(57)【要約】がんを有する個体を治療する方法が開示されている。幾つかの方法では、がんは機能性グアニリルシクラーＣ及び／またはｐ５３を欠いている可能性がある。幾つかの方法では、該方法は、胃腸細胞の細胞内ｃＧＭＰを上昇させるのに十分な１つまたは複数の化合物を投与することにより胃腸細胞を遺伝毒性の損傷から保護すること、次いで化学療法及び／または放射線療法を適用してがん細胞を死滅させることを含む。幾つかの方法では、該方法は、１つまたは複数のグアニリルシクラーゼＣアゴニスト化合物を、腸幹細胞のグアニリルシクラーゼＣを活性化し、腸内幹細胞の細胞内ｃＧＭＰを上昇させるのに十分な量を個体の腸幹細胞に投与すること、次いで、化学療法及び／または放射線療法を適用してがん細胞を死滅させることを含む。【選択図】なし
2020531580.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能性グアニリルシクラーゼＣを欠くがんを有すると特定された個体においてがんを有する個体を治療する方法であって、
機能性グアニリルシクラーゼＣを欠くがんを有すると特定された前記個体の胃腸細胞に対して、
前記胃腸細胞の細胞増殖の停止、及び／または
ＤＮＡ合成の阻害及びＧ１〜Ｓの遅延を課すことによる前記胃腸細胞の細胞周期の延長、及び／または
増強されたＤＮＡ損傷の感知及び修復によって維持される前記胃腸細胞のゲノムの完全性
を引き起こすことによって
前記胃腸細胞のグアニリルシクラーゼＣを活性化し、胃腸細胞を遺伝毒性の損傷から保護するレベルまで、前記胃腸細胞において細胞内ｃＧＭＰを上昇させるのに十分な量の１つまたは複数のグアニリルシクラーゼＣアゴニスト化合物を投与すること；並びに
機能性グアニリルシクラーゼＣを欠くがん細胞を死滅させるために化学療法及び／または放射線療法を適用すること、を含み、
前記化学療法及び／または放射線は、正常な胃腸細胞が前記胃腸細胞における細胞内ｃＧＭＰの上昇の効果により遺伝毒性損傷細胞から保護されている場合に適用される、前記方法。
【請求項２】
前記機能性グアニリルシクラーゼＣを欠くがんが、機能性グアニリルシクラーゼＣを欠く結腸直腸癌、機能性グアニリルシクラーゼＣを欠く食道癌、機能性グアニリルシクラーゼＣを欠く膵臓癌、機能性グアニリルシクラーゼＣを欠く肝癌、機能性グアニリルシクラーゼＣを欠く胃癌、機能性グアニリルシクラーゼＣを欠く胆管系癌、機能性グアニリルシクラーゼＣを欠く腹膜の癌、機能性グアニリルシクラーゼＣを欠く膀胱癌、機能性グアニリルシクラーゼＣを欠く腎臓癌、機能性グアニリルシクラーゼＣを欠く尿管の癌、機能性グアニリルシクラーゼＣを欠く前立腺癌、機能性グアニリルシクラーゼＣを欠く卵巣癌、機能性グアニリルシクラーゼＣを欠く子宮癌、及び機能性アニリルシクラーゼＣを欠く肉腫等の腹部及び骨盤の軟組織からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記がんを機能性ｐ５３を欠いていると特定し、グアニリルシクラーゼＡ（ＧＣＡ）アゴニスト（ＡＮＰ、ＢＮＰ）、グアニリルシクラーゼＢ（ＧＣＢ）アゴニスト（ＣＮＰ）、可溶性グアニリルシクラーゼ活性物質（一酸化窒素、ニトロ血管拡張剤、プロトプロフィリンＩＸ、及び直接活性物質）、ＰＤＥ阻害剤、ＭＲＰ阻害剤、環状ＧＭＰ及びｃＧＭＰ類縁体からなる群から選択される１つまたは複数の活性剤を投与することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記がんを機能性ｐ５３が欠いていると特定し、グアニリルシクラーゼＡ（ＧＣＡ）アゴニスト（ＡＮＰ、ＢＮＰ）、グアニリルシクラーゼＢ（ＧＣＢ）アゴニスト（ＣＮＰ）、可溶性グアニリルシクラーゼ活性物質（一酸化窒素、ニトロ血管拡張剤、プロトプロフィリンＩＸ、及び直接活性物質）、ＰＤＥ阻害剤、ＭＲＰ阻害剤、環状ＧＭＰ及びｃＧＭＰ類縁体からなる群から選択される１つまたは複数の活性剤を投与することを更に含み、前記個体からのがん細胞のサンプル中のｐ５３またはｐ５３をコードするＲＮＡの不在を検出することにより、前記がんが機能性ｐ５３を欠いていると特定される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
機能性グアニリルシクラーゼＣを欠くがんを有すると特定された個体においてがんを有する個体を治療する方法であって、
前記個体を、機能性グアニリルシクラーゼＣを欠くがんを有すると特定すること、
前記個体において胃腸細胞に対して、
前記胃腸細胞の細胞増殖の停止、及び／またはＤＮＡ合成の阻害及びＧ１〜Ｓの遅延を課すことによる前記胃腸細胞の細胞周期の延長、及び／または
増強されたＤＮＡ損傷の感知及び修復によって維持される前記胃腸細胞のゲノムの完全性
を引き起こすことによって
前記胃腸細胞のグアニリルシクラーゼＣを活性化し、胃腸細胞を遺伝毒性の損傷から保護するレベルまで前記胃腸細胞において細胞内ｃＧＭＰを上昇させるのに十分な量の１つまたは複数のグアニリルシクラーゼＣアゴニスト化合物を投与すること；並びに
機能性グアニリルシクラーゼＣを欠くがん細胞を死滅させるために化学療法及び／または放射線療法を適用すること、を含み、
前記化学療法及び／または放射線は、正常な胃腸細胞が前記胃腸細胞における細胞内ｃＧＭＰの上昇の効果により遺伝毒性損傷細胞から保護されている場合に適用される、前記方法。
【請求項６】
前記個体由来のがん細胞のサンプル中のグアニリルシクラーゼＣまたはグアニリルシクラーゼＣをコードするＲＮＡの不在を検出することにより、機能性グアニリルシクラーゼＣを欠くがんを有すると前記個体を特定する工程を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記がん細胞のサンプルをグアニリルシクラーゼＣに結合する試薬と接触させて、前記サンプルがん細胞に対する前記試薬の結合の不在を検出することにより、前記個体を機能性グアニリルシクラーゼＣを欠くがんを有すると特定する工程を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記がん細胞のサンプルをグアニリルシクラーゼＣに結合する試薬と接触させて、前記サンプルがん細胞に対する前記試薬の結合の不在を検出することにより、前記個体由来のがん細胞のサンプル中のグアニリルシクラーゼＣの不在を検出することによって、前記個体を、機能性グアニリルシクラーゼＣを欠くがんを有すると特定する工程を含み、前記試薬が抗グアニリルシクラーゼＣまたはグアニリルシクラーゼＣリガンドである、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
グアニリルシクラーゼＣをコードするＲＮＡを増幅するＰＣＲプライマーを使用して前記がん細胞のサンプルに由来するｍＲＮＡに対してＰＣＲを行い、前記サンプルがん細胞中における増幅されたＲＮＡの不在を検出することにより、前記個体由来のがん細胞のサンプル中のグアニリルシクラーゼＣをコードするＲＮＡの不在を検出することによって、または
グアニリルシクラーゼＣをコードするＲＮＡにハイブリダイズする配列を有する前記オリゴヌクレオチドを、前記がん細胞のサンプルに由来するｍＲＮＡと接触させ、前記がん細胞のサンプルに由来するｍＲＮＡにハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの不在を検出することによって、
前記個体を、機能性グアニリルシクラーゼＣを欠くがんを有すると特定する工程を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記機能性グアニリルシクラーゼＣを欠くがんが、機能性グアニリルシクラーゼＣを欠く結腸直腸癌、機能性グアニリルシクラーゼＣを欠く食道癌、機能性グアニリルシクラーゼＣを欠く膵臓癌、機能性グアニリルシクラーゼＣを欠く肝癌、機能性グアニリルシクラーゼＣを欠く胃癌、機能性グアニリルシクラーゼＣを欠く胆管系癌、機能性グアニリルシクラーゼＣを欠く腹膜の癌、機能性グアニリルシクラーゼを欠く膀胱癌、機能性グアニリルシクラーゼＣを欠く腎臓癌、機能性グアニリルシクラーゼＣを欠く尿管の癌、機能性グアニリルシクラーゼＣを欠く前立腺癌、機能性グアニリルシクラーゼＣを欠く卵巣癌、機能性グアニリルシクラーゼＣを欠く子宮癌機能性アニリルシクラーゼＣを欠く、肉腫等の腹部及び骨盤の軟組織からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記がんを機能性ｐ５３を欠くものと特定し、グアニリルシクラーゼＡ（ＧＣＡ）アゴニスト（ＡＮＰ、ＢＮＰ）、グアニリルシクラーゼＢ（ＧＣＢ）アゴニスト（ＣＮＰ）、可溶性グアニリルシクラーゼ活性物質（一酸化窒素、ニトロ血管拡張剤、プロトプロフィリンＩＸ、及び直接活性物質）、ＰＤＥ阻害剤、ＭＲＰ阻害剤、環状ＧＭＰ及びｃＧＭＰ類縁体からなる群から選択される１つまたは複数の活性剤を投与することを更に含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
前記がんを機能性ｐ５３が欠如していると特定し、グアニリルシクラーゼＡ（ＧＣＡ）アゴニスト（ＡＮＰ、ＢＮＰ）、グアニリルシクラーゼＢ（ＧＣＢ）アゴニスト（ＣＮＰ）、可溶性グアニリルシクラーゼ活性物質（一酸化窒素、ニトロ血管拡張剤、プロトプロフィリンＩＸ、及び直接活性物質）、ＰＤＥ阻害剤、ＭＲＰ阻害剤、環状ＧＭＰ及びｃＧＭＰ類縁体からなる群から選択される１つまたは複数の活性剤を投与することを更に含み、前記個体由来のがん細胞のサンプル中のｐ５３またはｐ５３をコードするＲＮＡの不在を検出することにより、前記がんが機能性ｐ５３を欠いていると特定される、請求項５に記載の方法。
【請求項１３】
機能性ｐ５３を欠く原発性結腸直腸癌を有すると特定された個体において原発性結腸直腸癌を有する個体を治療する方法であって、
機能性ｐ５３を欠く原発性結腸直腸癌を有すると特定された前記個体において胃腸細胞に対して、
前記胃腸細胞の細胞増殖の停止、及び／または
ＤＮＡ合成の阻害及びＧ１〜Ｓの遅延を課すことによる前記胃腸細胞の細胞周期の延長、及び／または
増強されたＤＮＡ損傷の感知及び修復によって維持される前記胃腸細胞のゲノムの完全性
を引き起こすことによって
前記胃腸細胞のグアニリルシクラーゼＣを活性化し、前記胃腸細胞において細胞内ｃＧＭＰを、胃腸細胞を遺伝毒性の損傷から保護するレベルまで上昇させるのに十分な量の１つまたは複数のグアニリルシクラーゼＣアゴニスト化合物を投与すること；並びに
機能性ｐ５３を欠く原発性結腸直腸癌細胞を死滅させるために化学療法及び／または放射線療法を適用すること、
を含み、
前記化学療法及び／または放射線は、正常な胃腸細胞が前記胃腸細胞における細胞内ｃＧＭＰの上昇の効果により遺伝毒性損傷細胞から保護されている場合に適用される、前記方法。
【請求項１４】
機能性ｐ５３を欠く原発性結腸直腸癌を有すると特定された個体において原発性結腸直腸癌を有する個体を治療する方法であって、
前記個体を機能性ｐ５３を欠く原発性結腸直腸癌を有すると特定すること；
前記個体において胃腸細胞に対して、
前記胃腸細胞の細胞増殖の停止、及び／または
ＤＮＡ合成の阻害及びＧ１〜Ｓの遅延を課すことによる前記胃腸細胞の細胞周期の延長、及び／または
増強されたＤＮＡ損傷の感知及び修復によって維持される前記胃腸細胞のゲノムの完全性
を引き起こすことによって
前記胃腸細胞のグアニリルシクラーゼＣを活性化し、前記胃腸細胞において細胞内ｃＧＭＰを、胃腸細胞を遺伝毒性の損傷から保護するレベルまで上昇させるのに十分な量の１つまたは複数のグアニリルシクラーゼＣアゴニスト化合物を投与すること；並びに
機能性グアニリルシクラーゼＣを欠くがん細胞を死滅させるために化学療法及び／または放射線療法を適用すること、を含み、
前記化学療法及び／または放射線は、正常な胃腸細胞が前記胃腸細胞における細胞内ｃＧＭＰの上昇の効果により遺伝毒性損傷細胞から保護されている場合に適用される、前記方法。
【請求項１５】
がんを有する個体を治療する方法であって、
前記個体において腸幹細胞に対して、前記腸幹細胞のグアニリルシクラーゼＣを活性化し、前記腸幹細胞において細胞内ｃＧＭＰを、腸幹細胞数の増加及び腸幹細胞の相対的なバランスのシフトを引き起こしてＬｇｒ５＋活性表現型を有する腸幹細胞を増加させ、Ｂｍｉｌ＋予備表現型を有する腸幹細胞を減少させるレベルまで上昇させるのに十分な量の１つまたは複数のグアニリルシクラーゼＣアゴニスト化合物を投与すること、
腸幹細胞数が増加し、腸幹細胞の相対的なバランスがシフトして、Ｌｇｒ５＋活性表現型を有する腸幹細胞が増加し、Ｂｍｉｌ＋予備表現型を有する腸幹細胞が減少する場合に、化学療法及び／または放射線療法を適用してがん細胞を死滅させること、を含み、
腸幹細胞数が増加し、腸幹細胞の相対的なバランスがシフトして、Ｌｇｒ５＋活性表現型を有する腸幹細胞が増加し、Ｂｍｉｌ＋予備表現型を有する腸幹細胞を減少する場合に適用される前記化学療法及び／または放射線が、結果として胃腸副作用を少なくする、前記方法。
【請求項１６】
前記個体に化学療法が適用される、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記個体に放射線が適用される、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記個体に腹骨盤放射線が適用される、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記個体にＧＣＣアゴニストペプチドを投与することを含む、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記個体に、配列番号２、配列番号３及び配列番号５〜配列番号６０からなる群から選択されるＧＣＣアゴニストペプチドを投与することを含む、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記個体に、グアニリン、オログアニリン、配列番号５９、配列番号６０及びそれらの組み合わせから選択されるグアニリルシクラーゼＣアゴニストが投与される、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記ＧＣＣアゴニスト化合物が経口投与によって投与される、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記ＧＣＣアゴニスト化合物が制御放出組成物で経口投与により投与される、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
がんを治療するのに十分な量の化学療法若しくは放射線を前記個体に適用する２４時間前に；がんを治療するのに十分な量の化学療法若しくは放射線を前記個体に適用する４８時間前に；がんを治療するのに十分な量の化学療法若しくは放射線を前記個体に適用する７２時間前に；またはがんを治療するのに十分な量の化学療法若しくは放射線を前記個体に適用する９６時間前に、前記ＧＣＣアゴニスト化合物を前記個体に投与する、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記個体にグアニリルシクラーゼＣアゴニストが２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間または１４日間にわたって毎日投与される、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記ＧＣＣアゴニスト化合物が複数用量で投与される、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記グアニリルシクラーゼＣアゴニストの投与前に、腫瘍が前記個体から外科的に摘除される、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記個体を、前記グアニリルシクラーゼＣアゴニストの投与後の前記個体の便通の変化を検出することにより、前記グアニリルシクラーゼＣアゴニスト化合物の保護作用に応答していると特定し、前記グアニリルシクラーゼＣアゴニストの投与後の前記個体の便通の変化を検出することで治療が進行する、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
機能性ｐ５３を欠くがんを有すると特定された個体を治療する方法であって、
前記個体を、機能性５３を欠くがんを有すると特定すること；
前記個体において胃腸細胞に対して、グアニリルシクラーゼＡ（ＧＣＡ）アゴニスト（ＡＮＰ、ＢＮＰ）、グアニリルシクラーゼＢ（ＧＣＢ）アゴニスト（ＣＮＰ）、可溶性グアニリルシクラーゼ活性物質（一酸化窒素、ニトロ血管拡張剤、プロトプロフィリンＩＸ、及び直接活性物質）、ＰＤＥ阻害剤、ＭＲＰ阻害剤、環状ＧＭＰ及びｃＧＭＰ類縁体からなる群から選択される１つまたは複数の化合物を、正常細胞において細胞内ｃＧＭＰを上昇させ、化学療法及び／または放射線の遺伝毒性の影響から前記正常細胞を保護するのに十分な量で投与すること；並びに
がん細胞を死滅させるために化学療法及び／または放射線療法を適用すること、を含み、
前記化学療法及び／または放射線が、前記正常細胞が化学療法及び／または放射線の遺伝毒性の影響から保護されている場合に適用される、前記方法。
【請求項３０】
前記個体由来のがん細胞のサンプル中のｐ５３またはｐ５３をコードするＲＮＡの不在を検出することにより、機能性ｐ５３を欠くがんを有すると前記個体を特定する工程を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記個体に化学療法を適用する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記個体に放射線を適用する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
グアニリルシクラーゼＡ（ＧＣＡ）アゴニスト（ＡＮＰ、ＢＮＰ）、グアニリルシクラーゼＢ（ＧＣＢ）アゴニスト（ＣＮＰ）、可溶性グアニリルシクラーゼ活性物質（一酸化窒素、ニトロ血管拡張剤、プロトプロフィリンＩＸ、及び直接活性物質）、ＰＤＥ阻害剤、ＭＲＰ阻害剤、環状ＧＭＰ及びｃＧＭＰ類縁体からなる群から選択される１つまたは複数の化合物が、がんを治療するのに十分な量の化学療法若しくは放射線を前記個体に適用する２４時間前に；がんを治療するのに十分な量の化学療法若しくは放射線を前記個体に適用する４８時間前に；がんを治療するのに十分な量の化学療法若しくは放射線を前記個体に適用する７２時間前に；またはがんを治療するのに十分な量の化学療法若しくは放射線を前記個体に適用する９６時間前に前記個体に投与される、請求項２９〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
グアニリルシクラーゼＡ（ＧＣＡ）アゴニスト（ＡＮＰ、ＢＮＰ）、グアニリルシクラーゼＢ（ＧＣＢ）アゴニスト（ＣＮＰ）、可溶性グアニリルシクラーゼ活性物質（一酸化窒素、ニトロ血管拡張剤、プロトプロフィリンＩＸ、及び直接活性物質）、ＰＤＥ阻害剤、ＭＲＰ阻害剤、環状ＧＭＰ及びｃＧＭＰ類縁体からなる群から選択される１つまたは複数の化合物を、前記個体に２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、または１４日間にわたって毎日投与する、請求項２９〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
グアニリルシクラーゼＡ（ＧＣＡ）アゴニスト（ＡＮＰ、ＢＮＰ）、グアニリルシクラーゼＢ（ＧＣＢ）アゴニスト（ＣＮＰ）、可溶性グアニリルシクラーゼ活性物質（一酸化窒素、ニトロ血管拡張剤、プロトプロフィリンＩＸ、及び直接活性物質）、ＰＤＥ阻害剤、ＭＲＰ阻害剤、環状ＧＭＰ及びｃＧＭＰ類縁体からなる群から選択される１つまたは複数の化合物が複数用量で投与される、請求項２９〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
グアニリルシクラーゼＡ（ＧＣＡ）アゴニスト（ＡＮＰ、ＢＮＰ）、グアニリルシクラーゼＢ（ＧＣＢ）アゴニスト（ＣＮＰ）、可溶性グアニリルシクラーゼ活性物質（一酸化窒素、ニトロ血管拡張剤、プロトプロフィリンＩＸ、及び直接活性物質）、ＰＤＥ阻害剤、ＭＲＰ阻害剤、環状ＧＭＰ及びｃＧＭＰ類縁体からなる群から選択される１つまたは複数の化合物の投与前に、前記個体から外科的に腫瘍を摘除する、請求項２９〜３２のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がんの化学療法及び放射線療法に関連する深刻でおそらくは致命的な副作用から個体を保護する組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは世界中で主たる死因であり：２００４年以降、年間７００万人〜８００万人（全死亡者の約１３％）を占めている。世界中のがんによる死亡は増加し続けると予測されており、２０３０年には１２００万人が死亡すると推定される。肺癌、胃癌、肝臓癌、結腸癌、及び乳癌は、毎年最も多くのがん死を引き起こす。米国では、がんは成人の２番目の死因であり、毎年５０万人超の死を引き起こしている。肺癌、前立腺癌、乳癌、及び結腸癌は、がん関連死の主な原因である。
【０００３】
化学療法及び放射線療法は、がん治療の２つの最も一般的なタイプであり、がん細胞等の急増殖している細胞を破壊することによって作用する。化学療法及び放射線療法は、正常な非がん性分裂細胞を含む急速に分裂する細胞を死滅させるため、非常に毒性の高い治療である。したがって、化学療法及び放射線の望ましくない副作用として、造血細胞、毛髪細胞、消化管（ＧＩ）細胞等、体内で急速に増殖する他の種類の正常細胞も損傷を受け、死滅させる。化学療法及び放射線療法の重篤な副作用は、人々が治療を続けるのを妨げ、治療の有効性を制限し、時には患者を殺すことさえある。これらの副作用によって現れる毒性は、患者に適用することができる化学療法及び放射線の投与量を制限する。
【０００４】
胃腸毒性は、放射線及び幾つかの化学療法剤による治療の副作用として臨床での診療で起こる。さらに、この臨床試験及び他の多くの大規模な第ＩＩＩ相臨床試験で、治療に関連して１％〜３％の死亡率が観察されている。副作用は致命的となる可能性があるが、ほとんどの急性の副作用は時間とともに改善する。ただし、がん治療の一部の慢性的な副作用は、生涯にわたる病的状態に結び付く可能性がある。化学療法及び放射線の副作用を最小限に抑えることは、患者及び医師等にとって、依然として最優先事項の１つである。
【０００５】
１５Ｇｙを超える放射線を照射されたマウスは、造血細胞の致死効果が発現する前に、小腸損傷の合併症−胃腸（ＧＩ）症候群−により治療後７日〜１２日で死亡する。大量のｐ５３依存性アポトーシスが致死量の放射線の後に観察され、ｐ５３が放射線誘発死の決定因子であることを示唆している。しかしながら、ガンマ線に対する小腸の反応は病理形態学的レベルで十分に検討されてきたのに対し、ＧＩ致死の正確な原因は完全には解明されていない。死は、体液と電解質の不均衡、菌血症及び内毒素血症に結び付く、上皮陰窩細胞の損傷とそれに続く絨毛の裸出の直接的な結果として起こる可能性がある。炎症及び間質反応に加えて、内皮機能障害も致死の一因となる可能性がある。
【０００６】
Ｇａｒｉｎ−Ｌａｆｌａｒｎ，ｅｔ  ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２００９２９６  Ｇ７４０−９は、放射線誘発腸管上皮アポトーシスの予防におけるＧＣＣ及びｃＧＭＰの関与を報告している。ＧＩ症候群からの生存ではなく、アポトーシスを起こしている腸細胞の相対数を関連付けるこれらの研究は、ＧＣＣを発現する細胞が関与するアポトーシスのモデルにおいて、ＧＣＣ活性化がアポトーシス促進効果、抗アポトーシス効果、またはいずれかを有するかどうかを解決するために行われた。これらの研究では、腸組織をマウスから摘除し、アポトーシスを起こしている切除組織の細胞数を測定した。組織を、様々な野生型及び遺伝子修飾されたマウスと並んで、ｃＧＭＰ類縁体を注射したマウスから得た。実験は、照射されたマウスから摘除された組織が、照射されていない動物に由来する組織で観察されたレベルと比較して、アポトーシスを起こしている細胞の数が多いことを示した。さらに、データは、ＧＣＣまたはウログアニリンをコードする遺伝子を欠く照射されたマウスから摘除された組織が、照射された野生型マウスに由来する組織で観察されたレベルと比較して、アポトーシスを起こしている細胞の数が多いことを示している。実験はまた、ｃＧＭＰ補充がＧＣＣまたはウログアニリンをコードする遺伝子を欠くが野生型マウスではないマウスの照射腸組織におけるアポトーシスのレベルを改善することを示した。
【０００７】
Ｈｅｎｄｒｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９９７１４８（３）．２５４−９は、放射線が誘発した腸細胞のアポトーシスは、腸の上皮細胞の回復を担うクローン原性細胞の生存率と相関しないことを報告している。
【０００８】
Ｋｏｍａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２００４）２３，３２６５−３２７１は、ｐ５３欠損マウスを使用して、照射後の細胞周期停止が、陰窩細胞が分裂期細胞死（ｍｉｔｏｔｉｃ  ｃａｔａｓｔｒｏｐｈｅ）に入ること、及び放射線による損傷を受けた後に急死するのを遅らせることにより、生存を延長することを示している。放射線照射後の陰窩細胞の増殖の停止は、小腸の上皮の生存を促進する。サイクルの停止は、アポトーシス機能ではなく、その増殖停止によるｐ５３の保護的役割に起因する。
【０００９】
Ｋｉｒｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１０３２７：５９３−６は、放射線誘発胃腸症候群はアポトーシス非依存性であることを報告している。アポトーシスに必須の遺伝子を組織特異的に抑制する遺伝子修飾されたマウスを使用して、著者らは、放射線誘発性の胃腸症候群がアポトーシスを起こすために必要なタンパク質の完全な補完がなくても進行する可能性があることから、放射線誘発胃腸症候群は、内因性アポトーシス経路とは無関係であることを示している。上皮細胞におけるｐ５３発現の欠失は、照射マウスを放射線誘発胃腸症候群に対して感作させたのに対し、ｐ５３の過剰発現は防御的であった。データは、内因性アポトーシス経路に不可欠な他のタンパク質を欠く動物においてさえ、ｐ５３の発現が高線量の電離放射線後の生存に関連し；放射線誘発胃腸症候群はアポトーシスとは無関係であることを示している。
【００１０】
参照によりその全体が本明細書の一部をなす、米国特許出願番号第１４／１１４，２７２号は、放射線及び幾つかの毒性化合物への曝露に関連する深刻でおそらくは致死効果から個体を保護する組成物及び方法、がんの化学療法及び放射線療法に関連する重篤でおそらくは致命的な副作用から個体を保護する組成物及び方法、並びに放射線によって引き起こされるＧＩ症候群から胃腸（ＧＩ）管を保護するために特に有用な組成物及び方法に関する。
【００１１】
患者の快適さを増し、許容できないレベルの副作用のためにそうでなければ予防される投与量の増加を可能にするため、化学療法及び放射線療法の副作用を最小限にする治療の必要性が残されている。化学療法及び放射線療法の副作用を予防し、がん細胞に対する感受性を高めることにより、がん治療の治療効果を高めることは、がんの治療における大きな進歩を意味する。毒性の化学療法または放射線への曝露後のＧＩ症候群を予防し、胃腸の副作用の重症度を軽減する組成物及び方法を特定する必要性が残されている。ＧＩ症候群につながる毒性化学療法または放射線への曝露による損傷から胃腸細胞を保護する必要性が残されている。より効果的な治療を提供するため、胃腸細胞の損傷に起因する放射線及び化学療法の致死効果を低減し、毒性の化学療法及び放射線の認容レベルを増加させる必要性が残されている。
【発明の概要】
【００１２】
機能性グアニリルシクラーゼＣを欠くと同定されたがんを有する個体を治療する方法が提供される。該方法は、機能性グアニリルシクラーゼＣを欠くがんを有すると特定された個体の胃腸細胞に対して、胃腸細胞のグアニリルシクラーゼＣを活性化し、胃腸細胞を遺伝毒性の損傷から保護するレベルまで胃腸細胞において細胞内ｃＧＭＰを上昇させるのに十分な量の１つまたは複数のグアニリルシクラーゼＣアゴニスト化合物を投与することを含む。胃腸細胞のグアニリルシクラーゼＣの活性化は、胃腸細胞の細胞増殖の停止、及び／またはＤＮＡ合成の阻害及びＧ１〜Ｓの遅延を課すことによる胃腸細胞の細胞周期の延長、及び／または増強されたＤＮＡ損傷の感知及び修復によって維持される胃腸細胞のゲノムの完全性を引き起こすことによって、化学療法及び／または放射線によって引き起こされる遺伝毒性の損傷からの胃腸細胞の保護をもたらす、胃腸細胞における細胞内ｃＧＭＰの上昇を生じる。したがって、胃腸細胞を保護する胃腸細胞における細胞内ｃＧＭＰのレベルに対する言及は、胃腸細胞の細胞増殖の停止、及び／またはＤＮＡ合成の阻害及びＧ１〜Ｓの遅延を課すことによる胃腸細胞の細胞周期の延長、及び／または増強されたＤＮＡ損傷の感知及び修復によって維持される胃腸細胞のゲノムの完全性を引き起こすことで、化学療法及び／または放射線による遺伝毒性の損傷から胃腸細胞を保護するレベルを指す。上記方法は更に、機能性グアニリルシクラーゼＣを欠くがん細胞を死滅させるため、化学療法及び／または放射線療法を適用する工程を提供する。化学療法及び／または放射線は、正常胃腸細胞が、胃腸細胞における細胞内ｃＧＭＰの上昇の効果によって遺伝毒性損傷細胞から保護された場合に適用される。
【００１３】
個体において機能性ｐ５３を欠く原発性結腸直腸癌を有する個体を治療する方法が提供される。該方法は、かかる個体を特定する工程を含み得る。該方法は、機能性ｐ５３を欠く原発性結腸直腸癌を有すると特定された個体の胃腸細胞に対して、胃腸細胞のグアニリルシクラーゼＣを活性化し、胃腸細胞を遺伝毒性の損傷から保護するレベルまで胃腸細胞において細胞内ｃＧＭＰを上昇させるのに十分な量の１つまたは複数のグアニリルシクラーゼＣアゴニスト化合物を投与する工程を含む。該方法は更に、機能性ｐ５３を欠く原発性結腸直腸癌細胞を死滅させために化学療法及び／または放射線療法を適用することを提供する。化学療法及び／または放射線療法は、正常な胃腸細胞が胃腸細胞における細胞内ｃＧＭＰの上昇の影響により遺伝毒性損傷細胞から保護されている場合に適用される。
【００１４】
がんを有する個体を治療する方法が提供される。該方法は、腸幹細胞のグアニリルシクラーゼＣを活性化し、腸幹細胞において細胞内ｃＧＭＰを、腸幹細胞数を増加させ、腸幹細胞の相対的なバランスがシフトして、Ｌｇｒ５＋活性表現型を有する腸幹細胞を増加させ、Ｂｍｉｌ＋予備表現型を有する腸幹細胞を減少させるレベルまで上昇させるのに十分な量の１つまたは複数のグアニリルシクラーゼＣアゴニスト化合物を個体において腸幹細胞に対して投与することを含む。該方法はまた、腸幹細胞数が増加し、腸幹細胞の相対的なバランスが、Ｌｇｒ５＋活性表現型を有する腸幹細胞が増加し、Ｂｍｉｌ＋予備表現型を有する腸幹細胞が減少するようにシフトされる場合に、化学療法及び／または放射線療法を適用してがん細胞を死滅させる。腸幹細胞数が増加し、腸幹細胞の相対的なバランスが、Ｌｇｒ５＋活性表現型を有する腸幹細胞が増加し、Ｂｍｉｌ＋予備表現型を有する腸幹細胞が減少するようにシフトされる場合に、化学療法及び／または放射線療法を適用すると、胃腸副作用が少なくなり、重症度が低下する。
【００１５】
機能性ｐ５３を欠くがんを有すると特定された個体を治療する方法が提供される。該方法では、機能性ｐ５３を欠くがんを有する個体が特定される。グアニリルシクラーゼＡ（ＧＣＡ）アゴニスト（ＡＮＰ、ＢＮＰ）、グアニリルシクラーゼＢ（ＧＣＢ）アゴニスト（ＣＮＰ）、可溶性グアニリルシクラーゼ活性物質（一酸化窒素、ニトロ血管拡張剤、プロトプロフィリンＩＸ、及び直接活性物質）、ＰＤＥ阻害剤、ＭＲＰ阻害剤、環状ＧＭＰ及びｃＧＭＰ類縁体からなる群から選択される１つまたは複数の化合物を、正常細胞において細胞内ｃＧＭＰを上昇させ、正常細胞を化学療法及び／または放射線の遺伝毒性の影響から保護するのに十分な量で個体の胃腸細胞に投与する。化学療法及び／または放射線療法を適用してがん細胞を死滅させる。化学療法及び／または放射線は、正常細胞が化学療法及び／または放射線の遺伝毒性の影響から保護されている場合に適用される。
【００１６】
腸組織を放射線または化学療法から保護するのに有効な量のグアニリルシクラーゼＣアゴニストを含む組成物は、ＧＩ症候群またはＲＩＧＳを予防する方法が、放射線または化学療法を受けているがん患者の副作用を低減する方法と同様に開示される。
【００１７】
本発明の幾つかの実施形態は、がんを治療するために化学療法または放射線療法を受けている個体における胃腸の副作用を低減する方法に関する。該個体は、グアニリルシクラーゼＣ欠損、ｐ５３欠損、またはその両方であるがんを有し得る。ｐ５３を欠損する原発性結腸直腸癌を治療する方法が提供される。上記方法は、化学療法または放射線を適用する前に、胃腸細胞の生存を高め、化学療法または放射線療法の副作用の重症度を低減するのに十分な期間にわたり、胃腸細胞の細胞増殖を停止し、及び／またはＤＮＡ損傷の感知及び修復を増強することによりゲノムの完全性を維持するのに十分な量の胃腸細胞において細胞内ｃＧＭＰレベルを上昇させる１つまたは複数の化合物を該個体に投与することを含む。幾つかの実施形態では、副作用の軽減は、腸幹細胞におけるグアニリルシクラーゼＣの活性化によって起こる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ、図１Ｄ、図１Ｅ、図１Ｆ、図１Ｇ、図１Ｈ及び図１Ｉは、ＧＵＣＹ２ＣサイレンシングがＲＩＧＳを増幅することを示す実験によるデータを開示している。（１Ａ）Ｇｕｃｙ２ｃ−／−マウスは、Ｇｕｃｙ２ｃ＋／＋マウスと比較して、高線量（１５Ｇｙ）の全身照射に対してより感受性である（ＴＢＩ、カプラン−マイヤー分析、＊＊＊ｐ＜０．００１；ｎ＝３４  Ｇｕｃｙ２ｃ＋／＋マウス、ｎ＝３９  Ｇｕｃｙ２ｃ−／−マウス）。（１Ｂ）低線量（８Ｇｙ）ＴＢＩによる死亡率は、骨髄移植（ＢＭＴ）によって抑制された造血毒性を反映した。対照的に、高線量ＴＢＩ（１５Ｇｙ）による死亡率は、造血及びＢＭＴによって救出できなかったＧＩ毒性の両方を反映した［Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ分析、低線量（８Ｇｙ）ＴＢＩ後のＧｕｃｙ２ｃ＋／＋マウス（ｎ＝１１）とＢＭＴを有するＧｕｃｙ２ｃ＋／＋マウス（ｎ＝５）の間で＊＊＊ｐ＜０．００１；高線量ＴＢＩ後のＧｕｃｙ２ｃ＋／＋マウス（ｎ＝２１）とＢＭＴを有するＧｕｃｙ２ｃ＋／＋マウス（ｎ＝１５）間でｐ＜０．０５（有意ではない）］。１８Ｇｙ  ＳＴＢＩ後、Ｇｕｃｙ２ｃ−／−マウスは下痢（１Ｃ、カイ２乗検定、両側、＊ｐ＜０．０５）、死亡率（１Ｄ、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ分析、＊＊ｐ＜０．０１）、体重減少（１Ｅ、虚弱モデル分析、＊ｐ＜０．０５）、腸出血（１Ｆ、便潜血；ＦＯＢ；Ｃｏｃｈｒａｎ−Ｍａｎｔｅｌ−Ｈａｅｎｓｚｅｌ検定、＊ｐ＜０．０５）、衰弱（１Ｇ、乱雑な被毛；Ｃｏｃｈｒａｎ−Ｍａｎｔｅｌ−Ｈａｅｎｓｚｅｌ検定、＊ｐ＜０．０５）、及び便の水分の蓄積［１Ｈ、９５％信頼帯及び曲線下面積（ＡＵＣ）の比較によるＬｏｅｓｓ平滑曲線、＊ｐ＜０．０５；点線は照射前の便中水分量を示す］。（Ｉ〜Ｌ）Ｇｕｃｙ２ｃ＋／＋マウスと比較して、Ｇｕｃｙ２ｃ−／−マウスは、照射（１５Ｇｙ  ＴＢＩ）後の陰窩計数によって定量された小腸（Ｉ−Ｊ）及び大腸（１Ｋ−１Ｌ）の両方で、放射線誘発性ＧＩ損傷の影響をより受けやすかった（ＡＮＯＶＡ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、各時間点でｎ＞３  Ｇｕｃｙ２ｃ＋／＋及びＧｕｃｙ２ｃ−／−マウス）。１Ｉ及び１Ｋにおいて、低出力画像のバーは５００μｍ、高出力画像のバーは５０μｍを表す。１Ｃ〜１Ｂ及び１Ｇでは、ｎ＝３４のＧｕｃｙ２ｃ＋／＋マウス、ｎ＝３５のＧｕｃｙ２ｃ−／−マウス：１Ｆではｎ＝１３のＧｕｃｙ２ｃ＋／＋マウス、ｎ＝１３のＧｕｃｙ２ｃ−／−マウス；１Ｈでは、ｎ＝２６のＧｕｃｙ２ｃ＋／＋マウス及びｎ＝２８のＧｕｃｙ２ｃ−／−マウス。
【図２】図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ、図２Ｄ、図２Ｅ及び図２Ｆは、ＧＵＣＹ２Ｃホルモン軸がＲＩＧＳで保存されていることを示す実験によるデータを開示している。（２Ａ〜２Ｆ）ＴＢＩ（１５Ｇｙ）は、経時的な空腸内の（２Ａ）ＧＵＣＹ２Ｃ、（２Ｂ）グアニリン（ＧＵＣＡ２Ａ）、または（２Ｃ）ウログアニリン（ＧＵＣＡ２Ｂ）ｍＲＮＡまたは（２Ｄ）ＧＵＣＹ２Ｃ、（２Ｅ）ＧＵＣＡ２Ａまたは（２Ｆ）ＧＵＣＡ２Ｂのタンパク質の相対発現を有意に変化させなかった、［各時点でｎ＝４〜８；ＡＮＯＶＡによるｍＲＮＡまたはタンパク質についてｐ＞０．０５（有意ではない）］。（２Ｇ〜２Ｉ）１５Ｇｙ  ＴＢＩの前及び４８時間後のＧＵＣＹ２Ｃ、ＧＵＣＡ２Ａ、及びＧＵＣＡ２Ｂの発現の代表的な免疫蛍光画像［緑色、ＧＵＣＹ２Ｃ、赤色、ホルモン（ＧＵＡ２Ａ、ＧＵＣＡ２Ｂ）；青色、ＤＡＰＩ］。バーは５０μｍを表す。
【図３】図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ、図３Ｄ、図３Ｅ、図３Ｆ、図３Ｇ、図３Ｈ、図３Ｉ、図３Ｊ、図３Ｋは、経口ＳＴがＲＩＧＳに選択的に対抗することを示す実験によるデータを開示し、（３Ａ〜３Ｆ）１８Ｇｙ  ＳＴＢＩ（０日目）の前後で、１４日間経口ＳＴで事前処理されたＧｕｃｙ２ｃ＋／＋マウスは、対照ペプチド（ＣＰ）で処理されたマウスと比較して、ＳＴＢＩによって誘発された下痢（３Ａ）の発生率が低かった（Ｆｉｓｈｅｒの正確検定、両側、＊ｐ＜０．０５）。同様に、１８Ｇｙ  ＳＴＢＩの後、ＳＴは下痢のない生存を改善（３Ｂ）した（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存率分析、＊＊ｐ＜０．０１）；（３Ｃ）体重減少及び体重回復（虚弱モデル分析、＊ｐ＜０．０５）；（３Ｄ）ＦＯＢ及び（３Ｅ）乱雑な被毛（Ｃｏｃｈｒａｎ−Ｍａｎｔｅｌ−Ｈａｅｎｓｚｅｌ検定、＊ｐ＜０．０５）；及び（３Ｆ）便の含水量［９５％の信頼帯を有する損失平滑曲線と曲線下面積（ＡＵＣ）の比較、＊＊＊ｐ＜０．００１；破線、照射前の便含水率］。（３Ｇ〜３Ｈ）ＳＴＢＳ後１５日の放射線誘発腸損傷をＳＴの減少は、（３Ｇ）全体的な形態、低充血、浮腫、及び未形成の便、並びに（３Ｈ）組織学によって反映され、陰窩の深さによって定量される正常な陰窩絨毛構造の破壊を伴わず、間質性肥大は腸管壁の厚さ及びリンパ球浸潤によって反映される（Ｆｉｓｈｅｒの正確検定、両側、３Ｇにおいて＊ｐ＜０．０５；ｔ検定、両側、３Ｈにおいて＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎ＝４のＣＰ−治療マウス、ｎ＝５のＳＴ治療マウス）。３Ｈのバーは１００μｍを表す。（３Ｉ）経口ＳＴは皮下胸腺腫または黒色腫による放射線反応を変化させなかった（ｔ検定、両側、ｐ＞０．０５、破線、元の腫瘍サイズ）。（３Ｊ〜３Ｋ）慢性（２週間以上）経口ＳＴは下痢（３３）または成長遅延（３Ｋ）を引き起こさなかった（ｐ＞０．０５、分散分析）。３Ａ〜３Ｆ及び３Ｉ〜３Ｋでは、ｎ＝９のＣＰ処理マウス、ｎ＝９のＳＴ処理マウス。
【図４】図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、図４Ｄ、図４Ｅ、図４Ｆ、図４Ｇ及び図４Ｈは、ＧＵＣＹ２Ｃシグナリングがｐ５３−Ｍｄｍ２相互作用を妨げることによりＲＩＧＳに対するｐ５３応答を増幅することを示す実験によるデータを開示する。（４Ａ）ＧＵＣＹ２Ｃのサイレンシングは、小腸及び結腸における１５Ｇｙ  ＴＢＩによって誘発されたアポトーシスに影響を与えなかった（ｔ検定、両側、＊ｐ＜０．０５；各時間点でＧｕｃｙ２ｃ−／−マウス、≧３及びＧｕｃｙ２ｃ＋／＋マウス、ｎ≧３）。経口ＳＴは（４Ｂ）下痢のない生存率を改善した［Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ分析、ＣＰ（ｎ＝１７）またはＳＴ（ｎ＝１６）で治療されたｐ５３ｉｎｔ＋／＋マウス間で＊＊ｐ＜０．０１］；ＣＰ（ｎ＝１１）またはＳＴ（ｎ＝１１）で治療されたｐ５３ｉｎｔ−／−マウス間でｐ＞０．０５］；（４Ｃ）体重［虚弱モデル分析、ＣＰ（ｎ＝１７）またはＳＴ（ｎ＝１６）で治療されたｐ５３ｉｎｔ＋／＋マウス間で＊ｐ＜０．０５］；ＣＰ（ｎ＝１１）またはＳＴ（ｎ＝１１）で治療されたｐ５３ｉｎｔ−／−マウス間でｐ＞０．０５］；（４Ｄ）ｐ５３ｉｎｔ−／−マウスではなくｐ５３ｉｎｔ＋／＋マウスにおいて１８Ｇｙ  ＳＴＢＩ後の、ＦＯＢ及び（４Ｅ）乱雑な被毛［Ｃｏｃｈｒａｎ−Ｍａｎｔｅｌ−Ｈａｅｎｓｚｅｌ検定、ＣＰ（ｎ＝１７）またはＳＴ（ｎ＝１６）で治療されたｐ５３ｉｎｔ＋／＋マウス間で＊ｐ＜０．０５；ＣＰ（ｎ＝１１）またはＳＴ（ｎ＝１１）で治療されたｐ５３ｉｎｔ−／−マウス間でｐ＞０．０５］（４Ｆ）１８Ｇｙ  ＳＴＢＩの７日後、経口ＳＴは小腸のｐ５３リン酸化を促進した（ｔ検定、両側、＊ｐ＜０．０５、ＣＰでｎ＝６、ＳＴ治療マウスでｎ＝６）。バーは５０μｍを表す。（４Ｇ）８−Ｂｒ−ｃＧＭＰは、ＨＣＴ１１６ヒト結腸癌細胞における５Ｇｙの放射線に反応して、総ｐ５３とリン酸化ｐ５３を増加させた（各治療群でｎ≧３、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡ）。（４Ｈ）８−Ｂｒ−ｃＧＭＰは、ｐ５３−Ｍｄｍ２相互作用を妨げることにより、５Ｇｙ放射線に応答してＨＣＴ１１６細胞のｐ５３活性化を増加させ、免疫沈降（１Ｐ）及びｐ５３またはＭｄｍ２に対する抗体を用いたウエスタンブロット（ＷＢ）によって定量された（各群でｎ≧３；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡ）。マウス及びウサギのＩｇＧを（４Ｈ）のアイソタイ対照として使用した。
【図５】図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図５Ｅ、図５Ｆ、図５Ｇ及び図５Ｈは、ＧＵＣＹ２Ｃシグナル伝達が分裂期細胞死に対抗するためにｐ５３を必要とすることを示す実験によるデータを開示する。（５Ａ）経口ＳＴは、ＤＮＡ二本鎖切断を減少させ（γ−Ｈ２ＡＸ：ｔ検定、両側、＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎ＝４マウスはＣＰ治療、ｎ＝５マウスはＳＴ治療；２００個超の陰窩を各マウスで調査した）、（５Ｂ）１８Ｇｙ  ＳＴＢＩ後の有糸分裂の異常な方向を減少させた［（％）中期プレートの陰窩表面軸に対して非直交に配向）］（ｔ検定、両側、＊ｐ＜０．０５；ｎ＝４マウスをＣＰで治療；ｎ＝５マウスをＳＴで治療；各マウスの腸で５０超の有糸分裂像を評価した）（赤色、β−カテニン、緑色、γ−Ｈ２ＡＸ、青色、ＤＡＰＩ）。バーは５０μｍを表す。（５Ｃ）野生型（親）及びｐ５３−ｎｕｌｌ（ｐ５３−／−）ＨＣＴ１１６ヒト結腸癌細胞における後期ブリッジインデックス（ＡＢＩ）によって定量された異常有糸分裂のマーカーである放射線（５Ｇｙ）誘発後期ブリッジングは、ｐ５３依存的な様式でｃＧＭＰの細胞浸透性類縁体で前処理することにより減少された。ＡＢＩの代表的な画像：ｉ、後期ブリッジのない正常な有糸分裂、ｉｉ〜ｉｉｉ、後期ブリッジのある異常な有糸分裂（カイ２乗検定、両側、＊ｐ＜０．０５；各群で１００個超の細胞を調査した）。（５Ｄ）親（ｐ５３−ｎｕｌｌ  ＨＣＴ１１６細胞）の中心体の計数により定量された放射線（５Ｇｙ）誘発異数性は、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰによる前処理によりｐ５３依存的に減少した。倍数性の代表的な画像：ｉ、正常な２倍体、ｉｉ、異常な２倍体、ｉｉｉ、３倍体、ｉｖ、４倍体（赤色、α／β−チューブリン、緑色、γ−チューブリン、紫色、ＤＡＰＩ）（カイ二乗検定、両側、＊＊＊ｐ＜０．００１、各群で２００超の有糸分裂細胞を調べた）。（５Ｅ）コロニー形成によって定量された、放射線量の増加により誘発された親細胞及びｐ５３−ｎｕｌｌＨＣＴ１１６細胞における細胞遺伝毒性は、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰによる前処理によりｐ５３依存的に減少した［等温線勾配のペアワイズ比較、＊Ｐ＜０．０５：ＰＢＳで処理されたＨＣＴ１１６細胞、ＰＢＳまたはｃＧＭＰで処理されたＨＣＴ１１６  ｐ５３−ｎｕｌｌ細胞を含む他の３つの群と比較したｃＧＭＰで処理されたＨＣＴ１１６細胞；これら３つの後者の群のいずれか２つの間でｐ＞０．０５（有意ではない）］。
【図６】パネルＡ〜パネルＬは、実施例２のデータを示す。Ｇｕｃｙ２ｃは、陰窩のＬｇｒ５＋及びＢｍｉｌ＋の細胞のバランスを維持する。（Ａ〜Ｂ）透過型電子顕微鏡を使用した小腸切片のＣＢＣ  ＩＳＣの計数（ｎ＝３マウス、３０陰窩以上／マウス）。（Ｃ）Ｇｕｃｙ２ｃ＋／＋マウスと比較したＧｕｃｙ２ｃ−／−マウスの陰窩のｅｘ  ｖｉｖｏエンテロイド（ｅｎｔｅｒｏｉｄ）形成能。（Ｄ）Ｌｇｒ５−ＥＧＦＰ−Ｃｒｅ−Ｇｕｃｙ２ｃ＋／＋及びＧｕｃｙ２ｃ−／−のマウスの陰窩におけるフローサイトメトリーによるＬｇｒ５＋（ＧＦＰＨｉｇｈ）細胞の定量。（Ｅ〜Ｆ）Ｌｇｒ５＋ＧＦＰ＋細胞の計数は、ＥＧＦＰ  １Ｆ（４切片以上／マウス）による腸陰窩におけるものである。（Ｇ〜Ｈ）切片ごとの陰窩全体のパーセントとして表される、陰窩Ｌｇｒ５＋細胞系統トレーシング事象（４切片以上／マウス）。（Ｉ〜Ｊ）腸切片ごとのＢｍｉｌ＋細胞（４切片以上／マウス）。（Ｋ〜Ｌ）β−アクチンと比較した、分離された陰窩溶解物で発現されたＢｍｉｌの定量（ｎ＝５  Ｇｕｃｙ２ｃ＋／＋、４  Ｃｕｃｙ２ｃ−／−）。＊、ｐ＜０．０５；＊＊＊、ｐ＜０．００１。Ｅ及びＧのバーは５０μｍを表す。Ｉのバーは２０μｍを表す。
【図７】パネルＡ〜パネルＧ。機能性ＧＵＣＹ２ＣはＬｇｒ５＋細胞で発現している。（Ａ）Ｌｇｒ５−ＥＧＦＰ−Ｃｒｅ−Ｇｕｃｙ２ｃ＋／＋マウスの陰窩からのＧＦＰ＋及びＧＦＰ−細胞のフローソーティングにより、活性な幹細胞（Ｌｇｒ５Ｈｉｇｈ／ＳＩＬｏｗ）及び分化した（Ｌｇｒ５Ｌｏｗ／ＳＩＨｉｇｈ）細胞の集団（ｎ＝３）が生成された。（Ｂ）ＲＴ−ＰＣＲによって定量化されたＧＵＣＹ２Ｃ  ｍＲＮＡ発現を、Ｌｇｒ５Ｈｉｇｈ／ＳＩＬｏｗ細胞とＬｇｒ５Ｌｏｗ／ＳＩＨｉｇｈ細胞で比較した。（Ｃ）ＧＵＣＹ２Ｃ（緑）、ＧＦＰ＋（赤色）細胞における免疫蛍光。β−カテニン（シアン）は個々の細胞を強調し、ＤＡＰＩ（青色）は核を強調する。（Ｄ）ＳＴは、Ｇｕｃｙ２ｃ＋／＋ではなく、Ｇｕｃｙ２ｃ−／−、マウスのＧＦＰ＋（緑色）細胞でＧＵＣＹ２Ｃ及び下流のＶＡＳＰセリン２３９リン酸化（Ｐ−ＶＡＳＰ−２３９）（白色）を活性化する。β−カテニン（赤色）は個々の細胞を強調し、ＤＡＰＩ（青色）は核を強調する。（Ｅ〜Ｆ）８Ｂｒ−ｃＧＭＰは、Ｇｕｃｙ２ｃ−／−マウスの陰窩にある（Ｅ）Ｌｇｒ５＋ＧＦＰ＋及び（Ｆ）Ｂｍｉｌ＋細胞のレベルを再構成し、それはＧｕｃｙ２ｃ＋／＋マウスのものと同等である。（Ｇ）リナクロチドは、Ｇｕｃｙ２ｃ＋／＋マウスと比較して、Ｇｕｃｙ２ｃ−／−マウスの陰窩のエンテロイド形成能を増強する。＊、ｐ＜０．０５；ｎｓ、有意差なし。Ｃのバーは５０μｍを表す。Ｄのバーは２０μｍを表す。
【図８】パネルＡ〜パネルＦ。ＧＵＣＹ２Ｃは、ＥＲストレスのバランスをとる活性及び予備ＩＳＣに対抗する。（Ａ、Ｂ）Ｇｕｃｙ２ｃ＋／＋及びＧｕｃｙ２ｃ−／−マウスにおけるチューブリンと比較した陰窩ＥＲストレスマーカー発現の定量（ｎ＝３）。（Ｃ、Ｄ）ＴＵＤＣＡまたは８Ｂｒ−ｃＧＭＰによる治療前後のＧｕｃｙ２ｃ＋／＋マウス、及びＧｕｃｙ２ｃ−／−マウスの陰窩（＊）におけるＧｒｐ７８（ＢｉＰ）発現。（Ｅ、Ｆ）３日間の経口ＴＵＤＣＡ後のＧｕｃｙ２ｃ＋／＋及びＧｕｃｙ２ｃ−／−マウスにおける陰窩Ｌｇｒ５＋ＧＦＰ＋及びＢｍｉｌ＋の細胞の定量。＊、ｐ＜０．０５；＊＊＊、ｐ＜０．００１；ｎｓ、有意差なし。Ｃのバーは２０μｍを表す。
【図９】パネルＡ〜パネルＤ。ＧＵＣＹ２ＣによるＩＳＣの維持は、放射線誘発性腸傷害後の再生反応に寄与する。Ｌｇｒ５−ＥＧＥＰ−Ｃｒｅ−Ｇｕｃｙ２ｃ＋／＋及び−Ｇｕｃｙ２ｃ−／−マウスは１０Ｇｙの照射を受け、（Ａ〜Ｂ）生存陰窩、（Ｃ）ＧＦＰ＋Ｌｇｒ５＋活性幹細胞、及び（Ｄ）Ｂｍｉｌ＋予備幹細胞のダイナミクスを、その後３日間定量した。Ｂのバーは１００μｍを表す。
【図１０】Ｌｇｒ５−ＥＧＦＰ−Ｃｒｅ−Ｇｕｃｙ２ｃ＋／＋及びＬｇｒ５−ＥＧＦＰ−Ｃｒｅ−Ｇｕｃｙ２ｃ−／−のマウスにおけるＬｇｒ５＋ＧＦＰ＋細胞（４切片以上／マウス）を含む腸陰窩の計数。
【図１１】Ｇｕｃｙ２ｃ＋／＋及びＧｕｃｙ２ｃ−／−のマウスにおけるＢｍｉｌ＋細胞（４切片以上／マウス）を含む腸陰窩の列挙。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
細胞シグナル伝達分子環状ＧＭＰは、ｐ５３に依存するメカニズムにより、細胞への遺伝毒性の損傷を防ぐことができる。したがって、ｃＧＭＰの蓄積を促進するか、そうでなければその結果としてｃＧＭＰ蓄積をもたらす化合物を投与して、化学療法または放射線によって引き起こされる遺伝毒性の損傷から個体の細胞を保護することができる。個体が化学療法及び／または放射線でがんの治療を受けている例において、がん細胞が機能性ｐ５３を欠いている場合、ｃＧＭＰの蓄積を促進するか、そうでなければその結果としてｃＧＭＰの蓄積をもたらす化合物が特に有用である。かかる場合、そのような化合物の投与は、がん細胞を遺伝毒性の損傷から保護せずに、化学療法または放射線によって引き起こされる遺伝毒性の損傷から個体の細胞を保護する。かかる方法では、個体は、機能性ｐ５３を欠く腫瘍を有すると特定され、次いで正常細胞を保護するために上記化合物が投与される。
【００２０】
ＧＣＣアゴニストはよく知られている。ＧＣＣアゴニストが、細胞受容体ＧＣＣ（ＧＵＣＹ２Ｃとも称される）を持つ細胞と相互作用する場合、ＧＣＣの活性化により、細胞内にｃＧＭＰが蓄積される。したがって、ＧＣＣアゴニストを投与して、化学療法または放射線によって引き起こされる遺伝毒性の損傷から個体のＧＣＣ発現細胞を保護することができる。個体が化学療法及び／または放射線でがんを治療されている場合、ＧＣＣアゴニストはＧＣＣを欠くがん細胞を治療するのに特に有用である。かかる場合、ＧＣＣアゴニストの投与は、ＧＣＣ欠損がん細胞を遺伝毒性の損傷から保護せずに、化学療法または放射線によって引き起こされる遺伝毒性の損傷から個体の細胞を保護する。かかる方法では、個体を機能性ＧＣＣを欠く腫瘍を有すると特定し、次いで、正常な細胞を保護するためにＧＣＣアゴニスト化合物を投与する。
【００２１】
ＧＣＣ欠損腫瘍及びＧＣＣアゴニストの場合、この方法は特に有用である。ＧＣＣは主に正常な腸細胞において発現される。かかる腸細胞では、タンパク質のＧＣＣ細胞外部分は、腸の内部を構成する細胞の側に存在している。ＧＣＣアゴニストの経口投与は、ＧＣＣアゴニストを腸細胞のＧＣＣに送達し、腸細胞はｃＧＭＰを蓄積する。これにより、腸細胞は放射線や化学療法から保護される。この方法は、非ＧＣＣ発現がんの治療に特に有用である。
【００２２】
ほとんどの結腸直腸癌は、例えば胃癌、食道癌、膵臓癌等の他の消化管器官及び組織の幾つかのがんと同様に、ＧＣＣを発現する。ほとんどの結腸直腸癌細胞はＧＣＣを発現しているが、幾つかの結腸直腸癌細胞はＧＣＣを欠く。かかるＧＣＣ欠損表現型は、特に侵攻性で結腸直腸癌の治療が困難であることに関連している可能性がある。ＧＣＣを発現する結腸直腸癌等のＧＣＣを通常または時々発現することが知られているがん細胞を有する器官または組織のがん、胃、食道及び膵臓のがん等の他の消化管器官及び組織のがんの場合、上記方法は、ＧＣＣ発現について腫瘍を試験して、そのがんをＧＣＣ欠損であると特定し、次いでＧＣＣアゴニストを正常なＧＣＣ発現腸細胞に投与して、かかる正常な腸細胞でＧＣＣを活性化し、ｃＧＭＰの蓄積をもたらす工程を含み得る。ＧＣＣアゴニストによるかかる治療後、個体は放射線及び／または化学療法を受けて、正常な腸細胞を損傷から保護しながら、ＧＣＣ欠損がんを治療することができる。
【００２３】
正常な腸組織がＧＣＣアゴニストを使用して保護されている場合、正常な腸は、遺伝毒性機構によって作用する化学療法と同様に放射線療法から保護される。腹骨盤照射を受けている患者は、かかる放射線療法によって腸に遺伝毒性の損傷を特に受けやすく、ＧＣＣアゴニストを使用する正常な腸組織の保護は、かかる患者の治療に特に有用である。
【００２４】
正常細胞の保護により、腹部骨盤領域への放射線治療中にかかる放射線に曝された正常な腸組織への損傷に起因する、高線量の放射線の使用及び／または放射線療法の不快な起こりうる致死的な副作用を最小限に抑えることができる。
【００２５】
幾つかの実施形態では、ＧＣＣアゴニストを使用する保護に加えて、患者は、ＧＣＣ蓄積を促進する他の化合物で更に治療することができ、かかる化合物が全身送達される場合、がんはｐ５３欠損である。
【００２６】
既知のＧＣＣアゴニストのうち、熱安定性エンテロトキシンＳＴ、並びに米国ＦＤＡ承認薬のリナクロチド（配列番号５９）とプレカナチド（配列番号６０）は、特に、がんがＧＣＣ欠損である場合、すなわち、ほとんどの結腸直腸癌等のＧＣＣを発現しないがん、及び胃、食道及び膵臓のがん等の他の消化管の臓器及び組織の幾つかのがんである場合、遺伝毒性物質（例えば、放射線、化学療法）を用いる化学療法を受けている患者において正常な腸管上皮を保護するのに特に有用である。腫瘍サンプルにおいてＧＣＣ発現を検出する方法はよく知られており、腸を保護するために経口または他の手段で腸に直接投与されたＧＣＣアゴニストで患者を治療する前に、患者は、ＧＣＣ発現がないことを確認するために腫瘍サンプルを分析することによって、最初にＧＣＣ欠損（ＧＣＣ機能を欠く）がんを有すると特定され得る。腫瘍がｐ５３欠損（ｐ５３機能を欠く）であると特定された場合は、他の化合物を使用して、正常組織のみにおいてＧＣＣの蓄積を誘導するか、またはＧＣＣアゴニストと組み合わせて正常な腸を保護することができる。
【００２７】
ＧＣＣアゴニストを使用して正常な腸を保護するため、正常な腸は、ｃＧＭＰの蓄積を保護レベルまで可能にするのに十分な時間、ＧＣＣアゴニストに曝露されることが好ましい。幾つかの実施形態では、かかる蓄積は、１日〜１４日間、３日〜１０日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間または９日間かかることがある。ＧＣＣアゴニスト、例えば、熱安定性エンテロトキシンＳＴ、グアニリン、ウログアニリン、並びに米国ＦＤＡ承認薬物リナクロチド（配列番号５９）及びプレカナチド（配列番号６０）等は、正常な腸細胞を保護するのに十分なｃＧＭＰの蓄積を誘導するには有効ではない可能性がある。患者を治療する場合、ＧＣＣアゴニストの有効性は、ＧＣＣアゴニストを投与されている患者の腸活動の変化を監視することによって評価され得る。ＧＣＣアゴニストの投与開始後に腸の活動に変化が見られる患者は、保護される可能性が高い。便通の変化を経験しない患者は、非応答者である可能性が高く、保護されない。幾つかの実施形態は、患者を、非栄養性がん及び幾つかの結腸直腸癌等のＧＣＣ欠損がん、並びに胃、食道及び膵臓のがん等の他の消化管器官及び組織の幾つかのがんを有する患者として特定する工程を含む。腹骨盤への放射線治療が含まれるがんとしては、膵臓、肝臓、胃、胆道系、腹膜、膀胱、腎臓、尿管、前立腺、卵巣、子宮、並びに肉腫等の腹部の軟組織及び骨盤が挙げられるＧＣＣアゴニストを使用して正常な腸を放射線から保護することは特に有用である。がんがＧＣＣアゴニストと接触する可能性がある場合、ＧＣＣを発現していないとしてがんを特定することは有用な可能性がある。判断は、腫瘍のサンプルを試験して、ＧＣＣの存在またはＧＣＣ  ｍＲＮＡ等のＧＣＣ発現の他の証拠を判定することにより行われ得る。上記方法は、熱安定性エンテロトキシンＳＴ等のＧＣＣアゴニスト、または米国ＦＤＡ承認の薬物リナクロチド（配列番号５９）若しくは米国ＦＤＡ承認の薬物プレカナチド（配列番号６０）を、遺伝毒性物質（放射線、化学療法等）を用いるがん治療を受けている患者の正常な腸管上皮を保護するのに有効な量で投与することを更に含む。ＧＣＣアゴニストは、好ましくは経口送達される。患者が保護される可能性が高いことを示すための便通の変化が観察された場合、ＧＣＣアゴニストの送達が継続される。幾つかの実施形態では、がんは放射線の前に外科的に摘除される。かかる場合、腹骨盤放射線で治療する前に腫瘍が外科的に摘除される場合、上記方法はＧＣＣ＋がんを有する患者を治療することを含み得る。
【００２８】
幾つかの実施形態では、方法は、機能性グアニリルシクラーゼＣを欠くがんを有すると特定された個体を治療するために提供される。幾つかの実施形態では、機能性グアニリルシクラーゼＣを欠くがんは：機能性グアニリルシクラーゼＣを欠く結腸直腸癌、機能性グアニリルシクラーゼＣを欠く食道癌、機能性グアニリルシクラーゼＣを欠く膵臓癌、機能性グアニリルシクラーゼＣを欠く肝癌、機能性グアニリルシクラーゼＣを欠く胃癌、機能性グアニリルシクラーゼＣを欠く胆管系癌、機能性グアニリルシクラーゼＣを欠く腹膜の癌、機能性グアニリルシクラーゼＣを欠く膀胱癌、機能性グアニリルシクラーゼＣを欠く腎臓癌、機能性グアニリルシクラーゼＣを欠く尿管の癌、機能性グアニリルシクラーゼＣを欠く前立腺癌、機能性グアニリルシクラーゼＣを欠く卵巣癌、機能性グアニリルシクラーゼＣを欠く子宮癌機能性アニリルシクラーゼＣを欠く、肉腫等の腹部及び骨盤の軟組織から群から選択される。幾つかの実施形態では、上記方法は、機能性グアニリルシクラーゼＣを欠くがんを有すると特定された個体において胃腸細胞に対して、胃腸細胞のグアニリルシクラーゼＣを活性化し、胃腸細胞を遺伝毒性の損傷から保護するレベルまで胃腸細胞において細胞内ｃＧＭＰを上昇させるのに十分な量の１つまたは複数のグアニリルシクラーゼＣアゴニスト化合物を投与する工程を提供する。化学療法及び放射線によって引き起こされる遺伝毒性の損傷及び胃腸の副作用からの保護は、胃腸細胞における細胞内ｃＧＭＰが細胞に及ぼす影響から生じる。グアニリルシクラーゼＣの活性化により、ｃＧＭＰの上昇が起こる。その結果、胃腸細胞の細胞増殖が停止され、及び／またはＤＮＡ合成が阻害されて、Ｇ１〜Ｓ遅延を課すことにより胃腸細胞の細胞周期が延長され、及び／または消化管細胞のゲノムの完全性が、増強されたＤＮＡ損傷の感知及び修復によって維持される。
【００２９】
幾つかの実施形態では、上記方法は、機能性グアニリルシクラーゼＣを欠くがんを有すると個体を特定する工程を含む。幾つかの実施形態では、機能性グアニリルシクラーゼＣの欠如は、個体に由来するがん細胞のサンプル中のグアニリルシクラーゼＣまたはグアニリルシクラーゼＣをコードするＲＮＡの不在を検出することによって決定される。幾つかの実施形態では、上記方法は、がん細胞のサンプルをグアニリルシクラーゼＣに結合する試薬と接触させて、該サンプルがん細胞に対する前記試薬の結合の不在を検出することにより、個体由来のがん細胞のサンプル中のグアニリルシクラーゼＣの不在を検出することによって、機能性グアニリルシクラーゼＣを欠くがんを有するとその個体を特定する工程を含む。幾つかの実施形態では、上記方法は、がん細胞のサンプルをグアニリルシクラーゼＣに結合する試薬と接触させて、該サンプルがん細胞に対する前記試薬の結合の不在を検出することにより、個体由来のがん細胞のサンプル中のグアニリルシクラーゼＣの不在を検出することによって、機能性グアニリルシクラーゼＣを欠くがんを有するとその個体を特定する工程を含み、該試薬は抗グアニリルシクラーゼＣまたはグアニリルシクラーゼＣリガンドである。幾つかの実施形態では、上記方法は、グアニリルシクラーゼＣをコードするＲＮＡを増幅するＰＣＲプライマーを使用してがん細胞のサンプルに由来するｍＲＮＡに対してＰＣＲを行い、前記サンプルがん細胞中における増幅されたＲＮＡの不在を検出することにより、個体に由来するがん細胞のサンプルにおいて、グアニリルシクラーゼＣをコードするＲＮＡの不在を検出することによって、またはオリゴヌクレオチドであって、ＲＮＡにハイブリダイズする配列を有するグアニリルシクラーゼＣをコードする前記オリゴヌクレオチドを上記がん細胞のサンプルに由来するｍＲＮＡと接触させ、該がん細胞のサンプルに由来するｍＲＮＡにハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの不在を検出することによって、上記個体を、機能性グアニリルシクラーゼＣを欠くがんを有すると特定する工程を含む。
【００３０】
幾つかの実施形態では、上記方法は、グアニリルシクラーゼＣを欠くがんを、機能性ｐ５３も欠くものとして特定することを更に含む。かかる実施形態では、グアニリルシクラーゼＡ（ＧＣＡ）アゴニスト（ＡＮＰ、ＢＮＰ）、グアニリルシクラーゼＢ（ＧＣＢ）アゴニスト（ＣＮＰ）、可溶性グアニリルシクラーゼ活性物質（一酸化窒素、ニトロ−血管拡張剤、プロトプロフィリンＩＸ、及び直接活性物質）、ＰＤＥ阻害剤、ＭＲＰ阻害剤、環状ＧＭＰ及びｃＧＭＰ類縁体からなる群から選択される１つまたは複数の活性剤を投与して、細胞内ｃＧＭＰを増加させることにより正常細胞を保護することができる。幾つかのかかる実施形態では、がんは、個体に由来するがん細胞のサンプル中のｐ５３またはｐ５３をコードするＲＮＡの不在を検出することにより、機能性ｐ５３を欠いていると特定される。
【００３１】
幾つかの実施形態では、機能性ｐ５３を欠く原発性結腸直腸癌を有する個体を治療するための方法が提供される。該方法は、機能性ｐ５３を欠く原発性結腸直腸癌を有すると特定された個体の胃腸細胞に対して、胃腸細胞のグアニリルシクラーゼＣを活性化し、胃腸細胞を遺伝毒性の損傷から保護するレベルまで胃腸細胞において細胞内ｃＧＭＰを上昇させるのに十分な量の１つまたは複数のグアニリルシクラーゼＣアゴニスト化合物を投与することを含み得る。この方法は更に、機能性ｐ５３を欠く原発性結腸直腸癌細胞を死滅させるための化学療法及び／または放射線療法の適用を提供する。化学療法及び／または放射線の適用は、正常な胃腸細胞が胃腸細胞における細胞内ｃＧＭＰの上昇の効果により遺伝毒性損傷細胞から保護されている場合に行われる。幾つかの実施形態は、機能性ｐ５３を欠く原発性結腸直腸癌を有するとして個体を特定する工程を提供する。
【００３２】
個体において腸幹細胞に１つまたは複数のグアニリルシクラーゼＣアゴニスト化合物を投与することにより、がんを有する個体を治療するための幾つかの方法が提供される。グアニリルシクラーゼＣアゴニスト化合物は、腸幹細胞のグアニリルシクラーゼＣを活性化し、腸幹細胞において細胞内ｃＧＭＰを、腸幹細胞数を増加させ、腸幹細胞の相対的なバランスがシフトして、Ｌｇｒ５＋活性表現型を有する腸幹細胞が増加し、Ｂｍｉｌ＋予備表現型を有する腸幹細胞が減少するレベルまで上昇させるのに十分な量で投与される。化学療法及び／または放射線療法を適用してがん細胞を死滅させる。腸の幹細胞数を増加させ、表現型が活性型から予備型に移行した後、幹細胞がそのような場合に化学療法または放射線で治療することにより、消化管は再生し、より効果的に治癒する。
【００３３】
幾つかの方法は化学療法の適用を提供する。幾つかの方法は、放射線の適用を提供する。幾つかの方法は、適用された腹骨盤放射線を投与することを提供する。
【００３４】
幾つかの実施形態では、１つまたは複数のＧＣＣアゴニスト化合物は、ＧＣＣアゴニストペプチドである。幾つかの実施形態では、１つまたは複数のＧＣＣアゴニスト化合物は、配列番号２、配列番号３及び配列番号５〜配列番号６０からなる群から選択される。幾つかの実施形態では、１つまたは複数のＧＣＣアゴニスト化合物は、グアニリン、ウログアニリン、配列番号５９、配列番号６０及びそれらの組み合わせから選択される。幾つかの実施形態では、ＧＣＣアゴニスト化合物は、個体への１つまたは複数のＧＣＣアゴニスト化合物の経口投与によって胃腸細胞または腸幹細胞に投与される。幾つかの実施形態では、ＧＣＣアゴニスト化合物は、制御放出組成物で経口投与により投与される。
【００３５】
幾つかの実施形態において、がんを治療するのに十分な量の化学療法または放射線を上記個体に投与する２４時間、または４８時間、または７２時間、または９６時間前にＧＣＣアゴニスト化合物を個体に投与する。幾つかの実施形態では、ＧＣＣアゴニスト化合物は、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間または１４日間にわたって毎日個体に投与される。幾つかの実施形態では、ＧＣＣアゴニスト化合物は、複数用量で投与される。
【００３６】
幾つかの実施形態では、グアニリルシクラーゼＣアゴニストの投与前に、腫瘍を個体から外科的に摘除する。
【００３７】
誰もが胃腸細胞が保護される状態を作り出すことによってＧＣＣアゴニスト化合物に反応するわけではないことから、個体は、グアニリルシクラーゼＣアゴニストの投与後の個体の便通の変化を検出することにより、グアニリルシクラーゼＣアゴニスト化合物の保護作用に応答するものとして識別され得る。グアニリルシクラーゼＣアゴニストを投与されている個体がグアニリルシクラーゼＣアゴニストに応答して便通の変化を経験する場合、上記方法は記載される通りに継続することができる。応答しないことは、個体が利益を得る可能性が低く、上記方法が中止される可能性があることを示唆している。
【００３８】
幾つかの方法は、機能性ｐ５３を欠くがんを有すると特定された個体を治療するために提供される。かかる方法は、機能性５３を欠くがんを有すると個体を特定する工程を含み得る。かかる方法は、グアニリルシクラーゼＡ（ＧＣＡ）アゴニスト（ＡＮＰ、ＢＮＰ）、グアニリルシクラーゼＢ（ＧＣＢ）アゴニスト（ＣＮＰ）、可溶性グアニリルシクラーゼ活性物質（一酸化窒素、ニトロ血管拡張剤、プロトプロフィリンＩＸ、及び直接活性物質）、ＰＤＥ阻害剤、ＭＲＰ阻害剤、環状ＧＭＰ及びｃＧＭＰ類縁体からなる群から選択される１つまたは複数の化合物を、正常細胞の細胞内ｃＧＭＰを上昇させ、正常細胞を化学療法及び／または放射線遺伝毒性の影響から保護するのに十分な量で個体の胃腸細胞に投与することを提供し得る。かかる実施形態では、化学療法及び／または放射線療法を行って、がん細胞を死滅させることができる。幾つかの実施形態では、上記方法は、個体由来のがん細胞のサンプル中のｐ５３またはｐ５３をコードするＲＮＡの不在を検出することによって、該個体を、機能性ｐ５３を欠くがんを有すると特定する工程を含む。幾つかの実施形態では、上記方法は、グアニリルシクラーゼＡ（ＧＣＡ）アゴニスト（ＡＮＰ、ＢＮＰ）、グアニリルシクラーゼＢ（ＧＣＢ）アゴニスト（ＣＮＰ）、可溶性グアニリルシクラーゼ活性物質（一酸化窒素、ニトロ血管拡張剤、プロトプロフィリンＩＸ、及び直接活性物質）、ＰＤＥ阻害剤、ＭＲＰ阻害剤、環状ＧＭＰ及びｃＧＭＰ類縁体からなる群から選択される１つまたは複数の化合物を、がんを治療するのに十分な量の化学療法若しくは放射線を上記個体に適用する２４時間前；がんを治療するのに十分な量の化学療法若しくは放射線を上記個体に適用する４８時間前に；がんを治療するのに十分な量の化学療法若しくは放射線を上記個体に適用する７２時間前に；またはがんを治療するのに十分な量の化学療法若しくは放射線を上記個体に適用する９６時間前に上記個体に投与すること、及び／またはグアニリルシクラーゼＡ（ＧＣＡ）アゴニスト（ＡＮＰ、ＢＮＰ）、グアニリルシクラーゼＢ（ＧＣＢ）アゴニスト（ＣＮＰ）、可溶性グアニリルシクラーゼ活性物質（一酸化窒素、ニトロ血管拡張剤、プロトプロフィリンＩＸ、及び直接活性物質）、ＰＤＥ阻害剤、ＭＲＰ阻害剤、環状ＧＭＰ及びｃＧＭＰ類縁体からなる群から選択される１つまたは複数の化合物を、上記個体に２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、または１４日間にわたって毎日投与すること、を含む。幾つかの実施形態では、グアニリルシクラーゼＡ（ＧＣＡ）アゴニスト（ＡＮＰ、ＢＮＰ）、グアニリルシクラーゼＢ（ＧＣＢ）アゴニスト（ＣＮＰ）、可溶性グアニリルシクラーゼ活性物質（一酸化窒素、ニトロ血管拡張剤、プロトプロフィリンＩＸ、及び直接活性物質）、ＰＤＥ阻害剤、ＭＲＰ阻害剤、環状ＧＭＰ及びｃＧＭＰ類縁体からなる群から選択される１つまたは複数の化合物が複数用量で投与される。幾つかの実施形態では、グアニリルシクラーゼＡ（ＧＣＡ）アゴニスト（ＡＮＰ、ＢＮＰ）、グアニリルシクラーゼＢ（ＧＣＢ）アゴニスト（ＣＮＰ）、可溶性グアニリルシクラーゼ活性物質（一酸化窒素、ニトロ血管拡張剤、プロトプロフィリンＩＸ、及び直接活性物質）、ＰＤＥ阻害剤、ＭＲＰ阻害剤、環状ＧＭＰ及びｃＧＭＰ類縁体からなる群から選択される１つまたは複数の化合物の投与前に、個体から外科的に腫瘍を摘除する。
【００３９】
定義
本明細書で使用される場合、「グアニリルシクラーゼＡアゴニスト」及び「ＧＣＡアゴニスト」という用語は区別なく使用され、細胞表面上のグアニリルシクラーゼＡに結合することにより細胞内でのｃＧＭＰ蓄積をもたらすその活性を誘導する分子を指す。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「グアニリルシクラーゼＢアゴニスト」及び「ＧＣＢアゴニスト」という用語は区別なく使用され、細胞表面上のグアニリルシクラーゼＢに結合することにより、細胞内でｃＧＭＰ蓄積をもたらすその活性を誘導する分子を指す。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「グアニリルシクラーゼＣアゴニスト」及び「ＧＣＣアゴニスト」という用語は区別なく使用され、細胞表面のグアニリルシクラーゼＣに結合することにより、細胞内でｃＧＭＰの蓄積をもたらすその活性を誘導する分子を指す。
【００４２】
本明細書で使用する場合、「可溶性グアニリルシクラーゼ活性剤」及び「ｓＧＣ活性剤」という用語は区別なく使用され、可溶性グアニリルシクラーゼに結合することにより細胞内でｃＧＭＰ蓄積をもたらすその活性を誘導する分子を指す。
【００４３】
本明細書で使用する場合、「ホスホジエステラーゼ阻害剤」及び「ＰＤＥ阻害剤」という用語は区別なく使用され、ｃＧＭＰ加水分解ホスホジエステラーゼ酵素またはサブタイプの１つまたは複数の形態の活性を阻害することにより、細胞内にｃＧＭＰ蓄積をもたらす分子を指す
【００４４】
本明細書で使用される場合、「多剤耐性関連タンパク質阻害剤」及び「ＭＲＰ阻害剤」という用語は区別なく使用され、ｃＧＭＰ輸送ＭＲＰの１つまたは複数の形態またはサブタイプの活性を阻害することにより、細胞内でｃＧＭＰの蓄積をもたらす分子を指す。
【００４５】
本明細書で使用する場合、「有効量」という用語は、副作用の重症度を軽減するか、またはＧＵＩ症候群及び／または放射線病を予防するのに十分な化学療法または放射線によって引き起こされる細胞損傷を軽減するのに十分な期間にわたって、細胞内ｃＧＭＰレベルの蓄積をもたらし、胃腸細胞の細胞増殖を停止し、及び／または増強されたＤＮＡ損傷感知及び修復によりゲノムの完全性を維持するのに有効な化合物（複数の場合がある）の量を指す。
【００４６】
ＧＣＣ及びｐ５３の変異型の検出
腫瘍がグアニリルシクラーゼＣ（ＧＣＣ）を発現しているかどうかを判断するため、ｉｎ  ｓｉｔｕイメージングまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニング、並びに診断用の組成物、方法及びキットを使用することができる。ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングは、米国特許第６，２６８，１５８号に開示されており、その全体が引用することで本明細書の一部をなす。
【００４７】
ＧＣＣタンパク質またはＧＣＣタンパク質をコードするＲＮＡを検出するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニング、並びに診断用組成物、キット及び方法は、米国特許第６，０６０，０３７号に開示されており、その全体が引用することで本明細書の一部をなす。
【００４８】
変異型のｐ５３を含む細胞を検出するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニング、並びに診断用組成物、キット及び方法は、米国特許第５，５５２，２８３号に開示されており、その全体が引用することで本明細書の一部をなす。
【００４９】
ｃＧＭＰ
ｃＧＭＰの細胞内蓄積は、化学療法または放射線によって引き起こされる細胞の損傷を減らすのに十分な期間にわたって、ＤＮＡ損傷の感知及び修復を増強することにより、細胞がゲノムの完全性を維持するのに役立つ。ｐ５３は、細胞分裂の前に修復できるように細胞増殖の停止を媒介し、それによって分裂期細胞死による細胞死を防ぐことにより、照射された細胞を分裂期細胞死から保護する。
【００５０】
ＧＩ症候群を含む放射線及び化学療法によって引き起こされる副作用は、ｐ５３が媒介する細胞停止によって軽減され得る。細胞内ｃＧＭＰレベルが増加すると、かかる細胞が致死的な毒性のある化学療法または電離放射線による傷害に曝された場合に、ｐ５３が媒介する細胞停止が増強される。細胞内ｃＧＭＰの増加は、その産生を増加させること、及び／またはその分解若しくは細胞からの排除を阻害することによって達成され得る。ＤＮＡ損傷の修復が促進される可能性があり、順に化学療法及び電離放射線による傷害に反応して、正常な腸上皮細胞の死を防ぐことができる。
【００５１】
したがって、個体への化学療法または放射線の投与と併せて、ＧＩ症候群を予防するのに十分な期間にわたり、胃腸細胞の細胞増殖を停止し、及び／またはＤＮＡ損傷の感知及び修復を増強することによりゲノムの完全性を維持するのに十分な量の胃腸細胞において細胞内ｃＧＭＰレベルを上昇させる１つまたは複数の化合物を該個体に投与する。細胞内ｃＧＭＰレベルを上昇させる１つまたは複数の化合物は、個体への化学療法または放射線の適用の前及び／または同時及び／またはその後に投与され得るが、通常、ｐ５３が媒介する細胞保護が毒性のある化学物質または放射線に曝される前に開始されることを確実するように、細胞内ｃＧＭＰレベルを上昇させる１つまたは複数の化合物の予備治療が行われる。
【００５２】
ｃＧＭＰレベルの増加は、毒性発作後の腸細胞を保護するが、ｃＧＭＰは、ヒトの乳癌、肝臓癌、及び前立腺癌等の他のがん細胞の細胞死を増強する可能性がある。腸管上皮細胞におけるｃＧＭＰレベルを、化学療法または放射線療法の実施前及び併用してｐ５３が媒介する細胞停止を維持するのに十分なレベルに誘導することにより、致死的な副作用を軽減し、化学療法または放射線療法の増量を利用することができ、かかる治療法ががんに対してより効果的になり得る。腸管上皮細胞のｃＧＭＰレベルが上昇し、毒素及び放射線からかかる細胞が保護される場合、化学療法及び放射線療法は副作用及びリスクを抑えながら進行する可能性があり、場合によっては、許容できなかった高用量において、腸上皮細胞においてｃＧＭＰレベルの上昇によってもたらされる保護を欠く。さらに、患者のがん細胞におけるｃＧＭＰが同時に増加すると、化学療法及び放射線療法に相乗効果がもたらされる可能性がある。ｃＧＭＰの細胞内蓄積をもたらす治療によるＧＩ管及び標的臓器のプレコンディショニングは、治療ウィンドウを広げ、治療指数を増加させることにより、化学療法または放射線療法の効果を劇的に向上させる可能性がある。
【００５３】
ｃＧＭＰレベルの細胞内増加は、腸でのｐ５３が媒介する細胞の生存を促進し、それによりがん患者における化学療法及び放射線療法の副作用を制限する。したがって、患者が化学療法または放射線療法を受けている間、腸細胞がｐ５３によって保護されて典型的な化学療法及び放射線療法の副作用を低減させるように、特に腸細胞における細胞内ｃＧＭＰレベルの増加は、化学療法及び放射線療法の前に影響を受け得る。化学療法及び放射線療法中に腸上皮細胞を保護するには、ｃＧＭＰレベルを、ｐ５３が媒介する細胞生存率を高めるのに有効な量まで増やす必要がある。放射線損傷、及び放射線を受けた患者に重篤で時には致死的な副作用をもたらすＧＩ症候群は、ｐ５３によって減少され、アポトーシスとは無関係であるため、ｃＧＭＰレベルの上昇は、ｐ５３が媒介する細胞生存を高めるのに十分でなければならない。
【００５４】
一方、細胞内ｃＧＭＰの増加は、肺、前立腺、乳房、結腸直腸、及び肝臓のがん細胞における細胞アポトーシスを促進することにより、化学療法または電離放射線による遺伝的傷害に応答してがん細胞死を増強する可能性もある。データは、ｃＧＭＰ、または標的臓器及びＧＩ管内のｃＧＭＰレベルの増加をもたらす細胞のプレコンディショニングが、ＧＩ管（正常な腸細胞）の損傷を防ぎながら、標的臓器における化学療法及び放射線療法（がん細胞を死滅させる）を増強することを示唆している。
【００５５】
ｃＧＭＰ産生を増加させる化合物及び／またはｃＧＭＰ分解若しくは細胞からの排出を阻害する化合物の使用は、ｃＧＭＰレベルの増加をもたらす。正常なＧＩ管に投与すると、ｃＧＭＰレベルの増加は、化学療法や放射線療法に伴う副作用に関連する細胞死から細胞を保護することにより、これらの治療法の安全性を高める。さらに、副作用の低減により、用量の増加及びより効果的な用量の許容が可能になる。肺癌、乳癌、前立腺癌、結腸直腸癌、肝臓癌等のがん細胞に送達されてｃＧＭＰレベルを上げると、がん細胞は化学療法及び放射線療法の影響を受けやすくなり、治療効果が高まる。
【００５６】
ｃＧＭＰ生成を増加させる化合物としては、３つの細胞受容体型グアニリルシクラーゼＡ（ＧＣＡ）、グアニリルシクラーゼＢ（ＧＣＢ）、グアニリルシクラーゼＣ（ＧＣＣ）、及び可溶性グアニリルシクラーゼ（ｓＧＣ）を含むグアニリルシクラーゼの活性剤が挙げられる。ｃＧＭＰの分解及び細胞からの排出を阻害する化合物としては、ｃＧＭＰの変換に関与するＰＤＥ型及びサブタイプを阻害するホスホジエステラーゼ酵素（ＰＤＥ）阻害剤が挙げられる。
【００５７】
細胞からｃＧＭＰの排出を阻害する化合物としては、ｃＧＭＰの輸送に関与するＭＲＰ形態及びサブタイプを阻害する多剤耐性タンパク質（ＭＲＰ）阻害剤が挙げられる。
【００５８】
これらの化合物を単独でまたは２以上の組み合わせで使用して、細胞内ｃＧＭＰレベルを高め、化学療法及び放射線療法の副作用に関連する細胞死から腸の細胞を保護し、がん細胞を細胞死により感受性にすることができる。
【００５９】
ＧＣＣ
ＧＣＣは、ＧＩ管の主要なグアニリルシクラーゼである。したがって、ＧＣＣ活性剤またはアゴニストの使用は、ＧＩ管における細胞内ｃＧＭＰを増加させるために特に効果的である。ＧＣＣ活性剤としては、内因性ペプチドグアニリン及びウログアニリンと並んで、Ｅ．ｃｏｌｉＳＴ等の細菌によって産生される熱安定性エンテロトキシンが挙げられる。ＰＤＥ阻害剤及びＭＲＰ阻害剤も知られている。幾つかの実施形態では、１つまたは複数のＧＣＣアゴニストが使用される。幾つかの実施形態では、１つまたは複数のＰＤＥ阻害剤が使用される。幾つかの実施形態では、１つまたは複数のＭＲＰ阻害剤が使用される。幾つかの実施形態では、１つまたは複数のＧＣＣアゴニスト及び／または１つまたは複数のＰＤＥ阻害剤及び／または１つまたは複数のＭＲＰ阻害剤の組み合わせが使用される。
【００６０】
主にＧＩ管で発現するタンパク質である、細胞内受容体グアニリルシクラーゼＣ（ＧＣＣ）の活性化は、有毒な化学療法または電離放射線による傷害に反応してＧＩ管内の細胞が死ぬのを防ぐ。ＧＣＣの活性化は、ｐ５３が媒介する細胞の生存を高めるｃＧＭＰの細胞内蓄積につながる。放射線及び化学療法によって引き起こされる多くの副作用は、ｐ５３が媒介する細胞の生存率を高めることで軽減され得る。ＧＣＣを活性化することにより、細胞内のｃＧＭＰレベルが増加し、かかる細胞が致死的で有毒な化学療法または電離放射線の傷害に曝されると、ｐ５３が媒介する細胞の生存が増強される。
【００６１】
ＧＣＣは、内因性パラクリンホルモンであるグアニリン及びウログアニリンの腸上皮細胞受容体である。下痢原性細菌の熱安定性エンテロトキシン（ＳＴ）もＧＣＣを標的としている。グアニリンまたはウログアニリンとＧＣＣの細胞外ドメインの間のホルモン受容体相互作用、またはペプチドエンテロトキシンＳＴとＧＣＣの細胞外ドメインの間のＳＴ受容体相互作用は、ＧＴＰを環状ＧＭＰ（ｃＧＭＰ）に変換するＧＣＣの細胞内触媒ドメインをそれぞれ活性化する。この環状ヌクレオチドは、セカンドメッセンジャーとして、ＧＣＣの細胞効果を媒介するその下流エフェクターを活性化する。グアニリルシクラーゼ（粒子状及び可溶型を含む）を活性化することによって、またはホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）若しくは多剤耐性関連タンパク質（ＭＲＰ）の阻害剤によるｃＧＭＰ分解または排出をそれぞれ阻害することにより、細胞内ｃＧＭＰを増加させると、ＤＮＡ損傷の修復が促進され、それによって順番に化学療法及び電離放射線の傷害に反応して正常な腸上皮細胞が死ぬのを防ぐ。
【００６２】
ＧＣＣの活性化に関連するこれらの増加等のｃＧＭＰレベルの増加は、毒性傷害後のｐ５３が媒介する細胞の生存を通じて腸細胞を保護する。したがって、患者が化学療法または放射線療法を受けている間、ｐ５３が媒介する細胞の生存によってＧＣＣ活性化腸細胞が化学療法及び放射線療法の典型的な副作用から保護されるように、ＧＣＣの活性化は化学療法及び放射線療法の前に影響を受ける可能性がある。ＧＣＣの活性化に加えて、化学療法及び放射線療法の間、腸管上皮細胞の保護は、ｃＧＭＰレベルをｐ５３が媒介する細胞の生存を高めるのに有効な量まで増加させることによって行うことができる。
【００６３】
放射線損傷、及び放射線を受けている患者に重度の、時には致死的な副作用をもたらすＧＩ症候群は、アポトーシスとは無関係であり、ｐ５３によって軽減できるため、ＧＣＣ活性化のレベルまたはその他のｃＧＭＰレベルの増加は、ｐ５３が媒介する細胞の生存を高めるのに十分でなければならない。
【００６４】
ＧＣＣアゴニストの投与は、ＧＣＣに結合して活性化する１つまたは複数の化合物の投与を指す。
グアニリルシクラーゼＣ（ＧＣＣ）は、大腸及び小腸の内側を覆う細胞によって発現される細胞受容体である。消化管でのＧＣＣへのＧＣＣアゴニストの結合は、ＧＣＣを活性化して細胞内ｃＧＭＰの増加につながり、その結果、下流のシグナル伝達事象の活性化をもたらすことが知られている。
【００６５】
ＧＣＣアゴニスト
ＧＣＣアゴニストが知られている。２つのネイティブＧＣＣアゴニストであるグアニリンとウログアニリンが確認されており（米国特許番号５．９６９．０９７及び同第５，４８９，６７０号を参照されたい）、これらはそれぞれ、引用することで本明細書の一部をなす。さらに、腸内病原体によって産生される幾つかの小さなペプチドは、下痢を引き起こす毒性物質である（引用することで本明細書の一部をなす、米国特許第５，５１８，８８８号を参照されたい）。最も一般的な病原体由来のＧＣＣアゴニストは、病原性Ｅ．ｃｏｌｉ株によって産生される熱安定性エンテロトキシンである。病原性Ｅ．ｃｏｌｉが産生するネイティブ熱安定性エンテロトキシンは、ＳＴとも称される。エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）及びエンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）を含む様々な他の病原性生物もまた、グアニリルシクラーゼＣにアゴニスト様式で結合できるエンテロトキシンを作り、自然界では、毒素は一般に、異なる種間で「ジャンプ」できるプラスミドにコードされている。幾つかの異なる毒素が異なる種で発生すると報告されている。これらの毒素はいずれも有意な配列相同性を有し、それらは全てＳＴ受容体に結合し、いずれもグアニリルシクラーゼを活性化して下痢を引き起こす。
【００６６】
ＳＴは、化学的手法によってクローン化され、合成されてきたクローン分子または合成分子は、ネイティブＳＴと同様の結合特性を示す。Ｅ．ｃｏｌｉから分離されたネイティブＳＴは、長さが１８個または１９個のアミノ酸である。活性を保持するＳＴの最小の「フラグメント」は、システイン６からシステイン１８（１９アミノ酸型）のカルボキシ末端に向かって伸びる１３アミノ酸コアペプチドである。ＳＴの類縁体は、クローニング及び化学的手法によって生成されている。結合活性を付与する構造決定因子を含むネイティブＳＴ構造の小さなペプチドフラグメントを構築することができる。ＳＴ受容体に結合する構造が特定されると、空間でその構造を模倣する非ペプチド類縁体が設計され、米国特許第５，１４０，１０２号及び同第７，０４１／７８６号、並びに米国特許出願公開第２００４／０２５８６８７号Ａ１及び同第２００５／０２８７０６７号Ａ１はまた、グアニリルシクラーゼＣに結合し、活性化することができる化合物に言及し、配列番号１は、引用することで本明細書の一部をなす、Ｓｏ  ａｎｄ  ＭｃＣａｒｔｈｙ（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４０１１によって報告された、ＳＴ  Ｉａと呼ばれる１９アミノ酸のＳＴをコードするヌクレオチド配列を開示する。
【００６７】
ＳＴ１ａのアミノ酸配列は、配列番号２に開示されている。
【００６８】
配列番号３は、引用することで本明細書の一部をなすＣｈａｎ  ａｎｄ  Ｇｉａｎｎｅｌｌａ（１９８１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：７７４４によって報告される、ＳＴＩ＊と表示される、ＳＴ活性を示す１８アミノ酸ペプチドのアミノ酸配列を開示する。
【００６９】
配列番号４は、引用することで本明細書の一部をなすＭｏｓｅｌｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３９：１１６７によって報告された、ＳＴ  Ｉｂと表示される１９アミノ酸のＳＴをコードするヌクレオチド配列を開示する。
【００７０】
ＳＴＩｂのアミノ酸配列は、配列番号５に開示されている。
【００７１】
ＳＴと約５０％の配列相同性を有するグアニリンと呼ばれる１５アミノ酸のペプチドが哺乳類の腸で同定された（引用することで本明細書の一部をなす、Ｃｕｒｒｉｅ，Ｍ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：９４７−９５１）。グアニリンはＳＴ受容体に結合し、グアニリルシクラーゼをネイティブＳＴよりも約１０倍〜１００倍低いレベルで活性化する。グアニリンは、腸において１５アミノ酸ペプチドとして存在するのではなく、その臓器のより大きなタンパク質の一部として存在する場合がある。齧歯類由来のグアニリンのアミノ酸配列は、配列番号６として開示されている。
【００７２】
配列番号７は、配列番号２の１８アミノ酸フラグメントである。配列番号８は、配列番号２の１７アミノ酸フラグメントである。配列番号９は、配列番号２の１６アミノ酸フラグメントである。配列番号１０は、配列番号２の１５アミノ酸のフラグメントである。配列番号１１は、配列番号２の１４アミノ酸のフラグメントである。配列番号１２は、配列番号２の１３アミノ酸フラグメントであり、配列番号１３は、配列番号２の１８アミノ酸フラグメントである。配列番号１４は、配列番号２の１７アミノ酸フラグメントである。配列番号１５は、配列番号２の１６アミノ酸フラグメントである。配列番号１６は、配列番号２の１５アミノ酸のフラグメントである。配列番号１７は、配列番号２の１４アミノ酸フラグメントである。
【００７３】
配列番号１８は、配列番号３の１７アミノ酸フラグメントである。配列番号１９は、配列番号３の１６アミノ酸フラグメントであり、配列番号２０は、配列番号３の１５アミノ酸フラグメントである。配列番号２１は、配列番号３の１４アミノ酸のフラグメントである。配列番号２２は、配列番号３の１３アミノ酸フラグメントである。配列番号２３は、配列番号３の１７アミノ酸フラグメントである。配列番号２４は、配列番号３の１６アミノ酸フラグメントである。配列番号２５は、配列番号３の１５アミノ酸フラグメントである。配列番号２６は、配列番号３の１４アミノ酸のフラグメントである。
【００７４】
配列番号２７は、配列番号５の１８アミノ酸フラグメントである。配列番号２８は、配列番号５の１７アミノ酸フラグメントである。配列番号２９は、配列番号５の１６アミノ酸フラグメントである。配列番号３０は、配列番号５の１５アミノ酸フラグメントである。配列番号３１は、配列番号５の１４アミノ酸フラグメントである。配列番号３２は、配列番号５の１３アミノ酸フラグメントである。配列番号３３は、配列番号５の１８アミノ酸フラグメントである。配列番号３４は、配列番号５の１７アミノ酸フラグメントである。配列番号３５は、配列番号５の１６アミノ酸フラグメントである。配列番号３６は、配列番号５の１５アミノ酸フラグメントである。配列番号３７は、配列番号５の１４アミノ酸フラグメントである。
【００７５】
配列番号２７、配列番号３１、配列番号３６及び配列番号３７は、引用することで本明細書の一部をなす、Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８５）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１８１：１３８に開示されている。
【００７６】
配列番号３の誘導体である配列番号３８、配列番号３９及び配列番号４０は、引用することで本明細書の一部をなす、Ｗａｌｄｍａｎ，Ｓ．Ａ．ａｎｄ  Ｏ’Ｈａｎｌｅｙ，Ｐ．（１９８９）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５７：２４２０。
【００７７】
配列番号３の誘導体である配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４及び配列番号４５は、引用することで本明細書の一部をなす、Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８５）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１８１：１３８に開示されている。
【００７８】
配列番号４６は、ＳＴ受容体に結合するＹ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ由来の２５アミノ酸ペプチドである。
【００７９】
配列番号４７は、ＳＴ受容体に結合するＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ由来の１６アミノ酸ペプチドである。配列番号４７は、引用することで本明細書の一部をなす、Ｓｈｉｍｏｎｉｓｈｉ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２１５：１６５に報告されている。
【００８０】
配列番号４８は、ＳＴ受容体に結合するＹ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ由来の１８アミノ酸ペプチドである。配列番号４８は、引用することで本明細書の一部をなす、Ｏｋａｍｏｔｏ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｆｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．５５：２１２１に報告されている。
【００８１】
配列番号４９は、配列番号５の誘導体である。
【００８２】
配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２及び配列番号５３は誘導体である。配列番号５４は、ヒト由来のグアニリンのアミノ酸配列である。
【００８３】
ウログアニリンと呼ばれる１５アミノ酸のペプチドは、哺乳類の腸でオポッサムから同定されている（引用することで本明細書の一部をなす、Ｈａｍｒａ，Ｓ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１０４６４−１０４６８；また、引用することで本明細書の一部をなす、Ｆｏｒｔｅ  Ｌ．ａｎｄ  Ｍ．Ｃｕｒｒｙ  １９９５  ＦＡＳＥＢ  ９：６４３−６５０も参照されたい）。配列番号５５は、オポッサム由来のウログアニリンのアミノ酸配列である。
【００８４】
ウログアニリンと呼ばれる１６アミノ酸ペプチドは、ヒトの哺乳類の腸で同定されている（引用することで本明細書の一部をなす、Ｋｉｔａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６６：Ｆ３４２−３４８；また、引用することで本明細書の一部をなす、Ｆｏｒｔｅ  Ｌ．ａｎｄ  Ｍ．Ｃｕｒｒｙ  １９９５  ＦＡＳＥＥＢ  ９：６４３−６５０も参照されたい）。配列番号５６は、ヒト由来のウログアニリンのアミノ酸配列である。
【００８５】
配列番号５７は、活性グアニリンへとプロセシングされるグアニリン前駆体であるプログアニリンのアミノ酸配列である。
【００８６】
配列番号５８は、活性型ウログアニリンへとプロセシングされるウログアニリン前駆体であるプロウログアニリンのアミノ酸配列である。
【００８７】
米国で最近承認された２つの製品、リナクロチド（配列番号５９）及びプレカナチド（配列番号６０）は、本明細書に述べる方法でＧＣＣアゴニストとして使用され得る。
【００８８】
プログアニリン及びプロウログアニリンは、それぞれ成熟グアニリン及び成熟ウログアニリンの前駆体であるが、それらが成熟ペプチドへとプロセシングされ得るように送達されるならば、本明細書に記載されるようにＧＣＣアゴニストとして使用することができる。
【００８９】
引用することで本明細書の一部をなす、米国特許第５，１４０，１０２号、同第７，０４１，７８６号及び同第７，３０４，０３６号、並びに米国特許出願公開第２００４／０２５８６８７号、同第２００５／０２８７０６７号、同第２００７００１０４５０号、同第２００４０２６６９８９号、同第２００６０２８１６８２号、同第２００６０２５８５９３号、同第２００６００９４６５８号、同第２００８００２５９６６、２００３００７３６２８号、同第２００４０１２１９６１号及び同第２００４０１５２８６８号もまた、グアニリルシクラーゼＣに結合して活性化する可能性のある化合物に言及する。
【００９０】
ヒトグアニリン及びヒトウログアニリンに加えて、グアニリンまたはウログアニリンは、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウサギ、バイソン等の他の種から単離または他の方法で得ることができる。かかるグアニリンまたはウログアニリンは、ヒトを含む個体に投与され得る。
【００９１】
ＧＣＣ結合抗体フラグメントを含む抗体もＧＣＣアゴニストであり得る。抗体には、例えば、キメラ抗体、霊長類化抗体、ヒト化抗体、またはヒトモノクローナル抗体を含むポリクローナル及びモノクローナルの抗体と並んで、ＣＤＲ、ＦＡｂ、Ｆ（Ａｂ）、一本鎖Ｆｖ等を含むＦｖ’等のアゴニスト活性を有するＧＣＣに結合する抗体フラグメントが含まれ得る。抗体は、例えばＩｇＥ、ＩｇＡまたはＩｇＭであってもよい。
【００９２】
腸細胞死によって引き起こされる副作用を減らすために、ＧＣＣアゴニストは、かかるＧＣＣアゴニストの経口送達によって結腸直腸路に送達される。例えば、ＳＴペプチド及び内因性ＧＣＣアゴニストペプチドは安定であり、胃酸を生き延びて、小腸を通過して結腸直腸に到達する。ＧＣＣアゴニストが大腸のそれらの細胞にもｃＧＭＰの蓄積を誘導するのに十分な量で大腸に到達することを保証するのに十分な投与量が提供される。
【００９３】
例えばＳＴ、グアニリン及びウログアニリン等のＧＣＣアゴニストは、胃環境を生き延びることができる。したがって、ＧＣＣアゴニストは、胃酸に対するコーティングまたは保護なしで投与され得る。しかしながら、経口投与されるＧＣＣアゴニストの放出をより正確に制御するために、ＧＣＣアゴニストの一部または全部が胃を通過した後に放出されるように、ＧＣＣアゴニストを腸溶コーティングしてもよい。かかる腸溶性コーティングはまた、コーティングされたＧＣＣアゴニストが腸を通過する期間にわたってＧＣＣアゴニストの徐放または延長放出を提供するように設計され得る。幾つかの実施形態では、ＧＣＣアゴニストは、大腸に入る際の幾つかの化合物の放出を確実にするように処方され得る。幾つかの実施形態では、ＧＣＣアゴニストは直腸送達され得る。
【００９４】
ほとんどの腸溶性コーティングは、胃酸から内容物を保護することを目的としている。したがって、それらは、胃を通過すると活性剤を放出するように設計されている。本明細書で使用されるコーティング及びカプセル化は、ＧＣＣアゴニスト濃度をより長期間有効なレベルに維持できるように、好ましくは長期間にわたって小腸でＧＣＣアゴニストの放出を開始するために提供される。
【００９５】
幾つかの実施形態によれば、ＧＣＣアゴニストは、コーティング物質がＧＣＣアゴニストを溶解して放出するのに必要な時間が、口から腸までコーティングされたまたはカプセル化された組成物に必要な時間に対応する、十分な量のコーティング材料により被覆またはカプセル化される。
【００９６】
幾つかの実施形態によれば、ＧＣＣアゴニストは、小腸に存在する条件に接触するまでＧＣＣアゴニストを完全に溶解及び放出しないコーティング材料でコーティングまたはカプセル化されている。かかる状態には、結腸直腸経路における酵素の存在、ｐＨ、等張性、または胃と比べて変化する他の状態が含まれ得る。
【００９７】
幾つかの実施形態によれば、ＧＣＣアゴニストは、胃から小腸、大腸に通過するときに段階的に溶解するように設計されたコーティング材料でコーティングまたはカプセル化される。
【００９８】
幾つかの実施形態によれば、ＧＣＣアゴニストは、ＧＣＣアゴニストが分子実体との複合体形成をやめて、活性型で存在するまでそれらが不活性になるように、別の分子実体と複合体化される。かかる実施形態では、ＧＣＣアゴニストは、結腸直腸経路で活性ＧＣＣアゴニストにプロセシングされるようになる「プロドラッグ」として投与される。
【００９９】
経口投与された場合に徐放性のＧＣＣアゴニストを製剤化するため使用され得る技術の例としては、限定されないが、米国特許第５，００７，７９０号、同第４，４５１，２６０号、同第４，１３２，７５３号、同第５，４０７，６８６号、同第５，２１３，８１１号、同第４，７７７，０３３号、同第５，５１２，２９３号、同第５，０４７，２４８号及び同第５，８８５，６１６号が挙げられる。
【０１００】
投与されたときに大腸特異的放出のためのＧＣＣアゴニストまたは誘導物質を製剤化するために使用され得る技術の例としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ａｌｌｗｏｏｄ，ｅｔ  ａｌに１９９２年４月２８日付で発行された、延放出製剤を開示する、米国特許第５，１０８，７５８号；Ｓｅｋｉｇａｗａ，ｅｔ  ａｌ．に１９９３年６月８日付けで発行された、大腸での放出性を有する被覆された固形医薬剤形を開示する、米国特許第５，２１７，７２０号；Ｒｈｏｄｅｓ，ｅｔ  ａｌ．に１９９６年７月３０日付で発行された、経口投与可能な医薬組成物を開示する、米国特許第５，５４１，１７１号；Ｂａｕｅｒ，ｅｔ  ａｌ．に１９９７年１１月１８日付で発行された、架橋多糖類、それらの調製方法及びそれらの使用を開示する、米国特許第５，６８８，７７６号；Ｍａｎｉａｒ，ｅｔ  ａｌ．に１９９８年１２月８日付で発行された、経口投与のための保護された生体高分子及びその使用方法を開示する、米国特許第５，８４６，５２５号；Ｂｏｌｏｎｉｃｋ，ｅｔ  ａｌ．に１９９９年１月２６日付けで発行された、胃腸管の慢性炎症性疾患の治療を開示する、米国特許第５，８６３，９１０号；Ｖａｇｈｅｆｉ，ｅｔ  ａｌ．に２００５年２月１日付で発行された、マイクロカプセルマトリクスミクロスフェア、吸収促進医薬組成物及び方法を開示する米国特許Ｎｏ．６，８４９，２７１号；Ｋｕｄｏ，ｅｔ  ａｌに２００５年１２月６日付けで発行された、下部消化管での放出システムを開示する、米国特許第６，９７２，１３２号；Ｍｕｋａｉ，ｅｔ  ａｌ．に２００６年１１月２１日付けで発行された、下部消化管に可溶なコーティングされた製剤を開示する、米国特許第７，１３８，１４３号；米国特許第６，３０９，６６６号；米国特許第６，５６９，４６３号、米国特許第６，２１４，３７８号；米国特許第６，２４８，３６３号：米国特許第６，４５８，３８３号、米国特許第６，５３１，１５２号、米国特許第５，５７６，０２０号、米国特許第５，６５４，００４号、米国特許第５，２９４，４４８号、米国特許第６，３０９，６６３号、米国特許第５，５２５，６３４号、米国特許第６，２４８，３６２号、米国特許第５，８４３，４７９号、及び米国特許第５，６１４，２２０号、これらはそれぞれ引用することで本明細書の一部をなす。
【０１０１】
幾つかの実施形態では、有効量は、ｃＧＭＰの十分な蓄積が起こるように送達される。幾つかの実施形態では、有効量は、少なくとも２時間にわたって送達される。幾つかの実施形態では、有効量は、最大１２時間〜数日間存在する。複数用量を投与して、遊離またはＧＣＣに結合したいずれかの存在するＧＣＣアゴニストの量が有効用量以上であるようにレベルを維持することができ、幾つかの実施形態では、腸の細胞が放射線及び化学療法によって誘発される細胞死から保護されるようになるために、初期負荷量及び／または複数回投与が必要である。ＧＣＣアゴニストに曝露された細胞が放射線及び化学療法により誘発される細胞死に対して抵抗性となった後、場合によっては、ＧＣＣアゴニストで前処理されていない患者が許容できるよりもはるかに高い用量で放射線または化学療法剤が適用されてもよい。
【０１０２】
幾つかの実施形態では、ペプチドであるＧＣＣアゴニストは、４時間〜４８時間ごとに１００μｇ〜１グラムの範囲の量で投与され得る。幾つかの実施形態では、ＧＣＣアゴニストは、４時間〜４８時間ごとに１ｍｇ〜７５０ｍｇの範囲の量で投与される。幾つかの実施形態では、ＧＣＣアゴニストは、４時間〜４８時間ごとに１０ｍｇ〜５００ラグの範囲の量で投与される。幾つかの実施形態では、ＧＣＣアゴニストは、４時間〜４８時間ごとに５０ｍｇ〜２５０ｍｇの範囲の量で投与される。幾つかの実施形態では、ＧＣＣアゴニストは、４時間〜４８時間ごとに７５ｍｇ〜１５０ｍｇの範囲の量で投与される。
【０１０３】
幾つかの実施形態では、用量は４時間以上ごとに投与される。幾つかの実施形態では、用量は６時間以上ごとに投与される。幾つかの実施形態では、用量は８時間以上ごとに投与される。幾つかの実施形態では、用量は１２時間以上毎に投与される。幾つかの実施形態では、用量は２４時間以上ごとに投与される。幾つかの実施形態では、用量は、４８時間以上ごとに投与される。幾つかの実施形態では、用量は４時間以下ごとに投与される。幾つかの実施形態では、用量は６時間以下ごとに投与される。幾つかの実施形態では、用量は８時間以下ごとに投与される。幾つかの実施形態では、用量は１２時間以下でさえ投与される。幾つかの実施形態では、用量は、２４時間以下ごとに投与される。幾つかの実施形態では、用量は、４８時間以下ごとに投与される。
【０１０４】
幾つかの実施形態では、下痢または腹痛発作／腸管収縮の増加した運動性を最小限にするために、添加剤または補助剤がＧＣＣアゴニストと組み合わせて投与される。例えば、個体には、下痢を緩和する化合物を投与する前、それと同時またはその後に化合物を投与することができる。かかる止痢成分が、製剤に組み込まれてもよい。ロペラミド、次サリチル酸ビスマス等の止痢化合物及び調剤、並びにＬａｃｔｏｂａｃｃｉｌｕｓ菌株等のプロバイオティック処理はよく知られており、広く利用可能である。
【０１０５】
本発明の幾つかの態様によれば、通常は結腸に生息する種の無害な細菌に、結腸でグアニリルシクラーゼＣアゴニストを生成するために必要な遺伝情報が提供され、かかるグアニリルシクラーゼＣアゴニストを利用して結腸細胞に対してグアニリルシクラーゼＣを活性化する効果をもたらす。グアニリルシクラーゼＣアゴニストを産生することができる細菌の集団の存在は、グアニリルシクラーゼＣアゴニストの連続投与を提供する。幾つかの実施形態では、グアニリルシクラーゼＣアゴニストをコードする核酸配列は、誘導性プロモータの制御下にあり得る。したがって、個体は、誘導物質が摂取されているかどうかに応じて、発現をオンまたはオフにすることができる。幾つかの実施形態では、誘導物質は、結腸で特異的に放出されるように製剤化されることにより、小腸等の他の部位に生息している可能性がある細菌による発現の誘導を防止する。幾つかの実施形態では、細菌は、特定の薬物または栄養要求性に感受性であり、そのため、薬物の投与または必須のサプリメントを差し控えることによって細菌を排除することができる。
【０１０６】
発現可能な形態の遺伝子を細菌に導入する技術はよく知られており、必要な材料は広く利用可能である。
【０１０７】
幾つかの実施形態では、ＧＣＣアゴニストのコード配列を含む細菌は、個体の腸管に一般的に生息する種の細菌であり得る。一般的な腸内フローラには、バクテロイデス属、クロストリジウム属、フソバクテリウム属、ユーバクテリウム属、ルミノコッカス属、ペプトコッカス属、ペプトストレプトコッカス属、ビフィズス菌、エシェリヒア属、及びラクトバチルス属の種が含まれる。幾つかの実施形態では、選択される細菌は、プロバイオティクスとして有用であることが知られている株に由来する。ヒトへの投与のための組成物として使用される細菌の種の例としては、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ、及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉが挙げられる。その他の種としては、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｉｆｉｄｕｓ等が挙げられる。ヒトへの投与のための組成物として使用される細菌株の例としては、以下が挙げられる：Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ  ３５６２４、（Ａｌｉｇｎ）；ラクトバチルス・プランタラム２９９Ｖ；ビフィドバクテリウム・アニマリスＤＮ−１７３  ０１０；ビフィドバクテリウム・アニマリスＤＮ  １７３  ０１０（Ａｃｔｉｖｉａ  Ｄａｎｏｎｅ）；ビフィドバクテリウム・アニマリス亜属ラクティスＢＢ−１２（Ｃｈｒ．Ｈａｎｓｅｎ）；ビフィドバクテリウム・ブレヴェＹａｋｕｌｔ  Ｂｉｆｉｅｎｅ  Ｙａｋｕｌｔ；ビフィドバクテリウム・インファンティス３５６２４  ビフィドバクテリウム・ラクティスＨＮ０１９（ＤＲ１０）Ｈｏｗａｒｄ（商標）Ｂｉｆｉｄｏ  Ｄａｎｉｓｃｏ；ビフィドバクテリウム・ロンガムＢＢ５３６；エシェリキア・コリＮｉｓｓｌｅ  １９１７；ラクトバチルス・アシドフィルスＬＡ−５  Ｃｈｒ。ハンセン：ラクトバチルス・アシドフィルス  ＮＣＦＭ  Ｒｈｏｄｉａ  Ｉｎｃ．；ラクトバチルス・カゼイＤＮ１１４−００１；ラクトバチルス・カゼイＣＲＬ４３１  Ｃｈｒ。ハンセン；ラクトバチルス・カゼイＦ１９  Ｃｕｌｔｕｒａ  Ａｒｌａ  Ｆｏｏｄｓ；ラクトバチルス・カゼイＳｈｉｒｏｔａ  Ｙａｋｕｌｔ；ラクトバチルス・カゼイｉｍｍｕｎｉｔａｓｓ  Ａｃｔｉｍｅｌ  Ｄａｎｏｎｅ；ラクトバチルス・ジョンソニＬａｌ（＝ラクトバチルス・ＬＣ１）Ｎｅｓｔｌｅ；ラクトバチルス・プランタラム２９９Ｖ  ＦｒｏＶｉｖａ  Ｐｒｏｂｉ  ＩＢＳ；ラクトバチルス・ロイテリＡＴＴＣ  ５５７３０  ＢｉｏＧａｉａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ；ラクトバチルス・ロイテリＳＤ２１１２；ラクトバチルス・ラムノーサスＡＴＣＣ  ５３０１３  Ｖｉｆｉｔ及び他のＶａｌｉｏ；ラクトバチルス・ラムノーサスＬＢ２１  Ｖｅｒｕｍ  Ｎｏｒｒｍｅｊｅｒｉｅｒ；ラクトバチルス・サリバリウスＵＣＣ１１８；ラクトコッカス・ラクティスＬ１Ａ  Ｖｅｒｕｍ  Ｎｏｒｒｍｅｊｅｒｉｅｒ；サッカロミセス・セレビジエ（ボウファルディ）ｌｙｏ；ストレプトコッカス・サリバリウ���亜種サーモフィルス：ラクトバチルス・ラムノーサスＧＲ−ｌ：ラクトバチルス・ロイテリＲＣ−１４；ラクトバチルス・アシドフィルスＣＵＬ６０；ビフィドバクテリウム・ビフィダムＣＵＬ  ２０；ラクトバチルス・ヘルベティカスＲ００５２；及びラクトバチルス・ラムノーサスＲ００１１。
【０１０８】
引用することで本明細書の一部をなす以下の米国特許は、個体に投与され得る非病原性細菌を開示している。米国特許番号６，２００，６０９；米国特許第６，５２４，５７４号、米国特許第６，８４１，１４９号、米国特許第６，８７８，３７３号、米国特許第７，０１８，６２９号、米国特許第７，１０１，５６５号、米国特許第７，１２２，３７０号、米国特許第７，１７２，７７７号、米国特許第７，１８６，５４５号、米国特許第７，１９２，５８１号、米国特許第７，１９５，９０６号、米国特許第７，２２９，８１８号、及び米国特許第７，２４４，４２４号。
【０１０９】
したがって、本発明の態様である細菌は最初に、誘導性プロモータをオンにする誘導物質の存在によって構成的にまたは誘導の際に、細菌内のアゴニストペプチドの発現を可能にし得る形態のＧＣＣアゴニストをコードする遺伝物質が提供される。
【０１１０】
幾つかの実施形態は、誘導性プロモータ等の誘導性調節要素を含む。典型的には、誘導性プロモータは、存在する場合、薬剤がプロモータと相互作用して、プロモータに作動可能に連結されたコード配列の発現が進行するプロモータである。あるいは、誘導性プロモータは、プロモータと相互作用し、そしてプロモータに作動可能に連結されたコード配列の発現を妨げる因子であるリプレッサーを含み得る。リプレッサーの除去は、プロモータに機能性に連結されたコード配列の発現をもたらす。
【０１１１】
誘導性プロモータを誘導する物質は、好ましくは、導入遺伝子の発現が求められる生物には天然には存在しない。したがって、導入遺伝子は、生物が誘導剤に積極的に曝露された場合にのみ発現される。したがって、誘導性プロモータに作動可能に連結された導入遺伝子を含む細菌において、細菌が個体の腸内に生息している場合、プロモータがオンにされ得て、個体が誘導剤を摂取するときに導入遺伝子が発現され得る。
【０１１２】
誘導性プロモータを誘導する薬剤は、好ましくは毒性がない。したがって、誘導性プロモータに制御可能に連結された導入遺伝子を含む細菌において、誘導剤は、細菌がその腸内に生息している個体に対して毒性がなく、その結果、個体が誘導剤を摂取して導入遺伝子の発現をオンにするとき、誘導剤の用量は、個体に深刻な毒性の副作用はないことが好ましい。
【０１１３】
誘導性プロモータを誘導する薬剤は、好ましくは、目的の遺伝子の発現のみに影響を与える。したがって、誘導性プロモータに制御可能に連結された導入遺伝子を含む細菌において、誘導剤は、個体における他の遺伝子の発現に顕著な影響を及ぼさない。
【０１１４】
誘導性プロモータを誘導する薬剤は、好ましくは適用または除去が容易である。したがって、個体の腸内に生息する誘導性プロモータに機能性に連結された導入遺伝子を含む細菌において、誘導剤は、好ましくは、容易に腸に送達され得て、例えば、積極的中和により、または遺伝子発現を制御できるように代謝／通過により、除去され得る物質である。
【０１１５】
誘導性プロモータを誘導する薬剤は、好ましくは、高いまたは非常に低い遺伝子発現のいずれかの明確に検出可能な発現パターンを誘導する。
【０１１６】
幾つかの好ましい実施形態では、化学的に調節されたプロモータは、その作用が必要とされる生物への進化において遠い生物に由来する。
【０１１７】
誘導可能なまたは化学的に調節されたプロモータの例としては、テトラサイクリン調節プロモータが挙げられる。テトラサイクリン応答性プロモータ系は、テトラサイクリンの存在下で遺伝子発現系を活性化または抑制するように機能することができる。システムの幾つかの要素には、テトラサイクリンリプレッサータンパク質（ＴｅｔＲ）、テトラサイクリンオペレータシーケンス（ｔｅｔＯ）、及びＴｅｔＲと単純ヘルペスウイルスタンパク質１６（ＶＰ  １６）活性化配列の融合であるテトラサイクリントランス活性化因子融合タンパク質（ｔＴＡ）が含まれる。テトラサイクリン耐性オペロンは、エシェリキア・コリトランスポゾン（Ｔｎ）１０によって運ばれる。このオペロンは、ネガティブモードの操作を有する。オペロンによってコードされるリプレッサータンパク質、ＴｅｔＲ、及びそれが結合するＤＮＡ配列、ｔｅｔオペレータ（ｔｅｔＯ）間の相互作用は、オペレータの近くに配置されたプロモータの活性を抑制する。誘導物質が存在しない場合、ＴｅｔＲはｔｅｔＯに結合し、転写を妨げる。転写は、テトラサイクリン等の誘導物質がＴｅｔＲに干渉し、ＴｅｔＲがオペレータに結合したままになることを妨げる立体構造の変化を引き起こす場合にオンにすることができる。オペレータの部位が結合されていない場合、プロモータの活動が回復される。抗生物質であるテトラサイクリンは、誘導性プロモータに２つの有益な強化をもたらすために使用れている。１つの機能強化は、誘導性のオンまたはオフプロモータである。研究者らは、Ｔｅｔが追加されるまでプロモータを常にアクティブにするか、Ｔｅｔが追加されるまでプロモータを常に非アクティブにするかを選択することができる。これはＴｅｔオン／オフプロモータである。２つ目の機能強化は、プロモータの強度を調節する機能である。Ｔｅｔを追加するほど効果が強くなる。
【０１１８】
誘導可能なまたは化学的に調節されたプロモータの例としては、ステロイド調節プロモータが挙げられる。ステロイド応答性プロモータは、遺伝子発現の調節のために提供されており、ラットのグルココルチコイド受容体（ＧＲ）に基づくプロモータ；ヒトエストロゲン受容体（ＥＲ）；異なる蛾の種に由来するエクジソン受容体；ステロイド／レチノイド／甲状腺受容体スーパーファミリーのプロモータが挙げられる。ＧＲ及び他のステロイド受容体のホルモン結合ドメイン（ＨＢＤ）を使用して、シスで異種タンパク質を調節することもでき、つまり、作用するタンパク質コード配列に制御可能に連結されている。したがって、ＧＲのＨＢＤ、エストロゲン受容体（ＥＲ）、及び昆虫のエクジソン受容体は、比較的厳密な制御及び高い誘導性を示している。
【０１１９】
誘導性または化学的に調節されたプロモータの例としては、金属調節プロモータが挙げられる。酵母、マウス、及びヒトのメタロチオネイン（金属イオンを結合及び捕捉するタンパク質）遺伝子に由来するプロモータは、金属の存在が遺伝子発現を誘導するプロモータの例である。
【０１２０】
ＩＰＴＧは、プロモータを活性化するために細胞に添加される化合物の典型的な例である。ＩＰＴＧを細胞に追加して下流の遺伝子を活性化するか、または除去して遺伝子を不活性化することができる。
【０１２１】
引用することで本明細書の一部をなす、米国特許第６，１８０，３９１号は、銅誘導性プロモータに言及している。
【０１２２】
引用することで本明細書の一部をなす、米国特許第６，９４３，０２８号は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける外因性遺伝子の非常に効率的な制御された発現に言及している。
【０１２３】
引用することで本明細書の一部をなす、米国特許第６，１８０，３６７号は、ポリペプチドの細菌による産生のためのプロセスに言及している。
【０１２４】
細菌宿主での使用に適した誘導性プロモータの他の例としては、β−ラクタマーゼ及びラクトースプロモータ系（引用することで本明細書の一部をなす、Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２７５：６１５（１９７８）；引用することで本明細書の一部をなす、Ｇｏｅｄｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２８１：５４４（１９７９））、ａｒａＢＡＤプロモータを含むアラビノースプロモータ系（Ｇｕｚｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７４：７７１６−７７２８（１９９２）、引用することで本明細書の一部をなす；引用することで本明細書の一部をなす、Ｇｕｚｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７７：４１２１−４１３０（１９９５）；引用することで本明細書の一部をなす、Ｓｉｅｇｅｌｅ  ａｎｄ  Ｈｕ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：８１６８−８１７２（１９９７））、ラムノースプロモータ（Ｈａｌｄｉｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ，１８０：１２７７−１２８６（１９９８）、引用することで本明細書の一部をなす）、アルカリホスファターゼプロモータ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモータ系（Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，８：４０５７（１９８０）、引用することで本明細書の一部をなす）、Ｐ  ＬｔｅｔＯ−１及びＰ  ｌａｃ／ａｒｅ−１プロモータ（Ｌｕｔｚ  ａｎｄ  Ｂｕｊａｒｄ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５；１２０３−１２１０（１９９７）、引用することで本明細書の一部をなす）、並びに、ｔａｃプロモータのようなハイブリッドプロモータ、引用することで本明細書の一部をなす、ｄｅＢｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０：２１−２５（１９８３）が挙げられる。しかしながら、他の既知の細菌誘導性プロモータ及び低基礎発現（ｌｏｗ−ｂａｓａｌ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）プロモータが適している。
【０１２５】
引用することで本明細書の一部をなす、米国特許第６，０８３，７１５号は、細菌細胞において異種ジスルフィド結合含有ポリペプチドを生成するための方法に言及している。
【０１２６】
引用することで本明細書の一部をなす、米国特許第５，８３０，７２０号は、外来遺伝子の抑制可能かつ誘導可能な発現のための組換えＤＮＡ及び発現ベクターに言及している。
【０１２７】
引用することで本明細書の一部をなす、米国特許第５，７８９，１９９号は、ポリペプチドの細菌による産生のためのプロセスに言及している。
【０１２８】
引用することで本明細書の一部をなす、米国特許第５，０８５，５８８号は、植物抽出物により誘導可能な細菌プロモータに言及している。
【０１２９】
引用することで本明細書の一部をなす、米国特許第６，２４２，１９４号は、被験体に経口投与することができる、本発明のプロモータと制御可能に関連する目的のＤＮＡを含むプロバイオティック細菌宿主細胞に言及している。
【０１３０】
引用することで本明細書の一部をなす、米国特許第５，３６４，７８０号は、誘導性プロモータによる遺伝子発現の外部調節に言及している。
【０１３１】
引用することで本明細書の一部をなす、米国特許第５，６３９，６３５号は、ポリペプチドの細菌による産生のためのプロセスに言及している。
【０１３２】
引用することで本明細書の一部をなす、米国特許第５，７８９，１９９号は、ポリペプチドの細菌による産生のためのプロセスに言及している。
【０１３３】
引用することで本明細書の一部をなす、米国特許第５，６８９，０４４号は、植物ＰＲ−１遺伝子の化学的に誘導可能なプロモータに言及している。
【０１３４】
引用することで本明細書の一部をなす、米国特許第５，０６３，１５４号は、フェロモン誘導性酵母プロモータに言及している。
【０１３５】
引用することで本明細書の一部をなす、米国特許第５，６５８，５６５号は、誘導性一酸化窒素シンターゼ遺伝子に言及している。
【０１３６】
米国特許第５，５８９，３９２号、同第６，００２，０６９号、同第５，６９３，５３１号、同第５，４８０，７９４号、同第６，１７１，８１６、同第６，５４１，２２４号、同第６，４９５，３１８号、５，４９８，５３８号、同第５，７４７，２８１号、同第６，６３５，４８２号及び同第５，３６４，７８０号は、それぞれ引用することで本明細書の一部をなし、それぞれＩＰＴＧ誘導性プロモータに言及している。
【０１３７】
米国特許第６，４２０，１７０号、同第５，６５４，１６８号、同第５，９１２，４１１号、同第５，８９１，７１８号、同第６，１３３，０２７号、同第５，７３９，０１８号、同第６，１３６，９５４号、同第６，２５８，５９５号、同第６，００２，０６９号及び同第６，０２５，５４３号は、それぞれテトラサイクリン誘導性プロモータに言及している。
【０１３８】
グアニリルシクラーゼＡ（ＧＣＡ）アゴニスト（ＡＮＰ、ＢＮＰ）
グアニリルシクラーゼＡ／ナトリウム利尿ペプチド受容体Ａ（ＧＣＡ）は、腎及び心血管の恒常性の維持に関与する細胞性タンパク質である。ＧＣＡは、腎臓の細胞に見られる受容体であり、心臓で作られた２つのペプチドに結合して活性化される。心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ、心臓心房性ナトリウム利尿ペプチドとも呼ばれる）はｐｒｏ−ＡＮＰとして心臓に保存され、放出されると、成熟したＡＮＰに処理される。Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ、脳性ナトリウム利尿ペプチドとも呼ばれる）も心臓で産生される。ＡＮＰまたはＢＮＰがＧＣＡに結合すると、ＧＣＡ発現細胞はセカンドメッセンジャーとしてｃＧＭＰを産生する。したがって、ＡＮＰ及びＢＮＰは、ＧＣＡを活性化し、ＧＣＡを発現する細胞におけるｃＧＭＰの蓄積をもたらすＧＣＡアゴニストである。
【０１３９】
ＧＣＡアゴニストであるＡＮＰ類縁体は、Ｓｃｈｉｌｌｅｒ  ＰＷ，ｅｔ  ａｔ．Ｓｕｐｅｒａｃｔｉｖｅ  ａｎａｌｏｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｔｒｉａｌ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ（ＡＮＰ），Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．１９８７  Ｍａｒ  １３；１４３（２）：４９９−５０５；Ｓｃｈｉｌｌｅｒ  ＰＷ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｏｆ  ａｔｒｉａｌ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ（ＡＮＰ）ａｎａｌｏｇｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｒｉｎｇ  ｓｉｚｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．１９８６  Ｊｕｌ  ３１；１３８（２）：８８０−６；Ｇｏｇｈａｒｉ  ＭＨ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｏｆ  ａｔｒｉａｌ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｆａｃｔｏｒ（ＡＮＦ）ａｎａｌｏｇｓ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．１９９０  Ａｕｇ；３６（２）：１５６−６０；Ｂｏｖｙ  ＰＲ，ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｌｉｎｅａｒ  ｄｅｃａｐｅｐｔｉｄｅ  ｂｉｎｄｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ａｔｒｉａｌ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓ  ｃｙｃｌａｓｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｖａｓｏｒｅｌａｘａｎｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｇｈｅｍ  １９８９  Ｄｅｃ  ５；２６４（３４）：２０３０９−１３、及びＳｃｈｏｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  Ｊａｎｕａｒｙ  １９９５  ｖｏｌ．４７  ｎｏ．１  １７２−１８０に開示されている。
【０１４０】
グアニリルシクラーゼＢ（ＧＣＢ）アゴニスト（ＣＮＰ）
グアニリルシクラーゼＢ（ＧＣＢ）は、ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｂ、アトリオンナトリウム利尿ペプチド受容体Ｂ及びＮＰＲ２とも呼ばれる。ＧＣＢは、多くの異なる組織で局所的に産生される小さなペプチド（Ｃタイプナトリウム利尿ペプチド）の受容体である。ＧＣＡの発現は、腎臓、卵巣細胞、大動脈、軟骨細胞、海綿体、松果体等で報告されている。
【０１４１】
ＧＣＢはＡＮＰ及びＢＮＰに結合して活性化されると報告されているが、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ：Ｃ−ｔｙｐｅ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ）はＧＣＢの最も強力な活性物質である。ＡＮＰ、ＢＮＰ及びＣＮＰはＧＣＢアゴニストである。米国特許第５，４３４，１３３号及びフＦｕｒｕｙａ，Ｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｖｏｌｕｍｅ  １８３，Ｉｓｓｕｅ  ３，３１  Ｍａｒｃｈ  １９９２，Ｐａｇｅｓ  ９６４−９６９は、ＣＮＰアナログを開示している。
【０１４２】
可溶性グアニリルシクラーゼ活性物質（一酸化窒素、ニトロ血管拡張剤、プロトプロフィリンＩＸ、及び直接活性物質）
可溶性グアニリルシクラーゼ（ｓＧＣ）は、シクラーゼ活性を有するＣ末端領域を持つアルファドメインと、シクラーゼ活性を有するＣ末端領域を持つヘム結合ベータドメインとで構成されるヘテロ二量体タンパク質である。一酸化窒素の唯一の既知の受容体であるｓＧＣは、１つの二量体（ｄｉｍｍｅｒ）当たり１つのヘムを持つ。Ｆｅ（ＩＩ）形のヘム部分はＮＯの標的である。ＮＯ結合はｓＧＣの活性化、すなわちｓＧＣ活性の実質的な増加をもたらす。ｓＧＣの活性化は血管拡張に関与している。
【０１４３】
５−［１−（フェニルメチル）−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−２−フランメタノールであるＹＣ−１は、可溶性グアニリルシクラーゼの一酸化窒素（ＮＯ）に依存しない活性剤である。Ｋｏ  ＦＮ  ｅｔ  ａｌ．ＹＣ−１，ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｇｕａｎｙｌａｔｅ  ｃｙｃｌａｓｅ．Ｂｌｏｏｄ．１９９４  Ｄｅｃ  １５；８４（１２）：４２２６−３３。
ｓＧＣを活性化する２つの薬物はシナキグアト（４−（｛（４−カルボキシブチル）［２−（２−｛［４−（２−フェニルエチル）フェニル］メトキシ｝フェニル）エチル］アミノ｝安息香酸）ＷＯ−０１１９７８０  ７，０８７，６４４、７，５１７，８９６  ＷＯ  ２０００８００３４１４  ＷＯ  ２００８１４８４７４及びリオシグアト、（メチルＮ−［４，６−ジアミノ−２−［１−［（２−フルオロフェニル）メチル］−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル］−５−（ピリミジニル）−Ｎ−メチル−カルバメート）ＷＯ−０３０９５４５１、これは米国でＵＳ−０７１７３０３７として認可されている。
【０１４４】
ｓＧＣ活性物質の他の例としては、３−（５’−ヒドロキシメチル−２’−フリル）−１−ベンジルインダゾール（ＹＣ−１、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８４（１９９４），４２２６；Ｍｕｌｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１２０（１９９７），６８１），ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ，Ｃｈｅｍ，２５２（１９７７），１２７９）、ジフェニルヨードニウムヘキサフルオロホスフェー（Ｐｅｔｔｉｂｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，１１６（１９８５），３０７）、イソリキリチゲニン（Ｙｕ  ｅｔ．ａｌ．，Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１１４（１９９５），１５８７）及び様々な置換ピラゾール誘導体（国際公開第９８／１６２２３号）が挙げられる。さらに、国際公開第９８／１６５０７号、国際公開第９８／２３６１９号、国際公開第００／０６５６７号、国際公開第００／０６５６８号、国際公開第００／０６５６９、号、国際公開第００／２１９５４号、国際公開第０２／４２２９９号、国際公開第０２／４２３００号、国際公開第０２／４２３０１号、国際公開第０２／４２３０２号、国際公開第０２／０９２５９６号、及び国際公開第０３／００４５０３は、可溶性グアニリルシクラーゼの刺激因子としてのピラゾロピリジン誘導体を記載している。その中でとりわけ記載されているのは、３位にピリミジン残基を有するピラゾロピリジンである。このタイプの化合物は、可溶性グアニリルシクラーゼを刺激することに関して、非常に高いｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を有する。しかしながら、これらの化合物は、例えば、肝臓におけるそれらの挙動、それらの薬物動態学的挙動、それらの用量反応関係またはそれらの代謝経路等のそれらのｉｎ  ｖｉｖｏ特性に関して不利であることが明らかになっている。
【０１４５】
他のｓＧＣ活性物質は、Ｏ．Ｖ．Ｅｖｇｅｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ．５（２００６），７５５；及び米国特許出願公開第２０１１００３４４５０号、同第２０１００２１０６４３号、同第２０１００１９７６８０号、同第２０１００１６８２４０号、同第２０１００１４４８６４号、同第２０１００１４４６７５号、同第２００９０２９１９９３号、同第２００９０２８６８８２号、同第２００９０２１５８４３号、同第２００８０号に開示されている。
【０１４６】
ＰＤＥ阻害剤
幾つかの実施形態では、活性剤は、例えば、非選択的ホスホジエステラーゼ阻害剤、ＰＤＥ１選択的阻害剤、ＰＤＥ２選択的阻害剤、ＰＤＥ３選択的阻害剤、ＰＤＥ４選択的阻害剤、ＰＤＥ５選択的阻害剤、及びＰＤＥ１０選択的阻害剤を含むＰＤＥ阻害剤を含む。
【０１４７】
ＰＤＥ阻害剤は、一般に、参照によりそれぞれ本明細書に組み込まれる以下の引用文献で説明されている：Ｕｚｕｎｏｖ，Ｐ．ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓ，Ｂ．：Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  ｃｙｃｌｉｃ  ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ３’，５’−ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ  ｉｎ  ｒａｔ  ｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ  ｂｙ  ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ２８４：２２０−２２６，１９７２；Ｗｅｉｓｓ，Ｂ．：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  ｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ．Ａｄｖ．Ｃｙｃｌ．Ｎｕｃｌ．Ｒｅｓ．５：１９５−２１１，１９７５；Ｆｅｒｔｅｌ，Ｒ．ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓ，Ｂ．：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｄｒｕｇ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｏｆ  ｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅｓ  ｏｆ  ｒａｔ  ｌｕｎｇ．Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１２：６７８−６８７，１９７６；Ｗｅｉｓｓ，Ｂ．ａｎｄ  Ｈａｉｔ，Ｗ．Ｎ．：Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ａｓ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｇｅｎｔｓ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１７：４４１−４７７，１９７７；Ｅｓｓａｙａｎ  ＤＭ．（２００１）．“Ｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅｓ，”．Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１０８（５）：６７１−８０；Ｄｅｒｅｅ  Ｊ，Ｍａｒｔｉｎｓ  ＪＯ，Ｍｅｌｂｏｓｔａｄ  Ｈ，Ｌｏｏｍｉｓ  ＷＨ，Ｃｏｉｍｂｒａ  Ｒ．（２００８）．“Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＴＮＦ−α  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｃｅｌｌｓ：Ｔｈｅ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｎｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ”．Ｃｌｉｎｉｃｓ（Ｓａｏ  Ｐａｕｌｏ），６３（３）：３２１−８；Ｍａｒｑｕｅｓ  ＬＪ．Ｚｈｅｎｇ  Ｌ，Ｐｏｕｌａｋｉｓ  Ｎ，Ｇｕｚｍａｎ  Ｊ，Ｃｏｓｔａｂｅｌ  Ｕ（Ｆｅｂｒｕａｒｙ  １９９９）．“Ｐｅｎｔｏｘｉｆｙｌｌｉｎｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ＴＮＦ−ａｌｐｈａ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ａｌｖｅｏｌａｒ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ”．Ａｍ．Ｊ，Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１５９（２）：５０８−１１；Ｐｅｔｅｒｓ−Ｇｏｌｄｅｎ  Ｍ，Ｃａｎｅｔｔｉ  Ｃ，Ｍａｎｃｕｓｏ  Ｐ，Ｃｏｆｆｅｙ  ＭＪ．（２００５）．“Ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅｓ：ｕｎｄｅｒａｐｐｒｅｃｉａｔｅｄ  ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ”，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７４（２）：５８９−９４；Ｄａｌｙ  ＪＷ，Ｊａｃｏｂｓｏｎ  ＫＡ，Ｕｋｅｎａ  Ｄ．（１９８７）．“Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ａｇｏｎｉｓｔｓ  ａｎｄ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ”．Ｐｒｏｇ  Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｓ．２３０（１）：４１−６３；ＭａｃＣｏｒｑｕｏｄａｌｅ  ＤＷ．ＴＨＥ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ  ＯＦ  ＳＯＭＥ  ＡＬＫＹＬＸＡＮＴＨＩＮＥＳ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ．１９２９  Ｊｕｌｙ；５１（７）：２２４５−２２５１；国際公開第１９８５／００２５４０号；米国特許第４，２８８，４３３号；Ｄａｌｙ  ＪＷ，Ｐａｄｇｅｔｔ  ＷＬ，Ｓｈａｍｉｍ  ＭＴ（Ｊｕｌｙ  １９８６）．“Ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｏｆ  ｃａｆｆｅｉｎｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｏｐｈｙｌｌｉｎｅ：ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ａｔ  ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ”．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９（７）：１３０５−８；Ｄａｌｙ  ＪＷ，Ｊａｃｏｂｓｏｎ  ＫＡ，Ｕｋｅｎａ  Ｄ（１９８７）．“Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ａｇｏｎｉｓｔｓ  ａｎｄ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ”．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２３０：４１−６３；Ｃｈｏｉ  ＯＨ  Ｓｈａｍｉｍ  ＭＴ，Ｐａｄｇｅｔｔ  ＷＬ，Ｄａｌｙ  ＪＷ（１９８８）．“Ｃａｆｆｅｉｎｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｏｐｈｙｌｌｉｎｅ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ：ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｓ  ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ａｎｄ  ａｓ  ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ”．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ４３（５）：３８７−９８；Ｓｈａｍｉｍ  ＭＴ，Ｕｋｅｎａ  Ｄ，Ｐａｄｇｅｔｔ  ＷＬ，Ｄａｌｙ  ＪＷ（Ｊｕｎｅ  １９８９）．“Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ８−ｐｈｅｎｙｌ  ａｎｄ  ８−ｃｙｃｌｏａｌｋｙｌ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｍｏｎｏ−，ｄｉ−，ａｎｄ  ｔｒｉｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  ａｌｋｙｌｘａｎｔｈｉｎｅｓ  ｗｉｔｈ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ａｔ  ｔｈｅ  １−，３−，ａｎｄ  ７−ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ”．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２（６）：１２３１−７；Ｄａｌｙ  ＪＷ，Ｈｉｄｅ  Ｉ，Ｍｕｌｌｅｒ  ＣＥ，Ｓｈａｍｉｍ  Ｍ（１９９１）．“Ｃａｆｆｅｉｎｅ  ａｎａｌｏｇｓ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ａｔ  ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ”．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ４２（６）：３０９−２１；Ｕｋｅｎａ  Ｄ，Ｓｃｈｕｄｔ  Ｃ，Ｓｙｂｒｅｃｈｔ  ＧＷ（Ｆｅｂｒｕａｒｙ  １９９３）．“Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｘａｎｔｈｉｎｅｓ  ａｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ  ｉｓｏｚｙｍｅｓ”．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ４５（４）：８４７−５１．ｄｏｉ：１０．１０１６／０００６−２９５２（９３）９０１���８−Ｖ；Ｄａｌｙ  ＪＷ（Ｊｕｌｙ  ２０００）．“Ａｌｋｙｌｘａｎｔｈｉｎｅｓ  ａｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌｓ”．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｕｔｏｎｏｍｉｃ  Ｎｅｒｖｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ８１（１−３）：４４−５２．ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ０１６５−１８３８（００）００１１０−７；Ｄａｌｙ  ＪＷ（Ａｕｇｕｓｔ  ２００７）．“Ｃａｆｆｅｉｎｅ  ａｎａｌｏｇｓ；ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ｉｍｐａｃｔ”．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ：ＣＭＬＳ  ６４（１６）：２１５３−６９；Ｇｏｎｚａｌｅｚ  ＭＰ，Ｔｅｒａｎ  Ｃ，Ｔｅｉｊｅｉｒａ  Ｍ（Ｍａｙ  ２００８）．“Ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ｎｅｗ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｆｏｒ  ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｆｒｏｍ  ＱＳＡＲ  ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  ｖｉｅｗ．Ｈｏｗ  ｃｌｏｓｅ  ａｒｅ  ｗｅ？”．Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２８（３）；３２９−７１；Ｂａｒａｌｄｉ  ＰＧ，Ｔａｂｒｉｚｉ  ＭＡ，Ｇｅｓｓｉ  Ｓ，Ｂｏｒｅａ  ＰＡ（Ｊａｎｕａｒｙ  ２００８）．“Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ：ｔｒａｎｓｌａｔｉｎｇ  ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｉｎｔｏ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｕｔｉｌｉｔｙ”．Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １０８（１）：２３８−６３；ｄｅ  Ｖｉｓｓｅｒ  ＹＰ，Ｗａｌｔｈｅｒ  ＦＪ，Ｌａｇｈｍａｎｉ  ＥＨ，ｖａｎ  Ｗｉｊｎｇａａｒｄｅｎ  Ｓ，Ｎｉｅｕｗｌａｎｄ  Ｋ，Ｗａｇｅｎａａｒ  ＧＴ．（２００８）．“Ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ−４  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ｌｕｎｇ  ｉｎｊｕｒｙ”．Ｅｕｒ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｊ  ３１（３）：６３３−６４４；Ｙｕ  ＭＣ，Ｃｈｅｎ  ＪＨ，Ｌａｉ  ＣＹ，Ｈａｎ  ＣＹ，Ｋｏ  ＷＣ．（２００９）．“Ｌｕｔｅｏｌｉｎ，ａ  ｎｏｎ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅｓ  １−５，ｄｉｓｐｌａｃｅｄ  ［（３）Ｈ］−ｒｏｌｉｐｒａｒａ  ｆｒｏｍ  ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｒｏｌｉｐｒａｍ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｖｅｒｓｅｄ  ｘｙｌａｚｉｎｅ／ｋｅｔａｍｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｎｅｓｔｈｅｓｉａ”．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６２７（１−３）：２６９−７５；Ｂｏｂｏｎ  Ｄ，Ｂｒｅｕｌｅｔ  Ｍ，Ｇｅｒａｒｄ−Ｖａｎｄｅｎｈｏｖｅ  ＭＡ，Ｇｕｉｏｔ−Ｇｏｆｆｉｏｕｌ  Ｆ，Ｐｌｏｍｔｅｕｘ  Ｇ，Ｓａｓｔｒｅ−ｙ−Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ  Ｍ，Ｓｃｈｒａｔｚｅｒ  Ｍ，Ｔｒｏｉｓｆｏｎｔａｉｎｅｓ  Ｂ，ｖｏｎ  Ｆｒｅｎｃｋｅｌｌ  Ｒ，Ｗａｃｈｔｅｌ  Ｈ．（１９８８）．“Ｉｓ  ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ａ  ｎｅｗ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ａｎｔｉｄｅｐｒｅｓｓａｎｔ  ａｃｔｉｏｎ？Ａ  ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ  ｄｏｕｂｌｅ−ｄｕｍｍｙ  ｓｔｕｄｙ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｒｏｌｉｐｒａｍ  ａｎｄ  ｄｅｓｉｐｒａｍｉｎｅ  ｉｎ  ｈｏｓｐｉｔａｌｉｚｅｄ  ｍａｊｏｒ  ａｎｄ／ｏｒ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｄｅｐｒｅｓｓｉｖｅｓ”．Ｅｕｒ  Ａｒｃｈ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｓｃｉ．２３８（１）；２−６；Ｍａｘｗｅｌｌ  ＣＲ，Ｋａｎｅｓ  ＳＪ，Ａｂｅｌ  Ｔ，Ｓｉｅｇｅｌ  ＳＪ．（２００４）．“Ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｆｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｔｉｐｓｙｃｈｏｔｉｃ  ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ”．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．１２９（１）：１０１−７；Ｋａｎｅｓ  ＳＪ，Ｔｏｋａｒｃｚｙｋ  Ｊ，Ｓｉｅｇｅｌ  ＳＪ，Ｂｉｌｋｅｒ  Ｗ，Ａｂｅｌ  Ｔ，Ｋｅｌｌｙ  ＭＰ．（２００６），“Ｒｏｌｉｐｒａｍ：Ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ  ４  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ａｎｔｉｐｓｙｃｈｏｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ”．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．１４４（１）：２３９−４６；ａｎｄ  Ｖｅｃｓｅｙ  ＣＧ，Ｂａｉｌｌｉｅ  ＧＳ，Ｊａｇａｎａｔｈ  Ｄ，Ｈａｖｅｋｅｓ  Ｒ，Ｄａｎｉｅｌｓ  Ａ，Ｗｉｍｍｅｒ  Ｍ，Ｈｕａｎｇ  Ｔ，Ｂｒｏｗｎ  ＫＭ，Ｌｉ  ＸＹ，Ｄｅｓｃａｌｚｉ  Ｇ，Ｋｉｍ  ＳＳ，Ｃｈｅｎ  Ｔ，Ｓｈａｎｇ  ＹＺ，Ｚｈｕｏ  Ｍ，Ｈｏｕｓｌａｙ  ＭＤ，Ａｂｅｌ  Ｔ．（２００９），“Ｓｌｅｅｐ  ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ  ｉｍｐａｉｒｓ  ｃＡＭＰ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ”．Ｎａｔｕｒｅ．４６１（７２６７）：１１２２−１１２５．
【０１４８】
グアニリルシクラーゼの活性化に加えて、ｃＧＭＰレベルを上昇させ、ＰＤＥ１阻害剤、ＰＤＥ２阻害剤、ＰＤＥ３阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、ＰＤＥ５阻害剤、及びＰＤＥ１０阻害剤等のＰＤＥを使用する化学療法及び放射線療法から細胞を保護することができる。ｃＧＭＰの分解は、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）アイソザイムのファミリーによって制御される。現在までに、このファミリーの７つのメンバーが記載されており（ＰＤＥ  Ｉ〜ＶＩＩ）、その分布は組織ごとに異なる（Ｂｅａｖｏ＆Ｒｅｉｆｓｎｙｄｅｒ（１９９０）ＴＩＰＳ，１１：１５０−１５５  ａｎｄ  Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９１）ＴＩＰＳ，１２：１９−２７）。ＰＤＥアイソザイムの特定の阻害剤は、様々な組織でｃＧＭＰの異なる上昇を達成するのに役立ち得る。幾つかのＰＤＥ阻害剤は、ｃＡＭＰに影響を与えずにｃＧＭＰの分解を特異的に阻害する。幾つかの実施形態では、可能なＰＤＥ阻害剤は、ＰＤＥ３阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、ＰＤＥ５阻害剤、ＰＤＥ３／４阻害剤またはＰＤＥ３／４／５阻害剤であり得る。
【０１４９】
ｃＧＭＰを特異的に上昇させるＰＤＥ阻害剤は、米国特許第６，５７６，６４４号、同第７，３８４，９５８号、同第７，２７６，５０４号、同第７，２７３，８６８号、同第７，２２０，７３６号、同第７，０９８，２０９号、同第７，０８７，５９７号、同第７，０６０，７２１号、同第６，９８４，６４１号、同第６，９３０，１０８号、同第６，９１１，４６９号、同第６，７８４，１７９号、同第６，６５６，９４５号、同第６，６４２，２４４号、同第６，４７６，０２１号、同第６，３２６，３７９号、同第６，３１６，４３８号、同第６，３０６，８７０号、同第６，３００，３３５号、同第６，２１８，３９２号、同第６，１９７，７６８号、同第６，０３７，１１９号、同第６，０２５，４９４号、同第６，０１８，０４６号、同第５，８６９，５１６号、同第５，８６９，４８６号、同第５，７１６，９９３に開示されている。他の例としては、国際公開第９６／０５１７６号及び第６，０８７，３６８号、米国特許第４，１０１，５４８号、同第４，００１，２３８号、同第４，００１，２３７号、同第３，９２０，６３６号、同第４，０６０，６１５号、同第４，２０９，６２３号、同第５，３５４，５７１号、同第３，０３１，４５０号、同第３，３２２，７５５号、同第５，４０１，７７４号、同第５，１４７，８７５号、同第４，８８５，３０１号、同第４，１６２，３１６号、同第４，０４７，４０４号、同第５，６１４，５３０号、同第５，４８８，０５５号、同第４，８８０，８１０号、同第５，４３９，８９５号、同第５，６１４，６２７号、英国特許第２０６３２４９号、欧州特許第０６０７４３９号、国際公開第９７／０３９８５号、欧州特許第０３９５３２８号、欧州特許第０４２８２６８号、国際公開第９３／１２０９５号、国際公開第９３／０７１４９号、欧州特許第０３４９２３９号、欧州特許第０３５２９６０号、欧州特許第０５２６００４号、欧州特許第０４６３７５６号、欧州特許第０６０７４３９号、国際公開第９４／０５６６１号、欧州特許第０３５１０５８号、欧州特許第０３４７１４６号、国際公開第９７／０３９８５号、国際公開第９７／０３６７５号、国際公開第９５／１９９７８号、国際公開第９８／０８８４８号、国際公開第９８／１６５２１号、欧州特許第０７２２９４３号、欧州特許第０７２２９３７号、欧州特許第０７２２９４４号、国際公開第９８／１７６６８号、国際公開第９７／２４３３４号、国際公開第９８／０６７２２国際特許出願ＰＣＴ／ＪＰ９７／０３５９２号、国際公開第９８／２３５９７号、国際公開第９４／２９２７７号、国際公開第９８／１４４４８号、国際公開第９７／０３０７０号、国際公開第９８／３８１６８号、国際公開第９６／３２３７９号、及び国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ９８／０３７１２号が挙げられる。ＰＤＥ阻害剤は、以下の特許出願及び特許に開示されているものを含み得る：ドイツ国特許第１４７０３４１号、ドイツ国特許第２１０８４３８号、ドイツ国特許第２１２３３２８号、ドイツ国特許第２３０５３３９号、ドイツ国特許第２３０５５７５号、ドイツ国特許第２３１５８０１号、ドイツ国特許第２４０２９０８号、ドイツ国特許第２４１３９３５号、ドイツ国特許第２４５１４１７号、ドイツ国特許第２４５９０９０号、ドイツ国特許第２６４６４６９号、ドイツ国特許第２７２７４８１号、ドイツ国特許第２８２５０４８号、ドイツ国特許第２８３７１６１号、ドイツ国特許第２８４５２２０号、ドイツ国特許第２８４７６２１号、ドイツ国特許第２９３４７４７号、ドイツ国特許第３０２１７９２号、ドイツ国特許第３０３８１６６号、ドイツ国特許第３０４４５６８号、欧州特許第０００７１８号、欧州特許第０００８４０８号、欧州特許第００１０７５９号、欧州特許第００５９９４８号、欧州特許第００７５４３６号、欧州特許第００９６５１７号、欧州特許第０１１２９８７号、欧州特許第０１１６９４８号、欧州特許第０１５０９３７号、欧州特許第０１５８３８０号、欧州特許第０１６１６３２号、欧州特許第０１６１９１８号、欧州特許第０１６７１２１号、欧州特許第０１９９１２７号、欧州特許第０２２００４４号、欧州特許第０２４７７２５号、欧州特許第０２５８１９１号、欧州特許第０２７２９１０号、欧州特許第０２７２９１４号、欧州特許第０２９４６４７号、欧州特許第０３００７２６号、欧州特許第０３３５３８６号、欧州特許第０３５７７８８号、欧州特許第０３８９２８２号、欧州特許第０４０６９５８号、欧州特許第０４２６１８０号、欧州特許第０４２８３０２号、欧州特許第０４３５８１１号、欧州特許第０４７０８０５号、欧州特許第０４８２２０８号、欧州特許第０４９０８２３号、欧州特許第０５０６１９４号、欧州特許第０５１１８６５号、欧州特許第０５２７１１７号、欧州特許第０６２６９３９号、欧州特許第０６６４２８９号、欧州特許第０６７１３８９号、欧州特許第０６８５４７４号、欧州特許第０６８５４７５号、欧州特許第０６８５４７９号、日本国特許第９２２３４３８９号、日本国特許第９４３２９６５２号、日本国特許第９５０１０８７５号、米国特許第４，９６３，５６１号、米国特許第５，１４１，９３１号、国際公開第９１１７９９１号、国際公開第９２００９６８号、国際公開第９２１２９６１号、国際公開第９３０７１４６号、国際公開第９３１５０４４号、国際公開第９３１５０４５号、国際公開第９３１８０２４号、国際公開第９３１９０６８号、国際公開第９３１９７２０号、国際公開第９３１９７４７号、国際公開第９３１９７４９号、国際公開第９３１９７５１号、国際公開第９３２５５１７号、国際公開第９４０２４６５号、国際公開第９４０６４２３号、国際公開第９４１２４６１号、国際公開第９４２０４５５号、国際公開第９４２２８５２号、国際公開第９４２５４３７号、国際公開第９４２７９４７号、国際公開第９５００５１６号、国際公開第９５０１９８０号、国際公開第９５０３７９４号、国際公開第９５０４０４５号、国際公開第９５０４０４６号、国際公開第９５０５３８６号、国際公開第９５０８５３４号、国際公開第９５０９６２３号、国際公開第９５０９６２４号、国際公開第９５０９６２７号、国際公開第９５０９８３６号、国際公開第９５１４６６７号、国際公開第９５１４６８０号、国際公開第９５１４６８１号、国際公開第９５１７３９２号、国際公開第９５１７３９９号、国際公開第９５１９３６２号、国際公開第９５２２５２０号、国際公開第９５２４３８１号、国際公開第９５２７６９２号、国際公開第９５２８９２６号、国際公開第９５３５２８１号、国際公開第９５３５２８２号、国際公開第９６００２１８号、国際公開第９６０１８２５号、国際公開第９６０２５４１号、国際公開第９６１１９１７号、ドイツ国特許第３１４２９８２号、ドイツ国特許第１１１６６７６号、ドイツ国特許第２１６２０９６号、欧州特許第０２９３０６３号、欧州特許第０４６３７５６号、欧州特許第０４８２２０８号、欧州特許第０５７９４９６号、欧州特許第０６６７３４５及び国際公開第９３０７１２４号、欧州特許第０１６３９６５号、欧州特許第０３９３５００号、欧州特許第０５１０５６２号、欧州特許第０５５３１７４号、国際公開第９５０１３３８号、及び国際公開第９６０３３９９号。
【０１５０】
非選択的ホスホジエステラーゼ阻害剤の例としては、薬理学的研究で調査ツールとして使用される、メチル化キサンチン及び誘導体、例えば：カフェイン、弱刺激物質、アミノフィリン、ＩＢＭＸ（３−イソブチル−１−メチルキサンチン）等、パラキサンチン、ペントキシフィリン、循環を促進する可能性があり、糖尿病、線維性障害、末梢神経損傷、及び微小血管傷害の治療に適用可能性を有し得る薬物、テオブロミン及びテオフィリン、気管支拡張薬が挙げられる。メチル化キサンチンは、細胞内ｃＡＭＰを上昇させ、ＰＫＡを活性化し、ＴＮＦ−α及びロイコトリエンの合成を阻害し、炎症及び自然免疫及び非選択的アデノシン受容体拮抗薬を減少させる、競合的非選択的ホスホジエステラーゼ阻害剤として機能する。様々類縁体が多数のサブタイプで様々な効力を示し、ホスホジエステラーゼ酵素またはアデノシン受容体サブタイプに対する選択性が高い化合物の検索で、広範囲の合成キサンチン誘導体（一部は非メチル化）が開発された。
ＰＤＥ阻害剤としては、１−（３−クロロフェニルアミノ）−４−フェニルフタラジン及びジピリダモールが挙げられる。別のＰＤＥ１選択的阻害剤は、例えば、ビンポセチンである。
【０１５１】
ＰＤＥ２選択的阻害剤としては、例えば、ＥＨＮＡ（エリスロ−９−（２−ヒドロキシ−３−ノニル）アデニン）及びアナグレリドが挙げられる。
【０１５２】
ＰＤＥ３選択的阻害剤としては、例えば、スルマゾール、アンポゾン、シロスタミド、カルバゼランピロキシモン、イマゾダン、シガゾダン、アディベンダン、サテリノン、エモラダン、レビジノン、並びにエノキシモン及びミルリノンが挙げられる。幾つかは、心不全の短期治療のために臨床で使用されている。これらの薬物は交感神経刺激を模倣し、心拍出量を増加させる。ＰＤＥ３は、ｃＧＭＰ阻害ホスホジエステラーゼと称されることもある。
【０１５３】
ＰＤＥ３／４阻害剤の例としては、ベナフェントリン、トレキンシン、ザルダベリン及びトラフェントリンが挙げられる。
【０１５４】
ＰＤＥ４選択的阻害剤としては、例えば：ウィンクルーダー、デンブフィリン、ロリプラム、オキサグレラート、ニルタクアゾン、モタピゾン、リキサジノン、インドリダン、オルプリノン、アチゾラム、ジパムフィリン、アロフィリン、フィラミナスト、ピクラミラスト、チベネラスト、モピダモール、シアナジリモイド、アムアジリモイド、アナグレリドン、アナグレリド及びＮ−（３，５−ジクロロピリド−４−イル）−３−シクロプロピルメトキシ４−ジフルオロメトキシベンズアミドが挙げられる。ハーブのＳｃｅｌｅｔｉｕｍ  ｔｏｒｔｕｏｓｕｍのアルカロイドであるメセンブリン；薬理学研究の探索手段として使用されるロリプラム；主に喘息と脳卒中の治療に使用される神経保護剤及び気管支拡張薬であるイブジラスト（ＰＤＥ４を最大限に阻害するのみならず、他のＰＤＥサブタイプの有意な阻害も示すため、用量に応じて選択的ＰＤＥ４阻害剤または非選択的ホスホジエステラーゼ阻害剤として機能する）；ロリプラムより強力な阻害剤であるピクラミラスト；ＩＧＦ−１の特性も持っている、ピーナッツから抽出されたサプリメントであるルテオリン；腎疝痛を緩和するために使用され、分娩時の子宮頸管拡張を早めるためにも使用されるドロタベリン、及び咳及び過剰な粘液等の症状の悪化を防ぐために重度のＣＯＰＤを有する人に適応とされているロフルミラスト。ＰＤＥ４は、炎症細胞や免疫細胞に見られる主要なｃＡＭＰ代謝酵素である。ＰＤＥ４阻害剤は、特に喘息、ＣＯＰＤ、鼻炎等の炎症性肺疾患における抗炎症薬としての可能性が証明されている。ＰＤＥ４阻害剤はサイトカイン及び他の炎症性シグナルの放出を抑制し、活性酸素種の生成を阻害する。ＰＤＥ４阻害剤は抗うつ効果がある可能性があり［２６］、また抗精神病薬としての使用も最近提案されている。
【０１５５】
ＰＤＥ５選択的阻害剤としては、例えば：シルデナフィル、タダラフィル、バルデナフィル、ベスナリノン、ザプリナストロデナフィル、ミロデナフィル、ウデナフィル及びアバナフィルが挙げられ、ｃＧＭＰ特異的であり、海綿体のｃＧＭＰの劣化の原因であるＰＤＥ５（これらのホスホジエステラーゼ阻害剤は、主に勃起不全の治療薬として使用されるだけでなく、肺高血圧症の治療等の他の幾つかの医療用途を有する）；ジピリダモール（ＮＯまたはスタチンと一緒に与えると、追加の利益が得られる）；並びにより新しくより選択的な阻害剤は、Ｅｐｉｍｅｄｉｕｍ  ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍの活性成分であるイカリイン、またおそらく、苔癬のＸａｎｔｈｏｐａｒｍｅｌｉａ  ｓｃａｂｒｏｓａの成分である４−メチルピペラジン及びピラゾロピリミジン−７−１等である。
【０１５６】
ＰＤＥ１０は、アヘンアルカロイドであるパパベリンによって選択的に阻害される。ＰＤＥ１０Ａは線条体でほぼ独占的に発現され、ＰＤＥ１０Ａ阻害（例えば、パパベリンによる）後のｃＡＭＰ及びｃＧＭＰのその後の増加は、「抗精神病薬の発見における新しい治療手段」である。
【０１５７】
追加のＰＤＥ阻害剤としては、米国特許第８，１５３，１０４号、同第８，１３３，９０３号、同第８，１１４，４１９号、同第８，１０６，０６１，８，０８４，２６１号、同第７，９５１，３９７号、同第７，８９７，６３３号、同第７，８０７，８０３号、同第７，７９５，３７８号、同第７，７５０，０１５号、同第７，７３７，１５５号、同第７，７３２，１６２号、同第７，７２３，３４２号、同第７，７１８，７０２号、同第７，６７１，０７０号、同第７，６５９，２７３号、同第７，６０５，１３８号、同第７，５８５，８４７号、同第７，５７６，０６６号、同第７，５６９，５５３号、同第７，５６３，７９０号、同第７，４７０，６８７号、同第７，３９６，８１４号、同第７，３９３，８２５号、同第７，３７５，１００号、同第７，３６３，０７６号、同第７，３０４，０８６号、同第７，２３５，６２５号、同第７，１５３，８２４号、同第７，０９１，２０７号、同第７，０５６，９３６号、同第７，０３７，２５７号、同第７，０２２，７０９号、同第７，０１９，０１０号、同第６，９９２，０７０，６，９６９，７１９号、同第６，９６４，７８０号、同第６，８７５，５７５号、同第６，７４３，７９９号、同第６，７４０，３０６号、同第６，７１６，８３０号、同第６，６７０，３９４号、同第６，６４２，２４４号、同第６，６１０，６５２号、同第６，５５５，５４７号、同第６，５４８，５０８号、同第６，５４１，４８７号、同第６，５３８，００５号、同第６，５３４，５１９号、同第６，５３４，５１８号、同第６，４７９，５０５号、同第６，４７６，０２５号、同第６，４３６，９７１，６，４３６，９４４号、同第６，４２８，４７８号、同第６，４２３，６８３号、同第６，３９９，５７９号、同第６，３９１，８６９号、同第６，３８０，１９６号、同第６，３７６，４８５号、同第６，３３３，３５４号、同第６，３０６，８６９号、同第６，３０３，７８９号、同第６，２９４，５６４号、同第６，２８８，１１８号、同第６，２７１，２２８号、同第６，２３５，７８２号、同第６，２３５，７７６号、同第６，２２５，３１５号、同第６，１７７，４７１号、同第６，１４３，７５７号、同第６，１４３，７４６号、同第６，１２７，３７８号、同第６，１０３，７１８号、同第６，０８０，７９０号、同第６，０８０，７８２号、同第６，０７７，８５４号、同第６，０６６，６４９号、同第６，０６０，５０１，６，０４３，２５２号、同第６，０１１，０３７号、同第５，９９８，４２８号、同第５，９６２，４９２号、同第５，９２２，５５７号、同第５，９０２，８２４号、同第５，８９１，８９６号、同第５，８７４，４３７号、同第５，８７１，７８０号、同第５，８６６，５９３号、同第５，８５９，０３４号、同第５，８４９，７７０号、同第５，７９８，３７３号、同第５，７８６，３５４号、同第５，７７６，９５８号、同第５，７１２，２９８号、同第５，６９３，６５９号、同第５，６８１，９６１号、同第５，６７４，８８０号、同第５，６２２，９７７，５，５８０，８８８号、同第５，４９１，１４７号、同第５，４２６，１１９号、及び同第５，２９４，６２６号に記載されるものが挙げられ、これらはそれぞれ引用することで本明細書の一部をなす。追加のＰＤＥ２阻害剤としては、米国特許第６，５５５，５４７号、同第６，５３８，０２９号、同第６，４７９，４９３号及び同第６，４６５，４９４号に記載されているものが挙げられ、これらはそれぞれ、引用することで本明細書の一部をなす。追加のＰＤＥ３阻害剤としては、米国特許第７，３７５，１００号、同第７，０５６，９３６号、同第６，８９７，２２９号、同第６，７１６，８７１号、同第６，４９８，１７３号及び同第６，１１０，４７１号であり、これらはそれぞれ引用することで本明細書の一部をなす。追加のＰＤＥ４阻害剤としては、米国特許第８，１５３，６４６号、同第８，１１０，６８２号、同第８，０３０，３４０号、同第７，９６４，６１５号、同第７，９６０，４３３号、同第７，９５１，９５４号、同第７，９０２，２２４号、同第７，８４６，９７３号、同第７，７５９，３５３号、同第７，６５９，２７３号、同第７，５５７，２４７号、同第７，５５０，４７５号、同第７，５５０，４６４号、同第７５３８，１２７号、同第７，５１７，８８９号、同第７，４４６，１２９号、同第７，４３９，３９３号、同第７，４０２，６７３号、同第７，３７５，１００号、同第７，３６１，７８７号、同第７，２５３，１８９号、同第７，１３５，６００号、同第７，１０１，８６６号、同第７，０６０，７１２号、同第７，０５６，９３６号、同第７，０４５，６５８号、同第６，９５３，７７４号、同第６，８８４，８０２号、同第６，８５８，５９６号、同第６，７８７，５３２号、同第６，７４７，０４３号、同第６，７４０，６５５号、同第６，７１３，５０９号、同第６，６３０，４８３号、同第６，４３６，９７１号、同第６，２８８，１１８号、及び同第５，９１９，８０１号に記載されるものが挙げられ、これらはそれぞれ、引用することで本明細書の一部をなす。追加のＰＤＢ５阻害剤としては、米国特許第７，４４９，４６２号、同第７，３７５，１００号、同第６，９６９，５０７号、同第６，７２３，７１９号、同第６，６７７，３３５号、同第６，６６０，７５６号、同第６，５３８，０２９号、同第６，４７９，４９３号、同第６，４７６，０７８号、同第６，４６５，４９４号、同第６，４５１，８０７号、同第６，１４３，７５７号、同第６，１４３，７４６号、及び同第６，０４３，２５２号に記載されるものが挙げられ、引用することで本明細書の一部をなす。追加のＰＤＥ１０阻害剤としては、引用することで本明細書の一部をなす、米国特許第６，５３８，０２９号に記載されているものが挙げられる。
【０１５８】
ＭＲＰ阻害剤
ヒト多剤耐性タンパク質ＭＲＰ４及びＭＲＰ５は、ｃＧＭＰを含む環状ヌクレオチドを輸送する珍しい能力を持つ有機陰イオン輸送体である。したがって、ｃＧＭＰレベルは、ＭＲＰ４及びＭＲＰ５の阻害により増加し得る。ＭＲＰ４及びＭＲＰ５を阻害する化合物としては、ジピリダモール、ジラゼプ、ニトロベンジルメルカプトプリンリボシド、シルデナフィル、トレキンシン、ザプリナスト、及びＭＫ５７１（３−［［［３−［（１Ｅ）−２−（７−クロロ−２−キノリニル）エテニル］フェニル］［［３−（ジメチルアミノ）−３−オキソプロピル］チオ］メチル］チオ］プロパン酸）が挙げられる。これらの化合物は、ＭＲＰ５よりもＭＲＰ４の阻害により効果的な可能性がある。ＭＲＰ阻害剤として有用であり得る他の化合物としては、スルフィンピラゾン、ジドブジン一リン酸、ゲニステイン、インドメタシン、及びプロベネシドが挙げられる。
【０１５９】
環状ＧＭＰ及び／またはｃＧＭＰ類縁体
幾つかの実施形態では、活性剤は環状ＧＭＰを含む。幾つかの実施形態では、活性剤は、例えば８−ブロモ−ｃＧＭＰ及び２−クロロ−ｃＧＭＰ等のｃＧＭＰ類縁体を含む。
【０１６０】
制御放出製剤
制御放出組成物は、十二指腸、小腸、大腸、結腸及び／または直腸の組織に送達するために提供される。制御放出製剤は、グアニリルシクラーゼＡ（ＧＣＡ）アゴニスト（ＡＮＰ、ＢＮＰ）、グアニリルシクラーゼＢ（ＧＣＢ）アゴニスト（ＣＮＰ）、可溶性グアニリルシクラーゼ活性物質（一酸化窒素、ニトロ血管拡張剤、プロトプロフィリンＩＸ、及び直接活性物質）、グアニリルシクラーゼＣアゴニスト、ＰＤＥ阻害剤、ＭＲＰ阻害剤、環状ＧＭＰ及びｃＧＭＰ類縁体からなる群から選択される１つまたは複数の活性剤を含み、該活性剤は、十二指腸、小腸、大腸、結腸及び／または直腸の組織への制御放出のための制御放出組成物として製剤化される。がんを治療するために化学療法または放射線療法を受けている個体のＧＩ症候群を予防する方法が提供され、これは、化学療法または放射線を個体に適用する前に、ＧＩ症候群を防ぐのに十分な期間にわたり、胃腸細胞の細胞増殖を停止させ、及び／またはＤＮＡ損傷の感知及び修復を増強することによりゲノムの完全性を維持するのに十分な量の、上記胃腸細胞において細胞内ｃＧＭＰレベルを上昇させるための制御放出組成物を、経口投与によって個体に投与する工程を含む。がんを治療するために化学療法または放射線療法を受けている個体において胃腸の副作用を軽減する方法が提供され、これは、化学療法または放射線を個体に適用する前に、胃腸細胞の生存を高め、化学療法または放射線療法の副作用の重症度を減少させるのに十分な期間にわたり、胃腸細胞の細胞増殖を停止させ、及び／またはＤＮＡ損傷の感知及び修復を増強することによりゲノムの完全性を維持するのに十分な量の、上記胃腸細胞において細胞内ｃＧＭＰレベルを上昇させるための制御放出組成物を経口投与によって個体に投与する工程を含む。がんを有する個体を治療する方法が提供され、これは、ＧＩ症候群を防止するのに十分な期間にわたり、胃腸細胞の細胞増殖を停止し、及び／またはＤＮＡ損傷の感知及び修復を増強することによりゲノムの完全性を維持するのに十分な量の、該胃腸細胞において細胞内ｃＧＭＰレベルを上昇させる制御放出組成物を個体に経口投与することにより投与する工程；並びにがんを治療するのに十分な量の化学療法または放射線を上記個体に適用する工程を含む。がんを有する個体を治療する方法が提供され、これは、胃腸細胞の生存を高め、化学療法または放射線療法の副作用の重症度を軽減するのに十分な期間にわたり、胃腸細胞の細胞増殖を停止し、及び／またはＤＮＡ損傷の感知及び修復を増強することによりゲノムの完全性を維持するのに十分な量の、該胃腸細胞において細胞内ｃＧＭＰレベルを上昇させる制御放出組成物を個体に経口投与することにより投与する工程；並びにがんを治療するのに十分な量の化学療法または放射線を上記個体に適用する工程を含む。ＧＩ症候群を引き起こすのに十分な線量の放射線に被曝した、または被曝するリスクがある個体のＧＩ症候群を予防する方法が提供され、これは、ＧＩ症候群を引き起こすのに十分な線量の放射線に被曝した、または被曝するリスクがある個体に、ＧＩ症候群を防ぐのに十分な量の胃腸細胞の細胞内ｃＧＭＰレベルを上昇させる制御放出組成物を経口投与する工程を含む。放射線病を引き起こすのに十分な量の放射線に曝露された個体を治療する方法が提供され、これは、胃腸細胞の細胞増殖を停止し、及び／またはＤＮＡ損傷の感知及び修復を増強することによりゲノムの完全性を維持するのに十分な量の、胃腸細胞において細胞なｃＧＭＰレベルを上昇させるのに十分な、胃腸細胞においてｃＧＭＰレベルを上昇させる制御放出組成物を上記個体に投与する工程を含む。化学療法または放射線を受けている個体において副作用を予防する方法が提供され、これは、保護される細胞に対する損傷を軽減するのに十分な期間にわたり、胃腸細胞の細胞増殖を停止し、及び／またはＤＮＡ損傷の感知及び修復を増強することによりゲノムの完全性を維持するのに十分な、保護される細胞においてｃＧＭＰレベルを上昇させる制御放出組成物を、化学療法または放射線を適用する前に、経口投与によって上記個体に投与する工程を含む。がんを有する個体を治療する方法が提供され、これは、保護される細胞に対する損傷を軽減するのに十分な期間にわたり、胃腸細胞の細胞増殖を停止し、及び／またはＤＮＡ損傷の感知及び修復を増強することによりゲノムの完全性を維持するのに十分な量の、保護される細胞においてｃＧＭＰレベルを上昇させる制御放出組成物を、上記個体に投与する工程を含む。
【０１６１】
幾つかの実施形態では、上記方法は：グアニリルシクラーゼＡ（ＧＣＡ）アゴニスト（ＡＮＰ、ＢＮＰ）、グアニリルシクラーゼＢ（ＧＣＢ）アゴニスト（ＣＮＰ）、グアニリルシクラーゼＣ（ＧＣＣ）アゴニスト、可溶性グアニリルシクラーゼ活性物質（一酸化窒素、ニトロ血管拡張剤、プロトプロフィリンＩＸ、及び直接活性物質）、ＰＤＥ阻害剤、ＭＲＰ阻害剤、環状ＧＭＰ及びｃＧＭＰ類縁体からなる群から選択される１つまたは複数の活性剤の送達を含み、該活性剤の大部分または全てではないにしても少なくとも一部の放出が胃を迂回し、十二指腸、小腸、大腸、結腸及び／または直腸の組織に送達されるように、上記活性剤は制御放出用に製剤化されている。これらの製剤は、活性剤が胃によって不活性化されるか、または胃によって取り込まれる場合に特に有用であり、いずれの場合にも、活性剤が活性が望ましい胃の下流の組織に到達するのを防ぐ。幾つかの実施形態では、好ましい放出部位は十二指腸である。一部の実施形態では、好ましい放出部位は小腸である。幾つかの実施形態では、好ましい放出部位は大腸である。幾つかの実施形態では、好ましい放出部位は結腸である。胃を迂回し、胃を通過した後に薬物を放出することにより、有効量の活性剤の組織特異的送達が確実になる。
【０１６２】
該方法は、十二指腸、小腸及び大腸、並びに結腸を含む結腸直腸経路への活性剤のより効果的な送達を提供する。結腸直腸経路全体またはその中の特定の組織に活性剤を送達するための製剤が提供される。
【０１６３】
幾つかの実施形態は、制御放出から製剤化された、ＧＣＣアゴニスト、グアニリルシクラーゼＡ（ＧＣＡ）アゴニスト（ＡＮＰ、ＢＮＰ）、グアニリルシクラーゼＢ（ＧＣＢ）アゴニスト（ＣＮＰ）、可溶性グアニリルシクラーゼ活性物質（一酸化窒素、ニトロ血管拡張剤、プロトプロフィリンＩＸ、及び直接活性物質）、ＰＤＥ阻害剤、ＭＲＰ阻害剤及び／または環状ＧＭＰ及び／またはｃＧＭＰ類縁体及び／またはＰＤＥ阻害剤を利用し、それによって、該活性剤の大部分または全てではないにしても少なくとも一部の放出が胃を迂回し、十二指腸、小腸、大腸、結腸及び／または直腸の組織に送達される。これらの製剤は、活性剤が胃によって不活性化されるか、または胃によって取り込まれる場合に特に有用であり、いずれの場合にも、活性剤が活性が望ましい胃の下流の組織に到達するのを防ぐ。幾つかの実施形態では、好ましい放出部位は、十二指腸である。一部の実施形態では、好ましい放出部位は小腸である。幾つかの実施形態では、好ましい放出部位は大腸である。幾つかの実施形態では、好ましい放出部位は結腸である。
【０１６４】
ほとんどの腸溶性コーティングは、胃酸から内容物を保護することを目的としている。したがって、それらは、胃を通過すると活性剤を放出するように設計されている。本明細書で使用されるコーティング及びカプセル化は、結腸直腸路を通過する際に活性剤を放出するために提供される。これは幾つかの方法で実現可能である。
【０１６５】
腸溶性製剤は、米国特許第４，６０１，８９６号、米国特許米国特許第４，７２９，８９３号、米国特許米国特許第４，８４９，２２７号、米国特許米国特許第５，２７１，９６１号、米国特許米国特許第５，３５０，７４１号、及び米国特許米国特許第５，３９９，３４７号に記載されている。経口製剤及び直腸製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９０，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ  Ｐａ．に教示され、引用することで本明細書の一部をなす。
【０１６６】
幾つかの実施形態によれば、活性剤は、コーティング物質が活性剤を溶解及び放出するのに必要な時間が、口から結腸直腸路までコーティングされたまたはカプセル化された組成物に必要な時間に対応する、十分な量のコーティング材料により被覆またはカプセル化される。
【０１６７】
幾つかの実施形態によれば、活性剤は、結腸直腸路に存在する状態と接触するまで活性剤を完全に溶解及び放出しないコーティング材料でコーティングまたはカプセル化される。かかる状態には、結腸直腸経路における酵素の存在、ｐＨ、等張性、または小腸と比べて変化する他の状態が含まれ得る。
【０１６８】
幾つかの実施形態によれば、活性剤は、胃から小腸、大腸に通過するときに段階的に溶解するように設計されたコーティング材料でコーティングまたはカプセル化される。活性剤は、結腸直腸路で起こる最終段階の溶解時に放出される。
【０１６９】
幾つかの実施形態では、上記製剤は、結腸直腸路の特定の組織または領域、例えば、十二指腸、小腸、大腸または結腸における活性剤の放出のため提供される。
【０１７０】
投与されたときに大腸特異的放出のための活性剤を製剤化するために使用され得る技術の例としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ａｌｌｗｏｏｄ，ｅｔ  ａｌに１９９２年４月２８日付で発行された、延放出製剤を開示する、米国特許第５，１０８，７５８号；Ｓｅｋｉｇａｗａ，ｅｔ  ａｌ．に１９９３年６月８日付けで発行された、大腸での放出性を有する被覆された固形医薬剤形を開示する、米国特許第５，２１７，７２０号；Ｒｈｏｄｅｓ，ｅｔ  ａｌ．に１９９６年７月３０日付で発行された、経口投与可能な医薬組成物を開示する、米国特許第５，５４１，１７１号；Ｂａｕｅｒ，ｅｔ  ａｌ．に１９９７年１１月１８日付で発行された、架橋多糖類、それらの調製方法及びそれらの使用を開示する、米国特許第５，６８８，７７６号；Ｍａｎｉａｒ，ｅｔ  ａｌ．に１９９８年１２月８日付で発行された、経口投与のための保護された生体高分子及びその使用方法を開示する、米国特許第５，８４６，５２５号；Ｂｏｌｏｎｉｃｋ，ｅｔ  ａｌ．に１９９９年１月２６日付けで発行された、胃腸管の慢性炎症性疾患の治療を開示する、米国特許第５，８６３，９１０号；Ｖａｇｈｅｆｉ，ｅｔ  ａｌ．に２００５年２月１日付で発行された、マイクロカプセルマトリクスミクロスフェア、吸収促進医薬組成物及び方法を開示する米国特許Ｎｏ．６，８４９，２７１号；Ｋｕｄｏ，ｅｔ  ａｌに２００５年１２月６日付けで発行された、下部消化管での放出システムを開示する、米国特許第６，９７２，１３２号；Ｍｕｋａｉ，ｅｔ  ａｌ．に２００６年１１月２１日付けで発行された、下部消化管に可溶なコーティングされた製剤を開示する、米国特許第７，１３８，１４３号；米国特許第６，３０９，６６６号；米国特許第６，５６９，４６３号、米国特許第６，２１４，３７８号；米国特許第６，２４８，３６３号：米国特許第６，４５８，３８３号、米国特許第６，５３１，１５２号、米国特許第５，５７６，０２０号、米国特許第５，６５４，００４号、米国特許第５，２９４，４４８号、米国特許第６，３０９，６６３号、米国特許第５，５２５，６３４号、米国特許第６，２４８，３６２号、米国特許第５，８４３，４７９号、及び米国特許第５，６１４，２２０号、これらはそれぞれ引用することで本明細書の一部をなす。
【０１７１】
徐放性製剤はよく知られており、十二指腸への活性剤の放出に特に適しているものを含む。使用され得る制御放出製剤の例としては、米国特許出願公開第２０１０／０２７８９１２号、米国特許第４，７９２，４５２号、米国特許出願公開第２００５／００８０１３７号、米国特許出願公開第２００６／０１５９７６０号、米国特許出願公開第２０１１／０２５１２３１号、米国特許第５，４４３，８４３号、米国特許出願公開第２００８／０１５３７７９号、米国特許出願公開第２００９／０１９１２８２号、米国特許出願公開第２００３／０２２８３６２号、米国特許出願公開第２００４／０２２４０１９号、米国特許出願公開第２０１０／０１２９４４２号、米国特許出願公開第２００７／０１４８１５３号、米国特許第５，５３６，５０７号、米国特許第７，７９０，７５５号、米国特許出願公開第２００５／００５８７０４号、米国特許出願公開第２００１／００２６８００号、米国特許出願公開第２００９／０１７５９３９号、米国特許出願公開第２００２／０１９２２８５号、米国特許出願公開第２００８／０１４５４１７号、米国特許出願公開第２００９／００５３３０８号、米国特許第８，０４３，６３０号、米国特許出願公開第２０１１／００５３８６６号、米国特許出願公開第２００９／０１４２３７８号、米国特許出願公開第２００６／００９９２５６号、米国特許出願公開第２００９／０１０４２６４号、米国特許出願公開第２００４／００５２８４６号、米国特許出願公開第２００４／００５３８１７号、米国特許第４，０１３，７８４号、米国特許第５，６９３，３４０号、米国特許出願公開第２０１１／０１５９０９３号、米国特許出願公開第２００９／０２１４６４０号、米国特許第５１３３９７４号、米国特許第５０２６５５９，号、米国特許出願公開第２０１０／０１６６８６４号、米国特許出願公開第２００２／０１１０５９５号、米国特許出願公開第２００７／０１４８１５３号、米国特許出願公開第２００９／０２２０６１１号、米国特許出願公開第２０１０／０２５５０８７号、及び米国特許出願公開第２００９／００４２８８９号が挙げられ、これらのそれぞれが引用することで本明細書の一部をなす。経口投与された場合に徐放性の活性剤を処方するため使用され得る技術の他の例としては、限定されないが、米国特許第５，００７，７９０号、同第４，４５１，２６０号、同第４，１３２，７５３号、同第５，４０７，６８６号、同第５，２１３，８１１号、同第４，７７７，０３３号、同第５，５１２，２９３号、同第５，０４７，２４８号及び同第５，８８５，６１６号が挙げられる。
【０１７２】
患者集団
抗がん化学療法または放射線療法を受ける前に、化学療法及び／または放射線療法を受けている患者に、胃腸組織等の分裂細胞を含む非がん組織のｃＧＭＰレベルを上昇させて、分裂細胞に対する非特異的毒性による有害な副作用からそれらの組織を保護するための組成物を提供することができる。化学療法及び／または放射線が存在している間、ｃＧＭＰのレベルの上昇が維持される。非がん細胞のｃＧＭＰレベルを上昇させることにより、個々の患者は、化学療法や放射線に伴う毒性の低下及び副作用の軽減を経験する。非がん細胞への副作用が少ないため、化学療法及び高線量の放射線は許容され得る。
【０１７３】
放射線療法、またはアルキル化剤、代謝拮抗剤、アントラサイクリン、植物アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、及び細胞分裂またはＤＮＡ合成に影響を与え、何らかの形で機能する他の抗腫瘍剤等の１つ若しくは複数の化学療法薬による治療を受けている個人は、放射線及び化学療法は選択的ではなく、がん細胞と同様に正常に分裂する非がん細胞にも影響を与えることから、通常は、正常に分裂している非がん細胞の保護による恩恵を受ける。
【０１７４】
本方法の患者はがんを有する。幾つかの実施形態では、上記個体は、機能性グアニリルシクラーゼＣを欠くがんを有すると特定される。幾つかの実施形態では、機能性グアニリルシクラーゼＣを欠くがんは、機能性グアニリルシクラーゼＣを欠く結腸直腸癌、機能性グアニリルシクラーゼＣを欠く食道癌、機能性グアニリルシクラーゼＣを欠く膵臓癌、機能性グアニリルシクラーゼＣを欠く肝癌、機能性グアニリルシクラーゼＣを欠く胃癌、機能性グアニリルシクラーゼＣを欠く胆管系癌、機能性グアニリルシクラーゼＣを欠く腹膜の癌、機能性グアニリルシクラーゼＣを欠く膀胱癌、機能性グアニリルシクラーゼＣを欠く腎臓癌、機能性グアニリルシクラーゼＣを欠く尿管の癌、機能性グアニリルシクラーゼＣを欠く前立腺癌、機能性グアニリルシクラーゼＣを欠く卵巣癌、機能性グアニリルシクラーゼＣを欠く子宮癌機能性アニリルシクラーゼＣを欠く、肉腫等の腹部及び骨盤の軟組織から群から選択される。幾つかの実施形態では、個体は、機能性ｐ５３を欠くがんを有すると特定される。幾つかの実施形態では、機能性グアニリルシクラーゼＣ及び機能性ｐ５３を欠くがんは、幾つかの実施形態では、がんは機能性ｐ５３を欠く原発性結腸直腸癌である。
【０１７５】
毒性化学療法
アルキル化剤は、解剖治療化学分類法（Ａｎａｔｏｍｉｃａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ＳｙｓＴｅｍ）のＬ０１Ａに分類される。これらの薬剤は、イミダゾール環の７番の窒素原子で、ＤＮＡのグアニン塩基に付着したアルキル基への付着によってＤＮＡに損傷を与えることにより、抗がん剤として機能する。アルキル化剤は正常な細胞に対して毒性があり、抗がん剤として使用すると重篤な副作用を引き起こす可能性がある。古典的なアルキル化剤には、真のアルキル基が含まれ、シクロホスファミド、メクロルテタミンまたはマスタリン（ＨＮ２）、ウラムスチンまたはウラシルマスタード、メルファラン、クロラムブシル、イホスファミジル、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン等のニトロソウレア；ブスルファン等のアルキルスルホネートが挙げられる。チオテパ及びその類縁体は、常にではないが、しばしば古典的であるとされている。アルキル化様プラチナ系化学療法薬は、プラチナ類縁体と呼ばれることもあり、アルキル基を持たないが、それでもＤＮＡに損傷を与える。これらの化合物は、ＤＮＡに配位してＤＮＡ修復を妨げるため、「アルキル化様」と記載されることがある。これらの薬剤はまた、グアニンのＮ７にも結合する。アルキル化様プラチナ系化学療法薬の例としては、シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン、トリプラチン、及び四硝酸塩が挙げられる。プラチナ薬剤は非古典的であると説明されることもあるが、より典型的には、非古典的アルキル化剤にはプロカルバジン及びアルトレタミンが含まれる。テトラジン（ダカルバジン、ミトゾロミド、テモゾロミド）もこのカテゴリに含まれることがある。
【０１７６】
代謝拮抗剤は、ＡＴＣシステムのＬ０１Ｂに分類される。代謝拮抗剤は、正常な代謝の一部である代謝産物の使用を阻害する有毒な化学物質であるため、ＤＮＡ生成、したがって細胞分裂及び腫瘍の増殖を妨げることによって、細胞増殖及び細胞分裂を停止させる。代謝拮抗剤は、正常な分裂細胞及びがん細胞に対して毒性があり、抗がん剤として使用した場合、深刻な副作用を引き起こす可能性がある。代謝拮抗薬としては、アザチオプリン、メルカプトプリン、チオグアニン、フルダラビン、ペントスタチン、及びクラドリビン等のプリン類縁体；５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、チミジル酸シンターゼ阻害剤、トロクスウリジン、及びシトシンアラビノシド（シタラブ）等のピリミジン類縁体；並びにメトトレキサート、トリメトプリム、ピリメタミン、ペメトレキセド、ラルチトレキセド、及びプララトレキサート等の抗葉酸薬が挙げられる。
【０１７７】
アントラシジンは、ストレプトマイセス属細菌に由来する抗がん剤の一種である。アントラサイクリンの作用機構には、ＤＮＡ／ＲＮＡ鎖の塩基対間にインターカレートすることによるＤＮＡ及びＲＮＡ合成の阻害が含まれるため、急速に増殖するがん細胞の複製；トポイオソメラーゼＩＩ酵素の阻害；スーパーコイルＤＮＡの弛緩を防止し、ＤＮＡの転写及び複製を阻止して、ＤＮＡ及び細胞膜に損傷を与える鉄媒介遊離酸素ラジカルの生成を防止する。アントラサイクリンの例としては、ダウノルビシン（ダウノマイシン）、リポソームダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、リポソームドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、バルルビシン、及びアントラサイクリン類縁体ミトキサントロンが挙げられる。
【０１７８】
微小管機能を阻害することにより細胞分裂を阻止するアルカロイドは抗がん剤として有用である。微小管は細胞分裂に必要なことから、それらの形成を防ぐことは細胞分裂の発生を防ぐ。ビンカアルカロイドは、ＡＴＣシステムのＬ０１ＣＡに分類され、チューブリンに結合し、細胞周期のＭ期における微小管の集合を阻害する。ビンカアルカロイドとしては、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビオレルビン及びビンデシンが挙げられる。ビンカアルカロイドに類似するコルセミド及びノコダゾールは、抗有糸分裂剤と抗微小管剤の薬物である。ＡＴＣシステムでＬ０１ＣＢに分類されるポドフィロトキシンは、他の２つの細胞増殖抑制薬、エトポシドとテニポシドを生成するために使用される植物由来の化合物であり、細胞がＧ１期（ＤＮＡの複製の開始）及びＳ期（ＤＮＡの複製）に入るのを防ぐ。ＡＴＣシステムでＬ０１ＣＤに分類されるタキサンには、タキサンまたはパクリタキセル（タキソール）が含まれる。ドセタキセルはパクリタキセルの半合成類縁体である。タキサンは微小管の安定性を高め、後期の染色体の分離を防ぐ。
【０１７９】
幾つかのトポイソメラーゼ阻害剤は、ＡＴＣシステムのＬ０１ＣＢに分類されており、ＤＮＡスニッパーコイルの維持に重要な役割を果たすトポイソメラーゼ酵素を阻害する。適切なＤＮＡスーパーコイリングを混乱させることにより、Ｉ型またはＩＩ型のトポイソメラーゼの阻害は、ＤＮＡの転写と複製の両方を妨げる。Ｉ型トポイソメラーゼ阻害剤の例としては、カンプトテシン：イリノテカン及びトポテカンが挙げられる。ＩＩ型阻害剤の例としては、天然に存在するアルカロイド、エピポドフィロトキシンの半合成誘導体である、アムサクリン、エトポシド、リン酸エトポシド、及びテニポシドが挙げられる。
【０１８０】
他の抗腫瘍性化合物は、フリーラジカルを生成することによって機能する。例としては、ブレオマイシン（Ｌ０１ＤＣ０１）、プリカマイシン（Ｌ０１ＤＣ０２）、マイトマイシン（Ｌ０１ＤＣ０３）等の細胞毒性抗生物質が挙げられる。
【０１８１】
毒性放射線
放射線療法は、光子または荷電粒子を使用してがん細胞のＤＮＡを損傷する。損傷は、ＤＮＡ鎖を構成する原子を直接的または間接的に電離することである。間接電離は、水のイオン化の結果として起こり、フリーラジカル、特にヒドロキシルラジカルを形成し、それがＤＮＡに損傷を与える。ＤＮＡへの直接的な損傷は、プロトン、ホウ素、炭素、ネオンのイオン等の高ＬＥＴ（線形エネルギー移動）荷電粒子を通じて発生し、これらの粒子はほとんどが、直接エネルギー移動を介して作用して通常、二本鎖ＤＮＡの切断をもたらすことから、腫瘍の酸素供給とは無関係に抗腫瘍効果を有する。従来の外部ビーム放射線療法は、線形加速器マシンを使用して２次元ビームを介して行われる。定位放射線は、非常に詳細なイメージングスキャンを使用して明確な腫瘍を標的とする集束放射線ビームを使用する、特殊なタイプの外部ビーム放射線療法である。
【０１８２】
放射線治療で使用される放射線に加えて、事故または放射性物質の故意の放出の結果等、個体が意図せずに大量の放射線に曝された場合、ＧＩ症候群及び放射線病を発生する可能性がある。かかる事象では、腸細胞への損傷を減らし、ＧＵＩ症候群及び／または放射線病を防ぐのに十分な期間にわたりＤＮＡ損傷の感知及び修復を増強することにより、胃腸細胞の細胞増殖を停止する及び／またはゲノムの完全性を維持するのに十分な胃腸細胞の細胞内ｃＧＭＰレベルを上昇させるのに十分な胃腸細胞のｃＧＭＰレベルを上昇させる化合物を投与することにより、ＧＩ症候群及び放射線病を防ぐことができる。幾つかの実施形態では、ｃＧＭＰレベルを上昇させる化合物を、放射線への曝露の直後から、または緊急作業員の場合は高レベルの放射線の領域に入る前に投与することができる。幾つかの実施形態では、ｃＧＭＰレベルを上昇させる化合物は、放射線病の症状を経験している個体に投与され得る。
【０１８３】
正常に分裂する非がん性腸細胞の保護
正常に分裂する非がん性腸細胞の保護は、ｃＧＭＰレベルの上昇によって達成することができる。正常に分裂している非がん性腸細胞におけるｃＧＭＰレベルの上昇は、ｃＧＭＰレベルの上昇を達成するのに十分な量の１つまたは複数の化合物の投与によって達成され得る。１つまたは複数の化合物は、毒性化学療法及び／または放射線への曝露前及び曝露中に、ｃＧＭＰを高いレベルで維持するのに十分な量及び頻度で腸細胞に送達される。
【０１８４】
幾つかの実施形態では、ｃＧＭＰを上昇させる化合物は、細胞上に存在する細胞受容体との相互作用を通じてそれを行う。ＧＣＣアゴニストは、受容体を活性化するために、腸細胞によって発現されたＧＣＣと接触するアゴニストを提供する経路によって送達され得る。幾つかの実施形態では、ｃＧＭＰレベルを上昇させる化合物は、他の手段によって細胞によって取り込まれてもよい。例えば、特定のＰＤＥまたはＭＲＰのアイソフォームを含む細胞は、使用される阻害化合物を示し得る。例えば、ＰＤＥ５を発現する細胞はＰＤＥ５阻害剤の使用により保護されるのに対し、ＭＲＰ５を発現する細胞はＭＲＰ５阻害剤の使用により保護される。かかる実施形態では、化合物を、それらが細胞によって取り込まれることができるような任意の経路によって投与することができる。
【０１８５】
細胞への送達のメカニズムに関係なく、がん細胞がｃＧＭＰレベルの上昇によって保護されるタイプであり、使用される化合物がかかる細胞に影響を及ぼし得る場合、用量及び送達経路はがん細胞による取り込みを最小限にすることが好ましい。ＧＣＣアゴニストを使用して正常な腸細胞においてｃＧＭＰレベルを増加させる実施形態では、腸への経口送達が好ましい。腸に到達する前に、化合物を分解または取り込みから保護する必要がある。ＧＣＣの多くの既知のペプチドアゴニストは、胃の酸性環境で安定であり、胃を通過して腸に至るまで、活性型で生存する。幾つかの化合物は、腸溶性コーティングが必要な場合がある。腸内膜の細胞におけるＧＣＣ発現の場合、例えば経口投与または直腸投与による腸の内部への局所送達によるＧＣＣアゴニストの送達は、腸組織のタイトジャンクションがほとんどのＧＣＣアゴニストの直接通過を妨げることから、腸の外側の細胞がＧＣＣアゴニストに曝露されないという点で特に有用である。
【０１８６】
分裂している非がん性腸細胞においてｃＧＭＰレベルを上昇させる化合物の送達の量及び期間は、毒性化学療法及び放射線への曝露前及び曝露中に保護レベルまで上昇したレベルを維持するのに十分である。その結果、ｐ５３が媒介する細胞の生存を通じて十分な数のかかる細胞を保護して、副作用の重症度を効果的に軽減させ、及び／または致死的となることなく、望ましくない若しくは許容できないレベルの副作用を引き起こすことなく、使用する化学療法及び放射線のレベルを上げることができる。
【０１８７】
幾つかの実施形態では、ｃＧＭＰレベルを増加させる１つまたは複数の化合物は、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内または皮下の注射等による非経口投与に適した注射用医薬組成物として製剤化される。したがって、上記組成物は、注射用製品に必要な構造的／物理的特性を有する無菌の発熱物質を含まない製剤であり、すなわち、それは、純度、ｐＨ、等張性、無菌性、及び粒子状物質について、当業者に認識されている周知の基準を満たしている。
【０１８８】
一部の好ましい実施形態では、ｃＧＭＰレベルを上昇させる１種または複数の化合物を経口または直腸投与し、組成物を経口または直腸投与に適切な医薬組成物として製剤化する。ｃＧＭＰレベルを上昇させる１種または複数の化合物を提供する一部の実施形態を、経口投与に適切であるように提供し、かつ持続放出のために製剤化する。ｃＧＭＰレベルを上昇させる１種または複数の化合物を提供する一部の実施形態を、経口投与に適切であるように提供し、かつ小腸で活性薬剤を放出するために腸溶コーティングにより製剤化する。腸溶製剤は、米国特許第４，６０１，８９６号、米国特許第４，７２９，８９３号、米国特許第４，８４９，２２７号、米国特許第５，２７１，９６１号、米国特許第５，３５０，７４１号、及び米国特許第５，３９９，３４７号に記載されている。経口及び直腸製剤は、参照により本明細書の一部をなすＲｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９０，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ  Ｐａ．において教示されている。
【０１８９】
代替の実施形態は、ｃＧＭＰレベルを上昇させる１種または複数の化合物の持続的な送達をもたらす持続放出製剤及び埋め込みデバイスを含む。一部の実施形態では、ｃＧＭＰレベルを上昇させる１種または複数の化合物を局所、髄腔内、脳室内、胸膜内、気管支内、または頭蓋内投与する。
【０１９０】
一般に、ｃＧＭＰレベルを上昇させる１種または複数の化合物は、細胞が毒性の化学療法または放射線に暴露される可能性がある期間中に、ｃＧＭＰレベルを上昇させるために、持続時間量にわたって十分なレベルで存在しなければならない。一般に、十分な量の、ｃＧＭＰレベルを上昇させる１種または複数の化合物を最初に、及び／または多くの場合に、全期間にわたって患者が毒性の化学療法または放射線に暴露されるわけではないとしても、ｃＧＭＰレベルの上昇を維持するために十分な濃度を維持するために持続投与により投与しなければならない。ｐ５３媒介性細胞の生存を増強するために十分なｃＧＭＰレベルの上昇が、少なくとも約６時間にわたって、好ましくは少なくとも約８時間にわたって、より好ましくは少なくとも約１２時間、一部の実施形態では少なくとも１６時間、一部の実施形態では少なくとも２０時間、一部の実施形態では少なくとも２４時間、一部の実施形態では少なくとも３６時間、一部の実施形態では少なくとも４８時間、一部の実施形態では少なくとも７２時間、一部の実施形態では少なくとも９６時間、一部の実施形態では少なくとも１週間、一部の実施形態では少なくとも２週間、一部の実施形態では少なくとも３週間、及び最高約４週間またはそれ以上にわたって維持されることが好ましい。副作用の重症度を低下させ、及び／または化学療法薬または放射線の許容される用量を増加させ得るように、投薬量及び投与が、ｐ５３媒介性細胞生存を増強するために十分な時間にわたって十分な量で、ｃＧＭＰレベルを上昇させるために十分であることは重要である。投薬量は、特定の作用物質の薬力学的特徴、及びその投与様式及び経路；受容者の年齢、健康、及び体重；症状の性質及び規模、同時治療の種類、治療頻度、ならびに所望の効果などの既知の因子に応じて変化する。
【０１９１】
一部の実施形態では、配列番号２、３または５〜６０を有するペプチドなどのＧＣＣアゴニストを個体に投与する。前記方法を実施する際には、化合物を単独で、または他の化合物と組み合わせて投与することができる。前記方法では、化合物を好ましくは、選択された投与経路及び標準的な薬務に基づき選択される薬学的に許容される担体と共に投与する。前記方法で使用される化合物の１日投薬量は、１日あたり約１マイクログラムから約１０グラムの範囲であることが企図される。一部の好ましい実施形態では、化合物の１日投薬量は、１日あたり約１０ｍｇから約１グラムの範囲である。一部の好ましい実施形態では、化合物の１日投薬量は、１日あたり約１００ｍｇから約５００ｍｇの範囲である。本発明である方法で使用される化合物の１日投薬量は、体重１ｋｇあたり約１μｇから約１００ｍｇ、一部の実施形態では、体重１ｋｇあたり約１μｇから約４０ｍｇ；一部の実施形態では、１日あたり体重１ｋｇあたり約１０μｇから約２０ｍｇ、及び一部の実施形態では、１日あたり体重１ｋｇあたり１０μｇから約１ｍｇの範囲であることが企図される。医薬組成物を、単回投薬量で、分割投薬量で、または持続放出で投与することができる。一部の好ましい実施形態では、化合物を１日あたり複数回の用量で投与する。一部の好ましい実施形態では、化合物を１日あたり３〜４回の用量で投与する。化合物を投与する方法には、医薬組成物として、経口で、カプセル剤、錠剤、及び散剤などの固体剤形で、またはエリキシル剤、シロップ剤、及び懸濁剤などの液体剤形での投与が含まれる。化合物を、ゼラチンカプセルに入れるための、または錠剤に成型するためのラクトース、スクロース、マンニトール、デンプン、セルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、及びステアリン酸などの粉末化担体と混合することができる。錠剤及びカプセル剤は両方とも、ある期間にわたって薬物を持続放出させるための持続放出製品として製造することができる。圧縮錠剤を糖衣またはフィルムコーティングして、何らかの不快な味をマスキングする、及び錠剤を大気から保護することができるか、または消化管での選択的分解のために腸溶コーティングすることができる。一部の好ましい実施形態では、化合物を経口送達し、化合物を、胃を通過して腸管に入ると、好ましくは大腸に入ると利用可能なものにする腸溶コーティングでコーティングする。参照により本明細書の一部をなす米国特許第４，０７９，１２５号は、本発明の方法で有用な腸溶コーティングされた本発明の化合物を調製するために使用することができる腸溶コーティングを教示している。経口投与のための液体剤形は、水、緩衝剤または生理食塩水などの薬学的に許容される希釈剤に加えて、患者の受容を増加させる着色剤及び香味剤を含有してよい。非経口投与では、化合物を、水、油、生理食塩水、水性デキストロース（グルコース）、及び関連糖溶液、及びプロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどのグリコールなどの適切な担体または希釈剤と混合してよい。非経口投与用の液剤は好ましくは、化合物の水溶性塩を含有する。安定化剤、酸化防止剤及び防腐剤も添加してよい。適切な酸化防止剤には、亜硫酸水素ナトリウム、���硫酸ナトリウム、ならびにアスコルビン酸、クエン酸及びその塩、ならびにＥＤＴＡナトリウムが含まれる。適切な防腐剤には、塩化ベンザルコニウム、メチル−またはプロピル−パラベン、及びクロロブタノールが含まれる。
【０１９２】
一部のがんにおける増感活性
上述のとおり、ｃＧＭＰは、肺、乳房、前立腺、結腸直腸、及び肝臓癌細胞を含む様々ながん細胞において、化学療法または放射線療法によるＤＮＡ損傷に応答した細胞死を促進する。小腸における細胞死に対するｃＧＭＰの組織特異的効果を考慮すると、化学療法または放射線療法と併せた腸管細胞におけるｃＧＭＰの増加は、ＧＩ副作用を減少させ、場合によっては、肺、乳房、前立腺、結腸直腸、及び肝臓癌についての治療効力を強化し得る。
【０１９３】
ｃＧＭＰレベルが上昇した場合に、化学療法または放射線療法誘発細胞死に対して、より感受性があるようになる種類のがんの治療において、ｃＧＭＰを上昇させる化合物を、がん細胞を死滅させる化学療法及び放射線療法の有効性を上昇させるために十分な化合物をがん細胞に送達するような用量で、及び投与経路により投与することができる。一部の実施形態では、化合物は、ｐ５３媒介性細胞生存により化学療法または放射線療法から非がん細胞を保護しながら、がん細胞における化学療法または放射線療法誘発細胞死を強化し得る。
【０１９４】
他の細胞型
一部の実施形態では、正常な非分裂細胞は、ｃＧＭＰの上昇がｐ５３媒介性細胞生存を増強し得る他の種類の細胞であってよい。一部の実施形態では、正常な非分裂細胞は、毛包、皮膚、肺、鼻腔、他の粘膜または口腔内の組織であってよい。化合物を頭皮に、または口、舌、歯肉、及び頬側組織を含む口腔の組織に局所送達することができ、好ましくは最小限の全身取り込みを伴う局所取り込みのために製剤化することができる。化合物を吸入デバイス及び／または鼻噴霧を使用して送達することができ、好ましくは、最小限の全身取り込みを伴う局所取り込みのために製剤化することができる。同様に、他の粘膜細胞など、または皮膚細胞などの正常な非がん分裂細胞においてｃＧＭＰレベルを上昇させる化合物を、優先的取り込みのために製剤化することができ、かつそのような細胞に直接的に送達することができる。そのような送達には、眼内、膣内、尿道内、直腸／肛門または局所が含まれ得る。
【０１９５】
ｃＧＭＰの上昇によるｐ５３媒介性細胞生存により保護され得る非がん分裂細胞においてｃＧＭＰレベルを上昇させる化合物の量及び送達期間は、毒性の化学療法及び放射線への暴露前及び暴露中に、保護レベルまでレベルを上昇させたままにするために十分なものである。結果は、ｐ５３媒介性細胞生存により十分な数のそのような細胞を保護して、副作用の重症度を効果的に低下させること、及び／または致死的であるか、または望ましくない、もしくは許容不可能なレベルの副作用をもたらすことなく、より高レベルの化学療法及び放射線の使用を可能にすることである。
【実施例】
【０１９６】
実施例１
治療用放射線及び遺伝毒性化学療法薬は、がん治療の医療装備の一部である。これらの遺伝毒性作用物質は一般に、正常組織に対する損傷により、それらの用量が限定される。本発明者らは、細胞シグナル伝達分子の環状ＧＭＰがｐ５３依存性機構により細胞に対する遺伝毒性損傷を阻止することができることを発見した。したがって、本発明者らは、ＧＵＣＹ２Ｃ陰性である、または変異ｐ５３を担持するかのいずれかである腫瘍を同定することにより、放射線または化学療法での結腸直腸腫瘍の治療を改善する方法を記載する。これらの腫瘍では、ＧＵＣＹ２Ｃ活性化作用物質（例えば、ＳＴ、リナクロチド（配列番号５９、プレカナチド配列番号６０）を使用して、遺伝毒性作用物質（例えば、放射線、化学療法）の治療効力に影響を及ぼすことなく、正常な腸管上皮細胞を助けることができる。この方法では、より多い用量の遺伝毒性療法を、正常組織の損傷をもたらすことなく、腫瘍を死滅させるために適用することができる。加えて、本明細書では、遺伝毒性作用物質を、組織において環状ＧＭＰを上昇させる作用物質（例えば、酸化窒素、ナトリウム利尿ペプチド、ホスホジエステラーゼ阻害薬）と組み合わせて使用し、野生型ｐ５３を有する正常組織を助けながら、これらの作用物質の治療量を増加させることで、腸管外腫瘍治療を、変異ｐ５３を有する腫瘍について改善する方法を提供する。
【０１９７】
現在、腫瘍を選択的に死滅させ、ただし正常組織を選択的に助けることを可能にする細胞保護作用物質は存在しない。この発見が、この特有の選択性を達成するための環状ＧＭＰの細胞保護効果、及び野生型ｐ５３に対するその依存性に対する特有の洞察に影響を及ぼしている。現在、抗腫瘍治療に対する最大の限界の１つは、治療ウィンドウ、すなわち、腫瘍を死滅させる用量と正常な組織を死滅させる用量との間の差である。本発明は、治療ウィンドウを改善する機会を提供するものである。
【０１９８】
一部の実施形態では、小腸で生じる腫瘍では、それらがＧＣＣについて陰性であるか、またはｐ５３についての変異体であれば、ＧＣＣ（ＧＵＣＹ２Ｃとも称される）リガンドを使用して、正常な腸管上皮細胞において抵抗性を生じさせるが、腫瘍においては遺伝毒性作用を維持する。これは、遺伝毒性療法の治療ウィンドウを改善する。
【０１９９】
一部の実施形態では、小腸の外側で生じ、かつｐ５３に変異を担持する腫瘍のために、組織において環状ＧＭＰを上昇させる作用物質（例えば、酸化窒素生成作用物質、ナトリウム利尿ペプチド及び類似体、ホスホジエステラーゼ阻害薬）を使用して、遺伝毒性療法での治療ウィンドウを改善するが、これは、腫瘍細胞の死滅は可能にするが、正常組織は助けるであろう。
【０２００】
治療ウィンドウは、ほぼすべての腫瘍細胞治療パラダイムの律速因子である。
【０２０１】
高線量の電離放射線は、胃腸（ＧＩ）管の上皮細胞の急性損傷を惹起し、がんにおいては放射線の治療効力を制限する毒性を、かつ放射線災害においては罹患及び死亡を媒介する。承認されている予防法または治療は存在せず、一部では、急性放射線誘発ＧＩ症候群（ＲＩＧＳ）に寄与する機構の不完全な理解を反映している。グアニル酸シクラーゼＣ（ＧＵＣＹ２Ｃ）及びそのホルモンであるグアニリン及びウログアニリンが最近になって、変異、化学的、及び炎症性損傷に対して腸管粘膜完全性を防御するパラクリン軸の１つとして出現している。本明細書において、本発明者らは、ＲＩＧＳに対抗する補償機構におけるＧＵＣＹ２Ｃパラクリン軸の役割を明らかにする。ＧＵＣＹ２Ｃシグナル伝達の除去はＲＩＧＳを悪化させ、放射線誘発死亡、体重減少、粘膜出血、衰弱及び腸管機能障害を増幅する。その状況において、ＲＩＧＳを誘発する致死的照射後に、腸管上皮細胞によるＧＵＣＹ２Ｃ、グアニリン及びウログアニリンｍＲＮＡ及びタンパク質の永続的な発現が保存された。さらに、外因性ＧＵＣＹ２Ｃリガンドである耐熱性腸毒素（ＳＴ）の経口送達が、ＲＩＧＳに対抗したが、プロセスは、ＭＤＭ２からの分離により媒介されるｐ５３活性化を必要とした。次いで、ｐ５３活性化は、アポトーシスではなく、分裂期細胞死を選択的に制限することにより、細胞死を阻止した。これらの研究は、ＲＩＧＳに対抗する新規の補償機構としてのＧＵＣＹ２Ｃパラクリンホルモン軸の役割を明らかにしている。これらは、がん治療及び放射線災害においてＲＩＧＳを予防及び治療するための経口ＧＵＣＹ２Ｃアゴニスト（Ｌｉｎｚｅｓｓ（商標）；Ｔｒｕｌａｎｃｅ（商標））の可能性を強調している。
【０２０２】
序論
テロ攻撃または天災の状況での放射線への暴露は、急性放射線誘発ＧＩ症候群（ＲＩＧＳ）を構成する胃腸（ＧＩ）管に対する毒性を反映して、約１０日以内での死亡をもたらす（１〜３）。骨髄移植により死亡を阻止することができる放射線誘発骨髄毒性とは対照的に、ＲＩＧＳを予防または治療するための承認された管理パラダイムは存在しない（４）。重要なことに、放射線療法は、全世界で主要な死因であるがんの管理における主力であり続けている。
【０２０３】
放射線療法は、増殖中のがん細胞を、さらに毛包、骨髄、ＧＩ管、さらには他の腺上皮を含む連続的な再生プログラムにより特徴づけられる正常組織をも避けがたく、迅速に破壊する（５）。その状況において、放射線の用量制限毒性が、患者に治療の完了をあきらめさせる；最大用量の放射線を制限して、治療の有効性を限定する；ならびに慢性罹患及び死亡をもたらし得る（５）。不十分な管理は一部では、ＲＩＧＳの根底にある機構の不完全な理解を反映している。実際に、ＲＩＧＳの根底にある上皮毒性を媒介する決定的な分子機構及び細胞標的が問題であり続けている（６〜１４）。最近の研究は、腸管上皮細胞中のｐ５３が主に、アポトーシスとは独立に、マウスにおいて放射線誘発ＧＩ毒性を制御していることを示唆している（７）。その状況において、腸管内皮または上皮細胞からの内因性アポトーシス経路の削除は、ＧＩ毒性関連死からのマウスの保護に失敗した（７）。
【０２０４】
対照的に、腸管上皮細胞ｐ５３の組織特異的標的化削除は、マウスにおいて、ＲＩＧＳを悪化させるが、その過剰発現はＲＩＧＳを救済する（７、１４）。しかしながら、放射線誘発腸管上皮細胞の死及び腸管粘膜損傷の根底にある機構は、定義されないままである（７）。ＧＵＣＹ２Ｃは、内因性パラクリンホルモンのグアニリン（ＧＵＣＡ２Ａ）及びウログアニリン（ＧＵＣＡ２Ｂ）ならびに下痢原性細菌により産生される耐熱性腸毒素（ＳＴ）のための腸管受容体である（１５〜１７）。このシグナル伝達軸は、粘膜生理学、液体及び電解質分泌の調節（１５、１６）において、ならびに陰窩表面恒常性の協調、腸細胞増殖、分化、代謝、アポトーシス、ＤＮＡ修復、及び上皮−間葉クロストークの調節（１８〜２０）において中心的な役割を果たす。さらに、この軸は腸管関門を維持し、発がん因子、炎症、及び放射線により誘発される上皮損傷に対抗し、かつその機能障害は、炎症性腸疾患及び腫瘍形成の病態生理に寄与する（１９〜３０）。ＧＵＣＹ２Ｃシグナル伝達軸が、腸管上皮完全性の保護者の１つとして出現しているものの、致死的放射線に応じたこの軸の役割、ならびにＲＩＧＳを予防及び治療するための治療標的としてのその有用性は不明確なままである（２２）。
【０２０５】
本明細書で、本発明者らは、ＲＩＧＳに対抗する補償応答におけるＧＵＣＹ２Ｃパラクリンホルモン軸の新規の役割を定義する。実際に、ＧＵＣＹ２Ｃシグナル伝達の除去は、放射線誘発ＧＩ毒性を増幅する。その状況において、ＲＩＧＳを誘発する高線量の放射線後に、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＧＵＣＡ２Ａ、及び  ＧＵＣＡ２Ｂ  ｍＲＮＡ及びタンパク質の永続的な発現が保存される。さらに、ＧＵＹＣ２ＣリガンドＳＴの経口投与は、アポトーシスからではなく、分裂期細胞死から選択的に腸管上皮細胞を救済することと関連するｐ５３依存性機構により、ＲＩＧＳに対抗する。これらの観察は、ＲＩＧＳに対抗するＧＵＣＹ２Ｃパラクリン軸によるシグナル伝達を伴う、高線量放射線により誘発される上皮損傷に対する、以前には認識されていなかった補償機構を明らかにしている。これらは、がん放射線療法または原子力事故もしくはテロリズムによる環境曝露の状況においてＲＩＧＳを予防及び治療するための経口ＧＵＣＹ２Ｃ標的化作用物質の可能性を強調している。これらのアプローチを直ちに変換する機会は、慢性便秘を治療するリナクロチド（Ｌｉｎｚｅｓｓ（商標））及びプレカナチド（Ｔｒｕｌａｎｃｅ（商標））、経口ＧＵＣＹ２Ｃリガンドの最近の規制当局の承認により強調される（３１）。
【０２０６】
物質及び方法
動物モデル
ＧＵＣＹ２Ｃの標的化生殖細胞系欠失を有するマウス（Ｇｕｃｙ２ｃ−／−）はよく特徴づけられており、Ｃ５７ＢＬ／６背景への戻し交配の１４世代以降後に使用した（１５、１６、１８〜２０、２６、３２）。ｐ５３ＦＬ−ｖｉｌ−Ｃｒｅ−ＥＲＴ２マウスを、ｖｉｌ−Ｃｒｅ−ＥＲＴ２（Ｓ．  Ｒｏｂｉｎｅ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｃｕｒｉｅ−ＣＮＲＳ、Ｆｒａｎｃｅが供給）をｐ５３ＦＬ遺伝子導入マウス（混合ＦＶＢ．１２９及びＣ５７ＢＬ／６背景、Ｄｒ，Ｋａｒｅｎ  Ｋｎｕｄｓｅｎ、Ｔｈｏｍａｓ  Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡが厚意で提供）と異種交配することにより生産した。腸管上皮細胞におけるｐ５３の二対立遺伝子欠損（ｐ５３ｉｎｔ−／−）を、タモキシフェン（タモキシフェン７５ｍｇ／ｋｇ／ｄ×５ｄ）をＦ２  ｐ５３ＦＬ−ｖｉｌ−Ｃｒｅ−ＥＲＴ２及び対照同腹子ｐ５３＋−ｖｉｌ−Ｃｒｅ−ＥＲＴ２にＩＰ投与することにより誘発し、欠失を、リン酸化ｐ５３のイムノブロット分析により構造的に、かつ放射線誘発死亡により機能的に確認した。すべての実験を２〜３．５か月齢であるマウス（雌雄混合）で実施し、すべてのマウスは、上記のとおりの混合した遺伝的背景上にあった。適切な場合には、年齢適合同腹子対照を利用して、遺伝的背景の作用を最小限にした。経口ＳＴまたは対照ペプチド補充研究で使用したＣ５７ＢＬ／６マウスはＮＩＨ（ＮＣｌ−Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ）から入手した一方で、ＧＵＣＹ２Ｃ及びリガンド発現分析のために使用したマウスはＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から入手した。この研究は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  Ｔｈｏｍａｓ  Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（プロトコル０１５１８）により承認された。
【０２０７】
ガンマ線照射誘発ＧＩ毒性
麻酔をかけたマウスに、全身ガンマ線照射（ＴＢＩ）を、またはリードカバーで後肢から尾及び前肢から頭部を遮蔽して部分的身体照射（ＳＴＢＩ）を、暴露した腹部領域（剣状突起から恥骨結合まで約１インチ２）で照射した。マウスに、１３７Ｃｓ照射器（Ｇａｍｍａｃｅｌｌ４０）で、約７０ｃＧｙ／分の線量率で８〜２５Ｇｙ／マウスの種々の線量を照射した。マウスは、照射の前後に、通常の食事及び水を自由に摂取することができた。ＧＩ毒性の重症度を死亡率、衰弱（毛皮の乱れ）、体重、眼にみえる下痢、便潜血、糞便形成、糞便水蓄積、及び病理組織学により評価した。
【０２０８】
ＳＴ及び対照ペプチド
ＳＴ１−１８及び対照ペプチド（ＣＰ；不活性なＳＴ類似体は同じ一次アミノ酸配列を含有するが、５、６、９、１０，１４、１７位のシステインがアラニンにより置き換えられている）をＢａｃｈｅｍ  Ｃｏ．から購入した（顧客注文；純度＞９９．０％）。ＳＴ及び対照ペプチドを１倍リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に５０ｎｇ／μＬの濃度で再懸濁した。マウスに、１０μｇのＣＰまたはＳＴ（溶液２００μＬ）を、経口ゾンデ（ｃａｔ．＃０１−２０８−８８、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（２６）を使用して毎日、照射の前に１４日間、及び照射の後に１４日間にわたって強制経口投与した。ＳＴ及びＣＰを固相合成により調製し、逆相ＨＰＬＣにより精製し、それらの構造をＢａｃｈｅｍ  Ｃｏ．（顧客注文；純度＞９９．０％）が質量分析法により確認し、それらの活性を乳飲みマウスアッセイにおいて競合リガンド結合、グアニル酸シクラーゼ活性化及び分泌を定量化することにより確認した（１６、３３）。
【０２０９】
試薬
１０％ウシ胎児血清及び細胞培養のための他の試薬を含有するマッコイ５Ａ及びダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）はＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手した。８−ブロモグアノシン３’，５’−環状モノホスファート（８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ）、ｃＧＭＰの細胞透過性類似体はＳｉｇｍａ（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から入手し、５００μＭをすべての実験（１８、２０、２５、２６、３４）で使用した。
【０２１０】
細胞株
Ｃ５７ＢＬ／６由来ＥＬ４リンパ腫細胞（マウス胸腺のリンパ芽球；胸腺腫）及びＣ５７ＢＬ／６由来Ｂ１６黒色腫細胞はＡＴＣＣから入手した。ＧＵＣＹ２Ｃ（（１９、３４、３５）を欠損したＨＣＴＴ１６（野生型ｐ５３）ヒト結腸癌細胞はＡＴＣＣから購入した。同質遺伝子型のＨＣＴ１１６−ｐ５３−ヌル細胞は、Ｄｒ．Ｂｅｒｔ  Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ（Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＭＤ）からの寄贈であった（３６）．
【０２１１】
異所性腫瘍播種及び成長測定
ＥＬ４及びＢ１６細胞（１回の注射あたり１０４細胞）をマウス側腹部に皮下注射した（ＥＬ４を左及びＢ１６を右）。腫瘍成長を３日に１回測定し、腫瘍体積を、３つの腫瘍寸法を掛けることにより計算した。ＣＰと比較して、ＳＴで治療されたマウスでは、部分的身体照射の前後で、腫瘍成長に有意な差は観察されなかった。
【０２１２】
イムノブロット分析
タンパク質をマウス小腸及び結腸粘膜からＴ−Ｐｅｒ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ）に、またはインビトロ細胞溶解産物からＬａｅｍｍｌｉバッファーに抽出し、かつプロテアーゼ及びホスファターゼ阻害薬（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を補充した。Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）製のリン酸化ヒストンＨ２ＡＸ（ｃａｔ．＃２５７７、１：２００希釈）、リン酸化ｐ５３（ｃａｔ．＃９２８４，１：２００希釈）、切断カスパーゼ３（ｃａｔ．＃９５７９、１：２００希釈）、Ｍｄｍ２（ｃａｔ．＃３５２１、１：２００希釈）、及びＧＡＰＤＨ（ｃａｔ．＃２１１８、１：２００希釈）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）製のリン酸化ヒストンＨ２ＡＸ（ｃａｔ＃０５−６３６，１：１０００希釈）、及びＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）製のｐ５３（ｃａｔ．＃ｓｃ−１２６，１：１．０００希釈）に対する抗体を使用して、タンパク質をイムノブロット分析により定量化した。ＧＵＣＹ２Ｃに対する抗体は以前に検証された（２５、２６）。ＧＵＣＡ２Ａ及びＧＵＣＡ２Ｂに対する抗血清は、Ｄｒ，Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｇｏｙ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ，Ｃｈａｐｅｌ  Ｈｉｌｌ，ＮＣ）（３７、３８）によって厚意で提供された。ホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲートした二次抗体は、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）製であった。Ｋｏｄａｋイメージングシステムを使用して、デンシトメトリーにより定量化された特異的バンドの染色強度をＧＡＰＤＨでの染色強度に対して正規化した。平均相対強度は、各群の少なくとも３匹の動物の平均及び少なくとも２つの独立した実験の平均を反映している。イムノブロット分析のための分子量マーカー（Ｃａｔ．＃１０７４８０１０、１つのランあたり５μＬ、またはＣａｔ．＃ＬＣ５８００、１つのランあたり１０μＬ）はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）製であった。ヤギ抗マウスＩｇＧ（ｃａｔ．＃１１５−０６５−１７４）及びマウス抗ウサギＩｇＧ（ｃａｔ．＃２１１−０６２−１７１）を含む軽鎖に特異的な二次抗体は、免疫沈降後のイムノブロット分析用で、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓｕｆｆｏｌｋ、ＵＫ）製であった。
【０２１３】
免疫沈降
８〜１０×１０６のＨＣＴ１１６細胞からのタンパク質を、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害薬を補充した１％ＮＰ４０免疫沈降（ＩＰ）溶解バッファーに抽出し、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製のＭｄｍ２に対する抗体（ｃａｔ．＃３５２１、５μｇ）及びＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ製のｐ５３（ｃａｔ．＃ｓｃ−１２６、１μｇ）及びプロテインＡビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）と共に終夜インキュベートし、続いて、６回洗浄した。沈澱したタンパク質を、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害薬（Ｒｏｃｈｅ）を補充したＬａｅｍｍｌｉバッファー（５％ベータメルカプトエタノール含有）に収集し、かつＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製のＭｄｍ２に対する抗体（ｃａｔ＃３５２１、１：２００希釈）及びＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ製のｐ５３（ｃａｔ．＃ｓｃ−１２６、１：１０００希釈）を使用してイムノブロット分析により定量化した。マウスＩｇＧ（５μｇ、ｃａｔ．＃１０４０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びウサギＩｇＧ（５μｇ、ｃａｔ．＃１０４００Ｃ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が、免疫沈降のためのアイソタイプ対照であった。
【０２１４】
免疫組織染色及び免疫蛍光
１０ｍＭクエン酸バッファー、ｐｈ６．０中で１００℃で１０分間にわたって加熱することにより、抗原をパラフィン包埋切片（５μｍ）にアンマスクした。既に記載したものに加えて、ここでプローブされる抗原に対する抗体には、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ製またはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（ｃａｔ．＃０５−６３６，１：１０００希釈）製のリン酸化ヒストンＨ２ＡＸ（ｃａｔ．＃２５７７、１：２００希釈）、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ製の切断カスパーゼ３（ｃａｔ．＃９５７９、１：２００希釈）、及びＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ製のβ−カテニン（ｃａｔ．＃ｓｃ−７１９９、１：５０希釈）が含まれた。ＧＵＣＹ２Ｃに対する抗体（２５、２６）ならびにＧＵＣＡ２Ａ及びＧＵＣＡ２Ｂに対する抗血清は以前に記載された（３７、３８）。蛍光二次抗体は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製であった。チラミドシグナル増幅を使用して、ＧＵＣＹ２Ｃ及びＧＵＣＡ２Ａを検出した；ホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲートした二次抗体はＪａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製であり（ｃａｔ＃１１５−０３５−２０６及び＃１１１−０３６−０４６、１：１０００希釈）、フルオレセイン−コンジュゲートチラミンはチラミンＨＣｌ（ｃａｔ  ＃Ｔ２８７９、Ｓｉｇｍａ）及びＮＨＳ−フルオレセイン（ｃａｔ＃４６４１０、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（３９）から調製した。
【０２１５】
リン酸化ヒストンＨ２ＡＸ陽性細胞を動物１匹あたり切片１つあたり２００〜１０００の陰窩で定量化し、陽性細胞を陰窩数に対して正規化した。結果は、各群で少なくとも３匹の動物での平均±ＳＥＭを反映している。Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ製のα／β−チューブリン（ｃａｔ．＃２１４８、１：２００希釈）及びＡｂｃａｍ製のγ−チューブリン（ｃａｔ．＃ａｂ１１３１７、１：１００希釈、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を含む抗原に対する抗体を使用して、ＨＣＴ１１６及びＨＣＴ１１６ｐ５３−ヌル細胞で、免疫蛍光染色を行った。蛍光イメージを、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ−Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）製のＥＶＯＳ  ＦＬ  ａｕｔｏ  ｃｅｌｌ ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍを用いて取り込んだ。
【０２１６】
細胞処理、照射及びコロニー形成アッセイ
ＨＣＴ１１６及びＨＣＴ１１６  ｐ５３−ヌル細胞を１×１０４細胞／ウェルで６ウェルシャーレにプレーティングし、続いて、ビヒクルまたは細胞透過性ｃＧＭＰ（８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ、５００μＭ）で７日間にわたって処理した。種々の処理剤を含有する培地を１日おきに変えた。放射線（０〜４Ｇｙ）に暴露した後に、細胞をトリプシン処理し、処理剤の効力に応じて種々の密度で６ウェルシャーレにプレーティングした（０、１及び２Ｇｙに暴露されるＨＣＴ１１６では１０４細胞／ウェル；０、１及び２Ｇｙに暴露されるＨＣＴ１１６  ｐ５３−ヌルでは４×１０４細胞／ウェル；３及び４Ｇｙで暴露されるＨＣＴ１１６では５０×１０４細胞／ウェル；３及び４Ｇｙで暴露されるＨＣＴ１１６  ｐ５３−ヌルでは２００×１０４細胞／ウェル）。細胞を、照射後にビヒクルまたは８−Ｂｒ−ｃＧＭＰで７日間にわたって処理し、次いで、固定し、７０％エタノール中１０％メチレンで染色した。＞５０細胞／コロニーとして定義されるコロニーの数をカウントし、生存画分を、照射されなかった細胞により生成されるコロニーの数に対する処理サンプルにおけるコロニーの数の比として計算した。各条件について、３つの独立した実験で、三重反復を用いた
【０２１７】
後期ブリッジ指数（ＡＢＩ）及び異数性
８−Ｂｒ−ｃＧＭＰで事前調整した細胞、または対照細胞に照射し（５Ｇｙ）、次いで、２４ウェルプレートのカバーガラスに播種した（１ウェルあたり５×１０４細胞）。ＡＢＩ及び異数性を照射の２日後に定量化した。
【０２１８】
ＡＢＩ：細胞を４％ＰＦＡ中に固定し、ＤＡＰIで染色した。後期細胞を分析し、異常な後期細胞を蛍光顕微鏡下で計算した。各処理群で、それぞれ独立した実験で、２００個超の後期細胞を分析した。２つの紡錘体極の間の染色体ブリッジングの延長を示す、後期ブリッジまたは後期遅延を有するいずれの異常な後期細胞も数え、ＡＢＩを、全後期細胞に対する異常な後期細胞のパーセンテージとして計算した。
【０２１９】
異数性：細胞を４％ＰＦＡ中に固定し、ＤＡＰＬで染色し、α／β−チューブリン特異的抗体及びセントロメア特異的γ−チューブリン抗体を使用して免疫蛍光染色を行い、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識二次抗体で検出した。画像をレーザー共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  ５１０Ｍ及びＮｉｋｏｎ  Ｃｌ  Ｐｌｕｓ、Ｔｈｏｍａｓ  Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｉｏｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｈａｒｅｄ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ）で取得し、ｚ軸の０．５μｍ光切片を１００×１．３ＮＡ油浸対物レンズで室温で収集した。ＬＳＭ  Ｉｍａｇｅ  Ｂｒｏｗｅｒ（Ｚｅｉｓｓ）を使用して逐次回復を行い、画像は、ｚ軸での３〜４つの集積面を表している。細胞が、２つよりも多い中心体、または極にキネトコアから分離した紡錘体中間帯に対して同じ方向に位置する２つの中心体を含有する場合に、異常な後期染色分体をカウントした。
【０２２０】
定量ＲＴ−ＰＣＲ分析
ＧＵＣＹ２Ｃ、ＧＵＣＡ２Ａ、及びＧＵＣＡ２Ｂでの転写物を、以前に記載されたプライマー及び条件を使用するＲＴ−ＰＣＲにより定量化した（２５、２６）。
【０２２１】
１２５Ｉ標識ＳＴ結合
以前に記載されたとおりに、ＧＵＣＹ２Ｃへの１２５Ｉ標識ＳＴの結合を行った（３３）。簡単に述べると、以前に記載されたとおりに、細胞から膜を調製し（３３）、ＳＴを２，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌの最終特異的活性までヨウ化した（１２５ＩＴｙｒ４−ＳＴ）（３３）。全結合量を非標識ＳＴ競合の非存在下でカウント毎分（ＣＰＭ）により測定した一方で、非特異的結合量を１×１０−５Ｍ未標識ＳＴの存在下で測定した。非特異的結合量を全結合量から差し引くことにより、特異的結合量を計算した（３３）。アッセイを少なくとも三重に行った。
【０２２２】
統計的分析
別段に示されていない限り、非対合両側ステューデントｔ検定により、統計学的有意性を決定した。結果は、少なくとも３匹の動物または三重で行われた３回の実験からの平均±ＳＥＭを表している。生存及び無病生存率をカプラン−マイヤー分析により分析した。体重のセグメント縦方向線形モデルを組み合わせるフレイルティモデル、生存期間でのログ−ノーマルモデル、及び体重でのランダムブレークポイント（屈曲点）のためのログ−ノーマルモデルを使用して、体重を分析した。コクラン−マンテル−ヘンツェル検定により、便潜血及び毛皮の乱れの分析を行った。線形回帰による等温勾配を用いる４つの処理での一対比較により、コロニー形成を分析した。
【０２２３】
結果
ＧＵＣＹ２ＣのサイレンシングはＲＩＧＳを悪化させる。低線量の電離放射線により誘発される上皮細胞アポトーシスへの対抗におけるＧＵＣＹ２Ｃの役割（２２）は、この受容体がＲＩＧＳにおいて役割を果たし得ることを示唆した。Ｇｕｃｙ２ｃの標的化生殖細胞系の欠失（Ｇｕｃｙ２ｃ−／−マウス）（１５、１６、１８〜２０、２６、３２）は、致死線量（高線量、１５Ｇｙ）の全身照射（ＴＢＩ；図１Ａ）に暴露した後のマウスの死亡を加速させた。放射線のこの線量は、ＲＩＧＳを誘発することにより死亡をもたらし、これは、ＧＩではなく造血症候群をもたらした低線量（８Ｇｙ）照射とは対照的に、骨髄移植により救済することはできなかった（図１Ｂ）。同様に、ＧＵＣＹ２Ｃシグナル伝達のサイレンシングは、遮蔽による骨髄保存を伴う１８Ｇｙ部分的腹部照射（ＳＴＢＩ）後に、下痢により定量化される急性ＧＩ毒性を悪化させ（図１Ｃ）、かつ生存率を低下させた（図１Ｄ）。ＧＵＣＹ２Ｃシグナル伝達の非存在下でのＲＩＧＳの増悪は、体重減少（図１Ｅ）、腸管出血（図１Ｆ）、衰弱（毛皮の乱れ、図１Ｇ）（４０）、及び糞便水蓄積（図１Ｈ）を含む腸管機能障害の増加と関連した（４１）。ＧＵＣＹ２Ｃシグナル伝達のサイレンシングは、小腸におけるＳＴＢＩにより生じ、陰窩消失として定量化される腸管上皮の破壊を増幅させた（図１Ｉ〜Ｊ）。さらに、これは、ＲＩＧＳに対して比較的抵抗性がある結腸において新規の上皮易損性をもたらした（図１Ｋ〜Ｌ）（１〜５）。総じて、これらの観察は、ＧＵＣＹ２Ｃシグナル伝達軸が、ＲＩＧＳに寄与する機構の調節において補償的な役割を果たすことを明らかにしている。
【０２２４】
ＧＩ毒性照射は、ＧＵＣＹ２Ｃ及びそのパラクリンホルモンの永続的な発現を保存する。ＲＩＧＳに対抗する補償機構におけるＧＵＣＹ２Ｃパラクリンホルモン軸の役割は、高線量放射線後の受容体及びそのホルモンの発現の存続に基づく。実際に、全陰窩−絨毛軸に沿って特徴的に発現されるＧＵＣＹ２Ｃ  ｍＲＮＡ及びタンパク質は（１７）、致死的ＴＢＩ後に永続的に保存され（図２Ａ、Ｄ、Ｇ）、結果は、腫瘍形成を含む上皮完全性を破壊する他の条件に似ている（１８〜２０、２５）。予想外に、リガンド発現が失われる腫瘍形成、炎症性腸疾患、及び代謝ストレスを含む上皮完全性を破壊する他の様式とは対照的に、ＧＩ毒性ＴＢＩは、ＧＵＣＡ２Ａ（図２Ｂ、Ｅ、Ｈ）及びＧＵＣＡ２Ｂ（図２Ｃ、Ｆ、Ｉ）の発現を保存した（１８〜２１、２５、２６）。実際に、以前に記載されたとおり、小腸では低いＧＵＣＡ２Ａの発現は主に、単離上皮細胞において維持された（４２）。対照的に、小腸における主要なＧＵＣＹ２ＣホルモンであるＧＵＣＡ２Ｂの発現は主に、遠位絨毛における分化上皮細胞により維持された（４２）。受容体及びホルモン発現の保存は永続的であり、損傷応答の時間経過を通じて、ｍＲＮＡまたはタンパク質レベルに有意な差はなかった（図２）。さらに、ホルモン発現の保存は、ＧＵＣＹ２Ｃ発現とは独立していた。これらの観察は、急性放射線誘発ＧＩ毒性に対抗する補償応答におけるＧＵＣＹ２Ｃパラクリンホルモンシグナル伝達軸の役割と一致する。
【０２２５】
さらに、損傷応答の連続を通じての受容体発現の存続は、ＲＩＧＳを予防する治療標的としてのＧＵＣＹ２Ｃの潜在的な有用性を示唆している。経口リガンドによるＧＵＣＹ２Ｃ活性化はＲＩＧＳを救済するが、放射線に対するＧＩ外腫瘍応答は救済しない。野生型マウスでは、ＳＴ、外因性ＧＵＣＹ２Ｃリガンドの経口投与は、それぞれ下痢の発病率（図３Ａ）及び生存率（図３Ｂ）により定量化される、ＳＴＢＩにより誘発される罹患及び死亡を減少させた。同様に、経口ＳＴは、体重減少（図３Ｃ）、腸管出血（図３Ｄ）、衰弱（図３Ｅ）、及び糞便水蓄積（図３Ｆ）を含むＳＴＢＩ誘発腸管機能障害に対抗した。さらに、経口ＳＴは、ＳＴＢＩ後に、腸管形態及び糞便形成（図３Ｇ）、ならびに正常な組織の保存と関連する水再吸収（図３Ｈ）を救済した。対照的に、経口ＳＴは、Ｇｕｃｙ２ｃ−／−マウスにおいてＲＩＧＳを救済しなかった。さらに、経口ＳＴは、放射線感受性胸腺腫または放射線抵抗性黒色腫の治療用放射線応答を変更しなかった（図３１）。さらに、長期経口ＳＴは安全であり、下痢（図３Ｊ）または成長遅滞（図３Ｋ）などの不利な薬理学的作用を伴わなかった。これらの観察は、ＧＵＣＹ２Ｃシグナル伝達は、経口投与されたリガンドにより保障され得る、ＲＩＧＳに対抗する補償機構を含むという示唆を裏付ける。実際に、ＧＵＣＹ２Ｃリガンドは特異的に腸管上皮細胞を安全に保護し（２６）、小腸以外の腫瘍の放射線に対する治療反応を変更することはない。ＲＩＧＳに対抗するＧＵＣＹ２Ｃシグナル伝達はｐ５３を必要とする。ＧＵＣＹ２Ｃシグナル伝達は、腸管上皮細胞を、低線量放射線により誘発されるアポトーシスから保護する（２２）。しかしながら、以前に実証されたとおり、ＧＵＣＹ２Ｃシグナル伝達のサイレンシングは、小腸におけるアポトーシスの基礎レベルを上昇させたが（１８）、損傷応答の連続を通じての小腸の全陰窩−絨毛軸に沿ったＲＩＧＳと関連するアポトーシスを変えなかった（図４Ａ）。その状況において、ｐ５３はまた、アポトーシスとは独立した機構を介してＲＩＧＳに対抗する（７）。実際に、ｐ５３の除去は、ＧＵＣＹ２Ｃサイレンシングを表現型模写し、ＲＩＧＳ関連死亡率を悪化させた（図１Ｄ）。さらに、経口ＳＴでのＧＵＣＹ２Ｃの活性化は、ＳＴＢＩ後に、野生型において生存率を改善したが、ｐ５３Ｉｎｔ−／−マウスでは改善しなかった（図４Ｂ）。さらに、ＧＵＣＹ２Ｃ活性化は、体重減少（図４Ｃ）、腸管出血（図４Ｄ）及び衰弱（図４Ｅ）により定量化されるＳＴＢＩ誘発腸管機能障害に、野生型では対抗したが、ｐ５３ｉｎｔ−／−マウスでは対抗しなかった。これらの観察は、ＧＵＣＹ２Ｃシグナル伝達軸が、ｐ５３を必要とする機構を介してＲＩＧＳに対抗することを示唆している。ＲＩＧＳに対抗するＧＵＣＹ２Ｃシグナル伝達は、ｐ５３応答の増幅と関連する。放射線誘発腸管毒性に対するＧＵＣＹ２Ｃシグナル伝達の作用の媒介におけるｐ５３の役割と一致して、経口ＳＴは、ＳＴＢＩにより誘発されるＲＩＧＳにおいて、マウス腸管上皮細胞におけるリン酸化ｐ５３のレベルを上昇させた（図４Ｆ）。これらのインビボ結果を要約すると、ＧＵＣＹ２Ｃセカンドメッセンジャー、ｃＧＭＰは、ＨＣＴ１１６ヒト結腸癌腫細胞（図４Ｇ）、野生型ｐ５３を発現するがＧＵＣＹ２Ｃは発現しない腸管上皮細胞のインビトロモデル（１９，３４．３５）において放射線により誘発される合計及びリン酸化ｐ５３を増加させた。ＨＣＴ１１６細胞においてｃＧＭＰシグナル伝達により誘発される、放射性に対するｐ５３応答の増幅は、ｐ５３と阻害タンパク質Ｍｄｍ２との間の相互作用の減少と関連した（図４Ｈ）。ＲＩＧＳに対抗するＧＵＣＹ２Ｃシグナル伝達は、分裂期細胞死のｐ５３依存性救済と関連する。経口ＳＴによるＧＵＣＹ２Ｃシグナル伝達の誘発は、ＳＴＢＩ後の腸管上皮細胞における染色体不安定性に対抗し、二本鎖ＤＮＡ破断（図５Ａ）及び分裂期細胞死と特徴的に関連する異常な有糸分裂を減少させた（図５Ｂ）。同様に、中心体のカウントまたは後期ブリッジ指数により定量化される照射により生じる染色体不安定性（４３）は、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰで処理されたＨＣＴ１１６細胞では低下した（図５Ｃ〜Ｄ）。対照的に、ｐ５３（ＨＣＴ１１６ｐ５３−／−）の除去は、照射により生じる染色体不安定性を増幅し、この損傷は、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰに対して非感受性であった（図５Ｃ〜Ｄ）。さらに、放射線が誘発した異常な有糸分裂を反映している分裂期細胞死による細胞死は、ｃＧＭＰにより、親細胞では減少したが、ｐ５３−／−、ＨＣＴ１１６細胞では減少しなかった（図５Ｅ）。
【０２２６】
考察
ＲＩＧＳは、腸管上皮細胞における放射線誘発遺伝毒性ストレスを指す（７〜９、１１、１２、１４）。放射線は、直接的に、かつ活性酸素種を介してＤＮＡ損傷をもたらし（２３）、ｐ５３を活性化させる（７、９、１４、４４）。次いで、ｐ５３は、分岐損傷応答を媒介する。修復を上回る損傷を受けた細胞は、ＰＵＭＡのｐ５３活性化により開始されるカスパーゼ依存性アポトーシスを受ける（６、９、１２、１３）。さらに、救済され得る細胞では、ｐ５３が、細胞周期チェックポイントを調節するサイクリン依存性キナーゼの重要な阻害物質であるｐ２１の発現を誘発する（７、９、１４）。これらのチェックポイントと関連する増殖の阻害は、細胞が損傷を受けたＤＮＡ（７〜９、１２、１４、４５）を修復することを可能にした。しかしながら、ｐ５３応答は限定され、かつ損傷を受けたＤＮＡを有する細胞は照射の数日以内にチェックポイントを逃れ、損傷を受けたＤＮＡと共に細胞周期に早まって入り、分裂期細胞死を受ける（７、９、１２、１４、４６）。次いで、これは、上皮消失及び粘膜炎をもたらし、ＲＩＧＳによる死亡の主な機構である液体及び電解質消失ならびに感染と関連する関門機能を破壊する（４７）。本明細書において、本発明者らは、放射線損傷及びｐ５３応答の交差点にあるＧＵＣＹ２Ｃシグナル伝達軸を含む、この病態生理に対抗する予測されていなかった補償機構を明らかにする。
【０２２７】
ＧＵＣＹ２Ｃは、腸管上皮細胞により選択的に発現され、内因性ホルモンであるグアニリン及びウログアニリン、または下痢原性細菌ＳＴにより活性化され、細胞内ｃＧＭＰ蓄積を増加させる（１７）。他の組織におけるＧＵＣＹ２Ｃシグナル伝達についての証拠は存在するが（３２，４８）、本研究でのＲＩＧＳの改善における経口ＳＴの効果は、腸管受容体に対する一次作用と一致し、経口ＧＵＣＹ２Ｃリガンドの生物学的利用能が存在しないことを反映している（３１）。ＧＵＣＹ２Ｃ−ｃＧＭＰシグナル伝達は、細菌が下痢を誘発する機構の１つである腸管分泌を調節し、かつ経口ＧＵＣＹ２Ｃリガンドのリナクロチド（Ｌｉｎｚｅｓｓ（商標））及びプレカナチド（Ｔｒｕｌａｎｃｅ（商標））は便秘を改善し、かつ過敏性腸症候群を有する患者において腹部疼痛を軽減する（３１、４９）。さらに、ＧＵＣＹ２Ｃシグナル伝達は、増殖及びＤＮＡ損傷修復、ＲＩＧＳでは正準で破壊されるプロセスを調節する（２６）。実際に、ＧＵＣＹ２Ｃ−ｃＧＭＰ軸を介したシグナル伝達はＤＮＡ合成を阻害し、かつ細胞周期を延長して、一部ではｐ２１、放射線に対する重要な損傷応答を調節することによりＧ１−Ｓ遅延を負わせる（１８〜２０、５０）。さらに、ＧＵＣＹ２Ｃのサイレンシングは、ＤＮＡ酸化及び二本鎖ＤＮＡ破断を増加させ、ＲＯＳ及び不十分な修復を反映して、化学的または遺伝的ＤＮＡ損傷により誘発される変異を増幅する（２０）。さらに、ＧＵＣＹ２Ｃのサイレンシングは、腸管関門（２６）、ＲＩＧＳに寄与する重要な病態生理学的機構（４７）を破壊する。
【０２２８】
逆に、ＧＵＣＹ２Ｃリガンドは、その損傷をブロックして、関門の完全性を強化し、かつ損傷からの回復を促進する（２３、２４、２６、２７、３０）。粘膜関門完全性を促進するこの役割は、ＲＩＧＳのための治療標的としてのＧＵＣＹ２Ｃを支持する。本観察は、ＲＩＧＳに対抗する、以前には認識されていなかった補償機構を示唆しており、その際、パラクリンホルモンのグアニリン及びウログアニリンが、腸管上皮関門の完全性を規定するＧＵＣＹ２ＣｃＧＭＰシグナル伝達を活性化する。そのモデルでは、ＧＵＣＹ２Ｃ−ｃＧＭＰシグナル伝達軸のパラクリンホルモン刺激は、１８−１９．ｐ５３のアミノ末端に結合する、遺伝毒性ストレスに対する応答の重要な調節因子であるＭｄｍ２との相互作用を破壊し、そのトランス活性化機能を阻害し、かつそれをプロテアソーム分解のための標的とすることにより、放射線損傷に対するｐ５３応答を支持する（４５、５１、５２）。次いで、ｐ５３応答の増幅は、ＤＮＡ損傷の解消、分裂期細胞死の限定に寄与する（７）。これらの補償応答以外に、小腸の頭−尾軸及び損傷応答の連続を通じて、高線量照射後のＧＵＣＹ２Ｃ発現の永続的な保存は、経口ＧＵＣＹ２Ｃホルモン投与によるＲＩＧＳの緩和のためにこの受容体を標的とする機会をもたらす。実際に、これは、不可逆的ＤＮＡ損傷の症候群から、経口ＧＵＣＹ２Ｃリガンド補充により逆転または予防することができるものへとＲＩＧＳを変換する無比の可能性をもたらす。
【０２２９】
これらの研究は、恒常性がＧＵＣＹ２Ｃをサイレンシングするパラクリンホルモン消失により破壊される腸管損傷の他のモデルと対照的である。実際に、グアニリン及びウログアニリンは、散発性結腸直腸癌における最も共通する消失遺伝子産物であり、これらのホルモンは、新形成の最初期の段階で消失する（２９、５３、５４）。ホルモン消失は、ＧＵＣＹ２Ｃシグナル伝達軸をサイレンシングし、かつ腸管上皮細胞の継続的な再生を調節し、かつその破壊が腫瘍形成に必須である正準恒常性維持機構を中断させる（１７〜２０、２５、２６、３４）。同様に、肥満及び結腸直腸癌が関連する一方で、発症機序は不明なままである。最近の研究は、肥満に寄与する必須機構であるカロリーの過剰摂取は、ＧＵＣＹ２Ｃ腫瘍抑制因子をサイレンシングするグアニリン消失につながるＥＲストレスをもたらすことを明らかにした（２５）。実際に、カロリーにより抑制されたグアニリンを補充すると、腫瘍形成が除去された（２５）。さらに、マウスにおいて、経口硫酸デキストランは腸管粘膜を損傷して炎症性腸疾患（ＩＢＤ）をもたらし、ＧＵＣＹ２ＣのサイレンシングはＩＢＤの損傷を増幅して、死亡率を上昇させる（２４、２６、３０）。実際にＩＢＤは、ヒトにおけるＧＵＣＹ２Ｃパラクリンホルモン消失と関連している（２１）。腸管上皮損傷のこの新たに出現したパラダイムの状況において、高線量照射の状況におけるパラクリンホルモン発現の保存を実証するこの結果は予測されていなかった。しかしながら、これらは、ＲＩＧＳに対抗する補償機構におけるＧＵＣＹ２Ｃパラクリンホルモン軸の役割と一致する。以前の研究が、ＧＵＣＹ２Ｃのサイレンシングが低線量の放射線（５Ｇｙ）により誘発されるアポトーシスを増幅することを明らかにした（２２）。これらの放射線量は、ＲＩＧＳまたは骨髄不全をもたらすＧＩ毒性レベル未満である。さらに、ＧＵＣＹ２Ｃのサイレンシング（Ｇｕｃｙ２ｃ−／−マウス）は、初期の研究とは対照的に、ＲＩＧＳにおける小腸または大腸でのアポトーシスの誘発を変えなかった（図４Ａを参照されたい）。さらに、ＧＵＣＹ２Ｃのサイレンシングは、ｐ５３シグナル伝達の除去（ｐ５３−／−マウス）の効果を再現し、これはまた、以前に報告されたとおり、ＲＩＧＳにおける小腸または大腸でのアポトーシスに対して効果を有さなかった（７）。ｐ５３−／−マウスを表現型模写するＧｕｃｙ２ｃ−／−マウスの能力により強化される、ｐ５３損傷応答を最適化する際のＧＵＣＹ２Ｃの役割の状況において（７）、ＧＵＣＹ２Ｃの非存在下でＲＩＧＳにおける上皮破壊を増幅する主な機構は、アポトーシスではなく、分裂期細胞死であると考えられる。ＲＩＧＳを直接的に予防及び治療するためにｐ５３を標的化することには、特有の困難があり、この機構を利用する治療は未だ出現していない（７、９、１２、１４）。治療上の困難は、ＲＩＧＳ及び放射線誘発造血症候群（この２つの主な毒性は放射線と関連している）におけるｐ５３の逆説的な逆の役割から生じている。ｐ５３による上皮細胞の保護により、その活性化が、ＲＩＧＳを治療するための標的と成っている（７〜９、１４、４６）。顕著に対照的に、骨髄においてｐ５３により媒介される放射線毒性により、その阻害が、造血症候群を治療するための標的と成っている（８、４６、５５）。したがって、ｐ５３は、依然として分かりにくい標的であり、適切な指向性調節のために組織特異的ストラテジーを必要とする。本研究は、急性放射線誘発ＧＩ毒性を予防及び治療するためのｐ５３標的化医学的対抗手段に容易に変換され得る、ＲＩＧＳの病態生理の根底にある新規の分子機構についての洞察を提供する。このように、ＧＵＣＹ２Ｃは、十二指腸から直腸までの腸管上皮細胞により選択的に発現される狭い組織分布を有する（１５〜１７）。さらに、ＧＵＣＹ２Ｃは、解剖学的に特権があり、これらの細胞の内腔膜で発現され、経口薬剤には直接的にアクセス可能であるが、全身区画にはアクセス不可能である（１７、３１）。さらに、リナクロチド（Ｌｉｎｚｅｓｓ（商標））及びプレカナチド（Ｔｒｕｌａｎｃｅ（商標））は、慢性便秘症候群の治療のために最近承認された、ＧＩ管以外では無視できる経口生物学的利用能または生体活性を有する経口ＧＵＣＹ２Ｃリガンドである（３１）。腸管内腔にのみ限られるリナクロチド及びプレカナチドの区画化活性と結びついたＧＵＣＹ２Ｃの解剖学的特権は、ＲＩＧＳを予防及び治療するために、他の利用可能なアプローチと比較してｐ５３依存性機構に特異的に関係する特有の標的化アプローチを提案している。次いで、これは、チェルノブイリまたは福島などの原子力事故による危険性において、予防上及び治療上の解決を一般市民、第一対応者、及び軍人に提案する。同様に、これは、がんのための腹骨盤放射線療法によるＧＩ毒性の標的化予防のための臨床的に扱いやすいアプローチを提供し、用量制限毒性を低下させ、かつ腸管外腫瘍の治療上の放射線感受性を変えることなく、より大きな放射線分画を投与することを可能にする（図３１を参照されたい）（５）。
【０２３０】
参照文献（参照により本明細書の一部をなす）
１．  Ｔｅｒｒｙ  ＮＨ，  Ｔｒａｖｉｓ  ＥＬ．  Ｔｈｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｏｎ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｄａｍａｇｅ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｒａｄｉａｔ  Ｏｎｃｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｐｈｙｓ  １９８９；１７：５６９−７３
２．  Ｍａｓｏｎ  ＫＡ，  Ｗｉｔｈｅｒｓ  ＨＲ，  Ｄａｖｉｓ  ＣＡ．  Ｄｏｓｅ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｌａｔｅｎｃｙ  ｏｆ  ｆａｔａｌ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ａｎｄ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｒａｄｉａｔ  Ｂｉｏｌ  １９８９；５５：１−５
３．  Ｍａｓｏｎ  ＫＡ，  Ｗｉｔｈｅｒｓ  ＨＲ，  ＭｃＢｒｉｄｅ  ＷＨ，  Ｄａｖｉｓ  ＣＡ，  Ｓｍａｔｈｅｒｓ  ＪＢ．  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ａｆｔｅｒ  ｔｏｔａｌ−ｂｏｄｙ  ｏｒ  ｔｏｔａｌ−ａｂｄｏｍｉｎａｌ  ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ．  Ｒａｄｉａｔ  Ｒｅｓ  １９８９；１１７：４８０−８
４．  Ｂｅｒｇｅｒ  ＭＥ，  Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ＤＭ，  Ｌｏｗｒｙ  ＰＣ，  Ｊｏｎｅｓ  Ｏ  Ｗ，  Ｗｉｌｅｙ  ＡＬ，  Ｍｅｄｉｃａｌ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｉｎｊｕｒｉｅｓ：ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ．  Ｏｃｃｕｐ  Ｍｅｄ  （Ｌｏｎｄ）  ２００６；５６：１６２−７２
５．  Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ＭＬ，  Ｍａｒｔｉｎ  ＭＭ，  Ｐａｄｅｌｌａｎｏ  ＬＣ，  Ｐａｌｏｍｏ  ＡＭ，  Ｐｕｅｂｌａ  ＹＩ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｔｏ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｃｌｉｎ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１０；１２：５５４−６１
６．  Ｊｅｆｆｅｒｓ  ＪＲ，  Ｐａｒｇａｎａｓ  Ｅ，  Ｌｅｅ  Ｙ，  Ｙａｎｇ  Ｃ，  Ｗａｎｇ  Ｊ，  Ｂｒｅｎｎａｎ  Ｊ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｕｍａ  ｉｓ  ａｎ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉａｔｏｒ  ｏｆ  ｐ５３−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｄ  −ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｐａｔｈｗａｙｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２００３；４：３２１−８
７．  Ｋｉｒｓｃｈ  ＤＧ，  Ｓａｎｔｉａｇｏ  ＰＭ，  ｄｉ  Ｔｏｍａｓｏ  Ｅ，  Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ＪＭ，  Ｈｏｕ  ＷＳ，  Ｄａｙｔｏｎ  Ｔ，  ｅｔ  ａｌ．  ｐ５３  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１０；３２７：５９３−６
８．  Ｋｏｍａｒｏｖａ  ＥＡ，  Ｋｏｎｄｒａｔｏｖ  ＲＶ，  Ｗａｎｇ  Ｋ，  Ｃｈｒｉｓｔｏｖ  Ｋ，  Ｇｏｌｏｖｋｉｎａ  ＴＶ，  Ｇｏｌｄｂｌｕｍ  ＪＲ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｕａｌ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｐ５３  ｏｎ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｖｉｖｏ：ｐ５３  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｉｎｊｕｒｙ，  ｂｕｔ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｆｒｏｍ  ｇａｓｔｒｏ−ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｉｎ  ｍｉｃｅ，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２００４；２３：３２６５−７１
９．  Ｌｅｉｂｏｗｉｔｚ  ＢＪ，  Ｑｉｕ  Ｗ，  Ｌｉｕ  Ｈ，  Ｃｈｅｎｇ  Ｔ，  Ｚｈａｎｇ  Ｌ，  Ｙｕ  Ｊ．  Ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｐ５３  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａｄｉａｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｄａｍａｇｅ  ｖｉａ  ＰＵＭＡ  ａｎｄ  ｐ２１．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ：ＭＣＲ  ２０１１；９：６１６−２５
１０．  Ｐａｒｉｓ  Ｆ，  Ｆｕｋｓ  Ｚ，  Ｋａｎｇ  Ａ，  Ｃａｐｏｄｉｅｃｉ  Ｐ，  Ｊｕａｎ  Ｇ，  Ｅｈｌｅｉｔｅｒ  Ｄ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｓ  ｔｈｅ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｌｅｓｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｄａｍａｇｅ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００１；２９３：２９３−７
１１．  Ｐｏｔｔｅｎ  ＣＳ．  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ，  ｔｈｅ  ｉｄｅａｌ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ａｇｅｎｔ  ｆｏｒ  ｓｔｕｄｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ｓｕｃｈ  ａｓ  ｔｈｅ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ．  Ｒａｄｉａｔ  Ｒｅｓ  ２００４；１６１：１２３−３６
１２．  Ｑｉｕ  Ｗ，  Ｃａｒｓｏｎ−Ｗａｌｔｅｒ  ＥＢ，  Ｌｉｕ  Ｈ，  Ｅｐｐｅｒｌｙ  Ｍ，  Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇｅｒ  ＪＳ，  Ｚａｍｂｅｔｔｉ  ＧＰ，  ｅｔ  ａｌ．  ＰＵＭＡ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ  ｒａｄｉｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ２００８；２：５７６−８３
１３．  Ｖｉｌｌｕｎｇｅｒ  Ａ，  Ｍｉｃｈａｌａｋ．  ＥＭ，  Ｃｏｕｌｔａｓ  Ｌ，  Ｍｕｌｌａｕｅｒ  Ｆ，  Ｂｏｃｋ  Ｇ，  Ａｕｓｓｅｒｌｅｃｈｎｅｒ  ＭＪ，  ｅｔ  ａｌ．  ｐ５３−  ａｎｄ  ｄｒｕｇ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ＢＨ３−ｏｎｌｙ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｐｕｍａ  ａｎｄ  ｎｏｘａ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００３；３０２：１０３６−８
１４．  Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ＪＭ．  Ｊｅｆｆｏｒｄｓ  ＬＢ，  Ｌｅｅ  ＣＬ，  Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ  Ｒ，  Ｍａ  Ｙ，  Ｋｉｒｓｃｈ  ＤＧ．  ｐ２１  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ”Ｓｕｐｅｒ  ｐ５３”  ｍｉｃｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．  Ｒａｄｉａｔ  Ｒｅｓ  ２０１２；１７７：３０７−１０
１５．  Ｓｃｈｕｌｚ  Ｓ，  Ｇｒｅｅｎ  ＣＫ，  Ｙｕｅｎ  ＰＳ，  Ｇａｒｂｅｒｓ  ＤＬ，  Ｇｎａｎｙｌｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅ  ｉｓ  ａ  ｈｅａｔ−ｓｔａｂｌｅ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．  Ｃｅｌｌ  １９９０；６３：９４１−８
１６．  Ｓｃｈｕｌｚ  Ｓ，  Ｌｏｐｅｚ  ＭＪ，  Ｋｕｈｎ  Ｍ，  Ｇａｒｂｅｒｓ  ＤＬ．  Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｕａｎｙｌｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅ−Ｃ  ｇｅｎｅ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ａ  ｐａｒａｄｏｘｉｃａｌ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｏｆ  ｖｉａｂｌｅ  ｂｕｔ  ｈｅａｔ−ｓｔａｂｌｅ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｍｉｃｅ，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １９９７；１００：１５９０−５
１７．  Ｋｕｈｎ  Ｍ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｇｕａｎｙｌｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ  ２０１６；９６：７５１−８０４
１８．  Ｌｉ  Ｐ，  Ｌｉｎ  ＪＥ，  Ｃｈｅｒｖｏｎｅｖａ  Ｉ，  Ｓｃｈｕｌｚ  Ｓ，  Ｗａｌｄｍａｎ  ＳＡ，  Ｐｉｔａｒｉ  ＧＭ．  Ｈｏｍｅｏｓｔａｔｉｃ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｒｙｐｔ−ｖｉｌｌｕｓ  ａｘｉｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｕａｎｙｌｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅ  Ｃ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｓ  ｔｈｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ  ｉｎ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ．  Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  ２００７；１７１：１８４７−５８
１９．  Ｌｉ  Ｐ，  Ｓｃｈｕｌｚ  Ｓ，  Ｂｏｍｂｏｎａｔｉ  Ａ，  Ｐａｌａｚｚｏ  ＪＰ，  Ｈｙｓｌｏｐ  ＴＭ，  Ｘｕ  Ｙ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｕａｎｙｌｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅ  Ｃ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ．  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ２００７；１３３：５９９−６０７
２０．  Ｌｉｎ  ＪＥ，  Ｌｉ  Ｐ，  Ｓｎｏｏｋ  ＡＥ，  Ｓｃｈｕｌｚ  Ｓ，  Ｄａｓｇｕｐｔａ  Ａ，  Ｈｙｓｌｏｐ  ＴＭ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＧＵＣＹ２Ｃ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｕｍｏｒ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ＡＫＴ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ２０１０；１３８：２４１−５４
２１．  Ｂｒｅｎｎａ  Ｏ，  Ｂｒｕｌａｎｄ  Ｔ，  Ｆｕｒｎｅｓ  ＭＷ，  Ｇｒａｎｌｕｎｄ  Ａ，  Ｄｒｏｚｄｏｖ  Ｉ，  Ｅｍｇａｒｄ  Ｊ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  ｇｕａｎｙｌａｔｅ  ｃｙｃｌａｓｅ−Ｃ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｓ  ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ，  Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  ２０１５；５０：１２４１−５２
２２．  Ｇａｒｉｎ−Ｌａｆｌａｍ  ＭＰ，  Ｓｔｅｉｎｂｒｅｃｈｅｒ  ＫＡ，  Ｒｕｄｏｌｐｈ  ＪＡ，  Ｍａｏ  Ｊ，  Ｃｏｈｅｎ  ＭＢ．  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｕａｎｙｌａｔｅ  ｃｙｃｌａｓｅ  Ｃ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ａｃｕｔｅ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．  Ａｍ  ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２００９；２９６：Ｇ７４０−９
２３．  Ｈａｎ  Ｘ，  Ｍａｎｎ  Ｅ，  Ｇｉｌｂｅｒｔ  Ｓ，  Ｇｕａｎ  Ｙ，  Ｓｔｅｉｎｂｒｅｃｈｅｒ  ＫＡ，  Ｍｏｎｔｒｏｓｅ  ＭＨ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｇｕａｎｙｌｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅ  Ｃ  （ＧＣＣ）  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｂａｒｒｉｅｒ．  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２０１１；６：ｅ１６１３９
２４．  Ｈａｒｍｅｌ−Ｌａｗｓ  Ｅ，  Ｍａｎｎ  ＥＡ，  Ｃｏｈｅｎ  ＭＢ，  Ｓｔｅｉｎｂｒｅｃｈｅｒ  ＫＡ．  Ｇｕａｎｙｌａｔｅ  ｃｙｃｌａｓｅ  Ｃ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｃａｕｓｅｓ  ｓｅｖｅｒｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｃｏｌｉｔｉｓ．  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２０１３；８：ｅ７９１８０
２５．  Ｌｉｎ  ＪＥ，  Ｃｏｌｏｎ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ  Ｆ，  Ｂｌｏｍａｉｎ  Ｅ，  Ｋｉｍ  ＧＷ，  Ａｉｎｇ  Ａ，  Ｓｔｏｅｃｋｅｒ  Ｂ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｏｂｅｓｉｔｙ−ｉｎｄｕｃｅｄ，  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｓ  ｄｒｉｖｅｎ  ｂｙ  ｃａｌｏｒｉｃ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｕａｎｙｌｉｎ−ＧＵＣＹ２Ｃ  ｐａｒａｃｒｉｎｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｘｉｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１６；７６：３３９−４６
２６．  Ｌｉｎ  ＪＥ，  Ｓｎｏｏｋ  ＡＥ，  Ｌｉ  Ｐ，  Ｓｔｏｅｃｋｅｒ  ＢＡ，  Ｋｉｍ  ＧＷ，  Ｍａｇｅｅ  ＭＳ，  ｅｔ  ａｌ．  ＧＵＣＹ２Ｃ  ｏｐｐｏｓｅｓ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｇｅｎｏｔｏｘｉｃ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ＡＫＴ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ．  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２０１２；７：ｅ３１６８６
２７．  Ｍａｎｎ  ＥＡ，  Ｈａｒｍｅｌ−Ｌａｗｓ  Ｅ，  Ｃｏｈｅｎ  ＭＢ，  Ｓｔｅｉｎｂｒｅｃｈｅｒ  ＫＡ．  Ｇｕａｎｙｌａｔｅ  ｃｙｃｌａｓｅ  Ｃ  ｌｉｍｉｔｓ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｅｎｔｅｒｉｃ  ｐａｔｈｏｇｅｎ．  ＢＭＣ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  ２０１３；１３：１３５
２８．  Ｓｈａｉｌｕｂｈａｉ  Ｋ，  Ｐａｌｅｊｗａｌａ  Ｖ，  Ａｒｊｕｎａｎ  ＫＰ，  Ｓａｙｋｈｅｄｋａｒ  Ｓ，  Ｎｅｆｓｋｙ  Ｂ，  Ｆｏｓｓ  ＪＡ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｌｅｃａｎａｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｄｏｌｃａｎａｔｉｄｅ，  ｎｏｖｅｌ  ｇｕａｎｙｌａｔｅ  ｃｙｃｌａｓｅ−Ｃ  ａｇｏｎｉｓｔｓ，  ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｃｏｌｉｔｉｓ．  Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２０１５；６：２１３−２２
２９．  Ｓｈａｉｌｕｂｈａｉ  Ｋ，  Ｙｕ  ＨＨ，  Ｋａｒｕｎａｎａｎｄａａ  Ｋ，  Ｗａｎｇ  ＪＹ，  Ｅｂｅｒ  ＳＬ，  Ｗａｎｇ  Ｙ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｕｒｏｇｕａｎｙｌｉｎ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｐｏｌｙｐ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ａｐｃ（Ｍｉｎ／＋）  ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｎ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  ｃｙｃｌｉｃ  ＧＭＰ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０００；６０：５１５１−７
３０．  Ｓｔｅｉｎｂｒｅｃｈｅｒ  ＫＡ，  Ｈａｒｍｅｌ−Ｌａｗｓ  Ｅ，  Ｇａｒｉｎ−Ｌａｆｌａｍ  ＭＰ，  Ｍａｎｎ  ＥＡ，  Ｂｅｚｅｒｒａ  ＬＤ，  Ｈｏｇａｎ  ＳＰ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｕｒｉｎｅ  ｇｕａｎｙｌａｔｅ  ｃｙｃｌａｓｅ  Ｃ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｃｏｌｏｎｉｃ  ｉｎｊｕｒｙ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１１；１８６：７２０５−１４
３１．  Ｃａｍｉｌｌｅｒｉ  Ｍ．  Ｇｕａｎｙｌａｔｅ  ｃｙｃｌａｓｅ  Ｃ  ａｇｏｎｉｓｔｓ：ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ａｎｄ  ａｃｔｉｏｎｓ．  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ２０１５；１４８：４８３−７
３２．  Ｖａｌｅｎｔｉｎｏ  ＭＡ，  Ｌｉｎ  ＪＥ，  Ｓｎｏｏｋ  ＡＥ，  Ｌｉ  Ｐ，  Ｋｉｍ  Ｇ  Ｗ，  Ｍａｒｓｚａｌｏｗｉｃｚ  Ｇ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  ｕｒｏｇｕａｎｙｌｉｎ−ＧＵＣＹ２Ｃ  ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ａｘｉｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｆｅｅｄｉｎｇ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２０１１；１２１：３５７８−８８
３３．  Ｗａｌｄｍａｎ  ＳＡ，  Ｂａｒｂｅｒ  Ｍ，  Ｐｅａｒｌｍａｎ  Ｊ，  Ｐａｒｋ  Ｊ，  Ｇｅｏｒｇｅ  Ｒ，  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ  ＳＪ．  Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｏｆ  ｇｕａｎｙｌｙ  ｌ  ｃｙｃｌａｓｅ  Ｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｐｒｅｖ  １９９８；７：５０５−１４
３４．  Ｇｉｂｂｏｎｓ  ＡＶ，  Ｌｉｎ  ＪＥ，  Ｋｉｍ  ＧＷ，  Ｍａｒｓｚａｌｏｗｉｃｚ  ＧＰ，  Ｌｉ  Ｐ，  Ｓｔｏｅｃｋｅｒ  ＢＡ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ＧＵＣＹ２Ｃ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ＴＧＦ−ｂｅｔａ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｎｇ  ｄｅｓｍｏｐｌａｓｉａ  ａｎｄ  ｈｙｐｅｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１３；７３：６６５４−６６
３５．  Ｚｕｚｇａ  ＤＳ，  Ｐｅｌｔａ−Ｈｅｌｌｅｒ  Ｊ，  Ｌｉ  Ｐ，  Ｂｏｍｂｏｎａｔｉ  Ａ，  Ｗａｌｄｍａｎ  ＳＡ，  Ｐｉｔａｒｉ  ＧＭ．  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ
ｖａｓｏｄｉｌａｔｏｒ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｒ２３９  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｆｉｌｏｐｏｄｉａ  ａｎｄ  ｉｎｖａｄｏｐｏｄｉａ  ｉｎ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２０１２；１３０：２５３９−４８
３６．  Ｂｕｎｚ  Ｆ，  Ｄｕｔｒｉａｕｘ  Ａ，  Ｌｅｎｇａｕｅｒ  Ｃ，  Ｗａｌｄｍａｎ  Ｔ，  Ｚｈｏｕ  Ｓ，  Ｂｒｏｗｎ  ＪＰ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｐ５３  ａｎｄ  ｐ２１  ｔｏ  ｓｕｓｔａｉｎ  Ｇ２  ａｒｒｅｓｔ  ａｆｔｅｒ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９８；２８２：１４９７−５０１
３７．  Ｌｉ  Ｚ，  Ｔａｙｌｏｒ−Ｂｌａｋｅ  Ｂ，  Ｌｉｇｈｔ  ＡＲ，  Ｇｏｙ  ＭＦ，  Ｇｕａｎｙｌｉｎ，  ａｎ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｉｇａｎｄ  ｆｏｒ  Ｃ−ｔｙｐｅ  ｇｕａｎｙｌａｔｅ  ｃｙｃｌａｓｅ，  ｉｓ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｇｏｂｌｅｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ．  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １９９５；１０９：１８６３−７５
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５０．  Ｂａｓｕ  Ｎ，  Ｓａｈａ  Ｓ，  Ｋｈａｎ  １，  Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａ  ＳＧ，  Ｖｉｓｗｅｓｗａｒｉａｈ  ＳＳ．  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ  ａｒｅ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｕａｎｙｌｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅ  Ｃ  ａｎｄ  ｐ２１．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１４；２８９：５８１−９３
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Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００３；３：１０２−９
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５４．  Ｓｔｅｉｎｂｒｅｃｈｅｒ  ＫＡ，  Ｔｕｏｈｙ  ＴＭ，  Ｈｅｐｐｎｅｒ  Ｇｏｓｓ  Ｋ，  Ｓｃｏｔｔ  ＭＣ，  Ｗｉｔｔｅ  ＤＰ，  Ｇｒｏｄｅｎ  ．  Ｊ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｇｕａｎｙｌｉｎ  ｉｓ  ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ａｄｅｎｏｍａｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２０００：２７３：２２５−３０
５５．  Ｌｏｔｅｍ  Ｊ，  Ｓａｃｈｓ  Ｌ，  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｍｉｃｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｉｎ  ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ  ｐ５３  ａｒｅ  ｍｏｒｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｔｏ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｂｙ  ｓｏｍｅ  ａｇｅｎｔｓ．  Ｂｌｏｏｄ  １９９３；８２：１０９２−６
【０２３１】
実施例２
腸管陰窩の基底にある長命複能性幹細胞（ＩＳＣ）は、それらの表現型を調節して、上皮細胞の正常な維持及び損傷後再生に対応する。それらの長命、分化系列可塑性、及び増殖可能性が、ＩＳＣ区画の厳密な恒常性調節の必要性の基礎となっている。その状況において、グアニル酸シクラーゼＣ（ＧＵＣＹ２Ｃ）受容体及びそのパラクリンリガンドは、増殖、分化系列決定、及びＤＮＡ損傷修復を含む腸管上皮恒常性を調節する。しかしながら、ＩＳＣの維持におけるこの軸の役割は依然として未知である。ＩＳＣの支持におけるＧＵＣＹ２Ｃシグナル伝達軸の役割を定義するために、ＧＵＣＹ２Ｃ除去（Ｇｕｃｙ２ｃ−／−）の状況においてＩＳＣ（Ｌｇｒ５−ＧＦＰ）の分析を可能にする遺伝子導入マウスが、免疫検出技術及び薬理学的治療と組み合わされた。ＩＳＣはＧｕｃｙ２ｃ−／−マウスにおいて、活性Ｌｇｒ５＋細胞の消失、ただし貯蔵Ｂｍｉｌ＋細胞の逆数増加と関連して減少した。ＧＵＣＹ２Ｃは陰窩基底Ｌｇｒ５＋細胞で発現され、そこで、正準環状（ｃ）ＧＭＰ依存性シグナル伝達を媒介する。典型的にはＩＳＣには欠如している小胞体（ＥＲ）ストレスが、Ｇｕｃｙ２ｃ−／−マウスの陰窩基底全体で増加した。化学的シャペロンであるタウロウルソデオキシコール酸は、このＥＲストレスを解消し、かつＩＳＣのバランス、ＧＵＣＹ２Ｃエフェクター８Ｂｒ−ｃＧＭＰにより模倣される効果を回復させる。Ｇｕｃｙ２ｃ−／−マウスにおけるＩＳＣの減少は、致死量以下の線量の照射後の、より大きな上皮損傷及び再生の障害と関連した。これらの観察は、ＧＵＣＹ２Ｃが、ＩＳＣの完全性に寄与する機構の一部として、ＥＲストレス及び細胞易損性を変調する恒常性シグナルを提供することを示唆している。
【０２３２】
序論
腸管上皮細胞は高度に動的であり、再生及び修復の連続的なサイクルを受ける。陰窩の基底にある幹細胞は前駆細胞を生じさせ、その前駆細胞は分裂し続け、陰窩−絨毛軸へ遊走し、小腸の特殊上皮細胞種へと分化する［５６］。吸収細胞は週ベースで壊死して、コンベヤーベルト式に腸管内腔に入る一方で、房飾細胞及びパネート細胞などの分泌細胞は数週間にわたって生存する［５７、５８］。このプログラムされたターンオーバー以外に、炎症、酸化的損傷、及び放射線などの腸管の傷害［５９、６０］が細胞死を誘発し、上皮関門を維持するための交換を要求する。ターンオーバー及び再生のこれらのプロセスは、同様に動的な腸管幹細胞（ＩＳＣ）集団により駆動されるが、それらの特徴は明らかになり始めたに過ぎない［５７］。
【０２３３】
陰窩の基底にある高度に組織化されたＩＳＣ区画は、別個のマーカー発現及び機能性表現型を有する細胞型を含む。Ｌｇｒ５＋、または陰窩基底円柱（ＣＢＣ）細胞は、陰窩細胞位置０〜４に位置する長命複能性幹細胞であり、これは、毎日分裂して、上皮細胞の毎週のターンオーバーを駆動し、それらを「活性」幹細胞にしている［６１］。これらの細胞は、傷害に対して精妙な感度があり、かつパネート細胞を含む、必須の調節シグナルを供給する分化細胞と緊密に関係している［６１〜６３］。細胞位置４〜８のあたりの陰窩軸より上に位置する別の長命複能性幹細胞型は一般に、マーカーＢｍｉｌを発現する［６４］。これらのＢｍｉｌ＋細胞は静止状態にあり、かつ組織恒常性に最小限しか寄与しない［６１］。しかしながら、損傷すると、Ｂｍｉｌ＋細胞は、より活性なＣＢＣ、さらには腸管上皮細胞の分化した細胞型のすべてを両方とも回復させることができるので、それらは「貯蔵」ＩＳＣとのラベルを得ている［６１、６５］。腸管傷害の際の死に対するＬｇｒ５＋細胞の感受性、及び再生に対するＢｍｉｌ＋細胞の貢献にもかかわらず、Ｌｇｒ５＋細胞が、放射線誘発胃腸損傷からの回復に必要とされる［６０］。腸管幹細胞集団のアイデンティティ及び機能は明らかになりつつあるが、それらの維持及び相対的バランスに寄与する機構は改訂され続けている［６１〜６３、６６］。
【０２３４】
ＧＵＣＹ２Ｃは、十二指腸から遠位直腸までの腸管上皮細胞の頂端膜で選択的に発現される膜関連グアニル酸シクラーゼ受容体である［６７］。同種リガンドは、構造的に相似のペプチドであり、パラクリンホルモンである小腸を通じて産生されるグアニリン、及び小腸で選択的に産生されるウログアニリン、及び下痢原性細菌により産生される耐熱性腸毒素（ＳＴ）が含まれる［６７］。ＧＵＣＹ２Ｃは元々、毒素原性下痢の病態生理に寄与する腸管液及び電解質分泌の媒介因子として同定された［６７］。しかしながら、ＧＵＣＹ２Ｃ−パラクリンホルモン軸は、細胞増殖［６８、６９］、分化系列決定［７０］、及びＤＮＡ損傷修復［６９］、陰窩の完全性に必須である機能［７１］を含む重要な恒常性プロセスの必須の調節因子として明らかになってきている。さらに、損傷及び回復が特徴的にＩＳＣに関与している腫瘍発生または炎症性腸疾患のマウスモデルにおいて［７２］、ＧＵＣＹ２Ｃのサイレンシングは、病態生理、組織損傷、及び死亡を増幅する［６９、７３〜７６］。本明細書において、本発明者らは、ＩＳＣの維持におけるＧＵＣＹ２Ｃシグナル伝達の役割を調査している。
【０２３５】
結果
ＧＵＣＹ２Ｃ発現の除去はＩＳＣ数を撹乱する
電子顕微鏡法により、幹細胞を、Ｇｕｃｙ２ｃ＋／＋及びＧｕｃｙ２ｃ−／−マウスからの小腸陰窩において数えた。陰窩位置０〜５のくさび形細胞が含まれ、パネート細胞は、それらの小胞形態により排除された（図６、パネルＡ）［６１〜６３］。陰窩基底におけるＩＳＣの総数は、ＧＵＣＹ２Ｃの非存在下で減少した（図６、パネルＢ）。同様に、ＩＳＣ数及び機能の尺度であるエクスビボエンテロイド形成［７７］がＧＵＣＹ２Ｃの非存在下で減少した（ｐ＜０．００１；図６、パネルＣ）。ＦＡＣＳ分析は、ＧＵＣＹ２Ｃが除去されたＬｇｒ５−ＥＧＦＰ−ＩＲＥＳ−ＣｒｅＥＲＴ２マウス（Ｌｇｒ５−ＥＧＦＰ−Ｃｒｅ−Ｇｕｃｙ２ｃー／ー；図６、パネルＤ）において、より少ないＬｇｒ５＋／ＧＦＰＨｉｇｈ細胞を明らかにし、これは免疫蛍光顕微鏡検査法により確認された（図６、パネルＥ〜Ｆ；図１０）。さらに、Ｒｏｓａ−ＳＴＯＰｆｌ−ＬａｃＺ背景に交配したＬｇｒ５−ＥＧＦＰ−Ｃｒｅ−Ｇｗｙ２ｃ＋／＋及び−Ｇｕｃｙ２ｃ−／−マウスにおける系統追跡により、Ｇｕｃｙ２ｃ−／−マウスは、より少ないＬａｃＺ−標識陰窩を有することが明らかになった（図６、パネルＧ〜Ｈ）。逆に、Ｇｕｃｙ２ｃ−／−マウスは、免疫蛍光顕微鏡検査法によるとＢｍｉｌ＋細胞集団の拡大を示し（図６、パネルＩ〜Ｊ；図１１）、これはイムノブロット分析により確認された（図６、パネルＫ〜Ｌ）。総じて、これらの結果は、ＧＵＣＹ２Ｃシグナル伝達の除去が幹細胞集団のバランスを取り戻し、「貯蔵」ＩＳＣ表現型に助力することを示唆している。
【０２３６】
ＩＳＣにおけるＧＵＣＹ２Ｃシグナル伝達軸の機能発現
Ｌｇｒ５＋ＧＦＰ＋細胞をＦＡＣＳによりＬｇｒ５−ＥＧＦＰ−Ｃｒｅ−Ｇｕｃｙ２ｃ＋／＋及び−Ｇｕｃｙ２ｃ−／−マウスから収集し［７８］、富化を幹細胞（Ｌｇｒ５）及び分化細胞［スクロースイソマルターゼ（ＳＩ）］ｍＲＮＡマーカーのＲＴ−ｑＰＣＲにより検証した（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｖｅｒｉｆｉｅｄ）（図７、パネルＡ）。幹（Ｌｇｒ５Ｈｉｇｈ／ＳＩＬｏｗ）細胞におけるＧｕｃｙ２ｃ  ｍＲＮＡの発現は分化（Ｌｇｒ５Ｌｏｗ／ＳＩＨｉｇｈ）細胞のものと定量的に同様であり、これは、幹細胞及び分化区画における同様の発現レベルを示唆している（図７、パネルＢ）。免疫蛍光顕微鏡検査法により、Ｌｇｒ５＋ＧＦＰ＋幹細胞におけるＧＵＣＹ２Ｃの特異的共局在が確認された（図７、パネルＣ）。ＩＳＣにおけるＧＵＣＹ２Ｃ受容体の機能性を確認するために、ＳＴを、Ｌｇｒ５−ＥＧＦＰ−Ｃｒｅ−Ｇｕｃｙ２ｃ＋／＋及びＬｇｒ５−ＥＧＦＰ−Ｃｒｅ−Ｇｕｃｙ２ｃ−／−マウスの腸管腔のセグメントに注射した［７９］。このＧＵＣＹ２Ｃアゴニストへの管腔曝露［８０］は、Ｇｕｃｙ２ｃ−／−マウスではなくＧｕｃｙ２ｃ＋／＋マウスにおいて、Ｌｇｒ５＋ＧＦＰ＋細胞で、ｃＧＭＰ蓄積及びｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼの下流標的、血管拡張因子刺激リン酸化タンパク質（ＶＡＳＰ）のｃＧＭＰ特異的リン酸化をもたらし（図７、パネルＤ）、ＩＳＣにおけるＧＵＣＹ２Ｃの機能性を強調した。さらに、８Ｂｒ−ｃＧＭＰ、ＧＵＣＹ２Ｃ第二メッセンジャーｃＧＭＰの細胞透過性類似体［８１］は、ＩＳＣのバランスを回復させ、Ｇｕｃｙ２ｃ−／−マウスにおけるＬｇｒ５＋ＧＦＰ＋（図７、パネルＥ）及びＢｍｉｌ＋（図７、パネルＦ）細胞を、Ｇｕｃｙ２ｃ＋／＋マウスにおいてのものに匹敵するレベルまで戻した。さらに、経口ＧＵＣＹ２Ｃアゴニスト、リナクロチド（Ｌｉｎｚｅｓｓ（商標）、Ｉｒｏｎｗｏｏｄ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）は、Ｇｕｃｙ２ｃ＋／＋マウスにおけるエンテロイドの効率を増幅した（図７、パネルＧ）。これらの観察は、ＩＳＣの維持におけるＧＵＣＹ２Ｃシグナル伝達の役割を強化する。
【０２３７】
ＧＵＣＹ２Ｃシグナル伝達は陰窩ＥＲストレスに対抗する
正常なＩＳＣ区画は小胞体（ＥＲ）ストレスを最小化し、かつ長期曝露は、幹細胞区画から増殖性前駆細胞プールへのＩＳＣのシフト［８２、８３］、ＧＵＣＹ２Ｃシグナル伝達を除去することにより表現型模写される作用［６８〜７０、７５、８４］を誘発する。この点において、ＧＵＣＹ２Ｃ発現の除去は、Ｇｕｃｙ２ｃ−／−マウスの陰窩において、シャペロンタンパク質ＢｉＰ（Ｇｒｐ７８）、ＥＲストレスの正準マーカー［８５］の過剰発現を誘発した（図８、パネルＡ〜Ｄ）。興味深いことに、ＡＴＦ６、カルレティキュリン、及びリン酸化ｅＩＦ２α（ｐ−ｅＩＦ２α）を含む、ＥＲストレスにより誘発されるフォールディングされていないタンパク質のマーカーは、その陰窩において変わらなかった［８６］（図８、パネルＡ、Ｂ）。さらに、不可逆的ＥＲストレスを有する細胞を除去するアポトーシス促進性タンパク質ＣＨＯＰ［８７］が、それらの陰窩において逆説的に減少した（図８、パネルＡ、Ｂ）。このパターンのマーカーは適応ＥＲストレスを特異的に反映し、その際、ＢｉＰのようなシャペロンが過剰発現して、長期ＥＲストレスを軽減し、フォールディングされていないタンパク質の応答を最小限にする一方で、ＣＨＯＰ転写が下方調節されて、細胞死を阻止する［８８，８９］。その状況において、シャペロンタンパク質ＢｉＰを模倣して、タンパク質ミスフォールディングの除去によりＥＲストレスを減少させるタウロウルソデオキシコリン酸（ＴＵＤＣＡ）、胆汁酸塩［９０］は、Ｇｕｃｙ２ｃ−／−マウスの陰窩における正常なＢｉＰ発現、８Ｂｒ−ｃＧＭＰにより模倣される効果を回復させた（図８、パネルＣ〜Ｄ）。さらに、８Ｂｒ−ｃＧＭＰ（図７、パネルＦ〜Ｇ）のように、ＴＵＤＣＡはまた、Ｇｕｃｙ２ｃ−／−マウスにおいて、Ｌｇｒ５＋ＧＦＰ＋（図８、パネルＥ）及びＢｍｉｌ＋（図８、パネルＦ）細胞を正常レベルまで回復させた。これらの観察は、ＩＳＣの維持に必須である、ＥＲストレスに対抗する際のＧＵＣＹ２Ｃシグナル伝達の役割を強調している。
【０２３８】
ＧＵＣＹ２Ｃは、放射線損傷後の再生を支持するＩＳＣを維持する
腸管照射は、ＩＳＣ易損性及び再生能力を定量化するために確立されたモデルである［９１］。Ｌｇｒ５＋細胞は、精妙な感受性があり、照射により除去される一方で、Ｂｍｉｌ＋細胞は、陰窩基底を拡大及び再増殖させるために動員されて、再生を支持する［６１］。単回の致死量以下の１０Ｇｙ線量の全身放射線は、Ｇｕｃｙ２ｃ＋／＋及びＧｕｃｙ２ｃー／ーマウスの小腸におけるミクロコロニーアッセイ［９２］により定量化される大量の陰窩死をもたらした（図４Ａ）。しかしながら、Ｇｕｃｙ２ｃー／ーマウスは、照射から４８時間後に、Ｇｕｃｙ２ｃ＋／＋マウスと比較してより大きな部分的陰窩消失を示し（３６％対６２％、ｐ＜０．０５）、これは、ＧＵＣＹ２Ｃシグナル伝達の非存在下での放射線誘発ＩＳＣ細胞死に対する感受性の増加と一致した（図９、パネルＡ）。さらに、ＧＵＣＹ２Ｃシグナル伝達の非存在は再生の遅れと関連した；Ｇｕｃｙ２ｃー／ーマウスは、７２時間目に、Ｇｕｃｙ２ｃ＋／＋マウスにおける８２％と比較して、それらの陰窩の４９％のみを回復させ（ｐ＜０．０１）、これは、ＧＵＣＹ２Ｃの非存在下での陰窩の易損性の増強と一致した（図９、パネルＡ〜Ｂ）。実際に、照射から４８時間後のＬｇｒ５＋ＧＦＰ＋細胞の絶対数が、Ｇｕｃｙ２ｃ＋／＋マウスと比較して、Ｇｕｃｙ２ｃー／ーマウスでは少なかった（３１対９、ｐ＜０．０５）（図９、パネルＣ）。対照的に、Ｂｍｉｌ＋細胞は、Ｇｕｃｙ２ｃ＋／＋マウスでは照射後に拡大して、陰窩を再配置し、４８時間目に最大応答を達成した一方で、Ｇｕｃｙ２ｃー／ーマウスでは、回復せずに、これらの細胞の逆説的消失が存在し（ｐ＜０．０１；図９、パネルＤ）、再生の遅れに平行した（図９、パネルＡ）。総じて、これらの観察は、ＧＵＣＹ２Ｃシグナル伝達が少なくとも部分的に、放射線損傷に対する再生応答に必要なＬｇｒ５＋及びＢｍｉｌ＋幹細胞を保護しているという仮説を裏付ける。
【０２３９】
考察
新たに出現しているパラダイムは、陰窩が、腸管上皮細胞を継続的に再生させるという特有の恒常性要求を支持する多能性幹細胞集団を収容していることを示唆している。表現型及び機能的特徴を反映して、いくつかの腸管幹細胞集団が示唆されているが、２つの大分類で合意されている［９３］。迅速に増殖し、かつ放射線などの損傷に対して感受性がある、０〜４位の活性陰窩基底幹細胞は、最終的にはルーチン的な粘膜維持において分化上皮細胞に替わる一過性増殖細胞の源である［６１、９４］。対照的に、ゆっくりと増殖し、かつ損傷に対して比較的耐性がある４より上の位置に存在する幹細胞は、損傷後に腸管上皮細胞を再生させる貯蔵集団を含む［９５］。いくつかのタンパク質マーカーが、目立たない幹細胞集団を同定すると主張されているが、すべて、陰窩のＩＳＣにより不定に発現される［９６］。しかしながら、Ｌｇｒ５及びＢｍｉｌは、それぞれ活性及び貯蔵幹細胞集団のマーカーとして比較的選択的であると考えられる［９３］。マーカー発現におけるこの異質性はおそらく、ＩＳＣの可塑性を反映している。実際に、目立たない安定な集団ではなく、ＩＳＣはおそらく、正常または損傷上皮細胞の即時の必要性を満たすための、活性表現型と貯蔵表現型との間の移行期である［９７］。この可塑性が、粘膜の完全性に対する環境攻撃において幅広い変形に対応する機能的能力をもたらす［９８］。次いで、この可塑性は、活性及び貯蔵幹細胞の量及び相対的バランスを維持し、かつ今日やっと発見されつつある特異的な機構を必要とする。
【０２４０】
本明細書において、本発明者らは、ＧＵＣＹ２Ｃが活性及び貯蔵ＩＳＣの量及び相対的バランスの重要な決定子の１つであることを明らかにする。ＧＵＣＹ２Ｃの非存在下では、ＩＳＣの量の減少があり、それらの総数に、かつエクスビボでエンテロイドを形成するそれらの能力に反映される。また、活性Ｌｇｒ５＋細胞の減少及び貯蔵Ｂｍｉｌ＋細胞の逆数上昇を伴う、これらの細胞の相対的バランスのシフトが存在する。ＩＳＣの量及び相対的バランスの調節は、幹細胞におけるＧＵＣＹ２Ｃの機能的共発現と関連する。その状況において、Ｇｕｃｙ２ｃ−／−マウスにおいて８Ｂｒ−ｃＧＭＰを経口送達することによりｃＧＭＰシグナル伝達を再構成すると、活性及び貯蔵幹細胞の量及び相対的バランスが回復した。ＧＵＣＹ２Ｃの除去は、陰窩における長期ＥＲストレス、小腸の幹細胞の消失と関連するプロセスと関連する［８９、９９］。８Ｂｒ−ｃＧＭＰまたはＴＵＤＣＡ、化学的シャペロン［９０］がＥＲストレスを解消し、かつＬｇｒ５＋及びＢｍｉｌ＋幹細胞の量及びバランスを回復させるので、ＥＲストレスは、Ｇｕｃｙ２ｃ−／−マウスにおいてＩＳＣ消失に寄与し得る。重要なことに、ＧＵＣＹ２Ｃのサイレンシングは、致死量以下の放射線に暴露されたＧｕｃｙ２ｃ−／−マウスにおいて、ＩＳＣ易損性、幹細胞消失、及び上皮損傷及び再生の遅れを増加させた。これらの観察は、活性及び貯蔵幹細胞のプールを維持し、かつバランスを取り、次いで、環境損傷に対する再生上皮応答に影響を及ぼす、ＧＵＣＹ２Ｃの以前は知られていなかった役割を強調している。
【０２４１】
ＧＵＣＹ２ＣによりＩＳＣプールを調節する機構はおそらく、複雑で、かつ多因子的である。一般に、ＧＵＣＹ２Ｃ効果は、ホルモンのグアニリン及びウログアニリンにより駆動されるルミノセントリック（ｌｕｍｉｎｏｃｅｎｔｒｉｃ）なパラ分泌及び自己分泌シグナル伝達により媒介される［７４］。ＩＳＣでは、この調節は、そのｍＲＮＡが腸管陰窩で発現されるグアニリンにより選択的に媒介され得る［１００］。ホルモンシグナル伝達の効果は、細胞自律的で、ＩＳＣにより直接的に媒介され得、ＩＳＣは、頂端膜においてＧＵＣＹ２Ｃを発現して、それらをルミノセントリックなホルモン分泌にアクセス可能なものとする。別法では、これらの効果は、非自律的であり得、ＩＳＣの維持におけるパネート細胞の必須の役割［５７、６３、７８、９１］及びＧＵＣＹ２Ｃがサイレンシングされた場合のそれらの細胞の消失［６９］を反映している。また、ＧＵＣＹ２Ｃの非存在下でのＩＳＣの消失は関連ＥＲストレスを反映し得、これは、腸管上皮細胞を更新する正準分化プログラムの一部として、幹細胞を活性Ｌｇｒ５＋プールから増殖性始原体（一過性増殖）プールへと出す［８９］。実際に、これらの観察は、Ｇｕｃｙ２ｃ−／−マウスにおける腸管陰窩の増殖性始原細胞区画の拡大についての機械論的説明の１つを提供している［６８〜７０、７５、８４］。さらに、ＧＵＣＹ２Ｃの非存在下でのＩＳＣの消失は、環境傷害に対する幹細胞易損性の上昇を反映し得て、この場合もおそらく、アポトーシスに対する幹細胞罹患性を増幅する関連長期ＥＲストレスを反映している［９９］。その関連で、ＧＵＣＹ２Ｃシグナル伝達は、化学的、炎症性及び放射線誘発損傷に対する腸管上皮細胞の抵抗性を増強する［６９、７３、７６、１０１〜１０３］。さらに、本明細書で、本発明者らは、典型的には傷害に対して抵抗性がある活性Ｌｇｒ５＋細胞及び貯蔵Ｂｍｉｌ＋細胞［６１］が、ＧＵＣＹ２Ｃシグナル伝達の非存在下では、放射線損傷に対して増感していることを明らかにする。ＩＳＣプールからの幹細胞の逸出及びそれらの易損性の増幅以外に、ＩＳＣの可塑性プールと活性貯蔵プールとの間でシフトするそれらの能力に対するＧＵＣＹ２Ｃシグナル伝達の影響は依然として定義されていない。その状況において、Ｇｕｃｙ２ｃ−／−マウスにおける貯蔵Ｂｍｉｌ＋細胞プールの逆数増加が存在する一方で、これらの細胞は、それぞれ正常な、または照射された上皮細胞における活性Ｌｇｒ５＋細胞の消失の完全な補償、またはその回復に失敗する。これらの観察は、ＧＵＣＹ２Ｃシグナル伝達が、一部では、環境傷害に応答して再生する機能的能力を定義するＢｍｉｌ＋及びＬｇｒ５＋細胞の相互変換において役割を果たし得ることを示唆している。
【０２４２】
本観察に基づき、病態生理学的機構におけるＧＵＣＹ２Ｃシグナル伝達の役割が少なくとも一部で、ＩＳＣ区画の調節不全の寄与を反映しているかを推測することは魅力的である。ＧＵＣＹ２Ｃシグナル伝達軸は普遍的に、結腸直腸癌ではサイレンシングされ、陰窩の悪性転換におけるグアニリンの発現の消失を反映している［１０４〜１０６］。逆に、ＧＵＣＹ２Ｃ発現の除去は、腸管腫瘍形成を促進する［６９、７５、１０７］。腸管癌の現行の病態生理学的パラダイムは、悪性転換事象の開始が幹細胞区画で生じることを示唆している［１０８］。さらに、Ｂｍｉｌは、様々な腫瘍においてがん幹細胞の悪性転換を支持する重要な転写因子として同定されている［１０９、１１０］。さらに、ＧＵＣＹ２Ｃは、ＤＮＡ損傷修復を調節する機構の重要な構成成分である［６９］。これらの観察は、グアニリンの消失がＧＵＣＹ２Ｃをサイレンシングして、ＩＳＣプールを活性Ｌｇｒ５＋細胞から、ｃＧＭＰシグナル伝達の非存在下では、遺伝毒性傷害に対して特に易損性であり得るＢｍｉｌ＋細胞へとシフトさせ、悪性転換及びがんのリスクを増幅するという仮定を示唆する。同様に、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、ＧＵＣＹ２Ｃシグナル伝達軸の構成成分の消失と関連する［１１１］。逆に、ＧＵＣＹ２Ｃシグナル伝達の除去は、ＩＢＤのげっ歯類モデルにおいて組織損傷及び死亡を増幅する［７３、７６、１０２、１０３］。これらのデータは、ＩＢＤにおけるＧＵＣＹ２Ｃシグナル伝達の消失が幹細胞の量、バランス、及び質を変化させ、これが次いで、それらの損傷に対する易損性に寄与し、かつ損傷した上皮細胞を回復させる再生応答を減弱させるという仮定を示唆する。これらの考察は、将来の研究で調査され得る結腸直腸癌及びＩＢＤの根底にある、以前には予期されなかった病態生理学的パラダイムを示唆している。
【０２４３】
病態生理以外に、これらの観察は、ＩＳＣを標的とする新規の治療及び予防アプローチを開発するための相関性翻訳機会（ｃｏｒｒｅｌａｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ）を示唆する。その状況において、慢性便秘症候群を治療するために、いくつかの経口ＧＵＣＹ２Ｃリガンドが承認されている、または開発中である［１１２］。幹細胞によるＧＵＣＹ２Ｃの内腔発現は、ＩＳＣ区画において機能障害をもたらしているパラクリンホルモン機能不全を修正するために経口補充戦略を使用して、この受容体を標的とすることの実行可能性を強調している。実際に、この場合、ＦＤＡ承認済みの経口ＧＵＣＹ２Ｃリガンド、リナクロチド（Ｌｉｎｚｅｓｓ（商標））は、野生型マウスにおいて、幹細胞の量及び質の尺度であるエンテロイド形成能を増幅した（図７、パネルＨを参照されたい）。さらに、内腔ＧＵＣＹ２Ｃリガンド補充は、マウスにおいて腸管腫瘍形成を減弱し、かつ経口ＧＵＣＹ２Ｃリガンドは、ヒトにおける結腸直腸癌のための新規の化学的予防戦略として調査中である［１０７、１１３、１１４］。加えて、ＧＵＣＹ２Ｃリガンドの内腔補充は、マウスにおいて炎症を寛解し、かつこれらの作用物質は、ＩＢＤ患者において初期臨床開発中である［７６、１１５］。さらに、本研究は、ＧＵＣＹ２Ｃ軸のサイレンシングが、その病態生理がＩＳＣの損傷及び死に広く帰せられている放射線誘発胃腸症候群（ＲＩＧＳ）を悪化させることを明らかにする［１１６、１１７］。本観察は、陰窩を防御してＲＩＧＳを減弱または予防するために経口ＧＵＣＹ２Ｃリガンドを使用して、このシグナル伝達軸を治療標的化する可能性を強調する。
【０２４４】
結論として、本発明者らは、腸管上皮恒常性の重要な調節因子であるグアニル酸シクラーゼＣ（ＧＵＣＹ２Ｃ）パラクリンシグナル伝達軸が、小胞体ストレスの調節により活性及び貯蔵腸管幹細胞の完全性及びバランスを維持していることを実証する。これらの研究は、腸管幹細胞の支持におけるＧＵＣＹ２Ｃの新規の役割を明らかにする。重要なことに、これらは、放射線誘発胃腸症候群を含む、腸管幹細胞機能障害を反映している疾患を予防または治療するための経口ＧＵＣＹ２Ｃリガンドの治療上の可能性を強調する。
【０２４５】
物質及び方法
マウス及び治療
Ｇｕｃｙｃ−／−（Ｇｕｃｙ２ｃｔｍｌＧａｒ［６３］）、Ｌｇｒ５−ＥＧＦＰ−ＣｒｅＥＲＴ２（Ｂ６．１２９Ｐ２−Ｌｇｒ５ｔｍｌ（ｃｒｅ／ＥＲＴ２）Ｃｌｅ／Ｊ；ＪＡＸ  Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ、＃００８８７５）及びＲｏｓａ−ＳＴＯＰｆｌ−ＬａｃＺ（Ｂ６．１２９Ｓ４−Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６ＳｏｒｔｍｌＳｏｒ／Ｊ；Ｊａｘ  ＃００３４７４）トランスジェニックマウス系を異種交配させて、所望の対立遺伝子を有する子孫を作出した。すべてのマウスを共飼育し、適切な対立遺伝子を有するＧｕｃｙ２ｃ＋／＋（野生型）同腹子を対照として使用した。組織を成体マウス（１２〜１６週齢）から収集した。Ｃｒｅをヒマワリ油中１０ｍｇ／ｍｌのタモキシフェン（Ｓｉｇｍａ；Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ；Ｔ５６４８）の単回２００μＬ投与で誘発した。タウロウルソデオキシコリン酸（ＴＵＤＣＡ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ５８０５４９）治療薬を３日間にわたって毎日、１００ｍｇ／ｋｇ／日で腹腔内投与した。マウスを、ＰａｎＴａｋ、３１０ｋＶｅＸ線装置を用いて単回１０Ｇｙ線量の全身γ照射に暴露し、照射後に、組織を、示された時点で採取した。一部の実験では、マウスに、２０ｍＭ  ８−ｃｐｔ−ｃＧＭＰ１００μＬを７日間にわたって毎日強制経口投与した。グラフ（ｎ）中の各ポイントは、別段に示されていない限り、マウス１匹を表す。すべての動物プロトコルが、Ｔｈｏｍａｓ  Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認された。
【０２４６】
免疫組織化学及び免疫蛍光
以前に記載されたとおり［７５］、マウスから小腸を採取し、ホルマリン中で固定し、パラフィン中に包埋した。切片（４μＭ）を切断し、次いで、連続エタノール−水浴中で再水和させ、ヘマトキシリン及びエオシンまたは抗原特異的一次及び二次抗体で染色した。免疫蛍光のための一次抗体には、抗ＧＦＰ、抗Ｂｍｉｌ、及び抗ＧＲＰ７８（Ａｂｃａｍ；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）：抗ホスホＶＡＳＰ  Ｓｅｒ２３９（Ｓｉｇｍａ；Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）；及び抗ＧＵＣＹ２Ｃ（インハウスで調製及び検証）が含まれた［１１９］。二次抗体は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）製であり、一次宿主に特異的であった。チラミドシグナル増幅［１２０］を使用してＧＵＣＹ２Ｃを検出し；ホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲートした二次抗体は、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製（ｃａｔ＃１１５−０３５−２０６及び＃１１１−０３６−０４６、１：１０００希釈）であり、かつフルオレセイン−コンジュゲートしたチラミンは、記載されたとおり［１２１］、チラミンＨＣｌ（ｃａｔ＃Ｔ２８７９、Ｓｉｇｍａ）及びＮＨＳ−フルオレセイン（ｃａｔ＃４６４１０、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）から調製した。Ｒｏｓａ−ＬａｃＺ系統追跡を可視化するために、以前に記載されたとおりに［１２２］、タモキシフェン誘発組み換えＣｒｅ小腸を調製した。マウス１匹あたり少なくとも４つの腸管周径切片を評価した。
【０２４７】
陰窩単離及び培養
その後の分析（エンテロイドアッセイ、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、イムノブロット）のための陰窩単離を、キレート化分離法の変形を使用して行った［１２３］。簡単に述べると、小腸を採取し、絨毛を小腸から優しくこすり落とし、組織を細かくし、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ／Ｃａ非含有、Ｍｇ非含有ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）中、氷上で合計４０分間にわたってインキュベートした。この時間を通じて、溶液を、１秒あたり２回の振盪速度で手動で間欠的に振盪し、上清を合計６回廃棄し、各廃棄後に、新鮮なＥＤＴＡ／ＨＢＳＳを添加した。組織を、乱すことなく３０分間にわたって氷上でインキュベートし、続いて、残りの陰窩を分離するために、１０ｍＬピペットで激しくピペット操作した。陰窩を、７０μＭストレーナーを通して濾過し、ピペット操作した。エンテロイドの培養のために、各遺伝子型について同数の陰窩（３００〜１５００陰窩／ウェルの範囲）をマトリゲル小滴（ＢＤ、３５４２３０）に再懸濁し、１０００μＬマイクロピペットで短時間ピペット操作し、３０μＬにプレーティングし、３５０μＬのＩｎｔｅｓｔｉｃｕｌｔ培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ；０６００５）を重ねた。ＦＡＣＳでは、単細胞懸濁液が得られるまで（１０分以下）、陰窩を０．２５％トリプシン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ；１５０５００６５）中で３７℃でインキュベートした。次いで、細胞を、４０μＭストレーナーを使用して再度濾過し、選別のためにＥＤＴＡ溶液中に保持した。
【０２４８】
蛍光標識細胞選別
Ｌｇｒ５−ＥＧＦＰ−ＣｒｅＥＲＴ２マウスからの細胞集団を、Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＭｏＦｌｏセルソーターを使用して収集するか、またはＢＤ  ＬＳＲＩＩを使用して分析した。前方散乱、側方散乱、及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ、Ｒｏｃｈｅ）により決定された生細胞をＣＤ４５（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で陰性ゲーティングし、次いで、ＣＤ２４Ｌｏｗ（ＢＤ  Ｐｂａｒｍｉｎｇｅｎ）で陽性ゲーティングした［１２４、１２５］。最後に、細胞を（分化細胞について）陰性ゲーティングし、かつ（Ｌｇｒ５＋細胞について）内因性ｅＧＦＰ蛍光で陽性ゲーティングした。
【０２４９】
定量逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ｑＰＣＲ）
選別された細胞からのＲＮＡを増幅し、かつＣＤ４５ー／ＣＤ２４Ｌｏｗ／ＥＧＦＰ＋集団からの全ＲＮＡを使用してインサイチュで逆転写した。ＲＮＡを、ＭｅｓｓａｇｅＢＯＯＳＴＥＲ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  ｑＰＣＲ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して増幅し、次いで、ＡＢＩ  ７９００におけるＴａｑＭａｎ  ＧｅｎｅＥｘｐｘｅｓｓｉｏｎ  ＡｓｓａｙのためのＴａｑＭａｎ  ＥＺ逆転写ポリメラーゼ連鎖反応Ｃｏｒｅ試薬及び適切なプライマー／プローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ）を使用して、ワンステップ逆転写ポリメラーゼ連鎖反応に掛けた。
【０２５０】
イムノブロット
記載のとおりに［１０７］、タンパク質を抽出し、ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して定量化し、かつ抗Ｂｍｉｌ（Ａｂｃａｍ；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍ．Ａ）、抗ＣＨＯＰ、抗カルレティキュリン、抗ホスホ−ＥＩＦ２α、抗β−チューブリン（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）及び抗Ｇｒｐ７８（Ａｂｃａｍ）を使用するイムノブロット分析に掛けた。二次抗体はＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ）製であった。イムノブロット分析用の分子量マーカー（Ｃａｔ．＃１０７４８０１０、１ランあたり５μＬ、またはＣａｔ．＃ＬＣ５８００、１ランあたり１０μＬ）はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）製であった。
【０２５１】
透過型電子顕微鏡法
一片（３ｃｍ）の腸管組織を、２．５％グルタルアルデヒド、０．１％タンニン酸、及び０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸バッファーを含有する固定剤中に５分間にわたって３回入れ、４℃で貯蔵した。組織をプラスチックブロックに載せ、２％ＯｓＯ４（オスミウム）、酢酸ウラニルを補充した０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸バッファーで処理し、次いで、段階的アセトン列により脱水した。Ｓｐｕｒｒｓ培地に包埋した後に、ブロックを切片にし、ＦＥＩ  Ｔｅｃｎａｉ１２顕微鏡を使用して可視化し、画像をＡＭＴデジタルカメラで取り込んだ。各群の代表的な電子顕微鏡写真を撮影した（Ｔｉｍｏｔｈｙ  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、Ｔｈｏｍａｓ  Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙが厚意で行った）。マウス１匹あたり少なくとも３０の陰窩からの細胞を数えた。
【０２５２】
統計的分析
すべての分析を盲検様式で行った。別段に示されていない限り、両側ステューデントｔ検定を単一比較で、かつ二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を多重比較で使用した。不等分散を想定し、かつ群の間で等しくないサンプルサイズを許容して、９５％信頼度及び検定力８０％で両側の統計学的に有意な差を検出するために十分であるように、コホートサイズを計算した。Ｐ＜０．０５を有意と判断した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ６ソフトウェアを用いて、統計的分析を行った。データは平均±ＳＥＭを表す。
【０２５３】
略語：ＣＢＣ、陰窩基底円柱細胞；ｃＧＭＰ、環状ＧＭＰ：ＥＲ、小胞体；ＧＵＣＹ２Ｃ、グアニリルシクラーゼＣ；ＩＳＣ、腸管幹細胞；ＳＴ、細菌性耐熱性腸毒素
【０２５４】
参照文献（参照により本明細書の一部をなす）
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６４．  Ｓａｎｇｉｏｒｇｉ  Ｅ  ａｎｄ  Ｃａｐｅｃｃｈｉ  ＭＲ，  Ｂｍｉｌ  ｉｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｎ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ．  ２００８；４０（７）：９１５−９２０．
６５．  Ｔｉａｎ  Ｈ，  Ｂｉｅｈｓ  Ｂ，  Ｗａｒｍｉｎｇ  Ｓ，  Ｌｅｏｎｇ  ＫＧ，  Ｒａｎｇｅｌｌ  Ｌ，  Ｋｌｅｉｎ  ＯＤ  ａｎｄ  ｄｅ  Ｓａｕｖａｇｅ  ＦＪ．  Ａ  ｒｅｓｅｒｖｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  ｒｅｎｄｅｒｓ  Ｌｇｒ５−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｅｌｌｓ  ｄｉｓｐｅｎｓａｂｌｅ．  Ｎａｔｕｒｅ．  ２０１１：４７８（７３６８）：２５５−２５９．
６６．  Ｔａｋｅｄａ  Ｎ，  Ｊａｉｎ  Ｒ，  ＬｅＢｏｅｕｆ  ＭＲ，  Ｗａｎｇ  Ｑ，  Ｌｕ  ＭＭ  ａｎｄ  Ｅｐｓｔｅｉｎ  ＪＡ．  Ｉｎｔｅｒｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｎｉｃｈｅｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２０１１：３３４（６０６１）：１４２０−１４２４．
６７．  Ｋｕｈｎ  Ｍ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｇｕａｎｙｌｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ．  ２０１６；９６（２）：７５１−８０４．
６８．  Ｐｉｔａｒｉ  ＧＭ，  Ｄｉ  Ｇｕｇｌｉｅｌｍｏ  ＭＤ，  Ｐａｒｋ  Ｊ，  Ｓｃｈｕｌｚ  Ｓ  ａｎｄ  Ｗａｌｄｍａｎ  ＳＡ．  Ｇｕａｎｙｌｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅ  Ｃ  ａｇｏｎｉｓｔｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ．  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，  ２００１；９８（１４）：７８４６−７８５１．
６９．  Ｌｉ  Ｐ，  Ｓｃｈｕｌｚ  Ｓ，  Ｂｏｍｂｏｎａｔｉ  Ａ，  Ｐａｌａｚｚｏ  ＪＰ，  Ｈｙｓｌｏｐ  ＴＭ，  Ｘｕ  Ｙ，  Ｂａｒａｎ  ＡＡ，  Ｓｉｒａｃｕｓａ  ＬＤ，  Ｐｉｔａｒｉ  ＧＭ  ａｎｄ  Ｗａｌｄｍａｎ  ＳＡ．  Ｇｕａｎｙｌｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅ  Ｃ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ．  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．  ２００７；１３３（２）：５９９−６０７．
７０．  Ｌｉ  Ｐ，  Ｌｉｎ  ＪＥ，  Ｃｈｅｒｖｏｎｅｖａ  Ｉ，  Ｓｃｈｕｌｚ  Ｓ，  Ｗａｌｄｍａｎ  ＳＡ  ａｎｄ  Ｐｉｔａｒｉ  ＧＭ．  Ｈｏｍｅｏｓｔａｔｉｃ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｒｙｐｔ−ｖｉｌｌｕｓ  ａｘｉｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｕａｎｙｌｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅ  Ｃ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｓ  ｔｈｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ  ｉｎ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ．  Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ．  ２００７；１７１  （６）：１８４７−１８５８．
７１．  Ｍａｒｓｈｍａｎ  Ｅ，  Ｂｏｏｔｈ  Ｃ  ａｎｄ  Ｐｏｔｔｅｎ  ＣＳ．  Ｔｈｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ．  ２００２；２４（１）：９１−９８．
７２．  Ｂｉｓｗａｓ  Ｓ，  Ｄａｖｉｓ  Ｈ，  Ｉｒｓｈａｄ  Ｓ，  Ｓａｎｄｂｅｒｇ  Ｔ，  Ｗｏｒｔｈｌｅｙ  Ｄ  ａｎｄ  Ｌｅｅｄｈａｍ  Ｓ，  Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｔｅ  ｉｎ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．  ２０１５；２３７（２）：１３５−１４５．
７３．  Ｈａｎ  Ｘ，  Ｍａｎｎ  Ｅ，  Ｇｉｌｂｅｒｔ  Ｓ，  Ｇｕａｎ  Ｙ，  Ｓｔｅｉｎｂｒｅｃｈｅｒ  ＫＡ，  Ｍｏｎｔｒｏｓｅ  ＭＨ  ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ  ＭＢ．  Ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｇｕａｎｙｌｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅ  Ｃ  （ＧＣＣ）  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｂａｒｒｉｅｒ．  ＰｌｏＳ  ｏｎｅ．  ２０１１；６（ｌ）：ｅ１６１３９．
７４．  Ｋｕｈｎ  Ｍ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｇｕａｎｙｌｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ．  ２０１６；９６（２）；７５１−８０４．
７５．  Ｌｉｎ  ＪＥ，  Ｌｉ  Ｐ，  Ｓｎｏｏｋ  ＡＥ，  Ｓｃｈｕｌｚ  Ｓ，  Ｄａｓｇｕｐｔａ  Ａ，  Ｈｙｓｌｏｐ  ＴＭ，  Ｇｉｂｂｏｎｓ  ＡＶ，  Ｍａｒｓｚｌｏｗｉｃｚ  Ｇ，  Ｐｉｔａｒｉ  ＧＭ  ａｎｄ  Ｗａｌｄｍａｎ  ＳＡ．  Ｔｈｅ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＧＵＣＹ２Ｃ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｕｍｏｒ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ＡＫＴ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．  ２０１０；１３８（ｌ）：２４１−２５４．
７６．  Ｌｉｎ  ＪＥ，  Ｓｎｏｏｋ  ＡＥ，  Ｌｉ  Ｐ，  Ｓｔｏｅｃｋｅｒ  ＢＡ，  Ｋｉｍ  ＧＷ，  Ｍａｇｅｅ  ＭＳ，  Ｇａｒｃｉａ  ＡＶ，  Ｖａｌｅｎｔｉｎｏ  ＭＡ，  Ｈｙｓｌｏｐ  Ｔ，  Ｓｃｈｕｌｚ  Ｓ  ａｎｄ  Ｗａｌｄｍａｎ  ＳＡ．  ＧＵＣＹ２Ｃ  ｏｐｐｏｓｅｓ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｇｅｎｏｔｏｘｉｃ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ＡＫＴ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ．  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．  ２０１２；７（２）；ｅ３１６８６．
７７．  Ｌｅｕｓｈａｃｋｅ  Ｍ  ａｎｄ  Ｂａｒｋｅｒ  Ｎ．  Ｅｘ  ｖｉｖｏ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ：ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．  Ｇｕｔ  ２０１４；６３（８）：１３４５−１３５４．
７８．  Ｂａｒｋｅｒ  Ｎ，  ｖａｎ  Ｅｓ  ＪＨ，  Ｋｕｉｐｅｒｓ  Ｊ，  Ｋｕｊａｌａ  Ｐ，  ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｏｒｎ  Ｍ，  Ｃｏｚｉｊｎｓｅｎ  Ｍ，  Ｈａｅｇｅｂａｒｔｈ  Ａ，  Ｋｏｒｖｉｎｇ  Ｊ，  Ｂｅｇｔｈｅｌ  Ｈ，  Ｐｅｔｅｒｓ  ＰＪ  ａｎｄ  Ｃｌｅｖｅｒｓ  Ｈ．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  ａｎｄ  ｃｏｌｏｎ  ｂｙ  ｍａｒｋｅｒ  ｇｅｎｅ  Ｌｇｒ５，  Ｎａｔｕｒｅ．  ２００７；４４９（７１６５）；１００３−１００７．
７９．  Ｐｕｎｙａｓｈｔｈｉｔｉ  Ｋ  ａｎｄ  Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ  ＲＡ，  Ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，  １．  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｌｏｏｐｓ．  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  １９７１；４（４）：４７３−４７８．
８０．  Ｐｉｔａｒｉ  ＧＭ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｇｕａｎｙｌｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅ  Ｃ  ａｇｏｎｉｓｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ  ｃｏｌｉｔｉｓ．  Ｄｒｕｇ  ｄｅｓｉｇｎ，  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｙ．  ２０１３；７：３５１−３６０．
８１．  Ｐｏｐｐｅ  Ｈ，  Ｒｙｂａｌｋｉｎ  ＳＤ，  Ｒｅｈｍａｎｎ  Ｈ，  Ｈｉｎｄｓ  ＴＲ，  Ｔａｎｇ  ＸＢ，  Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ＡＥ，  Ｓｃｈｗｅｄｅ  Ｆ，  Ｇｅｎｉｅｓｅｒ  ＨＧ，  Ｂｏｓ  ＪＬ，  Ｄｏｓｋｅｌａｎｄ  ＳＯ，  Ｂｅａｖｏ  ＪＡ  ａｎｄ  Ｂｕｔｔ  Ｅ，  Ｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｎａｌｏｇｓ  ａｓ  ｐｒｏｂｅｓ  ｏｆ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ．  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  ２００８；５（４）：２７７−２７８．
８２．  Ｈｅｉｊｍａｎｓ  Ｊ，  ｖａｎ  Ｌｉｄｔｈ  ｄｅ  Ｊｅｕｄｅ  ＪＦ，  Ｋｏｏ  ＢＫ，  Ｒｏｓｅｋｒａｎｓ  ＳＬ，  Ｗｉｅｌｅｎｇａ  ＭＣ，  ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｅｔｅｒｉｎｇ  Ｍ，  Ｆｅｒｒａｎｔｅ  Ｍ，  Ｌｅｅ  ＡＳ，  Ｏｎｄｅｒｗａｔｅｒ  ＪＪ，  Ｐａｔｏｎ  ＪＣ，  Ｐａｔｏｎ  ＡＷ，  Ｍｏｍｍａａｓ  ＡＭ，  Ｋｏｄａｃｈ  ＬＬ，  Ｈａｒｄｗｉｃｋ  ＪＣ，  Ｈｏｍｍｅｓ  ＤＷ，  Ｃｌｅｖｅｒｓ  Ｈ，  ｅｔ  ａｌ．  ＥＲ．  ｓｔｒｅｓｓ  ｃａｕｓｅｓ  ｒａｐｉｄ  ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｓｔｅｍｎｅｓｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｕｎｆｏｌｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．  Ｃｅｌｌ  ｒｅｐｏｒｔｓ．  ２０１３；３（４）：１１２８−１１３９．
８３．  Ｎｉｅｄｅｒｒｅｉｔｅｒ  Ｌ，  Ｆｒｉｔｚ  ＴＭ，  Ａｄｏｌｐｈ  ＴＥ，  Ｋｒｉｓｍｅｒ  ＡＭ，  Ｏｆｆｎｅｒ  ＦＡ，  Ｔｓｃｈｕｒｔｓｃｈｅｎｔｈａｌｅｒ  Ｍ，  Ｆｌａｋ  ＭＢ，  Ｈｏｓｏｍｉ  Ｓ，  Ｔｏｍｃｚａｋ  ＭＦ，  Ｋａｎｅｉｄｅｒ  ＮＣ，  Ｓａｒｃｅｖｉｃ  Ｅ，  Ｋｅｍｐｓｔｅｒ  ＳＬ，  Ｒａｉｎｅ  Ｔ，  Ｅｓｓｅｒ  Ｄ，  Ｒｏｓｅｎａｔｉｅｌ  Ｐ，  Ｋｏｈｎｏ  Ｋ，  ｅｔ  ａｌ．  ＥＲ  ｓｔｒｅｓｓ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｘｂｐｌ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｄｉｒｅｃｔｓ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  ２０１３；２１０（１０）：２０４１−２０５６．
８４．  Ｐｉｔａｒｉ  ＧＭ，  Ｚｉｎｇｍａｎ  ＬＶ，  Ｈｏｄｇｓｏｎ  ＤＭ，  Ａｌｅｋｓｅｅｖ  ＡＥ，  Ｋａｚｅｒｏｕｎｉａｎ  Ｓ，  Ｂｉｅｎｅｎｇｒａｅｂｅｒ  Ｍ，  Ｈａｊｎｏｃｚｋｙ  Ｇ，  Ｔｅｒｚｉｃ  Ａ  ａｎｄ  Ｗａｌｄｍａｎ  ＳＡ．  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎｓ  ａｒｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ．  ２００３；１００（５）；２６９５−２６９９．
８５．  Ｌｅｅ  ＡＳ．  Ｔｈｅ  ＥＲ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅ  ａｎｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ＧＲＰ７８／ＢｉＰ  ａｓ  ａ  ｍｏｎｉｔｏｒ  ｏｆ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｓｔｒｅｓｓ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  ２００５；３５（４）：３７３−３８１．
８６．  Ｘｕ  Ｃ，  Ｂａｉｌｌｙ−Ｍａｉｔｒｅ  Ｂ  ａｎｄ  Ｒｅｅｄ  ＪＣ，  Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｓｔｒｅｓｓ：ｃｅｌｌ  ｌｉｆｅ  ａｎｄ  ｄｅａｔｈ  ｄｅｃｉｓｉｏｎｓ．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．  ２００５；１１５（１０）：２６５６−２６６４．
８７．  Ｕｒｒａ  Ｈ，  Ｄｕｆｅｙ  Ｅ，  Ｌｉｓｂｏｎａ  Ｆ，  Ｒｏｊａｓ−Ｒｉｖｅｒａ  Ｄ  ａｎｄ  Ｈｅｔｚ  Ｃ．  Ｗｈｅｎ  ＥＲ  ｓｔｒｅｓｓ  ｒｅａｃｈｅｓ  ａ  ｄｅａｄ  ｅｎｄ．  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  ａｃｔａ．  ２０１３；１８３３（１２）：３５０７−３５１７．
８８．  Ｒｕｔｋｏｗｓｋｉ  ＤＴ，  Ａｒｎｏｌｄ  ＳＭ，  Ｍｉｌｌｅｒ  ＣＮ，  Ｗｕ  Ｊ，  Ｌｉ  Ｊ，  Ｇｕｎｎｉｓｏｎ  ＫＭ，  Ｍｏｒｉ  Ｋ，  Ｓａｄｉｇｈｉ  Ａｋｈａ  ＡＡ，  Ｒａｄｅｎ  Ｄ  ａｎｄ  Ｋａｕｆｍａｎ  ＲＪ．  Ａｄａｐｔａｔｉｏｎ  ｔｏ  ＥＲ  ｓｔｒｅｓｓ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｔａｂｉｌｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏ−ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｎｄ  ｐｒｏ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｍＲＮＡｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ，  ２００６；４（１１）：ｅ３７４．
８９．  Ｔｓａｎｇ  ＫＹ，  Ｃｈａｎ  Ｄ，  Ｂａｔｅｍａｎ  ＪＦ  ａｎｄ  Ｃｈｅａｈ  ＫＳ，  Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｄａｐｔａｔｉｏｎ  ｔｏ  ＥＲ  ｓｔｒｅｓｓ；ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ｄｏｕｂｌｅ−ｅｄｇｅｄ  ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ，  ２０１０；１２３（Ｐｔ  １３）：２１４５−２１５４，
９０．  Ｃｏｒｔｅｚ  Ｌ  ａｎｄ  Ｓｉｍ  Ｖ．  Ｔｈｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｌｄｉｎｇ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．  Ｐｒｉｏｎ，  ２０１４；８（２）．
９１．  Ｂａｃｈ  ＳＰ，  Ｒｅｎｅｈａｎ  ＡＧ  ａｎｄ  Ｐｏｔｔｅｎ  ＣＳ，  Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：ｔｈｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ａｓ  ａ  ｐａｒａｄｉｇｍ．  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．  ２０００；２１（３）；４６９−４７６．
９２．  Ｗｉｔｈｅｒｓ  ＨＲ  ａｎｄ  Ｅｌｋｉｎｄ  ＭＭ．  Ｍｉｃｒｏｃｏｌｏｎｙ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｍｕｃｏｓａ  ｅｘｐｏｓｅｄ  ｔｏ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｒａｄｉａｔ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｌａｔ  Ｓｔｕｄ  Ｐｈｙｓ  Ｃｈｅｍ  Ｍｅｄ．  １９７０；１７（３）：２６１−２６７．
９３．  Ｌｉ  Ｎ，  Ｙｏｕｓｅｆｉ  Ｍ，  Ｎａｋａｕｋａ−Ｄｄａｍｂａ  Ａ，  Ｊａｉｎ  Ｒ，  Ｔｏｂｉａｓ  Ｊ，  Ｅｐｓｔｅｉｎ  ＪＡ，  Ｊｅｎｓｅｎ  ＳＴ  ａｎｄ  Ｌｅｎｇｎｅｒ  ＣＪ．  Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｘｙ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ａｌｌｅｌｅ−ｍａｒｋｅｄ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｓ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｈｉｅｒａｒｃｈｙ．  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ．  ２０１４；３（５）：８７６−８９１．
９４．  Ｋｉｍ  Ｅ，  Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ＬＡ，  Ｚｏｈ  ＲＳ，  Ｈｅｎｓｅｌ  ＭＥ，  Ｐａｔｉｌ  ＢＳ，  Ｊａｙａｐｒａｋａｓｈａ  ＧＫ，  Ｃａｌｌａｗａｙ  ＥＳ，  Ａｌｌｒｅｄ  ＣＤ，  Ｔｕｒｎｅｒ  ＮＤ，  Ｗｅｅｋｓ  ＢＲ  ａｎｄ  Ｃｈａｐｋｉｎ  ＲＳ．  Ｈｏｍｅｏｓｔａｔｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｏｆ  ｃｏｌｏｎｉｃ  ＬＧＲ５＋  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ａｃｕｔｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｔｏ  ａ  ｇｅｎｏｔｏｘｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎ．  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．  ２０１６；３７（２）：２０６−２１４．
９５．  Ｍｉｌｌｓ  ＪＣ  ａｎｄ  Ｓａｎｓｏｍ  ＯＪ．  Ｒｅｓｅｒｖｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍ  ｔｏ  ｆｕｅｌ  ｒｅｐａｉｒ，  ｍｅｔａｐｌａｓｉａ，  ａｎｄ  ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｄｕｌｔ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｒａｃｔ．  Ｓｃｉ  Ｓｉｇｎａｌ．  ２０１５；８（３８５）：ｒｅ８．
９６．  Ｉｔｚｋｏｖｉｔｚ  Ｓ，  Ｌｙｕｂｉｍｏｖａ  Ａ，  Ｂｌａｔ  ＩＣ，  Ｍａｙｎａｒｄ  Ｍ，  ｖａｎ  Ｅｓ  Ｊ，  Ｌｅｅｓ  Ｊ，  Ｊａｃｋｓ  Ｔ，  Ｃｌｅｖｅｒｓ  Ｈ  ａｎｄ  ｖａｎ  Ｏｕｄｅｎａａｒｄｅｎ  Ａ．  Ｓｉｎｇｌｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｏｆ  ｓｔｅｍ−ｃｅｌｌ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ．  Ｎａｔ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２０１２；１４（１）；１０６−１１４．
９７．  Ｔｅｔｔｅｈ  ＰＷ，  Ｆａｒｉｎ  ＨＦ  ａｎｄ  Ｃｌｅｖｅｒｓ  Ｈ．  Ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ  ｗｉｔｈｉｎ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｈｉｅｒａｒｃｈｉｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２０１５；２５（２）：１００−１０８．
９８．  Ｄｏｎａｔｉ  Ｇ  ａｎｄ  Ｗａｔｔ  ＦＭ．  Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ  ｉｎ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａ，  Ｃｅｌｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ．  ２０１５；１６（５）：４６５−４７６．
９９．  Ｑｉｕ  Ｗ，  Ｗａｎｇ  Ｘ，  Ｂｕｃｈａｎａｎ  Ｍ，  Ｈｅ  Ｋ，  Ｓｈａｒｍａ  Ｒ，  Ｚｈａｎｇ  Ｌ，  Ｗａｎｇ  Ｑ  ａｎｄ  Ｙｕ  Ｊ．  ＡＤＡＲ１  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ａｎｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ．  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｓ．  ２０１３；４：ｅ５９９．
１００．  Ｂｒｅｎｎａ  Ｏ，  Ｆｕｒｎｅｓ  ＭＷ，  Ｍｕｎｋｖｏｌｄ  Ｂ，  Ｋｉｄｄ  Ｍ，  Ｓａｎｄｖｉｋ  ＡＫ  ａｎｄ  Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ  Ｂｌ．  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｕａｎｙｌｉｎ  ａｎｄ  ｕｒｏｇｕａｎｙｌｉｎ  ｍＲＮＡｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｒａｔ  ｄｕｏｄｅｎａｌ  ａｎｄ  ｃｏｌｏｎｉｃ  ｍｕｃｏｓａ．  Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．  ２０１６．
１０１．  Ｇａｒｉｎ−Ｌａｆｌａｍ  ＭＰ，  Ｓｔｅｉｎｂｒｅｃｈｅｒ  ＫＡ，  Ｒｕｄｏｌｐｈ  ＪＡ，  Ｍａｏ  Ｊ  ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ  ＭＢ．  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｕａｎｙｌａｔｅ  ｃｙｃｌａｓｅ  Ｃ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ａｃｕｔｅ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２００９；２９６（４）：Ｇ７４０−７４９．
１０２．  Ｈａｒｍｅｌ−Ｌａｗｓ  Ｅ，  Ｍａｎｎ  ＥＡ，  Ｃｏｈｅｎ  ＭＢ  ａｎｄ  Ｓｔｅｉｎｂｒｅｃｈｅｒ  ＫＡ．  Ｇｕａｎｙｌａｔｅ  ｃｙｃｌａｓｅ  Ｃ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｃａｕｓｅｓ  ｓｅｖｅｒｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｃｏｌｉｔｉｓ．  ＰｌｏＳ  ｏｎｅ．  ２０１３；８（１１）：ｅ７９１８０．
１０３．  Ｓｔｅｉｎｂｒｅｃｈｅｒ  ＫＡ，  Ｈａｒｍｅｌ−Ｌａｗｓ  Ｅ，  Ｇａｒｉｎ−Ｌａｆｌａｍ  ＭＰ，  Ｍａｎｎ  ＥＡ，  Ｂｅｚｅｒｒａ  ＬＤ，  Ｈｏｇａｎ  ＳＰ  ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ  ＭＢ．  Ｍｕｒｉｎｅ  ｇｕａｎｙｌａｔｅ  ｃｙｃｌａｓｅ  Ｃ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｃｏｌｏｎｉｃ  ｉｎｊｕｒｙ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２０１１；１８６（１２）：７２０５−７２１４．
１０４．  Ｎｏｔｔｅｒｍａｎ  ＤＡ，  Ａｌｏｎ  Ｕ，  Ｓｉｅｒｋ  ＡＪ  ａｎｄ  Ｌｅｖｉｎｅ  ＡＪ．  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｏｆ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ａｄｅｎｏｍａ，  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ，  ａｎｄ  ｎｏｒｍａｌ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｘａｍｉｎｅｄ  ｂｙ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｒｒａｙｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００１；６１（７）；３１２４−３１３０．
１０５．  Ｓｔｅｉｎｂｒｅｃｈｅｒ  ＫＡ，  Ｔｕｏｈｙ  ＴＭ，  Ｈｅｐｐｎｅｒ  Ｇｏｓｓ  Ｋ，  Ｓｃｏｔｔ  ＭＣ，  Ｗｉｔｔｅ  ＤＰ，  Ｇｒｏｄｅｎ  Ｊ  ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ  ＭＢ．  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｇｕａｎｙｌｉｎ  ｉｓ  ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ａｄｅｎｏｍａｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２０００；２７３（１）：２２５−２３０．
１０６．  Ｗｉｌｓｏｎ  Ｃ，  Ｌｉｎ  ＪＥ，  Ｌｉ  Ｐ，  Ｓｎｏｏｋ  ＡＥ，  Ｇｏｎｇ  Ｊ，  Ｓａｔｏ  Ｔ，  Ｌｉｕ  Ｃ，  Ｇｉｒｏｎｄｏ  ＭＡ，  Ｒｕｉ  Ｈ，  Ｈｙｓｌｏｐ  Ｔ  ａｎｄ  Ｗａｌｄｍａｎ  ＳＡ．  Ｔｈｅ  ｐａｒａｃｒｉｎｅ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＧＵＣＹ２Ｃ  ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ，  ｇｕａｎｙｌｉｎ，  ｉｓ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌｌｙ  ｌｏｓｔ  ｉｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｐｒｅｖ．  ２０１４；２３（１１）；２３２８−２３３７．
１０７．  Ｌｉｎ  ＪＥ，  Ｃｏｌｏｎ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ  Ｆ，  Ｂｌｏｍａｉｎ  Ｅ，  Ｋｉｍ  ＧＷ，  Ａｉｎｇ  Ａ，  Ｓｔｏｅｃｋｅｒ  Ｂ，  Ｒｏｃｋ  Ｊ，  Ｓｎｏｏｋ  ＡＥ，  Ｚｈａｎ  Ｔ，  Ｈｙｓｌｏｐ  ＴＭ，  Ｔｏｍｃｚａｋ  Ｍ，  Ｂｌｕｍｂｅｒｇ  ＲＳ  ａｎｄ  Ｗａｌｄｍａｎ  ＳＡ．  Ｏｂｅｓｉｔｙ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ  Ｉｓ  ｄｒｉｖｅｎ  ｂｙ  ｃａｌｏｒｉｃ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｕａｎｙｌｉｎ−ＧＵＣＹ２Ｃ  ｐａｒａｃｒｉｎｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｘｉｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２０１６；７６（２）：３３９〜３４６．
１０８．  Ｂａｒｋｅｒ  Ｎ，  Ｒｉｄｇｗａｙ  ＲＡ，  ｖａｎ  Ｅｓ  ＪＨ，  ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｅｔｅｒｉｎｇ  Ｍ，  Ｂｅｇｔｈｅｌ  Ｈ，  ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｏｒｎ  Ｍ，  Ｄａｎｅｎｂｅｒｇ  Ｅ，  Ｃｌａｒｋｅ  ＡＲ，  Ｓａｎｓｏｍ  ＯＪ  ａｎｄ  Ｃｌｅｖｅｒｓ  Ｈ．  Ｃｒｙｐｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｓ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌｓ−ｏｆ−ｏｒｉｇｉｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｎａｔｕｒｅ，  ２００９；４５７（７２２９）：６０８−６１１．
１０９．  Ｐｒｏｃｔｏｒ  Ｅ，  Ｗａｇｈｒａｙ  Ｍ，  Ｌｅｅ  ＣＪ，  Ｈｅｉｄｔ  ＤＧ，  Ｙａｌａｍａｎｃｈｉｌｉ  Ｍ，  Ｌｉ  Ｃ，  Ｂｅｄｎａｒ  Ｆ  ａｎｄ  Ｓｉｍｅｏｎｅ  ＤＭ．  Ｂｍｉｌ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．  ＰｌｏＳ  ｏｎｅ．  ２０１３；８（２）；ｅ５５８２０．
１１０．  Ｚｈｕ  Ｄ，  Ｗａｎ  Ｘ，  Ｈｕａｎｇ  Ｈ，  Ｃｈｅｎ  Ｘ，  Ｌｉａｎｇ  Ｗ，  Ｚｈａｏ  Ｆ，  Ｌｉｎ  Ｔ，  Ｈａｎ  Ｊ  ａｎｄ  Ｘｉｅ  Ｗ．  Ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ  ｏｆ  Ｂｍｉｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｔｈｅ  ｓｔｅｍｎｅｓｓ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ−ｌｉｋｅ  ｓｉｄｅ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｃｅｌｌｓ．  Ｏｎｃｏｌ  Ｒｅｐ．  ２０１４；３１（２）：７２７−７３６．
１１１．  Ｂｒｅｎｎａ  Ｏ，  Ｂｒｕｌａｎｄ  Ｔ，  Ｆｕｒｎｅｓ  ＭＷ，  Ｇｒａｎｌｕｎｄ  Ａ，  Ｄｒｏｚｄｏｖ  Ｉ，  Ｅｍｇａｒｄ  Ｊ，  Ｂｒｏｎｓｔａｄ  Ｇ，  Ｋｉｄｄ  Ｍ，  Ｓａｎｄｖｉｋ  ＡＫ．  ａｎｄ  Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ  Ｂｌ．  Ｔｈｅ  ｇｕａｎｙｌａｔｅ  ｃｙｃｌａｓｅ−Ｃ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｓ  ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．  ２０１５；５０（１０）；１２４１−１２５２．
１１２．  Ｃａｍｉｌｌｅｒｉ  Ｍ．  Ｇｕａｎｙｌａｔｅ  ｃｙｃｌａｓｅ  Ｃ  ａｇｏｎｉｓｔｓ：ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ａｎｄ  ａｃｔｉｏｎｓ．  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．  ２０１５；１４８（３）：４８３−４８７．
１１３．  Ｓｈａｉｌｕｂｈａｉ  Ｋ，  Ｙｕ  ＨＨ，  Ｋａｒｕｎａｎａｎｄａａ  Ｋ，  Ｗａｎｇ  ＪＹ，  Ｅｂｅｒ  ＳＬ，  Ｗａｎｇ  Ｙ，  Ｊｏｏ  ＮＳ，  Ｋｉｍ  ＨＤ，  Ｍｉｅｄｅｍａ  ＢＷ，  Ａｂｂａｓ  ＳＺ，  Ｂｏｄｄｕｐａｌｌｉ  ＳＳ，  Ｃｕｒｒｉｅ  ＭＧ  ａｎｄ  Ｆｏｒｔｅ  ＬＲ．  Ｕｒｏｇｕａｎｙｌｉｎ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｐｏｌｙｐ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ａｐｃ（Ｍｉｎ／＋）  ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｎ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  ｃｙｃｌｉｃ  ＧＭＰ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２０００；６０（１８）：５１５１−５１５７．
１１４．  Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  ＤＳ，  Ｌｉｎ  ＪＥ，  Ｆｏｓｔｅｒ  ＮＲ，  Ｄｅｌｌａ’Ｚａｎｎａ  Ｇ，  Ｕｍａｒ  Ａ，  Ｓｅｉｓｌｅｒ  Ｄ，  Ｋｒａｆｔ  ＷＫ，  Ｋａｓｔｅｎｂｅｒｇ  ＤＭ，  Ｋａｔｚ  ＬＣ，  Ｌｉｍｂｕｒｇ  ＰＪ  ａｎｄ  Ｗａｌｄｍａｎ  ＳＡ．  Ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｏｒａｌ  ｌｉｎａｃｌｏｔｉｄｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔｕｍ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｖ  Ｒｅｓ  （Ｐｈｉｌａ）．  ２０１７；１０（６）；３４５−３５４．
１１５．  Ｓｈａｉｌｕｂｈａｉ  Ｋ，  Ｐａｌｅｊｗａｌａ  Ｖ，  Ａｒｊｕｎａｎ  ＫＰ，  Ｓａｙｋｈｅｄｋａｒ  Ｓ，  Ｎｅｆｓｋｙ  Ｂ，  Ｆｏｓｓ  ＪＡ，  Ｃｏｍｉｓｋｅｙ  Ｓ，  Ｊａｃｏｂ  ＧＳ  ａｎｄ  Ｐｌｅｖｙ  ＳＥ．  Ｐｌｅｃａｎａｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｄｏｌｃａｎａｔｉｄｅ，  ｎｏｖｅｌ  ｇｕａｎｙｌａｔｅ  ｃｙｃｌａｓｅ−Ｃ  ａｇｏｎｉｓｔｓ，  ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｃｏｌｉｔｉｓ．  Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ．  ２０１５；６（４）：２１３−２２２．
１１６．  Ｋａｎｔａｒａ  Ｃ，  Ｍｏｙａ  ＳＭ，  Ｈｏｕｃｈｅｎ  ＣＷ，  Ｕｍａｒ  Ｓ，  Ｕｌｌｒｉｃｈ  ＲＬ，  Ｓｉｎｇｈ  Ｐ  ａｎｄ  Ｃａｒｎｅｙ  ＤＨ．  Ｎｏｖｅｌ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ＴＰ５０８  ｍｉｔｉｇａｔｅｓ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｄａｍａｇｅ  ｂｙ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ  ｃｒｙｐｔ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ．  Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．  ２０１５；９５（１１）：１２２２−１２３３．
１１７．  Ｂｏｏｔｈ  Ｃ，  Ｔｕｄｏｒ  Ｇ，  Ｔｕｄｏｒ  Ｊ，  Ｋａｔｚ  ＢＰ  ａｎｄ  ＭａｃＶｉｔｔｉｅ  ＴＪ．  Ａｃｕｔｅ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｉｎ  ｈｉｇｈ−ｄｏｓｅ  ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ  ｍｉｃｅ．  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｈｙｓ．  ２０１２；１０３（４）：３８３−３９９．
１１８．  Ｓｃｈｕｌｚ  Ｓ，  Ｌｏｐｅｚ  ＭＪ，  Ｋｕｈｎ  Ｍ  ａｎｄ  Ｇａｒｂｅｒｓ  ＤＬ．  Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｕａｎｙｌｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅ−Ｃ  ｇｅｎｅ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ａ  ｐａｒａｄｏｘｉｃａｌ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｏｆ  ｖｉａｂｌｅ  ｂｕｔ  ｈｅａｔ−ｓｔａｂｌｅ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｍｉｃｅ．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．  １９９７；１００（６）；１５９０−１５９５．
１１９．  Ｍａｒｓｚａｌｏｗｉｃｚ  ＧＰ，  Ｓｎｏｏｋ  ＡＥ，  Ｍａｇｅｅ  ＭＳ，  Ｍｅｒｌｉｎｏ  Ｄ，  Ｂｅｒｍａｎ−Ｂｏｏｔｙ  ＬＤ  ａｎｄ  Ｗａｌｄｍａｎ  ＳＡ，  ＧＵＣＹ２Ｃ  ｌｙｓｏｓｏｍｏｔｒｏｐｉｃ  ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｄｅｌｉｖｅｒｓ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｔｏ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ  ２０１４；５（１９）：９４６０−９４７１．
１２０．  Ｆａｇｅｔ  Ｌ  ａｎｄ  Ｈｎａｓｋｏ  ＴＳ．  Ｔｙｒａｍｉｄｅ  Ｓｉｇｎａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｉｍｍｏｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｃｌｉｆｔｏｎ，  ＮＪ）．  ２０１５；１３１．  ８：１６１−１７２．
１２１．  Ｈｏｐｍａｎ  ＡＨ，  Ｒａｍａｅｋｅｒｓ  ＦＣ  ａｎｄ  Ｓｐｅｅｌ  ＥＪ．  Ｒａｐｉｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｂｉｏｔｉｎ−，  ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ−，  ｔｒｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−，  ａｎｄ  ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅ−ｌａｂｅｌｅｄ  ｔｙｒａｍｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ＣＡＲＤ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．  Ｔｈｅ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｏｃｉｅｔｙ．  １９９８；４６（６）：７７１−７７７．
１２２．  ｅｌ  Ｍａｒｊｏｕ  Ｆ，  Ｊａｎｓｓｅｎ  ＫＰ，  Ｃｈａｎｇ  ＢＨ，  Ｌｉ  Ｍ，  Ｈｉｎｄｉｅ  Ｖ，  Ｃｈａｎ  Ｌ，  Ｌｏｕｖａｒｄ  Ｄ，  Ｃｈａｍｂｏｎ  Ｐ，  Ｍｅｔｚｇｅｒ  Ｄ  ａｎｄ  Ｒｏｂｉｎｅ  Ｓ．  Ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｃｒｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｕｔ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ．  Ｇｅｎｅｓｉｓ．  ２００４；３９（３）：１８６−１９３．
１２３．  Ｙｉｌｍａｚ  ＯＨ，  Ｋａｔａｊｉｓｔｏ  Ｐ，  Ｌａｍｍｉｎｇ  ＤＷ，  Ｇｕｌｔｅｋｉｎ  Ｙ，  Ｂａｕｅｒ−Ｒｏｗｅ  ＫＥ，  Ｓｅｎｇｕｐｔａ  Ｓ，  Ｂｉｒｓｏｙ  Ｋ，  Ｄｕｒｓｕｎ  Ａ，  Ｙｉｌｍａｚ  ＶＯ，  Ｓｅｌｉｇ  Ｍ，  Ｎｉｅｌｓｅｎ  ＧＰ，  Ｍｉｎｏ−Ｋｅｎｕｄｓｏｎ  Ｍ，  Ｚｕｋｅｒｂｅｒｇ  ＬＲ，  Ｂｈａｎ  ＡＫ，  Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ  Ｖ  ａｎｄ  Ｓａｂａｔｉｎｉ  ＤＭ．  ｍＴＯＲＣｌ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｐａｎｅｔｈ  ｃｅｌｌ  ｎｉｃｈｅ  ｃｏｕｐｌｅｓ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｓｔｅｍ−ｃｅｌｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｔｏ  ｃａｌｏｒｉｅ  ｉｎｔａｋｅ．  Ｎａｔｕｒｅ．  ２０１２；４８６（７４０４）：４９０−４９５．
１２４．  ｖｏｎ  Ｆｕｒｓｔｅｎｂｅｒｇ  ＲＪ，  Ｇｕｌａｔｉ  ＡＳ，  Ｂａｘｉ  Ａ，  Ｄｏｈｅｒｔｙ  ＪＭ，  Ｓｔａｐｐｅｎｂｅｃｋ  ＴＳ，  Ｇｒａｃｚ  ＡＤ，  Ｍａｇｎｅｓｓ  ＳＴ  ａｎｄ  Ｈｅｎｎｉｎｇ  ＳＪ，  Ｓｏｒｔｉｎｇ  ｍｏｕｓｅ  ｊｅｊｕｎａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ＣＤ２４  ｙｉｅｌｄｓ  ａ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２０１１；３００（３）：Ｇ４０９−４１７．
１２５．  Ｓａｔｏ  Ｔ，  ｖａｎ  Ｅｓ  ＪＨ，  Ｓｎｉｐｐｅｒｔ  ＨＪ，  Ｓｔａｎｇｅ  ＤＥ，  Ｖｒｉｅｓ  ＲＧ，  ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｏｒｎ  Ｍ，  Ｂａｒｋｅｒ  Ｎ，  Ｓｈｒｏｙｅｒ  ＮＦ，  ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｅｔｅｒｉｎｇ  Ｍ  ａｎｄ  Ｃｌｅｖｅｒｓ  Ｈ．  Ｐａｎｅｔｈ  ｃｅｌｌｓ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｔｈｅ  ｎｉｃｈｅ  ｆｏｒ  Ｌｇｒ５  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｃｒｙｐｔｓ．  Ｎａｔｕｒｅ．  ２０１１；４６９（７３３０）：４１５−４１８．
【図１−１】
2020531580.tif 000003
【図１−２】
2020531580.tif 000004
【図１−３】
2020531580.tif 000005
【図１−４】
2020531580.tif 000006
【図２】
2020531580.tif 000007
【図３−１】
2020531580.tif 000008
【図３−２】
2020531580.tif 000009
【図４】
2020531580.tif 000010
【図５−１】
2020531580.tif 000011
【図５−２】
2020531580.tif 000012
【図６−１】
2020531580.tif 000013
【図７】
2020531580.tif 000014
【図８】
2020531580.tif 000015
【図９】
2020531580.tif 000016
【図１０】
2020531580.tif 000017
【図１１】
2020531580.tif 000018
【手続補正書】
【提出日】令和2年6月15日(2020.6.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
2020531580.tif 000019
2020531580.tif 000020
2020531580.tif 000021
2020531580.tif 000022