(57)【要約】  本発明は、カルベトシンの結晶形態、その製造方法、およびその医薬組成物に関する。
2020530456.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
結晶形態のカルベトシン。
【請求項２】
溶媒和結晶形態のカルベトシン。
【請求項３】
脱溶媒和結晶形態のカルベトシン。
【請求項４】
約４．８３、７．４３、９．２０、１７．８７、１９．６０、２０．４３および２１．３４度の２θ（Ｃｕ−Ｋ）におけるＸ線粉末回折ピークによって特徴づけられる、請求項１または請求項２に記載のカルベトシン。
【請求項５】
図１に例示されているＸ線粉末回折パターンによって実質的に特徴づけられる、請求項１、２または４のいずれか一項に記載のカルベトシン。
【請求項６】
約４．１１、４．３９、５．６０、７．４５、１７．７５、１９．１６および１９．４５度の２θ（Ｃｕ−Ｋ）におけるＸ線粉末回折ピークによって特徴づけられる、請求項１または請求項３に記載のカルベトシン。
【請求項７】
図２に例示されているＸ線粉末回折パターンによって実質的に特徴づけられる、請求項１、３および６のいずれか一項に記載のカルベトシン。
【請求項８】
約４．３４、６．４３、８．６６、１７．３７、１９．０３、および１９．３９度の２θ（Ｃｕ−Ｋα１）におけるＸ線粉末回折ピークによって特徴づけられる、請求項１、２または３のいずれか一項に記載のカルベトシン。
【請求項９】
結晶形態のカルベトシンを製造する方法であって、カルベトシンを結晶化させるステップを含む、方法。
【請求項１０】
結晶形態のカルベトシンが、カルベトシンおよび１種または複数の液体を含む混合物から結晶化され、１種または複数の液体が、任意選択で、エチレングリコール、アセトニトリル、エタノール、メタノール、プロパノール、イソプロパノール、１，２−プロパンジオールおよびジメチルホルムアミドからなる群の１種または複数、例えばエチレングリコールとアセトニトリルの混合物、例えばエタノール、エチレングリコールおよびアセトニトリルの混合物を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
結晶形態のカルベトシンが、カルベトシンおよび１種または複数の液体を含む混合物から結晶化され、１種または複数の液体が、水および水性酢酸緩衝液の一方または両方を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
結晶形態のカルベトシンが、カルベトシンおよび１種もしくは複数の液体を含む混合物を、例えば４０℃〜５℃に冷却することによって、またはカルベトシンおよび１種もしくは複数の液体を含む混合物の温度を、例えば４０℃から５℃に、および５℃から４０℃にサイクルさせることによって得られる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
１種または複数の液体が、エチレングリコールおよびアセトニトリルを１：９９〜５０：５０の比、例えば２：９８〜４０：６０の比、例えば３：９７〜３５：６５の比、例えば５：９５〜３５：６５の比、例えば８：９２〜３０：７０の比、例えば１０：９０〜３０：７０の比、例えば１５：８５〜２５：７５の比、例えば１７．５：８２．５〜２２．５：７７．５の比、例えば約２０：８０の比で含む、請求項１０または請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
貧溶媒をカルベトシンおよび１種または複数の液体を含む混合物に加えるさらなるステップを含み、貧溶媒がアセトニトリルであってもよい、請求項１０、１２または１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
結晶形態のカルベトシンが、カルベトシンおよび１種または複数の液体を含む混合物を、カルベトシンを結晶化させるために、３〜１００日、例えば３〜６０日、例えば７〜１２日間、少なくとも１５℃、例えば２０℃、例えば３０℃、例えば４０℃の温度に維持することによって得られる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
１種または複数の液体が、エチレングリコールとアセトニトリルの混合物を含み、貧溶媒がアセトニトリルを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
１種または複数の液体が、エチレングリコールおよびアセトニトリルを１５：８５〜２５：７５の比、例えば１７．５：８２．５〜２２．５：７７．５の比、例えば約２０：８０の比で含み、ここでアセトニトリル貧溶媒を加えると、エチレングリコール対アセトニトリルの比が、１：９９〜３０：７０の比、例えば２：９８〜２５：７５の比、例えば３：９７〜２０：８０の比、例えば５：９５〜２０：８０の比、例えば５：９５〜１５：８５の比、例えば７．５：９２．５〜１２．５：８７．５の比、例えば約１０：９０の比に変わる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
カルベトシンおよび１種または複数の液体を含む混合物に結晶、例えばカルベトシン結晶をシード添加するさらなるステップを含む、請求項９から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
結晶形態のカルベトシンを脱溶媒するさらなるステップを含み、カルベトシンを乾燥させてもよい、請求項９から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
結晶形態のカルベトシンの脱溶媒が、結晶形態のカルベトシンを貧溶媒、例えばアセトニトリル中で洗浄することによって実施され、当該脱溶媒が、２０℃以下、例えば−３０℃〜２０℃、例えば−２０℃〜２０℃、例えば−１０℃〜２０℃、例えば−５℃〜１５℃、例えば０℃〜１０℃、例えば約５℃の温度で実施されてもよい、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１から８のいずれかに記載のカルベトシンまたは請求項９から２０のいずれかに記載の方法に従って作製されたカルベトシンを含む医薬組成物。
【請求項２２】
医薬品として使用するための、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
神経障害または生殖障害の治療に使用するため、例えばプラーダー−ヴィリ症候群の治療に使用するため；あるいは例えば乳児の経腟分娩、帝王切開による乳児の分娩後の例えば子宮弛緩症の治療または予防に使用するため；あるいは分娩後出血（ＰＰＨ）を発症する危険性がある患者の子宮弛緩症の治療または予防に使用するため；および／または経腟分娩後の過度の出血の治療または予防に使用するための、請求項２２に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルベトシンの結晶形態、その製造方法、およびその医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
カルベトシン［（別名１−デスアミノ−１−モノカルバ−２−（Ｏ−メチル）−チロシン）オキシトシンまたは１−ブタン酸−２−（Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン）−１−カルバオキシトシン］は、アゴニスト作用をもつオキシトシンの長時間作用型合成オリゴペプチド類似体である。カルベトシンは、オキシトシンに関連する以下の置き換えを組み込んでいる：ａ）水素原子によるシステインのアミノ基（位置１）の置き換え；ｂ）チオエーテル結合によるそのジスルフィド結合の置き換え；およびｃ）メチルオキシル基によるチロシンのヒドロキシル基（位置２）の置き換え。カルベトシン（ＰＡＢＡＬ（商標）、ＤＵＲＡＴＯＣＩＮ（商標））は、現在、硬膜外または脊髄麻酔下で帝王切開によって乳児を出産した後の子宮弛緩症の予防として承認されている。この医療適用に使用される投与量は比較的少なく、例として１００マイクログラム程度が１回に投与される。
【０００３】
最近、オキシトシン受容体アゴニスト、特にカルベトシンの必要性が増加している。例えば、オキシトシン受容体は、最近、プラーダー−ヴィリ症候群の治療に示されている（ＷＯ２０１６／０４４１３１参照）。プラーダー−ヴィリ症候群は、過食症、食糧探索行動、急速な体重増加、強迫行動および幼児における攻撃性を特徴とする遺伝的障害である。ＷＯ２０１６／０４４１３１に記載されているように、カルベトシンで治療した患者は、過食症、強迫性障害、食糧探索行動および臨床全般印象度の測定において、１５日後にプラセボ治療患者よりも統計的に有意な改善を示す。使用される投与量は子宮弛緩症の治療に使用される投与量よりも著しく高く、例として、１日当たり数十ミリグラム程度であり、治療はより長期的であるので、この徴候のためには比較的大量のペプチドを製造する必要がある。そのような徴候のために、高純度の比較的大量のカルベトシンを製造することが望ましいはずである。
【０００４】
ペプチドの合成は、当技術分野でよく知られている固相合成手順を用いて実施することができる。溶液相合成は代替方法であり、少量のペプチドに有用なことがある。ペプチド生成のこのステップは、「上流プロセス」として知られており、粗製ペプチド生成物の形成をもたらす。
【０００５】
粗製ペプチドの合成の後、通常目的のペプチドを、種々のペプチドおよび非ペプチド不純物から分離する必要がある。このステップは、精製ステップとして知られている。
【０００６】
ペプチドを精製する多くの方法は、当業者に既知である。しかしながら、ペプチド精製方法には通常、少なくとも１つのクロマトグラフィーステップ、例えばサイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、フリーフロー電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などが含まれる。最も一般的に使用されるＨＰＬＣの形式は、「逆相」ＨＰＬＣ（別名ＲＰ−ＨＰＬＣ）であり、ペプチドは、それらの疎水性に応じて、アセトニトリルなどの増大した量の有機溶媒で溶出する。
【０００７】
精製ステップの後、ペプチドは通常、揮発性溶媒から分離しなければならない。このステップは、単離ステップとして知られている。ペプチドを溶媒から分離する既知の方法には、限外ろ過および凍結乾燥が含まれる。
【０００８】
凍結乾燥（別名フリーズドライ（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ））は、通常、溶液を保持する容器を液体窒素に浸漬することによる、ペプチド含有溶液の急速凍結のステップを含む。その後容器を、冷却コイルを含む真空チャンバー内に置く。揮発性溶媒は、真空中で昇華する。昇華プロセスは、精製された試料を確実に冷たいまま保つことを保証する。
凍結乾燥は、溶液からペプチドを単離するために当技術分野で最も一般的に使用されている技術である。これは主に、この技術がよく知られており、再現性があり、実施しやすいからである。さらに、ペプチドの安定性は、通常低温で増大する。
【０００９】
カルベトシンおよび関連するペプチドの精製および単離の方法は、当技術分野で既知である：
【００１０】
ＣＮ１０４５９２３６２は、カルベトシンの液体クロマトグラフィー精製とそれに続く凍結乾燥のステップについて記載している。ほとんどの場合、液体クロマトグラフィーステップは、ＨＰＬＣである。
【００１１】
ＷＯ２０１５１８５５８４は、カルベトシン以外のオキシトシンアゴニストの精製および凍結乾燥について記載している。
【００１２】
ＣＮ１０２９７７１９２は、液体クロマトグラフィーとイオン交換クロマトグラフィーを合わせることによってカルベトシンを精製するプロセスについて記載している。精製後、生成物は、脱塩および凍結乾燥のステップを経る。
【００１３】
ＣＮ１０４７４４５６７は、イオン交換クロマトグラフィーによるカルベトシンの精製とそれに続く凍結乾燥のプロセスについて記載している。
【００１４】
ＣＮ１０１５３１７０５は、逆相ＨＰＬＣを使用してカルベトシンを精製し、続いてイオン交換法を使用して生成物を酢酸塩に変換するプロセスについて記載している。塩に変換された後、生成物は続いて凍結乾燥される。
【００１５】
ＷＯ２００９／１２２２８５は、ＨＰＬＣステップとそれに続く凍結乾燥のステップを含むオキシトシン類似体を精製する方法について開示している。Ｒｕｄｋｏ  Ａ  Ｄら「Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ  Ｓａｌｔｓ  ｏｆ  Ｏｘｙｔｏｃｉｎ：Ｘ−ｒａｙ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ  ｄａｔａ」Ｊ．  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ、ｖｏｌ．１０、ｎｏ．３、１９７１年、２６０〜２６２頁は、結晶化したオキシトシン塩の特徴づけについて記載している。Ｂｒｙｎ  Ｓら「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｏｌｉｄｓ：Ａ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｃ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ」Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ｖｏｌ．１２、ｎｏ．７、１９９５年、９４５〜９５４頁は、医薬用固体の特性について記載している。
【００１６】
上記の参考文献から、カルベトシンおよび他のオキシトシン受容体アゴニストの合成における単離ステップとして凍結乾燥を使用することに対して当技術分野では強い偏見があることがわかる。
【００１７】
しかしながら、凍結乾燥に関連していくつかの問題があり、例えば、ペプチドの処理に多大な時間を費やす必要があり、冷媒および機器の費用は非常に高い。
【００１８】
これらの問題は、少量のペプチドを生産する場合に許容され得る。しかしながら、ペプチドを大量生産する場合、凍結乾燥が製造プロセスの「ボトルネック」になる。さらに、凍結乾燥に費やされる全製造コストの割合は、生産されるペプチドの質量とともに増加する。
【００１９】
したがって、当技術分野では、プラーダー−ヴィリ症候群の治療などの徴候の必要性を満たすために十分な純度の大量のカルベトシンを生成できるように、凍結乾燥の「ボトルネック」を除去するためのカルベトシンを単離する改善された方法が必要とされる。
【発明の概要】
【００２０】
一態様では、本発明は、結晶形態のカルベトシンに関する。
【００２１】
他の態様では、本発明は、カルベトシンを結晶化させるステップを含む、結晶形態のカルベトシンを製造する方法に関する。
【００２２】
他の態様では、本発明は、本発明に基づくカルベトシンを含む医薬組成物、または本発明に従って作製されたカルベトシンに関する。
【００２３】
本発明に関連する図面を以下に説明する：
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】溶媒和結晶形態ＩのカルベトシンのＸ線回折図（Ｃｕ）を示す。
【図２】脱溶媒和結晶形態ＩＩのカルベトシンのＸ線回折図（Ｃｕ）を示す。
【図３ａ】実施例１から単離した固体（図３ａ）；および実施例４（図３ｂ）から単離した固体のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図３ｂ】実施例１から単離した固体（図３ａ）；および実施例４（図３ｂ）から単離した固体のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図４ａ】実施例１（図４ａ）からの溶媒和結晶形態Ｉのカルベトシンおよび実施例４（図４ｂ）からの脱溶媒和結晶形態ＩＩのカルベトシンに関連するＴＧ／ＤＴＡデータを示す。
【図４ｂ】実施例１（図４ａ）からの溶媒和結晶形態Ｉのカルベトシンおよび実施例４（図４ｂ）からの脱溶媒和結晶形態ＩＩのカルベトシンに関連するＴＧ／ＤＴＡデータを示す。
【図５】実施例５で得られた結晶カルベトシンのＸ線回折図（Ｃｕ−Ｋα１）を示す。
【図６】実施例５から単離した固体のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図７】実施例５から単離した結晶カルベトシンに関連する示差走査熱分析（ＤＳＣ）データを示す。
【図８ａ】実施例５から単離した結晶カルベトシンからの重量水収着（ＧＶＳ）データ：質量変化のプロット（図８ａ）および等温プロット（図８ｂ）を示す。
【図８ｂ】実施例５から単離した結晶カルベトシンからの重量水収着（ＧＶＳ）データ：質量変化のプロット（図８ａ）および等温プロット（図８ｂ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
カルベトシンは、結晶を形成することをこれまで知られていない。本出願人は、驚くべきことに、本明細書に記載の通り、カルベトシンの３つの結晶形態を形成することが可能であることを見出したが、そのうちの２つは、形態Ｉおよび形態ＩＩと表され得る。形態Ｉは、溶媒和（例えば水和）しているが、形態ＩＩは、脱溶媒和している。形態ＩＩは、安定性が高く（図４Ｂ参照）、エチレングリコール含有量が許容できるほど低く（実施例３参照）、例えば、医薬品として使用することができる。エチレングリコール含有量が許容できるほど低いことは、ガスクロマトグラフィーで決定されたように、ＩＣＨ限界である６２０ｐｐｍ未満のエチレングリコール含有量を表す。形態Ｉは、形態ＩＩの生成における合成中間体として使用することができる。第３の結晶形態も本明細書に記載されている（実施例５参照）。
【００２６】
本発明によれば、第１の態様から、結晶形態のカルベトシンが提供されている。第２の態様から、溶媒和（例えば水和）した結晶形態のカルベトシンが提供されている。第３の態様から、脱溶媒和した結晶形態のカルベトシンが提供されている。
【００２７】
溶媒和とは、結晶構造が秩序化されたまたは無秩序な溶媒分子を含むことを意味する。無秩序とは、溶媒分子の位置またはその中の原子の位置が結晶構造内で変わり得ることを意味する。溶媒分子は、室温および大気圧で液体またはガス状であってよい。溶媒分子は、１種類のみの分子からなっていてもよい。あるいは、溶媒分子は、２種以上の異なる種類の分子（そのうちの１種は水でもよい）からなっていてもよい。カルベトシン１分子当たり少なくとも０．１以上の溶媒分子、例えばカルベトシン１分子当たり少なくとも０．２溶媒分子、例えばカルベトシン１分子当たり少なくとも０．５溶媒分子、例えばカルベトシン１分子当たり少なくとも１溶媒分子、例えばカルベトシン１分子当たり少なくとも２溶媒分子、例えばカルベトシン１分子当たり少なくとも５溶媒分子があってもよい。したがって、溶媒和結晶形態のカルベトシンは、モノ−、ジ−、トリ−、テトラ−、ペンタ−、またはヘキサ−水和物の溶媒和結晶形態の形態であってもよい。好ましくは、カルベトシンが溶媒和結晶形態の場合、溶媒和結晶形態は、一水和物または五水和物である。したがって、一態様では、カルベトシンは、一水和物または五水和物結晶形態である。このようなカルベトシンは、秩序化されたまたは無秩序な溶媒分子を含んでいてもよい。溶媒分子の数は、秩序化しているまたは無秩序であるかどうかに影響しないと考えられている。
【００２８】
脱溶媒和とは、結晶構造が、秩序化されたまたは無秩序な溶媒分子をほとんどまたは全く含まないことを意味する。カルベトシン１分子当たり２溶媒分子以下、例えばカルベトシン１分子当たり１溶媒分子以下、例えばカルベトシン１分子当たり０．５溶媒分子以下、例えばカルベトシン１分子当たり０．２溶媒分子以下、例えばカルベトシン１分子当たり０．１溶媒分子以下、例えばカルベトシン１分子当たり０．０５溶媒分子以下、例えばカルベトシン１分子当たり０．０２溶媒分子以下、例えばカルベトシン１分子当たり０．０１溶媒分子以下であってもよい。
【００２９】
結晶形態を決定するために、Ｘ線粉末回折（ＸＲＰＤ）分析を実施することができる。本発明では、実施例１にさらに詳しく述べているように、ＸＲＰＤ分析を、ＰＡＮａｌｙｔｉｃａｌ  Ｘ’ｐｅｒｔ  ｐｒｏでＣｕＫ放射線（α１λ＝１．５４０６０Å；α２＝１．５４４４３Å；β＝１．３９２２５Å；α１：α２比＝０．５）を使用して実施した。結晶形態のカルベトシンおよび／または溶媒和結晶形態のカルベトシンは、約４．８３、７．４３、９．２０、１７．８７、１９．６０、２０．４３および２１．３４度の２θ（Ｃｕ）におけるＸ線粉末回折ピークによって特徴づけることができ、かつ／または図１に例示されているＸ線粉末回折（Ｃｕ）パターンによって実質的に特徴づけることができ、かつ／または、表１に示される（Ｃｕ）Ｘ線粉末回折ピークの５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、または実質的に全てを有することによって特徴づけることができる。したがって、一態様では、結晶形態のカルベトシンは、ＣｕＫ放射線（α１λ＝１．５４０６０Å；α２＝１．５４４４３Å；β＝１．３９２２５Å；α１：α２比＝０．５）を使用して実施した、約４．８３、７．４３、９．２０、１７．８７、１９．６０、２０．４３、および２１．３４度の２θにおけるＸ線粉末回折ピークによって特徴づけられる。
【００３０】
結晶形態のカルベトシンおよび／または溶媒和結晶形態のカルベトシンは、約４．１１、４．３９、５．６０、７．４５、１７．７５、１９．１６および１９．４５度の２θ（Ｃｕ）におけるＸ線粉末回折ピークによって特徴づけることができ、かつ／または図２に例示されているＸ線粉末回折（Ｃｕ）パターンによって実質的に特徴づけることができ、かつ／または表２に示される（Ｃｕ）Ｘ線粉末回折ピークの５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、または実質的に全てを有することによって特徴づけることができる。したがって、一態様では、結晶形態のカルベトシンは、ＣｕＫ放射線（α１λ＝１．５４０６０Å；α２＝１．５４４４３Å；β＝１．３９２２５Å；α１：α２比＝０．５）を使用して実施した、約４．１１、４．３９、５．６０、７．４５、１７．７５、１９．１６および１９．４５４度２θにおけるＸ線粉末回折ピークによって特徴づけられる。
【００３１】
結晶形態のカルベトシンは、約４．３４、６．４３、８．６６、１７．３７、１９．０３、および１９．３９度の２θ（Ｃｕ−Ｋα１）におけるＸ線粉末回折ピークによって特徴づけることができ、かつ／または図５に例示されているＸ線粉末回折（Ｃｕ−Ｋα１）パターンによって実質的に特徴づけることができ、かつ／または表２に示される（Ｃｕ）Ｘ線粉末回折ピークの５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、または実質的に全てを有することによって特徴づけることができる。したがって、一態様では、結晶形態のカルベトシンは、Ｃｕ  Ｋα１放射線（α１λ＝１．５４０６０Å）を使用して実施した、約４．３４、６．４３、８．６６、１７．３７、１９．０３、および１９．３９度の２θにおけるＸ線粉末回折ピークによって特徴づけられる。
【００３２】
【表１】
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【００３３】
【表２】
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【００３４】
【表３】
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【００３５】
表３は、実施例５から得られたデータを示す。表３に報告されている値の放射線源は、Ｃｕ−Ｋα１源であるが、表１および２に報告されている値の放射線源は、Ｃｕ−Ｋ源であることに留意されたい。上記ＸＰＲＤピーク表、表３（図５、実施例５）は、それにもかかわらず、実施例１および２（図１、表１）ならびに実施例３および４（図２、表２）と比較した場合、異なる結晶形態または多形のカルベトシンを示す。
【００３６】
他の態様における本発明によれば、結晶形態のカルベトシンを製造する方法を提供しており、この方法は、カルベトシンを結晶化させるステップを含む。
【００３７】
結晶化とは、溶媒に溶解させたカルベトシンからカルベトシンの結晶形態を形成するプロセスを意味する。結晶形態とは、規則正しく繰り返される原子の内部配列と外部平面をもつ固体材料を意味する。結晶形態は、Ｘ線粉末回折分析に基づいて非晶形から区別することができる。結晶形態は、本明細書に記載の通りＸ線粉末回折ピークによって特徴づけられる。非晶質固体形態では、ＸＰＲＤパターンは、外観が本質的に連続しており、すなわち明確なピークがない。
【００３８】
結晶形態のカルベトシンは、カルベトシンおよび１種または複数の液体を含む混合物から結晶化させることができ、１種または複数の液体は、水、水性酢酸緩衝液、エチレングリコール、アセトニトリル、エタノール、メタノール、プロパノール、イソプロパノール、１，２−プロパンジオールおよびジメチルホルムアミドからなる群からの１種または複数の液体、例えばエチレングリコールとアセトニトリルの混合物、例えばエタノール、エチレングリコールおよびアセトニトリルの混合物、例えばプロパノール、エチレングリコールおよびアセトンの混合物、例えばイソプロパノール、エチレングリコールおよびアセトンの混合物、例えばジメチルホルムアミド、エチレングリコールおよびアセトニトリルの混合物、例えばジメチルホルムアミドとアセトニトリルの混合物、例えばジメチルホルムアミドおよびアセトンの混合物、例えばエタノールとアセトニトリルの混合物、例えばメタノールとアセトニトリルの混合物、例えば１，２−プロパンジオールとアセトニトリルの混合物、例えば１，２−プロパンジオールとアセトンの混合物を含んでいてもよい。１種または複数の液体が２種以上の液体を含む場合、２種以上の液体のうちの１種の液体は、貧溶媒（ａｎｔｉｓｏｌｖｅｎｔ）であってよい（以下に定義する通り）。１種または複数の液体は、エチレングリコールおよび貧溶媒を１５：８５〜２５：７５の比、例えば１７．５：８２．５〜２２．５：７７．５の比、例えば約２０：８０の比で、含んでいてもよく、ここで貧溶媒を加えると、エチレングリコール対アセトニトリルの比が、１：９９〜３０：７０の比、例えば２：９８〜２５：７５の比、例えば３：９７〜２０：８０の比、例えば５：９５〜２０：８０の比、例えば５：９５〜１５：８５の比、例えば７．５：９２．５〜１２．５：８７．５の比、例えば約１０：９０の比、例えば５：９５〜１０：９０の比、例えば５：９５〜７．５：９２．５の比、例えば約６．７：９３．３の比に変わる。
【００３９】
１種または複数の液体は、エチレングリコールとアセトニトリルの混合物を含んでいてもよい。
【００４０】
１種または複数の液体は、エチレングリコールおよびアセトニトリルを１：９９〜５０：５０の比、例えば２：９８〜４０：６０の比、例えば３：９７〜３５：６５の比、例えば５：９５〜３５：６５の比、例えば８：９２〜３０：７０の比、例えば１０：９０〜３０：７０の比、例えば１５：８５〜２５：７５の比、例えば１７．５：８２．５〜２２．５：７７．５の比、例えば約２０：８０の比で含んでいてもよい。
【００４１】
１種または複数の液体は、水を含んでいてもよい。１種または複数の液体は、水性酢酸緩衝液を含んでいてもよい。特定の態様では、結晶形態のカルベトシンは、カルベトシンおよび１種または複数の液体を含む混合物から結晶化され、１種または複数の液体は、水および水性酢酸緩衝液の一方または両方を含む。
【００４２】
一実施形態では、１種または複数の液体は、水であってもよい。１種または複数の液体が水の場合、水は、ｐＨが約２〜６、好ましくはｐＨが約３〜４、より好ましくはｐＨが約３．５であってもよい。
【００４３】
一実施形態では、１種または複数の液体は、水性酢酸緩衝液であってもよい。水性酢酸緩衝液は、酢酸と酢酸塩の水性混合物から形成することができる。酢酸塩は、適当な対イオンを有する酢酸塩であってもよい。適当な対イオンは、例として、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオンまたは有機陽イオンであってもよい。対イオンは、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムまたはアンモニウムであってもよい。好ましくは、対イオンは、ナトリウムまたはカリウムであってもよく、最も好ましくは、対イオンはナトリウムであってもよい。好ましくは、水性酢酸緩衝液は、ｐＨが約４〜７、好ましくはｐＨが約５〜６、最も好ましくはｐＨが約５．５である。好ましくは、水性酢酸緩衝液は、濃度が２０〜３０ｍＭであり、最も好ましくは濃度が約２５ｍＭである。
【００４４】
結晶形態のカルベトシンは、カルベトシンおよび１種もしくは複数の液体を含む混合物を、例えば４０℃から５℃に冷却することによって、またはカルベトシンおよび１種もしくは複数の液体を含む混合物の温度を、例えば４０℃と５℃の間でサイクルさせることによって得ることができる。温度は、１時間当たり３５℃など、１時間当たり５℃〜５０℃の速度で変化させることができる。混合物の温度をサイクルさせることは、温度を続いて下げ、次いで上げ、または逆にしなければならないことを表す。２回以上、例えば３回以上、例えば４回以上、例えば５回以上、例えば１０回以上、温度を下げ、次いで上げ、または逆にすることもよい。カルベトシンおよび１種または複数の液体を含む混合物の冷却または温度のサイクルに続いて、結晶カルベトシンを形成するのに適当な長さの時間、温度を５℃などに維持することができる。通常、結晶カルベトシンは、６時間〜２４時間以内、例えば約１２時間または約１８時間に形成および単離され得る。温度の冷却、サイクルまたは維持は、混合物の撹拌の有無にかかわらず起こり得る。
【００４５】
あるいは、結晶形態のカルベトシンは、意外なことに、カルベトシンと水を含む混合物またはカルベトシンと水性酢酸緩衝液を含む混合物を、結晶カルベトシンを形成するのに適当な長さの時間、少なくとも１５℃、例えば２０℃、例えば３０℃、例えば４０℃の温度に維持することによって得られ得る。通常、結晶カルベトシンは、３〜１００日、より一般的には３〜６０日、最も一般的には７〜１２日で形成する。一代替実施形態では、結晶形態のカルベトシンは、カルベトシンと水を含む混合物、またはカルベトシンと水性酢酸緩衝液を含む混合物を、２０℃の温度で約３〜６０日間維持することによって得ることができる。別の代替実施形態では、結晶形態のカルベトシンは、カルベトシンと水を含む混合物、またはカルベトシンと水性酢酸緩衝液を含む混合物を、４０℃の温度で約７〜１２日間維持することによって得ることができる。これらの代替実施形態では、後述の他の全てのステップは、貧溶媒の添加に関連するステップを除いて、行なうことができる。
【００４６】
カルベトシンは、少なくとも１種の溶媒および少なくとも１種の貧溶媒を含有する混合物から結晶化させることができる。溶媒とは、カルベトシンが容易に溶解、または容易に可溶する液体を表す。溶媒は、カルベトシンが、０．０１ｍｇ／ｍｌ以上、例えば０．０５ｍｇ／ｍｌ以上、例えば０．１ｍｇ／ｍｌ以上、例えば０．５ｍｇ／ｍｌ以上、例えば１ｍｇ／ｍｌ以上、例えば５ｍｇ／ｍｌ以上、例えば１０ｍｇ／ｍｌ以上、例えば２０ｍｇ／ｍｌ以上の標準条件の量で可溶である任意の溶媒であってもよい。貧溶媒とは、溶媒に比べてカルベトシンが溶解しにくい、または溶媒と比較してカルベトシンがより可溶ではない液体を表す。貧溶媒は、溶媒と比較して選択してもよく、カルベトシンが２０ｍｇ／ｍｌ未満、例えば１０ｍｇ／ｍｌ未満、例えば５ｍｇ／ｍｌ未満、例えば１ｍｇ／ｍｌ未満、例えば０．５ｍｇ／ｍｌ未満、例えば０．１ｍｇ／ｍｌ未満、例えば０．０５ｍｇ／ｍｌ未満、例えば０．０１ｍｇ／ｍｌ未満の標準条件の量で可溶である任意の溶媒であってもよい。カルベトシンが、例えば、溶媒に１０ｍｇ／ｍｌ以上の量で可溶な場合、貧溶媒にはより可溶ではないことになり、すなわち１０ｍｇ／ｍｌ未満、例えば５ｍｇ／ｍｌ未満、例えば１ｍｇ／ｍｌ未満、例えば０．５ｍｇ／ｍｌ未満、例えば０．１ｍｇ／ｍｌ未満、例えば０．０５ｍｇ／ｍｌ未満、例えば０．０１ｍｇ／ｍｌ未満の量で可溶であることになることが当業者には理解されたい。特に指定のない限り、溶媒および貧溶媒という用語は、室温および大気圧でのカルベトシン溶解度挙動を意味する。
【００４７】
溶媒は、水、水性酢酸緩衝液、エチレングリコール、エタノール、メタノール、プロパノール、イソプロパノール、および１，２−プロパンジオールからなる群から１種または複数の液体を含んでいてもよい。溶媒は、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  Ｒｅｉｃｈａｒｄｔ（Ｓｏｌｖｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｓｏｌｖｅｎｔ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、第３版、２００３年）によって記載されているように、相対極性指数（ＲＰＩ）が、０．５超、例えば０．６超、例えば０．７超、例えば０．８超、例えば０．９超、例えば１．０超であってもよい。溶媒は、任意の１種または複数の水、酢酸緩衝水溶液、またはアルコール、例えば任意の１種または複数の、水（ＲＰＩ＝１．０００）、酢酸緩衝水溶液、エチレングリコール（ＲＰＩ＝０．７９０）、エタノール（ＲＰＩ＝０．６５４）、メタノール（ＲＰＩ＝０．７６２）、プロパノール（ＲＰＩ＝０．８０３）、イソプロパノール（ＲＰＩ＝０．７８７）、または１，２−プロパンジオール（ＲＰＩ＝０．７２）であっても、あるいは含んでいてもよい。
【００４８】
結晶形態のカルベトシンは、カルベトシンおよび１種または複数の液体を含む混合物から結晶化することができ、カルベトシンは、約１ｍｇ／ｍｌ〜２００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約１０ｍｇ／ｍｌ〜１５０ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約２０ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度で溶媒中に存在している。一実施形態では、溶媒は、水であってもよい。一実施形態では、溶媒は、水性酢酸緩衝液であってもよい。一実施形態では、溶媒は、エチレングリコールであってもよい。
【００４９】
方法は、貧溶媒をカルベトシンおよび１種または複数の液体を含む混合物に加えるステップ、例えば混合物を冷却する前に貧溶媒を加えるさらなるステップを含んでいてもよい。
【００５０】
貧溶媒は、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  Ｒｅｉｃｈａｒｄｔ（Ｓｏｌｖｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｓｏｌｖｅｎｔ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、第３版、２００３年）によって記載されているように、相対極性指数（ＲＰＩ）が、１未満、例えば０．９未満、例えば０．８未満、例えば０．７５未満、例えば０．７未満、例えば０．６未満、例えば０．５未満であってもよい。貧溶媒は、任意の１種または複数の、エステル、ケトン、ニトリル、またはエーテル、例えば任意の１種または複数の、アセトニトリル（ＲＰＩ＝０．４６０）、酢酸エチル（ＲＰＩ＝０．２２８）、アセトン（ＲＰＩ＝０．３５５）、またはメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＲＰＩ＝０．１２４）であっても、あるいは含んでいてもよい。
【００５１】
したがって、方法の一実施形態では、カルベトシンは、カルベトシンおよび１種または複数の液体を含む混合物から結晶化させることができ、１種または複数の液体は、エチレングリコールおよびアセトニトリルを含む。カルベトシンは、カルベトシンおよび１種または複数の液体を含む混合物中に１０ｍｇ／ｍｌ〜１５０ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約１００ｍｇ／ｍｌの濃度で存在していてもよい。エチレングリコールおよびアセトニトリルは、５：９５〜３５：６５の比で存在していてもよい。結晶形態のカルベトシンは、カルベトシンおよび１種または複数の液体を含む混合物を、毎時３５℃の速度で４０℃から５℃に冷却し、結晶カルベトシンを形成するのに適当な長さの時間、例えば約１２時間または約１８時間、温度を５℃に維持することによって得ることができる。
【００５２】
方法は、カルベトシンおよび１種または複数の液体を含む混合物に結晶、例えばカルベトシン結晶、例えばカルベトシンの溶媒和結晶形態Ｉの結晶をシード添加するさらなるステップを含んでいてもよい。
【００５３】
シード添加とは、均一または不均一な結晶、すなわちシード結晶を混合物に加えて結晶形態のさらなるカルベトシンを核生成および／または成長させることを意味する。均一な結晶とは、そのいずれかの形態の結晶カルベトシンを意味する。不均一な結晶とは、別の材料の結晶を意味する。
【００５４】
方法は、カルベトシンおよび１種または複数の液体を含む混合物に結晶化を誘導するさらなるステップを含んでいてもよい。結晶化は、結晶の核生成および成長を促進するための任意の適当な手段によって、例えばカルベトシンおよび１種または複数の液体を含む混合物の表面を乱してシード結晶を作成することによって、例えば、カルベトシンおよび１種または複数の液体を含む混合物の表面から液体を上下にピペッティングするか、あるいはカルベトシンおよび１種または複数の液体を含む混合物の表面が、混合物が保持されている容器の表面に接触するところを引っ掻くことによって、誘導され得る。
【００５５】
方法は、結晶形態のカルベトシンを脱溶媒する（さらに乾燥させてもよい）、さらなるステップを含んでいてもよい。
【００５６】
脱溶媒とは、結晶構造が秩序化されたまたは無秩序な溶媒分子をほとんどまたは全く含まないように、カルベトシンの結晶構造から一部または実質的に全ての溶媒和分子を除去することを意味する。好ましい実施形態では、脱溶媒は、カルベトシンを五水和物結晶形態から一水和物結晶形態に変換することを意味する。
【００５７】
結晶形態のカルベトシンの脱溶媒は、結晶形態のカルベトシンを、２０℃以下であってもよく、例えば−３０℃〜２０℃であってもよく、例えば−２０℃〜２０℃であってもよく、例えば−１０℃〜２０℃であってもよく、例えば−５℃〜１５℃であってもよく、例えば０℃〜１０℃であってもよく、例えば約５℃であってもよい温度で、貧溶媒、例えばアセトニトリル中で洗浄し、次いで乾燥、例えば真空乾燥することによって実施することができる。乾燥は、脱溶媒を行なうのに適当な長さの時間、例えば１時間超、例えば約２４時間、真空下で起こることがある。好ましくは、結晶形態のカルベトシンは、アセトニトリル中約５℃の温度で洗浄し、約２０℃の温度で約２４時間真空下で乾燥させて脱溶媒を行なうことができる。
【００５８】
脱溶媒はまた、結晶形態のカルベトシンを少なくとも４０℃〜高くても１９０℃の温度まで加熱することによって、または結晶形態のカルベトシンを低い相対湿度、例えば相対湿度４０％以下の環境に曝露することによって、実施することができる。
【００５９】
したがって、方法の一実施形態では、カルベトシンは、カルベトシンおよび１種または複数の液体を含む混合物から結晶化させることができ、１種または複数の液体は、エチレングリコールおよびアセトニトリルを含む。カルベトシンは、１０ｍｇ／ｍｌ〜１５０ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約１００ｍｇ／ｍｌの濃度でカルベトシンおよび１種または複数の液体を含む混合物中に存在していてもよい。エチレングリコールおよびアセトニトリルは、５：９５〜３５：６５の比で存在していてもよい。アセトニトリルなどの追加の貧溶媒を加えてもよい。結晶形態のカルベトシンは、カルベトシンおよび１種または複数の液体を含む混合物を、毎時３５℃の速度で４０℃から５℃に冷却し、結晶カルベトシンを単離するのに適当な長さの時間、例えば約１２時間または約１８時間、温度を５℃に維持することによって得られ得る。結晶形態のカルベトシンは、アセトニトリル中約５℃の温度で洗浄し、約２０℃の温度で約２４時間真空下で乾燥させて脱溶媒を行なってもよい。
【００６０】
結晶化の前にろ過ステップを実施してもよい。ろ過ステップは、好ましくは遠心分離によるろ過を含む。したがって、一態様では、結晶形態のカルベトシンを製造する方法は、（１）ろ過、好ましくは遠心分離による；および（２）結晶化のステップを含む。
【００６１】
結晶化の前に洗浄ステップを実施してもよい。例えば、カルベトシン、例えば粗製カルベトシンは、スラリー化、例えばアセトニトリル中でスラリー化、例えばアセトニトリル中で２時間から１週間スラリー化、例えばアセトニトリル中で約１８時間連続的に撹拌しながらスラリー化することができる。粗製カルベトシンを洗浄すると、結晶化前の純度が約１〜２％増加し、アッセイ値が約４４％から約７０％に（アセトニトリル中）著しく増加する。したがって、一態様では、結晶形態のカルベトシンを製造する方法は、（１）カルベトシン、例えば粗製カルベトシンを、アセトニトリル中で洗浄するステップ；および（２）結晶化ステップを含む。別の態様では、結晶形態のカルベトシンを製造する方法は、（１）カルベトシン、例えば粗製カルベトシンを、アセトニトリル中で洗浄するステップ；（２）ろ過、好ましくは遠心分離による、ステップ；および（３）結晶化ステップを含む。
【００６２】
出願人は、有利かつ驚くべきことに、カルベトシンを結晶化すること、例えば溶液からカルベトシンを結晶化することにより、凍結乾燥を必要とせずにカルベトシンを単離することが可能であることを発見した。
【００６３】
方法は、凍結乾燥ステップを必要としないで許容可能な収率で高純度カルベトシンをもたらす。
【００６４】
カルベトシンおよび１種または複数の液体を含む混合物中のカルベトシンは、実質的に純粋なカルベトシンであっても、あるいは粗製カルベトシンであってもよい。
【００６５】
本明細書では、「粗製カルベトシン」にあるような「粗製」という用語は、医薬品として使用するには純度が不十分なカルベトシンを意味する。粗製ペプチドは、ＵＶ−ＨＰＬＣで測定したように、純度が９５％未満、例えば９２．５％未満、例えば９０％〜９３％、例えば９１％〜９３％であってもよい。粗製ペプチドに見られる不純物は、１種または複数の無機物、残留溶媒（例えばＤＭＦ）、ペプチド関連不純物および残留ペプチドカップリング試薬を含み得る。
【００６６】
（生成物）結晶形態のカルベトシン／溶媒和（例えば水和）結晶形態のカルベトシン／脱溶媒和結晶形態のカルベトシンは、純度が９５％以上の場合がある。
【００６７】
粗製カルベトシンは、当業者によく知られている方法、例えばＦｅｒｒｉｎｇ  Ｂ．Ｖ．のＷＯ２００９／１２２２８５（国際特許出願第ＰＣＴ／ＩＢ２００９／００５３５１号）に記載されているものに類似した方法によって合成することができる。
【００６８】
本発明によれば、他の態様では、本発明に基づくカルベトシン、または本発明の方法に従って作製されたカルベトシンを含む医薬組成物を提供している。本発明の医薬組成物は、医薬品として使用するためのものであり得る。本発明の医薬組成物は、神経障害または生殖障害の治療に使用するため、例えばプラーダー−ヴィリ症候群の治療に使用するため（Ｆｅｒｒｉｎｇ  Ｂ．Ｖ．のＷＯ２０１６／０４４１３１（国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０４９１１号）に記載されている）；あるいは例えば乳児の経腟分娩、帝王切開による乳児の分娩後の例えば子宮弛緩症の治療または予防に使用するため；あるいは分娩後出血（ＰＰＨ）を発症する危険性がある患者の子宮弛緩症の治療または予防に使用するため；および／または経腟分娩後の過度の出血の治療または予防に使用するため（Ｆｅｒｒｉｎｇ  Ｂ．Ｖ．のＷＯ２００９／１２２２８５（国際特許出願第ＰＣＴ／ＩＢ２００９／００５３５１号）に記載されている）のものであり得る。
【００６９】
本発明を以下に例示する。実施例は、本発明の好ましい実施形態を説明することもあるが、決して限定的であることを意味しない。
【実施例１】
【００７０】
溶媒和結晶形態Ｉカルベトシンの調製
ステップｉ：合成
Ｆｅｒｒｉｎｇ  Ｂ．Ｖ．のＷＯ２００９／１２２２８５（国際特許出願第ＰＣＴ／ＩＢ２００９／００５３５１号）に記載されているものと類似した合成法によって、純度約９１％の粗製カルベトシンを得た。
【００７１】
ステップｉｉ：溶液の調製
ステップｉ）で得た粗製カルベトシン６０ｍｇを、エチレングリコール（第１液体）：アセトニトリル（第２液体）の３０：７０（ｖ／ｖ）混合物０．６ｍＬに４０℃で溶解した。次いで容器に形態Ｉ（溶媒和）カルベトシン結晶を入れた。シード添加は必要ないが、結晶化を促進する可能性があることが理解されたい。
【００７２】
ステップｉｉｉ：結晶化
ステップｉｉ）で得た溶液を、４０℃に加熱し、この温度で３０分間保持した。次いで混合物を遠心分離によってろ過して、不溶性不純物を除去した。次いで混合物を４０℃で３０分間撹拌し、１時間にわたって５℃まで冷却し、次いで連続的に撹拌しながら５℃で終夜保持した。
【００７３】
沈殿した物質を単離した。
【００７４】
ＸＲＰＤ分析をＰＡＮａｌｙｔｉｃａｌ  Ｘ’ｐｅｒｔ  ｐｒｏで実施した。試料を３〜３５°２θでスキャンした。物質を穏やかに粉砕して凝集物を離し、試料を支持するためのＫａｐｔｏｎまたはＭｙｌａｒポリマーフィルムと共にマルチウェルプレートに入れた。次いでマルチウェルプレートを回折計の中に配置し、４０ｋＶ／４０ｍＡ生成器設定を用いた透過モード（ステップサイズ０．０１３０°２θ）で実行してＣｕＫ放射線（α１λ＝１．５４０６０Å；α２＝１．５４４４３Å；β＝１．３９２２５Å；α１：α２比＝０．５）を使用して分析した。
【００７５】
実質的に表１および図１（形態Ｉ）に示されるようなＸ線回折図を有するカルベトシンが、溶液から結晶化した。
【００７６】
固体をＴＧ／ＤＴＡによって分析し、質量損失／熱的事象（図４ａ）を簡略化した。
【００７７】
（溶媒和）結晶形態のカルベトシンの純度は、表４に概説した方法に従ってＵＶ−ＨＰＬＣ（図３ａ）によって９６．２％で計算した。
【００７８】
【表４】
2020530456.tif 000008
【実施例２】
【００７９】
溶媒和結晶形態Ｉカルベトシンの調製
ステップｉ：合成
Ｆｅｒｒｉｎｇ  Ｂ．Ｖ．のＷＯ２００９／１２２２８５（国際特許出願第ＰＣＴ／ＩＢ２００９／００５３５１号）に記載されているものと類似した合成法によって、純度約９１％の粗製カルベトシンを得た。
【００８０】
ステップｉｉ：溶液の調製
ステップｉ）で得た粗製カルベトシン６０ｍｇを、エチレングリコール（第１液体）：アセトニトリル（第２液体）の３０：７０（ｖ／ｖ）混合物０．６ｍＬに４０℃で溶解した。次いで容器に形態Ｉ（溶媒和）カルベトシン結晶を入れた。シード添加は必要ないが、結晶化を促進する可能性があることが理解されたい。
【００８１】
ステップｉｉｉ：貧溶媒の添加
十分なアセトニトリルを加えて、エチレングリコール：アセトニトリルの比を６．７：９３．３（ｖ／ｖ）に調整した。
【００８２】
ステップｉｖ：結晶化
ステップｉｉｉ）で得た溶液を、４０℃に加熱し、この温度で３０分間保持した。次いで混合物を遠心分離によってろ過して、任意の不溶性不純物を除去した。次いで混合物を４０℃で３０分間撹拌し、１時間にわたって５℃まで冷却し、次いで連続的に撹拌しながら５℃で終夜保持した。
【００８３】
沈殿した物質を単離した。
【００８４】
ＸＲＰＤ分析は、実施例１に関して上述したように実施した。
【００８５】
実質的に表１および図１に示されるようなＸ線回折図を有するカルベトシンが、溶液から結晶化した。
【実施例３】
【００８６】
脱溶媒和結晶形態ＩＩカルベトシンの調製
実施例１および２によって生成した結晶化物質に存在するエチレングリコールを除去するために、実施例１または実施例２の結晶化物質を脱溶媒和および乾燥させた。
【００８７】
形態Ｉ結晶化物質をアセトニトリル中５℃で洗浄し、続いて真空乾燥すると、溶媒和形態Ｉの脱溶媒和をもたらし、実質的に表２および図２に示されるような回折図を有する脱溶媒和形態ＩＩ結晶が生成した。形態ＩＩ結晶は、ガスクロマトグラフィーによって決定されるように、ＩＣＨ限界である６２０ｐｐｍ未満のエチレングリコールレベルを有することがわかり、パラメーターは下記の表５の通りであった。
【００８８】
【表５】
2020530456.tif 000009
【実施例４】
【００８９】
脱溶媒和結晶形態ＩＩカルベトシンの調製
粗製カルベトシン（純度約９１．３％）約３００ｍｇに、あらかじめ調製した３０％エチレングリコール：７０％アセトニトリル（ｖ／ｖ）溶媒混合物３ｍＬを加え、連続的に撹拌しながら混合物を３０分間４０℃に加熱した。
【００９０】
３０分後、混合物を遠心分離によってろ過して、不溶性不純物を除去した。この混合物（４０℃のまま）に、アセトニトリル１．５ｍＬを０．５ｍＬアリコートで加えた。アセトニトリルを完全に加えた後でも、沈殿は４０℃で観察されなかった。
【００９１】
次いで混合物を４０℃で１時間撹拌し、１時間にわたって５℃まで冷却し、次いで連続的に撹拌しながら５℃で１８時間保持した。
【００９２】
１８時間後、沈殿した物質を単離し、アセトニトリル約５ｍＬで洗浄し、次いで真空下に周囲温度で２４時間乾燥させた。
【００９３】
次の日、固体を、純度およびアッセイ（図３ｂ）のためにＨＰＬＣ、質量損失／熱的事象（図４ｂ）の簡略化のためにＴＧ／ＤＴＡ、ならびに形態および結晶含有量のために偏光顕微鏡（ＰＬＭ）およびＸＲＰＤによって分析した。
【００９４】
ＰＬＭ分析は、最後に単離した固体は、凝集物（５０〜１００μｍ）の混合物を含み、それは非常に小さな針状結晶（長さ＜１０μｍ）に容易に分散したことを示した。
【００９５】
実施例４の方法によって形成し、図４ｂに示した結晶のＴＧ／ＤＴＡデータは、１１０℃までわずか約０．８％の全質量損失があったことを示す。これは、第１の質量損失が約６０℃まで約０．５％、第２の質量損失が約１１０℃まで約０．３％の２段階プロセスであることがわかった。これらの質量損失は、表面に弱く結合したアセトニトリルと水に対応し、結晶形態自体の溶媒和を示すものではない。したがって、この溶媒の損失は、脱溶媒和結晶形態ＩＩの結晶化度を変化させない。
【００９６】
これらの結果は、脱溶媒和結晶形態ＩＩカルベトシンが非常に安定していることを示す。
【実施例５】
【００９７】
溶媒和結晶形態Ｉカルベトシンの調製
ステップｉ：合成
Ｆｅｒｒｉｎｇ  Ｂ．Ｖ．のＷＯ２００９／１２２２８５（国際特許出願第ＰＣＴ／ＩＢ２００９／００５３５１号）に記載されているものと類似した合成法によって、純度約９３．５％の粗製カルベトシンを得た。
【００９８】
ステップｉｉ：溶液の調製
酢酸緩衝液、２５ｍＭ、ｐＨ５．５を、酢酸ナトリウム三水和物、氷酢酸および超純水から調製した。ステップｉ）で得た粗製カルベトシン３５４ｍｇを、酢酸緩衝液１６．６ｍＬに溶解させた。溶液を０．２２μＭ  ＰＶＤＦシリンジフィルターでろ過し、溶液の５００μＬ部分をバイアルに分取し、その後それを密封した。カルベトシン溶液のｐＨは、５．３だった。
【００９９】
ステップｉｉｉ：結晶化
ステップｉｉ）で得た溶液を、４０℃に加熱し、この温度で密封バイアル中に保持した。３日後、バイアルを取り出し、エッペンドルフガラスピペットを用いて溶液を穏やかに吸引しバイアルに戻して、それによって結晶化のためのシードをいくらか作成した。ピペッティング後、バイアルを再度密封し、４０℃で保持した。９日後、結晶様の外観をもつ粒子が形成した。沈殿した物質を単離した。
【０１００】
ＸＲＰＤ分析を、Ｃｕ−Ｋα１モノクロメーター（α１λ＝１．５４０６０Å）を用いてＰＡＮａｌｙｔｉｃａｌ  Ｘ’ｐｅｒｔ  ｐｒｏで実施した。試料を２〜３５°２θでスキャンした。物質を穏やかに破砕し、Ｓｉゼロバックグラウンドウェーハ上に塗り付け、次いでそれを、４５ｋＶ／４０ｍＡ生成器設定を用いた透過モード（スキャン速度０．０１°／秒、ステップサイズ０．０１７°２θ）で実行される回折計の中のゆっくり回転する試料ホルダーに配置した。プログラム可能な入射発散スリットを用いて測定を行なった。
【０１０１】
得られたカルベトシン結晶のＸ線回折図を表３および図５に示す。Ｘ線回折図は、実施例１および２（図１、表１）ならびに実施例３および４（図２、表２）と比較すると、異なる結晶形態または多形をもつカルベトシンを示す。
【０１０２】
示差走査熱分析（ＤＳＣ）分析をＮｅｔｚｓｃｈ  ＤＳＣ  ２０４Ｆ１で行なった。数ミリグラムの結晶を母液から単離し、換気フード中約２０％相対湿度（ＲＨ）で数時間空気乾燥させたままにした。結晶を穏やかに破砕して粉末物質にし、この物質１．２ｍｇを２５μＬ  Ａｌパンに投入した。ピンホール（直径０．２５ｍｍ）の穴を開ける前に、蓋をパンに合わせて圧着した。５Ｋ／分の加熱速度を用いて試料を２０〜２５０℃まで分析した。
【０１０３】
実施例５の方法によって形成し、図７に示した結晶のＤＳＣデータは、表面に弱く結合した水および溶媒和水の損失に対応する、４０〜１２０℃の範囲で揮発性物質の損失があることを示す。１９２℃の開始による融解吸熱は、無水カルベトシンの融解に対応する。
【０１０４】
重量蒸気収着（ＧＶＳ）をＳＭＳ  ＤＶＳ−１で行なった。結晶および粉末１．４ｍｇをＡｌパンに加え、２つの連続サイクル中に段階的相対湿度（ＲＨ）変化に曝露した：２０−３０−４０−５０−６０−７０−８０−７０−６０−５０−４０−３０−２０−１０−０−１０−２０−３０−４０−５０−６０−７０−８０−９０−８０−７０−６０−５０−４０−３０−２０−１０−０％ＲＨの開ループモード。温度を２５℃に保持し、純粋な窒素流速２００ｍＬ／分を使用した。適用したｄｍ／ｄｔ基準は、５分間で０．００１重量％／分であり、６時間に設定された０％ＲＨにおけるステップを除いて、全てのステップで最大時間１５０分であった。
【０１０５】
ＧＶＳデータを図８に示す。ＧＶＳ等温プロットを図８ｂに示す。約２％（ｗ／ｗ）におけるプラトーは、一水和物といくらかの緩く結合した表面水に対応する。追加の約８％（ｗ／ｗ）における２つ目のプラトーは、五水和物といくらかの緩く結合した表面水に対応する。五水和物が約６０％ＲＨ以上（収着）、約４０〜９０％ＲＨ（脱着）で存在する。
【０１０６】
（溶媒和）結晶形態のカルベトシンの純度は、表６に概説した方法に従ってＵＶ−ＨＰＬＣによって９８．７％で計算した。
【０１０７】
【表６】
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【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【国際調査報告】
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