(57)【要約】  本出願で提供されるのは、シェダーゼ切断に対する耐性を示すＴＲＥＭ２変異体（例えば、シェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体）と、そのようなシェダーゼ切断に対する耐性を示すＴＲＥＭ２変異体をコードする核酸とに関連する方法及び組成物である。
2020530986.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体をコードする配列を含む核酸。
【請求項２】
前記シェダーゼはＡＤＡＭ１７又はＡＤＡＭ１０である、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
前記シェダーゼはＡＤＡＭ１７である、請求項１に記載の核酸。
【請求項４】
前記ヒトＴＲＥＭ２変異体は、配列番号３３〜４０のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含むストーク領域を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項５】
前記ヒトＴＲＥＭ２変異体は、配列番号３３〜４０のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列からなるストーク領域を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項６】
前記ヒトＴＲＥＭ２変異体は、配列番号３３〜３５のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含むストーク領域を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項７】
前記ヒトＴＲＥＭ２変異体は、配列番号３３〜３５のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列からなるストーク領域を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項８】
前記ヒトＴＲＥＭ２変異体は、配列番号４１〜４８のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項９】
前記ヒトＴＲＥＭ２変異体は、配列番号４１〜４８のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項１０】
前記配列は配列番号６７〜７４のいずれか１つを含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項１１】
プロモーターをさらに含む請求項１に記載の核酸。
【請求項１２】
前記プロモーターは構成的プロモーターである、請求項１１に記載の核酸。
【請求項１３】
前記プロモーターは誘導性プロモーターである、請求項１１に記載の核酸。
【請求項１４】
前記プロモーターは合成プロモーターである、請求項１１に記載の核酸。
【請求項１５】
前記プロモーターは細胞型特異的プロモーターである、請求項１１に記載の核酸。
【請求項１６】
前記プロモーターは、特にミクログリア中で、マクロファージ中で、又は樹状細胞中で、前記核酸の発現を駆動する、請求項１５に記載の核酸。
【請求項１７】
前記プロモーターは、ＴＲＥＭ２プロモーター、ＴＭＥＭ１１９プロモーター、Ｈｅｘｂプロモーター、ＩＢＡ１プロモーター、ＣＤ４５プロモーター、ＣＤ１１ｂプロモーター、Ｃｓｔ７プロモーター、Ｌｐｌプロモーター、Ｃｓｆ１プロモーター、Ｃｓ１Ｒプロモーター、Ｉｔｇａｘプロモーター、Ｃｌｅｃ７ａプロモーター、Ｌｉｌｒｂ４プロモーター、Ｔｙｒｏｂｐプロモーター、Ｃｔｓｂプロモーター、Ｃｔｓｄプロモーター、Ｂ２ｍプロモーター、Ｌｙｚ２プロモーター、Ｃｘ３ｃｒ１プロモーター、Ｃｓｔ３プロモーター、Ｃｔｓｓプロモーター、Ｐ２ｒｙ１２プロモーター、Ｃ１ｑａプロモーター、又はＣ１ｑｂプロモーターから選択される、請求項１１に記載の核酸。
【請求項１８】
前記プロモーターはＴＲＥＭ２プロモーターである、請求項１１に記載の核酸。
【請求項１９】
ポリアデニル化シグナルをさらに含む請求項１に記載の核酸。
【請求項２０】
ＤＡＰ１２タンパク質をコードする第２の配列をさらに含む請求項１に記載の核酸。
【請求項２１】
前記ＤＡＰ１２タンパク質は配列番号４９を含む、請求項２０に記載の核酸。
【請求項２２】
前記ＤＡＰ１２タンパク質は配列番号４９からなる、請求項２０に記載の核酸。
【請求項２３】
前記核酸は、前記第２の配列の上流に配列内リボソーム侵入部位を含む、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項２４】
前記核酸は、前記第２の配列の上流に２Ａ配列を含み、前記２Ａ配列は、配列番号５２〜６６のいずれか１つから選択される、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項２５】
請求項１〜２４のいずれか一項に記載の核酸を含むベクター。
【請求項２６】
前記ベクターは、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、プラスミド、コスミド、又はウイルスベクターから選択される、請求項２５に記載のベクター。
【請求項２７】
前記ウイルスベクターは、下記のウイルスのいずれか１つをベースとするベクターから選択される：レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、パルボウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、シンドビスウイルス（Ｓｉｎｂｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、インフルエンザウイルス、レオウイルス、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、麻疹ウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ポリオウイルス、ポックスウイルス、セネカバレーウイルス、コクサッキーウイルス、エンテロウイルス、粘液腫ウイルス、又はマラバウイルス、請求項２６に記載のベクター。
【請求項２８】
前記ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである、請求項２６に記載のベクター。
【請求項２９】
前記ウイルスベクターはＡＡＶベクターである、請求項２６に記載のベクター。
【請求項３０】
選択マーカーをさらに含む請求項２５に記載のベクター。
【請求項３１】
請求項１〜２４のいずれか一項に記載の核酸又は請求項２５〜３０のいずれか一項に記載のベクターを含む細胞。
【請求項３２】
前記細胞は、マクロファージ、樹状細胞、又はミクログリアから選択される、請求項３１に記載の細胞。
【請求項３３】
前記細胞は選択マーカーを発現する、請求項３１又は３２に記載の細胞。
【請求項３４】
配列番号３３〜４０のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項３５】
前記ポリペプチドは、配列番号４１〜４８のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３４に記載のポリペプチド。
【請求項３６】
対象中においてＴＲＥＭ２発現を増加させる方法であって、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の核酸、請求項２５〜３０のいずれか一項に記載のベクター、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の細胞を前記対象に投与する工程を含む方法。
【請求項３７】
必要とする対象のＴＲＥＭ２関連の疾患又は障害を処置する方法であって、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の核酸、請求項２５〜３０のいずれか一項に記載のベクター、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の細胞を前記対象に投与する工程を含む方法。
【請求項３８】
前記対象はＴＲＥＭ２関連の疾患又は障害を有する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記対象はヒトである、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＴＲＥＭ２関連の疾患又は障害は、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、那須・ハコラ病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、抗ＮＭＤＡ受容体脳炎、自閉症、脳ループス（ＮＰ−ＳＬＥ）、化学療法誘発性末梢神経障害（ＣＩＰＮ）、帯状疱疹後神経痛（ｐｏｓｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｎｅｕｒａｌｇｉａ）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、てんかん、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、封入体筋炎、リソソーム蓄積症、スフィンゴミエリンリピドーズ（ニーマン・ピックＣ）、ムコ多糖症ＩＩ／ＩＩＢ、異染性白質ジストロフィー、多巣性運動ニューロパチー、重症筋無力症、神経ベーチェット病、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、視神経炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、ラスムッセン脳炎、レット症候群、脳卒中、横断性脊髄炎、脳外傷、脊髄損傷、ウイルス性脳炎、又は細菌性髄膜炎から選択される神経炎症性疾患又は神経変性疾患である、請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＴＲＥＭ２関連の疾患又は障害はアルツハイマー病である、請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＴＲＥＭ２関連の疾患又は障害は前頭側頭型認知症である、請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記核酸、ベクター、又は細胞を、静脈内経路、頭蓋内経路、髄腔内経路、皮下経路、又は鼻腔内経路を通して前記対象に投与する、請求項３６〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記方法は、前記対象に第２の薬剤を投与する工程をさらに含む、請求項３６〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記方法は、対象から得られた試料中における細胞表面ヒトＴＲＥＭ２レベルをアッセイする工程をさらに含む、請求項３６〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記試料は脳脊髄液を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記試料中における前記細胞表面ヒトＴＲＥＭ２レベルを、フローサイトメトリー、免疫組織化学、ウエスタンブロッティング、免疫蛍光アッセイ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）、又はポジトロン断層撮影（ＰＥＴ）から選択されるアッセイにより決定する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
対象のＴＲＥＭ２関連の疾患又は障害の処置のための、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の核酸、請求項２５〜３０のいずれか一項に記載のベクター、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の細胞、又は請求項３４若しくは３５に記載のポリペプチドの使用。
【請求項４９】
対象のＴＲＥＭ２関連の疾患又は障害の処置のための薬物の製造における、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の核酸、請求項２５〜３０のいずれか一項に記載のベクター、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の細胞、又は請求項３４若しくは３５に記載のポリペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的手段により提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０１８年７月２０日に作成された前記ＡＳＣＩＩの複製は、ＰＡＴ０５７８３６−ＷＯ−ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、サイズは６０，５３８バイトである。
【０００２】
本発明は、シェダーゼ（ｓｈｅｄｄａｓｅ）切断に対する耐性を示すＴＲＥＭ２変異体（例えば、シェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体）と、そのようなシェダーゼ切断に対する耐性を示すＴＲＥＭ２変異体をコードする核酸とに関連する方法及び組成物を提供する。
【背景技術】
【０００３】
骨髄細胞上で発現されるトリガー受容体（即ち「ＴＲＥＭ」）は、様々なタイプの骨髄細胞（例えば、マスト細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、及び好中球）上で発現される一群の膜貫通糖タンパク質である。ＴＲＥＭは、その細胞外ドメイン中に免疫グロブリン（Ｉｇ）型の折り畳みを有し、そのため免疫グロブリンスーパーファミリ（ＩｇＳＦ）に属する。ＴＲＥＭ受容体は短い細胞内ドメインを含むがシグナル伝達メディエータのためのドッキングモチーフを欠いており、細胞活性化のためにはアダプタータンパク質（例えばＤＡＰ１２（１２ｋＤａのＤＮＡＸ−活性化タンパク質））を必要とする。ＴＲＥＭには下記の２種のメンバー：ＴＲＥＭ１及びＴＲＥＭ２が報告されており、これらは両方とも、免疫反応及び炎症反応において重要な役割を果たす。
【０００４】
ＴＲＥＭ２は、マクロファージ上で、樹状細胞上で、破骨細胞上で、ミクログリア上で、肺上皮細胞上で、及び肝細胞癌細胞上で発現されるが、血液中の骨髄系細胞には存在しない。ＴＲＥＭ２はＤＡＰ１２と物理的に会合し、このＤＡＰ１２は、ＴＲＥＭ２及び多くのその他の細胞表面受容体のシグナル伝達アダプタータンパク質として作用する。ＤＡＰ１２の細胞質ドメインは、免疫受容体チロシン活性化モチーフを含む（Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８８，３３０２７−３３０３６，２０１３）。相互作用する受容体の活性化後、ＤＡＰ１２は、Ｓｒｃキナーゼにより、２つの保存されたＩＴＡＭチロシン残基でリン酸化を受ける。その後のＳｙｋタンパク質キナーゼの動員及び活性化により、下流のシグナル伝達経路（例えば、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）及びホスホリパーゼＣγ（ＰＬＣγ）の活性化）が引き起こされる。
【０００５】
ＴＲＥＭ２は、リポ多糖（ＬＰＳ）、熱ショックタンパク質６０、神経突起デブリ（ｎｅｕｒｉｔｉｃ  ｄｅｂｒｉｓ）、細菌、並びに広範な陰イオン性脂質及び双性イオン性脂質、例えばホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、及びスフィンゴミエリンにより活性化され得る。ＴＲＥＭ２の活性化により、ミクログリア及びマクロファージの貪食能が増加し、炎症性サイトカインの放出が減少し、且つＴＬＲシグナル伝達が制限される。ＴＲＥＭ２は、ＣＳＦ−１受容体シグナル伝達と相乗作用することによりミクログリアの生存を維持する。さらに、ＴＲＥＭ２は、細胞の付着及び運動性を制御するプレキシン−Ａ１と相互作用する。ＴＲＥＭ２シグナル伝達は、摂取された獲物の分解を促進し、脂質代謝、ミエリンの取込み、及び細胞内分解に重要である。
【０００６】
ＴＲＥＭ２は、外部ドメインの脱落及び膜内タンパク質分解による連続的なタンパク質分解処理を受ける（Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８８，３３０２７−３３０３６，２０１３）。外部ドメインの脱落の最中に、ＴＲＥＭ２の外部ドメインは、ＡＤＡＭ（ディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼドメイン含有タンパク質）ファミリ又はＢＡＣＥ（ｂ−部位ＡＰＰ切断酵素）ファミリのメンバー等のプロテアーゼにより放出される（Ｋｌｅｉｎｂｅｒｇｅｒ，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．２０１４；６（２４３）：２４３ｒａ８６）。外部ドメインの除去後、残存する膜保持断片は、γ−セクレターゼにより媒介される膜内タンパク質分解によりさらに処理される。外部ドメインの脱落により生じるＴＲＥＭ２の可溶性断片（ｓＴＲＥＭ２）は、樹状細胞培養物の上清と、非炎症性の神経性疾患及び多発性硬化症の患者の血漿試料及びＣＳＦ試料とで観察されている（Ｋｌｅｉｎｂｅｒｇｅｒ，２０１４）。ヒトＣＳＦ中におけるＴＲＥＭ２の脱落した外部ドメイン（ｓＴＲＥＭ２）は、潜在的なアルツハイマー病（ＡＤ）のバイオマーカーとして評価されており、且つ一般に加齢と共に増加することが分かっている（Ｓｕａｒｅｚ−Ｃａｌｖｅｔ，ＥＭＢＯ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ８，４６６−４７６，２０１６）。ＡＤの経過中の詳細な分析により、ｓＴＲＥＭ２は、臨床症状が現れる前のＡＤの初期に増加し、ＭＣＩ−ＡＤでピークに達し、上昇したままであるがＡＤ認知症のＭＣＩ−ＡＤステージと比較して低いレベルであることが明らかとなった（Ｓｕａｒｅｚ−Ｃａｌｖｅｔ，２０１６）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本明細書で提供されるのは、シェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体（例えば、ＡＤＡＭ１７切断又はＡＤＡＭ１０切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体）、シェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体をコードする核酸、並びにそのような核酸を含むベクター及び細胞である。同様に本明細書で提供されるのは、シェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体をコードする核酸又はそのような核酸を含むベクター及び細胞を使用することによる、対象中においてＴＲＥＭ２発現を増加させる方法、及び対象のＴＲＥＭ２関連の疾患又は障害を処置する方法である。
【０００８】
一態様では、本明細書で提供されるのは、シェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体（例えば、ＤＡＭ１７切断又はＡＤＡＭ１０切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体）をコードする配列を含む核酸である。
【０００９】
いくつかの実施形態では、このヒトＴＲＥＭ２変異体は、配列番号３３〜４０のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含むストーク領域（ｓｔａｌｋ  ｒｅｇｉｏｎ）を含む。いくつかの実施形態では、このヒトＴＲＥＭ２変異体は、配列番号３３〜４０のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列からなるストーク領域を含む。いくつかの実施形態では、このヒトＴＲＥＭ２変異体は、配列番号３３〜３５のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含むストーク領域を含む。いくつかの実施形態では、このヒトＴＲＥＭ２変異体は、配列番号３３〜３５のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列からなるストーク領域を含む。いくつかの実施形態では、このヒトＴＲＥＭ２変異体は、配列番号４１〜４８のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、このヒトＴＲＥＭ２変異体は、配列番号４１〜４８のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１０】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、配列番号６７〜７４のいずれか１つを含む核酸である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、配列番号６７〜６９のいずれか１つを含む核酸である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、配列番号６７、７０、又は７４のいずれか１つを含む核酸である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、配列番号６７を含む核酸である。
【００１１】
いくつかの実施形態では、そのような核酸は、プロモーター（例えば、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、合成プロモーター、又は細胞型特異的プロモーター）を含み得る。いくつかの実施形態では、このプロモーターは細胞型特異的プロモーターである。例えば、このプロモーターは、特にミクログリア中で、マクロファージ中で、又は樹状細胞中で、前記核酸の発現を駆動する。いくつかの実施形態では、そのような核酸は、ＴＲＥＭ２プロモーター、ＴＭＥＭ１１９プロモーター、Ｈｅｘｂプロモーター、ＩＢＡ１プロモーター、ＣＤ４５プロモーター、ＣＤ１１ｂプロモーター、Ｃｓｔ７プロモーター、Ｌｐｌプロモーター、Ｃｓｆ１プロモーター、Ｃｓ１Ｒプロモーター、Ｉｔｇａｘプロモーター、Ｃｌｅｃ７ａプロモーター、Ｌｉｌｒｂ４プロモーター、Ｔｙｒｏｂｐプロモーター、Ｃｔｓｂプロモーター、Ｃｔｓｄプロモーター、Ｂ２ｍプロモーター、Ｌｙｚ２プロモーター、Ｃｘ３ｃｒ１プロモーター、Ｃｓｔ３プロモーター、Ｃｔｓｓプロモーター、Ｐ２ｒｙ１２プロモーター、Ｃ１ｑａプロモーター、又はＣ１ｑｂプロモーターから選択されるプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、そのような核酸はＴＲＥＭ２プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、そのような核酸はポリアデニル化シグナルを含み得る。
【００１２】
いくつかの実施形態では、シェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体をコードする配列を含む核酸は、ＤＡＰ１２タンパク質をコードする第２の配列をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、そのような核酸は、この第２の配列の上流に配列内リボソーム侵入部位を含む。いくつかの実施形態では、そのような核酸は、この第２の配列の上流に２Ａ配列（例えば、配列番号５２〜６６のいずれか１つから選択される２Ａ配列）を含む。このＤＡＰ１２タンパク質は配列番号４９を含み得る。いくつかの実施形態では、このＤＡＰ１２タンパク質は配列番号４９からなる。
【００１３】
別の態様では、本明細書で提供されるのは、シェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体をコードする配列を含む核酸を含むベクター（例えば発現ベクター）である。そのようなベクターは、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、プラスミド、コスミド、又はウイルスベクターであり得る。いくつかの実施形態では、このベクターは、下記のウイルスのいずれか１つをベースとするベクターから選択されるウイルスベクターである：レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、パルボウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、シンドビスウイルス（Ｓｉｎｂｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、インフルエンザウイルス、レオウイルス、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、麻疹ウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ポリオウイルス、ポックスウイルス、セネカバレーウイルス、コクサッキーウイルス、エンテロウイルス、粘液腫ウイルス、又はマラバウイルス。いくつかの実施形態では、このベクターはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、このベクターはＡＡＶベクターである。いくつかの実施形態では、このベクターは選択マーカーをさらに含む。
【００１４】
別の態様では、本明細書で提供されるのは、シェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体をコードする配列を含む核酸又はベクターを含む細胞である。そのような細胞は、マクロファージ、樹状細胞、又はミクログリアであり得る。いくつかの実施形態では、この細胞は選択マーカーを発現し得る。
【００１５】
さらなる態様では、本明細書で提供されるのは、配列番号３３〜４０のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。同様に提供されるのは、配列番号４１〜４８のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００１６】
さらなる態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で説明されている核酸、ベクター、又は細胞のいずれかを対象（例えばヒト）に投与することによる、この対象中においてＴＲＥＭ２発現を増加させる方法である。この対象は、ＴＲＥＭ２関連の疾患又は障害を有し得る。そのような核酸、ベクター、又は細胞を、静脈内経路、頭蓋内経路、髄腔内経路、皮下経路、又は鼻腔内経路を通して、この対象に投与し得る。この方法は、この対象に第２の薬剤を投与する工程をさらに含み得る。
【００１７】
さらなる態様では、本明細書で提供されるのは、必要とする対象（例えばヒト）のＴＲＥＭ２関連の疾患又は障害を処置する方法であって、本明細書で説明されている核酸、ベクター、又は細胞のいずれかをこの対象に投与する工程を含む方法である。そのような核酸、ベクター、又は細胞を、静脈内経路、頭蓋内経路、髄腔内経路、皮下経路、又は鼻腔内経路を通して、この対象に投与し得る。この方法は、この対象に第２の薬剤を投与する工程をさらに含み得る。
【００１８】
いくつかの実施形態では、このＴＲＥＭ２関連の疾患又は障害は、下記から選択される神経炎症性疾患又は神経変性疾患である：アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、那須・ハコラ病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、抗ＮＭＤＡ受容体脳炎、自閉症、脳ループス（ｂｒａｉｎ  ｌｕｐｕｓ）（ＮＰ−ＳＬＥ）、化学療法誘発性末梢神経障害（ＣＩＰＮ）、帯状疱疹後神経痛（ｐｏｓｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｎｅｕｒａｌｇｉａ）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、てんかん、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、封入体筋炎、リソソーム蓄積症、スフィンゴミエリンリピドーズ（ニーマン・ピックＣ）、ムコ多糖症ＩＩ／ＩＩＩＢ、異染性白質ジストロフィー、多巣性運動ニューロパチー、重症筋無力症、神経ベーチェット病、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、視神経炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、ラスムッセン脳炎、レット症候群、脳卒中、横断性脊髄炎、脳外傷、脊髄損傷、ウイルス性脳炎、又は細菌性髄膜炎。いくつかの実施形態では、このＴＲＥＭ２関連の疾患又は障害はアルツハイマー病である。いくつかの実施形態では、このＴＲＥＭ２関連の疾患又は障害は前頭側頭型認知症である。
【００１９】
いくつかの実施形態では、本明細書で説明されている方法は、対象から得られた試料（例えば脳脊髄液試料）中における細胞表面ヒトＴＲＥＭ２レベルをアッセイする工程をさらに含み得る。この試料中における細胞表面ヒトＴＲＥＭ２レベルを、フローサイトメトリー、免疫組織化学、ウエスタンブロッティング、免疫蛍光アッセイ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）、又はポジトロン断層撮影（ＰＥＴ）から選択されるアッセイにより決定し得る。
【００２０】
同様に含まれるのは、対象のＴＲＥＭ２関連の疾患又は障害の処置のための、本明細書で説明されている核酸、ベクター、細胞、又はポリペプチドの使用である。対象のＴＲＥＭ２関連の疾患又は障害の処置のための薬物の製造における、本明細書で説明されている核酸、ベクター、細胞、又はポリペプチドの使用も企図される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】図１：図１Ａは、ヒトＴＲＥＭ２アイソフォーム１のアミノ酸配列（配列番号１）、カニクイザル（Ｃｙｎｏ）ＴＲＥＭ２アイソフォーム１のアミノ酸配列（配列番号５）、及びマウスＴＲＥＭ２アイソフォーム１のアミノ酸配列（配列番号６）の例示的なアラインメントを示す。ＴＲＥＭ２のストーク領域は、薄い灰色の影付きの残基を含む。ＴＲＥＭ２の膜貫通ドメインは、下線付きの残基を含む。図１Ｂは、ヒトＴＲＥＭ２のアイソフォーム１のアミノ酸配列（配列番号１）、アイソフォーム２のアミノ酸配列（配列番号３）、及びアイソフォーム３のアミノ酸配列（配列番号４）の例示的なアラインメントを示す。図１Ｃは、ヒトＴＲＥＭ２のアイソフォーム１のストーク領域のアミノ酸配列（配列番号８９）、アイソフォーム２のストーク領域のアミノ酸配列（配列番号８）、及びアイソフォーム３のストーク領域のアミノ酸配列（配列番号９）の例示的なアラインメントを含む。図１Ｄは、ヒトＴＲＥＭ２アイソフォーム１のストーク領域のアミノ酸配列（配列番号７）、カニクイザルＴＲＥＭ２アイソフォーム１のストーク領域のアミノ酸配列（配列番号１０）、及びマウスＴＲＥＭ２アイソフォーム１のストーク領域のアミノ酸配列（配列番号１１）の例示的なアラインメントを示す。図１Ｅは、ＴＲＥＭ２の構造と、このＴＲＥＭ２の、シグナル伝達アダプタータンパク質ＤＡＰ１２との相互作用とを示す。成熟ＴＲＥＭ２は、単一免疫グロブリン（ＩｇＳＦ）ドメイン、ストーク領域、膜貫通（ＴＭ）ドメイン、及び細胞質ドメインを含む。
【図１Ｂ】（上記の通り。）
【図１Ｃ】（上記の通り。）
【図１Ｄ】（上記の通り。）
【図１Ｅ】（上記の通り。）
【図２Ａ】図２：図２Ａ〜２Ｅは、ＡＤＡＭ１７が、ＣＨＯ−ｈＤＡＰ１２−ｈＴＲＥＭ２細胞及びヒトＭ２ＡマクロファージでのＴＲＥＭ２外部ドメインの切断に極めて重要なシェダーゼであることを示す。図２Ａ〜２Ｂは、ＡＤＡＭ阻害剤ＤＰＣ３３３（黒丸）又はＧＩ２５４０２３（上向き三角形）による処理の後のＣＨＯ−ｈＤＡＰ１２−ｈＴＲＥＭ２におけるＴＲＥＭ２細胞表面発現を示し、図２Ｂでは追加のミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）処理を適用した。図２Ｃ〜２Ｄは、ＡＤＡＭ阻害剤ＤＰＣ３３３（黒丸）又はＧＩ２５４０２３（上向き三角形）による処理の後のヒトＭ２ＡマクロファージにおけるＴＲＥＭ２細胞表面発現を示し、図２Ｄでは追加のＰＭＡ処理を適用した。ＴＲＥＭ２細胞表面染色を、平均±Ｓ．Ｅ．（ｎ＝３）とした核染色に関して補正された平均強度としてプロットしている。２つの実験からの代表的な実験を示す。図２Ｅは、ｐＨ７．５のＨｅｐｅｓ緩衝液中におけるインビトロでのＤＰＣ３３３及びＧＩ２５４０２３による組換えＡＤＡＭ１０及びＡＤＡＭ１７の阻害を示す線グラフである。
【図２Ｂ】（上記の通り。）
【図２Ｃ】（上記の通り。）
【図２Ｄ】（上記の通り。）
【図２Ｅ】（上記の通り。）
【図３Ａ】図３：図３Ａ〜３Ｄは、ＡＤＡＭ１７  ＴＲＥＭ２ノックアウトＴＨＰ１細胞がＴＲＥＭ２発現の増加及び脱落したＴＲＥＭ２（ｓＴＲＥＭ２）の減少を示すが、ＡＤＡＭ１０  ＴＲＥＭ２ノックアウトＴＨＰ１細胞は示さないことを示す棒グラフである。図３Ａは、ＴＨＰ１  ＣＲＩＳＰＲ細胞クローンにおけるＴＲＥＭ２細胞表面発現を示す。図３Ｂは、ＴＨＰ１  Ｃ  ＣＲＩＳＰＲ細胞クローンからの上清のｓＴＲＥＭ２レベルを示す。データを、平均±Ｓ．Ｅ．（ｎ＝２）としてプロットする。＊ｐ＜０．０１、Ｃｔｒｌ  ｇＲＮＡクローンの未処理群に対する統計的差異。＃ｐ＜０．０１、Ｃｔｒｌ  ｇＲＮＡクローンのＰＭＡ処理群に対する統計的差異。Ｃｔｒｌ  ｇＲＮＡは、対照ｇＲＮＡがトランスフェクトされたクローンであり、ＡＤ１０  Ｈ４は、ＡＤＡＭ１０  ＣＲＩＳＰＲノックアウトクローンであり、ＡＤ１７  Ｇ１２  は、ＡＤＡＭ１７  ＣＲＩＳＰＲノックアウトクローンである。図３Ｃは、ＴＨＰ１  ＡＤＡＭ１０  Ｈ４  ＣＲＩＳＰＲクローンにおけるＡＤＡＭ１０発現の欠如を示す。左側のパネルは対照クローンＣｔｒｌ  ｇＲＮＡであり、右側のパネルはＡＤ１０  Ｈ４クローンである。図３Ｄは、ＴＨＰ１対照クローンＣｔｒｌ  ｇＲＮＡ（レーン１）及びＡＤＡＭ１７  ＡＤ１７  Ｇ１２  ＣＲＩＳＰＲ細胞（クローン２）の代表的なウエスタンブロット分析であり、ＴＨＰ１  ＡＤＡＭ１７  Ｇ１２  ＣＩＳＰＲクローンにおけるＡＤＡＭ１７発現の欠如を示す。
【図３Ｂ】（上記の通り。）
【図３Ｃ】（上記の通り。）
【図３Ｄ】（上記の通り。）
【図４Ａ】図４：図４Ａ〜４Ｄは、ＴＲＥＭ２ストーク領域の膜近位部でのアミノ酸ストレッチが脱落に重要であることを示す。図４Ａは、野生型の又は変異体のヒトＴＲＥＭ２ストーク領域の膜近位部のアミノ酸配列を示す。ｉＰｒｏｔ  Ｑ９ＮＺＣ２に従うアミノ酸ナンバリング。ＴＭ：膜貫通領域。ギャップは、それぞれの変異体内でのアミノ酸の欠失を示す。交換されたアミノ酸は太字。下線付きのアミノ酸は、ＴＲＥＭ２外部ドメインのＣ末端の生成のための主要なシェダーゼ切断部位を示す。表４で示す場合、ＷＴ：配列番号１２；ＴＲＵＮＣ３（１５９〜１７４欠失）：配列番号１３；ＴＲＵＮＣ１：配列番号１４；Ｔ２ｄｅｌ  ３−８：配列番号１５；Ｔ２ｄｅｌ  ６−１１：配列番号１６；Ｔ２ｄｅｌ  １１−１６：配列番号１７；Ｔ２−ＹＧＧ：配列番号１８；Ｔ２−ＷＦＲ：配列番号１９；Ｔ２−二重：配列番号２０；Ｔ２−ＩＰＤ：配列番号２１；Ｔ２−ＩＰＰ：配列番号２２、Ｔ２−ＩＤＰ：配列番号２３。図４Ｂは、ＨＥＫ２９３−ＦＴ細胞で一時的に発現されたＴＲＥＭ２  ＷＴ及び変異体のＦＡＣＳ分析を示す棒グラフである。細胞を、トランスフェクションの４８時間後に５０ｎｇ／ｍｌのＰＡＭ又は０．０５％のＤＭＳＯで処理した。細胞を剥離し、ＡＦ１８２８抗血清で標識し、フローサイトメトリーで分析した。データを、平均±Ｓ．Ｅ．（ｎ＝３）として、各変異体のＰＭＡ処理に対する未処理の比としてプロットする。ＷＴに対する統計的差異を、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定によるＡｎｏｖａにより算出した。＊Ｐ＜０．０１。図４Ｃは、図４Ａで示すようなＴＲＥＭ２二重変異体による遺伝子活性化を示す棒グラフである。ＴＲＥＭ２二重変異体は、ＢＷＺ−ｌａｃＺ−ｍＤＡＰ１２細胞で安定的に発現された。細胞を、活性化モノクローナル抗体又はアイソタイプ対照に播種し、１６時間後にレポーター遺伝子活性を評価した。データを、平均±Ｓ．Ｅ．（ｎ＝３）として、活性化／対照ＡｂのＲＧＡの比としてプロットする。図４Ｄは、シェダーゼ切断部位での３つのアミノ酸の置き換えによりＴＲＥＭ２細胞表面発現が大きく増加することを示す棒グラフである。ＨＥＫ２９３−ＦＴ細胞で一時的に発現されたＴＲＥＭ２  ＷＴ及び変異体のＦＡＣＳ分析。細胞を、トランスフェクションの４８時間後に５０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ又は０．０５％のＤＭＳＯで処理した。細胞を剥離し、ＡＦ１８２８抗血清で標識し、フローサイトメトリーで分析した。データを、平均±Ｓ．Ｅ．（ｎ＝３）として、各変異体のＰＭＡ処理に対する未処理の比としてプロットする。統計的差異を、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定によるＡｎｏｖａにより算出した。＊Ｐ＜０．０１。
【図４Ｂ】（上記の通り。）
【図４Ｃ】（上記の通り。）
【図４Ｄ】（上記の通り。）
【図５Ａ】図５：図５Ａ〜５Ｅは、ＡＤＡＭ１７がＨ１５７〜Ｓ１５８にてインビトロでＴＲＥＭ２ストーク領域ペプチドを切断することを示す。図５Ａは、インビトロ切断アッセイのための、ＴＲＥＭ２ストーク領域由来の合成ペプチドのアミノ酸配列を示す。全てのペプチドを、Ｃ末端でのＮ末端７−メトキシクマリン（Ｍｃａ）蛍光タグと共に得た。下線付きのアミノ酸は主要なシェダーゼ切断部位を示す。ＡＡ１１２−１７１：配列番号２４；ペプチド１：配列番号２５；ペプチド２：配列番号２６；ペプチド３：配列番号２７；ペプチド１ａ：配列番号２８；ペプチド２ａ：配列番号２９；ペプチド４：配列番号３０；ペプチド５：配列番号３１；ペプチド６：配列番号３２。図５Ｂは、１、５、又は２４時間にわたるＡＤＡＭ１７（３１ｎＭ）によるペプチド３（１０μＭ）の切断のＨＰＬＣ分析を示す。図５Ｃは、主要な生成物及び２種の微量な生成物の特定と共に、４８時間にわたるＡＤＡＭ１７（３１ｎＭ）によるペプチド３（１０μＭ）の切断のＨＰＬＣ分析を示す。図５Ｃは、出現順にそれぞれ配列番号８３、５１、及び８４を開示する。図５Ｄは、ペプチド１、ペプチド２、又はペプチド３のＡＤＡＭ１７切断の時間経過を示す（２つの実験の平均）。図５Ｅは、ペプチド４、ペプチド５、又はペプチド６のＡＤＡＭ１７切断の時間経過を示す（２つの実験の平均）。
【図５Ｂ】（上記の通り。）
【図５Ｃ】（上記の通り。）
【図５Ｄ】（上記の通り。）
【図５Ｅ】（上記の通り。）
【図６Ａ】図６：図６Ａは、ＷＴ又はＲ４７ＨヒトＴＲＥＭ２（配列番号８５）及びＤＡＰ１２が一時的にトランスフェクトされたＨＥＫ−ＦＴ細胞から脱落したＴＲＥＭ２外部ドメインのＣ末端の特定を示す。３回帯電した［Ｄ１３７〜Ｈ１５７］ペプチドイオンのイオン抽出物、ｍ／ｚ  ７９１．９４〜７９２．０６。目的のペプチドイオンは、４種全ての脱落したＴＲＥＭ２トリプシン消化物（囲まれたイオン抽出物）中に明確に存在する。＊は、５回帯電したイオンとして存在する未知のペプチドを表し、＊＊は、同じペプチドの脱アミノ型である。図６Ｂは、ペプチドＤ１３７〜Ｈ１５７（配列番号８５）のデコンボリュートされたＭＳＥスペクトルを示す。上部のパネルは、どのｂ断片イオン及びｙ断片イオンが特定されるかを示す。この質量スペクトルは、ＴＲＥＭ２  Ｒ４７Ｈ  ＰＭＡのトリプシン消化物に由来する。
【図６Ｂ】（上記の通り。）
【図７】図７は、ＷＴ又は変異体のＲ４７Ｈ  ｈＴＲＥＭ２及びｈＤＡＰ１２が一時的にトランスフェクトされたＨＥＫ−ＦＴ細胞から脱落したＴＲＥＭ２外部ドメインの特定を示す。４種の質量スペクトルのデコンボリュートされた質量スペクトル：脱落したｈＴＲＥＭ２［１９〜１５７］は、４種全ての細胞上清抽出物中に明確に存在する。細胞上清を、アフィニティ精製後にＰＮＧアーゼ−Ｆ及びシアリダーゼＡで処理しているが、減少しなかった。
【図８Ａ】図８：図８Ａ〜８Ｃは、ＴＲＥＭ２ストーク領域内のＯ−グリコシル化部位の決定を示す。ＴＲＥＭ２−ＨｉｓをシアリダーゼＡで最初に処理し、次いで還元し、アルキル化し、その後にＰＮＧアーゼ−Ｆで処理した。次いで、得られた試料を、トリプシンにより又はＡｓｐ−及びＧｌｕ−Ｃ酵素により消化した。消化物をＬＣ−ＭＳＥで分析した。図８Ａ：デコンボリュートされた質量スペクトル、複合スキャン：１９２６：２０９７（配列番号８６）。図８Ｂ：デコンボリュートされた質量スペクトル、複合スキャン：１５６６：１５８４（配列番号８７）。図８Ｃ：デコンボリュートされた質量スペクトル、複合スキャン：１３７３：１４７７（配列番号８８）。
【図８Ｂ】（上記の通り。）
【図８Ｃ】（上記の通り。）
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本明細書で提供されるのは、シェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体（例えば、ＡＤＡＭ１７切断又はＡＤＡＭ１０切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体）、シェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体をコードする核酸、並びにそのような核酸を含むベクター及び細胞である。同様に本明細書で提供されるのは、シェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体をコードする核酸又はそのような核酸を含むベクター及び細胞を使用することによる、対象中においてＴＲＥＭ２発現を増加させる方法、及び対象のＴＲＭＥ２関連の疾患又は障害を処置する方法である。
【００２３】
ＴＲＥＭ−２は、細菌及び瀕死の細胞の非炎症性食作用を媒介し、炎症反応を弱める。ヒトＴＲＥＭ−２のホモ接合性機能喪失により、那須・ハコラ病（硬化性白質脳症を伴う多発嚢胞脂肪膜性骨異形成症、「ＰＬＯＳＬ」）、又は前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）様症候群、骨嚢胞を特徴とする疾患、神経炎症、進行性神経変性、及び初老期認知症が引き起こされる。ＴＲＥＭ−２の機能変異Ｒ４７Ｈのヘテロ接合性喪失はまた、遅発性アルツハイマー病（ＡＤ）の重要な危険因子でもあり、効果サイズは、アポリポタンパク質Ｅε４対立遺伝子の効果サイズと類似する。ＴＲＥＭ−２は、白質、海馬、及び新皮質で見出されるミクログリアで発現され、ＡＤ脳で報告された病理学的特徴と部分的に一致し、このことはＡＤ病因でのＴＲＥＭ−２の関与の可能性を支持する。現在では、遺伝子スクリーニングにより、ＡＤに加えて、パーキンソン病（ＰＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、及び前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）の危険因子としてのＴＲＥＭ２のヘテロ接合性ミスセンス変異も特定されている（Ｋｌｅｉｎｂｅｒｇｅｒ，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．２０１４  Ｊｕｌ  ２；６（２４３）：２４３ｒａ８６）。そのため、機能するＴＲＥＭ−２は、重度の認知障害及び認知症を引き起こす、加齢に関連する神経炎症性疾患及び神経変性疾患からの保護に必要である。
【００２４】
選択的スプライシングに起因して、３種のヒトＴＲＥＭ２アイソフォームが存在し、アイソフォーム１が最長のアイソフォームである。ヒトＴＲＥＭ２アイソフォーム１のアミノ鎖配列（配列番号１）、ヒトＴＲＥＭ２アイソフォーム２のアミノ鎖配列（配列番号３）、及びヒトＴＲＥＭ２アイソフォーム３のアミノ鎖配列（配列番号４）を図１Ｂでアラインさせた。ヒトＴＲＥＭ２のアイソフォーム１のストーク領域のアミノ酸配列（配列番号８９）、アイソフォーム２のストーク領域のアミノ酸配列（配列番号８）、及びアイソフォーム３のストーク領域のアミノ酸配列（配列番号９）のアラインメントにより、ヒトＴＲＥＭ２アイソフォーム１のストーク領域は、ヒトＴＲＥＭ２アイソフォーム２又は３のストーク領域に対して約７９％の配列同一性を共有することが明らかとなった（図１Ｃ）。
【００２５】
ヒトＴＲＥＭ２アイソフォーム１のアミノ酸配列（配列番号１）、カニクイザルＴＲＥＭ２アイソフォーム１のアミノ酸配列（配列番号５）、及びマウスＴＲＥＭ２アイソフォーム１のアミノ酸配列（配列番号６）を図１Ａでアラインさせた。ヒトＴＲＥＭ２アイソフォーム１のストーク領域のアミノ酸配列（配列番号７）、カニクイザルＴＲＥＭ２アイソフォーム１のストーク領域のアミノ酸配列（配列番号１０）、及びマウスＴＲＥＭ２アイソフォーム１のストーク領域のアミノ酸配列（配列番号１１）のアラインメントにより、ヒトＴＲＥＭ２アイソフォーム１のストーク領域は、カニクイザルＴＲＥＭ２アイソフォーム１のストーク領域に対して９８％の配列同一性を共有し、且つマウスＴＲＥＭ２アイソフォーム１のストーク領域に対して６９％の配列同一性を共有することが明らかとなった（図１Ｄ）。図１Ｅは、ＴＲＥＭ２の構造と、このＴＲＥＭ２の、シグナル伝達アダプタータンパク質ＤＡＰ１２との相互作用とを示す。
【００２６】
定義
本明細書及び特許請求の範囲で用いられる単数形の「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、他に明確な断りがなければ、複数の対象を含む。例えば、用語「細胞」は、その混合物を含む複数の細胞を含む。
【００２７】
全ての数の指定、例えば、範囲を含むｐＨ、温度、時間、濃度、及び分子量は、０．１単位で（＋）又は（−）変化する近似値とする。いつも明確に提示されるとは限らないが、全ての数の指定に「約」という用語が付けられることを理解されたい。またいつも明確に述べられるとは限らないが、本明細書に記載される試薬は単に例であり、その等価物が当技術分野において知られていることも理解されたい。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「ＴＲＥＭ２」（「骨髄細胞２上で発現されるトリガー受容体」、ＴＲＥＭ−２、ＴＲＥＭ２ａ、ＴＲＥＭ２ｂ、又はＴＲＥＭ２ｃとしても既知である）は、ＴＲＥＭ２遺伝子によりコードされる糖タンパク質を指す。ヒトＴＲＥＭ２は免疫グロブリンスーパーファミリ（ＩｇＳＦ）に属し、シグナルペプチド、単一Ｖ型免疫グロブリンドメイン（ＩｇＶ）、ストーク領域、膜貫通ドメイン、及び細胞質尾部を含む。ヒトＴＲＥＭ２遺伝子は染色体位置６ｐ２１．１にマッピングされており、ヒトＴＲＥＭ２遺伝子のゲノム配列を、ＮＣ＿０００００６．１２でＧｅｎＢａｎｋにおいて見出し得る。選択的スプライシングに起因して、少なくとも３種のヒトＴＲＥＭ２アイソフォームが存在する。用語「ヒトＴＲＥＭ２」は、ヒトＴＲＥＭ２のあらゆるアイソフォームを指すために使用される。最長のヒトＴＲＥＭ２アイソフォーム（アイソフォーム１）のタンパク質配列及びｍＲＮＡ配列は、
骨髄細胞２上で発現されるトリガー受容体の前駆体アイソフォーム１前駆体［ヒト］  （ＮＰ＿０６１８３８．１）
【化１】
2020530986.tif 000003
骨髄細胞２上で発現されるヒトトリガー受容体（ＴＲＥＭ２）、転写変異体１、ｍＲＮＡ  （ＮＭ＿０１８９６５．３）
【化２】
2020530986.tif 000004
である。ヒトＴＲＥＭ２のアイソフォーム２のアミノ酸配列（配列番号３）及びアイソフォーム３のアミノ酸配列（配列番号４）を図１Ｂに示す。いくつかの実施形態では、ＴＲＥＭ２タンパク質はまた、全長にわたり配列番号１、３、又は４のいずれかと少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するタンパク質も包含し、そのようなタンパク質は依然として、リガンド結合、細胞内シグナル伝達、食作用性物質の食作用及び分解の促進、並びにＴＲＥＭ２の他の制御機能を有する。マウス、カニクイザル、及び他の動物のＴＲＥＭ２タンパク質の配列は当分野で既知である（例えば、マウスＴＲＥＭ２タンパク質の場合にはＮＰ＿１１２５４４．１及びＮＰ＿００１２５９００７．１）。
【００２９】
用語「細胞外ドメイン」は、膜貫通タンパク質において細胞の脂質二重層の細胞外側に露出している部分を指す。タンパク質の外部ドメインを決定する方法は当分野で既知である（Ｓｉｎｇｅｒ（１９９０）；Ｈｉｇｈ他（１９９３）、及びＭｃＶｅｃｔｏｒソフトウェア、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）。例えば、ヒトＴＲＥＭ２タンパク質の細胞外ドメインとして、配列番号１（アイソフォーム１）のアミノ酸残基１４〜１７４、配列番号３（アイソフォーム２）のアミノ酸残基１４〜１６８、又は配列番号４（アイソフォーム３）のアミノ酸残基１４〜１７１が挙げられ得る。
【００３０】
ＴＲＥＭ２の用語「外部ドメイン」は、シェダーゼ切断後に放出される、ＴＲＥＭ２の細胞外ドメインの一部を指す。
【００３１】
ＴＲＥＭ２の用語「ストーク領域」は、Ｖ型免疫グロブリン（ＩｇＶ）ドメインと膜貫通ドメインとを接続する、ＴＲＥＭ２の細胞外ドメインの一部を指す。
【００３２】
用語「膜貫通ドメイン」は、膜貫通タンパク質において細胞の脂質二重層にまたがる部分を指す。タンパク質の膜貫通ドメインを決定する方法は当分野で既知である（Ｅｌｏｆｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７６：１２５−１４０；Ｂｅｒｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １４：１７２３−１７２８）。
【００３３】
用語「細胞質ドメイン」及び「細胞質尾部」は互換的に使用され、膜貫通タンパク質において細胞の脂質二重層の細胞質側に存在する部分を指す。タンパク質の細胞質尾部を決定する方法は当分野で既知である（Ｅｌｏｆｓｓｏｎ他（２００７）及びＢｅｒｎｓｅｌ他（２００５））。
【００３４】
用語「切断耐性ＴＲＥＭ２変異体」及び「シェダーゼ切断に対する耐性を示すＴＲＥＭ２変異体」は本明細書において互換的に使用され、ＴＲＥＭ２変異体であって、野生型ＴＲＥＭ２を切断するシェダーゼ（例えばＡＤＡＭ１７又はＡＤＡＭ１０）の切断部位付近に１つ又は複数の変異を有し、そのためシェダーゼによる切断が減少しており、例えば、同一条件下での野生型ＴＲＥＭ２タンパク質と比較して、シェダーゼによる切断が約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％減少しているＴＲＥＭ２変異体を指す。「切断耐性ＴＲＥＭ２変異体」は外部ドメインの脱落が減少し得、例えば、同一条件下での野生型ＴＲＥＭ２タンパク質と比べて、脱落が約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％減少し得る。そのような切断耐性ＴＲＥＭ２変異体は、主要なＴＲＥＭ２機能を保持しつつ脱落を減少させ得、例えば、リガンド結合、細胞内シグナル伝達、食作用性物質の食作用及び分解の促進、並びにＴＲＥＭ２の他の制御機能を依然として有し得る。
【００３５】
本明細書で使用される場合、「ＤＡＰ１２」（ＴＹＲＯＢＰ；ＫＡＲＡＰ；ＰＬＯＳＬとしても既知である）は、細胞質ドメイン中に免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む膜貫通シグナル伝達ポリペプチドを指す。最長のヒトＤＡＰ１２アイソフォーム（アイソフォーム１）のタンパク質配列及びｍＲＮＡ配列は、
ＴＹＲＯタンパク質チロシンキナーゼ結合タンパク質アイソフォーム１前駆体［ヒト］  （ＮＰ＿００３３２３．１）
【化３】
2020530986.tif 000005
ヒトＴＹＲＯタンパク質チロシンキナーゼ結合タンパク質（ＴＹＲＯＢＰ）、転写変異体１、ｍＲＮＡ  （ＮＭ＿００３３３２．３）
【化４】
2020530986.tif 000006
である。
【００３６】
用語「処置する」及び「処置」は、治療的処置と、予防的手段又は防止手段との両方を指し、その目的は、望ましくない生理学的変化又は障害を予防するか又は遅延させることである。本発明の目的のために、有益な又は所望の臨床結果として下記が挙げられるがこれらに限定されない：検出可能か検出不能かにかかわらず、症状の緩和、疾患の程度の低減、疾患の安定化した（即ち、悪化していない）状態、疾患の進行の遅延又は減速、疾患の状態の緩和又は軽減、及び寛解（不完全か又は完全）。「処置」はまた、処置を受けていない場合に予想される生存期間と比較して長い生存期間も意味し得る。
【００３７】
用語「対象」は、本発明の方法に従う処置が提供される動物、ヒト、又は非ヒトを指す。獣医学的用途及び非獣医学的用途が企図される。この用語は下記を含むがこれらに限定されない：哺乳動物、例えば、ヒト、他の霊長類、ブタ、齧歯動物、例えば、マウス、及びラット、ウサギ、モルモット、ハムスター、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、ヒツジ、並びにヤギ。典型的な対象として、ヒト、家畜、及び家庭内ペット（例えばネコ及びイヌ）が挙げられる。
【００３８】
「有効量」は、有利な又は所望の結果をもたらすのに十分な量を指す。例えば、治療量は、所望の治療効果を達成するものである。この量は、疾患又は疾患症状の発症を予防するのに必要な量である予防有効量と同じであっても、異なってもよい。有効量を１回以上の投与、適用又は投薬において投与することができる。治療用化合物の「治療有効量」（すなわち、有効な投与量）は、選択される治療用化合物に依存する。組成物は、１日当たり１回以上から、１日おきに１回を含む１週間当たり１回以上投与することができる。当業者は、疾患又は障害の重症度、以前の治療、対象の全体的な健康状態及び／又は年齢、並びに存在する他の疾患を含むがこれらに限定されない、一定の因子が対象を効果的に治療するのに必要な投与量及び時機に影響し得ることを理解するであろう。さらに、治療有効量の本明細書に記載の治療用化合物による対象の治療は、１回の治療又は一連の治療を含み得る。
【００３９】
用語「核酸」又は「ポリヌクレオチド」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）及び一本鎖又は二本鎖のいずれかの形態のそのポリマーを指す。特に限定しない限り、本用語は、基準核酸と同様の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様の様式で代謝される、天然ヌクレオチドの既知のアナログを含む核酸を包含する。別段の指示がない限り、特定の核酸配列はまた、明示的に示される配列だけでなく、保存的に改変されたその変異体（例えば、縮重コドン置換）、アレル、オルソログ、ＳＮＰ、及び相補的配列も暗示的に包含する。とりわけ、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（又は全ての）コドンの第３位が、混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換された配列を作製することによって実現してもよい（Ｂａｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；及びＲｏｓｓｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８（１９９４））。
【００４０】
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」は、互換的に使用され、ペプチド結合によって共有結合されたアミノ酸残基で構成される化合物を指す。タンパク質又はペプチドは少なくとも２つのアミノ酸を含まなければならず、タンパク質又はペプチドの配列を構成し得るアミノ酸数の最大数に制限はない。ポリペプチドは、互いにペプチド結合により連結した２つ以上のアミノ酸を含むあらゆるペプチド又はタンパク質を含む。本明細書で使用する場合、本用語は、例えば、当技術分野で一般にペプチド、オリゴペプチド及びオリゴマーと呼ばれる短鎖、並びに当技術分野で一般にタンパク質と呼ばれ、多くの種類が存在する長鎖の両方を指す。「ポリペプチド」は、とりわけ、例えば、生物学的に活性な断片、実質的に相同のポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドのバリアント、修飾ポリペプチド、誘導体、アナログ、融合タンパク質を含む。ポリペプチドは天然ペプチド、組換えペプチド又はこれらの組み合わせを含む。
【００４１】
用語「保存的配列改変」は、アミノ酸配列を含む抗体又は抗体断片の結合特性に有意な影響又は変更を与えないアミノ酸改変を指す。そのような保存的改変として、アミノ酸の置換、付加、及び欠失が挙げられる。当分野で既知の標準的な技術（例えば、部位特異的変異誘発、及びＰＣＲ媒介変異誘発）により、改変を抗体又は抗体断片に導入し得る。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられているものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリは当分野で定義されている。このファミリとして下記が挙げられる：塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）。
【００４２】
用語「相同」又は「同一性」は、２つのポリマー分子間、例えば、２つの核酸分子間、例えば、２つのＤＮＡ分子又は２つのＲＮＡ分子間又は２つのポリペプチド分子間のサブユニット配列の同一性を指す。２つの分子の両方におけるサブユニットの位置が同じモノマーのサブユニットで占められている場合、例えば、２つのＤＮＡ分子それぞれにおける位置がアデニンで占められている場合、それらは、その位置において相同又は同一である。２つの配列間の相同性は、マッチした位置又は相同な位置の数の一次関数であり、例えば、２つの配列中の位置の半分（例えば、ポリマーの長さが１０個のサブユニット中の５個の位置）が相同である場合、２つの配列は５０％相同であり、位置の９０％（例えば、１０個のうち９個）がマッチしているか又は相同である場合、２つの配列は９０％相同である。「配列同一性」のパーセンテージは、比較ウィンドウにわたって２つの最適に整列された配列を比較することによって決定され得るが、このとき比較ウィンドウ内のアミノ酸配列の断片は、２つの配列の最適なアラインメントのための基準配列（付加又は欠失を含まない）と比較して付加又は欠失（例えば、ギャップ又はオーバーハング）を含む場合がある。パーセンテージは、両配列内で同一の酸残基が存在する位置の数を決定して、マッチした位置の数を得、そのマッチした位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で除算し、その結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出することができる。結果は、クエリー配列に対する対象配列の同一性パーセントである。
【００４３】
用語「単離された」は、天然状態から変更されているか又は取り出されたことを意味する。例えば、生きている動物中に天然に存在する核酸又はペプチドは「単離され」ていないが、その天然状態の共存物質から部分的に又は完全に分離されている同一の核酸又はペプチドは「単離され」ている。単離された核酸又はタンパク質は、実質的に純粋な形態で存在し得るか、又は例えば宿主細胞等の非天然環境中で存在し得る。単離抗体は、抗原特異性が異なる他の抗体を実施的に含まない（例えば、ＴＲＥＭ２に特異的に結合する単離抗体は、ＴＲＥＭ２以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかしながら、標的分子に特異的に結合する単離抗体は、他の種由来の同一抗原に交差反応性を示す場合があり、例えば、ＴＲＥＭ２に特異的に結合する単離抗体は、他の種由来のＴＲＥＭ２分子に結合する場合がある。さらに、単離抗体は、他の細胞物質及び／又は化学物質を実質的に含まない場合がある。
【００４４】
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が関連する分野の当業者により一般に理解されるのと同一の意味を有する。本明細書で説明されたものと類似の又は等価の方法及び材料を使用して本発明を実施し得るが、適切な方法及び材料を下記で説明する。本明細書で言及されている全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が支配するだろう。加えて、材料、方法、及び例は説明的のみであり、限定することは意図されていない。
【００４５】
シェダーゼ切断に対する耐性を示すＴＲＥＭ２変異体
ＴＲＥＭ２は、外部ドメインの脱落及び膜内タンパク質分解による連続的なタンパク質分解処理を受ける（Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８８，３３０２７−３３０３６，２０１３）。外部ドメインの脱落の最中に、ＴＲＥＭ２の外部ドメインは、ＡＤＡＭ（ディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼドメイン含有タンパク質）ファミリ又はＢＡＣＥ（ｂ−部位ＡＰＰ切断酵素）ファミリのメンバー等のプロテアーゼにより放出される（Ｋｌｅｉｎｂｅｒｇｅｒ，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．２０１４  Ｊｕｌ  ２；６（２４３）：２４３ｒａ８６）。外部ドメインの脱落により生じるＴＲＥＭ２の可溶性断片（ｓＴＲＥＭ２）は、樹状細胞培養物の上清と、非炎症性の神経性疾患及び多発性硬化症の患者の血漿試料及びＣＳＦ試料とで観察されている（Ｋｌｅｉｎｂｅｒｇｅｒ，２０１４）。アルツハイマー病（ＡＤ）の経過中の詳細な分析により、ｓＴＲＥＭ２は、臨床症状が現れる前のＡＤの初期に増加し、ＭＣＩ−ＡＤでピークに達し、上昇したままであるがＡＤ認知症のＭＣＩ−ＡＤステージと比較して低いレベルであることが明らかとなった（Ｓｕａｒｅｚ−Ｃａｌｖｅｔ，ＥＭＢＯ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ８，４６６−４７６，２０１６）。
【００４６】
本明細書で示されたデータにより、ＡＤＡＭ１７が構成的脱落の原因である主要なシェダーゼと特定した（実施例２）。ＡＤＡＭ１７の除去により、ＴＲＥＭ２の構成的脱落が減少し、且つ細胞表面ＴＲＥＭ２が増加した（実施例３）。ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）処理の後、さらなる脱落メカニズムが作用し始め、この内の１つはＡＤＡＭ１０を伴う可能性があった（実施例３）。ＴＲＥＭ２のＰＭＡにより誘発される脱落に重要な下記の２つの領域を特定した：アミノ酸１６９〜１７２での膜近位、領域アミノ酸１５６〜１６４での膜遠位（実施例４）。ＨＰＬＣ分析により、ＴＲＥＭ２中のＨ１５７−Ｓ１５８結合がＡＤＡＭ１７の主要な切断部位であることが分かった（実施例５）。細胞から脱落したＴＲＥＭ２外部ドメインの特性を調べ、Ｈ１５７とＳ１５８との間の主要な切断部位を確認した（実施例６）。この切断部位に近い位置（Ｓ１６０又はＳ１６８）では、Ｏ−グリコシル化を確認しなかった（実施例７）。このシェダーゼ切断部位で変異を有するＴＲＥＭ２変異体は、細胞表面発現の増加とシェダーゼ切断に対する耐性とを示す（実施例８）。
【００４７】
本明細書で提供されるのは、シェダーゼ切断に対する耐性を示すＴＲＥＭ２変異体（又は「切断耐性ＴＲＥＭ２変異体」）であり、例えば、シェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体（又は「切断耐性ヒトＴＲＥＭ２変異体」）である。いくつかの実施形態では、この切断耐性ＴＲＥＭ２変異体は、ＡＤＡＭ１７切断又はＡＤＡＭ１０切断に対する耐性を示す。いくつかの実施形態では、この切断耐性ＴＲＥＭ２変異体は、変異体ストーク領域を含む。例えば、この切断耐性ＴＲＥＭ２変異体は、シェダーゼ切断部位の近くに１つ又は複数の変異を有し得る。いくつかの実施形態では、この切断耐性ＴＲＥＭ２変異体は、Ｈ１５７とＳ１５８との間のＡＤＡＭ１７切断部位の近くに１つ又は複数の変異を含む。
【００４８】
いくつかの実施形態では、シェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体は、表１に記載されたアミノ酸配列のいずれか１つを含むストーク領域を含む。いくつかの実施形態では、シェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体は、配列番号３３〜４０のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含むストーク領域を含む。いくつかの実施形態では、シェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体は、配列番号３３〜４０のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列からなるストーク領域を含む。いくつかの実施形態では、シェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体は、配列番号３３〜３５のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含むストーク領域を含む。いくつかの実施形態では、シェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体は、配列番号３３〜３５のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列からなるストーク領域を含む。いくつかの実施形態では、シェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体は、配列番号３３、３６、４０のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含むストーク領域を含む。いくつかの実施形態では、シェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体は、配列番号３３、３６、４０のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列からなるストーク領域を含む。いくつかの実施形態では、シェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体は、配列番号３３を含むストーク領域を含む。いくつかの実施形態では、シェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体は、配列番号３３からなるストーク領域を含む。
【００４９】
【表１】
2020530986.tif 000007
【００５０】
いくつかの実施形態では、シェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体は、表２に記載されたアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、シェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体は、配列番号４１〜４８のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、シェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体は、配列番号４１〜４８のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態では、シェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体は、配列番号４１〜４３のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、シェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体は、配列番号４１〜４３のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態では、シェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体は、配列番号４１、４４、４８のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、シェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体は、配列番号４１、４４、４８のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態では、シェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体は、配列番号４１を含む。いくつかの実施形態では、シェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体は、配列番号４１からなる。
【００５１】
同様に本明細書で提供されるのは、配列番号３３〜４０のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。いくつかの実施形態では、配列番号３３〜４０のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。いくつかの実施形態では、配列番号４１〜４８のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。いくつかの実施形態では、配列番号４１〜４８のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。いくつかの実施形態では、配列番号４１〜４３のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。いくつかの実施形態では、配列番号４１〜４３のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００５２】
【表２】
2020530986.tif 000008
【００５３】
【表３】
2020530986.tif 000009
【００５４】
ヒトＴＲＥＭ２変異体をコードする核酸、ベクター、及び細胞
本開示はまた、シェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体をコードする核酸、シェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体の発現用のベクター、及びそのような発現ベクターを含む細胞も提供する。他の態様では、本開示は、シェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体をコードする配列、並びにそのようなポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び宿主細胞を提供する。
【００５５】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、表１に記載されたアミノ酸配列のいずれか１つを含むストーク領域を含むシェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体をコードする配列を含む核酸である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、配列番号３３〜４０のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含むストーク領域を含むシェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体をコードする配列を含む核酸である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、配列番号３３〜４０のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列からなるストーク領域を含むシェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体をコードする配列を含む核酸である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、配列番号３３〜３５のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含むストーク領域を含むシェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体をコードする配列を含む核酸である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、配列番号３３〜３５のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列からなるストーク領域を含むシェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体をコードする配列を含む核酸である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、配列番号３３、３６、４０のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含むストーク領域を含むシェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体をコードする配列を含む核酸である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、配列番号３３、３６、４０のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列からなるストーク領域を含むシェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体をコードする配列を含む核酸である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、配列番号３３を含むストーク領域を含むシェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体をコードする配列を含む核酸である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、配列番号３３からなるストーク領域を含むシェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体をコードする配列を含む核酸である。
【００５６】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、表２に記載されたアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含むシェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体をコードする配列を含む核酸である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、配列番号４１〜４８のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含むシェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体をコードする配列を含む核酸である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、配列番号４１〜４８のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列からなるシェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体をコードする配列を含む核酸である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、配列番号４１〜４３のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含むシェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体をコードする配列を含む核酸である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、配列番号４１〜４３のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列からなるシェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体をコードする配列を含む核酸である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、配列番号４１、４４、４８のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含むシェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体をコードする配列を含む核酸である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、配列番号４１、４４、４８のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列からなるシェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体をコードする配列を含む核酸である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、配列番号４１を含むシェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体をコードする配列を含む核酸である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、配列番号４１からなるシェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体をコードする配列を含む核酸である。
【００５７】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、シェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体をコードする配列を含む核酸であって、この配列は、表３に記載された配列のいずれか１つを含む、核酸である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、シェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体をコードする配列を含む核酸であって、この配列は配列番号６７〜７４のいずれか１つを含む、核酸である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、シェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体をコードする配列を含む核酸であって、この配列は配列番号６７〜６９のいずれか１つを含む、核酸である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、シェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体をコードする配列を含む核酸であって、この配列は配列番号６７、７０、又は７４のいずれか１つを含む、核酸である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、シェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体をコードする配列を含む核酸であって、この配列は配列番号６７を含む、核酸である。
【００５８】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、配列番号６７〜７４のいずれか１つを含む核酸である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、配列番号６７〜６９のいずれか１つを含む核酸である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、配列番号６７、７０、又は７４のいずれか１つを含む核酸である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、配列番号６７を含む核酸である。
【００５９】
【表４】
2020530986.tif 000010
【００６０】
本明細書で提供されるのは、シェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体を発現するために用いられ得るベクター（例えば発現ベクター）である。用語「発現ベクター」は、所望のコード配列が、それが発現され得る細胞への導入のために挿入され得るキャリア核酸分子を指す。発現ベクターは、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、プラスミド、コスミド、ウイルスベクター、又は人工染色体（例えば、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １５：３４５，１９９７を参照のこと）であり得る。例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）細胞におけるポリペプチドの発現に有用な非ウイルスベクターとしては、ｐＴｈｉｏＨｉｓ  Ａ、Ｂ及びＣ、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ、ｐＥＢＶＨｉｓ  Ａ、Ｂ及びＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＭＰＳＶベクター並びに他のタンパク質を発現するための、当技術分野において知られる多数のその他のベクターが挙げられる。いくつかの実施形態では、この発現ベクターは自律複製可能であり得るか、又は宿主ＤＮＡ中に組み込まれ得る。いくつかの実施形態では、この発現ベクターは選択マーカーをさらに含む。
【００６１】
有用なウイルスベクターとしては、次のウイルス：アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、パルボウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、シンドビスウイルス、インフルエンザウイルス、レオウイルス、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、麻疹ウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ポリオウイルス、ポックスウイルス、セネカバレーウイルス、コクサッキーウイルス、エンテロウイルス、粘液腫ウイルス、又はマラバウイルスのいずれかをベースにしたウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
いくつかの実施形態では、この発現ベクターはレンチウイルスベクターである。レンチウイルス等のレトロウイスルに由来するベクターは、導入遺伝子の長期にわたる安定した組み込み及び娘細胞中での増殖を可能にすることから、長期にわたる遺伝子導入を達成するのに適したツールである。レンチウイルスベクターは、肝細胞等の非増殖細胞を形質導入し得るという点で、マウス白血病ウイルス等の腫瘍レトロウイルスに由来するベクターに勝るさらなる利点を有する。レンチウイルスベクターはまた、免疫原性が低いというさらなる利点も有する。レトロウイルスベクターはまた、例えばガンマレトロウイルスベクターでもあり得る。ガンマレトロウイルスベクターは、例えば、プロモーター、パッケージングシグナル（ψ）、プライマー結合部位（ＰＢＳ）、１つ又は複数の（例えば２つの）長い末端反復（ＬＴＲ）、及び目的の導入遺伝子（例えば、ＣＡＲをコードする遺伝子）を含み得る。ガンマレトロウイルスベクターは、ウイルス構造遺伝子（例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ）を欠く場合がある。例示的なガンマレトロウイルスベクターとして、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、脾フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦＶ）、及び骨髄増殖性肉腫ウイルス（ＭＰＳＶ）、並びにこれらに由来するベクターが挙げられる。他のガンマレトロウイルスベクターが、例えば、Ｔｏｂｉａｓ  Ｍａｅｔｚｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｇａｍｍａｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ”Ｖｉｒｕｓｅｓ．２０１１  Ｊｕｎ；３（６）：６７７−７１３で説明されている。
【００６３】
いくつかの実施形態では、この発現ベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであり、例えば組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターである。「ＡＡＶ」はアデノ随伴ウイルスの略語であり、ウイルス自体又はその誘導体を指すために使用され得る。この用語は、別途必要な場合を除き、全てのサブタイプと、天然に存在する形態及び組換え形態の両方とを包含する。略語「ｒＡＡＶ」は、組換えＡＡＶベクター（又は「ｒＡＡＶベクター」）とも称される組換えアデノ随伴ウイルスを指す。用語「ＡＡＶ」は、例えば、ＡＡＶ１型（ＡＡＶ１）、ＡＡＶ２型（ＡＡＶ２）、ＡＡＶ３型（ＡＡＶ３）、ＡＡＶ４型（ＡＡＶ４）、ＡＡＶ５型（ＡＡＶ５）、ＡＡＶ６型（ＡＡＶ６）、ＡＡＶ７型（ＡＡＶ７）、ＡＡＶ８型（ＡＡＶ８）、ＡＡＶ９型（ＡＡＶ９）、ＡＡＶ１０型（ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０を含む）、ＡＡＶ１２型（ＡＡＶ１２）、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、及びヒツジＡＡＶを含む。「霊長類ＡＡＶ」は霊長類に感染するＡＡＶを指し、「非霊長類ＡＡＶ」は非霊長類動物に感染するＡＡＶを指し、「ウシＡＡＶ」はウシ哺乳類に感染するＡＡＶを指し、以下同様である。
【００６４】
ＡＡＶの様々な血清型のゲノム配列と、天然の逆位末端配列（ＩＴＲ）、Ｒｅｐタンパク質、及びキャプシドサブユニットの配列とは当分野で既知である。そのような配列を、文献又はＧｅｎＢａｎｋ等の公共データベースで見出し得る。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮＯ．ＮＣ−００２０７７（ＡＡＶ１）、ＡＦ０６３４９７（ＡＡＶ１）、ＮＣ−００１４０１（ＡＡＶ２）、ＡＦ０４３３０３（ＡＡＶ２）、ＮＣ−００１７２９（ＡＡＶ３）、ＮＣ−００１８２９（ＡＡＶ４）、Ｕ８９７９０（ＡＡＶ４）、ＮＣ−００６１５２（ＡＡＶ５）、ＡＦ５１３８５１（ＡＡＶ７）、ＡＦ５１３８５２（ＡＡＶ８）、及びＮＣ−００６２６１（ＡＡＶ８）；又は国際公開第２００５０３３３２１号パンフレット（ＡＡＶ１−９）等の公開文献（これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。同様に、例えば、Ｓｒｉｖｉｓｔａｖａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４５：５５５；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７１：６８２３；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７３：１３０９；Ｂａｎｔｅｌ−Ｓｃｈａａｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７３：９３９；Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７３：３９９４；Ｍｕｒａｍａｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２２１：２０８；Ｓｈａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５８：９２１；Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：１１８５４；Ｍｏｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３３：３７５−３８３；国際特許公開  国際公開第００／２８０６１号パンフレット、国際公開第９９／６１６０１号パンフレット、国際公開第９８／１１２４４号パンフレット；及び米国特許第６，１５６，３０３号明細書も参照されたい。
【００６５】
「ｒＡＡＶベクター」は、本明細書で使用される場合、ＡＡＶ起源ではないポリヌクレオチド配列（即ち、ＡＡＶに対して異種のポリヌクレオチド）を含むＡＡＶベクターを指し、典型的には、遺伝子による細胞の形質転換のための目的の配列を含むＡＡＶベクターを指す。いくつかの実施形態では、この異種ポリヌクレオチドには、少なくとも１つの（場合によっては２つの）ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）配列が隣接し得る。用語ｒＡＡＶベクターは、ｒＡＡＶベクター粒子とｒＡＡＶベクタープラスミドとの両方を包含する。ｒＡＡＶベクターは、一本鎖（ｓｓＡＡＶ）又は自己相補的（ｓｃＡＡＶ）のいずれかであり得る。「ＡＡＶウイルス」、又は「ＡＡＶウイルス粒子」、又は「ｒＡＡＶベクター粒子」は、少なくとも１種のＡＡＶキャプシドタンパク質（典型的には、野生型ＡＡＶの全てのキャプシドタンパク質）と、キャプシド化ポリヌクレオチドｒＡＡＶベクターとで構成されたウイルス粒子を指す。この粒子が異種ポリヌクレオチド（即ち、哺乳動物細胞に送達される導入遺伝子等の野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む場合には、この粒子は典型的には、「ｒＡＡＶベクター粒子」又は単に「ｒＡＡＶベクター」と称される。そのため、ｒＡＡＶ粒子の生成にはｒＡＡＶベクターの生成が必然的に含まれ、従って、ベクターはｒＡＡＶ粒子内に含まれる。
【００６６】
いくつかの実施形態では、本発現ベクターは、シェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体をコードする核酸を含む組換えＤＮＡ分子であり得る。「組換え」は、本明細書で使用される場合、ベクター、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、又は細胞が、（例えば、含まれるポリヌクレオチド又はポリペプチドに関する）クローニング工程、制限工程、若しくはライゲーション工程、及び／又は自然界で見出される生成物とは異なる構築物をもたらす他の手順の様々な組み合わせの生成物であることを意味する。組換えウイルス又は組換えベクターは、組換えポリヌクレオチドを含むウイルス粒子である。これらの用語はそれぞれ、元々のポリヌクレオチド構築物の複製物、及び元々のウイルス構築物の子孫を含む。
【００６７】
組換え発現ベクターは通常、発現される核酸配列に作動可能に連結された１つ以上の調節配列を含む。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサー及び他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含む。調節配列は、ヌクレオチド配列の構成的な発現、並びに組織特異的調節及び／又は誘導性配列を指示するものを含む。発現ベクターはまた、宿主細胞におけるメッセンジャーＲＮＡの安定性及び翻訳可能性を最適化するように設計されたエレメント、及び／又はヒトＴＲＥＭ２変異体を発現する持続的な安定的細胞クローンを確立するための薬剤選択マーカーを含む。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞、所望のタンパク質発現レベルなどの選択のような要素に依存し得る。このような組換え発現ベクターを作製するための一般的な方法は、とりわけ当技術分野で知られるＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ  ｅｄｓ．（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ；叢書Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．（２００７  ｗｉｔｈ  ｕｐｄａｔｅｄ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ２０１０）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙに見出すことができる。
【００６８】
「プロモーター」は、転写の開始及び速度が制御される核酸配列の領域である制御配列である。それは、調節タンパク質及び分子が、例えばＲＮＡポリメラーゼ及び他の転写因子として結合し得る遺伝的エレメントを含有し得る。語句「作動可能に位置付けられる」、「作動可能に連結される」、「制御下」、及び「転写制御下」は、プロモーターが、当該配列の転写開始及び／又は発現を制御するための核酸配列に対して、適切な機能的位置及び／又は向きにあることを意味する。プロモーターは、核酸配列の転写活性化に関与するシス作用性調節配列を指す「エンハンサー」と共に使用されてもよいし、又は使用されなくてもよい。
【００６９】
プロモーターは、コードセグメント及び／又はエクソンの上流に位置する５’非コード配列を単離することによって得られ得るような、遺伝子又は配列に自然に関連するものであってもよい。このようなプロモーターは、「内因性」と呼ぶことができる。同様に、エンハンサーは、当該配列の下流又は上流のいずれかに位置する核酸配列に自然に関連するものであってもよい。或いは、天然の環境において核酸配列と通常は関連しないプロモーターを指す組換え又は異種プロモーターの制御下にコード核酸セグメントを位置付けることによって、一定の利点が得られることになる。組換え又は異種エンハンサーはまた、その天然の環境において核酸配列と通常は関連しないエンハンサーを指す。このようなプロモーター又はエンハンサーには、他の遺伝子のプロモーター又はエンハンサー、並びに任意の他の原核生物、ウイルス、又は真核生物細胞から単離されるプロモーター又はエンハンサー、並びに「天然に存在」しない、すなわち、異なる転写調節領域の異なるエレメント及び／又は発現を変化させる変異を含有するプロモーター又はエンハンサーが含まれてもよい。プロモーター又はエンハンサーの核酸配列を合成的に生成することに加えて、配列は、本明細書に開示される組成物と関連させて組換えクローニング及び／又はＰＣＲ（商標）を含む核酸増幅技術を用いて生成されてもよい（米国特許第４６８３２０２号明細書、米国特許第５９２８９０６号明細書を参照のこと、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる）。さらに、ミトコンドリア、葉緑体などの非核オルガネラ内の配列の転写及び／又は発現を指示する制御配列も同様に使用できることが企図される。
【００７０】
使用されるプロモーターは、構成的、誘導性、合成的、組織又は細胞特異的、且つ／又は組換え体タンパク質及び／又はペプチドの大規模生産に有利であるような、導入されたＤＮＡセグメントの高レベルの発現を導く適切な条件下で有用であり得る。加えて、他の調節エレメント（例えば、エンハンサー、リボソーム結合部位、転写終結配列、及び同類のもの）も組み込んで、ＴＲＥＭ２変異体タンパク質をコードする核酸の発現を改善し得る。
【００７１】
いくつかの実施形態では、構成的プロモーターを用いて、ＴＲＥＭ２変異体タンパク質の定常発現を生じさせる。構成的プロモーターの例として下記が挙げられるがこれらに限定されない：最初期サイトメガロウイルス（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ最初期プロモーター、Ｒｏｕｓ肉腫ウイルスプロモーター、並びにヒト遺伝子プロモーター、例えば、限定されないが、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、伸長因子−１αプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、及びクレアチンキナーゼプロモーター。
【００７２】
誘導性プロモーターもまた、本開示の一部として企図される。誘導性プロモーターの使用により、発現が望まれる場合には、作動可能に連結されているポリヌクレオチド配列の発現をオンにし得、且つ発現が望まれていない場合にはこの発現をオフにし得る分子スイッチが提供される。誘導性プロモーターの例として、メタロチオニンプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、及びテトラサイクリンプロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。
【００７３】
いくつかの実施形態では、組織又は細胞特異的プロモーターを使用して、特定の組織又は細胞においてのみＴＲＥＭ２変異体タンパク質の発現をもたらす。組織又は細胞特異的プロモーター又はエレメントの性質、及びそれらの活性を特徴付けるためのアッセイは、当業者によく知られている。例としては、ヒトＬＩＭＫ２遺伝子（Ｎｏｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９９，Ｇｅｎｅ，２３６（２）：２５９−２７１）、ソマトスタチン受容体２遺伝子（Ｋｒａｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，ＦＥＥＳ  Ｌｅｔｔ．，４２８（３）：１６５−１７０）、マウスの精巣上体レチノイン酸結合遺伝子（Ｌａｒｅｙｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４（１２）：８２８２−８２９０）、ヒトＣＤ４（Ｚｈａｏ−Ｅｍｏｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｂｉｏｃｈｉｒｎ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１４４２（２−３）：１０９−１１９）、マウスの（ＸＩ型）コラーゲンα２（Ｔｓｕｍａｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３（３６）：２２８６１−２２８６４）、Ｄ１Ａドーパミン受容体遺伝子（Ｌｅｅ，ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ａｕｔｏｎ．Ｎｅｒｖ．Ｓｙｓｔ．，７４（２−３）：８６−９０）、インスリン様増殖因子ＩＩ（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２３３（１）：２２１−２２６）、ヒト血小板内皮細胞接着分子−１（Ａｌｍｅｎｄｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５７（１２）：５４１１−５４２１）、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００８  Ｎｏｖ；１５（２２）：１４８９−９９）が挙げられる。
【００７４】
いくつかの実施形態では、このプロモーターは細胞型特異的プロモーターである。例えば、プロモーターを使用してＴＲＥＭ２発現を駆動させ得、特にマクロファージ中で、樹状細胞中で、又はミクログリア中でＴＲＥＭ２発現を駆動させ得る。いくつかの実施形態では、特異的プロモーターを用いて、ミクログリア中でＴＲＥＭ２タンパク質を発現させる。ミクログリア中でＴＲＥＭ２タンパク質発現を駆動し得るプロモーターとして、下記が挙げられるがこれらに限定されない：ＴＲＥＭ２プロモーター、ＴＭＥＭ１１９プロモーター、Ｈｅｘｂプロモーター、ＩＢＡ１プロモーター、ＣＤ４５プロモーター、ＣＤ１１ｂプロモーター、Ｃｓｔ７プロモーター、Ｌｐｌプロモーター、Ｃｓｆ１プロモーター、Ｃｓ１Ｒプロモーター、Ｉｔｇａｘプロモーター、Ｃｌｅｃ７ａプロモーター、Ｌｉｌｒｂ４プロモーター、Ｔｙｒｏｂｐプロモーター、Ｃｔｓｂプロモーター、Ｃｔｓｄプロモーター、Ｂ２ｍプロモーター、Ｌｙｚ２プロモーター、Ｃｘ３ｃｒ１プロモーター、Ｃｓｔ３プロモーター、Ｃｔｓｓプロモーター、Ｐ２ｒｙ１２プロモーター、Ｃ１ｑａプロモーター、Ｃ１ｑｂプロモーター、Ａｘｌプロモーター、Ｔｉｍｐ２プロモーター、Ｃｔｓｌプロモーター、Ｇｎａｓプロモーター、Ｃｄ９プロモーター、Ｆｔｈ１プロモーター、Ｔｍｓｂ４ｘプロモーター。いくつかの実施形態では、本発現ベクターは、下記から選択されるプロモーターを含む：
ＴＲＥＭ２プロモーター、ＴＭＥＭ１１９プロモーター、Ｈｅｘｂプロモーター、ＩＢＡ１プロモーター、ＣＤ４５プロモーター、ＣＤ１１ｂプロモーター、Ｃｓｔ７プロモーター、Ｌｐｌプロモーター、Ｃｓｆ１プロモーター、Ｃｓ１Ｒプロモーター、Ｉｔｇａｘプロモーター、Ｃｌｅｃ７ａプロモーター、Ｌｉｌｒｂ４プロモーター、Ｔｙｒｏｂｐプロモーター、Ｃｔｓｂプロモーター、Ｃｔｓｄプロモーター、Ｂ２ｍプロモーター、Ｌｙｚ２プロモーター、Ｃｘ３ｃｒ１プロモーター、Ｃｓｔ３プロモーター、Ｃｔｓｓプロモーター、Ｐ２ｒｙ１２プロモーター、Ｃ１ｑａプロモーター、又はＣ１ｑｂプロモーター。いくつかの実施形態では、本発現ベクターはＴＲＥＭ２プロモーターを含む。
【００７５】
いくつかの実施形態では、合成プロモーターを用いて、ＴＲＥＭ２変異体タンパク質を発現させる。合成プロモーターは、天然プロモーターの転写能力を大幅に上回り得る。例えば、内因性の細胞機構又は細胞因子による活性を遮断しないか又は低下させない合成プロモーターを選択し得る。この合成プロモーターに他の要素（例えば、トランス作用因子結合部位、及びエンハンサー）を挿入して、転写効率を改善し得る。合成プロモーターと生物プロモーターとの両方の最良の特徴を組み合わせるために、合成プロモーターを合理的に設計して化学的に合成し得る。いくつかのプロセスを経て合成オリゴがアニーリング及びライゲートされ、完全長の化学的に合成されたプロモーターが生成される。合成プロモーターは、誘導性プロモーター又は細胞型特異的プロモーターであり得る。例えば、特にマクロファージ中で、樹状細胞中で、又はミクログリア中でＴＲＥＭ２発現を駆動し得る合成プロモーターを、合理的に設計して化学的に合成し得る。
【００７６】
特定の開始シグナルもまた、コード配列の効率的な翻訳に必要とされ得る。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドン又は隣接配列を含む。ＡＴＧ開始コドンを含む外因性の翻訳制御シグナルが提供されることが必要であり得る。当業者は容易にこれを決定し、必要なシグナルを提供することができるであろう。開始コドンは、インサート全体の翻訳を確実にするために望ましいコード配列の読み枠と「インフレーム」でなければならないことはよく知られている。外因性の翻訳制御シグナル及び開始コドンは天然又は合成のいずれかであり得る。発現効率は、適切な転写エンハンサーエレメントを含めることによって増強されてもよい。
【００７７】
発現には、当技術分野において知られる任意の適切な宿主細胞を利用することができ、例えば、哺乳動物宿主細胞、細菌宿主細胞、酵母菌宿主細胞、昆虫宿主細胞などである。原核生物及び真核生物の両方の発現系が広く利用可能である。いくつかの実施形態では、発現系は、ＣＨＯ細胞発現系などの哺乳動物細胞発現である。いくつかの実施形態では、核酸は、所望の宿主細胞における発現を容易にするためにコドンが最適化されてもよい。発現のために選択した細胞型、オルガネラ、及び生物体においてＤＮＡセグメントの発現を効率よく導くプロモーター及び／又はエンハンサーを使用することは重要であろう。分子生物学の当業者は通常、タンパク質発現のためのプロモーター、エンハンサー、及び細胞型の組み合わせの使用を知っており、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）を参照されたい。
【００７８】
大部分の転写された真核生物のＲＮＡ分子は、ＲＮＡスプライシングを受けて、一次転写物からイントロンが除去されることになる。真核生物のゲノム配列を含有するベクターは、タンパク質発現のための転写物の適切なプロセシングを確実にするためにドナー及び／又はアクセプタースプライシング部位を必要とし得る（Ｃｈａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４（８）：３５９６−６０１を参照のこと）。
【００７９】
本開示のベクター又はコンストラクトは通常、少なくとも１つの終結シグナルを含むことになる。「終結シグナル」又は「ターミネーター」は、ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ転写物の特異的な終結に関与するＤＮＡ配列で構成されている。このように、ある種の態様において、ＲＮＡ転写物の産生を終了させる終結シグナルが企図される。ターミネーターは、所望のメッセージレベルを達成するためにインビボにおいて必要である場合がある。真核細胞系において、ターミネーター領域はまた、ポリアデニル化部位を露出するように新しい転写物の部位特異的切断を許容する特異的ＤＮＡ配列を含んでもよい。これは、一続きの約２００個のＡ残基（ポリＡ）を転写物の３’末端に付加するために、特殊化された内因性のポリメラーゼにシグナルを伝える。このポリＡテールによって修飾されたＲＮＡ分子は、より安定であるように見え、より効率的に翻訳される。このように、真核生物が関与する他の態様において、ターミネーターは、ＲＮＡの切断のためのシグナルを含むことが好ましく、ターミネーターシグナルは、メッセージのポリアデニル化を促進することがより好ましい。ターミネーター及び／又はポリアデニル化部位エレメントは、メッセージレベルを増強するために、及び／又はカセットから他の配列へのリードスルーを最小限にするために役立ち得る。本開示における使用が企図されるターミネーターには、例えば、ウシ成長ホルモンターミネーターなどの遺伝子の終結配列、又は例えばＳＶ４０ターミネーターなどのウイルスの終結配列が含まれるがこれらに限定されない、本明細書に記載される、又は当業者に知られる任意の既知の転写ターミネーターが含まれる。ある種の実施形態では、終結シグナルは、配列のトランケーションによるなど、転写可能な配列又は翻訳可能な配列の欠如であってもよい。
【００８０】
発現、特に真核細胞の発現においては、通常、転写物の適切なポリアデニル化をもたらすポリアデニル化シグナルが含まれることになる。ポリアデニル化シグナルの性質は、本開示の実施の成功にとって重大ではないと考えられ、且つ／又は任意のそのような配列を使用してもよい。好ましい実施形態には、簡便で、且つ／又は様々な標的細胞において十分に機能することが知られる、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル及び／又はウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルが含まれる。ポリアデニル化は、転写物の安定性を増大させる可能性があり、又は細胞質輸送を促進する可能性がある。
【００８１】
宿主細胞においてベクターを増やすために、それは、複製が開始される特異的核酸配列である１つ以上の複製開始点（しばしば、「オリ」と呼ばれる）を含有してもよい。或いは、宿主細胞が酵母である場合、自律複製配列（ＡＲＳ）を使用することができる。
【００８２】
本開示のある種の実施形態では、発現ベクターにマーカーを含めることによって、本開示の核酸コンストラクトを含有する細胞をインビトロ又はインビボにおいて同定してもよい。このようなマーカーは、細胞に対して同定可能な変化を付与し、発現ベクターを含有する細胞の容易な同定を可能にするであろう。一般に、選択マーカーは、選択を可能にする特性を付与するものである。陽性選択マーカーは、マーカーの存在がその選択を可能にするものであり、陰性選択マーカーはその存在がその選択を防止するものである。陽性選択マーカーの例は、薬剤耐性マーカーである。
【００８３】
通常、薬剤選択マーカーを含めることは、形質転換体のクローニング及び同定において役立ち、例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシン、及びヒスチジノールに対する耐性を付与する遺伝子は有用な選択マーカーである。条件の実行に基づく形質転換体の識別を可能にする表現型を付与するマーカーの他に、基盤が比色分析であるＧＦＰなどのスクリーニング可能なマーカーを含む他の種類のマーカーもまた企図される。或いは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）又はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などのスクリーニング可能な酵素を利用してもよい。当業者はまた、場合によってはＦＡＣＳ分析とともに免疫マーカーを使用する方法を知っていると考えられる。用いられるマーカーは、それが遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現され得る限り、重要ではないと考えられる。選択及びスクリーニング可能なマーカーのさらなる例は当業者によく知られている。
【００８４】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、シェダーゼ切断（例えば、ＡＤＡＭ１７切断又はＡＤＡＭ１０切断）に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体をコードする配列を含む発現ベクターである。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、配列番号３３〜４０のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含むストーク領域を含むヒトＴＲＥＭ２変異体をコードする配列を含む発現ベクターである。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、配列番号３３〜４０のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列からなるストーク領域を含むヒトＴＲＥＭ２変異体をコードする配列を含む発現ベクターである。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、配列番号３３〜３５のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含むストーク領域を含むヒトＴＲＥＭ２変異体をコードする配列を含む発現ベクターである。いくつかの実施形態では、配列番号３３〜３５のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列からなるストーク領域を含むヒトＴＲＥＭ２変異体をコードする配列を含む発現ベクターである。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、配列番号４１〜４８のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含むヒトＴＲＥＭ２変異体をコードする配列を含む発現ベクターである。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、配列番号４１〜４８のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列からなるヒトＴＲＥＭ２変異体をコードする配列を含む発現ベクターである。
【００８５】
いくつかの実施形態では、この発現ベクターは、マクロファージ中で、樹状細胞中で、又はミクログリア中でＴＲＥＭ２タンパク質を発現させるプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、この発現ベクターは、ＴＲＥＭ２プロモーター、ＴＭＥＭ１１９プロモーター、Ｈｅｘｂプロモーター、ＩＢＡ１プロモーター、ＣＤ４５プロモーター、ＣＤ１１ｂプロモーター、Ｃｓｔ７プロモーター、Ｌｐｌプロモーター、Ｃｓｆ１プロモーター、Ｃｓ１Ｒプロモーター、Ｉｔｇａｘプロモーター、Ｃｌｅｃ７ａプロモーター、Ｌｉｌｒｂ４プロモーター、Ｔｙｒｏｂｐプロモーター、Ｃｔｓｂプロモーター、Ｃｔｓｄプロモーター、Ｂ２ｍプロモーター、Ｌｙｚ２プロモーター、Ｃｘ３ｃｒ１プロモーター、Ｃｓｔ３プロモーター、Ｃｔｓｓプロモーター、Ｐ２ｒｙ１２プロモーター、Ｃ１ｑａプロモーター、又はＣ１ｑｂプロモーターから選択されるプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、この発現ベクターはＴＲＥＭ２プロモーターを含む。
【００８６】
いくつかの実施形態では、この発現ベクターはポリアデニル化シグナルを含む。いくつかの実施形態では、この発現ベクターは選択マーカーを含む。
【００８７】
いくつかの実施形態では、この発現ベクターは、ＤＡＰ１２タンパク質をコードする第２の配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、このＤＡＰ１２タンパク質は配列番号４９を含む。いくつかの実施形態では、このＤＡＰ１２タンパク質は配列番号４９からなる。
【００８８】
いくつかの実施形態では、ＴＲＥＭ２ポリペプチドとＤＡＰ１２ポリペプチドとの両方を発現するための発現ベクターは、ＤＡＭ１２コード配列の上流に配列内リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含み得る。ＩＲＥＳエレメントは、５’メチル化Ｃａｐ依存的翻訳のリボソームスキャニングモデルをバイパスし、内部部位での翻訳を開始することができる（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ  ａｎｄ  Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，１９８８，  Ｎａｔｕｒｅ，３３４：３２０−３２５）。ピコルナウイルスファミリーのうちの２つのメンバー（ポリオ及び脳心筋炎）由来のＩＲＥＳエレメント（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ  ａｎｄ  Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，１９８８）、及び哺乳動物メッセージ由来のＩＲＥＳ（Ｍａｃｅｊａｋ  ａｎｄ  Ｓａｒｎｏｗ，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ，３５３：９０−９４，１９９１）が記載されている。ＩＲＥＳエレメントは、異種オープンリーディングフレームに連結させることができる。それぞれＩＲＥＳによって離れている多数のオープンリーディングフレームをともに転写して、ポリシストロニックメッセージを産生することができる。ＩＲＥＳエレメントによって、それぞれのオープンリーディングフレームは、効率的な翻訳のためにリボソームに接近することができる。１つのメッセージを転写するための１つのプロモーター／エンハンサーを用いて、多数の遺伝子を効率よく発現させることができる（参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５９２５５６５号明細書及び第５９３５８１９号明細書を参照されたい）。
【００８９】
いくつかの実施形態では、ＴＲＥＭ２ポリペプチド及びＤＡＰ１２ポリペプチドの両方を発現するための発現ベクターは、ＤＡＰ１２コード配列の上流に２Ａ配列を含む。２Ａオリゴペプチド配列は、プラス鎖ＲＮＡピコルナウイルス口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）から最初に特徴付けられ；且つＦＭＤＶ  ２Ａ又はＦ２Ａが、ＦＭＤＶポリタンパク質の上流（キャプシドタンパク質）ドメインと下流（ＲＮＡ複製タンパク質）ドメインの間で翻訳共役的「切断」を媒介することが示された（Ｒｙａｎ  ＭＤ，ＥＭＢＯ  Ｊ  １９９４；１３４：９２８−９３３；Ｒｙａｎ  ＭＤ，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  １９９１；７２：２７２７−２７３２；Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ＭＬＬ，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  １９９７；７８：１３−２１；Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ＭＬＬ，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ２００１；８２：１０１３−１０２５）。活性の２Ａ配列は、他の属のピコルナウイルス由来のウイルスのゲノムにおいて特徴付けられ、さらに「２Ａ様」配列が、様々な異なるＲＮＡウイルス及び非ＬＴＲレトロトランスポゾンのゲノム内で見出された（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ＭＬＬ，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ２００１；８２：１０２７−１０４１；Ｈｅｒａｓ  ＳＲ，Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ２００６；６３：１４４９−１４６０；Ｌｕｋｅ  ＧＡ，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ２００８；８９：１０３６−１０４２；Ｏｄｏｎ  Ｖ，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｅｖｏｌ  ２０１３；３０：１９５５−１９６５；Ｌｕｋｅ  ＧＡ，Ｍｏｂ  Ｇｅｎ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ２０１４；３：ｅ２７５２５）。これらの２Ａ又は「２Ａ様」オリゴペプチド配列は、「リボソームスキッピング」、「ストップ・キャリーオン（ｓｔｏｐ  ｃａｒｒｙ−ｏｎ）」又は「ストップ・ゴー（ｓｔｏｐ−ｇｏ）」翻訳と呼ばれる翻訳「リコーディング」イベントを媒介することが示された（Ａｔｋｉｎｓ  ＪＦ，ＲＮＡ  ２００７；１３：１−８）。
【００９０】
本明細書で使用される場合、「２Ａ配列」は、２つのタンパク質間のリンカーとして機能する２Ａ又は「２Ａ様」オリゴペプチドをコードする任意の核酸配列を指し、ポリタンパク質の自律的リボソーム内自己プロセシングを可能にする（例えば、ｄｅ  Ｆｅｌｉｐｅ．Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒ．２：１３（２００４）；ｄｅＦｅｌｉｐｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｒａｆｆｉｃ  ５：６１６−６２６（２００４）を参照のこと）。これらのオリゴペプチドにより、単一ベクターからの複数のタンパク質の共発現が可能になる。多くの２Ａエレメントが、当技術分野において知られている。例えば、ウイルスの２Ａ配列は、全てが参照として本明細書に組み込まれる米国特許第９１７５３１１号明細書、同第８８６５８８１号明細書、同第７９３９０５９号明細書、同第７９４７４９３号明細書において記載されている。例えば、ウイルスの２Ａ配列は、ピコルナウイルス、テトラウイルスの２Ａ配列、又はこれらの組み合わせであり得る。ピコルナウイルスの２Ａ配列は、エンテロウイルスの２Ａ配列、ライノウイルスの２Ａ配列、カルジオウイルスの２Ａ配列、アフトウイルスの２Ａ配列、ヘパトウイルスの２Ａ配列、エルボウイルスの２Ａ配列、コブウイルスの２Ａ配列、テッショウウイルスの２Ａ配列、及びパレコウイルスの２Ａ配列のいずれか１つから選択され得る。テトラウイルスの２Ａ配列は、ベータテトラウイルスの２Ａ配列又はオメガテトラウイルスの２Ａ配列のいずれかから選択され得る。本明細書に開示される方法及びシステムにおいて使用することができる２Ａ配列の例としては、口蹄疫ウイルス（Ｆ２Ａ）、ウマ鼻炎ウイルスＡ型（Ｅ２Ａ）、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルス（Ｔ２Ａ）、及びブタのテッショウウイルス−１（Ｐ２Ａ）からの２Ａ配列が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、２Ａ配列は、Ｔ２Ａ（ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号：５２）若しくはＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号：５３））、Ｐ２Ａ（ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号：５４）若しくはＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号：５５））、Ｅ２Ａ（ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号：５６）若しくはＧＳＧＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号：５７））、又はＦ２Ａ（ＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号：５８）若しくはＧＳＧＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号：５９））から選択されるウイルスの２Ａオリゴペプチドをコードする。
【００９１】
非ウイルスの２Ａ配列は、本明細書に参照により組み込まれる米国特許第８９４５８７６号明細書に記載されている。例えば、非ウイルスの２Ａ配列は、ウニ（ムラサキウニ（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｃｅｎｔｒｏｔｕｓ  ｐｕｒｐｕｒａｔｕｓ））の２Ａ配列（ＤＧＦＣＩＬＹＬＬＬＩＬＬＭＲＳＧＤＶＥＴＮＰＧＰ）（配列番号６０）；海綿（Ａｍｐｈｉｍｅｄｏｎ  ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄｉｃａ）の２Ａ配列（ＬＬＣＦＭＬＬＬＬＬＳＧＤＶＥＬＮＰＧＰ（配列番号６１）若しくはＨＨＦＭＦＬＬＬＬＬＡＧＤＩＥＬＮＰＧＰ（配列番号６２））；ギボシムシ（Ｓａｃｃｏｇｌｏｓｓｕｓ  ｋｏｗａｌｅｖｓｋｉｉ）の２Ａ配列（ＷＦＬＶＬＬＳＦＩＬＳＧＤＩＥＶＮＰＧＰ（配列番号６３））；又はナメクジウオ（Ｂｒａｎｃｈｉｏｓｔｏｍａ  ｆｌｏｒｉｄａｅ）の２Ａ配列（ＫＮＣＡＭＹＭＬＬＬＳＧＤＶＥＴＮＰＧＰ（配列番号６４）若しくはＭＶＩＳＱＬＭＬＫＬＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号６５））であり得る。いくつかの実施形態では、２Ａ配列は、２Ａコンセンサス配列Ｄ−Ｘ−Ｅ−Ｘ−ＮＰＧＰ（配列番号６６）（Ｘは任意のアミノ酸残基）を含む天然に存在するか、又は合成の配列である。
【００９２】
いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号５２〜６６のいずれか１つから選択される２Ａオリゴペプチドをコードする２Ａ配列を含む。
【００９３】
いくつかの実施形態では、ヒトＴＲＥＭ２変異体をコードする核酸はまた、ポリペプチドが宿主細胞から分泌されるように分泌シグナル配列をコードする配列を含んでもよい。このような配列は、ベクターによって、又はベクター中に存在するＴＲＥＭ２核酸の一部としてもたらされ得る。
【００９４】
発現ベクターの作製には、ベクターを消化するために標準的な組換え技術とともにいずれかを用いることができる多数の制限酵素部位を含有する核酸領域であるマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）を含むベクターを利用することができる。参照により本明細書に組み込まれるＣａｒｂｏｎｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９、Ｌｅｖｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８、及びＣｏｃｅａ，１９９７を参照されたい。「制限酵素消化」は、核酸分子中の特定の部位でのみ機能する酵素による核酸分子の触媒的切断を指す。これらの制限酵素の多くは市販されている。このような酵素の使用は、当業者に広く理解されている。多くの場合、ベクターは、外因性配列をベクターにライゲートすることが可能なＭＣＳ内で切断する制限酵素を用いて線状化又は断片化される。「ライゲーション」は、互いに隣接しても、隣接していなくてもよい２つの核酸断片間のホスホジエステル結合を形成するプロセスを指す。制限酵素及びライゲーション反応を含む手法は、組換え技術の当業者によく知られている。
【００９５】
目的のポリヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを導入するための方法は、細胞宿主の種類に応じて変わる。例えば、塩化カルシウムによるトランスフェクションは、一般的に原核生物の細胞に対して利用される一方で、その他の細胞宿主に対してはリン酸カルシウム処理又はエレクトロポレーションが使用され得る（一般に、前出のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．を参照のこと）。その他の方法としては、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム処理、リポソーム媒介性形質転換、注入及び微量注入、遺伝子銃法、ビロソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ウイルス粒子、ヘルペスウイルス構造タンパク質ＶＰ２２への融合、薬剤によるＤＮＡの取り込みの増強並びにエクスビボ形質導入が挙げられる。組換えタンパク質の長期にわたる高収率生産のためには、安定的な発現が所望されることが多い。例えば、ポリペプチドを安定的に発現させる細胞株は、ウイルスの複製開始点又は内因性発現エレメント、及び選択マーカー遺伝子を含有する発現ベクターを使用して作製することができる。
【００９６】
同様に本明細書で提供されるのは、本明細書で説明された発現ベクターのいずれかを含む細胞である。いくつかの実施形態では、シェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体を発現するための発現ベクターを含むそのような細胞。いくつかの実施形態では、ヒトＴＲＥＭ２変異体とヒトＤＡＰ１２タンパク質との両方を発現するための発現ベクターを含むそのような細胞。いくつかの実施形態では、ヒトＴＲＥＭ２変異体を発現するための発現ベクターと、ヒトＤＡＰ１２タンパク質を発現するための別の発現ベクターとを含むそのような細胞。そのような細胞は宿主細胞又は治療用細胞であり得る。
【００９７】
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の核酸分子を含む宿主細胞を特徴とする。宿主細胞を使用して、本明細書に記載のシェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体を産生又は発現することができる。用語「宿主細胞」及び「組換え体宿主細胞」は、本明細書において互換的に使用され、これらは、特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の子孫又は潜在的な子孫も指す。一定の改変が変異又は環境的影響のいずれかに起因して後続世代において生じ得るため、そのような子孫は、事実上、親細胞と同一であり得ないが、依然として本明細書において使用される用語の範囲内に含まれる。宿主細胞は、任意の原核細胞又は真核細胞であり得る。例えば、タンパク質は、細菌細胞（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）など）、昆虫細胞、酵母細胞、又は哺乳動物細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）若しくはＣＯＳ細胞、例えば、ＣＯＳ−７細胞、ＣＶ−１  ｏｒｉｇｉｎ  ＳＶ４０細胞など；Ｇｌｕｚｍａｎ（１９８１）Ｃｅｌｌ  ２３：１７５−１８２）において発現され得る。他の好適な宿主細胞は、当業者に知られている。
【００９８】
宿主細胞を使用して、本明細書に記載のヒトＴＲＥＭ２変異体を産生又は発現することができる。したがって、本開示はまた、宿主細胞を用いてヒトＴＲＥＭ２変異体を産生するための方法を特徴とする。一実施形態では、方法は、ヒトＴＲＥＭ２変異体が産生されるように、好適な培地中で宿主細胞（内部にタンパク質を発現する組換え発現ベクターが導入されている）を培養する工程を含む。別の実施形態では、方法はさらに、培地又は宿主細胞からヒトＴＲＥＭ２変異体を単離する工程を含む。
【００９９】
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の核酸分子を含む治療用細胞を特徴とする。本明細書で使用される場合、用語「治療用細胞」は、シェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体を発現するように遺伝子操作されている細胞を指す。そのような治療用細胞はヒト細胞であり得、例えば、マクロファージ、樹状細胞、又はミクログリアであり得る。
【０１００】
いくつかの実施形態では、このような治療用細胞は、検出可能なマーカー、例えば、蛍光分子（例えば、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質など）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）、発光分子（例えば、ルシフェラーゼ）、放射性分子（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、若しくは３２Ｐ）、又はコロイド金若しくは着色ビーズなどの熱量測定ラベルを発現する。検出可能なマーカーを発現する細胞は、顕微鏡法、オートラジオグラフィー、及び／又は当技術分野で知られる他の画像化方法などの適切な検出方法によって追跡又は可視化され得る。
【０１０１】
処置の方法及び治療上での使用
本明細書で提供されるのは、本明細書で開示された、シェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体をコードする核酸を対象（例えばヒト）に投与するか又はそのような核酸を含むベクター若しくは細胞をこの対象に投与することによる、この対象中においてＴＲＥＭ２発現を増加させる方法である。この対象は、ＴＲＥＭ２関連の疾患又は障害を有する可能性がある。細胞表面ヒトＴＲＥＭ２の非存在又はＴＲＥＭ２の過剰な脱落はヒトの神経炎症性病変及び神経変性病変と関連していたことから、本明細書で説明された方法を使用して切断耐性ヒトＴＲＥＭ２変異体の発現を増加させることを使用して、そのような神経炎症性疾患又は神経変性疾患を処置し得るか、又は予防し得る。シェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体をコードする核酸、又はそのような核酸を含むベクター若しくは細胞は、ＴＲＥＭ２の広範なタンパク質分解切断により媒介されるか又はこのタンパク質分解切断と関連する自己免疫障害、炎症性障害、又は悪性障害の処置又は予防にも適する。
【０１０２】
ＴＲＥＭ２発現レベルを増加させ得る核酸又はベクターを、インビトロ細胞アッセイ、細胞フリーアッセイ、及び／又はインビボ動物モデルを使用して候補核酸又は候補ベクターをスクリーニングすることにより特定し得る。例えば、細胞に、候補核酸又は候補ベクターをトランスフェクトさせ得るか、又は感染させ得る。細胞表面上でのＴＲＥＭ２のレベル（配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するＴＲＥＭ２ポリペプチド又はその断片のレベルであり得る）をモニタリングして、ＴＲＥＭ２レベルが、未処置の細胞又は対照核酸若しくは対照ベクターで処理された細胞におけるＴＲＥＭ２ポリペプチドのレベルと比較して増加しているかどうかを決定し得る。試料中における細胞表面ヒトＴＲＥＭ２のレベルを当分野で既知のアッセイにより決定し得、例えば、フローサイトメトリー、免疫組織化学、ウエスタンブロッティング、免疫蛍光アッセイ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）、若しくはポジトロン断層撮影（ＰＥＴ）により決定し得るか、又はヒトＴＲＥＭ２タンパク質に対する抗体若しくは抗体断片による任意の他の免疫検出により決定し得る。
【０１０３】
ＴＲＥＭ発現レベルを増加させ得る核酸、ベクター、又は細胞を、非ヒト哺乳動物（例えば、ＴＲＥＭ２トランスジェニック非ヒト哺乳動物、又はＴＲＥＭ２ノックアウト非ヒト哺乳動物）中において候補核酸、候補ベクター、又は候補細胞をスクリーニングすることによっても特定し得る。例えば、ＴＲＥＭ２発現レベルを、この核酸、ベクター、又は細胞を投与した非ヒト哺乳動物の群で評価し、次いで未処理対照哺乳動物と比較して、この核酸、ベクター、又は細胞の投与によりＴＲＥＭ２レベルが増加するかどうかを決定し得る。非ヒト哺乳動物として、例えば、齧歯動物（例えば、ラット、モルモット、及びマウス）、並びに家畜（例えば、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、及びウシ）が挙げられる。非ヒト哺乳動物を、ＴＲＥＭ２ポリペプチドをコードする内因性核酸を欠くようにも設計し得るか、又はトランケートされたか若しくは破壊された内因性ＴＲＥＭ２核酸を含むようにも設計し得る（例えばノックアウト動物）。
【０１０４】
同様に本明細書で提供されるのは、本明細書で開示された、シェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体をコードする核酸を対象（例えばヒト）に投与するか又はそのような核酸を含むベクター若しくは細胞をこの対象に投与することによる、この対象のＴＲＥＭ２関連の疾患又は障害を処置する方法である。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、ＴＲＥＭ２関連の疾患又は障害は神経炎症性疾患又は神経変性疾患であり、例えば、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、那須・ハコラ病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、抗ＮＭＤＡ受容体脳炎、自閉症、脳ループス（ＮＰ−ＳＬＥ）、化学療法誘発性末梢神経障害（ＣＩＰＮ）、帯状疱疹後神経痛（ｐｏｓｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｎｅｕｒａｌｇｉａ）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、てんかん、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、封入体筋炎、リソソーム蓄積症、例えば、スフィンゴミエリンリピドーズ（ニーマン・ピックＣ）、及びムコ多糖症ＩＩ／ＩＩＩＢ、異染性白質ジストロフィー、多巣性運動ニューロパチー、重症筋無力症、神経ベーチェット病、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、視神経炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、ラスムッセン脳炎、レット症候群、脳卒中、横断性脊髄炎、脳外傷、脊髄損傷、ウイルス性脳炎、又は細菌性髄膜炎である。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、ＴＲＥＭ２関連の疾患又は障害として、ＣＮＳ関連疾患、ＰＮＳ関連疾患、全身性炎症、及び炎症に関連する他の疾患、化学物質の乱用により引き起こされる疼痛及び離脱症状が挙げられ、ＣＮＳ関連の疾患又は障害として下記が挙げられる：全般性不安症、認知障害、学習及び記憶の障害及び機能不全、アルツハイマー病（軽度、中程度、及び重度）、注意欠陥及び多動性障害、パーキンソン病、パーキンソン病における認知症、ハンチントン病、ＡＬＳ、プリオン性神経変性疾患、例えば、クロイツフェルト・ヤコブ病、及びクールー病、ジル・ドゥ・ラ・トゥレット症候群、精神病、うつ病及びうつ病性障害、躁病、躁うつ病、統合失調症、統合失調症における認知障害、強迫性障害、パニック症、摂食障害、ナルコレプシー、侵害受容、ＡＩＤＳ−認知症、老年認知症、年齢に関連する軽度認知障害（ＭＣＩ）、年齢関連の記憶障害、失読症、遅発性ジスキネジア、てんかん、及び痙攣性疾患、心的外傷後ストレス障害、一過性無酸素症、仮性認知症、月経前症候群、黄体後期症候群、慢性疲労症候群、及び時差ぼけ。
【０１０７】
ＴＲＥＭ２関連の疾患又は障害として下記も挙げられる：免疫障害、特に炎症性障害を伴う免疫障害（例えば、細菌感染、真菌感染、ウイルス感染、原虫又は他の寄生虫の感染、乾癬、敗血症、脳性マラリア、炎症性腸疾患、関節炎、例えば、関節リウマチ、毛包炎、膿痂疹、肉芽腫、リポイド肺炎、血管炎、及び骨関節炎）、自己免疫障害（例えば、関節リウマチ、甲状腺炎、例えば、橋本甲状腺炎及びグレーブス病、インスリン抵抗性糖尿病、悪性貧血、アジソン病、天疱瘡、白斑、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、シェーグレン症候群、多発性硬化症、皮膚筋炎、混合性結合組織疾患、強皮症、多発性筋炎、移植片拒絶、例えば同種移植片拒絶）、Ｔ細胞障害（例えばＡＩＤＳ）、アレルギー性炎症性障害（例えば、皮膚及び／若しくは粘膜のアレルギー、例えば、アレルギー性鼻炎、喘息、乾癬）、神経障害、眼障害、胚性障害、又は異常なＴＲＥＭ２の活性及び／若しくは発現と直接的に若しくは間接的に関連するあらゆる他の障害（例えば、腫瘍、癌、白血病、骨髄性疾患、及び外傷）。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、ＴＲＥＭ２関連の疾患又は障害は、ＴＲＥＭ２の広範なタンパク質分解切断又はＴＲＥＭ２受容体の異常な若しくは変異した変異体を発現する細胞により媒介されるか又はこのタンパク質分解切断と関連する自己免疫障害、炎症性障害、又は悪性障害である。自己免疫疾患の例として下記が挙げられるこれらに限定されない：関節炎（例えば、関節リウマチ、慢性進行性関節炎（ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｃｈｒｏｎｉｃａ  ｐｒｏｇｒｅｄｉｅｎｔｅ）、及び変形性関節炎）、並びにリウマチ性疾患、例えば、骨量減少を伴う炎症性状態及びリウマチ性疾患、炎症性疼痛、脊椎関節症、例えば、強直性脊椎炎、ライター症候群、反応性関節炎、乾癬性関節炎、及び腸疾患性関節炎、過敏症（気道過敏及び皮膚過敏の両方を含む）、並びにアレルギー。自己免疫疾患として下記が挙げられる：自己免疫性血液疾患（例えば、溶血性貧血、再生不良性貧血、真正赤血球性貧血、及び特発性血小板減少症を含む）、全身性エリテマトーデス、炎症性筋障害、多発性軟骨炎、強皮症、ウェゲナー肉芽腫症、皮膚筋炎、慢性活動性肝炎、重症筋無力症、乾癬、スティーブンス・ジョンソン症候群、突発性スプルー、内分泌性眼障害、グレーブス病、サルコイドーシス、多発性硬化症、原発性胆汁性肝硬変、若年性糖尿病（Ｉ型糖尿病）、ぶどう膜炎（全部及び後部）、乾性角結膜炎及び春季角結膜炎、間質性肺線維症、乾癬性関節炎及び糸球体腎炎（ネフローゼ症候群（例えば、痛風、ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ細胞組織球症、特発性ネフローゼ症候群、若しくは微小変化型ネフローゼ）を伴うか又は伴わない）、腫瘍、皮膚及び角膜の炎症性疾患、骨インプラントのゆるみ、代謝障害、例えば、粥状動脈硬化、糖尿病、及び脂質異常症。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、ＴＲＥＭ２関連の疾患又は障害は、喘息、気管支炎、じん肺症、肺気腫、特発性肺線維症若しくはＣＯＰＤを含む気道の他の閉塞性疾患又は炎症性疾患から選択される。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、ＴＲＥＭ２関連の疾患又は障害は、造血性の（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ）又は造血性の（ｈｅｐａｔｏｐｏｅｔｉｃ）悪性障害であり、例えば、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄増殖性疾患、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、発作性夜間ヘモグロビン尿症、ファンコニー貧血、重症型サラセミア、ヴィスコット・オールドリッチ症候群、血球貪食性リンパ組織球症である。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、ＴＲＥＭ２関連の疾患又は障害は、喘息、脳炎、炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、アレルギー性障害、敗血症性ショック、肺線維症、未分化脊椎関節症、未分化関節症、関節炎、炎症性骨溶解症、又は慢性ウイルス感染若しくは慢性細菌感染に起因する慢性炎症から選択される。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、ＴＲＥＭ２関連の疾患又は障害は、認知症、前頭側頭型認知症、アルツハイマー病、血管性認知症、混合型認知症、クロイツフェルト・ヤコブ病、正常圧水頭症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、Ｔａｕｐａｔｈｙ病、那須・ハコラ病、脳卒中、急性外傷、慢性外傷、ループス、急性及び慢性の大腸炎、創傷治癒、クローン病、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、肥満、マラリア、本態性振戦、中枢神経ループス、ベーチェット病、パーキンソン病、レビー小体型認知症、多系統萎縮症、シャイ・ドレーガー症候群、進行性核上性麻痺、皮質基底神経節変性症、急性播種性脳脊髄炎、肉芽腫性障害、サルコイドーシス、加齢性疾患、発作、脊髄損傷、脳外傷、加齢黄斑変性、緑内障、網膜色素変性症、網膜変性症、気道感染症、敗血症、眼感染、全身感染、ループス、関節炎、多発性硬化症、低骨密度、骨粗鬆症、骨形成、大理石骨病、骨ページェット病、及び癌から選択される。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、ＴＲＥＭ２関連の疾患又は障害は、認知症、前頭側頭型認知症、アルツハイマー病、那須・ハコラ病、及び多発性硬化症から選択される。いくつかの実施形態では、ＴＲＥＭ２関連の疾患又は障害は、認知症（例えば、前頭側頭型認知症、アルツハイマー病、血管性認知症、意味性認知症、又はレビー小体型認知症）である。いくつかの実施形態では、ＴＲＥＭ２関連の疾患又は障害はアルツハイマー病である。いくつかの実施形態では、ＴＲＥＭ２関連の疾患又は障害は前頭側頭型認知症である。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、本核酸、本ベクター、又は本細胞を、静脈内経路、頭蓋内経路、髄腔内経路、皮下経路、又は鼻腔内経路を介して対象に投与する。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、そのような方法は、対象から得られた試料（例えば脳脊髄液試料）中における細胞表面ヒトＴＲＥＭ２レベルをアッセイする工程も含む。この試料中における細胞表面ヒトＴＲＥＭ２レベルを当分野で既知のアッセイにより決定し得、例えば、フローサイトメトリー、免疫組織化学、ウエスタンブロッティング、免疫蛍光アッセイ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）、若しくはポジトロン断層撮影（ＰＥＴ）により決定し得るか、又はヒトＴＲＥＭ２タンパク質に対する抗体若しくは抗体断片による任意の他の免疫検出により決定し得る。
【０１１６】
本明細書で提供されるのはまた、対象のＴＲＥＭ２関連の疾患又は障害の処置のための、本明細書で開示された、シェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体をコードする核酸又はそのような核酸を含むベクター若しくは細胞の使用でもある。ＴＲＥＭ２関連の疾患又は障害の処置のための薬物の製造における、本明細書で開示された、シェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体をコードする核酸又はそのような核酸を含むベクター若しくは細胞の使用も含まれる。
【０１１７】
併用療法
上記で説明された様々な処置を、ＴＲＥＭ２関連の疾患又は障害の現在標準の治療（例えば、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、又は那須・ハコラ病の現在標準の治療）等の他の処置パートナーと組み合わせ得る。例えば、本明細書で説明された、シェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体をコードする核酸又はそのような核酸を含むベクター若しくは細胞を、ＢＡＣＥ阻害剤、抗Ｔａｕ抗体、抗アミロイドベータ抗体、ＦＴＹ７２０、ＢＧ１２、インターフェロンベータ、又はタイサブリの１つ又は複数と組み合わせ得る。従って、本明細書で説明されたＴＲＥＭ２関連の疾患又は障害を処置する方法は、処置が必要な対象に第２の薬剤を投与する工程をさらに含み得る。
【０１１８】
用語「併用」は、１つの投与単位形態における固定の組み合わせ、又は本発明の化合物と併用パートナー（例えば、「治療薬」若しくは「補助薬」とも称される、下記で説明する別の薬物）とを同時に独立して投与し得るか若しくは時間間隔内で別々に投与し得、特に、これらの時間間隔により併用パートナーは共同的効果（例えば相乗効果）を示すことが可能になる組み合わせ投与のいずれかを指す。これらの単一成分は、キットにパッケージングされてもよいし別々であってもよい。これらの成分（例えば粉末又は液体）の一方又は両方を、投与前に再構成してもよいし所望の用量まで希釈してもよい。用語「同時投与」又は「組み合わせ投与」等は、本明細書で利用される場合、必要とする単一対象（例えば患者）への、選択された併用パートナーの投与を包含すること意味しており、薬剤が必ずしも同一の投与経路で又は同時に投与されない処置レジメンを含むことが意図されている。用語「薬学的併用」は、本明細書で使用される場合、２種以上の治療薬の混合又は組み合わせから得られる製品を意味しており、治療薬の固定された組み合わせ又は固定されていない組み合わせの両方を含む。用語「固定された組み合わせ」は、治療薬（例えば、本発明の化合物及び併用パートナー）が両方とも、単一の実体又は投与量の形態で同時に患者に投与されることを意味する。用語「固定されていない組み合わせ」は、治療薬（例えば、本発明の化合物及び併用パートナー）が両方とも、別々の実体として、同時に、並行して、又は具体的な時間制限なしに逐次的に患者に投与されることを意味しており、そのような投与により、この患者の体内で２種の化合物の治療上有効なレベルがもたらされる。後者はまた、カクテル療法（例えば、３種以上の治療薬の投与）にも当てはまる。
【０１１９】
用語「薬学的併用」は、本明細書で使用される場合、１つの投与単位形態における固定の組み合わせ、又は２種以上の治療薬を同時に独立して投与し得るか若しくは時間間隔内で別々に投与し得、特に、これらの時間間隔により併用パートナーは共同的効果（例えば相乗効果）を示すことが可能になる組み合わせ投与のためのパーツの固定されていない組み合わせ若しくはキットを指す。
【０１２０】
用語「併用療法」は、本開示で説明されている治療状態又は障害を処置するための２種以上の治療薬の投与を指す。そのような投与は、実質的に同時の方法（例えば、活性成分の固定比を有する単一カプセル）でのこれらの治療薬の同時投与を包含する。或いは、そのような投与は、各活性成分に関する複数の又は別々の容器（例えば、錠剤、カプセル、粉末、及び液体）での同時投与を包含する。粉末及び／液体を、投与前に再構成してもよいし所望の用量まで希釈してもよい。加えて、そのような投与はまた、ほぼ同時又は異なる時間のいずれかでの連続的な方法での各タイプの治療薬の使用も包含する。いずれの場合でも、処置レジメンは、本明細書で説明された状態又は障害の処置において薬物組み合わせの有益な効果をもたらすだろう。
【０１２１】
試料調製
本明細書で説明された方法で使用される試料を、当分野で既知の方法のいずれかを使用して（例えば生検又は手術により）対象から得ることができる。例えば、脳脊髄液を含む試料を腰椎穿刺により得ることができ、この腰椎穿刺では、シリンジに取り付けられた細い針を腰部領域中の脊柱管に挿入し、脳脊髄液が針を介して吸引されてシリンジ中に採取され得るように真空を作り出す。ＣＴ撮像、超音波、又は内視鏡を使用して、このタイプの手順をガイドし得る。この試料を瞬間凍結させて、後の使用のために−８０℃で貯蔵してもよい。この試料をまた、固定剤（例えば、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、又は酢酸／エタノール）で固定してもよい。分析のために、新鮮な試料、凍結試料、又は固定試料からＲＮＡ又はタンパク質を抽出してもよい。
【０１２２】
医薬組成物、投与量、及び投与方法
同様に本明細書で提供されるのは、本明細書で説明された、シェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体をコードする１種若しくは複数種の核酸又はそのような核酸を含むベクター若しくは細胞を含む組成物（例えば医薬組成物）である。そのような組成物は、別の薬剤（例えば、処置する疾患の現在標準の治療）をさらに含み得る。
【０１２３】
医薬組成物は通常、薬学的に許容される担体を含む。本明細書で使用する場合、用語「薬学的に許容される担体」は、薬剤の投与に適合する生理食塩水、溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張化剤及び吸収遅延剤などを含む。医薬組成物は通常、その目的の投与経路に適合するように製剤化される。投与経路の例としては、非経口（例えば、静脈内、動脈内、腹腔内）、経口、頭蓋内、髄腔内、鼻腔内（例えば、吸入）、皮内、皮下、又は経粘膜の投与が挙げられる。いくつかの実施形態では、この医薬組成物を、血液脳関門を通過するようにＴＲＥＭ２結合分子を送達するように製剤化する。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、例えば、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、リン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウムなどの緩衝物質、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウムなどの塩又は電解質、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコール、及び羊毛脂を含む１種以上の薬学的に許容される担体を含む。
【０１２５】
好適な医薬組成物を製剤化する方法は当技術分野で知られており、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ．２１ｓｔ  ｅｄ．，２００５；及びｔｈｅ  ｂｏｏｋｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ：ａ  Ｓｅｒｉｅｓ  ｏｆ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋｓ  ａｎｄ  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ（Ｄｅｋｋｅｒ、ＮＹ）を参照されたい。例えば、非経口、皮内、又は皮下用途に使用される溶液又は懸濁液は、以下の成分：注射用水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、又は他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコール又はメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート化剤；酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩などの緩衝液及び塩化ナトリウム又はブドウ糖などの浸透圧の調整用薬剤を含み得る。ｐＨは、塩酸又は水酸化ナトリウムなどの酸又は塩基で調整され得る。非経口製剤は、アンプル、ディスポーザブルシリンジ又はガラス若しくはプラスチック製の複数回投与バイアル内に封入され得る。
【０１２６】
注射用途に好適な医薬組成物は、例えば、滅菌水溶液（水溶性の場合）又は分散体、及び注射用滅菌溶液又は分散体の即時調製のための滅菌粉末を含み得る。静脈内投与のために、好適な担体は、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。全ての場合について、組成物は無菌でなければならず、また容易に注射できる程度の流体でなければならない。それは、製造及び貯蔵の条件下で安定であるべきであり、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されているべきである。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液状ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｅｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）など）及びそれらの好適な混合物を含有する溶媒又は分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用、分散体の場合に必要とされる粒径の維持及び界面活性剤の使用により維持することができる。微生物作用の予防は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。多くの場合、組成物中に、等張化剤、例えば糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射可能な組成物の持続的吸収は、組成物中に吸収を遅延させる作用物質、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含めることによりもたらされ得る。
【０１２７】
注射用滅菌溶液は、必要に応じて上掲の成分の１つ又は組み合わせによる適切な溶媒中に必要量の活性化合物を組み込み、その後滅菌濾過を施すことにより調製することができる。
【０１２８】
一般に、分散体は、塩基性分散媒体及び上掲の成分由来の必要な他の成分を含有する無菌溶媒に活性化合物を組み込むことにより調製される。注射用滅菌溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、有効成分と任意の追加の所望成分の粉末を、予め滅菌濾過されたそれらの溶液から生成する真空乾燥及びフリーズドライである。
【０１２９】
非経口製剤は、単回ボーラス用量、注入又は負荷ボーラス用量に続いて維持用量であり得る。これらの組成物は特定の固定又は可変的な間隔、例えば１日に１回、又は「必要に応じた」原則で投与することができる。
【０１３０】
注射用の好適な医薬組成物は、緩衝液（例えば、酢酸塩、リン酸塩又はクエン酸塩緩衝液）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート）、任意選択により安定剤（例えば、ヒトアルブミン）などを含み得る。抹消投与用の製剤は、滅菌水性溶液又は滅菌非水性溶液、懸濁液、及び乳剤を含む。非水性溶液の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。水性担体は、例えば、水、アルコール性／水性溶液、乳剤又は縣濁液を含み、生理食塩水及び緩衝媒体を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、０．０１〜０．１Ｍのリン酸緩衝液又は０．８％の生理食塩水を含む。他の一般的な非経口溶媒としては、リン酸ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル、又は固定油が挙げられる。静脈内溶媒は、流体及び栄養素補充液、電解質補充液、例えば、リンゲルデキストロースに基づくものなどを含む。保存剤及び他の添加剤、例えば抗菌薬、抗酸化剤、キレート化剤及び不活性ガスなどもまた、存在してもよい。
【０１３１】
経口組成物は通常、不活性希釈剤又は可食性の担体を含む。経口治療投与の目的のために、活性化合物を賦形剤とともに組み込むことができ、錠剤、トローチ剤、又はカプセル剤、例えば、ゼラチンカプセル剤の形態で使用することができる。経口組成物は、うがい薬として使用するために、流体担体を使用して調製することもできる。薬学的に適合性の結合剤、及び／又はアジュバント物質は、組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、以下の成分のいずれか、又は同様な性質の化合物：結合剤、例えば、微結晶性セルロース、トラガカントゴム若しくはゼラチン；賦形剤、例えば、デンプン若しくはラクトース、崩壊剤、例えばアルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、若しくはトウモロコシデンプン；潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム若しくはＳｔｅｒｏｔｅｓ；流動促進剤、例えば、コロイド状二酸化ケイ素；甘味剤、例えば、スクロース若しくはサッカリン；又は着香剤、例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、若しくはオレンジ着香料を含有することができる。
【０１３２】
吸入による投与のために、化合物を、好適な噴射剤、例えば、二酸化炭素などのガスを含有する加圧された容器又はディスペンサー又はネブライザーから、エアロゾルスプレーの形態で送達することができる。このような方法は、米国特許第６，４６８，７９８号明細書に記載されるものを含む。本明細書に記載される治療用化合物の全身投与は、経粘膜又は経皮的な手段によることもできる。経粘膜又は経皮投与のために、バリアを透過するために適切な浸透剤が製剤中で使用される。このような浸透剤は、当技術分野において一般的に知られており、例えば、経粘膜投与のためには、界面活性剤、胆汁酸塩、及びフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、鼻腔スプレー剤又は坐剤の使用により遂行することができる。経皮投与のためには、活性化合物が、当技術分野で一般的に知られている軟膏剤、膏薬、ゲル剤、又はクリーム剤に製剤化される。
【０１３３】
一実施形態では、治療用化合物は、埋め込み及びマイクロカプセル化された送達システムを含む制御放出製剤などの、身体からの急速な排出に対して治療用化合物を保護することになる担体を用いて調製される。
【０１３４】
医薬組成物は、容器、パック、又はディスペンサー中に、投与のための指示書と合わせて含まれ得る。
【０１３５】
非限定的な例において、少なくとも１種の医薬品を含有する医薬組成物が、液剤（例えば、熱硬化性液剤）として、固体の構成要素（例えば、粉末又は生分解性生体適合性ポリマー（例えば、カチオン性生分解性生体適合性ポリマー））として、又はゲルの構成要素（例えば、生分解性生体適合性ポリマー）として製剤化される。いくつかの実施形態では、少なくとも１種の医薬品を含有する少なくとも組成物が、アルギン酸塩ゲル（例えば、アルギン酸ナトリウム）、セルロース系ゲル（例えば、カルボキシメチルセルロース又はカルボキシエチルセルロース）、又はキトサン系ゲル（例えば、キトサングリセロホスフェート）の群から選択されるゲルとして製剤化される。本明細書に記載される医薬組成物のいずれかを製剤化するために使用され得る薬物溶出性ポリマーの追加の非限定的な例としては、カラゲニン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコールと組み合わされたデキストラン、ポリアクリル酸と組み合わされたデキストラン、ポリガラクツロン酸、ガラクツロン多糖、ポリ乳酸（ｐｏｌｙｓａｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ）、ポリグリコール酸、タマリンドガム、キサンタムガム、セルロースガム、グアーガム（カルボキシメチルグアー）、ペクチン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、Ｎ−イソプロピルポリアクリルアミド、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン、プルロン酸、ポリ乳酸、シクロデキストリン、シクロアミロース、レジリン、ポリブタジエン、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）コポリマー、無水マレイン酸−アルキルビニルエーテル、ポリデプシペプチド、ポリヒドロキシブチレート、ポリカプロラクトン、ポリジオキサノン、ポリエチレングリコール、ポリオルガノホスファゼン、ポリオルトエステル、ポリビニルピロリドン、乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリ酸無水物、ポリサイラミン、ポリＮ−ビニルカプロラクタム、及びジェランが挙げられる。
【０１３６】
治療用化合物の投与量、毒性及び治療有効性は、細胞培養又は実験動物における、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％において致死的な用量）、及びＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効な用量）を決定するための標準的な薬学的手順により決定することができる。毒性と治療効果の間の用量比が治療指数であり、それはＬＤ５０／ＥＤ５０の比率として表すことができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。毒性の副作用を示す化合物が使用されることもあるが、感染されていない細胞を損傷する可能性を最小化して、それにより、副作用を低減するために、このような化合物を罹患した組織の部位に標的化する送達システムを設計するように注意が払われるべきである。
【０１３７】
細胞培養アッセイ及び動物試験から得られるデータを使用して、ヒトで使用するための投与量の範囲を製剤化することができる。そのような化合物の投与量は、毒性がほとんど又は全くなく、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にあることが好ましい。投与量は、用いられる剤形及び利用される投与経路に応じてこの範囲内で変化してもよい。本発明の方法で使用される任意の化合物のために、治療有効用量は、最初に細胞培養アッセイから概算することができる。用量は、細胞培養で決定されたＩＣ５０（すなわち、症状の最大半量の阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環する血漿中の濃度範囲を達成するように、動物モデルで製剤化され得る。このような情報を使用して、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定され得る。
【０１３８】
キット
同様に本明細書で提供されるのは、本明細書で説明された、シェダーゼ切断に対する耐性を示すヒトＴＲＥＭ２変異体をコードする１種若しくは複数種の核酸又はそのような核酸を含むベクター若しくは細胞と、使用のための指示書とを含むキットである。使用のための指示書は、ＴＲＥＭ２関連の疾患又は障害の診断又は処置のための指示書を含み得る。本明細書で提供されるキットはまた、分析用試料を、例えば研究室に返送するため使用することができる郵送用容器（例えば、郵便料金支払い済みの封筒又は郵送パック）を含むことができる。キットは、試料のための１つ以上の容器を含むことができ、すなわち、試料は、標準的な血液収集バイアル中にあり得る。キットは、１つ以上のインフォームドコンセント用紙、試験要求用紙、及び本明細書に記載される方法においてキットをどのように使用するかについての指示書を含むことができる。このようなキットを使用するための方法も本明細書に含まれる。１つ以上の用紙（例えば、試験要求用紙）及び試料を保存する容器を、例えば、試料を提供した対象を同定するためのバーコードでコード化することができる。
【０１３９】
当業者は、本明細書に記載されるものと同様の又は等価の多くの方法及び材料を認識し、それらを本発明の実施で使用することができるであろう。実際に、本発明は、記載された方法及び材料に一切限定されることはない。
【実施例】
【０１４０】
本発明を以下の実施例でさらに説明するが、これらの実施例は請求項に記載される本発明の範囲を限定しない。
【０１４１】
実施例１：材料及び方法
化合物
ＧＩ２５４０２３（（２Ｒ，３Ｓ）−３−（ホルミル−ヒドロキシアミノ）−２−（３−フェニル−１−プロピル）ブタン酸［（１Ｓ）−２，２−ジメチル−１−メチルカルバモイル−１−プロピル］アミド）を、Ｈｕｎｄｈａｕｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２００３；１０２：１１８６−１１９５）で説明されているように合成した。ＤＰＣ３３３（（２Ｒ）−２−（（３Ｒ）−３−アミノ−３｛４−［２−メチル−４−キノリニル）メトキシ］フェニル｝−２−オキソピロリジニル）−Ｎ−ヒドロキシ−４−メチルペンタンアミド））を、Ｑｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ：ｔｈｅ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆａｔｅ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ３５，１９１６−１９２５，２００７で説明されているように合成した。
【０１４２】
細胞培養
Ｃａｓ９と、レンチウイルスにより送達されるブラストサイジン耐性遺伝子とを安定的に共発現するＴＨＰ１細胞を、１０％ＦＢＳ、１％Ｌ−グルタミン、１％ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、及び１０μｇ／ｍｌのブラストサイジン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含むＲＰＭＩ培地中で培養した。この細胞を、５％ＣＯ２雰囲気中で３７℃にて培養した。
【０１４３】
ＡＤＡＭ１７ノックアウト系統及びＡＤＡＭ１０ノックアウト系統の生成
ＴＨＰ１−Ｃａｓ９細胞に、ピューロマイシン耐性遺伝子と、ＡＤＡＭ１０を標的とするｓｇＲＮＡ（ＧＴＡＡＴＧＴＧＡＧＡＧＡＣＴＴＴＧＧＧ、配列番号７５）又はＡＤＡＭ１７を標的とするｓｇＲＮＡ（ＣＣＧＡＡＧＣＣＣＧＧＧＴＣＡＴＣＣＧＧ、配列番号７６）のいずれか（ベクターデザイン用、Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １１１，３１２８−３１３３，２０１４を参照されたい）を発現するレンチウイルスを感染させた。レンチウイルスパッケージングを、既に説明したようにＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で実行した。簡潔に説明すると、レンチウイルスｓｇＲＮＡ上清３０μＬを、５μｇ／ｍｌポリブレン（Ｓｉｇｍａ）を含む培地２ｍｌ中の１×１０６個のＴＨＰ１−Ｃａｓ９細胞に添加し、６ウェルプレート中で９０分にわたり３００ｇで回転させた。２４時間後、細胞を沈降させ、１．５μｇ／ｍＬピューロマイシンを含む新鮮な培養培地に再懸濁させた。毎週の培地交換の４週間後、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）により、プール中に存在する挿入及び欠失（インデル）を評価するために、Ｑｕｉｃｋ−ｇＤＮＡミニプレップキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用してゲノムＤＮＡを単離した。フレームシフトインデルのみを含むクローンを単離するために、細胞を９６ウェルプレート中に限界希釈で播種した。クローンが拡大すると、クローンをＮＧＳでアッセイし、フレームシフト対立遺伝子のみを含むクローンを下流アッセイのために選択した。
【０１４４】
ＮＧＳインデル分析
ＮＧＳ用の操作された細胞を調製するために、遺伝子座特異的プライマーを使用して各標的を増幅させた。２ラウンドのＰＣＲを実施した。第１のラウンドでは、遺伝子座特異的プライマーを用いて、編集された領域を増幅させた。ＡＤＡＭ１０用のプライマーはＡＴＴＡＧＡＣＡＡＴＡＣＴＴＡＣＴＧＧＧＧＡＴＣＣ（配列番号７７）及びＧＧＡＡＧＣＴＣＴＧＧＡＧＧＡＡＴＡＴＧＴＧ（配列番号７８）であり、ＡＤＡＭ１７用のプライマーはＣＣＣＣＣＡＡＡＣＡＣＣＴＧＡＴＡＧＡＣ（配列番号７９）及びＣＣＡＧＡＧＡＧＧＴＧＧＡＧＴＣＧＧＴＡ（配列番号８０）であった。次いで、第１のラウンド中に形成された生成物を第２のラウンドのＰＣＲのテンプレートとして使用して、Ｉｌｌｕｍｉｎａシステムと互換性がある二重指標を追加した。両方の標的領域用のＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｎｅｘｔｅｒａ  Ａｄａｐｔｅｒ配列は、ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ（配列番号８１）及びＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ（配列番号８２）であった。ライブラリーをｑＲＴ−ＰＣＲで定量し、続いてＩｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑシステムで配列決定した。配列分析のために、生の読取り値を参照配列とアラインさせ、次いで遺伝子型に基づいて符号させた。最後に、符合した遺伝子型を、下記の３種のカテゴリー：野生型、インフレーム、及びフレームシフトの内の１つに分けた。
【０１４５】
ＨＥＫ２９３細胞における変異ＴＲＥＭ２の細胞表面発現
ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用してヒトＴＲＥＭ２変異体を生成し、配列分析により確認した。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）構築物のトランスフェクションを、製造業者の推奨に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ試薬（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｃｈｅｒ）を使用して、ＨＥＫ−ＦＴ細胞において１：１比のｈＤＡＰ１２及びＴＲＥＭ２で実行した。トランスフェクションの４８時間後、細胞を５０ｎｇ／ｍｌ  ＰＭＡ又は０．０５％ＤＭＳＯで３０分にわたり処理し、細胞剥離溶液Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）で剥離させ、ヤギ抗ヒトＴＲＥＭ２抗体ＡＦ１８２８（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）又はアイソタイプ対照で染色し、続いて二次Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８コンジュゲート抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）と共にインキュベートした。ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して取得を実施した。
【０１４６】
ヒトマクロファージ及びＣＨＯ細胞におけるＴＲＥＭ２発現
製造業者の推奨に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ試薬（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｃｈｅｒ）を使用して、ＣＨＯ細胞を、ｈＤＡＰ１２及びｈＴＲＥＭ２を共発現するようにトランスフェクトした。１つの陽性クローンを選択し、ＣＨＯ−ｈＤＡＰ１２−ｈＴＲＥＭ２と命名した。単球用のネガティブアイソレーションキット（Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してヒトＭ２Ａマクロファージをバフィーコートから得、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、ＰｅｎＳｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ）、１％ピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、０．０２５Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｇｉｂｃｏ）、０．０５ｍＭ  β−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、Ｍ−ＣＳＦ（４０ｎｇ／ｍｌ）、及びＩＬ−４（５０ｎｇ／ｍｌ）を補充したＧｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地中で５日にわたり分化させた。細胞表面ＴＲＥＭ２を、上記で説明したようにＦＡＣＳで検出した。
【０１４７】
生細胞撮像
ヒトＭ２Ａマクロファージ又はＣＨＯ−ｈＤＡＰ１２−ｈＴＲＥＭ２を３８４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）上に播種し、図に示す濃度にてＡＤＡＭ阻害剤ＤＰＣ３３３又はＧＩ２５４０２３で処理した。１６時間後、細胞を、３０分にわたりＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）又は０．１％ＤＭＳＯで３０分にわたり処理した。プレートを氷上に置き、ヤギ抗ヒトＴＲＥＭ２抗体ＡＦ１８２８（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）又はアイソタイプ対照とヘキスト染色とで染色し、続いて二次Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８コンジュゲート抗ヤギ抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）と共にインキュベートした。ＩｎＣｅｌｌ２０００アナライザ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して画像を取得した。画像の定量化のために、無料のオープンソースソフトウェアＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒを適用した。
【０１４８】
ＢＷＺ細胞におけるレポーター遺伝子アッセイ
活性化Ｔ細胞の核因子のプロモーターの制御下でｌａｃＺを発現するＢＷＺ胸腺腫レポーター細胞（ＮＦＡＴ、Ｈｓｉｅｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １０９，１１４４−１１５６，２００９）を、ｍＤＡＰ１２とＷＴ  ｈＴＲＥＭ２又はＴ２二重ＴＲＥＭ２とを共発現するようにトランスフェクトした。細胞を、ラット抗マウス／ヒトＴＲＥＭ２  ｍＡｂ（Ｒ＆Ｄ、ＭＡＢ１７２９１）又はアイソタイプ対照で予めコーティングした高結合マイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）上に、２％ＦＢＳ及び１％非必須アミノ酸を補充した、フェノールレッドを含まないＲＰＭＩで播種した。細胞培養を１６時間にわたり続けた。Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  ２１０４マルチラベルリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して、製造業者の推奨に従い、Ｂｅｔａ−ｇｌｏアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）でレポーター遺伝子活性を評価した。
【０１４９】
免疫精製
脱落したＴＲＥＭ２を、マイクロスケールの免疫精製により細胞上清から精製した。このことをＭＥＡプラットフォーム（ＰｈｙＮｅｘｕｓ）で実施し、ストレプトアビジンがコーティングされたチップ（ＰＴＲ  ９２−０５−０５、Ｐｈｙｎｅｘｕｓ）を使用している。最初に、このチップをＰＢＳで平衡化し、次いで、ビオチン化抗ＴＲＥＭ２抗体（０．５５ｐｍｏｌ／μＬ、Ｒ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍのＢＡＦ１８２８）２００μＬを、２５ｍＬ／分の速度及び８回の通過でストレプトアビジンμカラム（５μＬベッド容量）上にロードする。ＰＢＳによる洗浄後、脱落したＴＲＥＭ２を、２５ｍＬ／分の速度及び１２回の通過で細胞上清（２００μＬ）から捕捉する。その後、ＰＢＳで洗浄し、０．１ＭグリシンｐＨ２．５（２×４回の通過）で溶出させて２×６０μＬの最終体積にする。後者の溶液を、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ１０（５μｌ）の添加により中和し、次いで乾燥させ（Ｓｐｅｅｄｖａｃ）、８Ｍ尿素（５μＬ、Ｆｌｕｋａ）及び０．４Ｍ  ＮＨ４ＣＯ３（３０μＬ、Ｆｌｕｋａ）で再水和する。次いで、試料を還元し（１Ｍ  ＤＴＴ  ２μＬ、５０℃で３０分）、アルキル化し（１Ｍ  ＩＡＡ（Ｓｉｇｍａ）６μＬ、暗所にてＲＴで３０分）、１Ｍ  ＤＴＴ（２μＬ）及び０．４Ｍ  ＮＨ４ＣＯ３（３０μｌ）の添加により反応を終了させた。得られた試料を、トリプシン又はＡＳｐ−／Ｇｌｕ−Ｃ酵素のいずれか（＋１μｌのトリプシン（Ｐｒｏｇｅｍａ）若しくはＡＳｐ−Ｇｌｕ  Ｃ、１μｇ／μｌ、ｐＨ８、及び３７℃一晩インキュベーション）で消化する。消化された試料をＨＣＯＯＨ（１μＬ、Ｆｌｕｋａ）で最終的に酸化し、得られた消化物２５μＬをＬＣ−ＭＳプラットフォーム上に注入した。
【０１５０】
質量分析
ペプチドマッピングによる切断部位の特定：ＵＰＬＣ（ＡＣＱＵＩＴＹ  Ｉクラス、ＷＡＴＥＲＳ）と組み合わせたＳＹＮＡＰＴ  Ｇ２Ｓ  ＱＴＯＦ質量分析計（ＷＡＴＥＲＳ）を使用して、ＬＣ−ＭＳＥ分析を実施した。ペプチド分離にＢＥＨ  Ｃ１８  ＵＰＬＣカラム（１．７μｍ、１×１００ｍｍ、ＷＡＴＥＲＳ）を使用した。下記のプログラムを使用して、移動相Ａ（水中の０．１％ＨＣＯＯＨ）及び移動相Ｂ（アセトニトリル中の０．１％ＨＣＯＯＨ）の溶出勾配を作成した：１）３分にわたり２％Ｂで均一濃度；２）３から９０分まで２から３０％のＢへの直線勾配；３）９０から９５分まで３０から１００％のＢへの直線勾配；４）９５から１０５分まで１００％Ｂで均一濃度；５）１０５から１０５．５分まで１００から２％のＢへの直線勾配、及び最後に６）１０５．５から１２０分まで２％Ｂで均一濃度。質量分析計は、ロックスプレーシステム（Ｐ１４Ｒペプチド、ｍ／ｚ  ７６７．４３３、５μＬ／分で２５０ｆｍｏｌにて注入、スイッチ頻度は１スキャン当たり０．５秒で２０秒毎、平均３スキャン）を介した自動質量補正による正の分解能モードで作動していた。２つのＭＳトレースを取得し、１つはＭＳであり、１つはＭＳＥ用であった。両方とも、質量範囲ｍ／ｚ５０〜２０００、スキャン時間０．５秒、３ｋＶキャピラリー電圧、４０Ｖコーン電圧で取得した。ＭＳＥモードでは、トラップ電圧は、各スキャンで２０から４０Ｖへと上昇した。加えて、ＵＶトレースを２１４ｎｍの波長で取得した。
【０１５１】
無傷の質量測定による切断部位の特定
ＵＰＬＣ（ＡＣＱＵＩＴＹ  Ｉクラス、ＷＡＴＥＲＳ）と組み合わせたＳＹＮＡＰＴ  Ｇ１  ＱＴＯＦ質量分析計（ＷＡＴＥＲＳ）を使用して、ＬＣ−ＭＳ分析を実施した。タンパク質分離にＢＥＨ  Ｃ４  ＵＰＬＣカラム（１．７μｍ、１×１００ｍｍ、ＷＡＴＥＲＳ）を使用した。下記のプログラムを使用して、移動相Ａ（水中の０．１％ＨＣＯＯＨ）及び移動相Ｂ（アセトニトリル中の０．１％ＨＣＯＯＨ）の溶出勾配を作成した：１）１．５分にわたり５％Ｂで均一濃度；２）１．５から２分まで５から２５％のＢへの直線勾配；３）２から１２分まで２５から３５％のＢへの直線勾配；４）１２から１３分まで３５から９５％のＢへの直線勾配；５）１３から１５分まで９５％Ｂで均一濃度；５）１５から１５．５分まで９５から５％のＢへの直線勾配；及び最後に６）１５．５から２０分まで５％Ｂで均一濃度。質量分析計は正の分解能モードで作動し、ＮＡＩ  ２ｍｇ／ｍＬで較正された。ＭＳトレースを、質量範囲ｍ／ｚ６００〜４５００、スキャン時間０．５秒、３ｋＶキャピラリー電圧、４０Ｖコーン電圧、脱溶媒和温度２００℃、コーンガスフロー５０Ｌ／時間で取得した。加えて、ＵＶトレースを２１４ｎｍの波長で取得した。
【０１５２】
Ｏ−結合型グリコシル化の特定
ＵＰＬＣ（ＡＣＱＵＩＴＹ  Ｈクラス、ＷＡＴＥＲＳ）と組み合わせたＱＴＯＦ  Ｐｒｅｍｉｅｒ質量分析計（ＷＡＴＥＲＳ）を使用して、ＬＣ−ＭＳＥ分析を実施した。ペプチド分離にＢＥＨ  Ｃ１８  ＵＰＬＣカラム（１．７μｍ、１×１００ｍｍ、ＷＡＴＥＲＳ）を使用した。下記のプログラムを使用して、移動相Ａ（９８％水及び２％アセトニトリル中の０．１％ＨＣＯＯＨ）及び移動相Ｂ（アセトニトリル中の０．１％ＨＣＯＯＨ）の溶出勾配を作成した：１）３分にわたり２％Ｂで均一濃度；２）３から９０分まで２から３０％のＢへの直線勾配；３）９０から９５分まで３０から１００％のＢへの直線勾配；４）９５から１０５分まで１００％Ｂで均一濃度；５）１０５から１０５．５分まで１００から２％のＢへの直線勾配；及び最後に６）１０５．５から１２０分まで２％Ｂで均一濃度。質量分析計は、ロックスプレーシステム（Ｐ１４Ｒペプチド、１０μＬ／分にて１ｐｍｏｌで注入、スイッチ頻度は１スキャン当たり０．５秒で２０秒毎、平均３スキャン）による正のノーマルモードで作動していた。ＰＬＧＳ（ＷＡＴＥＲＳ）によるデータ処理中に、ロック質量（２＋、７６７．４３３Ｄａ）の適用により質量補正を実施した。２つのＭＳトレースを取得し、１つはＭＳであり、１つはＭＳＥ用であった。両方とも、質量範囲ｍ／ｚ５０〜２０００、スキャン時間０．５秒、３ｋＶキャピラリー電圧、４０Ｖコーン電圧で取得した。ＭＳＥモードでは、トラップ電圧は、各スキャンで２０から４０Ｖへと上昇した。加えて、ＵＶトレースを２１４ｎｍの波長で取得した。
【０１５３】
統計解析
ＡＮＯＶＡを使用し、必要に応じてスチューデントのｔ検定も使用するＰｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して、統計解析を実施した。＜０．０５のｐ値を有意と見なした。
【０１５４】
実施例２：ＡＤＡＭ１７阻害剤は細胞表面でＴＲＥＭ２を安定化させる
骨髄細胞で発現される誘発性レセプター（ＴＲＥＭ２）はＩ型膜貫通糖タンパク質であり、免疫グロブリン（Ｉｇ）受容体スーパーファミリのメンバーである（Ｂｏｕｃｈｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １９４，１１１１−１１２２，２００１）。ＴＲＥＭ２発現は、マクロファージ、樹状細胞、ミクログリア、及び破骨細胞で示されており、発現は時間的に及び空間的に制御されているように見える（Ｌｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ３０２，１３８−１５０，２０１５；Ｓｃｈｍｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ８３，１３０９−１３２０，２００２；Ｓｅｓｓａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２０，２６１７−２６２８，２００４）。マクロファージでは、ＴＲＥＭ２発現は炎症の過程中に上方制御され、例えば、腹膜炎のマウスモデルでは、チオグリコレート負荷の２〜３日後に発現はピークに達する（Ｔｕｒｎｂｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １７７，３５２０−３５２４，２００６）。ＴＲＥＭ２はまた、ＡＢプラーク又は神経細胞片に接触するミクログリア細胞表面領域でも富化される（Ｙｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  ９０，７２４−７３９，２０１６）。この環境でＴＲＥＭ２により感知されるリガンドの一部、例えば、リン脂質及びミエリン脂質（Ｐｏｌｉａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  １２５，２１６１−２１７０，２０１５）並びにＡｐｏＥ（Ａｔａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９０，２６０４３−２６０５０，２０１５；Ｂａｉｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９０，２６０３３−２６０４２，２０１５）が近年特定されている。他のリガンドはＡβ及びプラークに関連する神経細胞破片の可能性があり、なぜならば、ＴＲＥＭ２は、ミクログリアへのＡβの取込みに寄与するからである（Ｘｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ８，９９２−１００４，２０１６）。
【０１５５】
このことは、Ｒ４７Ｈ変異体をコードするｒｓ７５９３２６２８−ＴであるＴＲＥＭ２  ＳＮＰが５．０５（Ｇｕｅｒｒｅｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３６８，１１７−１２７，２０１３）及び２．９２（Ｊｏｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３６８，１０７−１１６，２０１３）のオッズ比で遅発性アルツハイマー病（ＬＯＡＤ）のリスクを有意に増加させることを示す以前のゲノムワイド関連研究とよく一致する。これらのオッズ比は、十分に確立されたＡＤリスク遺伝子ＡＰＯＥ４のものと同程度である（Ｎｅｕｍａｎｎ  ＆  Ｄａｌｙ，Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３６８，１８２−１８４，２０１３）。Ｒ４７Ｈ変異ＴＲＥＭ２は、ＷＴ  ＴＲＥＭ２（Ｋｌｅｉｎｂｅｒｇｅｒ，２０１４）とほぼ同一の細胞表面発現を示す（Ｋｌｅｉｎｂｅｒｇｅｒ，２０１４）が、機能が低下しており、ＴＲＥＭ２中のＲ４７Ｈ変異は、脂質リガンド（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １６０，１０６１−１０７１，２０１５）及びＡｐｏＥ（Ａｔａｇｉ，２０１５；Ｂａｉｌｅｙ，２０１５）の結合を減少させることに留意されたい。この変異はまた、貪食能も低下させ（Ｋｌｅｉｎｂｅｒｇｅｒ，２０１４）、且つレトロマー複合体内のＶｐｓ３５を介したＴＲＥＭ２の再利用も妨げる（Ｙｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｆｆｉｃ  １７，１２８６−１２９６，２０１６）。ＡＤを有さないいくつかのヒトＲ４７Ｈキャリアが特徴付けられており、これらの個体は、非キャリアと比べて速く脳容積を失い（Ｒａｊａｇｏｐａｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３６９，１５６５−１５６７，２０１３）、年齢が一致する対照と比べて認知機能が低く（Ｊｏｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３６８，１０７−１１６，２０１３）、且つ炎症性サイトカイン（例えば、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＮＦγ）の上方制御及び保護マーカー（例えば、ＩＬ−４、ＡｐｏＡ１；Ｒｏｕｓｓｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ＆  Ｄｅｍｅｎｔｉａ：ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  １１，１１６３−１１７０，２０１５を参照されたい）の下方制御を示す。
【０１５６】
ＴＲＥＭ２外部ドメインの脱落へのＡＤＡＭ１０又はＡＤＡＭ１７の寄与を決定するために、下記の選択的阻害剤を特定した：ＤＰＣ３３３（Ｑｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ：ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｆａｔｅ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ３５，１９１６−１９２５，２００７）及びＧＩ２５４０２３（Ｈｕｎｄｈａｕｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２００３；１０２：１１８６−１１９５）。ＤＰＣ３３３及びＧＩ２５４０２３を、ＡＤＡＭ１０及びＡＤＡＭ１７に対する阻害選択性に関して特徴付けた。図２Ｅは、ＤＰＣ３３３がＡＤＡＭ１０（ＩＣ５０＝５．３ｎＭ）と比べてＡＤＡＭ１７（ＩＣ５０＜０．６ｎＭ）に対して強力な阻害剤であり、且つＧＩ２５４０２３がＡＤＡＭ１７（ＩＣ５０＝１９６ｎＭ）よりもＡＤＡＭ１０（ＩＣ５０  １．５ｎＭ）に対する選択性を示すことを示した。生細胞撮像を使用して、条件付き脱落条件下で２種のＡＤＡＭ阻害剤による細胞の一晩の処理（図２Ａ）の後、又はＰＭＡによる細胞の処理（図２Ｂ）の後、ｈＴＲＥＭ２の細胞表面発現をＣＨＯ−ｈＤＡＰ１２−ｈＴＲＥＭ２細胞で評価した。ＡＤＡＭ１７選択的阻害剤ＤＰＣ３３３は、両方の条件下でＴＲＥＭ２細胞表面レベルを用量依存的に増加させる。ＴＲＥＭ２細胞表面レベルへの限定的な効果も、ＧＩ２５４０２３のより高い濃度で観察されるが、定常状態条件下のみである。この効果は、真のＡＤＡＭ１０阻害に起因する可能性があるか、又は高濃度で使用した場合にＧＩ２５４０２３によるＡＤＡＭ１７の非特異的阻害により引き起こされる可能性がある。ＰＭＡ処理細胞では、ＴＲＥＭ２細胞表面発現へのＧＩ２５４０２３の効果が完全に欠けている（図２Ｂ）。生理学的な細胞系に近づけるために、ＣＤ１４＋ヒト単球から分化したヒトＭ２Ａマクロファージで同様の実験を行なった（図２Ｃ〜２Ｄ）。これらの結果は、ＣＨＯ−ｈＤＡＰ１２−ｈＴＲＥＭ２細胞での最初の発見を非常によく再現しており、ＡＤＡＭ１７阻害剤ＤＰＣ３３３は、両方の条件下で用量依存的にＴＲＥＭ２細胞表面発現を増加させ（図２Ｃ〜２Ｄ）、選択的ＡＤＡＭ１０阻害剤は、定常状態の脱落に対して小さい効果を示す（図２Ｃ）。
【０１５７】
まとめると、これらの実験は、ヒトマクロファージにおいて、ＡＤＡＭ１７はＴＲＥＭ２脱落に重要な役割を果たすが、定常状態条件下でのＡＤＡＭ１０のわずかな寄与を排除することができないことを示す。
【０１５８】
実施例３：ＴＨＰ１細胞でのＡＤＡＭ１７除去は構成的脱落を減少させる
実施例２での結果を確認するために、遺伝的アプローチを使用して、ＴＲＥＭ２脱落へのＡＤＡＭ１０／１７の寄与をさらに調査した。ヒト単球ＴＨＰ１細胞を、ＴＲＥＭ２を内因的に発現するモデルシステムとして選択した。ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９技術を用いて、ＡＤＡＭ１０の発現を欠くクローン（ＡＤ１０  Ｈ４）又はＡＤＡＭ１７の発現を欠くクローン（ＡＤ１７  Ｇ１２）及び対照細胞系統（Ｃｔｒｌ  ｇＲＮＡ）を生成した。遺伝子産物の非存在を、ＦＡＣＳ分析又はウエスタンブロットにより検証した（図３Ｃ〜３Ｄ）。
【０１５９】
細胞表面で発現されたＴＲＥＭ２及びｓＴＲＥＭ２を、下記の３種の異なる条件を使用する同一実験で３種の細胞系統において評価した：構成的脱落を反映する処置なし、脱落を最大限に活性化するＰＭＡ処置、並びに最後にＰＭＡ及びＤＰＣ３３３処置。ＡＤＡＭ１７の損失により、条件付き脱落条件下でＴＲＥＭ２細胞表面発現が増加し且つ可溶性ＴＲＥＭ２が大幅に減少するが、ＡＤＡＭ１０の欠如は有意な効果を有さず（図３Ａ〜３Ｂにおける黒色のバーを参照されたい）、そのため、ＡＤＡＭ１７は構成的脱落に寄与する主要なシェダーゼであることが示される。ＰＭＡによるシェダーゼの最大限の活性化により、対照細胞系統及びＡＤＡＭ１０欠損クローンの両方において、細胞表面ＴＲＥＭ２が大幅に減少する。このことはｓＴＲＥＭ２の大幅な増加に反映される。ＡＤＡＭ１７欠損細胞系統では、ＰＭＡ処理により細胞表面ＴＲＥＭ２も減少するが、対照ＣＲＩＳＰＲクローンの場合と比べて程度は小さい。同様に、ｓＴＲＥＭ２の増加は、ＰＭＡで処理した対照ＣＲＩＳＰＲクローン及びＡＤＡＭ欠損クローンと比較して小さい。しかしながら、ＰＭＡの存在下におけるＡＤ１７  Ｇ１２クローンでのＴＲＥＭ２の切断は、ＡＤＡＭ１７以外のシェダーゼにより引き起こされなければならない。従って、ＡＤＡＭ１０  Ｈ４クローンでは、ＰＭＡにより誘発される脱落の増加は、ＡＤＡＭ１７のさらなる活性化により引き起こされる可能性がある。ＰＭＡとＤＰＣ３３３との同時処理により、Ｃｔｒｌ  ｇＲＮＡ及びＡＤ１０  Ｈ４細胞でのＴＲＥＭ２細胞表面レベルが回復したが、ＡＤ１７  Ｇ１２クローンでの効果はより小さかった。ＡＤ１７  Ｇ１２クローンでは、細胞表面ＴＲＥＭ２レベルは、構成的脱落条件下で見られる程度には達しない。しかしながら、ｓＴＲＥＭ２は、ＰＭＡ処理のみと比較して、これらの条件下でＡＤ１７  Ｇ１２クローンにおいて強く減少する。
【０１６０】
まとめると、ＴＨＰ１細胞では、ＡＤＡＭ１７は、構成的脱落の原因となる主要なシェダーゼであるように見える。ＰＭＡ処理後、さらなるシェダーゼメカニズムが作用し始め、その内の１つはＡＤＡＭ１０を伴う可能性がある。
【０１６１】
実施例４：ＴＲＥＭ２膜貫通ドメインに近いアミノ酸ストレッチは脱落に重要である
次の実験では、部位特異的変異誘発を使用して、ＴＲＥＭ２ストーク領域内において切断部位を保有するか又はシェダーゼの結合に重要である領域を特定した。図４Ａは、生成して試験した様々なＴＲＥＭ２変異体を示す。表４は、野生型ヒトＴＲＥＭ２又は変異体ヒトＴＲＥＭ２のストーク領域及び膜貫通ドメインの膜近位部のアミノ酸配列を列挙する。
【０１６２】
【表５】
2020530986.tif 000011
【０１６３】
野生型（ＷＴ）ＴＲＥＭ２又はＴＲＥＭ２変異体を、ｈＤＡＰ１２と一緒にＨＥＫ−ＦＴ細胞にトランスフェクトした。４８時間後、細胞をＰＭＡで３０分にわたり処理して、細胞表面でＡＤＡＭを活性化させた（Ｓｏｍｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ７，１１５２３，２０１６を参照されたい）。ＴＲＥＭ２細胞表面発現をＦＡＣＳにより評価し、結果を、ＰＭＡ処理に対する未処理の発現比として表す（図４Ｂ）。ＰＭＡ処理の有無における各構築物の評価により、いくつかの構築物が抗血清に関して異なる結合特性を示す可能性が克服され、シェダーゼの活性化後のＴＲＥＭ２細胞表面発現の変化の直接比較が可能になる。比１は脱落の完全な阻害を示す。膜貫通ドメイン（ＴＭ）に近い最初の１６個のアミノ酸（ＡＡ）の欠失により、ＴＲＥＭ２脱落が最大限に減少する（ＴＲＵＮＣＩＩＩ−１５９−１７４）。このことは、この領域が切断及び／又はＡＤＡＭの結合部位を伴う可能性があることを示唆する。次に、この領域を含む４種のより短い欠失変異体を生成し、それぞれ６個のアミノ酸超であった（ＴＲＵＮＣ１、Ｔ２ｄｅｌ３−８、Ｔ２ｄｅｌ６−１１、及びＴ２ｄｅｌ１１−１６）。変異体ＴＲＵＮＣ１、Ｔ２ｄｅｌ３−８、及びＴ２ｄｅｌ６−１１の場合には脱落への影響はないか又はほとんどなかったが、変異体Ｔ２ｄｅｌ１１−１６は、ＰＭＡにより誘発される脱落の減少を示した（図４Ｂ）。
【０１６４】
欠失変異体が膜貫通領域に近い切断部位をシフトさせて、立体障害に起因して切断の減少を引き起こすという問題を克服するために、アミノ酸置き換え変異体を設計した。アミノ酸１５６〜１６４及び１６９〜１７２をより大きな疎水性残基に置き換え、これにより、ストーク領域はプロテアーゼ切断に対する耐性を示すようになった（Ｓｔｒｏｍｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ５３，５９３−６０２，２００９）。Ｔ２−ＹＧＧ変異体はＴＲＥＭ２脱落の減少の傾向を示したが、４つの膜近位アミノ酸Ｔ２−ＷＦＲ変異体の置き換えはより効果的であり、両方の変異の組み合わせ（Ｔ２−二重変異体）は欠失変異体ＴＲＵＮＣＩＩＩ−１５９−１７４と同様の効果があった（図４Ａ及び４Ｂ）。そのため、これらのＴＲＥＭ２変異体はシェダーゼ切断に対する耐性を示した。
【０１６５】
まとめると、変異誘発アプローチにより、ＴＲＥＭ２のＰＭＡにより誘発される脱落には２つの領域（アミノ酸１６９〜１７２での膜近位と領域アミノ酸１５６〜１６４における膜遠位）が重要であることが明らかになった。
【０１６６】
次に、Ｔ２−二重−ＴＲＥＭ２構築物が機能性を保持しているかどうかを試験した。この目的のために、この変異体を、ＮＦＡＴにより駆動されるマウスＤＡＰ１２及びベータ−Ｇａｌレポーターを既に発現するＢＷＺ細胞に安定的にトランスフェクトした（Ｈｓｉｅｈ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １０９，１１４４−１１５６，２００９）。この細胞系統においてＴＲＥＭ２なしで発現されたｍＤＡＰ１２は、このシステムにおけるバックグラウンドレポーター遺伝子活性（ＲＧＡ）を表す。ＢＷＺ−Ｔ２−二重細胞及びＢＷＺ−ＴＲＥＭ２−ＺＴ細胞でのＴＲＥＭ２活性化後のＲＧＡの比較により同等の活性が明らかになり、このことは、変異したＴ２−二重はＤＡＰ１２によるシグナル伝達が依然として可能であることを示す（図４Ｃ）。そのため、Ｔ２−二重−ＴＲＥＭ２構築物はＴＲＥＭ２機能を保持した。
【０１６７】
実施例５：ＡＤＡＭ１７は、Ｈ１５７〜Ｓ１５８位でＴＲＥＭ２切断領域ペプチドを切断する
ＴＲＥＭ２のストーク領域内のＡＤＡＭ１０／ＡＤＡＭ１７の切断部位を特定するために、ストーク領域由来のペプチドのインビトロでの切断パターンを調べ、細胞培養上清由来の脱落した可溶性ＴＲＥＭ２のＣ末端の決定により切断部位を確認した。このストーク領域をカバーする一連のペプチドを、ＡＤＡＭ１０／ＡＤＡＭ１７切断のインビトロでの調査のために設計した（図５Ａ）。全てのペプチドを、Ｎ末端７−メトキシクマリン（Ｍｃａ）蛍光タグと共に得た。ペプチド１〜３，１ａ、及び２ａを、最大４８時間にわたり中性緩衝液中でＡＤＡＭ１７と共にインキュベートし、反応の後、様々な時点で採取したアリコートのＨＰＬＣ分析を行なった。ペプチド３でのみ有意な切断を観察し、ペプチド１、２、１ａ、及び２ａは親ペプチドの減少をほとんど示さないか又は示さなかった（図５Ｄ）。
【０１６８】
ペプチド３／ＡＤＡＭ１７の反応混合物のＨＰＬＣ−ＭＳ分析により、１種の主要な生成物ＳＩＳＲＳＬＬＥＧＥＩＰＦＰ−ＮＨ２（配列番号５１）を、２種の微量な切断生成物と一緒に特定した（図５Ｂ〜５Ｃ）。このことは、ＴＲＥＭ２のＨ１５７Ｓ−１５８部位がＡＤＡＭ１７の主要な切断部位であることを示唆する。＞２４時間の時間でのインキュベーション混合物のＨＰＬＣ分析により、主要生成物ピークの減少と一緒に複数の生成物ピークの出現が示された。これらの時点で、基質は本質的に残っていなかった。従って、微量な切断生成物は主要な生成物の二次ＡＤＡＭ１７切断に由来すると結論付けることができる。ＡＤＡＭ１０により同一の分析を実行し、非常に類似する切断パターンを得た（データは示さない）。
【０１６９】
近年の文献により、ペプチド及びタンパク質の切断に対するＡＤＡＭ１０及びＡＤＡＭ１７の優先度への洞察が与えられた（Ｃａｅｓｃｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ４２４，７９−８８，２００９；Ｔｕｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ  １３，２２０５−２２１４，２０１４）。驚くべきことに、ＨｉｓがＰ１で見出されるのは非常にまれであり、Ｓｅｒが、ＡＤＡＭ１０及びＡＤＡＭ１７により切断された基質のＰ１’位置で見出された。ＡＤＡＭ１０及びＡＤＡＭ１７の基質で最も好ましくないアミノ酸を検索した後、イソロイシンはＡＤＡＭ基質のＰ１で決して生じず、Ｐ１’及びＰ２’ではアスパラギン酸又はプロリンの優先度が非常に低いことが分かった。このことを証明するために、ペプチド４〜６を作成した。これらのペプチドでは、Ｈ−ＳＩ切断部位をそれぞれＩＰＰ、ＩＰＤ、及びＩＤＰに置き換えた。３種全てのペプチドはＡＤＡＭ１７によるインビトロでの切断に対して耐性を示し（図５Ｅ）、ペプチド５及び６は、ＡＤＡＭ１０により緩やかに切断された（データは示さない）。Ｈ−ＳＩ切断部位がＩＰＰに置き換えられたペプチド４はインビトロで切断耐性であると思われた。
【０１７０】
実施例６．細胞から脱落したＴＲＥＭ２外部ドメインは、Ｈ１５７とＳ１５８との間で切断される
細胞系におけるＴＲＥＭ２のシェダーゼ切断部位に関するペプチド分析からのインビトロでの発見を立証するために、ｈＤＡＰ１２と組み合わせてｈＴＲＥＭ２又はｈＴＲＥＭ２−Ｒ４７ＨをＨＥＤＫ−ＦＴ細胞に一時的にトランスフェクトした。両方の条件からのトランスフェクト細胞をＰＭＡ又は溶媒で処理した。ｓＴＲＥＭ２を細胞上清から免疫精製し、トリプシン消化又はＡＳｐ−／Ｇｌｕ−Ｃ酵素消化に供し、続いてＬＣ−ＭＳによりペプチドを分析した。４種全ての条件において、同一のＮ末端ペプチドを特定し（Ｄ１３７〜Ｈ１５７）、このことはＨ１５７とＳ１５８との間の主要な切断部位を示した（図６Ａ〜図６Ｂ）。これらの実験は、ＰＭＡ処理もＲ４７Ｈ変異も主要な切断部位のシフトを誘発しないことを示す。
【０１７１】
次の実験を、ＰＮＧアーゼ−Ｆ及びシアリダーゼＡで処理し、続いてＬＣ−ＭＳ分析した、免疫精製した細胞上清からの脱落ＴＲＥＭ２外部ドメイン全体を特定するように設定した。脱グリコシル化ＴＲＥＭ２１９−１５７に対応するＷＴ  ＴＲＥＭ２がトランスフェクトされた細胞からの上清では、１５，６１９ダルトンのペプチド種を検出した（図７）。Ｒ４７Ｈ−ＴＲＥＭ２トランスフェクト細胞の免疫精製した細胞上清では、１５，６００ダルトンの対応するペプチドを検出した。アミノ酸交換に起因して、このペプチドは、ＷＴペプチドと比べて１９ダルトン軽く、変異Ｒ４７Ｈ−ＴＲＥＭ２の場合と同一の切断部位を裏付ける。
【０１７２】
実施例７．ＴＲＥＭ２は切断部位に近い位置でＯ−グリコシル化されていない
翻訳後改変はシェダーゼ活性に影響を及ぼし得ることから（Ｇｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １１２，１４６２３−１４６２８，２０１５；Ｓｃｈｊｏｌｄａｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １８２０，２０７９−２０９４，２０１２）、グリコシル化がＴＲＥＭ２脱落にどのように影響を及ぼし得るかを研究した。ＴＲＥＭ２外部ドメインの特定されたＨ１５７切断部位の近くには、下記の２つの推定Ｏ−グリコシル化部位が存在する：Ｓ１６０及びＳ１６８。Ｃ末端にヒスタグが付されたｈＴＲＥＭ２を使用し、質量分析によりグリコシル化部位をマッピングすることにより、ｈＴＲＥＭ２はＴ１７１及び／又はＳ１７２でＯ−グリコシル化部位を示す（図８Ａ〜８Ｃ）が、Ｓ１６０又はＳ１６８ではＯ−グリコシル化を検出し得ないことが分かった。
【０１７３】
実施例８．シェダーゼ切断部位で変異を有するＴＲＥＭ２変異体は、細胞表面発現の増加を示す
次の一連の実験は、１５７〜１５９位で変異を有するＴＲＥＭ２変異体がＴＲＥＭ２のストーク領域の切断を減少させ得ることを細胞系で立証することを目的とした。ヒトＴＲＥＭ２のストーク領域内のＡＤＡＭ１７切断部位のアミノ酸ＨＳＩ（１５７〜１５９位）を、部位特異的変異誘発によりアミノ酸ＩＰＤに置き換えた。変異体構築物は、ｈＤＡＰ１２と一緒のＨＥＫ２９３−ＦＴ細胞で一時的に発現され、ＴＲＥＭ２の細胞表面発現を、図２で説明されているように評価した。最も興味深いことに、シェダーゼ切断部位で３つのアミノ酸置き換えを有するＴＲＥＭ２変異体は、切断部位のトランケーションを有するＴＲＥＭ２変異体（ＴＲＵＮＣ３）又はＴ２−二重変異を有するＴＲＥＭ２変異体と同様のＴＲＥＭ２細胞表面発現の増加を示し（図４Ｄ）、このことは、細胞状況下でシェダーゼ切断に対する耐性を示す。
【０１７４】
ここで示されたデータは、ＴＲＥＭ２の脱落に対するＡＤＡＭ１０及びＡＤＡＭ１７の寄与を最初に調べた。使用される薬理学的アプローチ及び遺伝的アプローチは、ＡＤＡＭ１７がこのプロセスに寄与する極めて重要なプロテアーゼであることを明確に示す。適用されたＡＤＡＭ阻害剤の酵素選択性をインビトロでの切断アッセイで決定し、両方の阻害剤を、ＣＨＯ−ｈＤＡＰ１２−ｈＴＲＥＭ２細胞及びヒトＭ２ＡマクロファージにおけるＴＲＥＭ２細胞表面発現への影響を調べるために広範な濃度範囲にわたり使用した。薬理学的アプローチが他の酵素の非特異的阻害により混乱しないことを除外するために、これらの発見を、ヒト単球ＴＨＰ−１細胞系統におけるＡＤＡＭ１０又はＡＤＡＭ１７のＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９ノックアウトにより実証した。このノックアウト実験により、ＡＤＡＭ１７の欠損が表面ＴＲＥＭ２を増加させ且つｓＴＲＥＭ２を減少させることが裏付けられた。ここで示されたデータは、定常状態条件下ではＴＲＥＭ２はＡＤＡＭ１７により主に切断されるが、ＰＭＡによるＡＤＡＭの活性化後では、さらなる脱落メカニズムが作用し始める可能性があることを示唆する。近年の文献データは、定常状態条件下ではＡＤＡＭ１０がｓＴＲＥＭ２の生成を媒介することを示した（Ｋｌｅｉｎｂｅｒｇｅｒ，２０１４）。この研究とここで示された結果との間の主な差異は、シグナル伝達アダプタータンパク質ＤＡＰ１２とＴＲＥＭ２との共発現を欠くＨＥＫ−Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞の使用である。ＴＲＥＭ２は、ＤＡＰ１２の非存在下での組換えシステムでの発現後にＡＤＡＭ１０切断に対する感受性を高めている可能性がある。興味深いことに、ＤＡＰ１２は１４個のアミノ酸長の細胞外ドメインを有する（Ｌａｎｉｅｒ  ＆  Ｂａｋｋｅｒ，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ２１，６１１−６１４，２０００を参照されたい）。ＴＲＥＭ２切断部位へのＤＡＰ１２の細胞外ドメインの近接は、細胞外タンパク質ＴＲＥＭ２と、活性化及び脱落を制御し得るＤＡＰ１２との間の相互作用を示唆し得た。
【０１７５】
構成的脱落の調査に加えて、ＰＭＡを使用して細胞表面からのＴＲＥＭ２の脱落を増強した。ＡＤＡＭ１７欠損ＴＨＰ１細胞においてこれらの条件下で観察された脱落はＡＤＡＭ１０活性に起因する可能性があるが、他のメカニズムも関与する可能性があった。例えば、ＴＲＥＭ２外部ドメインは、ＥＲから形質膜への輸送中に細胞内で切断され得、培地へのＴＲＥＭ２分泌が可能になる。
【０１７６】
近年の研究により、ＰＭＡ処理とシェダーゼ活性の変化とがどのように関連しているかが解明されており、ＰＭＡにより引き起こされたシグナル伝達カスケードは、形質膜の外葉へのホスファチジルセリン（ＰＳ）の転移を増強するスクランブラーゼを活性化する（Ｋｏｄｉｇｅｐａｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  １２：３２，２０１３）。ここで、ＰＳは、プロテアーゼがそのシェダーゼ機能の実行を可能にする、ＡＤＡＭ１７の膜近位ドメイン中のカチオン性モチーフに結合する（Ｓｏｍｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ７，１１５２３，２０１６）。これらの実験はＡＤＡＭ１７に焦点を当てており、ＡＤＡＭファミリ内のＡＤＡＭ１７に最も近い相同体であるＡＤＡＭ１０にこれらの発見のいずれが及ぶかどうかを解明するためには、さらなる研究が必要である。
【０１７７】
ＰＳはまたＴＲＥＭ２リガンドとしても説明されていることに留意されたい（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １６０，１０６１−１０７１，２０１５；Ｃａｎｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６４，３９−４７，２０１２；Ｄａｗｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １７１，５９４−５９９，２００３；Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ＆  Ｄｅｍｅｎｔｉａ  １３：３８１−３８７，２０１７）。ホスファチジルセリンは、損傷したニューロン及びグリア細胞により露出されるか又は損傷したミエリンにより放出される一連の膜リン脂質に属する。さらに、ＰＳのような負に帯電したリン脂質は脂質膜中のＡβと関連することが分かっている（Ａｈｙａｙａｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ  １０３，４５３−４６３，２０１２；Ｎａｇａｒａｔｈｉｎａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ３３，１９２８４−１９２９４，２０１３）。これら全てのプロセスにおいて、ＰＳはＴＲＥＭ２のリガンドとして作用し、同時にＴＲＥＭ２の脱落を促進する可能性がある。
【０１７８】
この変異分析により、ＴＲＥＭ２脱落に重要なＴＲＥＭ２のストーク領域内の２つのアミノ酸ストレッチが特定された。膜遠位領域は切断部位のアミノ酸を含む。興味深いことに、形質膜に近い５つのアミノ酸の交換（変異体Ｔ２−ＷＦＲ）によっても、細胞表面でＴＲＥＭ２が安定化された。このことはＴＲＥＭ２に関しては調べられていないが、ＡＤＡＭ１７とその基質Ｌ−セレクチンとの共クラスター化（Ｓｃｈａｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８３，９９−１０５，２００８）が説明されており、ストーク領域のこの部分は、（例えばＰＳにより）ＡＤＡＭ１７のタンパク質分解活性の活性化時に切断が開始される前に、ＡＤＡＭ１７のその基質への結合を可能にするこのプロセスに寄与する可能性がある。
【０１７９】
さらなる実験により、ＴＲＥＭ２外部ドメインの正確な切断部位を特定した。３種の補完的なアプローチを適用し、全てが同一の切断部位を示す。第１に、ストーク領域からのペプチドを、組み換え発現されたＡＤＡＭ１０及びＡＤＡＭ１７によるインビトロでの切断に供した。第２に、ＴＲＥＭ２外部ドメインのトリプシンペプチドからのＣ末端を、ｈＴＲＥＭ２及びｈＤＡＰ１２を組み換え発現するＨＥＫ−ＦＴ細胞の上清から精製し、次いで決定した。第３に、細胞上清から精製された完全長ＴＲＥＭ２外部ドメインのサイズを検証した。形質膜からの切断部位の距離（１７個のアミノ酸）は、最も既知のＡＤＡＭ基質（１２〜１６個のアミノ酸、Ｈｏｒｉｕｃｈｉ，Ｔｈｅ  Ｋｅｉｏ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６２，２９−３６，２０１３；Ｏｖｅｒａｌｌ  ＆  Ｂｌｏｂｅｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８，２４５−２５７，２００７を参照されたい）と比較した場合に上端であり、配列（Ｐ２：Ｖ、Ｐ１：Ｈ、Ｐ１’：Ｓ、Ｐ２’：Ｉ）は、既知のＡＤＡＭ１７基質又はＡＤＡＭ１０基質と比較して非常に独特である（Ｃａｅｓｃｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ４２４，７９−８８；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６２，１２２−１２８，２０１４；Ｔｕｃｈｅｒ，２０１４；Ｖａｈｉｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ４５０，７８２−７８７，２０１４）。ＡＤＡＭ１０及びＡＤＡＭ１７は、Ｐ２位からＰ２’位での小さい疎水性残基を優先し、このことは特異的に基質を駆動させる。しかしながら、ＡＤＡＭ１７及びＡＤＡＭ１０の両方の切断部位が編集されている場合には（Ｔｕｃｈｅｒ，２０１４）、Ｐ１でのアルギニンが非常に一般的である。ＴＲＥＭ２におけるこの位置でのヒスチジンも、正電荷を有する基本的な側鎖を有する。ＡＤＡＭ１７／ＡＤＡＭ１０切断モチーフに一般的でないアミノ酸によるＰ１、Ｐ１’、及びＰ２’の交換により、切断が減少した。ペプチド内の別側への切断のシフトが存在しなかったことは注目に値する。このことは、脱落が形質膜に近い領域に限定されていると思われ且つ二次部位への切断のシフトが起こらない観察を支持する。このことは、タンパク質の膜貫通領域及び最初の球状部分に対する部位の位置が、切断部位のアミノ酸配列と同じように重要であることを示唆する以前の発見と一致する（Ｈｏｒｉｕｃｈｉ，Ｔｈｅ  Ｋｅｉｏ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６２，２９−３６，２０１３；Ｈｉｎｋｌｅ，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７９，２４１７９−２４１８８，２００４；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７７，５０５１０−５０５１９，２００２）。
【０１８０】
Ｒ４７Ｈ変異体は、ＬＯＡＤを発症するリスクを有意に増加させる（Ｇｕｅｒｒｅｉｒｏ，２０１３；Ｊｏｎｓｓｏｎ，２０１３）。ＴＲＥＭ２の細胞表面発現を減少させるＴ６６Ｍ（Ｇｕｅｒｒｅｉｒｏ，２０１３；Ｋｌｅｉｎｂｅｒｇｅｒ，２０１４；Ｂｏｒｒｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｇｉｎｇ  ３５，９３４  ｅ９３７−９１０，２０１４；Ｌｅ  Ｂｅｒ，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｇｉｎｇ  ３５，２４１９  ｅ２４２３−２４１５，２０１７）及びＹ３８Ｃ（Ｇｕｅｒｒｅｉｒｏ，２０１３）のようなＦＴＤのリスクを高める多型の内のいくつかとは対照的に、Ｒ４７Ｈ変異は発現レベルには影響を及ぼさないが、むしろ機能的にＴＲＥＭ２を損なう（Ａｔａｇｉ，２０１５；Ｂａｉｌｅｙ，２０１５；Ｋｌｅｉｎｂｅｒｇｅｒ，２０１４；Ｗａｎｇ，Ｃｅｌｌ  １６０，１０６１−１０７１，２０１５；Ｙｉｎ，２０１６）。ここで示すデータは、Ｒ４７Ｈ変異が切断部位（即ち、可溶性の脱落ＴＲＥＭ２外部ドメインのサイズ）には影響を及ぼさないことを示す。しかしながら、これらの実験は、脱落の程度が変化しているかどうか、即ちｓＴＲＥＭ２の量が変化しているかどうかを結論付けることはできない。
【０１８１】
外部ドメインの脱落は、プロセシング部位の±４個の残基内であるセリン残基又はトレオニン残基でのＯ−グリコシル化による影響を受けると説明されている（Ｇｏｔｈ，２０１５；Ｓｃｈｊｏｌｄａｇｅｒ，２０１２）。切断部位付近でのＯ−グリコシル化の存在を調べた。結果は、ストーク領域内では、ＴＲＥＭ２はＴ１７１及び／又はＳ１７２でのみＯ−グリコシル化されており、Ｓ１６８又はＳ１６０ではＯ−グリコシル化されていないことを示す。おそらく、このＯ−グリコシル化部位は、プロセシング部位から離れすぎているために切断に影響を及ぼさない。これらの結果は、これらの研究に使用されたｈＴＲＥＭ２タンパク質が細胞表面から脱落したのではなく、組換えタンパク質の産生に使用された発現系での分泌経路を通じて分泌されたという事実により制限される。
【０１８２】
近年では、特定の神経変性疾患の感受性に影響を及ぼす多量のＴＲＥＭ２変異体が特定されている（Ｄａｒｄｉｏｔｉｓ，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ａｇｉｎｇ．２０１７  Ｍａｙ；５３：１９４．ｅ１３−１９４．ｅ２２を参照されたい）。最も興味深いことに、これらの変異Ｈ１５７Ｙの１つ（ｒｓ２２３４２５５，Ａｈｙａｙａｕｃｈ，２０１２；Ｃｕｙｖｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｇｉｎｇ  ３５，７２６  ｅ７１１−７２９，２０１４；Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｎｅｕｒｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ  １３，３１８−３２０，２０１６；Ｇｈａｎｉ，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｇｉｎｇ  ４２，２１７  ｅ２１７−２１７  ｅ２１３，２０１６）は、特定されたＴＲＥＭ２切断部位に正確に位置しており、ＡＤを発症する傾向を高める。インビトロでのデータは、ＡＤＡＭ１０／１７がＰ１’位置のチロシンに対する優先度を増加させることを示す（Ｔｕｃｈｅｒ，２０１４）。従って、この変異は、ＡＤＡＭ１０／１７による細胞表面からのＴＲＥＭ２の構成的脱落の増強につながり得、ＴＲＥＭ２脱落とＡＤの発症との間に機構的リンクをもたらすが、この変異がＴＲＥＭ２の脱落に正確にどのように影響を及ぼすかは現在不明である。
【０１８３】
これらの結果から生じる興味深い質問は、ｓＴＲＥＭ２は生理的役割を有するかどうかである。宿主防御又は無菌性炎症の初期段階では、強力な炎症は、病原体の中和又は損傷した組織の除去とその後の消散反応に有利である（Ｆｒｅｉｒｅ，Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌｏｇｙ  ２０００，６３，１４９−１６４）。炎症の消散時に、ＡＤＡＭ１７活性は低下し（Ｌｅ  Ｇａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ  ２０，１７８５−１７９４，２００９；Ｌｅ  Ｇａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １２３，３９１３−３９２２，２０１０）、結果として生じるＴＲＥＭ２の増加は消散及び食作用の両方を促進するだろう。同時に、ＴＮＲαのような他の炎症誘発性サイトカインの産生が減少するようになるだろう。
【０１８４】
特に指示がない限り、特に詳細に記載されていない全ての方法、工程、手法及び操作は、それ自体、当業者には明らかで知られている様式で実施することができ、また実施されてきた。例えば、ここでもまた、本明細書で言及される、標準的な手引き書、及び一般的な背景技術、並びにその中で引用されている、さらなる参考文献が参照される。特に指示がない限り、本明細書で引用される参考文献の各々は、参照によりその全体において組み込まれる。
【０１８５】
本発明に対する特許請求の範囲は、非限定的なものであり、下記に提示される。
【０１８６】
本明細書では、特定の態様及び特許請求の範囲について、詳細に開示してきたが、これは、例示のみを目的とする例としてなされたものであり、付属の特許請求の範囲、又は任意の、対応する、将来の適用についての、特許請求の範囲の対象事物の範囲に関して、限定することを意図するものではない。特に、本発明者らは、特許請求の範囲により規定される、本開示の精神及び範囲から逸脱しない限りにおいて、本開示に対して、多様な代替、改変、及び変更が施され得ることを想定する。核酸の出発材料、目的のクローン、又はライブラリーの種類の選択は、本明細書で記載される態様について通じた当業者には、通例の事項であると考えられる。他の態様、利点、及び変更も、以下の特許請求の範囲内にあると考えられる。当業者であれば、まさしく常用の実験を使用して、本明細に記載される本発明の特定の態様に対する多くの均等物を認識し、又は確認することができるであろう。このような均等物は、以下の特許請求の範囲により包含されることが意図される。後で出願される対応する出願における請求項の範囲の書き直しは、種々の国の特許法による制限に基づくこともあり、請求項の対象事物の放棄と解釈されるべきではない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2020530986.tif 000013
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
2020530986.tif 000015
【図１Ｅ】
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【図２Ａ】
2020530986.tif 000017
【図２Ｂ】
2020530986.tif 000018
【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
2020530986.tif 000020
【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
2020530986.tif 000022
【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
2020530986.tif 000025
【図４Ａ】
2020530986.tif 000026
【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６Ａ】
2020530986.tif 000035
【図６Ｂ】
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【図７】
2020530986.tif 000037
【図８Ａ】
2020530986.tif 000038
【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2020530986.tif 000041
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