(57)【要約】本開示は、可変鎖の配列によって特徴付けられる抗ＴＲＢＣ１抗原結合ドメインに関する。可変鎖のＣＤＲ配列は、（ＶＨ  ＣＤＲ１）ＧＹＴＦＴ、（ＶＨ  ＣＤＲ２）ＮＰＹＮＤＤＩＱＳ、（ＶＨ  ＣＤＲ３）ＧＡＧＹＮＦＤＧＡＹＲＦＦＤＦ、および（ＶＬ  ＣＤＲ１）ＲＳＳＱＲＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬ、（ＶＬ  ＣＤＲ２）ＲＶＳＮＲＦＰ、（ＶＬ  ＣＤＲ３）ＳＱＳＴＨＶＰＹＴである。特許請求されるヒト化抗体はマウスＪＯＶ１Ｉ抗体に由来する。がん治療における使用。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７および配列番号１８から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨドメイン；および
ｂ）配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬドメイン
を含む抗ＴＲＢＣ１抗原結合ドメイン。
【請求項２】
請求項１に記載の抗ＴＲＢＣ１抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項３】
請求項１に記載の抗ＴＲＢＣ１抗原結合ドメインを含む抗体。
【請求項４】
請求項１に記載の抗ＴＲＢＣ１抗原結合ドメインを含む二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）。
【請求項５】
請求項１に記載の抗ＴＲＢＣ１抗原結合ドメインを含む抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項６】
請求項２に記載のＣＡＲをコードする核酸配列。
【請求項７】
請求項６に記載の核酸配列を含むベクター。
【請求項８】
請求項２に記載のＣＡＲを含む細胞。
【請求項９】
請求項８に記載の細胞を作製するための方法であって、請求項６に記載の核酸または請求項７に記載のベクターを細胞に導入するステップを含む方法。
【請求項１０】
請求項８に記載の複数の細胞、請求項３に記載の抗体、請求項４に記載のＢｉＴＥまたは請求項１５に記載の抗体−薬物コンジュゲートを含む医薬組成物。
【請求項１１】
対象におけるＴＲＢＣ１発現Ｔ細胞リンパ腫または白血病の処置における使用のための、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
対象におけるＴＲＢＣ１発現Ｔ細胞リンパ腫または白血病を処置するための方法であって、請求項１０に記載の医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法。
【請求項１３】
対象におけるＴＲＢＣ１発現Ｔ細胞リンパ腫または白血病の処置のための医薬の製造における、請求項１０に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１４】
前記ＴＲＢＣ１発現Ｔ細胞リンパ腫または白血病が、他に特定されない末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ−ＮＯＳ）；血管免疫芽球性Ｔ細胞性リンパ腫（ＡＩＴＬ）、未分化大細胞型リンパ腫（ＡＬＣＬ）、腸症関連Ｔ細胞リンパ腫（ＥＡＴＬ）、肝脾Ｔ細胞リンパ腫（ＨＳＴＬ）、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫鼻型、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＡＬＣＬ、Ｔ細胞前リンパ球性白血病およびＴ細胞急性リンパ芽球性白血病から選択される、請求項１１に記載の使用のための医薬組成物、請求項１２に記載の方法、または請求項１３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、Ｔ細胞リンパ腫または白血病の処置において有用な作用因子に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
リンパ系悪性腫瘍は、Ｔ細胞に由来するものまたはＢ細胞に由来するもののいずれかに大きく分けることができる。Ｔ細胞悪性腫瘍は、臨床的かつ生物学的に不均一な障害の群であり、合わせて非ホジキンリンパ腫の１０〜２０％および急性白血病の２０％を占める。最も一般的に同定される組織学的サブタイプは、他に特定されない（not otherwise specified）末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ−ＮＯＳ）；血管免疫芽球性Ｔ細胞性リンパ腫（ＡＩＴＬ）および未分化大細胞型リンパ腫（ＡＬＣＬ）である。全ての急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）のうちの一部２０％がＴ細胞表現型である。
【０００３】
これらの状態は、一般には、例えばＢ細胞悪性腫瘍と比較して攻撃的に挙動し、推定５年生存率はわずか３０％である。Ｔ細胞リンパ腫の場合では、播種性疾患、好ましくない国際予後指標（ＩＰＩ：Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）スコアおよび節外性疾患の罹患率を示す患者の高い割合を伴う。化学療法単独では通常は有効ではなく、現行の処置で治癒する患者は３０％未満である。
【０００４】
さらに、Ｂ細胞悪性腫瘍が抗ＣＤ２０モノクローナル抗体リツキシマブなどの免疫療法によって転帰が劇的に改善されるのとは異なり、Ｔ細胞悪性腫瘍を処置するために利用可能な、同等に有効であり、毒性が最小である免疫療法薬は現在存在しない。Ｔ細胞障害に対する免疫療法の開発における重要な難しさは、クローンＴ細胞と正常Ｔ細胞のマーカー発現がかなり重複しており、クローン（悪性）細胞を同定することが明白に可能な単一の抗原が存在しないことである。
【０００５】
Ｂ細胞悪性腫瘍を処置するために汎Ｂ細胞抗原を標的とする場合にも同じ問題が存在する。しかし、この場合、Ｂ細胞コンパートメントの同時枯渇により、大多数の患者により容易に寛容される比較的軽微な免疫抑制がもたらされる。さらに、特に長期間にわたる正常Ｂコンパートメントの枯渇が生じる療法では、プールされた免疫グロブリンを投与することによって正常Ｂコンパートメントの喪失を大きく抑止することができる。Ｔ細胞悪性腫瘍を標的とする場合には状況が全く異なる。この場合、Ｔ細胞コンパートメントの同時枯渇により、重度の免疫抑制および重度の毒性が生じる。さらに、Ｔ細胞コンパートメントの喪失を減らす満足のいく方法は存在しない。
【０００６】
毒性は、一部において、治療用モノクローナル抗体アレムツズマブの臨床効果によって例示される。この作用因子は、ＣＤ５２を発現する細胞を溶解し、Ｔ細胞悪性腫瘍においていくらかの有効性がある。この作用因子の有用性は、Ｔ細胞の枯渇に大きく起因して細胞免疫不全が極めて大きく、感染のリスクが著しく上昇することによって著しく限定される。
【０００７】
したがって、上記の不都合を伴わない、Ｔ細胞悪性腫瘍の標的化処置のための新しい方法が必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の局面の概要
本発明者らは、ヒトＴＲＢＣ１に結合する一連のヒト化抗原結合ドメインを開発した。抗原結合ドメインは、対象における悪性ＴＲＢＣ１発現Ｔ細胞を健康なＴＲＢＣ２発現Ｔ細胞に影響を及ぼすことなく枯渇させるために、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、治療用抗体、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）および二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ｅｎｇａｇｅｒ）（ＢｉＴＥ）を含めた種々の治療形式で使用することができる。
【０００９】
したがって、第１の態様では、本発明は、
ａ）配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７および配列番号１８から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨドメイン；および
ｂ）配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬドメイン
を含む抗ＴＲＢＣ１抗原結合ドメインを提供する。
【００１０】
第２の態様では、本発明は、本発明の第１の態様にしたがう抗ＴＲＢＣ１抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。
【００１１】
第３の態様では、本発明は、本発明の第１の態様にしたがう抗ＴＲＢＣ１抗原結合ドメインを含む抗体を提供する。
【００１２】
第４の態様では、本発明は、本発明の第１の態様にしたがう抗ＴＲＢＣ１抗原結合ドメインを含む二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）を提供する。
【００１３】
第５の態様では、本発明は、本発明の第１の態様にしたがう抗ＴＲＢＣ１抗原結合ドメインを含む抗体−薬物コンジュゲートを提供する。
【００１４】
第６の態様では、本発明は、本発明の第２の態様にしたがうＣＡＲをコードする核酸配列を提供する。
【００１５】
第７の態様では、本発明は、本発明の第６の態様にしたがう核酸配列を含むベクターを提供する。
【００１６】
第８の態様では、本発明は、本発明の第２の態様にしたがうＣＡＲを含む細胞を提供する。
【００１７】
第９の態様では、本発明は、本発明の第８の態様にしたがう細胞を作製するための方法であって、本発明の第６の態様にしたがう核酸または本発明の第７の態様にしたがうベクターを細胞に導入するステップを含む方法を提供する。
【００１８】
第１０の態様では、本発明は、本発明の第８の態様にしたがう複数の細胞、本発明の第３の態様にしたがう抗体、本発明の第４の態様にしたがうＢｉＴＥまたは本発明の第５の態様にしたがう抗体−薬物コンジュゲートを含む医薬組成物を提供する。
【００１９】
第１１の態様では、本発明は、対象におけるＴＲＢＣ１発現Ｔ細胞リンパ腫または白血病の処置における使用のための、本発明の第１０の態様にしたがう医薬組成物を提供する。
【００２０】
第１２の態様では、本発明は、対象におけるＴＲＢＣ１発現Ｔ細胞リンパ腫または白血病を処置するための方法であって、本発明の第１０の態様にしたがう医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【００２１】
第１３の態様では、本発明は、対象におけるＴＲＢＣ１発現Ｔ細胞リンパ腫または白血病の処置のための医薬の製造における、本発明の第１０の態様にしたがう医薬組成物の使用を提供する。
【００２２】
ＴＲＢＣ１発現Ｔ細胞リンパ腫または白血病は、他に特定されない末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ−ＮＯＳ）；血管免疫芽球性Ｔ細胞性リンパ腫（ＡＩＴＬ）、未分化大細胞型リンパ腫（ＡＬＣＬ）、腸症関連Ｔ細胞リンパ腫（ＥＡＴＬ）、肝脾Ｔ細胞リンパ腫（ＨＳＴＬ）、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、鼻型、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＡＬＣＬ、Ｔ細胞前リンパ球性白血病およびＴ細胞急性リンパ芽球性白血病から選択され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、αβ  Ｔ細胞受容体／ＣＤ３複合体の図である。Ｔ細胞受容体は、６つの異なるタンパク質鎖から形成され、細胞表面上に発現するにはこれらが小胞体に集合しなければならない。ＣＤ３複合体の４つのタンパク質（ＣＤ３ζ、ＣＤ３γ、ＣＤ３εおよびＣＤ３δ）がＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を包む。このＴＣＲは、複合体に特定の抗原特異性を与え、２つの鎖：ＴＣＲαおよびＴＣＲβで構成される。各ＴＣＲ鎖は、膜に対して遠位の可変成分および膜に対して近位の定常成分を有する。ほぼ全てのＴ細胞リンパ腫および多くのＴ細胞白血病でＴＣＲ／ＣＤ３複合体が発現する。
【図２】図２は、Ｔ細胞受容体再構成の間のＴ細胞受容体β−定常領域（ＴＲＢＣ）−１とＴＲＢＣ２との分離を示す図である。各ＴＣＲベータ鎖は、特定のベータ可変（Ｖ）領域、多様性（Ｄ）領域、連結（Ｊ）領域および定常（ＴＲＢＣ）領域のゲノム組換えにより形成される。ヒトゲノムは、ＴＲＢＣ１およびＴＲＢＣ２として公知の２つの非常に類似した機能的に同等のＴＲＢＣ遺伝子座を含有する。ＴＣＲ遺伝子再構成の間、Ｊ領域がＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のいずれかと再結合する。この再構成は恒久的なものである。Ｔ細胞は、それらの表面上に単一のＴＣＲの多くのコピーを発現し、したがって、各Ｔ細胞は、β鎖定常領域がＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のいずれかによってコードされるＴＣＲを発現する。
【図３】図３は、ヒトＴＲＢＣ１およびヒトＴＲＢＣ２のアミノ酸レベルでのアラインメントを示す図である。ＴＲＢＣ１によってコードされるＴＣＲβ定常鎖とＴＲＢＣ２によってコードされるＴＣＲβ定常鎖は、４つのアミノ酸の差異でのみ異なる：ＴＲＢＣの３位においてＫ／Ｎ；ＴＲＢＣの４位においてＮ／Ｋ；ＴＲＢＣの３６位においてＦ／Ｙ；ＴＲＢＣの１３５位においてＶ／Ｅ。
【図４】ヒト化抗ＴＲＢＣ１結合物質の生成において参照される異なる抗体型を例示する概略図。
【図５】重鎖および軽鎖グラフト選択。ＪＯＶＩ−１由来のＣＤＲを種々のヒトフレームワーク領域と共に含むヒト化ＶＨおよびＶＬドメインを作製した。ヒト化ＶＨドメインとマウスＶＬドメイン、またはヒト化ＶＬドメインとマウスＶＨドメインを含むキメラ抗体を生成し、マウスＶＨおよびＶＬを有する対照キメラ抗体（Ｊｏｖｉ−１キメラＨＣ／Ｊｏｖｉ−１キメラＬＣ）と比較した。ヒト化ＶＨおよびＶＬの組合せを有するヒト化抗体も作製した。全ての抗体をＴＲＢＣ１への結合についてＥＬＩＳＡによって試験した。
【図６】復帰変異構築物のＴＲＢＣ１／ＴＲＢＣ２結合。表１に示されているＨ−ＡＦ０６２２５６フレームワークに基づいて一連の復帰変異ＶＨ構築物を作製した。これらのＶＨドメインを、３ａａｚヒトフレームワークを有するＶＬドメインと組み合わせてヒト化抗体を作製するために使用した。抗体をＴＲＢＣ１およびＴＲＢＣ２への結合についてＥＬＩＳＡによって試験した。
【図７】抗ＴＲＢＣ１抗体構築物の安定性（Ｔｍ℃）。表１に示されている復帰変異構築物を３ａａｚヒト化軽鎖と共に含む抗体のマウスＪＯＶＩ−１抗体と比較した安定性。
【図８】抗ＴＲＢＣ１抗体構築物の安定性（Ｔｍ℃）。
【図９】ヒト化抗ＴＲＢＣ１キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を例示する概略図。
【図１０】ＴＲＢＣ１＋標的のＣＡＲ媒介性特異的殺滅。トランスフェクトされていないＴ細胞、またはマウス抗ＴＲＢＣ１  ＣＡＲを発現するＴ細胞（陽性対照）；ヒト化抗ＴＲＢＣ１  ＣＡＲ；または抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲ（陰性対照）をＴＲＢＣ１発現ラジ標的細胞またはＴＲＢＣ２発現ラジ標的細胞と共培養し、フローサイトメトリーを使用して殺滅を分析した。
【図１１】標的細胞と共培養した後のＣＡＲ発現Ｔ細胞の増殖。トランスフェクトされていないＴ細胞、マウス抗ＴＲＢＣ１  ＣＡＲを発現するＴ細胞；またはヒト化抗ＴＲＢＣ１  ＣＡＲを発現するＴ細胞をＴＲＢＣ１発現ラジ標的細胞またはＴＲＢＣ２発現ラジ標的細胞と７２時間にわたって共培養し、Ｔ細胞増殖を測定した。
【図１２】ＣＡＲ発現Ｔ細胞および標的細胞と共培養した後のサイトカイン放出。トランスフェクトされていないＴ細胞、またはマウス抗ＴＲＢＣ１  ＣＡＲを発現するＴ細胞（陽性対照）；ヒト化抗ＴＲＢＣ１  ＣＡＲ；または抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲ（陰性対照）をＴＲＢＣ１発現ラジ標的細胞またはＴＲＢＣ２発現ラジ標的細胞と共培養した。２４時間後にＩＦＮγおよびＩＬ−２の放出を測定した。
【図１３】ＮＳＧマウスモデルにおける腫瘍成長に対するヒト化抗ＴＲＢＣ１  ＣＡＲの効果。
【図１４】標的細胞と共培養した後の疲弊マーカーの発現。活性化ＰＢＭＣにマウスＪＯＶＩ１  ＣＡＲ（ｍＪＯＶＩ）またはヒト化Ｊｏｖｉ−１  ＣＡＲ（Ｈ１Ｌヒンジ）を形質導入し、ＣＤ５６発現細胞を枯渇させ、ＴＲＢＣ１−ＴＣＲ発現ラジ標的細胞と共培養した。９６時間後に、細胞を抗ＰＤ１抗体、抗ＬＡＧ３抗体および抗Ｔｉｍ３抗体で染色し、次いで、フローサイトメトリーによって分析した。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
詳細な説明
本発明は、ＴＲＢＣ１に選択的に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）などの作用因子を提供する。そのような作用因子は、対象におけるＴ細胞リンパ腫または白血病を処置するための方法において有用である。Ｔ細胞悪性腫瘍はクローン性であり、したがって、ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２を発現する。ＴＣＲＢ１選択的作用因子を対象に投与することにより、当該作用因子は、ＴＲＢＣ１を発現する悪性Ｔ細胞と、ＴＲＢＣ１を発現する正常なＴ細胞との選択的な枯渇を引き起こすが、ＴＲＢＣ２を発現する正常なＴ細胞の枯渇は引き起こさない。
【００２５】
ＴＣＲβ定常領域（ＴＲＢＣ）
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、Ｔリンパ球の表面上に発現され、主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合した抗原の認識に関与する。ＴＣＲが抗原性ペプチドおよびＭＨＣ（ペプチド／ＭＨＣ）と会合すると、関連する酵素、補助受容体、特殊アダプター分子、および活性化または放出された転写因子によって媒介される一連の生化学的事象を通じてＴリンパ球が活性化される。
【００２６】
ＴＣＲは、通常、不変のＣＤ３鎖分子との複合体の一部として発現される高度に可変性のアルファ（α）鎖およびベータ（β）鎖からなるジスルフィド連結した膜係留型ヘテロ二量体である。この受容体を発現するＴ細胞はα：β（またはαβ）Ｔ細胞と称される（総Ｔ細胞の約９５％）。少数のＴ細胞は、可変性のガンマ（γ）鎖およびデルタ（δ）鎖によって形成される代替の受容体を発現し、これらはγδ  Ｔ細胞と称される（総Ｔ細胞の約５％）。
【００２７】
各α鎖およびβ鎖は、２つの細胞外ドメイン：可変（Ｖ）領域および定常（Ｃ）領域で構成され、これらはどちらも、逆平行β−シートを形成する免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）ドメインである。定常領域は細胞膜に対して近位にあり、その後ろに膜貫通領域および短い細胞質尾部があり、可変領域は、ペプチド／ＭＨＣ複合体に結合する（図１参照）。ＴＣＲの定常領域は、システイン残基がジスルフィド結合を形成し、それにより２つの鎖間に連結が形成される、短い接続配列からなる。
【００２８】
ＴＣＲ  α鎖およびβ鎖の可変ドメインはどちらも３つの超可変または相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する。β鎖の可変領域は、追加的な領域の超可変性（ＨＶ４）も有するが、これは通常は抗原と接触せず、したがって、ＣＤＲとはみなされない。
【００２９】
ＴＣＲはまた、最大５つの不変鎖γ、δ、ε（集合的にＣＤ３と称される）およびζも含む。ＣＤ３およびζサブユニットは、αβまたはγδによる抗原の認識後に第２のメッセンジャーおよびアダプター分子と相互作用する特異的な細胞質ドメインを通じてＴＣＲシグナル伝達を媒介する。ＴＣＲ複合体の細胞表面発現の前に、サブユニットが対で集合し、そこではＴＣＲ  αおよびβならびにＣＤ３  γおよびδの膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインの両方が役割を果たす。
【００３０】
したがって、ＴＣＲは、一般にＣＤ３複合体と、ＴＣＲ  α鎖およびβ鎖とで構成され可、それが今度は変領域および定常領域で構成される（図１）。
【００３１】
ＴＣＲ  β定常領域（ＴＲＢＣ）を供給する遺伝子座（Ｃｈｒ７：ｑ３４）は、進化の歴史の中で複製されて、２つのほぼ同一であり機能的に同等な遺伝子：ＴＲＢＣ１およびＴＲＢＣ２を生じ（図２）、これらは、各遺伝子から生じる成熟タンパク質内の４アミノ酸のみが異なる（図３）。各ＴＣＲは、相互排他的にＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のいずれかを含み、したがって、各αβ  Ｔ細胞は、ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のいずれかを相互排他的に発現する。
【００３２】
ＴＲＢＣ１の配列とＴＲＢＣ２の配列は類似しているにもかかわらず、それらを識別することが可能である。ＴＲＢＣ１のアミノ酸配列およびＴＲＢＣ２のアミノ酸配列を、細胞、例えばＴ細胞の表面上でｉｎ  ｓｉｔｕで識別することができる。
【００３３】
抗原結合ドメイン
本発明は、以下の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）を有するヒト化抗ＴＲＢＣ１抗原結合ドメインを提供する：
ＶＨ  ＣＤＲ１：ＧＹＴＦＴＧＹ（配列番号１）；
ＶＨ  ＣＤＲ２：ＮＰＹＮＤＤ（配列番号２）；
ＶＨ  ＣＤＲ３：ＧＡＧＹＮＦＤＧＡＹＲＦＦＤＦ（配列番号３）；
ＶＬ  ＣＤＲ１：ＲＳＳＱＲＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨ（配列番号４）；
ＶＬ  ＣＤＲ２：ＲＶＳＮＲＦＰ（配列番号５）；および
ＶＬ  ＣＤＲ３：ＳＱＳＴＨＶＰＹＴ（配列番号６）。
【００３４】
抗原結合ドメインは、ヒトフレームワーク領域、または１つまたは複数の変異を有するヒトフレームワーク領域を含む。例えば、フレームワーク領域（複数可）は、ヒトフレームワーク領域配列と比較して１つまたは複数の置換を含んでよい。置換は、１つまたは複数のアミノ酸がマウス抗体配列由来の等価の残基で置換される「復帰変異」であってよい。マウス抗体可変重鎖（ＶＨ）配列が配列番号７として下に示されており、可変軽鎖（ＶＬ）配列が配列番号８で示される。どちらの配列においても、ＣＤＲ配列が太字で示され下線が引かれている。
【化１】
2020527027.tif 000002
【００３５】
配列番号１、２および３で示されるマウスＪＯＶＩ−１  ＣＤＲを含むヒト化ＶＨ配列は、野生型ヒトフレームワーク領域配列と比較して６つもしくはそれよりも少ない、５つもしくはそれよりも少ない、４つもしくはそれよりも少ない、３つもしくはそれよりも少ない、２つ、または１つの変異を有してよい。
【００３６】
配列番号４、５および６で示されるマウスＪＯＶＩ−１  ＣＤＲを含むヒト化ＶＬ配列は、野生型ヒトフレームワーク領域配列と比較して６つもしくはそれよりも少ない、５つもしくはそれよりも少ない、４つもしくはそれよりも少ない、３つもしくはそれよりも少ない、２つ、または１つの変異を有してよい。
【００３７】
ＶＨ配列は、ヒトフレームワークＨ−ＡＦ０６２２５６を有するＪＯＶＩ−１  ＶＨ  ＣＤＲを含んでよい。この配列は、配列番号９で示される。ＣＤＲ配列に下線が引かれている。
【化２】
2020527027.tif 000003
【００３８】
ＶＨ配列は、ヒトフレームワークＨ−ＥＦ１７７９９９を有するＪＯＶＩ−１  ＶＨ  ＣＤＲを含んでよい。この配列は、配列番号１０で示される。ＣＤＲ配列に下線が引かれている。
【化３】
2020527027.tif 000004
【００３９】
ＶＨ配列は、ヒトフレームワークＨ−ＫＦ６８８１６５を有するＪＯＶＩ−１  ＶＨ  ＣＤＲを含んでよい。この配列は、配列番号１１で示される。ＣＤＲ配列に下線が引かれている。
【化４】
2020527027.tif 000005
【００４０】
ＶＨ配列は、復帰変異などの１つまたは複数の変異を有する配列番号９、１０または１１で示される配列を含んでよい。ＶＨ配列は、野生型ヒトフレームワーク領域配列と比較して６つもしくはそれよりも少ない、５つもしくはそれよりも少ない、４つもしくはそれよりも少ない、３つもしくはそれよりも少ない、２つ、または１つの変異を有し得る。例えば、ＶＨ配列は、実施例の表１に示されている復帰変異のセットのうちの１つを有する配列番号９で示される配列を含んでよい。
【００４１】
ＶＨ配列は、配列番号１２〜１８で示される配列のうちの１つを含んでよい。ＣＤＲ配列に下線が引かれているおよび復帰変異が太字で示されている。
【化５】
2020527027.tif 000006
【化６】
2020527027.tif 000007
【００４２】
ＶＬ配列は、ヒトフレームワーク３ａａｚを有するＪＯＶＩ−１  ＶＬ  ＣＤＲを含んでよい。この配列は、配列番号１９で示される。ＣＤＲ配列に下線が引かれている。
【化７】
2020527027.tif 000008
【００４３】
ＶＬ配列は、復帰変異などの１つまたは複数の変異を有する、配列番号１９で示される配列を含んでよい。ＶＬ配列は、野生型ヒトフレームワーク領域配列と比較して６つもしくはそれよりも少ない、５つもしくはそれよりも少ない、４つもしくはそれよりも少ない、３つもしくはそれよりも少ない、２つ、または１つの変異を有し得る。例えば、ＶＬ配列は、配列番号２０〜３４で示される配列のうちの１つを含んでよい。ＣＤＲ配列に下線が引かれているおよび復帰変異が太字で示されている。
【化８】
2020527027.tif 000009
【化９】
2020527027.tif 000010
【化１０】
2020527027.tif 000011
【００４４】
抗ＴＲＢＣ１抗原結合ドメインは、
ａ）ヒトフレームワークＨ−ＡＦ０６２２５６またはそのバリアントを有するＪＯＶＩ−１  ＶＨ  ＣＤＲを含むＶＨドメイン；および
ｂ））ヒトフレームワーク３ａａｚまたはそのバリアントを有するＪＯＶＩ−１  ＶＬ  ＣＤＲを含むＶＨドメイン
を含んでよい。
【００４５】
バリアントは、野生型ヒトフレームワーク領域配列と比較して５つまたはそれよりも少ない、４つまたはそれよりも少ない、３つまたはそれよりも少ない、２つまたは１つの変異を有してよい。
【００４６】
ＶＨドメインは、配列番号９、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７または配列番号１８で示される配列を含んでよい。ＶＬドメインは、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４で示される配列を含んでよい。
【００４７】
抗ＴＲＢＣ１抗原結合ドメインは、
ａ）配列番号９で示される配列を含むＶＨドメイン；および
ｂ））配列番号１９で示される配列を含むＶＨドメイン
を含んでよい。
【００４８】
抗体
本発明の第１の態様の抗原結合ドメインは、抗体またはその機能性断片であってよい。抗体は、枯渇性抗体などの治療用抗体であってよい。抗体は、ＴＲＢＣ１と別の抗原とに結合する二重特異性抗体であってよい。抗体は、例えば、二重親和性再標的化抗体であってよい。
【００４９】
「枯渇性抗体」という用語は、従来の意味で使用され、標的Ｔ細胞上に存在する抗原（すなわち、ＴＲＢＣ１）に結合し、標的Ｔ細胞の死滅を媒介する抗体に関する。したがって、枯渇性抗体を対象に投与することにより、対象内の標的抗原を発現する細胞の数の低下／減少がもたらされる。
【００５０】
本明細書で使用される場合、「抗体」とは、少なくとも１つの相補性決定領域ＣＤＲを含む抗原結合部位を有するポリペプチドを意味する。抗体は、３つのＣＤＲを含み、ドメイン抗体（ｄＡｂ）のものと同等の抗原結合部位を有し得る。抗体は、６つのＣＤＲを含み、古典的な抗体分子のものと同等の抗原結合部位を有し得る。ポリペプチドの残りは、抗原結合部位のための適切な足場をもたらし、抗原との結合のために適した様式でこれをディスプレイする任意の配列であってよい。抗体は、免疫グロブリン分子全体であってもよく、全抗体の抗原特異性を保持するその一部、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）’２、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）断片、およびｓｃＦｖ−Ｆｃ融合物またはダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）またはナノボディであってもよい。抗体は、二機能性抗体であってよい。抗体は、非ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体または完全ヒト抗体であってよい。
【００５１】
コンジュゲート
抗体は、抗体と、別の作用因子または抗体とのコンジュゲートであってよく、例えば、コンジュゲートは、検出可能な実体または化学療法用実体であってよい。
【００５２】
検出可能な実体は、蛍光部分、例えば、蛍光ペプチドであってよい。「蛍光ペプチド」とは、励起後に検出可能な波長で光を放出するポリペプチドを指す。蛍光タンパク質の例としては、これだけに限定されないが、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、増強ＧＦＰ、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）およびｍＣｈｅｒｒｙが挙げられる。
【００５３】
化学療法用実体とは、本明細書で使用される場合、細胞に対して破壊的である実体を指す、つまり、実体により細胞の生存能力が低下する。化学療法用実体は、細胞傷害性薬物であってよい。企図される化学療法剤としては、これだけに限定することなく、アルキル化剤、ニトロソウレア、エチレンイミン／メチルメラミン、スルホン酸アルキル、代謝拮抗薬、ピリミジン類似体、エピポドフィロトキシン（ｅｐｉｐｏｄｏｐｈｙｌｏｔｏｘｉｎ）、Ｌ−アスパラギナーゼなどの酵素；ＩＦＮα、ＩＬ−２、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦなどの生物学的反応修飾物質；シスプラチンおよびカルボプラチンなどの白金配位錯体、アントラセンジオン、ヒドロキシウレアなどの置換尿素、Ｎ−メチルヒドラジン（ＭＩＨ）およびプロカルバジンを含めたメチルヒドラジン誘導体、ミトタン（ｏ，ｐ’−ＤＤＤ）およびアミノグルテチミドなどの副腎皮質抑制薬；プレドニゾンおよび等価物などの副腎皮質ステロイドアンタゴニストを含めたホルモンおよびアンタゴニスト、デキサメタゾンおよびアミノグルテチミド；カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロンおよび酢酸メゲストロールなどのプロゲスチン；ジエチルスチルベストロールおよびエチニルエストラジオール等価物などのエストロゲン；タモキシフェンなどの抗エストロゲン薬；プロピオン酸テストステロンおよびフルオキシメステロン／等価物を含めたアンドロゲン；フルタミド、ゴナドトロピン放出ホルモン類似体およびロイプロリドなどの抗アントロゲン薬；ならびにフルタミドなどの非ステロイド性抗アントロゲン薬が挙げられる。
【００５４】
ＴＲＢＣ１特異的抗体−薬物コンジュゲートにより、ＴＲＢＣ１を発現する細胞に化学療法用実体（chemotherapeutic entity）を標的化送達することが可能になる。
【００５５】
二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー
抗体様結合ドメインを２つ有するという基本概念に基づく多種多様な分子が開発されてきた。
【００５６】
二重特異性Ｔ細胞エンゲージ分子（Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｎｇａｇｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）は、主に抗がん薬として使用するために開発されてきた二重特異性抗体型分子のクラスである。これらは、宿主の免疫系、より具体的には、Ｔ細胞の細胞傷害活性をがん細胞などの標的細胞に対して方向付ける。これらの分子では、一方の結合ドメインがＴ細胞にＣＤ３受容体を介して結合し、他方が腫瘍細胞などの標的細胞（腫瘍特異的分子を介して）に結合する。二重特異性分子は標的細胞およびＴ細胞の両方に結合するので、それにより標的細胞がＴ細胞と近づき、そうすることで、Ｔ細胞がその効果、例えば、がん細胞に対する細胞傷害効果を発揮することが可能になる。Ｔ細胞：二重特異性Ａｂ：がん細胞複合体の形成により、Ｔ細胞におけるシグナル伝達が誘導され、それにより、例えば、細胞傷害性メディエーターの放出が導かれる。当該作用因子により標的細胞の存在下で所望のシグナル伝達のみが誘導され、選択的な殺滅が導かれることが理想的である。
【００５７】
二重特異性Ｔ細胞エンゲージ分子はいくつもの異なる構成で開発されてきたが、最も一般的なもののうちの１つは、異なる抗体の２つの単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）からなる融合物である。これらは、時には、ＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー）として公知である。
【００５８】
したがって、本発明は、ＴＲＢＣ１を選択的に認識し、Ｔ細胞を活性化することができる二重特異性分子を提供する。例えば、作用因子は、ＢｉＴＥであってよい。作用因子は、（ｉ）上で定義された抗原結合ドメインを有する、ＴＲＢＣ１に結合する第１のドメイン；および（ｉｉ）Ｔ細胞を活性化することができる第２のドメインを含んでよい。
【００５９】
二重特異性分子は、その産生を補助するためにシグナルペプチドを含んでよい。シグナルペプチドにより、二重特異性分子を宿主細胞から分泌させることができ、そうすることで、二重特異性分子を宿主細胞上清から回収することができる。
【００６０】
シグナルペプチドは、分子のアミノ末端にあってよい。二重特異性分子は、一般式：シグナルペプチド−第１のドメイン−第２のドメインを有してよい。
【００６１】
二重特異性分子は、第１のドメインを第２のドメインと接続し、２つのドメインを空間的に分離するためのスペーサー配列を含んでよい。
【００６２】
スペーサー配列は、例えば、ＩｇＧ１ヒンジまたはＣＤ８ストークを含んでよい。あるいは、リンカーは、長さおよび／またはドメイン間隔の性質がＩｇＧ１ヒンジまたはＣＤ８ストークと同様である代替リンカー配列を含んでよい。
【００６３】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
本発明は、ＴＲＢＣ１を選択的に認識するＣＡＲを提供する。
【００６４】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、キメラＴ細胞受容体、人工Ｔ細胞受容体およびキメラ免疫受容体としても公知であり、任意の特異性を免疫エフェクター細胞に移植する、工学的に作製された受容体である。古典的ＣＡＲでは、モノクローナル抗体の特異性がＴ細胞に移植されている。ＣＡＲをコードする核酸を、例えば、レトロウイルスベクターを使用してＴ細胞に移入することができる。この方法では、養子細胞移入のための多数のがん特異的Ｔ細胞を生成することができる。この手法の第Ｉ相臨床試験では有効性が示されている。
【００６５】
ＣＡＲの標的抗原結合ドメインは、一般に、スペーサーおよび膜貫通ドメインを介して細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含むまたはそれと会合するエンドドメイン（ｅｎｄｏｄｏｍａｉｎ）と融合させる。ＣＡＲが標的抗原に結合すると、それを発現するＴ細胞に活性化シグナルが伝達される。
【００６６】
ＣＡＲは、膜にまたがる膜貫通ドメインも含んでよい。ＣＡＲは、疎水性アルファヘリックスを含んでよい。膜貫通ドメインは、良好な受容体安定性をもたらす、ＣＤ２８に由来するものであってよい。
【００６７】
エンドドメインは、シグナル伝達に関与するＣＡＲの部分である。エンドドメインは、細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含むか、またはそれと会合する。抗原認識後、受容体が密集し、シグナルが細胞に伝達される。最も一般的に使用されるＴ細胞シグナル伝達成分は、３つのＩＴＡＭを含有するＣＤ３−ゼータのものである。これにより、抗原が結合した後、活性化シグナルがＴ細胞に伝達される。ＣＤ３−ゼータからは完全にコンピテントな活性化シグナルはもたらされず、追加的な共刺激シグナルが必要な場合がある。例えば、増殖／生存シグナルを伝達するためにキメラＣＤ２８およびＯＸ４０をＣＤ３−ゼータと一緒に使用することができる、または３つ全てを一緒に使用することができる。
【００６８】
ＣＡＲのエンドドメインは、ＣＤ２８エンドドメインおよびＯＸ４０およびＣＤ３−ゼータエンドドメインを含んでよい。
【００６９】
あるいは、本発明の第２の態様のＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメインを欠いてよいが、シグナル伝達機能性をもたらす別の分子と結び付くことができる。
【００７０】
２つの部分：抗原結合ドメインおよび膜貫通ドメインを含むＣＡＲ；ならびに細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達成分を含むＣＡＲシグナル伝達系が以前に記載されている。１つまたは複数の共刺激ドメインがＣＡＲおよび／または細胞内シグナル伝達成分上に位置していてよい。
【００７１】
ＣＡＲと細胞内シグナル伝達成分の間のヘテロ二量体形成により、機能的なＣＡＲ系が生じる。ヘテロ二量体形成は、ＷＯ２０１６／１２４９３０に記載されている通り自然発生的に起こる場合もあり、ＷＯ２０１５／１５０７７１に記載されている通り二量体形成の化学的誘導物質（ＣＩＤ）の存在下でのみ起こる場合もある。第３の選択肢では、特定の小分子などの作用因子が存在することによってヘテロ二量体形成が破壊され、したがって、ＣＡＲ媒介性シグナル伝達は作用因子の不在下でのみ起こる。そのような系は、ＷＯ２０１６／０３０６９１に記載されている。
【００７２】
ＣＡＲは、シグナルペプチドを含んでよく、そうすることで、ＣＡＲがＴ細胞などの細胞の内部で発現すると、新生タンパク質が小胞体、その後、それが発現されている細胞表面に方向付けられる。
【００７３】
ＣＡＲは、ＴＲＢＣ結合ドメインを膜貫通ドメインに接続し、ＴＲＢＣ結合ドメインを膜から空間的に分離するためにスペーサー配列を含んでよい。柔軟なスペーサーにより、ＴＲＢＣ結性ドメインを異なる方向に向かせてＴＲＢＣとの結合を可能とすることが可能になる。
【００７４】
スペーサー配列は、例えば、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジもしくはＣＤ８ストーク、またはこれらの組合せを含んでよい。
【００７５】
核酸
本発明は、上で定義されたＢｉＴＥまたはＣＡＲをコードする核酸をさらに提供する。
【００７６】
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、および「核酸」という用語は、互いに同義であるものとする。
【００７７】
遺伝暗号の縮重の結果として、多数の異なるポリヌクレオチドおよび核酸が同じポリペプチドをコードする可能性があることが当業者には理解される。さらに、当業者は、ポリペプチドを発現する任意の特定の宿主生物体のコドン使用を反映するために、常套的な技法を使用して本明細書に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド配列に影響を及ぼさないヌクレオチド置換を行うことができることが理解されるべきである。
【００７８】
本発明による核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含んでもよい。核酸は一本鎖であっても二本鎖であってもよい。それは、合成または修飾されたヌクレオチドをその中に含むポリヌクレオチドであってもよい。オリゴヌクレオチドに対するいくつもの異なる型の修飾が当技術分野で公知である。これらとしては、メチルホスホネート骨格およびホスホロチオエート骨格、分子の３’末端および／または５’末端へのアクリジン鎖またはポリリシン鎖の付加が挙げられる。本明細書に記載の通り使用するために、当技術分野において利用可能な任意の方法によってポリヌクレオチドを修飾できることが理解されるべきである。そのような修飾は、目的のポリヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏにおける活性または寿命を増強するために行うことができる。
【００７９】
ヌクレオチド配列と関連した「バリアント」、「相同体」または「誘導体」という用語は、配列からまたは配列への１つ（または複数）の核酸の任意の置換、変動、修飾、置き換え、欠失または付加を含む。
【００８０】
本発明は、上で定義されたＣＡＲをコードする第１の核酸；および自殺遺伝子をコードする第２の核酸を含む核酸構築物も提供する。
【００８１】
本発明のＣＡＲ発現細胞に使用するための適切な自殺遺伝子としては、ＷＯ２０１３／１５３３９１に記載されているＲＱＲ８；およびＷＯ２０１６／１３５４７０に記載されているＲａｐＣａｓｐ９が挙げられる。
【００８２】
上記の核酸構築物では、第１の核酸配列と第２の核酸配列はいずれの順序であってもよい。
【００８３】
ベクター
本発明は、本発明の１つまたは複数の核酸配列または核酸構築物を含むベクターまたはベクターのキットも提供する。核酸配列（複数可）または構築物（複数可）を、例えば本発明の第１の態様にしたがう抗原結合ドメインを有するＣＡＲを発現するように宿主細胞に導入するために、そのようなベクターを使用することができる。
【００８４】
ベクターは、例えば、プラスミドまたはレトロウイルスベクターもしくはレンチウイルスベクターなどのウイルスベクター、またはトランスポゾンに基づくベクターまたは合成ｍＲＮＡであってよい。
【００８５】
ベクターは、Ｔ細胞またはＮＫ細胞にトランスフェクトまたは形質導入することができるものであってよい。
【００８６】
細胞
本発明は、本発明の第１の態様にしたがうＣＡＲを含む免疫細胞などの細胞にも関する。
【００８７】
細胞は、本発明の核酸、核酸構築物またはベクターを含んでよい。
【００８８】
細胞は、Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞であってよい。
【００８９】
Ｔ細胞は、細胞媒介性免疫において中心的な役割を果たすリンパ球の一種であるＴ細胞またはＴリンパ球であってよい。これらは、細胞表面上にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が存在することにより、Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）などの他のリンパ球と区別することができる。下に要約されている通り、種々の型のＴ細胞が存在する。
【００９０】
ヘルパーＴ細胞（ＴＨ細胞）は、Ｂ細胞の形質細胞およびメモリーＢ細胞への成熟化、ならびに細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージの活性化を含めた免疫学的プロセスにおいて他の白血球を補助する。ＴＨ細胞は、表面上にＣＤ４を発現する。ＴＨ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上のＭＨＣクラスＩＩ分子によってペプチド抗原が提示されると活性化される。これらの細胞は、異なる型の免疫応答を促進するような異なるサイトカインを分泌する、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ１７、Ｔｈ９、またはＴＦＨを含めたいくつかの亜型のうちの１つに分化し得る。
【００９１】
細胞溶解性Ｔ細胞（ＴＣ細胞、またはＣＴＬ）は、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を破壊し、また、移植拒絶にも関係づけられる。ＣＴＬは、表面上にＣＤ８を発現する。これらの細胞は、全ての有核細胞の表面上に存在するＭＨＣクラスＩに付随する抗原に結合することによってそれらの標的を認識する。調節性Ｔ細胞から分泌されるＩＬ−１０、アデノシンおよび他の分子を通じて、ＣＤ８＋細胞を不活性化してアネルギーの状態にすることができ、それにより、実験的自己免疫性脳脊髄炎などの自己免疫疾患を予防する。
【００９２】
メモリーＴ細胞は、感染が消散した後、長期間存続する抗原特異的Ｔ細胞のサブセットである。これらは、同族抗原に再曝露されると直ちに増大して多数のエフェクターＴ細胞になり、そうすることで、過去の感染に対する「メモリー」による免疫系をもたらす。メモリーＴ細胞は、３つの亜型：セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ細胞）およびエフェクターメモリーＴ細胞の２つの型（ＴＥＭ細胞およびＴＥＭＲＡ細胞）を含む。メモリー細胞は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋のいずれかであり得る。メモリーＴ細胞は、一般には、細胞表面タンパク質ＣＤ４５ＲＯを発現する。
【００９３】
調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）は、以前はサプレッサーＴ細胞として公知であり、免疫寛容を維持するために極めて重要である。それらの主要な役割は、Ｔ細胞媒介性免疫をシャットダウンして免疫反応の終わりに向かわせること、および胸腺における負の選択のプロセスを免れた自己反応性Ｔ細胞を抑制することである。
【００９４】
２種の主要なクラスのＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞が記載されている−天然に存在するＴｒｅｇ細胞および適応性Ｔｒｅｇ細胞。
【００９５】
天然に存在するＴｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞としても公知）は、胸腺において生じ、発達中のＴ細胞と、ＴＳＬＰで活性化された骨髄樹状細胞（ＣＤ１１ｃ＋）および形質細胞様樹状細胞（ＣＤ１２３＋）との間の相互作用に関連付けられている。天然に存在するＴｒｅｇ細胞は、ＦｏｘＰ３と称される細胞内分子が存在することにより、他のＴ細胞と区別することができる。ＦＯＸＰ３遺伝子の変異により、調節性Ｔ細胞の発生が妨げられ、それにより、致死的な自己免疫疾患ＩＰＥＸが引き起こされる可能性がある。
【００９６】
適応性Ｔｒｅｇ細胞（Ｔｒ１細胞またはＴｈ３細胞としても公知）は、正常な免疫応答の間に生じる可能性がある。
【００９７】
細胞は、ナチュラルキラー細胞（またはＮＫ細胞）であってよい。ＮＫ細胞は、自然免疫系の一部を形成する。ＮＫ細胞により、ウイルス感染細胞からの生得的なシグナルに対する迅速な応答がＭＨＣ非依存的にもたらされる。
【００９８】
ＮＫ細胞（生得的なリンパ系細胞の群に属する）は、大型顆粒リンパ球（ＬＧＬ）と定義され、Ｂリンパ球およびＴリンパ球を生成する共通のリンパ系前駆細胞から分化する第３の種類の細胞を構成する。ＮＫ細胞は、骨髄、リンパ節、脾臓、扁桃および胸腺において分化および成熟し、次いでそこから循環中に入ることが公知である。
【００９９】
本発明のＣＡＲ細胞は、上記の細胞型のいずれであってもよい。
【０１００】
本発明の第１の態様にしたがうＣＡＲを発現するＴ細胞またはＮＫ細胞は、患者自身の末梢血（第一者）、またはドナー末梢血からの造血幹細胞移植の状況で（第二者）、または無関係のドナー由来の末梢血（第三者）のいずれかからｅｘ  ｖｉｖｏで作製することができる。
【０１０１】
あるいは、本発明の第１の態様にしたがうＣＡＲを発現するＴ細胞またはＮＫ細胞は、誘導性前駆細胞または胚性前駆細胞のＴ細胞またはＮＫ細胞へのｅｘ  ｖｉｖｏにおける分化から誘導されてもよい。あるいは、その溶解機能を保持し、治療薬としての機能を果たし得る不死化Ｔ細胞株を使用することができる。
【０１０２】
これらの実施形態の全てにおいて、ＣＡＲ細胞は、ウイルスベクターを用いた形質導入、ＤＮＡまたはＲＮＡを用いたトランスフェクションを含めた多くの手段のうちの１つによってＣＡＲをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを導入することにより生成される。
【０１０３】
本発明のＣＡＲ発現細胞は、対象に由来するｅｘ  ｖｉｖｏのＴ細胞またはＮＫ細胞であってよい。Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）試料に由来するものであってよい。Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、本発明の第１の態様にしたがうＣＡＲをコードする核酸を用いて形質導入する前に、例えば、抗ＣＤ３モノクローナル抗体を用いて処理することによって活性化および／または増大させることができる。
【０１０４】
本発明のＴ細胞またはＮＫ細胞は、
（ｉ）対象または上に列挙されている他の供給源由来のＴ細胞またはＮＫ細胞を含有する試料の単離；および
（ｉｉ）Ｔ細胞またはＮＫ細胞への本発明のＣＡＲをコードする核酸配列の形質導入またはトランスフェクト
によって作製することができる。
【０１０５】
次いで、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を、精製、例えば、抗原結合ポリペプチドの抗原結合ドメインの発現に基づいて選択することができる。
【０１０６】
本発明は、本発明の第１の態様にしたがうＣＡＲを含むＴ細胞またはＮＫ細胞を含むキットも提供する。
【０１０７】
医薬組成物
本発明は、本発明のＣＡＲ発現細胞、治療用抗体もしくはそのコンジュゲート、または二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーなどの治療用実体を含有する医薬組成物にも関する。医薬組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤をさらに含んでよい。医薬組成物は、任意選択で、１つまたは複数のさらなる薬学的に活性なポリペプチドおよび／または化合物を含んでよい。そのような製剤は、例えば、静脈内注入に適した形態であってよい。
【０１０８】
Ｔ細胞リンパ腫および／または白血病
本発明は、Ｔ細胞リンパ腫および／または白血病を処置するための作用因子、細胞および方法に関する。
【０１０９】
Ｔ細胞リンパ腫および／または白血病を処置するための方法は、作用因子の処置的使用に関する。本明細書では、疾患に伴う少なくとも１つの症状を和らげる、軽減または改善するため、および／または疾患の進行を遅らせる、軽減または遮断するために、Ｔ細胞リンパ腫および／または白血病の現存する疾患を有する対象に作用因子を投与することができる。
【０１１０】
本発明の方法は、ＴＲＢＣ１を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する細胞のクローン拡大に関連する任意のリンパ腫および／または白血病を処置するために使用することができる。
【０１１１】
本発明の方法は、悪性Ｔ細胞がＴＲＢＣ１を含むＴＣＲを発現するＴ細胞リンパ腫を処置するために使用することができる。「リンパ腫」とは、本明細書では、その標準の意味に従って使用され、一般には、リンパ節において発生するが、脾臓、骨髄、血液および他の器官にも影響を及ぼす可能性があるがんを指す。リンパ腫は、一般には、リンパ系細胞の固形腫瘍として存在する。リンパ腫に関連する一次性症状はリンパ節腫脹であるが、二次性（Ｂ）症状として、発熱、寝汗、体重減少、食欲の喪失、疲労、呼吸窮迫およびそう痒を挙げることができる。
【０１１２】
本発明の方法は、悪性Ｔ細胞がＴＲＢＣ１を含むＴＣＲを発現するＴ細胞白血病を処置するために使用することができる。「白血病」とは、本明細書では、その標準の意味に従って使用され、血液または骨髄のがんを指す。
【０１１３】
以下は、本発明の方法によって処置することができる疾患の例示的な、包括的ではない一覧である。
【０１１４】
末梢性Ｔ細胞リンパ腫
末梢性Ｔ細胞リンパ腫は、比較的稀なリンパ腫であり、全ての非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の１０％未満を占める。しかし、それらは侵攻性の臨床経過を伴い、大多数のＴ細胞リンパ腫の原因および正確な細胞起源は未だ十分に定義されていない。
【０１１５】
リンパ腫は、通常、まず頸部、脇の下または鼠径部の腫脹として現れる。例えば脾臓内など、他のリンパ節が位置する場所に追加的な腫脹が生じる可能性がある。一般に、腫大したリンパ節は、血管、神経、または胃の空間を侵害し、それぞれ腕および脚の膨張、刺痛およびしびれ、または満腹感が生じる可能性がある。リンパ腫の症状としては、発熱、悪寒、不明の体重減少、寝汗、嗜眠、およびそう痒などの非特異的な症状も挙げられる。
【０１１６】
ＷＨＯ分類では、末梢性Ｔ細胞リンパ腫に関して予後および治療に意味のあるカテゴリー化を詳細に説明するために、形態的特徴および免疫表現型特徴と、臨床的態様およびいくつかの症例では遺伝学を併せて利用する（Ｓｗｅｒｄｌｏｗら；ＷＨＯ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｕｒｓ  ｏｆ  ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｔｉｓｓｕｅｓ．  第４版；Ｌｙｏｎ：ＩＡＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；２００８年）。腫瘍性Ｔ細胞の解剖学的局在化は、一部において、それらの提唱された正常細胞対応物および機能と並行し、そのため、Ｔ細胞リンパ腫はリンパ節および末梢血に関連する。この手法により、細胞分布、形態のいくつかの態様、さらには関連する臨床所見を含めた、Ｔ細胞リンパ腫の顕在化のいくつかをよりよく理解することが可能になる。
【０１１７】
最も一般的なＴ細胞リンパ腫は、他に特定されない末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ−ＮＯＳ）であり、これが全体の２５％を占め、その次に血管免疫芽細胞性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）（１８．５％）が続く。
【０１１８】
他に特定されない末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ−ＮＯＳ）
ＰＴＣＬ−ＮＯＳは、全ての末梢性Ｔ細胞リンパ腫およびＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫の２５％超を占め、最も一般的な亜型である。これは、除外診断によって決定され、現行のＷＨＯ  ２００８に列挙されている特定の成熟Ｔ細胞リンパ腫実体のいずれにも対応しない。そのため、これは、他に特定されないびまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ−ＮＯＳ）と類似している。
【０１１９】
大多数の患者は成人であり、年齢の中央値は６０歳であり、男女比は２：１である。大多数の症例は結節起源であるが、患者のおよそ１３％で結節外症状が生じ、最も一般的には皮膚および胃腸管が関与する。
【０１２０】
細胞学的スペクトルは非常に広範であり、多形から単一形までにわたる。リンパ類上皮（レンネルト）バリアント、Ｔゾーンバリアントおよび濾胞バリアントを含めた、３つの形態学的に定義されたバリアントが記載されている。ＰＴＣＬのリンパ類上皮バリアントは、豊富なバックグラウンド類上皮細胞組織球を含有し、一般にＣＤ８について陽性である。それは、より良い予後と関連付けられている。ＰＴＣＬ−ＮＯＳの濾胞バリアントは、潜在的に別個の臨床病理学的実体として出現し始めている。
【０１２１】
大多数のＰＴＣＬ−ＮＯＳは成熟Ｔ細胞表現型を有し、大多数の症例はＣＤ４陽性である。症例の７５％で少なくとも１つの汎Ｔ細胞マーカー（ＣＤ３、ＣＤ２、ＣＤ５またはＣＤ７）の可変性の喪失が示され、ＣＤ７およびＣＤ５は、最もしばしば下方制御される。ＣＤ３０および稀にＣＤ１５が発現する場合があり、ＣＤ１５は有害な予後の特徴である。ＣＤ５６発現も、稀であるが、負の予後の影響を有する。追加的な有害な病理的予後因子としては、ＫＩ−６７発現に基づいて増殖率が２５％を超えること、および形質転換された細胞が７０％超存在することが挙げられる。これらのリンパ腫の免疫表現分析からもたらされるそれらの生物学への洞察はわずかである。
【０１２２】
血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）
ＡＩＴＬは、リンパ節が関与する多形浸潤、顕著な高内皮細静脈（ＨＥＶ）および濾胞樹状細胞（ＦＤＣ）網目構造の血管周囲増大を特徴とする全身性疾患である。ＡＩＴＬは、通常は胚中心において見いだされる、濾胞ヘルパー型のαβ  Ｔ細胞（ＴＦＨ）に由来するデノボのＴ細胞リンパ腫と考えられる。
【０１２３】
ＡＩＴＬは、末梢性Ｔ細胞リンパ腫およびＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫の中で２番目に一般的な実体であり、症例の約１８．５％を占める。それは、中年〜高齢の成人において生じ、年齢の中央値は６５歳であり、発生率は男性と女性でほぼ同等である。臨床的に、患者は、通常、全身リンパ節腫脹、肝脾腫および顕著な体質性症状を伴う進行期疾患を有する。そう痒を伴う皮疹が一般に存在する。多くの場合、自己免疫性現象に関連したポリクローナル高ガンマグロブリン血症が存在する。
【０１２４】
ＡＩＴＬでは３つの異なる形態的パターンが記載されている。ＡＩＴＬの初期病変（パターンＩ）では、通常、特徴的な過形成性卵胞を伴う保存されたアーキテクチャが示される。腫瘍性増殖が卵胞の末梢に局在している。パターンＩＩでは、結節のアーキテクチャが部分的に消滅し、わずかに退行した卵胞が保持される。被膜下洞は保存され、さらには拡大する。傍皮質は分枝ＨＥＶを含有し、Ｂ細胞卵胞を超えてＦＤＣが増殖する。新生物細胞は小〜中サイズであり、細胞学的な非定型性は最小である。それは、多くの場合、澄明〜ぼんやりした細胞質を有し、はっきりした細胞膜を示し得る。通常は多形炎症性バックグラウンドが明らかである。
【０１２５】
ＡＩＴＬはＴ細胞悪性腫瘍であるが、Ｂ細胞および形質細胞が特徴的に増大し、これは、新生物細胞のＴＦＨ細胞としての機能を反映すると思われる。ＥＢＶ陽性Ｂ細胞およびＥＢＶ陰性Ｂ細胞が両方存在する。場合によって、非定型Ｂ細胞はホジキン／リード・シュテルンベルク様細胞と形態学的におよび免疫表現型的に類似するときがあり、時には、その実体との診断的錯乱が生じる。ＡＩＴＬにおけるＢ細胞増殖は広範囲にわたる可能性があり、一部の患者では二次性ＥＢＶ陽性びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）またはより稀にＥＢＶ陰性Ｂ細胞腫瘍が発生し、多くの場合、形質細胞性分化を伴う。
【０１２６】
ＡＩＴＬの腫瘍性ＣＤ４陽性Ｔ細胞は、ＣＤ１０およびＣＤ２７９（ＰＤ−１）の強力な発現を示し、そして、ＣＸＣＬ１３について陽性である。ＣＸＣＬ１３により、ＨＥＶへの接着を介したリンパ節へのＢ細胞動員の増加、Ｂ細胞活性化、形質細胞性分化およびＦＤＣ網目構造の増大が導かれ、これらは全て、ＡＩＴＬの形態的特徴および臨床的特徴に寄与する。濾胞周囲の腫瘍細胞における強いＰＤ−１発現が、ＡＩＴＬパターンＩと反応性濾胞および傍皮質過形成との区別に特に役立つ。
【０１２７】
ＰＴＣＬ−ＮＯＳの濾胞バリアントは、ＴＦＨ表現型を有する別の実体である。ＡＩＴＬと対比して、それは、顕著なＨＥＶまたはＦＤＣ網目構造の濾胞外増大を有しない。新生物細胞が、Ｂ細胞濾胞性リンパ腫を模倣する濾胞内凝集体を形成する可能性があるが、濾胞間の成長パターンを有するまたは外套帯の増大を伴う可能性もある。臨床的に、ＰＴＣＬ−ＮＯＳの濾胞バリアントは、患者が部分的なリンパ節の関与を伴う初期疾患を示す頻度がより多く、そしてＡＩＴＬに関連する体質性症状がない場合があるので、ＡＩＴＬとは別個のものである。
【０１２８】
未分化大細胞型リンパ腫（ＡＬＣＬ）
ＡＬＣＬは、ＡＬＣＬ−「未分化リンパ腫キナーゼ」（ＡＬＫ）＋またはＡＬＣＬ−ＡＬＫ−に細分され得る。
【０１２９】
ＡＬＣＬ−ＡＬＫ＋は、末梢性Ｔ細胞リンパ腫の中で最もよく定義された実体の１つであり、蹄鉄形の核を有し、ＡＬＫおよびＣＤ３０を発現する特徴的な「特質細胞」を有する。それは、全ての末梢性Ｔ細胞およびＮＫ−細胞リンパ腫の約７％を占め、人生の最初の３０年で最も一般的なものである。患者は、多くの場合リンパ節腫脹を示すが、結節外の部位（皮膚、骨、軟部組織、肺、肝臓）への関与およびＢ症状が一般的である。
【０１３０】
ＡＬＣＬ、ＡＬＫ＋は広い形態スペクトルを示し、５つの異なるパターンが記載されているが、全てのバリアントが何らかの特質細胞を含有する。特質細胞は偏心性の蹄鉄形または腎臓形の核、および顕著な核周囲の好酸性ゴルジ領域を有する。腫瘍細胞は、洞関与に偏好した粘着性パターンで成長する。小細胞バリアントではより小さな腫瘍細胞が優性であり、リンパ組織球性バリアントでは、豊富な組織球により腫瘍細胞の存在が遮蔽され、その多くが小さなものである。
【０１３１】
定義によれば、全症例でＡＬＫおよびＣＤ３０陽性が示され、発現は、通常はより小さな腫瘍細胞においてより弱い。多くの場合、汎Ｔ細胞マーカーが欠如し、症例の７５％でＣＤ３の表面発現が欠如している。
【０１３２】
ＡＬＫ発現は、キメラタンパク質の発現をもたらす、第２染色体ｐ２３上のＡＬＫ遺伝子の、多くのパートナー遺伝子のうちの１つへの再構成からなる特徴的な再発性遺伝子変更の結果である。症例の７５％において生じる最も一般的なパートナー遺伝子は、第５染色体ｑ３５上のヌクレオフォスミン（ＮＰＭ１）であり、ｔ（２；５）（ｐ２３；ｑ３５）をもたらす。異なる転座バリアントにおけるＡＬＫの細胞分布は、パートナー遺伝子に応じて変動し得る。
【０１３３】
ＡＬＣＬ−ＡＬＫ−は、２００８  ＷＨＯ分類に暫定的なカテゴリーとして含まれる。それは、粘着性成長パターンおよび特質細胞の存在を伴い、形態学的にはＡＬＣＬ−ＡＬＫ＋と区別できないが、ＡＬＫタンパク質の発現を欠くＣＤ３０陽性Ｔ細胞リンパ腫と定義される。
【０１３４】
患者は、通常、４０歳から６５歳の間の成人であり、これは、小児および若年成人においてより一般的であるＡＬＣＬ−ＡＬＫ＋とは対照的である。ＡＬＣＬ−ＡＬＫ−では、リンパ節および結節外組織のどちらも関与する可能性があるが、後者はＡＬＣＬ−ＡＬＫ＋において見られるよりも一般的でない。ＡＬＣＬ−ＡＬＫ−の大多数の症例で、典型的な「特質」特徴を有する粘着性新生物細胞のシートによるリンパ節アーキテクチャの消滅が実証される。ＡＬＣＬ−ＡＬＫ＋とは対照的に、小細胞形態バリアントは認識されていない。
【０１３５】
ＡＬＣＬ−ＡＬＫ−では、そのＡＬＫ＋対応物とは異なり、表面Ｔ細胞マーカー発現のより大きな保存が示されるが、細胞傷害性マーカーおよび上皮膜抗原（ＥＭＡ）の発現は可能性がより低い。遺伝子発現シグネチャおよび再発性染色体不均衡はＡＬＣＬ−ＡＬＫ−とＡＬＣＬ−ＡＬＫ＋とで異なり、これらが分子レベルおよび遺伝子レベルで別個の実体であることが確認される。
【０１３６】
ＡＬＣＬ−ＡＬＫ−は、ＡＬＣＬ−ＡＬＫ＋およびＰＴＣＬ−ＮＯＳのどちらとも臨床的に別個のものであり、これらの３つの異なる実体で予後に顕著な差がある。ＡＬＣＬ−ＡＬＫ−の５年全生存率は４９％と報告されており、これはＡＬＣＬ−ＡＬＫ＋の５年全生存率（７０％）ほど良好ではないが、同時に、ＰＴＣＬ−ＮＯＳの５年全生存率（３２％）よりも顕著に良好である。
【０１３７】
腸症関連Ｔ細胞リンパ腫（ＥＡＴＬ）
ＥＡＴＬは、腸の上皮内Ｔ細胞に由来すると考えられる侵攻性新生物である。２００８  ＷＨＯ分類ではＥＡＴＬの形態学的、免疫組織化学的かつ遺伝学的に別個の型が２種類認識されている：Ｉ型（大多数のＥＡＴＬを表す）およびＩＩ型（症例の１０〜２０％を占める）。
【０１３８】
Ｉ型ＥＡＴＬは、通常、顕性または臨床的に無症候性のグルテン過敏性腸症を伴い、北欧人血統の患者において見られることがより多く、これは、この集団ではセリアック症の分布率が高いことに起因する。
【０１３９】
最も一般的に、ＥＡＴＬの病変は空腸または回腸において見られ（症例の９０％）、稀に十二指腸、結腸、胃、または胃腸管の外部の領域において現れる。腸の病変は通常は多巣性であり、粘膜の潰瘍形成を伴う。ＥＡＴＬの臨床経過は侵攻性であり、大多数の患者が疾患または疾患の合併症で１年以内に死亡する。
【０１４０】
ＥＡＴＬ  Ｉ型の細胞学的スペクトルは広範であり、いくつかの症例は未分化の細胞を含有する場合がある。いくつかの症例では、腫瘍性成分を不明瞭にさせ得る多形炎症性バックグラウンドが存在する。腫瘍に隣接する領域内の腸粘膜は、多くの場合、病変性前駆細胞を表し得る絨毛の平滑化および上皮内リンパ球（ＩＥＬ）の数の増加を伴うセリアック症の特徴を示す。
【０１４１】
免疫組織化学によると、新生物細胞は、多くの場合、ＣＤ３＋ＣＤ４−ＣＤ８−ＣＤ７＋ＣＤ５−ＣＤ５６−βＦ１＋であり、細胞傷害性顆粒関連タンパク質（ＴＩＡ−１、グランザイムＢ、パーフォリン）を含有する。ほとんど全ての症例でＣＤ３０が部分的に発現される。粘膜ホーミング受容体であるＣＤ１０３がＥＡＴＬで発現される可能性がある。
【０１４２】
ＩＩ型ＥＡＴＬは、単形性ＣＤ５６＋腸Ｔ細胞リンパ腫とも称され、ＣＤ８とＣＤ５６との両方を発現する小〜中型の単形性Ｔ細胞で構成される腸の腫瘍と定義される。多くの場合、粘膜内で腫瘍が側方拡散し、炎症性バックグラウンドは存在しない。大多数の症例でγδ  ＴＣＲが発現されるが、αβ  ＴＣＲを伴う症例もある。
【０１４３】
ＩＩ型ＥＡＴＬは、Ｉ型ＥＡＴＬよりも世界的に分布しており、多くの場合、セリアック症が稀であるアジア人またはラテンアメリカ系集団において見られる。ヨーロッパ血統の個体では、ＥＡＴＬ、ＩＩは腸Ｔ細胞リンパ腫の約２０％を表し、症例の少なくともサブセットにおいてセリアック症の病歴を伴う。臨床経過は侵攻性である。
【０１４４】
肝脾Ｔ細胞リンパ腫（ＨＳＴＬ）
ＨＳＴＬは、一般に自然免疫系のγδ細胞傷害性Ｔ細胞に由来する侵攻性の全身性新生物であるが、稀な症例ではαβ  Ｔ細胞に由来することもあり得る。これは最も稀なＴ細胞リンパ腫の１つであり、一般には、青年および若年成人（年齢の中央値、３５歳）に影響を及ぼし、強力に男性優性である。
【０１４５】
節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫鼻型
節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、鼻型は、侵攻性疾患であり、多くの場合、破壊的な正中病変および壊死を伴う。大多数の症例はＮＫ細胞に由来するが、いくつかの症例は細胞傷害性Ｔ細胞に由来する。これは、普遍的にエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）に関連する。
【０１４６】
皮膚Ｔ細胞リンパ腫
本発明の方法は、皮膚Ｔ細胞リンパ腫を処置するためにも使用することができる。
【０１４７】
皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）は、悪性Ｔ細胞の皮膚への遊走を特徴とし、これにより種々の病変が出現する。これらの病変は疾患が進行するにつれて形状が変化し、一般には、発疹と思われるもので始まり、最終的にプラークおよび腫瘍が形成された後、体の他の部分に転移する。
【０１４８】
皮膚Ｔ細胞リンパ腫としては、以下の例示的な、包括的ではない一覧に記載されるものが挙げられる；菌状息肉腫、パジェット様細網症、セザリー症候群、肉芽腫様弛緩皮膚、リンパ腫様丘疹症、慢性苔癬状粃糠疹、ＣＤ３０＋皮膚Ｔ細胞リンパ腫、続発性皮膚ＣＤ３０＋大細胞型リンパ腫、非菌状息肉腫ＣＤ３０−皮膚大Ｔ細胞リンパ腫、多形Ｔ細胞リンパ腫、レンネルトリンパ腫、皮下Ｔ細胞リンパ腫および血管中心性リンパ腫。
【０１４９】
ＣＴＣＬの徴候および症状は、特定の疾患に応じて変動し、そのうち２つの最も一般的な型は菌状息肉腫およびセザリー症候群である。古典的な菌状息肉腫は３つの病期：
斑（萎縮性または非萎縮性）：非特異的皮膚炎、体幹下部および臀部の斑；そう痒が最小／存在しない；
プラーク：強いそう痒性プラーク、リンパ節腫脹；および
腫瘍：潰瘍形成易発性
に分けられる。
【０１５０】
セザリー症候群は、紅皮症および白血病によって定義される。徴候および症状としては、浮腫状皮膚、リンパ節腫脹、手掌および／または足底の角質増殖、脱毛症、爪ジストロフィー、外反および肝脾腫が挙げられる。
【０１５１】
全ての原発性皮膚リンパ腫の中で、６５％がＴ細胞型である。最も一般的な免疫表現型はＣＤ４陽性である。皮膚Ｔ細胞リンパ腫という用語には多種多様な障害が包含されるので、これらの疾患には共通の病態生理は存在しない。
【０１５２】
皮膚Ｔ細胞リンパ腫（すなわち、菌状息肉腫）の発生についての一次的な病因機構は解明されていない。菌状息肉腫には、Ｔ細胞媒介性慢性炎症性皮膚疾患が先行する可能性があり、これは、場合によって、致死性リンパ腫に進行する場合がある。
【０１５３】
原発性皮膚ＡＬＣＬ（Ｃ−ＡＬＣＬ）
Ｃ−ＡＬＣＬは、多くの場合、形態ではＡＬＣ−ＡＬＫ−と区別できない。これは、細胞の７５％超がＣＤ３０を発現する未分化形態、多形性形態または免疫芽球性形態の大細胞の皮膚腫瘍と定義される。リンパ腫様丘疹症（ＬｙＰ）と共に、Ｃ−ＡＬＣＬは一次皮膚ＣＤ３０陽性Ｔ細胞リンパ球増殖性障害のスペクトルに属し、これは群として、菌状息肉腫の次に２番目に多い皮膚Ｔ細胞リンパ球増殖の群を含む。
【０１５４】
免疫組織化学的染色プロファイルは、ＡＬＣＬ−ＡＬＫ−とかなり類似しており、細胞傷害性マーカーについて染色陽性である症例の割合がより大きい。腫瘍細胞の少なくとも７５％がＣＤ３０について陽性のはずである。ＣＤ１５も発現し、そして、リンパ節の関与が生じた場合、古典的なホジキンリンパ腫との弁別が難しい可能性がある。ＡＬＣＬ−ＡＬＫ＋の稀な症例は、局在する皮膚病変を示す可能性があり、そしてＣ−ＡＬＣＬと類似する可能性がある。
【０１５５】
Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病
Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）は、小児コホートのＡＬＬの約１５％を占め、成人コホートのＡＬＬの約２５％を占める。患者は、通常、高白血球数を有し、そして臓器肥大、特に縦隔肥大およびＣＮＳの関与を示す可能性がある。
【０１５６】
本発明の方法は、ＴＲＢＣ１を含むＴＣＲを発現する悪性Ｔ細胞に関連するＴ−ＡＬＬを処置するために使用することができる。
【０１５７】
Ｔ細胞前リンパ球性白血病
Ｔ細胞前リンパ球性白血病（Ｔ−ＰＬＬ）は、侵攻性の挙動ならびに血液、骨髄、リンパ節、肝臓、脾臓、および皮膚の関与への偏好を伴う成熟Ｔ細胞白血病である。Ｔ−ＰＬＬは、主に３０歳を超える成人に影響を及ぼす。他の名称として、Ｔ細胞慢性リンパ球性白血病、「こぶ状」型Ｔ細胞白血病、およびＴ前リンパ球性白血病／Ｔ細胞リンパ球性白血病が挙げられる。
【０１５８】
末梢血では、Ｔ−ＰＬＬは、場合によってブレブまたは突起を伴う単一の核小体および好塩基性細胞質を有する中型リンパ球からなる。核は、通常、丸形から卵形の形状であり、患者は場合によって、セザリー症候群において見られる大脳様核形状と同様の、核の輪郭がより不規則な細胞を有する。小細胞バリアントは全てのＴ−ＰＬＬ症例の２０％を占め、セザリー細胞様（大脳様）バリアントは症例の５％に見られる。
【０１５９】
Ｔ−ＰＬＬは成熟（胸腺後）Ｔリンパ球の免疫表現型を有し、新生物細胞は、一般には汎Ｔ抗原ＣＤ２、ＣＤ３、およびＣＤ７について陽性であり、ＴｄＴおよびＣＤ１ａについては陰性である。免疫表現型ＣＤ４＋／ＣＤ８−は症例の６０％に存在し、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋免疫表現型は２５％に存在し、ＣＤ４−／ＣＤ８＋免疫表現型は症例の１５％に存在する。
【０１６０】
医薬組成物
本発明の方法は、当該作用因子を医薬組成物の形態で投与するステップを含み得る。
【０１６１】
作用因子は、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤またはアジュバントと共に投与することができる。医薬担体、賦形剤または希釈剤の選択は、意図された投与経路および標準の薬務に関して選択される。医薬組成物は、担体、賦形剤または希釈剤として（またはそれに加えて）、任意の適切な結合物質、滑沢剤、懸濁剤、コーティング剤、可溶化剤、および他の担体剤を含んでよい。
【０１６２】
投与
当該作用因子の投与は、活性成分が生物により利用可能になるような種々の経路のいずれかを使用して実現することができる。例えば、当該作用因子は、経口経路および非経口経路によって、腹腔内に、静脈内に、皮下に、経皮的に、筋肉内に、局所送達によって、例えばカテーテルまたはステントによって投与することができる。
【０１６３】
一般には、個々の対象に最も適した実際の投与量は医師により決定され、投与量は、特定の患者の年齢、体重および応答によって変動する。投与量は、ＴＲＢＣ１を発現するクローン性Ｔ細胞の数を減少または枯渇させるために十分であるようなものである。
【０１６４】
ここで本発明を実施例によってさらに記載し、これは、当業者が本発明を実行するのを補助するのに役立つように意味付けられ、いかなる形でも本発明の範囲の限定を意図するものではない。
【実施例】
【０１６５】
（実施例１）
重鎖および軽鎖グラフト選択
ヒトＶＨフレームワーク： Ｈ−ＡＦ０６２２５６、Ｈ−ＥＦ１７７９９９、Ｈ−ＫＦ６８８１６５の後にＪＯＶＩ−１  ＶＨ  ＣＤＲを有するヒト化ＶＨドメインを構築した。３ａａｚヒトフレームワークを有するヒト化ＶＬドメインを構築した。
【０１６６】
ヒト化ＶＨドメインおよびマウスＪＯＶＩ−１  ＶＬドメイン；マウスＶＨドメインおよびヒト化ＶＬドメイン；またはヒト化ＶＨドメインおよびヒト化ＶＬドメインのいずれかを用いて抗体を作製した（図４参照）。
【０１６７】
ＴＲＢＣ１への結合をＥＬＩＳＡによって試験した。図５に結果が示されている。
【０１６８】
キメラ結合物質とヒト化結合物質の組合せの全てがＴＲＢＣ１に結合できることが見いだされ、結合は、マウスＶＨドメインおよびＶＬドメインを有するキメラ抗体と同様であった。
【０１６９】
（実施例２）
復帰変異構築物の作製および試験
表１に示されている通りヒトフレームワークＨ−ＡＦ０６２２５６について復帰変異した一連の結合物質を作製した。表１では、復帰変異が太字で示されている。
【０１７０】
【表１−１】
2020527027.tif 000012
【表１−２】
2020527027.tif 000013
【０１７１】
結合物質は、３ａａｚフレームワークを含むヒト化ＶＬドメインを有した。
【０１７２】
ＴＲＢＣ１およびＴＲＢＣ２への結合をＥＬＩＳＡによって試験した。図６に結果が示されている。全ての構築物が、ＴＲＢＣ１には結合したがＴＲＢＣ２には結合せず、マウスＶＨドメインおよびＶＬドメインを有するキメラ抗体（Ｊｏｖｉ−Ｍｕ）と同様のＥＣ５０を示した。これにより、ＣＤＲ移植後、ヒト化抗体においてマウス抗体の特異性および親和性が保持されることが示される。
【０１７３】
（実施例３）
ヒト化ｍＡｂおよびｓｃＦｖの安定性の調査
実施例２に記載の結合物質の安定性を、示差走査型蛍光定量法によって試験した。タンパク質をＰＢＳ中に１５０ｕｇ／ｍｌで保管した後、ｓｙｐｒｏ  ｏｒａｎｇｅ色素をタンパク質：色素比率５０００：１で添加した。溶液を混合し、ｑＰＣＲ機械に入れ、ＦＲＥＴモードで実行した。溶液を１５℃で１０分間保持し、その後、温度勾配を、９５℃まで、０．５℃ずつ増加させ、各ステップで３０秒間保持した。各ステップ後に蛍光読み取りを得た。Ｔｍ値（平衡定数；アンフォールディングしたタンパク質＝フォールディングしたタンパク質）を得るために、蛍光の変化の第１の導関数（ΔＲＦＵ／Δ℃）を温度変化（Δ℃）に対してプロットした。
【０１７４】
図７に結果が示されている。ヒトフレームワークの使用により、ｍＡｂ形式における結合物質の安定性が増加することが見いだされた。
【０１７５】
同様の実験を行って、等価の結合物質のｓｃＦｖ形式における安定性を調査した。この試験のために、示差走査熱量測定を使用した。ＣＡＰ  ＤＳＣ系を使用して実験を実施した。保管緩衝液（１×ＰＢＳ）中のタンパク質を熱量計試料セルに入れ、参照セルには保管緩衝液のみを満たした。セルを熱量計内部で、２５℃、１時間にわたって安定化した後、最終温度１００℃まで１時間当たり２００℃の速度で加熱した。最大の転移ピークに対応する変性温度、Ｔｍを、少なくとも２回繰り返し実行して決定し、それは、０．２５℃以下の変動であった。
【０１７６】
１つの結合物質ｓｃＦｖ比較の結果が図８に示されている。マウスＪｏｖｉ−１  ｓｃＦｖの融解温度は６１℃であり、ヒト化ｓｃＦｖ（Ｈ−ＡＦ１、３ａａｚ）の融解温度は６５℃であった。
【０１７７】
（実施例４）
ヒト化抗ＴＲＢＣ１抗原結合ドメインを有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の生成
【０１７８】
図９に概略的に例示されている通り４１ＢＢおよびＣＤ３ゼータエンドドメインならびにヒト化ＪＯＶＩ−１  ｓｃＦｖ（Ｈ−ＡＦ１、３ａａｚ）を含む抗原結合ドメインを有する第２世代ＣＡＲを設計した。正常なドナー由来の初代ヒトＴ細胞を抗ＴＲＢＣ１  ＣＡＲを発現するレトロウイルスベクターまたは陰性対照として無関連のＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲを発現するレトロウイルスベクターを用いて形質導入した。細胞のＴＲＢＣ１発現標的細胞またはＴＲＢＣ２発現標的細胞を死滅させる能力を、フローサイトメトリーを使用して調査した。
【０１７９】
図１０に結果が示されている。ヒト化ＴＲＢＣ１  ＣＡＲを発現するＴ細胞はＴＲＢＣ１発現標的細胞を死滅させたが、ＴＲＢＣ２発現標的細胞は死滅させなかった。
【０１８０】
ＴＲＢＣ１発現標的細胞またはＴＲＢＣ２発現標的細胞と７２時間共培養した後にＴ細胞増殖を測定した。図１１に結果が示されている。マウスＪｏｖｉ−１  ＣＡＲまたはヒト化ＣＡＲのいずれかを発現するＴ細胞はＴＲＢＣ１発現標的細胞と共培養した場合には増殖の増加を示したが、ＴＲＢＣ２発現標的細胞と共培養した場合には増殖の増加を示さなかった。
【０１８１】
ＴＲＢＣ１発現標的またはＴＲＢＣ２発現標的と２４時間共培養した後にサイトカイン放出を測定した。図１２に結果が示されている。マウスＪｏｖｉ−１  ＣＡＲまたはヒト化ＣＡＲいずれかを発現するＴ細胞はＴＲＢＣ１発現標的細胞と共培養した場合にはＩＦＮγおよびＩＬ−２の放出の増加を示したが、ＴＲＢＣ２発現標的細胞と共培養した場合にはＩＦＮγおよびＩＬ−２の放出の増大を示さなかった。
【０１８２】
（実施例５）
ＮＳＧマウスモデルにおいてヒト化αＴＲＢＣ１  ＣＡＲにより腫瘍が取り除かれる
７〜８週齢の雌ＮＳＧマウスに、ＣＤ１９−Ｆｌｕｃを発現するように形質導入されたジャーカット細胞を埋め込んだ（動物当たり細胞３×１０６個、ＰＢＳ  ０．１ｍｌ中）。７日目に、マウス（ｎ＝８／群）にａＴＲＢＣ１  ＣＡＲ  Ｔ細胞または偽形質導入細胞（ＮＴ）１．０×１０６個を静脈内注入した。腫瘍成長を試験６日目、９日目、１２日目および１５日目に生物発光イメージング（ＢＬＩ）によって確認した。簡単に述べると、イメージングの１５分前にマウスに１５０ｍｇ／ｋｇのＤ−ルシフェリンを注射（ｓ．ｃ．）した。Ｄ−ルシフェリン投与の１０分後に、マウスに麻酔をかけ、イメージングチャンバーに入れ、発光についてイメージングした（腹側写真および背側写真；最大５匹のマウスをケージ順に互いに並べて横たえた）。Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ４．３．１ソフトウェアを使用して画像取得の持続時間およびビニング（感度）を取り込み、処理した。
【０１８３】
図１３に結果が示されている。１２日目までに、全ての動物においてヒト化抗ＴＲＢＣ１  ＣＡＲ−Ｔ細胞により腫瘍が取り除かれた。
【０１８４】
（実施例６）
マウス抗ＴＲＢＣ１  ＣＡＲ  Ｔ細胞およびヒト化抗ＴＲＢＣ１  ＣＡＲ  Ｔ細胞の疲弊に対する効果の比較
活性化ＰＢＭＣを、Ｈ−ＡＦ０６２２５６  ＶＨフレームワーク領域および３ａａｚ  ＶＬフレームワーク領域を有するＪＯＶＩ−１由来のＣＤＲを含むマウスＪｏｖｉ−１  ＣＡＲまたはヒト化Ｊｏｖｉ−１  ＣＡＲを発現するベクターを用いて形質導入した。２日後に細胞を収集し、５０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を伴う培養培地中でさらに２日間維持した。ＥａｓｙＳｅｐ  ＣＤ５６陽性選択キットを使用し、形質導入されたＴ細胞からＣＤ５６発現細胞を枯渇させた。ＴＲＢＣ１−ＴＣＲ発現ラジ標的とＣＡＲ  Ｔ細胞の共培養を以下の通り行った：標的細胞を９６ウェルＵ底プレートに１ウェル当たり細胞５０，０００個、エフェクター：標的比１：１でプレーティングした。９６時間後に、共培養物を回収し、細胞を抗ＰＤ１抗体、抗ＬＡＧ３抗体および抗Ｔｉｍ３抗体で染色し、次いで、フローサイトメトリーによって分析した。
【０１８５】
図１４に結果が示されている。ヒト化抗ＴＲＢＣ１  ＣＡＲを発現するＴ細胞は３種全ての疲弊マーカーを、マウスＣＡＲを発現するＴ細胞よりも低いレベルで発現した。これは、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方に当てはまった。したがって、ヒト化ＣＡＲを発現するＴ細胞は、驚いたことに、標的細胞への曝露の間、マウスＪｏｖｉ−１抗体に由来するｓｃＦｖを有するＣＡＲを発現するＴ細胞よりも疲弊が少なくなる。
【０１８６】
Ｔ細胞疲弊は、多くの慢性感染症およびがんの間に生じるＴ細胞機能障害の状態である。Ｔ細胞疲弊は、エフェクター機能が乏しいことによって定義される。ＣＡＲ−Ｔ細胞が標的細胞の殺滅に関して効率的になるためには、Ｔ細胞疲弊を回避するまたはＴ細胞疲弊の速度を低下させることが有利である。
【０１８７】
上記の明細書に記載されている全ての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の範囲および主旨から逸脱することなく、当該記載の方法および本発明のシステムの種々の改変および変形が当業者には明らかである。本発明は、特定の好ましい実施形態に関連して記載されているが、特許請求された本発明はそのような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実際に、分子生物学または関連する分野の当業者には明らかである本発明を実行するための記載の方式の種々の改変は以下の特許請求の範囲の範囲内にあるものとする。
【図１】
2020527027.tif 000014
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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