(57)【要約】  本発明は、IDEをコードする遺伝子の発現レベルの測定に基づいた、老化の徴候を表す皮膚を診断する方法に関する。本発明はまた、皮膚の美容的処置の方法に関する。本発明はまた、皮膚の老化の徴候を低減する化合物を同定する方法並びにキットに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における老化の徴候を有する皮膚の診断方法であって、
a)前記対象の皮膚試料におけるインスリン分解酵素(IDE)をコードする遺伝子の発現レベルを測定する工程
を含む方法。
【請求項２】
対象における老化の徴候を有する皮膚の美容的処置の方法であって、
a)前記対象の皮膚試料におけるIDEをコードする遺伝子の発現レベルを測定する工程、
b)工程a)から、前記対象の皮膚が老化の徴候を有するかどうかを推定する工程、及び
c)工程b)において、皮膚が老化の徴候を有するとされた場合、前記皮膚を、皮膚の老化の徴候の進行を低減及び/又は遅延させる化粧品組成物で処置する工程
を含む方法。
【請求項３】
皮膚の老化の徴候の進行を低減及び/又は遅延させるのに適切な化合物を同定する方法であって、
a)候補化合物に曝露した皮膚試料においてIDEをコードする遺伝子の発現レベルを測定する工程、
b)工程a)で測定した前記発現レベルを、前記化合物に曝露していない皮膚試料におけるIDEをコードする遺伝子の発現レベルと比較する工程、
c)候補化合物に曝露していない皮膚試料におけるIDEをコードする遺伝子の発現レベルに対して、前記候補化合物に曝露した皮膚試料においてIDEをコードする遺伝子の発現レベルの増加が検出されたとき、前記候補化合物を皮膚の老化の徴候の進行を低減及び/又は遅延させるのに適切な化合物として同定する工程
を含む方法。
【請求項４】
前記皮膚試料が皮膚細胞培養物、表皮培養物、再構築された全皮膚、ヒト皮膚移植片又は対象の皮膚試料である、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
皮膚試料が、皮膚表面をこすることによって、又は粘着表面を使用して採取される、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
IDEをコードする遺伝子の発現レベルが、前記遺伝子のmRNAの発現レベルによって、又は前記遺伝子によってコードされるタンパク質の発現レベルの測定によって判定される、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
IDEをコードする遺伝子によってコードされるタンパク質の発現レベルが、IDEタンパク質の少なくとも1つの特異的リガンドを使用して測定される、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
a)皮膚試料においてIDEをコードする遺伝子の発現レベルを測定する手段、
b)使用説明書、
c)皮膚試料を採取する手段、及び
d)IDEをコードする遺伝子の発現の標準的範囲
を含むキット。
【請求項９】
皮膚試料においてIDEをコードする遺伝子の発現レベルを測定する手段が、IDEの特異的リガンド又はmRNAの相補的ヌクレオチド配列又は後者の断片、IDEのmRNAのプライマー対又は特異的プローブである、請求項8に記載のキット。
【請求項１０】
皮膚の老化の徴候の進行を低減及び/又は遅延させるのに適切な化合物を同定するための、請求項8又は9に記載のキットの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、老化の徴候を示す皮膚の診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
老化中、皮膚は全体的に、血管新生の質が落ちるのと同時に、皮膚の区画(表皮、真皮-表皮接合部、真皮、真皮-皮下組織接合部)全ての機能的及び構造的変化及び劣化の現れとして多くの損傷を受ける。細胞レベルでは、多くの代謝機能が影響を受ける。表皮は年齢と共に薄くなり、ケラチン生成細胞は再生及び修復能力を失い、ヒアルロン酸、プロテオグリカンの合成は年齢と共に弱まり、真皮-表皮接合部の密着の質は落ち、皮膚組織はより薄く脆弱になり、表皮の厚さもより薄くなり、真皮-表皮接合部は若い皮膚の主な特徴である陥入(invagination)を失う。同じことが、真皮レベルでも当てはまり、組織体(コラーゲン、特に、プロテオグリカン)において繊維芽細胞が合成するタンパク質又は基礎的なマトリクス分子は少なくなる。皮下組織も影響を受ける。これらの事象は全て、皮膚全体を弱くし、皮膚は張りが低下し、弾力性が低下し、脆弱になり、適正な水分レベルを保持することが困難である(バリア機能の障害)。皮膚はまた、輝きを失い、マイクロレリーフが変化して、外気に晒された(weathered)肌理の出現、皺及び線条の出現の原因となり、孔の直径の不均一性が増加し、どの徴候も「体調不良」又は疲労として認識され、見かけ上の年齢の認識を変更する。さらに、皮膚の特性全ての変化は、様々な2次的要素、例えば、様々な生理学的障害の結果、汚染若しくは紫外線等の照射等の環境による攻撃、タバコ等の外的要素、体重の変更、妊娠、肥満、セルライトに続く組織体、皮下組織の密度の変動、又は、実際には、例えば、皮膚線条、瘢痕から生じる細胞外マトリクスの成分の無秩序によって、悪化する可能性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際出願公開第2011/126249号パンフレット
【特許文献２】仏国特許出願公開第2667778号
【特許文献３】国際出願公開第2015/009085号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記のことから、特に皮膚の老化の徴候がまだ見えないとき、皮膚の老化のこれらの徴候の進行を低減及び/又は遅延を可能にするために、皮膚の老化の徴候の検出を可能にするバイオマーカーの発見が重要であると理解されている。より詳細には、皮膚の老化は本明細書で前述した様々な徴候の1つ又はいくつかによって具体的に示すことができるので、所与の対象においてそれらの徴候を適切に標的化するために、これらの徴候の1つ又は複数の特異的バイオマーカーが実質的に必要である。本発明の目的は、これらの必要性を満たすことである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本出願人は、驚くべきことに、皮膚におけるインスリン分解酵素(IDE)をコードする遺伝子の発現が、皮膚の老化の徴候の存在、より詳細には、弾力線維症、目尻の皺の出現及び目の下の皺の出現と相関することを発見した。
【０００６】
インスリン分解酵素(略してIDE)は、細菌、キノコ、植物及び動物に存在する113kDaの亜鉛を含むメタロプロテアーゼである。インスリン分解酵素は、インスリジン、インスリナーゼ、インスリングルカゴンプロテアーゼ、インスリン特異的プロテアーゼ、FLJ35968、インスリンプロテアーゼ等の別名でも記載される。IDEは、細胞の細胞膜に関連することが多い分泌酵素である。IDEは多くの組織で発現し、最高レベルのIDEは脳、腎臓、肝臓及び精巣において見いだされる。
【０００７】
したがって、第1の態様によれば、本発明は、目的として、好ましくはインビトロにおける、対象における老化の徴候を表す皮膚の診断方法であって、
a)前記対象の皮膚試料におけるIDEをコードする遺伝子の発現レベルを測定する工程
を含む方法を有する。
【０００８】
場合によって、本発明によるこの診断方法はさらに、
b)工程a)で測定したIDEをコードする遺伝子の発現レベルに基づいて、前記対象の皮膚が老化の徴候を有するかどうかを判定する工程
を含む。
【０００９】
本発明はまた、対象における老化の徴候を有する皮膚の美容的処置の方法であって、
a)前記対象の皮膚試料におけるIDEをコードする遺伝子の発現レベルを測定する工程、
b)工程a)から、前記対象の皮膚が老化の徴候を有するかどうかを推定する工程、及び
c)工程b)において、前記皮膚が老化の徴候を有するとされた場合、前記皮膚を、皮膚の老化の徴候の進行を低減及び/又は遅延させる化粧品組成物で処置する工程
を含む方法に関する。
【００１０】
「皮膚の老化の徴候」という用語は、本明細書では、年齢に伴って生じ、時々早期段階では見えない皮膚の変更全てを意味する。老化の徴候は、皮膚の著しいマイクロレリーフ、細かい線条、皺の出現、張度の低下、密度の低下、張りの低下、弾力性の低下、真皮及び/又は表皮の厚さの減少、乾燥、しぼんだ(withered)皮膚、皮膚の艶の輝きの低下、皮膚のしわくちゃな(wizened)外観の出現、皮膚のたるみ及び皮膚の萎縮(withering)を含む。
【００１１】
好ましくは、本発明の方法によって検出及び/又は処置する皮膚老化の徴候は、皮膚の著しいマイクロレリーフ、細かい線条及び皺の出現及び弾力性の低下である。より好ましくは、本発明の方法によって検出及び/又は処置する皮膚老化の徴候は、弾力線維症、目尻の皺の出現及び目の下の皺の出現である。特に、フケの出現は老化には直接関係なく、老化の徴候とは考えられない。
【００１２】
IDEは、アミノ酸配列が公知で、特に、NCBI受入コード:NP_004960.2(2016年4月13日バージョン)及びNP_001159418.1(2016年4月13日バージョン)の配列に対応する2つのアイソフォームを有するタンパク質である。IDEをコードするmRNA配列はまた当業者に公知で、特に、NCBI受入コード:M21188.1(2010年6月23日バージョン)で利用可能である。
【００１３】
用語「IDEをコードする遺伝子の発現レベル」は、IDEをコードする遺伝子のメッセンジャーRNA(mRNA)の発現レベル及び/又はIDEタンパク質の発現レベルを意味する。
【００１４】
好ましくは、IDEタンパク質の発現レベルは、例えば、このタンパク質に特異的な抗体、好ましくは、モノクローナル抗体、Fab断片、scFv又はナノボディ等のIDEタンパク質の特異的リガントを使用して測定する。次に、発現レベルは、例えば、ELISA検査等を用いて、当業者に公知の任意の方法を用いて測定することができる。特に、IDEタンパク質の発現レベルの測定は、国際出願公開第2011/126249号パンフレットに記載されたもの等のマイクロ流体チップであって、IDEタンパク質に特異的なリガンドを含有するチップ等の小型化システムを使用して行うことができる。このチップはその後、IDEタンパク質が前記リガンドと結合したかどうかを判定し、皮膚試料中のIDEの存在及び量に関する結論に達するために、適切な読み取り機を用いて分析することができる。
【００１５】
好ましくは、IDEをコードする遺伝子のmRNAの発現レベルは、IDEをコードする遺伝子のmRNAに特異的にハイブリダイズするIDEをコードする遺伝子のmRNAの相補的ヌクレオチド配列、又はIDEをコードする遺伝子のmRNAに特異的にハイブリダイズするそれらの断片であって、5個から50個のヌクレオチド、好ましくは10個から20個のヌクレオチドを含む配列又は断片を使用して、或いは、前記配列又は前記断片を含む10個から60個のヌクレオチド、好ましくは15個から30個のヌクレオチドのプライマー対又はプローブを使用して、測定する。次に、発現レベルは、当業者に公知の任意の手段によって、例えば、定量的PCRを用いて測定することができる。
【００１６】
本発明の範囲内では、用語「ハイブリダイズする」又は「ハイブリダイゼーション」は、当業者には周知の通り、適切な条件下、特に、ストリンジェント条件下で、核酸配列が特定のヌクレオチド配列と結合することを意味する。
【００１７】
本明細書では、用語「ストリンジェント条件」は、規定の相補性レベルを有する核酸の間に結合対を生成するために適切であるが、前記規定レベルよりも相補性の低い結合核酸の間の対形成には適切ではない条件に対応する。ストリンジェント条件は、ハイブリダイゼーション及び洗浄条件に左右される。これらの条件は、当業者に公知の方法によって変更することができる。一般的に、高ストリンジェント条件は、融点(Tm)よりも約5℃低い、好ましくは、完全な塩基対鎖のTmに近いハイブリダイゼーション温度である。ハイブリダイゼーション手法は当業界では周知である。
【００１８】
高ストリンジェント条件は一般的に、5×SSC/5×デンハート液/1.0%SDS溶液中における約50℃から約68℃の温度でのハイブリダイゼーション、及び0.2×SSC/0.1%SDS溶液中における約60℃から約68℃の間の温度での洗浄を含む。
【００１９】
好ましい一実施形態によれば、本発明による診断及び美容的処置法で使用した対象の皮膚試料は、好ましくは非侵襲的に、対象の皮膚、好ましくは顔の皮膚及び/又は体の皮膚、好ましくは対象の顔、特に対象の頬から採取した試料である。好ましい一実施形態によれば、本発明による診断及び美容的処置法で使用した対象の皮膚試料は、頭皮からは採取しない。好ましくは、皮膚試料は角質層から入手する。好ましくは、皮膚試料は皮膚表面から入手する。好ましくは、皮膚試料は対象の皮膚の病変のない領域で採取した試料である。
【００２０】
角質層は、表皮の最も外側の層であり、皮膚表面を含む。角質層は、基本的に、死んだ細胞で構成される。
【００２１】
一実施形態によれば、本発明による方法は、対象から皮膚試料を採取する工程を含む。この工程は、好ましくは非侵襲的に実施し、特に局所麻酔を必要としない。例えば、採取方法は、ストリッピング型の技術であってもよく、検討中の表皮に粘着テープの一部を適用することで構成される。この粘着テープを剥がすと、皮膚表面の画分が取り出される。これらのストリッピングは、3M社製のBlenderm(登録商標)、D'squam(CuDERM社製から市販されている粘着物)、シアノアクリル酸接着剤又はワニス「ストリッピング」法等の表皮の表面に適用した粘着表面である。これらのストリッピングによって、付着した角質細胞及び角質細胞の細胞間隙の内容物を採取し、その後、タンパク質内容物を入手するために抽出を行うことができる。
【００２２】
本発明の方法に適切な試料の採取はまた、より直接的には、例えば、流体回路と組み合わせた仏国特許出願公開第2667778号に記載されたような羽タービン型若しくはスパイラルセル型の付属物を用いて、皮膚表面を「洗浄すること」によって、又は皮膚の表面で緩衝液1滴を添加/採取することによって簡単に実施することができる。本発明の実施に適切なその他の採取方法は、2枚刃システム又はスワブを用いた角質層の上部をこすることによる方法であってもよい。
【００２３】
好ましい一実施形態によれば、試料採取の工程は、皮膚表面をこすることによって、又はD-squame(登録商標)ディスク等の粘着表面の使用によって実施する。用語「対象」は、好ましくは、20歳から90歳、好ましくは30歳から80歳、36歳から75歳、さらにより好ましくは60歳から80歳のヒトを意味する。好ましくは、対象は女性である。好ましくは、対象は、皮膚科学的病変及び/又は皮膚科学的疾患に罹患しておらず、より好ましくは対象はいかなる疾患にも罹患していない。
【００２４】
特定の一実施形態では、工程(b)は得られたIDEをコードする遺伝子の発現レベルを参照値と比較した後で実施する。一実施形態では、参照値は、規定集団、例えば、規定の年齢群、及び/又は規定の皮膚型(コーカサス人、アジア人等、又は、脂性傾向の皮膚、乾燥した皮膚若しくはフィッツパトリック分類によって規定された特定の表現型を有する皮膚)を有する集団におけるIDEをコードする遺伝子の発現レベルの平均値によって判定することができる。好ましくは、参照値は、コーカサス人、及び/又はフィッツパトリック分類によって表現型II若しくはIIIを有する集団におけるIDEをコードする遺伝子の発現レベルの平均値によって判定される。
【００２５】
特定の一実施形態では、参照値は、30歳から80歳、36歳から75歳、さらにより好ましくは60歳から80歳の年齢の女性におけるIDEをコードする遺伝子の発現レベルの平均値によって判定する。特定の一実施形態では、参照値は9.0から13.0ng/mlの間のIDEタンパク質であり、より好ましくは参照値は9.35から12.65ng/mlの間のIDEタンパク質である。別の実施形態では、参照値はROC分析によって判定された最適な閾値である。本発明では、参照値は、複数の試料、好ましくは50、100、200、300又は500より多い試料によって判定することができる。
【００２６】
用語「比較」とは、IDEをコードする遺伝子の発現レベルが基本的に参照値と同一であるか、又は参照値とは異なるのかを判定する事実を意味する。好ましくは、IDEをコードする遺伝子の発現レベルは、観察された差が統計学的に有意であれば、参照値とは異なると考えられる。差が統計学的に有意でなければ、IDEをコードする遺伝子の発現レベル及び参照値は基本的に同一である。
【００２７】
この比較に基づいて、皮膚が老化の徴候を表すかどうかを判定することが可能である。典型的に、皮膚は、IDEをコードする遺伝子の発現レベルが参照値よりも有意に低いとき、老化の徴候を表していると考えられ、皮膚は、IDEをコードする遺伝子の発現レベルが参照値と基本的に同一であるか、又は参照値よりも有意に大きいとき、老化の徴候を示していないと考えられる。
【００２８】
用語「皮膚の老化の徴候の進行を低減及び/又は遅延させるのに適切な化粧品組成物」は、皮膚の著しいマイクロレリーフ、細かい線条、皺の出現及び弾力性の低下等、特に、エラスターゼ、目尻の皺の出現及び目の下の皺の出現等の皮膚の老化の徴候の進行を低減及び/又は遅延させるのに適切な、当業者に公知の任意の化粧品組成物を意味する。
【００２９】
本発明はまた、皮膚の老化の徴候の進行を低減及び/又は遅延させるのに適切な化合物を同定する方法であって、
a)候補化合物に曝露した皮膚試料においてIDEをコードする遺伝子の発現レベルを測定する工程、
b)前記発現レベルを前記化合物に曝露していない前記皮膚の試料における発現レベルと比較する工程、
c)候補化合物に曝露していない皮膚試料におけるIDEをコードする遺伝子の発現レベルに対して、前記候補化合物に曝露した皮膚試料におけるIDEをコードする遺伝子の発現レベルの増加が検出されたとき、前記候補化合物を皮膚の老化の徴候の進行を低減及び/又は遅延させるのに適切な化合物として同定する工程
を含む方法に関する。
【００３０】
好ましい一実施形態によれば、本発明による皮膚の老化の徴候の進行を低減及び/又は遅延させるのに適切な化合物を同定する方法において使用した皮膚試料は、皮膚細胞培養物、表皮培養物、再構築された全皮膚、ヒト皮膚移植片又は前記で規定した対象の皮膚試料である。
【００３１】
好ましくは、本発明による方法は、IDEをコードする遺伝子の発現レベルの測定の準備をするために、試料を処置する工程を含む。例えば、処置した試料は、可溶性タンパク質抽出物である。特に、皮膚試料が非侵襲的方法によって、特に、D-squame(登録商標)ディスク等の粘着表面を使用して角質層のテープストリッピングによって採取して得られた場合、可溶性タンパク質抽出物は、D-squame試料を最小量の抽出緩衝液と接触させ、それによって可溶性タンパク質抽出物を得るために適切である国際出願公開第2015/009085号パンフレットに記載されたもの等のタンパク質抽出系を使用して得ることができる。
【００３２】
本発明はまた、
a)皮膚試料においてIDEをコードする遺伝子の発現レベルを測定する手段、及び
b)使用説明書
を含むキットに関する。
【００３３】
用語「IDEをコードする遺伝子の発現を測定する手段」とは、例えば、IEDタンパク質に特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体、Fab断片、scFv若しくはナノボディ等のIDEタンパク質の特異的リガンド、又は国際出願公開第2011/126249号パンフレットに記載されたもの等のマイクロ流体チップであって、IDEタンパク質の特異的リガンドを含有するチップを意味する。或いは、IDEをコードする遺伝子のmRNAと特異的にハイブリダイズするIDEをコードする遺伝子のmRNAの相補的ヌクレオチド配列、又はIDEをコードする遺伝子のmRNAと特異的にハイブリダイズするそれらの断片であって、5個から50個のヌクレオチド、好ましくは10個から20個のヌクレオチドを含む配列若しくはその断片、又は前記配列若しくは前記断片を含む10個から60個のヌクレオチド、好ましくは15個から30個のヌクレオチドのプライマー対又はプローブを意味する。
【００３４】
一実施形態によれば、本発明によるキットはまた、IDEをコードする遺伝子の発現の標準的範囲を含む。
【００３５】
一実施形態によれば、本発明によるキットはまた、D-squame(登録商標)ディスク又は3M社製のBlenderm(登録商標)等の粘着表面、前述のシアノアクリル酸接着剤又はワニス、仏国特許出願公開第2667778号に記載されたような羽タービン型若しくはスパイラルセル型の付属物、2枚刃システム若しくはスワブ等の皮膚試料を採取するための手段を含む。好ましくは、皮膚試料を採取する手段は、D-squame(登録商標)ディスク又は3M社製のBlenderm(登録商標)、前述のシアノアクリル酸接着剤又はワニス等の粘着表面である。
【００３６】
本発明はさらに、皮膚の老化の徴候の進行を低減及び/又は遅延させるのに適切な化合物を同定するための本発明によるキットの使用に関する。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
本発明は、以下の実施例によって例示される。
【実施例】
【００３８】
目尻の皺、目の下の皺及び弾力線維症は、36歳から75歳の女性376人の目及び顔全体について評価した。IDEをコードする遺伝子のタンパク質発現レベルはまた、これらの女性の頬を、D-squame試料を用いて、可溶性タンパク質抽出物をチップで実施するELISA検査を使用する分析によって評価した。
【００３９】
老化の徴候を明確に区別した後、得られた結果の統計学的解析は、これらの老化の徴候の存在とIDEの発現レベルとの間の相関を示した。
【００４０】
【表１】
2020531027.tif 000002
【００４１】
統計学的解析は、IDEの濃度と以下の老化の徴候:1-目尻の皺、2-目の下の皺、及び3-弾力線維症との間の関連性、p値<0.001(ロジスティック回帰モデルによる)を示す。したがって、IDEをコードする遺伝子の発現レベルの減少は、老化の徴候、特に弾力線維症の出現、目尻の皺の出現及び目の下の皺の出現に特徴的である。結果の解析によってさらに、9.35から12.65ng/mlの間の閾値を規定することが可能で、したがってこの閾値は参照値として使用することができた。
【００４２】
いくつかの統計学的方法を使用して、特に、AUCを判定することによって、IDE濃度でこれらの臨床徴候の1変量予測モデルの性能を評価した。
【国際調査報告】
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2020531027.tif 000005