(57)【要約】  本開示は、当技術分野においてこれまで公知の抗体と比較した、さまざまなＰＩＶＫＡ−ＩＩ形態に結合する特異的結合剤に関する。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の合成ペプチドに結合し、配列番号２の合成ペプチドと比較して配列番号１のペプチドに対して少なくとも１０倍の結合優先性を有し、配列番号１のペプチドと比較して配列番号３の合成ペプチドに少なくとも同様に結合することを特徴とする、ＰＩＶＫＡ−ＩＩに結合する特異的結合剤。
【請求項２】
配列番号１の合成ペプチドに結合し、配列番号２の合成ペプチドと比較して配列番号１のペプチドに対して少なくとも１５倍の結合優先性を有し、配列番号１のペプチドと比較して配列番号３の合成ペプチドに少なくとも同様に結合することを特徴とする、ＰＩＶＫＡ−ＩＩに結合する特異的結合剤。
【請求項３】
配列番号４のペプチドと比較して配列番号１のペプチドに結合優先性を有することをさらに特徴とする、請求項１または２に記載の特異的結合剤。
【請求項４】
前記特異的結合剤がモノクローナル抗体である、請求項１から３のいずれかに記載の特異的結合剤。
【請求項５】
ＣＤＲが、以下のアミノ酸配列、またはＣＤＲあたり最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含む：
（ｉ）軽鎖可変ドメイン中の配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、ならびに重鎖可変ドメイン中の配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（ｉｉ）軽鎖可変ドメイン中の配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、ならびに重鎖可変ドメイン中の配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（ｉｉｉ）軽鎖可変ドメイン中の配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、ならびに重鎖可変ドメイン中の配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または
（ｉｖ）軽鎖可変ドメイン中の配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、ならびに重鎖可変ドメイン中の配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３
ことをさらに特徴とする、請求項４に記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
ａ）試料を請求項１から５のいずれかに記載のＰＩＶＫＡ−ＩＩへの特異的結合剤と、特異的結合剤−ＰＩＶＫＡ−ＩＩ複合体の形成のために十分な時間および条件下で接触させるステップ；および
ｂ）特異的結合剤−ＰＩＶＫＡ−ＩＩ複合体の存在を検出するステップであって、特異的結合剤−ＰＩＶＫＡ−ＩＩ複合体の存在が試料中のＰＩＶＫＡ−ＩＩの存在を示す、ステップ
を含む、試料中のＰＩＶＫＡ−ＩＩを検出する方法。
【請求項７】
ａ）試料を請求項１から５のいずれかに記載のＰＩＶＫＡ−ＩＩへの第１の特異的結合剤およびＰＩＶＫＡ−ＩＩへの第２の特異的結合剤と、第１の特異的結合剤−ＰＩＶＫＡ−ＩＩ−第２の特異的結合剤複合体を形成するために十分な時間および条件下で接触させるステップであって、第２の特異的結合剤が検出可能に標識化されている、ステップ；および
ｂ）（ａ）において形成された複合体を測定することにより、試料中のＰＩＶＫＡ−ＩＩを検出するステップ
を含む、試料中のＰＩＶＫＡ−ＩＩを検出する方法。
【請求項８】
ａ）試料を請求項１から５のいずれかに記載のＰＩＶＫＡ−ＩＩへの第１の特異的結合剤と、第１の特異的結合剤−ＰＩＶＫＡ−ＩＩ複合体の形成のために十分な時間および条件下で接触させるステップ；
ｂ）ＰＩＶＫＡ−ＩＩへの第２の特異的結合剤を第１の特異的結合剤−ＰＩＶＫＡ−ＩＩ複合体に、第１の特異的結合剤−ＰＩＶＫＡ−ＩＩ−第２の特異的結合剤複合体を形成するために十分な時間および条件下で加えておくステップであって、第２の特異的結合剤が検出可能に標識化されている、ステップ；および
ｃ）（ｂ）において形成された複合体を測定することにより、試料中のＰＩＶＫＡ−ＩＩを検出するステップ
を含む、試料中のＰＩＶＫＡ−ＩＩを検出する方法。
【請求項９】
第２の特異的結合剤がポリクローナルまたはモノクローナル抗体である、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
第２の特異的結合剤が結合するＰＩＶＫＡ−ＩＩ上のエピトープがＦ１／Ｆ２内に含まれる、請求項７から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
第２の特異的結合剤が結合するＰＩＶＫＡ−ＩＩ上のエピトープがＦ１内に含まれる、請求項７から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
第２の特異的結合剤が結合するＰＩＶＫＡ−ＩＩ上のエピトープがＰＩＶＫＡ−ＩＩのＧｌａ−ドメイン内に含まれる、請求項７から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
ａ）患者から試料を得るステップ；
ｂ）試料を請求項１から５のいずれかに記載のＰＩＶＫＡ−ＩＩへの第１の特異的結合剤およびＰＩＶＫＡ−ＩＩへの第２の特異的結合剤と、第１の特異的結合剤−ＰＩＶＫＡ−ＩＩ−第２の特異的結合剤複合体を形成するために十分な時間および条件下で接触させるステップであって、第２の特異的結合剤が検出可能に標識化されている、ステップ；
ｃ）（ｂ）において形成された複合体を測定することにより、試料中に存在するＰＩＶＫＡ−ＩＩの量を測定するステップであって、参照レベルより多いＰＩＶＫＡ−ＩＩの量が患者におけるＨＣＣの存在を示す、ステップ
を含む、ＨＣＣを有することが疑われる患者においてＨＣＣを診断する方法。
【請求項１４】
ＰＩＶＫＡ−ＩＩの測定における、請求項１から５のいずれかに記載の特異的結合剤の使用。
【請求項１５】
請求項１から５のいずれかに記載の特異的結合剤を含有する容器を含む、試料中のＰＩＶＫＡ−ＩＩを検出するおよび／またはその量を定量するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、配列番号１の合成ペプチドに結合し、配列番号２の合成ペプチドと比較して配列番号１のペプチドに対して少なくとも１０倍の結合優先性（binding preference）を有し、配列番号１のペプチドと比較して配列番号３の合成ペプチドに少なくとも同様に結合することを特徴とする、ＰＩＶＫＡ−ＩＩに結合する特異的結合剤に関する。同様に、低カルボキシル化ＰＩＶＫＡ−ＩＩのサブセットを測定するための方法およびかかる特異的結合剤に基づいてＨＣＣを診断するための方法が開示される。
【背景技術】
【０００２】
第ＩＩ因子としても公知のタンパク質プロトロンビンＩＩ、は、ビタミンＫの存在下で、グルタミン酸（ＧＬＡ）ドメイン中の１０個のグルタミン酸（ＧＬＡ）残基がγ−カルボキシグルタミン酸にカルボキシル化される合成後修飾を受ける。カルボキシル化工程は、疾患状態では異常で不完全である。この不完全なカルボキシル化により、成熟プロトロンビンではなくＰＩＶＫＡ−ＩＩ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｋ  Ａｂｓｅｎｃｅ／Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ−ＩＩ）が形成される。ＰＩＶＫＡ−ＩＩは、分子量７２ＫＤａを有する大きな糖タンパク質であり、肝細胞癌（ＨＣＣ）患者において上昇することが公知である（Ｌｉｅｂｍａｎら、Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（１９８４）、３１０（２２）、１４２７〜１４３１頁；Ｆｕｊｉｙａｍａら、Ｈｅｐａｔｏｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ（１９８６）、３３、２０１〜２０５頁；Ｍａｒｒｅｏら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（２００３）、３７、１１１４〜１１２１頁）。
【０００３】
肝臓がんは、７番目に多いがんであり、世界でがんによる死亡の２番目の原因である。罹患率および死亡率は、２０１２年に人口１００，０００人あたり１０．１および９．５であった。肝細胞癌（ＨＣＣ）は、世界において生じる原発性肝臓がんの主要な組織学的種類であり、全負荷の７０％から８５％を占める。ＨＣＣは、初期ステージと診断された患者に対しては切除、肝臓移植またはラジオ周波数を用いる局所アブレーションによって処置され得る。
【０００４】
マーカーＰＩＶＫＡ−ＩＩは、ＨＣＣの早期診断に主に関連すると考えられ、ＰＩＶＫＡ−ＩＩの測定のためのいくつかのイムノアッセイが開発された。しかし、１０個の異なるカルボキシル化部位が存在し、カルボキシル化されたりカルボキシル化されなかったりするため、および個々のグルタミン酸残基のγ−カルボキシグルタミン酸への段階的カルボキシル化のために、ＰＩＶＫＡ−ＩＩの多様ないわゆる「低カルボキシル化」形態が存在する。
【０００５】
数個の一部カルボキシル化されたプロトロンビン変種が、ビタミンＫ−依存カルボキシル化に遺伝的欠損を有する患者（Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９８２；６９、１２５３〜１２６０、Ｂｏｒｏｗｓｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８５；２６０（１６）：９２５８〜６４）、ＨＣＣ患者およびワルファリン治療中の患者（Ｕｅｈａｒａら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  １９９９；２８９（１−２）：３３〜４４）において示されている。さまざまなカルボキシル化パターンは、プロトロンビンの機能性および疾患の重症度の両方とそれぞれ関連する可能性がある。
【０００６】
Ｇｌａ−ドメイン（成熟プロトロンビンのアミノ酸１から４６）内のγ−カルボキシグルタミン酸への個々のグルタミン酸残基のカルボキシル化の配列、およびプロトロンビン機能へのその重要性は、広く研究された。Ｕｅｈａｒａら、（１９９９）は、ヒトプロトロンビンの１０個のＧｌａ残基が、Ｇｌａ残基２６から開始して次のＧｌａ残基２５、１６、２９、２０、１９、１４、３２、７から６の特定の順でカルボキシル化されることを示した。加えて、Ｇｌａ１６は、プロトロンビンの機能性において重要な役割を演じており、この部位でのカルボキシル化を失うことは、凝固活性およびリン脂質結合の欠損を生じる（Ｂｏｒｏｗｓｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８６；２６１（３２）：１４９６９〜７５）。
【０００７】
ＰＩＶＫＡ−ＩＩの検出のための既存の商業的に入手できるキットでは、主に抗ＰＩＶＫＡ−ＩＩモノクローナル抗体ＭＵ−３が応用される（ＥｉｄｉａのおよびＦｕｊｉｒｅｂｉｏのＰＩＶＫＡ−ＩＩアッセイ）。ＭＵ−３のエピトープはアミノ酸（ＡＡ）１７〜２７の間に位置し、１９位（Ｇｌｕ１９）および２０位（Ｇｌｕ２０）のグルタミン酸残基が必須であり、２５位（Ｇｌｕ２５）のグルタミン酸残基がこの抗体の結合を顕著に増強する（Ｍｏｔｏｈａｒａら、Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｒｅｓ．１９８５；１９：３５４〜３５７、Ｎａｒａｋｉら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ２００２；１５８６：２８７〜２９８）。
【０００８】
ＩＶＤ  Ａｂｂｏｔｔ  ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ  ＰＩＶＫＡ−ＩＩアッセイは、３Ｃ１０と名付けられたモノクローナル抗体を使用する。この抗体が結合するエピトープは、ＭＵ−３エピトープと実質的に等価であることが示された（Ｋｉｎｕｋａｗａら、Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１５；４８（１６−１７）：１１２０〜５）。
【０００９】
ＰＩＶＫＡ−ＩＩについてのいくつかの商業的に入手できるアッセイを比較した。ＷＡＫＯ  ＤＣＰ、Ａｂｂｏｔｔ  ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ  ＰＩＶＫＡ−ＩＩ、Ｓａｎｋｏ  Ｊｕｎｙａｋｕ  ａｎｄ  Ｅｉｓａｉ  Ｐｉｃｏｌｕｍｉ  ＰＩＶＫＡ−ＩＩとＦｕｊｉｒｅｂｉｏ  ＰＩＶＫＡ−ＩＩ  Ｌｕｍｉｐｕｌｓｅ  ａｓｓａｙとの間に高い相関（Ｐａｓｓｉｎｇ−Ｂａｂｌｏｋ相関係数＞０．９５）が示された（Ｋｉｎｕｋａｗａら、Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１５；４８（１６−１７）：１１２０〜５、およびＰＩＶＫＡ−ＩＩ  Ｌｕｍｉｐｕｌｓｅ、Ｆｕｊｉｒｅｂｉｏ；ＤＣＰ−Ａｓｓａｙ、ＷＡＫＯ；Ａｒｃｈｉｔｅｃｔ  ＰＩＶＫＡ−ＩＩ、Ａｂｂｏｔｔのそれぞれの添付文書）。したがってこれらすべてのアッセイは、低カルボキシル化ＰＩＶＫＡ−ＩＩの同じサブセット（形態）を検出していると考えられる。
【００１０】
Ｓｅｋｉｓｕｉは、２つのモノクローナル抗体Ｐ１１およびＰ１６に基づくサンドイッチイムノアッセイを開発した（ＷＯ２０１２／００２３４５；Ｔｏｙｏｄａ、Ｈ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、１０３（２０１２）９２１〜９２５）。これらのモノクローナル抗体の１つは、ＰＩＶＫＡ−ＩＩのＮ末端アミノ酸に結合する一方で、他の１つはＰＩＶＫＡ−ＩＩのアミノ酸６０から１５６内のどこかに結合すると考えられている。いくつかの論文に示されるとおり、これら２つのモノクローナル抗体に基づくアッセイは、低カルボキシル化ＰＩＶＫＡ−ＩＩ形態の別のサブセットに結合し得ると考えられる。
【００１１】
すべての商業的に入手できるＰＩＶＫＡ−ＩＩアッセイは、互いに良好に相関する一方で、日常的に使用されるアッセイ以外の低カルボキシル化ＰＩＶＫＡ−ＩＩの他のサブセットを検出するアッセイが開発され得るかどうか、およびその場合かかるアッセイが臨床的に有意義な結果をもたらすかどうかについて、問題および課題が存在する。
【００１２】
代表的モノクローナル抗体ＭＵ−３と比較して異なる結合特性を示す新規モノクローナル抗体が開発および使用され得ることが今や驚くべきことに見出された。これらの新規モノクローナル抗体のエピトープは、Ｇｌｕ１６の存在を必要とする一方で、Ｇｌｕ２５の存在はこれらの新規抗体の効率的な結合のために必要でない。これらの新規抗体に基づくサンドイッチイムノアッセイは、商業的に入手できるＰＩＶＫＡ−ＩＩアッセイとは中程度の相関だけを示すが、臨床的に有意義なデータを、特に、高い臨床感度（例えば９０％）のためのカットオフ設定でのアッセイの特異性の改善に関してもたらすことが驚くべきことに見出された。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、配列番号１の合成ペプチドに結合し、配列番号２の合成ペプチドと比較して配列番号１のペプチドに対して少なくとも１０倍の結合優先性を有し、配列番号１のペプチドと比較して配列番号３の合成ペプチドに少なくとも同様に結合することを特徴とする、ＰＩＶＫＡ−ＩＩに結合する特異的結合剤を開示する。
【００１４】
さらに：ａ）試料を、配列番号１の合成ペプチドに結合し、配列番号２の合成ペプチドと比較して配列番号１のペプチドに対して少なくとも１０倍の結合優先性を有し、配列番号１のペプチドと比較して配列番号３の合成ペプチドに少なくとも同様に結合することを特徴とする、ＰＩＶＫＡ−ＩＩに結合する特異的結合剤と；特異的結合剤−ＰＩＶＫＡ−ＩＩ複合体の形成のために十分な時間および条件下で接触させるステップ；ならびにｂ）特異的結合剤−ＰＩＶＫＡ−ＩＩ複合体の存在を検出するステップであって、特異的結合剤−ＰＩＶＫＡ−ＩＩ複合体の存在が試料中のＰＩＶＫＡ−ＩＩの存在を示す、ステップを含む試料中のＰＩＶＫＡ−ＩＩを検出する方法が開示される。
【００１５】
同様に：ａ）試料を、配列番号１の合成ペプチドに結合し、配列番号２の合成ペプチドと比較して配列番号１のペプチドに対して少なくとも１０倍の結合優先性を有し、配列番号１のペプチドと比較して配列番号３の合成ペプチドに少なくとも同様に結合することを特徴とする、ＰＩＶＫＡ−ＩＩへの第１の特異的結合剤およびＰＩＶＫＡ−ＩＩへの第２の特異的結合剤と、第１の特異的結合剤−ＰＩＶＫＡ−ＩＩ−第２の特異的結合剤複合体を形成するために十分な時間および条件下で接触させるステップであって、第２の特異的結合剤が検出可能に標識化されている、ステップ；ならびにｂ）（ａ）において形成された複合体を測定することにより、試料中のＰＩＶＫＡ−ＩＩを検出するステップを含む試料中のＰＩＶＫＡ−ＩＩを検出する方法が開示される。
【００１６】
同様に：ａ）試料を、配列番号１の合成ペプチドに結合し、配列番号２の合成ペプチドと比較して配列番号１のペプチドに対して少なくとも１０倍の結合優先性を有し、配列番号１のペプチドと比較して配列番号３の合成ペプチドに少なくとも同様に結合することを特徴とする、ＰＩＶＫＡ−ＩＩに結合する特異的結合剤と；特異的結合剤−ＰＩＶＫＡ−ＩＩ複合体の形成のために十分な時間および条件下で接触させるステップ；ｂ）ＰＩＶＫＡ−ＩＩへの第２の特異的結合剤を第１の特異的結合剤−ＰＩＶＫＡ−ＩＩ複合体に、第１の特異的結合剤−ＰＩＶＫＡ−ＩＩ−第２の特異的結合剤複合体を形成するために十分な時間および条件下で加えておくステップであって、第２の特異的結合剤が配列番号１の部分ではないＰＩＶＫＡ−ＩＩ上のエピトープに結合し、検出可能に標識化されている、ステップ；ならびにｃ）（ｂ）において形成された複合体を測定することにより、試料中のＰＩＶＫＡ−ＩＩの存在を検出するステップを含む試料中のＰＩＶＫＡ−ＩＩを検出する方法が開示される。
【００１７】
同様に：ａ）患者から試料を得るステップ；ｂ）試料を、配列番号１の合成ペプチドに結合し、配列番号２の合成ペプチドと比較して配列番号１のペプチドに対して少なくとも１０倍の結合優先性を有し、配列番号１のペプチドと比較して配列番号３の合成ペプチドに少なくとも同様に結合することを特徴とする、ＰＩＶＫＡ−ＩＩへの第１の特異的結合剤およびＰＩＶＫＡ−ＩＩへの第２の特異的結合剤と、第１の特異的結合剤−ＰＩＶＫＡ−ＩＩ−第２の特異的結合剤複合体を形成するために十分な時間および条件下で接触させるステップであって、第２の特異的結合剤が検出可能に標識化されている、ステップ；ｃ）（ｂ）において形成された複合体を測定することにより、試料中に存在するＰＩＶＫＡ−ＩＩの量を測定するステップであって、参照レベルより多いＰＩＶＫＡ−ＩＩの量が患者におけるＨＣＣの存在を示す、ステップを含む、ＨＣＣを有することが疑われる患者においてＨＣＣを診断する方法が開示される。
【００１８】
さらに：ａ）患者から試料を得るステップ；ｂ）試料を、配列番号１の合成ペプチドに結合し、配列番号２の合成ペプチドと比較して配列番号１のペプチドに対して少なくとも１０倍の結合優先性を有し、配列番号１のペプチドと比較して配列番号３の合成ペプチドに少なくとも同様に結合することを特徴とする、ＰＩＶＫＡ−ＩＩに結合する特異的結合剤と；特異的結合剤−ＰＩＶＫＡ−ＩＩ複合体の形成のために十分な時間および条件下で接触させるステップ；ｃ）ＰＩＶＫＡ−ＩＩへの第２の特異的結合剤を第１の特異的結合剤−ＰＩＶＫＡ−ＩＩ複合体に、第１の特異的結合剤−ＰＩＶＫＡ−ＩＩ−第２の特異的結合剤複合体を形成するために十分な時間および条件下で加えておくステップであって、第２の特異的結合剤が配列番号１の部分ではないＰＩＶＫＡ−ＩＩ上のエピトープに結合し、検出可能に標識化されている、ステップ；ｄ）（ｃ）において形成された複合体を測定することにより、試料中に存在するＰＩＶＫＡ−ＩＩの量を測定するステップであって、予め決定されたレベルより多いＰＩＶＫＡ−ＩＩの量が患者におけるＨＣＣの存在を示す、ステップを含む、ＨＣＣを有することが疑われる患者においてＨＣＣを診断する方法が開示される。
【００１９】
さらに、配列番号１の合成ペプチドに結合し、配列番号２の合成ペプチドと比較して配列番号１のペプチドに対して少なくとも１０倍の結合優先性を有し、配列番号１のペプチドと比較して配列番号３の合成ペプチドに少なくとも同様に結合することを特徴とする、ＰＩＶＫＡ−ＩＩに結合する特異的結合剤のＰＩＶＫＡ−ＩＩの測定における使用、ならびに、かかる特異的結合剤を含む試料中のＰＩＶＫＡ−ＩＩを検出するおよび／またはその量を定量するためのキットが開示される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ＥｌｅｃｓｙｓでのＰＩＶＫＡ−ＩＩイムノアッセイの模式図である。  抗体−ＰＩＶＫＡ−ＩＩ−抗体サンドイッチの形成およびそのストレプトアビジンコート微小粒子結合が模式的に示されている。ＤＣＰ（デスカルボキシ−プロトロンビン）は、ＰＩＶＫＡ−ＩＩに対する代替名であり、「ＲＵ」は第２の抗ＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗体に結合するルテニウム標識を示す。
【図２】ＰＩＶＫＡ−ＩＩ  Ｅｌｅｃｓｙｓ対ＤＣＰ  ＷＡＫＯの方法比較を示すグラフである。
【００２１】
ＰＩＶＫＡ−ＩＩ  Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）アッセイにおいて測定された値対ＤＣＰ  ＷＡＫＯアッセイにおいて測定された値が比較されている。ＨＣＣ患者、対照およびその他（すなわち、胆管細胞癌（ＣＣＣ）またはＨＣＣ／ＣＣＣ混合患者またはＨＣＣ／ＣＣＣを有すると疑われる患者）からなる３つの群が異なる記号を用いて示されている。すべての点についてのデミング回帰（実線）および参照線（破線／傾き１および切片０を有する参照対角線）がプロットされている。見出された相関係数は、それぞれピアソンのｒ＝０．８６およびスピアマンのｐ＝０．８８であった。Ｗａｒｆａｒｉｎによって処置された患者由来の試料は除外された。
【図３】ＷＡＫＯ  ＤＣＰおよびＥｌｅｃｓｙｓ  ＰＩＶＫＡ−ＩＩ／すべてのＨＣＣの臨床成績を示す図である。
【００２２】
この図は、ＷＡＫＯ  ＤＣＰアッセイおよびＥｌｅｃｓｙｓ  ＰＩＶＫＡ−ＩＩアッセイのそれぞれについてのＡＵＣがすべてのＨＣＣ患者（ＢＣＬＣステージ０〜Ｄ）対対照について示されている。高感度領域について、Ｅｌｅｃｓｙｓ  ＰＩＶＫＡ−ＩＩアッセイは、ＷＡＫＯ  ＤＣＰ検査よりも良好な特異度を示している。
【図４】ＷＡＫＯ  ＤＣＰおよびＥｌｅｃｓｙｓ  ＰＩＶＫＡ−ＩＩ／ｅａｒｌｙ  ＨＣＣの臨床成績  この図は、ＷＡＫＯ  ＤＣＰアッセイおよびＥｌｅｃｓｙｓ  ＰＩＶＫＡ−ＩＩアッセイのそれぞれについてのＡＵＣがすべてのＨＣＣ患者（ＢＣＬＣステージ０およびＡ）対対照について示されている。高感度領域（６０〜９０％）について、Ｅｌｅｃｓｙｓ  ＰＩＶＫＡ−ＩＩアッセイは、ＷＡＫＯ  ＤＣＰ検査よりも良好な特異度を示している。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本開示は、配列番号１の合成ペプチドに結合し、配列番号２の合成ペプチドと比較して配列番号１のペプチドに対して少なくとも１０倍の結合優先性を有し、配列番号１のペプチドと比較して配列番号３の合成ペプチドに少なくとも同様に結合することを特徴とする、ＰＩＶＫＡ−ＩＩに結合する特異的結合剤に関する。
【００２４】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容が他を明確に示す場合を除いて、複数の参照物を含む。
プレプロトロンビン（配列番号５）は、細胞内で合成され、最初の４３個のＮ末端アミノ酸（シグナルペプチドおよびプロペプチド配列→配列番号６）の切断、およびプロトロンビンポリペプチドの６、７、１２、１４、１６、１９、２０、２５、２６および３１位のグルタミン酸残基のγ−カルボキシル化によって（「成熟」）プロトロンビンにプロセスされる。循環において経時的に、プロトロンビンも種々の分解産物に分解される。低カルボキシル化の検出に関して特に興味深いのは、少なくともいわゆるＧＬＡドメイン（配列番号７）を含むプロトロンビン切断（分解）産物である。主に関連するプロトロンビン切断産物は、それぞれいわゆるＦ１／Ｆ２−断片（配列番号８）およびいわゆるＦ１−断片（配列番号９）である。
【００２５】
配列番号１のペプチド配列は、プレプロトロンビン（配列番号５）のアミノ酸５５から７０位、すなわち（低カルボキシル化および「成熟」）プロトロンビンのアミノ酸１２から２７位に対応する。配列番号１のペプチドにおいて、すべてのグルタミン酸残基は、γ−カルボキシル化されていない。したがって、配列番号１の合成ペプチドは、１９位でγ−カルボキシル化されておらず、２０および２５位でもそれぞれγ−カルボキシル化されていないＰＩＶＫＡ−ＩＩ形態に対応し、それを模倣している。
【００２６】
配列番号２のペプチド配列は、プレプロトロンビン（配列番号５）のアミノ酸５５から７０位、すなわち（一部カルボキシル化された）プロトロンビンのアミノ酸１２から２７位に対応する。配列番号２のペプチドは、成熟プロトロンビンの１９位のγ−カルボキシル化グルタミン酸に対応するγ−カルボキシル化グルタミン酸を含む。言い換えると、このペプチドは、１９位でγ−カルボキシル化されている（しかし、２０でも２５位でもそれぞれされていない）ＰＩＶＫＡ−ＩＩ形態に対応し、それを模倣している。
【００２７】
配列番号３のペプチド配列は、プレプロトロンビン（配列番号５）のアミノ酸５５から７０位、すなわち（一部カルボキシル化された）プロトロンビンのアミノ酸１２から２７位に対応する。配列番号２のペプチドは、成熟プロトロンビンの２５位のγ−カルボキシル化グルタミン酸に対応するγ−カルボキシル化グルタミン酸を含む。言い換えると、このペプチドは、２５位でγ−カルボキシル化されている（しかし、１９でも２０位でもそれぞれされていない）ＰＩＶＫＡ−ＩＩ形態に対応し、それを模倣している。
【００２８】
当業者が理解するとおり、配列番号１のペプチド配列は、プレプロトロンビン（配列番号５）のアミノ酸５５から７０位、すなわち非カルボキシル化プロトロンビンのアミノ酸１２から２７位に対応する。この配列、およびアミノ酸の同じストレッチにわたって一部ガンマカルボキシル化された配列（配列番号２、３または４）は、２個のシステイン残基を含む。本開示により選択された合成条件下で、２個のシステインが酸化され、シスチン架橋を形成することに注意が払われた。したがって、本明細書において使用／開示されるおよび／または配列表に記載される配列番号１、２、３および４ならびに配列番号３２、３３および３４の配列を含む全ての合成ペプチドにおいて、２個のシステイン残基はシスチン架橋を形成するように酸化される。
【００２９】
一実施形態では、ＰＩＶＫＡ−ＩＩに結合する特異的結合剤は、ＰＩＶＫＡ−ＩＩに結合する単離された特異的結合剤である。「単離された」特異的結合剤、例えば単離された抗体は、その天然環境の構成成分から同定され、分離および／または回収されたものである。その天然環境の混入成分は、特異的結合剤、例えば抗体についての研究、診断または治療的使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモンおよび他のタンパク質性または非タンパク質性溶質が挙げられる。一部の実施形態では、特異的結合剤は（１）例えばローリー法によって決定して９０重量％より高くまで、一部の実施形態では９５重量％より高くまで；（２）例えば、スピニングカップシークエネーター（spinning cup sequenator）の使用によってＮ末端もしくは内部のアミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るために十分な程度まで、または（３）例えば、クーマシーブルーもしくは銀染色を使用する還元または非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一まで、精製される。
【００３０】
通常、単離された特異的結合剤、例えば単離された抗体は、例えば当技術分野において周知のタンパク質精製技術を使用する少なくとも１つの精製ステップによって調製される。
【００３１】
用語「特異的結合剤」は、標的に特異的に結合する天然または非天然分子を指す。特異的結合剤の例として、これだけに限らないが、タンパク質、ペプチドおよび核酸が挙げられる。ある特定の実施形態では、特異的結合剤は、抗体または核酸である。ある特定の実施形態では、特異的結合剤は、抗体である。ある特定の実施形態では、特異的結合剤は、抗体の抗原結合領域を含む。用語、標的および抗原は、互換的に使用され得る。一実施形態では、標的は抗原であり、特異的結合剤は抗体である。特異的結合剤は、その対応する標的分子に対して１０７ｌ／ｍｏｌの親和性を少なくとも有する。特異的結合剤は、一実施形態では、少なくとも１０８ｌ／ｍｏｌもしくはより良好な、またはさらなる実施形態では少なくとも１０９ｌ／ｍｏｌもしくはより良好な親和性をその標的分子に対して有する。
【００３２】
一実施形態では、本明細書で開示される特異的結合剤は、抗体またはアプタマーからなる群から選択される。
一実施形態では、特異的結合剤は、アプタマーとしても公知の特異的結合核酸である。
【００３３】
用語「アプタマー」は、ポリペプチドを認識し、結合する核酸を指す。アプタマーは、さまざまな１本鎖ＲＮＡ分子の大きなプールからＳＥＬＥＸなどの選択方法によって単離され得る（例えば、Ｊａｙａｓｅｎａ（１９９９）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．、４５、１６２８〜５０；ＫｌｕｇおよびＦａｍｕｌｏｋ（１９９４）Ｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．、２０、９７〜１０７；ＵＳ ５，５８２，９８１を参照されたい）。アプタマーは、それらの鏡像形態で、例えばＬ−リボヌクレオチドとしても合成および選択され得る（Ｎｏｌｔｅら、（１９９６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１４、１１１６〜９；Ｋｌｕｓｓｍａｎｎら、（１９９６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１４、１１１２〜５）。後者の方法において単離された形態は、天然に存在するリボヌクレアーゼによって分解されず、そのためより大きな安定性を有する有利点を享受する。
【００３４】
本発明の内容では、用語「ペプチド」は、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸の短いポリマーを指す。タンパク質と同じ化学（ペプチド）結合を有するが、一般に長さが短い。最も短いペプチドはジペプチドであり、単一のペプチド結合によって繋がれた２つのアミノ酸からなる。トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチドなどもあり得る。典型的にはペプチドは、４、６、８、１０、１２、１５、１８または２０アミノ酸までの長さを有する。ペプチドは、それが環状ペプチドである場合を除いて、アミノ末端およびカルボキシ末端を有する。
【００３５】
本発明の内容では、用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって互いに結合されているアミノ酸の単一の直鎖を指し、典型的には少なくとも約２１個のアミノ酸、すなわち少なくとも２１個、２２個、２３個、２４個、２５個などのアミノ酸を含む。ポリペプチドは、１本より多い鎖からなるタンパク質の１本の鎖であってよく、またはタンパク質が１本鎖からなる場合、タンパク質自体であってもよい。
【００３６】
ペプチドの内容では用語「合成」は、当業者に完全に明らかであり、ペプチドが天然供給源から単離されておらず、むしろｉｎ  ｖｉｔｒｏでの化学合成によって得られたことを示すために単に使用される。
【００３７】
用語「結合優先性」または「結合優先性」は、他は同等の条件下で、２つの代替的抗原または標的の１つが他の１つよりも良好に結合を受けることを示す。本開示による特異的結合剤は、配列番号１のペプチドに強く結合し、配列番号２のペプチドにしにくい。これら２つのペプチドおよび例えば配列番号３のような他のペプチドへの特異的結合は、実施例３に記載のとおり評価される。簡潔には、ビオチン化ペプチドは、分析される配列を含んで使用される。それらは、実施例３のアッセイ条件下で評価され、分析される各（ビオチン化）ペプチドで得られるシグナル（カウント）は、配列番号１を含むビオチン化ペプチドを用いて得られたシグナルと比較される。
【００３８】
本明細書において開示されるＰＩＶＫＡ−ＩＩへの特異的結合剤は、ａ）配列番号２を少なくとも１０倍超える配列番号１の優先的結合、ｂ）配列番号１のペプチドと同様またはさらに良好な配列番号３のペプチドへの結合、の少なくとも２つの判定基準に合致する。言い換えると、ＭＵ−３抗体および当技術分野において公知の同様の抗体とは異なり、本発明の特異的結合剤は、ＰＩＶＫＡ−ＩＩの２５位にグルタミン酸を含まないか、またはＰＩＶＫＡ−ＩＩの２５位でのグルタミン酸のカルボキシル化の存在もしくは非存在に依存しないエピトープに結合する。
【００３９】
当業者が完全に理解するとおり、任意の他の実験と同様に、結合強度または結合優先性の実験的評価は、いくらかの変動を受ける。かかる変動は、シグナル強度において例えばプラス／マイナス２０％を生じる場合がある。したがってかかる変動は、絶対数に与えられる限度内である、例えば５０％は、４０％から６０％の範囲として理解されるべきである。したがって、別の標的への結合と同様に良好（すなわち１００％）であることが見出されている１つの標的への比較結合は、かかる比較量が８０から１２０％（標的１に対するシグナル割る標的２に対するシグナル掛ける１００）の範囲で生じる場合に認められ得る。一実施形態では、本発明による結合剤の結合特性は、実施例３に開示されるとおり評価される。表現「少なくとも同様の結合」は、特異的結合剤が等しいまたはより大きな結合親和性で結合することを意味する。同様に「少なくとも１０倍の結合優先性」は、少なくとも１０倍大きい結合親和性を有する結合を意味する。
【００４０】
本開示は、配列番号１の合成ペプチドに結合し、配列番号２の合成ペプチドと比較して配列番号１のペプチドに対して少なくとも１５倍の結合優先性を有し、配列番号１のペプチドと比較して配列番号３の合成ペプチドに少なくとも同様に結合することを特徴とする、ＰＩＶＫＡ−ＩＩに結合する単離された特異的結合剤にも関する。
【００４１】
本発明の一実施形態では、配列番号１の合成ペプチドに結合し、配列番号２の合成ペプチドと比較して配列番号１のペプチドに対して少なくとも１０倍の結合優先性を有し、配列番号１のペプチドと比較して配列番号３の合成ペプチドに少なくとも同様に結合することを特徴とし、配列番号４のペプチドと比較して配列番号１のペプチドに対して結合優先性を有することをさらに特徴とする、ＰＩＶＫＡ−ＩＩに結合する特異的結合剤に関する。言い換えると、本実施形態ではＰＩＶＫＡ−ＩＩへの特異的結合剤は、１９位にグルタミン酸を有するが２０位にγ−カルボキシグルタミン酸を有するペプチドと比較して、ＰＩＶＫＡ−ＩＩのアミノ酸１９および２０に対応する両方の位置にグルタミン酸残基を有するペプチドに良好に結合する。しかし、２０位のγ−カルボキシグルタミン酸と比較した２０位のグルタミン酸に関する結合優先性は、先行技術結合剤、すなわちＭＵ−３抗体などほど明白ではまったくない。
【００４２】
一実施形態では、本開示による特異的結合剤は、抗体である。
一実施形態では、本明細書で開示される特異的結合剤は、モノクローナル抗体である。
抗体の全体構造は、当技術分野において周知であり、ジスルフィド結合によって繋がれた２本の重鎖および２本の軽鎖から構成される。重鎖および軽鎖は、それぞれ１つの定常ドメインおよび１つの可変ドメインからなる。抗原への結合特異性は、抗体を形成する軽鎖および重鎖の可変ドメインによってもたらされる。より具体的には、それらの特異性を決定し、特異的リガンドと接触する抗体の部分は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される。ＣＤＲは、分子の最も可変性の部分であり、これらの分子の多様性に寄与する。各可変ドメインには３つのＣＤＲ領域、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３があり、４つのフレームワーク領域（ＦＷ）に埋め込まれる。本明細書において使用される場合、ＣＤＲ−ＨＣ（またはＣＤＲ（ＨＣ））は可変重鎖のＣＤＲ領域を示し、ＣＤＲ−ＬＣ（またはＣＤＲ（ＬＣ））は可変軽鎖のＣＤＲ領域に関する。同様に、ＦＷ−ＨＣ（またはＦＷ（ＨＣ））は可変重鎖のフレームワーク領域を示し、ＦＷ−ＬＣ（またはＦＷ（ＬＣ））は可変軽鎖のフレームワーク領域に関する。
【００４３】
本発明により使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、さらなる配列／構成成分が、具体的に述べられる配列および／または構成成分に加えて含まれてよいことを記している。しかし、この用語は、特許請求される主題が述べられる配列および／または構成成分から厳密になることも包含する。
【００４４】
本発明の抗体が述べられるアミノ酸配列より多くを含むこれらの実施形態では、追加的アミノ酸伸長は、Ｎ末端もしくはＣ末端のいずれかまたは両方に存在し得る。追加的配列は、例えば本明細書において下に詳細に考察されるとおり、例えば精製または検出のために導入された配列を含み得る。さらに、個々の配列は、述べられる配列を「含み」、それらは、追加的アミノ酸をＮ末端もしくはＣ末端または両方に含み得る。
【００４５】
本発明の内容では、用語「抗体」は、免疫グロブリン分子全体およびＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなどのその抗原結合断片に関する。さらに、用語は、改変および／または変更された抗体分子、ならびに組換え的にまたは合成的に生成された／合成された抗体に関する。用語「抗体」は、二機能性抗体、三機能性抗体、完全ヒト抗体、キメラ抗体および１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）もしくは抗体融合タンパク質のような抗体構築物も含む。
【００４６】
本明細書において使用される場合、「Ｆａｂ断片」は、１本の軽鎖ならびに１本の重鎖のＣＨ１および可変領域からなる。Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成できない。「Ｆａｂ’断片」は、１本の軽鎖ならびに、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインならびにＣＨ１とＣＨ２ドメインとの間の領域も含有する１本の重鎖の一部を、鎖間ジスルフィド結合がＦ（ａｂ’）２分子を形成するように２つのＦａｂ’断片の２本の重鎖の間に形成され得るように含有する。「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、２本の軽鎖および、ＣＨ１とＣＨ２ドメインとの間の定常領域の一部を含有する２本の重鎖を、鎖間ジスルフィド結合が２本の重鎖の間に形成されるように含有する。したがって、Ｆ（ａｂ’）２断片は、２本の重鎖の間のジスルフィド結合によって互いに合わさっている２つのＦａｂ’断片から構成される。
【００４７】
Ｆａｂ／ｃ断片は、ＦｃおよびＦａｂ決定基の両方を含有し、ここで「Ｆｃ」領域は抗体のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む２つの重鎖断片を含有する。２つの重鎖断片は、２つ以上ジスルフィド結合によって、およびＣＨ３ドメインの疎水性相互作用によって互いに合わさっている。
【００４８】
「Ｆｖ領域」は、重鎖および軽鎖の両方由来の可変領域を含むが、定常領域を欠いている。「１本鎖Ｆｖ」（「ｓｃＦｖ」とも略される）は、本発明の内容では、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを有する抗体断片であり、ここでこれらのドメインは、単一のポリペプチド鎖中に存在している。一般に、ｓｃＦｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合のための望ましい構造を形成できるようにするポリペプチドリンカーをＶＨドメインとＶＬドメインとの間にさらに含む。１本鎖抗体の産生について記載される技術は、例えばＰｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．１１３（１９９４）、２６９〜３１５に記載されている。
【００４９】
本明細書において使用される場合、用語「完全ヒト抗体」は、ヒト免疫グロブリンタンパク質配列のみを含む抗体を指す。それでもなお、完全ヒト抗体は、マウスにおいて、マウス細胞において、もしくはマウス細胞由来の融合細胞において産生された場合はマウス（murine）炭水化物鎖を含む場合がある、またはラットにおいて、ラット細胞において、もしくはラット細胞由来の融合細胞において産生された場合はラット炭水化物鎖を含む場合がある。同様に、完全ヒト抗体は、ハムスターにおいて、ハムスター細胞、例えばＣＨＯ細胞などにおいて、またはハムスター細胞由来の融合細胞において産生された場合はハムスター炭水化物鎖を含む場合がある。一方、「マウス抗体」または「マウス（murine）抗体」は、マウス（マウス（murine））免疫グロブリンタンパク質配列のみを含む抗体であり、一方「ラット抗体」または「ウサギ抗体」は、それぞれラットまたはウサギ免疫グロブリン配列のみを含む抗体である。完全ヒト抗体と同様に、かかるマウス（murine）、ラットまたはウサギ抗体は、かかる動物またはかかる動物の細胞において産生される場合に、他の種からの炭水化物鎖を含有する場合がある。例えば抗体は、ハムスター細胞、例えばＣＨＯ細胞などにおいて、またはハムスター細胞由来の融合細胞において産生された場合はハムスター炭水化物鎖を含む場合がある。完全ヒト抗体は、例えば、完全ヒト抗体の産生およびスクリーニングを可能にする広く使用されているスクリーニング技術であるファージディスプレイによって産生され得る。同様に、ファージ抗体は、本発明の内容において使用され得る。ファージディスプレイ法は、例えばＵＳ５，４０３，４８４、ＵＳ５，９６９，１０８およびＵＳ５，８８５，７９３に記載されている。完全ヒト抗体の開発を可能にする別の技術は、マウス融合細胞技術の改変を含む。マウスは、それら自体のマウス遺伝子の代わりにヒト免疫グロブリン遺伝子座を含有するようにトランスジェニックにされる（例えば、ＵＳ５，８７７，３９７を参照されたい）。
【００５０】
用語「キメラ抗体」は、ヒトまたは非ヒト（例えば、マウス、ウマ、ウサギ、イヌ、ウシ、ニワトリ）のいずれかの別の種由来の抗体領域（例えば、定常領域）に融合されたまたはそれとキメラ化された、ヒトまたは非ヒト種の可変領域を含む抗体を指す。
【００５１】
上述のとおり、用語「抗体」は、抗体融合タンパク質などの抗体構築物も包含し、ここで抗体は、具体的なアミノ酸配列によって本明細書において定義されるドメインに加えて、例えば組換え的に産生された構築物の単離および／または調製のための追加的ドメイン（複数可）を含む。
【００５２】
本発明の抗体は、組換え抗体、例えば組換えヒト抗体、異種性抗体またはヘテロハイブリッド抗体であるように産生され得る。用語「組換え（ヒト）抗体」として、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現された抗体、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体または、ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む任意の他の手段によって調製、発現、作製もしくは単離された抗体、などの組換え手段によって調製、発現、作製または単離されたすべての（ヒト配列）抗体が挙げられる。組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変および定常領域（存在する場合）を有する。しかし、かかる抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ変異導入（または、ヒトＩｇ配列についてのトランスジェニック動物が使用される場合はｉｎ  ｖｉｖｏ体細胞変異導入）に供されてよく、それにより組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列に由来し、関連する一方で、ｉｎ  ｖｉｖｏでヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然で存在しない配列である。
【００５３】
「異種性抗体」は、かかる抗体を産生するトランスジェニック非ヒト生物との関連において定義される。この用語は、トランスジェニック非ヒト動物ではない生物において見出され、一般にトランスジェニック非ヒト動物のもの以外の種由来のものに対応するアミノ酸配列またはコード核酸配列を有する抗体を指す。
【００５４】
用語「ヘテロハイブリッド抗体」は、異なる生物に由来する軽鎖および重鎖を有する抗体を指す。例えば、マウス（murine）軽鎖と会合したヒト重鎖を有する抗体は、ヘテロハイブリッド抗体である。ヘテロハイブリッド抗体の例として、キメラおよびヒト化抗体が挙げられる。
【００５５】
ＰＩＶＫＡ−ＩＩまたは対応する合成ペプチドへの結合のための、ＭＵ−３などの、ＰＩＶＫＡ−ＩＩに対する先行技術抗体は、２０位のグルタミン酸の存在に強く依存（および２５位のグルタミン酸の存在に一部依存）する。γ−カルボキシグルタミン酸が２０位に存在する場合、これらの先行技術抗体は、かかるペプチドに、およびおそらく２０位でγ−カルボキシル化された対応するＰＩＶＫＡ−ＩＩ形態にも、いかなる結合もほとんど示さない。しかし、まったく異なって、本明細書に開示される抗体は、２０位のグルタミン酸の存在にそれほど依存しない。一実施形態では本発明は、配列番号１と比較して４０から８０％未満の範囲の、およびさらなる実施形態では５０から８０％の範囲内の配列番号４への相対的結合によってさらに特徴付けられる、上に定義される特異的結合剤に関する。
【００５６】
したがって、本発明は、配列番号１の合成ペプチドに結合し、配列番号２の合成ペプチドと比較して配列番号１のペプチドに対して少なくとも１０倍の結合優先性を有し、配列番号１のペプチドと比較して配列番号３の合成ペプチドに少なくとも同様に結合することを特徴とする、ＰＩＶＫＡ−ＩＩに特異的に結合する抗体に関し、ここで前記抗体は、ＣＤＲが以下のアミノ酸配列、またはＣＤＲあたり最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むことをさらに特徴とする：
（ｉ）軽鎖可変ドメイン中の配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、ならびに重鎖可変ドメイン中の配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（ｉｉ）軽鎖可変ドメイン中の配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、ならびに重鎖可変ドメイン中の配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（ｉｉｉ）軽鎖可変ドメイン中の配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、ならびに重鎖可変ドメイン中の配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または
（ｉｖ）軽鎖可変ドメイン中の配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、ならびに重鎖可変ドメイン中の配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３。
【００５７】
本発明による抗体は、軽鎖ＣＤＲおよび重鎖ＣＤＲの（ｉ）から（ｉｖ）の４種の述べられた組合せ１つを含む。ＣＤＲが組み込まれるそれぞれの可変ドメインの周囲のフレームワーク配列は、さらなる負担を伴うことなく当業者によって選択され得る。例えば、下にさらに記載されるフレームワーク配列または添付の実施例において使用される具体的なフレームワーク配列は、使用され得る。
【００５８】
本発明によりＣＤＲは、具体的に述べられた配列を含むことができる、またはＣＤＲあたり最大１個のアミノ酸置換においてそれから異なっていてよい。そのため、各ＣＤＲ中の１つのアミノ酸は、異なるアミノ酸によって置き換えられてよい。アミノ酸置換は、１本鎖のまたは１つの抗体のＣＤＲの一部に存在するが、全てにおいてではないことも包含されることは、理解される。
【００５９】
本発明により用語「置換」は、アミノ酸の別のアミノ酸での置き換えを指す。したがって、アミノ酸の総数は同じままである。ある特定の位置でのアミノ酸の欠失または、異なる位置での１つ（もしくは複数の）アミノ酸（複数可）の導入は、それぞれ用語「置換」によって明確に包含されない。
【００６０】
本発明による置換は、一実施形態では保存的アミノ酸置換である。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、同様の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されているものである。一般に保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させない。かかる類似性として、例えば、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性の性質における類似性が挙げられる。一実施形態では、保存的アミノ酸置換は、以下の群、（ｉ）アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびメチオニンが挙げられる非極性（疎水性）アミノ酸；（ｉｉ）グリシン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられる極性中性アミノ酸；（ｉｉｉ）アルギニン、リシンおよびヒスチジンが挙げられる正荷電を有する（塩基性）アミノ酸；ならびに（ｉｖ）アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる負荷電を有する（酸性）アミノ酸、の１つの中に含まれる１つのアミノ酸の別のものへの置換である。
【００６１】
一実施形態では本発明は、配列番号１の合成ペプチドに結合し、配列番号２の合成ペプチドと比較して配列番号１のペプチドに対して少なくとも１０倍の結合優先性を有し、配列番号１のペプチドと比較して配列番号３の合成ペプチドに少なくとも同様に結合することを特徴とする、ＰＩＶＫＡ−ＩＩに特異的に結合する抗体に関し、ここで前記抗体は、ＣＤＲが以下のアミノ酸配列、または、ＣＤＲあたり最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含み、ただし重鎖可変ドメインのＣＤＲ３が配列番号１５のアミノ酸配列からなることをさらに特徴とする：
（ｉ）軽鎖可変ドメイン中の配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、ならびに重鎖可変ドメイン中の配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（ｉｉ）軽鎖可変ドメイン中の配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、ならびに重鎖可変ドメイン中の配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（ｉｉｉ）軽鎖可変ドメイン中の配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２およびに配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、ならびに重鎖可変ドメイン中の配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または
（ｉｖ）軽鎖可変ドメイン中の配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、ならびに重鎖可変ドメイン中の配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３。
【００６２】
一実施形態では、ＣＤＲは、上に具体的に述べられる、すなわちいかなるアミノ酸変化も含まない配列を含む。
重鎖および軽鎖の両方の軽鎖可変領域／ドメイン／配列は、抗体の特異性を決定するＣＤＲおよび「ＣＤＲを適切な位置に保つ」さらなる一般的フレームワーク領域をそれぞれ含む。
【００６３】
軽鎖可変ドメイン／配列は、式Ｉ：
ＦＷ（ＬＣ）１−ＣＤＲ（ＬＣ）１−ＦＷ（ＬＣ）２−ＣＤＲ（ＬＣ）２−ＦＷ（ＬＣ）３−ＣＤＲ（ＬＣ）３−ＦＷ（ＬＣ）４（式Ｉ）
に表されるフレームワーク領域（ＦＷ）およびＣＤＲからなる。
【００６４】
重鎖可変ドメイン／配列は、式ＩＩ：
ＦＷ（ＨＣ）１−ＣＤＲ（ＨＣ）１−ＦＷ（ＨＣ）２−ＣＤＲ（ＨＣ）２−ＦＷ（ＨＣ）３−ＣＤＲ（ＨＣ）３−ＦＷ（ＨＣ）４（式ＩＩ）
に表されるＦＷおよびＣＤＲからなる。
【００６５】
式Ｉに示される一次構造は、Ｎ末端からＣ末端への本発明の抗体の軽鎖可変ドメインの構成成分の順序を表す。式ＩＩに示される一次構造は、Ｎ末端からＣ末端への本発明の抗体の重鎖可変ドメインの構成成分の順序を表す。各場合において、フレームワーク領域（ＦＷ）１は、それぞれの可変鎖ドメインの最もＮ末端部分を表し、一方ＦＷ４は、それぞれの可変鎖ドメインの最もＣ末端部分を表す。
【００６６】
本開示のとおり、全長可変鎖配列およびそれに含まれるＣＤＲの配列が与えられると、当業者は各ＦＷ領域の配列を完全に推定できる。
さらに本開示は、配列番号１の合成ペプチドに結合し、配列番号２の合成ペプチドと比較して配列番号１のペプチドに対して少なくとも１０倍の結合優先性を有し、配列番号１のペプチドと比較して配列番号３の合成ペプチドに少なくとも同様に結合することを特徴とする、ＰＩＶＫＡ−ＩＩに特異的に結合する抗体に関し、ここで前記抗体は、
（ｉ）配列番号１０のＣＤＲ１、配列番号１１のＣＤＲ２および配列番号１２のＣＤＲ３を含む配列番号１６の軽鎖可変配列ならびに配列番号１３のＣＤＲ１、配列番号１４のＣＤＲ２および配列番号１５のＣＤＲ３を含む配列番号１７の重鎖可変配列；
（ｉｉ）配列番号１８のＣＤＲ１、配列番号１９のＣＤＲ２および配列番号２０のＣＤＲ３を含む配列番号２３の軽鎖可変配列ならびに配列番号２１のＣＤＲ１、配列番号２２のＣＤＲ２および配列番号１５のＣＤＲ３を含む配列番号２４の重鎖可変配列；
（ｉｉｉ）配列番号１８のＣＤＲ１、配列番号１１のＣＤＲ２および配列番号２０のＣＤＲ３を含む配列番号２６の軽鎖可変配列ならびに配列番号２１のＣＤＲ１、配列番号２５のＣＤＲ２および配列番号１５のＣＤＲ３を含む配列番号２７の重鎖可変配列；または
（ｉｖ）配列番号１８のＣＤＲ１、配列番号１１のＣＤＲ２および配列番号２８のＣＤＲ３を含む配列番号３０の軽鎖可変配列ならびに配列番号２９のＣＤＲ１、配列番号２５のＣＤＲ２および配列番号１５のＣＤＲ３を含む配列番号３１の重鎖可変配列
を含むことをさらに特徴とし、
ここで、それぞれのＦＷは、上の所与の可変鎖配列に含有されるとおりであるか、または上の可変鎖配列を介して開示されるＦＷ配列と少なくとも８５％同一であるその変種であり、ここでそれぞれのＣＤＲは、上に示されるとおりであるか、または最大１個のアミノ酸置換において異なっている。
【００６７】
ＣＤＲおよびその変種に関して、上に提供される定義および具体的に例示される実施形態を準用する。
フレームワーク領域に関して、ある特定の程度の変動も本明細書において想定される、すなわち個々のＦＷは、具体的に述べられるアミノ酸配列またはそれに少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含み得る、またはそれからなり得る。さらなる一実施形態では、同一性は、少なくとも９０％である。またさらなる実施形態では、同一性は少なくとも９５％である。
【００６８】
本発明により、用語「％配列同一性」は、２つ以上のアライメントされたアミノ酸配列の同一アミノ酸のマッチ（「ヒット」）数を、アミノ酸配列の長さ全体（またはその比較される部分全体）を構成するアミノ酸残基数と比較して記載する。同一性パーセントは、同一残基の数を残基の総数で割り、商に１００を掛けることによって決定される。言い換えると、アライメントを使用して、同じであるアミノ酸残基の百分率（例えば、８５％同一性）は、２つ以上の（サブ）配列が、当技術分野において公知の配列比較アルゴリズムを使用して測定される、比較ウインドウにわたるまたは指定の領域にわたる最大の対応について比較およびアライメントされる場合、または手作業でアライメントされ、目視で検査された場合に、２つ以上の配列またはサブ配列について決定され得る。
【００６９】
当業者は、例えばＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、［１９９７］Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２）、ＣＬＵＳＴＡＬＷコンピュータープログラム（Ｔｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ら、［１９９４］Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４６７３〜４６８０）またはＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．［１９８８］Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４〜２４４８）に基づくものなどのアルゴリズムを使用して、配列間の／内のパーセント配列同一性をどの様に決定するかを公知である。一実施形態では、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、本発明により使用される。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、ワード長（Ｗ）３、および期待値（Ｅ）１０を初期設定として使用する。ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｊ．Ｇ．［１９９２］Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：１０９１５〜１０９１９）は、配列比較（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４および両鎖の比較を使用する。したがってこれらの実施形態では、％配列同一性が示される場合、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いて決定された少なくとも８５％の配列同一性を有するすべてのアミノ酸配列は、前記実施形態の範囲内である。
【００７０】
具体的に述べられたそれぞれのアミノ酸配列と比較した、フレームワーク領域における変動の上に記載の程度は、アミノ酸（複数可）の置換、挿入、付加または欠失によるものであり得る。
【００７１】
用語「置換」は、本明細書において上で定義された。１つより多いアミノ酸が置換される場合、各アミノ酸は独立に別のアミノ酸を用いて置換される、すなわち除去される各アミノ酸について異なるアミノ酸が同じ位置に導入される。
【００７２】
用語「挿入」は、本発明により、１つまたは複数のアミノ酸の具体的に述べられるアミノ酸配列への付加を指し、ここで付加は、ポリペプチドのＮまたはＣ末端への付加ではない。
【００７３】
用語「付加」は、本発明により、１つまたは複数のアミノ酸の具体的に述べられるアミノ酸配列へのポリペプチドのＮもしくはＣ末端へのまたは両方への付加を指す。
本発明により使用される場合、用語「欠失」は、具体的に述べられるアミノ酸配列から１つまたは複数のアミノ酸を失うことを指す。
【００７４】
一実施形態では、フレームワーク領域のアミノ酸配列における変動は、アミノ酸（複数可）の置換による。本明細書において上で定義されたとおり置換は、保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換であってよい。用語「置換」に関して上に提供された定義および具体的に例示された実施形態を準用する。一実施形態では、フレームワーク領域中の置換は、保存的アミノ酸置換である。
【００７５】
本発明の抗体のさらなる実施形態では、抗体は、フレームワーク領域（ＦＷ）および上の式Ｉに表されるＣＤＲからなる軽鎖可変ドメイン、ならびにＦＷおよび上の式ＩＩに表されるＣＤＲからなる重鎖可変ドメインを含み、ここでＦＷは可変鎖配列を介して開示されるアミノ酸配列またはそれに少なくとも８５％同一であるその変種を含み、ここでＣＤＲは、以下のアミノ酸配列を含む：
（ｉ）配列番号１０のＣＤＲ１、配列番号１１のＣＤＲ２および配列番号１２のＣＤＲ３を含む配列番号１６の軽鎖可変配列ならびに配列番号１３のＣＤＲ１、配列番号１４のＣＤＲ２および配列番号１５のＣＤＲ３を含む配列番号１７の重鎖可変配列；
（ｉｉ）配列番号１８のＣＤＲ１、配列番号１９のＣＤＲ２および配列番号２０のＣＤＲ３を含む配列番号２３の軽鎖可変配列ならびに配列番号２１のＣＤＲ１、配列番号２２のＣＤＲ２および配列番号１５のＣＤＲ３を含む配列番号２４の重鎖可変配列；
（ｉｉｉ）配列番号１８のＣＤＲ１、配列番号１１のＣＤＲ２および配列番号２０のＣＤＲ３を含む配列番号２６の軽鎖可変配列ならびに配列番号２１のＣＤＲ１、配列番号２５のＣＤＲ２および配列番号１５のＣＤＲ３を含む配列番号２７の重鎖可変配列；または
（ｉｖ）配列番号１８のＣＤＲ１、配列番号１１のＣＤＲ２および配列番号２８のＣＤＲ３を含む配列番号３０の軽鎖可変配列ならびに配列番号２９のＣＤＲ１、配列番号２５のＣＤＲ２および配列番号１５のＣＤＲ３を含む配列番号３１の重鎖可変配列。
【００７６】
本明細書においてＦＷとして定義される式Ｉおよび式ＩＩの一部が、可変鎖領域のフレームまたはスキャホールドの一部を形成するアミノ酸配列であることから、前記配列内の置換、特に保存的アミノ酸置換の形態は、多くの場合、抗ＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗体の結合能力に影響を与えない。
【００７７】
本発明は、配列番号１の合成ペプチドに結合し、配列番号２の合成ペプチドと比較して配列番号１のペプチドに対して少なくとも１０倍の結合優先性を有し、配列番号１のペプチドと比較して配列番号３の合成ペプチドに少なくとも同様に結合することを特徴とする、ＰＩＶＫＡ−ＩＩに特異的に結合する抗体にさらに関し、前記抗体は、
（ｉ）配列番号１６のアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメイン、および配列番号１７のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメイン；
（ｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメイン、および配列番号２４のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメイン；
（ｉｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメイン、および配列番号２７のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメイン；または
（ｉｖ）配列番号３０のアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメイン、および配列番号３１のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメイン
を含む。
【００７８】
本発明の抗ＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗体に関して本明細書で上に提供されるすべての定義および具体的例示的実施形態、特に多様性の言及される程度および種類を準用する。
一実施形態では、ＰＩＶＫＡ−ＩＩに特異的に結合する抗体は、配列番号１の合成ペプチドに結合し、配列番号２の合成ペプチドと比較して配列番号１のペプチドに対して少なくとも１０倍の結合優先性を有し、配列番号１のペプチドと比較して配列番号３の合成ペプチドに少なくとも同様に結合し、
（ｉ）軽鎖可変ドメインとして配列番号１６のアミノ酸配列および重鎖可変ドメインとして配列番号１７のアミノ酸配列（すなわち、添付の実施例において７Ａ１０と呼ばれるモノクローナル抗体の可変鎖領域に対応する）を含む；
（ｉｉ）軽鎖可変ドメインとして配列番号２３のアミノ酸配列および重鎖可変ドメインとして配列番号２４のアミノ酸配列（すなわち、添付の実施例において４Ｅ８と呼ばれるモノクローナル抗体の可変鎖領域に対応する）を含む；
（ｉｉｉ）軽鎖可変ドメインとして配列番号２６のアミノ酸配列および重鎖可変ドメインとして配列番号２７のアミノ酸配列（すなわち、添付の実施例において９Ａ６と呼ばれるモノクローナル抗体の可変鎖領域に対応する）を含む；または
（ｉｖ）軽鎖可変ドメインとして配列番号３０のアミノ酸配列および重鎖可変ドメインとして配列番号３１のアミノ酸配列（すなわち、添付の実施例において１３Ｈ７と呼ばれる可変鎖領域に対応する）を含むことを特徴とする。
【００７９】
改変軽鎖および重鎖領域について上に述べられた配列は、添付の実施例において使用されたアミノ酸配列である。実施例において使用された（前記可変ドメインを含む）抗体中に存在する軽鎖および重鎖についての全長アミノ酸配列は、配列番号１６、２３、２６および３０ならびに配列番号１７、２４、２７および３１にそれぞれ表されている。実施例において示されるとおり、これらの抗ＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗体は、優れた結合効率および特異性を提供する。
【００８０】
本発明は、本明細書において上に定義される本発明の抗体のいずれか１つの軽鎖可変領域をコードする核酸分子にさらに関する。この核酸分子は、本明細書において本発明の第１の核酸分子と称される。さらに本発明は、本明細書において上に定義される本発明の抗体のいずれか１つの重鎖可変領域をコードする核酸分子にも関する。この核酸分子は、本明細書において本発明の第２の核酸分子と称される。
【００８１】
本発明により、用語「核酸分子」は、本明細書において核酸配列またはポリヌクレオチドとも称され、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡなどのＤＮＡを含む。
本発明の核酸分子は、例えば標準的化学合成方法および／もしくは組換え法によって合成され得る、または例えば化学合成と組換え法を組み合わせることによって半合成的に産生され得る。コード配列の転写制御エレメントへの、および／または他のアミノ酸コード配列へのライゲーションは、制限消化、ライゲーションおよび分子クローニングなどの確立された方法を使用して実行され得る。
【００８２】
本発明により、本発明の第１の核酸分子は、配列番号１の合成ペプチドに結合し、配列番号２の合成ペプチドと比較して配列番号１のペプチドに対して少なくとも１０倍の結合優先性を有し、配列番号１のペプチドと比較して配列番号３の合成ペプチドに少なくとも同様に結合することを特徴とする、ＰＩＶＫＡ−ＩＩに特異的に結合する抗体の
（ｉ）配列番号１０のアミノ酸配列または最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列または最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ２、および配列番号１２のアミノ酸配列または最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
（ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列または最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ１、配列番号１９のアミノ酸配列または最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ２、および配列番号２０のアミノ酸配列または最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
（ｉｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列または最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列または最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ２、および配列番号２０のアミノ酸配列または最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
（ｉｖ）配列番号１８のアミノ酸配列または最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列または最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ２、および配列番号２８のアミノ酸配列または最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
（ｖ）配列番号１６のアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列；
（ｖｉ）配列番号２３のアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列；
（ｖｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列；または
（ｖｉｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列
をコードする。
【００８３】
同様に、本発明の第２の核酸分子は、配列番号１の合成ペプチドに結合し、配列番号２の合成ペプチドと比較して配列番号１のペプチドに対して少なくとも１０倍の結合優先性を有し、配列番号１のペプチドと比較して配列番号３の合成ペプチドに少なくとも同様に結合することを特徴とする、ＰＩＶＫＡ−ＩＩに特異的に結合する抗体の
（ｉ）配列番号１３のアミノ酸配列または最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列または最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ２、および配列番号１５のアミノ酸配列または最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列または最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ１、配列番号２２のアミノ酸配列または最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ２、および配列番号１５のアミノ酸配列または最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
（ｉｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列または最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ１、配列番号２５のアミノ酸配列または最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ２、および配列番号１５のアミノ酸配列または最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
（ｉｖ）配列番号２９のアミノ酸配列または最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ１、配列番号２５のアミノ酸配列または最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ２、および配列番号１５のアミノ酸配列または最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
（ｖ）配列番号１７のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列；
（ｖｉ）配列番号２４のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列；
（ｖｉｉ）配列番号２７のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列；または
（ｖｉｉｉ）配列番号３１のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列
をコードする。
【００８４】
本発明は、本発明の第１の核酸分子、すなわち本明細書において上に定義される本発明の抗体のいずれか１つの軽鎖可変領域をコードする核酸分子を含むベクターにさらに関する。本発明は、本発明の第２の核酸分子、すなわち本明細書において上に定義される本発明の抗体のいずれか１つの重鎖可変領域をコードする核酸分子を含むベクターにさらに関する。かかるベクターは、本明細書において「本発明の個別のベクター（複数可）」とも称される。
【００８５】
多数の好適なベクターが分子生物学の当業者に公知であり、その選択は所望の機能に依存する。ベクターの非限定的例として、プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージおよび例えば遺伝子工学において慣用されている他のベクターが挙げられる。当業者に周知である方法は、種々のプラスミドおよびベクターを構築するために使用できる；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（同上）およびＡｕｓｕｂｅｌ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）、（１９９４）に記載される技術を参照されたい。
【００８６】
一実施形態では、ベクターは発現ベクターである。本発明による発現ベクターは、宿主において本発明の核酸分子の複製および発現を導くことができ、したがって、それによりコードされた本発明の抗ＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗体の可変鎖ドメインの選択された宿主での発現を提供する。さらなる実施形態では、ベクター（複数可）は、本発明の前記可変鎖ドメインだけでなく、本発明の前記可変鎖ドメインを含む全長ＩｇＧ抗体も発現されることを確実にするためのさらなる配列を含む。
【００８７】
発現ベクターは、例えば、クローニングベクター、バイナリーベクターまたはインテグレーティングベクターであり得る。発現は、核酸分子の、例えば翻訳可能なｍＲＮＡへの転写を含む。一実施形態では、ベクターは、モノクローナルウサギ抗体の重鎖および／または軽鎖の一過的組換え発現のための真核生物発現プラスミドである。かかるベクターは、抗体発現のためだけでなく、例えば真核細胞、例えばＨＥＫ２９３もしくはその誘導体またはＣＨＯ細胞の一過性トランスフェクションによる抗体産物のために特に開発された。
【００８８】
ベクターの非限定的例として、ｐＱＥ−１２、ｐＵＣシリーズ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、発現ベクターのｐＥＴシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ）もしくはｐＣＲＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｌａｍｂｄａ  ｇｔ１１、ｐＪＯＥ、ｐＢＢＲ１−ＭＣＳシリーズ、ｐＪＢ８６１、ｐＢＳＭｕＬ、ｐＢＣ２、ｐＵＣＰＫＳ、ｐＴＡＣＴ１、ｐＴＲＥ、ｐＣＡＬ−ｎ−ＥＫ、ｐＥＳＰ−１、ｐＯＰ１３ＣＡＴ、Ｅ−０２７  ｐＣＡＧ  Ｋｏｓａｋ−Ｃｈｅｒｒｙ（Ｌ４５ａ）ベクターシステム、ｐＲＥＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＢＰＶ−１、ｐｄＢＰＶＭＭＴｎｅｏ、ｐＲＳＶｇｐｔ、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＩＺＤ３５、Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ  ｃＤＮＡ発現ベクターｐｃＤＶ１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＳＰＯＲＴ１（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）、ｐＧＥＭＨＥ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＬＸＩＮ、ｐＳＩＲ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＥＡＫ−１０（Ｅｄｇｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）ｐＴｒｉＥｘ−Ｈｙｇｒｏ（Ｎｏｖａｇｅｎ）およびｐＣＩＮｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）が挙げられる。Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓに対する好適なプラスミドベクターの非限定的例は、例えばプラスミドｐＡＯ８１５、ｐＰＩＣ９ＫおよびｐＰＩＣ３．５Ｋ（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む。Ｘｅｎｏｐｕｓ胚、ゼブラフィッシュ胚ならびに多種多様な哺乳動物および鳥類細胞においてタンパク質を発現するために好適な別のベクターは、多目的発現ベクターｐＣＳ２＋である。
【００８９】
一般に、ベクターは、１つまたは複数の複製開始点（ｏｒｉ）およびクローニングまたは発現のための遺伝系、宿主における選択のための１つまたは複数のマーカー、例えば、抗菌薬耐性ならびに１つまたは複数の発現カセットを含有することができる。加えて、ベクターに含まれるコード配列は、転写制御エレメントおよび／または他のアミノ酸コード配列に、確立された方法を使用してライゲートされてよい。かかる制御配列は、当業者に周知であり、限定されることなく、転写の開始を確実にする制御配列、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）（Ｏｗｅｎｓ，Ｇ．Ｃ．ら、［２００１］Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８：１４７１〜１４７６）ならびに任意選択で転写の終了および転写物の安定化を確実にする制御エレメントを含む。転写の開始を確実にするかかる制御エレメントの非限定的例は、プロモーター、翻訳開始コドン、エンハンサー、インスレーターおよび／または転写終結を確実にする制御エレメントを含み、これらは本発明の核酸分子の下流に含まれるものである。さらなる例として、Ｋｏｚａｋ配列ならびにＲＮＡスプライシングのためのドナーおよびアクセプター部位が隣接する介在配列、分泌シグナルをコードするヌクレオチド配列または、使用される発現系に応じて、細胞性コンパートメントへまたは培養培地へ発現されたタンパク質を方向付けることができるシグナル配列が挙げられる。
【００９０】
ベクターは、正しいタンパク質フォールディングを促進するための１つまたは複数のシャペロンをコードする追加的な発現可能なポリヌクレオチドも含有する場合がある。
好適な複製開始点の追加的例として、例えば全長ＣｏｌＥ１、切断型ＣｏｌＥＩ、ＳＶ４０ウイルス性およびＭ１３複製開始点が挙げられる一方で、好適なプロモーターの追加的例として、限定されることなく、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーター（ラウス肉腫（Rous sarcome）ウイルス）、ｌａｃＺプロモーター、テトラサイクリンプロモーター／オペレーター（ｔｅｔｐ／ｏ）、ニワトリβ−アクチンプロモーター、ＣＡＧ−プロモーター（ニワトリβ−アクチンプロモーターとサイトメガロウイルス最初期エンハンサーとの組合せ）、ｇａｉ１０プロモーター、ヒト伸長因子１α−プロモーター、ＡＯＸ１プロモーター、ＧＡＬ１プロモーターＣａＭ−キナーゼプロモーター、ｌａｃ、ｔｒｐもしくはｔａｃプロモーター、Ｔ７もしくはＴ５プロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ多核多角体ウイルス（multiple nuclear polyhedrosis virus）（ＡｃＭＮＰＶ）多角体プロモーターまたは哺乳動物および他の動物細胞におけるグロビンイントロンが挙げられる。エンハンサーの一例は、例えばＳＶ４０エンハンサーである。転写終結を確実にする制御エレメントについての非限定的な追加的例として、ＳＶ４０−ポリＡ部位、ｔｋ−ポリＡ部位、ｒｈｏ−非依存性ｌｐｐターミネーターまたはＡｃＭＮＰＶ多角体ポリアデニル化シグナルが挙げられる。選択可能マーカーのさらなる非限定的例として、メトトレキサートへの耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｒｅｉｓｓ、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．Ａｄｖ．）１３（１９９４）、１４３〜１４９）、アミノグリコシド  ネオマイシン、カナマイシンおよびパロマイシン（paromycin）に対する耐性を付与するｎｐｔ  （Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ、ＥＭＢＯ  Ｊ．２（１９８３）、９８７〜９９５）ならびに、ハイグロマイシンへの耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｍａｒｓｈ、Ｇｅｎｅ  ３２（１９８４）、４８１〜４８５）が挙げられる。追加的な選択可能遺伝子は、記載されており、すなわちｔｒｐＢ、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用できるようにする；ｈｉｓＤ、細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノール（histinol）を利用できるようにする（Ｈａｒｔｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５（１９８８）、８０４７）；マンノース−６−リン酸イソメラーゼ、細胞がマンノースを利用できるようにする（ＷＯ９４／２０６２７）、およびＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）、オルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤、２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチン、ＤＦＭＯに対する耐性を付与する（ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅ、１９８７、Ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｅｄ．）またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ由来のデアミナーゼ、ブラストサイジンＳに対する耐性を付与する（Ｔａｍｕｒａ、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９（１９９５）、２３３６〜２３３８）。
【００９１】
さらなる実施形態では、ベクターは、イントロンＡを含む５‘ＣＭＶプロモーターおよび３‘ＢＧＨポリアデニル化配列からなる発現カセットを含有する真核生物発現プラスミドである。発現カセットに加えて、プラスミドは、ｐＵＣ１８由来複製開始点および、Ｅ．ｃｏｌｉにプラスミド増幅のためのアンピリシン耐性を付与するベータラクタマーゼ遺伝子を含有できる。抗体の分泌のために、真核生物リーダー配列は、抗体遺伝子の５’にクローニングされてよい。
【００９２】
好適な細菌性発現宿主は、例えばＪＭ８３、Ｗ３１１０、ＫＳ２７２、ＴＧ１、Ｋ１２、ＢＬ２１（ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）ＰｌｙｓＳ、ＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬ、ＢＬ２１（ＤＥ３）ＰＲＡＲＥなど）またはＲｏｓｅｔｔａａ由来の株を含む。ベクター改変、ＰＣＲ増幅およびライゲーション技術について、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌ［２００１］（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＮＹ）を参照されたい。
【００９３】
本発明の核酸分子および／またはベクターは、例えば化学に基づく方法（ポリエチレンイミン、リン酸カルシウム、リポソーム、ＤＥＡＥデキストラン、ヌクレオフェクション）、非化学的方法（電気穿孔法、ソノポレーション、光学トランスフェクション（optical transfection）、遺伝子電気泳動転写、水力学的送達（hydrodynamic delivery）または細胞を本発明の核酸分子に接触させることで自然に生じる形質転換）、粒子に基づく方法（遺伝子銃、マグネトフェクション、インペールフェクション（impalefection））ファージベクターに基づく方法およびウイルスでの方法による細胞への導入のために設計されてよい。例えば、レトロウイルス、ワクチニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、セムリキ森林ウイルスまたはウシパピローマウイルスなどのウイルス由来の発現ベクターは、標的細胞集団への核酸分子の送達のために使用され得る。加えて、バキュロウイルス系も本発明の核酸分子のための真核生物発現系においてベクターとして使用され得る。一実施形態では、本発明の核酸分子および／またはベクターは、リン酸カルシウムによる化学的にコンピテントなＥ．ｃｏｌｉの形質転換のためおよび／またはポリエチレンイミンもしくはリポフェクタミントランスフェクションによるＨＥＫ２９３およびＣＨＯの一過性トランスフェクションのために設計される。
【００９４】
本発明は、本明細書において上に定義される選択肢（ｉ）から（ｖｉｉｉ）による軽鎖可変ドメインならびに本明細書において上に定義される選択肢（ｉ）から（ｖｉｉｉ）による合致する（例えば上の（ｖｉ）および（ｖｉ））重鎖可変ドメインをコードする核酸分子を含むベクターにさらに関する。
【００９５】
一実施形態では、ベクターは発現ベクターである。
本発明のベクター、具体的にはベクターの種類または制御配列に関して、本明細書において上で提供されるすべての定義および具体的に例示される実施形態を準用する。この第２の種類のベクターは、少なくとも２つの核酸分子、すなわち１つは軽鎖可変ドメインをコードし１つは重鎖可変ドメインをコードする２つの核酸分子を含むベクターに関する。上の組合せから明らかであるとおり、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとは、本発明の機能性抗ＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗体の発現が可能であるようにベクターにおいて組み合わされる。この第２の種類のベクターは、本明細書において「本発明の組合せベクター」とも称される。
【００９６】
本発明は、
（ｉ）本発明の組合せベクター；または
（ｉｉ）本発明の第１の核酸分子、すなわち本発明による軽鎖可変領域をコードする核酸分子を含む本発明の個別のベクターおよび本発明の第２の核酸分子、すなわち本発明の重鎖可変領域をコードする核酸分子を含む本発明の個別のベクターであって、これら２つのベクターが上に定義される合致する軽鎖および重鎖可変領域をコードする核酸分子を含む、ベクター
を含む宿主細胞または非ヒト宿主にさらに関する。
【００９７】
宿主細胞は、任意の原核または真核細胞であってよい。用語「原核生物」は、本発明のタンパク質の発現のためにＤＮＡまたはＤＮＡもしくはＲＮＡ分子を用いて形質転換、形質導入またはトランスフェクトされ得るすべての細菌を含んで意味する。原核生物宿主は、例えばＥ．ｃｏｌｉ、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓなどのグラム陰性およびグラム陽性細菌を含み得る。
【００９８】
用語「真核生物」は、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞を含んで意味する。典型的な哺乳動物宿主細胞として、Ｈｅｌａ、ＨＥＫ２９３、Ｈ９、Ｐｅｒ．Ｃ６およびＪｕｒｋａｔ細胞、マウスＮＩＨ３Ｔ３、ＮＳ／０、ＳＰ２／０およびＣ１２７細胞、ＣＯＳ細胞、例えばＣＯＳ１またはＣＯＳ７、ＣＶ１、ウズラＱＣ１−３細胞、マウスＬ細胞、マウス肉腫細胞、Ｂｏｗｅｓメラノーマ細胞ならびにチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が挙げられる。本発明による例示的な哺乳動物宿主細胞は、ＣＨＯ細胞である。他の好適な真核生物宿主細胞として、限定されることなく、例えばＤＴ４０細胞などのニワトリ細胞、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅおよびＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓなどの酵母が挙げられる。発現のために好適な昆虫細胞は、例えばＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｋｃ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｓｆ９およびＳｆ２１またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  Ｈｉ５細胞である。好適なゼブラフィッシュ細胞株として、限定されることなく、ＺＦＬ、ＳＪＤまたはＺＦ４が挙げられる。
【００９９】
記載されるベクター（複数可）は、宿主のゲノムにインテグレートされ得るか、または染色体外に維持され得るか、のいずれかである。ベクターが適切な宿主に組み込まれると、宿主は核酸分子の高レベル発現のために好適な条件下に維持され、所望により、本発明の抗体の回収および精製が続き得る。上に記載の宿主細胞のために適切な培養培地および条件は、当技術分野において公知である。
【０１００】
一実施形態では、述べられる宿主は、ヒト細胞またはヒト細胞株などの哺乳動物細胞である。さらなる実施形態では、本発明のベクター（複数可）を用いて形質転換される宿主細胞は、ＨＥＫ２９３またはＣＨＯである。またさらなる実施形態では、本発明のベクター（複数可）を用いて形質転換される宿主細胞は、ＣＨＯである。これらの宿主細胞ならびに好適な培地および細胞培養条件は、当技術分野において記載されている、例えばＢａｌｄｉ  Ｌ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ．２００５  Ｊａｎ−Ｆｅｂ；２１（１）：１４８〜５３、Ｇｉｒａｒｄ  Ｐ．ら、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００２  Ｊａｎ；３８（１−３）：１５〜２１およびＳｔｅｔｔｌｅｒ  Ｍ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２００７  Ｎｏｖ−Ｄｅｃ；２３（６）：１３４０〜６を参照されたい。
【０１０１】
本発明による用語「を含むベクター」に関して、本発明の抗ＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗体を産生するために宿主細胞に必要および／または十分であるさらなる核酸配列が、ベクター中に存在することは理解される。かかるさらなる核酸配列は、例えば、軽鎖の残部をコードする核酸配列および重鎖の残部をコードする核酸配列である。
【０１０２】
本発明による宿主細胞または非ヒト宿主は、本明細書において上に定義される軽鎖および重鎖可変領域の両方をコードする１つのベクターを含むか、または一方のベクターが本発明による軽鎖可変領域をコードする核酸分子を保有し、第２のベクターが本発明による合致する重鎖可変領域をコードする核酸分子を保有する２つの別々のベクターを含む。したがって、第１のベクターが本明細書において上の選択肢（ｉ）による軽鎖可変領域をコードする核酸分子を保有する場合、それにより第２のベクターは同様に上の選択肢（ｉ）による重鎖可変領域をコードする核酸分子を保有する。同じことを選択肢（ｉｉ）から（ｖｉｉｉ）に準用する。
【０１０３】
したがって、各場合において、本明細書において上に記載される結合能力からなる本発明の抗ＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗体の産生を確実にするために、１つの抗体分子内に存在することが必要であるこれらの核酸分子の発現は、互いに関連付けられている。
【０１０４】
本実施形態による宿主細胞は、例えば、多量の本発明の抗ＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗体を産生するために使用され得る。前記宿主細胞は、上に記載のベクター（複数可）を宿主に導入することによって産生される。宿主中の前記ベクター（複数可）の存在は、次に本発明の抗ＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗体の上に記載の軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインをコードする核酸分子の発現を媒介する。本明細書において上に記載のとおり、本発明のベクター（複数可）は、全長ＩｇＧ抗体の発現を可能にする配列をさらに含むことができ、それにより宿主細胞による全長ＩｇＧ抗体の産生をもたらし、ここで前記抗体は、本発明による可変軽鎖および／または重鎖ドメインの存在によって特徴付けられる。
【０１０５】
本発明は、配列番号１の合成ペプチドに結合し、配列番号２の合成ペプチドと比較して配列番号１のペプチドに対して少なくとも１０倍の結合優先性を有し、配列番号１のペプチドと比較して配列番号３の合成ペプチドに少なくとも同様に結合することを特徴とする、ＰＩＶＫＡ−ＩＩに特異的に結合する抗体の産生のための方法にさらに関し、方法は本発明の宿主細胞を好適な条件下で培養するステップおよび産生された抗体を単離するステップを含む。
【０１０６】
本実施形態により、本発明の宿主中に存在するベクター（複数可）は、発現ベクター（複数可）、または宿主細胞のゲノムへの本発明の核酸分子（複数可）の、その発現が確実である様式での安定なインテグレーションを媒介するベクター（複数可）のいずれかである。本発明の抗ＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗体の軽鎖および重鎖ドメインそれぞれをコードする核酸分子が、抗体の発現が確実であるように良好に導入されている宿主細胞の選択のための手段および方法は、当技術分野において周知であり、記載されている（Ｂｒｏｗｎｅ，Ｓ．Ｍ．＆  Ａｌ−Ｒｕｂｅａｉ，Ｍ．［２００７］Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５：４２５〜４３２；Ｍａｔａｓｃｉ，Ｍら、［２００８］Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ：Ｔｅｃｈｎｏｌ．５：ｅ３７−ｅ４２；Ｗｕｒｍ，Ｆ．Ｍ．［２００４］Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：１３９３〜１３９８）。
【０１０７】
原核または真核生物宿主細胞を培養するための好適な条件は、当業者に周知である。例えば細菌、例えばＥ．ｃｏｌｉなどの細菌は、Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地中、通気下、典型的には４から約３７℃の温度で培養され得る。発現産物の収量および溶解度を増加させるために、培地は、緩衝されてよく、または両者を増強もしくは促進することが公知である好適な添加物を補充されてよい。誘導性プロモーターが宿主細胞に存在するベクター（複数可）中の本発明の核酸分子を調節する場合、ポリペプチドの発現は、例えばアンヒドロテトラサイクリンなどの適切な誘導剤の添加によって誘導され得る。好適な発現プロトコールおよび戦略は、当技術分野において記載されており（例えば、Ｄｙｓｏｎ，Ｍ．Ｒ．ら、（２００４）．ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４、３２〜４９においておよびＢａｌｄｉ，Ｌ．ら、（２００７）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２９、６７７〜６８４において）、必要に応じて、特定の宿主細胞が必要とすることおよび発現されるタンパク質の必要要件に適合され得る。
【０１０８】
細胞型およびその具体的な必要要件に依存して、哺乳動物細胞培養は、例えば１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ’ＥまたはＤＭＥＭ培地において実行されてよい。細胞は、ＤＴ４０ニワトリ細胞では例えば３７℃または４１℃、５％ＣＯ２、水飽和雰囲気中に保たれてよい。
【０１０９】
昆虫細胞培養のために好適な培地は、例えばＴＮＭ＋１０％ＦＣＳ、ＳＦ９００またはＨｙＣｌｏｎｅ  ＳＦＸ−Ｉｎｓｅｃｔ培地である。昆虫細胞は、通常付着培養または懸濁培養として２７℃で増殖させる。
【０１１０】
真核細胞または脊椎動物細胞のための好適な発現プロトコールは、当業者に周知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌ，Ｄ．Ｗ．［２００１］（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＮＹ）から検索され得る。
【０１１１】
一実施形態では、方法は、例えばＣＨＯまたはＨＥＫ２９３細胞などの哺乳動物細胞を使用して実行される。さらなる実施形態では、方法は、ＣＨＯ細胞を使用して実行される。
【０１１２】
組換え産生手順において使用される宿主に依存して、発現される抗体は、グリコシル化されている場合とされていない場合がある。一実施形態では、プラスミドまたはウイルスは、本発明の抗体のコード配列ならびにそれに遺伝子的に融合されたＮ末端ＦＬＡＧタグおよび／またはＣ末端Ｈｉｓタグを含有して使用される。さらなる実施形態では、前記ＦＬＡＧ−タグの長さは、例えば正確に８アミノ酸などの約４から８アミノ酸である。上に記載されるベクターは、当業者に一般に公知の任意の技術を使用して宿主を形質転換またはトランスフェクトするために使用され得る。さらに、融合し、作動可能に連結した遺伝子を調製するため、ならびにそれらを例えば哺乳動物細胞および細菌において発現するための方法は、当技術分野において周知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、同上）。
【０１１３】
形質転換された宿主は、バイオリアクターにおいて増殖させることができ、当技術分野において公知の技術によって最適な細胞増殖を達成するように培養され得る。次に本発明の抗体は、増殖培地から単離され得る。例えば、本発明の微生物によって発現された抗体の単離および精製は、例えば、親和性クロマトグラフィー（例えば、ＳｔｒｅｐタグＩＩもしくはＨｉｓ６タグなどの融合タグを使用する）、ゲルろ過（サイズ排除クロマトグラフィー）、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、逆相ＨＰＬＣまたは免疫沈降などの任意の従来の手段によってでよい。これらの方法は、当技術分野において周知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌ，Ｄ．Ｗ．［２００１］（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＮＹ）に一般に記載されている。
【０１１４】
本発明により、用語「産生された抗体を単離すること」が本発明の抗ＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗体の単離を指すことは理解される。
さらに、本発明は、配列番号１の合成ペプチドに結合し、配列番号２の合成ペプチドと比較して配列番号１のペプチドに対して少なくとも１０倍の結合優先性を有し、配列番号１のペプチドと比較して配列番号３の合成ペプチドに少なくとも同様に結合することを特徴とする、ＰＩＶＫＡ−ＩＩに特異的に結合する抗体であって、本発明の方法によって得ることができるまたは得られる、抗体に関する。
【０１１５】
本発明は、
（ｉ）本発明の抗体、
（ｉｉ）本発明の核酸分子、
（ｉｉｉ）本発明のベクター、
（ｉｖ）本発明の宿主細胞、および／または
（ｖ）本発明の方法によって産生された抗体
の少なくとも１つを含む組成物にさらに関する。
【０１１６】
本発明により使用される場合、用語「組成物」は、述べられた化合物の少なくとも１つを含む組成物に関する。それは、任意選択で、本発明の化合物の特徴を変更でき、それによりそれらの機能を、例えば、安定化、モジュレートおよび／または増強するさらなる分子を含み得る。組成物は、固体または液体形態であってよく、とりわけ粉末（複数可）、錠剤（複数可）または溶液（複数可）の形態であってよい。
【０１１７】
組成物の構成成分は、１つまたは複数の容器、例えば、密封されたアンプルもしくはバイアルに、水溶液としてまたは再構成のための凍結乾燥製剤として包装されてよい。凍結乾燥製剤の例として、１０ｍｌバイアルは５ｍｌの１％（ｗ／ｖ）または１０％（ｗ／ｖ）水溶液を用いて充填され、得られた混合物は凍結乾燥される。使用のための溶液は、例えば、治療使用のための注射用水または別の望ましい溶媒、例えば、診断目的のための緩衝液、のいずれかを使用して凍結乾燥化合物（複数可）を再構成することによって調製される。保存剤および、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤および不活性ガスなどの他の添加剤も存在してよい。
【０１１８】
組成物の種々の構成成分は、使用のための説明書を含むキットとして包装されてよい。
一実施形態では本開示は、ａ）試料を、配列番号１の合成ペプチドに結合し、配列番号２の合成ペプチドと比較して配列番号１のペプチドに対して少なくとも１０倍の結合優先性を有し、配列番号１のペプチドと比較して配列番号３の合成ペプチドに少なくとも同様に結合することを特徴とする、ＰＩＶＫＡ−ＩＩに結合する特異的結合剤と；特異的結合剤−ＰＩＶＫＡ−ＩＩ複合体の形成のために十分な時間および条件下で接触させるステップ；およびｂ）特異的結合剤−ＰＩＶＫＡ−ＩＩ複合体の存在を検出するステップであって、特異的結合剤−ＰＩＶＫＡ−ＩＩ複合体の存在が試料中のＰＩＶＫＡ−ＩＩの存在を示す、ステップを含む試料中のＰＩＶＫＡ−ＩＩを検出する方法に関する。
【０１１９】
一実施形態では本発明は、ａ）試料を、配列番号１の合成ペプチドに結合し、配列番号２の合成ペプチドと比較して配列番号１のペプチドに対して少なくとも１０倍の結合優先性を有し、配列番号１のペプチドと比較して配列番号３の合成ペプチドに少なくとも同様に結合することを特徴とする、ＰＩＶＫＡ−ＩＩへの第１の特異的結合剤およびＰＩＶＫＡ−ＩＩへの第２の特異的結合剤と、第１の特異的結合剤−ＰＩＶＫＡ−ＩＩ−第２の特異的結合剤複合体を形成するために十分な時間および条件下で接触させるステップであって、第２の特異的結合剤が検出可能に標識化されているステップ；ならびにｂ）（ａ）において形成された複合体を測定することにより、試料中のＰＩＶＫＡ−ＩＩを検出する、ステップを含む、試料中のＰＩＶＫＡ−ＩＩを検出する方法に関する。
【０１２０】
当業者に明らかであるとおり、試料は、第１のおよび第２の特異的結合剤と任意の望ましい順序で、すなわち第１の→第２の；第２の→第１のまたは同時に、第１の特異的結合剤ＰＩＶＫＡ−ＩＩ第２の特異的結合剤複合体を形成するために十分な時間および条件下で接触されてよい。
【０１２１】
一実施形態では本開示は、ａ）試料を、配列番号１の合成ペプチドに結合し、配列番号２の合成ペプチドと比較して配列番号１のペプチドに対して少なくとも１０倍の結合優先性を有し、配列番号１のペプチドと比較して配列番号３の合成ペプチドに少なくとも同様に結合することを特徴とする、ＰＩＶＫＡ−ＩＩに結合する第１の特異的結合剤と；第１の特異的結合剤−ＰＩＶＫＡ−ＩＩ複合体の形成のために十分な時間および条件下で接触させるステップ；ｂ）ＰＩＶＫＡ−ＩＩへの第２の特異的結合剤を第１の特異的結合剤−ＰＩＶＫＡ−ＩＩ複合体に、第１の特異的結合剤−ＰＩＶＫＡ−ＩＩ−第２の特異的結合剤複合体を形成するために十分な時間および条件下で加えておくステップであって、第２の特異的結合剤が検出可能に標識化されている、ステップ；およびｃ）（ｂ）において形成された複合体を測定することにより、試料中のＰＩＶＫＡ−ＩＩを検出するステップを含む、試料中のＰＩＶＫＡ−ＩＩを検出する方法に関する。
【０１２２】
当業者が容易に理解するとおり、特異的結合剤（ＰＩＶＫＡ−ＩＩへの）と（ＰＩＶＫＡ−ＩＩ）抗原／分析物（＝特異的結合剤−抗原／分析物複合体）とのいずれかの間の複合体の形成、または第１の特異的結合剤（ＰＩＶＫＡ−ＩＩへの）、（ＰＩＶＫＡ−ＩＩ）抗原／分析物および第２の特異的結合剤（ＰＩＶＫＡ−ＩＩへの）を含む二次もしくはサンドイッチ複合体（＝第１の特異的結合剤−抗原／分析物−第２の特異的結合剤複合体）の形成のために、適切であるまたは十分である時間および条件を確立することは、日常的な実験に過ぎない。
【０１２３】
分析物ＰＩＶＫＡ−ＩＩを検出するための方法のさらなる実施形態では、ＰＩＶＫＡ−ＩＩへの特異的結合剤または使用される結合剤の少なくとも１つは、上に定義されるとおりである。
【０１２４】
特異的結合剤−ＰＩＶＫＡ−ＩＩ複合体の検出は、任意の適切な手段によって実施され得る。当業者は、かかる手段／方法を完全に熟知している。
用語「試料」または「目的の試料」または「検査試料」は、本明細書において互換的に用いられる。試料は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試料であり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで分析され、身体に戻されない。試料の例として、これだけに限らないが血液、血清、血漿、滑膜液、尿、唾液およびリンパ液などの液体試料または、組織抽出物、軟骨、骨、滑膜および結合組織などの固形試料が挙げられる。一実施形態では試料は、血液、血清、血漿、滑膜液および尿から選択される。一実施形態では試料は、血液、血清および血漿から選択される。一実施形態では試料は、血清または血漿である。
【０１２５】
本明細書において使用される場合、用語「参照試料」は、目的の試料と実質的に同一の様式で分析され、その情報が目的の試料のものと比較される試料を指す。それにより参照試料は、目的の試料から得られた情報の評価を可能にする基準を提供する。参照試料は、健康なまたは正常な組織、器官または個体由来であってよく、それにより、組織、器官または個体の健康な状況の基準を提供する。正常な参照試料の状況と目的の試料の状況との間の差異は、疾患発症のリスクまたはかかる疾患もしくは障害の存在もしくはさらなる進行を示し得る。参照試料は、異常なまたは病的な組織、器官または個体由来であってよく、それにより組織、器官または個体の病的な状況の基準を提供する。異常な参照試料の状況と目的の試料の状況との間の差異は、疾患発症のリスクが低いことまたはかかる疾患または障害が存在しないこと、もしくはそれらが改善していることを示し得る。
【０１２６】
用語、指標の「上昇した」または「増加した」レベルは、試料中のかかる指標のレベルが参照または参照試料におけるかかる指標のレベルと比較して高いことを指す。例えば、所与の疾患を罹患していない個体の同じ液体試料より高い量で、前記疾患を罹患している１個の個体の液体試料において検出可能であるタンパク質は、上昇したレベルを有する。
【０１２７】
ある特定の実施形態では、サンドイッチは、第１の特異的結合剤（ＰＩＶＫＡ−ＩＩへの）、（ＰＩＶＫＡ−ＩＩ）抗原および第２の特異的結合剤（ＰＩＶＫＡ−ＩＩへの）を含んで形成され、ここで第２の特異的結合剤は検出可能に標識化されている。
【０１２８】
多数の標識（色素とも称される）は、利用可能であり、一般に以下のカテゴリーに分類することができ、それらすべてを合わせておよびそれらそれぞれが本開示による実施形態を表す：
（ａ）蛍光色素
蛍光色素は、例えば、Ｂｒｉｇｇｓら、”Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｄｙｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｔｏ  Ａｍｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，”  Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｔｒａｎｓ．１（１９９７）１０５１〜１０５８）によって記載されている。
【０１２９】
蛍光標識またはフルオロフォアとして、希土類キレート（ユーロピウムキレート）、ＦＩＴＣ、５−カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシフルオレセインを含むフルオレセイン型標識；ＴＡＭＲＡを含むローダミン型標識；ダンシル；リサミン；シアニン；フィコエリトリン；テキサスレッド；およびこれらの類似体が挙げられる。蛍光標識は、本明細書に開示される技術を使用して標的分子中に含まれるアルデヒド基にコンジュゲートされてよい。蛍光色素および蛍光標識試薬として、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇｏｎ、ＵＳＡ）およびＰｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．）から商業的に入手できるものが挙げられる。
【０１３０】
（ｂ）発光色素
発光色素または標識は、化学発光および電気化学発光色素にさらに細分類され得る。
化学発光（chemiluminogenic）標識のさまざまなクラスとして、ルミノール、アクリジニウム化合物、セレンテラジンおよび類似物、ジオキセタン、ペルオキシオキサリック酸（peroxyoxalic acid）およびそれらの誘導体に基づく系が挙げられる。免疫診断手順のために主にアクリジニウムに基づく標識が使用される（詳細な概説は、Ｄｏｄｅｉｇｎｅ  Ｃ．ら、Ｔａｌａｎｔａ  ５１（２０００）４１５〜４３９に示されている）。
【０１３１】
電気化学発光標識として使用される主な関連標識は、それぞれルテニウムおよびイリジウムに基づく電気化学発光複合体である。電気化学発光（Electrochemiluminescense）（ＥＣＬ）は、高感度および選択的な方法として分析的応用において非常に有用であることが証明されている。それは、化学発光分析（バックグラウンド光学シグナルの非存在）の分析的有利点と、印加する電極電位による反応調節の容易さとを組み合わせている。一般に、ルテニウム複合体、特に、液相または液体固相界面においてＴＰＡ（トリプロピルアミン）を用いて再生される［Ｒｕ（Ｂｐｙ）３］２＋（約６２０ｎｍで光子を放出する）は、ＥＣＬ標識として使用される。近年、イリジウムに基づくＥＣＬ標識も記載されている（ＷＯ２０１２１０７４１９（Ａ１））。
【０１３２】
（ｃ）放射性標識は、３Ｈ、１１Ｃ、１４Ｃ、１８Ｆ、３２Ｐ、３５Ｓ、６４Ｃｕ、６８Ｇｎ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９９ＴＣ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１３３Ｘｅ、１７７Ｌｕ、２１１Ａｔまたは１３１Ｂｉなどの放射性同位元素（放射性核種）を利用する。
【０１３３】
（ｄ）画像化および治療目的のための標識として好適な金属キレート複合体は、当技術分野において周知である（ＵＳ２０１０／０１１１８５６；ＵＳ５，３４２，６０６；ＵＳ５，４２８，１５５；ＵＳ５，３１６，７５７；ＵＳ５，４８０，９９０；ＵＳ５，４６２，７２５；ＵＳ５，４２８，１３９；ＵＳ５，３８５，８９３；ＵＳ５，７３９，２９４；ＵＳ５，７５０，６６０；ＵＳ５，８３４，４５６；Ｈｎａｔｏｗｉｃｈら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６５（１９８３）１４７〜１５７；Ｍｅａｒｅｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４２（１９８４）６８〜７８；Ｍｉｒｚａｄｅｈら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１（１９９０）５９〜６５；Ｍｅａｒｅｓら、Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（１９９０）、Ｓｕｐｐｌ．１０：２１〜２６；Ｉｚａｒｄら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．３（１９９２）３４６〜３５０；Ｎｉｋｕｌａら、Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２２（１９９５）３８７〜９０；Ｃａｍｅｒａら、Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２０（１９９３）９５５〜６２；Ｋｕｋｉｓら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３９（１９９８）２１０５〜２１１０；Ｖｅｒｅｌら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４４（２００３）１６６３〜１６７０；Ｃａｍｅｒａら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２１（１９９４）６４０〜６４６；Ｒｕｅｇｇら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０（１９９０）４２２１〜４２２６；Ｖｅｒｅｌら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４４（２００３）１６６３〜１６７０；Ｌｅｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１（２００１）４４７４〜４４８２；Ｍｉｔｃｈｅｌｌら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４４（２００３）１１０５〜１１１２；Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１０（１９９９）１０３〜１１１；Ｍｉｅｄｅｒｅｒら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４５（２００４）１２９〜１３７；ＤｅＮａｒｄｏら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４（１９９８）２４８３〜９０；Ｂｌｅｎｄら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ＆  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  １８（２００３）３５５〜３６３；Ｎｉｋｕｌａら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４０（１９９９）１６６〜７６；Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３９（１９９８）８２９〜３６；Ｍａｒｄｉｒｏｓｓｉａｎら、Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２０（１９９３）６５〜７４；Ｒｏｓｅｌｌｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ＆  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、１４（１９９９）２０９〜２０）。
【０１３４】
一実施形態では、第１の特異的結合剤、ＰＩＶＫＡ−ＩＩおよび第２の特異的結合剤複合体を含むサンドイッチの形成のために使用されるＰＩＶＫＡ−ＩＩへの第２の特異的結合剤は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体である。
【０１３５】
一実施形態では、サンドイッチイムノアッセイ方法は、かかるサンドイッチアッセイにおける一方のパートナーとして本発明によるＰＩＶＫＡ−ＩＩへの第１の特異的結合剤、および別の結合パートナーとしてＰＩＶＫＡ−ＩＩ（配列番号８）のＦ１／Ｆ２断片に結合する第２の特異的結合剤を使用して行われる。
【０１３６】
一実施形態ではサンドイッチイムノアッセイ法は、かかるサンドイッチアッセイにおける一方のパートナーとして本発明によるＰＩＶＫＡ−ＩＩへの第１の特異的結合剤、および別の結合パートナーとしてＰＩＶＫＡ−ＩＩ（配列番号９）のＦ１断片に結合する第２の特異的結合剤を使用して行われる。
【０１３７】
一実施形態ではサンドイッチイムノアッセイ法は、かかるサンドイッチアッセイにおける一方のパートナーとして本発明によるＰＩＶＫＡ−ＩＩへの第１の特異的結合剤、および別の結合パートナーとしてＰＩＶＫＡ−ＩＩ（配列番号７）のＧｌａドメインに結合する第２の特異的結合剤を使用して行われる。
【０１３８】
第１の特異的結合剤、ＰＩＶＫＡ−ＩＩおよび第２の特異的結合剤を含むサンドイッチの形成では；２つの特異的結合剤は非重複エピトープに結合する。一実施形態ではＰＩＶＫＡ−ＩＩへの第２の特異的結合剤は、配列番号１の部分ではないＰＩＶＫＡ−ＩＩ上のエピトープに結合する。一実施形態では、第１のおよび第２の特異的結合剤の両方、それぞれは抗体であり、一実施形態ではそれらの両方は、モノクローナル抗体である。
【０１３９】
一実施形態では本開示は、ａ）患者から試料を得るステップ；ｂ）試料を請求項１から５のいずれかに記載のＰＩＶＫＡ−ＩＩへの第１の特異的結合剤およびＰＩＶＫＡ−ＩＩへの第２の特異的結合剤と、第１の特異的結合剤−ＰＩＶＫＡ−ＩＩ−第２の特異的結合剤複合体を形成するために十分な時間および条件下で接触させるステップであって、第２の特異的結合剤が検出可能に標識化されている、ステップ；ｃ）（ｂ）において形成された複合体を測定することにより、試料中に存在するＰＩＶＫＡ−ＩＩの量を測定するステップであって、参照レベルより多いＰＩＶＫＡ−ＩＩの量が患者におけるＨＣＣの存在を示す、ステップを含む、ＨＣＣを有することが疑われる患者においてＨＣＣを診断する方法に関する。
【０１４０】
一実施形態では本開示は、ａ）患者から試料を得るステップ；ｂ）試料を、配列番号１の合成ペプチドに結合し、配列番号２の合成ペプチドと比較して配列番号１のペプチドに対して少なくとも１０倍の結合優先性を有し、配列番号１のペプチドと比較して配列番号３の合成ペプチドに少なくとも同様に結合することを特徴とする、ＰＩＶＫＡ−ＩＩに結合する特異的結合剤と；特異的結合剤−ＰＩＶＫＡ−ＩＩ複合体の形成のために十分な時間および条件下で接触させるステップ；ｃ）ＰＩＶＫＡ−ＩＩへの第２の特異的結合剤を第１の特異的結合剤−ＰＩＶＫＡ−ＩＩ複合体に、第１の特異的結合剤−ＰＩＶＫＡ−ＩＩ−第２の特異的結合剤複合体を形成するために十分な時間および条件下で加えておくステップであって、第２の特異的結合剤が配列番号１の部分ではないＰＩＶＫＡ−ＩＩ上のエピトープに結合し、検出可能に標識化されている、ステップ；ｄ）（ｃ）において形成された複合体を測定することにより、試料中に存在するＰＩＶＫＡ−ＩＩの量を測定するステップであって、予め決定されたレベルより多いＰＩＶＫＡ−ＩＩの量が患者におけるＨＣＣの存在を示す、ステップを含む、ＨＣＣを有することが疑われる患者においてＨＣＣを診断する方法に関する。
【０１４１】
一実施形態では本開示は、配列番号１の合成ペプチドに結合し、配列番号２の合成ペプチドと比較して配列番号１のペプチドに対して少なくとも１０倍の結合優先性を有し、配列番号１のペプチドと比較して配列番号３の合成ペプチドに少なくとも同様に結合することを特徴とする、ＰＩＶＫＡ−ＩＩに結合する特異的結合剤の、ＰＩＶＫＡ−ＩＩの測定における使用に関する。
【０１４２】
一実施形態では本開示は、配列番号１の合成ペプチドに結合し、配列番号２の合成ペプチドと比較して配列番号１のペプチドに対して少なくとも１０倍の結合優先性を有し、配列番号１のペプチドと比較して配列番号３の合成ペプチドに少なくとも同様に結合することを特徴とする、ＰＩＶＫＡ−ＩＩに結合する特異的結合剤を含有する容器を含む、試料中のＰＩＶＫＡ−ＩＩを検出するおよび／またはその量を定量するためのキットに関する。
【０１４３】
以下の実施例は、本発明の理解を助けるために提供され、その真の範囲は、添付の特許請求の範囲に記されている。記載される手順において改変が、本発明の精神から逸脱することなく作製され得ることは理解される。
【実施例】
【０１４４】
実施例１
モノクローナル抗ＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗体の生成における使用のためのペプチド免疫原の合成
１．１免疫原においておよびスクリーニング試薬において使用されるペプチドのための一般的合成方法
ペプチドを例えばＰｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃからのマルチプルペプチド合成機でフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）固相ペプチド合成によって合成した。この合成では、合成の各ステップにおいて各アミノ酸誘導体の４当量を使用した。アミノ酸誘導体を１当量の１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾールを含有するジメチルホルムアミドに溶解した。ペプチドをＴｅｎｔａｇｅｌ（登録商標）レジン（Ｒａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ  ＧｍｂＨ、Ｔｕｂｉｎｇｅｎ）上で合成した。カップリング反応を、レジン負荷量と比較して４当量のＨＡＴＵ（１−［Ｂｉｓ（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウム３−オキシドヘキサフルオロホスフェート）および８当量のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを含む、反応媒体としてのジメチルホルムアミド中で５分間実行した。Ｆｍｏｃ基をジメチルホルムアミド中の２０％ピペリジンを使用して各合成ステップ後８分間以内に切断した。合成レジンからのペプチドの遊離および酸不安定性保護基の切断を３時間以内に室温で、トリフルオロ酢酸、トリイソプロピルシランおよび水（３８：１：１）を含有するカクテルを用いて達成した。次に反応溶液を、ペプチドを沈殿させるための冷却ジイソプロピルエーテルと混合した。沈殿物をろ過し、冷却ジイソプロピルエーテルを用いて再度洗浄し、少量の酢酸水溶液に溶解し、凍結乾燥させた。得られた粗物質を０．１％トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリル／水の勾配を使用して調製用ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。精製された物質の同一性をイオンスプレー質量分析によって調べた。
【０１４５】
１．２ペプチド免疫原５１−７３
プレプロトロンビン（配列番号５）のアミノ酸５１から７３を含み、但し、５３位のリシンがアルギニンによって置換され、βＡｌａ−Ａｈｘ−βＡｌａ−βＡｌａのＮ末端伸長がある、ペプチドβＡｌａ−Ａｈｘ−βＡｌａ−βＡｌａ−ＶＲＲＧＮＬＥＲＥＣＶＥＥＴＣＳＹＥＥＡＦＥＡ−ＮＨ２（配列番号３２）を合成した。
【０１４６】
ＥＳＩ−ＭＳｃａｌｃ：Ｍ＋＝３０４５．４Ｄａ；
ＥＳＩ−ＭＳｅｘｐ：［Ｍ＋３Ｈ］３＋＝１０１５．６Ｄａ
このペプチドのジスルフィド酸化を以下のとおり実施した。ＣＬＥＡＲ−ＯＸ（商標）レジン（１３０ｍｇ、２６μｍｏｌ）をジクロロメタン（ＤＣＭ）中で３０分間膨潤させ、次にジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、メタノールおよびアセトニトリルを用いて連続的に洗浄した。還元ペプチド（１６ｍｇ、８．５μｍｏｌ）を脱気したアンモニウムアセテート緩衝液（０．１Ｍ；ｐＨ７．８）とアセトニトリルとの混合物（１：１、２．５ｍＬ）に溶解し、レジンに加え、穏やかに４時間撹拌した。レジンを５０％アセトニトリル水溶液を用いて洗浄し、ろ液を凍結乾燥した。
【０１４７】
ＥＳＩ−ＭＳｃａｌｃ：Ｍ＋＝３０４３．４Ｄａ；ＥＳＩ−ＭＳｅｘｐ：［Ｍ＋３Ｈ］３＋＝１０１５．２Ｄａ
次のステップは、ジエチルスクアレート（スクアレート＝３−エトキシ−３−シクロブテン−１，２−ジオン）のＮ末端コンジュゲーションであった。エタノールおよび水（１：１）中のペプチド（９ｍｇ、３μｍｏｌ）の溶液に３，４−ジエトキシ−３−シクロブテン−１，２−ジオン（１．２当量）を加えた。溶液を炭酸ナトリウムの添加によってｐＨ８．０に保ち、一晩撹拌し、次に乾燥のために蒸発させた。
【０１４８】
ＥＳＩ−ＭＳｃａｌｃ：Ｍ＋＝３１６７．２Ｄａ；ＥＳＩ−ＭＳｅｘｐ：［Ｍ＋３Ｈ］３＋＝１０５６．５Ｄａ
次に、ペプチド−ＫＬＨコンジュゲートを合成した。ホウ酸緩衝液（１０ｍＬ、０．１Ｍ、ｐＨ９．０）中ＫＬＨ（３５ｍｇ）の溶液にスクアラミド含有ペプチド（９ｍｇ、３μｍｏｌ）を加えた。反応物を一晩、室温でインキュベートし、リン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０）に対して透析し、３５．３ｍｇペプチド−ＫＬＨコンジュゲートを得た。
【０１４９】
１．３ペプチド免疫原５５−７０
プレプロトロンビン（配列番号５）のアミノ酸５５から７０およびβＡｌａ−Ａｈｘ−βＡｌａ−βＡｌａのＮ末端伸長を含んで、ペプチドβＡｌａ−Ａｈｘ−βＡｌａ−βＡｌａ−ＮＬＥＲＥＣＶＥＥＴＣＳＹＥＥＡ−ＮＨ２（配列番号３３）を合成した。
【０１５０】
ＥＳＩ−ＭＳｃａｌｃ：Ｍ＋＝２２２９．０Ｄａ；
ＥＳＩ−ＭＳｅｘｐ：［Ｍ＋２Ｈ］２＋＝１１１５．５Ｄａ
このペプチドのジスルフィド酸化を以下のとおり実施した。ＣＬＥＡＲ−ＯＸ（商標）レジン（２３０ｍｇ、４６μｍｏｌ）をＤＣＭ中で３０分間膨潤させ、次にＤＭＦ、メタノールおよびアセトニトリルを用いて連続的に洗浄した。還元ペプチド（３４ｍｇ、１５．３μｍｏｌ）を脱気したアンモニウムアセテート緩衝液（０．１Ｍ；ｐＨ７．８）とアセトニトリルとの混合物（１：１、５ｍＬ）に溶解し、レジンに加え、穏やかに４時間撹拌した。レジンを５０％アセトニトリル水溶液を用いて洗浄し、ろ液を凍結乾燥した。
【０１５１】
ＥＳＩ−ＭＳｃａｌｃ：Ｍ＋＝２２２７．０Ｄａ；
ＥＳＩ−ＭＳｅｘｐ：［Ｍ＋２Ｈ］２＋＝１１１４．５Ｄａ
次のステップは、ジエチルスクアレートのＮ末端コンジュゲーションであった。エタノールおよび水（１：１）中のペプチド（３４ｍｇ、１５．３μｍｏｌ）の溶液に３，４−ジエトキシ−３−シクロブテン−１，２−ジオン（１．５当量）を加えた。溶液を炭酸ナトリウムの添加によってｐＨ８．０に保ち、一晩撹拌し、次に乾燥のために蒸発させた。
【０１５２】
ＥＳＩ−ＭＳｃａｌｃ：Ｍ＋＝２３５１．４Ｄａ；
ＥＳＩ−ＭＳｅｘｐ：［Ｍ＋２Ｈ］２＋＝１１７６．６Ｄａ
次にペプチド−ＫＬＨコンジュゲートを合成した。ホウ酸緩衝液（１５ｍＬ、０．１Ｍ、ｐＨ９．０）中ＫＬＨ（５０ｍｇ）の溶液にスクアラミド含有ペプチド（２７．２ｍｇ、１２．２μｍｏｌ）を加えた。反応物を一晩、室温でインキュベートし、リン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０）に対して透析し、４９．５ｍｇペプチド−ＫＬＨコンジュゲートを得た。
【０１５３】
実施例２
モノクローナル抗ＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗体の生成
２．１  ＰＩＶＫＡ−ＩＩに対する抗体の生成のためのウサギの免疫処置
本明細書において本発明者らは、ＰＩＶＫＡ−ＩＩのＮ末端領域内のさまざまなエピトープに結合する能力を有する抗体の開発を記載する。かかる抗体の生成のために、１２〜１６週齢ＮＺＷウサギをＰＩＶＫＡ−ＩＩのＮ末端領域にわたる種々のペプチドを用いて免疫処置した。ペプチドの免疫原性を増強するために、実施例１に記載のとおり、それらを担体タンパク質としてのＫＬＨにカップルした。免疫処置のために、プレプロトロンビンのそれぞれＡＡ５１〜７３および５５〜７０を網羅するペプチドを選択した。すべてのウサギを反復免疫処置に供した。１ヵ月目は、動物を毎週免疫処置した。２ヵ月目からは、動物を１ヵ月に１回免疫処置した。１回目の免疫処置のために５００μｇＫＬＨ−カップルペプチドを１ｍＬ  １４０ｍＭ  ＮａＣｌに溶解し、１ｍｌフロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）に乳化した。続くすべての免疫処置についてはＣＦＡをフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）によって置き換えた。動物の力価を免疫処置の開始後４５日目および１０５日目にそれぞれ評価した。
【０１５４】
２．２  力価分析
免疫処置した動物の力価を決定するために、血清滴定を配列番号１のＣ末端ビオチン化ペプチド（＝ＮＬＥＲＥＣＶＥＥＴＣＳＹＥＥＡ−Ｅ（ビオチン−ＰＥＧ）−ＮＨ２、ジスルフィドとしてＣ／Ｃを含む）を使用して実施した。ペプチドを例えばＰｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃからのマルチプルペプチド合成機でフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）固相ペプチド合成によって合成した。このために各アミノ酸誘導体の４当量を使用した。アミノ酸誘導体を１当量の１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾールを含有するジメチルホルムアミドに溶解した。ペプチドをＴｅｎｔａｇｅｌ  Ｒレジン上で合成した。カップリング反応を、レジン負荷量と比較して４当量のＨＡＴＵおよび８当量のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを含む、反応媒体としてのジメチルホルムアミド中で５分間実行した。Ｆｍｏｃ基をジメチルホルムアミド中の２０％ピペリジンを使用して各合成ステップ後８分間以内に切断した。合成レジンからのペプチドの遊離および酸不安定性保護基の切断を３時間以内に室温で、トリフルオロ酢酸、トリイソプロピルシランおよび水（３８：１：１）を含有するカクテルを用いて達成した。次に反応溶液を、ペプチドを沈殿させるための冷却ジイソプロピルエーテルと混合した。沈殿をろ過し、冷却ジイソプロピルエーテルを用いて再度洗浄し、少量の酢酸水溶液に溶解し、凍結乾燥させた。得られた粗物質を０．１％トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリル／水の勾配を使用して調製用ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。精製された物質の同一性をイオンスプレー質量分析によって調べた。
【０１５５】
配列：ＮＬＥＲＥＣＶＥＥＴＣＳＹＥＥＡ−Ｅ（ビオチン−ＰＥＧ）−ＮＨ２
略号：ＤＭＦ＝ジメチルホルムアミド；ＤＣＭ＝ジクロロメタン；Ｅ（ビオチン−ＰＥＧ）＝Ｎδ−（Ｎ−ビオチニル−３−（２−（２−（３−アミノプロピルオキシ）−エトキシ）−エトキシプロピル）−Ｌ−グルタミン；−ＮＨ２＝Ｃ末端カルボキサミド；
ＥＳＩ−ＭＳｃａｌｃ：Ｍ＋＝２４５９．７Ｄａ；ＥＳＩ−ＭＳｅｘｐ：［Ｍ＋２Ｈ］２＋＝１２３１．０Ｄａ
ジスルフィド酸化
ＣＬＥＡＲ−ＯＸ（商標）レジン（８０ｍｇ、１６μｍｏｌ）をＤＣＭ中で３０分間膨潤させ、次にＤＭＦ、メタノールおよびアセトニトリルを用いて連続的に洗浄した。還元ペプチド（１０．４ｍｇ、４．２μｍｏｌ）を脱気したアンモニウムアセテート緩衝液（０．１Ｍ；ｐＨ７．８）とアセトニトリルとの混合物（１：１、１．５ｍＬ）に溶解し、レジンに加え、穏やかに２時間撹拌した。レジンを水を用いて洗浄し、ろ液を凍結乾燥した。
【０１５６】
ＥＳＩ−ＭＳｃａｌｃ：Ｍ＋＝２４５７．７Ｄａ；ＥＳＩ−ＭＳｅｘｐ：［Ｍ＋２Ｈ］２＋＝１２３０．１Ｄａ
上のビオチン化スクリーニングペプチドを９６ウエルストレプトアビジンコートマイクロタイタープレートの表面に固定した。固定化のために、ビオチン化ペプチド（１００μｌ）をマイクロタイタープレートのウエルで３０分間、１００ｎｇ／ｍｌの濃度でインキュベートした。各ウサギの少量の血清（動物あたり２〜３ｍｌ）を免疫処置キャンペーンの開始後４５日目および１０５日目にそれぞれ回収した。各ウサギからの血清を１％ＢＳＡを含むＰＢＳに希釈し、希釈物をプレートに加えた。血清を１：３００、１：９００、１：２７００、１：８１００、１：２４３００、１：７２９００、１：２１８７００および１：６５６１００の希釈でそれぞれ検査した。ＥＬＩＳＡ検査のために種々の希釈での１００μｌの血清を、各ペプチドを用いて上に記載のとおりコートした９６ウエルプレートのウエルに加えた。血清を３０分間、室温でインキュベートした。結合抗体をＨＲＰ−標識Ｆ（ａｂ‘）２ヤギ抗ウサギＦｃγ（Ｄｉａｎｏｖａ）および基質としてのＡＢＴＳ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて検出した。分析した動物の力価は希釈曲線の５０％シグナル減少に設定した。
【０１５７】
【表１】
2020526542.tif 000003
【０１５８】
表１から見られるとおり、免疫処置した動物からのポリクローナル血清は、スクリーニングペプチドに結合する。したがってすべての動物は、続く抗体開発のために好適であった。
【０１５９】
２．３  ＰＩＶＫＡ−ＩＩに結合する抗体の開発
ＰＩＶＫＡ−ＩＩに結合する抗体の開発では、Ｓｅｅｂｅｒら、（２０１４）、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１４  Ｆｅｂ４；９（２）に記載されるＢ細胞クローニングを使用した。抗原反応性Ｂ細胞の濃縮のために、免疫原に相同性の配列を有するビオチン化スクリーニングペプチドそれぞれをストレプトアビジンコート磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）に固定した。ビーズのコーティングのために、ペプチドを２５０ｎｇ／ｍｌの濃度で使用した。その後、免疫処置した動物の末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）プールを調製し、ペプチドコートビーズと共に１時間インキュベートした。抗原反応性Ｂ細胞の濃縮のために、ＭＡＣＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用した。Ｂ細胞選別およびインキュベーションをＳｅｅｂｅｒら、（２０１４）、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１４  Ｆｅｂ４；９（２）に記載のとおり行った。いわゆるＨｉｔ−ＥＬＩＳＡのために、スクリーニングペプチドそれぞれをストレプトアビジンコート９６ウエルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ）の表面に固定化した。ビオチン化ペプチドをプレート表面に１００ｎｇ／ｍｌの濃度で固定化した。それにより１００μｌのペプチド溶液をプレート上で３０分間、室温でインキュベートした。洗浄後、バックグラウンドシグナルを低減するためにプレートを、１００μｌの５％ＢＳＡを用いて３０分間、室温でブロックした。プレートを再度洗浄し、３０μｌのウサギＢ細胞培養物を９６ウエルプレートに移し、１時間、室温でインキュベートした。スクリーニングペプチドに結合した抗体の検出のために、ＨＲＰ−標識Ｆ（ａｂ‘）２ヤギ抗ウサギＦｃγ（Ｄｉａｎｏｖａ）およびＡＢＴＳ（Ｒｏｃｈｅ）を基質として加えた。それらそれぞれのスクリーニングペプチドに結合したクローンを続く分子クローニングのためにＳｅｅｂｅｒら、（２０１４）、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１４  Ｆｅｂ  ４；９（２）に記載のとおり選択した。
【０１６０】
２．４  選択されたクローンのスクリーニング
ヒトプロトロンビンは、Ｈａｅｍｏｃｈｒｏｍ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  （Ｅｓｓｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から得た。プロトロンビンのγ−カルボキシグルタミン酸残基を、Ｂａｊａｊ，Ｓ．Ｐ．ら、（１９８２）、ＪＢＣ  １９８２、Ｖｏｌ．２５７、Ｎｏ．７、３７２６〜３７３１の方法に従って熱で脱炭酸させた。ビオチン化プロトロンビンおよびビオチン化脱炭酸（decarboylated）プロトロンビンを以下のとおり生成した：プロトロンビン変種を１００ｍＭ  ＫＰＯ４／１００ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ８．０に対して透析し、続いてｐＨをｐＨ８．４に調整し、それぞれのプロトロンビン変種をビオチン−ＤＤＳ（ビオチノイル−アミノ−３，６−ジオキサオクタノイル−アミノカルボニル−ヘプタン酸−Ｎ−ヒドロキシサクシニミドエステル（ＥＰ０６３２８１０  Ｂ１））を化学量論１：２．７５（ｍｏｌ  ＰＴ／ｍｏｌ  ビオチン−ＮＨＳ−エステル）で使用してビオチン化した。反応完了後、ビオチン化プロトロンビン変種をＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨＲ  １０／３０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）でのサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。
【０１６１】
それらそれぞれのスクリーニングペプチドに結合する抗体をクローンの小規模発現（ＨＥＫ細胞の２ｍＬトランスフェクション）によって得て以下のとおりさらに評価した：
最初に、培養物上清中の（試料量２０μＬ）ウサギ−ＩｇＧの濃度を標準ウサギＩｇＧサンドイッチＥＣＬ−イムノアッセイを使用して決定した。このアッセイでは、いずれもアッセイ緩衝液（アッセイ緩衝液は、４０ｍＭ  ＮａＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％（ｗ／ｖ）ポリドカノール、２．０％（ｗ／ｖ）ウシ血漿アルブミンを含み、ｐＨ７．５を有する）中の、１μｇ／ｍＬビオチン化ＩｇＧヒツジ抗ウサギＦｃγ（７５μＬ）および１μｇ／ｍＬルテニル化ヒツジ抗ウサギＦｃγ（７０μｌ）をストレプトアビジンコート磁気ビーズ（＝Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）ビーズ）（３５μＬ；０．７ｍｇ／ｍＬ）と混合し、形成されたサンドイッチをＥｌｅｃｓｙｓ  ２０１０（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）自動化イムノアナライザーで測定する。ここで使用されるストレプトアビジンコート磁気ビーズ（Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）ビーズ）は、Ｒｏｃｈｅ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって販売されるＥｌｅｃｓｙｓ（登録商標）試薬容器に含まれるストレプトアビジンコート磁気ビーズと同じである。
【０１６２】
得られた結果に基づいて、上清をウサギＩｇＧ濃度に関して標準化し、ビオチン化デスカルボキシ−プロトロンビンへの反応性およびビオチン化プロトロンビンへの交差反応性を決定した：５０ｎｇ／ｍＬウサギＩｇＧ（５０μＬ）に希釈した培養上清を７５ｎｇ／ｍＬビオチン化デスカルボキシ−プロトロンビンまたはプロトロンビン（５０μＬ）と第１のステップにおいてそれぞれ反応させた、アッセイ緩衝液（上記；６０μＬ）中の１μｇ／ｍＬルテニル化ＩｇＧヒツジ抗ウサギＦｃγおよびストレプトアビジンコート磁気Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）ビーズ（４０μＬ；０．７ｍｇ／ｍＬ）を第２のインキュベーションステップにおいて使用した。形成されたサンドイッチ複合体をＥｌｅｃｓｙｓ  ２０１０自動化イムノアナライザーを使用して測定した。天然プロトロンビンに無視できるだけの交差反応性を示すクローンだけをさらに評価した。
【０１６３】
ヒト試料に含有される天然ＰＩＶＫＡ−ＩＩへのクローンのこのサブセットの反応性をマルコウマー（marcoumar）処置患者の希釈血漿（「クマリン血漿」）または、肝細胞癌を罹患している患者の血漿（「ＨＣＣ血漿」）の存在によって生じる阻害の程度を、上に記載のデスカルボキシプロトロンビン結合アッセイにおいて分析することによって調査した：ＩＮＲ＞４を有するクマリン血漿をＢｉｏｍｅｘ  ＧｍｂＨ、（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から得た。上に記載の実験と同様に、第１のステップで５０ｎｇ／ｍＬウサギＩｇＧ（２０μＬ）に希釈した培養上清をクマリン血漿（アッセイ緩衝液中１：２５）とまたはアッセイ緩衝液（参照）（４０μＬ）のみと反応させ、続いて７５ｎｇ／ｍＬビオチン化デスカルボキシプロトロンビンを含む５０μＬおよびアッセイ緩衝液中１μｇ／ｍＬルテニル化ＩｇＧヒツジ抗ウサギＦｃγ  ５５μＬおよびストレプトアビジンコート磁気Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）ビーズ（３５μＬ；０．７ｍｇ／ｍＬ）とＥｌｅｃｓｙｓ  ２０１０自動化イムノアナライザーを使用して反応させた。同様に、第１のステップとして培養上清（２０μＬ）を希釈ＨＣＣ血漿（試料に応じてアッセイ緩衝液中１：３〜１：１６０）またはアッセイ緩衝液（参照）（４０μＬ）と反応させ、クマリン血漿阻害実験について記載されたステップが続いた。天然ＰＩＶＫＡ  ＩＩへのクローンの相対的反応性をパーセント阻害、すなわち天然ＰＩＶＫＡ−ＩＩの存在または非存在（すなわち参照条件）において得られたシグナルの比、を算出することによって評価した。
【０１６４】
実施例３
抗体結合へのカルボキシル化の影響
ＰＩＶＫＡ−ＩＩにおける規定のグルタミン酸残基のガンマカルボキシル化の影響に関する、選択されたクローンのエピトープ−特異度の詳細な分析のために一連のビオチン化ペプチドを使用した（表２）：
【０１６５】
【表２】
2020526542.tif 000004
【０１６６】
Ｎ末端ビオチン化のために、Ｅ（ビオチン−ＰＥＧ）（＝Ｎδ−（Ｎ−ビオチニルｌ−３−（２−（２−（３−アミノプロピルオキシ）−エトキシ）−エトキシプロピル）−Ｌ−グルタミン）を標準的手順に従って使用した。Ｎ末端ビオチン−（リンカー）−タグは、表２において＊Ｈ＊＊Ｇｌｕ（Ｂｉ−ＰＥＧ）＊によって表される。＊ＮＨ２は、Ｃ末端アミノ酸がＣ末端カルボキサミドの形態で存在することを例示するために使用する。
【０１６７】
Ｅｌｅｃｓｙｓ  ２０１０イムノアナライザーを上のペプチド（aboveeptide）と選択した抗ＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗体との反応性を決定するために以下のとおり使用した：
５０μＬのルテニル化（ruthenylated）抗ＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗体（アッセイ緩衝液中３００ｎｇ／ｍＬ。実施例２．４を参照されたい）を第１のステップでビオチン化ペプチド（アッセイ緩衝液中２．５ｎｇ／ｍＬ）５０μＬおよびアッセイ緩衝液７０μＬと反応させ、３７℃、９分間インキュベートした。ストレプトアビジンコート常磁性Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）ビーズ（０．７ｍｇ／ｍＬ；実施例２．４を参照されたい）３０μＬの添加および第２のインキュベーションステップ（３７℃、９分間）後、反応混合物を、微小粒子が測定電極の表面に磁気的に捕捉される測定セルに吸引した。未結合物質をＰｒｏＣｅｌｌシステム緩衝液（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて除去する。次いで電極への電圧の印加は、光電子増倍管によって測定される光の電気化学発光に基づく発光を誘導する。
【０１６８】
種々のγ−カルボキシ−グルタミン酸残基含有ペプチド（Ｂｉ−配列番号２、３および４、それぞれ）を用いて得られたシグナルをいかなるγ−カルボキシグルタミン酸残基も有さない参照ペプチド（Ｂｉ−配列番号１）に標準化した。
【０１６９】
【表３】
2020526542.tif 000005
【０１７０】
表３に見られるとおり、成熟プロトロンビン（配列番号６）の１９位のグルタミン酸（グルタミン酸残基のγ−カルボキシル化の非存在）の存在は、良好な抗体結合のために不可欠である。配列番号１（γ−カルボキシ−グルタミン酸残基をまったく有さない）の参照ペプチドと正確に同じ方法でビオチン化および他に処置された配列番号２のペプチドは、参照ペプチドを用いて得られるシグナルの約５％だけをもたらす。一方、先行技術抗体とは対照的に、本開示による、表３において例示される抗体は、配列番号１のペプチドと比較して配列番号３の合成ペプチドに少なくとも同様に結合する。
【０１７１】
実施例４
ＰＩＶＫＡ−ＩＩの測定のためのサンドイッチアッセイ
４．１  抗体の多量産生および精製
ＨＥＫ−細胞の１Ｌ  トランスフェクション培養上清のｐＨを２Ｍ酢酸を用いてｐＨ４．７５に調整し、溶液を２０分間、室温で撹拌した。濁った溶液を≧２００００ｘｇ、＞２０分間の遠心分離によって透明化した。続いて溶液のｐＨを２Ｍ  Ｋ３ＰＯ４の添加によってｐＨ７．５に再調整した。ウサギＩｇＧをＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｍｅｄｉａを使用する親和性クロマトグラフィーによって精製した：１０ｍＬ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）をＰＢＳ（２５ｍＭ  ＫＰＯ４、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．５）を用いて平衡化し、次に、透明培養上清をカラムに流速５〜２０ＣＶ／時でポンプで注入し、ＰＢＳを用いる第１の洗浄、１３０ｍＭ  ＫＰＯ４／１５ｍＭ  クエン酸Ｎａ  ｐＨ６．５を用いる第２の洗浄および０，１４Ｍ  ＫＰＯ４、１５ｍＭクエン酸、０，１Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ５．０を使用する最終溶出が続いた。ＩｇＧ含有画分をプールし、プールのｐＨをｐＨ７．５〜８．０に２Ｍ  Ｋ３ＰＯ４を使用して再調整した。最後に溶液を５０ｍＭ  ＫＰＯ４、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．５に対して透析した。
【０１７２】
４．２  ビオチン化
ＩｇＧ（１００ｍＭ  ＫＰＯ４／１５０ｍＭ  ＫＣｌ  ｐＨ８．４中４．５ｍｇ／ｍＬ）の溶液１ｍＬに、ビオチン−ＤＤＳ（ビオチノイル−アミノ−３，６−ジオキサオクタニル−アミノカルボニル−ヘプタン酸−Ｎ−ヒドロキシサクシニミドエステル（ＥＰ  ０６３２８１０  Ｂ１）；ＤＭＳＯ中１．４ｍｇ／ｍｌ）の５０μＬ溶液を加えた（すなわち、ＩｇＧ  １ｍｏｌあたり３ｍｏｌビオチン−ＮＨＳ−エステルの化学量論）。３０分間、室温で撹拌した後、１０ｍＭリシンの添加によって誘導体化を停止した。ｐＨを飽和ＫＨ２ＰＯ４を用いてｐＨ７．５に調整し、溶液を５０ｍＭ  ＫＰＯ４／１５０ｍＭ  ＫＣｌ  ｐＨ７．４に対して透析した。凝集物の除去のために、適切な画分をＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ＨＲ  １０／３０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上でのサイズ排除クロマトグラフィーから回収した。
【０１７３】
４．３  ルテニル化
ＩｇＧ（１００ｍＭ  ＫＰＯ４／１５０ｍＭ  ＫＣｌ  ｐＨ８．４中４．５ｍｇ／ｍＬ）の溶液１ｍＬに、ルテネート（３−）、ビス（２，２’−ビピリジン−κＮ１，κＮ１’）［Ｎ−［４−（４’−メチル［２，２’−ビピリジン］−４−イル−κＮ１，κＮ１’）−１−オキソブチル］−β−アラニル−Ｌ−α−グルタミル−Ｌ−α−グルタミル−Ｎ６−［８−［（２，５−ジオキソ−１−ピロリジニル）オキシ］−１，８−ジオキソオクチル］−Ｌ−リジネート（３−）］−、（ＯＣ−６−３３）−（９ＣＩ）（ＢＰＲｕ−ＵＥＥＫ−ＤＳＳ；ＣＡＳ４０６２１８−５９−５；ＤＭＳＯ中４．３ｍｇ／ｍｌ）の溶液５０μＬを加えた（すなわち１ｍｏｌのＩｇＧあたり４．０ｍｏｌルテニウム−ＮＨＳ−エステルの化学量論）。３０分間、室温で撹拌した後、１０ｍＭリシンの添加によって誘導体化を停止した。ｐＨを飽和ＫＨ２ＰＯ４を用いてｐＨ７．０に調整し、反応混合物を５０ｍＭ  Ｋ−ＰＯ４／０．１５Ｍ  ＫＣｌ／２％ショ糖、ｐＨ７．０に対して透析した。凝集物の除去のために、適切な画分をＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ＨＲ  １０／３０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上でのサイズ排除クロマトグラフィーから回収した。
【０１７４】
実施例５
ＰＩＶＫＡ−ＩＩのＮ末端への抗体の生成
ＰＩＶＫＡ−ＩＩのＮ末端へのモノクローナル抗体も生成した。簡潔にはペプチドＡＮＴＦＬＥＥＶＲＫＧＮＬＥＲＥ−βＡｌａ−Ａｈｘ−βＡｌａ−Ｃｙｓ−ＮＨ２（配列番号３４）を、プレプロトロンビンのアミノ酸４４から５９（配列番号５）および−βＡｌａ−Ａｈｘ−βＡｌａ−Ｃｙｓ−ＮＨ２からなるＮ末端リンカーを含んで、合成した。このリンカーは、アミノ酸誘導体βＡｌａ＝ベーターアラニンおよびＡｈｘ＝６−アミノヘキサン酸をそれぞれ含んだ。
【０１７５】
ＥＳＩ−ＭＳｃａｌｃ：Ｍ＋＝２２６２．６Ｄａ；
ＥＳＩ−ＭＳｅｘｐ：［Ｍ＋２Ｈ］２＋＝１１３１．８Ｄａ
リン酸緩衝液（４５ｍＬ、２０ｍＭ、ｐＨ７．２）中のキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）（１５０ｍｇ）の溶液に３−（マレイミド）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシサクシニミドエステル（５５ｍｇ、１．５ｍＬジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解２０７μｍｏｌ）を加えた。反応混合物を５時間、室温でインキュベートし、次にリン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０５）に対して透析した。Ｎ末端システインを含むペプチド（配列番号３４）（６．８ｍｇ、３μｍｏｌ）をＤＭＳＯに溶解し、０．１Ｍ  ＥＤＴＡを含有するマレイミド活性化ＫＬＨ（３６．７ｍｇ）の溶液に加えた。溶液を５時間、室温で撹拌し、次にリン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０５）に対して透析し、２８ｍｇ  ＫＬＨ−ペプチドコンジュゲートを得た。
【０１７６】
その後、この免疫原の支援によって生成された抗体を標準的手順に従って得た。
実施例６
Ｅｌｅｃｓｙｓサンドイッチアッセイの一般的記載
免疫学的サンドイッチアッセイの検査原理を図１に示す。アッセイのために必要な総インキュベーション時間は、１８分間である。
【０１７７】
第１のインキュベーション（９分間）：２０μＬの試料（１：５  希釈済）、ＰＩＶＫＡ−ＩＩのＮ末端に対する第１のビオチン化モノクローナルＰＩＶＫＡ−ＩＩ特異的抗体）、および実施例４によりルテニウム複合体を用いて標識された第２のＰＩＶＫＡ−ＩＩ特異的モノクローナル抗体（７Ａ１０）を同時インキュベートし、ビオチン化抗体、ＰＩＶＫＡ−ＩＩおよびルテニル化抗体を含むサンドイッチ複合体を形成する。
【０１７８】
第２のインキュベーション（９分間）：ストレプトアビジンコート微小粒子（Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）ビーズ）を第１のインキュベーションステップの混合物に加え、この第２のインキュベーションの際に、ビオチン化抗体、ＰＩＶＫＡ−ＩＩおよびルテニル化抗体を含む複合体は、ビオチンおよびストレプトアビジンの相互作用を介して固相に結合する。
【０１７９】
反応混合物を、微小粒子が電極の表面に磁気的に捕捉されている測定セルに吸引する。次に未結合物質をＰｒｏＣｅｌｌ  Ｍ．を用いて除去する。次いで電極への電圧の印加は、光電子増倍管によって測定される光の電気化学発光に基づく発光を誘導する。
【０１８０】
標準および慣用のとおり、次にＰＩＶＫＡ−ＩＩは較正曲線を介して定量／測定される。
新たに開発されたＰＩＶＫＡ−ＩＩ  Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）アッセイの測定範囲は、０〜５０００ｎｇ／ｍｌである。
【０１８１】
実施例７
肝細胞癌（ＨＣＣ）の早期検出におけるＰＩＶＫＡ−ＩＩ  Ｅｌｅｃｓｙｓアッセイの応用
７．１  分析試料
ＰＩＶＫＡ−ＩＩレベルを前向き多施設試料回収で患者および対照から回収した血清において検討した。
【０１８２】
試料パネルの構成は以下のとおり組成物：
患者：
・  肝細胞癌（ＨＣＣ）（ｎ＝３０９）、次を含む
・  ＢＣＬＣ（バルセロナ臨床肝臓がん）ステージ０（ｎ＝１０）、ＢＣＬＣ  Ａ（ｎ＝１１６）、ＢＣＬＣ  Ｂ（ｎ＝７７）、ＢＣＬＣ  Ｃ（ｎ＝８２）、ＢＣＬＣ  Ｄ：（ｎ＝１２）；ステージ分類を有さない患者（ｎ＝１２）
・  他の患者ＣＣＣ（＝胆管細胞癌）およびＨＣＣ／ＣＣＣ混合（ｎ＝２１）、
対照：
対照対象から、慢性Ｂ型肝炎感染（ＨＢＶ）患者（ｎ＝２２６）、慢性Ｃ型肝炎感染（ＨＣＶ）患者（ｎ＝５２）、肝硬変＋ＨＢＶ（ｎ＝１７３）、肝硬変＋ＨＣＶ（ｎ＝１３６）、肝硬変混合（ｎ＝８８）、その他（ｎ＝６７）を含んで合計７４２試料を得た。対照対象の別の群は、疑わしいがさらには明らかにされなかった症例（ｎ＝１２）を含む。
【０１８３】
試料の由来：
試料は、以下の施設で回収された：（１）タイ：Ｓｏｎｇｋｌａｎａｇａｒｉｎｄ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｈａｔ  Ｙａｉ；Ｓｒｉｎａｇａｒｉｎｄ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｋｈｏｎ  Ｋａｅｎ；  Ｓｉｒｉｒａｊ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｂａｎｇｋｏｋ；Ｍａｈａｒａｊ  Ｎａｋｏｒｎ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｃｈｉａｎｇ  Ｍａｉ；（２）中国：Ｐｒｉｎｃｅ  ｏｆ  Ｗａｌｅｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ；（３）ドイツ：ＮＣＴ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ；（４）スペイン：Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｖａｌｌ  ｄ‘Ｈｅｂｒｏｎ  Ｂａｒｃｅｌｏｎａ
【０１８４】
【表４】
2020526542.tif 000006
【０１８５】
７．２  Ｅｌｅｃｓｙｓ  ＰＩＶＫＡ−ＩＩアッセイとＷＡＫＯ  ＤＣＰ  ｔｅｓｔとの比較方法
７．１に記載の血清試料（ｎ＝１０８４）をＰＩＶＫＡ−ＩＩ  ＥｌｅｃｓｙｓアッセイおよびＷＡＫＯ  ＤＣＰアッセイ（ＷＡＫＯ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＧｍｂＨ、Ｆｕｇｇｅｒｓｔｒ．１２、Ｄ−４１  ４６８  Ｎｅｕｓｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって分析した。
【０１８６】
ＷＡＫＯ  ＤＣＰアッセイは、レーザー誘起蛍光を用いて検出される抗体結合ＤＣＰのマイクロ流体等速電気泳動に基づいており、プロトロンビンのａａ１１〜３５に対して産生させた１つの特異的抗体を利用する（ＹＳ５；Ｙａｍａｇｕｃｈｉら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．２００８；４６（３）：４１１〜６）。ＷＡＫＯ  ＤＣＰ検査の報告可能な範囲は、０．１〜９５０ｎｇ／ｍｌである。
【０１８７】
線形相関の係数（図２）は、０．９未満であり、分析される試料中の天然ＰＩＶＫＡ−ＩＩの認識における差異を示している。ＷＡＫＯと本明細書で上において開示されるＥｌｅｃｓｙｓアッセイとの間の弱い相関の原因は、本発明による捕捉抗体の異なる抗体結合による異なるＰＩＶＫＡ−ＩＩ形態の認識にあることが想定される。
【０１８８】
７．３．  ＷＡＫＯ  ＤＣＰ（ＰＩＶＫＡ−ＩＩ）検査と比較するＥｌｅｃｓｙｓ  ＰＩＶＫＡ−ＩＩアッセイの臨床成績の比較
Ｒｏｃｈｅ  ＰＩＶＫＡ−ＩＩおよびＷＡＫＯ  ＤＣＰアッセイに関する臨床感度を９０％特異度で算出した。並行して、Ｒｏｃｈｅ  ＰＩＶＫＡ−ＩＩおよびＷＡＫＯ  ＤＣＰアッセイに関する臨床特異度を９０％感度で算出した。独立した評価をすべてのステージのＨＣＣ（ｎ＝３０９）対すべての対照について、および初期ステージＨＣＣ（ＢＣＬＣ  ０およびＡ、ｎ＝１２６）対すべての対照について実施した。加えて、曲線下面積（ＡＵＣ）を両アッセイおよび評価方法について算出した。
【０１８９】
【表５】
2020526542.tif 000007
【０１９０】
表５から見られるとおり、Ｅｌｅｃｓｙｓ  ＰＩＶＫＡ−ＩＩアッセイでの、すべてのＨＣＣステージ対対照について、および初期ステージＨＣＣ対対照についての９０％感度に関して最適化されたカットオフでの臨床特異度は、ＷＡＫＯ  ＤＣＰ検査と比較して優れている（それぞれ、５９％対５１％および２７．６％対２６．１％）。
【０１９１】
同時に、９０％特異度に関して最適化されたカットオフでの感度は、両アッセイについてまさに同等である。
Ｅｌｅｃｓｙｓ  ＰＩＶＫＡ−ＩＩアッセイは、すべてのＨＣＣおよび初期ステージＨＣＣ群の両方についてそれぞれ対照に対して算出されたＡＵＣのわずかな増加も示す。高感度領域（６０〜９５％）における受信者動作曲線（ＲＯＣ）の詳細な分析は、ＷＡＫＯ  ＤＣＰに対するＥｌｅｃｓｙｓ  ＰＩＶＫＡ−ＩＩの優れた特異度をすべてのＨＣＣステージ（図３）および初期ＨＣＣステージ（図４）それぞれについて確認している。
【０１９２】
７．４．結論
既存のＰＩＶＫＡ−ＩＩアッセイにおける擬陽性率が、いまだ著しいことから（Ｌｅｅら、Ｋｏｒｅａｎ  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．１９９７；１７（３）：３９５〜４０４、Ｔａｋｅｔａら、Ａｃｔａ  Ｍｅｄ．Ｏｋａｙａｍａ  ２００２；５６（６）：３１７〜３２０）ならびに初期ステージのＨＣＣの検出における感度および特異度が後期ＨＣＣについてほど良好でない（Ｌｉｍら、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２０１６；５１（３）：３４４〜５３）ことので、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ検出方法の改善は、臨床的判断において重要性が高い。本明細書において開示のとおり、ＰＩＶＫＡ−ＩＩのγ−カルボキシル化アミノ酸１９および２０付近にそれぞれ独自の結合特性を有する抗体の使用は、この新たに開発されたＰＩＶＫＡ−ＩＩアッセイの特異度の改善を、特に高感度領域においてもたらす。すべてのＨＣＣ患者の検出およびさらにＨＣＣの初期ステージ（ＢＣＬＣ  ０〜Ａ）の検出の両方についてもこれはあてはまる。
【図１】
2020526542.tif 000008
【図２】
2020526542.tif 000009
【図３】
2020526542.tif 000010
【図４】
2020526542.tif 000011
【配列表】
2020526542000001.app
【国際調査報告】
2020526542.tif 000012
2020526542.tif 000013