(57)【要約】  所望の遺伝形質を有する反芻動物を選択する方法を開示する。この方法は、動物のマイクロバイオーム中の遺伝形質に関連する経世代微生物の量を分析することを含み、経世代微生物の量は、動物が所望の遺伝形質を有するかどうかの指標となる。【選択図】  図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
所望の遺伝形質を有する反芻動物を選択する方法であって、動物のマイクロバイオーム中の前記遺伝形質に関連する経世代微生物の量を分析することを含み、前記経世代微生物の量は、動物が前記所望の遺伝形質を有するかどうかの指標となる、方法。
【請求項２】
前記経世代微生物は、経世代細菌を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記経世代細菌は、表１に記載の操作的分類単位（ＯＴＵ）の内の少なくとも１種である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記経世代細菌は、バクテロイデス門及びファーミキューテス門の細菌であり、その量は、動物が前記所望の遺伝形質を有するかどうかの指標となる、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記経世代細菌は、バクテロイデス目及びクロストリジウム目の細菌である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１種のＯＴＵは、配列番号１、３、５、７、８、９、１１〜１７、１９、２０又は２１に記載のものから選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１種の経世代細菌は、経世代性の属の細菌、経世代性の科の細菌及び経世代性の目の細菌から成る群から選択される、請求項３又は６に記載の方法。
【請求項８】
前記経世代細菌は、配列番号１〜２２から成る群から選択される１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列を発現する、請求項３、６、又は７に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも１種のＯＴＵは、少なくとも５種のＯＴＵを含む、請求項３、６、７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記反芻動物は雌ウシである、請求項３〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
選択した前記動物を繁殖に使用することを更に含む、請求項３〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記所望の遺伝形質は、乳タンパク質、乾物摂取量、メタン生成、飼料効率及び乳脂肪から成る群から選択される、請求項３〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記マイクロバイオームは、非病原性マイクロバイオームである、請求項３〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記量の分析は、前記少なくとも１種の細菌のゲノム中の少なくとも１種の遺伝子の発現を分析することによって行う、請求項３〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記量の分析は、前記マイクロバイオームの試料に由来するＤＮＡをシーケンシングによって行う、請求項３〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
反芻動物の品種純度を決定する方法であって、前記反芻動物のマイクロバイオームを分析することを含み、前記マイクロバイオーム中の細菌の量の類似度は、品種純度の指標となる、方法。
【請求項１７】
前記細菌は、表１に記載の操作的分類単位（ＯＴＵ）の内の少なくとも１種である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも１種のＯＴＵは、属、科及び目から成る群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記細菌は、配列番号１〜２２から成る群から選択される１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列を発現する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記少なくとも１種のＯＴＵは少なくとも５種のＯＴＵを含む、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記反芻動物は雌ウシである、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記マイクロバイオームは、第一胃内マイクロバイオーム又は糞便マイクロバイオームを含む、請求項３〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
反芻動物を繁殖させるための方法であって、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法に従って選択した雌性反芻動物を雄性反芻動物由来の精液で受精させて、反芻動物を繁殖させることを含む方法。
【請求項２４】
前記雄性反芻動物は、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法に従って選択したものである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
反芻動物を繁殖させるための方法であって、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法に従って選択した雄性反芻動物由来の精液で雌性反芻動物を受精させて、反芻動物を繁殖させることを含む方法。
【請求項２６】
所望のマイクロバイオームを有する反芻動物の数を増加させる方法であって、前記反芻動物の雌雄を繁殖させることを含み、雄性の前記反芻動物及び／又は雌性の前記反芻動物の第一胃内マイクロバイオームは所定レベルを超える経世代微生物を含んでおり、これによって所望のマイクロバイオームを有する反芻動物の数を増加させる方法。
【請求項２７】
前記経世代微生物は、遺伝形質と関連する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記経世代微生物は、前記マイクロバイオームの微生物の相対量に影響を及ぼす、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記雄性反芻動物および前記雌性反芻動物の両方の第一胃内マイクロバイオームは、所定レベルを超える経世代微生物を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記経世代微生物は細菌である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記細菌は、配列番号１〜２２から成る群から選択される１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列を発現する、請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、その幾つかの実施形態において、所望の遺伝形質を有する反芻動物をそのマイクロバイオーム中の特定の細菌の存在に基づいて選択する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウシの第一胃内マイクロバイオームは、基本的に、その宿主である反芻動物がその飼料を消化することができるように分解し、発酵させる。この意味で、こうした関係は独特であり、そのような依存性が存在しないヒトや非草食動物の間で進化した宿主−マイクロバイオーム相互作用とは異なる。約５０００万年前に確立された、この厳密で必須の宿主とマイクロバイオームとの関係は、宿主の生理機能に大きな役割を果たすと考えられている。その重要性にも関わらず、有性生殖と減数分裂組換えによって引き起こされる、宿主の自然な遺伝的変異が第一胃内マイクロバイオーム成分と宿主の生理学的形質との複雑な関係に及ぼす影響については、殆ど理解されていない。第一胃内マイクロバイオームの特定成分と動物の生理機能との間に関連性があることが知られており、これは主に、動物がその飼料からエネルギーを取得する能力で示される［Kruger Ben Shabat S, et al., 2016. ISME J 10:2958-2972］。
【０００３】
このような最近の知見から、ウシの第一胃内マイクロバイオームが、乳牛の飼料効率を高める試みの新しい領域として位置付けられている。ヒトの人口が増え続けているため、このようなことは、地球規模での環境影響を軽減しながら、ヒトによる消費のために利用可能な食料源を補充する試みとして食料安全保障問題に重要な意味を持ち得る。その重要性にも関わらず、第一胃内マイクロバイオーム成分と宿主の遺伝的特徴や生理機能との複雑な関係は殆ど理解されていない。
【０００４】
背景技術としては、Guan LL, et al., 2008. FEMS Microbiology Letters 288:85-9、Roehe R, et al., 2016. PLoS Genet 12:el005846、Li Z, et al., 2016. Microbiology Reports 8: 1016-102、及びＷＯ２０１７／１８７４３３号が挙げられる。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の一様相によれば、所望の遺伝形質を有する反芻動物を選択する方法を提供し、この方法は、動物のマイクロバイオーム中の遺伝形質に関連する経世代微生物の量を分析することを含み、経世代微生物の量は動物が所望の遺伝形質を有するかどうかの指標となる。
【０００６】
本発明の一様相によれば、反芻動物を繁殖させるための方法であって、本明細書に記載の方法に従って選択した雄性反芻動物由来の精液で雌性反芻動物を受精させて反芻動物を繁殖させることを含む方法を提供する。
【０００７】
本発明の一様相によれば、所望のマイクロバイオームを有する反芻動物の数を増加させる方法であって、反芻動物の雌雄を繁殖させることを含み、雄性反芻動物及び／又は雌性反芻動物の第一胃内マイクロバイオームは所定レベルを超える経世代微生物を含んでおり、これによって所望のマイクロバイオームを有する反芻動物の数を増加させる方法を提供する。
【０００８】
本発明の一様相によれば、反芻動物の品種純度を決定する方法であって、反芻動物のマイクロバイオームを分析することを含み、マイクロバイオーム中の細菌の量の類似度は品種純度の指標となる方法を提供する。
【０００９】
本発明の一様相によれば、反芻動物を繁殖させるための方法であって、本明細書に記載の方法に従って選択した雌性反芻動物を雄性反芻動物由来の精液で受精させて反芻動物を繁殖させることを含む方法を提供する。
【００１０】
本発明の幾つかの実施形態によれば、経世代微生物は経世代細菌を含む。
【００１１】
本発明の幾つかの実施形態によれば、経世代細菌は表１に記載の操作的分類単位（ＯＴＵ）の内の少なくとも１種である。
【００１２】
本発明の幾つかの実施形態によれば、経世代細菌はバクテロイデス門及びファーミキューテス門の細菌であり、その量は、動物が所望の遺伝形質を有するかどうかの指標となる。
【００１３】
本発明の幾つかの実施形態によれば、経世代細菌はバクテロイデス目及びクロストリジウム目の細菌である。
【００１４】
本発明の幾つかの実施形態によれば、少なくとも１種のＯＴＵは、配列番号１、３、５、７、８、９、１１〜１７、１９、２０又は２１に記載のものから選択される。
【００１５】
本発明の幾つかの実施形態によれば、少なくとも１種の経世代細菌は、経世代性の属の細菌、経世代性の科の細菌及び経世代性の目の細菌から成る群から選択される。
【００１６】
本発明の幾つかの実施形態によれば、細菌は、配列番号１〜２２から成る群から選択される１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列を発現する。
【００１７】
本発明の幾つかの実施形態によれば、少なくとも１種のＯＴＵは、少なくとも５種のＯＴＵを含む。
【００１８】
本発明の幾つかの実施形態によれば、反芻動物は雌ウシである。
【００１９】
本発明の幾つかの実施形態によれば、方法は選択した動物を繁殖に使用することを更に含む。
【００２０】
本発明の幾つかの実施形態によれば、所望の遺伝形質は、乳タンパク質、乾物摂取量、メタン生成、飼料効率及び乳脂肪から成る群から選択される。
【００２１】
本発明の幾つかの実施形態によれば、マイクロバイオームは非病原性マイクロバイオームである。
【００２２】
本発明の幾つかの実施形態によれば、量の分析は、少なくとも１種の細菌のゲノム中の少なくとも１種の遺伝子の発現を分析することによって行う。
【００２３】
本発明の幾つかの実施形態によれば、量の分析は、マイクロバイオームの試料に由来するＤＮＡをシーケンシングして行う。
【００２４】
本発明の幾つかの実施形態によれば、細菌は表１に記載の操作的分類単位（ＯＴＵ）の内の少なくとも１種である。
【００２５】
本発明の幾つかの実施形態によれば、少なくとも１種のＯＴＵは、属、科及び目から成る群から選択される。
【００２６】
本発明の幾つかの実施形態によれば、細菌は、配列番号１〜２２から成る群から選択される１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列を発現する。
【００２７】
本発明の幾つかの実施形態によれば、少なくとも１種のＯＴＵは、少なくとも５種のＯＴＵを含む。
【００２８】
本発明の幾つかの実施形態によれば、反芻動物は雌ウシである。
【００２９】
本発明の幾つかの実施形態によれば、マイクロバイオームは、第一胃内マイクロバイオーム又は糞便マイクロバイオームを含む。
【００３０】
本発明の幾つかの実施形態によれば、雄性反芻動物は本明細書に記載の方法に従って選択したものである。
【００３１】
本発明の幾つかの実施形態によれば、経世代微生物は遺伝形質と関連している。
【００３２】
本発明の幾つかの実施形態によれば、経世代微生物はマイクロバイオームの微生物の相対量に影響を及ぼす。
【００３３】
本発明の幾つかの実施形態によれば、雄性又は雌性の反芻動物の両方の第一胃内マイクロバイオームは、所定レベルを超える経世代微生物を含む。
【００３４】
本発明の幾つかの実施形態によれば、経世代微生物は細菌である。
【００３５】
本発明の幾つかの実施形態によれば、細菌は、配列番号１〜２２から成る群から選択される１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列を発現する。
【００３６】
特に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術および／または科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様のまたは等価な方法および材料を、本発明の実施形態の実践または試験に使用することができるが、例示的な方法および／または材料を下記に記載する。矛盾する場合、定義を含む特許明細書が優先する。加えて、材料、方法、および実施例は単なる例示であり、必ずしも限定を意図するものではない。
【００３７】
本発明のいくつかの実施形態について、その例示のみを目的として添付の図面を参照して本明細書に記載する。以下、特に図面を詳細に参照して示す細部は、例示を目的とし、また本発明の実施形態の詳細な説明を目的とすることを強調する。同様に、図面と共に説明を見ることで、本発明の実施形態をどのように実践し得るかが当業者には明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】ウシの第一胃内マイクロバイオームの遺伝性の部分は、系統学的に密接に関連している。無作為に選択した同一サイズの第一胃内ＯＴＵの群（ｎ＝２２）の１６Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子配列の平均ペアワイズ類似度を、２２種の遺伝性ＯＴＵの平均ペアワイズ類似度と比較した。Ｙ軸は群の数を表し、Ｘ軸は配列の類似度を表す。１６Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子配列において計算平均類似度が７２％の遺伝性ＯＴＵの群をピンク色で示す。第一胃内ＯＴＵの無作為に選択した群の分布を青色で示す。全ての無作為群で１６Ｓ  ｒＤＮＡの類似度が低かった（Ｐ＜０．０１）。
【図２】遺伝性ＯＴＵは存在性が高い。分類注釈付きのＯＴＵを左側に列挙する。雌ウシのコホートに沿った各ＯＴＵの相対存在量を左パネルに表し、各ＯＴＵの存在を右パネルに表す。緑色はバクテロイデス目由来のＯＴＵを示し、茶色はクロストリジウム目由来のＯＴＵを示す。
【図３】遺伝性ＯＴＵは宿主の特質及び第一胃内代謝産物と相関している。ヒートマップは、第一胃内遺伝性ＯＴＵの相対存在量（行）と、宿主又は第一胃内代謝産物の様々な生理学的特質を表す選択指標（列）との相関を示す。ＯＴＵは目によって色分けされている（緑色はバクテロイデスを表し、茶色はクロストリジウムを表す）。生理学的特質は黒で色付けされ、第一胃内代謝産物は４種の群に従って色分けされている（アミノ酸（青色）、糖（黄色）、ＶＦＡ（緑）及び他の全ての測定された代謝産物（灰色））。＊／＊＊＊／＊＊＊＊は、それぞれ０．０５、０．００５及び０．０００５より小さい公称ｐ値を表す。
【図４Ａ】遺伝性ＯＴＵは、他の第一胃内微生物よりも宿主の生理機能と第一胃内代謝産物に関連している。（Ａ）所定の指標に対する遺伝性ＯＴＵの平均絶対相関（スピアマン）をマイクロバイオーム全体と比較する。アスタリスクは平均の有意差を表す（ｔ検定、ｐ＜０．０５）。赤色の棒は遺伝性マイクロバイオームの相関を表し、青色の棒はマイクロバイオーム全体の相関を表す。
【図４Ｂ】（Ｂ）遺伝性ＯＴＵと全てのＯＴＵとの間の所定の指標に相関するＯＴＵのオッズ比（Ｏ．Ｒ．）（公称スピアマンｐ＜０．０５）。Ｙ軸：オッズ比、Ｘ軸：フィッシャーの正確検定から導かれたｐ値。赤色の垂直線は、ボンフェローニ補正した０．０５有意閾値を示す。各点の色は凡例に記載のカテゴリーを表す。
【図５】遺伝性ＯＴＵの一部が宿主の生理機能に関連していることが過去の研究で分かった（Shabat, Sheerli Kruger Ben, et al., ISME J 10:2958-2972, 2016, doi: 10.1038/ismej.2016.62）。その研究では、２２種の遺伝性ＯＴＵの内の６種が、様々な雌ウシの産生指標、即ち、乾物摂取量（ＤＭＩ）、乳タンパク質、及び残留飼料摂取量（ＲＦＩ）として測定される飼料効率に関連付けられた。ＯＴＵとその分類を行に示し、産生指標を列に示す。タイル内のアンパサンド記号は、本例では、遺伝性ＯＴＵと産生指標との間に有意な相関が見られたことを示す。
【図６】１，００無作為順列に基づく順列仮定の下での遺伝率試験の偽発見率を示すヒストグラム。Ｘ軸：検出された遺伝性ＯＴＵの数。Ｙ軸：順列の数。赤色の垂直線は、実際の（順序を変えてない）データで遺伝性と検出されたＯＴＵの数を示す。
【図７】各指標に対する遺伝性ＯＴＵの実際のスピアマン相関ｒ値の有意性を試験するためのヌルモデル。赤色の棒は実際の遺伝性ＯＴＵの相対存在量プロファイルから得た値を表し、黒色の棒は１，０００個の順列から得た値を表す。このような各順列では、各ＯＴＵの存在量プロファイルは無作為にシャッフルした。
【図８】上位遺伝率推定値を日数順に並べた５０種のＯＴＵであり（異なる３日間でマイクロバイオームを採取）、遺伝率推定値が１次ソートキーとして重要であり、平均遺伝率推定値が２次ソートキーとして重要であることが分かった。Ｘ軸：試料採取日。Ｙ軸：微生物のＯＴＵ分類。赤色の線は、それを超えるとＯＴＵが遺伝性と見なされた閾値を示す。
【図９】研究コホート全体に沿った経世代微生物ＯＴＵの存在量プロファイル（試料採取３日間の平均）を示すヒートマップ。Ｘ軸：実験における動物識別番号。Ｙ軸：微生物ＯＴＵの分類。ヒートマップは、所定の動物での所定のＯＴＵの相対存在量に応じて色付けされている。相対存在量に１Ｍを掛けて読み易くしている。赤色の水平線は、それを超えるとＯＴＵが遺伝性と見なされた閾値を示す。
【図１０】研究コホートの遺伝子型判定サブセットに沿った経世代微生物ＯＴＵの存在量プロファイル（試料採取３日間の平均）を示すヒートマップ。Ｘ軸：実験における動物識別番号。Ｙ軸：微生物ＯＴＵの分類。ヒートマップは、所定の動物での所定のＯＴＵの相対存在量に応じて色付けされている。相対存在量に１Ｍを掛けて読み易くしている。赤色の水平線は、それを超えるとＯＴＵが遺伝性と見なされた閾値を示す。
【図１１】宿主形質の遺伝率推定値。Ｘ軸：形質、Ｙ軸：遺伝率推定値。棒上部の星印は重要な遺伝的要素であること表す。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本発明は、その幾つかの実施形態において、反芻動物をそのマイクロバイオーム中の特定の細菌の存在に基づいて所望の遺伝形質に関して選択する方法に関する。
【００４０】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、必ずしもその用途が、以下の記載に示す、および／または図面および／または実施例で例示する、構成の詳細および要素の配置および／または方法に限定されるものではないことを理解するべきである。本発明は、他の実施形態が可能であり、また、さまざまな手段で実施または実行することが可能である。
【００４１】
反芻動物は、その第一胃内マイクロバイオームとの必須な関係を５０００万年に亘って長期的に維持している。この独特な宿主−マイクロバイオームの関係では、宿主の飼料を消化する能力は共進化したマイクロバイオームに完全に依存している。この特別な協調によって、反芻動物の遺伝的特徴及び生理機能と第一胃内マイクロバイオームの構造、組成及び代謝との間の依存に関する問題が提起される。この関係を解明するため、本発明者らは、第一胃内マイクロバイオームの系統発生的及び機能的組成に対する宿主の遺伝性特徴の関連性を調べた。本発明者らはこれを達成するため、７８頭のホルスタイン乳牛の集団について、各動物由来の第一胃内マイクロバイオータ・データ及びその他の表現型と４７頭のサブセット由来の遺伝子型データとの組み合わせを使用して研究を行った。より具体的には、ＳＮＰベースの遺伝率推定値をアンプリコン・シーケンシング・データ、宿主の形質及び第一胃内代謝産物と組み合わせて適用することにより、本発明者らは、存在量が第一胃内代謝形質と宿主の生理学的形質とに関連し、測定可能な遺伝率を示す２２種の操作的分類単位（ＯＴＵ）を特定した（図８参照）。
【００４２】
本結果から、経世代微生物種が関連する系統発生群を表すことが分かる（図１）。この知見は、同様の生態学的ニッチを共有する生物は、同じニッチを共有しない生物よりも系統学的に互いに近い傾向があるという基本的な生態学的概念に対応している。測定された代謝産物と生理学的パラメータは一般には、その相関プロファイルの様々な遺伝性ＯＴＵへの階層的クラスタリングに基づき、そのカテゴリーに従って一緒にクラスター化する（図３、ヒートマップの列）。例えば、殆どのアミノ酸は一緒にクラスター化し、幾つかの揮発性脂肪酸は互いに対になり、９種の産生指標の内の６種がヒートマップに沿って互いに隣接する。同時に、遺伝性ＯＴＵの観点から、この研究で特定された遺伝性ＯＴＵの顕著なニッチ内であっても、存在量プロファイル（図３、ヒートマップの行）に従ってＯＴＵをクラスター化すると、分類学的な所属に従って高度に分離されることが分かる。例えば、９種の未知のバクテロイデス科の内の８種が一緒にクラスター化し、５種のプレボテラ科の内の３種が一緒にクラスター化した。
【００４３】
本発明者らは更に、経世代細菌が、宿主形質と第一胃内代謝パラメータに相関する微生物を高い割合で含むことを見出した（図４Ａ及びＢ）。このような知見から、第一胃内微生物の異なる群の存在量を潜在的に調節することによって、宿主の遺伝的変異が宿主の生理学的形質や第一胃内代謝に測定可能な影響を及ぼし得ることが示唆される。このような知見から、宿主の遺伝的特徴が特定の第一胃内細菌に関連していることが分かり、この細菌は第一胃内代謝と宿主の生理機能に影響を及ぼす可能性がある。特に、経世代細菌と相関することが分かった代謝産物と宿主形質は更にその代謝によって関連していた。これは、メタン生成、プロピオネート：アセテート比、ラクテート、プロピオネート及びブチレートの相関値、及び経世代細菌に相関する宿主のエネルギー取得効率（ＲＦＩで表される）で見ることができる。特に興味深いのは、経世代細菌が主にプロピオネート：酢酸比と相関することである（平均｜ｒ｜＝０．６４）が、これはメタン生成と乳酸に逆相関する一方、エネルギー取得効率を推定するＲＦＩと正の相関がある（図３及び４）。他の注目すべき知見は、乳タンパク質形質が経世代微生物と相関があって、オッズ比が最も高かったことであり、これはこの宿主形質に関連する経世代細菌が豊富であることを示している（図４）。このような所見によって、宿主の遺伝子型、第一胃内細菌及び宿主形質の間の三角関係の概念が更に強化される。
【００４４】
従って、本発明の一様相によれば、所望の遺伝形質を有する反芻動物を選択する方法であって、動物のマイクロバイオーム中の遺伝形質に関連する経世代微生物の量を分析することを含み、経世代微生物の量は動物が所望の遺伝形質を有するかどうかの指標となる方法を提供する。
【００４５】
本発明で企図される反芻動物としては、例えば、ウシ（例えば、雌ウシ）、ヤギ、ヒツジ、キリン、アメリカバイソン、ヨーロッパバイソン、ヤク、水牛、シカ、ラクダ、アルパカ、ラマ、ヌー、アンテロープ、プロングホーン及びニルガイが挙げられる。
【００４６】
特定の実施形態によれば、反芻動物は雌ウシ又は雄ウシであり、例えば、Bos taurus又はホルスタイン種である。
【００４７】
特定の実施形態によれば、選択する動物は新生仔であり、通常は１日齢以下である。他の実施形態によれば、選択する動物は２日齢以下である。他の実施形態によれば、選択する動物は３日齢以下である。他の実施形態によれば、選択する動物は１週齢以下である。他の実施形態によれば、選択する動物は２週齢以下である。他の実施形態によれば、選択する動物は１月齢以下である。他の実施形態によれば、選択する動物は３月齢以下である。更に他の実施形態によれば、動物は成体である。
【００４８】
本明細書で使用される「遺伝形質」という語句は、所定の集団における個体間の変異が部分的に（又は全体的に）遺伝的変異に起因する形質を意味する。このような遺伝的変異により、マイクロバイオーム中の特定の微生物集団（マーカーとして機能）の相対存在量又は絶対存在量は、統計的に有意に、ある世代と次の世代との間で類似している。
【００４９】
微生物が遺伝性であると分類できるのは、動物群間の存在量の変動を、動物間の遺伝的分散によって説明できる場合である。
【００５０】
本発明の状況で使用できる統計的方法としては、単一成分ＧＲＭアプローチ、ＭＡＦ−層別ＧＲＥＭＬ（ＧＲＥＭＬＬＭＳ）、ＬＤＬ及びＭＡＦ層別ＧＲＥＭＬ（ＧＲＥＭＬＬＬＤＭＳ）、単一成分及びＭＡＦ層別ＬＤ調整血縁（ＬＤＡＫ−ＳＣ及びＬＤＡＫ−ＭＳ）、閾値ＧＲＭによる拡張系統、ツリーレット共分散平滑化（ＴＣＳ）、ＬＤスコア回帰、及びＢＯＬＴ−ＲＥＭＬが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５１】
一実施形態では、形質は第一胃内代謝に関連し、その例としては、プロピオネート：アセテート比、第一胃内のメタンの量／濃度、第一胃内のプロピオン酸の量／濃度、及び第一胃内の吉草酸の量／濃度が挙げられるが、これらに限定されない。また、形質は第一胃内のアミノ酸（例えば、グリシン、アスパルテート及びチロシン）の量／濃度とすることができる。
【００５２】
他の実施形態では、形質は宿主の特質に関連し、その例としては、動物の乳に存在するタンパク質又は脂肪の量、乾物摂取量又は飼料効率が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５３】
本発明者らが少なくとも部分的に経世代的であることを示した遺伝形質の例としては、飼料効率、メタン生成が挙げられる。
【００５４】
本明細書で使用される「飼料効率」という用語は、動物が食物からエネルギーを抽出する能力を意味する。飼料効率は、動物の実際の飼料摂取量とその産生レベル及び体重に基づいた予測飼料摂取量との差である。従って、飼料効率が「高い」動物とは、飼料摂取量に基づいて予測される値よりも乳の産生量が多いか、体重を増やす動物である。飼料効率が「負の」動物とは、飼料摂取量に基づいて予測されるよりも乳の産生量が少ないか、体重を減らす動物である。一実施形態では、エネルギー効率は、残留飼料摂取量（ＲＦＩ）法（Koch et al., 1963, J Anim Sci, 22, 486-494）を用いて測定し、米国学術研究会議２００１の式によって計算することができる。各雌ウシの期待ＲＦＩ値は重回帰式に基づいて計算することができる。
【００５５】
一実施形態によれば、動物をＲＦＩが低い（又は飼料効率が高い）と分類することができるのは、群れ（少なくとも１５頭の群れ）の平均ＲＦＩを少なくとも０．０５標準偏差下回る場合である。
【００５６】
一実施形態によれば、動物をＲＦＩが低い（又はエネルギー効率が高い）と分類することができるのは、群れ（少なくとも１５頭の群れ）の平均ＲＦＩを少なくとも０．０５標準偏差下回る場合である。
【００５７】
一実施形態によれば、動物をＲＦＩが低い（又はエネルギー効率が高い）と分類することができるのは、群れ（少なくとも１５頭の群れ）の平均ＲＦＩを少なくとも１標準偏差下回る場合である。
【００５８】
一実施形態によれば、動物をＲＦＩが低い（又はエネルギー効率が高い）と分類することができるのは、群れ（少なくとも１５頭の群れ）の平均ＲＦＩを少なくとも２標準偏差下回る場合である。
【００５９】
一実施形態によれば、動物をＲＦＩが低い（又はエネルギー効率が高い）と分類することができるのは、群れ（少なくとも１５頭の群れ）の平均ＲＦＩを少なくとも３標準偏差下回る場合である。
【００６０】
一実施形態によれば、動物をＲＦＩが低い（又はエネルギー効率が高い）と分類することができるのは、群れ（少なくとも１５頭の群れ）の平均ＲＦＩを少なくとも４標準偏差下回る場合である。
【００６１】
一実施形態によれば、動物をＲＦＩが低い（又はエネルギー効率が高い）と分類することができるのは、群れ（少なくとも１５頭の群れ）の平均ＲＦＩを少なくとも５標準偏差下回る場合である。
【００６２】
一実施形態によれば、動物をＲＦＩが低い（又はエネルギー効率が高い）と分類することができるのは、群れ（少なくとも１５頭の群れ）の平均ＲＦＩを少なくとも６標準偏差下回る場合である。
【００６３】
一実施形態によれば、動物をＲＦＩが高い（又は試料効率が低い）と分類することができるのは、群れ（少なくとも１５頭の群れ）の平均ＲＦＩを少なくとも０．０５標準偏差上回る場合である。
【００６４】
一実施形態によれば、動物をＲＦＩが高い（又はエネルギー効率が低い）と分類することができるのは、群れ（少なくとも１５頭の群れ）の平均ＲＦＩを少なくとも０．０５標準偏差上回る場合である。
【００６５】
一実施形態によれば、動物をＲＦＩが高い（又はエネルギー効率が低い）と分類することができるのは、群れ（少なくとも１５頭の群れ）の平均ＲＦＩを少なくとも１標準偏差上回る場合である。
【００６６】
一実施形態によれば、動物をＲＦＩが高い（又はエネルギー効率が低い）と分類することができるのは、群れ（少なくとも１５頭の群れ）の平均ＲＦＩを少なくとも２標準偏差上回る場合である。
【００６７】
一実施形態によれば、動物をＲＦＩが高い（又はエネルギー効率が低い）と分類することができるのは、群れ（少なくとも１５頭の群れ）の平均ＲＦＩを少なくとも３標準偏差上回る場合である。
【００６８】
一実施形態によれば、動物をＲＦＩが高い（又はエネルギー効率が低い）と分類することができるのは、群れ（少なくとも１５頭の群れ）の平均ＲＦＩを少なくとも４標準偏差上回る場合である。
【００６９】
一実施形態によれば、動物をＲＦＩが高い（又はエネルギー効率が低い）と分類することができるのは、群れ（少なくとも１５頭の群れ）の平均ＲＦＩを少なくとも５標準偏差下回る場合である。
【００７０】
一実施形態によれば、動物をＲＦＩが高い（又はエネルギー効率が低い）と分類することができるのは、群れ（少なくとも１５頭の群れ）の平均ＲＦＩを少なくとも６標準偏差上回る場合である。
【００７１】
一実施形態によれば、動物をＲＦＩが低い（又はエネルギー効率が高い）と分類することができるのは、その１日当たりの乾物摂取量（ＤＭＩ）が期待食物摂取量（上述のように重量と乳産生量の関数として計算される）に従って予測される値よりも１ｋｇ少ない場合である。
【００７２】
一実施形態によれば、動物をＲＦＩが低い（又はエネルギー効率が高い）と分類することができるのは、その１日当たりの乾物摂取量（ＤＭＩ）が期待食物摂取量に従って予測される値よりも２ｋｇ少ない場合である。
【００７３】
一実施形態によれば、動物をＲＦＩが低い（又はエネルギー効率が高い）と分類することができるのは、その１日当たりの乾物摂取量（ＤＭＩ）が期待食物摂取量に従って予測される値よりも４ｋｇ少ない場合である。
【００７４】
一実施形態によれば、動物をＲＦＩが低い（又はエネルギー効率が高い）と分類することができるのは、その１日当たりの乾物摂取量（ＤＭＩ）が期待食物摂取量に従って予測される値よりも８ｋｇ少ない場合である。
【００７５】
一実施形態によれば、動物をＲＦＩが低い（又はエネルギー効率が高い）と分類することができるのは、その１日当たりの乾物摂取量（ＤＭＩ）が期待食物摂取量に従って予測される値よりも１６ｋｇ少ない場合である。
【００７６】
一実施形態によれば、動物をＲＦＩが低い（又はエネルギー効率が高い）と分類することができるのは、その１日当たりの乾物摂取量（ＤＭＩ）が期待食物摂取量に従って予測される値よりも３２ｋｇ少ない場合である。
【００７７】
一実施形態によれば、動物をＲＦＩが低い（又はエネルギー効率が高い）と分類することができるのは、その試料摂取量に従って予測される値の１．５倍の量の乳を産生するか、又は重量が１．５倍となる場合である。
【００７８】
一実施形態によれば、動物をＲＦＩが低い（又はエネルギー効率が高い）と分類することができるのは、その試料摂取量に従って予測される値の２倍の量の乳を産生するか、又は重量が２倍となる場合である。
【００７９】
一実施形態によれば、動物をＲＦＩが低い（又はエネルギー効率が高い）と分類することができるのは、その試料摂取量に従って予測される値の２．５倍の量の乳を産生するか、又は重量が２．５倍となる場合である。
【００８０】
一実施形態によれば、動物をＲＦＩが低い（又はエネルギー効率が高い）と分類することができるのは、その試料摂取量に従って予測される値の３倍の量の乳を産生するか、又は重量が３倍となる場合である。
【００８１】
一実施形態によれば、動物をＲＦＩが低い（又はエネルギー効率が高い）と分類することができるのは、その試料摂取量に従って予測される値の３．５倍の量の乳を産生するか、又は重量が３．５倍となる場合である。
【００８２】
一実施形態によれば、動物をＲＦＩが低い（又はエネルギー効率が高い）と分類することができるのは、その試料摂取量に従って予測される値の４倍の量の乳を産生するか、又は重量が４倍となる場合である。
【００８３】
一実施形態によれば、動物をＲＦＩが低い（又はエネルギー効率が高い）と分類することができるのは、その試料摂取量に従って予測される値の４．５倍の量の乳を産生するか、又は重量が４．５倍となる場合である。
【００８４】
一実施形態によれば、動物をＲＦＩが低い（又はエネルギー効率が高い）と分類することができるのは、その試料摂取量に従って予測される値の５倍の量の乳を産生するか、又は重量が５倍となる場合である。
【００８５】
「メタン生成」という用語は、動物自体によって放出されるか、又はマイクロバイオームによって生成されるメタンの量を意味する。１日当たりのグラム数又は乾物摂取量１ｋｇ当たりのグラム数で測定することができる。
【００８６】
一実施形態によれば、動物を「高メタン生成体」として分類することができるのは、群れの平均メタン生成量を少なくとも０．０５標準偏差上回る場合である。
【００８７】
一実施形態によれば、動物を「高メタン生成体」として分類することができるのは、群れの平均メタン生成量を少なくとも０．５標準偏差上回る場合である。
【００８８】
一実施形態によれば、動物を「高メタン生成体」として分類することができるのは、群れの平均メタン生成量を少なくとも１標準偏差上回る場合である。
【００８９】
一実施形態によれば、動物を「高メタン生成体」として分類することができるのは、群れの平均メタン生成量を少なくとも２標準偏差上回る場合である。
【００９０】
一実施形態によれば、動物を「高メタン生成体」として分類することができるのは、群れの平均メタン生成量を少なくとも３標準偏差上回る場合である。
【００９１】
一実施形態によれば、動物を「高メタン生成体」として分類することができるのは、群れの平均メタン生成量を少なくとも４標準偏差上回る場合である。
【００９２】
一実施形態によれば、動物を「高メタン生成体」として分類することができるのは、群れの平均メタン生成量を少なくとも５標準偏差上回る場合である。
【００９３】
一実施形態によれば、動物を「高メタン生成体」として分類することができるのは、群れの平均メタン生成量を少なくとも６標準偏差上回る場合である。
【００９４】
「低メタン生成」という用語は、動物のマイクロバイオーム（例えば、第一胃内マイクロバイオーム／糞便マイクロバイオーム）で生成される量が１日当たり１００ｇ未満又は乾物摂取量１ｋｇ当たり１０ｇ未満であることを意味する。
【００９５】
一実施形態によれば、動物を「低メタン生成体」として分類することができるのは、群れの平均メタン生成量を少なくとも０．０５標準偏差下回る場合である。
【００９６】
一実施形態によれば、動物を「低メタン生成体」として分類することができるのは、群れの平均メタン生成量を少なくとも０．５標準偏差下回る場合である。
【００９７】
一実施形態によれば、動物を「低メタン生成体」として分類することができるのは、群れの平均メタン生成量を少なくとも１標準偏差下回る場合である。
【００９８】
一実施形態によれば、動物を「低メタン生成体」として分類することができるのは、群れの平均メタン生成量を少なくとも２標準偏差下回る場合である。
【００９９】
一実施形態によれば、動物を「低メタン生成体」として分類することができるのは、群れの平均メタン生成量を少なくとも３標準偏差下回る場合である。
【０１００】
一実施形態によれば、動物を「低メタン生成体」として分類することができるのは、群れの平均メタン生成量を少なくとも４標準偏差下回る場合である。
【０１０１】
一実施形態によれば、動物を「低メタン生成体」として分類することができるのは、群れの平均メタン生成量を少なくとも５標準偏差下回る場合である。
【０１０２】
一実施形態によれば、動物を「低メタン生成体」として分類することができるのは、群れの平均メタン生成量を少なくとも６標準偏差下回る場合である。
【０１０３】
本明細書で使用される「マイクロバイオーム」という用語は、所定の環境における微生物（細菌、真菌、原生生物）、それらの遺伝的要素（ゲノム）の全体を意味する。
【０１０４】
マイクロバイオータ試料は、微生物及び／又はマイクロバイオーム由来の成分又はその生成物の試料を含む。
【０１０５】
特定の実施形態によれば、マイクロバイオームは第一胃内マイクロバイオームである。更に他の実施形態では、マイクロバイオームは糞便マイクロバイオームである。
【０１０６】
他の実施形態によれば、マイクロバイオームは健康な動物に由来する（即ち、マイクロバイオームは非病原性マイクロバイオームである）。
【０１０７】
マイクロバイオームの微生物を分析するために、動物からマイクロバイオータ試料を採取する。これは、微生物又はマイクロバイオームの成分又はその生成物の回収を可能にする任意の手段によって行い、関連するマイクロバイオーム源（例えば、第一胃）に適している。
【０１０８】
第一胃の採取は当技術分野で既知の方法を用いて行うことができ、例えば、第一胃真空サンプラーを備えた胃管を使用する。通常、第一胃は摂食後に採取する。
【０１０９】
幾つかの実施形態では、第一胃試料を分析する代わりに、第一胃のマイクロバイオームを反映する糞便試料を使用する。従って、この実施形態では、糞便マイクロバイオームを分析する。
【０１１０】
本発明のこの様相の一実施形態によれば、特定の細菌分類群の存在量をマイクロバイオータ試料で分析する。
【０１１１】
様々な分類群の微生物（例えば、細菌）のレベルを定量化する方法を以下に説明する。
【０１１２】
幾つかの実施形態では、１種以上の微生物又はその成分又は生成物のレベルを決定することは、１種以上のＤＮＡ配列のレベルを決定することを含む。幾つかの実施形態では、１種以上のＤＮＡ配列は、異なる微生物種を区別するのに使用可能な任意のＤＮＡ配列を含む。ある実施形態では、１種以上のＤＮＡ配列は１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列を含む。ある実施形態では、１種以上のＤＮＡ配列は１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列を含む。幾つかの実施形態では、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、１００、１０００、５０００又はそれ以上の配列を増幅する。
【０１１３】
種の分類の割り当ては、適切な参照データベース（例えば、１６Ｓ  ｒＲＮＡ参照データベース）に対して適切なコンピュータプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ）を使用して行うことができる。
【０１１４】
核酸又はタンパク質が本発明の配列と実質的に相同であるか、又は一定の割合で配列同一性を共有するかどうかを決定する際に、配列類似度は従来のアルゴリズムによって定義することができ、通常は少数のギャップを導入して最良適合を得ることができる。特に、２種のポリペプチド又は２種の核酸配列の「同一性割合」は、KarlinとAltschul（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1993）のアルゴリズムを使用して決定する。このようなアルゴリズムは、Altschul et al.（J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990）のＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＸプログラムに組み込まれている。ＢＬＡＳＴＮプログラムでＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を行って本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。同様に、ＢＬＡＳＴＸプログラムでＢＬＡＳＴタンパク質検索を行って本発明のポリペプチドに相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較を目的としたギャップのあるアライメントを得るには、Altschul et al.（Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997）に記載のようにＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用する。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータ（例えば、ＢＬＡＳＴＸ及びＢＬＡＳＴＮ）を使用する。
【０１１５】
一実施形態によれば、微生物が特定の属に属すると分類するためには、特定の属に属することが知られている参照微生物に対して、少なくとも９０％の配列相同性、少なくとも９１％の配列相同性、少なくとも９２％の配列相同性、少なくとも９３％の配列相同性、少なくとも９４％の配列相同性、少なくとも９５％の配列相同性、少なくとも９６％の配列相同性、少なくとも９７％の配列相同性、少なくとも９８％の配列相同性、少なくとも９９％の配列相同性を有する必要がある。特定の実施形態によれば、配列相同性は少なくとも９５％である。
【０１１６】
他の実施形態によれば、微生物が特定の種に属すると分類するためには、特定の種に属することが知られている参照微生物に対して、少なくとも９０％の配列相同性、少なくとも９１％の配列相同性、少なくとも９２％の配列相同性、少なくとも９３％の配列相同性、少なくとも９４％の配列相同性、少なくとも９５％の配列相同性、少なくとも９６％の配列相同性、少なくとも９７％の配列相同性、少なくとも９８％の配列相同性、少なくとも９９％の配列相同性を有する必要がある。特定の実施形態によれば、配列相同性は少なくとも９７％である。
【０１１７】
幾つかの実施形態では、マイクロバイオータ試料を直接アッセイして１種以上のＤＮＡ配列のレベルを求める。幾つかの実施形態では、ＤＮＡをマイクロバイオータ試料から単離し、単離したＤＮＡをアッセイして１種以上のＤＮＡ配列のレベルを求める。微生物ＤＮＡを単離する方法は当技術分野では周知である。その例としては、フェノール−クロロホルム抽出やＱＪＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｓｔｏｏｌ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（カリフォルニア州、バレンシア、Ｑｉａｇｅｎ社）等の様々な市販キットが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１８】
幾つかの実施形態では、１種以上のＤＮＡ配列のレベルは、ＰＣＲ（例えば、標準ＰＣＲ、半定量的ＰＣＲ又は定量的ＰＣＲ）を使用してＤＮＡ配列を増幅することによって決定する。幾つかの実施形態では、１種以上のＤＮＡ配列のレベルは、定量的ＰＣＲを使用してＤＮＡ配列を増幅することによって決定する。このような手順や他の基本的なＤＮＡ増幅手順は当業者に周知であり、Ausebel et al.（Ausubel F M, Brent R, Kingston R E, Moore D, Seidman J G, Smith J A, Struhl K (eds). 1998. Current Protocols in Molecular Biology. Wiley: New York）に記載されている。
【０１１９】
幾つかの実施形態では、ＤＮＡ配列の増幅は、個々の微生物種を他の異なる微生物種から区別する１種以上の配列に対して、特異的なプライマーを使用して行う。幾つかの実施形態では、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列又はその断片は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列に特異的なプライマーを使用して増幅する。幾つかの実施形態では、１８Ｓ  ＤＮＡ配列は、１８Ｓ  ＤＮＡ配列に特異的なプライマーを使用して増幅する。
【０１２０】
幾つかの実施形態では、１種以上の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列のレベルはフィロチップ技術を用いて決定する。フィロチップの使用は当技術分野で周知であり、Hazen et al.（"Deep-sea oil plume enriches indigenous oil-degrading bacteria." Science, 330, 204-208, 2010）に記載されており、この文献全体を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。即ち、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列を増幅し、マイクロバイオータ試料から抽出したＤＮＡから標識する。増幅したＤＮＡを、微生物の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のプローブを含むアレイにハイブリダイズする。次に各プローブへの結合レベルを定量化し、探索された１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列に対応する微生物種の試料レベルを得る。幾つかの実施形態では、フィロチップ分析は商業ベンダーが行う。その例としては、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｃ．（カリフォルニア州、サンフランシスコ）が挙げられるが、これに限定されない。
【０１２１】
幾つかの実施形態では、１種以上の微生物又はその成分又はそれらの生成物のレベルまたは各レベルの決定は、１種以上の微生物ＲＮＡ分子（例えば、転写産物）のレベル又は各レベルの決定を含む。ＲＮＡ転写産物のレベルを定量化する方法は当技術分野で周知であり、ノーザン分析、半定量的逆転写酵素ＰＣＲ、定量的逆転写酵素ＰＣＲ、及びマイクロアレイ解析が挙げられるが、これらに限定されない。このような手順や他の基本的なＲＮＡ転写産物検出手順は、Ausebel et al.（Ausubel F M, Brent R, Kingston R E, Moore D D, Seidman J G, Smith J A, Struhl K (eds). 1998. Current Protocols in Molecular Biology. Wiley: New York）に記載されている。
【０１２２】
幾つかの実施形態では、１種以上の微生物又はその成分又はそれらの生成物のレベルまたは各レベルの決定は、１種以上の微生物タンパク質のレベル又は各レベルの決定を含む。タンパク質レベルを定量化する方法は当技術分野で周知であり、ウエスタン分析や質量分析が挙げられるが、これらに限定されない。このような手順や他の全ての基本的なタンパク質検出手順は、Ausebel et al.（Ausubel F M, Brent R, Kingston R E, Moore D D, Seidman J G, Smith J A, Struhl K (eds). 1998. Current Protocols in Molecular Biology. Wiley: New York）に記載されている。幾つかの実施形態では、１種以上の微生物又はその成分又はそれらの生成物のレベルまたは各レベルの決定は、１種以上の微生物代謝産物のレベル又は各レベルの決定を含む。幾つかの実施形態では、代謝産物のレベルは質量分析によって決定する。幾つかの実施形態では、代謝産物のレベルは核磁気共鳴分光法によって決定する。幾つかの実施形態では、代謝産物のレベルは酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって決定する。幾つかの実施形態では、代謝産物のレベルは比色分析によって決定する。幾つかの実施形態では、代謝産物のレベルは分光光度法により決定する。
【０１２３】
幾つかの実施形態において決定されるのは、マイクロバイオーム内での微生物ファミリーの分布である。しかし、特徴付けは、必要に応じてより詳細なレベル、例えば、属及び／又は種のレベル、及び／又は種内の株又は変異（例えば、変異体）のレベルまで行うことができる（これらは、遺伝子等の様々な遺伝的要素の有無、プラスミドの有無等を含む）。或いは、門、綱又は目等のより高次の分類学的名称を使用することができる。その目的は、反芻動物由来の試料に存在する微生物（通常は細菌だけでなく、真菌（例えば、酵母）、原生生物等）及びその微生物の相対分布（例えば、存在する微生物の総数の割合として表される）を特定して、試験する動物のミクロフローラパターン又は特性を確立することである。
【０１２４】
本発明の他の実施形態では、多くの分類群を検討する場合、ミクロフローラの全体的なパターンを評価する。即ち、同定した特定の分類群のみならず、検出された全分類群に対する、各分類群の割合を考慮し、通常又は必要に応じて、互いにも比較する。当業者であれば、そのようなデータを表現又は蓄積する多くの可能な方法が存在し、その全てが本発明に包含されることを認識するであろう。例えば、「パイチャート」形式を使用してミクロフローラの特性を表すことができる、即ち、検出された全ての分類群の比率又は割合等としてその関係を数値又はグラフで表すことができる。更に、データを操作して、選択した分類群のサブセットのみ（例えば、強い正の相関を示す重要な指標）を考慮することができる。データは、例えば、検出された微生物の総数に対する割合として、又は重量に対する割合等として表すことができる。
【０１２５】
２種の反芻動物の遺伝的背景の類似度を分析する方法は、当技術分野で既知の遺伝子型判定アッセイを用いて実施することができる。
【０１２６】
本明細書で使用される「遺伝子型判定」という用語は、種の個体間の遺伝的変異を決定するプロセスを意味する。一塩基多型（ＳＮＰ）は遺伝子型判定に使用される最も一般的な遺伝的変異であり、集団の１％超で見られる特定の遺伝子座の単一塩基の違いとして定義される。ＳＮＰは、ゲノムのコード領域と非コード領域の両方に見られ、対象となる表現型形質（例えば、対象となる定量的表現型形質）と関連付けることができる。従って、対象となる定量的表現型形質のマーカーとしてＳＮＰを使用することができる。遺伝子型判定に使用される他の一般的な遺伝的変異は「ＩｎＤｅｌｓ」、即ち、様々な長さのヌクレオチドの挿入と欠失である。ＳＮＰとＩｎＤｅｌの両方の遺伝子型判定では、個体間の遺伝子型を決定する多くの方法が存在する。選択する方法は通常、必要なスループットに依存するが、これは、遺伝子型を判定する個体の数と各個体で試験する遺伝子型の数の両方の関数である。選択する方法は、各個体又は試料から入手できる試料物質の量にも依存する。例えば、ＳＮＰ等のマーカーの有無を決定するために、サンガーシーケンシングやハイスループットシーケンシング技術（ＨＴＳ）等のシーケンシングを使用することができる。サンガーシーケンシングでは（キャピラリー）電気泳動による検出を介したシーケンシングを行うことがあり、１回の操作で最大３８４個のキャピラリーの配列を解析することができる。ハイスループットシーケンシングでは、１度に数千又は数百万以上の配列の並行シーケンシングを行う。ＨＴＳは、次世代のシーケンシング、即ち、固相パイロシークエンシングに基づく技術として、又は単一ヌクレオチド・リアルタイム・シーケンシング（ＳＭＲＴ）に基づく次次世代のシーケンシングとして定義することができる。Ｒｏｃｈｅ社、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）が提供するようなＨＴＳ技術が利用可能である。更なるハイスループットシーケンシング技術は、Ｈｅｌｉｃｏｓ社、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ社、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｎａｂｓｙｓ社、ＺＳ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社、ＧｎｕＢｉｏ社によって記載されている、及び／又はそこから入手可能である。これらのシーケンシング技術には各々、実際のシーケンシング段階の前に試料を調製する独自の方法がある。このような段階はハイスループットシーケンシング法に含まれることがある。場合によっては、効率又は経済的な理由から、実際のシーケンシング段階の前に、シーケンシング段階に特定の段階を試料調製プロトコルに統合することができる。例えば、断片に連結されたアダプターには、後続のシーケンシング段階で使用可能な切片が含まれる場合がある（いわゆるシーケンシングアダプター）。シーケンシングの前に断片のサブセットを増幅するのに使用するプライマーには、例えば、増幅段階によってシーケンシングアダプター又は後続のシーケンシング段階で使用可能なアンプリコンの捕捉部分を導入することにより、後にシーケンシング段階で使用できる切片を導入する部分が配列内に含まれることがある。用いるシーケンシング技術にもよるが、増幅段階を省略することができる。
【０１２７】
３０００〜８０００００個のＳＮＰから成るＳＮＰアレイ等の低密度及び高密度チップが本発明での使用に企図されている。一例として、「５０Ｋ」ＳＮＰチップは約５００００個のＳＮＰを測定し、一般には、家畜産業で遺伝的利点又はゲノム推定繁殖値（ＧＥＢＶ）を確立するのに使用される。本発明のある実施形態では、以下のＳＮＰチップのいずれかを使用することができる：ＢｏｖｉｎｅＳＮＰ５０  ｖｌ  ＢｅａｄＣｈｉｐ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）、Ｂｏｖｉｎｅ  ＳＮＰ  ｖ２  ＢｅａｄＣｈｉｐ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）、Ｂｏｖｉｎｅ  ３Ｋ  ＢｅａｄＣｈｉｐ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）、Ｂｏｖｉｎｅ  ＬＤ  ＢｅａｄＣｈｉｐ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）、Ｂｏｖｉｎｅ  ＨＤ  ＢｅａｄＣｈｉｐ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）、Ｇｅｎｅｓｅｅｋ（登録商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ（商標）ＬＤ  ＢｅａｄＣｈｉｐ、又はＧｅｎｅｓｅｅｋ（登録商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ（商標）ＨＤ  ＢｅａｄＣｈｉｐ。
【０１２８】
一実施形態では、動物間の遺伝的類似度を測定するために、ＳＮＰデータに基づいた動物間の遺伝的関連性を計算する。この目的のため、動物の各固有の対間での遺伝的関連性を推定するマトリックスを作成することができる。このマトリックスは共有対立遺伝子の数に基づいており、対立遺伝子の希少性に重きが置かれている。
【０１２９】
【数１】
2020530310.tif 000003
（式中、Ａｊｋは動物ｊとｋとの間の遺伝的関係の推定値を表し、ｘｉｊとｘｉｋはそれぞれ動物ｊ及びｋの参照対立遺伝子の数であり、ｐｉは母集団における参照対立遺伝子の割合であり、ｎは関連性の推定に使用されるＳＮＰの総数である。）
【０１３０】
存在量プロファイルにおける変動のかなりの割合が遺伝的要因に起因し得る微生物種を特定するために、マイクロバイオータ試料を分析して、類似の遺伝的背景を共有する動物内で同様の存在量（絶対存在量又は相対存在量）を示す微生物の分類群（例えば、種）を明らかにする。
【０１３１】
一実施形態では、微生物又はＯＴＵが重要な遺伝的要素を示すと見なされるのは、遺伝率推定値が＞０．０１であり、Ｐ値が＜０．１である場合である。試験のストリンジェンシーに応じて信頼レベルの増減が可能であることが理解されよう。従って、例えば、他の実施形態では、微生物が重要な遺伝的要素を示すと見なされるのは、遺伝率推定値が＞０．０１であり、Ｐ値が＜０．０５である場合である。本発明者らが企図した、他の企図された遺伝率推定値としては、＞０．０２（Ｐ値は＜０．１）、＞０．０３（Ｐ値は＜０．１）、＞０．０４（Ｐ値は＜０．１）、＞０．０５（Ｐ値は＜０．１）、＞０．０６（Ｐ値は＜０．１）、＞０．０７（Ｐ値は＜０．１）、＞０．０８（Ｐ値は＜０．１）、＞０．０９（Ｐ値は＜０．１）、＞０．１（Ｐ値は＜０．１）、＞０．２（Ｐ値は＜０．１）、＞０．３（Ｐ値は＜０．１）、＞０．４（Ｐ値は＜０．１）、＞０．５（Ｐ値は＜０．１）、＞０．６（Ｐ値は＜０．１）、＞０．７（Ｐ値は＜０．１）、＞０．８（Ｐ値は＜０．１）が挙げられる。
【０１３２】
本発明者らが企図した、他の企図された遺伝率推定値としては、＞０．０２（Ｐ値は＜０．０５）、＞０．０３（Ｐ値は＜０．０５）、＞０．０４（Ｐ値は＜０．０５）、＞０．０５（Ｐ値は＜０．０５）、＞０．０６（Ｐ値は＜０．０５）、＞０．０７（Ｐ値は＜０．０５）、＞０．０８（Ｐ値は＜０．０５）、＞０．０９（Ｐ値は０．０５）、＞０．１（Ｐ値は０．０５）、＞０．２（Ｐ値は０．０５）、＞０．３（Ｐ値は０．０５）、＞０．４（Ｐ値は０．０５）、＞０．５（Ｐ値は０．０５）、＞０．６（Ｐ値は０．０５）、＞０．７（Ｐ値は０．０５）、＞０．８（Ｐ値は０．０５）が挙げられる。
【０１３３】
特定の実施形態によれば、遺伝率推定値は＞０．７であり、Ｐ値は＜０．０５である。
【０１３４】
分析の信頼性を高めるため、遺伝率分析は、遺伝子型判定されたサブセットの少なくとも２０％、２５％、３０％、４０％、５０％又はそれ以上に存在する細菌分類群のみに限定することができる。また、各細菌分類群の遺伝率分析は複数回、例えば、複数の異なる試料採取日（例：２日、３日、４日、５日又はそれ以上）に亘って行うことができる。個々の試料採取日の全ての日において重要な遺伝的要素（例えば、遺伝率推定値が＞０．７、ｐ値が＜０．０５）を示した細菌分類群のみを遺伝性と見なすことができる。
【０１３５】
一実施形態では、経世代細菌はバクテロイデス門及び／又はファーミキューテス門に属し、門の量は動物が所望の遺伝形質を有するかどうかの指標となる。
【０１３６】
他の実施形態では、経世代細菌はバクテロイデス目及び／又はクロストリジウム目に属し、門の量は動物が所望の遺伝形質を有するかどうかの指標となる。
【０１３７】
既に述べたように、本発明者らは上述の手順を実施しながら、遺伝性基準に適合する２２種のＯＴＵを特定した。
【０１３８】
本明細書で使用される「ＯＴＵ」という用語は、系統樹の末端の葉を意味し、核酸配列、例えば、全ゲノム又は特定の遺伝子配列、及びこの核酸配列と種のレベルでの配列同一性を共有する全ての配列によって定義される。幾つかの実施形態では、特定の遺伝子配列は１６Ｓ配列又は１６Ｓ配列の一部とすることができる。他の実施形態では、２種の実体の全ゲノムをシーケンシングして比較する。他の実施形態では、多座位配列タグ（ＭＬＳＴ）等の選択領域、特定の遺伝子、又は遺伝子のセットを遺伝的に比較することができる。１６Ｓの実施形態では、１６Ｓ全体又は１６Ｓの一部の可変領域に亘って９７％を超える平均ヌクレオチド同一性を共有するＯＴＵを同一のＯＴＵと見なす。例えば、Claesson et al., 2010. Comparison of two next-generation sequencing technologies for resolving highly complex microbiota composition using tandem variable 16S rRNA gene regions. Nucleic Acids Res 38: e200. Konstantinidis et al., 2006. The bacterial species definition in the genomic era. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 361 : 1929-1940を参照。全ゲノム、ＭＬＳＴ、１６Ｓ以外の特定の遺伝子又は遺伝子のセットを伴う実施形態では、９５％を超える平均ヌクレオチド同一性を共有するＯＴＵを同一のＯＴＵと見なす。例えば、Achtman and Wagner. 2008. Microbial diversity and the genetic nature of microbial species. Nat. Rev. Microbiol. 6: 431-440; Konstantinidis et al., 2006, supra.The bacterial species definition in the genomic era. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 361: 1929-1940を参照。生物間の配列を比較してＯＴＵを定義することができる。一般に、配列同一性が９５％未満の配列は同一のＯＴＵの一部を構成するとは見なされない。ＯＴＵの特徴付けは、ヌクレオチドマーカー又は遺伝子（特に高度に保存された遺伝子（例えば、「ハウスキーピング」遺伝子））の任意の組み合わせ、又はそれらの組み合わせによって行うこともできる。このような特徴付けでは、例えば、ＷＧＳデータ又は全ゲノム配列を使用する。本明細書においては、細菌の「種」とは、株、種、クレード又は科のレベルとなり得るＯＴＵを意味する。
【０１３９】
一実施形態では、ＯＴＵを以下の表１に記載する。
【０１４０】
【表１−１】
2020530310.tif 000004
【０１４１】
【表１−２】
2020530310.tif 000005
【０１４２】
【表１−３】
2020530310.tif 000006
【０１４３】
【表１−４】
2020530310.tif 000007
【０１４４】
【表１−５】
2020530310.tif 000008
【０１４５】
【表１−６】
2020530310.tif 000009
【０１４６】
【表１−７】
2020530310.tif 000010
【０１４７】
【表１−８】
2020530310.tif 000011
【０１４８】
一実施形態では、ＯＴＵは、配列番号１〜２２に記載の配列のいずれか１個に記載されている。他の実施形態では、ＯＴＵは配列番号１、３、５、７、８、９、１１〜１７、１９、２０又は２１に記載されている。
【０１４９】
特定の形質に対する特定のＯＴＵを以下の表２にまとめる。表中、（１）は正の相関を表し、（−１）は負の相関を表し、（０）は有意な相関なしを表す。
【０１５０】
【表２】
2020530310.tif 000012
【０１５１】
本発明は上述の複数のＯＴＵを分析することを更に企図する。従って、少なくとも１種のＯＴＵ、上述のＯＴＵの少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、少なくとも１１種、少なくとも１２種、少なくとも１３種、少なくとも１４種、少なくとも１５種又は全てを分析する。
【０１５２】
動物が所望の表現型と相関する十分な量の経世代微生物を有すると一旦分類されれば、その動物が所望の表現型を有するものとして選択し（例えば、群れの残りから分離し）、分類できることが理解されよう。一実施形態によれば、この表現型を含むことが明らかとなるように動物をブランド化した。
【０１５３】
一実施形態では、動物を繁殖の候補として選択する。従って、動物が自然交配、人工受精又は体外受精用の配偶子ドナーとして適していると見なされることがある。
【０１５４】
従って、本発明の他の様相によれば、反芻動物を繁殖させるための方法であって、本明細書に記載の方法に従って選択した雌性反芻動物を雄性反芻動物由来の精液で受精させて反芻動物を繁殖させることを含む方法を提供する。
【０１５５】
本発明の他の様相によれば、反芻動物を繁殖させるための方法であって、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法に従って選択した雄性反芻動物由来の精液で雌性反芻動物を受精させて反芻動物を繁殖させることを含む方法を提供する。
【０１５６】
１種以上の雄ウシと雌ウシとの交配は、人工受精によることが好ましいが、自然受精によることもある。
【０１５７】
本発明の更に他の様相によれば、反芻動物の品種純度を決定する方法が提供され、この方法は、反芻動物のマイクロバイオームを分析することを含み、マイクロバイオーム中の細菌の量の類似度は品種純度を示す。
【０１５８】
従って、同一種の２頭の動物を同一品種と見なすことができるのは、マイクロバイオームにおいて表１に記載の細菌ＯＴＵの内の少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、更には少なくとも１０種又は全ての量（quantity）（例えば、発生率）が統計的に有意に類似している場合である。他の実施形態によれば、同一種の２頭の動物を同一品種と見なすことができるのは、マイクロバイオームにおいてバクテロイデス門及び／又はファーミキューテス門に属する細菌、又はバクテロイデス目及び／又はクロストリジウム目に属する細菌の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、更には７０％の量（quantity）（例えば、相対比）が同一である場合である。
【０１５９】
本発明者らは、第一胃内マイクロバイオーム中の特定の微生物の存在量が遺伝性であることを示した。よって、本発明者らは、マイクロバイオーム中に微生物が特定量存在する反芻動物の繁殖が可能であると更に予測する。これは、経世代細菌に関連する形質又は目的に関する知見がなくても実施可能であることが理解されよう。
【０１６０】
従って、本発明の更に他の様相によれば、所望のマイクロバイオームを有する反芻動物の数を増加させる方法であって、前記反芻動物の雌雄を繁殖させることを含み、前記雄性反芻動物及び／又は前記雌性反芻動物のいずれかの第一胃内マイクロバイオームは所定レベルを超える経世代微生物を含んでおり、これによって所望のマイクロバイオームを有する反芻動物の数を増加させる方法を提供する。
【０１６１】
経世代微生物（例えば、細菌）を含む第一胃内マイクロバイオームを有する動物の選択は、更に上述のように、第一胃内マイクロバイオームの試料を分析することによって行うことができる。
【０１６２】
上述のように、経世代微生物は既知の遺伝形質に関連していることがある。遺伝形質の例は上述されている。
【０１６３】
上記に加え、又は上記に代えて、経世代微生物は動物のマイクロバイオームの微生物の相対量（即ち、マイクロバイオーム全体の組成）に影響を及ぼすことがある。
【０１６４】
経世代微生物（例えば、細菌）の例は、上述されているもの、例えば、配列番号１〜２２から成る群から選択される１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列を発現する細菌である。
【０１６５】
本明細書で使用する「約」は、±１０％を指す。
【０１６６】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」およびその活用形は、「限定されるものではないが、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」を意味する。
【０１６７】
「からなる」という用語は、「含み、限定される」ことを意味する。
【０１６８】
「から実質的になる」という用語は、組成物、方法または構造が追加の成分、工程および／または部分を含み得ることを意味する。但しこれは、追加の成分、工程および／または部分が、請求項に記載の組成物、方法または構造の基本的かつ新規な特性を実質的に変更しない場合に限られる。
【０１６９】
本明細書において、単数形を表す「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他を示さない限り、複数をも対象とする。例えば、「化合物（a compound）」または「少なくとも１種の化合物」には、複数の化合物が含まれ、それらの混合物をも含み得る。
【０１７０】
本願全体を通して、本発明のさまざまな実施形態は、範囲形式にて示され得る。範囲形式での記載は、単に利便性および簡潔さのためであり、本発明の範囲の柔軟性を欠く制限ではないことを理解されたい。したがって、範囲の記載は、可能な下位の範囲の全部、およびその範囲内の個々の数値を特異的に開示していると考えるべきである。例えば、１〜６といった範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６等の部分範囲のみならず、その範囲内の個々の数値、例えば１、２、３、４、５および６も具体的に開示するものとする。これは、範囲の大きさに関わらず適用される。
【０１７１】
本明細書において数値範囲を示す場合、それは常に示す範囲内の任意の引用数（分数または整数）を含むことを意図する。第１の指示数と第２の指示数「との間の範囲」という表現と、第１の指示数「から」第２の指示数「までの範囲」という表現は、本明細書で代替可能に使用され、第１の指示数および第２の指示数と、それらの間の分数および整数の全部を含むことを意図する。
【０１７２】
本明細書で使用する「方法」という用語は、所定の課題を達成するための様式、手段、技術および手順を意味し、化学、薬理学、生物学、生化学および医療の各分野の従事者に既知のもの、または既知の様式、手段、技術および手順から従事者が容易に開発できるものが含まれるが、これらに限定されない。
【０１７３】
特定の配列リストを参照する場合、そのような参照は、例えば、シーケンシングエラー、クローニングエラー、又は塩基置換、塩基欠失又は塩基付加を生じる他の変化に起因する微量な配列変異を含む相補配列に実質的に対応する配列も包含すると理解されるべきであるが、但しこれは、そのような変異の頻度が５０個のヌクレオチド中１個未満、或いは、１００個のヌクレオチド中１個未満、或いは、２００個のヌクレオチド中１個未満、或いは、５００個のヌクレオチド中１個未満、或いは、１０００個のヌクレオチド中１個未満、或いは、５０００個のヌクレオチド中１個未満、或いは、１００００個のヌクレオチド中１個未満の場合である。
【０１７４】
明確さのために別個の実施形態に関連して記載した本発明の所定の特徴はまた、１つの実施形態において、これら特徴を組み合わせて提供され得ることを理解されたい。逆に、簡潔さのために１つの実施形態に関連して記載した本発明の複数の特徴はまた、別々に、または任意の好適な部分的な組み合わせ、または適当な他の記載された実施形態に対しても提供され得る。さまざまな実施形態に関連して記載される所定の特徴は、その要素なしでは特定の実施形態が動作不能でない限り、その実施形態の必須要件であると捉えてはならない。
【０１７５】
上述したように、本明細書に記載され、特許請求の範囲に請求される本発明のさまざまな実施形態および態様は、以下の実施例によって実験的に支持されるものである。
【実施例】
【０１７６】
ここで、上記の記載と共に本発明を限定することなく説明する以下の実施例に参照する。
【０１７７】
一般に、本明細書で使用される命名法や本発明で利用される実験手順には、分子、生化学、微生物学及び組換えＤＮＡ技術が含まれる。そのような技術は文献で十分に説明されている。例えば、"Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998);米国特許第４，６６６，８２８号、第４，６８３，２０２号、第４，８０１，５３１号、第５，１９２，６５９号及び第５，２７２，０５７号に記載の方法、"Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique" by Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), Third Edition; "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980)、利用可能なイムノアッセイは特許及び科学文献に広く記載されている（例えば、米国特許第３，７９１，９３２号、第３，８３９，１５３号、第３，８５０，７５２号、第３，８５０，５７８号、第３，８５３，９８７号、第３，８６７，５１７号、第３，８７９，２６２号、第３，９０１，６５４号、第３，９３５，０７４号、第３，９８４，５３３号、第３，９９６，３４５号、第４，０３４，０７４号、第４，０９８，８７６号、第４，８７９，２１９号、第５，０１１，７７１号及び第５，２８１，５２１号参照）、"Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) and "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996)。これら文献の全てを本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。他の一般的な参考文献はこの文書全体で提供される。そこに記載の手順は、当技術分野で周知であると考えられており、読者の便宜のために提供される。そこに含まれる全ての情報を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。
【０１７８】
材料及び方法
微生物ＤＮＡ抽出：  第一胃液の微生物画分を、Stevenson and Weimer, 2007, Applied Microbiology and Biotechnology 75: 165-174の方法に、Jami et al., 2013, The ISME journal 7: 1069-1079が実施した小規模な改変を加えた方法に従って分離した。ＤＮＡはStevenson and Weimer（上述）に記載のように抽出した。
【０１７９】
ゲノムＤＮＡ抽出：  各動物の全血５００μＬをＴｒｉｓ−ＨＣｌ飽和フェノール（ｐＨ８．０）５００μＬ及びＤＤＷ（再蒸留水）５００μＬと混合した。混合物を室温で４時間振盪した後、７５００ｇで５分間遠心分離し、水相を５００μＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）飽和フェノール−クロロホルム（１：１）を含む新しいチューブに移した後、７５００ｇで５分間遠心分離した。ＤＮＡを含む水相を新しい管に移して更なる処理に備えた。
【０１８０】
動物の遺伝子型判定：  動物は、イスラエルの農業研究機関のＶｏｌｃａｎｉ  Ｃｅｎｔｅｒ群れのメンバーである。遺伝子型判定を行った動物の中には、各々が共通の種雄親を共有する１１の群（半兄弟の群）が存在した。このような群の内の１群は４頭の半兄弟で構成され、他の群は３頭の半兄弟で構成され、残りの群は全て２頭の半兄弟で構成されていた。更に、共通の雌親を共有する２組の半兄弟が存在した。遺伝子型判定した動物間に完全兄弟はいなかった。雌ウシ間の遺伝的関連性はそのゲノム情報のみに基づいて評価した。
【０１８１】
動物からのゲノムＤＮＡ抽出物をウシＳＮＰチップ５０Ｋにロードした。これは、ウシゲノム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）に沿って等間隔に配置した５４６０９個の一般のＳＮＰを対象としている。使用したＳＮＰチップモデルはＩｌｌｕｍｉｎａ  ＢｏｖｉｎｅＳＮＰ５０−２４  ｖ３．０  ｃａｔ  ２００００７６６であり、バイオメディカルコア施設のゲノミクスセンター（イスラエル、テクニオン）で製造業者のプロトコル（Adler et al., 2013, JoVE (Journal of Visualized Experiments):e50683-e50683）に従って処理した。
【０１８２】
１６Ｓ  ｒＲＮＡシーケンシング及び分析：  １６Ｓ  Ｖ２領域の増幅は、プライマーＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ（配列番号１；フォワード）及びＣＣＧＴＣＡＡＴＴＣＭＴＴＴＲＡＧＴ（配列番号２；リバース）を用いて実施した。次にライブラリーをプールし、Ｃａｓａｖａ１．８で分析した後、断片の各末端を、２５１サイクルにわたって単一のＭｉＳｅｑフローセル（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）でシーケンシングした。試料全体から計４９７６０４７８個のペアエンドリードが得られ、試料１個当たり平均１０６３２５個のペアエンドリードが得られた。ＱＩＩＭＥパイプラインバージョン１．７．０３７を使用してデータ品質管理と分析を行った。ＯＴＵ分析は、ＵＣＬＵＳＴを使用して作成した種クラスター（９７％の同一性）で行った。１６Ｓ  ｒＲＮＡ参照データベースＲＤＰに対してＢＬＡＳＴを使用してＯＴＵを分類割り当てに付した。シングルトンとダブルトンをデータセットから選別し、試料１個当たり平均５０３９の８５Ｋ種を得た。
【０１８３】
遺伝子型データ品質管理：  現在の分析で得た４７個体の遺伝子型を、イスラエルとオランダの農場の個々のホルスタイン乳牛から採取した２６９１種の個々の遺伝子型の参照セットと組み合わせた（Ｉｓｒａｅｌｉ  Ｃｏｗ  Ｂｒｅｅｄｅｒｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＩＣＢＡ）の厚意）。遺伝子型の参照セットによって、より強い品質管理（ＱＣ）と一般的な関係マトリックスの作成が可能になった。ＱＣは、ＰＬＩＮＫプログラムを使用し、以下のパラメータによって行った：−ｃｏｗ−−ｆｉｌｅ  ｉｓｇｅｎｏｔｙｐｅ  ＿ａｌｌ−−ｍａｆ  ０．０５−−ｇｅｎｏ  ０．０５−−ｍｉｎｄ  ０．０５−ｏｕｔ  ｉｓｇｅｎｏｔｙｐｅ  ＿ａｌｌ＿ｑｃ−−ｒｅｃｏｄｅ１２。
【０１８４】
５％を超える個体で遺伝子型判定がなされなかったＳＮＰを除外した。同様に、遺伝子型判定が成された遺伝子座（ＳＮＰ）が、ＳＮＰチップが網羅するものの９５％未満の場合には、その個体を分析から除外した。
【０１８５】
３５４個体（１個体は研究群に属する）を遺伝子型判定の低さ故に除外し、３７９７個のＳＮＰを遺伝子型判定集団の「欠損」故に除外し、１１２９０個のＳＮＰはＭＡＦ基準に沿わなかった。ＱＣに合格したＳＮＰの総数は４０８１２個であった。
【０１８６】
遺伝的関連性マトリックスの生成：  ＱＣに合格した全ての動物とＳＮＰとを使用して、動物の各固有対間の遺伝的関連性を推定するマトリックスを生成した。ＧＣＴＡ（Yang et al. 2011, The American Journal of Human Genetics 88:76-82）ソフトウェアを使用して関係マトリックスを計算した。このマトリックスは共有対立遺伝子の数に基づいており、対立遺伝子の希少性に重きが置かれている。
【０１８７】
【数２】
2020530310.tif 000013
式中、Ａｊｋは動物ｊとｋとの間の遺伝的関係の推定値を表し、ＸｉｊとＸｉｋはそれぞれ動物ｊとｋの参照対立遺伝子の数であり、Ｐｉは母集団における参照対立遺伝子の割合であり、Ｎは関連性の推定に使用されるＳＮＰの総数である。
【０１８８】
遺伝率推定値：それぞれの種の遺伝率推定値は、動物間の推定遺伝的関連性と関連させ、問題となっている種の相対存在量の分布に基づいて確立した。ソフトウェアＧＣＴＡを使用して推定を行った。このソフトウェアで使用されるモデルは全遺伝率と称され、ＱＣに合格した全てのＳＮＰで説明された遺伝率を反映している。このモデルは、下記式で表される。
【０１８９】
【数３】
2020530310.tif 000014
（式中、ｙは観測結果（表現型）のベクトルである。βは固定効果のベクトルである（研究共変量）。Ｘはデザイン行列、ｕはＳＮＰ効果のベクトルである。Ｗは標準化された遺伝子型行列、εは個々の（残余）効果である。）
【０１９０】
モデルの分散は、次のように遺伝性誤差と偶発誤差の２種の原因に起因する可能性がある。
【０１９１】
【数４】
2020530310.tif 000015
（式中、Ｖは全体分散である。Ｉは単位行列（ｎ＊ｎ）である。σｕ２は遺伝（全体的なＳＮＰ効果）に起因する分散である。σε２は個々の効果（残余）に起因する分散である。）
【０１９２】
次にＧＣＴＡによってσｕ２とσｇ２の値を推定した後、遺伝率を次のように推定する。
【０１９３】
【数５】
2020530310.tif 000016
【０１９４】
経世代細菌ＯＴＵ内の系統発生距離と全第一胃内マイクロバイオーム内の系統発生距離との比較：  ２２種の経世代細菌ＯＴＵ内の各固有対間のＤＮＡ類似度（百分率）をｃｌｕｓｔａｌｗ２（４４）によって計算した後、これらの類似度の平均を計算した。平均類似度の参照範囲は、少なくとも１２種の遺伝子型判定動物（９Ｋ）に出現するＯＴＵのプールから各々同じサイズ（ｎ＝２２）の１００個のサブセットを無作為に採取して計算した。無作為サブセット各々についてペアワイズＤＮＡ類似度とその平均を計算した。経世代細菌ＯＴＵ群内の平均類似度の有意性を導くため、その平均類似度を無作為サブセットから得た全部で１００個の平均類似度値内においてランク付けした。
【０１９５】
ＯＴＵ相関オッズ比：
【数６】
2020530310.tif 000017
式中、ｈｃは指標に関連付けられる遺伝性ＯＴＵの数であり、ｈｎは指標に関連付けられない遺伝性ＯＴＵの数であり、ｎｃは指標に関連付けられる非遺伝性ＯＴＵの数であり、ｎｎは指標に関連付けられない非遺伝性ＯＴＵの数である。この状況では、ＯＴＵの公称スピアマンがｐ＜０．０５の場合にＯＴＵは指標と相関していた。
【０１９６】
統計及びプロット：  Ｒソフトウェアを使用して統計分析を行い、ｇｇｐｌｏｔ２及びｐｈｅａｔｍａｐパッケージを使用してプロットを作成した。
【０１９７】
実験計画：  主たる目的は、存在量プロファイル中の変動のかなりの割合が遺伝的要因に起因し得る微生物種を特定することであった。これを実現するために、本発明者らは４７頭のホルスタイン乳牛の共通ＳＮＰ遺伝子型判定情報を分析した。この情報を、最近の研究（Kruger et al., 2016, ISME J 10:2958-2972）から得たこのような動物に関する追加データと統合させた。各動物に関し、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のシーケンシングを連続する３日間で得られた試料によって行った。第一胃内代謝産物も定量化し、第一胃代謝活性アッセイ（生体外第一胃内メタン生成や繊維消化測定等）を行った。個々の雌ウシの産生指標と生理学的指標のメタデータを統合した。ＱＣパイプライン（材料及び方法を参照）を使用して低品質および無益なＳＮＰを除外した。ＱＩＩＭＥパイプラインを使用して１６Ｓアンプリコンシーケンシング分析を行った。８５Ｋ種レベルのＯＴＵ（一動物当たり試料３個）で表される第一胃内マイクロバイオーム分類プロファイルは、一般的なＳＮＰ遺伝子座の遺伝子型判定で表されるゲノムデータと関連していた（方法を参照）。特に、本発明者らは、遺伝率推定値の大きさよりも経世代微生物ＯＴＵの特定に重点を置いた。このアプローチは、推定手順で試料サイズが小さい場合の典型的な遺伝率推定値に対してよりロバスト（robust）である。動物のゲノムに関連していることが分かった微生物のＯＴＵは、マイクロバイオームのメタボロミクスデータ、及び動物の生理機能及び産生性パラメータと更に相関があった。
【０１９８】
結果
遺伝性種は系統発生的な関連性が高く、バクテロイデス目が豊富である。
本分析の最初の段階は、経世代細菌種、即ち、存在量プロファイル変化のかなりの割合が遺伝性要因に起因し得る微生物種を特定することであった。これは、類似の遺伝的背景を共有する動物間で、ある種の存在量が非常に類似していることに反映され得る。従って、コホート内の全ての動物対間の関連性を推定した。この推定は、参照遺伝子型の対立遺伝子（ＳＮＰ）の数と低頻度の両方を考慮して行った。このようなペアワイズ遺伝的関係の推定値を各種の存在量プロファイルと一緒に使用して、その遺伝率推定値を計算した。
【０１９９】
この分析の信頼性を高めるために、上述のように（Benson AK et al, 2010, Proceedings of the National Academy of Sciences 107: 18933-18938）、遺伝率分析は少なくとも１２頭の遺伝子型判定された動物（遺伝子型判定されたサブセットの２５％）に存在するＯＴＵに限定された。また、３種の独立した遺伝率分析を各ＯＴＵに対して各試料採取日に１回行った。３日間の個々の試料採取日全てで重要な遺伝的要素（遺伝率推定値が＞０．７でｐ値が＜０．０５）を示したＯＴＵのみを遺伝性ＯＴＵと見なした。この手順に続いて、このような基準に適合する２２種の遺伝性ＯＴＵの分析を行い（図８）、その結果、全てが細菌ドメインに属していた。遺伝率の有意性評価手順はパラメトリック試験に基づいているが、それにもかかわらず、本発明者らは、順列仮定の下での試験の偽発見率分布を調べることによって、この知見の堅牢性を検査した。その目的のために、本発明者らは１００回の反復でヌルモデルを生成し、各反復では、遺伝性プロファイルの順序を無作為にシャッフルし、その後、遺伝率分析を繰り返した。順列の９４％において遺伝性と検出されたＯＴＵの数は２２未満であったが、殆どの順列では、遺伝性と検出されたＯＴＵの数は５未満であった（図６）。
【０２００】
興味深いのは、遺伝性ＯＴＵが動物間で（動物の５０％〜１００％の範囲で）高い存在を示し、その大半が検査した動物の７０〜１００％で見られることである（図２、９及び１０）。経世代微生物の存在量プロファイルはその存在プロファイルと相関があった（存在数と存在量合計との間のスピアマン相関：ｒ＝０．７５、ｐ＜５×１０−５）。
【０２０１】
これらのＯＴＵ間の系統発生距離を測定したところ、１６Ｓヌクレオチド配列の類似度に基づいて、それらが系統発生的に非常に関連していることが分かった（図１）。
【０２０２】
これらのＯＴＵは、第一胃内マイクロバイオームの２種の主要な門、即ち、バクテロイデス門とファーミキューテス門に属し、第一胃内の２種の優位な目であるバクテロイデス目及びクロストリジウム目に分類される（図２）。
【０２０３】
本発明者らは更に、この遺伝性ＯＴＵの系統学的組成が第一胃内の種組成全体を表すかどうか求めた。バクテロイデス目は、第一胃内マイクロバイオーム全体で示されるよりも多くの種によって遺伝性ＯＴＵ内で示されることが分かった（傾向、フィッシャー直接確率法ｐ＜０．０５３）。
【０２０４】
経世代細菌の存在量は、第一胃内代謝パラメータだけでなく宿主形質とも相関しており、動物間の変異の高い割合を有意に説明することができる。
【０２０５】
本発明者らは、宿主ゲノムに相関する遺伝性分類群は、潜在的に第一胃内代謝と宿主生理機能に関連すると仮定した。従って、本発明者らは、経世代微生物と、動物について測定された全ての生理学的パラメータとの相関、更には第一胃内代謝パラメータとの相関を探索した。詳細には、各遺伝性ＯＴＵの７８頭の雌ウシのコホートに沿った存在量プロファイルを各測定指標（第一胃内代謝産物又は他の指標）のプロファイルと相関させた。次に、遺伝性ＯＴＵと各第一胃内代謝産物の平均相関を比較し、宿主の生理学的特質をヌルモデルと比較した。ヌルモデルの１０００回の反復の各々において、各遺伝性ＯＴＵの存在量プロファイルをシャッフルし、各第一胃内代謝産物と宿主の生理学的特質との平均相関を再計算した。この分析によって、遺伝性ＯＴＵは、第一胃内代謝パラメータの多くと強く有意な相関を示すと共に、宿主の生理学的特質とも強く有意な相関を示すことが明らかになった（図３、７）。
【０２０６】
第一胃内代謝との関係では、遺伝性ＯＴＵに対して最も強く相関するのは、プロピオネート：アセテート比（最大強度ｒ＝０．８６、平均｜ｒ｜＝０．６４）、メタン代謝（最大強度ｒ＝０．６９、平均｜ｒ｜＝０．４９）、プロピオン酸（最大強度ｒ＝−０．６２４５２７４、平均｜ｒ｜＝０．４４）及び吉草酸（最大強度ｒ＝−０．５７、平均｜ｒ｜＝０．３９）、更には数種のアミノ酸、即ち、グリシン、アスパルテート及びチロシンの濃度であった（それぞれ最大強度ｒ＝０．５１、０．５、−０．５３、平均｜ｒ｜＝０．３２、０．３９、０．３６）。宿主の特質に関しては、最も相関のあるパラメータは、乳タンパク質（最大強度ｒ＝０．４６、平均｜ｒ｜＝０．３３）、乾物摂取量（最大強度ｒ＝０．４１、平均｜ｒ｜＝０．２８）、飼料効率（残留飼料摂取量（ＲＦＩ）で表される、最大強度ｒ＝０．２６、平均｜ｒ｜＝０．３９）及び乳脂肪（最大強度ｒ＝０．３９、平均｜ｒ｜＝０．２５）であった。更に、遺伝性ＯＴＵとプロピオネート：アセテート比、メタン代謝、プロピオン酸及び吉草酸との個々の相関を分析すると、これらのＯＴＵの大部分がこれらのパラメータと正又は負に相関していることが分かった（図４Ａ）。宿主の生理学的特質に関して、遺伝性ＯＴＵの大部分はＲＦＩ、ＤＭＩ及び乳タンパク質と正に相関していた。
【０２０７】
これらの知見によって、宿主の生理機能と第一胃内代謝に相関する経世代微生物の部分が、第一胃内のマイクロバイオーム全体で見られる部分と異なるかどうかという問題が提起された。この目的のため、本発明者らは各指標についてＯＴＵ相関オッズ比を計算し（材料及び方法を参照）、多くのパラメータについて遺伝性マイクロバイオーム内の所定の指標に相関するＯＴＵの有意に高いオッズを特定した。これは、これらの経世代微生物が高い相関を示したパラメータについて特に当てはまった（図４Ｂ）。
【０２０８】
バクテロイデス目と系統発生的関連を有する遺伝性ＯＴＵの１種は遺伝性であり、本研究で飼料効率形質と高度に相関していることが見出されたが、過去の研究（Kruger Ben Shabat S, et al., 2016. ISME J 10:2958-2972）でこの形質と相関することが独自に分かっていた（図５）。更に、本研究では、バクテロイデス、プレボテラ、クロストリジウム及びフラベファシエンスと系統発生的関連を有する他の５種の遺伝性ＯＴＵが乳タンパク質と高度に相関していることが分かったが、上述のプレボテラ属の内の１種のＯＴＵが乾物摂取量（ＤＭＩ）と有意に相関することもこの過去の研究で分かっていた（図５）。
【０２０９】
第一胃及び動物の生理学的形質は遺伝率推定値を変化させる。
宿主形質との相関を示す経世代微生物種を特定した後、本発明者らは、経世代微生物が相関することが分かった様々な重要な宿主及び第一胃内代謝形質の遺伝率を推定することを試みた（図１１）。ＶＦＡ（プロピオネート、サクシネート及びバレレート）、乳タンパク質及びＲＦＩとＤＭＩの効率測定値は有意な遺伝率推定値を示した。
【０２１０】
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【配列表フリーテキスト】
【０２１１】
配列番号１：  操作的分類単位（ＯＴＵ）核酸配列
配列番号２：  操作的分類単位（ＯＴＵ）核酸配列
配列番号３：  操作的分類単位（ＯＴＵ）核酸配列
配列番号４：  操作的分類単位（ＯＴＵ）核酸配列
配列番号５：  操作的分類単位（ＯＴＵ）核酸配列
配列番号６：  操作的分類単位（ＯＴＵ）核酸配列
配列番号７：  操作的分類単位（ＯＴＵ）核酸配列
配列番号８：  操作的分類単位（ＯＴＵ）核酸配列
配列番号９：  操作的分類単位（ＯＴＵ）核酸配列
配列番号１０：  操作的分類単位（ＯＴＵ）核酸配列
配列番号１１：  操作的分類単位（ＯＴＵ）核酸配列
配列番号１２：  操作的分類単位（ＯＴＵ）核酸配列
配列番号１３：  操作的分類単位（ＯＴＵ）核酸配列
配列番号１４：  操作的分類単位（ＯＴＵ）核酸配列
配列番号１５：  操作的分類単位（ＯＴＵ）核酸配列
配列番号１６：  操作的分類単位（ＯＴＵ）核酸配列
配列番号１７：  操作的分類単位（ＯＴＵ）核酸配列
配列番号１８：  操作的分類単位（ＯＴＵ）核酸配列
配列番号１９：  操作的分類単位（ＯＴＵ）核酸配列
配列番号２０：  操作的分類単位（ＯＴＵ）核酸配列
配列番号２１：  操作的分類単位（ＯＴＵ）核酸配列
配列番号２２：  操作的分類単位（ＯＴＵ）核酸配列
配列番号２３：  １本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号２４：  １本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
【図１】
2020530310.tif 000018
【図２】
2020530310.tif 000019
【図３】
2020530310.tif 000020
【図４Ａ】
2020530310.tif 000021
【図４Ｂ】
2020530310.tif 000022
【図５】
2020530310.tif 000023
【図６】
2020530310.tif 000024
【図７】
2020530310.tif 000025
【図８】
2020530310.tif 000026
【図９】
2020530310.tif 000027
【図１０】
2020530310.tif 000028
【図１１】
2020530310.tif 000029
【配列表】
2020530310000001.app
【国際調査報告】
2020530310.tif 000030