局所的にまたは局在的に、舌下にまたは筋肉内に、好ましくは静脈内にまたは皮下に投与される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の使用のための組換えポリペプチド。
【請求項１７】
前記ポリペプチドは、機能性のＶＷＦ  Ｄ’ドメインおよび／または機能性のＶＷＦ  Ｄ３ドメインを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の使用のための組換えポリペプチド。
【請求項１８】
トランケート型ＶＷＦは、配列番号４のアミノ酸７７６から８０５と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは配列番号４のアミノ酸７６４から１２４２と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の使用のための組換えポリペプチド。
【請求項１９】
組換えポリペプチドは、配列番号４の配列付番を参照する場合に、ＶＷＦ野生型アミノ酸配列と比較して、以下のアミノ酸置換のうち少なくとも１つを有し、置換は、Ｓ７６４Ｇ／Ｓ７６６Ｙ、Ｓ７６４Ｐ／Ｓ７６６Ｉ、Ｓ７６４Ｐ／Ｓ７６６Ｍ、Ｓ７６４Ｖ／Ｓ７６６Ｙ、Ｓ７６４Ｅ／Ｓ７６６Ｙ、Ｓ７６４Ｙ／Ｓ７６６Ｙ、Ｓ７６４Ｌ／Ｓ７６６Ｙ、Ｓ７６４Ｐ／Ｓ７６６Ｗ、Ｓ７６６Ｗ／Ｓ８０６Ａ、Ｓ７６６Ｙ／Ｐ７６９Ｋ、Ｓ７６６Ｙ／Ｐ７６９Ｎ、Ｓ７６６Ｙ／Ｐ７６９ＲおよびＳ７６４Ｐ／Ｓ７６６Ｌ、Ｓ７６４Ｐ／Ｓ７６６Ｗ／Ｖ１０８３Ａ、Ｓ７６４Ｇ／Ｓ７６６Ｙ／Ｖ１０８３Ａ、Ｓ７６４Ｅ／Ｓ７６６Ｙ／Ｖ１０８３Ａ、Ｎ１０１１Ｓ／Ｖ１０８３Ａ／Ｋ１１８１Ｅ、Ｓ７６６Ｙ／Ｖ１０８３Ａ、Ｖ１０８３Ａ、Ｓ１０４２Ｔ、Ｖ８０５Ａ／Ｑ１１５８Ｌ、Ｋ９１２Ｅ／Ｔ１０８８Ｓ、ならびにＬ７８１Ｐからなる群から選択される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の使用のための組換えポリペプチド。
【請求項２０】
前記ポリペプチドは、半減期延長部分（ＨＬＥＭ）を含み、ＨＬＥＭは、好ましくはトランケート型ＶＷＦに融合された異種アミノ酸配列であり、前記異種アミノ酸配列は、さらに好ましくは、イムノグロブリン定常領域およびその一部分、好ましくはイムノグロブリンのＦｃ部分、アルブミンおよびその断片、トランスフェリンおよびその断片、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのＣ末端ペプチド、ＸＴＥＮ配列、ホモアミノ酸反復（ＨＡＰ）、プロリン−アラニン−セリン反復（ＰＡＳ）、アルブミンまたはその断片、アファミン、アルファ−フェトタンパク質、ビタミンＤ結合タンパク質、生理的条件下でアルブミンまたはイムノグロブリン定常領域に結合可能なポリペプチド、新生仔Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合可能なポリペプチド、ならびにそれらの組合せからなる群から選択されるポリペプチドを含むかまたはそれからなる、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の使用のための組換えポリペプチド。
【請求項２１】
（ｉ）トランケート型フォン・ウィルブランド因子（ＶＷＦ）を含む組換えポリペプチド、および
（ｉｉ）場合により、第ＶＩＩＩ因子タンパク質（ＦＶＩＩＩ）
を含む、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の免疫原性を低減する際の使用のための医薬組成物であって、前記組成物は、血液凝固障害を患う対象に投与され、前記対象は好ましくは、ＦＶＩＩＩに対する免疫反応、具体的にはＦＶＩＩＩに対する阻害抗体という特徴を有する免疫反応を発生することが予想される、前記医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の免疫原性を低減する際の使用のための、血液凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）に結合可能なトランケート型フォン・ウィルブランド因子（ＶＷＦ）を含む組換えポリペプチドに関するものであり、ここでは、前記組換えポリペプチドおよび第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質は、血液凝固障害を患う対象に共投与される。
【背景技術】
【０００２】
血液凝固因子の欠損に起因する様々な出血障害がある。最も一般的な障害は、血友病ＡおよびＢであり、それぞれ血液凝固第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子の欠損の結果として生じる。知られている別の出血障害は、フォン・ウィルブランド病（ＶＷＤ）である。
【０００３】
血友病Ａは遺伝性の出血障害である。これは血液凝固第ＶＩＩＩ因子のＸ染色体連鎖性欠損の結果として生じ、１０，０００人当たり１人から２人の間の頻度でほぼ男性のみに影響を及ぼす。このＸ染色体の欠陥は、自身は血友病ではない女性の保因者によって伝達される。血友病Ａの臨床症状は、出血傾向の増加である。第ＶＩＩＩ因子濃縮物を用いた治療を導入する以前は、重度の血友病者の平均寿命は２０歳未満であった。血漿由来の第ＶＩＩＩ因子の濃縮物の使用は、状況を著しく向上させており、血友病Ａ患者の平均寿命を大幅に増やし、彼らのほとんどにある程度通常の生活を送る可能性をもたらしている。しかし、血漿由来濃縮物とその使用に伴うある種の問題があり、その最も重大なものはウイルスの伝染である。これまで、Ｂ型肝炎、非Ａ非Ｂ型肝炎、およびＡＩＤＳを引き起こすウイルスが、人々に深刻な攻撃を与えてきた。以降、最近では各種ウイルス不活化方法と新しい高度精製第ＶＩＩＩ因子濃縮物とが開発されており、それらは血漿由来の第ＶＩＩＩ因子についても非常に高い安全性水準を確立した。
【０００４】
第ＶＩＩＩ因子のｃＤＮＡのクローニング（非特許文献１、２）によって、第ＶＩＩＩ因子を組換えにより発現することが可能となり、いくつかの組換え第ＶＩＩＩ因子製品の開発に至り、それらの製品は１９９２年から２００３年の間に規制当局によって認可された。アミノ酸Ａｒｇ−７４０とＧｌｕ−１６４９との間に存在する第ＶＩＩＩ因子のポリペプチド鎖の中央のＢドメインは、完全な生物活性には必要ではないようであるという事実は、Ｂドメインを欠失した第ＶＩＩＩ因子製品の開発をも導いてきた。
【０００５】
成熟型第ＶＩＩＩ因子の分子は２３３２アミノ酸からなり、このアミノ酸は３つの相同なＡドメイン、２つの相同なＣドメイン、および１つのＢドメインのグループに分けることができ、それらは：Ａ１−Ａ２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２の順に整列されている。血漿中に分泌される間に、単鎖の第ＶＩＩＩ因子がＢ−Ａ３境界およびＢドメイン内の異なる部位で切断されるにつれて、第ＶＩＩＩ因子は、細胞内で一連の金属イオン連結型のヘテロ二量体へとプロセシングされる。このプロセシングは、Ａ１ドメイン、Ａ２ドメイン、および様々なＢドメインの一部からなる不均一な重鎖分子を生じ、それらの分子は、９０ｋＤａから２００ｋＤａに及ぶ分子サイズを有する。この重鎖は、Ａ３ドメイン、Ｃ１ドメイン、およびＣ２ドメインからなる軽鎖に、金属イオンを介して結合する（非特許文献３）。血漿中で、このヘテロ二量体の第ＶＩＩＩ因子は、高い親和性でフォン・ウィルブランド因子（ｖＷＦ）に結合し、それにより成熟前の異化から保護される。ｖＷＦに結合した活性化されていない第ＶＩＩＩ因子の半減期は、血漿中で約１２時間である。
【０００６】
ＶＷＦは、哺乳類の血漿中に存在する多量体の接着性糖タンパク質であり、複数の生理機能を有する。初期の止血の間、ＶＷＦは、血小板表面上の特定の受容体とコラーゲンなどの細胞外マトリックス成分との間のメディエーターとして作用する。さらに、ＶＷＦは、凝血原であるＦＶＩＩＩのためのキャリアおよび安定化タンパク質としての役割を果たす。ＶＷＦは、内皮細胞および巨核球で２８１３アミノ酸の前駆体分子として合成される。野生型ＶＷＦのアミノ酸配列およびｃＤＮＡ配列は、非特許文献４に開示されている。前駆体ポリペプチドであるプレプロＶＷＦは、２２残基のシグナルペプチドと、７４１残基のプロペプチドと、成熟型の血漿ＶＷＦに見られる２０５０残基ポリペプチドとからなる（非特許文献５）。血漿中に分泌されると、プロテアーゼＡＤＡＭＴＳ１３は、ＶＷＦのＡ１ドメイン内でＶＷＦを切断する。
【０００７】
血漿中では、ＦＶＩＩＩは、高い親和性でフォンＶＷＦに結合し、ＶＷＦによって成熟前の異化から保護され、初期の止血における役割に加えて血漿レベルを調節するための決定的な役割を果たし、それゆえ二次止血を制御するための中心的な因子でもある。ＶＷＦに結合した活性化されていないＦＶＩＩＩの半減期は、血漿中で約１２時間から１４時間である。ＶＷＦが全くまたはほぼ存在しないフォン・ウィルブランド疾患３型では、ＦＶＩＩＩの半減期は約６時間に過ぎず、ＦＶＩＩＩ濃度の減少ゆえにそのような患者に軽度から中等度の血友病Ａの症状を生じる。このＶＷＦがＦＶＩＩＩに及ぼす安定化効果は、ＣＨＯ細胞でのＦＶＩＩＩの組換え発現の一助とするためにも使用されている（非特許文献６）。ＶＷＦに結合していない遊離ＦＶＩＩＩは、およそ２時間の循環内半減期を有する（非特許文献７）。
【０００８】
予防的な治療を受けている重度の血友病Ａ患者では、第ＶＩＩＩ因子の血漿中半減期が約１２時間と短いために、第ＶＩＩＩ因子を週に約３回、静脈内に（ｉ．ｖ．）投与しなければならない。各ｉ．ｖ．投与は、煩わしいものであり、痛みを伴い、感染のリスクを必然的に伴う。特に、ほとんどの場合、血友病Ａと診断されている患者自身によって、または子どもの親によって、家庭でこれが行われるためである。
【０００９】
そのため、投与しなければならない頻度がより低い第ＶＩＩＩ因子含有医薬組成物の製造を可能にする、機能的半減期を増加させた第ＶＩＩＩ因子を作出することが非常に望ましかった。
【００１０】
ＶＷＦ由来ポリペプチド、具体的にはＶＷＦ断片は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでＦＶＩＩＩを安定化することが記載されてきた。特許文献１は、ある特定のＶＷＦ断片およびＦＶＩＩＩタンパク質を含むキメラタンパク質を対象とする。それらのＦＶＩＩＩとＶＷＦ断片とのキメラヘテロ二量体は、ＶＷＦとＦＶＩＩＩとの固定モル比１：１を有する。
【００１１】
特許文献２および特許文献３は、ＶＷＦ断片および血友病の治療におけるそれらの使用を記載している。ＦＶＩＩＩの生物学的利用能は、同様のモル量のＶＷＦ断片と併せて血管外で共投与されると、大幅に向上する場合があることが見出された。非特許文献８では、ＶＷＦ欠損マウスにおいて、Ｄ’Ｄ３ドメインを含有するＶＷＦ断片が、第ＶＩＩＩ因子を安定化するのに充分であることが見出された。
トランケート型ＶＷＦの共投与によって第ＶＩＩＩ因子のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期の延長をもたらすアプローチの１つは、特許文献４に開示されている。
【００１２】
しかし、血友病Ａを患う患者の最大３０％における主要な合併症は、ＦＶＩＩＩ活性を不活性化し補充療法（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ）を無効化しうる阻害物質、具体的にはアロ抗体の発生である。以前に治療されていない血友病Ａの患者にＦＶＩＩＩ阻害物質が生成するリスクは、組換えＦＶＩＩＩ製品を用いて治療される場合にさらに高いことが記載されており、ＦＶＩＩＩ−ＬＣ中の異なるエピトープ（Ａ３およびＣ２ドメイン）にＶＷＦが結合することにより、これらのエピトープを遮蔽し、それゆえに免疫原性を低減する上で有益な効果を有する可能性があることが推定されている（非特許文献９）。遮蔽されていないＦＶＩＩＩのエピトープは、阻害物質の生成を誘発するリスクをもたらすものと思われる。さらに、２本鎖のＦＶＩＩＩ複合体におけるＦＶＩＩＩ−ＨＣとＦＶＩＩＩ−ＬＣとの相互作用は、ＦＶＩＩＩ−ＨＣおよびＦＶＩＩＩ−ＬＣにあるその他自由に接近可能なエピトープへの遮蔽効果を有することも想定される。
【００１３】
重度の血友病Ａの患者における抗第ＶＩＩＩ因子アロ抗体（阻害物質）の中和の発生は、補充療法に使用される濃縮物に依存しうる。フォン・ウィルブランド因子を含有する血漿由来第ＶＩＩＩ因子を用いて治療された患者は、組換え第ＶＩＩＩ因子を用いて治療された患者よりも阻害物質の発生率が低い。組換えＦＶＩＩＩを用いて治療された幼年男子（年齢＜６歳、重度の血友病Ａ、および以前に何らかの第ＶＩＩＩ因子濃縮物を用いた前治療なし）における阻害物質の発生率は、ｐｄＦＶＩＩＩを用いて治療された患者と比較して１．８７倍高いことが測定された。阻害物質の発生率は、組換えＦＶＩＩＩを用いて治療されたコホートでは２６．８％であり、それに対しｐｄＦＶＩＩＩのコホートでは４４．５％であった（非特許文献１０）。
【００１４】
ゆえに、ＦＶＩＩＩのｉｎ  ｖｉｖｏ半減期の増加に加えて、そのようなＦＶＩＩＩ阻害物質の発生を回避または低減するための改善された治療法の必要性が継続して存在する。
【００１５】
ＶＷＦは、第ＶＩＩＩ因子との複合体である際に、重鎖（Ａ２ドメイン）および軽鎖（Ａ３／Ｃ２ドメイン）上の公知の潜在的な阻害性抗体部位からＦＶＩＩＩを遮蔽することによって、第ＶＩＩＩ因子に対する免疫反応を減少させる可能性があることが示唆されている（非特許文献１１）。
【００１６】
ＦＶＩＩＩ濃縮物の純度は、議論の余地はあるものの、特にフォン・ウィルブランド因子（ＶＷＦ）の存在下で外因性ＦＶＩＩＩの免疫原性に影響を与えると主張された。そのため、Ｓ．Ｄｅｌｉｇｎａｔら（非特許文献１２）は、ＦＶＩＩＩに対するＶＷＦの免疫防御効果をｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価した。ＶＷＦは、ＦＶＩＩＩ欠損マウスにおいてＦＶＩＩＩの免疫原性を低減し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでプロフェッショナル抗原提示細胞（例えばＤＣ）によるＦＶＩＩＩのエンドサイトーシスを防止した。ＶＷＦは、循環内のＦＶＩＩＩの半減期を増加させることによって、脾臓中の免疫寛容原性の辺縁帯Ｂ細胞との接触時間を増加させることを可能としうることが提唱されている。
【００１７】
特許文献５では、ＶＷＦ断片およびＦＶＩＩＩタンパク質を含むキメラタンパク質が示されており、そこでは、ＶＷＦ断片およびＦＶＩＩＩタンパク質が共有結合で互いに会合しているか、または共有結合で互いに連結されている。このキメラタンパク質は、共有結合で連結された断片ＶＷＦを持たないＦＶＩＩＩタンパク質よりも免疫原性が少ないことが提唱されている。免疫原性に関するデータは示されていない。構築物のモル比は、１：１に固定されている。
【００１８】
特許文献６の開示によれば、第ＶＩＩＩ因子とＶＷＦペプチドとの非共有結合複合体を含む組成物は、ＦＶＩＩＩに対する阻害物質の形成を低減することが提唱されている。しかし、このＶＷＦペプチドは、やはりアミノ酸７６４から１０３５および１６９１から１９０５を示し、免疫原性に関するデータが提示されていない。
【００１９】
特許文献７は、ＶＷＦおよびその断片が、ヒト抗原提示細胞による細胞性取り込みからＦＶＩＩＩを保護しうることを記載している。しかし、完全長の血漿由来ＶＷＦ（アミノ酸７６４〜２８１３）と比較して、供試された断片は、中等度のＦＶＩＩＩ取り込みの低減を示したに過ぎなかった。供試されたＶＷＦ断片は、ＶＷＦ断片および／またはＦＶＩＩＩの半減期を増加するための半減期延長部分を何ら含まなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】ＷＯ２０１３／１０６７８７Ａ１
【特許文献２】ＷＯ２０１４／１９８６９９Ａ２
【特許文献３】ＷＯ２０１３／０８３８５８Ａ２
【特許文献４】ＷＯ２０１６／１８８９０７Ａ１
【特許文献５】ＷＯ２０１３１０６７８７Ａ１
【特許文献６】ＷＯ２０１５１８５７５８Ａ２
【特許文献７】ＷＯ２０１３／０８３８５８Ａ２
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】Ｗｏｏｄら、１９８４年、Ｎａｔｕｒｅ、３１２巻、３３０〜３３６頁
【非特許文献２】Ｖｅｈａｒら、１９８４年、Ｎａｔｕｒｅ、３１２巻、３３７〜３４２頁
【非特許文献３】Ｓａｅｎｋｏら、２００２年、Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ、８３巻、８９〜９６頁
【非特許文献４】Ｃｏｌｌｉｎｓら、１９８７年、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４巻、４３９３〜４３９７頁
【非特許文献５】Ｆｉｓｃｈｅｒら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ３５１：３４５−３４８，１９９４
【非特許文献６】Ｋａｕｆｍａｎら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、９巻、１２３３〜１２４２頁、１９８９年
【非特許文献７】Ｖｌｏｔら、Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ、２０００年、８３巻、６５〜９１頁
【非特許文献８】Ｙｅｅら（２０１４年）、Ｂｌｏｏｄ、１２４（３）巻、４４５〜４５２頁
【非特許文献９】Ｃ．Ｅｓｃｕｒｉｏｌａ  Ｅｔｔｉｎｇｈａｕｓｅｎ、Ｗ．Ｋｒｅｕｚ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ（２００６年）、１２巻（増刊６号）、１０２〜１０６頁
【非特許文献１０】Ｐｅｙｖａｎｄｉ  Ｆ、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ（２０１６年）、７４巻、２０５４〜６４頁
【非特許文献１１】Ｒａｇｎｉ、Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．、１０巻、２３２４〜２３２７頁、２０１２年
【非特許文献１２】Ｓ．  Ｄｅｌｉｇｎａｔ  ら、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ  （２０１２年）、１８巻、２４８〜２５４頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
それゆえ、長期の半減期と低減された免疫原性とを有するＦＶＩＩＩ製品または組成物を提供するための未対応の臨床的なニーズが依然としてある。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
トランケート型ＶＷＦ、好ましくは配列番号４のアミノ酸７６４から１２４２を含むトランケート型ＶＷＦを含む二量体の組換えポリペプチドと併せて第ＶＩＩＩ因子タンパク質を共投与することによって、抗原提示細胞、具体的には単球由来樹状細胞による第ＶＩＩＩ因子取り込みを実質的に低減できることが、発明者らによって見出された。この組換えポリペプチドは、好ましくは半減期延長部分（ＨＬＥＭ）を含み、具体的には、ヒトアルブミンに融合されることがある。
【００２４】
そのため、本発明の一態様は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の免疫原性を低減する際の使用のための、血液凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）に結合可能なトランケート型フォン・ウィルブランド因子（ＶＷＦ）を含む組換えポリペプチドに関するものであり、ここでは、前記組換えポリペプチドおよび第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質は、血液凝固障害を患う対象に共投与される。このことは、前記組換えポリペプチドおよび第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質が、好ましくは同時に、逐次的に、または別々に投与されることを含み、前記投与様式は、用語「共投与されること」に包含される。第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の免疫原性は、好ましくは参照治療と比較して低減され、前記参照治療は、組換えポリペプチドの共投与なく前記ＦＶＩＩＩが投与されることを除いて、前記治療と同一である。
【００２５】
さらに、トランケート型ＶＷＦを含むモル過剰の組換えポリペプチドと併せて第ＶＩＩＩ因子タンパク質を共投与することによって、抗原提示細胞、具体的には単球由来樹状細胞による第ＶＩＩＩ因子取り込みをさらに低減できることが、発明者らによって見出されている。換言すれば、共投与されるＦＶＩＩＩに対する、トランケート型ＶＷＦを含む組換えポリペプチドのモル比を、増加させることによって、抗原提示細胞、具体的には単球由来樹状細胞による第ＶＩＩＩ因子取り込みの低減の亢進を達成することができる。
【００２６】
そのため、本発明のさらに別の態様は、少なくとも２：１、少なくとも３：１、少なくとも４：１、少なくとも５：１、少なくとも８：１、少なくとも１０：１、少なくとも１５：１、少なくとも２０：１、少なくとも２５：１、もしくは少なくとも５０：１、またはさらにそれよりも高いモル比である、共投与される組換えポリペプチドのＦＶＩＩＩに対するモル比に関する。
【００２７】
本発明のさらに別の態様は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の免疫原性を低減する際の使用のための、（ｉ）本発明によるトランケート型フォン・ウィルブランド因子（ＶＷＦ）を含む組換えポリペプチドと、（ｉｉ）第ＶＩＩＩ因子タンパク質（ＦＶＩＩＩ）とを含む医薬組成物を指し、ここでは、前記組成物は、血液凝固障害を患う対象に投与され、好ましくは、前記対象は、ＦＶＩＩＩに対する免疫反応、具体的にはＦＶＩＩＩに対する阻害抗体という特徴を有する免疫反応を発生することが予想される。
【００２８】
また、さらに別の態様は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の免疫原性を低減する際の使用のための、（ｉ）第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質を含む第１の組成物と、（ｉｉ）トランケート型フォン・ウィルブランド因子（ＶＷＦ）を含む組換えポリペプチドを含む第２の組成物とを含む医薬キットを指し、ここでは、前記組成物は、血液凝固障害を患う対象に共投与され、好ましくは、前記対象は、ＦＶＩＩＩに対する免疫反応、具体的にはＦＶＩＩＩに対する阻害抗体という特徴を有する免疫反応を発生することが予想され、前記ＦＶＩＩＩおよび前記組換えポリペプチドは、投与前に少なくともある割合の前記組換えポリペプチドを前記ＦＶＩＩＩに結合させるために、キット内に提供される。
【００２９】
また、本発明のさらに別の態様は、ＦＶＩＩＩの免疫原性を低減するための方法を指し、本方法は、トランケート型フォン・ウィルブランド因子（ＶＷＦ）を含む有効量の組換えポリペプチド、および第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質を、血液凝固障害を患う対象に共投与することを含み、前記組換えポリペプチドは、ＦＶＩＩＩの免疫原性を低減する。好ましくは、前記対象は、ＦＶＩＩＩに対する免疫反応、具体的にはＦＶＩＩＩに対する阻害抗体という特徴を有する免疫反応を発生することが予想される。
【００３０】
具体的な態様では、組換えポリペプチドは、二量体であるトランケート型ＶＷＦを含む。
【００３１】
さらに別の具体的な態様では、組換えポリペプチドは、機能性のＶＷＦ  Ｄ’ドメインと機能性のＶＷＦ  Ｄ３ドメインとを有し、好ましくは機能性のＶＷＦ  Ａ１ドメインを欠く、トランケート型ＶＷＦを含む。
【００３２】
さらに別の具体的な態様では、組換えポリペプチドは、機能性のＶＷＦ  Ｄ’ドメインと機能性のＶＷＦ  Ｄ３ドメインとを有し、好ましくは任意の他のＶＷＦ機能性のドメインを欠く、トランケート型ＶＷＦを含む。
【００３３】
さらに別の具体的な態様では、組換えポリペプチドは、機能性のＶＷＦ  Ｄ’ドメインと機能性のＶＷＦ  Ｄ３ドメインとを有し、好ましくは任意の他のＶＷＦ機能性ドメインを欠き、ＦＶＩＩＩとの親和性を増加させる１つまたは複数のアミノ酸変異を有するトランケート型ＶＷＦを含む。
【００３４】
さらになお別の具体的な実施形態では、組換えポリペプチドは、アルブミンなど、半減期延長部分（ＨＬＥＭ）を含む。
【００３５】
ゆえに、本発明は、以下の好適な実施形態［１］から［４４］に関する。
［１］血液凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の免疫原性を低減する際の使用のための、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）に結合可能なトランケート型フォン・ウィルブランド因子（ＶＷＦ）を含む組換えポリペプチドであって、前記組換えポリペプチドおよび血液凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質は、血液凝固障害を患う対象に共投与される、前記組換えポリペプチド。第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の免疫原性は、参照治療と比較して好ましくは低減されており、前記参照治療は、組換えポリペプチドの共投与なく前記ＦＶＩＩＩが投与されることを除いて、前記治療と同一である。
［２］ＦＶＩＩＩの免疫原性の低減は、ＦＶＩＩＩに対する対象の体液性免疫応答の低減、具体的にはＦＶＩＩＩに対する阻害抗体の力価および／もしくは頻度の低下、ならびに／またはＦＶＩＩＩに対する細胞媒介性免疫応答の低減を含む、実施形態［１］による使用のための組換えポリペプチド。
［３］好ましくは参照治療と比較すると、投与後のＦＶＩＩＩの免疫原性の低減は、共投与された組換えポリペプチドの存在下、対象の抗原提示細胞（ＡＰＣ）内へのＦＶＩＩＩの取り込みの低減によって達成されるかまたは該低減を伴うものであり、前記参照治療は、組換えポリペプチドの共投与なく前記ＦＶＩＩＩが投与されることを除いて、前記治療と同一である、前述の実施形態のうちいずれか１項による使用のための組換えポリペプチド。
［４］ＡＰＣは、樹状細胞およびマクロファージからなる群から選択される、実施形態［３］による使用のための組換えポリペプチド。
［５］組換えポリペプチドおよびＦＶＩＩＩの共投与に続いて、内部移行されたＦＶＩＩＩを有する対象のＡＰＣの一部は、参照治療と比較すると１．１分の１以下、１．２分の１以下、１．３分の１以下、１．４分の１以下、１．５分の１以下、２分の１以下、３分の１以下、４分の１以下、５分の１以下、または１０分の１以下に低減され、前記参照治療は、組換えポリペプチドの共投与なく前記ＦＶＩＩＩが投与されることを除いて、前記治療と同一である、実施形態［３］または［４］による使用のための組換えポリペプチド。
［６］ＡＰＣ内へのＦＶＩＩＩ取り込み阻害能を表す共投与された組換えポリペプチドのＩＣ５０値は、完全長ＶＷＦのそれぞれのＩＣ５０値と比較すると中等度にのみ増加され、好ましくは、共投与された組換えポリペプチドのＩＣ５０値は、完全長ＶＷＦのＩＣ５０値を３倍以下、２．５倍以下、２．４倍以下、２．３倍以下、２．２倍以下、２．１倍以下、２．０倍以下、１．８倍以下、１．５倍以下、１．３倍以下、１．２倍以下、または１．１倍以下超過する、実施形態［３］から［５］のいずれか１項による使用のための組換えポリペプチド。本開示内でのＩＣ５０値の計算は、組換えポリペプチド単量体のモル濃度に基づき、二量体として存在する場合であっても当該モル濃度に基づく。
［７］ＡＰＣ内へのＦＶＩＩＩ取り込み阻害能を表す共投与された組換えポリペプチドのＩＣ５０値（単量体のモル濃度に基づく計算）は、完全長ＶＷＦのそれぞれのＩＣ５０値と比較すると同一であるかそれどころか低減されるかのどちらかであり、好ましくは共投与された組換えポリペプチドのＩＣ５０値は、完全長ＶＷＦのＩＣ５０値と比較して１．２分の１以下、１．５分の１以下、２分の１以下、２．５分の１以下、または３分の１以下に低減される、実施形態［３］から［５］のいずれか１項による使用のための組換えポリペプチド。
［８］好ましくは参照治療と比較すると、組換えポリペプチドの投与後のＦＶＩＩＩの免疫原性の低減は、組換えポリペプチドの存在下、対象の抗原提示細胞（ＡＰＣ）によるＦＶＩＩＩペプチドのＭＨＣクラスＩＩ型抗原提示の消滅によって達成されるかまたは該消滅を伴うものであり、前記参照治療は、組換えポリペプチドの投与なく前記ＦＶＩＩＩが投与されることを除いて、前記治療と同一である、前述の実施形態のうちいずれか１項による使用のための組換えポリペプチド。対象の抗原提示細胞（ＡＰＣ）によるＦＶＩＩＩペプチドの前記ＭＨＣクラスＩＩ型抗原提示は、好ましくは１．５分の１以下、２．０分の１以下、２．５分の１以下、３．０分の１以下、３．５分の１以下、または４．０分の１以下に消滅（すなわち低減）される。
［９］好ましくは参照治療と比較すると、組換えポリペプチドの投与後のＦＶＩＩＩの免疫原性の低減は、組換えポリペプチドの存在下、対象の抗原提示細胞（ＡＰＣ）によるユニークなＭＨＣクラスＩＩ型結合性ＦＶＩＩＩペプチドの数の消滅によって達成されるかまたは該消滅を伴うものであり、前記参照治療は、組換えポリペプチドの投与なく前記ＦＶＩＩＩが投与されることを除いて、前記治療と同一である、前述の実施形態のうちいずれか１項による使用のための組換えポリペプチド。対象の抗原提示細胞（ＡＰＣ）による前記ユニークなＭＨＣクラスＩＩ型結合性ＦＶＩＩＩペプチドの数は、好ましくは１．５分の１以下、２．０分の１以下、２．５分の１以下、３．０分の１以下、３．５分の１以下、または４．０分の１以下に消滅（すなわち低減）される。
［１０］好ましくは参照治療と比較すると、組換えポリペプチドの投与後のＦＶＩＩＩの免疫原性の低減は、組換えポリペプチドの存在下、対象の抗原提示細胞（ＡＰＣ）によるクラスター化されたＭＨＣクラスＩＩ型結合性ＦＶＩＩＩペプチドの数の消滅によって達成されるかまたは該消滅を伴うものであり、前記参照治療は、組換えポリペプチドの投与なく前記ＦＶＩＩＩが投与されることを除いて、前記治療と同一である、前述の実施形態のうちいずれか１項による使用のための組換えポリペプチド。対象の抗原提示細胞（ＡＰＣ）による前記クラスター化されたＭＨＣクラスＩＩ型結合性ＦＶＩＩＩペプチドの数は、好ましくは１．５分の１以下、２．０分の１以下、２．５分の１以下、３．０分の１以下、３．５分の１以下、または４．０分の１以下に消滅（すなわち低減）される。
［１１］対象は、以前にＦＶＩＩＩを用いて治療されていない対象である、前述の実施形態のうちいずれか１項による使用のための組換えポリペプチド。
［１２］対象は、ＦＶＩＩＩを用いて予め治療されている対象である、および／または治療の変更に付されている、実施形態［１］から［１０］のいずれか１項の使用のための組換えポリペプチド。
［１３］対象は、ＦＶＩＩＩに対する免疫反応、具体的にはＦＶＩＩＩに対する阻害抗体という特徴を有する免疫反応を発生するリスクを有するおよび／または発生することが予想される、前述の実施形態のうちいずれか１項による使用のための組換えポリペプチド。
［１４］組換えポリペプチドおよびＦＶＩＩＩは、血液凝固障害を患う対象の予防的または治療的な治療のために共投与される、前述の実施形態のうちいずれか１項による使用のための組換えポリペプチド。
［１５］ＦＶＩＩＩの免疫原性の低減は、ＦＶＩＩＩに対する阻害抗体の力価の低下という特徴を有し、好ましくはＦＶＩＩＩに対する阻害抗体の力価は、参照治療後の対象におけるＦＶＩＩＩ抗体の力価と比較すると少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、または少なくとも８０％低減され、前記参照治療は、前記組換えポリペプチドの共投与なく前記ＦＶＩＩＩが投与されることを除いて、前記治療と同一である、前述の実施形態のうちいずれか１項による使用のための組換えポリペプチド。
［１６］ＦＶＩＩＩの免疫原性の低減は、対象集団におけるＦＶＩＩＩに対する阻害抗体の頻度の低下という特徴を有し、好ましくはＦＶＩＩＩに対する阻害抗体の頻度は、参照治療後の対象集団におけるＦＶＩＩＩ抗体の頻度と比較すると少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％低減され、前記参照治療は、前記組換えポリペプチドの共投与なく前記ＦＶＩＩＩが投与されることを除いて、前記治療と同一である、前述の実施形態のうちいずれか１項による使用のための組換えポリペプチド。
［１７］ＦＶＩＩＩの免疫原性の低減は、治療後少なくとも３か月間、少なくとも４か月間、少なくとも５か月間、少なくとも６か月間、少なくとも７か月間、少なくとも８か月間、少なくとも９か月間、または少なくとも１２か月間患者にもたらされる、前述の実施形態のうちいずれか１項による使用のための組換えポリペプチド。
［１８］組換えポリペプチドは、二量体として、好ましくはホモ二量体として投与される、前述の実施形態のうちいずれか１項による使用のための組換えポリペプチド。
［１９］共投与される組換えポリペプチドのＦＶＩＩＩに対するモル比は、単量体として算出される組換えポリペプチドの量および単量体として算出されるＦＶＩＩＩの量に基づき、少なくとも２：１、少なくとも３：１、少なくとも４：１、少なくとも５：１、少なくとも６：１、少なくとも８：１、少なくとも１０：１、少なくとも１５：１、少なくとも２０：１、少なくとも２５：１、少なくとも５０：１、少なくとも７０：１、少なくとも８０：１、少なくとも１００：１、または少なくとも１５０：１である、前述の実施形態のうちいずれか１項による使用のための組換えポリペプチド。
［２０］対象はヒト対象である、前述の実施形態のうちいずれか１項による使用のための組換えポリペプチド。
［２１］前記ポリペプチドは、静脈内に、皮下に、皮内に、経口的に、経皮的に、鼻腔内に、腹腔内に、局所的にまたは局在的に、舌下にまたは筋肉内に、好ましくは静脈内にまたは皮下に投与される、前述の実施形態のうちいずれか１項による使用のための組換えポリペプチド。
［２２］前記ポリペプチドは、機能性のＶＷＦ  Ｄ’ドメインおよび／または機能性のＶＷＦ  Ｄ３ドメインを含む、前述の実施形態のうちいずれか１項による使用のための組換えポリペプチド。
［２３］前記ポリペプチドは、機能性のＶＷＦ  Ａ１ドメインを欠く、前述の実施形態のうちいずれか１項による使用のための組換えポリペプチド。
［２４］前記組換えポリペプチドは、機能性のＶＷＦ  Ｄ’ドメインおよび／または機能性のＶＷＦ  Ｄ３ドメインを含み、組換えポリペプチドは、任意の他のＶＷＦ機能性ドメインを欠く、前述の実施形態のうちいずれか１項による使用のための組換えポリペプチド。
［２５］トランケート型ＶＷＦは、配列番号４のアミノ酸７７６から８０５と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは配列番号４のアミノ酸７６４から１２４２と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前述の実施形態のうちいずれか１項による使用のための組換えポリペプチド。
［２６］トランケート型ＶＷＦが、（ａ）配列番号４のアミノ酸７６４から１２４２からなるか、（ｂ）配列番号４のアミノ酸７６４から１２４２と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるか、または（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）の断片からなる、前述の実施形態のうちいずれか１項による使用のための組換えポリペプチド。
［２７］組換えポリペプチドは、配列番号４の配列付番を参照する場合に、ＶＷＦ野生型アミノ酸配列と比較して、以下のアミノ酸置換のうち少なくとも１つを有し、置換は、Ｓ７６４Ｇ／Ｓ７６６Ｙ、Ｓ７６４Ｐ／Ｓ７６６Ｉ、Ｓ７６４Ｐ／Ｓ７６６Ｍ、Ｓ７６４Ｖ／Ｓ７６６Ｙ、Ｓ７６４Ｅ／Ｓ７６６Ｙ、Ｓ７６４Ｙ／Ｓ７６６Ｙ、Ｓ７６４Ｌ／Ｓ７６６Ｙ、Ｓ７６４Ｐ／Ｓ７６６Ｗ、Ｓ７６６Ｗ／Ｓ８０６Ａ、Ｓ７６６Ｙ／Ｐ７６９Ｋ、Ｓ７６６Ｙ／Ｐ７６９Ｎ、Ｓ７６６Ｙ／Ｐ７６９ＲおよびＳ７６４Ｐ／Ｓ７６６Ｌ、Ｓ７６４Ｐ／Ｓ７６６Ｗ／Ｖ１０８３Ａ、Ｓ７６４Ｇ／Ｓ７６６Ｙ／Ｖ１０８３Ａ、Ｓ７６４Ｅ／Ｓ７６６Ｙ／Ｖ１０８３Ａ、Ｎ１０１１Ｓ／Ｖ１０８３Ａ／Ｋ１１８１Ｅ、Ｓ７６６Ｙ／Ｖ１０８３Ａ、Ｖ１０８３Ａ、Ｓ１０４２Ｔ、Ｖ８０５Ａ／Ｑ１１５８Ｌ、Ｋ９１２Ｅ／Ｔ１０８８Ｓ、ならびにＬ７８１Ｐからなる群から選択される、前述の実施形態のうちいずれか１項による使用のための組換えポリペプチド。
［２８］組換えポリペプチドは、アミノ酸置換Ｓ７６４Ｅ／Ｓ７６６ＹまたはＳ７６４Ｅ／Ｓ７６６Ｙ／Ｖ１０８３Ａのうち少なくとも１つを有し、好ましくは組換えポリペプチドは、２つのアミノ酸置換Ｓ７６４Ｅ／Ｓ７６６Ｙを有するか、または３つのアミノ酸置換Ｓ７６４Ｅ／Ｓ７６６Ｙ／Ｖ１０８３Ａを有する、実施形態［２７］による使用のための組換えポリペプチド。
［２９］前記ポリペプチドは、半減期延長部分（ＨＬＥＭ）を含む、前述の実施形態のうちいずれか１項による使用のための組換えポリペプチド。
［３０］ＨＬＥＭは、トランケート型ＶＷＦに融合された異種アミノ酸配列である、実施形態［２９］による使用のための組換えポリペプチド。
［３１］前記異種アミノ酸配列は、イムノグロブリン定常領域およびその一部分、好ましくはイムノグロブリンのＦｃ部分、アルブミンおよびその断片、トランスフェリンおよびその断片、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのＣ末端ペプチド、ＸＴＥＮ配列、ホモアミノ酸反復（ＨＡＰ）、プロリン−アラニン−セリン反復（ＰＡＳ）、アルブミンまたはその断片、アファミン、アルファ−フェトタンパク質、ビタミンＤ結合タンパク質、生理的条件下でアルブミンまたはイムノグロブリン定常領域に結合可能なポリペプチド、新生仔Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合可能なポリペプチド、ならびにそれらの組合せからなる群から選択されるポリペプチドを含むかまたはそれからなる、実施形態［３０］による使用のための組換えポリペプチド。
［３２］ＨＬＥＭは、組換えポリペプチドにコンジュゲーションされている、実施形態［２９］による使用のための組換えポリペプチド。
［３３］前記ＨＬＥＭは、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、エラスチン様ポリペプチド、ヘパロサンポリマー、ヒアルロン酸、およびアルブミン結合性リガンド、例えば脂肪酸鎖、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される、実施形態［３２］による使用のための組換えポリペプチド。
［３４］血液凝固障害は血友病Ａである、前述の実施形態のうちいずれか１項による使用のための組換えポリペプチド。
［３５］組換えポリペプチドおよびＦＶＩＩＩタンパク質の共投与は、（ｉ）組換えポリペプチドおよびＦＶＩＩＩタンパク質を含む単一組成物で併せて投与することによって、または（ｉｉ）併用療法の一部として別々の組成物中に提供された組換えポリペプチド（第１の化合物）およびＦＶＩＩＩタンパク質（第２の化合物）を投与することによって達成され、第１の化合物は、第２の化合物の前に、後に、または併用で投与される、前述の実施形態のうちいずれか１項による使用のための組換えポリペプチド。
［３６］投与後、ＦＶＩＩＩに対する過感受性は低減されている、および／またはアナフィラキシーのリスクは低減されている、前述の実施形態のうちいずれか１項による使用のための組換えポリペプチド。
［３７］ＦＶＩＩＩは、血漿由来ＦＶＩＩＩタンパク質または組換えＦＶＩＩＩタンパク質である、前述の実施形態のうちいずれか１項による使用のための組換えポリペプチド。
［３８］共投与されるＦＶＩＩＩタンパク質の投薬量は、２５００ＩＵ／ｋｇ、１５００ＩＵ／ｋｇ、１０００ＩＵ／ｋｇ、６００ＩＵ／ｋｇ、５００ＩＵ／ｋｇ、または４００ＩＵ／ｋｇを超えない、前述の実施形態のうちいずれか１項による使用のための組換えポリペプチド。
［３９］（ｉ）トランケート型フォン・ウィルブランド因子（ＶＷＦ）を含む組換えポリペプチドであって、具体的には本明細書に開示される任意の実施形態による組換えポリペプチド、および
（ｉｉ）場合により、第ＶＩＩＩ因子タンパク質（ＦＶＩＩＩ）、
を含む、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の免疫原性を低減する際の使用のための医薬組成物であって、前記組成物は、血液凝固障害を患う対象に投与され、好ましくは、前記対象は、ＦＶＩＩＩに対する免疫反応、具体的にはＦＶＩＩＩに対する阻害抗体という特徴を有する免疫反応を発生するリスクを有するおよび／または発生することが予想される、前記医薬組成物。
［４０］トランケート型フォン・ウィルブランド因子（ＶＷＦ）を含む組換えポリペプチド、具体的には本明細書に開示される任意の実施形態による組換えポリペプチドを含む医薬組成物であって、該組成物は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の免疫原性を低減する際の使用のために提供され、第ＶＩＩＩ因子タンパク質（ＦＶＩＩＩ）を含んでおらず、第ＶＩＩＩ因子タンパク質（ＦＶＩＩＩ）と併用して血液凝固障害を患う対象に投与され、好ましくは、前記対象は、ＦＶＩＩＩに対する免疫反応、具体的にはＦＶＩＩＩに対する阻害抗体という特徴を有する免疫反応を発生するリスクを有するおよび／または発生することが予想される、前記医薬組成物。
［４１］患者は、ＦＶＩＩＩ製品を用いた予防的な治療の開始時にあるかまたは開始間近である、実施形態［３９］から［４０］のいずれか１項による医薬組成物。
［４２］（ｉ）第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質を含む第１の組成物、および
（ｉｉ）トランケート型フォン・ウィルブランド因子（ＶＷＦ）を含む組換えポリペプチドであって具体的には本明細書に開示される任意の実施形態による組換えポリペプチドを含む、第２の組成物
を含む医薬キットであって、
該キットは、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の免疫原性を低減する際の使用のためにもたらされ、前記組成物は、血液凝固障害を患う対象に共投与されるはずのものであり、好ましくは、前記対象は、ＦＶＩＩＩに対する免疫反応、具体的にはＦＶＩＩＩに対する阻害抗体という特徴を有する免疫反応を発生するリスクを有するおよび／または発生することが予想され、
前記ＦＶＩＩＩおよび前記組換えポリペプチドは、投与前に少なくともある割合の前記組換えポリペプチドを前記ＦＶＩＩＩに結合させるために、キット内に提供される、前記医薬キット。
［４３］ＦＶＩＩＩの免疫原性を低減するための方法であって、トランケート型フォン・ウィルブランド因子（ＶＷＦ）を含む有効量の組換えポリペプチド、好ましくは本明細書に開示される任意の実施形態による組換えポリペプチド、および第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質を、血液凝固障害を患う対象に共投与することを含み、前記組換えポリペプチドは、ＦＶＩＩＩの免疫原性を低減する、前記方法。
［４４］前記対象は、ＦＶＩＩＩに対する免疫反応、具体的にはＦＶＩＩＩに対する阻害抗体という特徴を有する免疫反応を発生するリスクを有するおよび／または発生することが予想される、実施形態［４３］の方法。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】ＭＤＤＣの表面マーカーによる表現型解析を示す図であり、フローサイトメトリーによるＣＤ１４についての陰性染色とＣＤ４０、ＨＬＡ−ＤＲ、およびＣＤ８６についての陽性染色とを示す。
【図２−１】ＭＤＤＣにおける第ＶＩＩＩ因子取り込みのＶＷＦによる阻害を示す図である。市販のＦＶＩＩＩタンパク質［アドベイト（Ａｄｖａｔｅ）、ヘリキセート（Ｈｅｌｉｘａｔｅ）、およびリファクト（Ｒｅｆａｃｔｏ）］およびｒｅｃ  ｓｃＦＶＩＩＩ（ＣＳＬ６２７）を、（ａ）ｐｄＶＷＦ製品Ｂｉｏｓｔａｔｅ、（ｂ）トランケート型ＶＷＦ−アルブミン融合体ＣＳＬ６２６、および（ｃ）完全長ｒｅｃＶＷＦ−アルブミン融合体ＣＳＬ６５０の存在下での取り込みについて評価した。４種の異なるＦＶＩＩＩ製品、すなわちアドベイト、ＣＳＬ６２７、ヘリキセート、およびリファクトに関してＭＤＤＣにおけるＦＶＩＩＩ取り込みのパーセンテージを、モル比ＶＷＦ：ＦＶＩＩＩの増加に対して別々にプロットした。モル比ＶＷＦ：ＦＶＩＩＩは、各種ＶＷＦ製品についての単量体サブユニットを指す。実験は、３連で（ａ）を、または４連で（ｂ）および（ｃ）を、それぞれ行った。
【図２−２】図２−１の続き。
【図３−１】ＭＤＤＣにおける第ＶＩＩＩ因子取り込みのＶＷＦによる阻害を示す図である。各種ＶＷＦタンパク質（ｐｄＶＷＦ製品Ｂｉｏｓｔａｔｅ、トランケート型ＶＷＦ−アルブミン融合体ＣＳＬ６２６、および完全長ｒｅｃＶＷＦ−アルブミン融合体ＣＳＬ６５０）を、ＭＤＤＣにおけるＦＶＩＩＩ取り込みの阻害について評価した。４種の異なるＦＶＩＩＩ製品、すなわち（ａ）アドベイト、（ｂ）ＣＳＬ６２７、（ｃ）ヘリキセート、および（ｄ）リファクトに関してＭＤＤＣにおけるＦＶＩＩＩ取り込みのパーセンテージを、モル比ＶＷＦ：ＦＶＩＩＩの増加に対して別々にプロットした。モル比ＶＷＦ：ＦＶＩＩＩは、各種ＶＷＦ製品についての単量体サブユニットを指す。
【図３−２】図３−１の続き。
【図４−１】ＭＤＤＣにおける第ＶＩＩＩ因子取り込みのＶＷＦによる阻害の正規化曲線を示す図である。市販のＦＶＩＩＩタンパク質［アドベイト（登録商標）、ヘリキセート（登録商標）、およびリファクト（登録商標）］ならびにｒｅｃ  ｓｃＦＶＩＩＩ（ＣＳＬ６２７）を、（ａ）ｐｄＶＷＦ製品Ｂｉｏｓｔａｔｅ、（ｂ）トランケート型ＶＷＦ−アルブミン融合体ＣＳＬ６２６、および（ｃ）完全長ｒｅｃＶＷＦ−アルブミン融合体ＣＳＬ６５０の存在下での取り込みについて評価した。ＶＷＦ濃度は、各種ＶＷＦ製品についての単量体サブユニットを指す。実験は、３連で（ａ）を、または４連で（ｂ）および（ｃ）を、それぞれ行った。データを、個々の実験のそれぞれについて正規化した。個々の実験のそれぞれについて、ＶＷＦ（０ｎＭ）の非存在下での読取りを１００％として定義し、最も高いＶＷＦ濃度（２２２２ｎＭまたは４４４４ｎＭ）の存在下での読取りを０％として定義した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて曲線をフィッティングした［ｌｏｇ（阻害物質）ｖｓ．応答−可変勾配、４パラメーター、最小二乗フィット］。これらのフィッティングした曲線に基づき、それぞれのＶＷＦタンパク質についてのＩＣ５０値を算出し、表２にまとめている。
【図４−２】図４−１の続き。
【図５−１】ＰｒｏＰｒｅｓｅｎｔ（登録商標）ＭＨＣクラスＩＩ抗原提示アッセイのＰｒｏＩｍｍｕｎｅのワークフローを示す図である。（Ａ）ＨＬＡ型判定済みのＰＢＭＣの単球の単離、（Ｂ）単球の培養および未成熟な樹状細胞の生成、（Ｃ）抗原のローディング（ＣＳＬ６２７、ｐｄＶＷＦ）、細胞内でのプロセシング、樹状細胞の成熟、および抗原提示、（Ｄ）樹状細胞の溶解、（Ｅ）免疫親和性工程によるペプチド／ＭＨＣクラスＩＩ複合体の単離およびペプチドの溶出、（Ｆ）ＬＣ−ＭＳ２によるペプチドのシークエンシング（ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ  ＰｒｏＰｒｅｓｅｎｔ（登録商標）ホームページから適応させる）。
【図５−２】図５−１の続き。
【図５−３】図５−２の続き。
【図６】ｐｄＶＷＦの存在下および非存在下におけるＣＳＬ６２７のＰｒｏＩｍｍｕｎｅ  ＰｒｏＰｒｅｓｅｎｔ（登録商標）抗原提示の比較を示す図である。各データ点は、ＨＬＡ−ＤＲ拘束性ペプチドクラスターを表す。ＨＬＡ−ＤＲ拘束性ペプチドクラスターのＣＳＬ６２７由来のユニークなＨＬＡ−ＤＲ結合ペプチドの数を、ｐｄＶＷＦの非存在下（Ｘ軸）および存在下（Ｙ軸）でプロットした。Ｘ−Ｙ−Ｐｌｏｔ、線形回帰（ＭＳ  Ｅｘｃｅｌ）。
【図７】ＣＳＬ６２６の存在下および非存在下におけるＣＳＬ６２７のＰｒｏＩｍｍｕｎｅ  ＰｒｏＰｒｅｓｅｎｔ（登録商標）抗原提示の比較を示す図である。各データ点は、ＨＬＡ−ＤＲ拘束性ペプチドクラスターを表す。ＨＬＡ−ＤＲ拘束性ペプチドクラスターのＣＳＬ６２７由来のユニークなＨＬＡ−ＤＲ結合ペプチドの数を、ＣＳＬ６２６の非存在下（Ｘ軸）および存在下（Ｙ軸）でプロットした。Ｘ−Ｙ−Ｐｌｏｔ、線形回帰（ＭＳ  Ｅｘｃｅｌ）。
【図８】ＥＹＡ−ＦＰの存在下および非存在下におけるＣＳＬ６２７のＰｒｏＩｍｍｕｎｅ  ＰｒｏＰｒｅｓｅｎｔ（登録商標）抗原提示の比較を示す図である。各データ点は、ＨＬＡ−ＤＲ拘束性ペプチドクラスターを表す。ＨＬＡ−ＤＲ拘束性ペプチドクラスターのＣＳＬ６２７由来のユニークなＨＬＡ−ＤＲ結合ペプチドの数を、ＥＹＡ−ＦＰの非存在下（Ｘ軸）および存在下（Ｙ軸）でプロットした。Ｘ−Ｙ−Ｐｌｏｔ、線形回帰（ＭＳ  Ｅｘｃｅｌ）。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
ＦＶＩＩＩの免疫原性の低減
本開示内では、「組換えポリペプチド」は、代替的に「本発明のポリペプチド」ともよばれる。
【００３８】
本発明は、参照治療後の取り込みと比較すると、トランケート型ＶＷＦを含む組換えポリペプチドの存在下では、抗原提示細胞（ＡＰＣ）内へのＦＶＩＩＩの取り込みが実質的に低減されるという観察に基づくものであり、ここでは、前記参照治療は、組換えポリペプチドの共投与なくＦＶＩＩＩが投与されることを除いて、本発明の治療と同一である。
【００３９】
本発明の観点では、ＦＶＩＩＩの免疫原性の低減の達成はまた、ＦＶＩＩＩに対しより少ない免疫原性を誘導するものと理解されることがある。
【００４０】
ＦＶＩＩＩの免疫原性の低減としては、以下に限定されないが、体液性免疫応答の低減、すなわち阻害性抗ＦＶＩＩＩ抗体の力価および／もしくは頻度の低下、ならびに／またはＦＶＩＩＩに対する細胞媒介性免疫応答の低減が挙げられる。さらに、免疫原性の低減としては、ＦＶＩＩＩに対する過感受性反応の低減が挙げられ、そのようなものとしては、アナフィラキシーのリスクの低減が挙げられる。例えば、ＦＶＩＩＩの免疫原性の低減は、ＦＶＩＩＩに対する阻害抗体の力価の低下という特徴を有することがあり、好ましくはＦＶＩＩＩに対する阻害抗体の力価は、参照治療後の対象における阻害抗体の力価と比較すると少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、または少なくとも２０％低減され、ここでは、前記参照治療は、前記組換えポリペプチドの共投与なく前記ＦＶＩＩＩが投与されることを除いて、前記治療と同一である。阻害抗体は、本明細書では代替的に「阻害物質」と称される。
【００４１】
さらに、ＦＶＩＩＩの免疫原性の低減は、ＦＶＩＩＩに対する阻害抗体の頻度の低下という特徴を有することがあり、好ましくはＦＶＩＩＩに対する阻害抗体の頻度は、参照治療後の対象集団における阻害抗体の頻度と比較すると少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、または少なくとも３０％低減され、前記参照治療は、前記組換えポリペプチドの共投与なく前記ＦＶＩＩＩが投与されることを除いて、前記治療と同一である。ＦＶＩＩＩに対する阻害抗体の力価および／または頻度は、標準的な方法によって、例えばベセスダアッセイによって、決定されることがある。
【００４２】
ＦＶＩＩＩの免疫原性の低減は、共投与された組換えポリペプチドの存在下、抗原提示細胞（ＡＰＣ）内へのＦＶＩＩＩの取り込みの低減によって達成されることがあり、ここでは、ＡＰＣは、樹状細胞またはマクロファージからなる群から選択されることがある。例えば、組換えポリペプチドとＦＶＩＩＩとの共投与は、参照治療と比較するとＦＶＩＩＩが１．１分の１以下、１．２分の１以下、１．３分の１以下、１．４分の１以下、１．５分の１以下、２分の１以下、３分の１以下、または４分の１以下に、内部移行されている対象のＡＰＣの一部を低減し、ここでは、前記参照治療は、組換えポリペプチドの共投与なく前記ＦＶＩＩＩが投与されることを除いて、前記治療と同一である。
【００４３】
好適な実施形態によれば、好ましくは参照治療と比較すると、組換えポリペプチドの投与後のＦＶＩＩＩの免疫原性の低減は、組換えポリペプチドの存在下、対象の抗原提示細胞（ＡＰＣ）によるＦＶＩＩＩペプチドのＭＨＣクラスＩＩ型抗原提示の消滅によって達成されるかまたは該消滅を伴うものであり、前記参照治療は、組換えポリペプチドの投与なく前記ＦＶＩＩＩが投与されることを除いて、前記治療と同一である。対象の抗原提示細胞（ＡＰＣ）によるＦＶＩＩＩペプチドの前記ＭＨＣクラスＩＩ型抗原提示は、好ましくは１．５分の１以下、２．０分の１以下、２．５分の１以下、３．０分の１以下、３．５分の１以下、または４．０分の１以下に消滅（すなわち低減）されている。
【００４４】
さらに好適な実施形態によれば、好ましくは参照治療と比較すると、組換えポリペプチドの投与後のＦＶＩＩＩの免疫原性の低減は、組換えポリペプチドの存在下、対象の抗原提示細胞（ＡＰＣ）によるユニークなＭＨＣクラスＩＩ型結合性ＦＶＩＩＩペプチドの数の消滅によって達成されるかまたは該消滅を伴うものであり、前記参照治療は、組換えポリペプチドの投与なく前記ＦＶＩＩＩが投与されることを除いて、前記治療と同一である。対象の抗原提示細胞（ＡＰＣ）による前記ユニークなＭＨＣクラスＩＩ型結合性ＦＶＩＩＩペプチドの数は、好ましくは１．５分の１以下、２．０分の１以下、２．５分の１以下、３．０分の１以下、３．５分の１以下、または４．０分の１以下に消滅（すなわち低減）される。
【００４５】
さらに好適な実施形態によれば、好ましくは参照治療と比較すると、組換えポリペプチドの投与後のＦＶＩＩＩの免疫原性の低減は、組換えポリペプチドの存在下、対象の抗原提示細胞（ＡＰＣ）によるクラスター化されたＭＨＣクラスＩＩ型結合性ＦＶＩＩＩペプチドの数の消滅によって達成されるかまたは該消滅を伴うものであり、前記参照治療は、組換えポリペプチドの投与なく前記ＦＶＩＩＩが投与されることを除いて、前記治療と同一である。対象の抗原提示細胞（ＡＰＣ）によるクラスター化されたＭＨＣクラスＩＩ型結合性ＦＶＩＩＩペプチドの数は、好ましくは１．５分の１以下、２．０分の１以下、２．５分の１以下、３．０分の１以下、３．５分の１以下、または４．０分の１以下に消滅（すなわち低減）されている。
【００４６】
対象のＭＨＣクラスＩＩハプロタイプは、具体的にはＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ、およびＨＬＡ−ＤＱからなる群から選択されることがある。
【００４７】
さらに好適な実施形態によれば、少なくとも前記ＦＶＩＩＩペプチドの一部分は、Ｔヘルパー媒介性のＢ細胞の活性化／抗体の分泌に必要なステップであるＴ細胞の増殖を誘発することが可能である。
【００４８】
ユニークなＭＨＣクラスＩＩ結合性ＦＶＩＩＩペプチドの数は、ＦＶＩＩＩにユニークに帰属させることができる別個のペプチド配列の数である。これらは、ＦＶＩＩＩタンパク質にユニークなペプチドであり、他のタンパク質に発生しない。ユニークなＭＨＣクラスＩＩ結合性ＦＶＩＩＩペプチドの数は、対象の抗原提示細胞（ＡＰＣ）による抗原提示を定量するために使用される。
【００４９】
ユニークなＭＨＣクラス結合性ＦＶＩＩＩペプチドは、重複することがあり、グループ分けされることがある。ＭＨＣクラスＩＩ結合性ＦＶＩＩＩペプチドクラスターは、重複したユニークなＭＨＣクラスＩＩ結合性ＦＶＩＩＩペプチドの埋め込みアライメントである。対象の抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって提示されたＭＨＣクラスＩＩ結合性ＦＶＩＩＩペプチドクラスターの数も、抗原提示を定量するために使用される。
【００５０】
比
下記にさらに詳細に記載されるように、本発明のポリペプチドは、単量体、二量体、またはそれらの混合物であることがある。好ましくは、ポリペプチドは二量体である。実際には単量体として存在していても二量体として存在していても、本発明による任意のモル比は、本発明のポリペプチドの単量体サブユニットのモル濃度の比を指す。比は、共投与されたＦＶＩＩＩのモル濃度に対するものとして得られる。この出願におけるＦＶＩＩＩに対する本発明のポリペプチドの任意の比は、別段に指示のない限り、好ましくは二量体として存在する投与される本発明のポリペプチドに含まれる単量体の量（モル）を、投与されるＦＶＩＩＩの量（モル）により除算したものを指す。非限定的な例として、１００μＭの単量体の本発明のポリペプチドと１μＭのＦＶＩＩＩとの共投与は、比１００を意味する。５０μＭの二量体の本発明のポリペプチドが１μＭのＦＶＩＩＩと共投与される場合、同じ比１００が得られる。例えば比１００は、代替的に本明細書では１００：１と称する。
【００５１】
投与される本発明の組換えポリペプチドの、投与されるＦＶＩＩＩに対するモル比は、単量体として算出される組換えポリペプチドの量および単量体として算出されるＦＶＩＩＩの量に基づき、好ましくは少なくとも２：１、少なくとも３：１、少なくとも４：１、少なくとも５：１、少なくとも６：１、少なくとも８：１、少なくとも１０：１、少なくとも１５：１、少なくとも２０：１、少なくとも２５：１、または少なくとも５０：１である。
【００５２】
投与される本発明のポリペプチドの、投与されるＦＶＩＩＩに対するモル比は、本発明の別の態様によれば５０：１を超え、さらに好ましくは、その比は６０：１超、少なくとも７５：１、少なくとも１００：１、２００：１超、少なくとも３００：１、少なくとも４００：１、少なくとも５００：１、少なくとも６００：１、少なくとも７００：１、少なくとも８００：１、少なくとも９００：１、少なくとも１，０００：１、少なくとも１，５００：１、少なくとも２，０００：１、少なくとも２，５００：１、少なくとも３，０００：１少なくとも５，０００：１、少なくとも８，０００：１、または最大１０，０００：１である。
【００５３】
投与される本発明のポリペプチドの、投与されるＦＶＩＩＩに対するモル比は、ある特定の実施形態によれば、比１０，０００、比５，０００、比２，５００、比２，０００、比１，５００、比１，０００、比７５０を超えないかまたは比５００を超えない場合がある。
【００５４】
さらに別の実施形態による、投与される本発明のポリペプチドの、投与されるＦＶＩＩＩに対するモル比は、２から１，０００まで、または４から７５０まで、または１０から５００までに及ぶことがある。
【００５５】
投与される本発明のポリペプチドの、投与されるＦＶＩＩＩに対する比は、本発明のポリペプチドの共投与によって、ＦＶＩＩＩの半減期の充分な増加を確実なものとするとともに、本明細書に同定されたＦＶＩＩＩの免疫原性の低減を確実なものとする範囲で提供される。具体的には、先行して公開された開示の観点から、上記に引用されたＤｅｌｉｇｎｅｔら、２０１２年を特に考慮すると、ここに非常な驚きを以て、両方の目的をともに達成し得たことが見出された。
【００５６】
本発明に従う治療のさらに進んだ詳細を下記にさらに記載する。
【００５７】
トランケート型ＶＷＦ
本発明は、トランケート型フォン・ウィルブランド因子（ＶＷＦ）を含む組換えポリペプチドに関する。用語「フォン・ウィルブランド因子」（ＶＷＦ）は、本明細書に使用される際には、天然に存在する（天然の）ＶＷＦを含むが、少なくとも天然に存在するＶＷＦのＦＶＩＩＩ結合活性を保持するそのバリアント、例えば配列バリアントをも含み、そこでは、１つまたはそれ以上の残基が、挿入、欠失、または置換されている。ＦＶＩＩＩ結合活性は、参照によって本明細書に組み入れるＷＯ２０１６／１８８９０７Ａ１の実施例２に記載されているようなＦＶＩＩＩ−ＶＷＦ結合アッセイによって決定される。
【００５８】
この発明に従う好適なＶＷＦは、配列番号４に示されるアミノ酸配列によって表されるヒトＶＷＦである。配列番号４をコードするｃＤＮＡは、配列番号３に示されている。
【００５９】
ヒトの天然のＶＷＦをコードする遺伝子は、９ｋｂのｍＲＮＡに転写され、そのｍＲＮＡは、推定分子量３１０，０００Ｄａを有する２８１３アミノ酸のプレプロポリペプチドに翻訳される。このプレプロポリペプチドは、Ｎ末端の２２アミノ酸のシグナルペプチドと、それに続く７４１アミノ酸のプロポリペプチド（配列番号４のアミノ酸２３〜７６３）と成熟型サブユニット（配列番号４のアミノ酸７６４〜２８１３）とを含有する。Ｎ末端からの７４１アミノ酸のプロポリペプチドが切断されると、結果として２０５０アミノ酸からなる成熟型ＶＷＦが生じる。ヒトの天然のＶＷＦプレプロポリペプチドのアミノ酸配列を、配列番号４に示す。別段に指示のない限り、この出願におけるＶＷＦ残基のアミノ酸の付番は、配列番号４を参照し、ＶＷＦ分子、具体的にはトランケート型ＶＷＦが配列番号４の全ての残基を含まない場合であっても当該配列を参照する。
【００６０】
天然ＶＷＦのプロポリペプチドは、複数のドメインを含む。各種のドメインアノテーションを文献に見出すことができる［例えばＺｈｏｕら（２０１２年）、Ｂｌｏｏｄ、１２０巻２号、４４９〜４５８頁を参照］。この出願では、ＶＷＦの天然のプレプロポリペプチドの以下のドメインアノテーションが適用される：
Ｄ１−Ｄ２−Ｄ’−Ｄ３−Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ｄ４−Ｃ１−Ｃ２−Ｃ３−Ｃ４−Ｃ５−Ｃ６−ＣＫ
【００６１】
配列番号４を参照して、Ｄ’ドメインはアミノ酸７６４〜８６５からなり；Ｄ３ドメインはアミノ酸８６６〜１２４２からなる。
【００６２】
本発明の観点からの「トランケート型」という構成は、ポリペプチドが成熟型ＶＷＦ（配列番号４のアミノ酸７６４〜２８１３）の全アミノ酸配列を含まないことを意味する。典型的には、トランケート型ＶＷＦは、配列番号４のアミノ酸７６４〜２８１３の全てを含むものではないが、その断片のみを含む。トランケート型ＶＷＦは、ＶＷＦ断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）または複数でＶＷＦ断片（ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）ともよばれることがある。
【００６３】
典型的には，トランケート型ＶＷＦは、第ＶＩＩＩ因子に結合可能である。好ましくは、トランケート型ＶＷＦは、ヒトの天然の第ＶＩＩＩ因子の成熟体に結合可能である。別の実施形態では、トランケート型ＶＷＦは、組換えＦＶＩＩＩに、好ましくは本明細書に記載されるようなＦＶＩＩＩに、さらに好適には配列番号５のアミノ酸配列からなる単鎖の第ＶＩＩＩ因子に、結合可能である。第ＶＩＩＩ因子へのトランケート型ＶＷＦの結合性は、参照によって本明細書に組み入れるＷＯ２０１６／１８８９０７Ａ１の実施例２に記載されるようなＦＶＩＩＩ−ＶＷＦ結合アッセイによって決定することができる。
【００６４】
本発明のトランケート型ＶＷＦは好ましくは、機能性のＤ’ドメインおよび／または機能性のＤ３ドメインを、具体的には機能性のＤ’ドメインおよび機能性のＤ３ドメインを、含むかまたはそれからなる。本発明のトランケート型フォン・ウィルブランド因子（ＶＷＦ）は少なくとも、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）に結合可能である。さらに好ましくは、トランケート型ＶＷＦは、配列番号４のアミノ酸７７６から８０５と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、ＦＶＩＩＩに結合可能である。好適な実施形態では、トランケート型ＶＷＦは、配列番号４のアミノ酸７７６から８０５と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、ＦＶＩＩＩに結合可能である。最も好ましくは、トランケート型ＶＷＦは、配列番号４のアミノ酸７７６から８０５を含むかまたはそれからなる。本明細書に別段に指示のない限り、配列同一性は、参照配列（例えば配列番号４のアミノ酸７７６から８０５）の全体の長さにわたって決定される。
【００６５】
本発明のトランケート型ＶＷＦは好ましくは、配列番号４のアミノ酸７６６から８６４と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、ＦＶＩＩＩに結合可能である。好適な実施形態では、トランケート型ＶＷＦは、配列番号４のアミノ酸７６６から８６４と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、ＦＶＩＩＩに結合可能である。最も好ましくは、トランケート型ＶＷＦは、配列番号４のアミノ酸７６６から８６４を含むかまたはそれからなる。
【００６６】
別の好適な実施形態では、トランケート型ＶＷＦが依然としてＦＶＩＩＩに結合可能であることを条件として、トランケート型ＶＷＦは、（ａ）配列番号４のアミノ酸７６４から１２４２と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または（ｂ）それらの断片からなる。さらに好ましくは、トランケート型ＶＷＦが依然としてＦＶＩＩＩに結合可能であることを条件として、トランケート型ＶＷＦは、（ａ）配列番号４のアミノ酸７６４から１２４２と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または（ｂ）その断片からなる。最も好ましくは、トランケート型ＶＷＦが依然としてＦＶＩＩＩに結合可能であることを条件として、トランケート型ＶＷＦは、（ａ）配列番号４のアミノ酸７６４から１２４２、または（ｂ）その断片からなる。
【００６７】
下記にさらに詳細に記載されるように、本発明のポリペプチドは、トランケート型ＶＷＦを含むポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を使用する方法によって調製されることがある。核酸は、それ自体で公知の手法によって、適切な宿主細胞内に導入される。
【００６８】
好適な実施形態では、トランケート型の成熟型ＶＷＦが依然としてＦＶＩＩＩに結合可能であることを条件として、宿主細胞の核酸は、（ａ）配列番号４のアミノ酸１から１２４２と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または（ｂ）その断片をコードする。さらに好ましくは、トランケート型ＶＷＦが依然としてＦＶＩＩＩに結合可能であることを条件として、核酸は、（ａ）配列番号４のアミノ酸１から１２４２と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または（ｂ）その断片をコードする。最も好ましくは、トランケート型ＶＷＦが依然としてＦＶＩＩＩに結合可能であることを条件として、核酸は、（ａ）配列番号４のアミノ酸１から１２４２、または（ｂ）その断片をコードする。特に、この発明に従うポリペプチドが二量体である場合、核酸は、ＶＷＦ（例えば配列番号４）のアミノ酸１から７６３をコードする配列を含むみ、ポリペプチド中のトランケート型ＶＷＦがＶＷＦ（例えば配列番号４）のアミノ酸１から７６３を含まない場合であっても当該配列を含むむ。
【００６９】
好適な実施形態による本発明の組換えポリペプチドのトランケート型ＶＷＦは、配列番号４のＶＷＦのアミノ酸配列の１から７６３を含みうる。
【００７０】
さらに好適な実施形態によれば、トランケート型ＶＷＦは、それぞれが配列番号４を参照する以下のアミノ酸配列のうち１つを含むかまたはそれからなる：
７７６〜８０５；７６６〜８０５；７６４〜８０５；７７６〜８１０；７６６〜８１０；７６４〜８１０；７７６〜８１５；７６６〜８１５；７６４〜８１５；
７７６〜８２０；７６６〜８２０；７６４〜８２０；７７６〜８２５；７６６〜８２５；７６４〜８２５；７７６〜８３０；７６６〜８３０；７６４〜８３０；
７７６〜８３５；７６６〜８３５；７６４〜８３５；７７６〜８４０；７６６〜８４０；７６４〜８４０；７７６〜８４５；７６６〜８４５；７６４〜８４５；
７７６〜８５０；７６６〜８５０；７６４〜８５０；７７６〜８５５；７６６〜８５５；７６４〜８５５；７７６〜８６０；７６６〜８６０；７６４〜８６０；
７７６〜８６４；７６６〜８６４；７６４〜８６４；７７６〜８６５；７６６〜８６５；７６４〜８６５；７７６〜８７０；７６６〜８７０；７６４〜８７０；
７７６〜８７５；７６６〜８７５；７６４〜８７５；７７６〜８８０；７６６〜８８０；７６４〜８８０；７７６〜８８５；７６６〜８８５；７６４〜８８５；
７７６〜８９０；７６６〜８９０；７６４〜８９０；７７６〜８９５；７６６〜８９５；７６４〜８９５；７７６〜９００；７６６〜９００；７６４〜９００；
７７６〜９０５；７６６〜９０５；７６４〜９０５；７７６〜９１０；７６６〜９１０；７６４〜９１０；７７６〜９１５；７６６〜９１５；７６４〜９１５；
７７６〜９２０；７６６〜９２０；７６４〜９２０；７７６〜９２５；７６６〜９２５；７６４〜９２５；７７６〜９３０；７６６〜９３０；７６４〜９３０；
７７６〜９３５；７６６〜９３５；７６４〜９３５；７７６〜９４０；７６６〜９４０；７６４〜９４０；７７６〜９４５；７６６〜９４５；７６４〜９４５；
７７６〜９５０；７６６〜９５０；７６４〜９５０；７７６〜９５５；７６６〜９５５；７６４〜９５５；７７６〜９６０；７６６〜９６０；７６４〜９６０；
７７６〜９６５；７６６〜９６５；７６４〜９６５；７７６〜９７０；７６６〜９７０；７６４〜９７０；７７６〜９７５；７６６〜９７５；７６４〜９７５；
７７６〜９８０；７６６〜９８０；７６４〜９８０；７７６〜９８５；７６６〜９８５；７６４〜９８５；７７６〜９９０；７６６〜９９０；７６４〜９９０；
７７６〜９９５；７６６〜９９５；７６４〜９９５；７７６〜１０００；７６６〜１０００；７６４〜１０００；７７６〜１００５；７６６〜１００５；７６４〜１００５；７７６〜１０１０；７６６〜１０１０；７６４〜１０１０；７７６〜１０１５；７６６〜１０１５；７６４〜１０１５；７７６〜１０２０；７６６〜１０２０；７６４〜１０２０；７７６〜１０２５；７６６〜１０２５；７６４〜１０２５；７７６〜１０３０；７６６〜１０３０；７６４〜１０３０；７７６〜１０３５；７６６〜１０３５；７６４〜１０３５；７７６〜１０４０；７６６〜１０４０；７６４〜１０４０；７７６〜１０４５；７６６〜１０４５；７６４〜１０４５；７７６〜１０５０；７６６〜１０５０；７６４〜１０５０；７７６〜１０５５；７６６〜１０５５；７６４〜１０５５；７７６〜１０６０；７６６〜１０６０；７６４〜１０６０；７７６〜１０６５；７６６〜１０６５；７６４〜１０６５；７７６〜１０７０；７６６〜１０７０；７６４〜１０７０；７７６〜１０７５；７６６〜１０７５；７６４〜１０７５；７７６〜１０８０；７６６〜１０８０；７６４〜１０８０；７７６〜１０８５；７６６〜１０８５；７６４〜１０８５；７７６〜１０９０；７６６〜１０９０；７６４〜１０９０；７７６〜１０９５；７６６〜１０９５；７６４〜１０９５；７７６〜１１００；７６６〜１１００；７６４〜１１００；７７６〜１１０５；７６６〜１１０５；７６４〜１１０５；７７６〜１１１０；７６６〜１１１０；７６４〜１１１０；７７６〜１１１５；７６６〜１１１５；７６４〜１１１５；７７６〜１１２０；７６６〜１１２０；７６４〜１１２０；７７６〜１１２５；７６６〜１１２５；７６４〜１１２５；７７６〜１１３０；７６６〜１１３０；７６４〜１１３０；７７６〜１１３５；７６６〜１１３５；７６４〜１１３５；７７６〜１１４０；７６６〜１１４０；７６４〜１１４０；７７６〜１１４５；７６６〜１１４５；７６４〜１１４５；７７６〜１１５０；７６６〜１１５０；７６４〜１１５０；７７６〜１１５５；７６６〜１１５５；７６４〜１１５５；７７６〜１１６０；７６６〜１１６０；７６４〜１１６０；７７６〜１１６５；７６６〜１１６５；７６４〜１１６５；７７６〜１１７０；７６６〜１１７０；７６４〜１１７０；７７６〜１１７５；７６６〜１１７５；７６４〜１１７５；７７６〜１１８０；７６６〜１１８０；７６４〜１１８０；７７６〜１１８５；７６６〜１１８５；７６４〜１１８５；７７６〜１１９０；７６６〜１１９０；７６４〜１１９０；７７６〜１１９５；７６６〜１１９５；７６４〜１１９５；７７６〜１２００；７６６〜１２００；７６４〜１２００；７７６〜１２０５；７６６〜１２０５；７６４〜１２０５；７７６〜１２１０；７６６〜１２１０；７６４〜１２１０；７７６〜１２１５；７６６〜１２１５；７６４〜１２１５；７７６〜１２２０；７６６〜１２２０；７６４〜１２２０；７７６〜１２２５；７６６〜１２２５；７６４〜１２２５；７７６〜１２３０；７６６〜１２３０；７６４〜１２３０；７７６〜１２３５；７６６〜１２３５；７６４〜１２３５；７７６〜１２４０；７６６〜１２４０；７６４〜１２４０；７７６〜１２４２；７６６〜１２４２；７６４〜１２４２；７６４〜１４６４；７６４〜１２５０；７６４〜１０４１；７６４〜８２８；７６４〜８６５；７６４〜１０４５；７６４〜１０３５；７６４〜１１２８；７６４〜１１９８；７６４〜１２６８；７６４〜１２６１；７６４〜１２６４；７６４〜１４５９；７６４〜１４６３；７６４〜１４６４；７６４〜１６８３；７６４〜１８７３；７６４〜１４８２；７６４〜１４７９；７６４〜１６７２；および７６４〜１８７４。
【００７１】
ある特定の実施形態では、トランケート型ＶＷＦは、成熟型の野生型ＶＷＦと比較して内部欠失を有する。例えば、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ｄ４、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、ＣＫドメインのうちの１つ、複数、もしくは全て、またはそれらの組合せが欠失しており、Ｄ’ドメインおよび／またはＤ３ドメインが保持されている。さらに別の実施形態によれば、トランケート型ＶＷＦは、ドメインＡ１、Ａ２、Ａ３、Ｄ４、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、またはＣＫのうちの１つ、複数、または全てを欠いている。さらに別の実施形態によれば、トランケート型ＶＷＦは、配列番号４のアミノ酸１２４３から２８１３、すなわちドメインＡ１−Ａ２−Ａ３−Ｄ４−Ｃ１−Ｃ２−Ｃ３−Ｃ４−Ｃ５−Ｃ６−ＣＫを欠いている。
【００７２】
さらに別の実施形態では、トランケート型ＶＷＦは、血小板糖タンパク質Ｉｂα（ＧＰＩｂα）、コラーゲン、および／またはインテグリンαＩＩｂβＩＩＩ（Ｃ１ドメイン内のＲＧＤＳ配列）との結合部位を含まない。他の実施形態では、トランケート型ＶＷＦは、ＶＷＦの中央のＡ２ドメインに位置するＡＤＡＭＴＳ１３のための切断部位（Ｔｙｒ１６０５−Ｍｅｔ１６０６）を含まない。さらに別の実施形態では、トランケート型ＶＷＦは、ＧＰＩｂαとの結合部位を含まない、および／またはコラーゲンとの結合部位を含まない、および／またはインテグリンαＩＩｂβＩＩＩとの結合部位を含まない、および／またはそれはＶＷＦの中央のＡ２ドメインに位置するＡＤＡＭＴＳ１３のための切断部位（Ｔｙｒ１６０５−Ｍｅｔ１６０６）を含まない。
【００７３】
他の実施形態では、トランケート型ＶＷＦがＦＶＩＩＩに結合可能であることを条件として、トランケート型ＶＷＦは、先の段落に記載されたアミノ酸配列のうち１つと少なくとも９０％、または少なくとも９１％、または少なくとも９２％、または少なくとも９３％、または少なくとも９４％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むかそれからなる。
【００７４】
本発明のポリペプチドの２つの単量体が共有結合で連結されている場合に、本発明のポリペプチドは、本発明では「二量体」と称される。好ましくは、共有結合は、本発明のポリペプチドのトランケート型ＶＷＦ部分内に位置する。好ましくは、２つの単量体サブユニットは、少なくとも１本のジスルフィド架橋を介して、例えば１本、２本、３本、または４本のジスルフィド架橋によって、共有結合で連結される。少なくとも１本のジスルフィド架橋を形成するシステイン残基は、好ましくは本発明のポリペプチドのトランケート型ＶＷＦ部分内に位置する。一実施形態では、これらのシステイン残基は、Ｃｙｓ−１０９９、Ｃｙｓ−１１４２、Ｃｙｓ−１２２２、Ｃｙｓ−１２２５、もしくはＣｙｓ−１２２７、またはそれらの組合せである。好ましくは、二量体の本発明のポリペプチドは、ポリペプチドのトランケート型ＶＷＦ部分内に位置する前記共有結合に加えて、単量体を連結するさらに別の共有結合を何も含まず、具体的には、ポリペプチドのＨＬＥＭ部分内またはＨＬＥＰ部分内に位置するさらに別の共有結合を何も含まない。しかし、代替的な実施形態によれば、二量体の本発明のポリペプチドは、単量体を連結するポリペプチドのＨＬＥＭ部分またはＨＬＥＰ部分に位置する共有結合を含むことがある。
【００７５】
二量体は、好ましくはホモ二量体であり、各単量体は、好ましくは本明細書に開示されるようなＨＬＥＭを含む。本発明のポリペプチドが二量体である場合、トランケート型ＶＷＦは、好ましくは、配列番号４のアミノ酸７６４から１０９９、アミノ酸７６４から１１４２、アミノ酸７６４から１２２２、アミノ酸７６４から１２２５、またはアミノ酸７６４から１２２７と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をそれぞれ含む２つのポリペプチドを含むかまたはそれらからなり、ＦＶＩＩＩに結合可能である。好適な実施形態では、トランケート型ＶＷＦは、配列番号４のアミノ酸７６４から１０９９、アミノ酸７６４から１１４２、アミノ酸７６４から１２２２、アミノ酸７６４から１２２５、またはアミノ酸７６４から１２２７と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、ＦＶＩＩＩに結合可能である。最も好ましくは，トランケート型ＶＷＦは、配列番号４のアミノ酸７６４から１０９９、アミノ酸７６４から１１４２、アミノ酸７６４から１２２２、アミノ酸７６４から１２２５、アミノ酸７６４から１２２７、またはアミノ酸７６４から１２４２を含むかまたはそれからなる。
【００７６】
トランケート型ＶＷＦは、参照によってその開示を本明細書に組み入れるＷＯ２０１３／１０６７８７Ａ１、ＷＯ２０１４／１９８６９９Ａ２、ＷＯ２０１１／０６０２４２Ａ２、ＷＯ２０１３／０９３７６０Ａ２、またはＷＯ２０１６／１８８９０７Ａ１に開示されたＶＷＦ断片のうち、いずれか１つであることがある。
【００７７】
さらに別の好適な実施形態によれば、上記に開示されたようなトランケート型ＶＷＦは、ＷＯ２０１６／００００３９Ａ１に開示されたようなアミノ酸置換のうち少なくとも１つを含むことがある。それらのトランケート型ＶＷＦの改変バージョンは、配列番号４による野生型ＶＷＦのＤ’ドメインのアミノ酸配列と比較して、そのＤ’ドメイン内に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。トランケート型ＶＷＦの改変バージョンのアミノ酸配列は、それぞれの野生型配列と比較して、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有し得る。それらのトランケート型ＶＷＦの改変バージョンは、前記改変を除いて同じアミノ酸配列を有する参照ポリペプチドの結合親和性と比較して、好ましくはさらに高いＦＶＩＩＩとの結合親和性を示す。
【００７８】
別段に指示のない限り、本明細書におけるトランケート型ＶＷＦ残基のアミノ酸の付番は、配列番号４を参照し、トランケート型ＶＷＦ分子が配列番号４の全ての残基を含まない場合であっても当該配列を参照する。
【００７９】
改変型のトランケート型ＶＷＦのＤ’ドメインのアミノ酸配列は、好ましくは、配列番号４のＤ’ドメインと比較して、１つまたは２つのアミノ酸置換を有する。配列番号２の１位に対応する配列番号４の７６４位のＳが、Ｇ、Ｐ、Ｖ、Ｅ、Ｙ、Ａ、およびＬからなる群から選択されるアミノ酸に置換されることが好適である。また、配列番号２の３位に相当する配列番号４の７６６位のＳが、Ｙ、Ｉ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｈ、Ｒ、Ｗからなる群から選択されるアミノ酸に置換されることも好適である。好適な置換の組合せとしては、配列番号４の配列を参照して、Ｓ７６４Ｇ／Ｓ７６６Ｙ、Ｓ７６４Ｐ／Ｓ７６６Ｉ、Ｓ７６４Ｐ／Ｓ７６６Ｍ、Ｓ７６４Ｖ／Ｓ７６６Ｙ、Ｓ７６４Ｅ／Ｓ７６６Ｙ、Ｓ７６４Ｙ／Ｓ７６６Ｙ、Ｓ７６４Ｌ／Ｓ７６６Ｙ、Ｓ７６４Ｐ／Ｓ７６６Ｗ、Ｓ７６６Ｗ／Ｓ８０６Ａ、Ｓ７６６Ｙ／Ｐ７６９Ｋ、Ｓ７６６Ｙ／Ｐ７６９Ｎ、Ｓ７６６Ｙ／Ｐ７６９Ｒ、およびＳ７６４Ｐ／Ｓ７６６Ｌが挙げられる。本発明のポリペプチドのＦＶＩＩＩとの結合親和性は、前記置換の導入によって、前記改変を除いて同じアミノ酸を有する参照ポリペプチドの結合親和性と比較して、さらに増加されることがある。ＶＷＦのＦＶＩＩＩとの相互作用は、典型的には高い結合速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）を有することから、解離定数の変化は、解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）の変化に大きく依存する。したがって、ＶＷＦのＦＶＩＩＩとの会合を増加させる際の主な焦点は、ＦＶＩＩＩとＶＷＦとの間の解離速度を減少させる取り組みを含む。好ましくは、野生型ＶＷＦとＦＶＩＩＩと比較して、前記改変を有するトランケート型ＶＷＦバリアントとＦＶＩＩＩとの解離速度は、２分の１以下であり、さらに好ましくは５分の１以下であり、好ましくは１０分の１以下であり、さらに好ましくは２０分の１以下である。トランケート型ＶＷＦ内の前記置換は、共投与されたＦＶＩＩＩの半減期の増加に寄与することがある、および／または本発明の組換えポリペプチドの投与される用量の低減を可能にすることがある。
【００８０】
さらに好適な実施形態によれば、本明細書に開示されるようなトランケート型ＶＷＦは、同時係属中のＰＣＴ／ＡＵ２０１７／０５００１０Ａ１に記載されるようなアミノ酸置換のうち少なくとも１つを含むことがある。それらのトランケート型ＶＷＦの改変バージョンは、好ましくは、前記改変を除いて同じアミノ酸配列を有する参照ポリペプチドの結合親和性と比較して、さらに高いＦＶＩＩＩとの結合親和性を示す。そのため、本明細書に開示されるようなトランケート型ＶＷＦは、以下のアミノ酸置換のうちの１つまたはアミノ酸置換の組合せを含むことがある：Ｓ７６４Ｐ／Ｓ７６６Ｗ／Ｖ１０８３Ａ、Ｓ７６４Ｇ／Ｓ７６６Ｙ／Ｖ１０８３Ａ、Ｓ７６４Ｅ／Ｓ７６６Ｙ／Ｖ１０８３Ａ、Ｎ１０１１Ｓ／Ｖ１０８３Ａ／Ｋ１１８１Ｅ、Ｓ７６６Ｙ／Ｖ１０８３Ａ、Ｖ１０８３Ａ、Ｓ１０４２Ｔ、Ｖ８０５Ａ／Ｑ１１５８Ｌ、Ｋ９１２Ｅ／Ｔ１０８８Ｓ、またはＬ７８１Ｐ。トランケート型ＶＷＦ内の前記置換は、共投与されたＦＶＩＩＩの半減期の増加に寄与することがある、および／または本発明の組換えポリペプチドの投与される用量の低減を可能にすることがある。
【００８１】
前記置換を有する本発明のポリペプチドを好ましくは使用して、共投与されたＦＶＩＩＩの半減期のいっそうの増加を確実なものとするとともに、ＦＶＩＩＩの免疫原性の低減をもたらすことが可能であり、共投与されるＦＶＩＩＩよりも中等度にモル過剰であるに過ぎない本発明のポリペプチドを投与する場合であってもこれは可能である。
【００８２】
用語「内因性のＶＷＦ」は、二量体化または多量体化の程度とは独立して、本明細書に使用される際には、ＶＷＦの単量体サブユニットを指す。
【００８３】
半減期延長部分（ＨＬＥＭ）
トランケート型ＶＷＦに加えて、本発明のポリペプチドは、ある好適な実施形態では、半減期延長部分（ＨＬＥＭ）をさらに含むことがある。半減期延長部分は、異種アミノ酸配列、具体的には半減期亢進タンパク質（ＨＬＥＰ）であることがある。代替的には、半減期延長部分は、ペプチド結合とは異なる共有結合によってトランケート型ＶＷＦを含むポリペプチドに化学的にコンジュゲーションされた非ペプチド性部分である。
【００８４】
本発明のある特定の実施形態では、本発明の組換えポリペプチドの半減期は、化学修飾、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ化）、グリコシル化ＰＥＧ、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ化）、ポリシアル酸、エラスチン様ポリペプチド、ヘパロサンポリマー、またはヒアルロン酸などの半減期延長部分の付加によって延長される。別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、アルブミンなどのＨＬＥＰに化学リンカーを介してコンジュゲーションされる。このコンジュゲーション技術の原理は、Ｃｏｎｊｕｃｈｅｍ  ＬＬＣにより例示的な方式で記載されている（例えば、米国特許第７，２５６，２５３号を参照）。
【００８５】
組換えポリペプチドは、好ましくはトランケート型ＶＷＦとＨＬＥＭまたはＨＬＥＰとの間に位置する化学結合またはリンカー配列をさらに含む。
【００８６】
前記リンカー配列は、１つまたはそれ以上のアミノ酸、具体的には１個から５０個、１個から３０個、１個から２０個、１個から１５個、１個から１０個、１個から５個、または１個から３個（例えば１個、２個、または３個）のアミノ酸であって互いに等しいことも異なることもあるアミノ酸からなるペプチド性リンカーであることがある。好ましくは、リンカー配列は、野生型ＶＷＦの対応する位置に存在しない。前記リンカー配列に存在する好適なアミノ酸としては、ＧｌｙおよびＳｅｒが挙げられる。リンカー配列は、非免疫原性とするべきである。好適なリンカーは、交互のグリシン残基およびセリン残基から構成されることがある。適したリンカーは、例えばＷＯ２００７／０９０５８４に記載されている。
【００８７】
本発明の別の実施形態では、トランケート型ＶＷＦ部分とＨＬＥＭとの間のペプチド性リンカーは、ペプチド配列からなり、この配列は、ヒトタンパク質の自然のドメイン間リンカーとして役割を果たす。好ましくはその自然環境でのそのようなペプチド配列は、この配列に対する自然寛容を呈することができるように、タンパク質表面近くに位置し免疫系にアクセス可能である。例は、ＷＯ２００７／０９０５８４に示されている。切断可能なリンカー配列は、例えばＷＯ２０１３／１２０９３９Ａ１に記載されている。
【００８８】
組換えポリペプチドの好適な実施形態では、トランケート型ＶＷＦとＨＬＥＭとの間のリンカーは、配列番号２のアミノ酸配列４８０〜５１０を有するかまたはそれからなるグリシン／セリンペプチド性リンカーである。
【００８９】
一実施形態では、ポリペプチドは、以下の構造を含む：
ｔＶＷＦ−Ｌ１−Ｈ、（Ｉ）
上式で、ｔＶＷＦはトランケート型ＶＷＦであり、Ｌ１は化学結合またはリンカー配列であり、ＨはＨＬＥＭ、具体的にはＨＬＥＰである。
【００９０】
Ｌ１は、１つまたはそれ以上のアミノ酸、例えば１個から５０個、１個から３０個、１個から２０個、１個から１５個、１個から１０個、１個から５個、または１個から３個（例えば１個、２個、または３個）のアミノ酸であって互いに同じであることも異なることもあるアミノ酸からなる化学結合またはリンカー配列である。通常、リンカー配列は、野生型ＶＷＦの対応する位置には存在しない。Ｌ１に存在する適切なアミノ酸の例としては、ＧｌｙおよびＳｅｒが挙げられる。リンカーは、非免疫原性とするべきであり、切断不能または切断可能なリンカーである。切断不能なリンカーは、ＷＯ２００７／０９０５８４に例示されるように、交互のグリシン残基およびセリン残基から構成されることがある。本発明の別の実施形態では、トランケート型ＶＷＦ部分とアルブミン部分との間のペプチド性リンカーは、ペプチド配列からなり、この配列は、ヒトタンパク質の自然のドメイン間リンカーとして役割を果たす。好ましくはその自然環境でのそのようなペプチド配列は、この配列に対する自然寛容を呈することができるように、タンパク質表面近くに位置し免疫系にアクセス可能である。例は、ＷＯ２００７／０９０５８４に示されている。切断可能なリンカー配列は、例えばＷＯ２０１３／１２０９３９Ａ１に記載されている。
【００９１】
好適なＨＬＥＰ配列は、のちに記載される。同様に本発明により包含されるのは、それぞれのＨＬＥＰのまさにその「Ｎ末端アミノ酸」とのもしくはまさにその「Ｃ末端アミノ酸」との融合体、またはそれぞれのＨＬＥＰの「Ｎ末端部」もしくは「Ｃ末端部」との融合体であり、それらにはＨＬＥＰの１つまたはそれ以上のアミノ酸のＮ末端欠失が含まれる。ポリペプチドは、２つ以上のＨＬＥＰ配列、例えば２つまたは３つのＨＬＥＰ配列を含むことがある。これらの複数のＨＬＥＰ配列は、ＶＷＦのＣ末端部にタンデムに、例えば連続した反復として融合されることがある。
【００９２】
半減期亢進ポリペプチド（ＨＬＥＰ）
好ましくは、半減期延長部分は、半減期延長ポリペプチド（ＨＬＥＰ）である。１つまたはそれ以上のＨＬＥＰは、それらがＦＶＩＩＩへのトランケート型ＶＷＦの結合能に干渉しないかまたはそれを無効にしないことを条件として、ＶＷＦのＣ末端部に融合されることがある。さらに好ましくは、ＨＬＥＰは、新生仔Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合可能なポリペプチド、例えばアルブミンもしくはその断片など、またはイムノグロブリン定常領域およびその一部分、例えばＦｃ断片、流体力学的に大きな体積を有する溶媒和されたランダム鎖［例えばＸＴＥＮ（Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒら、２００９年；Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２７巻、１１８６〜１１９０頁］、ホモアミノ酸反復（ＨＡＰ）、プロリン−アラニン−セリン反復（ＰＡＳ）、アファミン、アルファ−フェトタンパク質、ビタミンＤ結合タンパク質、トランスフェリンまたはその断片、ヒト絨毛性ゴナドトロピン−βサブユニットのカルボキシル末端ペプチド（ＣＴＰ）、生理的条件下でアルブミンもしくはイムノグロブリン定常領域に結合可能なポリペプチドまたは脂質からなる群から選択される。イムノグロブリン定常領域またはその一部は、好ましくはイムノグロブリンＧ１のＦｃ断片、イムノグロブリンＧ２のＦｃ断片、またはイムノグロブリンＡのＦｃ断片である。
【００９３】
「半減期亢進ポリペプチド」は、本明細書に使用される際に、好ましくは、アルブミン、アルブミンファミリーのメンバー、イムノグロブリンＧの定常領域およびその断片、生理的条件下でアルブミン、アルブミンファミリーのメンバー、およびイムノグロブリン定常領域の一部に結合可能な領域およびポリペプチドからなる群から選択される。それは、本明細書に記載される完全長の半減期亢進タンパク質（例えばアルブミン、アルブミンファミリーのメンバー、もしくはイムノグロブリンＧの定常領域）、または凝固因子の医薬活性もしくは生物活性を安定化もしくは延長することが可能なその１つもしくはそれ以上の断片である。そのような断片は、ＨＬＥＰを含まないそれぞれのポリペプチドと比較してＨＬＥＰ断片が少なくとも２５％の機能的な半減期の延長をもたらす限り、長さ１０以上のアミノ酸であり、少なくとも約１５、少なくとも約２０，少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約５０、少なくとも約１００、またはさらに多くの連続した、ＨＬＥＰ配列由来のアミノ酸であるか、またはそれぞれのＨＬＥＰの特定のドメインの一部もしくは全てを含むことがある。
【００９４】
本発明のポリペプチドのＨＬＥＰ部分は、野生型ＨＬＥＰのバリアントであることがある。用語「バリアント」は、保存されているか保存されていないかのどちらかである挿入、欠失、および置換を含み、その場合、そのような変化は、トランケート型ＶＷＦのＦＶＩＩＩ結合活性を実質的に変えない。
【００９５】
具体的には、本発明の提案されるＶＷＦ  ＨＬＥＰ融合体構築物は、ＨＬＥＰおよびＨＬＥＰの断片の天然に存在する多型バリアントを含むことがある。ＨＬＥＰは、任意の脊椎動物、特に任意の哺乳動物、例えばヒト、サル、ウシ、ヒツジ、またはブタに由来する。非哺乳類ＨＬＥＰとしては、以下に限定されないが、ニワトリおよびサケが挙げられる。
【００９６】
本開示のある特定の実施形態によれば、本発明の組換えポリペプチドのＨＬＥＭ部分、具体的にはＨＬＥＰ部分は、代替的な用語「ＦＰ」を用いて特定されることがある。好ましくは、用語「ＦＰ」はヒトアルブミンを表す。
【００９７】
ある好適な実施形態によれば、組換えポリペプチドは、融合タンパク質である。本発明の観点での融合タンパク質は、トランケート型ＶＷＦならびにＨＬＥＰをコードする少なくとも２つのＤＮＡ配列のインフレーム接合によって作出されるタンパク質である。当業者は、融合タンパク質のＤＮＡ配列の翻訳の結果として単一のタンパク質配列が生じることを理解する。さらに好適な実施形態によるペプチド性リンカーをコードするＤＮＡ配列のインフレーム挿入の結果として、トランケート型ＶＷＦ、適切なリンカー、およびＨＬＥＰを含む融合タンパク質が得られることがある。
【００９８】
いくつかの実施形態によれば、共投与されるＦＶＩＩＩは、本明細書に記載されたいかなるＨＬＥＭ構造もＨＬＥＰ構造も含まない。ある特定の他の実施形態によれば、共投与されるＦＶＩＩＩは、本明細書に記載されたＨＬＥＭ構造またはＨＬＥＰ構造のうち少なくとも１つを含むことがある。
【００９９】
ＨＬＥＰとしてのアルブミン
好ましくは、ＨＬＥＰは、アルブミンまたはその断片である。アルブミンのＮ末端は、トランケート型ＶＷＦのＣ末端に融合されることがある。代替的には、アルブミンのＣ末端が、トランケート型ＶＷＦのＮ末端に融合されることがある。
【０１００】
用語「ヒト血清アルブミン」（ＨＳＡ）および「ヒトアルブミン」（ＨＡ）および「アルブミン」（ＡＬＢ）は、この出願では互換的に用いられる。用語「アルブミン」および「血清アルブミン」はより広範であり、ヒト血清アルブミン（ならびにその断片およびバリアント）ならびに他の種に由来するアルブミン（ならびにその断片およびバリアント）を包含する。
【０１０１】
本明細書に使用される際に、「アルブミン」とは、アルブミンのポリペプチドもしくはアミノ酸配列、またはアルブミンの１つもしくはそれ以上の機能的な活性（例えば生物活性）を有するアルブミンの断片もしくはバリアントをまとめて指す。具体的には、「アルブミン」は、ヒトアルブミンもしくはその断片、特に本明細書の配列番号６に示されるようなヒトアルブミンの成熟体、または他の脊椎動物由来のアルブミンもしくはその断片、またはこれらの分子もしくはその断片の類似体もしくはバリアントを指す。
【０１０２】
本開示のある特定の実施形態によれば、代替的な用語「ＦＰ」は、ＨＬＥＰを同定するために、具体的にはアルブミンをＨＬＥＰとして定義するために使用される。
【０１０３】
さらに好適な実施形態によれば、トランケート型ＶＷＦを含む本発明の組換えポリペプチドは、配列番号２として定義されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。
【０１０４】
具体的には、提案される本発明のポリペプチドは、ヒトアルブミンおよびヒトアルブミン断片の天然に存在する多型のバリアントを含むことがある。概して、アルブミンの断片またはバリアントは、少なくとも１０、好ましくは少なくとも４０、最も好ましくは７０超のアミノ酸長となる。
【０１０５】
本発明の好適な実施形態は、ＦｃＲｎ受容体との結合が亢進された本発明のポリペプチドのＨＬＥＰとして使用される、アルブミンバリアントを含む。そのようなアルブミンバリアントは、野生型アルブミンを有するトランケート型ＶＷＦ融合体と比較して、さらに長期のトランケート型ＶＷＦアルブミンバリアント融合タンパク質の血漿半減期をもたらすことがある。バリアントとしては、相互参照によりその開示を組み入れるＷＯ２０１４０７２４８１、ＷＯ２０１２１５０３１９、ＷＯ２０１３１３５８９６、ＷＯ２０１１１２４７１８、ＷＯ２０１１０５１４８９、およびＷＯ２０１２０５９４８６に記載されたものが挙げられる。本発明のポリペプチドのアルブミン部分は、ＨＡまたはその保存された改変物の少なくとも１つのサブドメインまたはドメインを含むことがある。
【０１０６】
ＨＬＥＰとしてのイムノグロブリン
さらに好適な実施形態では、ＨＬＥＰは、イムノグロブリン定常領域（Ｆｃ）である。イムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）の定常領域（Ｆｃ）は、治療タンパク質の半減期を増加させることが当技術分野に公知である（Ｄｕｍｏｎｔ  Ｊ  Ａら、２００６年、ＢｉｏＤｒｕｇｓ  ２０巻、１５１〜１６０頁）。重鎖のＩｇＧ定常領域は、３つのドメイン（ＣＨ１〜ＣＨ３）とヒンジ領域とからなる。イムノグロブリン配列は、任意の哺乳動物、またはサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４をそれぞれ由来とすることがある。抗原結合ドメインのないＩｇＧおよびＩｇＧ断片もまた、ＨＬＥＰとして使用されることがある。治療ポリペプチド部分は、ＩｇＧまたはＩｇＧ断片に好ましくは抗体のヒンジ領域またはペプチド性リンカーを介して接続され、それらはさらに切断できる場合がある。いくつかの特許および特許出願は、治療タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を亢進するための、治療タンパク質とイムノグロブリン定常領域との融合体を記載している。米国特許出願公開第２００４／００８７７７８号およびＷＯ２００５／００１０２５は、融合させていなかったなら急速にｉｎ  ｖｉｖｏで排除されていたであろう、Ｆｃドメインとの、またはペプチドの半減期を増加させる生物活性ペプチドを含むイムノグロブリン定常領域の少なくとも一部との、融合タンパク質を記載している。Ｆｃ−ＩＦＮ−β融合タンパク質は、生物活性の亢進、循環半減期の延長、およびさらに高い溶解性を達成することが記載された（ＷＯ２００６／０００４４８）。血清半減期が延長されかつｉｎ  ｖｉｖｏ効能が増加されたＦｃ−ＥＰＯタンパク質（ＷＯ２００５／０６３８０８）が開示されたとともに、Ｇ−ＣＳＦ（ＷＯ２００３／０７６５６７）、グルカゴン様ペプチド１（ＷＯ２００５／０００８９２）、凝血因子（ＷＯ２００４／１０１７４０）、およびインターロイキン１０（米国特許第６，４０３，０７７号）を含むＦｃ融合体が開示され、それらは全て半減期亢進性を有していた。
【０１０７】
この発明に従って使用することができる様々なＨＬＥＰが、ＷＯ２０１３／１２０９３９Ａ１に詳細に記載されている。
【０１０８】
本発明のポリペプチドのＮ−グリカンおよびシアリル化
本発明のポリペプチドは好ましくは、Ｎ−グリカンを含み、前記Ｎ−グリカンの少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％は、平均で少なくとも１つのシアル酸部分を含む。好適な実施形態では、前記Ｎ−グリカンの少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％は、平均で少なくとも１つのシアル酸部分を含む。発明者らは、高度にシアリル化されたＶＷＦ断片を含むポリペプチドが、さらに延長された半減期をそれ自体で有するだけでなく、共投与されたＦＶＩＩＩの半減期をさらに延長できることがあることを見出した。言い換えれば、本発明のポリペプチドの投与は、共投与されたＦＶＩＩＩの半減期の延長および／またはクリアランスの低減をもたらす。
【０１０９】
本発明のポリペプチドは、好ましくはＮ−グリカンを含み、糖タンパク質のＮ−グリカンのシアリル基の少なくとも５０％は、α−２，６連結型シアリル基である。一般に、末端シアリル基は、ガラクトース基にα−２，３連結またはα−２，６連結を介して付加することができる。典型的には，本発明のポリペプチドのＮ−グリカンは、α−２，３連結型シアリル基よりも多くのα−２，６連結型シアリル基を含む。好ましくは、Ｎ−グリカンのシアリル基の少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％は、α−２，６連結型シアリル基である。これらの実施形態は、例えば、哺乳類細胞においてヒトα−２，６−シアル酸転移酵素を共発現することによって得ることができる。
【０１１０】
そのような糖タンパク質を生産する適切な方法は、ＷＯ２０１６／１８８９０５Ａ１に記載されている。よって、シアリル化の増加されたＮ−グリカンを含む糖タンパク質を生産する方法は、そこに記載されており、この方法は、（ｉ）トランケート型フォン・ウィルブランド因子（ＶＷＦ）を含むポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を提供すること、および（ｉｉ）前記細胞を３６．０℃未満の温度で培養することを含む。さらに、トランケート型フォン・ウィルブランド因子（ＶＷＦ）を含む二量体の糖タンパク質を生産するか、または前記糖タンパク質の二量体化を増加させるための方法が記載されており、この方法は、（ｉ）上記糖タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸を含む細胞を提供すること、および（ｉｉ）前記細胞を３６．０℃未満の温度で培養することを含む。さらに、シアリル化の増加されたＮ−グリカンを含む糖タンパク質を生産する方法が、そこに記載されており、その方法は、（ｉ）トランケート型フォン・ウィルブランド因子（ＶＷＦ）を含むポリペプチドをコードする核酸とα−２，６−シアル酸転移酵素をコードする組換え核酸とを含む細胞を提供すること、および（ｉｉ）上記糖タンパク質およびα−２，６−シアル酸転移酵素の発現を可能にする条件下で細胞を培養することを含む。
【０１１１】
一実施形態では、本発明のポリペプチドのＮ−グリカンの少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％は、少なくとも１つのシアル酸基を有する。別の実施形態では、本発明のポリペプチドのＮ−グリカンの少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％は、少なくとも１つのシアル酸基を含む。
【０１１２】
別の実施形態では、本発明のポリペプチドのＮ−グリカンの１５％未満、１２％未満、１０％未満、または８％未満、または６％未満、または５％未満、または４％未満、または３％未満、または２％未満、またはさらに１％未満は、アシアロ−Ｎ−グリカンであり、すなわち、それらはシアル酸基を欠いたＮ−グリカンである。別の実施形態では、本発明のポリペプチドのＮ−グリカンの１５％未満、１２％未満、１０％未満、または８％未満、または６％未満、または５％未満、または４％未満、または３％未満、または２％未満、またはさらに１％未満は、アシアロ−Ｎ−グリカンであり、すなわち、それらはシアル酸基を持たない。
【０１１３】
本発明の他の実施形態は、トランケート型フォン・ウィルブランド因子（ＶＷＦ）を含み、ここでは、前記トランケート型ＶＷＦは、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）に結合可能であり、前記糖タンパク質は、Ｎ−グリカンを含み、前記Ｎ−グリカンの３５％未満、好ましくは３４％未満、好ましくは３３％未満、好ましくは３２％未満、好ましくは３１％未満、好ましくは３０％未満、好ましくは２９％未満、好ましくは２８％未満、好ましくは２７％未満、好ましくは２６％未満、好ましくは２５％未満、好ましくは２４％未満、好ましくは２３％未満、好ましくは２２％未満、好ましくは２１％未満、好ましくは２０％未満、好ましくは１９％未満、好ましくは１８％未満、好ましくは１７％未満、好ましくは１６％未満、好ましくは１５％未満、好ましくは１４％未満、好ましくは１３％未満、好ましくは１２％未満、好ましくは１１％未満、好ましくは１０％未満、好ましくは９％未満、好ましくは８％未満、好ましくは７％未満、好ましくは６％未満、および好ましくは５％未満は、平均で２つ以上の末端非シアリル化ガラクトース残基を含む。
【０１１４】
本発明のさらに他の実施形態は、トランケート型フォン・ウィルブランド因子（ＶＷＦ）を含み、ここでは、前記トランケート型ＶＷＦは、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）に結合可能であり、前記トランケート型ＶＷＦは、Ｎ−グリカンを含み、前記Ｎ−グリカンの６％未満、好ましくは５％未満、好ましくは４％未満、好ましくは３％未満、好ましくは２％未満、および好ましくは１％未満は、平均で３つ以上の末端非シアリル化ガラクトース残基を含む。
【０１１５】
上記に記載された実施形態は、互いに組み合わせることができる。上記に記述されたいかなるＮ−グリカンのパーセンテージまたはいかなるシアリル化度の標示も、平均のパーセンテージまたは程度として理解されるべきものであり、すなわち、それらは単分子ではなく分子の集団を指す。糖タンパク質の集団内で個別の糖タンパク質分子のグリコシル化またはシアリル化は、いくらかの不均一性を示すはずであることが明らかである。
【０１１６】
二量体
この発明のポリペプチドは、高い割合の二量体を有する。そのため、本発明のポリペプチドは、好ましくは二量体として存在する。一実施形態では、ポリペプチドの少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または約１００％が、二量体として存在する。別の実施形態では、本発明のポリペプチドの二量体：単量体の比は、少なくとも１．５、好ましくは少なくとも２、さらに好ましくは少なくとも２．５、または少なくとも３である。最も好ましくは、本発明の全てのポリペプチドは、二量体として存在する。さらに好適なのは、本発明のポリペプチドが多量体の形態を含まないことである。二量体は単量体と比較して第ＶＩＩＩ因子との親和性が向上していることから、二量体の使用が好ましい。本発明のポリペプチドの二量体の含有量、および二量体の単量体に対する比は、参照によって本明細書に組み入れるＷＯ２０１６／１８８９０７の実施例２に記載されるように決定することができる。
【０１１７】
一実施形態では、第ＶＩＩＩ因子との本発明のポリペプチドの親和性は、同じ第ＶＩＩＩ因子分子とのヒトの天然ＶＷＦのものよりも大きい。第ＶＩＩＩ因子の親和性は、ヒトの天然の第ＶＩＩＩ因子、または配列番号５の特徴を有する第ＶＩＩＩ因子分子を参照することがある。
【０１１８】
二量体の割合が高いこの発明のポリペプチドの調製物は、第ＶＩＩＩ因子との親和性が増加することが見出されている。そのような第ＶＩＩＩ因子との親和性の増加は、本発明のポリペプチドによる第ＶＩＩＩ因子の安定化の亢進をもたらす。二量体の割合の増加に代えてまたは組み合わせて、第ＶＩＩＩ因子との親和性を増加させる第ＶＩＩＩ因子結合ドメイン内の変異を有する本発明に従うポリペプチドもまた、本発明の好適な実施形態である。適した変異は本明細書に開示されている。
【０１１９】
ポリペプチドの調製
本発明のポリペプチドをコードする核酸は、当技術分野に公知の方法に従って調製することができる。ヒトの天然ＶＷＦ（配列番号３）のプレプロ体のｃＤＮＡ配列に基づき、本発明の上記のトランケート型ＶＷＦ構築物またはポリペプチドをコードする組換えＤＮＡを設計し生成することができる。
【０１２０】
宿主細胞によって分泌されるポリペプチドがヒトの天然ＶＷＦのアミノ酸１から７６３のプレプロ体を含まない場合であっても、ポリペプチドの細胞内前駆体をコードする核酸（例えばＤＮＡ）が、配列番号４のアミノ酸２３から７６３、または好ましくはアミノ酸１から７６３と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むことが好適である。最も好ましくは、ポリペプチドの細胞内前駆体をコードする核酸（例えばＤＮＡ）は、配列番号４のアミノ酸２３から７６３または配列番号４のアミノ酸１から７６３をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１２１】
正しい方位で発現プラスミド内に挿入されたオープンリーディングフレーム全体をＤＮＡが含有する構築物は、タンパク質発現のために使用されることがある。典型的な発現ベクターは、プラスミドを有する細胞中の挿入された核酸に対応する大量のｍＲＮＡの合成を指示するプロモーターを含有する。それらはまた、宿主生物内での自律複製を可能にする複製配列の起点と、合成されたｍＲＮＡが翻訳される効率を増加させる配列とを含有することがある。安定な長期ベクターは、例えばウイルス（例えば、エプスタイン・バーウイルスゲノム由来のＯｒｉＰ配列）の調節配列を用いることによって、自由に複製する実体として維持されることがある。ゲノムＤＮＡ内にベクターが組み込まれている細胞株も生産されることがあり、このようにして、遺伝子製品が継続的に生産される。
【０１２２】
典型的には、提供される細胞は、本発明のポリペプチドをコードする核酸を哺乳類宿主細胞内に導入することによって取得される。
【０１２３】
細胞培養の可能な、および糖タンパク質の発現の可能な任意の宿主細胞が、本発明に従って利用されることがある。ある特定の実施形態では、宿主細胞は哺乳類由来である。本発明に従って使用される場合がある哺乳類細胞の非限定的な例としては、ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫株（ＮＳ０／１、ＥＣＡＣＣ番号：８５１１０５０３）；ヒト網膜芽細胞［ＰＥＲ．Ｃ６（ＣｒｕＣｅｌｌ、ライデン、オランダ）］；ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）；ヒト胚性腎臓株（２９３細胞、または懸濁培養での増殖のためにサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．ＧｅｎＶｉｒｏｌ．、３６巻、５９頁、１９７７年）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞＋／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７巻、４２１６頁、１９８０年）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．、２３巻、２４３〜２５１頁、１９８０）；サル腎臓細胞（ＣＶ１、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１  ５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２、ＨＢ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ  ＮＹ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、３８３巻、４４〜６８頁、１９８２年）；ＭＲＣ５細胞；ＰＳ４細胞；ヒト羊膜細胞（ＣＡＰ）；およびヒト肝細胞癌株（ＨｅｐＧ２）が挙げられる。好ましくは、細胞株は、齧歯類細胞株であり、特にＣＨＯまたはＢＨＫなどのハムスター細胞株である。
【０１２４】
哺乳類宿主細胞内への目的の糖タンパク質の発現を達成するのに充分な核酸の導入に適した方法は、当技術分野に公知である。例えば、Ｇｅｔｈｉｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、２９３巻、６２０〜６２５頁、１９８１年；Ｍａｎｔｅｉら、Ｎａｔｕｒｅ、２８１巻、４０〜４６巻、１９７９年；Ｌｅｖｉｎｓｏｎら、ＥＰ１１７，０６０；およびＥＰ１１７，０５８を参照されたい。哺乳類細胞について、遺伝子材料を哺乳類細胞内に導入する一般的な方法としては、Ｇｒａｈａｍおよびｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｒｂ（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２巻、４５６〜４５７頁、１９７８年）のリン酸カルシウム沈殿法、またはＨａｗｌｅｙ−Ｎｅｌｓｏｎ（Ｆｏｃｕｓ、１５巻、７３頁、１９９３年）のリポフェクタミン（商標）（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）法が挙げられる。哺乳類細胞宿主系の形質転換の一般的な態様は、Ａｘｅｌによって米国特許第４，３９９，２１６号に記載されている。遺伝子材料を哺乳類細胞内に導入するための様々な技法については、Ｋｅｏｗｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９８９年、Ｋｅｏｗｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８５巻、５２７〜５３７、１９９０年、およびＭａｎｓｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ、３３６巻、３４８〜３５２頁、１９８８年を参照されたい。
【０１２５】
細胞は、ポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養される。ポリペプチドは、当業者に公知の方法を用いて回収および精製することができる。
【０１２６】
凝固障害の治療
上記に記載されるトランケート型ＶＷＦを含む組換えポリペプチドは、ＦＶＩＩＩの免疫原性を低減するために使用され、その場合、組換えポリペプチドおよびＦＶＩＩＩタンパク質は、血液凝固障害を患う対象に共投与される。具体的には、血液凝固障害としては、血友病Ａが挙げられる。用語「血友病Ａ」は、機能性の凝固ＦＶＩＩＩの欠損を指し、この欠損は通常は遺伝性である。
【０１２７】
一実施形態では、血液凝固障害は、重度の血友病Ａであり、好ましくは、ＮＨＰ中の内因性のＦＶＩＩＩ活性レベルの１％を下回る内因性のＦＶＩＩＩ活性レベルを伴う。本発明の観点では、血液凝固障害は、好ましくは重度の血友病Ａである。
【０１２８】
別の実施形態では、血液凝固障害は、中等度の血友病Ａである。中等度の血友病Ａは、好ましくは、内因性ＦＶＩＩＩ活性レベルがＮＨＰ中の内因性ＦＶＩＩＩ活性レベルの約１％から約５％までであるという特徴を有する。典型的には、中等度の血友病Ａに罹った対象は、内因性のＦＶＩＩＩ活性レベルが血漿中で０．０１から０．０５ＩＵ／ｍＬである。
【０１２９】
別の実施形態では、血液凝固障害は、軽度の血友病Ａである。軽度の血友病Ａは、好ましくは、内因性のＦＶＩＩＩ活性レベルがＮＨＰ中の内因性のＦＶＩＩＩ活性レベルの約５％から約４０％までであるという特徴を有する。典型的には、軽度の血友病Ａに罹った対象は、内因性のＦＶＩＩＩ活性レベルが血漿中で０．０５から０．４ＩＵ／ｍＬである。
【０１３０】
血液凝固障害の治療は、任意の臨床ステージまたは症状にある任意の疾患の形態を有するものと既に診断された患者の治療；疾患の症状もしくは徴候の発生もしくは発展もしくは増悪もしくは悪化の遅延；ならびに／または疾患の重症度の予防および／もしくは低減を包含する。
【０１３１】
本発明のポリペプチドが投与される「対象」または「患者」は、好ましくはヒトである。ある態様では、ヒトとは小児患者である。他の態様では、ヒトとは成人患者である。
【０１３２】
ある特定の実施形態では、対象は、ＦＶＩＩＩに対する免疫反応を発生することが予想されるおよび／または発生するリスクを有する。
【０１３３】
ある特定の実施形態では、対象は、以前にＦＶＩＩＩを用いて治療されていない対象である。
【０１３４】
他の実施形態では、対象は、ＦＶＩＩＩを用いて前治療されている対象、例えば第１のＦＶＩＩＩ製品から第２の異なるＦＶＩＩＩ製品への治療の変更に付されている対象、具体的には寒冷沈降物および／もしくは新鮮凍結血漿を用いた治療から因子濃縮物を用いた治療への、または血漿由来因子濃縮物を用いた治療から組換え因子濃縮物への、または第１の製造業者のＦＶＩＩＩ濃縮物から別の製造業者のＦＶＩＩＩ濃縮物への変更に付されている対象である。治療の変更は、ある特定の実施形態に従うものであり、この実施形態はまた、ＦＶＩＩＩ濃縮物のみの投与から本発明の組換えポリペプチドとの併用でのＦＶＩＩＩの投与を含む治療への変更を包含する。
【０１３５】
具体的な実施形態では、対象は、ＦＶＩＩＩに対する免疫反応、具体的にはＦＶＩＩＩに対する阻害抗体という特徴を有する免疫反応を発生するリスクを有する。患者において、具体的には血友病Ａの患者において、ＦＶＩＩＩ投与後に阻害性の抗ＦＶＩＩＩ抗体を発達させる、いくつかのタイプのそのようなリスク因子が公知である。例えば、対象は、前記対象においてＦＶＩＩＩの内因性の産生を排除するかまたは実質的に排除するＦＶＩＩＩ遺伝子の逆位、大きな欠失、および／またはナンセンス変異という特徴を有する遺伝子型を示すことがある。そのため、ある特定のタイプのＦ８遺伝子変異は、遺伝的なリスク因子に関連することが同定されている。さらに遺伝的なリスク因子は、ＩＬ１０、ＴＮＦＡ、ＦＣＧＲ２Ａ、またはＣＴＬＡ４に多型を含む。
【０１３６】
ある特定の実施形態では、組換えポリペプチドをＦＶＩＩＩと共投与することは、例えば、上記に記載されるような血液凝固障害を患う対象が組換えポリペプチドとＦＶＩＩＩとの定期的な共投与を含む継続的な治療を受ける状況下では予防的である。
【０１３７】
他の実施形態では、共投与は、例えば、血液凝固障害を患う対象が急性出血のエピソードに遭うかまたは急性出血のエピソードに遭うリスクを有する環境下で、治療的であることがある。
【０１３８】
本発明のポリペプチドを含む組成物およびキット、ならびに本発明のポリペプチドおよびＦＶＩＩＩを含む組成物およびキットは、本明細書に記載されている。組成物は、典型的には、医薬的に許容可能な担体を含む滅菌された医薬組成物の一部として供給される。この組成物は、（それを患者に投与する所望の方法に応じて）任意の適した形態とすることができる。
【０１３９】
用語「第ＶＩＩＩ因子」および「ＦＶＩＩＩ」または「第ＶＩＩＩ因子タンパク質」は、本明細書では互換的に使用され、血漿由来ＦＶＩＩＩおよび組換えＦＶＩＩＩの両方を包含する。組換えＦＶＩＩＩは、限定なく、完全長ＦＶＩＩＩ、ならびに２本鎖Ｂドメイン欠失型またはトランケート型バリアント、ならびに単鎖Ｂ−ドメイン欠失型またはトランケート型バリアント、例えばＷＯ２００４／０６７５６６に記載されているもの、およびＢドメイン外の変異を含むがＦＶＩＩＩの生物活性を有する他のＦＶＩＩＩバリアントを包含する。好適な一実施形態によれば、ＦＶＩＩＩは、配列番号５のアミノ酸配列からなる単鎖の第ＶＩＩＩ因子である。
【０１４０】
本発明のポリペプチドは、種々の経路によって、例えば経口的に、経皮的に、皮下に、皮内に、鼻腔内に、静脈内に、腹腔内に、筋肉内に、舌下に、局所的にまたは局在的に、患者に投与することができる。任意の所与の症例における投与のための最も適した経路は、具体的なポリペプチド、対象、ならびに疾患の性質および重症度、ならびに対象の健康状態に応じたものとなる。好ましくは、本発明のポリペプチドは、静脈内または皮下に投与される。ポリペプチドおよびＦＶＩＩＩは、好ましくは共投与される。
【０１４１】
本発明のポリペプチドおよびＦＶＩＩＩを用いた治療の用量投与の総数および長さを決定することは、充分に当業者の能力の範囲内にある。投与される本発明のポリペプチドならびにＦＶＩＩＩの投薬量は、投与されるＦＶＩＩＩの濃度、治療される患者の内因性ＶＷＦの濃度、またはその両方に依存するものとなる。この出願の発明者らによって規定される比に基づく有効な投薬量は、投与される本発明のポリペプチドの分子量ならびにＦＶＩＩＩの分子量を考慮して、当業者によって決定することができる。血液凝固障害の重症度の程度もまた、投与される本発明のポリペプチドならびにＦＶＩＩＩの適切な投薬量を決定するために考慮されることがある。典型的なＦＶＩＩＩの投薬量は、約２０ＩＵ／ｋｇ体重から約１０００ＩＵ／ｋｇ体重まで、好ましくは約２０ＩＵ／ｋｇ体重から約５００ＩＵ／ｋｇ体重まで、さらに好適には約２０ＩＵ／ｋｇ体重から約４００ＩＵ／ｋｇ体重まで、さらに好適には約２０ＩＵ／ｋｇ体重から約３００ＩＵ／ｋｇ体重までに及ぶことがある。
【０１４２】
この発明に従って、本発明のポリペプチドを用いて治療されている患者は、血液凝固第ＶＩＩＩ因子を用いてさらに治療されるか、または少なくとも治療されてきている。本発明のポリペプチドおよびＦＶＩＩＩは、同時に、すなわち併せて、または逐次的な方式で、投与されることがある。代替的には、別々の方式での投与を実施することができる。本明細書の前記投与様式の全てが、用語「組合せ療法」および「共投与」に包含される。
【０１４３】
ある特定の実施形態によれば、本発明のポリペプチドおよびＦＶＩＩＩは、混合物として、すなわち同じ組成物内とするかもしくは２つの組成物の混合工程後とするかのどちらかで投与されることがあるか；または逐次的にもしくは別々に、すなわち別々の組成物として投与されることがある。
【０１４４】
組換えポリペプチドとＦＶＩＩＩタンパク質との共投与は、組換えポリペプチドおよびＦＶＩＩＩタンパク質を含む単一の組成物にて共に投与することによって達成される好適な一実施形態に従う。さらに好適な実施形態によれば、組換えポリペプチドとＦＶＩＩＩタンパク質との共投与は、単一組成物に配合された組換えポリペプチドとＦＶＩＩＩとを含む組合せ製品を提供することによって、または投与前に混合されるように準備された少なくとも２つの別々の製品のセットまたはキットを提供することによって達成され、その場合、第１の製品は組換えポリペプチドを含み、第２の製品はＦＶＩＩＩを含む。前記組合せ製品は、具体的には同時投与に適している。前記セットまたはキットは、具体的には同時投与または逐次投与に適している。
【０１４５】
ある特定の実施形態によれば、本発明のポリペプチドおよびＦＶＩＩＩは、別々に、すなわち別々の組成物として、かつ適切な場合には異なる用量投与スケジュールで、投与されることがある。好ましくは、本発明のポリペプチドおよびＦＶＩＩＩは、併用で投与されることがある。本発明のポリペプチドに用いる投与スケジュールは、ＦＶＩＩＩの投与スケジュールと同一であることも異なることもある。特に、この実施形態によれば、本発明のポリペプチドおよびＦＶＩＩＩの両方がｉｎ  ｖｉｖｏで少なくとも一過的に共存することが、投与様式よりも重要であることを認識することができる。併用で投与される限り、用量投与レジメンを同一にすることは、本発明のポリペプチドがＦＶＩＩＩの免疫原性を低減させるというベネフィットを有するためには決定的に重要ではない。ゆえに、ｉｎ  ｖｉｖｏでの共存が達成される限り、本発明のポリペプチドおよびＦＶＩＩＩの用量投与レジメンおよび／または投与経路については、投与を独立に提供することができる。この実施形態によれば、ＦＶＩＩＩが独立して、しかし好ましくは本発明のポリペプチドと併用で、提供または投与されることから、本発明のポリペプチドを含むがＦＶＩＩＩを少しも含まない組成物が特に適することがある。
【０１４６】
具体的には、組換えポリペプチドおよびＦＶＩＩＩタンパク質が、共投与の前に混合されるはずのものである別々の組成物または製品中に提供される場合に、混合物は、投与前に少なくともある割合の前記組換えポリペプチドを前記ＦＶＩＩＩに結合させるように、投与前に処理されることがある。例えば，混合物を、ある特定の時間インキュベーションすることができよう。そのようなインキュベーションは、１分弱または５分弱、大気温度または適切であれば昇温のどちらかで、しかし好ましくは４０℃を下回る温度で、実施することができよう。そのような急速なインキュベーション工程はまた、単一組成物に配合される組換えポリペプチドおよびＦＶＩＩＩを含む組合せ製品の復元の間、適切であることがある。
【０１４７】
使用される組成物中の第ＶＩＩＩ因子の濃度は、典型的には１０〜１０，０００ＩＵ／ｍＬの範囲にある。異なる実施形態では、本明細書に定義される本発明のＶＷＦポリペプチドに関する比についての要件が満たされる場合、本発明の組成物中のＦＶＩＩＩの濃度は、１０〜８，０００ＩＵ／ｍＬ、または１０〜５，０００ＩＵ／ｍＬ、または２０〜３，０００ＩＵ／ｍＬ、または５０〜１，５００ＩＵ／ｍＬ、または３，０００ＩＵ／ｍＬ、または２，５００ＩＵ／ｍＬ、または２，０００ＩＵ／ｍＬ、または１，５００ＩＵ／ｍＬ、または１，２００ＩＵ／ｍＬ、または１，０００ＩＵ／ｍＬ、または８００ＩＵ／ｍＬ、または７５０ＩＵ／ｍＬ、または６００ＩＵ／ｍＬ、または５００ＩＵ／ｍＬ、または４００ＩＵ／ｍＬ、または３００ＩＵ／ｍＬ、または２５０ＩＵ／ｍＬ、または２００ＩＵ／ｍＬ、または１５０ＩＵ／ｍＬ、または１２５ＩＵ／ｍＬ、または１００ＩＵ／ｍＬ、または６２．５ＩＵ／ｍＬ、または５０ＩＵ／ｍＬの範囲にある。
【０１４８】
「国際単位」または「ＩＵ」は、国際標準調製物に対し「ＩＵ」で較正された標品を用いて一段階凝血アッセイまたは発色基質ＦＶＩＩＩ活性アッセイなどのＦＶＩＩＩ活性アッセイにより測定された際の、ＦＶＩＩＩの血液凝固活性（能）の測定の単位である。一段階凝血アッセイ、例えばＮ  Ｌｅｅ、Ｍａｒｔｉｎ  Ｌら、Ａｎ  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｐｒｅｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｏｎ  Ｐｏｔｅｎｃｙ  Ａｓｓａｙｓ  ｏｆ  ＦＶＩＩＩ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｓ、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ．）３０巻、５１１  ５１９頁（１９８３年）に記載されたものなどが、当技術分野に公知である。一段階アッセイの原理：試験を活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）アッセイの改変バージョンとして実施する：血漿をリン脂質および表面活性化因子とインキュベーションすることで、内在的な凝固系の因子の活性化を生じる。カルシウムイオンの添加によって、凝固カスケードを誘発する。測定可能なフィブリン血餅の形成までの時間を決定する。アッセイは、第ＶＩＩＩ因子を欠損した血漿の存在下で実施する。この欠損血漿の凝固能は、供試される試料に含まれる凝固第ＶＩＩＩ因子によって回復される。凝固時間の短縮は、試料中に存在する第ＶＩＩＩ因子の量に比例する。凝固第ＶＩＩＩ因子の活性は、第ＶＩＩＩ因子の活性が国際単位で既知である標準調製物との直接的な比較によって定量される。
【０１４９】
別の標準的なアッセイは、発色基質アッセイである。発色基質アッセイは、商業的に購入される場合があり、例えばｃｏａｍａｔｉｃ  ＦＶＩＩＩテストキット（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ−Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ＳｐＡ  Ｖ．モンツァ３３８−２０１２８、ミラノ、イタリア）などがある。発色アッセイの原理：カルシウムおよびリン脂質の存在下、第Ｘ因子を第Ｉｘａ因子によって第Ｘａ因子に活性化する。補因子として第ＶＩＩＩａ因子によって、この反応を刺激する。測定される試料中のＦＶＩＩＩから、反応混合物中で少量のトロンビンによってＦＶＩＩＩａを形成する。最適濃度のＣａ２＋、リン脂質、および第ＩＸａ因子、ならびに過剰量の第Ｘ因子を使用すると、第Ｘ因子の活性化は、第ＶＩＩＩ因子の効能に比例する。活性化された第Ｘ因子は、発色基質Ｓ−２７６５から発色団ｐＮＡを放出する。そのため、４０５ｎｍで測定されるｐＮＡの放出は、形成されたＦｘａの量に比例し、ひいては試料の第ＶＩＩＩ因子の活性にも比例する。
【０１５０】
医薬組成物
本明細書に記載される方法において適した本発明のポリペプチドの治療製剤は、所望の純度のポリペプチドを、当技術分野で典型的に採用される任意選択の医薬的に許容可能な担体、賦形剤、または安定化剤（これらの全てが本明細書では「担体」と称される）、すなわち緩衝剤、安定化剤、保存剤、等張剤、非イオン性界面活性剤、抗酸化剤、および他の種々雑多な添加剤と混合することによって、凍結乾燥製剤または水溶液として保管用に調製することができる。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、（Ｏｓｏｌ編、１９８０年）を参照されたい、そのような添加剤は、採用される投薬量および濃度で、レシピエントに対し非毒性でなければならない。
【０１５１】
緩衝剤は、ほぼ生理的条件にある範囲にｐＨを維持するのに役立つ。それらは、約２ｍＭから約５０ｍＭに及ぶ濃度を呈することができる。適した緩衝剤としては、有機酸と無機酸の両方、およびそれらの塩、例えばクエン酸塩緩衝液（例えば、クエン酸一ナトリウム−クエン酸二ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸三ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸一ナトリウム混合物など）、コハク酸塩緩衝液（例えば、コハク酸−コハク酸一ナトリウム混合物、コハク酸−水酸化ナトリウム混合物、コハク酸−コハク酸二ナトリウム混合物など）、酒石酸塩緩衝液（例えば、酒石酸−酒石酸ナトリウム混合物、酒石酸−酒石酸カリウム混合物、酒石酸−水酸化ナトリウム混合物など）、フマル酸緩衝液（例えば、フマル酸−フマル酸一ナトリウム混合物、フマル酸−フマル酸二ナトリウム混合物、フマル酸一ナトリウム−フマル酸二ナトリウム混合物など）、グルコン酸塩緩衝液（例えば、グルコン酸−グルコン酸ナトリウム混合物、グルコン酸−水酸化ナトリウム混合物、グルコン酸−グルコン酸カリウム混合物など）、シュウ酸塩緩衝液（例えば、シュウ酸−シュウ酸ナトリウム混合物、シュウ酸−水酸化ナトリウム混合物、シュウ酸−シュウ酸カリウム混合物など）、乳酸塩緩衝液（例えば、乳酸−乳酸ナトリウム混合物、乳酸−水酸化ナトリウム混合物、乳酸−乳酸カリウム混合物など）、および酢酸塩緩衝液（例えば、酢酸−酢酸ナトリウム混合物、酢酸−水酸化ナトリウム混合物など）などが挙げられる。さらに、リン酸塩緩衝液、ヒスチジン緩衝液、およびトリメチルアミン塩、例えばトリスを使用することができる。
【０１５２】
保存剤は、添加して、微生物の増殖を遅延させることができ、０．２％〜１％（ｗ／ｖ）に及ぶ量で添加することができる。適した保存剤としては、フェノール、ベンジルアルコール、メタ−クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ハロゲン化ベンザルコニウム（例えば、塩化物、臭化物、およびヨウ化物）、塩化ヘキサメトニウム、ならびにメチルパラベンまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レソルシノール、シクロヘキサノール、ならびに３−ペンタノールなどが挙げられる。「安定化剤」として時には知られる等張剤は、添加して、液体組成物の等張性を確保することができ、多価の糖アルコール、好ましくは三価以上の糖アルコール、例えばグリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、およびマンニトールが挙げられる。安定化剤とは、機能的には治療剤を可溶化するかまたは変性もしくは容器壁への接着を防止するのに役立つ増量剤から添加剤までに及ぶ、広範なカテゴリーの賦形剤を指す。典型的な安定化剤は、多価の糖アルコール（上記に挙げたもの）；アミノ酸、例えばアルギニン、リジン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、Ｌ−ロイシン、２−フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニンなど、有機糖または糖アルコール、例えばラクトース、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイニシトール、ガラクチトール、グリセロールなどであって、イノシトールなどのシクリトールを含む；ポリエチレングリコール；アミノ酸ポリマー；含硫還元剤、例えば尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α−モノチオグリセロール、およびチオ硫酸ナトリウムなど；低分子量ポリペプチド（例えば１０残基以下のペプチド）；タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、またはイムノグロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；単糖類、例えばキシロース、マンノース、フルクトース、グルコース；二糖類、例えばラクトース、マルトース、スクロース、および三糖類、例えばラフィノース；ならびに多糖類、例えばデキストランとすることができる。安定化剤は、活性タンパク質の重量の０．１から１０，０００重量部の範囲で存在することができる。
【０１５３】
非イオン性の表面活性剤または界面活性剤（「湿潤剤」としても知られる）は、添加して、治療剤を可溶化するとともに、攪拌により誘導される凝集から治療タンパク質を保護するのに役立てることができ、それによって、タンパク質の変性を引き起こさずに応力の加わる表面を剪断変形させるように製剤を曝露することも可能になる。適した非イオン性表面活性剤としては、ポリソルベート類（２０、８０など）、ポリオキサマー類（１８４、１８８など）、プルロニックポリオール類、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル類［ＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０など）が挙げられる。非イオン性表面活性剤は、約０．０５ｍｇ／ｍＬから約１．０ｍｇ／ｍＬの範囲で、または約０．０７ｍｇ／ｍＬから約０．２ｍｇ／ｍＬの範囲で、存在することができる。
【０１５４】
追加の種々雑多な賦形剤としては、増量剤（例えばデンプン）、キレート剤（例えばＥＤＴＡ）、抗酸化剤（例えばアスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ）および共溶媒が挙げられる。
【０１５５】
本明細書における製剤はまた、本発明のポリペプチドに加えて、第２の治療剤を含有することができる。適した第２の治療剤の例を下記に示す。
【０１５６】
用量投与スケジュールは、１か月に１回から毎日まで、数多くの臨床学的要因に応じて変えることができ、そのような要因としては、疾患のタイプ、疾患の重症度、および本発明のポリペプチドに対する患者の感度が挙げられる。特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、週２回、５日毎、週１回、１０日毎、２週間毎、３週間毎、４週間毎、もしくは月１回、または前述の値のうち任意の２つの間の任意の範囲、例えば４週間毎から毎月、１０日毎から２週間毎、もしくは週に２回から３回などで投与される。
【０１５７】
投与される本発明のポリペプチドの投薬量は、具体的なポリペプチド、対象、ならびに疾患の性質および重症度、対象の健康状態、治療レジメン（例えば、第２の治療剤を使用するか否か）、ならびに選択された投与経路に従って変わるはずである；そして、適切な投薬量は、当業者が容易に決定することができる。
【０１５８】
本発明のポリペプチドの個々の投薬の最適な量および間隔は、治療されている状態の性質および程度、投与の形態、経路、および部位、ならびに治療されている具体的な対象の年齢および状態によって決定されるはずであること、ならびに使用される適切な投薬量を医師が最終的に決定するはずであることを、当業者は認識されよう。この投薬は、適切な頻度で繰り返すことができる。副作用が発生した場合、通常の臨床診療に従って、投薬の量および／または頻度を変更または低減することができる。
【０１５９】
好ましくは、医薬組成物は、血管外で投与されるように、好ましくは皮下に投与されるように、製剤化される。
【０１６０】
ある特定の実施形態によれば、医薬組成物は、活性成分として、本発明のポリペプチドならびにＦＶＩＩＩのどちらかもしくは両方を含むか、または代替的には、本明細書に開示される投与の様式に応じて、ＦＶＩＩＩを含まず本発明のポリペプチドのみを含む。
【０１６１】
本明細書に記載された本発明は特に記載されたもの以外の変形および改変が可能であることを、当業者は認識するはずである。本発明は趣旨および範囲内にある全てのそのような変形および改変を含むことが認識されよう。本発明はまた、この明細書に個々にまたはまとめて言及または標示された構成、組成物、工程、および化合物の全て、ならびに前記の構成、組成物、工程、および化合物のうち任意の２つ以上のいずれかおよび全ての組合せを含む。
【０１６２】
配列表に示されるヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、表１にまとめる。
【０１６３】
【表１】
2020530436.tif 000002
【０１６４】
本発明のある特定の実施形態を、以下の実施例を参照して記載するが、これらの実施例は、説明のみを目的とし、先に本明細書に記載された一般概念の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例１】
【０１６５】
血漿由来ＶＷＦおよび組換えトランケート型ＶＷＦを用いて処理された際の単球由来樹状細胞による第ＶＩＩＩ因子取り込みのレベル
【０１６６】
１．１  定義／略称
【表２】
2020530436.tif 000003
【０１６７】
１．２  材料および方法
ＢＩＯＳＴＡＴＥ（ＣＳＬ  Ｂｅｈｒｉｎｇから得られるヒト血漿由来（ｐｄ）ＶＷＦ）
ＣＳＬ６２６［トランケート型ＶＷＦ（７６４〜１２４２）−アルブミン融合体、二量体］
ＣＳＬ６５０（ＣＳＬ  Ｂｅｈｒｉｎｇから得られる組換えＶＷＦ−アルブミン融合体）
ＣＳＬ６２７（ＣＳＬ  Ｂｅｈｒｉｎｇから得られる組換え単鎖ＦＶＩＩＩ）
アドベイト（登録商標）（Ｓｈｉｒｅから得られる組換えＦＶＩＩＩ）
ヘリキセート（登録商標）（ＣＳＬ  Ｂｅｈｒｉｎｇから得られる組換えＦＶＩＩＩ）
リファクト（登録商標）（Ｐｆｉｚｅｒから得られる組換えＦＶＩＩＩ）
【０１６８】
本明細書にトランケート型ＶＷＦ−アルブミン融合体ＣＳＬ６２６としても特定されるとともに、Ｄ’Ｄ３−ＦＰ二量体がＦＶＩＩＩと結合するという特徴を有するＤ’Ｄ３アルブミン融合タンパク質（Ｄ’Ｄ３−ＦＰ）の生成は、本明細書に参照によって組み入れるＷＯ２０１６／１８８９０７Ａ１に開示されている。コード配列Ｄ’Ｄ３−ＦＰのヌクレオチド配列は、配列番号１として示され、成熟型Ｄ’Ｄ３−ＦＰのアミノ酸配列は、配列番号２として示されている。
【０１６９】
組換えＢドメイン欠失型単鎖ＦＶＩＩＩ（ＣＳＬ６２７）、すなわちｒＶＩＩＩ−ＳｉｎｇｌｅＣｈａｉｎは、配列番号５に定義されるようなアミノ酸配列を有する。
【０１７０】
ＣＳＬ６５０（組換えＶＷＦ−アルブミン融合体）は、ＷＯ２００９／１５６１３７Ａ１に記載されるようなアミノ酸配列を有する。
【０１７１】
１．３  単球由来樹状細胞におけるＦＶＩＩＩの取り込み
全バフィーコートを５０ｍＬファルコンチューブ内にデカントし、１：２に滅菌ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ＃Ｄ８５３７、血液２５ｍＬ／ＰＢＳ２５ｍＬ）で希釈した。血液を混合し、Ｆｉｃｏｌｌ  １５ｍＬを含有するＦｉｃｏｌｌ勾配（ＧＥ、＃１７−１４４０−０２）上に重層した。勾配を、１０００×ｇ［アクセル（５）；ブレーキ（１）］で２０分間の遠心分離によって分離した。ＰＢＭＣを含有する中央の層を採集し、新しい５０ｍＬ採集チューブ内に移した。
【０１７２】
次いで、細胞を遠心分離（１４００ｒｐｍ）によりペレットにして、滅菌ＰＢＳ  ５０ｍＬで２回洗浄し、毎回上清をデカントした。次いで、ペレットを塩化アンモニウム（１０ｍＬ）に再懸濁し、室温（ＲＴ）で１０分間インキュベーションして残りのＲＢＣを溶解した。溶解後、細胞にＰＢＳ  ４０ｍＬを足して、スピンダウンして残りのＰＢＭＣをペレットにした。細胞をＰＢＳ  ５０ｍＬで１回洗浄し、スピンダウン（１２００ｒｐｍ）して最終的な細胞ペレットを採集した。細胞ペレットをＰＢＳ  ２０ｍＬ中に再懸濁し、血球計算器を用いて細胞を計数して単球精製用に調製した。
【０１７３】
２×１０８個のＰＢＭＣを採取し、遠心分離（１２００ｒｐｍ、１０分、４℃）によってペレットにした。細胞ペレットを精製緩衝液［ＰＢＳ  ｐＨ７．２、０．５％ＢＳＡ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ＃１３０−０９１−３７６）、２ｍＭ  ＥＤＴＡ］１６００μＬ中に再懸濁した。次いで、ＣＤ１４マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ＃１３０−０５０−２０１）を細胞（４００μＬ）に添加し、４℃で１５分間インキュベーションした。インキュベーション後、細胞を氷冷精製緩衝液（２０ｍＬ）で洗浄し、遠心分離（１２００ｒｐｍ、１０分、４℃）により再度１回ペレットにした。上清を完全に吸引し、氷冷精製緩衝液（５００μＬ）を用いて再懸濁した。
【０１７４】
細胞を７０μｍセルストレーナーに通して、塊状の細胞を除去し、次いで、平衡化したＭＡＣＳ  ＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ＃１３０−０４１−４０１）上に直接添加した。カラムを精製緩衝液３ｍＬで３回洗浄し、結合しなかった細胞を除去した。次いで、ＭＡＣＳカラムを磁石から取り出し、精製緩衝液５ｍＬをカラムに添加した。シリンジを通じて圧力をかけることにより細胞をデカントし、遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分）によってペレットにした。
【０１７５】
細胞を完全増殖培地［１０％ＦＢＳ（ＧＥ＃ＳＶ３０１７６．０３）、５０Ｕ／ｍＬペニシリンおよび５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ、Ｇｉｂｃｏ＃１５０７０−６３）、２ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ＃３５０５０）］を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｓｉｇｍａ＃Ｒ０８８３）に再懸濁し、計数した。細胞をペトリ皿（１×１０７細胞個／皿）に播き、サイトカインを細胞に添加して分化を誘導した（５００ＩＵ  ＩＬ−４／１０６細胞個、１０００ＩＵ  ＧＭ−ＣＳＦ／１０６細胞個、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、２０４−ＩＬ−０１０／ＣＦ／２１５−ＧＭ−０５０／ＣＦ）。プレートを３７℃、５％ＣＯ２でインキュベーションしておいた。３日目に、細胞に新鮮完全培地５ｍＬ中サイトカイン（５００ＩＵ  ＩＬ−４／１０６細胞個、１０００ＩＵ  ＧＭ−ＣＳＦ／１０６細胞個）を足した。
【０１７６】
５日後、培養した細胞を各プレートから取り出し、遠心分離（１２００ｒｐｍ、１０分）によりペレットにした。次いで、細胞を予め加温したＸＶＩＶＯ培地（ＬＯＮＺＡ＃０４−７４３Ｑ）で１回洗浄し、ＸＶＩＶＯ培地（２ｍＬ）に再懸濁して計数した。細胞を、フローサイトメトリーによって、ＣＤ１４（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＣＤ１４−Ｖ４５０、＃５６０３４９）、ＣＤ４０（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＤ４０−ＰＥ、＃５５５５８９）、ＣＤ８６（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＤ８６−ＰＥ、＃５５５６５８）、およびＨＬＡ−ＤＲ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＨＬＡ−ＤＲ−ＰＥ、＃３４７４０１）の発現について特性解析した。次いで、細胞を９６ウェル丸底プレートに播種した（２．５×１０５細胞個／ウェル）。３７℃での解析に用いるために調製した細胞は、インキュベーター内（３７℃、５％ＣＯ２）に置き、４℃でのベースライン対照として用いるプレートは、氷上に置いた。
【０１７７】
ＶＷＦタンパク質を体積５０μＬに希釈し、ウェルに添加した。単量体サブユニットに基づきｐｄＶＷＦおよびＣＳＬ６５０について終濃度２２２２ｎＭ、１１１１ｎＭ、５５５．５ｎＭ、および０ｎＭを、ならびに単量体サブユニットに基づきＣＳＬ６２６について４４４４ｎＭ、２２２２ｎＭ、および１１１１ｎＭを達成するように希釈を行った。１０分間のＶＷＦタンパク質のプレインキュベーション後、ＦＶＩＩＩタンパク質も希釈し（最終的に８８．８８ｎＭ）、対応の各ウェルに添加した。プレートを２時間インキュベーションしておき、第ＶＩＩＩ因子を取り込ませた。
【０１７８】
インキュベーション後、プレートをスピンして細胞をペレットとし（１２００ｒｐｍ、５分）、上清を捨てた。ウェルをＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ、ＧＥ＃ＳＶ３０１７６．０３）で２回洗浄し、次いで、Ｉｎｔｒａｐｅｐ試薬２（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、＃ＩＭ２３８９）１００μＬに再懸濁して細胞を固定した。細胞をＲＴで１５分間固定しておき、次いでスピンダウンして（１２００ｒｐｍ、５分）、上清を捨てた。細胞をＦＡＣＳ緩衝液２００μＬで洗浄し、Ｉｎｔｒａｐｅｐ試薬２（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、＃ＩＭ２３８９）１００μＬに再懸濁して細胞を透過処理した。細胞をＲＴで５分間インキュベーションしておき、次いで、１０μｇ／ｍＬの抗第ＶＩＩＩ因子Ａ２抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ＃ＭＡ１−２７３８９）を用いて１５分間処理した。次いで、細胞をペレットとし、ＦＡＣＳ洗浄により洗浄し、二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ＃１１５−１１５−１６４、抗マウスＩｇＧ、５０μＬ、１：１００希釈）を用いてＲＴで１５分間、暗所で染色した。インキュベーション後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、フローサイトメトリーによって解析した。
【０１７９】
１．４  データ解析
Ｆｌｏｗｊｏを用いて、ＦＳＣおよびＳＳＣにより、単一のＭＤＤＣについて細胞をゲートし、第ＶＩＩＩ因子またはＶＷＦのどちらによっても治療されていないＭＤＤＣにベースラインクワドラント（ｑｕａｄｒａｎｔ）を設定した。ベースラインクワドラントを超える陽性の移動をパーセンテージとして表し、同等の治療についての４℃での取り込みを差し引くことによって最終的な値を決定した。ｐｒｉｓｍを用いて、移動の最終パーセンテージを、対応のＶＷＦ取り込みの比に対してプロットした。
【０１８０】
１．５  結果
ＭＤＤＣの表面マーカーによる表現型解析は、ＣＤ１４について陰性染色を、ＣＤ４０、ＨＬＡ−ＤＲ、およびＣＤ８６について陽性染色を示した（図１）。
【０１８１】
図２および図３は、ＭＤＤＣにおける第ＶＩＩＩ因子取り込みのパーセンテージを示す。３種の商業的に入手可能なＦＶＩＩＩタンパク質［アドベイト（登録商標）、ヘリキセート（登録商標）、およびリファクト（登録商標）］ならびにｒｅｃ  ｓｃＦＶＩＩＩ（ＣＳＬ６２７）を、ｐｄＶＷＦ製品Ｂｉｏｓｔａｔｅ、トランケート型ＶＷＦ−アルブミン融合体ＣＳＬ６２６、および完全長ｒｅｃＶＷＦ−アルブミン融合体ＣＳＬ６５０の存在下で、取り込みについて評価した。各種のモル比ＶＷＦ：ＦＶＩＩＩを適用した。ＶＷＦ濃度は、各種ＶＷＦ製品についての単量体サブユニットを指す。ＶＷＦの非存在下（モル比ＶＷＦ：ＦＶＩＩＩ＝０）、最大２５倍モル過剰のｐｄＶＷＦ製品Ｂｉｏｓｔａｔｅおよび完全長ｒｅｃＶＷＦ−アルブミン融合体ＣＳＬ６５０、ならびに最大５０倍モル過剰のトランケート型ＶＷＦ−アルブミン融合体ＣＳＬ６２６で、第ＶＩＩＩ因子取り込みを評価した。
【０１８２】
図２は、（ａ）ｐｄＶＷＦ製品Ｂｉｏｓｔａｔｅ、（ｂ）トランケート型ＶＷＦ−アルブミン融合体ＣＳＬ６２６、および（ｃ）完全長ｒｅｃＶＷＦ−アルブミン融合体ＣＳＬ６５０について、３つの個別のパネルで結果を示す。３種の市販のＦＶＩＩＩタンパク質［アドベイト（登録商標）、ヘリキセート（登録商標）、およびリファクト（登録商標）］およびｒｅｃ  ｓｃＦＶＩＩＩ（ＣＳＬ６２７）の結果を、各パネルに別々にプロットしている。図３は、異なる配置での図２のデータを表す。（ａ）アドベイト（登録商標）、（ｂ）ＣＳＬ６２７、（ｃ）ヘリキセート（登録商標）、および（ｄ）リファクト（登録商標）についての４つの個別のパネルは、モル比ＶＷＦ：ＦＶＩＩＩの増加の存在下でのＭＤＤＣにおけるＦＶＩＩＩ取り込みの結果を示す。各パネルでは、ｐｄＶＷＦ製品Ｂｉｏｓｔａｔｅ、トランケート型ＶＷＦ−アルブミン融合体ＣＳＬ６２６、および完全長ｒｅｃＶＷＦ−アルブミン融合体ＣＳＬ６５０の結果を別々にプロットしている。
【０１８３】
ｐｄＶＷＦ製品Ｂｉｏｓｔａｔｅ、トランケート型ＶＷＦ−アルブミン融合体ＣＳＬ６２６、ならびに完全長ｒｅｃＶＷＦ−アルブミン融合体ＣＳＬ６５０を用いてモル比ＶＷＦ：ＦＶＩＩＩが増加されると、全ての第ＶＩＩＩ因子タンパク質について、ＭＤＤＣにおけるＦＶＩＩＩ取り込みが低減された。
【０１８４】
図４は、図２に示したデータに基づく、ＭＤＤＣにおける第ＶＩＩＩ因子取り込みの正規化されたパーセンテージを示す。（ａ）ｐｄＶＷＦ製品Ｂｉｏｓｔａｔｅ、（ｂ）トランケート型ＶＷＦ−アルブミン融合体ＣＳＬ６２６、および（ｃ）完全長ｒｅｃＶＷＦ−アルブミン融合体ＣＳＬ６５０の３つの個別のパネルは、３種の市販のＦＶＩＩＩタンパク質［アドベイト（登録商標）、ヘリキセート（登録商標）、およびリファクト（登録商標）］ならびにｒｅｃ  ｓｃＦＶＩＩＩ（ＣＳＬ６２７）の結果を別々に示す。データをモルＶＷＦ濃度に対してプロットした。ＶＷＦ濃度は、各種ＶＷＦ製品についての単量体サブユニットを指す。データをそれぞれの個別の実験について正規化した。実験は、３連で（ａ）を、または４連で（ｂ）および（ｃ）をそれぞれ行った。ＶＷＦ（０ｎＭ）の非存在下での読取りを１００％として定義し、最も高いＶＷＦ濃度（２２２２ｎＭまたは４４４４ｎＭ）の存在下での読取りをそれぞれの個別の実験についての０％で定義した。正規化後に負の値ならびに外れ値を除外した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて曲線をフィッティングし［ｌｏｇ（阻害物質）ｖｓ．応答−可変勾配、４パラメーター、最小二乗フィット］、ＩＣ５０値を算出した。これらのフィッティング曲線に基づき、それぞれのＶＷＦ製品についてのＩＣ５０値を算出しており、表２にまとめている。
【０１８５】
【表３】
2020530436.tif 000004
【０１８６】
表２は、ＭＤＤＣにおける第ＶＩＩＩ因子取り込みの阻害についての算出したＩＣ５０値を示す。アドベイト（登録商標），ＣＳＬ６２７，ヘリキセート（登録商標）、およびリファクト（登録商標）の各ＦＶＩＩＩ製品についてのＩＣ５０値を、３種の異なるＶＷＦタンパク質ｐｄＶＷＦ／Ｂｉｏｓｔａｔｅ、ＣＳＬ６２６、およびＣＳＬ６５０について別々に算出した（図４）。全てのＦＶＩＩＩについてのＩＣ５０の平均値および標準偏差も、３種の各種ＶＷＦタンパク質について別々に算出した。トランケート型ＶＷＦ−アルブミン融合体ＣＳＬ６２６の存在下で供試した全てのＦＶＩＩＩ製品についてのＩＣ５０は、ｐｄＶＷＦ製品Ｂｉｏｓｔａｔｅおよび完全長ｒｅｃＶＷＦ−アルブミン融合体ＣＳＬ６５０と比較して中等度に増加されたに過ぎなかった。
【０１８７】
図２、図３、および表２に示した結果は、ｐｄＶＷＦと、完全長ｒｅｃＶＷＦとが、しかし驚くべきことにトランケート型ＶＷＦアルブミン融合体ＣＳＬ６２６までもが、各種ＦＶＩＩＩ製品の単球樹状細胞内へのエンドサイトーシスを、同様の比率で阻害できることを実証している。ＶＷＦ濃度の増加は、完全長とＢＤＤの両方のＦＶＩＩＩ製品について、ＦＶＩＩＩ取り込みの低減が増加していることを示す。
【０１８８】
特に、供試したトランケート型ＶＷＦアルブミン融合体ＣＳＬ６２６についてのＩＣ５０値は、供試した完全長ＶＷＦ製品のＩＣ５０値に少なくとも同様に匹敵するものであった。
【０１８９】
単球樹状細胞などの抗原提示細胞によるＦＶＩＩＩの取り込みは、投与されたＦＶＩＩＩに対する免疫反応の第１の段階であることから、この結果は、二量体として存在するトランケート型ＶＷＦ−アルブミン融合体ＣＳＬ６２６の投与によりＦＶＩＩＩ免疫が低減されることを実証している。完全長ＶＷＦ製品と比較した際のＣＳＬ６２６により媒介される細胞性取り込みの定量的な低減は、驚くほど大きいものである。
【実施例２】
【０１９０】
血漿由来ＶＷＦおよび組換えトランケート型ＶＷＦを用いて処理された際の単球由来樹状細胞による第ＶＩＩＩ因子抗原提示
【０１９１】
２．１  定義／略称
【表４】
2020530436.tif 000005
【０１９２】
２．２  材料および方法
血漿由来のフォン・ウィルブランド因子（ｐｄＶＷＦ）：ｐｄＶＷＦの供給源はヒト血漿である。ｐｄＶＷＦに結合していた残留の血漿由来ＦＶＩＩＩを、濃縮中間体から、４００ｎＭカルシウムを含有するＨＥＰＥＳ緩衝液を用いたサイズ排除クロマトグラフィー工程（ＨｉＰｒｅｐ  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ５００、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を経て分離した［Ｊｏｓｉｃａ  Ｄ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（１９９８年）；７９６巻２号、２８９〜２９８頁］。
【０１９３】
ＣＳＬ６２７（ＣＳＬ  Ｂｅｈｒｉｎｇから得られる組換え単鎖ＦＶＩＩＩ）：は、配列番号５に定義されるようなアミノ酸配列を有する組換えＢドメイン欠失型単鎖ＦＶＩＩＩ、すなわちｒＶＩＩＩ−ＳｉｎｇｌｅＣｈａｉｎである。ＣＳＬ６２６［トランケート型ＶＷＦ（７６４〜１２４２）−アルブミン融合体、二量体］を、実施例１下に記載されたように使用した。ＦＶＩＩＩとの結合親和性がさらに増加したＣＳＬ６２６のバリアントを使用したが、このバリアントは、配列番号４の配列付番を参照する場合に、ＶＷＦ野生型アミノ酸配列と比較してアミノ酸置換を有し、その置換はＳ７６４Ｅ／Ｓ７６６Ｙ／Ｖ１０８３Ａであった。このＤ’Ｄ３−ＦＰバリアントはまた、実施例２では、ＥＹＡ−ＦＰとも称する。
【０１９４】
２．３  ＰｒｏＰｒｅｓｅｎｔ抗原提示アッセイ
ＰｒｏＰｒｅｓｅｎｔアッセイをＰｒｏＩｍｍｕｎｅ（オックスフォード、イギリス）によって実施して、抗原の取り込みおよびプロセシングの後に単球由来樹状細胞（ＭＯＤＣ）でＨＬＡ分子と結合したユニークなＣＳＬ６２７ペプチドと、ｐｄＶＷＦペプチド、ＣＳＬ６２６ペプチド、またはＥＹＡ−ＦＰペプチドとを同定した。被験抗原（ＣＳＬ６２７、ｐｄＶＷＦ、ＣＳＬ６２６、およびＥＹＡ−ＦＰ）は、本発明者らが調製した。
【０１９５】
手短に述べれば、１２人から２４人のＨＬＡ型判定済みの健康な非血縁ドナー（表３〜表５）から得たＰＢＭＣを、全血から密度勾配遠心分離によって精製した。未成熟な単球由来ＤＣ（ＭＯＤＣ）をｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成し、１４６．４ｎＭのＣＳＬ６２７のみの存在下で、または１．９６６７μＭのｐｄＶＷＦ、ＣＳＬ６２６、またはＥＹＡ−ＦＰを用いて予め複合体形成された１４６．４ｎＭのＣＳＬ６２７（単量体の含有量に基づきモル濃度を算出）の存在下で、成熟させた。ＭＯＤＣの成熟を、フローサイトメトリーにより、ＣＤ２０９、ＣＤ８６、およびＨＬＡ−ＤＲの上方制御を介してモニタリングした。ＭＯＤＣを収集して洗浄した後、界面活性剤を含有する緩衝溶液中で溶解した。ＨＬＡ分子を特異的な免疫親和性工程で回収した。次いで、精製したＨＬＡ複合体からペプチドを溶出し、さらに解析するために処理した。続いて、ペプチド試料を高分解能シークエンシング質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によって解析したので、図５を参照されたい。次いで、結果として得られたデータは、取り込ませた被験抗原の配列ならびに６種の内因性の対照タンパク質、すなわちリソソーム関連膜タンパク質１（ＬＡＭＰ−１）、リソソーム関連膜タンパク質３（ＬＡＭＰ−３）、トランスフェリン受容体（ＴＦＲＣ）、低親和性ＩｇＥ受容体およびＦｃガンマ結合受容体（ＦｃＥＲ２／ＦｃＧＲ２）、アポリポタンパク質Ｂ（ＡｐｏＢ）、ならびにインテグリンα−Ｍ（ＩＴＧＡＭ）に由来するペプチドと併せて、Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅデータベースを参照し、配列解析ソフトウェアを用いて集約し解析した。ＭＨＣクラスＩＩ関連インバリアント鎖ペプチド（ＣＬＩＰ）は、下方制御され、完全に成熟したＭＯＤＣには検出されないことがある。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるペプチド配列の同定は、スコアリングアルゴリズムおよび統計的有意性の決定に基づくものとした。ペプチドの正体の可能性は、それらの期待値で記載されている［Ｘｕｅ  Ｌ、Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１６年）；１８３巻１号：１０２〜１３頁、Ｌｅｏｎｅ  ＤＡ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０１７年）、１９９巻２号、５３１〜５４６頁、Ｌａｍｂｅｒｔｈら、Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．、９巻、ｅａａｇ１２８６（２０１７年）］。図５は、ＰｒｏＰｒｅｓｅｎｔ（登録商標）ＭＨＣクラスＩＩ抗原提示アッセイのＰｒｏＩｍｍｕｎｅのワークフローを示す：（Ａ）ＨＬＡ型判定済みのＰＢＭＣの単球を単離、（Ｂ）単球の培養および未成熟な樹状細胞の生成、（Ｃ）抗原のローディング（ＣＳＬ６２７、ｐｄＶＷＦ）、細胞内でのプロセシング、樹状細胞の成熟、および抗原提示、（Ｄ）樹状細胞の溶解、（Ｅ）免疫親和性工程によるペプチド／ＭＨＣクラスＩＩ複合体の単離およびペプチドの溶出、（Ｆ）ＬＣ−ＭＳ２によるペプチドのシークエンシング（ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ  ＰｒｏＰｒｅｓｅｎｔ（登録商標）ホームページから適応させる）。
【０１９６】
２．４  データ解析
同定した全てのペプチドをグループ分けして、各ドナーについてアラインメントした。１つのアラインメントに埋め込まれた重なり合うペプチド群は、被験タンパク質の特定のアミノ酸位置にあるペプチドクラスターを規定する。同定したペプチドクラスターのコアペプチドを、ＮｅｔＭＨＣＩＩ  ３．１を用いて予測した。予測した結合親和性の最も高いコアペプチドを使用して、上記の特異的なペプチドクラスターの場所を標示した。ドナーセットの全てのペプチドクラスターの数を、対応の被験タンパク質について、抗原提示効率を定量するために、および潜在的な免疫原性のスコアとして、それぞれ使用した。各ドナーについての全てのペプチドクラスター中のユニークなペプチドの総数も考慮して、抗原提示強度を定量した（下記の例を参照）。
【０１９７】
データ解析の例：
【表５】
2020530436.tif 000006
【０１９８】
ｐｄＶＷＦ、ＣＳＬ６２６、またはＥＹＡ−ＦＰの存在下および非存在下におけるＣＳＬ６２７の抗原提示を比較するために、それぞれのＨＬＡ−ＤＲ拘束性ペプチドクラスターのユニークなＨＬＡ−ＤＲ結合ペプチドの数をさらに解析した。ＨＬＡ−ＤＲ拘束性ペプチドクラスター当たりのユニークなＨＬＡ−ＤＲ結合ペプチドの数を、Ｘ−Ｙ−Ｐｌｏｔに図示した。Ｘ軸上では、ｐｄＶＷＦ、ＣＳＬ６２６、およびＥＹＡ−ＦＰの非存在下におけるＣＳＬ６２７抗原提示の結果として、同定された全てのＨＬＡ−ＤＲ拘束性ペプチドクラスターに、ユニークなＨＬＡ−ＤＲ結合ペプチドのそれぞれの数を付して、Ｙ軸上では、ｐｄＶＷＦ、ＣＳＬ６２６、およびＥＹＡ−ＦＰの存在下におけるＣＳＬ６２７抗原提示の結果として、同定された全てのＨＬＡ−ＤＲ拘束性ペプチドクラスターに、ユニークなＨＬＡ−ＤＲ結合ペプチドのそれぞれの数を付して、プロットした。簡単な線形回帰を実行して（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ）、ＭＯＤＣのＨＬＡ−ＤＲによるＣＳＬ６２７抗原提示効率を比較した。
【０１９９】
２．５  ドナーの選択
健康なヒトドナー由来の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）試料のパネルを、ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ細胞バンクから選択した。各ＰＢＭＣ試料をＨＬＡ（ヒト白血球抗原）型判定し、使用前に液体窒素（気相）中で凍結保存した。世界人口に高発現することが知られているＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子がよく表されるように、パネルを選択した。ドナーセットのパネルとそれらのＨＬＡ−ＤＲＢ１またはＨＬＡ−ＤＲＢ１／ＤＱＢ１／ＤＰＢ１型判定の情報を、下記の表に一覧にする。
【０２００】
【表６】
2020530436.tif 000007
【０２０１】
【表７】
2020530436.tif 000008
【０２０２】
【表８】
2020530436.tif 000009
【０２０３】
２．６．１  結果
ｐｄＶＷＦの存在下および非存在下におけるＭＯＤＣによるＣＳＬ６２７のＭＨＣクラスＩＩ抗原提示
シークエンシング質量分析による内因性タンパク質の検出（ＬＡＭＰ−１、ＬＡＭＰ−２、ＴＦＲＣ、ＦｃＥＲ２／ＦｃＧＲ２、ＡｐｏＢ、ＩＴＧＡＭ、ＣＬＩＰ）およびフローサイトメトリーによるＤＣ表面マーカー（ＣＤ２０９、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲ）のモニタリングは、堅牢性のある試料データを生成するために許容可能であるものとした。
【０２０４】
【表９】
2020530436.tif 000010
【０２０５】
表６は、ＰＢＭＣの供給源として総計３６人の健康な非血縁のＨＬＡ−ＤＲＢ１型判定済みおよびＨＬＡ−ＤＲＢ１／ＤＱＢ１／ＤＰＢ１型判定済みのドナーの３つの独立したパネルＡ、Ｂ、およびＣを用いて、ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ  ＰｒｏＰｒｅｓｅｎｔ（登録商標）抗原提示アッセイによって生成したデータをまとめたものである。単量体の含有量に基づき１４６．４ｎＭのＣＳＬ６２７のみ、または１．９６６７μＭのｐｄＶＷＦと予め複合体形成させた１４６．４ｎＭのＣＳＬ６２７のどちらかを、未成熟なＤＣにロードした。ｐｄＶＷＦの非存在下でのＣＳＬ６２７抗原提示と、それに続くシークエンシング質量分析により、２つの独立したドナーのパネルに３８．０±７．１個のＨＬＡ−ＤＲＢ１ペプチドクラスターが同定された。ｐｄＶＷＦの存在下でのＣＳＬ６２７抗原提示とそれに続くシークエンシング質量分析により、２つの独立したドナーのパネルに１４．５±０．７個のＨＬＡ−ＤＲＢ１ペプチドクラスターが同定された。ｐｄＶＷＦは、同定したペプチドクラスターの数に基づくと２．２分の１から３．０分の１に、ＣＳＬ６２７のＨＬＡ−ＤＲＢ１拘束性抗原提示を低減することが可能であった。１つの、ＨＬＡ−ＤＲＢ１／ＤＱＢ１／ＤＰＢ１型判定済みのドナーのパネルを用いると、ｐｄＶＷＦの存在下でのＣＳＬ６２７抗原提示は、同定したＨＬＡ−ＤＱＢ１拘束性ペプチドクラスターに基づくと１０分の１に低減され、同定したＨＬＡ−ＤＱＢ１拘束性ペプチドクラスターに基づくと３．５分の１に低減された。およそ５０〜７０％のＣＳＬ６２７ペプチドクラスターが、ＨＬＡ−ＤＲＢ１拘束性であり、およそ３０〜５０％のＣＳＬ６２７ペプチドクラスターが、ＨＬＡ−ＤＱＢ１およびＨＬＡ−ＤＰＢ１により提示された。ＣＳＬ６２７由来、ならびにＨＬＡ−ＤＲＢ１拘束性、ＨＬＡ−ＤＱＢ１拘束性、およびＨＬＡ−ＤＰＢ１拘束性ペプチドクラスターの数が、ｐｄＶＷＦの存在下で減少またはいくらか消失したのに対し、ｐｄＶＷＦ非存在下のＣＳＬ６２７抗原提示に由来するペプチドクラスター配列と比較して、追加または新しいＣＳＬ６２７由来、ならびにＨＬＡ−ＤＲＢ１拘束性、ＨＬＡ−ＤＱＢ１拘束性、およびＨＬＡ−ＤＰＢ１拘束性ペプチドクラスターは検出されず、ＣＳＬ６２７由来、ならびにＨＬＡ−ＤＲＢ１拘束性、ＨＬＡ−ＤＱＢ１拘束性、およびＨＬＡ−ＤＰＢ１拘束性ペプチドクラスターで増加したものはなかった。
【０２０６】
ＣＳＬ６２７の存在下または非存在下でのｐｄＶＷＦの抗原提示を、ＨＬＡ−ＤＲＢ１／ＤＱＢ１／ＤＰＢ１型判定済みのドナーのパネルおよびＨＬＡ−ＤＲＢ１型判定済みのドナーの第２の独立したパネルにおいて検討した。ＣＳＬ６２７の非存在下でのｐｄＶＷＦの抗原提示を、ＨＬＡ−ＤＲＢ１型判定済みのドナーのパネルにおいて検討した。ＣＳＬ６２７の存在下のｐｄＶＷＦ抗原提示を、ＨＬＡ−ＤＲＢ１／ＤＱＢ１／ＤＰＢ１型判定済みのドナーおよびＨＬＡ−ＤＲＢ１型判定済みのドナーの両方のパネルで検討した。ＣＳＬ６２７の存在下でのｐｄＶＷＦ抗原提示およびそれに続くシークエンシング質量分析によって、２つの独立したドナーパネルに１３．０±５．７個のＨＬＡ−ＤＲＢ１ペプチドクラスターが同定され、そこでは、ＣＳＬ６２７の非存在下でのｐｄＶＷＦ抗原提示によって、１つのドナーパネルに１７個のＨＬＡ−ＤＲＢ１ペプチドクラスターが同定された。
【０２０７】
モル過剰のｐｄＶＷＦの存在下でのペプチドクラスターの数に基づくＣＳＬ６２７の抗原提示の複数分の１への低減は、大量のｐｄＶＷＦタンパク質のロードを介して偏った可能性がある。しかし、ｐｄＶＷＦ抗原提示は、ＣＳＬ６２７の存在を介しても不在を介しても影響を受けなかった。ＣＳＬ６２７タンパク質のロードと比較してモル過剰のｐｄＶＷＦのロードがあったことを考慮すると、ｐｄＶＷＦの抗原提示は、ＣＳＬ６２７よりも有効性の低いものであった。過剰量の競合的なｐｄＶＷＦ由来ペプチドを介したＣＳＬ６２７抗原提示の阻害は除外できないが、これはまた、ＤＣにｐｄＶＷＦのみをロードした際のｐｄＶＷＦの抗原提示の増加をもたらした。
【０２０８】
【表１０】
2020530436.tif 000011
【０２０９】
表７は、ＰＢＭＣの供給源として総計３６人の健康な非血縁のＨＬＡ−ＤＲＢ１型判定済みおよびＨＬＡ−ＤＲＢ１／ＤＱＢ１／ＤＰＢ１型判定済みのドナーの３つの独立したパネルＡ、Ｂ、およびＣを用いて、ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ  ＰｒｏＰｒｅｓｅｎｔ（登録商標）抗原提示アッセイによって生成されたデータをまとめたものである。単量体の含有量に基づき１４６．４ｎＭのＣＳＬ６２７のみ、または１．９６６７μＭのｐｄＶＷＦと予め複合体形成させた１４６．４ｎＭのＣＳＬ６２７のどちらかを、未成熟なＤＣにロードした。ｐｄＶＷＦの非存在下でのＣＳＬ６２７抗原提示と、それに続くシークエンシング質量分析により、２つの独立したドナーのパネルに１０３５±９９個のユニークなＨＬＡ−ＤＲＢ１結合ペプチドが同定された。ｐｄＶＷＦの存在下でのＣＳＬ６２７抗原提示とそれに続くシークエンシング質量分析により、２つの独立したドナーのパネルに１９２±９．９個のユニークなＨＬＡ−ＤＲＢ１結合ペプチドが同定された。ｐｄＶＷＦは、ユニークなＨＬＡ−ＤＲＢ１結合ペプチドの数に基づくと４．８分の１から６．０分の１に、ＣＳＬ６２７のＨＬＡ−ＤＲＢ１拘束性抗原の提示を低減することが可能であった。１つの、ＨＬＡ−ＤＲＢ１／ＤＱＢ１／ＤＰＢ１型判定済みのドナーのパネルを用いると、ｐｄＶＷＦの存在下でのＣＳＬ６２７抗原提示は、同定したユニークなＨＬＡ−ＤＱＢ１結合ペプチドに基づくと２１．７分の１に低減され、同定したユニークなＨＬＡ−ＤＰＢ１結合ペプチドに基づくと１４．２分の１に低減された。およそ８０％のユニークなＣＳＬ６２７由来ペプチドが、ＨＬＡ−ＤＲＢ１拘束性であり、およそ２０％のユニークなＣＳＬ６２７由来ペプチドが、ＨＬＡ−ＤＱＢ１およびＨＬＡ−ＤＰＢ１により提示された。
【０２１０】
ＣＳＬ６２７の存在下または非存在下でのｐｄＶＷＦの抗原提示を、ＨＬＡ−ＤＲＢ１／ＤＱＢ１／ＤＰＢ１型判定済みのドナーのパネルおよびＨＬＡ−ＤＲＢ１型判定済みのドナーの第２の独立したパネルにおいて検討した。ＣＳＬ６２７の非存在下でのｐｄＶＷＦの抗原提示を、ＨＬＡ−ＤＲＢ１型判定済みのドナーのパネルにおいて検討した。ＣＳＬ６２７の存在下のｐｄＶＷＦの抗原提示を、ＨＬＡ−ＤＲＢ１／ＤＱＢ１／ＤＰＢ１型判定済みのドナーおよびＨＬＡ−ＤＲＢ１型判定済みのドナーの両方のパネルで検討した。ＣＳＬ６２７の存在下でのｐｄＶＷＦ抗原提示およびそれに続くシークエンシング質量分析によって、２つの独立したドナーパネルに３９．０±２８．３個のユニークなＨＬＡ−ＤＲＢ１結合ペプチドが同定され、そこでは、ＣＳＬ６２７の非存在下でのｐｄＶＷＦ抗原提示によって、１つのドナーパネルに６０個のユニークなＨＬＡ−ＤＲＢ１結合ペプチドが同定された。
【０２１１】
モル過剰のｐｄＶＷＦの存在下でのユニークなペプチドの数に基づくＣＳＬ６２７の抗原提示の複数分の１への低減は、大量のｐｄＶＷＦタンパク質のロードを介して偏った可能性がある。しかし、ｐｄＶＷＦ抗原提示は、ＣＳＬ６２７の存在を介しても不在を介しても影響を受けなかった。ＣＳＬ６２７タンパク質のロードと比較してモル過剰のｐｄＶＷＦのロードがあったことを考慮すると、ｐｄＶＷＦの抗原提示は、ＣＳＬ６２７よりも有効性の低いものであった。ＣＳＬ６２７をＤＣにロードした際に、同定したユニークなペプチドのうちｐｄＶＷＦ由来であったのはおよそ２５％に過ぎなかった。過剰量の競合的なｐｄＶＷＦ由来ペプチドを介したＣＳＬ６２７抗原提示の阻害は除外できないが、これはまた、ＤＣにｐｄＶＷＦのみをロードした際のｐｄＶＷＦの抗原提示の増加をもたらした。
【０２１２】
図６は、ｐｄＶＷＦの存在下および非存在下におけるＣＳＬ６２７のＰｒｏＩｍｍｕｎｅ  ＰｒｏＰｒｅｓｅｎｔ（登録商標）抗原提示の比較を示す。各データ点は、ＨＬＡ−ＤＲ拘束性ペプチドクラスターを表す。ＨＬＡ−ＤＲ拘束性ペプチドクラスターのＣＳＬ６２７由来のユニークなＨＬＡ−ＤＲ結合ペプチドの数を、ｐｄＶＷＦの非存在下（Ｘ軸）および存在下（Ｙ軸）でプロットした。Ｘ−Ｙ−Ｐｌｏｔ、線形回帰（ＭＳ  Ｅｘｃｅｌ）。
【０２１３】
図６は、ＰＢＭＣの供給源として総計３６人の健康な非血縁のＨＬＡ−ＤＲＢ１型判定済みおよびＨＬＡ−ＤＲＢ１／ＤＱＢ１／ＤＰＢ１型判定済みのドナーの３つの独立したパネルＡ、Ｂ、およびＣを用いて、ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ  ＰｒｏＰｒｅｓｅｎｔ（登録商標）抗原提示アッセイを図示する。単量体の含有量に基づき１４６．４ｎＭのＣＳＬ６２７のみ、または１．９６６７μＭのｐｄＶＷＦと予め複合体形成させた１４６．４ｎＭのＣＳＬ６２７のどちらかを、未成熟なＤＣにロードした。
【０２１４】
相対的に、各ペプチドクラスターのユニークなＨＬＡ−ＤＲＢ１結合性ＣＳＬ６２７由来ペプチドの全体数は、ＶＷＦの存在下で低減された。ＤＣにｐｄＶＷＦ非存在下でＣＳＬ６２７をロードした際に、数多くのペプチドクラスターが同定されたが、ｐｄＶＷＦの存在下では、ＣＳＬ６２７由来ペプチドクラスターがいくらか消失した（表４および表５）。ＣＳＬ６２７をｐｄＶＷＦの存在下で供試した際に、ｐｄＶＷＦ不在でのＣＳＬ６２７と比較して、ユニークなＨＬＡ−ＤＲＢ１結合ペプチドの数に基づくと、さらに高い効率で提示されるペプチドクラスターはなかった。
【０２１５】
線形回帰は、傾き０．２２＊Ｘ（Ｒ２＝０．７３）でデータを相関付けている。ｐｄＶＷＦの存在下では、ＣＳＬ６２７抗原提示は、ｐｄＶＷＦの非存在下でのＣＳＬ６２７の抗原提示効率のおよそ５分の１（およそ２２％）である。
【０２１６】
２．６．２  結果
ＣＳＬ６２６の存在下および非存在下におけるＭＯＤＣによるＣＳＬ６２７のＭＨＣクラスＩＩ抗原提示
シークエンシング質量分析による内因性タンパク質の検出（ＬＡＭＰ−１、ＬＡＭＰ−２、ＴＦＲＣ、ＦｃＥＲ２／ＦｃＧＲ２、ＡｐｏＢ、ＩＴＧＡＭ、ＣＬＩＰ）およびフローサイトメトリーによるＤＣ表面マーカー（ＣＤ２０９、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲ）のモニタリングは、堅牢性のある試料データを生成するために許容可能であるものとした。
【０２１７】
【表１１】
2020530436.tif 000012
【０２１８】
表８は、ＰＢＭＣの供給源として２４人の健康な非血縁のＨＬＡ−ＤＲＢ１型判定済みのドナーの２つの独立したパネルＡおよびＢを用いて、ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ  ＰｒｏＰｒｅｓｅｎｔ（登録商標）抗原提示アッセイによって生成されたデータをまとめたものである。単量体の含有量に基づき１４６．４ｎＭのＣＳＬ６２７のみ、または１．９６６７μＭのＣＳＬ６２６と予め複合体形成させた１４６．４ｎＭのＣＳＬ６２７のどちらかを、未成熟なＤＣにロードした。ＣＳＬ６２６の非存在下でのＣＳＬ６２７抗原提示と、それに続くシークエンシング質量分析により、２つの独立したドナーのパネルに３８．０±７．１個のＨＬＡ−ＤＲＢ１ペプチドクラスターが同定された。ＣＳＬ６２６の存在下でのＣＳＬ６２７抗原提示とそれに続くシークエンシング質量分析により、２つの独立したドナーのパネルに２０個のＨＬＡ−ＤＲＢ１ペプチドクラスターが同定された。ＣＳＬ６２６は、同定したペプチドクラスターの数に基づくと１．５５分の１から２．５５分の１に、ＣＳＬ６２７のＨＬＡ−ＤＲＢ１拘束性抗原の提示を低減することが可能であった。
【０２１９】
ＣＳＬ６２７由来およびＨＬＡ−ＤＲＢ１拘束性ペプチドクラスターの数が、ＣＳＬ６２６の存在下で減少またはいくらか消失したのに対し、ＣＳＬ６２６非存在下のＣＳＬ６２７抗原提示に由来するペプチドクラスター配列と比較して、追加または新しいＣＳＬ６２７由来およびＨＬＡ−ＤＲＢ１拘束性ペプチドクラスターは検出されず、ＣＳＬ６２７由来およびＨＬＡ−ＤＲＢ１拘束性ペプチドクラスターで増加したものはなかった。
【０２２０】
ＣＳＬ６２７の存在下または非存在下でのＣＳＬ６２６の抗原提示を、１２人のＨＬＡ−ＤＲＢ１型判定済みのドナーのパネルにおいて検討した。ＣＳＬ６２７の存在下のＣＳＬ６２６抗原提示およびそれに続くシークエンシング質量分析によって、１２人の健康な非血縁のドナーに３個のＨＬＡ−ＤＲＢ１ペプチドクラスターが同定され、そこでは、ＣＳＬ６２７の非存在下でのＣＳＬ６２６抗原提示によって、同じドナーセットに２個のＨＬＡ−ＤＲＢ１ペプチドクラスターが同定された。
【０２２１】
モル過剰のＣＳＬ６２６の存在下でのペプチドクラスターの数に基づくＣＳＬ６２７の抗原提示の低減は、大量のＣＳＬ６２６タンパク質のロードを介して偏った可能性がある。しかし、ＣＳＬ６２６抗原提示は、ＣＳＬ６２７の存在を介しても不在を介しても影響を受けなかった。ＣＳＬ６２７タンパク質のロードと比較してモル過剰のＣＳＬ６２６のロードがあったことを考慮すると、ＣＳＬ６２６の抗原提示は、ＣＳＬ６２７よりも有効性の低いものであった。過剰量の競合的なＣＳＬ６２６由来ペプチドを介したＣＳＬ６２７抗原提示の阻害は除外できないが、これはまた、ＤＣにＣＳＬ６２６のみをロードした際のＣＳＬ６２６の抗原提示の増加をもたらした。
【０２２２】
【表１２】
2020530436.tif 000013
【０２２３】
表９は、ＰＢＭＣの供給源として２４人の健康な非血縁のＨＬＡ−ＤＲＢ１型判定済みのドナーの２つの独立したパネルＡおよびＢを用いて、ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ  ＰｒｏＰｒｅｓｅｎｔ（登録商標）抗原提示アッセイによって生成されたデータをまとめたものである。単量体の含有量に基づき１４６．４ｎＭのＣＳＬ６２７のみ、または１．９６６７μＭのＣＳＬ６２６と予め複合体形成させた１４６．４ｎＭのＣＳＬ６２７のどちらかを、未成熟なＤＣにロードした。ＣＳＬ６２６の非存在下でのＣＳＬ６２７抗原提示と、それに続くシークエンシング質量分析により、２つの独立したドナーのパネルに１０３５±９９個のユニークなＨＬＡ−ＤＲＢ１結合ペプチドが同定された。ＣＳＬ６２６の存在下でのＣＳＬ６２７抗原提示とそれに続くシークエンシング質量分析により、１２人のドナーセットに２１２個のユニークなＨＬＡ−ＤＲＢ１結合ペプチドが同定された。ＣＳＬ６２６は、ユニークなＨＬＡ−ＤＲＢ１結合ペプチドの数に基づくと４．４分の１から５．４分の１に、ＣＳＬ６２７のＨＬＡ−ＤＲＢ１拘束性抗原の提示を低減することが可能であった。
【０２２４】
ＣＳＬ６２７の存在下または非存在下でのＣＳＬ６２６の抗原提示を、ＨＬＡ−ＤＲＢ１型判定済みのドナーのパネルにおいて検討した。ＣＳＬ６２７の存在下のＣＳＬ６２６抗原提示およびそれに続くシークエンシング質量分析によって、１２人の健康な非血縁のドナーに２４個のユニークなＨＬＡ−ＤＲＢ１結合ペプチドが同定され、そこでは、ＣＳＬ６２７の非存在下でのＣＳＬ６２６抗原提示によって、同じドナーセットに２８個のユニークなＨＬＡ−ＤＲＢ１結合ペプチドが同定された。
【０２２５】
モル過剰のＣＳＬ６２６の存在下でのユニークなペプチドの数に基づくＣＳＬ６２７の抗原提示の複数分の１への低減は、大量のＣＳＬ６２６タンパク質のロードを介して偏ることがある。しかし、ＣＳＬ６２６抗原提示は、ＣＳＬ６２７の存在を介しても不在を介しても影響を受けなかった。ＣＳＬ６２７タンパク質のロードと比較してモル過剰のＣＳＬ６２６のロードがあったことを考慮すると、ＣＳＬ６２６の抗原提示は、ＣＳＬ６２７よりも有効性の低いものであった。ＣＳＬ６２７をＤＣにロードした際に、同定したユニークなペプチドのうちＣＳＬ６２６由来であったのはおよそ１０％に過ぎなかった。過剰量の競合的なＣＳＬ６２６由来ペプチドを介したＣＳＬ６２７抗原提示の阻害は除外できないが、これはまた、ＤＣにＣＳＬ６２６のみをロードした際のＣＳＬ６２６の抗原提示の有意な増加をもたらした。
【０２２６】
図７は、ＣＳＬ６２６の存在下および非存在下におけるＣＳＬ６２７のＰｒｏＩｍｍｕｎｅ  ＰｒｏＰｒｅｓｅｎｔ（登録商標）抗原提示の比較を示す。各データ点は、ＨＬＡ−ＤＲ拘束性ペプチドクラスターを表す。ＨＬＡ−ＤＲ拘束性ペプチドクラスターのＣＳＬ６２７由来のユニークなＨＬＡ−ＤＲ結合ペプチドの数を、ＣＳＬ６２６の非存在下（Ｘ軸）および存在下（Ｙ軸）でプロットした。Ｘ−Ｙ−Ｐｌｏｔ、線形回帰（ＭＳ  Ｅｘｃｅｌ）。
【０２２７】
図７は、ＰＢＭＣの供給源として２４人の健康な非血縁のＨＬＡ−ＤＲＢ１型判定済みドナーの２つの独立したパネルＡおよびＢを用いて、ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ  ＰｒｏＰｒｅｓｅｎｔ（登録商標）抗原提示アッセイを図示する。単量体の含有量に基づき１４６．４ｎＭのＣＳＬ６２７のみ、または１．９６６７μＭのＣＳＬ６２６と予め複合体形成させた１４６．４ｎＭのＣＳＬ６２７のどちらかを、未成熟なＤＣにロードした。
【０２２８】
相対的に、各ペプチドクラスターのユニークなＨＬＡ−ＤＲＢ１結合性ＣＳＬ６２７由来ペプチドの全体数は、ＣＳＬ６２６の存在下で低減された。ＤＣにＣＳＬ６２６非存在下でＣＳＬ６２７をロードした際に、数多くのペプチドクラスターが同定されたが、ＣＳＬ６２６の存在下では、ＣＳＬ６２７由来ペプチドクラスターがいくらか消失した（表６および表７）。ＣＳＬ６２７をＣＳＬ６２６存在下で供試した際に、ＣＳＬ６２６不在でのＣＳＬ６２７と比較して、ユニークなＨＬＡ−ＤＲＢ１結合ペプチドの数に基づくと、さらに高い効率で提示されるペプチドクラスターはなかった。
【０２２９】
線形回帰は、傾き０．２５＊Ｘ（Ｒ２＝０．６６）でデータを相関付けている。ＣＳＬ６２６の存在下では、ＣＳＬ６２７抗原提示は、ＣＳＬ６２６の非存在下でのＣＳＬ６２７の抗原提示効率のおよそ４分の１（およそ２５％）である。
【０２３０】
２．６．３  結果
ＥＹＡ−ＦＰの存在下および非存在下におけるＭＯＤＣによるＣＳＬ６２７のＭＨＣクラスＩＩ抗原提示
シークエンシング質量分析による内因性タンパク質の検出（ＬＡＭＰ−１、ＬＡＭＰ−２、ＴＦＲＣ、ＦｃＥＲ２／ＦｃＧＲ２、ＡｐｏＢ、ＩＴＧＡＭ、ＣＬＩＰ）およびフローサイトメトリーによるＤＣ表面マーカー（ＣＤ２０９、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲ）のモニタリングは、堅牢性のある試料データを生成するために許容可能であるものとした。
【０２３１】
【表１３】
2020530436.tif 000014
【０２３２】
表１０は、ＰＢＭＣの供給源として２４人の健康な非血縁のＨＬＡ−ＤＲＢ１型判定済みのドナーの２つの独立したパネルＡおよびＢを用いて、ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ  ＰｒｏＰｒｅｓｅｎｔ（登録商標）抗原提示アッセイによって生成されたデータをまとめたものである。単量体の含有量に基づき１４６．４ｎＭのＣＳＬ６２７のみ、または１．９６６７μＭのＥＹＡ−ＦＰと予め複合体形成させた１４６．４ｎＭのＣＳＬ６２７のどちらかを、未成熟なＤＣにロードした。ＥＹＡ−ＦＰの非存在下でのＣＳＬ６２７抗原提示と、それに続くシークエンシング質量分析により、２つの独立したドナーのパネルに３８．０±７．１個のＨＬＡ−ＤＲＢ１ペプチドクラスターが同定された。ＥＹＡ−ＦＰの存在下でのＣＳＬ６２７抗原提示とそれに続くシークエンシング質量分析により、２つの独立したドナーのパネルに１５個のＨＬＡ−ＤＲＢ１ペプチドクラスターが同定された。ＥＹＡ−ＦＰは、同定したペプチドクラスターの数に基づくと２．１分の１から３．０分の１に、ＣＳＬ６２７のＨＬＡ−ＤＲＢ１拘束性抗原の提示を低減することが可能であった。
【０２３３】
ＣＳＬ６２７由来およびＨＬＡ−ＤＲＢ１拘束性ペプチドクラスターの数が、ＥＹＡ−ＦＰの存在下で減少またはいくらか消失したのに対し、ＥＹＡ−ＦＰ非存在下のＣＳＬ６２７抗原提示に由来するペプチドクラスター配列と比較して、追加または新しいＣＳＬ６２７由来およびＨＬＡ−ＤＲＢ１拘束性ペプチドクラスターは検出されず、ＣＳＬ６２７由来およびＨＬＡ−ＤＲＢ１拘束性ペプチドクラスターで増加したものはなかった。
【０２３４】
ＣＳＬ６２７の存在下または非存在下でのＥＹＡ−ＦＰの抗原提示を、１２人のＨＬＡ−ＤＲＢ１型判定済みのドナーのパネルにおいて検討した。ＣＳＬ６２７の存在下のＥＹＡ−ＦＰ抗原提示およびそれに続くシークエンシング質量分析によって、１２人の健康な非血縁のドナーに２個のＨＬＡ−ＤＲＢ１ペプチドクラスターが同定され、そこでは、ＣＳＬ６２７の非存在下でのＥＹＡ−ＦＰ抗原提示によって、同じドナーセットに同じ２個のＨＬＡ−ＤＲＢ１ペプチドクラスターが同定された。
【０２３５】
モル過剰のＥＹＡ−ＦＰの存在下でのペプチドクラスターの数に基づくＣＳＬ６２７の抗原提示の低減は、大量のＥＹＡ−ＦＰタンパク質のロードを介して偏ることがある。しかし、ＥＹＡ−ＦＰ抗原提示は、ＣＳＬ６２７の存在を介しても不在を介しても大きな影響を受けなかった。ＣＳＬ６２７タンパク質のロードと比較してモル過剰のＥＹＡ−ＦＰのロードがあったことを考慮すると、ＥＹＡ−ＦＰの抗原提示は、ＣＳＬ６２７よりも有効性の低いものであった。過剰量の競合的なＥＹＡ−ＦＰ由来ペプチドを介したＣＳＬ６２７抗原提示の阻害は除外できないが、これはまた、ＤＣにＥＹＡ−ＦＰのみをロードした際のＥＹＡ−ＦＰの抗原提示の増加をもたらした。
【０２３６】
【表１４】
2020530436.tif 000015
【０２３７】
表１１は、ＰＢＭＣの供給源として２４人の健康な非血縁のＨＬＡ−ＤＲＢ１型判定済みのドナーの２つの独立したパネルＡおよびＢを用いて、ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ  ＰｒｏＰｒｅｓｅｎｔ（登録商標）抗原提示アッセイによって生成されたデータをまとめたものである。単量体の含有量に基づき１４６．４ｎＭのＣＳＬ６２７のみ、または１．９６６７μＭのＥＹＡ−ＦＰと予め複合体形成させた１４６．４ｎＭのＣＳＬ６２７のどちらかを、未成熟なＤＣにロードした。ＥＹＡ−ＦＰの非存在下でのＣＳＬ６２７抗原提示と、それに続くシークエンシング質量分析により、２つの独立したドナーのパネルに１０３５±９９個のユニークなＨＬＡ−ＤＲＢ１結合ペプチドが同定された。ＥＹＡ−ＦＰの存在下でのＣＳＬ６２７抗原提示とそれに続くシークエンシング質量分析により、１２人のドナーセットに２４１個のユニークなＨＬＡ−ＤＲＢ１結合ペプチドが同定された。ＥＹＡ−ＦＰは、ユニークなＨＬＡ−ＤＲＢ１結合ペプチドの数に基づくと３．９分の１から４．７分の１に、ＣＳＬ６２７のＨＬＡ−ＤＲＢ１拘束性抗原の提示を低減することが可能であった。
【０２３８】
ＣＳＬ６２７の存在下または非存在下でのＥＹＡ−ＦＰの抗原提示を、ＨＬＡ−ＤＲＢ１型判定済みのドナーのパネルにおいて検討した。ＣＳＬ６２７の存在下のＥＹＡ−ＦＰ抗原提示およびそれに続くシークエンシング質量分析によって、１２人の健康な非血縁のドナーに２１個のユニークなＨＬＡ−ＤＲＢ１結合ペプチドが同定され、そこでは、ＣＳＬ６２７の非存在下でのＥＹＡ−ＦＰ抗原提示によって、同じドナーセットに２０個のユニークなＨＬＡ−ＤＲＢ１結合ペプチドが同定された。
【０２３９】
モル過剰のＥＹＡ−ＦＰの存在下でのユニークなペプチドの数に基づくＣＳＬ６２７の抗原提示の複数分の１への低減は、大量のＥＹＡ−ＦＰタンパク質のロードを介して偏ることがある。しかし、ＥＹＡ−ＦＰ抗原提示は、ＣＳＬ６２７の存在を介しても不在を介しても影響を受けなかった。ＣＳＬ６２７タンパク質のロードと比較してモル過剰のＥＹＡ−ＦＰのロードがあったことを考慮すると、ＥＹＡ−ＦＰの抗原提示は、ＣＳＬ６２７よりも有効性の低いものであった。ＣＳＬ６２７をＤＣにロードした際に、同定したユニークなペプチドのうちＥＹＡ−ＦＰ由来であったのはおよそ８％に過ぎなかった。過剰量の競合的なＥＹＡ−ＦＰ由来ペプチドを介したＣＳＬ６２７抗原提示の阻害は除外できないが、これはまた、ＤＣにＥＹＡ−ＦＰのみをロードした際のＥＹＡ−ＦＰの抗原提示の有意な増加をもたらした。
【０２４０】
図８は、ＥＹＡ−ＦＰの存在下および非存在下におけるＣＳＬ６２７のＰｒｏＩｍｍｕｎｅ  ＰｒｏＰｒｅｓｅｎｔ（登録商標）抗原提示の比較を示す。各データ点は、ＨＬＡ−ＤＲ拘束性ペプチドクラスターを表す。ＨＬＡ−ＤＲ拘束性ペプチドクラスターのＣＳＬ６２７由来のユニークなＨＬＡ−ＤＲ結合ペプチドの数を、ＥＹＡ−ＦＰの非存在下（Ｘ軸）および存在下（Ｙ軸）でプロットした。Ｘ−Ｙ−Ｐｌｏｔ、線形回帰（ＭＳ  Ｅｘｃｅｌ）
【０２４１】
図８は、ＰＢＭＣの供給源として２４人の健康な非血縁のＨＬＡ−ＤＲＢ１型判定済みドナーの２つの独立したパネルＡおよびＢを用いて、ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ  ＰｒｏＰｒｅｓｅｎｔ（登録商標）抗原提示アッセイを図示する。単量体の含有量に基づき１４６．４ｎＭのＣＳＬ６２７のみ、または１．９６６７μＭのＥＹＡ−ＦＰと予め複合体形成させた１４６．４ｎＭのＣＳＬ６２７のどちらかを、未成熟なＤＣにロードした。
【０２４２】
相対的に、各ペプチドクラスターのユニークなＨＬＡ−ＤＲＢ１結合性ＣＳＬ６２７由来ペプチドの全体数は、ＥＹＡ−ＦＰの存在下で低減された。ＤＣにＥＹＡ−ＦＰ非存在下でＣＳＬ６２７をロードした際に、数多くのペプチドクラスターが同定されたが、ＥＹＡ−ＦＰの存在下では、ＣＳＬ６２７由来ペプチドクラスターがいくらか消失した（表８および表９）。ＣＳＬ６２７をＥＹＡ−ＦＰの存在下で供試した際に、ＥＹＡ−ＦＰ不在でのＣＳＬ６２７と比較して、ユニークなＨＬＡ−ＤＲＢ１結合ペプチドの数に基づくと、さらに高い効率で提示されるペプチドクラスターはなかった。
【０２４３】
線形回帰は、傾き０．２７＊Ｘ（Ｒ２＝０．６３）でデータを相関付けている。ＥＹＡ−ＦＰの存在下では、ＣＳＬ６２７の抗原提示は、ＥＹＡ−ＦＰの非存在下でのＣＳＬ６２７の抗原提示効率のおよそ４分の１である。
【図１】
2020530436.tif 000016
【図２−１】
2020530436.tif 000017
【図２−２】
2020530436.tif 000018
【図３−１】
2020530436.tif 000019
【図３−２】
2020530436.tif 000020
【図４−１】
2020530436.tif 000021
【図４−２】
2020530436.tif 000022
【図５−１】
2020530436.tif 000023
【図５−２】
2020530436.tif 000024
【図５−３】
2020530436.tif 000025
【図６】
2020530436.tif 000026
【図７】
2020530436.tif 000027
【図８】
2020530436.tif 000028
【配列表】
2020530436000001.app
【国際調査報告】
2020530436.tif 000029
2020530436.tif 000030
2020530436.tif 000031