(57)【要約】  本明細書に提供されるのは、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）から単離されたエキソソームである。かかる単離されたエキソソームは、夾雑物を実質的に含まず、様々な疾患（例えば、ＢＰＤなどの肺疾患）の処置において治療的に活性である。単離されたＭＳＣエキソソームは、本明細書に記載の１以上のタンパク質マーカーによって同定される。かかるＭＳＣエキソソームを精製する方法も提供される。
2020531011.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された間葉系幹細胞（ＭＣＳ）エキソソームであって、
（ｉ）単離されたＭＳＣエキソソームは、ＦＬＴ１、ＰＬＡＵＲ、ＭＭＥ、ＣＤＨ２、ＳＬＣ１６Ａ３、ＣＤＨ１３、ＩＴＧＢ５、ＩＴＧＡ１１、ＡＰＰ、ＧＰＣ６、ＩＧＳＦ８、ＩＲＰ２、ＴＳＰＡＮ９、ＤＡＧ１、ＳＬＣ３８Ａ２、ＳＬＣ１２Ａ８、ＧＪＡ１、ＩＴＧＡ１、ＰＬＸＮＢ２、ＳＬＣ１６Ａ１、およびＰＲＯＣＲからなる群から選択される１以上のマーカーを含む；
（ｉｉ）単離されたＭＳＣエキソソームは、線維芽細胞エキソソームと比較して濃縮された１以上のマーカーを含み、該１以上のマーカーは、ＰＴｋ７、ＣＤ１０９、ＳＬＣ１Ａ５、ＩＴＧＡ３、ＩＴＧＡ２、ＢＳＧ、ＤＰＰ４、ＡＴＰ１Ａ１、ＦＡＰ、ＶＡＳＮ、ＩＧＦ２Ｒ、およびＣＤ８２からなる群から選択される；および／または
（ｉｉｉ）単離されたＭＳＣエキソソームは、線維芽細胞エキソソームと比較して濃縮された１以上のマーカーを含み、該１以上のマーカーは、ＲＣＮ１、ＲＡＰ１Ｂ、ＧＤＦ１５、ＦＬＴ１、ＯＬＦＭＬ３、ＰＬＯＤ２、ＰＳＭＡ４、ＰＡＰＰＡ、ＩＮＨＢＡ、ＳＰＯＣＫ１、ＨＳＰＢ１、ＬＯＸＬ４、ＰＯＬＤ３、ＣＡＬＵ、ＩＧＦＢＰ４、Ｃ４Ｂ、ＴＩＮＡＧＬ１、ＳＵＬＦ１、ＴＰＭ３、ＡＨＮＡＫ、ＣＡＬＲ、ＲＲＡＳ２、ＰＦＫＰ、およびＣＯＬ１６Ａ１からなる群から選択される、
前記ＭＣＳエキソソーム。
【請求項２】
ＦＬＴ１、ＰＬＡＵＲ、ＭＭＥ、ＣＤＨ２、ＳＬＣ１６Ａ３、ＣＤＨ１３、ＩＴＧＢ５、ＩＴＧＡ１１、ＡＰＰ、ＧＰＣ６、ＩＧＳＦ８、ＩＲＰ２、ＴＳＰＡＮ９、ＤＡＧ１、ＳＬＣ３８Ａ２、ＳＬＣ１２Ａ８、ＧＪＡ１、ＩＴＧＡ１、ＰＬＸＮＢ２、ＳＬＣ１６Ａ１、およびＰＲＯＣＲからなる群から選択される１以上のマーカーを含む、請求項１に記載のＭＳＣエキソソーム。
【請求項３】
線維芽細胞エキソソームと比較して濃縮された１以上のマーカーを含み、該１以上のマーカーが、ＰＴｋ７、ＣＤ１０９、ＳＬＣ１Ａ５、ＩＧＴＡ３、ＩＴＧＡ２、ＢＳＧ、ＤＰＰ４、ＡＴＰ１Ａ１、ＦＡＰ、ＶＡＳＮ、ＩＧＦ２Ｒ、およびＣＤ８２からなる群から選択される、請求項１に記載のＭＳＣエキソソーム。
【請求項４】
線維芽細胞エキソソームと比較して濃縮された１以上のマーカーを含み、該１以上のマーカーが、ＲＣＮ１、ＲＡＰ１Ｂ、ＧＤＦ１５、ＦＬＴ１、ＯＬＦＭＬ３、ＰＬＯＤ２、ＰＳＭＡ４、ＰＡＰＰＡ、ＩＮＨＢＡ、ＳＰＯＣＫ１、ＨＳＰＢ１、ＬＯＸＬ４、ＰＯＬＤ３、ＣＡＬＵ、ＩＧＦＢＰ４、Ｃ４Ｂ、ＴＩＮＡＧＬ１、ＳＵＬＦ１、ＴＰＭ３、ＡＨＮＡＫ、ＣＡＬＲ、ＲＲＡＳ２、ＰＦＫＰおよびＣＯＬ１６Ａ１からなる群から選択される、請求項１に記載のＭＳＣエキソソーム。
【請求項５】
ＦＬＯＴ１、ＣＤ９、およびＣＤ６３からなる群から選択される１以上のマーカーをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離されたＭＳＣエキソソーム。
【請求項６】
ＭＳＣ馴化培地から単離されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離されたＭＳＣエキソソーム。
【請求項７】
ＭＳＣが、ホウォートンゼリーまたは骨髄からのものである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離されたＭＣＳエキソソーム。
【請求項８】
非エキソソームタンパク質夾雑物を実質的に含まない、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離されたＭＳＣエキソソーム。
【請求項９】
約３０〜１５０ｎｍの直径を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の単離されたＭＳＣエキソソーム。
【請求項１０】
免疫調節活性を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の単離されたＭＳＣエキソソーム。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の単離されたＭＳＣエキソソームを含む、医薬組成物。
【請求項１２】
二次薬剤をさらに含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
二次薬剤が、肺サーファクタント、ステロイド、抗酸化剤、または吸入された一酸化窒素である、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
薬学的に許容し得る担体をさらに含む、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
有効量の請求項１〜９のいずれか一項に記載の単離された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）エキソソーム、または請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の医薬組成物を、これを必要とする対象に投与することを含む、肺疾患を処置する方法。
【請求項１６】
対象がヒト対象である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ヒト対象が、妊娠３７週前に生まれている、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ヒト対象が、妊娠２６週前に生まれている、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
対象が、過酸素症に誘発された肺損傷を有する、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
対象に酸素が投与されていたか、または対象に人工呼吸器が取り付けられていた、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
対象が、気管支肺異形成症（ＢＰＤ）を発症しているか、または発症するリスクがある、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
対象が、過酸素症に誘発された肺高血圧症を有する、請求項１５〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
対象が、末梢肺動脈リモデリングを示す、請求項１５〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
対象が、肺において炎症を有する、請求項１５〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
対象が、４週齢未満である、請求項１５〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
対象が、４週齢〜３歳である、請求項１５〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
対象が、３〜１８歳である、請求項１５〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
対象が成人である、請求項１５〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
単離されたＭＳＣエキソソームが、ボーラス用量で対象に投与される、請求項１５〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
単離されたＭＳＣエキソソームが、対象に繰り返し投与される、請求項１５〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
単離されたＭＳＣエキソソームが、肺機能を改善する、請求項１５〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
単離されたＭＳＣエキソソームが、肺構造を回復する、請求項１５〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
単離されたＭＳＣエキソソームが、肺線維症を低減する、請求項１５〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
単離されたＭＳＣエキソソームが、肺における炎症を低減する、請求項１５〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
単離されたＭＳＣエキソソームが、末梢肺動脈リモデリングを低減する、請求項１５〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
単離されたＭＳＣエキソソームが、生後１時間以内に投与される、請求項１５〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
単離されたＭＳＣエキソソームが、生後１ヶ月以内に投与される、請求項１５〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
単離されたＭＳＣエキソソームが、静脈内または鼻腔内に投与される、請求項１５〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
単離されたＭＳＣエキソソームが、対象の肺または気管に投与される、請求項１５〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
単離されたＭＳＣエキソソームが、吸入によって投与される、請求項１５〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
単離されたＭＳＣエキソソームが、エアロゾルで投与される、請求項１５〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
単離されたＭＳＣエキソソームが、ネブライザーを使用して投与される、請求項１５〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
単離されたＭＳＣエキソソームが、気管内チューブを使用して投与される、請求項１５〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
対象が哺乳動物である、請求項１５〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
哺乳動物がヒトである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
哺乳動物が齧歯類の動物である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
齧歯類の動物がマウスまたはラットである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
肺疾患を処置するための医薬の製造における使用のための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の単離された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）エキソソーム、または請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項４９】
イオジキサノール（ＩＤＸ）クッション勾配を使用してＭＳＣ馴化培地を分画すること、および、非エキソソームタンパク質夾雑物を実質的に含まない画分を収集することを含む、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）エキソソームを単離する方法。
【請求項５０】
ＭＳＣ馴化培地が、分画前に濃縮される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
ＭＳＣ馴化培地が、タンジェント流濾過を介して濃縮される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
分画することが、ＩＤＸクッション勾配のＭＳＣ馴化培地で浮遊させることおよび超遠心分離を含む、請求項４９〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
請求項４９〜５２のいずれか一項に記載の方法を使用して単離されたＭＳＣエキソソーム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2017年8月15日に出願された米国仮出願番号62/545,610に対して35 U.S.C.§119（e）下の利益を主張する。該出願は「精製された間葉系幹細胞エキソソームおよびその使用」と題され、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
政府の支援
本発明は、NIHによって授与された助成金番号RO1 HL085446、RO1 HL055454、およびT32 HD007466の下で政府の支援を受けて行われた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
背景
種々の臓器（例えば、肺）における間葉系幹／間質細胞（ＭＳＣ）の治療能力は、それらのセクレトーム（例えば、それらが放出するエキソソーム）に含まれることが示されている。ＭＳＣエキソソーム処置の有益な特性は、心筋梗塞、腎障害、アレルギーと同様の免疫調節状態、神経保護を含む、多くの疾患モデルでも報告されている。しかしながら、粗いエキソソーム単離技術は、分析の特性解析が不十分であるため、ＭＳＣエキソソームの治療効果が低下し、バイオアベイラビリティが低下し、調製物が非エキソソーム材料で汚染されることがよくある。
【発明の概要】
【０００３】
概要
本明細書に提供されるのは、精製されたＭＳＣエキソソーム（例えば、ヒト臍帯ホウォートンゼリーまたは骨髄由来）の特性解析である。本明細書に記載の精製方法を使用して、肺疾患（例えば、気管支肺異形成症（ＢＰＤ））に治療的な有効性をもたらすＭＳＣエキソソームが単離され、かかる精製されたＭＣＳエキソソームに関連するマーカーが同定される。さらに本明細書に提供されるのは、精製されたＭＳＣエキソソームを使用して肺疾患（例えば、ＢＰＤ）を処置する方法である。いくつかの態様において、ＭＳＣエキソソームのボーラス用量は、肺疾患（例えば、ＢＰＤ）の重症度を低減するのに有効である。
【０００４】
したがって、本開示のいくつかの側面は、単離された間葉系幹細胞（ＭＣＳ）エキソソームを提供し、ここで、（ｉ）単離されたＭＳＣエキソソームは、ＦＬＴ１、ＰＬＡＵＲ、ＭＭＥ、ＣＤＨ２、ＳＬＣ１６Ａ３、ＣＤＨ１３、ＩＴＧＢ５、ＩＴＧＡ１１、ＡＰＰ、ＧＰＣ６、ＩＧＳＦ８、ＩＲＰ２、ＴＳＰＡＮ９、ＤＡＧ１、ＳＬＣ３８Ａ２、ＳＬＣ１２Ａ８、ＧＪＡ１、ＩＴＧＡ１、ＰＬＸＮＢ２、ＳＬＣ１６Ａ１、およびＰＲＯＣＲからなる群から選択される１以上のマーカーを含む；（ｉｉ）単離されたＭＳＣエキソソームは、線維芽細胞エキソソームと比較して濃縮された１以上のマーカーを含み、該１以上のマーカーは、ＰＴｋ７、ＣＤ１０９、ＳＬＣ１Ａ５、ＩＴＧＡ３、ＩＴＧＡ２、ＢＳＧ、ＤＰＰ４、ＡＴＰ１Ａ１、ＦＡＰ、ＶＡＳＮ、ＩＧＦ２Ｒ、およびＣＤ８２からなる群から選択される；および／または（ｉｉｉ）単離されたＭＳＣエキソソームは線維芽細胞エキソソームと比較して濃縮された１以上のマーカーを含み、該１以上のマーカーは、ＲＣＮ１、ＲＡＰ１Ｂ、ＧＤＦ１５、ＦＬＴ１、ＯＬＦＭＬ３、ＰＬＯＤ２、ＰＳＭＡ４、ＰＡＰＰＡ、ＩＮＨＢＡ、ＳＰＯＣＫ１、ＨＳＰＢ１、ＬＯＸＬ４、ＰＯＬＤ３、ＣＡＬＵ、ＩＧＦＢＰ４、Ｃ４Ｂ、ＴＩＮＡＧＬ１、ＳＵＬＦ１、ＴＰＭ３、ＡＨＮＡＫ、ＣＡＬＲ、ＲＲＡＳ２、ＰＦＫＰ、およびＣＯＬ１６Ａ１からなる群から選択される。
【０００５】
いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソームは、ＦＬＴ１、ＰＬＡＵＲ、ＭＭＥ、ＣＤＨ２、ＳＬＣ１６Ａ３、ＣＤＨ１３、ＩＴＧＢ５、ＩＴＧＡ１１、ＡＰＰ、ＧＰＣ６、ＩＧＳＦ８、ＩＲＰ２、ＴＳＰＡＮ９、ＤＡＧ１、ＳＬＣ３８Ａ２、ＳＬＣ１２Ａ８、ＧＪＡ１、ＩＴＧＡ１、ＰＬＸＮＢ２、ＳＬＣ１６Ａ１、およびＰＲＯＣＲからなる群から選択される１以上のマーカーを含む。
いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソームは、線維芽細胞エキソソームと比較して濃縮された１以上のマーカーを含み、該１以上のマーカーは、ＰＴｋ７、ＣＤ１０９、ＳＬＣ１Ａ５、ＩＧＴＡ３、ＩＴＧＡ２、ＢＳＧ、ＤＰＰ４、ＡＴＰ１Ａ１、ＦＡＰ、ＶＡＳＮ、ＩＧＦ２Ｒ、およびＣＤ８２からなる群から選択される。
いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソームは、線維芽細胞エキソソームと比較して濃縮された１以上のマーカーを含み、該１以上のマーカーは、ＲＣＮ１、ＲＡＰ１Ｂ、ＧＤＦ１５、ＦＬＴ１、ＯＬＦＭＬ３、ＰＬＯＤ２、ＰＳＭＡ４、ＰＡＰＰＡ、ＩＮＨＢＡ、ＳＰＯＣＫ１、ＨＳＰＢ１、ＬＯＸＬ４、ＰＯＬＤ３、ＣＡＬＵ、ＩＧＦＢＰ４、Ｃ４Ｂ、ＴＩＮＡＧＬ１、ＳＵＬＦ１、ＴＰＭ３、ＡＨＮＡＫ、ＣＡＬＲ、ＲＲＡＳ２、ＰＦＫＰおよびＣＯＬ１６Ａ１からなる群から選択される。
【０００６】
いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソームは、ＦＬＯＴ１、ＣＤ９、およびＣＤ６３からなる群から選択される１以上のマーカーをさらに含む。
いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソームは、ＭＳＣ馴化培地から単離されている。いくつかの態様において、ＭＳＣは、ホウォートンゼリーまたは骨髄からのものである。いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソームは、非エキソソームタンパク質夾雑物を実質的に含まない。いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソームは、約３０〜１５０ｎｍの直径を有する。いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソームは免疫調節活性を有する。
さらに本明細書に提供されるのは、本明細書に記載の単離されたＭＳＣエキソソームを含む医薬組成物である。いくつかの態様において、医薬組成物は二次薬剤をさらに含む。いくつかの態様において、二次薬剤は、肺サーファクタント、ステロイド、抗酸化剤、または吸入された一酸化窒素である。いくつかの態様において、医薬組成物は薬学的に許容し得る担体をさらに含む。
【０００７】
本開示の他の側面は、肺疾患を処置する方法を提供し、該方法は、有効量の単離された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）エキソソームまたは本明細書に記載の医薬組成物を、これを必要とする対象に投与することを含む。
いくつかの態様において、対象はヒト対象である。いくつかの態様において、ヒト対象は妊娠３７週前に生まれている。いくつかの態様において、ヒト対象は妊娠２６週前に生まれている。いくつかの態様において、対象は過酸素症に誘発された肺損傷を有する。いくつかの態様において、対象には酸素が投与されていたか、または対象に人工呼吸器が取り付けられていた。いくつかの態様において、対象は気管支肺異形成症（ＢＰＤ）を発症しているか、または発症するリスクがある。いくつかの態様において、対象は過酸素症に誘発された肺高血圧症を有する。いくつかの態様において、対象は末梢肺動脈リモデリングを示す。いくつかの態様において、対象は肺において炎症を有する。
【０００８】
いくつかの態様において、対象は４週齢未満である。いくつかの態様において、対象は３〜１８歳である。いくつかの態様において、対象は成人である。
いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソームは、ボーラス用量で対象に投与される。いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソームは、繰り返し対象に投与される。
いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソームは、肺機能を改善する。いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソームは、肺構造を回復する。いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソームは、肺線維症を低減する。いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソームは、肺における炎症を低減する。いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソームは、末梢肺動脈リモデリングを低減する。
【０００９】
いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソームは、生後１時間以内に投与される。いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソームは、生後１月以内に投与される。
いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソームは、静脈内または鼻腔内に投与される。いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソームは、対象の肺または気管に投与される。いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソームは、吸入によって投与される。いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソームは、エアロゾルで投与される。いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソームは、ネブライザーを使用して投与される。いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソームは、気管内チューブを使用して投与される。
いくつかの態様において、対象は哺乳動物である。いくつかの態様において、哺乳動物はヒトである。いくつかの態様において、哺乳動物は齧歯類の動物である。いくつかの態様において、齧歯類の動物はマウスまたはラットである。
【００１０】
単離された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）エキソソームおよび本明細書に記載の医薬組成物は、肺疾患を処置するための医薬の製造においても使用され得る。
本開示の他の側面は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ） エキソソームを単離する方法を提供し、該方法は、イオジキサノール（ＩＤＸ）クッション勾配を使用してＭＳＣ馴化培地を分画すること、および、非エキソソームタンパク質夾雑物を実質的に含まない画分を収集することを含む。いくつかの態様において、ＭＳＣ馴化培地は、分画前に濃縮される。いくつかの態様において、ＭＳＣ馴化培地は、タンジェント流濾過を介して濃縮される。いくつかの態様において、分画することは、ＭＳＣ馴化培地をIDX クッション勾配上で浮遊させることおよび超遠心分離することを含む。
本明細書に記載の単離の方法を使用して単離されたＭＳＣエキソソームもまた提供される。
上記の概要は、本明細書に開示された技術の態様、利点、特徴、および使用のいくつかを非限定的に例示することを意図している。 本明細書に開示される技術の他の態様、利点、特徴、および使用は、詳細な説明、図面、例、および特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【００１１】
図面の簡単な説明
添付の図面は縮尺通りに描かれることを意図したものではない。図面において、様々な図に示される同一またはほぼ同一の各構成要素は、同様の数字で表されている。明確にするために、すべての構成要素がすべての図面で標識されているわけではない。特許または出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１の図面を含む。カラー図面（単数または複数）を有するこの特許または特許出願の刊行物のコピーは、請求および必要な料金の支払いに応じて庁によって提供される。図面内：
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ−Ｂ】図１Ａ〜１Ｆ。エキソソーム（ＥＶ）の精製、単離、および特性解析。（図１Ａ）ＷＪＭＳＣ、ＢＭＳＣ、およびＨＤＦは、タンジェント流濾過を介して結合および濃縮された連続差動遠心分離によって単離され得る異種ＥＶを分泌する。（図１Ｂ）濃縮（５０ｘ）馴化培地（ＣＭ）をイオジキサノール（ＩＤＸ）クッション勾配に浮遊させて、ＥＶ集団（画分９、密度約１．１８ｇ／ｍｌ）を精製および単離した。
【図１Ｃ】（図１Ｃ）ナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）とタンパク質濃度を使用して、ＩＤＸクッション（１２×１ｍｌ画分）におけるＥＶ濃度と粒子：タンパク質比をそれぞれ評価した。線はタンパク質濃度を示し、棒グラフはＮＴＡによるナノ粒子濃度を反映している。画分密度はｇ／ｍｌで表される。
【図１Ｄ】（図１Ｄ）対応する画分９勾配から単離されたＷＪＭＳＣ-ＥＶ、ＢＭＳＣ-ＥＶ、およびＨＤＦ-ＥＶの代表的なサイズ分布。
【図１Ｅ−Ｆ】（図１Ｅ）異種ＥＶ形態を示す透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像（高倍率、×３０，０００、スケールバー＝１００ｎｍ）。（図１Ｆ）ＩＤＸクッション勾配画分は、エキソソームマーカーであるフロチリン（ＦＬＯＴ-１）およびテトラスパニンＣＤ６３およびＣＤ９を表すタンパク質に対する抗体を使用して、ウエスタンブロット（画分１-６および７-１２、並列）によって分析された。レーンごとに同等の体積の各画分がロードされ、代表的な画像が示されている。
【００１３】
【図２】図２Ａ〜２Ｂ。ＭＳＣ-ＥＶ処置は、短期間の肺構造の転帰を改善する。新生児ＦＶＢマウスはＨＹＲＸ（７５％Ｏ２）に７日間暴露された。ＨＹＲＸ暴露マウスはＮＲＭＸ（室内空気）にとどまったマウスと比較された。ＥＶ処置はＰＮ４で静脈内（ＩＶ）送達された。ＰＮ１４で短期転帰が評価された（図２Ａに示された概略図）。（図２Ｂ）収集された肺切片はヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色された。挿入物は２００×の倍率で撮影された。ＨＹＲＸ-対照およびＨＤＦ-ＥＶ処置マウスは、大きな空域と不完全な肺胞形成を特徴とする顕著な肺胞単純化を示した。ＷＪＭＳＣ-ＥＶまたはＢＭＳＣ-ＥＶのいずれかのボーラス用量を受けたＨＹＲＸ暴露動物は、ＨＹＲＸ対照マウスの肺気腫様の外観と比較して、著しく改善された肺胞形成を有した。平均線形切片の定量化（ＭＬＩ、μｍ）は、平均空域直径のサロゲートを表す。データは、３つの個別の研究の結果を表す。平均±ＳＥＭ、ｎ＝１群あたり５〜１５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。スケールバー＝１００μｍ。
【００１４】
【図３】図３。ＭＳＣ-ＥＶ処置は肺の構造を改善し、ＨＹＲＸ誘発線維症を低減する。長期転帰については、ＰＮ４２でマウスを評価した（６週間）。肺切片をＨ＆Ｅおよびマッソントリクロームで染色して、それぞれ肺胞の単純化および線維症の程度を評価した。Nikon Eclipse 80i顕微鏡を使用して１００×（Ｈ＆Ｅ）および２００×（マッソントリクローム）の倍率で切片を撮影し、肺胞の単純化と中隔野のコラーゲン沈着を示す中程度の肺線維症を示した。ＨＹＲＸ対照動物の肺気腫様外観と比較して、ＷＪＭＳＣ-ＥＶまたはＢＭＳＣ-ＥＶを受けたマウスは、ＮＲＭＸ対照（Ｈ＆Ｅ染色）に似た修復された肺胞発達を示した。コラーゲン沈着を評価すると、矢印で強調されているように、ＮＲＭＸ対照と比較すると、ＨＹＲＸ対照は中隔コラーゲン沈着のわずかではあるが有意な増加を有した（マッソントリクローム染色）。ＷＪＭＳＣ-ＥＶまたはＢＭＳＣ-ＥＶのいずれかを受けたＨＹＲＸ暴露マウスのＮＲＭＸ対照のレベルが回復した。平均線形切片（ＭＬＩ、μｍ）を測定することにより、肺胞単純化の定量化が行われた。コラーゲン沈着は線維症のサロゲートとして使用され、中隔野の％として報告された。平均±ＳＥＭ、ｎ＝１群あたり４〜５、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。Ｈ＆Ｅスケールバー＝１００μｍ。マッソントリクロームスケールバー＝５０μｍ。
【００１５】
【図４Ａ−Ｆ】図４Ａ〜４Ｆ。ＭＳＣ−ＥＶ投与は、肺高血圧症を改善し、末梢肺動脈リモデリングを救済し、過酸素症に誘発された肺損傷後の肺機能を改善する。ＷＪＭＳＣ−ｅｘｏとＢＭＳＣ−ｅｘｏ処置の間の違いを示唆する最小限の証拠により、長期の肺構造、線維症および肺血管系に対する有益な効果に関して、我々のエキソソーム処置（ＷＪＭＳＣ−ＥＶとＢＭＳＣ−ＥＶ）が一緒にプロットされ、ＭＳＣ−ＥＶと称された。ＨＹＲＸ誘発末梢肺血管リモデリングに対するＭＳＣ−ＥＶの潜在的な影響を評価するために、ＰＮ４２で収集されたマウスの肺切片はα平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）で染色された。（図４Ａ）ＨＹＲＸ対照では、それらのＮＲＭＸの対応物と比較して増加した肺血管リモデリングが明らかであり、ＭＳＣ−ＥＶ処置は肺血管リモデリングのＨＹＲＸに誘発された増加を鈍化させた。挿入物は２００×の倍率で撮影された。（図４Ｂ）内壁厚指数＝１００×（面積［ｅｘｔ］−面積［ｉｎｔ］）／面積［ｅｘｔ］）。面積［ｅｘｔ］および面積［ｉｎｔ］は、それぞれα−ＳＭＡ層の外部および内部境界内の面積を示す。平均±ＳＥＭ、ｎ＝１群あたり４〜５。スケールバー＝５０μｍ。（図４Ｃ）肺高血圧症の程度を定量化するために、直接ＲＶＳＰ測定が行われた。（図４Ｄ）右心室と体重（ＲＶ：ＢＷ）の比率の評価。平均±ＳＥＭ、ｎ＝１群あたり６〜１２。（図４Ｅ〜４Ｆ）出生後４２日目に肺機能試験が行われた。（図４Ｅ）全肺容量は、ＭＳＣ-ＥＶ処置により大幅に改善された。（図４Ｆ）圧力−体積（ＰＶ）の関係は、代表的なＰＶループを示し、ＨＹＲＸ対照動物の上方および左方への有意なシフトを示す。これは、ＮＲＭＸ対照と比較した場合の肺疾患および空気捕捉の肺気腫様の特徴を示す。単回用量のＭＳＣ-ＥＶを受けたＨＹＲＸ暴露動物は、ＰＶループの下方および右方への有意なシフトを示した（図４Ｆ）。平均±ＳＥＭ、ｎ＝１群あたり５〜８、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【００１６】
【図４Ｇ−Ｈ】（図４Ｇ）ＭＳＣ-ｅｘｏは、末梢微小血管系のＨＹＲＸによって誘発された血管の喪失を防ぐ。ＰＮ４２で収集されたマウスで、フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）の肺切片が染色された。外径２５と１５０μｍとの間のｖＷＦ陽性血管を、８〜１２のランダムビューで１００×の倍率でカウントした。代表的な免疫蛍光染色は、ＮＲＭＸ対照マウスと比較してＨＹＲＸ暴露で小さな血管（直径＜５０μｍ）の著しい喪失、および、小さい（＜５０μｍ）血管の数がＭＳＣ-ｅｘｏの保護効果を示す。平均±ＳＥＭ、ｎ＝１群あたり５〜１０。スケールバー＝１００μｍ。矢印はｖＷＦで染色された肺血管を強調している。（図４Ｈ）図４Ｇで得られた結果の定量化。
【００１７】
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｂ。ＷＪＭＳＣ-ＥＶ処置は、過酸素症肺トランスクリプトームを調節し、ＨＹＲＸ誘発炎症を鈍化させる。ＰＮ７での全マウス肺ｍＲＮＡのポリＡ捕捉ＲＮＡｓｅｑは、ＮＲＭＸ対照（ｎ＝３）、ＨＹＲＸ対照動物（ｎ＝２）、およびＷＪＭＳＣ-ＥＶ処置動物（ｎ＝３）のサブセットで行われた。（図５Ａ）ＰＮ７で調整されたｐ値でランク付けされた上位５０の差次的に発現した遺伝子をカタログ化したヒートマップ。
【図５Ｂ】（図５Ｂ）別の実験でＲＴ-ｑＰＣＲによって評価された、ＭＳＣ-ＥＶ処置による炎症促進性マーカーの抑制を示す選択遺伝子プロファイルの検証。ここでは、エキソソーム処置の結果（ＷＪＭＳＣエキソソームとＢＭＳＣエキソソーム）が一緒にプロットされ、ＭＳＣ-ＥＶと称された。箱ひげ図は中央値（最小−最大）を表し、ｎ＝１群あたり３〜８、＊ｐ＜０．０５。
【００１８】
【図６Ａ−Ｂ】図６Ａ〜６Ｄ。ＭＳＣ−ＥＶの免疫調節能力：マクロファージ極性化能アッセイ。マクロファージの極性化は、発達中の肺の免疫応答と炎症の調節に重要な役割を果たす。（図６Ａ）炎症促進性Ｍ１表現型に極性化したマウス骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）または肺胞マクロファージ（ＭＨ-Ｓ細胞）にＷＪＭＳＣ-ＥＶを追加すると、Ｉｌ６、Ｃｃｌ５、およびＴＮＦαなどのマーカーのｍＲＮＡ誘導が減少した。（図６Ｂ）別の（Ｍ２）極性化マクロファージへのＷＪＭＳＣ-ＥＶの追加は、アルギナーゼ-１（Ａｒｇ-１）ｍＲＮＡをさらに誘発し、レジスチン様アルファ（Ｒｅｔｎｌａ）およびＣｄ２０６誘導を調節した。フローサイトメトリーを使用して、肺マクロファージ（Ｃｄ４５＋ｖｅ、Ｃｄ１１ｂ-ｖｅ、Ｃｄ１１ｃ＋ｖｅ、Ｃｄ６４＋ｖｅ）の表現型が評価された。
【図６Ｃ−Ｄ】（図６Ｃ）Ｍ１マーカーＣｄ４０とＣｄ８６ならびにＭ２マーカーＣｄ２０６がＰＮ７とＰＮ１４で評価された。蛍光強度中央値（ＭＦＩ）が記録された。（図６Ｄ）Ｃｄ４０、Ｃｄ８６、およびＣｄ２０６の代表的なヒストグラム（図６Ｄ）。平均±ＳＥＭ、ｎ＝１群あたり４〜８、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【００１９】
【図７Ａ】図７Ａ〜７Ｂ。細胞表面マーカーのサイトメトリー分析。４継代目の細胞のサイトメトリー分析からの代表的なヒストグラム。ヒト臍帯ＷＪＭＳＣ（図７Ａ）およびヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）（図７Ｂ）の両方は、ＣＤ１０５、ＣＤ９０、ＣＤ７３およびＣＤ４４を発現するが、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３１、ＣＤ３４およびＣＤ４５の発現を欠く。染色されていない対照はより淡い灰色のヒストグラムで、結合抗体染色された細胞はより濃い灰色で示されている。
【図７Ｂ】図７Ａ〜７Ｂ。細胞表面マーカーのサイトメトリー分析。４継代目の細胞のサイトメトリー分析からの代表的なヒストグラム。ヒト臍帯ＷＪＭＳＣ（図７Ａ）およびヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）（図７Ｂ）の両方は、ＣＤ１０５、ＣＤ９０、ＣＤ７３およびＣＤ４４を発現するが、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３１、ＣＤ３４およびＣＤ４５の発現を欠く。染色されていない対照はより淡い灰色のヒストグラムで、結合抗体染色された細胞はより濃い灰色で示されている。
【００２０】
【図８】図８。間葉系幹細胞の分化能力。骨細胞、脂肪細胞、および軟骨細胞系統に対するＷＪＭＳＣおよびＨＤＦ培養のin vitro分化能が、市販のキットを使用して評価された。ＨＤＦとは対照的に、ＷＪＭＳＣは、それぞれの分化培地に供されたときに、カルシウム沈着（アリザリンレッドＳ染色を使用して視覚化）、脂肪滴（脂肪形成、その後オイルレッドを使用して染色）、および正の軟骨細胞形成（アルシアンブルー染色）を示した。
【００２１】
【図９Ａ−Ｂ】図９Ａ〜９Ｆ。ＰＮ７およびＰＮ１４のマウス肺からのｍＲＮＡ配列決定データのグローバル分析。（図９Ａ）ＰＮ７またはＰＮ１４のマウス肺から抽出されたＲＮＡから得られた遺伝子発現プロファイルの主構成要素分析（ＰＣＡ）。（図９Ｂ）ＮＲＭＸマウス対ＨＹＲＸ暴露マウス、およびＮＲＭＸ対ＰＮ７およびＰＮ１４のＭＳＣ−ＥＶで処置したＨＹＲＸ暴露マウスのＭＡプロット。ＭＡプロットは、平均発現（正規化されたカウント）と比較したｍＲＮＡ発現の対数変化を示す。ＤＥＳｅｑ２を使用して、赤でマークされた差次的に発現される転写産物（ｐａｄｊ＜０．１）を決定した。
【図９Ｃ−Ｅ】（図９Ｃ）ＨＹＲＸおよびＮＲＭＸ対照と比較して、ＭＳＣ−ＥＶ処置によって独自に上方調節された遺伝子（ＰＮ７）の遺伝子オントロジー（ＧＯ）濃縮分析（生物学的プロセス）の上位１０カテゴリー。（図９Ｄ）ＮＲＭＸマウスと比較してＨＹＲＸ群で上昇した遺伝子。（図９Ｅ）ＨＹＲＸ対照マウスと比較してＭＳＣ−ＥＶ処置によって有意に抑制された遺伝子のＧＯ濃縮分析（生物学的プロセス）の上位１０カテゴリー。
【図９Ｆ】（図９Ｆ）ＰＮ１４でのＭＳＣ−ＥＶ処置によって有意に調節される遺伝子を強調するヒートマップ。
【００２２】
【図１０Ａ】図１０Ａ〜１０Ｂ。肺胞マクロファージとＷＪＭＳＣ−ＥＶの相互作用。（図１０Ａ）蛍光顕微鏡を使用して、ＷＪＭＳＣ−ＥＶが肺胞マクロファージ（ＭＨ−Ｓ細胞）と容易に相互作用することが観察された。スケールバー＝２０μｍ。
【図１０Ｂ】（図１０Ｂ）用量依存的な方法で、ＭＨ−Ｓ細胞にＷＪＭＳＣ−ＥＶを追加すると、Ｃｃｌ５およびＴＮＦαなどの古典的に活性化された（Ｍ１）マクロファージマーカーのｍＲＮＡ誘導が減少したが、ＷＪＭＳＣ−ＥＶを代わりに極性化（Ｍ２）マクロファージに用量依存的に追加すると、Ａｒｇ−１ｍＲＮＡの誘導を増加させた。＋０．０５〜０．５×１０６は、ＭＳＣ−ＥＶ（細胞当量）用量を指す。平均±ＳＥＭ、ｎ＝１群あたり３〜５、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【００２３】
【図１１】図１１。代表的なin vivo肺マクロファージゲーティング戦略。マウス肺の肺マクロファージ細胞集団を同定するために使用される代表的なゲーティング戦略。細胞は、酵素で消化されたマウス肺から単離された。細胞凝集体および細胞破片（前方および側方散乱パラメータに基づく）を除き、免疫細胞はＣｄ４５染色により同定された。シーケンシャルゲーティング戦略を使用して、特定のマーカー（Ｃｄ４５＋ｖｅ、Ｃｄ１１ｂ−ｖｅ、Ｃｄ１１ｃ＋ｖｅ、Ｃｄ６４＋ｖｅ）を発現している肺マクロファージ集団を同定した。肺マクロファージの同定後、陽性マクロファージ表現型マーカー（Ｃｄ４０、Ｃｄ８６、およびＣｄ２０６（上記で選択）は、適切な蛍光マイナス−１対照と比較することにより評価された。左ヒストグラム：（Ｃｄ４５＋ｖｅ、Ｃｄ１１ｂ−ｖｅ、Ｃｄ１１ｃ＋ｖｅ、Ｃｄ６４＋ｖｅおよびＣｄ２０６−ｖｅ）。右ヒストグラム：（Ｃｄ４５＋ｖｅ、Ｃｄ１１ｂ−ｖｅ、Ｃｄ１１ｃ＋ｖｅ、Ｃｄ６４＋ｖｅおよびＣｄ２０６＋ｖｅ）。
【００２４】
【図１２】図１２。ＷＪＭＳＣ−ｅｘｏ投与は、損傷していない肺には影響しない。ＮＲＭＸ対照動物は、ＰＮ４でＷＪＭＳＣ−ｅｘｏの単回静脈内（ＩＶ）用量を受けた（「方法」で説明）。ＰＮ１４での肺構造の評価では、ＮＲＭＸ対照マウスとＷＪＭＳＣ−ｅｘｏで処置したＮＲＭＸマウスの間に違いは見つからなかった（ｐ＝０．９）。ＭＬＩ：平均線形切片。
【００２５】
【図１３Ａ−Ｂ】図１３Ａ〜１３Ｄ。ＷＪＭＳＣ−ｅｘｏおよびＢＭＳＣ−ｅｘｏ処置は、肺高血圧症の改善において同様の傾向を示し、過酸素症に誘発された微小血管系の喪失を防ぎ、末梢肺動脈リモデリングを救済する。（図１３Ａ）ＨＹＲＸ誘発末梢肺血管リモデリングに対するＭＳＣ−ｅｘｏ処置の潜在的影響を評価するため、ＰＮ４２で収集されたマウスの肺切片がα平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）で染色された。内壁厚指数＝１００×（面積［ｅｘｔ］−面積［ｉｎｔ］）／面積［ｅｘｔ］）。面積［ｅｘｔ］および面積［ｉｎｔ］は、それぞれα−ＳＭＡ層の外部および内部境界内の面積を示す。ＮＲＭＸおよびＨＹＲＸ対照と比較した２つのＭＳＣ−ｅｘｏ群（ＷＪＭＳＣ−ｅｘｏおよびＢＭＳＣ−ｅｘｏ）について内壁厚の値が示されている。ｎ＝１群あたり４〜５。（図１３Ｂ）ＭＳＣ−ｅｘｏは、末梢血管の過酸素症に誘発された血管の喪失を防ぐ。ＰＮ４２で収集されたマウスで、フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）について肺切片が染色された。
【図１３Ｃ−Ｄ】１群あたりｎ＝５。肺高血圧症の程度を定量化するために、我々は、ＰＮ４２のマウスでＲＶＳＰの直接測定を行い（図１３Ｃ）、フルトン指数を評価した（図１３Ｄ）。ｎ＝１群あたり６〜１２。平均±ＳＥＭ。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、¶ｐ＝０．０６対ＨＹＲＸ。
【００２６】
【図１４】図１４。ＷＪＭＳＣ−ｅｘｏおよびＢＭＳＣ−ｅｘｏは肺トランスクリプトームを変化させる。選択された全肺ＲＮＡ−ｓｅｑデータの検証とＷＪＭＳＣ−ｅｘｏおよびＢＭＳＣ−ｅｘｏ処置による候補炎症促進性マーカーの抑制は、別々の実験でＲＴ−ｑＰＣＲによって評価された。平均値±ＳＥＭ、ｎ＝１群あたり３〜４、＊ｐ＜０．０５対ＨＹＲＸ対照。
【００２７】
特定の態様の詳細な記載
本開示は、少なくとも部分的に、間葉系幹細胞エキソソーム（ＭＳＣエキソソーム）が異種であり、全ＭＳＣエキソソームの亜集団が肺疾患、例えば気管支肺異形成症（ＢＰＤ）の処置におけるＭＳＣエキソソームの治療的な有効性をもたらすという驚くべき発見に基づいている。ＭＳＣエキソソームの精製画分は、エキソソーム含有量が高く、タンパク質夾雑物が少ない。ＭＳＣエキソソームの他の画分または他の細胞型に由来するエクソームと比較して、ＭＳＣエキソソームの精製画分に差次的に表されるタンパク質マーカーが同定される。精製されたＭＳＣエキソソームは、免疫調節活性を有することがわかり、様々な障害（例えば肺疾患）の処置に有効である。エキソソームの亜集団を精製する方法も提供される。
【００２８】
したがって、本開示のいくつかの側面は、単離されたＭＳＣエキソソームに関する。「エキソソーム」は、細胞（例えば、任意の真核細胞）から放出される膜（例えば、脂質二重層）ベシクルである。エキソソームは、血液、尿、および細胞培養の培養培地を含む真核生物の液体に含まれている。本開示のエキソソームは、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）から放出され、「間葉系幹細胞エキソソーム」または「ＭＳＣエキソソーム」と互換的に称される。同様に、線維芽細胞から放出されるエキソソームは、本明細書では「線維芽細胞エキソソーム」と称される。驚くべきことに、他の細胞型、例えば線維芽細胞から放出されたエキソソームは、ＭＳＣエキソソームと同じ特性（例えば、タンパク質マーカーおよび生物活性）を有しないことが本明細書で発見された。
【００２９】
「間葉系幹細胞（ＭＳＣ）」は、神経細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、筋細胞、心臓組織、および他の内皮細胞または上皮細胞に分化する能力を有する前駆細胞である。（例えば、Wang, Stem Cells 2004;22(7);1330-7; McElreavey;1991 Biochem Soc Trans (1);29s; Takechi, Placenta 1993 March/April; 14 (2); 235-45; Takechi, 1993; Kobayashi; Early Human Development;1998; July 10; 51 (3); 223-33; Yen; Stem Cells; 2005; 23 (1) 3-9. を参照。）これらの細胞は、遺伝子またはタンパク質発現によって表現型的に定義され得る。これらの細胞は、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ４９ａ、ｂ、ｃ、ｅ、ｆ、ＣＤ５１、ＣＤ５４、ＣＤ５８、ＣＤ７１、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０２、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤｗ１１９、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１２４、ＣＤ１２６、ＣＤ１２７、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１６６、Ｐ７５、ＴＧＦ−ｂＩＲ、ＴＧＦ−ｂＩＩＲ、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｄ７およびＰＤ−Ｌ１の１以上を発現する（したがって陽性である）ことを特徴としている。これらの細胞は、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１８、ＣＤ２１、ＣＤ２５、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５０、ＣＤ６２Ｅ、Ｌ、Ｓ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９５、ＣＤ１１７、ＣＤ１３３、ＳＳＥＡ−１、およびＡＢＯを発現していない（したがって陰性である）としても特徴付けられている。よって、ＭＳＣは、分化の可能性に従って表現型的および／または機能的に特徴付けられ得る。
【００３０】
ＭＳＣは、骨髄、血液、骨膜、真皮、臍帯血および／またはマトリックス（例えば、ホウォートンゼリー）、および胎盤を含むが、これらに限定されない多くの供給源から収集され得る。ＭＳＣを収集するための方法は、当該技術分野、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許番号5486359に記載されている。
ＭＳＣは、組織培養プラスチックへの付着に基づいて、複数の供給源、例えば骨髄単核細胞、臍帯血、脂肪組織、胎盤組織から単離され得る。例えば、ＭＳＣは市販の骨髄吸引液から単離され得る。細胞集団内のＭＳＣの濃縮は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を含むがこれに限定されない当該技術分野において知られている方法を使用して達成され得る。
【００３１】
ＭＳＣの成長、培養、および維持には、市販の培地が使用され得る。かかる培地は、ダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）を含むが、これに限定されない。ＭＳＣ、線維芽細胞、およびマクロファージの成長、培養、および維持に有用であるかかる培地の構成要素は、アミノ酸、ビタミン、炭素供給源（天然および非天然）、塩、糖、植物由来の加水分解物、ピルビン酸ナトリウム、サーファクタント、アンモニア、脂質、ホルモンまたは成長因子、バッファー、非天然アミノ酸、糖前駆体、指示薬、ヌクレオシドおよび／またはヌクレオチド、酪酸または有機物、ＤＭＳＯ、動物由来産物、遺伝子誘導物質、非天然糖、細胞内ｐＨの調節剤、ベタインまたは浸透圧保護剤、微量元素、ミネラル、非天然ビタミンを含むが、これらに限定されない。市販の組織培養培地を補充するために使用され得る追加の構成要素は、例えば、動物血清（例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、ウマ血清（ＨＳ））、抗生物質（例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン、硫酸ネオマイシン、アンホテリシンＢ、ブラストサイジン、クロラムフェニコール、アモキシシリン、バシトラシン、ブレオマイシン、セファロスポリン、クロルテトラサイクリン、ゼオシン、およびピューロマイシン）、およびグルタミン（例えば、Ｌ−グルタミン）を含む。間葉系幹細胞の生存と成長は、適切な好気性環境、ｐＨ、および温度の維持にも依存する。ＭＳＣは、例えば、参照により本明細書に組み込まれるPittenger et al., Science, 284:143-147 (1999)に記載されるように、当該技術分野において知られている方法を使用して維持され得る。
【００３２】
線維芽細胞は、細胞外マトリックスとコラーゲン、動物組織の構造的フレームワーク（例えば、間質）を合成する細胞の一種であり、創傷治癒に重要な役割を果たす。線維芽細胞は、動物の結合組織の最も一般的な細胞である。線維芽細胞は、典型的には、２以上の核小体を有する楕円形の斑点状核を取り囲む分枝の細胞質を有する。活性な線維芽細胞は、豊富な粗面小胞体によって認識され得る。線維細胞（fibrocyte）とも呼ばれる非活性の線維芽細胞は、より小さく紡錘形である。それらは低減された粗面小胞体を有する。
線維芽細胞の供給源は、緩い、密な、弾性のある、網状の、および脂肪の結合組織などの結合組織を含む。さらに、胚性結合組織だけでなく、骨、軟骨、および血液を含む特殊な結合組織もある。他の供給源は皮膚を含む。線維芽細胞を単離および培養する方法は、当該技術分野において周知である（例えば、以下を参照：Weber et al., “Isolation and Culture of Fibroblasts, Vascular Smooth Muscle, and Endothelial Cells From the Fetal Rat Ductus Arteriosus.”  Pediatric Research. 2011; 70, 236-241; Huschtscha et al., “Enhanced isolation of fibroblasts from human skin explants.” Biotechniques. 2012;53(4):239-44；これらの全体の内容は参照によって本明細書に組み込まれる）。
【００３３】
本開示のいくつかの側面は、単離されたエキソソームに関する。本明細書で使用される場合、「単離されたエキソソーム」は、その天然の環境から物理的に分離されているエキソソームである。単離されたエキソソームは、ＭＳＣ、線維芽細胞、およびマクロファージを含む、それが天然に存在する組織または細胞から、全体的または部分的に物理的に分離されていてもよい。いくつかの態様において、単離されたエキソソームは、単離されたＭＳＣエキソソームである。いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソームは、ヒト骨髄または臍帯ホウォートンゼリーからのＭＳＣの培養培地から単離される。かかる培養培地は、本明細書では「ＭＳＣ馴化培地」と呼ばれる。いくつかの態様において、単離されたエキソソームは、ＭＳＣなどの細胞を含まなくてもよく、または馴化培地を含まないかまたは実質的に含まなくてもよく、またはタンパク質などの生物学的夾雑物を含まなくてもよい。典型的には、単離されたエキソソームは、操作されていない馴化培地中に存在するエキソソームよりも高い濃度で提供される。
【００３４】
本開示の単離されたＭＳＣエキソソームは、他の細胞型（例えば、線維芽細胞）に由来するエキソソーム、または精製プロセスから生じる他の画分に比べて存在または濃縮されるマーカー（例えば、タンパク質）について特徴付けられる。本明細書で使用される「マーカー」は、ＭＳＣエキソソームに関連し、本明細書に記載される精製方法においてＭＳＣエキソソームと同時精製される分子（例えば、タンパク質）を指す。ＭＳＣエキソソームに関連付けられているマーカーは、ＭＳＣエキソソームの脂質膜に結合し得るか（例えば、外表面に結合する、または脂質膜に挿入される）、ＭＳＣエキソソームによってカプセル化され得る。エキソソーム中の特定のマーカーを検出する方法、例えば、ウエスタンブロッティング、免疫染色、または質量分析は、当業者に知られている。
【００３５】
いくつかの態様において、本開示の単離されたＭＳＣエキソソームは、以下からなる群から選択されるマーカーの１以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１）を含む：ＦＬＴ１（血管内皮成長因子受容体１、Uniprot ID P17948）、ＰＬＡＵＲ（ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター表面受容体、Uniprot ID Q03405）、ＭＭＥ（ネプリライシン、Uniprot ID P08473）、ＣＤＨ２（カドヘリン２、P19022）、ＳＬＣ１６Ａ３（モノカルボキシラートトランスポーター４、Uniprot ID: O15427）、ＣＤＨ１３（カドヘリン１３、Uniprot ID: P55290）、ＩＴＧＢ５（インテグリンベータ５、Uniprot ID: P18084）、ＩＴＧＡ１１（インテグリンアルファ１１、Uniprot ID: Q9UKX5）、ＡＰＰ（アミロイドベータＡ４タンパク質、Uniprot ID: P05067）、ＧＰＣ６（グリピカン６、Uniprot ID: Q9Y625）、ＩＧＳＦ８（免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー８、Uniprot ID: Q969P0）、ＩＲＰ２（鉄応答要素結合タンパク質２（ＩＲＥＢ２としても知られる）、uniprot ID: P48200)、ＴＳＰＡＮ９（テトラスパニン９、Uniprot ID: O75954）、ＤＡＧ１（ジストログリカン、Uniprot ID: Q14118）、ＳＬＣ３８Ａ２（ナトリウム結合中性アミノ酸トランスポーター２、Uniprot ID: Q96QD8）、ＳＬＣ１２Ａ８（溶質担体ファミリー１２メンバー８、Uniprot ID: A0AV02）、ＧＪＡ１（ギャップジャンクションアルファ１タンパク質、Uniprot ID: P17302）、ＩＴＧＡ１（インテグリンアルファ１、Uniprot ID: P56199）、ＰＬＸＮＢ２（プレキシンＢ２、Uniprot ID: O15031）、ＳＬＣ１６Ａ１（モノカルボキシラートトランスポーター１、Umiprot ID: P53985）、およびＰＲＯＣＲ（内皮タンパク質Ｃ受容体、Uniprot ID: Q9UNN8）。単離されたＭＳＣエキソソームが「マーカーを含む」とは、マーカーが、例えばウエスタンブロッティング、免疫染色、または質量分析によって、単離されたエキソソーム中で検出可能であることを意味する。いくつかの態様において、マーカーは、ＭＳＣ以外の細胞型、例えば線維芽細胞に由来するエキソソーム中に存在しない（例えば、検出不可能）。
【００３６】
いくつかの態様において、本開示の単離されたＭＳＣエキソソームは、線維芽細胞エキソソームと比較して濃縮された１以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２）のマーカーを含み、該１以上のマーカーは以下からなる群から選択される：ＰＴｋ７（非活性チロシンタンパク質キナーゼ７、Uniprot ID: Q13308）、ＣＤ１０９（ＣＤ１０９抗原、Uniprot ID: Q6YHK3）、ＳＬＣ１Ａ５（中性アミノ酸トランスポーターＢ（０）、Uniprot ID: Q15758）、ＩＴＧＡ３（インテグリンアルファ３、Uniprot ID: P26006）、ＩＴＧＡ２（インテグリンアルファ２、Uniprot ID: P17301）、ＢＳＧ（バシギン、Uniprot ID: P35613）、ＤＰＰ４（ジペプチジルペプチダーゼ４、Uniprot ID: P27487）、ＡＴＰ１Ａ１（ナトリウム／カリウム輸送ＡＴＰａｓｅサブユニットアルファ１、Uniprot ID: P05023）、ＦＡＰ（プロリルエンドペプチダーゼＦＡＰ、Uniprot ID: Q12884）、ＶＡＳＮ（バソリン、Uniprot ID: Q6EMK4）、ＩＧＦ２Ｒ（カチオン非依存性マンノース６リン酸受容体、Uniprot ID: P11717）、およびＣＤ８２（ＣＤ８２抗原、Uniprot ID: P27701）。
【００３７】
いくつかの態様において、本開示の単離されたＭＳＣエキソソームは、線維芽細胞エキソソームと比較して濃縮された１以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４）のマーカーを含み、該１以上のマーカーは以下からなる群から選択される：ＲＣＮ１（レチクロカルビン１、Uniprot ID: Q15293）、ＲＡＰ１Ｂ（Ｒａｓ関連タンパク質Ｒａｐ−１ｂ、Uniprot ID: P61224）、ＧＤＦ１５（成長／分化因子15、Uniprot ID: Q99988）、ＦＬＴ１（血管内皮成長因子受容体１、Uniprot ID: P17948）、ＯＬＦＭＬ３（オルファクトメジン様タンパク質３、Uniprot ID: Q9NRN5）、ＰＬＯＤ２（プロコラーゲンリシン，２オキソグルタル酸５ジオキシゲナーゼ２、Uniprot ID: O00469）、ＰＳＭＡ４（プロテアソームサブユニットアルファタイプ４、Uniprot ID: P25789）、ＰＡＰＰＡ（パパリシン１、Uniprot ID: Q13219）、ＩＮＨＢＡ（インヒビンベータＡ鎖、Uniprot ID: P08476）、ＳＰＯＣＫ１（テスティカン１、Uniprot ID: Q08629）、ＨＳＰＢ１（熱ショックタンパク質ベータ１、Uniprot ID: P04792）、ＬＯＸＬ４（リシルオキシダーゼホモログ４、Uniprot ID: Q96JB6）、ＰＯＬＤ３（ＤＮＡポリメラーゼデルタサブユニット３、Uniprot ID: Q15054）、ＣＡＬＵ（カルメニン、Uniprot ID: O43852）、ＩＧＦＢＰ４（インスリン様成長因子結合タンパク質４、Uniprot ID: P22692）、Ｃ４Ｂ（補体Ｃ４−Ｂ、Uniprot ID: P0C0L5）、ＴＩＮＡＧＬ１（尿細管間質性腎炎抗原様、Uniprot ID: Q9GZM7）、ＳＵＬＦ１（細胞外スルファターゼＳｕｌｆ−１、Uniprot ID: Q8IWU6）、ＴＰＭ３（トロポミオシンアルファ３鎖、Uniprot ID: P06753)、ＡＨＮＡＫ（神経芽細胞分化関連タンパク質ＡＨＮＡＫ、Uniprot ID: Q09666）、ＣＡＬＲ（カルレティキュリン、Uniprot ID: P27797）、ＲＲＡＳ２（Ｒａｓ関連タンパク質Ｒ−Ｒａｓ２、Uniprot ID: P62070）、ＰＦＫＰ（ＡＴＰ依存性６ホスホフルクトキナーゼ、血小板型、Uniprot ID: Q01813）、およびＣＯＬ１６Ａ１（コラーゲンアルファ１（ＸＶＩ）鎖、Uniprot ID: Q07092）。
【００３８】
単離されたＭＳＣエキソソームにおいてマーカーが「濃縮」されていることは、マーカーが単離されたＭＳＣエキソソームに以下のレベルで存在することを意味する：少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、または少なくとも１００倍以上、他の細胞型（例えば、線維芽細胞）に由来するエキソソーム中のマーカーのレベル超。いくつかの態様において、マーカーは、単離されたＭＳＣエキソソームに以下のレベルで存在する：２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、または１００倍以上、他の細胞型に由来するエキソソーム（例えば、線維芽細胞エキソソーム）中のマーカーのレベル超。
【００３９】
いくつかの態様において、本明細書に記載される単離されたＭＳＣエキソソームは、１以上（例えば、１、２、３、４、または５以上）の既知のエキソソームマーカーを含む。いくつかの態様において、既知のエキソソームマーカーは、以下からなる群から選択される：ＦＬＯＴ１（フロチリン１、Uniprot ID: O75955）、ＣＤ９（ＣＤ９抗原、Uniprot ID: P21926）、およびＣＤ６３（ＣＤ６３抗原、Uniprot ID: P08962）。
いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソームは、夾雑物（例えば、タンパク質夾雑物）を実質的に含まない。単離されたＭＳＣエキソソームの調製物が任意の他の物質（例えば、タンパク質）を２０％、１５％、１０％、５％、２％、１％、または１％未満含む場合、単離されたＭＳＣエキソソームは「実質的に夾雑物を含まない」。いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソームの調製物が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．９％の純度である場合、夾雑物（例えば、タンパク質）に関して、単離されたＭＳＣは「実質的に夾雑物を含まない」。
【００４０】
「タンパク質夾雑物」は、単離されたエキソソームに関連しておらず、エキソソームの生物活性に寄与しないタンパク質を指す。タンパク質夾雑物は、本明細書では「非エキソソームタンパク質夾雑物」とも呼ばれる。
本明細書に記載される単離されたＭＳＣエキソソームは、約３０〜１５０ｎｍの直径を有する。例えば、単離されたＭＳＣエキソソームは、以下の直径を有し得る：３０〜１５０、３０〜１４０、３０〜１３０、３０〜１２０、３０〜１１０、３０〜１００、３０〜９０、３０〜８０、３０〜７０、３０〜６０、３０〜５０、３０〜４０、４０〜１５０、４０〜１４０、４０〜１３０、４０〜１２０、４０〜１１０、４０〜１００、４０〜９０、４０〜８０、４０〜７０、４０〜６０、４０〜５０、５０〜１５０ｎｍ、５０〜１４０ｎｍ、５０〜１３０ｎｍ、５０〜１２０ｎｍ、５０〜１１０ｎｍ、５０〜１００ｎｍ、５０〜９０ｎｍ、５０〜８０ｎｍ、５０〜７０ｎｍ、５０〜６０ｎｍ、６０〜１５０ｎｍ、６０〜１４０ｎｍ、６０〜１３０ｎｍ、６０〜１２０ｎｍ、６０〜１１０ｎｍ、６０〜１００ｎｍ、６０〜９０ｎｍ、６０〜８０ｎｍ、６０〜７０ｎｍ、７０〜１５０ｎｍ、７０〜１４０ｎｍ、７０〜１３０ｎｍ、７０〜１２０ｎｍ、７０〜１１０ｎｍ、７０〜１００ｎｍ、７０〜９０ｎｍ、７０〜８０ｎｍ、８０〜１５０ｎｍ、８０〜１４０ｎｍ、８０〜１３０ｎｍ、８０〜１２０ｎｍ、８０〜１１０ｎｍ、８０〜１００ｎｍ、８０〜９０ｎｍ、９０〜１５０ｎｍ、９０〜１４０ｎｍ、９０〜１３０ｎｍ、９０〜１２０ｎｍ、９０〜１１０ｎｍ、９０〜１００ｎｍ、１００〜１５０ｎｍ、１００〜１４０ｎｍ、１００〜１３０ｎｍ、１００〜１２０ｎｍ、１００〜１１０ｎｍ、１１０〜１５０ｎｍ、１１０〜１４０ｎｍ、１１０〜１３０ｎｍ、１１０〜１２０ｎｍ、１２０〜１５０ｎｍ、１２０〜１４０ｎｍ、１２０〜１３０ｎｍ、１３０〜１５０ｎｍ、１３０〜１４０ｎｍ、または１４０〜１５０ｎｍ。いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソームは、約５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１１０ｎｍ、１２０ｎｍ、１３０ｎｍ、１４０ｎｍ、または１５０ｎｍの直径を有し得る。いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソームは両凹の形態を示す。
【００４１】
本明細書に記載されるように、単離されたＭＳＣエキソソームは生物学的に活性であり、肺疾患の処置におけるＭＳＣエキソソームの治療的な有効性は、この単離された（精製された）画分に起因し得る。したがって、単離されたＭＳＣエキソソームは、疾患（例えば、肺疾患）の処置において、または疾患（例えば、肺疾患）を処置する医薬の製造において使用され得る。
本開示のいくつかの側面は、本明細書に記載されている単離されたＭＳＣエキソソームを含む医薬組成物に関する。いくつかの態様において、かかる医薬組成物は、薬学的に許容し得る濃度の塩、バッファー剤、防腐剤、適合性担体、および／または他の（すなわち、二次）治療剤をさらに含む。
【００４２】
薬学的に許容し得る担体は、予防的または治療的に活性な薬剤の運搬または輸送に関与する、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒またはカプセル化材料などの薬学的に許容し得る材料、組成物またはビヒクルである。各担体は、製剤の他の成分と適合し、対象に害を及ぼさないという意味で「許容し得る」ものでなければならない。薬学的に許容し得る担体として役立ち得る材料のいくつかの例は、以下を含む：ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖；プロピレングリコールなどのグリコール；グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなどのポリオール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどのバッファー剤；発熱物質を含まない水；等張生理食塩水；リンガー液；エチルアルコール；リン酸バッファー液；および医薬製剤に使用される他の非毒性適合性物質。
【００４３】
いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソームを含む医薬組成物は、肺疾患の処置のために処方される。したがって、医薬組成物は、肺疾患の処置に使用できる他の治療薬（二次薬剤）をさらに含み得る。本明細書で使用される場合、治療剤は、本明細書で論じられるものなどの肺疾患の予防、処置および／または管理に使用できる任意の薬剤を指す。これらは、サーファクタント、吸入した一酸化窒素、ビスメシレートアルミトリン、免疫調節物質、および抗酸化剤を含むが、これらに限定されない。免疫調節剤の例は、メチルプレドニゾロンなどであるがこれらに限定されない、ステロイドおよびコルチコステロイドを含む。抗酸化剤の例は、スーパーオキシドジスムターゼを含むが、これに限定されない。
【００４４】
肺高血圧症を含むがこれに限定されない特定の肺および他の疾患の処置または管理に使用される特定の二次治療剤は、以下を含む：酸素、ワルファリン（クマジン）などの抗凝固剤；フロセミド（Lasix（登録商標））またはスピロナラクトン（Aldactone（登録商標））などの利尿薬；カルシウムチャネル遮断薬；K-dur（登録商標）などのカリウム；ジゴキシンなどの変力剤；ニフェジピン（Procardia（登録商標））またはジルチアゼム（Cardizem（登録商標））などの血管拡張薬；ボセンタン（Tracleer（登録商標））およびアンブリセンタン（Letairis（登録商標））などのエンドセリン受容体アンタゴニスト；エポプロステノール（Flolan（登録商標））、トレプロスチニルナトリウム（Remodulin（登録商標）、Tyvaso（登録商標））、およびイロプロスト（Ventavis（登録商標））などのプロスタサイクリン類似体；およびシルデナフィル（Revatio（登録商標））およびタダラフィル（Adcirca（登録商標））などのＰＤＥ−５インヒビター。
【００４５】
いくつかの態様において、肺疾患の処置のために、第２の薬剤は肺サーファクタントである。「肺サーファクタント」は、（例えば、肺胞壁が互いに付着するのを防ぐことにより）肺気道を開いた状態に保つのに有用なリポタンパク質混合物である。肺サーファクタントは以下で構成され得る：ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ホスホチジルコリン（ＰＣ）、ホスホチジルグリセロール（ＰＧ）などのリン脂質；コレステロール；およびＳＰ−Ａ、Ｂ、ＣおよびＤなどのタンパク質。肺サーファクタントは、ウシまたはブタの肺組織などの天然の供給源に由来し得る。例は、Alveofact（商標）（ウシの肺洗浄から）、Curosurf（商標）（ミンチした豚の肺から）、Infasurf（商標）（子ウシの肺洗浄から）、およびSurvanta（商標）（ミンチしたウシの肺から、ＤＰＰＣ、パルミチン酸、およびトリパルミチンを含む追加の構成要素を含む）を含む。肺サーファクタントもまた合成であり得る。例は、Exosurf（商標）（ヘキサデカノールおよびチロキサポールを含むＤＰＰＣで構成）、Pumactant（商標）または人工肺拡張化合物（ＡＬＥＣ）（ＤＰＰＣおよびＰＧで構成）、KL-4（ＤＰＰＣ、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリココール、パルミチン酸、およびＳＰ−Ｂを模倣する合成ペプチドで構成）、Venticute（商標）（ＤＰＰＣ、ＰＧ、パルミチン酸、および組み換えＳＰ−Ｃで構成）を含む。肺サーファクタントは、商業的供給業者から入手することができる。
【００４６】
本開示の他の側面は、肺疾患を処置する方法を提供し、該方法は、本明細書に記載の単離されたＭＳＣエキソソームまたはかかる単離されたＭＳＣエキソソームを含む医薬組成物の有効量を、これを必要とする対象に投与することを含む。本明細書に記載の方法を使用して処置され得る肺疾患は、肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）とも呼ばれる肺高血圧症（ＰＨ）、喘息、気管支肺異形成症（ＢＰＤ）、アレルギー、サルコイドーシス、および特発性肺線維症を含むが、これらに限定されない。これらの疾患は、炎症性の構成要素を有し得ない肺血管疾患も含む。本開示に従って処置され得るさらなる他の肺の状態は、敗血症または人口呼吸に関連し得る急性肺損傷を含む。この後者の状態の例は、年長の子供および成人に生じる急性呼吸窮迫症候群である。
【００４７】
いくつかの態様において、本明細書に記載される方法は、気管支肺異形成症（ＢＰＤ）を処置するために使用される。ＢＰＤは、酸素を与えられた、または人工呼吸器が取り付けられた新生児、または早産で生まれた新生児、特に極端に早産で生まれた新生児（例えば、妊娠３２週前に生まれた新生児）に影響を与える状態である。新生児慢性肺疾患とも呼ばれる。ＢＰＤの原因は、例えば人工呼吸の結果としての機械的損傷、例えば酸素治療の結果としての酸素毒性、および感染症を含む。疾患は時間とともに非炎症性から炎症性に進行し得る。症状は、青みがかった皮膚、慢性的な咳、急速な呼吸、および息切れを含む。ＢＰＤを有する対象は、呼吸器合胞体ウイルス感染症などの感染症にかかりやすくなる。ＢＰＤを有する対象は、肺高血圧症を発症し得る。ＢＰＤを有する対象は肺にも炎症を有し得、末梢肺動脈リモデリングおよび肺線維症を示す。本開示は、対象における気管支肺異形成症（ＢＰＤ）を処置する方法を提供する。本明細書に示されるように、単離されたＭＳＣエキソソームのボーラス用量は、ＢＰＤに関連する短期的および長期的症状を改善するのに有効である。本明細書に提供される方法を使用して処置され得る対象は、ＢＰＤに罹患している、または罹患した新生児、または子供、または成人であり得る。
【００４８】
いくつかの態様において、本明細書に記載の方法は、肺高血圧症を処置するために使用される。肺高血圧症は、正常レベルを超える肺動脈の血圧を特徴とする肺疾患である。症状は、息切れ、特に身体活動中の胸の痛み、脱力感、疲労、失神、特に運動中の立ちくらみ、めまい、異常な心音および雑音、頸静脈の充血、腹部、脚および足首の水分貯留、および爪床の青みがかった色を含む。いくつかの態様において、過酸素状態（例えば、対象に酸素が投与されたとき）は、肺高血圧症（過酸素症に誘発された肺高血圧症）を誘発し得る。
【００４９】
いくつかの態様において、本明細書に記載される方法は、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を処置するために使用される。ＡＲＤＳは、呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）、または肺への損傷または急性疾患の結果として生じる状態である成人の呼吸窮迫症候群としても知られている。肺への損傷は、人工呼吸、外傷、火傷、および／または誤嚥の結果であり得る。急性疾患は感染性肺炎または敗血症であり得る。それは急性肺損傷の重篤な形態と考えられており、しばしば致命的である。それは、肺の炎症、気体交換の障害、および炎症性メディエーターの放出、低酸素血症、および多臓器不全を特徴とする。ＡＲＤＳは、胸部Ｘ線上の両側浸潤の存在下での２００ｍｍＨｇ未満の吸気酸素（ＦｉＯ２）の割合としての動脈部分酸素分圧（ＰａＯ２）の比率としても定義され得る。ＰａＯ２／ＦｉＯ２比が両側浸潤で３００ｍｍＨｇ未満の場合、急性肺障害を示し、これはしばしばＡＲＤＳの前兆である。ＡＲＤＳの症状は、息切れ、頻呼吸、および低酸素レベルによる精神錯乱を含む。
【００５０】
いくつかの態様において、本明細書に記載される方法は、特発性肺線維症を処置するために使用される。特発性肺線維症は、原因不明の肺の瘢痕化または肥厚を特徴とする。それは５０〜７０歳の人に最も頻繁に生じる。その症状は、息切れ定期的な咳（典型的には乾いた咳）、胸の痛み、および減少した活動レベルを含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載の方法は、アレルギーを処置するために使用される。アレルギーは免疫系の過敏性障害であり、赤目、かゆみ、鼻水、湿疹、じんましん、または喘息発作を含む症状がある。アレルギーは喘息などの症状に主要な役割を果たす。環境アレルゲンまたは食事アレルゲン、あるいは薬物に対する重度のアレルギーは、アナフィラキシーと呼ばれる生命を脅かす反応を引き起こし得る。アレルギー反応は、人の免疫系が環境中の通常は無害な物質であることが多いものに反応したときに生じ得る。アレルギーは、４つの形態の過敏症の１つであり、Ｉ型（または即時型）過敏症と呼ばれることもある。免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）による特定の白血球（マスト細胞および好塩基球）の過剰な活性化のため、アレルギー反応は独特である。この反応は炎症反応をもたらし、軽度の不快感から危険な状態までの範囲に及び得る。アレルギー状態を診断するための様々な試験が存在する。試験は、可能性のあるアレルゲンを皮膚に置き、アレルゲン特異的ＩｇＥを探すための腫れおよび血液試験などの反応を探すことを含む。
【００５１】
いくつかの態様において、本明細書に記載の方法は、低酸素症によって誘発された肺の炎症を処置するために使用される。低酸素症によって誘発された肺の炎症は、急性肺損傷および／またはＡＲＤＳからしばしば生じる状態であり、それにより、炎症反応は低酸素状態への長期の曝露から生じる。かかる炎症反応は、低圧低酸素に曝されたヒトの気管支肺胞洗浄液における、マクロファージ、好中球、およびＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、およびＴＮＦ−αを含む炎症性サイトカインの増加を含む。
「有効量」は、望ましい転帰を達成する薬剤の量である。絶対量は、投与のために選択された材料、投与が単回または複数回の用量か、年齢、体調、サイズ、体重、および疾患の段階を含む個々の患者パラメーターを含む、様々な因子に依存するであろう。これらの因子は当業者によく知られており、通常の実験で対処され得る。
【００５２】
いくつかの態様において、有効量は、対象に毒性を引き起こさない薬剤の投薬量である。いくつかの態様において、有効量は、対象への毒性の低減を引き起こす薬剤の投薬量である。毒性を測定する方法は、当該技術分野において周知である（例えば、肝臓、脾臓、および／または腎臓の生検／組織学；肝臓毒性についてのアラニントランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼおよびビリルビンアッセイ；および腎臓毒性についてのクレアチニンレベル）。
「処置する」または「処置」は、肺疾患の発症の予防、低減、または停止、肺疾患の症状の低減または排除、または肺疾患の予防を含むが、これらに限定されない。
対象は、ヒトまたは脊椎動物または哺乳動物を意味するものとし、これは、齧歯類の動物（例えば、ラットまたはマウス）、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、シチメンチョウ、ニワトリおよび霊長目の動物（例えば、サル）を含むが、これらに限定されない。本開示の方法は、これを必要とする対象を処置するために有用である。これを必要とする対象は、（すなわち、遺伝子試験を介して）肺疾患を発症するリスクを有する対象、または肺疾患を有する対象であり得る。
【００５３】
対象は、本開示に記載のエキソソームを使用した処置に適している、本明細書に記載の疾患（または状態）を有するものであり得、またはかかる疾患（または状態）を発症するリスクがあるものであり得る。かかる対象は、新生児、特に低在胎齢で生まれた新生児を含む。本明細書で使用される場合、ヒト新生児は、出生時から約４週齢までのヒトを指す。本明細書で使用される場合、ヒト幼児は、約４週齢から約３歳までのヒトを指す。本明細書で使用される場合、低在胎齢は、所与の種の通常の在胎期間の前に生じる出産（または分娩）を指す。ヒトでは、妊娠期間全体は約４０週間で、３７週間から４０週間超の範囲であり得る。ヒトの低妊娠期間は、早産に類似しており、妊娠３７週の前に生じる出産と定義される。したがって、本開示は、さらに短い在胎期間（例えば、妊娠３６週前、３５週前、３４週前、３３週前、３２週前、３１週前、３０週前、２９週前、２８週前、２７週前、２６週前、または２５週前）で生まれたものを含む、妊娠３７週前に生まれた対象の予防および／または処置を企図している。いくつかの態様において、対象は酸素を投与されている。いくつかの態様において、対象は、外因性酸素投与の有無に関わらず人工呼吸などの機械的介入を受けている。いくつかの態様において、対象は、過酸素症に誘発された肺損傷を有する。いくつかの態様において、対象は、ＢＰＤを発症したか、発症するリスクがある。
【００５４】
乳児または新生児の場合、本開示は、新生児期を超えて、小児期および／または成人期へのそれらの処置を企図する。例えば、いくつかの態様において、本開示の方法を使用して処置される対象は、３〜１８歳である。いくつかの態様において、本開示の方法を使用して処置される対象は以下であり得る：３〜１８、３〜１７、３〜１６、３〜１５、３〜１４、３〜１３、３〜１２、３〜１１、３〜１０、３〜９、３〜８、３〜７、３〜６、３〜５、３〜４、４〜１８、４〜１７、４〜１６、４〜１５、４〜１４、４〜１３、４〜１２、４〜１１、４〜１０、４〜９、４〜８、４〜７、４〜６、４〜５、５〜１８、５〜１７、５〜１６、５〜１５、５〜１４、５〜１３、５〜１２、５〜１１、５〜１０、５〜９、５〜８、５〜７、５〜６、６〜１８、６〜１７、６〜１６、６〜１５、６〜１４、６〜１３、６〜１２、６〜１１、６〜１０、６〜９、６〜８、６〜７、７〜１８、７〜１７、７〜１６、７〜１５、７〜１４、７〜１３、７〜１２、７〜１１、７〜１０、７〜９、７〜８、８〜１８、８〜１７、８〜１６、８〜１５、８〜１４、８〜１３、８〜１２、８〜１１、８〜１０、８〜９、９〜１８、９〜１７、９〜１６、９〜１５、９〜１４、９〜１３、９〜１２、９〜１１、９〜１０、１０〜１８、１０〜１７、１０〜１６、１０〜１５、１０〜１４、１０〜１３、１０〜１２、１０〜１１、１１〜１８、１１〜１７、１１〜１６、１１〜１５、１１〜１４、１１〜１３、１１〜１２、１２〜１８、１２〜１７、１２〜１６、１２〜１５、１２〜１４、１２〜１３、１３〜１８、１３〜１７、１３〜１６、１３〜１５、１３〜１４、１４〜１８、１４〜１７、１４〜１６、１４〜１５、１５〜１８、１５〜１７、１５〜１６、１６〜１８、１６〜１７、または１７〜１８歳。いくつかの態様において、対象は、例えば１８歳または１８歳超の成人である。
特定の対象は、例えば肺高血圧症など、本明細書に記載される疾患（または状態）の特定の形態に対する遺伝的素因を有し得、それらの対象も本開示に従って処置され得る。
【００５５】
新生児、特に妊娠期間の短い新生児に関して、本開示は、生後１年、１１月、１０月、９月、８月、７月、６月、５月、４月、３月、２月、１月、４週、３週、２週、１週、６日、５日、４日、３日、２日、１日、１２時間、６時間、３時間、または１時間以内の単離されたＭＳＣエキソソームの投与を企図する。いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソームは、生後１時間以内（例えば、１時間以内、５５分以内、５０分以内、４５分以内、４０分以内、３５分以内、３０分以内、２５分以内、２０分以内、１５分以内、１０分以内、５分以内、または１分以内）に投与される。
【００５６】
本開示はさらに、本明細書に記載の疾患または障害を示す症状がなくても、単離されたＭＳＣエキソソームの投与を企図する。
いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソームまたは単離されたエキソソームを含む組成物は、ボーラス用量で対象（例えば、新生児）に投与される。「ボーラス用量」は、治療的に有効なレベルを達成するための、個別の量の薬品、薬物または他の化合物の単回投与を指す。いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソームの２回、３回、４回、または５回以上の投与を含む、単離されたＭＳＣエキソソームの反復投与が企図される。いくつかの例において、単離されたＭＳＣエキソソームは連続的に投与され得る。反復投与または連続投与は、処置される状態の重症度に応じて、数時間（例えば、１〜２、１〜３、１〜６、１〜１２、１〜１８、または１〜２４時間）、数日（例えば、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６日、または１〜７日）または数週（例えば、１〜２週、１〜３週、または１〜４週）にわたって行われる場合がある。投与が繰り返されるが連続的でない場合、投与間の時間は、数時間（例えば、４時間、６時間、または１２時間）、数日（例えば、１日、２日、３日、４日、５日、または６日）、または数週間（例えば、１週間、２週間、３週間、または４週間）であり得る。投与間の時間は同じであっても、異なっていてもよい。例として、疾患の症状が悪化しているように見える場合、ａ型エキソソームがより頻繁に投与され、その後症状が安定するかまたは減少すると、ａ型エキソソームはより少ない頻度で投与され得る。
【００５７】
いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソームは、生後２４時間以内に少なくとも１回、次いで生後１週間以内に少なくとももう１回投与される。いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソームは、生後１時間以内に少なくとも１回、次いで生後３〜４日以内に少なくとももう１回投与される。
単離されたＭＳＣエキソソームは、肺または他の組織への送達をもたらす任意の経路によって投与され得る。静脈内ボーラス注射または持続注入などの全身投与経路が好適である。鼻腔内投与、気管内投与（例えば、挿管による）、および吸入（例えば、口または鼻を介したエアロゾルによる）などのより直接的な経路も本開示により企図され、場合によっては、特に、迅速な作用が必要である場合により適切であり得る。本明細書で使用されるとき、エアロゾルは、気体中に小さな粒子として分散した液体の懸濁液であり、それは、かかる粒子を含む微細なミストまたはスプレーを含む。本明細書で使用されるとき、エアロゾル化は、液体懸濁液を小さな粒子または液滴に変換することによってエアロゾルを生成するプロセスである。これは、加圧パックまたはネブライザーなどのエアロゾル送達システムを使用してなされ得る。ネブライザーは、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の好適な気体などであるがこれらに限定されない好適な推進剤を使用する、エアジェット（すなわち、空気圧式）、超音波、および振動メッシュネブライザーを含む。ネブライザーに加えて、肺送達のための他のデバイスは、定量吸入器（ＭＤＩ）および乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）を含むが、これらに限定されない。吸入器または注入器で使用するための、例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、凍結乾燥されたエキソソームおよびラクトースまたはデンプンなどの好適な粉末基剤を含有して処方され得る。
【００５８】
単離されたＭＳＣエキソソームは、それらを全身的に送達することが望ましい場合、例えばボーラス注射または連続注入を含む、注射による非経口投与のために処方され得る。注射用の製剤は、添加された防腐剤の有無に関わらず、例えばアンプルまたは複数回用量容器の単位剤形で提供され得る。
組成物は、油性または水性ビヒクル中の水溶性懸濁液、溶液またはエマルションなどの形態をとることができ、懸濁剤、安定剤および／または分散剤などの処方剤を含み得る。好適な親油性溶媒またはビヒクルは、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルまたはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステルを含む。水性注射用懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどの、懸濁液の粘度を増加させる物質を含み得る。任意に、懸濁液はまた、溶解度を増加させる好適な安定剤または薬剤を含み得る。代わりに、エキソソームは、使用前に、好適なビヒクル、例えば、滅菌された発熱物質を含まない水で構成するために、凍結乾燥または他の粉末または固体の形態であり得る。
本開示に従って処置されている対象に投与される他の薬剤は、経口投与、鼻腔内投与、気管内投与、吸入、静脈内投与などを含む任意の好適な経路によって投与され得ることが理解されるべきである。当業者は、かかる二次薬剤の通常の投与経路を知るであろう。
【００５９】
いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソーム、またはＭＳＣエキソソームを含む医薬組成物は、対象に投与されると、肺機能を改善する。本明細書では、肺機能は、例えば当業者に既知の任意の方法により測定される肺の機能性が、単離されたＭＳＣエキソソームを投与された対象において、単離されたＭＳＣエキソソームを投与されていない対象と比較して少なくとも２０％改善された場合、「改善された」と見なされる。例えば、肺機能は、例えば当業者に知られている任意の方法により測定される肺の機能性が、単離されたＭＳＣエキソソームを投与された対象において、単離されたＭＳＣエキソソームを投与されていない対象と比較して、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍以上改善された場合に改善されたと見なされ得る。いくつかの態様において、肺機能は、例えば当業者に知られている任意の方法によって測定された肺機能が、単離されたＭＳＣエキソソームを投与された対象において、単離されたＭＳＣエキソソームを投与されていない対象と比較して、２０％、３０％、４０％、５０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２倍、５倍、１０倍、５０倍、または１００倍以上改善された場合に改善されたと見なされる。
【００６０】
肺機能を評価する方法は、当業者に知られている。かかる方法の非限定的な例は、肺活量測定（空気の流量を測定し、肺のサイズを推定する）、肺容量試験（肺が保持できる空気の量を測定する）、肺拡散能力（酸素が吸入された空気からどれだけ血液に入るかを評価する）、パルスオキシメトリー（血中の酸素レベルを推定）、動脈血気体試験（血液中の酸素および二酸化炭素などの気体のレベルを直接測定）、および呼気一酸化窒素試験（呼気中の一酸化窒素の量を測定）を含む。
【００６１】
いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソーム、またはＭＳＣエキソソームを含む医薬組成物は、対象に投与されると、肺構造を回復させる。本明細書では、肺構造（例えば正常な（例えば、健康な対象の）構造形態の肺胞のパーセンテージによって示される）が、単離されたＭＳＣエキソソームを投与された対象において、単離されたＭＳＣエキソソームを投与されていない対象と比較して、少なくとも２０％増加した場合に「回復」すると見なされる。例えば、肺構造は、肺構造（例えば正常な（例えば、健康な対象の）構造形態の肺胞のパーセンテージによって示される）が、単離されたＭＳＣエキソソームを投与された対象において、単離されたＭＳＣエキソソームを投与されていない対象と比較して、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍以上改善された場合に「回復した」と見なされ得る。いくつかの態様において、肺構造は、肺構造（例えば正常な（例えば、健康な対象の）構造形態の肺胞のパーセンテージによって示される）が、単離されたＭＳＣエキソソームを投与された対象において、単離されたＭＳＣエキソソームを投与されていない対象と比較して、２０％、３０％、４０％、５０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２倍、５倍、１０倍、５０倍、または１００倍以上改善された場合に「回復した」と見なされ得る。当業者は、肺構造を評価する方法に精通している。
【００６２】
いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソーム、またはＭＳＣエキソソームを含む医薬組成物は、対象に投与されると、肺線維症を低減する。「肺線維症」は、肺組織が損傷および瘢痕化し、肺組織の肥厚および硬直を引き起こし、肺機能を低下させる状態を指す。肺線維症は様々な原因を有する。肺線維症は典型的には、ＢＰＤの対象に見られる。本明細書において、肺線維症は、肺線維症の程度（例えば、肺組織へのコラーゲン沈着によって示される）が、単離されたＭＳＣエキソソームを投与された対象において、単離されたＭＳＣエキソソームを投与されていない対象と比較して、少なくとも２０％低減された場合に「低減した」と見なされる。例えば、肺線維症は、肺線維症の程度（例えば、肺組織へのコラーゲン沈着によって示される）が、単離されたＭＳＣエキソソームを投与された対象において、単離されたＭＳＣエキソソームを投与されていない対象と比較して、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％低減された場合に低減したと見なされ得る。いくつかの態様において、肺線維症は、肺線維症の程度（例えば、肺組織へのコラーゲン沈着によって示される）が、単離されたＭＳＣエキソソームを投与された対象において、単離されたＭＳＣエキソソームを投与されていない対象と比較して、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％低減された場合に低減したと見なされる。
【００６３】
いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソーム、またはＭＳＣエキソソームを含む医薬組成物は、対象に投与されると、肺の炎症を低減する。当業者は、例えば、肺または血液中の炎症のバイオマーカーのレベルを測定することにより、肺における炎症の程度を評価する方法に精通している。いくつかの態様において、肺における炎症は、単離されたＭＳＣエキソソームを投与された対象において、単離されたＭＳＣエキソソームを投与されていない対象と比較して、少なくとも２０％低減される。例えば、炎症は、単離されたＭＳＣエキソソームを投与された対象において、単離されたＭＳＣエキソソームを投与されていない対象と比較して、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％低減され得る。いくつかの態様において、炎症は、単離されたＭＳＣエキソソームを投与された対象において、単離されたＭＳＣエキソソームを投与されていない対象と比較して、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％低減される。科学的な理論に束縛されることを望まないが、本明細書に記載される単離されたＭＳＣエキソソームは、おそらく免疫応答および炎症に関与する遺伝子の発現の調節および／またはマクロファージ極性化の調節を介して免疫調節活性を有することが示される。「免疫調節活性」は、免疫応答および／または炎症反応の調節（例えば、増強または低減）に説明される単離されたＭＳＣエキソソームの活性を指す。本明細書に記載されるように、単離されたＭＳＣエキソソームは、様々な炎症促進性遺伝子の発現を下方調節する（例えば、図９Ｅ）。
【００６４】
いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソーム、またはＭＳＣエキソソームを含む医薬組成物は、対象に投与されると、末梢肺動脈リモデリングを低減させる。「末梢肺動脈リモデリング」は、肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）の重要な病理学的特徴であり、肺血管平滑筋細胞（ＳＭＣ）および／または内皮細胞（ＥＣ）の著しい増殖を伴う、肺血管抵抗の増加とコンプライアンスの低下につながり、その結果、抵抗性肺動脈の血流が妨げられる。特定の形態の肺動脈リモデリングは可逆的である。肺動脈リモデリングの「低減」は、新しいリモデリングを予防するか、または古いリモデリングを逆転させることによって達成され得る。当業者は、肺動脈リモデリングの程度を評価する方法に精通している。いくつかの態様において、肺動脈リモデリングは、単離されたＭＳＣエキソソームを投与された対象において、単離されたＭＳＣエキソソームを投与されていない対象と比較して、少なくとも２０％低減される。例えば、肺動脈リモデリングは、単離されたＭＳＣエキソソームを投与された対象において、単離されたＭＳＣエキソソームを投与されていない対象と比較して、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％低減され得る。いくつかの態様において、肺動脈リモデリングは、単離されたＭＳＣエキソソームを投与された対象において、単離されたＭＳＣエキソソームを投与されていない対象と比較して、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％低減される。
【００６５】
本開示の他の側面は、本明細書に記載されているＭＳＣエキソソームを単離する方法を提供する。単離されたＭＳＣエキソソームは、他の物質、例えばタンパク質夾雑物を実質的に含まず、ＭＳＣエキソソームの治療的な有効性を保持する。本明細書（例えば、図１Ａおよび１Ｂ）に記載されるように、ＭＳＣ（例えば、ホウォートンゼリーまたは骨髄からのＭＳＣ）の培養培地は、（例えば、タンジェント流濾過を介して）濃縮され、１０％〜５５％勾配のイオジキサノール（ＩＤＸ）クッションによる分画に供される。分画は、濃縮された培地をＩＤＸクッションの上に浮遊させ、混合物を超遠心分離することによって達成される。図１Ｂに示されているように画分が収集され、画分９は本明細書に記載の単離されたＭＳＣエキソソームを含む。画分９のＭＳＣエキソソームは、タンパク質含量が低く、ＭＳＣエキソソーム含量が高い。いくつかの態様において、画分９中のＭＳＣエキソソームは、非エキソソームタンパク質夾雑物を実質的に含まない。
【００６６】
単離されたＭＳＣエキソソーム（画分９）はすぐに（例えば、本明細書に記載の方法で）使用され得る。または代わりに、単離されたＭＳＣエキソソームは、例えば、使用前に低温保存状態で、短期および／または長期保存され得る。プロテイナーゼインヒビターは、長期保存中にエキソソームの完全性を提供するため、典型的には、凍結培地に含まれる。−２０℃での凍結は、エキソソーム活性の喪失の増加に関連するため、好ましくない。活性を維持するため、−８０℃での急速凍結がより好ましい。（例えば、Kidney International (2006) 69, 1471-1476を参照。）エキソソームの生物学的活性の保持を高めるために、凍結培地への添加剤が使用され得る。かかる添加剤は、インタクトの細胞の凍結保存に使用されるものと同様であり、ＤＭＳＯ、グリセロール、およびポリエチレングリコールを含み得るが、これらに限定されない。
本明細書に開示される技術の態様、利点、特徴、および使用のいくつかは、以下の例からより完全に理解されるであろう。例は、本開示のいくつかの利点を例示し、特定の態様を説明することを意図しているが、本開示の全範囲を例示することを意図しておらず、したがって、本開示の範囲を限定しない。
【００６７】
例
例１：幹細胞エキソソームは、気管支肺異形成症を改善し、マクロファージの免疫調節により肺機能を回復させる。
気管支肺異形成症（ＢＰＤ）は、機械的人口呼吸および酸素療法を必要とする早産児にほぼ排他的に生じる慢性肺疾患である。それは、制限された肺の成長（組織の単純化）、抑制された肺胞および血管の発達、および肺機能の障害を特徴とする。いくつかのＢＰＤの転帰は、異常な肺機能の試験結果、気道過敏性の変化、中等度から重度の症例では二次性肺高血圧症（ＰＨ）など、長期の肺合併症に関連している（１〜５）。発達性肺損傷を予防または処置するための有効な単一治療法がないため、極度の早産に関連するかかる生涯にわたる合併症の負担を処置および低減する新しいツールの必要性が急務である。
【００６８】
肺の発達が制限されていることに加えて、数人の研究者は、観察された組織の単純化の根底にあるかもしれない幹細胞／前駆細胞の集団の喪失に注目している（６〜８）。かかる発見は、早産に関連する肺損傷を改善するための幹細胞ベースの治療の適用のためのプラットフォームを提供している。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）（９〜１１）、内皮結腸形成細胞（ＥＣＦＣ）（１２）、ヒト羊膜上皮細胞（ｈＡＥＣ）（１３）などの異なる幹細胞／前駆細胞型の投与は、ＢＰＤおよび未熟児の他の主要な後遺症の予防および／または処置のための前臨床モデルで有望であることが示されている（１４、１５）。
【００６９】
ＭＳＣ療法後のレシピエント肺の実質的な生理学的改善にもかかわらず、いくつかの前臨床研究では、肺にドナー細胞の有意な生着がないことが指摘されており、作用の治療メカニズムはパラクリンまたは間接的であり得ることが示唆されている（１６、１７）。実際、以前の研究（９、１８、１９、および２０）では、ＭＳＣの無細胞馴化培地（ＣＭ）が、肺の構造を維持し、前臨床ＢＰＤモデルの肺胞喪失を防ぐ上でＭＳＣ自体よりも優れた保護を提供することを実証した。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）療法は、ＢＰＤの前臨床モデルで有望であり、最近の研究により、ＭＳＣの主要な治療ベクターの１つがセクレトームに含まれ、エキソソーム（細胞外ベシクル；ＥＶ）によって表され、特にエキソソームと呼ばれるエンドサイトーシス経路を介して生成されたより小さな（直径１５０ｎｍ未満）亜集団であることが確立された（１９）。
【００７０】
肺のＭＳＣの治療能力はセクレトームに含まれることに留意して、以前の研究では、治療用ベクターが放出するＥＶによって表されることが示されている（２１〜２３）。ＭＳＣ−ＥＶ処置の有益な特性は、心筋梗塞（２４、２５）、腎障害（２６、２７）、免疫応答の調節（２８、２９）および神経保護（３０、３１）を含む数多の疾患モデルについて報告されており、最近のレビューについては（３２）を参照されたい。しかし、多くの場合、粗いＥＶ単離技術と不十分な分析特性により、ＭＳＣ−ＥＶの治療効果がわかりにくくなり、バイオアベイラビリティが損なわれ、非ＥＶ材料で調製物が汚染される。ここでは、ヒト臍帯ホウォートンゼリー（ＷＪＭＳＣ）と骨髄ＭＳＣ（ＢＭＳＣ）の両方から精製されたＭＳＣ−ＥＶの詳細な特性解析について説明する。さらに、ＢＰＤの実験モデルにおけるＭＳＣ−ＥＶ処置の有効性が調査されている。本明細書で概説する結果は、精製ＭＳＣ−ＥＶのボーラス用量が肺形態および肺発達を有意に改善し、肺線維症を減少させ、ＢＰＤの過酸素症に誘発されたモデルにおける肺血管リモデリングを改善することを示す。さらに、ＭＳＣ−ＥＶ処置は肺機能試験の結果を改善し、関連する肺高血圧症を緩和することが示されている。さらに、この研究は、ＭＳＣ−ＥＶ処置が過酸素症に誘発された炎症を鈍化することを実証している。これは、部分的に、肺マクロファージの極性化の変調を介した効果である。
【００７１】
本明細書では、エキソソーム（直径３０〜１５０ｎｍ、マーカーＣＤ９、ＣＤ６３およびフロチリン−１を発現し、〜１．１８ｇ／ｍｌの密度で浮遊しているＥＶ）を無血清培地（ＳＦＭ）で３６時間インキュベートした後、細胞培養上清（ＣＭ）から単離した。細胞の破片と関連するアポトーシスの破片を明確にするための差動遠心分離後、ＣＭを濾過により濃縮し、OptiPrep（商標）（イオジキサノール；ＩＤＸ）クッションでの浮遊によりエキソソームを単離し、さらに特性解析した。詳細については、オンラインのデータ補足を参照されたい。
分散分析後にボンフェローニ多重比較検定（GraphPad、v 6.0、CA、US）を統計分析に使用した。ピアソン相関係数を使用して、免疫組織化学血管リモデリングパラメーターとＰＨの生理学的指数との間の関係の強さを調べた。フローサイトメトリーのデータ分析では、FlowJoソフトウェアv10.2（TreeStar、OR、US）を使用した。炎症マーカーのｍＲＮＡレベルをＲＴ−ｑＰＣＲによって評価し、同種のＮＲＭＸ対照群の平均レベルと比較して表した。有意性をｐ＜０．０５で考慮した。
in vivo研究では、試料サイズの計算は以前の研究に基づいており（１４）、５％のαレベル、＞９０％の出力での肺構造の１５％の改善の検出（平均線形切片；ＭＬＩで評価）には、群ごとに最低５匹の動物が必要であることが示唆された。
研究者は、組織学的分析および生理学的測定のために実験群に対して盲検化された。
【００７２】
ＭＳＣ−ＥＶの精製、単離、および特性解析
ヒトＭＳＣは多様なベシクル集団を分泌する。多くのＥＶ単離方法は、しばしばタンパク質でＥＶ調製物を汚染し、ＥＶのバイオアベイラビリティを低下させ、凝集体を促進する（３３）。したがって、目的は、従来のＥＶ単離技術の前述の制限を克服するために、イオジキサノール密度勾配によって濃縮ＭＳＣ−ＣＭからＥＶを単離および精製することであった（図１Ａおよび１Ｂ）。ＩＤＸクッションでのＷＪＭＳＣ、ＢＭＳＣ、またはヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）培養からのＣＭの浮遊により、勾配の画分９でＥＶを抽出できた。透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）とナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）によって画分６〜１０の間で評価されたベシクルを比較すると、画分９は優れたタンパク質：粒子の比（〜１．１８ｇ／ｍｌの密度に対応した）を誇った（図１Ｃ）。
画分９のＴＥＭおよびＮＴＡ分析により、５０〜１５０ｎｍの典型的な直径を占め、タンパク質夾雑物が最小限で、ＥＶの明確な両凹の形態学的特徴を示す、ＷＪＭＳＣ−ＥＶ、ＢＭＳＣ−ＥＶ、およびＨＤＦ−ＥＶ試料の異種ＥＶ集団が明らかになった（図１Ｄおよび１Ｅ）。ＩＤＸクッション勾配のイムノブロットにより、すべての細胞型の画分９がＣＤ９、ＣＤ６３、およびフロチリン−１に陽性であることが明らかになった（Ｆｌｏｔ−１、図１Ｆ）。
【００７３】
短期評価（ＰＮ１４）：ＭＳＣ−ＥＶ処置の単回用量は肺構造を回復させる
新生児マウスをＨＹＲＸ（７５％Ｏ２）に７日間（生後日（ＰＮ）１〜７）暴露した後、さらに７日間室内空気に戻した。ＨＹＲＸ暴露マウスをＮＲＭＸ（室内空気）にとどまったマウスと比較した。ＰＮ４でＨＹＲＸ暴露が開始された後、処置群はＷＪＭＳＣ−ＥＶ、ＢＭＳＣ−ＥＶ、またはＨＤＦ−ＥＶの単回静脈内（ＩＶ）用量を受けた（図２Ａに概略図を示す）。ＮＲＭＸ対照マウスと比較して、ＨＹＲＸ暴露マウスは、肺胞成長の重度の障害、大きな空域、および不完全な肺胞中隔を特徴とする、ヒトＢＰＤを思わせる組織学的パターンを示した（図２Ｂ）。ＰＮ１４では、ＮＲＭＸ群と比較した場合、ＨＹＲＸ対照マウスで平均線形切片（ＭＬＩ）値が上昇した（それぞれ３８．７±１対２５．１±１、ｐ＜０．０００１）。ＭＳＣ−ＥＶで処置した動物は、ＨＹＲＸ対照群と比較して、肺胞形成が劇的に改善し、肺構造がほぼ完全に回復した。この改善はＭＳＣの起源に依存せず、ＷＪＭＳＣ−ＥＶ（２９．８±１、ｐ＜０．００１）とＢＭＳＣ−ＥＶ（３１．６±２、ｐ＜０．００１）のいずれかの処置で観察された。ＨＤＦ−ＥＶは、生物学的およびビヒクルの対照として機能し、ＰＮ１４で有意な保護効果を示さなかったため（３４．２４±２μｍ、ｐ＞０．０５）、長期効果を評価する実験には利用しなかった。ＮＲＭＸ対照動物と正常酸素下でＷＪＭＳＣ−ｅｘｏで処置した動物を比較しても差は見られなかった（図Ｅ１、ｐ＞０．０５）。
【００７４】
長期評価（ＰＮ４２）：ＭＳＣ−ＥＶ処置の単回用量は肺の発達を改善し、中隔線維症を改善する
長期エンドポイントを評価するために、ＰＮ４２で肺の構造とコラーゲン沈着を評価した（図３）。ＨＹＲＸ対照マウスは、ＮＲＭＸ対照群と比較して、肺胞構造の持続的な破壊、大きな空域、および有意な肺胞の単純化を示した（ＭＬＩ＝２６．７±０．７対１８．８±０．５μｍ、ｐ＜０．０００１）。繰り返しになるが、ＷＪＭＳＣ−ＥＶまたはＢＭＳＣ−ＥＶのいずれかで処置した動物は、ＨＹＲＸ対照マウスと比較して、劇的に改善された肺胞および肺構造の確固たる回復を示した（ＷＪＭＳＣ−ＥＶ：ＭＬＩ＝２１．６±０．９μｍ、ｐ＜０．０１；ＢＭＳＣ−ＥＶ：ＭＬＩ＝２２．７±０．４μｍ、ｐ＜０．０１）。
【００７５】
ＰＮ４２でコラーゲン沈着（マッソントリクローム染色）を評価して、肺線維症の程度を測定した。動物がＨＹＲＸに１４日間暴露された場合のより重度のＢＰＤモデルと比較して、このＢＰＤモデルのすべての群でわずかなコラーゲン沈着を記録した（全中隔野の＜１％）（１８）。しかしながら、ＨＹＲＸ対照マウスは、ＮＲＭＸ対照マウスと比較して、微妙ではあるが有意に高いコラーゲン沈着量を有した（０．２２±０．０６対０．０８±０．０１μｍ、それぞれｐ＜０．０１）。ＷＪＭＳＣ−ＥＶまたはＢＭＳＣ−ＥＶのいずれかで処置したＨＹＲＸ暴露マウスでは、コラーゲン沈着が大幅に減少した（０．１±０．０２および０．１３±０．０１μｍ、それぞれｐ＜０．０１、ｐ＜０．０５、図３）。
【００７６】
ＭＳＣ−ＥＶ処置は、末梢肺血管の過酸素症に誘発された喪失と末梢肺動脈リモデリングを救済する
ＨＹＲＸ誘発末梢肺血管リモデリングに対するＭＳＣ−ＥＶの潜在的な影響を調べるために、ＰＮ４２で収集したマウスの肺切片をα平滑筋アクチンで染色した（α−ＳＭＡ、図４Ａ）。ＨＹＲＸ暴露動物は、ＮＲＭＸ対照動物（２０．２３±２．２ＭＴＩ、ｐ＜０．０１）と比較して、より大きな末梢肺血管筋形成（３６．５５±２．７内壁厚指数（ＭＴＩ））を示した。長期的な肺構造の改善と線維症の低減に関して、ＷＪＭＳＣ−ＥＶとＢＭＳＣ−ＥＶとの間の違いを示唆する証拠はほとんどないため、ＭＳＣ−ＥＶ群を組わ合わせた。ＭＳＣ−ＥＶ処置により、ＨＹＲＸ誘発血管筋形成が改善された（２６．８±１．３ＭＴＩ、ｐ＜０．０１、図４Ｂ）。ＷＪＭＳＣ−ｅｘｏおよびＢＭＳＣ−ｅｘｏ処置は、ＨＹＲＸ誘発血管筋形成を改善した（それぞれ２６．３±１．１ＭＴＩ、ｐ＜０．０５および２７．２２±２．３ＭＴＩ、ｐ＜０．０５、図１３Ａ）。
【００７７】
ＨＹＲＸ誘発ＰＨの程度を定量化するために、直接的な右室収縮期圧（ＲＶＳＰ）測定、右心室と体重の比（ＲＶ：ＢＷ）およびフルトン指数を評価した。ＮＲＭＸ対照と比較して、ＲＶＳＰはＨＹＲＸ対照動物でわずかに上昇することがわかった（それぞれ２２．３８±０．６８対３０．８±０．８５ｍｍＨｇ、ｐ＜０．００１）。ＭＳＣ−ＥＶ処置により、このＲＶＳＰのわずかな上昇が改善された（２６．８５±０．８３ｍｍＨｇ、ｐ＜０．０５、図４Ｃおよび図１３Ｃ）。同じ傾向が、ＮＲＭＸの対応物と比較して、ＨＹＲＸ対照マウスが上昇したＲＶ：ＢＷ比（それぞれ７．７±０．０１×１０−４対８．５±０．０２×１０−４、ｐ＜０．０５）およびフルトン指数（それぞれ、０．２２±０．００７対０．２６±０．０１５、ｐ＜０．０５、図１３Ｄ）を示した場合に、ＲＶ：ＢＷ比とフルトン指数の評価で再現された。ＭＳＣ−ＥＶ処置は、ＲＶ：ＢＷ比（７．７±０．０１×１０−４、ｐ＜０．０５、図４Ｄ）およびフルトン指数（０．２３±０．０２７、ｐ＜０．０５）のわずかな増加を改善したが、フルトン指数の傾向は重要性に達しなかった（表示なし）。すべての実験群にわたって、血管リモデリングの程度（α−ＳＭＡ染色）は、ＲＶ：ＢＷ（ｐ＝０．００２、ｒ＝０．８０７）、フルトン指数（ｐ＝０．００１、ｒ＝０．６９）およびＲＶＳＰ（ｐ＝０．００２、ｒ＝０．８０６）に有意に相関した。
【００７８】
肺血管数に対するＨＹＲＸ曝露の効果を判断するために、ＰＮ４２のマウスの肺切片におけるフォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）染色を評価した。ＮＲＭＸ対照マウスと比較して、ＨＹＲＸ曝露により、直径＜５０μｍの小さな（末梢）血管が著しく失われたが（それぞれ４．４±０．３対２．９±０．２血管／フィールド（ＶＰＦ）、ｐ＜０．０１）、ＷＪＭＳＣ−ｅｘｏまたはＢＭＳＣ−ｅｘｏ処置によりこれらの血管は回復した（それぞれ３．９±０．４および４．４±０．６ＶＰＦ、ｐ＝０．０６、ｐ＜０．０１（図４Ｈおよび図１３Ｂ））。直径＞１５０μｍの血管の数に群間で有意差はなかった（表示なし）。
【００７９】
ＭＳＣ−ＥＶ処置は、過酸素症に誘発された肺損傷後の肺機能を改善する
組織構造と線維症の変化の機能的影響を判断するために、次に、ＰＮ４２で実験群（具体的にはＮＲＭＸ対照、ＨＹＲＸ対照、およびＷＪＭＳＣ−ＥＶで処置したＨＹＲＸ暴露マウス）で肺機能試験を行った。すべての動物を３ｃｍ Ｈ２Ｏの終末呼気陽圧（ＰＥＥＰ）で人口呼吸させた。肺の組織学（肺疾患の肺胞の単純化と肺気腫様の特徴の単純化）に従って、ＨＹＲＸ暴露マウスは、ＮＲＭＸ対照群と比較して、変化した圧力−体積（ＰＶ）ループを示した。ＨＹＲＸ対照群のＰＶループは、肺疾患と空気捕捉の肺気腫様の特徴を示す上向きおよび左にシフトした（３４）。ＨＹＲＸ対照マウスの全肺容量は増加しており（ＴＬＣ、１．３６±０．０４ｍｌ）、ＮＲＭＸ対照群（０．７７±０．０４ｍｌ、ｐ＜０．０００１）と比較して、ＷＪＭＳＣ−ＥＶ処置により改善された（１．１８±０．０２ｍｌ、ｐ＜０．０１、図４Ｅ）。ＭＳＣ−ＥＶ処置はＨＹＲＸ誘発気腫性変化を改善し、ＰＶループを大幅に右下にシフトした（図４Ｆ）。ベースライン測定により、気道抵抗は３つの群間で差がないことが明らかになった。しかしながら、ＨＹＲＸ対照群のベースラインコンプライアンス測定値は高く、ＭＳＣ−ＥＶ処置の影響を受けなかった。
【００８０】
ＭＳＣ−ＥＶは肺トランスクリプトームを調節し、過酸素症に誘発された炎症を鈍化する
全臓器ＲＮＡ配列決定を使用して、ＭＳＣ−ＥＶが肺トランスクリプトームに及ぼす影響の公平な概要を生成した（図９Ａ〜９Ｆ）。ＷＪＭＳＣ−ＥＶ処置からの全肺ＲＮＡをＮＲＭＸおよびＨＹＲＸ対照群と比較した。ＰＮ７では、ＨＹＲＸに暴露された動物は、それらのＮＲＭＸの対応物と比較して、２５６１個の有意に濃縮されたｍＲＮＡを、２３４４個の抑制されたｍＲＮＡを有した。ＷＪＭＳＣ−ＥＶ処置は、ＨＹＲＸ誘発遺伝子のサブセット（１１７個のｍＲＮＡ）を有意に抑制し、ＨＹＲＸ曝露によって抑制された８３個の遺伝子を有意に上方調節し、全体の遺伝子発現プロファイルをそれらのＮＲＭＸの対応物にシフトした（図５Ａ）。興味深いことに、４１個の遺伝子がＨＹＲＸではなくＷＪＭＳＣ−ＥＶ処置によって特異的に誘発された。遺伝子オントロジー（ＧＯ）分析は、これらの遺伝子が細胞外マトリックスおよび構造組織、心血管発達／形態形成、および核へのＳＭＡＤタンパク質の輸入に関与している傾向があることを示した（図９Ｃ）。Ｆ９画分の血漿メンバー関連タンパク質の表を表１および２に示す。ＧＯ分類は以下のとおりである：膜のインテグラル構成要素（ＧＯ：００１６０２１）および膜のアンカー構成要素（ＧＯ：００３１２２５）。
【００８１】
表１：ＭＥＸ固有の膜タンパク質：精製ＭＳＣエキソソームに存在し、皮膚線維芽細胞エキソソームには非存在。
【表１】
2020531011.tif 000003
【００８２】
表２：皮膚線維芽細胞エキソソームと比較して、精製ＭＳＣエキソソームで＞４倍濃縮された膜タンパク質。
【表２】
2020531011.tif 000004
【００８３】
表３：ＭＥＸ固有の膜タンパク質：精製ＭＳＣエキソソームに存在し、皮膚線維芽細胞エキソソームに非存在
【表３】
2020531011.tif 000005
【００８４】
ＧＯ分析を使用すると、ＨＹＲＸ暴露が、適応免疫応答、炎症応答、および白血球媒介免疫に関与する遺伝子を上方調節することがわかった（図９Ｄ）。ＷＪＭＳＣ−ＥＶ処置により、炎症促進性ＨＹＲＸ応答遺伝子の誘導が鈍化され、炎症、適応免疫応答、ＩＦＮ−γを介したシグナル伝達、顆粒球産生、白血球の走化性およびサイトカイン産生に関与する遺伝子が抑制された（図９Ｅ）。ＰＮ７とは対照的に、肺ｍＲＮＡプロファイルの変化はＰＮ１４でほとんど検出されなかった（図９Ｂ）。ＨＹＲＸ対照マウスは、それらのＮＲＭＸの対応物と比較して、３５６個の有意に濃縮されたｍＲＮＡ、２８２個の抑制されたｍＲＮＡを有した。ＷＪＭＳＣ−ＥＶ処置マウスは、ＨＹＲＸ調節不全遺伝子のサブセットのレベルを有意に調整し続けた（図９Ｆ）。
【００８５】
選択した全肺ＲＮＡ−ｓｅｑデータの検証は、ＲＴ−ｑＰＣＲによって評価した。したがって、ＰＮ７では、Ｃｃｌ２、Ｃｃｌ７、Ｉｌ６などの古典的に活性化されたＭ１マクロファージの炎症促進性マーカーと指数は、ＮＲＭＸ対照マウスと比較してＨＹＲＸ対照群で上昇し、ＭＳＣ−ＥＶ処置によって有意に抑制された（図５Ｂ）。さらに、アルギナーゼ−１（Ａｒｇ１）、Ｃｄ２０６、Ｃｃｌ１７などの抗炎症Ｍ２様極性化に関連する遺伝子もＨＹＲＸ対照群で調節不全であり、ＭＳＣ−ＥＶ処置により有効に調節された（図５Ｂ）。ＷＪＭＳＣ−ｅｘｏまたはＢＭＳＣ−ｅｘｏ調製物の効果を示すグラフは図１４に見出すことができる。
【００８６】
ＭＳＣ−ＥＶはin vitroおよびin vivoでマクロファージ表現型の免疫調節により炎症を抑制する
マクロファージの極性化は、発達中の肺の免疫応答と炎症の調節に重要な役割を果たす（３５）。全肺ＲＮＡ分析は、ＭＳＣ−ＥＶがＨＹＲＸ誘発炎症遺伝子の発現を調節することを示しており、ＥＶが免疫細胞機能を調節することによりＢＰＤに治療的利益をもたらす可能性があることを示唆している。ＥＶが免疫機能を直接調節できるかどうかを試験するために、次に、ＥＶがin vitroでマクロファージ表現型を調節する能力を評価した。蛍光顕微鏡を使用して、肺胞マクロファージによってＷＪＭＳＣ−ＥＶが容易に取り込まれることが観察された（図１０Ａ）。次いで、ＷＪＭＳＣ−ＥＶがＲＴ−ｑＰＣＲによって主要なマクロファージ遺伝子を調節できるかどうかを判断した。用量依存的に、古典的に活性化された（Ｍ１）マクロファージにＷＪＭＳＣ−ＥＶを追加すると、ＴＮＦα、Ｉｌ６、Ｃｃｌ５などの確立された炎症促進性Ｍ１マーカーのｍＲＮＡレベルが有意に減少した（ｐ＜０．０５）（図６Ａおよび１０Ｂ）。ＷＪＭＳＣ−ＥＶをＭ２極性化マクロファージに追加すると、ＲｅｔｎｌａおよびＣｄ２０６の誘導が有意に抑制され（それぞれｐ＜０．００１およびｐ＜０．０１、図６Ｂ）、最も重要なこととして、マクロファージＡｒｇ１発現レベルが大幅に向上した。これは、ＭＳＣ−ＥＶの抗炎症作用を直接反映したものである。ｉＮＯＳ基質であるアルギニンが枯渇すると、マクロファージのＭ１機能が有効に減少し、Ｍ２様状態が強化されるためである。ＨＤＦ−ＥＶは、ビヒクルおよび生物学的対照として使用され、最小限の効果を示した。
【００８７】
本明細書で説明するＨＹＲＸ誘発ＢＰＤモデルでは、フローサイトメトリーを使用して、ＰＮ７およびＰＮ１４でのin vivoでの肺マクロファージ（Ｃｄ４５＋ｖｅ、Ｃｄ１１ｂ−ｖｅ、Ｃｄ１１ｃ＋ｖｅ、Ｃｄ６４＋ｖｅ）表現型を評価した（図６Ｃ、６Ｄ、および１１）。Ｃｄ４０とＣｄ８６を炎症促進性Ｍ１マーカーとして使用し、Ｃｄ２０６を代わりに活性化された（Ｍ２様）マクロファージを同定するために使用した。in vitro実験およびin vivo肺ｍＲＮＡレベルと同様に、ＷＪＭＳＣ−ＥＶはＰＮ７（ｐ＜０．０５）でＨＹＲＸが誘発するＣｄ２０６レベルの増加を有意に抑制し、この傾向はＰＮ１４（ｐ＜０．０１）に続いた。ＰＮ７およびＰＮ１４では、ＮＲＭＸの対応物と比較して、ＨＹＲＸ暴露マウスでＣｄ４０レベルが上昇した。この増加はＰＮ１４でＷＪＭＳＣ−ＥＶ処置によって抑制されたが、ＰＮ７でも同様の傾向が観察され、これは有意ではなかった。ＰＮ７とＰＮ１４の両方で、すべての群でＣｄ８６レベルに違いは見られなかった。
【００８８】
考察
いくつかの動物モデルが開発され、洗練され続け、ＢＰＤのヒト新生児の肺に見られる病理学的肺の特徴を再現することを目指している。ＢＰＤのすべての前臨床モデルには独自の利点と制限があるが、おそらくＢＰＤはマウスで最も一般的にモデル化されている。この理由は多様であり、比較的短い妊娠期間が含まれ、肺の発達に関する適切な研究を可能にしている。重要なことに、マウス肺の発達の嚢状の段階はＥ１７．５とＰＮ５の間で発達する。したがって、満期マウスの肺は、妊娠２４週と２８週との間のヒトの早産児に似た発達段階を示す。これは、発達性肺損傷の優れたモデルであり、最近（２７）でレビューされた。この研究で使用されるモデルは、「新しい」ＢＰＤのヒト表現型に非常に似た、二次ＰＨの指数の有意な肺胞単純化と微妙な上昇を示す。
【００８９】
本明細書に記載の研究は、損傷が始まった後でも、精製されたヒトＭＳＣ−ＥＶのボーラス用量がＨＹＲＸ誘発ＢＰＤのコアの特色を有効に低減および救済することを示す。具体的には、本明細書に記載の研究は、ＭＳＣ−ＥＶ処置が根本的に肺の形態と肺の発達を改善し、肺線維症を減少させ、肺血管系の喪失を救済し、肺血管リモデリングを改善したことを示す最初の研究である。これらの観察は、ＭＳＣ−ＥＶの細胞保護作用が、肺機能試験結果の改善および関連するＰＨの改善などの望ましい機能的転帰をもたらすことを示すために拡張された。さらに、ＭＳＣ−ＥＶは、部分的には肺マクロファージ表現型の調節を介し得るＨＹＲＸ誘発炎症促進性シグナル伝達および免疫応答を鈍化させることがわかった。
【００９０】
これまでの研究では、ＭＳＣセクレトームの投与により、実質線維症および末梢肺動脈血管新生の部分的な予防および／または逆転、肺胞形成の改善、ＢＰＤの実験モデルにおける肺機能試験結果の改善が示された（１８、２０）。しかしながら、ＭＳＣセクレトームの原因となる生物学的メディエーターはとらえどころのないままであった。したがって、このデータは、ＭＳＣ−ＣＭ内の治療ベクターがＥＶによって利用され、ＭＳＣ−ＥＶの単回用量がＨＹＲＸ誘発肺胞の単純化を改善し、血管リモデリング、肺血管喪失を改善し、肺線維症を鈍化することができることを示すために、知見を支持および拡張する。以前の研究では、ＢＰＤの乳児は肺機能の異常を示し、乳児期に始まり、多くの場合、小児期を通して、さらに思春期初期まで持続することが明らかになっている。その結果、元ＢＰＤの乳児だった成人は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を発症するリスクが高くなる可能性がある（３６）。ほぼ完全に回復した肺の構造、血管のリモデリング、および血行動態の組織学的知見を補完することにより、この研究もまた、ＭＳＣ−ＥＶ処置が肺力学に有意な長期機能的利益をもたらし、ＰＶループを改善し、ＴＬＣを低下させたことを示す。
【００９１】
好中球の活性化は肺の炎症の重要な原因であるが（３７）、マクロファージは新生児の肺の免疫応答の重要なメディエーターであり、炎症の開始と消散の両方を促進する（３８、３９）。ＭＳＣ−ＥＶは免疫疾患のモデルで免疫調節性であり、マクロファージ表現型を調節することが示された（２８、２９、４０）。マクロファージ表現型は多様であり、多次元ネットワークが発達、活性化、および機能的多様性に与える影響を表している（３７、３８）。従来のＭ１／Ｍ２バイナリパラダイムは時代遅れと考えられ（３９）、実際、前臨床モデルの最近のエレガントな研究は、肺マクロファージの可塑性に対する微小環境の影響を強調し、肺の恒常性と疾患に関連する時間的およびコンパートメントのマクロファージ表現型の多様性に取り組んでいる（３５、３６、４０）。
【００９２】
ＭＳＣ−マクロファージ共培養を使用すると、ＭＳＣセクレトームがＭ１からＭ２へのシフトにおける主要なパラクリンメディエーターであることが示された。特に、慢性Ｍ２活性化は、増幅された組織のリモデリングが最適な修復を妨げる可能性のある線維症の有害な状態を触媒する可能性があった（３８、４１）。したがって、Siccoと同僚は、マクロファージへのＭＳＣ−ＥＶの追加により、炎症促進性Ｍ１表現型からＭ２様状態への切り替えが誘発され、ＭＳＣ−ＥＶが心毒素誘発筋肉損傷モデルにおいてＭ１およびＭ２マーカーの組織ｍＲＮＡレベルを調節したことを報告した（４２）。
【００９３】
この研究からの観察は、ＭＳＣ−ＥＶがＭ１／Ｍ２表現型支点を調節し、炎症促進性Ｍ１状態を抑制し、in vitroおよびin vivoで抗炎症Ｍ２様極性化を調節するという証拠を提供する。ＭＳＣ−ＥＶの抗炎症および免疫調節能力に直接関係するＭＳＣ−ＥＶ処置は、新生児肺の発達停止の根底にあり得るＨＹＲＸ誘発シグナル伝達のすべてではなく、ほとんどを集合的に調節する多面発現効果を有していた。以前、ＨＹＲＸ誘発新生児肺損傷の前臨床モデル（４３）および臨床研究（４４）は、炎症経路がＢＰＤで調節不全であることを示した。具体的には、１０６７人の超低出生体重児を対象とした研究では、ＩＬ−１β、−６、−８、−１０、およびＩＦＮ−γの濃度が高いほど、ＢＰＤと乳児死亡が関連付けられることがわかった（４５）。総合すると、肺全体のトランスクリプトーム分析とin vitroおよびin vivoでのマクロファージ極性化の評価は、ＭＳＣ−ＥＶが強力な免疫調節能力を発揮し、過酸素障害時に炎症状態のピークで作用できることを示している。ＰＮ１４では、暴露した動物が１週間室内空気に戻った後、ＨＹＲＸが誘発する遺伝子発現の調節不全のすべてではないが、ある程度の回復と正常化を示唆する証拠があった。したがって、ＨＹＲＸ誘発炎症プロセスの早期介入と鈍化は、肺の発達を維持するために重要であるように見える。ＰＮ１４では、暴露動物がすでに１週間室内空気に戻されていた場合、肺遺伝子発現の過酸素症に誘発された調節不全の大部分（すべてではないが）が正常に戻っていたため、早期の介入と初期の過酸素症に誘発された炎症フェーズの鈍化が、適切な肺の発達を維持するために重要であることが示唆された。
【００９４】
ＭＳＣ−ＥＶ処置後、確固たる生理学的変化を観察した。ＭＳＣ−ＥＶに基づく用量は、低酸素誘発性ＰＨの成体マウスモデルでＭＳＣ−ＥＶを使用した先行文献で推定された（２１）。今後の研究では、用量応答と種々の投与経路がさらに調査されるであろう。
要約すると、慢性新生児肺疾患の発生率が上昇し続けているため、ＥＶ治療薬が新生児の疾患の主要なパラダイムを表している可能性があることは明らかである。この研究では、ヒトＷＪＭＳＣ、ＢＭＳＣ、およびＨＤＦ−ＥＶに由来するＥＶが単離、同定、および包括的に特徴付けられた。さらに、本明細書では、ＭＳＦ−ＥＶとＨＤＦに由来するベシクルに特有の確固たる治療効果が実証されている。重要なことに、これは、精製されたＭＳＣ−ＥＶが肺のＭＳＣ作用の主要なパラクリン抗炎症および治療メディエーターであることが初めて示されたものであり、これらは少なくとも部分的には肺マクロファージ表現型の調節を通じて作用し、肺炎症および免疫応答を抑制して組織の発達を促進し得る。ＭＳＣ−ＥＶの多面的効果が認められていることを考えると（４６）、神経障害を含む他の未熟児関連の病態は、エキソソームベースの治療の標的になる可能性がある。
【００９５】
方法
動物モデルと実験計画
過酸素症に誘発されたＢＰＤモデル、実験計画、および標準分析法の詳細な説明は、補足の方法に記載されている。すべての動物実験は、ボストン小児病院の動物管理使用委員会によって承認された。
【００９６】
エキソソームの単離、精製、および特性解析
ＥＶを細胞培養上清から直接単離した。ＦＢＳからのＥＶ汚染を避けるため、無血清培地（ＳＦＭ）で３６時間インキュベートした後、細胞培養培地を収集した。細胞培養培地を３００×ｇで１０分間（懸濁液中の細胞を除去するため）、続いて３０００×ｇで１０分間、１３，０００×ｇで３０分間の差動遠心分離にかけ、懸濁液中の細胞破片および大きなアポトーシス体を除去した（図１Ａ）。ＭＳＣ−ＣＭは、３００ｋＤａ ＭＷカットオフの改質ポリエーテルスルホン（ｍＰＥＳ）中空糸（Spectrum Labs、Irving TX）を使用したタンジェント流濾過（ＴＦＦ）により５０倍に濃縮した。ＥＶをOPTIPREP（商標）（イオジキサノール；ＩＤＸ）クッション密度の浮遊を使用してさらに精製した。３ｍｌの５５％ｗ／ｖ ＩＤＸ溶液上に、ＮａＣｌ（１５０ｍＭ）および２５ｍＭ Ｔｒｉｓ：ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を含む３ｍｌの１０％ｗ／ｖ ＩＤＸ溶液を浮遊させることにより、ＩＤＸ勾配を慎重に調製した。濃縮ＣＭ（６ｍｌ）をＩＤＸクッションの上に浮遊させ、１００，０００×ｇで３．５時間、ＳＷ４０ Ｔｉローターを使用して超遠心分離した（４℃、図１Ｂ）。すぐにＥＶの特性解析を行うために、勾配の上部から１２の画分（各１ｍｌ）を収集するか、凍結（−１℃／分）して−８０℃に保った。ＩＤＸ画分密度を重量／体積比（ｇ／ｍｌ）で評価した。
【００９７】
統計
種々の群間のデータを分散分析で比較し、続いてGraphPad Prism（v6.0; GraphPad、CA、US）を使用したボンフェローニ多重比較検定を行った。ピアソン相関係数を使用して、免疫組織化学血管リモデリングパラメーターとＰＨの生理学的指標との関係の強さを調べた。FlowJoソフトウェアv10.2（TreeStar、OR、US）を使用して、フローサイトメトリーデータ分析を行った。特に明記しない限り、値は平均±ＳＥＭとして表される。ＲＴ−ｑＰＣＲによる炎症マーカーｍＲＮＡレベルの評価は、同種のＮＲＭＸ対照群と比較して表され、中央値±範囲として表される。特に明記しない限り、有意性はｐ＜０．０５で考慮した。in vivo研究では、試料サイズの計算は以前の研究に基づいており（１８）、５％αレベル、＞９０％の出力で、肺構造の１５％の改善（平均線形切片；ＭＬＩで評価）を検出するには、１群あたり最低５匹の動物が必要であることを示唆する。
【００９８】
細胞の単離と培養
ヒト臍帯ホウォートンゼリー間葉系幹細胞（ＷＪＭＳＣ）を、外植片法の改変を使用して単離した（４７）。簡潔には、臍帯をダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（dPBS、Invitrogen、MA、US）で２回すすぎ、縦に切断し、動脈と静脈を除去した。軟らかいゲル組織を小片（約３〜６ｍｍ２）に細かく切開し、２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Invitrogen、MA、US）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、およびペニシリン／ストレプトマイシンを補充したα-Modified Eagle Medium（αMEM、Invitrogen、MA、US）を含む１９３ｍｍ２の組織培養皿（２４ウェルプレート）に個々に配置し、５％ＣＯ２の加湿雰囲気で、３７℃で１２日間インキュベートした。補充したαＭＥＭを定期的に加えた後、臍帯組織を慎重に除去した。プレートを培地で３回洗浄した。プラスチック接着細胞コロニーをトリプシン処理し、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、およびペニシリン／ストレプトマイシンを補充したαＭＥＭの培養で維持した。４代継代で、ＷＪＭＳＣは６３６０ｃｍ２の細胞増殖面積を占める１０スタックのCorning CELLSTACK（登録商標）細胞培養チャンバー（Sigma、PA、US）に拡張した。いくつかの臍帯を使用し、それぞれが個々のＭＳＣコロニーを生じさせた。すべてのクローンおよび対応するＥＶを以下のように特性解析した。
【００９９】
ヒト骨髄間葉系幹細胞（ＢＭＳＣ）をRoosterBio（RoosterBio、MD、US）から得た。細胞は、ｈＭＳＣ高性能培地キット（RoosterBio、MD、US）を使用することを除いて、ＷＪＭＳＣと同様に培養および拡大させた。細胞は、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで維持した。ヒトの包皮（皮膚）線維芽細胞（ＨＤＦ）を、組織外植片法によって確立した（４８）。新たに切除した組織をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回すすいだ。組織切片を、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、およびペニシリン／ストレプトマイシンを補充したα−ＭＥＭで維持し、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中、３７℃で７日間インキュベートした。７日後、プラスチック接着細胞コロニーをトリプシン処理し、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、およびペニシリン／ストレプトマイシンを補充したαＭＥＭの培養で維持した。細胞を培養し、ＷＪＭＳＣと同様に拡大させた（上記のとおり）。トリパンブルー排除（１：１ ｖ／ｖ）を使用して細胞数を測定し、Cellometer Auto T4（Nexcelom Biosciences、MA、USA）を使用して分析した。
【０１００】
ＭＳＣ細胞表面の特性解析と分化
細胞表面プロファイルのサイトメトリー評価は、４継代目に行った。サイトメトリー分析に使用する抗体は、BioLegend、CA、USAおよびBD Biosciences、MA、USから得た。例えば以下の確立されたＭＳＣマーカーの発現のために、ＷＪＭＳＣとＨＤＦを選択した：蛍光結合抗体のセットを使用する、ＡＰＣ／ＦＩＴＣ結合ＣＤ１０５、ＦＩＴＣ結合ＣＤ９０、ＰＥ結合ＣＤ４４、およびＡＰＣ結合ＣＤ７３、およびＦＩＴＣ結合ＣＤ１１ｂ、ＰＥ結合ＣＤ３１、ＰＥ結合ＣＤ３４、およびＰＥ結合ＣＤ４５の不在（図７）。フローサイトメトリーは、４０７ｎｍ、４８８ｎｍ、６４０ｎｍレーザー、およびBD FACS Divaソフトウェア（v 5.0.3）を備えたBD（商標）LSR IIフローサイトメーターレーザーベンチトップフローサイトメーターを使用して行った。
ＷＪＭＳＣおよびＨＤＦ培養物の軟骨細胞、骨細胞、および脂肪細胞系統への分化能は、製造業者の指示に従って、それぞれSTEMPRO（登録商標）、軟骨形成、骨形成、および脂肪形成分化キット（ThermoFisher Scientific）を使用して評価した（図８）。
【０１０１】
透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）
ＥＶの視覚化と形態評価のために、ＥＶ調製物のアリコート（５〜１０μｌ）を１５秒間フォームバー／炭素被覆グリッド（Electron Microscopy Sciences、PA、US）に吸着させた。余分な液体をWhatman Grade 1濾紙（Sigma）で除去した後、２％酢酸ウラニルで１５秒間染色した。JEOL 1200EX透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で吸着したＥＶを検査し、AMT 2k CCDカメラで画像を記録した。
【０１０２】
ナノ粒子追跡分析
ＥＶのサイズと濃度分布を、前述のように、ナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ、NanoSight LM10システム、Malvern instruments、MA、US）を使用して決定した（４９）。ＮＴＡは、６４２ｎｍレーザーと高感度デジタルカメラシステム（OrcaFlash2.8、Hamamatsu、NanoSight Ltd）を備えたレーザー照射顕微鏡技術であり、ナノ粒子のブラウン運動をリアルタイムで決定してサイズと濃度を評価する。試料は、NanoSightシリンジポンプとスクリプト制御システムを使用して、制御されたフローの下で管理および記録され、各試料について、６０秒の持続時間の３つのビデオを記録した。ＮＴＡソフトウェア（バージョン３．０）を使用して、粒子の動きを分析した。カメラのシャッタースピードは３０．０１ｍｓ、カメラゲインは５００に固定した。カメラの感度と検出閾値は、それぞれ（１１〜１４）と（５０〜５２）であった。ＥＶ試料は、ＥＶを含まないｄＰＢＳで希釈した。試料は３回実行し、そこからＥＶ分布、サイズ、および平均濃度を計算した。
【０１０３】
イムノブロッティング
ＥＶ調製物中のタンパク質を４〜２０％ポリアクリルアミドゲル（Bio-Rad、Hercules、CA）で分離し、次いで０．４５μｍＰＶＤＦ膜（Millipore、MA、US）に転写した。ウサギポリクローナル抗フロチリン−１および抗ＣＤ６３抗体（Santa Cruz Biotech、CA、US）、およびマウスポリクローナルＣＤ９抗体（Santa Cruz  Biotech、CA、US）を、製造業者が推奨する希釈でのイムノブロッティングに使用した。
【０１０４】
実験計画
実験計画の概略図を図２Ａに示す。新生児ＦＶＢマウスを過酸素症（ＨＹＲＸ、７５％Ｏ２）に７日間暴露し、ＭＳＣ−ＥＶの有無にかかわらず処置した。追加の対照として、ＮＲＭＸ対照動物は、ＷＪＭＳＣ−ｅｘｏの静脈内（ＩＶ）単回用量を受けた。ＨＹＲＸに暴露した動物を、酸素正常状態のままのマウス（ＮＲＭＸ、室内空気）と比較した。ＰＮ７でマウスを犠牲死させ、フローサイトメトリー分析と全肺ｍＲＮＡプロファイリングのために肺全体を収集した。２週齢（ＰＮ１４）で、組織学、全肺ｍＲＮＡ分析、フローサイトメトリー、および免疫組織化学のために肺組織を収集した。ＰＮ４２で長期転帰を評価した。ここでは、マウスは組織学、圧力測定、ＲＶ肥大、および肺機能試験のために犠牲死させた。動物実験は、ボストン小児病院の動物管理使用委員会によって承認された。
【０１０５】
ＥＶ投薬
ＰＮ４で、ＥＶ調製物（５０μｌのＷＪＭＳＣ−ＥＶ、ＢＭＳＣ−ＥＶ、またはＨＤＦ−ＥＶ）を浅側頭静脈から静脈内（ＩＶ）注射した。ＥＶ調製物をｄＰＢＳで適宜希釈し、０．５×１０６細胞当量に対応するＥＶ用量を達成した。対応するＮＴＡおよびタンパク質濃度値を記録した（表４）。
【０１０６】
表４：ＥＶ投薬。ＥＶベースの治療薬のＥＶ定量化のための「ゴールドスタンダード」方法は存在しない。ＰＮ４では、ＥＶ集団［対応する画分９］を適宜希釈して、３６時間で０．５×１０６個の細胞に相当する単一ボーラス用量を達成した。エキソソーム調製物をＰＢＳで希釈して、１匹の動物あたり５０μｌのこの標準的な投薬量を達成した。種々の細胞型からのエキソソーム調製物は、ＮＴＡによって評価される匹敵するナノ粒子数を含んでいたが、それらのタンパク質含有量は異なっていた。これは、我々の高度に精製された密度浮遊調製物に依然として存在する残留非エキソソームタンパク質夾雑物の存在によるものである。比較として、７５分間の１００，０００ｘｇでの差動遠心分離およびペレット化によるＣＭの収集により、タンパク質の最大９５％がフィブロネクチン凝集体および他の細胞マトリックス破片を表す調製物が得られる（我々の未公開所見）。かかるペレットは、しばしばエキソソームまたは細胞外ベシクルと呼ばれるが、タンパク質濃度とナノ粒子数の間にはほとんど関係がない。
【０１０７】
【表４】
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【０１０８】
過酸素症（ＨＹＲＸ）チャンバー
新生児の子をプールし、プレキシガラスチャンバー内の７５％Ｏ２またはＰＮ１で始まり７日間継続する（ＰＮ１−７）室内空気に暴露した。人口呼吸をOxycyclerコントローラー（Biospherix、NY、US）で調整し、ＣＯ２が５，０００ｐｐｍ（０．５％）を超えないようにＣＯ２を除去した。人口呼吸器と空気清浄機による木炭濾過によりアンモニアを除去した。成体マウスへの過剰なＯ２毒性を防ぐため、４８時間ごとに室内空気とＨＹＲＸチャンバーの間でダムを回転させた。
【０１０９】
肺組織灌流、解剖および組織学
６０ｍｇ／ｋｇのペントバルビタール（腹腔内（ＩＰ））による麻酔後、２５ｃｍ Ｈ２Ｏの一定圧力で右心室（ＲＶ）を介して肺にＰＢＳを灌流した。左肺を慎重に摘出し、−８０℃で保存した。右肺は、in situで４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を使用して１５〜２０ｃｍ Ｈ２Ｏの固定圧力まで膨張させ、４％ＰＦＡで終夜保存した。固定した肺組織を７５％エタノール（ＥｔＯＨ）に移し、その後の処理と、４つの別個の右肺葉としての切片のパラフィン包埋を行った。
【０１１０】
肺実質、血管形態計測、免疫蛍光、および免疫組織化学
ＰＦＡ（４％ｗ／ｖ）による肺固定後、肺切片を組織学的に分析した。肺切片をヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）およびマッソントリクローム（コラーゲン沈着）で染色した。Nikon Eclipse 80i顕微鏡（Nikon、Tokyo、Japan）を使用して、厚さ５μｍの肺切片から無作為に選択した領域（１０〜２０個のフィールド）を１００倍（Ｈ＆Ｅ）および２００倍（マッソントリクローム）の倍率で撮影した。画像のキャリブレーションは、同じ倍率を使用して標準的なマイクロメーター画像を取得することにより行った。肺の形態計測のために、大きな気道と血管を避けた。平均線形切片（ＭＬＩ）を測定するために、次いで５８μｍ間隔の平行線のグリッドを画像にオーバーレイし、肺胞壁の切片によって定義された各弦の長さをMetamorphソフトウェアv.6.2r（Universal Imaging、Downingtown、PA）を使用して記録した。コラーゲン沈着の程度を、Metamorphソフトウェアを使用して測定し、全中隔野あたりのコラーゲン沈着のパーセンテージとして表した。
【０１１１】
肺微小血管系の喪失は、Metamorphソフトウェアを使用して、直径（＜５０および５０〜１５０μｍ）で層別化された１００×の倍率の８〜１２のランダム画像のフォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）陽性血管の数を数えることで決定した。組織切片を再水和し、１０ｍＭクエン酸バッファーでマスキングを解除し、次いで一次抗体（Dacko；ポリクローナルｖＷＦ Ａｂ、１：２００）とともにインキュベートした。その後、スライドを洗浄し、Alexa fluor 488結合ロバ抗ウサギ（１：５００）抗体とともにインキュベートした。
【０１１２】
肺の血管新生を評価するために、アルファ平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）の免疫組織化学（ＩＨＣ）分析を行った。簡潔には、肺組織切片をキシレンで脱パラフィンし、再水和した。組織スライドをメタノール中の０．３％Ｈ２Ｏ２で処理して内因性ペルオキシダーゼを不活性化し、ウマ血清で２０分間遮断した。１：１２５希釈のモノクローナル抗マウスα−ＳＭＡ抗体（Sigma、MO、US）とインキュベートした後、二次抗体とペルオキシダーゼ染色を製造業者の指示に従って適用した（Vector Laboratories, CA, US）。血管壁厚は、２００×の倍率で撮影された約１５切片の直径＜１００μｍの血管のα−ＳＭＡ陽性染色を測定することで評価した。壁厚は、Metamorphソフトウェアを使用して測定し、以下の式を使用して群間で比較した：内壁厚指数（ＭＴＩ）＝１００ｘ（面積［ｅｘｔ］−面積［ｉｎｔ］）／面積［ｅｘｔ］。面積［ｅｘｔ］および面積［ｉｎｔ］は、それぞれα−ＳＭＡ層の外部および内部境界内の面積を示す。組織学的分析のために、研究者は実験群に対して盲検化された。
【０１１３】
肺機能試験
肺機能を評価するために、ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）、キシラジン（６．５ｍｇ／ｋｇ）、およびペントバルビタール（２０ｍｇ／ｋｇ）のカクテルでマウスに麻酔をかけ、ＩＰ注射で投与した。気管切開後、コンピュータ制御の小動物用人工呼吸器（Scireq、モントリオール、カナダ）を使用して、マウスを１５０呼吸／分の速度、１回人口呼吸量１０ｍｌ／ｋｇ、および終末呼気陽圧（ＰＥＥＰ）３ｃｍ Ｈ２Ｏで機械的に人口呼吸させた。前述のように、圧力−体積（ＰＶ）ループ、平均気道抵抗、および肺コンプライアンスを決定した（５０）。
【０１１４】
右心室収縮期圧（ＲＶＳＰ）および右心室肥大（ＲＶＨ）の測定
直接的な右心室収縮期圧（ＲＶＳＰ）を前述のように測定した（５１）。簡潔には、１００％Ｏ２中のイソフルランでマウスを麻酔した。腹壁に小さな切開を行い、半透明の横隔膜を露出させた。圧力変換器に取り付けられたチューブ付きの２３ゲージのバタフライ針をダイアフラムを通して右心室に挿入し、PowerLab（ADInstruments、CO、US）モニタリングハードウェアおよびソフトウェアで圧力測定を記録した。心拍数が１分あたり＜３００拍の動物を除外した。最初の１０回の安定した心拍の平均ＲＶＳＰを記録した。右心室肥大（ＲＶＨ）の程度を定量化するために、心臓と肺血管系を右心室（ＲＶ）へのＰＢＳ注入でin situで灌流した。心臓を切除し、ＲＶと体重（ＢＷ）の比率（ＲＶ：ＢＷ）を記録した。フルトン指数測定（左心室（ＬＶ）＋中隔（Ｓ）重量に対するＲＶ重量の比、ＲＶ／［ＬＶ＋Ｓ］）について、最初に心臓全体の重量を測定した後、ＲＶ壁を解剖して重量を測定し、その後、残っているＬＶと心室中隔を測定した。生理学的測定のために、研究者は実験群に対して盲検化された。
【０１１５】
肺ＲＮＡ配列決定
肺ＲＮＡ配列決定のために、ＰＮ７およびＰＮ１４でマウスを収集した。ＰＢＳでＲＶを介して灌流した後、左肺を除去し、大きな気道を末梢肺組織から切開した。全肺ＲＮＡを以前に記載されているように単離した（５２）。ＲＮＡの質は、Advanced Analytical Fragment Analyzerを使用して確認した。ポリアデニル化ｍＲＮＡ（１μｇ）を、oligoDTベースの精製を使用して単離し、逆転写酵素反応のインプットとして使用した。次いで、TruSeq Stranded mRNAキット（Illumina、CA、US）を使用して、ｃＤＮＡの配列決定ライブラリー調製を行った。ライブラリーのモル濃度を、Advanced Analytical Fragment Analyzerを使用して決定し、ライブラリーは等モル濃度でプールした。ライブラリーを、Hi-Seq 2500機器を使用して、高出力シングルリード５０ベースフォーマットで配列決定した。Trimmomaticソフトウェアを使用して短い（＜３５塩基対）または低品質の読み取りを除去した後（５３）、生ＲＮＡｓｅｑデータを、STARを使用してマウス参照ゲノム（ｍｍ１０ビルド）にアライメントした（５４）。UCSC Genome Browserから取得したマウス注釈付き遺伝子のカウントテーブルを、Feature Counts（５５）を使用して生成し、次いで、配列決定の深度に基づいてデータセットを正規化し、RのDESeq2パッケージを使用してWald試験を実行した後、差次的に発現する遺伝子を同定した（５６）。遺伝子オントロジー（ＧＯ）分析とIngenuity Pathway Analysis（IPA）を使用して、潜在的なｍＲＮＡネットワークと標的を調査した。ＲＴ−ｑＰＣＲを使用して、配列決定結果の再現性と選択候補遺伝子のレベルを検証した（以下で説明）。
【０１１６】
ＭＳＣ−ＥＶの免疫調節効力：マクロファージ極性化アッセイ
初代マウス骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）を、６〜８週齢のＦＶＢマウスの大腿骨と脛骨を洗い流し、３０％ｖ／ｖ Ｌ９２９条件培地（マクロファージコロニー刺激因子の供給源として；Ｍ-ＣＳＦ）を含む１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭで細胞を７日間培養することによって得た。肺胞マクロファージ（ＭＨ−Ｓ）細胞株をATCC（ATCC、US）から得た。ＭＨ−Ｓ細胞またはＢＭＤＭをin vitroでＭ１およびＭ２極性化状態に駆動した。簡潔には、Ｍ１極性化をリポ多糖（ＬＰＳ）１００ｎｇ／ｍｌおよびインターフェロン−γ（ＩＦＮγ）２０ｎｇ／ｍｌ刺激によって開始した。Ｍ２極性化状態をＩＬ−４（２０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−１３（２０ｎｇ／ｍｌ）によって駆動した。ＷＪＭＳＣ−ＥＶの免疫調節機能を評価するために、ＷＪＭＳＣ-ＥＶ調製物（０．０５〜１×１０６個の細胞当量）の存在下／非存在下で、マクロファージ極性化（０．５×１０６ ＢＭＤＭ）を開始した。ＨＤＦ−ＥＶは生物学的およびビヒクル対照として機能した。ＢＭＤＭ全ＲＮＡを単離し、補足的方法に記載されているようにＲＴ−ｑＰＣＲにより遺伝子発現レベルを評価した。すべてのサイトカインをPeprotech（Peprotech、NJ、US）から購入した。
【０１１７】
ＭＳＣ-ＥＶがマクロファージと相互作用することを証明するために、ＤｉＬ標識ＥＶは、８ｍｌ ＤｉＬ（鮮やかなＤｉＬ標識溶液、Invitrogen、ＤＭＥＭで１：１０００に希釈）で３７℃および５％ＣＯ２で３０分間インキュベート処理したＷＪＭＳＣ（５×１０６）に由来した。インキュベーション後、２ｘ１０ｍｌのＰＢＳ洗浄により遊離トレーサーを除去し、１８ｍｌのＥＶを含まないＳＦＭで２４時間維持した。２４時間後、細胞培養上清を採取し、差動遠心分離ステップ（前述）を行った後、超遠心分離（１００，０００×ｇ、７０分間、４℃）を行った。ペレット化ＥＶを、超遠心分離（１００，０００×ｇ、７０分間、４℃）で、ＰＢＳで洗浄した。最後の洗浄段階からの上清を保持し、対照として使用して、ＤｉＬ汚染を除去した。次に、７５％コンフルエンスまで増殖したＭＨ−Ｓ細胞をＤｉＬ標識ＭＳＣ−ＥＶで３時間処理した（３７℃および５％ＣＯ２）。非接着ＭＳＣ−ＥＶを除去するために、３×１０ｍｌのＰＢＳ洗浄を行った。細胞および接着ＥＶを、Nikon Eclipse 80i顕微鏡（Nikon、東京、日本）を使用して蛍光によって視覚化されるまで、増殖培地で維持した。
【０１１８】
マウス肺全体のサイトメトリー分析
前述のように（５７）、フローサイトメトリーを使用して、肺細胞集団の濃度と肺マクロファージの表現型を評価した。マウスをＰＮ７およびＰＮ１４で収集した。ＰＢＳでＲＶを介して灌流した後、左肺を除去し、大きな気道を末梢肺組織から切開した。肺組織を小片に切断し、ファルコンチューブ（Fisher Scientific、NH、US）に移し、RPMI-1640（Invitrogen、CA、US）、コラゲナーゼＩＶ（１．６ｍｇ／ｍｌ）およびＤＮＡｓｅ１（５０単位／ｍｌ）（両方ともWorthington Biochemical Corp、NJ、USから）からなる５ｍｌの消化バッファーで処理した。均質化した肺を４０μｍのセルストレーナー（Corning、MA、US）に通して、単一細胞懸濁液を得た。残りの赤血球を、赤血球溶解バッファー（Roche、IN、US）を使用して溶解した。細胞懸濁液を抗体（ＰＥ／Ｃｙ７結合Ｃｄ４５、ＦＩＴＣ結合Ｃｄ１１ｂ、ＰｅｒＣＰ Ｃｙ５．５結合Ｃｄ１１ｃ、およびＰＥ結合Ｃｄ６４）で染色した。マクロファージ表現型マーカーＣｄ４０、Ｃｄ８６、およびＣｄ２０６は、ブリリアントバイオレット４２１（ＢＶ４２１）に結合していた。すべての抗体をBiolegendまたはBD Biosciencesから得た。BD FACSDivaソフトウェア（BD Biosciences、MA、US）を使用して、BD LSR IIフローサイトメーターでデータを取得した。補償は適宜調整され、UltraComp ebeads（Affymetrix、CA、US）によって支持された。蛍光マイナス１対照を適宜使用した。連続ゲーティング戦略を使用して細胞集団を同定し、CountBright（商標）Absolute Counting Beads（ThermoFisher、MA、US）を使用して定量化し、絶対濃度または全細胞集団のパーセンテージとして記録した。マクロファージ活性化マーカーの発現は、蛍光強度中央値（ＭＦＩ）として表される。
【０１１９】
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応分析
肺のｍＲＮＡ評価のために、滅菌ＰＢＳでＲＶを灌流した後、前述のように（５１、５２）、ＲＮＡ抽出のために左肺を摘出し、その後ＲＴ−ｑＰＣＲによるｍＲＮＡ分析を行った。TRIZOL（ThermoFisher）を使用して、製造業者の指示に従ってＢＭＤＭ全ＲＮＡを抽出した。ＴＮＦα、Ｃｃｌ２、Ｃｃｌ７、Ｉｌ６、Ｉｌ３３、Ｃｄ２０６、Ｒｅｔｎｌａ、およびＡｒｇ１を含むＰＣＲ反応で使用されるTAQMAN（登録商標）プライマーをInvitrogenから得た。Ｎｕｐ１３３は内部標準として機能した。倍率変化の分析を以前に説明されているように行った（５１）。
【０１２０】
参考文献
【表５−１】
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【０１２１】
【表５−２】
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【０１２２】
【表５−３】
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【０１２３】
【表５−４】
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【０１２４】
【表５−５】
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【０１２５】
【表５−６】
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【０１２６】
例えば、背景、概要、詳細な説明、例、および／または参考文献のセクションで、本明細書で言及されるすべての刊行物、特許、特許出願、刊行物、およびデータベースエントリ（例えば、配列データベースエントリ）は、個々の刊行物、特許、特許出願、刊行物、およびデータベースエントリが、参照により本明細書に具体的かつ個別に組み込まれたかのように、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。矛盾する場合、本明細書の定義を含む本出願が支配するであろう。
【０１２７】
均等物と範囲
当業者は、本明細書に記載の態様の多くの均等物を認識し、または日常的な実験のみを使用して確認することができるであろう。本開示の範囲は、上記の説明に限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲に記載されているものである。
「a」、「an」、および「the」などの冠詞は、逆の指示がない限り、または文脈から明白でない限り、１以上を意味する場合がある。グループの２以上のメンバー間の「または」を含む請求項または説明は、反対の指示がない限り、または文脈から明白でない限り、１、複数、またはすべてのグループメンバーが存在する場合に満足されると考えられる。２以上のグループメンバー間に「または」を含むグループの開示は、グループのメンバーが１つだけ存在する態様、グループのメンバーが複数存在する態様、およびグループのメンバーのすべてが存在する態様を提供する。簡潔にするために、これらの態様は本明細書では個々に説明されていないが、これらの態様のそれぞれは本明細書に提供され、具体的に請求または放棄され得ることが理解される。
【０１２８】
本開示は、請求項の１以上から、または説明の１以上の関連部分からの１以上の限定、要素、条項、または説明用語が別の請求項に導入される、すべての変形、組み合わせ、および置換を包含することを理解されたい。例えば、別の請求項に従属する請求項を修正して、同じベースの請求項に従属する任意の他の請求項に見られる１以上の制限を含めることができる。さらに、特許請求の範囲に組成物が記載されている場合、本明細書に開示される作製または使用の方法のいずれか、またはもしあれば、当該技術分野において知られている方法に従って組成物の作製または使用の方法が（特に断りのない限り、または矛盾または矛盾が生じることが当業者に明らかである場合を除き）含まれることを理解されたい。
【０１２９】
要素がリストとして、例えばマーカッシュグループ形式で提示されている場合、要素のすべての可能なサブグループも開示されており、任意の要素または要素のサブグループはグループから除去できることを理解されたい。「含む」という用語は、オープンであることを意図しており、追加の要素またはステップの包含を許可することにも留意されたい。一般に、態様、物、または方法が特定の要素、特徴、またはステップを含むものとされる場合、かかる要素、特徴、またはステップからなるか、またはそれらから本質的になる態様、物、または方法も十分に提供されることが理解されるべきである。簡潔にするためにそれらの態様は本明細書では個々に説明されていないが、これらの態様のそれぞれは本明細書に提供され、具体的に請求または放棄され得ることが理解されるであろう。
【０１３０】
範囲が指定されている場合、エンドポイントが含まれる。さらに、特に断りのない限り、そうでなければ文脈および／または当業者の理解から明白でない限り、範囲として表される値は、いくつかの態様において述べられた範囲内の任意の特定の値（文脈で明確に指示されていない限り、範囲の下限の単位の１０分の１まで）をとり得ることを理解されたい。簡潔にするために、各範囲の値は本明細書中では個々に説明されていないが、これらの値のそれぞれは本明細書中で提供され、具体的に請求または放棄され得ることが理解されるであろう。また、特に断りのない限り、そうでなければ文脈および／または当業者の理解から明白でない限り、範囲として表される値は、所与の範囲内の任意の下位範囲をとり得ることを理解されたい（下位範囲のエンドポイントは範囲の下限の１０分の１の単位と同じ精度で表される）。
【０１３１】
Ｗｅｂサイトが提供される場合、ＵＲＬアドレスは、ブラウザで実行できないコードとして提供され、それぞれのＷｅｂアドレスの期間は括弧で囲まれる。実際のＷｅｂアドレスは括弧を含まない。
さらに、本開示の任意の特定の態様は、請求項のいずれか１以上から明示的に除外され得ることを理解されたい。範囲が指定されている場合、範囲内の任意の値は、１以上の請求項から明示的に除外され得る。本開示の組成物および／または方法の任意の態様、要素、特徴、用途、または側面は、任意の１以上の請求項から除外され得る。簡潔にするために、１以上の要素、特徴、目的、または側面が除外される態様のすべては、本明細書に明示的に記載されていない。
【図１Ａ−Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ−Ｆ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ−Ｆ】
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【図４Ｇ−Ｈ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ−Ｂ】
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【図６Ｃ−Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ−Ｂ】
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【図９Ｃ−Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
2020531011.tif 000034
【図１３Ａ−Ｂ】
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【図１３Ｃ−Ｄ】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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