(57)【要約】  本発明は、ワンステップでアンプリコンライブラリを迅速に構築する方法を開示し、当該方法は、目的アンプリコンに基づき設計されたフォワードフュージョンプライマーと、目的アンプリコンに基づき設計されたリバースフュージョンプライマーと、フォワードユニバーサルプライマーと、リバースユニバーサルプライマーとを含むように、ＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築するためのプライマー組み合わせを合成するステップ１と、ＤＮＡサンプルのＰＣＲ反応系を構築するステップ２と、ＰＣＲを行うステップ３と、を含む。
2020512405.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法であって、
５’から３’方向へと順に配置された第１のリンカー配列（ブリッジ配列）と目的アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列とを含む、目的アンプリコンに基づき設計されたフォワードフュージョンプライマーと、
５’から３’方向へと順に配置された第２のリンカー配列（ｔｒＰ１配列）と目的アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列とを含む、目的アンプリコンに基づき設計されたリバースフュージョンプライマーと、
５’から３’方向へと順に配置された第３のリンカー配列（Ａ配列）と、バーコード配列と第１のリンカー配列とを含む、フォワードユニバーサルプライマーと、
５’から３’方向へと順に配置されたユニバーサル配列（Ｕｎｉ配列）と第２のリンカー配列とを含む、リバースユニバーサルプライマーとを含むように、ＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築するためのプライマー組み合わせを合成するステップ１）と、
目的アンプリコンに基づき設計されたフォワードフュージョンプライマー、目的アンプリコンに基づき設計されたリバースフュージョンプライマー、フォワードユニバーサルプライマー及びリバースユニバーサルプライマーを混合してＰＣＲ反応系中のプライマー組み合わせとするように、ＤＮＡサンプルのＰＣＲ反応系を構築するステップ２）と、
ＰＣＲを行うステップ３）と、を含むことを特徴とする、ＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法。
【請求項２】
前記第１のリンカー配列は、配列番号１の配列を含み、前記第２のリンカー配列は、配列番号２の配列を含むことが好ましく、前記第３のリンカー配列は、配列番号３の配列を含むことが好ましく、前記ユニバーサル配列は、配列番号４の配列を含むことが好ましいことを特徴とする、請求項１に記載のＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法。
【請求項３】
同一のＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築するためのプライマー組み合わせで、フォワードユニバーサルプライマーにおけるバーコード配列は同一であり、異なるＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築するためのプライマー組み合わせで、フォワードユニバーサルプライマーにおけるバーコード配列は異なることを特徴とする、請求項１に記載のＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法。
【請求項４】
同一のＰＣＲ反応中の目的アンプリコンの数量が１より大きい場合、前記目的アンプリコンに基づき設計されたフォワードフュージョンプライマーは各種類の目的アンプリコンに基づき設計されたフォワードフュージョンプライマーの組み合わせであり、前記目的アンプリコンに基づき設計されたリバースフュージョンプライマーは各種類の目的アンプリコンに基づき設計されたリバースフュージョンプライマーの組み合わせであることを特徴とする、請求項１にＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法。
【請求項５】
前記ＤＮＡサンプルはゲノムＤＮＡであり、前記ゲノムＤＮＡは組織サンプルまたはホルマリン固定・パラフィン包埋サンプルから抽出されることが好ましいことを特徴とする、請求項１に記載のＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法。
【請求項６】
前記目的アンプリコンは、次の２２種類の目的アンプリコン：
配列番号５の配列を有する、ＡＬＫ遺伝子のＣｈｒ２：２９４３２５８８−２９４３２７０７（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号６の配列を有する、ＡＬＫ遺伝子のＣｈｒ２：２９４４３６１６−２９４４３７３０（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号７の配列を有する、ＢＲＡＦ遺伝子のＣｈｒ７：１４０４５３０９１−１４０４５３１９７（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号８の配列を有する、ＥＧＦＲ遺伝子のＣｈｒ７：５５２４１６０４−５５２４１７２６（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号９の配列を有する、ＥＧＦＲ遺伝子のＣｈｒ７：５５２４２３９８−５５２４２５１３（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号１０の配列を有する、ＥＧＦＲ遺伝子のＣｈｒ７：５５２４８９７０−５５２４９０９６（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号１１の配列を有する、ＥＧＦＲ遺伝子のＣｈｒ７：５５２５９５０５−５５２５９６２１（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号１２の配列を有する、ＥＲＢＢ２遺伝子のＣｈｒ１７：３７８８０９６９−３７８８１０８２（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号１３の配列を有する、ＫＲＡＳ遺伝子のＣｈｒ１２：２５３８０２６１−２５３８０３６３（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号１４の配列を有する、ＫＲＡＳ遺伝子のＣｈｒ１２：２５３９８１８３−２５３９８３１０（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号１５の配列を有する、ＭＥＴ遺伝子のＣｈｒ７：１１６３４０２３３−１１６３４０３３５（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号１６の配列を有する、ＭＥＴ遺伝子のＣｈｒ７：１１６４１１８８０−１１６４１２００５（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号１７の配列を有する、ＭＥＴ遺伝子のＣｈｒ７：１１６４１７４２６−１１６４１７５４６（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号１８の配列を有する、ＭＥＴ遺伝子のＣｈｒ７：１１６４２３３９９−１１６４２３４９９（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号１９の配列を有する、ＮＲＡＳ遺伝子のＣｈｒ１：１１５２５６５０７−１１５２５６５８６（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号２０の配列を有する、ＮＲＡＳ遺伝子のＣｈｒ１：１１５２５８６５１−１１５２５８７５５（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号２１の配列を有する、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のＣｈｒ３：１７８９３６０５６−１７８９３６１７９（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号２２の配列を有する、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のＣｈｒ３：１７８９５２０００−１７８９５２０９２（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号２３の配列を有する、ＴＰ５３遺伝子のＣｈｒ１７：７５７７０２７−７５７７１５４（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号２４の配列を有する、ＴＰ５３遺伝子のＣｈｒ１７：７５７７５０７−７５７７６１３（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号２５の配列を有する、ＴＰ５３遺伝子のＣｈｒ１７：７５７８１８２−７５７８２９８（Ｈｇ１９）アンプリコン、及び
配列番号２６の配列を有する、ＴＰ５３遺伝子のＣｈｒ１７：７５７８３８９−７５７８５３７（Ｈｇ１９）アンプリコン、
から選ばれる少なくとも１つを含むことを特徴とする、請求項１に記載のＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法。
【請求項７】
ＡＬＫ遺伝子のＣｈｒ２：２９４３２５８８−２９４３２７０７（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列は、配列番号２７の配列であり、ＡＬＫ遺伝子のＣｈｒ２：２９４３２５８８−２９４３２７０７（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列は、配列番号２８の配列であり、
好ましくは、ＡＬＫ遺伝子のＣｈｒ２：２９４４３６１６−２９４４３７３０（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列は、配列番号２９の配列であり、ＡＬＫ遺伝子のＣｈｒ２：２９４４３６１６−２９４４３７３０（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列は、配列番号３０の配列であり、
好ましくは、ＢＲＡＦ遺伝子のＣｈｒ７：１４０４５３０９１−１４０４５３１９７（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列は、配列番号３１の配列であり、ＢＲＡＦ遺伝子のＣｈｒ７：１４０４５３０９１−１４０４５３１９７（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列は、配列番号３２の配列であり、
好ましくは、ＥＧＦＲ遺伝子のＣｈｒ７：５５２４１６０４−５５２４１７２６（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列は、配列番号３３の配列であり、ＥＧＦＲ遺伝子のＣｈｒ７：５５２４１６０４−５５２４１７２６（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列は、配列番号３４の配列であり、
好ましくは、ＥＧＦＲ遺伝子のＣｈｒ７：５５２４２３９８−５５２４２５１３（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列は、配列番号３５の配列であり、ＥＧＦＲ遺伝子のＣｈｒ７：５５２４２３９８−５５２４２５１３（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列は、配列番号３６の配列であり、
好ましくは、ＥＧＦＲ遺伝子のＣｈｒ７：５５２４８９７０−５５２４９０９６（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列は、配列番号３７の配列であり、ＥＧＦＲ遺伝子のＣｈｒ７：５５２４８９７０−５５２４９０９６（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列は、配列番号３８の配列であり、
好ましくは、ＥＧＦＲ遺伝子のＣｈｒ７：５５２５９５０５−５５２５９６２１（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列は、配列番号３９の配列であり、ＥＧＦＲ遺伝子のＣｈｒ７：５５２５９５０５−５５２５９６２１（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列は、配列番号４０の配列であり、
好ましくは、ＥＲＢＢ２遺伝子のＣｈｒ１７：３７８８０９６９−３７８８１０８２（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列は、配列番号４１の配列であり、ＥＲＢＢ２遺伝子のＣｈｒ１７：３７８８０９６９−３７８８１０８２（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列は、配列番号４２の配列であり、
好ましくは、ＫＲＡＳ遺伝子のＣｈｒ１２：２５３８０２６１−２５３８０３６３（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列は、配列番号４３の配列であり、ＫＲＡＳ遺伝子のＣｈｒ１２：２５３８０２６１−２５３８０３６３（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列は、配列番号４４の配列であり、
好ましくは、ＫＲＡＳ遺伝子のＣｈｒ１２：２５３９８１８３−２５３９８３１０（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列は、配列番号４５の配列であり、ＫＲＡＳ遺伝子のＣｈｒ１２：２５３９８１８３−２５３９８３１０（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列は、配列番号４６の配列であり、
好ましくは、ＭＥＴ遺伝子のＣｈｒ７：１１６３４０２３３−１１６３４０３３５（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列は、配列番号４７の配列であり、ＭＥＴ遺伝子のＣｈｒ７：１１６３４０２３３−１１６３４０３３５（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列は、配列番号４８の配列であり、
好ましくは、ＭＥＴ遺伝子のＣｈｒ７：１１６４１１８８０−１１６４１２００５（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列は、配列番号４９の配列であり、ＭＥＴ遺伝子のＣｈｒ７：１１６４１１８８０−１１６４１２００５（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列は、配列番号５０の配列であり、
好ましくは、ＭＥＴ遺伝子のＣｈｒ７：１１６４１７４２６−１１６４１７５４６（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列は、配列番号５１の配列であり、ＭＥＴ遺伝子のＣｈｒ７：１１６４１７４２６−１１６４１７５４６（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列は、配列番号５２の配列であり、
好ましくは、ＭＥＴ遺伝子のＣｈｒ７：１１６４２３３９９−１１６４２３４９９（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列は、配列番号５３の配列であり、ＭＥＴ遺伝子のＣｈｒ７：１１６４２３３９９−１１６４２３４９９（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列は、配列番号５４の配列であり、
好ましくは、ＮＲＡＳ遺伝子のＣｈｒ１：１１５２５６５０７−１１５２５６５８６（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列は、配列番号５５の配列であり、ＮＲＡＳ遺伝子のＣｈｒ１：１１５２５６５０７−１１５２５６５８６（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列は、配列番号５６の配列であり、
好ましくは、ＮＲＡＳ遺伝子のＣｈｒ１：１１５２５８６５１−１１５２５８７５５（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列は、配列番号５７の配列であり、ＮＲＡＳ遺伝子のＣｈｒ１：１１５２５８６５１−１１５２５８７５５（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列は、配列番号５８の配列であり、
好ましくは、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のＣｈｒ３：１７８９３６０５６−１７８９３６１７９（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列は、配列番号５９の配列であり、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のＣｈｒ３：１７８９３６０５６−１７８９３６１７９（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列は、配列番号６０の配列であり、
好ましくは、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のＣｈｒ３：１７８９５２０００−１７８９５２０９２（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列は、配列番号６１の配列であり、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のＣｈｒ３：１７８９５２０００−１７８９５２０９２（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列は、配列番号６２の配列であり、
好ましくは、ＴＰ５３遺伝子のＣｈｒ１７：７５７７０２７−７５７７１５４（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列は、配列番号６３の配列であり、ＴＰ５３遺伝子のＣｈｒ１７：７５７７０２７−７５７７１５４（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列は、配列番号６４の配列であり、
好ましくは、ＴＰ５３遺伝子のＣｈｒ１７：７５７７５０７−７５７７６１３（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列は、配列番号６５の配列であり、ＴＰ５３遺伝子のＣｈｒ１７：７５７７５０７−７５７７６１３（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列は、配列番号６６の配列であり、
好ましくは、ＴＰ５３遺伝子のＣｈｒ１７：７５７８１８２−７５７８２９８（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列は、配列番号６７の配列であり、ＴＰ５３遺伝子のＣｈｒ１７：７５７８１８２−７５７８２９８（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列は、配列番号６８の配列であり、
好ましくは、ＴＰ５３遺伝子のＣｈｒ１７：７５７８３８９−７５７８５３７（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列は、配列番号６９の配列であり、ＴＰ５３遺伝子のＣｈｒ１７：７５７８３８９−７５７８５３７（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列は、配列番号７０のＳＥＱ  ＩＤ：７０配列である、
ことを特徴とする、請求項６に記載のＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法。
【請求項８】
前記目的アンプリコンは、以下の２２種類：
配列番号５の配列を有する、ＡＬＫ遺伝子のＣｈｒ２：２９４３２５８８−２９４３２７０７（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号６の配列を有する、ＡＬＫ遺伝子のＣｈｒ２：２９４４３６１６−２９４４３７３０（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号７の配列を有する、ＢＲＡＦ遺伝子のＣｈｒ７：１４０４５３０９１−１４０４５３１９７（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号８の配列を有する、ＥＧＦＲ遺伝子のＣｈｒ７：５５２４１６０４−５５２４１７２６（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号９の配列を有する、ＥＧＦＲ遺伝子のＣｈｒ７：５５２４２３９８−５５２４２５１３（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号１０の配列を有する、ＥＧＦＲ遺伝子のＣｈｒ７：５５２４８９７０−５５２４９０９６（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号１１の配列を有する、ＥＧＦＲ遺伝子のＣｈｒ７：５５２５９５０５−５５２５９６２１（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号１２の配列を有する、ＥＲＢＢ２遺伝子のＣｈｒ１７：３７８８０９６９−３７８８１０８２（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号１３の配列を有する、ＫＲＡＳ遺伝子のＣｈｒ１２：２５３８０２６１−２５３８０３６３（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号１４の配列を有する、ＫＲＡＳ遺伝子のＣｈｒ１２：２５３９８１８３−２５３９８３１０（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号１５の配列を有する、ＭＥＴ遺伝子のＣｈｒ７：１１６３４０２３３−１１６３４０３３５（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号１６の配列を有する、ＭＥＴ遺伝子のＣｈｒ７：１１６４１１８８０−１１６４１２００５（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号１７の配列を有する、ＭＥＴ遺伝子のＣｈｒ７：１１６４１７４２６−１１６４１７５４６（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号１８の配列を有する、ＭＥＴ遺伝子のＣｈｒ７：１１６４２３３９９−１１６４２３４９９（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号１９の配列を有する、ＮＲＡＳ遺伝子のＣｈｒ１：１１５２５６５０７−１１５２５６５８６（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号２０の配列を有する、ＮＲＡＳ遺伝子のＣｈｒ１：１１５２５８６５１−１１５２５８７５５（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号２１の配列を有する、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のＣｈｒ３：１７８９３６０５６−１７８９３６１７９（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号２２の配列を有する、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のＣｈｒ３：１７８９５２０００−１７８９５２０９２（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号２３の配列を有する、ＴＰ５３遺伝子のＣｈｒ１７：７５７７０２７−７５７７１５４（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号２４の配列を有する、ＴＰ５３遺伝子のＣｈｒ１７：７５７７５０７−７５７７６１３（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号２５の配列を有する、ＴＰ５３遺伝子のＣｈｒ１７：７５７８１８２−７５７８２９８（Ｈｇ１９）アンプリコン、及び
配列番号２６の配列を有する、ＴＰ５３遺伝子のＣｈｒ１７：７５７８３８９−７５７８５３７（Ｈｇ１９）アンプリコン、
であることを特徴とする、請求項１に記載のＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法。
【請求項９】
請求項８に記載の２２種類の目的アンプリコンに基づき設計されたフォワードフュージョンプライマーの組み合わせと、前記２２種類の目的アンプリコンに基づき設計されたリバースフュージョンプライマーの組み合わせと、フォワードユニバーサルプライマーと、リバースユニバーサルプライマーとのモル比が、０．１〜０．３：０．１〜０．３：０．５〜１：０．５〜１であることを特徴とする、請求項８に記載のＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法。
【請求項１０】
ＰＣＲ反応系は以下の成分を含むことを特徴とする、請求項９に記載のＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法。
【表１】
2020512405.tif 000012
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
「関連出願の相互参照」
本発明は、北京泛生子基因科技有限公司が２０１７年４月５日に中国専利局に提出した、出願番号が２０１７１０２１８５２９．４で、発明名称が「ワンステップでアンプリコンライブラリを迅速に構築する方法」である中国専利の優先権を主張し、当該出願の全ての内容を援用する形で本発明に組み込む。
【０００２】
本発明は、生物工学の分野に関し、より詳しく言えば、ワンステップでアンプリコンライブラリを迅速に構築する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
次世代シーケンシング（ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、略称ＮＧＳ）は、ハイスループット、高感度、高度な自動化等の特徴により、近年疾患の研究、診断及び治療において幅広く利用される。ＮＧＳ技術は超並列ＤＮＡシーケンシングを実現できるため、従来の検出方法よりも少ないサンプルを使用し、感度が高く、腫瘍変異の全過程を客観的に再現することができる。一方、Ｌｉｆｅ  ＮＧＳシステムを用いる従来のアンプリコンライブラリの構築方法は、ＰＣＲ増幅、制限酵素消化、リンカーライゲーション、精製等多くのステップが必要であり、約５時間を要するだけでなく、複数のステップでは操作中に装置を開く必要があるため、ライブラリが汚染されやすく、損失率が高い。また、従来のアンプリコンライブラリ構築方法では、１つのサンプル当たりライブラリを構築するには、２００〜１０００元／例とコストが高い。
【０００４】
背景技術に記載された情報は、本発明の背景に対する理解を深めるためのものに過ぎず、当該情報を当業者に周知された従来技術として認定するものでもなければ、何らかの形でこのような認定を示唆するものでもない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ワンステップでアンプリコンライブラリを迅速に構築する方法を提供することを目的とする。当該方法は、ワンステップＰＣＲで、簡単でかつ迅速にアンプリコンライブラリを構築することができ、また、ＰＣＲを開始する前にバーコードが導入されるため、サンプルとライブラリの交差汚染の可能性は大幅に低減される。また、実験エリアの機能設定を簡素化することができ、１つのサンプル当たりライブラリを構築するコストを３０元／例に抑えることができる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、上記目的を達成するためになされるものであり、ＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法を提供し、当該方法は、以下のステップ１〜ステップ３を含む：
ステップ１；ＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築するためのプライマー組み合わせを合成し、前記ＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築するためのプライマー組み合わせは、目的アンプリコンに基づき設計されたフォワードフュージョンプライマーと、目的アンプリコンに基づき設計されたリバースフュージョンプライマーと、フォワードユニバーサルプライマーと、リバースユニバーサルプライマーとを含み、
但し、前記フォワードフュージョンプライマーは、５’から３’方向へと順に配置された第１のリンカー配列（ブリッジ配列）と目的アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列とを含み、
前記リバースフュージョンプライマーは、５’から３’方向へと順に配置された第２のリンカー配列（ｔｒＰ１配列）と目的アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列とを含み、
前記フォワードユニバーサルプライマーは、５’から３’方向へと順に配置された第３のリンカー配列（Ａ配列）と、バーコード配列と第１のリンカー配列とを含み、
前記リバースユニバーサルプライマーは、５’から３’方向へと順に配置されたユニバーサル配列（Ｕｎｉ配列）と第２のリンカー配列とを含む：
ステップ２；目的アンプリコンに基づき設計されたフォワードフュージョンプライマー、目的アンプリコンに基づき設計されたリバースフュージョンプライマー、フォワードユニバーサルプライマー及びリバースユニバーサルプライマーを混合してＰＣＲ反応系中のプライマー組み合わせとするように、ＤＮＡサンプルのＰＣＲ反応系を構築する：
ステップ３；ＰＣＲを行う。
【０００７】
上記ＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法の別の実施形態として、前記第１のリンカー配列は配列番号１の配列を含み、前記配列番号１の塩基配列はＧＧＣＡＴＡＣＧＴＣＣＴＣＧＴＣＴＡである。
【０００８】
上記ＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法の別の実施形態として、前記第２のリンカー配列は配列番号２の配列を含み、前記配列番号２の塩基配列はＴＣＴＡＴＧＧＧＣＡＧＴＣＧＧＴＧＡＴである。
【０００９】
上記ＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法の別の実施形態として、前記第３のリンカー配列は配列番号３の配列を含み、前記配列番号３の塩基配列はＣＣＡＴＣＴＣＡＴＣＣＣＴＧＣＧＴＧＴＣＴＣＣＧＡＣＴＣＡＧである。
【００１０】
上記ＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法の別の実施形態として、前記ユニバーサル配列は配列番号４の配列を含み、前記配列番号４の塩基配列はＣＣＡＣＴＡＣＧＣＣＴＣＣＧＣＴＴＴＣＣＴＣである。
【００１１】
上記ＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法の別の実施形態として、同一のＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築するためのプライマー組み合わせにおいて、フォワードユニバーサルプライマーにおけるバーコード配列は同一であり、異なるＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築するためのプライマー組み合わせにおいて、フォワードユニバーサルプライマーにおけるバーコード配列は異なる。バーコード配列はサンプルに対応しており、サンプルが異なるとバーコード配列も異なる。異なるサンプルを区分することさえできればよいため、バーコード配列は特異性的なものではなく、その配列を変更することができる。
【００１２】
上記ＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法の別の実施形態として、任意の１種の目的アンプリコンに基づき設計されたフォワードフュージョンプライマー、任意の１種の目的アンプリコンに基づき設計されたリバースフュージョンプライマー、フォワードユニバーサルプライマー、及びリバースユニバーサルプライマーの濃度はいずれも１００μＭである。
【００１３】
上記ＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法の別の実施形態として、同一のＰＣＲ反応中の目的アンプリコンの数量が１より大きい場合、前記目的アンプリコンに基づき設計されたフォワードフュージョンプライマーは各種類の目的アンプリコンに基づき設計されたフォワードフュージョンプライマーの組み合わせであり、前記目的アンプリコンに基づき設計されたリバースフュージョンプライマーは各種類の目的アンプリコンに基づき設計されたリバースフュージョンプライマーの組み合わせである。
【００１４】
上記ＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法の別の実施形態として、任意の１種の目的アンプリコンに基づき設計されたフォワードフュージョンプライマーと、当該目的アンプリコンに基づき設計されたリバースフュージョンプライマーとのモル比は１：１であり、前記フォワードユニバーサルプライマーと前記リバースユニバーサルプライマーとのモル比は１：１である。フォワードユニバーサルプライマー及びリバースユニバーサルプライマーの使用量はＰＣＲ増幅時の目的アンプリコンの数量に基づき調整される。例えば、ＰＣＲ増幅時、５種類の目的アンプリコンを増幅する場合と２２種類の目的アンプリコンを増幅する場合とでは、フォワードユニバーサルプライマーとリバースユニバーサルプライマーの使用量が異なる可能性があり、当業者は本分野通常の技術的手段によりフォワードユニバーサルプライマー及びリバースユニバーサルプライマーの使用量を決定することができる。
【００１５】
上記ＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法の別の実施形態として、前記ＤＮＡサンプルはゲノムＤＮＡである。
【００１６】
上記ＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法の別の実施形態として、前記ゲノムＤＮＡは組織サンプル又はホルマリン固定・パラフィン包埋サンプルから抽出される。
【００１７】
上記ＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法の別の実施形態として、前記目的アンプリコンは、次の２２種類の目的アンプリコンから選ばれる少なくとも１つを含む：
ＴＡＡＧＧＧＡＣＡＡＧＣＡＧＣＣＡＣＡＣＣＣＣＡＴＴＣＴＴＧＡＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＧＡＡＧＡＧＡＣＡＧＧＣＣＣＧＧＡＧＧＧＧＴＧＡＧＧＣＡＧＴＣＴＴＴＡＣＴＣＡＣＣＴＧＴＡＧＡＴＧＴＣＴＣＧＧＧＣＣＡＴＣＣＣＧＡＡＧＴＣＴＣＣＡＡＴＣＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＴＴＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＧＧＴＣＡＡＧＡＧＧＣＡＧＴである配列番号５の配列を有する、ＡＬＫ遺伝子のＣｈｒ２：２９４３２５８８−２９４３２７０７（Ｈｇ１９）アンプリコン、
ＣＧＧＡＧＧＡＡＧＧＡＣＴＴＧＡＧＧＴＣＴＣＣＣＣＣＣＧＣＣＡＴＧＡＧＣＴＣＣＡＧＣＡＧＧＡＴＧＡＡＣＣＧＧＧＧＣＡＧＧＧＡＴＴＧＣＡＧＧＣＴＣＡＣＣＣＣＡＡＴＧＣＡＧＣＧＡＡＣＡＡＴＧＴＴＣＴＧＧＴＧＧＴＴＧＡＡＴＴＴＧＣＴＧＣＡＧＡＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＴＧＴＡＡＣＣＡＡＡＡＴＴＡＡＣＴＧＡＧＣＴＧＡＧＴＣＴＧＧである配列番号６の配列を有する、ＡＬＫ遺伝子のＣｈｒ２：２９４４３６１６−２９４４３７３０（Ｈｇ１９）アンプリコン、
ＣＣＴＣＡＡＴＴＣＴＴＡＣＣＡＴＣＣＡＣＡＡＡＡＴＧＧＡＴＣＣＡＧＡＣＡＡＣＴＧＴＴＣＡＡＡＣＴＧＡＴＧＧＧＡＣＣＣＡＣＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＴＴＴＣＡＣＴＧＴＡＧＣＴＡＧＡＣＣＡＡＡＡＴＣＡＣＣＴＡＴＴＴＴＴＡＣＴＧＴＧＡＧＧＴＣＴＴＣＡＴＧＡＡＧＡＡＡＴＡＴＡＴＣＴＧＡＧＧＴＧＴＡＧＴＡＡＧＴＡＡＡＧＧＡＡＡＡＣＡＧＴＡＧである配列番号７の配列を有する、ＢＲＡＦ遺伝子のＣｈｒ７：１４０４５３０９１−１４０４５３１９７（Ｈｇ１９）アンプリコン、
ＴＧＡＣＣＣＴＴＧＴＣＴＣＴＧＴＧＴＴＣＴＴＧＴＣＣＣＣＣＣＣＡＧＣＴＴＧＴＧＧＡＧＣＣＴＣＴＴＡＣＡＣＣＣＡＧＴＧＧＡＧＡＡＧＣＴＣＣＣＡＡＣＣＡＡＧＣＴＣＴＣＴＴＧＡＧＧＡＴＣＴＴＧＡＡＧＧＡＡＡＣＴＧＡＡＴＴＣＡＡＡＡＡＧＡＴＣＡＡＡＧＴＧＣＴＧＧＧＣＴＣＣＧＧＴＧＣＧＴＴＣＧＧＣＡＣＧＧＴＧＴＡＴＡＡＧＧＴＡＡＧＧＴＣＣＣＴＧＧである配列番号８の配列を有する、ＥＧＦＲ遺伝子のＣｈｒ７：５５２４１６０４−５５２４１７２６（Ｈｇ１９）アンプリコン、
ＡＣＡＡＴＴＧＣＣＡＧＴＴＡＡＣＧＴＣＴＴＣＣＴＴＣＴＣＴＣＴＣＴＧＴＣＡＴＡＧＧＧＡＣＴＣＴＧＧＡＴＣＣＣＡＧＡＡＧＧＴＧＡＧＡＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＴＣＣＣＧＴＣＧＣＴＡＴＣＡＡＧＧＡＡＴＴＡＡＧＡＧＡＡＧＣＡＡＣＡＴＣＴＣＣＧＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＧＧＡＡＡＴＣＣＴＣＧＡＴＧＴＧＡＧＴＴＴＣＴＧＣＴＴＴＧＣＴＧＴＧＴである配列番号９の配列を有する、ＥＧＦＲ遺伝子のＣｈｒ７：５５２４２３９８−５５２４２５１３（Ｈｇ１９）アンプリコン、
ＧＡＡＧＣＣＡＣＡＣＴＧＡＣＧＴＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＣＣＣＴＣＣＡＧＧＡＡＧＣＣＴＡＣＧＴＧＡＴＧＧＣＣＡＧＣＧＴＧＧＡＣＡＡＣＣＣＣＣＡＣＧＴＧＴＧＣＣＧＣＣＴＧＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＣＡＣＣＴＣＣＡＣＣＧＴＧＣＡＧＣＴＣＡＴＣＡＣＧＣＡＧＣＴＣＡＴＧＣＣＣＴＴＣＧＧＣＴＧＣＣＴＣＣＴＧＧＡＣＴＡＴＧＴＣＣＧＧＧＡＡＣＡＣである配列番号１０の配列を有する、ＥＧＦＲ遺伝子のＣｈｒ７：５５２４８９７０−５５２４９０９６（Ｈｇ１９）アンプリコン、
ＣＣＧＣＡＧＣＡＴＧＴＣＡＡＧＡＴＣＡＣＡＧＡＴＴＴＴＧＧＧＣＴＧＧＣＣＡＡＡＣＴＧＣＴＧＧＧＴＧＣＧＧＡＡＧＡＧＡＡＡＧＡＡＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧＡＡＧＧＡＧＧＣＡＡＡＧＴＡＡＧＧＡＧＧＴＧＧＣＴＴＴＡＧＧＴＣＡＧＣＣＡＧＣＡＴＴＴＴＣＣＴＧＡＣＡＣＣＡＧＧＧＡＣＣＡＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＣＣＡＣＴＡＧＣＴＧＴＡＴＴＧＴＴＴＡである配列番号１１の配列を有する、ＥＧＦＲ遺伝子のＣｈｒ７：５５２５９５０５−５５２５９６２１（Ｈｇ１９）アンプリコン、
ＣＡＴＡＣＣＣＴＣＴＣＡＧＣＧＴＡＣＣＣＴＴＧＴＣＣＣＣＡＧＧＡＡＧＣＡＴＡＣＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＣＴＣＣＣＣＡＴＡＴＧＴＣＴＣＣＣＧＣＣＴＴＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＧＣＴＴＡＴＧＣＣＣＴＡＴＧＧＣＴＧＣＣＴＣＴＴＡＧＡＣＣＡＴＧＴＣＣＧである配列番号１２の配列を有する、ＥＲＢＢ２遺伝子のＣｈｒ１７：３７８８０９６９−３７８８１０８２（Ｈｇ１９）アンプリコン、
ＡＧＴＣＣＴＣＡＴＧＴＡＣＴＧＧＴＣＣＣＴＣＡＴＴＧＣＡＣＴＧＴＡＣＴＣＣＴＣＴＴＧＡＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧＡＧＡＡＴＡＴＣＣＡＡＧＡＧＡＣＡＧＧＴＴＴＣＴＣＣＡＴＣＡＡＴＴＡＣＴＡＣＴＴＧＣＴＴＣＣＴＧＴＡＧＧＡＡＴＣＣＴＧＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＧＴＣＴＧＧＡＴＴＡＴＴＡＣＡＧＴＧＣＡである配列番号１３の配列を有する、ＫＲＡＳ遺伝子のＣｈｒ１２：２５３８０２６１−２５３８０３６３（Ｈｇ１９）アンプリコン、
ＡＡＡＧＡＡＴＧＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＴＡＡＴＡＴＧＣＡＴＡＴＴＡＡＡＡＣＡＡＧＡＴＴＴＡＣＣＴＣＴＡＴＴＧＴＴＧＧＡＴＣＡＴＡＴＴＣＧＴＣＣＡＣＡＡＡＡＴＧＡＴＴＣＴＧＡＡＴＴＡＧＣＴＧＴＡＴＣＧＴＣＡＡＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣＴＡＣＧＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＡＡＣＴＡＣＣＡＣＡＡＧＴＴＴＡＴＡＴＴＣＡＧＴＣＡＴＴＴＴＣＡＧＣＡＧＧＣＣＴＴである配列番号１４の配列を有する、ＫＲＡＳ遺伝子のＣｈｒ１２：２５３９８１８３−２５３９８３１０（Ｈｇ１９）アンプリコン、
ＴＣＧＡＴＣＴＧＣＣＡＴＧＴＧＴＧＣＡＴＴＣＣＣＴＡＴＣＡＡＡＴＡＴＧＴＣＡＡＣＧＡＣＴＴＣＴＴＣＡＡＣＡＡＧＡＴＣＧＴＣＡＡＣＡＡＡＡＡＣＡＡＴＧＴＧＡＧＡＴＧＴＣＴＣＣＡＧＣＡＴＴＴＴＴＡＣＧＧＡＣＣＣＡＡＴＣＡＴＧＡＧＣＡＣＴＧＣＴＴＴＡＡＴＡＧＧＧＴＡＡＧＴＣＡＣＡＴＣＡＧＴＴＣＣＣである配列番号１５の配列を有する、ＭＥＴ遺伝子のＣｈｒ７：１１６３４０２３３−１１６３４０３３５（Ｈｇ１９）アンプリコン、
ＣＣＡＴＧＡＴＡＧＣＣＧＴＣＴＴＴＡＡＣＡＡＧＣＴＣＴＴＴＣＴＴＴＣＴＣＴＣＴＧＴＴＴＴＡＡＧＡＴＣＴＧＧＧＣＡＧＴＧＡＡＴＴＡＧＴＴＣＧＣＴＡＣＧＡＴＧＣＡＡＧＡＧＴＡＣＡＣＡＣＴＣＣＴＣＡＴＴＴＧＧＡＴＡＧＧＣＴＴＧＴＡＡＧＴＧＣＣＣＧＡＡＧＴＧＴＡＡＧＣＣＣＡＡＣＴＡＣＡＧＡＡＡＴＧＧＴＴＴＣＡＡＡＴＧＡＡＴＣＴＧＴＡＧＡＣＴＡＣＣＧＡＧＣＴである配列番号１６の配列を有する、ＭＥＴ遺伝子のＣｈｒ７：１１６４１１８８０−１１６４１２００５（Ｈｇ１９）アンプリコン、
ＡＴＧＴＴＡＣＧＣＡＧＴＧＣＴＡＡＣＣＡＡＧＴＴＣＴＴＴＣＴＴＴＴＧＣＡＣＡＧＧＧＣＡＴＴＴＴＧＧＴＴＧＴＧＴＡＴＡＴＣＡＴＧＧＧＡＣＴＴＴＧＴＴＧＧＡＣＡＡＴＧＡＴＧＧＣＡＡＧＡＡＡＡＴＴＣＡＣＴＧＴＧＣＴＧＴＧＡＡＡＴＣＣＴＴＧＡＡＣＡＧＴＡＡＧＴＧＧＣＡＴＴＴＴＡＴＴＴＡＡＣＣＡＴＧＧＡＧＴＡＴＡＣＴＴＴＴＧＴＧＧＴＴＴＧＣＡＡＣである配列番号１７の配列を有する、ＭＥＴ遺伝子のＣｈｒ７：１１６４１７４２６−１１６４１７５４６（Ｈｇ１９）アンプリコン、
ＣＡＧＴＣＡＡＧＧＴＴＧＣＴＧＡＴＴＴＴＧＧＴＣＴＴＧＣＣＡＧＡＧＡＣＡＴＧＴＡＴＧＡＴＡＡＡＧＡＡＴＡＣＴＡＴＡＧＴＧＴＡＣＡＣＡＡＣＡＡＡＡＣＡＧＧＴＧＣＡＡＡＧＣＴＧＣＣＡＧＴＧＡＡＧＴＧＧＡＴＧＧＣＴＴＴＧＧＡＡＡＧＴＣＴＧＣＡＡＡＣＴＣＡＡＡＡＧＴＴＴＡＣＣＡＣＣＡＡＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧである配列番号１８の配列を有する、ＭＥＴ遺伝子のＣｈｒ７：１１６４２３３９９−１１６４２３４９９（Ｈｇ１９）アンプリコン、
ＴＴＣＧＣＣＴＧＴＣＣＴＣＡＴＧＴＡＴＴＧＧＴＣＴＣＴＣＡＴＧＧＣＡＣＴＧＴＡＣＴＣＴＴＣＴＴＧＴＣＣＡＧＣＴＧＴＡＴＣＣＡＧＴＡＴＧＴＣＣＡＡＣＡＡＡＣＡＧＧＴＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＡＴＡＡＣＣＡＣＴＴＧＴＴＴＴＣＴＧＴＡＡＧＡＡＴＣＣＴＧＧＧＧＧＴＧである配列番号１９の配列を有する、ＮＲＡＳ遺伝子のＣｈｒ１：１１５２５６５０７−１１５２５６５８６（Ｈｇ１９）アンプリコン、
ＴＧＡＧＡＧＡＣＡＧＧＡＴＣＡＧＧＴＣＡＧＣＧＧＧＣＴＡＣＣＡＣＴＧＧＧＣＣＴＣＡＣＣＴＣＴＡＴＧＧＴＧＧＧＡＴＣＡＴＡＴＴＣＡＴＣＴＡＣＡＡＡＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧＡＴＴＡＧＣＴＧＧＡＴＴＧＴＣＡＧＴＧＣＧＣＴＴＴＴＣＣＣＡＡＣＡＣＣＡＣＣＴＧＣＴＣＣＡＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＴＴＴＧＴＡＣＴＣＡＧである配列番号２０の配列を有する、ＮＲＡＳ遺伝子のＣｈｒ１：１１５２５８６５１−１１５２５８７５５（Ｈｇ１９）アンプリコン、
ＧＧＡＡＡＡＴＧＡＣＡＡＡＧＡＡＣＡＧＣＴＣＡＡＡＧＣＡＡＴＴＴＣＴＡＣＡＣＧＡＧＡＴＣＣＴＣＴＣＴＣＴＧＡＡＡＴＣＡＣＴＧＡＧＣＡＧＧＡＧＡＡＡＧＡＴＴＴＴＣＴＡＴＧＧＡＧＴＣＡＣＡＧＧＴＡＡＧＴＧＣＴＡＡＡＡＴＧＧＡＧＡＴＴＣＴＣＴＧＴＴＴＣＴＴＴＴＴＣＴＴＴＡＴＴＡＣＡＧＡＡＡＡＡＡＴＡＡＣＴＧＡＡＴＴＴＧＧＣＴＧＡＴＣＴＣＡＧＣＡＴＧＴＴである配列番号２１の配列を有する、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のＣｈｒ３：１７８９３６０５６−１７８９３６１７９（Ｈｇ１９）アンプリコン、
ＡＴＧＣＣＡＧＡＡＣＴＡＣＡＡＴＣＴＴＴＴＧＡＴＧＡＣＡＴＴＧＣＡＴＡＣＡＴＴＣＧＡＡＡＧＡＣＣＣＴＡＧＣＣＴＴＡＧＡＴＡＡＡＡＣＴＧＡＧＣＡＡＧＡＧＧＣＴＴＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴＣＡＴＧＡＡＡＣＡＡＡＴＧＡＡＴＧＡＴＧＣＡＣＡＴＣＡＴＧＧＴＧＧＣＴＧＧＡＣＡＡＣＡＡＡＡＡＴＧＧＡＴＴＧである配列番号２２の配列を有する、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のＣｈｒ３：１７８９５２０００−１７８９５２０９２（Ｈｇ１９）アンプリコン、
ＣＴＴＣＴＴＧＴＣＣＴＧＣＴＴＧＣＴＴＡＣＣＴＣＧＣＴＴＡＧＴＧＣＴＣＣＣＴＧＧＧＧＧＣＡＧＣＴＣＧＴＧＧＴＧＡＧＧＣＴＣＣＣＣＴＴＴＣＴＴＧＣＧＧＡＧＡＴＴＣＴＣＴＴＣＣＴＣＴＧＴＧＣＧＣＣＧＧＴＣＴＣＴＣＣＣＡＧＧＡＣＡＧＧＣＡＣＡＡＡＣＡＣＧＣＡＣＣＴＣＡＡＡＧＣＴＧＴＴＣＣＧＴＣＣＣＡＧＴＡＧＡＴＴＡＣＣＡＣＴＡＣＴＣＡＧＧＡＴＡＧＧＡＡＡＡＧＡＧである配列番号２３の配列を有する、ＴＰ５３遺伝子のＣｈｒ１７：７５７７０２７−７５７７１５４（Ｈｇ１９）アンプリコン、
ＧＣＡＡＧＴＧＧＣＴＣＣＴＧＡＣＣＴＧＧＡＧＴＣＴＴＣＣＡＧＴＧＴＧＡＴＧＡＴＧＧＴＧＡＧＧＡＴＧＧＧＣＣＴＣＣＧＧＴＴＣＡＴＧＣＣＧＣＣＣＡＴＧＣＡＧＧＡＡＣＴＧＴＴＡＣＡＣＡＴＧＴＡＧＴＴＧＴＡＧＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＴＡＣＡＧＴＣＡＧＡＧＣＣＡＡＣＣＴＡＧＧＡＧＡＴＡＡＣＡＣＡＧＧＣＣＣＡＡＧＡである配列番号２４の配列を有する、ＴＰ５３遺伝子のＣｈｒ１７：７５７７５０７−７５７７６１３（Ｈｇ１９）アンプリコン、
ＣＣＣＣＡＧＴＴＧＣＡＡＡＣＣＡＧＡＣＣＴＣＡＧＧＣＧＧＣＴＣＡＴＡＧＧＧＣＡＣＣＡＣＣＡＣＡＣＴＡＴＧＴＣＧＡＡＡＡＧＴＧＴＴＴＣＴＧＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＡＣＴＣＣＡＣＡＣＧＣＡＡＡＴＴＴＣＣＴＴＣＣＡＣＴＣＧＧＡＴＡＡＧＡＴＧＣＴＧＡＧＧＡＧＧＧＧＣＣＡＧＡＣＣＴＡＡＧＡＧＣＡＡＴＣＡＧＴＧＡＧＧＡＡＴＣＡＧＡＧＧである配列番号２５の配列を有する、ＴＰ５３遺伝子のＣｈｒ１７：７５７８１８２−７５７８２９８（Ｈｇ１９）アンプリコン、及び
ＡＣＣＡＴＣＧＣＴＡＴＣＴＧＡＧＣＡＧＣＧＣＴＣＡＴＧＧＴＧＧＧＧＧＣＡＧＣＧＣＣＴＣＡＣＡＡＣＣＴＣＣＧＴＣＡＴＧＴＧＣＴＧＴＧＡＣＴＧＣＴＴＧＴＡＧＡＴＧＧＣＣＡＴＧＧＣＧＣＧＧＡＣＧＣＧＧＧＴＧＣＣＧＧＧＣＧＧＧＧＧＴＧＴＧＧＡＡＴＣＡＡＣＣＣＡＣＡＧＣＴＧＣＡＣＡＧＧＧＣＡＧＧＴＣＴＴＧＧＣＣＡＧＴＴＧＧＣＡＡＡＡＣＡＴＣＴＴＧＴＴＧＡＧＧＧＣＡＧＧＧＧＡＧＴＡＣＴＧである配列番号２６の配列を有する、ＴＰ５３遺伝子のＣｈｒ１７：７５７８３８９−７５７８５３７（Ｈｇ１９）アンプリコン。
【００１８】
上記ＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法の別の実施形態として、ＡＬＫ遺伝子のＣｈｒ２：２９４３２５８８−２９４３２７０７（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列は、ＡＣＴＧＣＣＴＣＴＴＧＡＣＣＴＧＴＣＣである配列番号２７の配列であり、ＡＬＫ遺伝子のＣｈｒ２：２９４３２５８８−２９４３２７０７（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列は、ＴＡＡＧＧＧＡＣＡＡＧＣＡＧＣＣＡＣＡＣである配列番号２８の配列である。
【００１９】
上記ＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法の別の実施形態として、ＡＬＫ遺伝子のＣｈｒ２：２９４４３６１６−２９４４３７３０（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列は、ＣＣＡＧＡＣＴＣＡＧＣＴＣＡＧＴＴＡＡＴＴＴＴＧＧである配列番号２９の配列であり、ＡＬＫ遺伝子のＣｈｒ２：２９４４３６１６−２９４４３７３０（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列は、ＣＧＧＡＧＧＡＡＧＧＡＣＴＴＧＡＧＧＴである配列番号３０の配列である。
【００２０】
上記ＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法の別の実施形態として、ＢＲＡＦ遺伝子のＣｈｒ７：１４０４５３０９１−１４０４５３１９７（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列は、ＣＴＡＣＴＧＴＴＴＴＣＣＴＴＴＡＣＴＴＡＣＴＡＣＡＣＣＴＣである配列番号３１の配列であり、ＢＲＡＦ遺伝子のＣｈｒ７：１４０４５３０９１−１４０４５３１９７（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列は、ＣＣＴＣＡＡＴＴＣＴＴＡＣＣＡＴＣＣＡＣＡＡＡＡＴＧＧである配列番号３２の配列である。
【００２１】
上記ＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法の別の実施形態として、ＥＧＦＲ遺伝子のＣｈｒ７：５５２４１６０４−５５２４１７２６（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列は、ＴＧＡＣＣＣＴＴＧＴＣＴＣＴＧＴＧＴＴＣＴＴＧである配列番号３３の配列であり、ＥＧＦＲ遺伝子のＣｈｒ７：５５２４１６０４−５５２４１７２６（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列は、ＣＣＡＧＧＧＡＣＣＴＴＡＣＣＴＴＡＴＡＣＡＣＣである配列番号３４の配列である。
【００２２】
上記ＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法の別の実施形態として、ＥＧＦＲ遺伝子のＣｈｒ７：５５２４２３９８−５５２４２５１３（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列は、ＡＣＡＡＴＴＧＣＣＡＧＴＴＡＡＣＧＴＣＴＴＣＣである配列番号３５の配列であり、ＥＧＦＲ遺伝子のＣｈｒ７：５５２４２３９８−５５２４２５１３（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列は、ＡＣＡＣＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＡＡＣＴＣＡＣである配列番号３６の配列である。
【００２３】
上記ＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法の別の実施形態として、ＥＧＦＲ遺伝子のＣｈｒ７：５５２４８９７０−５５２４９０９６（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列は、ＧＡＡＧＣＣＡＣＡＣＴＧＡＣＧＴＧＣである配列番号３７の配列であり、ＥＧＦＲ遺伝子のＣｈｒ７：５５２４８９７０−５５２４９０９６（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列は、ＧＴＧＴＴＣＣＣＧＧＡＣＡＴＡＧＴＣＣＡＧである配列番号３８の配列である。
【００２４】
上記ＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法の別の実施形態として、ＥＧＦＲ遺伝子のＣｈｒ７：５５２５９５０５−５５２５９６２１（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列は、ＣＣＧＣＡＧＣＡＴＧＴＣＡＡＧＡＴＣＡＣＡである配列番号３９の配列であり、ＥＧＦＲ遺伝子のＣｈｒ７：５５２５９５０５−５５２５９６２１（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列は、ＴＡＡＡＣＡＡＴＡＣＡＧＣＴＡＧＴＧＧＧＡＡＧＧＣである配列番号４０の配列である。
【００２５】
上記ＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法の別の実施形態として、ＥＲＢＢ２遺伝子のＣｈｒ１７：３７８８０９６９−３７８８１０８２（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列は、ＣＡＴＡＣＣＣＴＣＴＣＡＧＣＧＴＡＣＣＣである配列番号４１の配列であり、ＥＲＢＢ２遺伝子のＣｈｒ１７：３７８８０９６９−３７８８１０８２（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列は、ＣＧＧＡＣＡＴＧＧＴＣＴＡＡＧＡＧＧＣＡＧである配列番号４２の配列である。
【００２６】
上記ＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法の別の実施形態として、ＫＲＡＳ遺伝子のＣｈｒ１２：２５３８０２６１−２５３８０３６３（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列は、ＴＧＣＡＣＴＧＴＡＡＴＡＡＴＣＣＡＧＡＣＴＧＴＧＴである配列番号４３の配列であり、ＫＲＡＳ遺伝子のＣｈｒ１２：２５３８０２６１−２５３８０３６３（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列は、ＡＧＴＣＣＴＣＡＴＧＴＡＣＴＧＧＴＣＣＣＴＣである配列番号４４の配列である。
【００２７】
上記ＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法の別の実施形態として、ＫＲＡＳ遺伝子のＣｈｒ１２：２５３９８１８３−２５３９８３１０（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列は、ＡＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡである配列番号４５の配列であり、ＫＲＡＳ遺伝子のＣｈｒ１２：２５３９８１８３−２５３９８３１０（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列は、ＡＡＡＧＡＡＴＧＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＴＡである配列番号４６の配列である。
【００２８】
上記ＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法の別の実施形態として、ＭＥＴ遺伝子のＣｈｒ７：１１６３４０２３３−１１６３４０３３５（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列は、ＴＣＧＡＴＣＴＧＣＣＡＴＧＴＧＴＧＣＡＴＴである配列番号４７の配列であり、ＭＥＴ遺伝子のＣｈｒ７：１１６３４０２３３−１１６３４０３３５（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列は、ＧＧＧＡＡＣＴＧＡＴＧＴＧＡＣＴＴＡＣＣＣＴである配列番号４８の配列である。
【００２９】
上記ＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法の別の実施形態として、ＭＥＴ遺伝子のＣｈｒ７：１１６４１１８８０−１１６４１２００５（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列は、ＣＣＡＴＧＡＴＡＧＣＣＧＴＣＴＴＴＡＡＣＡＡＧＣである配列番号４９の配列であり、ＭＥＴ遺伝子のＣｈｒ７：１１６４１１８８０−１１６４１２００５（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列は、ＡＧＣＴＣＧＧＴＡＧＴＣＴＡＣＡＧＡＴＴＣＡＴＴＴである配列番号５０の配列である。
【００３０】
上記ＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法の別の実施形態として、ＭＥＴ遺伝子のＣｈｒ７：１１６４１７４２６−１１６４１７５４６（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列は、ＡＴＧＴＴＡＣＧＣＡＧＴＧＣＴＡＡＣＣＡＡＧである配列番号５１の配列であり、ＭＥＴ遺伝子のＣｈｒ７：１１６４１７４２６−１１６４１７５４６（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列は、ＧＴＴＧＣＡＡＡＣＣＡＣＡＡＡＡＧＴＡＴＡＣＴＣＣＡである配列番号５２の配列である。
【００３１】
上記ＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法の別の実施形態として、ＭＥＴ遺伝子のＣｈｒ７：１１６４２３３９９−１１６４２３４９９（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列は、ＣＡＧＴＣＡＡＧＧＴＴＧＣＴＧＡＴＴＴＴＧＧＴＣである配列番号５３の配列であり、ＭＥＴ遺伝子のＣｈｒ７：１１６４２３３９９−１１６４２３４９９（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列は、ＣＡＣＡＴＣＴＧＡＣＴＴＧＧＴＧＧＴＡＡＡＣＴＴである配列番号５４の配列である。
【００３２】
上記ＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法の別の実施形態として、ＮＲＡＳ遺伝子のＣｈｒ１：１１５２５６５０７−１１５２５６５８６（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列は、ＣＡＣＣＣＣＣＡＧＧＡＴＴＣＴＴＡＣＡＧＡＡＡＡである配列番号５５の配列であり、ＮＲＡＳ遺伝子のＣｈｒ１：１１５２５６５０７−１１５２５６５８６（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列は、ＴＴＣＧＣＣＴＧＴＣＣＴＣＡＴＧＴＡＴＴＧＧである配列番号５６の配列である。
【００３３】
上記ＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法の別の実施形態として、ＮＲＡＳ遺伝子のＣｈｒ１：１１５２５８６５１−１１５２５８７５５（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列は、ＣＴＧＡＧＴＡＣＡＡＡＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴである配列番号５７の配列であり、ＮＲＡＳ遺伝子のＣｈｒ１：１１５２５８６５１−１１５２５８７５５（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列は、ＴＧＡＧＡＧＡＣＡＧＧＡＴＣＡＧＧＴＣＡＧＣである配列番号５８の配列である。
【００３４】
上記ＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法の別の実施形態として、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のＣｈｒ３：１７８９３６０５６−１７８９３６１７９（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列は、ＧＧＡＡＡＡＴＧＡＣＡＡＡＧＡＡＣＡＧＣＴＣＡＡＡＧである配列番号５９の配列であり、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のＣｈｒ３：１７８９３６０５６−１７８９３６１７９（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列は、ＡＡＣＡＴＧＣＴＧＡＧＡＴＣＡＧＣＣＡＡＡＴＴＣである配列番号６０の配列である。
【００３５】
上記ＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法の別の実施形態として、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のＣｈｒ３：１７８９５２０００−１７８９５２０９２（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列は、ＡＴＧＣＣＡＧＡＡＣＴＡＣＡＡＴＣＴＴＴＴＧＡＴＧＡＣである配列番号６１の配列であり、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のＣｈｒ３：１７８９５２０００−１７８９５２０９２（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列は、ＣＡＡＴＣＣＡＴＴＴＴＴＧＴＴＧＴＣＣＡＧＣＣである配列番号６２の配列である。
【００３６】
上記ＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法の別の実施形態として、ＴＰ５３遺伝子のＣｈｒ１７：７５７７０２７−７５７７１５４（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列は、ＣＴＣＴＴＴＴＣＣＴＡＴＣＣＴＧＡＧＴＡＧＴＧＧＴＡＡＴＣである配列番号６３の配列であり、ＴＰ５３遺伝子のＣｈｒ１７：７５７７０２７−７５７７１５４（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列は、ＣＴＴＣＴＴＧＴＣＣＴＧＣＴＴＧＣＴＴＡＣＣである配列番号６４の配列である。
【００３７】
上記ＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法の別の実施形態として、ＴＰ５３遺伝子のＣｈｒ１７：７５７７５０７−７５７７６１３（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列は、ＴＣＴＴＧＧＧＣＣＴＧＴＧＴＴＡＴＣＴＣＣＴＡＧである配列番号６５の配列であり、ＴＰ５３遺伝子のＣｈｒ１７：７５７７５０７−７５７７６１３（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列は、ＧＣＡＡＧＴＧＧＣＴＣＣＴＧＡＣＣＴＧである配列番号６６の配列である。
【００３８】
上記ＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法の別の実施形態として、ＴＰ５３遺伝子のＣｈｒ１７：７５７８１８２−７５７８２９８（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列は、ＣＣＴＣＴＧＡＴＴＣＣＴＣＡＣＴＧＡＴＴＧＣＴＣである配列番号６７の配列であり、ＴＰ５３遺伝子のＣｈｒ１７：７５７８１８２−７５７８２９８（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列は、ＣＣＣＣＡＧＴＴＧＣＡＡＡＣＣＡＧＡＣである配列番号６８の配列である。
【００３９】
上記ＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法の別の実施形態として、ＴＰ５３遺伝子のＣｈｒ１７：７５７８３８９−７５７８５３７（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列は、ＣＡＧＴＡＣＴＣＣＣＣＴＧＣＣＣＴＣＡＡである配列番号６９の配列であり、ＴＰ５３遺伝子のＣｈｒ１７：７５７８３８９−７５７８５３７（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列は、ＡＣＣＡＴＣＧＣＴＡＴＣＴＧＡＧＣＡＧＣである配列番号７０の配列である。
【００４０】
上記ＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法の別の実施形態として、前記目的アンプリコンは、以下の２２種類であって、
配列番号５の配列を有する、ＡＬＫ遺伝子のＣｈｒ２：２９４３２５８８−２９４３２７０７（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号６の配列を有する、ＡＬＫ遺伝子のＣｈｒ２：２９４４３６１６−２９４４３７３０（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号７の配列を有する、ＢＲＡＦ遺伝子のＣｈｒ７：１４０４５３０９１−１４０４５３１９７（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号８の配列を有する、ＥＧＦＲ遺伝子のＣｈｒ７：５５２４１６０４−５５２４１７２６（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号９の配列を有する、ＥＧＦＲ遺伝子のＣｈｒ７：５５２４２３９８−５５２４２５１３（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号１０の配列を有する、ＥＧＦＲ遺伝子のＣｈｒ７：５５２４８９７０−５５２４９０９６（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号１１の配列を有する、ＥＧＦＲ遺伝子のＣｈｒ７：５５２５９５０５−５５２５９６２１（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号１２の配列を有する、ＥＲＢＢ２遺伝子のＣｈｒ１７：３７８８０９６９−３７８８１０８２（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号１３の配列を有する、ＫＲＡＳ遺伝子のＣｈｒ１２：２５３８０２６１−２５３８０３６３（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号１４の配列を有する、ＫＲＡＳ遺伝子のＣｈｒ１２：２５３９８１８３−２５３９８３１０（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号１５の配列を有する、ＭＥＴ遺伝子のＣｈｒ７：１１６３４０２３３−１１６３４０３３５（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号１６の配列を有する、ＭＥＴ遺伝子のＣｈｒ７：１１６４１１８８０−１１６４１２００５（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号１７の配列を有する、ＭＥＴ遺伝子のＣｈｒ７：１１６４１７４２６−１１６４１７５４６（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号１８の配列を有する、ＭＥＴ遺伝子のＣｈｒ７：１１６４２３３９９−１１６４２３４９９（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号１９の配列を有する、ＮＲＡＳ遺伝子のＣｈｒ１：１１５２５６５０７−１１５２５６５８６（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号２０の配列を有する、ＮＲＡＳ遺伝子のＣｈｒ１：１１５２５８６５１−１１５２５８７５５（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号２１の配列を有する、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のＣｈｒ３：１７８９３６０５６−１７８９３６１７９（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号２２の配列を有する、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のＣｈｒ３：１７８９５２０００−１７８９５２０９２（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号２３の配列を有する、ＴＰ５３遺伝子のＣｈｒ１７：７５７７０２７−７５７７１５４（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号２４の配列を有する、ＴＰ５３遺伝子のＣｈｒ１７：７５７７５０７−７５７７６１３（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号２５の配列を有する、ＴＰ５３遺伝子のＣｈｒ１７：７５７８１８２−７５７８２９８（Ｈｇ１９）アンプリコン、及び、
配列番号２６の配列を有する、ＴＰ５３遺伝子のＣｈｒ１７：７５７８３８９−７５７８５３７（Ｈｇ１９）アンプリコンである。
【００４１】
上記ＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法の別の実施形態として、上記２２種類の目的アンプリコンに基づき設計されたフォワードフュージョンプライマーの組み合わせと、上記２２種類の目的アンプリコンに基づき設計されたリバースフュージョンプライマーの組み合わせと、フォワードユニバーサルプライマーと、リバースユニバーサルプライマーとのモル比は、０．１〜０．３：０．１〜０．３：０．５〜１：０．５〜１で、例えば０．１：０．１：０．５：０．５である。
【００４２】
上記ＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法の別の実施形態として、ＡＬＫ遺伝子のＣｈｒ２：２９４３２５８８−２９４３２７０７（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計されたフォワードフュージョンプライマーと、ＡＬＫ遺伝子のＣｈｒ２：２９４４３６１６−２９４４３７３０（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計されたフォワードフュージョンプライマーと、ＢＲＡＦ遺伝子のＣｈｒ７：１４０４５３０９１−１４０４５３１９７（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計されたフォワードフュージョンプライマーと、ＥＧＦＲ遺伝子のＣｈｒ７：５５２４１６０４−５５２４１７２６（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計されたフォワードフュージョンプライマーと、ＥＧＦＲ遺伝子のＣｈｒ７：５５２４２３９８−５５２４２５１３（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計されたフォワードフュージョンプライマーと、ＥＧＦＲ遺伝子のＣｈｒ７：５５２４８９７０−５５２４９０９６（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計されたフォワードフュージョンプライマーと、ＥＧＦＲ遺伝子のＣｈｒ７：５５２５９５０５−５５２５９６２１（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計されたフォワードフュージョンプライマーと、ＥＲＢＢ２遺伝子のＣｈｒ１７：３７８８０９６９−３７８８１０８２（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計されたフォワードフュージョンプライマーと、ＫＲＡＳ遺伝子のＣｈｒ１２：２５３８０２６１−２５３８０３６３（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計されたフォワードフュージョンプライマーと、ＫＲＡＳ遺伝子のＣｈｒ１２：２５３９８１８３−２５３９８３１０（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計されたフォワードフュージョンプライマーと、ＭＥＴ遺伝子のＣｈｒ７：１１６３４０２３３−１１６３４０３３５（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計されたフォワードフュージョンプライマーと、ＭＥＴ遺伝子のＣｈｒ７：１１６４１１８８０−１１６４１２００５（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計されたフォワードフュージョンプライマーと、ＭＥＴ遺伝子のＣｈｒ７：１１６４１７４２６−１１６４１７５４６（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計されたフォワードフュージョンプライマーと、ＭＥＴ遺伝子のＣｈｒ７：１１６４２３３９９−１１６４２３４９９（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計されたフォワードフュージョンプライマーと、ＮＲＡＳ遺伝子のＣｈｒ１：１１５２５６５０７−１１５２５６５８６（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計されたフォワードフュージョンプライマーと、ＮＲＡＳ遺伝子のＣｈｒ１：１１５２５８６５１−１１５２５８７５５（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計されたフォワードフュージョンプライマーと、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のＣｈｒ３：１７８９３６０５６−１７８９３６１７９（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計されたフォワードフュージョンプライマーと、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のＣｈｒ３：１７８９５２０００−１７８９５２０９２（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計されたフォワードフュージョンプライマーと、ＴＰ５３遺伝子のＣｈｒ１７：７５７７０２７−７５７７１５４（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計されたフォワードフュージョンプライマー、ＴＰ５３遺伝子のＣｈｒ１７：７５７７５０７−７５７７６１３（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計されたフォワードフュージョンプライマーと、ＴＰ５３遺伝子のＣｈｒ１７：７５７８１８２−７５７８２９８（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計されたフォワードフュージョンプライマーと、ＴＰ５３遺伝子のＣｈｒ１７：７５７８３８９−７５７８５３７（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計されたフォワードフュージョンプライマーとのモル比は、１：２：１：４：２：１：２：４：２：２：２：２：１：４：２：２：２：２：４：２：４：２である。
【００４３】
上記ＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法の別の実施形態として、ＰＣＲ反応系は下表に示される成分を含む。
【００４４】
【表１】
2020512405.tif 000003
【００４５】
上記ＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法の別の実施形態として、前記ＰＣＲプレミックス試薬は、ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ  ＰＣＲ  Ｋｉｔｓ  ２×である。
【００４６】
上記ＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法の別の実施形態として、下表に示される反応プログラムでＰＣＲを行う。
【００４７】
【表２】
2020512405.tif 000004
【００４８】
上記ＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法の別の実施形態として、ＰＣＲ反応終了後に、ＰＣＲ増幅産物に対して精製を行うステップを更に含む。
【発明の効果】
【００４９】
本発明は、従来技術と比べ、以下の有益な効果を有する。
【００５０】
本発明は、ＰＧＭシステムに基づき設計されるため、正確に複数の目的領域（アンプリコン）に対して同時に効果的な増幅を行うことができる。本発明を利用してライブラリの構築を行う過程において、ＰＣＲ反応ステップ及び産物精製ステップをそれぞれ１回行うだけで済むため、従来の試薬キット製品を使用する場合の実験操作（例えばＰＣＲ、精製及び制限酵素消化、リンカーライゲーション等ステップ）が大幅に簡素化されるだけでなく、ライブラリの構築に要する時間も、２．５時間に短縮される（同一サンプルのＤＮＡ及びＲＮＡに対するライブラリ構築を含む）。
【００５１】
サンプル及びライブラリの汚染は効果的に避けられる。操作プロセスの大幅な簡素化により、ライブラリの構築プロセスの安全性及び信頼性が向上し、操作ステップが減少するのに伴い、ライブラリの構築を行う間に発生しかねるライブラリ汚染は効果的に避けられる。
【００５２】
生命情報科学的分析プロセスが簡素化される。当該方法で得られるアンプリコンライブラリは構造が単一であり、データの信頼性が高く、得られるライブラリによるＤＮＡ鎖は簡単で明確な構成を有し、後続の生命情報科学的分析も簡素化される。
【００５３】
ライブラリの構築完了後、Ｑｕｂｉｔ２．０を用いて定量するだけでよい。ｑＰＣＲ定量のステップが省略されるため、ライブラリ構築に要する時間がさらに短縮され、また必要な操作ステップも減少されるので、実験プロセスの複雑さにより生じる実験誤差は避けられる。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】本発明の実施例１でアンプリコンライブラリの構築完了後に検出された増幅産物の分布図である。
【図２】本発明の実施例１で得られたライブラリの２２個のアンプリコンの関連パラメータである。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
以下、本発明の具体的な実施形態を、図１及び図２を参照して詳細に説明する。なお、本発明の保護範囲は下記実施形態に限定されない。
【実施例】
【００５６】
（実施例１）
被検サンプルとして、６つのＦＦＰＥサンプル（ＦＦＰＥはＦｏｒｍａｌｉｎ−Ｆｉｘｅｄ  ａｎｄ  Ｐａｒｒｆｆｉｎ−Ｅｍｂｅｄｄｅｄの略記で、ホルマリン固定・パラフィン包埋サンプルを意味する）を準備し、そのうち４つは非小細胞肺癌患者に由来するＦＦＰＥサンプルであり、残り２つは非腫瘍患者に由来するＦＦＰＥサンプルである。特異的に設計されたフュージョンプライマーを利用するワンステップの方法により、６つのＦＦＰＥサンプルに対してＤＮＡのアンプリコンライブラリを構築する。構築の手順は以下のとおりである。
【００５７】
１．ゲノムＤＮＡの抽出：
Ｑｉａｇｅｎ  ＦＦＰＥ  ＤＮＡ  Ｋｉｔ（遠心カラム型）試薬キットを使用してＦＦＰＥサンプルからゲノムＤＮＡを抽出する。具体的なステップは試薬キットの操作説明を参照する。得られるゲノムＤＮＡをＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に溶解して、Ｎａｎｏ  Ｄｒｏｐで抽出ＤＮＡの品質を検出し、Ｑｕｂｉｔ３．０でサンプルのＤＮＡ濃度を検出し、ゲノムＤＮＡサンプルをそれぞれ濃度２０ｎｇ／μｌに希釈する。
【００５８】
２．プライマーの設計及び合成：
５’から３’方向へと順に配置された第１のリンカー配列と目的アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列とを含む、目的アンプリコンに基づき設計されたフォワードフュージョンプライマーと、
５’から３’方向へと順に配置された第２のリンカー配列と目的アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列とを含む、目的アンプリコンに基づき設計されたリバースフュージョンプライマーと、
５’から３’方向へと順に配置された第３のリンカー配列と、バーコード配列と第１のリンカー配列とを含む、フォワードユニバーサルプライマーと、
５’から３’方向へと順に配置されたユニバーサル配列と第２のリンカー配列とを含む、リバースユニバーサルプライマーと、
を含むプライマー組み合わせとする。
【００５９】
ＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築するプライマー組み合わせにおいて、目的アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列及び特異性リバースプライマー配列の情報について、以下が参照される。
【００６０】
下表には、異なる目的アンプリコンの情報が示されるとともに、これらのアンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｓｔａｒｔ及び特異性リバースプライマー配列Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｎｄも示される。また、目的アンプリコンに基づき設計されたフォワードフュージョンプライマー、目的アンプリコンに基づき設計されたリバースフュージョンプライマー、フォワードユニバーサルプライマー及びリバースユニバーサルプライマーのそれぞれの配列も示される。Ｐｕｆは、好適なフォワードユニバーサルプライマー、Ｐｕｒは、リバースユニバーサルプライマーを表す。
【００６１】
【表３】
2020512405.tif 000005
2020512405.tif 000006
2020512405.tif 000007
【００６２】
【表４】
2020512405.tif 000008
2020512405.tif 000009
【００６３】
第１のリンカー配列はＧＧＣＡＴＡＣＧＴＣＣＴＣＧＴＣＴＡで、第２のリンカー配列はＴＣＴＡＴＧＧＧＣＡＧＴＣＧＧＴＧＡＴで、第３のリンカー配列はＣＣＡＴＣＴＣＡＴＣＣＣＴＧＣＧＴＧＴＣＴＣＣＧＡＣＴＣＡＧで、ユニバーサル配列はＣＣＡＣＴＡＣＧＣＣＴＣＣＧＣＴＴＴＣＣＴＣである。
【００６４】
３．下表に示される成分で、ＰＣＲ反応系を調製する。
【表５】
2020512405.tif 000010
【００６５】
同一のＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築するためのプライマー組み合わせは以下の方法で調製される。（１）ステップ２で合成されたフォワードユニバーサルプライマー、リバースユニバーサルプライマー、２２種類の目的アンプリコンに基づき設計されたフォワードフュージョンプライマー及びリバースフュージョンプライマーのそれぞれに水を加え濃度１００μＭにて溶解する。（２）濃度がいずれも１００μＭである２２のフォワードフュージョンプライマーを番号の小さい順で、モル比１：２：１：４：２：１：２：４：２：２：２：２：１：４：２：２：２：２：４：２：４：２で混合することによりフォワードフュージョンプライマー組み合わせを得て、濃度がいずれも１００μＭである２２のリバースフュージョンプライマーをそれぞれに対応するフォワードフュージョンプライマーと等体積の量で混合することによりリバースフュージョンプライマー組み合わせを得て、フォワードフュージョンプライマー組み合わせ及びリバースフュージョンプライマー組み合わせを等体積で混合する。（３）濃度がいずれも１００μＭであるフォワードユニバーサルプライマー及びリバースユニバーサルプライマーを等体積で混合する。（４）フォワードフュージョンプライマー組み合わせ、リバースフュージョンプライマー組み合わせ、フォワードユニバーサルプライマー及びリバースユニバーサルプライマーをモル比：０．１：０．１：０．５：０．５で混合することで、ＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築するためのプライマー組み合わせを得る。６つの異なる被検サンプルは、異なるバーコード配列タブを有する６つのプライマー組み合わせにそれぞれ対応する必要がある。
【００６６】
４．ＰＣＲプログラムを行い、ＰＣＲ装置としてアプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ｂｉｏ−ｓｙｓｔｅｍ）社の２７２０  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒを使用する。ＰＣＲ反応プログラムは以下のとおりに設定される。
【表６】
2020512405.tif 000011
【００６７】
５．ＰＣＲ反応終了後に、ベックマン・コールター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）社のＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ  Ｋｉｔ（商品番号Ａ６３８８０／Ａ６３８８１／Ａ６３８８２）を使用して精製を行う。操作ステップは以下のとおりである。
【００６８】
１）精製開始から３０分前に、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ  Ｋｉｔに磁気ビーズを入れ、十分にボルテックス攪拌して、室温でＥＰ管を静置する。
【００６９】
２）ＰＣＲ反応終了後に、再度磁気ビーズを十分にボルテックス攪拌して、磁気ビーズ２０ｕｌを加え、５回以上ピペティングするまたは十分にボルテックス攪拌して、室温で５分間静置する。
【００７０】
３）ＥＰ管を磁気スタンドに移し、５分間静置して溶液が清澄になると、磁気ビーズに触れないようにピペットで少しずつ上清液を除去する。
【００７１】
４）１管当たり新たに調製された８０％エタノール溶液１００ｕｌを加え、ＥＰ管を磁気スタンドに置いて２周低速回旋させ、５分間静置して上清液を捨てる。
【００７２】
５）ステップ４を１回繰り返す。
【００７３】
６）ＥＰ管を開き、室温で静置して液体を完全に揮発させると、磁気ビーズの表面に光沢がない程度で、適宜磁気ビーズを干燥させる。
【００７４】
７）磁気スタンドからＥＰ管を取り、ＰＣＲ用精製水３０ｕｌを加え、ボルテックス攪拌して均一に混合させ、室温で１０分間静置する。
【００７５】
８）ステップ７）の処理を経たＥＰ管を磁気スタンドに２分間置く、又は溶液が清澄になると、ピペットを用いて磁石から離れた表面から、磁気ビーズに触れないように上清液を吸い取る。
【００７６】
これでアンプリコンライブラリの構築が完了する。図１は、ライブラリの構築完了後にＡｇｉｌｅｎｔ  ２２００  ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓで検出された増幅産物の分布図である。図中、横軸は断片長さ、縦軸は信号強度（ＦＵ）を表す。ｌｏｗｅｒピークは２５ｂｐ位置のマーカー、ｕｐｐｅｒピークは１５００ｂｐ位置のマーカーである。図１から分かるように、ＰＣＲ増幅後に得られたＰＣＲ産物は、２４１〜２７１ｂｐの範囲に集中し、実験結果が実験設計に合致する。図１より、構築されたライブラリのサイズ及びライブラリの濃度を判断することができる。
【００７７】
６．シーケンシング及び結果分析
上記のようにフュージョンプライマーを用いるワンステップの方法で得たアンプリコンライブラリに対して、Ｉｏｎ  ＰＧＭシステムの３１８チップを使用してアンプリコンのシーケンシングを行い、それぞれのライブラリのデータ量は５０Ｍｂｐｓとする。それぞれのサンプルの平均シーケンシング深度は１６００×以上とし、１つのアンプリコン当たりシーケンシング深度はいずれも６００×に達する。得られたシーケンシング結果を図２に示す。図２より、２２のアンプリコンのそれぞれが増幅されているか、それぞれのアンプリコンの増幅の均一性について分析することもできる。
【００７８】
シーケンシング結果に対してデータ処理、生命情報科学的分析を行うことにより、被検遺伝子の突然変異情報を得る。データ処理のプロセスはシーケンシングデータの変換、品質管理、配列照合（参照ゲノムはＮＣＢＩ  ＧＲＣｈ３７／Ｈｇ１９）、変異部位分析等プロセスを含む。データ処理及び関連分析を経て検出サンプルの突然変異情報を得る。
【００７９】
被検サンプルの検出結果は以下のとおりである。被検者によるＦＦＰＥサンプル６例のうち、健常者によるサンプル２例には腫瘍関連突然変異が検出されず、腫瘍患者によるＦＦＰＥサンプル４例の検出結果では、サンプル１にｐ．Ｒ２４８Ｗ突然変異、サンプル２にｐ．Ｔ７９０Ｍ突然変異、サンプル３にｐ．Ｇ１２Ａ突然変異、サンプル４にｐ．Ｅ５４５Ｋ突然変異がそれぞれ検出されている。当該結果はサンガー法による検出結果と一致することから、本発明の適用可能性及び優れた特異性が充分に示唆される。
【００８０】
本発明の代表的な実施形態に関する上記説明は、例示的なものに過ぎない。本発明は、当該説明の内容に限定されるものではない。当然ながら、上記説明をベースに様々な変更及び変形を行うこともできる。代表的な実施例を用いて説明するのは、本発明の特定の原理及びその実際応用を解釈することにより、当業者が本発明の様々な代表的な実施形態を実現しこれを利用する上、様々な選択及び変更を行えるようにすることが目的である。本発明の保護範囲は、特許請求の範囲及びその同等形式の内容により限定されるものとする。
【図１】
2020512405.tif 000013
【図２】
2020512405.tif 000014
【配列表】
2020512405000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年9月27日(2019.9.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法であって、
５’から３’方向へと順に配置された第１のリンカー配列（ブリッジ配列）と目的アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列とを含む、目的アンプリコンに基づき設計されたフォワードフュージョンプライマーと、
５’から３’方向へと順に配置された第２のリンカー配列（ｔｒＰ１配列）と目的アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列とを含む、目的アンプリコンに基づき設計されたリバースフュージョンプライマーと、
５’から３’方向へと順に配置された第３のリンカー配列（Ａ配列）と、バーコード配列と第１のリンカー配列とを含む、フォワードユニバーサルプライマーと、
５’から３’方向へと順に配置されたユニバーサル配列（Ｕｎｉ配列）と第２のリンカー配列とを含む、リバースユニバーサルプライマーとを含むように、ＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築するためのプライマー組み合わせを合成するステップ１）と、
目的アンプリコンに基づき設計されたフォワードフュージョンプライマー、目的アンプリコンに基づき設計されたリバースフュージョンプライマー、フォワードユニバーサルプライマー及びリバースユニバーサルプライマーを混合してＰＣＲ反応系中のプライマー組み合わせとするように、ＤＮＡサンプルのＰＣＲ反応系を構築するステップ２）と、
ＰＣＲを行うステップ３）と、を含むことを特徴とする、ＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法。
【請求項２】
前記第１のリンカー配列は、配列番号１の配列を含み、前記第２のリンカー配列は、配列番号２の配列を含み、前記第３のリンカー配列は、配列番号３の配列を含み、前記ユニバーサル配列は、配列番号４の配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載のＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法。
【請求項３】
同一のＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築するためのプライマー組み合わせで、フォワードユニバーサルプライマーにおけるバーコード配列は同一であり、異なるＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築するためのプライマー組み合わせで、フォワードユニバーサルプライマーにおけるバーコード配列は異なることを特徴とする、請求項１に記載のＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法。
【請求項４】
同一のＰＣＲ反応中の目的アンプリコンの数量が１より大きい場合、前記目的アンプリコンに基づき設計されたフォワードフュージョンプライマーは各種類の目的アンプリコンに基づき設計されたフォワードフュージョンプライマーの組み合わせであり、前記目的アンプリコンに基づき設計されたリバースフュージョンプライマーは各種類の目的アンプリコンに基づき設計されたリバースフュージョンプライマーの組み合わせであることを特徴とする、請求項１にＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法。
【請求項５】
前記ＤＮＡサンプルはゲノムＤＮＡであり、前記ゲノムＤＮＡは組織サンプルまたはホルマリン固定・パラフィン包埋サンプルから抽出されることを特徴とする、請求項１に記載のＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法。
【請求項６】
前記目的アンプリコンは、次の２２種類の目的アンプリコン：
配列番号５の配列を有する、ＡＬＫ遺伝子のＣｈｒ２：２９４３２５８８−２９４３２７０７（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号６の配列を有する、ＡＬＫ遺伝子のＣｈｒ２：２９４４３６１６−２９４４３７３０（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号７の配列を有する、ＢＲＡＦ遺伝子のＣｈｒ７：１４０４５３０９１−１４０４５３１９７（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号８の配列を有する、ＥＧＦＲ遺伝子のＣｈｒ７：５５２４１６０４−５５２４１７２６（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号９の配列を有する、ＥＧＦＲ遺伝子のＣｈｒ７：５５２４２３９８−５５２４２５１３（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号１０の配列を有する、ＥＧＦＲ遺伝子のＣｈｒ７：５５２４８９７０−５５２４９０９６（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号１１の配列を有する、ＥＧＦＲ遺伝子のＣｈｒ７：５５２５９５０５−５５２５９６２１（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号１２の配列を有する、ＥＲＢＢ２遺伝子のＣｈｒ１７：３７８８０９６９−３７８８１０８２（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号１３の配列を有する、ＫＲＡＳ遺伝子のＣｈｒ１２：２５３８０２６１−２５３８０３６３（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号１４の配列を有する、ＫＲＡＳ遺伝子のＣｈｒ１２：２５３９８１８３−２５３９８３１０（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号１５の配列を有する、ＭＥＴ遺伝子のＣｈｒ７：１１６３４０２３３−１１６３４０３３５（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号１６の配列を有する、ＭＥＴ遺伝子のＣｈｒ７：１１６４１１８８０−１１６４１２００５（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号１７の配列を有する、ＭＥＴ遺伝子のＣｈｒ７：１１６４１７４２６−１１６４１７５４６（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号１８の配列を有する、ＭＥＴ遺伝子のＣｈｒ７：１１６４２３３９９−１１６４２３４９９（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号１９の配列を有する、ＮＲＡＳ遺伝子のＣｈｒ１：１１５２５６５０７−１１５２５６５８６（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号２０の配列を有する、ＮＲＡＳ遺伝子のＣｈｒ１：１１５２５８６５１−１１５２５８７５５（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号２１の配列を有する、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のＣｈｒ３：１７８９３６０５６−１７８９３６１７９（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号２２の配列を有する、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のＣｈｒ３：１７８９５２０００−１７８９５２０９２（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号２３の配列を有する、ＴＰ５３遺伝子のＣｈｒ１７：７５７７０２７−７５７７１５４（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号２４の配列を有する、ＴＰ５３遺伝子のＣｈｒ１７：７５７７５０７−７５７７６１３（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号２５の配列を有する、ＴＰ５３遺伝子のＣｈｒ１７：７５７８１８２−７５７８２９８（Ｈｇ１９）アンプリコン、及び
配列番号２６の配列を有する、ＴＰ５３遺伝子のＣｈｒ１７：７５７８３８９−７５７８５３７（Ｈｇ１９）アンプリコン、
から選ばれる少なくとも１つを含むことを特徴とする、請求項１に記載のＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法。
【請求項７】
ＡＬＫ遺伝子のＣｈｒ２：２９４３２５８８−２９４３２７０７（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列は、配列番号２７の配列であり、ＡＬＫ遺伝子のＣｈｒ２：２９４３２５８８−２９４３２７０７（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列は、配列番号２８の配列であり、
ＡＬＫ遺伝子のＣｈｒ２：２９４４３６１６−２９４４３７３０（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列は、配列番号２９の配列であり、ＡＬＫ遺伝子のＣｈｒ２：２９４４３６１６−２９４４３７３０（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列は、配列番号３０の配列であり、
ＢＲＡＦ遺伝子のＣｈｒ７：１４０４５３０９１−１４０４５３１９７（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列は、配列番号３１の配列であり、ＢＲＡＦ遺伝子のＣｈｒ７：１４０４５３０９１−１４０４５３１９７（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列は、配列番号３２の配列であり、
ＥＧＦＲ遺伝子のＣｈｒ７：５５２４１６０４−５５２４１７２６（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列は、配列番号３３の配列であり、ＥＧＦＲ遺伝子のＣｈｒ７：５５２４１６０４−５５２４１７２６（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列は、
配列番号３４の配列である、
ことを特徴とする、請求項６に記載のＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法。
【請求項８】
ＥＧＦＲ遺伝子のＣｈｒ７：５５２４２３９８−５５２４２５１３（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列は、配列番号３５の配列であり、ＥＧＦＲ遺伝子のＣｈｒ７：５５２４２３９８−５５２４２５１３（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列は、配列番号３６の配列であり、
ＥＧＦＲ遺伝子のＣｈｒ７：５５２４８９７０−５５２４９０９６（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列は、配列番号３７の配列であり、ＥＧＦＲ遺伝子のＣｈｒ７：５５２４８９７０−５５２４９０９６（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列は、配列番号３８の配列であり、
ＥＧＦＲ遺伝子のＣｈｒ７：５５２５９５０５−５５２５９６２１（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列は、配列番号３９の配列であり、ＥＧＦＲ遺伝子のＣｈｒ７：５５２５９５０５−５５２５９６２１（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列は、配列番号４０の配列である、
ことを特徴とする、請求項６に記載のＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法。
【請求項９】
ＥＲＢＢ２遺伝子のＣｈｒ１７：３７８８０９６９−３７８８１０８２（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列は、配列番号４１の配列であり、ＥＲＢＢ２遺伝子のＣｈｒ１７：３７８８０９６９−３７８８１０８２（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列は、配列番号４２の配列であり、
ＫＲＡＳ遺伝子のＣｈｒ１２：２５３８０２６１−２５３８０３６３（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列は、配列番号４３の配列であり、ＫＲＡＳ遺伝子のＣｈｒ１２：２５３８０２６１−２５３８０３６３（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列は、配列番号４４の配列であり、
ＫＲＡＳ遺伝子のＣｈｒ１２：２５３９８１８３−２５３９８３１０（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列は、配列番号４５の配列であり、ＫＲＡＳ遺伝子のＣｈｒ１２：２５３９８１８３−２５３９８３１０（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列は、配列番号４６の配列であり、
ＭＥＴ遺伝子のＣｈｒ７：１１６３４０２３３−１１６３４０３３５（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列は、配列番号４７の配列であり、ＭＥＴ遺伝子のＣｈｒ７：１１６３４０２３３−１１６３４０３３５（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列は、配列番号４８の配列である、
ことを特徴とする、請求項６に記載のＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法。
【請求項１０】
ＭＥＴ遺伝子のＣｈｒ７：１１６４１１８８０−１１６４１２００５（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列は、配列番号４９の配列であり、ＭＥＴ遺伝子のＣｈｒ７：１１６４１１８８０−１１６４１２００５（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列は、配列番号５０の配列であり、
ＭＥＴ遺伝子のＣｈｒ７：１１６４１７４２６−１１６４１７５４６（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列は、配列番号５１の配列であり、ＭＥＴ遺伝子のＣｈｒ７：１１６４１７４２６−１１６４１７５４６（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列は、配列番号５２の配列であり、
ＭＥＴ遺伝子のＣｈｒ７：１１６４２３３９９−１１６４２３４９９（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列は、配列番号５３の配列であり、ＭＥＴ遺伝子のＣｈｒ７：１１６４２３３９９−１１６４２３４９９（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列は、配列番号５４の配列であり、
ＮＲＡＳ遺伝子のＣｈｒ１：１１５２５６５０７−１１５２５６５８６（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列は、配列番号５５の配列であり、ＮＲＡＳ遺伝子のＣｈｒ１：１１５２５６５０７−１１５２５６５８６（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列は、配列番号５６の配列である、
ことを特徴とする、請求項６に記載のＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法。
【請求項１１】
ＮＲＡＳ遺伝子のＣｈｒ１：１１５２５８６５１−１１５２５８７５５（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列は、配列番号５７の配列であり、ＮＲＡＳ遺伝子のＣｈｒ１：１１５２５８６５１−１１５２５８７５５（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列は、配列番号５８の配列であり、
ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のＣｈｒ３：１７８９３６０５６−１７８９３６１７９（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列は、配列番号５９の配列であり、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のＣｈｒ３：１７８９３６０５６−１７８９３６１７９（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列は、配列番号６０の配列であり、
ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のＣｈｒ３：１７８９５２０００−１７８９５２０９２（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列は、配列番号６１の配列であり、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のＣｈｒ３：１７８９５２０００−１７８９５２０９２（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列は、配列番号６２の配列であり、
ＴＰ５３遺伝子のＣｈｒ１７：７５７７０２７−７５７７１５４（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列は、配列番号６３の配列であり、ＴＰ５３遺伝子のＣｈｒ１７：７５７７０２７−７５７７１５４（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列は、配列番号６４の配列である、
ことを特徴とする、請求項６に記載のＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法。
【請求項１２】
ＴＰ５３遺伝子のＣｈｒ１７：７５７７５０７−７５７７６１３（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列は、配列番号６５の配列であり、ＴＰ５３遺伝子のＣｈｒ１７：７５７７５０７−７５７７６１３（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列は、配列番号６６の配列であり、
ＴＰ５３遺伝子のＣｈｒ１７：７５７８１８２−７５７８２９８（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列は、配列番号６７の配列であり、ＴＰ５３遺伝子のＣｈｒ１７：７５７８１８２−７５７８２９８（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列は、配列番号６８の配列であり、
ＴＰ５３遺伝子のＣｈｒ１７：７５７８３８９−７５７８５３７（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性フォワードプライマー配列は、配列番号６９の配列であり、ＴＰ５３遺伝子のＣｈｒ１７：７５７８３８９−７５７８５３７（Ｈｇ１９）アンプリコンに基づき設計された特異性リバースプライマー配列は、配列番号７０のＳＥＱ  ＩＤ：７０配列である、
ことを特徴とする、請求項６に記載のＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法。
【請求項１３】
前記目的アンプリコンは、以下の２２種類：
配列番号５の配列を有する、ＡＬＫ遺伝子のＣｈｒ２：２９４３２５８８−２９４３２７０７（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号６の配列を有する、ＡＬＫ遺伝子のＣｈｒ２：２９４４３６１６−２９４４３７３０（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号７の配列を有する、ＢＲＡＦ遺伝子のＣｈｒ７：１４０４５３０９１−１４０４５３１９７（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号８の配列を有する、ＥＧＦＲ遺伝子のＣｈｒ７：５５２４１６０４−５５２４１７２６（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号９の配列を有する、ＥＧＦＲ遺伝子のＣｈｒ７：５５２４２３９８−５５２４２５１３（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号１０の配列を有する、ＥＧＦＲ遺伝子のＣｈｒ７：５５２４８９７０−５５２４９０９６（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号１１の配列を有する、ＥＧＦＲ遺伝子のＣｈｒ７：５５２５９５０５−５５２５９６２１（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号１２の配列を有する、ＥＲＢＢ２遺伝子のＣｈｒ１７：３７８８０９６９−３７８８１０８２（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号１３の配列を有する、ＫＲＡＳ遺伝子のＣｈｒ１２：２５３８０２６１−２５３８０３６３（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号１４の配列を有する、ＫＲＡＳ遺伝子のＣｈｒ１２：２５３９８１８３−２５３９８３１０（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号１５の配列を有する、ＭＥＴ遺伝子のＣｈｒ７：１１６３４０２３３−１１６３４０３３５（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号１６の配列を有する、ＭＥＴ遺伝子のＣｈｒ７：１１６４１１８８０−１１６４１２００５（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号１７の配列を有する、ＭＥＴ遺伝子のＣｈｒ７：１１６４１７４２６−１１６４１７５４６（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号１８の配列を有する、ＭＥＴ遺伝子のＣｈｒ７：１１６４２３３９９−１１６４２３４９９（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号１９の配列を有する、ＮＲＡＳ遺伝子のＣｈｒ１：１１５２５６５０７−１１５２５６５８６（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号２０の配列を有する、ＮＲＡＳ遺伝子のＣｈｒ１：１１５２５８６５１−１１５２５８７５５（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号２１の配列を有する、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のＣｈｒ３：１７８９３６０５６−１７８９３６１７９（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号２２の配列を有する、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のＣｈｒ３：１７８９５２０００−１７８９５２０９２（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号２３の配列を有する、ＴＰ５３遺伝子のＣｈｒ１７：７５７７０２７−７５７７１５４（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号２４の配列を有する、ＴＰ５３遺伝子のＣｈｒ１７：７５７７５０７−７５７７６１３（Ｈｇ１９）アンプリコン、
配列番号２５の配列を有する、ＴＰ５３遺伝子のＣｈｒ１７：７５７８１８２−７５７８２９８（Ｈｇ１９）アンプリコン、及び
配列番号２６の配列を有する、ＴＰ５３遺伝子のＣｈｒ１７：７５７８３８９−７５７８５３７（Ｈｇ１９）アンプリコン、
であることを特徴とする、請求項１に記載のＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の２２種類の目的アンプリコンに基づき設計されたフォワードフュージョンプライマーの組み合わせと、前記２２種類の目的アンプリコンに基づき設計されたリバースフュージョンプライマーの組み合わせと、フォワードユニバーサルプライマーと、リバースユニバーサルプライマーとのモル比が、０．１〜０．３：０．１〜０．３：０．５〜１：０．５〜１であることを特徴とする、請求項１３に記載のＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法。
【請求項１５】
ＰＣＲ反応系は以下の成分を含むことを特徴とする、請求項１４に記載のＤＮＡサンプルのアンプリコンライブラリを構築する方法。
【表１】
2020512405.tif 000015
【国際調査報告】
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2020512405.tif 000017
2020512405.tif 000018
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