(57)【要約】  患者の癌を治療する方法が開示される。本方法は、（ａ）ＮＧＳまたは他の技法による患者からの癌細胞の試料のスクリーニングにより特定された病原性遺伝子を標的とする物質のセットを定義することと、（ｂ）それぞれが作用可能な変異を含む癌細胞中の２つ以上の標的遺伝子を特定することと、（ｃ）インビトロ培養細胞実験を使用して、特定された２つ以上の標的遺伝子のそれぞれについて作用可能な変異を標的とする（順次または同時に投与された）１つ以上の物質の効果を試験することと、（ｄ）患者の癌の治療に使用される潜在的な効果的な治療オプションを指定することと、を含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌の治療を必要とする患者の癌を治療する方法であって、（ａ）それぞれが病原性かつ作用可能な（ａｃｔｉｏｎａｂｌｅ）変異を有する癌細胞中の２つ以上の標的遺伝子を特定することと、（ｂ）遺伝子−原薬相互作用のリストを使用することと、（ｃ）（ａ）で特定された前記２つ以上の標的遺伝子のそれぞれについて前記作用可能な変異を標的とする１つ以上の物質を前記患者に投与することと、を含む方法。
【請求項２】
前記特定することが、ＮＧＳ配列決定の使用を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
併用療法が相乗的治療効果を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記癌が、固形腫瘍および非固形腫瘍からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
試料が癌細胞または癌ＤＮＡを含む無細胞試料を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記２つ以上の標的遺伝子のそれぞれが異なる経路にマッピングされる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記癌が膵管腺癌であり、前記２つ以上の標的遺伝子がＫＲＡＳおよびＡＢＬ１である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ＫＲＡＳが病原性変化を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＡＢＬ１が病原性変化を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
ＫＲＡＳおよびＡＢＬ１の両方が病原性変化を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
ＡＢＬ１がＦＡＮＣＣ  ＡＢＬ１である、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
ＫＲＡＳのＧ１２が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択される非標準アミノ酸で置換される、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
ＡＢＬ１のＧ１０６０が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択される非標準アミノ酸で置換される、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
ＫＲＡＳのＧ１２は、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択される非標準アミノ酸で置換され、ならびに／または
ＡＢＬ１のＧ１０６０は、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択される非標準アミノ酸で置換される、請求項７に記載の方法。
【請求項１５】
ＫＲＡＳのＧ１２は、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択される非標準アミノ酸で置換され、ならびに／または
ＡＢＬ１のＧ１０６０は、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷ；からなる群から選択される非標準アミノ酸で置換され、ならびに／または
ＦＡＮＣＣのＥ５２１は、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択される非標準アミノ酸で置換される、請求項７に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＫＲＡＳ遺伝子を標的とする前記１つ以上の物質がマイトジェン／細胞外シグナル関連キナーゼ（ＭＥＫ）の阻害剤である、請求項７に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＭＥＫ阻害剤がトラメチニブである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＡＢＬ１遺伝子を標的とする前記１つ以上の物質がチロシンキナーゼ阻害剤である、請求項７に記載の方法。
【請求項１９】
前記チロシンキナーゼ阻害剤がレゴラフェニブである、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
トラメチニブとレゴラフェニブの併用療法が前記患者に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記トラメチニブおよび少なくとも１つの追加の抗癌剤が順次投与される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記トラメチニブおよび少なくとも１つの追加の抗癌剤が同時に投与される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記対象がヒトである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記レゴラフェニブおよび少なくとも１つの追加の抗癌剤が順次投与される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記レゴラフェニブおよび少なくとも１つの追加の抗癌剤が同時に投与される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
癌細胞増殖を阻害する方法であって、癌細胞を、少なくとも１つの追加の抗癌剤と組み合わせてトラメチニブに曝露することを含み、前記組み合わせは、トラメチニブ単独および／または単独で投与された少なくとも１つの追加の抗癌剤の効果と比べて、増強された抗癌効果を提供する、方法。
【請求項２７】
癌を有する患者の治療を特定するための方法であって、（ａ）癌細胞を含む試料を前記患者から取得することと、（ｂ）前記試料のＮＧＳ配列決定の結果を取得することと、（ｃ）それぞれが作用可能な変異を有する前記癌細胞中の２つ以上の標的遺伝子を特定することと、（ｄ）（ｃ）で特定された前記２つ以上の標的遺伝子のそれぞれについて前記作用可能な変異を標的とする１つ以上の物質の存在下で前記癌細胞を培養することと、（ｅ）前記１つ以上の物質の存在下で癌細胞生存率を測定することと、（ｆ）前記１つ以上の物質の存在下で前記細胞の生存率が、（ｉ）前記２つ以上の物質の非存在下での生存率よりも低く、（ｉｉ）１つ以上の標準治療の非標的化物質の存在下での生存率より低く、（ｉｉｉ）標的化されているが適合しない物質（陰性対照）の存在下での生存率よりも低い場合に、前記治療が前記患者において有効であり得ると結論付けることと、を含む方法。
【請求項２８】
前記２つ以上の特定された標的遺伝子のそれぞれが異なる経路にマッピングされる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記癌が膵管腺癌であり、前記２つ以上の特定された標的遺伝子がＫＲＡＳおよびＡＢＬ１である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
ＫＲＡＳが病原性変化を含む、請求項２９に記載の方法。１２Ｂ。ＡＢＬ１が病原性変化を含む、請求項１２に記載の方法。１２Ｃ。ＫＲＡＳおよびＡＢＬ１の両方が病原性変化を含む、請求項１２に記載の方法
【請求項３１】
ＫＲＡＳ、ＡＢＬ１、およびＦＡＮＣＣが病原性変化を含む、請求項２９に記載の方法
【請求項３２】
ＫＲＡＳのＧ１２が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択される非標準アミノ酸で置換される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
ＡＢＬ１のＧ１０６０が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択される非標準アミノ酸で置換される、請求項１２に記載の方法。
【請求項３４】
ＫＲＡＳのＧ１２は、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択される非標準アミノ酸で置換され、かつ／または
ＡＢＬ１のＧ１０６０は、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、およびＷからなる群から選択される非標準アミノ酸で置換される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
ＫＲＡＳのＧ１２は、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択される非標準アミノ酸で置換され、かつ／または
ＡＢＬ１のＧ１０６０は、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択される非標準アミノ酸で置換され、かつ／または
ＦＡＮＣＣのＥ５２１は、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷからなる群から選択される非標準アミノ酸で置換される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＫＲＡＳ遺伝子を標的とする前記１つ以上の物質がマイトジェン／細胞外シグナル関連キナーゼ（ＭＥＫ）の阻害剤である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＭＥＫ阻害剤がトラメチニブである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＡＢＬ１遺伝子を標的とする前記１つ以上の物質がチロシンキナーゼ阻害剤である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３９】
前記チロシンキナーゼ阻害剤がレゴラフェニブである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
トラメチニブとレゴラフェニブの併用療法が、癌を有する患者の治療方法として特定される、請求項１０に記載の方法。
【請求項４１】
癌を治療するための組成物であって、有効量のトラメチニブからなる第１の成分と、有効量の少なくとも１つの追加の抗癌剤を含む第２の成分とを含む、組成物。
【請求項４２】
トラメチニブおよび少なくとも１つの追加の抗癌剤の総量が相乗的な治療的抗癌効果を提供する、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
トラメチニブおよび少なくとも１つの追加の抗癌剤の総量が、増強された治療的抗癌効果を提供する、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４４】
トラメチニブおよび少なくとも１つの追加の抗癌剤の総量が相乗的な治療的抗癌効果を提供する、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４５】
前記癌が、固形腫瘍および非固形腫瘍からなる群から選択される、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４６】
前記癌が、結腸直腸癌、胃癌、結腸直腸癌、膵臓癌および前立腺癌からなる群から選択される固形腫瘍である、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４７】
前記少なくとも１つの追加の抗癌剤が化学療法剤である、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４８】
癌を治療するための組成物であって、有効量のレゴラフェニブからなる第１の成分と、有効量の少なくとも１つの追加の抗癌剤を含む第２の成分とを含む、組成物。
【請求項４９】
レゴラフェニブおよび少なくとも１つの追加の抗癌剤の総量が、増強された治療的抗癌効果を提供する、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５０】
レゴラフェニブおよび少なくとも１つの追加の抗癌剤の総量が、相乗的な治療的抗癌効果を提供する、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５１】
前記癌が、固形腫瘍および非固形腫瘍からなる群から選択される、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５２】
癌を有する患者の治療方法を特定するためのキットであって、（ａ）（ＮＧＳ配列決定法または他の方法を用いた）それぞれが病原性かつ作用可能な変異を有する癌細胞中の２つ以上の標的遺伝子のデータと、（ｂ）遺伝子−原薬相互作用のリストと、（ｃ）（ａ）で特定された前記２つ以上の特定された標的遺伝子のそれぞれについて前記作用可能な変異を標的化する１つ以上の物質と、（ｄ）前記（ｃ）における１つ以上の物質のそれぞれの存在下で前記患者由来の癌細胞を培養するための、１つ以上の容器にパッケージされた培地と、を含む、キット。
【請求項５３】
前記癌が膵管腺癌であり、前記２つ以上の特定された標的遺伝子がＫＲＡＳおよびＡＢＬ１である、請求項５２に記載のキット。
【請求項５４】
前記ＫＲＡＳ遺伝子を標的とする前記１つ以上の物質がマイトジェン／細胞外シグナル関連キナーゼ（ＭＥＫ）の阻害剤である、請求項５３に記載のキット。
【請求項５５】
前記ＭＥＫ阻害剤がトラメチニブである、請求項５４に記載のキット。
【請求項５６】
前記ＡＢＬ１遺伝子を標的とする前記１つ以上の物質がチロシンキナーゼ阻害剤である、請求項５３に記載のキット。
【請求項５７】
前記チロシンキナーゼ阻害剤がレゴラフェニブである、請求項５６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
この出願は、２０１７年８月１１日に出願された米国仮出願第６２／５４４，６９３号から優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究または開発に関する記載
適用しない。
【０００３】
本発明は、癌治療に関し、より具体的には、複数の癌細胞変異の特定および同時標的化に関する。
【背景技術】
【０００４】
高度な分子技術の開発により、個別化医療が癌の診断と治療の最前線に登場した（１）。これにより、細胞毒性のある非特異的な化学療法から分子標的化アプローチへの移行がもたらされた（２）。このような標的化アプローチは、ハイスループットで大規模な並列シーケンスを実行する次世代シーケンシング（ＮＧＳ）技術の開発の結果、ほぼ可能になった（３、４）。
【０００５】
膵管腺癌（ＰＤＡＣ）は、膵臓の小さな管または管の内側を覆う細胞から発生する外分泌性膵臓腫瘍である。これは、ＰＤＡＣが世界中のすべての癌関連死亡の最大４％を占め、わずか約２５％の５年生存率であるいう点で非常に攻撃的な癌である（５）。
【発明の概要】
【０００６】
したがって、本明細書の発明者らは、ＰＤＡＣを含む癌の治療のための改善されたアプローチを考案することに成功した。このアプローチでは、癌細胞内の２つ以上の遺伝子または経路の作用可能な（ａｃｔｉｏｎａｂｌｅ）変異を標的とする。
【０００７】
したがって、様々な実施形態において、本発明は、癌の治療を必要とする患者の癌を治療する方法を対象とする。この方法には、（ＮＧＳシーケンシングまたは他の方法を使用して）それぞれが病原性かつ作用可能な変異を有する癌細胞内の２つ以上の標的遺伝子を特定することと、（ａ）遺伝子−原薬相互作用のリスト、および（ｂ）患者の腫瘍／癌試料で特定された２つ以上の標的遺伝子のそれぞれについて、作用可能な変異を標的とする１つ以上の物質を患者に投与することと、が含まれる。様々な態様において、試料は、癌細胞または癌ＤＮＡを含む無細胞試料でよく、２つ以上の標的遺伝子は異なる経路にマップされる。様々な実施形態において、癌はＰＤＡＣであってもよく、２つ以上の標的遺伝子はＫＲＡＳ（またはマイトジェン／細胞外シグナル関連キナーゼ（ＭＥＫ）経路を介してシグナル伝達する遺伝子）およびＡＢＬ１（またはチロシンキナーゼ（ＴＫ）経路を介してシグナル伝達する遺伝子）でよい。阻害剤は、マイトジェン／細胞外シグナル関連キナーゼ（ＭＥＫ）阻害剤、トラメチニブ、および複数のチロシンキナーゼ阻害剤、レゴラフェニブ）でよい。
【０００８】
様々な他の実施形態では、癌を有する患者の治療を特定する方法を対象とする。この方法は、（ａ）癌細胞を含む試料を患者から取得することと、（ｂ）ＮＧＳ技術を使用して試料をスクリーニングすることと、（ｃ）それぞれが病原性かつ作用可能な変異を有する癌細胞中の２つ以上の標的遺伝子を特定することと、（ｄ）（ｃ）で特定された２つ以上の標的遺伝子のそれぞれについて作用可能な変異を標的とする１つ以上の物質の存在下で癌細胞を培養することと、（ｅ）１つ以上の物質の存在下で癌細胞生存率を測定することと、（ｆ）１つ以上の標的物質の存在下で細胞の生存率が、（ｉ）２つ以上の物質の非存在下での生存率よりも低く、（ｉｉ）１つ以上の標準治療対象外の物質の存在下での生存率より低く、（ｉｉｉ）標的とされているが適合しない物質（陰性対照）の存在下での生存率よりも低い場合に、決定することと、を含み得る。様々な側面において、２つ以上の特定された標的遺伝子のそれぞれは、異なる経路に影響を及ぼす。様々な実施形態において、癌はＰＤＡＣであり、２つ以上の特定された標的遺伝子はＫＲＡＳおよびＡＢＬ１である。阻害剤は、マイトジェン／細胞外シグナル関連キナーゼ（ＭＥＫ）阻害剤であるトラメチニブおよびチロシンキナーゼ阻害剤であるレゴラフェニブである。標準治療の非標的物質はゲムシタビンであり、標的であるが適合しない物質はパルボシクリブでよい。
【０００９】
様々な他の実施形態は、癌を有する患者の治療を特定するためのキットを対象とする。キットは、（ａ）ＮＧＳ（またはその他の技法）によって得られた患者の癌細胞異常のリストと、（ｂ）遺伝子−原薬相互作用のリストと、（ｃ）リスト（ａ）から特定された２つ以上の標的遺伝子のそれぞれについて、作用可能な変異を標的とする１つ以上の物質と、（ｄ）１つ以上の容器にパッケージされた、（ｂ）の１つ以上の物質のそれぞれの存在下で患者から癌細胞を培養するための培地と、を含む。様々な実施形態において、癌はＰＤＡＣであり、２つ以上の特定された標的遺伝子はＫＲＡＳおよびＡＢＬ１である。阻害剤は、マイトジェン／細胞外シグナル関連キナーゼ（ＭＥＫ）阻害剤であるトラメチニブおよびチロシンキナーゼ阻害剤であるレゴラフェニブでよい。
【００１０】
本教示のこれらおよび他の特徴、態様、および利点は、以下の説明、実施例、および添付の特許請求の範囲を参照してよりよく理解されるようになる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
当業者は、以下に記載される図面が例示目的のみのためであることを理解するであろう。図面は、本教示の範囲を決して限定することを意図していない。
【００１２】
【図１】この図は、（Ａ）ゲムシタビン、（Ｂ）トラメチニブ、（Ｃ）レゴラフェニブ、または（Ｄ）パルボシクリブの濃度を増加させて処理したＣＡＰＡＮ２細胞のグラフを示す、ＣＡＰＡＮ２細胞生存に対する単剤療法の効果を示し、黒円（各グラフの下部の曲線）は薬物治療であり、赤（カラーバージョン）の円（各グラフの上部の曲線）は薬物の連続希釈におけるＤＭＳＯの割合に相当する濃度でＤＭＳＯ処理され、薬物への４８時間の曝露後に、ゲムシタビン（Ｂ）の１ｍＭとの高濃度は細胞死の誘発にほとんど影響を及ぼさず、一方、適合した単剤療法、トラメチニブ（Ｂ）およびレゴラフェニブ（Ｃ）は細胞生存に重大な悪影響を誘発し、（Ｄ）パルボシクリブは、細胞の生存に何らかの影響があったとしても、高濃度であってもほとんど認められなかった。薬物の濃度は、μＭ濃度のｌｏｇ１０として表示される（例えば、１０００μＭ＝３．００）（平均値±ＳＤ；Ｎ≧３）。
【図２】この図は、適合した組み合わせ療法の効果を示す。（Ａ）レゴラフェニブ（青色（カラーバージョン）の円）、トラメチニブ（赤色（カラーバージョン）の三角形）、またはレゴラフェニブとトラメチニブの１：１の組み合わせ（紫色（カラーバージョン）の四角）のいずれかの連続的に増加する濃度で４８時間処理されたＣＡＰＡＮ２細胞の生存のグラフであり、黒の上部の線はＤＭＳＯ治療であり、２種類の薬剤の１：１の組み合わせで治療した後の細胞生存率のグラフから、増加した細胞生存率の領域を囲む生存率を著しく減少させた２つの異なる領域をもつ二相性曲線が明らかになり、また、破線のボックスの間の強調表示された領域（網掛けのボックス）は潜在的なホルミシス（Ｂ−Ｃ）の領域を示し、３つのバーのそれぞれのセットは、左にレゴラフェニブ、中央にトラメチニブ、右にレゴラフェニブおよびトラメチニブを示し、強調表示された領域（破線のボックスで囲まれた領域）の細胞死はＡに表示される。
【図３】この図は、（Ａ）レゴラフェニブ（青（カラーバージョン）の円）、トラメチニブ（赤（カラーバージョン）の三角）、またはレゴラフェニブとトラメチニブの２：１の組み合わせ（紫色（カラーバージョン）の四角）のいずれかの濃度を連続的に増加させて４８時間処理したＣＡＰＡＮ２細胞の生存率のグラフを示す適合した併用療法の効果を示し、黒い線はＤＭＳＯ治療であり、２つの薬物の２：１の組み合わせによる治療後の細胞生存率のグラフから、増加した細胞生存の領域を囲む、有意に減少した細胞生存の２つの明確な領域をもつ二相性曲線が明らかとなっている。破線のボックスの間の強調表示された領域（網掛けのボックス）は、潜在的なホルミシスの領域を示す。（Ｂ−Ｃ）３つのバーの各セットは、左側にレゴラフェニブ、中央にトラメチニブ、右側にレゴラフェニブとトラメチニブを示し、強調表示された領域（破線のボックスで囲まれた）の細胞死をＡに示す。
【図４】この図は、ＣＡＰＡＮ２細胞におけるレゴラフェニブとトラメチニブの相乗効果を示し、組み合わせ指数（ＣＩ）分析は、レゴラフェニブとトラメチニブの異なる比率に対して生じたＣＩ値を示す。トレンドラインは、特定の効果におけるＣＩ値を示し、シンボルは実際のデータポイントから導出されたＣＩ値を表す。ＣＩ＝１、加法性；ＣＩ＞１、拮抗作用；ＣＩ、＜１、相乗効果。１：１レゴラフェニブ：トラメチニブ曲線（カラーバージョンの青）はＥＣ６０で最高値、１０：１レゴラフェニブ：トラメチニブ曲線（カラーバージョンの緑）はＥＣ６０で２番目に高い値、５：１レゴラフェニブ：トラメチニブ曲線（カラーバージョンの赤）はＥＣ６０で３番目に高い値を有し、２：１レゴラフェニブ：トラメチニブ曲線（カラーバージョンの黄色）はＥＣ６０で４番目に高い値を有する。
【図５】この図は、ＣＡＰＡＮ２細胞におけるレゴラフェニブとトラメチニブの相乗効果を示す（アイソボログラム分析）。（Ａ−Ｂ）１：１および２：１の組み合わせ比でのレゴラフェニブとトラメチニブの相乗効果を示すアイソボログラム。対角線の色付きの線は相加性を示し、色付きの記号は２０％（ＥＤ８０−青（カラーバージョン））下線）、２５％（ＥＤ７５−黄色（カラーバージョン）中央線）、または４０％（ＥＤ６０−赤色（カラーバージョン）上線）ＣＡＰＡＮ２細胞死、上記のデータポイントが示す相乗効果は、拮抗作用を示す。
【図６】正常なＫＲＡＳ細胞間シグナル伝達の概要。成長因子（三角形ラベルの成長因子；カラーバージョンの赤／ピンク）がその受容体の細胞外部分に結合すると（細胞膜標識成長因子レセプターを通過するＹ字型構造；カラーバージョンの黒と青）下流のシグナル伝達イベントはＲＡＳ（ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、またはＨＲＡＳ）の活性化につながる一連の低分子中間体（丸で囲まれた（カラーバージョンの緑））によって開始され、続いてＲＡＦ（ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦ）が活性化され、続いてＭＥＫ１／２およびＥＲＫ１／２が活性化され、転写と細胞の生存と増殖の増加につながる。
【図７】通常のＡＢＬシグナリングの概要（Ｂ）。ＡＢＬは、成長因子（三角形、カラーバージョンの紫）、ケモカイン（正方形、カラーバージョンの青）、およびインテグリンシグナル伝達（黒い列）など、多くの刺激によって調節される。ＡＢＬ（円、カラーバージョンのオレンジ色）は、細胞質内（遊離型およびアクチン結合型の両方）および核内に見られる。核ＡＢＬは転写を制御するが、細胞質ＡＢＬは遊離型とアクチン結合型の両方で見つけることができる。遊離の細胞質ＡＢＬはキナーゼ活性を有し、細胞の走化性と有糸分裂誘発において役割を果たす。アクチン結合ＡＢＬにはキナーゼ活性はないが、インテグリンシグナル伝達に応答してアクチンから放出される。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、癌患者の治療における癌細胞の２つ以上の変異の特定および標的化を対象とする。
【００１４】
本明細書で使用される以下の用語は、特に明記しない限り、以下の意味で定義される。
【００１５】
「約」という用語は、数値指定の前に使用される場合、例えばｐＨ、温度、量、濃度、範囲などの分子量は、±５％、±１％、または±０．１％変化する可能性がある近似値を示す。
【００１６】
明細書および請求項で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないことを明確に指示しない限り、複数の参照を含む。例えば、「薬学的に許容される担体」という用語は、その混合物を含む複数の薬学的に許容される担体を含み得る。
【００１７】
「および／または」という用語は、本発明の２つの構成要素の一方または両方を意味することを意図している。
【００１８】
「対象」、「個体」および「患者」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、哺乳動物、特にヒトを指す。
【００１９】
本明細書で使用される「デバイス」という用語は、薬物の送達を必要とする患者に薬物を送達することができる装置またはシステムを指す。
【００２０】
用語「治療を必要とする」および用語「それを必要とする」は、交換可能に使用され、患者が治療から利益を得るとの、介護者、例えば医師、看護師、看護師によって行われる判断を指す。
【００２１】
本明細書で使用される「薬学的に許容される」という用語は、製剤の他の成分と適合性があり、そのレシピエントに過度に有害ではない医薬組成物の成分を指す。
【００２２】
「担体」という用語は、治療薬と共に投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、またはビヒクルを指し、親水性物質、疎水性物質、および乳化剤などの親水性と疎水性の両方の性質を有する物質である液体および粉末を含むが、これらに限定されない。
【００２３】
本明細書で使用する「治療有効量」という用語は、研究者、医療提供者、または個人が探している組織、システム、または個人の生物学的または医学的応答を引き出す活性化合物または医薬品の量を指す。
【００２４】
本明細書で使用される「ｗ／ｗ」という用語は、質量分率、すなわち、成分の質量を全体の総質量で割ったものを指すものとする。「ｗ／ｗ％」という用語は、質量分率に１００を掛けたものを指す。同様に、「ｗ／ｖ」という用語は、体積濃度、すなわち全体の総体積で割った成分の質量を指し、「ｗ／ｖ％」という用語は体積濃度に１００を掛けたものを指す。
【００２５】
本発明の様々な実施形態は、癌の治療を必要とする患者の癌を治療する方法、および癌を有する患者の治療方法を特定する方法を対象とする。
【００２６】
「癌」という用語は、異常な細胞が制御されずに分裂し、しばしば近くの組織に侵入し、血液およびリンパ系を介して体の他の部分に広がる疾患のグループを指す。１つの特定の癌は膵管腺癌（ＰＤＡＣ）である。ＰＤＡＣは膵管から発生する極めて侵攻性の癌であり、世界中の癌関連死亡の最大４％を占め、５年生存率はわずか約２５％である（５）。
【００２７】
本明細書で使用される「試料」という用語は、例えばコア生検、針吸引生検などを含む切除または切開生検などの患者の癌からの癌性組織または細胞群を指す。「試料」は、癌からのＤＮＡを含む患者から得られた無細胞液であってもよい。
【００２８】
患者からの試料は、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を使用してスクリーニングできる。ＮＧＳは、数百万のＤＮＡテンプレートを大規模に並列配列できる技術を指す（３、４）。この用語には、第１世代のジデオキシ「サンガー」配列決定とは区別される、第２世代および第３世代の配列決定が含まれる。ＮＧＳ技術では、固体支持体マトリックス上でＤＮＡテンプレートのクローン増幅を行い、続いて周期的配列決定を行う。ＮＧＳの例には、ＭｉＳｅｑ（登録商標）、ＨｉＳｅｑ（登録商標）およびＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｃ．、サンディエゴ、カリフォルニア）などの製品の合成によるシーケンス（リバーシブルターミネーターベース）、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ（登録商標）、Ｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｎ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標）、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州ウォルサム）などの製品、およびＰＡＣＢＩＯ（登録商標）ＲＳＩＩ（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、メンロパーク、カリフォルニア州）などの単一分子リアルタイムシーケンスが含まれる。
【００２９】
「病原性変異」という用語は、癌などの特定の疾患または障害に対する個人の感受性または素因を高める遺伝子変化を指す。
【００３０】
「作用可能な変異」という用語は、癌などの特定の疾患または障害を効果的に治療する際に薬物が標的とする遺伝子または経路に影響を与える変異を指す（６、７）。作用可能な変異は、経路を標的とする治療が効果的であるように、既知の経路にマッピングされる（８）。そのような治療薬は、特にＰＤＣＡの治療のために、ＭＥＫ阻害剤、トラメチニブおよび多重チロシンキナーゼ阻害剤、レゴラフェニブなどの阻害剤を含んでもよい。
【００３１】
癌原遺伝子は、変異またはコピー数の増加によって活性化されると癌遺伝子になり、癌の一因となる正常な遺伝子である。癌原遺伝子は、細胞分裂またはアポトーシスの調節につながるシグナルを提供するなど、細胞内で様々な機能を有している可能性がある。
【００３２】
標的遺伝子の１つは変異ＫＲＡＳ遺伝子であり得る。変異したＫＲＡＳ癌遺伝子は、細胞の成長と分化を制御するマイトジェン活性化（ＭＡＰ）キナーゼ経路に寄与する（９）。ＫＲＡＳはＧＴＰにより活性化され、ＲＡＦキナーゼ、ＭＥＫキナーゼ、ＥＲＫキナーゼの連続的な活性化を引き起こし、ＥＲＫは転写因子をリン酸化して細胞増殖を引き起こす（１０）。作用性のあるＭＥＫ阻害剤の１つはトラメチニブで、これはＭＥＫのＲＡＦ依存性活性化を通じてＥＲＫリン酸化を抑制する（１１）。トラメチニブは、約１〜約３ｍｇ／日ＰＯ、特に２ｍｇ／日ＰＯで投与されてもよい。
【００３３】
標的遺伝子のもう１つは、異常に活性化されて癌遺伝子になると下流のシグナル伝達経路を乱し、増強された増殖、分化停止、細胞死に対する抵抗性を引き起こすタンパク質チロシンキナーゼをコードするＡＢＬ１癌原遺伝子でよい（１２）。作用可能なＡＢＬ１キナーゼ阻害剤の１つは、複数のプロテインキナーゼの阻害剤であるレゴラフェニブである（１３）。レゴラフェニブは、約８０〜約２４０ｍｇ／日ＰＯ、特に約１６０ｍｇ／日ＰＯで投与されてもよい。
【００３４】
様々な他の実施形態は、癌を有する患者の治療方法を特定するキットを対象とする。キットには、遺伝子と薬物の相互作用のリストが含まれる、患者由来の癌細胞の試料。ＮＧＳまたはその他の技法によって取得されたこれらの癌細胞の異常のリスト。キットは、可能な組み合わせ標的療法のリストを生成する。ＰＤＡＣを有する患者の治療方法を特定するためのキットでは、２つの標的遺伝子はＫＲＡＳおよびＡＢＬ１でよい。これらの２つの標的遺伝子には、トラメチニブ（ＭＥＫ阻害剤）とレゴラフェニブ（チロシンキナーゼ阻害剤）がキットに含まれる。キットにさらに含まれるのは、患者から得られた試料癌細胞を培養するための培地でよい。そのような培地は、例えば、カリフォルニア州カールスバッドのＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ−Ｇｉｂｃｏから入手できる１０％ＦＣＳ、１Ｘペニシリン／ストレプトマイシンおよび１Ｘアンホテリシンを補充したマッコイ改変５Ａ培地などの標準的な培地でよい。キットの各成分は、適切な説明書とともに１つ以上の容器にパッケージされる。
【実施例】
【００３５】
本教示の態様は、以下の実施例に照らしてさらに理解することができ、これらの実施例は、本教示の範囲を決して限定するものとして解釈されるべきではない。
【００３６】
実施例１
この実施例は、培養法で治療薬の組み合わせを使用して、癌細胞の複数の作用可能な変異を同時（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔｌｙ）に／同時（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ）に標的化する有効性を示す。
【００３７】
導入
癌治療は、依然として大部分が「すべてに適合する」アプローチであり、大半の治療選択肢と手順（例えば、手術、放射線療法、化学療法）が特定の種類の癌（例えば、肝臓癌、肺癌、結腸直腸癌）との闘いを主な目的とする（１４）。しかし、過去数年にわたり、次世代配列決定戦略の活用により、癌の感受性と進行を促進する遺伝子変化に関する知識が大幅に増加しただけでなく、個々の患者の癌の特有の性質を明らかに示している（１５）。これらの遺伝子変化の多くによって影響を受けるタンパク質と経路を標的とする治療法の開発の進歩とともに、これは一人の患者の癌を攻撃することを目的とした個別の癌治療戦略を利用する可能性を高めた（１６）。
【００３８】
この概念を支持する多くの研究が、いくつかの異なるタイプの癌の治療における特定の変異を標的とする単剤療法の有効性を実証している。いくつかのリスク（例えば、毒性および薬剤耐性）がないわけではないが、これらの研究の多くは、非標的アプローチと比較して、反応率と無増悪生存期間の大幅な増加を実証している（１６〜２０）。しかし、全ゲノムシーケンシングが実証しているように、癌ゲノムは一般に、単一遺伝子の変化ではなく、全体的な遺伝的不安定性（すなわち、変異の負荷）に起因する遺伝的異常のカクテルによって特徴付けられる（２１）。それにもかかわらず、標的化療法が実施されているほとんどの癌患者は、一般に、単剤適合異常（単剤療法）を目的とした療法で治療されている。これは、そのような標的化単剤療法の結果に基づいて、本明細書の発明者らが、患者の癌ゲノムプロファイルによって示される作用可能な変化のセット全体に適合する療法の組み合わせがより良い応答をもたらす可能性が高いと考えている事実にもかかわらず、そうである。
【００３９】
適合した併用療法の有効性の証明として、ヒト／患者の膵管腺癌に由来する確立された細胞株であるＣＡＰＡＮ２を使用して、インビトロ細胞ベースの生存率アッセイを実施した（２２）。この細胞株は特徴づけられており、いくつかの変異がある。そのいくつかは、細胞で見られる遺伝子異常の影響を受ける経路を特異的に阻害する利用可能なＦＤＡ承認薬と適合した（「適合」療法）。したがって、この研究では、次のいずれかで処理された細胞間で細胞生存率の比較が行われた：１）膵管癌（すなわち、ゲムシタビン）の標準治療（２３）、２）細胞内で変更された選択された単一／固有のシグナル伝達経路を標的とする個々の薬物／阻害剤との単独療法との適合、および３）選択された同じ異常に適合する併用療法。
【００４０】
材料および方法
材料
特に明記しない限り、ゲムシタビン、トラメチニブ、パルボシクリブ、およびレゴラフェニブを含むすべての化学物質は、ＳｅｌｌｅｃｋＣｈｅｍ（ヒューストン、テキサス州）から入手した。ＭｃＣｏｙの５Ａ修飾成長培地、ペニシリン−ストレプトマイシン、アンホテリシン、およびウシ胎児血清は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ−Ｇｉｂｃｏ（カリフォルニア州カールスバッド）から入手した。組織培養皿、血清ピペット、ピペットチップ、および微量遠心管を含むすべてのプラスチック製品は、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ミズーリ州セントルイス）製であった。
【００４１】
細胞株の選択
細胞株は、１，０００個の癌細胞株についてＤＮＡコピー数、ｍＲＮＡ発現、変異データなどの分析および視覚化へのアクセスを提供するＣａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ（ＣＣＬＥ）の分析によって選択された（２４）。関心のある細胞株の選択基準には以下が含まれる：１）細胞株が提示する変異の総数は、少なくとも５であるが、１０を超えてはならない（追加の交絡因子の複雑さを避けるため）、２）作用可能な標的の数は、少なくとも２つであるが、３つを超えるべきではない（試験する潜在的な薬物の組み合わせの数を制限するため）、３）変異は著しく重複することはなく、明確な発癌経路に影響を与えるべきである（薬物治療の重複を避けるため）。１８の細胞株のセットから、ヒト膵臓腺癌原発腫瘍に由来するＣＡＰＡＮ２を選択した。
【００４２】
細胞培養
ヒト膵臓癌細胞株ＣＡＰＡＮ２は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；バージニア州マナサス）から購入した。細胞は、１０％ＦＣＳ、１Ｘペニシリン／ストレプトマイシン、および１Ｘアムホテリシンを添加したＭｃＣｏｙ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ５Ａ培地で増殖させた。試験では、ＰＢＳ（カルシウムを含まない）で約３０分間、続いて０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡで、３７℃で５分間処理することにより、細胞を皿から放出した。細胞を１５ｍｌの遠心管に集め、臨床用遠心分離機で５分間遠心分離した後、１ｍｌの新鮮な培地に再懸濁し、血球計を使用して細胞をカウントした。細胞（１×１０３〜５×１０３）、メディアの１００μＬで９６ウェルプレートに播種し、細胞を４８時間インキュベートした。４８時間後、薬剤で処理する前に、培地を交換し、細胞をさらに２４時間再インキュベートした。
【００４３】
細胞処理、生存率アッセイ、用量反応評価
目的の細胞株に対応するゲノム情報（すなわち、変異状態、コピー数の変動など）を分析し、トラメチニブ（ＭＥＫＩＮＩＳＴ（登録商標）、ＫＲＡＳ活性化変異に対抗するＭＥＫ阻害剤）とレゴラフェニブ（ＳＴＩＶＡＲＧＡ（登録商標）、マルチキナーゼ阻害剤）の組み合わせＡＢＬ１活性化変異に対抗する）は、これらの２つの作用可能な変異を標的とするため、ＣＡＰＡＮ２細胞の潜在的な治療レジメンとして選択された。
【００４４】
原薬溶液は、製造元の指示に従ってＤＭＳＯで調製したマスター原液から完全な培地で調製した。これらの原液を使用して、レゴラフェニブとトラメチニブの１：１、２：１、５：１、および１０：１の体積−体積（ｖ／ｖ）混合物を調製した。次に、これらの混合物を２倍連続希釈して、それぞれの場合に２０の濃度範囲を生成した。細胞生存率アッセイ／評価の前に、細胞を薬物混合物中で４８〜７２時間インキュベートした。
【００４５】
細胞の生存率は、ＷＳＴ−１比色細胞増殖アッセイ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、製造元の指示に従って決定した。安定したテトラゾリウム塩ＷＳＴ−１は、主に細胞表面で発生する複雑な細胞メカニズムによって、可溶性ホルマザンに切断される。この減少は、生細胞におけるＮＡＤ（Ｐ）Ｈの解糖生産に大きく依存する。したがって、形成され、分光光度計（ＢＩＯ−ＴＥＫ  ３４０、ＢＩＯＴＥＫ）を使用して推定されるホルマザン色素の量は、培養中の代謝的に活性な細胞の数と直接相関する。すべての試験ポイントは、少なくとも３回行った。
【００４６】
データは、Ｅｘｃｅｌ  ２０１６（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）、およびＤｒ  Ｆｉｔ（Ｄｒ  Ｆｉｔソフトウェア）で処理された（１２）。データを使用して用量反応曲線を作成し、２０％、２５％、または４０％の成長阻害（それぞれＩＣ２０、ＩＣ２５、およびＩＣ４０）を示す薬物濃度をさらに分析するために決定した。
【００４７】
アイソボログラム分析
組み合わせて投与された薬物は、個々の効能から予測される効果よりも大きいまたは小さい効果を発揮することがある。薬物の組み合わせの効果を評価するために、薬物ペア間の相乗効果、相加性、または拮抗作用を検出するアイソボログラム分析を実施した（２６）。一般に、薬物ペアが各薬物単独の場合と比較して阻害効力を改善する場合、その組み合わせは相乗的とみなされる。効力が変わらない場合、効果は相加的とみなされる。また、効力が低下した場合、その効果は拮抗的とみなされる。トラメチニブとレゴラフェニブの用量依存的相互作用を説明するために、癌細胞増殖の効果レベル２０％、２５％、４０％の阻害のアイソボログラムを作成した。これらのそれぞれにおいて、相加性は、その単一の使用（ＩＣ２０、ＩＣ２５、およびＩＣ４０）からの組み合わせで各薬物の用量要件を推定することにより決定された。相加性の線の上または下のデータポイントは、それぞれ拮抗作用または相乗効果を示す。
【００４８】
イソボログラムは、ｙ軸にトラメチニブの濃度を、ｘ軸にレゴラフェニブの濃度をプロットすることによって作成した。相加性のアイソボールは、各薬物（単剤療法で使用する場合）のＩＣ２０（またはＩＣ２５、ＩＣ４０）をそれぞれの軸にプロットし、それらを対角線で結ぶことによって生成した。異なる用量比でのトラメチニブとレゴラフェニブの組み合わせの効果は、このＸＹグラフにそれぞれのＩＣ２０（またはＩＣ２５、ＩＣ４０）をプロットすることにより決定した。
【００４９】
統計分析
すべての値は、平均＋／−ＳＤとして報告された。スチューデントのｔ検定を使用して、治療間の違いを評価した。０．０５以下のｐ値は、すべての結果の有意性とみなされた。
【００５０】
結果
細胞株の選択。
選択した薬物レジメンの有効性を試験する細胞株は、約１，０００個の細胞株の分子注釈を含むデータベースから選択された（Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ、ＣＣＬＥ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ／Ｂｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（２４）。多数の基準（例えば、変異の数と種類、変異の病原性と作用性）を使用して、目的の細胞株のリストを１８の可能な選択肢に減らした（表１）。
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【００５１】
このリストから、５６歳の白人男性の膵管腺癌（ＰＤＡＣ）に由来する上皮細胞株であるＣＡＰＡＮ２（２３）が分析のために選択された。最適な培養条件では、細胞は約９６時間の倍加時間を示す（９）。ＣＣＬＥによると、ＣＡＰＡＮ２細胞は約８個のミスセンス変異を有しており、そのうち３個（ＫＲＡＳ  ｐ．Ｇ１２Ｖ；ＡＢＬ１  ｐ．Ｇ１０６０Ｄ；ＦＡＮＣＣ  ｐ．Ｅ５２１Ｋ）が作用可能な標的であることが判明した（表１）。しかし、ＦＡＮＣＣ  ｐ．Ｅ５２１Ｋはヘテロ接合性の変異であり、その機能的意義は不明であるため（２７）、他の２つの作用可能な変異に注目した。
【００５２】
ＫＲＡＳ
小さなＧＴＰａｓｅであるＫＲＡＳは、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）シグナル伝達経路への関与を通じて、細胞の成長と増殖の調節に機能する（図６）。通常の条件下では、成長因子（例えば、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ）が対応する受容体チロシンキナーゼ（例えば、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ）に結合するとＫＲＡＳが活性化される。ＫＲＡＳのこの誘導性の活性化は、その後、下流の分子であるＲＡＦ（ＡＲＡＦ、ＢＲＡＦおよびＣＲＡＦ）を刺激し、続いて下流のマイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼキナーゼ、ＭＥＫ１およびＭＥＫ２、ＥＲＫ１およびＥＲＫ２をリン酸化および活性化する（図６）。最終的に、ＥＲＫ１／２は核に移行し、細胞増殖に必要な遺伝子の転写を増強する。成長因子の刺激がない場合、ＫＲＡＳは通常、ＧＴＰのＧＤＰへの脱リン酸化によって不活性化されたままになる。しかし、変異型では、ＫＲＡＳはＧＴＰをＧＤＰに切断する能力を失い、したがって（成長因子が結合していない場合でも）構成的に活性を維持し、制御されない連続的な細胞増殖と成長をもたらす。
表２．ＣＡＰＡＮ２細胞で見つかった遺伝子異常のリスト。変更された遺伝子がリストされ、それらのゲノム配列（既知の場合）および結果のタンパク質配列が表示される。タンパク質の機能に対する変異の影響、および異常が作用するかどうか（すなわち、変異効果を直接または間接的に治療する薬剤があるか）も示されている。
【表２】
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【００５３】
すべてのＰＤＡＣの約９０％がＫＲＡＳの活性化変異を示し、ＰＤＡＣで最も頻繁に変異する腫瘍性タンパク質になる（１５）。さらに、置換ｐ．Ｇ１２Ｖなどのコドン１２の変異は、ＰＤＡＣのすべてのＫＲＡＳ変異の約９８％を占める（１６）。ｐ．Ｇ１２Ｖ変異は、キナーゼの構成的活性化を引き起こし（１７）、結腸直腸および非小細胞肺腺癌などの追加の腫瘍タイプで観察される。
【００５４】
ＡＢＬ１
ＡＢＬ１癌原遺伝子は、細胞分化、細胞分裂、細胞接着、ストレス応答に関与する非受容体型チロシンキナーゼをコードする（３１）（図７）。ＡＢＬ１は一般的な細胞内局在を示し、核、細胞質で見られ、アクチン細胞骨格に結合する（３２）。核では、ＡＢＬ１は細胞周期依存性およびＤＮＡ損傷誘導性の転写の制御に機能する（３３）。細胞質では、この非受容体型チロシンキナーゼは遊離しており、糸状アクチンに結合する。遊離分子として、ＡＢＬ１はいくつかの潜在的な調節シグナルの下流にあり、細胞の侵入と成長に関与する多くの下流タンパク質の活性を調節し、アクチン細胞骨格に結合している間、このキナーゼ活性はオフになる（３３）（図７）。
【００５５】
チロシンキナーゼの構成的発現とさらなる過活動につながる慢性骨髄性白血病の特徴である（３４）、発癌性融合タンパク質ＢＣＲ−ＡＢＬ１の十分に確立された役割とは対照的に、固形腫瘍の点変異により変異した場合のＡＢＬ１のその役割についてはあまり知られていない（３１）。ただし、この非受容体型チロシンキナーゼを活性化して細胞の形質転換を引き起こすことがわかっているＡＢＬ１のチロシンキナーゼドメイン内にある多くの点変異とは異なり（３５）、これらの細胞で見られるＡＢＬ１のｐ．Ｇ１０６０Ｄ変異はキナーゼのアクチン結合ドメインで発生する。機能的に特徴付けられていないが、このドメインはアクチン細胞骨格へのキナーゼの細胞内局在の主要な決定因子であるため（ＡＢ１キナーゼ活性をブロックする）、これまでに特定されたＡＢＬ１変異の形質転換は、細胞質の蓄積のみをもたらすキナーゼ（３３，３４）−タンパク質がＦ−アクチンに結合するとＡＢＬ１のキナーゼ活性が阻害されるため、この変化はその細胞質レベルの増加とさらなる活性化をもたらすと推定される（３２、３５）。
【００５６】
薬物治療
ゲムシタビン単剤療法。
ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））単独療法は、数十年間膵臓癌の標準治療であり、この疾患の治療に使用される最も一般的な細胞毒性薬である（２３）。このピリミジン類似体は細胞内でリン酸化され、ＤＮＡ合成を阻害するＤＮＡに組み込まれるため（３７）、すべての増殖性細胞を標的とし（腫瘍細胞に制限されない）、したがって重要な副作用（好中球減少症による重度の骨髄抑制、および出血、脱毛症、吐き気と嘔吐、疲労など）をもたらす。ゲムシタビン治療は、最良の支持療法と比較して全生存期間に関してわずかな改善しかもたらさないという事実にもかかわらず（３ヶ月と比較して５〜６ヶ月）、２０１７年の時点で、ゲムシタビンは進行膵臓癌の標準治療のままである。（３８）。
【００５７】
この研究では、ＣＡＰＡＮ２細胞を２ｎＭから１ｍＭの範囲の濃度のゲムシタビンの２倍連続希釈液で４８〜７２時間処理した。これらの培養条件下で、ゲムシタビンは細胞の生存にほとんど影響を与えないことがわかった（図１Ａ）（ＩＣ２０＝１１１μＭ、１ｍＭの濃度で約３０％の細胞生存率の低下のみを達成）（ｐ≦０．００１）。
【００５８】
トラメチニブ単剤療法。
ＣＡＰＡＮ２細胞では、ＫＲＡＳのｐ．Ｇ１２Ｖ変異により、ＭＡＰＫシグナル伝達経路のＫＲＡＳの下流にある構成的に活性なマイトジェン／細胞外シグナル関連キナーゼ（ＭＥＫ）が生じる（図６）。ＭＥＫの選択的阻害剤としてのトラメチニブ（ＭＥＫＩＮＩＳＴ（登録商標））は、この構成的に活性化される経路の下流阻害剤である（３９）。ゲムシタビンによる治療とは対照的に、４８〜７２時間にわたって１００μＭ〜０．２ｎＭの範囲の濃度のトラメチニブの単独療法で治療されたＣＡＰＡＮ２細胞は、細胞生存率を有意に低下させ、ＩＣ２０は４ｎＭ（ｐ≦０．０５）およびＩＣ５０  ２８ｎＭ（ｐ≦０．０５）（図１Ｂ）であった。
【００５９】
レゴラフェニブ単剤療法。
上記のように、ＡＢＬ１のｐ．Ｇ１０６０Ｄ変異は、この非受容体型チロシンキナーゼの細胞質濃度の増加につながる活性化変異である可能性が高い（図７）。レゴラフェニブ（ＳＴＩＶＡＲＧＡ（登録商標））は、ＲＥＴ、ＶＥＧＦＲ１−３、ＦＧＦＲ１−２、ＴＩＥ２、およびＡＢＬ１をはじめとする受容体および非受容体型チロシンキナーゼを標的とするマルチキナーゼ阻害剤である（４０）。したがって、活性化された経路を阻害するはずである。レゴラフェニブ単独の２倍連続希釈（つまり、２ｎＭから１ｍＭの範囲の濃度）でＣＡＰＡＮ２細胞を処理すると、細胞生存率が大幅に低下し、ＩＣ２０は約２μＭ（ｐ≦０．０５）（図１Ｃ）および７．１μＭのＩＣ５０（ｐ≦０．０５）であった。
【００６０】
パルボシクリブ単剤療法。
膵管腺癌は、ｐ１６ｉｎｋ４ａタンパク質（サイクリン依存性キナーゼ４および６（ＣＤＫ４／６）の阻害剤）をコードする腫瘍抑制遺伝子であるＣＤＫＮ２Ａの喪失またはサイレンシングを含む、一連の遺伝的変化を示すことがわかっている（４１）。ＣＤＫＮ２Ａの機能変異の喪失は、ＣＤＫ４およびＣＤＫ６を介した細胞周期の調節解除をもたらし、細胞増殖を増強する。ＣＡＰＡＮ２細胞のＣＤＫＮ２Ａの状態は不明のままであるが、一部のグループはｐ１６タンパク質の発現を実証しており、他のグループはこれらの細胞でＣＤＫＮ２Ａが不活性化されていることを示す（４２）。細胞を、ＣＤＫ４／６阻害剤の２倍連続希釈、１２５μＭ〜２ｎＭの範囲の濃度のパルボシクリブで４８〜７２時間処理した。Ｐａｌｂｏｃｉｃｌｉｂは、この研究で使用したＣＡＰＡＮ２細胞の生存に有意な影響を及ぼさないことがわかった（図１Ｄ）（ＩＣ２０＝１５ｍＭ）。この発見は、ｐ１６機能活性の持続性を実証し、少なくともこの特定のＣＡＰＡＮ２細胞株では、増殖がＣＤＫ４および／またはＣＤＫ６に依存しないことを示す。さらに、この結果により、パルボシクリブは、比類のない単独療法として、陰性対照としても機能する。
【００６１】
トラメチニブとレゴラフェニブの併用療法。
次に、トラメチニブとレゴラフェニブによるＣＡＰＡＮ２細胞の同時治療を使用して、ＣＡＰＡＮ２細胞の生存に対する適合した併用療法の効果を調査した。これら２つの阻害剤を１：１の濃度で共投与すると、ＩＣ２０が２ｎＭのいずれかの薬物単独治療（単剤療法）と比較して、細胞死が大幅に増加した（図２）。
【００６２】
興味深いことに、これらの薬物のこの１：１の組み合わせの細胞生存率の用量反応曲線は、１５ｎＭから１μＭの間で効率の損失を伴う、２相性のＵが反転した形状を示す（図２）。それにもかかわらず、この効果の直前と直後に位置する濃度の２つの領域を調べると、レゴラフェニブとトラメチニブ単独では−２％、−１０％と比較して、統計的に有意な細胞死の増加が示されており（図２Ｂ〜２Ｃ）（１：１の組み合わせで、３００ｎＭで−５５％）（ｐ≦０．０５））、このことは細胞増殖に対する薬物の組み合わせの潜在的な相乗的阻害効果を示す。
【００６３】
両方の薬物の存在が各薬物単独の個々の効果を増強するかどうかを調査するために、「固定比率モデル」が採用された（４３〜４５）。このモデルでは、Ｌｏｅｗｅの（４３〜４５）の概念に基づいて、各用量反応曲線（薬物単独または併用）の勾配とＩＣＸ値に基づいて組み合わせ指数（ＣＩ）値が計算され、薬物間相互作用は、相乗的（ＣＩ＜１）、相加的（ＣＩ＝１）、または拮抗的（ＣＩ＞１）（Ｆｉ．４）である。これに続いて、細胞生存率の２０％の減少をもたらす組み合わせ指数（ＣＩ）は０．３４５に等しく、細胞生存率の２５％は０．３２０に等しく、一方、４０％の生存率は１よりも大きいことがわかった。これは、ＥＤ８０とＥＤ７５の場合、両方の薬物を同じ濃度で使用すると、ＣＡＰＡＮ２細胞の増殖に対する薬物の組み合わせの相乗効果があることを示す。（３３）。
【００６４】
しかし、トラメチニブに対するレゴラフェニブの２：１濃度での薬物の同時投与は多少異なっていた（図３）。上記のように、二相性の用量反応曲線が見られ、細胞死の増加の２つの領域は、濃度０．７８〜０．３９μＭから６．２５／３．１２５μＭの、明らかに増加した細胞生存の小さな領域に隣接する（図４Ｂ、４Ｃ）。それにもかかわらず、両方の場合（例えば、１：１、２：１濃度）、細胞生存の全体的なレベルはレゴラフェニブ単独で見られるものよりも著しく低く（図２〜３）、薬物の組み合わせは相乗的である（ＣＩ２０％＝０．５６８、ＣＩ２５％＝０．５４６、ＣＩ４０％＝０．４７１の場合、比率２：１を使用し、ＣＩ５０％は１を超えていた）（図４）。同様の実験を、トラメチニブに対するレゴラフェニブの５：１および１０：１の濃度で実施したが、これらの濃度比で細胞死の有意な差は見られなかった（データは非表示）。
【００６５】
トラメチニブとレゴラフェニブの細胞毒性は、膵管腺癌の癌細胞で相乗作用する。
次に相乗効果の読み取り値として、アイソボログラムを作成し、２０％、２５％、４０％の癌細胞死における各薬物の用量要件を決定した。図５に示すように、レゴラフェニブ：トラメチニブノ１：１と２：１の組み合わせのアイソボールは、各相乗効果を示す効果レベル毎に追加のアイソボールを下回った。５：１および１０：１のレゴラフェニブ：トラメチニブの組み合わせでのアイソボールは、各効果レベルで付加的なアイソボールに非常に近く、組み合わせの僅かな付加的な効果を示す（データ非表示）。
【００６６】
討論
膵臓癌の８０％以上は腺管腺癌（ＰＤＡＣ）であり（４７）、癌関連死の４番目に多い原因として、最も致命的な固形悪性腫瘍の１つである（４８）。ゲムシタビンは１０年超にわたって高度ＰＤＡＣの唯一の有効な標準レジメンだったが、この疾患の５年生存率は過去４０年間で大幅に改善されていない（３８）。
【００６７】
すべてのＰＤＡＣの約９０％が、ＰＤＡＣで最も頻繁に変異する癌遺伝子／タンパク質であるＫｉｒｓｔｅｎラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）に変異を示す（２８）。さらに、ｐ．Ｇ１２Ｖ（この研究で使用されたＣＡＰＡＮ２細胞に見られる）などのコドン１２の変異は、ＰＤＡＣのすべてのＫＲＡＳ変異の約９８％を占める（２９）。ｐ．Ｇ１２Ｖ変異は、このプロテインキナーゼの構成的活性化を引き起こし、細胞増殖、運動性、接着、浸潤、アポトーシスの遮断、化学療法に対する耐性の制御されない増加を媒介する一連の下流シグナル伝達イベントをもたらす（３０）。それにもかかわらず、特定のＲＡＳ阻害剤は特定されておらず、このプロテインキナーゼは「ドラッグ不可能」であると広く認識されている（４９）。
【００６８】
それにもかかわらず、少なくとも間接的に、その下流のエフェクターの阻害を通じてＫＲＡＳ機能をブロックできる治療薬の開発と商業化が開発された。例えば、ＭＥＫの選択的阻害剤であるトラメチニブ（ＭＥＫＩＮＩＳＴ（登録商標））は、ＫＲＡＳ  ｐ．Ｇ１２Ｖ変異によって構成的に活性化されるＭＡＰキナーゼシグナル伝達経路の下流阻害剤であり（４９）、そのようなＭＡＰキナーゼ阻害剤はＲＡＳを標的とする重要な治療法であることが証明されている（４０）。
【００６９】
非受容体型チロシンキナーゼであるＡＢＬ１は、細胞の成長、生存、侵入、接着、移動を制御する細胞プロセスの多様なセットを制御する（３１）。これらのＣＡＰＡＮ２細胞に見られるＡＢＬ１のｐ．Ｇ１０６０Ｄ変異は、キナーゼのアクチン結合ドメインで発生し、機能的に特徴付けられていないが、これは活性化変異であると考えられている。ＡＢＬの細胞質レベル、したがってそのキナーゼ活性は、線維状アクチン細胞骨格への結合によってブロックされる（３３、３４）。マルチキナーゼ阻害剤レゴラフェニブは、ＡＢＬ１を含む非受容体型チロシンキナーゼを標的とすることが示される（４０）。
【００７０】
本研究では、トラメチニブとレゴラフェニブの両方（個別および組み合わせ）が、ＫＲＡＳおよびＡＢＬ１の活性化変異をもつＣＡＰＡＮ２細胞の細胞増殖を阻害することを示す。実際、これらの２つの阻害剤の組み合わせは、単独の薬物のいずれよりもはるかに低い濃度で細胞死の増加につながることがわかった（図１〜３）。観察された薬物間相互作用の正確なタイプを評価するために、アイソボログラム分析が適用された。この方法は、作用機序に関係なく、活性剤の組み合わせの有効性の評価を可能にする（３８、３９）。レゴラフェニブとトラメチニブの１：１の組み合わせと２：１の組み合わせの両方が、ＥＣ８０とＥＣ７５で細胞死に相乗効果をもたらし、一方、これら２つの薬剤の２：１の組み合わせは、ＥＣ６０での細胞死に対して相乗効果があることがわかった（図５）。
【００７１】
細胞をトラメチニブとレゴラフェニブの組み合わせで処理した場合に観察された二相性応答は、いずれかの適合単剤療法での処理後、どの濃度でも見られなかった（図１〜３）。この二相性の反応は、様々な化学物質で処理された多くのヒト腫瘍細胞株で報告されているホルム効果を連想させる（５３）。この効果の正確な原因は不明であるが、ホルミシスは、少なくとも部分的には、ストレスに対する細胞の反応が原因であると考えられている（５３）。上記のように、どちらかの薬物単独での治療ではそのような効果が示されなかったことは興味深い。両方の薬物を組み合わせて使用した場合にのみ現れ、まだ決定されていないが、いくつかの濃度でのキナーゼの組み合わせ阻害がいずれかの薬物単独よりも細胞に対しておそらくよりストレスがかかる可能性を高める。
【００７２】
全体として、この研究は、ゲノムの変化に適合する単剤療法および抗癌剤の組み合わせの体系的分析を報告し、次の概念をサポートしている：１）作用可能な変化を標的とする適合単剤療法は、標準治療に比べて細胞死の顕著な増加を与える、２）さらに重要なことは、適合併用療法は、適合単剤療法または標準治療よりも効果的な治療を提供する可能性があることである。癌腫瘍のゲノミクス分析、および薬剤の設計と開発における最近の進歩と合わせて考えると、研究者と臨床医が癌を個人の病気として治療する機会と手段を持っていることは明らかである。
【００７３】
その他の実施形態
上記の詳細な説明は、本発明を実施する際に当業者を支援するために提供される。しかし、本明細書に記載および請求される本発明は、本明細書に開示される特定の実施形態によって範囲が限定されるものではない。同等の実施形態は、本発明の範囲内にあるものとする。実際、本明細書に示し説明したものに加えて、本発明の発見の趣旨または範囲から逸脱しない前述の説明から、本発明の様々な修正が当業者には明らかになるであろう。そのような修正も、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。
【００７４】
引用文献
本出願で引用されたすべての出版物、特許、特許出願および他の参考文献は、すべての目的のためにその全体が参照により、個々の出版物、特許、特許出願または他の参考文献が具体的かつ個別に組み込まれることが示されているのと同程度に、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。本明細書における参考文献の引用は、それが本発明の先行技術であることの承認として解釈されるべきではない。
【００７５】
本発明の範囲内にあることが特に意図され、その全体が参照により本明細書に組み込まれるのは、以下の刊行物である。
【００７６】
１．Ｂｅｎｎｅｔｔ  ＣＷ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６），Ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｅｒｖｉｃｅ  ｏｆ  ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ｆｏｒ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ  ７：７１０１３−７１０３５．
【００７７】
２．ｄｅ  Ｂｏｎｏ  ＪＳ１  ｅｔ  ａｌ．（２０１０），Ｔｒａｎｓｌａｔｉｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎｔｏ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４６７：５４３−５４９．
【００７８】
３．Ｌｕｔｈｒａ  Ｒ（２０１５）  Ｎｅｘｔ−Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ：Ａｄｖａｎｔａｇｅｓ  ａｎｄ  Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ，Ｃａｎｃｅｒｓ  ７：２０２３−２０３６．
【００７９】
４．Ｍｅｌｄｒｕｍ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）  Ｎｅｘｔ−Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｒｅｖ  ３２：１７７−１９５．
【００８０】
５．Ｄｉｗａｋａｒｌａ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）  Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｄｕｃｔａｌ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  −  Ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｏｐｔｉｏｎｓ，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  ２３：２２７６−２２８５．
【００８１】
６．Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ  ＣＣ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）  Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｃａｐｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｃｔｉｏｎａｂｌｅ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ，Ｃｏｐｙ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ  ｉｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  １６：５７−６７．
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７．Ｋｏｕ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．２０１７，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂａｓｅｄ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｇｅｎｅ  ａｓｓａｙ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒｓ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ  Ａｐｒ  ２５．ｄｏｉ：１０．１１１１／ｃａｓ．１３２６５．［Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ］．
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１３．Ｌｉｎ  Ｘ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）  Ｒｅｇｏｒａｆｅｎｉｂ  ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ｖｉａ  ＣＸＣＲ４  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｗｎｔ  ｐａｔｈｗａｙ  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  １０；１２（５）
【００８９】
１４．Ｍｏｒｇａｎ，Ｍ．Ｍ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｂ．Ｐ．，Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ，Ｍ．Ｋ．，Ｓｃｈｕｌｅｒ，Ｌ．Ａ．，Ａｌａｒｉｄ，Ｅ．Ｔ．，Ｓｕｎｇ，Ｋ．Ｅ．，ａｎｄ  Ｂｅｅｂｅ，Ｄ．Ｊ．（２０１６）  Ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｏｄｅｌｓ  ｔｏ  ｐｒｅｄｉｃｔ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ：Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ  ａｎｄ  ａ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｆｏｒ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ  １６５，７９−９２
【００９０】
１５．Ｍａｒｔｉｎｉ，Ｍ．，Ｖｅｃｃｈｉｏｎｅ，Ｌ．，Ｓｉｅｎａ，Ｓ．，Ｔｅｊｐａｒ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｂａｒｄｅｌｌｉ，Ａ．（２０１１）  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ：ｈｏｗ  ｐｅｒｓｏｎａｌ  ｓｈｏｕｌｄ  ｗｅ  ｇｏ？Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ９，８７−９７
【００９１】
１６．Ｓｃｈｗａｅｄｅｒｌｅ，Ｍ．，Ｚｈａｏ，Ｍ．，Ｌｅｅ，Ｊ．Ｊ．，Ｅｇｇｅｒｍｏｎｔ，Ａ．Ｍ．，Ｓｃｈｉｌｓｋｙ，Ｒ．Ｌ．，Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ，Ｊ．，Ｌａｚａｒ，Ｖ．，ａｎｄ  Ｋｕｒｚｒｏｃｋ，Ｒ．（２０１５）  Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ｉｎ  Ｄｉｖｅｒｓｅ  Ｃａｎｃｅｒｓ：Ａ  Ｍｅｔａ−Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｈａｓｅ  ＩＩ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ３３，３８１７−３８２５
【００９２】
１７．Ｈｅｎａｒｙ，Ｈ．，Ｈｏｎｇ，Ｄ．Ｓ．，Ｆａｌｃｈｏｏｋ，Ｇ．Ｓ．，Ｔｓｉｍｂｅｒｉｄｏｕ，Ａ．，Ｇｅｏｒｇｅ，Ｇ．Ｃ．，Ｗｅｎ，Ｓ．，Ｗｈｅｌｅｒ，Ｊ．，Ｆｕ，Ｓ．，Ｎａｉｎｇ，Ａ．，Ｐｉｈａ−Ｐａｕｌ，Ｓ．，Ｊａｎｋｕ，Ｆ．，Ｋｉｍ，Ｋ．Ｂ．，Ｈｗｕ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｋｕｒｚｒｏｃｋ，Ｒ．（２０１３）  Ｍｅｌａｎｏｍａ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｉｎ  ａ  ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｃｌｉｎｉｃ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｂｅｒｒａｔｉｏｎｓ，ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｏｕｔｃｏｍｅｓ．Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２４，２１５８−２１６５
【００９３】
１８．Ｖｏｎ  Ｈｏｆｆ，Ｄ．Ｄ．，Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ，Ｊ．Ｊ．，Ｊｒ．，Ｒｏｓｅｎ，Ｐ．，Ｌｏｅｓｃｈ，Ｄ．Ｍ．，Ｂｏｒａｄ，Ｍ．Ｊ．，Ａｎｔｈｏｎｙ，Ｓ．，Ｊａｍｅｓｏｎ，Ｇ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｓ．，Ｃａｎｔａｆｉｏ，Ｎ．，Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｄ．Ａ．，Ｆｉｔｃｈ，Ｔ．Ｒ．，Ｗａｓｓｅｒｍａｎ，Ｅ．，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｃ．，Ｇｒｅｅｎ，Ｓ．，Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，Ｗ．，Ｂｉｔｔｎｅｒ，Ｍ．，Ａｌａｒｃｏｎ，Ａ．，Ｍａｌｌｅｒｙ，Ｄ．，ａｎｄ  Ｐｅｎｎｙ，Ｒ．（２０１０）  Ｐｉｌｏｔ  ｓｔｕｄｙ  ｕｓｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ’  ｔｕｍｏｒｓ  ｔｏ  ｆｉｎｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔａｒｇｅｔｓ  ａｎｄ  ｓｅｌｅｃｔ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  ｃａｎｃｅｒｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２８，４８７７−４８８３
【００９４】
１９．Ｗｅｉｓｓ，Ｇ．Ｊ．，Ｌｉａｎｇ，Ｗ．Ｓ．，Ｄｅｍｅｕｒｅ，Ｍ．Ｊ．，Ｋｉｅｆｅｒ，Ｊ．Ａ．，Ｈｏｓｔｅｔｔｅｒ，Ｇ．，Ｉｚａｔｔ，Ｔ．，Ｓｉｎａｒｉ，Ｓ．，Ｃｈｒｉｓｔｏｆｏｒｉｄｅｓ，Ａ．，Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｊ．，Ｋｕｒｄｏｇｌｕ，Ａ．，Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｌ．，Ｂｅｎｓｏｎ，Ｈ．，Ｒｅｉｍａｎ，Ｒ．，Ｂａｋｅｒ，Ａ．，Ｍａｒｓｈ，Ｖ．，Ｖｏｎ  Ｈｏｆｆ，Ｄ．Ｄ．，Ｃａｒｐｔｅｎ，Ｊ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｃｒａｉｇ，Ｄ．Ｗ．（２０１３）  Ａ  ｐｉｌｏｔ  ｓｔｕｄｙ  ｕｓｉｎｇ  ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｃａｎｃｅｒｓ：ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ８，ｅ７６４３８
【００９５】
２０．Ｔｓｉｍｂｅｒｉｄｏｕ，Ａ．Ｍ．，Ｗｅｎ，Ｓ．，Ｈｏｎｇ，Ｄ．Ｓ．，Ｗｈｅｌｅｒ，Ｊ．Ｊ．，Ｆａｌｃｈｏｏｋ，Ｇ．Ｓ．，Ｆｕ，Ｓ．，Ｐｉｈａ−Ｐａｕｌ，Ｓ．，Ｎａｉｎｇ，Ａ．，Ｊａｎｋｕ，Ｆ．，Ａｌｄａｐｅ，Ｋ．，Ｙｅ，Ｙ．，Ｋｕｒｚｒｏｃｋ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｂｅｒｒｙ，Ｄ．（２０１４）  Ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ｆｏｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｐｒｏｇｒａｍ  ａｔ  ＭＤ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ：ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｌａｎｄｍａｒｋ  ａｎａｌｙｓｅｓ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０，４８２７−４８３６
【００９６】
２１．Ｋａｓｓ，Ｅ．Ｍ．，Ｍｏｙｎａｈａｎ，Ｍ．Ｅ．，ａｎｄ  Ｊａｓｉｎ，Ｍ．（２０１６）  Ｗｈｅｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  Ｇｏｅｓ  Ｂａｄｌｙ  Ａｗｒｙ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ６２，７７７−７８７
【００９７】
２２．Ｋｙｒｉａｚｉｓ，Ａ．Ａ．，Ｋｙｒｉａｚｉｓ，Ａ．Ｐ．，Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ，Ｃ．Ｎ．，Ｓｌｏａｎｅ，Ｎ．Ｈ．，ａｎｄ  Ｌｏｖｅｌｅｓｓ，Ｊ．Ｄ．（１９８６）  Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ，ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，ａｎｄ  ｋａｒｙｏｔｙｐｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｄｕｃｔａｌ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  Ｃａｐａｎ−２  ｉｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｎｕｄｅ  ｍｏｕｓｅ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４６，５８１０−５８１５
【００９８】
２３．Ｔｈｏｔａ，Ｒ．，Ｐａｕｆｆ，Ｊ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｂｅｒｌｉｎ，Ｊ．Ｄ．（２０１４）  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｌｉｓｔｏｎ  Ｐａｒｋ）  ２８，７０−７４
【００９９】
２４．Ｂａｒｒｅｔｉｎａ，Ｊ．，Ｃａｐｏｎｉｇｒｏ，Ｇ．，Ｓｔｒａｎｓｋｙ，Ｎ．，Ｖｅｎｋａｔｅｓａｎ，Ｋ．，Ｍａｒｇｏｌｉｎ，Ａ．Ａ．，Ｋｉｍ，Ｓ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｃ．Ｊ．，Ｌｅｈａｒ，Ｊ．，Ｋｒｙｕｋｏｖ，Ｇ．Ｖ．，Ｓｏｎｋｉｎ，Ｄ．，Ｒｅｄｄｙ，Ａ．，Ｌｉｕ，Ｍ．，Ｍｕｒｒａｙ，Ｌ．，Ｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｆ．，Ｍｏｎａｈａｎ，Ｊ．Ｅ．，Ｍｏｒａｉｓ，Ｐ．，Ｍｅｌｔｚｅｒ，Ｊ．，Ｋｏｒｅｊｗａ，Ａ．，Ｊａｎｅ−Ｖａｌｂｕｅｎａ，Ｊ．，Ｍａｐａ，Ｆ．Ａ．，Ｔｈｉｂａｕｌｔ，Ｊ．，Ｂｒｉｃ−Ｆｕｒｌｏｎｇ，Ｅ．，Ｒａｍａｎ，Ｐ．，Ｓｈｉｐｗａｙ，Ａ．，Ｅｎｇｅｌｓ，Ｉ．Ｈ．，Ｃｈｅｎｇ，Ｊ．，Ｙｕ，Ｇ．Ｋ．，Ｙｕ，Ｊ．，Ａｓｐｅｓｉ，Ｐ．，Ｊｒ．，ｄｅ  Ｓｉｌｖａ，Ｍ．，Ｊａｇｔａｐ，Ｋ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｍ．Ｄ．，Ｗａｎｇ，Ｌ．，Ｈａｔｔｏｎ，Ｃ．，Ｐａｌｅｓｃａｎｄｏｌｏ，Ｅ．，Ｇｕｐｔａ，Ｓ．，Ｍａｈａｎ，Ｓ．，Ｓｏｕｇｎｅｚ，Ｃ．，Ｏｎｏｆｒｉｏ，Ｒ．Ｃ．，Ｌｉｅｆｅｌｄ，Ｔ．，ＭａｃＣｏｎａｉｌｌ，Ｌ．，Ｗｉｎｃｋｌｅｒ，Ｗ．，Ｒｅｉｃｈ，Ｍ．，Ｌｉ，Ｎ．，Ｍｅｓｉｒｏｖ，Ｊ．Ｐ．，Ｇａｂｒｉｅｌ，Ｓ．Ｂ．，Ｇｅｔｚ，Ｇ．，Ａｒｄｌｉｅ，Ｋ．，Ｃｈａｎ，Ｖ．，Ｍｙｅｒ，Ｖ．Ｅ．，Ｗｅｂｅｒ，Ｂ．Ｌ．，Ｐｏｒｔｅｒ，Ｊ．，Ｗａｒｍｕｔｈ，Ｍ．，Ｆｉｎａｎ，Ｐ．，Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｌ．，Ｍｅｙｅｒｓｏｎ，Ｍ．，Ｇｏｌｕｂ，Ｔ．Ｒ．，Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，Ｍ．Ｐ．，Ｓｅｌｌｅｒｓ，Ｗ．Ｒ．，Ｓｃｈｌｅｇｅｌ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｇａｒｒａｗａｙ，Ｌ．Ａ．（２０１２）  Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｅｎａｂｌｅｓ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ  ｏｆ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｄｒｕｇ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ  ４８３，６０３−６０７
【０１００】
２５．Ｄｉ  Ｖｅｒｏｌｉ，Ｇ．Ｙ．，Ｆｏｒｎａｒｉ，Ｃ．，Ｇｏｌｄｌｕｓｔ，Ｉ．，Ｍｉｌｌｓ，Ｇ．，Ｋｏｈ，Ｓ．Ｂ．，Ｂｒａｍｈａｌｌ，Ｊ．Ｌ．，Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｆ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｊｏｄｒｅｌｌ，Ｄ．Ｉ．（２０１５）  Ａｎ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｆｉｔｔｉｎｇ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ａｎｄ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｆｏｒ  ｄｏｓｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｃｕｒｖｅｓ  ｗｉｔｈ  ｍｕｌｔｉｐｈａｓｉｃ  ｆｅａｔｕｒｅｓ．Ｓｃｉ  Ｒｅｐ  ５，１４７０１
【０１０１】
２６．Ｔａｌｌａｒｉｄａ，Ｒ．Ｊ．，Ｐｏｒｒｅｃａ，Ｆ．，ａｎｄ  Ｃｏｗａｎ，Ａ．（１９８９）  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｄｒｕｇ−ｄｒｕｇ  ａｎｄ  ｓｉｔｅ−ｓｉｔｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｉｓｏｂｏｌｏｇｒａｍｓ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ４５，９４７−９６１
【０１０２】
２７．ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｈｅｉｊｄｅｎ，Ｍ．Ｓ．，Ｙｅｏ，Ｃ．Ｊ．，Ｈｒｕｂａｎ，Ｒ．Ｈ．，ａｎｄ  Ｋｅｒｎ，Ｓ．Ｅ．（２００３）  Ｆａｎｃｏｎｉ  ａｎｅｍｉａ  ｇｅｎｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｙｏｕｎｇ−ｏｎｓｅｔ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６３，２５８５−２５８８
【０１０３】
２８．Ｈｒｕｂａｎ，Ｒ．Ｈ．，Ｐｉｔｍａｎ，Ｍ．Ｂ．，ａｎｄ  Ｋｌｉｍｓｔｒａ，Ｄ．Ｓ．（２００７）  Ｔｕｍｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｎｃｒｅａｓ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｓｅｒｉｅｓ  ４．
【０１０４】
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【０１２３】
４８．Ｓｉｅｇｅｌ，Ｒ．Ｌ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｋ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｊｅｍａｌ，Ａ．（２０１６）  Ｃａｎｃｅｒ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，２０１６．ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  ６６，７−３０
【０１２４】
４９．Ｃｏｘ，Ａ．Ｄ．，Ｆｅｓｉｋ，Ｓ．Ｗ．，Ｋｉｍｍｅｌｍａｎ，Ａ．Ｃ．，Ｌｕｏ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｄｅｒ，Ｃ．Ｊ．（２０１４）  Ｄｒｕｇｇｉｎｇ  ｔｈｅ  ｕｎｄｒｕｇｇａｂｌｅ  ＲＡＳ：Ｍｉｓｓｉｏｎ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ？Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  １３，８２８−８５１
【０１２５】
５０．Ｋｉｅｓｓｌｉｎｇ，Ｍ．Ｋ．，ａｎｄ  Ｒｏｇｌｅｒ，Ｇ．（２０１５）  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ＲＡＳ  ｐａｔｈｗａｙ  ｂｙ  ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｓｗｉｓｓ  Ｍｅｄ  Ｗｋｌｙ  １４５，ｗ１４２０７
【０１２６】
５１．Ｔｅｕｓｃｈｌｅｒ，Ｌ．，Ｋｌａｕｎｉｇ，Ｊ．，Ｃａｒｎｅｙ，Ｅ．，Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｊ．，Ｃｏｎｏｌｌｙ，Ｒ．，Ｇｅｎｎｉｎｇｓ，Ｃ．，Ｇｉｅｓｙ，Ｊ．，Ｈｅｒｔｚｂｅｒｇ，Ｒ．，Ｋｌａａｓｓｅｎ，Ｃ．，Ｋｏｄｅｌｌ，Ｒ．，Ｐａｕｓｔｅｎｂａｃｈ，Ｄ．，ａｎｄ  Ｙａｎｇ，Ｒ．（２００２）  Ｓｕｐｐｏｒｔ  ｏｆ  ｓｃｉｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ｄｅｃｉｓｉｏｎｓ  ｃｏｎｃｅｒｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ：ａ  ｎｅｗ  ｂｅｇｉｎｎｉｎｇ．Ｒｅｇｕｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ３６，３４−３９
【０１２７】
５２．Ｇｕｍｂａｒｅｗｉｃｚ，Ｅ．，Ｌｕｓｚｃｚｋｉ，Ｊ．Ｊ．，Ｗａｗｒｕｓｚａｋ，Ａ．，Ｄｍｏｓｚｙｎｓｋａ−Ｇｒａｎｉｃｚｋａ，Ｍ．，Ｇｒａｂａｒｓｋａ，Ａ．Ｊ．，Ｊａｒｚａｂ，Ａ．Ｍ．，Ｐｏｌｂｅｒｇ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｓｔｅｐｕｌａｋ，Ａ．（２０１６）  Ｉｓｏｂｏｌｏｇｒａｐｈｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓ  ａｄｄｉｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｃｉｓｐｌａｔｉｎ  ａｎｄ  ＨＤＩｓ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ａｕｇｍｅｎｔｉｎｇ  ｔｈｅｉｒ  ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６，２８３１−２８４５．
【０１２８】
５３．Ｃａｌａｂｒｅｓｅ，Ｅ．Ｊ．（２００５）  Ｃａｎｃｅｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｈｏｒｍｅｓｉｓ：ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｃｏｍｍｏｎｌｙ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｈｏｒｍｅｔｉｃ（ｂｉｐｈａｓｉｃ）  ｄｏｓｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ３５，４６３−５８２．
【図１】
2020530498.tif 000007
【図２】
2020530498.tif 000008
【図３】
2020530498.tif 000009
【図４】
2020530498.tif 000010
【図５】
2020530498.tif 000011
【図６】
2020530498.tif 000012
【図７】
2020530498.tif 000013
【国際調査報告】
2020530498.tif 000014
2020530498.tif 000015
2020530498.tif 000016