(57)【要約】  ゲノム工学技術を用いた、非天然アミノ酸含有タンパク質の産生を促進するための細胞株を作製するための方法および組成物を、本明細書に開示する。
2020522247.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非天然アミノ酸をタンパク質に組み込むための細胞株を作製する方法であって、前記方法は、セレクターコドンを含有する目的の遺伝子を発現する細胞において、不活性化の標的とされる１つ以上の部位または領域を含み、細胞は、直交アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）および直交サプレッサーｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を含む、方法。
【請求項２】
前記細胞または細胞株が、真核生物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞または細胞株が、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、またはＨＥＫ２９３から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記非天然アミノ酸が、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチル−フェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、ｐ−プロパルギルオキシ−Ｌ−フェニルアラニン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、Ｌ−Ｄｏｐａ、フッ化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ヨード−フェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、またはイソプロピル−Ｌ−フェニルアラニンから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記目的の遺伝子が、生物学的治療遺伝子または生物学的治療産物である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記生物学的治療遺伝子または生物学的治療産物が、ワクチンである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記目的の遺伝子が、抗体、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ融合タンパク質、Ｆｃ融合タンパク質、
第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、または第ＩＶ因子である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記目的の遺伝子が、抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記目的の遺伝子が、サイトカイン、インターロイキン、インターフェロン、ケモカイン、成長因子、ホルモン、およびこれらのレセプター、類似体、二重特異性またはこれらの断片である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記目的の遺伝子が、ＨＥＲ２、ＣＤ−７０、ＰＳＭＡ、５Ｔ４、ＥＧＦＲ、ＴＲＯＰ２、ＣＤ３、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、ＧＰＣ３、ＤＬＬ３、ＲＯＲ１、レプチン、ＦＧＦ−２１、ＦＧＦ−２３、ＨＧＨ、ＦｃＲ、インスリン、ＴＮＦＲ１、ＴＲＡＩＬ、ＥＰＯ、およびこれらの類似体、二重特異性またはフラグメントである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
不活性化の標的とされる前記１つ以上の部位または領域が、ＧＳ、Ｂｃｌ−２、ＩＧＦＢＰ４、ＡＱＰ１、Ｍａｆ１、ｅＲＦ１、ＦＵＴ８、Ｐ５３、カスパーゼ３、ＵＰＦ１、Ｓｍｇ１、Ｓｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯ、Ａｐａｆ−１、カスパーゼ−６、カスパーゼ−７、カスパーゼ−９、カスパーゼ−１０、ＰＡＲＰ、アルファ  ホドリン、ＮｕＭＡ、ＡＩＦ、ＣＡＤ、Ｐｕｍａ、Ｎｏｘａ、１４−３−３、Ａｖｅｎ、Ｍｙｃ、またはＨｔｒＡ２／Ｏｍｉである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
不活性化の標的とされる前記部位または領域が、外因性選択マーカー遺伝子である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記選択マーカー遺伝子が、ゼオシン、ハイグロマイシン、またはピューロマイシンである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
不活性化の標的とされる前記部位または領域が、Ｂｃｌ−２部位または領域である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
不活性化の標的とされる前記部位または領域が、ＢａｘまたはＢａｋである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
不活性化の標的とされる前記部位または領域が、完全にまたは部分的に不活性化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記セレクターコドンが、ナンセンスコドン、希少コドン、または４塩基コドンである、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記セレクターコドンが、オーカーコドン、オパールコドン、またはアンバーコドンを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
非天然アミノ酸を組み込んでいるタンパク質またはポリペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記非天然アミノ酸が、部位特異的に組み込まれている、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞または細胞株が、一過性の、安定な細胞集団または安定なクローン細胞株である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
細胞または細胞株におけるアポトーシスを減少または低減させるための、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
非天然アミノ酸を組み込んでいるタンパク質またはポリペプチドの収率を改善するための、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１に記載の方法に係る単離された細胞。
【請求項２５】
非天然アミノ酸を組み込んでいるタンパク質を得るための、請求項２２に係る単離された細胞。
【請求項２６】
非天然アミノ酸をタンパク質に組み込むための細胞または細胞株であって、前記細胞は、セレクターコドンを含有する目的の遺伝子を発現し、前記目的の遺伝子は、直交アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）および直交サプレッサーｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を含み、前記細胞は、不活性化の標的とされる１つ以上の部位または領域を含む、細胞または細胞株。
【請求項２７】
直交アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）および直交サプレッサーｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を含む、非天然アミノ酸をタンパク質に組み込むための細胞または細胞株であって、前記細胞は、不活性化の標的とされる１つ以上の部位または領域を含む、細胞または細胞株。
【請求項２８】
目的の遺伝子を発現する細胞または細胞株であって、前記目的の遺伝子は、直交アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）、直交サプレッサーｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を含み、前記細胞は、不活性化の標的とされる１つ以上の部位または領域を含む、細胞または細胞株。
【請求項２９】
直交アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）および直交サプレッサーｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を含む細胞におけるアポトーシスを減少または低減させる方法であって、前記細胞における１つ以上のアポトーシス促進部位または領域を、不活性化の標的とする工程を含む、方法。
【請求項３０】
セレクターコドンを含有する目的の遺伝子を発現する細胞において、不活性化の標的とされる１つ以上の部位または領域を不活性化することができる核酸分子を提供する工程、および
直交アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）および直交サプレッサーｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を含み、セレクターコドンを含有する目的の遺伝子を発現する細胞へ、前記核酸分子を導入する工程
を含む、非天然アミノ酸をタンパク質に組み込むための細胞を作製する方法。
【請求項３１】
前記核酸分子が、配列番号１〜４２から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記核酸分子が、不活性化の標的とされる１つ以上の部位または領域を不活性化する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
不活性化の標的とされる前記１つ以上の部位または領域が、同じであるか、または異なる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
不活性化の標的とされる前記部位または領域が、ＧＳ、Ｂｃｌ−２ファミリー、ＩＧＦＢＰ４、ＡＱＰ１、Ｍａｆ１、ｅＲＦ１、ＦＵＴ８、Ｐ５３、カスパーゼ３、ＵＰＦ１、Ｓｍｇ１、ゼオシン、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、Ｓｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯ、Ａｐａｆ−１、カスパーゼ−６、カスパーゼ−７、カスパーゼ−９、カスパーゼ−１０、ＰＡＲＰ、アルファ  ホドリン、ＮｕＭＡ、ＡＩＦ、ＣＡＤ、Ｐｕｍａ、Ｎｏｘａ、１４−３−３、Ａｖｅｎ、Ｍｙｃ、またはＨｔｒＡ２／Ｏｍｉである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
不活性化の標的とされる前記部位または領域が、外因性選択マーカー遺伝子である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
前記選択マーカー遺伝子が、ゼオシン、ハイグロマイシン、またはピューロマイシンである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３７】
不活性化の標的とされる前記部位または領域が、Ｂｃｌ−２部位または領域である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３８】
不活性化の標的とされる前記部位または領域が、ＢａｘまたはＢａｋである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３９】
不活性化の標的とされる部位または領域が、完全にまたは部分的に不活性化されている、請求項３０に記載の方法。
【請求項４０】
前記細胞が、一過性の、安定な細胞集団または安定なクローン細胞である、請求項３０に記載の方法。
【請求項４１】
細胞におけるアポトーシスを減少または低減させるための、請求項３０に記載の方法。
【請求項４２】
部位特異的に組み込まれた非天然アミノ酸を有するタンパク質またはポリペプチドの収率を改善するための、請求項３０に記載の方法。
【請求項４３】
前記非天然アミノ酸が、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチル−フェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、ｐ−プロパルギルオキシ−Ｌ−フェニルアラニン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、Ｌ−Ｄｏｐａ、フッ化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ヨード−フェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、またはイソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、パラ−アセチルフェニルアラニン、ｐ−ニトロフェニルアラニン、ｐ−スルホチロシン、ｐ−カルボキシフェニルアラニン、Ｏ−ニトロフェニルアラニン、ｍ−ニトロフェニルアラニン、ｐ−ボロニルフェニルアラニン、ｏ−ボロニルフェニルアラニン、ｍ−ボロニルフェニルアラニン、ｐ−アミノフェニルアラニン、ｏ−アミノフェニルアラニン、ｍ−アミノフェニルアラニン、ｐ−アシルフェニルアラニン、ｏ−アシルフェニルアラニン、ｍ−アシルフェニルアラニン、ｐ−ＯＭｅフェニルアラニン、ｏ−ＯＭｅフェニルアラニン、ｍ−ＯＭｅフェニルアラニン、ｐ−スルホフェニルアラニン、ｏ−スルホフェニルアラニン、ｍ−スルホフェニルアラニン、５−ニトロＨｉｓ、３−ニトロＴｙｒ、２−ニトロＴｙｒ、ニトロ置換されたＬｅｕ、ニトロ置換されたＨｉｓ、ニトロ置換されたＤｅ、ニトロ置換されたＴｒｐ、２−ニトロＴｒｐ、４−ニトロＴｒｐ、５−ニトロＴｒｐ、６−ニトロＴｒｐ、７−ニトロＴｒｐ、３−アミノチロシン、２−アミノチロシン、Ｏ−スルホチロシン、２−スルホオキシフェニルアラニン、３−スルホオキシフェニルアラニン、Ｏ−カルボキシフェニルアラニン、ｍ−カルボキシフェニルアラニン、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−プロパルギル−フェニルアラニン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチル−フェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、Ｌ−Ｄｏｐａ、フッ化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ヨード−フェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、またはｐ−プロパルギルオキシ−フェニルアラニンである、請求項３０に記載の方法。
【請求項４４】
前記細胞が、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、またはＨＥＫ２９３である、請求項３０に記載の方法。
【請求項４５】
請求項３０に記載の方法に係る単離された細胞。
【請求項４６】
直交アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）および直交サプレッサーｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を含み、セレクターコドンを含有する目的の遺伝子を発現する細胞株を提供する工程、
前記細胞における１つ以上の標的部位を不活性化することができる核酸分子を、前記細胞へ導入する工程、および
非天然アミノ酸を前記細胞に提供する工程
を含む、非天然アミノ酸を含む細胞株を作製する方法。
【請求項４７】
細胞における不活性化の標的とされる１つ以上の部位または領域を不活性化することができる核酸分子を提供する工程、および
直交アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）および直交サプレッサーｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を含む前記細胞へ、前記核酸分子を導入する工程
を含む、非天然アミノ酸をタンパク質に組み込むための細胞を作製する方法。
【請求項４８】
上述の請求項のいずれか１項に係る単離された細胞または細胞株。
【請求項４９】
直交アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）および直交サプレッサーｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を含む、安定な細胞または細胞株を得るための、請求項１に記載の方法。
【請求項５０】
前記安定な細胞または細胞株が、プラットフォームもしくは産生細胞または細胞株である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記細胞が、直交アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）および直交サプレッサーｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を含む、産生細胞株の開発を最適化するための、請求項１に記載の方法。
【請求項５２】
細胞または細胞株における非天然アミノ酸含有ポリペプチドの収率を最適化するための、請求項１に記載の方法。
【請求項５３】
細胞または細胞株におけるアポトーシスを減少させるための、請求項１に記載の方法。
【請求項５４】
非天然アミノ酸を含む、請求項１に係る単離されたポリペプチド。
【請求項５５】
請求項１に係る単離された細胞または細胞株。
【請求項５６】
非天然アミノ酸含有タンパク質またはポリペプチドを産生するための、請求項２８に係る単離された細胞または細胞株。
【請求項５７】
前記非天然アミノ酸含有タンパク質の収率が、細胞における不活性化の標的とされる１つ以上の部位または領域を不活性化しない場合の少なくとも０．５倍以上大きい、請求項１に記載の細胞または細胞株。
【請求項５８】
請求項２６〜２８のいずれか１項に係るワクチン。
【請求項５９】
上述の請求項のいずれか１項に記載の方法によって得られるワクチン。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔関連出願の参照〕
本出願は２０１７年６月２日に出願された「Methods and Compositions for Promoting Non-Natural Amino Acid-Containing Protein Production」という名称の米国仮出願第６２／５１４，７５４号の利益を主張し、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
〔配列表〕
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩフォーマットで提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＡＳＣＩＩコピーが、２０１８年５月２９日に作成され、名称はAMBX_0223_PCT_SL.txtであり、サイズは１３，１７２バイトである。
【０００３】
〔技術分野〕
本開示は、非天然アミノ酸含有ポリペプチドを産生するためのゲノム工学および細胞株の作製の分野に関する。本発明は一般に、非天然アミノ酸含有ポリペプチドおよびタンパク質の細胞株の作製、開発、および産生の分野に関する。
【０００４】
〔背景技術〕
非天然アミノ酸を含むタンパク質の遺伝的産生における飛躍的発展として、真核細胞（ＥｕＣＯＤＥ）における化学的に直交する方向付けられた操作系の適用（Feng et al, (2013), A general approach to site-specific antibody drug conjugates, PNAS 111(5): 1766-1771；Schultz et al, USPN 7,083,970、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる）がある。近年、この技術は抗体薬物結合（ＡＤＣ）の分野において急速な進歩を遂げている（例えば、米国特許出願公開第２０１５００１８５３０号、第２０１５０１４１６２４号、第２０１５０１５２１８７号および第２０１５０１５２１９０号を参照のこと。それぞれが参照により本明細書に組み込まれる）。しかしながら、産業界における非天然アミノ酸含有タンパク質のより広範な適用は、哺乳動物細胞における比較的低い収率によって妨げられてきた。
【０００５】
タンパク質産生の低収率の原因となる可能性のある主要な因子は、システムにおける過剰なチャージされていないｔＲＮＡによって引き起こされた誘導アポトーシスかもしれないことが、観察によって示されている。当該分野で公知のように、アポトーシスは、産生プロセスを含む、細胞培養物中の種々の内因子または外因子によって引き起こされ得る。タンパク質産生の低収率の原因となる他の課題は、バイオリアクタープロセスにおけるスケールアップ時に内因性アポトーシス経路を活性化することができる細胞ストレッサーである。したがって、非天然アミノ酸含有タンパク質の産生を促進および増加させる改善された方法および組成物が、産業界において必要とされている。本発明の開示は、以下の記載から明らかなように、これらおよび他の必要性に対処する。
【０００６】
〔発明の概要〕
本明細書には非天然アミノ酸含有タンパク質の産生を促進するための方法および組成物が開示される。非天然アミノ酸含有タンパク質の産生を促進するための細胞および細胞株もまた、本明細書中に開示される。一実施形態において、本発明の開示は非天然アミノ酸をタンパク質に組み込むための細胞株を作製する方法を提供し、この方法はセレクターコドンを含有する目的の遺伝子を発現する細胞において不活性化の標的となれる１つ以上の部位または領域を含み、ここで、細胞は、直交アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）および直交サプレッサーｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を含む。別の実施形態では、細胞または細胞株は真核生物である。他の実施形態では、細胞または細胞株がＣＯＳ、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、またはＨＥＫ２９３から選択される。他の一実施形態では、細胞または細胞株は、一過性の、安定な細胞集団または安定なクローン細胞株である。別の実施形態では、細胞は単離された細胞である。単離された細胞は、非天然アミノ酸を組み込んでいるタンパク質を得るためのものである。
【０００７】
別の実施形態において、本発明は、非天然アミノ酸を組み込んでいるタンパク質またはポリペプチドを含む。別の実施形態において、非天然アミノ酸は、部位特異的に組み込まれている。別の実施形態において、非天然アミノ酸は、パラ−アセチルフェニルアラニン、ｐ−ニトロフェニルアラニン、ｐ−スルホチロシン、ｐ−カルボキシフェニルアラニン、Ｏ−ニトロフェニルアラニン、ｍ−ニトロフェニルアラニン、ｐ−ボロニルフェニルアラニン、ｏ−ボロニルフェニルアラニン、ｍ−ボロニルフェニルアラニン、ｐ−アミノフェニルアラニン、ｏ−アミノフェニルアラニン、ｍ−アミノフェニルアラニン、ｐ−アシルフェニルアラニン、ｏ−アシルフェニルアラニン、ｍ−アシルフェニルアラニン、ｐ−ＯＭｅフェニルアラニン、ｏ−ＯＭｅフェニルアラニン、ｍ−ＯＭｅフェニルアラニン、ｐ−スルホフェニルアラニン、ｏ−スルホフェニルアラニン、ｍ−スルホフェニルアラニン、５−ニトロＨｉｓ、３−ニトロＴｙｒ、２−ニトロＴｙｒ、ニトロ置換されたＬｅｕ、ニトロ置換されたＨｉｓ、ニトロ置換されたＤｅ、ニトロ置換されたＴｒｐ、２−ニトロＴｒｐ、４−ニトロＴｒｐ、５−ニトロＴｒｐ、６−ニトロＴｒｐ、７−ニトロＴｒｐ、３−アミノチロシン、２−アミノチロシン、Ｏ−スルホチロシン、２−スルホオキシフェニルアラニン、３−スルホオキシフェニルアラニン、Ｏ−カルボキシフェニルアラニン、ｍ−カルボキシフェニルアラニン、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−プロパルギル−フェニルアラニン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチル−フェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、Ｌ−Ｄｏｐａ、フッ化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ヨード−フェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、またはｐ−プロパルギルオキシ−フェニルアラニンである。
【０００８】
本発明のいくつかの実施形態において、非天然アミノ酸は、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチル−フェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、ｐ−プロパルギルオキシ−Ｌ−フェニルアラニン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、Ｌ−Ｄｏｐａ、フッ化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ヨード−フェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニンｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニンまたはイソプロピル−Ｌ−フェニルアラニンから選択される。
【０００９】
他の実施形態において、本発明は、目的の遺伝子またはセレクターコドンを含有する目的の遺伝子を提供する。セレクターコドンは、ナンセンスコドン、希少コドン、または４塩基コドンである。別の実施形態では、セレクターコドンは、オーカーコドン、オパールコドン、またはアンバーコドンを含む。cetain実施形態において、セレクターコドンは、アンバーコドンである。
【００１０】
本発明の実施形態において、目的の遺伝子またはセレクターコドンを含有する目的の遺伝子は、ワクチンまたは抗体を含む生物学的治療遺伝子または生物学的治療産物である。目的の遺伝子またはセレクターコドンを含有する目的の遺伝子は、抗体、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ融合タンパク質、Ｆｃ融合タンパク質、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、または第ＩＶ因子である。他の実施形態において、目的の遺伝子またはセレクターコドンを含有する目的の遺伝子は、サイトカイン、インターロイキン、インターフェロン、ケモカイン、成長因子、ホルモン、およびこれらのレセプター、類似体、二重特異性またはこれらの断片である。別の実施形態において、目的の遺伝子は、ＨＥＲ２、ＣＤ−７０、ＰＳＭＡ、５Ｔ４、ＥＧＦＲ、ＴＲＯＰ２、ＣＤ３、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、ＧＰＣ３、ＤＬＬ３、ＲＯＲ１、レプチン、ＦＧＦ−２１、ＦＧＦ−２３、ＨＧＨ、ＦｃＲ、インスリン、ＴＮＦＲ１、ＴＲＡＩＬ、ＥＰＯ、およびこれらの類似体、二重特異性またはフラグメントである。他の実施形態において、目的の遺伝子またはセレクターコドンを含有する目的の遺伝子は、サイトカイン、成長因子、成長因子受容体、インターフェロン、インターロイキン、炎症性分子、癌遺伝子産物、ペプチドホルモン、シグナル伝達分子、ステロイドホルモン受容体、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、インスリン、ヒト成長ホルモン、アルファ−１抗トリプシン、アンギオスタチン、抗体、アポリポタンパク質、アポタンパク質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ペプチド、ｃ−Ｘ−ｃケモカイン、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、Ｇｒｏ−ａ、Ｇｒｏ−ｂ、Ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ４、ＭＩＧ、カルシトニン、ｃ−ｋｉｔリガンド、サイトカイン、ＣＣケモカイン、単球化学誘引タンパク質−１、単球化学誘引タンパク質−２、単球化学誘引タンパク質−３、単球炎症タンパク質−１α、単球炎症タンパク質−１β、ＲＡＮＴＥＳ、Ｉ３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ｃ−Ｋｉｔリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子５ａ、補体阻害剤、補体受容体１、サイトカイン、ＤＨＦＲ、上皮好中球活性化ペプチド−７８、Ｇｒｏα／ＭＧＳＡ、Ｇｒｏβ、Ｇｒｏγ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１δ、ＭＣＰ−１、上皮成長因子（ＥＧＦ）、上皮好中球活性化ペプチド、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、表皮剥脱毒素、第ＩＸ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第Ｘ因子、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、フィブリノーゲン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、成長因子、成長因子受容体、ヘッジホッグタンパク質、ヘモグロビン、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ヒルジン、ヒト血清アルブミン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１受容体、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−１受容体、インスリン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−１）、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、インターフェロン、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、インターロイキン、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、Ｉ���−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病抑制因子、ルシフェラーゼ、ニュールツリン、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、オンコスタチン  Ｍ、骨形成タンパク質、癌遺伝子産物、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン、ヒト成長ホルモン、プレイオトロピン、プロテインＡ、プロテインＧ、連鎖球菌発熱外毒素Ａ、ＢまたはＣ、リラキシン、レニン、ＳＣＦ、可溶性補体受容体Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ  １、可溶性インターロイキン受容体、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、スーパー抗原、ブドウ球菌エンテロトキシン、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ、ステロイドホルモン受容体、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、トキシックショック症候群毒素、チモシンアルファ１、組織プラスミノーゲンアクチベーター、
腫瘍成長因子（ＴＧＦ）、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子α、腫瘍壊死因子β、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、ＶＬＡ−４タンパク質、ＶＣＡＭ−１タンパク質、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＥＦ）、ウロキナーゼ、Ｍｏｓ、Ｒａｓ、Ｒａｆ、Ｍｅｔ、ｐ５３、Ｔａｔ、Ｆｏｓ、Ｍｙｃ、Ｊｕｎ、Ｍｙｂ、Ｒｅｌ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、テストステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体、ＳＣＦ／Ｃ−ｋｉｔ、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０、ＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１、ヒアルリン／ＣＤ４４、およびコルチコステロンである。
【００１１】
他の実施形態では、本発明は不活性化、切除、破壊またはノックアウトの標的とされる１つ以上の部位または領域を提供する。不活性化の標的とされる１つ以上の部位または領域は、ＧＳ、Ｂｃｌ−２、ＩＧＦＢＰ４、ＡＱＰ１、Ｍａｆ１、ｅＲＦ１、ＦＵＴ８、Ｐ５３、カスパーゼ３、ＵＰＦ１、Ｓｍｇ１、Ｓｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯ、Ａｐａｆ−１、カスパーゼ−６、カスパーゼ−７、カスパーゼ−９、カスパーゼ−１０、ＰＡＲＰ、アルファ  ホドリン、ＮｕＭＡ、ＡＩＦ、ＣＡＤ、Ｐｕｍａ、Ｎｏｘａ、１４−３−３、Ａｖｅｎ、Ｍｙｃ、またはＨｔｒＡ２／Ｏｍｉである。
【００１２】
一実施形態において、不活性化の標的とされる部位または領域は、外因性選択マーカー遺伝子である。別の実施形態において、選択マーカー遺伝子は、ゼオシン、ハイグロマイシン、またはピューロマイシンである。別の実施形態において、不活性化の標的とされる部位または領域は、Ｂｃｌ−２部位または領域である。別の実施形態において、不活性化の標的とされる部位または領域は、ＢａｘまたはＢａｋである。他の実施形態において、不活性化の標的とされる部位または領域は、完全にまたは部分的に不活性化されている。部分的に不活性化された、破壊された、ノックアウトされた、または切除された部位または領域は、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の不活性化された、破壊された、ノックアウトされた、または切除された部位または領域を含んでもよい。
【００１３】
別の実施形態において、本発明は、非天然アミノ酸をタンパク質に組み込むための細胞または細胞株であって、細胞は、セレクターコドンを含有する目的の遺伝子を発現し、目的の遺伝子は、直交アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）および直交サプレッサーｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を含み、細胞は、不活性化の標的とされる１つ以上の部位または領域を含む細胞または細胞株を提供する。
【００１４】
別の実施形態では、本発明は、直交アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）、直交サプレッサーｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を含む、非天然アミノ酸をタンパク質に組み込むための細胞または細胞株であって、前記細胞は、不活性化の標的とされる１つ以上の部位または領域を含む、細胞または細胞株を提供する。
【００１５】
他の実施形態では、本発明は、目的の遺伝子を発現する細胞または細胞株であって、直交アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）、直交サプレッサーｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を含み、細胞は、不活性化の標的とされる１つ以上の部位または領域を含む、細胞または細胞株を提供する。
【００１６】
別の実施形態において、本発明は、直交アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）および直交サプレッサーｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を含む細胞におけるアポトーシスを減少または低減させる方法であって細胞における１つ以上のアポトーシス促進部位または領域を不活性の標的とする工程を含む方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、細胞または細胞株のアポトーシスを減少または低減させるための細胞または細胞株を提供する。
【００１７】
別の実施形態において、本発明は、セレクターコドンを含有する目的の遺伝子を発現する細胞において、不活性化の標的とされる１つ以上の部位または領域を不活性化することができる核酸分子を提供する工程、および直交アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）および直交サプレッサーｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を含み、セレクターコドンを含有する目的の遺伝子を発現する細胞へ、核酸分子を導入する工程を含む、非天然アミノ酸をタンパク質に組み込むための細胞を作製する方法を提供する。他の実施形態では、核酸分子は、配列番号１〜４２から選択される。別の実施形態において、核酸分子は、不活性化の標的とされる１つ以上の部位または領域を不活性化する。１つの他の実施形態において、不活性化の標的とされる１つ以上の部位または領域は、同じであるか、または異なる。
【００１８】
別の実施形態において、本発明は、非天然アミノ酸を組み込んでいるタンパク質またはポリペプチドの収率を改善するための方法または細胞または細胞株を提供する。いくつかの実施形態では、細胞が一過性の、安定な細胞集団または安定なクローン細胞である。本発明の別の実施形態では、細胞におけるアポトーシスを減少または減少させるための方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、非天然アミノ酸部位特異的に組み込まれたタンパク質またはポリペプチドの収率を改善するための方法を提供する。
【００１９】
別の実施形態では、本発明は、直交アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）および直交サプレッサーｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を含み、セレクターコドンを含有する目的の遺伝子を発現する細胞株を提供する工程、細胞における１つ以上の標的部位を不活性化することができる核酸分子を、細胞へ導入する工程、および非天然アミノ酸を細胞に提供する工程を含む、非天然アミノ酸を含む細胞株を作製する方法を提供する。
【００２０】
他の実施形態において、本発明は、細胞における不活性化の標的とされる１つ以上の部位または領域を不活性化することができる核酸分子を提供する工程、および直交アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）および直交サプレッサーｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を含む細胞へ、核酸分子を導入する工程を含む、非天然アミノ酸をタンパク質に組み込むための細胞を作製する方法を提供する。
【００２１】
別の実施形態において、本発明は、請求項のいずれか１項に係る単離された細胞または細胞株を提供する。他の実施形態では、本発明は、直交アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）および直交サプレッサーｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を含む、安定な細胞または細胞株を得るための方法を提供する。他の実施形態では、安定な細胞または細胞株は、プラットフォームもしくは産生細胞または細胞株である。
【００２２】
別の実施形態では、本発明が直交アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）および直交サプレッサーｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を含む、産生細胞株の開発を最適化するための方法を提供する。他の一実施形態では、本発明が非天然アミノ酸を含む単離ポリペプチドを提供する。別の実施形態において、本発明は、非天然アミノ酸含有タンパク質の収率が、細胞における不活性化の標的とされる１つ以上の部位または領域を不活性化しない場合の少なくとも０．５倍以上大きい細胞または細胞株を提供する。
【００２３】
本発明の一実施形態では、１つ以上の操作された核酸分子が細胞株に導入される。１つ以上の操作された核酸分子は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上の操作された核酸分子を含み得る。他の実施形態において、１つ以上の操作された核酸分子は、同じかまたは異なる標的部位または領域に由来する。いくつかの実施形態では、操作された核酸分子が細胞中の同じ標的部位または領域由来の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上の操作された核酸分子を含み得る。いくつかの実施形態において、操作された核酸分子は、異なる標的部位または領域由来の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上の操作された核酸分子を含み得る。
【００２４】
他の実施形態では細胞における不活性化、切除、ノックアウトまたは破壊を標的とする１つ以上の部位または領域を認識するポリヌクレオチドは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上の部位または領域を認識するポリヌクレオチドを含み得る。
【００２５】
他の実施形態では、細胞または細胞株が提供される。特定の実施形態において、安定な産生細胞株が提供される。他の実施形態では、細胞または細胞株は真核細胞または細胞株である。他の実施形態において、真核細胞または細胞株は例えば、哺乳動物細胞、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞のいずれかを含み得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、真核生物細胞または細胞株は脊椎動物細胞または細胞株である。いくつかの実施形態では、真核細胞または細胞株は、哺乳動物またはヒト細胞または細胞株である。他の実施形態において、細胞または細胞株はＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、またはＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３−Ｆ、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ）細胞または細胞株を含み得るが、これらに限定されない。他の実施形態では、細胞または細胞株が例えば、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶを含むＣＨＯ細胞または細胞株である。他の実施形態では、細胞または細胞株がＣＨＯ−Ｋ１、ＭＤＣＫまたはＨＥＫ２９３細胞または細胞株である。特定の実施形態では、細胞または細胞株がＣＨＯ−Ｋ１細胞または細胞株である。
【００２６】
他の実施形態では非天然アミノ酸含有ポリペプチドまたはタンパク質の収率を最適化、または増強、または増加、または改善することは、不活性化、切除、破壊またはノックアウトの標的とされる１つ以上の部位または領域を認識するポリヌクレオチドを含む核酸分子の不存在下で、少なくとも０．５倍、少なくとも１倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、または少なくとも１０倍以上、収率を最適化、または増強、または増加、または改善することを含み得る。
【００２７】
別の実施形態では、本発明は本明細書に開示される方法および細胞のいずれかで製造されるワクチンを提供する。
【００２８】
〔図面の簡単な説明〕
本発明の新規な特色を、添付の特許請求の範囲に詳細に記載する。本発明の原理が利用される例示的な実施形態を記載する以下の詳細な説明、および添付の図面を参照することによって、本発明の開示の特徴および利点のより良好な理解が得られるだろう。
【００２９】
（図１）パネルＡおよびＢ。非天然アミノ酸含有タンパク質を産生するために、産業および製薬会社においてプラットフォーム細胞株を利用する方策。図１は、産業（図１Ａ）および製薬会社（図１Ｂ）におけるプラットフォーム細胞株を使用することの重要な役割を示す。
【００３０】
（図２）高産生細胞株の開発においてプラットフォーム細胞株を利用する一般的な手順。
【００３１】
（図３）パネルＡ、Ｂ、Ｃ。高産生細胞株の開発を最適化するための方策。図３は、ＦＡＣＳ依存性単細胞沈着（図３Ａ）、ＣＲＩＳＰＲノックアウト（図３Ｂ）、および細胞株開発プロセス最適化（図３Ｃ）等のいくつかの態様からの高産生細胞株開発の最適化を示す。
【００３２】
（図４）パネルＡおよびＢ。プラットフォーム細胞株４Ｅ２由来の細胞におけるアポトーシスの観察。Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖアッセイによって、パラ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンを特異的に組み込んでいる、直交対ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼを遺伝的に組み込まれる形で含む、ＣＨＯ−Ｓ細胞（図４Ａ）およびプラットフォーム細胞株４Ｅ２（図４Ｂ）の生存率を評価した。図４に示すように、ＣＨＯ−Ｓ細胞（生存率は９６％）と比較して、４Ｅ２は過剰なアポトーシスを示した（生存率は８５％）。
【００３３】
（図５）ＣＨＯ細胞における標的ＢＡＸ遺伝子のＣＲＩＳＰＲ  ｇＲＮＡ設計。図５は、３つのｇＲＮＡ配列に注釈を付けたＣＨＯ細胞におけるＢＡＸ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列を示す。ＢＡＸ遺伝子、エキソン１およびエキソン２のゲノムＤＮＡ配列を灰色の陰影で示す。ＢＡＸの他のシーケンスは通常の文字で示されている。ＰＣＲおよび配列決定において使用されるプライマーは、フォワードプライマーおよびリバースプライマーとして、それぞれ配列の先頭および末尾に示される。
【００３４】
（図６）ＣＨＯ細胞における標的ＢＡＫ遺伝子のＣＲＩＳＰＲ  ｇＲＮＡ設計。図６は、２つのｇＲＮＡ配列に注釈を付けたＣＨＯ細胞におけるＢＡＫ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列を示す。ＢＡＫ遺伝子、エキソン２およびエキソン３のゲノムＤＮＡ配列を灰色の陰影で示す。ＢＡＫの他のシーケンスは通常の文字で示されている。ＰＣＲおよび配列決定において使用されるプライマーは、フォワードプライマーおよびリバースプライマーとして、それぞれ配列の先頭および末尾に示される。
【００３５】
（図７）ＢＡＸまたはＢＡＫ  ＣＲＩＳＰＲ構築物。図７は、ＢＡＸまたはＢＡＫノックアウト実験において使用されるＣＲＩＳＰＲプラスミドの設計を示す。Ｇｅｎｅａｒｔ  ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼベクター（ｐＧＣＮＶ）は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）製の市販のベクターである。ｐＧＣＮＶプラスミドの完成形は、遺伝子部位を個別に標的化するために特定の１９ヌクレオチド長のｇＲＮＡ配列を用いて設計されたオリゴ二重鎖のためのスロットを含む、切断により開いたｐＧＣＮＶベクターに、オリゴ二重鎖を挿入することによって調製される（本明細書中の表１を参照のこと）。
【００３６】
（図８）本発明の代表的な非天然アミノ酸の構造を示す。
【００３７】
（図９）ＣＲＩＳＰＲを用いてＢＡＸまたはＢＡＫをノックアウトした抗ＨＥＲ２発現細胞集団のＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイ。図９は、ＣＲＩＳＰＲを用いたＢＡＸまたはＢＡＫノックアウト中のノックアウト効率のＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイ分析を示す。上部バンドの縮小および底部の新しいバンドの出現は、Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアによる走査画像の濃度測定分析によって定量化できる当該効率を示す。ＣＲＩＳＰＲノックアウト（ＫＯ）の前後の元のバンドの比率を使用して、ノックアウト効率を測定した。ＢＡＸおよびＢＡＫについてのノックアウト効率はそれぞれ３０％および７０％であり、計算の結果、約２１％の二重ノックアウト効率をもたらした。
【００３８】
（図１０）ＣＲＩＳＰＲを用いてノックアウトされたＢＡＸおよびＢＡＫ遺伝子を有する抗ＨＥＲ２発現単細胞クローンのＤＮＡ分析。図１０は、ＣＲＩＳＰＲを用いたＢＡＫノックアウト後の２０個の単細胞クローンのＤＮＡ配列決定結果を示す。頂部ＤＮＡ配列（Ｂａｋ−ＣＨＯ−ｇＤＮＡ１）は、元のＢＡＫ遺伝子のゲノム領域のＤＮＡ配列である。「ＺＡ＿１１２＿Ｋ３２＿ＢａｋＩ−ＩＩ」クローンのみが、元のＢＡＫ遺伝子と同一の配列を有する。図に示される他の遺伝子は、前記配列に欠失または挿入のいずれかを有する。
【００３９】
（図１１）ＣＲＩＳＰＲを用いた抗ＨＥＲ２発現ＢＡＸノックアウトクローニングにおけるＢＡＸノックアウト確認のウェスタンブロット分析。ＢＡＸは、遺伝子ノックアウトを有さず、野生型ＢＡＸタンパク質を発現するＬ０８２細胞においてバンドとして示される２１−ＫＤタンパク質である。他のクローニングは、残留ＢＡＸ発現を示すクローニングＵＢＢ３を除いて、ＢＡＸタンパク質の検出可能な発現を示さなかった。
【００４０】
（図１２）パネルＡおよびＢ。ＢＡＸ／ＢＡＫノックアウト細胞株を発現する抗ＨＥＲ２のアポトーシス分析。図１２は、親細胞株Ｌ０８２（図１２Ａ）およびＢＡＸ／ＢＡＫ二重ノックアウト細胞株ＢＢ１５（図１２Ｂ）のＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖアポトーシス分析を示す。表に示すように、細胞生存率は、ＢＡＸおよびＢＡＫノックアウト後に４０％から８０％に改善される。同時に、アポトーシス細胞は５３％から１７％に減少する。
【００４１】
（図１３）パネルＡ〜Ｄ。一括培養におけるＢＡＸ／ＢＡＫノックアウト細胞株における抗ＨＥＲ２抗体産生の促進。図１３は、ＢＡＸ／ＢＡＫ二重ノックアウト細胞株におけるタンパク質産生の変化を示す。タンパク質産生を一括産生の間に分析する。生細胞密度（ＶＣＤ、図１３Ａ）。細胞生存率（図１３Ｂ）。一括生産の間（７日目）、ＢＡＸ／ＢＡＫ二重ノックアウト細胞株は、１５０ｍｇ／Ｌから２７０ｍｇ／Ｌへの力価増加を示した（図１３Ｃ）。比生産性（Ｑｐ）（図１３Ｄ）。
【００４２】
（図１４）パネルＡ〜Ｄ。流加培養におけるＢＡＸ／ＢＡＫノックアウト細胞株における抗ＨＥＲ２抗体産生の促進。図１４は、ＢＡＸ／ＢＡＫ二重ノックアウト細胞株におけるタンパク質産生の変化を示す。タンパク質産生は、流加生産の間に分析される。生細胞密度（ＶＣＤ、図１４Ａ）。細胞生存率（図１４Ｂ）。流加生産（ｄａｙ１４）の間、ＢＡＸ／ＢＡＫ二重ノックアウト細胞株は、４５０ｍｇ／Ｌから１５００ｍｇ／Ｌへの力価増加を示す（図１４Ｃ）。比生産性（Ｑｐ）（図１４Ｄ）。
【００４３】
（図１５）ＣＲＩＳＰＲを用いてＢＡＸまたはＢＡＫをノックアウトした抗ＰＳＭＡ発現細胞集団のＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイを示す。図１５は、ＣＲＩＳＰＲを用いたＢＡＸまたはＢＡＫノックアウト中のノックアウト効率のＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイ分析を示す。ＣＲＩＳＰＲノックアウト（ＫＯ）の前後の元のバンドの比率を、Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアによる走査画像の濃度分析によって定量し、ノックアウト効率を測定するために使用した。ＢＡＸおよびＢＡＫについてのノックアウト効率はそれぞれ４２％および５３％であり、計算の結果、約２０％の二重ノックアウト効率をもたらした。
【００４４】
（図１６）パネルＡおよびＢ。抗ＰＳＭＡ発現クローンにおけるＢＡＸおよびＢＡＫノックアウト確認のウェスタンブロット分析。ＣＲＩＳＰＲを用いた抗ＰＳＭＡ発現クローンにおけるＢＡＸノックアウト確認（図１６Ａ）。抗ＰＳＭＡ発現クローンにおけるＢＡＫノックアウト確認（図１６Ｂ）。コントロールは、野生型ＢＡＸタンパク質を発現するＬ０８２細胞、２１−ＫＤでのバンド、およびＢＢ１５細胞を発現する抗ＨＥＲ２−ＢＡＸ／ＢＡＫ二重ノックアウトである。
【００４５】
（図１７）ＢＡＸ／ＢＡＫノックアウト抗ＰＳＭＡ発現細胞株のアポトーシス分析。図１７は、単一ＫＯクローニング（ＰＳＭＡ−８８２）または非ノックアウトクローニング（ＰＳＭＡ−４８４）における約３５〜３７％と比較して約８５％の細胞生存率を有するＢＡＸ／ＢＡＫ二重ノックアウト細胞株ＰＳＭＡ−１９２およびＰＳＭＡ  ７１９のＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖアポトーシス分析を示す。
【００４６】
（図１８）パネルＡ〜Ｃ。流加培養におけるＢＡＸ／ＢＡＫノックアウト細胞株における抗ＰＳＭＡ抗体産生の促進。図１８はＢＡＸ／ＢＡＫ二重ノックアウト細胞株（例えば、細胞株ＰＳＭＡ−ＢＢＫＯ−１９２）におけるタンパク質産生量の変化を示す。タンパク質産生は、流加生産の間に分析される。生細胞密度（ＶＣＤ、図１８Ａ）。細胞生存率（図１８Ｂ）。流加生産（１４日目）の間、ＢＡＸ／ＢＡＫ二重ノックアウト細胞株は、５００ｍｇ／Ｌから１４００ｍｇ／Ｌへの力価増加を示した（図１８Ｃ）。
【００４７】
（図１９）ＣＲＩＳＰＲを用いてＢＡＸまたはＢＡＫをノックアウトした抗ＣＤ７０発現細胞集団のＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイ。図１９は、ＣＲＩＳＰＲを用いたＢＡＸまたはＢＡＫノックアウト中のノックアウト効率のＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイ分析を示す。ＣＲＩＳＰＲノックアウト（ＫＯ）の前後の元のバンドの比率を、Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアによる走査画像の濃度分析によって定量し、ノックアウト効率を測定するために用いた。ＢＡＸおよびＢＡＫについてのノックアウト効率はそれぞれ５１％および２３％であり、計算の結果、約１０％の二重ノックアウト効率をもたらした。
【００４８】
（図２０）パネルＡおよびＢ。抗ＣＤ７０発現クローンにおけるＢＡＸおよびＢＡＫノックアウト確認のウェスタンブロット分析。抗ＣＤ７０発現クローンにおけるＢＡＸノックアウト確認（図２０Ａ）。抗ＣＤ７０発現クローンにおけるＢＡＫノックアウト確認（図２０Ｂ）。コントロールは野生型ＢＡＸタンパク質を発現するＬ０８２細胞、２１−ＫＤのバンド、およびＢＡＫ野生型タンパク質、２４  ＫＤのバンド。
【００４９】
（図２１）ＢＡＸ／ＢＡＫノックアウト抗ＣＤ７０発現細胞株のアポトーシス分析。図２１はＢＡＸ／ＢＡＫ二重ノックアウト細胞株（例えばＣＤ７０−ＢＢＫＯ−５６３）のＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖアポトーシス分析において、細胞生存率が親細胞株のＣＤ７０−ＭＷ−１０８と比較して１８％から６０％に増加したことを示す。アッセイアポトーシス細胞は８０％から４０％に減少した。
【００５０】
（図２２）パネルＡ〜Ｃ。流加培養におけるＢＡＸ／ＢＡＫノックアウト細胞株の抗ＣＤ７０抗体産生の促進。図２２は、振盪フラスコおよびベンチトップバイオリアクター中のＢＡＸ／ＢＡＫ二重ノックアウト抗ＣＤ７０発現細胞株の産生状態を示す。生細胞密度（ＶＣＤ、図２２Ａ）。細胞生存率（図２２Ｂ）。ＢＡＸ／ＢＡＫ二重ノックアウト細胞株（例えばＣＤ７０−ＢＢＫＯ−５６３）は１０００ｍｇ／Ｌの高い力価を示す。（図２２Ｃ）
〔詳細な説明〕
本発明を詳細に説明する前に、本発明は特定の方法論、または組成物、または生物学的系に限定されず、これらは当然、変化し得ることが理解されるべきである。また、本明細書で用いられる用語は特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図していないことを理解されたい。本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は別として明確に指示をしない限り、含有量としては複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「セル」への言及は、２つ以上のセルの組み合わせ等を含む。
【００５１】
本発明の好ましい実施形態が本明細書に開示され、説明されてきたが、上記のような実施形態が単に例として提供されることは、当業者にとって明らかだと言える。当業者は本発明から逸脱しない範囲で、数々の変化、変更、置き換えを実施できる。本願で説明した本発明の実施形態において、様々な代替物を採用して本発明を実施することができることは明らかである。添付の請求項は本発明の範囲を定義し、それにより、前記請求項およびその等価物の範囲内の方法および構成を含むことを目的としている。
【００５２】
本明細書において、または本明細書の以降の部分において、以下で別の定義がない限り、本明細書で用いられるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【００５３】
〔定義〕
本明細書で用いられる用語「核酸」は、デオキシリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシドまたはリボヌクレオチド、および一本鎖または二本鎖のいずれかの形態のこれらのポリマーを指す。単なる例として、このような核酸および核酸ポリマーは（ｉ）参照核酸と同様の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様の様式で代謝される天然ヌクレオチドの類似体；（ｉｉ）ＰＮＡ（ペプチド核酸）、アンチセンス技術において用いられるＤＮＡの類似体（ホスホロチオエート、ホスホロアミデート等）を含む、ただしこれらに限定されない、オリゴヌクレオチド類似体；（ｉｉｉ）、前記核酸が保存的に改変された変異体（縮重コドン置換を含むが、これらに限定されない）、ならびに明示的に示される相補的配列および配列を含むが、これらに限定されない。例として、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（または全ての）コドンの第３の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基（Batzer et al, Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al, J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); and Rossolini et al, Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)）で置換される配列を作製することによって達成され得る。
【００５４】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書中で互換的に用いられる。すなわち、ポリペプチドに関する説明は、ペプチドの説明およびタンパク質の説明に等しく適用され、逆もまた同様である。この用語は、天然に存在するアミノ酸ポリマー、ならびに１つ以上のアミノ酸残基が非天然アミノ酸であるアミノ酸ポリマーに適用される。さらに、このような「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は全長タンパク質を含む任意の長さのアミノ酸鎖を含み、ここで、アミノ酸残基は、共有ペプチド結合によって連結される。
【００５５】
本明細書中で用いられる場合、用語「直交」は細胞の内因性構成要素と共に機能する分子（例えば、直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）および／または直交アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ））をいう。前記分子は、細胞または翻訳系に内因性であるか、または細胞の内因性構成要素と共に機能しない、対応する分子と比較して、低い効率で機能する。ｔＲＮＡおよびアミノアシルｔＲＮＡシンセターゼに言及する場合、直交とは、内因性ｔＲＮＡシンセターゼと共に機能する内因性ｔＲＮＡと比較した、内因性ｔＲＮＡシンセターゼと共に機能する直交ｔＲＮＡの、あるいは内因性ｔＲＮＡと共に機能する直交アミノアシルｔＲＮＡと比較した、内因性ｔＲＮＡと共に機能する内因性ｔＲＮＡシンセターゼの、不活性または減少した効率を意味する。前記効率は、例えば、２０％未満の効率、１０％未満の効率、５％未満の効率、または１％未満の効率を意味する。直交分子は、細胞内に機能的な内因性相補的分子を欠く。例えば、細胞中の直交ｔＲＮＡは、内因性ＲＳによる内因性ｔＲＮＡのアミノアシル化と比較した場合、細胞の任意の内因性ＲＳによって、減少した、またはゼロ効率でアミノアシル化される。別の例では、直交ＲＳは内因性ＲＳによる内因性ｔＲＮＡのアミノアシル化と比較して、減少した、またはゼロ効率で、目的の細胞中の任意の内因性ｔＲＮＡをアミノアシル化する。第２の直交分子は第１の直交分子と共に機能する細胞に導入され得る。例えば、直交ｔＲＮＡ／ＲＳペアは対応するｔＲＮＡ／ＲＳ内因性ペアの効率（例えば、５０％の効率、６０％の効率、７０％の効率、７５％の効率、８０％の効率、９０％の効率、９５％の効率、または９９％以上の効率）で機能する導入された相補的構成要素を含む。
【００５６】
用語「セレクターコドン」は、翻訳プロセスにおいてＯ−ｔＲＮＡによって認識されるが、内因性ｔＲＮＡによっては認識されないコドンをいう。Ｏ−ｔＲＮＡアンチコドンループはｍＲＮＡ上のセレクターコドンを認識し、前記アミノ酸（例えば、非天然アミノ酸）を、ポリペプチド中のアンチコドンループの部位に組み込む。セレクターコドンは例えば、アンバー、オーカー、およびオパールコドンといった終止コドンであるナンセンスコドン、４つ以上の塩基コドン、希少コドン、天然または非天然の塩基対および／または類似物に由来するコドンを含み得る。
【００５７】
用語「サプレッサーｔＲＮＡ」は例えば、セレクターコドンに応答してアミノ酸をポリペプチド鎖に組み込むための機構を提供することにより、所定の翻訳系におけるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の読み取りを変化させるｔＲＮＡを意味する。例として、サプレッサーｔＲＮＡは、例えば、終止コドン、４塩基コドン、希少コドン等を介して読み取ることができる。
【００５８】
用語「翻訳系」は、天然に存在するアミノ酸を伸長するポリペプチド鎖（タンパク質）に組み込む構成要素の集合体をいう。翻訳系の要素としては、例えば、リボソーム、ｔＲＮＡ、シンセターゼ、ｍＲＮＡ、アミノ酸等が挙げられ得る。本発明の成分（例えば、ＯＲＳ、ＯｔＲＮＡ、非天然アミノ酸等）はｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏの翻訳系、例えば、真核生物細胞、脊椎動物細胞、例えば、酵母細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、藻類細胞、真菌細胞、昆虫細胞等に添加することができる。
【００５９】
用語「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸および非天然のアミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣物をいう。天然にコードされるアミノ酸は、２０種類の共通アミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリン）ならびにピロリジンおよびセレノシステインである。アミノ酸類似体とは、天然に存在するアミノ酸と基本的に同じ化学構造を有する化合物をいい、単なる例としては、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合したα−炭素を指す。このような類似体は修飾されたＲ群（例として、ノルロイシン）を有し得るか、または天然に存在するアミノ酸と同じ群本化学構造をなお保持しながら、修飾されたペプチド骨格を有し得る。アミノ酸類似体としては、以下に限定されるものではないが、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムが含まれる。
【００６０】
アミノ酸配列において、個々の置換、コードされた配列中の、核酸への付加または欠失、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質配列に対する置換、コードされた配列中の単一の天然および非天然アミノ酸、または数パーセントの天然および非天然アミノ酸の付加あるいは欠失は、「保存的に修飾された変異体」であり、ここで、変化は、アミノ酸の欠失、アミノ酸の付加、または天然および非天然アミノ酸への、化学的に類似したアミノ酸による置換を引き起こす。機能的に類似した天然アミノ酸を示す保存的置換表は、当該分野では公知である。前記保存的に改変された変異体は、本明細書中に記載される方法および組成物の多型改変体、種間相同体、および対立遺伝子に加えられ、いずれも除外されることはない。
【００６１】
機能的に類似したアミノ酸を示す保存的置換表は、当該分野では公知である。以下の８つの群はそれぞれ、一つ以上の保存的置換されるアミノ酸を含む：
１）  アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）  アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）  アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）  アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）  イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）  フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）  セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）
８）  システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）；
（例えば、Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.; 2nd edition (December 1993を参照のこと。）
本明細書中で用いられる場合、用語「非天然アミノ酸」は、２０の共通のアミノ酸またはピロリジンまたはセレノシステイン以外のアミノ酸をいう。用語「非天然アミノ酸」と同義的に用いられ得る他の用語は、「非天然にコードされるアミノ酸」、「人工（unnatural）アミノ酸」、「非天然で存在しているアミノ酸」、ならびにこれらの種々の連結体および非連結体である。用語「非天然アミノ酸」は天然にコードされるアミノ酸（２０個の共通アミノ酸またはピロリジンおよびセレノシステインを含むが、これらに限定されない）の改変によって天然に生じるが、これらに限定されず、翻訳複合体によって伸長されるポリペプチド鎖に組み込まれないアミノ酸を含む。天然にコードされずに、天然に発生するアミノ酸の例としては、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−トレオニン、およびＯ−ホスホチロシンが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、用語「非天然アミノ酸」は天然に存在せず、合成的に得られ得るか、または非天然アミノ酸の修飾によって得られ得るアミノ酸を含むが、これらに限定されない。非天然アミノ酸中の反応性基は、２０個のカノニカルアミノ酸中に存在する官能基からは入手できないことを留意されたい。従って、これらの反応性基は、ポリペプチド部位を特異的かつ均質に改変するために用いられ得る。
【００６２】
本明細書中で用いられる用語「抗体」は分析対象物（抗原）に特異的に結合し、そして認識する、免疫グロブリン遺伝子または複数の免疫グロブリン遺伝子、またはその断片によって実質的にコードされるポリペプチドを含むが、これらに限定されない。例としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、および一本鎖抗体等が挙げられる。Ｆａｂ断片を含む免疫グロブリンの断片、およびファージディスプレイを含む発現ライブラリーによって産生される断片もまた、本明細書中で用いられる場合、用語「抗体」に含まれる。抗体の構造および用語については、例えば、Paul, Fundamental Immunology, 4th Ed., 1999, Raven Press, New Yorkを参照のこと。抗体断片は、全長形態以外の抗体の任意の形態を指す。本明細書中の抗体断片は、全長抗体内に存在するより小さい成分である抗体、および操作された抗体を含む。
抗体断片としてはＦｖ、Ｆｃ、Ｆａｂ、および（Ｆａｂ’）２、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、二量体、三量体、四量体、二機能性ハイブリッド抗体、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＣＤＲの組み合わせ、可変領域、フレームワーク領域、定常領域、重鎖、軽鎖、および可変領域、ならびに代替のスキャフォールド非抗体分子、二重特異性抗体等が挙げられるが、これらに限定されない（Maynard & Georgiou, 2000, Annu. Rev. Biomed. Eng. 2:339-76; Hudson, 1998, Curr. Opin. Biotechnol. 9:395-402）。別の機能的構造は、ペプチドリンカー（S-z Hu et al, 1996, Cancer Research, 56, 3055-3061）によって共有結合された免疫グロブリン重鎖および軽鎖の可変領域からなる単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である。これらの小さい（分子量  ２５，０００）タンパク質は一般に、単一のポリペプチド中の抗原に対する特異性および親和性を保持し、より大きな抗原特異的分子に対して都合のいい構築ブロックを提供し得る。特に断らない限り、「抗体(antibody)」または「抗体(antibodies)」という用語を用いる記述および特許請求の範囲は、「抗体断片(antibosy fragment)」および「抗体断片(antibody fragments)」を特に含む。
【００６３】
本明細書で用いられる用語「単離された」は、均一または不均一な細胞株から細胞またはクローンを分離および除去することを指す。本発明の実施形態では、単離されたという用語は、細胞株または細胞集団から得られた、単離されたまたは単一の細胞を含む。細胞またはクローンは、目的とする所望の細胞またはクローンに何らかの選択的有利を提供する培地中で培養することによって、他の細胞株またはクローニング集団よりも選択され得る。例えば、所定の細胞培養において、特定の細胞型は、特定の成長因子およびサイトカインを添加することによって濃縮され得る。これは、所望の細胞またはクローンを獲得するために、特定の系統および分化段階の集団を濃縮することと、特定の細胞を増殖させ他の細胞の成長を阻害することを可能にする、抗生物質または特定の増殖阻害剤、または当業者に周知の上記のような選択物の組み合わせによる、選択的な培地の使用を含み得る。例えば、選択的な培地はしばしば、トランスフェクションされた細胞を単離するために用いられる。哺乳類の細胞選択に用いられる一般的な抗生物質にはブレオマイシン、ピューロマイシンおよびハイグロマイシンが含まれるが、これらに限定されない。本明細書で用いられる用語「単離された」はまた、目的の成分を目的ではない成分から分離および除去することを指す。単離された物質は乾燥状態または半乾燥状態のいずれかであり得るか、または溶液（水溶液を含むが、これに限定されない）であり得る。単離された構成要素は均質な状態であってもよく、または単離された構成要素は追加の薬学的に許容可能な担体および／または賦形剤を含む医薬組成物の一部であってもよい。純度および均質性は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーを含むが、これらに限定されない分析化学技術を用いて決定され得る。さらに、目的の成分が単離され、かつ調製物中に主に存在する成分である場合、この成分は、実質的に精製されたものとして本明細書中に記載される。本明細書で用いられる用語「精製された」は、少なくとも８５％の純粋な、少なくとも９０％の純粋な、少なくとも９５％の純粋な、少なくとも９９％以上の純粋な目的の成分を指し得る。単なる一例ではあるが、核酸、ポリペプチドまたはタンパク質が、上記の核酸、ポリペプチドまたはタンパク質として「単離された」というのは、天然の状態でこれらが関連する、少なくとも複数の細胞成分を含まない場合、または核酸、ポリペプチドまたはタンパク質がそのｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生の濃度よりも高いレベルに濃縮されている場合をいう。また、例として、遺伝子が単離されるというのは、遺伝子に隣接している、目的の遺伝子以外のポリペプチドまたはタンパク質をコードするオープンリーディングフレームから分離される場合をいう。
【００６４】
本明細書中で用いられる場合、用語「真核生物」は系統発生ドメインＥｕｃａｒｙａに属する生物をいい、動物（哺乳類、昆虫、は虫、鳥等を含むがこれらに限定されない）、繊毛虫、植物（単子葉植物、双子葉植物、および藻類を含むがこれらに限定されない）、真菌、酵母、べん毛虫、ミクロスポリジア、および原生生物を含むがこれらに限定されない。用語「脊椎動物」および「真核生物」は、本明細書において互換的に用いられ得る。
【００６５】
本発明の実施形態において、ＣＨＯ細胞中タンパク質に対する、培養培地中で提供される、非天然アミノ酸の効率的な取り込みのために、直交サプレッサーｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼペアを安定に発現する目的で、ＣＨＯＫ１から作製されるプラットフォーム細胞株を提供する（例えば、Ｔｉａｎ  Ｆら、２０１４を参照のこと）。産生細胞株は、ＧＳ（グルタミンシンセターゼ）発現系における、目的の遺伝子を含有するアンバーナンセンスコドンを、プラットフォーム細胞株の宿主にトランスフェクションさせることによって、非天然アミノ酸組み込みタンパク質の生産を作製できる。製造細胞株を作製するために、ＧＳ発現系においては、安定な細胞株が成長する間、宿主細胞のゲノムと関連した産物遺伝子の安定なトランスフェクションの選択のための選択可能なマーカー遺伝子として、グルタミンシンセターゼを用いる。プラットフォーム細胞株は、改善された非天然アミノ酸取り込み効率およびクローン選択効率で十分に特徴付けられ、開発されている。プラットフォーム細胞株は、バイオリアクターへの急速な進行を目的として、懸濁液での成長に予め適合させた。
【００６６】
産業上の観点から、プラットフォーム細胞株は医薬品開発におけるあらゆる段階をサポートするための、段階的で適切な材料を提供するために用いられ得るが、それだけでなく、臨床への製品の導入および商業化の前に、安定で十分に特徴付けられた産生細胞株を作製するためにも用いられ得る。したがって、製薬会社では、細胞株および細胞株群が交差的な機能活性に密接に関与している。例えば、発見チームは標的を同定し、候補分子を作製する。プラットフォーム細胞株宿主における一過性のトランスフェクションおよび安定なプールの作製を実施して、候補分子の発現を評価し、開発研究（精製、接合および分析方法開発）およびリード分子を同定するための機能的アッセイのための材料を提供する。一旦、リード分子が選択されると、次いで、所望の品質の特性を有する高収率の産物を産生するために、安定な細胞株が作製される。最良のクローンの選択は、臨床試験および商業化を支援するために、産業での標準的製造において拡張可能で、安定した、十分に特徴付けられた産生細胞株を同定するための細胞株、プロセスの開発および分析機能を含む。細胞培養プロセスの開発は細胞株の作製および選択から始まり、続いて、高スループットスクリーニング目的のために、９６ウェルプレート、振盪フラスコおよびベンチスケールバイオリアクターを含む小規模システムにおけるプロセスおよび培地の最適化が行われる。一旦、条件が定義されると、プロセスはしばしば、パイロットスケールでは拡張可能性を試験し、前臨床毒性試験のための材料を製造し、次いで、現在の良好な製造実行（ｃＧＭＰ）の規則下で臨床材料を製造するための大規模製造へと移行する。生物学的産物の産生のための商業的細胞培養プロセスの開発が実験室およびパイロットスケールで完了すると、商業化プロセスは、プロセスの特徴付け、スケールアップ、技術移転、および製造プロセスの検証から始まる。細胞株の開発、細胞培養プロセスの開発および製造、またはこれらの代替のためのほとんどの上記のような方法は、当該分野で周知である。例えば、Weishou Hu, et al, Cell Culture Process Engineering(2013)を参照のこと。
【００６７】
本発明では、プラットフォーム細胞株を親細胞として用いて、３〜４ヶ月で５〜１０ＰＣＤを有し、６ヶ月で２０〜３０ＰＣＤを有する産生細胞株を得るために、安定な細胞株を開発する方策が行われた。本明細書の実施例も参照されたい。産生細胞株は少なくとも８週間の安定性試験に合格し、１２，０００Ｌまでのバイオリアクター製造規模を与えた。マスターセルバンク（ＭＣＢ）に用いるクローニングを、増殖、生産性および生産物の品質に基づいて選択した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集技術を用いた、さらなる細胞株の操作は、０．５ｇ／Ｌまたは５００ｍｇ／Ｌを産生する産生細胞株に対して、細胞増殖を改善し、１．５ｇ／Ｌまたは１５００ｍｇ／Ｌまで体積の力価を増加させることを実証した。産生細胞株のために開発された流加法は、臨床材料調製のための２０００Ｌ単回使用バイオリアクター（ＳＵＢ）スケールでの拡張可能性を実証した。従って、他の実施形態において、本発明は、高産生細胞株の開発の最適化を提供する。高産生細胞株の開発の上記のような最適化はＦＡＣＳ依存性単細胞沈着、ＣＲＩＳＰＲノックアウト手順、および産生スケールアップを含むがこれらに限定されず、当技術分野で周知の方法および技術によって達成することができる。
【００６８】
方法と技術
本発明は、当技術分野で周知の、分子生物学、細胞培養、生化学等における多くの従来技術を用いる。細胞株の開発、細胞培養プロセスの開発および製造のための方法および技術は例えば、Weishou Hu, et al, Cell Culture Process Engineering (2013)に十分に記載されている。分子生物学的技術を記載する一般的なテキストには、以下が含まれる：Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook et al, Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2nd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989 (“Sambrook”) and Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al, eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (supplemented through 1999) (“Ausubel”))。これらのテキストはベクター、プロモーター、および例えば、非天然アミノ酸、直交ｔＲＮＡ、直交シンセターゼ、およびこれらの対を含むタンパク質の産生のためのセレクターコドンを含む遺伝子の作製に関連する多くの他の関連する項目の使用について記載する。
【００６９】
他の手順は、以下の刊行物およびその中で引用される参考文献で確認され得る。：Ling et al, Approaches to DNA mutagenesis: an overview, Anal Biochem. 254(2): 157-178 (1997); Dale et al, Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method, Methods Mol. Biol. 57:369-374 (1996); Smith, In vitro mutagenesis, Ann. Rev. Genet. 19:423-462(1985); Botstein & Shortle, Strategies and applications of in vitro mutagenesis, Science 229:1193-1201(1985); Carter, Site-directed mutagenesis, Biochem. J. 237:1-7 (1986); Kunkel, The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis, in Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. and Lilley, D.M.J. eds., Springer Verlag, Berlin)) (1987); Kunkel, Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492 (1985); Kunkel et al, Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Methods in Enzymol. 154, 367-382 (1987); Bass et al, Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities, Science 242:240-245 (1988); Methods in Enzymol. 100: 468-500 (1983); Methods in Enzymol. 154: 329-350 (1987); Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment, Nucleic Acids Res. 10:6487-6500 (1982); Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors, Methods in Enzymol. 100:468-500 (1983); Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template, Methods in Enzymol. 154:329-350 (1987); Taylor et al, The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA, Nucl. Acids Res. 13: 8749-8764 (1985); Taylor et al, The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA, Nucl. Acids Res. 13: 8765-8787 (1985); Nakamaye & Eckstein, Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl. Acids Res. 14: 9679-9698 (1986); Sayers et al, Y-T Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl. Acids Res. 16:791-802 (1988); Sayers et al, Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide, (1988) Nucl. Acids Res. 16: 803-814; Kramer et al, The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction, Nucl. Acids Res. 12: 9441-9456 (1984); Kramer & Fritz Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA, Methods in Enzymol. 154:350-367 (1987); Kramer et al, Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations, Nucl. Acids Res. 16: 7207 (1988); Fritz et al, Oligonucleotide-directed construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro, Nucl. Acids Res. 16: 6987-6999 (1988); Kramer et al, Point Mismatch Repair, Cell 38:879-887 (1984); Carter et al, Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors, Nucl. Acids Res. 13: 4431-4443 (1985); Carter, Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors, Methods in Enzymol. 154: 382-403 (1987); Eghtedarzadeh & Henikoff, Use of oligonucleotides to generate large deletions, Nucl. Acids Res. 14: 5115 (1986); Wells et al, Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin, Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317: 415-423 (1986); Nambiar et al, Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein, Science 223: 1299-1301 (1984); Sakamar and Khorana, Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin), Nucl. Acids Res. 14: 6361-6372 (1988); Wells et al, Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites, Gene 34:315-323 (1985); Grundstrom et al, Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale 'shot-gun' gene synthesis, Nucl. Acids Res. 13: 3305-3316 (1985); Mandecki, Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:7177-7181 (1986); Arnold, Protein engineering for unusual environments, Current Opinion in Biotechnology 4:450-455 (1993); Sieber, et al, Nature Biotechnology, 19:456-460 (2001). W. P. C. Stemmer, Nature 370, 389-91 (1994); and, I. A. Lorimer, I. Pastan, Nucleic Acids Res. 23, 3067-8 (1995)。多くの上記方法に関するさらなる詳細は酵素学第１５４巻の方法において確認でき、これはまた、種々の突然変異誘発法に関する問題を解決するための有用な手段を記載する。
【００７０】
本発明のポリペプチドおよびタンパク質の精製および検出のための様々な技法および方法は、当該分野で公知である。これらの技術および方法論は、本明細書中に記載されるような非天然アミノ酸を含むタンパク質の検出および精製に適用され得る。一般に、抗体は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング、免疫化学、アフィニティークロマトグラフィー法、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ、ＦＡＣＳおよび多くの他の方法のための有用な試薬である。本明細書中の参考文献は、ＥＬＩＳＡアッセイ、ウェスタンブロット、ＳＰＲ等を実施する方法に関する詳細を提供する。本発明の他の技術および方法論は、インタクト質量分析（ＭＳ）およびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を含み得る。完全質量分析法は、タンパク質の正確な質量およびそのアイソフォームの相対的存在量に関する情報を提供する。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は当技術分野では分子篩クロマトグラフィーとしても知られており、溶液中の分子をこれらのサイズによって分離し、ある程度のケース重量を分離するクロマトグラフィー法である。
【００７１】
ゲノム編集技術
いくつかの実施形態において、本発明は、遺伝子編集ツールを用いて、細胞における標的部位または領域の不活性化、破壊、切除またはノックアウトのためのポリヌクレオチドを提供する。本明細書中で用いられる場合、用語「標的」、「標的」、「標的化された」または「標的化された」ノックアウト、切除、不活性化または破壊は、切除、不活性化、破壊またはノックアウトされた細胞または遺伝子中の部位あるいは領域をいう。いくつかの遺伝子編集ツールを用いて、標的のＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導することによって遺伝子を正確に改変することができる。当該技術分野で周知のこのような遺伝子編集ツールにはジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）としても当該技術分野で知られているメガヌクレアーゼ（ＭＮ）（Ｇａｊら、２０１３；  Ｇｕｈａら、２０１７）、およびクラスター化された規則的に間隔を置いた短絡パリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）が含まれ得るが、これらに限定されない。本発明の態様において、遺伝子編集ツールは、目的の遺伝子を発現する細胞または産生細胞における標的部位または領域を認識するための構築物を設計するためと、トランスフェクション後に標的遺伝子に二本鎖切断を起こすために用いた。
【００７２】
ＺＦＮは、ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼ由来のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよび非特異的ＤＮＡ切断ドメインからなる人工融合タンパク質である。ジンクフィンガードメインは遺伝子編集を達成し得るために、特定のＤＮＡ配列を認識し得るように操作できる。また、ＴＡＬＥＮも人工融合タンパク質であり、ＴＡＬＥタンパク質由来のＤＮＡ結合ドメインおよびＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼ由来の非特異的ＤＮＡ切断ドメインからなる。ＴＡＬＥ（転写活性化因子様エフェクター）はキサントモナス細菌由来のタンパク質であり、ＤＮＡ結合ドメインは、特定のＤＮＡ配列に結合するように操作され得る。ＺＦＮと同様に、ＴＡＬＥＮは、遺伝子不活性化が達成され得るようにＤＳＢを誘導し得る。当技術分野でホーミングエンドヌクレアーゼとしても知られているＭＮは、二本鎖ＤＮＡの作製において、部位特異性が高いエンドヌクレアーゼである。ＭＮは、１８〜４４塩基対のＤＮＡを認識することができる大きな部位特異的認識部位を有する。ＭＮのファミリーメンバーの中で、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧは、ゲノム編集の適用において最も広く研究され、操作されている。Clustered regularly interspaced short palindromic repeats（ＣＲＩＳＰＲ）技術は、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ（Ｃａｓ９は最も広く用いられているＩＩタイプヌクレアーゼである）を用いて標的ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を形成する最近のゲノム編集技術である。細胞における標的化ＤＳＢの自己修復処理の間に、ヌクレオチドの欠失および挿入がしばしば起こり、そして標的化タンパク質のコード領域の対応するゲノム配列のフレームシフトおよび最終的にこれらの機能の喪失を生じる。ＣＲＩＳＰＲはウイルス侵入を防御する際の原核細胞の免疫系として最初に発見されたが、ゲノム編集ツールとしての真核細胞におけるその適用は首尾よく開発されている（例えば、Ｃｏｎｇら、２０１３；  Ｈｓｕら、２０１４；  Ｊｉｎｅｋら、２０１２；  Ｒａｎら、２０１３を参照のこと）。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）および転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ならびにＤＳＢの形成を誘導するために特異的ＤＮＡ結合ドメインを用いるメガヌクレアーゼ（ＭＮ）（例えば、ＵＳＰＮ  ８，５９７，９１２）等の他のゲノム編集技術と比べると、ＣＲＩＳＰＲ技術は、特定のＤＮＡ配列に対するワトソン−クリック塩基対形成を用いる誘導ＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の補助を得ることで、ＤＮＡの切断を触媒する。
【００７３】
本明細書中に記載される遺伝子編集ツールのいずれも、本発明と共に用いられ得るが、ＣＲＩＳＰＲ技術は種々の細胞および生物に適用され得る、より効率的で高度に特異的な技術を提供するために例示される（Ｈｓｕら、２０１４）。本明細書中の実施例に例示されるように、目的の遺伝子を発現する細胞におけるノックアウト、切除、不活性化または破壊を行うｇＲＮＡ標的化部位または領域は、ＣＨＯ−Ｋ１ゲノムに特定オンラインＣＲＩＳＰＲ  ｇＲＮＡ設計ツールを用いることで設計され得る（インターネット上のstaff.biosustain.dtu.dk/laeb/crispy/を参照のこと）。目的の遺伝子においてノックアウト、除去、不活性化または破壊され得る部位または領域標的遺伝子の例を、以下の表１に示す。
【００７４】
【表１】
2020522247.tif 000003
2020522247.tif 000004
本発明の他の態様において、オリゴヌクレオチドを合成し、そして以下の表２に示すように、上記の表に開示されるｇＲＮＡのゲノムＤＮＡ遺伝子座を増幅するために用いた。これらの技術は全て、文献で説明されている。例えば、 Sambrook et al MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 and Third edition, 2001; Ausubel et al, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987および定期的な更新を参照する。
【００７５】
【表２】
2020522247.tif 000005
2020522247.tif 000006
〔遺伝子編集標的〕
本発明の実施形態において、目的の遺伝子を発現する細胞におけるノックアウト、破壊、切除または不活性化を標的とする遺伝子が提供される。標的ノックアウト遺伝子、標的または標的化されたアブレーション遺伝子、標的または標的化された不活性化遺伝子、標的または標的化された破壊遺伝子という用語は、本明細書中で用いられる場合、遺伝子編集によるノックアウト、アブレーション、または不活性化のために標的化される遺伝子をいう。本発明のいくつかの態様において、標的または標的化された部位あるいは領域は、アポトーシス経路に関与する。本発明の他の実施形態において、細胞または細胞株におけるノックアウト、破壊、切除または不活性化された標的遺伝子を提供する。ノックアウト、破壊された、除去された、または不活性化された、標的化された遺伝子は、細胞増殖、分化、調節等を調節する遺伝子を含み得る。他の実施形態では、目的の遺伝子を発現する細胞におけるノックアウト、破壊、切除または不活性化のための標的遺伝子は、アポトーシス経路に関与する遺伝子、例えば、アポトーシス促進遺伝子、癌遺伝子等を含む。ノックアウト、破壊、切除、または不活性化のための標的遺伝子はＧＳ、Ｂｃｌ−２ファミリー、
ＩＧＦＢＰ４、ＡＱＰ１、Ｍａｆ１、ｅＲＦ１、ＦＵＴ８、Ｐ５３、カスパーゼ３、ＵＰＦ１、Ｓｍｇ１、ならびに任意の外因性で追加された選択的マーカー遺伝子（適用可能な場合）であるゼオシン、ハイグロマイシン、ピューロマイシン等、Ｓｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯ、Ａｐａｆ−１、カスパーゼ−６、カスパーゼ−７、カスパーゼ−９、カスパーゼ−１０、ＰＡＲＰ、アルファ  ホドリン、ＮｕＭＡ、ＡＩＦ、ＣＡＤ、Ｐｕｍａ、Ｎｏｘａ、１４−３−３，Ａｖｅｎ、Ｍｙｃ、ＨｔｒＡ２／Ｏｍｉ等を含み得るが、これらに限定されない。ノックアウト、破壊、切除または不活性化のための標的遺伝子は、Ｂｃｌ−ｘ１、Ｂａｋ、Ｂａｘ、Ｂｃｌ−ｘｓ、Ｂｉｄ、Ｂｉｍ、ＢａｄおよびＢｉｋのようなｂｃｌ−２ファミリーを含み得る。特定の実施形態において、ノックアウト、破壊、切除または不活性化のための標的は、ＢＡＸおよび／またはＢＡＫである。他の実施形態では前記標的化された、ノックアウト、破壊、除去または不活性化遺伝子は完全にまたは部分的にノックアウト、除去または不活性化される。部分的に不活性化された、破壊された、ノックアウトされた、または除去された遺伝子は、不活性化された、破壊された、ノックアウトされた、または除去された遺伝子を、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％含み得る。
【００７６】
〔生物学的治療遺伝子〕
本発明の開示は、プラットフォーム細胞株において発現される目的の遺伝子を提供する。目的の上記遺伝子は、サイトカイン、成長因子、ホルモン、インターフェロン、インターロイキン、他の調節ペプチドおよびタンパク質ならびに抗体を含むが、これらに限定されない生物学的治療剤であり得る。本発明の生物学的治療剤は、遺伝子操作された細菌、酵母、真菌、または細胞由来の任意の生物学的産物を含み得る。本発明の生物学的治療剤には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、組換えＤＮＡ、タンパク質、ポリペプチドが含まれる。いくつかの実施形態では生物学的治療剤はワクチンであり、ワクチンは本発明の任意の方法または細胞によって得られる。
【００７７】
他の実施形態において、本発明は例えば、目的の遺伝子を発現するプラットフォーム細胞または細胞株を提供するが、これらに限定されず、例えばアルファ−１抗トリプシン、アンギオスタチン、抗溶血因子、抗体、アポリポタンパク質、アポタンパク質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウムペプチド、心房性ペプチド、カルシトニン、ＣＤ４０リガンド、Ｃ−キットリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子５ａ、補体阻害剤、補体受容体１、サイトカイン（例えば、上皮好中球活性化ペプチド−７８、ＧＲＯα／ＭＧＳＡ、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１δ、ＭＣＰ−１）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、エリスロポエチン（「ＥＰＯ」）、剥脱毒素ＡおよびＢ、第ＸＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子を含むが、第Ｘ因子、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＤ１１６、Ｍ−ＣＳＦ、ＣＳＦ−１Ｒ、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、成長因子、ヘッジホッグタンパク質（例えば、Ｓｏｎｉｃ、Ｉｎｄｉａｎ、Ｄｅｓｅｒｔ）、ヘモグロビン、ヘパトサイト増殖因子（ＨＧＦ）、ヒルジン、ヒト血清アルブミン、インスリン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病阻止因子、ルシフェラーゼ、ニュールツリン、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成タンパク質、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン（例えば、ヒト成長ホルモン）、プレイオトロピン、プロテインＡ、プロテインＧ、発熱性外毒素Ａ、Ｂ、およびＣ、リラキシン、レニン、ＳＣＦ、可溶性補体受容体Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ可溶性インターロイキン受容体（ＩＬ−１、２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５）、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、スーパー抗原、すなわちブドウ球菌エンテロトキシン（ＳＥＡ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、トキシックショック症候群毒素（ＴＳＳＴ−１）、チモシンα１、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ＴＧＦβ、およびＭＩＦ、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ウロキナーゼ等も含む。
【００７８】
他の実施形態において、目的の遺伝子は、これらに限定されるものではないが、ＩＬ−１およびＣＤ１２１ａ、ＩＬ−２およびＣＤ２５／ＣＤ１２２／ＣＤ１３７、ＩＬ−３およびＣＤ１２３、ＩＬ−５およびＣＤ１２５、ＩＬ−６およびＣＤ１２６、ＩＬ−７およびＣＤ１２７／ＣＤ１３２、ＩＬ−９およびＩＬ−９Ｒ、ＩＬ−１０およＣＲＦ２−４、ＩＬ−１１およびＩＬ−１１Ｒ、ＩＬ−１２およびＩＬ−１２Ｒβ１ｃ／ＩＬ−１２Ｒβ２、ＩＬ−１３およびＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１５およびＣＤ１２２／ＣＤ１３２、ＩＬ−１６およびＣＤ４、ＩＬ−１７およびＣＤ２１７、ＩＬ−１８およびＩＬ−１Ｒｒｐ、ＩＬ−１９およびＩＬ−２０Ｒα／１０Ｒβｃ、ＩＬ−２１およびＩＬ−２１Ｒ／ＣＤ１３２、ＩＬ−２２およびＩＬ−２２Ｒαｃ／ＩＬ−１０Ｒβｃ等のインターロイキンを含み得るが、これらに限定されない。ＩＬ−２３およびＩＬ−２３Ｒ、、ＩＬ−２４およびＩＬ−２２Ｒαｃ／ＩＬ−１０Ｒβｃ、ＩＬ−２５およびＩＬ−１７ＢＲ、ＩＬ−２６およびＩＬ−２０Ｒα／ＩＬ−１０Ｒβｃ、ＩＬ−２７およびＷＳＸ−１／ＣＤ１３０ｃ、ＩＬ−２８およびＩＬ−２８Ｒαｃ／ＩＬ−１０Ｒβｃ、ＩＬ−２９およびＩＬ−２８Ｒαｃ／ＩＬ−１０Ｒβｃ、ＩＬ−２９およびＩＬ−２８Ｒαｃ／ＩＬ−１０Ｒβｃ、ＩＬ−３０およびＷＳＸ−１／ＣＤ１３０ｃ、ＩＬ−３１およびＩＬ−３１Ａ／ＯＳＭＲ、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３およびＳＴ２／ＩＬ１ＲＡＰ、ＩＬ−３４およびＣＳＦ−１Ｒ、ＩＬ−３５およびＩＬ−１２ＲＢ２、ＩＬ−３６およびＩＬ−１Ｒｒｐ２、ＩＬ−３７およびＩＬ−１８Ｒα、ＴＳＬＰおよびＴＳＬＰＲ、ＬＩＦおよびＬＩＦＲ、ＯＳＭおよびＯＳＭＲ等のインターロイキンを含む。
【００７９】
本発明のいくつかの態様において、目的の遺伝子は、これらに限定されるものではないが、腫瘍壊死因子β（ＴＮＦβ）、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）およびｐ５５／ｐ７５、ＬＴ−αおよびｐ５５／ｐ７５、ＬＴ−βおよびｐ５５／ｐ７５、ＣＤ４０ＬおよびＣＤ４０、ＦａｓＬおよびＣＤ９５、ＣＤ２７ＬおよびＣＤ２７、ＣＤ３０ＬおよびＣＤ３０、４−１ＢＢＬおよび４−１ＢＢ、ＴｒａｉｌおよびＤＲ４、ＲＡＮＫ−ＬおよびＲＮＡＫ、ＡＰＲＩＬおよびＴＡＣ１、ＬＩＧＨＴおよびＨＶＥＭ、ＴＷＥＡＫおよびＴＷＥＡＫＲ、ＢＡＦＦおよびＴＡＣ１等を含むが、これらに限定されない腫瘍壊死因子ＴＮＦを含み得る。
【００８０】
目的の遺伝子はＣ−Ｘ−Ｃケモカイン（例えば、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、Ｇｒｏ−ａ、Ｇｒｏ−ｂ、Ｇｒｏ−Ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ４、ＭＩＧ）を含み得、ＣＸＣＬ１およびＣＸＣＲ２、ＣＸＣＬ２およびＣＸＣＲ２、ＣＸＣＬ３およびＣＸＣＲ２、ＣＸＣＬ４およびＣＸＣＲ３Ｂ、ＣＸＣＬ５およびＣＸＣＲ２、ＣＸＣＬ６およびＣＸＣＲ２、ＣＸＣＬ７およびＣＸＣＲ１／ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＬ８およびＣＸＣＲ１／ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＬ９およびＣＸＲ３Ａ／３Ｂ、ＣＸＣＬ１０およびＣＸＣＲＡ／３Ｂ、ＣＸＣＬ１１およびＣＸＣＲ３Ａ／３Ｂ／ＣＲＣＲ７、ＣＸＣＲ１２およびＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ７、ＣＸＣＬ１３およびＣＸＣＲ５、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６およびＣＸＣＲ６等を含み得る。目的の遺伝子はまた、ＣＣケモカイン（例えば、単球ケモアトラクタントタンパク質−１、単球ケネアトラクタントタンパク質−２、単球ケモアトラクタントタンパク質−３、単球炎症タンパク質−１α、単球炎症タンパク質−１β、ＲＡＮＴＥＳ、Ｉ３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２）、ＣＣＬ１およびＣＣＲ６、ＣＣＬ２およびＣＣＲ２、ＣＣＬ３およびＣＣＲ１／５、ＣＣＬ４およびＣＣＲ５、ＣＣＬ５およびＣＣＲ１／ＣＣＲ３、ＣＣＲ５、ＣＣＬ６およびＣＣＲ１、ＣＣＬ７およびＣＣＲ１／ＣＣＲ２／ＣＣＲ３／ＣＣＲ５、ＣＣＬ８およびＣＣＲ１／ＣＣＲ２／ＣＣＲ５、ＣＣＬ９およびＣＣＲ１、ＣＣＬ１１およびＣＣＲ３、ＣＣＬ１２およびＣＣＬ２、ＣＣＬ１３およびＣＣＲ２／３、ＣＣＬ１４およびＣＣＲ１／３／５、ＣＣＬ１５およびＣＣＲ１／３、ＣＣＬ１６およびＣＣＲ１／２／５／８、ＣＣＬ１７およびＣＣＲ４、ＣＣＬ１８およびＰＩＴＰＮＭ３、ＣＣＬ１９およびＣＣＲ７、ＣＣＬ２０およびＣＣＲ６、ＣＣＬ２１およびＣＣＲ７、ＣＣＬ２２およびＣＣＲ４、ＣＣＬ２３およびＣＣＲ１／ＦＰＲＬ−１、ＣＣＬ２４およびＣＣＲ３、ＣＣＬ２５およびＣＣＲ９、ＣＣＬ２６およびＣＣＲ３、ＣＣＬ２７およびＣＣＲ１０、ＣＣＬ２８およびＣＣＲ１０を含み、また、ＸＣＬ１およびＸＣＲ１、ＸＣＬ２およびＸＣＲ１、ＣＸ３ＣＬ１およびＣＸ３ＣＲ１等を含む。
【００８１】
本明細書に記載の方法、組成物、方策および技術は、ポリペプチドまたはタンパク質の特定種類、クラスまたはファミリーに限定されない。実際、実質的には、任意のポリペプチドが本明細書に記載される少なくとも１つの「改変されたまたは改変されていない」非天然アミノ酸を含むように設計または改変され得る。単なる例であるが、ポリペプチドは、本明細書中に記載される生物学的治療用または治療用タンパク質と相同であり得る。少なくとも１つの非天然アミノ酸を有する目的のタンパク質またはポリペプチドが、本発明の特徴である。本発明はまた、本発明の組成物および方法を用いて産生される少なくとも１つの非天然アミノ酸を有するポリペプチドまたはタンパク質を含む。賦形剤（例えば、薬学的に許容可能な賦形剤）もまた、タンパク質と共に存在し得る。
【００８２】
脊椎動物細胞に組み込まれた少なくとも１つの非天然アミノ酸を有する目的のタンパク質またはポリペプチドを産生することによって、タンパク質またはポリペプチドは、典型的には脊椎動物翻訳後修飾を含む。特定の実施形態では、タンパク質が少なくとも１つの非天然アミノ酸と、脊椎動物細胞によりｉｎ  ｖｉｖｏで作製される少なくとも１つの翻訳後修飾とを含み、上記翻訳後修飾は原核細胞によっては行われない。例えば、翻訳後修飾には、例として、アセチル化、アシル化、脂質修飾、パルミトイル化、パルミチン酸付加、リン酸化、糖脂質結合修飾、グリコシル化等が含まれる。
【００８３】
本発明の開示には、セレクターコドンを含有する遺伝子または目的の遺伝子が含まれる。目的の遺伝子は治療用タンパク質またはポリペプチドを含み得、遺伝子は細胞増殖、分化、調節、炎症、癌遺伝子等に関与するが、これらに限定されない。他の実施形態では、本発明の開示がセレクターコドンを含有する抗体遺伝子を含む。他の実施形態では抗体が抗Ｈｅｒ２、抗ＣＤ−７０、抗ＰＳＭＡ、５Ｔ４、ＥＧＦＲ、ＴＲＯＰ２、ＣＤ３、インターロイキン（２、３、１０を含むが、これらに限定されない）、ＧＰＣ３、ＤＬＬ３、ＲＯＲ１、レプチン、ＦＧＦ−２１およびＦＧＦ−２３を含むＦＧＦファミリー、ＨＧＨ、ＦｃＲ、インスリン、ＴＮＦＲ１、ＴＲＡＩＬ、エリスロポエチン、ならびにこれらに限定されない類似体、二重特異性およびその断片等を含むが、これらに限定されない、任意の対象抗体であり得る。いくつかの実施形態において、本発明は、セレクターコドンを含有する抗体遺伝子を含む。本発明の抗体は例えば、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化、一本鎖、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生されるフラグメント等であり得る。本発明の抗体は例えば、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）または補体媒介性溶解（ＣＭＬ）による破壊のために腫瘍細胞を標的化することによって腫瘍増殖を停止させる腫瘍特異的ＭＡｂを含み得るが、これらに限定されない（これらの一般的なタイプのＡｂは時に「魔法弾(Magic bullets)」と呼ばれる）。一例としては、非ホジキンリンパ腫の治療のための、抗ＣＤ２０  ＭＡｂであるリツキサンは、腫瘍増殖の重要な構成要素を阻害する抗体である（Scott (1998) Rituximab: a new therapeutic monoclonal antibody for non-Hodgkin's lymphoma Cancer Pract 6: 195-7）。ハーセプチンは転移性乳癌の治療のための抗ＨＥＲ−２モノクローナル抗体であり、この作用メカニズムを有する抗体の例を提供する（Baselga et al (1998) Recombinant humanized anti-HER2 antibody (Herceptin) enhances the antitumor activity of paclitaxel and doxorubicin against HER2/neu overexpressing human breast cancer xenografts [published erratum appears in Cancer Res (1999) 59(8):2020], Cancer Res 58: 2825-31）。別の例では、細胞毒性化合物（毒素、放射性核種等）を腫瘍または目的の他の部位に直接送達するための抗体に関する。例えば、前立腺腫瘍細胞に対して、直接放射線標識を行う９０Ｙ結合抗体であるＣＹＴ−３５６がある（Deb et al (1996) Treatment of hormone-refractory prostate cancer with 90Y-CYT-356 monoclonal antibody Clin Cancer Res 2: 1289-97）。他の例としては、腫瘍に局在化した酵素が腫瘍周辺に全体的に投与されたプロドラッグを活性化する、抗体特異的酵素プロドラッグ療法が挙げられる。例えば、結腸直腸癌の治療のためにカルボキシペプチダーゼＡに結合した抗Ｅｐ−ＣＡＭ１抗体が開発されている（Wolfe et al (1999) Antibody-directed enzyme prodrug therapy with the T268G mutant of human carboxypeptidase A1: in vitro and in vivo studies with prodrugs of methotrexate and the thymidylate synthase inhibitors GW1031 and GW1843 Bioconjug Chem 10: 38-48）治療上の恩恵のために正常な細胞機能を特異的に阻害するように設計された他の抗体（例えば、アンタゴニスト）も含まれ得る。例としては、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎが提供する急性臓器移植拒絶反応を抑制するための抗ＣＤ３  ＭａｂであるＯ��ｔｈｏｃｌｏｎｅ  ＯＫＴ３が挙げられる。（Strate et al (1990) Orthoclone OKT3 as first-line therapy in acute renal allograft rejection Transplant Proc 22: 219-20）。別のクラスの抗体には、アゴニストが含まれる。これらのＭＡｂは正常な細胞機能を特異的に増強して治療に役立てるように設計されている。例えば、神経治療のためのアセチルコリン受容体のＭＡｂベースのアゴニストが開発中である（Xie et al (1997) Direct demonstration of MuSK involvement in acetylcholine receptor clustering through identification of agonist ScFv Nat. Biotechnol. 15: 768-71）。これらの抗体はいずれも、１つ以上の治療特性（特異性、結合活性、血清半減期等）を増強するために、１つ以上の非天然アミノ酸を含むように修飾することができる。別の例としては、酵素の触媒能力を模倣するように操作されたＩｇ配列のような触媒抗体を含んでもよい。（Wentworth and Janda (1998) Catalytic antibodies Curr Opin Chem Biol 2: 138-44）。触媒抗体はまた、１つ以上の目的の特性を改善するために、１つ以上の非天然アミノ酸を含むように改変され得る。
【００８４】
本発明のセレクターコドンは、タンパク質生合成機構の遺伝子コドンフレームワークを拡張する。例えば、セレクターコドンは、固有の３塩基コドン、アンバーコドン（ＵＡＧ）、オパールコドン（ＵＧＡ）といった終止コドンのようなナンセンスコドン、非天コドン、少なくとも４塩基のコドン、希少コドン等を含む。例えば、１つかそれ以上、２つかそれ以上、３つ以上、あるいはその他の数の、複数のセレクターコドンを所望の遺伝子に導入することができる。遺伝子は与えられたセレクターコドンの複数のコピー、または複数の異なるセレクターコドン、またはこれらの任意の組み合わせを含むことができる。一実施形態において、本発明の方法および組成物は、本明細書中に開示される、セレクターコドンを含有する遺伝子または目的の遺伝子の使用を含む。一実施形態では、本発明の方法および組成物は、セレクターコドンが重鎖、軽鎖、またはその両方に存在し得るセレクターコドンを含有する抗体の使用を含む。従って、本発明のセレクターコドンは、真核生物におけるｉｎ  ｖｉｖｏでの非天然アミノ酸の取り込みのための終止コドンを含む。
【００８５】
〔産生細胞〕
いくつかの実施形態において、本発明の開示は、目的の遺伝子を発現する産生細胞、細胞株、およびこれらから作製されたクローニングを提供する。このような産生細胞または細胞株は一過性にトランスフェクトされた細胞集団、安定な大量の細胞集団（例えば、細胞の混合またはプール）、安定なミニ細胞集団（例えば、ミニプールまたはマスターウェル集団）、および安定なクローン細胞株（例えば、単細胞由来）を含むが、これらに限定されない。本明細書中で用いられる一過性のトランスフェクションをされた細胞集団とは、目的の遺伝子がゲノム中に導入され、かつゲノム中に安定に組み込まれていない細胞プールをいう。本明細書中で用いられる安定な細胞または安定な産生細胞株とは、目的の遺伝子がゲノムに導入され、そして安定にゲノムに組み込まれる細胞をいう。安定な小細胞集団は、安定な大量の細胞集団よりも不均一性が少ない可能性がある。
【００８６】
いくつかの実施形態において、本発明は直交アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）、直交サプレッサーｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）、および非天然アミノ酸が組み込まれたセレクターコドンを含有する目的の遺伝子、ならびに標的ノックアウト、除去、不活性化または破壊された遺伝子を含む安定な産生細胞株に関する。他の実施形態において、本発明の開示は、目的の遺伝子および標的ノックアウト、除去、不活性化または破壊された遺伝子を発現する、産生細胞、細胞株およびこれらから作製されたクローニングに関する。他の実施形態では標的ノックアウト、除去、不活性化、または破壊された遺伝子は細胞増殖および生産性の促進に関与する遺伝子である。他の実施形態では、標的ノックアウト、除去、不活性化、または破壊された遺伝子はアポトーシス経路に関与する遺伝子、例えば、プロアポトーシス遺伝子である。例示的な実施形態において、本発明の開示は非天然に組み込まれたアミノ酸および１つ以上の標的ノックアウト、破壊、切除または不活性化遺伝子（例えば、ＢＡＸおよび／またはＢＡＫ）を有する、目的の遺伝子を発現する細胞、または細胞株を作製するための方法および組成物を提供する。他の標的ノックアウト遺伝子は、ミトコンドリア経路を介してアポトーシスによる細胞死を制御する能力について、当該分野で周知のタンパク質のＢｃｌ−２ファミリーを含み得る。Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−ｘ１等の相同体のいくつかは、アポトーシスを阻害することが知られている。他の公知のプロアポトーシスＢｃｌ−２ファミリーメンバーには、Ｂａｋ、Ｂａｘ、Ｂｃｌ−ｘｓ、Ｂｉｄ、Ｂｉｍ、ＢａｄおよびＢｉｋが含まれる。適切な刺激により、Ｂａｘおよび／またはＢａｋは、アポトーシスを誘導または促進することができる。タンパク質のＢｃｌ−２ファミリーは、類似した配列および構造の相同性を共有する。このタンパク質ファミリーは、Ｂｃｌ−２相同ドメインとして知られる配列相同性の４つまでの領域を特徴とする。例えば、Ｂａｘタンパク質は、Ｂｃｌ−２と高度に保存されたドメインを共有する。これらのドメインのいくつかは、アポトーシスシグナルに応答する細胞生存または細胞死に重要であると考えられるＢａｘ／Ｂｃｌ−２ヘテロダイマー形成に関与する。活性化すると、Ｂａｘはミトコンドリア外膜に移動し、そこでオリゴマー化し、膜を透過性にし、チトクロームＣを含むいくつかの死滅促進因子を放出する（Scorrano et al (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 304:437-444）。Ｂａｘは、Ｂａｘをミトコンドリアから隔離するＫｕ７０タンパク質との相互作用を介して、正常細胞において不活性化できる（Sawada et al (2003) Nat. Cell Biol. 5:320-329）。Ｂａｘと同様に、Ｂａｋ遺伝子産物は、適切な刺激の存在下でアポトーシスによる細胞死を増強する。Ｂａｋはまた、細胞死を促進し、Ｂｃｌ−２のアポトーシス保護を阻害する。Ｂａｋは、種々の細胞型における公知の強力なアポトーシス誘導因子である。従って、本発明の開示は、例示的な方法において、目的の遺伝子および非天然アミノ酸が組み込まれた細胞または細胞株において、ＢＡＫ遺伝子および／またはＢＡＸ遺伝子のうちの１つ以上の部分的または完全な不活性化を伴う、産生細胞株の作製方法および組成物を��供する。目的の遺伝子を発現する細胞におけるアポトーシス剤（例えば、ＢＡＸおよび／またはＢＡＫ）を不活性化することは、細胞にアポトーシスに対する抵抗性を与え、そして組換えタンパク質（例えば、抗体、組換えウイルスベクターを含むがこれらに限定されない）の産生を改善した細胞株を作製するため、およびワクチンの製造のために用いられ得る。
【００８７】
本開示の細胞株は、組換えタンパク質産生のために利用され得る。組換えタンパク質には本明細書の他の箇所に開示されるような抗体、抗原、治療用タンパク質が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本発明は、真核生物または脊椎動物の細胞または細胞株（哺乳類、昆虫、は虫、鳥等を含むがこれらに限定されない）、または繊毛虫、植物（単子葉植物、双子葉植物、および藻類を含むがこれらに限定されない）、真菌、酵母、べん毛虫、ミクロスポリジア、および原生生物を含む。真核細胞は、非天然アミノ酸のｉｎ  ｖｉｖｏへの取り込みのために用いられ得る。細胞は本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のポリヌクレオチドを含む構築物、例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得る、本発明のベクターを用いて遺伝子操作（例えば、形質転換、形質導入またはトランスフェクション）するために用いられ得る。ベクターは例えば、プラスミド、細菌、ウイルス、裸のポリヌクレオチド、または共役ポリヌクレオチドの形成であり得る。ベクターはエレクトロポレーション法（et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 5824 (1985)より、ウイルスベクターによる感染、微小ビーズまたは粒子のマトリックス内、または表面上の、いずれかの核酸と微小粒子による高速弾道浸透（high velocity ballistic penetration）を含む標準的な方法によって、細胞および／または微生物に導入される（Klein et al, Nature 327, 70-73 (1987)）。
【００８８】
核酸を細胞に導入するいくつかの周知の方法が利用可能であり、そのいずれも本発明において用いることができる。これらには、レシピエント細胞と、ＤＮＡを含有する細菌プロトプラストとの融合、エレクトロポレーション、発射体衝撃（projectile bombardment）、およびウイルスベクター（以下でさらに記載する）による感染等が含まれる。細菌細胞を用いて、本発明のＤＮＡ構築物を含むプラスミドの数を増幅することができる。細菌を対数増殖期まで増殖させ、細菌内のプラスミドを、当該分野で公知の種々の方法によって単離し得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋを参照のこと）。さらに、細菌からプラスミドを精製するための多数のキットが市販されている（例えば、ＥａｓｙＰｒｅｐ（商標）、ＦｌｅｘｉＰｒｅｐ（商標）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈの両方を参照、ＳｔｒａｔａＣｌｅａｎ（商標）、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＱＩＡｐｒｅｐ（商標）、ＱｉａｇｅｎのＱＩＡｐｒｅｐ（商標）を参照のこと）。次いで、単離および精製されたプラスミドをさらに操作して、他のプラスミドを産生し、細胞をトランスフェクトするために使用、または関連するベクターに組み込んで、生物に感染させる。典型的なベクターは、転写および翻訳ターミネーター、転写および翻訳開始配列、ならびに目的の特定の核酸の発現の調節に有用なプロモーターを含む。ベクターは任意に、少なくとも１つの独立したターミネーター配列、真核生物もしくは原核生物、またはその両方におけるカセットの複製を可能にする配列（例えば、シャトルベクター）、および原核生物系および脊椎動物系の両方についての選択マーカーを含む一般的な発現カセットを含む。ベクターは、原核生物、真核生物、好ましくはその両方における複製および組み込みに適している。Giliman & Smith, Gene 8:81 (1979); Roberts, et al, Nature, 328:731 (1987); Schneider, B., et al, Protein Expr. Purif. 6435:10 (1995); Ausubel, Sambrook, Berger (all supra)参照。クローニングに有用な細菌およびバクテリオファージのカタログは例えば、ＡＴＣＣ（例えばThe ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophage(1992) Gherna et al (eds) published by the ATCC）によって提供される。配列決定、クローニング、および分子生物学の他の態様のためのさらなる基本的な手順、ならびに基礎となる理論的考察もまた、Watson et al (1992) Recombinant DNA Second Edition Scientific American Books, NYで確認できる。さらに、本質的に任意の核酸（および標準であろうと非標準であろうと、実質的に任意の標識核酸）は種々の市販品（例えば、the Midland Certified Reagent Company (Midland, TX mcrc.com), The Great American Gene Company (Ramona, CA available on the World Wide Web at genco.com), ExpressGen Inc. (Chicago, IL available on the World Wide Web at expressgen.com), Operon Technologies Inc. (Alameda, CA) および多くの他の市販品）のいずれかから特注で購入または標準的に購入できる。
【００８９】
本開示の細胞または細胞株は例えば、スクリーニング工程、プロモーターの活性化、または形質転換体の選択のような活性について適切に改変された従来の栄養培地中で培養され得る。これらの細胞は、必要に応じて、トランスジェニック生物中で培養され得る。他の有用な参考文献としては、例えば、細胞単離および培養（例えば、その後の核酸単離）については、Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, third edition, Wiley- Liss, New York and the references cited therein; Payne et al (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY; Gamborg and Phillips (eds) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York) and Atlas and Parks (eds) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FLが含まれる。
【００９０】
従来の培地（midium）または培地（media）は、本明細書中で用いられる場合、細胞および／またはこのような細胞によって発現および／または分泌される産物を増殖および採取するために用いられる任意の培地をいう。このような「培地」または「培地」は例えば、細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞、植物宿主細胞、真核宿主細胞、哺乳動物宿主細胞、ＣＨＯ細胞、原核宿主細胞、大腸菌、またはシュードモナス宿主細胞、および細胞内容物を含む、任意の宿主細胞を支持または含有し得る溶液、固体、半固体、または剛性支持体を含むが、これらに限定されない。上記のような「培地」または「培地」は増殖工程の前または後のいずれかの培地を含む、ポリペプチドが分泌された宿主細胞が増殖された培地または培地を含むが、これらに限定されない。上記のような「培地」または「培地」は、宿主細胞の溶解物を含む緩衝液または試薬（例えば、細胞内で産生されたポリペプチド）を含み、そして宿主細胞はポリペプチドを放出するために溶解または破壊されるが、これらに限定されない。本発明の他の実施形態では、培地が完全細胞培養培地、従来の細胞培養培地、または化学的に規定された培地であってもよい。完全細胞培養培地はしばしば、２つの主要なカテゴリーの構成要素：基礎培地および成長補助剤を有する。基礎培地は、糖、アミノ酸、ビタミン、種々の塩等を含む低分子量成分からなる栄養混合物である。基礎培地はエネルギーを供給し、新しい細胞塊および産物を作製するための栄養源を単に提供するだけでなく、細胞増殖を可能にするために、バランスのとれた塩濃度および浸透圧を提供する。しかし、基礎培地は「最適である」増殖条件に必要な増殖因子または他の因子を含まないので、基礎培地単独で提供される場合、ほとんどの細胞は増殖しない。基礎培地に添加され得る増殖補助剤には、成長因子、リン脂質、大豆加水分解物、血清等が含まれる。これらの補助剤は特定のシグナル伝達経路のための構成成分を提供することによって細胞増殖を促進し得、または特別な栄養要求性（例えば、コレステロールを送達すること）を満たし得、そして細胞分化を指向し得る。従来の細胞培養培地は、基礎培地に加えて１５％までの動物血清を含有する。血清は、化学組成が非常に複雑な流体である。上記のような媒体は大部分が未定義の化学組成を含み、複合媒体と呼ばれる。工業プロセスで一般的に用いられる多くの補助剤、例えば、植物加水分解物、大豆リン脂質もまた、このカテゴリーに入る。上記のような補助剤の使用は、媒体の化学組成を不明確にする。化学的に定義された培地はその化学組成が知られており、特徴付けられており、その化学種のすべてが指定されている成分のみを含む。上記培地は、未知または未定義の組成を有する構成要素のいかなる混合物も含まない。例えば、「脂質」または「リン脂質」は明確に定義された化合物ではないが、化合物クラスの混合物であり、化学的に特定されていない。化学的に規定された培地はしばしば、成長因子、サイトカイン、およびキャリアタンパク質を含む。したがって、化学的に定義された培地は、必ずしもタンパク質を含まないわけではない。
【００９１】
本発明の実施形態では、バッチおよび流加生産が利用される。バッチおよび流加生産のための標準的な方法は、当技術分野において十分に理解されている。バッチ工程において、浸透圧モル濃度の制約は、最初に添加され得る栄養素の量を制限する。この低栄養レベルは、培養物が高い細胞および産物濃度を達成することを妨げる。流加培養では、培養中に培地を添加して栄養素の枯渇を防ぐことで、したがって増殖期を延長し、最終的に細胞および産物濃度を増加させる。非常に単純なものから非常に複雑で自動化されたものまでの様々な流加操作が、現在の生産設備で利用されている。バッチおよび流加の両方で用いられる培地は、市販されているか、または自社で開発された独自の培地であり得る。培地の種類は大部分が未定義の化学組成を含有する複合培地、または既知であり、特徴付けられ、その化学物質のすべてが指定された化学組成を有する成分を含む化学的に定義された培地とすることができる。いくつかの実施形態では、化学的に定義された培地は、その化学組成が既知であり、特徴付けられ、その化学物質のすべてが指定されている成分のみを含む。他の実施形態では、利用される培地の種類が未定義の化学組成および化学的に定義された組成を含有する混合物であってもよい。別の実施形態では、未定義の化学組成と化学的に定義された組成とが、それぞれ９９％〜９０％および１％〜１０％、またはそれぞれ８９％〜８０％および１１％〜２０％、またはそれぞれ７９％〜７０％および２１％〜３０％、またはそれぞれ６９％〜６０％および３１％〜４０％、またはそれぞれ５９％〜５０％および４１％〜５０％；またはそれぞれ１％〜１０％と９９％〜９０％、１１％〜２０％と８９％〜８０％、２１％〜３０％と７９％〜７０％、３１％〜４０％と６９％〜６０％、４１％〜５０％と５９％〜５０％のうちの組み合わせのいずれかである。ほとんどの上記のような方法または、代替の方法は、当業者に周知である。例えば、Weishou Hu, et al, Cell Culture Process Engineering (2013)を参照のこと。
【００９２】
本発明の方法および組成物は、大量の有用な量の非天然アミノ酸を含有するまたは含むタンパク質またはポリペプチドの作製のための高い生産性真核細胞または細胞株を提供する。一態様では、組成物が任意に、例えば、非天然アミノ酸を含むタンパク質のポリペプチドの少なくとも１０マイクログラム、少なくとも５０マイクログラム、少なくとも７５マイクログラム、少なくとも１００マイクログラム、少なくとも２００マイクログラム、少なくとも２５０マイクログラム、少なくとも５００マイクログラム、少なくとも１ミリグラム、少なくとも１０ミリグラム以上、またはｉｎ  ｖｉｖｏタンパク質産生方法で達成することができる量を含む。別の態様では、タンパク質が例えば、細胞溶解物、緩衝液、医薬緩衝液、または他の液体懸濁液（例えば、約１ｎｌ〜約１００Ｌのいずれかの体積）中に、例えば、１リットル当たり少なくとも１０マイクログラムのタンパク質、１リットル当たり少なくとも５０マイクログラムのタンパク質、１リットル当たり少なくとも７５マイクログラムのタンパク質、１リットル当たり少なくとも１００マイクログラムのタンパク質、１リットル当たり少なくとも２００マイクログラムのタンパク質、１リットル当たり少なくとも２５０マイクログラムのタンパク質、１リットル当たり少なくとも５００マイクログラムのタンパク質、１リットル当たり少なくとも１ミリグラムのタンパク質、または１リットル当たり少なくとも１０ミリグラム以上のタンパク質の濃度で組成物中に任意に存在する。少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む真核生物または脊椎動物細胞におけるタンパク質の大量（例えば、他の方法（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳）で典型的に可能であるよりも多い）の産生は、本発明の特徴である。
【００９３】
いくつかの実施形態では、本発明の細胞が「宿主細胞」とも呼ばれる、操作または組み換え宿主細胞またはプラットフォーム細胞である。このようなプラットフォーム、操作もしくは組み換え宿主細胞、または宿主細胞は外因性のポリヌクレオチドを含む細胞をいい、ここで、外因性のポリヌクレオチドを細胞に挿入するために用いられる方法は直接取り込み、形質導入、ｆ接合、または組み換え宿主細胞を作製するための当該分野で公知の他の方法を含むが、限定されない。単なる例として、このような外因性ポリヌクレオチドは非組み込みベクター（プラスミドを含むが、これに限定されない）であり得るか、または宿主ゲノムに組み込まれ得る。本発明の他の態様において、目的の遺伝子はプラットフォーム、または操作もしくは組み換え宿主細胞にトランスフェクションされて、生物学的治療剤（抗体を含むが、これに限定されない）を作製または製造するための産生細胞株を作製し得る。本発明の別の実施形態において、産生細胞株は、目的の遺伝子を有する細胞株である。本発明の他の実施形態において、サイレンシングまたはノックアウトされた、切除された、不活性化された、または破壊された目的の遺伝子を有する産生細胞株は、プラットフォーム細胞株となり得る。本発明のいくつかの態様において、プラットフォーム細胞は、目的の遺伝子を有さない直交ｔＲＮＡ／ＲＳシステムを含む細胞株であり得る。
【００９４】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、実質的に精製され得る。本明細書で用いられる用語「実質的に精製された」は、精製前に目的の成分に通常付随するかまたは相互作用する他の成分を実質的にまたは本質的に含まない目的の成分をいう。単なる例として、目的の成分の調製物が、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満の汚染成分を含有する場合、目的の成分は「実質的に精製」され得る。従って、目的の「実質的に精製された」成分は、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、またはそれ以上の純度レベルを有し得る。単なる例として、天然アミノ酸ポリペプチドまたは非天然アミノ酸ポリペプチドは、組み換え的に産生された天然アミノ酸ポリペプチドまたは非天然アミノ酸ポリペプチドの場合には天然細胞または宿主細胞から精製され得る。例として、天然アミノ酸ポリペプチドまたは非天然アミノ酸ポリペプチドの調製物は、調製物が約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満の汚染物質を含有する場合、「実質的に精製」され得る。例として、天然アミノ酸ポリペプチドまたは非天然アミノ酸ポリペプチドが宿主細胞によって組み換え的に産生される場合、天然アミノ酸ポリペプチドまたは非天然アミノ酸ポリペプチドは、細胞の乾燥重量の約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、約５％、約４％、約３％、約２％、または約１％以下で存在し得る。例として、天然アミノ酸ポリペプチドまたは非天然アミノ酸ポリペプチドが宿主細胞によって組み換え的に産生される場合、天然アミノ酸ポリペプチドまたは非天然アミノ酸ポリペプチドは、細胞の乾燥重量の約５ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ、約７５０ｍｇ／Ｌ、約５００ｍｇ／Ｌ、約２５０ｍｇ／Ｌ、約１００ｍｇ／Ｌ、約５０ｍｇ／Ｌ、約１０ｍｇ／Ｌ、または約１ｍｇ／Ｌ以下で培養培地中に存在し得る。例として、「実質的に精製された」天然アミノ酸ポリペプチドまたは非天然アミノ酸ポリペプチドはＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＥＣ、およびキャピラリー電気泳動を含むがこれらに限定されない適切な方法によって決定されるように、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、またはそれ以上の純度レベルを有し得る。本発明のポリペプチドまたはタンパク質は賦形剤（例えば、緩衝液、水、薬学的に許容可能な賦形剤であるが、これに限定されない）を含み得る。
【００９５】
特定の実施形態では、本発明が本発明の操作された核酸、直交サプレッサーｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）、直交アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）、セレクターコドンを含有する抗体遺伝子を含むベクター（例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルスであるが、これらに限定されない）を提供する。一実施形態では、ベクターは発現ベクターである。別の実施形態において、発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチドの１つ以上に作動可能に連結されたプロモーターを含む。別の実施形態において、細胞は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクトルを含む。ベクターは、レポーターをさらに含んでもよい。本明細書中で用いられる場合、用語「レポーター」は、目的のシステムの標的成分を選択するために用いられ得る成分をいう。例えば、レポーターは蛍光スクリーニングマーカー（例えば、緑色蛍光タンパク質）、発光マーカー（例えば、ホタルルシフェラーゼタンパク質）、親和性に基づくスクリーニングマーカー、または選択可能なマーカー遺伝子（例えば、ｈｉｓ３、ｕｒａ３、ｌｅｕ２、ｌｙｓ２、ｌａｃＺ、β−ｇａｌ／ｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ）、Ａｄｈ（アルコールデヒドロゲナーゼ）等）を含み得る。
【００９６】
本発明の方法および組成物は、遺伝子、ポリペプチドまたはタンパク質をスクリーニングまたは選択するための薬剤、物質およびマーカーを含み得る。本明細書中で用いられる選択またはスクリーニング剤は、存在する場合、集団からの特定の成分の選択／スクリーニングを可能にする薬剤をいう。例えば、選択またはスクリーニング剤は栄養素、抗生物質、光の波長、抗体、発現されたポリヌクレオチド（例えば、転写モジュレータータンパク質）等を含むが、これらに限定されない。選択剤は例えば、濃度、強度等によって変化させることができる。他の実施形態では、本発明の方法および組成物が検出可能な物質を含む。検出可能な物質を用いることもできる。用語「検出可能な物質」は、本明細書中で用いられる場合、活性化、改変、発現等される場合、集団からの特定の成分の選択／スクリーニングを可能にする薬剤をいう。例えば、検出可能な物質は化学物質、例えば、５−フルオロ酸（５−ＦＯＡ）であり得、これは、特定の条件、例えば、ＵＲＡ３レポーターの発現下で、検出可能になり、例えば、ＵＲＡ３レポーターを発現する細胞を殺す毒性産物である。さらに、本発明の方法、組成物、細胞または細胞株は、陽性および／または陰性の選択またはスクリーニングマーカーを含む。本明細書中で用いられる場合、用語「陽性の選択またはスクリーニングマーカー」は存在する場合（例えば、発現、活性化等）、陽性の選択マーカーを有さないものからの陽性の選択マーカーを有する細胞の同定をもたらすマーカーをいう。本明細書中で用いられる場合、用語「陰性の選択またはスクリーニングマーカー」は存在する場合（例えば、発現、活性化等）、所望の特性を有さない細胞の同定を可能にするマーカーをいう（例えば、所望の特性を有する細胞と比較して）。
【００９７】
〔直交ｔＲＮＡおよび直交アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ〕
いくつかの実施形態において、本発明は直交アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）、直交サプレッサーｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）、およびセレクターコドンを含有する目的の遺伝子（例えば、抗体を含む生物学的治療剤）を含む安定な産生細胞株に関する。真核生物細胞において、遺伝コードによって課される化学的制約を超えて、タンパク質の構造を直接遺伝的に改変する能力は細胞プロセスをプローブし、操作するための強力な分子ツールを提供する。本発明は、脊椎動物細胞において遺伝的にコードされるアミノ酸の数を拡大する翻訳成分を提供する。これらには、ｔＲＮＡ（例えば、直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ））、アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ（例えば、直交シンセターゼ（Ｏ−ＲＳ））、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳのペア、および非天然アミノ酸が含まれる。
【００９８】
直交ペアは、Ｏ−ｔＲＮＡ、例えばサプレッサーｔＲＮＡ、フレームシフトｔＲＮＡ等、およびＯ−ＲＳから構成される。Ｏ−ｔＲＮＡは内因性シンセターゼによってアシル化されず、ｉｎ  ｖｉｖｏでＯ−ｔＲＮＡによって認識されるセレクターコドンを含むポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質への非天然アミノ酸の取り込みを媒介することができる。Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを認識し、脊椎動物細胞においてＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。このような方法によって生成された直交ペアと共に直交ペアを生成するための方法、および脊椎動物細胞において用いるための直交ペアの組成物は、「Methods and compositions for the production of orthogonal tRNA-aminoacyltRNA synthetase pairs.」と題する国際特許出願ＷＯ２００２／０８６０７５に記載されている。Forster et al, (2003) Programming peptidomimetic synthetases by translating genetic codes designed de novo PNAS 100(11):6353-6357;およびFeng et al, (2003), Expanding tRNA recognition of a tRNA synthetase by a single amino acid change, PNAS 100(10): 5676-5681も参照のこと；各々は本明細書中に参考として組み込まれる。複数の直交ｔＲＮＡ／シンセターゼペアの開発は、脊椎動物細胞における異なるコドンを用いて、複数の非天然アミノ酸の同時取り込みを可能にし得る。
【００９９】
直交ｔＲＮＡおよび直交アミノアシル−ｔＲＮＡは、当該分野で公知である。例えば、ＷＯ２００８／０３０６１２、ＷＯ２００８／０３０６１４、ＷＯ２００８／０３０６１３、ＷＯ２００６／０６８８０２、ＷＯ２００７／０２１２９７、ＷＯ２００７／０７０６５９、ＵＳＰＮ８，４２０，７９２、ＵＳＰＮ９，１３３，４９５；ＵＳＰＮ７，７３６，８７２；ＵＳＰＮ７，８４６，６８９；ＵＳＰＮ７，８８３，８６６；ＵＳＰＮ７，８３８，２６５；ＵＳＰＮ７，８２９，３１０；ＵＳＰＮ７，８５８，３４４；ＵＳＰＮ７，６３２，８２３；およびＵＳＰＮ９，５８６，９８８を参照のこと、各々は参照により本明細書に組み込まれる。Ｏ−ＲＳを製造するためのさらなる詳細は、「Methods and compositions for the production of orthogonal tRNA-aminoacyltRNA synthetase pairs」と題するＷＯ２００２／０８６０７５に見出すことができる。Hamano-Takaku et al, (2000) A mutant Escherichia coli Tyrosyl-tRNA Synthetase Utilizes the Unnatural Amino Acid Azatyrosine More Efficiently than Tyrosine, Journal of Biological Chemistry, 275(51):40324-40328; Kiga et al (2002), An engineered Escherichia coli tyrosyl-tRNA synthetase for site-specific incorporation of an unnatural amino acid into proteins in vertebrate translation and its application in a wheat germ cell-free system, PNAS 99(15): 9715-9723;およびFrancklyn et al, (2002), Aminoacyl-tRNA synthetases: Versatile players in the changing theater of translation; RNA, 8:1363-1372も参照のこと。
【０１００】
脊椎動物細胞における直交Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳペアは非効率的な交差種アミノアシル化を有する異なる生物から、ペア、例えば、ナンセンスサプレッサーペアを移入することによって産生され得る。Ｏ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳは脊椎動物細胞で効率的に発現およびプロセシングされ、Ｏ−ｔＲＮＡは核から細胞質に効率的に輸送される。例えば、そのようなペアの１つは、大腸菌由来のチロシルｔＲＮＡシンセターゼ／ｔＲＮＡＣＵＡペアである（例えば、H. M. Goodman, et al, (1968), Nature 217:1019-24;およびD. G. Barker, et al, (1982), FEBS Letters 150:419-23を参照のこと）。大腸菌チロシルｔＲＮＡシンセターゼは両者がS. cerevisiaeの細胞質に発現すると、その同族の大腸菌ｔＲＮＡＣＵＡを効率的にアミノアシル化するが、S. cerevisiaeｔＲＮＡをアミノアシル化しない。例えば、H. Edwards, & P. Schimmel, (1990), Molecular & Cellular Biology 10:1633-41;およびH. Edwards, et al, (1991), PNAS United States of America 88:1153-6を参照のこと。さらに、大腸菌のチロシルｔＲＮＡＣＵＡはS. cerevisiaeのアミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ（例えば、 V. Trezeguet, et al, (1991), Molecular & Cellular Biology 11:2744-51を参照のこと）の基質としては不十分であるが、S. cerevisiaeのタンパク質翻訳においては効率的に機能している。例えば、H. Edwards, & P. Schimmel, (1990) Molecular & Cellular Biology 10:1633-41; H. Edwards, et al, (1991), PNAS United States of America 88:1153-6;およびV. Trezeguet, et al, (1991), Molecular & Cellular Biology 11:2744-51を参照のこと。さらに、大腸菌ＴｙｒＲＳは、ｔＲＮＡに連結された非天然アミノ酸を校正する編集メカニズムを有さない。
【０１０１】
〔非天然アミノ酸〕
非天然または人工アミノ酸の組み込みは、サイズ、酸性度、求核性、水素結合、疎水性、プロテアーゼ標的部位の接近性（accessibility）、部分への標的（例えば、タンパク質アレイについて）等を変化させることを含む、タンパク質の構造および／または機能の変化を調整するために行われ得る。非天然アミノ酸を含むタンパク質は、増強された、または全く新しい触媒特性または物理特性を有し得る。例えば、以下の特性：毒性、生体分布、構造特性、分光特性、化学的および／または光化学的特性、触媒能力、半減期（例えば、血清半減期）、他の分子と反応する能力（例えば、共有結合的または非共有結合的）等が、タンパク質へのアノン天然（anon-natural）アミノ酸の包含によって任意に改変される。少なくとも１つの非天然アミノ酸を含むタンパク質を含む組成物は、例えば、新規な治療薬、診断薬、触媒酵素、工業用酵素、結合タンパク質（例えば、抗体）、ならびに例えば、タンパク質の構造および機能の研究に有用である。例えば、Dougherty, (2000) Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure and Function, Current Opinion in Chemical Biology, 4:645-652を参照のこと。
【０１０２】
本明細書中に記載される方法および組成物において用いられる非天然アミノ酸は以下の４つの特性のうちの少なくとも１つを有する：（１）非天然アミノ酸の側鎖上の少なくとも１つの官能基が２０の共通の遺伝的にコードされるアミノ酸（すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリン）の化学反応性に直交する、または非天然アミノ酸を含むポリペプチド中に存在する天然に存在するアミノ酸の化学反応性に少なくとも直交する、少なくとも１つの特徴および／もしくは活性および／もしくは反応性を有する；（２）導入された非天然アミノ酸は、２０の共通の遺伝的にコードされたアミノ酸に対して実質的に化学的に不活性である；（３）非天然アミノ酸は好ましくは天然に存在するアミノ酸と同等の安定性で、または典型的な生理学的条件下で、ポリペプチドに安定的に組み込むことができ、さらに好ましくは、そのような組み込みはｉｎ  ｖｉｖｏ系を介して行うことができる；ならびに（４）非天然アミノ酸は好ましくは非天然アミノ酸を含むポリペプチドの生物学的特性を破壊しない条件下で（もちろん、このような生物学的特性の破壊が修飾／変換の目的である場合を除いて）、または変換が約４〜約８のｐＨの水溶液条件下で起こり得るか、または非天然アミノ酸上の反応性部位が求電子性部位である場合に、試薬と反応することによってオキシム官能基またはオキシム基に変換され得る官能基を含む。任意の数の非天然アミノ酸をポリペプチドに導入することができる。非天然アミノ酸はまた、保護されたもしくはマスクされたオキシム、または保護されたもしくはマスクされた基を含み得、これは、保護された基の脱保護またはマスクされた基のアンマスキングの後にオキシム基に変換され得る。非天然アミノ酸はまた、保護されたまたはマスクされたカルボニルまたはジカルボニル基を含み得、これは、保護された基の脱保護またはマスクされた基のアンマスキング後にカルボニルまたはジカルボニル基に変換され得、そしてそれによってヒドロキシルアミンまたはオキシムと反応してオキシム基を形成するために利用可能である。
【０１０３】
本明細書中に記載される方法および組成物において用いられ得る非天然アミノ酸には新規官能基を有するアミノ酸を含むアミノ酸、他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用するアミノ酸、糖置換セリン等のグリコシル化アミノ酸、他の炭水化物修飾アミノ酸、ケト含有アミノ酸、アルデヒド含有アミノ酸、ポリエチレングリコールまたは他のポリエーテルを含むアミノ酸、重原子置換アミノ酸、化学的に切断可能および／または光切断可能なアミノ酸、天然アミノ酸と比較して伸長した側鎖を有するアミノ酸（ポリエーテルまたは長鎖炭化水素（約５よりも多いまたは約１０よりも多い炭素を含む炭化水素を含むが、これらに限定されない）を含むが、これらに限定されない）、炭素結合糖含有アミノ酸、酸化還元活性アミノ酸、アミノチオ酸含有アミノ酸、ならびに１つ以上の毒性部分を含むアミノ酸が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、非天然アミノ酸は糖部分を含む。
そのようなアミノ酸の例には、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−ガラクトサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−トレオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−アスパラギンおよびＯ−マンノサミニル−Ｌ−セリンが含まれる。そのようなアミノ酸の例はまた、アミノ酸と糖との間の天然に存在するＮ−またはＯ−結合が、天然に一般に見出されない共有結合（アルケン、オキシム、チオエーテル、アミド等を含むが、これらに限定されない）によって置換される例を含む。このようなアミノ酸の例には、２−デオキシ−グルコース、２−デオキシガラクトース等の天然に存在するタンパク質に一般に見出されない糖類も含まれる。
【０１０５】
人工アミノ酸の具体例としてはｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチル−フェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、Ｌ−Ｄｏｐａ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ヨード−フェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０６】
非天然アミノ酸のこのようなポリペプチドへの組み込みを介してポリペプチドに組み込まれる化学部分は、ポリペプチドの種々の利点および操作を提供する。例えば、カルボニルまたはジカルボニル官能基（ケトまたはアルデヒド官能基を含む）の特有の反応度は、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの多数のヒドラジンまたはヒドロキシルアミン含有試薬のいずれかによるタンパク質の選択的修飾を可能にする。重原子非天然アミノ酸は、例えば、ｘ線構造データを位相合わせするために有用であり得る。非天然アミノ酸を用いた重原子の部位特異的導入はまた、重原子の位置を選択するときの選択性および柔軟性を提供する。光反応性非天然アミノ酸（ベンゾフェノンおよびアリールアジド（フェニルアジドを含むが、これに限定されない）側鎖を有するアミノ酸を含むが、これらに限定されない）は例えば、ポリペプチドの効率的なｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｒｔｏ光架橋を可能にする。光反応性非天然アミノ酸の例としては、ｐ−アジド−フェニルアラニンおよびｐ−ベンゾイル−フェニルアラニンが挙げられるが、これらに限定されない。次いで、光反応性非天然アミノ酸を有するポリペプチドは、光反応性基の励起によって架橋され得、時間的制御を提供する。非限定的な例において、非天然アミノのメチル基は核磁気共鳴および振動分光法の使用を含むがこれらに限定されない、局所の構造および動力学のプローブとして、メチル基を含むがこれらに限定されない同位体標識で置換され得る。
【０１０７】
真核細胞による非天然アミノ酸の取り込みは、非天然アミノ酸（ポリペプチドまたはタンパク質への取り込みを含むが、これらに限定されない）を設計および選択する場合に典型的に考慮される１つの問題である。例えば、α−アミノ酸の高い電荷密度は、これらの化合物が細胞透過性である可能性が低いことを示唆する。天然アミノ酸は、タンパク質ベースの輸送系の収集を介して真核細胞に取り込まれる。非天然アミノ酸がもしあれば、細胞によって取り込まれるかを評価する迅速なスクリーニングを行うことができる。例えば、例えばその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００４／１９８６３７号、名称「Protein Arrays」における毒性アッセイおよびLiu, D.R. & Schultz, P.G. (1999) Progress toward the evolution of an organism with an expanded genetic code. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 96:4780-4785を参照のこと。取り込みは種々のアッセイで容易に分析されるが、細胞取り込み経路に従い得る非天然アミノ酸を設計することの代替は生合成経路を提供して、ｉｎ  ｖｉｖｏでアミノ酸を作製することである。
【０１０８】
典型的には本明細書に記載されるような細胞取り込みを介して産生される非天然アミノ酸が効率的なタンパク質生合成に十分な濃度で産生され、これには他のアミノ酸の濃度または排出細胞資源に影響を及ぼす程度ではないが、天然細胞量が含まれるが、これに限定されない。このようにして産生される典型的な濃度は、約１０ｍＭ〜約０．０５ｍＭである。
【０１０９】
多くの生合成経路が、アミノ酸および他の化合物の産生のための細胞に既に存在する。特定の非天然アミノ酸のための生合成方法は、天然（細胞を含むが、これに限定されない）に存在し得ないが、本明細書に記載される方法および組成物はそのような方法を提供する。例えば、非天然アミノ酸のための生合成経路は、新しい酵素を添加するか、または既存の宿主細胞経路を改変することによって、宿主細胞において作製され得る。さらなる新しい酵素には、天然に存在する酵素または人工的に進化した酵素が含まれる。例えば、ｐ−アミノフェニルアラニンの生合成（「In vivo incorporation of unnatural amino acids」と題するＷＯ２００２／０８５９２３の実施例に提示されるように）は、他の生物由来の公知の酵素の組み合わせの添加に依存する。これらの酵素の遺伝子は、遺伝子を含むプラスミドで細胞を形質転換することによって真核細胞に導入することができる。遺伝子は、細胞中で発現される場合、所望の化合物を合成するための酵素経路を提供する。任意に添加される酵素のタイプの例は、本明細書中に提供される。さらなる酵素配列は例えば、Ｇｅｎｂａｎｋに見られる。人工的に進化した酵素は、同じ様式で細胞に添加され得る。このようにして、細胞の細胞機構およびリソースは、非天然アミノ酸を産生するように操作される。
【０１１０】
生合成経路における使用のための、または既存の経路の進化のための新規酵素を産生するために、種々の方法が利用可能である。例えば、再帰的組み換え（Ｍａｘｙｇｅｎ、Ｉｎｃ．（ｍａｘｙｇｅｎ．ｃｏｍのワールドワイドウェブ上で入手可能）によって開発されたものを含むが、これに限定されない）を用いて、新規酵素および経路を開発することができる。例えば、Stemmer (1994), Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling, Nature 370(4):389-391;およびStemmer, (1994), DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91:10747-10751を参照のこと。同様に、Ｇｅｎｅｎｃｏｒによって開発されたＤｅｓｉｇｎＰａｔｈ（商標）（Ｇｅｎｃｏｒ．ｃｏｍのワールドワイドウェブ上で入手可能）は代謝経路操作（細胞中に非天然アミノ酸を作製するための経路を操作することを含むが、これに限定されない）のために任意に用いられる。この技術は、新しい遺伝子（機能的ゲノム学、分子進化および設計によって同定されたものを含むが、これらに限定されない）の組み合わせを用いて、宿主生物における既存の経路を再構築する。Ｄｉｖｅｒｓａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ｄｉｖｅｒｓａ．ｃｏｍのワールドワイドウェブ上で入手可能）はまた、遺伝子および遺伝子経路のライブラリーを迅速にスクリーニングするための技術（非天然アミノ酸を生合成的に産生するための新たな経路を作製することを含むが、これに限定されない）を提供する。
【０１１１】
典型的には本明細書に記載されるような操作された生合成経路を用いて産生される非天然アミノ酸が効率的なタンパク質生合成に十分な濃度（他のアミノ酸の濃度または排出細胞資源に影響を及ぼす程度ではないが、天然の細胞量を含むが、これに限定されない）で産生される。このようにしてｉｎ  ｖｉｖｏで産生される典型的な濃度は、約１０ｍＭ〜約０．０５ｍＭである。一旦、細胞が特定の経路に所望される酵素を産生するために用いられる遺伝子を含むプラスミドで形質転換され、そして非天然アミノ酸が作製されると、ｉｎ  ｖｉｖｏ選択は、必要に応じて、リボソームタンパク質合成および細胞増殖の両方のための非天然アミノ酸の産生をさらに最適化するために用いられる。本明細書に記載される非天然アミノ酸は、当技術分野に記載される方法論を用いて、または本明細書に記載される技術を用いて、またはこれらの組み合わせによって合成されてもよい。
【０１１２】
〔産物の特徴付け〕
生物学的治療剤の包括的な特徴付けは、規制当局によって設定された安全性基準を満たし、タンパク質の薬物の有効性を保証するのを助けるために必要である。医薬品の開発および製造のすべての段階を通して、生物薬剤学的な特徴付けが必要である。従って、産物の品質および生産性がクローンおよび細胞培養条件の両方に依存することが多いので、適切なクローンが選択されることを確実にするために、細胞株の開発、操作、および細胞培養プロセスの開発の各段階の間、産物の品質をモニターすることが最重要である。クローン選択プロセスの間、クローン特異的である可能性が高い産物の品質パラメーターに重点が置かれる。これらのパラメーターは、例えば、グリコシル化およびタンパク質分解性クリッピングのような酵素プロセス、ならびに突然変異、フレームシフト、およびスプライスのような遺伝的問題を含むが、これらに限定されない。また、生物学的活性に寄与することが知られている分子パラメーターにも重点が置かれる。例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）はフコシル化に依存し、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）はガラクトシル化に依存する。酸化または脱アミド化のような化学修飾の程度においてクローン間で観察される差異は、精製プロセスの最適化によって、または細胞培養プロセスパラメーターの調節によって、狭められ得るかまたは排除され得、そしてそれほど有意ではない。（Lewis et al, 2010）。
【０１１３】
本発明の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ゲノム編集および単細胞クローニングが、生物学的治療剤を発現する細胞または細胞株の産物の品質に及ぼす影響を試験する。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９操作細胞のクローン選択の間に評価される産物の品質属性は、分子完全性、凝集、グリコシル化、および電荷不均一性を含み得るが、これらに限定されない。分子完全性はクローン依存性であり、遺伝的問題またはタンパク質分解性クリッピングによって引き起こされ得る。当業者に周知の種々の方法論、技術およびアッセイを用いて、アミノ酸配列突然変異または切断抗体を回避するための基準を用いて分子の完全性を評価することができる。このような方法論、技術およびアッセイは、ｃＤＮＡ配列決定、ペプチドマッピング、ＣＥ−ＳＤＳまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥを含み得るが、これらに限定されない。凝集は、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて測定することができる。この分析の基準は、免疫原性であり得る高レベルの凝集を回避することである。いくつかのレベルの凝集は、細胞培養プロセスの最適化によって減少され得るか、または精製プロセスの最適化によって除去され得る。グリコシル化は、細胞株に高度に依存する別の重要な分子的および翻訳後属性である。当技術分野で周知のＨＰＬＣまたはＣＥベースのグリカンアッセイは、高レベルの異常なグリコシル化形態を回避することを目的として、クローン選択段階でのグリコシル化評価に一般に用いられる。化学修飾により起こり得る電荷の不均一性は、細胞培養プロセスに非常に依存し、従ってクローン選択段階の間、あまり重要でない役割を有する。従って、本発明の実施形態において、本開示は例えば、抗Ｈｅｒ２、抗ＣＤ７０、または抗ＰＳＭＡ発現細胞または細胞株を含むがこれらに限定されない、本発明の生物学的治療剤を発現する細胞または細胞株のクローン特異的な産物の品質パラメーターを決定するための方法、技術およびアッセイを提供する。
【０１１４】
インタクト質量分析（ＭＳ）は、タンパク質の正確な質量およびそのアイソフォームの相対的存在量に関する情報を提供する。分子ふるいクロマトグラフィーとしても知られるサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、溶液中の分子がこれらのサイズ、場合によっては分子量によって分離されるクロマトグラフィー法である。本発明において、作製された、操作されたクローンおよび親細胞株について、一次アミノ酸配列がｍＡｂの同定を確認するときにｃＤＮＡ配列から推定されるものと同じであることを実証するときにＭＳを利用した。改変され、そして作製されたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の純度および製造の整合性の決定のためにもＳＥＣを利用した。
【０１１５】
〔キット〕
キットはまた、本発明の特徴であり、ここで、キットは、本発明の成分のいずれかを含む１つ以上の容器を含む。このキットは、直交アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）、および／または直交サプレッサーｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）、および／またはセレクターコドンを含有する目的の遺伝子を含むかまたはコードする、操作された核酸分子またはポリヌクレオチド配列の１つ以上を含み得る。キットは、少なくとも１つの人工アミノ酸を含み得る。別の実施形態では、キットが直交アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）、直交サプレッサーｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）、またはセレクターコドンを含有する目的の遺伝子と一緒に、または別々に、細胞または株を含み得る。本明細書に開示される成分、材料のいずれも、１つ以上の容器内で別々に、または一緒に提供することができる。別の実施形態において、キットは、目的のポリペプチドまたはタンパク質を産生するための説明資料をさらに含む。
【０１１６】
〔実施例〕
本明細書に記述された実施例および実施形態は説明のみを目的とするものであり、これらに関する様々な改変または変更は、当業者に対して示唆され、本出願の精神および範囲、ならびに添付された特許請求の範囲内に含まれるべきであると理解される。
【０１１７】
（実施例１：薬剤開発産業においてプラットフォーム細胞株エンジニアリングを利用する方策：発見から製造まで）
産業の観点において、プラットフォーム細胞株開発は、段階的に適切な材料を提供することによって薬剤開発のあらゆる段階を支援するだけでなく、産物を臨床および商業化に導入する前に、安定で十分に特徴付けられた産生細胞株を生成する（図１）。薬剤開発のあらゆる段階を効率的に支援するために、図１に示すように、一過性の安定な大量のプールを含む材料を提供するための複数の方法を開発し、安定な細胞株を開発した。抗体候補分子の選択のために、一過性発現を利用して少量の産物を迅速に提供した。安定な大量のプールは、８週間でＩＮＤ許可毒性試験（１００〜２００ｇ）までの開発可能性試験（精製、調合、分析法開発）のための大量の材料を提供する代替法である。一旦、リード分子が決定されると、安定な細胞株は、６ヶ月で、１．５ｇ／Ｌまでの力価で生成された。これは、臨床試験および潜在的な商業化のための支持を与える。
【０１１８】
（実施例２：高産生細胞株の開発においてプラットフォーム細胞株を利用する一般的な手順）
図２は、安定な細胞株の開発のためのフローチャートを示す。本発明者らはこの戦略を用いて、産業での標準的製造に拡張可能で、高い生産性の、安定な、十分に特徴付けられた生産細胞株を生成し、治療薬の所望の安全性および有効性の特性を維持しながら、臨床試験および商業化を支援した。目的の遺伝子（ＧＯＩ）および選択可能なマーカーを有する哺乳動物発現ベクターを、操作されたＣＨＯプラットフォーム細胞株にトランスフェクトして、９６ウェル中にミニプール（ＭＰ）を生成した。選択およびスクリーニング後、ＦＡＣＳを用いてウェル当たり単細胞として最良のＭＰをプレートし、続いて高分解能イメージングを行ってクローン細胞株を誘導した。単細胞由来の細胞株をスクリーニングし、最良のクローンをプロセスの開発のために細胞培養群に移した。臨床材料を製造するための最終クローン選択は、増殖、生産性およびＰＱに基づいた。全ＣＬＤプロセスは６ヶ月を要し、細胞特定生産性は１日当たり細胞当たり２０〜３０ピコグラムであった。１２，０００Ｌのバイオリアクター製造を支持するために１０週間よりも長く安定な、細胞株および流加プロセスは、現在進行中の臨床試験を支持するために、これまでのところ２０００Ｌまでにスケールアップすることができる。
【０１１９】
（実施例３：高産生細胞株開発の最適化）
ＦＡＣＳ依存性単細胞沈着（図３Ａ）、ＣＲＩＳＰＲノックアウト手順（図３Ｂ）、および細胞株開発プロセス最適化（図３Ｃ）等のいくつかの態様から、高産生細胞株開発の最適化を達成することができる。
【０１２０】
調節ガイダンス（ＩＣＨ  Ｑ５Ｄ）は細胞株の開発の間に、「単細胞前駆体から」細胞基質をクローニングすることを指示する。過去数年の間に、クローン性の高い保証を提供するという期待が、ＦＤＡおよび産業界によって確立されてきた（Kennett, 2014; Novak, 2017; Welch, 2017）。ＦＤＡは、十分に低い播種密度（＜０．５細胞／ウェル）での２ラウンドの限界希釈クローニング（ＬＤＣ）が、細胞株がクローン性である許容可能な確率を提供することを推奨している。さらに最近では、イメージング技術の使用等、十分な裏付けとなる妥当性を有するＦＡＣＳまたはＬＤＣによる１ラウンドのクローニングが検証された方法を用いる場合、クローン性の許容可能な保証を提供している。このように、本発明者らは高分解能イメージングと組み合わせたＦＡＣＳ単細胞沈着（ＦＡＣＳ  ＳＣＤ）を、細胞株開発プロセスにおけるクローニング工程の１ラウンドとして改変し、検証して、タイムラインを短縮し、クローン性を保証するための規制要件を満たした。
【０１２１】
ここに示すように（図３Ａ）、従来の限界希釈クローニング（ＬＤＣ）と比較して、ＦＡＣＳ  ＳＣＤは、匹敵する沈着および増殖速度を生じた。しかしながら、ＦＡＣＳアプローチを用いたモノクローナル増殖を単離する効率（単細胞由来のコロニーを含むウェルの数をウェルの総数で割った比率）はＬＤＣを用いたものの１．５倍（４９％対３２％）であり、イメージングおよびスクリーニングにおける有意な時間およびリソースを節約する。各ウェルについての徹底的な画像分析と共に、ＦＡＣＳ計測および遠心分離ｇ力変動における広範な最適化を実施して、このアプローチを検証した。単細胞由来コロニーのモノクローナル性の確率は＞９９．５％であることが観察された。
【０１２２】
ＣＲＩＳＲＲ−ｃａｓ９ゲノム編集技術を用いた産生細胞株の遺伝子工学は、所望の産物品質を維持しながら、細胞増殖および生産性を改善するために、遺伝子のパネルを標的とするために試験されている。ＣＲＩＳＰＲノックアウト手順を図３Ｂに示す。ウェブベースの標的発見ツール、ＣＲＩＳＰｙを用いて、好ましくはＣＨＯ−Ｋ１細胞中のゼロオフ標的を有する初期のエキソン中のｇＲＮＡ標的配列を迅速に同定した。ｇＲＮＡを、ＣＨＯコドン最適化バージョンのＣａｓ９と共発現する哺乳動物発現ベクターｐＧＮＣＶにクローニングした。産生細胞株をベクターｐＧＮＣＶでトランスフェクションして細胞のプールを生成し、続いてクローニングして遺伝子ノックアウトした単細胞単離物を同定した。複数のプロジェクトの複合結果からのインデル（挿入／欠失）頻度は、細胞および単細胞分離株のプールについて、それぞれ３０〜９０％および５０〜８０％であった。ウェスタンブロットは、ノックアウト効率がＤＮＡ配列決定について５０〜９０％であることを再確認し、ノックアウト単細胞単離物を検証した。ノックアウト単細胞クローンを、生産性、増殖、アポトーシスアッセイおよび産物品質についてさらなる評価を行い、ｃＧＭＰ製造のための産生クローンを選択した。ノックアウトのために用いた検証された標的を、産生細胞株を用いて試験した。これは、生産性および増殖を評価するために有益であることが証明され、ＣＲＩＳＰＲを用いてプラットフォーム細胞株宿主における破壊に適用可能であり、目的の将来の遺伝子のために高産生細胞株を単離する効率を増加させた。
【０１２３】
細胞株開発プロセスはまた、プラットフォーム細胞株開発と共に最適化されている。第１のプラットフォーム細胞株を宿主として用いると、力価０．５〜１ｇ／Ｌを産生する産生細胞株を生成するのに３〜４工程（または９ヶ月〜１２ヶ月）を要する（図３Ｃ）。現在の細胞株の開発プロセスは、（図２）に示すようにプラットフォーム細胞株の改善および１工程クローニングに起因して、２工程または６ヶ月に短縮されている。
【０１２４】
（実施例４：プラットフォーム細胞株は、培養物中で過剰なアポトーシスを示す）
Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖアッセイを用いて、ＣＨＯ−Ｓ細胞およびパラ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンに特有のｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼの遺伝的に組み込まれた直交対を含むプラットフォーム細胞株４Ｅ２の生存率を評価した。図４に示すように、ＣＨＯ−Ｓ細胞（生存率は９６％）と比較して、４Ｅ２は過剰なアポトーシスを示した（生存率は８５％）。観察はｔＲＮＡシンセターゼおよびｔＲＮＡ対（例えば、非天然アミノ酸パラアセチルアラニン、ｐＡＦに特異的）を組み込んでいる４Ｅ２細胞が、その対応する細胞、ＣＨＯ−Ｓ細胞よりも過剰なアポトーシスを示したことを示す。
【０１２５】
（実施例５：ＢＡＸ−およびＢＡＫ−ＣＲＩＳＰＲ構築物の設計および調製）
ＣＲＩＳＰＲ構築物はＢＡＸまたはＢＡＫ遺伝子中の標的部位を認識し、トランスフェクション後にＣＨＯ細胞中で二本鎖切断を行うように設計した。例示的な設計を図５、図６および図７に示す。
【０１２６】
遺伝子のノックアウトは、連続的または同時の手順を用いて行うことができる。ＢＡＸおよびＢＡＫの二重ノックアウトはまた、連続ノックアウト手順によって達成され得る。一般に、第１の工程は、抗ＨＥＲ２発現細胞株上に３つのＢＡＸ標的ｇＲＮＡ構築物を適用することである。同時ノックアウト手順において用いた同様の産生後、ＢＡＸノックアウトを有する細胞株を単離する。この細胞株を用いて、２つのＢＡＫ標的化ｇＲＮＡ構築物を適用して、ＢＡＫノックアウトを達成する。ゲノムＤＮＡ配列決定による検証の後、ＢＡＸおよびＢＡＫダブルノックアウト細胞株は、このような連続手順によって達成されていることを確認する。
【０１２７】
ＣＨＯ細胞における標的ＢＡＸ遺伝子のＣＲＩＳＰＲ  ｇＲＮＡ設計を図５に示す。示されるように、ＣＨＯ細胞におけるＢＡＸ遺伝子を標的とする３つのｇＲＮＡ部位を、ＣＨＯ−Ｋ１ゲノムに特有のオンラインＣＲＩＳＰＲ  ｇＲＮＡ設計ツールを用いて設計した（staff.biosustain.dtu.dk/laeb/crispy/のワールドワイドウェブを参照のこと）。ＢＡＸ遺伝子、エキソン１およびエキソン２のゲノムＤＮＡ配列を灰色の陰影で示す。ＢＡＸの他の配列は平文で示されている。ＰＣＲ配列決定において用いたプライマーを、フォワードプライマーおよびリバースプライマーとして、それぞれ配列の始めおよび終わりに示す。表１に示すように、３つのＢＡＸ部位（それぞれが１９ヌクレオチド長の配列を有し、図７に示すように、切り開かれた、２つのくっつく末端を有するプラスミドｐＧＣＮＶの性質のために、設計中に−ＮＧＧ  ＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）配列が省略される）は以下の通りである：部位−Ｉ（ＡＧＧＣＡＣＴＣＧＣＴＣＡＡＣＴＴＣＧ）（配列番号１）、部位−ＩＩ（ＴＧＡＧＴＧＴＧＡＣＣＧＧＣＴＧＴＴＧ）（配列番号２）および部位−ＩＩＩ（ＴＴＴＣＡＴＣＣＡＴＧＴＡＴＣＧＡＧＣＴ）（配列番号３）。
【０１２８】
図６に示すように、ＣＲＩＳＰＲを用いて、ＣＨＯ細胞中の標的ＢＡＫ遺伝子のｇＲＮＡを設計した。図６は、２つのｇＲＮＡ配列に注釈を付けたＣＨＯ細胞におけるＢＡＫ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列を示す。ＢＡＫ遺伝子、エキソン２およびエキソン３のゲノムＤＮＡ配列を灰色の陰影で示す。ＢＡＫの他の配列は平文で示されている。ＰＣＲ配列決定において用いたプライマーを、フォワードプライマーおよびリバースプライマーとして、それぞれ配列の始めおよび終わりに示す。表１に示す３つのＢＡＫ部位は以下の通りである：
（配列番号４）  ＢＡＫ−ＩＧＡＡＣＡＡＡＴＴＧＴＣＣＡＴＣＴＣＧ  エキソン２、
（配列番号５）  ＢＡＫ−ＩＩＡＴＧＣＴＧＴＡＡＧＡＡＣＧＧＧＡＧＴ  エキソン３、
（配列番号６）  ＢＡＫ−ＩＩＩＧＡＡＧＣＣＧＧＴＣＡＡＡＣＣＡＣＧＴ  エキソン３。
【０１２９】
ＢＡＸまたはＢＡＫノックアウト実験において用いたＣＲＩＳＰＲプラスミドはまた、市販のベクター、Ｇｅｎｅａｒｔ  ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼベクター（ｐＧＣＮＶ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、図７に示すように設計した。完全な形態のｐＧＣＮＶプラスミドを、オリゴ二重鎖のためのスロットを含む切り開かれたｐＧＣＮＶベクターにオリゴ二重鎖を挿入することによって調製し、そして遺伝子部位を個別に標的化するために特定の１９ヌクレオチド長のｇＲＮＡ配列を用いて設計した（本明細書の他の箇所の表１を参照のこと）。
【０１３０】
ｐＧＣＮＶに挿入することができるオリゴ二重鎖を形成するために、５つの（５）ペアのオリゴを以下の表３に開示するように合成した。
【０１３１】
【表３】
2020522247.tif 000007
二本鎖オリゴヌクレオチドを生成するために、各オリゴペアを、オリゴヌクレオチドアニーリング緩衝液中、９５℃で４分間、５０ｕＭの最終濃度でインキュベートした後、２５℃まで５〜１０分間冷却する。１０倍希釈（５ｕＭ）後、オリゴヌクレオチド二重鎖をライゲーション手順に用いることができる。ライゲーションは、Ｒｏｃｈｅ  ｑｕｉｃｋ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて行うことができる。２１ｕｌの反応物中、３ｕｌのｐＧＣＮＶベクター、１ｕｌのオリゴ二重鎖、２ｕｌのＤＮＡ希釈緩衝液、４ｕｌの水、１０ｕｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液および１ｕｌのＴ４リガーゼを含んでいる。反応混合物を室温で５分間インキュベートした。３ｕｌのライゲーション混合物を大腸菌の形質転換に用いて、陽性クローンをスクリーニングすることができる。
【０１３２】
（実施例６：本発明に用いられる非天然アミノ酸の例）
本発明は、本明細書中の他の箇所で議論される直交アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ／転移ＲＮＡペアを用いる、目的の遺伝子における非カノニカルまたは非天然アミノ酸の部位特異的組み込みを包含する。図８は、用いることができる非天然アミノ酸の代表的な数を提供する。例示的な様式では、１つのそのような非天然アミノ酸パラ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン（ｐＡＦ）を培養培地に添加して、ｐＡＦの部位特異的組み込みを伴う、例えばモノクローナル抗体を含む生物学的治療剤等の、目的の完全に集合した遺伝子の産生を開始した。
【０１３３】
（実施例７：ＢＡＸ／ＢＡＫ欠失抗ＨＥＲ２発現細胞株の生成および分析）
ＣＲＩＳＰＲ技術を用いて、ＢＡＸおよびＢＡＫの同時切除を行った。抗ＨＥＲ２発現細胞株Ｌ０８２上の３つのＢＡＸ標的ｇＲＮＡ構築物および２つのＢＡＫ標的ｇＲＮＡ構築物を用いて、一過性トランスフェクションを行った。プラスミドのトランスフェクションをエレクトロポレーションで行った。エレクトロポレーションの間、６００万個の細胞を１００ｕｌのエレクトロポレーション水溶液中で２ｕｇのＤＮＡプラスミドと混合した。プログラムＵ−０２３を用いて細胞をＡｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ＩＩ（Ｌｏｎｚａ）にトランスフェクトし、０．５ｍｌの温培地中に回収した。実施例３、図３Ｂに開示されるように、ノックアウト効率を測定するために、トランスフェクトされた細胞のプールについてＳｕｒｖｅｙｏｒを行った。３つのＢＡＸ標的ｇＲＮＡ構築物を２つのＢＡＫ標的ｇＲＮＡ構築物と同時にトランスフェクトした７日後、細胞を、限界希釈法を用いて、９６ウェルプレート中に０．５細胞／ウェルの播種密度で単クローンにサブクローニングした。９６ウェルプレート中の各単細胞を約２〜３週間増殖させて、さらなる遺伝子分析に用いるために十分な数の細胞を作製した。単細胞由来クローンを選択し、そして生産性、増殖、および標的ＤＮＡ配列決定による遺伝子型決定について、９６ウェル、２４ウェルおよび２４ディープウェルによりスクリーニングした。
【０１３４】
（実施例８：ＢＡＸおよびＢＡＫ欠失抗ＨＥＲ２発現クローンのＤＮＡ分析）
ＢＡＸおよびＢＡＫ不活性ＣＨＯ細胞を作製し、遺伝子レベルで分析した。ＢＡＫ部位を標的とする３つの異なるｇＲＮＡ配列をコードする３つのプラスミドを、ｐＡＦ−ＲＳおよびｐＡＦ−ｔＲＮＡ＋抗ＨＥＲ２遺伝子またはその断片を有するように操作されたＣＨＯ細胞由来の安定な細胞株にコトランスフェクションした。トランスフェクションの７２時間後、ゲノムＤＮＡを単離し、ＢＡＫ遺伝子座の一部を、オリゴＫ−Ｉ−ＩＩ−ＦおよびＫ−Ｉ−ＩＩ−Ｒを用いてＰＣＲ増幅した（表２；５’ＣＡＧＡＣＡＧＣＣＴＴＣＴＣＴＴＧＣＴ−３’（配列番号４５）および５’ＡＧＡＧＣＴＣＣＴＧＡＧＡＧＧＣＡＴＧＡ−３’（配列番号４６））。ＰＣＲは、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲマスターミックス（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を用いて行った。条件は以下の通りであった：９５℃で２分間の初期変性の後、９５℃で２０秒間の変性で３０サイクルのＰＣＲを行い、続いて６０℃で３０秒のアニーリングする工程を行い、続いて７２℃で１分間の伸長を行った。３０サイクル後、反応物を７２℃で５分間、次いで４℃で無期限にインキュベートした。ノックアウト効率を評価するために、ＰＣＲ産物をＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイ分析で用いた。Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイ検出は、ＩＤＴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）からのＳｕｒｖｅｙｏｒ突然変異検出キットを用いて行った。加熱したオリゴ混合物の自然冷却手順を模倣するために、サーモサイクラーを用いてヘテロ二重鎖を形成した。ヘテロ二重鎖の形成に以下の手順を用いた：９５℃で１０分間、
続いて９５℃から８５℃への冷却（−２．０℃／ｓ）、８５℃で１分間のインキュベーション；８５℃から７５℃への冷却（−０．３℃／ｓ）、７５℃で１分間のインキュベーション；７５℃から６５℃への冷却（−０．３℃／ｓ）、６５℃で１分間のインキュベーション；６５℃から５５℃への冷却（−０．３℃／ｓ）、５５℃で１分間のインキュベーション；５５℃から４５℃への冷却（−０．３℃／ｓ）、４５℃で１分間のインキュベーション；４５℃から３５℃への冷却（−０．３℃／ｓ）、３５℃で１分間のインキュベーション；３５℃から２５℃への冷却（−０．３℃／ｓ）、２５℃で１分間のインキュベーション；その後無期限に４℃。ヘテロ二重鎖ＤＮＡ（２０ｕｌ）を、１ｕｌのＳｕｒｖｅｙｏｒ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ  Ｓ（２ｕｌ）およびＳｕｒｖｅｙｏｒ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｓ（１ｕｌ）と共に４２℃で６０分間インキュベートした。１０ｕｌの消化サンプルを、１０ｕｌの未消化サンプルと並べて１％アガロースゲル上で泳動した。図９に示すように、実施例３、図３Ｂに開示されるように、ノックアウト効率を測定するために、細胞のトランスフェクションされたプールに対してＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイを行った。ノックアウト効率の分析を、抗ＨＥＲ２発現細胞集団において行った。一番上のバンドが減少し、底部の新しいバンドが出現することは、Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアによる走査画像の濃度分析によって定量化することができる効率を示している。ＣＲＩＳＰＲ  ＫＯの前後の元のバンドの比率を用いてノックアウト効率を測定した。ＢＡＸおよびＢＡＫについてのノックアウト効率はそれぞれ３０％および７０％であり、適切に２１％の計算された二重ノックアウト効率をもたらした。
【０１３５】
９６ウェルプレートを含む単細胞の複製プレートを用いて、ゲノムＤＮＡ単離およびＤＮＡ配列決定を行った。ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ水溶液をゲノムＤＮＡのハイスループット単離に用いた。１５０ｕｌの細胞培養物の上清を培養物から除去した後、１５０ｕｌのＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ水溶液を添加した。室温で１０分間溶解した後、細胞溶解物を新しいマイクロチューブに移し、６５℃で６分間、続いて９８℃で２分間加熱ブロック上で加熱した。
【０１３６】
ゲノムＤＮＡ抽出物をＰＣＲ増幅に用いた。次いで、ＰＣＲ産物を精製し、配列決定した。配列決定の結果を、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩソフトウェア一式中のアラインメントツールを用いて分析した。ＣＨＯｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇでワールドワイドウェブ上で得られた遺伝子（この場合、ＢＡＫ遺伝子）のゲノム配列を、アライメント分析の間の野生型配列として用いた。図１０は、ＣＲＩＳＰＲを用いたＢＡＫノックアウト後の２０個の単細胞クローンのＤＮＡ配列決定結果を示す。一番上のＤＮＡ配列（Ｂａｋ−ＣＨＯ−ｇＤＮＡ１）は、元のＢＡＫ遺伝子のゲノム領域のＤＮＡ配列である。「ＺＡ＿１１２＿Ｋ３２＿ＢａｋＩ−ＩＩ」クローンのみが、元のＢＡＫ遺伝子と同一の配列を有する。示される他の遺伝子は、これらの配列中に欠失または挿入のいずれかを有する。ＢＡＸでも同様の観察が認められた（データは示さず）。
【０１３７】
（実施例９：抗ＨＥＲ２発現クローンにおけるＢＡＸおよびＢＡＫノックアウトのタンパク質分析）
ＢＡＸおよびＢＡＫノックアウト抗ＨＥＲ２発現単細胞由来細胞株を、ウェスタンブロット分析を用いてＢＡＸタンパク質発現について試験した（図１１）。６００万個のＢＡＸ／ＢＡＫ二重ノックアウト細胞株からの溶解物を、１００ｕｌのＲＩＰＡ緩衝液（Ａｂｃａｍ）＋プロテアーゼインヒビター（Ｓｉｇｍａタブレット、Ｓｉｇｍａ）に再懸濁することによって調製した。溶解物を氷上で１時間インキュベートした後、１２，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。タンパク質濃度は、ＢＣＡキット（Ｐｉｅｒｃｅ）によって測定した。２０ｕｇのタンパク質をウェスタンブロットに用いた。異なる細胞株からのタンパク質抽出物を、抗ＢＡＸ抗体（Ａｂｃａｍ）でプローブした。図１１に示すように、ＢＢ１５、ＢＢ１２およびＢＢＳ１９等のＢＡＸ／ＢＡＫ二重ノックアウト細胞株は、検出可能なＢＡＸタンパク質を発現しなかった。対照的に、陽性対照細胞株として、Ｌ０８２は、２１−ＫＤタンパク質である全長ＢＡＸの発現を示した。遺伝子配列決定により遺伝的にＢＡＸ欠失であることが特徴付けられたが、ＵＢＢ３細胞株は残留ＢＡＸを発現したことが認められた。ＢＡＫでも同様の観察が認められた（データは示さず）。
【０１３８】
（実施例１０：アポトーシスは、ＢＡＸ／ＢＡＫ欠失抗ＨＥＲ２発現細胞株において妨げられる）
ＢＡＸ／ＢＡＫ二重ノックアウト細胞株を、アポトーシスに対するこれらの耐性について試験した。アポトーシス耐性の特性を、流加手順の間に評価した。流加バッチ中の１２日目の細胞のＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ染色のフローサイトメトリー分析を行った。ＢＤ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからのＦＩＴＣ  Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖアポトーシス検出キットを用いる標準プロトコルを、製品の推奨条件下で追跡した。細胞は、アポトーシスアッセイの間に４つの段階および／または集団に分けることができる：正常な生存細胞段階（四分円３、Ｑ３）、アポトーシスの初期段階（四分円４、Ｑ４）、アポトーシスの後期段階（四分円２、Ｑ２）、および死細胞段階（四分円１、Ｑ１）。図１２Ａに示すように、ノックアウトしていない正常（対照）Ｌ０８２細胞はＱ４（１１．８％）およびＱ２（４１．８％）に示すように、重度のアポトーシスを示した。対照的に、ＢＡＸ／ＢＡＫ二重ノックアウト細胞株（ＢＢ１５）は、図１２Ｂに示すように、はるかに改善された生存率（Ｑ３、８０．９％）およびアポトーシスに対する耐性（Ｑ４、１３．２％；Ｑ２、３．５％）を示した。従って、アポトーシス細胞は５３％から１７％に減少することが観察された。
【０１３９】
（実施例１１：組み換えタンパク質の産生は、ＢＡＸ／ＢＡＫ欠失抗ＨＥＲ２発現細胞株において増加する）
抗体の産生を、バッチ手順および流加手順の両方で評価した（それぞれ、図１３および１４）。バッチ培養条件下で、非天然アミノ酸ｐＡＦを３日目に培養培地に添加して、ｐＡＦの部位特異的取り込みを伴う完全に集合した抗ＨＥＲ２抗体の産生を開始した。抗アポトーシス工学について予想されるように、ノックアウト細胞の生細胞密度（ＶＣＤ）によって測定されるピーク細胞密度（図１３Ａ）は親細胞よりも２５％高く、そして生産時間（図１３Ｂ）は親細胞について７日から１０日まで延長された。驚くべきことに、ノックアウト細胞の７日目の１日のＱｐ（図１３Ｄ）はおそらく抗アポトーシス工学から生じる維持された細胞活性のために、親細胞よりも５０％改善された。ＢＡＸ／ＢＡＫ二重ノックアウト細胞株は、産生の７日目に親細胞（図１３Ｃ）と比較して力価の１．８倍の増加（２７０ｍｇ／Ｌ対１５０ｍｇ／Ｌ）を示した。
【０１４０】
流加培養条件下（図１４）、図１４Ａに示すようなピーク細胞密度（ＶＣＤ）に基づく増殖の改善の組み合わせ、産生時間（図１４Ｂ）、および細胞特定生産性（図１４Ｄ）では、親細胞株（Ｌ０８２、４５０ｍｇ／Ｌ）と比較して１５００ｍｇ／Ｌの力価を有するＢＢ１５クローンを示すＢＡＸ／ＢＡＫ二重ノックアウト細胞株（図１４Ｃ）について力価の３．３倍の増加をもたらした。
【０１４１】
（実施例１２：ＢＡＸ／ＢＡＫ欠失抗ＨＥＲ２発現細胞株の産物品質）
抗ＨＥＲ２発現親細胞株およびＢＡＸ／ＢＡＫ二重ノックアウト抗ＨＥＲ２発現細胞株から流加産生によって産生された試料を用いて、インタクト質量分析（ＭＳ）およびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって産物の品質を分析した（表４）。操作されたクローンおよび親細胞株の一次アミノ酸配列はｍＡｂの同定を確認するｃＤＮＡ配列から推定されたものと同じであることが、ＭＳによって観察された（データは示さず）。
【０１４２】
【表４】
2020522247.tif 000008
表４に示すように、親およびＢＡＸ／ＢＡＫ二重ノックアウト抗ＨＥＲ２発現細胞株から流加産生によって産生された試料を用いて、産物の品質を分析した。ＭＳによって評価された糖型特性は、ノックアウト前（ＨＥＲ２−Ｌ０８２）およびノックアウト後（ＨＥＲ２−ＢＢ１５）で同等であり、クローン選択段階でのｍＡｂの正規分布範囲内であった。ＳＥＣは高分子量（ＨＭＷ）凝集体および低分子量（ＬＭＷ）分解種の割合が両方とも５％未満であり、操作の前後で同等であることを示し、ノックアウトおよび単細胞クローニング手順が産物の純度に負の影響を与えなかったことを示した。
【０１４３】
（実施例１３：ＢＡＸ／ＢＡＫ欠失抗ＰＳＭＡ発現細胞株の作製）
ＣＲＩＳＲＰ技術を用いたＢＡＸおよびＢＡＫの同時切除を、３つのＢＡＸ標的ｇＲＮＡ構築物および２つのＢＡＫ標的ｇＲＮＡ構築物の抗ＰＳＭＡ発現細胞株ＫＯ１８３へのトランスフェクションによって行った。この実験で用いたＢＡＸおよびＢＡＫ構築物は、上記の実施例に記載され、図５〜７および表１〜３に示すように設計し、調製した。抗ＰＳＭＡに関するノックアウト実験において用いたＣＲＩＳＰＲプラスミドはまた、市販のベクター、Ｇｅｎｅａｒｔ  ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼベクター（ｐＧＣＮＶ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、図７に示すように設計した。ｐＧＣＮＶに挿入されたオリゴ二重鎖は、配列番号８３〜配列番号９２の５つの（５）ペアの合成オリゴを含んでいた。
【０１４４】
ＢＡＸ部位を標的とする３つの異なるｇＲＮＡ配列をコードする３つのプラスミドおよびＢＡＫ部位を標的とする２つの異なるｇＲＮＡ配列をコードする２つのプラスミドを、ｐＡＦ−ＲＳおよびｐＡＦ−ｔＲＮＡ＋抗ＰＳＭＡ遺伝子またはその断片を有するように操作されたＣＨＯ細胞由来の安定な細胞株にコトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後、ゲノムＤＮＡを単離し、そしてＢＡＫ遺伝子座の一部を、実施例８に記載されるように、配列番号４５および４６のオリゴを用いてＰＣＲ増幅した。代わりに配列番号４３および４４のオリゴを用いてＢＡＸ遺伝子座をＰＣＲ増幅した。ＢＡＸおよびＢＡＫ欠失抗ＰＳＭＡ発現クローンのＤＮＡ分析を、上記の実施例に記載のように行った。図１５に示すように、ＣＲＩＳＰＲ編集技術に基づいて、抗ＰＳＭＡ発現細胞集団におけるノックアウト効率を決定するために、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイを行った。ＣＲＩＳＰＲ  ＫＯの前後の元のバンドの比率を用いてノックアウト効率を測定した。ＢａｘおよびＢａｋについてのノックアウト効率はそれぞれ４２％および５３％であり、約２０％の計算された二重ノックアウト効率をもたらした。
【０１４５】
７日後、細胞のトランスフェクションされたプールを、ＦＡＣＳを用いて、１細胞／ウェルの播種密度で４０プレートにサブクローニングした。約１０００の画像確認された単細胞由来クローンを選択し、そして生産性、増殖および標的ＤＮＡ配列決定による遺伝子型決定について、９６ウェル、２４ウェルおよび２４ディープウェルによりスクリーニングした。
【０１４６】
ＢＡＸおよびＢＡＫ欠失抗ＰＳＭＡ発現クローンのＤＮＡ分析を、実施例８に記載のように行った（データは示さず）。最良のＫＯ１８３  ＢＡＸ／ＢＡＫ二重ＫＯクローン（ＫＯ１８３  ＢＢ  ＫＯ）を、２ヶ月の安定性研究による増殖および生産性のさらなる評価のために、およびウェスタンブロッティングによるノックアウト状態の確認のために選択した。
【０１４７】
図１６に示すように、抗ＰＳＭＡ発現クローンにおけるＢＡＸおよびＢＡＫノックアウトのタンパク質分析を、ウェスタンブロットを用いることによって評価した。６００万個のＢＡＸ／ＢＡＫ二重ノックアウト細胞株からの溶解物を、１００ｕｌのＲＩＰＡ緩衝液（Ａｂｃａｍ）＋プロテアーゼインヒビター（Ｓｉｇｍａタブレット；  Ｓｉｇｍａ）に再懸濁することによって調製した。溶解物を氷上で１時間インキュベートした後、１２，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。タンパク質濃度は、ＢＣＡキット（Ｐｉｅｒｃｅ）によって測定した。２０ｕｇのタンパク質をウェスタンブロットに用いた。異なる細胞株からのタンパク質抽出物を、抗ＢＡＸ抗体（Ａｂｃａｍ）でプローブした。
【０１４８】
図１６Ａは、ＣＲＩＳＰＲを用いて操作された抗ＰＳＭＡ発現クローンにおけるＢＡＸノックアウトを示す。図１６Ｂ、ＣＲＩＳＰＲを用いて操作された抗ＰＳＭＡ発現クローンにおけるＢＡＫノックアウト。示された上位１５クローンのうち、５クローンはＢＡＸ／ＢＡＫ二重ノックアウトであった。Ｌ０８２は、野生型または全長ＢＡＸ、２１ＫＤタンパク質および野生型ＢＡＫ、２４ＫＤタンパク質を発現する陽性対照細胞株である。ＢＢ１５細胞を発現する抗ＨＥＲ２を二重ノックアウト対照として用いた。
【０１４９】
アポトーシスの分析を、Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ結合アポトーシスアッセイによって、本発明の抗ＰＳＭＡ発現クローンにおいてさらに行った。図１７に示すように、ＢＡＸ／ＢＡＫ二重ノックアウトクローン、例えばＰＳＭＡ−１９２およびＰＳＭＡ−７１９は、単一ノックアウトクローン、例えばＰＳＭＡ−８８２および非ノックアウトクローン、例えばＰＳＭＡ−４８４で観察された約３５〜３７％と比較して、約８５％の細胞生存率を示した。
【０１５０】
（実施例１４：組み換えタンパク質の産生は、ＢＡＸ／ＢＡＫ欠失抗ＰＳＭＡ発現クローンにおいて増加する）
ウェスタンブロッティングおよびＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ分析による抗ＰＳＭＡ発現ＢＡＸおよびＢＡＫクローンの分析に基づいて、さらなる最適化のために多数の安定なクローンを選択した。３つの（３）安定なクローン１９２、７１９（両方ともＢＡＸ／ＢＡＫノックアウトを有する）および８８２（ＢＡＫノックアウト）をプロセス最適化のために選択して、それぞれについて観察される高い生産性、強い増殖および２ヶ月の安定性に基づいて力価を改善した。
【０１５１】
抗体の産生は、図１８に示すような流加プロセスにおいて評価した。流加培養条件下、ＢＡＸ／ＢＡＫ二重ノックアウト細胞株（ＰＳＭＡ−ＢＢＫＯ−１９２）は、産物の１０日目の力価において３倍の増加（１４００ｍｇ／Ｌ対５００ｍｇ／Ｌ）（図１８Ｃ）を示した。同時に、生存率も９０％を超えて有意に改善された（図１８Ｂ）。操作されていない細胞株ＰＳＭＡ−Ｓ−１６４を対照として用いた。
【０１５２】
（実施例１５：ＢＡＸ／ＢＡＫ欠失抗ＰＳＭＡ発現細胞株の産物の品質）
表５に開示されるような抗ＰＳＭＡ発現対照細胞株（ＰＳＭＡ−Ｓ−１６４）、およびＢＡＸ／ＢＡＫ二重ノックアウト抗ＰＳＭＡ発現細胞株（ＰＳＭＡ−ＢＢＫＯ−１９２）から流加産生によって産生された試料を用いて、インタクト質量分析およびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって産物の品質を分析した。操作されたクローンおよび親細胞株の一次アミノ酸配列はｍＡｂの同定を確認するｃＤＮＡ配列から推定されたものと同じであることが、ＭＳによって観察された（データは示さず）。
【０１５３】
【表５】
2020522247.tif 000009
表５に示すように、ＭＳによって評価された糖型特性は、操作されていない細胞株（ＰＳＭＡ−Ｓ−１６４）とＢＡＸ／ＢＡＫ二重ノックアウト細胞株（ＰＳＭＡ−ＢＢＫＯ−１９２）との間で同等であり、クローン選択段階でのｍＡｂの正規分布範囲内であった。ＳＥＣは高分子量（ＨＭＷ）凝集体の割合を測定し、ｎｒＣＥ−ＳＤＳは低分子量（ＬＭＷ）分解種の割合を測定した。ＨＭＷ凝集体およびＬＭＷ分解種の両方は５％未満であり、抗ＰＳＭＡ発現の操作されていない細胞株と操作された細胞株との間で同等であった。これらの品質特性は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９操作およびその後の単細胞クローニングが抗ＰＳＭＡ発現細胞株の産物の品質に悪影響を及ぼさなかったことを示す。
【０１５４】
（実施例１６：ＢＡＸ／ＢＡＫ欠失抗ＣＤ７０発現細胞株の作製）
ＣＲＩＳＲＰ−Ｃａｓ９編集技術を用いたＢＡＸおよびＢＡＫの同時切除を、３つのＢＡＸ標的ｇＲＮＡ構築物および２つのＢＡＫ標的ｇＲＮＡ構築物の抗ＣＤ７０発現ミニプール細胞集団（ＣＤ７０−ＭＷ−１０８）へのトランスフェクションによって行った。この実験で用いたＢＡＸおよびＢＡＫ構築物は、上記の実施例に記載され、図５〜７および表１〜３に示すように設計し、調製した。抗ＣＤ７０に関連するノックアウト実験において用いたＣＲＩＳＰＲプラスミドはまた、市販のベクター、Ｇｅｎｅａｒｔ  ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼベクター（ｐＧＣＮＶ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、図７に示すように設計した。ｐＧＣＮＶに挿入されたオリゴ二重鎖は、配列番号８３〜配列番号９２の５つの（５）ペアの合成オリゴを含んでいた。
【０１５５】
ＢＡＸ部位を標的とする３つの異なるｇＲＮＡ配列をコードする３つのプラスミドおよびＢＡＫ部位を標的とする２つの異なるｇＲＮＡ配列をコードする２つのプラスミドを、ｐＡＦ−ＲＳおよびｐＡＦ−ｔＲＮＡ＋抗ＰＳＭＡ遺伝子またはその断片を有するように操作されたＣＨＯ細胞由来の安定な細胞株にコトランスフェクションした。トランスフェクションの７２時間後、ゲノムＤＮＡを単離し、そしてＢＡＫ遺伝子座の一部を、実施例５に記載されるように、配列番号４５および４６のオリゴを用いてＰＣＲ増幅した。代わりに配列番号４３および４４のオリゴを用いてＢＡＸ遺伝子座をＰＣＲ増幅した。図１９に示すように、ＣＲＩＳＰＲ編集技術に基づいて、抗ＣＤ７０発現細胞集団におけるノックアウト効率を決定するために、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイを行った。ＣＲＩＳＰＲ  ＫＯの前後の元のバンドの比率を、Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアによる走査画像の濃度分析によって定量し、ノックアウト効率を測定するために用いた。ＢＡＸおよびＢＡＫについてのノックアウト効率はそれぞれ５１％および２３％であり、約１０％の計算された二重ノックアウト効率をもたらした。このアッセイでは、非特異的バンドが観察された。このバンドは、細胞集団のミニプールの性質によるものであり得ると考えられる。
【０１５６】
７日後、細胞のトランスフェクションされたプールを、ＦＡＣＳを用いて、１細胞／ウェルの播種密度で４０プレートにサブクローニングした。約１０００個の画像確認された単細胞由来クローンを選択し、そして生産性、増殖および標的ＤＮＡ配列決定による遺伝子型決定について、９６ウェル、２４ウェルおよび２４ディープウェルによりスクリーニングした。ＢＡＸおよびＢＡＫ欠失抗ＣＤ７０発現クローンのＤＮＡ分析を、実施例８に記載のように行った（データは示さず）。作製された抗ＣＤ７０発現クローンの数から、ＢＡＸ／ＢＡＫ二重ノックアウトクローンを、２ヶ月の安定性研究による増殖および生産性のさらなる評価のため、ならびにウェスタンブロッティングによるノックアウト状態の確認のために選択した。
【０１５７】
図２０に示すように、抗ＣＤ７０発現クローンにおけるＢＡＸおよびＢＡＫノックアウトのタンパク質分析を、ウェスタンブロットを用いることによって評価した。６００万個のＢＡＸ／ＢＡＫ二重ノックアウト細胞株からの溶解物を、１００ｕｌのＲＩＰＡ緩衝液（Ａｂｃａｍ）＋プロテアーゼインヒビター（Ｓｉｇｍａタブレット；Ｓｉｇｍａ）に再懸濁することによって調製した。溶解物を氷上で１時間インキュベートした後、１２，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。タンパク質濃度は、ＢＣＡキット（Ｐｉｅｒｃｅ）によって測定した。２０ｕｇのタンパク質をウェスタンブロットに用いた。異なる細胞株からのタンパク質抽出物を、抗ＢＡＸ抗体（Ａｂｃａｍ）でプローブした。図２０Ａは、ＣＲＩＳＰＲを用いて操作された抗ＣＤ７０発現クローンにおけるＢＡＸノックアウトを示す。図２０Ｂに示すように、ＣＲＩＳＰＲを用いて操作された抗ＣＤ７０発現クローンにおけるＢＡＫノックアウトが、多数のクローンにおいて観察された。示された上位１３クローンのうち、８クローンはＢＡＸ／ＢＡＫ二重ノックアウトであった。クローン１０８親細胞株は残留ＢＡＫタンパク質発現を保持していたことに注目されたい。Ｌ０８２は、野生型または全長ＢＡＸ、２１−ＫＤタンパク質およびＢＡＫ野生型タンパク質、２４ＫＤのバンドを発現する陽性対照細胞株である。
【０１５８】
アポトーシスの分析を、Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ結合アポトーシスアッセイによって、本発明の抗ＣＤ７０発現クローンにおいてさらに行った。図２１に示すように、ＢＡＸ／ＢＡＫ二重ノックアウトクローン、例えばＣＤ７０−ＢＢＫＯ−５６３は、親細胞株ＣＤ７０−ＭＷ−１０８において観察された約１８％と比較して、約６０％の細胞生存率を示した。同時に、アポトーシス細胞は各細胞株についてＱ２およびＱ４から観察されるように、８０％から４０％に減少した。
【０１５９】
（実施例１７：組み換えタンパク質の産生は、ＢＡＸ／ＢＡＫ欠失抗ＣＤ７０発現クローンにおいて増加する）
ウェスタンブロッティングおよびＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ分析による抗ＣＤ７０発現ＢＡＸおよびＢＡＫクローンの分析に基づいて、さらなる最適化のために多数の安定なクローンを選択した。図２１に示すように、ＢＡＸ／ＢＡＫノックアウトの両方を有する安定なクローンの９つ（９）を、プロセスの最適化のために選択して、それぞれについて観察される高い生産性、強力な増殖および２ヶ月間の安定性に基づいて力価を改善した。
【０１６０】
抗体の産生は、図２２に示すような流加プロセスにおいて評価した。流加培養条件下、抗ＣＤ７０発現ＢＡＸ／ＢＡＫ二重ノックアウト細胞株（ＣＤ７０−ＢＢＫＯ−５６３）は、産物の１４日目において、振盪フラスコおよびベンチトップバイオリアクターの両方の条件において１０００ｍｇ／Ｌの力価（図２２Ｃ）を示した。振盪フラスコおよびベンチトップバイオリアクター条件の両方の条件下での細胞生存率（図２２Ｂ）は、約９０％であった。全体として、振盪フラスコおよびバイオリアクター条件下での産生特性、ＶＣＤ、生存率および力価は同等であり、プロセスが拡張可能であることを支持した。さらなる研究を、分析された同等の生産性および増殖特性に基づいて、バイオリアクター条件およびプロセス下で行った（データは示さず）。この研究は、アポトーシスを制御または調節する遺伝子をノックアウトするためのＣＲＩＳＰＲ技術を用いることによって、バイオリアクターの条件下で細胞増殖に影響を及ぼすアポトーシスストレッサーを制御する本発明の実施形態を支持する。
【０１６１】
（実施例１８：ＢＡＸ／ＢＡＫ欠失抗ＣＤ７０発現細胞株の産物の品質）
表６に開示されるようなバイオリアクターおよび振盪フラスコ条件下で、抗ＣＤ７０発現ＢＡＸ／ＢＡＫ二重ノックアウト細胞株をからの流加産生によって産生された試料を用いて、インタクト質量分析（ＭＳ）およびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって、産物の品質を分析した。
【０１６２】
【表６】
2020522247.tif 000010
表５に示すように、ＭＳによって評価された糖型特性は振盪フラスコ条件とバイオリアクター条件との間で同等であり、クローン選択段階でｍＡｂの正規分布範囲内であった。ＳＥＣは、高分子量（ＨＭＷ）凝集体の割合および低分子量（ＬＭＷ）分解種の割合を測定した。ＨＭＷ凝集体およびＬＭＷ分解種の両方は、クローン選択段階で正常範囲内であった。５％よりわずかに高いＨＭＷは、精製後に２〜３％に減少することが観察された（データは示さず）。これらの品質特性は、ＣＲＩＳＰＲおよびその後の単細胞クローニングが抗ＣＤ７０発現細胞株の産物品質に悪影響を与えなかったことを示す。また、バイオリアクター条件における産物品質属性（凝集体、完全性および糖型）は振盪フラスコ条件における対応物と一致し、このプロセスが拡張可能であることを証明したことにも注目されたい。
【０１６３】
本明細書中に記載される方法および組成物は、本明細書中に記載される特定の方法論、プロトコル、細胞株、構築物、および試薬に限定されず、変更を施し得ることが理解されるべきである。また、本明細書で用いられている専門用語は特定の実施形態を記載する目的のためのみに用いられているのであって、本明細書に記載の方法および組成物の範囲を限定することを意図していないことを理解されたい。なお、本明細書に記載の方法および組成物の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【０１６４】
本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は文脈が明らかに異なったことを示さない限り、複数の対象を含む。
【０１６５】
別段の定義がない限り、本明細書で用いられるすべての技術用語および科学用語は、本明細書で開示され、説明される発明が属する当業者に通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法、装置、および材料を、本明細書に記載される本発明の実施または試験において用いることができるが、好ましい方法、装置、および材料はここに記載されているものである。
【０１６６】
本明細書で言及される全ての刊行物および特許は、例えば現在記載されている発明に関連して用いられ得る、刊行物に記載されている構築物および方法を記載および開示する目的のために、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ここで述べる刊行物は、単に、本出願の出願日以前における開示を提供するためのものである。本明細書に記載された発明者は、先行発明によって、または任意の他の理由によって、そのような開示に先行する権利を有さないという承認として、本明細書のいかなるものも解釈されるべきではない。
【０１６７】
上記の発明は明確さおよび理解の目的のために、ある程度詳細に記載されているが、本開示を読むことから、本発明の真の範囲から逸脱することなく、形態および詳細における種々の変更をなすことができることが、当業者には明らかである。例えば、本明細書で説明されるすべての技術および装置は、様々な組合せで用いることができる。本明細書に記述された実施例および実施形態は説明のみを目的とするものであり、これらに関する様々な改変または変更は、当業者に対して示唆され、本出願の精神および範囲、ならびに添付された特許請求の範囲の内に含まれるべきであると理解される。
【０１６８】
〔参照による援用〕
本出願において引用される全ての刊行物、特許、特許出願、および／または他の文献はあたかも同じ個々の刊行物、特許、特許出願、および／または他の文献が全ての目的のために参照により組み込まれるように個々に示されたかのように、全ての目的のためにその全体が参照により組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１６９】
【図１】パネルＡおよびＢ。非天然アミノ酸含有タンパク質を産生するために、産業および製薬会社においてプラットフォーム細胞株を利用する方策。図１は、産業（図１Ａ）および製薬会社（図１Ｂ）におけるプラットフォーム細胞株を使用することの重要な役割を示す。
【図２】高産生細胞株の開発においてプラットフォーム細胞株を利用する一般的な手順。
【図３】パネルＡ、Ｂ、Ｃ。高産生細胞株の開発を最適化するための方策。図３は、ＦＡＣＳ依存性単細胞沈着（図３Ａ）、ＣＲＩＳＰＲノックアウト（図３Ｂ）、および細胞株開発プロセス最適化（図３Ｃ）等のいくつかの態様からの高産生細胞株開発の最適化を示す。
【図４】パネルＡおよびＢ。プラットフォーム細胞株４Ｅ２由来の細胞におけるアポトーシスの観察。Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖアッセイによって、パラ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンを特異的に組み込んでいる、直交対ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼを遺伝的に組み込まれる形で含む、ＣＨＯ−Ｓ細胞（図４Ａ）およびプラットフォーム細胞株４Ｅ２（図４Ｂ）の生存率を評価した。図４に示すように、ＣＨＯ−Ｓ細胞（生存率は９６％）と比較して、４Ｅ２は過剰なアポトーシスを示した（生存率は８５％）。
【図５】ＣＨＯ細胞における標的ＢＡＸ遺伝子のＣＲＩＳＰＲ  ｇＲＮＡ設計。図５は、３つのｇＲＮＡ配列に注釈を付けたＣＨＯ細胞におけるＢＡＸ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列を示す。ＢＡＸ遺伝子、エキソン１およびエキソン２のゲノムＤＮＡ配列を灰色の陰影で示す。ＢＡＸの他のシーケンスは通常の文字で示されている。ＰＣＲおよび配列決定において使用されるプライマーは、フォワードプライマーおよびリバースプライマーとして、それぞれ配列の先頭および末尾に示される。
【図６】ＣＨＯ細胞における標的ＢＡＫ遺伝子のＣＲＩＳＰＲ  ｇＲＮＡ設計。図６は、２つのｇＲＮＡ配列に注釈を付けたＣＨＯ細胞におけるＢＡＫ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列を示す。ＢＡＫ遺伝子、エキソン２およびエキソン３のゲノムＤＮＡ配列を灰色の陰影で示す。ＢＡＫの他のシーケンスは通常の文字で示されている。ＰＣＲおよび配列決定において使用されるプライマーは、フォワードプライマーおよびリバースプライマーとして、それぞれ配列の先頭および末尾に示される。
【図７】ＢＡＸまたはＢＡＫ  ＣＲＩＳＰＲ構築物。図７は、ＢＡＸまたはＢＡＫノックアウト実験において使用されるＣＲＩＳＰＲプラスミドの設計を示す。Ｇｅｎｅａｒｔ  ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼベクター（ｐＧＣＮＶ）は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）製の市販のベクターである。ｐＧＣＮＶプラスミドの完成形は、遺伝子部位を個別に標的化するために特定の１９ヌクレオチド長のｇＲＮＡ配列を用いて設計されたオリゴ二重鎖のためのスロットを含む、切断により開いたｐＧＣＮＶベクターに、オリゴ二重鎖を挿入することによって調製される（本明細書中の表１を参照のこと）。
【図８】本発明の代表的な非天然アミノ酸の構造を示す。
【図９】ＣＲＩＳＰＲを用いてＢＡＸまたはＢＡＫをノックアウトした抗ＨＥＲ２発現細胞集団のＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイ。図９は、ＣＲＩＳＰＲを用いたＢＡＸまたはＢＡＫノックアウト中のノックアウト効率のＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイ分析を示す。上部バンドの縮小および底部の新しいバンドの出現は、Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアによる走査画像の濃度測定分析によって定量化できる当該効率を示す。ＣＲＩＳＰＲノックアウト（ＫＯ）の前後の元のバンドの比率を使用して、ノックアウト効率を測定した。ＢＡＸおよびＢＡＫについてのノックアウト効率はそれぞれ３０％および７０％であり、計算の結果、約２１％の二重ノックアウト効率をもたらした。
【図１０】ＣＲＩＳＰＲを用いてノックアウトされたＢＡＸおよびＢＡＫ遺伝子を有する抗ＨＥＲ２発現単細胞クローンのＤＮＡ分析。図１０は、ＣＲＩＳＰＲを用いたＢＡＫノックアウト後の２０個の単細胞クローンのＤＮＡ配列決定結果を示す。頂部ＤＮＡ配列（Ｂａｋ−ＣＨＯ−ｇＤＮＡ１）は、元のＢＡＫ遺伝子のゲノム領域のＤＮＡ配列である。「ＺＡ＿１１２＿Ｋ３２＿ＢａｋＩ−ＩＩ」クローンのみが、元のＢＡＫ遺伝子と同一の配列を有する。図に示される他の遺伝子は、前記配列に欠失または挿入のいずれかを有する。
【図１１】ＣＲＩＳＰＲを用いた抗ＨＥＲ２発現ＢＡＸノックアウトクローニングにおけるＢＡＸノックアウト確認のウェスタンブロット分析。ＢＡＸは、遺伝子ノックアウトを有さず、野生型ＢＡＸタンパク質を発現するＬ０８２細胞においてバンドとして示される２１−ＫＤタンパク質である。他のクローニングは、残留ＢＡＸ発現を示すクローニングＵＢＢ３を除いて、ＢＡＸタンパク質の検出可能な発現を示さなかった。
【図１２】パネルＡおよびＢ。ＢＡＸ／ＢＡＫノックアウト細胞株を発現する抗ＨＥＲ２のアポトーシス分析。図１２は、親細胞株Ｌ０８２（図１２Ａ）およびＢＡＸ／ＢＡＫ二重ノックアウト細胞株ＢＢ１５（図１２Ｂ）のＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖアポトーシス分析を示す。表に示すように、細胞生存率は、ＢＡＸおよびＢＡＫノックアウト後に４０％から８０％に改善される。同時に、アポトーシス細胞は５３％から１７％に減少する。
【図１３】パネルＡ〜Ｄ。一括培養におけるＢＡＸ／ＢＡＫノックアウト細胞株における抗ＨＥＲ２抗体産生の促進。図１３は、ＢＡＸ／ＢＡＫ二重ノックアウト細胞株におけるタンパク質産生の変化を示す。タンパク質産生を一括産生の間に分析する。生細胞密度（ＶＣＤ、図１３Ａ）。細胞生存率（図１３Ｂ）。一括生産の間（７日目）、ＢＡＸ／ＢＡＫ二重ノックアウト細胞株は、１５０ｍｇ／Ｌから２７０ｍｇ／Ｌへの力価増加を示した（図１３Ｃ）。比生産性（Ｑｐ）（図１３Ｄ）。
【図１４】パネルＡ〜Ｄ。流加培養におけるＢＡＸ／ＢＡＫノックアウト細胞株における抗ＨＥＲ２抗体産生の促進。図１４は、ＢＡＸ／ＢＡＫ二重ノックアウト細胞株におけるタンパク質産生の変化を示す。タンパク質産生は、流加生産の間に分析される。生細胞密度（ＶＣＤ、図１４Ａ）。細胞生存率（図１４Ｂ）。流加生産（ｄａｙ１４）の間、ＢＡＸ／ＢＡＫ二重ノックアウト細胞株は、４５０ｍｇ／Ｌから１５００ｍｇ／Ｌへの力価増加を示す（図１４Ｃ）。比生産性（Ｑｐ）（図１４Ｄ）。
【図１５】ＣＲＩＳＰＲを用いてＢＡＸまたはＢＡＫをノックアウトした抗ＰＳＭＡ発現細胞集団のＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイを示す。図１５は、ＣＲＩＳＰＲを用いたＢＡＸまたはＢＡＫノックアウト中のノックアウト効率のＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイ分析を示す。ＣＲＩＳＰＲノックアウト（ＫＯ）の前後の元のバンドの比率を、Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアによる走査画像の濃度分析によって定量し、ノックアウト効率を測定するために使用した。ＢＡＸおよびＢＡＫについてのノックアウト効率はそれぞれ４２％および５３％であり、計算の結果、約２０％の二重ノックアウト効率をもたらした。
【図１６】パネルＡおよびＢ。抗ＰＳＭＡ発現クローンにおけるＢＡＸおよびＢＡＫノックアウト確認のウェスタンブロット分析。ＣＲＩＳＰＲを用いた抗ＰＳＭＡ発現クローンにおけるＢＡＸノックアウト確認（図１６Ａ）。抗ＰＳＭＡ発現クローンにおけるＢＡＫノックアウト確認（図１６Ｂ）。コントロールは、野生型ＢＡＸタンパク質を発現するＬ０８２細胞、２１−ＫＤでのバンド、およびＢＢ１５細胞を発現する抗ＨＥＲ２−ＢＡＸ／ＢＡＫ二重ノックアウトである。
【図１７】ＢＡＸ／ＢＡＫノックアウト抗ＰＳＭＡ発現細胞株のアポトーシス分析。図１７は、単一ＫＯクローニング（ＰＳＭＡ−８８２）または非ノックアウトクローニング（ＰＳＭＡ−４８４）における約３５〜３７％と比較して約８５％の細胞生存率を有するＢＡＸ／ＢＡＫ二重ノックアウト細胞株ＰＳＭＡ−１９２およびＰＳＭＡ  ７１９のＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖアポトーシス分析を示す。
【図１８】パネルＡ〜Ｃ。流加培養におけるＢＡＸ／ＢＡＫノックアウト細胞株における抗ＰＳＭＡ抗体産生の促進。図１８はＢＡＸ／ＢＡＫ二重ノックアウト細胞株（例えば、細胞株ＰＳＭＡ−ＢＢＫＯ−１９２）におけるタンパク質産生量の変化を示す。タンパク質産生は、流加生産の間に分析される。生細胞密度（ＶＣＤ、図１８Ａ）。細胞生存率（図１８Ｂ）。流加生産（１４日目）の間、ＢＡＸ／ＢＡＫ二重ノックアウト細胞株は、５００ｍｇ／Ｌから１４００ｍｇ／Ｌへの力価増加を示した（図１８Ｃ）。
【図１９】ＣＲＩＳＰＲを用いてＢＡＸまたはＢＡＫをノックアウトした抗ＣＤ７０発現細胞集団のＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイ。図１９は、ＣＲＩＳＰＲを用いたＢＡＸまたはＢＡＫノックアウト中のノックアウト効率のＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイ分析を示す。ＣＲＩＳＰＲノックアウト（ＫＯ）の前後の元のバンドの比率を、Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアによる走査画像の濃度分析によって定量し、ノックアウト効率を測定するために用いた。ＢＡＸおよびＢＡＫについてのノックアウト効率はそれぞれ５１％および２３％であり、計算の結果、約１０％の二重ノックアウト効率をもたらした。
【図２０】パネルＡおよびＢ。抗ＣＤ７０発現クローンにおけるＢＡＸおよびＢＡＫノックアウト確認のウェスタンブロット分析。抗ＣＤ７０発現クローンにおけるＢＡＸノックアウト確認（図２０Ａ）。抗ＣＤ７０発現クローンにおけるＢＡＫノックアウト確認（図２０Ｂ）。コントロールは野生型ＢＡＸタンパク質を発現するＬ０８２細胞、２１−ＫＤのバンド、およびＢＡＫ野生型タンパク質、２４  ＫＤのバンド。
【図２１】ＢＡＸ／ＢＡＫノックアウト抗ＣＤ７０発現細胞株のアポトーシス分析。図２１はＢＡＸ／ＢＡＫ二重ノックアウト細胞株（例えばＣＤ７０−ＢＢＫＯ−５６３）のＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖアポトーシス分析において、細胞生存率が親細胞株のＣＤ７０−ＭＷ−１０８と比較して１８％から６０％に増加したことを示す。アッセイアポトーシス細胞は８０％から４０％に減少した。
【図２２】パネルＡ〜Ｃ。流加培養におけるＢＡＸ／ＢＡＫノックアウト細胞株の抗ＣＤ７０抗体産生の促進。図２２は、振盪フラスコおよびベンチトップバイオリアクター中のＢＡＸ／ＢＡＫ二重ノックアウト抗ＣＤ７０発現細胞株の産生状態を示す。生細胞密度（ＶＣＤ、図２２Ａ）。細胞生存率（図２２Ｂ）。ＢＡＸ／ＢＡＫ二重ノックアウト細胞株（例えばＣＤ７０−ＢＢＫＯ−５６３）は１０００ｍｇ／Ｌの高い力価を示す。（図２２Ｃ）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2020522247.tif 000023
【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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