(57)【要約】  本発明は、二価の二重特異性モノクローナル抗体（ｂｂｍＡｂ）又はその変異体に関し、哺乳動物細胞系において２つの異なるモノクローナル抗体の修飾Ｆｃ突然変異誘導体を同時発現させることによりこのような抗体を製造する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
共通の宿主細胞における同時発現に適切な二重特異性抗体であって、
ａ．第１の標的に特異的に結合するラムダ野生型の第１の可変軽鎖（ＶＬ１）及び野生型の第１の可変重鎖（ＶＨ１）と、ヘテロ二量体化修飾を有する第１の定常重鎖（ＣＨ１）とを有する免疫グロブリンである第１の部分と、
ｂ．前記第１の標的とは異なる第２の標的に特異的に結合するカッパ野生型の第２の可変軽鎖（ＶＬ２）及び野生型の第２の可変重鎖（ＶＨ２）と、前記第１の定常重鎖のヘテロ二量体化修飾と相補的であるヘテロ二量体化修飾を有する第２の定常重鎖（ＣＨ２）とを有する免疫グロブリンである第２の部分と、
を含み、
前記第１の部分及び前記第２の部分が、共通の宿主細胞において同時発現される場合、二重特異性抗体を形成する、二重特異性抗体。
【請求項２】
前記第１及び第２の定常重鎖が、ヒトＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭ、好ましくはＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＧ、例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４など、好ましくはＩｇＧ１である、請求項１に記載の二重特異性抗体。
【請求項３】
前記第１の可変軽鎖がラムダ１型であり、前記第２の可変軽鎖がカッパ６型である、請求項２に記載の二重特異性抗体。
【請求項４】
前記第１及び第２の定常重鎖がＩｇＧ１であり、
ａ．前記第１の定常重鎖がノブ構造を生成させる点突然変異を有し、前記第２の定常重鎖がホール構造を生成させる点突然変異を有するか、又は
ｂ．前記第１の定常重鎖がホール構造を生成させる点突然変異を有し、前記第２の定常重鎖がノブ構造を生成させる点突然変異を有し、場合によっては、
ｃ．前記第１及び第２の定常重鎖が、ジスルフィド架橋を生じさせる突然変異を有する、請求項３に記載の二重特異性抗体。
【請求項５】
第１の免疫グロブリンＶＨ１ドメイン、第１の免疫グロブリンＶＬ１ドメイン、第２の免疫グロブリンＶＨ２ドメイン及び第２の免疫グロブリンＶＬ２ドメインを含み、
ａ．前記第１の免疫グロブリンＶＨ１ドメインが（例えば配列中）：
ｉ．ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号７６を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号７７を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号７８を有する、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３；又は
ｉｉ．ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号７９を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号８０を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号８１を有する、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３
を含み；
ｂ．前記第１の免疫グロブリンＶＬ１ドメインが（例えば配列中に）：
ｉ．ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号９２を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号９３を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号９４を有する、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３又は
ｉｉ．ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号９５を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号９６を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号９７を有する、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３
を含み；
ｃ．前記第２の免疫グロブリンＶＨ２ドメインが（例えば配列中に）：
ｉ．ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号４４を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号４５を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号４６を有する、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３；又は
ｉｉ．ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号４７を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号４８を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号４９を有する、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３
を含み、
ｄ．前記第２の免疫グロブリンＶＬ２ドメインが（例えば配列中に）：
ｉ．ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号６０を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号６１を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号６２を有する、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３又は
ｉｉ．ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号６３を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号６４を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号６５を有する、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３
を含む、請求項１〜４の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項６】
第１の免疫グロブリンＶＨ１ドメイン、第１の免疫グロブリンＶＬ１ドメイン、第２の免疫グロブリンＶＨ２ドメイン及び第２の免疫グロブリンＶＬ２ドメインを含み、
ａ．前記第１の免疫グロブリンＶＨ１ドメインがアミノ酸配列の配列番号８５を含み、
ｂ．前記第１の免疫グロブリンＶＬ１ドメインがアミノ酸配列の配列番号１０１を含み、
ｃ．前記第２の免疫グロブリンＶＨ２ドメインがアミノ酸配列の配列番号５３を含み、
ｄ．前記第２の免疫グロブリンＶＬ２ドメインがアミノ酸配列の配列番号６９を含む、
請求項１〜５の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項７】
第１の免疫グロブリン重鎖、第１の免疫グロブリン軽鎖、第２の免疫グロブリン重鎖及び第２の免疫グロブリン軽鎖を含み、
ａ．前記第１の免疫グロブリン重鎖がアミノ酸配列の配列番号８７を含み、
ｂ．前記第１の免疫グロブリン軽鎖がアミノ酸配列の配列番号１０３を含み、
ｃ．前記第２の免疫グロブリン重鎖がアミノ酸配列の配列番号５５を含み、
ｄ．前記第２の免疫グロブリン軽鎖がアミノ酸配列の配列番号７１を含む、
請求項１〜６の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項８】
請求項１〜７の何れか一項に記載の二重特異性抗体を選択するための方法であって、
ａ．前記第１の部分及び前記第２の部分を選択する第１のステップと；
ｂ．共通の宿主細胞において前記第１の部分及び前記第２の部分を同時発現させ、その結果、前記第１の部分及び前記第２の部分を含む二重特異性抗体を生じさせる第２のステップと；
ｃ．正確に適合した二重特異性抗体からミスマッチ断片を除去することによって前記二重特異性抗体を精製する第３のステップと、
を含む方法。
【請求項９】
精製の第３のステップの結果、少なくとも６０％（質量）、７０％（質量）、８０％（質量）、８５％（質量）純粋、例えば少なくとも９０％（質量）純粋、９５％（質量）、９６％（質量）、９７％（質量）、９８％（質量）又は９９％（質量）純粋である二重特異性抗体が生じる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
共通の宿主細胞での同時発現により請求項１〜７の何れか一項に記載の二重特異性抗体を作製するための方法であって、
ａ．前記第１の部分及び前記第２の部分をコードする少なくとも１つのベクターを生成させる第１のステップと；
ｂ．前記少なくとも１つのベクターを前記共通の宿主細胞に導入する第２のステップと；
ｃ．前記二重特異性抗体を特異的に発現する細胞を選択する第３のステップと；
ｄ．前記細胞が前記二重特異性抗体を発現する条件下で前記選択した細胞を培養する第４のステップと；
ｅ．少なくとも６０％（質量）、７０％（質量）、８０％（質量）又は８５％（質量）純粋である、例えば少なくとも９０％（質量）純粋、９５％（質量）、９６％（質量）、９７％（質量）、９８％（質量）又は９９％（質量）純粋である前記二重特異性抗体を精製する第５のステップと、
を含む方法。
【請求項１１】
前記第１のステップが、前記第１の部分をコードする第１のベクター及び前記第２の部分をコードする第２のベクターを生成させることを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜７の何れか一項に記載の二重特異性抗体の前記第１の部分又は前記第２の部分をコードするポリヌクレオチドと、選択可能マーカーとを含む、少なくとも１つのベクターを含む、発現系。
【請求項１３】
ａ．第１の選択可能マーカー（ｓｍ  Ｉ）をコードするポリヌクレオチドと；
ｂ．前記第１の選択可能マーカー（ｓｍ  Ｉ）とは異なる第２の選択可能マーカー（ｓｍ  ＩＩ）をコードするポリヌクレオチドと、
を含む、請求項１２に記載の発現系。
【請求項１４】
前記第１の選択可能マーカー（ｓｍ  Ｉ）が葉酸輸送体又は突然変異した葉酸受容体をコードするポリヌクレオチドであり、前記突然変異した葉酸受容体の葉酸結合親和性が、野生型葉酸受容体と比較して低下しており、前記第２の選択可能マーカー（ｓｍ  ＩＩ）がＤＨＦＲである、請求項１２又は１３に記載の発現系。
【請求項１５】
前記第１の選択可能マーカー（ｓｍ  Ｉ）がハイグロマイシンであり、前記第２の選択可能マーカー（ｓｍ  ＩＩ）がＮｅｏ／Ｇ４１８である、請求項１２〜１４の何れか一項に記載の発現系。
【請求項１６】
２つの発現ベクターを含み、
ａ．第１のベクターが、少なくとも第１の選択可能マーカー（ｓｍ  Ｉ）をコードするポリヌクレオチドと、少なくとも前記第１の部分をコードするポリヌクレオチドと、を含み；
ｂ．第２のベクターが、少なくとも第２の選択可能マーカー（ｓｍ  ＩＩ）をコードするポリヌクレオチドと、少なくとも前記第２の部分をコードするポリヌクレオチドと、を含む、
請求項１２〜１５の何れか一項に記載の発現系。
【請求項１７】
重鎖をコードするポリヌクレオチドの下流の停止コドンと、前記停止コドンの下流に位置する免疫グロブリン膜アンカーをコードするポリヌクレオチドと、を含む、請求項１２〜１６の何れか一項に記載の発現系。
【請求項１８】
請求項８〜１１の何れか一項に記載の方法における使用のための共通の宿主細胞を選択するための方法であって、
ａ．請求項１２〜１７の何れか一項に記載の発現系を含む、複数の宿主細胞を提供する第１のステップと；
ｂ．前記選択可能マーカーに対して選択的な条件下で前記複数の宿主細胞を培養し、それによって対象となる生成物を発現する宿主細胞を得ることと、
を含む、方法。
【請求項１９】
ａ．葉酸の制限濃度を含む；及び／又は
ｂ．５００ｎＭ以下の濃度で葉酸を含む；及び／又は
ｃ．
ｉ．１０００ｎＭ〜１００ｐＭ；
ｉｉ．１００ｎＭ〜１ｎＭ；
ｉｉｉ．１５ｎＭ〜１ｎＭ；
ｉｖ．１０ｎＭ〜１ｎＭ；及び
ｖ．１０ｎＭ〜２．５ｎＭ
から選択される濃度で葉酸を含む；及び／又は
ｄ．ＤＨＦＲ阻害剤を含む；及び／又は
ｅ．抗葉酸剤を含む；及び／又は
ｆ．５００ｎＭ以下の濃度で抗葉酸剤を含む；及び／又は
ｇ．
ｉ．５００ｎＭ〜３ｎＭ；
ｉｉ．１００ｎＭ〜１０ｎＭ；
ｉｉｉ．５０ｎＭ〜１０ｎＭ；及び
ｉｖ．５０ｎＭ
から選択される濃度でＭＴＸを含む；及び／又は
ｈ．葉酸濃度の２０倍までの抗葉酸剤の濃度を含む；及び／又は
ｉ．葉酸濃度の１０〜２０倍の抗葉酸剤の濃度を含む；及び／又は
ｊ．１５ｎＭ以下の濃度の葉酸と、等モル〜２０倍までの濃度のＭＴＸとを含む、
選択培地が使用される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記宿主細胞が、請求項１７に記載の発現系を含み、前記第１の部分又は第２の部分の少なくとも一部が、前記免疫グロブリン膜貫通アンカー又はそれらの断片を含む融合ポリペプチドとして発現され、前記融合ポリペプチドが前記宿主細胞の表面上で提示され、
ａ．前記融合ポリペプチドに結合する検出化合物と前記複数の宿主細胞をを接触させ；
ｂ．細胞表面に結合した前記検出化合物の存在又は量に基づいて少なくとも１つの宿主細胞を選択する、
ステップをさらに含む、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記検出化合物が、前記第１若しくは第２の標的又はその誘導体及び少なくとも１つの検出標識を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記二重特異性抗体を精製する前記第５のステップが、アフィニティークロマトグラフィー及び／又はイオン交換クロマトグラフィーを含む、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項２３】
前記クロマトグラフィーが、
ａ．捕捉を行う第１のステップと；
ｂ．ポリッシングを行う第２のステップと；場合によっては
ｃ．さらなるポリッシングを行う第３のステップと、
を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
捕捉を行う前記第１のステップが、Ｆｃ−結合アフィニティークロマトグラフィー、例えばプロテインＡ又はプロテインＧなど、ラムダ軽鎖特異的アフィニティークロマトグラフィー、例えばＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）など、カッパ軽鎖特異的アフィニティークロマトグラフィー、例えばＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（商標）など、抗イディオタイプアフィニティークロマトグラフィー、例えば前記第１の部分又は前記第２の部分など、標的に基づくアフィニティークロマトグラフィー、例えば前記第１の標的又は第２の標的を用いるアフィニティークロマトグラフィーなど、イオン交換クロマトグラフィー、例えばＣａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ又はＦｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＥＭＤ  ＳＯ３など及び疎水性相互作用クロマトグラフィーからなる群から選択される原理で行われる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ポリッシングを行う前記第２のステップが、Ｆｃ−結合アフィニティークロマトグラフィー、例えばプロテインＡ又はプロテインＧなど、ラムダ軽鎖特異的アフィニティークロマトグラフィー、例えばＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）など、カッパ軽鎖特異的アフィニティークロマトグラフィー、例えばＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（商標）など、抗イディオタイプアフィニティークロマトグラフィー、例えば前記第１の部分又は前記第２の部分など、標的に基づくアフィニティークロマトグラフィー、例えば前記第１の標的又は第２の標的を用いるアフィニティークロマトグラフィーなど、イオン交換クロマトグラフィー、例えばＣａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ又はＦｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＥＭＤ  ＳＯ３など、疎水性相互作用クロマトグラフィー及びウイルス不活性化からなる群から選択される原理で行われる、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２６】
さらなるポリッシングを行う前記第３のステップが、Ｆｃ−結合アフィニティークロマトグラフィー、例えばプロテインＡ又はプロテインＧなど、ラムダ軽鎖特異的アフィニティークロマトグラフィー、例えばＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）など、カッパ軽鎖特異的アフィニティークロマトグラフィー、例えばＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（商標）など、抗イディオタイプアフィニティークロマトグラフィー、例えば前記第１の部分又は前記第２の部分など、標的に基づくアフィニティークロマトグラフィー、例えば前記第１の標的又は第２の標的を用いるアフィニティークロマトグラフィーなど、イオン交換クロマトグラフィー、例えばＣａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ又はＦｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＥＭＤ  ＳＯ３など、疎水性相互作用クロマトグラフィー及びウイルス不活性化単独又はそれらの組み合わせからなる群から選択される原理で行われる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ａ．ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅ（商標）などのプロテインＡ捕捉の第１のステップ、ＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）などのラムダ軽鎖アフィニティークロマトグラフィーの第２のステップ及びＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（商標）などのカッパ軽鎖アフィニティークロマトグラフィーの第３のステップ；又は
ｂ．ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅ（商標）などのプロテインＡの第１のステップ、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（商標）などのカッパ軽鎖アフィニティークロマトグラフィーの第２のステップ及びＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）などのラムダ軽鎖アフィニティークロマトグラフィーの第３のステップ；又は
ｃ．ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（商標）などのカッパ軽鎖アフィニティークロマトグラフィーの第１のステップ及びＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）などのラムダ軽鎖アフィニティークロマトグラフィーの第２のステップ；又は
ｄ．ＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）などのラムダ軽鎖アフィニティークロマトグラフィーの第１のステップ及びＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（商標）などのカッパ軽鎖アフィニティークロマトグラフィーの第２のステップ
から選択される、請求項２３の何れか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞系が、ＣＨＯ細胞、非産生ハイブリドーマ、例えばＳｐ２／０又はＮＳ０など、ヒト由来細胞系、例えばＨＥＫ又はＰＥＲ．Ｃ６など、新生児ハムスター腎臓（ＢＨＫ）誘導体、酵母又は糸状菌、原核細菌、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又はシュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）など、植物誘導体、藻類及び繊毛虫類からなる群から選択される、請求項８〜１１又は１８〜２７に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１〜７の何れか一項に記載の抗体と、薬学的に許容可能な担体と、を含む、医薬組成物。
【請求項３０】
医薬としての使用のための、請求項１〜７の何れか一項に記載の二重特異性抗体又は請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
インフラマソーム関連疾患の処置への使用のための、請求項１〜７の何れか一項に記載の二重特異性抗体又は請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
前記インフラマソーム関連疾患が、鎌状赤血球症、脈管障害、虚血−再灌流傷害、循環器疾患、末梢動脈疾患、アテローム性硬化症、脈管機能不全、骨格筋虚血、肺サルコイドーシス、線維症、マラリア、血液透析依存性慢性腎臓病及びクローン病からなる群から選択される、請求項３１に記載のインフラマソーム関連疾患の処置への使用のための請求項１〜７の何れか一項に記載の二重特異性抗体又は請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
請求項１〜７に記載の二重特異性抗体又は請求項２９に記載の医薬組成物の有効量をインフラマソーム関連障害に罹患している対象に投与することを含む、インフラマソーム関連障害を処置する方法。
【請求項３４】
前記インフラマソーム関連障害が、鎌状赤血球症、脈管障害、虚血−再灌流傷害、循環器疾患、末梢動脈疾患、アテローム性硬化症、脈管機能不全、骨格筋虚血、肺サルコイドーシス、線維症、マラリア、血液透析依存性慢性腎臓病又はクローン病である、請求項３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列リスト
本願は、ＡＳＣＩＩ方式で電子提出され、本明細書によりその全体において参照により組み込まれる配列リストを含有する。このＡＳＣＩＩコピーは、２０１８年５月３０日に作成され、ＰＡＴ０５７７１６−ＷＯ−ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔと名付け、サイズは６８，４９８バイトである。
【０００２】
本発明は、二価二重特異性モノクローナル抗体（ｂｂｍＡｂ）又はそれらの変異体及び哺乳動物細胞系において２つの異なるモノクローナル抗体のいわゆるノブ・イントゥー・ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）修飾ＦＣ−突然変異誘導体を同時発現させることによってこのような抗体を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
二重特異性抗体、すなわち２つの別個のエピトープへ結合する抗体は当技術分野で周知である。二重特異性抗体を作製するためのある１つのアプローチは、例えばＭｅｒｃｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：６７７−６８１（１９９８）に記載の、いわゆるノブ・イントゥー・ホール（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）（ＫｉＨ）アプローチであり、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖのような点突然変異を導入することにより、第１の重鎖ＩｇＧを修飾して、ホール様構造を提示させ；第２の重鎖ＩｇＧを修飾して、点突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを導入することによりノブ様構造を提示させる（（Ｍｅｒｃｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：６７７−６８１（１９９８），ｐａｇｅ  ６７８，ｔａｂｌｅ  １）。２つの異なるＩｇＧ構造を相互作用させて二価二重特異性抗体（ｂｂｍＡｂ）、すなわち２つの異なる軽鎖及び２つの異なる重鎖からなるヘテロ四量体タンパク質を形成させる。
【０００４】
同じ宿主細胞系において２つのＫｉＨ修飾ｍＡｂを発現させる場合、所望のｂｂｍＡｂが占める割合は統計学的に、発現されるタンパク質の２５％のみであるが、７５％はいわゆる生成物に関連する不純物である（Ｋｌｅｉｎ，Ｃｈ．ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。
【０００５】
これを克服するための一部のアプローチは、さらなる配列修飾を適用して正しいＨ−Ｌ結合を強制することによりｂｂｍＡｂの正しい形成を促進することなど、当技術分野で公知である（概説については、Ｋｌｅｉｎ，Ｃｈ．ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．ａｎｄ  Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ，Ｕ．，２０１５を参照）。しかし、このようなさらなる修飾は、抗薬物抗体のリスクを向上させ得る。
【０００６】
ｂｂｍＡｂを作製するための別のアプローチは、国際公開第１２０２３０５３Ａ２号パンフレット又は同第０４００９６１８Ａ２号パンフレットで開示されており、異なる可変鎖と組み合わせて共通する重鎖又は軽鎖を利用する。しかし、重鎖の何れかを一定に保つことにより、結合剤がスクリーニングされ得る抗体レパートリーの多様性が顕著に減少する。
【０００７】
ｂｂｍＡｂの作製に対するまた別のアプローチは、米国特許第９２１２２３０号明細書で開示され、これは異なる修飾を保有するｍＡｂの個々の発現及び精製を必要とする。得られるｍＡｂは、意図するｂｂｍＡｂを形成させるために最終的にインビトロで組み換えられる。このようなインビトロでの組み換えは、慎重な検証及び分析的評価を必要とし、コストを大幅に引き上げ得る複雑なさらなる工程ステップである。
【０００８】
したがって、ｂｂｍＡｂを作製するための既存の方法は、結合剤についてスクリーニングするための利用可能な抗体レパートリーの多様性を制限し得るか、又は、臨床開発及び商業で実行可能なスケールでの製造を可能にするのに十分にコスト効率が良い方法で、十分な全体的収率、純度及び生成物の品質を提供し得ないかの何れかである。さらに、タンパク質鎖の何らかの修飾は、本質的に抗薬物抗体を誘導するリスクを上昇させる。したがって、最小限のタンパク質操作のみを必要とするアプローチは臨床的に好ましいものであり得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
二価二重特異性抗体の製造のための改善された方法を提供する必要がある。特に、合理的なコストで臨床開発及び商業的な製造を進めるために十分な全体的収率、純度及び生成物の品質を確実にする、二価二重特異性モノクローナル抗体（ｂｂｍＡｂ）の製造のための方法が必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、とりわけ、次の長所の１つ以上を有するｂｂｍＡｂの作製のための方法を提供する：これは、共通する軽鎖又は重鎖が必要ないので、結合剤を同定するために大きな抗体レパートリーの使用を可能にし、Ｈ鎖二量体化を推進する突然変異に加えて、大規模なタンパク質操作を全く必要とせず、したがって抗薬物抗体に対するリスクが限定的であり、共通の（common）細胞系で発現が行われ、したがって特異的なインビトロ組み換えの必要なくある１つの細胞培養工程においてｂｂｍＡｂが産生され得るので、コスト効率が高く、生成物に関連する不純物が効果的に除去され得るのでヒトの使用に適切な高品質の物質が産生される。
【００１１】
本発明は、対応物の重鎖に対して軽鎖が強い乱雑な結合を示さないカッパ及びラムダ型の抗体を同定するために有用である。これによって、本発明の方法での使用に抗体が適切になる。本方法の長所は、両軽鎖が元来の重鎖結合パートナーを交換し、その結果、Ｈ１Ｌ２−Ｈ２Ｌ１型の生成物関連不純物を生じさせる抗体の組み合わせが除外され得るということであり得る。このような生成物関連不純物は最先端の精製工程を使用して枯渇させることが容易ではないので、これは長所である。
【００１２】
以下で示されるように、本発明の実施形態は、生物製剤の臨床開発及び商業化に適切な収率及び品質でのＣＨＯ同時発現の使用によるｂｂｍＡｂの製造を可能にする。
【００１３】
本発明の第１の態様において、共通の宿主細胞における同時発現に適切な二重特異性抗体が提供され、本抗体は、ａ）ラムダ野生型の可変軽鎖（ＶＬ１）及び野生型の可変重鎖（ＶＨ１）（第１の標的に特異的に結合）及びヘテロ二量体化修飾を有する第１の定常重鎖（ＣＨ１）を有する免疫グロブリンである第１の部分と、ｂ）カッパ野生型の可変軽鎖（Ｌ２）及び野生型の可変重鎖（Ｈ２）（第１の標的とは異なる第２の標的に特異的に結合）及び第１の定常重鎖のヘテロ二量体化修飾に対して相補的であるヘテロ二量体化修飾を有する第２の定常重鎖（ＣＨ２）を有する免疫グロブリンである第２の部分と、を含み、この第１の部分及び第２の部分は、共通の宿主細胞において同時発現される場合、二重特異性抗体を形成する。
【００１４】
第１の態様のさらなる実施形態において、共通の宿主細胞における同時発現に適切な二重特異性抗体によって、正確に適合した二重特異性抗体からミスマッチ断片を除去することにより二重特異性抗体を精製した後、少なくとも６０％（質量）、７０％（質量）、８０％（質量）、８５％（質量）純粋、例えば少なくとも９０％（質量）純粋、９５％（質量）、９６％（質量）、９７％（質量）、９８％（質量）又は９９％（質量）純粋である二重特異性抗体が生じる。
【００１５】
二重特異性抗体の第１及び第２の定常重鎖は、ヒトＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭ、好ましくはＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＧであり得る。好ましい実施形態において、第１及び第２の定常重鎖は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４、最も好ましくはＩｇＧ１である。一実施形態において、第１の可変軽鎖はラムダ型であり、第２の可変軽鎖はカッパ型である。
【００１６】
具体的な好ましい実施形態において、第１の可変軽鎖はラムダ１型のものであり、第２の可変軽鎖はカッパ６型のものである。
【００１７】
第１及び第２の定常重鎖はＩｇＧ１であり得、第１の定常重鎖はノブ構造を生成させる点突然変異を有し、第２の定常重鎖はホール構造を生成させる点突然変異を有するか、又は第１の定常重鎖はホール構造を生成させる点突然変異を有し、第２の定常重鎖はノブ構造を生成させる点突然変異を有する。場合によっては、第１及び第２の定常重鎖は、ジスルフィド架橋を生じさせる突然変異をさらに有し得る。
【００１８】
一実施形態において、二重特異性抗体は、第１の免疫グロブリンＶＨ１ドメイン、第１の免疫グロブリンＶＬ１ドメイン、第２の免疫グロブリンＶＨ２ドメイン及び第２の免疫グロブリンＶＬ２ドメインを含み、第１の免疫グロブリンＶＨ１ドメインは（例えば配列中で）：ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号７６を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号７７を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号７８を有する、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３；又はＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号７９を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号８０を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号８１を有する、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み；第１の免疫グロブリンＶＬ１ドメインは（例えば配列中で）：ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号９２を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号９３を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号９４を有する、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３又は、ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号９５を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号９６を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号９７を有する、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み；第２の免疫グロブリンＶＨ２ドメインは（例えば配列中で）：ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号４４を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号４５を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号４６を有する、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３；又はＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号４７を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号４８を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号４９を有する、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み；第２の免疫グロブリンＶＬ２ドメインは（例えば配列中で）：ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号６０を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号６１を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号６２を有する、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３又は、ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号６３を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号６４を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号６５を有する、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む。
【００１９】
一実施形態において、二重特異性抗体は、第１の免疫グロブリンＶＨ１ドメイン、第１の免疫グロブリンＶＬ１ドメイン、第２の免疫グロブリンＶＨ２ドメイン及び第２の免疫グロブリンＶＬ２ドメインを含み、第１の免疫グロブリンＶＨ１ドメインはアミノ酸配列の配列番号８５を含み、第１の免疫グロブリンＶＬ１ドメインはアミノ酸配列の配列番号１０１を含み、第２の免疫グロブリンＶＨ２ドメインはアミノ酸配列の配列番号５３を含み、第２の免疫グロブリンＶＬ２ドメインはアミノ酸配列の配列番号６９を含む。
【００２０】
一実施形態において、二重特異性抗体は、第１の免疫グロブリン重鎖、第１の免疫グロブリン軽鎖、第２の免疫グロブリン重鎖及び第２の免疫グロブリン軽鎖を含み、第１の免疫グロブリン重鎖はアミノ酸配列の配列番号８７を含み、第１の免疫グロブリン軽鎖はアミノ酸配列の配列番号１０３を含み、第２の免疫グロブリン重鎖はアミノ酸配列の配列番号５５を含み、第２の免疫グロブリン軽鎖はアミノ酸配列の配列番号７１を含む。
【００２１】
第２の態様によれば、第１の態様による二重特異性抗体を選択するための方法が提供され、この方法は；第１の部分及び第２の部分を選択する第１のステップと；共通の宿主細胞において第１の部分及び第２の部分を同時発現させ、それにより第１の部分及び第２の部分を含む二重特異性抗体を生じさせる第２のステップと；正確に適合する二重特異性抗体からミスマッチ断片を除去することにより二重特異性抗体を精製する第３のステップと、を含む。一実施形態において、精製の第３のステップの結果、少なくとも６０％（質量）、７０％（質量）、８０％（質量）、８５％（質量）純粋、例えば少なくとも９０％（質量）純粋、９５％（質量）、９６％（質量）、９７％（質量）、９８％（質量）又は９９％（質量）純粋である二重特異性抗体が得られる。
【００２２】
第３の態様によれば、共通の宿主細胞での同時発現により第１の態様による二重特異性抗体を製造するための方法が提供され、この方法は、第１の部分及び第２の部分をコードする少なくとも１つのベクターを生成させる第１のステップと；共通の宿主細胞に少なくとも１つのベクターを導入する第２のステップと；二重特異性抗体を特異的に発現させる細胞を選択する第３のステップと；細胞がこの二重特異性抗体を発現する条件下で選択細胞を培養する第４のステップと；少なくとも６０％（質量）、７０％（質量）、８０％（質量）、８５％（質量）純粋、例えば少なくとも９０％（質量）純粋、９５％（質量）、９６％（質量）、９７％（質量）、９８％（質量）又は９９％（質量）純粋である本二重特異性抗体を精製する第５のステップと、を含む。
【００２３】
一実施形態において、第１のステップは、第１の部分をコードする第１のベクター及び第２の部分をコードする第２のベクターを生成させることを含む。
【００２４】
第４の態様によれば、発現系は、第１の態様による二重特異性抗体の第１の部分又は第２の部分をコードするポリヌクレオチドと、選択可能マーカーを含む少なくとも１つのベクターと、を含む。
【００２５】
一実施形態において、発現系は、第１の選択可能マーカー（ｓｍ  Ｉ）をコードするポリヌクレオチドと、第１の選択可能マーカー（ｓｍ  Ｉ）とは異なる第２の選択可能マーカー（ｓｍ  ＩＩ）をコードするポリヌクレオチドと、を含む。
【００２６】
一実施形態において、第１の選択可能マーカー（ｓｍ  Ｉ）は、葉酸輸送体又は突然変異を有する葉酸受容体をコードするポリヌクレオチドであり、突然変異を有する葉酸受容体は野生型葉酸受容体と比較して葉酸結合親和性が低下しており、第２の選択可能マーカー（ｓｍ  ＩＩ）はＤＨＦＲである。
【００２７】
一実施形態において、第１の選択可能マーカー（ｓｍ  Ｉ）はハイグロマイシンであり、第２の選択可能マーカー（ｓｍ  ＩＩ）はＮｅｏ／Ｇ４１８である。
【００２８】
一実施形態において、発現系は２つの発現ベクターを含み、第１のベクターは、少なくとも第１の選択可能マーカー（ｓｍ  Ｉ）をコードするポリヌクレオチドと、少なくとも第１の部分をコードするポリヌクレオチドと、を含み；第２のベクターは、少なくとも第２の選択可能マーカー（ｓｍ  ＩＩ）をコードするポリヌクレオチドと、少なくとも第２の部分をコードするポリヌクレオチドと、を含む。
【００２９】
発現系は、重鎖をコードするポリヌクレオチドの下流にある停止コドンと、停止コドンの下流に位置する免疫グロブリン膜アンカーをコードするポリヌクレオチドと、を含み得る。
【００３０】
第５の態様によれば、先行する態様による方法での使用のための共通の宿主細胞を選択するための方法が提供され、この方法は、前述の態様による発現系を含む複数の宿主細胞を提供し；選択可能マーカーに対して選択的な条件下でその複数の宿主細胞を培養し、それにより対象となる産物を発現する宿主細胞を得る第１のステップを含む。
【００３１】
一実施形態において、選択的培地は、制限濃度の葉酸を含み；及び／又は５００ｎＭ以下の濃度で葉酸を含み；及び／又は１０００ｎＭ〜１００ｐＭ；１００ｎＭ〜１ｎＭ；１５ｎＭ〜１ｎＭ；１０ｎＭ〜１ｎＭ；及び１０ｎＭ〜２．５ｎＭから選択される濃度で葉酸を含み；及び／又はＤＨＦＲ阻害剤を含み；及び／又は抗葉酸剤を含み；及び／又は５００ｎＭ以下の濃度で抗葉酸剤を含み；及び／又は５００ｎＭ〜３ｎＭ；１００ｎＭ〜１０ｎＭ；５０ｎＭ〜１０ｎＭ；及び５０ｎＭから選択される濃度でＭＴＸを含み；及び／又は葉酸濃度の２０倍までの抗葉酸剤の濃度を含み；及び／又は葉酸濃度の１０〜２０倍の抗葉酸剤の濃度を含み；及び／又は１５ｎＭ以下の濃度の葉酸と、等モル〜２０倍までの濃度のＭＴＸとを含む培地を含む群から選択される。
【００３２】
一実施形態において、宿主細胞は、免疫グロブリン膜貫通アンカー又はそれらの断片を含む融合ポリペプチドとして第１又は第２の部分の少なくとも一部が発現され、この融合ポリペプチドがこの宿主細胞の表面上で示されている発現系を含み、融合ポリペプチドに結合する検出化合物と複数の宿主細胞を接触させ；細胞表面に結合する検出化合物の存在又は量に基づいて少なくとも１つの宿主細胞を選択するステップをさらに含む。
【００３３】
一実施形態において、検出化合物は、第１若しくは第２の標的又はその誘導体及び検出標識を含む。
【００３４】
一実施形態において、二重特異性抗体を精製する第５のステップは、アフィニティークロマトグラフィー及び／又はイオン交換クロマトグラフィーを含む。
【００３５】
一実施形態において、クロマトグラフィーは、捕捉（capturing）を行う第１のステップと；ポリッシング（polishing）を行う第２のステップと；場合によってはポリッシングを行う第３のステップと、を含む。
【００３６】
一実施形態において、捕捉を行う第１のステップは、Ｆｃ−結合アフィニティークロマトグラフィー、例えばプロテインＡ又はプロテインＧなど、当技術分野で周知であり、容易に市販品を入手可能なラムダ軽鎖特異的アフィニティークロマトグラフィー、例えばＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）など、当技術分野で周知であり、容易に市販品を入手可能なカッパ軽鎖特異的アフィニティークロマトグラフィー、例えばＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（商標）など、抗イディオタイプアフィニティークロマトグラフィー、例えば第１の部分又は第２の部分など、標的に基づくアフィニティークロマトグラフィー、例えば第１の標的又は第２の標的を使用するアフィニティークロマトグラフィーなど、当技術分野で周知であり、容易に市販品を入手可能なイオン交換クロマトグラフィー、例えばＣａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ又はＦｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＥＭＤ  ＳＯ３など及び疎水性相互作用クロマトグラフィーからなる群から選択される原理により行われる。
【００３７】
一実施形態において、ポリッシングを行う第２のステップは、Ｆｃ−結合アフィニティークロマトグラフィー、例えばプロテインＡ又はプロテインＧなど、ラムダ軽鎖特異的アフィニティークロマトグラフィー、例えばＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）など、カッパ軽鎖特異的アフィニティークロマトグラフィー、例えばＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（商標）など、抗イディオタイプアフィニティークロマトグラフィー、例えば第１の部分又は第２の部分など、標的に基づくアフィニティークロマトグラフィー、例えば第１の標的又は第２の標的を使用するアフィニティークロマトグラフィーなど、イオン交換クロマトグラフィー、例えばＣａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ又はＦｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＥＭＤ  ＳＯ３など、疎水性相互作用クロマトグラフィー及びウイルス不活性化からなる群から選択される原理で行われる。
【００３８】
一実施形態において、ポリッシングを行う第３のステップは、Ｆｃ−結合アフィニティークロマトグラフィー、例えばプロテインＡ又はプロテインＧなど、ラムダ軽鎖特異的アフィニティークロマトグラフィー、例えばＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）など、カッパ軽鎖特異的アフィニティークロマトグラフィー、例えばＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（商標）など、抗イディオタイプアフィニティークロマトグラフィー、例えば第１の部分又は第２の部分など、標的に基づくアフィニティークロマトグラフィー、例えば第１の標的又は第２の標的を使用するアフィニティークロマトグラフィーなど、イオン交換クロマトグラフィー、例えばＣａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ又はＦｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＥＭＤ  ＳＯ３など、疎水性相互作用クロマトグラフィー及びウイルス不活性化からなる群から選択される原理で行われる。
【００３９】
一実施形態において、本方法は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅ（商標）などのプロテインＡ捕捉の第１のステップと、ＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）などのラムダ軽鎖アフィニティークロマトグラフィーの第２のステップと、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（商標）などのカッパ軽鎖アフィニティークロマトグラフィーの第３のステップと；又はＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅ（商標）などのプロテインＡの第１のステップと、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（商標）などのカッパ軽鎖アフィニティークロマトグラフィーの第２のステップと、ＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）などのラムダ軽鎖アフィニティークロマトグラフィーの第３のステップと；又はＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（商標）などのカッパ軽鎖アフィニティークロマトグラフィーの第１のステップと、ＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）などのラムダ軽鎖アフィニティークロマトグラフィーの第２のステップと；又はＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）などのラムダ軽鎖アフィニティークロマトグラフィーの第１のステップと、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（商標）などのカッパ軽鎖アフィニティークロマトグラフィーの第２のステップと、を含む。
【００４０】
一実施形態において、細胞系は、ＣＨＯ細胞、非産生ハイブリドーマ、例えばＳｐ  ２／０又はＮＳ０など、ヒト由来細胞系、例えばＨＥＫ又はＰＥＲ．Ｃ６など、新生児ハムスター腎臓（ＢＨＫ）誘導体、酵母又は糸状菌、原核性の細菌、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又はシュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）など、植物誘導体、藻類及び繊毛虫類からなる群から選択される。
【００４１】
第６の態様によれば、第１の態様による抗体と、薬学的に許容可能な担体と、を含む医薬組成物が提供される。
【００４２】
第７の態様によれば、医薬としての使用のための、第１の態様による抗体又は第６の態様による医薬組成物が提供される。
【００４３】
第７の態様によれば、インフラマソーム関連疾患の処置への使用のための、第１の態様による抗体又は第６の態様による医薬組成物が提供される。
【００４４】
第８の態様によれば、インフラマソーム関連疾患の処置への使用のための、第１の態様による抗体又は第６の態様による医薬組成物が提供され、インフラマソーム関連疾患は、鎌状赤血球症、脈管障害、虚血−再灌流傷害、循環器疾患、末梢動脈疾患、アテローム性硬化症、脈管機能不全、骨格筋虚血、肺サルコイドーシス、線維症、マラリア、血液透析依存性慢性腎臓病及びクローン病からなる群から選択される。
【００４５】
第９の態様によれば、第１の態様による抗体又は第６の態様による医薬組成物の有効量をインフラマソーム関連障害に罹患する対象に投与することを含む、インフラマソーム関連障害を処置する方法が提供される。
【００４６】
インフラマソーム関連障害は、鎌状赤血球症、脈管障害、虚血−再灌流傷害、循環器疾患、末梢動脈疾患、アテローム性硬化症、脈管機能不全、骨格筋虚血、肺サルコイドーシス、線維症、マラリア、血液透析依存性慢性腎臓病又はクローン病であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１は、一実施形態によるベクター設定の図式的概観である。
【図２−１】図２：図２Ａ〜２Ｅは、一実施形態によるクロマトグラムを示す。図２Ａは、一実施形態による脱グリコシル化したインタクトなｂｂｍＡｂのＲＰ−ＵＶクロマトグラムである。図２Ｂは、一実施形態によるインタクトな脱グリコシル化ｂｂｍＡｂ１のデコンボリューション質量分析である。図２Ｃは、一実施形態によるｂｂｍＡｂのパパイン消化断片を示すＲＰ−ＵＶクロマトグラムである。図２Ｄは、一実施形態によるｂｂｍＡｂのＩｄｅＳ消化断片を示すＲＰ−ＵＶクロマトグラムである。図２Ｅは、一実施形態によるｂｂｍＡｂの脱グリコシル化及びＤＴＴ還元断片を示すＲＰ−ＵＶクロマトグラムである。
【図２−２】（上記の通り。）
【図２−３】（上記の通り。）
【図２−４】（上記の通り。）
【図２−５】（上記の通り。）
【図３−１】図３：図３Ａ〜３Ｄは、一実施形態によるＲＰ−ＵＶクロマトグラムを示す。図３Ａは、培養後の一実施形態によるｂｂｍＡｂの発現純度プロファイルを示すクロマトグラムである。図３Ｂは、ＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）による捕捉後の一実施形態によるｂｂｍＡｂのクロマトグラムである。図３Ｃは、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅ（商標）での捕捉後の一実施形態によるｂｂｍＡｂのクロマトグラムである。図３Ｄは、ＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）での捕捉、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＥＭＤ  ＳＯ３によるポリッシング及び限外ろ過後の一実施形態によるｂｂｍＡｂのクロマトグラムである。
【図３−２】（上記の通り。）
【図３−３】（上記の通り。）
【図３−４】（上記の通り。）
【図４】図４Ａ〜４Ｍは、二重特異性ミスマッチングに対する様々な選択肢の図式的概観である。図４Ａは、ｍＡｂ１ノブ（ラムダ）単量体の略図であり、番号１は可変重鎖ドメインを表し、番号２は第１の定常重鎖ドメインを表し、番号３は第２の定常重鎖ドメインを表し、番号４は第３の定常重鎖ドメインを表す。番号５は可変軽鎖ドメインを表し、番号６は可変重鎖ドメインを表す。図４Ｂは、ｍＡｂ１ノブ（ラムダ）ホモ二量体の略図である。図４Ｃは、ｍＡｂ２ホール（カッパ）単量体の略図であり、番号７は可変重鎖ドメインを表し、番号８は第１の定常重鎖ドメインを表し、番号９は第２の定常重鎖ドメインを表し、番号１０は第３の定常重鎖ドメインを表す。番号１１は可変軽鎖ドメインを表し、番号１２は定常重鎖ドメインを表す。図４Ｄは、ｍＡｂ２ホール（カッパ）ホモ二量体の略図である。図４Ｅは、ＣＨ／ＬＣ誤対合を有するｍＡｂ１ノブホモ二量体の略図である。図４Ｆは、２つのＣＨ／ＬＣ誤対合を有するｍＡｂ１ノブホモ二量体の略図である。図４Ｇは、１つのＣＨ／ＬＣ誤対合を有するｍＡｂ１ノブホモ二量体の略図である。図４Ｈは、１つのＣＨ／ＬＣ誤対合を有するｍＡｂ２ホールホモ二量体の略図である。図４Ｉは、２つのＣＨ／ＬＣ誤対合を有するｍＡｂ２ホールホモ二量体の略図である。図４Ｊは、１つのＣＨ／ＬＣ誤対合を有するｍＡｂ２ホールホモ二量体の略図である。図４Ｋは、１つのカッパ（ＣＨ／ＬＣ）誤対合を有するｂｂｍＡｂ１の略図である。図４Ｌは、１つのラムダ（ＣＨ／ＬＣ）誤対合を有するｂｂｍＡｂ１の略図である。図４Ｍは、２つのＣＨ／ＬＣ誤対合を有するｂｂｍＡｂ１の略図である。
【図５】図５は、一実施例によるＥＣＬに基づく親和性決定の滴定曲線を示す。
【図６−１】図６：図６Ａ〜６Ｂは、一実施例による２つのグラフを示す。
【図６−２】（上記の通り。）
【図７−１】図７：図７Ａ〜７Ｂは、一実施例による２つのグラフを示す。
【図７−２】（上記の通り。）
【図８−１】図８：図８Ａ〜８Ｂは、一実施例によるｍＲＮＡ発現レベルを示す。
【図８−２】（上記の通り。）
【図９−１】図９：図９Ａ〜９Ｂは、一実施例によるｍＲＮＡ発現レベルを示す。
【図９−２】（上記の通り。）
【図１０−１】図１０：図１０Ａ〜１０Ｂは、一実施例による２つのグラフを示す。
【図１０−２】（上記の通り。）
【図１１】図１１は、一実施例による統計学的相関を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
本開示は、とりわけ、ラムダ（λ）型の軽鎖を有するある種の抗体が、所望のｂｂｍＡｂを形成させるためにカッパ（κ）型の軽鎖を有するある種の抗体と同時発現可能であるという予想外の知見に基づく。
【００４９】
理論により縛られることを望むものではないが、各軽鎖及び／又は重鎖のＣＤＲは、形成されるｂｂｍａｂを良好に得るためにどのラムダ（λ）型の軽鎖がカッパ（κ）型の軽鎖を有するある種の抗体とともに同時発現することが可能であるかに顕著に影響し得る。
【００５０】
ファージディスプレイライブラリ、例えばＨｕＵＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）又はＨｕＣＡＬ  ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）（ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ）などのカッパ又はラムダ型抗体の何れか一方の抗体を両型とも得るための機会を与える技術の使用によるか又はトランスジェニックマウスの使用によるかの何れかで、一特異性結合剤とも呼ばれる次のものにおいて所望のｂｂｍＡｂを形成させるためにカッパ（κ）型の軽鎖を有するある種の抗体と同時発現可能であるラムダ（λ）型の軽鎖を有する抗体を作製し得、遺伝子操作によって適切なヒト免疫グロブリン配列が動物のゲノムに導入されており、例えばＯｍｎｉＡｂ抗体（ＯＭＴ）、Ｋｙｍｏｕｓｅ（商標）（Ｋｙｍａｂ）、Ｔｒｉａｎｎｉ  Ｍｏｕｓｅ（商標）（Ｔｒｉａｎｎｉ）又はＡｌｉｖａＭａｂ  Ｍｏｕｓｅ（Ａｂｌｅｘｉｓ）（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）はカッパ又はラムダ型抗体を産生し得る。このような一特異性結合剤を作製するための方法は当専門分野で周知であり、対象となる適切な標的に対するカッパ又はラムダ型一特異性結合剤の何れかの幅広いセットを作製するために広く適用されている。個別の一特異性結合剤は、適切な生物学的パラメーター、例えば親和性又は効力などに関して特徴が評価され、また例えば当技術分野でも非常によく知られるいわゆる開発可能な特徴を判断するために適切な物理化学的特徴についてスクリーニングされる（例えばＬｏｒｅｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ，Ａｕｇｕｓｔ  ２０１４）。最良の特徴を示す一特異性結合剤は、以下で詳述するように例えばＣＨＯ細胞において最終的に同時発現される。第１の標的に対するカッパ型抗体結合が第２の標的に対するラムダ型抗体結合と組み合わせられるか、又はその逆である組み合わせのみを同時発現により試験する。最良のプロファイルを与える組み合わせ、特に誤った重鎖（例えばＨ２、重鎖２）に対する１つの軽鎖（例えばＬ１、軽鎖１、例えばラムダ）の少量の乱雑な結合のみを示すもの、を選択する意図で、得られる同時発現生成物及び適切な生成物に関連する不純物が詳細に特徴評価される。本方法の長所は、両軽鎖が元来の重鎖結合パートナーを交換し、その結果、Ｈ１Ｌ２−Ｈ２Ｌ１型の生成物関連不純物を生じさせる抗体の組み合わせが除外され得るということであり得る。このような生成物に関連する不純物は最先端の精製工程を使用して容易に枯渇させられないので、これは長所である。個別の抗体をどのようにして同時発現させるか、及び同時発現生成物をどのように分析するかという手順は以下で詳述する。
【００５１】
例として特異的な抗体、主に、軽鎖Ｖκ６を有するＩＬ−１βに結合するｍＡｂ２及び軽鎖Ｖλ１を有するＩＬ−１８に結合するｍＡｂ１を使用した。
【００５２】
好ましい一実施形態において、Ｒｉｄｇｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）による２つの抗体のＦｃ部分のＫｉＨ修飾を使用した。他の抗体も試験した。
【００５３】
以下の具体例で示されるように、好ましい実施形態において、ｂｂｍＡｂ１は、臨床開発及び商業化を進めるために生物製剤又は診断薬にとって必要とされる十分な全体的収率、純度及び生成物の品質を確実にする、単一の一般的細胞系で発現される。
【００５４】
１．定義
本願を解釈する目的で、次の定義が適用され、適切な場合は常に、単数形で使用される用語は複数形の意味も含み逆もまた成り立つ。発明を実施するための形態を通じて、さらなる定義を記す。
【００５５】
「ＩＬ−１８」という用語は、ＩＬ−１８ポリペプチド、インターロイキン−１８ポリペプチド、ＩＦＮ−ガンマ誘導因子又はインターフェロン−ガンマ−誘導因子又はＩＮＦ−γ誘導因子の同義語である。「ＩＬ−１８」という用語は、別の種が指定されない限り、ヒトＩＬ−１８を指す。ＩＬ−１８は当業者にとって周知であり、例えば製品番号＃Ｂ００１−５でＭＢＬ（登録商標）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能である。本願を通じて、ＩＬ−１８という用語は、プロ又は成熟形態を意味することが指定されない限り、プロ−ＩＬ−１８（プロテアーゼ切断前の成熟ＩＬ−１８の前駆体）及び成熟ＩＬ−１８（プロテアーゼ切断後）の両方を交換可能に包含する。
【００５６】
「ＩＬ−１β」又は「ＩＬ−１ｂ」という用語は、ＩＬ−１βポリペプチド及びインターロイキン−１βポリペプチドの同義語である。「ＩＬ−１β」という用語は、別の種が指定されない限り、ヒトＩＬ−１βを指す。ＩＬ−１βは当業者にとって周知であり、例えば製品番号＃１０１３９−ＨＮＡＥ−５でＳｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから入手可能である。
【００５７】
「抗体」という用語は、インタクトな免疫グロブリン又はそれらの機能的断片を指す。天然の抗体は、一般的には、通常、少なくとも２本の重（Ｈ）鎖及び少なくとも２本の軽（Ｌ）鎖から構成される四量体を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書中でＶＨと略称）及び通常は３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）から構成される重鎖定常領域から構成される。重鎖は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１及びＩｇＡ２サブタイプ）、ＩｇＭ及びＩｇＥを含め、何れかのアイソタイプのものであり得る。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書中でＶＬと略称）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成される。軽鎖はカッパ（κ）鎖及びラムダ（λ）鎖を含む。重鎖及び軽鎖可変領域は一般的に抗原認識に関与し、重鎖及び軽鎖定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えばエフェクター細胞）及び古典的補体系の第１の成分（Ｃｌｑ）を含め、宿主組織又は因子に対する免疫グロブリンの結合に介在し得る。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存的な領域が間に入る、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらにサブ分類され得る。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へと、次の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配列される３個のＣＤＲ及び４つのＦＲから構成される。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。
【００５８】
抗体の「抗原−結合部分」（又は単純に「抗原部分」）という用語は、本明細書中で使用される場合、ＩＬ−１８又はＩＬ−１β抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の全長又は１つ以上の断片を指す。抗体の抗原−結合機能は、全長抗体の断片により行われ得ることが示されている。抗体の「抗原−結合部分」という用語内に包含される結合断片の例としては、Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる１価断片；Ｆ（ａｂ）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結される２つのＦａｂ断片を含む二価断片；ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片；ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ；３４１：５４４−５４６）；及び単離される相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。
【００５９】
さらに、Ｆｖ断片、ＶＬ及びＶＨの２つのドメインが個別の遺伝子によりコードされているものの、それらは、ＶＬ及びＶＨ領域が対形成して１価分子を形成する、単一タンパク質鎖としてそれらが生成されることを可能にするフレキシブルリンカーによって、組み換え法を使用して連結され得る（１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えばＢｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；及びＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃ；．８５：５８７９−５８８３）。このような１本鎖抗体も抗体の「抗原−結合部分」という用語内に包含されるものとする。これらの抗体断片は、当業者にとって公知の従来技術を使用して得られ、インタクトな抗体である場合と同じように有用性について断片をスクリーニングする。
【００６０】
「単離される」という用語は、本願を通じて、免疫グロブリン、抗体又はポリヌクレオチドが、場合に応じて、それが天然で生じ得るものとは異なる物理的環境で存在し得ることを意味する。
【００６１】
本願を通じて、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）は、別の定義に従いＣＤＲが定義されることが示されない限り、Ｋａｂａｔの定義に従い定義される。あるＣＤＲの正確なアミノ酸配列境界は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１），”Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（”Ｋａｂａｔ”  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  ｓｃｈｅｍｅ），Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）ＪＭＢ  ２７３，９２７−９４８（”Ｃｈｏｔｈｉａ”  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  ｓｃｈｅｍｅ）及びＩｍＭｕｎｏＧｅｎＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ（Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．，Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ，７，１３２−１３６（１９９９）；Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７，５５−７７（２００３）（”ＩＭＧＴ”  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  ｓｃｈｅｍｅ）に記載のものを含め、多くの周知のスキームの何れかを使用して決定され得る。例えば、古典的形式の場合、Ｋａｂａｔ下で、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）中のＣＤＲアミノ酸残基は、番号３１〜３５（ＨＣＤＲ１）、５０〜６５（ＨＣＤＲ２）及び９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）であり；軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）中のＣＤＲアミノ酸残基は、番号２４〜３４（ＬＣＤＲ１）、５０〜５６（ＬＣＤＲ２）及び８９〜９７（ＬＣＤＲ３）である。Ｃｈｏｔｈｉａ下で、ＶＨ中のＣＤＲアミノ酸は、番号２６〜３２（ＨＣＤＲ１）、５２〜５６（ＨＣＤＲ２）及び９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）であり；ＶＬ中のアミノ酸残基は、番号２６〜３２（ＬＣＤＲ１）、５０〜５２（ＬＣＤＲ２）及び９１〜９６（ＬＣＤＲ３）である。Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの両方のＣＤＲ定義を組み合わせることによって、ＣＤＲは、ヒトＶＨ中のアミノ酸残基２６〜３５（ＨＣＤＲ１）、５０〜６５（ＨＣＤＲ２）及び９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）及びヒトＶＬ中のアミノ酸残基２４〜３４（ＬＣＤＲ１）、５０〜５６（ＬＣＤＲ２）及び８９〜９７（ＬＣＤＲ３）からなる。ＩＭＧＴ下で、ＶＨ中のＣＤＲアミノ酸残基は、およそ２６〜３５番（ＣＤＲ１）、５１〜５７（ＣＤＲ２）及び９３〜１０２（ＣＤＲ３）であり、ＶＬ中のＣＤＲアミノ酸残基は、およそ２７〜３２番（ＣＤＲ１）、５０〜５２（ＣＤＲ２）及び８９〜９７（ＣＤＲ３）である（「Ｋａｂａｔ」に従い付番）。ＩＭＧＴ下で、抗体のＣＤＲ領域は、プログラムＩＭＧＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐ  Ａｌｉｇｎを使用して決定され得る。
【００６２】
慣例により、重鎖中のＣＤＲ領域は一般的にはＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２及びＨ−ＣＤＲ３と呼ばれ、軽鎖ではＬ−ＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬ−ＣＤＲ３と呼ばれる。これらは、アミノ末端からカルボキシ末端の方向で順に番号が付けられる。
【００６３】
「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」という用語は、本明細書中で使用される場合、単一分子組成物の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は単一の結合特異性及び特定のエピトープへの親和性を示す。
【００６４】
「ヒト抗体」という用語は、本明細書中で使用される場合、フレームワーク及びＣＤＲ領域の両方がヒト起源の配列由来である可変領域を有する抗体を含むものとする。さらに、抗体が定常領域を含有する場合、定常領域はまた、このようなヒト配列、例えばＫｎａｐｐｉｋ，ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ；２９６：５７−８６）に記載のような、例えばヒト生殖系列配列又はヒト生殖系列配列の突然変異型又はヒトフレームワーク配列分析由来のコンセンサスフレームワーク配列を含有する抗体由来でもある。
【００６５】
本発明のヒト抗体は、ヒト配列によりコードされないアミノ酸残基を含み得る（例えばインビトロでのランダム若しくは部位特異的突然変異生成によるか又はインビボでの体細胞突然変異により導入される突然変異）。しかし、「ヒト抗体」という用語は、本明細書中で使用される場合、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列由来のＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植されている抗体を含まないものとする。
【００６６】
「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、フレームワーク及びＣＤＲ領域の両方がヒト配列由来である可変領域を有する単一の結合特異性を示す抗体を指す。
【００６７】
「組み換えヒト抗体」という用語は、本明細書中で使用される場合、ヒト免疫グロブリン遺伝子に対してトランスジェニックであるか又は染色体導入性である動物（例えばマウス）又はそれから調製されるハイブリドーマから単離される抗体、など、組み換え手段により調製される、発現される、作製される、又は単離される全てのヒト抗体、例えばトランスフェクトーマからヒト抗体を発現させるために形質転換された宿主細胞から単離される抗体、組み換え、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離される抗体及びヒト免疫グロブリン遺伝子の全て又は一部のスプライシングを含む何れかの他の手段によって調製される、発現される、作製される、又は単離される抗体を含む。このような組み換えヒト抗体は、フレームワーク及びＣＤＲ領域がヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来である可変領域を有する。しかし、ある一定の実施形態において、このような組み換えヒト抗体は、インビトロでの突然変異誘発（又はヒトＩｇ配列に対してトランスジェニックである動物が使用される場合、インビボでの体細胞突然変異誘発）に供され得、したがって、組み換え抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨ及びＶＬ配列由来であり、それに関連する一方で、インビボのヒト抗体生殖系列レパートリー内に自然に存在し得ない配列である。
【００６８】
「抗原を認識する抗体」及び「抗原に特異的な抗体」という句は、「抗原に特異的に結合する抗体」という用語と本明細書中で交換可能に使用される。
【００６９】
本明細書中で使用される場合、「ＩＬ−１８に特異的に結合する」結合分子は、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下のＫＤでヒトＩＬ−１８に結合する結合分子を指すものとする。
【００７０】
本明細書中で使用される場合、「ＩＬ−１βに特異的に結合する」結合分子は、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下のＫＤでヒトＩＬ−１βに結合する結合分子を指すものとする。
【００７１】
「ＩＬ−１８以外の抗原と交差反応する」結合分子は、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下のＫＤで抗原に結合する結合分子を指すものとする。「ＩＬ−１β以外の抗原と交差反応する」結合分子は、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下のＫＤで抗原に結合する結合分子を指すものとする。
【００７２】
「特定の抗原と交差反応しない」結合分子は、標準的な結合アッセイにおいてこれらのタンパク質に対して示す結合が基本的に検出不可能である結合分子を指すものとする。
【００７３】
本明細書中で使用される場合、「アンタゴニスト」という用語は、活性化化合物の存在下でシグナル伝達活性を阻害する結合分子を指すものとする。例えば、ＩＬ−１８の場合、ＩＬ−１８アンタゴニスは、ヒト血液細胞におけるＩＬ−１８依存性インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）産生アッセイなどのヒト細胞アッセイにおいてＩＬ−１８の存在下でシグナル伝達活性を阻害する結合分子である。ヒト血液細胞におけるＩＬ−１８依存性ＩＦＮ−γ産生アッセイの例は以下の実施例で詳述する。
【００７４】
二価二重特異性抗体又は二価二重特異性抗体という用語は、ＩＬ−１８及びＩＬ−１βなどの２つの異なる標的に結合する抗体を指す。
【００７５】
二重特異性抗体は、「ヘテロ二量体」であり、これは、一方の部分が第１の標的に特異的な第１の抗体由来であり、別の部分が第２の標的に特異的な第２の抗体由来であることを意味する。「ヘテロ二量体化修飾」は、ヘテロ二量体二重特異性抗体を形成する抗体の片方又は両方に対する修飾であり、このような形成を促進するものである。二重特異性を形成することが意図される抗体の２つのＩｇＧ１部分のＦｃドメインのヘテロ二量体化修飾の例は、第１の重鎖における嵩張るアミノ酸（ａａ）側鎖（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ）を有する「ノブ」及び小さなａａ側鎖（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ）を有する「ホール」が第２の重鎖において導入されたものであり、またＣＨ３領域中のさらなるジスルフィド架橋が両重鎖を連結している（Ｍｅｒｃｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：６７７−６８１（１９９８），ｐａｇｅ  ６７８，ｔａｂｌｅ  １）。
【００７６】
本明細書中で使用される場合、「アゴニスト活性がない」抗体は、細胞に基づくアッセイにおいて標的の非存在下及び／又は存在下で標的依存的シグナル伝達活性を顕著に向上させない結合分子を指すものとし、例えばＩＬ−１８の場合、ＩＬ−１８ヒト血液細胞ＩＦＮ−γ産生アッセイの非存在下及び／又は存在下で、ＩＬ−１８依存性シグナル伝達活性を顕著に向上させない。このようなアッセイは以下の実施例で詳述する。
【００７７】
「Ｋａｓｓｏｃ」又は「Ｋａ」という用語は、本明細書中で使用される場合、特定の結合分子−抗原相互作用の会合速度を指すものとし、同時に、「Ｋｄｉｓ」又は「Ｋｄ」という用語は、本明細書中で使用される場合、特定の結合分子−抗原相互作用の解離速度を指すものとする。「ＫＤ」という用語は、本明細書中で使用される場合、解離定数を指すものとし、これはＫｄとＫａとの比（すなわちＫｄ／Ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される。抗体に対するＫＤ値は、当技術分野で十分に確立された方法を使用して決定し得る。抗体のＫＤを決定するための方法は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどの表面プラズモン共鳴を使用することによる。
【００７８】
本明細書中で使用される場合、「親和性」という用語は、単一の抗原部位での結合分子と抗原との間の相互作用の強度を指す。
【００７９】
本明細書中で使用される場合、抗体に対する「高い親和性」という用語は、標的抗原に対して１ｎＭ以下のＫＤを有する抗体を指す。
【００８０】
本明細書中で使用される場合、「対象」という用語は、何らかのヒト又は非ヒト動物を含む。
【００８１】
「非ヒト動物」という用語は、全ての脊椎動物、例えば哺乳動物及び非哺乳動物、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などを含む。
【００８２】
本明細書中で使用される場合、「最適化ヌクレオチド配列」という用語は、産生細胞又は生物、一般的には真核細胞、例えばピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）の細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）又はヒト細胞において好ましいコドンを使用してアミノ酸配列をコードするためにヌクレオチド配列が改変されていることを意味する。最適化ヌクレオチド配列は、「親」配列としても知られる出発ヌクレオチド配列により元来コードされるアミノ酸配列を完全に保持するように改変される。本明細書中の最適化配列は、ＣＨＯ哺乳動物細胞において好ましいコドンを有するように改変されているが；しかし他の真核細胞でのこれらの配列の最適化発現も本明細書中で想定される。
【００８３】
「同一性」という用語は、少なくとも２つの異なる配列間での類似性を指す。この同一性はパーセント同一性として表され得、標準的アライメントアルゴリズム、例えばＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｊ  ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ；２１５：４０３−４１０）；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７０）Ｊ  ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ；４８：４４４−４５３のアルゴリズム又はＭｅｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｃｏｍｐｕｔ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｓｃｉ；４：１１−１７のアルゴリズム）により決定される。一連のパラメーターは、Ｂｌｏｓｕｍ  ６２スコア行列であり得、ギャップペナルティーが１２、ギャップ伸長ペナルティーが４、フレームシフトギャップペナルティーが５であり得る。２つのアミノ酸又はヌクレオチド配列間のパーセント同一性も、ＰＡＭ１２０重み付き残基表（ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ）、１２のギャップ長及び４のギャップペナルティーを使用して、ＡＬＩＧＮプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０）に組み込まれているＥ．Ｍｅｙｅｒｓ及びＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ；４（１）：１−１７）のアルゴリズムを使用して決定され得る。パーセント同一性は通常、同様の長さの配列を比較することにより計算される。
【００８４】
「免疫反応」という用語は、侵入病原体、病原体に感染した細胞又は組織、癌性細胞、又は自己免疫若しくは病理学的炎症の場合は正常なヒト細胞又は組織に対する、選択的障害、その破壊又はヒト身体からの排除を引き起こす、例えば、リンパ球、抗原提示細胞、貪食細胞、顆粒球及び上記細胞又は肝臓により産生される可溶性巨大分子（抗体、サイトカイン及び補体を含む）の作用を指す。
【００８５】
「シグナル伝達経路」又は「シグナル伝達活性」は、一般的に増殖因子の受容体への結合などのタンパク質−タンパク質相互作用により開始され、その結果、細胞のある部分から細胞の別の部分へのシグナルの伝達が起こる生化学的因果関係を指す。一般に、伝達は、一連の反応を引き起こすシグナル伝達における、１つ以上のタンパク質での１つ以上のチロシン、セリン又はスレオニン残基の特異的なリン酸化を含む。最後から２番目の過程は、一般的には、核事象を含み、その結果、遺伝子発現の変化が起こる。
【００８６】
「中和する」という用語及びその文法的な変形物は、本願を通じて、場合により結合タンパク質又は抗体の存在下で、標的の生物学的活性を完全又は部分的の何れかで低下させることを意味する。
【００８７】
「核酸」又は「ポリヌクレオチド」という用語は、１本鎖又は２本鎖形態の何れかのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）及びそのポリマーを指す。具体的に制限されない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然のヌクレオチドと同様に代謝される天然ヌクレオチドの既知の類似体を含有する核酸を包含する。別段の指示がない限り、特定の核酸配列も保存的に修飾されたそれらの変異体（例えば縮重コドン置換）、アレル、オルソログ、ＳＮＰ及び相補配列並びに明確に指示される配列を暗黙的に包含する。具体的に、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（又は全ての）コドンの第３の位置が混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換される配列を生成させることにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；及びＲｏｓｓｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８（１９９４））。
【００８８】
「ポリヌクレオチド」又は「核酸」におけるヌクレオチドは、ブロモウリジン及びイノシン誘導体などの塩基修飾、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホロセレノアート、ホスホロジセレノアート、ホスホロアニロチオアート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｎｉｌｏｔｈｉｏａｔｅ）、ホスホルアニラダート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｎｉｌａｄａｔｅ）及びホスホロアミダートなどのリボース修飾を含む修飾を含み得る。
【００８９】
「ベクター」という用語は、宿主細胞の形質転換又は遺伝子移入に適切であり、それに操作可能に連結される１つ以上の異種コード領域の発現を（宿主細胞と同時に）支配及び／又は調節する核酸配列を含有する、何れかの分子又は実体（例えば核酸、プラスミド、バクテリオファージ又はウイルス）を意味する。
【００９０】
「同時発現」という用語は、ポリペプチド全てに対して共通の単一の宿主細胞において一緒に異なるポリペプチドが発現されることを意味する。二重特異性抗体の同時発現は、機能的二重特異性抗体を形成する異なる部分が単一で共通の宿主細胞で発現されることを意味する。二重特異性抗体の各半分に対するものなど、発現宿主細胞においていくつかの発現ベクターを組み込むことによって、又は二重特異性抗体の全ての部分をコードする１つの発現ベクターを組み込むことによって、同時発現が達成され得る。
【００９１】
「ミスマッチ」という用語は、二重特異性抗体などの意図するタンパク質複合体の異なる部分が意図されるように複合結合しないことを意味し、これは、タンパク質複合体が意図されるように見えないか又は挙動しないことを意味する。二重特異性抗体に関するミスマッチの例を図４で示す。
【００９２】
結合分子、抗体又はそれらの断片をコードする配列の「保存的変異体」は、保存的アミノ酸修飾を含む配列を指す。「保存的アミノ酸修飾」は、そのアミノ酸配列を含有する抗体の結合の特徴に顕著に影響しないか又はそれを変化させないアミノ酸修飾を指すものとする。このような保存的修飾としては、アミノ酸置換、付加及び欠失が挙げられる。保存的アミノ酸置換は、あるアミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられるものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが当技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ−分岐状側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。部位特異的突然変異誘発及びＰＣＲ介在突然変異誘発など、当技術分野で公知の標準的な技術によって本発明の結合タンパク質に修飾が導入され得る。保存的アミノ酸置換は、一般的に、生物学的系での合成によるのではなく化学ペプチド合成により組み込まれる非天然のアミノ酸残基も包含し得る。非天然のアミノ酸としては、アミノ酸部分のペプチド模倣物の逆転形態又は逆位形態が挙げられるが限定されない。
【００９３】
「エピトープ」という用語は、抗体又はそれらの断片など、免疫系により認識される抗原の部分である。本願内で、「エピトープ」という用語は、立体構造エピトープ及び直鎖状エピトープの両方に対して交換可能に使用される。立体構造エピトープは抗原のアミノ酸配列の非連続的セクションから構成され、一方で直鎖状エピトープは、抗原からのアミノ酸の連続配列により形成される。
【００９４】
「処置する」、「処置すること」、「処置」、「予防する」、「予防すること」又は「予防」という用語は、治療的処置、予防的処置及び対象が障害又は他のリスク因子を発現するリスクを低下させる適用を含む。処置は、障害の完全な治癒を必要とせず、症状又は基礎になるリスク因子の軽減を包含する。本明細書中で使用される場合、ヒト抗体又はそれらの断片は、抗体の可変領域又は全長鎖がヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子を使用する系から得られる場合、特定の生殖系列配列の「産物」であるか又はそれに「由来する」重鎖若しくは軽鎖可変領域又は全長重鎖若しくは軽鎖を含む。このような系は、対象となる抗原でヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスに免疫付与すること又は対象となる抗原を用いてファージ上に提示されるヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリをスクリーニングすることを含む。ヒト生殖系列免疫グロブリン配列の「産物」であるか又はそれに「由来する」ヒト抗体又はそれらの断片は、ヒト生殖系列免疫グロブリンのアミノ酸配列とヒト抗体のアミノ酸配列を比較し、ヒト抗体の配列に対して配列が最も近い（すなわち最大の％同一性）ヒト生殖系列免疫グロブリン配列を選択することによってそのようなものとして同定され得る。特定のヒト生殖系列免疫グロブリン配列の「産物」であるか又はそれに「由来する」ヒト抗体は、例えば天然の体細胞突然変異又は部位特異的突然変異の意図的導入ゆえに、生殖系列配列と比較した場合、アミノ酸の相違を含有し得る。しかし、選択されるヒト抗体は、一般的には、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列とアミノ酸配列が少なくとも９０％同一であり、他の種の生殖系列免疫グロブリンアミノ酸配列（例えばマウス生殖系列配列）と比較した場合にヒトであるとしてヒト抗体を同定するアミノ酸残基を含有する。ある種のケースにおいて、ヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列に対して、アミノ酸配列が、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％若しくは少なくとも９５％又はさらに少なくとも９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一であり得る。一般的には、特定のヒト生殖系列配列由来のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列とのアミノ酸の相違が１０個以下である。ある一定のケースにおいて、ヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列と、５個以下か又はさらには４、３、２又は１個以下のアミノ酸の相違を示し得る。
【００９５】
ヒト抗体は、当業者にとって公知の多くの方法により作製され得る。ヒト抗体は、ヒト骨髄腫又はマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞系を使用して、ハイブリドーマ法により作製され得る（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ；（１９８４）１３３：３００１；Ｂｒｏｄｅｕｒ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｉｓｏｌａｔｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ５１−６３，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ，１９８７）。代替的な方法としては、ファージライブラリ又はトランスジェニックマウスの使用が挙げられ、両者ともヒト可変領域レパートリーを利用する（Ｗｉｎｔｅｒ  Ｇ；（１９９４）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １２：４３３−４５５，Ｇｒｅｅｎ  ＬＬ，（１９９９）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：１１−２３）。
【００９６】
マウス免疫グロブリン遺伝子座がヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントで置き換えられているトランスジェニックマウスのいくつかの系列が現在利用可能である（Ｔｏｍｉｚｕｋａ  Ｋ，（２０００）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，９７：７２２−７２７；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ＤＭ（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １４：８４５−８５１；Ｍｅｎｄｅｚ  ＭＪ，（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６）。このようなマウスは、抗原負荷時に、対象となる抗体が選択され得るヒト抗体のレパートリーを産生可能である。特に注目すべきは、ヒトリンパ球が照射マウスに移植されるＴｒｉｍｅｒａ（商標）システム（Ｅｒｅｎ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ，（１９８８）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ９３：１５４−１６１）、大量のプールされたインビトロ単離抗体作製手順を通じてヒト（又は他の種の）リンパ球が効果的に入れられ、続いてデコンボリューション、制限希釈及び選択手順が行われる選択リンパ球単離抗体系（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｉｓｏｌａｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍ）（ＳＬＡＭ，Ｂａｂｃｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ（１９９６）９３：７８４３−７８４８）及びＸｅｎｏｍｏｕｓｅ（商標）（Ａｂｇｅｎｉｘ  Ｉｎｃ）である。代替的なアプローチは、Ｍｏｒｐｈｏｄｏｍａ（商標）技術を使用し、Ｍｏｒｐｈｏｔｅｋ  Ｉｎｃから入手可能である。
【００９７】
ヒト抗体及びその断片を作製するために、ファージディスプレイ技術が使用され得る（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ；（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５３及びＧｒｉｆｆｉｔｈｓ  ＡＤ  ｅｔ  ａｌ（１９９４）ＥＭＢＯ  １３：３２４５−３２６０）。この技術によれば、Ｍ１３又はｆｄなどの糸状バクテリオファージのタンパク質遺伝子の大きいか又は小さいコートの何れかに単離抗体可変ドメイン遺伝子をインフレームでクローニングし、（通常、ヘルパーファージの助力により）ファージ粒子の表面上で機能単離抗体断片として提示させる。単離抗体の機能特性に基づく選択の結果、これらの特性を提示する単離抗体をコードする遺伝子が選択される。疾患若しくは障害に罹患している個体又はあるいは非免疫付与ヒトドナーから採取されたヒトＢ細胞から作製されたライブラリから抗原特異的な抗体を選択するために、ファージディスプレイ技術を使用し得る（Ｍａｒｋｓ；Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏ（１９９１）２２２：５８１−５９１）。インタクトなヒト単離抗体がＦｃドメインを含むことが所望される場合、所望の定常領域を含む哺乳動物発現ベクターにファージディスプレイ由来断片を再クローニングし、安定した発現細胞系を確立することが必要である。
【００９８】
親和性成熟の技術（Ｍａｒｋｓ；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（１９９２）１０：７７９−７８３）は、結合親和性を提供するために使用され得、Ｈ及びＬ鎖可変領域を天然の変異体で連続的に置き換え、結合親和性の向上に基づき選択することによって、一次性のヒト単離抗体の親和性が改善される。「エピトープインプリンティング」など、この技術の変形物も現在入手可能である（国際公開第９３／０６２１３号パンフレット；Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ；Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９９３）２１：２２６５−２２６６）。
【００９９】
「純粋」という用語は、精製二重特異性抗体に関して使用される場合、細胞が二重特異性抗体を発現する条件下で選択された細胞での同時発現後、及びインタクトなＵＰＬＣ−ＭＳマススクリーニングアプローチを使用したタンパク質−Ａ精製後の、異なる二重特異性抗体の組み合わせ及びコンストラクトの純度及び同一性に関する。純粋又は純度は、形成されるヘテロ及びホモ二量体ｂｂｍＡｂの相対的定量を指す。本発明の方法を使用して、正確に形成されたヘテロ二量体ｂｂｍＡｂ１及びｂｂｍＡｂ２は、インタクトな質量シグナル強度に基づき８５％を超える相対純度で観察され得る。
【０１００】
２．ＩＬ−１８抗体
開示される方法で使用される特に好ましいＩＬ−１８抗体又はその抗原−結合断片はヒト抗体である。
【０１０１】
参照し易いように、Ｋａｂａｔ定義及びＣｈｏｔｈｉａ定義に基づき、ｍＡｂ１と呼ばれる特異的ＩＬ−１８抗体の超可変領域のアミノ酸配列並びにＶＬ及びＶＨドメイン及び完全重鎖及び軽鎖が下記の表１で提供される。
【０１０２】
【表１】
2020524991.tif 000002
【０１０３】
一実施形態において、ＩＬ−１８抗体又はその抗原−結合断片は、ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号１を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号２を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号３を有する超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む少なくとも１つの免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。一実施形態において、ＩＬ−１８抗体又はその抗原−結合断片は、ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号４を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号５を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号６を有する超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む少なくとも１つの免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。
【０１０４】
一実施形態において、ＩＬ−１８抗体又はその抗原−結合断片は、ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号１１を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号１２を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号１３を有する超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む少なくとも１つの免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。一実施形態において、ＩＬ−１８抗体又はその抗原−結合断片は、ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号１４を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号１５を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号１６を有する超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む少なくとも１つの免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。
【０１０５】
一実施形態において、ＩＬ−１８抗体又はその抗原−結合断片は、少なくとも１つの免疫グロブリンＶＨドメイン及び少なくとも１つの免疫グロブリンＶＬドメインを含み、ａ）免疫グロブリンＶＨドメインは（例えば配列中で）：ｉ）ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号１を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号２を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号３を有する、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３；又はｉｉ）ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号４を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号５を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号６を有する、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み；ｂ）免疫グロブリンＶＬドメインは（例えば配列中で）：ｉ）ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号１１を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号１２を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号１３を有する、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３又はｉｉ）ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号１４を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号１５を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号１６を有する、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む。
【０１０６】
一実施形態において、ＩＬ−１８抗体又はその抗原−結合断片は、ａ）配列番号７として示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；ｂ）配列番号１７として示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；ｃ）配列番号７として示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリンＶＨドメイン及び配列番号１７として示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリンＶＬドメイン；ｄ）配列番号１、配列番号２及び配列番号３として示される超可変領域を含む免疫グロブリンＶＨドメイン；ｅ）配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３として示される超可変領域を含む免疫グロブリンＶＬドメイン；ｆ）配列番号４、配列番号５及び配列番号６として示される超可変領域を含む免疫グロブリンＶＨドメイン；ｇ）配列番号１４、配列番号１５及び配列番号１６として示される超可変領域を含む免疫グロブリンＶＬドメイン；ｈ）配列番号１、配列番号２及び配列番号３として示される超可変領域を含む免疫グロブリンＶＨドメイン及び配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３として示される超可変領域を含む免疫グロブリンＶＬドメイン；ｉ）配列番号４、配列番号５及び配列番号６として示される超可変領域を含む免疫グロブリンＶＨドメイン及び配列番号１４、配列番号１５及び配列番号１６として示される超可変領域を含む免疫グロブリンＶＬドメイン；ｊ）配列番号１９を含む軽鎖；ｋ）配列番号９を含む重鎖；又はｌ）配列番号１９を含む軽鎖及び配列番号９を含む重鎖を含む。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、ＩＬ−１８抗体又はその抗原−結合断片（例えばｍＡｂ１）は、配列番号７の３個のＣＤＲを含む。他の実施形態において、ＩＬ−１８抗体又はその抗原−結合断片は、配列番号１７の３個のＣＤＲを含む。他の実施形態において、ＩＬ−１８抗体又はその抗原−結合断片は、配列番号７の３個のＣＤＲ及び配列番号１７の３個のＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−１８抗体又はその抗原−結合断片は、配列番号９の３個のＣＤＲを含む。他の実施形態において、ＩＬ−１８抗体又はその抗原−結合断片は、配列番号１９の３個のＣＤＲを含む。他の実施形態において、ＩＬ−１８抗体又はその抗原−結合断片は、配列番号９の３個のＣＤＲ及び配列番号１９の３個のＣＤＲを含む。
【０１０８】
一実施形態において、ＩＬ−１８抗体又はその抗原−結合断片（例えばｍＡｂ１）は、少なくとも：ａ）ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号１を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号２を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号３を有する超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を配列中に含む可変ドメイン及びヒト重鎖の定常部分又はその断片を含む免疫グロブリン重鎖又はその断片と、ｂ）ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号１１を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号１２を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号１３を有する超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を配列中に含む可変ドメイン及びヒト軽鎖の定常部分又はその断片を含む免疫グロブリン軽鎖又はその断片と、を含むヒトＩＬ−１８抗体から選択される。
【０１０９】
一実施形態において、ＩＬ−１８抗体又はその抗原−結合断片（例えばｍＡｂ１）は、少なくとも：ａ）ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号４を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号５を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号６を有する超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を配列中に含む可変ドメイン及びヒト重鎖の定常部分又はその断片を含む免疫グロブリン重鎖又はその断片と、ｂ）ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号１４を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号１５を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号１６を有する超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を配列中に含む可変ドメイン及びヒト軽鎖の定常部分又はその断片を含む免疫グロブリン軽鎖又はその断片と、を含むヒトＩＬ−１８抗体から選択される。
【０１１０】
一実施形態において、ＩＬ−１８抗体又はその抗原−結合断片は、ａ）ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号１を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号２を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号３を有する、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を配列中に含む第１のドメインと、ｂ）ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号１１を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号１２を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号１３を有する、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を配列中に含む第２のドメインと、ｃ）第１のドメインのＮ末端及び第２のドメインのＣ末端又は第１のドメインのＣ末端及び第２のドメインのＮ末端の何れかに結合するペプチドリンカーと、を含む抗原−結合部位を含む、１本鎖抗体又はその抗原−結合断片から選択される。
【０１１１】
一実施形態において、ＩＬ−１８抗体又はその抗原−結合断片（例えばｍＡｂ１）は、ａ）ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号４を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号５を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号６を有する、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を配列中に含む第１のドメインと、ｂ）ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号１４を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号１５を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号１６を有する、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を配列中に含む第２のドメインと、ｃ）第１のドメインのＮ末端及び第２のドメインのＣ末端又は第１のドメインのＣ末端及び第２のドメインのＮ末端の何れかに結合するペプチドリンカーと、を含む抗原結合部位を含む、１本鎖抗体又はその抗原結合断片から選択される。
【０１１２】
開示される方法で使用されるＩＬ−１８抗体又はその抗原−結合断片のＶＨ又はＶＬドメインは、配列番号７及び１７で示されるＶＨ又はＶＬドメインと実質的に同一であるＶＨ及び／又はＶＬドメインを有し得る。本明細書中で開示されるヒトＩＬ−１８抗体は、配列番号９として示されるものと実質的に同一である重鎖及び／又は配列番号１９として示されるものと実質的に同一である軽鎖を含み得る。本明細書中で開示されるヒトＩＬ−１８抗体は、配列番号９を含む重鎖及び配列番号１９を含む軽鎖を含み得る。本明細書中で開示されるヒトＩＬ−１８は、ａ）配列番号７で示されるものと実質的に同一であるアミノ酸配列を有する可変ドメイン及びヒト重鎖の定常部分を含む１本の重鎖と、ｂ）配列番号１７で示されるものと実質的に同一であるアミノ酸配列を有する可変ドメイン及びヒト軽鎖の定常部分を含む１本の軽鎖と、を含み得る。
【０１１３】
開示される方法、キット及び治療計画での使用のための他の好ましいＩＬ−１８アンタゴニスト（例えば抗体）は、その全体において本明細書中で参照により組み込まれる米国特許第９，３７６，４８９号明細書で示されるものである。
【０１１４】
３．ＩＬ−１β抗体
開示される方法で使用される特に好ましいＩＬ−１β抗体又はその抗原−結合断片はヒト抗体である。
【０１１５】
参照を容易にするために、Ｋａｂａｔ定義及びＣｈｏｔｈｉａ定義に基づきｍＡｂ２と呼ばれる特異的ＩＬ−１β抗体の超可変領域並びにＶＬ及びＶＨドメイン及び完全な重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を以下の表２で提供する。
【０１１６】
【表２】
2020524991.tif 000003
【０１１７】
一実施形態において、ＩＬ−１β抗体又はその抗原−結合断片は、ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号２１を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号２２を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号２３を有する超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む少なくとも１つの免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。一実施形態において、ＩＬ−１β抗体又はその抗原−結合断片は、ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号２４を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号２５を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号２６を有する超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む少なくとも１つの免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。
【０１１８】
一実施形態において、ＩＬ−１β抗体又はその抗原−結合断片は、ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号３１を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号３２を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号３３を有する超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む少なくとも１つの免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。一実施形態において、ＩＬ−１β抗体又はその抗原−結合断片は、ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号３４を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号３５を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号３６を有する超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む少なくとも１つの免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。
【０１１９】
一実施形態において、ＩＬ−１β抗体又はその抗原−結合断片は、少なくとも１つの免疫グロブリンＶＨドメイン及び少なくとも１つの免疫グロブリンＶＬドメインを含み、ａ）免疫グロブリンＶＨドメインは、（例えば配列中で）：ｉ）ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号２１を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号２２を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号２３を有する、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３；又はｉｉ）ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号２４を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号２５を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号２６を有する、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み；ｂ）免疫グロブリンＶＬドメインは、（例えば配列中で）：ｉ）ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号３１を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号３２を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号３３を有する、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３又はｉｉ）ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号３４を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号３５を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号３６を有する、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む。
【０１２０】
一実施形態において、ＩＬ−１β抗体又はその抗原−結合断片は、：ａ）配列番号２７として示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；ｂ）配列番号３７として示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；ｃ）配列番号２７として示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリンＶＨドメイン及び配列番号３７として示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリンＶＬドメイン；ｄ）配列番号２１、配列番号２２及び配列番号２３として示される超可変領域を含む免疫グロブリンＶＨドメイン；ｅ）配列番号３１、配列番号３２及び配列番号３３として示される超可変領域を含む免疫グロブリンＶＬドメイン；ｆ）配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６として示される超可変領域を含む免疫グロブリンＶＨドメイン；ｇ）配列番号３４、配列番号３５及び配列番号３６として示される超可変領域を含む免疫グロブリンＶＬドメイン；ｈ）配列番号２１、配列番号２２及び配列番号２３として示される超可変領域を含む免疫グロブリンＶＨドメイン及び配列番号３１、配列番号３２及び配列番号３３として示される超可変領域を含む免疫グロブリンＶＬドメイン；ｉ）配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６として示される超可変領域を含む免疫グロブリンＶＨドメイン及び配列番号３４、配列番号３５及び配列番号３６として示される超可変領域を含む免疫グロブリンＶＬドメイン；ｊ）配列番号３７を含む軽鎖；ｋ）配列番号２９を含む重鎖；又はｌ）配列番号３９を含む軽鎖及び配列番号２９を含む重鎖を含む。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、ＩＬ−１β抗体又はその抗原−結合断片（例えばｍＡｂ２）は、配列番号３７の３個のＣＤＲを含む。他の実施形態において、ＩＬ−１β抗体又はその抗原−結合断片は、配列番号２７の３個のＣＤＲを含む。他の実施形態において、ＩＬ−１β抗体又はその抗原−結合断片は、配列番号３７の３個のＣＤＲ及び配列番号２７の３個のＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−１β抗体又はその抗原−結合断片は、配列番号３９の３個のＣＤＲを含む。他の実施形態において、ＩＬ−１β抗体又はその抗原−結合断片は、配列番号２９の３個のＣＤＲを含む。他の実施形態において、ＩＬ−１β抗体又はその抗原−結合断片は、配列番号３９の３個のＣＤＲ及び配列番号２９の３個のＣＤＲを含む。
【０１２２】
一実施形態において、ＩＬ−１β抗体又はその抗原−結合断片（例えばｍＡｂ２）は、少なくとも：ａ）ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号２１を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号２２を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号２３を有する超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を配列中に含む可変ドメイン及びヒト重鎖の定常部分又はその断片を含む免疫グロブリン重鎖又はその断片と、ｂ）ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号３１を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号３２を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号３３を有する超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を配列中に含む可変ドメイン及びヒト軽鎖の定常部分又はその断片を含む免疫グロブリン軽鎖又はその断片と、を含むヒトＩＬ−１β抗体から選択される。
【０１２３】
一実施形態において、ＩＬ−１β抗体又はその抗原−結合断片（例えばｍＡｂ２）は、少なくとも：ａ）ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号２４を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号２５を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号２６を有する超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を配列中に含む可変ドメイン及びヒト重鎖の定常部分又はその断片を含む免疫グロブリン重鎖又はその断片と、ｂ）ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号３４を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号３５を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号３６を有する超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を配列中に含む可変ドメイン及びヒト軽鎖の定常部分又はその断片を含む免疫グロブリン軽鎖又はその断片と、を含むヒトＩＬ−１β抗体から選択される。
【０１２４】
一実施形態において、ＩＬ−１β抗体又はその抗原−結合断片は、ａ）ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号２１を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号２２を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号２３を有する超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を配列中に含む第１のドメインと、ｂ）ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号３１を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号３２を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号３３を有する超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を配列中に含む第２のドメインと、ｃ）第１のドメインのＮ末端及び第２のドメインのＣ末端又は第１のドメインのＣ末端及び第２のドメインのＮ末端の何れかに結合するペプチドリンカーと、を含む抗原結合部位を含む、１本鎖抗体又はその抗原結合断片から選択される。
【０１２５】
一実施形態において、ＩＬ−１β抗体又はその抗原−結合断片（例えばｍＡｂ２）は、ａ）ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号２４を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号２５を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号２６を有する超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を配列中に含む第１のドメインと、ｂ）ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号３４を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号３５を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号３６を有する超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を配列中に含む第２のドメインと、ｃ）第１のドメインのＮ末端及び第２のドメインのＣ末端又は第１のドメインのＣ末端及び第２のドメインのＮ末端の何れかに結合するペプチドリンカーと、を含む抗原−結合部位を含む、１本鎖抗体又はそれらの抗原−結合断片から選択される。
【０１２６】
開示される方法で使用されるＩＬ−１β抗体のＶＨ若しくはＶＬドメイン又はその抗原−結合断片は、配列番号２７及び３７で示されるＶＨ又はＶＬドメインと実質的に同一であるＶＨ及び／又はＶＬドメインを有し得る。本明細書中で開示されるヒトＩＬ−１β抗体は、配列番号２９として示されるものと実質的に同一である重鎖及び／又は配列番号３９として示されるものと実質的に同一である軽鎖を含み得る。本明細書中で開示されるヒトＩＬ−１β抗体は、配列番号２９を含む重鎖及び配列番号３９を含む軽鎖を含み得る。本明細書中で開示されるヒトＩＬ−１β抗体は、：ａ）配列番号２７で示されるものと実質的に同一であるアミノ酸配列を有する可変ドメイン及びヒト重鎖の定常部分を含む１本の重鎖と、ｂ）配列番号３７で示されるものと実質的に同一であるアミノ酸配列を有する可変ドメイン及びヒト軽鎖の定常部分を含む１本の軽鎖と、を含み得る。
【０１２７】
開示される方法、キット及び治療計画での使用のための他の好ましいＩＬ−１βアンタゴニスト（例えば抗体）は、それらの全体において参照により本明細書中で組み込まれる米国特許第：７，４４６，１７５号明細書又は同第７，９９３，８７８号明細書又は同第８，２７３，３５０号明細書で示されるものである。
【０１２８】
４．Ｆｃ修飾
フレームワーク又はＣＤＲ領域内でなされる修飾に加えて、又はその代わりに、本発明の抗体は、Ｆｃ領域内に修飾を含むように、一般的には、血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合及び／又は抗原依存性の細胞毒性など、抗体の１つ以上の機能的特性を変化させるために操作され得る。さらに、本発明の抗体は、化学的に修飾され得る（例えば１つ以上の化学部分が抗体に連結され得る）か又はそのグリコシル化を変化させて、再び抗体の１つ以上の機能的特性を変化させるために修飾され得る。これらの実施形態のそれぞれを以下でさらに詳細に記載する。Ｆｃ領域における残基のナンバリングは、Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，１９６９  Ｍａｙ，６３（１）：７８−８５のＥＵナンバリングスキームのものである。
【０１２９】
一実施形態において、ヒンジ領域中のシステイン残基数が変更される、例えば増加するか又は減少するようにＣＨ１のヒンジ領域が修飾される。このアプローチは、Ｂｏｄｍｅｒらによる米国特許第５，６７７，４２５号明細書にさらに記載されている。例えば軽鎖及び重鎖の集合を促進するために、又は抗体の安定性を上下させるために、ＣＨ１のヒンジ領域中のシステイン残基数を変更する。
【０１３０】
別の実施形態において、抗体のＦｃヒンジ領域に対して突然変異を行い、抗体の生物学的半減期を短縮する。より具体的には、ネイティブＦｃ−ヒンジドメインＳｐＡ結合と比較して抗体のスタフィロコッカスプロテインＡ（ＳｐＡ）結合が損なわれるように、Ｆｃ−ヒンジ断片のＣＨ２−ＣＨ３ドメイン境界領域に１つ以上のアミノ酸突然変異が導入される。このアプローチは、Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．による米国特許第６，１６５，７４５号明細書にさらに詳細に記載される。
【０１３１】
別の実施形態において、本抗体は、その生物学的半減期を延長させるように修飾される。様々なアプローチが可能である。例えば、Ｗａｒｄに対する米国特許第６，２７７，３７５号明細書に記載のように次の突然変異の１つ以上：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆを導入し得る。あるいは、Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．による米国特許第５，８６９，０４６号明細書及び同第６，１２１，０２２号明細書に記載のように、生物学的半減期を延長させるために、ＣＨ１又はＣＬ領域内で抗体を改変して、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから取られるサルベージ受容体結合エピトープを含有させ得る。
【０１３２】
また他の実施形態において、抗体のエフェクター機能を変化させるために少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置き換えることによってＦｃ領域が改変される。例えば、エフェクターリガンドに対する抗体の親和性が変化するが、親抗体の抗原結合能を保持するように、１つ以上のアミノ酸を異なるアミノ酸残基で置き換え得る。親和性を変化させるエフェクターリガンドは、例えばＦｃ受容体又は補体のＣ１成分であり得る。このアプローチは、両方ともＷｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．による米国特許第５，６２４，８２１号明細書及び同第５，６４８，２６０号明細書でさらに詳細に記載されている。
【０１３３】
別の実施形態において、抗体のＣ１ｑ結合が変化する、及び／又は、補体依存性の細胞傷害性（ＣＤＣ）が低下するか若しくは消失するように、アミノ酸残基から選択される１つ以上のアミノ酸を異なるアミノ酸残基で置き換え得る。このアプローチは、Ｉｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．による米国特許第６，１９４，５５１号明細書でさらに詳細に記載されている。
【０１３４】
別の実施形態において、１つ以上のアミノ酸残基を変化させて、それにより補体への抗体の固定能を変化させる。このアプローチは、Ｂｏｄｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．による国際公開第９４／２９３５１号パンフレットでさらに記載されている。
【０１３５】
また別の実施形態において、抗体の抗体依存性細胞傷害性を媒介する能力を向上させるために及び／又は１つ以上のアミノ酸を修飾することによりＦｃγ受容体に対する抗体の親和性を向上させるためにＦｃ領域を修飾する。このアプローチはＰｒｅｓｔａによる国際公開第００／４２０７２号パンフレットでさらに記載されている。さらに、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ及びＦｃＲｎに対するヒトＩｇＧ１上の結合部位がマッピングされ、結合性が向上した変異体が記載されている（Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ，（２００１）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：６５９１−６６０４参照）。
【０１３６】
ある一定の実施形態において、ＩｇＧ１アイソタイプのＦｃドメインが使用される。いくつかの具体的な実施形態において、ＩｇＧ１  Ｆｃ断片の突然変異体、例えば抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を媒介する及び／又はＦｃγ受容体に結合する融合ポリペプチドの能力を低下させるか又は排除するサイレントＩｇＧ１  Ｆｃが使用される。アミノ酸位置２３４及び２３５でロイシン残基がアラニン残基により置き換えられるＩｇＧ１アイソタイプサイレント突然変異体の例は、Ｈｅｚａｒｅｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ（２００１）；７５（２４）：１２１６１−８に記載の通りである。
【０１３７】
ある一定の実施形態において、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの位置２９７でグリコシル化を防ぐ突然変異体である。例えば、Ｆｃドメインは、位置２９７でアスパラギン残基のアミノ酸置換を含有する。このようなアミノ酸置換の例は、グリシン又はアラニンによるＮ２９７の置き換えである。
【０１３８】
抗体のＦｃ領域での突然変異によってエフェクター機能の抑制が得られ得、これは当技術分野で記載されている：ＬＡＬＡ及びＮ２９７Ａ（Ｓｔｒｏｈｌ，Ｗ．，２００９，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．ｖｏｌ．２０（６）：６８５−６９１）；及びＤ２６５Ａ（Ｂａｕｄｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｊ．ｌｍｍｕｎｏｌ．１８１：６６６４−６９；Ｓｔｒｏｈｌ，Ｗ．上出）；及びＤＡＰＡ（Ｄ２６５Ａ及びＰ３２９Ａ）（Ｓｈｉｅｌｄｓ  ＲＬ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００１；２７６（９）：６５９１−６０４；米国特許出願公開第２０１５／０３２０８８０号明細書）。サイレントＦｃ  ＩｇＧ１抗体の例としては、ＩｇＧ１  Ｆｃアミノ酸配列においていわゆるＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ突然変異を含むＬＡＬＡ突然変異体が挙げられる。サイレントＩｇＧ１抗体の別の例はＤ２６５Ａ突然変異を含む。サイレントＩｇＧ１抗体の別の例は、ＩｇＧ１  Ｆｃアミノ酸配列に対してＤ２６５Ａ及びＰ３２９Ａ突然変異を含むいわゆるＤＡＰＡ突然変異体である。別のサイレントＩｇＧ１抗体はＮ２９７Ａ突然変異を含み、その結果、アグリコシル化／非グリコシル化抗体が生じる。エフェクター機能抑制をもたらすためのさらなるＦｃ突然変異は、その全体において参照により本明細書中に組み込まれる国際公開第２０１４／１４５８０６号パンフレット（例えば国際公開第２０１４／１４５８０６号パンフレットの図７）に記載されている。サイレントＩｇＧ１抗体の国際公開第２０１４／１４５８０６号パンフレットからの一例は、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ及びＳ２６７Ｋ突然変異及びＧ２３６の欠失（Ｇ２３６ｄｅｌ）を含む。サイレントＩｇＧ１抗体の国際公開第２０１４／１４５８０６号パンフレットからの別の例は、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ及びＬ２３５Ａ突然変異及びＧ２３６の欠失（Ｇ２３６ｄｅｌ）を含む。サイレントＩｇＧ１抗体の国際公開第２０１４／１４５８０６号パンフレットからの別の例は、Ｓ２６７Ｋ突然変異を含む。
【０１３９】
さらに別の実施形態において、抗体のグリコシル化が修飾される。例えば、アグリコシル化抗体（すなわち抗体がグリコシル化を欠く）が作製され得る。グリコシル化を改変して、例えば抗原に対する抗体の親和性を向上させ得る。このような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内でグリコシル化の１つ以上の部位を改変することによって遂行され得る。例えば、１つ以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位が排除され、それによりその部位のグリコシル化を削除する、１つ以上のアミノ酸置換がなされ得る。このようなアグリコシル化によって、抗原に対する抗体の親和性が向上し得る。このようなアプローチは、Ｃｏ  ｅｔ  ａｌ．による米国特許第５，７１４，３５０号明細書及び同第６，３５０，８６１号明細書でさらに詳細に記載される。
【０１４０】
さらに又はあるいは、フコシル残基の量が減少している低フコシル化抗体又はＧｌｃＮａｃ構造の二分化が増加している抗体など、グリコシル化のタイプが変化した抗体を作製し得る。このような改変グリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能を向上させることが明らかになっている。このような炭水化物修飾は、例えば改変グリコシル化機構を有する宿主細胞において抗体を発現させることにより遂行され得る。グリコシル化機構が改変された細胞は、当技術分野で記載され、本発明の組み換え抗体を発現させ、それによりグリコシル化が変化した抗体を産生させる宿主細胞として使用され得る。例えば、Ｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．による欧州特許第１，１７６，１９５号明細書は、ＦＵＴ８遺伝子が機能的に破壊された細胞系を記載しており、これはフコシルトランスフェラーゼをコードし、このような細胞系で発現される抗体は低フコシル化を示すようになる。したがって、一実施形態において、本発明の抗体は、例えばフコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子の発現が不十分である哺乳動物細胞系など、低フコシル化パターンを示す細胞系での組み換え発現により産生される。Ｐｒｅｓｔａによる国際公開第０３／０３５８３５号パンフレットは、変異体ＣＨＯ細胞系、Ａｓｎ（２９７）連結炭水化物にフコースを付着させる能力が低下し、その結果また、その宿主細胞で発現される抗体の低フコシル化が起こるＬｅｃｌ３細胞を記載する（Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，２００２  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０も参照）。Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．による国際公開第９９／５４３４２号パンフレットは、改変細胞系で発現される抗体が、抗体のＡＤＣＣ活性を上昇させる二分ＧｌｃＮａｃ構造の増加を呈するように、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ（例えばベータ（１，４）−ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現させるために改変された細胞系を記載する（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６−１８０も参照）。あるいは、哺乳動物様グリコシル化パターンのために改変され、グリコシル化パターンとしてフコースを欠く抗体を産生可能な酵母又は糸状菌において本発明の抗体を産生させ得る（例えば欧州特許第１２９７１７２Ｂ１号明細書を参照）。
【０１４１】
本発明により企図される本明細書中の抗体の別の修飾はペグ化である。例えば抗体の生物学的（例えば血清）半減期を延長させるために、抗体をペグ化し得る。抗体をペグ化するために、一般的には、１つ以上のＰＥＧ基が抗体又は抗体断片に連結されるようになる条件下でポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えばＰＥＧの反応性エステル又はアルデヒド誘導体と抗体又はその断片を反応させる。アシル化反応又はアルキル化反応によって、反応性ＰＥＧ分子（又は類似反応性水溶性ポリマー）を用いてＰＥＧ化を行い得る。本明細書中で使用される場合、「ポリエチレングリコール」という用語は、モノ（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−又はアリールオキシ−ポリエチレングリコール又はポリエチレングリコール−マレイミドなど、他のタンパク質を誘導体化するために使用されているＰＥＧの形態の何れも包含するものとする。ある一定の実施形態において、ペグ化しようとする抗体はアグリコシル化抗体である。タンパク質をペグ化するための方法は当技術分野で公知であり、本発明の抗体に適用され得る。例えば、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．による欧州特許第０１５４３１６号明細書及びＩｓｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．による欧州特許第０４０１３８４号明細書を参照。
【０１４２】
本発明により企図される抗体の別の修飾は、得られる分子の半減期を延長させるための、ヒト血清アルブミン又はそれらの断片などの血清タンパク質に対する本発明の抗体の少なくとも抗原−結合領域のコンジュゲート又はタンパク質融合である。このようなアプローチは例えばＢａｌｌａｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．欧州特許第０３２２０９４号明細書に記載されている。
【０１４３】
本発明により企図される抗体の別の修飾は、ヘテロ二量体性の二重特異性抗体の形成を増加させるための１つ以上の修飾である。例えば、その内容が、それらの全体において本明細書中に組み込まれる、欧州特許第１８７０４５９Ａ１号明細書；米国特許第５，５８２，９９６号明細書；米国特許第５，７３１，１６８号明細書；米国特許第５，９１０，５７３号明細書；米国特許第５，９３２，４４８号明細書；米国特許第６，８３３，４４１号明細書；米国特許第７，１８３，０７６号明細書；米国特許出願公開第２００６２０４４９３Ａ１号明細書；及び国際公開第２００９／０８９００４Ａ１号パンフレットで開示されるような、二重特異性抗体、例えばｂｂｍＡｂ、の２つの重鎖ドメインの二量体化を促進するために、当技術分野で利用可能な様々なアプローチを使用し得る。
【０１４４】
ノブ・イントゥー・ホール（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）を使用した二重特異性抗体の作製は、例えば国際公開第１９９６／０２７０１１号パンフレット、Ｒｉｄｇｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）及びＭｅｒｃｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）で開示される。
【０１４５】
（１）ノブ・イン・ホール（Ｋｎｏｂ−ｉｎ−Ｈｏｌｅ）（ＫＩＨ）
本発明の多特異性分子、例えば多特異性抗体又は抗体様分子は、定常ドメインの１つ以上に対する、例えばＣＨ３ドメインに対する、１つ以上の、例えば複数の突然変異を含み得る。一例において、本発明の多特異性分子は、抗体の重鎖定常ドメイン、例えばＣＨ２又はＣＨ３ドメインをそれぞれ含む２つのポリペプチドを含む。一例において、２つの重鎖定常ドメイン、例えば多特異性分子のＣＨ２又はＣＨ３ドメインは、２本の鎖間のヘテロ二量体性の会合を可能にする１つ以上の突然変異を含む。一態様において、１つ以上の突然変異は、多特異性、例えば、二重特異性の、抗体又は抗体様分子の２本の重鎖のＣＨ２ドメインにおいて配置される。一態様において、１つ以上の突然変異は、多特異性分子の少なくとも２つのポリペプチドのＣＨ３ドメイン上に配置される。一態様において、重鎖定常ドメインを含む多特異性分子の第１のポリペプチドに対する１つ以上の突然変異が「ノブ」を生成させ、重鎖定常ドメインを含む多特異性分子の第２のポリペプチドに対する１つ以上の突然変異は「ホール」を生成させ、重鎖定常ドメインを含む多特異性分子のポリペプチドのヘテロ二量体化は、「ノブ」を「ホール」と連結させる（例えば、相互作用、例えば第２のポリペプチドのＣＨ２ドメインと第１のポリペプチドのＣＨ２ドメインの相互作用又は第２のポリペプチドのＣＨ３ドメインと第１のポリペプチドのＣＨ３ドメインの相互作用）。その用語が本明細書中で使用される場合、「ノブ」は、重鎖定常ドメインを含む多特異性分子の第１のポリペプチドの境界面から突出する少なくとも１つのアミノ酸側鎖を指し、したがって、例えば、ヘテロ多量体を安定化し、それによりホモ多量体形成よりもヘテロ多量体形成に好都合となるように、重鎖定常ドメインを含む多特異性分子の第２のポリペプチドとの境界面で代償的な「ホール」に置くことが可能である。ノブは、元来の境界面に存在し得るか、又は合成により（例えば境界面をコードする核酸を変化させることにより）導入され得る。ノブの形成のための好ましい輸入残基は、一般に天然のアミノ酸残基であり、好ましくはアルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）及びトリプトファン（Ｗ）から選択される。最も好ましいのはトリプトファン及びチロシンである。好ましい実施形態において、隆起の形成のための元来の残基は、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、セリン、スレオニン又はバリンなど、小さい側鎖体積を有する。
【０１４６】
「ホール」は、重鎖定常ドメインを含む多特異性分子の第２のポリペプチドの境界面から後退させられ、したがって重鎖定常ドメインを含む多特異性分子の第１のポリペプチドの隣接する境界面上で対応するノブを受け入れる少なくとも１つのアミノ酸側鎖を指す。ホールは、元来の境界面に存在し得るか、又は合成により（例えば境界面をコードする核酸を変化させることにより）導入され得る。ホールの形成のための好ましい輸入残基は、通常、天然のアミノ酸残基であり、好ましくはアラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）及びバリン（Ｖ）から選択される。最も好ましいのは、セリン、アラニン又はスレオニンである。好ましい実施形態において、ホールの形成のための元来の残基は大きな側鎖体積を有し、例えばチロシン、アルギニン、フェニルアラニン又はトリプトファン等である。
【０１４７】
好ましい実施形態において、第１のＣＨ３ドメインは、「ノブ」又は「ホール」（上記の通り）の何れかを生成させるために、Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，１９６９  Ｍａｙ，６３（１）：７８−８５のＥＵナンバリングスキームに従う残基３６６、４０５又は４０７で突然変異が起こり、第１のＣＨ３ドメインとヘテロ二量体化する第２のＣＨ３ドメインは、Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，１９６９  Ｍａｙ，６３（１）：７８−８５のＥＵナンバリングスキームに従い、残基３６６が第１のＣＨ３ドメインにおいて突然変異している場合は残基４０７、残基４０５が第１のＣＨ３ドメインで突然変異している場合は残基３４９、又は残基４０７が第１のＣＨ３ドメインで突然変異している場合は残基３６６で突然変異が起こり、第１のＣＨ３ドメインの「ノブ」又は「ホール」と相補的な「ホール」又は「ノブ」を生成させる。
【０１４８】
別の好ましい実施形態において、第１のＣＨ３ドメインは、「ノブ」又は「ホール」（上記の通り）の何れかを生成させるために、Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，１９６９  Ｍａｙ，６３（１）：７８−８５のＥＵナンバリングスキームに従う残基３６６で突然変異しており、第１のＣＨ３ドメインとヘテロ二量体化する第２のＣＨ３ドメインは、第１のＣＨ３ドメインの「ノブ」又は「ホール」に相補的な「ホール」又は「ノブ」を生成させるために、Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，１９６９  Ｍａｙ，６３（１）：７８−８５のＥＵナンバリングスキームに従う残基３６６、３６８及び／又は４０７で突然変異している。一実施形態において、第１のＣＨ３ドメインに対する突然変異は位置３６６でチロシン（Ｙ）残基を導入する。一実施形態において、第１のＣＨ３に対する突然変異はＴ３６６Ｙである。一実施形態において、第１のＣＨ３ドメインに対する突然変異は位置３６６でトリプトファン（Ｗ）残基を導入する。一実施形態において、第１のＣＨ３に対する突然変異はＴ３６６Ｗである。実施形態において、位置３６６で突然変異した（例えばチロシン（Ｙ）又はトリプトファン（Ｗ）が位置３６６で導入され、例えば突然変異Ｔ３６６Ｙ又はＴ３６６Ｗを含む）第１のＣＨ３ドメインとヘテロ二量体化する第２のＣＨ３ドメインに対する突然変異は、Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，１９６９  Ｍａｙ，６３（１）：７８−８５のＥＵナンバリングスキームに従う、位置３６６の突然変異、位置３６８の突然変異及び位置４０７の突然変異を含む。実施形態において、位置３６６の突然変異はセリン（Ｓ）残基を導入し、位置３６８の突然変異はアラニン（Ａ）を導入し、位置４０７の突然変異はバリン（Ｖ）を導入する。実施形態において、突然変異はＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む。一実施形態において、多特異性分子の第１のＣＨ３ドメインは突然変異Ｔ３６６Ｙを含み、第１のＣＨ３ドメインとヘテロ二量体化する第２のＣＨ３ドメインは、突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含むか、又はその逆である。一実施形態において、多特異性分子の第１のＣＨ３ドメインは、突然変異Ｔ３６６Ｗを含み、第１のＣＨ３ドメインとヘテロ二量体化する第２のＣＨ３ドメインは、突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含むか、又はその逆である。
【０１４９】
さらなる立体的又は「歪んだ」（例えばノブ・イン・ホール（ｋｎｏｂ  ｉｎ  ｈｏｌｅ））突然変異は、その内容が、それらの全体において本明細書中に組み込まれる、国際公開第２０１４／１４５８０６（例えば国際公開第２０１４／１４５８０６号パンフレットの図３、図４及び図１２）、国際公開第２０１４／１１０６０１号パンフレット及び国際公開第２０１６／０８６１８６号パンフレット、国際公開第２０１６／０８６１８９号パンフレット、国際公開第２０１６／０８６１９６号パンフレット及び国際公開第２０１６／１８２７５１号パンフレットに記載されている。ＫＩＨ変異体の例は、Ｓ３６４Ｋ及びＥ３５７Ｑ突然変異を含む第２の定常鎖と対形成する、Ｌ３６８Ｄ及びＫ３７０Ｓ突然変異を含む第１の定常鎖を含む。
【０１５０】
本発明の多特異性分子の何れかでの使用に適切なさらなるノブ・イン・ホール（ｋｎｏｂ  ｉｎ  ｈｏｌｅ）突然変異対は、例えば、内容がそれらの全体において参照により本明細書によって組み込まれる、国際公開第１９９６／０２７０１１号パンフレット及びＭｅｒｃｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：６７７−６８１（１９９８）にさらに記載されている。
【０１５１】
本明細書中に記載の実施形態の何れかにおいて、ＣＨ３ドメインは、システイン残基の対を導入するためにさらに突然変異させ得る。理論により縛られるものではないが、ジスルフィド結合を形成可能なシステイン残基の対の導入が、ヘテロ二量体化した多特異性分子の安定性をもたらすと考えられる。実施形態において、第１のＣＨ３ドメインは、Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，１９６９  Ｍａｙ，６３（１）：７８−８５のＥＵナンバリングスキームに従う位置３５４でシステインを含み、第１のＣＨ３ドメインとヘテロ二量体化する第２のＣＨ３ドメインは、Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，１９６９  Ｍａｙ，６３（１）：７８−８５のＥＵナンバリングスキームに従う位置３４９でシステインを含む。実施形態において、多特異性分子の第１のＣＨ３ドメインは、位置３５４でシステイン（例えば突然変異Ｓ３５４Ｃを含む）及び位置３６６のチロシン（Ｙ）（例えば突然変異Ｔ３６６Ｙを含む）を含み、第１のＣＨ３ドメインとヘテロ二量体化する第２のＣＨ３ドメインは、位置３４９でシステイン（例えば突然変異Ｙ３４９Ｃを含む）、位置３６６でセリン（例えば突然変異Ｔ３６６Ｓを含む）、位置３６８でアラニン（例えば突然変異Ｌ３６８Ａを含む）及び位置４０７でバリン（例えば突然変異Ｙ４０７Ｖを含む）を含む。実施形態において、多特異性分子の第１のＣＨ３ドメインは、位置３５４でシステイン（例えば突然変異Ｓ３５４Ｃを含む）及び位置３６６でトリプトファン（Ｗ）（例えば突然変異Ｔ３６６Ｗを含む）を含み、第１のＣＨ３ドメインとヘテロ二量体化する第２のＣＨ３ドメインは、位置３４９でシステイン（例えば突然変異Ｙ３４９Ｃを含む）、位置３６６でセリン（例えば突然変異Ｔ３６６Ｓを含む）、位置３６８でアラニン（例えば突然変異Ｌ３６８Ａを含む）及び位置４０７でバリン（例えば突然変異Ｙ４０７Ｖを含む）を含む。
【０１５２】
（２）代替的なノブ及びホール：ＩｇＧヘテロ二量体化
一態様において、ＩｇＧ１抗体クラス由来であるＣＨ３ドメインにおいて１つ以上の突然変異を導入することによって、多特異性分子のポリペプチド鎖の（例えば半抗体の）ヘテロ二量体化を増加させる。一実施形態において、突然変異は、Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，１９６９  Ｍａｙ，６３（１）：７８−８５のＥＵナンバリングスキームに従う、第２のＣＨ３ドメイン中のＦ４０５Ｌ突然変異と対形成する１つのＣＨ３ドメインに対してＫ４０９Ｒ突然変異を含む。さらなる突然変異はまた、又はあるいは、Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，１９６９  Ｍａｙ，６３（１）：７８−８５のＥＵナンバリングスキームに従う位置３６６、３６８、３７０、３９９、４０５、４０７及び４０９であり得る。好ましくは、このような突然変異を含むポリペプチドのヘテロ二量体化は、２５−３７Ｃ、例えば２５Ｃ又は３７Ｃで、１〜１０、例えば１．５〜５、例えば５時間にわたる、例えば１０〜１００ｍＭ  ２−ＭＥＡ（例えば２５、５０又は１００ｍＭ  ２−ＭＥＡ）での還元条件下で達成される。
【０１５３】
当技術分野で周知である技術を使用して、本明細書中に記載のアミノ酸置き換えがＣＨ３ドメインに導入される。通常、重鎖をコードするＤＮＡは、Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈに記載の技術を使用して遺伝子操作される。オリゴヌクレオチド介在突然変異誘発は、２本のハイブリッド重鎖をコードするＤＮＡの置換変異体を調製するための好ましい方法である。この技術は、Ａｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）ＤＮＡ，２：１８３により記載のように当技術分野で周知である。
【０１５４】
例えば内容がそれらの全体において参照により本明細書によって組み込まれる国際公開第２００８／１１９３５３号パンフレット、国際公開第２０１１／１３１７４６号パンフレット及び国際公開第２０１３／０６０８６７号パンフレットにＩｇＧヘテロ二量体化ストラテジーが記載されている。
【０１５５】
本明細書中に記載の実施形態の何れかにおいて、システイン残基の対を導入するためにＣＨ３ドメインをさらに突然変異させ得る。理論により縛られるものではないが、ジスルフィド結合を形成可能なシステイン残基の対の導入がヘテロ二量体化多特異性分子に対して安定性をもたらすと考えられる。実施形態において、第１のＣＨ３ドメインは、Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，１９６９  Ｍａｙ，６３（１）：７８−８５のＥＵナンバリングスキームに従う位置３５４でシステインを含み、第１のＣＨ３ドメインとヘテロ二量体化する第２のＣＨ３ドメインは、Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，１９６９  Ｍａｙ，６３（１）：７８−８５のＥＵナンバリングスキームに従う位置３４９でシステインを含む。
【０１５６】
（３）極性架橋
一態様において、合理的な「極性架橋」に基づく突然変異を導入することにより多特異性分子のポリペプチド鎖の（例えば半抗体の）ヘテロ二量体化を増加させるが、これは、２本のポリペプチド鎖の結合境界面の残基が、ホモ二量体立体配置で異なる物理的特性の残基と同時に、ヘテロ二量体立体配置で同様の（又は相補的）物理的特性の残基と相互作用するようにすることである。特に、これらの突然変異は、ヘテロ二量体形成において、極性残基が極性残基と相互作用し、一方で疎水性残基が疎水性残基と相互作用するように設計される。対照的に、ホモ二量体形成において、極性残基が疎水性残基と相互作用するように残基を突然変異させる。ヘテロ二量体立体配置における都合がよい相互作用及びホモ二量体立体配置における都合が悪い相互作用が一緒に作用し、ＣＨ３ドメインが、ホモ二量体を形成させることよりもヘテロ二量体を形成し易いようにする。
【０１５７】
代表的な実施形態において、上記の突然変異は、Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，１９６９  Ｍａｙ，６３（１）：７８−８５のＥＵナンバリングスキームに従うアミノ酸ナンバリングでＣＨ３ドメインの残基３６４、３６８、３９９、４０５、４０９及び４１１の１つ以上の位置で生成される。
【０１５８】
一態様において、Ｓｅｒ３６４Ｌｅｕ、Ｔｈｒ３６６Ｖａｌ、Ｌｅｕ３６８Ｇｌｎ、Ａｓｐ３９９Ｌｙｓ、Ｐｈｅ４０５Ｓｅｒ、Ｌｙｓ４０９Ｐｈｅ及びＴｈｒ４１１Ｌｙｓからなる群から選択される１つ以上の突然変異が２つのＣＨ３ドメインのうち１つに導入される。（Ｓｅｒ３６４Ｌｅｕ：位置３６４のセリンの元来の残基がロイシンにより置き換えられ；Ｔｈｒ３６６Ｖａｌ：位置３６６のスレオニンの元来の残基がバリンにより置き換えられ；Ｌｅｕ３６８Ｇｌｎ：位置３６８のロイシンの元来の残基がグルタミンにより置き換えられ；Ａｓｐ３９９Ｌｙｓ：位置３９９の元来の残基アスパラギン酸がリジンにより置き換えられ；Ｐｈｅ４０５Ｓｅｒ：位置４０５の元来の残基フェニルアラニンがセリンにより置き換えられ；Ｌｙｓ４０９Ｐｈｅ：位置４０９の元来の残基リジンがフェニルアラニンにより置き換えられ；Ｔｈｒ４１１Ｌｙｓ：位置４１１のスレオニンの元来の残基がリジンにより置き換えられる）。
【０１５９】
別の態様において、Ｔｙｒ４０７Ｐｈｅ、Ｌｙｓ４０９Ｇｌｎ及びＴｈｒ４１１Ａｓｐ（Ｔｙｒ４０７Ｐｈｅ：位置４０７の元来の残基チロシンがフェニルアラニンにより置き換えられ；Ｌｙｓ４０９Ｇｌｕ：位置４０９の元来の残基リジンがグルタミン酸により置き換えられ；Ｔｈｒ４１１Ａｓｐ：位置４１１のスレオニンの元来の残基がアスパラギン酸により置き換えられる）からなる群から選択される１つ以上の突然変異とともに他のＣＨ３が導入され得る。
【０１６０】
さらなる態様において、１つのＣＨ３ドメインが、Ｓｅｒ３６４Ｌｅｕ、Ｔｈｒ３６６Ｖａｌ、Ｌｅｕ３６８Ｇｌｎ、Ａｓｐ３９９Ｌｙｓ、Ｐｈｅ４０５Ｓｅｒ、Ｌｙｓ４０９Ｐｈｅ及びＴｈｒ４１１Ｌｙからなる群から選択される１つ以上の突然変異を有し、一方で他のＣＨ３ドメインが、Ｔｙｒ４０７Ｐｈｅ、Ｌｙｓ４０９Ｇｌｎ及びＴｈｒ４１１Ａｓｐからなる群から選択される１つ以上の突然変異を有する。
【０１６１】
代表的な一実施形態において、１つのＣＨ３ドメインの位置３６６のスレオニンの元来の残基がバリンにより置き換えられ、一方で他のＣＨ３ドメインの位置４０７のチロシンの元来の残基がフェニルアラニンにより置き換えられる。
【０１６２】
別の代表的な実施形態において、１つのＣＨ３ドメインの位置３６４のセリンの元来の残基がロイシンにより置き換えられ、一方で同じＣＨ３ドメインの位置３６８のロイシンの元来の残基がグルタミンにより置き換えられる。
【０１６３】
また別の代表的な実施形態において、１つのＣＨ３ドメインの位置４０５のフェニルアラニンの元来の残基がセリンにより置き換えられ、このＣＨ３ドメインの位置４０９のリジンの元来の残基がフェニルアラニンにより置き換えられ、一方で他のＣＨ３ドメインの位置４０９のリジンの元来の残基がグルタミンにより置き換えられる。
【０１６４】
また別の代表的な実施形態において、１つのＣＨ３ドメインの位置３９９のアスパラギン酸の元来の残基がリジンにより置き換えられ、同じＣＨ３ドメインの位置４１１のスレオニンの元来の残基がリジンにより置き換えられ、一方で他のＣＨ３ドメインの位置４１１のスレオニンの元来の残基がアスパラギン酸により置き換えられる。
【０１６５】
当技術分野で周知である技術を使用して、本明細書中に記載のアミノ酸置き換えをＣＨ３ドメインに導入する。通常、Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈに記載の技術を使用して、重鎖をコードするＤＮＡが遺伝子操作される。オリゴヌクレオチド介在性突然変異誘発は、２本のハイブリッド重鎖をコードするＤＮＡの置換変異体を調製するために好ましい方法である。この技術は、Ａｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）ＤＮＡ，２：１８３により記載のように当技術分野で周知である。
【０１６６】
極性架橋ストラテジーは、例えば内容がそれらの全体において参照により本明細書によって組み込まれる国際公開第２００６／１０６９０５号パンフレット、国際公開第２００９／０８９００４号パンフレット及びＫ．Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８５：１９６３７−１９６４６に記載されている。
【０１６７】
さらなる極性架橋突然変異は、例えばその内容が、それらの全体において本明細書中に組み込まれる、国際公開第２０１４／１４５８０６号パンフレット（例えば国際公開第２０１４／１４５８０６号パンフレットの図６）、国際公開第２０１４／１１０６０１号パンフレット及び国際公開第２０１６／０８６１８６号パンフレット、国際公開第２０１６／０８６１８９号パンフレット、国際公開第２０１６／０８６１９６号パンフレット及び国際公開第２０１６／１８２７５１号パンフレットに記載される。極性架橋変異体の例は、Ｎ２０８Ｄ、Ｑ２９５Ｅ、Ｎ３８４Ｄ、Ｑ４１８Ｅ及びＮ４２１Ｄ突然変異を含む定常鎖を含む。
【０１６８】
本明細書中に記載の実施形態の何れかにおいて、システイン残基の対を導入するためにＣＨ３ドメインをさらに突然変異させ得る。理論により縛られるものではないが、ジスルフィド結合を形成可能なシステイン残基の対の導入が、ヘテロ二量体化した多特異性分子に安定性をもたらすと考えられる。実施形態において、第１のＣＨ３ドメインは、Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，１９６９  Ｍａｙ，６３（１）：７８−８５のＥＵナンバリングスキームに従う位置３５４でシステインを含み、第１のＣＨ３ドメインとヘテロ二量体化する第２のＣＨ３ドメインは、Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，１９６９  Ｍａｙ，６３（１）：７８−８５のＥＵナンバリングスキームに従う位置３４９でシステインを含む。
【０１６９】
ヘテロ二量体化を促進するためのさらなるストラテジーは、例えばそれぞれの内容全体がその全体において参照により本明細書によって組み込まれる、国際公開第２０１６／１０５４５０号パンフレット、国際公開第２０１６／０８６１８６号パンフレット、国際公開第２０１６／０８６１８９号パンフレット、国際公開第２０１６／０８６１９６号パンフレット、国際公開第２０１６／１４１３７８号パンフレット及び国際公開第２０１４／１４５８０６号パンフレット及び国際公開第２０１４／１１０６０１号パンフレットに記載されている。このストラテジーの何れも本明細書中に記載の多特異性分子において使用され得る。
【０１７０】
実施形態において、例えばｂｂｍＡｂなど、本明細書中で論じられる修飾の２つ以上を単一の二重特異性抗体で組み合わせる。
【実施例】
【０１７１】
５．実施例１：ｂｂｍＡｂ  ｂｂｍＡｂ１の作製
例として、本発明を当業者が実施できるようにするために、具体的なｂｂｍＡｂの作製を以下に記載する。
【０１７２】
得られるｂｂｍＡｂ、ｂｂｍＡｂ１は、ＬＡＬＡサイレンシング突然変異を有する二重特異性ＩｇＧ１であり、２つの別個の標的、ＩＬ−１β及びＩＬ−１８に同時に結合する。本抗体は２つの別個の抗原結合アーム（Ｆａｂ断片）を組み合わせ、一方でＩＬ−１βに対するＦａｂはｍＡｂ２に基づき、カッパ軽鎖（Ｖｋ６）を含有する。ＩＬ−１８に対するＦａｂはｍＡｂ１に基づき、ラムダ軽鎖（Ｖλ１）から構成される。発現中のＦｃドメインのヘテロ二量体化を推進するために、ｍＡｂ１重鎖中の嵩張るアミノ酸（ａａ）側鎖（Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ）を有する「ノブ」及び小さなａａ側鎖（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ）を有する「ホール」をｍＡｂ２重鎖において導入した。
【０１７３】
参照を容易にするために、Ｋａｂａｔ定義及びＣｈｏｔｈｉａ定義に基づくｂｂｍＡｂ１の超可変領域並びにＶＬ及びＶＨドメイン及び完全重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を以下の表３で提供する。
【０１７４】
【表３】
2020524991.tif 000004
【０１７５】
【表４】
2020524991.tif 000005
【０１７６】
一実施形態において、ＩＬ−１８／ＩＬ−１β二重特異性抗体は、ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号７６を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号７７を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号７８を有する超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）を含む。一実施形態において、ＩＬ−１８／ＩＬ−１β二重特異性抗体は、ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号７９を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号８０を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号８１を有する超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）を含む。一実施形態において、ＩＬ−１８／ＩＬ−１β二重特異性抗体は、ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号８２を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号８３を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号８４を有する超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）を含む。
【０１７７】
一実施形態において、ＩＬ−１８／ＩＬ−１β二重特異性抗体は、ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号４４を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号４５を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号４６を有する超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）を含む。一実施形態において、ＩＬ−１８／ＩＬ−１β二重特異性抗体は、ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号４７を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号４８を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号４９を有する超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）を含む。一実施形態において、ＩＬ−１８／ＩＬ−１β二重特異性抗体は、ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号５０を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号５１を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号５２を有する超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）を含む。
【０１７８】
一実施形態において、ＩＬ−１８／ＩＬ−１β二重特異性抗体は、ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号９２を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号９３を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号９４を有する超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）を含む。一実施形態において、ＩＬ−１８／ＩＬ−１β二重特異性抗体は、ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号９５を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号９６を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号９７を有する超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）を含む。一実施形態において、ＩＬ−１８／ＩＬ−１β二重特異性抗体は、ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号９８を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号９９を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号１００を有する超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）を含む。
【０１７９】
一実施形態において、ＩＬ−１８／ＩＬ−１β二重特異性抗体は、ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号６０を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号６１を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号６２を有する超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）を含む。一実施形態において、ＩＬ−１８／ＩＬ−１β二重特異性抗体は、ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号６３を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号６４を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号６５を有する超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）を含む。一実施形態において、ＩＬ−１８／ＩＬ−１β二重特異性抗体は、ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号６６を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号６７を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号６８を有する超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）を含む。
【０１８０】
一実施形態において、ＩＬ−１８／ＩＬ−１β二重特異性抗体は、第１の免疫グロブリンＶＨ１ドメイン及び第１の免疫グロブリンＶＬ１ドメインを含み、ここで：ａ）第１の免疫グロブリンＶＨ１ドメインは、（例えば配列中で）：ｉ）ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号７６を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号７７を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号７８を有する、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３；又はｉｉ）ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号７９を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号８０を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号８１を有する、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３；又はｉｉｉ）ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号８２を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号８３を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号８４を有する、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、ｂ）第１の免疫グロブリンＶＬ１ドメインは、（例えば配列中で）：ｉ）ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号９２を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号９３を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号９４を有する、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３又はｉｉ）ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号９５を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号９６を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号９７を有する、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３又はｉｉｉ）ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号９８を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号９９を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号１００を有する、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む。
【０１８１】
一実施形態において、ＩＬ−１８／ＩＬ−１β二重特異性抗体は、第２の免疫グロブリンＶＨ２ドメイン及び第２の免疫グロブリンＶＬ２ドメインを含み、ここで：ａ）第２の免疫グロブリンＶＨ２ドメインは、（例えば配列中で）：ｉ）ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号４４を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号４５を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号４６を有する、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３；又はｉｉ）ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号４７を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号４８を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号４９を有する、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３；又はｉｉｉ）ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号５０を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号５１を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号５２を有する、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、ｂ）第２の免疫グロブリンＶＬ２ドメインは、（例えば配列中で）：ｉ）ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号６０を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号６１を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号６２を有する、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３又はｉｉ）ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号６３を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号６４を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号６５を有する、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３又はｉｉｉ）ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号６６を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号６７を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号６８を有する、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む。
【０１８２】
一実施形態において、ＩＬ−１８／ＩＬ−１β二重特異性抗体は、ａ）配列番号８５として示されるアミノ酸配列を含む第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）；ｂ）配列番号１０１として示されるアミノ酸配列を含む第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）；ｃ）配列番号８５として示されるアミノ酸配列を含む第１の免疫グロブリンＶＨ１ドメイン及び配列番号１０１として示されるアミノ酸配列を含む第１の免疫グロブリンＶＬ１ドメイン；ｄ）配列番号７６、配列番号７７及び配列番号７８として示される超可変領域を含む第１の免疫グロブリンＶＨ１ドメイン；ｅ）配列番号９２、配列番号９３及び配列番号９４として示される超可変領域を含む第１の免疫グロブリンＶＬ１ドメイン；ｆ）配列番号７９、配列番号８０及び配列番号８１として示される超可変領域を含む第１の免疫グロブリンＶＨ１ドメイン；ｇ）配列番号９５、配列番号９６及び配列番号９７として示される超可変領域を含む第１の免疫グロブリンＶＬ１ドメイン；ｈ）配列番号７６、配列番号７７及び配列番号７８として示される超可変領域を含む第１の免疫グロブリンＶＨ１ドメイン及び配列番号９２、配列番号９３及び配列番号９４として示される超可変領域を含む第１の免疫グロブリンＶＬ１ドメイン；ｉ）配列番号７９、配列番号８０及び配列番号８１として示される超可変領域を含む第１の免疫グロブリンＶＨ１ドメイン及び配列番号９５、配列番号９６及び配列番号９７で示される超可変領域を含む第１の免疫グロブリンＶＬ１ドメイン；ｊ）配列番号１０３を含む第１の軽鎖；ｋ）配列番号８７を含む第１の重鎖；又はｌ）配列番号１０３を含む第１の軽鎖及び配列番号８７を含む第１の重鎖を含む。
【０１８３】
一実施形態において、ＩＬ−１８／ＩＬ−１β二重特異性抗体は、ａ）配列番号５３として示されるアミノ酸配列を含む第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）；ｂ）配列番号６９として示されるアミノ酸配列を含む第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）；ｃ）配列番号５３として示されるアミノ酸配列を含む第２の免疫グロブリンＶＨ２ドメイン及び配列番号６９として示されるアミノ酸配列を含む第２の免疫グロブリンＶＬ２ドメイン；ｄ）配列番号４４、配列番号４５及び配列番号４６として示される超可変領域を含む第２の免疫グロブリンＶＨ２ドメイン；ｅ）配列番号６０、配列番号６１及び配列番号６２として示される超可変領域を含む第２の免疫グロブリンＶＬ２ドメイン；ｆ）配列番号４７、配列番号４８及び配列番号４９として示される超可変領域を含む第２の免疫グロブリンＶＨ２ドメイン；ｇ）配列番号６３、配列番号６４及び配列番号６５として示される超可変領域を含む第２の免疫グロブリンＶＬ２ドメイン；ｈ）配列番号４４、配列番号４５及び配列番号４６として示される超可変領域を含む第２の免疫グロブリンＶＨ２ドメイン及び配列番号６０、配列番号６１及び配列番号６２として示される超可変領域を含む第２の免疫グロブリンＶＬ２ドメイン；ｉ）配列番号４７、配列番号４８及び配列番号４９として示される超可変領域を含む第２の免疫グロブリンＶＨ２ドメイン及び配列番号６３、配列番号６４及び配列番号６５として示される超可変領域を含む第２の免疫グロブリンＶＬ２ドメイン；ｊ）配列番号８１を含む第２の軽鎖；ｋ）配列番号５５を含む第２の重鎖；又はｌ）配列番号８１を含む第２の軽鎖及び配列番号５５を含む第２の重鎖を含む。
【０１８４】
いくつかの実施形態において、ＩＬ−１８／ＩＬ−１β二重特異性抗体は配列番号５３の３個のＣＤＲを含む。他の実施形態において、ＩＬ−１８／ＩＬ−１β二重特異性抗体は、配列番号６９の３個のＣＤＲを含む。他の実施形態において、ＩＬ−１８／ＩＬ−１β二重特異性抗体は配列番号５３の３個のＣＤＲ及び配列番号６９の３個のＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−１８／ＩＬ−１β二重特異性抗体は、配列番号８５の３個のＣＤＲを含む。他の実施形態において、ＩＬ−１８／ＩＬ−１β二重特異性抗体は配列番号１０１の３個のＣＤＲを含む。他の実施形態において、ＩＬ−１８／ＩＬ−１β二重特異性抗体は、配列番号８５の３個のＣＤＲ及び配列番号１０１の３個のＣＤＲを含む。
【０１８５】
いくつかの実施形態において、ＩＬ−１８／ＩＬ−１β二重特異性抗体は配列番号８５の３個のＣＤＲを含む。他の実施形態において、ＩＬ−１８／ＩＬ−１β二重特異性抗体は配列番号１０１の３個のＣＤＲを含む。他の実施形態において、ＩＬ−１８／ＩＬ−１β二重特異性抗体は、配列番号８５の３個のＣＤＲ及び配列番号１０１の３個のＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−１８／ＩＬ−１β二重特異性抗体は配列番号５３の３個のＣＤＲを含む。他の実施形態において、ＩＬ−１８／ＩＬ−１β二重特異性抗体は、配列番号６９の３個のＣＤＲを含む。他の実施形態において、ＩＬ−１８／ＩＬ−１β二重特異性抗体は配列番号５３の３個のＣＤＲ及び配列番号６９の３個のＣＤＲを含む。一実施形態において、Ｌ−１８／ＩＬ−１β二重特異性抗体は、配列番号８５の３個のＣＤＲ、配列番号１０１の３個のＣＤＲ、配列番号５３の３個のＣＤＲ及び配列番号６９の３個のＣＤＲを含む。
【０１８６】
一実施形態において、ＩＬ−１８／ＩＬ−１β二重特異性抗体の第１の部分は、少なくとも：ａ）ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号７６を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号７７を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号７８を有する超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を配列中に含む可変ドメイン及びヒト重鎖の定常部分又はその断片を含む免疫グロブリン重鎖又はその断片と、ｂ）ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号９２を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号９３を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号９４を有する超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を配列中に含む可変ドメイン及びヒト軽鎖の定常部分又はその断片を含む免疫グロブリン軽鎖又はその断片と、を含むヒトＩＬ−１８抗体から選択される。さらに、ＩＬ−１８／ＩＬ−１β二重特異性抗体の第２の部分は、少なくとも：ａ）ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号４４を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号４５を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号４６を有する超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を配列中に含む可変ドメイン及びヒト重鎖の定常部分又はその断片を含む免疫グロブリン重鎖又はその断片と、ｂ）ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号６０を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号６１を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号６２を有する超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を配列中に含む可変ドメイン及びヒト軽鎖の定常部分又はその断片を含む免疫グロブリン軽鎖又はその断片と、を含むヒトＩＬ−１β抗体から選択される。
【０１８７】
一実施形態において、ＩＬ−１８／ＩＬ−１β二重特異性抗体の第１の部分は、少なくとも：ａ）ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号７６を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号７７を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号７８を有する超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を配列中に含む可変ドメイン及びヒト重鎖の定常部分又はその断片を含む免疫グロブリン重鎖又はその断片と、ｂ）ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号９２を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号９３を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号９４を有する超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を配列中に含む可変ドメイン及びヒト軽鎖の定常部分又はその断片を含む免疫グロブリン軽鎖又はその断片と、を含むヒトＩＬ−１８抗体から選択される。さらに、ＩＬ−１８／ＩＬ−１β二重特異性抗体の第２の部分は、少なくとも：ａ）ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号４４を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号４５を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号４６を有する超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を配列中に含む可変ドメイン及びヒト重鎖の定常部分又はその断片を含む免疫グロブリン重鎖又はその断片と、ｂ）ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号６０を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号６１を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号６２を有する超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を配列中に含む可変ドメイン及びヒト軽鎖の定常部分又はその断片を含む免疫グロブリン軽鎖又はその断片と、を含むヒトＩＬ−１β抗体から選択される。
【０１８８】
開示される方法で使用されるＩＬ−１８／ＩＬ−１β二重特異性抗体の第１のＶＨ１又はＶＬ１ドメインは、配列番号８５及び１０１で示されるＶＨ又はＶＬドメインと実質的に同一である第１のＶＨ１及び／又は第１のＶＬ１ドメインを有し得る。本明細書中で開示されるＩＬ−１８／ＩＬ−１β二重特異性抗体は、配列番号８７として示されるものと実質的に同一である第１の重鎖及び／又は配列番号１０３として示されるものと実質的に同一である第１の軽鎖を含み得る。本明細書中で開示されるＩＬ−１８／ＩＬ−１β二重特異性抗体は、配列番号８７を含む第１の重鎖及び配列番号１０３を含む第１の軽鎖を含み得る。本明細書中で開示されるＩＬ−１８／ＩＬ−１β二重特異性抗体は、：ａ）配列番号８５で示されるものと実質的に同一であるアミノ酸配列を有する可変ドメイン及びヘテロ二量体化修飾を有するヒト重鎖の定常部分を含む第１の重鎖と、ｂ）配列番号１０１で示されるものと実質的に同一であるアミノ酸配列を有する可変ドメイン及びヒト軽鎖の定常部分を含む第１の軽鎖と、を含み得る。ヒト重鎖の定常部分はＩｇＧ１であり得る。一実施形態において、ＩｇＧ１は、エフェクター突然変異がないヒトＩｇＧ１である。一実施形態において、ヒト重鎖ＩｇＧ１は、サイレンシング突然変異Ｎ２９７Ａ、Ｄ２６５Ａ又はＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａの組み合わせを含む。ある具体的な実施形態において、ヒト重鎖ＩｇＧ１は、配列番号８７によるＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａの組み合わせであるサイレンシング突然変異を含む。
【０１８９】
開示される方法で使用されるＩＬ−１８／ＩＬ−１β二重特異性抗体の第２のＶＨ２又はＶＬ２ドメインは、配列番号５３及び６９で示されるＶＨ又はＶＬドメインと実質的に同一である第２のＶＨ２及び／又は第１のＶＬ２ドメインを有し得る。本明細書中で開示されるＩＬ−１８／ＩＬ−１β二重特異性抗体は、配列番号５５として示されるものと実質的に同一である第２の重鎖及び／又は配列番号７１として示されるものと実質的に同一である第２の軽鎖を含み得る。本明細書中で開示されるＩＬ−１８／ＩＬ−１β二重特異性抗体は、配列番号５３を含む第２の重鎖及び配列番号６９を含む第２の軽鎖を含み得る。本明細書中で開示されるＩＬ−１８／ＩＬ−１β二重特異性抗体は、ａ）配列番号５３で示されるものと実質的に同一であるアミノ酸配列を有する可変ドメイン及び第１の重鎖のヘテロ二量体化と相補的であるヘテロ二量体化修飾を有するヒト重鎖の定常部分を含む第２の重鎖と、ｂ）配列番号６９で示されるものと実質的に同一であるアミノ酸配列を有する可変ドメイン及びヒト軽鎖の定常部分を含む第２の軽鎖と、を含み得る。ヒト重鎖の定常部分はＩｇＧ１であり得る。一実施形態において、ＩｇＧ１は、エフェクター突然変異がないヒトＩｇＧ１である。一実施形態において、ヒト重鎖ＩｇＧ１は、サイレンシング突然変異Ｎ２９７Ａ、Ｄ２６５Ａ又はＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａの組み合わせを含む。ある具体的な実施形態において、ヒト重鎖ＩｇＧ１は、配列番号５５による、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａの組み合わせであるサイレンシング突然変異を含む。
【０１９０】
開示される方法、キット及び投与計画において二重特異性抗体の第１の部分としての使用のための他の好ましいＩＬ−１８アンタゴニスト（例えば抗体）は、その全体において本明細書中で参照により組み込まれる米国特許第９，３７６，４８９号明細書で示されるものである。
【０１９１】
開示される方法、キット及び投与計画において二重特異性の第２の部分としての使用のための他の好ましいＩＬ−１βアンタゴニスト（例えば抗体）は、その全体において本明細書中で参照により組み込まれる米国特許第７，４４６，１７５号明細書又は同第７，９９３，８７８号明細書又は同第８，２７３，３５０号明細書で示されるものである。
【０１９２】
（１）ベクター設計
次の設定に従い、２つのベクター、ベクターＡ及びベクターＢを作製した。抗体部分ｍＡｂ１（抗ＩＬ１８  ＩｇＧ１）に対して、ベクターＡを設計した。ノブ構造を作製し、Ｃｙｓ−架橋を可能にするために、２つの点突然変異、配列番号８７の位置３６６で見られるようなＴからＷ及び配列番号８７の位置３５４で見られるようなＳからＣにより重鎖１の定常領域を修飾した。さらに、ＦＣエフェクター機能の部分的抑制のために、点突然変異、配列番号８７の位置２３４で見られるようなＬからＡ及び配列番号８７の位置２３５で見られるようなＬからＡにより重鎖１の定常領域を修飾した（いわゆるＬＡＬＡ）。抗体は、可変軽鎖領域を有し、これはラムダ１型、Ｖλ１のものである。
【０１９３】
抗体部分ｍＡｂ２（抗ＩＬ−１β  ＩｇＧ１）に対してベクターＢを設計した。ホール構造を作製し、さらなるＣｙｓ架橋を形成させるために、４つの点突然変異、配列番号５５の位置３６６で見られるようなＴからＳ、配列番号５５の位置３６８で見られるようなＬからＡ、配列番号５５の位置４０７で見られるようなＹからＶ及び配列番号５５の位置３４９で見られるようなＹからＣにより、重鎖２の定常領域を修飾した。ホール構造はノブ構造と相互作用し、二重特異性抗体の生成を促進する。さらに、ＦＣエフェクター機能の抑制のために、２つのＬＡＬＡ突然変異、配列番号５５の位置２３４で見られるようなＬからＡ、配列番号５５の位置２３５で見られるようなＬからＡで重鎖２の定常領域を修飾した。抗体は可変軽鎖領域を有し、これはカッパ６型、Ｖκ６のものである。
【０１９４】
ベクターＡ及びＢは、それぞれＤＨＦＲ及びネオマイシン選択マーカー並びにＦＯＬＲ及びハイグロマイシン選択マーカーの組み合わせを保有する。葉酸はプリン及びメチオニン合成に必須のビタミンであり、培地から哺乳動物細胞により取り込まれる必要がある。発現プラスミドＡ上に存在する「葉酸受容体」（ＦｏｌＲ）は、葉酸に対する親和性が改変された突然変異体ＦｏｌＲであり、培地から哺乳動物細胞への葉酸の輸送を促進する。高親和性葉酸受容体が培養ＣＨＯ細胞では弱くしか発現されないことを考慮すると、組み換えＦｏｌＲを発現する細胞は低葉酸条件（５０ｎＭ）下で明確な増殖面での長所を有する。ＦｏｌＲ選択マーカーはベクターＢでコードされた。
【０１９５】
ＦｏｌＲに加えて、「ジヒドロ葉酸レダクターゼ」（ＤＨＦＲ）は、選択マーカーとしてベクターＡ上に存在する。ＤＨＦＲは、葉酸をプリン及びメチオニン合成の重要な前駆体に変換させる。ＭＴＸは葉酸の化学的類似体である。これはＤＨＦＲ上のフリーの結合部位に対して競合し、それにより酵素を遮断する。外因性ＤＨＦＲを過剰発現する細胞は、ＭＴＸ濃度上昇に対処し得、ＭＴＸが補給された培地中で増殖する明確な選択的長所を細胞に与える。ＦｏｌＲ及びＤＨＦＲ選択の組み合わせは、当業者にとって周知であり、例えばその全体において参照により本明細書中で組み込まれる特許文書、国際公開第２０１０／０９７２４０Ａ１号パンフレット中で開示されている。ＭＴＸは、当業者にとって周知であり、例えばその全体において参照により本明細書中で組み込まれる特許文書、国際公開第２０１０／０９７２３９Ａ１号パンフレットで開示される。発現ベクターは、当業者にとって周知であり、例えばその全体において参照により本明細書中で組み込まれる特許文書、国際公開第２００９／０８０７２０Ａ１号パンフレットで開示される。
【０１９６】
２つのベクターの図式的概観は図１で見られる。
【０１９７】
（２）宿主細胞系及び遺伝子移入
ｂｂｍＡｂ１発現細胞系の作製のために宿主細胞系として親ＣＨＯ細胞系を使用した。例えば両者ともその全体において参照により本明細書中で組み込まれる特許出願、国際公開第２０１５０９２７３７号パンフレット及び国際公開第２０１５０９２７３５号パンフレットに記載のように、宿主細胞系は当業者にとって周知のＣＨＯ−Ｋ１細胞系由来である。
【０１９８】
ｂｂｍＡｂ１組み換え細胞系を調製するために、ＣＨＯ株由来の１本のバイアルを使用した。化学的に定義された培地中でＣＨＯ株を調製した。
【０１９９】
化学的に定義された培地中で細胞を増殖させた。
【０２００】
１μｇのＳｗａＩで直線化したプラスミドＤＮＡ、ｂｂｍＡｂをコードする発現ベクターＡ及びＢを遺伝子移入ごとに添加した。化学的に定義された培地中で遺伝子移入反応を行った。
【０２０１】
製造者の説明書に従い、ＡＭＡＸＡ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒを使用して、エレクトロポレーションによって遺伝子移入を行った。遺伝子移入のために使用した親ＣＨＯ細胞は、９５％より高い細胞生存率で対数増殖期にあった。全部で、遺伝子移入あたり５ｘ１０６個の細胞で３回の遺伝子移入を行った。遺伝子移入直後に、化学的に定義された培地を含有する振盪フラスコに細胞を移した。
【０２０２】
選択工程の開始前に、細胞プールを３６．５℃及び１０％ＣＯ２で４８時間温置した。
【０２０３】
（３）細胞選択及びソーティング
上記の通り、個々の発現ベクターＡ及びＢによりコードされる選択マーカーを使用して選択手順を行った。両タンパク質（ＦｏｌＲ及びＤＨＦＲ）は同じ分子経路で関与しており；ＦｏｌＲは葉酸並びに葉酸類似体ＭＴＸを細胞へ輸送しており、ＤＨＦＲはそれをプリン及びメチオニン合成に対する重要な前駆体へと変換する。選択的原理としてそれらを組み合わせて、両組み換えタンパク質を発現する組み換え細胞を濃縮するために特定の強力な選択形態を採用し得る。
【０２０４】
遺伝子移入及び低葉酸条件下での増殖から４８時間後、化学的に定義される培地に１０ｎＭ  ＭＴＸを添加することによって、さらなる選択圧をかけた。ＭＴＸ選択開始から２２日後、主にＭＴＸ耐性細胞からなるプール集団が出現した。プール回収後、細胞を凍結し、細胞ペレットを調製した。ｂｂｍＡｂの濃度決定のために、化学的に定義される培地中の標準的なバッチを設定した。
【０２０５】
完全な全ての種類の生成物及びＦｃ部分を保有する関連する不純物を調べるために、プロテインＡ  ＨＰＬＣ法を使用し、一方で個々の分画の分布に関してフィンガープリントを得るために、逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）を使用し−個々のピークをＭＳ法により割り当てた。
【０２０６】
ＦＡＣＳクローニング手順のためにｂｂｍＡｂ１を産生するＣＨＯ細胞プールを使用して、全てのさらなる評価用の出発物質として個別化したクローン細胞系を得た。ＦＡＣＳ分析を使用する細胞選択は、例えばその全体において参照により本明細書中で組み込まれる、米国特許出願公開第２０１１０２８１７５１号明細書に記載されている。
【０２０７】
蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）によってｂｂｍＡｂ１を発現する個々のクローンＣＨＯ細胞系を作製した。ＦＡＣＳソーティングを可能にするために、ＦＩＴＣ−標識抗ＩｇＧ１  Ｆａｂとともに３０分間細胞を温置し、当業者にとって周知の工程であるＦＡＣＳ支援単一細胞ソーティングを使用する前にＰＢＳ中で２回洗浄した。
【０２０８】
ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａソフトウェアを用い、Ａｕｔｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ  Ｕｎｉｔ（ＡＣＤＵ）を備えたＦＡＣＳ  Ａｒｉａ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用してＦＡＣＳ細胞ソーティングを行った。
【０２０９】
ＦＡＣＳ装置により単一細胞のみが選別されたことを確実にするために、１３０μｍのノズル並びに良好な選別の品質を保証する適切な流速を使用して単一細胞精密モード（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌ  ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ｍｏｄｅ）に対する設定を調整した。
【０２１０】
単一細胞モードで、ピュリティーマスク（Ｐｕｒｉｔｙ  Ｍａｓｋ）を最大に設定し、粒子又はさらなる細胞不含の液滴のみを選別した。
【０２１１】
フェーズマスク（Ｐｈａｓｅ  Ｍａｓｋ）を最大の半分に設定し、選別される液滴内の中心の粒子のみを偏向させた。各液滴が１個以下の単一細胞を含有した可能性を向上させるために、エクスペンス・オブ・イールド（ｅｘｐｅｎｓｅ  ｏｆ  ｙｉｅｌｄ）で、液滴の軌跡及びカウント精度を最適化した。
【０２１２】
モノクローナル起源を検証し、実証するために、及びＦＡＣＳクローニング後第０日の単一細胞状態を確認するために、イメージングシステムを使用して、９６ウェルプレートの全ウェルの画像を取得した。
【０２１３】
ｂｂｍＡｂ１産生クローンと呼ばれる第０日の画像を２つ組で視覚的に調べ、イメージングシステムによりうまく取得された個々の画像において１個の単一細胞のみを同定し得ることを確認した。
【０２１４】
これは、ｂｂｍＡｂ１産生クローンの単一細胞起源を強調する。
【０２１５】
（４）細胞増殖
ＦＡＣＳクローニング後、第１週目にわたりロボットシステムによりクローンを取り扱い、その後手動で取り扱い、段階的に９６ウェル、２４ウェルから、振盪機に、最終的には当業者にとって周知のバイオリアクター増殖へと拡大して、性能（ｂｂｍＡｂ発現の生産性及び品質）を評価した。
【０２１６】
増殖／培養中、１０ｎＭの最終濃度でメトトレキサート（ＭＴＸ）を補給した化学的に定義された培地中で組み換えＣＨＯ細胞を培養した。
【０２１７】
週に２〜３回新鮮培地へと細胞を継代し、この試験を通じて対数増殖期で維持した。
【０２１８】
プロテインＡ  ＨＰＬＣによって生産性を評価し、逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）によって最初の製品の品質プロファイルを決定した。
【０２１９】
７．５％ＤＭＳＯを補給した培地中で全ての凍結保存物を作製した。
【０２２０】
（５）クローン安定性
生成物の特徴及び最適産生クローンの選択を確実にするための品質パラメーターを判断するために、異なる分析法によってプール及びクローンからの単離ｂｂｍＡｂを慎重に評価した。
【０２２１】
さらに、最適な産生クローンの選択を確実にするために、産生クローンに対して産生安定性の過剰な分析を行った。
【０２２２】
様々な最先端の分析法を使用して、クローン安定性：アフィニティー液体クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ＦＡＣＳ及びＭＳを評価した。
【０２２３】
（６）製造
（ａ）上流処理
振盪フラスコ又はウェーブフェッドバッチ（ｗａｖｅ  ｆｅｄ  ｂａｔｃｈ）培養の何れかでｂｂｍＡｂ物質を生成させた。ＰＳＬなどのプール又はクローンの凍結保存物を凍結融解し、化学的に定義された培地中で必要とされる時間にわたり増殖させて、典型的には細胞４．０ｘ１０５個／ｍＬの種細胞密度で、産生培養物を播種するための必要な細胞数を得た。１３〜１４日にわたり個々の培養物を培養した。培養中、工程内調節を行って、上清中のｂｂｍＡｂ濃度及び品質プロファイルを監視した。培養工程の終了時に、遠心分離（例えば振盪機）又は深層ろ過の何れかとそれに続くさらなるＤＳＰ処理前の滅菌ろ過によって、培養上清から細胞を分離した。
【０２２４】
（ｂ）下流処理
フォーマット設計及び同時発現アプローチに基づいて、インタクトな生成物ｂｂｍＡｂ１及び凝集体、ＤＮＡ及び宿主細胞タンパク質などの一般的な不純物だけでなく、図４で示されるように、ｍＡｂ１及びｍＡｂ２由来の単量体、ホモ二量体及び誤対合軽鎖／重鎖ｂｂｍＡｂ１変異体も、細胞培養及び細胞残屑除去後に上清中で予想した。誤対合軽鎖／重鎖ｂｂｍＡｂ１変異体（図４Ｅ〜４Ｍ）は、分取スケールで、容易に除去され得ないインタクトなｂｂｍＡｂ１と同じ生物物理学的特性を有することが疑われる。
【０２２５】
アプローチＩ：ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅ（商標）上での捕捉、ＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）及びＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（商標）上でのポリッシングによる精製
ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅ（商標）上での第１のアフィニティー液体クロマトグラフィー（ＡＬＣ）ステップによって、細胞不含上清からＦｃ部分を保有するｂｂｍＡｂ１及びｂｂｍＡｂ１変異体を捕捉した。ＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）上での第１のポリッシングによりカッパ軽鎖のみを含有するｂｂｍＡｂ１変異体（ｍＡｂ２ホール、図４Ｃ及び４Ｄ）及びＨＣＰを除去し、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（商標）上での第２のポリッシングステップによりラムダ軽鎖のみを含有するｂｂｍＡｂ１変異体（ｍＡｂ１ノブ、図４Ａ及び４Ｂ）及びＨＣＰを除去した。
【０２２６】
本方法を通じて４分間の保持時間（ＲＴ）を使用して室温でクロマトグラフィーを行った。添加前に４カラム体積（ＣＶ）の２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．０で、全てのカラムを平衡化した。宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、培地成分及びＤＮＡなど、非特異的結合不純物を生成物からなくすために、振盪フラスコからＡＬＣカラム上に細胞不含ｂｂｍＡｂ１上清を添加した後、４ＣＶ  ２５０ｍＭ  アルギニン−ＨＣｌ、１Ｍ  ＮａＣｌ、８８ｍＭ  ＮａＯＨ、ｐＨ９．０及び３ＣＶ平衡化緩衝液でクロマトグラフィーカラムを洗浄した。ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（商標）及びＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）からの溶出のために５０ｍＭ酢酸、ｐＨ３．０、５０ｍＭ酢酸／ＨＣｌ、ｐＨ２．０をそれぞれに使用することによって、クロマトグラフィーカラムからｂｂｍＡｂ１及び潜在的ｂｂｍＡｂ１変異体を溶出した。生成物ピーク回収は０．５ＡＵ／ｃｍ又は０．２５ＡＵ／ｃｍ（２８０ｎｍ）で開始、終了した。ｂｂｍＡｂ１溶出物のｐＨは、分析評価のためにそれぞれ２〜８℃で保存する前に０．１又は１Ｍ  Ｔｒｉｓで約ｐＨ５．０に調整した。
【０２２７】
アプローチＩＩ：ＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）上での捕捉による精製、Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ及びＦｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＥＭＤ  ＳＯ３上でのポリッシング
第２のアプローチにおいて、ＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）上でのアフィニティー液体クロマトグラフィーによってインタクトなｂｂｍＡｂ１及びラムダ軽鎖のみを含有するｂｂｍＡｂ１変異体（ｍＡｂ１ノブ単量体及びホモ二量体、図４Ａ及び４Ｂ）を細胞不含上清から捕捉した。存在する可能性があるエンベロープウイルスを不活性化するために、ＡＬＣ溶出物の低ｐＨ処理を行い、続いてＣａｐｔｏ  ａｄｈｅｒｅ及びＦｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＥＭＤ  ＳＯ３上での２つのクロマトグラフィーポリッシングステップを行い、生成物に関連する不純物、ＤＮＡ及びＨＣＰを除去した。その後、接線流ろ過を使用した最終濃縮及び緩衝液交換ステップ前にナノろ過によって存在する可能性があるウイルスを除去した。
【０２２８】
ａ）ＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）上のアフィニティー液体クロマトグラフィー（ＡＬＣ）
本方法を通じて３．６〜４．４分間の保持時間（ＲＴ）を使用して、１８〜２８℃でＡＬＣを行った。最初に、４〜６ＣＶ  ２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．０でＡＬＣカラムを平衡化した。次にウェーブ（ｗａｖｅｓ）又はバイオリアクターからの透明化細胞不含ｂｂｍＡｂ１上清を７〜２３ｇ／Ｌの添加密度でＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）カラムに添加した。４〜６ＣＶ  ５０ｍＭ酢酸での生成物溶出前に、４〜６ＣＶ  ２５０ｍＭアルギニン−ＨＣｌ、１Ｍ  ＮａＣｌ、８８ｍＭ  ＮａＯＨ、ｐＨ９．０でのカラム洗浄及び３〜５ＣＶ平衡緩衝液での第２の洗浄を行った。０．５〜２．０ＡＵ／ｃｍ（２８０ｎｍ）上昇から０．５〜２．０ＡＵ／ｃｍ（２８０ｎｍ）下降で生成物ピークを回収した。３〜５ＣＶ  ２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．０での再平衡化及び４〜６ＣＶ  ２０％エタノール中での保存前に、３〜５ＣＶ  １２０ｍＭリン酸、１６７ｍＭ酢酸、ｐＨ１．５を使用してＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）カラムを浄化した。
【０２２９】
ｂ）ウイルス不活性化
０．３Ｍリン酸を使用して、ＡＬＣ溶出物のｐＨをｐＨ３．４〜３．６に調整した。次に、続いてタンパク質溶液を１Ｍ  Ｔｒｉｓでの７．３〜７．７へのｐＨ調整前に、この低ｐＨで６０〜９０分にわたり温置した。０．４５／０．２μｍ  Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ（商標）滅菌フィルターでの滅菌ろ過前に、１００〜３００ＬＭＨの流速を適用して、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｂ１ＨＣ  Ｐｏｄフィルターを用いた深層ろ過ステップを使用した。
【０２３０】
ｃ）Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ上のマルチモーダル陰イオン交換クロマトグラフィー（ＭＡＣ）
本方法を通じて、４〜６分間の保持時間を使用して、１８〜２８℃のフロースルーモードでＭＡＣを行った。最初に、ＭＡＣカラムを７〜９ＣＶ  ２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５で平衡化した。次に、１７５〜３５０ｇ／Ｌの添加密度を使用して、低ｐＨ処理ＡＬＣ溶出液をＣａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅカラム上に添加した。生成物ピーク回収を、それにより０．５〜２．０ＡＵ／ｃｍ（２８０ｎｍ）上昇で開始した。次に、５〜７ＣＶ平衡化緩衝液でＭＡＣカラムを洗浄し、生成物ピーク回収を０．５〜２．０ＡＵ／ｃｍ（２８０ｎｍ）下降で終了した。続いてＣａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅカラムに対して６〜８ＣＶ  １００ｍＭ酢酸でストリップ処理を行い、続いて３〜５ＣＶ  ０．５Ｍ  ＮａＯＨで定置洗浄ステップを行い、３〜５ＣＶ  ０．１Ｍ  ＮａＯＨ中で保存した。
【０２３１】
ｄ）Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＥＭＤ  ＳＯ３上の陽イオン交換クロマトグラフィー
１８〜２８℃にて結合溶出モードでＦｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＥＭＤ  ＳＯ３上でのＣＥＣを行った。平衡化、ストリップ処理、ＣＩＰ及び保存中に６〜８分間の保持時間を使用し、添加、洗浄及び溶出中に８〜１０分間の保持時間を使用した。６〜８ＣＶ  ２０ｍＭコハク酸、３５．１ｍＭ  ＮａＯＨ、ｐＨ６．０でＣＥＣカラムを平衡化した。次に、３５〜７０ｇ／Ｌの添加密度でカラム上にＭＡＣパーコレートを添加した。その後、５〜７ＣＶ平衡化緩衝液でＣＥＣカラムを洗浄した。１５ＣＶにわたり１０〜９０％２０ｍＭコハク酸、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、３７．４ｍＭ  ＮａＯＨ、ｐＨ６．０から直線状の塩勾配を使用して溶出を行った。０．１〜０．４ＡＵ／ｃｍ上昇で開始して、３００ｎｍの２０％〜４０％最大ピーク高まで、ｂｂｍＡｂ１生成物ピークを回収した。３〜５ＣＶ  １Ｍ  ＮａＣｌでＦｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＥＭＤ  ＳＯ３カラムに対してストリップ処理を行い、続いて３〜５ＣＶ  ０．５Ｍ  ＮａＯＨを用いて定置洗浄ステップを行い、３〜５ＣＶ  ０．１Ｍ  ＮａＯＨ中で保存した。
【０２３２】
ｅ）ナノろ過
Ｐｌａｎｏｖａ（商標）２０Ｎナノフィルター及び０．５／０．１μｍ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＳＨＲ−Ｐプレフィルターを用いたナノろ過によって、存在する可能性があるウイルスを除去した。０．７〜０．９ｂａｒの様々な圧力をかけることによって、プレ及びナノろ過を行った。
【０２３３】
ｆ）接線流ろ過及び処方
ｂｂｍＡｂ１を濃縮し、ダイアフィルトレーションを行うために、１８〜２８℃でＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（商標）Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（商標）３ＲＣ  ３０ｋＤａ膜上の接線流ろ過ステップを行った。最初に、０．５〜１．２ｂａｒの供給フロー圧力及び０．３〜０．６ｂａｒの膜間圧（ＴＭＰ）を使用して１０００ｇ／ｍ２〜６０−８０ｇ／Ｌの最大添加密度でナノろ過ｂｂｍＡｂ１タンパク質溶液を濃縮した。次に、７〜９のダイアフィルトレーション体積の２０ｍＭヒスチジン／ヒスチジン−ＨＣｌ、ｐＨ６．０に対して、０．８〜１．８ｂａｒの供給フロー圧力及び０．４〜０．９ｂａｒのＴＭＰで、ｂｂｍＡｂ１に対してダイアフィルトレーションを行った。１．４〜３．０ｂａｒの供給フロー圧力及び０．７〜１．５ｂａｒのＴＭＰで、１３４±１０ｇ／Ｌへの第２の濃縮ステップを行った。限外ろ過したｂｂｍＡｂ１タンパク質溶液を最終的に１００±１０ｇ／Ｌの濃度及び０．０４％（ｗ／ｖ）Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔ２０に処方した。０．２μｍフィルターを通じて最終製剤原料（ＤＳ）をろ過し、≦−６０℃で凍結保存する。
【０２３４】
（７）分析学的特徴及び純度評価
（ａ）インタクトなｂｂｍＡｂ及び変異体のＬＣ−ＭＳスクリーニング
１００μＬの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５）緩衝液中で９６ウェルプレートにおいて１００μｇのプロテインＡ精製ｂｂｍＡｂ試料を凍結乾燥し、３７℃で１８時間にわたりＰＮＧａｓｅＦ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）により脱グリコシル化した。Ｓｙｎａｐｔ  Ｇ２  Ｑ−ＴＯＦ質量分析装置（Ｗａｔｅｒｓ）に連結されたＨ−Ｃｌａｓｓ  ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ）上でＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳにより試料を測定した。８０℃カラム温度でＭａｓｓＰＲＥＰ  Ｍｉｃｒｏ  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇカラム２．１ｘ５ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ）を使用した。移動相Ａ：水中０．１％ギ酸、移動相Ｂ：アセトニトリル中０．１％ＦＡ：０〜２ｍｉｎ  ５％Ｂ、２〜１２ｍｉｎ  ５〜９０％Ｂにより０．３ｍＬ／ｍｉｎで直線状勾配を適用し、続いて０．５ｍＬ／ｍｉｎでの数回の洗浄ステップを行った。ＭＳパラメーター：ＥＳＩ＋レゾリューションモード、キャピラリー電圧３ｋＶ、サンプリングコーン４０Ｖ、ソース温度１５０℃、脱溶媒和温度４００℃。ＮａＣｌ較正溶液でシステムを較正し、ロックマスはＬｅｕｃｉｎ  Ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎであった。ＵＮＩＦＩ  １．６ソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ）とともに自動ＭａｘＥｎｔ１デコンボリューション（質量範囲６０〜１５０ｋＤａ、高調波抑制）によってデータを処理した。ｂｂｍＡｂ種及び誤対合変異体の同定及び相対的定量は、理論的に予想される質量及びデコンボリューション質量分析の相対的質量シグナル強度との一致に基づく。
【０２３５】
（ｂ）ｂｂｍＡｂ１のＬＣ−ＭＳ特徴評価
インタクトな脱グリコシル化ｂｂｍＡｂ：２μＬ  ＰＮＧａｓｅＦ酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５中で精製ｂｂｍＡｂ１抗体を１ｍｇ／ｍＬに希釈し、３７℃で４時間、脱グリコシル化した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を２％まで添加することによって、消化を停止させた。
【０２３６】
還元脱グリコシル化ｂｂｍＡｂ：２０μＬの０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５中でｂｂｍＡｂ１を５ｍｇ／ｍＬに希釈した。２μＬのＰＮＧａｓｅ  Ｆを添加し、３７℃で４時間温置し、次いで８０μＬの変性緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、６Ｍ塩酸グアニジン）及び１μＬの１Ｍ  ＤＴＴを混合物に添加した。３７℃で１時間温置後、試料を１μＬ  ＴＦＡで酸性化した。
【０２３７】
Ｆａｂ及びＦｃへのｂｂｍＡｂのパパイン消化。ｂｂｍＡｂ１を５ｍｇ／ｍＬまで消化緩衝液（２０ｍＭコハク酸、３５．１ｍＭ  ＮａＯＨ、ｐＨ６．０、１ｍＭ  Ｃｙｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）と混合し、次いでパパインプロテアーゼ（Ｒｏｃｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を５μｇ／ｍＬ（プロテアーゼ／タンパク質比１：１０００）の最終濃度まで添加し、振盪下で３７℃にて２時間温置した。温置後、１．２ｍＭ最終濃度までヨードアセトアミド溶液を添加することによって溶解を停止させた。
【０２３８】
Ｆ（ａｂ’）２及びＦｃへのｂｂｍＡｂのＩｄｅＳ消化。１００μｇ  ｂｂｍＡｂ１を切断緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．６）と混合し、１００Ｕ  ＩｄｅＳプロテアーゼ（Ｆａｂｒｉｃａｔｏｒ，Ｇｅｎｏｖｉｓ）により３７℃で一晩消化した。温置後、２％の最終濃度までＴＦＡを添加することによって、溶解を停止させた。
【０２３９】
還元ＬｙｓＣ消化−ペプチドマッピング。（Ｒｏｍｂａｃｈ−Ｒｉｅｇｒａｆ  ｅｔ  ａｌ．，ＰｌｏｓＯｎｅ  ２０１４により）１５０μＬの変性溶液（６Ｍ塩酸グアニジン、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ  Ｎａ２ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を使用して２００μｇタンパク質を変性させ、１．５μＬの１Ｍ  ＤＴＴを添加し、３７℃で１時間にわたり温置することによって還元した。３μＬの１Ｍヨードアセトアミドを添加し、続いて暗所にて３７℃で温置することによってアルキル化を行った。１μＬの１Ｍ  ＤＴＴで反応を停止させた。還元／アルキル化後、７５０μＬの消化緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８）を試料に添加した。次に、４μＬの１μｇ／μＬエンドプロテアーゼＬｙｓＣ溶液（Ｗａｋｏ（Ｏｓａｋａ、Ｊａｐａｎ））の２回の添加及び３７℃でそれぞれ１時間及び３時間にわたる温置によって、試料を消化した。消化を停止させるために５μＬ  ＴＦＡを添加した。
【０２４０】
ＬＣ−ＭＳ測定。ＢＥＨ  Ｃ４  ＲＰカラム（１．７μｍ、２．１ｘ１００ｍｍ、３００Å、Ｗａｔｅｒｓ）及びＸｅｖｏ  Ｇ２  ＴＯＦ質量分析装置（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ）を備えたＷａｔｅｒｓ  ＵＰＬＣ  Ｈ−Ｃｌａｓｓを使用して、タンパク質試料をＬＣ−ＭＳ系に供した。溶出液は、Ａ：水中０．１％ＴＦＡ及びＢ：アセトニトリル中０．０９％ＴＦＡであった。カラムを８０℃に設定した。流速は０．２ｍＬ／ｍｉｎであった。次のように：０〜５ｍｉｎ  １０％Ｂ、５〜１０ｍｉｎ  １０〜３０％Ｂ、１０〜２５ｍｉｎ  ３０〜４０％Ｂ、２５〜２６ｍｉｎ  ４０〜９５％Ｂ、２６〜２８ｍｉｎ  ９５％、２８〜４０ｍｉｎ  １０％Ｂ、４０分勾配でタンパク質を溶出させた。
【０２４１】
ＭＳ設定：ＥＳＩ（＋）ＴＯＦモード、レゾリューションモード、質量範囲４００〜４０００Ｄａ、スキャン時間１ｓ、キャピラリー電圧３ｋＶ、サンプリングコーン２５Ｖ〜４０Ｖ。ＮａＣｓｌ溶液を使用してシステムを較正した。
【０２４２】
ＣＳＨ１３０  Ｃ１８  ２．１ｍｍｘ１５０、１．７μｍ（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ）を使用してＳｙｎａｐｔ  Ｇ２  Ｑ−ＴＯＦ質量分析（Ｗａｔｅｒｓ）にカップリングされたＨ−Ｃｌａｓｓ  ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ）上でのＲＰ−ＬＣ−ＭＳによりペプチド消化物を分析した。移動相Ａ：水中０．１％ＴＦＡ及び移動相Ｂ：アセトニトリル中の０．０９％ＴＦＡ。４０℃のカラム温度で次の勾配：０〜５ｍｉｎ  ０％Ｂ、５〜１０ｍｉｎ  ０〜２％Ｂ、１０〜４０ｍｉｎ  ２〜２０％Ｂ、４０〜１２０ｍｉｎ  ２０〜４０％Ｂ、１２０〜１３５ｍｉｎ  ４０〜７０％によりカラムからペプチドを溶出させた。２１４ｎｍでＵＶクロマトグラムを記録し、低エネルギー（４ｅＶ）及び高エネルギー断片化（３０〜５５Ｖ）を使用して、ＭＳＥ実験のように陽性ＥＳ（＋）レゾリューションモードでＭＳデータ取得を行った。ロックマスはＬｅｕｃｉｎ  Ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ（Ｗａｔｅｒｓ）であった。
【０２４３】
ＭａｓｓＬｙｎｘ  ４．２又はＵＮＩＦＩ  １．６ソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ）により、データ処理及び評価を行った。タンパク質質量分析のデコンボリューションのために、ＭａｘＥｎｔ１アルゴリズムを使用した。ＧＰＭＡＷ９．２ソフトウェア（Ｌｉｇｈｔｈｏｕｓｅ  ｄａｔａ）を用いて理論質量計算を行った。
【０２４４】
（ｃ）逆相クロマトグラフィー
Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ  ３００  ＳＢ−Ｃ８  ＲＰカラム、２．１ｍｍ  ｘ  ７５ｍｍ、５μｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ  １２６０  ＨＰＬＣ上でｂｂｍＡｂ試料を分析した。カラム温度を８０℃に設定し、流速は２ｍＬ／ｍｉｎ、移動相Ａ：９０％水、１０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ、０．３％ＰＥＧ−３００、移動相Ｂ：１０％水、９０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ、０．３％ＰＥＧ−３００であった。使用した勾配は、０〜５ｍｉｎ  ２２〜３７％Ｂ、５．０〜５．１ｍｉｎ  １００％Ｂ、５．１〜６ｍｉｎ  １００％Ｂ、６．１．〜８．５ｍｉｎ  ２２％Ｂであった。ＵＶシグナルを２１０ｎｍで記録した。データ取得及び評価を調整し、Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎ（商標）６．８ソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して行った。
【０２４５】
（ｄ）サイズ排除クロマトグラフィー
Ａｇｉｌｅｎｔ１２６０システムを使用して、ｂｂｍＡｂ１試料をＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷＸＬ（Ｔｏｓｏｈ  ＃８０８５４１、５μｍ、７．８ｍｍｘ３００ｍｍ）ＳＥＣカラム、ポアサイズ２５０Ａに供した。移動相は１５０ｍＭリン酸カリウム溶液、ｐＨ６．５であり、流速は０．４ｍＬ／ｍｉｎであり、カラム温度は３０℃であった。２１０ｎｍでＵＶを記録した。Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎ（商標）６．８（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、データ取得及びピーク積分を行った。
【０２４６】
（ｅ）キャピラリー電気泳動ＣＥ−ＳＤＳ
非還元ＣＥ−ＳＤＳに対して、ｂｂｍＡｂ試料を試料緩衝液（０．１リン酸ナトリウム／１．０％ＳＤＳ、ｐＨ６．６）と混合し、次にヨードアセトアミド溶液と混合した。還元ＣＥ−ＳＤＳのために、タンパク質を０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ／１％ＳＤＳ試料緩衝液、ｐＨ８．０と混合し、５％（ｖ／ｖ）メルカプトエタノールで還元した。両試料に対して１０分間７０℃で熱変性ステップを行った。
【０２４７】
３０ｃｍの総キャピラリー長のベア融解（ｂａｒｅ  ｆｕｓｅｄ）シリカキャピラリー（５０μｍ、３７５ＯＤ、６７ｃｍ、Ｂｅｃｋｍａｎ）を備え、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＳＤＳ  ＭＷシービングゲル（ｓｉｅｖｉｎｇ  ｇｅｌ）緩衝液を満たしたＢｅｃｋｍａｎ  ＰＡ  ８００システム上で試料を分析した。１５ｋＶ及び２５℃キャピラリー温度で陰性から陽性への極性で分離を行い、２１４ｎｍでＵＶにより検出した。電気泳動図を処理し、Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎ（商標）６．８ソフトウェアを使用して積分した。
【０２４８】
（ｆ）キャピラリーゾーン電気泳動ＣＺＥ
２１４ｎｍ  ＵＶ検出器を備えたＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＰＡ  ８００  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ上で分離を行った。２５℃にて２０ｋＶのキャピラリー電圧及び陽性の極性で全長４０ｃｍの石英ガラスキャピラリー（５０μｍ  ＩＤ）上でタンパク質を分離した。ランニング緩衝液：２ｍＭ  ＴＥＴＡ及び０．０３％Ｔｗｅｅｎ  ２０入りの４００ｍＭ  ６−アミノカプロン酸／酢酸ｐＨ５．７。Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎ（商標）６．８ソフトウェアでピーク積分を行った。
【０２４９】
（８）分析結果
インタクトＵＰＬＣ−ＭＳ質量スクリーニングアプローチを用いて、プロテインＡ精製後に、同時発現後の異なる二重特異性抗体の組み合わせ及びコンストラクトの純度及び同一性を分析した。このアプローチを使用して、細胞上清由来の形成されたヘテロ及びホモ二量体を確認し、相対的に定量した。適正に形成されたヘテロ二量体ｂｂｍＡｂ１及びｂｂｍＡｂ２は、インタクトな質量シグナル強度に基づき８５％を超える相対純度で観察され得た。このスクリーニングで観察される主要な不純物は、２本のカッパ軽鎖、２本のラムダ軽鎖及びＨＣホール−二量体分子を伴う誤対合抗体であった。
【０２５０】
【表５】
2020524991.tif 000006
【０２５１】
【表６】
2020524991.tif 000007
【０２５２】
ｌという表示はラムダ鎖であり、ｋはカッパ鎖である。
ｍＡｂ３は、ＶＨ３型、Ｖｋ１の抗体である。
ｍＡｂ４は、ＶＨ３型、Ｖｋ１の抗体である。
ｍＡｂ５は、ｍＡｂ１のグラフトバージョンである（ＶＨ１、Ｖｌ１）。
ｍＡｂ６は、ｍＡｂ２のグラフトバージョンである（ＶＨ１＿４６、Ｖｋ３）。
ｍＡｂ７は、ＶＨ３型、Ｖｋ１の抗体である。
ｍＡｂ８は、ＶＨ１＿２型、Ｖｋ２の抗体である。
ｍＡｂ９は、ＶＨ５型、Ｖｋ６の抗体である。
ｍＡｂ１０は、ＶＨ１＿４６型、Ｖｋ６の抗体である。
ｍＡｂ１１は、ＶＨ３型、Ｖｋ３の抗体である。
ｍＡｂ１２は、ＶＨ３型、Ｖｋ２の抗体である。
【０２５３】
ＬＣ−ＭＳにより、いくつかの試料調製方法を使用して、他の分離技術により、異なる精製ステップ後の形成された全ての生成物変異体及び不純物を評価するために、より詳細にｂｂｍＡｂ１の特徴を調べた。ＰＮＧａｓｅＦ酵素での脱グリコシル化及び続くＲＰ−ＬＣ−ＭＳ装置への注入後に、インタクトな２ステップ（ラムダ／ＣＥＣ）精製生成物の質量を決定した。インタクトなｂｂｍＡｂ１のデコンボリューション質量分析から、同時発現及びラムダ選択精製後、ノブ・イン・ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ）ヘテロ二量体の正確な形成が確認された。ラムダ選択精製後、ホモ二量体又は部分的抗体のような主要な不純物は検出され得なかった。試料の還元及び脱グリコシル化後、４つの異なる抗体鎖の同一性を確認し得た。
【０２５４】
鎖の誤対合及び他の低レベル不純物について調べるために、個々のＦａｂ及びＦｃ断片を分析するため、パパインプロテアーゼによって精製試料を消化した。断片の測定質量から、異なるＦａｂアーム（ノブ−ラムダ、ホール−カッパ）の正確な形成並びにノブ・イン・ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ）Ｆｃ断片の正確な形成が再び確認された。誤対合Ｆａｂ断片（Ｆａｂ４、ノブ−カッパ）が＜１％のレベルで観察され得た。プール及びクローン選択中により速い試料調製を可能にする、制限ＬｙｓＣ消化によりＦａｂ断片を生成させるための代替的なアプローチを試験した。
【０２５５】
Ｆｃ及びＦ（ａｂ’）２断片を生成させるためにＩｄｅＳ（Ｆａｂｒｉｃａｔｏｒ）酵素を使用した別の消化ストラテジーを試験した。この実験において、Ｆｃヘテロ二量体の質量及び正確に形成されたヘテロ二量体Ｆ（ａｂ’）２の形成を観察した。Ｆｃヘテロ二量体の存在は、そうでなければより小さい質量のＦｃ／２断片のみが生成されるので、ｂｂｍＡｂ１のＦｃ部におけるさらなるジスルフィド架橋の正確な形成の証拠でもある。
【０２５６】
ＬＣ−ＭＳによるＬｙｓＣペプチドマッピングにより、９９％のペプチドの全体的な配列カバレージでの分子の同一性を確認し得た。
【０２５７】
精製試料の具体的な結果を図２で示す。特に、脱グリコシル化されたインタクトな二重特異性ｍＡｂのＲＰ−ＵＶクロマトグラムを図２Ａで示す。パパイン消化ｂｂｍＡｂ１断片を図２Ｃで示す。ＩｄｅＳ消化ｂｂｍＡｂ１断片を図２Ｄで示す。脱グリコシル化及びＤＴＴ還元ｂｂｍＡｂ１断片を図２Ｅで示す。インタクトな脱グリコシル化二重特異性ｍＡｂ  ｂｂｍＡｂ１のデコンボリューション質量分析を図２Ｂで示す。
【０２５８】
結果を表５で示す。
【０２５９】
【表７】
2020524991.tif 000008
【０２６０】
上記の異なるステップを適用した後に得られた純度上昇は図３から分かる。図３Ａは、培養後の発現プロファイルを示すクロマトグラムであり、図３Ｂは、ＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）による捕捉後のクロマトグラムであり、図３Ｃは、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅ（商標）での捕捉後のクロマトグラムであり、図３Ｄは、ＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）での捕捉、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＥＭＤ  ＳＯ３及び限外ろ過によるポリッシング後のクロマトグラムである。
【０２６１】
表６で挙げた方法によって、最後の２ステップ精製（ラムダ／ＣＥＣ）二重特異性ｂｂｍＡｂ１をさらに分析した。本物質全体が、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、ＣＥ−ＳＤＳ及びキャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）などのいくつかの分離方法により検出されるように、高い純度を示し、凝集体又は変性産物は低レベルである。
【０２６２】
【表８】
2020524991.tif 000009
【０２６３】
他の抗体のさらなる組み合わせも試験した。表４は得られた分析結果のまとめを示す。
【０２６４】
６．実施例２：ｂｂｍＡｂ１のインビトロ活性
様々な異なる細胞アッセイでｂｂｍＡｂ１の結合活性を試験した。
【０２６５】
（１）材料及び方法
（ａ）溶液平衡滴定（ＳＥＴ）アッセイの場合
次の材料を使用した。
組み換えヒトＩＬ−１８、ビオチン化（ＢＴＰ２５８２８）
組み換えカニクイザルＩＬ−１β（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）
抗ヒトＩｇＧ抗体、スルホ−ＴＡＧ標識（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）＃Ｒ３２ＡＪ−５）
ヤギ抗ヒトＦａｂ特異的、ＭＳＤスルホ−ＴＡＧ  ＮＨＳエステルと複合化（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ＃１０９−００５−０９７、ＭＳＤ＃Ｒ９１ＡＮ−１）ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ＃Ａ−９６４７）
界面活性剤入りのＭＳＤリード緩衝液（ＭＳＤ＃Ｒ９２ＴＣ−１）
リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）１０ｘ（Ｔｅｋｎｏｖａ＃Ｐ０１９５）Ｔｒｉｓ−緩衝食塩水、ｐＨ７．５（ＴＢＳ）１０ｘ（Ｔｅｋｎｏｖａ＃Ｔ１６８０）Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｆｌｕｋａ＃９３７７３）
ポリプロピレンマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）（Ｇｒｅｉｎｅｒ＃７８１２８０）
３８４ウェルプレート、標準（ＭＳＤ＃Ｌ２１ＸＡ）
【０２６６】
（ｂ）細胞アッセイ及びＳＥＴアッセイの場合
ＩＬ−１β抗体のセクションに記載のようなｍＡｂ２。
ＩＬ−１８抗体のセクションに記載のようなｍＡｂ１。
実施例１に記載のようなｂｂｍＡｂ１。
ＭＢＬ  Ｉｎｔ．Ｃｏｒｐ．（＃Ｂ００１−５）から購入される組み換えヒトＩＬ−１８（ＢＴＰ２５８２９）
組み換えマーモセットＩＬ−１β（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）
組み換えマーモセットＩＬ−１８（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）
組み換えヒトＩＬ−１２（＃５７３００８）はＢｉｏｌｅｇｅｎｄから購入。ＫＧ−１細胞系（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−２４６）
正常ヒト皮膚線維芽細胞（＃ＣＣ−２５０９）はＬｏｎｚａから購入した
マーモセット皮膚線維芽細胞（＃４２６３７Ｆ（５１０））
ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ−１８／ＩＬ−１β細胞（＃ｈｋｂ−ｉｌ１８）はＩｎｖｉｖｏＧｅｎから購入した
ＰＢＭＣは、バフィーコートから単離され、Ｂｌｕｔｓｐｅｎｄｅｚｅｎｔｒｕｍ  Ｂｅｒｎから入手した
マーモセット血液はＳＩＬＡＢＥ，Ｎｉｅｄｅｒｈａｕｓｂｅｒｇｅｎから入手した
ＩＬ−６  ＥＬＩＳＡ：ヒト（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃４３０５０３）；マーモセット（Ｕ−ＣｙＴｅｃｈ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＴ９７４−５）
ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＡ：ヒト（ＢＤ５５５１４２）及びマーモセット（Ｕ−ＣｙＴｅｃｈ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ＃ＣＴ３４０Ａ）
ＳＥＡＰの検出のためのＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ（商標）アッセ（＃ｒｅｐ−ｑｂ１）はＩｎｖｉｖｏＧｅｎから購入した
細胞培地：１０％胎児ウシ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃１０１０８−１５７）、１％Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃２５０３０−０３）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃１５１４０−１４８）、１０μＭ  ２−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ＃３１３５０−０１０）、５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ＃１５６３０−０８０）を補給したＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃３１８７０）
丸底、組織培養処理９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ＃３７９９）
平底、組織培養処理９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ＃３５９６）
Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｃｑｕｅ（商標）Ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ＃１７−１４４０−０２）ＰＢＳ  １Ｘ、カルシウム及びマグネシウム不含（Ｇｉｂｃｏ＃１４１９００９４）
多孔性隔膜付きのＬｅｕｃｏｓｅｐチューブ、５０ｍＬ、ポリプロピレン（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ＃２２７２９０）
Ｆａｌｃｏｎ  １５ｍＬポリプロピレンコニカルチューブ（ＢＤ＃３５２０９６）
Ｆａｌｃｏｎ  ５０ｍＬポリプロピレンコニカルチューブ（ＢＤ＃３５２０７０）
【０２６７】
（ｃ）ＳＥＴによる親和性測定
ＳＥＴ個別標的結合アッセイ
試料緩衝液（０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ）中で抗原の２２種類の連続１．６ｎ希釈液（最大濃度：ｈｕＩＬ−１８、５ｎＭ；ｍａｒＩＬ−１８、１０ｎＭ；ｈｕＩＬ−１β、０．５ｎＭ；ｍａｒＩＬ−１β、０．５ｎＭ）を調製し、抗体の一定濃度を添加した（ＩＬ−１８読み取りの場合１０ｐＭ、ＩＬ−１β読み取りの場合１ｐＭ）。各抗原−抗体混合物の６０μＬ／ウェルの体積を２つ組で３８４ウェルポリプロピレンマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）に分配した。試料緩衝液を陰性対照とし、抗体のみを含有する試料を陽性対照とした（抗原なしの最大電気化学発光シグナル、Ｂｍａｘ）。プレートを密封し、振盪機上にて室温（ＲＴ）で一晩（ｏ／ｎ、少なくとも１６時間）温置した。
【０２６８】
ＩＬ−１８読み取り：ストレプトアビジンコーティング３８４ウェルＭＳＤアレイＭＴＰを３０μＬ／ウェルのビオチン化ｈｕＩＬ−１８（０．１μｇ／ｍＬ、ＰＢＳ）でコーティングし、振盪機上でＲＴにて１時間温置した。
【０２６９】
ＩＬ−１β読み取り：標準的な３８４ウェルＭＳＤアレイＭＴＰを補足剤としてのＰＢＳ中で希釈したｈｕＩＬ−１（３μｇ／ｍＬ、ＰＢＳ）の３０μＬ／ウェルでコーティングし、４℃で一晩温置した。
【０２７０】
室温（ＲＴ）で１時間（ｈ）、５０μＬ／ウェルのブロッキング緩衝液（５％ＢＳＡ含有ＰＢＳ）でプレートをブロッキング処理した。洗浄後（ＴＢＳＴ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＴＢＳ）、平衡化抗原−抗体混合物の３０μＬ／ウェルの体積をポリプロピレンＭＴＰからコーティングしたＭＳＤプレートに移し、ＲＴで２０分間温置した。さらなる洗浄ステップ後、試料緩衝液中で希釈した３０μＬスルホタグ標識抗ＩｇＧ検出抗体（０．５μｇ／ｍＬ）を各ウェルに添加し、振盪機上でＲＴにて３０分間温置した。ＭＳＤプレートを洗浄し、３５μＬ／ウェルＭＳＤリード緩衝液を添加し、ＲＴで５分間温置した。電気化学発光（ＥＣＬ）シグナルが生じ、ＭＳＤ  Ｓｅｃｔｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ６０００により測定した。
【０２７１】
ＳＥＴ同時標的結合アッセイ
アッセイＡを除いて、上記のように、ＳＥＴアッセイを行った：他方の標的のＫＤを評価しながら、過剰量のある１つの標的（５００ｐＭのＩＬ１８又はＩＬ−１βの何れか）の存在下で平衡化工程（抗体／抗原混合物）を行った。アッセイＢ：同時に１つの混合物中の連続希釈物において両標的で平衡化工程（抗体／抗原混合物）を行った（抗体の一定濃度１０ｐＭ、最大抗原濃度、上記参照）。次に、上記の通りＩＬ１８及びＩＬ−１βコーティングプレート上で同じ混合物をその遊離抗体濃度について分析した。
【０２７２】
ＳＥＴデータをＸｌｆｉｔ、ＭＳ  Ｅｘｃｅｌアドインソフトウェアにエクスポートした。各アッセイ内で２つ組測定から平均ＥＣＬ−シグナルを計算した。データは、最低値を全てのデータ点から差し引くことによりベースライン調整し、対応する抗原濃度に対してプロットして、滴定曲線を作成した。次のものを用いてプロットをフィットさせることによって、ＫＤ値を決定した：
【０２７３】
一特異性Ａｂに対する１：２結合モデル
【数１】
2020524991.tif 000010
ホール二重特異性Ａｂにおけるノブに対する１：１結合モデル
【数２】
2020524991.tif 000011
式中、
ｙ：ブランクを差し引いたＥＣＬシグナル
Ｂｍａｘ：ゼロ抗原濃度での最大ＥＣＬシグナル
［ＩｇＧ］：適用した抗体濃度
［Ｆａｂ］：適用した総Ｆａｂ濃度
ＫＤ：解離平衡定数
ｘ：適用した抗原濃度
【０２７４】
（ｄ）細胞培養
２ｘ１０５〜１ｘ１０６個の生存細胞／ｍＬの密度で、１０％ウシ胎児血清、１％Ｌ−グルタミン及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補給したＲＰＭＩ１６４０中でＫＧ−１細胞を増殖させた。
【０２７５】
ｂＦＧＦ（１ｎｇ／ｍＬ、ＣＣ−４０６５）、インスリン（５μｇ／ｍＬ、ＣＣ−４０２１）及び２％ＦＣＳ（ＣＣ−４１０１）を含むＦＢＭ（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ、ＣＣ−３１３１）中で正常ヒト線維芽細胞及びマーモセット線維芽細胞を増殖させた。飢餓培地として、線維芽細胞基本培地（ＬＯＮＺＡ＃ＣＣ−３１３１）を使用した。
【０２７６】
３０μｇ／ｍＬのブラストサイジン、２００μｇ／ｍＬのＨｙｇｒｏＧｏｌｄ（商標）及び１００μｇ／ｍＬのＺｅｏｃｉｎ（商標）を補給した増殖培地（ＤＭＥＭ、４．５ｇ／Ｌグルコース、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、５０Ｕ／ｍＬペニシリン、５０ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン、１００ｍｇ／ｍＬ  Ｎｏｒｍｏｃｉｎ（商標）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン）中でＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ−１８／ＩＬ−１β細胞を増殖させた。
【０２７７】
製造者の説明書に従い、ＬｅｕｃｏＳｅｐチューブを使用して、ヒト末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）をバフィーコートから新鮮に単離した。簡潔に述べると、１，０００ｘｇでの３０秒間にわたる遠心分離によって、１４ｍＬのＬｅｕｃｏＳｅｐチューブ中に１３ｍＬのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅを予め充填した。ヘパリン処理全血試料を等体積のＰＢＳで希釈し、２５ｍＬの希釈血液をＬｅｕｃｏＳｅｐチューブに添加した。室温で破壊なく８００ｘｇで１５分間、細胞分離チューブを遠心分離した。細胞懸濁液層を回収し、細胞をＰＢＳで２回洗浄し（それぞれ６４０及び４７０ｘｇで１０分間、２回連続洗浄）、計数前に培地中で再懸濁した。
【０２７８】
ヘパリン処理チューブ中でマーモセット血液を回収し、７０μｍ細胞ストレイナー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ＃３５２３５０）を使用してろ過した。
【０２７９】
（ｅ）ＩＬ−１β中和アッセイ
僅かに改変を行い、基本的には記載のように（Ｇｒａｍ２０００）、線維芽細胞におけるＩＬ−１β誘導性ＩＬ−６産生アッセイを行った。簡潔に述べると、９６ウェル平底組織培養プレート中で細胞５ｘ１０３個／ウェル（１００μＬ中）の密度で線維芽細胞を播種した。翌日、組み換えＩＬ−１β／化合物溶液混合物の添加前に飢餓培地中で５時間にわたり細胞を飢餓状態にした（ＩＬ−１β濃度は表中で示す）。３７℃で３０分間、濃度範囲の化合物とともに組み換えＩＬ−１βを温置することによって、前もってＩＬ−１β／化合物溶液混合物を調製した。３７℃でのｏ／ｎ温置後、細胞上清を回収し、放出されたＩＬ−６の量をＥＬＩＳＡにより決定した。次のようにＰＢＭＣ中のＩＬ−１β誘導性ＩＬ−６産生アッセイを行った。細胞３ｘ１０５個／ウェル（１００μＬ中）で９６ウェル組織培養プレートにおいてＰＢＭＣを播種し、３７℃で２４時間、組み換えＩＬ−１β／化合物溶液混合物とともに温置した（ＩＬ−１β濃度は表中で示す）。３７℃で３０分間、濃度範囲の化合物とともに組み換えＩＬ−１βを温置することによって、前もってＩＬ−１β／化合物溶液混合物を調製した。刺激２４時間後に細胞上清を回収し、放出されたＩＬ−６の量をＥＬＩＳＡにより決定した。
【０２８０】
（ｆ）ＩＬ−１８中和アッセイ
基本的に次のようにアッセイを行った。３ｘ１０５／ウェルの密度のＫＧ−１細胞（前もってＰＢＳ＋１％ＦＣＳ中で１時間飢餓状態にした）又はＰＢＭＣを丸底９６ウェル細胞培養プレートに播種し、濃度範囲の化合物と一緒に、組み換えＩＬ−１８／ＩＬ−１２の溶液混合物とともに温置した（ＩＬ−１８／ＩＬ−１２濃度は表で示す）。３７℃で２４時間の温置後、上清を回収し、放出されたＩＦＮγの量をＥＬＩＳＡにより決定した。マーモセット血液でのアッセイの場合、血液８５μＬ／ウェルを使用した。
【０２８１】
（ｇ）ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）細胞における二重ＩＬ１β／ＩＬ−１８中和
基本的に製造者の操作手順に記載のようにアッセイを行った。簡潔に述べると、９６ウェル細胞培養プレートに４ｘ１０４／ウェルの密度でＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）細胞を播種し、濃度範囲の化合物と一緒に組み換えＩＬ−１β及びＩＬ−１８の溶液混合物とともに温置した（１：１  ＳＥＡＰシグナルを生じさせるため）。３７℃で２４時間の温置後、上清を回収し、製造者の説明書に従い、ＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ（商標）法を使用することによって、放出ＳＥＡＰの量を決定した。
【０２８２】
全てのデータをＥＸＣＥＬソフトウェアにエクスポートし、ＥＸＣＥＬ／ＸＬｆｉｔ４又はＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアの何れかを使用して、対数曲線フィッティング関数に対して用量−反応曲線をプロットすることによってＩＣ５０値を計算した。
【０２８３】
（２）結果
（ａ）組み換えヒト及びマーモセットＩＬ１β及びＩＬ−１８に対する親和性
溶液平衡滴定（ＳＥＴ）滴定（図５）によってヒト及びマーモセット組み換えＩＬ−１β及びＩＬ−１８タンパク質に対するｂｂｍＡｂ１の結合親和性を測定し、生成したＫＤ値を、ＩＬ−１βについてはｍＡｂ２と、ＩＬ−１８結合についてはｍＡｂ１と比較した。図５は、溶液中のＥＣＬに基づく親和性決定の滴定曲線、抗体の定常濃度：ＩＬ−１８読み取りの場合、１０ｐＭ、ＩＬ−１β読み取りの場合、１ｐＭ；抗原希釈液：最大濃度：ｈｕＩＬ−１８、５ｎＭ；ｍａｒＩＬ−１８、１０ｎＭ；ｈｕＩＬ−１β、０．５ｎＭ；ｍａｒＩＬ−１β、０．５ｎＭを示す。実線は上記モデルを使用したデータのフィットを示す。点線は９５％信頼区間、ｎ＝３を示す。
【０２８４】
個々の標的結合アッセイにおいて結合親和性を比較すると、ｂｂｍＡｂ１は、ヒト及びマーモセットＩＬ−１８に対するｍＡｂ１と比較して、同様の平均ＫＤを示した（表７）。ヒトＩＬ−１β結合の場合、平均ＫＤ値は、ｍＡｂ２（０．６ｐＭ）と比較して、ｂｂｍＡｂ１（２．６ｐＭ）に対して僅かに高かったが、同じ低いｐＭ範囲であった。同時二重標的結合アッセイでの続く測定（表８）によって、ＩＬ−１βに対するｂｂｍＡｂ１結合ＫＤ値が、前臨床並びに臨床グレード物質でのｍＡｂ２の値と同様であったことが確認された。したがって、ｂｂｍＡｂ１は、それぞれｍＡｂ２及びｍＡｂ１と同様であるヒト及びマーモセットにおいて両標的に対して結合親和性を保持する。
【０２８５】
【表９】
2020524991.tif 000012
【０２８６】
個々の標的結合結果に加えて、他の標的のＫＤ値結合の評価中に過剰な１つの標的の何れかを適用することによって（アッセイＡ）、又は連続希釈中に両標的の混合物を適用することによって（アッセイＢ）、ｂｂｍＡｂ１の同時二重標的結合親和性を調べた（表８）。同時ＩＬ−１β／ＩＬ−１８親和性決定から、アッセイＡ（過剰な１つの抗原）とアッセイＢ（連続希釈液中の両抗原の混合物）との間に有意差は示されず、他方の標的の結合に影響を及ぼさずに両標的が同時に結合されることを証明した。さらに、同時二重結合アッセイにより得られたＫＤ値は、標準的アッセイで得られたＫＤ値と同様であり（表７；第２の抗原非存在下）、これはｂｂｍＡｂ１が独立に両抗原と結合し得ることを証明した。したがって、ｂｂｍＡｂ１は、両ヒトＩＬ−１β及びＩＬ−１８と同時に、及び独立に結合し、対応するマーモセットタンパク質と完全に交差反応する。
【０２８７】
【表１０】
2020524991.tif 000013
【０２８８】
（ｂ）ヒト及びマーモセット細胞アッセイにおけるｂｂｍＡｂ１の中和活性
両サイトカイン（ＩＬ１β及びＩＬ−１８）に対するｂｂｍＡｂ１の中和活性を評価したｍＡｂ２ｍＡｂ１）。さらに、マーモセット細胞アッセイ系を用いたマーモセットＩＬ−１β及びＩＬ−１８の中和に対するｂｂｍＡｂ１の効力を評価した（セクションｄ参照）。
【０２８９】
（ｃ）ヒト細胞における個別及び同時ＩＬ−１β及びＩＬ−１８中和
ヒト皮膚線維芽細胞（６ｐＭでＩＬ−１β使用）における、及びヒトＰＢＭＣ（６０ｐＭでＩＬ−１β使用）における、組み換えＩＬ−１β誘導性ＩＬ−６産生の阻害により、ＩＬ−１βにおけるｂｂｍＡｂ１の中和活性を評価した。ＫＧ−１細胞及びヒトＰＢＭＣにおける組み換えＩＬ−１８誘導性ＩＦＮ−γ産生の阻害により、ＩＬ−１８におけるｂｂｍＡｂ１の中和活性を測定した（組み換えヒトＩＬ−１２の１ｎｇ／ｍＬと一緒に３ｎＭ組み換えヒトＩＬ−１８により両細胞を活性化）。ＩＬ−１β及びＩＬ−１８上のｂｂｍＡｂ１の阻害効力は、常に、それぞれｍＡｂ２又はｍＡｂ１の何れかのものと比較した。アッセイに依存して、ｂｂｍＡｂ１の平均ＩＣ５０値は、サブｎＭ又は１桁ｎＭの範囲であり、それぞれ、直接比較ｍＡｂ２（ＩＬ−１βの場合）及びｍＡｂ１（ＩＬ−１８の場合）で、最大２〜４倍高かった（表９及び表１０）。ｍＡｂ２／ｍＡｂ１の二価方式と比較した場合のｂｂｍＡｂ１の一価方式、また潜在的にはＫｉＨ突然変異も、ｂｂｍＡｂ１の効力におけるこの僅かな相違に対する理由であり得る。
【０２９０】
【表１１】
2020524991.tif 000014
【０２９１】
【表１２】
2020524991.tif 000015
【０２９２】
ｂｂｍＡｂ１は、組み換えＩＬ−１β及びＩＬ−１８での１＋１刺激に応答してＳＥＡＰを産生するＨＥＫ  Ｂｌｕｅ（商標）レポーター細胞で明らかにされるように、ＩＬ−１β及びＩＬ−１８の両方の生体活性を同時に中和可能であった（表１１）。このアッセイ系におけるＳＥＡＰの同様の阻害は、ｍＡｂ２及びｍＡｂ１の組み合わせによってのみ達成可能であったが、個々の抗体の使用では達成できなかった。
【０２９３】
【表１３】
2020524991.tif 000016
【０２９４】
（ｄ）マーモセット細胞アッセイでの、マーモセットＩＬ−１β及びマーモセットＩＬ−１８におけるｂｂｍＡｂ１の中和活性
マーモセットにおけるｂｂｍＡｂ１の阻害活性を明らかにするために、ヒト細胞と同様であるが、刺激のために組み換えマーモセットＩＬ−１β及びＩＬ−１８を使用して、マーモセット細胞による同様のインビトロアッセイを行った。マーモセット皮膚線維芽細胞における組み換えマーモセットＩＬ−１β−誘導性ＩＬ−６産生の阻害を評価した場合、ｂｂｍＡｂ１は、ｍＡｂ２と比較して２〜３倍高いＩＣ５０値のサブｎＭ効力を示した（表１２）。マーモセットＩＬ−１βで刺激したヒト皮膚線維芽細胞を用いたｂｂｍＡｂ１の試験により、ヒトＩＬ−６を用いた場合と同様の阻害プロファイルが得られた。
【０２９５】
【表１４】
2020524991.tif 000017
【０２９６】
ｂｂｍＡｂ１の１桁から２桁ｎＭ  ＩＣ５０値から、マーモセット血液細胞を用いたＩＦＮγ産生アッセイで試験したマーモセットＩＬ−１８に対するｂｂｍＡｂ１の中和活性が確認された（表３〜７）。マーモセットＩＬ−１８で刺激したヒトＰＢＭＣによるｂｂｍＡｂ１試験から、ヒトＩＦＮγ産生を測定した場合と同様の阻害プロファイルが得られた。
【０２９７】
したがって、ｂｂｍＡｂ１は、マーモセット応答細胞を使用した機能アッセイにおいて、マーモセットＩＬ−１β及びマーモセットＩＬ−１８と完全に交差反応性であることが示された。
【０２９８】
【表１５】
2020524991.tif 000018
【０２９９】
様々な異なる細胞アッセイにおいて、ｍＡｂ、ｍＡｂ２及びｍＡｂ１と比較した場合、ｂｂｍＡｂ１、ＫｉＨ方式ＩＬ−１β／ＩＬ−１８二重特異性ｍＡｂが、２つの個別の標的ＩＬ−１β及びＩＬ−１８に対する、高親和性結合並びにサイトカイン中和効力を保持することが明らかになった。ｂｂｍＡｂ１の二重ＩＬ−１β及びＩＬ−１８中和特性は、ヒトサイトカイン／細胞に対してだけでなく、適切な毒性学研究を促進する、対応するマーモセットサイトカイン／細胞でも明らかにされた。ＩＬ−１β及びＩＬ−１８中和に対する細胞アッセイの一部において生じた最大２〜４倍高いＩＣ５０値は、それぞれｍＡｂ２及びｍＡｂ１の二価結合とは逆に、ｂｂｍＡｂ１の一価結合の結果であり得る。にもかかわらず、ｂｂｍＡｂ１による二重サイトカイン中和の結果、発明者らのインビトロ細胞系で正確に表され得ないインビボでの相加的又は相乗的阻害活性が得られ得る。
【０３００】
７．実施例３：ＰＢＭＣにおけるＩＬ−１β及びＩＬ−１８の組み合わせの刺激及び遮断の効果
エフェクターサイトカインＩＬ−１β及びＩＬ−１８のインフラマソーム活性化依存性切断は、二次性の炎症促進性メディエーターの誘導につながり、全身的だけでなく炎症部位でも、免疫細胞動員／活性化を促進する。致死的全身炎症に対する２つの異なるマウスモデル（ａ）ＬＰＳ注射モデル及び（ｂ）ＦＣＡＳマウス（ＮＬＲＰ３における活性化ミスセンス突然変異）において、ＩＬ−１β及びＩＬ−１８の両方の同時欠如／阻害は、単一ＩＬ−１β又は単一ＩＬ−１８欠如／阻害と比較して致死性に対してより防御的であり、これにより、免疫活性化に対する相加的又は相乗的機序が明らかになる（Ｂｒｙｄｇｅｓ  ２０１３，ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇｈｅ  ２０１４）。ｂｂｍＡｂ１は、げっ歯類と交差反応性がないヒト／マーモセットＩＬ−１β／ＩＬ−１８反応性二重特異性ｍＡｂであり、したがってマウスモデルにおいて試験できない。したがって、ｂｂｍＡｂ１によるＩＬ−１β／ＩＬ−１８中和の組み合わせの相加的又は相乗的阻害効果を明らかにするために、発明者らはＬＰＳ／ＩＬ−１２を使用してヒトＰＢＭＣの刺激に対するインビトロでのインフラマソーム依存性経路活性化を模倣し、マイクロアレイを使用して非偏向遺伝子発現分析を行った。補完的活性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）として、発明者らは、組み換えＩＬ−１β及び組み換えＩＬ−１８の組み合わせ又は単一サイトカインのみの何れかで刺激した異なるドナー由来のＰＢＭＣの遺伝子発現プロファイルも比較した。
【０３０１】
（１）材料及び方法
（ａ）細胞培養及びＥＬＩＳＡ
１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃１０１０８−１５７）、１％Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃２５０３０−０３）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃１５１４０−１４８）、１０μＭ  ２−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ＃３１３５０−０１０）、５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ＃１５６３０−０８０）を補給したＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃３１８７０又はＧｉｂｃｏ＃６１８７０−０１０）
組み換えヒトＩＬ−１βは、Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．（＃１０１３９−ＨＮＡＥ−５）から購入した
組み換えヒトＩＬ−１８は、ＭＢＬ（＃Ｂ００１−５）から購入した
組み換えヒトＩＬ−１２は、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（＃５７３００８）から購入した
ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＡ：ＭＡＸ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｓｅｔ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃４３０１０３又はＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ  ヒトＩＦＮγ  ＥＬＩＳＡ  Ｓｅｔ、ＢＤ＃５５５１４２
ＩＬ−６  ＥＬＩＳＡ：ＭＡＸ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｓｅｔ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃４３０５０３
ＩＬ−２６  ＥＬＩＳＡ：Ｃｌｏｕｄ  Ｃｌｏｎｅ  Ｃｏｒｐ  ＃ＳＥＢ６９５Ｈｕ
ＩＬ−１β抗体のセクションに記載のようなｍＡｂ２。
ＩＬ−１８抗体のセクションに記載のようなｍＡｂ１。
実施例１に記載のようなｂｂｍＡｂ１。
サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）血清型エンテリティディス（ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）由来のＬＰＳ、Ｓｉｇｍａ＃Ｌ７７７０
ＰＢＭＣは、Ｂｌｕｔｓｐｅｎｄｅｚｅｎｔｒｕｍ  Ｂｅｒｎから得たバフィーコートから単離した
丸底の組織培養処理９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ＃３７９９）平底の組織培養処理９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ＃３５９６）Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｃｑｕｅ（商標）Ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ＃１７−１４４０−０２）ＰＢＳ  １Ｘ、カルシウム及びマグネシウム不含（Ｇｉｂｃｏ＃１４１９００９４）
Ｆａｌｃｏｎ  １５ｍＬポリプロピレンコニカルチューブ（ＢＤ＃３５２０９６）Ｆａｌｃｏｎ  ５０ｍＬポリプロピレンコニカルチューブ（ＢＤ＃３５２０７０）
多孔性隔膜付きＬｅｕｃｏｓｅｐＴＭチューブ、５０ｍＬ、Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ＃２２７２９０
細胞ストレイナー７０μＭ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ＃３５２３５０
トリパンブルー、Ｓｉｇｍａ＃Ｔ８１５４
ＲＮＡ単離、定量及び品質測定及びｑＰＣＲ：
ヌクレアーゼ不含水、Ａｍｂｉｏｎ＃ＡＭ９９３８
Ｒｎａｓｅ  Ｚａｐ、Ａｍｂｉｏｎ＃ＡＭ９７８０
１．５ｍＬエッペンドルフチューブ、滅菌、Ｒｎａｓｅ及びＤｎａｓｅ不含
ＲＬＴ緩衝液、Ｑｉａｇｅｎ＃１０１５７６２
Ｒｎｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ＃７４１０４
ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ  Ｓｅｔ、Ｑｉａｇｅｎ＃７９２５４
Ａｇｉｌｅｎｔ  ＲＮＡ  ６０００  Ｎａｎｏ  Ｋｉｔ、Ａｇｉｌｅｎｔ＃５０６７−１５１１
チッププライミングステーション、Ａｇｉｌｅｎｔ＃５０６５−４４０１
ＩＫＡボルテックスミキサー
ＲＮａｓｅＺＡＰ（登録商標）、Ａｍｂｉｏｎ＃９７８０
Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ
Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ逆転写キット、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、＃ＰＮ４３７４９６６
Ｎａｓｅ不含、薄壁、フォーステッドリッド（ｆｏｒｓｔｅｄ  Ｌｉｄ）０．２ｍＬ  ＰＣＲチューブ、Ａｍｂｉｏｎ＃ＡＭ１２２２５
ＭｉｃｒｏＡｍｐ  Ｏｐｔｉｃａｌ  ３８４ウェル反応プレート、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ＃４３０９８４９
ＴａｑＭａｎ  ＧｅｎＥｘ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ＃４３６９５１４
ＰＣＲプライマー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
【０３０２】
【表１６】
2020524991.tif 000019
【０３０３】
ＰＢＭＣ調製：製造者の説明書に従い、Ｌｅｕｃｏｓｅｐチューブ中でＦｉｃｏｌｌ  −Ｐａｑｕｅ勾配遠心分離によってバフィーコートからＰＢＭＣを単離した。簡潔に述べると、１５ｍＬのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅを５０ｍＬ  ＬｅｕｃｏｓｅｐＴＭチューブに入れ、ＲＴにて１３００ｒｐｍで３０秒間遠心分離した。ピペットを用いて、バフィーコートの３０ｍＬの希釈済み懸濁液をＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ溶液の上部に添加し、破壊せずにＲＴにて１０００ｇで１５分間遠心分離した。血漿を廃棄し（およそ２０ｍＬ）、境界面の環状部分を回収し（＝ヒトＰＢＭＣ）、５０ｍＬファルコンチューブに移した。このチューブに５０ｍＬの滅菌ＰＢＳ及びを満たし、ＲＴにて５分間、１２００ｒｐｍで１度遠心分離した。この遠心分離を２回繰り返した。上清を穏やかに廃棄し、２％ＦＣＳ及び２ｍＭ  ＥＤＴＡ入りの５０ｍＬのＰＢＳ中で細胞を再懸濁した。７０μｍ細胞ストレイナーを用いて細胞懸濁液をろ過し、トリパンブルー染色（５００μＬのトリパンブルー＋２００μＬの細胞＋３００μＬのＰＢＳ）を使用して細胞を数えた。
【０３０４】
ＰＢＭＣのＬＰＳ／ＩＬ−１２刺激：次のように上清中のサイトカイン産生を調製した。１００μＬ最終体積中２５００００個細胞／ウェルを９６ウェル丸底プレートにおいて分配した。１０ｎｇ／ｍＬで組み換えＩＬ−１２と一緒に０．３μｇ／ｍＬ〜３０００μｇ／ｍＬの濃度でＬＰＳを使用した。３７℃及び１０％ＣＯ２にて２４時間後に上清を回収した。
【０３０５】
次のように細胞ペレットからのＲＮＡ抽出を行った。１０００μＬ最終体積中細胞３ｘ１０６個／ウェルを平底２４ウェルプレートにおいて分配した。１０ｎｇ／ｍＬの組み換えＩＬ−１２と一緒に３μｇ／ｍＬでＬＰＳを使用した。３７℃及び１０％ＣＯ２にて２４時間後に細胞を回収した。
【０３０６】
組み換えサイトカインでのＰＢＭＣの刺激：１．５ｍＬの最終完全ＲＰＭＩ培地中で１２ウェルプレートのウェルあたり７ｘ１０６個のＰＢＭＣを使用した。次の最終濃度：１０ｎｇ／ｍＬの組み換えＩＬ−１β、３ｎＭの組み換えＩＬ−１８、１ｎｇ／ｍＬの組み換えＩＬ−１２で組み換えサイトカインを添加した。３７℃及び１０％ＣＯ２にて４時間及び２４時間後に上清並びに細胞の両方を回収した。
【０３０７】
ＲＮＡ単離、定量及び品質評価：細胞をペレット化し、２％β−メルカプトエタノール入りの３５０μＬのＱｉａｇｅｎ  ＲＴＬ緩衝液中でペレットを溶解させ、試験の全試料が回収されるまで−２０℃又は−８０℃で凍結した。Ｑｉａｇｅｎ標準プロトコールを使用してＲＮＡ単離を行った。簡潔に述べると、ＲＮｅａｓｙスピンカラムに移す前に３５０μＬの７０％エタノールを全試料において添加し、８０００ｇで１５秒間、遠心分離した。フロースルーを廃棄した後、３５０μＬの緩衝液ＲＷ１を添加し、スピンカラム膜を洗浄するために８０００ｇで１５秒間カラム遠心分離を行った。製造者の説明書に従い、ＤＮａｓｅ  Ｉ温置混合溶液を調製し、ＲＮｅａｓｙスピンカラムに添加し、ＲＴで１５分間温置した。３５０μＬ及び５００μＬの緩衝液ＲＷ１で洗浄した後、ＲＮｅａｓｙスピンカラムを新しい２ｍＬ回収チューブに置き、１分間、フル速度で遠心分離した。スピンカラム膜に３５μＬ  ＲＮａｓｅ−不含水を直接添加することによってＲＮＡを最後に回収し、８０００ｇで１分間遠心分離してＲＮＡを溶出させた。Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ＮＤ−１０００を使用してＲＮＡの量を測定し、−２０℃でＲＮＡを保管した。製造者の説明書に従い、ＲＮＡ品質評価のためにＲＩＮ測定を行った。簡潔に述べると、１μＬのＲＮＡ又はラダーをＡｇｉｌｅｎｔ  ＲＮＡ  ６０００  Ｎａｎｏチップにピペットで添加し、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｓｅｒを使用することにより測定した。
【０３０８】
ｑＰＣＲによるサイトカイン遺伝子発現分析：
製造者の説明書に対応して本方法を行った。簡潔に述べると、Ｈｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ逆転写キットを使用して説明書に従い４００ｎｇのＲＮＡを逆転写した。ＲＮＡ／ＤＮＡ不含水中でｃＤＮＡ溶液を１／１０希釈し、１μＬのｃＤＮＡを３８４ウェル反応プレートに移し、次いで１μＬの２０Ｘ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  標的ＦＡＭ遺伝子及び１０μＬの２ｘ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ及び１０μＬのＲＮＡ／ＤＮＡ不含水と混合した。プレートをＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＶｉｉＡ（商標）７  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ上に載せ、次の機器設定を使用した：
【０３０９】
【表１７】
2020524991.tif 000020
【０３１０】
この試験のために使用したハウスキーピング遺伝子はＨＰＲＴ１及びＲＬＰ２７であった。標的遺伝子の相対的発現レベルを計算するために次の式を使用した：
１）Ｃｔ［Ｒｅｆ］＝（Ｃｔ［ＨＰＲＴ１］＋Ｃｔ［ＲＬＰ２７］）／２
２）ｄＣｔ［Ｒｅｆ］＝４０−Ｃｔ［Ｒｅｆ］
３）ｄＣｔ［Ｔａｒｇｅｔ］＝Ｃｔ［Ｔａｒｇｅｔ］−Ｃｔ［Ｒｅｆ］
４）ｄｄＣｔ＝ｄＣｔ［Ｒｅｆ］−ｄＣｔ［Ｔａｒｇｅｔ］
５）相対的標的遺伝子発現＝２＾ｄｄＣｔ
【０３１１】
次のようにマイクロアレイを行った。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ＿Ｕ１３３＿Ｐｌｕｓ２マイクロアレイ上でＣｉＴｏｘＬＡＢ  Ｆｒａｎｃｅによって試料を処理した。これらをＲＭＡ正規化し、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  １１．５．１（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）で分析した。Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）及びＮｅｘｔｂｉｏ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用してパスウェイ分析を行った。２つのデータセットを独立に処理した。
【０３１２】
最初に、Ｒｓｔｕｄｉｏ  ｓｕｉｔｅ及びＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ（ＰＣＡ、ハイブリッド形成対照）においてＲ  ｓｃｒｉｐｔ（ＭＡ＿ＡｆｆｙＱＣ．Ｒ）を使用することによって、ＣｉＴｏｘＬＡＢ、社内ＱＣによりデータを標準クオリティーコントロール（ＱＣ）に供した。その後、信頼できない発現レベルを除くためにそれをフィルタリングした：実験条件の何れか１つにおいて試料の少なくとも１００パーセントが２０番目のパーセンタイルを上回る値を有する実体（プローブセット）を維持した。
【０３１３】
ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇにおいて「ボルケーノプロット上のフィルター」特性を使用して、差次的に発現された遺伝子（ＤＥＧ）を同定した。独立ｔ検定とともにフィルタリングした遺伝子（２０．０〜１００．０ｔｈパーセンタイルの発現）を使用して、補正したｐ−値が０．０５を下回り、２．０を上回る倍率変化があるプローブセットを差次的に発現されるものとみなした。可能の場合、すなわちＬＰＳ（ＮＵＩＤ−００００−０２０２−４１５０）での試験において、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇの多重検定補正を使用した。
【０３１４】
サイトカイン刺激実験の場合、次の式：シグナルＡ＋Ｂ／（シグナルＡ＋シグナルＢ−対照）≧１．５を用いて相乗作用を計算した。
【０３１５】
個々のシグネチャー（又はＤＥＧリスト）を使用して、シグネチャーと公開データセットの「疾患遺伝子リスト」（病巣対非病巣）との間の重複を観察する統計学的有意性を表すフィッシャーの直接検定によりｐ値を計算した。それを行うために、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｂａｓｅ  Ｓｐａｃｅ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  Ｅｎｇｉｎｅ（かつてのＮｅｘｔｂｉｏ）にリストをアップロードし、疾患に対するメタ解析特性及びキーワード検索を使用して比較した。
【０３１６】
全データをＥＸＣＥＬソフトウェアにエクスポートし、ＥＸＣＥＬ／ＸＬｆｉｔ４又はＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアの何れかを使用したロジスティック曲線フィッティング関数に対して用量−反応曲線をプロットすることによってＩＣ５０値を計算した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、一元配置ＡＮＯＶＡ、続いてダネットの多重比較を行うことにより、処置群間の差を分析し、結果をｐ＜０．０５で統計学的に有意とみなした。
【０３１７】
（２）結果
（ａ）全血中でＬＰＳ／ＩＬ−１２誘導性ＩＦＮγ産生を阻害することにおいてｂｂｍＡｂ１は非常に効果的である
１０ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−１２を補給したＬＰＳへのヒト全血の曝露の結果、血液細胞により産生される「ネイティブ」ＩＬ−１８に大きく依存するがそれだけではないＩＦＮγ応答が起こる。ＩＬ−１２の添加によって、おそらく応答細胞でのＩＬ−１８受容体の上方制御により、ＬＰＳ誘導性ＩＦＮγ応答が促進される。
【０３１８】
使用した実験条件において、ｍＡｂ１でのＩＬ−１８中和はＩＦＮγ産生の不完全な阻害にしか至らず、一方でＩＬ−１β阻止（ｍＡｂ２を使用）はＩＦＮγ応答に対して小さな効果しかなかった。興味深いことに、ｂｂｍＡｂ１又はｍＡｂ２及びｍＡｂ１の組み合わせの何れかによるＩＬ−１β及びＩＬ−１８の阻害の組み合わせは、単一のサイトカイン中和と比較して、ＩＦＮγ産生をより深く、完全に阻害していた（図６）。図６は、ｂｂｍＡｂ１、ｍＡｂ２、ｍＡｂ１又はｍＡｂ２及びｍＡｂ１の組み合わせ（Ｃｏｍｂｏ）による、全血中でのＬＰＳ（０．３μｇ／ｍＬ）／ＩＬ−１２誘導性ＩＦＮγの阻害を示す（典型的な阻害曲線は図６Ａで示す）。１００ｎＭで使用されるｂｂｍＡｂ１、ｍＡｂ１又はｍＡｂ２による全血中のｎ＝４の個々のドナーのパーセントＩＦＮγ阻害（平均及びＳＥＭは図６Ｂで示す）。
【０３１９】
ＩＦＮγは別として、発明者らの細胞アッセイにおいて、試験した他のサイトカイン（ＩＬ−２、−４、−６、−８、−１０、−１３及びＴＮＦα）の中でＩＬ−１β及びＩＬ−１８の中和の組み合わせにより相加的に阻害されたものはなかった（データは示さない）。ｂｂｍＡｂ１の効力は、二重特異性分子の１価方式を考慮すると、ｍＡｂ２及びｍＡｂ１の組み合わせ（コンボ）と同じ範囲であった。
【０３２０】
（ｂ）ＩＦＮγは、ＬＰＳ／ＩＬ−１２活性化ヒトＰＢＭＣにおいて単一ＩＬ−１β又はＩＬ−１８阻害と比較して、ｂｂｍＡｂ１（すなわちＩＬ−１β／ＩＬ−１８阻害の組み合わせ）により相加的に阻害された
ｂｂｍＡｂ１を使用したＩＬ−１β／ＩＬ−１８阻害の組み合わせによるさらなる相加的効果を明らかにするために（ＩＦＮγとは別）、バイアスがないトランスクリプトミクスの評価が必要とされた。全血はトランスクリプトミクス分析に最適ではないので、発明者らは、ヒトＰＢＭＣ試料に対して、上の材料及び方法セクションに記載のＬＰＳ／ＩＬ−１２刺激アッセイ条件を適応させた。全部で９名のドナーからのＰＢＭＣを使用することによって、発明者らは、ＰＢＭＣの上清へのＩＦＮγタンパク質分泌をｂｂｍＡｂ１が相加的に阻害したことを確認し得た（図７）。全血実験と比較して、およそ１０倍低い濃度の個々のｍＡｂを使用してＩＦＮγ産生を阻害した。重要なこととして、ＩＦＮγに対するｍＲＮＡレベルで同様の阻害パターンが明らかになり（図７）、これにより、非バイアスマイクロアレイに基づく遺伝子発現分析に対する試料の適切性が確認された。図７は、ヒトＰＢＭＣにおける、ｂｂｍＡｂ１、ｍＡｂ２及びｍＡｂ１（各１０ｎＭ濃度）による、ＬＰＳ（０．３μｇ／ｍＬ）／ＩＬ−１２誘導性ＩＦＮγタンパク質産生（図７Ａ）及びＩＦＮγ遺伝子発現（図７Ｂ）の阻害を示す。ｎ＝９ドナー±ＳＥＭでパーセント阻害を示す。＊＊＊ｐ＜０．０５（一元配置ＡＮＯＶＡ）。
【０３２１】
上の材料及び方法セクションに記載のＬＰＳ／ＩＬ−１２刺激実験から試料採取したＰＢＭＣからのｎ＝５のドナーでＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイを行った。残念ながら、遺伝子発現プロファイルの全体的な評価から、強力なＬＰＳ／ＩＬ−１２刺激効果が明らかになり、ＰＣＡは、刺激又は非刺激群内の化合物ではなく、ドナーごとのクラスタリングを示した。それにもかかわらず、差次的に発現される遺伝子についてのＬＰＳ／ＩＬ−１２刺激試料と刺激＋ｂｂｍＡｂ１との比較から、ｂｂｍＡｂ１でのＩＬ−１β／ＩＬ−１８遮断の組み合わせにより下方制御される遺伝子の最終候補リストが明らかになった（表１４）。発明者らのマイクロアレイデータを再検証したＩＦＮγ遺伝子の強力な下方制御とは別に、ＩＬ−２６遺伝子も、単一のＩＬ−１β阻害（ｍＡｂ２による）又はＩＬ−１８阻害（ｍＡｂ１による）と比較して、ｂｂｍＡｂ１により相加的に阻害されるさらなるサイトカイン遺伝子であった（図８参照）。図８及び図９は、ＩＦＮγ及びＩＬ−２６に対するマイクロアレイデータ由来の遺伝子発現レベル及び２４時間でのＬＰＳ（０．３μｇ／ｍＬ）／ＩＬ−１２刺激ＰＢＭＣにおけるｂｂｍＡｂ１、ｍＡｂ２及びｍＡｂ１（各１０ｎＭ）による阻害を示す。個々のドナーの値を図８Ａ（ＩＦＮγ）及び図８Ｂ（ＩＬ−２６）で示し、ｎ＝５のドナーからのパーセント阻害（平均±ＳＥＭ）を図９Ａ（ＩＦＮγ）及び図９Ｂ（ＩＬ−２６）で示す。
【０３２２】
【表１８】
2020524991.tif 000021
【０３２３】
（ｃ）ＩＬ−２６は、ＬＰＳ／ＩＬ−１２刺激ＰＢＭＣにおいてｂｂｍＡｂ１により相加的に阻害される別の炎症促進性サイトカインである
ｂｂｍＡｂ１を使用して、ＬＰＳ／ＩＬ−１２推進ＩＬ−２６遺伝子発現及びタンパク質産生がＩＬ−１β／ＩＬ−１８遮断の組み合わせにより最も効果的に阻害されることをさらに確認するために、全部でｎ＝９のＰＢＭＣドナーに試験を拡大し、ｑＰＣＲによりＩＬ−２６遺伝子発現を、及びＥＬＩＳＡによりＩＬ−２６タンパク質産生を調べた。図１０で示されるように、これにより、マイクロアレイアプローチを用いて得られるＩＬ−２６遺伝子発現の阻害が大きく確認された（図１０Ａ）。興味深いことに、上清中のＩＬ−２６タンパク質レベルは、ｍＡｂの添加によって、２４時間で部分的にしか低下しなかった（図１０Ｂ）。この相違に対する理由は不明であるが、ＩＬ−２６遺伝子発現とタンパク質産生の間の動的相違並びにＩＦＮγと比較したＩＬ−２６の消費の相違に関連し得る。それにもかかわらず、ｂｂｍＡｂ１は、ｍＡｂ２及びｍＡｂ１と比較して、ＰＢＭＣ上清中のＩＬ−２６タンパク質レベルを低下させる点で優れていた。図１０は、ヒトＰＢＭＣにおけるｂｂｍＡｂ１、ｍＡｂ２及びｍＡｂ１（各１０ｎＭ）によるＬＰＳ（０．３μｇ／ｍＬ）／ＩＬ−１２誘導性ＩＬ−２６遺伝子発現（ｑＰＣＲによる）（図１０Ａ）及びＩＬ−２６タンパク質レベル（図１０Ｂ）の阻害を示す。ｎ＝９の個々のＰＢＭＣドナーのパーセント阻害（平均及びＳＥＭ）。＊＊＊ｐ＜０．０５（一元配置ＡＮＯＶＡ）。
【０３２４】
（ｄ）ＩＬ１β／ＩＬ１８シグナル伝達シグネチャーは疾患と相関する
組み換えＩＬ−１β刺激の結果、ＩＬ−６産生が起こるか、又は組み換えＩＬ−１８／ＩＬ−１２刺激の結果、ＩＦＮγ産生が起こる、以前に確立されたＰＢＭＣ培養条件を合わせて、相加的若しくは相乗的な下流標的遺伝子又はシグネチャーを明らかにした（データは示さない）。異なる２回の時点（６時間及び２４時間）で試料採取したｎ＝４のドナーからのＰＢＭＣを用いて、遺伝子発現プロファイルの偏向のない評価に対するＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイ評価を行った。ＩＬ−１β及びＩＬ−１８による刺激の組み合わせを用いて６時間及び２４時間で相乗的に上方制御された遺伝子を明らかにした（データは示さない）。ＩＬ−１β／ＩＬ−１８の組み合わせへのＩＬ−１２の付加によって、上方制御された一連の遺伝子に対する相乗作用が大きく向上した。いくつかの自己免疫疾患にわたる患者由来のデータセットを調べるために、単一又は組み合わせたＩＬ−１β／ＩＬ−１８経路刺激（上方制御遺伝子のみ）の、生成されたシグナル伝達シグネチャーを使用した。例えば、公開サルコイドーシスデータセットに対する相関が図１１の例として示される。Ｐ値（フィッシャーの直接検定で計算）は、サルコイドーシス患者由来の疾患組織と健康な組織を比較するいくつかの公表されている試験に対する有意な相関を示す。組織としては、皮膚並びに肺、涙腺及び眼窩前部が挙げられる。全てのデータセットにわたり、ＩＬ１β／ＩＬ１８シグナル伝達の組み合わせが疾患に対する最良の相関を示し、ＩＬ−１β及びＩＬ−１８がそれに続く。５つの異なるサルコイドーシス組織「疾患対健康」ＤＥＧと比較して、ＰＢＭＣ（ｘ−軸）においてＩＬ−１β／ＩＬ−１８は差次的に遺伝子（ＤＥＧ）を上方制御する。Ｐ値（ｙ−軸）は、シグネチャーと「疾患遺伝子リスト」との間の重複を認める統計学的有意性を表す。黒いバーは、皮膚サルコイドーシス病変由来の皮膚対健常者由来の皮膚である。灰白色バーは、皮膚サルコイドーシス病変由来の皮膚対非病変皮膚である。白色のバーは、サルコイドーシス患者由来の涙腺対正常涙腺である。暗灰色のバーは、サルコイドーシス患者由来の眼窩前部対正常である。ストライプのバーは、進行性の線維化、肺サルコイドーシスを有する肺試料対結節状の自然治癒肺サルコイドーシスを有する肺試料である。
【０３２５】
（ｅ）結論
インビトロ培養の最初の２４時間内の病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）依存性のＮＬＲＰ３インフラマソーム活性化を模倣するために、ＬＰＳ及び組み換えＩＬ−１２を使用した。ｂｂｍＡｂ１を使用することによるＩＬ−１β及びＩＬ−１８の阻害の組み合わせは、ＬＰＳ／ＩＬ−１２で刺激したＰＢＭＣでのＩＦＮγ産生を相加的に低下させる／阻害するように作用することが明らかになった。ＩＬ−１２は、ＩＬ−１８と相乗的に作用して、（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，２００１により概説されるように）Ｔ、Ｂ、ＮＫ細胞、マクロファージ及び樹状細胞においてＩＦＮγ産生を誘導することが以前記載されたが、今回、ＩＦＮγ産生におけるＩＬ−１βのさらなる刺激効果が使用した実験条件下で明らかにされ得た。したがって、ＬＰＳ／ＩＬ−１２とのＰＢＭＣの同時温置は、両方とも強力なＩＦＮγ応答に寄与する「ネイティブ」ＩＬ−１β及びＩＬ−１８の産生を効果的に推進する。非バイアスマイクロアレイトランスクリプトミクスを使用することによって、単一のＩＬ−１β又はＩＬ−１８遮断に対して、ＩＬ−１β／ＩＬ−１８中和の組み合わせにより相加的に下方制御されたさらなる遺伝子が同定された。殆どの脊椎動物種で保存されるが（マウス及びラットを含む）殆どのげっ歯類系列には存在しないＩＬ−２０サイトカインサブファミリー（ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２２、ＩＬ−２４及びＩＬ−２６）のメンバーの中でもとりわけＩＬ−２６であった（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ２０１０）。これは、ＩＬ−２０Ｒ１及びＩＬ−１０Ｒ２鎖から構成されるヘテロ二量体受容体複合体を通じてシグナル伝達する。ＩＬ−２６受容体は、非血球細胞型、特に上皮細胞で主に発現される。ＲＡ患者の血清及び特に滑液中でＩＬ−２６のレベル上昇が報告されたが（Ｃｏｒｖａｉｓｉｅｒ  ２０１２）、これはＴｈ１７細胞増殖及び分化を促進するための因子として作用し得る。残念ながら、ＩＬ−１β及びＩＬ−１８の組み合わせ遮断により誘導されるさらなる遺伝子／経路の発見は、ＰＢＭＣ試料のＬＰＳ／ＩＬ−１２刺激の強力な効果により妨害された。それにもかかわらず、ＩＦＮγ及びＩＬ−２６の両者とも、ＩＬ−２２もある程度まで、ＰＢＭＣでの組み換えＩＬ−１β及びＩＬ−１８での刺激の組み合わせにより相乗的に上方制御された遺伝子の中にあり、このことから、この活性化経路においてこれらの２つの要因が下流エフェクターであることが確認される。したがって、（ＩＬ−２６及びＩＬ−２２を含む）サイトカインのＩＬ−２０サブファミリーが、ＩＬ−１β及びＩＬ−１８からの同時シグナルに強く依存すると思われる。個々のシグナル伝達シグネチャーの選択性並びに潜在的な遮断効果に関して然るべき注意を払い、これらの比較は、個々の経路がサルコイドーシスのような疾患において活性があることを示すのに有用である。
【０３２６】
８．実施例４：治療での使用
ＩＬ−１β及びＩＬ−１８の複合標的化は、自然及び適応免疫要素の両方が関与するインフラマソーム推進性の炎症状態において、単一サイトカイン遮断よりも効果的な処置ストラテジーを与え得る。ＩＬ−１β及びＩＬ−１８の同時中和は、免疫及び内皮細胞及び炎症促進性サイトカイン（例えばＩＬ−６、ＩＦＮγ及びＩＬ−１７）における好中球、Ｔｈ１／Ｔｃ１及びＮＫ細胞、接着分子を含む自然及び適応免疫要素の両方を標的とする。ＩＬ−１β及びＩＬ−１８の両方を遮断する長所は、構成的なＮｌｒｐ３インフラマソーム活性化及びＩＬ−１β及びＩＬ−１８の過剰産生により推進される家族性寒冷自己免疫症候群（ＦＣＡＳ）の前臨床マウスモデルにおいて得られるデータにより裏付けられる（Ｂｒｙｄｇｅｓ  ２０１３）。ＩＬ−１β又はＩＬ−１８シグナル伝達の何れかが遺伝的に消された場合にマウスにおいてＦＣＡＳ状態からの部分的レスキューが達成され、これにより、疾患の病態形成における両サイトカインの関与が示される。重要なこととして、ＩＬ−１８及びＩＬ−１βシグナル伝達の両方を欠くＦＣＡＳマウスは、この２つのサイトカインのうち一方のみが不活性化されたマウスと比較して疾患の発現がさらに低く、このことから、二重ＩＬ−１β／ＩＬ−１８中和の相加的効果が明らかになる。敗血症ショックを引き起こすために高用量のＬＰＳをマウスに注射した別のマウスモデルにおいてもＩＬ−１β及びＩＬ−１８中和の相加的効果が明らかになった（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇｈｅ  ２０１４）。このモデルにおいて、ＩＬ−１β及びＩＬ−１８の両方又は中和抗体による両サイトカインの複合中和に対する遺伝的欠損の何れも、ＬＰＳの致死性を完全に防ぎ、一方で単一サイトカイン欠乏／中和は部分的にしか防げなかった。
【０３２７】
ＩＬ−１β及びＩＬ−１８の両方を同時に標的とする二重特異性に対する全体的な臨床ストラテジーは、現在利用可能な選択肢よりも効果的な処置手段に相当し得る。候補疾患を同定するために、前臨床及びトランスレーショナル研究を利用して、候補疾患の基本的な病態生理学におけるＩＬ−１β及びＩＬ−１８両方の下流経路の能動的な関与を明らかにした。慢性肺サルコイドーシスが、自然及び適応免疫の両方の関与があるインフラマソーム駆動型疾患であるという新規の証拠がある。さらに、最初の知見から、この疾患においてＩＬ−１β及びＩＬ−１８エフェクターサイトカインの両方に対する重要な役割が示される。したがって、サルコイドーシスは、確立された慢性組織炎症がある疾患においてｂｂｍＡｂ１の二重特異性を明らかにするための理想的な機会に相当する。サルコイドーシスにおけるｂｂｍＡｂ１の効果は、シリカ又はベリリウムによる過敏性（職業性）肺疾患などの他の間質性肺疾患での進歩につながり得る。他の候補疾患は、クローン病など、他の器官の組織を含む肉芽腫性炎症である。
【０３２８】
組織損傷及び内皮機能不全を伴う血管炎症もｂｂｍＡｂ１に対する潜在的な標的に相当する。機能障害性内皮細胞は有効な抗炎症処置に応答し得、その結果、固定された血管内欠損の存在下でさえも血流を改善する。最近の文献の証拠により、鎌状赤血球症（ＳＣＤ）が、構成的な血管内溶血の比率が高いことを介して強力なインフラマソーム駆動型の成分を有することが同定された。慢性的なＲＢＣ溶解からの危険信号（尿酸、ヘム／Ｆｅ３＋、他の細胞内成分）の放出ゆえのインフラマソーム活性化はインフラマソーム受容体、その活性化を惹起し、血管内炎症カスケードにつながり、内皮細胞接着分子の上方制御、好中球及び血小板の活性化をもたらし、その結果、内皮細胞の慢性的な活性化が起こる。ＳＣＤ患者におけるこの絶え間のない血管炎症は、反復性で疼痛のある血管閉塞性の発作及び慢性組織障害の急性増悪につながる。予備的な内的証拠から、ＳＣＤの基本的な疾患過程におけるＩＬ−１８並びにＩＬ−１βの関与に対する裏付けが与えられる。したがって、ｂｂｍＡｂ１処置によるＳＣＤ患者における基礎的な炎症の軽減は、付随する慢性痛及び疲労を軽減することによって患者の全体的なクオリティーオブライフを向上させながら、慢性の背景にある炎症を減弱させ、関連する末端器官障害を伴う急性発作を防ぎ、急性鎌状赤血球発作及び関連する末端器官障害を防ぎ得る。ＳＣＤ患者におけるｂｂｍＡｂ１の治療効果の実証は、マラリア及び血液透析依存性慢性腎臓病など、高率の溶血を含む他の慢性又は急性増悪した慢性炎症性状態における進歩につながり得る。さらに、ＩＬ−１β及びＩＬ−１８の両方の調整から利益を得ることができる適応症は、虚血再灌流組織傷害、例えば心血管系疾患又は全てのタイプの創傷、特に最も重篤な熱傷の軟組織傷害の治癒の改善などと関連する適応症である。
【０３２９】
したがって、本発明の実施形態において、インフラマソーム関連障害を処置する方法は、インフラマソーム関連障害に罹患している対象に、有効量の本明細書中で開示されるｂｂｍＡｂ、例えばｂｂｍＡｂ１などを投与することを含む。潜在的なインフラマソーム関連障害は、クリオピリン関連自己免疫症候群（ＣＡＰＳ）、家族性地中海熱（ＦＭＦ）、全身型若年性特発性関節炎（ＳＪＩＡ）、狼瘡腎炎、糖尿病性ニューロパチー、急性腎臓傷害、腎臓高血圧、ＩｇＡ腎症、糸球体腎炎（ＧＮ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、てんかん、脳卒中、パーキンソン病（ＰＤ）、うつ、サルコイドーシス、例えば肺サルコイドーシスなど、膵炎、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、アテローム性硬化症、巨細胞動脈炎、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連脈管炎、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、移植片対宿主疾患、２型糖尿病、ざ瘡、鎌状赤血球症、脈管障害、虚血再灌流傷害、循環器疾患、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、アテローム性硬化症、脈管機能不全、骨格筋虚血、線維症、マラリア、血液透析依存性慢性腎臓病又はクローン病である。
【０３３０】
一実施形態において、有効量の本明細書中で開示されるｂｂｍＡｂ、例えばｂｂｍＡｂ１などを対象に投与することによって、対象において鎌状赤血球症、脈管障害、虚血再灌流傷害、循環器疾患、末梢動脈疾患、アテローム性硬化症、脈管機能不全、骨格筋虚血、肺サルコイドーシス、線維症、マラリア、血液透析依存性慢性腎臓病又はクローン病を処置する方法が提供される。
【０３３１】
９．実施例５：医薬組成物
薬学的に許容可能な担体と一緒に処方されるｂｂｍＡｂ１などのｂｂｍＡｂ抗体を含む医薬組成物が本明細書中で提供される。本組成物は、医学的状態を処置するのに適切である１つ以上の他の治療剤をさらに含有し得る。薬学的に許容可能な担体は、本組成物を増強若しくは安定化するか、又は本組成物の調製を推進するために使用され得る。薬学的に許容可能な担体としては、生理学的に適合する、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延剤などが挙げられる。
【０３３２】
本明細書中に記載の医薬組成物は、当技術分野で公知の様々な方法により投与され得る。投与経路及び／又は方式は所望の結果に依存して変動する。投与が硝子体内、静脈内、筋肉内、腹腔内若しくは皮下であるか、又は標的部位に対して近位で投与されることが好ましい。薬学的に許容可能な担体は、硝子体内、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄又は上皮投与（例えば注射又は点滴による）に適切であるはずである。投与経路に依存して、活性化合物、すなわちｂｂｍＡｂは、本化合物を不活性化し得る酸及び他の天然の状態の作用から本化合物を保護するための材料においてコーティングされ得る。
【０３３３】
本組成物は滅菌性及び流動性であるべきである。例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散の場合は必要とされる粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって、適正な流動性が維持され得る。多くの場合において、本組成物中で、等張剤、例えば糖、ポリアルコール、例えばマンニトール又はソルビトールなど、及び塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射可能な組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム又はゼラチンを本組成物中で含むことによりもたらされ得る。
【０３３４】
本明細書中に記載の医薬組成物は、当技術分野で周知であり、通常実施される方法に従い、調製され得る。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，２０ｔｈ  ｅｄ．，２０００；及びＳｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７８を参照。医薬組成物は、好ましくはＧＭＰ条件下で製造される。一般的には、本明細書中に記載の医薬組成物において、ｂｂｍＡｂの治療的有効用量又は有効な用量が使用される。ｂｂｍＡｂは、当業者にとって公知の従来の方法によって薬学的に許容可能な剤型に処方される。最適な所望の応答（例えば治療応答）を提供するために、投与計画が調整される。例えば、単回ボーラスが投与され得るか、ある時間にわたり数回の分割用量が投与され得るか、又は用量を比例的に減少させ得るか、又は治療状況の緊急事態により示される場合は増加させ得る。投与の容易さ及び投与量の均一性のための剤型で非経口組成物を処方することは特に有利である。単位剤型は、本明細書中で使用される場合、処置しようとする対照に対して単位投与量として適した物理的に分離される単位を指し；各単位は、必要とされる医薬担体に関連する所望の治療効果を生じさせるために計算される活性化合物の所定量を含有する。
【０３３５】
本明細書中に記載の医薬組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、患者に対する毒性なく、特定の患者、組成物及び投与方式に対する所望の治療応答を達成するのに有効である活性成分の量を得るために変動させ得る。選択される投与量レベルは、使用される本明細書中に記載の特定の組成物又はそのエステル、塩若しくはアミドの活性、投与経路、投与時間、使用される特定の化合物の排泄速度、処置の持続時間、使用される特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物及び／又は材料、処置される患者の、年齢、性別、体重、状態、総体的健康状態及び以前の病歴などの要因を含む、様々な薬物動態学的要因に依存する。
【０３３６】
医師又は獣医師は、所望の治療効果を達成するのに必要とされるものよりも低いレベルで本医薬組成物中で使用される本明細書中に記載の抗体の投与を開始し、所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増加させ得る。一般に、本明細書中に記載の消耗疾患の処置のための本明細書中に記載の組成物の有効用量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるか又は動物であるか、投与される他の医薬品及び処置が予防的であるか又は治療的であるかを含め、多くの様々な要因に依存して変動する。処置投与量は、安全性及び効力を最適化するために滴定する必要がある。抗体での全身投与の場合、投与量は、約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ宿主体重、より一般的には０．０１〜１５ｍｇ／ｋｇ宿主体重の範囲である。抗体での硝子体内投与の場合、投与量は、０．１ｍｇ／眼〜５ｍｇ／眼の範囲であり得る。代表的な処置計画は、２週間に１回又は１か月に１回又は３〜６か月に１回の全身投与を伴う。代表的な処置計画は、２週間に１回又は１か月に１回又は３〜６か月に１回又は必要時の（ＰＲＮ）全身投与を伴う。
【０３３７】
生物学的治療剤、例えばｂｂｍＡｂ１などは、通常複数回投与される。単回投与間の間隔は、１週間、１か月又は１年であり得る。間隔は、患者においてｂｂｍＡｂ１の血中レベルを測定することによって適応があれば不規則でもあり得る。さらに代替的投与間隔は、医師により決定され得、１か月に１回又は有効となるために必要に応じて投与され得る。全身投与のいくつかの方法において、１〜１０００μｇ／ｍＬ、一部の方法では２５〜５００μｇ／ｍＬ、の血漿抗体濃度を達成するために投与量が調整される。あるいは、抗体は徐放性処方物として投与され得、この場合、必要とされる投与頻度はより低い。投与量及び頻度は、患者において抗体の半減期に依存して変動する。一般に、ヒト抗体が示す半減期はキメラ抗体及び非ヒト抗体よりも長い。投与量及び投与頻度は、処置が予防的であるか又は治療的であるかに依存して変動し得る。予防適用において、長期間にわたり、比較的低頻度の間隔で比較的低い投与量が投与される。一部の患者は、生涯にわたり処置を受け続ける。治療適用において、比較的短い間隔での比較的高い投与量は、疾患の進行が軽減されるか又は終止するまで、好ましくは患者が疾患の症状の部分的又は完全な寛解を示すまで、必要とされることがある。その後、患者に予防的投与計画を行い得る。
【０３３８】
配列表
本発明を実施するための有用なアミノ酸及びヌクレオチド配列を表１５で開示する。
【０３３９】
【表１９】
2020524991.tif 000022
【０３４０】
【表２０】
2020524991.tif 000023
【０３４１】
【表２１】
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【０３４２】
【表２２】
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【０３４３】
【表２３】
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【０３４４】
【表２４】
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【０３４５】
【表２５】
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【０３４６】
【表２６】
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【０３４７】
【表２７】
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【０３４８】
【表２８】
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【０３４９】
【表２９】
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【０３５０】
【表３０】
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【０３５１】
【表３１】
2020524991.tif 000034
【０３５２】
【表３２】
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【０３５３】
【表３３】
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【０３５４】
【表３４】
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【０３５５】
【表３５】
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【０３５６】
【表３６】
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【０３５７】
【表３７】
2020524991.tif 000040
【０３５８】
本願の文章全体にわたり、本願の文章（例えば表１５）と配列リストとの間に矛盾がある場合、本願の文章が優先する。
【図１】
2020524991.tif 000041
【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年2月6日(2020.2.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
共通の宿主細胞における同時発現に適切な二重特異性抗体であって、
ａ．第１の標的に特異的に結合するラムダ野生型の第１の可変軽鎖（ＶＬ１）及び野生型の第１の可変重鎖（ＶＨ１）と、ヘテロ二量体化修飾を有する第１の定常重鎖（ＣＨ１）とを有する免疫グロブリンである第１の部分と、
ｂ．前記第１の標的とは異なる第２の標的に特異的に結合するカッパ野生型の第２の可変軽鎖（ＶＬ２）及び野生型の第２の可変重鎖（ＶＨ２）と、前記第１の定常重鎖のヘテロ二量体化修飾と相補的であるヘテロ二量体化修飾を有する第２の定常重鎖（ＣＨ２）とを有する免疫グロブリンである第２の部分と、
を含み、
前記第１の部分及び前記第２の部分が、共通の宿主細胞において同時発現される場合、二重特異性抗体を形成し、前記第１及び第２の定常重鎖が、ヒトＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭ、好ましくはＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＧ、例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４など、好ましくはＩｇＧ１であり、前記第１の可変軽鎖がラムダ１型であり、前記第２の可変軽鎖がカッパ６型である、二重特異性抗体。
【請求項２】
前記第１及び第２の定常重鎖がＩｇＧ１であり、
ａ．前記第１の定常重鎖がノブ構造を生成させる点突然変異を有し、前記第２の定常重鎖がホール構造を生成させる点突然変異を有するか、又は
ｂ．前記第１の定常重鎖がホール構造を生成させる点突然変異を有し、前記第２の定常重鎖がノブ構造を生成させる点突然変異を有し、場合によっては、
ｃ．前記第１及び第２の定常重鎖が、ジスルフィド架橋を生じさせる突然変異を有する、請求項１に記載の二重特異性抗体。
【請求項３】
第１の免疫グロブリンＶＨ１ドメイン、第１の免疫グロブリンＶＬ１ドメイン、第２の免疫グロブリンＶＨ２ドメイン及び第２の免疫グロブリンＶＬ２ドメインを含み、
ａ．前記第１の免疫グロブリンＶＨ１ドメインが（例えば配列中）：
ｉ．ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号７６を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号７７を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号７８を有する、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３；又は
ｉｉ．ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号７９を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号８０を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号８１を有する、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３
を含み；
ｂ．前記第１の免疫グロブリンＶＬ１ドメインが（例えば配列中に）：
ｉ．ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号９２を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号９３を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号９４を有する、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３又は
ｉｉ．ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号９５を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号９６を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号９７を有する、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３
を含み；
ｃ．前記第２の免疫グロブリンＶＨ２ドメインが（例えば配列中に）：
ｉ．ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号４４を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号４５を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号４６を有する、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３；又は
ｉｉ．ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号４７を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号４８を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号４９を有する、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３
を含み、
ｄ．前記第２の免疫グロブリンＶＬ２ドメインが（例えば配列中に）：
ｉ．ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号６０を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号６１を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号６２を有する、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３又は
ｉｉ．ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号６３を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号６４を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号６５を有する、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３
を含む、請求項１又は２に記載の二重特異性抗体。
【請求項４】
第１の免疫グロブリンＶＨ１ドメイン、第１の免疫グロブリンＶＬ１ドメイン、第２の免疫グロブリンＶＨ２ドメイン及び第２の免疫グロブリンＶＬ２ドメインを含み、
ａ．前記第１の免疫グロブリンＶＨ１ドメインがアミノ酸配列の配列番号８５を含み、
ｂ．前記第１の免疫グロブリンＶＬ１ドメインがアミノ酸配列の配列番号１０１を含み、
ｃ．前記第２の免疫グロブリンＶＨ２ドメインがアミノ酸配列の配列番号５３を含み、
ｄ．前記第２の免疫グロブリンＶＬ２ドメインがアミノ酸配列の配列番号６９を含む、
請求項１〜３の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項５】
第１の免疫グロブリン重鎖、第１の免疫グロブリン軽鎖、第２の免疫グロブリン重鎖及び第２の免疫グロブリン軽鎖を含み、
ａ．前記第１の免疫グロブリン重鎖がアミノ酸配列の配列番号８７を含み、
ｂ．前記第１の免疫グロブリン軽鎖がアミノ酸配列の配列番号１０３を含み、
ｃ．前記第２の免疫グロブリン重鎖がアミノ酸配列の配列番号５５を含み、
ｄ．前記第２の免疫グロブリン軽鎖がアミノ酸配列の配列番号７１を含む、
請求項１〜４の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項６】
請求項１〜５の何れか一項に記載の二重特異性抗体を選択するための方法であって、
ａ．前記第１の部分及び前記第２の部分を選択する第１のステップと；
ｂ．共通の宿主細胞において前記第１の部分及び前記第２の部分を同時発現させ、その結果、前記第１の部分及び前記第２の部分を含む二重特異性抗体を生じさせる第２のステップと；
ｃ．正確に適合した二重特異性抗体からミスマッチ断片を除去することによって前記二重特異性抗体を精製する第３のステップと、
を含む方法。
【請求項７】
精製の第３のステップの結果、少なくとも６０％（質量）、７０％（質量）、８０％（質量）、８５％（質量）純粋、例えば少なくとも９０％（質量）純粋、９５％（質量）、９６％（質量）、９７％（質量）、９８％（質量）又は９９％（質量）純粋である二重特異性抗体が生じる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
共通の宿主細胞での同時発現により請求項１〜５の何れか一項に記載の二重特異性抗体を作製するための方法であって、
ａ．前記第１の部分及び前記第２の部分をコードする少なくとも１つのベクターを生成させる第１のステップと；
ｂ．前記少なくとも１つのベクターを前記共通の宿主細胞に導入する第２のステップと；
ｃ．前記二重特異性抗体を特異的に発現する細胞を選択する第３のステップと；
ｄ．前記細胞が前記二重特異性抗体を発現する条件下で前記選択した細胞を培養する第４のステップと；
ｅ．少なくとも６０％（質量）、７０％（質量）、８０％（質量）又は８５％（質量）純粋である、例えば少なくとも９０％（質量）純粋、９５％（質量）、９６％（質量）、９７％（質量）、９８％（質量）又は９９％（質量）純粋である前記二重特異性抗体を精製する第５のステップと、
を含む方法。
【請求項９】
前記第１のステップが、前記第１の部分をコードする第１のベクター及び前記第２の部分をコードする第２のベクターを生成させることを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜５の何れか一項に記載の二重特異性抗体の前記第１の部分又は前記第２の部分をコードするポリヌクレオチドと、選択可能マーカーとを含む、少なくとも１つのベクターを含む、発現系。
【請求項１１】
ａ．第１の選択可能マーカー（ｓｍ  Ｉ）をコードするポリヌクレオチドと；
ｂ．前記第１の選択可能マーカー（ｓｍ  Ｉ）とは異なる第２の選択可能マーカー（ｓｍ  ＩＩ）をコードするポリヌクレオチドと、
を含む、請求項１０に記載の発現系。
【請求項１２】
前記第１の選択可能マーカー（ｓｍ  Ｉ）が葉酸輸送体又は突然変異した葉酸受容体をコードするポリヌクレオチドであり、前記突然変異した葉酸受容体の葉酸結合親和性が、野生型葉酸受容体と比較して低下しており、前記第２の選択可能マーカー（ｓｍ  ＩＩ）がＤＨＦＲである、請求項１０又は１１に記載の発現系。
【請求項１３】
前記第１の選択可能マーカー（ｓｍ  Ｉ）がハイグロマイシンであり、前記第２の選択可能マーカー（ｓｍ  ＩＩ）がＮｅｏ／Ｇ４１８である、請求項１０〜１２の何れか一項に記載の発現系。
【請求項１４】
２つの発現ベクターを含み、
ａ．第１のベクターが、少なくとも第１の選択可能マーカー（ｓｍ  Ｉ）をコードするポリヌクレオチドと、少なくとも前記第１の部分をコードするポリヌクレオチドと、を含み；
ｂ．第２のベクターが、少なくとも第２の選択可能マーカー（ｓｍ  ＩＩ）をコードするポリヌクレオチドと、少なくとも前記第２の部分をコードするポリヌクレオチドと、を含む、
請求項１０〜１３の何れか一項に記載の発現系。
【請求項１５】
重鎖をコードするポリヌクレオチドの下流の停止コドンと、前記停止コドンの下流に位置する免疫グロブリン膜アンカーをコードするポリヌクレオチドと、を含む、請求項１０〜１４の何れか一項に記載の発現系。
【請求項１６】
請求項６〜９の何れか一項に記載の方法における使用のための共通の宿主細胞を選択するための方法であって、
ａ．請求項１０〜１５の何れか一項に記載の発現系を含む、複数の宿主細胞を提供する第１のステップと；
ｂ．前記選択可能マーカーに対して選択的な条件下で前記複数の宿主細胞を培養し、それによって対象となる生成物を発現する宿主細胞を得ることと、
を含む、方法。
【請求項１７】
ａ．葉酸の制限濃度を含む；及び／又は
ｂ．５００ｎＭ以下の濃度で葉酸を含む；及び／又は
ｃ．
ｉ．１０００ｎＭ〜１００ｐＭ；
ｉｉ．１００ｎＭ〜１ｎＭ；
ｉｉｉ．１５ｎＭ〜１ｎＭ；
ｉｖ．１０ｎＭ〜１ｎＭ；及び
ｖ．１０ｎＭ〜２．５ｎＭ
から選択される濃度で葉酸を含む；及び／又は
ｄ．ＤＨＦＲ阻害剤を含む；及び／又は
ｅ．抗葉酸剤を含む；及び／又は
ｆ．５００ｎＭ以下の濃度で抗葉酸剤を含む；及び／又は
ｇ．
ｉ．５００ｎＭ〜３ｎＭ；
ｉｉ．１００ｎＭ〜１０ｎＭ；
ｉｉｉ．５０ｎＭ〜１０ｎＭ；及び
ｉｖ．５０ｎＭ
から選択される濃度でＭＴＸを含む；及び／又は
ｈ．葉酸濃度の２０倍までの抗葉酸剤の濃度を含む；及び／又は
ｉ．葉酸濃度の１０〜２０倍の抗葉酸剤の濃度を含む；及び／又は
ｊ．１５ｎＭ以下の濃度の葉酸と、等モル〜２０倍までの濃度のＭＴＸとを含む、
選択培地が使用される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記宿主細胞が、請求項１５に記載の発現系を含み、前記第１の部分又は第２の部分の少なくとも一部が、前記免疫グロブリン膜貫通アンカー又はそれらの断片を含む融合ポリペプチドとして発現され、前記融合ポリペプチドが前記宿主細胞の表面上で提示され、
ａ．前記融合ポリペプチドに結合する検出化合物と前記複数の宿主細胞をを接触させ；
ｂ．細胞表面に結合した前記検出化合物の存在又は量に基づいて少なくとも１つの宿主細胞を選択する、
ステップをさらに含む、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記検出化合物が、前記第１若しくは第２の標的又はその誘導体及び少なくとも１つの検出標識を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記二重特異性抗体を精製する前記第５のステップが、アフィニティークロマトグラフィー及び／又はイオン交換クロマトグラフィーを含む、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項２１】
前記クロマトグラフィーが、
ａ．捕捉を行う第１のステップと；
ｂ．ポリッシングを行う第２のステップと；場合によっては
ｃ．さらなるポリッシングを行う第３のステップと、
を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
捕捉を行う前記第１のステップが、Ｆｃ−結合アフィニティークロマトグラフィー、例えばプロテインＡ又はプロテインＧなど、ラムダ軽鎖特異的アフィニティークロマトグラフィー、例えばＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）など、カッパ軽鎖特異的アフィニティークロマトグラフィー、例えばＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（商標）など、抗イディオタイプアフィニティークロマトグラフィー、例えば前記第１の部分又は前記第２の部分など、標的に基づくアフィニティークロマトグラフィー、例えば前記第１の標的又は第２の標的を用いるアフィニティークロマトグラフィーなど、イオン交換クロマトグラフィー、例えばＣａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ又はＦｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＥＭＤ  ＳＯ３など及び疎水性相互作用クロマトグラフィーからなる群から選択される原理で行われる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ポリッシングを行う前記第２のステップが、Ｆｃ−結合アフィニティークロマトグラフィー、例えばプロテインＡ又はプロテインＧなど、ラムダ軽鎖特異的アフィニティークロマトグラフィー、例えばＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）など、カッパ軽鎖特異的アフィニティークロマトグラフィー、例えばＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（商標）など、抗イディオタイプアフィニティークロマトグラフィー、例えば前記第１の部分又は前記第２の部分など、標的に基づくアフィニティークロマトグラフィー、例えば前記第１の標的又は第２の標的を用いるアフィニティークロマトグラフィーなど、イオン交換クロマトグラフィー、例えばＣａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ又はＦｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＥＭＤ  ＳＯ３など、疎水性相互作用クロマトグラフィー及びウイルス不活性化からなる群から選択される原理で行われる、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２４】
さらなるポリッシングを行う前記第３のステップが、Ｆｃ−結合アフィニティークロマトグラフィー、例えばプロテインＡ又はプロテインＧなど、ラムダ軽鎖特異的アフィニティークロマトグラフィー、例えばＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）など、カッパ軽鎖特異的アフィニティークロマトグラフィー、例えばＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（商標）など、抗イディオタイプアフィニティークロマトグラフィー、例えば前記第１の部分又は前記第２の部分など、標的に基づくアフィニティークロマトグラフィー、例えば前記第１の標的又は第２の標的を用いるアフィニティークロマトグラフィーなど、イオン交換クロマトグラフィー、例えばＣａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ又はＦｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＥＭＤ  ＳＯ３など、疎水性相互作用クロマトグラフィー及びウイルス不活性化単独又はそれらの組み合わせからなる群から選択される原理で行われる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ａ．ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅ（商標）などのプロテインＡ捕捉の第１のステップ、ＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）などのラムダ軽鎖アフィニティークロマトグラフィーの第２のステップ及びＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（商標）などのカッパ軽鎖アフィニティークロマトグラフィーの第３のステップ；又は
ｂ．ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅ（商標）などのプロテインＡの第１のステップ、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（商標）などのカッパ軽鎖アフィニティークロマトグラフィーの第２のステップ及びＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）などのラムダ軽鎖アフィニティークロマトグラフィーの第３のステップ；又は
ｃ．ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（商標）などのカッパ軽鎖アフィニティークロマトグラフィーの第１のステップ及びＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）などのラムダ軽鎖アフィニティークロマトグラフィーの第２のステップ；又は
ｄ．ＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）などのラムダ軽鎖アフィニティークロマトグラフィーの第１のステップ及びＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（商標）などのカッパ軽鎖アフィニティークロマトグラフィーの第２のステップ
から選択される、請求項２１〜２４の何れか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞系が、ＣＨＯ細胞、非産生ハイブリドーマ、例えばＳｐ２／０又はＮＳ０など、ヒト由来細胞系、例えばＨＥＫ又はＰＥＲ．Ｃ６など、新生児ハムスター腎臓（ＢＨＫ）誘導体、酵母又は糸状菌、原核細菌、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又はシュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）など、植物誘導体、藻類及び繊毛虫類からなる群から選択される、請求項６〜９及び１６〜２５の何れか一項に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１〜５の何れか一項に記載の抗体と、薬学的に許容可能な担体と、を含む、医薬組成物。
【請求項２８】
医薬としての使用のための、請求項１〜５の何れか一項に記載の二重特異性抗体又は請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
インフラマソーム関連疾患の処置への使用のための、請求項１〜５の何れか一項に記載の二重特異性抗体又は請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
前記インフラマソーム関連疾患が、鎌状赤血球症、脈管障害、虚血−再灌流傷害、循環器疾患、末梢動脈疾患、アテローム性硬化症、脈管機能不全、骨格筋虚血、肺サルコイドーシス、線維症、マラリア、血液透析依存性慢性腎臓病及びクローン病からなる群から選択される、請求項３１に記載のインフラマソーム関連疾患の処置への使用のための請求項１〜５の何れか一項に記載の二重特異性抗体又は請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
請求項１〜５に記載の二重特異性抗体又は請求項２７に記載の医薬組成物の、インフラマソーム関連障害を処置するための医薬の製造への使用。
【請求項３２】
前記インフラマソーム関連障害が、鎌状赤血球症、脈管障害、虚血−再灌流傷害、循環器疾患、末梢動脈疾患、アテローム性硬化症、脈管機能不全、骨格筋虚血、肺サルコイドーシス、線維症、マラリア、血液透析依存性慢性腎臓病又はクローン病である、請求項３１に記載の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３５８】
本願の文章全体にわたり、本願の文章（例えば表１５）と配列リストとの間に矛盾がある場合、本願の文章が優先する。
また、本発明は以下を提供する。
［１］
共通の宿主細胞における同時発現に適切な二重特異性抗体であって、
ａ．第１の標的に特異的に結合するラムダ野生型の第１の可変軽鎖（ＶＬ１）及び野生型の第１の可変重鎖（ＶＨ１）と、ヘテロ二量体化修飾を有する第１の定常重鎖（ＣＨ１）とを有する免疫グロブリンである第１の部分と、
ｂ．前記第１の標的とは異なる第２の標的に特異的に結合するカッパ野生型の第２の可変軽鎖（ＶＬ２）及び野生型の第２の可変重鎖（ＶＨ２）と、前記第１の定常重鎖のヘテロ二量体化修飾と相補的であるヘテロ二量体化修飾を有する第２の定常重鎖（ＣＨ２）とを有する免疫グロブリンである第２の部分と、
を含み、
前記第１の部分及び前記第２の部分が、共通の宿主細胞において同時発現される場合、二重特異性抗体を形成する、二重特異性抗体。
［２］
前記第１及び第２の定常重鎖が、ヒトＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭ、好ましくはＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＧ、例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４など、好ましくはＩｇＧ１である、［１］に記載の二重特異性抗体。
［３］
前記第１の可変軽鎖がラムダ１型であり、前記第２の可変軽鎖がカッパ６型である、［２］に記載の二重特異性抗体。
［４］
前記第１及び第２の定常重鎖がＩｇＧ１であり、
ａ．前記第１の定常重鎖がノブ構造を生成させる点突然変異を有し、前記第２の定常重鎖がホール構造を生成させる点突然変異を有するか、又は
ｂ．前記第１の定常重鎖がホール構造を生成させる点突然変異を有し、前記第２の定常重鎖がノブ構造を生成させる点突然変異を有し、場合によっては、
ｃ．前記第１及び第２の定常重鎖が、ジスルフィド架橋を生じさせる突然変異を有する、［３］に記載の二重特異性抗体。
［５］
第１の免疫グロブリンＶＨ１ドメイン、第１の免疫グロブリンＶＬ１ドメイン、第２の免疫グロブリンＶＨ２ドメイン及び第２の免疫グロブリンＶＬ２ドメインを含み、
ａ．前記第１の免疫グロブリンＶＨ１ドメインが（例えば配列中）：
ｉ．ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号７６を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号７７を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号７８を有する、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３；又は
ｉｉ．ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号７９を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号８０を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号８１を有する、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３
を含み；
ｂ．前記第１の免疫グロブリンＶＬ１ドメインが（例えば配列中に）：
ｉ．ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号９２を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号９３を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号９４を有する、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３又は
ｉｉ．ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号９５を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号９６を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号９７を有する、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３
を含み；
ｃ．前記第２の免疫グロブリンＶＨ２ドメインが（例えば配列中に）：
ｉ．ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号４４を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号４５を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号４６を有する、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３；又は
ｉｉ．ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号４７を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号４８を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号４９を有する、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３
を含み、
ｄ．前記第２の免疫グロブリンＶＬ２ドメインが（例えば配列中に）：
ｉ．ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号６０を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号６１を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号６２を有する、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３又は
ｉｉ．ＣＤＲ１がアミノ酸配列の配列番号６３を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列の配列番号６４を有し、ＣＤＲ３がアミノ酸配列の配列番号６５を有する、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３
を含む、［１］〜［４］の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
［６］
第１の免疫グロブリンＶＨ１ドメイン、第１の免疫グロブリンＶＬ１ドメイン、第２の免疫グロブリンＶＨ２ドメイン及び第２の免疫グロブリンＶＬ２ドメインを含み、
ａ．前記第１の免疫グロブリンＶＨ１ドメインがアミノ酸配列の配列番号８５を含み、
ｂ．前記第１の免疫グロブリンＶＬ１ドメインがアミノ酸配列の配列番号１０１を含み、
ｃ．前記第２の免疫グロブリンＶＨ２ドメインがアミノ酸配列の配列番号５３を含み、
ｄ．前記第２の免疫グロブリンＶＬ２ドメインがアミノ酸配列の配列番号６９を含む、
［１］〜［５］の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
［７］
第１の免疫グロブリン重鎖、第１の免疫グロブリン軽鎖、第２の免疫グロブリン重鎖及び第２の免疫グロブリン軽鎖を含み、
ａ．前記第１の免疫グロブリン重鎖がアミノ酸配列の配列番号８７を含み、
ｂ．前記第１の免疫グロブリン軽鎖がアミノ酸配列の配列番号１０３を含み、
ｃ．前記第２の免疫グロブリン重鎖がアミノ酸配列の配列番号５５を含み、
ｄ．前記第２の免疫グロブリン軽鎖がアミノ酸配列の配列番号７１を含む、
［１］〜［６］の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
［８］
［１］〜［７］の何れか一項に記載の二重特異性抗体を選択するための方法であって、
ａ．前記第１の部分及び前記第２の部分を選択する第１のステップと；
ｂ．共通の宿主細胞において前記第１の部分及び前記第２の部分を同時発現させ、その結果、前記第１の部分及び前記第２の部分を含む二重特異性抗体を生じさせる第２のステップと；
ｃ．正確に適合した二重特異性抗体からミスマッチ断片を除去することによって前記二重特異性抗体を精製する第３のステップと、
を含む方法。
［９］
精製の第３のステップの結果、少なくとも６０％（質量）、７０％（質量）、８０％（質量）、８５％（質量）純粋、例えば少なくとも９０％（質量）純粋、９５％（質量）、９６％（質量）、９７％（質量）、９８％（質量）又は９９％（質量）純粋である二重特異性抗体が生じる、［８］に記載の方法。
［１０］
共通の宿主細胞での同時発現により［１］〜［７］の何れか一項に記載の二重特異性抗体を作製するための方法であって、
ａ．前記第１の部分及び前記第２の部分をコードする少なくとも１つのベクターを生成させる第１のステップと；
ｂ．前記少なくとも１つのベクターを前記共通の宿主細胞に導入する第２のステップと；
ｃ．前記二重特異性抗体を特異的に発現する細胞を選択する第３のステップと；
ｄ．前記細胞が前記二重特異性抗体を発現する条件下で前記選択した細胞を培養する第４のステップと；
ｅ．少なくとも６０％（質量）、７０％（質量）、８０％（質量）又は８５％（質量）純粋である、例えば少なくとも９０％（質量）純粋、９５％（質量）、９６％（質量）、９７％（質量）、９８％（質量）又は９９％（質量）純粋である前記二重特異性抗体を精製する第５のステップと、
を含む方法。
［１１］
前記第１のステップが、前記第１の部分をコードする第１のベクター及び前記第２の部分をコードする第２のベクターを生成させることを含む、［１０］に記載の方法。
［１２］
［１］〜［７］の何れか一項に記載の二重特異性抗体の前記第１の部分又は前記第２の部分をコードするポリヌクレオチドと、選択可能マーカーとを含む、少なくとも１つのベクターを含む、発現系。
［１３］
ａ．第１の選択可能マーカー（ｓｍ  Ｉ）をコードするポリヌクレオチドと；
ｂ．前記第１の選択可能マーカー（ｓｍ  Ｉ）とは異なる第２の選択可能マーカー（ｓｍ  ＩＩ）をコードするポリヌクレオチドと、
を含む、［１２］に記載の発現系。
［１４］
前記第１の選択可能マーカー（ｓｍ  Ｉ）が葉酸輸送体又は突然変異した葉酸受容体をコードするポリヌクレオチドであり、前記突然変異した葉酸受容体の葉酸結合親和性が、野生型葉酸受容体と比較して低下しており、前記第２の選択可能マーカー（ｓｍ  ＩＩ）がＤＨＦＲである、［１２］又は［１３］に記載の発現系。
［１５］
前記第１の選択可能マーカー（ｓｍ  Ｉ）がハイグロマイシンであり、前記第２の選択可能マーカー（ｓｍ  ＩＩ）がＮｅｏ／Ｇ４１８である、［１２］〜［１４］の何れか一項に記載の発現系。
［１６］
２つの発現ベクターを含み、
ａ．第１のベクターが、少なくとも第１の選択可能マーカー（ｓｍ  Ｉ）をコードするポリヌクレオチドと、少なくとも前記第１の部分をコードするポリヌクレオチドと、を含み；
ｂ．第２のベクターが、少なくとも第２の選択可能マーカー（ｓｍ  ＩＩ）をコードするポリヌクレオチドと、少なくとも前記第２の部分をコードするポリヌクレオチドと、を含む、
［１２］〜［１５］の何れか一項に記載の発現系。
［１７］
重鎖をコードするポリヌクレオチドの下流の停止コドンと、前記停止コドンの下流に位置する免疫グロブリン膜アンカーをコードするポリヌクレオチドと、を含む、［１２］〜［１６］の何れか一項に記載の発現系。
［１８］
［８］〜［１１］の何れか一項に記載の方法における使用のための共通の宿主細胞を選択するための方法であって、
ａ．［１２］〜［１７］の何れか一項に記載の発現系を含む、複数の宿主細胞を提供する第１のステップと；
ｂ．前記選択可能マーカーに対して選択的な条件下で前記複数の宿主細胞を培養し、それによって対象となる生成物を発現する宿主細胞を得ることと、
を含む、方法。
［１９］
ａ．葉酸の制限濃度を含む；及び／又は
ｂ．５００ｎＭ以下の濃度で葉酸を含む；及び／又は
ｃ．
ｉ．１０００ｎＭ〜１００ｐＭ；
ｉｉ．１００ｎＭ〜１ｎＭ；
ｉｉｉ．１５ｎＭ〜１ｎＭ；
ｉｖ．１０ｎＭ〜１ｎＭ；及び
ｖ．１０ｎＭ〜２．５ｎＭ
から選択される濃度で葉酸を含む；及び／又は
ｄ．ＤＨＦＲ阻害剤を含む；及び／又は
ｅ．抗葉酸剤を含む；及び／又は
ｆ．５００ｎＭ以下の濃度で抗葉酸剤を含む；及び／又は
ｇ．
ｉ．５００ｎＭ〜３ｎＭ；
ｉｉ．１００ｎＭ〜１０ｎＭ；
ｉｉｉ．５０ｎＭ〜１０ｎＭ；及び
ｉｖ．５０ｎＭ
から選択される濃度でＭＴＸを含む；及び／又は
ｈ．葉酸濃度の２０倍までの抗葉酸剤の濃度を含む；及び／又は
ｉ．葉酸濃度の１０〜２０倍の抗葉酸剤の濃度を含む；及び／又は
ｊ．１５ｎＭ以下の濃度の葉酸と、等モル〜２０倍までの濃度のＭＴＸとを含む、
選択培地が使用される、［１８］に記載の方法。
［２０］
前記宿主細胞が、［１７］に記載の発現系を含み、前記第１の部分又は第２の部分の少なくとも一部が、前記免疫グロブリン膜貫通アンカー又はそれらの断片を含む融合ポリペプチドとして発現され、前記融合ポリペプチドが前記宿主細胞の表面上で提示され、
ａ．前記融合ポリペプチドに結合する検出化合物と前記複数の宿主細胞をを接触させ；
ｂ．細胞表面に結合した前記検出化合物の存在又は量に基づいて少なくとも１つの宿主細胞を選択する、
ステップをさらに含む、［１８］又は［１９］に記載の方法。
［２１］
前記検出化合物が、前記第１若しくは第２の標的又はその誘導体及び少なくとも１つの検出標識を含む、［２０］に記載の方法。
［２２］
前記二重特異性抗体を精製する前記第５のステップが、アフィニティークロマトグラフィー及び／又はイオン交換クロマトグラフィーを含む、［１０］又は［１１］に記載の方法。
［２３］
前記クロマトグラフィーが、
ａ．捕捉を行う第１のステップと；
ｂ．ポリッシングを行う第２のステップと；場合によっては
ｃ．さらなるポリッシングを行う第３のステップと、
を含む、［２２］に記載の方法。
［２４］
捕捉を行う前記第１のステップが、Ｆｃ−結合アフィニティークロマトグラフィー、例えばプロテインＡ又はプロテインＧなど、ラムダ軽鎖特異的アフィニティークロマトグラフィー、例えばＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）など、カッパ軽鎖特異的アフィニティークロマトグラフィー、例えばＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（商標）など、抗イディオタイプアフィニティークロマトグラフィー、例えば前記第１の部分又は前記第２の部分など、標的に基づくアフィニティークロマトグラフィー、例えば前記第１の標的又は第２の標的を用いるアフィニティークロマトグラフィーなど、イオン交換クロマトグラフィー、例えばＣａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ又はＦｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＥＭＤ  ＳＯ３など及び疎水性相互作用クロマトグラフィーからなる群から選択される原理で行われる、［２３］に記載の方法。
［２５］
ポリッシングを行う前記第２のステップが、Ｆｃ−結合アフィニティークロマトグラフィー、例えばプロテインＡ又はプロテインＧなど、ラムダ軽鎖特異的アフィニティークロマトグラフィー、例えばＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）など、カッパ軽鎖特異的アフィニティークロマトグラフィー、例えばＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（商標）など、抗イディオタイプアフィニティークロマトグラフィー、例えば前記第１の部分又は前記第２の部分など、標的に基づくアフィニティークロマトグラフィー、例えば前記第１の標的又は第２の標的を用いるアフィニティークロマトグラフィーなど、イオン交換クロマトグラフィー、例えばＣａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ又はＦｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＥＭＤ  ＳＯ３など、疎水性相互作用クロマトグラフィー及びウイルス不活性化からなる群から選択される原理で行われる、［２２］又は［２３］に記載の方法。
［２６］
さらなるポリッシングを行う前記第３のステップが、Ｆｃ−結合アフィニティークロマトグラフィー、例えばプロテインＡ又はプロテインＧなど、ラムダ軽鎖特異的アフィニティークロマトグラフィー、例えばＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）など、カッパ軽鎖特異的アフィニティークロマトグラフィー、例えばＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（商標）など、抗イディオタイプアフィニティークロマトグラフィー、例えば前記第１の部分又は前記第２の部分など、標的に基づくアフィニティークロマトグラフィー、例えば前記第１の標的又は第２の標的を用いるアフィニティークロマトグラフィーなど、イオン交換クロマトグラフィー、例えばＣａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ又はＦｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＥＭＤ  ＳＯ３など、疎水性相互作用クロマトグラフィー及びウイルス不活性化単独又はそれらの組み合わせからなる群から選択される原理で行われる、［２５］に記載の方法。
［２７］
ａ．ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅ（商標）などのプロテインＡ捕捉の第１のステップ、ＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）などのラムダ軽鎖アフィニティークロマトグラフィーの第２のステップ及びＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（商標）などのカッパ軽鎖アフィニティークロマトグラフィーの第３のステップ；又は
ｂ．ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅ（商標）などのプロテインＡの第１のステップ、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（商標）などのカッパ軽鎖アフィニティークロマトグラフィーの第２のステップ及びＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）などのラムダ軽鎖アフィニティークロマトグラフィーの第３のステップ；又は
ｃ．ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（商標）などのカッパ軽鎖アフィニティークロマトグラフィーの第１のステップ及びＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）などのラムダ軽鎖アフィニティークロマトグラフィーの第２のステップ；又は
ｄ．ＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）などのラムダ軽鎖アフィニティークロマトグラフィーの第１のステップ及びＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（商標）などのカッパ軽鎖アフィニティークロマトグラフィーの第２のステップ
から選択される、［２３］の何れか一項に記載の方法。
［２８］
前記細胞系が、ＣＨＯ細胞、非産生ハイブリドーマ、例えばＳｐ２／０又はＮＳ０など、ヒト由来細胞系、例えばＨＥＫ又はＰＥＲ．Ｃ６など、新生児ハムスター腎臓（ＢＨＫ）誘導体、酵母又は糸状菌、原核細菌、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又はシュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）など、植物誘導体、藻類及び繊毛虫類からなる群から選択される、［８］〜［１１］又は［１８］〜［２７に記載の方法。
［２９］
［１］〜［７］の何れか一項に記載の抗体と、薬学的に許容可能な担体と、を含む、医薬組成物。
［３０］
医薬としての使用のための、［１］〜［７］の何れか一項に記載の二重特異性抗体又は［２９］に記載の医薬組成物。
［３１］
インフラマソーム関連疾患の処置への使用のための、［１］〜［７］の何れか一項に記載の二重特異性抗体又は［２９］に記載の医薬組成物。
［３２］
前記インフラマソーム関連疾患が、鎌状赤血球症、脈管障害、虚血−再灌流傷害、循環器疾患、末梢動脈疾患、アテローム性硬化症、脈管機能不全、骨格筋虚血、肺サルコイドーシス、線維症、マラリア、血液透析依存性慢性腎臓病及びクローン病からなる群から選択される、［３１］に記載のインフラマソーム関連疾患の処置への使用のための［１］〜［７］の何れか一項に記載の二重特異性抗体又は［２９］に記載の医薬組成物。
［３３］
［１］〜［７］に記載の二重特異性抗体又は［２９］に記載の医薬組成物の有効量をインフラマソーム関連障害に罹患している対象に投与することを含む、インフラマソーム関連障害を処置する方法。
［３４］
前記インフラマソーム関連障害が、鎌状赤血球症、脈管障害、虚血−再灌流傷害、循環器疾患、末梢動脈疾患、アテローム性硬化症、脈管機能不全、骨格筋虚血、肺サルコイドーシス、線維症、マラリア、血液透析依存性慢性腎臓病又はクローン病である、［３３］に記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】令和2年3月9日(2020.3.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２３】
ポリッシングを行う前記第２のステップが、Ｆｃ−結合アフィニティークロマトグラフィー、例えばプロテインＡ又はプロテインＧなど、ラムダ軽鎖特異的アフィニティークロマトグラフィー、例えばＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）など、カッパ軽鎖特異的アフィニティークロマトグラフィー、例えばＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（商標）など、抗イディオタイプアフィニティークロマトグラフィー、例えば前記第１の部分又は前記第２の部分など、標的に基づくアフィニティークロマトグラフィー、例えば前記第１の標的又は第２の標的を用いるアフィニティークロマトグラフィーなど、イオン交換クロマトグラフィー、例えばＣａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ又はＦｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＥＭＤ  ＳＯ３など、疎水性相互作用クロマトグラフィー及びウイルス不活性化からなる群から選択される原理で行われる、請求項２１又は２２に記載の方法。
【国際調査報告】
2020524991.tif 000064
2020524991.tif 000065
2020524991.tif 000066
2020524991.tif 000067