(57)【要約】  本発明は、ＩＣＢ、特に抗ＰＤ１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体または抗ＰＤ−Ｌ２抗体を用いた治療に対する反応性または抵抗性に関係する腸内微生物叢プロファイルに関する。本発明は特に、抗ＰＤ１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体または抗ＰＤ−Ｌ２抗体の投与が可能な高奏効者を同定するセラノスティクス法に関するものであり、ディスバイオシスを示す低奏効者には、ＦＭＴおよび／または免疫原性プロバイオティクスに基づく予備治療が推奨される。本発明は特に、奏効者をがん進行者から識別する主要な常在種としてのアッカーマンシア・ムシニフィラと、抗生剤または腸レパートリーの不十分さに関連するディスバイオシスを治療するための、アッカーマンシア・ムシニフィラ単独での使用、またはエンテロコッカス・ヒラエと組み合わせた使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
がんの治療に使用するため、エンテロコッカス・ヒラエ、アッカーマンシア・ムシニフィラ、アリスティペス・シャヒイ、アリスティペス属の他の種と、これらの混合物からなる群より選択される細菌を、抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤と組み合わせて含む組成物であって、がん患者で免疫刺激を誘導する、上記組成物。
【請求項２】
エンテロコッカス・ヒラエ、アッカーマンシア・ムシニフィラ、アリスティペス属の種、ユウバクテリウム属の種、ルミノコッカス科、クロストリジウム目の種、バクテロイデス目の種、放線菌、コリオバクテリウム目の種、メタノブレビバクター・スミティイからなる群より選択される少なくとも２系統の種の細菌を含む、請求項１に記載の使用のための請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
エンテロコッカス・ヒラエとアッカーマンシア・ムシニフィラという種の細菌を含む、請求項１に記載の使用のための請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
バークホリデリア・セパシアおよび／またはバクテロイデス・フラギリスおよび／またはアクチノチグナム・シャアリイおよび／またはアリスティペス・インディスティンクタスおよび／またはアリスティペス・オンデルドンキイという種の細菌をさらに含む、請求項１に記載の使用のための請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
−  クロストリジウム目のクリステンセネラ・ミヌタという種の細菌；および／または
−  エリュシペロトリクス綱のディエルマ・ファスティディオサまたはエリュシペラトクロストリジウム・ラモサムという種；および／または
−  アリスティペス属のアリスティペス・シャヒイ、アリスティペス・インディスティンクタス、アリスティペス・オンデルドンキイ、およびアリスティペス・フィネゴルディイからなる群より選択される種の細菌；および／または
−  ユウバクテリウム属のユウバクテリウム・リモサムという種の細菌；および／または
−  バクテロイデス目のバクテロイデス・セイリヤーシアエおよび／またはバルネシエラ・インテスティニホミニスという種の細菌；および／または
−  放線菌門のアクチノチグナム・シャアリイという種；および／または
−  コリオバクテリウム目のコリンセラ・インテスティナリスおよび／またはコリンセラ・タナカエイという種の細菌；および／または
−  フィルミクテス門のフラボニフラクター・プラウティイという種の細菌を含む、請求項１に記載の使用のための請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
（ｉ）国立微生物菌株保存機関（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ：ＣＮＣＭ）に２０１３年１１月７日に番号Ｉ−４８１５で寄託されたエンテロコッカス・ヒラエ株１３１４４、ＣＮＣＭに２０１７年８月３１日に番号Ｉ−５２２４で寄託されたエンテロコッカス・ヒラエ株ＩＧＲ７、ＣＮＣＭに２０１７年１１月２７日に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５２６０で寄託されたエンテロコッカス・ヒラエ株ＩＧＲ４、ＣＮＣＭに２０１７年１１月２７日に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５２６１で寄託されたエンテロコッカス・ヒラエ株ＩＧＲ１１と、これらの混合物からなる群より選択されるエンテロコッカス・ヒラエ；と
（ｉｉ）アッカーマンシア・ムシニフィラ株ｐ２２６１、およびアッカーマンシア・ムシニフィラ株ｐ３４１５（両方ともリケッチアユニットの菌株保存機関（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｄｅ  ｓｏｕｃｈｅｓ  ｄｅ  ｌ’Ｕｎｉｔｅ  ｄｅｓ  Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｅｓ：ＣＳＵＲ）に寄託された）と、これらの混合物からなる群より選択されるアッカーマンシア・ムシニフィラ；と
（ｉｉｉ）ユウバクテリウム・リモサムを含む、請求項１に記載の使用のための請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
（ｉ）国立微生物菌株保存機関（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ：ＣＮＣＭ）に２０１３年１１月７日に番号Ｉ−４８１５で寄託されたエンテロコッカス・ヒラエ株１３１４４、ＣＮＣＭに２０１７年８月３１日に番号Ｉ−５２２４で寄託されたエンテロコッカス・ヒラエ株ＩＧＲ７、ＣＮＣＭに２０１７年１１月２７日に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５２６０で寄託されたエンテロコッカス・ヒラエ株ＩＧＲ４、ＣＮＣＭに２０１７年１１月２７日に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５２６１で寄託されたエンテロコッカス・ヒラエ株ＩＧＲ１１と、これらの混合物からなる群より選択されるエンテロコッカス・ヒラエ；と
（ｉｉ）バルネシエラ・インテスティニホミニスを含む、請求項１に記載の使用のための請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
（ｉ）国立微生物菌株保存機関（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ：ＣＮＣＭ）に２０１３年１１月７日に番号Ｉ−４８１５で寄託されたエンテロコッカス・ヒラエ株１３１４４、ＣＮＣＭに２０１７年８月３１日に番号Ｉ−５２２４で寄託されたエンテロコッカス・ヒラエ株ＩＧＲ７、ＣＮＣＭに２０１７年１１月２７日に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５２６０で寄託されたエンテロコッカス・ヒラエ株ＩＧＲ４、ＣＮＣＭに２０１７年１１月２７日に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５２６１で寄託されたエンテロコッカス・ヒラエ株ＩＧＲ１１と、これらの混合物からなる群より選択されるエンテロコッカス・ヒラエ；と
（ｉｉ）クリステンセネラ・ミヌタを含む、請求項１に記載の使用のための請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
（ｉ）国立微生物菌株保存機関（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ：ＣＮＣＭ）に２０１３年１１月７日に番号Ｉ−４８１５で寄託されたエンテロコッカス・ヒラエ株１３１４４、ＣＮＣＭに２０１７年８月３１日に番号Ｉ−５２２４で寄託されたエンテロコッカス・ヒラエ株ＩＧＲ７、ＣＮＣＭに２０１７年１１月２７日に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５２６０で寄託されたエンテロコッカス・ヒラエ株ＩＧＲ４、ＣＮＣＭに２０１７年１１月２７日に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５２６１で寄託されたエンテロコッカス・ヒラエ株ＩＧＲ１１と、これらの混合物からなる群より選択されるエンテロコッカス・ヒラエ；と
（ｉｉ）アクチノチグナム・シャアリイを含む、請求項１に記載の使用のための請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
がん患者でディスバイオシスを補償する薬剤として使用するための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
細菌組成物が個人において免疫刺激を誘導する、請求項１または１０に記載の使用のための請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記個人を抗ＰＤ１と抗ＣＴＬＡ４の同時阻止、または抗ＰＤ−Ｌ２と抗ＣＴＬＡ４の同時阻止により治療する、請求項１、１０、１１のいずれか１項に記載の使用のための請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
がんの再発を予防する免疫刺激剤として使用するための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤および／または抗ＣＴＬＡ４抗体をベースとした治療剤の腸毒性を低下させるか予防する薬剤として使用するための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤と組み合わされる、がんの治療に用いるための糞便微生物組成物。
【請求項１６】
フィルミクテス門の種、クロストリジウム目の種、アリスティペス属の種、ユウバクテリウム属の種、バクテロイデス目の種、メタノブレビバクター・スミティイ、アッカーマンシア・ムシニフィラ、およびエンテロコッカス・ヒラエからなる群より選択される少なくとも１０系統の菌種を含む、請求項１５に記載の使用のための請求項１５に記載の糞便微生物組成物。
【請求項１７】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物が豊富にされている、請求項１５に記載の使用のための請求項１５または１６に記載の糞便微生物組成物。
【請求項１８】
がん患者が、抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤の投与前に細菌の補償を必要とするかどうかを判断するセラノスティクス法であって、その患者に由来する糞便サンプルの中で、アッカーマンシア・ムシニフィラ、エンテロコッカス・ヒラエ、およびディエルマ・ファスティディオサからなる群より選択される１つまたはいくつかの種の細菌の存在を評価することを含み、アッカーマンシア・ムシニフィラ、エンテロコッカス・ヒラエ、ディエルマ・ファスティディオサのいずれか１つがその糞便サンプルの中に不在である場合には、前記患者が、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物、または請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の糞便微生物組成物を用いた細菌の補償を必要とする、セラノスティクス法。
【請求項１９】
がん患者が、抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤の投与前に細菌の補償を必要とするかどうかを判断するセラノスティクス法であって、その患者に由来する糞便サンプルの中で、ルミノコッカス属の種ＣＡＧ：３５３、ルミノコッカス属の細菌  ＬＭ１５８、ルミノコッカス・トルケス２、およびルミノコッカス科細菌Ｄ１６の存在を評価することを含み、ルミノコッカス属の種ＣＡＧ：３５３、ルミノコッカス属の細菌  ＬＭ１５８、ルミノコッカス・トルケス２、およびルミノコッカス科細菌Ｄ１６のどれもその糞便サンプルの中に存在しない場合には、前記患者が、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物、または請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の糞便微生物組成物を用いた細菌の補償を必要とする、セラノスティクス法。
【請求項２０】
がん患者が、抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤の投与前に細菌の補償を必要とするかどうかを判断するセラノスティクス法であって、その患者に由来する糞便サンプルの中で、アリスティペス属の種ＣＡＧ：４３５、アリスティペス属の種ＣＡＧ：５１４、アリスティペス・インディスティンクタスＣＡＧ３２８、およびアリスティペス属の種ＣＡＧ／２６８の存在を評価することを含み、アリスティペス属の種ＣＡＧ：４３５、アリスティペス属の種ＣＡＧ：５１４、アリスティペス・インディスティンクタスＣＡＧ３２８、およびアリスティペス属の種ＣＡＧ／２６８のどれもその糞便サンプルの中に存在しない場合には、前記患者が、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物、または請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の糞便微生物組成物を用いた細菌の補償を必要とする、セラノスティクス法。
【請求項２１】
がん患者が、抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤の投与前に細菌の補償を必要とするかどうかを判断するセラノスティクス法であって、その患者に由来する糞便サンプルの中で、バクテロイデス・キシラニソルベンスＣＡＧ９４５、バクテロイデス・ユニフォルミスＣＡＧ１５９、バクテロイデス・オバタスＣＡＧ１１６５、プレボテラＣＡＧ：２５５、ＣＡＧ１６３、ルミノコッカス・ブロミイＣＡＧ６１１、ロセブリア・インテスティナリスＣＡＧ２９１、およびユウバクテリウムＣＡＧ：３８、ＣＡＧ  ６２９の存在を評価することを含み、バクテロイデス・キシラニソルベンスＣＡＧ９４５、バクテロイデス・ユニフォルミスＣＡＧ１５９、バクテロイデス・オバタスＣＡＧ１１６５、プレボテラＣＡＧ：２５５、ＣＡＧ１６３、ルミノコッカス・ブロミイＣＡＧ６１１、ロセブリア・インテスティナリスＣＡＧ２９１、およびユウバクテリウムＣＡＧ：３８、ＣＡＧ  ６２９がその糞便サンプルの中に存在する場合には、前記患者が、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物、または請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の糞便微生物組成物を用いた細菌の補償を必要とする、セラノスティクス法。
【請求項２２】
がん患者が、抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤の投与前に細菌の補償を必要とするかどうかを判断するセラノスティクス法であって、その患者に由来する糞便サンプルの中で、フィルミクテス門の細菌、ユウバクテリウム、ブラウティア、およびロセブリアからなる群より選択される短鎖脂肪酸産生クロストリジウム科の存在を評価することを含み、その糞便サンプルからフィルミクテス門の細菌、ユウバクテリウム、ブラウティア、およびロセブリアが不在であることが、前記患者が、エンテロコッカス・ヒラエおよび／またはアッカーマンシア・ムシニフィラを用いた、または請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物を用いた、または請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の糞便微生物組成物を用いた細菌の補償を必要とすることを示している、セラノスティクス法。
【請求項２３】
がん患者が、抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤の奏効者である可能性が高いかどうかを判断するインビトロのセラノスティクス法であって、その患者に由来する糞便サンプルの中で、表１と表２に開示されている微生物種から選択される少なくとも１０系統の微生物種の存在を評価することを含み、表１に開示されている微生物種が存在し、表２に開示されている微生物種が不在であることが、前記患者が、抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤の奏効者である可能性が高いことを示しており、表１に開示されている微生物種が不在であり、表２に開示されている微生物種が存在することが、前記患者が、抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤に対して抵抗性である可能性が高いことを示している、インビトロセラノスティクス法。
【請求項２４】
フィルミクテス門の少なくとも５系統の種、クロストリジウム目の５系統の種（そのうちの少なくとも３系統はルミノコッカス科）、アリスティペス属の１系統の種、ユウバクテリウム属の１系統の種、バクテロイデス目の１系統の種、メタノブレビバクター・スミティイ、および／またはアッカーマンシア・ムシニフィラの存在を評価する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
アナエロトランカス・コリホミニスと、オシリバクター属の少なくとも１系統の種の存在を評価する、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤を単独で投与するか、抗ＣＴＬＡ４抗体、またはＩＤＯ阻害剤、または他の免疫調節剤と組み合わせて投与する、請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記患者が抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をすでに投与されている、請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
請求項２３〜２７のいずれか１項に記載の方法を実施するために設計された核酸マイクロアレイであって、その方法で検出される微生物種のそれぞれに対して特異的な核酸プローブを含むことを特徴とする核酸マイクロアレイ。
【請求項２９】
請求項２３〜２８のいずれか１項に記載の方法を実施するためのプライマーセットであって、その方法で検出される微生物種のそれぞれに対して特異的な配列を増幅するプライマーペアを含むことを特徴とする、プライマーセット。
【請求項３０】
がん患者が、がんに関係するディスバイオシスを有するかどうかを評価するインビトロの方法であって、その患者に由来する糞便サンプルの中で、フィーカリバクテリウムＣＡＧ２９７、ブラウティアＣＡＧ１７９、ロセブリアＣＡＧ５５、パラインフルエンザ菌ＣＡＧ１０５６、クロストリジウム目ＣＡＧ１１３２、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス、フィルミクテス門ＣＡＧ１３０８、フィルミクテス門の細菌ＣＡＧ７１３、ビフィドバクテリウム・デンティウム、エンテロコッカス・フェカーリス、サブドリグラヌラムＣＡＧ１４０、ラクノスピラ科の細菌ＣＡＧ１４、クロストリジウム・イノキュウムＣＡＧ３６、ルミノコッカス・トルケス１、ハンガテラ・ハテワイイ１  ＣＡＧ２５、大腸菌ＣＡＧ  １１、大腸菌ＣＡＧ  ３７１、クロストリジウム目ＣＡＧ５３３、およびティゼレラ・ネキシリスＣＡＧ３１１からなる群より選択される少なくとも１０系統、１１系統、１２系統、１３系統、１４系統、１５系統、１６系統、１７系統、１８系統、または１９系統の微生物種の存在を評価することを含み、ここで
−  ビフィドバクテリウム・デンティウム、エンテロコッカス・フェカーリス、サブドリグラヌラムＣＡＧ１４０、ラクノスピラ科の細菌ＣＡＧ１４、クロストリジウム・イノキュウムＣＡＧ３６、ルミノコッカス・トルケス１、ハンガテラ・ハテワイイ１  ＣＡＧ２５、大腸菌ＣＡＧ  １１、大腸菌ＣＡＧ  ３７１、クロストリジウム目ＣＡＧ５３３、およびティゼレラ・ネキシリスＣＡＧ３１１からなる群より選択される微生物種が存在し、
−  フィーカリバクテリウムＣＡＧ２９７、ブラウティアＣＡＧ１７９、ロセブリアＣＡＧ５５、パラインフルエンザ菌ＣＡＧ１０５６、クロストリジウム目ＣＡＧ１１３２、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス、フィルミクテス門ＣＡＧ１３０８、およびフィルミクテス門の細菌ＣＡＧ７１３からなる群より選択される微生物種が不在であることが、前記患者が、がんに関係するディスバイオシスを有することを示している、方法。
【請求項３１】
がんの治療を受けている患者、またはがんの治療を受けたことがある患者で再発を予測する方法であって、異なる時点でその患者から得られた糞便サンプルの中で、フィーカリバクテリウムＣＡＧ２９７、ブラウティアＣＡＧ１７９、ロセブリアＣＡＧ５５、パラインフルエンザ菌ＣＡＧ１０５６、クロストリジウム目ＣＡＧ１１３２、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス、フィルミクテス門ＣＡＧ１３０８、フィルミクテス門の細菌ＣＡＧ７１３、ビフィドバクテリウム・デンティウム、エンテロコッカス・フェカーリス、サブドリグラヌラムＣＡＧ１４０、ラクノスピラ科の細菌ＣＡＧ１４、クロストリジウム・イノキュウムＣＡＧ３６、ルミノコッカス・トルケス１、ハンガテラ・ハテワイイ１  ＣＡＧ２５、大腸菌ＣＡＧ  １１、大腸菌ＣＡＧ  ３７１、クロストリジウム目ＣＡＧ５３３、およびティゼレラ・ネキシリスＣＡＧ３１１からなる群より選択される少なくとも５系統、または６系統、または７系統、または８系統、または９系統、または１０系統、または１１系統、または１２系統、または１３系統、または１４系統、または１５系統、または１６系統、または１７系統、または１８系統、または１９系統の微生物種の存在を評価することを含み、ここで
−  ビフィドバクテリウム・デンティウム、エンテロコッカス・フェカーリス、サブドリグラヌラムＣＡＧ１４０、ラクノスピラ科の細菌ＣＡＧ１４、クロストリジウム・イノキュウムＣＡＧ３６、ルミノコッカス・トルケス１、ハンガテラ・ハテワイイ１  ＣＡＧ２５、大腸菌ＣＡＧ  １１、大腸菌ＣＡＧ  ３７１、クロストリジウム目ＣＡＧ５３３、ティゼレラ・ネキシリスＣＡＧ３１１からなる群より選択される微生物種が増加し、
−  フィーカリバクテリウムＣＡＧ２９７、ブラウティア  ＣＡＧ１７９、ロセブリアＣＡＧ５５、パラインフルエンザ菌ＣＡＧ１０５６、クロストリジウム目ＣＡＧ１１３２、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス、フィルミクテス門ＣＡＧ１３０８、およびフィルミクテス門の細菌ＣＡＧ７１３からなる群より選択される微生物種が減少していることが、前記患者が再発する可能性が高いことを示している、方法。
【請求項３２】
がん患者が抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤を用いた治療の恩恵を受ける可能性が高いかどうかを生体外で判断する方法であって、その患者に由来する血液サンプルの中で、バークホリデリア・セパシア、エンテロコッカス・ヒラエ、および／またはバクテロイデス・フラギリスに対する記憶Ｔｈ１細胞または記憶Ｔｃ１細胞の存在を評価することを含み、ここで、バークホリデリア・セパシアとエンテロコッカス・ヒラエに対する記憶Ｔｈ１細胞または記憶Ｔｃ１細胞の存在が、前記患者が前記治療の高奏効者である可能性が高いことを示し、バクテロイデス・フラギリスに対する記憶Ｔｈ１細胞または記憶Ｔｃ１細胞の存在が、前記患者が前記治療の低奏効者である可能性が高いことを示している、方法。
【請求項３３】
がん患者が抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤を用いた治療からの恩恵を受ける可能性が高いかどうかを生体外で判断する方法であって、前記患者に由来する血液サンプル中でアッカーマンシア・ムシニフィラに対する記憶Ｔｈ１細胞または記憶Ｔｃ１細胞の存在を評価することを含み、ここで、アッカーマンシア・ムシニフィラに対する（ＩＦＮγを産生する）記憶ＣＤ４＋Ｔｈ１細胞または記憶ＣＤ８＋Ｔｃ１細胞、または（ＩＬ−１０を産生する）記憶ＣＤ４＋Ｔｒ１細胞の存在が、前記患者が前記治療の高奏効者である可能性が高いことを示している方法。
【請求項３４】
抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤を用いて治療しているがん患者がその治療の高奏効者であるかどうかを評価する方法であって、
（ｉ）その治療の開始時に前記患者から得られた糞便サンプルの中で、バクテロイデス・キシラニソルベンスＣＡＧ９４５、バクテロイデス・ユニフォルミスＣＡＧ１５９、バクテロイデス・オバタスＣＡＧ１１６５、プレボテラＣＡＧ ：２５５、ＣＡＧ１６３、ルミノコッカス・ブロミイＣＡＧ６１１、ロセブリア・インテスティナリスＣＡＧ２９１、ユウバクテリウムＣＡＧ ：３８、ＣＡＧ  ６２９、ルミノコッカス科ＣＡＧ１００３、フラボニフラクター・プラウティイＣＡＧ  ４３９、フィルミクテス門の細菌ＣＡＧ：１２４、ＣＡＧ  ６２９からなる群より選択される少なくとも３系統、４系統、５系統、６系統、７系統、８系統、９系統、または１０系統の微生物種の存在または相対存在量を評価する工程と；
（ｉｉ）前記抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体を３回または４回投与した後に前記患者から得られた糞便サンプルの中で、工程（ｉ）と同じ種の存在または相対存在量を評価する工程を含み、ここで
−  バクテロイデス・キシラニソルベンス  ＣＡＧ９４５、バクテロイデス・ユニフォルミスＣＡＧ１５９、バクテロイデス・オバタスＣＡＧ１１６５、プレボテラＣＡＧ ：２５５、ＣＡＧ１６３、ルミノコッカス・ブロミイＣＡＧ６１１、ロセブリア・インテスティナリスＣＡＧ２９１、およびユウバクテリウム  ＣＡＧ：３８、ＣＡＧ  ６２９が減少しているか完全に消失していること、および／または
−  ルミノコッカス科ＣＡＧ１００３、フラボニフラクター・プラウティイＣＡＧ  ４３９、フィルミクテス門の細菌ＣＡＧ：１２４、ＣＡＧ  ６２９が増加しているか獲得されていることが、
前記患者が前記治療の高奏効者であることを示している、方法。
【請求項３５】
がん患者に投与される抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤のアジュバントとして用いるため、フィルミクテス門の種、クロストリジウム目の種、アリスティペス属の種、ユウバクテリウム属の種、バクテロイデス目の種、メタノブレビバクター・スミティイ、アッカーマンシア・ムシニフィラ、エンテロコッカス・ヒラエ、およびこれらの混合物からなる群より選択される細菌の断片を含む免疫原性組成物。
【請求項３６】
バクテロイデス・フラギリスおよび／またはバークホリデリア・セパシアの断片をさらに含む、請求項３５に記載の免疫原性組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗がん治療の分野に関する。本発明は特に、がん治療の効果における腸内微生物叢の役割に関するものであり、本発明により、患者が、あるがん治療法からの恩恵、より正確には、免疫チェックポイントブロッカーＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２に対する抗体を単独で、またはＣＴＬＡ４に対する抗体との組み合わせで投与することを含む治療法からの恩恵を受ける可能性が高いかどうかを判断する方法が提供される。本発明により、そのような治療剤を必要とする患者でその治療剤の効果を改善するプロバイオティクスも提供される。
【背景技術】
【０００２】
胃腸管は免疫系の最大の器官である。胃腸管は、常在抗原である食物に曝露されるとともに、多くの病原体にとっての入口になっている。まとめて腸内微生物叢と呼ばれる１００兆もの生物（主に細菌、ファージだが、それだけでなく古細菌、真菌、寄生虫も含まれる）がヒトの腸に定着している（Ｈｕｇｏｎ他、２０１６年）。腸内微生物叢は、ヒトの胃腸管に（上から下へと）増大する密度で定着している微生物の集団を含んでいて、ヒトの健康に決定的な役割を果たすことが示されている（Ｂｌａｓｅｒ、２０１６年；Ｇｅｎｓｏｌｌｅｎ他、２０１６年）。実際、腸内微生物叢は多くの基本的な機能を果たしており、その例として、エネルギー源を提供するための栄養素の分解、生体外物質の除去、免疫系の教育、上皮細胞の増殖と最終分化、腸の蠕動、病原体を根絶して定着に確実に抵抗するための抗微生物ペプチドの産生などがある（Ｇｏｏｄｒｉｃｈ他、２０１６年；Ｒｏｏｋｓ  とＧａｒｒｅｔｔ、２０１６年）。
【０００３】
ヒトの腸内マイクロバイオームに関する研究から、健康な個人にはさまざまな微生物集団が住み着いていることと、腸内微生物叢の組成は個人間で異なっていることが明らかにされており、そのことが、健康と疾患において意味を持っている可能性がある。細菌の大半は、分類群ではフィルミクテス門とバクテロイデス門に属しているが、放線菌門、プロテオバクテリア門、ウェルコミクロビウム門、フソバクテリウム門に属する細菌も代表的である。腸内微生物叢における遺伝子と機能の多様性に関するわれわれの知識は完全からはほど遠い。ｑＰＣＲまたはＦＩＳＨ分析からなるこれまでの細菌同定法は、包括的でもなく、特異的でもなく、十分な感度もない。１６Ｓ  ｒＲＮＡを標的とした遺伝子分析から、そしてそれ以上に、深いデータマイニングを伴うコストのかかる方法であるメタゲノムショットガンシークエンシング（Ｎｉｅｌｓｅｎ他、２０１４年）により、最近の大量の知見が得られた。というのも後者では、（データベースに存在する既知または未知の参照遺伝子とともに）存在するすべての微生物種とそれらのコード化能力を同定することができるからである。ヒトの腸内マイクロバイオームに含まれる参照遺伝子のカタログが以前に報告されており、そこにはＭｅｔａＨＩＴ、ヒトマイクロバイオーム計画ＨＭＰ、大規模中国糖尿病試験からのデータのほか、ヒト腸起源の可能性があると見られる３４００超のシークエンシングされた原核生物のゲノムが集められている。９，８７９，８９６個の遺伝子からなる重複を除いたこの参照カタログにはインターネットを通じて自由にアクセスでき（ヒト腸内マイクロバイオームの統合参照カタログ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｃａｔａｌｏｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｕｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ））、データはＧｉｇａＳｃｉｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（Ｌｉ他、２０１４年）で入手することができる。主要な遺伝子の内容と機能のカバー率は飽和状態に到達している可能性がある。検査対象の５０％超に存在する遺伝子の数は３００，０００個未満に留まっているため、これは個人に特異的な遺伝子が優勢であることを示していることに注意すべきである。個人に特異的な遺伝子は、細胞壁／膜／エンベロープの生合成と、ＤＮＡ複製、組み換え、修復のカテゴリーで豊富にある。共通する遺伝子は、シグナル伝達機構、エネルギー生成、炭水化物の輸送と代謝、アミノ酸の輸送と代謝などの機能で豊富にある。
【０００４】
腸内マイクロバイオームと腸上皮と宿主免疫系の間の共生の乱れは、さまざまな免疫系疾患および慢性炎症と関係していて、がんもその中に含まれる。したがって腸内微生物叢の組成は、栄養失調、肥満、慢性炎症性障害（ＮＡＳＨ、ＩＢＤなど）と関係付けられてきた（ＰｉｇｎｅｕｒとＳｏｋｏｌ、２０１６年；Ｒａｏｕｌｔ、２０１６年）。腸内微生物叢は、病原体の定着に抵抗するだけでなく、異なる表現型へのＴ細胞の分化を促進することによって免疫機能も調節していることが明らかになってきており、それが、自己免疫障害またはアトピー障害（関節リウマチや喘息）を説明できる可能性がある（Ａｒｒｉｅｔａ他、２０１５年）。Ｚｉｔｖｏｇｅｌのグループの以前の研究は、腸内微生物叢が全身がん化学療法に対する免疫反応に影響を与える可能性があることを示しており、腸内微生物叢の破綻が、がん治療剤に対する抵抗性と関係付けられた（Ｖｉａｕｄ他、２０１３年；ＷＯ ２０１５／０７５６８８）。Ｐａｍｅｒらも、同種異系造血幹細胞移植の間の移植片対宿主病と移植片対白血病の効果が腸内微生物叢のさまざまな組成と関係していて、両者を因果関係で結びつけていることを報告している（Ｓｈｏｎｏ他、２０１６年；Ｔａｕｒ他、２０１５年）。
【０００５】
肺がん（ＬＣ）はあらゆるがんのうちで最も一般的な死因であり続けており、毎年世界中でほぼ１６０万人、フランスで約３０，０００人の死因であると推定されている（Ｆｉｄｌｅｒ他、２０１６年）。この疾患は、若い人たちに不治と宣告し、年齢の中央値５０〜５５歳に重大な衝撃を与え、「未解決の医学的課題」の１つとなっている。過去１０年の間に、腫瘍の生物学、ゲノミクス技術、コンピュータ分析、ドラッグデリバリーが進歩し、ＬＣに関してトランスレーショナルながん研究と臨床がん研究の進展が促進された。ＬＣは、個別化された標的療法（特にＣＴＬＡ４やＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１を標的とするＴ細胞抑制受容体またはＴ細胞抑制リガンドに対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）などの免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＢ）を用いた免疫療法）のプロトタイプになった（Ｇａｒｏｎ、２０１５年）。ＰＤ１受容体をブロックする２つのｍＡｂ（ニボルマブとペムブロリズマブ）と、ＰＤ１リガンド（ＰＤ−Ｌ１）を中和する３つのｍＡｂ（アテゾリズマブ、ドゥルバルマブ、アベルマブ）が、第Ｉ相試験で調べられてきた。１１７人の扁平非小細胞ＬＣ（ＮＳＣＬＣ）での１つの第ＩＩ相試験から、ニボルマブは１５％の客観的奏効率につながり、奏効までの時間の中央値は３．３ヶ月であることがわかった（Ｒｉｚｖｉ他、２０１５年）のに対し、シスプラスチン（cisplatinum）抵抗性の扁平細胞（ＳＱ）と非扁平細胞（ＮＳＱ）のＮＳＣＬＣ患者における２つの重要な第ＩＩＩ相無作為化試験でも、ニボルマブ群では第２選択肢のドセタキセルと比べて全生存（ＯＳ）に利益があることが証明された（ＳＱではＯＳ中央値＝９．２ヶ月であるのに対し、ＮＳＱでは６ヶ月：１８ヶ月の時点におけるＯＳ率＝３９％であるのに対して２３％）。２０１５年３月、ニボルマブはついに、白金系化学療法の間または後に進行した後期ＳＱ  ＮＳＣＬＣに関して承認された最初のチェックポイント阻害剤になった。これらの革新的かつ高価な治療剤の第１の制約は、比較的小さくて予測不能な効果である。ごく少数のパラメータ（肺がん細胞でのＰＤ−Ｌ１の陽性発現（約２５％のケース）や、ＬＣの大きな変異負荷など）が、抗ＰＤ１抗体に対する大きな奏効率と結び付いているように見える。第２に、重い有害事象が通常は観察される（疲労感（４％）、間質性肺炎（３％）、下痢（３％））。ＣＴＬＡ４とＰＤ１を同時にブロックすると客観的奏効率が顕著に増大するが、これらの組み合わせによって毒性がより大きくなり、特に免疫関連の有害事象（ｉｒＡＥ）が、常在微生物叢に曝露される部位（例えば腸）に生じる（Ｂｅｒｍａｎ他、２０１０年）。ｉｒＡＥは２０％のケースでグレードＩＩＩ〜ＩＶになる可能性があり、ほぼ５％のケースで生命が脅かされるため、治療を早期に中断することになる（Ｃｈａｍｐｉａｔ他、２０１６年）。重要なことだが、ｉｒＡＥは、制御性Ｔｒｅｇの数が少ないことと特定の遺伝形質が特徴だが、現在のところ、うまく予測することも、予防することもできていない。しかし患者は腸内マイクロバイオームに対する抗体を発達させている。これは、腸の常在細菌または細菌抗原がこれらのｉｒＡＥに寄与している可能性があることを示唆している。
【０００６】
したがってＩＣＢに対する主要な抵抗性を予測し、ＩＣＢの効果を腸毒性と分離することが未解決の１つの医学的課題であり、ＬＣ（または抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１抗体、または化学療法との組み合わせが適した他の任意のがん（腎細胞がん、頭頸部腫瘍、膀胱がんなど）とあらゆる腫瘍）を治療するための免疫チェックポイント阻害剤が将来開発されるのが待たれている。
【０００７】
Ｚｉｔｖｏｇｅｌらは、がん治療剤（細胞毒性剤とＩＣＢ）がそのような相利共生をどのように変化させるかを調べた。３年前、Ｚｉｔｖｏｇｅｌのグループと他の研究者は、がんに対する有効な治療剤（シクロホスファミド、白金塩など）という文脈で、宿主にとって有益な自然免疫反応と獲得免疫反応を誘導する際の腸内微生物叢の極めて重要な役割を報告した（Ｐｉｔｔ他、２０１６年；Ｖｉａｕｄ他、２０１３年；ＷＯ ２０１５／０７５６８８；  ＷＯ ２０１６／０６３２６３）。化学療法剤は腸の健全さを損なうことによって腸の透過性を増大させ、特定の免疫原性細菌（すなわちエンテロコッカス・ヒラエ）の選択的な転移を促進し、腫瘍微小環境に劇的な変化（骨髄細胞の酸化還元と、エフェクタＴＨ１細胞の蓄積）を誘導する。さらに、ＩＣＢと免疫調節剤（抗ＩＬ−１０Ｒ、ＴＬＲ９Ｌ）も腸粘膜の微妙な共生に影響を与えて特定の菌種の出現を促進することで、腫瘍の微小環境の状態に有利に作用する。実際、Ｚｉｔｖｏｇｅｌのグループは、第１選択肢の免疫チェックポイント阻害剤である抗ＣＴＬＡ−４抗体／イピリムマブで研究し、マウスにおいて、抗腫瘍免疫における微生物叢の役割と、無症状の大腸炎に対するそのような常在菌の臨床効果および予防的役割を示した（Ｖｅｔｉｚｏｕ他、２０１５年；ＷＯ ２０１６／０６３２６３）。それと並行して、Ｇａｊｅｗｓｋｉのグループは、腫瘍内樹状細胞が成熟するとき、ビフィズス菌が、腫瘍床の中で抗がんＴ細胞を増殖させることと、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を用いて抗がんＴ細胞を活性化させる役割を果たせることを明らかにした（Ｓｉｖａｎ他、２０１５年）。これらモデル系のすべてで、研究者は、ＩＣＢが、無菌マウスでは抗腫瘍効果を発揮できず、特定の病原体がない条件で育てられた齧歯類に広域抗生剤を投与した後にも抗腫瘍効果を発揮できないことを示している。したがって肺がんのＩＣＢ療法を実施している間の入口における粘膜免疫と上皮−微生物間の免疫学的クロストークをよりよく理解することで、ＩＣＢまたは化学療法に対するがん患者の抵抗性を説明する新たな道が開かれる可能性がある。
【０００８】
下に開示されている実験データにおいて、発明者は、抗生剤の摂取により、進行がんと診断された個人でＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１阻止に対する反応が妨げられることを示した後、がん（肺がんや腎細胞がんなど）における腸内容物の典型的ながん関連微生物フィンガープリント（「ディスバイオシス」と呼ばれ、予後不良と関係することが見いだされている）を同定した。この予後は、健康な個人からの糞便の同種異系糞便微生物移植（allogenic fecal microbial transplantation）（ＦＭＴ）によって、またはプロバイオティック組成物の投与によって改善することができる。プロバイオティック組成物は、例えば、エンテロコッカス・ヒラエ、アッカーマンシア・ムシニフィラ、アリスティペスのほか、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス、クロストリジウム目の種、ロセブリア、ブラウティア、フィーカリバクテリウム、ルミノコッカス科、クリステンセネラ・ミヌタ、ユウバクテリウム・リモサムから選択される細菌および／またはメタノブレビバクター・スミティイ、バルネシエラ・インテスティニホミニス、バクテロイデス・フラギリス、コリンセラ・インテスティナリス、ディエルマ・ファスティディオサ、フラボニフラクター・プラウティイ、アクチノチグナム・シャアリイ、バークホリデリア・セパシアから選択される免疫原性細菌の組成物である。
【０００９】
発明者は、ＩＣＢ、特に抗ＰＤ１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体または抗ＰＤ−Ｌ２抗体を用いた治療に対する反応または抵抗性に関係する腸内微生物叢のプロファイルのほか、関連する血液プロファイルも同定した。その結果として、発明者は、抗ＰＤ１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体または抗ＰＤ−Ｌ２抗体の投与が可能な高奏効者（good responders）を同定する一方で、ディスバイオシスを示す低奏効者（bad responders）には、ＦＭＴおよび／またはプロバイオティクスに基づく予備治療を推奨するというセラノスティクス（theranostics）法を提案する。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤を必要とする患者のため、その治療剤に対する反応を改善する設計のプロバイオティック組成物に関する。本発明のプロバイオティック組成物は、エンテロコッカス・ヒラエ、アッカーマンシア・ムシニフィラ、アリスティペス・シャヒイ、アリスティペス属の他の種（アリスティペス・インディスティンクタスなど）の１つまたはいくつかの単離体と、これらの混合物からなる群より選択される細菌を含んでいる。
【００１１】
一実施態様によれば、この組成物は、フィルミクテス門の種、クロストリジウム目の種、アリスティペス属の種、ユウバクテリウム属の種、バクテロイデス目の種、メタノブレビバクター・スミティイ、アッカーマンシア・ムシニフィラ、エンテロコッカス・ヒラエからなる群より選択される少なくとも２系統、または少なくとも３系統、または少なくとも４系統、または少なくとも５系統の菌種を含んでいる。抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤を投与されているがん患者で免疫刺激を誘導するため本発明に従って使用できる特定の一つの組成物は、エンテロコッカス・ヒラエおよび／またはアッカーマンシア・ムシニフィラおよび／またはアリスティペスを含む細菌組成物である。
【００１２】
一実施態様によれば、この組成物は、エンテロコッカス・ヒラエ、アッカーマンシア・ムシニフィラ、アリスティペス・インディスティンクタス、ユウバクテリウム属の種（ユウバクテリウム・リモサムなど）、フィルミクテス門の種（クリステンセネラ・ミヌタ、ディエルマ・ファスティディオサなど）、バクテロイデス属（バクテロイデス・フラギリス、バクテロイデス・サルイェルサエ、バルネシエラ・インテスティニホミニスなど）、放線菌（コリンセラ・インテスティナリス、コリンセラ・タナカエイ、アクチノチグナム・シャアリイなど）、古細菌メタノブレビバクター・スミティイからなる群より選択される少なくとも２系統、または少なくとも３系統、または少なくとも４系統、または少なくとも５系統の菌種を含んでいる。
【００１３】
本発明によれば、抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤を投与されているがん患者で免疫刺激を誘導するため本発明に従って使用できる特定の一つの組成物は、エンテロコッカス・ヒラエ  および／またはアッカーマンシア・ムシニフィラおよび／またはアリスティペスを含む細菌組成物である。
【００１４】
別の１つの側面では、本発明は、がん患者が、抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤の高奏効者である可能性が高いかどうかを判断するインビトロセラノスティクス法に関するものであり、この方法は、
（ｉ）その患者に由来する糞便サンプルの中で、表１と表２に開示されている微生物種から選択される少なくとも１０系統の微生物種の相対存在量（relative abundance）を評価し；
（ｉｉ）各微生物について、工程（ｉ）で測定した相対存在量をあらかじめ決めた閾値と比較することを含んでいて
表１（後出）に開示されている微生物種が過剰出現し、表２（後出）に開示されている微生物種が過少出現していることが、患者が、抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤の高奏効者である可能性が高いことを示している。
【００１５】
上記の方法を容易に実行できる設計されたツール類も本発明の一部であり、その例は、上記の方法の工程（ｉ）で検出される微生物種のそれぞれに対して特異的な核酸プローブを含む核酸マイクロアレイや、上記の方法の工程（ｉ）で検出される微生物種のそれぞれに対して特異的な配列を増幅するためのプライマーペアを含むプライマーセットである。
【００１６】
本発明は、がん患者に投与される抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤のアジュバントとして用いるため、フィルミクテス門の種、クロストリジウム目の種、アリスティペス属の種、ユウバクテリウム属の種、バクテロイデス目の種、メタノブレビバクター・スミティイ、アッカーマンシア・ムシニフィラ、エンテロコッカス・ヒラエと、これらの混合物からなる群より選択される細菌の断片を含む免疫原性組成物にも関する。
【００１７】
本発明の別の重要な１つの側面によれば、本発明は、がんを治療するため、同種異系の正常なボランティアまたは奏効患者に由来する糞便微生物組成物（an allogeneic normal volunteer or responding patient derived-fecal microbial composition）を、抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤と組み合わせて利用することに関する。そのような組成物を用いた糞便微生物移植（ＦＭＴ）は、本発明のセラノスティクス法によって低奏効者であると同定された患者の抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体に対する奏効率を改善させるのに特に有用である。
【００１８】
ある個人が、抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤を投与される前に、細菌組成物を用いた細菌組成物、および／またはＦＭＴによる細菌組成物を必要とするかどうかを判断するセラノスティクス法も本発明の一部である。
【００１９】
本発明は、がん患者が抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤を用いた治療の恩恵を受ける可能性が高いかどうかを生体外で判断する方法にも関係しており、この方法は、患者に由来する血液サンプルの中で、バークホリデリア・セパシア、および／またはアッカーマンシア・ムシニフィラ、および／またはエンテロコッカス・ヒラエ、および／またはバクテロイデス・フラギリスに対する記憶Ｔｈ１細胞または記憶Ｔｃ１細胞の存在を評価することを含んでいて、バークホリデリア・セパシア、アッカーマンシア・ムシニフィラ、エンテロコッカス・ヒラエに対する記憶Ｔｈ１細胞または記憶Ｔｃ１細胞の存在が、患者がその治療の高奏効者である可能性が高いことを示し、バクテロイデス・フラギリスに対する記憶Ｔｈ１細胞または記憶Ｔｃ１細胞の存在が、患者がその治療の低奏効者である可能性が高いことを示している。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】腎細胞がん患者でのカプラン−マイヤー無増悪生存（progression-free survival）（ＰＦＳ）曲線。ニボルマブ（ＩＣＢ）を、抗生剤（ＡＴＢ、上図）またはプロトンポンプ阻害剤（ＰＰＩ、下図）（どちらも、ＩＣＢを最初に注射する前の１〜２ヶ月以内とＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１阻止の開始後１ヶ月が経過するまで摂取）と併用する治療法で治療した７０人の転移性腎細胞がん患者。
【図２】膀胱がん患者のＡＴＢ（＋）群とＡＴＢ（−）群で患者のＰＦＳを評価するためのカプラン−マイヤー法。抗ＰＤ−Ｌ１抗体（ＩＣＢ）と抗生剤（ＡＴＢ）（ＩＣＢを最初に注射する前の１〜２ヶ月以内とＰＤ−Ｌ１阻止の開始後１ヶ月が経過するまで摂取）の併用療法で治療した４２人の転移性膀胱尿路上皮細胞がん患者。
【図３】がんコホートで違いが見られた１４７系統のＭＧＳのヒートマップ／階層的クラスタリング。ヒートマップの色彩コード：３つのがんコホートで選択された１４７系統のＭＧＳのｐ値をｌｏｇ１０変換した後にヒートマップを作成した。「がん」種を「健康な」種から識別するため、「健康」値を逆転させて正値にした。したがって健康な種は上部に現われ、がん種は下部に現われる。行の色彩コード（Ｒと表示した列）：色彩は、がんと診断されていなくて対照となる３８７人の個人で同定された豊富さが大きいＭＧＳと豊富さが小さいＭＧＳを示す（スピアマン相関｜ｒｈｏ｜＞０．３、ｐ値＜２×１０−５）。３色勾配コードを｜ｒｈｏ｜＞０．３、０．４、０．５について使用してあり、より濃い色彩は相関がより強いことを示す。がん患者は、初期乳がん、または転移性肺がん、または転移性腎臓がんと診断された（３種類のがん）。
【図４】がんコホートで違いが見られた４３系統の「健康な」種のヒートマップ／階層的クラスタリング。図３に示したヒートマップからの抜粋。
【図５】がんコホートで違いが見られた１０４系統の「がん」種のヒートマップ／階層的クラスタリング。図３に示したヒートマップからの抜粋。
【図６】（３種類のがんのうちで）少なくとも２つの異なるがんコホートで差があってまとまった２７系統の種のヒートマップ／階層的クラスタリング。
【図７】がん患者コホート（Ｃ）と健康なコホート（Ｈ）の間で差が見られたＭＧＳのバーコードとｐ値（遺伝子カウント（ＧＣ）＊）。
【図８】ＰＤ１阻止の間のＭＧＳの展開の速度（kinetics）。抗ＰＤ１／ＰＤＬ１抗体を用いた治療の間に肺がんＶ１患者（開始前）と（治療を開始して６ヶ月の時点で）プールされた肺＋膀胱がんＶ４患者の間で差があったＭＧＳのバーコード。
【図９】肺＋腎臓がんに関してプールされたＲ（奏効者）サンプルとＮＲ（非奏効者）サンプルの間で、抗生剤と診断（抗ＰＤ１抗体を用いた治療の前）に関係なく差があったＭＧＳのバーコード。
【図１０】ＡＴＢで治療した腫瘍保持マウス（アバターマウス）に、ＰＤ１を阻止する前にＦＭＴを移植するための実験設定。肺がん患者の糞便を用い、確立されたＭＣＡ２０５  ＷＴを有するＡＴＢ治療マウスにＦＭＴを実施した（２つの実験）。
【図１１】進行（Ａ）ＮＳＣＬＣ患者または奏効（Ｄ）ＮＳＣＬＣ患者からのＦＭＴを受けた５匹のＳＰＦレシピエントまたは５匹のＡＴＢ治療マウスに接種されたＭＣＡ２０５の典型的な成長曲線と速度。
【図１２】いくつかの独立な群のマウスにおける安楽死の時点の腫瘍サイズの連結データ。マウスは、ＡＴＢを摂取した後、ＦＭＴを受けなかった（ＮａＣｌ）か、異なる４人の進行者（Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ）と異なる２人の奏効者（Ｃ、Ｄ）からのＦＭＴを受けた。それぞれの点は、治療を開始してから１２日目の時点における１匹のマウスの腫瘍サイズを表わす。治療は、抗ＰＤ１抗体の腹腔内投与であった。
【図１３】進行（Ａ）ＮＳＣＬＣ患者からのＦＭＴを受けた後、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋ）、またはエンテロコッカス・ヒラエ  １３１４４（ＥＨ）、またはユウバクテリウム・テヌエ（Ｅｕｂａ）の経口強制摂取（oral gavage）を受けたＧＦマウスに接種されたＭＣＡ２０５の成長曲線。抗ＰＤ１抗体を最初に注射するときと２回目に注射するとき、１０９個の細菌を２回強制的に摂取させた。異なる３系統の細菌を使用した。別々のアイソレータの中にいる各マウス群（群ごとにｎ＝５匹のマウス）に１つの細菌である。
【図１４】ＰＤ１を阻止する前とＰＤ１を阻止している間の、ＡＴＢで治療した腫瘍保持マウス（アバターマウス）への細菌補償の実験設定。確立されたＭＣＡ２０５  ＷＴを有するＡＴＢ治療マウスに細菌を強制的に摂取させた。抗ＰＤ１抗体を注射する前と、最初に注射するとき、２回目、３回目、４回目に注射するとき、１０９個の細菌を５回強制的に摂取させた。別々のアイソレータで飼育した各マウス群（群ごとにｎ＝５〜６匹のマウス）について、異なる３系統の細菌を単独で（アッカーマンシア・ムシニフィラ、アリスティペス属の種、エンテロコッカス・ヒラエ  １３１４４）、またはアッカーマンシア・ムシニフィラ＋エンテロコッカス・ヒラエ  １３１４４の組み合わせで使用した。
【図１５】図１４のプロトコルに従ってアッカーマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋ）またはアッカーマンシア・ムシニフィラ＋エンテロコッカス・ヒラエ  １３１４４（ＥＨ）を経口で強制的に摂取させた場合のＭＣＡ２０５の成長曲線。細菌は、図１４に示した実験設定に従い、ＡＴＢの停止後にマウスマイクロフローラが自発的に再構成されたアバターマウスに強制摂取によって投与した。
【図１６】進行（Ｂ）ＮＳＣＬＣ患者からのＦＭＴを受けた後、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋ）、またはアッカーマンシア・ムシニフィラ＋エンテロコッカス・ヒラエ  １３１４４（ＥＨ）、またはアリスティペス属の種（Ａｌｉ）の経口強制摂取を受けたＧＦマウスに接種されたＭＣＡ２０５の成長曲線。細菌は、図１４に示した実験設定に従い、進行（Ｂ）ＮＳＣＬＣ患者からのＦＭＴを受けたアバターマウスに強制摂取によって投与した。
【図１７】異なる２人の進行（ＢとＦ）ＮＳＣＬＣ患者からのＦＭＴを受けた後、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋ）、エンテロコッカス・ヒラエ  １３１４４（ＥＨ）、アリスティペス属の種（Ａｌｉ）、アッカーマンシア・ムシニフィラ＋エンテロコッカス・ヒラエ  １３１４４（Ａｋｋ＋ＥＨ）いずれかの経口強制摂取を受けたいくつかの独立な群のＡＴＢ治療マウスにおける腫瘍サイズの変化。細菌は、図１４に示した実験設定に従い、進行（ＢまたはＦ）ＮＳＣＬＣ患者からのＦＭＴを受けたアバターマウスに強制摂取によって投与した。それぞれの点は、治療開始後０日目、３日目、６日目、９日目の時点における１匹のマウスの腫瘍サイズを表わす。治療は、抗ＰＤ１抗体の腹腔内投与であった。
【図１８】ＣＴＬＡ４＋ＰＤ１同時阻止の組み合わせが奏効しないＡＴＢ治療ディスバイオシスマウスへの「オンコバックス」（免疫原性常在菌）の補償。広域ＡＴＢを投与してから１４日後にＣ５７ＢＬ／６マウスにＭＣＡ２０５肉腫を接種した。次に、ＭＣＡ２０５を移植してから６日目にマウスに抗ＣＴＬＡ４抗体（３日ごとに４回の注射）と抗ＰＤ１抗体（３日ごとに６回の注射）を静脈内注射して治療した。異なるケージに分けた独立な群のマウスに異なるオンコバックス（ビフィドバクテリウム・ブレーベとビフィドバクテリウム・ロンガムの組み合わせ、または単独のバクテロイデス・フラギリス、またはバクテロイデス・フラギリスとバークホリデリア・セパシアの組み合わせ、またはバルネシエラ・インテスティニホミニス）を経口で強制的に摂取させた（「直腸」は、投与経路が直腸であることを意味する）。６匹のマウス／群で腫瘍成長速度を２週間に１回モニタした。安楽死させたときに腫瘍がなかったマウスの数を括弧の中に示す。
【図１９】記憶Ｔｈ１／Ｔｒ１反応が、ステージＩＶのＮＳＣＬＣにおけるＰＤ１阻止下での無増悪期間（time to progression）（ＴＴＰ）を予測する。ＴＴＰを計算するため、がん患者における所定の常在菌に対するＴｃ１記憶Ｔ細胞またはＴＨ１記憶Ｔ細胞の反応が、診断時について、または抗ＰＤ１抗体をベースとした治療をしている最初の１ヶ月間について、コホート全体でのＩＦＮγの産生の平均値に従って分離されている。１４人の進行肺がん患者の個々の常在菌とともにインキュベートした自家単球に曝露された記憶ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＩＦＮγとＩＬ−１０の比も示してある。カプラン−マイヤー曲線は、コホートの中央値よりも大きな比の患者と小さな比の患者に分けてある。
【図２０】ＡＴＢを投与された非小細胞肺がん患者、または抗ＰＤ１抗体を最初に注射する前の２ヶ月間と最初に注射してから１ヶ月後まではＡＴＢを投与されていない非小細胞肺がん患者における無増悪生存率（ＰＦＳ）と全生存率（ＯＳ）。ＡＴＢ（＋）／（−）でニボルマブを用いて治療したＮＳＣＬＣ患者の無増悪生存に関するカプラン−マイヤー生存曲線を左図と右図に示してある：全生存。ログ−ランク（マンテル−コックス）。＊ｐ＜０．０５、＊＊  ｐ＜０．０１、＊＊＊  ｐ＜０．００１、ｎｓ＝有意ではない。
【図２１】ＰＤ１／ＰＤＬ１阻害剤を用いて治療した３種類の進行がん（ＮＳＣＬＣ、ｍＲＣＣ、ｍＵＣ）すべて（ｎ＝１７５）におけるＰＦＳとＯＳ。進行がんを有する患者をプールした３つのコホートの無増悪生存率（左図）と生存率（右図）のカプラン−マイヤー曲線による分析。ｎ＝６６：非小細胞肺がん、ｎ＝６７：転移性腎細胞がん、ｎ＝４２：転移性尿路上皮がんであり、全員をＰＤ１／ＰＤＬ１阻害剤で治療してＡＴＢ（＋）とＡＴＢ（−）を比較した。ＡＴＢ（＋）／（−）群は、ＡＴＢで治療した患者と、ＩＣＢを用いた治療の前（２ヶ月間）またはその治療から最初の１ヶ月以内はＡＴＢで治療していない患者として定義した。＊ｐ＜０．０５、＊＊  ｐ＜０．０１、＊＊＊  ｐ＜０．００１、ｎｓ＝有意ではない。
【図２２】メタゲノミクス種（ＭＧＳ）におけるがん関連の腸フィンガープリント：差がある１８系統のＭＧＳ。がん患者（Ｂｒ：乳がん、Ｌｕ：肺がん、Ｎｉ：腎臓がん）の２つの独立なコホート（１、２）に共通する細菌ＭＧＳの教師なし階層的クラスタリングのヒートマップであり、全患者（全体）、または多様性が大きいサブセット（大）、または多様性が小さいサブセット（小）が考慮されている。青色は、がん患者には過少出現しているが健康なボランティアには過剰出現しているＭＧＳであり、赤色は、がん患者に過剰出現しているＭＧＳである。
【図２３】ＭＧにおけるがん関連の腸フィンガープリント：差がある１１系統のＭＧＳ（ＡＴＢなし）。図２２と同じ分析だが、糞便を回収する２ヶ月前に少なくとも１週間にわたって何らかの抗生剤を摂取したがん患者は除かれている。
【図２４】腎臓がん患者または肺がん患者で診断時に糞便中の遺伝子カウントとメタゲノム種の豊富さがより大きいと、抗ＰＤ１抗体を用いた治療を６ヶ月続けた時点で無増悪生存がより優れていることが予測される。診断時の糞便サンプルのショットガンシークエンシングであり、全がん患者での遺伝子カウントとＭＧＳカウントを臨床転帰ごとに表示してある（６ヶ月の時点でのＰＦＳ）。ＰＦＳが６ヶ月未満の患者と６ヶ月超の患者についてカウントの平均値±ＳＥＭを示してある。遺伝子またはＭＧＳの豊富さは、３ヶ月の時点でのＰＦＳを予測しなかったことに注意されたい。
【図２５】ＡＴＢ−ＳＰＦレシピエントにおいて２人のＮＳＣＬＣ進行者のＦＭＴをオンコバックスで補償する実験設定。実験設計：ＡＴＢ治療マウスへの、抗ＰＤ１抗体で治療中のＮＳＣＬＣを有する２人の非奏効患者の糞便微生物移植。Ｃ５７／ＢＬ６  ＳＰＦマウスに広域ＡＴＢ（コリスチン、アンピリシン、ストレプトマイシン）を３日間与えた。ＡＴＢを中断してから１２時間後、２００μｌの糞便を用いたＦＭＴを実施し、１００μｌを各マウスの皮膚に適用した（患者の糞便はＩＨＭＳの指示に従って保管した）。その２週間後、ＭＣＡ２０５  ＷＴ腫瘍を右脇腹に接種し、腫瘍のサイズが２０〜２５  ｍｍ２に達したときに抗ＰＤ１抗体を開始した。抗ＰＤ１抗体を最初に腹腔内に注射する前日と、その後は抗ＰＤ１抗体を注射するごとに、オンコバックス−細菌の強制摂取（１０８個の細菌）を実施した。
【図２６】図２５に記載した実験の結果。ＡＴＢ−ＳＰＦレシピエントにおいて、２人のＮＳＣＬＣ進行者のＦＭＴをオンコバックスによって補償した：Ａｋｋ  ＋／−  エンテロコッカス・ヒラエ（オンコバックス）の効果。２人の非奏効ＮＳＣＬＣ患者のＦＭＴまたはＮａＣｌ対照の後のＡＴＢ治療マウスにおけるＭＣＡ−２０５  ＷＴ腫瘍の成長。アイソタイプ対照抗体で処置したマウスと、抗ＰＤ１抗体＋オンコバックスのさまざまな組み合わせで治療したマウスを比較した。ｔ検定を実施した。＊ｐ＜０．０５、＊＊  ｐ＜０．０１、＊＊＊  ｐ＜０．００１、ｎｓ＝有意ではない。
【図２７】有効なオンコバックスによる腫瘍流入リンパ節中のエフェクタ記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞とセントラル記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞の蓄積。ＡＴＢで治療し、肺がん患者の糞便（患者Ｆ）を用いてＦＭＴを実施し、抗ＰＤ１抗体＋さまざまなオンコバックスの組み合わせで治療した後の腫瘍流入リンパ節の中のＣＤ８＋エフェクタ（ＣＤ６２−ＣＤ４４＋）細胞とＣＤ８＋セントラル記憶（ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４４＋）細胞のサイトメトリー分析。
【図２８】ＡＴＢ−ディスバイオシスＳＰＦレシピエントにおけるＲＥＴ黒色腫モデルでの実験設定：さまざまなオンコバックスを用いた補償。コリスチン、ストレプトマイシン、アンピシリンで２週間にわたって治療したＡＴＢ−ディスバイオシスＳＰＦ  Ｃ５７／ＢＬ６マウスの脇腹にＲＥＴ黒色腫を注射した。次いでＡＴＢを中断した後、詳細なスケジュールに従い、各群に細菌を強制摂取させ、オンコバックスとして１０８個の細菌または２系統の細菌の組み合わせを用いて単一のコロニーを形成した。各マウスには、アイソタイプ対照抗体または抗ＰＤ１抗体を腹腔内に４回注射した。
【図２９】図２８に記載した実験設定からの結果。エンテロコッカス・ヒラエ（１３１４４）＋アッカーマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋ）の組み合わせはＲＥＴモデルにおいて非常に有効である。図２８で説明した実験設定に従って治療したＡＴＢディスバイオシスＳＰＦマウスにおける腫瘍の成長。それぞれの線は１匹のマウスを表わす。左上の２つの図は、水だけを与えた対照マウスを表わす。右上の２つの図は、ＡＴＢを与えたマウスでの腫瘍の成長を示している。下の４つの図は、それぞれ、ＡＴＢの後にオンコバックスであるアッカーマンシア・ムシニフィラ、エンテロコッカス・ヒラエ  １３１４４＋アッカーマンシア・ムシニフィラ、ユウバクテリウム・テヌエ＋アッカーマンシア・ムシニフィラ、アリスティペス・インディスティンクタスが単一のコロニーを形成したマウスでの腫瘍の成長を示している。２回の実験のうちの代表的な１つを示してある。
【図３０】同所性ＬＬＣ：ＰＤ１阻止＋放射線療法にオンコバックスを組み合わせた効果（１）。ＳＰＦマウスで放射線療法＋抗ＰＤ１抗体を組み合わせるための実験設定。ＡＴＢを３日間使用した後、  Ｃ５７／ＢＬ６マウスにルシフェラーゼを発現するルイス肺がん（ＬＬＣ）細胞系を本来の場所に注射した。ルシフェラーゼは、ルシフェリンの注射後にＩＶＩＳスペクトル生体内イメージングシステムを用いてモニタすることができる。３〜４日目、マウスの胸部を標的とする９  Ｇｙの放射線療法を実施した。詳細なスケジュールに従って３日ごとに抗ＰＤ１抗体またはアイソタイプ対照抗体を腹腔内に注射した。細菌群では、抗ＰＤ１抗体を注射したのと同じ日にマウスにエンテロコッカス・ヒラエ  １３１４４＋アッカーマンシア・ムシニフィラを１０８個の量で与えた。
【図３１】同所性ＬＬＣ：ＰＤ１阻止＋放射線療法にオンコバックスを組み合わせた効果（２）。左図は、ＩＶＩＳスペクトル生体内イメージングシステムを用いて測定した腫瘍の成長を表わしている。各群について、１０日目における規格化した全フラックスが示されている。右図：アイソタイプ対照群、または放射線療法＋抗ＰＤ１抗体群、または放射線療法＋抗ＰＤ１抗体＋細菌群に含まれる全マウスのカプラン−マイヤー曲線による生存分析。ログ−ランク（マンテル−コックス）。＊ｐ＜０．０５、＊＊  ｐ＜０．０１、＊＊＊  ｐ＜０．００１、ｎｓ＝有意ではない。
【図３２】ＲＥＮＣＡ腫瘍モデルにおいて腸マイクロバイオームが抗ＣＴＬＡ４抗体＋抗ＰＤ１抗体の抗がん効果に対して果たす役割（１）。Ｂａｌｂ／ｃ  ＡＴＢ治療マウスに対して転移性腎細胞がんを有する患者からの糞便を用いた糞便微生物移植をするための実験設定。アンピリシン、コリスチン、ストレプトマイシンの３日後、Ｂａｌｂ／ｃマウスに、ニボルマブで治療中のｍＲＣＣを有する異なる３人の患者からのＦＭＴを実施した。その治療は２人の患者には臨床上の利益がなかったが、もう１人は１０ヶ月後に部分奏効のままであった。ＦＭＴから１４日目にマウスにＲＥＮＣＡ−ルシフェラーゼ腫瘍を本来の場所に注射し、スケジュールに従って４日ごとにアイソタイプ対照抗体または抗ＰＤ１抗体＋抗ＣＴＬＡ４抗体の組み合わせを与えた。下部の表は、３人のドナーのメタゲノム糞便組成をいくつかの細菌について示してある。
【図３３】ＲＥＮＣＡ腫瘍モデルにおいて腸マイクロバイオームが抗ＣＴＬＡ４抗体＋抗ＰＤ１抗体の抗がん効果に対して果たす役割（２）。ＩＶＩＳ（登録商標）スペクトル生体内イメージングシステム装置を用いたＢａｌｂ／ｃ  ＦＭＴ後マウスでのＲＥＮＣＡの腫瘍サイズの評価。各マウスの全フラックスを９〜１５日目について示してある。ｔ検定を実施した。＊ｐ＜０．０５、＊＊  ｐ＜０．０１、＊＊＊  ｐ＜０．００１、ｎｓ＝有意ではない。
【図３４】循環しているＴ細胞でのＰＤ−Ｌ１の上方調節は、ＰＤ１阻止に対する臨床上の利益と関係する糞便の好ましいＭＧ組成の特徴である。脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞と脾臓ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞表面におけるＰＤＬ１分子発現のフローサイトメトリー分析。図Ａ：ＡＴＢで治療したマウスに奏効者または低奏効者のＦＭＴを実施した後。図Ｂ：非奏効者のＦＭＴを実施した後にオンコバックスで処置。
【図３５】オンコバックスを経口で強制的に摂取させた後の腸間膜リンパ節における表現型の変化。単独のエンテロコッカス・ヒラエ、またはアッカーマンシア・ムシニフィラと組み合わせたエンテロコッカス・ヒラエを用いたときのＣＤ４＋セントラル記憶ＣＣＲ９＋とＣＤ８＋セントラル記憶ＣＣＲ９＋（といくらかのナイーブ）の増加。オンコバックスを強制的に摂取させ、抗ＰＤ１抗体を腹腔内に１回注射して治療してから４８時間後の腸間膜リンパ節のフローサイトメトリー分析。図Ａ：ＣＤ４＋ナイーブＣＣＲ９＋とＣＤ４＋セントラル記憶ＣＣＲ９＋。図Ｂ：ＣＤ８＋ＣＣＲ９＋、ＣＤ８＋セントラル記憶ＣＣＲ９＋、ＣＤ８＋セントラル記憶ＣＣＲ９＋ＣＸＣＲ３＋。エンテロコッカス・ヒラエはＣＤ８＋セントラル記憶ＣＣＲ９＋とＣＣＲ９＋ＣＸＣＲ３＋を顕著に増加させるのに対し、アッカーマンシア・ムシニフィラは主にＣＤ４＋セントラル記憶ＣＣＲ９＋を増加させる。
【図３６】患者の糞便のメタゲノム組成を利用した、ＡＴＢ治療マウスにおける腫瘍サイズの予測。ＡＴＢで治療したマウスにニボルマブで治療中のＮＳＣＬＣ（２人の奏効者と４人のがん進行者）からの糞便を用いたＦＭＴを実施した（図１２）。個々のマウスの腫瘍サイズと、患者の糞便組成の間のスピアマン相関を、奏効者または非奏効者のメタゲノムシグネチャの中に存在するさまざまな細菌について示してある。
【図３７】アッカーマンシア・ムシニフィラを用いたＣＤ４の刺激と、エンテロコッカス・フェカーリスを用いたＣＤ４の刺激の比較。免疫療法中のそれぞれの転移性腎細胞がん患者について、単球／ＣＤ４＋Ｔ細胞同時培養物をさまざまな細菌で刺激した後のＣＤ４によるＩＦＮγ放出をＥＬＩＳＡによって求めた予測値。ＣＤ８−ＩＦＮγ（Ｔｃ１）を用いると、アッカーマンシア・ムシニフィラを用いた再刺激に反応して同様の結果が得られた。サイトカイン産生の中央値よりも上／下である各サブグループ（ＴＨ１：ＩＦＮγ、またはＴＲ１：ＩＬ−１０、または比ＩＦＮγ／ＩＬ−１０）の患者についてのＰＦＳを示すカプラン−マイヤー曲線を２系統の細菌について示してある。アッカーマンシア・ムシニフィラに対する記憶Ｔｈ１免疫反応と記憶Ｔｃ１免疫反応が、肺がん患者と腎臓がん患者の両方でＰＤ１阻止の間のＴＴＰを予測する（図示せず）。ログ−ランク。＊ｐ＜０．０５、＊＊  ｐ＜０．０１。
【図３８】免疫チェックポイント阻害剤に対する反応を回復させるため、奏効患者からの糞便を用いて腎臓がん患者（ＲＣＣ）のディスバイオシスを補償する。Ｂａｌｂ／ｃマウスを広域抗生剤で３日間治療した後、非奏効患者からの糞便を経口で強制的に摂取させた。２０日後、ＲＥＮＣＡ−ルシフェラーゼ腫瘍を本来の場所であるＢａｌｂ／ｃマウスの腎臓に接種した。その腫瘍は、レポータイメージングシステムＩＶＩを用いて追跡することができた。８日後、Ｂａｌｂ／ｃマウスの腹腔内に抗ＰＤ１抗体と抗ＣＴＬＡ４抗体を３日ごとに５回注射した。ｍＡｂを用いた各回の腹腔内治療の前日に、レシピエントである腫瘍を有するマウスに、抗ＰＤ１抗体をベースとする治療剤が奏効した１人のＲＣＣ患者からの糞便（１０１０  ｃｆｕ）を経口で強制的に摂取させた。異なる３人のＲＣＣ奏効患者（Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６）の糞便を使用した。腫瘍が成長する速度を追跡した。グラフは、安楽死させた時点の腫瘍のサイズを示している。個々のデータを示すとともに、３つの群Ｒ４〜Ｒ６からのデータをまとめたデータも示してある。分散統計分析：＊ｐ＜０．０５。
【図３９】メトロノミックシクロホスファミド（ＣＴＸ）に対する反応を回復させるため、健康なボランティア（ＨＶ）からの糞便を用いて乳がん患者（ＢＣ）のディスバイオシスを補償する。Ａ．実験設定。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを広域抗生剤で３日間治療した後、２人の乳がん患者（ＢＣ１とＢＣ２）からの糞便（化学療法の後にディスバイオシスを示していて多様性の低くなっているときに回収した糞便）を経口で強制的に摂取させた（ＦＭＴ）。ＢＣ１はトリプルネガティブのＢＣであって予後不良であるのに対し、ＢＣ２は予後良好である。２０日後、ＡＴ３乳がん同系マウスに腫瘍を皮下接種した。１０日後、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにメトロノミックＣＴＸを２日ごとに３回腹腔内投与した。初回はＣＴＸを用いた腹腔内治療の前日に、その後はＣＴＸを用いた腹腔内治療と同じ日に、レシピエントである腫瘍を有するマウスに１人のＨＶからの糞便（１０１０  ｃｆｕ）を経口で強制的に摂取させた。あるいは（ＨＶまたはＢＣからの糞便を用いたＦＭＴを実施した）マウスを３週間にわたって同居させた。Ｂ．腫瘍が成長する様子を追跡した。グラフは、腫瘍のサイズの経時変化と、安楽死させた時点のサイズを示している。分散統計分析：＊ｐ＜０．０５；＊＊  ｐ＜０．０１；＊＊＊  ｐ＜０．００１。
【図４０】免疫チェックポイント阻害剤に対する反応を回復させるため、所定の株を用いて非奏効腎臓がん患者（ＲＣＣ）のディスバイオシスを補償する。Ａ．Ｂａｌｂ／ｃマウスを広域抗生剤で３日間治療した後、非奏効患者からの糞便を経口で強制的に摂取させた。２０日後、ＲＥＮＣＡ−ルシフェラーゼ腫瘍を本来の場所であるＢａｌｂ／ｃマウスの腎臓に接種した。その腫瘍は、レポータイメージングシステムＩＶＩを用いて追跡することができた。８日後、Ｂａｌｂ／ｃマウスの腹腔内に抗ＰＤ１抗体と抗ＣＴＬＡ４抗体を３日ごとに５回注射した。モノクローナル抗体を用いた各回の腹腔内治療の前日に、レシピエントである腫瘍を有するマウスに１０１０  ｃｆｕのさまざまな株（Ｘ軸に記載）を経口で強制的に摂取させた。Ｂ．腫瘍が成長する速度を追跡した。グラフは、安楽死させた時点の腫瘍のサイズを示している。安楽死させた時点で腫瘍のないマウスの割合を下に示してある。分散統計分析：＊ｐ＜０．０５；＊＊  ｐ＜０．０１；＊＊＊  ｐ＜０．００１。
【図４１】免疫チェックポイント阻害剤に対する反応を回復させるため、バクテロイデス・サルイェルサエを用いて非奏効腎臓がん患者（ＲＣＣ）のディスバイオシスを補償する。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを広域抗生剤で３日間治療した後、非奏効ＲＣＣ患者からの糞便を経口で強制的に摂取させた。２０日後、ＭＣＡ２０５骨肉腫を皮下接種した。８日後、Ｂａｌｂ／ｃマウスの腹腔内に抗ＰＤ１抗体と抗ＣＴＬＡ４抗体を３日ごとに５回注射した。ｍＡｂを用いた各回の腹腔内治療の前日に、レシピエントである腫瘍を有するマウスに、１０１０  ｃｆｕのさまざまな株（Ｘ軸に記載）を経口で強制的に摂取させた。腫瘍が成長する速度を追跡した。グラフは、安楽死させた時点の腫瘍のサイズを示している。安楽死させた時点で腫瘍のないマウスの割合を下に示してある。分散統計分析：＊ｐ＜０．０５。
【図４２】抗ＰＤ１モノクローナル抗体に対する反応を回復させるため、６系統の菌株のコンソーシアムを用いてＮＳＣＬＣ肺がん患者のディスバイオシスを補償する。Ａ．Ｃ５７ＢＬ／６マウスを広域抗生剤で３日間治療した後、非奏効ＮＳＣＬＣ患者からの糞便を経口で強制的に摂取させた。２０日後、ＭＣＡ２０５骨肉腫を皮下接種した。８日後、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腹腔内に抗ＰＤ１抗体と抗ＣＴＬＡ４抗体を３日ごとに５回注射した。モノクローナル抗体を用いた各回の腹腔内治療の前日に、レシピエントである腫瘍を有するマウスに、１０１０  ｃｆｕのさまざまな株（図４２Ａに記載）を経口で強制的に摂取させた。Ｂ．腫瘍が成長する速度（平均値±ＳＥＭまたは個々の曲線）を追跡した。グラフは、最良の群における成長の経時的速度（growth kinetics over time）を示している（上図はマウスごと、下図は平均）。Ｃ．すべての群について、１３日目のすべての腫瘍のサイズをまとめた。腫瘍の分散統計分析：＊ｐ＜０．０５。
【図４３】特定の細菌コンソーシアムが抗ＰＤ１抗体の効果を改善することができる。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを広域抗生剤で３日間治療した後、肺がん患者からの糞便を経口で強制的に摂取させた（ＦＭＴ）。１５日後、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＭＣＡ２０５骨肉腫マウスの腫瘍を皮下接種した。４日後、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腹腔内に抗ＰＤ１抗体を３日ごとに合計４回注射し、場合によってはさまざまな株（Ｘ軸に記載）からなる１０９  ｃｆｕの細菌コンソーシアムを経口で強制的に摂取させた。腫瘍が成長する速度を追跡した。強制摂取させてから８日目の腫瘍の成長を示してある。それぞれの点は、１匹のマウスの腫瘍のサイズを表わす。似た結果が得られた２つの実験のうちの代表的な１つを示してある。
【図４４】バルネシエラ・インテスティニホミニスが、抗ＰＤ１抗体を用いた治療（とこの治療に対する反応）の特徴的なシグネチャに含まれている。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＭＣＡ２０５骨肉腫マウスの腫瘍を皮下接種した。６日後、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腹腔内に抗ＰＤ１抗体または抗ＰＤ１抗体／抗ＣＴＬＡ４抗体の組み合わせを３日ごとに合計６回注射した。各モノクローナル抗体を用いた治療と関係する特定の腸フィンガープリントを明確にするための、ＰＤ１阻止の後、またはＰＤ１＋ＣＴＬＡ４同時阻止の後の糞便メタゲノム分析。モノクローナル抗体をベースとした免疫療法剤を２回注射した後（Ｆ３）のＬｅｆｓｅ（Ａ）とボックスプロット（Ｂ）のグラフ。クラスカル−ウォリス分析：ｐ＜０．０５。ＭＣＡ２０５は骨肉腫であり、ＲＥＴは黒色腫である（示さず）。したがってバルネシエラ・インテスティニホミニスがＰＤ１阻止後に選択され、臨床上の利益と関係している。
【図４５】ヘマトキシリン・エオジン染色、または抗切断型カスパーゼ３抗体を用いた染色で腸毒性（陰窩の不規則さ、絨毛の喪失、炎症パターン）を分析する免疫組織化学。図４０〜図４２に記載されている実験設定。奏効者からの糞便を移植することにより、非奏効者からの糞便による毒性が低下する。ＦＭＴをオンコバックスで補償することによって大腸炎スコアが低下する。
【図４６】２つの独立な腫瘍マウスモデルにおける実験設定とサンプル回収のタイミング。異なる２つのマウス腫瘍モデルから糞便サンプルを回収するタイミング。ＭＣＡ−２０５骨肉腫またはＲＥＴ黒色腫をＳＰＦマウスに接種した後、抗ＰＤ−１モノクローナル抗体単独療法（ｎ＝６）、または抗ＰＤ−１モノクローナル抗体＋抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体の組み合わせ（ｎ＝６）、またはアイソタイプ対照抗体（ｎ＝６）で処置した。Ｆ１：腫瘍を接種する前。Ｆ２：腫瘍を接種してから５〜７日後かつ最初の処置前。Ｆ３：２回目の注射から４８時間後。Ｆ４：５回目の注射から４８時間後。Ｆ５：６回目の注射から４８時間後。
【図４７】ＭＣＡ２０５マウスモデルにおいて、腸内微生物叢の組成は、単独の抗ＰＤ−１モノクローナル抗体、または抗ＣＴＬＡ−１モノクローナル抗体との組み合わせを用いた治療と、腫瘍のサイズの影響を受ける。左図：主成分分析（Principle component analysis）（ＰＣＡ）のグラフは、糞便の１６Ｓ  ｒＲＮＡシークエンシング（図４６の実験設定）に由来する分類学的β多様性を、各群（アイソタイプ対照抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−１抗体＋抗ＣＴＬＡ−４抗体の組み合わせ）についての異なる時点Ｆ２−Ｆ３−Ｆ４におけるＢｒａｙ−Ｃｕｒｔｉｓ距離に基づいて示したものである。右図：各処置群について腫瘍のサイズを用いて細菌の分類学的多様度を評価する（ＡＮＯＳＩＭからの）Ｒ統計。Ｒ値が「１．０」に近いというのは、（１つの明確な基準に関して）群間に差があることを示唆しているのに対し、Ｒ値が「０」に近いというのは、群内と群間で高いランクと低いランクが均等に分布していることを示唆している。Ｒ値が「０」よりも小さいというのは、群内の差が群間の差よりも大きいことを示唆している。
【図４８】ＲＥＴマウスモデルにおいて、腸内微生物叢の変化はＩＣＢの組み合わせ（抗ＰＤ１抗体＋抗ＣＴＬＡ４抗体）の影響を受け、腫瘍のサイズと相関している。左図：主成分分析は、糞便の１６Ｓ  ｒＲＮＡシークエンシング（図４６の実験設定）で得られた分類学的β多様性を、各群（アイソタイプ対照抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−１抗体＋抗ＣＴＬＡ−４抗体の組み合わせ）についての異なる時点Ｆ２−Ｆ３−Ｆ４におけるＢｒａｙ−Ｃｕｒｔｉｓ距離に基づいて示したものである。右図：各処置群について腫瘍のサイズを用いて細菌の分類学的多様度を評価する（ＡＮＯＳＩＭからの）Ｒ統計。Ｒ値が「１．０」に近いというのは、（１つの明確な基準に関して）群間に差があることを示唆しているのに対し、Ｒ値が「０」に近いというのは、群内と群間で高いランクと低いランクが均等に分布していることを示唆している。Ｒ値が「０」よりも小さいというのは、群内の差が群間の差よりも大きいことを示唆している。
【図４９】特定のベースライン微生物叢組成と菌種が、図４６の実験設定においてＩＣＢに対する反応性または抵抗性を予測する。ＲＥＴまたはＭＣＡ−２０５を接種されたマウスのベースライン糞便組成（Ｆ２）の１６Ｓ  ｒＲＮＡパイロシークエンシング分析。どの処置（アイソタイプ対照抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−１抗体＋抗ＣＴＬＡ−４抗体の組み合わせ）を受けたかに関係なく、安楽死させたときにマウスを腫瘍のサイズに応じて奏効マウス（Ｒ）と非奏効マウス（ＮＲ）の２つの群に分けた。奏効マウスでは、７８系統の細菌が、ＮＲ群と比べてこのＲ群だけに見いだされた。
【図５０】免疫チェックポイント阻害剤の組み合わせ（抗ＰＤ−１抗体＋抗ＣＴＬＡ−４抗体）で治療したマウスにおける有益な反応に関係する種。ＭＣＡ−２０５またはＲＥＴを接種されたマウスのＦ２時点でのベースライン糞便サンプルに含まれる遺伝子アンプリコンの１６Ｓ  ｒＲＮＡパイロシークエンシング分析。両方の腫瘍モデルにおいて、抗ＰＤ−１抗体＋抗ＣＴＬＡ−４抗体で治療した奏効マウスで１６９系統の菌種が共通していた。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本明細書では以下の一般的な定義を用いる。
【００２２】
腸内微生物叢
「腸内微生物叢」（以前は腸内フローラまたはマイクロフローラと呼ばれていた）は、動物界に属する任意の生物（ヒト、動物、昆虫など）の腸に棲息する微生物の集団を意味する。各個体は独自の微生物叢組成を有する（合計４００〜５００系統の異なる菌種／個体のうちで６０〜８０系統の菌種が、サンプリングした集団の５０％超で共有されている）が、似た主要な生理学的機能を常に果たしており、各個体の健康に直接影響を与えている：
・胃と小腸が消化できないある種の食物（主に非消化性繊維）の消化に寄与する；
・何種類かのビタミン（ＢとＫ）の産生に寄与する；
・他の微生物からの攻撃から保護し、腸粘膜の健全さを維持する；
・独自の免疫系を発達させる際に重要な役割を果たす；
・健康で多様でバランスの取れた腸内微生物叢が、独自の腸機能を保証するカギである。
【００２３】
腸内微生物叢は、身体が正常に機能する上で重要な役割を持つことと、さまざまな機能を担っていることが考慮され、現在では１つの「器官」であると見なされている。しかし新生児は無菌で誕生するため、すなわち腸への細菌定着は誕生後に始まってその後進行するため、腸内微生物叢は「獲得された」器官である。
【００２４】
腸内微生物叢の発達は誕生時に始まる。子宮の内部は無菌であるため、新生児の消化管には、空気などが供給される環境である母親（膣、皮膚、乳房など）からの微生物がただちに定着する。３日目からは、腸内微生物叢の組成は、その新生児が何を摂取するかに直接依存する。例えば母乳を飲む乳児の腸内微生物叢は、乳児用調整乳を飲む乳児と比べると、主にビフィズス菌が支配している。
【００２５】
腸内微生物叢の組成は誕生から老年まで全生涯を通じて変化していくため、さまざまな環境の影響を受けた結果である。腸内微生物叢のバランスは、年齢を重ねていく間に影響を受ける可能性があるため、老人は若者とは実質的に異なった微生物叢を有する。
【００２６】
優勢な腸内微生物叢の一般的な組成は大半の健康な人で似ている（４つの主な門、すなわちフィルミクテス門、バクテロイデス門、放線菌門、プロテオバクテリア門）が、種レベルでの組成は高度に個別化されていて、主に個人の遺伝、環境、食事によって決まる。腸内微生物叢の組成は一時的または永続的に食品成分に適合したものになる可能性がある。例えば日本人は、微生物叢が海洋細菌から特殊な酵素を獲得したおかげで、海草（日常の食事の一部）を消化することができる。
【００２７】
ディスバイオシス
腸内微生物叢は変化に適応できて大きな復元力を有するが、いくつかの特別な状況では組成のバランスが崩れる可能性がある。それは、腸内の潜在的な「悪玉」細菌と「善玉」細菌の間のバランスの乱れ、すなわち主な細菌群の組成と多様性に関して「健康な」微生物叢であると考えられているものからのあらゆるずれであり、「ディスバイオシス」と呼ばれている。ディスバイオシスは、健康問題（機能性腸障害、炎症性腸疾患、アレルギー、肥満、糖尿病など）と結び付いている可能性がある。ディスバイオシスは、治療（細胞毒性療法、抗生剤療法など）の帰結である可能性もある。本明細書では、健康な個人の腸内微生物叢の組成と比べてがん患者で観察される腸内微生物叢の組成のあらゆるずれを「ディスバイオシス」と呼ぶとともに、表１と表２にそれぞれ記載されている個々の種のあらゆる過少出現と過剰出現を「ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１阻止に対する反応の欠如に関係するディスバイオシス」と呼ぶことにする。
【００２８】
抗腫瘍治療
「抗腫瘍治療」は、本明細書では、がんに関して手術を除くあらゆる治療を意味する。その中には、化学療法、ホルモン療法、生物学的療法、放射線療法が含まれる。
【００２９】
生物学的療法
抗がん「生物学的療法」には、がんを治療するため、生きている生物、生きている生物に由来する物質、実験室で製造したそのような物質を利用し、がん細胞を直接標的とすること、または身体の免疫系を刺激してがん細胞に作用させること（「免疫療法」）が含まれる。生物学的療法に含まれるのは、モノクローナル抗体（Ｍａｂ）（がん細胞の表面を標的とするもの（例えばリツキシマブ、アレムツズマブ）；抗ＣＴＬＡ４モノクローナル抗体（イピリムマブなど）；増殖因子を標的とするもの（例えばベバシズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、トラスツズマブ）；抗ＰＤ１モノクローナル抗体（ニボルマブ、ペムブロリズマブなど）；抗Ｔｉｍ３モノクローナル抗体；抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体（アテゾリズマブ、ドゥルバルマブ、アベルマブなど）；抗ＰＤ−Ｌ２モノクローナル抗体が含まれる）、アゴニスト抗体（抗ＩＣＯＳモノクローナル抗体、抗ＯＸ４０、抗４１ＢＢモノクローナル抗体）、免疫複合体（例えば９０Ｙ−イブロツモマブチウキセタン、１３１Ｉ−トシツモマブ、アドトラスツズマブエムタンシン）、サイトカイン（インターフェロン（ＩＦＮαなど）；インターロイキン（ＩＬ−２、ＩＬ−１１、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦなど）が含まれる）、治療用ワクチン（例えばＳｉｐｕｌｅｕｃｅｌ−Ｔ（Ｐｒｏｖｅｎｇｅ（登録商標）））、カルメット−ゲラン桿菌、がんを殺すウイルス（腫瘍溶解性）、遺伝子療法、養子Ｔ細胞移植である。
【００３０】
免疫チェックポイント阻害剤
本明細書では、「免疫チェックポイントをブロックする薬」または「免疫チェックポイント阻害剤」または「免疫チェックポイント阻害薬」は、免疫チェックポイントをブロックするあらゆる薬、分子、組成物を意味する。免疫チェックポイント阻害剤には特に、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（アテゾリズマブ、ドゥルバルマブなど）、抗ＰＤ−Ｌ２抗体が含まれる。さらに特定すると、免疫チェックポイント阻害剤として抗ＰＤ１モノクローナル抗体（ニボルマブ、ペムブロリズマブなど）が可能である。
【００３１】
「抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤（anti-PD1/PD-L1/PD-L2 Ab-based therapy）」は、本明細書では、ＰＤ１またはＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２と拮抗するあらゆる薬を示す。ＰＤ１またはＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２と拮抗させるのに現在用いられている薬はモノクローナル抗体だが、将来のＩＣＢ（例えば抗体フラグメントや特別に設計されたアプタマー）を開発するのにＰＤ１またはＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２に特異的に結合する他の分子を使用することができよう。もちろん「抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤」という用語には、ＰＤ１またはＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２と拮抗する活性な分子を用いた任意の治療（therapy）が含まれる。
【００３２】
プロバイオティクス
「プロバイオティクス」は、摂取したときに健康に有益であると主張されている微生物である。プロバイオティクスは、活性な生きた培養物が特別に添加された発酵食品の一部（ヨーグルトや豆乳など）として、または、食品サプリメントとして一般に消費されている。一般にプロバイオティクスは、腸内微生物叢が、バランス、健全さ、多様性を維持する（または回復する）のを助ける。本明細書では、「抗がんプロバイオティクス」という用語、または「オンコバックス」と「オンコミクロバイオティクス」という造語を、ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１阻止に対する反応や、抗ＣＴＬＡ４抗体＋抗ＰＤ１抗体、または抗ＣＴＬＡ４抗体＋抗ＰＤ−Ｌ１抗体に対する反応を回復するあらゆる常在細菌組成物を指すのに用いる。したがって本発明の文脈では、「プロバイオティック組成物」は、食品または食品サプリメントに限定されることはなく、一般に、患者にとって有益な微生物を含むあらゆる細菌組成物を指す。したがってそのようなプロバイオティック組成物は、薬剤または薬になることができる。
【００３３】
がん、治療など
本明細書では、「がん」は、あらゆる種類のがんを意味する。がんとして特に固形がんまたは非固形がんが可能である。がんの非限定的な例は癌腫または腺癌であり、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、肺がん、膵臓癌、大腸がん（colon cancer）、肉腫、リンパ腫、黒色腫、白血病、生殖細胞がん、芽細胞腫などが挙げられる。
【００３４】
免疫系はがんに対して二重の役割を果たしていて、腫瘍細胞の成長を阻止するとともに、腫瘍細胞の免疫原性を生み出しもする。したがって免疫チェックポイントをブロックする薬を用いると、実質的にあらゆる種類のがんを治療することができる。したがって本発明の方法は、がんを有する患者にとって有用である可能性がある。そのがんの選択は、副腎皮質がん、肛門がん、胆管がん（例えば末梢（ｐｅｒｉｐｈｉｌａｒ）がん、遠位胆管がん、肝内胆管がん）、膀胱がん、骨がん（例えば骨芽細胞腫、骨軟骨腫、血管腫、軟骨粘液線維腫、骨肉腫、軟骨肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、骨の巨大細胞腫、脊索腫、リンパ腫、多発性骨髄腫）、脳と中枢神経系のがん（例えば髄膜腫、星細胞腫、乏突起膠腫、上衣腫、神経膠腫、髄芽腫、神経節膠腫、シュワン細胞腫、胚細胞腫、頭蓋咽頭腫）、乳がん（例えば非浸潤性乳管がん、浸潤性乳管がん、浸潤性小葉がん、非浸潤性小葉がん、女性化乳房）、キャッスルマン病（例えば巨大リンパ節過形成、血管濾胞性リンパ節過形成）、子宮頸がん、大腸がん、子宮内膜がん（例えば子宮内膜腺癌、腺類がん、乳頭状漿液性腺癌、明細胞）、食道がん、胆嚢がん（粘液腺がん、小細胞がん）、消化管カルチノイド腫瘍（例えば絨毛がん、破壊性絨毛腺癌）、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、腎臓がん（例えば腎細胞がん）、咽頭と下咽頭のがん、肝臓がん（例えば血管腫、肝腺腫、限局性結節性過形成、肝細胞がん）、肺がん（例えば小細胞肺がん、非小細胞肺がん）、中皮腫、形質細胞腫、鼻腔と副鼻腔のがん（例えば嗅神経芽腫、正中肉芽腫）、上咽頭がん、神経芽腫、口腔と咽頭のがん、卵巣がん、膵臓がん、陰茎がん、下垂体がん、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫（例えば胎児性横紋筋肉腫、胞巣性横紋筋肉腫、多形性横紋筋肉腫）、唾液腺がん、皮膚がん（例えば黒色腫、非黒色腫皮膚がん）、胃がん、精巣がん（例えばセミノーマ、非セミノーマ生殖細胞がん）、胸腺がん、甲状腺がん（例えば濾胞性がん、退形成がん、低分化がん、甲状腺髄様がん、甲状腺リンパ腫）、膣がん、外陰がん、子宮がん（例えば子宮平滑筋肉腫）からなされる。より具体的には、本発明の方法を用いて免疫チェックポイントを標的とする薬に対する患者の反応を予測し、最適化することができる。ただしその患者が有するがんは、転移性黒色腫、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、中皮腫、膀胱がん、腎細胞がん、頭頸部がん、食道と胃のがん、直腸がん、肝がん、肉腫、ウィルムス腫瘍、ホジキンリンパ腫、ＡＬＫ−神経芽細胞腫、（ホルモン抵抗性）前立腺がん、ＧＩＳＴからなるグループから選択される。
他の定義は、あとで必要なときに記載することにする。
【００３５】
第１の側面によれば、本発明は、がん患者が、抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤の高奏効者である可能性が高いかどうかを判断するインビトロセラノスティクス法に関するものであり、この方法は、
（ｉ）その患者に由来する糞便サンプルの中で、表１と表２に開示されている微生物種から選択される少なくとも１０系統の微生物種の相対存在量を評価し；
（ｉｉ）各微生物について、工程（ｉ）で測定した相対存在量をあらかじめ決めた閾値と比較することを含んでいて
表１に開示されている微生物種が過剰出現し、表２に開示されている微生物種が過少出現していることが、患者が、抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤の高奏効者である可能性が高いことを示している。
【００３６】
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【００３７】
【表２】
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【００３８】
上記の方法の特定の一実施態様によれば、表１ａと表２ａに開示されている微生物種から選択される少なくとも１０系統の微生物種の相対存在量を工程（ｉ）で評価する。
【００３９】
【表３−１】
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【表３−２】
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【００４０】
【表４】
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【００４１】
上記の方法の別の特定の一実施態様によれば、表１ｂと表２ｂに開示されている微生物種から選択される少なくとも７系統、または８系統、または９系統、または１０系統の微生物種の相対存在量を工程（ｉ）で評価する。
【００４２】
【表５】
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【００４３】
【表６】
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【００４４】
ここまでの記述の中で、「過剰出現」は、各微生物種について、その種がサンプル中に、所定の閾値よりも多い相対存在量で存在することを意味する。もちろん「過少出現」は、その種がサンプル中に、所定の閾値よりも少ない相対存在量で存在することを意味する。
【００４５】
本発明の範囲で「あらかじめ決めた閾値」として使用できる閾値の例は、下記の実験の項に開示されている。もちろん当業者は、微生物の相対存在量の測定に用いる技術（例えば定量ＰＣＲ、マイクロアレイ上のハイブリダイゼーション、パイロシークエンシング）、具体的な抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体、患者の具体的な病理、患者の食習慣や、他の可能な因子に応じてその閾値を適合させること、または洗練させることができる。より一般には、上記の方法を実施するときに考慮すべき閾値は、免疫チェックポイント阻害剤によって治療されてその阻害剤に対する反応がわかっている個人からなる代表的なコホートの中の上記微生物の相対存在量を測定することによってあらかじめ決められる。
【００４６】
一実施態様によれば、閾値は、反応（感度と特異度）の予測が最良になるように計算する。例えば閾値は、ヨーデン指数が最大になるように計算する。
【００４７】
この方法の特定の一実施態様によれば、種のそれぞれに関して用いる閾値は、感度検出法（ＭＧＳ分析など）の検出限界である。そのような場合に評価するのは種の「相対存在量」ではなく、単にその存在（「過剰出現」に対応）または不在（「過少出現」に対応）である。このことは、下記の本発明による別の方法に関する記述にも当てはまり、そこでは「相対存在量」を「存在または不在」と読むことができ、「存在」は「過剰出現」と読むことができ、「不在」は「過少出現」と読むことができる。
【００４８】
本発明によれば、「菌種」は、腸内マイクロバイオーム（すなわち腸内微生物叢の遺伝子レパートリー）からの一群の細菌遺伝子であり、その量のレベルは、異なる個々のサンプル間で同じ割合で変化する。言い換えると、本発明の菌種は、個々の対象からのサンプル中の量レベルがランダムに分布しているのではなくて統計的に関連している細菌遺伝子配列のクラスターである。
【００４９】
メタゲノムデータを分析するための最新のアプローチは、参照ゲノムとの比較に基づいているが、ヒトの腸内微生物叢の多様性は、参照データベースによって現在カバーされる範囲を超えている。本明細書に開示されている結果の中で、発明者は、一連のメタゲノムサンプルで共通して豊富な遺伝子のビニングに基づく方法を利用した。この方法により、参照配列を必要とせずに新たな微生物を包括的に発見することが可能になる。以下の記述では、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２に対する抗体をベースとした治療剤に対する患者の反応においてある役割を果たしている可能性が高いと同定された種の大半が、新たに同定された種であり、まだ公開データベースには掲載されていない。同定された種（新たに同定された種と、すでに参照されている種の近縁種の両方）のそれぞれについて、本出願では重複を除いた配列である２５個の細菌遺伝子のセットを開示しており、それらを単独で、または組み合わせてトレーサ遺伝子として使用し、対応する種の存在と相対存在量を評価することができる。もちろん、本明細書に開示されている重複を除いた遺伝子のセットによって、または今後さらなる同定および／またはデータベースへの組み込みによって種が同定されると、当業者は、適切な任意の手段によって（例えば本出願に開示されている２５個の配列と共変する重複を除いた別の遺伝子のコピー数を測定することによって）その相対存在量を評価することができる。したがって本発明は、開示されている配列を用いて対応する種の相対存在量を測定することに限定されない。
【００５０】
表１と表２に示してあるように、抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２阻止に対する反応において重要な役割を果たしていると同定された種のいくつかは、すでに参照されていて例えばＮＣＢＩデータベースで入手できる種の近縁である。表１と表２の中の「対応する登録種」は、それぞれの種について、同定された近縁の生物（記載されている種の株）である。示されている登録種のそれぞれについて、発明者が同定したＣＡＧの遺伝子と参照ゲノムの間のアラインメントと一致の割合の平均値は、９３％超（アラインメント）と９８％（一致）である。
【００５１】
上記の方法の特定の一実施態様によれば、表１に開示されている微生物の過少出現と、表２に開示されている微生物の過剰出現は、患者が抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤に対して抵抗性である可能性が高いことを示す。そのような場合、患者には、別の治療剤を提案するか、後出のプロバイオティック組成物を用いた予備治療を提案することで、その患者の微生物叢を変化させ、抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤に反応する可能性を改善することができる。
【００５２】
本発明の方法を実施するときに表１と表２の中から選択される少なくとも１０系統の種の相対存在量が測定されるが、より多い系統の種（例えば１１系統、１２系統、１３系統、１４系統、１５系統、１６系統、１７系統、１８系統、１９系統、２０系統、２５系統、３０系統、３５系統、４０系統の種、またはそれよりも多くの種）を測定することによってこの方法を実施することができる。上記の方法の特定の一実施態様では、測定される種は、プロファイルの関連性が最適化されるように選択する。例えばフィルミクテス門の少なくとも５系統の種と、クロストリジウム目の３系統の種と、アリスティペス属の１系統の種と、ユウバクテリウム属の１系統の種と、バクテロイデス目の１系統の種と、メタノブレビバクター・スミティイの相対存在量を工程（ｉ）で測定する。この実施態様によれば、メタノブレビバクター・スミティイの相対存在量の代わりに、またはその相対存在量に加えて、アッカーマンシア・ムシニフィラの相対存在量を工程（ｉ）で測定することができる。
【００５３】
別の特定の一実施態様によれば、アナエロトランカス・コリホミニスと、オシリバクター属の少なくとも１系統の種の相対存在量も工程（ｉ）で測定する。
【００５４】
上記の方法は、ＰＤ１またはＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２の阻止が有効ながんを患っている任意の患者で用いると有利である可能性がある。もちろん、そのような治療剤で現在治療されていない何人かの患者が抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体の新たな適用者になる可能性があり、するとそのようながんを患っている患者は本発明の恩恵を得ることになろう。本発明は、新たな適応での臨床試験、および／または新たな分子を用いた臨床試験の枠組みにおいて、ＰＤ１またはＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２を阻止することの効果を判断する場合にも特に有用であることに注意されたい。特定の一実施態様によれば、本発明を実施して、肺がん（扁平細胞肺がんだけでなく、非小細胞肺腺癌または小細胞肺腺癌も含む）、腎細胞がん、頭頸部腫瘍、膀胱がん、肝臓がん、中皮腫、メルケル細胞がん、食道がん、胃がん、トリプルネガティブ乳がん、黒色腫、胸腺腫からなる群より選択されるがんを有する患者の反応／抵抗状態を評価する。
【００５５】
本発明の方法は、局所的に進行したがん、または転移がん、またはネオアジュバント状態の手術可能ながん（すなわち本発明の場合には、ＰＤ１またはＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２を阻止した後に手術で切除できる可能性のある腫瘍）を有する患者の反応／抵抗状態を評価して、例えば治療がうまくいかないと宣告された患者で手術後のサイクル数を減らしたり、治療を続けるため抗がんプロバイオティックを用いて補償したりするのに特に有用である。
【００５６】
下記の実験の項に開示されているように、本発明の方法は、抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤が第２または第３に選択される治療剤である患者にとって有用である。別の一実施態様によれば、この方法を実施して、その患者に第１選択肢の治療剤として抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤を投与する前に、その患者の反応状態または抵抗状態を評価するか、第１選択肢の治療剤として抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤がすでに投与された患者の反応状態または抵抗状態を評価する。
【００５７】
上記の方法は、抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤が単独で投与されるときだけでなく、抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤が抗ＣＴＬＡ４抗体またはＩＤＯ阻害剤、または他の任意の免疫調節剤と組み合わせて投与されるときに用いると有利である可能性がある。
【００５８】
すでに述べたように、上記の方法は、抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体を用いた治療を開始する前に、低奏効者にそのような治療剤を投与することを回避することを目的として、および／またはその低奏効者（poor responder）を適切な予備治療によって高奏効者に変換することを目的として利用できるが、奏効者／すでに抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体を投与された患者の抵抗状態を評価するのにも使用できる。そのような場合には、患者が抵抗性であると同定されているのであれば、治療を停止すること、またはその患者の反応を増大させる可能性が高い別の治療法と組み合わせることができる。そのような治療法は下に開示する。
【００５９】
上記の方法を実施するとき、各微生物の相対存在量を、サンプル中のその微生物に対して特異的な少なくとも１個、または２個、または５個、または１０個、または１５個、または２０個、または少なくとも２５個の核酸配列のコピー数を測定することによって評価することができる。当業者に知られている適切な任意の技術（ＰＣＲに基づく技術（Ｑ−ＰＣＲ、ＱＲＴ−ＰＣＲなど）、ハイブリダイゼーション（例えば核酸マイクロアレイを用いる）、シークエンシング（例えばＮＧＳによる）や、当業者に知られている他の適切な任意の技術など）を利用して上記の配列のコピー数を測定することができる。もちろん、所与の微生物に特異的な任意の核酸配列を選択してその微生物の相対存在量を測定することができる。例えば表１と表２に記載されている任意の配列のコピー数を測定することができる。所与の種に特異的な開示されている配列とともに共変する任意の配列を用いてその種の相対存在量を測定することもできることを理解されたい。データベースにすでに登録されている細菌と近縁な（または同一の）種の相対存在量は、表１と表２で同定された対応する登録種に特異的な任意の配列のコピー数を測定することによって評価できる。
【００６０】
特別な第１の実施態様では、表１と表２に掲載されている種に特異的な配列のコピー数は、ＰＣＲに基づく技術によって評価される。利用するＰＣＲ技術によって、開始時のＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡいずれかの量を定量的に測定することができる。本発明によるＰＣＲに基づく技術の非限定的な例に含まれるのは、定量ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、定量逆転写酵素ＰＣＲ（ＱＲＴ−ＰＣＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、ディジタルＰＣＲといった技術である。これらの技術は周知であって容易に利用できるため、詳しい説明は必要としない。特定の一実施態様では、本発明の細菌遺伝子のコピー数は、定量ＰＣＲによって求められる。
【００６１】
ＰＣＲに基づく技術は、測定される配列に対して特異的になるように設計された増幅プライマーを用いて実施される。したがって本発明は、上記の方法を実施するのに適したプライマーセット、すなわちその方法の工程（ｉ）で検出される微生物種（すなわち表１と表２に記載されている種のうちの少なくとも１０系統の種）のそれぞれに特異的な配列を増幅するためのプライマーペアを含むプライマーセットにも関する。このようなプライマーセットは少なくとも２０個のプライマーを含んでいるが、より多くのプライマー、例えば３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、１００個、２００個、３００個、５００個、１０００個、２０００個、またはそれよりも多くのプライマーを含むことができる。特定の一実施態様によれば、プライマーセットは、配列ＩＤ番号１〜１１２５から選択される１つの配列の一部を特異的に増幅する少なくとも１組のプライマーペアを含んでいる。もちろん、本発明のプライマーセットは、それぞれが配列ＩＤ番号１〜１１２５から選択される１つの配列の一部を特異的に増幅する２組、３組、４組、５組、１０組、２０組、３０組、４０組、５０組、６０組、７０組、８０組、１００組、２００組、３００組、５００組、１０００組、またはそれよりも多くのプライマーペアを含むことが有利である可能性がある。
【００６２】
別の特定の一実施態様では、選択される種の相対存在量を、工程（ｉ）において核酸マイクロアレイを用いて評価する。「核酸マイクロアレイ」は、固体支持体（マイクロチップ、またはスライドガラス、またはマイクロスフェアのサイズのビーズが可能である）に付着させたさまざまな核酸プローブからなる。プローブとして、ｃＤＮＡなどの核酸（「ｃＤＮＡマイクロアレイ」）またはオリゴヌクレオチド（「オリゴヌクレオチドマイクロアレイ」）が可能であり、オリゴヌクレオチドは長さを約２５〜約６０塩基対にすることができる。標的核酸サンプルのコピー数を求めるため、このサンプルに標識した後、ハイブリダイゼーション条件にてマイクロアレイと接触させることで、マイクロアレイの表面に付着したプローブ配列と、それと相補的な標的核酸の間に複合体を形成させる。その後、標識されているハイブリダイズした複合体の存在を検出する。当業者は、マイクロアレイハイブリダイゼーション技術の多くのバリエーションを利用することができる。
【００６３】
したがって本発明の方法を実施する設計にされた核酸マイクロアレイも本発明の一部である。そのような核酸マイクロアレイは、この方法の工程（ｉ）で検出される微生物種（すなわち表１と表２に記載されている種から選択される少なくとも１０系統の種）のそれぞれに特異的な核酸プローブを含んでいる。特定の一実施態様では、核酸マイクロアレイは、配列ＩＤ番号１〜１１２５から選択される少なくとも１つの配列に特異的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドマイクロアレイである。例えばこのマイクロアレイは、少なくとも４５個のオリゴヌクレオチドを含んでいて、各オリゴヌクレオチドは、表１と表２に記載されている個々の種の１つの配列に特異的である。本発明のマイクロアレイはもちろん、配列ＩＤ番号１〜１１２５の配列のそれぞれに特異的な１１２５個のオリゴヌクレオチドを含んでいる。本発明のマイクロアレイはさらに、少なくとも１つの対照菌種の少なくとも１つの遺伝子を検出するための少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含むことができる。便利な菌種として、例えばがんを有する個人と健康な個人で量が変わらない菌種が可能である。オリゴヌクレオチドは長さが約５０塩基であることが好ましい。配列ＩＤ番号１〜１１２５の任意の遺伝子に特異的な適切なマイクロアレイオリゴヌクレオチドは、各遺伝子のゲノム配列に基づき、本分野で知られている任意のマイクロアレイオリゴヌクレオチド設計法を利用して設計することができる。特に、マイクロアレイオリゴヌクレオチドの設計用に開発された入手可能な任意のソフトウエアを用いることができる。それは例えば、ＯｌｉｇｏＡｒｒａｙソフトウエア、ＧｏＡｒｒａｙｓソフトウエア、Ａｒｒａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒソフトウエア、Ｐｒｉｍｅｒ３ソフトウエア、Ｐｒｏｍｉｄｅソフトウエアなどであり、これらはすべて当業者に知られている。
【００６４】
さらに別の一実施態様によれば、対象から得られたサンプル中の少なくとも１つの細菌遺伝子のコピー数は、シークエンシングを利用して求められる。場合によってはシークエンシングの前に制限ヌクレアーゼによってＤＮＡを断片化する。シークエンシングは、本分野で知られている任意の技術（その中には、連結によるシークエンシング、パイロシークエンシング、合成によるシークエンシング、単分子シークエンシング、次世代シークエンシングが含まれる）を利用して実施される。シークエンシングには、ＰＣＲに基づく技術も含まれる（例えば定量ＰＣＲや、エマルジョンＰＣＲなど）。次世代シークエンシング（ＭＧＳ、「大規模並列ＤＮＡシークエンシング」とも呼ばれる）を実施するのに多数のプラットフォームを利用することができる。プラットフォームの非限定的な例は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒプラットフォーム、Ｒｏｃｈｅ  ４５４プラットフォーム、ＡＢＩ  ＳＯＬｉＤプラットフォーム、Ｈｅｌｉｃｏｓ単分子シークエンシングプラットフォーム、単一のポリメラーゼ分子を用いたリアルタイムシークエンシング（Ｅｉｄ他、２００９年）、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔシークエンシング（ＷＯ ２０１０／００８４８０）、ナノポアシークエンシング（Ｃｌａｒｋｅ他、２００９年）である。
【００６５】
当業者がシークエンシング法を利用して特定の遺伝子のコピー数を測定するとき、回収した情報を処理するのにバイオインフォマティクスのツールが必要とされる。実際、シークエンシングを利用すると、参照配列との比較によって全シークエンシングデータの中で求める核酸配列が同定される。したがって（シークエンシングされたデータと参照配列の間の）アラインメントが実行されると、当業者は一致率の閾値を選択する。ある配列が参照配列と一致すると見なされるのは、その閾値を超えたときである。例えば一実施態様では、関係する菌種の核酸配列は、表１と表２に記載されている種に含まれる核酸配列と比較することによって全シークエンシングデータの中で同定される。この比較は、配列ＩＤ番号１〜１１２５の配列との配列一致のレベル、または表１と表２に記載されている種または「対応する登録種」に含まれる他の核酸配列との配列一致のレベルに基づくことが好ましい。したがって配列ＩＤ番号１〜１１２５の核酸配列と少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または１００％一致する核酸配列は、抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体に対する反応または抵抗性においてある役割を果たすことが明らかにされている菌種の１つに含まれる配列であると同定される。
【００６６】
「配列一致」という用語は、本明細書では、２つの核酸配列が一致することを意味する。２つのアミノ酸配列の一致率を求めるには、最適な比較ができるように配列をアラインメントする。この比較において、配列は、同じ長さにすること、または異なる長さにすることができる。いくつかのアラインメントアルゴリズムとソフトウエア（例えばＢＬＡＳＴソフトウエアなど）が利用でき、それらを用いて比較ウインドウで２つの配列の間の一致率を評価することができる。当業者は、適切な任意のアルゴリズムと方法を自由に利用してシークエンシングされたデータと参照配列の間の一致率を評価する。
【００６７】
本発明の別の１つの側面は、プロバイオティック組成物である。
【００６８】
一実施態様によれば、この組成物は、エンテロコッカス・ヒラエ、アッカーマンシア・ムシニフィラ、アリスティペス・シャヒイ、アリスティペス属の他の種と、これらの混合物からなる群より選択される細菌を含んでいる。
【００６９】
一実施態様によれば、この組成物は、がんを治療するため、抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤と組み合わせて用いられる。治療でのこの利用の基礎は、そのような組成物ががん患者で免疫刺激を誘導することにある。本発明の組成物と抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤を組み合わせて投与すると相乗効果につながるため、抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤がまったく奏効しなかった患者やよく奏効しなかった患者が奏効者になる。興味深いことに、図４５と下記の実施例２３に示してあるように、本発明の組成物は、抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤のいくつかの副作用も予防する。
【００７０】
一実施態様によれば、本発明のプロバイオティック組成物は、エンテロコッカス・ヒラエ、アッカーマンシア・ムシニフィラ、アリスティペス・インディスティンクタス、アリスティペス属の他の種の１つまたはいくつかの単離体と、これらの混合物からなる群より選択される細菌を含んでいる。別の組成物は、エンテロコッカス・ヒラエ、アッカーマンシア・ムシニフィラ、アリスティペス・インディスティンクタス、ユウバクテリウム属の種（ユウバクテリウム・リモサムなど）、フィルミクテス門の種（クリステンセネラ・ミヌタ、ディエルマ・ファスティディオサ、フラボニフラクター・プラウティイなど）、バクテロイデス綱  （バクテロイデス・フラギリス、バクテロイデス・サルイェルサエ、バルネシエラ・インテスティニホミニスなど）、放線菌  （コリンセラ・インテスティナリス、コリンセラ・タナカエイ、アクチノチグナム・シャアリイなど）、古細菌メタノブレビバクター・スミティイからなる群より選択される少なくとも５系統の菌種を含んでいる。抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤を投与されているがん患者で免疫刺激を誘導するため本発明に従って使用できる特定の一つの組成物は、エンテロコッカス・ヒラエおよび／またはアッカーマンシア・ムシニフィラおよび／またはアリスティペスおよび／またはクリステンセネラ・ミヌタを含む細菌組成物である。
【００７１】
本明細書では、がん患者に投与すると有利である可能性がある細菌を含む本発明の組成物は、区別なく「プロバイオティック組成物」、「細菌組成物」、「オンコバックス組成物」と呼ばれ、組成物が細菌を含むことが文脈から明らかであるときには単に「組成物」と呼ばれる。
【００７２】
特定の一実施態様によれば、本発明の組成物は、フィルミクテス門の種、クロストリジウム目の種、アリスティペス属の種、ユウバクテリウム属の種、バクテロイデス目の種、メタノブレビバクター・スミティイ、アッカーマンシア・ムシニフィラ、エンテロコッカス・ヒラエからなる群より選択される少なくとも２系統の菌種、例えばエンテロコッカス・ヒラエ、アッカーマンシア・ムシニフィラ、アリスティペス属の種、ユウバクテリウム属の種、ルミノコッカス科、クロストリジウム目の種、バクテロイデス目の種、放線菌、コリオバクテリウム目の種、メタノブレビバクター・スミティイからなる群より選択される少なくとも２系統の菌種を含んでいる。本発明のプロバイオティック組成物で使用できるエンテロコッカス・ヒラエ株の非限定的な例は、国立微生物菌株保存機関（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ：ＣＮＣＭ）に２０１３年１１月７日に番号Ｉ−４８１５で寄託されたエンテロコッカス・ヒラエ株１３１４４、ＣＮＣＭに２０１７年８月３１日に番号Ｉ−５２２４で寄託されたエンテロコッカス・ヒラエ株ＩＧＲ７、ＣＮＣＭに２０１７年１１月２７日に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５２６０で寄託されたエンテロコッカス・ヒラエ株ＩＧＲ４、ＣＮＣＭに２０１７年１１月２７日に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５２６１で寄託されたエンテロコッカス・ヒラエ株ＩＧＲ１１である。（上に列挙したものや、それ以外のものの中の）エンテロコッカス・ヒラエ株の２つ、または３つ、または４つ以上の混合物も本発明の範囲で用いることができる。
【００７３】
一実施態様によれば、本発明の組成物は、エンテロコッカス・ヒラエ、アッカーマンシア・ムシニフィラ、アリスティペス・インディスティンクタス、アリスティペスの他の種と、これらの混合物の少なくとも１つまたはいくつかの単離体を含んでいる。別の組成物は、エンテロコッカス・ヒラエ、アッカーマンシア・ムシニフィラ、アリスティペス・インディスティンクタス、ユウバクテリウム属の種（ユウバクテリウム・リモサムなど）、フィルミクテス門の種（クリステンセネラ・ミヌタ、ディエルマ・ファスティディオサ、フラボニフラクター・プラウティイなど）、バクテロイデス綱（バクテロイデス・フラギリス、バクテロイデス・サルイェルサエ、バルネシエラ・インテスティニホミニスなど）、放線菌  （コリンセラ・インテスティナリス、コリンセラ・タナカエイ、アクチノチグナム・シャアリイなど）、古細菌メタノブレビバクター・スミティイからなる群より選択される少なくとも５系統の菌種を含んでいる。抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤を投与されているがん患者で免疫刺激を誘導するため本発明に従って使用できる特定の一つの組成物は、エンテロコッカス・ヒラエおよび／またはアッカーマンシア・ムシニフィラおよび／またはアリスティペスおよび／またはクリステンセネラ・ミヌタのうちの２つを含むことが最も好ましい細菌組成物である。
【００７４】
一実施態様によれば、組成物はさらに、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス、クロストリジウム目の種、ロセブリア、ブラウティア、フィーカリバクテリウム、ルミノコッカス科、フラボニフラクター・プラウティイ、バークホリデリア・セパシアからなる群より選択される細菌を含んでいる。
【００７５】
本発明のプロバイオティック組成物の好ましい一実施態様によれば、この組成物はエンテロコッカス・ヒラエとアッカーマンシア・ムシニフィラを含んでいる。
【００７６】
本発明のプロバイオティック組成物の好ましい一実施態様によれば、この組成物は、アリスティペス・シャヒイまたはアリスティペス属の他の種を、エンテロコッカス・ヒラエおよびアッカーマンシア・ムシニフィラとともに、またはエンテロコッカス・ヒラエおよびアッカーマンシア・ムシニフィラなしで含んでいる。
【００７７】
そのような組成物はさらに、バークホリデリア・セパシアおよび／またはバクテロイデス・フラギリスおよび／またはアクチノチグナム・シャアリイおよび／またはアリスティペス・インディスティンクタスおよび／またはアリスティペス・オンデルドンキイを含むことが有利である可能性がある。
【００７８】
特定の一実施態様によれば、本発明の組成物は、
−  クロストリジウム目のクリステンセネラ・ミヌタという種の細菌；および／または
−  エリュシペロトリクス綱のディエルマ・ファスティディオサまたはエリュシペラトクロストリジウム・ラモサムという種；および／または
−  アリスティペス属のアリスティペス・シャヒイ、アリスティペス・インディスティンクタス、アリスティペス・オンデルドンキイ、アリスティペス・フィネゴルディイからなる群より選択される種；および／または
−  ユウバクテリウム属のユウバクテリウム・リモサムという種の細菌；および／または
−  バクテロイデス目のバクテロイデス・フラギリス、バクテロイデス・セイリヤーシアエ、バルネシエラ・インテスティニホミニスからなる群より選択される種、特に  バクテロイデス・セイリヤーシアエおよび／またはバルネシエラ・インテスティニホミニス；および／または
−  放線菌門のアクチノチグナム・シャアリイという種の細菌；および／または
−  コリオバクテリウム目のコリンセラ・インテスティナリスおよび／またはコリンセラ・タナカエイという種の細菌；および／または
−  フィルミクテス門のフラボニフラクター・プラウティイ
−  古細菌のメタノブレビバクター・スミティイという種を含んでいる。
【００７９】
ディスバイオシスを補償して抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤に対する反応を回復させるのに特に有効であることが証明されているいくつかの細菌コンソーシアムを下記の実施例に示す（少なくとも図４２と図４３を参照されたい）。したがって本発明は、特定の細菌コンソーシアムを含む組成物に関する。
【００８０】
本発明の特定の一実施態様によれば、組成物は、
（ｉ）株１３１４４（ＣＮＣＭ  Ｉ−４８１５）、株ＩＧＲ７（ＣＮＣＭ  Ｉ−５２２４）、株ＩＧＲ４（ＣＮＣＭ  Ｉ−５２６０）、株ＩＧＲ１１（ＣＮＣＭ  Ｉ−５２６１）と、これらの混合物からなる群より選択されるエンテロコッカス・ヒラエ；と
（ｉｉ）アッカーマンシア・ムシニフィラ、例えば株ｐ２２６１および／またはｐ３４１５（両方ともリケッチアユニットの菌株保存機関（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｄｅ  ｓｏｕｃｈｅｓ  ｄｅ  ｌ’Ｕｎｉｔｅ  ｄｅｓ  Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｅｓ：ＣＳＵＲ）に寄託された）；と  
（ｉｉｉ）ユウバクテリウム・リモサムを含んでいる。
【００８１】
本発明の別の特定の一実施態様によれば、組成物は、
（ｉ）株１３１４４（ＣＮＣＭ  Ｉ−４８１５）、株ＩＧＲ７（ＣＮＣＭ  Ｉ−５２２４）、株ＩＧＲ４（ＣＮＣＭ  Ｉ−５２６０）、株ＩＧＲ１１（ＣＮＣＭ  Ｉ−５２６１）と、これらの混合物からなる群より選択されるエンテロコッカス・ヒラエ；と
（ｉｉ）バルネシエラ・インテスティニホミニスを含んでいる。
【００８２】
本発明のさらに別の特定の一実施態様によれば、組成物は、
（ｉ）株１３１４４（ＣＮＣＭ  Ｉ−４８１５）、株ＩＧＲ７（ＣＮＣＭ  Ｉ−５２２４）、株ＩＧＲ４（ＣＮＣＭ  Ｉ−５２６０）、株ＩＧＲ１１（ＣＮＣＭ  Ｉ−５２６１）と、これらの混合物からなる群より選択されるエンテロコッカス・ヒラエ；と
（ｉｉ）クリステンセネラ・ミヌタを含んでいる。
【００８３】
本発明のさらに別の特定の一実施態様によれば、組成物は、
（ｉ）株１３１４４（ＣＮＣＭ  Ｉ−４８１５）、株ＩＧＲ７（ＣＮＣＭ  Ｉ−５２２４）、株ＩＧＲ４（ＣＮＣＭ  Ｉ−５２６０）、株ＩＧＲ１１（ＣＮＣＭ  Ｉ−５２６１）と、これらの混合物からなる群より選択されるエンテロコッカス・ヒラエ；と
（ｉｉ）アクチノチグナム・シャアリイを含んでいる。
【００８４】
本発明によれば、上記の組成物は、がん患者でディスバイオシスを補償する薬として用いることが好ましい。この組成物は特に、がん患者に投与される抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤に対するアジュバントとして用いることができる。
【００８５】
本発明の組成物は、抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤および／または抗ＣＴＬＡ−４抗体をベースとした治療剤の腸毒性（免疫チェックポイント阻害剤による治療に付随することがしばしばある例えば陰窩の不規則さ、絨毛の喪失、炎症パターン）を低下させるか予防する薬としても有効である。
【００８６】
上記のプロバイオティック組成物は、経口投与用に製剤化されて食品サプリメントまたは機能食品として投与すると有利である可能性がある。当業者は多彩な製剤（生きている微生物や死んだ微生物が含まれる）を知っており、食品サプリメント（例えばピル、錠剤など）や機能性食品（飲料、発酵したヨーグルトなど）として存在することができる。本発明の組成物は、薬剤として、カプセル、ピル、溶液にすることもできる（例えばカプセル内の凍結乾燥させた細菌など）。
【００８７】
すでに述べたように、本発明による上記のプロバイオティック組成物は、それを必要とする患者に抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤と組み合わせて投与すると有利である可能性がある。そのような組み合わせにすると、プロバイオティクス細菌組成物は、好ましいことに免疫刺激を誘導する。
【００８８】
本明細書では、「組み合わせて」という表現は、２つ以上の薬剤（例えばプロバイオティック組成物株と抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体）を使用することを意味する。「組み合わせて」という表現によって治療剤を患者に投与する順番が制限されることはないが、プロバイオティクス株を抗腫瘍治療剤の前に、または抗腫瘍治療剤と同時に投与することが好ましい。例えばプロバイオティック株は、抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体の前（例えば６時間前、１２時間前、２４時間前、４８時間前、７２時間前、９６時間前、１週間前、２週間前、３週間前、４週間前、５週間前、６週間前、８週間前、１２週間前のいずれか）に投与することができ、抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤を投与する前に予定通りに、または数回（例えば毎日）投与される。したがってがん患者を治療する方法として、その患者にＰＤ１またはＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２を阻止する薬を投与する前に上記の組成物（例えばフィルミクテス門の種、クロストリジウム目の種、アリスティペス属の種、ユウバクテリウム属の種、バクテロイデス目の種、メタノブレビバクター・スミティイ、アッカーマンシア・ムシニフィラ、エンテロコッカス・ヒラエからなる群より選択される少なくとも２系統の菌種を含むプロバイオティック細菌組成物）を投与することを含む方法も本発明の一部である。
【００８９】
上記のプロバイオティック組成物は、ＰＤ１だけを阻止する文脈、またはＣＴＬＡ４も同時に阻止する文脈で特に有用である。
【００９０】
特定の１つの側面によれば、本発明は、がんの治療に用いるため、エンテロコッカス・ヒラエ、アッカーマンシア・ムシニフィラ、アリスティペス属の種と、これらの混合物からなる群より選択される細菌を含んでいて、抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤と組み合わされてがん患者で免疫刺激を誘導するプロバイオティック組成物に関する。
【００９１】
本発明のプロバイオティック組成物は、抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤に対して抵抗性である可能性が高いことが同定されたがん患者を治療するアジュバント治療剤として特に有用である。
【００９２】
特定の一実施態様によれば、本発明のプロバイオティック組成物は、患者に抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤を投与する前、または投与している間に投与される。例えば、抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療の全期間にわたって３日ごとに投与されたり、抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体（典型的には１年半にわたって１ヶ月に１回投与される）を毎回静脈内に投与する少なくとも前日と翌日に投与されたりする。
【００９３】
別の特定の一実施態様によれば、患者は、自らの腸内に存在する細菌の少なくとも一部を殺すか除去することになる治療を、本発明のプロバイオティック組成物の投与前に受ける。そのような治療は、プロバイオティック組成物の中に存在する「好ましい」細菌の定着を促進することを目的としている。そのような予備治療の非限定的な例は、ポリエチレングリコールおよび／または短期間（典型的には３日間）の広域抗生剤（例えばアンピシリンやセファロスポリン）の投与である。したがってがん患者を治療する方法として、その患者に（ｉ）ポリエチレングリコールおよび／または短期間の広域抗生剤を投与し、次いで（ｉｉ）上記のプロバイオティック細菌組成物と、（ｉｉｉ）ＰＤ１またはＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２を阻止する薬を投与することを含む方法も本発明の一部である。
【００９４】
別の１つの側面によれば、本発明の組成物は、がんの再発を防止する免疫刺激治療剤として用いられる。したがって例えばＰＤ１またはＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２を阻止する薬を用いたがんの治療を受けたことがある個人でがんの再発を防止する方法も本発明の一部であり、この方法では、上記の組成物を免疫刺激治療剤としてその個人に投与する。
【００９５】
本発明は、抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤を必要とする個人が、この治療剤を投与される前に細菌の補償を必要とするかどうかを判断するセラノスティクス法にも関する。実際、抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤は、起こりうる副作用とコストの両方の負担が大きいため、その治療剤が患者に確実に利益をもたらすようすべてが取り計らわれる必要がある。
【００９６】
したがって本発明は、がん患者が、抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤を投与される前に細菌の補償を必要とするかどうかを判断するセラノスティクス法に関するものであり、この方法は、その患者に由来する糞便サンプルの中で、アッカーマンシア・ムシニフィラの存在または不在を評価することを含んでいて、アッカーマンシア・ムシニフィラがその糞便サンプルの中に不在である場合には、患者は、上記の細菌組成物または糞便微生物組成物（a bacterial composition or a fecal microbial composition）を用いた細菌の補償を必要とする。
【００９７】
抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤を投与する前に細菌の補償を必要とするかどうかを判断するための本発明による別のセラノスティクス法は、その患者に由来する糞便サンプルの中で、エンテロコッカス・ヒラエの存在または不在を評価することを含んでいて、エンテロコッカス・ヒラエがその糞便サンプルの中に不在である場合には、患者は、上記の細菌組成物または糞便微生物組成物を用いた細菌の補償を必要とする。
【００９８】
抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤を投与する前に細菌の補償を必要とするかどうかを判断するための本発明による別のセラノスティクス法は、その患者に由来する糞便サンプルの中で、ルミノコッカス属の種ＣＡＧ：３５３、ルミノコッカス属の細菌  ＬＭ１５８、ルミノコッカス・トルケス２、ルミノコッカス科細菌Ｄ１６の存在または不在を評価することを含んでいて、ルミノコッカス属の種ＣＡＧ：３５３、ルミノコッカス属の細菌  ＬＭ１５８、ルミノコッカス・トルケス２、ルミノコッカス科細菌Ｄ１６のどれもその糞便サンプルの中に存在しない場合には、患者は、上記の細菌組成物または糞便微生物組成物を用いた細菌の補償を必要とする。
【００９９】
抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤を投与する前に細菌の補償を必要とするかどうかを判断するための本発明による別のセラノスティクス法は、その患者に由来する糞便サンプルの中で、アリスティペス属の種ＣＡＧ：４３５、アリスティペス属の種ＣＡＧ：５１４、アリスティペス・インディスティンクタスＣＡＧ３２８、アリスティペス属の種ＣＡＧ／２６８の存在または不在を評価することを含んでいて、アリスティペス属の種ＣＡＧ：４３５、アリスティペス属の種ＣＡＧ：５１４、アリスティペス・インディスティンクタスＣＡＧ３２８、アリスティペス属の種ＣＡＧ／２６８のどれもその糞便サンプルの中に存在しない場合には、患者は、上記の細菌組成物または糞便微生物組成物を用いた細菌の補償を必要とする。
【０１００】
抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤を投与する前に細菌の補償を必要とするかどうかを判断するための本発明による別のセラノスティクス法は、その患者に由来する糞便サンプルの中で、バクテロイデス・キシラニソルベンスＣＡＧ９４５、バクテロイデス・ユニフォルミスＣＡＧ１５９、バクテロイデス・オバタスＣＡＧ１１６５、プレボテラＣＡＧ：２５５、ＣＡＧ１６３、ルミノコッカス・ブロミイＣＡＧ６１１、ロセブリア・インテスティナリスＣＡＧ２９１、ユウバクテリウムＣＡＧ：３８、ＣＡＧ  ６２９の存在または不在を評価することを含んでいて、バクテロイデス・キシラニソルベンスＣＡＧ９４５、バクテロイデス・ユニフォルミスＣＡＧ１５９、バクテロイデス・オバタスＣＡＧ１１６５、プレボテラＣＡＧ：２５５、ＣＡＧ１６３、ルミノコッカス・ブロミイＣＡＧ６１１、ロセブリア・インテスティナリスＣＡＧ２９１、ユウバクテリウムＣＡＧ：３８、ＣＡＧ  ６２９のいずれかがその糞便サンプルの中に存在する場合には、患者は、上記の細菌組成物または糞便微生物叢組成物を用いた細菌の補償を必要とする。
【０１０１】
抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤を投与する前に細菌の補償を必要とするかどうかを判断するための本発明による別のセラノスティクス法は、その患者に由来する糞便サンプルの中で、フィルミクテス門の細菌、ユウバクテリウム、ブラウティア、ロセブリアからなる群より選択される短鎖脂肪酸産生クロストリジウム科の存在または不在を評価することを含んでいて、その糞便サンプルの中にフィルミクテス門の細菌、ユウバクテリウム、ブラウティア、ロセブリアが不在であることが、患者が、エンテロコッカス・ヒラエおよび／またはアッカーマンシア・ムシニフィラを用いた細菌の補償を必要とするか、上記の組成物または糞便微生物叢組成物を用いた細菌の補償を必要とすることを示している。
【０１０２】
抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤を投与する前に細菌の補償を必要とするかどうかを判断するための本発明による別のセラノスティクス法は、その患者に由来する糞便サンプルの中で、ディエルマ・ファスティディオサの存在または不在を評価することを含んでいて、ディエルマ・ファスティディオサがその糞便サンプルの中に不在である場合には、患者が、エンテロコッカス・ヒラエおよび／またはアッカーマンシア・ムシニフィラを用いた細菌の補償を必要とするか、上記の細菌組成物または糞便微生物叢組成物を用いた細菌の補償を必要とすることを示している。
【０１０３】
下記の実験の項に示されている本発明の別の側面によれば、本発明は、がん患者が、がんに関係するディスバイオシスを有するかどうかを評価するインビトロの方法に関するものであり、この方法は、その患者に由来する糞便サンプルの中で、フィーカリバクテリウムＣＡＧ２９７、ブラウティアＣＡＧ１７９、ロセブリアＣＡＧ５５、パラインフルエンザ菌（Haemophila parainfluenzae）ＣＡＧ１０５６、クロストリジウム目ＣＡＧ１１３２、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス、フィルミクテス門ＣＡＧ１３０８、フィルミクテス門の細菌ＣＡＧ７１３、ビフィドバクテリウム・デンティウム、エンテロコッカス・フェカーリス、サブドリグラヌラムＣＡＧ１４０、ラクノスピラ科の細菌ＣＡＧ１４、クロストリジウム・イノキュウムＣＡＧ３６、ルミノコッカス・トルケス１、ハンガテラ・ハテワイイ１  ＣＡＧ２５、大腸菌ＣＡＧ  １１、大腸菌ＣＡＧ  ３７１、クロストリジウム目ＣＡＧ５３３、ティゼレラ・ネキシリスＣＡＧ３１１からなる群より選択される少なくとも１０系統、または１１系統、または１２系統、または１３系統、または１４系統、または１５系統、または１６系統、または１７系統、または１８系統、または１９系統の微生物種の存在を評価することを含んでいて、
−  ビフィドバクテリウム・デンティウム、エンテロコッカス・フェカーリス、サブドリグラヌラムＣＡＧ１４０、ラクノスピラ科の細菌ＣＡＧ１４、クロストリジウム・イノキュウムＣＡＧ３６、ルミノコッカス・トルケス１、ハンガテラ・ハテワイイ１  ＣＡＧ２５、大腸菌ＣＡＧ  １１、大腸菌ＣＡＧ  ３７１、クロストリジウム目ＣＡＧ５３３、ティゼレラ・ネキシリスＣＡＧ３１１からなる群より選択される微生物種が存在し、
−  フィーカリバクテリウムＣＡＧ２９７、ブラウティアＣＡＧ１７９、ロセブリアＣＡＧ５５、パラインフルエンザ菌ＣＡＧ１０５６、クロストリジウム目ＣＡＧ１１３２、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス、フィルミクテス門ＣＡＧ１３０８、フィルミクテス門の細菌ＣＡＧ７１３からなる群より選択される微生物種が不在であることが、患者が、がんに関係するディスバイオシスを有することを示している。
【０１０４】
がんの治療を受けている患者、またはがんの治療を受けたことがある患者で再発を予測するインビトロの方法にも関係しており、この方法は、異なる時点でその患者から得られた糞便サンプルの中で、フィーカリバクテリウムＣＡＧ２９７、ブラウティアＣＡＧ１７９、ロセブリアＣＡＧ５５、パラインフルエンザ菌ＣＡＧ１０５６、クロストリジウム目ＣＡＧ１１３２、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス、フィルミクテス門ＣＡＧ１３０８、フィルミクテス門の細菌ＣＡＧ７１３、ビフィドバクテリウム・デンティウム、エンテロコッカス・フェカーリス、サブドリグラヌラムＣＡＧ１４０、ラクノスピラ科の細菌ＣＡＧ１４、クロストリジウム・イノキュウムＣＡＧ３６、ルミノコッカス・トルケス１、ハンガテラ・ハテワイイ１  ＣＡＧ２５、大腸菌ＣＡＧ  １１、大腸菌ＣＡＧ  ３７１、クロストリジウム目ＣＡＧ５３３、ティゼレラ・ネキシリス  ＣＡＧ３１１からなる群より選択される少なくとも５系統、または６系統、または７系統、または８系統、または９系統、または１０系統、または１１系統、または１２系統、または１３系統、または１４系統、または１５系統、または１６系統、または１７系統、または１８系統、または１９系統の微生物種の存在を評価することを含んでいて、
−  ビフィドバクテリウム・デンティウム、エンテロコッカス・フェカーリス、サブドリグラヌラムＣＡＧ１４０、ラクノスピラ科の細菌ＣＡＧ１４、クロストリジウム・イノキュウムＣＡＧ３６、ルミノコッカス・トルケス１、ハンガテラ・ハテワイイ１  ＣＡＧ２５、大腸菌ＣＡＧ  １１、大腸菌ＣＡＧ  ３７１、クロストリジウム目ＣＡＧ５３３、ティゼレラ・ネキシリスＣＡＧ３１１からなる群より選択される微生物種が増加し、
−  フィーカリバクテリウムＣＡＧ２９７、ブラウティアＣＡＧ１７９、ロセブリアＣＡＧ５５、パラインフルエンザ菌ＣＡＧ１０５６、クロストリジウム目ＣＡＧ１１３２、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス、フィルミクテス門ＣＡＧ１３０８、フィルミクテス門の細菌ＣＡＧ７１３からなる群より選択される微生物種が減少していることが、患者で再発する可能性が高いことを示している。
【０１０５】
本発明は、がん患者が抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤を用いた治療からの恩恵を受ける可能性が高いかどうかを、その患者からの記憶Ｔ細胞の分析に基づいて生体外で判断する方法にも関する。これらの方法では、患者に由来する血液サンプルの中のバークホリデリア・セパシア、および／またはエンテロコッカス・ヒラエ、および／またはバクテロイデス・フラギリスに対する記憶Ｔｈ１細胞または記憶Ｔｃ１細胞の存在が評価され、バークホリデリア・セパシアとエンテロコッカス・ヒラエに対する記憶Ｔｈ１細胞または記憶Ｔｃ１細胞の存在が、患者がその治療の高奏効者である可能性が高いことを示し、バクテロイデス・フラギリスに対する記憶Ｔｈ１細胞または記憶Ｔｃ１細胞の存在が、患者がその治療の低奏効者である可能性が高いことを示している。
【０１０６】
がん患者が抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤を用いた治療からの恩恵を受ける可能性が高いかどうかを生体外で判断するための本発明による別の方法は、下記の実験の項に示してあるように、患者に由来する血液サンプルの中のアッカーマンシア・ムシニフィラに対する記憶Ｔｈ１細胞または記憶Ｔｃ１細胞の存在を評価することを含んでいて、アッカーマンシア・ムシニフィラに対する（ＩＦＮγを産生する）記憶ＣＤ４＋Ｔｈ１細胞または記憶ＣＤ８＋Ｔｃ１細胞、または（ＩＬ−１０を産生する）記憶ＣＤ４＋  Ｔｒ１細胞の存在が、患者がその治療の高奏効者である可能性が高いことを示し、アッカーマンシア・ムシニフィラに対する記憶Ｔｒ１細胞だけの存在が、その患者が低奏効者であることを示している。
【０１０７】
本発明により、抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤で治療した患者の反応を追跡する手段も提供される。したがって本発明は、抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤で治療されているがん患者がその治療の高奏効者であるかどうかを評価する方法に関するものであり、この方法は、
（ｉ）その治療の開始時に患者から得られた糞便サンプルの中で、バクテロイデス・キシラニソルベンスＣＡＧ９４５、バクテロイデス・ユニフォルミスＣＡＧ１５９、バクテロイデス・オバタスＣＡＧ１１６５、プレボテラＣＡＧ ：２５５、ＣＡＧ１６３、ルミノコッカス・ブロミイＣＡＧ６１１、ロセブリア・インテスティナリスＣＡＧ２９１、ユウバクテリウムＣＡＧ ：３８、ＣＡＧ  ６２９、ルミノコッカス科ＣＡＧ１００３、フラボニフラクター・プラウティイＣＡＧ  ４３９、フィルミクテス門の細菌ＣＡＧ：１２４、ＣＡＧ  ６２９からなる群より選択される少なくとも３系統、または４系統、または５系統、または６系統、または７系統、または８系統、または９系統、または１０系統の微生物種の存在または相対存在量を評価する工程と；
（ｉｉ）抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体を３回または４回投与した後に患者から得られた糞便サンプルの中で、工程（ｉ）と同じ種の存在または相対存在量を評価する工程を含んでいて、
−  バクテロイデス・キシラニソルベンスＣＡＧ９４５、バクテロイデス・ユニフォルミスＣＡＧ１５９、バクテロイデス・オバタスＣＡＧ１１６５、プレボテラＣＡＧ ：２５５、ＣＡＧ１６３、ルミノコッカス・ブロミイＣＡＧ６１１、ロセブリア・インテスティナリスＣＡＧ２９１、ユウバクテリウムＣＡＧ ：３８、ＣＡＧ  ６２９が減少すること、または完全に消失すること、および／または
−  ルミノコッカス科ＣＡＧ１００３、フラボニフラクター・プラウティイＣＡＧ  ４３９、フィルミクテス門の細菌ＣＡＧ：１２４、ＣＡＧ  ６２９が増加すること、または獲得されることが、
患者がこの治療の高奏効者であることを示している。
【０１０８】
本発明のプロバイオティック組成物では、プロバイオティクス細菌は生きていることが好ましい。しかし死んだ細菌（オートクレーブされた細菌、低温殺菌された細菌、放射線を照射された細菌、断片化された細菌など）を含む組成物のほか、いくつかの細菌抗原だけを含む組成物も本発明の一部である。実際、単離された細菌成分が、生きている細菌と同じ効果、それどころかさらに増強された効果を及ぼしうることが示されている（Ｐｌｏｖｉｅｒ他、２０１６年）。したがって上記の組成物では、生体からの腫瘍細胞除去を促進する自然免疫反応または獲得免疫反応を開始させるため、生きている細菌を適切な細菌産物で置き換えることができる。
【０１０９】
別の１つの側面によれば、本発明はしたがって、がん患者に投与される抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤のアジュバントとして用いるため、フィルミクテス門の種、クロストリジウム目の種、アリスティペス属の種、ユウバクテリウム属の種、バクテロイデス目の種、メタノブレビバクター・スミティイ、アッカーマンシア・ムシニフィラ、エンテロコッカス・ヒラエと、これらの混合物からなる群より選択される細菌の断片を含む免疫原性組成物に関する。好ましい一実施態様によれば、この免疫原性組成物は、エンテロコッカス・ヒラエの断片（例えばそのＴＬＲ２またはＮＯＤ２アゴニスト）、例えば株ＣＮＣＭ  Ｉ−４８１５の断片を、アッカーマンシア・ムシニフィラの断片とともに含んでいる。上記の免疫原性組成物はさらに、バクテロイデス・フラギリスおよび／またはバークホリデリア・セパシアの断片を含むことができる。
【０１１０】
ここまでの記述の中で、「断片」という用語は、細胞成分、代謝産物、分泌された分子、上記細菌の代謝から得られる化合物を意味することができる。断片は、例えば１つまたはいくつかの系統の菌種の培養物の上清を回収することによって、またはそのような培養物からの細胞成分、細胞分画、代謝産物、分泌された化合物を抽出することによって取得することができる。「断片」という用語は、分解産物も意味することができる。断片は、単離された形態の成分や、考慮する菌種に由来する１つ以上の成分の任意の混合物に対応する可能性がある。上記の免疫原性組成物の好ましい成分となる可能性がある細菌成分の非限定的な例に含まれるのは、アッカーマンシア・ムシニフィラの外膜から単離された特別なタンパク質であるＡｍｕｃ＿１１００（Ｐｌｏｖｉｅｒ他、上記文献）、バクテロイデス・フラギリスが大腸内の粘膜ニッチを占めるために必要な莢膜多糖Ａ（ＰＳＡ）、バクテロイデス属の種（例えばバクテロイデス・フラギリス）からの両性イオン性多糖（ＺＰＳ）反復モチーフ、１５反復単位未満のリシン−アスパラギン酸（ＫＤ）ペプチドである。
【０１１１】
本発明の免疫原性組成物は、皮内投与、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、経口投与のための製剤にされることが好ましい。この免疫原性組成物は、好ましいことに、抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤を投与する前、および／または投与するのと同時に、および／または投与した後に投与し、その治療剤のアジュバント効果を持つことになる免疫反応を誘導することができる。
【０１１２】
本発明の別の１つの側面によれば、抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤を用いた治療を必要とする個人は、糞便微生物叢移植（ＦＭＴ）によって治療される。その目的で用いられるのは、健康な個人からの糞便微生物叢、および／または抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤で治療されてこの治療剤の奏効者であることが証明された１人または数人の個人からの糞便微生物叢、および／または想定する治療の奏効者である可能性が高い腸内微生物叢プロファイルを示す１人または数人の個人か、奏効患者からの糞便微生物叢である。本発明のセラノスティクス法は、もちろん、適切なドナーを選択するのに利用できる。この方法は任意の患者に対して実施できるが、もちろんそのようなＦＭＴは、抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤を用いた治療の低奏効者である可能性が高いと同定された個人で特に有用である。
【０１１３】
したがって本発明は、がんを治療するため抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤と組み合わせて用いられる糞便微生物叢組成物にも関する。上記のように、糞便微生物叢組成物は、健康な個人または抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤を用いた治療の奏効者からの糞便サンプルから、あるいは少なくとも、想定する治療が奏効する可能性が高い腸内微生物叢プロファイルを示す個人から（直接または間接に）得られることが好ましい。糞便微生物叢組成物を健康な個人の糞便サンプルから間接的に得ることができるという事実は、糞便微生物叢材料のバンクを創設することで、糞便サンプルを混合できること、そしてＦＭＴを必要とする所定の条件（クロストリジウム感染を治療するための糞便微生物叢組成物は、がんの文脈で用いられる糞便微生物叢組成物とは異なる可能性がある）および／または患者の他の特徴（年齢、人種、食習慣など）に適合させることのできる「標準的な健康な糞便微生物叢組成物」を作れる可能性があることを意味する。糞便微生物叢材料を調製してＦＭＴを実施するいくつかの方法がこれまでに報告されるとともに現在開発されており、当業者は、本発明の糞便微生物叢組成物（新たに調製される液体、凍結乾燥させた材料、他の任意の状態のものが可能である）を調製するのに適切な技術を自由に選択できる。
【０１１４】
特定の一実施態様によれば、本発明の糞便微生物叢組成物（fecal microbiota composition）は、フィルミクテス門の種、クロストリジウム目の種、アリスティペス属の種、ユウバクテリウム属の種、バクテロイデス目の種、メタノブレビバクター・スミティイ、アッカーマンシア・ムシニフィラ、エンテロコッカス・ヒラエからなる群より選択される少なくとも１０系統の菌種を含んでおり、より好ましくはフィルミクテス門の少なくとも５系統の種と、クロストリジウム目の３系統の種と、アリスティペス属の１系統の種と、ユウバクテリウム属の１系統の種と、バクテロイデス目の１系統の種と、メタノブレビバクター・スミティイと、アッカーマンシア・ムシニフィラと、エンテロコッカス・ヒラエを含んでいる。
【０１１５】
特定の一実施態様では、この組成物とその抗腫瘍効果を確認するため、ＭＣＡ２０５肉腫を有する動物モデルとして用いる無菌動物にこの組成物を移植すると、フィルミクテス門の種、クロストリジウム目の種、アリスティペス属の種、ユウバクテリウム属の種、バクテロイデス目の種、メタノブレビバクター・スミティイ、アッカーマンシア・ムシニフィラ、エンテロコッカス・ヒラエからなる群より選択される少なくとも１０系統の菌種の定住が可能になる。
【０１１６】
別の一実施態様によれば、腫瘍を有する無菌宿主を抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体で治療した後にこの宿主に糞便微生物叢組成物を移植すると、この糞便微生物叢組成物により、フィルミクテス門の種、クロストリジウム目の種、アリスティペス属の種、ユウバクテリウム属の種、バクテロイデス目の種、メタノブレビバクター・スミティイ、アッカーマンシア・ムシニフィラ、エンテロコッカス・ヒラエからなる群より選択される少なくとも１０系統の菌種を増殖させることが可能になる。ここまでの記述では、宿主として、腸から菌を除去する予備治療を受けた上記のようながん患者が可能だが、糞便微生物材料をスクリーニングして適切な糞便微生物叢組成物を選択するのに適した臨床前モデルとしての動物も可能である。
【０１１７】
別の一実施態様によれば、糞便微生物叢組成物は、上記の細菌組成物が豊富にされている。
【０１１８】
本発明の糞便微生物叢組成物は、上記のセラノスティクス法によって抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤に対して抵抗性である可能性が高いと同定されたがん患者で同種異系の健康な糞便微生物叢移植に用いることが好ましい。
【０１１９】
本発明の組成物を用いたＦＭＴは、治療を開始する前（例えば数日前）に実行することが好ましいが、治療中に実行することもできる。
【０１２０】
下記の実験の項に記載してあるように（実施例８）、発明者は、ある種の細菌に対するＴｈ１反応またはＴｃ１反応が、抗ＰＤ１抗体で治療した患者がその治療の高奏効者であることを示していることも明らかにした。実際、抗ＰＤ１抗体を２〜４回投与した後にエンテロコッカス・ヒラエまたはアッカーマンシア・ムシニフィラまたはバークホリデリア・セパシアに対するＴｈ１免疫反応またはＴｃ１免疫反応を展開した患者は、バクテロイデス・フラギリスに対するＴｈ１免疫反応またはＴｃ１免疫反応を展開した患者とは異なり、ＰＤ１が記憶を阻止した恩恵を長期にわたって受ける。したがって本発明は、がん患者が抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした治療剤を用いた治療からの恩恵を受ける可能性が高いかどうかを生体外で判断する方法にも関係しており、この方法は、患者に由来する血液サンプル中で、バークホリデリア・セパシア、および／またはエンテロコッカス・ヒラエ、および／またはバクテロイデス・フラギリスに対する記憶Ｔｈ１細胞または記憶Ｔｃ１細胞の存在を評価することを含んでいて、バークホリデリア・セパシアとエンテロコッカス・ヒラエに対する記憶Ｔｈ１細胞または記憶Ｔｃ１細胞の存在が、患者がその治療の高奏効者である可能性が高いことを示し、バクテロイデス・フラギリスに対する記憶Ｔｈ１細胞または記憶Ｔｃ１細胞の存在が、患者がその治療の低奏効者である可能性が高いことを示している。
【０１２１】
この方法は、抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体をベースとした薬を用いた任意の治療を開始する前に血液サンプルで実施することができる。しかし試験の感度は、何らかの明確な結果を提供するには不十分である可能性がある。その薬を１回または２回投与した後にはそれはもはや問題ではなく、そのときが、この方法を実施できる別の機会である。
【０１２２】
この方法の１つの特に有利な側面は、血液サンプルを用いて実施できることである。患者のＴｈ１反応またはＴｃ１反応を治療中の異なる時点で評価することができるため、患者が低奏効者であるか低奏効者になる場合には、治療を停止する判断、またはその治療を上記のようにＦＭＴまたはプロバイオティック組成物または免疫原性組成物で補足する判断へとつながる。もちろんこの方法は、あらゆる種類のがん（肺がん、腎細胞がん、頭頸部腫瘍、膀胱がん、肝臓がん、中皮腫、メルケル細胞がん、食道がん、胃がん、黒色腫、胸腺腫が含まれる）を有する患者で実施することができる。この方法の結果は、進行した非小細胞肺がんを有する患者にとって特に意味がある。
【０１２３】
本発明の他の特徴は、本発明の範囲で実施した下記の生物学的アッセイに関する記述の中でも明らかになろう。生物学的アッセイは、必要な実験的サポートを本発明に提供するが、本発明の範囲がその実験的サポートに制限されることはない。
【実施例】
【０１２４】
材料と方法
特に断わらない限り、実施例１〜８は、以下の材料と方法を用いて実施した。追加の材料と方法は、必要なときには実施例の中に記載されている。
【０１２５】
データセット
３つの異なるがんでニボルマブを試験するために設計された３つの異なるコホートに対応する１２７個のサンプルのシークエンシングを、いくつかの時点（治療前（Ｖ１）または治療中（Ｖ２〜Ｖ４））で実施した。
−  肺がんを有する２８人の患者からの５４個のサンプル、
−  腎臓がんを有する１６個のサンプル／患者（Ｎｉｖｏｒｅｎコホート）、
−  膀胱がんを有する４個のサンプル／患者。
【０１２６】
肺がんまたは腎臓がんまたは膀胱がんを有する患者（表３〜表５）はすべて、第２選択または第３選択の従来の治療剤で治療してがんが進行した後に抗ＰＤ１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体をベースとする単剤療法に登録された進行した患者、または手術不能な患者、または転移した患者であった。彼らは、欧州医薬品庁（ＥＭＡ）による薬の承認の文脈において倫理ガイドラインに従ってＧｕｓｔａｖｅ  Ｒｏｕｓｓｙがん研究所に登録されることで、ＰＤ１阻止の異なる複数の時点で糞便を回収してＭＧ組成を分析することが可能になった。この補助的研究のエンドポイントは、糞便組成（種と遺伝子のレベル）と、ＰＤ１阻止に対する臨床反応（奏効率と無増悪生存（ＰＦＳ））の間の相関を確立することであった。
【０１２７】
【表７】
2020512294.tif 000012
【０１２８】
【表８】
2020512294.tif 000013
【０１２９】
【表９】
2020512294.tif 000014
【０１３０】
同じ試験の少なくとも６０人超の患者を含む別のより大きな後ろ向き分析（特徴を下記の表６と表８に示す）では、糞便を回収せず、抗生剤の使用が臨床成果に及ぼす影響を分析した。
【０１３１】
分析のパイプラインと方法
ＭｅｔａＧｅｎｏＰｏｌｉｓ（ＭＧＰ）で開発された定量メタゲノミクスパイプラインを利用して腸内微生物叢を分析した。このアプローチによって微生物叢を遺伝子と種のレベルで分析することが可能になる。
【０１３２】
１２７個の糞便サンプル（ＳＡＭＢＯプラットフォーム）から全ＤＮＡを抽出し、Ｐｒｏｔｏｎシークエンサを用いてショットガンシークエンシングを実施すると、２０００万個を超える短いＤＮＡ配列の読み取りが得られた（ＭｅｔａＱｕａｎｔプラットフォーム）。高品質の読み取りを選択し、ヒトからの読み取りである可能性のある汚染物を除去してクリーンにした。次に、ＭｅｔａＨＩＴ  ｈｓ＿９．９Ｍ遺伝子カタログ（Ｌｉ他、２０１４年）を利用して高品質のクリーンな読み取りをマッピングし（共有されている手続き）、カウントすることを、自家製ＭＥＴＥＯＲ  Ｓｔｕｄｉｏパイプラインを用いて２工程の手続きで実施した。すなわち第１の工程ではマッピングされる読み取りだけを用い、次いで共有された読み取りの帰属を、それらのマッピング比に従い、独自の読み取りを用いて明らかにした（カタログからの異なる遺伝子をマッピングした）。マッピングは、遺伝子が変動することとカタログに重複がないことを考慮し、一致閾値を９５％超にして実施した。
【０１３３】
（シークエンシング深度の違いを補正するための）ダウンサイジング工程と規格化（ＲＰＫＭ）の後、遺伝子頻度プロファイル行列を取得し、それを、大規模定量メタゲノミクスデータセット分析用のＭｅｔａＯＭｉｎｅＲ（ＭＧＰで開発された一連のＲパッケージ）を用いて分析するための出発点として用いた。
【０１３４】
ＭＧＳ
ｈｓ＿９．９Ｍ遺伝子カタログは、１４３８系統のＭＧＳ（ＭｅｔａＧｅｎｏｍｉｃ  Ｓｐｅｃｉｅｓ、数百個のサンプルの中で量が共変するため同じ微生物種に属する５００個超の遺伝子のグループ）にクラスター化されている。ＭＧＳの遺伝子と以前にシークエンシングされている生物の間の相同性を利用してＭＧＳの分類学的アノテーションを実施した（ｎｔデータバンクとｗｇｓデータバンクに対してｂｌａｓｔＮを利用）。
【０１３５】
サンプル間のＭＧＳシグナルを計算して５０個のマーカー遺伝子の平均シグナルとした。
【０１３６】
ＭＧＳシグナルを用い、規格化（１つのサンプルのＭＧＳ頻度の和＝１）した後にＭＧＳ頻度プロファイル行列を構成した。
【０１３７】
ＭＧＳバーコード：「バーコード」（５０個のマーカー遺伝子に関して列をサンプル、行を遺伝子にした頻度表のヒートマップ）を用いてサンプル中のＭＧＳの出現と量を可視化する。ヒート色彩コードを用いる（白色は０であり、量が増加するにつれて水色＜青色＜緑色＜黄色＜オレンジ色＜赤色となり、それぞれの色の変化は４倍の量変化に対応する）。これらのバーコードでは、ＭＧＳは、遺伝子の量に応じて着色された鉛直線（サンプル中の同量の遺伝子）として出現する。
【０１３８】
豊富さ
サンプルの豊富さは、遺伝子レベルまたはＭＧＳレベルで評価することができる。
ＧＣ：遺伝子カウント、１つのサンプル中で見られる遺伝子の数。
ＭＧＳカウント：１つのサンプル中に見られるＭＧＳの数。
【０１３９】
類似性
サンプル間の類似性は、スピアマン相関を利用して遺伝子レベルとＭＧＳレベルで評価した。
【０１４０】
微生物叢の分析
微生物叢をＭＧＳレベルで分析した。
最初に、異なるがん患者コホートの微生物叢を健康な「対照」の微生物叢と比較して分析した。
第２に、調べる微生物叢を、いくつかのホットな質問に従って分析した。
差があるＭＧＳまたは相関しているＭＧＳの検索を、サンプルのクラスまたは臨床パラメータに従ってウィルコクソン検定またはスピアマン相関とＭＧＳ平均シグナルを利用して実施し、ｐ値に従って選択した。
【０１４１】
統計的分析
細菌カットオフの決定：ウィルコクソンの順位和検定から両側ｐ値を計算した。バイオマーカーが取る可能なそれぞれの値に関して感度と特異度の補数の間の関係を記述する受信者動作特性曲線（ＡＵＣ）よりも下の面積から、バイオマーカーの有効性を識別閾値として求めた。最適なカットオフは、最も有効なバイオマーカー識別閾値に対応する。それは、バイオマーカーの可能なそれぞれの値に関する感度と特異度の和として定義されるヨーデン指数を最大にする値に対応する。ＡＵＣに関する９５％信頼区間と最適なカットオフはブートストラッピングによって求めた（Ｂ＝１９９９）。
【０１４２】
実施例１：腎細胞がんと尿路上皮がんの患者ではＰＤ１阻止の効果が経口抗生剤によって有意に低下する
最初に、第２選択肢または第３選択肢の治療で抗ＰＤ１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体を用いる第ＩＩ相Ｎｉｖｏｒｅｎ  プロトコルに登録された７０人の転移性ＲＣＣ患者からなるコホートを後ろ向きに分析し、Ｎｉｖｏｒｅｎに登録される６０日前〜３０日前に経口投与した抗生剤（ＡＴＢ、β−ラクタミンを少なくとも７日間）またはプロトンポンプ阻害剤（ＰＰＩ）の効果を調べた。７０人のうちの１４人の患者がβ−ラクタミンを摂取し、２１人の患者がＰＰＩを摂取した。無増悪生存（ＰＦＳ）に関係する全臨床パラメータの一変数分析において、カルノフスキー全身状態（ＫＰＳ）とＡＴＢ摂取がこのモデルで残った２つの有意な変数であり、より短いＰＦＳが予測される。多変数コックス回帰分析では、ＡＴＢ（と、より少ない程度でＰＰＩ）の投与が、ＰＤ１阻止からの利益低下に関係する有意な因子として残った（短くなったＰＦＳ、それぞれｐ＜０．０１とｐ＜０．０３）（図１、表６、表７）。
【０１４３】
【表１０】
2020512294.tif 000015
【０１４４】
【表１１】
2020512294.tif 000016
【０１４５】
第２に、同様の分析を、ＰＤ−Ｌ１阻害剤（抗ＰＤ−Ｌ１抗体）で治療した尿路上皮がん（ＵＣ）を有する患者で実施した。Ｇｕｓｔａｖｅ  Ｒｏｕｓｓｙ  がん研究所でＰＤ−Ｌ１阻害剤を用いて治療していてＡＴＢに関するデータが入手できるＵＣ患者の後ろ向き研究を実施した。ＡＴＢ（＋）／（−）群は、ＡＴＢで治療した患者、またはＡＴＢで治療していない患者と定義した（最初に注射する前２ヶ月間と、注射後１ヶ月まで）。無増悪生存（ＰＦＳ）、奏効率（ＲＲ）、全生存（ＯＳ）をＡＴＢ（＋）とＡＴＢ（−）の間で比較した。カプラン−マイヤー法と、リスク因子に関して調整したコックス回帰を利用して統計分析を実施した。４２人の患者がこの研究に含まれており、１２人の患者（２９％）がＡＴＢ（β−ラクタマーゼとフルオロキノロンが最頻）を摂取していた。ＡＴＢ（＋）群はＡＴＢ（−）群と比べてＰＦＳが短くなっていた（１．８ヶ月対４．３ヶ月、ｐ＜０．０４）。この統計的関連性は、年齢、性別、カルノフスキー全身状態、ヘモグロビン、肝転移の存在について調整した多変数分析の後に維持された。ＡＴＢ（＋）群ではＡＴＢ（−）群よりもＲＲが小さかった（４人（３３％）対２１人（７０％））（ｐ＜０．０３）。１５ヶ月という追跡時間の中央値が過ぎた後、ＯＳ  に対するＡＴＢの影響がマイナスになる傾向が存在していたが、ＯＳの中央値はＡＴＢ（−）群での値に到達しないままであった。（表８、表８ａ、図２）。
【０１４６】
【表１２】
2020512294.tif 000017
【０１４７】
【表１３】
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【０１４８】
結論として、これらの知見は、ＡＴＢが、抗ＰＤ１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体からの臨床上の利益を妨げることを示している。これは、ニボルマブまたはアテゾリズマブが生物活性であるためには健全な腸内微生物叢が必要とされる可能性のあることを示唆している。このデータに促され、がん患者における腸マイクロバイオームの潜在的なずれと、予後に対するその帰結ならびに化学療法またはＩＣＢに対する反応を調べるに至った。
【０１４９】
抗ＰＤ１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体の生物活性と臨床効果にＡＴＢの摂取が及ぼす影響に関する追加データは、下記の実施例９に開示されている（図２０〜図２１）。
【０１５０】
実施例２：がんは腸内微生物叢の豊富さに影響を与える
読み取りの品質制御は満足すべきものであり、すべてのがん患者で一様であることを示していた。興味深いことに、ヒトに関する読み取りによる汚染が、ニボルマブで治療した後に増悪したがん患者で観察された（データは示さない）。これは、腫瘍細胞が広がる前に、または広がるのと同時に腸アポトーシスが起こっている可能性があることを示唆している。同様の豊富さ（ＧＣカウントとＭＧＳカウント）が、コホートや転帰に関係なく観察された（データは示さない）。
【０１５１】
がん患者と「健康な対照」の比較（Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔを用いてシークエンシングされて１３Ｍ以上がｈｓ＿９．９Ｍ遺伝子カタログにマッピングされた読み取りのサンプルから選択された：８５個のサンプル）から、がん患者では健康な対照と比べて遺伝子レベルとＭＧＳレベルの両方で豊富さがより少ないわずかな傾向が存在することが明らかになった（データは示さない）。
【０１５２】
がんと健康な（Ｈ）対照の間の豊富さの違いは有意でなかったにもかかわらず、遺伝子（ＭＧＳではない）に基づく階層的クラスタリングを実施すると、豊富さの大きな喪失が、がん患者のほぼ半数で見られる。実際、５４％（６８／１２７）のがん（Ｃ）サンプルと９％（８／８５）の健康な（Ｈ）サンプルが「低い」群に属する（χ検定、ｐ値＝１．４×１０−１０）。これは、種の分類学に含まれない機能に関係する遺伝子が、がん保持者を健康な個人から分離していることを示唆している（データは示さない）。
【０１５３】
実施例３：がんに関連する微生物叢を健康な微生物叢と比べたときの表現型の特徴：がんによるディスバイオシスと関係する１９個のマーカー
さまざまながん（Ｃ）患者コホートと健康な（Ｈ）対照の間の微生物叢の違いを同定することを目指す。各患者について、分析のため（治療前の診断時の）最初のサンプルを選択した。
この実施例では、５３人の乳がん患者を含む追加コホートを追加した（表９）。
【０１５４】
【表１４】
2020512294.tif 000019
【０１５５】
サンプル
・がんを有する患者：１０１人
乳がん：５３人の患者
腎臓がん：１６人の患者
肺がん：２８人の患者
膀胱がん：４人の患者
・健康な対照：８５人。
【０１５６】
微生物叢
以下の戦略を用い、がん患者と健康な対照で違いが見られるＭＧＳを同定した。
・遺伝子含量によるサンプルの相関を利用して得られた２つのクラスターに基づき、コホート全体を、豊富さが「大きい」サンプルと「小さい」サンプルに分けた。
・乳がん：２８人の「大きい」と２５人の「小さい」
・腎臓がん：１１人の「大きい」と５人の「小さい」
・肺がん：１４人の「大きい」と１４人の「小さい」
・健康：７７人の「大きい」と８人の「小さい」
・各がんコホートについて、健康人のコホート全体との違いが見られたＭＧＳを、
・全個人
・豊富さが「大きい」サンプル
・豊富さが「小さい」サンプル
を用いて探した。
・違いが見られたＭＧＳが、以下の基準：
・全サンプルと豊富さが大きいサンプルの両方で有意差がある（ｐ値＜０．０５）
・両方の分析で状態が同じである
・少なくとも１つの検定で有意性が０．００１以下である
を満たしている場合に、そのＭＧＳを選択した。
【０１５７】
この戦略を用いると、以下のＭＧＳで違いが見いだされた：
・乳がん：両方ともｐ値＜０．０５を用いた場合に違いが見られた９０系統のＭＧＳと、最良のｐ値＜０．００１を用いた場合の４０系統のＭＧＳ、
・腎臓がん：両方ともｐ値＜０．０５を用いた場合に違いが見られた１５７系統のＭＧＳと、最良のｐ値＜０．００１を用いた場合の４２系統のＭＧＳ、
・肺がん：両方ともｐ値＜０．０５を用いた場合に違いが見られた１６０系統のＭＧＳと、最良のｐ値＜０．００１を用いた場合の１００系統のＭＧＳ。
【０１５８】
１４７系統のＭＧＳが、上記の分析のうちの少なくとも１つで有意差があることが見いだされ（ｐ＜０．００１）、そのうちのいくつかは、図３〜図５に示したヒートマップ／階層的クラスタリングによって共通していると判断された。がんになったときの豊富さの喪失には有意差がないとはいえ、菌種の豊富さには、健康な対照／豊富さが大きい種  対  がんコホート／豊富さが小さい種という大きな相関が観察された。
【０１５９】
違いが見られたＭＧＳの２９％は、豊富さの大きいＭＧＳまたは豊富さの小さいＭＧＳであり、ＭＧＳの豊富さと表現型の間には、豊富さの大きいＭＧＳ／健康な対照  対  豊富さの小さいＭＧＳ／がんコホートという非常に強い関連性があるように見える。「健康なＭＧＳ」の中には、短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）を産生する可能性がある多くの細菌（例えばフィーカリバクテリウム、ロセブリア、ブラウティアの種）が見いだされる（図４）。
【０１６０】
少なくとも２つのがんコホートで、差がある２７系統のＭＧＳが見いだされた（図６〜図７）。
【０１６１】
結論として、腸内容物の典型的ながん関連微生物叢フィンガープリントは、以下に示す１９個のマーカーに基づくものになろう。
【０１６２】
過剰出現しているマーカーは、ビフィドバクテリウム・デンティウム、クリプトバクテリウム属の種ＣＡＧ：３３８、未分類のエガセラ、ファスコラークトバクテリウム属の種ＣＡＧ：２６６、クロストリジウム属の種ＣＡＧ：１６９、エンテロコッカス・フェカーリス、フェーカリタレア・シリンドロイデス、サブドリグラヌラム属の種４＿３＿５４Ａ２ＦＡＡ、ルミノコッカス・トルケス、ハンガテラ・ハテワイイ、クロストリジウム属の種ＣＡＧ：２４２、大腸菌ＣＡＧ０００１１；ＣＡＧ００８１５、ラクトコッカス・ラクティスである。
【０１６３】
【表１５】
2020512294.tif 000020
【０１６４】
過少出現しているマーカーは、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス、未分類のクロストリジウム目、ロセブリア属の種ＣＡＧ：１８２、未分類のブラウティア、ブラウティア属の種ＣＡＧ：２３７、未分類のフィーカリバクテリウムである。
【０１６５】
【表１６】
2020512294.tif 000021
【０１６６】
腸内容物の典型的ながん関連微生物叢フィンガープリントに関するこの観察結果から、発明者は、健康な個人の糞便の同系異種糞便微生物移植、および／または抗腫瘍治療剤に対する患者の反応促進を目的とした組成物の投与を、その必要のあるがん患者に対して提案するに至った。その組成物は例えば、（ｉ）ビフィドバクテリウム・アドレセンティスと、未分類のクロストリジウム目、ロセブリア  属の種ＣＡＧ：１８２と、未分類のブラウティア、ブラウティア属の種ＣＡＧ：２３７と、未分類のフィーカリバクテリウムを混合した組成物、または（ｉｉ）エンテロコッカス・ヒラエ、アッカーマンシア・ムシニフィラ、アリスティペス・シャヒイ、他のアリスティペス属の種、バルネシエラ・インテスティニホミニス、バクテロイデス・フラギリスのいずれかとバークホリデリア・セパシアの免疫原性細菌のプロバイオティック組成物である。
【０１６７】
腸内容物のがん関連微生物叢フィンガープリントに関する追加データが下記の実施例１０に開示されている（図２２〜図２３）。
【０１６８】
実施例４：腸フィンガープリントが、抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２軸を阻止する抗体を用いたときの臨床上の利益を予測する
最初に、抗ＰＤ１抗体を最初に投与する前にマイクロバイオームのプロファイル（Ｖ１）を調べ、それを６ヶ月後に観察されたプロファイル（２ヶ月ごとに６ヶ月間にわたって注射、Ｖ４）と比較した。すべてのＶ４が奏効者であった（非奏効者では治療剤の投与を３ヶ月で停止したため）。膀胱がんと肺がんを有する患者をこの分析のためにプールした。というのも別に採取した肺がんでも非常によく似た結果だったからである。
【０１６９】
サンプル：
・肺がん：１６個のサンプル；１１個のＶ１と５個のＶ４
・膀胱がん：追加の３人の奏効者のＶ４サンプル
【０１７０】
結果
ＰＤ１阻止に反応する人では治療の間に微生物叢の組成が有意にシフトしており、以下のプロファイルを示す傾向があった（図８）。
【０１７１】
過剰出現しているのは、ブラウティア属の種ＫＬＥ  １７３２、アリスティペス・シャヒイ、フィルミクテス門の細菌  ＣＡＧ：１１４、クロストリジウム属の種ＣＡＧ：２６５、未分類のフィルミクテス門  （ＣＡＧ００６１８）、未分類のクロストリジウム目、ビフィドバクテリウム・アドレセンティスである。
【０１７２】
過少出現しているのは、未分類のクロストリジウム目、クロストリジウム目の細菌１＿７＿４７ＦＡＡ、ドレア・フォルミシゲネランス、ユウバクテリウム属の種ＣＡＧ：３８である。
【０１７３】
【表１７】
2020512294.tif 000022
【０１７４】
第２に、ＰＤ１阻止を開始する前に試料を分析して時刻０の時点で奏効者／非奏効者で差がある微生物叢（サンプルＶ１、治療前）を同定することにより、抗ＰＤ１抗体（ニボルマブ）に対する臨床上の利益を予測することを目指した。ペアにしたＶ１とＶ２の肺がんサンプルの間に明確な違いを検出できなかった（データは示さない）ため、Ｖ１サンプルを入手してコホートのサイズを大きくすることができなかったときにはＶ２サンプルを使用した。
【０１７５】
サンプル：
・肺がん：６人のＲ（３個のＶ１と３個のＶ２）／１９人のＮＲ（８個のＶ１と１１個のＶ２）
ＮＢ：３人のＲを比較から除外した（１個のＶ３と２個のＶ４）
１人のＲは２．４ヶ月だけ追跡した
・腎臓がん：９人のＲのＶ１／６人のＮＲのＶ１
【０１７６】
豊富さ
奏効者と非奏効者の間で豊富さの違いは有意でなかったが、肺ＮＲでは豊富さがより小さい傾向があった（データは示さず）。
【０１７７】
肺がん患者＋腎臓がん患者をそのままプールした。
【０１７８】
転帰を腎臓がん患者では約３ヶ月後に評価したため、プールした分析は、Ｒ＋ＮＲ＞３ヶ月：１３人の肺がん患者＋９人の腎臓がん患者／ＮＲ＜３ヶ月：１２人の肺がん患者＋６人の腎臓がん患者を用いて実施した。
【０１７９】
奏効者でより豊富になっている３６系統のＭＧＳと、進行者でより豊富になっている１１系統のＭＧＳを見いだした（図９）。
【０１８０】
結論として、ＰＤ１の阻止に反応する傾向がある腸内容物の微生物叢フィンガープリントは、約４５個のマーカーに基づくと、フィルミクテス門、クロストリジウム目、アリスティペス、ユウバクテリウムのほか、メタノブレビバクター・スミティイやアッカーマンシア・ムシニフィラなどの興味深い種は豊富だが、オシリバクターは豊富でないという以下のプロファイルであり、それを明確に示すと以下の通りである。
【０１８１】
過剰出現しているのは、
・未分類の種：
−  ＣＡＧ０００６４
−  ＣＡＧ００２４５
・フィルミクテス門の種：
−  ＣＡＧ００６０４、１７１４
−  ＣＡＧ０１０９０、１０２６
−  ＣＡＧ００９６５、１２１０
−  ＣＡＧ００６２１、１６９５
−  ＣＡＧ０１２４５、７８０
−  ＣＡＧ０１３０８、６０６
−  ＣＡＧ００６６９、１６４９
−  ＣＡＧ００６７０、１６４８
−  ＣＡＧ００８７２、１３５９
−  ＣＡＧ００８５１、１４２２
−  ＣＡＧ００２８８、２１８９
クロストリジウム目の種：
−  ＣＡＧ００３６３、２０５６
−  ＣＡＧ００３９１、２０１９
−  ＣＡＧ００４４９、１９４５
−  ＣＡＧ００５１３、１８５３
−  ＣＡＧ００５５９、１７７６
−  ＣＡＧ００６４４、１６７０
−  ＣＡＧ００８１１
−  ＣＡＧ００９０７、１２９９
−  ＣＡＧ０１３５０
ルミノコッカス科の種：
−  未分類のルミノコッカス科、ＣＡＧ０１１６９、９１２
−  サブドリグラヌラム属の種ＣＡＧ：３１４、ＣＡＧ００８８０、１３５２
−  未分類のフィーカリバクテリウム、ＣＡＧ００６２８、１６８６
−  ルミノコッカス・ラクタリス  ＣＡＧ００５５８、１７７７
ユウバクテリウム属の種：
−  ＣＡＧ００４６９、１９２８
−  ＣＡＧ００３９３、２０１１
・バクテロイデス目の種：
−  バクテロイデス・ノルディイ、ＣＡＧ００１１６、２７８３
−  バクテロイデス属の種ＣＡＧ：６６１、ＣＡＧ００３５５、２０６７
−  バクテロイデス属の種ＣＡＧ：５９８、ＣＡＧ００４４０、１９５２
−  未分類のアリスティペス、ＣＡＧ００６４６、１６６８
−  アリスティペス属の種ＣＡＧ：４３５、ＣＡＧ００８８７、１３３２
・ウェルコミクロビウム門の種：
−  アッカーマンシア・ムシニフィラ、ＣＡＧ００３０１、３１８７
−  コラリオマルガリタの種ＣＡＧ：３１２、ＣＡＧ００３１３、２１３９
・古細菌の種：
−  メタノブレビバクター・スミティイ  ＣＡＧ００７２１、１８３０である。
【０１８２】
過少出現しているのは、
オシリバクター（ＣＡＧ００９３１、１２５７とＣＡＧ００２７０、２２２５）
ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（ＣＡＧ００７０２、１６０９）
アナエロトランカス・コリホミニス（ＣＡＧ００７２０、１５９０）
クロストリジウム属の種ＣＡＧ：２４２、ＣＡＧ００３８１、２０３３
クロストリジウム目の細菌ＶＥ２０２−１４、ＣＡＧ００１６８、２５３４
ユウバクテリウム属の種ＣＡＧ：２５２、ＣＡＧ００３５３、２３４１
未分類のビロフィラ、ＣＡＧ０１０１８、１１３５である。
【０１８３】
【表１８−１】
2020512294.tif 000023
【表１８−２】
2020512294.tif 000024
【０１８４】
実施例５：肺がん（ＮＳＣＬＣ）患者に由来するヒト糞便を用いた糞便微生物叢移植は、腫瘍を有する無菌マウスに、ＰＤ１阻止に対する感受性または抵抗性を与える
４ヶ月間のニボルマブが奏効しなかったステージＩＶの４人のＮＳＣＬＣ患者（Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ）と、ニボルマブが部分奏効したステージＩＶの２人のＮＳＣＬＣ患者を選択し、彼らの糞便をＡＴＢで処置したレシピエントマウスに移植した。それと並行して、対照となる特定の病原体なし（ＳＰＦ）のマウスにニボルマブを腹腔内投与すると反応し、予想通り腫瘍の成長が減少した（実験の設定は図１０に記載されている）。しかしがん進行者に由来する糞便を移植されたＡＴＢで処置したマウスは反応しなかった一方で、奏効者に由来する糞便を移植されたＡＴＢで処置した同腹マウスは反応した（図１１〜図１２）。
【０１８５】
ＦＭＴを実行する前にマウスにＡＴＢを３日間与えた。次に、抗ＰＤ１抗体で治療した異なるＮＳＣＬＣ患者からの糞便を用いてＦＭＴを実行した。その後、マウスにＭＣＡ２０５  ＷＴ腫瘍を接種し、抗ＰＤ１抗体またはアイソタイプ対照抗体を４回注射した。
【０１８６】
奏効者または非奏効者からのＦＭＴをなされたマウスからのアイソタイプ群では腫瘍のサイズに違いがなかった。しかし抗ＰＤ１抗体で処置したマウスにおいて、奏効者（ＲＥＳ）からのＦＭＴを受けた場合には、がん進行者（ＰＲＯ）からのＦＭＴを受けた場合と比べると、腫瘍の最終的なサイズが有意に小さくなることが観察された。
【０１８７】
この実験を、レシピエントとしてＡＴＢで処置したＣ５７ＢＬ／６マウスの代わりに無菌マウスで２回反復したところ、同様の結果が得られた。
【０１８８】
実施例６：補償用の抗がんプロバイオティクス（アッカーマンシア・ムシニフィラ、またはエンテロコッカス・ヒラエ、またはアリスティペス、またはこれらの組み合わせであり、「オンコマイクロバイオバイオティクス」または「オンコバックス」とも呼ばれる）
非奏効患者には存在していない免疫原性細菌を経口摂取することが有益であるという考え方を証明するため、（図１０、図１１、図１２に記載した）アバターモデルでＦＭＴを実施した後、細菌で補償した。患者Ａ、Ｂ（両者とも増悪中）のメタゲノムデータにアクセスすることができた。彼らの糞便はアッカーマンシア・ムシニフィラＣＡＧ００３０１のレベルが低く、それぞれ０  と  ０．００３４４６６７であった（カットオフは０．０１５９８３６１）。バクテロイデス・ノルディイＣＡＧ００１１６の値もカットオフである１．２２×１０−５よりも小さかった（それぞれ０と０）。
【０１８９】
図１０〜図１２に示した実験に基づき、患者Ａ（臨床的には非奏効者、メタゲノムプロファイル：少ないアッカーマンシア）に由来する糞便のＦＭＴをＧＦマウスで実施した。次に、抗ＰＤ１抗体を初回と２回目に注射するとき、１０９個の細菌を２回強制的に摂取させた。３つの異なる細菌を使用し、別々のアイソレータの中にいる各群のマウス（群ごとにｎ＝５匹のマウス）に１つの細菌を摂取させた。
【０１９０】
アッカーマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋ）またはエンテロコッカス・ヒラエ  １３１４４（ＥＨ）を経口で強制的に摂取させると、増悪患者ＡからのＦＭＴを受けたアバターマウスの腫瘍の最終的なサイズが有意に縮小した。それに対してユウバクテリウム・テヌエは、ＦＭＴ後の腫瘍のサイズを変化させなかった（図１３）。
【０１９１】
この実験を、他の患者（患者ＢとＦ）に由来する糞便のＦＭＴを利用し、細菌が同じプロバイオティクスを用いた場合、細菌が異なるプロバイオティクスを用いた場合、プロバイオティクスの投与数をより多くした場合について繰り返した。
【０１９２】
患者ＢとＦ（両者とも進行中）のメタゲノムデータにアクセスすることができた。彼らの糞便は、アッカーマンシア・ムシニフィラＣＡＧ００３０１とアリスティペス属の種のレベルが低かった。次に、抗ＰＤ１抗体を初回、２回目、３回目、４回目に注射する前と注射するとき、１０９個の細菌を５回強制的に摂取させた。別々のアイソレータで飼育している各群のマウス（群ごとにｎ＝５〜６匹のマウス）で異なる３系統の細菌（アッカーマンシア・ムシニフィラ、アリスティペス属の種、エンテロコッカス・ヒラエ  １３１４４）を単独で使用するとともに、Ａｋｋ＋ＥＨ  １３１４４の組み合わせを使用した（図１４）。
【０１９３】
最良の奏効群は、アッカーマンシア・ムシニフィラ＋エンテロコッカス・ヒラエ  １３１４４を経口で強制摂取させた群であり、（ＡＴＢの停止後に）マウスのマイクロフローラが自発的に再構成されたアバターマウス（図１５）や、患者Ｂ（図１６）または患者ＦからのＦＭＴを受けたアバターマウスで腫瘍の最終的なサイズが有意に縮小した。図１７は、この実験のすべてのマウスの結果を示しており、Ａｋｋ＋ＥＨの組み合わせは、単独の個々の常在菌よりも有効であった。
【０１９４】
実施例７：ＰＤ１とＣＴＬＡ４の同時阻止の効果は腸内微生物叢に依存しており、ディスバイオシスを有するマウスにおいて、この組み合わせの殺腫瘍活性の喪失を、バクテロイデス・フラギリスにバクテロイデス・セパシアまたはバルネシエラ・インテスティニホミニスを組み合わせることによって回復させることができる
【０１９５】
広域ＡＴＢを投与してから１４日後、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＭＣＡ２０５肉腫を接種した。次に、ＭＣＡ２０５を移植してから６日目にマウスに抗ＣＴＬＡ４抗体（３日ごとに４回注射）と抗ＰＤ１抗体（３日ごとに６回注射）を静脈内注射して処置した。異なるケージに隔離した独立な群において、マウスに異なる「オンコバックス」（ビフィドバクテリウム・ロンガム  と組み合わせたビフィドバクテリウム・ブレーベ、単独のバクテロイデス・フラギリス、バークホリデリア・セパシアまたはバルネシエラ・インテスティニホミニスと組み合わせたバクテロイデス・フラギリスなど）を経口で強制的に摂取させた。６匹のマウス／群で腫瘍が成長する速度を週に２回モニタした。
【０１９６】
２つの独立な実験における最良の結果は、バクテロイデス・フラギリスにバークホリデリア・セパシアまたはバルネシエラ・インテスティニホミニスを組み合わせた場合に得られた。腫瘍が排除された無腫瘍マウスの割合は、この群では３／６（５０％）であった（図１８）。
【０１９７】
実施例１〜７に対する結論としての所見
疾患のステージが非常に異なるがん患者（診断時に乳がん、ＰＤ１を阻止してから６ヶ月後の時点で奏効しているシスプラチン抵抗性の膀胱がん、チロシンキナーゼ阻害剤とｍＴＯＲ阻害剤に対して抵抗性で第２または第３の選択肢の治療法で治療中の転移性腎臓がん、シスプラチン抵抗性の進行した肺がん）の腸マイクロバイオームをより明確にすることを目指した。１人の患者を除き、糞便を回収する前の１ヶ月間は誰も抗生剤を摂取していなかった。
【０１９８】
疾患の組織学とステージがこのように多様であるにもかかわらず、読み取り数と大きなマッピング率から判断すると非常に一様にシークエンシングされたサンプルが見いだされた。
【０１９９】
コホートや転帰に関係なく、がんサンプルで似た豊富さ（ＧＣカウントとＭＧＳカウント）が見られた。
【０２００】
遺伝子カウントとＭＧＳカウントによれば、がん患者で豊富さがより低くなる傾向があるが、違いは有意でなかった。しかしサンプルの階層的クラスタリングから、微生物叢の豊富さに支配される２つの大きなクラスターが得られ、豊富さが大きいサンプルが健康なサンプルでは大半（９０％）を占めたのに対し、がんサンプルではわずかに半分であった。これは、がんに関係するマイクロバイオームの半数で豊富さが欠けていることを示唆している。
【０２０１】
がんに関係する微生物種は、健康な対象の微生物種とは対照的であった。少なくとも１つのがんコホートで、有意差がある１３８系統のＭＧＳが見いだされ、そのうちの４０％はＭＧＳの豊富さが大きいか小さく、ＭＧＳの豊富さと表現型の間には、豊富さの大きいＭＧＳ／健康な対照  対  豊富さの小さいＭＧＳ／がんコホートという非常に強い関連性があるように見える。そこですべてのサンプルを遺伝子の豊富さのクラスターに従って階層化した後、コホート全体と豊富さが大きいサンプルの両方を用い、違いが有意なＭＧＳに焦点を絞った。少なくとも１つのがんコホートで、有意差がある１４７系統のＭＧＳが見いだされ、２７系統は少なくとも２つの異なるコホートで差があった。差があったＭＧＳの３０％は、豊富さが大きいＭＧＳ、または小さいＭＧＳであるように見えるが、豊富さ／表現型の関連性はそれほど明確ではない。「健康なＭＧＳ」の中に、ＳＣＦＡ産生の可能性がある多くの細菌（フィーカリバクテリウム、ロセブリアの種など）と、がん患者に非常に不足しているように見えるビフィドバクテリウム・アドレセンティスが見いだされた。
【０２０２】
特に、以下に示す１９個のマーカーに基づく腸内容物の典型的ながん関連微生物フィンガープリントを提案する。
【０２０３】
過剰出現しているマーカーは、ビフィドバクテリウム・デンティウム、クリプトバクテリウム属の種ＣＡＧ：３３８、未分類のエガテラ、ファスコラークトバクテリウム属の種ＣＡＧ：２６６、クロストリジウム属の種ＣＡＧ：１６９、エンテロコッカス・フェカーリス、フェーカリタレア・シリンドロイデス、サブドリグラヌラム属の種４＿３＿５４Ａ２ＦＡＡ、ルミノコッカス・トルケス、ハンガテラ・ハテワイイ、クロストリジウム属の種ＣＡＧ：２４２、大腸菌、ラクトコッカス・ラクティスである。
【０２０４】
過少出現しているマーカーは、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス、未分類のクロストリジウム目、ロセブリア属の種ＣＡＧ：１８２、未分類のブラウティア、ブラウティア属の種ＣＡＧ：２３７、未分類のフィーカリバクテリウムである。
【０２０５】
したがって肺がんと膀胱がんの患者でＰＤ１阻止を少なくとも６ヶ月間  にわたって継続すると（この療法に反応して）微生物叢のシフトが起こって健康なボランティアの微生物叢と似たものになり、クロストリジウム・レプタムの量が減少し（肺がんだけを考慮した場合）、ビフィドバクテリウム・アドレセンティスが豊富になった（健康な対照ではすべてのがんコホートと比べて非常に豊富である）。
【０２０６】
ＰＤ１に対する反応に関連する腸内容物の微生物フィンガープリントは、１６系統のＭＧＳ（フィルミクテス門、クロストリジウム目、アリスティペス、ユウバクテリウムのほか、興味深い種であるメタノブレビバクター・スミティイやアッカーマンシア・ムシニフィラなどが豊富だが、オシリバクターは少ない）に基づいている。アッカーマンシア・ムシニフィラは、拒食症の人のほか、メトホルミンで治療した人に見られ、糖尿病とインスリン依存性を改善する。ウェルコミクロビウム科に属するこのアッカーマンシア・ムシニフィラは、ＰＤ１阻止が奏効するがん患者でも過剰出現しており、われわれのＦＭＴ実験では、非奏効アバターマウスを奏効マウスに変換した。興味深いことに、シクロホスファミドの文脈におけるエンテロコッカスの大きな免疫原性（エンテロコッカス・ヒラエ）は、アバターマウスで増悪マウスを奏効マウスに変換する上でも非常に効果的であった。さらに、カルチュロミクス分析から、奏効しやすいＮＳＣＬＣ患者で診断時の糞便中に検出されるエンテロコッカス・ヒラエのコロニーの数は、抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１抗体を用いた治療が失敗する運命にある患者の糞便中よりも多いことが明らかになった。
【０２０７】
まとめると、がん患者の糞便微生物叢の組成はディスバイオシスを示していて、遺伝子の多様性が小さく、「健康に関連するＭＧＳ」（ＳＣＦＡ産生細菌など）の出現が少ないため、免疫作用が低下したり、ＰＤ１阻止などの免疫調節に反応する傾向や可能性が低下したりする。がん患者は、健康な個人に由来する糞便の同系異種糞便微生物移植、または適切なプロバイオティック組成物の恩恵を受ける可能性がある。例えばその組成物は、ビフィドバクテリウム・アドレセンティスと、未分類のクロストリジウム目と、ロセブリア  属の種ＣＡＧ：１８２と、未分類のブラウティア、ブラウティア属の種ＣＡＧ：２３７と、未分類のフィーカリバクテリウムを混合した組成物や、免疫原性細菌であるエンテロコッカス・ヒラエ、アッカーマンシア・ムシニフィラ、アリスティペス・シャヒイ、他のアリスティペス属の種、バルネシエラ・インテスティニホミニス、バクテロイデス・フラギリスのいずれかとバークホリデリア・セパシアのプロバイオティック組成物である。
【０２０８】
実施例８：抗ＰＤ１抗体を最初に２〜４回投与した後にエンテロコッカス・ヒラエまたはバークホリデリア・セパシアまたはアッカーマンシア・ムシニフィラに対するＴｈ１免疫反応を発達させるステージＩＶのＮＳＣＬＣ患者は、ＰＤ１阻止の恩恵を長期にわたって受ける
抗ＰＤ１抗体（ニボルマブ）を用いて治療した１４人のＮＳＣＬＣ患者（下記の表１４）で、１回目または２回目または３回目の注射の後、異なる多彩な常在菌に対する記憶Ｔｈ１と記憶ＴＣ１または記憶Ｔｒ１の免疫反応を、ＶｅｔｉｚｏｕらがＳｃｉｅｎｃｅ  ２０１５年に記載しているようにして追跡した。
【０２０９】
【表１９】
2020512294.tif 000025
【０２１０】
簡単に述べると、自家単球を生きている細菌とともに１：１０の比率でインキュベートし、次いで適切なＡＴＢによって細菌を不活性化した後、（磁性ビーズを用いて患者の血液からソーティングした）自家ＣＤ４＋Ｔ細胞または自家ＣＤ８＋Ｔ細胞を添加した。４８時間後のこれら培養物の上清をＥＬＩＳＡで調べ、ＩＦＮγまたはＩＬ−１０の濃度を明らかにした。コホート全体に含まれる各細菌が産生するＩＦＮγまたはＩＬ−１０の中央値、または両者の比を用いて患者を選別し、ＰＤ１阻止の間に増悪するまでの時間を計算した。エンテロコッカス・ヒラエ  １３１４４（ＭＨ１３１４４）に対する記憶Ｔｈ１／Ｔｒ１  ＣＤ４＋Ｔ細胞の反応は、抗ＰＤ１抗体を用いて治療したこれら１４人の患者における長期の無増悪期間（ＴＴＰ）と関係していたのに対し、エンテロコッカス・フェカーリス（ＥＦ）またはＴＣＲ架橋（ビーズ）に対する反応は、ＴＴＰの予測に失敗した（図１９Ａ、図１９Ｂ、図１９Ｃ）。
【０２１１】
このＮＳＣＬＣ患者コホートにおいてＰＤ１阻止に対する反応に関するエンテロコッカス・ヒラエの免疫原性の重要性を確認するため、エンテロコッカス・ヒラエの他の単離物（ＥＨ１７／１３３４４）に対するＣＤ８＋Ｔｃ１免疫反応もＴＴＰの予測にとって極めて重要であることを例示した（図１９Ｄ〜図１９Ｅ）。エンテロコッカス・ヒラエに対する大きなＴｃ１免疫反応は、抗ＰＤ１抗体をベースとした治療のもとでＴＴＰを予測する好ましい免疫反応（ｉｍｍｕｎｏｄｙｎａｍｉｃ）パラメータである。図３７には、ウェルコミクロビウム科のアッカーマンシア・ムシニフィラに対するＣＤ４＋Ｔｈ１免疫反応（図３７）とＣＤ８＋Ｔｃ１免疫反応（Ｒｏｕｔｙ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１７年）がＴＴＰの予測にとって極めて重要であることも示してある。
【０２１２】
他の８つの常在菌のうちで、バークホリデリア・セパシア（Ｂ）に対するＴｈ１反応だけが、この患者コホートにおけるＴＴＰの予測にも関係しており、大きなＴＨ１またはＴＨ１／Ｔｒ１比が、長いＴＴＰと関係していた（図１９Ｆと図１９Ｈ）。
【０２１３】
実施例９：非小細胞肺がん患者では、ＰＤ１阻止の効果が経口抗生剤によって有意に低下する
ＰＤ１阻止に対する反応に関する抗生剤（ＡＴＢ）の有害な役割を非小細胞肺がん患者へと拡張した。第２または第３選択肢の治療法で抗ＰＤ１抗体（ＩＣＢ）を用いる治療に登録された６６人のＮＳＣＬＣ患者（表１５に特徴を詳細に示してある）を１８ヶ月間追跡した。２０人の患者が、ＩＣＢ開始の２ヶ間前までに（Ｖ１）、または最初にＩＣＢを接種した後の最初の１ヶ月の間に（Ｖ２）抗生剤を投与された（表１６に詳述）。ＡＴＢ（＋）：群Ｖ１（ＩＣＢを最初に注射する前）＋Ｖ２（ＩＣＢを注射してから１ヶ月以内）。
【０２１４】
【表２０】
2020512294.tif 000026
【０２１５】
【表２１】
2020512294.tif 000027
【０２１６】
カプラン−マイヤー生存曲線を、無増悪生存（ＡＴＢで治療した群とＡＴＢで治療しない群の間に有意差はない、図２０の左図）または全生存（有意差あり、図２０の右図）に関して示す。コックス回帰多変数分析から、ＡＴＢの投与が、ＮＳＣＬＣ患者でのＩＣＢに対する抵抗性の独立な予測因子であることがわかる（表１７）。
【０２１７】
【表２２】
2020512294.tif 000028
【０２１８】
肺がん患者（Ｎ＝６６、表１５に記載したコホート）、膀胱がん患者（Ｎ＝４２、表５に記載したコホート）、腎臓がん患者（Ｎ＝６７、下記の表１８に記載したコホート）を集めた。第２または第３の選択肢の治療法においてＩＣＢをベースとした治療剤が適している合計でＮ＝１７５人のこれらの患者で、ＡＴＢがＰＤ１阻止に対する抵抗性を誘導することを示した（ＰＦＳとＯＳ、図２１）。
【０２１９】
【表２３】
2020512294.tif 000029
【０２２０】
実施例１０：がんに関係する腸フィンガープリント（ＡＴＢあり、またはＡＴＢなし）
材料
２９２人の健康な対照
がん患者：
乳がん：表９に記載されているバッチ１と、表１９に記載されているバッチ２。
肺がん：表３に記載されているバッチ１と、表２０に記載されているバッチ２。
腎臓がん：表４に記載されているバッチ１と、表２１に記載されているバッチ２。
【０２２１】
３０個のサンプルは、抗生剤（ＡＢ）で治療した患者に由来する。
−  ３個：オーグメンチン（β−ラクタミン＋ペニシリン）、
−  １個：オフロキサシン（フルオロキノロン）、
−  １個：セルトリアキソン（β−ラクタミン）、
−  ２５個：報告なし
【０２２２】
ＡＢを処方された人からの情報はほんの一部であったため、ＡＢサンプルは全体として処理した。
【０２２３】
２つの分析を実施した：
−  すべてのサンプル
−  ペアにしたサンプル＋／−ＡＢ（１２個の肺がん＋５個の腎臓がんをペアにしたサンプル）
【０２２４】
ＡＢで治療したサンプルは、豊富さがより低い傾向がある（有意ではない）。
【０２２５】
【表２４】
2020512294.tif 000030
【０２２６】
【表２５】
2020512294.tif 000031
【０２２７】
【表２６】
2020512294.tif 000032
【０２２８】
結果
少なくとも２つのがんコホートにおいて２つのバッチで差がある１８系統のメタゲノム種（ＭＧＳ）を見いだした。それらのうちの１５系統は、最初に同定された２７系統の種のリストの中にあった（図６と図７）。
【０２２９】
ＡＴＢで治療した患者を除くと１１系統のメタゲノム種が残る。
【０２３０】
そこでわれわれは、ＡＴＢあり、またはＡＴＢなし（＊）の２つのバッチで確認されたがん患者の腸フィンガープリントを提案する。そこには１９系統のＭＧＳが含まれている。
【０２３１】
健康なボランティアと比べてがん患者で過少出現している８系統のＭＧＳ：
フィーカリバクテリウムＣＡＧ２９７＊
ブラウティアＣＡＧ１７９
ロセブリアＣＡＧ５５＊
パラインフルエンザ菌ＣＡＧ１０５６
クロストリジウム目ＣＡＧ１１３２
ビフィドバクテリウム・アドレセンティス  （ＣＡＧ７０２）
フィルミクテス門ＣＡＧ１３０８＊
フィルミクテス門の細菌ＣＡＧ７１３＊
【０２３２】
健康なボランティアと比べてがん患者で過剰出現している１１系統のＭＧＳ：
ビフィドバクテリウム・デンティウム  （ＣＡＧ４５６）＊
エンテロコッカス・フェカーリス  （ＣＡＧ２５７）
サブドリグラヌラムＣＡＧ１４０＊
ラクノスピラ科の細菌ＣＡＧ１４
クロストリジウム・イノキュウムＣＡＧ３６
ルミノコッカス・トルケス１  （ＣＡＧ２４３）＊
ハンガテラ・ハテワイイ１  ＣＡＧ２５＊
２系統の大腸菌  （ＣＡＧ  １１＊と３７１＊）
クロストリジウム目ＣＡＧ５３３＊
ティゼレラ・ネキシリスＣＡＧ３１１
【０２３３】
これらのうちの１８系統は、（３つのうちの）少なくとも２つのがんコホートで差がある（図２２、データは示さない）。
【０２３４】
抗生剤を摂取しなかった（ＡＴＢなし）患者だけを考慮するのであれば、１１系統のＭＧＳだけが、（３つのうちの）少なくとも２つのがんコホートで差がある（図２３）。
【０２３５】
ＡＴＢががんコホートに及ぼす直接的な効果は、ＭＧＳ分析によって明らかである。ＡＴＢの後には９系統のＭＧＳが豊富であり、６系統が除去される。ＡＴＢは、ＰＤ１阻止や他の免疫原性化学療法の効果を消す有害な細菌（バクテロイデス・ユニフォルミス、バクテロイデス・セルロシリティカス、コプロバクター・ファスティディオサス、ラクノスピラ科の細菌など）を豊富にする傾向がある。さらに、ＡＴＢは、宿主のフローラから重要な保護性抗がん細菌（ロセブリアＣＡＧ１００、ブラウティアＣＡＧ０１２１４、ユウバクテリウムＣＡＧ３８とＣＡＧ１１５など）を失わせる傾向がある。
【０２３６】
実施例１１：抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２軸を阻止する抗体を用いた場合の臨床上の利益を予測する腸フィンガープリント
上記の実施例４に開示されているのと同じ実験を、腎臓がん患者または肺がん患者のプールで実施した（Ｎ＝１００人の患者）。結果から、いくつかの種の好ましい役割が以下のように確認される：
１．診断時のシグネチャ：アッカーマンシア・ムシニフィラ、ルミノコッカス科（ＣＡＧ  ２１０  ビシルクランス、ＣＡＧ８５４、トルケス２  ＣＡＧ１２６２、２５０、細菌Ｄ１６  ＣＡＧ９４９）の好ましくかつ優勢な役割；
２．診断時のシグネチャ：インテスティニモナス・ブチリシプロドゥセンス、オシリバクター、コリンセラ属の種（タナカエイとインテスティニホミニス）の好ましい役割（データは示さず＋表２７）；
３．診断時のシグネチャ：ビフィドバクテリウム・アドレセンティス、ビフィドバクテリウム・ロンガムのほか、パラバクテロイデス・ディスタソニスとパラバクテロイデス・ゴルドステイニイ、ビロフィラ・ワズワーティア、エリュシペロトリクス科、バクテロイデス・ユニフォルミスの有害な役割。
【０２３７】
実施例１２：肺がんでＰＤ１阻止に対する反応に関係する腸フィンガープリント（ＡＴＢあり、またはＡＴＢなし）
抗ＰＤ１抗体に対する反応または抵抗性に関係していて末期ステージの肺がんに特異的な腸フィンガープリントを、３ヶ月間進行した時点で同定した。
【０２３８】
【表２７−１】
2020512294.tif 000033
【表２７−２】
2020512294.tif 000034
【０２３９】
【表２８】
2020512294.tif 000035
【０２４０】
したがって、患者が抗ＰＤ１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはＰＤ−Ｌ２抗体を用いた治療の奏効者である可能性が高いかどうかを一般に判断するために探すＭＧＳに加え、以下のＭＧＳの相対存在量を肺がん患者で測定することができる：
−  抗ＰＤ１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体または抗ＰＤ−Ｌ２抗体の奏効者である可能性が高い肺がん患者に３ヶ月経過した時点で過剰出現している追加の菌種：ＣＡＧ００２７８、ＣＡＧ００６７６（フィルミクテス門）、ＣＡＧ０１１８８、ＣＡＧ０９９４（フィルミクテス門）、ＣＡＧ１２０５、ＣＡＧ１２２０、ＣＡＧ１３９９（クロストリジウム目、オシロスピラ科）、ＣＡＧ００１１２、ＣＡＧ１３８６、ＣＡＧ００６７４、ＣＡＧ００３２８（アリスティペス）、ＣＡＧ００７３１（パラサテレラ）、ＣＡＧ０９０３、ＣＡＧ００１３４２（ルミノコッカス科）、ＣＡＧ０１２６２（ルミノコッカス科）；
−  抗ＰＤ１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体または抗ＰＤ−Ｌ２抗体に対して抵抗性である可能性が高い肺がん患者に３ヶ月経過した時点で過剰出現している追加の菌種：ＣＡＧ０１６２９（フィルミクテス門）、ＣＡＧ４３０、ＣＡＧ００３８９、ＣＡＧ００００５＿４（クロストリジウム目）。
【０２４１】
実施例１３：腎臓がんでＰＤ１阻止に対する反応に関係する腸フィンガープリント（ＡＴＢあり、またはＡＴＢなし）
初期の再発またはＰＤ阻止に対する反応に関与している可能性があるいくつかの追加のＭＧＳが存在している（表２４〜表２５）。
【０２４２】
【表２９】
2020512294.tif 000036
【０２４３】
【表３０】
2020512294.tif 000037
【０２４４】
実施例１４：非小細胞肺がんと腎臓がんの検証コホートでＰＤ１阻止に対する反応に関係する腸フィンガープリント（ＡＴＢなし）
下記の表２６に、検証コホートに関する臨床データを示す。この検証コホート（ＡＴＢなしの群）に存在する細菌は表２７に掲載してある。
【０２４５】
【表３１】
2020512294.tif 000038
【０２４６】
【表３２】
2020512294.tif 000039
【０２４７】
実施例１５：診断時のＧＣとＭＳＧの多様性が、腎臓がん＋肺がんでのＰＤ１阻止に対する６ヶ月経過した時点での反応を決める（ＡＴＢあり、またはＡＴＢなし）
抗ＰＤ１抗体を用いた治療を６ヶ月間実施した時点で反応する傾向がある患者を予測する別の指標は、遺伝子カウント（ＧＣ）とメタゲノム種（ＭＧＳ）に関する多様性指数を分析することである（図２４）。
【０２４８】
ＧＣ＞６×１０６またはＭＧＳ＞２５０だとがん患者は奏効者になる傾向がある。
【０２４９】
実施例１６：腎臓がんと肺がんでＰＤ１阻止に対する長期反応を６ヶ月の時点で予測するための、ＭＧＳに基づく動的パラメータ（ＡＴＢあり、またはＡＴＢなし）
上記の全パラメータが、ベースラインの時点、診断時、治療開始前に計算した値と関係していた。
【０２５０】
ここに、いくつかのＭＧＳの概略を提示する。治療中にこれらＭＧＳが有意に変化するというのは、患者が、治療に反応する傾向を持つこと、またはがん再発の傾向を持つことを示している。
【０２５１】
Ｖ１（治療開始前）とＶ２（モノクローナル抗体を１５日間隔で２回注射した後）の間に有意な変化が顕著に現われることはない。
【０２５２】
Ｖ３（最初のコンピュータ断層撮影の時点）で観察された変化が、臨床上の利益を予測する上で最も重要な変化である（ＭＧＳのデータは示さない）。臨床上の利益と関係する変化は、
（ｉ）以下の菌種の喪失：
−  バクテロイデス・キシラニソルベンスＣＡＧ９４５
−  バクテロイデス・ユニフォルミスＣＡＧ１５９（２つのがんに共通）
−  バクテロイデス・オバタスＣＡＧ１１６５
−  プレボテラＣＡＧ ：２５５、ＣＡＧ１６３
−  ルミノコッカス・ブロミイＣＡＧ６１１
−  ロセブリア・インテスティナリスＣＡＧ２９１
−  ユウバクテリウムＣＡＧ ：３８、ＣＡＧ  ６２９と、
（ｉｉ）以下の菌種の獲得：
−  ルミノコッカス科  ＣＡＧ１００３
−  フラボニフラクター・プラウティイＣＡＧ  ４３９
−  フィルミクテス門の細菌ＣＡＧ：１２４、ＣＡＧ  ６２９
である。
【０２５３】
実施例１７：いくつかの腫瘍モデルと、前臨床モデルでのさまざまな組織型におけるオンコバックスの効果
以下の菌株を使用した：
−  エンテロコッカス・ヒラエ：国立微生物菌株保存機関（ＣＮＣＭ）に２０１３年１１月７日に番号Ｉ−４８１５で寄託された株；
−  アッカーマンシア・ムシニフィラ：リケッチアユニットの菌株保存機関（ＣＳＵＲ）に参照番号ＣＳＵＲ  Ｐ２２６１で寄託された株；
−  アリスティペス・インディスティンクタス：リケッチアユニットの菌株保存機関（ＣＳＵＲ）に参照番号ＣＳＵＲ  Ｐ７２３で寄託された株。
【０２５４】
アッカーマンシア・ムシニフィラは、嫌気性環境において、コロンビア寒天（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社、マルシー・レトワール、フランス国）を豊富にした５％ヒツジの血液の表面で、３つの嫌気性ジェネレータ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社）を用いて３７℃にて７２時間増殖させた。アリスティペス・インディスティンクタスも、嫌気性環境において、コロンビア寒天（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社、マルシー・レトワール、フランス国）を豊富にした５％ヒツジの血液の表面で、単一の嫌気性ジェネレータを用いて３７℃にて４８時間増殖させた。エンテロコッカス・ヒラエは、嫌気性環境において、コロンビア寒天（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社、マルシー・レトワール、フランス国）を豊富にした５％ヒツジの血液の表面で３７℃にて４８時間増殖させた。
【０２５５】
細菌強制摂取について：ＰＢＳの中で蛍光分光測光器（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社）を６００  ｎｍの波長で用いて１０９  ｃｆｕ／ｍｌの懸濁液を取得した。マウスに経口で各細菌懸濁液を１００μｌ摂取させた。
【０２５６】
Ａ．ＭＣＡ２０５骨肉腫モデル：ディスバイオシスを補償できるオンコバックス（図２５〜図２６）は、単独のエンテロコッカス・ヒラエまたはアッカーマンシア・ムシニフィラであるか、それらを同時に、または順番に混合したもののほか、アリスティペス・インディスティンクタスである。アッカーマンシア・ムシニフィラ＋エンテロコッカス・ヒラエとアリスティペス・インディスティンクタスは、腫瘍微小環境（１２日目に安楽死させたときの腫瘍流入リンパ節）内のエフェクタ記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞とセントラル記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞を増加させた（図２７）。
【０２５７】
Ｂ．ＲＥＴ黒色腫モデル：図２８〜図２９に示してあるように、エンテロコッカス・ヒラエ＋アッカーマンシア・ムシニフィラの組み合わせは、このモデルにおいて非常に有効である。
【０２５８】
Ｃ．ルイス同所性肺がんモデル：図３０〜図３１。このモデルは、ｉ）われわれの結論が、放射線療法と組み合わせたＰＤ１阻止の文脈に当てはまることと、ｉｉ）ディスバイオシスが不在だと、オンコバックスが、ＩＣＢの組み合わせの抗腫瘍効果をさらに向上させうることを示している。
【０２５９】
Ｄ．ＩＣＢの組み合わせが抗ＣＴＬＡ４抗体＋抗ＰＤ１抗体である場合のＲＥＮＣＡ−ルシフェラーゼ腫瘍モデル：２人のディスバイオシス患者に由来する糞便を用いてＦＭＴを実施した。メタゲノミクスで糞便組成物にアッカーマンシア・ムシニフィラ／ルミノコッカス属の細菌  Ｄ１６  ＣＡＧ９４９を検出することはできなかった。ＦＭＴによって併用ＩＣＢ療法の効果が大きくなることはなかった（図３２〜図３３）。
【０２６０】
抗がんプロバイオティクス、すなわち「オンコバックス」を投与すると、ディスバイオシス患者で抗ＰＤ１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体または抗ＰＤ−Ｌ２抗体の効果を改善することができる、とわれわれは結論する。なおディスバイオシスは、アッカーマンシア・ムシニフィラ、ルミノコッカスの各ＣＡＧ、アリスティペス、ユウバクテリウム、インテスティニモナス・ブチリシプロドゥセンス、ビフィズス菌（アドレセンティス、ロンガム）、バクテロイデス（ノルディイ、ゴルドステイニイ）、ビロフィラ・ワズワーティアに焦点を当てたＭＧ分析に基づいている。
【０２６１】
重要なことだが、これらの抗がんプロバイオティクスは、ユーバイオシス（ｅｕｂｉｏｓｉｓ：腸内細菌叢のバランスが取れた状態）を示す患者でも反応を改善する可能性がある。また、これらの抗がんプロバイオティクスは、単独の抗ＰＤ１抗体の効果だけでなく、抗ＣＴＬＡ４抗体または放射線療法との組み合わせの効果も大きくする。
【０２６２】
実施例１８：ＰＤ−１を阻止している間の「好ましい糞便組成、すなわちユーバイオシス」の生物活性に関係する血液マーカー
オンコバックスまたは好ましい糞便（優れたＭＧ組成）のＦＭＴの効果または生物活性の最良の代替マーカーの１つは、循環している（または脾臓の）ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞の表面におけるＰＤ−Ｌ１の上方調節（図３４〜図３７）、または循環しているＴ細胞の表面におけるＣＣＲ９の上方調節である。
【０２６３】
実施例１９：奏効患者からの糞便を用いたＦＭＴは、非奏効患者でディスバイオシスを補償し、免疫チェックポイント阻害剤に対する反応を回復させることができる
同所性腎臓がんモデル（ＲＥＮＣＡ）において、ディスバイオシスを示す（ＰＤ１阻止を逃れた）非奏効ＲＣＣがん患者からのＦＭＴがアバターマウスでＰＤ１阻止の効果を消せることを示した。（抗ＰＤ１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体を投与されてＲＥＣＩＳＴ基準に従う臨床反応を示した）奏効ＲＣＣ患者からの糞便を経口で強制的に摂取させると、ディスバイオシスを示すアバターマウスで失われたＰＤ１阻止の抗腫瘍効果を回復させることができた。したがってディスバイオシスを示すＮＳＣＬＣ／ＲＣＣ患者または乳がん患者を、正常なボランティアからのＦＭＴの代わりに、奏効患者からのＦＭＴ（診断時または６ヶ月間治療した後の糞便）で治療することが考えられる（図３８）。
【０２６４】
実施例２０：健康なボランティアからの糞便を用いたＦＭＴは、非奏効患者でディスバイオシスを補償し、メトロノミックシクロホスファミド（ＣＴＸ）に対する反応を回復させることができる
マウス乳がんモデル（ＡＴ３）を用い、（化学療法が奏効せず、トリプルネガティブで、Ｋｉ６７が高く、ＭＧ分析でα多様性とβ多様性が低下していた）ディスバイオシスを示す乳がん患者からのＦＭＴがアバターＡＴ３保持マウスでＣＴＸの効果を低下させることを示した（図３９）。健康なボランティアＨＶからの糞便を（経口強制摂取または同居（cohousing）によって）補償すると、ある種のユーバイオシス（ＨＶに由来する微生物フローラ）が回復されることでＣＴＸの効果喪失が補償される。
【０２６５】
実施例２１：多彩ながん患者のディスバイオシスは、特定の株と細菌コンソーシアムを用いて補償することができる
同所性腎臓がんモデル（ＲＥＮＣＡ）において、ディスバイオシスを示す（ＰＤ１阻止を逃れた）非奏効ＲＣＣがん患者からのＦＭＴがアバターマウスでＰＤ１阻止の効果を消せることを示した。アッカーマンシア・ムシニフィラ、バクテロイデス・セイリヤーシアエ、アッカーマンシア・ムシニフィラのいずれかとエンテロコッカス・ヒラエを経口で強制的に摂取させると、ＰＤ１阻止の抗腫瘍効果を回復させることができた。
【０２６６】
それと並行して、（図４０〜図４３に示したように）異なる腫瘍モデル（アバターマウスの肉腫）において、抗ＰＤ１抗体だけを注射したＭＣＡ２０５肉腫保持マウスで失われたＰＤ１阻止の効果をＦＭＴで処置することによって改善できた。実際、アッカーマンシア・ムシニフィラ、バクテロイデス・セイリヤーシアエ、アッカーマンシア・ムシニフィラのいずれかとエンテロコッカス・ヒラエを経口で強制的に摂取させると、ＰＤ１阻止の抗腫瘍効果を回復させることができた。さらに、エンテロコッカス・ヒラエ（クローン１３１４４＝ＣＮＣＭ  Ｉ−４８１５、ＩＧＲ７＝ＣＮＣＭ  Ｉ−５２２４、ＩＧＲ４＝ＣＮＣＭ  Ｉ−５２６０）とバルネシエラ・インテスティニホミニスの組み合わせ、またはエンテロコッカス・ヒラエ（クローンＩＧＲ７、ＩＧＲ４、１３１４４）とクリステンセネラ・ミヌタの組み合わせ、またはエンテロコッカス・ヒラエ（クローンＩＧＲ７、ＩＧＲ４、１３１４４）とアクチノチグナム・シャアリイの組み合わせ、またはエンテロコッカス・ヒラエ（クローンＩＧＲ７、ＩＧＲ４、１３１４４）とアッカーマンシア・ムシニフィラ（ｐ２２６１とｐ３４１５）とユウバクテリウム・リモサムの組み合わせも、そうするのに効果的であった。
【０２６７】
ここに記載した常在菌コンソーシアムは、ＰＤ１阻止が有効なあらゆる種類の腫瘍（特にＮＳＣＬＣ、ＲＣＣ、乳がん）の文脈で有効である可能性がある。
【０２６８】
実施例２２：バルネシエラ・インテスティニホミニスは、抗ＰＤ１抗体の効果と関係している
抗ＰＤ１抗体で治療したＭＣＡ２０５腫瘍保持マウスとアイソタイプ対照抗体で治療したＭＣＡ２０５腫瘍保持マウスの糞便のメタゲノム分析を実施することにより、抗ＰＤ１抗体で治療したマウスにバルネシエラ・インテスティニホミニスが存在していることが治療効果と相関していることを明らかにできた（図４４）。実際、バルネシエラ・インテスティニホミニスを経口で強制的に摂取させると、単独の抗ＰＤ１抗体の効果、または抗ＣＴＬＡ４抗体との組み合わせの効果を改善することができる（図４３）。
【０２６９】
オンコバックスバルネシエラ・インテスティニホミニス（患者またはマウスに由来する株）を単独で、またはエンテロコッカス・ヒラエ単離体＋／−  アッカーマンシア・ムシニフィラを含むコンソーシアムの中で用いた補償により、腎臓がん患者または肺がん患者や、免疫チェックポイント阻害剤を用いた治療が有効なあらゆるがん患者で、特に抗生剤を投与された患者や腸内ディスバイオシスがあると診断された患者で、ＰＤ１阻止またはＰＤ１／ＣＴＬＡ４同時阻止の効果を回復させることができる、とわれわれは結論する。
【０２７０】
実施例２３：オンコバックスを保護すると、抗ＰＤ１治療剤の毒性（抗ＣＴＬＡ４抗体＋抗ＰＤ１抗体の組み合わせで発生する自己免疫障害）が減少する
実施例２１で用いたのと同じ腫瘍モデルにおいて、発明者は、免疫チェックポイント阻害剤の効果と毒性を分離できることを明らかにした。実際、図４５に示してあるように、奏効者に由来する糞便の移植により、非奏効者からの糞便で生じた毒性が減少した。オンコバックスで補償したＦＭＴは、大腸炎スコアを低下させた。
【０２７１】
実施例２４：免疫チェックポイント阻害剤は、治療効果（腫瘍サイズの縮小）に関与する腸マイクロバイオーム組成の有意な変化を誘導する
２つの異なるマウス腫瘍モデル（ＭＣＡ２０５肉腫とＲＥＴ黒色腫）で皮膚に存在するマイクロバイオームの経時変化を、６匹のマウス／群において、マウスの糞便の遺伝子アンプリコンの１６Ｓ  ｒＲＮＡシークエンシングを利用して、抗ＰＤ１抗体だけ、または抗ＣＴＬＡ４抗体との組み合わせを注射する前、２回注射した後、５回注射した後に、細菌組成の有意な変化を分析することによって分析した（図４６）。β多様性の主成分分析から、時間が経過して有意な差が生じたことがわかる。これは、ＩＣＢの組み合わせが、腫瘍のサイズと有意に相関しているマイクロバイオーム組成のシフトを誘導することを意味する（図４７、図４８）。
【０２７２】
奏効者では両方の腫瘍モデルで共通して見られた（が非奏効者では見られなかった）７８系統の菌種は、ＳＣＦＡ産生細菌（健康に関係する細菌であるクロストリジウム科、ブラウティア、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイなど）に属する（図４９）。ＰＤ１阻止が奏効するヒト肺／腎臓がん患者で見られたバクテロイデス門のいくつかのメンバー（バクテロイデス・フィネゴルディイ、バクテロイデス・インテスティナリス、バクテロイデス・メディテラネエンシス）と、アリスティペス・オンデルドンキイ、ビフィズス菌、ユウバクテリウムが優勢であることが確認される。われわれは、以前の特許出願ＥＰ １７３０６５０９．５からの他のデータ（大腸がんとオキサリプラチン。ここではエリュシペロトリクス科のエリュシペラトクロストリジウム・ラモサムが免疫原性であることが見いだされた）に基づき、ディエルマ・ファスティディオサ（フィルミクテス門／エリュシペロトリクス綱）には免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＢ）の効果に対する潜在的に有利な役割があると予測する。
【０２７３】
興味深いことに、抗ＣＴＬＡ４抗体＋抗ＰＤ１抗体の組み合わせの奏効者で共有されている共通の細菌は、アッカーマンシア・ムシニフィラ、アリスティペス・インディスティンクタス、バクテロイデス属のいくつかの種、バルネシエラ・インテスティニホミニス、エリュシペラトクロストリジウム・ラモサム、フラボニフラクター・プラウティイを含んでいる（これらはすべて、ＰＤ１阻止が奏効するヒト（ＮＳＣＬＣ／腎臓がん）で見られ、免疫原性プロバイオティクス「オンコバックス」のわれわれのリストに含まれている）（図５０）。これらの細菌が連携することにより、ＩＣＢの組み合わせに対する臨床反応と関係するエコシステムが提供される。
【０２７４】
参考文献Arrieta, M.-C., Stiemsma, L.T., Dimitriu, P.A., Thorson, L., Russell, S., Yurist-Doutsch, S., Kuzeljevic, B., Gold, M.J., Britton, H.M., Lefebvre, D.L., et al. (2015). Early infancy microbial and metabolic alterations affect risk of childhood asthma. Sci. Transl. Med. 7, 307ra152.
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【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ−Ｃ】
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【図１９Ｄ−Ｅ】
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【図１９Ｆ−Ｉ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【図４０Ａ】
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【図４０Ｂ】
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【図４１】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ−Ｃ】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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