(57)【要約】本発明は、リンカーによって連結された単量体サブユニットを有する多量体オリゴヌクレオチドを対象に投与する方法に関する。多量体オリゴヌクレオチドは、少なくとも約４５ｋＤの分子量、及び糸球体濾過によるそのクリアランスが低減されているなどの他の特質を有する。本発明はさらに、そのような多量体オリゴヌクレオチド、及びそのような多量体オリゴヌクレオチドを合成する方法に関する。2020518552.tif 000577
2020518552.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多量体オリゴヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与する方法であって、前記方法は、有効量の前記多量体オリゴヌクレオチドを前記対象に投与することを含み、
前記多量体オリゴヌクレオチドが、サブユニット
2020518552.tif 000538
を含み、
前記サブユニット
2020518552.tif 000539
の各々が、独立して一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドであり、かつ前記サブユニット
2020518552.tif 000540
の各々が、共有結合リンカー●によって別のサブユニットに連結されており、
前記多量体オリゴヌクレオチドが、糸球体濾過によるそのクリアランスを減少させるように設定された分子量及び／または分子サイズを有し、かつ
前記多量体オリゴヌクレオチドの前記分子量が、少なくとも約４５ｋＤである、
前記方法。
【請求項２】
前記多量体オリゴヌクレオチドが含有するサブユニットの個数が、ｍであり、ｍが、糸球体濾過による前記多量体オリゴヌクレオチドのクリアランスを減少させるように設定された前記分子量及び／または分子サイズを前記多量体オリゴヌクレオチドが有することを可能にするように選択される整数である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記多量体オリゴヌクレオチドが構造２１
2020518552.tif 000541
を含み、かつｎが０以上の整数である、請求項１及び請求項２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
前記サブユニットが一本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ｎが１以上である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記サブユニットが二本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項１〜３及び請求項５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ｎ＝０の場合、糸球体濾過による前記多量体オリゴヌクレオチドの前記クリアランスが、前記多量体オリゴヌクレオチドの単量体サブユニット
2020518552.tif 000542
及び／または二量体サブユニット
2020518552.tif 000543
のそれに比べて減少し、かつ
ｎ≧１の場合、糸球体濾過による前記多量体オリゴヌクレオチドの前記クリアランスが、前記多量体オリゴヌクレオチドの単量体サブユニット
2020518552.tif 000544
、二量体サブユニット
2020518552.tif 000545
、及び／または三量体サブユニット
2020518552.tif 000546
のそれに比べて減少する、
請求項３に記載の方法。
【請求項８】
糸球体濾過によるクリアランスの前記減少が、前記多量体オリゴヌクレオチドのインビボでの循環半減期の増加をもたらす、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
糸球体濾過によるクリアランスの前記減少が、
前記多量体オリゴヌクレオチドを前記対象に投与した後に前記多量体オリゴヌクレオチドのインビボでの循環半減期を測定すること
によって判定される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
糸球体濾過によるクリアランスの前記減少が、
前記多量体オリゴヌクレオチドの血清中濃度が所定値にまで減少するのに要する時間を測定すること
によって判定される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
糸球体濾過によるクリアランスの前記減少が、
前記多量体オリゴヌクレオチドを前記対象に投与した後の所定時に前記多量体オリゴヌクレオチドの血清中濃度を測定すること
によって判定される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
糸球体濾過によるクリアランスの前記減少が、
前記多量体オリゴヌクレオチドを前記対象に投与した後の経時的な前記多量体オリゴヌクレオチドの血清中濃度を表すグラフの曲線下面積を測定すること
によって判定される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
糸球体濾過によるクリアランスの前記減少が、前記多量体オリゴヌクレオチドのインビボでの生物学的利用能を向上させる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
糸球体濾過によるクリアランスの前記減少が、前記多量体オリゴヌクレオチドのインビボでの細胞内取込みを増加させる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
糸球体濾過によるクリアランスの前記減少が、前記多量体オリゴヌクレオチドのインビボでの治療指数／治療率を上昇させる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
サブユニット
2020518552.tif 000547
を含む多量体オリゴヌクレオチドであって、
前記サブユニット
2020518552.tif 000548
の各々が、独立して一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドであり、かつ前記サブユニット
2020518552.tif 000549
の各々が、共有結合リンカー●によって別のサブユニットに連結されており、
前記多量体オリゴヌクレオチドが、糸球体濾過によるそのクリアランスを減少させるように設定された分子量及び／または分子サイズを有し、かつ
前記多量体オリゴヌクレオチドの前記分子量が、少なくとも約４５ｋＤである、
前記多量体オリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
前記多量体オリゴヌクレオチドが含有するサブユニットの個数が、ｍであり、ｍが、糸球体濾過による前記多量体オリゴヌクレオチドのクリアランスを減少させるように設定された前記分子量及び／または分子サイズを前記多量体オリゴヌクレオチドが有することを可能にするように選択される整数である、請求項１６に記載の多量体オリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
構造２１
2020518552.tif 000550
を含む、請求項１６及び請求項１７のいずれか１項に記載の多量体オリゴヌクレオチドであって、
前記サブユニット
2020518552.tif 000551
の少なくとも１つは、
その３’末端に連結された１つの前記共有結合リンカー●と、その５’末端に連結された別の前記共有結合リンカーとを有する、一本鎖
を含み、かつｎが０以上の整数である、
前記多量体オリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
各サブユニット
2020518552.tif 000552
の長さが１５〜３０、１７〜２７、１９〜２６、または２０〜２５ヌクレオチドである、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の多量体オリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
ｎ≧１かつｎ≦１７である、請求項１８に記載の多量体オリゴヌクレオチド。
【請求項２１】
ｎ≧１かつｎ≦５である、請求項１８及び請求項２０のいずれか１項に記載の多量体オリゴヌクレオチド。
【請求項２２】
ｎが１、２、３、４、または５である、請求項１８、請求項２０、及び請求項２１のいずれか１項に記載の多量体オリゴヌクレオチド。
【請求項２３】
各サブユニットが二本鎖ＲＮＡであり、かつｎ≧１である、請求項１８に記載の多量体オリゴヌクレオチド。
【請求項２４】
各サブユニットが一本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項１６〜２２のいずれか１項に記載の多量体オリゴヌクレオチド。
【請求項２５】
各サブユニットが二本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項１６〜２２のいずれか１項に記載の多量体オリゴヌクレオチド。
【請求項２６】
前記サブユニットが、一本鎖オリゴヌクレオチドと二本鎖オリゴヌクレオチドとの組み合わせを含む、請求項１６〜２２のいずれか１項に記載の多量体オリゴヌクレオチド。
【請求項２７】
各サブユニットがＲＮＡ、ＤＮＡ、または人工もしくは非天然型の核酸アナログである、請求項１６〜２２及び請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の多量体オリゴヌクレオチド。
【請求項２８】
１つまたは複数の標的指向性リガンドをさらに含む、請求項１６〜２７のいずれか１項に記載の多量体オリゴヌクレオチド。
【請求項２９】
前記サブユニットの少なくとも１つが標的指向性リガンドである、請求項１６〜２８のいずれか１項に記載の多量体オリゴヌクレオチド。
【請求項３０】
前記標的指向性リガンドがアプタマーである、請求項２８及び請求項２９のいずれか１項に記載の多量体オリゴヌクレオチド。
【請求項３１】
各サブユニットがＲＮＡである、請求項１６〜２２及び請求項２４〜３０のいずれか１項に記載の多量体オリゴヌクレオチド。
【請求項３２】
各サブユニットがｓｉＲＮＡ、ｓａＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡである、請求項１６〜３１のいずれか１項に記載の多量体オリゴヌクレオチド。
【請求項３３】
各サブユニットが二本鎖ｓｉＲＮＡであり、かつ前記共有結合リンカーの各々が前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖同士を連結している、請求項１６〜２３、請求項２５、及び請求項２８〜３２のいずれか１項に記載の多量体オリゴヌクレオチド。
【請求項３４】
前記共有結合リンカー●の１つまたは複数が、切断可能な共有結合リンカーを含む、請求項１６〜３３のいずれか１項に記載の多量体オリゴヌクレオチド。
【請求項３５】
前記切断可能な共有結合リンカーが、酸で切断可能な結合、還元剤で切断可能な結合、生物学的に切断可能な結合、または酵素で切断可能な結合を含有する、請求項３４に記載の多量体オリゴヌクレオチド。
【請求項３６】
前記切断可能な共有結合リンカーが、細胞内条件下で切断可能である、請求項３４及び請求項３５のいずれか１項に記載の多量体オリゴヌクレオチド。
【請求項３７】
各共有結合リンカー●が同じである、請求項１８〜３６のいずれか１項に記載の多量体オリゴヌクレオチド。
【請求項３８】
前記共有結合リンカー●が、２種以上の異なる共有結合リンカーを含む、請求項１８〜３６のいずれか１項に記載の多量体オリゴヌクレオチド。
【請求項３９】
各共有結合リンカー●が、２つの単量体サブユニット
2020518552.tif 000553
を連結している、請求項１６〜３８のいずれか１項に記載の多量体オリゴヌクレオチド。
【請求項４０】
少なくとも１つの共有結合リンカー●が、３つ以上の単量体サブユニット
2020518552.tif 000554
を連結している、請求項１６〜３８のいずれか１項に記載の多量体オリゴヌクレオチド。
【請求項４１】
実質的に同一なサブユニット
2020518552.tif 000555
のホモ多量体を含む、請求項１６〜４０のいずれか１項に記載の多量体オリゴヌクレオチド。
【請求項４２】
２種以上の実質的に異なるサブユニット
2020518552.tif 000556
のヘテロ多量体を含む、請求項１６〜４０のいずれか１項に記載の多量体オリゴヌクレオチド。
【請求項４３】
少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％純粋である、請求項１６〜４２のいずれか１項に記載の多量体オリゴヌクレオチド。
【請求項４４】
各サブユニット
2020518552.tif 000557
が、独立して二本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000558
であり、かつｎが１以上の整数である、請求項１８に記載の多量体オリゴヌクレオチド。
【請求項４５】
各サブユニット
2020518552.tif 000559
が、独立して二本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000560
であり、ｎが１以上の整数であり、かつ各共有結合リンカー●が同一鎖上にある、請求項１８に記載の多量体オリゴヌクレオチド：
2020518552.tif 000561
ここで、ｄは１以上の整数である。
【請求項４６】
構造２２または構造２３
2020518552.tif 000562
を含む、請求項１７に記載の多量体オリゴヌクレオチドであって、
各
2020518552.tif 000563
は二本鎖オリゴヌクレオチドであり、各●は、隣接する二本鎖オリゴヌクレオチド同士を連結している共有結合リンカーであり、ｆは１以上の整数であり、かつｇは０以上の整数である、
前記多量体オリゴヌクレオチド。
【請求項４７】
構造５１
2020518552.tif 000564
を含む多量体オリゴヌクレオチドを合成する方法であって、
ここで、各
2020518552.tif 000565
は一本鎖オリゴヌクレオチドであり、各●は、隣接する一本鎖オリゴヌクレオチド同士を連結している共有結合リンカーであり、かつａは１以上の整数であり、
以下のステップを含む、前記方法：
（ｉ）
2020518552.tif 000566
と、
2020518552.tif 000567
とを反応させ、
ここで、○は結合部分であり、Ｒ１は、前記結合部分○と反応することができる化学基であり、ｂ及びｃは各々独立して０以上の整数であり、ｂ及びｃが両方とも同時に０であることはできず、かつｂ＋ｃ＝ａであり、
それによって構造５１
2020518552.tif 000568
を形成するステップ、ならびに
（ｉｉ）任意で、構造５１
2020518552.tif 000569
を相補的一本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000570
とアニーリングさせ、それによって構造５４
2020518552.tif 000571
を形成するステップ。
【請求項４８】
構造５４
2020518552.tif 000572
を含む多量体オリゴヌクレオチドを合成する方法であって、
ここで、各
2020518552.tif 000573
は一本鎖オリゴヌクレオチドであり、各●は、隣接する一本鎖オリゴヌクレオチド同士を連結している共有結合リンカーであり、かつａは１以上であり、
以下のステップを含む、前記方法：（ｉ）構造５１
2020518552.tif 000574
を相補的一本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000575
とアニーリングさせ、それによって構造５４
2020518552.tif 000576
を形成するステップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１７年２月６日に出願された米国仮特許出願第６２／４５５，２３１号、２０１７年１月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／５２２，３６３号、及び２０１７年９月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／５６１，８５３号の利益を主張するものであり、参照によりそれらの開示内容の全体を本明細書に援用する。
【０００２】
配列表
本願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子提出された配列表を含み、これをもって参照によりその全体を援用する。上記ＡＳＣＩＩコピーは２０１８年２月５日に作成され、名前は１１６２４４＿６０４＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔであり、サイズは２４，８２８バイトである。
【０００３】
発明の分野
本発明は、改善された薬力学及び／または薬理動態を有する多量体オリゴヌクレオチド、ならびにそのような多量体オリゴヌクレオチドを対象に投与する方法に関する。例えば、本発明の多量体オリゴヌクレオチドは、少なくとも約４５ｋＤの分子量、及び／またはその腎クリアランスの低減をもたらす他の特質を有し得る。
【背景技術】
【０００４】
背景
今日においてオリゴヌクレオチドは、複数の用途（例えばＲＮＡ干渉すなわちＲＮＡｉ）を有し治験が続けられている十分に確立された部類の治療薬である。しかしながら、多くの因子、例えば、標的細胞へのオリゴヌクレオチドの送達、及びそれに続く標的細胞内へのオリゴヌクレオチドの内在化がオリゴヌクレオチド治療薬を未だに制限している。
【０００５】
これらの送達及び内在化の限界に対処しようと多くの関係者達が脂質ナノ粒子（ＬＮＰ、例えば脂質球状体、例えば、オリゴヌクレオチドの負電荷を中和し標的細胞との結合及び内在化を容易にする正に帯電した脂質）を研究してきた。ＬＮＰは、いくつかの事例では送達及び内在化を容易にするが、大きな欠点に悩まされ、例えば、標的指向性及び毒性が好ましくなく、結果として治療的機会が狭くなる。
【０００６】
ＬＮＰの限界が少なくとも部分的にもととなって、特定細胞表面受容体を指向するリガンドも研究されてきた。１つのそのようなリガンドであるＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）の使用は、肝細胞にオリゴヌクレオチドを送達するために選ばれる方法となった。しかしながら、ＧａｌＮＡｃ複合体は毒物学的プロファイルがＬＮＰよりも良好であり得るが、送達がそれほど効率的でない。この限界は投薬量の増加、大抵においては１桁分以上の増加を必要にする。増加した投薬量は毒性、副作用及び／または費用ゆえに望ましくないことがある。
【０００７】
したがって、従来技術のこれら及びその他の手法はオリゴヌクレオチド送達の課題及び限界を完全には解決しない。このため、改良されたオリゴヌクレオチド組成物は必要とされ続けている。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、共有結合リンカーによって連結されたオリゴヌクレオチドの単量体サブユニットを有する多量体オリゴヌクレオチドの形態のオリゴヌクレオチドを対象に投与する方法に関する。本発明の多量体オリゴヌクレオチドは、分子量が少なくとも約４５ｋＤであり、糸球体濾過によるそのクリアランスが低減されるように構成される。本発明はさらに、多量体オリゴヌクレオチド、及び多量体オリゴヌクレオチドを合成する方法に関する。例えば、典型的なｓｉＲＮＡ（例えば、二本鎖単量体）が約１５ｋＤの分子量及び比較的短い循環半減期（例えば、尿素またはグルコースに類似した糸球体濾過速度）を有し得るのに対し、本発明に係るオリゴヌクレオチド多量体は少なくとも約４５ｋＤの分子量及び比較的より長い循環半減期（例えば、糸球体濾過速度による、より小さいクリアランス速度）を有し得る。本発明に係る多量体の向上した有益な特性は、インビボでの循環半減期の増加に関して表現されることができる。それはまた、インビボでの活性の増加に関して表現されてもよい。
【０００９】
多重複合体（「多量体オリゴヌクレオチド」または「多量体」とも呼ぶ）はさらに、標的指向性リガンドと組み合わされた場合、リガンド／受容体結合事象１回あたりに送達することができる搭載負荷が単量体の等価体に比べてより多い。本発明はさらに、新規合成中間体、及び多重複合体オリゴヌクレオチドを合成する方法に関する。本発明はさらに、多重複合体オリゴヌクレオチドを、例えば遺伝子発現の低減、生物学的研究、病状の治療もしくは予防、及び／または新規なもしくは改変された表現型を生むことのために使用する方法に関する。
【００１０】
様々な態様において、本発明は、多量体オリゴヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与する方法であって、当該方法は、有効量の多量体オリゴヌクレオチドを対象に投与することを含み、
多量体オリゴヌクレオチドが、サブユニット
2020518552.tif 000003
を含み、
サブユニット
2020518552.tif 000004
の各々が、独立して一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドであり、サブユニット
2020518552.tif 000005
の各々が、共有結合リンカー●によって別のサブユニットに連結されており、
多量体オリゴヌクレオチドが、糸球体濾過によるそのクリアランスを減少させるように設定された分子量及び／または分子サイズを有し、
多量体オリゴヌクレオチドの分子量が、少なくとも約４５ｋＤである、
当該方法を提供する。
【００１１】
様々な態様において、本発明は、サブユニット
2020518552.tif 000006
を含む多量体オリゴヌクレオチドであって、
サブユニット
2020518552.tif 000007
の各々が、独立して一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドであり、サブユニット
2020518552.tif 000008
の各々が、共有結合リンカー●によって別のサブユニットに連結されており、
多量体オリゴヌクレオチドが、糸球体濾過によるそのクリアランスを減少させるように設定された分子量及び／または分子サイズを有し、
多量体オリゴヌクレオチドの分子量が、少なくとも約４５ｋＤである、当該多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【００１２】
様々な態様において、本発明は、構造５１
2020518552.tif 000009
〔ここで、各
2020518552.tif 000010
は一本鎖オリゴヌクレオチドであり、各●は、隣接する一本鎖オリゴヌクレオチド同士を連結している共有結合リンカーであり、ａは１以上の整数である〕
を含む多量体オリゴヌクレオチドを合成する方法であって、
（ｉ）
2020518552.tif 000011
と、
2020518552.tif 000012
と
〔ここで、○は結合部分であり、Ｒ１は、結合部分○と反応することができる化学基であり、ｂ及びｃは各々独立して０以上の整数であり、ｂ及びｃが両方とも同時に０であることはできず、ｂ＋ｃ＝ａである〕
を反応させ、それによって構造５１
2020518552.tif 000013
を形成するステップ、及び
（ｉｉ）任意で、構造５１
2020518552.tif 000014
を相補的一本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000015
とアニーリングさせ、それによって構造５４
2020518552.tif 000016
を形成するステップ
を含む、当該方法を提供する。
【００１３】
様々な態様において、本発明は、構造５４
2020518552.tif 000017
〔ここで、各
2020518552.tif 000018
は一本鎖オリゴヌクレオチドであり、各●は、隣接する一本鎖オリゴヌクレオチド同士を連結している共有結合リンカーであり、ａは１以上である〕
を含む多量体オリゴヌクレオチドを合成する方法であって、
（ｉ）構造５１
2020518552.tif 000019
を相補的一本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000020
とアニーリングさせ、それによって構造５４
2020518552.tif 000021
を形成するステップ
を含む、当該方法を提供する。
【００１４】
様々な態様において、本発明は、構造２１
2020518552.tif 000022
〔ここで、各
2020518552.tif 000023
は一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドであり、各●は、隣接するオリゴヌクレオチド同士を連結している共有結合リンカーであり、ｍは０以上の整数である〕
を含む多量体オリゴヌクレオチドであって、
インビボでの糸球体濾過を減少させるように設定された分子サイズ及び／または分子量を有する、当該多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【００１５】
様々な態様において、本発明は、構造２２または構造２３
2020518552.tif 000024
〔ここで、各
2020518552.tif 000025
は二本鎖オリゴヌクレオチドであり、各●は、隣接するオリゴヌクレオチドの一本鎖同士を連結している共有結合リンカーであり、ｍは１以上の整数であり、ｎは０以上の整数である〕
を含む多量体オリゴヌクレオチドであって、インビボでの糸球体濾過を減少させるように設定された分子サイズ及び／または分子量を有する、当該多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【００１６】
様々な態様において、本発明は複数の上記多量体オリゴヌクレオチドを提供し、この場合、実質的に全ての多量体オリゴヌクレオチドが、インビボでの糸球体濾過を減少させるように設定された分子サイズ及び／または分子量を有する。
【００１７】
様々な態様において、本発明は複数の上記多量体オリゴヌクレオチドを提供し、この場合、実質的に全ての多量体オリゴヌクレオチドが所定のｍまたはｎの値を有する。
【００１８】
様々な態様において、本発明は複数の上記多量体オリゴヌクレオチドを提供し、この場合、実質的に全ての多量体オリゴヌクレオチドが、同じｍまたはｎの値を有する定義された多量体（例えば多重複合体）である。
【００１９】
様々な態様において、本発明は複数の上記多量体オリゴヌクレオチドを提供し、この場合、実質的に全ての多量体オリゴヌクレオチドが、定義された四量体（ｍ＝１）（例えば四重複合体）である。
【００２０】
様々な態様において、本発明は複数の上記多量体オリゴヌクレオチドを提供し、この場合、実質的に全ての多量体オリゴヌクレオチドが、定義された五量体（例えば五重複合体）であるかまたはそれよりも長い（ｍ＞１またはｎ≧１）。
【００２１】
様々な態様において、本発明は、本発明の多量体オリゴヌクレオチドと薬学的に許容される賦形剤とを含む組成物を提供する。
【００２２】
様々な態様において、本発明は、本発明の多量体オリゴヌクレオチド、または本発明の多量体オリゴヌクレオチドを含む組成物を、それを必要とする対象に有効量投与することを含む、遺伝子発現を減少させる方法を提供する。
【００２３】
様々な態様において、本発明は、本発明の多量体オリゴヌクレオチド、または本発明の多量体オリゴヌクレオチドを含む組成物を、それを必要とする対象に有効量投与することを含む、対象を処置する方法を提供する。
【００２４】
様々な態様において、本発明は、構造２２または構造２３
2020518552.tif 000026
〔ここで、各
2020518552.tif 000027
は二本鎖オリゴヌクレオチドであり、各●は、隣接するオリゴヌクレオチドの一本鎖同士を連結している共有結合リンカーであり、ｍは１以上の整数であり、ｎは０以上の整数である〕
を含む多量体オリゴヌクレオチドを合成する方法であって、
（ｉ）第１一本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000028
と、結合部分を含む相補的第２一本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000029
とをアニーリングさせ、それによって
2020518552.tif 000030
を形成するステップ；
（ｉｉ）
2020518552.tif 000031
を、第３一本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000032
〔ここで、Ｒ１は、結合部分○と反応することができる化学基である〕
と反応させ、それによって［エラー！フィールドコードの編集からオブジェクトを作成できません。］を形成するステップ；
（ｉｉｉ）［エラー！フィールドコードの編集からオブジェクトを作成できません。］と、結合部分を含む第４相補的一本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000033
とをアニーリングさせ、それによって
2020518552.tif 000034
を形成するステップ；
（ｉｖ）
2020518552.tif 000035
と第５一本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000036
とを反応させ、それによって
2020518552.tif 000037
を形成するステップ
（ｖ）
2020518552.tif 000038
と、結合部分を含む第６相補的一本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000039
とをアニーリングさせ、それによって
2020518552.tif 000040
を形成するステップ；
（ｖｉ）
2020518552.tif 000041
と、第７一本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000042
とを反応させ、それによって
2020518552.tif 000043
を形成するステップ；
（ｖｉｉ）任意で、（ａ）結合部分を含む追加一本鎖オリゴヌクレオチド（複数可）
2020518552.tif 000044
及び（ｂ）一本鎖オリゴヌクレオチド（複数可）
2020518552.tif 000045
を１つまたは複数アニーリングさせ、それによって
2020518552.tif 000046
〔ここで、ｍは２以上の整数である〕
または
2020518552.tif 000047
〔ここで、ｎは１以上の整数である〕
を形成するステップ；ならびに
（ｖｉｉｉ）最終相補的一本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000048
を構造２４、構造２５または構造２６とアニーリングさせ、それによって構造２２または構造２３を含む多量体オリゴヌクレオチドを形成するステップ
を含む、当該方法を提供する。
【００２５】
本発明はさらに、構造２４、構造２５、構造２６または構造２７を含む多量体オリゴヌクレオチドを提供する：
2020518552.tif 000049
。
ここで、各
2020518552.tif 000050
は二本鎖オリゴヌクレオチドであり、各●は、隣接する一本鎖オリゴヌクレオチドの一本鎖同士を連結している共有結合リンカーであり、各○は結合部分であり、ｍは１以上の整数であり、ｎは１以上の整数である。
【００２６】
様々な態様において、本発明は、構造２１
2020518552.tif 000051
を含む多量体オリゴヌクレオチドであって、各単量体サブユニット
2020518552.tif 000052
が、独立して一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドであり、ｍが１以上の整数であり、各●が、隣接する単量体サブユニット
2020518552.tif 000053
同士を連結している共有結合リンカーであり、単量体サブユニット
2020518552.tif 000054
の少なくとも１つは、
その３’末端に連結された１つの共有結合リンカー●と、その５’末端に連結された別の共有結合リンカーとを有する、一本鎖
を含む、当該多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【００２７】
様々な態様において、本発明は、構造２１
2020518552.tif 000055
を含む多量体オリゴヌクレオチドであって、各単量体サブユニット
2020518552.tif 000056
が、独立して一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドであり、各●が、隣接する単量体サブユニット
2020518552.tif 000057
同士を連結している共有結合リンカーであり、ｍが、（ａ）多量体オリゴヌクレオチドのインビボでの循環半減期が個々の単量体サブユニット
2020518552.tif 000058
のそれに比べて増加するように及び／または（ｂ）多量体オリゴヌクレオチドのインビボでの活性が個々の単量体サブユニット
2020518552.tif 000059
のそれに比べて増加するように選択される０以上の整数である、当該多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【００２８】
構造２１
2020518552.tif 000060
〔ここで、各単量体サブユニット
2020518552.tif 000061
は独立して一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドであり、各●は、隣接する単量体サブユニット
2020518552.tif 000062
同士を連結している共有結合リンカーであり、ｍは０以上の整数である〕
を含む多量体オリゴヌクレオチドであって、
（ａ）多量体オリゴヌクレオチドのインビボでの循環半減期が個々の単量体サブユニット
2020518552.tif 000063
のそれに比べて増加するように及び／または（ｂ）多量体オリゴヌクレオチドのインビボでの活性が個々の単量体サブユニット
2020518552.tif 000064
のそれに比べて増加するように設定された分子サイズ及び／または分子量
を有する、当該多量体オリゴヌクレオチド。
【００２９】
１つもしくは複数のオリゴヌクレオチドのインビボでの循環半減期及び／またはインビボでの活性を増加させる方法であって、当該方法は、構造２１
2020518552.tif 000065
を含む多量体オリゴヌクレオチドの形態である１つまたは複数のオリゴヌクレオチドを対象に投与することを含み、
各単量体サブユニット
2020518552.tif 000066
が、独立して一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドであり、各●が、隣接する単量体サブユニット
2020518552.tif 000067
同士を連結している共有結合リンカーであり、ｍが、（ａ）多量体オリゴヌクレオチドのインビボでの循環半減期が個々の単量体サブユニット
2020518552.tif 000068
のそれに比べて増加するように及び／または（ｂ）多量体オリゴヌクレオチドのインビボでの活性が個々の単量体サブユニット
2020518552.tif 000069
のそれに比べて増加するように選択される０以上の整数である、
当該方法。
【００３０】
１つもしくは複数のオリゴヌクレオチドのインビボでの循環半減期及び／またはインビボでの活性を増加させる方法であって、当該方法は、構造２１
2020518552.tif 000070
〔ここで、各単量体サブユニット
2020518552.tif 000071
は独立して一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドであり、各●は、隣接する単量体サブユニット
2020518552.tif 000072
同士を連結している共有結合リンカーであり、ｍは０以上の整数である〕
を含む多量体オリゴヌクレオチドの形態である１つまたは複数のオリゴヌクレオチドを対象に投与することを含み、
多量体オリゴヌクレオチドが、
（ａ）多量体オリゴヌクレオチドのインビボでの循環半減期が個々の単量体サブユニット
2020518552.tif 000073
のそれに比べて増加するように及び／または（ｂ）多量体オリゴヌクレオチドのインビボでの活性が個々の単量体サブユニット
2020518552.tif 000074
のそれに比べて増加するように設計された分子サイズ及び／または分子量
を有する、
当該方法。
【００３１】
様々な態様において、本発明は、本明細書に記載の多量体オリゴヌクレオチドと、薬学的に許容される賦形剤とを含む組成物を提供する。
【００３２】
様々な態様において、本発明は、本発明に記載の多量体オリゴヌクレオチドを、それを必要とする対象に有効量投与することを含む、遺伝子発現を減少させる方法を提供する。
【００３３】
様々な態様において、本発明は、有効量の多量体オリゴヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与することを含む、対象を処置する方法を提供する。
【００３４】
様々な態様において、本発明は、ｍ個の単量体サブユニット
2020518552.tif 000075
を含む多量体オリゴヌクレオチドであって、単量体サブユニット
2020518552.tif 000076
の各々が、独立して一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドであり、単量体サブユニット
2020518552.tif 000077
の各々が、共有結合リンカー●によって別の単量体サブユニットに連結されており、ｍが、（ａ）多量体オリゴヌクレオチドのインビボでの循環半減期が個々の単量体サブユニット
2020518552.tif 000078
のそれに比べて増加するように及び／または（ｂ）多量体オリゴヌクレオチドのインビボでの活性が個々の単量体サブユニット
2020518552.tif 000079
のそれに比べて増加するように選択される３以上の整数である、当該多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【００３５】
様々な態様において、本発明は、ｍ個の単量体サブユニット
2020518552.tif 000080
を含む多量体オリゴヌクレオチドであって、単量体サブユニット
2020518552.tif 000081
の各々が、独立して一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドであり、単量体サブユニット
2020518552.tif 000082
の各々が、共有結合リンカー●によって別の単量体サブユニットに連結されており、ｍが３以上の整数であり、多量体オリゴヌクレオチドが、（ａ）多量体オリゴヌクレオチドのインビボでの循環半減期が個々の単量体サブユニット
2020518552.tif 000083
のそれに比べて増加するように及び／または（ｂ）多量体オリゴヌクレオチドのインビボでの活性が個々の単量体サブユニット
2020518552.tif 000084
のそれに比べて増加するように設定された分子サイズ及び／または分子量を有する、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【００３６】
様々な態様において、本発明は、構造３４
2020518552.tif 000085
〔ここで、各
2020518552.tif 000086
は一本鎖オリゴヌクレオチドであり、各●は、隣接する一本鎖オリゴヌクレオチド同士を連結している共有結合リンカーである〕
を含む多量体オリゴヌクレオチドを合成する方法であって、
（ｉ）
2020518552.tif 000087
と、
2020518552.tif 000088
と
〔ここで、○は結合部分であり、Ｒ１は、結合部分○と反応することができる化学基である〕
を反応させ、それによって
2020518552.tif 000089
を形成するステップ、及び
（ｉｉ）任意で、
2020518552.tif 000090
を相補的一本鎖オリゴヌクレオチドとアニーリングさせ、それによって
2020518552.tif 000091
を形成するステップ
を含む、当該方法を提供する。
【００３７】
様々な態様において、本発明は、構造３５
2020518552.tif 000092
〔ここで、各
2020518552.tif 000093
は一本鎖オリゴヌクレオチドであり、各●は、隣接する一本鎖オリゴヌクレオチド同士を連結している共有結合リンカーである〕
を含む多量体オリゴヌクレオチドを合成する方法であって、
（ｉ）
2020518552.tif 000094
と、
2020518552.tif 000095
と
〔ここで、○は結合部分であり、Ｒ１は、結合部分○と反応することができる化学基である〕
を反応させ、それによって
2020518552.tif 000096
を形成するステップ、及び
（ｉｉ）任意で、
2020518552.tif 000097
を相補的一本鎖オリゴヌクレオチドとアニーリングさせ、それによって
2020518552.tif 000098
を形成するステップ
を含む、当該方法を提供する。
【００３８】
様々な態様において、本発明は、構造３７
2020518552.tif 000099
〔ここで、各
2020518552.tif 000100
は一本鎖オリゴヌクレオチドであり、各●は、隣接する一本鎖オリゴヌクレオチド同士を連結している共有結合リンカーである〕
を含む多量体オリゴヌクレオチドを合成する方法であって、
（ｉ）
2020518552.tif 000101
と、
2020518552.tif 000102
と
〔ここで、○は結合部分であり、Ｒ１は、結合部分○と反応することができる化学基である〕
を反応させ、それによって
2020518552.tif 000103
を形成するステップ、及び
（ｉｉ）任意で、
2020518552.tif 000104
を相補的一本鎖オリゴヌクレオチドとアニーリングさせ、それによって
2020518552.tif 000105
を形成するステップ
を含む、当該方法を提供する。
【００３９】
当業者であれば、本発明のこれら及びその他の態様を、本明細書に記載の１つまたは複数の好適な特徴と組み合わせることができるということを認識するであろう。
【００４０】
様々な実施形態において、本発明の多量体オリゴヌクレオチド、例えば構造２１を含むものは、少なくとも約４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４または６５ｋＤの分子量を有する。
【００４１】
様々な実施形態において、構造２１を含むものを含めて本発明の多量体オリゴヌクレオチドは、少なくとも約４０〜４５、４５〜５０、５０〜５５、５５〜６０、６０〜６５、６５〜７０、または７０〜７５ｋＤの分子量を有する。
【００４２】
一態様では、本発明は、多量体オリゴヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与する方法であって、多量体オリゴヌクレオチドが含有するサブユニットの個数が、ｍであり、ｍが、糸球体濾過による多量体オリゴヌクレオチドのクリアランスを減少させるように設定された分子量及び／または分子サイズを多量体オリゴヌクレオチドが有することを可能にするように選択される整数である、当該方法を提供する。様々な態様において、ｍは例えば、（ｉ）２以上、（ｉｉ）３以上、（ｉｉｉ）４以上、（ｉｖ）４以上かつ１７以下、（ｖ）４以上かつ８以下、または（ｖｉ）４、５、６、７もしくは８である。
【００４３】
一態様では、本発明は、多量体オリゴヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与する方法であって、多量体オリゴヌクレオチドが構造２１
2020518552.tif 000106
を含み、ｎが０以上の整数である、当該方法を提供する。
【００４４】
一態様では、本発明は、多量体オリゴヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与する方法であって、サブユニットが一本鎖オリゴヌクレオチドである、当該方法を提供する。
【００４５】
一態様では、本発明は、多量体オリゴヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与する方法であって、ｎが１以上である、当該方法を提供する。
【００４６】
一態様では、本発明は、多量体オリゴヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与する方法であって、サブユニットが二本鎖オリゴヌクレオチドである、当該方法を提供する。
【００４７】
一態様では、本発明は、多量体オリゴヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与する方法であって、
ｎ＝０の場合、糸球体濾過による多量体オリゴヌクレオチドのクリアランスが、多量体オリゴヌクレオチドの単量体サブユニット
2020518552.tif 000107
及び／または二量体サブユニット
2020518552.tif 000108
のそれに比べて減少し、
ｎ≧１の場合、糸球体濾過による多量体オリゴヌクレオチドのクリアランスが、多量体オリゴヌクレオチドの単量体サブユニット
2020518552.tif 000109
、二量体サブユニット
2020518552.tif 000110
及び／または三量体サブユニット
2020518552.tif 000111
のそれに比べて減少する、当該方法を提供する。
【００４８】
一態様では、本発明は、多量体オリゴヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与する方法であって、糸球体濾過によるクリアランスの減少が多量体オリゴヌクレオチドのインビボでの循環半減期を増加させる、当該方法を提供する。
【００４９】
一態様では、本発明は、多量体オリゴヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与する方法であって、糸球体濾過によるクリアランスの減少が、多量体オリゴヌクレオチドを対象に投与した後に多量体オリゴヌクレオチドのインビボでの循環半減期を測定することによって判定される、当該方法を提供する。
【００５０】
一態様では、本発明は、多量体オリゴヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与する方法であって、糸球体濾過によるクリアランスの減少が、多量体オリゴヌクレオチドの血清中濃度が所定値にまで減少するのに要する時間を測定することによって判定される、当該方法を提供する。
【００５１】
一態様では、本発明は、多量体オリゴヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与する方法であって、糸球体濾過によるクリアランスの減少が、多量体オリゴヌクレオチドを対象に投与した後の所定時に多量体オリゴヌクレオチドの血清中濃度を測定することによって判定される、当該方法を提供する。
【００５２】
一態様では、本発明は、多量体オリゴヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与する方法であって、糸球体濾過によるクリアランスの減少が、多量体オリゴヌクレオチドを対象に投与した後の経時的な多量体オリゴヌクレオチドの血清中濃度を表すグラフの曲線下面積を測定することによって判定される、当該方法を提供する。
【００５３】
一態様では、本発明は、多量体オリゴヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与する方法であって、糸球体濾過によるクリアランスの減少が多量体オリゴヌクレオチドのインビボでの生物学的利用能を向上させる、当該方法を提供する。
【００５４】
一態様では、本発明は、多量体オリゴヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与する方法であって、糸球体濾過によるクリアランスの減少が多量体オリゴヌクレオチドのインビボでの細胞内取込みを増加させる、当該方法を提供する。
【００５５】
一態様では、本発明は、多量体オリゴヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与する方法であって、糸球体濾過によるクリアランスの減少が多量体オリゴヌクレオチドのインビボでの治療指数／治療率を上昇させる、当該方法を提供する。
【００５６】
一態様では、本発明は、サブユニット
2020518552.tif 000112
を含む多量体オリゴヌクレオチドであって、多量体オリゴヌクレオチドが含有するサブユニットの個数が、ｍであり、ｍが、糸球体濾過による多量体オリゴヌクレオチドのクリアランスを減少させるように設定された分子量及び／または分子サイズを多量体オリゴヌクレオチドが有することを可能にするように選択される整数である、当該多量体オリゴヌクレオチドを提供する。様々な態様において、ｍは例えば、（ｉ）２以上、（ｉｉ）３以上、（ｉｉｉ）４以上、（ｉｖ）４以上かつ１７以下、（ｖ）４以上かつ８以下、または（ｖｉ）４、５、６、７もしくは８である。
【００５７】
一態様では、本発明は、構造２１
2020518552.tif 000113
を含む多量体オリゴヌクレオチドであって、サブユニット
2020518552.tif 000114
の少なくとも１つは、
その３’末端に連結された１つの共有結合リンカー●と、その５’末端に連結された別の共有結合リンカーとを有する、一本鎖
を含み、ｎが０以上の整数である、当該多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【００５８】
一態様では、本発明は、サブユニット
2020518552.tif 000115
を含む多量体オリゴヌクレオチドであって、各サブユニット
2020518552.tif 000116
の長さが１５〜３０、１７〜２７、１９〜２６または２０〜２５ヌクレオチドである、当該多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【００５９】
一態様では、本発明は、ｎ≧１かつｎ≦１７である多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【００６０】
一態様では、本発明は、ｎ≧１かつｎ≦５である多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【００６１】
一態様では、本発明は、ｎが例えば１、２、３、４または５である多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【００６２】
一態様では、本発明は、各サブユニットが二本鎖ＲＮＡであり、ｎ≧１である、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【００６３】
一態様では、本発明は、各サブユニットが一本鎖オリゴヌクレオチドである多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【００６４】
一態様では、本発明は、各サブユニットが二本鎖オリゴヌクレオチドである多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【００６５】
一態様では、本発明は、サブユニットが一本鎖オリゴヌクレオチドと二本鎖オリゴヌクレオチドとの組み合わせを含む、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【００６６】
一態様では、本発明は、各サブユニットがＲＮＡ、ＤＮＡ、または人工もしくは非天然型の核酸アナログである、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【００６７】
一態様では、本発明は、多量体オリゴヌクレオチドが１つまたは複数の標的指向性リガンドをさらに含む、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【００６８】
一態様では、本発明は、サブユニットの少なくとも１つが標的指向性リガンドである多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【００６９】
一態様では、本発明は、標的指向性リガンドがアプタマーである多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【００７０】
一態様では、本発明は、各サブユニットがＲＮＡである、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【００７１】
一態様では、本発明は、各サブユニットがｓｉＲＮＡ、ｓａＲＮＡまたはｍｉＲＮＡである多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【００７２】
一態様では、本発明は、各サブユニットが二本鎖ｓｉＲＮＡであり、共有結合リンカーの各々がｓｉＲＮＡのセンス鎖同士を連結している、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【００７３】
一態様では、本発明は、共有結合リンカー●の１つまたは複数が、切断可能な共有結合リンカーを含む、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【００７４】
一態様では、本発明は、切断可能な共有結合リンカーが、酸で切断可能な結合、還元剤で切断可能な結合、生物学的に切断可能な結合、または酵素で切断可能な結合を含有する、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【００７５】
一態様では、本発明は、切断可能な共有結合リンカーが、細胞内条件下で切断可能である、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【００７６】
一態様では、本発明は、各共有結合リンカー●が同じである多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【００７７】
一態様では、本発明は、共有結合リンカー●が、２種以上の異なる共有結合リンカーを含む、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【００７８】
一態様では、本発明は、各共有結合リンカー●が、２つの単量体サブユニット
2020518552.tif 000117
を連結している、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【００７９】
一態様では、本発明は、少なくとも１つの共有結合リンカー●が、３つ以上の単量体サブユニット
2020518552.tif 000118
を連結している、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【００８０】
一態様では、本発明は、実質的に同一なサブユニット
2020518552.tif 000119
のホモ多量体を含む、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【００８１】
一態様では、本発明は、２種以上の実質的に異なるサブユニット
2020518552.tif 000120
のヘテロ多量体を含む、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【００８２】
一態様では、本発明は、少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００％純粋である、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【００８３】
一態様では、本発明は、各サブユニット
2020518552.tif 000121
が、独立して二本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000122
であり、ｎが１以上の整数である、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【００８４】
一態様では、本発明は、各サブユニット
2020518552.tif 000123
が、独立して二本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000124
であり、ｎが１以上の整数であり、各共有結合リンカー●が同一鎖上にある、多量体オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000125
〔ここで、ｄは１以上の整数である〕
を提供する。
【００８５】
一態様では、本発明は、構造２２または構造２３
2020518552.tif 000126
〔ここで、各
2020518552.tif 000127
は二本鎖オリゴヌクレオチドであり、各●は、隣接する二本鎖オリゴヌクレオチド同士を連結している共有結合リンカーであり、ｆは１以上の整数であり、ｇは０以上の整数である〕
を含む多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【００８６】
一態様では、本発明は、糸球体濾過の減少が、多量体オリゴヌクレオチドの単量体、二量体及び／または三量体オリゴヌクレオチドサブユニットの糸球体濾過の速度に対するものである、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【００８７】
一態様では、本発明は、糸球体濾過の減少が多量体オリゴヌクレオチドのインビボでの循環半減期を増加させる、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【００８８】
一態様では、本発明は、糸球体濾過の減少が多量体オリゴヌクレオチドのインビボでの生物学的利用能を向上させる、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【００８９】
一態様では、本発明は、糸球体濾過の減少が多量体オリゴヌクレオチドのインビボでの細胞内取込みを増加させる、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【００９０】
一態様では、本発明は、糸球体濾過の減少が多量体オリゴヌクレオチドのインビボでの治療指数／治療率を上昇させる、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【００９１】
一態様では、本発明は、各オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000128
が一本鎖オリゴヌクレオチドである、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【００９２】
一態様では、本発明は、各オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000129
が二本鎖オリゴヌクレオチドである、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【００９３】
一態様では、本発明は、オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000130
が一本鎖オリゴヌクレオチドと二本鎖オリゴヌクレオチドとの組み合わせを含む、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【００９４】
一態様では、本発明は、実質的に同一なオリゴヌクレオチドのホモ多量体を含む、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【００９５】
一態様では、本発明は、実質的に同一なオリゴヌクレオチドが各々、インビボで同じ分子標的を指向するｓｉＲＮＡを含む、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【００９６】
一態様では、本発明は、２種以上の実質的に異なるオリゴヌクレオチドのヘテロ多量体を含む多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【００９７】
一態様では、本発明は、実質的に異なるオリゴヌクレオチドが各々、インビボで異なる分子標的を指向するｓｉＲＮＡを含む、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【００９８】
一態様では、本発明は、多量体オリゴヌクレオチドがＰＥＧを含まない、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【００９９】
一態様では、本発明は、標的指向性リガンドをさらに含む多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【０１００】
一態様では、本発明は、標的指向性リガンドがオリゴヌクレオチドと複合体化している、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【０１０１】
一態様では、本発明は、標的指向性リガンドが、当該オリゴヌクレオチドの３’または５’末端を介して当該オリゴヌクレオチドと複合体化している、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【０１０２】
一態様では、本発明は、各共有結合リンカー●が同じである、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【０１０３】
一態様では、本発明は、２種以上の異なる共有結合リンカー●を含む多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【０１０４】
一態様では、本発明は、●の１つまたは複数が、切断可能な共有結合リンカーを含む、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【０１０５】
一態様では、本発明は、化合物が少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００％純粋である、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【０１０６】
一態様では、本発明は、各オリゴヌクレオチドがＲＮＡである、ＤＮＡである、または人工もしくは非天然型の核酸アナログを含む、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【０１０７】
一態様では、本発明は、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡである、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【０１０８】
一態様では、本発明は、各オリゴヌクレオチドの長さが１５〜３０、１７〜２７、１９〜２６または２０〜２５ヌクレオチドである多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【０１０９】
一態様では、本発明は、標的指向性リガンドを、構造２２または構造２３を含む多量体オリゴヌクレオチドと複合体化させるステップをさらに含む、多量体オリゴヌクレオチドを合成する方法を提供する。
【０１１０】
一態様では、本発明は、標的指向性リガンドを第１一本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000131
と複合体化させるステップをさらに含む、多量体オリゴヌクレオチドを合成する方法を提供する。
【０１１１】
一態様では、本発明は、ｍが例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２である、多量体オリゴヌクレオチドを合成する方法を提供する。
【０１１２】
一態様では、本発明は、単量体サブユニット
2020518552.tif 000132
の各々がｓｉＲＮＡを含み、共有結合リンカーの各々がｓｉＲＮＡのセンス鎖同士を連結している、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【０１１３】
一態様では、本発明は、共有結合リンカー●の各々が、２つの単量体サブユニット
2020518552.tif 000133
を連結している、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【０１１４】
一態様では、本発明は、共有結合リンカー●の少なくとも１つが、３つ以上の単量体サブユニット
2020518552.tif 000134
を連結している、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【０１１５】
一態様では、本発明は、各単量体サブユニット
2020518552.tif 000135
が、独立して二本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000136
であり、ｍが１である、多量体オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000137
を提供する。
【０１１６】
一態様では、本発明は、各単量体サブユニット
2020518552.tif 000138
が、独立して二本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000139
であり、ｍが１であり、各共有結合リンカー●が同一鎖上にある、多量体オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000140
を提供する。
【０１１７】
一態様では、本発明は、各単量体サブユニット
2020518552.tif 000141
が、独立して二本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000142
であり、ｍが２である、多量体オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000143
を提供する。
【０１１８】
一態様では、本発明は、各単量体サブユニット
2020518552.tif 000144
が、独立して二本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000145
であり、ｍが２であり、各共有結合リンカー●が同一鎖上にある、多量体オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000146
を提供する。
【０１１９】
一態様では、本発明は、各単量体サブユニット
2020518552.tif 000147
が、独立して二本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000148
であり、ｍが３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２である、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【０１２０】
一態様では、本発明は、各単量体サブユニット
2020518552.tif 000149
が、独立して二本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000150
であり、ｍが３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２であり、各共有結合リンカー●が同一鎖上にある、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【０１２１】
一態様では、本発明は、各単量体サブユニット
2020518552.tif 000151
が、独立して二本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000152
であり、ｍが１３以上である、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【０１２２】
一態様では、本発明は、各単量体サブユニット
2020518552.tif 000153
が、独立して二本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000154
であり、ｍが１３以上であり、各共有結合リンカー●が同一鎖上にある、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【０１２３】
一態様では、本発明は、ｍが０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２である、多量体オリゴヌクレオチド、または当該多量体オリゴヌクレオチドのインビボでの循環半減期を増加させる方法を提供する。
【０１２４】
一態様では、本発明は、構造２１が構造２２もしくは構造２３
2020518552.tif 000155
〔ここで、各
2020518552.tif 000156
は二本鎖オリゴヌクレオチドであり、各●は、隣接する二本鎖オリゴヌクレオチド同士を連結している共有結合リンカーであり、ｍは１以上の整数であり、ｎは０以上の整数である〕
である、多量体オリゴヌクレオチド、または当該多量体オリゴヌクレオチドのインビボでの循環半減期を増加させる方法を提供する。
【０１２５】
一態様では、本発明は、多量体オリゴヌクレオチド、または当該多量体オリゴヌクレオチドのインビボでの循環半減期を増加させる方法を提供し、この場合、構造２１は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０３７６８５に開示されているいかなる構造とも同じ及び／または実質的に同じ構造ではない。
【０１２６】
一態様では、本発明は、インビボでの循環半減期が少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、５００もしくは１，０００倍増加する、多量体オリゴヌクレオチド、または当該多量体オリゴヌクレオチドのインビボでの循環半減期を増加させる方法を提供する。
【０１２７】
一態様では、本発明は、インビボでの循環半減期が約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは１００％増加する、多量体オリゴヌクレオチド、または当該多量体オリゴヌクレオチドのインビボでの循環半減期を増加させる方法を提供する。
【０１２８】
一態様では、本発明は、インビボでの活性の増加が、ｔｍａｘでのインビボでの活性の比率として測定される、多量体オリゴヌクレオチド、または当該多量体オリゴヌクレオチドのインビボでの循環半減期を増加させる方法を提供する。
【０１２９】
一態様では、本発明は、インビボでの活性が少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、５００もしくは１，０００倍増加する、多量体オリゴヌクレオチド、または当該多量体オリゴヌクレオチドのインビボでの循環半減期を増加させる方法を提供する。
【０１３０】
一態様では、本発明は、各オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000157
が一本鎖オリゴヌクレオチドである、多量体オリゴヌクレオチド、または当該多量体オリゴヌクレオチドのインビボでの循環半減期を増加させる方法を提供する。
【０１３１】
一態様では、本発明は、各オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000158
が二本鎖オリゴヌクレオチドである、多量体オリゴヌクレオチド、または当該多量体オリゴヌクレオチドのインビボでの循環半減期を増加させる方法を提供する。
【０１３２】
一態様では、本発明は、オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000159
が一本鎖オリゴヌクレオチドと二本鎖オリゴヌクレオチドとの組み合わせを含む、多量体オリゴヌクレオチド、または当該多量体オリゴヌクレオチドのインビボでの循環半減期を増加させる方法を提供する。
【０１３３】
一態様では、本発明は、実質的に同一なオリゴヌクレオチドのホモ多量体を含む、多量体オリゴヌクレオチド、または当該多量体オリゴヌクレオチドのインビボでの循環半減期を増加させる方法を提供する。
【０１３４】
一態様では、本発明は、実質的に同一なオリゴヌクレオチドが、
（ａ）インビボで同じ分子標的を指向するｓｉＲＮＡ；
（ｂ）インビボで同じ分子標的を指向するｍｉＲＮＡ；
（ｃ）インビボで同じ分子標的を指向するアンチセンスＲＮＡ；または
（ｄ）インビボで同じ分子標的を指向するｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及び／もしくはアンチセンスＲＮＡの組み合わせ
である、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【０１３５】
一態様では、本発明は、２種以上の実質的に異なるオリゴヌクレオチドのヘテロ多量体を含む、多量体オリゴヌクレオチド、または当該多量体オリゴヌクレオチドのインビボでの循環半減期を増加させる方法を提供する。
【０１３６】
一態様では、本発明は、実質的に異なるオリゴヌクレオチドが、
（ａ）インビボで異なる分子標的を指向するｓｉＲＮＡ；
（ｂ）インビボで異なる分子標的を指向するｍｉＲＮＡ；
（ｃ）インビボで異なる分子標的を指向するアンチセンスＲＮＡ；または
（ｄ）インビボで異なる分子標的を指向するｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及び／もしくはアンチセンスＲＮＡの組み合わせ
である、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【０１３７】
一態様では、本発明は、多量体オリゴヌクレオチドが、ＰＥＧ、ポリエーテル化合物、及び／もしくは、オリゴヌクレオチド以外のポリマーを含まない、多量体オリゴヌクレオチド、または当該多量体オリゴヌクレオチドのインビボでの循環半減期を増加させる方法を提供する。
【０１３８】
一態様では、本発明は、多量体オリゴヌクレオチドが、ナノ粒子（ＮＰ）もしくはより具体的には脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の中に製剤化されていない、多量体オリゴヌクレオチド、または当該多量体オリゴヌクレオチドのインビボでの循環半減期を増加させる方法を提供する。
【０１３９】
一態様では、本発明は、多量体オリゴヌクレオチドが構造２１及び任意選択の標的指向性リガンドから本質的になる、多量体オリゴヌクレオチド、または当該多量体オリゴヌクレオチドのインビボでの循環半減期を増加させる方法を提供する。
【０１４０】
一態様では、本発明は、多量体オリゴヌクレオチドがさらに標的指向性リガンドを含む、多量体オリゴヌクレオチド、または当該多量体オリゴヌクレオチドのインビボでの循環半減期を増加させる方法を提供する。
【０１４１】
一態様では、本発明は、標的指向性リガンドがオリゴヌクレオチドと複合体化している、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【０１４２】
一態様では、本発明は、標的指向性リガンドが、当該オリゴヌクレオチドの３’または５’末端を介して当該オリゴヌクレオチドと複合体化している、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【０１４３】
一態様では、本発明は、各共有結合リンカー●が同じである、多量体オリゴヌクレオチド、または当該多量体オリゴヌクレオチドのインビボでの循環半減期を増加させる方法を提供する。
【０１４４】
一態様では、本発明は、２種以上の異なる共有結合リンカー●を含む、多量体オリゴヌクレオチド、または当該多量体オリゴヌクレオチドのインビボでの循環半減期を増加させる方法を提供する。
【０１４５】
一態様では、本発明は、●の１つもしくは複数が、切断可能な共有結合リンカーを含む、多量体オリゴヌクレオチド、または当該多量体オリゴヌクレオチドのインビボでの循環半減期を増加させる方法を提供する。
【０１４６】
一態様では、本発明は、共有結合リンカー●の各々が、２つの単量体サブユニット
2020518552.tif 000160
を連結している、直鎖構造を含む多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【０１４７】
一態様では、本発明は、共有結合リンカー●の少なくとも１つが、３つ以上の単量体サブユニット
2020518552.tif 000161
を連結している、分岐構造を含む多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【０１４８】
一態様では、本発明は、各単量体サブユニット
2020518552.tif 000162
が、独立して一本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000163
である、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【０１４９】
一態様では、本発明は、
ｍが１である
2020518552.tif 000164
；
ｍが２である
2020518552.tif 000165
；
ｍが３である
2020518552.tif 000166
；
ｍが４である
2020518552.tif 000167
；または
ｍが５である
2020518552.tif 000168
の多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【０１５０】
一態様では、本発明は、ｍが６、７、８、９、１０、１１または１２である、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【０１５１】
一態様では、本発明は、ｍが１３以上の整数である、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【０１５２】
一態様では、本発明は、少なくとも１つの一本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000169
がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【０１５３】
一態様では、本発明は、各一本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000170
が、独立してアンチセンスオリゴヌクレオチドである、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【０１５４】
本発明の技術のこれら及びその他の利点は、添付の図面及び以下の説明を参照すれば明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１】図１Ａは、三分岐Ｎ−アセチルガラクトサミンリガンドの化学構造を表す。図１Ｂは、ジチオ−ビス−マレイミドエタンの化学構造を表す。
【図２】５’−ＧａｌＮＡｃ−ＦＶＩＩ基準対照を表し、実施例９と関連付けて説明される。
【図３】ＧａｌＮＡｃ−ホモ二量体複合体（ＸＤ−０６３３０）を表し、実施例１０と関連付けて説明される。
【図４】ＧａｌＮＡｃ−ホモ二量体複合体（ＸＤ−０６３６０）の合成の模式図を表し、実施例１１と関連付けて説明される。
【図５】ＧａｌＮＡｃ−ホモ二量体複合体（ＸＤ−０６３２９）の合成の模式図を表し、実施例１２と関連付けて説明される。
【図６】マウス血清のＦＶＩＩ活性（ＦＶＩＩホモ二量体ＧａｌＮＡｃ複合体によるノックダウン）を示すデータを表し、実施例１３と関連付けて説明される。
【図７】図７Ａ及び７Ｂ及び７Ｃは、マウス血清のＦＶＩＩ活性（ＧａｌＮＡｃ含有量に対して正規化されたＦＶＩＩホモ二量体ＧａｌＮＡｃ複合体によるノックダウン）を示すデータを表し、実施例１３と関連付けて説明される。
【図８】独立してＦＶＩＩ、ＡｐｏＢ及びＴＴＲを指向する基準ＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡを表し、実施例１４と関連付けて説明される。
【図９】ＧａｌＮＡｃ−ヘテロ三量体複合体（ＸＤ−０６７２６）を表し、実施例１５と関連付けて説明される。要点：この実施例では「ＧｅｎｅＡ」はｓｉＦＶＩＩであり、「ＧｅｎｅＢ」はｓｉＡｐｏＢであり、「ＧｅｎｅＣ」はｓｉＴＴＲである。
【図１０】ＧａｌＮＡｃ複合体化ヘテロ三量体（ＸＤ−０６７２６）の合成方策の模式図を表し、実施例１５と関連付けて説明される。要点：この実施例では「ＧｅｎｅＡ」はｓｉＦＶＩＩであり、「ＧｅｎｅＢ」はｓｉＡｐｏＢであり、「ＧｅｎｅＣ」はｓｉＴＴＲである。
【図１１】ＧａｌＮＡｃ−ヘテロ三量体複合体（ＸＤ−０６７２７）を表し、実施例１６と関連付けて説明される。要点：この実施例では「ＧｅｎｅＡ」はｓｉＦＶＩＩであり、「ＧｅｎｅＢ」はｓｉＡｐｏＢであり、「ＧｅｎｅＣ」はｓｉＴＴＲである。
【図１２】ＧａｌＮＡｃ複合体化ヘテロ三量体（ＸＤ−０６７２７）の合成方策の模式図を表し、実施例１６と関連付けて説明される。要点：この実施例では「ＧｅｎｅＡ」はｓｉＦＶＩＩであり、「ＧｅｎｅＢ」はｓｉＡｐｏＢであり、「ＧｅｎｅＣ」はｓｉＴＴＲである。
【図１３】Ｘ２０３６６に対するＸ２０３３６の付加のＨＰＬＣ分析のデータを表し、実施例１６と関連付けて説明される。
【図１４】Ｘ２０３３６とＸ２０３６６との反応生成物に対するＸ１９５８０のさらなる付加のＨＰＬＣ分析のデータを表し、実施例１６と関連付けて説明される。
【図１５】ＸＤ−０６７２７を得るための、Ｘ２０３３６とＸ２０３６６とＸ１９５８０との反応生成物に対するＸ１８７９５（５’−ｓｉＦＶＩＩアンチセンス−３’）のさらなる付加のＨＰＬＣ分析のデータを表し、実施例１６と関連付けて説明される。
【図１６】図１６Ａ及び１６Ｂは、血漿試料におけるＴＴＲタンパク質レベル（ＥＬＩＳＡによる測定）のデータを表し、実施例１８と関連付けて説明される。
【図１７】図１７Ａ及び１７Ｂは、血漿試料におけるＦＶＩＩ酵素活性のデータを表し、実施例１８と関連付けて説明される。
【図１８】図１８Ａ及び１８Ｂは、血漿試料におけるＡｐｏＢタンパク質レベル（ＥＬＩＳＡによる測定）のデータを表し、実施例１８と関連付けて説明される。
【図１９】図１９Ａ及び１９Ｂは、肝臓における標的ノックダウンのデータを表し、実施例１８と関係付けて説明される。
【図２０】ＧａｌＮＡｃ−ヘテロ四量体複合体（ＸＤ−０７１４０）を表し、実施例１９と関連付けて説明される。要点：この実施例では「ＧｅｎｅＡ」はｓｉＦＶＩＩであり、「ＧｅｎｅＢ」はｓｉＡｐｏＢであり、「ＧｅｎｅＣ」はｓｉＴＴＲである。
【図２１−１】ＧａｌＮＡｃ−ヘテロ四量体複合体（ＸＤ−０７１４０）の合成の模式図を表し、実施例１９と関連付けて説明される。要点：この実施例では「ＧｅｎｅＡ」はｓｉＦＶＩＩであり、「ＧｅｎｅＢ」はｓｉＡｐｏＢであり、「ＧｅｎｅＣ」はｓｉＴＴＲである。
【図２１−２】ＧａｌＮＡｃ−ヘテロ四量体複合体（ＸＤ−０７１４０）の合成の模式図を表し、実施例１９と関連付けて説明される。要点：この実施例では「ＧｅｎｅＡ」はｓｉＦＶＩＩであり、「ＧｅｎｅＢ」はｓｉＡｐｏＢであり、「ＧｅｎｅＣ」はｓｉＴＴＲである。
【図２２】ＧａｌＮＡｃ−ｓｉＦＶＩＩ−ｓｉＡｐｏＢ−ｓｉＴＴＲ−ｓｉＦＶＩＩ四量体（ＸＤ−０７１４０）のＨＰＬＣ結果を表し、実施例１９と関連付けて説明される。
【図２３】ホモ六量体を合成するステップを例示する模式図を表し、実施例２３と関連付けて説明される。
【図２４Ａ】図２４Ａ及び２４Ｂは、ｓｓＲＮＡ  Ｘ３０８３５の収率及び純度を示すＲＰ−ＨＰＬＣ結果を表し、実施例２４と関連付けて説明される。
【図２４Ｂ】図２４Ａ及び２４Ｂは、ｓｓＲＮＡ  Ｘ３０８３５の収率及び純度を示すＲＰ−ＨＰＬＣ結果を表し、実施例２４と関連付けて説明される。
【図２４Ｃ】図２４Ｃ及び２４Ｄは、ｓｓＲＮＡ  Ｘ３０８３７の収率及び純度を示すＲＰ−ＨＰＬＣ結果を表し、実施例２４と関連付けて説明される。
【図２４Ｄ】図２４Ｃ及び２４Ｄは、ｓｓＲＮＡ  Ｘ３０８３７の収率及び純度を示すＲＰ−ＨＰＬＣ結果を表し、実施例２４と関連付けて説明される。
【図２４Ｅ】Ｘ３０８３８のＲＰ−ＨＰＬＣ結果を表し、実施例２４と関連付けて説明される。
【図２４Ｆ】Ｘ３０８３８、Ｘ１８７９５及びＸＤ−０９７９５のＲＰ−ＨＰＬＣ結果を表し、実施例２４と関連付けて説明される。
【図２５】ＸＤ−０９７９５またはＸＤ−０９７９４を注射した後の様々な時間でのマウスにおけるＦＶＩＩアンチセンスＲＮＡの血清中濃度を示すデータを表し、実施例２５と関連付けて説明される。
【図２６Ａ】図２６Ａ〜Ｊは、ＸＤ−０９７９５またはＸＤ−０９７９４を注射した後の様々な時間でのマウスにおける様々なサイトカインの血清レベルを示すデータを表し、実施例２６と関連付けて説明される。
【図２６Ｂ】図２６Ａ〜Ｊは、ＸＤ−０９７９５またはＸＤ−０９７９４を注射した後の様々な時間でのマウスにおける様々なサイトカインの血清レベルを示すデータを表し、実施例２６と関連付けて説明される。
【図２６Ｃ】図２６Ａ〜Ｊは、ＸＤ−０９７９５またはＸＤ−０９７９４を注射した後の様々な時間でのマウスにおける様々なサイトカインの血清レベルを示すデータを表し、実施例２６と関連付けて説明される。
【図２６Ｄ】図２６Ａ〜Ｊは、ＸＤ−０９７９５またはＸＤ−０９７９４を注射した後の様々な時間でのマウスにおける様々なサイトカインの血清レベルを示すデータを表し、実施例２６と関連付けて説明される。
【図２６Ｅ】図２６Ａ〜Ｊは、ＸＤ−０９７９５またはＸＤ−０９７９４を注射した後の様々な時間でのマウスにおける様々なサイトカインの血清レベルを示すデータを表し、実施例２６と関連付けて説明される。
【図２６Ｆ】図２６Ａ〜Ｊは、ＸＤ−０９７９５またはＸＤ−０９７９４を注射した後の様々な時間でのマウスにおける様々なサイトカインの血清レベルを示すデータを表し、実施例２６と関連付けて説明される。
【図２６Ｇ】図２６Ａ〜Ｊは、ＸＤ−０９７９５またはＸＤ−０９７９４を注射した後の様々な時間でのマウスにおける様々なサイトカインの血清レベルを示すデータを表し、実施例２６と関連付けて説明される。
【図２６Ｈ】図２６Ａ〜Ｊは、ＸＤ−０９７９５またはＸＤ−０９７９４を注射した後の様々な時間でのマウスにおける様々なサイトカインの血清レベルを示すデータを表し、実施例２６と関連付けて説明される。
【図２６Ｉ】図２６Ａ〜Ｊは、ＸＤ−０９７９５またはＸＤ−０９７９４を注射した後の様々な時間でのマウスにおける様々なサイトカインの血清レベルを示すデータを表し、実施例２６と関連付けて説明される。
【図２６Ｊ】図２６Ａ〜Ｊは、ＸＤ−０９７９５またはＸＤ−０９７９４を注射した後の様々な時間でのマウスにおける様々なサイトカインの血清レベルを示すデータを表し、実施例２６と関連付けて説明される。
【図２７】図２７Ａは、ＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡの単量体の合成方策の模式図を表し、実施例２８と関連付けて説明される。図２７Ｂは、ＸＤ−０９７９４のＲＰ−ＨＰＬＣ結果を表し、実施例２８と関連付けて説明される。
【図２８】図２８Ａは、ＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡのホモ二量体の合成方策の模式図を表し、実施例２９と関連付けて説明される。図２８Ｂは、ＸＤ−１０６３５のＲＰ−ＨＰＬＣ結果を表し、実施例２９と関連付けて説明される。
【図２９】図２９Ａは、ＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡのホモ三量体の合成方策の模式図を表し、実施例３０と関連付けて説明される。図２９Ｂは、ＸＤ−１０６３６のＲＰ−ＨＰＬＣ結果を表し、実施例３０と関連付けて説明される。
【図３０】図３０Ａは、ＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡのホモ四量体の合成方策の模式図を表し、実施例３１と関連付けて説明される。図３０Ｂは、ＸＤ−１０６３７のＲＰ−ＨＰＬＣ結果を表し、実施例３１と関連付けて説明される。
【図３１】図３１Ａは、ＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡのホモ五量体の合成方策の模式図を表し、実施例３２と関連付けて説明される。図３１Ｂは、ＸＤ−１０６３８のＲＰ−ＨＰＬＣ結果を表し、実施例３２と関連付けて説明される。
【図３２】図３２Ａは、ＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡのホモ六量体の合成方策の模式図を表し、実施例３３と関連付けて説明される。図３２Ｂは、ＸＤ−１０６３９のＲＰ−ＨＰＬＣ結果を表し、実施例３３と関連付けて説明される。
【図３３Ａ】モノＤＴＭＥ複合体を介したＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡのホモ六量体の合成方策の模式図を表し、実施例３４と関連付けて説明される。
【図３３Ｂ】ＸＤ−０９７９５のＲＰ−ＨＰＬＣ結果を表し、実施例３４と関連付けて説明される。
【図３４Ａ】モノＤＴＭＥ複合体を介したＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡのホモ七量体の合成方策の模式図を表し、実施例３５と関連付けて説明される。
【図３４Ｂ】ＸＤ−１０６４０のＲＰ−ＨＰＬＣ結果を表し、実施例３５と関連付けて説明される。
【図３５Ａ】モノＤＴＭＥ複合体を介したＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡのホモ八量体の合成方策の模式図を表し、実施例３６と関連付けて説明される。
【図３５Ｂ】ＸＤ−１０６４１のＲＰ−ＨＰＬＣ結果を表し、実施例３６と関連付けて説明される。
【図３６Ａ】様々なＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡ多量体について経時的な血清中ＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡレベルの平滑線散布図を表し、実施例３７と関連付けて説明される。
【図３６Ｂ】様々なＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡ多量体について経時的な血清中ＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡレベルの直線描写散布図を表し、実施例３７と関連付けて説明される。
【図３７Ａ】図３７Ａ〜Ｄは、それぞれのオリゴヌクレオチドを投与した後の様々な時間でのＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡ多量体についての血清中ＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡレベルの棒グラフを表し、実施例３７と関連付けて説明される。
【図３７Ｂ】図３７Ａ〜Ｄは、それぞれのオリゴヌクレオチドを投与した後の様々な時間でのＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡ多量体についての血清中ＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡレベルの棒グラフを表し、実施例３７と関連付けて説明される。
【図３７Ｃ】図３７Ａ〜Ｄは、それぞれのオリゴヌクレオチドを投与した後の様々な時間でのＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡ多量体についての血清中ＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡレベルの棒グラフを表し、実施例３７と関連付けて説明される。
【図３７Ｄ】図３７Ａ〜Ｄは、それぞれのオリゴヌクレオチドを投与した後の様々な時間でのＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡ多量体についての血清中ＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡレベルの棒グラフを表し、実施例３７と関連付けて説明される。
【図３８】図３８Ａは、ＦＶＩＩ多量体についての血清のＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡ曝露レベル（曲線下面積）の棒グラフを表し、実施例３７と関連付けて説明される。図３８Ｂは、単量体に対して正規化されたＦＶＩＩ多量体についての血清中総ＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡレベル（曲線下面積）の棒グラフを表し、実施例３７と関連付けて説明される。
【図３９】多量体が単量体の５分経過時と同じＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡ血清中濃度に達するまでに掛かった時間の棒グラフを表し、実施例３８と関連付けて説明される。
【図４０】ホモ四量体ｓｉＲＮＡの合成方策の模式図を表し、実施例２０と関連付けて説明される。
【図４１−１】交互の鎖上に結合を有するホモ四量体ｓｉＲＮＡの合成方策の模式図を表し、実施例２０と関連付けて説明される。
【図４１−２】交互の鎖上に結合を有するホモ四量体ｓｉＲＮＡの合成方策の模式図を表し、実施例２０と関連付けて説明される。
【０１５６】
本発明は多種多様な形態の実施形態を含むが、本開示が技術の原理の例証としてみなされるべきであり本発明を例示されている実施形態に限定することを意図していないという理解の下で、いくつかの具体的な実施形態を図面に示し、本明細書中で詳しく説明することにする。
【発明を実施するための形態】
【０１５７】
詳細な説明
本発明は、共有結合リンカーによって連結された単量体サブユニットを有する多量体オリゴヌクレオチドを対象に投与する方法に関する。多量体オリゴヌクレオチドは、糸球体濾過による多量体オリゴヌクレオチドのクリアランスが低減されるように少なくとも約４５ｋＤの分子量を有し得る。本発明はさらに、多量体オリゴヌクレオチド、及び多量体オリゴヌクレオチドを合成する方法に関する。例えば、典型的なｓｉＲＮＡ（例えば二本鎖単量体）が約１５ｋＤの分子量及び比較的より短い循環半減期（例えば、尿素またはグルコースに類似した糸球体濾過速度）を有し得るのに対し、本発明に係るオリゴヌクレオチド多量体は少なくとも約４５ｋＤの分子量及び比較的より長い循環半減期（例えば、糸球体濾過速度による、より小さいクリアランス速度）を有し得る。本発明に係る多量体の向上した有益な特性は、インビボでの循環半減期の増加に関して表現されることができる。それはまた、インビボでの活性の増加に関して表現されてもよい。
【０１５８】
多重複合体はさらに、標的指向性リガンドと組み合わされた場合、リガンド／受容体結合事象１回あたりに送達することができる搭載負荷が単量体の等価体に比べてより多い。本発明はさらに、新規合成中間体、及び多重複合体オリゴヌクレオチドを合成する方法に関する。本発明はさらに、多重複合体オリゴヌクレオチドを、例えば遺伝子発現の低減、生物学的研究、病状の治療もしくは予防、及び／または新規なもしくは改変された表現型を生むことのために使用する方法に関する。
【０１５９】
多量体オリゴヌクレオチドを対象に投与する方法
様々な態様において、本発明は、多量体オリゴヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与する方法を提供し、当該方法は、有効量の多量体オリゴヌクレオチドを対象に投与することを含み、
多量体オリゴヌクレオチドはサブユニット
2020518552.tif 000171
を含み、
サブユニット
2020518552.tif 000172
の各々は独立して一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドであり、サブユニット
2020518552.tif 000173
の各々は共有結合リンカー●によって別のサブユニットに連結されており、
多量体オリゴヌクレオチドは、糸球体濾過によるそのクリアランスを減少させるように設定された分子量及び／または分子サイズを有し、
多量体オリゴヌクレオチドの分子量は少なくとも約４５ｋＤである。
【０１６０】
一態様では、本発明は、多量体オリゴヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与する方法を提供し、多量体オリゴヌクレオチドが含有するサブユニットの個数はｍであり、ｍは、糸球体濾過による多量体オリゴヌクレオチドのクリアランスを減少させるように設定された分子量及び／または分子サイズを多量体オリゴヌクレオチドが有することを可能にするように選択される整数である。様々な態様において、ｍは、（ｉ）２以上、（ｉｉ）３以上、（ｉｉｉ）４以上、（ｉｖ）４以上かつ１７以下、（ｖ）４以上かつ８以下、または（ｖｉ）４、５、６、７もしくは８である。
【０１６１】
一態様では、本発明は、多量体オリゴヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与する方法を提供し、多量体オリゴヌクレオチドは、構造２１
2020518552.tif 000174
を含み、ｎは０以上の整数である。
【０１６２】
一態様では、本発明は、多量体オリゴヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与する方法を提供し、サブユニットは一本鎖オリゴヌクレオチドである。
【０１６３】
一態様では、本発明は、多量体オリゴヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与する方法を提供し、ｎは１以上である。
【０１６４】
一態様では、本発明は、多量体オリゴヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与する方法を提供し、サブユニットは二本鎖オリゴヌクレオチドである。
【０１６５】
一態様では、本発明は、多量体オリゴヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与する方法を提供し、
ｎ＝０の場合、糸球体濾過による多量体オリゴヌクレオチドのクリアランスは多量体オリゴヌクレオチドの単量体サブユニット
2020518552.tif 000175
及び／または二量体サブユニット
2020518552.tif 000176
のそれに比べて減少し、
ｎ≧１の場合、糸球体濾過による多量体オリゴヌクレオチドのクリアランスは多量体オリゴヌクレオチドの単量体サブユニット
2020518552.tif 000177
、二量体サブユニット
2020518552.tif 000178
及び／または三量体サブユニット
2020518552.tif 000179
のそれに比べて減少する。
【０１６６】
多量体オリゴヌクレオチドのクリアランスの減少を測定する方法
一態様では、本発明は、本発明は、多量体オリゴヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与する方法を提供し、糸球体濾過によるクリアランスの減少は多量体オリゴヌクレオチドのインビボでの循環半減期を増加させる。
【０１６７】
一態様では、本発明は、多量体オリゴヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与する方法を提供し、糸球体濾過によるクリアランスの減少は、多量体オリゴヌクレオチドを対象に投与した後に多量体オリゴヌクレオチドのインビボでの循環半減期を測定することによって判定される。
【０１６８】
一態様では、本発明は、多量体オリゴヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与する方法を提供し、糸球体濾過によるクリアランスの減少は、多量体オリゴヌクレオチドの血清中濃度が所定値にまで減少するのに要する時間を測定することによって判定される。所定値は、投与された用量の９０％、８０％、７０％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％または１％であり得る。
【０１６９】
一態様では、本発明は、多量体オリゴヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与する方法を提供し、糸球体濾過によるクリアランスの減少は、多量体オリゴヌクレオチドを対象に投与した後の所定時に多量体オリゴヌクレオチドの血清中濃度を測定することによって判定される。
【０１７０】
一態様では、本発明は、多量体オリゴヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与する方法を提供し、糸球体濾過によるクリアランスの減少は、多量体オリゴヌクレオチドを対象に投与した後の経時的な多量体オリゴヌクレオチドの血清中濃度を表すグラフの曲線下面積を測定することによって判定される。
【０１７１】
対象に投与された多量体オリゴヌクレオチドのクリアランスの減少の効果
一態様では、本発明は、多量体オリゴヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与する方法を提供し、糸球体濾過によるクリアランスの減少は多量体オリゴヌクレオチドのインビボでの生物学的利用能を向上させる。
【０１７２】
一態様では、本発明は、多量体オリゴヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与する方法を提供し、糸球体濾過によるクリアランスの減少は多量体オリゴヌクレオチドのインビボでの細胞内取込みを増加させる。
【０１７３】
一態様では、本発明は、多量体オリゴヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与する方法を提供し、糸球体濾過によるクリアランスの減少は多量体オリゴヌクレオチドのインビボでの治療指数／治療率を上昇させる。
【０１７４】
一態様では、本発明は、多量体オリゴヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与する方法を提供し、測定されたパラメータは、例えば図３７Ａ〜３７Ｄに示されているように、単量体、二量体、三量体及びより高い多重度のオリゴヌクレオチドのサブユニット数に関してシグモイドの関係性を有する。
【０１７５】
一態様では、本発明は、多量体オリゴヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与する方法を提供し、多量体オリゴヌクレオチド、及び単量体サブユニットから始まるそのサブユニットの各々について測定されたパラメータはプロットされた場合に例えば図３８Ａ〜３８Ｂに示されているようにシグモイド曲線の輪郭を描く。
【０１７６】
多量体オリゴヌクレオチド
様々な態様において、本発明は、サブユニット
2020518552.tif 000180
を含む多量体オリゴヌクレオチドを提供し、
サブユニット
2020518552.tif 000181
の各々は独立して一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドであり、サブユニット
2020518552.tif 000182
の各々は共有結合リンカー●によって別のサブユニットに連結されており、
多量体オリゴヌクレオチドは、糸球体濾過によるそのクリアランスを減少させるように設定された分子量及び／または分子サイズを有し、
多量体オリゴヌクレオチドの分子量は少なくとも約４５ｋＤである。
【０１７７】
一態様では、本発明は、多量体オリゴヌクレオチドが含有するサブユニットの個数が、ｍであり、ｍが、糸球体濾過による多量体オリゴヌクレオチドのクリアランスを減少させるように設定された分子量及び／または分子サイズを多量体オリゴヌクレオチドが有することを可能にするように選択される整数である、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。様々な態様において、ｍは、（ｉ）２以上、（ｉｉ）３以上、（ｉｉｉ）４以上、（ｉｖ）４以上かつ１７以下、（ｖ）４以上かつ８以下、または（ｖｉ）４、５、６、７もしくは８である。
【０１７８】
構造２１
2020518552.tif 000183
を含む、請求項１６及び請求項１７のいずれか１項に記載の多量体オリゴヌクレオチドであって、
サブユニット
2020518552.tif 000184
の少なくとも１つは、
その３’末端に連結された１つの共有結合リンカー●と、その５’末端に連結された別の共有結合リンカーとを有する、一本鎖
を含み、ｎが０以上の整数である、請求項１６及び請求項１７のいずれか１項に記載の多量体オリゴヌクレオチド。
【０１７９】
一態様では、本発明は、各サブユニット
2020518552.tif 000185
の長さが１５〜３０、１７〜２７、１９〜２６または２０〜２５ヌクレオチドである多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【０１８０】
一態様では、本発明は、ｎ≧１かつｎ≦１７である多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【０１８１】
一態様では、本発明は、ｎ≧１かつｎ≦５である多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【０１８２】
一態様では、本発明は、ｎが１、２、３、４または５である多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【０１８３】
一態様では、本発明は、各サブユニットが二本鎖ＲＮＡであり、ｎ≧１である、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【０１８４】
一態様では、本発明は、各サブユニットが一本鎖オリゴヌクレオチドである多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【０１８５】
一態様では、本発明は、各サブユニットが二本鎖オリゴヌクレオチドである多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【０１８６】
一態様では、本発明は、サブユニットが一本鎖オリゴヌクレオチドと二本鎖オリゴヌクレオチドとの組み合わせを含む、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【０１８７】
一態様では、本発明は、各サブユニットがＲＮＡ、ＤＮＡ、または人工もしくは非天然型の核酸アナログである、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【０１８８】
一態様では、本発明は、各サブユニットがＲＮＡである多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【０１８９】
一態様では、本発明は、各サブユニットがｓｉＲＮＡ、ｓａＲＮＡまたはｍｉＲＮＡである多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【０１９０】
一態様では、本発明は、各サブユニットが二本鎖ｓｉＲＮＡであり、共有結合リンカーの各々がｓｉＲＮＡのセンス鎖同士を連結している、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【０１９１】
一態様では、本発明は、実質的に同一なサブユニット
2020518552.tif 000186
のホモ多量体を含む、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【０１９２】
一態様では、本発明は、２種以上の実質的に異なるサブユニット
2020518552.tif 000187
のヘテロ多量体を含む、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【０１９３】
一態様では、本発明は、少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００％純粋である多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【０１９４】
一態様では、本発明は、各サブユニット
2020518552.tif 000188
が、独立して二本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000189
であり、ｎが１以上の整数である、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【０１９５】
一態様では、本発明は、各サブユニット
2020518552.tif 000190
が、独立して二本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000191
であり、ｎが１以上の整数であり、各共有結合リンカー●が同一鎖上にある、多量体オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000192
〔ここで、ｄは１以上の整数である〕
を提供する。
【０１９６】
一態様では、本発明は、構造２２または構造２３
2020518552.tif 000193
〔ここで、各
2020518552.tif 000194
は二本鎖オリゴヌクレオチドであり、各●は、隣接する二本鎖オリゴヌクレオチド同士を連結している共有結合リンカーであり、ｆは１以上の整数であり、ｇは０以上の整数である〕
を含む多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【０１９７】
一態様では、本発明は、実質的に全ての多量体オリゴヌクレオチドが所定のｎの値及び／または所定の分子量を有する、複数の多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【０１９８】
標的リガンド及びアプタマー
一態様では、本発明は、多量体オリゴヌクレオチドが１つまたは複数の標的指向性リガンドをさらに含む、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【０１９９】
一態様では、本発明は、サブユニットの少なくとも１つが標的指向性リガンドである多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【０２００】
一態様では、本発明は、標的指向性リガンドがアプタマーである多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【０２０１】
リンカー
一態様では、本発明は、共有結合リンカー●の１つまたは複数が、切断可能な共有結合リンカーを含み、ヌクレオチドリンカー、例えば実施例２０、２２Ｂ及び２７で説明されているものを含む、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。ヌクレオチドリンカーは、１つまたは複数のヌクレオチドを含有するリンカーであり、それは、他のいかなる指定の機能も行わないように選択され得る。
【０２０２】
一態様では、本発明は、切断可能な共有結合リンカーが、酸で切断可能な結合、還元剤で切断可能な結合、生物学的に切断可能な結合、または酵素で切断可能な結合を含有する、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【０２０３】
一態様では、本発明は、切断可能な共有結合リンカーが、細胞内条件下で切断可能である、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【０２０４】
一態様では、本発明は、各共有結合リンカー●が同じである、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【０２０５】
一態様では、本発明は、共有結合リンカー●が、２種以上の異なる共有結合リンカーを含む、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【０２０６】
一態様では、本発明は、各共有結合リンカー●が、２つの単量体サブユニット
2020518552.tif 000195
を連結している、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【０２０７】
一態様では、本発明は、少なくとも１つの共有結合リンカー●が、３つ以上の単量体サブユニット
2020518552.tif 000196
を連結している、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【０２０８】
多量体オリゴヌクレオチドの合成方法
様々な態様において、本発明は、構造５１
2020518552.tif 000197
〔ここで、各
2020518552.tif 000198
は一本鎖オリゴヌクレオチドであり、各●は、隣接する一本鎖オリゴヌクレオチド同士を連結している共有結合リンカーであり、ａは１以上の整数である〕
を含む多量体オリゴヌクレオチドを合成する方法であって、
（ｉ）
2020518552.tif 000199
と、
2020518552.tif 000200
と
〔ここで、○は結合部分であり、Ｒ１は、結合部分○と反応することができる化学基であり、ｂ及びｃは各々独立して０以上の整数であり、ｂ及びｃが両方とも同時に０であることはできず、ｂ＋ｃ＝ａである〕
を反応させ、それによって構造５１
2020518552.tif 000201
を形成するステップ、及び
（ｉｉ）任意で、構造５１
2020518552.tif 000202
を相補的一本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000203
とアニーリングさせ、それによって構造５４
2020518552.tif 000204
を形成するステップ
を含む、当該方法を提供する。
【０２０９】
様々な態様において、本発明は、構造５４
2020518552.tif 000205
〔ここで、各
2020518552.tif 000206
は一本鎖オリゴヌクレオチドであり、各●は、隣接する一本鎖オリゴヌクレオチド同士を連結している共有結合リンカーであり、ａは１以上である〕
を含む多量体オリゴヌクレオチドを合成する方法であって、
（ｉ）構造５１
2020518552.tif 000207
を相補的一本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000208
とアニーリングさせ、それによって構造５４
2020518552.tif 000209
を形成するステップ
を含む、当該方法を提供する。
【０２１０】
対象
一態様では、本発明は、多量体オリゴヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与する方法を提供し、対象は齧歯動物、例えばマウスまたはラットである。
【０２１１】
一態様では、本発明は、多量体オリゴヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与する方法を提供し、対象は霊長類、例えばヒトである。
【０２１２】
マウスの糸球体濾過速度（ＧＦＲ）は約０．１５〜０．２５ｍｌ／分であり得る。ヒトのＧＦＲは約１．８ｍｌ／分／ｋｇであり得る（Ｍａｈｍｏｏｄ  Ｉ：（１９９８）Ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ  ｓｃａｌｉｎｇ  ｏｆ  ｒｅｎａｌｌｙ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｄｒｕｇｓ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ６３：２３６５−２３７１）。
【０２１３】
マウスは約１．４６ｍｌの血液を有し得る。したがって、マウスにおける全血液量の糸球体濾過の時間は約７．３分（１．４６／０．２）であり得る。ヒトは約５リットルの血液及び約７０ｋｇの体重を有し得る。したがって、ヒトにおける全血液量の糸球体濾過の時間は３９．７分であり得る［５０００／１２６（１．８×７０）］。
【０２１４】
当業者であれば、少なくとも上記理由から、種が異なれば糸球体濾過によるクリアランスの速度が異なり得ることを認識するであろう。当業者であれば、ヒトとマウスとの糸球体濾過によるクリアランスの速度の比は約１：５または１：６であり得ることを推察することができる。換言すれば、ヒトによる特定物質（例えば特定オリゴヌクレオチド）のクリアランスの速度はマウスのそれよりも５〜６倍遅くなり得る。
【０２１５】
一態様では、本発明は、多量体オリゴヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与する方法を提供し、インビボでの循環半減期は、多量体オリゴヌクレオチドを対象に投与してから３０〜１２０分後に測定される。
【０２１６】
一態様では、本発明は、多量体オリゴヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与する方法を提供し、所定時は、多量体オリゴヌクレオチドを対象に投与してから３０〜１２０分後である。
【０２１７】
一態様では、本発明は、多量体オリゴヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与する方法を提供し、曲線下面積は、多量体オリゴヌクレオチドを対象に投与してからｘ〜ｙ分後における多量体オリゴヌクレオチドの血清中濃度に基づいて算出される。いくつかの実施形態では、ｘは１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７５、９０、１２０、１８０、２４０または３００分であり得、ｙは９０、１２０、１８０、２４０、３００、３６０、４２０、４８０、５４０、６００、７２０、８４０、９６０、１０８０、１２００、１３２０、１４４０または１６００分であり得る。例えば、時間範囲は３０〜１２０分、１〜１６００分、または３００〜６００分であり得る。
【０２１８】
一態様では、本発明は、多量体オリゴヌクレオチド、または当該多量体オリゴヌクレオチドのインビボでの循環半減期を増加させる方法を提供し、多量体オリゴヌクレオチドは、ナノ粒子（ＮＰ）または脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の中に製剤化されていない。
【０２１９】
本発明はまた、改善された薬力学及び／または薬理動態を有する多重複合体オリゴヌクレオチドに関する。例えば、多重複合体オリゴヌクレオチド（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個またはそれ以上のｓｉＲＮＡを含む多量体オリゴヌクレオチド）は、個々の単量体サブユニットに比べて増加したインビボでの循環半減期及び／または増加したインビボでの活性を有し得る。さらに、多重複合体は、標的指向性リガンドと複合体化している場合、リガンド／受容体結合事象１回あたりに送達することができるオリゴヌクレオチドの搭載負荷が単量体の等価体に比べてより多い。本発明はさらに、新規合成中間体、及び多重複合体オリゴヌクレオチドを合成する方法に関する。本発明はさらに、多重複合体オリゴヌクレオチドを、例えば遺伝子発現の低減、生物学的研究、病状の治療もしくは予防、及び／または新規なもしくは改変された表現型を生むことのために使用する方法に関する。
【０２２０】
代わって、本発明の様々な特徴を以下に述べる。
【０２２１】
核酸
様々な実施形態において、核酸またはオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡである、または人工もしくは非天然型の核酸アナログを含む。様々な実施形態において、核酸またはオリゴヌクレオチドは一本鎖である。様々な実施形態において、核酸またはオリゴヌクレオチドは二本鎖（例えば、逆平行二本鎖）である。
【０２２２】
様々な実施形態において、核酸またはオリゴヌクレオチドはＲＮＡ、例えば、アンチセンスＲＮＡ（ａＲＮＡ）、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｐｉｗｉ相互作用性ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子活性化（ｓａＲＮＡ）、またはリボザイムである。
【０２２３】
一実施形態では、ＲＮＡはｓｉＲＮＡである。例えば、各二本鎖オリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡであり、及び／または１５〜３０塩基対の長さを有する。
【０２２４】
様々な実施形態において、核酸またはオリゴヌクレオチドはアプタマーである。
【０２２５】
ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）は、標的遺伝子を分解することによって遺伝子の発現を抑制すべく、ヌクレオチド配列がそのセンス鎖と同一な遺伝子のｍＲＮＡ（伝令ＲＮＡ）を指向する、１９〜２２核酸からなる短い二本鎖ＲＮＡである（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．，Ｈａｒｂｏｒｔｈ，Ｊ．，Ｌｅｎｄｅｃｋｅｌ，Ｗ．，Ｙａｌｃｉｎ，Ａ．，Ｗｅｂｅｒ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．（２００１）Ｄｕｐｌｅｘｅｓ  ｏｆ  ２１−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ＲＮＡｓ  ｍｅｄｉａｔｅ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：４９４−８）。
【０２２６】
本発明の方法において有用となる別の部類の核酸はｍｉＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、転写後遺伝子調節において肝要な役割を果たす非コードＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、全ての哺乳動物タンパク質コード遺伝子の３０％の発現を調節することができる。二本鎖ＲＮＡによる特異的かつ強力な遺伝子サイレンシング（ＲＮＡｉ）が、さらなる低分子非コードＲＮＡと共に発見された（Ｃａｎｖｅｒ，Ｍ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２０１５））。前駆体ｍｉＲＮＡは、２−ヌクレオチド３’−突出部を有する長さ約７０ヌクレオチドの短いステムループであり、移出されて、成熟した１９〜２５ヌクレオチドの二本鎖となる。より低い塩基対安定性を有するｍｉＲＮＡ鎖（ガイド鎖）は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）上に負荷されることができる。パッセンジャーガイド鎖は、機能的であることもあるが、通常は分解される。成熟ｍｉＲＮＡはＲＩＳＣを、標的ｍＲＮＡの主として３’非翻訳領域（ＵＴＲ）内にみられる部分的に相補的な配列モチーフに繋ぎ止め、転写後遺伝子サイレンシングを誘導する（Ｂａｒｔｅｌ，Ｄ．Ｐ．Ｃｅｌｌ，１３６：２１５−２３３（２００９）、Ｓａｊ，Ａ．＆  Ｌａｉ，Ｅ．Ｃ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  Ｄｅｖ，２１：５０４−５１０（２０１１））。ｍｉＲＮＡ模倣体は例えば米国特許第８，７６５，７０９号に記載されている。
【０２２７】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡは短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、例えば、米国特許第８，２０２，８４６号及び第８，３８３，５９９号に記載されているものであり得る。
【０２２８】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡはＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）であり得、例えば、Ｖ型の一連のＣＲＩＳＰＲは長さ４２〜４４ヌクレオチドの短い成熟ｃｒＲＮＡにプロセシングされ得、各成熟ｃｒＲＮＡは、１９ヌクレオチドの同方向反復配列から始まって２３〜２５ヌクレオチドのスペーサー配列が後に続いている。あるいは、ＩＩ型システムの成熟ｃｒＲＮＡは、２０〜２４ヌクレオチドのスペーサー配列から始まって約２２ヌクレオチドの同方向反復配列が後に続いている。ＣＲＩＳＰＲシステムは例えば、米国特許第８，７７１，９４５号、Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７（６０９６）：８１６−８２１（２０１２）、及び国際特許出願公開第ＷＯ２０１３／１７６７７２号に記載されている。
【０２２９】
様々な実施形態において、核酸またはオリゴヌクレオチドは長さが１５〜３０、１７〜２７、１９〜２６、２０〜２５、４０〜５０、４０〜１５０、１００〜３００、１０００〜２０００ヌクレオチド、または１００００ヌクレオチド以下である。
【０２３０】
様々な実施形態において、オリゴヌクレオチドは二本鎖であり、相補的である。相補性は、１００％相補的であり得るかまたは、妥当な条件（例えば生理学的に妥当な条件）の下でオリゴヌクレオチドがなおもハイブリダイズしかつ二本鎖を維持する場合に１００％未満において相補的であり得る。例えば、二本鎖オリゴヌクレオチドは少なくとも約８０、８５、９０または９５％相補的であり得る。
【０２３１】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡは長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）であり、ｌｎｃＲＮＡは、タンパク質をコードせず（または１００アミノ酸超のオープンリーディングフレームを欠き）長さ２００ヌクレオチド超である転写されたＲＮＡ分子の広く多様な部類である。ヒトにおいてｌｎｃＲＮＡは３０，０００近い種々の転写産物を包含すると考えられ、それゆえｌｎｃＲＮＡ転写産物は非コードトランスクリプトームの大部分を占める（例えば、Ｄｅｒｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ＧＥＮＣＯＤＥ  ｖ７  ｃａｔａｌｏｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｌｏｎｇ  ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡｓ：ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅｉｒ  ｇｅｎｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ，２２（９）：１７７５−８９（２０１２）を参照のこと）。
【０２３２】
さらに他の実施形態では、ＲＮＡは伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。ｍＲＮＡ、及びインビボでのタンパク質産生のための送達方法としてのその用途は、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２０１３／１５１７３６号に記載されている。
【０２３３】
他の実施形態では、ＲＮＡは、低分子活性化（ｓａＲＮＡ）（例えば、Ｃｈａｐｐｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１１：２１４−２２０（２０１５）に記載されているもの）、またはリボザイム（Ｄｏｈｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｂｉｏｍｏ  Ｓｔｒｕｃｔ，３０：４５７−４７５（２００１））であり得る。
【０２３４】
いくつかの実施形態では、核酸またはオリゴヌクレオチドはＤＮＡ、例えばアンチセンスＤＮＡ（ａＤＮＡ）（例えばアンタゴミール）またはアンチセンスギャップマーである。ａＤＮＡの例は、ギャップマー及び多量体を含めて例えば、Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，４３（１９）：９１２３−９１３２（２０１５）及び国際特許出願公開第ＷＯ２０１３／０４０４２９号に記載されている。アンタゴミールの例は例えば米国特許第７，２３２，８０６号に記載されている。
【０２３５】
様々な実施形態において、オリゴヌクレオチドは特定の配列、例えば本明細書中で開示される配列のいずれか１つを有する。
【０２３６】
オリゴヌクレオチド合成のための一般的手順は以下の実施例に示す。本発明に関する用途に適合することができる他の方法は当技術分野において既知である。
【０２３７】
核酸に対する修飾
様々な実施形態において、核酸またはオリゴヌクレオチドはさらに、化学修飾を含む。化学修飾は、修飾ヌクレオシド、修飾主鎖、修飾糖または修飾末端を含み得る。
【０２３８】
リン含有結合としては、限定されないが、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートを含めたメチルホスホネート及びその他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホロアミダート及びアミノアルキルホスホロアミダートを含めたホスホロアミダート、チオノホスホロアミダート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびに通常の３’−５’結合を有するボラノホスフェート、これらの２’−５’結合アナログ、ならびに隣接するヌクレオシド単位の対が３’−５’から５’−３’へ、または２’−５’から５’−２’へと結合している逆向き極性を有するものが挙げられる。
【０２３９】
本発明の多重複合体が含有するオリゴヌクレオチドは、例えばインビトロ及びインビボでの有効性及び安定性の向上を含めた様々な効果を生むために当技術分野で知られている様々な方策を用いて修飾され得る。これらの方策の中でも特に、人工核酸、例えば、２’−Ｏ−メチル置換ＲＮＡ；２’−フルロ−２’デオキシＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）；モルホリノ；ロックド核酸（ＬＮＡ）；アンロックド核酸（ＵＮＡ）；架橋型核酸（ＢＮＡ）；グリコール核酸（ＧＮＡ）；及びトレオース核酸（ＴＮＡ）；またはより一般的には、天然に存在するＲＮＡ及びＤＮＡに構造的に類似しているが天然に存在する分子のリン酸主鎖、糖または核酸塩基部分の１つまたは複数が改変されている核酸アナログ、例えば二環式及び三環式ヌクレオシドアナログが挙げられる。典型的には、アナログ核酸塩基は、数ある中でも特に、種々の塩基対合及び塩基スタッキング特性を付与する。例としては、４つ全ての標準塩基と対合することができるユニバーサル塩基が挙げられる。リン酸−糖骨格アナログの例としては、ＰＮＡが挙げられる。モルホリノ系オリゴマー化合物はＢｒａａｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４１（１４）：４５０３−４５１０（２００２）及び米国特許第５，５３９，０８２号；第５，７１４，３３１号；第５，７１９，２６２号；及び第５，０３４，５０６号に記載されている。
【０２４０】
本明細書に記載の製造方法において、オリゴヌクレオチドのいくつかは末端部が化学官能基による置換によって修飾されている。置換は、オリゴヌクレオチドの３’または５’端部において実施され得、好ましくは単量体のセンス鎖とアンチセンス鎖との両方の３’端部において実施されるが、常にそれに限定されるわけではない。化学官能基には、例えば、スルフヒドリル基（−ＳＨ）、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、アミン基（−ＮＨ２）、ヒドロキシ基（−ＯＨ）、ホルミル基（−ＣＨＯ）、カルボニル基（−ＣＯ−）、エーテル基（−Ｏ−）、エステル基（−ＣＯＯ−）、ニトロ基（−ＮＯ２）、アジド基（−Ｎ３）またはスルホン酸基（−ＳＯ３Ｈ）が含まれ得る。
【０２４１】
本発明の多重複合体が含有するオリゴヌクレオチドは、追加または代替として核酸塩基（当技術分野では単に「塩基」と呼ばれることが多い）による修飾または置換も含むように修飾され得る。修飾核酸塩基としては、例えば、ごくまれに、または一過的に天然核酸にみられる核酸塩基、例えば、ヒポキサンチン、６−メチルアデニン、５−Ｍｅピリミジン、特に５−メチルシトシン（５−メチル−２’デオキシシトシンとも呼ばれ、当技術分野では５−Ｍｅ−Ｃと呼ばれることが多い）、５−ヒドロキシメチルシトシン（ＨＭＣ）、グリコシルＨＭＣ及びゲントビオシルＨＭＣ、ならびに合成核酸塩基、例えば、２−アミノアデニン、２−（メチルアミノ）アデニン、２−（イミダゾリルアルキル）アデニン、２−（アミノアルキルアミノ）アデニン、または他のヘテロ置換アルキルアデニン、２−チオウラシル、２−チオチミン、５−ブロモウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、８−アザグアニン、７−デアザグアニン、Ｎ６（６−アミノヘキシル）アデニン、及び２，６−ジアミノプリンが挙げられる。Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，Ａ．，ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ  ７５−７７（１９８０）、Ｇｅｂｅｙｅｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，１５：４５１３（１９９７）。当技術分野で知られている「ユニバーサル」塩基、例えばイノシンも含まれ得る。５−Ｍｅ−Ｃ置換は、核酸二本鎖安定性を０．６〜１．２℃向上させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，ｉｎ  Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ｐｐ  ２７６−２７８（１９９３））、塩基置換の態様である。修飾核酸塩基には、他の合成及び天然型核酸塩基、例えば、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６−メチル誘導体及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２−プロピル誘導体及び他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、５−プロピニルウラシル及びシトシン、６−アゾウラシル，シトシン及びチミン、５−ウラシル（擬似ウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル及び他の８−置換アデニン及びグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル及び他の５−置換ウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン（ｑｕａｎｉｎｅ）及び７−メチルアデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニン及び３−デアザアデニンが含まれ得る。核酸の末端にあるヒドロキシ基（−ＯＨ）を官能基、例えば、スルフヒドリル基（−ＳＨ）、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはアミン基（−ＮＨ２）で置換することができる。置換は３’端部または５’端部で行われ得る。
【０２４２】
リンカー
本発明の様々な態様及び実施形態において、オリゴヌクレオチド同士は共有結合で連結される。リンカーは、（例えば、オリゴヌクレオチドの送達及び／または作用を容易にする細胞内条件下で）切断可能であってもよいし、切断不可能であってもよい。求核−求電子化学を用いるリンカーに関して以下及び実施例に概略を記載しているが、他の化学及び配置は可能である。そして、通常の技能を有する者であれば理解するであろうように、様々なリンカーがその組成、合成及び用途を含めて当業者に知られており、本発明に関する用途に適合し得る。
【０２４３】
様々な実施形態において、共有結合リンカーは、求核及び求電子基の反応生成物を含み得る。例えば、共有結合リンカーは、チオールとマレイミド、チオールとビニルスルホン、チオールとピリジルジスルフィド、チオールとインドアセトアミド、チオールとアクリレート、アジドとアルキン、またはアミンとカルボキシル基との反応生成物を含み得る。本明細書において記載されているように、これらの基のうちの１つはオリゴヌクレオチドに接続（例えば、３’または５’端部におけるチオール（−ＳＨ）官能化）され、他の基は、２つのオリゴヌクレオチドを最終的に結合させる第２分子（例えば連結剤）によって取り込まれる（例えば、ＤＴＭＥ中のマレイミド）。
【０２４４】
様々な実施形態において、共有結合リンカーは、未修飾のジヌクレオチド結合、またはチオールとマレイミドとの反応生成物を含み得る。
【０２４５】
様々な実施形態において、多量体オリゴヌクレオチドの２つ以上のリンカーは、２つの直交型の生物学的に切断可能な結合を含み得る。好ましい実施形態では、２つの直交性の生物学的に切断可能な結合は、未修飾のジヌクレオチド及び、チオールとマレイミドとの反応生成物を含み得る。
【０２４６】
様々な実施形態において、核酸またはオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステルまたはチオホスホジエステルを介してリンカーに接続される（例えば、構造１中のＲ１はホスホジエステルまたはチオホスホジエステルである）。様々な実施形態において、核酸またはオリゴヌクレオチドは、Ｃ１〜８アルキル、Ｃ２〜８アルケニル、Ｃ２〜８アルキニル、ヘテロシクリル、アリール及びヘテロアリール、分岐アルキル、アリール、ハロアリール及び／またはその他の炭素系コネクタを介してリンカーに接続される。様々な実施形態において、核酸またはオリゴヌクレオチドは、Ｃ２〜Ｃ１０、Ｃ３〜Ｃ６またはＣ６アルキルを介してリンカーに接続される（例えば、構造１中のＲ２はＣ２〜Ｃ１０、Ｃ３〜Ｃ６またはＣ６アルキルである）。好ましい実施形態では、核酸またはオリゴヌクレオチドは、Ｃ６アルキルを介してリンカーに接続される。あるいは、これらの部分（例えば、構造１中のＲ１及び／またはＲ２）は任意であり、直接結合が可能である。
【０２４７】
様々な実施形態において、核酸またはオリゴヌクレオチドは、チオールとマレイミド基との反応生成物を介してリンカーに接続される。（例えば、構造１中のＡはチオールとマレイミド基との反応生成物である）。そのような化学を利用する好ましい連結剤としては、例えば、ＤＴＭＥ（ジチオビスマレイミドエタン）、ＢＭ（ＰＥＧ）２（１，８−ビス（マレイミド）ジエチレングリコール）、ＢＭ（ＰＥＧ）３（１，１１−ビスマレイミド−トリエチレングリコール）、ＢＭＯＥ（ビスマレイミドエタン）、ＢＭＨ（ビスマレイミドヘキサン）またはＢＭＢ（１，４−ビスマレイミドブタン）が挙げられる。
【０２４８】
また、実施例は例示的なものであり、限定的なものではない。様々な実施形態において、直接的に、官能性端部置換によって、または連結剤を介して間接的に、オリゴヌクレオチド同士をともに連結することができる。様々な実施形態において、オリゴヌクレオチドをリンカーに直接結合させることができる（例えば、構造１のＲ１及びＲ２が存在しない）。そのような結合は、例えば、当技術分野の通常の技能によって調製され得る３’−チオヌクレオシドを使用することによって成し遂げることができる。例えば、Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ３’−ｔｈｉｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ｏｌｉｇｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｖｉａ  ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”ＲＮＡ．１９９７  Ｎｏｖ；３（１１）：１３５２−６３を参照されたい。様々な実施形態において、連結剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン及びポリオキサゾリンなどの非イオン性親水性ポリマーまたは、ＰＬＧＡ及びＰＬＡなどの疎水性ポリマーであり得る。
【０２４９】
共有結合のための介在物質として使用されるポリマー連結剤は、ＰＥＧ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ、ポリビニルピロリドン、ポリオキサゾリンもしくはそれらのコポリマーを含めた非イオン性親水性ポリマー；または、ポリ−Ｌ−乳酸、ポリ−Ｄ−乳酸、ポリ−Ｄ，Ｌ−乳酸、ポリグリコール酸、ポリ−Ｄ−乳酸−コ−グリコール酸、ポリ−Ｌ−乳酸−コ−グリコール酸、ポリ−Ｄ，Ｌ−乳酸−コ−グリコール酸、ポリカプロラクトン、ポリバレロラクトン、ポリヒドロキシブチレート、ポリヒドロキシバレラートもしくはそれらのコポリマーを含めた１つまたは複数の生物学的に切断可能なポリエステルポリマーであり得るが、常にそれらに限定されるわけではない。
【０２５０】
連結剤の分子量は１００〜１０，０００ダルトンであり得る。そのような連結剤の例としては、ジチオ−ビス−マレイミドエタン（ＤＴＭＥ）、１，８−ビス−マレイミドジエチレングリコール（ＢＭ（ＰＥＧ）２）、トリス−（２−マレイミドエチル）−アミン（ＴＭＥＡ）、トリ−スクシンイミジルアミノトリアセテート（ＴＳＡＴ）、３−アーム−ポリ（エチレングリコール）（３−アームＰＥＧ）、マレイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、ビニルスルホン、ヨードアセチル、ニトロフェニルアジド、イソシアネート、ピリジルジスルフィド、ヒドラジド、及びヒドロキシフェニルアジドが挙げられる。
【０２５１】
本明細書においては、切断可能な結合（例えば、サイトゾルの化学環境によって切断する還元剤結合）を有する連結剤、または切断不可能な結合を有する連結剤を使用することができる。例えば、本発明の上記態様の連結剤は、アミド結合またはウレタン結合などの切断不可能な結合を有し得る。あるいは、本発明の上記態様の連結剤は、切断可能な結合、例えば、酸で切断可能な結合（例えば、エステル、ヒドラゾンまたはアセタールの共有結合）、還元剤で切断可能な結合（例えばジスルフィド結合）、生物学的に切断可能な結合、または酵素で切断可能な結合を有し得る。一実施形態では、切断可能な共有結合リンカーは細胞内条件下で切断可能である。さらに、薬物修飾のために使用することができる任意の連結剤を本発明の上記態様において限定されずに使用することができる。
【０２５２】
さらに、官能基と連結剤との組み合わせには次のものが含まれ得る：（ａ）官能基がアミノ及びチオールである場合、連結剤はスクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネートまたはスクシンイミジル６−（［３（２−ピリジルジチオ）プロピオアミド］ヘキサノエートであり得；（ｂ）官能基がアミノである場合、連結剤は３，３’ジチオジプロピオン酸ジ−（Ｎ−スクシンイミジルエステル）、ジチオ−ビス（エチル１Ｈ−イミダゾール−１−カルボキシレート）またはジチオ−ビス（エチル１Ｈ−イミダゾール−１−カルボキシレート）であり得；（ｃ）官能基がアミノ及びアルキンである場合、連結剤はスルホ−Ｎ−スクシンイミジル３−［［２−（ｐ−アジドサリチルアミド）エチル］−１，３’−ジチオ］プロピオネートであり得；（ｄ）官能基ｙがチオールである場合、連結剤はジチオ−ビス−マレイミドエタン（ＤＴＭＥ）、１，８−ビス−マレイミドジエチレングリコール（ＢＭ（ＰＥＧ）２）、またはジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（ＤＴＳＳＰ）である。
【０２５３】
化合物を調製する上記方法には、官能基を活性化させる追加ステップが含まれ得る。官能基の活性化に使用することができる化合物としては、限定されないが例えば、１−エチル−３，３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド、イミダゾール、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ジクロロヘキシルカルボジイミド、Ｎ−ベータ−マレイミドプロピオン酸、Ｎ−ベータ−マレイミドプロピルスクシンイミドエステルまたはＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネートが挙げられる。
【０２５４】
単量体中間体化合物
様々な態様において、本発明は、例えば所定のサイズ及び組成を有する定義された多重複合体オリゴヌクレオチドの合成に使用することができる、共有結合リンカーに結び付いたオリゴヌクレオチドを提供する。
【０２５５】
一態様では、本発明は、構造１
Ｘ−Ｒ１−Ｒ２−Ａ−Ｒ３−Ｂ  （構造１）
〔ここで、
Ｘは、その３’または５’末端を介してＲ１と結合された核酸であり；
Ｒ１は、リン酸の誘導体、チオリン酸の誘導体、スルフェート、アミド、グリコールであるか、または存在せず；
Ｒ２は、Ｃ２〜Ｃ１０アルキル、アルコキシもしくはアリール基であるか、または存在せず；
Ａは、求核剤と求電子剤との反応生成物であり；
Ｒ３は、Ｃ２〜Ｃ１０アルキル、アルコキシ、アリール、アルキルジチオ基、エーテル、チオエーテル、チオプロピオネートまたはジスルフィドであり；さらに
Ｂは、求核剤または求電子剤（例えば、チオール、マレイミド、ビニルスルホン、ピリジルジスルフィド、ヨードアセトアミド、アクリレート、アジド、アルキン、アミンまたはカルボキシル基）である〕
で示される化合物を提供する。
【０２５６】
一態様では、本発明は、構造２
2020518552.tif 000210
（構造２）
〔ここで、
Ｘは、その３’または５’末端においてホスフェートもしくはその誘導体、またはチオホスフェートもしくはその誘導体を介してＲ１と結合された核酸であり；
各Ｒ１は独立してＣ２〜Ｃ１０アルキル、アルコキシまたはアリール基であり；さらに
Ｒ２はチオプロピオネートまたはジスルフィド基である〕
で示される化合物を提供する。
【０２５７】
一態様では、本発明は、構造３
Ｘ−Ｒ１−Ｒ２−Ａ−Ｒ３−Ｂ  （構造３）
〔ここで、
Ｘは、その３’または５’末端を介してＲ１と結合された核酸であり；
Ｒ１は、リン酸の誘導体、例えば、ホスフェート、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ホスホネート、ホスホロアミダートなど、チオリン酸の誘導体、例えば、チオホスフェート、チオホスホジエステル、チオホスホトリエステル、チオホスホロアミダートなど、スルフェート、アミド、グリコールであるか、または存在せず；
Ｒ２は、Ｃ２〜Ｃ１０アルキル、アルコキシもしくはアリール基であるか、または存在せず；
Ａは、第１反応性部分と第２反応性部分との反応生成物であり；
Ｒ３は、Ｃ２〜Ｃ１０アルキル、アルコキシ、アリール、アルキルジチオ基、エーテル、チオエーテル、チオプロピオネートまたはジスルフィドであり；さらに
Ｂは、第３反応性部分である〕
で示される化合物を提供する。
【０２５８】
様々な態様において、本発明はさらに、共有結合リンカーに結び付いたオリゴヌクレオチドを合成する方法を提供する。
【０２５９】
一態様では、本発明は、構造１で示される（または、構造２もしくは構造３で示される化合物の合成に適合する）化合物を合成する方法を提供し、当該方法は、
官能化核酸Ｘ−Ｒ１−Ｒ２−Ａ’と共有結合リンカーＡ’’−Ｒ３−Ｂと
〔ここで、Ａ’及びＡ’’は求核剤及び求電子剤を含む〕
をＸ−Ｒ１−Ｒ２−Ａ’の希釈溶液中で、Ａ’’−Ｒ３−Ｂを化学量論的に過剰にして反応させ、それによって化合物Ｘ−Ｒ１−Ｒ２−Ａ−Ｒ３−Ｂ（構造１）
〔ここで、
Ｘは、その３’または５’末端を介してＲ１と結合された核酸であり；
Ｒ１は、ホスホジエステル、チオホスホジエステル、スルフェート、アミド、グリコールであるか、または存在せず；
Ｒ２は、Ｃ２〜Ｃ１０アルキル、アルコキシもしくはアリール基であるか、または存在せず；
Ａは、求核剤と求電子剤との反応生成物であり；
Ｒ３は、Ｃ２〜Ｃ１０アルキル、アルコキシ、アリール、アルキルジチオ基、エーテル、チオエーテル、チオプロピオネートまたはジスルフィドであり；さらに
Ｂは、求核剤または求電子剤（例えば、チオール、マレイミド、ビニルスルホン、ピリジルジスルフィド、ヨードアセトアミド、アクリレート、アジド、アルキン、アミンまたはカルボキシル基）である〕
を形成することを含む。
【０２６０】
方法はさらに、官能化核酸Ｘ−Ｒ１−Ｒ２−Ａ’を合成するステップを含み得、ここで、Ａ’は、（ｉ）ホスホロアミダイトオリゴマー化化学を用いて核酸の固相合成中にチオールを導入すること、または（ｉｉ）固相合成中に導入されたジスルフィドの還元によって、チオール（−ＳＨ）を含む。
【０２６１】
様々な実施形態において、構造１の化合物を合成する方法はさらに、構造２の化合物を合成することを含む。
【０２６２】
共有結合リンカーに結び付いたオリゴヌクレオチドは、実施例を含めた本明細書に記載されている特徴のいずれか１つまたは複数を含み得る。例えば、化合物は、本明細書に記載の（修飾を含む、または含まない）核酸、標的指向性リガンド及び／またはリンカーのいずれか１つもしくは複数、または、概要、説明もしくは実施例に示されているいずれかの具体的な構造もしくは化学を含み得る。実施例１は、チオール末端オリゴヌクレオチドを生成するための方法論の一例を提供する。実施例２は、リンカーに結び付いたオリゴヌクレオチドを調製するための方法論の一例を提供する。
【０２６３】
様々な実施形態において、構造１、２または３の化合物を合成する方法は、構造１、２または３の形成に実質的に有利となりＸの二量体化を実質的に防止する条件の下で行われる。当該条件は、反応の収率を向上させる（例えば生成物の純度を向上させる）ことができる。
【０２６４】
様々な実施形態において、構造１、２または３の化合物を合成する方法、官能化核酸Ｘ−Ｒ１−Ｒ２−Ａ’と共有結合リンカーＡ’’−Ｒ３−Ｂとを反応させるステップは、Ｘ−Ｒ１−Ｒ２−Ａ’の約１ｍＭ、５００μＭ、２５０μＭ、１００μＭまたは５０μＭよりも低い濃度で行われる。あるいは、Ｘ−Ｒ１−Ｒ２−Ａ’の濃度は約１ｍＭ、５００μＭ、２５０μＭ、１００μＭまたは５０μＭとすることができる。
【０２６５】
様々な実施形態において、構造１、２または３の化合物を合成する方法、官能化核酸Ｘ−Ｒ１−Ｒ２−Ａ’と共有結合リンカーＡ’’−Ｒ３−Ｂとを反応させるステップは、Ａ’’−Ｒ３−Ｂを少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０または１００モル過剰にして行われる。あるいは、Ａ’’−Ｒ３−Ｂを約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０または１００モル過剰とすることができる。
【０２６６】
様々な実施形態において、構造１、２または３の化合物を合成する方法、官能化核酸Ｘ−Ｒ１−Ｒ２−Ａ’と共有結合リンカーＡ’’−Ｒ３−Ｂとを反応させるステップは、約７、６、５または４より低いｐＨで行われる。あるいは、ｐＨは約７、６、５または４とすることができる。
【０２６７】
様々な実施形態において、構造１、２または３の化合物を合成する方法、官能化核酸Ｘ−Ｒ１−Ｒ２−Ａ’と共有結合リンカーＡ’’−Ｒ３−Ｂとを反応させるステップは、水及び水混和性有機共溶媒を含む溶液の中で行われる。水混和性有機共溶媒は、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）、ＮＭＰ（Ｎ−メチル−２−ピロリドン）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキド）またはアセトニトリルを含み得る。水混和性有機共溶媒は溶液の約１０、１５、２０、２５、３０、４０または５０％Ｖ（ｖ／ｖ）を構成し得る。
【０２６８】
様々な実施形態において、化合物は、単離されているかまたは実質的に純粋である。例えば、化合物は、少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００％純粋であり得る。一実施形態では、化合物は約８５〜９５％純粋である。同様に、本発明に係る化合物及び組成物を合成する方法は、少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００％純粋な生成物をもたらすことができる。一実施形態では、生成物は約８５〜９５％純粋である。調製物は、５０％以上純粋；好ましくは７５％以上純粋；より好ましくは８５％以上純粋；さらにいっそう好ましくは９５％以上純粋であり得る。
【０２６９】
本明細書中で使用する場合、約という用語は、近似的に、というその明らかで普通の意味に合致して使用される。例えば、「約Ｘ」は、近似での示された値Ｘを包含し、Ｘの値の測定誤差範囲内にある類似する量または、Ｘと近似的に同じでありかつＸと本質的に同じ特性を有する量を含む。
【０２７０】
本明細書中で使用する場合、単離されたとは、他の不要物質から分離された化合物を含む。単離された化合物は、粗反応混合物の他成分の残存量を含めたいくらかの量の不純物が残存する可能性があることを別とすれば、実質的に純粋な状態で合成され得るかまたは、粗反応混合物の他成分から分離され得る。同様に、純粋または実質的に純粋とは、その意図された（例えば、医薬製剤での、または後の化学反応のための材料としての）用途を許容するのに十分な程度に不純物を含まないことを意味する。Ｘ％純粋とは、例えばＨＰＬＣなどの分析的方法によるものであり得る適切な測定によって、化合物が組成物全体のＸ％であることを意味する。
【０２７１】
二量体化合物及び中間体
様々な態様において、本発明は、二量体によって定義付けられる多重複合体オリゴヌクレオチドを提供する。これらの化合物は、ホモ二量体（例えば、実質的に同じである、例えばインビボで同じ遺伝子を指向する、２つのオリゴヌクレオチド）及びヘテロ二量体（例えば、実質的に異なる、例えば異なる配列である、インビボで異なる遺伝子を指向する２つのオリゴヌクレオチド）を含む。
【０２７２】
一態様では、本発明は、構造４
2020518552.tif 000211
で示される単離された化合物を提供し、ここで、
各
2020518552.tif 000212
は、インビボで同じ分子標的と反応するように設計された二本鎖オリゴヌクレオチドであり、さらに
●は、隣接する一本鎖オリゴヌクレオチドの一本鎖同士をそれらの３’または５’末端において連結しており、構造−Ｒ１−Ｒ２−Ａ−Ｒ３−Ａ−Ｒ２−Ｒ１−を有する共有結合リンカーであり、ここで、
各Ｒ１は、リン酸の誘導体、例えば、ホスフェート、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ホスホネート、ホスホロアミダートなど、チオリン酸の誘導体、例えば、チオホスフェート、チオホスホジエステル、チオホスホトリエステル、チオホスホロアミダートなど、
スルフェート、アミド、グリコールであるか、または存在せず；
各Ｒ２は独立してＣ２〜Ｃ１０アルキル、アルコキシもしくはアリール基であるか、または存在せず；
各Ａは独立して、求核剤と求電子剤との反応生成物であり；さらに
Ｒ３は、Ｃ２〜Ｃ１０アルキル、アルコキシ、アリール、アルキルジチオ基、エーテル、チオエーテル、チオプロピオネートまたはジスルフィドである。
【０２７３】
一態様では、本発明は、構造５
2020518552.tif 000213
で示される単離された化合物を提供し、ここで、
2020518552.tif 000214
は第１一本鎖オリゴヌクレオチドであり、
2020518552.tif 000215
は、第１一本鎖オリゴヌクレオチドとは異なる配列を有する第２一本鎖オリゴヌクレオチドであり、
●は、隣接する一本鎖オリゴヌクレオチドの一本鎖同士をそれらの３’または５’末端において連結しており、構造−Ｒ１−Ｒ２−Ａ−Ｒ３−Ａ−Ｒ２−Ｒ１−を有する共有結合リンカーであり、ここで、
各Ｒ１は、リン酸の誘導体、例えば、ホスフェート、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ホスホネート、ホスホロアミダートなど、チオリン酸の誘導体、例えば、チオホスフェート、チオホスホジエステル、チオホスホトリエステル、チオホスホロアミダートなど、
スルフェート、アミド、グリコールであるか、または存在せず；
各Ｒ２は独立してＣ２〜Ｃ１０アルキル、アルコキシもしくはアリール基であるか、または存在せず；
各Ａは独立して、チオールとマレイミド、チオールとビニルスルホン、チオールとピリジルジスルフィド、チオールとヨードアセトアミド、チオールとアクリレート、アジドとアルキン、またはアミンとカルボキシル基との反応生成物であり；さらに
Ｒ３は、Ｃ２〜Ｃ１０アルキル、アルコキシ、アリール、アルキルジチオ基、エーテル、チオエーテル、チオプロピオネートまたはジスルフィドである。
【０２７４】
一態様では、本発明は、構造６
2020518552.tif 000216
で示される単離された化合物を提供し、ここで、
2020518552.tif 000217
は、第１二本鎖オリゴヌクレオチドであり、
2020518552.tif 000218
は、第１二本鎖オリゴヌクレオチドとは異なる配列を有する第２二本鎖オリゴヌクレオチドであり、さらに
●は、隣接する一本鎖オリゴヌクレオチドの一本鎖同士をそれらの３’または５’末端において連結しており、構造−Ｒ１−Ｒ２−Ａ−Ｒ３−Ａ−Ｒ２−Ｒ１−を有する共有結合リンカーであり、ここで、
各Ｒ１は、リン酸の誘導体、例えば、ホスフェート、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ホスホネート、ホスホロアミダートなど、チオリン酸の誘導体、例えば、チオホスフェート、チオホスホジエステル、チオホスホトリエステル、チオホスホロアミダートなど、スルフェート、アミド、グリコールであるか、または存在せず；
各Ｒ２は独立してＣ２〜Ｃ１０アルキル、アルコキシもしくはアリール基であるか、または存在せず；
各Ａは独立して、チオールとマレイミド、チオールとビニルスルホン、チオールとピリジルジスルフィド、チオールとヨードアセトアミド、チオールとアクリレート、アジドとアルキン、またはアミンとカルボキシル基との反応生成物であり；さらに
Ｒ３は、Ｃ２〜Ｃ１０アルキル、アルコキシ、アリール、アルキルジチオ基、エーテル、チオエーテル、チオプロピオネートまたはジスルフィドである。
【０２７５】
一態様では、本発明は、構造１１
2020518552.tif 000219
で示される単離された化合物を提供し、ここで、
2020518552.tif 000220
は、二本鎖オリゴヌクレオチドであり、
2020518552.tif 000221
は、一本鎖オリゴヌクレオチドであり、さらに
●は、隣接する一本鎖オリゴヌクレオチドの一本鎖同士を連結している共有結合リンカーである。
【０２７６】
様々な態様において、本発明は、二量体によって定義付けられる多重複合体オリゴヌクレオチドを合成する方法を提供する。
【０２７７】
一態様では、本発明は、構造５
2020518552.tif 000222
〔ここで、
2020518552.tif 000223
は第１一本鎖オリゴヌクレオチドであり、
2020518552.tif 000224
は、第１一本鎖オリゴヌクレオチドとは異なる配列を有する第２一本鎖オリゴヌクレオチドであり、●は、隣接する一本鎖オリゴヌクレオチドの一本鎖同士をそれらの３’または５’末端において連結している共有結合リンカーである〕
の化合物を合成する方法を提供し、当該方法は、
（ｉ）第１一本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000225
と二官能性結合部分○と
〔ここで、Ｒ１は、一置換生成物
2020518552.tif 000226
を生成する条件の下で○と反応することができる化学基である〕
を反応させるステップ；
（ｉｉ）
2020518552.tif 000227
と第２一本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000228
と
〔ここで、Ｒ２は、○と反応することができる化学基である〕
を反応させ、それによって
2020518552.tif 000229
を形成するステップ
を含む。
【０２７８】
方法はさらに、相補的な
2020518552.tif 000230
をアニーリングさせて構造６
2020518552.tif 000231
を得るステップを含み得る。
【０２７９】
一態様では、本発明は、構造４
2020518552.tif 000232
〔ここで、各
2020518552.tif 000233
は二本鎖オリゴヌクレオチドであり、●は、隣接する一本鎖オリゴヌクレオチドの一本鎖同士をそれらの３’または５’末端において連結している共有結合リンカーである〕
の単離された化合物を合成する方法を提供し、当該方法は、
（ｉ）第１一本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000234
と二官能性結合部分○と
〔ここで、Ｒ１は、○と反応することができる化学基である〕
を反応させ、それによって一置換生成物
2020518552.tif 000235
を形成するステップ；
（ｉｉ）
2020518552.tif 000236
と第２一本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000237
と
〔ここで、Ｒ２は、○と反応することができる化学基である〕
を反応させ、それによって一本鎖二量体
2020518552.tif 000238
を形成するステップ；
（ｉｉｉ）一本鎖オリゴヌクレオチドを同時または逐次的にアニーリングさせ、それによって
2020518552.tif 000239
を形成するステップ
を含む。
【０２８０】
一態様では、本発明は、構造４
2020518552.tif 000240
〔ここで、各
2020518552.tif 000241
は二本鎖オリゴヌクレオチドであり、●は、隣接する一本鎖オリゴヌクレオチドの一本鎖同士をそれらの３’または５’末端において連結している共有結合リンカーである〕
の単離された化合物を合成する方法を提供し、当該方法は、
（ｉ）
（ａ）第１一本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000242
と第２一本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000243
とをアニーリングさせ、それによって
2020518552.tif 000244
を形成し、
2020518552.tif 000245
と第３一本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000246
と
〔ここで、Ｒ１及びＲ２は、直接的または間接的に反応して共有結合リンカー●を形成することができる化学部分である〕
を反応させ、それによって
2020518552.tif 000247
を形成すること；または
（ｂ）第２一本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000248
と第３一本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000249
とを反応させ、それによって
2020518552.tif 000250
を形成し、第１一本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000251
と
2020518552.tif 000252
とをアニーリングさせ、それによって
2020518552.tif 000253
を形成すること
によって、
2020518552.tif 000254
を形成するステップ；
（ｉｉ）
2020518552.tif 000255
と第４一本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000256
とをアニーリングさせ、それによって
2020518552.tif 000257
を形成するステップ
を含む。
【０２８１】
この方法論は、例えばステップ（ｉｉ）を省略することによって、
2020518552.tif 000258
で示される単離された化合物を合成することに適合し得る。
【０２８２】
一態様では、本発明は、構造４
2020518552.tif 000259
〔ここで、各
2020518552.tif 000260
は二本鎖オリゴヌクレオチドであり、●は、隣接する一本鎖オリゴヌクレオチドの一本鎖同士をそれらの３’または５’末端において連結している共有結合リンカーである〕
の単離された化合物を合成する方法を提供し、当該方法は、
（ａ）第１一本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000261
と第２一本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000262
とをアニーリングさせ、それによって
2020518552.tif 000263
を形成するステップ；
（ｂ）第３一本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000264
と第４一本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000265
とをアニーリングさせ、それによって
2020518552.tif 000266
を形成するステップ；
（ｃ）
2020518552.tif 000267
と
2020518552.tif 000268
と
〔ここで、Ｒ１及びＲ２は、直接的または間接的に反応して共有結合リンカー●を形成することができる化学部分である〕
を反応させ、それによって
2020518552.tif 000269
を形成するステップ
を含む。
【０２８３】
本発明に係る他の化合物及び組成物と同様に、二量体化合物及び中間体は、実施例を含めた本明細書に記載されている特徴のいずれか１つまたは複数を含み得る。例えば、化合物は、本明細書に記載の（修飾を含む、または含まない）核酸、標的指向性リガンド及び／またはリンカーのいずれか１つもしくは複数、または、概要、説明もしくは実施例に示されているいずれかの具体的な構造もしくは化学を含み得る。
【０２８４】
実施例３は、二量体化オリゴヌクレオチドを調製するための方法論の一例を提供し、実施例４は、一本鎖オリゴヌクレオチドをアニーリングさせて二本鎖オリゴヌクレオチドを形成するための方法論の一例を提供する。実施例７は、上記合成において有用となる様々なオリゴヌクレオチド前駆体を調製するための方法論の一例を提供する。実施例８は、上記合成において同様に有用となる様々なオリゴヌクレオチド多量体を調製するための方法論の一例を提供する。
【０２８５】
ヘテロ二量体の例は、実施例９及び実施例１０において提供される。
【０２８６】
ホモ二量体の例は、実施例１２〜１５において提供される。
【０２８７】
様々な実施形態において、Ｒ１、Ｒ２及び二官能性結合部分○は、本明細書において記載され示されている共有結合リンカー●を形成することができる。例えば、様々な実施形態において、Ｒ１及びＲ２は各々独立して反応性部分、例えば求電子剤または求核剤を含み得る。一実施形態では、Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、チオール、マレイミド、ビニルスルホン、ピリジルジスルフィド、ヨードアセトアミド、アクリレート、アジド、アルキン、アミン及びカルボキシル基からなる群から選択され得る。様々な実施形態において、二官能性結合部分○は、上記ステップ（ｉ）及び（ｉｉ）に従って逐次反応することができる２つの反応性部分、例えば、Ｒ１中及びＲ２中の求電子剤／求核剤と反応することができる第２求電子剤／求核剤を含む。二官能性結合部分○の例としては、限定されないが、ＤＴＭＥ、ＢＭ（ＰＥＧ）２、ＢＭ（ＰＥＧ）３、ＢＭＯＥ、ＢＭＨまたはＢＭＢが挙げられる。
【０２８８】
本発明のこれら及びその他全ての合成方法はさらに、標的指向性リガンドを分子に付加させるステップを含み得る。実施例６は、標的指向性リガンド（例えばＧａｌＮＡｃ）を付加させるための方法論の一例を提供する。標的指向性リガンドを付加させるさらなる方法は当技術分野において既知であり、当業者であれば当該方法を本発明に適合させることができる。
【０２８９】
多量体（ｎ＞２）化合物及び中間体
様々な態様において、本発明は、定義された三重複合体及び定義された四重複合体を含めた、多量体（ｎ＞２）によって定義付けられる多重複合体オリゴヌクレオチドを提供する。
【０２９０】
一態様では、本発明は、構造７または構造８
2020518552.tif 000270
〔ここで、
各
2020518552.tif 000271
は二本鎖オリゴヌクレオチドであり、
各●は、隣接する一本鎖オリゴヌクレオチドの一本鎖同士を連結している共有結合リンカーであり、さらに
ｍは１以上の整数であり、ｎは０以上の整数である〕
で示される化合物を提供する。
【０２９１】
一態様では、本発明は、ｎ＝０である場合の構造９
2020518552.tif 000272
で示される化合物を提供する。一態様では、本発明は、ｍ＝１である場合の構造１０
2020518552.tif 000273
で示される化合物を提供する。
【０２９２】
一態様では、本発明は、構造１２、１３、１４または１５
2020518552.tif 000274
〔ここで、
各
2020518552.tif 000275
は、二本鎖オリゴヌクレオチドであり、
各
2020518552.tif 000276
は、一本鎖オリゴヌクレオチドであり、
各●は、隣接する一本鎖オリゴヌクレオチドの一本鎖同士を連結している共有結合リンカーであり、ｍは１以上の整数であり、ｎは０以上の整数である〕
で示される化合物を提供する。
【０２９３】
様々な態様において、本発明は、定義された三重複合体及び定義された四重複合体を含めた、多量体（ｎ＞２）によって定義付けられる多重複合体オリゴヌクレオチドを合成する方法を提供する。
【０２９４】
一態様では、本発明は、構造７または構造８
2020518552.tif 000277
〔ここで、各
2020518552.tif 000278
は二本鎖オリゴヌクレオチドであり、各●は、隣接する一本鎖オリゴヌクレオチドの一本鎖同士を連結している共有結合リンカーであり、ｍは１以上の整数であり、ｎは０以上の整数である〕
で示される化合物を合成する方法を提供し、当該方法は、
（ｉ）
（ａ）第１一本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000279
と第２一本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000280
とをアニーリングさせ、それによって
2020518552.tif 000281
を形成し、
2020518552.tif 000282
と第３一本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000283
と
〔ここで、Ｒ１及びＲ２は、直接的または間接的に反応して共有結合リンカー●を形成することができる化学部分である〕
を反応させ、それによって
2020518552.tif 000284
を形成すること；または
（ｂ）第２一本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000285
と第３一本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000286
とを反応させ、それによって
2020518552.tif 000287
を形成し、第１一本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000288
と
2020518552.tif 000289
とをアニーリングさせ、それによって
2020518552.tif 000290
を形成すること
によって、
2020518552.tif 000291
を形成するステップ；
（ｉｉ）
2020518552.tif 000292
と第２一本鎖二量体
2020518552.tif 000293
とをアニーリングさせ、それによって
2020518552.tif 000294
を形成し、任意で、１つまたは複数の追加一本鎖二量体
2020518552.tif 000295
を
2020518552.tif 000296
とアニーリングさせ、それによって
2020518552.tif 000297
〔ここで、ｍは１以上の整数であり、ｎは０以上の整数である〕
を形成するステップ；及び
（ｉｉｉ）第４一本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000298
をステップ（ｉｉ）の生成物とアニーリングさせ、それによって構造７または構造８を形成するステップ
を含む。
【０２９５】
一態様では、本発明は、構造７または構造８
2020518552.tif 000299
〔ここで、各
2020518552.tif 000300
は二本鎖オリゴヌクレオチドであり、各●は、隣接する一本鎖オリゴヌクレオチドの一本鎖同士を連結している共有結合リンカーであり、ｍは１以上の整数であり、ｎは０以上の整数である〕
で示される化合物を合成する方法を提供し、当該方法は、
（ｉ）第１一本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000301
と第１一本鎖二量体
2020518552.tif 000302
とをアニーリングさせ、それによって
2020518552.tif 000303
を形成するステップ；
（ｉｉ）
2020518552.tif 000304
と第２一本鎖二量体
2020518552.tif 000305
とをアニーリングさせ、それによって
2020518552.tif 000306
を形成し、任意で、１つまたは複数の追加一本鎖二量体
2020518552.tif 000307
を
2020518552.tif 000308
とアニーリングさせ、それによって
2020518552.tif 000309
〔ここで、ｍは１以上の整数であり、ｎは０以上の整数である〕
を形成するステップ；及び
（ｉｉｉ）第２一本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000310
をステップ（ｉｉ）の生成物とアニーリングさせ、それによって構造７または構造８を形成するステップ
を含む。
【０２９６】
一態様では、本発明は、構造９
2020518552.tif 000311
〔ここで、各
2020518552.tif 000312
は二本鎖オリゴヌクレオチドであり、各●は、隣接する一本鎖オリゴヌクレオチドの一本鎖同士を連結している共有結合リンカーである〕
の化合物を合成する方法を提供し、当該方法は、
（ｉ）
（ａ）第１一本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000313
と第２一本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000314
とをアニーリングさせ、それによって
2020518552.tif 000315
を形成し、
2020518552.tif 000316
と第３一本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000317
と
〔ここで、Ｒ１及びＲ２は、直接的または間接的に反応して共有結合リンカー●を形成することができる化学部分である〕
を反応させ、それによって
2020518552.tif 000318
を形成すること；または
（ｂ）第２一本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000319
と第３一本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000320
とを反応させ、それによって
2020518552.tif 000321
を形成し、第１一本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000322
と
2020518552.tif 000323
とをアニーリングさせ、それによって
2020518552.tif 000324
を形成すること
によって、
2020518552.tif 000325
を形成するステップ；
（ｉｉ）
2020518552.tif 000326
と一本鎖二量体
2020518552.tif 000327
とをアニーリングさせ、それによって
2020518552.tif 000328
を形成するステップ；及び
（ｉｉｉ）
2020518552.tif 000329
と第４一本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000330
とをアニーリングさせ、それによって
2020518552.tif 000331
を形成するステップ
を含む。
【０２９７】
一態様では、本発明は、構造１０
2020518552.tif 000332
〔ここで、各
2020518552.tif 000333
は二本鎖オリゴヌクレオチドであり、各●は、隣接する一本鎖オリゴヌクレオチドの一本鎖同士を連結している共有結合リンカーである〕
の化合物を合成する方法を提供し、当該方法は、
（ｉ）
（ａ）第１一本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000334
と第２一本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000335
とをアニーリングさせ、それによって
2020518552.tif 000336
を形成し、
2020518552.tif 000337
と第３一本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000338
と
〔ここで、Ｒ１及びＲ２は、直接的または間接的に反応して共有結合リンカー●を形成することができる化学部分である〕
を反応させ、それによって
2020518552.tif 000339
を形成すること；または
（ｂ）第２一本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000340
と第３一本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000341
とを反応させ、それによって
2020518552.tif 000342
を形成し、第１一本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000343
と
2020518552.tif 000344
とをアニーリングさせ、それによって
2020518552.tif 000345
を形成すること
によって、
2020518552.tif 000346
を形成するステップ；
（ｉｉ）
2020518552.tif 000347
と一本鎖二量体
2020518552.tif 000348
とをアニーリングさせ、それによって
2020518552.tif 000349
を形成するステップ；
（ｉｉｉ）
2020518552.tif 000350
と第２一本鎖二量体
2020518552.tif 000351
とをアニーリングさせ、それによって
2020518552.tif 000352
を形成するステップ；及び
（ｉｖ）
2020518552.tif 000353
と第４一本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000354
とをアニーリングさせ、それによって
2020518552.tif 000355
を形成するステップ
を含む。
【０２９８】
本発明に係る他の化合物及び組成物と同様に、二量体化合物及び中間体は、実施例を含めた本明細書に記載されている特徴のいずれか１つまたは複数を含み得る。例えば、化合物は、本明細書に記載の（修飾を含む、または含まない）核酸、標的指向性リガンド及び／またはリンカーのいずれか１つもしくは複数、または、概要、説明もしくは実施例に示されているいずれかの具体的な構造もしくは化学を含み得る。
【０２９９】
実施例７は、上記合成において有用となる様々なオリゴヌクレオチド前駆体を調製するための方法論の一例を提供する。実施例８は、上記合成においても同様に有用となる様々なオリゴヌクレオチド多量体を調製するための方法論の一例を提供する。
【０３００】
様々な実施形態において、Ｒ１、Ｒ２及び二官能性結合部分○は、本明細書において記載され示されている共有結合リンカー●を形成することができる。例えば、様々な実施形態において、Ｒ１及びＲ２は各々独立して反応性部分、例えば求電子剤または求核剤を含み得る。一実施形態では、Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、チオール、マレイミド、ビニルスルホン、ピリジルジスルフィド、ヨードアセトアミド、アクリレート、アジド、アルキン、アミン及びカルボキシル基からなる群から選択され得る。様々な実施形態において、二官能性結合部分○は、上記ステップ（ｉ）及び（ｉｉ）に従って逐次反応することができる２つの反応性部分、例えば、Ｒ１中及びＲ２中の求電子剤／求核剤と反応することができる第２求電子剤／求核剤を含む。二官能性結合部分○の例としては、限定されないが、ＤＴＭＥ、ＢＭ（ＰＥＧ）２、ＢＭ（ＰＥＧ）３、ＢＭＯＥ、ＢＭＨまたはＢＭＢが挙げられる。
【０３０１】
２つ以上の共有結合リンカー●を（例えば構造７〜１６の中に）含む様々な実施形態において、リンカーは全て同じである。あるいは、化合物または組成物は２種以上の異なる共有結合リンカー●を含み得る。
【０３０２】
様々な実施形態において、各
2020518552.tif 000356
は独立して２つのセンスオリゴヌクレオチドまたは２つのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでいてもよい。例えば、ｓｉＲＮＡの場合、
2020518552.tif 000357
は２つの活性鎖または２つのパッセンジャー鎖を含んでいてもよい。
【０３０３】
様々な実施形態において、各
2020518552.tif 000358
は独立して１つのセンスオリゴヌクレオチドと１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドとを含んでいてもよい。例えば、ｓｉＲＮＡの場合、
2020518552.tif 000359
は１つの活性鎖と１つのパッセンジャー鎖とを含んでいてもよい。
【０３０４】
様々な実施形態において、化合物または組成物は、実質的に同一な二本鎖オリゴヌクレオチドのホモ多量体を含む。実質的に同一な二本鎖オリゴヌクレオチドは各々、インビボで同じ分子標的を指向するｓｉＲＮＡを含み得る。
【０３０５】
様々な実施形態において、化合物または組成物は、２種以上の実質的に異なる二本鎖オリゴヌクレオチドのヘテロ多量体を含む。実質的に異なる二本鎖オリゴヌクレオチドは各々、異なる遺伝子を指向するｓｉＲＮＡを含み得る。
【０３０６】
様々な実施形態において、化合物は、構造９を含み、ｎ＝０である：
2020518552.tif 000360
。化合物はさらに、標的指向性リガンドを含み得る。化合物はさらに、インビボで異なる分子標的を指向するｓｉＲＮＡを各々が含んでいる２つまたは３つの実質的に異なる二本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000361
を含み得る。化合物はさらに、標的指向性リガンド、第ＶＩＩ因子を指向する第１ｓｉＲＮＡガイド鎖とガイド鎖にハイブリダイズしている第１パッセンジャー鎖とを含む１つの
2020518552.tif 000362
、アポリポタンパク質Ｂを指向する第２ｓｉＲＮＡガイド鎖と第２ガイド鎖にハイブリダイズしている第２パッセンジャー鎖とを含む１つの
2020518552.tif 000363
及び、ＴＴＲを指向する第３ｓｉＲＮＡガイド鎖と第３ガイド鎖にハイブリダイズしている第３パッセンジャー鎖とを含む１つの
2020518552.tif 000364
を含み得る。標的指向性リガンドはＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を含み得る。
【０３０７】
三量体の例は実施例１７、１８及び２０で提供される。
【０３０８】
様々な実施形態において、化合物は構造１０を含み、ｍ＝１である：
2020518552.tif 000365
。化合物はさらに、標的指向性リガンドを含み得る。化合物はさらに、インビボで異なる分子標的を指向するｓｉＲＮＡを各々が含んでいる２つ、３つまたは４つの実質的に異なる二本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000366
を含み得る。化合物はさらに、標的指向性リガンド、第ＶＩＩ因子を指向する第１ｓｉＲＮＡガイド鎖とガイド鎖にハイブリダイズしている第１パッセンジャー鎖とを含む１つの
2020518552.tif 000367
、アポリポタンパク質Ｂを指向する第２ｓｉＲＮＡガイド鎖と第２ガイド鎖にハイブリダイズしている第２パッセンジャー鎖とを含む１つの
2020518552.tif 000368
及び、ＴＴＲを指向する第３ｓｉＲＮＡガイド鎖と第３ガイド鎖にハイブリダイズしている第３パッセンジャー鎖とを含む１つの
2020518552.tif 000369
を含み得る。標的指向性リガンドはＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を含み得る。
【０３０９】
四量体の例は実施例２１で提供される。
【０３１０】
様々な実施形態において、各二本鎖オリゴヌクレオチド（例えば
2020518552.tif 000370
、例えば構造４中のもの）は、第ＶＩＩ因子を指向するｓｉＲＮＡガイド鎖と、ガイド鎖にハイブリダイズするパッセンジャー鎖とを含む。
【０３１１】
様々な実施形態（例えば構造４）において、化合物はさらに標的指向性リガンドを含み、各二本鎖オリゴヌクレオチド（例えば
2020518552.tif 000371
）は、ｓｉＲＮＡガイド鎖と、ガイド鎖にハイブリダイズしているパッセンジャー鎖とを含み、化合物は少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００％純粋である。
【０３１２】
様々な実施形態において、少なくとも１つの二本鎖オリゴヌクレオチド（例えば
2020518552.tif 000372
、例えば構造６中のもの）は、第ＶＩＩ因子を指向する第１ｓｉＲＮＡガイド鎖と、ガイド鎖にハイブリダイズしている第１パッセンジャー鎖とを含み、少なくとも１つの二本鎖オリゴヌクレオチド（例えば
2020518552.tif 000373
、例えば構造６中のもの）は、アポリポタンパク質Ｂを指向する第２ｓｉＲＮＡガイド鎖と、第２ガイド鎖にハイブリダイズしている第２パッセンジャー鎖とを含む。
【０３１３】
インビボでの循環半減期及び／または活性が増加したオリゴヌクレオチド
本発明は、インビボでの循環半減期及び／または活性が増加した多量体オリゴヌクレオチド、ならびに多量体オリゴヌクレオチドを含む組成物、及びそれを合成及び使用する方法を提供する。
【０３１４】
様々な態様において、本発明は、構造２１
2020518552.tif 000374
を含む多量体オリゴヌクレオチドを提供し、各単量体サブユニット
2020518552.tif 000375
は独立して一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドであり、ｍは１以上の整数であり、各●は、隣接する単量体サブユニット
2020518552.tif 000376
同士を連結している共有結合リンカーであり、単量体サブユニット
2020518552.tif 000377
の少なくとも１つは、
その３’末端に連結された１つの共有結合リンカー●と、その５’末端に連結された別の共有結合リンカーとを有する、一本鎖
を含む。
【０３１５】
様々な態様において、本発明は、構造２１
2020518552.tif 000378
を含む多量体オリゴヌクレオチドを提供し、各単量体サブユニット
2020518552.tif 000379
は独立して一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドであり、各●は、隣接する単量体サブユニット
2020518552.tif 000380
同士を連結している共有結合リンカーであり、ｍは、（ａ）多量体オリゴヌクレオチドのインビボでの循環半減期が個々の単量体サブユニット
2020518552.tif 000381
のそれに比べて増加するように及び／または（ｂ）多量体オリゴヌクレオチドのインビボでの活性が個々の単量体サブユニット
2020518552.tif 000382
のそれに比べて増加するように選択される０以上の整数である。
【０３１６】
様々な態様において、本発明は、構造２１
2020518552.tif 000383
〔ここで、各単量体サブユニット
2020518552.tif 000384
は独立して一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドであり、各●は、隣接する単量体サブユニット
2020518552.tif 000385
同士を連結している共有結合リンカーであり、ｍは０以上の整数である〕
を含む多量体オリゴヌクレオチドであって、
（ａ）多量体オリゴヌクレオチドのインビボでの循環半減期が個々の単量体サブユニット
2020518552.tif 000386
のそれに比べて増加するように及び／または（ｂ）多量体オリゴヌクレオチドのインビボでの活性が個々の単量体サブユニット
2020518552.tif 000387
のそれに比べて増加するように設定された分子サイズ及び／または分子量
を有する、当該多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【０３１７】
様々な態様において、本発明は、１つもしくは複数のオリゴヌクレオチドのインビボでの循環半減期及び／またはインビボでの活性を増加させる方法を提供し、当該方法は、構造２１
2020518552.tif 000388
〔ここで、各単量体サブユニット
2020518552.tif 000389
は独立して一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドであり、各●は、隣接する単量体サブユニット
2020518552.tif 000390
同士を連結している共有結合リンカーであり、ｍは、（ａ）多量体オリゴヌクレオチドのインビボでの循環半減期が個々の単量体サブユニット
2020518552.tif 000391
のそれに比べて増加するように及び／または（ｂ）多量体オリゴヌクレオチドのインビボでの活性が個々の単量体サブユニット
2020518552.tif 000392
のそれに比べて増加するように選択される０以上の整数である〕
を含む多量体オリゴヌクレオチドの形態である１つまたは複数のオリゴヌクレオチドを対象に投与することを含む。
【０３１８】
様々な態様において、本発明は、１つもしくは複数のオリゴヌクレオチドのインビボでの循環半減期及び／またはインビボでの活性を増加させる方法であって、当該方法は、構造２１
2020518552.tif 000393
〔ここで、各単量体サブユニット
2020518552.tif 000394
は独立して一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドであり、各●は、隣接する単量体サブユニット
2020518552.tif 000395
同士を連結している共有結合リンカーであり、ｍは０以上の整数である〕
を含む多量体オリゴヌクレオチドの形態である１つまたは複数のオリゴヌクレオチドを対象に投与することを含み、
多量体オリゴヌクレオチドが、（ａ）多量体オリゴヌクレオチドのインビボでの循環半減期が個々の単量体サブユニット
2020518552.tif 000396
のそれに比べて増加するように及び／または（ｂ）多量体オリゴヌクレオチドのインビボでの活性が個々の単量体サブユニット
2020518552.tif 000397
のそれに比べて増加するように設定された分子サイズ及び／または分子量を有する、
当該方法を提供する。
【０３１９】
様々な態様において、本発明は、ｍ個の単量体サブユニット
2020518552.tif 000398
を含む多量体オリゴヌクレオチドであって、単量体サブユニット
2020518552.tif 000399
の各々が、独立して一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドであり、単量体サブユニット
2020518552.tif 000400
の各々が、共有結合リンカー●によって別の単量体サブユニットに連結されており、ｍが、（ａ）多量体オリゴヌクレオチドのインビボでの循環半減期が個々の単量体サブユニット
2020518552.tif 000401
のそれに比べて増加するように及び／または（ｂ）多量体オリゴヌクレオチドのインビボでの活性が個々の単量体サブユニット
2020518552.tif 000402
のそれに比べて増加するように選択される３以上の整数である、当該多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【０３２０】
様々な態様において、本発明は、ｍ個の単量体サブユニット
2020518552.tif 000403
を含む多量体オリゴヌクレオチドであって、単量体サブユニット
2020518552.tif 000404
の各々が、独立して一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドであり、単量体サブユニット
2020518552.tif 000405
の各々が、共有結合リンカー●によって別の単量体サブユニットに連結されており、ｍが３以上の整数であり、多量体オリゴヌクレオチドが、（ａ）多量体オリゴヌクレオチドのインビボでの循環半減期が個々の単量体サブユニット
2020518552.tif 000406
のそれに比べて増加するように及び／または（ｂ）多量体オリゴヌクレオチドのインビボでの活性が個々の単量体サブユニット
2020518552.tif 000407
のそれに比べて増加するように設定された分子サイズ及び／または分子量を有する、多量体オリゴヌクレオチドを提供する。
【０３２１】
様々な実施形態において、増加は、多量体オリゴヌクレオチドの単量体サブユニットの循環半減期及び／または活性に関するものである。循環半減期（及びそれと他の糸球体濾過などの特性との関係性）については、以下の、オリゴヌクレオチドの取込み及びクリアランスの節ならびに実施例２５及び実施例３７の中でさらに詳しく述べる。様々な実施形態において、インビボでの循環半減期は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、５００または１，０００倍増加する。インビボでの循環半減期は少なくとも２倍増加し得る。インビボでの循環半減期は少なくとも１０倍増加し得る。様々な実施形態において、インビボでの活性の増加は、ｔｍａｘでのインビボでの活性の比率として測定される。様々な実施形態において、インビボでの活性は少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、５００または１，０００倍増加する。インビボでの活性は少なくとも２倍増加し得る。インビボでの活性は少なくとも１０倍増加し得る。一実施形態では、増加はマウスにおけるものである。一実施形態では、増加はヒトにおけるものである。
【０３２２】
様々な実施形態において、ｍは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２である。
【０３２３】
様々な実施形態において、ｍは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２である。
【０３２４】
様々な実施形態において、単量体サブユニット
2020518552.tif 000408
の各々はｓｉＲＮＡを含み、共有結合リンカーの各々はｓｉＲＮＡのセンス鎖同士を連結している。
【０３２５】
様々な実施形態において、共有結合リンカー●の各々は、２つの単量体サブユニット
2020518552.tif 000409
を連結している。
【０３２６】
様々な実施形態において、共有結合リンカー●の少なくとも１つは、３つ以上の単量体サブユニット
2020518552.tif 000410
を連結している。
【０３２７】
様々な実施形態において、各単量体サブユニット
2020518552.tif 000411
は独立して二本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000412
であり、ｍは１である：
2020518552.tif 000413
。
【０３２８】
様々な実施形態において、各単量体サブユニット
2020518552.tif 000414
は独立して二本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000415
であり、ｍは１であり、各共有結合リンカー●は同一鎖上にある：
2020518552.tif 000416
。
【０３２９】
様々な実施形態において、各単量体サブユニット
2020518552.tif 000417
は独立して二本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000418
であり、ｍは２である：
2020518552.tif 000419
。
【０３３０】
様々な実施形態において、各単量体サブユニット
2020518552.tif 000420
は独立して二本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000421
であり、ｍは２であり、各共有結合リンカー●は同一鎖上にある：
2020518552.tif 000422
。
【０３３１】
様々な実施形態において、各単量体サブユニット
2020518552.tif 000423
は独立して二本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000424
であり、ｍは３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２である。
【０３３２】
様々な実施形態において、各単量体サブユニット
2020518552.tif 000425
は独立して二本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000426
であり、ｍは３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２であり、各共有結合リンカー●は同一鎖上にある。
【０３３３】
様々な実施形態において、各単量体サブユニット
2020518552.tif 000427
は独立して二本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000428
であり、ｍは１３以上である。
【０３３４】
様々な実施形態において、各単量体サブユニット
2020518552.tif 000429
は独立して二本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000430
であり、ｍは１３以上であり、各共有結合リンカー●は同一鎖上にある。様々な実施形態において、構造２１は構造２２または構造２３
2020518552.tif 000431
〔ここで、各
2020518552.tif 000432
は二本鎖オリゴヌクレオチドであり、各●は、隣接する二本鎖オリゴヌクレオチド同士を連結している共有結合リンカーであり、ｍは１以上の整数であり、ｎは０以上の整数である〕
である。
【０３３５】
様々な実施形態において、構造２１は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０３７６８５に開示されている構造ではない。
【０３３６】
様々な実施形態において、各オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000433
は一本鎖オリゴヌクレオチドである。
【０３３７】
様々な実施形態において、各オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000434
は二本鎖オリゴヌクレオチドである。
【０３３８】
様々な実施形態において、オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000435
は一本鎖オリゴヌクレオチドと二本鎖オリゴヌクレオチドとの組み合わせを含む。
【０３３９】
様々な実施形態において、多量体オリゴヌクレオチドは、各共有結合リンカー●が、２つの単量体サブユニット
2020518552.tif 000436
を連結している、直鎖構造を含む。
【０３４０】
様々な実施形態において、多量体オリゴヌクレオチドは、共有結合リンカー●の少なくとも１つが、３つ以上の単量体サブユニット
2020518552.tif 000437
を連結している、分岐構造を含む。例えば、構造２１は
2020518552.tif 000438
であり得る。
【０３４１】
様々な実施形態において、各単量体サブユニット
2020518552.tif 000439
は独立して一本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000440
である。いくつかのそのような実施形態では、ｍは１である
2020518552.tif 000441
；ｍは２である
2020518552.tif 000442
；ｍは３である
2020518552.tif 000443
；ｍは４である
2020518552.tif 000444
；またはｍは５である
2020518552.tif 000445
。いくつかのそのような実施形態では、ｍは６、７、８、９、１０、１１または１２である。いくつかのそのような実施形態では、ｍは１３以上の整数である。１つのそのような実施形態では、少なくとも１つの一本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000446
はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。１つのそのような実施形態では、各一本鎖オリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000447
は独立してアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【０３４２】
様々な実施形態において、多量体オリゴヌクレオチドは、実質的に同一なオリゴヌクレオチドのホモ多量体を含む。実質的に同一なオリゴヌクレオチドは、インビボで同じ分子標的を指向するｓｉＲＮＡであってもよい。実質的に同一なオリゴヌクレオチドは、インビボで同じ分子標的を指向するｍｉＲＮＡであってもよい。実質的に同一なオリゴヌクレオチドは、インビボで同じ分子標的を指向するアンチセンスＲＮＡであってもよい。実質的に同一なオリゴヌクレオチドは、インビボで同じ分子標的を指向するｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及び／またはアンチセンスＲＮＡの組み合わせであってもよい。
【０３４３】
様々な実施形態において、多量体オリゴヌクレオチドは、２種以上の実質的に異なるオリゴヌクレオチドのヘテロ多量体を含む。実質的に異なるオリゴヌクレオチドは、インビボで異なる分子標的を指向するｓｉＲＮＡであり得る。実質的に異なるオリゴヌクレオチドは、インビボで異なる分子標的を指向するｍｉＲＮＡであり得る。実質的に異なるオリゴヌクレオチドは、インビボで異なる分子標的を指向するアンチセンスＲＮＡであり得る。実質的に異なるオリゴヌクレオチドは、インビボで異なる分子標的を指向するｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及び／またはアンチセンスＲＮＡの組み合わせであり得る。
【０３４４】
特定薬物の循環半減期を増加させるために、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリマーリンカーが使用されてきた。そのような手法は、治療剤を「希釈する」こと（例えば、単位質量あたりの活性がより低い薬剤）を含めた難点を有する場合がある。本発明はそのような手法とは区別され得る。例えば、様々な実施形態において、多量体オリゴヌクレオチドはＰＥＧを含まない。様々な実施形態において、多量体オリゴヌクレオチドはポリエーテル化合物を含まない。様々な実施形態において、多量体オリゴヌクレオチドはオリゴヌクレオチド以外のポリマーを含まない。
【０３４５】
特定薬物の循環半減期を増加させるために、ナノ粒子（ＮＰ）、例えば脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）が使用されてきた。そのような手法は、（例えばカチオン性脂質による）毒性増加を含めた難点を有する場合がある。本発明はそのような手法とは区別され得る。例えば、様々な実施形態において、多量体オリゴヌクレオチドはＮＰまたはＬＮＰの中に製剤化されていない。
【０３４６】
特定薬物の循環半減期を増加させるために、ホスホロチオエート基が使用されてきた。そのような手法は、（例えばオリゴヌクレオチド／血漿タンパク質凝集に起因する）より低い活性を含めた難点を有する場合がある。本発明はそのような手法とは区別され得る。例えば、様々な実施形態において、多量体オリゴヌクレオチドはホスホロチオエートを含まない。
【０３４７】
様々な実施形態において、多量体オリゴヌクレオチドはさらに標的指向性リガンドを含む。様々な実施形態において、多量体オリゴヌクレオチドは構造２１と任意選択の標的指向性リガンドとから本質的になる。多量体オリゴヌクレオチドは、本明細書中で述べられている標的指向性リガンドのいずれかを含み得る（例えば、以下の標的指向性リガンドの節を参照のこと）。様々な実施形態において、標的指向性リガンドはオリゴヌクレオチドと複合体化しており、例えば、標的指向性リガンドはオリゴヌクレオチドの３’または５’末端を介して当該オリゴヌクレオチドと複合体化することができる。
【０３４８】
多量体オリゴヌクレオチドは、本明細書中で述べられているいずれかのリンカーを使用するものであり得る（例えば、上記のリンカーの節を参照のこと）。様々な実施形態において、各共有結合リンカー●は同じである。様々な実施形態において、多量体オリゴヌクレオチドは２種以上の異なる共有結合リンカー●を含む。様々な実施形態において、●の１つまたは複数は切断可能な共有結合リンカーを含む。切断可能なリンカーは、いくつかの状況においては特に有益となり得る。例えば、細胞指向化及び進入の後に細胞内切断は１本の多量体オリゴヌクレオチドを複数の生物学的活性オリゴヌクレオチドに変換することができ（例えば、単一のｓｉＲＮＡ構築物が４つ以上の活性ｓｉＲＮＡを送達することができ）、有効性を向上させ望ましくない副作用を軽減することができる。
【０３４９】
様々な実施形態において、●の１つまたは複数はヌクレオチドリンカー（例えば、切断可能なヌクレオチドリンカー、例えばＵＵＵ）を含む。あるいは、いくつかの実施形態では、多量体オリゴヌクレオチドはヌクレオチドリンカーを明確に排除している。
【０３５０】
様々な実施形態において、化合物は単離されているかまたは実質的に純粋である。例えば、化合物は少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００％純粋であり得る。一実施形態では、化合物は約８５〜９５％純粋である。同様に、本発明に係る化合物及び組成物を合成する方法は、少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００％純粋な生成物をもたらすことができる。一実施形態では、生成物は約８５〜９５％純粋である。調製物は、５０％以上純粋；好ましくは７５％以上純粋；より好ましくは８５％以上純粋；さらにいっそう好ましくは９５％以上純粋であり得る。
【０３５１】
様々な実施形態において、各オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡである、または人工もしくは非天然型の核酸アナログを含む。様々な実施形態において、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。様々な他の可能なオリゴヌクレオチド及び置換については例えば上記の核酸の節で述べられている。
【０３５２】
様々な実施形態において、各オリゴヌクレオチドは長さが１５〜３０、１７〜２７、１９〜２６または２０〜２５ヌクレオチドである。様々な実施形態において、核酸またはオリゴヌクレオチドは長さが、１５〜３０、１７〜２７、１９〜２６、２０〜２５、４０〜５０、４０〜１５０、１００〜３００、１０００〜２０００ヌクレオチド、または１００００ヌクレオチド以下である。
【０３５３】
様々な実施形態において、構造２１を含む多量体オリゴヌクレオチドは少なくとも約４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４または６５ｋＤの分子量を有する。様々な実施形態において、構造２１を含む多量体オリゴヌクレオチドは、少なくとも約４０〜４５、４５〜５０、５０〜５５、５５〜６０、６０〜６５、６５〜７０、または７０〜７５ｋＤの分子量を有する。分子量には、多量体オリゴヌクレオチドに共有結合している全てのもの、例えば標的指向性リガンド及びリンカーが含まれ得る。
【０３５４】
構造２１を含む多量体オリゴヌクレオチドは、様々な方法（例えば、四量体以上の多量体を作るための本明細書中に記載されている方法）で合成することができるが、特定の結果は特異な方法論を要求する場合がある。例えば、以下の方法（及び実施例２２で示される方法）は、同一鎖上に各共有結合リンカー●を有する多量体を効率的に生成するように設計される。
【０３５５】
例えば、一態様では、本発明は、構造３４
2020518552.tif 000448
〔ここで、各
2020518552.tif 000449
は一本鎖オリゴヌクレオチドであり、各●は、隣接する一本鎖オリゴヌクレオチド同士を連結している共有結合リンカーである〕
を含む多量体オリゴヌクレオチドを合成する方法であって、
（ｉ）
2020518552.tif 000450
と
2020518552.tif 000451
と
〔ここで、○は結合部分であり、Ｒ１は、結合部分○と反応することができる化学基である〕
を反応させ、それによって
2020518552.tif 000452
を形成するステップ、及び
（ｉｉ）任意で、
2020518552.tif 000453
を相補的一本鎖オリゴヌクレオチドとアニーリングさせ、それによって
2020518552.tif 000454
を形成するステップ
を含む、当該方法を提供する。
【０３５６】
例えば、一態様では、本発明は、構造３５
2020518552.tif 000455
〔ここで、各
2020518552.tif 000456
は一本鎖オリゴヌクレオチドであり、各●は、隣接する一本鎖オリゴヌクレオチド同士を連結している共有結合リンカーである〕
を含む多量体オリゴヌクレオチドを合成する方法であって、
（ｉ）
2020518552.tif 000457
と
2020518552.tif 000458
と
〔ここで、○は結合部分であり、Ｒ１は、結合部分○と反応することができる化学基である〕
を反応させ、それによって
2020518552.tif 000459
を形成するステップ、及び
（ｉｉ）任意で、
2020518552.tif 000460
を相補的一本鎖オリゴヌクレオチドとアニーリングさせ、それによって
2020518552.tif 000461
を形成するステップ
を含む、当該方法を提供する。
【０３５７】
例えば、一態様では、本発明は、構造３７
2020518552.tif 000462
〔ここで、各
2020518552.tif 000463
は一本鎖オリゴヌクレオチドであり、各●は、隣接する一本鎖オリゴヌクレオチド同士を連結している共有結合リンカーである〕
を含む多量体オリゴヌクレオチドを合成する方法であって、
（ｉ）
2020518552.tif 000464
と
2020518552.tif 000465
と
〔ここで、○は結合部分であり、Ｒ１は、結合部分○と反応することができる化学基である〕
を反応させ、それによって
2020518552.tif 000466
を形成するステップ、及び
（ｉｉ）任意で、
2020518552.tif 000467
を相補的一本鎖オリゴヌクレオチドとアニーリングさせ、それによって
2020518552.tif 000468
を形成するステップ
を含む、当該方法を提供する。
【０３５８】
本発明はさらに、一本鎖多量体オリゴヌクレオチド、例えば、ｍが２であるもの
2020518552.tif 000469
；ｍが４であるもの
2020518552.tif 000470
；ｍが６、７、８、９、１０、１１もしくは１２であるもの；またはｍが１３以上であるもの（以下の実施例２２を参照のこと）を合成する方法を提供する。
【０３５９】
多量体化合物は、本明細書に開示の特徴のいずれか１つまたは複数を含み得る。例えば、化合物は、本明細書に記載の（修飾を含む、または含まない）核酸、標的指向性リガンド及び／またはリンカーのいずれか１つもしくは複数、または、概要、説明もしくは実施例に示されているいずれかの具体的な構造もしくは化学を含み得る。同様に、化合物から、概要、説明または実施例に示されている（例えば実験用途または医学的用途のための）いずれかの組成物を調合することができる。例示となる例は以下の医薬組成物の節で提供される。
【０３６０】
オリゴヌクレオチドの取込み及びクリアランス
血流中の薬物の生物学的利用能は、腎クリアランスに対する標的細胞取込みの収支として特性評価することができる。実用的観点からは、インビボでの循環半減期及び／またはインビボでの活性が腎クリアランス／糸球体濾過のために良好に代用される、というのも、それらの定量及び測定が容易であるからであり、またそれらの改善（例えば増加）が薬力学及び／または薬理動態の改善と相関し得るからである。
【０３６１】
血中へのオリゴヌクレオチド（ＯＮＴ）などの治療剤の取込速度は多くの因子の関数であり、次のとおりに表され得る：取込速度＝ｆ｛（ＯＮＴ濃度）×（血流速度）×（受容体コピー数／細胞）×（細胞数）×（平行解離定数Ｋｄ）×（内在化速度）｝。所与のリガンド／受容体対についてコピー数、ＫＤ、細胞数及び内在化速度は一定となる。これは、肝細胞にとってＧａｌＮＡｃリガンドシステムが何故それほどまでに効果的であるかについての説明となり得る−それは、高コピー数で存在しているＡＳＧＰ受容体を指向する。いくつかのＡＳＧＰ／ＧａｌＮＡｃ変異型のＫＤはナノモーラーの範囲にあり、内在化速度は非常に大きい。
【０３６２】
しかしながら、効果的な標的指向化は、血流からのクリアランスゆえに時の経過とともに急速に減少するＯＮＴ濃度にも依存している。治療薬のクリアランスの速度は次のとおりに表され得る：クリアランスの速度＝ｆ｛（血流速度）×（腎濾過速度）×（他のクリアランス機序）｝。結果として得られる時間ｔにおけるＯＮＴの濃度は次のとおりに表され得る：（ＯＮＴ濃度）ｔ＝ｆ｛（初期濃度）−（クリアランスの速度×ｔ）｝。
【０３６３】
ヒトにおいては、クリアランスは主として腎臓での糸球体濾過による。一般に、約４５ｋＤ未満の分子は半減期が約３０分である。マウスにおいては、クリアランスの速度はなおいっそう速く、循環半減期が約５分である。いかなる特定の理論にも拘泥することを望まないが、本発明は、（例えば、特異的な組成物、サイズ、重量など）特異的に構成された多量体オリゴヌクレオチドを使用して糸球体濾過を低減することができ、結果としてより低速のクリアランスにつながり、所与の時間ｔにおける循環流中のＯＮＴの濃度がより高くなる（例えば、血中半減期が増加する、全体的取込みが大きくなる、及び活性がより高くなる）、と考えられる。
【０３６４】
またしても、いかなる特定の理論にも拘泥することを望まないが、実際の糸球体濾過速度は直接測定することが困難であり得る。例えば、糸球体毛細血管を通過する化合物は尿細管上皮細胞などの細胞によって速やかに吸収され、これによってｓｉＲＮＡのような化合物が著しい期間にわたって保持され得る（例えば、Ｈｅｎｒｙ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ；Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，３０１，１３−２０（２０１２）、及びｖａｎ  ｄｅ  Ｗａｔｅｒ，Ｆ．Ｍ  ｅｔ  ａｌ；Ｄｒｕｇ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ，３４，Ｎｏ  ８，１３９３−１３９７（２００６）を参照のこと）。さらに、吸収された化合物は分解生成物へと代謝され得、これは後に尿中に分泌される。このように、特定の時点におけるｓｉＲＮＡなどの治療剤の（例えば尿中の）濃度は必ずしも糸球体濾過速度を代表しているわけではない可能性がある。しかしながら、糸球体濾過と関係付けられ直接測定が可能である血中半減期を糸球体濾過のために代用することは好適であるとみなされ得る。
【０３６５】
以下の表は、結果として得られる時間ｔにおける成分の濃度に対して成分の循環半減期（ｔ１／２）の増加が及ぼし得る劇的影響を示す。
2020518552.tif 000471
値は時間ｔでの初期用量％として表される。
【０３６６】
したがって、成分の半減期を２倍増加させることで２時間目のその残存濃度が４倍増加する。半減期を４倍増加させることは残存濃度のさらにいっそう劇的な−２時間目及び４時間目にそれぞれ８倍及び６０倍以上の向上につながる。
【０３６７】
典型的なｓｉＲＮＡ（例えば二本鎖単量体）は分子量が約１５ｋＤである。本発明に係るｓｉＲＮＡ四量体は分子量が約６０ｋＤであり得る。いかなる特定の理論にも拘泥することを望まないが、そのような多量体（四量体、五量体など）は、インビボでの糸球体濾過の減少をもたらす分子サイズ及び／または分子量を有するように構成されることができると考えられる。そのような多量体は、増加した循環半減期を有することになるであろう。したがって、本発明に係る多量体は、個々の単量体サブユニットに比べて増加したインビボでの循環半減期及び／または増加したインビボでの活性を有するように構成されることができる。多量体（例えば四量体）はさらに、好適な標的指向性リガンドによって導かれる場合、単量体の等価体に比べてリガンド／受容体結合事象１回あたりに何倍も（例えば４倍）の搭載負荷を送達することとなるであろう。これらの効果は、組み合わされた場合、治療剤の生物学的利用能及び取込みの劇的な向上をもたらし得る。これは、所与のリガンド／受容体対のコピー数、ＫＤ、標的細胞数及び内在化速度の何らかの組み合わせが準最適である場合には特に有益であり得る。
【０３６８】
したがって、多量体オリゴヌクレオチドは、（ａ）多量体オリゴヌクレオチドのインビボでの循環半減期を個々の単量体サブユニットのそれに比べて増加させるように及び／または（ｂ）多量体オリゴヌクレオチドのインビボでの活性が個々の単量体サブユニットのそれに比べて増加するように選択される構造を有する。例えば、多量体オリゴヌクレオチドは、この目的のために設定された分子サイズ及び／または分子量を有し得る。
【０３６９】
医薬組成物
様々な態様において、本発明は、上記化合物または組成物の任意の１つまたは複数を含む医薬組成物を提供する。本明細書中で使用する場合、医薬組成物は、疾患を予防する、診断する、緩和する、処置する、または治癒させるために使用することができる食品以外の物体の組成物を含む。同様に、本発明に係る様々な化合物または組成物は、医薬としての用途のため及び／または医薬の製造における用途のための実施形態を含んでいると理解されるべきである。
【０３７０】
医薬組成物は、本発明に係る化合物または組成物と、薬学的に許容される賦形剤とを含み得る。本明細書中で使用する場合、賦形剤は、活性成分と一緒に製剤化される天然または合成物質であり得る。賦形剤は、長期安定性、増量（例えば、増量剤、フィラーまたは希釈剤）の目的のため、または最終剤形において活性成分に治療強化を付与するため、例えば、薬物吸収を容易にするため、粘度を低減するため、または溶解性を高めるために含まれ得る。賦形剤はさらに、製造及び分配に役立つことができ、例えば、活性成分の取扱いを助ける、及び／またはインビトロでの安定性を（例えば変性または凝集を防止することによって）助ける上で役立つことができる。当業者であれば理解するであろうように、適切な賦形剤選択は、投与経路、剤形及び活性成分（複数可）を含めた様々な因子に依存し得る。
【０３７１】
オリゴヌクレオチドは局所または全身に送達され得、本発明の医薬組成物はそれに応じて変化し得る。例えば、投与は必ずしも何らかの特定送達システムに限定されるわけではなく、非経口（皮下、静脈内、髄内、動脈内、筋肉内または腹腔内への注射を含む）、直腸、局所、経皮または経口を限定されずに含み得る。個体への投与は、単回用量もしくは反復投与で起こり得、様々な生理学的に許容される塩形態のいずれかで、及び／または医薬組成物の一部としての許容される薬学的担体及び／または添加剤と共に起こり得る。生理学的に許容される製剤及び標準的製剤化技術、投薬量及び賦形剤は当業者によく知られている（例えば、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（ＰＤＲ（登録商標））２００５，５９ｔｈ  ｅｄ．，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，２００４、及びＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，ｅｄｓ．Ｇｅｎｎａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．２１ｔｈ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５を参照のこと）。
【０３７２】
医薬組成物は、本発明に係る化合物または組成物を有効量含み得る。本明細書中で使用する場合、有効量とは、特定の明記された目的の達成をもたらす濃度または量であり得、または、より多い量は、例えばプラセボと比較して変化を引き起こすのに妥当な量を意味する。有効量が治療的有効量である場合、それは治療用途にとって妥当な量、例えば、疾患を防止、診断、緩和、処置させるもしくは治癒させるのに十分な量であり得る。有効量は、当技術分野で知られている方法で決定することができる。有効量は、実験的に、例えばヒト治験によって決定することができる。有効量はまた、ある動物（例えば、マウス、ラット、サル、ブタ、イヌ）から、当技術分野で知られている換算係数を使用して別の動物（例えばヒト）における使用のために外挿することもできる。例えば、Ｆｒｅｉｒｅｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ５０（４）：２１９−２４４（１９６６）を参照されたい。
【０３７３】
送達ビヒクル及び標的指向性リガンド
様々な態様において、本発明は、送達ビヒクル中に製剤化された上記の化合物または組成物のいずれか１つまたは複数を提供する。例えば、送達ビヒクルは脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、エキソソーム、微小小胞またはウイルスベクターであり得る。同様に、様々な態様において、本発明は、標的指向性リガンドをさらに含んでいる上記の化合物または組成物のいずれか１つまたは複数を提供する。例えば、標的指向性リガンドは、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、コレステロール、トコフェロール、フォレート、２−［３−（１，３−ジカルボキシプロピル）−ウレイド］ペンタン二酸（ＤＵＰＡ）、またはアニスアミドを含む。標的指向性リガンドは、核酸に例えばその３’または５’末端を介して（例えば直接）結合することができる。いくつかの実施形態では、２つの標的指向性リガンドがオリゴヌクレオチドと複合体化しており、一方のリガンドはオリゴヌクレオチドの３’末端を介して複合体化しており、他方のリガンドはオリゴヌクレオチドの５’末端を介して複合体化している。１つまたは複数の標的指向性リガンドをオリゴヌクレオチドのセンス鎖もしくはアンチセンス鎖、またはセンス鎖とアンチセンス鎖との両方と複合体化させることができる。本発明に関する用途に適合し得るさらなる例については、以下で述べる。
【０３７４】
当業者であれば理解するであろうように、生物学的標的または作用機序にかかわらず治療オリゴヌクレオチドは、生物（例えば、療法を必要とする動物、例えばヒト）の中の標的細胞に到達するためには一連の生理学的障壁を乗り越えなければならない。例えば、治療オリゴヌクレオチドは総じて、血流におけるクリアランスを回避し、標的細胞種に進入し、その後に細胞質に進入するものであって、そのいずれにおいても望ましくない免疫応答を誘発しないものでなければならない。このプロセスは一般に非効率的であると考えられ、例えば、インビボでエンドソームに進入するｓｉＲＮＡの９５％以上は遺伝子サイレンシングに何ら影響を与えることなくリソソーム中で分解され得るかまたは細胞外に押し出され得る。
【０３７５】
これらの障害を乗り越えるために科学者達は多くの薬物送達ビヒクルを設計してきた。これらのビヒクルは、低分子薬、タンパク質薬及びその他の治療分子の他、治療ＲＮＡを送達するためにも使用されてきた。薬物送達ビヒクルは、糖、脂質、脂質様材料、タンパク質、ポリマー、ペプチド、金属、ヒドロゲル、複合体及びペプチドといった多様な材料から作られた。多くの薬物送達ビヒクルはこれらの群の組み合わせによる態様を組み込んでおり、例えばいくつかの薬物送達ビヒクルは糖と脂質とを組み合わせたものであり得る。他のいくつかの例では、細胞を模倣することを意図した「細胞様」材料の中に薬物を直接隠すことができる一方、他の事例では、薬物を細胞自体の中に、または細胞上に配置することができる。薬物送達ビヒクルを、ｐＨ変化、生体分子濃度、磁場及び熱などの刺激に応答して薬物を放出するように設計することができる。
【０３７６】
多くの研究は、ｓｉＲＮＡなどのオリゴヌクレオチドを肝臓に送達することに焦点を当ててきた。インビボでの肝細胞への効果的なｓｉＲＮＡ送達のために必要とされる用量は過去十年間で１０，０００分の１未満に減少した−２００６年に報告された送達ビヒクルは、タンパク質産生を標的とするために１０ｍｇ／ｋｇ超のｓｉＲＮＡを必要とすることがあったが、現在は新しい送達ビヒクルによって０．００１ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡの全身注射後に標的タンパク質産生を減少させることができる。オリゴヌクレオチド送達効率の向上は、少なくとも部分的に、送達ビヒクルの開発によるものであり得る。
【０３７７】
別の重要な進歩は、介助成分が送達に影響を与える仕方について理解が増したことであった。介助成分は、当初の薬物送達システムに追加される化学構造を含み得る。介助成分は、粒子の安定性または特定臓器への送達を改善することができることが多い。例えば、ナノ粒子は脂質で作ることができるが、これらの脂質ナノ粒子によって媒介される送達は親水性ポリマー及び／または疎水性分子の存在によって影響を受けることがある。ナノ粒子送達に影響を与える１つの重要な親水性ポリマーはポリ（エチレングリコール）である。他の親水性ポリマーには非イオン性界面活性剤が含まれる。ナノ粒子送達に影響を与える疎水性分子としては、コレステロール、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）などが挙げられる。
【０３７８】
薬物送達システムは、標的指向性リガンドまたは複合体システムを使用して設計されたこともある。例えば、オリゴヌクレオチドをコレステロール、糖、ペプチド及び他の核酸と複合体化させて肝細胞及び／またはその他の細胞種の中への送達を容易にすることができる。そのような複合体システムは、特定の受容体との結合によって特定細胞種内への送達を容易にし得る。
【０３７９】
当業者であれば、既知の送達ビヒクル及び標的指向性リガンドが本発明に係る用途に概して適合し得ることを認識するであろう。送達ビヒクル及び標的指向性リガンドならびにそれらの用途の例は、以下に見出すことができる：
2020518552.tif 000472
2020518552.tif 000473
2020518552.tif 000474
【０３８０】
様々な実施形態において、本発明の化合物及び組成物は他の化学的または生物学的部分、例えば生物学的活性部分と複合体化する、またはそれと共に送達されることができる。生物学的活性部分は、生物学的効果、好ましくは測定可能な生物学的効果を有する任意の分子または薬剤である。化学的または生物学的部分としては、例えば、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸（例えば、ＤＮＡ、あらゆる類のＲＮＡ、ＲＮＡ及びＤＮＡアプタマー、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ならびにアンチセンスｍｉＲＮＡ阻害剤を含む）、標的指向性リガンド、炭水化物、多糖、脂質、有機化合物、及び無機化学化合物が挙げられる。
【０３８１】
本明細書中で使用する場合、標的指向性リガンドという用語には、例えばナノ粒子または送達複合体の細胞受容体付着を可能にすることによってナノ粒子または送達複合体の搭載負荷を特定の体組織種または体細胞種などの特定の標的に送達する目的のために、ナノ粒子の表面に到達できるようにされ得る部分、または送達複合体（例えば、多重複合体オリゴヌクレオチド、多量体オリゴヌクレオチド）の一部としての部分が含まれ得る。好適な標的指向性リガンドの例としては、限定されないが、細胞特異的ペプチドまたはタンパク質（例えばトランスフェリン及びモノクローナル抗体）、アプタマー、細胞増殖因子、ビタミン（例えば葉酸）、単糖（例えばガラクトース及びマンノース）、多糖、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）及び、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮａｃ）に由来するアシアロ糖タンパク質受容体リガンドが挙げられる。リガンドは、当技術分野で知られている様々な技術を用いて、例えば、ジスルフィド結合、アミド結合もしくはエステル結合などの共有結合を介するかまたはビオチン−ストレプトアビジンもしくは金属−リガンド錯体などの非共有結合を介して、本発明の上記化合物の中に組み込まれ得る。
【０３８２】
本発明の範囲に含まれるさらなる生物学的活性部分は、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ＴＡＬＥＳ、ＴＡＬＥＮ及び亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）に関与するオリゴヌクレオチド、ポリペプチド及びタンパク質などの材料を含めた既知の遺伝子編集材料のいずれかである。
【０３８３】
様々な実施形態において、本発明の化合物及び組成物は、細胞内送達のためのナノ粒子を形成する担体材料の中に封入され得る。既知の担体材料としては、例えば、カチオン性のポリマー、脂質もしくはペプチドまたはそれらの化学アナログが挙げられる。Ｊｅｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＩＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥ  ＣＨＥＭ．，Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．１，ｐｐ．５−１４（２００９）。カチオン性脂質としては、例えば、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン、コレステロールジオレイルホスファチジルコリン、塩化Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）、１，２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジオレオイル−３−（４’−トリメチル−アンモニオ）ブタノイル−ｓｎ−グリセロール（ＤＯＴＢ）、１，２−ジアシル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＡＰ）、１，２−ジアシル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＴＡＰ）、１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロール−３−エチルホスホコリン、３ベータ−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−コレステロール）、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）、及びそれらのコポリマーが挙げられる。カチオン性ポリマーの例としては、ポリエチレンイミン、ポリアミン、ポリビニルアミン、ポリ（アルキルアミン塩酸塩）、ポリアミドアミンデンドリマー、ジエチルアミノエチル−デキストラン、ポリビニルピロリドン、キチン、キトサン、及びポリ（２−ジメチルアミノ）エチルメタアクリレートが挙げられる。一実施形態では、担体は、特性が他の既知の担体材料と比較してインビボでの使用により適し得るものである１つまたは複数のアクリレート化アミンを含有する。
【０３８４】
一実施形態では、担体はカチオン性ペプチド、例えば、ＫＡＬＡ（カチオン性融合ペプチド）、ポリリジン、ポリグルタミン酸またはプロタミンである。一実施形態では、担体はカチオン性脂質、例えば、ジオレイルホスファチジルエタノールアミンまたはコレステロールジオレイルホスファチジルコリンである。一実施形態では、担体はカチオン性ポリマー、例えば、ポリエチレンイミン、ポリアミンまたはポリビニルアミンである。
【０３８５】
様々な実施形態において、本発明の化合物及び組成物はエキソソーム内に封入され得る。エキソソームは、血液、尿、及び細胞培養物の培地を含めた生体液の中に存在する直径３０〜１００ｎｍの細胞由来の小胞である。合成エキソソーム及びエキソソーム模倣体を含めてエキソソームを当技術分野の技能によって薬物送達における用途に適合させることができる。例えば、“Ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｅｘｏｓｏｍｅｓ  ａｓ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｖｅｈｉｃｌｅｓ  −ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｎａｎｏｃａｒｒｉｅｒｓ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ”Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１８４６（１）：７５−８７（２０１４）、２０１６年３月８日オンライン入手可能である（近刊の）“Ｅｘｏｓｏｍｅｓ  ａｓ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｄｒｕｇ  ｃａｒｒｉｅｒｓ  ａｎｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｖｅｈｉｃｌｅｓ  ａｃｒｏｓｓ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ：ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ”Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ  Ｓｉｎｉｃａ  Ｂ、及び“Ｅｘｏｓｏｍｅ  ｍｉｍｅｔｉｃｓ：ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｌａｓｓ  ｏｆ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ”Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，７：１５２５−１５４１（２０１２）を参照されたい。
【０３８６】
様々な実施形態において、本発明の化合物及び組成物は微小小胞内に封入され得る。微小小胞（循環微小小胞または微小粒子と呼ぶこともある）は、ほとんど全ての細胞種から流れ出る１００ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲の形質膜の断片であり、より小さい細胞内に生成するエキソソームとして知られる細胞外小胞とは別個のものである。微小小胞は細胞内伝達における役割を果たし、細胞間でｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びタンパク質を輸送することができる。合成微小小胞及び微小小胞模倣体を含めて微小小胞を当技術分野の技能によって薬物送達における使用に適合させることができる。例えば、“Ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅ−  ａｎｄ  ｅｘｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ  ｉｎ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，２２０：７２７−７３７（２０１５）、“Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅｓ  ｏｆ  Ｅｘｏｓｏｍｅｓ”Ｊ  Ｃｉｒｃ  Ｂｉｏｍａｒｋ，１：０（２０１３）を参照されたい。
【０３８７】
様々な実施形態において、本発明の化合物及び組成物はウイルスベクターを使用して送達されることができる。ウイルスベクターは、遺伝子材料を細胞内に送達するために分子生物学者によって一般的に使用されるツールである。このプロセスは、生きている生物の中（インビボ）で、または細胞培養物中（インビトロ）で実施され得る。ウイルスベクターを当技術分野の技能によって薬物送達における使用のために適合させることができる。例えば、“Ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｓ  ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ”Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２６：２０７−２１（２０１１）、“Ｖｉｒａｌ  ａｎｄ  ｎｏｎｖｉｒａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ”Ａｄｖ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｒｅｓ，１：２７（２０１２）、及び“Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｖｅｈｉｃｌｅｓ：Ｂｅｙｏｎｄ  Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１７（５）：７６７−７７７（２００９）を参照されたい。
【０３８８】
ＬＮＰ製剤化及び特性評価のための一般的手順は、ＬＮＰ製剤化ならびに他のインビトロ及びインビボ試験の実用実施例と同様に、以下の実施例で提供される。他の方法は当技術分野において既知であり、当業者であれば当該方法を、本発明に関する用途に適合させることができる。
【０３８９】
処置または遺伝子発現低減の方法
様々な態様において、本発明は、例えば医学的処置、研究のため、または動物及び植物において新規なもしくは改変された表現型を生むために、多重複合体オリゴヌクレオチドを使用する方法を提供する。
【０３９０】
一態様では、本発明は、本発明に係る化合物または組成物を、それを必要とする対象に有効量投与することを含む、対象を処置する方法を提供する。そのような治療的実施形態では、オリゴヌクレオチドは治療オリゴヌクレオチド、例えばｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡとなろう。
【０３９１】
この実施形態及びその他の実施形態では、本発明の組成物及び化合物は、医薬組成物の形態で、送達ビヒクル中で投与され得る、または標的指向性リガンドに結び付けられ得る。
【０３９２】
一態様では、本発明は、本発明に係る化合物または組成物を、それを必要とする対象に有効量投与することを含む、遺伝子発現をサイレンシングまたは低減する方法を提供する。そのような治療的実施形態では、オリゴヌクレオチドは、遺伝子発現をサイレンシングまたは低減するオリゴヌクレオチド、例えばｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドとなろう。
【０３９３】
同様に、本発明は、本発明に係る化合物または組成物を、それを必要とする対象に有効量投与することを含む、２つ以上の遺伝子の発現をサイレンシングまたは低減する方法を提供し、この場合、化合物または組成物は、２つ以上の遺伝子を指向するオリゴヌクレオチドを含む。化合物または組成物は、２つ、３つ、４つまたはそれより多い遺伝子を指向するオリゴヌクレオチドを含み得る。
【０３９４】
一態様では、本発明は、本発明に係る化合物または組成物を、それを必要とする対象に有効量投与することを含む、標的指向性リガンド結合事象１回あたり２つ以上のオリゴヌクレオチドを細胞に送達する方法を提供し、この場合、化合物または組成物は標的指向性リガンドを含む。
【０３９５】
一態様では、本発明は、本発明に係る化合物または組成物を、それを必要とする対象に有効量投与することを含む、所定の化学量論比の２つ以上のオリゴヌクレオチドを細胞に送達する方法を提供し、この場合、化合物または組成物は所定の化学量論比の２つ以上のオリゴヌクレオチドを含む。
【０３９６】
本明細書中で使用する場合、対象には、処置または投与を受ける細胞または生物が含まれる。対象は動物、例えば哺乳動物、例えば、実験動物（マウス、サル）、または獣医学的患者、または霊長類、例えばヒトであり得る。処置または投与を必要とする対象には、限定はされないが、疾患（例えば、本発明の化合物及び組成物を使用して処置され得る疾患）を有する対象、または症状（例えば、本発明の化合物及び組成物を使用して対処され得る症状、例えば、サイレンシングされるかまたは発現が低減されるべき１つまたは複数の遺伝子）を有する対象が含まれ得る。
【０３９７】
遺伝子ノックダウンの測定及び動物実験のための一般的手順は、他のインビトロ及びインビボでの試験の実用実施例と同様に、以下の実施例で提供される。他の方法は当技術分野において既知であり、当業者であればそれを本発明に関する用途に適合させることができる。
【０３９８】
以下の実施例は例示的なものであり、限定するものではない。本開示を見直すことで技術の多くの変化形態が当業者にとって明らかとなろう。したがって、技術の範囲は、実施例を参照することによってではなく、別記の請求項及びそれらの全範囲の均等物を参照することによって決定されるべきである。
【実施例】
【０３９９】
一般的手順１：一本鎖オリゴヌクレオチドの合成
ホスホロアミダイト化学を用いてオリゴヌクレオチドを１０μｍｏｌ規模でＡＢＩ３９４及び３９００合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で、または２８μｍｏｌ規模でＯｌｉｇｏｐｉｌｏｔ  １０合成装置で組み立てた。固体担体は、２’−デオキシチミジン（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ，ＵＳＡ）を負荷したポリスチレン、またはコントロールドポアグラス（ＣＰＧ、５２０Å、負荷量７５μｍｏｌ／ｇ、Ｐｒｉｍｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａｓｔｏｎ，ＰＡ，ＵＳＡから入手）であった。補助合成試薬、ＤＮＡ−、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ−、及び２’−デオキシ−２’−フルオロ−ＲＮＡホスホロアミダイトはＳＡＦＣ  Ｐｒｏｌｉｇｏ（Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。具体的には、２’−Ｏ−メチル−ウリジン（２’−ＯＭｅ−Ｕ）、４−Ｎ−アセチル−２’−Ｏ−メチル−シチジン（２’−ＯＭｅ−ＣＡｃ）、６−Ｎ−ベンゾイル−２’−Ｏ−メチル−アデノシン（２’−ＯＭｅ−Ａｂｚ）及び２−Ｎ−イソブチルグアノシン（２’−ＯＭｅ−ＧｉＢｕ）の５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホロアミダイト単量体を使用してオリゴマー配列を構築した。２’−フルオロ修飾は、ＲＮＡ構成要素２’−ＯＭｅと同じ核酸塩基保護基を保有する対応するホスホロアミダイトを使用して導入した。どのホスホロアミダイト（アセトニトリル中７０ｍＭ）も、活性化剤として５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾール（ＥＴＴ、アセトニトリル中０．５Ｍ）を使用し、カップリング時間を３分とした。ホスホロチオエート結合は、ピリジンとアセトニトリルとの１：１（ｖ／ｖ）混合物中５０ｍＭの３−（（ジメチルアミノ−メチリデン）アミノ）−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−３−チオン（ＤＤＴＴ、ＡＭ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｏｃｅａｎｓｉｄｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を使用して導入された。
【０４００】
ＤＭＴ基の除去を含めた固相合成（「ＤＭＴ除去合成」）が完了した時点で、公開されている方法（Ｗｉｎｃｏｔｔ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２３：２６７７−２６８４（１９９５））に従ってメチルアミン水溶液（４１％）及び濃アンモニア水溶液（３２％）からなる１：１混合物を使用して２５℃で３時間かけてオリゴヌクレオチドを固体担体から解離させ脱保護した。
【０４０１】
続いて、Ｓｏｕｒｃｅ  Ｑ１５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を充填したカラム及びＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してアニオン交換ＨＰＬＣによって粗オリゴマーを精製した。緩衝液Ａは、２０％アセトニトリル水溶液中の１０ｍＭの過塩素酸ナトリウム、２０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４（Ｆｌｕｋａ、Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含むものであり、緩衝液Ｂは緩衝液Ａと同じもので過塩素酸ナトリウムが５００ｍＭであった。３２カラムボリューム（ＣＶ）以内でＢを２２％から４２％までとする勾配を採用した。２８０ｎｍでのＵＶトレースを記録した。適切な画分をプールし、ｐＨ＝５．２、３ＭのＮａＯＡｃ及び７０％のエタノールで析出させた。遠心分離によってペレットを回収した。あるいは、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＨｉＰｒｅｐカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して製造者の推奨に従って脱塩を行った。
【０４０２】
オリゴヌクレオチドを水で戻し、オリゴヌクレオチドの同定をエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）による確認によって行った。純度は分析的アニオン交換ＨＰＬＣによって評価した。
【０４０３】
一般的手順２：脂質ナノ粒子製剤化
１，２−ジステアロイル−３−ホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）をＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，Ａｌａｂａｍａ，ＵＳＡ）から購入した。α−［３’−（１，２−ジミリストイル−３−プロパンオキシ）−カルボキシアミド−プロピル］−ω−メトキシ−ポリオキシエチレン（ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ）をＮＯＦ（Ｂｏｕｗｅｌｖｅｎ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）から入手した。コレステロールをＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。
【０４０４】
専有アミノ脂質ＫＬ２２及びＫＬ５２が特許文献（Ｃｏｎｓｔｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．“Ｎｏｖｅｌ  Ｌｉｐｉｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ”  ＵＳ２０１２／０２９５８３２Ａ１）に開示されている。ＫＬ５２及びＫＬ２２脂質、ＤＳＰＣ、コレステロールならびにＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧの原液をエタノール５０ｍＭの濃度で調製し、−２０℃で保存した。脂質を様々なモル比（以下の個々の実施例を参照のこと）となるように混ぜ合わせ、エタノールで２５ｍＭの脂質終濃度に希釈した。Ｈ２Ｏ中１０ｍｇ／ｍＬの濃度のｓｉＲＮＡ原液をｐＨ３、５０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液で希釈した。以下の実施例ではＫＬ２２及びＫＬ５２のことをそれぞれＸＬ７及びＸＬ１０と呼ぶ場合がある。
【０４０５】
脂質溶液とｓｉＲＮＡ溶液とを脂質合計対ｓｉＲＮＡの７：１の重量比で混ぜ合わせることによって脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を調製した。脂質エタノール溶液をｓｉＲＮＡ水溶液中に急速注入して３３％のエタノールを含有する懸濁液を得た。溶液はシリンジポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ｐｕｍｐ  ３３  Ｄｕａｌ  Ｓｙｒｉｎｇｅ  Ｐｕｍｐ  Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）によって注入した。
【０４０６】
続いて、１０ｋＤのＭＷＣＯ（ＲＣ膜）を備えたＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒカセット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して製剤を一次生成物体積の２００倍の体積のｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に対して２回透析してエタノールを除去し、緩衝剤交換を成し遂げた。最初の透析を室温で３時間行い、その後、製剤を４℃で一晩透析した。結果として得られたナノ粒子懸濁液を０．２μｍ無菌フィルター（Ｓａｒｓｔｅｄｔ，Ｎｕｍｂｒｅｃｈｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で濾過してガラス製バイアルに入れ、かしめ閉じによって密封した。
【０４０７】
一般的手順３：ＬＮＰの特性評価
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ，Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を使用して製剤の粒径及びゼータ電位をそれぞれ１ＸのＰＢＳ及び１５ｍＭのＰＢＳの中で決定した。
【０４０８】
リポソーム製剤中のｓｉＲＮＡの濃度をＵＶ−ｖｉｓによって測定した。手短に述べると、１ＸのＰＢＳで希釈した製剤１００μＬをメタノールとクロロホルムとの４：１（ｖ／ｖ）混合物９００μＬに添加した。混合後に溶液の２３０ｎｍ〜３３０ｎｍでの吸光度スペクトルをＤＵ８００分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｂｒｅａ，ＣＡ）で記録した。リポソーム製剤中のｓｉＲＮＡの濃度は、製剤に使用したｓｉＲＮＡの消光係数、及び波長２６０ｎｍでの吸光度と波長３３０ｎｍでのベースライン値との差に基づいて算出した。
【０４０９】
ナノ粒子によるｓｉＲＮＡの封入はＱｕａｎｔ−ｉＴ（商標）ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）ＲＮＡアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によって評価した。手短に述べると、試料をＴＥ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）でおよそ５μｇ／ｍＬの濃度に希釈した。希釈試料のうち５０μＬをポリスチレン９６ウェルプレートに移し、その後、ＴＥ緩衝液５０μＬか、２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００溶液５０μＬかのどちらかを添加した。プレートを３７℃の温度で１５分間インキュベートした。ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ試薬をＴＥ緩衝液で１：１００に希釈し、この溶液のうち１００μＬを各ウェルに加えた。蛍光プレートリーダー（Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ１４２０マルチラベルカウンター、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して約４８０ｎｍの励起波長及び約５２０ｎｍの発光波長で蛍光強度を測定した。試薬ブランクの蛍光値を各試料のそれから差し引き、未処理の（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００が添加されていない）試料の蛍光強度を、（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の添加によって）撹乱された試料の蛍光値で割ることによって遊離ｓｉＲＮＡの百分率を決定した。
【０４１０】
一般的手順４：動物実験
全てのインビボ実験においてマウス系統Ｃ５７ＢＬ／６Ｎを使用した。動物はＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｓｕｌｚｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手し、実験時に６〜８週齢であった。静脈内投与するＬＮＰ製剤は、尾静脈への２００μＬの点滴によって注入した。皮下投与する化合物は、１００〜２００μＬの体積で注射した。血液採取は、顎下静脈採血によって注射前日（「前採血」）及び注射後の実験中の示された時間に行った。血清は血清分離チューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ，Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で単離し、分析時まで凍結状態に保った。化合物投与から７日後にマウスをＣＯ２吸入によって麻酔し頸椎脱臼によって殺した。血液を心臓穿刺によって採取し、血清を上記のとおりに単離した。ｍＲＮＡ定量のための組織を採取し、すぐさま液体窒素中で急速冷凍した。
【０４１１】
一般的手順５：遺伝子ノックダウンの測定
血清タンパク質レベルの決定は以下を用いて成し遂げられた：第ＶＩＩ因子については発色性酵素活性アッセイＢＩＯＰＨＥＮ  ＦＶＩＩ（＃２２１３０４、Ｈｙｐｈｅｎ  ＢｉｏＭｅｄ，ＭａｒｉａＥｎｚｅｒｓｄｏｒｆ，Ａｕｓｔｒｉａ）を製造者の推奨に従って使用して分析した。マウス血清は分析前に１：３０００に希釈した。Ｖｉｃｔｏｒ３マルチラベルカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して４０５ｎｍでの比色発色の吸光度を測定した。
【０４１２】
血清中のＡｐｏＢタンパク質はＥＬＩＳＡ（ＣｌｏｕｄＣｌｏｎｅ  Ｃｏｒｐ．／Ｈｏｅｌｚｅｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ、＃ＳＥＣ００３Ｍｕ）によって測定した。マウス血清の１：５０００希釈液を製造者の指示に従って処理し、Ｖｉｃｔｏｒ３マルチラベルカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して４５０ｎｍでの吸光度を測定した。
【０４１３】
血清中のトランスサイレチン（ＴＴＲ、プレアルブミンとしても知られる）タンパク質をＥＬＩＳＡ（＃ＫＡ２０７０、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｅ，Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって測定した。マウス血清の１：４０００希釈液を製造者の指示に従って処理し、Ｖｉｃｔｏｒ３マルチラベルカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して４５０ｎｍでの吸光度を測定した。
【０４１４】
ｍＲＮＡレベルの定量のために、凍結組織片（３０〜５０ｍｇ）を凍結１．５ｍＬ反応チューブに移した。３．３μＬ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（５０μｇ／μＬ）（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＵＳＡ）を含有する１ｍＬの溶解混合物（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＵＳＡ）を添加し、超音波処理装置（ＨＤ２０７０、Ｂａｎｄｅｌｉｎ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して組織を数秒間の超音波処理によって溶解させ、サーモミキサー（Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ  ｃｏｍｆｏｒｔ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）内でプロテイナーゼＫで３０分間６５℃で消化した。分析時まで溶解物を−８０℃で保存した。ｍＲＮＡ分析のために分析物を解凍し、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ  １．０（ＦＶＩＩ、ＡｐｏＢ及びＧＡＰＤＨ）か、Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ  ２．０（ＴＴＲ）分岐型ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）アッセイキット（Ｐａｎｏｍｉｃｓ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ、カタログ番号ＱＧ０００４）かのどちらかを製造者の推奨に従って使用してｍＲＮＡレベルを定量した。アッセイ読出しとして化学発光信号をＶｉｃｔｏｒ２発光カウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で相対発光単位（ＲＬＵ）として測定した。対応するｍＲＮＡの信号を同じ溶解物からのＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの信号で割った。値をＧＡＰＤＨに対して正規化されたｍＲＮＡ発現として報告する。
【０４１５】
追加の一般的手順１：一本鎖オリゴヌクレオチドの合成
ホスホロアミダイト化学を用いてオリゴヌクレオチドを１０μｍｏｌ規模でＡＢＩ３９４及び３９００合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で、または２８μｍｏｌ規模でＯｌｉｇｏｐｉｌｏｔ１０合成装置で組み立てた。固体担体は、２’−デオキシチミジン（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ，ＵＳＡ）を負荷したポリスチレン、またはコントロールドポアグラス（ＣＰＧ、５２０Å、負荷量７５μｍｏｌ／ｇ、Ｐｒｉｍｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａｓｔｏｎ，ＰＡ，ＵＳＡから入手）であった。補助合成試薬、ＤＮＡ−、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ−、及び２’−デオキシ−２’−フルオロ−ＲＮＡホスホロアミダイトはＳＡＦＣ  Ｐｒｏｌｉｇｏ（Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。具体的には、２’−Ｏ−メチル−ウリジン（２’−ＯＭｅ−Ｕ）、４−Ｎ−アセチル−２’−Ｏ−メチル−シチジン（２’−ＯＭｅ−ＣＡｃ）、６−Ｎ−ベンゾイル−２’−Ｏ−メチル−アデノシン（２’−ＯＭｅ−Ａｂｚ）及び２−Ｎ−イソブチルグアノシン（２’−ＯＭｅ−ＧｉＢｕ）の５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホロアミダイト単量体を使用してオリゴマー配列を構築した。２’−フルオロ修飾は、ＲＮＡ構成要素２’−ＯＭｅと同じ核酸塩基保護基を保有する対応するホスホロアミダイトを使用して導入した。どのホスホロアミダイト（アセトニトリル中７０ｍＭ）も、活性化剤として５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾール（ＥＴＴ、アセトニトリル中０．５Ｍ）を使用し、カップリング時間を３分とした。ホスホロチオエート結合は、ピリジンとアセトニトリルとの１：１（ｖ／ｖ）混合物中５０ｍＭの３−（（ジメチルアミノ−メチリデン）アミノ）−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−３−チオン（ＤＤＴＴ、ＡＭ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｏｃｅａｎｓｉｄｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を使用して導入された。
【０４１６】
ＤＭＴ基の除去を含めた固相合成（「ＤＭＴ除去合成」）が完了した時点で、公開されている方法（Ｗｉｎｃｏｔｔ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２３：２６７７−２６８４（１９９５））に従ってメチルアミン水溶液（４１％）及び濃アンモニア水溶液（３２％）からなる１：１混合物を使用して２５℃で３時間かけてオリゴヌクレオチドを固体担体から解離させ脱保護した。
【０４１７】
続いて、Ｓｏｕｒｃｅ  Ｑ１５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を充填したカラム及びＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してアニオン交換ＨＰＬＣによって粗オリゴマーを精製した。緩衝液Ａは、２０％アセトニトリル水溶液中に１０ｍＭの過塩素酸ナトリウム、２０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４（Ｆｌｕｋａ、Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含むものであり、緩衝液Ｂは緩衝液Ａと同じもので過塩素酸ナトリウムが５００ｍＭであった。３２カラムボリューム（ＣＶ）以内でＢを２２％から４２％までとする勾配を採用した。２８０ｎｍでのＵＶトレースを記録した。適切な画分を溜め、ｐＨ＝５．２、３ＭのＮａＯＡｃ及び７０％のエタノールで析出させた。遠心分離によってペレットを回収した。あるいは、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＨｉＰｒｅｐカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して製造者の推奨に従って脱塩を行った。
【０４１８】
オリゴヌクレオチドを水で戻し、オリゴヌクレオチドの同定をエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）による確認によって行った。純度は分析的アニオン交換ＨＰＬＣによって評価した。
【０４１９】
５’−アミノヘキシルリンカーは、ＴＦＡ保護ヘキシルアミノリンカーホスホロアミダイト（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＳＡＦＣ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して導入した。３’−ヘキシルアミノリンカーは、ＣＰＧ（Ｐｒｉｍｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａｓｔｏｎ，ＰＡ，ＵＳＡ）上に固定されたフタルイミド保護ヘキシルアミノリンカーを使用して導入した。脱保護及び精製は上記のとおりに実施した。
【０４２０】
追加の一般的手順２：チオール末端ｓｉＲＮＡの生成
１−Ｏ−ジメトキシトリチル−ヘキシル−ジスルフィド，１’−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホロアミダイトリンカー（ＮｕｃｌｅｏＳｙｎ，Ｏｌｉｖｅｔ  Ｃｅｄｅｘ，Ｆｒａｎｃｅ）を介して３’−または５’−末端チオール基を導入した。上記のとおりに脱保護及び精製を行った後、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）（重炭酸トリエチルアンモニウム緩衝液（ＴＥＡＢｃ、０．１Ｍ、ｐＨ８．５、Ｓｉｇｍａ、＃９０３６０）中０．１ＭのＤＴＴ原液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ、＃６４６５６３））を使用して各ジスルフィド含有オリゴマーを還元した。オリゴヌクレオチドをＴＥＡＢｃ緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ８．５）中に溶解させて１ｍＭの溶液を得た。ジスルフィド還元を成し遂げるために、５０〜１００倍モル過剰のＤＴＴをオリゴヌクレオチド溶液に添加した。還元の進行を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒから入手したＤｉｏｎｅｘ  ＤＮＡ  Ｐａｃ２００カラム（４×２５０ｍｍ）で分析的ＡＥＸ  ＨＰＬＣによって追跡評価した。還元された材料、すなわち対応するチオール（Ｃ６ＳＨ）は出発材料よりも先に溶離する。反応終了後、ＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅからのＨｉＰｒｅｐカラム及び溶離剤としての水を使用してサイズ排除クロマトグラフィーによって過剰の試薬を除去する。続いて、３ＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）及びエタノールを使用してオリゴヌクレオチドを析出させ、マイナス２０℃で保存する。
【０４２１】
追加の一般的手順３：一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）同士をアニーリングさせて二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を形成するための一般的手順
センス鎖に対して必要とされる相補的アンチセンス鎖（複数可）をやや過剰に混合すること、及び２０ｍＭのＮａＣｌ／４ｍＭのリン酸ナトリウムのｐＨ６．８の緩衝液中でアニーリングさせることによって、ＲＮＡ一本鎖からｄｓＲＮＡを生成した。ＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅからのＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５カラム（１０×３００ｍｍ）を使用してネイティブサイズ排除ＨＰＬＣによって二本鎖形成の成功が確認された。試料は使用時まで冷凍保存した。
【０４２２】
本明細書に記載の配列において、大文字「Ａ」、「Ｃ」、「Ｇ」及び「Ｕ」はＲＮＡヌクレオチドを表す。小文字「ｃ」、「ｇ」、「ａ」及び「ｕ」は２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを表し、「ｓ」はホスホロチオエートを表し、「ｄＴ」はデオキシチミジン残基を表す。大文字Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕの後に続く「ｆ」は２’−フルオロヌクレオチドを示す。「（ＳＨＣ６）」はチオヘキシルリンカーを表す。「（ＤＴＭＥ）」は、切断可能なホモ二官能性クロスリンカーであるジチオビスマレイミドエタンを表し、「Ｃ６ＮＨ２」及び「Ｃ６ＮＨ」はアミノヘキシルリンカーを表して交換可能に使用される。「Ｃ６ＳＳＣ６」は、ジヘキシルジスルフィドリンカーを表す。「ＩｎｖｄＴ」は逆位チミジンを意味する。
【０４２３】
追加の一般的手順４：逐次アニーリングによって多量体ｓｉＲＮＡを生成するための一般的手順
多量体ｓｉＲＮＡの段階的アニーリングによる調製は水中で実施し、相補鎖の段階的添加を利用した。溶液の加熱／冷却は必要としなかった。各添加の後にアニーリング溶液のアリコートを取り出し、ネイティブ条件（２０℃）の下で分析的ＲＰ  ＨＰＬＣを用いて二本鎖形成を追跡評価した。等モル量の相補的一本鎖と結合するために必要とされる量は最近傍法によって計算した個々の一本鎖の消光係数に基づいて算出した。分析的ＲＰ  ＨＰＬＣトレースが過剰の一本鎖を示した場合には追加量の対応する相補鎖を添加して二本鎖形成を促した（「二本鎖滴定」）。
【０４２４】
二本鎖滴定は、２０℃に平衡化したＸＢｒｉｄｅ  Ｃ１８  Ｏｌｉｇｏ  ＢＥＨ（２．５μｍ、２．１×５０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ）カラムを装着したＤｉｏｎｅｘ  Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００ＨＰＬＣシステムを使用して追跡評価された。診断波長は２６０ｎｍであった。緩衝液Ａは、ヘキサフルオロ−イソプロパノール（ＨＦＩＰ）が１００ｍＭ、トリエチルアミン（ＴＥＡ）が１６．３ｍＭであり１％のメタノールを含有するものであった。緩衝液Ｂは、ＭｅＯＨが９５％であったことを除けば同じ組成を有していた。流速２５０μＬ／分で緩衝液Ｂを３０分で５％から７０％までとする勾配を適用した。２つの相補鎖を独立して流して保持時間を確立した。その後、二本鎖溶液を含有するアリコートを分析し、構成要素である一本鎖の保持時間と比較した。二本鎖溶液が一本鎖の著しい量を示した場合には、対応する相補鎖を二本鎖溶液に添加した。
【０４２５】
実施例１：チオール末端ｓｉＲＮＡの生成
必要な場合には、１−Ｏ−ジメトキシトリチル−ヘキシル−ジスルフィド，１’−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホロアミダイトリンカー（ＮｕｃｌｅｏＳｙｎ，Ｏｌｉｖｅｔ  Ｃｅｄｅｘ，Ｆｒａｎｃｅ）を介して３’−または５’−末端チオール基を導入した。固相合成及びＤＭＴ基の最終除去（「ＤＭＴ除去合成」）が完了した時点で、メチルアミン水溶液（４１％）及び濃アンモニア水溶液（３２％）からなる１：１混合物を使用して１０℃で６時間かけてオリゴヌクレオチドを固体担体から解離させ脱保護した。続いて、粗オリゴヌクレオチドをＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）でアニオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製した。精製された（Ｃ６ＳＳＣ６）−オリゴヌクレオチドをエタノールの添加及び冷凍庫内での一晩の保存によって析出させた。遠心分離によってペレットを回収した。オリゴヌクレオチドを水で戻し、オリゴヌクレオチドの同定をエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）による確認によって行った。純度は分析的アニオン交換及びＲＰ  ＨＰＬＣによって評価した。
【０４２６】
その後、１００ｍＭのＤＬ−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）溶液を使用して各ジスルフィド含有オリゴマーを還元した。１．０ＭのＤＴＴ原液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ、＃６４６５６３）を重炭酸トリエチルアンモニウム緩衝液（ＴＥＡＢｃ、１Ｍ、ｐＨ８．５、Ｓｉｇｍａ、＃９０３６０）及び水で希釈してＤＴＴ及びＴＥＡＢｃが各々１００ｍＭである溶液を得た。オリゴヌクレオチドをＴＥＡＢｃ緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ８．５）中に溶解させて１ｍＭの溶液を得た。ジスルフィド還元を成し遂げるために、５０〜１００倍モル過剰のＤＴＴをオリゴヌクレオチド溶液に添加する。還元の進行を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒから入手したＤｉｏｎｅｘ  ＤＮＡ  Ｐａｃ２００カラム（４×２５０ｍｍ）で分析的ＡＥＸ  ＨＰＬＣによって追跡評価した。還元された材料、すなわち対応するチオール（Ｃ６ＳＨ）は出発材料よりも先に溶離する。反応終了後、ＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅからのＨｉＰｒｅｐカラム及び溶離剤としての水を使用してサイズ排除クロマトグラフィーによって過剰の試薬を除去する。続いて、３ＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）及びエタノールを使用してオリゴヌクレオチドを析出させ、マイナス２０℃で保存する。
【０４２７】
実施例２：モノＤＴＭＥオリゴマーを調製するための一般的手順
２５％のアセトニトリルを含有する３００ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）の中にチオール修飾オリゴヌクレオチドを溶解させて２０ＯＤ／ｍＬの溶液を得た。４０当量のジチオビスマレイミドエタン（ＤＴＭＥ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、＃２２３３５）をアセトニトリル中に溶解させて１５．６ｍＭの溶液を提供した。ＤＴＭＥ溶液をオリゴヌクレオチド含有溶液に添加し、２５℃でＴｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で撹拌した。反応の進行を、Ｄｉｏｎｅｘ  ＤＮＡ  Ｐａｃ２００カラム（４×２５０ｍｍ）を使用して分析的ＡＥＸ  ＨＰＬＣによって追跡評価した。必要とされる純度レベルに応じて、ＨｉＰｒｅｐカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用するサイズ排除ＨＰＬＣによって過剰のＤＴＭＥを除去するか、あるいはＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから市販されているＳｏｕｒｃｅ１５Ｑ樹脂を充填したカラムを使用する分取ＡＥＸ  ＨＰＬＣによって粗反応混合物を精製する。
【０４２８】
実施例３：ＤＴＭＥ官能性によって二量体を調製するための一般的手順
実施例２の手順に従って調製したＤＴＭＥ修飾オリゴヌクレオチドを、チオールリンカーを備えた別のオリゴヌクレオチドと反応させる。この反応は、一本鎖配列に対して行ってもよいし、あるいは反応相手の１つに相補的なオリゴヌクレオチドをアニーリングさせた後に行ってもよい。結果として、所望により、ＤＴＭＥ修飾オリゴヌクレオチドを、チオール修飾オリゴヌクレオチドと直接反応させるかまたは、その相補鎖とアニーリングさせ、結果として得られた二本鎖をチオール修飾オリゴヌクレオチドと反応させた。あるいは、チオール修飾オリゴヌクレオチドをその相補鎖とアニーリングさせ、この二本鎖をＤＴＭＥ修飾一本鎖と反応させた。全ての場合において、反応は３００ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）の存在下で水溶液中で行った。
【０４２９】
実施例４：一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）をアニーリングして二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を形成するための一般的手順
等モル量の相補的センス及びアンチセンス鎖を混合すること、ならびに２０ｍＭのＮａＣｌ／４ｍＭのリン酸ナトリウムのｐＨ６．８の緩衝液中でアニーリングさせることによって、ＲＮＡ一本鎖からｄｓＲＮＡを生成した。ＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅからのＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５カラム（１０×３００ｍｍ）を使用してネイティブサイズ排除ＨＰＬＣによって二本鎖形成の成功が確認された。試料は使用時まで冷凍保存した。
【０４３０】
実施例５：３’−または５’−ＮＨ２誘導体化オリゴヌクレオチドを調製するための一般的手順
ＡＫＴＡ  Ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ  １００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）及び固体担体としてのコントロールドポアグラス（ＣＰＧ）（Ｐｒｉｍｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａｓｔｏｎ，ＰＡ，ＵＳＡ）を使用して固相上で１４０μｍｏｌの規模で、センス鎖の５’末端にＣ−６−アミノリンカーを備えたＲＮＡを標準的ホスホロアミダイト化学によって生成した。２’−Ｏ−メチル及び２’−Ｆヌクレオチドを含有するオリゴマーを、対応する２’−ＯＭｅ−ホスホロアミダイト、２’−Ｆ−メチルホスホロアミダイトを使用して生成した。センス鎖の５’末端の５’−アミノヘキシルリンカーは、ＴＦＡ保護ヘキシルアミノリンカーホスホロアミダイト（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＳＡＦＣ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して導入した。３’位にヘキシルアミノリンカーが必要とされる場合には、ＣＰＧ（Ｐｒｉｍｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａｓｔｏｎ，ＰＡ，ＵＳＡ）上に固定されたフタルイミド保護ヘキシルアミノリンカーを使用した。解離及び脱保護は、水中４１％のメチルアミンと濃アンモニア水溶液との混合物（１：１  ｖ／ｖ）を使用して成し遂げた。アニオン交換ＨＰＬＣ、及びＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから入手したＳｏｕｒｃｅ  １５Ｑ樹脂を充填したカラム（２．５×１８ｃｍ）を使用して粗オリゴヌクレオチドを精製した。
【０４３１】
実施例６：ＧａｌＮＡｃリガンド複合体化のための一般的方法
三価ＧａｌＮＡｃリガンドを、Ｈａｄｗｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、特許出願第ＵＳ２０１２／０１５７５０９Ａ１号に概説されているとおりに調製した。対応するカルボン酸誘導体を、以下の手順に従ってＮＨＳ化学を用いて活性化させた。
【０４３２】
３ＧａｌＮＡｃ−ＣＯＯＨ（９０μｍｏｌ、２０６ｍｇ）を２．０６ｍＬのＤＭＦに溶解させた。この溶液にＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、１４．３ｍｇ（９９μｍｏｌ、１．１当量））及びジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ、１８．２９μＬ、１．０５当量、９４μｍｏｌ）を０℃で添加した。この溶液を周囲温度で一晩撹拌した。反応の終了をＴＬＣ（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝９：１）によって追跡評価した。
【０４３３】
アミノヘキシルリンカーを備えた前駆体オリゴヌクレオチドを２：３  ｖ／ｖの炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）：ＤＭＳＯの中に溶解させて４．４ｍＭの溶液を得た。この溶液にＮＨＳ活性化ＧａｌＮＡｃ溶液のアリコート（１．２５当量、１１６μＬ）を添加した。２５℃で１時間振盪した後、ＮＨＳ活性化ＧａｌＮＡｃの別のアリコート（１１６μＬ）を添加した。ＲＰ  ＨＰＬＣ分析が少なくとも８５％より多い複合体化材料を示した時点で粗複合体をエタノールの添加及び冷凍庫内での一晩の保存によって析出させた。遠心分離によってペレットを回収した。ＧａｌＮＡｃ糖残基からＯ−アセテートを除去するために、ペレットを１ｍＬの濃アンモニア水に溶解させ、室温で４時間撹拌した。ＲＰ  ＨＰＬＣ  ＥＳＩ  ＭＳによってＯ−アセテートの定量的除去を確認した後、材料を１００ｍＭの酢酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ）で希釈し、ＡＫＴＡ  ｅｘｐｌｏｒｅｒ  ＨＰＬＣシステムでＸＢｒｉｄｇｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８（５μｍ、１０×５０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ）カラムを６０℃で使用するＲＰ  ＨＰＬＣによって粗反応混合物を精製した。溶媒Ａは１００ｍＭのＴＥＡＡ水であり、溶媒Ｂは１００ｍＭのＴＥＡＡを９５％のＣＡＮ中に含むものであり、どちらも緩衝液予熱装置によって６０℃に加熱された。流速３．５ｍＬ／分でＢを６０分で５％から２５％までとする勾配を採用した。化合物の溶離を２６０及び２８０ｎｍで観察した。体積１．０ｍＬの画分を収集し、分析的ＲＰ  ＨＰＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳによって分析した。８５％より高い純度を有する目標複合体を含有する画分を混ぜ合わせた。正確な分子量をＥＳＩ／ＭＳによって確認した。
【０４３４】
実施例７：オリゴヌクレオチド前駆体
上記実施例に記載の方法論を用いて、以下の一本鎖単量体、二量体、ならびにＧａｌＮＡｃタグ付き単量体及び二量体を調製した。
【０４３５】
（表１）オリゴヌクレオチド前駆体−一本鎖（「Ｘ」）
2020518552.tif 000475
【０４３６】
（表２）オリゴヌクレオチド一本鎖センス及びアンチセンス対、ならびにアニーリング後に得られる二本鎖（「ＸＤ−」）
2020518552.tif 000476
【０４３７】
（表３）誘導体化オリゴヌクレオチド一本鎖センス及びアンチセンス対、ならびにアニーリング後に得られる二本鎖
2020518552.tif 000477
【０４３８】
（表４）ＤＴＭＥによって連結された一本鎖オリゴヌクレオチド二量体
2020518552.tif 000478
【０４３９】
（表５）一本鎖ＤＴＭＥ二量体及び対応する単量体、ならびにアニーリング後に得られる二本鎖
2020518552.tif 000479
【０４４０】
（表６）化学合成されたジスルフィド結合二量体及び三量体
2020518552.tif 000480
【０４４１】
要点：上記表１〜６（及び以降）の配列部分において、大文字「Ａ」、「Ｃ」、「Ｇ」及び「Ｕ」はＲＮＡヌクレオチドを表す。小文字「ｃ」、「ｇ」、「ａ」及び「ｕ」は２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを表し、「ｓ」はホスホロチオエートを表し、「ｄＴ」はデオキシチミジン残基を表す。大文字Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕの後に続く「ｆ」は２’−フルオロヌクレオチドを示す。「（ＳＨＣ６）」はチオヘキシルリンカーを表す。「（ＤＴＭＥ）」は、切断可能なホモ二官能性クロスリンカーであるジチオビスマレイミドエタンを表し、その構造は図１Ｂで示される。「（ＢＭＰＥＧ２）」は切断不可能なホモ二官能性クロスリンカーである１，８−ビスマレイミド−ジエチレングリコールを表す。「Ｃ６ＮＨ２」及び「Ｃ６ＮＨ」はアミノヘキシルリンカーを表して交換可能に使用される。「Ｃ６ＳＳＣ６」は、ジヘキシルジスルフィドリンカーを表す。「ＧａｌＮＡｃ３」及び「ＧａｌＮＡｃ」は三分岐Ｎ−アセチルガラクトサミンリガンドを表して交換可能に使用され、その化学構造は図１Ａで示される。「ＳＰＤＰ」は、スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネートと、アミノリンカーを備えたＲＮＡとの反応の反応生成物を表す。「ＩｎｖｄＴ」は逆位チミジンを意味する。
【０４４２】
図の標的／鎖部分において、「Ｆ７」または「ＦＶＩＩ」は、第ＶＩＩ因子転写産物（ｍＲＮＡ）を指向するｓｉＲＮＡ配列を指す。「ＡｐｏＢ」は、アポリポタンパク質Ｂ転写産物を指向するｓｉＲＮＡ配列を指す。「ＴＴＲ」は、トランスサイレチン転写産物を指向するｓｉＲＮＡ配列を指す。センス鎖を「ｓ」で表し、アンチセンス鎖を「ａｓ」で表す。
【０４４３】
実施例８：逐次アニーリングによって二量体、三量体及び四量体ｓｉＲＮＡを生成する一般的手順
二量体、三量体及び四量体ｓｉＲＮＡを調製するために段階的アニーリング手順を実施した。アニーリングは水中で実施し、相補鎖の段階的添加を利用した。溶液の加熱／冷却は必要としなかった。各添加の後にアニーリング溶液のアリコートを取り出し、ネイティブ条件（２０℃）の下で分析的ＲＰ  ＨＰＬＣを用いて二本鎖形成を追跡評価した。等モル量の相補的一本鎖と結合するために必要とされる量は最近傍法によって計算した個々の一本鎖の消光係数に基づいて算出した。分析的ＲＰ  ＨＰＬＣトレースが過剰の一本鎖を示した場合には追加量の対応する相補鎖を添加して二本鎖形成を促した（「二本鎖滴定」）。
【０４４４】
二本鎖滴定は、２０℃に平衡化したＸＢｒｉｄｅ  Ｃ１８  Ｏｌｉｇｏ  ＢＥＨ（２．５μｍ、２．１×５０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ）カラムを装着したＤｉｏｎｅｘ  Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００ＨＰＬＣシステムを使用して追跡評価された。診断波長は２６０ｎｍであった。緩衝液Ａは、ヘキサフルオロ−イソプロパノール（ＨＦＩＰ）が１００ｍＭ、トリエチルアミン（ＴＥＡ）が１６．３ｍＭであり１％のメタノールを含有するものであった。緩衝液Ｂは、ＭｅＯＨが９５％であったことを除けば同じ組成を有していた。流速２５０μＬ／分で緩衝液Ｂを３０分で５％から７０％までとする勾配を適用した。２つの相補鎖を独立して流して保持時間を確立した。その後、二本鎖溶液を含有するアリコートを分析し、構成要素である一本鎖の保持時間と比較した。二本鎖溶液が一本鎖の著しい量を示した場合には対応する相補鎖を二本鎖溶液に添加した。
【０４４５】
実施例９：５’−ＧａｌＮＡｃ−ＦＶＩＩ基準対照（ＸＤ−０６３２８）の調製
実施例４に記載の方法によってｓｓＲＮＡ鎖Ｘ１８７９０及びＸ１８７９５をアニーリングさせることによって５’−ＧａｌＮＡｃ−ＦＶＩＩ基準対照（ＸＤ−０６３２８）（図２参照）を調製した。ＨＰＬＣ分析によって決定した純度が９１．６％である生成物が得られた。
【０４４６】
実施例１０：３’アンチセンス鎖同士を連結している切断可能なリンカーと、センス鎖の外側３’末端に複合体化したＧａｌＮＡｃとを有する、３’−ＧａｌＮＡｃ−ＦＶＩＩ−ＤＴＭＥ−ＦＶＩＩホモ二量体（ＸＤ−０６３３０）の調製
実施例８に記載の二本鎖滴定法に従って、一本鎖二量体Ｘ１９８１９をＸ１８７８８及びＸ１９５７１と段階的に組み合わせることにより、ＦＶＩＩを指向するＧａｌＮＡｃ複合体化ホモ二量体ｓｉＲＮＡ  ＸＤ−０６３３０（図３）を調製した（１０ｍｇ、３２３ｎｍｏｌ）。単離された材料はＨＰＬＣ分析によると本質的に純粋であった。
【０４４７】
（表８）ＧａｌＮＡｃ−ＦＶＩＩ−ＤＴＭＥ−ＦＶＩＩホモ二量体（ＸＤ−０６３３０）の合成に使用したオリゴマーの化学量論
2020518552.tif 000481
【０４４８】
実施例１１：５’センス鎖同士を接合している切断可能なリンカーと、センス鎖の外側３’末端に複合体化したＧａｌＮＡｃとを有する、３’−ＧａｌＮＡｃ−ＦＶＩＩ−ＤＴＭＥ−ＦＶＩＩホモ二量体（ＸＤ−０６３６０）の調製
図４に描写する合成方策及び実施例８に記載の方法論を用いて一本鎖を段階的に組み合わせることによって、ＦＶＩＩを指向するＧａｌＮＡｃ複合体化ホモ二量体ｓｉＲＮＡ  ＸＤ−０６３６０を調製した（１１ｍｇ、３２３ｎｍｏｌ）。
【０４４９】
どの反応ステップも質の高い材料を生成し、オリゴマーＸ１９５７５はイオン交換クロマトグラフィー及び逆相クロマトグラフィーによってそれぞれ純度９１．７％及び９３．４％と決定され、オリゴマーＸＤ−０６３６０は非変性逆相ＨＰＬＣで決定して純度８６．８％で単離された。合成に使用した様々なオリゴマーの化学量論を表９に示す。
【０４５０】
（表９）ＧａｌＮＡｃ−ＦＶＩＩ−ＦＶＩＩホモ二量体（ＸＤ−０６３６０）の合成に使用したオリゴマーの化学量論
2020518552.tif 000482
【０４５１】
実施例１２：３’アンチセンス鎖同士を接合している切断可能なリンカーと、センス鎖の内側５’末端に複合体化したＧａｌＮＡｃとを有する、５’−ＧａｌＮＡｃ−ＦＶＩＩ−ＤＴＭＥ−ＦＶＩＩホモ二量体（ＸＤ−０６３２９）の調製
ＦＶＩＩを指向するＧａｌＮＡｃ複合体化ホモ二量体ｓｉＲＮＡ  ＸＤ−０６３２９を、図５に描写するように１１５０ｎｍｏｌのＸ１８７８８と１１５０ｎｍｏｌのＸ１８７９８とをアニーリングさせることによって調製した。個々の鎖のＯＤの合計は４５０ＯＤであり、合一した溶液、すなわち二本鎖は深色効果のために３９４ＯＤを有していた（３９４ＯＤ＝１１５０ｎｍｏｌの二本鎖）。このＤＴＭＥ修飾二本鎖を１１５０ｎｍｏｌのＸ１８７９７（３’−ＳＨ修飾ＦＶＩＩアンチセンス）（２２４ＯＤ）と反応させた。ＨＰＬＣ精製後に３６４ＯＤの「半二量体」ｓｉＲＮＡが単離された。その後、「半二量体」ＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡ（１０ｍｇ、３２３ｎｍｏｌ、１７４ＯＤ）を５’ＧａｌＮＡｃ−ＦＶＩＩセンス（Ｘ１８７９０）（３２３ｎｍｏｌ、６２．３ＯＤ）とアニーリングさせて最終生成物ＸＤ−０６３２９を得た。
【０４５２】
実施例１３：ＦＶＩＩホモ二量体ＧａｌＮＡｃ複合体（ＸＤ−０６３２９、ＸＤ−０６３３０及びＸＤ−０６３６０）によるインビボでのＦＶＩＩ遺伝子ノックダウンの判定。
第ＶＩＩ因子を指向するホモ二量体ＧａｌＮＡｃ複合体化ｓｉＲＮＡの３つの異なる変異型（ＸＤ−０６３２９、ＸＤ−０６３３０及びＸＤ−０６３６０）及び単量体ＧａｌＮＡｃ複合体化ＦＶＩＩ−ｓｉＲＮＡ（ＸＤ−０６３２８）を、インビボでの有効性について上記（一般的手順：動物実験）の動物実験で試験した。群サイズは、処置群がｎ＝４マウス、生理食塩水対照がｎ＝５であった。どの化合物も、種々の用量（２５ｍｇ／ｋｇまたは５０ｍｇ／ｋｇ）で０．２ｍＬの体積で皮下注射された。処置の１日前、処置後１、３及び７日目に血液を採取し、ＦＶＩＩ酵素活性を分析した。結果を図６に示す。
【０４５３】
ホモ二量体ＧａｌＮＡｃ複合体（ＸＤ−０６３２９、ＸＤ−０６３３０及びＸＤ−０６３６０）のサイレンシング活性、作用の開始、及び有効性は、単位重量あたりのノックダウンにおいて単量体、基準対照（ＸＤ−０６３２８）と同程度であった。毒性のしるし（例えば、体重減少、異常行動）は観察されなかった。しかしながら、ＧａｌＮＡｃ含有量についてデータを正規化するとホモ二量体ＧａｌＮＡｃ複合体はどれもＧａｌＮＡｃ単量体よりもＦＶＩＩノックダウンが効果的であり、よって、リガンド／受容体結合事象１回あたりのｓｉＲＮＡ取込みがより効果的であることが実証された。これらの結果を図７Ａ及び７Ｂに示す。
【０４５４】
図７Ａ。各時点での第ＶＩＩ因子血清値は、１ＸのＰＢＳを注射された対照マウスに対して正規化されている。各データ点にあるバーは、左から右へとそれぞれ、生理食塩水、ＸＤ−０６３２８、ＸＤ−０６３２９、ＸＤ−０６３３０及びＸＤ−０６３６０に対応する。
【０４５５】
図７Ｂ。各時点での第ＶＩＩ因子血清値は、各個の群の採血前の値に対して正規化されている。各データ点にあるバーは、左から右へとそれぞれ、生理食塩水、ＸＤ−０６３２８、ＸＤ−０６３２９、ＸＤ−０６３３０及びＸＤ−０６３６０に対応する。
【０４５６】
実施例１４：独立してＦＶＩＩ（ＸＤ−０６３２８）、ＡｐｏＢ（ＸＤ−０６７２８）及びＴＴＲ（ＸＤ−０６３８６）を指向する基準ＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡの調製。
独立してＦＶＩＩ（ＸＤ−０６３２８）、ＡｐｏＢ（ＸＤ−０６７２８）及びＴＴＲ（ＸＤ−０６３８６）を指向する３つの基準ｓｉＲＮＡ（図８参照）を固相合成によって独立して調製した。５’−ヘキシルアミンリンカーを有する３つのセンス鎖（それぞれＸ１８７９０、Ｘ２０１２４、Ｘ２０２１６）を別々に調製した。オリゴヌクレオチドの解離及び脱保護ならびに粗材料のＨＰＬＣ精製に続いて、ＮＨＳ化学を用いて過アセチル化ＧａｌＮＡｃクラスターの各オリゴへの複合体化を成し遂げた。鹸化によるＯ−アセテートの除去はアンモニア水によって媒介された。相補的アンチセンス鎖（それぞれＸ１８７９５、Ｘ１９５８３及びＸ１９５８４）を、上に示した標準的手順によって合成し、ＧａｌＮＡｃ複合体化一本鎖とアニーリングさせて、ＦＶＩＩ（ＸＤ−０６３２８）、ＡｐｏＢ（ＸＤ−０６７２８）及びＴＴＲ（ＸＤ−０６３８６）を指向するｓｉＲＮＡをそれぞれ９９．７％、９３．１％及び９３．８％の純度で得た。
【０４５７】
（表１０）ＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡ複合体
2020518552.tif 000483
【０４５８】
実施例１５：センス鎖上に切断可能な結合を有するＧａｌＮＡｃ−ＦＶＩＩ−ＡｐｏＢ−ＴＴＲ三量体（ＸＤ−０６７２６）の調製
図１０に描写するように、固相と液相とを掛け合わせる方策を用いて、ＧａｌＮＡｃに複合体化したＦＶＩＩ、ＡｐｏＢ及びＴＴＲを指向するヘテロ三量体（図９参照）を合成した。
【０４５９】
固相化学を用いて５’端部にアミノヘキシルリンカーを有する二量体Ｘ１９５８１を、対応する市販のＴＦＡ保護ホスホロアミダイト（ＳＡＦＣ  Ｐｒｏｌｉｇｏ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して作った。上に概説した条件によって配列を固体担体から解離させ、脱保護し、精製した。追加のジスルフィドリンカーを組み込むために、オリゴヌクレオチドの５’−アミノヘキシルリンカーを、Ｓｉｇｍａ（＃Ｐ３４１５）から入手することができるＳＰＤＰ（スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）
2020518552.tif 000484
と反応させた。９２８ｎｍｏｌ（４００ＯＤ）のオリゴヌクレオチドを、２０％のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を含有するｐＨ８．５の１００ｍＭのＴＥＡＢ  ４．７ｍＬに溶解させた。この溶液に、１．４ｍｇ（４．６μｍｏｌ、５当量）のＳＰＤＰを１００μＬのＤＭＦ中に含む溶液を添加した。分析的ＲＰ  ＨＰＬＣが出発材料の消費を示唆した時点で粗反応混合物を、Ｗａｔｅｒｓから購入したＣ１８  ＸＢｒｉｄｇｅカラム（１０×５０ｍｍ）で精製した。ＲＰ精製は、ＡＫＴＡ  ｅｘｐｌｏｒｅｒ  ＨＰＬＣシステムで実施した。溶媒Ａは１００ｍＭのＴＥＡＡ水であり、溶媒Ｂは１００ｍＭのＴＥＡＡを９５％のＡＣＮ中に含むものであった。溶媒は緩衝液予熱装置によって６０℃に加熱し、カラムは炉内で同じ温度に保った。流速４ｍＬ／分でＢを４５分で０％から３５％までとする勾配を採用した。化合物の溶離を２６０及び２８０ｎｍで観察した。体積１．５ｍＬの画分を収集し、分析的ＲＰ  ＨＰＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳによって分析した。好適な画分を混ぜ合わせ、オリゴヌクレオチドＸ１９５８２はエタノール及び３ＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）の添加後にマイナス２０℃で析出した。同定はＲＰ−ＨＰＬＣ  ＥＳＩ−ＭＳによる確認によって行った。
【０４６０】
一本鎖三量体を調製するために、上記オリゴヌクレオチドＸ１９５８２（２５５ｎｍｏｌ）を１．３ｍＬの水に溶解させた。この溶液に３０６ｎｍｏｌ（１．２当量）のチオール修飾オリゴヌクレオチドＸ１８７９３を添加した。反応混合物は２００ｍＭのＴＥＡＡ及び２０％のアセトニトリルを含有していた。反応の進行をＲＰ  ＨＰＬＣによって追跡した。出発材料が消費された時点で反応混合物を、Ｂを４５分で０％から３０％までとする勾配で流すことを除けば先の段落で記載したのと同じ条件を用いて精製した。
【０４６１】
一本鎖ヘテロ三量体Ｘ２０２５６（連結された、ｓｉＦＶＩＩ、ｓｉＡｐｏＢ及びｓｉＴＴＲのセンス鎖を含有する）が高純度で得られた。Ｘ２０２５６の配列を表１１に示す。
【０４６２】
（表１１）一本鎖ヘテロ三量体
2020518552.tif 000485
【０４６３】
注記：原則として上記配列は１回の固相合成によって得ることができる。この場合、ＳＰＤＰ及びＣ６ＮＨ２はＣ６ＳＳＣ６ホスホロアミダイトで置き換えられよう。しかしながら、構築物全体の配列長ゆえにそのような合成は難題となるであろう。
【０４６４】
その後、実施例８に記載の二本鎖滴定法に従ってセンス鎖ヘテロ三量体中間体（Ｘ２０２５６）に段階的にアンチセンス一本鎖を逐次添加することによって、ＦＶＩＩ、ＡｐｏＢ及びＴＴＲを同時に指向するヘテロ三量体二本鎖構築物（ＸＤ−０６７２６）７ｍｇ（１５０ｎｍｏｌ）を調製した。ＨＰＬＣによって本質的に純粋であった７ｍｇの材料が得られた。
【０４６５】
（表１２）ＧａｌＮＡｃ−ＦＶＩＩ−ＡｐｏＢ−ＴＴＲ三量体（ＸＤ−０６７２６）の合成に使用したオリゴマーの化学量論
2020518552.tif 000486
【０４６６】
実施例１６：切断可能な結合をセンス鎖上及びアンチセンス鎖上に交互に有するＧａｌＮＡｃ−ＦＶＩＩ−ＡｐｏＢ−ＴＴＲ三量体（ＸＤ−０６７２７）の調製。
実施例８に記載の方法論を用いて、図１２に描写するように一本鎖を段階的に組み合わせることにより、ＦＶＩＩ、ＡｐｏＢ及びＴＴＲを同時に指向する９ｍｇ（１９２ｎｍｏｌ）の三量体ｓｉＲＮＡ  ＸＤ−０６７２７（図１１参照）が高純度で調製された。
【０４６７】
（表１３Ａ）ＧａｌＮＡｃ−ｓｉＦＶＩＩ−ｓｉＡｐｏＢ−ｓｉＴＴＲ三量体（ＸＤ−０６７２７）の合成に使用したオリゴマーの化学量論
2020518552.tif 000487
【０４６８】
ヘテロ三量体（ＸＤ−０６７２７）を生成した合成は非常に効率的である。この実施例では、各ステップで反応物質の１００％近い転化率が達成された。図１３、図１４及び図１５を参照されたい。
【０４６９】
実施例１７：個々にＦＶＩＩ、ＡｐｏＢ及びＴＴＲを指向するｓｉＲＮＡプールのＬＮＰ製剤の調製
ＦＶＩＩ（ＸＤ−０００３０）、ＡｐｏＢ（ＸＤ−０１０７８）及びＴＴＲ（ＸＤ−０６７２９）を指向する単量体ｓｉＲＮＡを脂質ナノ粒子の中に製剤化し、一般的手順：脂質ナノ粒子製剤化、及び一般的手順：ＬＮＰ特性評価に記載されている方法論を用いて特性評価した。脂質組成はＸＬ１０：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ−ＤＯＭＧ／５０：１０：３８．５：１．５モルパーセントであった。８８％のカプセル化が達成され、結果として得られた粒子はサイズが８３ｎｍであり、２．２ｍＶのゼータ電位及び０．０４のＰＤＩを有していた。
【０４７０】
（表１３Ｂ）ＴＴＲを指向する単量体ｓｉＲＮＡ（ＸＤ−０６７２９）
2020518552.tif 000488
【０４７１】
実施例１８：ＧａｌＮＡｃ複合体化ヘテロ三量体ｓｉＲＮＡによるｍＲＮＡノックダウンの評価
（ＦＶＩＩ、ＡｐｏＢ及びＴＴＲを指向する）ヘテロ三量体ＧａｌＮＡｃ複合体化ｓｉＲＮＡのインビボでの有効性を判定するために、処置群にｎ＝４マウス、生理食塩水対照にｎ＝５の群サイズを用いて上記（一般的手順：動物実験）のとおりに動物実験を実施した。ヘテロ三量体ＸＤ−０６７２６及びＸＤ−０６７２７、ならびに３つの単量体ＧａｌＮＡｃ複合体化ｓｉＲＮＡ（ＦＶＩＩを指向するＸＤ−０６３２８、ＴＴＲを指向するＸＤ−０６３８６、及びＡｐｏＢを指向するＸＤ−０６７２８）のプールを、三量体についてはＲＮＡ合計で５０ｍｇ／ｋｇ、単量体複合体の各々については１７ｍｇ／ｋｇの濃度で皮下注射した（体積０．１ｍＬ）。比較のために、同じ標的（ＦＶＩＩ（ＸＤ−０００３０）、ＡｐｏＢ（ＸＤ−０１０７８）及びＴＴＲ（ＸＤ−０６７２９））を指向するＬＮＰ製剤化ｓｉＲＮＡ（ＮＰＡ−７４１−１）のプールをｓｉＲＮＡにつき０．５ｍｇ／ｋｇで静脈内注射した。処置の１日前及び処置後１、３及び７日目に上記（一般的手順：動物実験）のとおりに血液を採取し、ＦＶＩＩ、ＡｐｏＢ及びＴＴＲの血清レベルを一般的手順：遺伝子ノックダウンの測定に従って測定した。結果を図１６Ａ及び１６Ｂ、図１７Ａ及び１７Ｂ、ならびに図１８Ａ及び１８Ｂに示す。肝臓溶解物におけるｍＲＮＡレベルを注射後７日目に測定した（図１９Ａ及び１９Ｂ）。
【０４７２】
群Ａ（ＸＤ−０６７２６）において１匹の動物はＴＴＲ血清レベルに何ら影響を示さなかった。２つのＴＴＲタンパク質グラフのうち最初のものは、非応答動物を除外した値によるデータを示している。
【０４７３】
比較のために、ＴＴＲ応答の乏しい動物からの値を２つ目のＦＶＩＩグラフから除外した。
【０４７４】
ＡｐｏＢ血清レベルは、１つの群の動物においても、血清対照の異なる２点間においても、高い変動を示した。
【０４７５】
上記の一般的手順：遺伝子ノックダウンの測定に従って、肝組織からのｍＲＮＡに対するｂＤＮＡアッセイを用いて３つ全ての遺伝子のノックダウンも測定した。標的遺伝子レベルはハウスキーパーＧＡＰＤＨに対して正規化した。
【０４７６】
実施例１９：ＧａｌＮＡｃ−ＦＶＩＩ−ＡｐｏＢ−ＴＴＲ−ＦＶＩＩ四量体（ＸＤ−０７１４０）の調製
実施例８に記載の二本鎖滴定法に従って、図２１に描写するように一本鎖を段階的に組み合わせることにより、ＦＶＩＩ、ＡｐｏＢ及びＴＴＲを同時に指向する四量体ｓｉＲＮＡであるＸＤ−０７１４０（図２０参照）を１２．４ｎｍｏｌ調製した。ＨＰＬＣ分析は生成物が高純度で得られたことを示した。
【０４７７】
（表１４）ＧａｌＮＡｃ−ＦＶＩＩ−ＡｐｏＢ−ＴＴＲ−ＦＶＩＩ四量体（ＸＤ−０７１４０）の合成に使用したオリゴマーの化学量論
2020518552.tif 000489
【０４７８】
実施例２０：ホモ四量体の合成
本発明に係る多量体オリゴヌクレオチドは本明細書に記載のいずれかの方法によって合成することができる。ホモ四量体のための２つの方法例を以下に提供する。これらの実施例を容易に、より長い多量体（例えば、五量体、六量体など）を合成することに適合させることができる。
【０４７９】
一本鎖上の結合を有するホモ四量体ｓｉＲＮＡは、図４０に示すように、切断可能なリンカーによって各センス鎖が連結されたセンス鎖の四量体を合成装置で調製すること、及びその後続いて標的指向性リガンドを付加させること、及びアンチセンス鎖をアニーリングさせることによって合成することができる。センス鎖の切断可能なリンカーは（示されているように）ジスルフィドであってもよいし、または他の不安定な結合（例えば、化学修飾されていない核酸配列、例えばＵＵＵ／ウリジン−ウリジン−ウリジン）であってもよい。
【０４８０】
図４０に示すスキームの変化形態は、代替のリンカーを使用すること、アンチセンス鎖同士を連結し、センス鎖をアニーリングさせること、より長い多量体を合成すること、または機械に基づく合成が技術的限界に達する場合に１つまたは複数の多量体を合成してから１つまたは複数の液相化学反応を用いて上記多量体同士をともに連結すること（例えば、リガンドを一方が有し他方が有さず、結合を容易にすべく一方または両方の鎖が官能基で適宜修飾されている２つの四量体を、スキーム１に従って合成し、その後、結合部分、例えばＤＴＭＥなどの付加を伴うかまたは伴わずに共有結合の形成によって２つの四量体をともに連結すること）を含むことができる。
【０４８１】
あるいは、図４１に示すようにホモ四量体を交互の鎖上の結合によって組み立てることができよう。
【０４８２】
図４１中、「−ＳＨ」はスルフヒドリル基を表し、「Ｍａｌ」はＤＴＭＥを表し、「−ＣＬ−」は切断可能なリンカーを表す。図４１に示すスキームの変化形態は、代替のリンカーを使用すること及びより長い多量体を合成することを含むことができる。
【０４８３】
実施例２１：リガンド複合体の合成
図４１に示すリガンド複合体は以下のとおりに合成することができる。
【０４８４】
単量体のセンス鎖とアンチセンス鎖との両方の３’−スルフヒドリル誘導体を合成する：
2020518552.tif 000490
【０４８５】
各々の一部を対応するモノマレイミド誘導体に変換する：
2020518552.tif 000491
【０４８６】
その後、このようにして得られたセンス鎖マレイミド誘導体の一部を最適な標的指向性リガンドのスルフヒドリル誘導体で処理する：
2020518552.tif 000492
【０４８７】
その後、ややモル過剰のアンチセンス−マレイミド誘導体を加え、所望のリガンド−ｄｓ−ｓｉＲＮＡ−マレイミド生成物を分取クロマトグラフィーによって単離する：
2020518552.tif 000493
【０４８８】
その後、図４１に概説するように、ホモ四量体のややモル過剰のセンス及びアンチセンス構成成分の各々を配列に付加させ、各ステップでの生成物は必要な場合に分取クロマトグラフィーで精製する。
【０４８９】
実施例２２：多量体オリゴヌクレオチドの合成
本発明に係る多量体オリゴヌクレオチドは、本明細書に記載されているかまたは当技術分野から適合させたいずれかの方法によって合成することができる。ホモ多量体について方法例を以下に提供するが、本合成を容易にヘテロ多量体の合成に適合させることもできる。
【０４９０】
これらの実施例を異なる長さの多量体の合成に適合させることもできる。例えば、本質的に同じ合成及び結合化学を用いて四量体と単量体と（または三量体と二量体と）を組み合わせて五量体を生成することができる。同様に、四量体と三量体とを組み合わせて七量体を合成するなどといったことができる。相補的結合化学（例えばクリックケミストリー）を用いてより大きい多量体を組み立てることができる。
【０４９１】
実施例２２Ａ：予備合成したホモ二量体によるｓｉＲＮＡのホモ四量体の合成
ステップ１：２つのセンス鎖がヌクレアーゼ切断可能オリゴヌクレオチド（ＮＡ）によって連結されアミノ官能及びジスルフィド部分の末端を有するセンス鎖ホモ二量体が合成される。
2020518552.tif 000494
（このステップ及び他のステップにおいて）個々の鎖は、一般的手順：一本鎖オリゴヌクレオチド合成の節で上に概説したとおりに合成する。当技術分野からオリゴヌクレオチド鎖合成、結合及び化学修飾のための他の方法を適合させることができる。
【０４９２】
ステップ２：その後、アシル活性化三分岐ＧａｌＮＡｃリガンドとの反応によって三分岐ＧａｌＮＡｃリガンドをセンス鎖ホモ二量体の一方の部分の末端アミノ官能に付加させる。
2020518552.tif 000495
【０４９３】
ステップ３：センス鎖ホモ二量体の残部をモル過剰のジチオスレイトールで処理してジスルフィド基を切断してチオール末端センス鎖ホモ二量体を生成する。
2020518552.tif 000496
【０４９４】
ステップ４：この材料を、ヘテロ多量体の調製のために用いた手順（上記参照）に従ってジチオビスマレイミドエタン（ＤＴＭＥ）でモノ誘導体化する。
2020518552.tif 000497
【０４９５】
ステップ５：ＧａｌＮＡｃ誘導体化ホモ二量体のジスルフィド基もモル過剰のジチオスレイトールによる処理によって切断する。
2020518552.tif 000498
【０４９６】
ステップ６：その後、ＧａｌＮＡｃ末端ホモ二量体を、末端チオール基の反応によってモノＤＴＭＥ誘導体化ホモ二量体に連結して一本鎖ホモ四量体を得る。「−Ｓ−ＣＬ−Ｓ−」は、ＤＴＭＥ中の切断可能なジスルフィド基、例えば切断可能なリンカー（ＣＬ）を表す。
2020518552.tif 000499
【０４９７】
ステップ７：その後、この材料を４分子当量のアンチセンス単量体とアニーリングさせて所望の二本鎖ホモ四量体を得る（このアニーリングステップは任意であり、省略して例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの一本鎖多量体を調製することができる）。
2020518552.tif 000500
【０４９８】
実施例２２Ｂ：予備合成したホモ二量体及びホモ四量体によるｓｉＲＮＡのホモ六量体の合成
ステップ１：４つのセンス鎖がヌクレアーゼ切断可能オリゴヌクレオチドによって連結されアミノ官能及びジスルフィド部分の末端を有するセンス鎖ホモ四量体を合成する。
2020518552.tif 000501
【０４９９】
ステップ２：この材料をモル過剰のジチオスレイトールで処理してジスルフィド基を切断する。
2020518552.tif 000502
【０５００】
ステップ３：ヘテロ多量体を調製するために用いる手順（上記参照）に従ってこの材料をジチオビスマレイミドエタン（ＤＴＭＥ）でモノ誘導体化する。
2020518552.tif 000503
【０５０１】
ステップ４：この材料をチオール末端ＧａｌＮＡｃホモ二量体と反応させて一本鎖ホモ六量体を得る。
2020518552.tif 000504
【０５０２】
注記：構造７７、７８、８１、８２、８９及び９１では単一の連続構造が記号
2020518552.tif 000505
によって２つの部分に分割されている。
【０５０３】
ステップ５：その後、この材料を６分子当量のアンチセンス単量体とアニーリングさせて所望の二本鎖ホモ六量体を得る（このアニーリングステップは任意であり、省略して例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの一本鎖多量体を調製することができる）。
2020518552.tif 000506
【０５０４】
実施例２２Ｃ：予備合成したホモ四量体によるｓｉＲＮＡのホモ八量体の合成
ステップ１：上で合成したアミノ末端ホモ四量体の一部分を、アシル活性化三分岐ＧａｌＮＡｃリガンドとの反応によって対応するＧａｌＮＡｃ誘導体に変換する。
2020518552.tif 000507
【０５０５】
ステップ２：この材料をモル過剰のジチオスレイトールで処理してジスルフィド基を切断する。
2020518552.tif 000508
【０５０６】
ステップ３：この材料をモノＤＴＭＥ誘導体化四量体と反応させて末端ＧａｌＮＡｃ誘導体化一本鎖八量体を得る。
2020518552.tif 000509
【０５０７】
ステップ４：その後、この材料を８分子当量のアンチセンス単量体とアニーリングさせて所望の二本鎖ホモ八量体を得る（このアニーリングステップは任意であり、省略して例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの一本鎖多量体を調製することができる）。
2020518552.tif 000510
【０５０８】
実施例２２Ｄ：チオール／マレイミド及びアジド／アセチレン（「クリック」）リンカーの組み合わせを使用する、予備合成したホモ四量体によるアンチセンスオリゴヌクレオチドのホモ十二量体の合成
ステップ１：３つのヌクレアーゼ切断可能オリゴヌクレオチドリンカーならびに末端のジスルフィド及びアミノ基を含有するアンチセンスオリゴヌクレオチドのホモ四量体を合成する。
2020518552.tif 000511
【０５０９】
ステップ２：この材料を、アシル活性化三分岐ＧａｌＮＡｃリガンドとの反応によって対応するＧａｌＮＡｃ誘導体に変換する。
2020518552.tif 000512
【０５１０】
ステップ３：この材料をモル過剰のジチオスレイトールで処理してジスルフィド基を切断する。
2020518552.tif 000513
【０５１１】
ステップ４：別個に、３つのヌクレアーゼ切断可能オリゴヌクレオチドリンカーならびに末端のジスルフィド及びアジド基を含有するアンチセンスオリゴヌクレオチドのホモ四量体を合成する。
2020518552.tif 000514
【０５１２】
ステップ５：この材料をモル過剰のジチオスレイトールで処理してジスルフィド基を切断する。
2020518552.tif 000515
【０５１３】
ステップ６：この材料を、ｓｉＲＮＡヘテロ多量体を調製するために用いる手順（上記参照）に従ってジチオビスマレイミドエタン（ＤＴＭＥ）でモノ誘導体化する。
2020518552.tif 000516
【０５１４】
ステップ７：この材料を、チオール末端ＧａｌＮＡｃ誘導体化四量体と反応させて末端ＧａｌＮＡｃ誘導体化一本鎖アンチセンス八量体を生成する。
2020518552.tif 000517
【０５１５】
ステップ８：別個に、第３の、３つのヌクレアーゼ切断可能オリゴヌクレオチドリンカーならびに末端のアセチレン基を含有するアンチセンスオリゴヌクレオチドのホモ四量体を合成する。後者は、誘導体化されていないもの、または立体的に歪んだ誘導体、例えばジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ，Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＶＡ，ＵＳＡ）であり得る。
2020518552.tif 000518
【０５１６】
ステップ９：その後、この材料を、ステップ７で調製したアジド末端八量体と反応させて所望のアンチセンスホモ十二量体を得る。四量体上の末端アセチレンが誘導体化されていない場合、結合をもたらすためには塩化銅１などの金属塩触媒が必要となるであろう。一方、末端アセチレンがＤＢＣＯである場合には結合反応が自発的となるであろう。
2020518552.tif 000519
【０５１７】
この方法論または、代替の結合化学を用いる方法を用いて他の長さ（例えば、９、１０、１１、１３、１４、１５、・・・オリゴヌクレオチド）の多量体を作ることもできる。一本鎖多量体を相補的オリゴヌクレオチドとアニーリングさせることによってそのような多量体を二本鎖にすることができる。
【０５１８】
実施例２３：ホモ六量体ｓｉＲＮＡの合成
ｉ）合成装置で簡単に導入された未修飾ジヌクレオチド結合と、ｉｉ）合成後に導入されたチオール／マレイミド誘導体との２つの直交型の生物学的に切断可能な結合を含有するＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡのホモ六量体を構築した。図２３に示すようにホモ二量体（Ｘ３０８３５）とホモ四量体（Ｘ３０８３７）とを組み合わせることによってＦＶＩＩホモ六量体（ＸＤ−０９７９５）を組み立てた。各末端にアミノ基及びジスルフィド基を有するホモ二量体及びホモ四量体はどちらも標準的技術によって固体担体上で合成された。そして、脱ブロッキング及び精製の後にホモ二量体及びホモ四量体をチオール／マレイミド反応によってともに連結し、アンチセンス鎖Ｘ１８７９５とアニーリングさせてＦＶＩＩホモ六量体（ＸＤ−０９７９５）を得た。
【０５１９】
一本鎖ホモ二量体Ｘ３０８３５、一本鎖ホモ四量体Ｘ３０８３７、結果として得られた一本鎖ホモ六量体Ｘ３０８３８、ならびに二本鎖六量体ＸＤ−０９７９５及び二本鎖単量体ＸＤ−０９７９４の配列を表１５に示す。
【０５２０】
（表１５）実施例２３のオリゴヌクレオチドの配列
2020518552.tif 000520
【０５２１】
実施例２４：ホモ六量体ｓｉＲＮＡの合成における純度及び収率
実施例２３に記載の合成ステップは、図２４Ａ〜２４Ｂ、２４Ｃ〜２４Ｄ、２４Ｅ及び２４ＦにＨＰＬＣトレースデータでそれぞれ示されているように中間体生成物、ホモ二量体（Ｘ３０８３５）、ホモ四量体（Ｘ３０８３７）及びホモ六量体（Ｘ３０８７８）ならびに結果として得られたｄｓＲＮＡホモ六量体（ＸＤ−０９７９５）の高い収率及び純度をもたらした。
【０５２２】
実施例２５：ホモ六量体ｓｉＲＮＡと対応する単量体とのインビボでの循環半減期の比較
マウスにおいて、ＦＶＩＩホモ六量体ＸＤ−０９７９５及び対応するＦＶＩＩ単量体ＸＤ−０９７９４の血中半減期を決定した。手短に述べると、１コホートあたり４匹のおよそ１１週齢のＣ５７／ＢＬ６Ｎ雌マウスの３コホートにホモ六量体または対応する単量体を静脈内（ＩＶ）ボーラス注射によって投与した。投薬量はＦＶＩＩ単量体及びＦＶＩＩ六量体のどちらについても２０ｍｇ／ｋｇとし、ＩＶボーラス注射から５、３０、６０及び１２０分後に血液試料を採った。様々な時点でＦＶＩＩアンチセンスの濃度をアンチセンス鎖に相補的な蛍光ＰＮＡプローブによって決定し、結果を図２５に示す。
【０５２３】
図２５に示すように、投与したＦＶＩＩ単量体のうちおよそ１０％しか５分後の循環流中に残らず、３０分後には本質的に全てが消失した。対照的に、投与したＦＶＩＩ六量体のほぼ全てが５分後の循環流中に残り、３０分後には初期用量の３分の１が残っていた。データは、六量体のインビボでの循環半減期が単量体よりもおよそ３０倍長いことを示している。
【０５２４】
実施例２６：ｔ＝５、３０、６０及び１２０分に採った血液試料におけるＭＳＤ  Ｕ−Ｐｌｅｘプラットフォームを使用したサイトカインのレベルの決定
六量体に対する有害な毒物学的応答がないかを評価するために、ＭＳＤ  Ｕ−Ｐｌｅｘプラットフォームを使用して血液試料におけるサイトカインレベルの分析を実施した。様々な時点で、単量体ＸＤ−０９７９４及びホモ六量体ＸＤ−０９７９５で処置したコホートからの血液試料をサイトカインレベルについて分析した。１０個のサイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＫＣ−ＧＲＯ、ＴＮＦ−α及びＧＭ−ＣＳＦ）の血清レベルを評価し、図２６Ａ〜Ｊに示す。評価した１０個のサイトカインのうち４つのサイトカインの血清レベルは単量体と六量体とで変化がなく、残り６つでは血清レベルは事実上同一であった。
【０５２５】
実施例２７：ホモ多量体の合成
上記方法論によって、以下の配列
2020518552.tif 000521
を使用し、以下のとおりエンドヌクレアーゼで切断可能なリンカーｄＣｄＡ及び還元的に切断可能なリンカーＤＴＭＥを介して連結された、ＦＶＩＩ  ｍＲＮＡを指向するｓｉＲＮＡのホモ多量体を調製した。
【０５２６】
（表１６Ａ）実施例２８〜３６のオリゴヌクレオチド
2020518552.tif 000522
【０５２７】
（表１６Ｂ）ＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡホモ多量体ＸＤ−１０６３５、ＸＤ−１０６３６、ＸＤ−０６３８６、ＸＤ−１０６３５
2020518552.tif 000523
【０５２８】
実施例２８：ＦＶＩＩ単量体ＸＤ−０９７９４の合成
図２７Ａ及び２７Ｂに示すようにセンス鎖の５’末端にアミノ官能を有するＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡの単量体センス鎖Ｘ１８７８９を合成及び精製した。収率４８．３ｍｇ、６．６９４ｍｍｏｌ、１８．６％。対応するアンチセンス鎖Ｘ１８７９５を同様に合成して収率が４６．３ｍｇ、６．３５ｍｍｏｌ、３１．９％となった。その後、５．３５ｍｇ（７４７．３ｎｍｏｌ）のセンス鎖と５．４５ｍｇ（７４７．３ｎｍｏｌ）のアンチセンス鎖とをアニーリングさせて１０．８ｍｇ（７４７．４ｎｍｏｌ）の対応する二本鎖ＦＶＩＩ単量体（ＸＤ−０９７９４）を得た。
【０５２９】
実施例２９：ＦＶＩＩ二量体ＸＤ−１０６３５の合成
図２８Ａ及び２８Ｂに示すように３’−及び５’−末端にそれぞれアミノ基及びジスルフィド基を有し切断可能なｄＣｄＡリンカーを含有するＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡのホモ二量体センス鎖Ｘ３０８３３を合成及び精製した。収率３５．８ｍｇ、６．６９４ｍｍｏｌ、１８．６％。
【０５３０】
その後、５．５１ｍｇ（３６２．６ｎｍｏｌ）のセンス鎖Ｘ３０８３３と５．２９ｍｇ（７２５．２ｎｍｏｌ）のアンチセンス鎖Ｘ１８７９５とをアニーリングさせて１０．８ｍｇ（３６２．６ｎｍｏｌ）の対応する二本鎖ＦＶＩＩホモ二量体（ＸＤ−１０６３５）を得た。
【０５３１】
実施例３０：ＦＶＩＩ三量体ＸＤ−１０６３６の合成
図２９Ａ及び２９Ｂに示すように３’−及び５’−末端にそれぞれアミノ基及びジスルフィド基を有し切断可能な２つのｄＣｄＡリンカーを含有するＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡのホモ三量体センス鎖Ｘ３４００３を合成及び精製した。収率１９．６ｍｇ（８５７．９ｎｍｏｌ、１９．３％）。
【０５３２】
その後、５．１６ｍｇ（２２５．５ｎｍｏｌ）のセンス鎖Ｘ３４００３と４．９３ｍｇ（６７６．５ｎｍｏｌ）のアンチセンス鎖Ｘ１８７９５とをアニーリングさせて１０．１ｍｇ（２２５．５ｎｍｏｌ）の対応する二本鎖ＦＶＩＩホモ三量体（ＸＤ−１０６３６）を得た。
【０５３３】
実施例３１：ＦＶＩＩ四量体ＸＤ−１０６３７の合成
図３０Ａ及び３０Ｂに示すように３’−及び５’−末端にそれぞれアミノ基及びジスルフィド基を有し切断可能な３つのｄＣｄＡリンカーを含有するＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡのホモ四量体センス鎖Ｘ３０８３６を合成及び精製した。収率５３．１ｍｇ（１７３４．５ｎｍｏｌ、１３％）。
【０５３４】
その後、５．５３ｍｇ（１８０．８ｎｍｏｌ）のセンス鎖Ｘ３０８３６と５．２７ｍｇ（７２３．２ｎｍｏｌ）のアンチセンス鎖Ｘ１８７９５とをアニーリングさせて１０．８ｍｇ（１８０．８ｎｍｏｌ）の対応する二本鎖ＦＶＩＩホモ四量体（ＸＤ−１０６３７）を得た。
【０５３５】
実施例３２：ＦＶＩＩ五量体ＸＤ−１０６３８の合成
図３１Ａ及び３１Ｂに示すように３’−及び５’−末端にそれぞれアミノ基及びジスルフィド基を有し切断可能な４つのｄＣｄＡリンカーを含有するＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡのホモ五量体センス鎖Ｘ３４００４を合成及び精製した。収率３５．９ｍｇ（９３８ｎｍｏｌ、１０．６％）。
【０５３６】
その後、５．５３ｍｇ（１４４．５ｎｍｏｌ）のセンス鎖Ｘ３４００４と５．２７ｍｇ（７２３．２ｎｍｏｌ）のアンチセンス鎖Ｘ１８７９５とをアニーリングさせて１０．８ｍｇ（１４４．５ｎｍｏｌ）の対応する二本鎖ＦＶＩＩホモ五量体（ＸＤ−１０６３８）を得た。
【０５３７】
実施例３３：ＦＶＩＩ六量体ＸＤ−１０６３９の合成
図３２Ａ及び３２Ｂに示すように３’−及び５’−末端にそれぞれアミノ基及びジスルフィド基を有し切断可能な５つのｄＣｄＡリンカーを含有するＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡのホモ六量体センス鎖Ｘ３４００５を合成及び精製した。収率２１．４ｍｇ（４６６．１ｎｍｏｌ、５．３％）。
【０５３８】
その後、５．１５ｍｇ（１４４．５ｎｍｏｌ）のセンス鎖Ｘ３４００５と４．８９ｍｇ（７２３．２ｎｍｏｌ）のアンチセンス鎖Ｘ１８７９５とをアニーリングさせて１０．０４ｍｇ（１１１．９ｎｍｏｌ）の対応する二本鎖ＦＶＩＩホモ六量体（ＸＤ−１０６３９）を得た。
【０５３９】
実施例３４：ＦＶＩＩ六量体ＸＤ−０９７９５の合成
図３３Ａ〜図３３Ｂに示すように両方の３’末端にアミノ基を有し切断可能な４つのｄＣｄＡリンカーと還元的に切断可能な１つのＤＴＭＥリンカーとを含有するＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡのホモ六量体センス鎖Ｘ３０８３８を、実施例２８及び実施例３０で調製したＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡのホモ二量体センス鎖Ｘ３０８３３及びＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡのホモ四量体センス鎖Ｘ３０８３６によって合成及び精製した。ＤＴＴを使用してＸ３０８３３及びＸ３０８３６からジスルフィド基を切断してそれぞれ対応する５−チオール誘導体Ｘ３０８３４及びＸ３０８３７を９７．６％及び９１．９％の収率で得た。その後、上に記載した手順を用いて１４．９ｍｇ（９８６．７ｎｍｏｌ）のＸ３０８３４を１０．６ｍｇ（７００．５ｎｍｏｌ、７１．０％）の対応するモノＤＴＭＥ誘導体Ｘ３０８３５に変換し、これを１当量のＸ３０８３７と反応させて４．２ｍｇ（９０．７ｎｍｏｌ、６４％）の一本鎖ホモ六量体Ｘ３０８３８を得た。その後、３．８ｍｇ（８３ｎｍｏｌ）のセンス鎖Ｘ３０８３８と３．７ｍｇ（５０２ｎｍｏｌ、６モル当量）のアンチセンス鎖Ｘ１８７９５とをアニーリングさせて７．５ｍｇ（８３．７ｎｍｏｌ）の対応する二本鎖ＦＶＩＩホモ六量体（ＸＤ−０９７９５）を得た。
【０５４０】
実施例３５：ＦＶＩＩ七量体ＸＤ−１０６４０の合成
図３４Ａ〜図３４Ｂに示すように両方の３’末端にアミノ基を有し切断可能な５つのｄＣｄＡリンカーを含有するＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡのホモ七量体センス鎖Ｘ３４００９を、ＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡのホモ二量体センス鎖Ｘ３０８３３及びＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡのホモ五量体センス鎖Ｘ３４００４によって合成及び精製した。ＤＴＴを使用してＸ３０８３３及びＸ３４００４からジスルフィド基を切断してそれぞれ対応する５−チオール誘導体Ｘ３０８３４（２８．３ｍｇ、１８７７．９ｎｍｏｌ、８６．７％）及びＸ３４００６（２１．８ｍｇ、５７２．２ｎｍｏｌ）を得た。その後、上に記載した手順を用いてＸ３０８３４を対応するモノＤＴＭＥ誘導体Ｘ３０８３５（２２．６ｍｇ、１４６５．２ｎｍｏｌ、７８．１％）に変換した。８．８ｍｇ（５７２．２ｎｍｏｌ）のＸ３０８３５をＸ３４００６（２１．８ｍｇ、５７２．２ｎｍｏｌ）と反応させて一本鎖ホモ七量体Ｘ３４００９（８．９６ｍｇ、１６７．３ｎｍｏｌ、２９．２％）を得た。その後、５．５３ｍｇ（１０３．３ｎｍｏｌ）のセンス鎖Ｘ３４００９と５．２７ｍｇ（７２３．１ｎｍｏｌ）のアンチセンス鎖Ｘ１８７９５とをアニーリングさせて１０．８ｍｇ（１０３．３ｎｍｏｌ）の対応する二本鎖ＦＶＩＩホモ七量体（ＸＤ−１０６４０）を得た。
【０５４１】
実施例３６：ＦＶＩＩ八量体ＸＤ−１０６４１の合成
図３５Ａ〜図３５Ｂに示すように両方の３’末端にアミノ基を有し切断可能な６つのｄＣｄＡリンカーを含有するＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡのホモ八量体センス鎖Ｘ３４０１０を、ＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡのホモ二量体センス鎖Ｘ３０８３３及びＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡのホモ六量体センス鎖Ｘ３４００５によって合成及び精製した。ＤＴＴを使用してＸ３４００５からジスルフィド基を切断して対応する５−チオール誘導体Ｘ３４００７（１１．５ｍｇ、２５１ｎｍｏｌ、９９．７％）を得、これを、先に得られたモノＤＴＭＥホモ二量体誘導体Ｘ３０８３５（３．８５ｍｇ、２５０．２ｎｍｏｌ）と反応させて一本鎖ホモ八量体Ｘ３４０１０（５．２ｍｇ、８５．０ｎｍｏｌ、３４．０％）を得た。その後、４．９２ｍｇ（８０．３３ｎｍｏｌ）のセンス鎖Ｘ３４０１０と４．６８ｍｇ（６４２．４ｎｍｏｌ）のアンチセンス鎖Ｘ１８７９５とをアニーリングさせて９．６ｍｇ（８０．３ｎｍｏｌ）の対応する二本鎖ＦＶＩＩホモ八量体（ＸＤ−１０６４１）を得た。
【０５４２】
実施例３７：動物実験
１コホートあたり４匹のおよそ１１週齢のＣ５７／ＢＬ６Ｎ雌マウスの３コホートに尾静脈を介してｘ１  ＰＢＳ中１ｎｇ／ｍｌの濃度の試験材料をボーラス静注することによってホモ多量体ＸＤ−１０６３５、ＸＤ−１０６３６、ＸＤ−１０６３７、ＸＤ−１０６３８、ＸＤ−１０６３９、ＸＤ−１０６４０及びＸＤ−１０６４１ならびに対応する単量体ＸＤ−０９７９４の血中半減期を決定した。投薬量はＦＶＩＩ単量体及びＦＶＩＩ多量体のどちらについても２０ｍｇ／ｋｇとし、５、３０、６０及び１２０及び３６０分目に血液試料を採った。血清試料をプロテイナーゼＫで消化し、特異的な相補的Ａｔｔｏ４２５−ペプチド核酸蛍光プローブをアンチセンス鎖にハイブリダイズさせた。その後のＡＥＸ−ＨＰＬＣ分析は、完全なアンチセンス鎖と代謝産物とを区別することを可能にし、本方法の高い特異性につながった。完全な親化合物の値のみを以下の表１７に示し、ＦＶＩＩ多量体について図３６Ａ及び図３６Ｂにそれぞれ経時的な血清中ＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡレベルの平滑線散布図及び直線描写散布図として示す。
【０５４３】
（表１７）ＦＶＩＩホモ多量体についての経時的な血清中ＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡレベル
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【０５４４】
図３７Ａ、３７Ｂ、３７Ｃ及び３７Ｄは、ＦＶＩＩ多量体についてのそれぞれ５分、３０分、６０分及び１２０分目の血清中ＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡレベルの棒グラフを示す。
【０５４５】
図３８Ａ及び３８Ｂは、ＦＶＩＩ多量体についてｎｇ×分／ｍＬで曲線下面積として表し単量体ＡＵＣ値に対して正規化した血清中総ＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡレベルを示す。
【０５４６】
（表１８）ＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡ単量体及び多量体についての曲線下面積値
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【０５４７】
多量体の血中半減期をＦＶＩＩ濃度データから下記等式による非線形１フェーズ減衰を用いて算出した：
Ｙ＝（Ｙ０−平坦部）×ｅｘｐ（−ｋ×ｘ）＋平坦部
ここで、Ｙは時間Ｘでの濃度であり、半減期は２／ｋの自然対数である。初期濃度及び終濃度に関して以下のとおり４つの異なる仮定を適用した：
１：データに関して何ら仮定をしなかった。
２：全てのｓｉＲＮＡを同じ初期濃度で注射した（つまり、全てについてｔ＝０での濃度を同じとする）。
３：全てのｓｉＲＮＡ濃度が皆、ｔ＝無限大で０に減衰する。
４：全てのｓｉＲＮＡを同じ初期濃度で注射し（つまり、全てについてｔ＝０での濃度を同じとし）、全てのｓｉＲＮＡ濃度が皆、ｔ＝無限大で０に減衰する。
【０５４８】
（表１９）算出されたＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡホモ多量体の血中半減期
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【０５４９】
実施例３８：ＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡホモ多量体が５分目の単量体と同じＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡ濃度に達するのに掛かる時間の算出
単量体のＦＶＩＩ濃度は第１試料時間（５分）で既に注射時濃度の５０％を優に下回ったので、多量体の血清ＦＶＩＩレベルが５分目の単量体のそれと等しくなるのに掛かる時間も下記等式を使用して算出し、図３９に示す：
Ｙ＝（Ｙ０−平坦部）×ｅｘｐ（−ｋ×ｘ）＋平坦部
ここで、平坦部は５分目の単量体の濃度（３４，２４５ｎｇ／ｍｌ）と定めた。
【０５５０】
ＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡホモ多量体がＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡ単量体の５分目の濃度に達する分表示での時間を決定するために、以下の計算を実施した：
Ｙ＝（Ｙ０−平坦部）×ｅｘｐ（−ｋ×ｘ）＋平坦部
ここで、ｘは分表示での時間である
３４２４５＝（２３１１７３−０）×ｅ＾（−ｋｘ）＋０
ここで、ｘは時間（分）である
３４２４５＝２３１１７３×＾ｅ（−ｋｘ）
０．１４８１３４５３＝ｅ＾−ｋｘ
Ｉｎ（０．１４８１３４５３）＝ｋｘ
−１．９０９６２５７７９＝ｋｘ
【０５５１】
（表２０）ＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡホモ多量体がＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡ単量体の５分目の濃度に達する算出された時間
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2020518552.tif 000583
【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２】
2020518552.tif 000600
【図２３】
2020518552.tif 000601
【図２４Ａ】
2020518552.tif 000602
【図２４Ｂ】
2020518552.tif 000603
【図２４Ｃ】
2020518552.tif 000604
【図２４Ｄ】
2020518552.tif 000605
【図２４Ｅ】
2020518552.tif 000606
【図２４Ｆ】
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【図２５】
2020518552.tif 000608
【図２６Ａ】
2020518552.tif 000609
【図２６Ｂ】
2020518552.tif 000610
【図２６Ｃ】
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【図２６Ｄ】
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【図２６Ｅ】
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【図２６Ｆ】
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【図２６Ｇ】
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【図２６Ｈ】
2020518552.tif 000616
【図２６Ｉ】
2020518552.tif 000617
【図２６Ｊ】
2020518552.tif 000618
【図２７】
2020518552.tif 000619
【図２８】
2020518552.tif 000620
【図２９】
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【図３０】
2020518552.tif 000622
【図３１】
2020518552.tif 000623
【図３２】
2020518552.tif 000624
【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
2020518552.tif 000626
【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３５Ａ】
2020518552.tif 000629
【図３５Ｂ】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
2020518552.tif 000634
【図３７Ｃ】
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【図３７Ｄ】
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【図３８】
2020518552.tif 000637
【図３９】
2020518552.tif 000638
【図４０】
2020518552.tif 000639
【図４１−１】
2020518552.tif 000640
【図４１−２】
2020518552.tif 000641
【配列表】
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【国際調査報告】
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