(57)【要約】  本発明は、急性心筋梗塞、アテローム性動脈硬化症、心不全、卒中、血栓症、心炎（急性心筋炎、急性心膜炎および複雑心膜炎を含む）、心臓同種移植片拒絶反応、心筋症などの心血管疾患、および末梢血管疾患を治療する方法に関する。本方法は、それを必要とする対象に有効量でダパンストリルを投与することを含む。好ましい投与経路は経口投与である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における心血管疾患を治療する方法であって、心血管疾患を患っている対象に有効量の３−メタンスルホニルプロピオニトリル、またはその医薬として許容される塩を投与する工程を含む方法。
【請求項２】
前記心血管疾患が、心不全、急性心筋梗塞、アテローム性動脈硬化症、卒中、血栓症、急性心筋炎、急性心膜炎、複雑心膜炎、心臓同種移植片拒絶反応、および末梢血管疾患からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記心血管疾患が、急性心筋梗塞、アテローム性動脈硬化症、卒中、血栓症、および末梢血管疾患からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記心血管疾患が、急性心筋炎、急性心膜炎、および複雑心膜炎からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記心血管疾患が心不全である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記心血管疾患が急性心筋梗塞である、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記心血管疾患が心臓同種移植片拒絶反応である、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記化合物が全身投与により投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記化合物が経口投与により投与される、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、有効量のダパンストリルを投与することによって、心血管疾患、例えば、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、アテローム性動脈硬化症、心不全（ＨＦ）、卒中、血栓症、心炎（急性心筋炎、急性心膜炎および複雑心膜炎を含む）、同種移植片拒絶反応、心筋症、ならびに末梢血管疾患を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
急性心筋梗塞（ＡＭＩ）は、世界中で罹患率と死亡率の主な原因です。ＡＭＩは、心筋虚血の突然の発症およびそれに続く壊死によって引き起こされる。ＡＭＩの生存者は、事件後の数年間、死亡の危険性が高いままである。ＡＭＩの最も一般的な合併症は、左心室（ＬＶ）機能不全および心不全の発生である。心筋への最初の虚血性損傷は、最終的に有害な心臓リモデリングおよび心不全を招き、その後の罹患率および死亡率の過剰を招く事象の連鎖を活性化する。ＩＬ−１ファミリーの一員であるインターロイキン−１（ＩＬ−１）受容体拮抗薬（ＩＬ−１Ｒａ）は、急性期反応物質として作用する天然に存在する抗炎症性タンパク質である。他の急性期反応物と同様に、ＩＬ−１ＲａレベルはＡＭＩの間に増加し、そのレベルは予後と相関する（Ａｂｂａｔｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１１７：２６７０−２６８３，２００８）。
【０００３】
アテローム性動脈硬化症は、西欧諸国の人口の３分の１以上の死亡を引き起こす血管疾患の原因となる根本的な疾患プロセスである。それは、大部分はマクロファージ白血球の蓄積に起因し、機能的高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）によるマクロファージからの脂肪およびコレステロールの適切な除去なしに低密度リポタンパク質によって促進される、動脈壁における慢性炎症反応である。それは動脈内の複数のプラークの形成によって引き起こされ、動脈の硬化をもたらす。疾患が進行するにつれて、内皮細胞の次のプラーク上への移動がある。これらのプラークはコレステロール、活性化血小板、マクロファージおよび蓄積したリポタンパク質からなる。これらのプラーク、炎症および内皮細胞の遊走の組み合わせにより、動脈が硬化し血管の弾力性が失われる。
【０００４】
心不全（ＨＦ）は、心筋が弱くなり、血液や酸素に対する体のニーズを満たすのに十分な血液を送り出すことができなくなったときに発生する。
【０００５】
心筋炎は、さまざまな原因から発生する可能性がある心筋の炎症性疾患（心筋）である。ほとんどの場合、ウイルス感染によって引き起こされるが、心筋の炎症は毒素、薬物、および過敏性免疫反応によっても引き起こされる可能性がある。急性心筋炎は心筋の炎症性疾患であり、そこでは傷害の重症度は原因となる物質（すなわちウイルス）の性質とそれに続く炎症の両方に依存する。
【０００６】
心膜炎は、心膜（心臓を取り囲む線維嚢）の炎症である。症状には通常、急激な胸痛の突然の発症が含まれる。
【０００７】
脳卒中は、脳への血流が悪い場合に、細胞死に至る。脳卒中には主に２つのタイプがあり、血流の欠如による虚血性と出血による出血性のものである。その結果、脳の一部が正しく機能しなくなる。脳卒中の徴候や症状には、身体の片側を動かしたり感じたりすることができない、理解や会話の問題、世界が回転しているような感覚、または他の徴候や症状の中で片側への視力の喪失などがある。
【０００８】
ＳＴＥＭＩはＳＴ上昇型心筋梗塞（ＭＩ）の一般名で、心筋梗塞の一種をより正確に定義したものである。それは心臓の広い領域に影響を与える長期間の遮断された血液供給によって引き起こされる。非ＳＴＥＭＩ心筋梗塞も発生する可能性がある。
【０００９】
血栓症は血管内の血栓の形成であり、循環系を通る血流を妨げる。血管が損傷した場合、体は血小板（血小板）とフィブリンを使って血栓を形成し、失血を防ぐ。血管が損傷していなくても、一定の条件下では血栓が体内に形成されることがある。血塊、または血塊の一部が自由に壊れて体の周りを移動し始めることを塞栓という。血栓症は静脈（静脈血栓症）または動脈に起こることがある。静脈血栓症は体の患部の鬱血を引き起こし、一方動脈血栓症（そしてめったに重症の静脈血栓症）は血液供給に影響を及ぼし、そしてその動脈によって供給される組織の損傷（虚血および壊死）をもたらす。
【００１０】
ＮＡＬＰ３またはクリオピリンとしても知られるＮＬＲＰ３（ＮＯＤ様受容体ファミリー、ピリンドメイン含有３）は、インフラマソーム、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）およびＩＬ−１８プロセシングに関与する高分子構造のセンサーの１つである。ＮＬＲＰ３は、細胞内感染（細菌性およびウイルス性タンパク質）または組織損傷（虚血）中の細胞内危険性を感知する。ＮＬＲＰ３活性化はＡＳＣ（カルボキシ末端カスパーゼ動員ドメインを含むアポトーシス関連スペック様タンパク質）およびカスパーゼ−１の動員をもたらし、インフラマソーム形成および最終的に細胞死をもたらす。増大する証拠は、ＡＭＩ後の有害な心臓リモデリングにおけるインフラマソームの中心的役割がさらなる機能不全およびＨＦにつながることを示唆している。しかしながら、心臓リモデリングおよびＨＦは、ＡＭＩに限定される合併症ではなく、そして非虚血性傷害の後にも起こり得る。
【００１１】
Ｔｏｌｄｏら（Ａｎｔｉｏｘｉｄ．Ｒｅｄｏｘ  Ｓｉｇｎａｌ，２２：１１４６−１１６１，２０１５）は、虚血性損傷後、インフラマソームの形成、インターロイキン−１βおよびＩＬ−１８のプロセシングによる応答の増幅、ならびに細胞死の促進が、有害な心臓リモデリングと心不全を促進することを報告している。
【００１２】
Ｍａｒｃｈｅｔｔｉら（Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，６６：１−８，２０１５）は、ＮＬＲＰ３インフラマソームの薬理学的阻害がマウスの虚血性および非虚血性損傷後の細胞死およびＬＶ収縮機能障害を制限することを報告している。
【発明の概要】
【００１３】
心血管疾患を治療するための方法が必要とされている。この方法は効果的でなければならず、重大な副作用はない。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、生体外で栄養素で処理したヒトマクロファージからのＩＬ−１βおよびＩＬ−１８の阻害を示す。
【図２】図２は、滑膜におけるＩＬ−１βのレベルが、未処理マウスと比較して、ダパンストリルで処理されたマウスにおいて有意に減少したことを示す。
【図３】図３Ａは、マウスＪ７７４Ａ．１細胞におけるリポ多糖（ＬＰＳ）／アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）刺激後のＪ７７４Ａ．１細胞からの細胞溶解物（Ｌｙｓ）および上清（Ｓｕｐ）のカスパーゼ−１（ｐ４５およびｐ１０）についてのウエスタンブロットの結果を示す。図３Ｂは、５０μＭのダパンストリル（または実験室コード、ＯＬＴ１１７７）の存在下でのＬＰＳおよびニゲリシン（ＮＩＧ）刺激後のＪ７７４Ａ．１細胞溶解物中のカスパーゼ−１活性の平均±ＳＥＭの結果を示す。
【図４】ＯＬＴ１１７７（５０μＭ）の存在下でのＬＰＳ／ＡＴＰ刺激後の４人の健康なドナーからのヒト単球由来マクロファージ（ＨＭＤＭ）のＦＲＥＴ強度の平均±ＳＥＭパーセント変化を示す。
【図５】図５は、不眠症治療およびインビボでのＬＰＳ投与後のマウスの心臓におけるＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−１αのサイトカインレベルを示す。
【図６】図６は、ＯＬＴ１１７７を用いたマウスにおける急性心筋梗塞の治療が梗塞サイズを減少させそして左室収縮機能を維持したことを示す。
【図７】ビヒクルおよび６０ｍｇ／ｋｇのＯＬＴ１１７７で処置したマウスにおける梗塞サイズ測定のための塩化トリフェニルテトラゾリウムおよびフタロブルー染色心室心臓切片の代表的な画像を示す。
【図８】研究パートＡにおける再灌流時に６、６０または６００ｍｇ／ｋｇのＯＬＴ１１７７またはビヒクルを投与されたマウスについての虚血／再灌流の２４時間後の左心室梗塞サイズの平均（±ＳＥＭ）パーセントを示す。
【図９】図９Ａおよび９Ｂは、研究パートＡにおける再灌流時に６、６０または６００ｍｇ／ｋｇのＯＬＴ１１７７またはビヒクルを投与されたマウスについての虚血／再灌流の２４時間後の左心室分数短縮（図９Ａ）および左心室駆出分画（図９Ｂ）の平均（±ＳＥＭ）を示す。
【図１０】試験パートＡにおける再灌流時と比較した、試験パートＢにおける再灌流の６０、１２０または１８０分後に６０ｍｇ／ｋｇのＯＬＴ１１７７を投与されたマウスについての虚血／再灌流の２４時間後の左心室梗塞サイズの平均（±ＳＥＭ）パーセントを示す。
【図１１】試験パートＡにおける再灌流時と比較した、試験パートＢにおける再灌流の６０、１２０または１８０分後に６０ｍｇ／ｋｇのＯＬＴ１１７７を投与されたマウスについての虚血／再灌流の２４時間後の左心室分数短縮（図１１Ａ）および左心室駆出分画（図１１Ｂ）の平均（±ＳＥＭ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
ＮＬＲＰ３インフラマソームの活性化は、組織損傷に対する炎症反応を増幅し、さらなる損傷を媒介する。ダパンストリルは、選択的ＮＬＲＰ３インフラマソーム阻害剤である。ダパンストリルは、ＮＬＲＰ３インフラマソームの活性化を妨げることによって炎症を軽減する。ダパンストリルは、インビトロでヒトマクロファージからのＩＬ−１βとＩＬ−１８の産生を阻害する。ダパンストリルは、インビトロでヒト好中球とマウスマクロファージのカスパーゼ１活性化を阻害する。
【００１６】
この作用機序を通して、ダパンストリルはカスパーゼ−１の活性化を防ぎ、動物やヒトの対象におけるＮＬＲＰ３インフラマソームの形成を阻害する。ダパンストリルは、ＮＬＲＰ３インフラマソームのアセンブリをブロックすることによって炎症の有害な影響を防ぎ、ＩＬ−１βとＩＬ−１８の産生を防ぐ。ダパンストリルは、対象の心筋虚血／再灌流後に梗塞サイズを縮小し、左心室の収縮機能障害を軽減するのに有効である。ダパンストリルは、対象の虚血性および非虚血性損傷後の心機能の温存に有効である。
【００１７】
本発明は、心血管疾患、例えば、急性心筋梗塞、アテローム性動脈硬化症、心不全、卒中、血栓症、心炎（急性心筋炎、急性心膜炎および複雑心膜炎を含む）、心臓同種移植拒絶反応、心筋症、および末梢血管疾患の治療方法に関する。
【００１８】
化合物
本発明は、精製されたダパンストリル（３−メタンスルホニル−プロピオニトリル）化合物、またはその医薬として許容される塩を使用する。
【００１９】
【化１】
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【００２０】
本明細書で使用される「医薬として許容される塩」は、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、そして望ましくない毒物学的効果を与えない塩である。医薬として許容される塩の形態には、様々な結晶性多形体ならびに異なる塩の非晶質形態が含まれる。医薬として許容される塩は、金属または有機対イオンを用いて形成することができ、ナトリウムまたはカリウムなどのアルカリ金属塩；マグネシウムまたはカルシウムなどのアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩またはテトラアルキルアンモニウム塩、すなわちＮＸ4＋（式中、ＸはＣ１−４である）を含むがこれらに限定されない。
【００２１】
医薬組成物
医薬組成物中の活性化合物ダパンストリルまたはその医薬として許容される塩もしくは溶媒和物は、一般に、注射製剤では約０．１〜５％、錠剤製剤では約１〜９０％、カプセル剤では１〜１００％、局所製剤では約０．０１〜２０％、０．０５〜２０％、０．１〜２０％、０．２〜１５％、０．５〜１０％、または１〜５％（ｗ／ｗ）、およびパッチ製剤では約０．１〜５％の量である。
【００２２】
本出願で使用される「約」は、記載された値の±１０％を指す。
【００２３】
不活性成分である医薬として許容される担体は、従来の基準を用いて当業者によって選択され得る。医薬として許容される担体には、非水性の溶液、懸濁液、エマルジョン、マイクロエマルジョン、ミセル溶液、ゲル、および軟膏が含まれるが、これらに限定されない。医薬として許容される担体はまた、限定されないが、食塩水および電解質水溶液；イオン性および非イオン性の浸透剤、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、デキシトロース；ｐＨ調整剤および緩衝剤、例えば、水酸化物の塩、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、ホウ酸塩およびトロラミン；酸化防止剤、例えば、重亜硫酸塩、亜硫酸塩、メタ重亜硫酸塩、チオ亜硫酸塩、アスコルビン酸、アセチルシステイン、システイン、グルタチオン、ブチルヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルエン、トコフェロール、およびアスコルビルパルミテートの塩、酸および／または塩基；界面活性剤、例えば、レシチン、例えば、限定されないが、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルイノシトール；ポロキサマーおよびプロキサミン、ポリソルベート、例えば、ポリソルベート８０、ポリソルベート６０、およびポリソルベート２０、ポリエーテル、例えば、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコール；ポリビニル、例えば、ポリビニルアルコールおよびポビドン；セルロース誘導体、例えば、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロースおよびヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびそれらの塩；石油誘導体、例えば、鉱油、白色；脂肪、例えば、ラノリン、落花生油、パーム油、大豆油；モノ−、ジ−、およびトリグリセリド；アクリル酸系重合体、例えば、カルボキシポリメチレンゲル、および疎水変性架橋アクリレート共重合体；多糖類、例えば、デキストラン、及びグリコサミノグリカン、例えば、ヒアルロン酸ナトリウムを含む成分を含有し得る。そのような医薬として許容される担体は、よく知られている防腐剤を用いて細菌汚染に対して防腐することができ、これらには、塩化ベンザルコニウム、エチレンジアミン四酢酸およびその塩、塩化ベンゼトニウム、クロルヘキシジン、クロロブタノール、メチルパラベン、チメロサール、およびフェニルエチルアルコールが含まれ、または単回使用または複数回使用のいずれかのための非保存製剤として製剤化することができる。
【００２４】
例えば、ダパンストリルの錠剤製剤またはカプセル製剤は、生物活性を有さずそして活性化合物との反応を有さない他の賦形剤を含み得る。錠剤の賦形剤は、増量剤、結合剤、滑剤および滑剤、崩壊剤、湿潤剤、ならびに放出速度調節剤を含み得る。結合剤は製剤の粒子の接着を促進し、そして錠剤製剤にとって重要である。結合剤の例としては、カルボキシメチルセルロース、セルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、カラヤガム、デンプン、デンプン、およびトラガカントガム、ポリ（アクリル酸）、およびポリビニルピロリドンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２５】
例えば、ダパンストリルのパッチ製剤は、１，３−ブチレングリコール、ジヒドロキシアルミニウムアミノアセテート、エデト酸二ナトリウム、ゼラチン、カオリン、メチルパラベン、ポリソルベート８０、ポビドン、プロピレングリコール、プロピルパラベン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、酒石酸、二酸化チタン、精製水などのいくつかの不活性成分を含み得る。パッチ製剤はまた、乳酸エステル（例えば、ラウリルラクテート）またはジエチレングリコールモノエチルエーテルなどの皮膚透過性増強剤を含み得る。
【００２６】
ダパンストリルを含む局所製剤は、ゲル、クリーム、ローション、液体、エマルジョン、軟膏、スプレー、溶液、および懸濁液の形態であり得る。局所製剤中の不活性成分としては、例えば、ラウリルラクテート（皮膚軟化剤／浸透促進剤）、ジエチレングリコールモノエチルエーテル（皮膚軟化剤／浸透促進剤）、ＤＭＳＯ（溶解促進剤）、シリコーンエラストマー（レオロジー／テクスチャー調整剤）、カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド、（エモリエント）、オクチサレート、（エモリエント／ＵＶフィルター）、シリコーン流体（エモリエント／希釈剤）、スクアレン（エモリエント）、ひまわり油（エモリエント）、および二酸化ケイ素（増粘剤）が挙げられる。一実施形態では、ジエチレングリコールモノエチルエーテルが局所用ゲル製剤に含まれる。
【００２７】
使用方法
ＮＬＲＰ３インフラマソームのアセンブリを阻害することによって、ダパンストリルはカスパーゼ−１の活性化およびそれに続く炎症誘発性サイトカインＩＬ−１βおよびＩＬ−１８へのプロ−ＩＬ−１βおよびプロ−ＩＬ−１８の成熟を防止する。
【００２８】
ダパンストリルは、ＩＬ−１βのプロセシングおよび放出を阻害するが、ＩＬ−１β前駆体ならびにＮＬＲＰ３およびＡＳＣを含む他のインフラマソーム成分の合成は阻害しない。ダパンストリルはカスパーゼ−１の活性化も阻害する。さらに、ダパンストリルは、ＮＬＲＣ４やＡＩＭ２などの他のインフラマソーム、構成的サイトカインを抑制しないことによって、そして細胞死から保護することによって、体の免疫監視を保護する。
【００２９】
本発明は、心血管疾患、例えば、急性心筋梗塞、アテローム性動脈硬化症、心不全、卒中、血栓症、心炎（急性心筋炎、急性心膜炎および複雑心膜炎を含む）、心臓同種移植片拒絶反応、心筋症、および末梢血管疾患の治療方法に関する。上記の心血管疾患はすべて、疾患の原因として、または事象の結果としてのいずれかで炎症性成分を有する。この方法は、それを必要としている対象に有効量のダパンストリルを投与する工程を含む。本明細書で使用される「有効量」は、病的状態を改善すること、および／または疾患の症状を軽減、改善、および／または排除することによって疾患を治療するのに有効な量である。
【００３０】
一実施形態では、本発明は、難治性／再発性急性心膜炎を含む急性心膜炎の治療に有効である。一実施形態では、本発明は急性心膜炎の再発防止に有効である。急性心膜炎に罹患している対象（例えば患者）にダパンストリルを投与することにより、患者は、急性心膜炎に関連した症状、例えば、胸痛、疲労、発熱、胸部圧迫、広範なＳＴ上昇、ＰＲ低下（以前には報告されていない）、心嚢液滲出、再発性疼痛、発熱、心嚢摩擦、ＥＣＧ変化、心膜滲出の心エコー所見の減少、白血球数増加、赤血球沈降速度、高感度Ｃ反応性タンパク質（ｈｓＣＲＰ）レベル、ＣＲＰレベル、心臓タンポナーデ、建設的心膜炎、息切れ、および／または急性心膜炎の再発の減少または再発なしを有する。
【００３１】
一実施形態では、本発明は、難治性／再発性の複雑な心膜炎を含む、複雑な心膜炎の治療に有効である。一実施形態では、本発明は、複雑な心膜炎の再発を予防するのに有効である。急性心膜炎を患っている患者にダパンストリルを投与することによって、患者は、急性心膜炎に関連した症状が減少し、例えば、胸痛、疲労、発熱、胸部圧迫感、広範なＳＴ上昇、以前に報告されていないＰＲ鬱病、心嚢液貯留、再発性疼痛、発熱、心膜摩擦、ＥＣＧ変化、心膜心エコーの証拠、白血球数の増加、赤血球沈降速度、ｈｓＣＲＰレベル、心臓タンポナーデ、建設的心膜炎、息切れ、および／または急性心膜炎の再発の減少または再発なしなどが挙げられる。
【００３２】
一実施形態では、本発明は、難治性／再発性心筋炎を含む心筋炎を治療するのに有効である。一実施形態では、本発明は、心筋炎の再発を予防するのに有効である。心筋炎に罹患している患者にダパンストリルを投与することによって、患者は、心筋炎に関連する以下の症状のうちの１つ以上を改善する：胸痛、めまい、疲労、倦怠感、異常心調律、つぶやき、動悸、息切れ、息切れ、および患者の四肢の腫れ。
【００３３】
一実施形態では、本発明は、難治性／再発性心臓同種移植片拒絶反応を含む心臓同種移植片拒絶反応を治療するのに有効である。一実施形態において、本発明は、心臓同種移植片拒絶反応の再発を予防するのに有効である。同種移植片拒絶反応を患っている患者にダパンストリルを投与することにより、患者は改善されたレベルのｈｓＣＲＰ、ＩＬ−１βおよび／またはＩＬ−６、改善された心肺運動試験（ＣＰＸ）値、改善された移植片受容および／または移植片生存および炎症の減少、心臓同種移植片拒絶反応に関連した適応症のためのその後の入院の欠如が挙げられる。
【００３４】
一実施形態では、本発明は、難治性／再発性心不全を含む心不全の治療に有効である。一実施形態では、本発明は心不全の再発を予防するのに有効である。心不全を患っている患者にダパンストリルを投与することによって、患者は、血漿中のｈｓＣＲＰ、ＩＬ−１ｂおよびＩＬ−６、ならびに／またはＢ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）のレベルなどの薬力学的エンドポイントおよび／またはバイオマーカーエンドポイントを改善する。患者はまた、一般に、改善されたＣＰＸスコア、改善されたＥＣＧ記録、および／または改善された生体インピーダンス分析を有し、および／または心不全に関連する徴候のために再入院する危険性が低い。一実施形態では、本発明は、心不全の予防のためのＳＴＥＭＩの治療に有効である。
【００３５】
一実施形態では、本発明は、難治性／再発性ＡＭＩを含むＡＭＩの治療に有効である。一実施形態において、本発明は、ＡＭＩの再発を予防するのに有効である。ＡＭＩに罹患している患者にダパンストリルを投与することにより、患者は左心室拡張末期径、収縮末期径、損傷した心臓組織の面積、および／または梗塞サイズを減少させる。
【００３６】
ダパンストリルによる治療は、虚血／再灌流ＡＭＩまたは非再灌流ＡＭＩのモデルにおいてＮＬＲＰ３インフラマソーム形成を阻害し、病理学的にまたは血清心筋トロポニンＩレベルとして測定される梗塞サイズの有意な減少を引き起こす。ＮＬＲＰ３インフラマソームの阻害は、心機能を保護し、虚血性および非虚血性傷害後のＬＶ収縮機能障害を軽減する。
【００３７】
一実施形態では、本発明は、難治性／再発性アテローム性動脈硬化症を含むアテローム性動脈硬化症の治療に有効である。一実施形態では、本発明はアテローム性動脈硬化症の再発を予防するのに有効である。アテローム性動脈硬化症を患っている患者にダパンストリルを投与することによって、患者は、平均血管壁面積比の改善、１つ以上の罹患血管におけるプラーク負荷の改善、１つ以上の罹患血管の伸展性の改善、ピーク酸素消費スコアの改善、ピーク酸素消費（ピークＶＯ2）変化の改善、換気効率の改善、左室駆出率の改善、拡張機能の改善、アテローム性動脈硬化症に関連する１つ以上の適応に対する入院の減少または欠如、脈波速度の改善、プラーク組成の改善、大動脈ひずみの減少、ｈｓＣＲＰの改善血中濃度、空腹時血糖値の改善、ＨｂＡ１ｃ値の改善、経口ブドウ糖負荷試験後の血糖値の改善、ベータ細胞機能の改善（ＨＯＭＡ−Ｂ）、インスリン抵抗性の改善（ＨＯＭＡ−ＩＲ）、および／または血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）の減少が挙げられる。
【００３８】
一実施形態では、本発明は、難治性／再発性心筋症を含む心筋症を治療するのに有効である。一実施形態において、本発明は、心筋症の再発を予防するのに有効である。心筋症に罹患している患者にダパンストリルを投与することにより、患者は胸痛の軽減、めまいの軽減、疲労の軽減、食欲の増大、心拍数の減少、心雑音の発生の減少、鼓脹の減少、腹水の減少、咳嗽の軽減、息切れの発生の減少、患者の四肢の一つ以上の腫脹の減少、および／または体重増加の減少が挙げられる。
【００３９】
一実施形態では、本発明は、難治性／再発性脳卒中を含む脳卒中の治療に有効である。一実施形態では、本発明は、脳卒中の再発を予防するのに有効である。脳卒中を患っている患者にダパンストリルを投与することによって、患者は、病変体積の減少、脳の炎症レベルの減少、ｍＲＳスコア上の回復の可能性の増加、および／または細胞傷害性浮腫の減少を有する。
【００４０】
一実施形態では、本発明は、難治性／再発性血栓症を含む血栓症の治療に有効である。一実施形態では、本発明は血栓症の再発を予防するのに有効である。血栓症を患っている患者にダパンストリルを投与することによって、患者は、１つ以上の血栓を有するかまたは１つ以上の血栓に曝された１つ以上の血管における改善された血流減少（例えば血流増加）、１つ以上の血栓（閉塞性血栓など）、血栓数の減少、血栓形成の減少、および／または血栓症の組織学的証拠の減少が挙げられる。
【００４１】
一実施形態では、本発明は、難治性／再発性末梢血管疾患を含む末梢血管疾患を治療するのに有効である。一実施形態では、本発明は末梢血管疾患の再発を予防するのに有効である。末梢血管疾患に罹患している患者にダパンストリルを投与することにより、患者は、血管壁面積比、ＳＡＡレベルおよび／または比率、ならびに／またはｈｓＣＲＰレベルおよび／または比率を低下させる。
【００４２】
本発明の医薬組成物は、全身投与または局所投与により適用することができる。全身投与には、経口、非経口（静脈内、筋肉内、皮下または直腸など）、および吸入投与が含まれるがこれらに限定されない。全身投与では、活性化合物は最初に血漿に到達し、次いで標的組織に分布する。経口投与は、本発明にとって好ましい投与経路である。局所投与は局所投与を含む。
【００４３】
組成物の投与量は、傷害の程度と各患者の個々の反応に基づいて変更可能である。全身投与の場合、送達される活性化合物の血漿濃度は様々であり得る。ただし、通常１×１０-10〜１×１０-4モル／リットル、好ましくは１×１０-8〜１×１０-5モル／リットルである。
【００４４】
一実施形態では、医薬組成物は対象に経口投与される。経口投与のための投与量は、対象の年齢や状態に応じて、通常０．１〜１００、０．１〜２０、または１〜５０ｍｇ／ｋｇ  ／日である。例えば、経口投与のための投薬量は、ヒト被験体について０．１〜１０、０．５〜１０、１〜１０、１〜５、または５〜５０ｍｇ／ｋｇ／日である。一実施形態において、活性化合物は、１〜１００、１０〜５０、２０〜１０００、２０〜５００、１００〜８００ｍｇ／用量、または２００〜６００ｍｇ／用量、１日１〜４回、ヒト対象に経口投与することができ、患者の年齢と状態によって異なる。
【００４５】
一実施形態では、医薬組成物は対象に静脈内投与される。静脈内ボーラス注射または静脈内注入のための投与量は、一般に０．０３〜５または０．０３〜１ｍｇ／ｋｇ／日である。
【００４６】
一実施形態では、医薬組成物は対象に皮下投与される。皮下投与のための投与量は、通常、０．３〜２０、０．３〜３、または０．１〜１ｍｇ／ｋｇ／日である。
【００４７】
一実施形態では、組成物は局所塗布される。組成物は、医学的問題および疾患の病理学に応じて、１日に少なくとも１回または２回、または１日に３から４回局所的に適用される。一般に、局所用組成物は、約０．０１〜２０％、または０．０５〜２０％、または０．１〜２０％、または０．２〜１５％、０．５〜１０、または１〜５％（ｗ／ｗ）の活性化合物を含む。典型的には、０．２〜１０ｍＬの局所用組成物が用量あたり個体に適用される。
【００４８】
当業者は、多種多様な送達機構も本発明に適していることを認識する。
【００４９】
本発明は、ヒト、ウマ、イヌおよびネコなどの哺乳動物対象を治療するのに有用である。本発明はヒトの治療に特に有用である。
【００５０】
以下の実施例は本発明をさらに説明する。これらの実施例は単に本発明を例示することを意図しており、限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【００５１】
実施例１．ヒト単球由来のマクロファージからのＩＬ−１βおよびＩＬ−１８放出の抑制
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を６人の健康なヒトドナーの血液から単離し、５日間ＧＭ−ＣＳＦ（５ｎｇ／ｍｌ）を用いてマクロファージに分化させた。それらを時間０でリポ多糖（ＬＰＳ、プライミング期）と共に１μｇ／ｍＬで刺激した。３０分で、それらを０．００１〜１００μＭの異なる濃度のダパンストリル（ＯＬＴ１１７７）と共にインキュベートした。４時間後に、１０μＭのニゲリシン（ＮＩＧ、放出期）を添加した。５時間のインキュベーション期間の終わりに、上清を採取し、製造者のプロトコルに従ってそれぞれのＥＬＩＳＡキットを使用してＩＬ−１βまたはＩＬ−８についてアッセイした。結果を図１（ＡおよびＢ）に示す。
【００５２】
図１ａは、リポ多糖（プライミング期）およびニゲリシン（放出期）で刺激した後のヒト単球由来マクロファージからのＩＬ−１β放出の抑制に関するデータを示す。最大抑制効果は、１μＭのダパンストリルで観察された。
【００５３】
図１ｂは、リポ多糖およびＮＩＧによる刺激後のヒト単球由来マクロファージからのＩＬ−１８放出の抑制に関するデータを示す。最大抑制効果は、１０〜５０μＭのダパンストリルで観察された。
【００５４】
結果は、ダパンストリルが、刺激された単球由来マクロファージからのＩＬ−１β（図１ａ）およびＩＬ−１８（図１ｂ）の放出を抑制することを示している。***：対照と比較してＰ＜０．００１、*：対照と比較してＰ＜０．０５。
【００５５】
実施例２．マウスＩＬ−１βレベル
マウスの膝関節に直接注射されたザイモサンは炎症反応を誘発し、関節炎のモデルとして使用される（Ｖｅｒｓｃｈｕｒｅ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ．５３：４５５−４６０，１９９４）。このモデルで測定されるエンドポイントには、膝関節腫脹スコア、滑膜組織のサイトカインレベル、および膝の顕微鏡的病理が含まれる。
【００５６】
各マウスの両膝の膝関節へのザイモサン（１８０μｇ）の関節内注射によってマウスに関節炎を誘発した。マウスは、−２５時間、−１３時間、および−１時間の時間で、ビヒクル（生理食塩水、ｎ＝５）またはビヒクル中のダパンストリル（薬物）（６００ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝４）を用いた経口胃管栄養法によって治療された。時間ゼロでのザイモサン注射の後、マウスを＋１１時間および＋２３時間の時点でさらにビヒクルまたはダパンストリル（６００ｍｇ／ｋｇ）で処置した。ザイモサン注射の２４時間後にマウスを屠殺した。
【００５７】
巨視的関節腫脹は、０〜３の範囲のスコアリングシステムを用いて皮膚を除去した後にすべての膝について評価した。０は腫脹なし、３は重度の腫脹である。結果は、ダパンストリル処置されたマウスは、ビヒクル処置されたマウスと比較した場合、関節腫脹の有意な減少を有することを示した。
【００５８】
さらに、滑膜をマウスあたり片方の膝から採取し、細胞をＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．からのＥＬＩＳＡキットを製造業者のプロトコルに従って使用して、マウスＩＬ−１βの測定のために溶解した。結果は平均値±平均値の標準誤差として示され、統計的評価が行われる（図２参照）。図２は、滑膜におけるＩＬ−１βのレベルが、未処理マウスと比較して、ダパンストリルで処理されたマウスにおいて有意に減少したことを示す。
【００５９】
実施例３．ダパンストリルによるカスパーゼ−１活性化の阻害
Ｊ７７４Ａ．１マウスマクロファージ細胞を１μｇ／ｍｌのリポ多糖（ＬＰＳ）で４時間刺激し、ニゲリシン（ＮＩＧ、１０μＭ）またはＡＴＰ（５ｍＭ）のいずれかを１時間添加した。ＬＰＳ刺激の３０分後またはＡＴＰと同時にＯＬＴ１１７７を細胞に添加した。
【００６０】
マウスＪ７７４Ａ．１細胞におけるＬＰＳ／ＡＴＰ刺激後のＪ７７４Ａ．１細胞からの細胞溶解物（Ｌｙｓ）および上清（Ｓｕｐ）のカスパーゼ−１（ｐ４５およびｐ１０）に関するウエスタンブロットの結果を示す。活性化カスパーゼ−１のサブユニット（ｐ１０）は、ダパンストリル（ＯＬＴ）の存在下でＪ７７４Ａ．１細胞において減少した。
【００６１】
図３Ｂは、５０μＭのダパンストリル（ＯＬＴ１１７７）の存在下でのＬＰＳおよびＮＩＧ刺激後のＪ７７４Ａ．１細胞溶解物中のカスパーゼ−１活性の平均±ＳＥＭの結果を示す。カスパーゼ−１活性は、ＬＰＳ／ＮＩＧを１００％に設定したときの各アッセイの平均値（ｎ＝３）のパーセント変化として表される。カスパーゼ−１活性は、対照と比較して、ダパンストリルの存在下で刺激された細胞からの細胞溶解物の酵素アッセイにおいて３５％減少した（ｐ＜０．０５）。
【００６２】
結果は、ダパンストリル（ＯＬＴ１１７７）がＪ７７４Ａ．１細胞株においてカスパーゼ−１活性化を阻害したことを示している。
【００６３】
実施例４．ダパンストリルによるインフラマソームアセンブリ／凝集の阻害
ヒト単球由来マクロファージ（ＨＭＤＭ）をガラススライド上でＧＭ−ＣＳＦと共に５日間培養し、１μｇ／ｍｌのＬＰＳで４時間刺激し、次いで５ｍＭのＡＴＰで１時間処理した。ダパンストリル（ＯＬＴ１１７７、５０μＭ）をＬＰＳ刺激の３０分後またはＡＴＰと同時に細胞に添加した。
【００６４】
ＰＢＳで洗浄した後、Ｇａｍｂｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｐ．，２（７），２０１４に記載されているように、細胞を固定し、７０〜３０のアセトン−メタノールで透過処理した。手短に言えば、細胞は、１０％正常ロバ血清中（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉａｌｓ、ペンシルバニア州ウェストグローブ）で、１時間ブロッキングした加湿スライドチャンバーに入れた。ロバ血清を除去した後、ヒトＮＬＲＰ３に対する一次抗体（Ｃｒｙｏ−２、ＡｄｉｐｏＧｅｎ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ヒトカスパーゼ１（ｓｃ−５１５、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）または等モルの種特異的抗ＩｇＧ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を加え、一晩４℃に保った。次にスライドをＰＢＳで３回洗浄し、細胞をロバ抗マウス−Ａｌｅｘａ５５５（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはロバ抗ウサギ−Ａｌｅｘａ４８８（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）蛍光色素コンジュゲートした二次抗体と共に室温で１時間インキュベートした。核をＤＡＰＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で染色した。Ｇａｍｂｏｎｉらによって記載されているように、Ｚｅｉｓｓ  ６３９  Ｐｌａｎ−Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ対物レンズ（１．４  Ｎ／Ａ）、Ｓｕｔｔｅｒ  Ｘｅｎｏｎ光源、およびＣｏｏｋｅ  ＳｅｎｓｉＣａｍを使用して、Ｍａｒｉａｎａｓ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｔａｔｉｏｎを使用してＦＲＥＴ画像を取得した。補正ＦＲＥＴは、Ｂｅｒｎｅｙら、Ｂｅｒｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ．，８４：３９９２−４０１０，２００３により報告されているように、ＦＲＥＴ＝トランスファー−Ｆｄ／Ｄドナー−Ｆａ／Ａａアクセプターとして計算した。
【００６５】
ＮＬＲＰ３インフラマソームの形成は、ＬＰＳおよびＡＴＰで刺激した後のＨＭＤＭにおける免疫蛍光および蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）分析を用いて調べた。刺激されていない細胞では、カスパーゼ−１（緑色）およびＮＬＲＰ３（赤色）が細胞内に拡散していた。ＬＰＳ／ＡＴＰの後、カスパーゼ−１およびＮＬＲＰ３は膜下領域に局在化し、ＦＲＥＴ分析は、カスパーゼ−１が刺激後にＮＬＲＰ３と会合することを示す。ＦＲＥＴ陽性は、２つの分子、この場合はＮＬＲＰ３とカスパーゼ−１の間の距離が３０ｎｍ未満であることを必要とする。５０μＭのＯＬＴ１１７７の存在下では、会合は減少した（Ｐ＜０．０１）。
【００６６】
図４は、ＯＬＴ１１７７（５０μＭ）の存在下でのＬＰＳ／ＡＴＰ刺激後の４人の健康なドナーからのＨＭＤＭのＦＲＥＴ強度の平均±ＳＥＭパーセント変化を示す。**：Ｐ＜０．０１。ＦＲＥＴ顕微鏡法の結果は、ダパンストリル処理された細胞におけるインフラマソームのアセンブリ／凝集の阻害を実証している。ＦＲＥＴのデータは、ダパンストリルによるカスパーゼ−１の抑制およびＩＬ−１βプロセシングの抑制と一致している。
【００６７】
実施例５．インビボリポ多糖類チャレンジ後のサイトカインレベル
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス雄マウス、２２〜２６グラム（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、バーハーバー、メイン州）を２００μｌの生理食塩水中の２００ｍｇ／ｋｇのダパンストリル（ＯＬＴ１１７７）または対応する量のビヒクル（生理食塩水）で５回の投与で１２時間ごとに腹腔内（ＩＰ）投与した。最後の投与または食塩水の１時間後、動物に５ｍｇ／ｋｇのリポ多糖（ＬＰＳ、大腸菌、０５５：Ｂ５、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）２００μｌを腹腔内注射し、２時間後に屠殺した。サイトカインは心臓ホモジネート中で測定した。プロテアーゼインヒビターの混合物（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を含むＲＩＰＡ緩衝液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて組織ホモジネートを溶解し、４℃で２０分間１３，０００ｇで遠心分離し、上清をＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−１αのサイトカインレベルについてアッセイした。サイトカイン濃度を総タンパク質含有量について補正した。
【００６８】
図５は、ＬＰＳ投与後のマウスの心臓におけるＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−１αのサイトカインレベルが、Ｐ値＜０．０５の食塩水ビヒクル処置と比較して薬物処置後に減少したことを示す。結果は、ダパンストリルが炎症中に心臓の炎症を軽減することを示す。この研究で使用されたＬＰＳの用量は、虚血性炎症、血管炎症および細胞性炎症をカバーする。
【００６９】
実施例６．動物におけるダパンストリルを用いた急性心筋梗塞（虚血／再灌流）を治療するためのプロトコル
マウスに麻酔下（ペントバルビタール、５０〜７０ｍｇ／ｋｇ）で気管内挿管し、右側臥位に配置した後、左開胸術、心膜切除術、および左前下行冠動脈結紮術（ＬＡＤ）を行った。結紮した冠状動脈を胸郭閉鎖の３０分前に解放する。動物が冠状動脈結紮なしで同じ外科的処置を受ける偽手術が行われる。マウスを再灌流時にダパンストリル（６０ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクル（生理食塩水）で腹腔内処理し、次いで心筋トロポニンＩレベルの測定および梗塞サイズの評価のために２４時間の再灌流後に殺す。
【００７０】
トロポニンＩレベル測定のために、各マウスの血液を下大静脈から採取し、血清単離のためにＶａｃｕｔａｉｎｅｒチューブ（ＢＤ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）に集める。マウストロポニンＩレベルは、酵素結合免疫吸着検定法（Ｌｉｆｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｃ．、ペンシルバニア州ウェストチェスター）によって決定される。梗塞サイズの評価は、Ｔｏｌｄｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ  ５１：２４４−５１，２０１１に従って行われる。
【００７１】
実施例７．動物におけるダパンストリルによる急性心筋梗塞（永久結紮）を治療するためのプロトコル
このモデルは、実施例６のモデルよりも厳しいＡＭＩを反映している。マウスを麻酔下（ペントバルビタール、５０〜７０ｍｇ／ｋｇ）で気管内挿管し、右側臥位に置き、次いで左開胸、心膜切除術、および左前下行（ＬＡＤ）冠動脈の永久結紮を行う。動物が冠状動脈結紮なしで同じ外科的処置を受ける偽手術が行われる。結紮直後にマウスをダパンストリル（６０ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクル（生理食塩水）で腹腔内処理し、次に心エコー検査を受けた後に病理学のために７日目に屠殺してＬＶ寸法および機能を測定する。梗塞サイズは、Ａｂｂａｔｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１１７：２６７０−８３，２００８に従って行われる。
【００７２】
実施例８．動物におけるダパンストリルの梗塞温存効果
成体ＣＤ１雄性マウスにおける急性心筋梗塞は、左冠状動脈の３０分間の一時的な外科的結紮とそれに続く２４時間の再灌流によって誘発した：３匹のマウスに再灌流直後に腹腔内投与し、８匹のマウス等量のビヒクル（ＮａＣｌ  ０．９％）を受けた。２４時間後、経胸壁心エコー検査を使用して、心臓収縮機能の代用物である左心室の短縮率を測定した。心エコー検査後、トリフェニル−テトラゾリウム−クロリド（ＴＴＣ）およびエバンスブルー法を用いてマウスを梗塞サイズ測定用に準備し、次いで屠殺した：虚血ではないと考えられる心臓の領域（非危険領域）は青色に見えた。危険にさらされていたが生存していた心臓は赤く見え、梗塞心筋は淡白色に見えた。図６の左パネルは、ビヒクルで処置した１匹のマウスおよびＯＬＴ１１７７で処置した１匹のマウスのＴＴＣ／エバンスブルー染色を示す：梗塞領域がビヒクル中ではるかに大きいことは明らかである。中央パネルは、危険領域の割合として表される梗塞サイズを定量化し、ビヒクル処置マウスと比較して、ＯＬＴ１１７７で処置されたマウスにおいて有意に小さい梗塞サイズを示している。右パネルは、ビヒクル処置マウスと比較した、ＯＬＴ１１７処置マウスにおける左心室収縮機能の維持を示す。
【００７３】
実施例９．動物におけるダパンストリルによる急性心筋梗塞の治療
目的：（１）再灌流時に投与されたＯＬＴ１１７７（６、６０および６００ｍｇ／ｋｇ）の単回投与（パートＡ）、および（２）。実験的マウスＡＭＩモデルにおいて再灌流の６０、１２０または１８０分後に投与された６０ｍｇ／ｋｇのＯＬＴ１１７７の単回投与の有効性を決定すること。
【００７４】
方法論：雄性ＣＤ−１マウスは、左冠状動脈の一過性の外科的結紮を３０分間受けた後、２４時間再灌流した。単回用量のＯＬＴ１１７７（６、６０、または６００ｍｇ／ｋｇ）または適合ビヒクルを再灌流時に腹腔内（ＩＰ）投与した（Ｎ＝５〜９匹／群、研究パートＡ）、あるいはＯＬＴ１１７７（６０ｍｇ／ｋｇ）は、６０分後、１２０分後、または１８０分後に投与した（Ｎ＝４〜７匹／群、試験パートＢ）。心エコー検査を行って左室（ＬＶ）短縮率（ＦＳ）を測定した。梗塞サイズは、トリフェニル−テトラゾリウム−クロリド（ＴＴＣ）およびフタロブルー染色によって病理学的に測定され、危険にさらされている心筋のパーセンテージとして表された。
【００７５】
６０ｍｇ／ｋｇ用量の場合、ＯＬＴ１１７７（１３ｍｇ／バイアル）を０．６５ｍｌの０．９％生理食塩水で希釈して２０ｍｇ／ｍｌの濃度にした。６ｍｇ／ｋｇ用量について、２０ｍｇ／ｍｌ用量を１０倍希釈し（０．１ｍｌのＯＬＴ１１７７  ２０ｍｇ／ｋｇ＋０．９ｍｌの０．９％通常食塩水）、２ｍｇ／ｍｌの最終濃度に到達させた。６００ｍｇ／ｋｇ用量の場合、ＯＬＴ１１７７の各バイアル（１３ｍｇ／バイアル）を０．１ｍｌの生理食塩水で希釈して１３０ｍｇ／ｍｌの最終濃度にした。複数のバイアルの内容物を合わせた。それぞれの各チューブをボルテックスし、薬物が完全に溶解するまで３７℃で加熱した。
【００７６】
再灌流が確認された後、雄マウスに６、６０、または６００ｍｇ／ｋｇの用量レベルでＯＬＴ１１７７を腹腔内経路で投与した（それぞれ約３３ｇのマウスに１００μｌの投与溶液を投与した；１５０μｌ）（研究パートＡ）。パートＢでは、６０ｍｇ／ｋｇのＯＬＴ１１７７を再灌流の時点から６０、１２０または１８０分の遅れで注射した（マウスあたり１００μｌの投与溶液）。
【００７７】
成体の非近交系の雄ＣＤ１マウス（８〜１０週齢）はＥｎｖｉｇｏ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）によって供給された。１人のオペレーターがすべての手術を行った。実験的ＡＭＩを３０分間の一過性冠状動脈結紮によって誘発し、前壁および心尖部（蒼白として見える）の虚血を誘発し、続いて再灌流し、そして約１５％の左心室を含む梗塞をもたらした。マウスをペントバルビタールナトリウム（７０ｍｇ／ｋｇ）で深く鎮静させ、２３Ｇカテーテルを使用して挿管し、そして右側臥位に配置した。マウスを剃毛し、皮膚をポビドン溶液およびイソプロピルアルコールで洗浄した。次にマウスを人工呼吸器に接続し、左開胸術を行い、続いて心膜切除術および近位左冠状動脈の結紮術を行った。結紮結び目の内側に直径１ｍｍのポリエチレンチューブを挿入し、固定し、定位置に置いて３０分間冠状動脈流を遮断した。虚血時間の終わりに、管を取り除き、冠状動脈流の再確立を観察した。このとき、再灌流確認後、６、６０、６００ｍｇ／ｋｇの用量のＯＬＴ１１７７、またはビヒクルとして通常の生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）（全量０．１ｍｌ）を腹腔内に注射した（パートＡ）。胸部アクセスを閉じた後、マウスを２４時間回復させた。皮下注射したブプレノルフィン（ブプレノルフィンＳＲ（商標）Ｌａｂ、０．５ｍｇ／ｋｇ）を用いて疼痛管理を達成した。研究パートＢでは、再灌流の瞬間から６０、１２０または１８０分後にマウスの群に６０ｍｇ／ｋｇのＯＬＴ１１７７を注射した。
【００７８】
手術中の目視検査で虚血の証拠を示し、全頂点を含むマウスのみを、目的の評価項目の判断に関与しない手術助手によって無作為に治療群に割り当てた。
【００７９】
屠殺前（再灌流の２４時間後）に、マウスは、ペントバルビタールナトリウム（５０ｍｇ／  ｋｇ）で軽度の麻酔下で経胸壁心エコー検査を受けた。心エコー検査は、Ｖｅｖｏ７７０イメージングシステム（ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ  Ｉｎｃ、トロント、オンタリオ州、カナダ）および３０ＭＨｚプローブを用いて行った。心臓を傍胸骨短軸および頂端図からＢモードで視覚化した。Ｍモードにおける左室（ＬＶ）拡張末期径（ＬＶＥＤＤ）およびＬＶ収縮末期径（ＬＶＥＳＤ）を測定した。これらの評価から、左心室分数短縮率（ＦＳ）を計算した。
【００８０】
【数１】
2020503358.tif 000004
【００８１】
駆出率（ＥＦ）は、ＶｅｖｏソフトウェアによるＴｅｉｃｈｈｏｌｚ  Ｆｏｒｍｕｌａを用いて計算した。心エコー図を実施して読む研究者は、治療配分を知らされていなかった。
【００８２】
梗塞サイズは手術の２４時間後に測定された。マウスを放血させ、そして心臓をヘパリン（４０Ｕ／ｍｌ）を含有する１×ｐＨ７．４のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で素早く灌流した。血液を洗い流した後、ＰＢＳ  １×中の１０％塩化トリフェニルテトラゾリウムを冠状動脈に灌流し、結紮した冠状動脈を再び閉じ、心臓の大部分が青色に変わるまで、ＰＢＳ  １×中の５ｍＭアデノシンにおける１％フタロブルー染料（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｉｎｋ、Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ、ＫＩ、ＵＳＡ）を冠状動脈に順に注入した。細い針を用いてＰＢＳおよびＴＴＣを左心尖部を通して灌流した。静脈内カテーテルを使用して青色染料を大動脈から注射した。
【００８３】
その後、心臓を外植し、凍結し、そして頂点から基部まで等しい厚さ（すなわち、約１ｍｍ）の６〜８個の横断スライスに切断した。心臓を３７℃で５分間解凍し、１０％ホルマリンを心臓切片に３０分間加えて色のコントラストを高めた。梗塞組織（白色に見える）および生存組織（真っ赤）は、Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ  ６．０ソフトウェア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇ、ＭＤ）を使用してコンピュータ形態計測によって測定した。梗塞サイズは、左心室の面積の割合として報告された。
【００８４】
転帰：この試験で測定されたパラメータは次のとおりである（Ｎ＝４〜９動物／グループ）：
・左心室（ＬＶ）の拡張末期径
・左心室（ＬＶ）の収縮末期径
・梗塞サイズ
【００８５】
結果：再灌流時に単回腹腔内注射として投与されたＯＬＴ１１７７（６、６０および６００ｍｇ／ｋｇ）は、左心室収縮機能の保存に関連して梗塞サイズの有意な減少を提供した（表１〜５）。
【００８６】
低用量の６ｍｇ／ｋｇのＯＬＴ１１７７は、ビヒクル対照と比較して梗塞サイズの３６％の減少を示した。中および高用量群（６０および６００ｍｇ／ｋｇ）の平均梗塞サイズは、ビヒクル対照と比較して６０％以上減少した。梗塞サイズの縮小は、左心室の収縮機能の維持とも関連していた。事実、再灌流の２４時間後に計算されたＬＶ短縮率および駆出率の両方が、ビヒクル対照群と比較してＯＬＴ１１７７の全用量について有意に高かった（ｐ＜０．０５）。
【００８７】
研究パートＡの再灌流時に腹腔内注射として投与されたＯＬＴ１１７７は、ビヒクル単独と比較した場合、ＴＴＣで測定された梗塞サイズの有意な減少をもたらした（図７）。ビヒクル処置群における平均梗塞サイズは、それぞれ、ＯＬＴ１１７７  ６、６０または６００ｍｇ／ｋｇの単回投与後の９．９％、５．１％および６．０％と比較して１５．４％であった（図８；ｐ＜０．００１）。中用量群と高用量群の間で梗塞サイズに有意差はなかった（ｐ＞０．０５）。梗塞サイズの縮小は、左心室の収縮機能の維持とも関連していた。実際、再灌流後２４時間で計算されたＬＶ短縮率および駆出率は、ビヒクル対照群と比較してＯＬＴ１１７７の全用量で有意に高かった（図９Ａおよび９Ｂ；ｐ＜０．０５）。
【００８８】
試験パートＡからの最小有効用量として、パートＢにおいて６０ｍｇ／ｋｇのＯＬＴ１１７７が再灌流後６０、１２０または１８０分のいずれかに投与されるように選択された。そのため、再灌流後６０分の遅延後に投与されたＯＬＴ１１７７は、パートＡで遅延なしで投与された治療と同様に、梗塞サイズの縮小とＬＶ機能の維持に有効であった。再灌流の１２０または１８０分後にＯＬＴ１１７７  ６０ｍｇ／ｋｇを投与した場合、梗塞サイズは有意に変化しなかった（図１０）。６０分または１２０分の治療遅延の後、ＬＶ短縮率および駆出率はビヒクル処理マウスと比較して有意に改善された（図１１Ａおよび１１Ｂ；ｐ＜０．０１）。しかしながら、１８０分の治療遅延の後、ＯＬＴ１１７７は短縮率の低下を防ぐことも梗塞サイズを縮小することもできなかった。
【００８９】
【表１】
2020503358.tif 000005
【００９０】
【表２】
2020503358.tif 000006
【００９１】
【表３】
2020503358.tif 000007
【００９２】
【表４】
2020503358.tif 000008
【００９３】
【表５】
2020503358.tif 000009
【００９４】
実施例１０．ダパンストリルによる急性心筋梗塞の治療（予言的な例）
目的：患者への経口投与、患者の治療、および／またはＡＭＩ後の患者転帰の改善のためのカプセルとして製剤化されたダパンストリルの有効性を調査する。
【００９５】
製剤：この例で使用する製剤は、１００ｍｇのダパンストリルとＡｖｉｃｅｌ（登録商標）ＰＨ−１０１のブレンドを含むカプセルである。各プラセボカプセルには、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）ＰＨ−１０１のみが含まれる。ダパンストリルカプセルとプラセボカプセルの両方は、経口投与用に処方される。
【００９６】
方法論：高感度Ｃ反応タンパク質（ｈｓＣＲＰまたはＣＲＰ）が上昇した安定したポストＭＩ患者のＡＭＩ治療における毎日経口投与されたダパンストリルの無作為化、二重盲検、プラセボ対照、イベント駆動型臨床活動研究。
【００９７】
過去にＡＭＩ（＞３０日）およびＣＲＰの上昇（ＣＲＰ＞２ｍｇ／ｌ）を有し、左心室駆出率も低下し（ＬＶＥＦ＜５０％）、心不全の症状を示す患者（ニューヨーク心臓協会の症状「ＮＹＨＡ」クラス）ＩＩ−ＩＩＩ）は、この研究に参加するために提供される。患者は、治療開始前にベースラインで心肺運動テスト（ＣＰＸ）を受け、その後３ヶ月と１２ヶ月で繰り返し、ベースラインと１２ヶ月で経胸壁心エコー図検査を受ける。
【００９８】
選択基準：
・書面によるインフォームドコンセント
・男性、または子供を産まない可能性のある女性
・年齢≧１８歳
・ランダム化の少なくとも３０日前の自然心筋梗塞（ＭＩ）
・ｈｓＣＲＰ≧２ｍｇ／Ｌ
・ＬＶＥＦ＜５０％
・ＮＹＨＡクラスＩＩ−ＩＩＩ
除外基準：
・妊娠中または授乳中の女性
・出産の可能性がある女性
・次の付随疾患のいずれか
ｏ計画された冠動脈血行再建ＰＣＩまたはＣＡＢＧ
ｏ過去６か月以内の主要な非心臓外科または内視鏡手術
ｏ過去３年以内の多血管ＣＡＢＧ手術
ｏクラスＩＶ  ＨＦの症候性患者
ｏ制御不能な高血圧
ｏコントロール不良の糖尿病
・トレッドミル運動テストを完了できない
・心肺検査の解釈を妨げる条件（不整脈、虚血、高血圧、肺疾患）
【００９９】
評価基準（以下の１つ以上を含むことができるが、次のいずれかに限定されない）：
臨床活動：
この研究では、連続的な心肺運動テスト（ＣＰＸ）を実行して、ダパンストリルまたはプラセボにランダムに割り当てられた、以前のＭＩ、上昇したＣＲＰレベル、および収縮機能が低下した症候性心不全の患者の有酸素運動能力の変化を前向きに測定する。
【０１００】
この研究に登録された対象は、試験の最初の１２か月間にわたってＣＰＸおよび心エコー図の繰り返しを受ける。
【０１０１】
研究エンドポイント：
一次臨床活動エンドポイントは次のとおりである
・ピーク酸素消費量（ＶＯ2）［時間枠：３か月］
ｏプラセボの間隔の変化と比較した場合の、ダパンストリル１００ｍｇの単回投与または経口のダパンストリル１００ｍｇの２回投与後の３か月でのピークＶＯ2のベースラインからの間隔の変化の差（プラセボ修正間隔の変化）。
二次臨床活動エンドポイントは次のとおりである：
・ピークＶＯ2変化［時間枠：１２か月］
ｏダパンストリル（両方の用量）とプラセボを比較して、ＶＯ2のピーク時とベースラインからの１２か月間の間隔変化の差。
・換気効率（ＶＥ／ＶＣＯ2勾配）の変化［時間枠：１２か月］
ｏダパンストリール（両方の用量）とプラセボを比較したＶＥ／ＶＣＯ2の傾きのベースラインと３か月間の間隔の変化の差。
・酸素利用効率勾配（ＯＵＥＳ）［期間：１２か月］
ｏダパンストリル（両方の用量）とプラセボを比較するＯＵＥＳのベースラインと１２か月からの間隔の変化の差。
・ＬＶＥＦの変更［時間枠：１２か月］
ｏダパンストリル（両方の用量）とプラセボを比較したＬＶＥＦのベースラインと１２か月からの間隔の変化の差。
・拡張機能の変化［時間枠：１２か月］
ｏダパンストリル（両方の用量）とプラセボを比較したＥ／Ｅ’（拡張機能）のベースラインと１２か月からの間隔の変化の差。
【０１０２】
実施例１１．ダパンストリルによるアテローム性動脈硬化症の治療（予言的な例）
目的：アテローム性動脈硬化症の治療において、患者への経口投与用カプセルとして製剤化されたダパンストリルの有効性を調査する。より具体的には、統合型血管ＭＲＩで測定された患者のプラーク負荷に対するプラセボと比較した経口ダパンストリルカプセルの毎日の投与の効果を評価すること。
【０１０３】
製剤：この実施例で使用する製剤は、１００ｍｇのダパンストリルとＡｖｉｃｅｌ（登録商標）ＰＨ−１０１のブレンドを含むカプセルである。各プラセボカプセルには、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）ＰＨ−１０１のみが含まれる。ダパンストリルカプセルとプラセボカプセルの両方は、経口投与用に処方される。
【０１０４】
方法論：ｈｓＣＲＰが上昇した安定したポストＭＩ患者のアテローム性動脈硬化症の治療における毎日経口投与されたダパンストリルの無作為化、二重盲検、プラセボ対照、イベント駆動臨床活動研究。
選択基準：
・書面によるインフォームドコンセント
・男性、または子供を産まない可能性のある女性
・１８歳以上
・ランダム化の少なくとも３０日前の自発的ＭＩ。ｈｓＣＲＰ≧２ｍｇ／Ｌ
・画像検査室による両側頸動脈の評価可能なベースラインＭＲＩ画像の取得
除外基準：
・妊娠中または授乳中の女性
・出産の可能性がある女性
・次の付随疾患のいずれか
ｏ計画された冠動脈血行再建術（ＰＣＩまたはＣＡＢＧ）
ｏ過去６か月以内の主要な非心臓外科または内視鏡手術
ｏ過去３年以内の多血管ＣＡＢＧ手術
ｏクラスＩＶ心不全（ＨＦ）の症候性患者
ｏ制御不能な高血圧
ｏコントロール不良の糖尿病
ｏＭＲＩ検査の禁忌がある患者（脳動脈瘤クリップ、埋め込み型神経刺激装置、埋め込み型心臓ペースメーカー、ペースメーカーワイヤまたは除細動器、人工心臓弁、人工内耳、眼の異物または他の埋め込み体、タトゥー、埋め込みインスリンポンプ、金属の破片または弾丸）
ｏ閉所恐怖症または既知の不安障害を起こしやすい患者
【０１０５】
評価基準（以下の１つ以上を含むことができるが、次のいずれかに限定されない）：
臨床活動：
この研究は、ｈｓＣＲＰが上昇した安定した心筋梗塞後患者のアテローム性動脈硬化の予防および／または治療における、毎日経口投与されるダパンストリルの有効性を決定する。
研究エンドポイント：
一次臨床活動エンドポイントには、以下が含まれるが、これらに限定されない：
・ベースラインに対する１２ヶ月の平均血管壁面積比［時間枠：ベースライン、投与後１２ヶ月］
ｏ磁気共鳴画像（ＭＲＩ）断面スライスを使用して測定された末梢動脈壁領域（表在性大腿動脈）。平均血管壁面積（ｍｍ2）は、血管の総プラーク体積（ＴＰＶ）（ｍＬ）をｍｍ3に変換し、１０００を乗算し、体積計算に使用されるスライス数で除算し、スライスの厚さ（３ｍｍ）で除算することで得られる。ベースラインに対する１２か月の比率の最小二乗平均は、来院、治療、来院ごとの治療相互作用、ベースライン、および固定効果としてのベースラインごとの来院相互作用を伴う反復測定混合効果モデルから測定される。
・インデックス頸動脈の分岐領域における頸動脈プラーク負荷のベースラインからの変化［時間枠：３６か月］
・有害事象、重篤な有害事象および死亡した参加者の数［時間枠：１２か月］
ｏ参加者は、有害事象、重篤な有害事象、および非致死性ＭＩ、非致死性脳卒中、心血管死などの研究全体の死亡について監視される。
・大動脈弾性のベースラインからの変化［時間枠：ベースライン、３か月、１２か月］
ｏ大動脈拡張性を決定するために、息止め中に２つの軸方向、ＥＣＧゲート、定常状態自由歳差運動（ＳＳＦＰ）「シネ」画像を取得する。最初の画像は、上行および近位下行大動脈を通る右肺動脈のレベルで取得され、横隔膜の下の遠位大動脈を通る第２の画像が取得される。大動脈の画像化により、プラーク負荷の評価と追加の血管機能測定も可能になる。
・プラーク負荷のベースラインからの変化（大動脈血管壁面積および頸動脈血管壁面積）［時間枠：ベースライン、３か月、１２か月］
ｏ大動脈のアテローム性動脈硬化プラークの負荷を評価するために、大動脈の血管壁画像は、心停止を適用した心エコー図（ＥＣＧ）ゲート二重反転回復（黒血）高速スピンエコーシーケンスで取得される。大動脈の斜矢状画像をパイロットとして使用して、下行胸部大動脈の一部をカバーするために連続軸画像を取得する。断面の右肺動脈の中点は、ベースラインおよびフォローアップスキャンの最初のスライスの解剖学的参照として使用される。頸動脈のアテローム性動脈硬化プラークの負荷を評価するために、軸方向の心電図ゲートＰＤ（プロトン密度）加重ブラック血液シーケンスで血管壁画像を取得する。頸動脈の分岐は、３つのイメージングのすべての時点（ベースライン、１２週間、４８週間）の解剖学的参照として使用され、分岐領域より下で取得された軸方向スライス面を使用する。ここで報告されている頸動脈の平均値は、近位総頸動脈領域について報告される。
【０１０６】
二次臨床活動エンドポイントには、以下が含まれるが、これらに限定されない。
・緊急の血行再建につながった不安定狭心症の入院
・事象発生までの時間の分析における前糖尿病患者のランダム化における新規発症２型糖尿病の発生率
・インデックス頸動脈の３か月目の血管壁面積のベースラインからの変化［期間：３６か月］
・３ヵ月目と２４ヵ月目における左右の頸動脈の血管壁の総面積の平均［時間枠：３６ヵ月］
・左右の頸動脈の対応する総血管壁面積のベースラインからの変化［期間：３６か月］
・治療の相互作用によるベースラインの総血管壁面積の存在、およびサブグループ間での治療効果の一貫性［期間：３６か月］
・脈波速度および脈波速度誤差のベースラインからの変化［時間枠：ベースライン、３か月、１２か月］
ｏＳｐｈｙｇｍｏＣｏｒデバイスを使用して、ＥＣＧリードを頸動脈に配置し、その特定の動脈位置での脈波の測定値を提供する大腿動脈を提供する。２つの血管床間の距離は、脈波速度の尺度を提供する脈波時間シフトで除算される。
・プラーク組成のベースラインからの変化［時間枠：ベースライン、３か月、１２か月］
ｏ頸動脈ＭＲＩ取得中に、プロトン密度（ＰＤ）で重み付けされたＥＣＧゲート二重反転高速スピンエコーシーケンスＴ１およびＴ２で重み付けされたシーケンスが取得される。ＰＤ強調画像と組み合わせて、マルチコントラスト画像を分析して、分岐領域に複雑な頸動脈プラークがある参加者の壊死脂質コア、石灰化、および線維組織の存在と一致するコントラストパターンで関心領域を決定する。
・大動脈緊張のベースラインからの変化［時間枠：ベースライン、３か月、１２か月］
ｏ動脈のひずみは、シネ定常状態歳差運動（ＳＳＦＰ）画像と心周期にわたる内腔直径の変化から直接計算される。この値は脈圧に依存せず、それぞれ拡張期と収縮期の最大内腔径と最小内腔径から導出される単位のない比率である。
・ｈｓＣＲＰのベースラインからの変化［時間枠：ベースライン、３か月、１２か月］
ｏｈｓＣＲＰを分析するために血液サンプルが収集さる。
・空腹時血漿グルコースのベースラインからの変化［時間枠：ベースライン、３か月、１２か月］
ｏ空腹時血漿グルコースを分析するために、血液サンプルが収集される。
・ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）のベースラインからの変化［時間枠：ベースライン、３か月、１２か月］
ｏＨｂＡ１ｃを分析するために血液サンプルが収集される。
・経口耐糖能試験（ＯＧＴＴ）後２時間のグルコースのベースラインからの変化［時間枠：ベースライン、３か月、１２か月］
ｏＯＧＴＴ後２時間のグルコースを分析するために、血液サンプルが収集される。
・ベータ細胞機能のベースラインからの変化（ＨＯＭＡ−Ｂ）［時間枠：ベースライン、３か月、１２か月］
ｏベータ細胞機能を分析するために血液サンプルが収集される。ベータ細胞機能は、ホメオスタシスモデルアセスメント（ベータ細胞機能（ＨＯＭＡ−Ｂ））によって次のように計算される：ＨＯＭＡ−Ｂ：２０と基礎インスリン（μＵ／ｍＬ）レベルの積を基礎グルコースの値（ｍｍｏｌ／Ｌ）濃度マイナス３．５［すなわち、ＨＯＭＡ−Ｂ＝２０＊基礎インスリン／（基礎グルコース−３．５）］。
・ベースラインのインスリン抵抗性（ＨＯＭＡ−ＩＲ）からの変化［時間枠：ベースライン、３か月、１２か月］
ｏインスリン抵抗性を分析するために血液サンプルが収集される。インスリン抵抗性は、インスリン抵抗性のホメオスタシスモデル評価（ＨＯＭＡ−ＩＲ））によって次のように計算される。ＨＯＭＡ−ＩＲ：基礎グルコース（ｍｍｏｌ／Ｌ）とインスリン（μＵ／ｍＬ）レベルの積を２２．５で割った値（ＨＯＭＡ−ＩＲ＝基礎グルコース＊基礎インスリン／２２．５］。
・ベースラインに対する１２か月の血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）レベル比［時間枠：ベースライン、投与後１２か月］
ｏベースラインに対する１２か月の比率の最小二乗平均は、来院、治療、来院ごとの治療相互作用、ベースライン、および固定効果としてのベースラインごとの来院相互作用を伴う反復測定混合効果モデルから測定される。
・ベースラインに対する１２か月のｈｓＣＲＰ比率［時間枠：ベースライン、投与後１２か月］
ｏベースラインに対する１２か月の比率の最小二乗平均は、来院、治療、来院ごとの治療相互作用、ベースライン、および固定効果としてのベースラインごとの来院相互作用を伴う反復測定混合効果モデルから測定される。
【０１０７】
実施例１２．ダパンストリルによる麻酔ラットにおける血栓形成の阻害
生体内での血栓形成に対するダパンストリルの効果を評価するために、以下の実験プロトコルが実行される。
【０１０８】
ラット（ＣＤ−１；オス；約３５０グラム；チャールズリバー、ローリー、ノースカロライナ州）は、ペントバルビタールナトリウム（７０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）で麻酔される。腹部を剃毛し、２２ゲージの静脈カテーテルを外側尾静脈に挿入する。正中切開を行い、腸を生理食塩水に浸したガーゼで包み、腹部大動脈にアクセスできるように配置する。下大静脈と腹部大動脈を慎重に隔離し、腹部大動脈の一部（約１ｃｍ）を分岐部の近位の腎動脈から遠位に切開する。このセクションの大動脈からのすべての枝は、４−０絹縫合糸で結紮される。遷音速流量計に接続された直径２．５ｍｍの流量プローブを動脈に配置し、ベースライン（狭窄前）の流量を記録する。２つのクリップを動脈の周りに配置して、血管の直径を約８０％縮小する。２回目のベースラインフロー測定が行われ（狭窄後）、充血反応がテストされる。その後、動物を尾静脈カテーテルを介してＲｈｏキナーゼ阻害化合物または生理食塩水で静脈内投与する。血栓症は、止血鉗子で血管を繰り返し外部から圧迫することにより、治療の５分後に誘発される。損傷の２分後、血管の圧迫が繰り返され、１０分間の流量監視が開始される。動物は、損傷後最低１０分間は継続的に監視されます。２０分後（傷害後）、流量測定を繰り返し、動物を安楽死させる。損傷した部分を含む大動脈の部分を採取し、組織学的評価のために１０％ホルマリンに入れる。ダパンストリルの化合物による治療は、血管損傷により誘発される血流の減少および血栓症の組織学的証拠の減少をもたらす。
【０１０９】
実施例１３．ダパンストリルによる麻酔犬における血栓形成の阻害
式ＩまたはＩＩの化合物のインビボでの動的血栓形成に対する効果を評価するために、Ｊ．Ｌ．Ｒｏｍｓｏｎら（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．１７：８４１−８５３，１９８０）の方法に類似した以下の実験プロトコルが実行される。
【０１１０】
手術の準備と器具。簡単に言えば、目的の犬を麻酔し、挿管し、室内の空気で換気する。心臓は、第５肋間腔の左開胸術によって露出され、心膜クレードルに吊り下げられる。左冠動脈回旋枝（ＬＣＣＡ）の２−３ｃｍのセグメントは、鈍的切開により分離される。動脈は、フロープローブ、刺激電極、およびＧｏｌｄｂｌａｔｔクランプで近位から遠位に計装される。フロープローブは、平均および相性ＬＣＣＡ血流速度を監視する。刺激電極とＬＣＣＡ内でのその配置、および閉塞性冠動脈血栓を誘発する方法論は以前に記載されている（Ｊ．Ｋ．Ｍｉｃｋｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ８１：６１７−６２７，１９９０；Ｒ．Ｊ．Ｓｈｅｂｕｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ８２：１６９−１７７，１９９０；Ｊ．Ｆ．Ｔｓｃｈｏｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｒｏｎ．Ａｒｔｅｒｙ  Ｄｉｓ．４：８０９−８１７，１９９３）。
【０１１１】
実験プロトコル：犬は、コントロールグループが生理食塩水を静脈内投与し、３つの薬物治療グループがＲｈｏキナーゼ阻害剤化合物を静脈内投与する４つの治療プロトコルの１つに無作為化される。外科的介入により安定化すると、犬は生理食塩水または異なる濃度の化合物を受け取る。約３０分後、ＬＣＣＡに１８０分間陽極電流が印加される。閉塞性血栓の形成に先行する循環流変動（ＣＦＶ）の数と周波数が記録される。これらの周期的現象は、血小板凝集の結果として狭くなった内腔に形成される血小板血栓によって引き起こされる（Ｊ．  Ｄ．  Ｆｏｌｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ５４：３６５−３７０，１９７６；Ｂｕｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ６９：１１６１−１１７０，１９８４）。最低３０分間のＬＣＣＡのゼロフローは、抗血栓効果の欠如を示す（Ｌ．Ｇ．Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９３：１２９−１３４，１９９６）。ダパンストリルの化合物による治療は、閉塞性血栓の形成に先行する循環流変動の数と周波数を著しく増加させる。
【０１１２】
実施例１４．ダパンストリルによる血栓症の治療（予言的な例）
目的：患者に経口投与するためのカプセルとして製剤化されたダパンストリルの有効性を調査し、血栓症を経験している患者または血栓症を患っている患者の転帰を治療および／または改善すること。
【０１１３】
製剤：この実施例で使用する製剤は、１００ｍｇのダパンストリルとＡｖｉｃｅｌ（登録商標）ＰＨ−１０１のブレンドを含むカプセルである。各プラセボカプセルには、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）ＰＨ−１０１のみが含まれる。ダパンストリルカプセルとプラセボカプセルの両方は、経口投与用に処方される。
【０１１４】
方法論：無作為化、二重盲検、プラセボ対照、並行治療の臨床活動研究。
【０１１５】
片側近位ＤＶＴ患者および下肢のＳＶＴ患者はこの研究に含まれる。対照として、ＤＶＴまたはＳＶＴがなく、血栓塞栓症の既往のないボランティアが募集される。
【０１１６】
選択基準（以下の１つ以上を含むことができるが、以下に限定されない）：
・１８歳以上
・急性、特発性または誘発性の片側近位ＤＶＴ（膝窩静脈またはさらなる近位静脈を含む）
・下肢のＳＶＴ（圧迫超音波検査では長さ５ｃｍ以上）
・ＤＶＴまたはＳＶＴを除外した後、血栓症および肺塞栓症の既往がない場合、年齢および性別が一致する対照がボランティアから募集される
除外基準（以下の１つ以上を含めることができるが、以下に限定されない）：
・下肢の以前のＤＶＴまたはＳＶＴの履歴
・肺塞栓症の歴史
・両側ＤＶＴまたはＳＶＴ
・静脈内薬物乱用、過去１０日間での下肢の手術、または過去３０日間での硬化療法に関連するＤＶＴ
・追跡は実行可能とはみなされない
・心不全（ＨＹＨＡ  ＩＩＩまたはＩＶ）
・急性冠症候群（＜７ｄ）
・重度の肺動脈高血圧症（肺動脈圧＞９０ｍｍＨｇ）
・妊娠
【０１１７】
評価基準（以下の１つ以上を含むことができるが、以下に限定されない）：
研究エンドポイント：
主要な臨床活動エンドポイントは次の通りである：
・患者の１つ以上の血管を通る血流の改善
二次臨床活動エンドポイントは次のとおりである：
・血栓症の組織学的証拠の減少
・血栓の数の減少
・１つ以上の血栓の形成の減少
【０１１８】
実施例１５．複雑な心膜炎のダパンストリルによる治療（予言的な例）
目的：患者の治療、および／または患者の転帰の改善、複雑な心膜炎の患者において、患者への経口投与用カプセルとして製剤化されたダパンストリルの有効性を調査すること。
【０１１９】
製剤：この実施例で使用する製剤は、１００ｍｇのダパンストリルとＡｖｉｃｅｌ（登録商標）ＰＨ−１０１のブレンドを含むカプセルである。各プラセボカプセルには、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）ＰＨ−１０１のみが含まれる。ダパンストリルカプセルとプラセボカプセルの両方は、経口投与用に処方される。
【０１２０】
方法論：複雑な心膜炎を有する患者の治療における毎日経口投与されたダパンストリルの無作為化、二重盲検、プラセボ対照、イベント駆動型臨床活動研究。
【０１２１】
複雑な心膜炎の患者は、研究に含めるためにスクリーニングされる。複雑な心膜炎の診断は、心臓磁気共鳴（ＣＭＲ）、胸部Ｘ線、心エコー検査、コンピュータ断層撮影（ＣＡＴ）スキャン、ウイルス血清学、および初期臨床的提示に基づく他の特定の検査の１つ以上を使用して行われる。心膜穿刺は、細菌性または腫瘍性の病因が疑われる場合、心臓タンポナーデが疑われる場合、または医学療法に反応しない重度の心膜液貯留の場合に実施される。さらに、患者の心膜の厚さ（例えば、Ｔ1またはＴ2強調高速スピンエコー画像を使用）、心膜浮腫（例えば、Ｔ2短タウ反転回復高速スピンエコー画像）、心膜炎症（例えば、ガドリニウム後期増強）、および心室相互依存性（例えば、深呼吸をするように指示された患者の基礎レベルでの短軸画像によるシネ画像）も測定できる。
【０１２２】
研究エンドポイント：
主要な臨床活動のエンドポイントは次のとおりである：
・次の２つ以上の症状の軽減：
ｏ発熱
ｏ前胸部の痛み
ｏ摩擦
ｏ正規化された（または大幅に減少した）ｈｓＣＲＰレベル
【０１２３】
実施例１６．ダパンストリルによるマウスの急性心膜炎の治療（予言的例）
心膜炎のザイモサンマウスモデルの概要：ＮＬＲＰ３インフラマソームを特異的に活性化することが知られている酵母の壁の生成物であるザイモサンは、各マウスの心臓の心膜腔に直接注入される。心膜の炎症は、心エコー検査（心膜肥厚および滲出液）および病理（心膜肥厚、活性インフラマソームの発現）で測定し、コルヒチンなどの抗炎症療法による治療を試験した。
【０１２４】
目的：ザイモサン心膜内注射によって引き起こされる急性心膜炎のマウスモデルにおけるダパンストリルの有効性を調査すること。
【０１２５】
方法論：Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ  Ｉｎｃ．）が提供する成体マウス（８〜１２週齢）に麻酔をかけ、以下に説明するように最初の経胸壁心エコー図を実施する。マウスを左開胸し、直接視覚化しながら、３０ゲージの針を使用して、５０μｌの滅菌ＮａＣｌ  ０．９％に溶解した１ｍｇのザイモサンを心膜腔に注入する。ザイモサン溶液は、一般的に完全に分布するまで、心膜嚢を鉗子で慎重に持ち上げることにより、心膜に分布する。シャム手術は、０．９％の滅菌ＮａＣｌを同量注入することで実行される。
【０１２６】
ダパンストリルは、腹腔内投与または強制経口投与（最終容量１００μｌ）のいずれかで投与され、同等の容量の適合媒体が対照として使用される。
【０１２７】
急性心膜炎モデルにおけるダパンストリルの効果を試験するために、次の転帰が使用される：
１．ザイモサンと同時に投与されたダパンストリル（６、１０、６０、６００ｍｇ／ｋｇ）の急性用量反応；
２．ザイモサン注射後３日目にダパンストリルによる遅延治療（最大の効果で最低用量を使用）；
３．ザイモサンの１〜２週間前に、強制経口投与（またはチャウもしくは水）を介して与えられたダパンストリルの慢性投与でテストされた慢性予防戦略。
【０１２８】
Ｖｅｖｏ７７０イメージングシステム（カナダ、トロントのＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ）は、軽い麻酔下で使用される。２次元モード（Ｂモード）での中脳室レベルの胸骨傍短軸ビューの左心室が視覚化される。画像は前壁用に最適化され、画像は前心膜構造を視覚化するためにズームされる。画像の最適化後、最適な時空間分解能のために一次元モード（Ｍモード）が取得され、心膜の２層間のエコーフリー空間として定義される心膜液の測定が可能になる。心エコー検査は手術の前に行われ、犠牲の３、７、１４日前に行われる。パイロット研究では、３〜７日間で不妊炎症のピークが見られ、１４日目までに消散する。グループ割り当てを知らない人は、ＭモードとＢモードの両方で最大心膜貯留を測定する。
【０１２９】
心臓は７または１４日後に外植され、病理学のために処理される。心臓のホルマリン固定パラフィン包埋横断面は、ヘマトキシリンとエオシンで染色される。グループ割り当てを知らない者は、Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ  ６．０ソフトウェア（メリーランド州シルバースプリングのＭｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ）を使用して、コンピュータ形態計測で心膜の厚さを測定する。
【０１３０】
細胞内のＮＬＲＰ３インフラマソームの形成は、ＡＳＣ染色後の光学顕微鏡で見える単一の斑点である（例えば、カスパーゼ動員ドメインを含むアポトーシス関連の斑点様タンパク質）。心膜を心筋構造から区別するために、抗α−心臓アクチンと組み合わせてＡＳＣに二重免疫蛍光法が使用される。
【０１３１】
実施例１７．ダパンストリルによる急性心膜炎の治療（予言的例）
目的：急性心膜炎患者の治療および／または患者転帰の改善における、患者への経口投与用カプセルとして製剤化されたダパンストリルの有効性を調査する。
【０１３２】
製剤：この実施例で使用する製剤は、１００ｍｇのダパンストリルとＡｖｉｃｅｌ（登録商標）ＰＨ−１０１のブレンドを含むカプセルである。各プラセボカプセルには、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）ＰＨ−１０１のみが含まれる。ダパンストリルカプセルとプラセボカプセルの両方は、経口投与用に処方される。
【０１３３】
方法論：急性心膜炎患者の治療における毎日経口投与されるダパンストリルの無作為化、二重盲検、プラセボ対照、イベント駆動型臨床活動研究。
【０１３４】
症状の発現から２４時間以内の急性心膜炎の連続症例はすべて、研究に含めるためにスクリーニングされる。特発性またはウイルス性の急性心膜炎の最終診断は、胸部Ｘ線、心エコー検査、ウイルス血清学、および最初の臨床症状に応じたその他の特定の検査によって行われる。心膜穿刺は、細菌性または腫瘍性の病因が疑われる場合、心臓タンポナーデが疑われる場合、または治療の１週間後に薬物療法に反応しない重度の心嚢液貯留が観察される場合に行われる。
【０１３５】
急性心膜炎の診断基準には、心膜炎性胸痛、心膜摩擦、広範囲にわたるＳＴ上昇、および／または以前に報告されていないＰＲ低下、および新しいまたは悪化する心膜液が含まれる。これらの基準のうち少なくとも２つが存在する場合、急性心膜炎の臨床診断が行われる。再発の診断基準には、再発性疼痛および以下の徴候のうち１つ以上が含まれる：発熱、心膜摩擦、ＥＣＧ変化、心膜液貯留の心エコー検査による証拠、および白血球数、赤血球沈降速度、またはＣＲＰの上昇。
【０１３６】
評価基準（以下の１つ以上を含むことができるが、次のいずれかに限定されない）：
臨床活動：
この研究では、連続心肺運動テスト（ＣＰＸ）を実行して、ダパンストリルまたはプラセボにランダムに割り当てられた、以前のＭＩ、ＣＲＰレベルの上昇、および収縮機能の低下を伴う症候性心不全の患者の有酸素運動能力の変化を前向きに測定する。
【０１３７】
この研究に登録された対象は、試験の最初の１２か月間にわたってＣＰＸおよび心エコー図の繰り返しを受ける
【０１３８】
研究エンドポイント：
主要な臨床活動のエンドポイントは次のとおりである：
・以下のいずれかの減少および／または欠如：心膜炎性胸痛、心膜摩擦、広範囲に及ぶＳＴ上昇、および／または以前に報告されていないＰＲ低下、摩擦、心電図の変化、心膜滲出の心エコー検査の証拠、および白血球数の増加、赤血球沈降速度、またはＣＲＰ。
・次のいずれかの減少よび／または欠如：
ｏ治療から１週間以内の症状
ｏ再発
ｏ心臓タンポナーデ
ｏ収縮性心膜炎
【０１３９】
実施例１８．ラットにおけるダパンストリルによる心臓同種移植片拒絶の治療（予言的例）
目的：ラットへの経口投与用カプセルとして製剤化されたダパンストリルの有効性を調査し、心臓同種移植片拒絶を経験しているまたは経験したラットの治療、副作用の軽減、および／または転帰の改善を行う。
【０１４０】
製剤：この実施例で使用する製剤は、ダパンストリルとＡｖｉｃｅｌ（登録商標）ＰＨ−１０１のブレンドを含むカプセルである。各プラセボカプセルには、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）ＰＨ−１０１のみが含まれる。ダパンストリルカプセルとプラセボカプセルの両方が経口投与用に処方されており、投与量は各マウスの体重に基づいて決定される。
【０１４１】
方法論：異所性血管化腹腔内心臓移植は、Ｏｎｏ及びＬｉｎｄｓｅｙ（Ｏｎｏ，Ｋ，  ａｎｄ  Ｌｉｎｄｓｅｙ，Ｅ．Ｓ．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｏｆ  ｈｅａｒｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒａｔｓ．Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．５７：２２５，１９６９）によって最初に記述された技術の修正を用いて行われる。
移植片は、腹部の触診によって心拍について毎日評価される。拒絶反応は、移植された臓器に触知可能な収縮がないことで決定される。切除後、適切な技術を使用して組織学のために、および／または他の適切な分析方法のために、心臓組織が準備される。４つの異なるグループ（移植なしのプラセボ、移植ありのプラセボ、移植なしのダパンストリル、および移植ありのダパンストリル）のそれぞれのラットをさまざまな時点で屠殺し、ラットの生理学に関するいくつかの要因を分析する。これらの要因は、プラセボグループを含むがこれに限定されない１つ以上の対照と比較される。
【０１４２】
研究エンドポイント：
・ｈｓＣＲＰ
・ＩＬ−１ベータ
・ＩＬ−６
・ＣＰＸ
・移植片の生存日数（または数ヶ月もしくは数年）に応じた同種移植片の受け入れ
・炎症の軽減
・再入院の欠如
【０１４３】
実施例１９．ダパンストリルによる心不全の治療（予言的な例）
目的：ＮＹＨＡ  ＩＩ−ＩＩＩ収縮期心不全などの心不全を経験しているまたは経験した患者の治療における、患者への経口投与用カプセルとして製剤化されたダパンストリルの有効性を調査すること。
【０１４４】
製剤：この実施例で使用する製剤は、１００ｍｇのダパンストリルとＡｖｉｃｅｌ（登録商標）ＰＨ−１０１のブレンドを含むカプセルである。各プラセボカプセルには、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）ＰＨ−１０１のみが含まれる。ダパンストリルカプセルとプラセボカプセルの両方は、経口投与用に処方される。
【０１４５】
投与量と投与方法：ダパンストリルカプセルまたはプラセボカプセルは、コホートに応じて１回または２回、ベースライン来院から始まり、１４日目の来院まで継続して自己投与される。治験薬の最初の投与量は、治験クリニックで施設職員の監督下で投与される。
【０１４６】
用量の選択：コホート１の用量は、１日１回投与される５つの１００ｍｇダパンストリルカプセルで構成される（１日あたり合計５００ｍｇのダパンストリル原薬）。コホート２の用量は、１日２回投与される５つの１００ｍｇダパンストリルカプセルで構成される（ＢＩＤ、１日あたり合計１，０００ｍｇのダパンストリル原薬）。
【０１４７】
併用薬：併用薬の使用は、各試験来院時に記録およびレビューされる。対象は、許可された併用薬の安定した投与量のままである。禁止されている併用薬には、経口コルチコステロイド（登録前２週間以内）または他の免疫調節療法（登録前５半減期内）が含まれる。禁止されている併用薬を使用している、または使用しようとしている対象は、研究への登録から除外される。
【０１４８】
方法論：これは、ＬＶＥＦ＜４０％の安定した収縮期ＨＦ、全身性炎症の徴候を示すＮＹＨＡ機能分類ＩＩ−ＩＩＩの症状（高感度血漿Ｃ反応性タンパク質［ｈｓＣＲＰ］＞２ｍｇ／Ｌ）を有する対象における、ダパンストリルまたはプラセボ（４：１の比率）の連続コホート、用量漸増、反復投与の無作為化、二重盲検、単一施設安全性および薬力学試験である。合計約２０人の対象が、無作為に割り当てられた２つの連続コホートに登録される（各コホート内で８人が活性、２人がプラセボ）。用量増加を伴うコホート２への進行は、最初のコホートにおける最後の対象の２８日目の来院後に生じる。
【０１４９】
対象はスクリーニングされ、適格性について２回評価される：１）スクリーニング時（無作為化の最大２８日前）；および２）無作為化前のベースライン来院時。ベースラインでは、評価が実施され、対象が適格である場合、すべての評価の完了およびベースラインパラメーターの収集時点で、治験薬の最初の用量（ダパンストリルカプセルまたは同一のプラセボカプセルのいずれか）が臨床現場で投与される。対象は、コホートに応じて、ベースライン来院から始まり、計画された１４日目の来院まで連続して最大１４日間、治験薬を１日１回または２回自己投与する。対象は、４、８、１４、２８日目に追跡来院のために研究クリニックに戻る。さらに、４２日目に電話で追跡のために対象に連絡される。
【０１５０】
安全性と忍容性は、有害事象（ＡＥ）の発生と、短縮された身体検査所見、バイタルサイン、臨床安全性の臨床検査結果（化学、血液学、心臓バイオマーカー）の変化、および生体インピーダンス分析で測定された体組成を監視することで評価される。薬力学／バイオマーカーのエンドポイントには、とりわけ血漿ｈｓＣＲＰ、ＩＬ−１β、インターロイキン−６（ＩＬ−６）の採血が含まれる。心肺フィットネスの評価には、心肺運動テスト（ＣＰＸ）を使用したピーク酸素消費量（ピークＶＯ2）および換気効率（ＶＥ／ＶＣＯ2勾配）の測定が含まれる。心収縮期および拡張期の機能は、経胸壁ドップラー心エコー検査および生活の質に関するアンケート（カンザスシティ心筋症アンケートおよびデュークアクティビティステータスインデックス）で測定される。さらに、ダパンストリル曝露の薬物動態評価のために血液試料が収集される。
【０１５１】
約１０人の対象が第１コホートで無作為化され、１４日前に中止した対象は置換が許可される。コホート１のすべての対象による２８日目の来院が完了すると、メディカルモニターによって中間データ分析が行われ、レビューされる。独立した心臓専門医と治験責任医師、およびコホート２を登録するための試験の進行に関する決定が行われる。
【０１５２】
選択基準（以下の１つ以上を含むことができるが、以下に限定されない）：
・１８歳以上の男性と女性の被験者
・左室駆出率が低下した症候性安定ＨＦ（ＮＹＨＡクラスＩＩ−ＩＩＩ）（登録後６か月以内に測定されたＬＶＥＦ≦４０％−過去２か月以内に心臓薬の変更または新しいデバイス移植なし）。
・息切れによって制限され、呼吸交換率（ＲＥＲ）＞１．００に関連する最大運動（最大有酸素運動を反映）
・ベースラインの年齢／性別による予測値の８０％未満にピーク有酸素運動能力（ピークＶＯ2）を減らした
・スクリーニング時の血漿ｈｓＣＲＰレベル＞２ｍｇ／Ｌ
・治験責任医師の意見により、安全に登録され、研究を完了するための許容可能な全体的な医学的状態（特に心血管、腎臓および肝臓の状態に関する）
・治験関連の手順を開始する前に書面によるインフォームドコンセントを提供する能力、および治験責任医師の意見では、治験のすべての要件を理解し、遵守する能力。
【０１５３】
除外基準（以下の１つ以上を含めることができるが、以下に限定されない）：
・妊娠中、授乳中、または研究中に妊娠する意図
・ＣＰＸ中に発生する異常な血圧または心拍数応答、狭心症またはＥＣＧの変化（虚血または不整脈）
・自己免疫状態の存在または既知の履歴（全身性エリテマトーデス、下垂体炎など）
・ベースライン来院時の活動性結核（ＴＢ）感染の履歴または証拠、または以下を含むがこれらに限定されない、または排他的な結核の危険因子の１つ：
ｏ次のいずれかの履歴：集合環境（例、刑務所または刑務所、ホームレスシェルター、または慢性治療施設）での居住、薬物乱用（例、注射または非注射）、被験者への保護されていない暴露を伴う医療従事者結核の危険性が高い人、または結核疾患のある対象の識別および正しい空中予防措置の前に、または
ｏ過去１２か月以内に活動性肺結核症の人との密接な接触（すなわち、家庭または他の囲まれた環境で同じ空間を長期間（数分または数時間ではなく、数日または数週間）共有する）。
・治療期間中の禁止された併用薬／療法の使用、または禁止された併用薬／療法の計画された使用
・治験責任医師の意見では、治験への安全な参加および／またはプロトコル要件の完了を被験者が損なう他の付随する医学的または精神医学的状態、疾患、または以前の手術、以下に限定されない：
ｏトレッドミルで歩くまたは走ることが物理的にできない
ｏ非代償性ＨＦ（浮腫、ＮＹＨＡ  ＩＶ）
ｏ著しい虚血性心疾患、狭心症ｏ動脈性低血圧（血圧［ＢＰ］収縮期＜９０ｍｍＨｇ）
ｏ動脈性高血圧（安静時血圧収縮期＞１６０ｍｍＨｇ）
ｏ急速な心室反応を伴う心房細動ｏ重度の弁膜症
ｏ重度の慢性閉塞性または拘束性肺疾患
ｏ中程度から重度の貧血（Ｈｇｂ＜１０ｇ／ｄＬ）
ｏ重度の糖尿病性神経障害またはミオパチー
・ベースライン来院前のアクティブまたは最近（２週間以内）の感染
・ＨＩＶ、Ｂ型肝炎表面抗原、またはＣ型肝炎ウイルスに対する抗体の既往歴または陽性
・過去６か月以内に化学療法治療を受けた活動性悪性腫瘍または最近の悪性腫瘍
・ベースライン来院の直前の３０日以内に、治験への登録および／または治験薬または治験薬の使用
・治験薬への過去の暴露
【０１５４】
評価基準（以下の１つ以上を含むことができるが、以下に限定されない）：
試験期間は、無作為化されたすべての対象について約４２日間であり、これは研究サイトへの６回の来院で構成されます：スクリーニング（ベースラインの２８日前まで）、ベースライン（１日目）、４日目（±１日）、８日目（±２日）、１４日目（±２日）、２８日目（±２日）。さらに、対象は４２日目（±３日）に電話でフォローアップのために連絡される。
【０１５５】
安全基準：
・身体検査（一般検査および部位特異検査の略）
・バイタルサイン（脈拍、安静時血圧、体温、呼吸数）
・安全検査室の対策（化学、血液学、心臓バイオマーカー）
・生体インピーダンス分析
・心肺運動テスト
・経胸壁ドップラー心エコー検査
・血漿ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰレベル
・臨床試験中の有害事象
【０１５６】
薬力学の転帰：ＰＤ／バイオマーカー分析のために、各試験来院時に血液サンプルが収集される：
・ｈｓＣＲＰのレベル
・循環サイトカインのレベル（例：ＩＬ−１β、ＩＬ−６）
【０１５７】
薬物動態の転帰には、ダパンストリルの血漿濃度の測定が含まれるが、これに限定されない。
【０１５８】
生活の質の転帰は、症状の変化を測定するために、カンザスシティ心筋症アンケートとデューク・アクティビティ・ステータス・インデックスによって評価される。
【０１５９】
研究エンドポイント：
・一時臨床活動エンドポイントは次のとおりである：
ｏ患者の薬力学／バイオマーカーエンドポイントには、２８日間の試験後の血漿ｈｓＣＲＰ、ＩＬ−１β、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）の採血が含まれる。
ｏ患者のＣＰＸスコア、ＥＣＧ、および／または生体インピーダンス分析の改善
ｏ患者が再入院したかどうか
・副次的な臨床活動エンドポイントには、患者の単回および複数回投与の薬物動態プロファイルが含まれる。
【０１６０】
実施例２０．ダパンストリルによる脳卒中の治療（予言例）
目的：１つ以上の脳卒中を経験している、または経験した患者の治療および／または転帰の改善における、患者への経口投与用カプセルとして製剤化されたダパンストリルの有効性を調査すること。
【０１６１】
製剤：この実施例で使用する製剤は、１００ｍｇのダパンストリルとＡｖｉｃｅｌ（登録商標）ＰＨ−１０１のブレンドを含むカプセルである。各プラセボカプセルには、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）ＰＨ−１０１のみが含まれる。ダパンストリルカプセルとプラセボカプセルの両方は、経口投与用に処方される。
【０１６２】
方法論：無作為化、二重盲検、プラセボ対照、並行治療の臨床活動研究。
【０１６３】
前大脳循環閉塞および脳卒中発症が４．５時間を超えるが４８時間未満続く患者は、（１）標準管理とプラセボ、（２）標準管理とダパンストリル（経口で１日あたり１００ｍｇで１４連続日）、または（３）標準管理とダパンストリル（経口で１日あたり２００ｍｇで１４連続日）を含む、２つのグループに無作為に分けられる。プラセボまたはダパンストリルのいずれかの投与は、ベースラインＭＲＩの１時間以内に開始してから、症状の発症後の４８時間以内に開始する。
【０１６４】
患者は、治療開始から２８日までの有害事象および神経学的転帰について監視される。データは、データ安全監視委員会（ＤＳＭＢ）によって継続的にレビューされる。薬物関連毒性が用量コホート内で用量制限有害事象の１つ（治療の４分の１）の所定のレベルに達しない限り、用量の増加は継続する。試験は、積極的治療を受けている患者の４人のうち２人または３人に用量制限毒性が重度であるか、または計画されたすべての用量コホートが完了した用量レベルで終了する。
【０１６５】
選択基準（以下の１つ以上を含むことができるが、以下に限定されない）：
・１８歳以上
・前循環虚血性脳卒中
ｏ限局性神経学的欠陥の症状および虚血性脳病変の同時放射線学的証拠（磁気共鳴画像法、ＭＲＩ）を有するすべての患者
・測定可能な神経学的欠陥（ＮＩＨＳＳ＞５）
・症状の発現と入院の間隔が４．５時間以上４８時間未満
ｏすべての患者は、症状発現の４．５時間を超えてリクルートされ、血栓溶解療法の許容時間枠を過ぎている。
除外基準（以下の１つ以上を含めることができるが、以下に限定されない）：
・出血性脳卒中および他の臓器の重度の出血
・他の中枢神経系疾患（ＣＮＳ）
・真性糖尿病
・腫瘍または血液の全身性疾患
・急性虚血性脳卒中前の感染
・抗腫瘍薬または免疫調節療法の併用
・ＭＲＩの禁忌
【０１６６】
評価基準（以下の１つ以上を含むことができるが、以下に限定されない）：
研究エンドポイント：
主要な臨床活動エンドポイントは次のとおりである：
・病変体積の変化［時間枠：ベースラインから７日目までの病変体積］
・脳炎症レベル（ＢＭＳ）［時間枠：７日目］
・臨床的改善の程度［時間枠：ベースラインから７および１４日目まで］
二次臨床活動エンドポイントは次のとおりである：
・優れた回復の確率［時間枠：９０日目］、ｍＲＳで０または１のスコアとして定義
・細胞毒性浮腫［時間枠：３日目］（ＡＤＣ値）
【０１６７】
実施例２１．ダパンストリルによる末梢血管疾患の治療（予言的例）
目的：患者に経口投与するためのカプセルとして製剤化されたダパンストリルの有効性を調査し、治療中、副作用の軽減、および／または末梢血管疾患を患っている患者の転帰を改善する。特に、この研究は、アテローム性動脈硬化性末梢動脈疾患と歩行による下肢痛の患者の脚動脈構造と身体活動に対するダパンストリルの安全性、忍容性、有効性を評価するように設計されている。
【０１６８】
製剤：この例で使用する製剤は、ダパンストリル１００ｍｇとＡｖｉｃｅｌ（登録商標）ＰＨ−１０１のブレンドを含むカプセルである。各プラセボカプセルには、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）ＰＨ−１０１のみが含まれる。ダパンストリルカプセルとプラセボカプセルの両方は、経口投与用に処方される。
【０１６９】
方法論：間欠性跛行を有する患者のダパンストリルの安全性、忍容性、動脈構造と機能への影響に関する多施設無作為化二重盲検プラセボ対照試験。
【０１７０】
選択基準（以下の１つ以上を含むことができるが、以下に限定されない）：
・インフォームドコンセントフォームに署名
・１８〜８５歳
・歩行に伴う脚の痛みを経験し、足首上腕のインデックスが０．４０〜０．９である
・少なくとも６週間安定したアスピリンとスタチンの投与
・プロトコルで指定された範囲内の血圧
・十分にコミュニケーションを取り、学習手順を理解し、順守できること
【０１７１】
除外基準（以下の１つ以上を含めることができるが、以下に限定されない）：
・任意の他の実験薬の最近の使用
・妊娠中または授乳中の女性
・プロトコルで詳述されているように避妊を使用する意思がない限り、出産の可能性がある女性
・１５メートル（５０フィート）歩くことができない
・プロトコルにリストされている制限された薬を服用している人
・３か月の研究開始または感染から２週間以内または研究開始後の開いたまたは治癒しない創傷
・重大な心臓病
・コントロール不良の糖尿病
・重大な腎臓または肝臓の病気
・試験開始から３か月以内の生ワクチン接種
・未治療の結核または活動性結核（ＴＢ）の既往
・プロトコルに詳述されているように、体内に金属がある患者（ＭＲＩスキャンにより除外される）。
【０１７２】
評価基準（以下の１つ以上を含むことができるが、以下に限定されない）：
研究エンドポイント：
主要な臨床活動エンドポイントは次のとおりである：
・ベースラインに対する１２ヶ月の平均血管壁面積比［時間枠：ベースライン、投与後１２ヶ月］
ｏ磁気共鳴画像（ＭＲＩ）断面スライスを使用して測定された末梢動脈壁領域（表在性大腿動脈）。
・平均血管壁面積（ｍｍ2）は、血管の総プラーク体積（ＴＰＶ）（ｍＬ）を１０００倍し、体積計算に使用するスライス数で割り、厚さスライス（３ｍｍ）。ベースラインに対する１２か月の比率の最小二乗平均は、来院、治療、来院ごとの治療相互作用、ベースライン、および固定効果としてのベースラインごとの来院相互作用を伴う反復測定混合効果モデルから測定される。
【０１７３】
二次臨床活動エンドポイントは次のとおりである：
・１２か月で有害事象を起こした患者の数［時間枠：投与後１２か月までのベースライン］
ｏ有害事象に関する要約統計が報告される。これは、総有害事象（非重篤および重篤なＡＥ）、重篤な有害事象、死亡の患者数に分類される。
・ベースラインに対する１２か月の血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）レベル比［時間枠：ベースライン、投与後１２か月］
ｏベースラインに対する１２か月の比率の最小二乗平均は、来院、治療、来院ごとの治療相互作用、ベースライン、および固定効果としてのベースラインごとの来院相互作用を伴う反復測定混合効果モデルから測定される。
・ベースラインに対する１２か月のｈｓＣＲＰ比率［時間枠：ベースライン、投与後１２か月］
ｏベースラインに対する１２か月の比率の最小二乗平均は、来院、治療、来院ごとの治療相互作用、ベースライン、および固定効果としてのベースラインごとの来院相互作用を伴う反復測定混合効果モデルから測定される。
【０１７４】
上記の説明は本発明の好ましい実施形態を説明するものであり、特許請求の範囲に記載された本発明の範囲から逸脱することなく変更を加えることができることを理解されたい。
【図１ａ】
2020503358.tif 000010
【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2020503358.tif 000018
【図９】
2020503358.tif 000019
【図１０】
2020503358.tif 000020
【図１１】
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【国際調査報告】
2020503358.tif 000022