(57)【要約】本発明は、血栓性微小血管症治療における使用のためのクラスタリン、および血栓性微小血管症治療における使用のためのクラスタリンを含む医薬組成物に関し、該組成物はフォンウィルブランド因子プロテアーゼを含まない。本発明は、ＴＭＡに罹患しているか、または罹患している可能性がある患者のex vivo層別化方法であって、前記方法は下記ステップ：１）該患者から得られた生体サンプルにおいて、クラスタリンレベルＬｃを測定するステップ、および２）ステップ１）で測定されたレベルＬｃを、スコアＳ１＝Ｌｃ／Ｌｒｅｆの算出によってクラスタリンレベルＬｒｅｆと比較するステップ、を含み、・Ｓ１≦１の場合、該患者はクラスタリンを用いたＴＭＡ治療の利益を受ける可能性があると見なされ、・Ｓ１＞１の場合、該患者はクラスタリンを用いたＴＭＡ治療の利益を受ける可能性があると見なされない、方法にも関する。
2020530484.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血栓性微小血管症治療におけるその使用のためのクラスタリン。
【請求項２】
前記クラスタリンは配列番号１のヒトクラスタリンである、請求項１に記載のその使用のためのクラスタリン。
【請求項３】
前記クラスタリンは配列番号１と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％の同一性を有するペプチド配列を有する、請求項１に記載のその使用のためのクラスタリン。
【請求項４】
前記クラスタリンは組換えクラスタリン、血漿クラスタリンおよび合成クラスタリンから選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のその使用のためのクラスタリン。
【請求項５】
前記血栓性微小血管症は血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、細菌に関連するかまたは関連しない溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）、ＨＥＬＬＰ症候群および二次性ＴＭＡから選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載のその使用のためのクラスタリン。
【請求項６】
前記治療は前記クラスタリンの経口投与または非経口投与を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のその使用のためのクラスタリン。
【請求項７】
前記非経口投与は静脈内投与、筋肉内投与および皮下投与を含む群から選択される、請求項６に記載のその使用のためのクラスタリン。
【請求項８】
血栓性微小血管症治療におけるその使用のための、クラスタリンを含む医薬組成物であって、前記組成物はプロテアーゼのフォンウィルブランド因子を含まない、医薬組成物。
【請求項９】
前記クラスタリンは請求項２〜４のいずれか一項に定義されている、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記医薬組成物は注射可能な溶液の形態である、請求項８または９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
ＴＭＡに罹患しているかまたは罹患している可能性がある患者のex vivo層別化方法であって、前記方法は：
１）前記患者から得られた生体サンプルにおいて、クラスタリンレベルＬｃを測定するステップ、および 
２）ステップ１）で測定されたレベルＬｃを、スコアＳ１＝Ｌｃ／Ｌｒｅｆの算出によってクラスタリンレベルＬｒｅｆと比較するステップ、
を含み、
・Ｓ１≦１の場合、前記患者はクラスタリンを用いたＴＭＡ治療の利益を受ける可能性があると見なされ、
・Ｓ１＞１の場合、前記患者はクラスタリンを用いたＴＭＡ治療の利益を受ける可能性があると見なされない、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血栓性微小血管症治療に使用するためのタンパク質の使用に関し、ＴＭＡに罹患しているかまたはＴＭＡに罹患している可能性がある患者のex vivo層別化方法にも関する。
【０００２】
下記明細書では、角括弧（［  ］）の参照は文章の最後にある参照リストに示している。
【背景技術】
【０００３】
血栓性微小血管障害（TMA）という名前には、血栓による小血管の閉塞をもたらし、組織虚血を引き起こす内皮病変の発生を特徴とする希少疾患のグループが含まれる。組織虚血は、細胞破壊および死細胞による、通常細胞内に拘束されている分子の細胞外培地への放出の原因となる。これらの危険分子は炎症誘発性であり、宿主の細胞に対する細胞傷害作用を有する。最近のデータにより危険分子としてヒストン（遊離型またはＤＮＡとの複合体）が同定され、この役割はＴＭＡには必要不可欠である。
【０００４】
ＴＭＡ（血栓性微小血管障害症）は生命を脅かす疾患であり、最も障害が生じる標的臓器は腎臓と脳である。ＴＭＡの最も古典的な形態は、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、および細菌に関連するあるいは細菌に関連しない溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）である。細菌に関連するＨＵＳはＨＵＳの最頻型（ＨＵＳの９０％）であり；いくつかの細菌株（エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｏ１５７：Ｈ７；赤痢菌、肺炎球菌、特にエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｏ１０４）は、志賀毒素として公知の毒素の分泌によって病気を引き起こすことが現在知られている。細菌に関連しないＨＵＳは、ＨＵＳの約１０％であり、遺伝子感受性との関連で見られることが多い。
【０００５】
ＴＴＰの新しい症例数は、百万人の住民当たり年に５〜１０症例である。ＨＵＳの発生頻度はこれらの値に非常に近い。
【０００６】
これらの最も古典的な形態に加えて、ＴＭＡとしては、重篤な合併症または妊婦における子癇前症の一変型であり、溶血、肝酵素上昇および血小板数低下を特徴とするＨＥＬＬＰ症候群が挙げられる。例えば、特定の治療中、化学療法中、がんに罹患中に、または同種骨髄移植中など、特定の状況において起こるＴＭＡの二次性型も存在する。
【０００７】
最も古典的な形態の現在の治療は、概して、小児に起こる志賀毒素関連ＨＵＳを除いて治療開始時に血漿交換によって行われる。血漿交換の目的は、ボランティアの提供者から、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質（ＴＴＰ）または補体タンパク質（ＨＵＳ）を含む大量の血漿を得ることである。他の治療はこれと併用されることが多く、特に副腎皮質ステロイドが併用される。これらが効果的である場合、血漿交換は、血小板数の持続的正常化が得られる（少なくとも４８時間）まで継続され、徐々に間隔を空ける。しかしながら、多くの場合、血漿交換は余り効果的でないことが判明している。
【０００８】
標準的治療に対する応答が最適でない状況では、補足的治療が加えられる。この関連で一般的に使用される治療、抗ＣＤ２０抗体（リツキシマブ）は、Ｂリンパ球を一過性に破壊することによって患者の抗体産生に対抗することを目標とする。その使用は、通常、治療プロトコルの枠組み内で、リファレンスセンターと協議して行われる。
【０００９】
非定型と呼ばれる特発性ＨＵＳ患者では、治療は、病気の原因となる補体タンパク質を遮断することのできる薬物を含む。エクリズマブは、非定型ＨＵＳ適応症において認可された現在唯一の治療である。エクリズマブ３００ｍｇ瓶が４０００ユーロ超の費用がかかるため、この治療は極めて高価であり、維持療法としての投与レジメンは１４日毎に１２００ｍｇである。
【００１０】
効果的であることが多いが、これらの治療は個体間で変わりやすく、ＴＭＡの性質に依存して作用時間が遅れる。しかしながら、病因診断は数日／数週の時間がかかることがある。したがって、例としてＴＴＰを挙げると、現在、死亡率は約１５％のままである。
【００１１】
したがって、これらの従来技術の欠点、弱点および障壁を克服する、特に、主に早期のＴＭＡの急性期の死亡率を減らすことができるように、迅速に、かつ、病気の病因に関わらず作用する新規治療に対する真の必要性がある。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
かなりの数の研究の後、本発明者らは、この技術的問題を何とか解決するに至った。
【００１３】
驚くべきことに、本発明者らは、クラスタリンはヒストンと結合し、その炎症作用および細胞障害作用を阻止することを示した。
【００１４】
事実、本発明者らは、クラスタリンはＴＭＡにおいて中心的役割を有する危険分子であるヒストンと結合することを示した。本発明者らはまた、クラスタリンが、一方では、ヒト単球による炎症性分子の産生、特に、ＩＬ−６やＴＮＦα等の炎症性サイトカインの産生を抑制することによって、他方では、内皮細胞の細胞死誘導を抑制し、特に、ヒストンが有する内皮細胞の細胞死誘導能力をなくすことによって、ヒストンの作用を中和することを示した。本発明者らは、ヒストンを含む患者から得られた血清へのクラスタリンの添加が、内皮細胞に関してその傷害性を低減することも示した。
【００１５】
さらに、本発明者らは、クラスタリンレベルはＴＭＡに罹患している患者の健康状態と相関することを示した。事実、本発明者らは、血清クラスタリンレベルは、健常対象より、診断においてＴＭＡに罹患している患者で低いことを立証することができた。
【００１６】
本発明は、現在の治療が病因に依存するＴＭＡ治療を促進できる可能性がある。したがって、クラスタリンの使用は、病因に関わらず、ＴＭＡ患者に提案することができ、病因診断に依存しないより迅速な治療を可能とする。
【００１７】
したがって、第一の主題は、血栓性微小血管症治療におけるその使用のためのクラスタリンに関する。
【００１８】
アポリポタンパク質Ｊとしても知られているクラスタリン（Ｃｌｕ）は、進化の間、哺乳類の中でよく保存されている、ジスルフィド架橋によって結合された８０ｋＤａの可溶性ヘテロ二量体糖タンパク質である。クラスタリンは生理液中に豊富であり（例として、ヒト血清中１００〜３００μｇ／ｍｌの範囲の濃度）、多種多様な細胞および組織病変に応答して誘発される。クラスタリンはシャペロン活性を有し、細胞内低分子熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）の機能相同体であることが知られている。クラスタリンは変性タンパク質の疎水性ドメインと結合し、受容体媒介内部移行および細胞内リソソーム分解の標的となる。この機能は、クラスタリンが、脂質、補体系成分、アミロイド斑形成タンパク質、および免疫グロブリンなどの広範囲の分子と相互作用することを可能とする。
【００１９】
本発明との関連で、用語「クラスタリン」はその一般的意味を有し、上記糖タンパク質
を表す。クラスタリンは、動物クラスタリンであってもよく、ヒトクラスタリンであってもよい。クラスタリンは、血漿クラスタリン、組換えクラスタリンおよび合成クラスタリンを含む群から選択されるクラスタリンであってよい。
【００２０】
血漿クラスタリンを、血漿、特にヒト血漿から、当業者に公知のいずれの精製方法、例えば、イムノアフィニティー、カチオン交換、血漿分画および／またはサイズ排除クロマトグラフィーによって精製することにより得ることができる。
【００２１】
組換えクラスタリンは、当業者に周知の標準的組換えＤＮＡ技術により得ることができる。例えば、クラスタリンをコードする遺伝子を、細菌、培養下の哺乳類細胞またはトランスジェニック動物などの産生種のゲノムへ、ベクターによって導入することができる。宿主細胞内の遺伝子の導入、維持および発現を可能とするベクターは、当業者に公知である。概して、ベクターは、プロモーター配列、ポリアデニル化配列および選択可能な遺伝子などの導入遺伝子の発現に必要不可欠な配列を有する。このようなベクターを、当業者に公知のもの、例えば、これに限定されないが、アデノウイルス、レトロウイルス、プラスミドまたはバクテリオファージから選択することができる。いずれもの哺乳類細胞を宿主細胞として、すなわち、クラスタリンをコードする遺伝子を発現する細胞として使用することができ、例えば、ＣＨＯ、ＣＨＯ  ｄｈｆｒ−（例えば、ＣＨＯ  ＤＸ  ＢＩ１、ＣＨＯ  ＤＧ４４）、ＣＨＯ  Ｌｅｃ１３、ＹＢ２／０、ＳＰ２／０、ＮＳＯ、２９３、ＢＨＫ、ジャーカット、ベロまたはＣＯＳである。
【００２２】
合成クラスタリンは、例えば、マトリックス上のアセンブリなどの、組換えタンパク質の製造に使用されるもの以外のデノボタンパク質デザインの公知の方法により得ることができる。
【００２３】
クラスタリンの製造方法に関わらず、多数の種からのクラスタリン配列は公知であり、本発明との関連で使用することができる。例えば、クラスタリンのアミノ酸配列は、配列番号１の配列であり得る。
配列番号１  クラスタリン＿ホモサピエンス
ＭＭＫＴＬＬＬＦＶＧ  ＬＬＬＴＷＥＳＧＱＶ  ＬＧＤＱＴＶＳＤＮＥ  ＬＱＥＭＳＮＱＧＳＫ  ＹＶＮＫＥＩＱＮＡＶ  ＮＧＶＫＱＩＫＴＬＩ  ＥＫＴＮＥＥＲＫＴＬ  ＬＳＮＬＥＥＡＫＫＫ  ＫＥＤＡＬＮＥＴＲＥ  ＳＥＴＫＬＫＥＬＰＧ  ＶＣＮＥＴＭＭＡＬＷ  ＥＥＣＫＰＣＬＫＱＴ  ＣＭＫＦＹＡＲＶＣＲ  ＳＧＳＧＬＶＧＲＱＬ  ＥＥＦＬＮＱＳＳＰＦ  ＹＦＷＭＮＧＤＲＩＤ  ＳＬＬＥＮＤＲＱＱＴ  ＨＭＬＤＶＭＱＤＨＦ  ＳＲＡＳＳＩＩＤＥＬ  ＦＱＤＲＦＦＴＲＥＰ  ＱＤＴＹＨＹＬＰＦＳ  ＬＰＨＲＲＰＨＦＦＦ  ＰＫＳＲＩＶＲＳＬＭ  ＰＦＳＰＹＥＰＬＮＦ  ＨＡＭＦＱＰＦＬＥＭ  ＩＨＥＡＱＱＡＭＤＩ  ＨＦＨＳＰＡＦＱＨＰ  ＰＴＥＦＩＲＥＧＤＤ  ＤＲＴＶＣＲＥＩＲＨ  ＮＳＴＧＣＬＲＭＫＤ  ＱＣＤＫＣＲＥＩＬＳ  ＶＤＣＳＴＮＮＰＳＱ  ＡＫＬＲＲＥＬＤＥＳ  ＬＱＶＡＥＲＬＴＲＫ  ＹＮＥＬＬＫＳＹＱＷ  ＫＭＬＮＴＳＳＬＬＥ  ＱＬＮＥＱＦＮＷＶＳ  ＲＬＡＮＬＴＱＧＥＤ  ＱＹＹＬＲＶＴＴＶＡ  ＳＨＴＳＤＳＤＶＰＳ
ＧＶＴＥＶＶＶＫＬＦ  ＤＳＤＰＩＴＶＴＶＰ  ＶＥＶＳＲＫＮＰＫＦ  ＭＥＴＶＡＥＫＡＬＱ  ＥＹＲＫＫＨＲＥＥ
【００２４】
使用されるクラスタリンは、配列番号１と少なくとも７０％の同一性、例えば、配列番号１と７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％または１００％の同一性を有する多様体であり得る。当業者に公知のいずれもの適切な技術によって、例えば、ＢＬＡＳＴ  Ｐなどの配列アライメントアルゴリズムによって配列同一性を決定することができる。特に、クラスタリン多様体はその機能が保存されている多様体であり得る。この点において、これに限定されないが
、例えば、極性、水素結合電位、疎水性、酸性、塩基性、芳香族性などの同様な特性を有するアミノ酸による、アミノ酸置換を含むクラスタリンの高次構造と機能全体のいずれも損なっていない多様体において、天然クラスタリン中の所与のアミノ酸残基が修飾されているクラスタリンであってもよい。結果として、多様体は、少なくとも７０％のアミノ酸同一性を有し、かつ、比較される天然または親タンパク質と同一または実質的に類似の同じ特性または機能を有するポリペプチドをも表す。
【００２５】
作用機序によって束縛されることは望まないが、クラスタリンの作用は、前記クラスタリンのヒストンのシャペロン機能と関連するように思われる。
【００２６】
本明細書で使用されるとき、用語「ヒストン」はその一般的意味を有する。ヒストンはリジンまたはアルギニン高含有率を有する低分子塩基性タンパク質であり、その機能はＤＮＡパッケージングにある。ヒストンは高度に保存されており、５つの主分類：コアヒストン（Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４）およびリンカーヒストン（Ｈ１およびＨ５）の２つ大分類に体系化されるＨ１／Ｈ５、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４にまとめて分類することができる。本発明との関連で、ヒストンタンパク質は、完全長ヒストン、そのフラグメントまたは多様体であってよい。ヒストン多様体は、例えば、アミノ酸欠失、付加および／または置換によって改変されていてもよい。あるいは、ヒストンは、リジンおよびアルギニンのアセチル化および／またはメチル化によって改変されていてもよい。概して、改変は、ヒストンのポリカチオン性またはヒストンの器官内に局在する能力に実質的に支障を来すことはない。
【００２７】
有利には、クラスタリンは、その炎症作用および／または毒性作用の全てまたは一部を阻止するようにヒストンと結合する。これにより、少なくとも２０％、例えば、３０％、または４０％、または５０％、または６０％、または７０％、または８０％、または９０％、または１００％のヒストンの炎症作用および／または毒性作用の阻止を引き起こし得る。
【００２８】
有利には、クラスタリンは、炎症誘発性分子、特に、ＩＬ−６およびＴＮＦαなどの炎症誘発性サイトカインのヒト単球による産生を阻止する。これにより、少なくとも２０％、例えば、３０％、または４０％、または５０％、または６０％、または７０％、または８０％、または９０％、または１００％の炎症誘発性分子の産生の阻止を引き起こし得る。
【００２９】
有利には、クラスタリンは、特に内皮細胞死を誘発するヒストンの能力の中和によって、内皮細胞死の誘発を阻止する。これにより、少なくとも２０％、例えば、３０％、または４０％、または５０％、または６０％、または７０％、または８０％、または９０％、または１００％の内皮細胞死を誘発の阻止を引き起こし得る。
【００３０】
本発明との関連で、上記効果の全てまたは一部は起こり得る。
【００３１】
血栓性微小血管症は、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、細菌に関連するまたは細菌に関連しない溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）、ＨＥＬＬＰ症候群および二次性ＴＭＡであり、例えば、特定の治療中、化学療法中、がんに罹患中に、または同種骨髄移植中に起こるものから選択され得る。
【００３２】
本発明の目的のため、用語「治療」は、ＴＭＡの１つ以上の症状を示している、またはＴＭＡの症状を示していないがＴＭＡと診断された、例えば、早期のＴＭＡと診断されたかいずれかの対象にクラスタリンを投与することを意味するものとする。有利には、いずれものＴＭＡの治療、すなわち、必ずしも事前にＴＭＡのタイプが判別しなくても、ＨＵ
Ｓ、ＴＴＰ、ＨＥＬＬＰ症候群または二次性ＴＭＡであろうがなかろうが治療を行うことができる。このことは、ＴＭＡのサブタイプを定義することを待たないで、患者の治療を可能とし、したがって、疾病、および／または症状発現の悪化を避ける利点を有する。あるいは、クラスタリンのアッセイ後に治療を行うことができ、このアッセイは患者を層別化し、必要に応じて、疾病の重症度を示すマーカーであるクラスタリンが低レベルの患者にのみ治療を提案することを可能とする。
【００３３】
有利には、治療は、ＴＭＡの１つ以上の症状を改善もしくは消失すること、またはＴＭＡの全てもしくは一部の症状を安定化すること、またはＴＭＡの全てもしくは一部の症状進行を減速することであり得る。
【００３４】
患者に対する治療効果を与えることを可能とする最小用量である、クラスタリンの治療効果用量の投与により、治療を行うことができる。これは、病態、病態の段階、患者のクラスタリンレベルの初期アッセイ、および／または患者に応じて、医師によって決定される用量であってよい。例えば、毎日のクラスタリン用量は、成人１日当たり０．０１〜１０００ｍｇであってよい。例えば、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０または５００ｍｇの１日の用量のクラスタリンであってよい。投与量は治療の段階に応じて調整してよく、例えば、医師の観察に応じて治療の間に増減してよい。
【００３５】
いずれもの適切な投与経路により治療を行ってよい。例えば、クラスタリンの経口投与または非経口投与であってよい。非経口投与の場合、例えば、静脈内投与、筋肉内投与または皮下投与であってよい。
【００３６】
有利には、ＴＭＡの治療において公知の少なくとも１つの有効成分または治療と併用して、上記のようにクラスタリンを投与することができる。ＴＴＰの場合、血漿交換、コルチコイド療法、免疫抑制剤、例えば、リツキシマブなどの抗ＣＤ２０、カプラシズマブなどのフォンウィルブランド因子に対するモノクローナル抗体から選択される治療であってよい。定型ＨＵＳの場合、対症療法、血漿交換、例えば、エクリズマブなどの補体Ｃ５フラクションに対するモノクローナル抗体、および、例えば、リツキシマブなどの抗ＣＤ２０から選択される少なくとも１つの治療であってよい。非定型ＨＵＳの場合、血漿交換およびエクリズマブなどの補体Ｃ５フラクションに対するモノクローナル抗体から選択される少なくとも１つの治療であってよい。ＨＥＬＬＰ症候群のケースでは、妊産婦の状態が悪化した場合に輸血や分娩開始の中から選択される少なくとも１つの治療に関与しうる。
【００３７】
本発明の別の主題は、血栓性微小血管症治療におけるその使用のための、クラスタリンを含む医薬組成物であって、前記組成物はフォンウィルブランド因子プロテアーゼであるＡＤＡＭＴＳ１３を含まない、医薬組成物に関する。
【００３８】
特に、本発明の医薬組成物は、ＨＵＳおよびＨＥＬＬＰ症候群の治療に使用することができる。
【００３９】
クラスタリンは上記の通りである。
【００４０】
医薬組成物は、約０．０１ｍｇ〜約１０００ｍｇのクラスタリン、例えば、約１ｍｇ〜約１００ｍｇを含んでよい。クラスタリンの効果用量は、概して、１日当たり約０．０００２ｍｇ／体重ｋｇ〜約２０ｍｇ／体重ｋｇ、より具体的には１日当たり約０．００１ｍｇ／体重ｋｇ〜約７ｍｇ／体重ｋｇの用量で与えられる。
【００４１】
典型的には、医薬組成物は、クラスタリンに加えて、１つ以上の薬剤的に許容可能な賦
形剤、および必要に応じて少なくとも１つの生分解性高分子などの徐放性マトリックスを含んでもよい。
【００４２】
用語「医薬の」および「薬剤的に許容可能な」は、その品質が施行されている規格の要件を満足する分子的実体または組成物を表す。薬剤的に許容可能な担体または賦形剤は、いずれもの適切な種類の半固体または液体および無毒性である充填剤、希釈剤、カプセル化材または製剤アジュバントを表す。経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、経皮、局所または直腸投与のための本発明の医薬組成物では、単独または別の有効成分との併用のクラスタリンを、単位投与形態で、必要に応じて、従来の医薬用担体との混合物として、動物およびヒトに投与してよい。
【００４３】
適切な単位投与形態は、錠剤、ゲルカプセル剤、散剤、顆粒剤および経口用懸濁剤または液剤などの経口用投与形態、舌下および口腔用投与形態、エアロゾル剤、インプラント錠、皮下、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、静脈内、真皮下、経皮、くも膜下腔内、動脈内および鼻内投与形態、ならびに直腸投与形態を含む。概して、医薬組成物は、注射製剤用に薬剤的に許容可能である担体を含んでよい。前記担体は、特に、等張性、滅菌生理食塩水（リン酸一ナトリウムもしくはリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムもしくは塩化マグネシウムおよび同様のもの、またはこのような塩の混合物）または乾燥組成物、詳細には、必要に応じて滅菌水もしくは生理食塩水の添加により注射可能な溶液を生成することができる凍結乾燥組成物であってよい。注射用途に適した医薬品形態は、滅菌水溶液もしくは分散液、ゴマ油、落花生油または水性プロピレングリコール、および滅菌された注射可能な溶液もしくは分散剤の即時調製用滅菌散剤を含む。いずれにしても、製剤は注射器を使用して注射することができるように滅菌されていなければならず、液体でなければならない。製剤は、従来の製造および保管条件下安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物による汚染を防止するために安定でなければならない。遊離塩基または薬剤的に許容可能な塩として本発明の化合物を含む液剤を、必要に応じてヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤を用いて適切な方法で水中に調製することができる。分散剤を、グリセロール、ヒドロキシプロピルセルロースなどの液体ポリエチレングリコールおよびその混合物の媒体中、ならびに油中に調製することができる。通常の保管および使用条件下、これらの製剤は、微生物の増殖を防止するために防腐剤を含んでよい。クラスタリンを、中性の形態または塩の形態で製剤することができる。
【００４４】
薬剤的に許容可能な塩は、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基とで生成）を含み、この付加塩は、例えば、塩酸もしくはリン酸などの無機塩、または酢酸、シュウ酸、酒石酸もしくはマンデル酸などの有機酸とで生成する。遊離カルボン酸基とで生成する塩は、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウムまたは水酸化鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジンおよびプロカインなどの有機塩基から誘導されてもよい。担体は、溶媒、または、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリセロールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、その適切な混合物、および植物油を含む、分散媒体であってもよい。適切な流動性は、例えば、レクチンなどのコーティングを使用することにより、分散剤の場合に必要な粒度を維持することにより、および界面活性剤を使用することにより維持することができる。微生物作用は、抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸またはチメロサールの添加により防止することができる。必要に応じて、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい場合がある。注射可能組成物の持続的吸収は、組成物中に、吸収遅延剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを使用することにより起こすことができる。滅菌された注射可能な溶液は、上記のいくつかの他の成分を含む適切な溶媒中に必要な量の活性化合物を混合することにより調製することができる。概して、分散剤は、塩基性分散媒体および上
記の可能性のある他成分を含む滅菌担体中に、滅菌された様々な活性成分の混合により調製することができる。滅菌された注射可能な溶液の調製のための滅菌された散剤の場合、好ましい調製方法は、有効成分の散剤＋事前にろ過滅菌された液剤から得られるいずれかの追加の所望成分を作り出す真空乾燥および凍結乾燥技術である。例えば、水性液剤における非経口投与のため、液剤は必要に応じて適切に緩衝してよく、液体希釈剤を先ず充分量の生理食塩水またはグルコースを用いて等張性にしてよい。これらの水性液剤は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与および腹腔内投与に特に適している。
【００４５】
本発明の別の主題は、ＴＭＡに罹患しているかまたは罹患している可能性がある患者のex vivo層別化方法であって、前記方法は下記ステップ：
１）前記患者から得られた生体サンプルにおいて、クラスタリンレベルＬｃを測定するステップ、および
２）ステップ１）で測定されたレベルＬｃを、スコアＳ１＝Ｌｃ／Ｌｒｅｆの算出によって参照クラスタリンレベルＬｒｅｆと比較するステップ、を含み、
・Ｓ１≦１の場合、前記患者はクラスタリンを用いたＴＭＡ治療の利益を受ける可能性があると見なされ、
・Ｓ１＞１の場合、前記患者はクラスタリンを用いたＴＭＡ治療の利益を受ける可能性があると見なされない、
方法に関する。
【００４６】
「層別化」とは、本明細書の意味の範囲内で、予測マーカー、本ケースではクラスタリン、に従って治療を施す対象患者を選択し、その対象となる、ＴＭＡの診断をされた人々の間で利益をもたらす可能性のある亜集団のみを治療することを目的とする治療アプローチを意味する。
【００４７】
したがって、本発明の層別化方法は、治療から利益を最も受ける可能性高い集団を標的とするために、ＴＭＡと診断された患者へのクラスタリン治療の開始前に行うことができる。実際、本発明者らは、ＴＭＡの診断時に低クラスタリンレベル、特に２００μｇ／ｍｌ以下を示す患者が、少なくとも血液学の観点から、疾病の重症度を示す２つのマーカーである、血小板レベルがより低いこと、およびＬＤＨレベルがより高いことを示した。
【００４８】
本発明の目的のため、用語「生体サンプル」は、対象、特に、ＴＭＡと既に診断された対象、またはＴＭＡと診断されている最中の対象から得られたいずれかの生体サンプルを意味するものとする。サンプルはクラスタリンを含有している可能性がある。サンプルは、例えば、細胞、例えば、血清および／または血漿であるかどうかに関わらず、血液を含んでも含まなくてもよい体液、尿、唾液または生検であってよい。サンプルは、組織学的目的のために採取された凍結切片などの組織切片であってもよい。用語「生体サンプル」は、生体サンプル由来の物質、例えば、サンプルから単離された細胞（またはその後代）、またはサンプルから抽出されたタンパク質も包含する。生体サンプルの処理は、ろ過、蒸留、抽出、濃縮、緩衝成分の不活性化または試薬添加から選択される１つ以上のステップを含み得る。生体サンプルが血液サンプルである場合、全血、血清または血漿であってよい。
【００４９】
患者からの生体サンプルにおいて、クラスタリンレベルＬｃを測定するステップは、当業者に公知のいずれもの適切な方法により行うことができる。測定されるクラスタリンは、遊離型クラスタリンでもよく、複合体型クラスタリンでもよい。このステップは、例えば、生体サンプル中に含まれるクラスタリンと選択的に相互作用することができる１つ以上の結合パートナーと、サンプルとを接触させることを含む。結合パートナーは、モノクローナル抗体などの抗体またはアプタマーであってよい。このステップの実施において使用することができる固体担体は、例えば、ニトロセルロース（例えば、膜またはマイクロ
滴定の形態）、ポリ塩化ビニル（例えば、マイクロ滴定ウェルまたはシート）、ポリスチレンラテックス（例えば、マイクロ滴定ビーズまたはプレート）、ポリフッ化ビニリデン、ジアゾ化紙、ナイロン膜、活性ビーズ、または磁気反応ビーズなどの基材であってよいが、これらに限定されない。クラスタリンを、クラスタリン特異的抗体またはアプタマーなどの二次結合パートナーを用いて明らかにしてもよい。通例、二次結合パートナーは酵素と結合した特定の抗体である。クラスタリンレベルを、競合アッセイ、直接反応アッセイまたはサンドイッチアッセイなどの免疫アッセイを含む標準的な免疫診断技術を用いて測定することができる。このようなアッセイは、これに限定されないが、凝集アッセイ、ＥＬＩＳＡなどの酵素媒介免疫アッセイ、ビオチン／アビジン型のアッセイ、ラジオイムノアッセイ、免疫電気泳動法または免疫沈降法を含む。アッセイは、例えば、ヒトクラスタリンＥＬＩＳＡキットアッセイ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社により市販されているＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）Ｐｉｅｒｃｅ（商標）、またはヒトの血清および血漿のアッセイに特異的なＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）ＥＬＩＳＡアッセイ−Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社であってよい。
【００５０】
所定参照値Ｌｒｅｆは、これに限定されないが、同じ年齢群または同様な年齢群からの対象、同民族群または類似の民族群に属する対象、ならびに同程度の疾病重症度を有する対象を含む集団試験から導出された値と関連し得る。このような所定参照値は、統計解析および／または数学アルゴリズムおよび疾病のために算出された指数から得られた集団リスク予測データから導出してよい。例えば、所定参照値は、ＴＭＡに罹患していない１つ以上の対象由来のコントロールサンプル中のクラスタリンレベルから導出してよい。あるいは、病歴的に正確に分類された対象由来のサンプル中のクラスタリンレベルのレトロスペクティブ測定を使用して所定参照値を定めてもよい。
【００５１】
本発明の目的のため、「ＴＭＡ治療の利益」は、ＴＭＡの１つ以上の症状の改善もしくは消失、またはＴＭＡの全てもしくは一部の症状の安定化、またはＴＭＡの全てもしくは一部の症状進行の減速を意味するものとする。
【００５２】
例えば、参照値を決定するため、クラスタリンレベルを、１００対象からの１００生体サンプルで測定することができる。第一の２つのサブセットに分け、カプラン・マイヤー曲線をその２つのサブセットの各々に対して作成し、その２つのサブセット間のｐ値を算出することができる。それから、最小ｐ値の基準に基づいた区別が最も強くなるように参照値を選択する。換言すれば、ｐ値が最小になる２つのサブセット間の限界に対応するクラスタリンレベルを、所定参照値であると見なす。なお、所定参照値は必ずしもクラスタリンレベルのメジアン値である必要はない。
【００５３】
したがって、所定参照値は、クラスタリンを用いたＴＭＡ治療から利益を受ける可能性があると見なしてよい患者と、クラスタリンを用いたＴＭＡ治療から利益を受ける可能性がないと見なしてよい患者との間の区別を可能とする。
【００５４】
付属の図面により例証され、例証によって与えられた下記実施例を読めば、他の利点は当業者にさらに明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】ヒストンと結合しているクラスタリンを表す。ヒストンＨ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、米国マサチューセッツ州イプスウィッチ）またはヒト細胞由来ゲノムＤＮＡを１０ｍＭ炭酸／重炭酸緩衝液、ｐＨ＝９．６中、ＥＬＩＳＡプレートの底部に固定化した（１μｇ／ｍｌ）。飽和後、プレートを、ビオチンと結合した組換えヒトクラスタリン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、英国アビンドン）またはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ；Ｓｉｇｍａ社、米国ミズーリ州セントルイス）の１μｇ／ｍｌと共にインキュベートした。ＣｌｕまたはＨＳＡのヒストンとの結合は、ペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンを用いて明らかにした。結果を光学濃度（平均±標準偏差、ｎ＝５）として示す。ＨＳＡ分子をコントロールタンパク質として使用した。ＥＬＩＳＡプレートにおけるゲノムＤＮＡの結合を、ペルオキシダーゼ結合抗ＤＮＡ抗体を用いて検証した（データ示さず）。
【図２】磁気選別により健康な提供者の血液から単離してから、クラスタリン（ＣＬＵ）２５μｇ／ｍｌの存在下（ダイヤグラム４）または非存在下（ダイヤグラム３）、ヒストン１２．５μｇ／ｍｌと共にインキュベートしたヒト単球の培養液上澄み中のＩＬ−６のＥＬＩＳＡ定量、ｐｇ／ｍｌ、を示す。ダイヤグラム１は単球単独の培養液のコントロールであり、ダイヤグラム２はクラスタリン２５μｇ／ｍｌと共に１２時間インキュベートされた単球の培養液のコントロールである。
【図３】（１）左図：ヒストン（５０ｎｇ／ｍｌ）（Ｒｏｃｈｅ社のヒストン）の存在下もしくは非存在下にコントロール血清（ＨＮＳ）の存在下、または（２）右図：Ｃｌｕ  ２００ｎｇ／ｍｌの存在下もしくは非存在下に内在性ヒストン（ＳＳ；ｎ＝５、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ））を含有する患者由来の血清とのいずれかで１５分間インキュベートしたヒト内皮細胞の場合に測定されたアポトーシス細胞のパーセンテージを示す。
【図４】ＴＭＡに罹患している患者および健常者における血清クラスタリン、μｇ／ｍｌ、のアッセイを示す。（Ａ）血清クラスタリンを健常者（四角）およびＴＭＡに罹患したばかり（黒丸）、または診断後３ヶ月（白丸）のＴＭＡ患者において測定する。（Ｂ）診断時（左の点）および診断後３ヶ月（右の点）のＴＭＡ患者における血清クラスタリン変化。各点は患者を示す。ノンパラメトリック検定によって統計解析を行った。
【図５】（Ａ）定型ＨＵＳに罹患している患者について、ＴＭＡ診断時（左）およびエクリズマブ（ソリリス）での治療３ヶ月後（右）における血清クラスタリンアッセイ；（Ｂ）定型ＨＵＳに罹患している患者について、ＴＭＡ診断時（左）およびエクリズマブ（ソリリス）での治療３ヶ月後（右）における循環ヌクレオソームレベル（ＡＵ）を示す。ＳＴ媒介ＴＭＡ患者（定型ＨＵＳ）を同じ治療スキームに従ってエクリズマブ（ソリリス）で一様に治療した。（Ｃ）および（Ｄ）補体媒介ＴＭＡに罹患している患者について、ＴＭＡ診断時（左）およびエクリズマブ（ソリリス）での治療３ヶ月後（右）の循環ヌクレオソームレベル（ＡＵ）；補体媒介ＴＭＡ患者は、臨床状況に応じて可変的に治療した。
【図６】患者（ｔＨＵＳ、ｎ＝７）の１回目〜８回目のエクリズマブ注射をした、ＴＭＡに罹患している７患者における血小板、ｇ／ｌ（暗灰色）、血清クラスタリン、μｇ／ｍｌ（淡灰色）および循環ヌクレオソーム、ＡＵ（中間灰色）の濃度を示す。血清クラスタリン、循環ヌクレオソームおよび血小板濃度を各エクリズマブ注射直前に測定した。エクリズマブを２週間毎に繰り返して注射した。ＨＵＳの診断から平均２ヶ月の期間後８回目の注射を行った。
【図７】Ａ：ＬＤＨ濃度（ＩＵ／ｍｌ）、Ｂ：循環ヌクレオソーム濃度（ＡＵ）、Ｃ：血小板濃度（ｇ／ｌ）、Ｄ：ヘモグロビン濃度（ｇ／ｄｌ）、Ｅ：ＡＤＡＭＴＳ１３濃度（活性％）およびＦ：ｔＨＵＳ（志賀毒素媒介ＨＵＳ）の診断時の患者における血清クラスタリン濃度（μｇ／ｍｌ）の関数としてのＩＥＣＡＥパーセンテージ（ＥＬＩＳＡアッセイにより共通終末補体経路の機能活性を測定する任意単位、Ｄｉａｓｏｒｉｎ社）を示す。
【図８】（Ａ）：志賀毒素媒介ＴＭＡ、ｔＨＵＳ（ｎ＝８）に罹患している患者、補体媒介ＴＭＡ、ａＨＵＳ（ｎ＝６）に罹患している患者および健常者（ｎ＝１４）における血清クラスタリン、μｇ／ｍｌ、のアッセイ；（Ｂ）志賀毒素媒介ＴＭＡ（ｎ＝８）に罹患している患者、補体媒介ＴＭＡ（ｎ＝６）に罹患している患者および健常者（ｎ＝１４）における循環ヌクレオソームレベル、ＡＵ、を示す。
【実施例】
【００５６】
実施例１：クラスタリンは炎症誘発性分子の産生を遮断することによりヒストンの作用
を中和する
【００５７】
磁気選別（ＣＤ１４マーカーの発現に基づいた陽性選別；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、独国ベルギッシュ・グラッドバッハ）により健康な提供者の血液からヒト単球を単離した。単球（２×１０６細胞／ｍｌ）を、クラスタリン（ＣＬＵ）２５μｇ／ｍｌの存在下または非存在下、ヒストン（Ｓｉｇｍａ社）１２．５μｇ／ｍｌと共に１２時間インキュベートした。培養液上澄み中のＩＬ−６を、ＥＬＩＳＡ（Ｄｉａｃｌｏｎｅ社、仏国ブザンソン）によって定量した。結果を単位ｐｇ／ｍｌ（平均±標準偏差、ｎ＝6）で示す。
【００５８】
結果を図２に示す。
【００５９】
実施例２：クラスタリンは、ヒストン含有血清によって誘発される死から内皮細胞を保護する
【００６０】
ヒト内皮細胞（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ社のＨＤＭＥＣ）を、ヒストン（５０ｎｇ／ｍｌ、Ｒｏｃｈｅ社のヒストン）の存在下もしくは非存在下にコントロール血清（ＨＮＳ；同上）の存在下、またはＣｌｕ  ２００ｎｇ／ｍｌの存在下もしくは非存在下に内在性ヒストン（ＳＳ；ｎ＝５、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ））を含有する患者血清とのいずれかで１５分間インキュベートする。１５分後、フローサイトメトリー法によりアポトーシス細胞のパーセンテージを評価するために、内皮細胞をアネキシンＶおよびヨウ化プロピジウム（ベクトン・ディッキンソンキット）で標識する。
【００６１】
結果を図３に示す。
【００６２】
実施例３：クラスタリンレベルはＴＭＡの作用と関連する
【００６３】
血清クラスタリンレベルは、健常者より診断時にＴＭＡに罹患している患者において低い。血清クラスタリンレベルを、治療後、ＴＭＡ診断後３ヶ月目の時点で１１／１４の患者において評価した。この結果は、健常者集団と有意に異ならなかったが、診断時より有意に高かった。健常者およびＴＭＡに罹患している患者由来の血清中のクラスタリンを、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）によって評価した。
【００６４】
結果を図４に示す。
【００６５】
実施例４：様々なタイプのＴＭＡにおいてクラスタリン欠乏が観察される
【００６６】
血清中のクラスタリン、ヒストンおよび共通終末経路の活性化のマーカーのアッセイを、診断時および経過観察として、定型ＨＵＳ（２０症例）もしくは非定型ＨＵＳ（１０症例）、ＴＴＰ（３０症例）および／またはＨＥＬＬＰ症候群（５０症例）に罹患している患者において行う。これらのアッセイを、市販ＥＬＩＳＡ技術を用いて行う。
【００６７】
期待される結果は、主要患者追跡観察の生物学的基準（血小板レベル、ＬＤＨ、ハプトグロビンレベル、腎障害マーカー（クレアチニン血症、アルブミン尿／クレアチニン尿など）、または該当する場合には、腎外障害マーカー（トロポニン、ＡＳＡＴ／ＡＬＡＴ、γＧＴなど））の統計的関連および／または相関の確立を可能とする。
【００６８】
実施例５：クラスタリンはＴＭＡ症候群において内皮細胞保護因子である
【００６９】
微小血管内皮細胞を、ＨＵＳ、ＴＴＰまたはＨＥＬＬＰ症候群に罹患している患者由来
の血清の存在下、組換えクラスタリン（標的用量２５μｇ／ｍｌ）の添加有りまたは無しで、２時間、６時間または２４時間インキュベートする。細胞死（アポトーシスまたはネクローシス細胞死）の分析を、フローサイトメトリー標識（アネキシン５、ヨウ化プロピジウム）によって行う。
【００７０】
ＴＭＡに罹患している患者の血清中に循環しているヒストンおよびヌクレオソームは内皮障害を引き起こし、クラスタリンの添加はこれらの有毒物質によって誘発される死から内皮細胞を保護することが期待される。
【００７１】
実施例６：クラスタリンは、定型ＨＵＳのマウスモデルにおいてin vivo効果を示す
【００７２】
２種類の分析を行う。
【００７３】
１）クラスタリンの非存在下、腎毒性およびＨＵＳ（血小板減少症、貧血症）の生物学的マーカーの悪化を示すための、クラスタリン遺伝子がノックアウトされた（ＫＯ  Ｃｌｕ）Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスにおけるＳＴＸ誘発腎毒性の試験
【００７４】
実験の第一部分では、ＨＵＳマーカー、すなわち、貧血症、血小板減少症および腎不全をより正確にモニターするために、致死量未満の量が望ましい。６２５ｐｇ／ｇ、３００ｐｇ／ｇおよび１００ｐｇ／ｇの用量を、野生型動物（用量毎に１０匹のマウス＋１０匹のコントロールマウス）に対して試験する。マウスの体重を毎日測定し、マウスモデルでは、体重損失が疾病と相関するため、毒性の指標として体重を使用する。
【００７５】
用量が決定したら、ＷＴマウスおよびクラスタリンＫＯマウスに、選択した用量のＳＴＸまたはＰＢＳを腹腔内に注射し、その後、血液サンプルを採取して全血球数計算を行う。貧血症の指標を算出するために、同時にヘモグロビンをアッセイする。腎不全マーカー（クレアチニンおよびシスタチン）についても血清を分析する。腎臓障害のマーカーであるＣ３タンパク質の沈着を分析するために腎臓を取り出す。
【００７６】
２）正常Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（クラスタリン欠乏でない）におけるＨＵＳマウスモデルのＴＭＡにおけるクラスタリンの保護的役割および治療的役割の試験
【００７７】
ＷＴマウスに、選択された用量のＳＴＸまたはＰＢＳを腹腔内に注射する。マウスは、組換えマウスクラスタリンの定期的注射で治療する（１ｍｇ／ｋｇ）。血液サンプルを採取して全血球数計算を行うことによりモニターを行う。貧血症の指標を算出するために、同時にヘモグロビンをアッセイする。腎不全マーカー（クレアチニンおよびシスタチン）についても血清を分析する。腎臓障害のマーカーであるＣ３タンパク質の沈着を分析するために腎臓を取り出す。
【００７８】
−  クラスタリンの非存在と、腎毒性およびＨＵＳ（血小板減少症、貧血症）の生物学的マーカーの悪化との間に相関がある、
−  結果は、マウスモデルで志賀毒素によって誘発される毒性の制御におけるクラスタリンの必須的役割を示すことを可能とする、
−  結果は、ＨＵＳマウスモデルのＴＭＡにおけるクラスタリンの保護的役割および治療的役割を示し、かつ、コントロール群と比較して、補充を受けたマウスの腎機能の改善ならびに溶血および血小板減少症パラメーターの改善を示す、
ことが期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
2020530484000001.app
【国際調査報告】
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