(57)【要約】  本発明は、血液成分、特に血清アルブミン及びリゾチームの活性及び使用に関し、それらに基づく方法、アッセイ、組成物、配合物及び構築物、特に溶菌ペプチド構築物、並びに抗菌性溶菌タンパク質及びペプチドの細菌死滅効果を増強するか、又はそれと相乗作用を示す、それらの活性及び使用を提供する。【選択図】図１Ａ及び図１Ｂ
2020527551.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グラム陽性細菌の増強された又は相乗的な死滅のための組成物又は組合せであって、ＳＨ３型結合ドメインを有する単離溶解素ポリペプチドと、血清アルブミン及びリゾチームから選択される１つ以上の血液成分タンパク質、又はそのペプチド若しくはフラグメントとを含み、そのペプチド又はフラグメントが、溶解素ポリペプチド活性増強効果に関して完全長アルブミン又はリゾチームタンパク質の活性を示す、組成物又は組合せ。
【請求項２】
前記ＳＨ３型結合ドメインを有する溶解素ポリペプチドがＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）溶解素、Ｓａｌ溶解素、ＬｙｓＫ溶解素、リゾスタフィン、ｐｈｉｌｌ溶解素、ＬｙｓＨ５溶解素、ＭＶ−Ｌ溶解素、ＬｙｓＧＨ１５溶解素及びＡＬＥ−１溶解素から選択される、請求項１に記載の組成物又は組合せ。
【請求項３】
前記ＳＨ３型結合ドメインを有する溶解素ポリペプチドがＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）溶解素であり、配列番号３に提示されるアミノ酸配列、又は配列番号３のポリペプチドに対して少なくとも８０％の同一性を有し、ブドウ球菌属及びレンサ球菌属細菌を死滅させるのに効果的なその変異体を含む、請求項１に記載の組成物又は組合せ。
【請求項４】
前記血清アルブミンがヒト血清アルブミン、ウマ血清アルブミン、イヌ血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、ラット血清アルブミン又は仔ウシ（ウシ／ウシ亜科）血清アルブミンから選択される、請求項１に記載の組成物又は組合せ。
【請求項５】
前記リゾチームがヒトリゾチームである、請求項１に記載の組成物又は組合せ。
【請求項６】
前記血液成分である血清アルブミン及び／又はリゾチームが、前記溶解素ポリペプチドの非存在下で内因性抗菌活性、特に抗ブドウ球菌活性を有しないか、又はそれが限られる、請求項１に記載の組成物又は組合せ。
【請求項７】
１つ以上の血清脂肪酸を更に含む、請求項１に記載の組成物又は組合せ。
【請求項８】
前記血清脂肪酸がオレエート及びパルミテートから選択される、請求項７に記載の組成物又は組合せ。
【請求項９】
グラム陽性細菌の集団を死滅又は減少させる方法であって、該細菌と、該グラム陽性細菌を死滅させるのに効果的な量の、ＳＨ３型結合ドメインを有する単離溶解素ポリペプチドと、血清アルブミン及びリゾチームから選択される１つ以上の血液成分とを含む組成物とを接触させることを含む、方法。
【請求項１０】
前記血清アルブミンがヒト血清アルブミン、ウマ血清アルブミン、イヌ血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、ラット血清アルブミン及び仔ウシ（ウシ／ウシ亜科）血清アルブミンから選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記血清アルブミンがヒト血清アルブミン、又はグラム陽性細菌に結合することが可能なそのフラグメント若しくはペプチドである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記リゾチームがヒトリゾチームである、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記グラム陽性細菌がブドウ球菌属又はレンサ球菌属細菌である、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記グラム陽性細菌が黄色ブドウ球菌である、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＳＨ３型結合ドメインを有する溶解素ポリペプチドがＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）溶解素、Ｓａｌ溶解素、ＬｙｓＫ溶解素、リゾスタフィン、ｐｈｉｌｌ溶解素、ＬｙｓＨ５溶解素、ＭＶ−Ｌ溶解素、ＬｙｓＧＨ１５溶解素及びＡＬＥ−１溶解素から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＳＨ３型結合ドメインを有する溶解素ポリペプチドがＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）溶解素であり、配列番号３に提示されるアミノ酸配列、又は配列番号３のポリペプチドに対して少なくとも８０％の同一性を有し、ブドウ球菌属及びレンサ球菌属細菌を死滅させるのに効果的なその変異体を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
前記細菌を、任意にオレエート及びパルミテートから選択される血清脂肪酸と更に接触させる、請求項９に記載の方法。
【請求項１８】
ヒトにおける抗生物質耐性黄色ブドウ球菌感染を治療する方法であって、抗生物質耐性黄色ブドウ球菌感染を有するヒトに、有効量の請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物又は組合せを投与する工程を含む、方法。
【請求項１９】
ヒトにおける抗生物質耐性黄色ブドウ球菌感染を治療する方法であって、抗生物質耐性黄色ブドウ球菌感染を有するヒトに、ＳＨ３型結合ドメインを有し、グラム陽性細菌を死滅させることが可能な或る量の単離溶解素ポリペプチドと、ヒトリゾチームとを含む有効量の組成物を投与する工程を含む、方法。
【請求項２０】
感染部位でのヒト血清アルブミンのレベルを評価し、及び／又は感染部位での血清アルブミンによる前記抗生物質耐性黄色ブドウ球菌の被覆を評価すると共に、ヒト血清アルブミン、又はグラム陽性細菌に結合することが可能なそのフラグメント若しくはペプチドを更に投与することを更に含み、前記溶解素ポリペプチド及びリゾチームが前記抗生物質耐性黄色ブドウ球菌を死滅させるのに効果的である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
溶解素由来のＳＨ３型細菌結合ドメインと、ヒト血清アルブミン、又はグラム陽性細菌に結合することが可能なそのフラグメント若しくはペプチドとを含むキメラ又は融合ポリペプチド。
【請求項２２】
ヒトリゾチームの溶菌ドメインを更に含む、請求項２１に記載のキメラ又は融合ポリペプチド。
【請求項２３】
溶解素由来のＳＨ３型細菌結合ドメインと、ヒトリゾチーム、又はグラム陽性細菌を溶解させることが可能なそのフラグメント若しくはペプチドとを含むキメラ又は融合ポリペプチド。
【請求項２４】
ヒト血清アルブミン、又はグラム陽性細菌に結合することが可能なそのフラグメント若しくはペプチドを更に含む、請求項２３に記載のキメラ又は融合ポリペプチド。
【請求項２５】
抗菌剤又はペプチドの抗菌活性を増強する方法であって、該ペプチドを、ＳＨ３型結合ドメインを有する溶解素ポリペプチド、及びヒト血清アルブミン、又はグラム陽性細菌に結合することが可能なそのフラグメント若しくはペプチドと組み合わせて投与することを含む、方法。
【請求項２６】
ヒトリゾチーム、又はグラム陽性細菌を溶解させることが可能なそのフラグメント若しくはペプチドを投与することを更に含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
抗菌剤又はペプチドの抗菌活性を増強する方法であって、該ペプチドを、ＳＨ３型結合ドメインを有する溶解素ポリペプチド、及びリゾチーム、又はグラム陽性細菌を溶解させることが可能なそのフラグメント若しくはペプチドと組み合わせて投与することを含む、方法。
【請求項２８】
ヒト血清アルブミン、又はグラム陽性細菌に結合することが可能なそのフラグメント若しくはペプチドを投与することを更に含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項２９】
グラム陽性細菌の感受性試験の方法であって、血清アルブミンを添加したブロス、アッセイ培地又は溶液中で抗菌性ペプチドを評価することを含む、方法。
【請求項３０】
前記ブロス、アッセイ培地又は溶液にヒト血清アルブミン、ウマ血清アルブミン、イヌ血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、ラット血清アルブミン又は仔ウシ（ウシ／ウシ亜科）血清アルブミンを添加する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ブロス、アッセイ培地又は溶液にヒト血清アルブミン、ウマ血清アルブミン、イヌ血清アルブミン又はウサギ血清アルブミンを添加する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記ブロス、アッセイ培地又は溶液にリゾチームを添加する、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記ブロス、アッセイ培地又は溶液にヒト血清アルブミンを１０％〜５０％のヒト血清アルブミンの濃度で添加する、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記ブロス、アッセイ培地又は溶液にヒト血清アルブミンを２０％〜４０％のヒト血清アルブミンの濃度で添加する、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記抗菌性ペプチドがＳＨ３結合ドメインを有する溶解素ポリペプチドである、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記溶解素ポリペプチドがＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）溶解素、Ｓａｌ溶解素、ＬｙｓＫ溶解素、リゾスタフィン、ｐｈｉｌｌ溶解素、ＬｙｓＨ５溶解素、ＭＶ−Ｌ溶解素、ＬｙｓＧＨ１５溶解素及びＡＬＥ−１溶解素から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記溶解素ポリペプチドがＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）であり、配列番号３に提示されるアミノ酸配列、又は配列番号３のポリペプチドに対して少なくとも８０％の同一性を有し、ブドウ球菌属及びレンサ球菌属細菌を死滅させるのに効果的なその変異体を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
溶解素ポリペプチドである抗菌性ペプチドを含み、１つ以上の抗菌剤を更に含む組成物を評価する、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記１つ以上の抗菌剤が抗生物質である、請求項３８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、包括的には、血液成分、特に血清アルブミン及びリゾチーム、並びに抗菌性溶菌タンパク質及びペプチドの細菌死滅効果を増強するか、又はそれと相乗作用を示す、それらの活性及び使用に関する。本発明は、血液成分及び／又はそのペプチド若しくはタンパク質に基づく溶菌ペプチド構築物、配合物、アッセイ及び方法に更に関する。
【背景技術】
【０００２】
グラム陽性細菌は、ポリペプチド及び多糖を含有する細胞壁に取り囲まれている。グラム陽性細胞壁は、厚さが２０ｎｍ〜８０ｎｍであり、ペプチドグリカンの多数の相互接続層からなる広く緻密な壁のように見える。グラム陽性細胞壁の６０％〜９０％は、細胞の形状、剛性構造及び浸透圧ショックへの耐性をもたらすペプチドグリカンである。細胞壁は、細胞を紫色に染色するグラム染色クリスタルバイオレットを排除せず、したがって「グラム陽性」である。グラム陽性細菌としては、アクチノミセス属、バシラス属、リステリア属、ラクトコッカス属、ブドウ球菌属、レンサ球菌属、エンテロコッカス属、マイコバクテリウム属、コリネバクテリウム属及びクロストリジウム属が挙げられるが、これらに限定されない。医学的に関連する種としては、化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）、肺炎レンサ球菌（Streptococcus pneumoniae）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）及びエンテロコッカス・フェカーリス（Enterococcus faecalis）が挙げられる。芽胞形成性であるバシラス属種は、炭疽及び胃腸炎を引き起こす。芽胞形成性クロストリジウム属種はボツリヌス中毒症、破傷風、ガス壊疽及び偽膜性大腸炎に関与する。コリネバクテリウム属種はジフテリアを引き起こし、リステリア属種は髄膜炎を引き起こす。
【０００３】
ペニシリン及びセファロスポリン等の細胞壁合成を阻害する抗菌薬は、ペプチドグリカンのペプチド間の連結を妨げ、グラム陽性細菌及びグラム陰性細菌の両方の細胞壁を脆化する。グラム陽性細菌のペプチドグリカンは露出しているため、グラム陽性細菌は、これらの抗生物質の影響をより受けやすい。有利なことに、真核細胞は細胞壁を欠き、これらの薬物又は他の細胞壁作用物質（cell wall agents）の影響を受けにくい。
【０００４】
薬物耐性、特に抗生物質耐性細菌の発生は、ますます多くの抗生物質が広範な病気及び他の病態に使用されているため、医学における重大な問題である。新規の抗微生物療法アプローチとしては、バクテリオファージ溶解素等の酵素ベースの抗生物質（「エンザイバイオティクス（enzybiotics）」）が挙げられる。ファージは、これらの溶解素を用いて、それらの細菌宿主の細胞壁を消化し、低張性溶解によりウイルス子孫を放出する。グラム陽性病原体に対する溶解素の高い致死活性は、それらを治療剤としての開発に魅力的な候補とする（非特許文献１、非特許文献２）。バクテリオファージ溶解素は、初めに病原性レンサ球菌属の鼻咽頭保菌の根絶について提案された（非特許文献３、非特許文献２）。
【０００５】
バクテリオファージ溶菌酵素は、様々な投与経路による被験体における様々なタイプの感染の評定及び特異的治療に有用であるとして確立された。例えば、特許文献１（Fischetti et al.）は、半精製Ｃ群レンサ球菌ファージ関連溶解素酵素による酵素消化を介した臨床試料におけるＡ群レンサ球菌属の迅速検出に関する。この酵素研究は、疾患の治療法につながる更なる研究の基礎となった。Fischetti and Loomisの特許（特許文献２、特許文献３及び特許文献４）は、Ｃ１バクテリオファージを感染させたＣ群レンサ球菌属細菌によって産生される溶解素酵素の使用を開示している。特許文献５（Fischetti and Loomis）は、皮膚組織への局所適用に好適な担体中の溶菌酵素を用いた皮膚感染に対する組成物を開示している。特許文献６（Fischetti and Loomis）は、感染細菌に特異的な溶菌酵素を投与することを含む、消化管の細菌感染を治療する方法を開示している。特許文献７（Fischetti and Loomis）は、その細菌に特異的なバクテリオファージを感染させた細菌によって産生される少なくとも１つの溶菌酵素及び患者への溶菌酵素の送達に適切な担体の非経口導入（筋肉内、皮下又は静脈内）による細菌感染の治療のための方法及び組成物を開示している。
【０００６】
特許文献８及び特許文献９、特許文献１０及び特許文献１１は、炭疽菌（Bacillus anthracis）感染の治療又は低減のための抗菌剤として有用な異なるファージ関連溶菌酵素、それぞれＰｌｙＧ、γ及びＷ、並びにＰｌｙＰＨを提供している。特許文献１２は、肺炎レンサ球菌に対するＰａｌ溶菌酵素を記載している。エンテロコッカス属（バンコマイシン耐性株を含むエンテロコッカス・フェカーリス及びエンテロコッカス・フェシウム（E. faecium））に有用な溶解素、特にＰｌｙＶ１２が特許文献１３に記載されている。特許文献１４は、Ｂ群レンサ球菌属を死滅させるのに極めて効果的な突然変異体ＰｌｙＧＢＳ溶解素を記載している。黄色ブドウ球菌を含むブドウ球菌属細菌に対する活性を有する、ＣｌｙＳとして表されるキメラ溶解素が特許文献１５及び特許文献１６に詳述されている。豚レンサ球菌（Streptococcus suis）から単離され、レンサ球菌属、ブドウ球菌属、エンテロコッカス属及びリステリア属株を死滅させるのに効果的なＰｌｙＳｓ２溶解素が特許文献１７及び特許文献１８に記載されている。
【０００７】
ＰｌｙＳｓ２溶解素（本明細書でＣＦ−３０１、ＣＦ３０１、ＰｌｙＳｓ２／ＣＦ−３０１、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）としても表される）は、ＦＤＡに許可された第Ｉ相臨床試験に入り、これを完了した最初の溶解素である。ＰｌｙＳｓ２溶解素は、特許文献１８及び特許文献１９、またGilmer et al（非特許文献４）に記載されている。ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）溶解素は、メチシリン感受性及び耐性黄色ブドウ球菌によって引き起こされる心内膜炎を含む血流感染の治療のために標準治療の抗生物質（バンコマイシン又はダプトマイシンを含むが、これらに限定されない）と組み合わせることができる。
【０００８】
臨床試験の裏付けとして、抗菌剤（複数の場合もある）を評価及び標準化するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗生物質感受性試験（ＡＳＴ）が用いられる。微量液体希釈（Broth microdilution；ＢＭＤ）を黄色ブドウ球菌分離株に対するＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）等の溶解素の活性を試験するために用いることができるが、標準的な方法（ＣＬＳＩの方法論）は信頼性のあるアッセイではなく、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）等の溶菌ポリペプチドに適用した場合に様々な問題を示す。ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）はヒト血液、血清及び血漿中で人工培地よりも効果的である。ヒト血液、血清及び血漿におけるＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）等の溶解素の活性及び機能性の増強の理解により、新規の有用な改善された抗菌アプローチ、方法及び治療剤をもたらすことができる。
【０００９】
本明細書における参照文献の引用は、かかる参照文献が本発明の従来技術であることを認めるものと解釈すべきではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第５，６０４，１０９号
【特許文献２】米国特許第５，９８５，２７１号
【特許文献３】米国特許第６，０１７，５２８号
【特許文献４】米国特許第６，０５６，９５５号
【特許文献５】米国特許第６，２４８，３２４号
【特許文献６】米国特許第６，２５４，８６６号
【特許文献７】米国特許第６，２６４，９４５号
【特許文献８】米国特許第７，４０２，３０９号
【特許文献９】米国特許第８，５８０，５５３号
【特許文献１０】米国特許第７，６３８，６００号
【特許文献１１】米国特許第８，３８９，４６９号
【特許文献１２】米国特許第７，５６９，２２３号
【特許文献１３】米国特許第７，５８２，２９１号
【特許文献１４】米国特許第８，１０５，５８５号
【特許文献１５】国際公開第２０１０／００２９５９号
【特許文献１６】米国特許第８，８４０，９００号
【特許文献１７】国際公開第２０１２／１４５６３０号
【特許文献１８】米国特許第９，０３４，３２２号
【特許文献１９】国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／３４４５６号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Fischetti, V.A. (2008) Curr Opinion Microbiol 11:393-400
【非特許文献２】Nelson, D.L. et al (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98:4107-4112
【非特許文献３】Loeffler, J. M. et al (2001) Science 294: 2170-2172
【非特許文献４】Gilmer DB et al (2013) Antimicrob Agents Chemother Epub 2013 April 9 [PMID 23571534]
【発明の概要】
【００１２】
一般的態様では、本発明は、ヒト血液中の潜在的抗微生物因子と相互作用し、溶菌を強化する溶解素、特にＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）溶解素を含むＳＨ３型結合ドメインを有する溶解素（複数の場合もある）ポリペプチドの付加的な新規の能力の特定及び特性評価に関する。本発明は、自身の内因性抗菌活性、特に抗ブドウ球菌活性を有しないか、又はそれが限られる血液成分との相乗作用を示し、その活性化をもたらすことにより、最大殺菌活性を可能にする溶解素ポリペプチド、特にＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）溶解素を含むＳＨ３型結合ドメインを有する溶解素（複数の場合もある）ポリペプチドの独自の特性に関する。
【００１３】
本願は、血液成分タンパク質、特に血清アルブミン及びリゾチーム、特にヒト血清アルブミン及びヒトリゾチーム、並びに抗菌性溶菌ペプチド、特に溶解素の活性増強効果に関する。一態様では、血清アルブミンはヒト血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、イヌ血清アルブミン及びウマ血清アルブミンから選択される。血清アルブミン、特にヒト血清アルブミンは、溶解素ポリペプチド、特にＳＨ−３型結合ドメインを有する溶解素ポリペプチド、例えばＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）溶解素、Ｓａｌ溶解素、ＬｙｓＫ溶解素、リゾスタフィン、ｐｈｉｌｌ溶解素、ＬｙｓＨ５溶解素、ＭＶ−Ｌ溶解素、ＬｙｓＧＨ１５溶解素及びＡＬＥ−１溶解素、特にＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）溶解素から選択される溶解素ポリペプチドの抗菌活性を増強するか、又は他の形で促進する。一態様では、リゾチームはヒトリゾチームである。リゾチーム、特にヒトリゾチームは、溶解素ポリペプチド、特にＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）溶解素の抗菌活性を増強するか、又は他の形で促進するように働く。一態様では、溶解素ポリペプチド、特にＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）溶解素ポリペプチドとヒトリゾチームとの組合せは、グラム陽性細菌を死滅させるように相乗的に作用する。
【００１４】
本発明の一態様では、溶解素ポリペプチド（複数の場合もある）と１つ以上の血液成分タンパク質との組合せが提供される。本発明の一態様では、溶解素ポリペプチド（複数の場合もある）と、血清アルブミン及びリゾチームから選択される１つ以上の血液成分タンパク質との組合せが提供される。一態様では、ＳＨ３型結合ドメインを有する溶解素ポリペプチドと、血清アルブミン及びリゾチームから選択される１つ以上の血液成分タンパク質との組合せが提供される。特定の態様では、ＳＨ３型結合ドメインを有し、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）溶解素、Ｓａｌ溶解素、ＬｙｓＫ溶解素、リゾスタフィン、ｐｈｉｌｌ溶解素、ＬｙｓＨ５溶解素、ＭＶ−Ｌ溶解素、ＬｙｓＧＨ１５溶解素及びＡＬＥ−１溶解素、又はブドウ球菌属を含むグラム陽性細菌に結合することが可能なその有効変異体から選択される溶解素ポリペプチドと、血清アルブミン及びリゾチームから選択される１つ以上の血液成分タンパク質とを含む組成物又は組合せが提供される。特定の態様では、ＳＨ３型結合ドメインを有し、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）溶解素、Ｓａｌ溶解素、ＬｙｓＫ溶解素、リゾスタフィン、又はブドウ球菌属を含むグラム陽性細菌に結合することが可能なその有効変異体から選択される溶解素ポリペプチドと、血清アルブミン及びリゾチームから選択される１つ以上の血液成分タンパク質とを含む組成物又は組合せが提供される。
【００１５】
本発明の一態様では、１つ以上の血液成分が溶解素ポリペプチド（複数の場合もある）の非存在下で内因性抗菌活性を有しないか、又は内因性抗菌活性が限られる、溶解素ポリペプチド（複数の場合もある）と１つ以上の血液成分タンパク質との相乗的な組合せが提供される。本発明の一態様では、溶解素ポリペプチド（複数の場合もある）と１つ以上の血液成分タンパク質との組合せは、グラム陽性細菌、特にブドウ球菌属細菌に対して相乗的な死滅活性を有する。本発明の一態様では、溶解素ポリペプチド（複数の場合もある）と、血清アルブミン及びリゾチームから選択される１つ以上の血液成分タンパク質との相乗的な組合せが提供される。一態様では、ＳＨ３型結合ドメインを有する溶解素ポリペプチドと、血清アルブミン及びリゾチームから選択される１つ以上の血液成分タンパク質との相乗的な組合せが提供される。特定の態様では、ＳＨ３型結合ドメインを有し、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）溶解素、Ｓａｌ溶解素、ＬｙｓＫ溶解素、リゾスタフィン、又はブドウ球菌属を含むグラム陽性細菌に結合することが可能なその有効変異体から選択される溶解素ポリペプチドと、血清アルブミン及びリゾチームから選択される１つ以上の血液成分タンパク質とを含む組成物又は相乗的な組合せが提供される。一態様では、組成物又は組合せは、例えばオレエート及びパルミテートから選択される１つ以上の血清脂肪酸を更に含む。
【００１６】
本発明の一態様では、リゾチーム、特にヒトリゾチームは、溶解素ポリペプチドＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）と組み合わせた場合に黄色ブドウ球菌細菌に対して効果的である。本発明の一態様では、リゾチーム、特にヒトリゾチームは、溶解素ポリペプチドと組み合わせた場合に、又は溶解素ポリペプチドの存在下で他の形で黄色ブドウ球菌細菌に対して効果的となる。一態様では、黄色ブドウ球菌細菌は、溶解素ポリペプチドＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）と組み合わせた場合の又は溶解素ポリペプチドＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）の存在下で他の形でのリゾチーム、特にヒトリゾチームに対して感受性を有する。
【００１７】
本発明の一態様では、リゾチーム、特にヒトリゾチームは、ＳＨ３型結合ドメインを有する溶解素ポリペプチドと組み合わせた場合に、又はＳＨ３型結合ドメインを有する溶解素ポリペプチドの存在下で他の形で黄色ブドウ球菌細菌に対して効果的となる。本発明の一態様では、血清アルブミン、特にヒト血清アルブミンは、ＳＨ３型結合ドメインを有する溶解素ポリペプチドの抗菌活性を増強するか、又は他の形で促進する。
【００１８】
本発明の特定の態様では、ＳＨ３型結合ドメインを有する溶解素ポリペプチドは、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）溶解素、Ｓａｌ溶解素、ＬｙｓＫ溶解素、リゾスタフィン、又はブドウ球菌属を含むグラム陽性細菌に結合することが可能なその有効変異体から選択される。本発明の特定の態様では、ＳＨ３型結合ドメインを有する溶解素ポリペプチドは、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）溶解素、Ｓａｌ溶解素、ＬｙｓＫ溶解素、リゾスタフィン、ｐｈｉｌｌ溶解素、ＬｙｓＨ５溶解素、ＭＶ−Ｌ溶解素、ＬｙｓＧＨ１５溶解素、ＡＬＥ−１溶解素、又はブドウ球菌属を含むグラム陽性細菌に結合することが可能なその有効変異体から選択される。
【００１９】
本願はペプチド、特に抗菌的に効果的なペプチド、特に溶菌ペプチドの最小阻止濃度を決定し、抗菌死滅有効性（antibacterial killing effectiveness）を評定する、血液成分を用いた改良方法及びアッセイに関する。本願は、動物における又はｉｎ  ｖｉｖｏでの、特にヒトにおける抗菌的に効果的なペプチド、特にＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）を含む溶菌ペプチドの抗菌死滅有効性及び／又は最小阻止濃度を正確に決定及び／又は予測するために血清アルブミン及び／又はリゾチームを添加する、ペプチド、特に抗菌的に効果的なペプチド、特に溶菌ペプチドの最小阻止濃度を決定し、抗菌死滅有効性を評定する方法及びアッセイを提供する。一態様では、ヒトリゾチームを添加する。一態様では、ヒト血清アルブミンを添加する。一態様では、ヒト、ウサギ、イヌ又はウマの血清アルブミンに由来するか、又は配列がそれに対応する血清アルブミンを添加する。一態様では、血清アルブミン及びリゾチームの両方を添加する。
【００２０】
本発明は、抗菌性ペプチド、特に溶菌ペプチドのＭＩＣを決定するか、又は抗菌活性及び／又は有効性を評価若しくは定量化するシステム又はアッセイに関し、該アッセイは、血清アルブミンを添加したアッセイ溶液、ブロス又は培地を用いて行われる。本発明は、抗菌性ペプチド、特に溶菌ペプチドのＭＩＣを決定するか、又は抗菌活性及び／又は有効性を評価若しくは定量化するシステム又はアッセイに関し、該アッセイは、リゾチームを添加したアッセイ溶液、ブロス又は培地を用いて行われる。本発明は、抗菌性ペプチド、特に溶菌ペプチドのＭＩＣを決定するか、又は抗菌活性及び／又は有効性を評価若しくは定量化するシステム又はアッセイに関し、該アッセイは、血清アルブミン及びリゾチームを添加したアッセイ溶液、ブロス又は培地を用いて行われる。本発明の一態様では、哺乳動物又は患者、特にヒトにおける溶菌ペプチド又は溶解素等の抗菌性ペプチドの細菌死滅有効性を正確に反映する抗菌性ペプチドの細菌死滅有効性を決定するアッセイが提供される。
【００２１】
一態様では、リゾチームはヒトリゾチームである。一態様では、血清アルブミンはヒト、ウサギ、イヌ、ウマ、ラット若しくは仔ウシ（ウシ／ウシ亜科）血清アルブミンであるか、又はアミノ酸配列がヒト、ウサギ、イヌ、ウマ、ラット若しくは仔ウシ（ウシ／ウシ亜科）血清アルブミンに対応する。一態様では、血清アルブミンはヒト、ウサギ、イヌ、若しくはウマ血清アルブミンであるか、又はアミノ酸配列がヒト、ウサギ、イヌ若しくはウマ血清アルブミンに対応する。一態様では、血清アルブミンは、天然のヒト、ウサギ、イヌ又はウマ血清アルブミンと相同であり、アミノ酸配列の点で天然のヒト、ウサギ、イヌ又はウマ血清アルブミンとは１つ以上のアミノ酸配列が異なる。本発明において使用される血清アルブミン又はリゾチームは、精製又は組換えであり得る。血清アルブミン又はリゾチームは、完全長タンパク質であっても、又はそのペプチド若しくはフラグメントであってもよく、そのペプチド若しくはフラグメントは、溶解素ポリペプチド活性増強効果に関して及び／又は溶解素ポリペプチド結合能に関して完全長タンパク質の活性を示す。血清アルブミン又はリゾチームは、完全長タンパク質であっても、又はそのペプチド若しくはフラグメントであってもよく、そのペプチド若しくはフラグメントは、溶解素ポリペプチド活性増強効果に関して及び／又は溶解素ポリペプチド結合能に関して、完全長タンパク質と比較して増大した活性を示す。一態様では、血清アルブミン、又はそのペプチド若しくはフラグメントのアミノ酸配列は、天然の配列とは異なる。一態様では、血清アルブミン、又はそのペプチド若しくはフラグメントのアミノ酸配列は、天然の配列とは異なり、より高い増強活性又は改善された溶解素ポリペプチド結合活性を有する。
【００２２】
本発明によると、溶菌ポリペプチド又は溶解素等の抗菌性ペプチドの細菌死滅活性を決定する方法であって、死滅活性がヒトにおける上記抗菌性ペプチドの細菌死滅を正確に模倣し、ヒト血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、イヌ血清アルブミン若しくはウマ血清アルブミン、又はその有効ペプチド若しくはフラグメントから単離された又はそれに対応する血清アルブミンを添加したブロス、アッセイ培地又は溶液中で抗菌性ペプチドを評価することを含む、方法が提供される。本発明の一態様では、溶菌ポリペプチド又は溶解素を、ヒト血清アルブミン、ウマ血清アルブミン、イヌ血清アルブミン又はウサギ血清アルブミンを添加した溶液、培地又はブロス中で感受性細菌に対して評価する。一態様では、還元剤をブロス、アッセイ培地又は溶液に付加的に添加する。一態様では、還元剤はＤＬ−ジチオトレイトール（ＤＴＴ）である。一態様では、還元剤はトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）である。一態様では、溶液、培地又はブロスに０．５ｍＭ  ＤＬ−ジチオトレイトール（ＤＴＴ）を添加する。
【００２３】
本発明によると、ペプチド、特に抗菌的に効果的なペプチド、特に溶菌ペプチド又は溶解素ペプチドを試験する、改良及び改善された微量液体希釈（ＢＭＤ）法及びアッセイが提供される。本発明の一態様では、ブロス又は培地に血清アルブミン、特にヒト血清アルブミン、ウマ血清アルブミン、イヌ血清アルブミン又はウサギ血清アルブミンを添加する、ブロス又は培地を評価に用いる改良ＢＭＤが提供される。本発明の一態様では、ブロス又は培地にリゾチーム、特にヒトリゾチームを添加する、ブロス又は培地を評価に用いる改良ＢＭＤが提供される。本発明の一態様では、ブロス又は培地に血清アルブミン、特にヒト血清アルブミン、ウマ血清アルブミン、イヌ血清アルブミン又はウサギ血清アルブミン、及びリゾチーム、特にヒトリゾチームを添加する、ブロス又は培地を評価に用いる改良ＢＭＤが提供される。
【００２４】
血清アルブミンの添加量は、ヒト血清との比較によって決定することができる。一態様では、血清アルブミンの添加量は、ヒト血液又は血清のサンプル中に通常存在する量と同等である。
【００２５】
リゾチームの添加量は、ヒトサンプル中に存在するリゾチームの通常の量との比較によって決定することができる。一態様では、リゾチームの添加量は、ヒト血液又は血清のサンプル中に通常存在する量と同等である。
【００２６】
一態様では、還元剤の量は０．１ｍＭ〜１０ｍＭである。一態様では、還元剤の量は、０．１ｍＭ〜５ｍＭである。一態様では、還元剤の量は０．１ｍＭ〜２ｍＭである。一態様では、還元剤の量は０．１ｍＭ〜１ｍＭである。一態様では、還元剤の量は０．１ｍＭ〜０．９ｍＭである。一態様では、還元剤の量は０．１ｍＭ〜０．６ｍＭである。一態様では、還元剤の量は０．２ｍＭ〜０．６ｍＭである。一態様では、還元剤の量は０．３ｍＭ〜０．６ｍＭである。一態様では、還元剤の量は０．４ｍＭ〜０．６ｍＭである。一態様では、還元剤の量は約０．５ｍＭである。一態様では、還元剤の量は０．２５ｍＭ〜１ｍＭである。一態様では、還元剤の量は１ｍＭ未満である。
【００２７】
一実施の形態では、本発明のアッセイ及び方法は、溶菌ポリペプチドの評定及び分析に用いられる。本発明の一態様では、添加剤（複数の場合もある）を用いたＢＭＤ法は、レンサ球菌属細菌に対して活性な溶菌ポリペプチドの細菌死滅有効性の決定に用いられる。本発明の一態様では、添加剤（複数の場合もある）を用いたＢＭＤ法は、レンサ球菌属及びブドウ球菌属細菌に対して活性な溶菌ポリペプチドの細菌死滅有効性の決定に用いられる。本発明の一態様では、添加剤（複数の場合もある）を用いたＢＭＤ法は、レンサ球菌属細菌に対して活性な溶菌ポリペプチドのＭＩＣ試験に用いられる。本発明の一態様では、添加剤（複数の場合もある）を用いたＢＭＤ法は、ブドウ球菌属細菌に対して活性な溶菌ポリペプチドのＭＩＣ試験に用いられる。本発明の一態様では、添加剤（複数の場合もある）を用いたＢＭＤ法は、レンサ球菌属及びブドウ球菌属細菌に対して活性な溶菌ポリペプチドのＭＩＣ試験に用いられる。本発明の一態様では、添加剤（複数の場合もある）を用いたＢＭＤ法は、エンテロコッカス属細菌に対して活性な溶菌ポリペプチドのＭＩＣ試験に用いられる。本発明の一態様では、添加剤（複数の場合もある）を用いたＢＭＤ法は、グラム陽性細菌に対する溶菌ポリペプチドのＭＩＣ試験に用いられる。本発明の一態様では、添加剤（複数の場合もある）を用いたＢＭＤ法は、グラム陽性細菌の２つ以上の種に対する溶菌ポリペプチドのＭＩＣ試験に用いられる。グラム陽性細菌は、レンサ球菌属、ブドウ球菌属、エンテロコッカス属及びリステリア属細菌から選択することができる。グラム陽性細菌は、抗生物質耐性細菌又は抗生物質感受性細菌であり得る。
【００２８】
本発明によると、溶解素ポリペプチド、特にＳＨ３型結合ドメインを有する溶解素ポリペプチドと、１つ以上の血清アルブミン、特にヒト血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、イヌ血清アルブミン、ウマ血清アルブミン、ラット血清アルブミン、仔ウシ（ウシ／ウシ亜科）血清アルブミン、又はその有効若しくは結合ペプチド若しくはフラグメント、及び／又はリゾチーム、特にヒトリゾチーム、又はその有効ペプチド若しくはフラグメントとを含む、有効抗菌性組成物等の新規の又は改良された配合物が提供される。本発明の一態様によると、溶解素ポリペプチド、特にＳＨ３型結合ドメインを有する溶解素ポリペプチドと、１つ以上の血清アルブミン、特にヒト血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、イヌ血清アルブミン若しくはウマ血清アルブミン、又はその有効若しくは結合ペプチド若しくはフラグメント、及び／又はリゾチーム、特にヒトリゾチーム、又はその有効ペプチド若しくはフラグメントとを含む、有効抗菌性組成物等の新規の又は改良された配合物が提供される。一態様では、溶解素ポリペプチド、特にＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）溶解素、Ｓａｌ溶解素、ＬｙｓＫ溶解素、リゾスタフィン、ｐｈｉｌｌ溶解素、ＬｙｓＨ５溶解素、ＭＶ−Ｌ溶解素、ＬｙｓＧＨ１５溶解素、ＡＬＥ−１溶解素、又はグラム陽性細菌、特にブドウ球菌属若しくはレンサ球菌属若しくはエンテロコッカス属細菌に結合し、及び／又はそれを死滅させることが可能なその有効変異体から選択される溶解素ポリペプチドと、１つ以上の血清アルブミン、特にヒト血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、イヌ血清アルブミン、ウマ血清アルブミン、ラット血清アルブミン若しくは仔ウシ（ウシ／ウシ亜科）血清アルブミン、若しくはその有効若しくは結合ペプチド若しくはフラグメント、又はリゾチーム、特にヒトリゾチーム、若しくはその有効ペプチド若しくはフラグメントとを含む、有効抗菌性組成物が提供される。別の態様では、溶解素ポリペプチド、特にＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）溶解素、Ｓａｌ溶解素、ＬｙｓＫ溶解素、リゾスタフィン、ｐｈｉｌｌ溶解素、ＬｙｓＨ５溶解素、ＭＶ−Ｌ溶解素、ＬｙｓＧＨ１５溶解素、ＡＬＥ−１溶解素、又はグラム陽性細菌、特にブドウ球菌属若しくはレンサ球菌属若しくはエンテロコッカス属細菌に結合し、及び／又はそれを死滅させることが可能なその有効変異体から選択される溶解素ポリペプチドと、１つ以上の血清アルブミン、特にヒト血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、イヌ血清アルブミン若しくはウマ血清アルブミン、若しくはその有効若しくは結合ペプチド若しくはフラグメント、又はリゾチーム、特にヒトリゾチーム、若しくはその有効ペプチド若しくはフラグメントとを含む、有効抗菌性組成物が提供される。一態様では、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）溶解素、又はブドウ球菌属及びレンサ球菌属細菌に結合し、及び／又はそれを死滅させるのに効果的なその変異体と、血清アルブミン、特にヒト血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、イヌ血清アルブミン又はウマ血清アルブミンとを含む抗菌性組成物が提供される。一態様では、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）溶解素、又はブドウ球菌属及びレンサ球菌属細菌に結合し、及び／又はそれを死滅させるのに効果的なその変異体と、リゾチーム、特にヒトリゾチームとを含む抗菌性組成物が提供される。一態様では、配合物は局所用又は吸入用配合物である。一態様では、組成物は、皮膚感染に対する又は肺感染若しくは経口感染に対する有効性のために配合される。
【００２９】
一態様では、溶解素ポリペプチド、特にＳＨ３型結合ドメインを有する溶解素ポリペプチドと、１つ以上の血清アルブミン、特にヒト血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、イヌ血清アルブミン、ウマ血清アルブミン、ラット血清アルブミン若しくは仔ウシ（ウシ／ウシ亜科）血清アルブミン、又はその有効若しくは結合ペプチド若しくはフラグメントとを含む、グラム陽性細菌の皮膚感染、特にブドウ球菌属又はレンサ球菌属細菌の皮膚感染を治療するための組成物の局所用配合物が提供される。別の態様では、溶解素ポリペプチド、特にＳＨ３型結合ドメインを有する溶解素ポリペプチドと、１つ以上の血清アルブミン、特にヒト血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、イヌ血清アルブミン若しくはウマ血清アルブミン、又はその有効若しくは結合ペプチド若しくはフラグメントとを含む、グラム陽性細菌の皮膚感染、特にブドウ球菌属又はレンサ球菌属細菌の皮膚感染を治療するための組成物の局所用配合物が提供される。一態様では、溶解素ポリペプチド、特にＳＨ３型結合ドメインを有する溶解素ポリペプチドと、リゾチーム、特にヒトリゾチーム、又はその有効ペプチド若しくはフラグメントとを含む、グラム陽性細菌の皮膚感染、特にブドウ球菌属又はレンサ球菌属細菌の皮膚感染を治療するための組成物の局所用配合物が提供される。一態様では、溶解素ポリペプチド、特にＳＨ３型結合ドメインを有する溶解素ポリペプチドと、１つ以上の血清アルブミン、特にヒト血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、イヌ血清アルブミン、ウマ血清アルブミン、ラット血清アルブミン若しくは仔ウシ（ウシ／ウシ亜科）血清アルブミン、又はその有効若しくは結合ペプチド若しくはフラグメントとを含む、グラム陽性細菌の皮膚感染、特にブドウ球菌属又はレンサ球菌属細菌の皮膚感染を治療するための組成物の吸入用の又は経口投与される配合物が提供される。別の態様では、溶解素ポリペプチド、特にＳＨ３型結合ドメインを有する溶解素ポリペプチドと、１つ以上の血清アルブミン、特にヒト血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、イヌ血清アルブミン若しくはウマ血清アルブミン、又はその有効若しくは結合ペプチド若しくはフラグメントとを含む、グラム陽性細菌の皮膚感染、特にブドウ球菌属又はレンサ球菌属細菌の皮膚感染を治療するための組成物の吸入用の又は経口投与される配合物が提供される。一態様では、溶解素ポリペプチド、特にＳＨ３型結合ドメインを有する溶解素ポリペプチドと、リゾチーム、特にヒトリゾチーム、又はその有効ペプチド若しくはフラグメントとを含む、グラム陽性細菌の皮膚感染、特にブドウ球菌属又はレンサ球菌属細菌の皮膚感染を治療するための組成物の吸入用の又は経口投与される配合物が提供される。特定の態様では、局所用又は吸入用配合物は、黄色ブドウ球菌感染の治療のためのものである。特定の態様では、局所用又は吸入用配合物は、抗生物質耐性黄色ブドウ球菌感染の治療のためのものである。一態様では、ＳＨ３型結合ドメインを有する溶解素ポリペプチドは、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）溶解素、Ｓａｌ溶解素、ＬｙｓＫ溶解素、リゾスタフィン、ｐｈｉｌｌ溶解素、ＬｙｓＨ５溶解素、ＭＶ−Ｌ溶解素、ＬｙｓＧＨ１５溶解素及びＡＬＥ−１溶解素から選択される。一態様では、ＳＨ３型結合ドメインを有する溶解素ポリペプチドは、ＰｌｙＳｓ２溶解素又はその有効変異体である。
【００３０】
配合物又は組成物中の血清アルブミンの量は、ヒト血清との比較によって決定することができる。一態様では、血清アルブミンの量は、ヒト血液又は血清のサンプル中に通常存在する量と同等である。
【００３１】
配合物又は組成物中のリゾチームの量は、ヒトサンプル中に存在するリゾチームの通常の量との比較によって決定することができる。一態様では、リゾチームの量は、ヒト血液又は血清のサンプル中に通常存在する量と同等である。
【００３２】
本発明の更なる態様は、血清アルブミン、特にヒト血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、イヌ血清アルブミン若しくはウマ血清アルブミンに操作可能に連結若しくは融合するか、又はリゾチーム、特にヒトリゾチームに操作可能に連結若しくは融合したＳＨ３結合ドメインを含むキメラ、二量体又は融合ペプチド又は溶解素に関する。一態様では、キメラ、二量体又は融合ペプチド又は溶解素は、少なくとも１つの触媒ドメインと、血清アルブミン若しくはリゾチーム、特にヒト血清アルブミン若しくはヒトリゾチーム、又はその活性若しくは結合フラグメント若しくはペプチドに操作可能に連結又は融合したＳＨ３結合ドメインとを含む。一態様では、その細菌結合フラグメント又はペプチドを含む、血清アルブミン、特にヒト血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、イヌ血清アルブミン、ウマ血清アルブミン、ラット血清アルブミン又は仔ウシ（ウシ／ウシ亜科）血清アルブミンに操作可能に連結又は融合したＳＨ３結合ドメインを含むキメラ、二量体又は融合ペプチドは、ブドウ球菌属又はレンサ球菌属細菌を含むグラム陽性細菌に効果的な治療剤、薬物又は他のペイロードの送達に用いることができる。別の態様では、その細菌結合フラグメント又はペプチドを含む血清アルブミン、特にヒト血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、イヌ血清アルブミン又はウマ血清アルブミンに操作可能に連結又は融合したＳＨ３結合ドメインを含むキメラ、二量体又は融合ペプチドは、ブドウ球菌属又はレンサ球菌属細菌を含むグラム陽性細菌に効果的な治療剤、薬物又は他のペイロードの送達に用いることができる。一態様では、治療剤、薬物又は他のペイロードはリゾチーム、又はキメラ若しくは二量体溶解素を含む他の抗菌性ペプチドの１つ以上であり得る。治療剤、薬物又は他のペイロードは、ＳＨ３結合ドメインに共有結合、融合又は操作可能に連結することができる。治療剤、薬物又は他のペイロードは、血清アルブミンに結合することが可能であり、血清アルブミン結合又は親和性により態様又はペイロードとすることができる。
【００３３】
一態様では、本発明は血清アルブミン、特にヒト血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、イヌ血清アルブミン、ウマ血清アルブミン、ラット血清アルブミン又は仔ウシ（ウシ／ウシ亜科）血清アルブミンのペプチド又は細菌結合フラグメント及び溶解素結合フラグメントに操作可能に連結又は融合した改良溶解素ポリペプチドを提供する。別の態様では、本発明は、血清アルブミン、特にヒト血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、イヌ血清アルブミン又はウマ血清アルブミンのペプチド又は細菌結合フラグメント及び溶解素結合フラグメントに操作可能に連結又は融合した改良溶解素ポリペプチドを提供する。一態様では、溶解素ＰｌｙＳｓ２又はその有効変異体は、血清アルブミン、特にヒト血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、イヌ血清アルブミン、ウマ血清アルブミン、ラット血清アルブミン、仔ウシ（ウシ／ウシ亜科）血清アルブミン、又は血清アルブミンのペプチド若しくはフラグメントに融合するか、又は共有結合的に付着し、該ペプチド又はフラグメントは、ブドウ球菌属又はレンサ球菌属細菌を含む細菌細胞に結合することが可能である。一態様では、溶解素ＰｌｙＳｓ２又はその有効変異体は、血清アルブミン、特にヒト血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、イヌ血清アルブミン若しくはウマ血清アルブミン、又は血清アルブミンのペプチド若しくはフラグメントに融合するか、又は共有結合的に付着し、該ペプチド又はフラグメントは、ブドウ球菌属又はレンサ球菌属細菌を含む細菌細胞に結合することが可能である。一態様では、溶解素ポリペプチドは、ＳＨ３型結合ドメインを有する溶解素ポリペプチドであり、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）溶解素、Ｓａｌ溶解素、ＬｙｓＫ溶解素、リゾスタフィン、ｐｈｉｌｌ溶解素、ＬｙｓＨ５溶解素、ＭＶ−Ｌ溶解素、ＬｙｓＧＨ１５溶解素及びＡＬＥ−１溶解素から選択される。一態様では、溶解素ポリペプチドはＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）である。
【００３４】
一態様では、本発明はリゾチーム、特にヒトリゾチームのペプチド又は細菌結合フラグメント及び溶解素結合フラグメントに操作可能に連結又は融合した改良溶解素ポリペプチドを提供する。一態様では、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）溶解素、Ｓａｌ溶解素、ＬｙｓＫ溶解素、リゾスタフィン、ｐｈｉｌｌ溶解素、ＬｙｓＨ５溶解素、ＭＶ−Ｌ溶解素、ＬｙｓＧＨ１５溶解素及びＡＬＥ−１溶解素、又はその有効死滅変異体から選択される溶解素ポリペプチドは、リゾチーム、特にヒトリゾチーム、又はグラム陽性細菌のペプチドグリカンを切断することが可能なリゾチームのフラグメントに融合するか、又は共有結合的に付着する。一態様では、溶解素ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）、又はブドウ球菌属及びレンサ球菌属細菌を死滅させることが可能なその有効変異体は、リゾチーム、特にヒトリゾチーム、又はグラム陽性細菌のペプチドグリカンを切断することが可能なリゾチームのフラグメントに融合するか、又は共有結合的に付着する。
【００３５】
本発明によると、細菌とグラム陽性細菌を死滅させるのに効果的な量の、ＳＨ３型結合ドメインを有する単離溶解素ポリペプチドを含む組成物とを接触させ、細菌と血清アルブミン、特にヒト血清アルブミン、及び／又はリゾチーム、特にヒトリゾチームとを更に接触させる工程を含む、グラム陽性細菌を死滅させる方法が提供される。一態様では、細菌とグラム陽性細菌を死滅させるのに効果的な量の、ＳＨ３型結合ドメインを有する単離溶解素ポリペプチドを含む組成物とを接触させ、細菌と血清アルブミン、特にヒト血清アルブミン、及び／又はリゾチーム、特にヒトリゾチームとを更に接触させる工程を含む、グラム陽性細菌の集団を減少させる方法が提供される。一態様では、細菌とグラム陽性細菌を死滅させるのに効果的な量の、ＳＨ３型結合ドメインを有する単離溶解素ポリペプチドを含む組成物とを接触させるか、又はグラム陽性細菌を死滅させるのに効果的な量の、ＳＨ３型結合ドメインを有する単離溶解素ポリペプチドを含む組成物をヒトに投与し、細菌と血清アルブミン、特にヒト血清アルブミン、及び／又はリゾチーム、特にヒトリゾチームとを更に接触させるか、又は血清アルブミン、特にヒト血清アルブミン、及び／又はリゾチーム、特にヒトリゾチームをヒトに更に投与する工程を含む、ヒトにおける抗生物質耐性黄色ブドウ球菌感染を治療する方法が提供される。該方法によると、血清アルブミン及び溶解素ポリペプチドを順次若しくは同時に投与してもよく、又は溶解素ポリペプチドと血清アルブミンとを含む組成物中で投与してもよい。上記方法によると、リゾチーム及び溶解素ポリペプチドを順次若しくは同時に投与してもよく、又は溶解素ポリペプチドとリゾチームとを含む組成物中で投与してもよい。本明細書の方法の一態様では、特にオレエート及びパルミテートの１つ以上から選択される１つ以上の血清脂肪酸を更に接触させるか、又は投与する。
【００３６】
本発明によると、細菌とグラム陽性細菌を死滅させるのに効果的な量の、ＳＨ３型結合ドメインを有する単離溶解素ポリペプチドを含む組成物とを接触させることを含み、組成物が、血清アルブミン及びリゾチームから選択され、特にヒト血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、イヌ血清アルブミン、ウマ血清アルブミン、ラット血清アルブミン及び仔ウシ（ウシ／ウシ亜科）血清アルブミン、並びにヒトリゾチームから選択される１つ以上の血液成分を更に含む、グラム陽性細菌、特にブドウ球菌属及び／又はレンサ球菌属細菌を相乗的に死滅させる方法が提供される。一態様では、細菌とグラム陽性細菌を死滅させるのに効果的な量の、ＳＨ３型結合ドメインを有する単離溶解素ポリペプチドを含む組成物とを接触させることを含み、組成物が、血清アルブミン及びリゾチームから選択され、特にヒト血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、イヌ血清アルブミン、ウマ血清アルブミン及びヒトリゾチームから選択される１つ以上の血液成分を更に含む、グラム陽性細菌、特にブドウ球菌属及び／又はレンサ球菌属細菌を相乗的に死滅させる方法が提供される。本発明による一態様では、細菌とグラム陽性細菌を死滅させるのに効果的な量の、ＳＨ３型結合ドメインを有する単離溶解素ポリペプチドを含む組成物とを接触させることを含み、組成物が、血清アルブミン及びリゾチーム、特にヒト血清アルブミン及びヒトリゾチームから選択される１つ以上の血液成分を更に含む、グラム陽性細菌、特にブドウ球菌属及び／又はレンサ球菌属細菌を相乗的に死滅させる方法が提供される。本発明の一態様では、細菌とグラム陽性細菌を死滅させるのに効果的な量の、ＳＨ３型結合ドメインを有する単離溶解素ポリペプチドを含む組成物とを接触させる工程を含み、組成物が血清アルブミン及びリゾチーム、特にヒト血清アルブミン及びヒトリゾチームから選択される１つ以上の血液成分を更に含む、黄色ブドウ球菌細菌を相乗的に死滅させる方法が提供される。
【００３７】
本発明によると、細菌と、グラム陽性細菌を死滅させるのに効果的な量の、ＳＨ３型結合ドメインを有する単離溶解素ポリペプチドを含み、血清アルブミンを更に含む組成物とを接触させ、その後、細菌とリゾチーム、特にヒトリゾチームとを更に接触させる工程を含む、グラム陽性細菌を死滅させる方法が提供される。本発明の一態様では、細菌と、グラム陽性細菌を死滅させるのに効果的な量の、ＳＨ３型結合ドメインを有する単離溶解素ポリペプチドを含み、血清アルブミンを更に含む組成物とを接触させ、その後、細菌とリゾチーム、特にヒトリゾチームとを更に接触させる工程を含む、リゾチームに抵抗性を示すか、又はリゾチームに非感受性の黄色ブドウ球菌細菌を死滅させる方法が提供される。
【００３８】
本発明の一態様では、細菌と、グラム陽性細菌を死滅させるのに効果的な量の、ＳＨ３型結合ドメインを有する単離溶解素ポリペプチドを含む組成物とを接触させ、その後、細菌とリゾチーム、特にヒトリゾチームとを更に接触させる工程を含む、リゾチームに抵抗性を示すか、又はリゾチームに非感受性の黄色ブドウ球菌細菌を死滅させる方法が提供される。その一態様では、血清アルブミン、特にヒト血清アルブミンを付加的に投与する。一態様では、血清アルブミンのレベル及び／又は黄色ブドウ球菌細菌への天然血清アルブミンの結合を初めに評定又は評価する。血清アルブミンが細菌に結合する場合、リゾチームを接触させ、続いて溶解素ポリペプチドを投与するか、又は例えば溶解素とリゾチームとを含む組合せ組成物により組み合わせて投与する。血清アルブミンが細菌に結合しないか、又は適切に結合しない場合、血清アルブミンを初めに投与し、続いて溶解素ポリペプチドを投与した後にリゾチームを投与するか、又は代替的には、血清アルブミンを初めに投与した後、リゾチームを、例えば溶解素とリゾチームとを含む組合せ組成物により組み合わせて投与する。別の態様では、血清アルブミンを溶解素ポリペプチドと同時に、順次に又は組み合わせて投与し、続いてリゾチームを投与する。
【００３９】
方法の一態様では、血清アルブミンはヒト、ウサギ、イヌ、ウマ、ラット又は仔ウシ（ウシ／ウシ亜科）血清アルブミンであり得る。方法の一態様では、血清アルブミンはヒト、ウサギ、イヌ又はウマ血清アルブミンであり得る。方法の一態様では、血清アルブミンはヒト血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、イヌ血清アルブミン、ウマ血清アルブミン、ラット血清アルブミン若しくは仔ウシ（ウシ／ウシ亜科）血清アルブミン、又はその活性若しくは細菌結合フラグメント若しくはペプチド、特に血清アルブミンの黄色ブドウ球菌結合フラグメント若しくはペプチドである。方法の一態様では、血清アルブミンはヒト血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、イヌ血清アルブミン若しくはウマ血清アルブミン、又はその活性若しくは細菌結合フラグメント若しくはペプチド、特に血清アルブミンの黄色ブドウ球菌結合フラグメント若しくはペプチドである。方法の一態様では、血清アルブミンは、ヒト血清アルブミン、又はその活性若しくは細菌結合フラグメント若しくはペプチド、特に血清アルブミン、特にヒト血清アルブミンの黄色ブドウ球菌結合フラグメント若しくはペプチドである。方法の一態様では、リゾチームはヒトリゾチーム、又はその活性若しくは溶菌フラグメント若しくはペプチドである。一態様では、溶解素ポリペプチドは、ＳＨ３型結合ドメインを含む。一態様では、溶菌ポリペプチドは、グラム陽性細菌に結合することが可能なＳＨ３型結合ドメインを含むキメラ又は融合ペプチドである。一態様では、ＳＨ３型結合ドメインを有する溶解素ポリペプチドは、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）溶解素、Ｓａｌ溶解素、ＬｙｓＫ溶解素、リゾスタフィン、ｐｈｉｌｌ溶解素、ＬｙｓＨ５溶解素、ＭＶ−Ｌ溶解素、ＬｙｓＧＨ１５溶解素及びＡＬＥ−１溶解素から選択される。一態様では、溶解素ポリペプチドは、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）である。一態様では、溶菌ポリペプチドは、グラム陽性細菌、特にブドウ球菌属細菌に結合することが可能なＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）ＳＨ３型結合ドメインを含むＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）のキメラ又は融合ペプチドである。
【００４０】
一態様では、本発明の構成要素、方法又はアッセイは、グラム陽性細菌に対する溶菌ポリペプチド、特に、例えばＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）ポリペプチド、又はその変異体若しくは誘導体を含む、ＳＨ３型結合ドメインを含む溶解素に関して用いられる。一態様では、本発明の構成要素、方法又はアッセイは、抗生物質耐性細菌に対する、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）ポリペプチド、又はその変異体若しくは誘導体を含む溶菌ポリペプチドに関して用いられる。一態様では、本発明の構成要素、方法又はアッセイは、レンサ球菌属及びブドウ球菌属細菌に対する、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）ポリペプチド、又はその変異体若しくは誘導体を含む溶菌ポリペプチドについて用いられる。一態様では、本発明の構成要素、方法又はアッセイは、抗生物質耐性レンサ球菌属及び／又はブドウ球菌属細菌に対する、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）ポリペプチド、又はその変異体若しくは誘導体を含む溶菌ポリペプチドに関して用いられる。一態様では、ＳＨ３型結合ドメインを有する溶解素ポリペプチドは、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）溶解素、Ｓａｌ溶解素、ＬｙｓＫ溶解素、リゾスタフィン、ｐｈｉｌｌ溶解素、ＬｙｓＨ５溶解素、ＭＶ−Ｌ溶解素、ＬｙｓＧＨ１５溶解素及びＡＬＥ−１溶解素から選択される。一態様では、溶菌ポリペプチドはＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）、又はその誘導体若しくは変異体である。一態様では、ポリペプチドは、本明細書に提示される配列を含む。
【００４１】
溶菌ポリペプチド、特にＳＨ３結合ドメインを有する溶菌ポリペプチド、特に溶菌ポリペプチドＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）、Ｓａｌ、リゾスタフィンが、血清アルブミン及び／又はリゾチームの添加と組み合わせた場合に、又はそれを含むアッセイにおいて顕著に活性が高いことが見出された。抗菌性溶菌ポリペプチド、特に例示的な溶菌ポリペプチドＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）、Ｓａｌ、リゾスタフィンは、ヒト血清アルブミン（並びに他の種、特にウマ、イヌ及びウサギの血清アルブミン、又は他の種、特にウマ、イヌ及びウサギの血清アルブミンに対応する血清アルブミン）の存在下及び／又はリゾチーム、特にヒトリゾチームの存在下で、血清アルブミンを添加しないカチオン調整ブロス等のブロス中よりも活性が高い（特に最大３２倍〜６４倍〜１００倍より活性が高い）。
【００４２】
本発明の一態様では、レンサ球菌属又はブドウ球菌属細菌に由来する及び／又はレンサ球菌属及び／又はブドウ球菌属細菌に対して効果的なバクテリオファージ溶解素が本発明の方法、アッセイ、組成物、配合物及び／又は構築物に用いられる。特定の態様では、溶解素はＳＨ３型細菌結合ドメインを含む。ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）溶解素、Ｓａｌ溶解素、ＬｙｓＫ溶解素、リゾスタフィン、ｐｈｉｌｌ溶解素、ＬｙｓＨ５溶解素、ＭＶ−Ｌ溶解素、ＬｙｓＧＨ１５溶解素及びＡＬＥ−１溶解素、特にＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）溶解素を含む、本発明に用いられる又は適用可能な例示的な溶解素ポリペプチド（複数の場合もある）が本明細書に提供される。かかる一態様では、溶解素は、本明細書で実証されるように黄色ブドウ球菌の株及び細菌を死滅させることが可能である。一態様では、溶解素は、ブドウ球菌属及びレンサ球菌属細菌を死滅させることが可能である。一態様では、溶解素はメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（ＶＲＳＡ）、ダプトマイシン耐性黄色ブドウ球菌（ＤＲＳＡ）及びリネゾリド耐性黄色ブドウ球菌（ＬＲＳＡ）等の抗生物質耐性黄色ブドウ球菌に対して効果的である。溶解素は、バンコマイシン中間耐性（intermediate-sensitivity）黄色ブドウ球菌（ＶＩＳＡ）に対して効果的であり得る。
【００４３】
かかる一態様では、溶解素はＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）溶解素であり、本明細書で実証されるように黄色ブドウ球菌の株及び細菌を死滅させることが可能である。一態様では、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）溶解素は、ブドウ球菌属及びレンサ球菌属細菌を死滅させることが可能である。ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）はメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（ＶＲＳＡ）、ダプトマイシン耐性黄色ブドウ球菌（ＤＲＳＡ）及びリネゾリド耐性黄色ブドウ球菌（ＬＲＳＡ）等の抗生物質耐性黄色ブドウ球菌に対して効果的である。ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）は、バンコマイシン中間耐性黄色ブドウ球菌（ＶＩＳＡ）に対して効果的である。
【００４４】
単離溶解素ポリペプチドは、本明細書に提示される溶解素アミノ酸配列、又は本明細書のポリペプチドに対して少なくとも８０％の同一性、８５％の同一性、９０％の同一性、９５％の同一性若しくは９９％の同一性を有し、グラム陽性細菌を死滅させるのに効果的なその変異体を含み得る。単離ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）溶解素ポリペプチドは、本明細書に提示されるＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）アミノ酸配列（配列番号３）、又は本明細書のポリペプチド（配列番号３）に対して少なくとも８０％の同一性、８５％の同一性、９０％の同一性、９５％の同一性若しくは９９％の同一性を有し、ブドウ球菌属及びレンサ球菌属細菌を死滅させるのに効果的なその変異体を含み得る。単離Ｓａｌ溶解素ポリペプチドは、本明細書に提示されるＳａｌ１アミノ酸配列（配列番号５）、又は本明細書のポリペプチド（配列番号５）に対して少なくとも８０％の同一性、８５％の同一性、９０％の同一性、９５％の同一性若しくは９９％の同一性を有し、ブドウ球菌属細菌を死滅させるのに効果的なその変異体を含み得る。単離ＬｙｓＫ溶解素ポリペプチドは、本明細書に提示されるＬｙｓＫアミノ酸配列（配列番号６）、又は本明細書のポリペプチド（配列番号６）に対して少なくとも８０％の同一性、８５％の同一性、９０％の同一性、９５％の同一性若しくは９９％の同一性を有し、ブドウ球菌属細菌を死滅させるのに効果的なその変異体を含み得る。単離リゾスタフィン溶解素ポリペプチドは、本明細書に提示されるリゾスタフィンアミノ酸配列（配列番号７）、又は本明細書のポリペプチド（配列番号７）に対して少なくとも８０％の同一性、８５％の同一性、９０％の同一性、９５％の同一性若しくは９９％の同一性を有し、ブドウ球菌属細菌若しくはブドウ球菌属及びレンサ球菌属細菌を死滅させるのに効果的なその変異体を含み得る。単離溶解素ポリペプチドは、本明細書で言及されるように、本明細書の又は既知の又は当該技術分野で認識されるポリペプチドに対して少なくとも８０％の同一性、８５％の同一性、９０％の同一性、９５％の同一性又は９９％の同一性を有し、ブドウ球菌属細菌、又はブドウ球菌属及びレンサ球菌属細菌を死滅させるのに効果的なその変異体を含む、本明細書に提示されるか、又は当該技術分野で既知の溶解素ポリペプチドアミノ酸配列を含み得る。
【００４５】
任意のかかる上記の方法（単数又は複数）では、細菌は黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）、スタフィロコッカス・シミュランス（Staphylococcus simulans）、豚レンサ球菌（Streptococcus suis）、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）、ストレプトコッカス・エクイ（Streptococcus equi）、ストレプトコッカス・エクイ・ズー（Streptococcus equi zoo）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Streptococcus agalactiae）（ＧＢＳ）、化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）（ＧＡＳ）、ストレプトコッカス・サングイニス（Streptococcus sanguinis）、ストレプトコッカス・ゴルドニ（Streptococcus gordonii）、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ（Streptococcus dysgalactiae）、Ｇ群レンサ球菌、Ｅ群レンサ球菌、エンテロコッカス・フェカーリス（Enterococcus faecalis）及び肺炎レンサ球菌（Streptococcus pneumonia）から選択することができる。
【００４６】
本発明の方法のいずれかによると、細菌は抗生物質耐性細菌であり得る。細菌はメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、バンコマイシン中間耐性黄色ブドウ球菌（ＶＩＳＡ）、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（ＶＲＳＡ）、ダプトマイシン耐性黄色ブドウ球菌（ＤＲＳＡ）又はリネゾリド耐性黄色ブドウ球菌（ＬＲＳＡ）であり得る。感受性細菌は、特にヒトに対する臨床的に関連する又は病原性の細菌であり得る。方法（複数の場合もある）の一態様では、溶解素ポリペプチド（複数の場合もある）はブドウ球菌属、レンサ球菌属、エンテロコッカス属及びリステリア属細菌株を死滅させるのに効果的である。
【００４７】
本明細書に提示される方法及び組成物の付加的な態様又は実施の形態では、別の異なるブドウ球菌に特異的な溶解素が単独で、又は本明細書に提示及び記載されるＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）溶解素を含む、本明細書に提示される溶解素と組み合わせて本明細書で使用される。本明細書に提示される方法及び組成物のかかる一態様又は実施の形態では、Ｓａｌ溶解素、ＬｙｓＫ溶解素、リゾスタフィン、ｐｈｉｌｌ溶解素、ＬｙｓＨ５溶解素、ＭＶ−Ｌ溶解素、ＬｙｓＧＨ１５溶解素及びＡＬＥ−１溶解素から選択される１つ以上の溶解素が単独で、又は本明細書に提示及び記載されるＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）溶解素と組み合わせて本明細書で使用される。本明細書に提示される方法及び組成物の一態様又は実施の形態では、Ｓａｌ溶解素、ＬｙｓＫ溶解素、リゾスタフィン、ｐｈｉｌｌ溶解素、ＬｙｓＨ５溶解素、ＭＶ−Ｌ溶解素、ＬｙｓＧＨ１５溶解素及びＡＬＥ−１溶解素から選択される１つ以上の溶解素を本明細書に提示及び記載されるように互いに組み合わせる。本明細書に提示される方法及び組成物の一態様又は実施の形態では、Ｓａｌ溶解素、ＬｙｓＫ溶解素、リゾスタフィン、ｐｈｉｌｌ溶解素、ＬｙｓＨ５溶解素、ＭＶ−Ｌ溶解素、ＬｙｓＧＨ１５溶解素及びＡＬＥ−１溶解素から選択される溶解素の１つ以上のＳＨ３結合ドメインを、本明細書に提示及び記載されるものを含む、別の溶解素の少なくとも１つの他の触媒ドメインと組み合わせて使用する。
【００４８】
添付の例示的な図面を参照して進められる以下の記載を検討することにより他の目的及び利点が当業者に明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１Ａ−１Ｄ】ヒト血液マトリックスにおけるＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）の溶菌活性の増強を示す図である。（Ａ）１６人の個体に由来するヒト血清及び４つのプールしたサンプル、（Ｂ）１０人の個体のヒト全血、（Ｃ）ＭＨＢ（１０回の反復試験）、並びに（Ｄ）プールしたＢＡＬＢ／ｃマウス血清中で試験した黄色ブドウ球菌株ＭＷ２に対するＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）の複合時間死滅曲線をバッファー対照と比較する。平均値（±ＳＥＭ）を各時点について示す。
【図２Ａ−２Ｎ】様々な指定の黄色ブドウ球菌株に対するヒト血液の効果の調査を示す図である。ＭＨＢ又はプールしたヒト血清のいずれかにおいて５回の反復試験を用いて試験した指定の黄色ブドウ球菌株に対するＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）の複合時間死滅曲線をバッファー対照と比較する。平均値（±ＳＥＭ）を各時点について示す。
【図３Ａ−３Ｄ】別の溶解素様タンパク質（リゾスタフィン）及び小分子抗生物質（バンコマイシン）に対するヒト血液の効果を示す図である。黄色ブドウ球菌株ＭＷ２に対する指定の化合物についての複合時間死滅曲線をバッファー対照と比較する。Ａ及びＢ、それぞれＭＨＢ又はプールしたヒト血清のいずれかにおいて５つの反復試験サンプルを用いて試験したリゾスタフィン。Ｃ及びＤ、それぞれＭＨＢ又はプールしたヒト血清のいずれかにおいて５つの反復試験サンプルを用いて試験したバンコマイシン。平均値（±ＳＥＭ）を各時点について示す。
【図４】動物血液マトリックスにおけるＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）の溶菌活性の増強を示す図である。（Ａ）ウシ胎児血清（３つの異なるロットについて各々３回の反復試験）、（Ｂ）Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット血清（serum blood）（２つのプールしたロットについて各々５回の反復試験）、（Ｃ）ウサギ血清（２つのプールした混合種ロットについて各々５回の反復試験）及び（Ｄ）８匹の個々の動物に由来するビーグル犬血清中で試験した黄色ブドウ球菌株ＭＷ２に対するＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）の複合時間死滅曲線をバッファー対照と比較する。平均値（±ＳＥＭ）を各時点について示す。
【図５】異なるヒト血液マトリックスにおける黄色ブドウ球菌ＭＷ２についてのＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）のＭＩＣ分布を示す図である。個々の及びプールした全血（ｎ＝１３）、血清（ｎ＝３２）及び血漿（ｎ＝１５）を含む複数の異なるサンプルにおいて行った分析について柱状図を示す。各サンプルを補足の表１に説明する。ＭＩＣをｘ軸上にプロットし、特定のＭＩＣを有する患者サンプルの数をｙ軸上にプロットする。
【図６Ａ−６Ｄ】ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）がヒト血清中で他の抗微生物剤と強力な相乗作用を示すことを実証する図である。黄色ブドウ球菌株ＭＷ２に対する指定の単一の作用物質（括弧内の濃度）についての複合時間死滅曲線をバッファー対照及び両方の作用物質の組合せ（各々指定の単一の作用物質の濃度）の両方と比較する。三連で行ったアッセイに基づく平均値（±ＳＥＭ）を各時点について示す。Ａ〜Ｃ、一定量のＤＡＰの存在下にてＭＩＣ以下の量で試験したＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）。Ｄ、ＭＩＣ以下の量を用いて試験したＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）及びリゾスタフィン。
【図７】１８時間の時点でのＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ（商標）を用いた黄色ブドウ球菌ＭＷ２の比色ＭＩＣ決定を示す図である。２時間にわたる各ウェルへのＡｌａｍａｒ  ｂｌｕｅ色素（レザズリン）の添加により、ｌｏｇ１０希釈範囲にわたる生存性（ピンク色）及び細胞死（青色）の評定が可能となる。Ａ、ＭＨＢ、ＨｕＳ及びＭｕＳにおける生存性アッセイ。サンプルを非処理の又はプロテイナーゼＫ−アガロースビーズで３時間前処理したＨｕＳ中でアッセイした。プロテアーゼのキャリーオーバーの対照として、プロテイナーゼＫで前処理した血清を分析前に非処理血清中で３：４に希釈した。Ｂ、様々な温度で３０分間前処理したＨｕＳにおける生存性アッセイ。Ｃ、希釈剤としてＭＨＢを用いるＨｕＳと組み合わせたＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）のチェッカーボード（Checkerboard）分析。赤色の四角は、増強効果（enhancer effect）が弱まったＨｕＳ希釈率を示す。
【図８Ａ−８Ｃ】ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）活性に対するＨｕＬＹＺ及びＨＳＡの効果を示す図である。Ａは、ＭＩＣ以下の量の溶解素と様々なｈｕＬＹＺ濃度とを組み合わせた時間−死滅アッセイを提示する。Ｂ及びＣは、ＨｕＬＹＺ（Ｂ）及びＨＳＡ（Ｃ）の添加による処理培養物における光学密度の喪失に基づく第２のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを示す。
【図９】抗ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）抗体を用いたウエスタンブロット研究を示す図である。
【図１０】ｒＨＳＡの存在下及び非存在下におけるＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）の標識化（赤色）を示す図である。データ（示さない）では、ＨＳＡの有無にかかわらず、２５μｇ／ｍｌのＰｌｙＧＧＦＰ又はＰｌｙＣＡＦはいずれも標識されない。
【図１１】その後のＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）の標識化（赤色）に対する異なる血清型（及びＭＨＢ）のプレインキュベーションの影響を示す図である。
【図１２】ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）（１倍〜０．２５倍ＭＩＣ）の存在下及び非存在下におけるＨｕＬＹＺによる標識化（緑色）を示す図である。
【図１３】ヒト血清（ＨｕＳ）又はＭＨＢのいずれかにおいて１５分間ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）で処理した黄色ブドウ球菌株ＭＷ２のＴＥＭ分析を示す図である。
【図１４Ａ−１４Ｂ】ダプトマイシンに加えた様々なＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）投与計画についてのラット（Ａ）及びウサギ（Ｂ）感染性心内膜炎（ＩＥ）モデルにおける有効性を示す図である。データを各用量群についての処理計画対平均ｌｏｇ１０  ＣＦＵ／ｇ（組織）としてプロットする。中央値±ＳＥＭも示す。
【図１５】ラット及びウサギにおける様々なＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）投与計画についてのＡＵＣ値及びＡＵＣ用量比例性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
本発明によると、当業者の技能の範囲内の従来の分子生物学、微生物学及び組換えＤＮＡ法を用いることができる。かかる技法は、文献中に十分に説明される。例えば、Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1989)、"Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III [Ausubel, R. M., ed. (1994)]、"Cell Biology: A Laboratory Handbook" Volumes I-III [J. E. Celis, ed. (1994))]、"Current Protocols in Immunology" Volumes I-III [Coligan, J. E., ed. (1994)]、"Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait ed. 1984)、"Nucleic Acid Hybridization" [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)]、"Transcription And Translation" [B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)]、"Animal Cell Culture" [R.I. Freshney, ed. (1986)]; "Immobilized Cells And Enzymes" [IRL Press, (1986)]、B. Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984)を参照されたい。
【００５１】
加えて、本発明によると、様々な用語が用いられ、言及され、本明細書及び下記に提示される定義又は説明を有し得る。
【００５２】
本発明の一般的態様では、或る特定の溶解素、特にＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）溶解素を含むＳＨ−３型結合ドメインを有する溶解素が、人工培地中よりもヒト血液、血清及び血漿中で効果的であることが認められた。最大１００倍の活性の増大及び増強が特定された。ヒト血清に加えて、ウサギ、イヌ及びウマの血清中でも増強効果が観察される。中間の効果がラット血清中で観察される。マウス血清は増強効果を示さない。本発明者らは、或る特定のファージ溶解素、特にＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）を含むＳＨ−３型結合ドメインを有する溶解素が血液又は血液画分中の１つ以上の成分と有利な抗菌相互作用が可能であることを仮定し、今回実証する。
【００５３】
本発明によると、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）を含む溶解素と相乗作用を示す血液成分が特定された。一態様では、血清アルブミン、特にヒト血清アルブミンが、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）溶解素を含む溶解素の抗菌活性を増強する。血清アルブミンは、ヒト血漿中で最も豊富なタンパク質であり、血清タンパク質の約半数を占める。血清中のアルブミン濃度の基準範囲は、およそ３５ｇ／Ｌ〜５０ｇ／Ｌ又は３．５ｇ／ｄＬ〜５．０ｇ／ｄＬである。アルブミンは、およそ２０日間の血清半減期を有する。
【００５４】
アルブミンの遺伝子は、第４染色体上に位置し、単一の原始ドメインの三重化によって生じたと考えられる３つのドメイン内に対称的に配置される１５個のエクソンに分割される。数ある機能の中でも、アルブミンはホルモン、脂肪酸及び他の化合物を輸送し、ｐＨを緩衝し、膠質浸透圧を維持する。ヒト血清アルブミン（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０２７６８）のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１）：
2020527551.tif 000003
この配列中の６０９個のアミノ酸のうち、５８５個のアミノ酸が血液中に存在する最終生成物において観察され、シグナルペプチド（１〜１８）及びプロペプチド部分を含む最初の２４個のアミノ酸（ここではイタリック体とし、下線を引いた）は、翻訳後に切断される。
【００５５】
更なる態様では、リゾチーム、特にヒトリゾチームは、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）溶解素を含む溶解素の抗菌活性を増強する。ムラミダーゼ又はＮ−アセチルムラミドグリカンヒドロラーゼとしても知られるリゾチームは、自然免疫系の一部をなす、動物によって産生される抗微生物酵素である。リゾチームは、グラム陽性細菌細胞壁の主要構成要素であるペプチドグリカン中のＮ−アセチルムラミン酸（ＮＡＭ）残基とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＮＡＧ）残基との間の１，４−β−連結の加水分解を触媒し、結果として細菌細胞壁の完全性を損ない、細菌の溶解を引き起こす。特に、黄色ブドウ球菌（Stapylococcus aureus）細菌は、完全にリゾチーム耐性であり、それらの持続並びにヒト及び動物の皮膚及び粘膜領域への定着の成功に大きく寄与する（Bera, A et al (2004) Molecular Microbiology 55(3):778-787、Pushkaran, AC et al (2015) J Chem Inf Model 55(4):760-770）。
【００５６】
ヒトリゾチームは、１８アミノ酸のシグナルペプチド配列を含み、１２９アミノ酸の成熟タンパク質をもたらす１４８アミノ酸のタンパク質である。ヒトリゾチームの配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ６１６２６及びＧｅｎｂａｎｋ  ＮＰ＿０００２３０に対応し、以下の通りである（配列番号２）（シグナルペプチドをイタリック体とし、下線を引いた）：
2020527551.tif 000004
【００５７】
本発明によると、本発明に使用され、関連する溶解素ポリペプチドは、特にＳＨ３型結合ドメインを有する溶解素ポリペプチドであり得る。Ｓｒｃ相同性３（ＳＨ３）酵素ドメインは、２つの密集したアンチパラレルβシートとして配置される５つ又は６つのβ鎖からなる特徴的なβ−バレルフォールドを有する。古典的ＳＨ３ドメインは通常、他のタンパク質と相互作用し、それらのそれぞれの結合パートナー中のプロリンリッチペプチドへの結合によるものを含む、特定のタンパク質複合体の集合を媒介するタンパク質中に見られる。タンパク質の多くのＳＨ３結合エピトープは、プロリン含有配列モチーフを有する。ＳＨ３ドメイン及び配列は、Whisstock, J.C. and Lesk, A.M. (1999) TIBS 24:132-133及びPonting, C.P. et al (1999) J Mol Biol 289:729-745を含む従来技術に記載及び概説されている。
【００５８】
その一態様では、ＳＨ３型結合ドメインを有する溶解素ポリペプチドは、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）溶解素、Ｓａｌ溶解素、ＬｙｓＫ溶解素、リゾスタフィン、ｐｈｉｌｌ溶解素、ＬｙｓＨ５溶解素、ＭＶ−Ｌ溶解素、ＬｙｓＧＨ１５溶解素及びＡＬＥ−１溶解素から選択される。一態様では、溶解素ポリペプチドはＰｌｙＳｓ２である。
【００５９】
「ＰｌｙＳｓ溶解素（複数の場合もある）」、「ＰｌｙＳｓ２溶解素」、「ＰｌｙＳｓ２」、「ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）」、「ＰｌｙＳｓ２／ＣＦ−３０１」、「ＣＦ−３０１」、「ＣＦ３０１」という用語及び具体的に挙げられない任意の変形語は、本明細書で区別なく使用される場合があり、本願及び特許請求の範囲全体を通して使用される場合、単一又は複数のタンパク質を含むタンパク性物質を指し、本明細書に記載され、下記に提示されるアミノ酸配列データ、並びに本明細書及び特許請求の範囲において説明される活性のプロファイルを有するタンパク質にまで及ぶ。したがって、実質的に同等の又は変化した活性を示すタンパク質が同様に企図される。これらの修飾は、例えば部位特異的突然変異誘発によって得られる修飾等の意図的なものであってもよく、又は複合体若しくはその指定のサブユニットの産生者である宿主における突然変異によって得られる修飾等の偶発的なものであってもよい。また、「ＰｌｙＳｓ溶解素（複数の場合もある）」、「ＰｌｙＳｓ２溶解素」、「ＰｌｙＳｓ２」、「ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）」、「ＰｌｙＳｓ２／ＣＦ−３０１」、「ＣＦ−３０１」、「ＣＦ３０１」という用語は、本明細書に具体的に列挙されるタンパク質、並びに全ての実質的に相同な類縁体、フラグメント又は切断体（truncations）、及び対立遺伝子変異を範囲内に含むことを意図したものである。ＰｌｙＳｓ２溶解素は、特許文献１８及び特許文献１９に記載されている。Gilmer et alもＰｌｙＳｓ２溶解素を記載している（非特許文献４）。ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）アミノ酸配列を下記に提示する（配列番号３）。ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）ポリペプチド溶解素のＮ末端ＣＨＡＰドメイン（システイン−ヒスチジンアミドヒドロラーゼ／ペプチダーゼ）（ＬＮＮＶ．．．から始まり、．．．ＨＹＩＴで終わる）及びＣ末端ＳＨ３型結合ドメイン（ＲＳＹＲ．．．から始まり、．．．ＹＶＡＴで終わる）には下記で下線を引いている。
2020527551.tif 000005
2020527551.tif 000006
【００６０】
「ＣｌｙＳ」、「ＣｌｙＳ溶解素」という用語は、黄色ブドウ球菌を含むブドウ球菌属細菌に対する活性を有するキメラ溶解素ＣｌｙＳを指し、特許文献１５に詳述され、Daniel et al（Daniel, A et al (2010) Antimicrobial Agents and Chemother 54(4):1603-1612）にも記載されている。ＣｌｙＳは、ＳＨ３型結合ドメインを有しない。ＣｌｙＳの例示的なアミノ酸配列を下記に提示する（配列番号４）。
2020527551.tif 000007
【００６１】
代替的にはＳａｌ１として表されるＳａｌ溶解素は、米国特許第８，２３２，３７０号、同第８，３７７，４３１号及び同第８，３７７，８６６号を含む幾つかのYoon et alの参照文献に記載されている。例示的なＳａｌ１配列を下記に提示する（配列番号５）。
2020527551.tif 000008
【００６２】
ＬｙｓＫ溶解素は抗ブドウ球菌溶解素であり、アミダーゼ、ＣＨＡＰドメイン及びＳＨ３型結合ドメインを含む。ＬｙｓＫは、O'Flaherty S et al (2005) J Bacteriol 187(20):7161-7164に記載されている。融合タンパク質、特にＬｙｓＫ及びリゾスタフィンの融合がDonovan et alの米国特許第８，５６８，７１４号に記載されている。Ｐｌｙ１８７エンドペプチダーゼドメイン及びＬｙｓＫ  ＳＨ３細胞壁結合ドメインを有するキメラ／キメラ溶解素が米国特許出願第１３／４３２，７５８号及び国際公開第２０１３／１４９０１０号に記載されている。ＬｙｓＫ配列を下記に提示する（配列番号６）。
2020527551.tif 000009
【００６３】
Ｓａｌ−１及びＬｙｓＫの配列が非常によく似ており、上記の各配列中で下線を引いたアミノ酸２６、１１４及び４８５でのみ異なることが注目に値する。
【００６４】
リゾスタフィン及び組換えリゾスタフィンは、Sloan GL et al (1982) Int J Sys Bacteriol 32:170-174及びOldham ER and Daley MJ (1991) J Dairy Science 74:1127-1131を含む様々な参照文献に記載されている。スタフィロコッカス・シミュランスに由来するクローン化リゾスタフィン配列がRecsei PA et al (1987) PNAS USA 84:1127-1131に記載されており、米国特許第４，９３１，３９０号に提示される。成熟リゾスタフィンは、２４６個のアミノ酸残基からなる。プレタンパク質は、前駆体タンパク質中に典型的なシグナルペプチド（約３０ａａ〜３８ａａ）、１４個の反復配列を含む親水性かつ高秩序のタンパク質ドメイン（２９６ａａ）及び疎水性の成熟リゾスタフィンという３つの異なる領域を含む。リゾスタフィンの例示的な配列を下記に提示する（配列番号７）。成熟配列を太字とする。
2020527551.tif 000010
【００６５】
ＡＬＥ−１溶解素は、リゾスタフィンのホモログであり、Liu JZ et al (2006) J Biol Chem 281:549-558に記載されている。
【００６６】
Ｐｈｉｌｌバクテリオファージ溶解素は、２つのヒドロラーゼドメインであるエンドペプチダーゼ及びアミダーゼ、並びにＳＨ３Ｂ型結合ドメインを含み、Donovan DM et al (2006) FEMS Microbiol Lett 265(1):133-139を含む当該技術分野で既知であり、記載されている。ＬｙｓＨ５溶解素は、同様に３つのドメイン、２つのヒドロラーゼドメインであるエンドペプチダーゼ及びアミダーゼ、並びにＳＨ３Ｂ型結合ドメインで構成され、例えばObeso JM et al (2008) Int J Food Microbiol 128(2):212-228に記載されており、既知である。ファージ溶解素ＭＶ−Ｌは、Rashel M et al (2007) J Infect Dis 196(8):1237-1247に記載されている。ＭＶ−Ｌ溶解素は、結合ドメインの一種である単一の細胞壁標的（ＣＷＴ）ドメインに連結した２つの触媒ドメイン（エンドペプチダーゼ及びアミダーゼドメイン）で構成される。他に指示のない限り、本明細書における「結合ドメイン」への言及は、ＣＷＴドメインを含む。ＭＶ−Ｌ  ＣＷＴドメインは、ブドウ球菌溶解（staphylolytic）酵素リゾスタフィンと同様、ＳＨ３ｂ様ドメインに対する相同性を示す。ＳＨ３ｂ様ドメインは、ブドウ球菌細胞壁中のペプチド架橋（ペンタグ溶解素）に結合する。
【００６７】
ポリペプチド及び溶菌酵素
「溶菌酵素」は、好適な条件下で、関連する期間にわたって１つ以上の細菌を死滅させる任意の細菌細胞壁溶菌酵素を含む。溶菌酵素の例としては、限定されるものではないが、様々なアミダーゼ細胞壁溶菌酵素が挙げられる。
【００６８】
「豚レンサ球菌溶菌酵素」は、好適な条件下で、関連する期間にわたって少なくとも１つ以上の豚レンサ球菌細菌を死滅させることが可能な溶菌酵素を含む。
【００６９】
「バクテリオファージ溶菌酵素」は、バクテリオファージから抽出若しくは単離された溶菌酵素、又は溶菌酵素機能性を維持する同様のタンパク質構造を有する合成溶菌酵素を指す。
【００７０】
溶菌酵素は、細菌細胞のペプチドグリカン中に存在する結合を特異的に切断し、細菌細胞壁を破壊することが可能である。細菌細胞壁のペプチドグリカンが殆どの細菌において高度に保存され、僅か数個の結合の切断により細菌細胞壁が破壊され得ることも現在仮定されている。バクテリオファージ溶菌酵素は、アミダーゼであり得るが、他のタイプの酵素も可能である。これらの結合を切断する溶菌酵素の例は、ムラミダーゼ、グルコサミニダーゼ、エンドペプチダーゼ又はＮ−アセチル−ムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼ等の様々なアミダーゼである。Fischetti et al (1974)は、Ｃ１レンサ球菌ファージ溶解素酵素がアミダーゼであると報告している。Garcia et al (1987, 1990)は、Ｃｐ−１ファージに由来する肺炎レンサ球菌からのＣｐｌ溶解素がリゾチームであると報告している。Caldentey and Bamford (1992)は、ｐｈｉ  ６シュードモナス属ファージに由来する溶菌酵素がエンドペプチダーゼであり、メソ−ジアミノピメリン酸及びＤ−アラニンによって形成されるペプチド架橋を分離させると報告している。大腸菌（E. coli）Ｔ１及びＴ６ファージ溶菌酵素は、リステリア属ファージに由来する溶菌酵素（ｐｌｙ）のようにアミダーゼである（Loessner et al, 1996）。細菌細胞壁を切断することが可能な他の溶菌酵素も当該技術分野で既知である。
【００７１】
「バクテリオファージによって遺伝的にコードされる溶菌酵素」は、例えば宿主細菌に対して少なくとも幾らかの細胞壁溶解活性を有することにより宿主細菌を死滅させることが可能なポリペプチドを含む。このポリペプチドは、天然配列溶菌酵素及びその変異体を包含する配列を有し得る。このポリペプチドは、バクテリオファージ（「ファージ」）等の様々な供給源から単離するか、又は例えばGarcia et alによって記載され、また本明細書に提示されるように組換え若しくは合成方法によって調製することができる。このポリペプチドは、カルボキシル末端側にコリン結合部分を含み得て、アミノ末端側の細胞壁ペプチドグリカンを切断することが可能な酵素活性（ペプチドグリカン中のアミド結合に作用するアミダーゼ活性等）を特徴とし得る。ＰｌｙＧＢＳ溶解素等の複数の酵素活性、例えば２つの酵素ドメインを含む溶菌酵素が記載されている。概して、溶菌酵素は、分子量が２５０００ダルトン〜３５０００ダルトンであり、単一のポリペプチド鎖を含み得るが、これは酵素鎖に応じて変化する場合がある。分子量は、変性ドデシル硫酸ナトリウムゲル電気泳動でのアッセイ及び分子量マーカーとの比較によって最も好都合に決定することができる。
【００７２】
「天然配列ファージ関連溶菌酵素」は、細菌に由来する酵素と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。かかる天然配列酵素は単離するか、又は組換え若しくは合成手段によって作製することができる。
【００７３】
「天然配列酵素」という用語は、酵素の自然発生形態（例えば、代替的にはスプライス又は改変形態）及び自然発生変異体を包含する。本発明の一実施形態では、天然配列酵素は、レンサ球菌属に特異的な又はレンサ球菌属を死滅させることが可能なバクテリオファージに由来する遺伝子によって遺伝的にコードされる成熟又は完全長ポリペプチドである。当然ながら、Lopez et al., Microbial Drug Resistance 3: 199-211 (1997)、Garcia et al., Gene 86: 81-88 (1990)、Garcia et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 914-918 (1988)、Garcia et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 914-918 (1988)、Garcia et al., Streptococcal Genetics (J. J. Ferretti and Curtis eds., 1987)、Lopez et al., FEMS Microbiol. Lett. 100: 439-448 (1992)、Romero et al., J. Bacteriol. 172: 5064-5070 (1990)、Ronda et al., Eur. J. Biochem. 164: 621-624 (1987)及びSanchez et al., Gene 61: 13-19 (1987)等の文献において認められているように、多数の変異体が可能であり、既知である。これらの参照文献の各々の内容、特に配列相同性に関する記述を含む、配列表及び配列を比較する付随の文章は、その全体が引用することにより具体的に本明細書の一部をなす。
【００７４】
「変異体配列溶菌酵素」は、自然発生溶菌酵素とは異なるが、機能活性を保持するポリペプチド配列を特徴とする溶菌酵素を含む。溶菌酵素は、幾つかの実施形態では、本明細書に提示又は言及される本明細書の溶菌酵素配列（複数の場合もある）と特定のアミノ酸配列同一性を有するレンサ球菌属等の細菌に特異的なバクテリオファージによって遺伝的にコードされ得る。例えば、幾つかの実施形態では、機能的に活性な溶菌酵素は、例えば細菌の細胞壁を破壊することによってレンサ球菌属細菌及び本明細書に提示される他の感受性細菌を死滅させることができる。活性な溶菌酵素は、本明細書に提示又は言及される本明細書の溶菌酵素配列（複数の場合もある）と６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は９９．５％のアミノ酸配列同一性を有し得る。かかるファージ関連溶菌酵素変異体は例えば、１つ以上のアミノ酸残基が、本明細書に提示又は言及される本明細書の溶菌酵素配列（複数の場合もある）の配列のＮ末端又はＣ末端で付加されるか、又は欠失した溶菌酵素ポリペプチドを含む。特定の態様では、ファージ関連溶菌酵素は、天然ファージ関連溶菌酵素配列と少なくとも約８０％又は８５％のアミノ酸配列同一性、特に少なくとも約９０％（例えば９０％）のアミノ酸配列同一性を有する。最も具体的には、ファージ関連溶菌酵素変異体は、本明細書に提示又は言及される本明細書の天然ファージ関連溶菌酵素配列（複数の場合もある）と少なくとも約９５％（例えば９５％）のアミノ酸配列同一性を有する。
【００７５】
特定されるファージ関連溶菌酵素配列に関する「パーセントアミノ酸配列同一性」は、任意の保存的置換を配列同一性の一部とみなさずに、同じリーディングフレーム内の配列をアラインメントし、最大のパーセント配列同一性を達成するように必要に応じてギャップを導入した後にファージ関連溶菌酵素配列中のアミノ酸残基と同一の候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして本明細書で規定される。
【００７６】
本明細書で特定されるファージ関連溶菌酵素配列に関する「パーセント核酸配列同一性」は、配列をアラインメントし、最大のパーセント配列同一性を達成するように必要に応じてギャップを導入した後にファージ関連溶菌酵素配列中のヌクレオチドと同一の候補配列中のヌクレオチドのパーセンテージとして規定される。
【００７７】
２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列のパーセント同一性を決定するために、配列を、最適な比較を目的としてアラインメントする（例えば、ギャップを第１のヌクレオチド配列の配列中に導入してもよい）。次いで、対応するヌクレオチド又はアミノ酸位置のヌクレオチド又はアミノ酸を比較する。第１の配列中の位置が第２の配列中の対応する位置と同じヌクレオチド又はアミノ酸によって占められる場合、分子はその位置で同一である。２つの配列間のパーセント同一性は、配列間で共通する同一の位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一の位置の数／位置の総数×１００）。
【００７８】
２つの配列間のパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。２つの配列の比較に用いられる数学的アルゴリズムの好ましい非限定的な例は、Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877 (1993)のアルゴリズムである。かかるアルゴリズムは、本発明のヌクレオチド配列に対して所望の同一性を有する配列を特定するために用いることができるＮＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれる。比較目的でギャップアラインメント（gapped alignments）を得るために、Altschul et al., Nucleic Acids Res, 25:3389-3402 (1997)に記載されるようにＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを用いることができる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合、それぞれのプログラム（例えば、ＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトのパラメーターを用いることができる。米国国立バイオテクノロジー情報センター、米国国立医学図書館、米国国立衛生研究所によって提供されるプログラムを参照されたい。一実施形態では、配列比較のためのパラメーターは、Ｗ＝１２に設定することができる。パラメーターを変更することもできる（例えば、Ｗ＝５又はＷ＝２０）。値「Ｗ」により、同一領域を有するとして２つの配列を特定するプログラムについて同一でなければならない連続ヌクレオチドの数が決定される。
【００７９】
「ポリペプチド」は、線状に接合した複数のアミノ酸で構成されるポリマー分子を含む。ポリペプチドは、幾つかの実施形態では、自然発生のポリヌクレオチド配列によってコードされる分子に対応し得る。ポリペプチドは、自然発生アミノ酸が同様の特性を有するアミノ酸に置き換えられる保存的置換を含んでいてもよいが、かかる保存的置換はポリペプチドの機能を変化させない（例えば、Lewin "Genes V" Oxford University Press Chapter 1, pp. 9-13 1994を参照されたい）。
【００８０】
「改変溶菌酵素」という用語は、シャッフル（shuffled）及び／又はキメラ溶菌酵素を含む。
【００８１】
特定のファージが感染した細菌に特異的なファージ溶菌酵素は、問題の細菌の細胞壁を効果的かつ効率的に分解することが見出されている。溶菌酵素は、タンパク質分解酵素活性を欠き、したがって細菌細胞壁の消化中に存在する場合に哺乳動物のタンパク質及び組織に対して非破壊的であると考えられている。"Rapid Killing of Streptococcus pneumoniae with a Bacteriophage Cell Wall Hydrolase," Science, 294: 2170-2172 (Dec. 7, 2001)（非特許文献３）及びサイエンス誌にオンラインで公表された補足資料（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす）によって示されるように、Ｐａｌ等の精製肺炎球菌バクテリオファージ溶菌酵素は、様々な肺炎球菌属を死滅させることが可能である。Loeffler et al.は、これらの実験により、接触後数秒以内に溶菌酵素Ｐａｌが、最もよく単離される血清群及びペニシリン耐性株を含む１５個の肺炎レンサ球菌の臨床株をｉｎ  ｖｉｔｒｏで死滅させることが可能であることを示した。Ｐａｌによるマウスの処理は、血清型１４の鼻腔保菌を用量依存的に解消するか又は顕著に低減することも可能であった。さらに、Ｐａｌの作用が、他のファージ溶菌酵素と同様であるが、抗生物質とは異なり、標的病原体に幾らか特異的であることが見出されたことから、正常細菌叢が本質的に無傷のままである可能性がある（M. J. Loessner, G. Wendlinger, S. Scherer, Mol Microbiol 16, 1231-41. (1995)、引用することにより本明細書の一部をなす）。対照的に、本発明の或る特定の溶解素ポリペプチドは、著しく広く、臨床的に顕著な細菌死滅プロファイルを有する。例えば、単離豚レンサ球菌溶解素ＰｌｙＳｓ２は、豚レンサ球菌、更にはＢ群レンサ球菌（ＧＢＳ）を含む様々な他のレンサ球菌属株、黄色ブドウ球菌を含むブドウ球菌属株、エンテロコッカス属及びリステリア属の死滅に効果的である。本発明の溶解素は、ブドウ球菌属及び／又はレンサ球菌属株又は細菌にわたって幅広い細菌細胞の死滅を示すことができる。
【００８２】
溶菌酵素（複数の場合もある）又はポリペプチド（複数の場合もある）は切断型、キメラ、シャッフル又は「天然」であってもよく、組合せであってもよい。関連の特許文献１は、その全体が引用することにより本明細書の一部をなす。「改変」溶菌酵素は、多数の方法で作製することができる。一実施形態では、改変溶菌酵素の遺伝子を転移又は可動ベクター、好ましくはプラスミドに入れ、プラスミドを発現ベクター又は発現系にクローニングする。本発明の溶解素ポリペプチド又は酵素を作製するための発現ベクターは大腸菌、バシラス属又は多数の他の好適な細菌に好適であり得る。ベクター系は、無細胞発現系であってもよい。遺伝子又は遺伝子群を発現するこれらの方法は全て当該技術分野で既知である。
【００８３】
「キメラタンパク質」又は「融合タンパク質」は、異種ポリペプチドに操作可能に連結した本発明のポリペプチドの全て又は（好ましくは生物活性）部分を含む。関連の生物活性部分は、触媒ドメインであってもよい。関連の生物活性部分は、結合ドメインであってもよい。キメラタンパク質又はペプチドは、例えば２つ以上の活性部位を有する２つ以上のタンパク質を組み合わせることによって作製される。キメラタンパク質及びペプチドは、独立して同じ又は異なる分子に作用し得るため、２つ以上の異なる細菌感染を同時に治療する可能性を有する。このため、キメラタンパク質では、ＳＨ３型結合ドメイン等の単一の結合ドメインと２つ以上の触媒ドメインとを組み合わせてもよい。キメラタンパク質及びペプチドは、例えば２つ（又はそれ以上）の触媒ドメイン又は２つ（又はそれ以上）の触媒活性により２つ以上の位置で細胞壁を切断し、潜在的に単一の溶解素分子又はキメラペプチドからより急速又は効果的な（又は相乗的な）死滅をもたらすことによって、細菌感染の治療にも使用することができる。
【００８４】
ＤＮＡ構築物又はペプチド構築物の「非相同」領域は、天然ではより大きな分子に関連して見られない、より大きなＤＮＡ分子内のＤＮＡ又はより大きなペプチド分子内のペプチドの識別可能なセグメントである。このため、非相同領域が哺乳動物遺伝子をコードする場合、遺伝子は通常、元の生物ゲノム内で哺乳動物ゲノムＤＮＡに隣接しないＤＮＡが隣接する。非相同コード配列の別の例は、コード配列自体が天然では見られない構築物（例えば、ゲノムコード配列がイントロン、又は天然遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列を含有するｃＤＮＡ）である。対立遺伝子変異又は自然発生突然変異事象は、本明細書で規定されるＤＮＡ又はペプチドの非相同領域を生じない。
【００８５】
「操作可能に連結した」という用語は、本開示のポリペプチド及び異種ポリペプチドがインフレームで融合していることを意味する。異種ポリペプチドは、本開示のポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に融合することができる。キメラタンパク質は、化学合成によって酵素的に、又は組換えＤＮＡ技術によって作製される。多数のキメラ溶菌酵素が作製され、研究されている。それぞれバクテリオファージｐｈｉ  Ｘ１７４及びＭＳ２溶菌タンパク質Ｅ及びＬから構築されるキメラ溶菌遺伝子Ｅ−Ｌを内部欠失に供し、溶菌又は死滅特性が変化した一連の新たなＥ−Ｌクローンを作製した。この研究では、親遺伝子Ｅ、Ｌ、Ｅ−Ｌ及びＥ−Ｌの内部切断型の溶菌活性を調査し、異なる膜貫通ドメインの構造の違いに基づく異なる溶菌機構を特性決定した。細胞質空間及び細胞周辺空間についての電子顕微鏡法及びマーカー酵素の放出から、２つの異なる溶菌機構が大腸菌の内膜又は内膜及び外膜のいずれかのタンパク質の透過に応じて区別され得ることが明らかになった（FEMS Microbiol. Lett. (1998) 164(1):159-67（引用することにより本明細書の一部をなす））。有用な融合タンパク質の一例は、本開示のポリペプチドがＧＳＴ配列のＣ末端に融合したＧＳＴ融合タンパク質である。かかるキメラタンパク質は、本開示の組換えポリペプチドの精製を促進することができる。
【００８６】
別の実施形態では、キメラタンパク質又はペプチドは、そのＮ末端に非相同シグナル配列を含有する。例えば、本開示のポリペプチドの天然シグナル配列を除去し、別のタンパク質に由来するシグナル配列に置き換えることができる。例えば、バキュロウイルスエンベロープタンパク質のｇｐ６７分泌配列を非相同シグナル配列として使用することができる（Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, 1992、引用することにより本明細書の一部をなす）。真核生物非相同シグナル配列の他の例としては、メリチン及びヒト胎盤アルカリホスファターゼの分泌配列（Stratagene；La Jolla，Calif.）が挙げられる。また別の例では、有用な原核生物非相同シグナル配列としてｐｈｏＡ分泌シグナル（Sambrook et al.、上掲）及びプロテインＡ分泌シグナル（Pharmacia Biotech；Piscataway，N.J.）が挙げられる。
【００８７】
融合タンパク質では、溶解素ポリペプチドと、異なる能力を有するか、又は付加的な能力若しくは追加の特徴を溶解素ポリペプチドに与えるタンパク質又はポリペプチドとを組み合わせることができる。融合タンパク質は、本開示のポリペプチドの全て又は一部が、免疫グロブリンタンパク質ファミリーの成員に由来する配列に融合した免疫グロブリン融合タンパク質であってもよい。免疫グロブリンは抗体、例えば感受性又は標的細菌の表面タンパク質又はエピトープに対する抗体であり得る。免疫グロブリン融合タンパク質は、リガンド（可溶性又は膜結合型）と細胞の表面上のタンパク質（受容体）との間の相互作用を阻害し、それによりシグナル伝達をｉｎ  ｖｉｖｏで抑制するために、医薬組成物に組み込み、被験体に投与することができる。免疫グロブリン融合タンパク質は、本開示のポリペプチドの同族リガンドのバイオアベイラビリティを変化させることができる。リガンド／受容体相互作用の阻害は、細胞生存を変調する（すなわち、促進又は阻害する）細菌関連疾患及び障害の両方の治療について治療上有用であり得る。さらに、本開示の免疫グロブリン融合タンパク質は、被験体において本開示のポリペプチドに対する抗体を生じ、リガンドを精製し、またスクリーニングアッセイでは、受容体とリガンドとの相互作用を阻害する分子を特定するために免疫原として使用することができる。本開示のキメラ及び融合タンパク質及びペプチドは、標準的な組換えＤＮＡ法によって作製することができる。
【００８８】
融合遺伝子は、自動化ＤＮＡシンセサイザーを含む従来の技法によって合成することができる。代替的には、アンカープライマーを用いて遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を行うことができ、これにより２つの連続した遺伝子フラグメントの間に相補的なオーバーハングが生じ、続いてこれをアニーリングし、再増幅してキメラ遺伝子配列を生成することができる（すなわち、Ausubel et al.（上掲）を参照されたい）。さらに、融合部分（すなわち、ＧＳＴポリペプチド）を既にコードする多くの発現ベクターが市販されている。本発明のポリペプチドをコードする核酸は、融合部分が本発明のポリペプチドにインフレームで連結するように、かかる発現ベクターにクローニングすることができる。
【００８９】
本明細書で使用される場合、シャッフルタンパク質若しくはペプチド、遺伝子産物、又は２つ以上の関連ファージタンパク質若しくはタンパク質ペプチドフラグメントのペプチドを無作為に切断し、より活性又は特異的なタンパク質を再構築した。シャッフルオリゴヌクレオチド、ペプチド又はペプチドフラグメント分子を、所望の機能特性を有する分子を特定するために選択又はスクリーニングする。この方法は、例えばStemmerの米国特許第６，１３２，９７０号（ポリヌクレオチドをシャフリングする方法）、Kauffmanの米国特許第５，９７６，８６２号（コドンベースの合成による進化）及びHuseの米国特許第５，８０８，０２２号（直接コドン合成）に記載されている。これらの特許の内容は、引用することにより本明細書の一部をなす。シャフリングは、鋳型タンパク質よりも活性な、例えば最大１０倍〜１００倍活性なタンパク質を作り出すために用いることができる。鋳型タンパク質は、様々な異なる溶解素タンパク質から選択される。シャッフルタンパク質又はペプチドは、例えば１つ以上の結合ドメイン及び１つ以上の触媒ドメインを構成する。各々の結合又は触媒ドメインは、同じ又は異なるファージ又はファージタンパク質に由来する。シャッフルドメインは、単独で、若しくは他の遺伝子若しくは遺伝子産物と組み合わせてペプチドフラグメントに翻訳可能な遺伝子若しくは遺伝子産物としてのオリゴヌクレオチドベースの分子であるか、又はペプチドベースの分子である。遺伝子フラグメントには、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ＥＳＴ、ＳＮＩＰの任意の分子、及び単独で又は他の分子と組み合わせてペプチドへの翻訳が可能又は不能なオリゴヌクレオチド分子を生じる他のオリゴヌクレオチドベースの分子が含まれる。
【００９０】
本明細書に開示されるタンパク質又はペプチド及びペプチドフラグメントの改良又は改変形態は、化学合成されるか、又は組換えＤＮＡ法によって作製されるか、又はその両方のタンパク質又はペプチド及びペプチドフラグメントを含む。これらの技法としては、例えばキメラ化及びシャフリングが挙げられる。タンパク質又はペプチドが化学合成によって作製される場合、化学的前駆体又は他の化学物質を実質的に含まず、すなわち化学的前駆体、又はタンパク質の合成に関与する他の化学物質から分離されるのが好ましい。したがって、タンパク質のかかる調製物は、関心のポリペプチド以外の約３０％、２０％、１０％、５％（乾燥重量）未満の化学的前駆体又は化合物を含む。
【００９１】
ポリペプチドのシグナル配列は、関心の分泌タンパク質又は他のタンパク質の分泌及び単離を促進することにより粘膜への、また粘膜からの本開示のタンパク質及びペプチド及びペプチドフラグメントの膜間移動を促進することができる。シグナル配列は通例、概して１つ以上の切断事象における分泌時に成熟タンパク質から切断される疎水性アミノ酸のコアを特徴とする。かかるシグナルペプチドは、分泌経路を経る際の成熟タンパク質からのシグナル配列の切断を可能にするプロセシング部位を含有する。このため、本開示は、シグナル配列を有する記載のポリペプチド、並びにシグナル配列自体、及びシグナル配列の非存在下のポリペプチド（すなわち、切断産物）に関し得る。本開示のシグナル配列をコードする核酸配列は、通常は分泌されないか、又はそうでなければ単離することが困難なタンパク質等の関心のタンパク質に発現ベクター中で操作可能に連結することができる。シグナル配列は、例えば発現ベクターが形質転換される真核生物宿主からのタンパク質の分泌を誘導し、シグナル配列が続いて又は同時に切断される。次いで、タンパク質を当該技術分野で認められる方法によって細胞外培地から容易に精製することができる。代替的には、ＧＳＴドメインを有する配列等の精製を促進する配列を用いて、シグナル配列を関心のタンパク質に連結することができる。
【００９２】
本発明は、本発明のポリペプチドの他の変異体にも関する。かかる変異体は、アゴニスト（模倣物）又はアンタゴニストのいずれかとして機能し得る改変アミノ酸配列を有していてもよい。変異体は突然変異誘発、すなわち離散的点突然変異又は切断によって生成することができる。アゴニストは、実質的に同じ又は一部の自然発生形態のタンパク質の生物活性を保持することができる。タンパク質のアンタゴニストは、例えば関心のタンパク質を含む細胞シグナル伝達カスケードの下流又は上流の成員に競合的に結合することによって、自然発生形態のタンパク質の活性の１つ以上を阻害することができる。このため、特定の生物学的効果を限られた機能の変異体による治療によって誘発することができる。自然発生形態のタンパク質の生物活性の一部を有する変異体による被験体の治療は、自然発生形態のタンパク質による治療と比べて少ない副作用を被験体において有し得る。アゴニスト（模倣物）又はアンタゴニストのいずれかとして機能する本開示のタンパク質の変異体は、アゴニスト又はアンタゴニスト活性についての本開示のタンパク質の突然変異体、すなわち切断突然変異体のコンビナトリアルライブラリーのスクリーニングによって特定することができる。一実施形態では、変異体の混合鎖（variegated）ライブラリーが、核酸レベルでのコンビナトリアル突然変異誘発によって生成され、混合鎖遺伝子ライブラリーによってコードされる。変異体の混合鎖ライブラリーは例えば、潜在的タンパク質配列の縮重セットが個々のポリペプチドとして、又は代替的には、より大きな融合タンパク質のセットとして（すなわち、ファージディスプレイのために）発現可能であるように、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列中に酵素的にライゲートすることによって作製することができる。縮重オリゴヌクレオチド配列からの本開示のポリペプチドの潜在的変異体のライブラリーの作製に用いることができる様々な方法がある。縮重オリゴヌクレオチドを合成する方法は、当該技術分野で既知である（すなわち、Narang (1983) Tetrahedron 39:3、Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323、Itakura et al. (1984) Science 198:1056、Ike et al. (1983) Nucleic Acid Res. 11:477を参照されたい、全て引用することにより本明細書の一部をなす）。
【００９３】
加えて、本開示のポリペプチドのコード配列のフラグメントのライブラリーを用いて、変異体、活性フラグメント又は切断のスクリーニング及びその後の選択のためにポリペプチドの混合鎖集団を生成することができる。例えば、コード配列フラグメントのライブラリーは、ニッキングが分子１つ当たり約１回のみ起こる条件下で関心のコード配列の二本鎖ＰＣＲフラグメントをヌクレアーゼで処理し、二本鎖ＤＮＡを変性させ、ＤＮＡを再生して、異なるニッキング産物に由来するセンス／アンチセンス対を含み得る二本鎖ＤＮＡを形成し、Ｓ１ヌクレアーゼでの処理により再形成された二重鎖から一本鎖部分を除去し、得られるフラグメントライブラリーを発現ベクターにライゲートすることによって生成することができる。この方法により、様々なサイズの関心のタンパク質のＮ末端及び内部フラグメントをコードする発現ライブラリーを得ることができる。点突然変異又は切断によって作製されるコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングし、選択される特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする幾つかの技法が当該技術分野で既知である。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするためのハイスループット分析に適した、最も広く用いられている技法は通例、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローニングすることと、得られるベクターのライブラリーで適切な細胞を形質転換することと、所望の活性の検出により、産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離が促進される条件下でコンビナトリアル遺伝子を発現させることとを含む。ライブラリーにおける機能的突然変異体の頻度を高める技法である再帰的アンサンブル突然変異誘発（Recursive ensemble mutagenesis；ＲＥＭ）を、本開示のタンパク質の変異体を特定するスクリーニングアッセイと組み合わせて用いることができる（Arkin and Yourvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815、Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3):327-331）。タンパク質又はペプチドフラグメントの免疫学的に活性な部分は、ファージ酵素を認識する抗体に結合する領域を含む。これに関連して、実施形態によるタンパク質（又はタンパク質をコードする核酸）の最小部分は、溶解素タンパク質を構成するファージに特異的であるとして認識可能なエピトープである。したがって、抗体等の標的又は受容体に結合すると予想することができ、幾つかの実施形態に有用な最小のポリペプチド（及びポリペプチドをコードする関連核酸）は、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７５、８５又は１００アミノ酸長であり得る。８、９、１０、１１、１２又は１５アミノ酸長と短い小さな配列は、標的又はエピトープとして作用するのに十分な構造を確実に含むが、５、６又は７アミノ酸長のより短い配列が条件によっては標的又はエピトープ構造を示し、一実施形態で価値を有する可能性がある。このため、配列番号３又は配列番号５〜配列番号６に提示されるものを含む本明細書に提示されるタンパク質（複数の場合もある）又は溶解素ポリペプチドの最小部分は、５、６、７、８、９、１０、１２、１４又は１６アミノ酸長と小さいポリペプチドを含���。
【００９４】
実施形態のタンパク質又はペプチドフラグメントの生物活性部分は、本明細書で記載されるように、ファージタンパク質の完全長タンパク質よりも少ないアミノ酸を含み、対応する完全長タンパク質の少なくとも１つの活性を示す、本開示のファージタンパク質のアミノ酸配列と十分に同一の又はそれに由来するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。通例、生物活性部分は、対応するタンパク質の少なくとも１つの活性を有するドメイン又はモチーフを含む。本開示のタンパク質又はタンパク質フラグメントの生物活性部分は、例えばアミノ酸長が１０、２５、５０、１００少ない又は多いポリペプチドであってもよい。さらに、タンパク質の他の領域が欠失又は付加した他の生物活性部分を組換え法によって作製し、実施形態のポリペプチドの天然形態の機能活性の１つ以上について評価することができる。
【００９５】
当業者に理解されるように、かかる小タンパク質及び／又は核酸（又はより大きな分子のタンパク質及び／又は核酸領域）と機能性が共通する相同タンパク質及び核酸を作製することができる。特異的に相同であり得るかかる小分子及びより大きな分子の短い領域が実施形態として意図される。かかる有益な領域の相同性は、例えば提示又は言及されるように、配列番号３及び配列番号５〜配列番号６を含む本明細書に提示される溶解素ポリペプチドと比較して少なくとも５０％、６５％、７５％、８０％、８５％、好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％又は少なくとも９９％であるのが好ましい。これらのパーセント相同性値は、保存的アミノ酸置換による変化を含まない。
【００９６】
２つのアミノ酸配列は、アミノ酸残基の少なくとも約７０％（好ましくは少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、好ましくは少なくとも約９０％又は９５％）が同一であるか、又は保存的置換を示す場合に「実質的に相同」である。同等のＰｌｙＳｓ２溶解素又は同等のＳａｌ若しくはＬｙｓＫ溶解素等の同等の溶解素の配列は、溶解素ポリペプチドの１つ以上、又は幾つか、又は最大１０％、又は最大１５％、又は最大２０％のアミノ酸が同様の又は保存的アミノ酸置換で置換される場合に実質的に相同であり、同等の溶解素は、本明細書に開示されるＰｌｙＳｓ２及び／又はＳａｌ又はＬｙｓＫ溶解素等の溶解素の活性、抗菌効果及び／又は細菌特異性のプロファイルを有する。
【００９７】
本明細書に記載されるアミノ酸残基は、「Ｌ」異性型であるのが好ましい。しかしながら、「Ｄ」異性型の残基は、免疫グロブリン結合の所望の機能特性がポリペプチドによって保持される限りにおいて、任意のＬ−アミノ酸残基に置換することができる。ＮＨ２は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基を指す。ＣＯＯＨは、ポリペプチドのカルボキシ末端に存在する遊離カルボキシ基を指す。J. Biol. Chem., 243:3552-59 (1969)の標準的なポリペプチドの命名法に即して、アミノ酸残基の略語を以下の対応表に示す。
【００９８】
対応表
記号                                        アミノ酸
１文字                  ３文字
Ｙ                      Ｔｙｒ              チロシン
Ｇ                      Ｇｌｙ              グリシン
Ｆ                      Ｐｈｅ              フェニルアラニン
Ｍ                      Ｍｅｔ              メチオニン
Ａ                      Ａｌａ              アラニン
Ｓ                      Ｓｅｒ              セリン
Ｉ                      Ｉｌｅ              イソロイシン
Ｌ                      Ｌｅｕ              ロイシン
Ｔ                      Ｔｈｒ              トレオニン
Ｖ                      Ｖａｌ              バリン
Ｐ                      Ｐｒｏ              プロリン
Ｋ                      Ｌｙｓ              リシン
Ｈ                      Ｈｉｓ              ヒスチジン
Ｑ                      Ｇｌｎ              グルタミン
Ｅ                      Ｇｌｕ              グルタミン酸
Ｗ                      Ｔｒｐ              トリプトファン
Ｒ                      Ａｒｇ              アルギニン
Ｄ                      Ａｓｐ              アスパラギン酸
Ｎ                      Ａｓｎ              アスパラギン
Ｃ                      Ｃｙｓ              システイン
【００９９】
全てのアミノ酸残基配列が、左から右の配向がアミノ末端からカルボキシ末端への従来の方向である式によって本明細書に表されることに留意されたい。さらに、アミノ酸残基配列の最初又は最後のダッシュ記号が１つ以上のアミノ酸残基の更なる配列へのペプチド結合を示すことに留意されたい。上記の表は、本明細書で交互に見られる場合がある３文字及び１文字の表記を関連付けるために提示される。
【０１００】
突然変異は、特定のコドンが異なるアミノ酸をコードするコドンに変更されるか、アミノ酸が別のアミノ酸に置換されるか、又は１つ以上のアミノ酸が欠失するように、アミノ酸配列、又は本明細書のポリペプチド及び溶解素をコードする核酸配列、例えば本明細書に提示若しくは言及される溶解素配列、又はその活性フラグメント若しくは切断体中に生じさせることができる。かかる突然変異は概して、可能な限り少ないアミノ酸又はヌクレオチド変化を生じさせることによって生じる。この種の置換突然変異は、得られるタンパク質中のアミノ酸が非保存的に（例えば、特定のサイズ又は特性を有するアミノ酸の群（grouping）に属するアミノ酸から別の群に属するアミノ酸へとコドンを変化させることによる）又は保存的に（例えば、特定のサイズ又は特性を有するアミノ酸の群に属するアミノ酸から同じ群に属するアミノ酸へとコドンを変化させることによる）変化するように生じさせることができる。かかる保存的変化は概して、得られるタンパク質の構造及び機能により少ない変化をもたらす。非保存的変化は、得られるタンパク質の構造、活性又は機能を変化させる可能性が高い。本発明は、得られるタンパク質の活性又は結合特性を顕著に変化させない保存的変化を有する配列を含むと考えるものとする。
【０１０１】
このため、当業者は、本明細書に提示される溶解素ポリペプチド、特に本明細書に提示されるＳＨ−３型結合ドメインを有する溶解素ポリペプチドの配列の検討、並びに当業者の知識、及び他の溶解素ポリペプチドについて利用可能な公開情報に基づいて、溶解素ポリペプチド配列中にアミノ酸変化又は置換を生じさせることができる。アミノ酸変化は、本明細書に提示される溶解素（複数の場合もある）の配列中の１個以上、１個若しくは少数、１個若しくは数個、１個〜５個、１個〜１０個、又はかかる他の数のアミノ酸を置き換え又は置換し、突然変異体又はその変異体を生成するように生じさせることができる。かかる突然変異体又はその変異体は、ブドウ球菌属、レンサ球菌属、リステリア属若しくはエンテロコッカス属細菌を含む細菌を死滅させ、及び／又は本明細書に提示される溶解素（複数の場合もある）に対して同等の活性を有する機能について予測するか、又は機能若しくは能力について試験することができる。このため、例えば本明細書に提示又は言及されるアミノ酸配列を修飾することによって、本明細書に提示及び言及されるＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）、Ｓａｌ、ＬｙｓＫ等を含む本発明のＳＨ−３型結合ドメインを有する溶解素ポリペプチドの配列に対して変化を生じさせることができ、配列中に変化を有する突然変異体又は変異体は、本明細書、例えば実施例に記載及び例示されるアッセイ及び方法を用いて試験することができる。当業者は、本明細書の溶解素（複数の場合もある）のドメイン構造に基づいて、適切な保存的又は非保存的置換を含む、置換若しくは置換えに好適な１つ以上、１つ若しくは幾つかのアミノ酸、及び／又は置換若しくは置換えに好適でない１つ以上のアミノ酸を予測することができる。
【０１０２】
この点で、限定されるものではないが、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）溶解素を例示的に参照して、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）ポリペプチド溶解素が本明細書に示されるＮ末端ＣＨＡＰドメイン（システイン−ヒスチジンアミドヒドロラーゼ／ペプチダーゼ）及びＣ末端ＳＨ３型５ドメインを含むことが指摘される。ドメインは、ＬＮＮＶ．．．から始まり、．．．ＨＹＩＴで終わる第１のアミノ酸配列領域に対応するＣＨＡＰドメイン、及びＲＳＹＲ．．．から始まり、．．．ＹＶＡＴで終わる第２の領域に対応するＳＨ−３型ドメインにより示される。同様に、Ｓａｌ溶解素、ＬｙｓＫ溶解素、リゾスタフィン、更にはｐｈｉｌｌ溶解素、ＬｙｓＨ５溶解素、ＭＶ−Ｌ溶解素、ＬｙｓＧＨ１５溶解素及びＡＬＥ−１溶解素を含むが、これらに限定されない、本明細書に言及され、本発明で使用される溶解素ポリペプチド中の関連のＮ末端触媒ドメイン及び／又はＣ末端結合ドメイン、特にＳＨ−３型結合ドメインを容易に特定することができる。ＣＨＡＰドメインは、幾つかの以前に特性決定された連鎖球菌及びブドウ球菌ファージ溶解素に含まれる。このため、当業者は、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）のＣＨＡＰドメイン及び／又はＳＨ−３ドメインに対して置換又は置換えを適切に生じさせ、試験することができる。Ｇｅｎｂａｎｋデータベースとの配列比較は、例えば置換のためのアミノ酸を特定するために、ＣＨＡＰ及び／又はＳＨ−３ドメイン配列のいずれか若しくは両方、又はＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）溶解素完全アミノ酸配列を用いて行うことができる。ＣＨＡＰドメインは例えば、保存システイン及びヒスチジンアミノ酸配列（本明細書のＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）配列中で下線を引いた）を含む。例えば、保存システイン及びヒスチジン残基が活性又は能力を維持するためにＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）の突然変異体又は変異体中で維持されるものと予測することは理にかなっている。ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）配列中のバリンアミノ酸１９でバリンがアラニンに置き換えられた突然変異体又は変異体が活性であり、初めに単離及びシークエンシングされたＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）溶解素と同様に、また同じくらい効果的にグラム陽性細菌を死滅させることが可能であることが注目に値する。
【０１０３】
例えば、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）溶解素（配列番号３）は、Ｎ末端ＣＨＡＰドメイン（ＬＮＮＶ．．．ＨＹＩＴ；アミノ酸８〜１４６）及びＣ末端ＳＨ３ドメイン（ＲＳＹＲ．．．ＹＶＡＴ；アミノ酸１６２〜２２８）を含む。合わせると、ドメイン配列相同性のこれら２つの領域は、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）アミノ酸配列（配列番号３）の合計２４５個のアミノ酸のうち２０６個を構成し、ポリペプチド配列の８４％を占める。このため、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）溶解素アミノ酸配列の大部分がドメイン相同配列に相当する。また、ＣＨＡＰ及びＳＨ３ドメイン配列の各々に関し、変異体の半合理的設計に寄与する構造／機能情報が当業者に利用可能である。例えば、Bateman and Rawlings（Bateman, A. and Rawlings N.D. (2003) Trends in Biochemical Sciences 28(5):234-237 "The CHAP domain: a large family of amidases including GSP amidase and peptidoglycan hydrolases"）は、多数のポリペプチド中のＣＨＡＰドメインを記載及び特定し、例示的なアラインメントにおける配列変異を実証し、必須の不変システイン及びヒスチジン残基を特定している。この分析及び情報は、Zou and Hou（Zou, Y. and Hou, C. (2010) Computational Biology and Chemistry 34:251-257 "Systematic analysis of an amidase domain CHAP in 12 Staphylococcus aureus genomes and 44 staphylococcal phage genomes"）により配列アラインメント、共通二次構造、配列変異の分析、並びに高度に保存された残基及び配列シグネチャの特性評価を含む５０個の細菌及びファージゲノムにわたるＣＨＡＰドメインの詳細な系統分析において拡張されている。原核生物又は細菌ＳＨ３ドメインは、よく保存された残基及び荷電残基、疎水性残基等の構造特性評価及び特定を含む公開されている技術において記載及び特性決定されている。例えば、Whisstock, J.C. and Lesk, A.M.（"SH3 domains in prokaryotes" Trends in Biochemical Sciences 24:132-133 (1999)）は、細菌におけるＳＨ３ドメイン相同性を記載し、保存残基及び態様を示すアミノ酸配列をアラインメントしている。この文献に続いて、Ponting et al（"Eukaryotic Signaling Domain Homologues in Archae and Bacteria. Ancient Ancestry and Horizontal Gene Transfer" J Mol Biol (1999) 289:729-745）は、ＳＨ３を含む様々なドメインホモログを評価し、多数の細菌ＳＨ３ｂドメイン配列にわたる拡張された配列評定及びアラインメントを提示し、例示的な置換を記載し、よく保存されたアミノ酸を強調している。
【０１０４】
以下は、アミノ酸の様々な群の一例である：
非極性Ｒ基を有するアミノ酸
アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン
非荷電極性Ｒ基を有するアミノ酸
グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン
荷電極性Ｒ基を有するアミノ酸（ｐＨ６．０で負に帯電する）
アスパラギン酸、グルタミン酸
塩基性アミノ酸（ｐＨ６．０で正に帯電する）
リシン、アルギニン、ヒスチジン（ｐＨ６．０）
【０１０５】
別の群は、フェニル基を有するこれらのアミノ酸であり得る：
フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン
【０１０６】
別の群は、分子量（すなわち、Ｒ基のサイズ）によるものであり得る：
グリシン          ７５              アラニン        ８９
セリン            １０５            プロリン        １１５
バリン            １１７            トレオニン      １１９
システイン        １２１            ロイシン        １３１
イソロイシン      １３１            アスパラギン    １３２
アスパラギン酸    １３３            グルタミン      １４６
リシン            １４６            グルタミン酸    １４７
メチオニン        １４９            ヒスチジン（ｐＨ６．０において）  １５５
フェニルアラニン  １６５            アルギニン      １７４
チロシン          １８１            トリプトファン  ２０４
【０１０７】
特に好ましい置換は、以下の通りである：
正電荷が維持され得るようなＡｒｇのＬｙｓによる置換（逆も同様）、
負電荷が維持され得るようなＡｓｐのＧｌｕによる置換（逆も同様）、
遊離−ＯＨが維持され得るようなＴｈｒのＳｅｒによる置換、及び、
遊離ＮＨ２が維持され得るようなＡｓｎのＧｌｎによる置換。
【０１０８】
例示的な好ましい保存的アミノ酸置換は、以下のいずれかを含む：
グルタミン酸（Ｅ）のグルタミン（Ｑ）による置換（逆も同様）；バリン（Ｖ）のロイシン（Ｌ）による置換（逆も同様）；トレオニン（Ｔ）のセリン（Ｓ）による置換（逆も同様）；バリン（Ｖ）のイソロイシン（Ｉ）による置換（逆も同様）；グルタミン（Ｑ）のリシン（Ｋ）による置換（逆も同様）；メチオニン（Ｍ）のイソロイシン（Ｉ）による置換（逆も同様）；アスパラギン（Ｎ）のセリン（Ｓ）による置換（逆も同様）；メチオニン（Ｍ）のロイシン（Ｌ）による置換（逆も同様）；グルタミン酸（Ｅ）のリシン（Ｌ）による置換（逆も同様）；セリン（Ｓ）のアラニン（Ａ）による置換（逆も同様）；フェニルアラニン（Ｆ）のチロシン（Ｙ）による置換（逆も同様）；アスパラギン酸（Ｄ）のグルタミン酸（Ｅ）による置換（逆も同様）；イソロイシン（Ｉ）のロイシン（Ｌ）による置換（逆も同様）；アルギニン（Ｒ）のリシン（Ｋ）による置換（逆も同様）。
【０１０９】
アミノ酸置換は、特に好ましい特性を有するアミノ酸を置換するために導入することもできる。例えば、Ｃｙｓを別のＣｙｓとのジスルフィド架橋の潜在的部位に導入することができる。Ｈｉｓを特に「触媒性の」部位として導入することができる（すなわち、Ｈｉｓは酸又は塩基として作用することができ、生化学的触媒作用において最もよく見られるアミノ酸である）。Ｐｒｏは、タンパク質の構造中にβ−ターンを誘導する、その特に平面的な構造のために導入することができる。
【０１１０】
本明細書で記載されるポリペプチド又はエピトープは、抗体を生成するために用いることができ、溶解素又は溶解素タンパク質を認識する分子への結合を検出するためにも用いることができる。別の実施形態は、例えば通常の免疫化、又は潜在的結合剤の場合にライブラリーをスクリーニングするためにエピトープを使用することができるファージディスプレイアプローチによるエピトープの使用によって生じさせることができる抗体又は他の特異的結合剤等の分子である。かかる分子は、溶解素タンパク質又は溶解素タンパク質をコードする核酸の１つ以上のエピトープを認識する。エピトープを認識する抗体は、モノクローナル抗体、ヒト化抗体又は抗体タンパク質の一部分であり得る。エピトープを認識する分子が、分子が血清アルブミンに対して有するより少なくとも１０倍強い特異的結合をそのエピトープに対して有するのが望ましい。特異的結合は、親和性（Ｋｍ）として測定することができる。特異的結合は、同じ条件下で血清アルブミンに対するよりも少なくとも１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８高い又は更に高いのがより望ましい。
【０１１１】
望ましい実施形態では、抗体又は抗体フラグメントは、溶解素タンパク質の存在の検出、又は代替的には、溶解素タンパク質の影響を受けやすい細菌の存在の検出に有用な形態である。更なる実施形態では、抗体は、例えばキメラ又は融合タンパク質中で本発明の溶解素ポリペプチドと付着させるか又は他の形で会合させることができ、溶解素を関心の又は標的の細菌細胞又は株に指向させるように働くことができる。代替的には、溶解素ポリペプチドは、抗体を指向させるように働くか、又は例えば抗体が細菌の上又は中で表面の又は表面下のそのエピトープに特異的に結合し得るように、細菌細胞壁を完全若しくは部分的に溶解させる上で抗体と共に作用することができる。例えば、本発明の溶解素は、抗レンサ球菌属抗体に付着し、抗体をそのエピトープに指向させることができる。
【０１１２】
当業者に理解されるように、様々な形態及び方法の抗体合成が既知である。抗体は蛍光体、光学シグナルを生じる酵素、化学発光体（chemilumiphore）、微小粒子又は放射性原子等のレポーター分子又は原子とコンジュゲートする（共有結合的に複合体化する）ことができる。抗体又は抗体フラグメントは、動物の免疫化後にｉｎ  ｖｉｖｏで合成することができ、例えば抗体又は抗体フラグメントは、遺伝子組換え後の細胞培養により合成することができる。抗体又は抗体フラグメントは、細胞合成と化学修飾との組合せによって作製することができる。
【０１１３】
「抗体」は、特異的エピトープに結合する抗体及びそのフラグメントを含む任意の免疫グロブリンである。この用語は、ポリクローナル、モノクローナル及びキメラ抗体を包含し、キメラ抗体は、米国特許第４，８１６，３９７号及び同第４，８１６，５６７号に更に詳細に記載される。「抗体」という用語は、天然であるか、又は部分的若しくは完全に合成的に作製されたかに関わらず、免疫グロブリンを表すものである。この用語は、抗体結合ドメインであるか、又はそれに相同な結合ドメインを有する任意のポリペプチド又はタンパク質も包含する。ＣＤＲグラフト抗体もこの用語によって企図される。「抗体」は、特異的エピトープに結合する抗体及びそのフラグメントを含む任意の免疫グロブリンである。この用語は、ポリクローナル、モノクローナル及びキメラ抗体を包含し、キメラ抗体は、米国特許第４，８１６，３９７号及び同第４，８１６，５６７号に更に詳細に記載される。「抗体（複数の場合もある）」という用語は、概して２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖の４つの完全長ポリペプチド鎖を含む野生型免疫グロブリン（Ｉｇ）分子、又はＩｇ分子の必須のエピトープ結合特徴を保持する、その完全長機能的突然変異体、変異体若しくは誘導体を含み、二重特異性（dual specific, bispecific）、多重特異性及び二重可変ドメイン抗体を含む、その同等のＩｇホモログ（例えば、重鎖のみを含むラクダ科ナノボディ）を含む。免疫グロブリン分子は、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、又はサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）であり得る。任意の「抗体フラグメント」も「抗体」という用語の意味に含まれる。
【０１１４】
「抗体フラグメント」は、（ｉ）可変軽（ＶＬ）、可変重（ＶＨ）、定常軽（ＣＬ）及び定常重１（ＣＨ１）ドメインからなる一価フラグメントであるＦａｂフラグメント、（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結した２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント、（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦａｂ（Ｆｄ）フラグメントの重鎖部分、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなる可変フラグメント（Ｆｖ）フラグメント、（ｖ）単一の可変ドメインを含むドメイン抗体（ｄＡｂ）フラグメント（Ward, E.S. et al., Nature 341, 544-546 (1989)）、（ｖｉ）ラクダ科抗体、（ｖｉｉ）単離相補性決定領域（ＣＤＲ）、（ｖｉｉｉ）ＶＨドメイン及びＶＬドメインが、２つのドメインが会合して抗原結合部位を形成することを可能にするペプチドリンカーによって連結した一本鎖Ｆｖフラグメント（Bird et al, Science, 242, 423-426, 1988、Huston et al, PNAS USA, 85, 5879-5883, 1988）、（ｉｘ）ＶＨ及びＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖上で発現されるが、同じ鎖上での２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを用いることで、ドメインを別の鎖の相補性ドメインと対合させ、２つの抗原結合部位を生じさせる、二価の二重特異性抗体であるダイアボディ（diabody）（国際公開第９４／１３８０４号、P. Holliger et al Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448, (1993)）、並びに（ｘ）相補性軽鎖ポリペプチドと共に一対の抗原結合領域を形成する、一対のタンデムＦｖセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む線状抗体、（ｘｉ）多価抗体フラグメント（ｓｃＦｖ二量体、三量体及び／又は四量体（Power and Hudson, J Immunol. Methods 242: 193-204 9 (2000)）、並びに（ｘｉｉ）単独又は任意の組合せでの重鎖及び／又は軽鎖の他の非完全長部分、又はその突然変異体、変異体若しくは誘導体を含む、完全長でない少なくとも１つのポリペプチド鎖を含む分子を意味する。
【０１１５】
抗体を多数の方法で修飾することができるため、「抗体」という用語は、必要とされる特異性を有する結合ドメインを有する任意の特異的結合成員又は物質を包含すると解釈されるものとする。このため、この用語は、天然であるか、又は完全若しくは部分的に合成的であるかに関わらず、免疫グロブリン結合ドメインを含む任意のポリペプチドを含む、抗体の抗体フラグメント、誘導体、機能的等価物及びホモログを包含する。したがって、別のポリペプチドに融合した免疫グロブリン結合ドメイン又は等価物を含むキメラ分子が含まれる。キメラ抗体のクローニング及び発現は、欧州特許出願公開第０１２０６９４号及び欧州特許出願公開第０１２５０２３号及び米国特許第４，８１６，３９７号及び同第４，８１６，５６７号に記載されている。
【０１１６】
「抗体結合部位」は、抗原に特異的に結合する、軽鎖又は重鎖及び軽鎖の可変及び超可変領域で構成される抗体分子の構造部分である。
【０１１７】
その様々な文法形式の「抗体分子」という用語は、本明細書で使用される場合、無傷の免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の両方を企図する。例示的な抗体分子は無傷の免疫グロブリン分子、実質的に無傷の免疫グロブリン分子、並びにＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦ（ｖ）として当該技術分野で既知の部分を含む、パラトープを含有する免疫グロブリン分子の部分であり、これらの部分が本明細書に記載の治療方法への使用に好ましい。
【０１１８】
その様々な文法形式の「モノクローナル抗体」という用語は、特定の抗原と免疫反応する（immunoreacting）ことが可能な一種の抗体結合部位のみを有する抗体を指す。このため、モノクローナル抗体は通例、それが免疫反応する任意の抗原について単一の結合親和性を示す。したがって、モノクローナル抗体は、各々が異なる抗原に対して免疫特異性の複数の抗体結合部位を有する抗体分子、例えば二重特異性（キメラ）モノクローナル抗体を含み得る。
【０１１９】
「特異的」という用語は、特異的結合対の一成員が、その特異的結合パートナー（複数の場合もある）以外の分子に対して顕著な結合を示さない状況を指すために用いることができる。この用語は、例えば抗原結合ドメインが、多数の抗原が保有する特定のエピトープに特異的である場合にも当てはまり、この場合、抗原結合ドメインを保有する特異的結合成員は、エピトープを保有する様々な抗原に結合することが可能である。
【０１２０】
「含む」という用語は概して、１つ以上の特徴又は構成要素を含む、すなわち、その存在を許容するという意味で用いられる。
【０１２１】
「から本質的になる」という用語は、より大きな生成物に共有結合的に付着しない規定数の残基の生成物、特にペプチド配列を指す。しかしながら、本明細書の本発明のペプチドの場合、保護基等を付加する末端の化学修飾、例えばＣ末端のアミド化のようなペプチドのＮ末端又はＣ末端への僅かな修飾が企図され得ることが当業者には理解される。
【０１２２】
「単離された」という用語は、本発明の溶解素ポリペプチド（複数の場合もある）、又はかかるポリペプチドをコードする核酸が本発明に従うものである状態を指す。ポリペプチド及び核酸は、それらの自然環境、又は作製がｉｎ  ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ  ｖｉｖｏで行われる組換えＤＮＡ技術によるものである場合に、それらが作製される環境（例えば、細胞培養）に見られる他のポリペプチド又は核酸等のそれらが天然で関連する物質を含まないか、又は実質的に含まない。ポリペプチド及び核酸を希釈剤又はアジュバントと配合し、依然として実用的な目的で単離することができる。例えば、ポリペプチドは通常、ポリマー若しくは粘膜付着性物質（mucoadhesives）若しくは他の担体と混合されるか、又は診断若しくは療法に用いられる場合に薬学的に許容可能な担体若しくは希釈剤と混合される。
【０１２３】
核酸
本発明の溶解素ポリペプチド（複数の場合もある）をコードすることが可能な核酸は、本明細書に言及若しくは提示されるか、又は本発明の態様を構成する。これに関連して代表的な核酸配列は、本明細書に提示又は言及される任意の溶解素のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、及びストリンジェントな条件下でコード配列のＤＮＡの相補的配列とハイブリダイズする配列である。得ることができる天然変異体を含む、これらの配列の更なる変異体及びこれらとハイブリダイズする核酸の配列も、本開示による溶解酵素（lysing enzymes）の作製への使用に企図される。ファージ関連溶解酵素をコードする多種多様な単離核酸配列又はｃＤＮＡ配列、及びかかる遺伝子配列とハイブリダイズする部分配列が、本発明の溶解素酵素（複数の場合もある）又はポリペプチド（複数の場合もある）の組換え作製に有用である。
【０１２４】
「レプリコン」は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＤＮＡ複製の自律単位として機能する、すなわち、自身の制御下で複製が可能な任意の遺伝要素（例えばプラスミド、染色体、ウイルス）である。
【０１２５】
「ベクター」は、付着したセグメントの複製をもたらすように別のＤＮＡセグメントを付着することができるプラスミド、ファージ又はコスミド等のレプリコンである。
【０１２６】
「ＤＮＡ分子」は、一本鎖形態又は二重螺旋のいずれかのデオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミン又はシトシン）のポリマー形態を指す。この用語は、分子の一次及び二次構造のみを指し、任意の特定の三次形態に限定するものではない。このため、この用語は、特に線状ＤＮＡ分子（例えば、制限フラグメント）、ウイルス、プラスミド及び染色体中に見られる二本鎖ＤＮＡを含む。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造を論考する上で、配列は、ＤＮＡの非転写鎖（すなわち、ｍＲＮＡに相同な配列を有する鎖）に沿って５’から３’の方向でのみ配列を生じる通常の慣例に従って本明細書に記載され得る。
【０１２７】
「複製起点」は、ＤＮＡ合成に関与するＤＮＡ配列を指す。
【０１２８】
ＤＮＡ「コード配列」は、適切な制御配列の制御下に置かれた場合にｉｎ  ｖｉｖｏで転写され、ポリペプチドへと翻訳される二本鎖ＤＮＡ配列である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドン及び３’（カルボキシル）末端の翻訳終止コドンによって決まる。コード配列は原核生物配列、真核生物ｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳動物）ＤＮＡに由来するゲノムＤＮＡ配列、更には合成ＤＮＡ配列を含み得るが、これらに限定されない。ポリアデニル化シグナル及び転写終結配列は通常、コード配列の３’に位置する。
【０１２９】
転写及び翻訳制御配列は、宿主細胞においてコード配列の発現をもたらすプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター等のようなＤＮＡ制御配列である。
【０１３０】
「プロモーター配列」は、細胞内でＲＮＡポリメラーゼに結合し、下流の（３’方向）コード配列の転写を開始することが可能なＤＮＡ制御領域である。本発明を定義する目的上、プロモーター配列は、その３’末端に転写開始部位が結合し、バックグラウンドを超えて検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小数の塩基又は要素を含むように上流（５’方向）に伸びる。プロモーター配列内には、転写開始部位（便宜上、ヌクレアーゼＳ１を用いてマッピングすることにより規定される）、及びＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見られる。真核生物プロモーターは、常にではないが多くの場合、「ＴＡＴＡ」ボックス及び「ＣＡＴ」ボックスを含有する。原核生物プロモーターは、−１０及び−３５コンセンサス配列に加えてシャイン−ダルガノ配列を含有する。
【０１３１】
「発現制御配列」は、別のＤＮＡ配列の転写及び翻訳を制御及び調節するＤＮＡ配列である。コード配列は、ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡに転写する場合に細胞内で転写及び翻訳制御配列の「制御下」にあり、このｍＲＮＡが続いてコード配列によってコードされるタンパク質へと翻訳される。
【０１３２】
「シグナル配列」は、コード配列の前に含まれ得る。この配列は、宿主細胞と連絡し、ポリペプチドを細胞表面へと指向するか、又はポリペプチドを培地中に分泌させるシグナルペプチドをポリペプチドのＮ末端にコードし、このシグナルペプチドは、タンパク質が細胞から遊離する前に宿主細胞によって切り取られる。シグナル配列は、原核生物及び真核生物に特有の様々なタンパク質と関連して見ることができる。
【０１３３】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、本発明のプローブに関して本明細書で使用される場合、２つ以上、好ましくは３つより多いリボヌクレオチドで構成される分子として規定される。その正確なサイズは、多くの要因によって決まり、この要因はオリゴヌクレオチドの最終的な機能及び用途によって決まる。
【０１３４】
「プライマー」という用語は本明細書で使用される場合、精製制限消化と同様に自然に発生するか、又は合成的に作製されるかに関わらず、核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下に置かれた場合、すなわちヌクレオチド、及びＤＮＡポリメラーゼ等の誘導剤の存在下で、また好適な温度及びｐＨで合成の開始点として作用することが可能なオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、一本鎖又は二本鎖のいずれであってもよく、誘導剤の存在下で所望の伸長産物の合成を始動するのに十分に長い必要がある。プライマーの正確な長さは温度、プライマーの供給源及び方法の用途を含む多くの要因によって決まる。例えば、診断用途では、標的配列の複雑さに応じて、オリゴヌクレオチドプライマーは通例、１５個〜２５個又はそれ以上のヌクレオチドを含有するが、より少ないヌクレオチドを含有していてもよい。
【０１３５】
本明細書のプライマーは、特定の標的ＤＮＡ配列の種々の鎖に「実質的に」相補的となるように選択される。これは、プライマーがそれらのそれぞれの鎖とハイブリダイズするのに十分に相補的でなくてはならないことを意味する。したがって、プライマー配列は、鋳型の正確な配列を反映する必要はない。例えば、非相補的ヌクレオチドフラグメントがプライマーの５’末端に付着し、プライマー配列の残りの部分が鎖に相補的であってもよい。代替的には、プライマー配列が鎖の配列とハイブリダイズするのに十分な相補性を有し、それにより伸長産物の合成のための鋳型が形成されるという条件で、非相補的な塩基又はより長い配列がプライマーに組み入れられてもよい。
【０１３６】
本明細書で使用される場合、「制限エンドヌクレアーゼ」及び「制限酵素」という用語は、各々が二本鎖ＤＮＡを特定のヌクレオチド配列で又はその近くで切断する細菌酵素を指す。
【０１３７】
細胞は、外因性又は非相同ＤＮＡが細胞内に導入されている場合に、かかるＤＮＡによって「形質転換」されている。形質転換ＤＮＡは、細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡ内に組み込まれて（共有結合的に連結して）いても、又はそうでなくてもよい。例えば、原核生物、酵母及び哺乳動物細胞では、形質転換ＤＮＡは、プラスミド等のエピソーム要素上に維持され得る。真核細胞に関しては、安定に形質転換された細胞は、形質転換ＤＮＡが染色体複製により娘細胞に受け継がれるように染色体内に組み込まれた細胞である。この安定性は、形質転換ＤＮＡを含有する娘細胞の集団で構成される細胞株又はクローンを確立する真核細胞の能力によって実証される。「クローン」は、有糸分裂により単一細胞又は共通祖先から生じる細胞の集団である。「細胞株」は、多世代にわたってｉｎ  ｖｉｔｒｏで安定した成長が可能な初代細胞のクローンである。
【０１３８】
２つのＤＮＡ配列は、少なくとも約７５％（好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０％又は９５％）のヌクレオチドが規定の長さのＤＮＡ配列にわたって一致する場合に「実質的に相同」である。実質的に相同な配列は、配列データバンクで利用可能な標準的なソフトウェアを用いて配列を比較することによって、又は例えば特定のシステムについて規定されるストリンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験において特定することができる。適切なハイブリダイゼーション条件の規定は、当業者の技能の範囲内である。例えば、Maniatis et al.（上掲）、DNA Cloning, Vols. I & II（上掲）、Nucleic Acid Hybridization（上掲）を参照されたい。
【０１３９】
本明細書で企図される変異体ＤＮＡ分子の多くは、Ｍ１３プライマー突然変異誘発等の標準的なＤＮＡ突然変異誘発法によって作り出されるものを含む。これらの技法の詳細は、Sambrook et al. (1989) In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y.（引用することにより本明細書の一部をなす）に提示されている。かかる技法を用いることで、開示のものと僅かに異なる変異体を作り出すことができる。本明細書に具体的に開示されるものの誘導体であり、ヌクレオチドの欠失、付加又は置換により開示のものとは異なるが、依然として溶解素ポリペプチド（複数の場合もある）の機能的特性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ分子及びヌクレオチド配列が本開示に企図される。開示のＤＮＡ分子に由来する小ＤＮＡ分子も含まれる。かかる小ＤＮＡ分子は、ハイブリダイゼーションプローブ又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーとしての使用に好適なオリゴヌクレオチドを含む。そのため、これらの小ＤＮＡ分子は、少なくとも豚レンサ球菌（Staphylococcus suis）のバクテリオファージによって遺伝的にコードされる溶菌酵素のセグメントを含み、ＰＣＲ目的では、遺伝子の少なくとも１０個〜１５個のヌクレオチド配列、より好ましくは１５個〜３０個のヌクレオチド配列を含む。開示のＤＮＡ分子から上記のように得られるＤＮＡ分子及びヌクレオチド配列も、ストリンジェントな条件下で開示のＤＮＡ配列又はそのフラグメントにハイブリダイズするＤＮＡ配列として規定することができる。
【０１４０】
特定の程度のストリンジェンシーに対応するハイブリダイゼーション条件は、選ばれるハイブリダイゼーション方法の性質、並びに使用されるハイブリダイズＤＮＡの組成及び長さに応じて異なる。概して、ハイブリダイゼーションの温度及びハイブリダイゼーションバッファーのイオン強度（特に、ナトリウムイオン濃度）により、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーが決まる。特定の程度のストリンジェンシーを達成するのに必要とされるハイブリダイゼーション条件に関する計算は、Sambrook et al. (1989), In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y., chapters 9 and 11（引用することにより本明細書の一部をなす）によって論考されている。
【０１４１】
かかる計算の一例は以下の通りである。ハイブリダイゼーション実験は、標的ＤＮＡ分子へのＤＮＡ分子（例えば、炭疽菌に特異的なバクテリオファージによって遺伝的にコードされる溶菌酵素の天然変異体（variation））のハイブリダイゼーションによって行うことができる。標的ＤＮＡは例えば、当該技術分野で既知であり、Sambrook et al. (1989) In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y.（引用することにより本明細書の一部をなす）に記載されている技法であるサザンブロッティング（Southern (1975). J. Mol. Biol. 98:503）によってアガロースゲル内で電気泳動され、ニトロセルロースメンブレンに転写された対応するｃＤＮＡであってもよい。同位体Ｐ３２標識ｄＣＴＰで標識された標的プローブとのハイブリダイゼーションを、６倍ＳＳＣ等の高イオン強度の溶液中で融解温度Ｔｍ（下記）より２０℃〜２５℃低い温度にて行う。サザンブロット上の標的ＤＮＡ分子が１０ｎｇ以上のＤＮＡを含有する、かかるサザンハイブリダイゼーション実験については、１ｎｇ／ｍｌ〜２ｎｇ／ｍｌの放射性標識プローブ（１０９ＣＰＭ／ｍｕｇ以上の比活性の）を用いて６時間〜８時間ハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーション後に、ニトロセルロースフィルターを洗浄して、バックグラウンドハイブリダイゼーションを除去する。洗浄条件は、特異的ハイブリダイゼーションシグナルを保持しながらバックグラウンドハイブリダイゼーションを除去するのに可能な限りストリンジェントである。「Ｔｍ」という用語は、それを超えると一般的なイオン条件下で放射性標識プローブ分子がその標的ＤＮＡ分子にハイブリダイズしない温度を表す。かかるハイブリッド分子のＴｍは、以下の等式から推定することができる：Ｔｍ＝８１．５℃−１６．６（ナトリウムイオン濃度のｌｏｇ１０）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６３（％ホルムアミド）−（６００／ｌ）（式中、ｌは、塩基対中のハイブリッドの長さである）。この等式は、０．０１Ｍ〜０．４Ｍの範囲のナトリウムイオンの濃度について有効であり、より高ナトリウムイオン濃度の溶液におけるＴｍの計算についてはあまり正確でない（Bolton and McCarthy (1962). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:1390）（引用することにより本明細書の一部をなす）。この等式は、３０％〜７５％以内のＧ＋Ｃ含量を有するＤＮＡについても有効であり、１００ヌクレオチド長を超えるハイブリッドにも適用される。オリゴヌクレオチドプローブの挙動は、Sambrook et al. (1989), In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y. （引用することにより本明細書の一部をなす）の第１１章に詳細に記載されている。ここで記載される好ましい例示的な条件は、溶菌遺伝子の変異の選択への使用について特に企図される。
【０１４２】
本開示の好ましい実施形態では、ストリンジェントな条件は、２５％を超える配列変異（「ミスマッチ」とも称される）を有するＤＮＡ分子がハイブリダイズしない条件と規定することができる。より好ましい実施形態では、ストリンジェントな条件は、１５％を超えるミスマッチを有するＤＮＡ分子がハイブリダイズしない条件であり、更により好ましくは、ストリンジェントな条件は、１０％を超えるミスマッチを有するＤＮＡ配列がハイブリダイズしない条件である。ストリンジェントな条件は、６％を超えるミスマッチを有するＤＮＡ配列がハイブリダイズしない条件であるのが好ましい。
【０１４３】
遺伝コードの縮重は、コードされるタンパク質のアミノ酸配列を維持しながら、ＤＮＡ分子のヌクレオチド配列中の大きな変異を可能にすることから、実施形態の範囲を更に広くする。例えば、代表的なアミノ酸残基は、アラニンである。アラニンは、ｃＤＮＡ中でヌクレオチドコドントリプレットＧＣＴによってコードされ得る。遺伝コードの縮重のために、３つの他のヌクレオチドコドントリプレットであるＧＣＴ、ＧＣＣ及びＧＣＡもアラニンをコードする。このため、遺伝子のヌクレオチド配列は、コードされるタンパク質のアミノ酸組成又はタンパク質の特性に影響を及ぼすことなく、この位置でこれらの３つのコドンのいずれかへと変化し得る。特定のアミノ酸についての遺伝コード及びヌクレオチドコドンの変異は、当業者に既知である。遺伝コードの縮重に基づき、上記のような標準的なＤＮＡ突然変異誘発法を用いて、又はＤＮＡ配列の合成によって変異体ＤＮＡ分子を本明細書に開示されるｃＤＮＡ分子から得ることができる。遺伝コードの縮重に基づく配列変異によりストリンジェントな条件下で開示のｃＤＮＡ配列にハイブリダイズしないＤＮＡ配列は、本明細書では本開示に包含される。
【０１４４】
このため、配列が本明細書に提示又は言及されるものと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするが、それに縮重した、又は提示若しくは言及される例示的な核酸配列に縮重した、ＰｌｙＳｓ２を含む本発明の溶解素をコードするＤＮＡ配列も本発明の範囲内であることを理解されたい。「に縮重した」とは、異なる３文字コドンが特定のアミノ酸の指定に用いられることを意味する。以下のコドンを、各々の特定のアミノ酸をコードするのに区別なく用いることができることが当該技術分野で既知である：
フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）  ＵＵＵ又はＵＵＣ
ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）  ＵＵＡ又はＵＵＧ又はＣＵＵ又はＣＵＣ又はＣＵＡ又はＣＵＧ
イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）  ＡＵＵ又はＡＵＣ又はＡＵＡ
メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）  ＡＵＧ
バリン（Ｖａｌ又はＶ）  ＧＵＵ又はＧＵＣ又はＧＵＡ又はＧＵＧ
セリン（Ｓｅｒ又はＳ）  ＵＣＵ又はＵＣＣ又はＵＣＡ又はＵＣＧ又はＡＧＵ又はＡＧＣ
プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）  ＣＣＵ又はＣＣＣ又はＣＣＡ又はＣＣＧ
トレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）  ＡＣＵ又はＡＣＣ又はＡＣＡ又はＡＣＧ
アラニン（Ａｌａ又はＡ）  ＧＣＵ又はＧＣＧ又はＧＣＡ又はＧＣＧ
チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）  ＵＡＵ又はＵＡＣ
ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）  ＣＡＵ又はＣＡＣ
グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）  ＣＡＡ又はＣＡＧ
アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）  ＡＡＵ又はＡＡＣ
リシン（Ｌｙｓ又はＫ）  ＡＡＡ又はＡＡＧ
アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）  ＧＡＵ又はＧＡＣ
グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）  ＧＡＡ又はＧＡＧ
システイン（Ｃｙｓ又はＣ）  ＵＧＵ又はＵＧＣ
アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）  ＣＧＵ又はＣＧＣ又はＣＧＡ又はＣＧＧ又はＡＧＡ又はＡＧＧ
グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）  ＧＧＵ又はＧＧＣ又はＧＧＡ又はＧＧＧ
トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）  ＵＧＧ
終止コドン  ＵＡＡ（ｏｃｈｒｅ）又はＵＡＧ（ａｍｂｅｒ）又はＵＧＡ（ｏｐａｌ）
【０１４５】
上で指定したコドンがＲＮＡ配列についてのものであることを理解されたい。ＤＮＡについての対応するコドンは、ＵがＴに置換される。
【０１４６】
本明細書に記載され、当該技術分野で既知のＤＮＡ突然変異誘発法により、一例としては、レンサ球菌属のバクテリオファージ溶解素をコードし、更には本明細書に記載及び提示される溶菌ポリペプチドの不可欠な特性を維持する広範なＤＮＡ分子を作製することができることが当業者には認識される。新たに誘導されたタンパク質は、下記でより十分に説明されるように、溶菌ポリペプチド（複数の場合もある）の特性の変化を得るために選択することもできる。かかる誘導体には、僅かな欠失、付加及び置換を含むアミノ酸配列の変異を有するものが含まれる。
【０１４７】
アミノ酸配列変異を導入するための部位を予め決定することができるが、突然変異自体を予め決定する必要はない。例えば、所与の部位での突然変異のパフォーマンスを最適化するために、ランダム突然変異誘発を標的コドン又は領域で行い、発現されたタンパク質変異体を所望の活性の最適な組合せについてスクリーニングすることができる。上記のような既知の配列を有するＤＮＡ中の所定の部位に置換突然変異を生じさせる技法が既知である。
【０１４８】
アミノ酸置換は通例、単一の残基の置換であるか、又は１個以上、１個若しくは少数、１個、２個、３個、４個、５個、６個若しくは７個の残基の置換とすることができ、挿入は通常、約１個〜１０個のアミノ酸残基程度であり、欠失は約１個〜３０個の残基の範囲である。欠失又は挿入は単一の形態であってもよいが、好ましくは隣接対、すなわち、２個の残基の欠失又は２個の残基の挿入で生じさせる。置換、欠失、挿入又は任意のそれらの組合せを最終構築物に達するように組み合わせることができる。明らかに、タンパク質をコードするＤＮＡ中に生じさせる突然変異は、配列をリーディングフレーム外に置いてはならず、好ましくは二次ｍＲＮＡ構造をもたらし得る相補的な領域を生じない。
【０１４９】
置換変異体は、アミノ酸配列中の少なくとも１つの残基が除去され、異なる残基がその位置に挿入された変異体である。かかる置換は、タンパク質の特性に対して顕著な影響を生じないように、又はタンパク質の特性を微調整することが望まれる場合に生じさせることができる。タンパク質中の元のアミノ酸を置換することができ、これが保存的置換とみなされるアミノ酸は上に記載され、当業者に認識される。
【０１５０】
機能又は免疫学的同一性の実質的な変化は、あまり保存的ではない置換を選択すること、例えば（ａ）例えばシート若しくはヘリカル構造としての置換領域におけるポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷若しくは疎水性、又は（ｃ）側鎖の体積を維持することに対する影響がより大幅に異なる残基を選択することによって生じさせることができる。概してタンパク質特性の最も大きな変化を生じることが予想される置換は、（ａ）親水性残基、例えばセリル若しくはトレオニルで、疎水性残基、例えばロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル若しくはアラニルを（又は親水性残基を疎水性残基で）置換するもの、（ｂ）システイン若しくはプロリンで任意の他の残基を（又はシステイン若しくはプロリンを任意の他の残基で）置換するもの、（ｃ）電気陽性側鎖を有する残基、例えばリシル、アルギニル若しくはヒスチジルで電気陰性残基、例えばグルタミル若しくはアスパルチルを（又は電気陽性側鎖を有する残基を電気陰性残基で）置換するもの、又は（ｄ）巨大な側鎖を有する残基、例えばフェニルアラニンで側鎖を有しない残基、例えばグリシンを（又は巨大な側鎖を有する残基を、側鎖を有しない残基で）置換するものである。
【０１５１】
これらのアミノ酸置換又は欠失又は付加の影響を、感受性細菌を溶解若しくは死滅させるか、又は感染した細菌宿主中のファージによって提示されるＤＮＡ架橋剤に対する感受性を補完する誘導体又は変異体タンパク質の能力を分析することにより、溶菌ポリペプチド（複数の場合もある）の誘導体又は変異体について評定することができる。これらのアッセイは、誘導体若しくは変異体タンパク質をコードするＤＮＡ分子を上記の細菌にトランスフェクトするか、又は誘導体若しくは変異体タンパク質をコードするＤＮＡ分子をトランスフェクトした宿主から発現されたタンパク質と共に細菌をインキュベートすることによって行うことができる。
【０１５２】
アミノ酸配列変異を導入するための部位を予め決定することができるが、突然変異自体を予め決定する必要はない。例えば、所与の部位での突然変異のパフォーマンスを最適化するために、ランダム突然変異誘発を標的コドン又は領域で行い、発現されたタンパク質変異体を所望の活性の最適な組合せについてスクリーニングすることができる。上記のような既知の配列を有するＤＮＡ中の所定の部位に置換突然変異を生じさせる技法が既知である。
【０１５３】
本発明の別の特徴は、本明細書に開示されるＤＮＡ配列の発現である。当該技術分野で既知のように、ＤＮＡ配列は、それらを適切な発現ベクター内の発現制御配列に操作可能に連結し、この発現ベクターを用いて適切な単細胞宿主を形質転換することによって発現させることができる。本発明のＤＮＡ配列の発現制御配列へのかかる操作的連結は、当然ながら、既にＤＮＡ配列の一部ではない場合、ＤＮＡ配列の上流の正確なリーディングフレーム内に開始コドンＡＴＧを設けることを含む。広範な宿主／発現ベクターの組合せを本発明のＤＮＡ配列の発現に用いることができる。有用な発現ベクターは例えば、染色体性、非染色体性及び合成ＤＮＡ配列のセグメントからなり得る。好適なベクターとしては、ＳＶ４０の誘導体、並びに既知の細菌プラスミド、例えば大腸菌プラスミドｃｏｌＥｌ、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９及びそれらの誘導体、ＲＰ４等のプラスミド；ファージＤＮＡ、例えばファージλの多数の誘導体、例えばＮＭ９８９、並びに他のファージＤＮＡ、例えばＭ１３及び繊維状一本鎖ファージＤＮＡ；２μプラスミド等の酵母プラスミド又はその誘導体；昆虫又は哺乳動物細胞に有用なベクター等の真核細胞に有用なベクター；ファージＤＮＡ又は他の発現制御配列を用いるように改変されたプラスミド等のプラスミドとファージＤＮＡとの組合せに由来するベクター等が挙げられる。
【０１５４】
広範な発現制御配列（それに操作可能に連結したＤＮＡ配列の発現を制御する配列）のいずれかを、本発明のＤＮＡ配列を発現するために、これらのベクターに用いることができる。かかる有用な発現制御配列としては、例えばＳＶ４０、ＣＭＶ、ワクシニア、ポリオーマ又はアデノウイルスの初期又は後期プロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ系、ＴＲＣ系、ＬＴＲ系、ファージλの主要オペレーター及びプロモーター領域、ｆｄ外被タンパク質の制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ又は他の解糖酵素のプロモーター、酸性ホスファターゼ（例えば、Ｐｈｏ５）のプロモーター、酵母接合因子のプロモーター、並びに原核若しくは真核細胞、又はそれらのウイルスの遺伝子の発現を制御することが知られる他の配列、並びにそれらの様々な組合せが挙げられる。
【０１５５】
広範な単細胞宿主細胞も本発明のＤＮＡ配列の発現に有用である。これらの宿主には、大腸菌、シュードモナス属、バシラス属、ストレプトミセス属の株、酵母等の真菌、並びに組織培養物中のＣＨＯ、Ｒ１．１、Ｂ−Ｗ及びＬ−Ｍ細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞（例えば、ＣＯＳ  １、ＣＯＳ  ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０及びＢＭＴ１０）等の動物細胞、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９）、並びにヒト細胞及び植物細胞等の既知の真核生物及び原核生物宿主が含まれ得る。
【０１５６】
全てのベクター、発現制御配列及び宿主が本発明のＤＮＡ配列の発現に同様に良好に機能するわけではないことが理解される。また、全ての宿主が同じ発現系で同様に良好に機能するわけではない。しかしながら、当業者は、本発明の範囲を逸脱することなく、所望の発現を達成するのに適当なベクター、発現制御配列及び宿主を過度な実験なしに選択することが可能である。
【０１５７】
ポリペプチドのコード配列のフラグメントのライブラリーを用いて、変異体のスクリーニング及びその後の選択のためにポリペプチドの混合鎖集団を生成することができる。例えば、コード配列フラグメントのライブラリーは、ニッキングが分子１つ当たり約１回のみ起こる条件下で関心のコード配列の二本鎖ＰＣＲフラグメントをヌクレアーゼで処理し、二本鎖ＤＮＡを変性させ、ＤＮＡを再生して、異なるニッキング産物に由来するセンス／アンチセンス対を含み得る二本鎖ＤＮＡを形成し、Ｓ１ヌクレアーゼでの処理により再形成された二重鎖から一本鎖部分を除去し、得られるフラグメントライブラリーを発現ベクターにライゲートすることによって生成することができる。この方法により、様々なサイズの関心のタンパク質のＮ末端及び内部フラグメントをコードする発現ライブラリーを得ることができる。
【０１５８】
点突然変異又は切断によって作製されるコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングし、選択される特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする幾つかの技法が当該技術分野で既知である。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするためのハイスループット分析に適した、最も広く用いられている技法は通例、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローニングし、得られるベクターのライブラリーで適切な細胞を形質転換し、所望の活性の検出により、産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離が促進される条件下でコンビナトリアル遺伝子を発現させることを含む。ライブラリーにおける機能的突然変異体の頻度を高める技法である再帰的アンサンブル突然変異誘発（ＲＥＭ）を、タンパク質の変異体を特定するスクリーニングアッセイと組み合わせて用いることができる（Arkin and Yourvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815、Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3):327-331）。
【０１５９】
組成物
本発明の溶菌酵素（複数の場合もある）／ポリペプチド（複数の場合もある）を含む治療用又は医薬組成物、並びに関連の使用方法及び製造方法が本発明に従って提供される。治療用又は医薬組成物は、１つ以上の溶菌ポリペプチドを含むことができ、任意に天然、切断型、キメラ又はシャッフル溶菌酵素を、任意に担体、ビヒクル、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ホリンタンパク質（複数の場合もある）、１つ以上の抗生物質、又は好適な賦形剤、担体若しくはビヒクル等の他の成分と組み合わせて含む。本発明は、細菌感染又は関連病態を含む、特にブドウ球菌属細菌を含むグラム陽性細菌の死滅、軽減、脱コロニー化（decolonization）、予防法又は治療に使用される、本発明の溶解素、特にＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）、Ｓａｌ溶解素、ＬｙｓＫ溶解素、リゾスタフィン、ｐｈｉｌｌ溶解素、ＬｙｓＨ５溶解素、ＭＶ−Ｌ溶解素、ＬｙｓＧＨ１５溶解素及びＡＬＥ−１溶解素を含むＳＨ３型結合ドメインを有する溶解素の治療用組成物又は医薬組成物を提供する。本発明は、皮膚等の外表面の又はそれを介した汚染又は感染におけるものを含む、特にレンサ球菌属を含むグラム陽性細菌による汚染及び／又は感染の治療、低減又は制御に使用される、本発明の溶解素、特にＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）、Ｓａｌ溶解素、ＬｙｓＫ溶解素、リゾスタフィン、ｐｈｉｌｌ溶解素、ＬｙｓＨ５溶解素、ＭＶ−Ｌ溶解素、ＬｙｓＧＨ１５溶解素及びＡＬＥ−１溶解素を含むＳＨ３型結合ドメインを有する溶解素の治療用組成物又は医薬組成物を提供する。局所又は皮膚への適用、及び皮膚又は他の外表面を含む外部への一般的投与のための組成物がこれにより企図及び提供される。細菌感染又は関連病態を含む、グラム陽性細菌、特に化膿レンサ球菌及び抗生物質耐性黄色ブドウ球菌を含むレンサ球菌属、ブドウ球菌属、エンテロコッカス属又はリステリア属の死滅、軽減、脱コロニー化、予防法又は治療に使用される、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）、Ｓａｌ溶解素、ＬｙｓＫ溶解素、リゾスタフィン、ｐｈｉｌｌ溶解素、ＬｙｓＨ５溶解素、ＭＶ−Ｌ溶解素、ＬｙｓＧＨ１５溶解素及びＡＬＥ−１溶解素、特にＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）を含むＳＨ３型結合ドメインを有する溶解素（そのドメイン、切断体又は変異体を含む）を含む組成物が本明細書に提示される。
【０１６０】
治療用組成物中に含まれる酵素（複数の場合もある）又はポリペプチド（複数の場合もある）は、非改変ファージ関連溶菌酵素（複数の場合もある）、切断型溶菌ポリペプチド、変異体溶菌ポリペプチド（複数の場合もある）、並びにキメラ及び／又はシャッフル溶菌酵素の１つ以上又は任意の組合せであり得る。さらに、同じ細菌の治療のための異なるファージによって遺伝的にコードされる異なる溶菌ポリペプチド（複数の場合もある）を使用してもよい。これらの溶菌酵素も「非改変」溶菌酵素又はポリペプチド、切断型溶菌ポリペプチド（複数の場合もある）、変異体溶菌ポリペプチド（複数の場合もある）、並びにキメラ及びシャッフル溶菌酵素の任意の組合せであり得る。レンサ球菌属、ブドウ球菌属、エンテロコッカス属及び／又はリステリア属を含むグラム陽性細菌に対する治療用又は医薬組成物中の溶菌酵素（複数の場合もある）／ポリペプチド（複数の場合もある）は、単独で、又は抗生物質と組み合わせて、又は治療すべき他の侵襲性の細菌性生物が存在する場合、標的とされる他の細菌に特異的な他のファージ関連溶菌酵素と組み合わせて使用することができる。溶菌酵素、切断型酵素、変異体酵素、キメラ酵素、キメラポリペプチド、融合ポリペプチド、ＳＨ−３結合ドメイン含有ペプチド若しくは構築物、及び／又はシャッフル溶菌酵素は、別の治療用又は抗菌性ペプチドと共に使用することができる。別の治療用又は抗菌性ペプチドの量も変更することができる。様々な抗生物質が酵素（複数の場合もある）又はポリペプチド（複数の場合もある）と共に、別の治療用又は抗菌性ペプチドを存在させて又は存在させずに、治療用組成物中に任意に含まれ得る。２つ以上の溶菌酵素又はポリペプチドが治療用組成物中に含まれていてもよい。
【０１６１】
医薬組成物は、化学合成又はＤＮＡ組換え法によって作製される１つ以上の改変溶菌酵素（そのアイソザイム、類縁体又は変異体を含む）を含んでいてもよい。特に、改変溶菌タンパク質は、アミノ酸の置換、欠失、切断、キメラ化、融合、シャフリング、又はそれらの組合せによって作製することができる。医薬組成物は、１つ以上の天然の溶菌タンパク質と１つ以上の切断型、変異体、キメラ又はシャッフル溶菌タンパク質との組合せを含有していてもよい。医薬組成物は、同じ又は異なる細菌種に由来する少なくとも１つの溶菌タンパク質のペプチド又はペプチドフラグメントを含有していてもよく、１つ以上の補助物質（complementary agent）、及び薬学的に許容可能な担体又は希釈剤が任意に添加される。
【０１６２】
本発明は、細菌死滅活性を有するＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）、Ｓａｌ溶解素、ＬｙｓＫ溶解素、リゾスタフィン、ｐｈｉｌｌ溶解素、ＬｙｓＨ５溶解素、ＭＶ−Ｌ溶解素、ＬｙｓＧＨ１５溶解素及びＡＬＥ−１溶解素の変異体、特にＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）溶解素ポリペプチド変異体等の溶菌ポリペプチド変異体を含む細菌溶解素を提供する。一態様では、変異体は、配列番号３〜７のいずれか若しくは１つ、又は本明細書に言及されるか、若しくは引用することにより本明細書に提示される任意の溶解素ポリペプチド配列、特にＳＨ−３型結合ドメインを有する参照溶解素を含む、本明細書に提示される溶解素ポリペプチドアミノ酸配列を含むか、又はそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を有する。本発明は、結合ドメインのみを含有するか、又は１つの触媒若しくは酵素ドメインのみを含有し、細菌結合活性又はグラム陽性抗菌活性を保持する、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）溶解素切断突然変異体を含むＳＨ−３型溶解素ポリペプチド切断突然変異体を含む。本発明は例えば、結合ドメイン、アミダーゼドメイン及びグルコサミニダーゼドメインから選択されるドメインを１つのみ含有する例示的な溶解素切断突然変異体を含む。切断突然変異体では、例えば、切断型溶解素が置換え又は代替のＮ末端酵素ドメイン及び細胞壁結合ドメイン、特にＳＨ３Ｂ型結合ドメインを含み、含有するようにグルコサミニダーゼドメイン等の酵素ドメインが欠失する。
【０１６３】
医薬組成物は、１つ以上の抗微生物剤及び／又は１つ以上の従来の抗生物質を含む補助物質を含有していてもよい。感染の治療を加速するために、治療剤は、溶菌酵素の殺菌活性を強化することもできる少なくとも１つの補助物質を更に含んでいてもよい。抗微生物剤は主に、細胞壁合成の阻害、細胞膜機能の阻害、及び／又はタンパク質及びＤＮＡ合成を含む代謝機能の阻害により細菌細胞の構造又は機能に干渉することによって作用する。抗生物質は、細胞壁ペプチドグリカン生合成に影響を及ぼすものと、グラム陽性細菌におけるＤＮＡ又はタンパク質合成に影響を及ぼすものとに大まかに細分することができる。ペニシリン及び同様の抗生物質を含む細胞壁合成阻害剤は、比較的支持されていない細胞が膨張し、最終的に破裂するように硬い外側の細胞壁を破壊する。細胞壁ペプチドグリカン生合成に影響を及ぼす抗生物質としては、ペプチドグリカンマトリックスへのＮ−アセチルムラミン酸（ＮＡＭ）及びＮ−アセチルグルコサミン（ＮＡＧ）ペプチドサブユニットの組込みを防ぐことによりペプチドグリカン合成を阻害するグリコペプチドが挙げられる。利用可能なグリコペプチドとしては、バンコマイシン及びテイコプラニン（teicoplanin）、ペプチドグリカン架橋の形成を阻害することによって作用するペニシリンが挙げられる。ペニシリンの官能基であるβ−ラクタム部分は、細菌内のペプチドグリカン分子を連結するＤＤ−トランスペプチダーゼに結合し、それを阻害する。加水分解酵素は、細胞壁の分解を継続し、浸透圧に起因する細胞溶解又は細胞死を引き起こす。一般的なペニシリンとしては、オキサシリン、アンピシリン及びクロキサシリン、並びに原形質膜の外側にペプチドグリカン構成単位を保有する分子であるＣ５５−イソプレニルピロリン酸の脱リン酸化を妨げるポリペプチドが挙げられる。細胞壁に影響を与えるポリペプチドは、バシトラシンである。
【０１６４】
補助物質は、溶菌酵素の治療効果を相乗的に増強するのに効果的な量のエリスロマイシン、クラリスロマイシン、アジスロマイシン、ロキシスロマイシン、マクロライドファミリーの他の成員、ペニシリン、セファロスポリン、及びそれらの任意の組合せ等の抗生物質であり得る。実質的に任意の他の抗生物質を改変及び／又は非改変溶菌酵素と共に使用することができる。同様に、他の溶菌酵素が他の細菌感染を治療するために担体中に含まれていてもよい。抗生物質添加剤は、種々の疾患を治療する場合の酵素の実質的に全ての用途に使用することができる。
【０１６５】
単独で又は他の核酸分子と組み合わせて、ｉｎ  ｖｉｖｏで有効量の溶菌ポリペプチド（複数の場合もある）又は溶菌ポリペプチドのペプチドフラグメント（複数の場合もある）を発現させることが可能な核酸分子を含有する組成物も提供される。これらの核酸分子、ポリヌクレオチド、及びこれらの分子を保有し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで発現するベクターを含有する細胞培養物も提供される。
【０１６６】
治療用又は医薬組成物は、感受性グラム陽性細菌によって引き起こされる病気を治療するために、様々な担体と組み合わせた溶菌ポリペプチド（複数の場合もある）を含み得る。担体は、等張性及び化学安定性を増強する物質等の少量の添加剤を適切に含有する。かかる物質は、用いられる投与量及び濃度でレシピエントに対して非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酢酸及び他の有機酸、又はそれらの塩等の緩衝液；アスコルビン酸等の酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、例えばポリアルギニン又はトリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン；グルタミン酸、アスパラギン酸、ヒスチジン又はアルギニン等のアミノ酸；単糖、二糖、及びセルロース若しくはその誘導体、グルコース、マンノース、トレハロース又はデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の対イオン；ポリソルベート、ポロキサマー又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン界面活性剤；及び／又は中性塩、例えばＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２等を含む。グリセリン又はグリセロール（１，２，３−プロパントリオール）は、製薬学的用途で市販されている。これは注射用滅菌水、又は塩化ナトリウム注射液、又は他の薬学的に許容可能な水性注射用流体で希釈し、０．１％〜１００％（ｖ／ｖ）、好ましくは１．０％〜５０％、より好ましくは約２０％の濃度で使用することができる。ＤＭＳＯは、多くの局所的に適用される薬物の透過を増強する顕著な能力を有する非プロトン性溶媒である。ＤＭＳＯは注射用滅菌水、又は塩化ナトリウム注射液、又は他の薬学的に許容可能な水性注射用流体で希釈し、０．１％〜１００％（ｖ／ｖ）の濃度で使用することができる。担体ビヒクルは、特に静脈注射用溶液を調製する場合にリンガー溶液、緩衝溶液及びデキストロース溶液も含み得る。
【０１６７】
溶菌ポリペプチド（複数の場合もある）の担体はいずれも従来の手段によって製造することができる。しかしながら、任意の洗口液又は同様のタイプの製品がポリペプチド／酵素の変性を防ぐためにアルコールを含有しないことが好ましい。同様に、溶菌ポリペプチド（複数の場合もある）を製造プロセス中に咳止めドロップ、ガム、キャンディー又はロゼンジに入れる場合、ロゼンジ又はキャンディーの硬化の前であるが、酵素の熱変性を回避するために、咳止めドロップ又はキャンディーを幾らか冷却した後に入れるものとする。
【０１６８】
溶菌ポリペプチド（複数の場合もある）は液体形態、又は唾液等の体液と接触して可溶化する凍結乾燥状態のこれらの物質に添加することができる。ポリペプチド（複数の場合もある）／酵素は、ミセル又はリポソーム内に入れてもよい。
【０１６９】
感染の治療に効果的な改変又は非改変溶菌酵素／ポリペプチド（複数の場合もある）の投与速度又は量は、一部には、溶菌酵素／ポリペプチド（複数の場合もある）が治療的に使用されるか又は予防的に使用されるか、感染性細菌へのレシピエントの曝露の期間、個体の大きさ及び体重等によって決まる。酵素／ポリペプチド（複数の場合もある）を含有する組成物の使用期間も、使用が予防目的であるか（この場合、使用は短期間にわたって時間単位、日単位又は週単位であり得る）、又は使用が治療目的であるか（この場合、数時間、数日若しくは数週間にわたって、及び／又は毎日、又は１日のうち指定の時間間隔で使用が継続され得るように、より集中的な組成物の使用計画が必要とされる場合がある）によって決まる。用いられる任意の剤形は、最小限の時間にわたって最小限の単位数をもたらすものとする。有効な量又は投与量の酵素をもたらすと考えられている酵素の活性単位の濃度は、約１００単位／ｍｌ〜約５０００００単位／ｍｌ（鼻腔及び口腔（oral passages）の湿潤（wet or damp）環境内の流体）の範囲、場合によっては約１００単位／ｍｌ〜約５００００単位／ｍｌの範囲であり得る。より具体的には、活性酵素／ポリペプチド（複数の場合もある）単位への曝露時間は、１ｍｌ当たりの活性酵素単位の所望の濃度に影響を与える可能性がある。「長時間」又は「緩徐」放出担体と分類される担体（例えば、或る特定の鼻腔用スプレー又はロゼンジ等）は、１ｍｌ当たりより低濃度の活性（酵素）単位を、より長時間にわたって有する又はもたらし得るが、「短時間」又は「急速」放出担体（例えば、含嗽薬等）は、１ｍｌ当たり高濃度の活性（酵素）単位を、より短時間にわたって有する又はもたらし得る。１ｍｌ当たりの活性単位の量及び曝露の持続時間は、感染の性質、治療を予防的とすべきか又は治療的とすべきか、及び他の変動要素によって決まる。はるかに高い単位／ｍｌ投与量又は低い単位／ｍｌ投与量を有することが必要となり得る状況がある。
【０１７０】
溶菌酵素／ポリペプチド（複数の場合もある）は、溶菌酵素／ポリペプチド（複数の場合もある）の活性を可能にするｐＨを有する環境内にあるものとする。例えば、ヒト個体が細菌性上気道障害を有する別のヒトに曝露された場合、溶菌酵素／ポリペプチド（複数の場合もある）を粘膜内層に存在させ、感染細菌の任意のコロニー形成を防ぐ。改変溶菌酵素を担体系又は経口送達方式に供する前又はその時点で、酵素が約４．０〜約９．０、より好ましくは約５．５〜約７．５のｐＨ範囲を維持するための安定化緩衝液環境内にあることが好ましい。
【０１７１】
安定化緩衝液は、溶解素酵素／ポリペプチド（複数の場合もある）の最適活性を可能にすることができる。緩衝液は、ジチオトレイトール等の還元試薬を含有していてもよい。安定化緩衝液は、エチレンジアミン四酢酸ジナトリウム塩等の金属キレート化試薬であるか、若しくはそれを含んでいてもよく、又はリン酸緩衝液若しくはクエン酸リン酸緩衝液、若しくは任意の他の緩衝液を含有していてもよい。これらのファージ及び他のファージをコードするＤＮＡは、組換え酵素が１つの細胞壁を３つ以上の位置で攻撃することを可能にするか、組換え酵素が２つ以上の細菌種の細胞壁を切断することを可能にするか、組換え酵素が他の細菌を攻撃することを可能にするか、又はそれらの任意の組合せとなるように改変することができる。組換えバクテリオファージにより産生される酵素に対する改変のタイプ及び数は数え切れないほどある。
【０１７２】
温和な界面活性剤が、組成物に使用され得る溶菌酵素／ポリペプチド（複数の場合もある）の治療効果を強化するのに効果的な量で治療用又は医薬組成物に含まれていてもよい。好適な温和な界面活性剤としては、特にポリオキシエチレンソルビタン及び脂肪酸のエステル（Ｔｗｅｅｎシリーズ）、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘシリーズ）、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド、ｎ−デシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、並びに生物学的に生じる界面活性剤、例えば脂肪酸、グリセリド、モノグリセリド、デオキシコール酸塩及びデオキシコール酸のエステルが挙げられる。
【０１７３】
保存料を本発明において使用することもでき、全組成物の約０．０５重量％〜０．５重量％を占めるのが好ましい。保存料の使用は、製品が微生物で汚染された場合、配合物により微生物の増殖が防がれる又は弱まることが確実となる。本発明に有用な幾つかの保存料としては、メチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、クロロキシレノール、安息香酸ナトリウム、ＤＭＤＭヒダントイン、３−ヨード−２−プロピルブチルカルバメート、ソルビン酸カリウム、ジグルコン酸クロルヘキシジン、又はそれらの組合せが挙げられる。
【０１７４】
本発明の全ての実施形態に用いられる医薬品としては、抗微生物剤、抗炎症剤、抗ウイルス剤、局所麻酔薬、コルチコステロイド、破壊療法剤（destructive therapy agents）、抗真菌薬及び抗アンドロゲンが挙げられる。座瘡の治療においては、使用することができる活性医薬品として、抗微生物剤、特にダプソン、エリスロマイシン、ミノサイクリン、テトラサイクリン、クリンダマイシン等の抗炎症特性を有するもの、及び他の抗微生物剤が挙げられる。抗微生物剤に好ましい重量百分率は、０．５％〜１０％である。
【０１７５】
局所麻酔薬としては、テトラカイン、塩酸テトラカイン、リドカイン、塩酸リドカイン、ジクロニン、塩酸ジクロニン、塩酸ジメチソキン、ジブカイン、塩酸ジブカイン、ブタンベンピクレート（butambenpicrate）及び塩酸プラモキシンが挙げられる。局所麻酔薬の好ましい濃度は、全組成物の約０．０２５重量％〜５重量％である。ベンゾカイン等の麻酔薬も約２重量％〜２５重量％の好ましい濃度で使用することができる。
【０１７６】
使用することができるコルチコステロイドとしては、ジプロピオン酸ベタメタゾン、フルオシノロンアクチニド、吉草酸ベタメタゾン、トリアムシノロンアクチニド（triamcinolone actinide）、プロピオン酸クロベタゾール、デスオキシメタゾン、酢酸ジフロラゾン、アムシノニド、フルランドレノリド（flurandrenolide）、吉草酸ヒドロコルチゾン、酪酸ヒドロコルチゾン及びデソニドが挙げられ、約０．０１重量％〜１．０重量％の濃度が推奨される。ヒドロコルチゾン又は酢酸メチルプレドニゾロン等のコルチコステロイドの好ましい濃度は、約０．２重量％〜約５．０重量％である。
【０１７７】
さらに、治療用組成物は、感受性グラム陽性細菌と共に存在する任意の黄色ブドウ球菌細菌の治療のための酵素リゾスタフィン等の他の酵素を更に含んでいてもよい。リゾスタフィン等の粘液溶解ペプチドは、ヒトの黄色ブドウ球菌感染の治療に有効であることが提唱されている（Schaffner et al., Yale J. Biol. & Med., 39:230 (1967)）。スタフィロコッカス・シミュランスの遺伝子産物であるリゾスタフィンは、細胞壁のポリグリシン架橋を酵素的に分解することにより黄色ブドウ球菌に対して静菌及び殺菌効果を発揮する（Browder et al., Res. Comm., 19: 393-400 (1965)）。米国特許第３，２７８，３７８号は、後にスタフィロコッカス・シミュランスと改名されたスタフィロコッカス・スタフィロリティカス（S. staphylolyticus）の培養培地からリゾスタフィンを作製する発酵方法を記載している。リゾスタフィンを作製する他の方法は、米国特許第３，３９８，０５６号及び同第３，５９４，２８４号に更に記載されている。リゾスタフィンの遺伝子は、続いてクローニング及びシークエンシングされた（Recsei et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 1127-1131 (1987)））。ｒ−リゾスタフィン等の組換え粘液溶解殺菌タンパク質は、その標的化特異性、低毒性、及び生物活性残留物を低減する可能性のために、現行の抗生物質療法と関連する問題を潜在的に回避し得る。さらに、殆どの抗生物質がそれらの効果を媒介するために活発に分裂する細胞を必要とするのに対し、リゾスタフィンは非分裂細胞に対しても活性である（Dixon et al., Yale J. Biology and Medicine, 41: 62-68 (1968)）。リゾスタフィンは、改変溶菌酵素と組み合わせて、抗生物質の存在下又は非存在下で使用することができる。リゾスタフィン及び溶解素酵素の両方を同じ治療剤中で使用するには或る程度の追加の重要性がある。ヒトが細菌感染を有する場合、或る細菌属による感染は、ヒトの身体を弱めるか、又は身体の細菌叢を変化させ、他の潜在的に病原性の細菌が身体に感染することを可能にすることが多い。身体に同時感染する場合がある細菌の１つは黄色ブドウ球菌である。黄色ブドウ球菌の多くの株がペニシリナーゼを産生することで、ブドウ球菌属、レンサ球菌属及び他のグラム陽性細菌株は、標準的な抗生物質によって死滅しなくなる。その結果として、場合により抗生物質と組み合わせた溶解素及びリゾスタフィンの使用は、最も迅速かつ効果的な細菌感染の治療となり得る。治療用組成物は、ムタノリシン（mutanolysin）及びリゾチームを含んでいてもよい。
【０１７８】
溶菌酵素／ポリペプチド（複数の場合もある）を含む治療用組成物の適用手段としては、直接的、間接的な担体及び特別な手段、又は手段の任意の組合せが挙げられるが、これらに限定されない。溶菌酵素／ポリペプチド（複数の場合もある）の直接的な適用は、例えば鼻腔領域への適用（例えば、鼻腔用スプレー）、皮膚（dermal or skin）適用（例えば、局所用軟膏又は配合物）、坐剤、タンポン適用等のポリペプチドを感染又は細菌コロニー形成の部位と直接接触させるのに好適な任意の手段によるものであり得る。鼻腔適用としては、例えば鼻腔用スプレー、点鼻薬、鼻腔用軟膏、鼻腔洗浄液、鼻腔内注射、鼻腔内パッキング、気管支スプレー及び吸入器、又は間接的にのど飴、洗口液若しくは含嗽薬を用いることによる適用、又は鼻孔若しくは顔に塗布される軟膏を用いることによる適用、又はこれら及び同様の適用方法の任意の組合せが挙げられる。溶菌酵素を投与することができる形態としては、ロゼンジ、トローチ、キャンディー、注入物質、チューインガム、錠剤、粉末、スプレー、液体、軟膏及びエアロゾルが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７９】
天然及び／又は改変溶菌酵素（複数の場合もある）／ポリペプチド（複数の場合もある）をスプレー、滴剤、軟膏、洗浄液、注射、パッキング及び吸入器を用いて直接導入する場合、酵素は液体又はゲル環境にあるのが好ましく、液体が担体として作用する。液体送達形態が好ましいが、乾燥無水型の改変酵素は、吸入器及び気管支スプレーによって投与することができる。
【０１８０】
局所感染又は汚染を治療するための組成物は、本発明によるＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）、Ｓａｌ溶解素、ＬｙｓＫ溶解素、リゾスタフィン、ｐｈｉｌｌ溶解素、ＬｙｓＨ５溶解素、ＭＶ−Ｌ溶解素、ＬｙｓＧＨ１５溶解素及びＡＬＥ−１溶解素を含み、特にＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）を含む少なくとも１つの溶菌酵素を有効量と、少なくとも１つの溶菌酵素を哺乳動物、ヒト、コンパニオンアニマル又は家畜の感染又は汚染された皮膚、外皮又は外表面へと送達するための担体とを含む。溶菌酵素の適用方式は、水性の液体、アルコールベースの液体、水溶性ゲル、ローション、軟膏、非水性の液体ベース、鉱油ベース、鉱油とワセリンとのブレンド、ラノリン、リポソーム、血清アルブミン又はゼラチン等のタンパク質担体、粉末セルロース、カルメロース（carmel）、及びそれらの組合せを含むが、これらに限定されない、多数の異なるタイプ及び組合せの担体を含む。治療剤を含有する担体の送達方式としては、塗抹、スプレー、徐放性パッチ、液体吸収ワイプ（liquid absorbed wipe）、及びそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。溶菌酵素は直接、又は他の担体の１つに入れて包帯に適用することができる。包帯は、湿潤又は乾燥（この場合、酵素は包帯上で凍結乾燥形態にある）させて販売することができる。この適用方法は、感染した皮膚の治療に最も効果的である。局所用組成物の担体は、ポリマー増粘剤、水、保存料、活性界面活性剤又は乳化剤、酸化防止剤、日焼け止め、及び溶媒又は混合溶媒系を含む半固体及びゲル状ビヒクルを含み得る。米国特許第５，８６３，５６０号（Osborne）は、薬剤への皮膚の曝露を助長し得る多数の異なる担体の組合せを論考している。使用することができるポリマー増粘剤には、化粧品及び医薬品産業においてよく用いられる親水性及び水性アルコールゲル化剤等の当業者に既知のものが含まれる。ＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）は、カルボマーという一般名が付けられた多数の架橋アクリル酸ポリマーの１つである。これらのポリマーは、水に溶解し、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、トリエタノールアミン又は他のアミン塩基等の腐食性物質による中和後に透明であるか、又は僅かに濁ったゲルを形成する。ＫＬＵＣＥＬ（商標）は、水に分散し、完全な水和後に均一なゲルを形成するセルロースポリマーである。他の好ましいゲル化ポリマーとしては、ヒドロキシエチルセルロース、セルロースガム、ＭＶＥ／ＭＡデカジエンクロスポリマー、ＰＶＭ／ＭＡコポリマー又はそれらの組合せが挙げられる。
【０１８１】
溶菌酵素／ポリペプチド（複数の場合もある）を含む組成物は、上気道疾患と関連する細菌感染の予防又は治療のためにキャンディー、チューインガム、ロゼンジ、トローチ、錠剤、粉末、エアロゾル、液体、液体スプレー又は練り歯磨きの形態で投与することができる。溶菌酵素／ポリペプチド（複数の場合もある）が添加されるロゼンジ、錠剤又はガムは、糖、トウモロコシシロップ、様々な色素、ノンシュガー甘味料、香料、任意の結合剤、又はそれらの組合せを含有し得る。同様に、任意のガムベースの製品は、アラビアゴム、カルナウバ蝋、クエン酸、コーンスターチ、食品着色料、香料、ノンシュガー甘味料、ゼラチン、グルコース、グリセリン、ガムベース、セラック、ナトリウムサッカリン、糖、水、白蝋、セルロース、他の結合剤、及びそれらの組合せを含有し得る。ロゼンジは、スクロース、コーンスターチ、アラビアゴム、トラガカントゴム、アネトール、アマニ、オレオレジン、鉱油及びセルロース、他の結合剤、並びにそれらの組合せを更に含有し得る。代替糖をデキストロース、スクロース又は他の糖の代わりに使用することもできる。
【０１８２】
溶菌酵素又はそれらのペプチドフラグメントを含む組成物は、粘膜内層に指向することができ、ここで常在してコロニー形成病原細菌を死滅させる。粘膜内層としては、本明細書に開示及び記載されるように、例えば上気道及び下気道、眼、口腔、鼻、直腸、膣、歯周ポケット、腸及び結腸が挙げられる。粘膜組織の自然排除又は浄化機構のために、従来の剤形は、任意の顕著な長さの時間にわたって適用部位に保持されることがない。
【０１８３】
粘膜組織への接着を示す物質を１つ以上のファージ酵素及び他の補助物質と共に或る期間にわたって投与することが有利であり得る。制御放出能を有する物質が特に望ましく、持続放出性粘膜接着性物質（mucoadhesives）の使用は、かなりの注目を集めている。J. R. Robinson（米国特許第４，６１５，６９７号、引用することにより本明細書の一部をなす）は、粘膜薬物送達に使用される様々な制御放出性ポリマー組成物の良い概説を与えている。この特許は、生体接着性物質と有効量の治療剤とを含む制御放出性治療用組成物を記載している。生体接着性物質は、（ａ）少なくとも約８０％が少なくとも１つのカルボキシル官能基を含有する複数の反復単位と、（ｂ）ポリアルケニルポリエーテルを実質的に含まない約０．０５％〜約１．５％の架橋剤とを含有する、水膨潤性であるが、非水溶性の繊維状架橋カルボキシ官能性ポリマーである。Robinsonのポリマーは、水膨潤性であるが、不溶性であり、架橋し、熱可塑性ではなく、活性物質と共に様々な剤形へと配合することが本願のコポリマー系ほど容易ではない。ミセル及び多重膜ミセルは、酵素の放出を制御するために使用することもできる。
【０１８４】
親水性材料と疎水性材料との組合せである粘膜接着性物質を用いる他のアプローチが既知である。E.R. Squibb & CoによるＯｒａｈｅｓｉｖｅ（商標）は、口腔粘膜への接着のための粘着性炭化水素ポリマー中のペクチン、ゼラチン及びカルボキシメチルセルロースナトリウムの組合せである接着性物質である。しかしながら、親水性成分と疎水性成分とのかかる物理的混合物は最終的に崩壊する。対照的に、本願における親水性及び疎水性ドメインは、不溶性コポリマーを生じる。米国特許第４，９４８，５８０号（同様に引用することにより本明細書の一部をなす）は、生体接着性経口薬物送達系を記載している。この組成物は、分散ポリエチレンを含有する鉱油等の軟膏ベース中に分散したポリ（メチルビニルエーテル／無水マレイン酸）コポリマーとゼラチンとから形成される凍結乾燥ポリマー混合物を含む。米国特許第５，４１３，７９２号（引用することにより本明細書の一部をなす）は、（Ａ）好ましくは３：６〜６：３の重量比で存在するポリオルガノシロキサン及び水溶性ポリマー物質を含むペースト状ベースと、（Ｂ）活性成分とを含むペースト状調製物を開示している。米国特許第５，５５４，３８０号は、少なくとも２つの相を有する油中水系を含有する固体又は半固体の生体接着性の経口摂取可能な薬物送達系を特許請求している。一方の相は、約２５体積％〜約７５体積％の内部親水性相を含み、他方の相は、約２３体積％〜約７５体積％の外部疎水性相を含み、外部疎水性相は、３つの成分：（ａ）乳化剤、（ｂ）グリセリドエステル及び（ｃ）蝋材料で構成される。米国特許第５，９４２，２４３号は、抗菌剤の投与に有用な幾つかの代表的な放出用材料を記載しており、引用することにより本明細書の一部をなす。
【０１８５】
治療用又は医薬組成物は、生物活性剤の制御放出のための親水性主鎖及び疎水性グラフト鎖を含むグラフトコポリマーを含むポリマー粘膜接着性物質を含有していてもよい。グラフトコポリマーは、（１）エチレン性不飽和官能基を有するポリスチレンマクロモノマーと、（２）エチレン性不飽和官能基を有する少なくとも１つの親水性酸性モノマーとの反応生成物である。グラフト鎖は、ポリスチレンと、一部が酸性官能基を有する親水性モノマー部分のポリマー主鎖とから本質的になる。グラフトコポリマー中のポリスチレンマクロモノマーの重量パーセントは約１％〜約２０％であり、グラフトコポリマー中の全親水性モノマーの重量パーセントは８０％〜９９％であり、ここで、上記全親水性モノマーの少なくとも１０％が酸性であり、上記グラフトコポリマーは、完全に水和した場合に少なくとも９０％の平衡含水比を有する。コポリマーを含有する組成物は、適用部位で組織液の吸着により徐々に水和し、粘膜表面への接着を示す非常に柔らかいゼリー状の塊を生じる。組成物は、粘膜表面に接着している期間に、薬理活性物質の持続放出をもたらし、これが粘膜組織によって吸収される。
【０１８６】
本願の組成物は、ポリ（アクリル酸）、ポリ（ビニルピロリドン）及びカルボキシメチルセルロースナトリウム可塑剤等の他のポリマー物質、並びに他の薬学的に許容可能な賦形剤を、組成物の粘膜接着性に対して有害作用を引き起こさない量で任意に含有していてもよい。
【０１８７】
本発明の組成物の剤形は、従来の方法によって調製することができる。筋肉内注射が選ばれる投与方式である場合、等張性配合物を使用するのが好ましい。概して、等張性のための添加剤としては、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール及びラクトースを挙げることができる。場合によっては、リン酸緩衝生理食塩水等の等張性溶液が好ましい。安定化剤としては、ゼラチン及びアルブミンが挙げられる。血管収縮剤を配合物に添加してもよい。本願による医薬調製物は、滅菌かつパイロジェンフリーで提供される。
【０１８８】
本発明の溶菌酵素／ポリペプチド（複数の場合もある）は、任意の薬学的に適用可能又は許容可能な手段によって、例えば局所的、経口的又は非経口的に投与することもできる。例えば、溶菌酵素／ポリペプチド（複数の場合もある）は、グラム陽性細菌による感染の治療のために筋肉内、髄腔内、真皮下、皮下又は静脈内に投与することができる。非経口注射が選ばれる投与方式である場合、等張性配合物を使用するのが好ましい。概して、等張性のための添加剤としては、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール及びラクトースを挙げることができる。場合によっては、リン酸緩衝生理食塩水等の等張性溶液が好ましい。安定化剤としては、ゼラチン及びアルブミンが挙げられる。血管収縮剤を配合物に添加してもよい。本願による医薬調製物は、滅菌かつパイロジェンフリーで提供される。
【０１８９】
任意の化合物について、治療有効用量を初めに細胞培養アッセイ、又は動物モデル、通常はマウス、ウサギ、イヌ若しくはブタのいずれかにおいて推定することができる。動物モデルは、望ましい濃度範囲及び投与経路を達成するためにも使用される。次いで、かかる情報を用いてヒトにおける投与に有用な用量及び経路を決定することができる。正確な投与量は、治療対象の患者を考慮して個々の医師により選ばれる。投与量及び投与は、十分なレベルの活性部分を提供するか、又は所望の効果を維持するように調整される。考慮され得る付加的な要因としては、患者の病状の重症度、年齢、体重及び性別、食生活、所望の治療期間、投与方法、投与の時間及び頻度、薬物の組合せ（複数の場合もある）、反応感度、並びに療法に対する耐容性／応答が挙げられる。長時間作用型医薬組成物は、特定の配合物の半減期及びクリアランス速度に応じて３日〜４日に１回、毎週、又は２週間に１回投与され得る。
【０１９０】
非経口投与される溶菌酵素／ポリペプチド（複数の場合もある）の効果的な投与速度又は量、及び治療期間は、一部には、感染の深刻さ、患者、特にヒトの体重、感染性細菌へのレシピエントの曝露の期間、感染している皮膚又は組織の平方センチメートル数、感染の深さ、感染の深刻さ、及び様々な多数の他の変動要素によって決まる。組成物は、１日１回〜数回のいずれで適用してもよく、短期又は長期にわたって適用することができる。使用は、数日間又は数週間継続することができる。用いられる任意の剤形は、最小限の時間にわたって最小限の単位数をもたらすものとする。有効な量又は投与量の酵素をもたらすと考えられている酵素の活性単位の濃度は、必要に応じて選択することができる。１ｍｌ当たりの活性単位の量及び曝露の持続時間は、感染の性質、及び担体により溶菌酵素（複数の場合もある）／ポリペプチド（複数の場合もある）が有することが可能になる接触量によって決まる。
【０１９１】
方法及びアッセイ
本発明の溶解素ポリペプチド（複数の場合もある）が示す細菌死滅能、実際は顕著に広範な細菌死滅により、本発明のポリペプチド（複数の場合もある）の抗菌有効性に基づく様々な方法が提供される。このため、本発明は、グラム陽性細菌を死滅させる方法、グラム陽性細菌の集団を減少させる方法、細菌感染を治療又は軽減する方法、病原性細菌に曝露されたヒト被験体を治療する方法、及びかかる曝露のリスクがあるヒト被験体を治療する方法を含む抗菌方法を企図する。感受性細菌は、本発明のファージ酵素（複数の場合もある）が本来由来する細菌を含み、様々な他のレンサ球菌属、ブドウ球菌属、エンテロコッカス属及び／又はリステリア属細菌株も含み得る。レンサ球菌属、ブドウ球菌属、エンテロコッカス属及び／又はリステリア属感染の予防的治療の方法、レンサ球菌属、ブドウ球菌属、エンテロコッカス属及び／又はリステリア属感染の治療の方法、レンサ球菌属、ブドウ球菌属、エンテロコッカス属及び／又はリステリア属集団又は保菌状態を低減する方法、下気道感染を治療する方法、耳感染を治療する方法、中耳炎を治療する方法、心内膜炎を治療する方法、並びに他の局部的又は全身感染又は病態を治療又は予防する方法を含む、様々な病態を治療する方法も提供される。
【０１９２】
本発明の溶解素（複数の場合もある）は、様々な種に由来する細菌、例えば複数のレンサ球菌属又はブドウ球菌属種、レンサ球菌属、ブドウ球菌属、エンテロコッカス属及び／又はリステリア属の各々に由来する細菌、及び異なる目に由来する細菌等の異なる種の群にわたる細菌を死滅させる能力及びそれに対する有効性を示す。特に、本発明の溶解素（複数の場合もある）は、レンサ球菌属及びブドウ球菌属細菌を死滅させる能力及びそれに対する有効性を示す。特に、本発明の溶解素（複数の場合もある）は、ブドウ球菌属細菌を死滅させる能力及びそれに対する有効性を示す。ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）溶解素は、２つの異なる目、特にバシラス目及びラクトバシラス目に由来する細菌を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで死滅させる能力を示す。このため、本発明は、細菌、培養物若しくは感染、又は２つ以上のグラム陽性細菌が疑われる若しくは存在する場合の治療、脱コロニー化及び／又は汚染除去を企図する。特に、本発明は、細菌、培養物若しくは感染、又は２種類以上のバシラス目細菌、２種類以上のラクトバシラス目細菌、若しくは少なくとも１種類のバシラス目及び１種類のラクトバシラス目細菌が疑われる、存在する、若しくは存在し得る場合の治療、脱コロニー化及び／又は汚染除去を企図する。
【０１９３】
本発明は、特にヒトにおける敗血症の治療に用いることもできる。肺炎又は細菌性髄膜炎等の敗血性感染の治療については、治療剤を血流中に連続的に静脈内で流入させるものとする。敗血症の治療のための酵素の濃度は、血中の細菌数及び血液量によって決まる。
【０１９４】
少なくとも１つの本発明の溶菌酵素（複数の場合もある）／ポリペプチド（複数の場合もある）、特にＳＨ３型結合ドメインを含む溶解素、特にＰｌｙＳｓ２を有効量含む治療剤で感染を治療することを含む、レンサ球菌属、ブドウ球菌属、エンテロコッカス属及び／又はリステリア属感染、保菌状態又は集団を治療する方法も提供される。少なくとも１つの本発明の溶菌酵素（複数の場合もある）／ポリペプチド（複数の場合もある）、特にＳＨ３型結合ドメインを含む溶解素、特にＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）溶解素、Ｓａｌ溶解素、ＬｙｓＫ溶解素、リゾスタフィン、ｐｈｉｌｌ溶解素、ＬｙｓＨ５溶解素、ＭＶ−Ｌ溶解素、ＬｙｓＧＨ１５溶解素又はＡＬＥ−１溶解素、特にＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）を有効量含む治療剤で感染を治療することを含む、レンサ球菌属感染を治療する方法、又はレンサ球菌属及び／又はブドウ球菌属感染、保菌状態若しくは集団を治療する方法も提供される。一態様では、レンサ球菌属、ブドウ球菌属、エンテロコッカス属及び／又はリステリア属細菌株の細胞壁を溶解させることが可能な溶菌酵素／ポリペプチドが作製又は提供される。本発明の方法では、本発明の溶解素ポリペプチド（複数の場合もある）、特にＳＨ３型結合ドメインを含む溶解素、例えば、特にＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）は、特にレンサ球菌属、ブドウ球菌属、エンテロコッカス属及び／又はリステリア属感染、特にレンサ球菌属及び／又はブドウ球菌属感染又は細菌コロニー形成から選択されるグラム陽性細菌に対する予防方法及び治療方法において有用及び有能である。本発明の方法において感受性の標的として関連する細菌株は、黄色ブドウ球菌、リステリア・モノサイトゲネス、スタフィロコッカス・シミュランス、豚レンサ球菌、表皮ブドウ球菌、ストレプトコッカス・エクイ、ストレプトコッカス・エクイ・ズー、ストレプトコッカス・アガラクティエ（ＧＢＳ）、化膿レンサ球菌（ＧＡＳ）、ストレプトコッカス・サングイニス、ストレプトコッカス・ゴルドニ、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ、Ｇ群レンサ球菌、Ｅ群レンサ球菌、エンテロコッカス・フェカーリス及び肺炎レンサ球菌を含み、これらから選択され得る。特定の態様では、細菌株は黄色ブドウ球菌、スタフィロコッカス・シミュランス、豚レンサ球菌、表皮ブドウ球菌、ストレプトコッカス・エクイ、ストレプトコッカス・エクイ・ズー、ストレプトコッカス・アガラクティエ（ＧＢＳ）、化膿レンサ球菌（ＧＡＳ）、ストレプトコッカス・サングイニス、ストレプトコッカス・ゴルドニ、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ、Ｇ群レンサ球菌、Ｅ群レンサ球菌及び肺炎レンサ球菌から選択される。
【０１９５】
本発明は、化膿レンサ球菌を含むレンサ球菌属、及び／又は黄色ブドウ球菌を含むブドウ球菌属、特にＭＲＳＡを含む抗生物質耐性黄色ブドウ球菌を含む関連の感染又は病態を治療又は軽減する方法であって、細菌、又は特定の細菌に感染した若しくはそれに曝露された、若しくは曝露されたことが疑われる若しくはリスクがあるヒト被験体を、特定の細菌を死滅させるのに効果的な量の本発明の単離溶解素ポリペプチド（複数の場合もある）と接触させるか、又はこれを投与する、方法を含む。このため、特にＳＨ３型結合ドメインを含む溶解素、特にＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）溶解素、Ｓａｌ溶解素、ＬｙｓＫ溶解素、リゾスタフィン、ｐｈｉｌｌ溶解素、ＬｙｓＨ５溶解素、ＭＶ−Ｌ溶解素、ＬｙｓＧＨ１５溶解素及びＡＬＥ−１溶解素、特にＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）（本明細書に提示及び言及されるかかるポリペプチドを含むその切断体又は変異体を含む）から選択される溶解素の１つ以上を、関連の細菌を死滅させるのに効果的となるように、又は他の形で細菌感染を軽減若しくは治療するように接触させる又は投与する。
【０１９６】
「作用物質」という用語は、ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、化学化合物及び小分子を含む任意の分子を意味する。特に、作用物質という用語は、試験化合物、追加の付加的な化合物（複数の場合もある）、又は溶解素酵素化合物等の化合物を含む。
【０１９７】
「アゴニスト」という用語は、最も広い意味では、リガンドが結合する受容体を刺激するリガンドを指す。
【０１９８】
「アッセイ」という用語は、化合物の特定の特性を測定するために用いられる任意のプロセスを意味する。「スクリーニングアッセイ」は、化合物をそれらの活性に基づいて化合物のコレクションから特性決定又は選択するために用いられるプロセスを意味する。
【０１９９】
「予防する」又は「予防」という用語は、疾患発症に先だつ、病原体に曝露され得る又は疾患にかかりやすい被験体における疾患又は障害を罹患又は発症するリスクの低減（すなわち、疾患の臨床症状の少なくとも１つを発症させないこと）を指す。
【０２００】
「予防法」という用語は、「予防」という用語に関連し、包含され、疾患を治療又は治癒するのではなく、予防する目的の手段又は手順を指す。予防的手段の非限定的な例としては、ワクチンの投与、例えば固定のために血栓症のリスクがある入院患者への低分子量ヘパリンの投与、及びマラリアが多く見られる又はマラリアにかかるリスクが高い地理的領域を訪れる前のクロロキン等の抗マラリア剤の投与が挙げられ得る。
【０２０１】
「治療有効量」は、医師又は他の臨床医が求める被験体の生物学的又は医学的応答を誘発する薬物、化合物、抗微生物剤、抗体、ポリペプチド又は医薬品の量を意味する。特に、グラム陽性細菌感染及びグラム陽性細菌の増殖に関して、「有効量」という用語は、殺菌及び／又は静菌効果を有することを含む、グラム陽性細菌の量又は感染の程度の生物学的に意味のある減少を生じさせる化合物又は作用物質の有効量を含むことを意図したものである。「治療有効量」という表現は、感染性細菌の増殖若しくは量、又は例えばその存在及び活性に伴い得る発熱若しくは白血球数等の病理の他の特徴の臨床的に顕著な変化を予防する、好ましくは少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも９０％低減するのに十分な量を意味するために本明細書で用いられる。
【０２０２】
任意の疾患又は感染を「治療する」又はその「治療」という用語は、一実施形態では、疾患又は感染を改善すること（すなわち、疾患、若しくは感染因子若しくは細菌の増殖を阻止すること、又はその臨床症状の少なくとも１つの発現、程度若しくは重症度を低減すること）を指す。別の実施形態では、「治療する」又は「治療」は、被験体により識別可能ではない可能性がある少なくとも１つの物理的パラメーターを改善することを指す。また別の実施形態では、「治療する」又は「治療」は、疾患又は感染を物理的に（例えば、識別可能な症状の安定化）、生理学的に（例えば物理的パラメーターの安定化）、又はその両方で調整することを指す。更なる実施形態では、「治療する」又は「治療」は、疾患の進行を遅くするか、又は感染を低減することに関する。
【０２０３】
「薬学的に許容可能な」という表現は、生理学的に耐容可能であり、通例、ヒトに投与した場合にアレルギー反応、又は同様の有害反応、例えば急性胃蠕動、眩暈等を生じない分子実体及び組成物を指す。
【０２０４】
ｉｎ  ｖｉｖｏで行われる治療方法、又は本願及び特許請求の範囲に従う医学的及び臨床的治療方法との関連で、被験体、患者又は個体という用語は、ヒトを指すことを意図したものであることが留意される。
【０２０５】
「グラム陽性細菌」（"gram-positive bacteria", "Gram-positive bacteria"）、「グラム陽性」という用語及び具体的に挙げられない任意の変形語は、本明細書で区別なく使用される場合があり、本願及び特許請求の範囲全体を通して使用される場合、既知であり、及び／又は或る特定の細胞壁及び／又は細胞膜の特性の存在、及び／又はグラム染色での染色によって特定することができるグラム陽性細菌を指す。グラム陽性細菌は既知であり、容易に特定することができ、リステリア属、ブドウ球菌属、レンサ球菌属、エンテロコッカス属、マイコバクテリウム属、コリネバクテリウム属及びクロストリジウム属から選択され得るが、これらに限定されず、それらの任意及び全ての認識されている又は認識されていない種又は株を含む。本発明の一態様では、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）溶解素感受性グラム陽性細菌には、リステリア属、ブドウ球菌属、レンサ球菌属及びエンテロコッカス属、特にレンサ球菌属及びブドウ球菌属細菌の１つ以上から選択される細菌が含まれる。ＬｙｓＫ及びＳａｌ１溶解素感受性細菌には、ブドウ球菌属細菌が含まれる。
【０２０６】
「殺菌」という用語は、細菌細胞を死滅させることが可能であることを指す。
【０２０７】
「静菌」という用語は、増殖細菌細胞の阻害を含む細菌増殖を阻害することが可能であることを指す。
【０２０８】
「薬学的に許容可能な」という表現は、生理学的に耐容可能であり、通例、ヒトに投与した場合にアレルギー反応、又は同様の有害反応、例えば急性胃蠕動、眩暈等を生じない分子実体及び組成物を指す。
【０２０９】
「治療有効量」という表現は、標的細胞塊のＳ期活性、又は例えばその存在及び活性に伴い得る例えば血圧上昇、発熱又は白血球数等の病理の他の特徴の臨床的に顕著な変化を予防する、好ましくは少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも９０％低減するのに十分な量を意味するために本明細書で用いられる。
【０２１０】
レンサ球菌属又はブドウ球菌属細菌によって引き起こされる全身又は組織細菌感染を治療する一方法は、１つ以上の本発明の溶解素ポリペプチド、特にＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）溶解素、Ｓａｌ溶解素、ＬｙｓＫ溶解素、リゾスタフィン、ｐｈｉｌｌ溶解素、ＬｙｓＨ５溶解素、ＭＶ−Ｌ溶解素、ＬｙｓＧＨ１５溶解素及びＡＬＥ−１溶解素、特にＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）から選択されるＳＨ３型結合ドメインを含む溶解素（本明細書に提示されるかかるポリペプチドを含むその融合体、キメラ、切断体又は変異体を含む）を有効量と、適切な担体とを含む治療剤で感染を非経口的に治療することを含む。多数の他の異なる方法を溶菌酵素（複数の場合もある）／ポリペプチド（複数の場合もある）の導入に用いることができる。これらの方法は、溶菌酵素（複数の場合もある）／ポリペプチド（複数の場合もある）を静脈内、筋肉内、皮下、髄腔内及び真皮下に導入することを含む。医療関係者を含む当業者は、細菌性病態の性質及び程度、並びに関与する又は疑われる細菌の株又は種類を考慮して、最も適切な投与方式又は手段を評価及び認識することが可能である。例えば、１つ以上の溶菌ポリペプチドの髄腔内での使用及び投与は、細菌性髄膜炎の治療に最も有益である。
【０２１１】
感染は、ヒト患者の感染組織に、適切な溶菌酵素（複数の場合もある）／ポリペプチド（複数の場合もある）と酵素の担体とを含む治療剤を注射することによっても治療することができる。担体は蒸留水、生理食塩水、アルブミン、血清又はそれらの任意の組合せで構成され得る。より具体的には、注入又は注射用の溶液は、従来の方法で、例えばｐ−ヒドロキシベンゾエート等の保存料又はエチレン−ジアミン四酢酸のアルカリ金属塩等の安定化剤を添加して調製することができ、これを続いて注入用容器、注射用バイアル又はアンプルに移すことができる。代替的には、注射用の化合物は、他の成分と共に又は他の成分なしに凍結乾燥し、使用時に必要に応じて緩衝溶液又は蒸留水に可溶化させることができる。不揮発性油、リポソーム及びオレイン酸エチル等の非水性ビヒクルも本明細書で有用である。他のファージ関連溶菌酵素がホリンタンパク質と共に、組成物中に含まれていてもよい。
【０２１２】
感受性細菌の保菌状態を解消若しくは低減し、感染の症状を有する他のヒトに曝露されたヒトが病気になることを防ぐ予防処置として、又は既に病気になったヒトの感染の治療処置としての特にＳＨ３型結合ドメインを含む溶解素、特に本明細書に例示されるＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）溶解素、Ｓａｌ溶解素、ＬｙｓＫ溶解素、リゾスタフィン、ｐｈｉｌｌ溶解素、ＬｙｓＨ５溶解素、ＭＶ−Ｌ溶解素、ＬｙｓＧＨ１５溶解素及びＡＬＥ−１溶解素から選択される溶菌酵素／ポリペプチド（複数の場合もある）、例えばＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）を使用する様々な治療方法が提供される。同様に、溶菌酵素（複数の場合もある）／ポリペプチド（複数の場合もある）は、特に気管支スプレーの使用又は酵素の静脈内投与により、例えば下気道疾患の治療に使用することができる。例えば、溶菌酵素を結膜炎等の眼感染の予防処置及び治療処置に使用することができる。治療方法は、有効量の少なくとも１つの本発明の溶菌ポリペプチドと、眼に安全に適用することが可能な担体（該担体は溶菌酵素を含有する）とを含む点眼剤又は洗眼剤を投与することを含む。点眼剤又は洗眼剤は、等張性溶液の形態であるのが好ましい。溶液のｐＨは、起こり得る他の生物による感染、場合によっては眼への損傷につながる眼の炎症が生じないように調整するものとする。ｐＨ範囲は他の溶菌酵素と同じ範囲であるものとするが、最適なｐＨは、本明細書で実証及び提示される範囲である。同様に、他の溶菌酵素について上に記載される種類の緩衝液も使用されるものとする。点眼剤への使用に好適な他の抗生物質を、酵素を含有する組成物に添加することができる。殺菌剤及び静菌化合物を添加してもよい。溶液中の酵素（複数の場合もある）の濃度は、約１００単位／ｍｌ〜約５０００００単位／ｍｌの範囲とすることができ、より好ましい範囲は約１００単位／ｍｌ〜約５０００単位／ｍｌ及び約１００単位／ｍｌ〜約５００００単位／ｍｌである。濃度は、提示の範囲よりも高く又は低くすることができる。
【０２１３】
本発明の溶菌ポリペプチド（複数の場合もある）は、コンタクトレンズを浸漬及び洗浄するためのコンタクトレンズ溶液に使用することもできる。この溶液は、通常は等張性溶液であり、酵素に加えて、塩化ナトリウム、マンニトール及び他の糖アルコール、ホウ酸塩、保存料等を含有し得る。本発明の溶菌酵素／ポリペプチドは、患者の耳に投与することもできる。このため、例えば本発明の溶菌ポリペプチド（複数の場合もある）は、例えば肺炎レンサ球菌によって引き起こされる耳感染の治療に使用することができる。中耳炎は、耳痛、聴力損失及び発熱等の症状を特徴とする中耳の炎症である。これらの症状の主因の１つは、中耳における流体（浸出液）の蓄積である。合併症としては、永久難聴、鼓膜穿孔、仮性真珠腫、乳様突起炎及び癒着性中耳炎が挙げられる。生後数年以内に中耳炎を発症する小児は、再発性急性又は慢性疾患のリスクがある。中耳炎の主因の１つは、肺炎レンサ球菌である。溶菌酵素（複数の場合もある）／ポリペプチド（複数の場合もある）は、適切な担体中の酵素（複数の場合もある）を外耳道に送達することにより、感染した耳に適用することができる。担体は、滅菌水性又は油性溶液又は懸濁液を含み得る。溶菌酵素（複数の場合もある）は、好適な保存料、好ましくは表面活性剤も含有し得る担体に添加することができる。滴剤中に含まれるのが好ましい殺菌剤及び殺真菌剤は、硝酸又は酢酸フェニル水銀（０．００２％）、塩化ベンザルコニウム（０．０１％）及び酢酸クロルヘキシジン（０．０１％）である。油性溶液の調製に好適な溶媒としては、グリセロール、希釈アルコール及びプロピレングリコールが挙げられる。さらに、任意の数の他の点耳剤担体を使用することができる。中耳炎及び他の同様の耳感染の治療に用いられる濃度及び保存料は、眼感染について論考されるものと同じであり、酵素が入れられる担体は、眼感染の治療のための担体と同様又は同一である。さらに、担体は通例、ビタミン、ミネラル、炭水化物、糖、アミノ酸、タンパク性物質、脂肪酸、リン脂質、酸化防止剤、フェノール化合物、等張性溶液、油性溶液、油性懸濁液及びそれらの組合せを含み得る。
【０２１４】
本発明の溶解素ポリペプチド（複数の場合もある）の認識及び単離によりもたらされる診断、予防及び治療の可能性及び用途は、本発明のポリペプチドが感受性細菌において直接的かつ特異的な効果（例えば、死滅）を生じるということから導き出される。このため、本発明のポリペプチドを使用して、関連の感受性細菌を排除、特性決定又は特定することができる。
【０２１５】
このため、本発明の診断法は、細胞サンプル又は培地を、それが感受性細菌を含有するか、又はサンプル若しくは培地中の細菌が感受性であるかを決定する目的で、有効量の１つ以上の溶解素ポリペプチドを含むアッセイ、及びサンプル中の１つ以上の細胞を特性決定するか、又は細胞溶解が生じたか若しくは生じるか否かを決定する手段を用いて試験することを含み得る。この方法から利益を得ることが可能な患者には、未確定の感染、認識された細菌感染を患うか、又は特定の細菌に曝露される若しくはこれを保有することが疑われる患者が含まれる。被験体又は患者と接触する流体、食品、医療用具、組成物又は他のかかるサンプルは、感受性細菌について試験することができ、又は関連の細菌を排除することができる。かかる一態様では、流体、食品、医療用具、組成物又は他のかかるサンプルは、１つ以上の本発明の溶菌ポリペプチドとのインキュベーション又はそれへの曝露により、滅菌するか、又は他の形で処理して、任意の潜在的な関連の細菌を排除又は除去することができる。
【０２１６】
手順及びそれらの適用は全て、当業者によく知られており、したがって本発明の範囲内で用いることができる。一例では、本発明の溶菌ポリペプチド（複数の場合もある）を、サンプル中の関連又は感受性細菌と複合体化するか、又は他の形で結合若しくは会合させ、複合体の一成員を検出可能な標識で標識する。複合体が形成されたという事実、及び所望に応じてその量を、標識の検出に適用可能な既知の方法によって決定することができる。これらの研究に最も一般的に用いられる標識は、放射性元素、酵素、紫外線に曝露されると蛍光を発する化学物質等である。多数の蛍光物質が既知であり、標識として用いることができる。これらとしては、例えばフルオレセイン、ローダミン、オーラミン、テキサスレッド、ＡＭＣＡブルー及びルシファーイエローが挙げられる。放射性標識は、現在利用可能な計数手順のいずれかによって検出することができる。好ましい同位体は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ及び１８６Ｒｅから選択され得る。酵素標識が同様に有用であり、現在用いられている比色法、分光光度法、蛍光分光光度法、電流測定法又はガス定量法のいずれかによって検出することができる。酵素は、カルボジイミド、ジイソシアネート、グルタルアルデヒド等のような架橋分子との反応によって選択された粒子にコンジュゲートされる。これらの手順に使用することができる多くの酵素が既知であり、用いることができる。ペルオキシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ＋ペルオキシダーゼ及びアルカリホスファターゼが好ましい。米国特許第３，６５４，０９０号、同第３，８５０，７５２号及び同第４，０１６，０４３号が、代替の標識化物質及び方法の開示のために例として言及される。
【０２１７】
ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）溶解素は、ブドウ球菌属、レンサ球菌属、リステリア属、又はエンテロコッカス属細菌を含む多数の異なる株及び種のグラム陽性細菌を死滅させる活性及び能力を示す。特に、重要なことには、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）は、黄色ブドウ球菌、特に抗生物質感受性株及び異なる抗生物質耐性株の両方を含むブドウ球菌属株の死滅に活性である。ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）もレンサ球菌属株の死滅に活性であり、Ａ群及びＢ群レンサ球菌属株に対して特に効果的な死滅を示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの単離株を用いたｌｏｇ死滅評定に基づく、細菌に対するＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）溶解素の能力を下記表１に示す。本明細書に提示される感受性細菌は、ＭＩＣ値を決定及び比較するための本発明の改良ＢＭＤ法に使用することができる。
【０２１８】
2020527551.tif 000011
【０２１９】
本発明は、本発明の例示として提示される以下の非限定的な実施例を参照することによって、より良好に理解することができる。以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態をより十分に説明するために提示されるが、本発明の広い範囲を限定するものとは何ら解釈されないものとする。
【実施例】
【０２２０】
実施例１
バクテリオファージ由来の溶解素は、薬物耐性細菌病原体の出現及び拡散に対処するための新たな治療選択肢をもたらす細胞壁加水分解酵素である。精製組換えタンパク質として、溶解素は、急速な種特異的溶菌効果、抗バイオフィルム活性、耐性の低い傾向、及び抗生物質との顕著な相乗作用を示す。溶解素の治療可能性を調査する取組みにおいて、ヒト血液マトリックスが溶解素ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）の抗ブドウ球菌活性に対して示す強力な「増強効果」を発見した。全血、血清及び血漿におけるＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）の活性は、様々な黄色ブドウ球菌株にわたって、従来の培地（カチオン調整ミューラーヒントンブロス（ｃａＭＨＢ））における活性と比較して最小滅菌濃度の１００倍以上の低下（時間−死滅アッセイ）及び最小阻止濃度の３２倍以上の低下（微量液体希釈アッセイ）をもたらす。増強効果は、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）とダプトマイシン又はバンコマイシンのいずれかとの相乗的な組合せによって更に増大する。このため、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）は、標準的な微生物学的試験フォーマット（例えば、ＭＩＣ、チェッカーボード及び時間死滅アッセイ）において、ｃａＭＨＢと比較してヒト血液中で実質的に大きな効力（３２倍〜１００倍以上）を示した。
【０２２１】
他の抗ブドウ球菌溶解素を用いた増強活性にも注目した。ヒト、ウサギ、ウマ及びイヌの血清は、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）活性に対して同等の増強効果を示したが、この効果は、ラット及び仔ウシにおいて中程度であり、マウス血清では見られない。増強機構が、血液効果を総括するために複数のアッセイフォーマットで添加することができる少なくとも２つの血液成分であるリゾチーム及び血清アルブミンとの相乗作用を伴うという証拠を付加的に提供する。最後に、ｅｘ  ｖｉｖｏでの研究結果に基づく予測を、ウサギでの感染性心内膜炎の治療においてラットと比較してＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）（ダプトマイシンに加えて）について優れた有効性プロファイルを示す研究によりｉｎ  ｖｉｖｏで確認した。確立された黄色ブドウ球菌感染性心内膜炎（ＩＥ）のウサギ及びラットモデルを用いて、ウサギモデル対ラットモデルにて１１１倍低い用量で同等の有効性を実証することにより、これらの研究結果をｉｎ  ｖｉｖｏで検証した。全体としては、これらの研究結果により、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）と血清タンパク質との有利な相乗的相互作用が殺菌活性を促進するように働き、重要な治療的意義を有することが予想されることが示唆される。
【０２２２】
薬物耐性及び多剤耐性細菌の出現及び拡散は、従来の抗生物質に対する新規の代替物又は補助的療法の必要性を生じさせた。現在開発中の有望なアプローチの１つは、グラム陽性細菌病原体を死滅させるための組換えにより作製されるバクテリオファージ由来の溶解素（細胞壁ヒドロラーゼ）の使用に基づくものである（１、２）。溶解素は、従来の抗生物質に対する新規の代替物をもたらす抗微生物酵素である。溶解素は、バクテリオファージによってコードされるタンパク質であり、自然状況で細菌を死滅させるために使用される。生物圏には約１０３１個のファージが存在し、ファージは、宿主細菌を死滅させる主な手段として溶解素タンパク質ファミリーを用いて全ての細菌のおよそ３分の１を毎日死滅させる（Hatful GF (2015) J Virol 89(16):8107-8110）。精製溶解素は、「外からの溶菌（lysis from without）」と呼ばれる現象を示し（Fischetti VA et al (20016) Nature Biotechnology 24:1508-1511）、合成組換え製造に適している。精製溶解素は、接触時に細胞壁加水分解を介して強力な溶菌効果を示す。溶解素ポリペプチドは通例、２０ｋＤａ〜３０ｋＤａのタンパク質である。
【０２２３】
ＣＦ−３０１、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）としても表されるＰｌｙＳｓ２溶解素は、抗ブドウ球菌溶解素であり、黄色ブドウ球菌に起因する心内膜炎を含む菌血症の治療について米国で臨床開発の第２相に入った最初の溶解素クラスの作用物質である（３）。ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）は当初、ブタの豚レンサ球菌が保有するプロファージに由来するものであった。ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）溶解素は、黄色ブドウ球菌のメチシリン及びバンコマイシン耐性及び感受性株（ＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ、ＶＲＳＡ、ＶＩＳＡ）、ダプトマイシン耐性黄色ブドウ球菌（ＤＲＳＡ）、並びにリネゾリド耐性黄色ブドウ球菌（ＬＲＳＡ）等の抗生物質耐性株を含む臨床的に有意なグラム陽性細菌の様々な株を死滅させることが実証された。ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）は、比較的広いが、限定された種の死滅活性を有し、複数の細菌種、特にブドウ球菌属、レンサ球菌属、エンテロコッカス属及びリステリア属細菌株を含むグラム陽性細菌を死滅させることができるが、天然腸内細菌叢中の細菌に対しては不活性である。
【０２２４】
臨床グレードのＰｌｙＳｓ２／ＣＦ−３０１が大腸菌において組換えにより作製されており、広いｐＨ（ｐＨ６〜９．７）及び温度（１６℃〜５５℃）範囲にわたって活性である（Gilmer et al (2013) Antimicrob Agents Chemother 57:2743-2750（非特許文献４）、Scuch et al (2014) J Infect Dis 209:1469-78）。これは血液、血清、血漿、唾液、滑液、肺サーファクタント及び気管支洗浄液を含む様々なヒトマトリックスにおいて活性である。ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）のアミノ酸配列及び構造は、本明細書に上記に提示される。
【０２２５】
ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）は、黄色ブドウ球菌を含む感受性細菌の細胞壁を標的とする。これは、細胞壁ペプチドグリカン中のＤ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｙ結合を標的とし、細胞壁のＤ−アラニン（ステムペプチド（stem peptide））とＬ−グリシン（架橋）との間を切断するシステイン−ヒスチジンアミノペプチダーゼである。溶菌は急速である。ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）は、限定された種特異性を有し、ＭＳＳＡ、ＭＲＳＡ、ＶＲＳＡ、ＤＲＳＡ及びＬＲＳＡを含む抗生物質耐性細菌、メチシリン、バンコマイシン、ダプトマイシン、リネゾリド抗生物質に耐性を示す細菌を死滅させる（Schuch R et al (2014) J Infect Dis 209:1469-1478）。死滅は急速かつ強力であり、溶菌ペプチドに対する低耐性プロファイルが見られる。ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）はバイオフィルムを根絶させ、難分解性細菌を死滅させる。バイオフィルムに対する有効性は、国際公開第２０１３／１７００２２号及び米国特許第９，４９９，５９４号（引用することにより本明細書の一部をなす）に記載されている。国際公開第２０１３／１７００１５号（引用することにより本明細書の一部をなす）に記載されるものを含む抗生物質との相乗作用が観察されている。
【０２２６】
ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）の特徴（Hallmark features）としては、（ｉ）広範な黄色ブドウ球菌分離株に対する強力な、標的化された急速な溶菌効果、（ｉｉ）抗バイオフィルム活性、（ｉｉｉ）耐性の低い傾向、及び（ｉｖ）従来の抗生物質との相乗作用が挙げられる（４、５）。ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）、実際には文献中に記載される多くの付加的な溶解素が、標準的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験培地の状況下で極めて効果的な溶菌剤であり、侵襲的及び局所感染の様々な動物モデルにおいて極めて有効であるが、全血、血漿及び血清等の複雑なヒト生理液における溶解素の活性は殆ど理解されていない。
【０２２７】
抗微生物剤開発の前臨床段階において、治療可能性の初期評価は、最小阻止濃度（ＭＩＣ）を決定し、時間−死滅アッセイフォーマットで時間依存性の死滅を評定するために人工培地を用いて行われるアッセイに基づく（６）。しかしながら、ｉｎ  ｖｉｖｏ有効性（特に全身的に送達される薬物について）がヒト身体の構成要素、特に血液の構成要素との多因子相互作用によって影響を受けることも知られている。β−ラクタム、キノロン及び環状リポペプチドを含む多くの抗生物質クラスについては、投与計画において説明されるべき血漿タンパク質結合と有効性の低下（最大１０倍）との相関（７〜１１）は、非常によく研究されている。例えば、アルブミン、α１−酸糖タンパク質、リポタンパク質、α−グロブリン、β−グロブリン及びγ−グロブリン、並びに赤血球等の血液成分への結合は、遊離活性薬物の量を減少させる可能性がある。逆に、抗生物質（１２、１３）及び抗微生物ペプチド（１３〜１７）の両方の抗菌活性を強化（最大１６倍）するヒト血液マトリックスの能力も実証する研究が増えつつある。抗微生物活性を増強する血清の能力は例えば、増殖速度への影響（７、１８）から自然免疫系及び適応免疫系の体液性エフェクターとの相乗的な相互作用（１３、１５、１６、１９）にまで及ぶ複数の要因に起因すると考えられている。強力な（内因性の）抗微生物活性及びヒト血液環境において既存の抗微生物活性を増強する能力の両方を有し得る作用物質の開発は、独立型作用物質としての又は抗生物質と組み合わせた非常に魅力的な治療選択肢を与える。
【０２２８】
ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）の全身的使用のための臨床計画を考慮すると、ヒト血液がＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）活性の最適な試験用マトリックスである。現在の調査では、ヒト血液マトリックスの状況下での様々な黄色ブドウ球菌分離株に対する溶解素ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）活性のｅｘ  ｖｉｖｏスクリーニングを用いた。単剤としての、また抗生物質との組合せでのＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）の抗ブドウ球菌活性は、人工培地と比較して血液マトリックス中で一貫してより効果的であることが見出された。さらに、ヒトリゾチーム及び血清アルブミンは各々、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）と強い相乗効果を示し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで観察された血液増強効果の多くについて説明された。ｉｎ  ｖｉｖｏ概念実証として、ウサギ（ヒトと同等の血液効果を有する）及びラット（中程度の血液効果を有する）の両方を用いた感染性心内膜炎モデルにおいてＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）の有効性を試験した。ｉｎ  ｖｉｖｏ研究から、ウサギと比較してラットにおいて約５０倍高い用量が殺菌効果に必要とされることが実証された。全体としては、本発明者らの結果から、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）の抗微生物活性がヒト血液中で少なくとも２つの血液成分との相乗作用により増強されることが実証される。複雑なヒト体液における血液因子及び抗生物質との相乗作用を示すＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）の能力は、現在臨床開発中の新規の抗微生物の非常に重要な特質である。
【０２２９】
結果
ヒト血液マトリックスにおける時間依存性の死滅
時間−死滅アッセイを用いて、様々な濃度にわたるメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）株ＭＷ２に対するＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）の時間依存性の殺菌活性を評定した。標準的な試験培地（すなわち、ミューラーヒントンブロス（ＭＨＢ））をヒト全（ヘパリン添加）血、血清又は血漿に置き換えた、米国臨床検査標準協議会（ＣＬＳＩ：Clinical and Laboratory Standards Institute）によって公開された方法論（CLSI document M07-A9 (Methods for dilutional antimicrobial sensitivity tests for bacteria that grow aerobically. Volume 32 (Wayne [PA]: Clinical and Laboratory Standards Institute [US], 2012)）の変法を用いた。複合時間−死滅曲線では、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）は、全てのヒト血液マトリックスにおいて３．２μｇ／ｍＬまで下げた濃度で急速殺菌性（３−ｌｏｇ１０（ＣＦＵ／ｍＬ）以上の低減）かつ滅菌性（２４時間の後処理により）であった（図１Ａ、図１Ｂ、及びデータを示さない）。対照的に、ＭＨＢにおけるＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）の最小滅菌濃度は３２０μｇ／ｍＬであった（図１Ｃ）。ＭＷ２について観察された滅菌活性の１００倍の差が同様に３つの付加的なＭＲＳＡ株、３つのメチシリン感受性黄色ブドウ球菌株（ＭＳＳＡ）及び１つの化膿レンサ球菌株についても観察された（図２）。ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）に加えて、第２の溶解素様酵素であるリゾスタフィン（２０）も試験したが、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）と同様に、ＭＨＢと比較して血液中で滅菌に必要とされる濃度の１００倍の減少が示された（図３Ａ及び図３Ｂ）。対照として、バンコマイシンも試験したが、血液中でＭＨＢ中よりも僅かに減少した効力が示された（図３Ｃ及び図３Ｄ）。
【０２３０】
また、時間−死滅実験を、異なる種における血液効果の程度を（ヒトマトリックス及びＭＨＢと比較して）試験するためにＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）を用いて行った。マウス血清におけるＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）の活性は、ＭＨＢとほぼ同様であり、滅菌濃度は３２０μｇ／ｍＬ超であった（図１Ｄ）。仔ウシ及びラット血清では、滅菌濃度が３２μｇ／ｍＬである中程度の効果が観察された（図４Ａ及び図４Ｂ）。ウサギ及びイヌ血清では、３．２μｇ／ｍＬの滅菌濃度でヒト様の血液効果が観察された（図４Ｃ及び図４Ｄ）。時間−死滅結果は、血液関連増強の以下の序列と一致する：ヒト＝ウサギ＝イヌ＞ラット＝仔ウシ＞ＭＨＢ＞マウス。以前の研究から、ウマ血清が時間死滅アッセイにおいて、特にＤＴＴ等の還元剤を添加することで、ヒト血清の代わりとなることが示されている。２０１６年５月１２日付で出願された米国特許出願第６２／３３５，１２９号に基づく２０１７年５月１２日付で出願された国際出願ＰＣＴ  ＵＳ２０１７／３２３４４号（引用することにより本明細書の一部をなす）に記載がある。ウマ血清も同様の増強を示し、したがってヒト＝ラット＝イヌ＝ウマである。
【０２３１】
ヒト血液マトリックスにおける最小阻止濃度
最小阻止濃度（ＭＩＣ）は、１８時間の一定のエンドポイントでの静止系における抗微生物活性の定量的尺度を与える。微量液体希釈によってＭＩＣを決定するＣＬＳＩの方法を用いて、様々な１７１個の臨床黄色ブドウ球菌分離株に対する標準的な試験培地（すなわち、ＭＨＢ）又はヒト血清のいずれかにおけるＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）活性を評価した。ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）は、７４個のＭＳＳＡ、７５個のＭＳＳＡ、並びに付加的なバンコマイシン耐性、リネゾリド耐性及びダプトマイシン耐性株を含む試験した全ての株について、ＭＨＢと比較してヒト血清中で増強された効力を示した（表１）。全体としては、各群において、試験した分離株の９０％について増殖を阻害するのに必要とされるＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）濃度（ＭＩＣ９０）の３２倍の減少が見られた。興味深いことに、抗ブドウ球菌溶解素Ｓａｌ１及び溶解素様タンパク質リゾスタフィンの両方も、血液マトリックス中で試験した場合にＭＩＣの顕著な３２倍の減少を示した（表２）。しかしながら、溶解素ＣｌｙＳは、僅かな２倍のシフトしか示さなかった。
【０２３２】
【表１】
2020527551.tif 000012
【０２３３】
【表２】
2020527551.tif 000013
【０２３４】
ヒト血液由来のマトリックスの供給源の変動が活性に影響を与え得るかを理解するために、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）のＭＩＣを年齢、性別、血液型及び使用する抗凝血剤のタイプを変えた異なる市販の供給源に由来する全血、血清及び血漿の６２個の異なるプールした及び個々のヒトドナーサンプルのアレイを用いて決定した。試験した全血（ｎ＝１３）、血清（ｎ＝３３）及び血漿（ｎ＝１５）のサンプルについては、０．５μｇ／ｍＬ〜２μｇ／ｍＬの範囲で１μｇ／ｍＬという値のＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）のＭＩＣ９０が観察された（表３）。種々のマトリックスの各々についてＭＩＣの頻度を示す柱状図から、全血及び血清における活性が同等であるが、血漿における活性が約１−ｌｏｇ２（希釈度）異なることが示される（図５）。全体としては、増強効果は個々の若しくはプールしたドナーの年齢、性別及び血液型の変動、又は抗凝血剤としてのクエン酸ナトリウム若しくはヘパリンナトリウムの使用に影響を受けなかった（表３）。この影響を補体不活性化培地、補体活性保持（complement preserved）培地においても観察したが、少なくとも３つの異なるヒト血液、血清及び血漿画分の適合セットにおいて同等であったが、脱脂血清では同等ではなかった。
【０２３５】
【表３】
2020527551.tif 000014
2020527551.tif 000015
2020527551.tif 000016
【０２３６】
種々の動物種の血清におけるＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）活性に対するサンプル変動の影響も試験した。マウスサンプル（ｎ＝１０）についてのＭＩＣ範囲は３２μｇ／ｍＬ〜６４μｇ／ｍＬであったが、ラット（ｎ＝５）についての範囲は８μｇ／ｍｌ〜１６μｇ／ｍｌであり、イヌ（ｎ＝８）についての範囲は０．５μｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌであり、ウサギ（ｎ＝２）では１μｇ／ｍＬであった（表４）。ウサギ及びイヌがラット及びマウスよりも上位であるという、ここで観察された序列は、上記の時間死滅研究において観察されたものと同一である。
【０２３７】
【表４】
2020527551.tif 000017
【０２３８】
ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）は、ヒト血液マトリックス中で抗生物質と相乗作用を示す
ヒト血清の状況下でのＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）とリゾスタフィン、ダプトマイシン又はバンコマイシンのいずれかとの相乗作用を、２つの異なる方法を用いて評定した。第１の方法は、相乗的な抗微生物活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験するのに好ましい技法である時間−死滅アッセイとした。ＭＩＣ以下の量のダプトマイシン及びＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）を個別に試験したが、黄色ブドウ球菌株ＭＷ２に対して最小殺菌効果を有することが見出された（図６Ａ〜図６Ｃ）。しかしながら、同じ量の各作用物質を組み合わせた場合、相乗作用と一致して、実質的により多くの死滅が観察された（２−ｌｏｇ１０  ＣＦＵ／ｍＬ以上の低減）。極めて相乗的な相互作用が、ＭＩＣ以下のＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）とリゾスタフィン（図６Ｄ）又はバンコマイシン（データは示さない）のいずれかとの組合せについても同様に観察された。
【０２３９】
時間−死滅フォーマットでは、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）は、様々なＭＩＣ以下の濃度（０．２５μｇ／ｍＬ〜０．０２５μｇ／ｍＬ）にわたって一定量のＤＡＰ（２．５μｇ／ｍＬ）との相乗作用を示した。相乗作用は、２４時間の時点での２−ｌｏｇ１０（ＣＦＵ／ｍＬ）以上の減少として規定される。これは、ヒト血清において行われる時間−死滅アッセイに必要とされるＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）（単剤として）の最小滅菌濃度の６４倍の減少に相当する。同様に、時間−死滅においてＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）と別の抗微生物剤であるリゾスタフィンとの強力な相乗作用が観察された。ここで、各作用物質（０．００５ｍｃｇ／ｍＬ）の組合せは、２４時間の時点で滅菌性である。注目すべきことに、ヒト血清中でダプトマイシンと相乗作用を示すＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）の最小濃度（すなわち、０．０２５μｇ／ｍＬ）は、ＣＡＭＨＢ中でダプトマイシンとの相乗作用に必要とされる４μｇ／ｍＬの最小濃度よりも１６０倍低く（Schuch R. et al (2014) J Infect Dis 209(9):1469-1478）、ヒト血液中の宿主因子とＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）の殺菌活性との潜在的関連性が示唆された。
【０２４０】
相乗作用を確認する第２の方法は、チェッカーボードアッセイとした（Verma P (2007) Methods for Determining Bactericidal Activity and Antimicrobial Interactions: Synergy Testing, Time-Kill Curves, and Population Analysis. Antimicrobial Susceptibility Testing Protocols, eds Schwalbe R, Steele-Moore L, & Goodwin AC (CRC Press, Boca Raton, FL), pp 275-298）。チェッカーボードを、ＭＨＢ又はヒト血清のいずれかにおいてＭＲＳＡ株ＭＷ２に対し、ＭＩＣ以下のＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）とＭＩＣ以下のリゾスタフィン、ダプトマイシン又はバンコマイシンのいずれかとの組合せを用いて作成した。相乗作用は、２つの薬物を共に添加することによって予測されるよりも大きい阻害活性として規定した（すなわち、０．５以下の最小又は平均部分阻止濃度（ＦＩＣＭＩＮ又はＦＩＣＡＶＧ））。ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）は、ＭＨＢと比較してヒト血清中でリゾスタフィン、ダプトマイシン及びバンコマイシンと非常に強力な相乗作用を示した（表５）。ＭＨＢと比較した血清中でのＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）についてのＭＩＣ値の３２倍の差を考慮すると、ＦＩＣ値の低下は、更により顕著であった。８つの付加的なＭＲＳＡ株の拡張分析では、ＦＩＣＭＩＮ及びＦＩＣＡＶＧ値は、一貫して０．５未満であり（すなわち、相乗作用）、ＭＨＢ中で決定されたものよりも優れていた（表６）。
【０２４１】
【表５】
2020527551.tif 000018
【０２４２】
【表６】
2020527551.tif 000019
【０２４３】
ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）は、ヒトリゾチーム及びヒト血清アルブミンと相乗作用を示す
ヒト血液効果の原理を理解するために、一連のアッセイを用いて、エンハンサー剤（複数の場合もある）の或る特定の物理的特徴を試験した。比色ベースのＭＩＣアッセイを用いて、ヒト血清の増強効果がプロテイナーゼＫの影響を受けるとともに（図７Ａ）、７５℃を超える温度で完全に不活性化されることを実証した（図７Ｂ）。さらに、増強効果は、６．２５％〜１．５％の血清濃度で弱まった（図７Ｃ）。これらの研究結果は、熱安定性かつ豊富であるタンパク性エンハンサー剤（複数の場合もある）と一致する。これらの研究結果、並びに宿主血液成分と相乗作用を示す抗生物質及びＡＭＰの可能性を記載する文献の両方に基づき、熱不活性化ヒト血清を基本培地として用いたチェッカーボードアッセイにおいて、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）と組み合わせた様々な潜在的に抗菌性の血液タンパク質の抗ブドウ球菌活性を次に試験した（表７）。ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）は、試験した作用物質の大部分と相乗作用を示さなかったが（０．５超のＦＩＣＡＶＧ値に基づく）、ヒトリゾチーム（ＨｕＬＹＺ）又はヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のいずれかの精製形態及び組換え発現形態の両方との著しい相乗的な相互作用が検出された。血清における非常に強い相乗作用と一致して、０．１以下のＦＩＣＡＶＧ値が観察された。重要なことには、ウサギ血清アルブミン（ＲａｂＳＡ）がＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）と相乗作用を示したが（ＦＩＣＡＶＧ≦０．１）、ラット血清アルブミン（ＲａｔＳＡ）及びマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）は、相乗作用を示さなかった（ＦＩＣＡＶＧ＞１．１６）。
【０２４４】
【表７】
2020527551.tif 000020
【０２４５】
ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）活性に対するＨｕＬＹＺ及びＨＳＡの影響を、付加的なフォーマットを用いて試験した。初めに、時間−死滅アッセイを用いて、ＭＩＣ以下の量のＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）と１μｇ／ｍＬ〜３５μｇ／ｍＬの様々なＨｕＬＹＺ濃度とを組み合わせた（図８Ａ）。ＨｕＬＹＺ単独は抗ブドウ球菌活性を有しないが（２１）、ヒト血液における濃度が１μｇ／ｍＬ〜３５μｇ／ｍＬで変動することが報告されている（２２）。５μｇ／ｍＬを超えるＨｕＬＹＺ濃度では、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）単独と比較して組合せについて２４時間の時点で２−ｌｏｇ１０（ＣＦＵ／ｍＬ）以上の低減に基づいて相乗的な相互作用が検出された。処理培養物における光学密度の減少に基づく第２のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイでは、様々な濃度にわたるＨｕＬＹＺ（図８Ｂ）及びＨＳＡ（図８Ｃ）の両方の添加により、高レベルのＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）活性が刺激された。ヒトリゾチーム単独は、試験した全ての濃度で黄色ブドウ球菌に対して完全に不活性であった。同様に、ＨＳＡ単独は、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）の非存在下で抗菌活性を有しなかった。約４０ｍｇ／ｍＬの濃度で血液中に生じるＨＳＡについては（７）、２０ｍｇ／ｍＬ〜４０ｍｇ／ｍＬのＨＳＡ濃度でＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）活性の最大の増強が観察された。溶菌アッセイもＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）の比活性を決定する基礎となる（４）。ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）の活性は、約２５００単位／ｍｇのタンパク質で標準的に観察されるが、ＨｕＬＹＺ又はＨＳＡのいずれかの添加は、それぞれ９．８倍又は１７．８倍の活性の増大をもたらす（表８）。ＨｕＬＹＺ及びＨＳＡを共に添加する場合、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）活性の増加倍数は２５％である。
【０２４６】
【表８】
2020527551.tif 000021
【０２４７】
様々な市販のリゾチーム及びＨＳＡ試薬を用い、試験したが、下記表９に示されるように同様の結果が得られた。
【０２４８】
【表９】
2020527551.tif 000022
【０２４９】
ＨｕＬＹＺ及びＨＳＡを用いたヒト血液効果の総括
ヒト血液効果の基準は、ＭＨＢと比較してヒト血清において決定されるＭＩＣ値の３２倍の減少である。ＭＩＣフォーマットを用いて、血液効果を欠く２つの異なる培地タイプ（すなわち、ＭＨＢ、及び５０％熱不活性化ヒト血清を添加したＭＨＢ）にＨｕＬＹＺ及び／又はＨＳＡのいずれかを添加することによりヒト血液効果を総括しようとした。最も強力な溶菌活性は、ＨｕＬＹＺ及びＨＳＡとＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）との組合せで観察された。ＭＨＢでは、ＨｕＬＹＺ（濃度１０μｇ／ｍＬ）又はＨＳＡ（濃度４０ｍｇ／ｍＬ）のいずれかの添加は、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）ＭＩＣのそれぞれ２倍及び８倍の減少をもたらした。ＨｕＬＹＺ及びＨＳＡの両方の添加は、１６倍の減少をもたらした（表１０）。５０％熱不活性化ヒト血清を添加したＭＨＢにおける効果は同様であった（表１１）。重要なことには、ＲａｂＳＡの添加は、ＨＳＡについて観察されるものと同様の効果（すなわち、８倍の減少）をもたらしたが、ＲａｔＳＡ又はＭＳＡのいずれかの添加は、殆ど又は全く効果を有しなかった。
【０２５０】
【表１０】
2020527551.tif 000023
【０２５１】
【表１１】
2020527551.tif 000024
【０２５２】
ヒト血清におけるＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）とＨＳＡとの相互作用
ウエスタンブロット分析を、抗ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）抗体を用いて行い、血液効果を有する条件（すなわち、ヒト血清）及び血液効果を有しない条件（すなわち、ＭＨＢ、及び５０％熱不活性化ヒト血清を添加したＭＨＢ（ＭＨＢ／ＨｉＨｕＳ））のＭＩＣウェルにおいてＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）を検出した。細菌細胞の存在下で、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）は、ヒト血清において高分子量（約１５０ｋＤＡ）のバンドを形成するが、ＭＨＢ又はＭＨＢ／ＨｉＨｕＳのいずれかにおいては形成しない（図９Ａ）。約１５０ｋＤＡのバンドは、通常検出されるＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）の単量体及び二量体（及び三量体）とは異なる。興味深いことに、約１５０ｋＤＡのバンドは、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）を、細菌細胞を含まないヒト血清中でインキュベートした場合に観察されない（データは示さない）。
【０２５３】
ＨＳＡ又はＲａｂＳＡ（いずれも４０ｍｇ／ｍＬ）のいずれかをＭＨＢに添加することの効果を試験した。ＨＳＡ又はＲａｂＳＡのいずれかの添加は、ＭＨＢにおいて血液効果を部分的に確立し（上記を参照されたい）、細菌細胞の存在下で約１５０ｋＤａのバンドの出現をもたらす（図９Ｂ）。ＨｕＬＹＺ（１０μｇ／ｍＬ）の添加は、約１５０ｋＤＡのバンドの形成と関連しない（図９Ｃ）。
【０２５４】
ヒト血清において形成される約１５０ｋＤａのバンドの性質を質量分析によって試験した。１５０ｋＤａで通常見られる他のタンパク質に加えて、検出される最も豊富なフラグメントシグナルは、ヒト血清アルブミンに由来するものであった（データは示さない）。
【０２５５】
血清脂質は、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）の強化効果に必要とされる
脱脂ヒト血清がＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）との相乗作用を示さないという本発明者らの観察結果（表３）から、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）が血清中のＨＳＡと相乗作用を示す機構の一部として脂肪酸（ＦＡ）が必要とされることが示唆される。循環血液中の遊離ＦＡの大部分がＨＳＡに結合し（２４）、脱脂プロセスは、ＨＳＡレベルを変化させないが、遊離ＦＡレベルをおよそ３分の１低下させる（Sacks FM et al (2009) J Lipid Res 50(5):894-907）。低いＦＡレベルが、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）が脱脂血清中で相乗作用を示す能力がないことに関与することを確認するために、ＭＩＣアッセイフォーマットでの脱脂血清の性能に対する循環血液中でより多く見られるＦＡの２つであるオレエート及びパルミテート（Richieri GV & Kleinfeld AM (1995) J Lipid Res 36(2):229-240）を導入することの効果を決定した。０．６２５ｍｇ／ｍＬの生理的濃度でのオレエート又はパルミテートのいずれかの添加は、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）ＭＩＣのそれぞれ８倍及び１６倍の減少をもたらし、両方の脂質の同時添加と関連する更なる減少は見られなかった（表１２）。ＦＡ単独（血清状況外）がＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）活性に影響を有しない（データは示さない）ことを考慮すると、この効果がＨＳＡによって媒介される可能性がある。また、ＨＳＡ上の高親和性部位に結合したＦＡが薬物及び他の化合物に対する付加的な結合活性を促進するように作用するという理解（Yang F et al (2014) Int J Mol Sci 15(3):3580-3595）に基づくと、この効果がＨＳＡとＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）との間の直接相互作用を反映する可能性もある。
【０２５６】
【表１２】
2020527551.tif 000025
【０２５７】
ＨｕＬＹＺ及びＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）を用いた細胞表面結合研究
共焦点顕微鏡法を用いて、４０ｍｇ／ｍＬのＨＳＡで前処理した黄色ブドウ球菌株ＡＴＣＣ  ７００６９９の表面へのローダミン標識ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）（ＣＦ−３０１ＲＨＤ）の結合を試験した（図１０）。０．２５倍ＭＩＣに相当する量では、ＣＦ−３０１ＲＨＤ構築物は、ＨＳＡで前処理した細胞においてブドウ球菌細胞壁の広範な標識化を示した。ＨＳＡ前処理の非存在下では、標識化は観察されなかった。ＨＳＡ前処理は、ブドウ球菌属への蛍光体タグ付き溶解素ＰｌｙＧ及びＰｌｙＣ（それぞれ炭疽菌及び化膿レンサ球菌の表面に特異的）の結合を可能とせず、ＨＳＡ活性の特異性が確認された（データは示さない）。
【０２５８】
また、０．２５倍ＭＩＣ量のＣＦ−３０１ＲＨＤによるその後の標識化に対する複数の異なる血清型及びＭＨＢとのブドウ球菌属のプレインキュベーションの効果を蛍光顕微鏡法によって試験した（図１１）。ヒト血清又はウサギ血清のいずれかとのプレインキュベーションのみが黄色ブドウ球菌株ＭＷ２の広範な標識化をもたらした。ラット血清、マウス血清又はＭＨＢ単独とのプレインキュベーションは、より長い曝露時間でのみ観察される細胞の不十分な標識化をもたらした。マウス血清へのＨＳＡの添加は、高レベルの結合及び蛍光を回復させた。
【０２５９】
ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）と相乗作用を示すＨｕＬＹＺの能力に基づき、次に共焦点顕微鏡法を用いて、ＭＩＣ以下の範囲のＣＦ−３０１で前処理したブドウ球菌属へのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ標識ＨｕＬＹＺ（ＨｕＬＹＺＡＦ）の結合を試験した（図１２）。ＨｕＬＹＺＡＦは、０．５倍又は０．２５倍ＭＩＣ量のＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）のいずれかで前処理した細菌の細胞壁を広範に標識した。ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）による前処理の非存在下では、標識化は観察されなかった。さらに、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）前処理は、ＰｌｙＧ又はＰｌｙＣ溶解素の結合を促進しなかった（データは示さない）。
【０２６０】
ヒト血清におけるＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）溶菌活性の可視化
ブドウ球菌属をヒト血清又はＭＨＢのいずれかにおいて様々なＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）濃度で１０分間処理した後、透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）による分析を行った。溶菌活性は、ＭＨＢにおいては最高濃度のＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）（すなわち、５μｇ／ｍＬ）でのみ観察されたが、溶菌の広範な証拠が１００倍範囲にわたる全ての濃度のヒト血清において観察された（図１３）。血清中でのより急速な溶菌に加えて、溶菌事象は、ＭＨＢ中での事象と比較して視覚的に異なっていた。ヒト血清中では、全ての細菌が、ＨＳＡを含む宿主タンパク質からなることが推定されるタンパク性の鞘に包まれる。鞘内では、溶解細菌は、電子密度の高い細胞壁物質の周辺溶解によって区別され、興味深いことに、細菌残屑は、鞘に包まれたままであるようである。対照的に、ＭＨＢにおける溶菌事象は、溶菌直前の典型的な細胞膜の泡立ち（bubbling）及び突出として現れる。
【０２６１】
ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）活性に対する強い血液効果のｉｎ  ｖｉｖｏ証拠
ＤＡＰに加えたＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）の有効性を、ＭＲＳＡ株ＭＷ２に起因する感染性心内膜炎のラット及びウサギモデルを用いて調査した。ｉｎ  ｖｉｖｏ研究から、ＤＡＰに加えたＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）が、ラットモデルと比較してウサギモデルにおけるＩＥの治療により効果的であることが示された（図１４）。ラットモデルでは、ヒト治療量（ＨＴＤ）当量のＤＡＰに加えて投与した総用量１０ｍｇ／ｋｇのＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）は、心臓弁疣贅（vegetation）の約３  ｌｏｇ１０（ＣＦＵ／ｇ）の低下をもたらす。ＤＡＰ処理単独と比較して同じ細菌密度の３  ｌｏｇ１０の減少が、ＨＴＤ当量未満のＤＡＰに加えた総用量０．０９ｍｇ／ｋｇ以上のＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）の投与後にウサギモデルにおいて達成される。２つのモデルにおけるＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）有効性の差は、ラットモデルではヒト等価用量のＤＡＰを用いた一方で、ウサギモデルではＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）をＨＴＤ当量よりも低い用量のＤＡＰと組み合わせたことを考慮すると、更により顕著である。
【０２６２】
実験的ラットＩＥモデルでは、ＤＡＰに加えた１０ｍｇ／ｋｇのＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）投与レベルで達成される０．８７以上の推定ＡＵＣ／ＭＩＣ比が、最大有効性（ＤＡＰ単独に対して心臓弁疣贅の３  ｌｏｇ１０（ＣＦＵ／ｇ）の低下）を達成するために必要とされた（表１３及び図１５）。反対に、同様のＡＵＣ／ＭＩＣ値がウサギモデルにおいて用量０．１８ｍｇ／ｋｇのＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）後に得られた。全体としては、ｉｎ  ｖｉｖｏ研究から、ウサギ（０．１８ｍｇ／ｋｇ）と比較してラット（１０ｍｇ／ｋｇ）において約５０倍高い用量が同様の殺菌効果に必要とされることが実証された。
【０２６３】
【表１３】
2020527551.tif 000026
【０２６４】
本明細書の研究に用いられる細菌株のリストを下記表１４に提示する。
【０２６５】
【表１４】
2020527551.tif 000027
【０２６６】
論考
この研究では、ミューラーヒントンブロス（標準的な試験培地）におけるＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）及び様々な他の抗菌性溶解素の活性を、ヒト全血、血漿及び血清を含む生体関連の培地タイプにおいて決定された活性と比較した。
【０２６７】
ヒト血液の成分を活性化し、それと相乗作用を示し、ＣＡＭＨＢ参照ブロスを用いた標準化手順（例えば、ＣＬＳＩ）に従うＡＳＴにより予測された抗ブドウ球菌活性に対して抗ブドウ球菌活性のレベルの増強を強化するＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）の実質的な能力を本明細書に記載し、実証する。本発明者らの研究結果は当初、ＣＡＭＨＢと比較した最大３４個の異なる供給源に由来する血液マトリックス中での１１個のブドウ球菌株に対するＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）の最小滅菌濃度の１００倍以上の低下を実証するｉｎ  ｖｉｔｒｏ時間−死滅アッセイに基づくものであった。ヒト血清中で試験した１７１個の黄色ブドウ球菌分離株に対するＭＩＣ９０の３２倍以上の低下、並びに６１個の異なるヒト供給源に由来する血液、血清及び血漿中で一貫して低レベルのＭＩＣ変動性を更に実証した。時間−死滅及び／又はチェッカーボードフォーマットでのダプトマイシン又はバンコマイシンのいずれかとの組合せで、ＣＡＭＨＢよりも最大１６０倍低いＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）濃度でのヒト血清において相乗的な活性が観察された。全体としては、これらの結果から、黄色ブドウ球菌菌血症及び心内膜炎の治療のために静脈内に投与される抗微生物剤としてのＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）の潜在的有効性が支持される。
【０２６８】
さらに、本発明者らの研究結果から、活性及び有効性の増強と関連する主要な要因として、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）と、明らかな（単剤）内因性抗ブドウ球菌活性を有しない２つの特定のヒト血液成分（すなわち、リゾチーム及びアルブミン）との間の相乗作用が示唆される。そうでなければ不活性な（dormant）バイスタンダーを活性化し、それと相乗作用を示すＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）の独自の能力（ブドウ球菌属の死滅に関して）は、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）の医薬用途及びその抗微生物活性の測定に重要な意味を有する。さらに、本発明者らの研究結果は、多くの全身的に送達される従来の小分子抗生物質について、循環血液中でのタンパク質結合（主にアルブミンに対する）が薬物活性を低下させるように働くという一般的な理解とは明らかに対照的である（Zeitlinger MA, et al. (2011) Antimicrob Agents Chemother 55(7):3067-3074、Schmidt S, et al. (2008) Antimicrob Agents Chemother 52(11):3994-4000、Burian A, et al. (2011) J Antimicrob Chemother 66(1):134-137、Stratton CW & Weeks LS (1990) Diagn Microbiol Infect Dis 13(3):245-252、Beer J, Wagner CC, & Zeitlinger M (2009) AAPS J 11(1):1-12、Hegde SS, et al. (2004) Antimicrob Agents Chemother 48(8):3043-3050、Garonzik SM, et al. (2016) PLoS One 11(6):e0156131）。
【０２６９】
本明細書の研究及び結果によると、血清中で収集されたＭＩＣデータは、溶解素ポリペプチド、特にＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）溶解素等の溶解素ポリペプチドについてのｉｎ  ｖｉｖｏ活性の予測及び臨床試験に先立つｉｎ  ｖｉｖｏ研究への使用により適切であり得る。特に、本研究に基づき、血清中で又は血清成分を添加して収集されたデータは、ＳＨ３型結合ドメインを有する、本明細書に提示されるＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）、Ｓａｌ溶解素、リゾスタフィン等、又はＳＨ３結合ドメインを有する他の溶解素、キメラ、構築物により適切であり得る。実際に、ｉｎ  ｖｉｖｏ治療に必要とされる或る特定のペプチド及びペプチド抗生物質（ａｂｘ）の濃度は、人工培地において決定されたＭＩＣから従来推定されるよりも低い場合がある。抗菌活性を試験するための改善されたアプローチの１つは、生体関連濃度の血液マトリックスの使用である。
【０２７０】
ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）について記載される抗微生物活性を相乗的に促進する際のＨＳＡの役割については以前に記載されていない。ＨＳＡに関する本発明者らの仮説は、以下の観察結果に強く基づく：（ｉ）チェッカーボード、時間−死滅及び溶菌アッセイを含む複数のアッセイフォーマットでのＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）との相乗作用；（ｉｉ）ＣＡＭＨＢ／ＨｉＨｕＳ及びＣＡＭＨＢのような培地中でのＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）による血清効果を殆ど再現する（reconstitute）能力；（ｉｉｉ）ウエスタンブロット分析によって検出されるＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）との推定的相互作用；並びに（ｉｖ）顕微鏡法によって検出されるブドウ球菌細胞表面へのＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）結合の促進。付加的な支持は、再現実験においてＨＳＡに取って代わる異なる種に由来するアルブミンの使用により得られる。特に、ウサギＳＡを４０ｍｇ／ｍＬの生理的濃度で使用する場合、ＨＳＡの活性を模倣することができる。ラットＳＡ及びマウスＳＡはどちらも、４０ｍｇ／ｍＬの超生理的濃度でのみＨＳＡ効果を再現することができる。ウサギ及びヒトにおける４０ｍｇ／ｍＬの正常生理的濃度の半分である、２０ｍｇ／ｍＬという齧歯類における比較的低い生理的ＳＡ濃度により、マウス及びラット血清が高レベルのＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）活性について基質として働く能力がないことを少なくとも部分的に説明することができる。
【０２７１】
相乗効果を再現するために脱脂血清を用いた、特にオレエート又はパルミテートの添加による本発明者らの実験から、活性の増強のための機構の一部としてのＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）とＨＳＡとの間の直接相互作用も示される。循環ＨＳＡモノマーは、一般に脂質と複合体化され、ＦＡに結合して、抗生物質及び他の分子との相互作用を調整及び変更することができる少なくとも７つの高親和性及び中親和性ＦＡ結合部位が存在する（Yang F, Zhang Y, & Liang H (2014) Int J Mol Sci 15(3):3580-3595）。ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）とのかかる相互作用が生じることは、１μｇ／ｍＬのＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）ＭＩＣと関連する条件にてＨＳＡの存在下でのみＳＤＳ耐性高分子量凝集体（すなわち、約９５ｋＤＡ及び約１５０ｋＤＡ）の形成を示す本発明者らのウエスタンブロットデータによっても支持される。ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）凝集体は、３２μｇ／ｍＬのＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）ＭＩＣと関連した条件にてＨＳＡの非存在下では形成されない。凝集体形成、ＨＳＡ結合及び高レベルのＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）活性の間の潜在的関係は、血清タンパク質への結合により活性が弱まる抗生物質と対照的である。
【０２７２】
黄色ブドウ球菌は、血液中での生存及びブドウ球菌感染の全体的発症機序に寄与する、大きなアルブミン結合タンパク質であるＥｂｈを表面上に発現する（Cheng AG, Missiakas D, & Schneewind O (2014) J Bacteriol 196(5):971-981）。アルブミン結合タンパク質は実際に、宿主組織における生存戦略の一環としてＨＳＡを吸着することが理論化されている様々な病原性微生物上で見られる（Egesten A et al (2011) J Biol Chem 286(4):2469-2476）。これらの研究結果は、電子顕微鏡法に基づき、アルブミン及び／又は他の血液成分からなる可能性がある、ヒト血清中の黄色ブドウ球菌上への緻密なタンパク性表面層の急速な蓄積を示す、本発明者らの観察結果と一致する。この層は、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）媒介溶菌の視覚的顕在化を変更し（ＣＡＭＨＢにおける事象と比較して）、おそらくは宿主由来の物質のマトリックスに封入される、無傷なことが多い細胞外被を有する細菌ゴースト様構造（Wu X, et al. (2017) Foodborne Pathog Dis 14(1):1-7）を最終的に生じる、目に見える鞘をブドウ球菌属の周囲に形成する。細菌残屑及びフラグメント（溶菌後に形成される）の封入は、宿主の血流中へのこれらのフラグメントの自由放出と関連する炎症誘発性応答の潜在的リスクの緩和においても重要な役割を果たし得る。さらに、ヒトＨＳＡマトリックスへの細菌及びＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）の封入は、潜在的に有害な免疫反応のリスクを低下させる可能性もある。全体としては、本発明者らの研究結果は、血流中にてＨＳＡで自身を被覆し、それによりヒト免疫学的監視を回避するブドウ球菌属の自然能力が、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）に対するＨＳＡの結合能に関して、溶菌の増強をもたらす、それらの唯一の弱点であり得るという仮定を支持する。言い換えると、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）とＨＳＡとの相乗作用の機構は、ＨＳＡによって媒介される細菌細胞表面でのＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）についての蓄積動態の改善に基づき、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）によるより急速かつ効率的な細菌死滅をもたらす。
【０２７３】
本明細書に提示する結果は、ヒト血清中で黄色ブドウ球菌に対してリゾチームを活性化するＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）の能力に関して結論を出すことも可能にする。初めに、成熟黄色ブドウ球菌ペプチドグリカンが細胞壁Ｎ−アセチルムラミン酸のＣ−６位でのＯ−アセチル化によりＨｕＬＹＺ活性に耐性を示すことが一般的に理解される（Bera A et al (2005) Mol Microbiol 55(3):778-787、Bera A et al (2006) Infect Immun 74(8):4598-4604）。したがって、複数の異なるＡＳＴフォーマットにおいて広範な濃度にわたって単独で試験したＨｕＬＹＺについていかなる抗ブドウ球菌活性も観察されなかった。しかしながら、時間−死滅、チェッカーボードアッセイ及び溶菌アッセイにおいて生理的濃度でＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）と組み合わせて試験した場合にＨｕＬＹＺの異なる相乗的な抗微生物活性が観察された。相乗効果へのＨＳＡの寄与は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ再現実験に基づくとより多大であるが、ＨｕＬＹＺが完全な再現効果に一貫して必要とされ、デコンボリューション顕微鏡法によりブドウ球菌属のＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）媒介表面標識化の程度を劇的に増大することが観察された。提唱されているＨＳＡの活性と併せると、本発明者らのモデルでは、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）がＨＳＡとの相互作用により、また、これとは独立して、ＨｕＬＹＺの活性化により細胞表面に選択的に蓄積すると考えられる。このＨｕＬＹＺ活性の正確な性質は不明であるが、考え得る説明の１つでは、ペプチドグリカンのＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）媒介切断により、Ｏ−アセチル化に先立って形成される新生ペプチドグリカンへのＨｕＬＹＺの接近が開始され、その後のＨｕＬＹＺの加水分解活性が、溶菌が進むにつれＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）結合をより促進すると考えられる。
【０２７４】
ブドウ球菌菌血症及び心内膜炎の対象とする臨床的適応におけるＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性プロファイルを理解するために、本明細書で報告されるｅｘ  ｖｉｖｏフォーマットにおいてそれぞれの血清型と相乗作用を示すＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）の能力の差が観察される２つの種（ウサギ及びラット）において実験を行うことにする。ＩＥモデルは、ウサギ及びラットの両方において確立されており（Abdelhady W et al (2017) Antimicrob Agents Chemother 61(2)、Hady WA, Bayer AS, & Xiong YQ (2012) J Vis Exp (64):e3863）、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）についての対象とする臨床的適応に関して非常に関連性がある顕著なバイオフィルム成分を有する。ラット血清ではなく、ウサギ血清における強力なＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）相乗作用の本発明者らのｅｘ  ｖｉｖｏ観察結果によると、ウサギ（０．１８ｍｇ／ｋｇ）と比較してラット（１０ｍｇ／ｋｇ）において同様の殺菌効果を得るために５０倍超高いＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）用量及び２０倍超高いＡＵＣ曝露が必要とされることが観察された。これらのモデルは、ＨＳＡ及びＨｕＬＹＺを活性化し、それと相乗作用を示すＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）の能力の潜在的な治療的意義に関して更なる証拠を与え、心内膜炎を含む黄色ブドウ球菌菌血症の治療についてＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）を評価する臨床試験において、治療用途について選択される用量で予想されるＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）の有効性を支持する。
【０２７５】
幾つかの以前の研究で血清及び血漿における抗菌効果が評価されているが、結果及び結論は様々であった。ヒト血漿の存在が大腸菌に対するα−ペプチド／β−ペプトイドペプチド模倣薬等の抗菌性ペプチド模倣薬（ＡＭＰ）の活性を増大させることが報告されており（Hein Kristiansen et al 2013、Citterio et al 2016）、血液成分との相乗作用が関与し得るという仮定が導かれるが、このことは完全には評価されていない。ペプチド模倣薬及びＰＭＢが血漿中でＭＩＣを２倍〜１６倍低下させたという研究結果は、血漿による強化が、熱不活性化が相乗作用を消失させたことから、補体等の内因性血液成分によって引き起こされ得るという示唆につながる。熱不活性化は、ＭＩＣの劇的な増大を引き起こした。補体カスケードのタンパク質を含む血漿の他の成分が強化において作用し得ることが示唆され、これにより血漿が幾つかのＡＭＰによる強化を血清よりも生じる理由が説明され得る。血清とは異なり、血漿は、細菌の存在に応答し得る活性凝固因子を含有する。
【０２７６】
血漿は、ゲンタマイシン及びアンピシリンではなく、ＰＭＢの活性を増強した。他の研究から、補体タンパク質がＰＭＢ及びＡＭＰ等の抗微生物性化合物と相乗的に作用し得ることが報告されている。細胞膜又は外被に対して活性な化合物のみが強化されるようであることから、強化効果は作用物質の作用様式によって決まる。凝固タンパク質が補体と作用して活性を強化するという結論が出された。
【０２７７】
Vaara et al 1984は、外膜破壊ペプチドＰＢＭＮを評価し、小カチオン性外膜破壊ペプチドＰＭＢＮが、血清の殺菌作用に対して大腸菌を感作し、得られる補体カスケードの活性化により正常血清中に存在する抗体又は他の因子の挿入又は結合を促進することを見出した。血清のＰＭＢＮ媒介殺菌活性は、加熱により消失した。この効果はヒト、モルモット及びウサギにおいて認められ、中程度の効果がラットにおいて認められ、マウス血清では効果が認められなかった。マウスは、正常又は高度免疫血清又は腹腔液も殺菌作用を欠いており、他の動物の血清において容易に死滅することから、哺乳動物において独特であるとして挙げられている。
【０２７８】
Pruul and McDonald 1992は、正常ヒト血清によるアジスロマイシンの抗菌活性の強化を評定した。Pruul and McDonaldの研究では、ＭＩＣアッセイにおいて４０％の血清が細菌黄色ブドウ球菌に対するＭＩＣの１５倍の減少を引き起こす。しかしながら、この増強は熱不活性化によって阻害されず、これが熱感受性ではないことが示された。また、Pruul and McDonaldは、補体不活性化血清又は抗体枯渇血清について違いを見出さなかった。また、ＴＳＢ試験ブロスへのアルブミン（Ｃｏｈｎ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ）の追加（７０ｍｇ／ｍｌまで）は、活性を回復させなかった。この効果は、グラム陰性種に限定され、ブドウ球菌属では観察されなかった。
【０２７９】
ヒト血清の血清増強因子としては、血清リポタンパク質、ｐＨの変化、抗菌性ペプチドを挙げることができる。血清因子によってもたらされる細菌増殖速度及び細菌表面の組成の変化は、細菌膜透過性を変更するか、抗生物質蓄積動態を変化させるか、又は抗生物質結合を増強する可能性がある。
【０２８０】
動物宿主における自然免疫分子の相当な多様性を考えると、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）活性が多くの他のペプチドと相乗作用を示し、その全体的有効性を改善する可能性がある。
【０２８１】
本研究に基づき、活性増強を生物学的に説明するために以下のモデルを提案する。血液中では、黄色ブドウ球菌細菌は、免疫系を回避するためにＨＳＡを含む血清タンパク質で被覆される（黄色ブドウ球菌上のＨＳＡ結合タンパク質は既知であり、以前に記載されている）。ＨＳＡ結合は、架橋の減少を含む、相当な犠牲となる。細菌の存在下でのＨＳＡとのＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）（及び他のＳＨ３結合型溶解素）の相互作用により、溶解素は細菌表面に集中する。この集中は、ＨＳＡ結合によって現れる架橋の減少と組み合わせて、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）の抗微生物活性を増強する。通常は黄色ブドウ球菌細菌に対する効果がないヒトリゾチーム（ＨｕＬＹＺ）の場合、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）の活性の増強は、架橋の減少と組み合わせて、ＨｕＬＹＺ結合、及びＨｕＬＹＺに感受性のままである新生ペプチドグリカンに対する活性を促進する。ＨＳＡ、ＨｕＬＹＺ及びＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）の組合せ活性により血液効果が可能となる。
【０２８２】
ＨｕＬＹＺへの黄色ブドウ球菌の感作は、新たに認識され、以前には観察されていない。黄色ブドウ球菌の特徴は、その免疫回避戦略の中心となるリゾチームに対する耐性である。ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）処理は、これを回避し、リゾチームを黄色ブドウ球菌に対して活性なものとする。
【０２８３】
このため、本実験により、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）が、その固有の加水分解活性及びリゾチームの抗菌活性を強化するその能力に基づき、非常に効率的な抗ブドウ球菌剤であることが実証される。加えて、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）は、ＨＳＡと相乗作用を示し、これを強化し、及び／又は細菌細胞に対するＨＳＡ結合を用いてＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）を細菌へと導き、及び／又はＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）を細菌感染部位に効果的に集中させる。
【０２８４】
本発明者らのデータから、ヒト血液環境が、自然免疫エフェクターであるリゾチーム及び最も豊富な血清タンパク質であるアルブミンの両方との相乗的な相互作用の結果として、抗ブドウ球菌溶解素ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）及び他の例示的なＳＨ３型結合ドメイン含有溶解素と相乗作用を示し、その抗微生物活性を大幅に増強又は強化することが実証される。この研究から、大きく異なるペプチドグリカン基質に対応する、この酵素クラスの顕著な適合性が強調される。この観察結果は、抗生物質チャレンジに応答した微生物の適合性を浮き彫りにし、耐性から除外されると長年考えられてきた、確立された抗生物質の感受性を実証する。
【０２８５】
材料及び方法
細菌、培地及び増殖条件。この研究に用いられる細菌株のサブセットを表Ｓ８に記載する。JMI Laboratories（North Libery，IA）から得られた２０１１個からの７４個のＭＳＳＡ及び７５個のＭＲＳＡ臨床分離株を含む、表１に用いられる１７１個の黄色ブドウ球菌株は、以前に記載されている（４）。細菌は、他に指定のない限り、５％ヒツジ血液を含むＢＢＬ（商標）トリプチケース（商標）ソイ寒天（ＴＳＡＢ；Becton, Dickinson & Company（BD））、カチオン調整ＢＢＬ（商標）ミューラーヒントンＩＩブロス（ＣＡＭＨＢ；BD）、又はブレインハートインフュージョンブロス（ＢＨＩ；BD）のいずれかにおいて培養した。ＨｙＣｌｏｎｅ（商標）ウシ胎仔血清（０．１ミクロン濾過；GE Healthcare Lifesciences）を除く、試験した全てのヒト及び動物血液マトリックスの供給源、説明及びロット番号を表Ｓ１及び表Ｓ２に記載する。ブドウ球菌属は、他に指定のない限り、通気しながら３７℃で増殖させた。
【０２８６】
試薬。溶解素ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）を以前に記載されているように発現させ、精製し、保管した（４）。ヒト抗ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）ＩｇＧ３モノクローナル抗体（ContraFect Corporationにて発現及び精製された）及びマウス抗ヒトＩｇＧ３重鎖抗体、ＡＰコンジュゲート（ThermoFisherの０５−３６２２）を、ウエスタンブロットのための一次及び二次抗体として１０００倍希釈で使用した。ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）と組み合わせて試験した全ての作用物質（及び供給業者（vendor sources））は、以下の通りである：β−ディフェンシン−３、ヒト（Anaspec）；Ｌｅａｐ−１、ヒト（Anaspec）；Ｌｅａｐ−２、ヒト（GenScript）；ＬＬ−３７、ヒト（Anaspec）；ＬＬ−１８−３７（Anaspec）；ヒスタチン−５、ヒト（Anaspec）；ＨＮＰ−１、ヒト（Anaspec）；ＨＮＰ−２、ヒト（Anaspec）；ヒト血小板第ＩＶ因子１８（Anaspec）；ラクトフェリン、ヒト乳汁（Sigma-Aldrich）；ラクトフェリン、ウシ初乳（Sigma-Aldrich）；ラクトフェリシンＨ、ヒト（Anaspec）；ヒトリゾチーム、コメにおいて組換え発現（Sigma-Aldrich）；リゾチーム、鶏卵（Sigma-Aldrich）；リゾチーム、ヒト好中球由来（AVIVA Biosciences）；リゾチーム、ヒト好中球由来（RayBiotech）；ヒト血清アルブミン、コメにおいて組換え発現（Sigma-Aldrich）；ヒト血清アルブミン、フラクションＶ（Sigma-Aldrich）；ヒト血清アルブミン、フラクションＶ、脂肪酸無含有、グロブリン無含有（Sigma-Aldrich）；ヒト血清アルブミン、酵母において組換え発現（Albumin Biosciences）；マウス血清アルブミン、酵母において組換え発現（Albumin Biosciences）；ウサギ血清アルブミン（Sigma-Aldrich）；及びラット血清アルブミン（Sigma-Aldrich）。オレイン酸ナトリウム、パルミチン酸ナトリウム、バンコマイシン塩酸塩、ダプトマイシン、トリチラキウム・アルブム（Tritirachium album）由来のプロテイナーゼＫ−アガロースは、Sigma-Aldrichから入手した。顕微鏡法のために、ＤＡＰＩ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（商標）  ４８８及びＮＨＳ−ローダミンをThermo Fisher Scientificから入手した。ＮＨＳ−ローダミンにコンジュゲートしたＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８にコンジュゲートしたＨｕＬＹＺの標識化及び精製は、製造業者のプロトコルに記載されているように行った。未反応フルオロフォアを、ＰＤ−１０脱塩カラム（GE Healthcare）を用いて除去し、標識化効率はいずれの場合にも８０％超であると決定された。ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）−ローダミン（ＣＦ−３０１ＲＨＯＤ）の活性は、標準的なＭＩＣアッセイを用いてＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）と同等であることが確認された。ＨｕＬＹＺ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（ＨｕＬＹＺＡＦ）の活性は、ミクロコッカス・ルテウス（Micrococcus luteus）に由来する１ｍｇ／ｍｌのペプチドグリカンを含浸させた１％アガロース表面（Sigma-Aldrich）上で液滴希釈（drop dilution）アッセイを用いてＨｕＬＹＺと同等であることが確認された。ＧＦＰ標識ＰｌｙＧ（ＰｌｙＧＧＦＰ）及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８標識ＰｌｙＣ（ＰｌｙＣＡＦ）の作製、精製及び使用は、以前に記載されている（３８、３９）。
【０２８７】
時間−死滅アッセイ。殺菌活性をＣＬＳＩの方法に従って試験した（５２）。アッセイは、１２５ｍＬ容ガラスエルレンマイヤーフラスコ内で撹拌しながら、ＣＡＭＨＢ又は指定の（非希釈）血液マトリックスにおいて５×１０５ＣＦＵ／ｍＬの細菌接種材料を用いて行った。指定の作用物質を１０倍範囲の濃度にわたって試験した。ダプトマイシンについては、ＣＡＭＨＢ培養物に５０μｇ／ｍＬ  Ｃａ２＋を添加した。緩衝液単独を用いた増殖対照を常に含めた。処理の直前及びその後２４時間まで指定の時間間隔で、培養物アリコートを取り出し、活性炭で希釈した（薬物活性を妨げる又は停止させるため）。次いで、不活性化培養物の１０倍希釈系列をＴＳＡＢ上にプレーティングし、コロニー計数の前に３７℃で２４時間インキュベートした。殺菌活性は、初期接種材料に対して３  ｌｏｇ１０（ＣＦＵ／ｍＬ）以上の減少として規定した。
【０２８８】
ＭＩＣアッセイ。ＭＩＣ値は、ＣＡＭＨＢ又は指定の血液マトリックスのいずれかにおいてＣＬＳＩの参照方法（６２）を用いた微量液体希釈によって決定した。ＣＡＭＨＢ／ＨｉＨｕＳは、ＣＡＭＨＢに５０％ヒト血清を添加した後、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔ（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５；Millipore）に通して５０ｋＤａカットオフで濾過し、続いてＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）との相乗作用に関与する成分（複数の場合もある）を完全に不活性化するために７０℃で２０分間インキュベートすることによって調製した。脱脂血清への脂肪酸の添加については、Ｈ２Ｏ中のオレエート又は１００％エタノール中のパルミテートのいずれかの５０ｍｇ／ｍＬストック溶液を調製し、０．６２５ｍｇ／ｍＬの最終濃度が達成されるように血清に添加した。次いで、添加血清を３７℃で１時間インキュベートした後、ＨＳＡへの脂肪酸結合を促進するために使用した。ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）ＭＩＣ値の比色決定は、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（商標）（Thermo Fisher Scientific）を用い、製造業者のプロトコルに正確に従って行った。プロテイナーゼＫ−アガロースビーズで３時間前処理したヒト血清におけるＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）活性の分析は、製造業者（Sigma-Aldrich）のプロトコルに従って行った。プロテイナーゼＫ−アガロースビーズの除去後のプロテアーゼキャリーオーバーの対照として、処理血清をＭＩＣ決定前に非処理血清で３：４希釈した。非処理血清の添加は、非結合プロテイナーゼＫ又はプロテイナーゼＫ−アガロースビーズのいずれかのキャリーオーバーが存在しない場合にのみ相乗効果を回復させることが予想された。
【０２８９】
溶菌アッセイ。ＭＲＳＡ株ＭＷ２の一晩培養物をＢＨＩで１００倍希釈し、通気しながら３７℃で２．５時間増殖させた。対数期細胞を洗浄し、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で１０倍濃縮し、様々な濃度にわたるＨＳＡ（Albumin Biosciences）又はヒト好中球由来のリゾチーム（AVIVA Bioscience）のいずれかを添加する等しいアリコートに分けた。各濃度のＨＳＡ又はリゾチームについては、０．１ｍＬの混合物を９６ウェル平底非組織培養処理マイクロタイタープレート（BD）に二連で分注した（aliquoted）。次いで、全てのウェルに０．１ｍＬのＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）（リン酸塩中）を４μｇ／ｍＬの最終濃度まで添加することによって溶菌反応を開始した。対照ウェルにはＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）、ＨＳＡ又はＨｕＬＹＺ単独を適切な濃度で加えた。サンプルを混合し、６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ６００）をＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５マイクロプレートリーダー（Molecular Devices）において室温で１５分間追跡した。
【０２９０】
溶菌アッセイの変法を行い、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）比活性を決定した。対数期ＭＷ２細胞を上記のように調製し、リン酸緩衝液（作用物質を添加せず、細胞単独を用いた反応）又はＨＳＡ（Albumin Biosciences）及び／又はヒトリゾチーム（AVIVA Bioscience）のいずれかを含有する４ｍＬアリコートに分割した。ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）（０．５ｍｇ／ｍＬから始める）を、９６ウェルプレートの１列目〜１１列目にわたって０．１ｍＬ容量にて２０ｍＭリン酸塩（ｐＨ７．４）で２倍段階希釈した。１２列目は酵素を含有せず、緩衝液のみを含有し、アッセイ対照ウェルとして使用した。ＨｕＬＹＺと組み合わせた緩衝液、ＨＳＡ、リゾチーム又はＨＳＡのいずれかと混合した細菌細胞を、段階希釈したＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）の３つの行の各ウェルに０．１ｍＬアリコートとして添加した。各プレートを６００ｎｍで室温にて１５分間（読取り間に３秒間振盪）、上記のようなマイクロプレートリーダーを用いて読み取った。ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）の比活性（単位／ｍｇ）を、１５分時点で緩衝液対照の５０％である光学密度のすぐ上及び下の曲線を示すＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）希釈率に基づいて決定した。
【０２９１】
チェッカーボードアッセイ。チェッカーボードアッセイは、記載のように行い（６６）、微量液体希釈のためのＣＬＳＩの方法により適合させる（６２）。チェッカーボードは、初めにｘ軸に沿って９６ウェルポリスチレンマイクロタイタープレートの各列に同量の２倍希釈したＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）を分注することによって作成した。別のプレートに、ｙ軸に沿って各ウェルが同量の２倍希釈した別の作用物質を含む対応する行を作成した。次いで、各列が一定量のＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）及び第２の作用物質の２倍希釈物を含み、各行が一定量の第２の作用物質及びＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）の２倍希釈物を含むように、希釈物を組み合わせた。これにより、各ウェルがＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）と第２の作用物質との独自の組合せを含む。細菌をＣＡＭＨＢ又はヒト血清（プールした男性、ＡＢ型、滅菌濾過、米国起源；Sigma-Aldrich）中において約５×１０５ＣＦＵ／ｍＬの濃度で各ウェルに添加した。単独及び組合せでの各薬物のＭＩＣを、周囲空気中にて３７℃で１８時間の後に記録した。結果は、各薬物についてのＦＩＣの総和に等しいΣＦＩＣ指数を単位として表す。薬物のＦＩＣは、組み合わせた薬物のＭＩＣを単独で使用した薬物のＭＩＣで除算したものとして規定される。ΣＦＩＣｍｉｎ（全ての組合せにおいて得られた最低のΣＦＩＣ値）及びΣＦＩＣＡＶＧ（３つの連続した薬物の組合せの平均ΣＦＩＣ値）の両方を、各々の作用物質対について報告する。ΣＦＩＣ指数が０．５以下である場合、組合せは相乗的であると解釈され、０．５超かつ２以下では相加的、２超では拮抗的と解釈される（１６）。また、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）ＭＩＣ値の比色決定を、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（商標）（Thermo Fisher Scientific）を用い、製造業者のプロトコルに従って行った。
【０２９２】
相乗作用時間−死滅アッセイ。相乗作用時間−死滅曲線を、ＣＬＳＩによって記載される方法に従って行った（５２）。株ＭＷ２を、５０％ＨｉＨｕＳを含むＣＡＭＨＢに５×１０５コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍＬの濃度で懸濁し、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）及び／又はダプトマイシン、ＨＳＡ（Albumin Biosciences）及びＨｕＬＹＺ（AVIVA Bioscience）に３５℃で２４時間、周囲空気にて撹拌しながら曝露した。指定の時間間隔で、培養物サンプルを取り出し、段階希釈し、プレーティングしてＣＦＵ／ｍＬを決定した。得られる死滅動態決定を、ｌｏｇ１０（ＣＦＵ／ｍＬ）を時間に対してプロットすることによりグラフに示す。相乗作用は、組合せとその最も活性な構成成分との間の２−ｌｏｇ１０（ＣＦＵ／ｍＬ）以上の減少として規定され、最低の構成成分は非効果的な濃度で試験した。
【０２９３】
蛍光顕微鏡法：種々の血清環境における細菌細胞表面へのＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）の結合。対数中期ＭＲＳＡ株ＭＷ２を、１×１０７ＣＦＵ／ｍＬでＣＡＭＨＢ、又はヒト（Sigma-Aldrich）、ウサギ（Gibco）、ラット（BioreclamationIVT）若しくはマウス（BioreclamationIVT）供給源のいずれかに由来する１００％血清のいずれかに懸濁し、３７℃で３０分間インキュベートした。４０ｍｇ／ｍＬ  ＨＳＡ（Albumin Biosciences）を含有する付加的なマウス血清サンプルも試験した。プレインキュベーション後に、細菌を１倍リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、５０μｌのＰＢＳに再懸濁し、ポリ−Ｌ−リシンコーティングカバーガラスの表面に付着させた。細胞を洗浄し、ＣＦ−３０１ＲＨＯＤ（ＰＢＳ中２μｇ／ｍＬ）で１０分間処理した後、洗浄し、ＤＡＰＩで対比染色した。スライドガラスをＰＢＳ（ｐＨ８）中の５０％グリセロール及び０．１％ｐ−フェニレンジアミン中でマウントした。蛍光顕微鏡法を、株式会社ニコンの１００×／１．２５油浸レンズ及びＲｅｔｉｇａ  ＥＸｉ  ｆａｓｔ  １３９４カメラ（QImaging）を備える株式会社ニコンのＥｃｌｉｐｓｅ  Ｅ４００顕微鏡を用いて行った。ＱＣａｐｔｕｒｅ  Ｐｒｏバージョン５．１．１．１４ソフトウェア（QImaging）を画像キャプチャ及び処理に用いた。
【０２９４】
蛍光顕微鏡法：ＨＳＡの存在下でのＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）結合の増強。ＶＩＳＡ株ＡＴＣＣ  ７００６９９の一晩培養物をＣＡＭＨＢで１００倍希釈し、０．６のＯＤ６００まで増殖させ、ポリ−Ｌ−リシンコーティングカバーガラスの表面に付着させた。細胞をＰＢＳで洗浄し、ＨＳＡ（Albumin Biosciences）を含有する１０μｌのＰＢＳ又はＰＢＳ単独により室温で３０分間処理した。次いで、複製サンプルに元の容量の１／１０のＰＢＳ、又はＮＨＳ−ローダミン標識ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）を含有するＰＢＳを最終濃度４μｇ／ｍＬ（０．２５倍ＭＩＣ）まで添加した。細胞を室温で更に３０分間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の２．６％パラホルムアルデヒドを用いて室温で４５分間固定した。次いで、スライドガラスをＰＢＳで洗浄し、５０％グリセロール及び０．１％ｐ−フェニレンジアミンを含有するＰＢＳ（ｐＨ８．０）中でマウントした。ＤＡＰＩを全てのアッセイ条件において対比染色色素として使用した。デコンボリューション顕微鏡法を、ＣｏｏｌＳｎａｐ  ＱＥ冷却ＣＣＤカメラ（Photometrics）を備えるＤｅｌｔａＶｉｓｉｏｎ画像復元顕微鏡（Applied Precision／オリンパス株式会社）を用いて行った。画像化を、１．５×ｏｐｔｏｖａｒと組み合わせたオリンパス株式会社の１００×／１．４０  Ｎ．Ａ．、ＵＰＬＳ  Ａｐｏ油浸対物レンズを用いて行った。Ｚ−スタックを０．１５μｍ間隔で取得した。画像を、ＳｏｆｔＷｏＲｘソフトウェア（Applied Precision／DeltaVision）を用いてデコンボリューションし（deconvolved）、色収差について補正し、全ての関連ｚ−セクションを組み合わせる最大値投影法として提示した。上記と同様の補完的な分析では、ＮＨＳ−ローダミン標識ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）を２５μｇ／ｍＬ  ＰｌｙＧＧＦＰ又はＰｌｙＣＡＦのいずれかに置き換えた。処理後に、株式会社ニコンの１００×／１．２５油浸レンズを備える株式会社ニコンのＥｃｌｉｐｓｅ  Ｅ４００顕微鏡を用いた蛍光顕微鏡法によってサンプルを視覚化した。
【０２９５】
蛍光顕微鏡法：ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）の存在下でのＨｕＬＹＺ結合の増強。ＶＩＳＡ株ＡＴＣＣ  ７００６９９の一晩培養物をＣＡＭＨＢで１００倍希釈し、０．６のＯＤ６００まで増殖させ、ポリ−Ｌ−リシンコーティングカバーガラスの表面に付着させた。細胞をＰＢＳで洗浄し、異なる濃度のＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）を含有する５０μｌのＰＢＳ又はＰＢＳ単独により室温で３０分間処理した。次いで、複製サンプルに元の容量の１／１０のＰＢＳ、又はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識ＨｕＬＹＺを含有するＰＢＳを最終濃度１０μｇ／ｍＬまで添加した。細胞を室温で更に３０分間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の２．６％パラホルムアルデヒドを用いて室温で４５分間固定した。次いで、スライドガラスをＰＢＳで洗浄し、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、９０％グリセロール、０．５％没食子酸ｎ−プロピル中でマウントした。ＤＡＰＩを全てのアッセイ条件において対比染色色素として使用した。デコンボリューション顕微鏡法を、ＣｏｏｌＳｎａｐ  ＱＥ冷却ＣＣＤカメラ（Photometrics）を備えるＤｅｌｔａＶｉｓｉｏｎ画像復元顕微鏡（Applied Precision／オリンパス株式会社）を用いて上記のように行った。補完的な分析では、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８標識ＣＦ−３０１を２５μｇ／ｍＬ  ＰｌｙＧＧＦＰ又はＰｌｙＣＡＦのいずれかに置き換えた。処理後に、株式会社ニコンの１００×／１．２５油浸レンズを備える株式会社ニコンのＥｃｌｉｐｓｅ  Ｅ４００顕微鏡を用いた蛍光顕微鏡法によってサンプルを視覚化した。
【０２９６】
電子顕微鏡法。ＣＡＭＨＢ又はヒト血清（Sigma-Aldrich）中で増殖する対数中期株ＭＷ２を、指定の濃度のＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）又は緩衝液単独（対照）により３７℃で１５分間処理した。次いで、細胞を１倍リン酸緩衝液（ＰＢ）で洗浄し、０．１Ｍカコジル酸緩衝液（ｐＨ７．４）中の４％パラホルムアルデヒド及び２％グルタルアルデヒドの溶液に再懸濁した。サンプルを１％四酸化オスミウム中で後固定し、酢酸ウラニルでブロック染色し（block stained）、Rockefeller University Electron Microscopy Serviceによる標準的な手順に従って処理した。Ｔｅｃｎａｉ（商標）  Ｓｐｉｒｉｔ  ＢＴ透過型電子顕微鏡（FEI）を用いてサンプルを視覚化した。ヒト血清を滅菌濾過し、ＡＢ血液型の米国起源のプールした男性集団（約７０の被験体）から得た。
【０２９７】
ウエスタンブロット分析。指定の培地タイプから採取したＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）ＭＩＣウェルサンプルをウエスタンブロットによって分析した。各１０μｌのサンプルアリコートを、４％〜１２％Ｔｒｉｓ−グリシンミニゲル（Ｎｏｖｅｘ（商標））上で泳動した後、エレクトロブロッティングによりポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に転写した。ＰＶＤＦ膜を抗ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）特異的プロテインＧアフィニティー精製ヒトＩｇＧ３組換えモノクローナル抗体、続いて二次モノクローナルマウス抗ＩｇＧ３−アルカリホスファターゼコンジュゲート検出抗体と共にインキュベートした。一次抗体及び二次抗体はどちらも１０００倍希釈で使用した。膜をニトロブルーテトラゾリウム及び５−ブロモ−４−クロロ−３’−インドリルホスフェート（ＮＢＴ／ＢＣＩＰ）発色基質で染色した。可視バンドの分子量を、同じゲル中での分子量標準の泳動のバンドとの比較によって決定した。
【０２９８】
ラット感染性心内膜炎モデル。ケタミン８７ｍｇ／ｋｇ及びキシラジン１３ｍｇ／ｋｇカクテルの腹腔内注射（ＩＰ）により麻酔したＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（２５０ｇ〜２７５ｇ）に、左心室への経頸動脈経大動脈バルブのカテーテル挿入の標準的な留置を行った。４８時間後に、動物を黄色ブドウ球菌株ＭＷ２（約１×１０５コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ラット；ＩＶ）でチャレンジし、心内膜炎を誘導した。感染の２４時間後に、ラットのコホートを安楽死させ、心臓弁疣贅を採取し、初期組織負荷を決定した（対照群）。残りのラットをビヒクル（生理食塩水；ＩＶ単回投与）、又はＤＡＰ単独（４０ｍｇ／ｋｇ；皮下注射（ＳＱ）；ｑｄ×４日間）、又はＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）に加えたＤＡＰのいずれかで処理した。ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）を、初回ＤＡＰ投与の直後に４つの投与計画（１ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ）で単回緩徐ボーラス（５分間〜１０分間にわたる注射）として処理の初日にのみＩＶ投与した。処理した動物を最後のＤＡＰ処理（感染の５日後）の２４時間後に安楽死させ（迅速ＩＰプッシュ（push）による２００ｍｇ／ｋｇのペントバルビタールナトリウム）、心臓弁疣贅を摘出し、秤量し、ホモジナイズし、ＴＳＡＢ上での定量培養のために滅菌ＰＢＳ中で段階希釈した。全ての培養プレートを３７℃で２４時間インキュベートし、生じるコロニーを計数し、ｌｏｇ１０（ＣＦＵ／ｇ（組織））として表した。異なる処理群の各臓器についてのデータを、ｌｏｇ１０（ＣＦＵ／ｇ（組織））の中央値±９５％ＣＩとして算出した。
【０２９９】
ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）の集団ＰＫモデリング。薬物動態（ＰＫ）データを、様々な用量のＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）で処理したラット及びイヌを含む以前の非臨床毒性学研究から収集した（４１、４２）。投与後血漿を時間経過にわたって採取し、有効ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）ＥＬＩＳＡを用いて分析した。１０分間の静脈注入としての１ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇの用量でのＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）についての予測ＡＵＣ値は、非臨床ラット及びイヌＰＫ実験に基づく集団ＰＫモデリングから導いた。本研究については、以前に報告されたＡＵＣ値を、ＭＲＳＡ分離株ＭＷ２についてラット血清において決定されたＭＩＣ値（すなわち、１６μｇ／ｍＬ）で除算して、表１３に報告する算出ＡＵＣ／ＭＩＣ比の値を得た。
【０３００】
ウサギ感染性心内膜炎モデル。ケタミン３５ｍｇ／ｋｇ及びキシラジン５ｍｇ／ｋｇカクテルの筋肉内注射（ＩＭ）により麻酔したニュージーランドホワイトウサギ（２．２ｋｇ〜２．５ｋｇ）に、左心室への経頸動脈−経大動脈バルブのカテーテル挿入の標準的な留置を行った（４３）。カテーテル留置の４８時間後に、動物を約２×１０５ＣＦＵの黄色ブドウ球菌株ＭＷ２の接種材料でＩＶチャレンジし、感染性心内膜炎（ＩＥ）を誘導した。以前の研究から、この接種材料がカテーテル処置した動物の９５％超でＩＥを誘導することが示されている。感染の２４時間後に、ウサギのコホートを安楽死させ、心臓弁疣贅を採取し、初期組織負荷を決定した（対照群）。残りのウサギをビヒクル（生理食塩水；ＩＶ単回投与）、又はＤＡＰ単独（４ｍｇ／ｋｇ  ＩＶ；ｑｄ×４日間）、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）単独、又はＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）に加えたＤＡＰのいずれかで処理した。ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）を、初回ＤＡＰ投与の直後に４つの投与計画（０．０９ｍｇ／ｋｇ、０．１８ｍｇ／ｋｇ、０．３５ｍｇ／ｋｇ、０．７０ｍｇ／ｋｇ及び１．４ｍｇ／ｋｇ）で単回緩徐ボーラス（５分間〜１０分間にわたる注射）として処理の初日にのみＩＶ投与した。処理した動物を最後のＤＡＰ処理（感染の５日後）の２４時間後に安楽死させ（迅速ＩＰプッシュによる２００ｍｇ／ｋｇのペントバルビタールナトリウム）、心臓弁疣贅を摘出し、秤量し、ホモジナイズし、ＴＳＡＢ上での定量培養のために滅菌ＰＢＳ中で段階希釈した。全ての培養プレートを３７℃で２４時間インキュベートし、生じるコロニーを計数し、ｌｏｇ１０（ＣＦＵ／ｇ（組織））として表した。異なる処理群の各臓器についてのデータを、ｌｏｇ１０（ＣＦＵ／ｇ（組織））の中央値±９５％ＣＩとして算出した。
【０３０１】
ウサギ薬物動態。ニュージーランドホワイトウサギに０．１８ｍｇ／ｋｇ、０．３５ｍｇ／ｋｇ、０．０７ｍｇ／ｋｇ又は１．４ｍｇ／ｋｇのＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）を投与した（ＩＶ、緩徐ボーラス）。投与の漸増時間後に、血漿を採取し、有効ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）ＥＬＩＳＡを用いて記載の方法で分析した（６３、６４）。１０分間の静脈注入としての１ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇの用量でのＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）についての予測ＡＵＣ値を、ＷｉｎＮｏｎＬｉｎを用いて導いた（データは示さない）。これらの値をＭＲＳＡ分離株ＭＷ２のＭＩＣ値（ウサギ血清中で１μｇ／ｍＬ）で除算し、表８に報告するＡＵＣ／ＭＩＣ比の値を算出した。
【０３０２】
ウサギにおけるダプトマイシン投与理論。ダプトマイシン用量応答実験を、黄色ブドウ球菌株ＭＷ２によって引き起こされるウサギＩＥモデルにおいて、１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ（ＩＶ）範囲の用量で４日間にわたって１日１回行った。ヒト治療量当量未満の用量に相当する４ｍｇ／ｋｇのダプトマイシンを、ダプトマイシンに加えたＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）療法の利益の探求のために選んだ。ウサギＩＥモデルでは、４ｍｇ／ｋｇ（ＩＶ）のダプトマイシン用量は、ビヒクル処理対照と比較して細菌負荷の約２〜３  ｌｏｇ１０の低減をもたらした。処理した動物は、依然として約５〜７  ｌｏｇ１０の顕著な負荷を有しており、顕著なダイナミックレンジをもたらし、この処理計画に対するＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）の相加的効果が観察された。
【０３０３】
参照文献
1. Wittekind M & Schuch R (2016) Cell wall hydrolases and antibiotics: exploiting synergy to create efficacious new antimicrobial treatments. Curr Opin Microbiol 33:18-24.
2. Nelson DC, et al. (2012) Endolysins as antimicrobials. Adv Virus Res 83:299-365.
3. ClinicalTrials.gov (2017) Safety, Efficacy and Pharacokinetics of CF-301 vs. Placebo in Addition to Antibacterial Therapy for Treatment of S. aureus Bacteremia.  (clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03163446).
4. Schuch R, et al. (2014) Combination therapy with lysin CF-301 and antibiotic is superior to antibiotic alone for treating methicillin-resistant Staphylococcus aureus-induced murine bacteremia. J Infect Dis 209(9):1469-1478.
5. Schuch R, Khan BK, Raz A, Rotolo JA, & Wittekind M (2017) Bacteriophage Lysin CF-301, a Potent Antistaphylococcal Biofilm Agent. Antimicrob Agents Chemother 61(7).
6. Levison ME & Levison JH (2009) Pharmacokinetics and Pharmacodynamics of Antibacterial Agents. Infect Dis Clin North Amer 23(4):1-29.
7. Zeitlinger MA, et al. (2011) Protein binding: do we ever learn? Antimicrob Agents Chemother 55(7):3067-3074.
8. Schmidt S, Gonzalez D, & Derendorf H (2010) Significance of protein binding in pharmacokinetics and pharmacodynamics. J Pharm Sci 99(3):1107-1122.
9. Schmidt S, et al. (2008) Effect of protein binding on the pharmacological activity of highly bound antibiotics. Antimicrob Agents Chemother 52(11):3994-4000.
10. Zeitlinger M, et al. (2008) Plasma protein binding of fluoroquinolones affects antimicrobial activity. J Antimicrob Chemother 61(3):561-567.
11. Burian A, et al. (2011) Plasma protein binding may reduce antimicrobial activity by preventing intra-bacterial uptake of antibiotics, for example clindamycin. J Antimicrob Chemother 66(1):134-137.
12. Pruul H & McDonald PJ (1992) Potentiation of antibacterial activity of azithromycin and other macrolides by normal human serum. Antimicrob Agents Chemother 36(1):10-16.
13. Citterio L, et al. (2016) Improved in vitro evaluation of novel antimicrobials: potential synergy between human plasma and antibacterial peptidomimetics, AMPs and antibiotics against human pathogenic bacteria. Res Microbiol 167(2):72-82.
14. Deslouches B, et al. (2005) Activity of the de novo engineered antimicrobial peptide WLBU2 against Pseudomonas aeruginosa in human serum and whole blood: implications for systemic applications. Antimicrob Agents Chemother 49(8):3208-3216.
15. Vaara M, Viljanen P, Vaara T, & Makela PH (1984) An outer membrane-disorganizing peptide PMBN sensitizes E. coli strains to serum bactericidal action. J Immunol 132(5):2582-2589.
16. Yan H & Hancock RE (2001) Synergistic interactions between mammalian antimicrobial defense peptides. Antimicrob Agents Chemother 45(5):1558-1560.
17. Yeaman MR & Yount NY (2003) Mechanisms of antimicrobial peptide action and resistance. Pharmacol Rev 55(1):27-55.
18. Brown MR & Williams P (1985) Influence of substrate limitation and growth phase on sensitivity to antimicrobial agents. J Antimicrob Chemother 15 Suppl A:7-14.
19. Hein-Kristensen L, Knapp KM, Franzyk H, & Gram L (2013) Selectivity in the potentiation of antibacterial activity of alpha-peptide/beta-peptoid peptidomimetics and antimicrobial peptides by human blood plasma. Res Microbiol 164(9):933-940.
20. Bastos MD, Coutinho BG, & Coelho ML (2010) Lysostaphin: A Staphylococcal Bacteriolysin with Potential Clinical Applications. Pharmaceuticals (Basel) 3(4):1139-1161.
21. Kraus D & Peschel A (2008) Staphylococcus aureus evasion of innate antimicrobial defense. Future Microbiol 3(4):437-451.
22. Pruzanski W, Saito S, & Ogryzlo MA (1970) The significance of lysozyme (muramidase) in rheumatoid arthritis. I. Levels in serum and synovial fluid. Arthritis Rheum 13(4):389-399.
23. Wiegand et al. 2008. Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory  concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nature Protocols. 3:163-175.
24. Gilmer et al. 2013. Novel Bacteriophage Lysin with Broad Lytic Activity Protects against Mixed Infection by Streptococcus pyogenes and Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57:2743-2750.
25. Hatful G. 2015. Dark Matter of the Biosphere: the Amazing World of Bacteriophage Diversity. Journal of Virology. 89:8107-10.
26. Fischetti, V.A., Nelson, D. & Schuch, R. 2006.  Reinventing phage therapy: are the parts greater than the sum? Nature Biotechnology. 24:1508-11.
27. Kusuma & Kokai-Kun. 2005. Comparison of Four Methods for Determining Lysostaphin Susceptibility of Various Strains of Staphylococcus aureus.  Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49:3256-63.
28. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. Vol. 32 (Clinical and Laboratory Standards Institute (US), Wayne (PA), 2012). Clinical Microbiology Procedures Handbook 3rd Ed. Washington DC, (ASM Press, 2010).
29. Fischetti, V.A. Bacteriophage lysins as effective antibacterials. Current opinion in microbiology 11, 393-400 (2008).
30. Fenton, M., Ross, P., McAuliffe, O., O'Mahony, J. & Coffey, A. Recombinant bacteriophage lysins as antibacterials. Bioengineered Bugs 1, 9-16 (2010).
31. Nelson, D., Loomis, L. & Fischetti, V.A. Prevention and elimination of upper respiratory colonization of mice by group A streptococci by using a bacteriophage lytic enzyme. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 98, 4107-4112 (2001).
32. Witzenrath, M., et al. Systemic use of the endolysin Cpl-1 rescues mice with fatal pneumococcal pneumonia. Critical care medicine 37, 642-649 (2009).
33. Pastagia, M., et al. A novel chimeric lysin shows superiority to mupirocin for skin decolonization of methicillin-resistant and -sensitive Staphylococcus aureus strains. Antimicrobial agents and chemotherapy 55, 738-744 (2011).
34. Loeffler, J.M., Djurkovic, S. & Fischetti, V.A. Phage Lytic Enzyme Cpl-1 as a Novel Antimicrobial for Pneumococcal Bacteremia. Infection and Immunity 71, 6199-6204 (2003).
35. Schuch, R., Fischetti, V.A. & Nelson, D.C. A Genetic Screen to Identify Bacteriophage Lysins. in Bacteriophages: Methods and Protocols, Volume 2: Molecular and Applied Aspects, Vol. 502 307-319 (2009).
36. Bateman, A. & Rawlings, N.D. The CHAP domain: a large family of amidases including GSP amidase and peptidoglycan hydrolases. Trends Biochem Sci 28, 234-237 (2003).
37. Whisstock, J.C. & Lesk, A.M. SH3 domains in prokaryotes. Trends in Biochemical Sciences 24, 132-133 (1999).
38. Rossi, P., et al. Structural elucidation of the Cys-His-Glu-Asn proteolytic relay in the secreted CHAP domain enzyme from the human pathogen Staphylococcus saprophyticus. Proteins 74, 515-519 (2009).
39. Mueller, M., de la Pena, A. & Derendorf, H. Issues in Pharmacokinetics and Pharmacodynamics of Anti-Infective Agents: Kill Curves versus MIC. Antimicrobial agents and chemotherapy 48, 369-377 (2004).
40. Cottarel, G. & Wierzbowski, J. Combination drugs, an emerging option for antibacterial therapy. Trends in biotechnology 25, 547-555 (2007).
41. Tallarida, R.J. Revisiting the isobole and related quantitative methods for assessing drug synergism. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics 342, 2-8 (2012).
42. LaPlante, K.L., Leonard, S.N., Andes, D.R., Craig, W.A. & Rybak, M.J. Activities of clindamycin, daptomycin, doxycycline, linezolid, trimethoprim-sulfamethoxazole, and vancomycin against community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus with inducible clindamycin resistance in murine thigh infection and in vitro pharmacodynamic models. Antimicrobial agents and chemotherapy 52, 2156-2162 (2008).
43. Crandon, J.L., Kuti, J.L. & Nicolau, D.P. Comparative efficacies of human simulated exposures of telavancin and vancomycin against methicillin-resistant Staphylococcus aureus with a range of vancomycin MICs in a murine pneumonia model. Antimicrobial agents and chemotherapy 54, 5115-5119 (2010).
44. Loeffler, J.M., Nelson, D. & Fischetti, V.A. Rapid killing of Streptococcus pneumoniae with a bacteriophage cell wall hydrolase. Science 294, 2170-2172 (2001).
45. Schuch, R., Nelson, D. & Fischetti, V. A bacteriolytic agent that detects and kills Bacillus anthracis. Nature 418, 884-889 (2002).
46. Manoharadas, S., Witte, A. & Blasi, U. Antimicrobial activity of a chimeric enzybiotic towards Staphylococcus aureus. Journal of biotechnology 139, 118-123 (2009).
47. Rashel, M., et al. Efficient elimination of multidrug-resistant Staphylococcus aureus by cloned lysin derived from bacteriophage phi MR11. The Journal of infectious diseases 196, 1237-1247 (2007).
48. Daniel, A., et al. Synergism between a novel chimeric lysin and oxacillin protects against infection by methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrobial agents and chemotherapy 54, 1603-1612 (2010).
49. Kokai-Kun, J.F., Chanturiya, T. & Mond, J.J. Lysostaphin as a treatment for systemic Staphylococcus aureus infection in a mouse model. The Journal of antimicrobial chemotherapy 60, 1051-1059 (2007).
50. Sopirala, M.M., et al. Synergy testing by Etest, microdilution checkerboard, and time-kill methods for pan-drug-resistant Acinetobacter baumannii. Antimicrobial agents and chemotherapy 54, 4678-4683 (2010).
51. Cassino C, Murphy G, Boyle J, Rotolo J, & Wittekind M (2016) Results of the First In Human Study of Lysin CF-301 Evaluating the Safety, Tolerability and Pharmacokinetic Profile in Healthy Volunteers. in ECCMID (Amsterdam, Netherlands).
52. CLSI (1999) Methods for Determining Bactericidal Activity of Antimicrobial Agents; Approved Guideline (Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA).
53. Moody J (2010) Synergy testing: broth microdilution checkerboard and broth macrodilution methods. Clinical Microbiology Procedures Handbook, ed Garcia LS (ASM Press, Washington, D.C.), Vol 2, pp 5.12.11-15.12.23.
54. Pruzanski W, Saito S, & Ogryzlo MA (1970) The significance of lysozyme (muramidase) in rheumatoid arthritis. I. Levels in serum and synovial fluid. Arthritis Rheum 13(4):389-399.
55. Sahin O, Ziaei A, Karaismailoglu E, & Taheri N (2016) The serum angiotensin converting enzyme and lysozyme levels in patients with ocular involvement of autoimmune and infectious diseases. BMC Ophthalmol 16:19.
56. Georgieva TM, et al. (2008) Blood serum concentrations of total proteins and main protein fractions in weaning rabbits experimentally infected with E. coli. Revue de medecine veterinaire 159(8-9):431- 436.
57. Zaias J, Mineau M, Cray C, Yoon D, & Altman NH (2009) Reference values for serum proteins of common laboratory rodent strains. J Am Assoc Lab Anim Sci 48(4):387-390.
58. Finn TE, Nunez AC, Sunde M, & Easterbrook-Smith SB (2012) Serum albumin prevents protein aggregation and amyloid formation and retains chaperone-like activity in the presence of physiological ligands. J Biol Chem 287(25):21530-21540.
59. Sakoulas G, Eliopoulos GM, Alder J, & Eliopoulos CT (2003) Efficacy of daptomycin in experimental endocarditis due to methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother 47(5):1714-1718
60. Nelson D, Schuch R, Chahales P, Zhu S, & Fischetti VA (2006) PlyC: a multimeric bacteriophage lysin. Proc Natl Acad Sci U S A 103(28):10765-10770.
61. Schuch R, Pelzek AJ, Kan S, & Fischetti VA (2010) Prevalence of Bacillus anthracis-like organisms and bacteriophages in the intestinal tract of Eisenia fetida earthworms. Applied & Environmental Microbiology 76:2286-2294.
62. CLSI (2015) Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard-10th Edition (Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA), CLSI document M07-A10.
63. Ghahramani P, et al. (2016) Pharmacokinetic Indices Driving Antibacterial Efficacy of CF-301- a Novel First-In-Class Lysin. in American Conference on Pharmacometrics (Bellevue, Washington).
64. Chiu J, et al. (2016) Interspecies Scaling in Pre-clinical Population Pharmacokinetics of CF-301. in American Conference on Pharmacmetrics (Bellevue, Washington).
65. Weidenmaier C, et al. (2005) DltABCD- and MprF-mediated cell envelope modifications of Staphylococcus aureus confer resistance to platelet microbicidal proteins and contribute to virulence in a rabbit endocarditis model. Infect Immun 73(12):8033-8038.
66. Verma P (2007) Methods for Determining Bactericidal Activity and Antimicrobial Interactions: Synergy Testing, Time-Kill Curves, and Population Analysis. Antimicrobial Susceptibility Testing Protocols, eds Schwalbe R, Steele-Moore L, & Goodwin AC (CRC Press, Boca Raton, FL), pp 275-298.
【０３０４】
実施例２
特に血清アルブミン及びリゾチームを介して血清成分効果を示す溶解素ポリペプチドＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）、リゾスタフィン（ＬＳＰ）及びＳａｌ溶解素が、全てのＳＨ３型結合ドメインを有する点で同様であることは注目に値する。血清成分効果に関連する結合ドメインを更に評価するために、或る結合ドメインを別のものに置き換えるか又は交換することによって様々なキメラを構築した。ＣｌｙＳ結合ドメイン、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）結合ドメイン又はリゾスタフィン結合ドメインと共にＳａｌ１  ＣＨＡＰ触媒ドメインを有するキメラ溶解素を、ヒト血清に対するＭＨＢを用いてＭＩＣについてアッセイした。結果を下記表１４に示す。ＣｌｙＳの結合ドメインは血液効果を支持しないが、ＳＨ３型結合ドメインであるＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）の結合ドメインは、血液効果を支持する。同様に、リゾスタフィンのＳＨ３型結合ドメインも血清成分効果を示し、キメラ溶解素としてＳａｌ１触媒ドメインに融合した場合に血清効果を保持する。
【０３０５】
【表１５】
2020527551.tif 000028
【０３０６】
本発明は、その趣旨又は本質的特性を逸脱することなく他の形態で具体化しても、又は他の方法で行ってもよい。したがって、本開示は、全ての態様において例示的であり、限定的ではないとみなすべきであり、添付の特許請求の範囲によって示される本発明の範囲、並びに意味及び均等範囲内に含まれる全ての変化が本明細書に包含されることが意図される。
【０３０７】
様々な参照文献が本明細書全体にわたって引用されるが、それらは各々、その全体が引用することにより本明細書の一部をなす。
【図１Ａ】
2020527551.tif 000029
【図１Ｂ】
2020527551.tif 000030
【図１Ｃ】
2020527551.tif 000031
【図１Ｄ】
2020527551.tif 000032
【図２Ａ】
2020527551.tif 000033
【図２Ｂ】
2020527551.tif 000034
【図２Ｃ】
2020527551.tif 000035
【図２Ｄ】
2020527551.tif 000036
【図２Ｅ】
2020527551.tif 000037
【図２Ｆ】
2020527551.tif 000038
【図２Ｇ】
2020527551.tif 000039
【図２Ｈ】
2020527551.tif 000040
【図２Ｉ】
2020527551.tif 000041
【図２Ｊ】
2020527551.tif 000042
【図２Ｋ】
2020527551.tif 000043
【図２Ｌ】
2020527551.tif 000044
【図２Ｍ】
2020527551.tif 000045
【図２Ｎ】
2020527551.tif 000046
【図３Ａ】
2020527551.tif 000047
【図３Ｂ】
2020527551.tif 000048
【図３Ｃ】
2020527551.tif 000049
【図３Ｄ】
2020527551.tif 000050
【図４Ａ】
2020527551.tif 000051
【図４Ｂ】
2020527551.tif 000052
【図４Ｃ】
2020527551.tif 000053
【図４Ｄ】
2020527551.tif 000054
【図５】
2020527551.tif 000055
【図６Ａ】
2020527551.tif 000056
【図６Ｂ】
2020527551.tif 000057
【図６Ｃ】
2020527551.tif 000058
【図６Ｄ】
2020527551.tif 000059
【図７】
2020527551.tif 000060
【図８Ａ】
2020527551.tif 000061
【図８Ｂ】
2020527551.tif 000062
【図８Ｃ】
2020527551.tif 000063
【図９】
2020527551.tif 000064
【図１０】
2020527551.tif 000065
【図１１】
2020527551.tif 000066
【図１２】
2020527551.tif 000067
【図１３】
2020527551.tif 000068
【図１４】
2020527551.tif 000069
【図１５】
2020527551.tif 000070
【配列表】
2020527551000001.app
【国際調査報告】
2020527551.tif 000071
2020527551.tif 000072