(57)【要約】  ジビニルベンゼンを含む少なくとも１つの疎水性モノマーとアクリロニトリルを含む少なくとも１つの親水性モノマーを共重合することにより形成される共重合体を含む、固相抽出（ＳＰＥ）に有用な高分子吸着剤。また、ジビニルベンゼン−アクリロニトリル親水性−親油性バランス吸着剤を含むＳＰＥカートリッジも提供される。さらに提供されるのは、従来の簡略化されたＳＰＥ技術においてジビニルベンゼン−アクリロニトリル親水性−親油性バランス吸着剤を使用する方法である。
2020531263.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの疎水性モノマーと少なくとも１つの親水性モノマーとを共重合することによって形成された共重合体を含み、
前記疎水性モノマーはジビニルベンゼンを含み、前記親水性モノマーはアクリロニトリルを含む、固相抽出（ＳＰＥ）用の高分子吸着剤。
【請求項２】
共重合がポロゲンの存在下で行われる、請求項１に記載の高分子吸着剤。
【請求項３】
前記ポロゲンは、非極性ポロゲン、極性ポロゲン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２に記載の高分子吸着剤。
【請求項４】
非極性ポロゲンは、トルエン、キシレン、ベンゼン、ヘキサン、シクロヘキサン、ペンタン、ヘプタン、オクタン、ノナン、デカン、ドデカン、イソオクタン、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３に記載の高分子吸着剤。
【請求項５】
前記極性ポロゲンが、ベンジルアルコール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、４−メチル−２−ペンタノール、イソアミルアルコール、ドデカノール、酢酸エチル、２−エチルヘキサノール、シクロヘキサノール、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３に記載の高分子吸着剤。
【請求項６】
共重合が非極性ポロゲンおよび極性ポロゲンの存在下で行われる、請求項３に記載の高分子吸着剤。
【請求項７】
前記非極性ポロゲンはｏ−キシレンを含み、前記極性ポロゲンは４−メチル−２−ペンタノールを含む、請求項６に記載の高分子吸着剤。
【請求項８】
疎水性モノマーの親水性モノマーに対する比率が１０：９０（重量％）から９０：１０（重量％）の範囲である、請求項１に記載の高分子吸着剤。
【請求項９】
疎水性モノマーの親水性モノマーに対する比率が３０：７０（重量％）から７０：３０（重量％）の範囲である、請求項８に記載の高分子吸着剤。
【請求項１０】
疎水性モノマーの親水性モノマーに対する比率が約６３：３７（重量％）である、請求項９に記載の高分子吸着剤。
【請求項１１】
前記共重合体は、ポリ（ジビニルベンゼン−ｃｏ−アクリロニトリル）である、請求項１に記載の高分子吸着剤。
【請求項１２】
ジビニルベンゼンのアクリロニトリルに対する比率が約９０：１０（重量％）から約１０：９０（重量％）の範囲である、請求項１１に記載の高分子吸着剤。
【請求項１３】
ジビニルベンゼンのアクリロニトリルに対する比率が約２５：７５（重量％）から約７５：２５（重量％）の範囲である、請求項１２に記載の高分子吸着剤。
【請求項１４】
ジビニルベンゼンのアクリロニトリルに対する比率が約６３：３７（重量％）である、請求項１３に記載の高分子吸着剤。
【請求項１５】
請求項１または請求項１１に記載の高分子吸着剤を含む、多孔質球状粒子。
【請求項１６】
前記多孔質球状粒子は、約２０μｍから約１２５μｍまでの範囲の直径を有する、請求項１５に記載の多孔質球状粒子。
【請求項１７】
前記多孔質球状粒子は、約３０μｍから約８５μｍまでの範囲の直径を有する、請求項１６に記載の多孔質球状粒子。
【請求項１８】
前記多孔質球状粒子は、約０．２μｍから約５μｍまでの範囲の直径を有する、請求項１５に記載の多孔質球状粒子。
【請求項１９】
前記多孔質球状粒子は、約０．８μｍから約２μｍまでの範囲の直径を有する、請求項１８に記載の多孔質球状粒子。
【請求項２０】
前記多孔質球状粒子は、約１００ｍ２／ｇから１０００ｍ２／ｇまでの範囲の表面積を有する、請求項１５に記載の多孔質球状粒子。
【請求項２１】
前記多孔質球状粒子は、約３５０ｍ２／ｇから約６７５ｍ２／ｇまでの範囲の表面積を有する、請求項２０に記載の多孔質球状粒子。
【請求項２２】
前記多孔質球状粒子は、約５０Åから約１０５Åまでの範囲の平均細孔径を有する、請求項１５に記載の多孔質球状粒子。
【請求項２３】
前記高分子吸着剤が基材上に被覆される、請求項１または請求項１１に記載の高分子吸着剤。
【請求項２４】
前記基材は、炭素、シリカおよび金属からなる群から選択される、請求項２３に記載の高分子吸着剤。
【請求項２５】
前記基材は、粒子状である、請求項２４に記載の高分子吸着剤。
【請求項２６】
前記基材は、繊維である、請求項２４に記載の高分子吸着剤。
【請求項２７】
請求項１に記載の高分子吸着剤を含む、繊維。
【請求項２８】
前記高分子吸着剤が前記繊維上に直接被覆される、請求項２７に記載の繊維。
【請求項２９】
前記高分子吸着剤は、多孔質である、請求項２７に記載の繊維。
【請求項３０】
前記高分子吸着剤は、非多孔質である、請求項２７に記載の繊維。
【請求項３１】
前記高分子吸着剤は、球状粒子である、請求項２７に記載の繊維。
【請求項３２】
接着剤をさらに含み、
前記接着剤は、エポキシ樹脂、ポリジメチルシロキサン、ポリシラザン、アクリル樹脂、フェノールホルムアルデヒド樹脂、ポリ酢酸ビニル、イエロー・カーペンターズ・グルー、ポリビニルピロリドン、ポリエステル樹脂、レゾルシノール樹脂、尿素樹脂接着剤、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３１に記載の繊維。
【請求項３３】
バインダーをさらに含み、
前記バインダーは、ポリアクリロニトリル、ポリテトラフルオロエチレン、ゼラチン、セルロース、セルロース誘導体、ポリビニルピロリドン、デンプン、スクロース、ポリエチレングリコール、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３１に記載の繊維。
【請求項３４】
請求項１に記載の高分子吸着剤を含むカートリッジ。
【請求項３５】
前記高分子吸着剤が多孔質球状粒子である、請求項３４に記載のカートリッジ。
【請求項３６】
前記多孔質球状粒子が、請求項１に記載の高分子吸着剤で被覆されたシリカ粒子である、請求項３５に記載のカートリッジ。
【請求項３７】
溶液から１つ以上の溶質を除去する方法であって、
溶液を請求項１または請求項１１に記載の高分子吸着剤と接触させる工程を含み、
溶質が高分子に吸着される、方法。
【請求項３８】
前記溶液は、極性溶媒を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記極性溶媒は、水性溶媒である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記水性溶媒は、１から１４までの範囲のｐＨを有する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記水性溶媒は、７未満のｐＨを有する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記極性溶媒は、有機溶媒である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
前記溶液は、１０より多くの溶質を有する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４４】
前記溶質は、少なくとも１つのタンパク質を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４５】
前記溶質は、少なくとも１つの医薬関連の分析種を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４６】
前記溶質は、少なくとも１つのリン脂質を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４７】
前記溶質は、少なくとも１つのタンパク質および少なくとも１つのリン脂質を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４８】
前記溶質の少なくとも約７５％が、少なくとも５０％の回収率で前記溶液から除去される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４９】
前記溶質の少なくとも約９０％が、少なくとも約７０％の回収率で前記溶液から除去される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
サンプルから複数の溶質を選択的に除去する方法であって、
請求項１に記載の高分子吸着剤を提供する工程と、
前記サンプルを前記高分子吸着剤と接触させる工程であって、前記溶質が高分子溶媒によって吸着される工程と、その後、
前記高分子吸着剤を洗浄する工程と、を含み、
いくつかの溶質は、前記洗浄工程後に前記高分子吸着剤に吸着されたままであり、いくつかの溶質は、前記洗浄工程中に高分子吸着剤から除去され、
前記溶質は、タンパク質、リン脂質、無機塩、それらの組み合わせ、および任意の他の不要成分からなる群から選択される、サンプルから複数の溶質を選択的に除去する方法。
【請求項５１】
前記溶質の少なくとも９０％が、前記接触工程において高分子吸着剤に吸着される、請求項５０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年８月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／５４９，７７１号の優先権の利益を主張し、その全体は参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
分析化学における遍在する欲求は、環境および農薬サンプルから生物学的サンプル、医学サンプル、食品および飲料まで、多種多様なマトリックス（matrices）に役立つサンプル調製への「ユニバーサル」なアプローチの開発である。これらのサンプルには、通常、対象となる分析種（analytes）と、不要または干渉する分析種の両方が含まれる。固相抽出（ＳＰＥ）は、長い間サンプル調製技術として使用されており、不要な分析種を除去することでマトリックスを単純化できるだけでなく、目的の分析種を微量濃縮できる。
【０００３】
ＳＰＥ用途では、一般的な吸着剤（adsorbents）は、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）およびＨＰＬＣパッキング（HPLC packing）として通常使用されるシリカ、カーボンまたはその他の吸着剤で構成される。それぞれがいくつかのクラスの分析種ではうまく機能するが、他のクラスでは機能しない可能性があるため、これらの吸着剤は、サンプルから除去され得る不要な分析種の中で最初に限定される。さらに、これらの材料は、使用前に活性化または前処理されて、最適なパフォーマンスを可能にし、分析に必要な追加のステップと時間を加えなければならない。さらに、使用中に材料が乾燥すると、パフォーマンスが低下し得る。これは、過乾燥効果（overdrying effect）として知られている問題である。
【０００４】
任意のサンプル中の分析種の数と種類は大きな課題（challenge）であるが、固相抽出（ＳＰＥ）用の親水性−親油性バランス（ＨＬＢ, Hydrophilic-Lipophilic Balance）高分子の発見により、一般的なＳＰＥ吸着剤のアイデアの実現可能性が高まっている。ＨＬＢ技術は、汎用性と幅広い分析種に対応するため、最も広く使用されているＳＰＥ材料である。ＨＬＢ樹脂は、親水性モノマーと親油性モノマーで構成される共重合体である。まだ逆相吸着剤（reversed-phase sorbent）と考えられているが、親水性モノマーの存在により、極性分析種の保持が向上し、１回の抽出で幅広い分析種（例えば、酸、中性、塩基、極性、非極性）に効果的である。
【０００５】
現在、市場にはいくつかのＨＬＢ  ＳＰＥ製品がある。最も一般的なＨＬＢ吸着剤（HLB sorbent）は、親水性成分としてＮ−ビニルピロリドン（ＶＰ）を含み、親油性モノマーとしてジビニルベンゼン（ＤＶＢ）を含む共重合体である。
【０００６】
しかしながら、ＨＬＢ  ＳＰＥ用途で広く使用されているが、ビニルピロリドン−ジビニルベンゼン共重合体の性質により、その有用性が制限される。これらのビニルピロリドンとジビニルベンゼンの共重合体は再現性がなく、クロマトグラフィー分離プロセスで保持（retention）とピーク形状の変動が生じる。ビニルピロリドンの水溶性により、懸濁重合プロセス中にコモノマー液滴／水界面でビニルピロリドンの重合が生じる。懸濁重合プロセスで表面界面活性剤としても広く使用されているビニルピロリドンを使用すると、共重合体シーケンスの再現性が失われる。そのため、球形の多孔質高分子のより深い細孔内のジビニルベンゼン（疎水性）表面が増加すると、多孔質共重合体内の選択性に偏りが生じる。この偏った選択性により、幅広いサイズと化学物質にわたって分析種を効果的に吸着できるＨＬＢ吸着剤の開発が制限されている。サイズと特性の両方が大きく異なる分析種を効果的かつ同時に除去できる、改善されたＨＬＢ吸着剤が必要とされている。
【０００７】
さらに、従来のＳＰＥ製品は、通常、コンディショニング、平衡化（equilibration）、ローディング（loading）、洗浄（washing）および溶出（elution）の５つのステップを有する従来のＳＰＥワークフロー（SPE workflow）に従う。ＨＬＢ吸着剤が種々の分析種を正常に抽出できることにより、必要な抽出の総数を減らすことができるが、このプロセスには依然としてかなりの時間がかかる場合がある。いくつかのＨＬＢ吸着剤は、簡略化されたプロセスで機能するように適合されているが、コンディショニングおよび平衡工程を必要とせずに分析種を抽出できる改善されたＨＬＢ吸着剤が依然として必要である。
【０００８】
したがって、ＳＰＥおよび他の分離技術に有用な新しい高分子吸着剤を開発することは有用であろう。理想的には、新しい高分子は、さまざまな溶媒中および広いｐＨ範囲で、酸、塩基、中性の分析種、強い極性、中程度の極性および非極性の分析種を含むさまざまな特性の分析種、および小分子や大分子を含むさまざまなサイズの分析種の効率的な同時抽出に役立つだろう。そのような新しい高分子吸着剤は、理想的には、多くの従来の吸着剤で見られる過乾燥効果に耐性があるべきであり、したがって、単純化されたワークフローでの使用を可能にする。
【発明の概要】
【０００９】
複数の分析種を同時に吸着することができるジビニルベンゼン−アクリロニトリル共重合体を含む、固相抽出（ＳＰＥ）用の改善された親水性−親油性バランス高分子吸着剤を提供する。そのような分析種は、酸、塩基、中性、強い極性、中程度の極性および非極性の分析種を含んでもよく、小分子、大分子または両方の組み合わせを含んでもよい。
【００１０】
いくつかの実施形態では、高分子吸着剤は球状粒子であってよい。いくつかの実施形態では、高分子吸着剤は、粒子または繊維などの基材上に被覆または基材に接着されてもよい。他の実施形態では、高分子吸着剤は、基材の中に形成されてもよい。
【００１１】
また、提供された高分子吸着剤と溶液を接触させることにより、溶液から１つ以上の溶質を除去する方法を提供する。提供する方法は、非極性溶媒と極性溶媒の両方に有用であり、広範囲のｐＨ値にわたって有用である。提供する方法は、様々な特性を有する複数の異なる溶質を除去することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、本明細書に記載されるＨＬＢ吸着剤（ＨＬＢ−６７）および２つの従来のＨＬＢ製品の細孔構造を示す細孔プロットオーバーレイ（overlay）である。
【図２】図２は、本明細書に記載されているＨＬＢ共重合体のバッチ間（batch to batch）合成再現性を示すグラフである。
【図３Ａ】図３Ａは、アセトニトリルで洗浄する前および後の、シリカ粒子上の実験用ＨＬＢ吸着剤ＨＬＢ−６５の密度汎関数理論（ＤＦＴ）プロットを示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、本明細書に記載されているシリカコーティングプロセスを使用した均一な細孔減少を示す密度汎関数理論（ＤＦＴ）細孔プロットを示す。
【図４】図４は、様々な共重合体比を有する３つの実験のＨＬＢ吸着剤、ＨＬＢ−４４、ＨＬＢ−４８およびＨＬＢ−４９のＤＦＴオーバーレイプロットを示す。
【図５】図５は、ＳＰＭＥ繊維に接着されたＨＬＢ高分子の走査型電子顕微鏡写真である。
【図６】図６は、６つの実験のＨＬＢ吸着剤および２つの従来のＨＬＢ吸着剤を使用した、６つの分析種混合物の成分の回収率を比較する。コンディショニングに続く乾燥工程を組み込んだ従来の５ステッププロトコルを使用した。
【図７】図７は、４つの実験用ＨＬＢ吸着剤および２つの従来のＨＬＢ吸着剤を使用して、６つの分析種の混合物の成分の回収率を比較する。３ステップのプロトコルが使用された。コンディショニングや平衡化は行われなかった。
【図８】図８は、実験用樹脂ＨＬＢ−０１、ＨＬＢ−２２およびＨＬＢ−２６を使用して、酸性条件下でスパイクされた血清（spiked serum）から抽出された２０個の分析種の絶対回収率（absolute recoveries）を示す。
【図９Ａ】図９Ａは、実験用樹脂ＨＬＢ−０１、ＨＬＢ−２２、ＨＬＢ−２６、および従来のＨＬＢ  Ａを使用した、未抽出の子牛血清の血清除去データを示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ｙ軸を拡大した同じものを示す。
【図１０】図１０は、実験用ＨＬＢ−６７および従来のＨＬＢ  Ｂを伴う標準的な５ステップのプロトコルを使用して抽出されたスパイクされたマトリックスサンプルからの絶対分析種回収率の比較を示す。
【図１１】図１１は、実験用ＨＬＢ−６７および従来のＨＬＢ  Ｂを伴う簡略化された３ステップのプロトコルを使用して抽出されたスパイクされたマトリックスサンプルからの絶対分析種回収率の比較を示す。
【図１２】図１２は、実験用ＨＬＢ−６７および従来のＨＬＢ  Ａを伴う３ステップのプロトコルを使用して抽出されたスパイクされたマトリックスサンプルからの絶対回収率の比較である。
【図１３】図１３は、緩衝液から抽出するために実験用ＨＬＢ−０１を使用した６つの分析種の絶対回収率を示す。
【図１４】図１４は、本明細書に記載のアクリロニトリル含有ＨＬＢ共重合体、ＨＬＢ−０１と、従来のＨＬＢ Ａ−ビニルピロリドン含有ＨＬＢ材料との絶対回収率の比較を示す。
【図１５】図１５は、実験用吸着剤ＨＬＢ−６５で被覆されたシリカを使用した様々な分析種の絶対回収率を示す。
【図１６】図１６は、３ステップのＳＰＥプロトコルを使用した、ＨＬＢ共重合体ＨＬＢ−７９被覆シリカ基材対従来のＨＬＢ吸着剤の比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書に記載されているＨＬＢ共重合体は、吸着剤とも呼ばれ、種々の溶媒中で、小分子および大分子を含む、種々のサイズの、酸、塩基、中性分析種、強い極性、中程度の極性、非極性の分析種を含む、種々の特性の幅広い様々な分析種の分離と除去を改善する。さらに、これらは、ＳＰＥワークフロー（workflow）内のコンディショニングおよび平衡工程を必要としない使用に適している。固相抽出（ＳＰＥ）技術に役立つだけでなく、これらは固相マイクロ抽出（ＳＰＭＥ）にも適しており、ＨＰＬＣまたはＵＨＬＰＣカラム（UHLPC columns）にも適用できる。
【００１４】
固相抽出（ＳＰＥ）用のＨＬＢ吸着剤は、少なくとも１つの疎水性モノマーと少なくとも１つの親水性モノマーとを共重合させることによって形成される。好ましい実施形態では、疎水性モノマーは、ジビニルベンゼンを含み、親水性モノマーは、アクリロニトリルを含む。ジビニルベンゼンに加えて使用できる他の疎水性モノマーは、スチレン、トリビニルベンゼン、ジビニルトルエン、ジビニルナフタレン、ジビニルピリジン、ビニルピリジン、エチルビニルベンゼンおよびジビニルキシレンなどのモノビニルおよびポリビニルモノマーを含む。１，５−ヘキサジエン、２，５−ジメチル−ヘキサジエン、１，７−オクタジエン、トリビニルシクロヘキサン、ポリ塩化ビニリデン、ポリ塩化ビニルおよびそれらの組み合わせなどの非芳香族モノマーが含まれる。アクリロニトリルに加えて使用できる他の親水性モノマーは、メチルメタクリレート、エチルメタクリレート、エチレングリコールジアクリレート、ジエチレングリコールジビニルエーテル、２−シアノエチルメタクリレート、ジメタクリル酸エステル、ビニルキノリンおよびこれらの組み合わせを含む。特に好ましい実施形態では、共重合体吸着剤は、ジビニルベンゼンおよびアクリロニトリルのみを含む。
【００１５】
ＨＬＢ共重合体では伝統的に使用されていないが、アクリロニトリルは、ＨＬＢ吸着剤で使用される伝統的な親水性モノマーであるＮ−ビニルピロリドンよりも多くの利点があることがわかっているため、本明細書に記載されているＨＬＢ共重合体の親水性モノマーとして特に好ましい。ｌｏｇＰが０．２５の場合、Ｎ−ビニルピロリドン（ｌｏｇＰが０．３７）よりも親水性が高くなる。また、図８に示すように、アクリロニトリルは、より広い範囲のモノマー比にわたってポリマー内により効果的に組み込まれるため、以下で説明するように、非常に親水性の高い分析種（ｌｏｇＰ＜０）と非常に親油性の高い分析種（ｌｏｇＰ＞６）を同時に抽出できる。
【００１６】
アクリロニトリルは吸湿性の材料でもあり、そのため、１９６０年代に米国Ｆ．Ｄ．Ａによって、スーパースラッパーポリマー（super sluper polymer）−重量の４００倍を保持できる高分子の開発に使用されていた。本発明者らは、吸湿性モノマーを利用することにより、ＳＰＥおよびＳＰＭＥのためのこの材料の性能が改善できることを見出した。これにより、一般にコンディショニングおよび平衡化と呼ばれる前処理工程を必要とせずに、材料を良好に機能させることができる。そのため、ＳＰＥの手順は、合計５つのステップ（コンディショニング、平衡化、サンプルローディング、洗浄および溶出）から３つのステップ（サンプルローディング、洗浄および溶出）または１つのステップ（サンプルローディング／溶出）に簡略化できる。
【００１７】
好ましい実施形態では、ポロゲンが合成プロセスに添加されて、ＨＬＢ共重合体の孔径分布を制御する。ポロゲンは、以前はフェーズ・エクステンダー（phase extenders）と呼ばれており、形成される高分子の特性に影響を与えるために重合に添加される溶媒である。ポロゲンは、限定されないが、表面積、細孔容積、孔径（pore size）、ポロシティー（porosity）および疎水性−親水性を含むポリマーの多くの特性に影響を与える可能性がある。特定のポロゲンまたはポロゲンの組み合わせが添加され、得られるポリマーの特性を調整することが好ましい。
【００１８】
適切なポロゲンは、非極性または疎水性；極性または親水性の溶媒、および、非極性および極性溶媒の組み合わせを含む。好ましい実施形態では、非極性および極性ポロゲンの組み合わせが使用される。本明細書に記載のＨＬＢ共重合体の準備に使用される好ましい非極性ポロゲンは、トルエン、キシレン、ベンゼン、ヘキサン、シクロヘキサン、ペンタン、ヘプタン、オクタン、ノナン、デカン、ドデカン、イソオクタン、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、およびそれらの組み合わせを含む。本明細書に記載のＨＬＢ共重合体の準備に使用される好ましい極性ポロゲンは、ベンジルアルコール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、４−メチル−２−ペンタノール、イソアミルアルコール、ドデカノール、酢酸エチル、２−エチルヘキサノール、シクロヘキサノールおよびそれらの組み合わせを含む。当業者はまた、得られるポリマーの特性を調整するために、追加の適切な非極性および極性ポロゲンを選択することができるであろう。特に好ましい実施形態では、ｏ−キシレンと４−メチル−２−ペンタノールの組み合わせがポロゲンのために使用される。
【００１９】
本明細書に記載の方法によれば、高分子吸着剤を形成するのに使用される、ジビニルベンゼンとアクリロニトリルモノマーの比率は、ＨＬＢポリマーのために必要な適切な分離特性を実現しながら、大きく変化させることができる。
【００２０】
いくつかの実施形態では、疎水性モノマーの親水性モノマーに対する比率は、１０：９０（重量％）から９０：１０（重量％）までの範囲である。さらなる実施形態では、疎水性モノマーの親水性モノマーに対する比率は、３０：７０（重量％）から７０：３０（重量％）までの範囲である。さらなる実施形態では、疎水性モノマーの親水性モノマーに対する比率は、１５：８５（重量％）から８５：１５（重量％）までの範囲；２０：８０（重量％）から８０：２０（重量％）までの範囲；２５：７５（重量％）から７５：２５（重量％）までの範囲；３０：７０（重量％）から７０：３０（重量％）までの範囲；３５：６５（重量％）から６５：３５（重量％）までの範囲；４０：６０（重量％）から６０：４０（重量％）までの範囲；５５：４５（重量％）から４５：５５（重量％）までの範囲；または約５０：５０（重量％）である。好ましい実施形態では、疎水性モノマーの親水性モノマーに対する比率は、約６３：３７（重量％）である。
【００２１】
好ましい一実施形態では、高分子吸着剤は、ポリ（ジビニルベンゼン−ｃｏ−アクリロニトリル）である。いくつかの実施形態では、ジビニルベンゼンのアクリロニトリルに対する比率は、９０：１０（重量％）から１０：９０（重量％）までの範囲である。さらなる実施形態では、ジビニルベンゼンのアクリロニトリルに対する比率は、１５：８５（重量％）から８５：１５（重量％）までの範囲；２０：８０（重量％）から８０：２０（重量％）までの範囲；２５：７５（重量％）から７５：２５（重量％）までの範囲；３０：７０（重量％）から７０：３０（重量％）までの範囲；３５：６５（重量％）から６５：３５（重量％）までの範囲；４０：６０（重量％）から６０：４０（重量％）までの範囲である。好ましい一実施形態では、ジビニルベンゼンのアクリロニトリルに対する比率は、約７５：２５（重量％）である。さらに好ましい実施形態では、ジビニルベンゼンのアクリロニトリルに対する比率は、約６３：３７（重量％）である。
【００２２】
特定の好ましい実施形態では、本明細書に開示される高分子吸着剤は、酸、塩基、中性、強い極性、中程度の極性、および非極性の分析種を含む複数の分析種を同時に吸着するように適合されている。例示的な分析種は、小分子、大分子、タンパク質、リン脂質、および医薬関連の分子を含んでもよい。
【００２３】
対象となるいくつかの典型的な分析種は、これらの幅広いクラス：エッセンシャルオイル、食品保存料、ビタミン、可塑剤、農薬、ステロイド、炭化水素、汚染物質、アミン、アルコール、染料、フェノール、アルカロイド、マイコトキシン、アミノ酸、フラボノイド、複素環式化合物、脂質、ステロイド、有機酸、テルペン（terpenes）、界面活性剤、炭水化物、カテコールアミン、抗生物質、アミノ酸、核酸、核酸塩基、タンパク質およびペプチドに適合する化合物を含んでもよいが、これらに限定されない。
【００２４】
対象となる医薬分析種のいくつかの非限定的な例は、アセトアミノフェン、アミロリド、アミトリプチリン、アトラジン、ベンゾイルエクゴニン、ブスピロン、クラリスロマイシン、２，７−ジヒドロキシナフタレン、ドキセピン、ハロペリドール、ヒドロキニジン、イミダクロプリド、イミプラミン、イミキモド、ロラタジン、ロサルタン、メソリダジン、メタピリレン、ミアンセリン、ミルタザピン、ネファゾドン、ネビラピン、ニザチジン、プロカインアミド、プロプラノロール、およびｐ−トルアミドを含む。
【００２５】
特定の実施形態では、高分子吸着剤は、多孔質球状粒子である。球状粒子が好ましい場合、粒子サイズは特に限定されない。粒子は、広範囲にわたって好ましい再現可能な粒子サイズ分布で形成され、これらのＨＬＢ共重合体を、ＳＰＥ、ＳＰＭＥ、ＨＰＬＣを含むが、これに限定されない種々の用途で使用してもよい。
【００２６】
様々な実施形態では、ＨＬＢ吸着剤は、約１０ｎｍから約１ｍｍまでの範囲の直径を有する多孔質球状粒子であってよい。いくつかの実施形態では、多孔質球状粒子は、約２０μｍから約１２５μｍまでの範囲の直径を有する。特定の実施形態では、多孔質球状粒子は、約３０μｍから約８５μｍまでの範囲の直径を有する。ＳＰＥでの使用のために、球状粒子は、約４０から約７５μｍまでの範囲の直径を有する。ＳＰＥのための好ましい実施形態では、球状粒子は、約５０μｍの直径を有する。いくつかの実施形態では、多孔質球状粒子は、約１０ｎｍから約１０μｍまでの範囲の直径を有する。ＳＰＭＥのために、球状粒子は、好ましくは約０．５μｍから約４μｍまでの範囲の直径；より好ましくは約０．８μｍから約２μｍまでの範囲の直径を有する。単分散粒子サイズを使用することは、試料作製プロセスを改善するため望ましい。
【００２７】
いくつかの実施形態では、多孔質球状粒子は、約１０ｍ２／ｇから１０００ｍ２／ｇまでの範囲の表面積を有する。いくつかの実施形態では、多孔質球状粒子は、約３５０ｍ２／ｇから約６７５ｍ２／ｇまでの範囲の表面積を有する。いくつかの実施形態では、表面積は約３５０ｍ２／ｇである；他の実施形態では、表面積は約３７５ｍ２／ｇであり、他の実施形態では、表面積は約４００ｍ２／ｇである；他の実施形態では、表面積は約４２５ｍ２／ｇである；他の実施形態では、表面積は約４５０ｍ２／ｇである；他の実施形態では、表面積は約４７５ｍ２／ｇである；他の実施形態では、表面積は約５００ｍ２／ｇである；他の実施形態では、表面積は約５２５ｍ２／ｇである；他の実施形態では、表面積は約５５０ｍ２／ｇである；他の実施形態では、表面積は約５７５ｍ２／ｇである；他の実施形態では、表面積は約６００ｍ２／ｇである；他の実施形態では、表面積は約６２５ｍ２／ｇである；他の実施形態では、表面積は約６５０ｍ２／ｇである；さらに他の実施形態では、表面積は約６７５ｍ２／ｇである；さらに他の実施形態では、表面積は約７００ｍ２／ｇである。
【００２８】
いくつかの実施形態では、多孔質球状粒子は、約５０Åから約１０５Åまでの範囲の平均細孔径を有する。さらに、本明細書に記載されるＨＬＢ吸着剤のための平均細孔径は、約５０Å、約５５Å、約６０Å、約６５Å、約７０Å、約７５Å、約８０Å、約８５Å、約９０Å、約９５Å、約１００Å、約１０５Åまたは約１１０Åであってもよい。
【００２９】
特定の実施形態では、高分子吸着剤は、基材上に被覆される。適切な基板は、特に、炭素、シリカおよび金属を含んでもよい。いくつかの実施形態では、基材は粒子状であってもよく、他の実施形態では、基材は繊維であってもよい。
【００３０】
基材が繊維である場合、高分子吸着剤は、繊維上に直接被覆されてもよい。いくつかの実施形態では、接着剤またはバインダーが使用され、高分子吸着剤を繊維に接着する。適切なバインダーは当業者に知られている。本明細書に記載のＨＬＰ吸着剤に従って使用され得る接着剤のいくつかの非限定的な例には、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、エポキシ樹脂、ポリシラザン、アクリル樹脂、フェノールホルムアルデヒド樹脂、ポリ酢酸ビニル（ＰＶＡ、白色接着剤(white glue)）、イエロー・カーペンターズ・グルー（yellow carpenter's glue）（脂肪族樹脂）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰまたはＰＶＡベース）、ポリエステル樹脂、レゾルシノール樹脂、尿素樹脂接着剤（プラスチック樹脂）、またはこれらの組み合わせが含まれる。特に好ましい接着剤は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）である。構造体に吸着剤を接着するためのバインダーとしてのＰＤＭＳの使用は、例えば、米国特許第５，５５９，４４５号および第７，８１５，８６４号に開示されており、特許の全体が参照により本明細書に組み込まれる。他の実施形態では、バインダー、すなわち、架橋特性を示さないものが使用されてもよい。そのようなバインダーには、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、テフロン（ＰＴＦＥおよび類似のフッ素化ポリマー／プラスチック）、ゼラチン、セルロース、セルロース誘導体、ポリビニルピロリドン、デンプン、スクロースおよびポリエチレングリコールが含まれるが、これらに限定されない。
【００３１】
特に、従来のＨＬＢ被覆繊維とは異なり、本明細書で提供されるＨＬＢ繊維は、コンディショニング工程なしで使用されてもよい。上述したように、抽出プロセスのこの単純化は、時間の観点から非常に望ましく、より短い時間でより多くのサンプルの分析を可能とする。
【００３２】
また、本明細書に記載されるように溶液を高分子吸着剤と接触させることにより溶液から１つ以上の溶質を除去する方法を提供し、それにより溶質は高分子吸着剤上に吸着される。いくつかの実施形態では、溶質は、その後、高分子吸着剤から溶出されてもよい。
【００３３】
この方法のいくつかの実施形態では、溶液は極性溶媒を有する。好ましい実施形態では、極性溶媒は水性溶媒である。別の好ましい実施形態では、極性溶媒は有機溶媒である。
【００３４】
本明細書で提供される方法によれば、ＨＬＢ吸着剤は、溶液から少なくとも６つの溶質を除去すること、干渉する分析種（interfering analytes）、または目的の分析種に有用である。いくつかの実施形態では、ＨＬＢ吸着剤は、溶液から少なくとも８つの溶質を除去するのに有用である。さらなる実施形態では、ＨＬＢ吸着剤は、溶液から少なくとも１０の溶質を除去するのに有用である。さらに他の実施形態では、ＨＬＢ吸着剤は、溶液から少なくとも１５の溶質を除去するのに有用である。好ましい実施形態では、ＨＬＢ吸着剤は、溶液から少なくとも２０の溶質を除去するのに有用である。本明細書で提供される方法によれば、ＨＬＢ吸着剤は、溶液からいくつかの異なるタイプの溶質を除去すること、干渉する分析種、または目的の分析種に有用である。溶質、干渉する分析種または分析種は、１つ以上のタンパク質、１つ以上の医薬関連の分析種、および１つ以上のリン脂質を含んでもよい。
【００３５】
好ましい実施形態では、ＨＬＢ吸着剤は、少なくとも５０％の回収率で溶液から除去される溶質の少なくとも約７５％を除去する。別の好ましい実施形態では、ＨＬＢ吸着剤は、少なくとも５０％の回収率で溶液から除去される溶質の少なくとも約８０％を除去する。別の好ましい実施形態では、ＨＬＢ吸着剤は、少なくとも５０％の回収率で溶液から除去される溶質の少なくとも約８５％を除去する。別の好ましい実施形態では、ＨＬＢ吸着剤は、少なくとも５０％の回収率で溶液から除去される溶質の少なくとも約９０％を除去する。さらに別の好ましい実施形態では、ＨＬＢ吸着剤は、少なくとも５０％の回収率で溶液から除去される溶質の少なくとも約９５％を除去する。
【００３６】
さらに別の好ましい実施形態では、ＨＬＢ吸着剤は、少なくとも７０％の回収率で溶液から除去される溶質の少なくとも約７５％を除去する。別の好ましい実施形態では、ＨＬＢ吸着剤は、少なくとも７０％の回収率で溶液から除去される溶質の少なくとも約８０％を除去する。別の好ましい実施形態では、ＨＬＢ吸着剤は、少なくとも７０％の回収率で溶液から除去される溶質の少なくとも約８５％を除去する。別の好ましい実施形態では、ＨＬＢ吸着剤は、少なくとも７０％の回収率で溶液から除去される溶質の少なくとも約９０％を除去する。別の好ましい実施形態では、ＨＬＢ吸着剤は、少なくとも７０％の回収率で溶液から除去される溶質の少なくとも約９５％を除去する。
【００３７】
また、本明細書に記載されるように、溶液を高分子ＨＬＢ吸着剤と接触させる工程を含む、溶液から干渉する溶質を選択的に除去するための方法を提供し、溶質は、高分子に吸着されるか、または本方法の洗浄工程で高分子から洗い流され、溶質は、タンパク質、リン脂質、無機塩、それらの組み合わせからなる群から選択され、干渉する溶質の少なくとも約９０％が除去される。
【００３８】
また、本明細書に記載されているＨＬＢ吸着剤を含むカートリッジを提供する。いくつかの実施形態では、カートリッジは、ＨＬＢ吸着剤の球状粒子を含む。他の実施形態では、カートリッジは、ＨＬＢ吸着剤で被覆された球状シリカ粒子を含む。
【００３９】
本明細書に記載されているＨＬＢ材料は、「高分子（polymers）」、「共重合体（copolymers）」、「樹脂（resins）」および「吸着剤（adsorbents）」と互換的に呼ばれることがある。これらの用語のいずれかを別の用語に置き換えてもよく、ある用語を別の用語に置き換えて使用しても、ＨＬＢ材料の組成または機能に違いがあることを意味するものではない。
【００４０】
本明細書に記載されるＨＬＢ吸着剤は、精製（purification）のための除去または濃縮（concentrating）のための除去のいずれかの機能のために、分析種を吸着するために有用である。「除去する（removing）」または「吸着する（adsorbing）」は、意味を変えることなく、交換可能に使用することができ、または「抽出する（extracting）」などの他の用語で置き換えることができることが理解される。「分析種（analytes）」、「対象分析物（analytes of interest）」、「溶質（solutes）」および「干渉する溶質（interfering solutes）」という用語は、本明細書に記載のＨＬＢ共重合体によって吸着または除去される物質として交換可能に使用されてもよいことがさらに理解される。
【００４１】
本明細書で提供される手順、実験および実施例は、本明細書で提供される改善されたＨＬＢ共重合体の例示であることを意味し、本発明を限定することを意味しない。
【００４２】
以下は、本明細書に記載されるＨＬＢ共重合体の合成、使用および特性を説明する。これらの高分子の改善された特性を示すために、本明細書に記載される新しいＨＬＢ共重合体は、現在利用可能なさまざまな従来のＨＬＢ吸着剤に対してテストされ、従来のＨＬＢ  Ａ、従来のＨＬＢ  Ｂ、従来のＨＬＢ  Ｃなどとして識別され、これらのラベルは、一貫して同じ材料で使用される。
【００４３】
上記のように、本明細書に記載されるＨＬＢ共重合体は、懸濁または分散重合プロセスを使用して作製されるジビニルベンゼン（ＤＶＢ）およびアクリロニトリル（ＡＮ）の共重合体である。
【００４４】
図１は、本明細書に記載されているＨＬＢ共重合体吸着剤の１つ、従来のＨＬＢ  Ａおよび従来のＨＢＬ  Ｂ材料の細孔構造を示す細孔プロットオーバーレイ（pore plot overlay）を示す。ＤＶＢ／ＡＮ共重合体は、表１に示すように、必要なミクロポロシティー（microporosity）とメソポロシティー（mesoporosity）を実現するために、疎水性と親水性の両方のフェーズ・エクステンダーを使用して調製された。
【００４５】
【表１】
2020531263.tif 000003
【００４６】
実施例：例示的なＨＬＢ共重合体の合成。
工業グレードのジビニルベンゼン（１００ｇ）、工業グレードのアクリロニトリル（４３ｇ）、過酸化ベンゾイル（６．９ｇ）、ｏ−キシレン（５４ｇ）および４−メチル−２−ペンタノール（５４ｇ）の混合物を混合して有機相を調製した。ドデシル硫酸ナトリウム（sodium dodecyl sulfate）（１．２ｇ）、カルミナール（１．２ｇ、高分子量メチルセルロース）、ホウ酸（３２ｇ）、バルク水（７９４ｇ）を混合して水相を調製した。反応器内で有機相を水相に投入した。撹拌して有機相を微細な液滴（fine droplets）に分散させ、反応器を８０℃に約１６時間加熱して、重合を開始して完了させた。その結果、収量約１４０ｇの球状の白色粉末が得られた。
【００４７】
図２に示すように、本明細書に記載されているプロセスで作製されたＨＬＢ共重合体は、バッチ間の合成再現性が良好であることが分かった。図２に示すように、細孔構造は、ミクロポーラスおよびメソポーラスの範囲全体で、バッチごとに再現可能であることが示された。
【００４８】
ＨＬＢ共重合体被覆シリカ
シリカを被覆するプロセスは以下の通りである。最初に、ＨＰＬＣグレードのシリカ（３．０μｍ、３００Å）を１４０℃で一晩真空乾燥する。乾燥したシリカをロータリエバポレータフラスコに入れる。ジビニルベンゼン（４．５ｇ）、アクリロニトリル（１．５ｇ）、過酸化ベンゾイル（０．１８ｇ）およびジクロロメタン（９０ｇ、バルク溶媒）を予混合し、予混合した溶液をフラスコに入れる。フラスコを周囲温度で２時間５０ｒｐｍで回転させて平衡化させる。以下のように、フラスコを段階的に加熱して、ジクロロメタンをゆっくりと蒸発させる：（１）周囲条件で２時間保持する；（２）温度を周囲温度から６０℃に上げ、１時間保持する；（３）６０℃〜６５℃で１時間保持する；次に、（４）温度を６５℃から８０°Ｃに上げ、１６時間保持する。高分子コーティングの前に、シリカを、例えばトリメチルクロロシランまたはオレイン酸で覆ってもよい。
【００４９】
ＳＰＭＥでは、共重合体被覆されたシリカは、２〜４μｍの典型的な粒子サイズ範囲を有し、シリカ・ハード・テンプレート（silica hard template）と同様の細孔構造と表面化学特性を有している。しかしながら、共重合体で被覆されたシリカは、目的の用途に応じて、約３０ｎｍ〜約５μｍの範囲であってもよいことに留意されたい。
【００５０】
本明細書に記載されているＨＬＢ共重合体をシリカ上に被覆することの適合性を調査するために、実施例ＨＬＢ−６５が選択された。この材料のために選択されたシリカは、１００Å、２００Åおよび３００Åの細孔径を有していた。シリカ表面でのＤＶＢとＡＣＮモノマーの共重合を確実にするために、共重合体の損失を測定するために洗浄手順を選択した。図３Ａに示すように、損失は検出されなかった。図３Ｂは、上記のシリカ被覆プロセスを使用した均一な細孔減少を示す。図４は、さまざまな共重合体比を使用したコーティングを示す。
【００５１】
分析種の回収率の洗浄の影響を、実験用ＨＬＢ共重合体のＨＬＢ−６５を使用して調査した。テストでは、以下に説明する２０の分析種の分析手順を使用した。結果を以下の表２、表３および表４にまとめた。
【００５２】
【表２】
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【００５３】
【表３】
2020531263.tif 000005
【００５４】
【表４】
2020531263.tif 000006
【００５５】
説明のために、図５は、典型的なシリカ被覆ＳＰＭＥ繊維の走査型電子顕微鏡写真である。３．０μｍ高分子被覆シリカの接着に使用する接着剤は、本明細書に記載されているポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）である。
【００５６】
本明細書に記載されているＨＬＢ共重合体のさらなる評価は、以下のように行われた：
【００５７】
分析種回収率の評価：６つの分析種の予備スクリーン（Six Analyte Preliminary Screen）。１ｍｇ／ｍＬのストック（stock）が、５０ｍＬのメタノールに、以下の５０ｍｇの分析種を溶媒和することにより調整された：アセトアミノフェン、プロカインアミド、ｐ−トルアミド、２，７−ジヒドロキシナフタレン、プロプラノロールおよびドキセピン。５００μＬの１ｍｇ／ｍＬストックを４９．５ｍＬの２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（buffer）に移して、１０μｇ／ｍＬの分析種ストックを調製した。試薬は、標準的な手順に従って満たされたメスフラスコを使用して調製された。
【００５８】
実験用樹脂または従来の比較例では、ベッド重量（bed weights）６０ｍｇの３ｍＬＳＰＥカートリッジフォーマット（cartridge formats）を使用した。表５に記載されているプロトコルを使用してサンプルを処理した。
【００５９】
【表５】
2020531263.tif 000007
【００６０】
ドロップ率（Drop rates）は、毎秒１ドロップ以下に維持された。分析種のストック（Analyte stocks）は、最初に１ｍｇ／ｍＬの濃度でメタノールに溶解し、２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７）で１０μｇ／ｍＬに希釈して、ローディングストック（loading stock）を製造した。蒸発後、すべてのサンプルを２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７）で３０秒間ボルテックスし、分析用に再構成した（reconstitute）。１０μｇ／ｍＬのローディング溶液（loading solution）の３つのアリコート（aliquots）を分析し、各化合物の平均面積カウント（average area count）を、各化合物の回収率を計算するためのリファレンスとして使用した。
【００６１】
ＨＰＬＣパラメータ。ＵＶ検出器と組み合わせたＡｇｉｌｅｎｔ  １１９０  ＨＰＬＣを使用して分析した。メソッドパラメータ（Method parameters）は、表６に記載した。
【００６２】
【表６】
2020531263.tif 000008
【００６３】
プロトコルＩ：このプロトコルは、以下で構成される２０の分析種の混合物を利用した：アミロライド、アミトリプチリン、アトラジン、ベンゾイルエクゴニン、ブスピロン、クラリスロマイシン、ハロペリドール、ヒドロキニジン、イミダクロプリド、イミプラミン、イミキモド、ロラタジン、メソリダジン、メタピリレン、ミアンセリン、ミルタザピン、ネファゾドン、ネビラピン、ニザチジンおよびロサルタン。酸性マトリックス抽出では、新生子牛の血清に２００ｎｇ／ｍＬの濃度の分析種を添加（spiked）した。次に、添加された血清を０．４％ギ酸溶液で１：１に希釈した。これらの溶液には内部標準混合物も添加されており、１００ｎｇ／ｍＬ分析種の最終濃度と５０ｎｇ／ｍＬの内部標準が可能である。ＳＰＥの手順を表７に示す。
【００６４】
実験用材料を含むすべてのカートリッジには、そうしなければ分析種と共抽出される（co-extracted）親油性の干渉を除くために、ソックスレー洗浄ポリエチレンフリット（soxhlet washed polyethylene frits）がパックされている（packed）ことに留意してほしい。
【００６５】
【表７】
2020531263.tif 000009
【００６６】
プロトコルＯ：新生子牛の血清を４％リン酸で１：１に希釈した（最終の分析種濃度：１００ｎｇ／ｍＬ；最終の内部標準濃度：５０ｎｇ／ｍＬ）。前述の手順に従って、溶出溶媒として１００％ＭｅＯＨを使用した。サンプル溶出液を乾燥させ、最初の移動相（starting mobile phase）に再構成した（reconstituted）。サンプルは、「５ステッププロトコル」に従っても準備され、これは、サンプルをロードする前にコンディショニング（１ｍＬ  ＭｅＯＨ）および平衡化（１ｍＬ水）ステップを追加するだけである。２０の分析種の混合が、この評価のために使用された。
【００６７】
実験用材料を含むすべてのカートリッジには、そうしなければ分析種と共抽出される（co-extracted）親油性の干渉を除くために、ソックスレー洗浄ポリエチレンフリット（soxhlet washed polyethylene frits）がパックされている（packed）ことに留意してほしい。
【００６８】
プロトコルＰ：新生子牛の血清を４％リン酸で１：１に希釈した（最終の分析種濃度：１００ｎｇ／ｍＬ；最終の内部標準濃度：５０ｎｇ／ｍＬ）。表５に記載されている手順に従い、溶出溶媒として１００％ＭｅＯＨを使用した。サンプル溶出液は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳで直接分析した。この評価には、アジドチミジン、フェナセチン、ベタメタゾン、アルプラゾラム、ナプロキセン、プロプラノロール、プロトリプチリンおよびアミトリプチリンを含む８つの分析種の混合を使用した
【００６９】
実験用材料を含むすべてのカートリッジには、そうしなければ分析種と共抽出される（co-extracted）親油性の干渉を除くために、ソックスレー洗浄ポリエチレンフリット（soxhlet washed polyethylene frits）がパックされている（packed）ことに留意してほしい。
【００７０】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析：プロトコルＩおよびプロトコルＯ  ＨＬＢプロトコルサンプルの分析。Ａｇｉｌｅｎｔ  １２９０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＵＨＰＬＣとＡｇｉｌｅｎｔ  ６４６０トリプル四重極質量分析計を組み合わせてサンプルを分析した。表８と表９に、特定のＵＨＰＬＣおよびＭＳソースパラメータ（MS source parameters）を示す。表１０および表１１は、それぞれポジティブモードとネガティブモードでの分析種の分析のための化合物固有のＭＳパラメータを示す。
【００７１】
【表８】
2020531263.tif 000010
【００７２】
【表９】
2020531263.tif 000011
【００７３】
【表１０】
2020531263.tif 000012
【００７４】
【表１１】
2020531263.tif 000013
【００７５】
３ステッププロトコルのサンプルの分析。Ａｇｉｌｅｎｔ  １２９０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＵＨＰＬＣとＡｇｉｌｅｎｔ  ６４６０トリプル四重極質量分析計を組み合わせてサンプルを分析した。表１２と表１３に、特定のＵＨＰＬＣおよびＭＳソースパラメータを示す。表１４に、化合物固有のＭＳパラメータを示す。
【００７６】
【表１２】
2020531263.tif 000014
【００７７】
【表１３】
2020531263.tif 000015
【００７８】
【表１４】
2020531263.tif 000016
【００７９】
リン脂質モニタリング。Ａｇｉｌｅｎｔ  １２９０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＵＨＰＬＣとＡｇｉｌｅｎｔ  ６４６０トリプル四重極質量分析計を組み合わせてサンプルを分析した。表１５と表１６に、特定のＵＨＰＬＣおよびＭＳソースパラメータを示す。表１７に、化合物固有のＭＳパラメータを示す。
【００８０】
【表１５】
2020531263.tif 000017
【００８１】
【表１６】
2020531263.tif 000018
【００８２】
【表１７】
2020531263.tif 000019
【００８３】
予備調査（Preliminary Studies）。予備調査の焦点は、バッファー（buffer）からの６つの分析種の混合の回収のために一連の共重合体樹脂をスクリーニングすることであった。対象となる分析種は、疎水性がさまざまであるために選択された（表１８）。単純なスクリーニングであるが、結果は、さらに評価する潜在的な樹脂を特定するのに有用であった。
【００８４】
【表１８】
2020531263.tif 000020
【００８５】
予備スクリーニング用に合計８つの共重合体樹脂を準備した。これらの樹脂は、分析種回収における共重合体比と細孔構造の役割を研究するために設計された。表１９に、各実験用樹脂の共重合体組成を示す。細孔構造を変えるために、ｏ−キシレン：ＭＩＢＣ（ｗ：ｗ）比をいくつかの樹脂で変えた。
【００８６】
【表１９】
2020531263.tif 000021
【００８７】
いくつかの実験用樹脂は、それらの化学をよりよく理解するためにさらに分析された。これらの樹脂は、ＣＨＮ組成（表２０）および表面積とポロシティー（表２１）について評価された。従来のＨＬＢ  Ａ、従来のＨＬＢ  Ｂおよび従来のＨＬＢ  Ｃ材料も比較のために評価された。
【００８８】
【表２０】
2020531263.tif 000022
【００８９】
ＣＨＮ組成に関して、従来のＨＬＢ  Ｂと従来のＨＬＢ  Ｃの材料が非常に似ていることが明らかになった。ただし、従来のＨＬＢ  Ａ材料は大きく異なり、炭素が３５．４７％だけであった。
【００９０】
【表２１】
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【００９１】
表面積とポロシティーに関して、従来のＨＬＢ  Ａと従来のＨＬＢ  Ｂも異なる。従来のＨＬＢ  Ｂは、従来のＨＬＢ  Ａ材料よりも表面積が大きく、細孔径が小さい。
【００９２】
各実験用樹脂は、２つのプロトコルに従って、対象となる６つの分析種を回収する能力について評価された。最初のプロトコルは、従来のＨＬＢメソッドに倣ってモデル化されたが、ベッド（bed）はコンディショニングと平衡化の後に乾燥された。この実験の結果を図６に示す。予想どおり、従来のＨＬＢ  Ｂ製品では、６つの分析種すべてで高い回収率が得られ、最も親油性の高い分析種であるドキセピンの回収率は最低で７９％であった。実験用樹脂のスクリーニングにより、大きな違いが明らかになった。この段階で最も性能の高い樹脂は、ＨＬＢ−０１であると判断された。６つの分析種すべてで、回収率は８０％を超えた。
【００９３】
２番目のプロトコルは、３ステッププロセスを利用した：ローディング（loading）、洗浄および溶出。これらの実験の時点では、３ステップのプロトコルは不明だったため、中性ｐＨで抽出を行った。この実験の結果を図７に示す。驚くべきことに、従来のＨＬＢ  Ａ製品を使用して回収された分析種は６つのうち３つだけであった。これらの結果は、製品の弱点を明らかにするか、単に中性ｐＨで実行されるこれらの初期抽出が原因である可能性がある。最高の性能を発揮する実験用樹脂は、再びＨＬＢ−０１であることがわかり、回収率は８０％を超え、ＲＳＤは６つの分析種すべてで典型的に５％以下（≦５％）であった。
【００９４】
予備スクリーニングにより、次のレベルの実験は樹脂ＨＬＢ−０１を中心とすべきことが明らかになった。この樹脂は、６３：３７（ＤＶＢ／ＡＮ）のモノマー比と１５０：１５０（ｏ−キシレン／ＭＩＢＣ）のフェーズ・エクステンダー比から調製された。この樹脂は、フェーズ・エクステンダー比のみが異なり、結果としてマクロポロシティー（macroporosity）がより低いＨＬＢ−０３、および親水性モノマーが異なる（アクリロニトリルの代わりにＮ−ビニルピロリドンを使用）ＨＬＢ−１００よりも優れた性能を発揮した。
【００９５】
拡張スクリーニング（Extended Screening）。実験用ＨＬＢ樹脂をさらに最適化するための拡張スクリーニングを実行するために、２０の追加の分析種が選択された。表２２に、２０すべての分析種とそのｌｏｇＰ値を示す。このミックス（mix）は、より広い範囲の疎水性を表す。この多様さは、さらに理想的なＨＬＢ樹脂を見つけるのに役立つ。
【００９６】
【表２２】
2020531263.tif 000024
【００９７】
予備スクリーニング中に、興味のある条件を特定するために、高分子化学（polymer chemistry）に大きな変更が加えられた。ＨＬＢ樹脂をさらに最適化するために、拡張スクリーニング中に化学的性質（chemistry）に小さな変更を加えた。これにより、高分子化学の「微調整」が可能になる。表２３は、ＨＬＢ−０１と比較した、追加の樹脂：ＨＬＢ−２２およびＨＬＢ−２６の共重合体組成とポロシティー特性（porosity characteristics）を含む。
【００９８】
【表２３】
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【００９９】
図８および表２４は、３つの実験用共重合体樹脂における酸性条件下でスパイクされた（spiked）血清から抽出された２０の分析種の回収率を比較する。この分析では、樹脂ＨＬＢ−２２は、樹脂ＨＬＢ−０１およびＨＬＢ−２６よりも性能が向上することが分かった。この樹脂は、７５：２５（ジビニルベンゼン／アクリロニトリル）の開始モノマー比を有する。
【０１００】
【表２４】
2020531263.tif 000026
【０１０１】
各実験用樹脂は、マトリックスサンプルからリン脂質を除去する能力についても評価された。図９は、未抽出の子牛血清のＭＲＭトレース（MRM traces）と、さまざまな実験用樹脂および従来のＨＬＢ  Ａで抽出されたサンプルのオーバーレイ（overlay）を示す。すべての実験用樹脂は、存在するリン脂質の９５％超（＞９５％）を除去できた。ＨＬＢ−２２は、酸性の抽出条件を利用した場合、９８．７％の除去をもたらすことが分かった。
【０１０２】
次に、高分子で被覆されたシリカも調査した。９９％を超える（＞９９％）リン脂質の除去に成功した材料が準備された。最適な高分子条件を特定した後、次の段階は、この実験用高分子の性能を、２つの従来製品：従来のＨＬＢ  Ａおよび従来のＨＬＢ  Ｂと比較することであった。
【０１０３】
最初の比較は、５ステップのプロトコルを使用して、表２２に示す２０の分析種の混合を使用して実行された。図１０は、実験用共重合体ＨＬＢ−６７と従来のＨＬＢ  Ｂを使用して、２０の分析種の絶対分析種回収率を比較する。同じ抽出方法を使用した場合、実験用共重合体ＨＬＢ−６７は、２０の分析種すべてで７０％を超える（＞７０％）回収率で抽出できた。従来のＨＬＢ  Ｂでは、１８／２０の分析種が高い絶対回収率を有していた。この結果は、本明細書に記載されている材料が、既存の従来の５ステップの方法の直接の代替として使用される可能性があることを確認する。
【０１０４】
次に、実験用樹脂ＨＬＢ−６７が従来のＨＬＢ  Ｂよりも優れている可能性を評価した。これには、酸性条件下でスパイクされた（spiked）血清から２０の分析種の混合を再度抽出することが含まれていたが、この評価では、簡略化された３ステップのプロトコルが使用された。コンディショニングや平衡化のステップは含まれていない。この評価の結果を図１１に示す。従来のＨＬＢ  Ｂを３ステップの方法で使用した場合、絶対回収率が７０％を超える（＞７０％）のは、１４／２０の分析種だけであることが分かった。我々の実験用樹脂ＨＬＢ−６７では、サンプルがドライベッド（dry bed）にロード（load）されたときに、１７／２０の分析種が７０％を超える（＞７０％）回収率を有していた。これは、実験用樹脂が従来製品よりも優れていることを示唆する。コンディショニングと平衡化のステップは必要ないため、ユーザーは５ステップよりもむしろ３ステップの方法を使用して時間とステップを節約できる。
【０１０５】
次に、実験用ＨＬＢ樹脂のＨＬＢ−６７を従来のＨＬＢ  Ａに対してテストした。このために、８つの分析種の混合を選択した。表２５に、８つの分析種とそれらのｌｏｇＰ値を示す。
【０１０６】
【表２５】
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【０１０７】
実験用ＨＬＢ共重合体樹脂のＨＬＢ−６７は、従来のＨＬＢ  Ａとほぼ同じように機能することが分かった（図１２）。これらの結果は、本明細書に記載されているＨＬＢ材料が３ステップＳＰＥメソッドに適していることも示す。
【０１０８】
従来のＨＬＢ製品で行われた次の比較は、マトリックス除去（matrix removal）であった。これは、リン脂質の異なるクラスを表す７つの異なるＭＲＭ遷移（MRM transitions）をモニタリングすることによって達成された。抽出されたサンプルと未抽出の血清の間で合計ピーク面積を比較して、リン脂質除去の平均パーセンテージを決定した。表２６は、実験用樹脂、従来のＨＬＢ  Ａおよび従来のＨＬＢ  Ｂの間のマトリックス除去を比較する。実験用材料は、従来の材料と同等の量のリン脂質をサンプルから除去することが示されている。
【０１０９】
【表２６】
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【０１１０】
本明細書で説明する実験用共重合体樹脂が、さまざまな従来製品に対する直接の置き換えと改善の両方に適していることを立証した後、評価の最終段階は、材料調製の再現性を決定することに集中した。合計５つの小規模ロットが準備された：３つの研究スケールロット（ＨＬＢ−２２、ＨＬＢ−６７およびＨＬＢ−７９）と２つの製造ロット。上記概説した２０の分析種のプロトコル：溶出溶媒として５０：５０（ＡＣＮ／ＭｅＯＨ）を使用する３ステップの方法を使用して、各材料を評価した。表２７、表２８および表２９は、各材料の絶対回収率、マトリックス・マッチド回収率（matrix matched recoveries）、および相対回収率をそれぞれ示す。
【０１１１】
【表２７】
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【０１１２】
【表２８】
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【０１１３】
【表２９】
2020531263.tif 000031
【０１１４】
追加実験
【０１１５】
実験用ＨＬＢ共重合体のＨＬＢ−０１は、以下の手順を使用して６分析種の混合の絶対値を測定することにより、見込まれる過乾燥効果について評価された。１ｍｇ／ｍＬのストック（stock）は、５０ｍＬのメタノールに５０  ｍｇの以下の分析種を溶媒和することにより調製した：アセトアミノフェン、プロカインアミド、ｐ−トルアミド、２，７ジヒドロキシナフタレン、プロプラノロールおよびドキセピン。５００μＬの１ｍｇ／ｍＬストックを４９．５ｍＬの２０ｍＭリン酸カリウムバッファーに移して、１０μｇ／ｍＬの分析種ストックを調製した。試薬は、標準的な手順に従って満たされたメスフラスコを使用して調製された。ベッド重量６０ｍｇの３つのｍＬＳＰＥカートリッジ形式（Three mL SPE cartridge formats）を使用した。表３０に記載されているプロトコルを使用してサンプルを処理した。
【０１１６】
【表３０】
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【０１１７】
ドロップ率（Drop rates）は、毎秒１ドロップ以下に維持された。分析種ストック（Analyte stocks）は、最初に１ｍｇ／ｍＬの濃度でメタノールに溶解し、２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７）で１０μｇ／ｍＬに希釈して、ローディングストック（loading stock）を作製した。蒸留（evaporation）後、すべてのサンプルを２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７）で３０秒ボルテックスし（vortexed）、分析用に再構成した（reconstitute）。１０μｇ／ｍＬのローディング溶液（loading solution）の３つのアリコート（aliquots）を分析し、各化合物の平均面積カウントを、各化合物の回収率を計算するためのリファレンスとして使用した。
【０１１８】
ＨＰＬＣパラメータ：分析は、ＵＶ検出器と組み合わせたＡｇｉｌｅｎｔ  １１９０  ＨＰＬＣを使用して行った。方法のパラメータは、表３１に示す。
【０１１９】
【表３１】
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【０１２０】
図１３は、本明細書に記載されているアクリロニトリル含有ＨＬＢ共重合体（ＨＬＢ−０１）を使用してバッファー（buffer）溶液から抽出した６つの分析種の絶対回収率を示す。前処理後に材料を乾燥させたところ、新しいＨＬＢ材料を使用する場合、過乾燥効果は問題にならないことを示している。これらの分析種は、０．５〜４．３のｌｏｇＰ範囲を表す。
【０１２１】
次に、ＨＬＢ共重合体のＨＬＢ−０１を、同じ６つの分析種の回収率を測定するが、３ステッププロセスを使用することにより、従来のビニルピロリドン含有ＨＬＢ、従来のＨＬＢ  Ａに対して評価した。上記と同じ溶液調製およびＨＰＬＣ分析を行った。表３２に示すように、ＳＰＥ手順をわずかに変更した。
【０１２２】
【表３２】
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【０１２３】
図１４は、簡略化された３ステップのプロトコルが利用されて（サンプルローディング前にコンディショニングまたは平衡化なし）、スパイクされた血清から抽出する場合の、アクリロニトリル含有ＨＬＢ材料（ＨＬＢ−０１）とビニルピロリドンを含有する従来のＨＬＢ材料（従来のＨＬＢ  Ａ）の絶対回収率の比較を示す。図１４のこの一連の化合物は、０．５〜４．３のｌｏｇＰ範囲を表す。
【０１２４】
実験用ＨＬＢ共重合体のＨＬＢ−６５は、上記のようにシリカ粒子上に被覆された。ＨＬＢ被覆シリカ粒子は、以下のように使用された。以下を含む２０の分析種の混合：アミロリド、アミトリプチリン、アトラジン、ベンゾイルエクゴニン、ブスピロン、クラリスロマイシン、ハロペリドール、ヒドロキニジン、イミダクロプリド、イミプラミン、イミキモド、ロラタジン、メソリダジン、メタピリレン、ミアンセリン、ミルタザピン、ネファゾドン、ネビラピン、ニザチジンおよびロサルタンを使用した。２０ｍＭ酢酸アンモニウムバッファー、ｐＨ７．４に、２００ｎｇ／ｍＬの濃度で分析種を混ぜた。次に、スパイクされたサンプルを２０ｍＭ酢酸アンモニウムで１：１に希釈した。これらの溶液には内部標準混合物（internal standard mixture）も混ぜられており、最終濃度１００ｎｇ／ｍＬの分析種と５０ｎｇ／ｍＬの内部標準（internal standards）を可能にする。ＳＰＥ手順を表３３に示す。
【０１２５】
【表３３】
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【０１２６】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析：Ａｇｉｌｅｎｔ  ６４６０トリプル四重極質量分析計と組み合わせたＡｇｉｌｅｎｔ  １２９０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＵＨＰＬＣを使用してサンプルを分析した。表３４と表３５に、特定のＵＨＰＬＣおよびＭＳソースパラメータを示す。表３６と表３７は、それぞれポジティブモードとネガティブモードでの分析種の分析のための化合物固有のＭＳパラメータを示す。
【０１２７】
【表３４】
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【０１２８】
【表３５】
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【０１２９】
【表３６】
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【０１３０】
【表３７】
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【０１３１】
実験用ＨＬＢ−６５で被覆されたシリカを使用した分析種の絶対回収率を図１５に示す。このＨＬＢ共重合体で被覆されたシリカは、伝統的な５ステップＳＰＥ手順を使用して、スパイクされた血清サンプルからさまざまな分析種を抽出した。
【０１３２】
従来のＨＬＢ  Ｂと実験用ＨＬＢ材料のＨＬＢ−７９の評価（図１６に示すデータ）。表３８は、ＳＰＥ手順を示す。前述のＬＣ−ＭＳ／ＭＳメソッドを使用した。
【０１３３】
【表３８】
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【０１３４】
図１６に示すように、簡略化された３ステッププロトコルが、スパイクされた血清から分析種を抽出するために使用された場合、実験用ＨＬＢ−７９は、ビニルピロリドンを含む従来のＨＬＢ  Ｂよりも２０分析種の混合の方がより一致した回収率を示した。化合物のこの２０分析種のセットは、−０．３〜６．１のｌｏｇＰ範囲を表す。アクリロニトリルの極性が増加し、ジビニルベンゼン内に組み込むことができるため、特にｌｏｇＰ値が低い分析種の回収率が向上した。
【０１３５】
本明細書で提供されるＨＬＢ共重合体は、様々なＳＰＥ用途で有用であることが示されている。本明細書に記載されている方法を使用すると、改良されたＨＬＢ吸着剤は、５ステップまたは３ステップの方法を使用した場合に、７０％超（＞７０％）の回収率で少なくとも１８／２０の分析種を一貫して抽出できる。有利なことには、本明細書で提供される改善されたＨＬＢ吸着剤は、コンディショニングおよび平衡化ステップが必要でない３ステップのプロトコルによく適している。改善されたＨＬＢ材料は、平均して血清サンプル内に存在するリン脂質の９８％超（＞９８％）を除去することも分かった。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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