(57)【要約】  本明細書中開示されるのは、１種以上の分子誘導システム（ＭＧＳ）ペプチド及び細胞傷害剤を含む組成物である。同じく本明細書中記載されるのは、本組成物を、がん患者に投与する方法である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種以上の分子誘導システム（ＭＧＳ）ペプチド及び細胞傷害剤を含む、組成物。
【請求項２】
前記１種以上のＭＧＳペプチドは、配列番号１、２、３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記１種以上のＭＧＳペプチドは、配列番号１、２、３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、または８４を含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記細胞傷害剤は、サポリンまたはその生物学的活性変異体である、請求項１から３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記１種以上のＭＧＳペプチドは、配列番号３であり、前記細胞傷害剤は、サポリンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記１種以上は、４つのＭＧＳペプチドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記１種以上のＭＧＳペプチドは、四量体足場タンパク質を形成する、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記１種以上のＭＧＳペプチドは、Ｎ末端がアセチル化されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記１種以上のＭＧＳペプチドは、前記細胞傷害剤と化学結合している、請求項１から８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
化学結合は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ＰＥＧは、長さが１１単位である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記１種以上のＭＧＳタンパク質は、配列番号３を含み、配列番号３は、Ｎ末端がアセチル化されており、かつＰＥＧと化学結合しており；かつ、前記細胞傷害剤は、サポリンであり、前記サポリンは、ＰＥＧと共有結合している、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
脂質膜を横断する輸送用の膜透過性複合体であり、１種以上の分子誘導システム（ＭＧＳ）ペプチド及び細胞傷害剤を含む、前記複合体。
【請求項１４】
前記１種以上のＭＧＳペプチドは、配列番号１、２、３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１３に記載の複合体。
【請求項１５】
前記１種以上のＭＧＳペプチドは、配列番号１、２、３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、または８４を含む、請求項１３または１４に記載の複合体
【請求項１６】
前記細胞傷害剤は、サポリンまたはその生物学的活性変異体である、請求項１３から１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記１種以上のＭＧＳペプチドは、配列番号３であり、前記細胞傷害剤は、サポリンである、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１８】
前記１種以上のＭＧＳペプチドは、４つのＭＧＳペプチドである、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１９】
前記１種以上のＭＧＳペプチドは、四量体足場タンパク質を形成する、請求項１３に記載の組成物。
【請求項２０】
前記１種以上のＭＧＳペプチドは、Ｎ末端がアセチル化されている、請求項１３に記載の組成物。
【請求項２１】
前記１種以上のＭＧＳペプチドは、前記細胞傷害剤と化学結合している、請求項１３から２０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
化学結合は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記ＰＥＧは、長さが１１単位である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記１種以上のＭＧＳタンパク質は、配列番号３を含み、配列番号３は、Ｎ末端がアセチル化されており、かつＰＥＧと化学結合しており；かつ、前記細胞傷害剤は、サポリンであり、前記サポリンは、ＰＥＧと共有結合している、請求項１３に記載の組成物。
【請求項２５】
請求項１に記載の組成物及び薬学上許容されるキャリアを含む、医薬組成物。
【請求項２６】
前記医薬組成物は、静脈内投与用に製剤化されている、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
がんを治療するための方法であって、（ａ）治療の必要がある患者を同定すること；（ｂ）前記患者に、治療上有効量の請求項１から２７のいずれか１項に記載の組成物を投与すること；及び（ｃ）薬学上許容されるキャリア、を含む、前記方法。
【請求項２８】
前記患者は、ヒト患者である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記がんは、原発性、続発性、難治性、または再発腫瘍である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記がんは、肺癌、乳癌、結腸直腸癌、卵巣癌、または膵癌である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
さらに、前記患者に、治療上有効量の放射線療法、免疫療法、または化学療法、あるいはそれらの組み合わせを行うことを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
細胞内標的を標的とする方法であって、細胞傷害剤と結合した１種以上のＭＧＳペプチドを投与することを含み、前記細胞傷害剤は、細胞内標的を標的とする、前記方法。
【請求項３３】
前記細胞内標的は、リソソームである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
１種以上の分子誘導システム（ＭＧＳ）ペプチド及び細胞傷害剤を含む組成物であって、前記１種以上のＭＧＳペプチドは、表１に列挙される群から選択される、前記組成物。
【請求項３５】
本明細書中開示されるとおりのＭＧＳペプチド。
【請求項３６】
本明細書中開示されるＭＧＳペプチドをコードすることができる、核酸配列。
【請求項３７】
請求項３６に記載の核酸配列を含む、ベクター。
【請求項３８】
請求項３４に記載のＭＧＳペプチド、請求項３６に記載の核酸配列、または請求項３７に記載のベクターを含む、細胞株。
【請求項３９】
配列番号１、２、３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、または８４の配列を含む、ＭＧＳペプチド。
【請求項４０】
請求項３９に記載のＭＧＳペプチドをコードすることができる核酸配列。
【請求項４１】
請求項４０に記載の核酸配列を含む、ベクター。
【請求項４２】
請求項３９に記載のＭＧＳペプチド、請求項４０に記載の核酸配列、または請求項４１に記載のベクターを含む、細胞株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府資金に関する記載
本発明は、米国保険福祉省の国立がん研究所により授与された助成金番号第７Ｒ０１ＣＡ１６４４４７−０４号の下、国からの支援によりなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
アメリカがん協会は、今年、米国において新たに１６０万を超える症例ががんと診断され、６００，０００人近くががんを理由に亡くなると推定している。社会にかかる負担は膨大である。ＮＩＨは、がんにより年間＄２１６６億の負担が生じると推定しており、そのうちの＄８９０億は、直接医療費である。大部分のがんの第一選択処置は、依然として、細胞傷害剤治療に依存している。これらの治療は、活発な分裂細胞を必要とし、有害副作用をもたらす。治療は、典型的には、最大有効量ではなく最大耐量で与えられる。また、これらの治療は、無活動がん細胞、幹細胞、または不十分に分化したがん細胞では無効である。なぜなら、それらは活発に分裂していないからである。その結果、再発を招く。腫瘍バイオマーカーに対してより特異性の高い標的指向性治療のほとんどは、細胞傷害剤ではなく細胞分裂阻害剤である。したがって、それらは、腫瘍の成長を遅くする可能性があるが、腫瘍を治癒させはしない。最後に、標的指向性及び非標的指向性治療両方に対する抵抗性は、臨床的に実在する。したがって、最小限の副作用しかない新規特異的細胞傷害剤治療が必要とされている。
【発明の概要】
【０００３】
サポリンは、細胞進入ドメインを持たないリボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ、３４ＫＤ）である。細胞への進入機構を考慮すると、サポリンは、リボソームの巨大サブユニットのリボソームＲＮＡから単一アデニンを触媒作用により除去し、リボソームを完全に不活性化する。そのため、もしサポリンを細胞内側に送達することができれば、それは、細胞を迅速に殺傷する強力な毒素となる。本明細書中記載されるのは、１種以上のＭＧＳペプチド及び植物毒素サポリンを含むがん標的治療である。本明細書中記載される組成物は、態様よっては、がん細胞に結合し、組成物ががん細胞に内部移行するのを仲介し、その結果迅速な細胞死をもたらすことを可能にする。ＭＧＳペプチドのがん特異性により、本治療は、正常組織に対して最小限の効果しか有さない。
【０００４】
本明細書中記載される組成物は、融合タンパク質として、すなわち化学結合により、作製することができる。複合体は送達可能であり、ＭＧＳは、サポリンを腫瘍に向かわせて、サポリンが腫瘍細胞に取り込まれるのを仲介し、そこでサポリンはその標的と結合することができる。この化合物は、現行の治療に勝る複数の利点を有する。例えば、態様によっては、開示される組成物は、（１）非常に強力な細胞傷害剤が、細胞内に送達されて、そこで機能を発揮することを可能にする；（２）ＭＧＳは、がん特異的であることが可能であり、他の組織における毒素の取り込みを最小限に抑える；（３）全ての細胞は、分裂細胞でなかったとしても、タンパク質合成に依存しているため、ＭＧＳペプチドサポリン複合体は、一般的な細胞傷害剤に対して抵抗性である細胞に対して有効である可能性がある；（４）抵抗性は、タンパク質としての作用機序による可能性が低く、多剤耐性ポンプは、活性を否定する可能性が低い；ならびに（５）ペプチド標的指向剤(targeting agent)は、小さく、抗体標的指向剤に比べて比較的安価であり、サポリンと複合体形成することができる。
【０００５】
本明細書中開示されるのは、１種以上の分子誘導システム(molecular guidance system)（ＭＧＳ）ペプチド及び細胞傷害剤(cytotoxic agent)を含む組成物である。
【０００６】
本明細書中開示されるのは、脂質膜を横断する輸送用の膜透過性複合体であり、これは以下を含む：１種以上の分子誘導システム（ＭＧＳ）ペプチド及び細胞傷害剤。
【０００７】
本明細書中開示されるのは、細胞内標的を狙う方法であり、本方法は、細胞傷害剤と複合体形成した１種以上のＭＧＳペプチドを投与することを含み、この細胞傷害剤は、細胞内標的を狙う。
【０００８】
本組成物及び方法の他の特長及び利点は、以下の説明、図面、及び特許請求の範囲にて説明される。
【０００９】
添付の図面は、本明細書に組み込まれてその一部を構成するものであり、開示される方法及び組成物の複数の実施形態を例示するとともに、説明と合わせて、開示される方法及び組成物の原則を説明する働きをする。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ＨＣＣ１５．２が、がん細胞に特異的であり、がん細胞内へと内部移行することを示す。
【図２】ＨＣＣ１５．２が、ＮＳＣＬＣの全てのサブタイプに結合することを示す。
【図３】ペプチド内部移行が受容体介在型であることを示す。
【図４】配列番号１の四量体化が、配列番号１の単量体に比べて、内部移行を顕著に改善することはないことを示す。
【図５】Ｎ末端及びＣ末端での切断が最小結合配列（ＦＨＡＶＰＱＳＦＹＴＡＰ、配列番号１；ＦＨＡＶＰＱＳＦＹＴＡ、配列番号２；及びＦＨＡＶＰＱＳＦＹＴ、配列番号３）を明らかにすることを示す。
【図６】アセチル化が、切断型ペプチド（配列番号３、ＦＨＡＶＰＱＳＦＹＴＡＰ、配列番号１）の結合を改善することを示す。
【図７】ペプチドが、リソソームと共存することを示す。
【図８】ＨＣＣ１５．２が、時間とともに、リソソームに蓄積していくことを示す。
【図９】サポリンと複合体形成したＨＣＣ１５．２のｉｎ  ｖｉｔｒｏ薬物データを示す。
【図１０】ＨＣＣ１５．２サポリン複合体が、ヒトＮＳＣＬＣ異種移植片モデルにおいて腫瘍成長を減少させることを示す。
【図１１】フローサイトメトリー実験から得られた柱状図及び柱状図の定量化を示す。
【図１２】ＨＣＣ１５．２が他のがん細胞株に結合することを示す棒グラフである。
【図１３】ＫＤを測定するためのフローサイトメトリーの結果を示す線グラフである。
【図１４】四量体化が、最大結合半量を顕著に改善することはないことを示す。
【図１５】Ｎ末端及びＣ末端での切断が最小結合配列を明らかにすることを示す。上段パネルは、上から下に向かって、以下の配列を示す：配列番号：１、２、３、７８、及び７９。下段パネルは、上から下に向かって、以下の配列を示す：配列番号：１、２、３、７８、７９、及び８０。
【図１６】ＨＣＣ１５．２が、時間とともにリソソームに蓄積していくことを示す。
【図１７】ＨＣＣ１５．２標的指向化ＮＩＲ色素が、ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍に蓄積することを示す。
【図１８】ＨＣＣ１５．２標的指向化色素が、時間が経過しても腫瘍に保持されることを示す。
【図１９】ｅｘ  ｖｉｖｏで、腫瘍が、ＨＣＣ１５．２標的指向化色素の明白な蓄積を示すことを実証する。
【図２０】臓器のｅｘ  ｖｉｖｏ画像化の結果を示す。
【図２１】ＨＣＣ１５．２がｉｎ  ｖｉｔｒｏでがん細胞を標的としてサポリンを向かわせることを示す。
【図２２】ＨＣＣ１５．２がｉｎ  ｖｉｔｒｏでがん細胞を標的としてサポリンを向かわせることを示すがん細胞殺傷アッセイの例である。
【図２３】サポリンを標的に向かわせるＨＣＣ１５．２が、腫瘍成長を目立って遅くしたことを示す。
【図２４】様々なＭＧＳ、適応症、標的となる細胞型、細胞内位置、及び送達されるペイロードを列挙した表である。
【図２５】選択されたＭＧＳペプチドについて、配列（上から下に向かっての順で：配列番号：２２、３９、４０、２３、４７、２５、２６、２７、２８、及び２９）、細胞内位置、結合価、がん特異性、及び結合プロファイル情報を示す。
【図２６】選択されたＭＧＳペプチドのさらなる特性評価を示す表である。開始配列は、上から下に向かって：配列番号：７、５、３６、３２、及び１。現在の配列は、上から下に向かって：配列番号：８１、８２、８３、８４、及び８０。
【図２７】Ｈ１２９９．３の１５量体とオートファゴソームの共存（上段パネル）、及びｉｎ  ｖｉｖｏで投与後の結果を示す。
【図２８】１２９９．３Ａｃ−１５量体のがん細胞結合を正常細胞結合と比較して示す棒グラフである。
【図２９】他のペプチド（ＨＣＣ１５．２を除き、最適化されていない親ペプチド）を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏでのサポリン送達を示す表である。
【図３０】多量体ＭＧＳペプチドの例及び多量体ＭＧＳペプチド（配列番号２２）を用いた実験結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
開示される方法及び組成物は、特定の実施形態についての以下の詳細な説明及びそこに含まれる実施例を参照することで、ならびに図面及びその前後の説明を参照することで、より容易に理解することができる。
【００１２】
本組成物及び方法を開示し説明する前に、当然のことながら、それらは、特に記載がない限り、具体的な合成法に限定されることもなければ、特に記載がない限り、特定の試薬に限定されることもなく、そうであるので、もちろん変更可能である。同じく当然のことながら、本明細書中使用される用語は、特定の態様を記載することのみを目的とし、限定することを意図しない。本明細書中記載されるものと同様または等価な方法及び材料は、何であっても本発明の実行及び試験に使用可能であるが、例示の方法及び材料を、ここに記載する。
【００１３】
その上、当然のことながら、特に明白に指定されない限り、本明細書中記載されるどの方法であっても、その方法の工程が特定の順序で行われることを必要とすると見なされることは、いかなるやり方でも意図しない。したがって、方法請求項が、その方法の工程が従うべき順序を実際に列挙しない、またはその工程が具体的な順序に限定されることが請求項もしくは明細書中に特に具体的に指定されない場合、あらゆる面において、順序が推測されることをいかなるやり方でも意図しない。これは、表明されていない解釈上の基礎について可能なあらゆるものに当てはまり、そのような基礎として、工程または操作の流れの配置に関する論理事項、文法構成または句読法に由来する明白な意味、及び明細書中に記載される態様の数または種類が含まれる。
【００１４】
本明細書中言及される刊行物は全て、方法及び／または材料を開示または説明するために、その刊行物が引用される内容に関して、本明細書中参照として援用される。本明細書中説明される刊行物は、本出願の出願日前にその開示があったことを提示するにすぎない。本明細書中には、本発明が、先行発明を理由にそのような刊行物に先行すると認められないとすることの承認と見なされるべきものはない。さらに、本明細書中提示される刊行物の日付は、実際の公開日と異なる可能性があり、実際の公開日は、それぞれ確認する必要がある可能性がある。
【００１５】
定義
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈から明白に指定されない限り、複数に関する言及も含む。
【００１６】
「ｏｒ」という語は、本明細書中使用される場合、特定の列挙の中の任意の１メンバーを意味するとともに、その列挙の中の複数のメンバーの任意の組み合わせも含む。すなわち、例えば、「ａ  ＭＧＳ  ｐｅｐｔｉｄｅ（ＭＧＳペプチド）」という言及は、そのようなＭＧＳペプチドが複数の場合も含み、「ｔｈｅ  ＭＧＳ  ｐｅｐｔｉｄｅ（ＭＧＳペプチド）」という言及は、１種以上のＭＧＳペプチド及び当業者に既知であるそれらの等価物についての言及であるといった具合である。
【００１７】
本明細書の説明及び特許請求の範囲全体を通じて、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む）」という語及びその語の変形、例えば「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」及び「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（含む）」は、「〜を含むが、それに限定されない」ことを意味し、例えば、他の追加成分、構成要素、整数、または工程を排除することを意図しない。詳細には、１つ以上の工程または操作を含むと記述された方法において、各工程は、列挙されるものを含む（その工程が、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ（〜からなる）」などの限定用語を含まない限り）ことが具体的に企図され、このことは、各工程が、例えば、工程に列挙されていない他の追加成分、構成要素、整数、または工程を排除することを意図しないことを意味する。
【００１８】
範囲は、本明細書中、「約」または「およそ」の１つの特定値から、及び／または「約」または「およそ」の別の特定値までとして表現することができる。そのような範囲が表現される場合、さらなる態様は、１つの特定値から、及び／または別の特定値までを含む。同様に、「約」または「およそ」の先行詞の使用により、値が近似値として表現される場合、当然のことながら、その特定の値は、さらなる態様を形成する。さらに当然のことながら、各範囲の限度値は、他方の限度値と関連して、及び他方の限度値とは独立して、の両方で意味がある。同じく当然のことながら、本明細書中開示される値は複数存在し、各値も、本明細書中、その特定の値自身の他に「約」特定値として開示されている。例えば、「１０」という値が開示されるならば、「約１０」も開示されている。同じく当然のことながら、２つの特定の単位間の各単位も開示されている。例えば、１０及び１５が開示されるならば、１１、１２、１３、及び１４も開示されている。
【００１９】
本明細書中使用される場合、「任意選択の」または「任意選択で」という用語は、続いて記載される事象または状況が、生じる可能性も生じない可能性もあることを意味し、この記載が、事象または状況が生じる場合も、それが生じない場合も含むことを意味する。
【００２０】
本明細書中使用される場合、「対象」という用語は、投与の標的、例えば、ヒトを示す。すなわち、開示される方法の対象は、脊椎動物、例えば、哺乳類、魚類、鳥類、爬虫類、または両生類などが可能である。「対象」という用語は、家庭用動物（例えば、ネコ、イヌなど）、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）、及び実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、ショウジョウバエなど）も含む。１つの態様において、対象は、哺乳類である。別の態様において、対象は、ヒトである。この用語は、特定の年齢または性別を意味しない。すなわち、成人、子供、青年、及び新生児対象、ならびに胎児を、男性女性を問わず、包含することを意図する。
【００２１】
本明細書中使用される場合、「患者」という用語は、疾患または障害を罹患している対象を示す。「患者」という用語は、ヒト及び獣医学対象を含む。開示される方法の態様によっては、「患者」は、例えば、投与工程の前に、自己免疫障害の治療が必要であると診断されている。
【００２２】
本明細書中使用される場合、「アミノ酸配列」という用語は、アミノ酸残基を表す略号、文字、記号、または単語の列挙を示す。本明細書中使用されるアミノ酸略号は、従来のアミノ酸一文字コードであり、以下のとおり表される：Ａ、アラニン；Ｃ、システイン；Ｄ、アスパラギン酸；Ｅ、グルタミン酸；Ｆ、フェニルアラニン；Ｇ、グリシン；Ｈ、ヒスチジン；Ｉイソロイシン；Ｋ、リシン；Ｌ、ロイシン；Ｍ、メチオニン；Ｎ、アスパラギン；Ｐ、プロリン；Ｑ、グルタミン；Ｒ、アルギニン；Ｓ、セリン；Ｔ、トレオニン；Ｖ、バリン；Ｗ、トリプトファン；Ｙ、チロシン。
【００２３】
「ポリペプチド」は、本明細書中使用される場合、任意のペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、遺伝子産物、発現産物、またはタンパク質を示す。ポリペプチドは、連続したアミノ酸で構成される。「ポリペプチド」という用語は、天然または合成分子を包含する。
【００２４】
また、本明細書中使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合または修飾ペプチド結合、例えば、ペプチドイソスターなどにより互いに結合したアミノ酸を示し、この用語は、遺伝子にコードされたアミノ酸２０種以外の修飾アミノ酸を含有することができる。ポリペプチドは、天然のプロセス、例えば、翻訳後プロセシングによるか、または当該分野で周知である化学修飾技法によるなど、いずれかにより修飾可能である。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、及びアミノ末端またはカルボキシル末端をはじめとするポリペプチドのどの部分でも生じることが可能である。同種の修飾が、所定のポリペプチド中、複数部位において、同一または異なる度合いで存在することが可能である。同じく、所定のポリペプチドは、多種の修飾を有することが可能である。修飾として、特に制限なく、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、共有結合による架橋または環化、フラビンの共有結合付加、ヘム部分の共有結合付加、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合付加、脂質または脂質誘導体の共有結合付加、ホスファチジルイノシトールの共有結合付加、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、システインまたはピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレン酸化、硫酸化、及びアルギニル化などのタンパク質へのｔ−ＲＮＡ介在型アミノ酸付加が挙げられる。（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  −  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ２ｎｄ  Ｅｄ．，  Ｔ．  Ｅ．  Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，  Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９３）；Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ｂ．  Ｃ．  Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ｅｄ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐｐ．  １−１２  （１９８３）を参照）。
【００２５】
「核酸」という語句は、本明細書中使用される場合、ＤＮＡかＲＮＡかＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドか、一本鎖か二本鎖か、センスかアンチセンスかに関わらず、ワトソンクリック塩基対形成により相補的核酸とハイブリダイズすることができる、天然または合成のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを示す。本発明の核酸は、ヌクレオチド類似体（例えば、ＢｒｄＵ）、及び非ホスホジエステルヌクレオシド間結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはチオジエステル結合）も含むことができる。詳細には、核酸として、特に制限なく、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｇＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせを挙げることができる。
【００２６】
本明細書中使用される場合、「試料」は、動物；動物の組織または臓器；細胞（対象内部にあるもの、対象から直接採取されたもの、または培養で維持されている細胞もしくは培養細胞系統由来のものいずれか）；細胞溶解液（または溶解液画分）または細胞抽出物；あるいは本明細書中記載されるとおりにアッセイされる、細胞または細胞材料に由来する１種以上の分子（例えば、ポリペプチドまたは核酸）を含有する溶液を意味するものとする。試料は、細胞または細胞構成要素を含有する任意の体液または排泄物（例えば、血液、尿、便、唾液、涙、胆汁などであるが、これらに限定されない）も可能である。
【００２７】
本明細書中使用される場合、「調節する」は、増加または減少させることにより、変更することを意味する。
【００２８】
本明細書中使用される場合、化合物の「有効量」は、所望の効果を提供するのに十分な化合物量を意味するものとする。正確な必要量は、種、年齢、及び対象の全般的な状態、治療されている疾患の重篤度（またはその根底にある遺伝的欠陥）、使用される特定化合物、その投与様式などに依存して、対象ごとに変化することになる。すなわち、正確な「有効量」を指定することは不可能である。しかしながら、適切な「有効量」は、定法実験にすぎないものを用いて、当業者により決定することができる。
【００２９】
本明細書中使用される場合、「単離ポリペプチド」または「精製ポリペプチド」は、自然ではポリペプチドに通常付随する材料を実質的に含まないポリペプチド（またはその断片）を意味するものとする。本発明のポリペプチド、またはその断片は、例えば、天然源（例えば、哺乳類細胞）からの抽出により、ポリペプチドをコードする組換え核酸の発現（例えば、細胞中または無細胞翻訳系中）により、またはポリペプチドの化学合成により、得ることができる。また、ポリペプチド断片は、これらの方法のいずれかにより、または全長タンパク質及び／またはポリペプチドの切断により得ることができる。
【００３０】
本明細書中使用される場合、「単離核酸」または「精製核酸」は、本発明のＤＮＡの由来元となる生物の天然ゲノム中、その遺伝子に隣接する遺伝子を含まないＤＮＡを意味するものとする。したがって、この用語は、例えば、ベクターに組み込まれた組換えＤＮＡ、例えば、自己複製プラスミドもしくはウイルスなど；または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれたもの（例えば、導入遺伝子）；または分離した分子として存在するもの（例えば、ＰＣＲ、制限エンドヌクレアーゼ消化、または化学もしくはｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成により生成されたｃＤＮＡまたはゲノムもしくはｃＤＮＡ断片）を含む。この用語は、追加のポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡも含む。「単離核酸」という用語は、ＲＮＡ、例えば、単離ＤＮＡ分子によりコードされるｍＲＮＡ分子、または化学合成されたｍＲＮＡ分子、あるいは少なくともある種の細胞成分、例えば、他の種類のＲＮＡ分子またはポリペプチド分子から分離されたまたはそれらを実質的に含まないｍＲＮＡ分子も示す。
【００３１】
本明細書中使用される場合、「治療する」は、がんを有する対象、例えば、ヒトまたは他の哺乳類（例えば、動物モデル）に、疾患または症状の影響の悪化を防ぐまたは遅らせる、あるいは疾患の影響を部分的または完全に反転させる目的で、本発明の化合物または分子を投与することを意味するものとする。
【００３２】
本明細書中使用される場合、「予防する」は、がんを発症する易罹患性が高い対象においてがんが発症する機会を最小限に抑えることを意味する。
【００３３】
本明細書中使用される場合、「特異的に結合する」は、抗体が、その同族抗原または標的（例えば、開示される合成ＭＧＳ配列）を認識してそれと物理的に相互作用するが、他の抗原または標的に対しては特に認識も相互作用もしないことを意味する；そのような抗体は、ポリクローナル抗体の場合もモノクローナル抗体の場合もあり、それらは、当該分野で周知である技法により生成される。
【００３４】
本明細書中使用される場合、「プローブ」、「プライマー」、または「オリゴヌクレオチド」は、相補配列（「標的」）を含有する第二のＤＮＡまたはＲＮＡ分子と塩基対形成することができる、定義された配列の一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を意味するものとする。得られるハイブリッドの安定性は、生じる塩基対形成の程度に依存する。塩基対形成の程度は、プローブ分子と標的分子の間の相補性度、及びハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーの度合いなどのパラメーターに影響を受ける。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーの度合いは、温度、塩濃度、及びホルムアミドなどの有機分子の濃度などのパラメーターに影響を受け、当業者に既知の方法により決定される。開示されるＭＧＳ配列をコードすることができる核酸（例えば、遺伝子及び／またはｍＲＮＡ）に特異的なプローブまたはプライマーは、それらがハイブリダイズする相手である開示されたＭＧＳ配列をコードすることができる核酸の領域と、少なくとも８０％〜９０％配列相補性、好ましくは少なくとも９１％〜９５％配列相補性、より好ましくは少なくとも９６％〜９９％配列相補性、特に好ましくは１００％配列相補性を有する。プローブ、プライマー、及びオリゴヌクレオチドは、当業者に周知の方法により、放射性または非放射性の標識で検出可能に標識化することができる。プローブ、プライマー、及びオリゴヌクレオチドは、核酸ハイブリダイゼーションが関与する方法に使用され、そのような方法として、以下：核酸配列決定、ポリメラーゼ連鎖反応法による逆転写及び／または核酸増幅、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）分析、制限酵素断片多型（ＲＦＬＰ）分析、サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、電気泳動移動度シフト解析（ＥＭＳＡ）がある。
【００３５】
本明細書中使用される場合、「特異的にハイブリダイズする」は、プローブ、プライマー、またはオリゴヌクレオチドが、高ストリンジェント条件下で、実質的に相補的な核酸（例えば、開示されるＭＧＳ配列をコードすることができる核酸）を認識しこれと物理的に相互作用する（すなわち、塩基対形成する）が、他の核酸とは実質的に塩基対形成しないことを意味するものとする。
【００３６】
本明細書中使用される場合、「高ストリンジェント条件」は、０．５ＭのＮａＨＰＯ4（ｐＨ７．２）、７％ＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ、及び１％ＢＳＡ（画分Ｖ）を含有する緩衝液中、温度６５℃で、または４８％ホルムアミド、４．８×ＳＳＣ、０．２Ｍのトリス−Ｃｌ（ｐＨ７．６）、１×デンハート液、１０％デキストラン硫酸塩、及び０．１％ＳＤＳを含有する緩衝液中、温度４２℃で、長さ少なくとも４０ヌクレオチドのＤＮＡプローブを使用して生じるハイブリダイゼーションと互角のハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。高ストリンジェントなハイブリダイゼーションの他の条件、例えば、ＰＣＲ用、ノーザン、サザン、もしくはｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用、ＤＮＡ配列決定用などのものは、分子生物学の当業者に周知である。（例えば、Ｆ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ，  １９９８を参照）。
【００３７】
特に定義されない限り、本明細書中使用される全ての技術用語及び科学用語は、開示される方法及び組成物が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中記載されるものと同様または等価な任意の方法及び材料を、本方法及び組成物の実行または試験に使用することが可能であるものの、特に有用な方法、装置、及び材料は、記載されるとおりである。本明細書中引用される刊行物及びそれらが引用される理由である材料は、本明細書により参照として具体的に援用される。本明細書中には、本発明が、先行発明を理由にそのような刊行物に先行すると認められないとすることの承認と見なされるべきものはない。どの参照も、先行技術を構成することの承認とはならない。参照文献の説明は、それらの著者が何を主張しているかを記述するものであり、出願人は、引用される文書の正確性及び適切性に異議を申し立てる権利を有する。明らかに当然のことながら、複数の刊行物が本明細書中言及されるものの、そのような言及は、それら文書のいずれかが、当該分野に共通する一般認識の一部を形成することの承認を構成しない。
【００３８】
開示されるのは、開示される組成物を調製するのに使用される構成要素、ならびに本明細書中開示される方法内で使用される組成物自身である。これら及び他の材料が本明細書中開示されるが、当然のことながら、これら材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、グループなどが開示される場合、これら化合物の様々な組み合わせ及び配列それぞれの個別及びまとめての具体的言及は明白に開示されないとしても、それぞれが、具体的に企図されており、本明細書中記載されている。すなわち、分子Ａ、Ｂ、及びＣからなるあるクラス、ならびに分子Ｄ、Ｅ、及びＦからなるあるクラスが開示され、例として分子Ａ−Ｄの組み合わせが開示される場合、たとえそれぞれが個別に言及されないとしても、組み合わせ、Ａ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−Ｅ、及びＣ−Ｆが開示されているとみなされるという意味が、個別に及び総合的に企図される。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせも開示されている。すなわち、例えば、Ａ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、及びＣ−Ｅのサブグループは、開示されているとみなされるだろう。この概念は、本出願の全ての態様に当てはまり、態様として、開示される組成物の作製法及び使用法における工程が含まれるが、これに限定されない。すなわち、実行可能な様々な追加工程が存在する場合、当然ながらそれら追加工程のそれぞれは、開示される方法の任意の特定実施形態または実施形態の組み合わせにおいて実行可能である。
【００３９】
同じく開示されるのは、開示される組成物の調製に使用されることになる構成要素、ならびに本明細書中開示される方法内で使用されることになる組成物自身である。これら及び他の材料が本明細書中開示されるが、当然のことながら、これら材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、グループなどが開示される場合、これら化合物の様々な組み合わせ及び配列それぞれの個別及びまとめての具体的言及は明白に開示されないとしても、それぞれが、具体的に企図されており、本明細書中記載されている。
【００４０】
本明細書中開示されるのは、がん標的治療であり、本治療は、植物トキシンであるサポリンと複合体形成したペプチド配列ＦＨＡＶＰＱＳＦＹＴ（配列番号３）を含むペプチド複合体を含む。サポリンは、細胞進入ドメインを持たないリボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ、３４ＫＤ）である。細胞への進入機構を考慮すると、サポリンは、リボソームの巨大サブユニットのリボソームＲＮＡから単一アデニンを触媒作用により除去し、リボソームを不活性化する。そのため、もしサポリンを細胞内側に送達することができれば、それは、細胞を迅速に殺傷する強力な毒素となる。本明細書中記載されるとおり、この課題は、がん細胞に対して選択的であり、がん細胞に結合して、毒素ががん細胞に内部移行するのを仲介し、その結果迅速な細胞死をもたらすペプチドとサポリンを複合体形成させることにより解決することができる。本明細書中開示されるＭＧＳペプチド複合体のがん特異性により、本治療は、正常組織に対して最小限の効果しか有さない。
【００４１】
本明細書中開示されるのは、肺癌、乳癌、結腸直腸癌、卵巣癌、及び膵癌に適用される抗がん療法である。本明細書中開示される化合物、組成物、またはペプチド複合体は、細胞腫の治療に広い用途を有する可能性がある標的指向化細胞傷害剤治療である。
【００４２】
本明細書中開示される組成物または複合体（例えば、ＭＧＳペプチドサポリン複合体）は、融合タンパク質として、すなわち化学結合により、作製可能である。複合体は送達可能であり、ＭＧＳペプチドは、毒素（例えば、サポリン）を腫瘍またはがん細胞に向かわせて、サポリンが腫瘍細胞に取り込まれるのを仲介し、そこでサポリンはその標的と結合することができる。
【００４３】
本明細書中開示される組成物の送達は、例えば、１種以上の分子誘導システム（ＭＧＳ）ペプチドがサポリンとカップリングまたは複合体形成している場合に、正常細胞へのサポリン取り込みを回避または最小限に抑えながら、がん細胞を標的として、サポリンを、がん細胞に対して特異的に送達することを可能にする。本明細書中開示されるＭＧＳペプチドは、上皮由来癌のサブセットに低ナノモル親和性を有する。これらのＭＧＳペプチドは小さいため、容易にサポリンと複合体形成させるまたは融合タンパク質として発現させることができる。米国では１年あたり約１６０万の新規診断及びほぼ６００，０００人の死亡がある結果、年間の医療費負担は約＄８９０億になるが、本明細書中開示される複合体は、現行のがん治療の限界を克服する可能性がある新規細胞腫治療を提供する。
【００４４】
ペプチドＨＣＣ１５．２は、１つ以上のアミノ酸の除去により切断することができる。さらに、ＰＥＧリンカーを単量体ペプチドに付加させることができ、アミノ末端をアセチル化することができる。
【００４５】
組成物
ＭＧＳペプチド。本明細書中開示されるのは、分子誘導システムペプチド（ＭＧＳ）または腫瘍標的指向性ペプチドである。これらのペプチドは、悪性腫瘍を含む腫瘍に選択的に結合することができる。開示される組成物で使用可能または修飾可能なＭＧＳペプチドの例として、ＭｃＧｕｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．  ２０１４  Ｍａｒ  ２７；４：４４８０に開示されるＭＧＳペプチドの１種以上が挙げられるが、これらに限定されない。開示される組成物及び方法で同じく使用可能なＭＧＳペプチドの例として、表１ならびに図２４及び図２５に示されるＭＧＳ配列が挙げられるが、これらに限定されない。
表１．ペプチド配列
【表１】
2020527556.tif 000003
2020527556.tif 000004
2020527556.tif 000005
【００４６】
ある態様において、組成物は、１種以上の分子誘導システム（ＭＧＳ）ペプチド及び細胞傷害剤を含む。ある態様において、脂質膜を横断する輸送用の膜透過性複合体は、１種以上の分子誘導システム（ＭＧＳ）ペプチド及び細胞傷害剤を含むことができる。
【００４７】
ある態様において、１種以上のＭＧＳペプチドは、本明細書中開示されるＭＧＳペプチドの任意のものが可能である。ある態様において、１種以上のＭＧＳペプチドは、配列番号１、２、３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、または８４、あるいはそれらの組み合わせを含む。ある態様において、１種以上のＭＧＳペプチドは、配列番号：１、２、または３を含む。ある態様において、細胞傷害剤は、サポリンまたはその生物学的活性変異体が可能である。ある態様において、１種以上のＭＧＳペプチドは、配列番号３が可能であり、細胞傷害剤は、サポリンが可能である。ある態様において、組成物は、１種以上のＭＧＳペプチドを含むことができ、例えば、態様によっては、組成物は、１、２、３、４、または５種のＭＧＳペプチドを含むことができる。ある態様において、１種以上のＭＧＳペプチドは、四量体足場タンパク質を形成することができる。ある態様において、本明細書中開示される１種以上のＭＧＳペプチドは、切断することができる。ある態様において、１種以上のＭＧＳペプチドは、修飾することができる。ある態様において、１種以上のＭＧＳペプチドは、Ｎ末端でアセチル化することができる。図２６は、選択されたＭＧＳペプチドの例を提示し、これはさらに特性決定されている。ある態様において、１種以上のＭＧＳペプチドは、細胞傷害剤と化学結合することができる。ある態様において、化学結合は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が可能である。ある態様において、ＰＥＧ単位の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、またはそれ以上が可能である。態様において、ＰＥＧ単位の数は、１種以上のＭＧＳペプチドを細胞傷害剤から離して、１種以上のＭＧＳペプチドと細胞傷害剤の間のあらゆる静的相互作用を防ぐのに十分なものが可能である。例えば、本明細書中開示されるのは、化学結合を含む組成物であり、この化学結合はＰＥＧであり、ＰＥＧは１１のＰＥＧ単位を含む。ある態様において、１種以上のＭＧＳペプチドは、配列番号３を含み、配列番号３は、Ｎ末端でアセチル化することができ、ＰＥＧと化学結合することができ；及び、細胞傷害剤は、サポリンが可能であり、サポリンはＰＥＧと化学結合することができる。
【００４８】
細胞傷害剤。多種多様な毒性（例えば、細胞障害性）作用剤を、開示される組成物に含ませることができる。細胞傷害剤は、本明細書中開示される１種以上のＭＧＳペプチドと共有結合を形成するまたは融合タンパク質を形成することができる。細胞傷害剤は、タンパク質が可能である。ある態様において、細胞傷害剤は、細菌または植物毒素が可能である。態様によっては、細胞傷害剤は、植物毒素が可能である。ある態様において、細胞傷害剤は、サポリンまたはその生物学的変異体が可能である。細胞傷害剤は、修飾可能である。ある態様において、細胞傷害剤は、細菌または植物毒素の断片である。
【００４９】
複合体または融合タンパク質の作製法は、当業者に既知であり、既知の技法を用いて実行することができる。ある態様において、ＭＧＳペプチドは、ポリエチレングリコールを用いて細胞傷害剤（例えば、サポリン）と複合体形成させる。最適なＰＥＧ単位を用いて本明細書中開示されるＭＧＳペプチドを化学結合させることは、当業者の能力の範囲内にある。
【００５０】
標識。同じく本明細書中記載されるのは、１種以上の分子誘導システム（ＭＧＳ）ペプチド及び標識を含む組成物である。例えば、本明細書中開示される組成物は、検出可能な標識を含むことができる。そのような検出可能な標識として、発現したポリペプチドまたは配列の検出（例えば、精製または局所化）用に設計されたタグ配列を挙げることができるが、これらに限定されない。タグ配列として、例えば、緑色蛍光タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ポリヒスチジン、ｃ−ｍｙｃ、ヘマグルチニン、またはＦｌａｇ（商標）タグが挙げられ、これらは、コードされた核酸に融合させることができる。そのような検出可能な標識として、蛍光作用剤、酵素標識、放射性同位体を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００５１】
医薬組成物
本明細書中開示されるのは、１種以上の本明細書中開示される組成物及び上記の医薬的に許容されるキャリアを含む医薬組成物である。態様によっては、ＭＳＧペプチドは、配列番号３であることが可能であり、細胞傷害剤は、サポリンまたはその生物学的変異体が可能であり、医薬組成物は、静脈内投与用に製剤化される。本開示の組成物は、治療上有効量の本明細書中記載されるとおりの細胞傷害剤も含有する。組成物は、様々な投与経路のいずれかによる投与用に配合することができ、１種以上の生理学的に許容される賦形剤を含むことができ、賦形剤は、投与経路に応じて変更可能である。本明細書中使用される場合、「賦形剤」という用語は、「キャリア」または「希釈剤」とも称することが可能なものを含め任意の化合物または物質を意味する。医薬的及び生理学的に許容される組成物の調製は、当該分野で日常的に検討されており、したがって、当業者なら、必要であれば、指針として多数の出典を参考にすることができる。
【００５２】
本明細書中開示されるとおりの医薬組成物は、経口または非経口投与用に調製することができる。非経口投与用に調製された医薬組成物として、静脈内（または動脈内）、筋肉内、皮下、腹腔内、経粘膜（例えば、鼻腔内、膣内、もしくは直腸）、または経皮（例えば、外用）投与用に調製されたものが挙げられる。エーロゾル吸入も、融合タンパク質を送達するのに利用可能である。すなわち、組成物は、許容できるキャリアに溶解または分散した融合タンパク質を含む非経口投与用に調製することができ、そのようなキャリアとして、水性キャリア、例えば、水、緩衝化水、生理食塩水、緩衝生理食塩水（例えば、ＰＢＳ）などが挙げられるが、これらに限定されない。含まれる賦形剤の１種以上は、生理学的条件を近似する補助となることができ、例えば、ｐＨ調節及び緩衝剤、浸透圧調節剤、湿潤剤、界面活性剤などである。組成物が固形成分を含む場合（それらが、経口投与用である場合など）、賦形剤の１種以上は、結合剤または充填剤（例えば、錠剤、カプセル剤などの配合用）として作用することができる。組成物が、皮膚または粘膜表面への塗布用に配合される場合、賦形剤の１種以上は、クリーム、軟膏などの配合用の溶媒または乳化剤であることが可能である。
【００５３】
医薬組成物は、滅菌状態である、または従来の滅菌技法により滅菌される、または滅菌ろ過することが可能である。水溶液は、そのまま使用するためにパッケージ化する、または凍結乾燥させることが可能であり、凍結乾燥製剤は、本開示に包含され、これは、投与前に滅菌水性キャリアと混合することができる。医薬組成物のｐＨは、典型的には、３〜１１（例えば、約５〜９）または６〜８（例えば、約７〜８）になる。得られる固形の組成物は、複数の単回用量単位でパッケージ化することが可能であり、各単位は、例えば錠剤またはカプセル剤の密閉されたパッケージ中に、固定量の上記作用剤単数または複数を含有する。固形の組成物は、柔軟な量のための容器、例えば、外用塗布用クリームまたは軟膏に設計された絞り出しチューブ中にパッケージ化することもできる。
【００５４】
治療方法
本明細書中開示されるのは、がん患者の治療法であり、本方法は以下を含む：（ａ）治療の必要がある対象を同定すること；及び（ｂ）対象に、１種以上の分子誘導システム（ＭＧＳ）ペプチド及び細胞傷害剤、ならびに薬学上許容されるキャリアを含む治療上有効量の医薬組成物を投与すること。ＭＧＳペプチドは、本明細書中開示されるＭＧＳペプチドのどれでも可能である。細胞傷害剤は、サポリンまたはその生物学的変異体が可能である。
【００５５】
本明細書中開示されるのは、細胞内標的を狙う方法である。本方法は、細胞傷害剤と複合体形成した１種以上のＭＧＳペプチドを投与することを含むことができる。細胞傷害剤は、細胞内標的を狙うことができる。ある態様において、細胞内標的は、リソソーム、ゴルジ装置、小胞体、細胞質、または核が可能である。
【００５６】
ある態様において、当業者なら、細胞内標的が不活性化され得るような細胞内標的への指向化を誘導するように、開示される組成物または開示される融合タンパク質または開示される融合タンパク質に有効な用量、有効なスケジュール、または有効な投与経路を決定することができる。
【００５７】
本明細書中開示される方法のいずれかについてのある態様において、本明細書中記載される組成物、複合体、または融合タンパク質は、１種以上のさらなる治療と併用することができる。ある態様において、組成物、複合体、または融合タンパク質は、単独で、または他の生物学的活性作用剤と組み合わせて、対象に投与するのに適した組成物に含ませて投与することができる。ある態様において、本明細書中開示される、がんを有する対象またはがんを発症するリスクがある対象の治療に関する方法、組成物、複合体、または融合タンパク質は、例えば、治療上有効量の放射線療法、免疫療法、または化学療法、あるいはそれらの組み合わせと併用することができる。併用療法は、合剤（ｃｏ−ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）として、または別々に投与することができる。別々に投与される場合、併用療法は、同時または順次に投与することができる。配合物は、当該分野の定法を用いて作製することができる。
【００５８】
上記の医薬組成物は、本明細書中開示されるとおりの組成物、複合体、または融合タンパク質を治療上有効量で含むように配合することができる。治療的投与は、予防的使用を包含する。遺伝子検査及び他の診断方法に基づき、医師は、担当する患者の診察において、患者が、１種以上の自己免疫疾患に対して臨床上確定した素因または上昇した易罹患性（場合によっては、大幅に上昇した易罹患性）を有する場合、あるいは患者が、がんに対して臨床上確定した素因または上昇した易罹患性（場合によっては、大幅に上昇した易罹患性）を有する場合に、予防的投与を選択することができる。
【００５９】
本明細書中記載される医薬組成物は、臨床疾患の発症を遅らせる、低減する、または好ましくは防ぐのに十分な量で、対象（例えば、ヒト対象またはヒト患者）に投与することができる。したがって、態様によっては、対象は、ヒト対象である。治療用途において、組成物は、すでに自己免疫疾患であるまたは自己免疫疾患と診断された対象（例えば、ヒト対象）に、兆候もしくは症候を少なくとも部分的に改善する、または症状、その合併症、及びその帰結の症候の進行を阻害（及び好ましくは抑止）するのに十分な量で、投与される。これを達成するのに十分な量が、「治療上有効量」と定義される。医薬組成物の治療上有効量は、治癒を達成するが、その帰結は達成可能な複数の帰結の中の１つにすぎない量であることも可能である。上記のとおり、治療上有効量は、がんの発症または進行を遅らせる、妨害する、もしくは予防する治療を提供する量、または自己免疫疾患もしくは自己免疫疾患の症候を寛解させる量を含む。回復は、治療を受けた個体において加速される可能性がある。
【００６０】
態様によっては、がんは、原発性、続発性、難治性、または再発腫瘍の場合がある。ある態様において、がんは、肺癌、乳癌、結腸直腸癌、卵巣癌、または膵癌の場合がある。
【００６１】
この使用に有効な量は、がんの重篤度ならびに対象の体重及び全般的な状態及び健康に依存する可能性がある。初期投与及びブースター投与に適したレジメンは、初期投与及びそれに続く、時間単位、日数単位、週単位、または月単位で間隔を開けた１回または複数回のその後の投与の繰り返し用量により、代表される。
【００６２】
本明細書中開示される医薬組成物中の複合体または融合タンパク質の合計有効量は、哺乳類に、単回用量として、ボーラスまたは点滴により比較的短期間の時間をかけてのいずれかで投与することができ、あるいは複数用量をより長い時間をかけて投与する分割治療プロトコルを用いて投与することができる（例えば、４〜６、８〜１２、１４〜１６、もしくは１８〜２４時間ごと、または２〜４日ごと、１〜２週間ごと、または月に１回の用量）。あるいは、治療上有効な血中濃度を維持するのに十分な連続静脈点滴も、本開示の範囲内にある。
【００６３】
本明細書中記載される組成物内に存在する、及び哺乳類（例えば、ヒト）に対して適用される本明細書中開示されるとおりの方法で使用される、毒素（または細胞傷害剤）の治療上有効量は、年齢、体重、及び他の全般的条件（上記したとおり）の個体差を考慮して、当業者が決定することができる。本開示の組成物、複合体、及び融合タンパク質は、血清及び血流中で安定である可能性があるため、より具体的な場合によっては、任意の個別の構成要素を含む組成物、複合体、及び融合タンパク質の投薬量は、個別の構成要素のいずれかが非結合の場合の有効量よりも低い（または高い）ことが可能である。したがって、態様によっては、投与される毒素は、複合体または融合タンパク質の一部として投与される場合、毒素が単独で投与されるまたは複合体もしくは融合タンパク質の一部としては投与されない場合に比べて、上昇した有効性または低下した副作用を有する可能性がある。
【００６４】
ベクター
開示されるのは、開示される組成物の１種または複数用にコードする核酸配列を含むベクターである。態様によっては、ベクターは、開示される１種以上のＭＧＳペプチドをコードすることができる核酸配列のみを含む。
【００６５】
キット
上記の材料ならびに他の材料は、開示される方法を実行するのに、または実行を助けるのに有用なキットとして、任意の適切な組み合わせでまとめてパッケージ化することができる。所定のキット中のキット構成要素が、開示される方法で一緒に使用されるように設計されている及びそれに適合していれば、便利である。例えば、開示されるのは、開示される組成物を１種以上含むキットである。
【００６６】
態様によっては、キットは、ＭＧＳペプチド及び細胞傷害剤、ならびに複合体形成の説明書を含む。
【００６７】
態様によっては、キットは、１種以上のＭＧＳペプチドをコードする核酸配列を含む細胞株を含む。
【実施例】
【００６８】
実施例１：ＨＣＣ１５．２は、がん細胞に対して特異性を示し、がん細胞へと内部移行する
ペプチドが臨床上有用な試薬であるためには、正常細胞とがん細胞を識別することが重要となる可能性がある。図１は、ＭＧＳペプチド、ＨＣＣ１５．２が、がん細胞に蓄積し、対照に比べて特異的であることを示す。ＨＣＣ１５．２結合は、フローサイトメトリー分析により分析した（図１を参照）。ＨＣＣ１５．２は、正常ＨＢＥＣには結合しないが、ＬＣ細胞株Ｈ１２９９には結合する。結合は、配列依存性であり、単一の組織病理学的クラスに関して特異的ではなかった（図２を参照）。
【００６９】
標準固相ＦＭＯＣ技法を用いて、Ｐｒｅｌｕｄｅ合成装置（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）でＭＧＳペプチドを合成した。ＭＧＳペプチドを、逆相ＨＰＬＣによりＣ１８分取カラムで純度＞９５％に精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより確認した。最適化ＨＣＣ１５．２ペプチド配列は、Ａｃ−ＦＨＡＶＰＱＳＦＹＴ−ＰＥＧ１１−ビオチンで分子量２３９４Ｄａを有するもの、及びＡｃ−ＦＨＡＶＰＱＳＦＹＴ−ＰＥＧ１１−Ｃで分子量１９４０Ｄａを有するものである。四量体型ＨＣＣ１５．２を、以前に公表されたプロトコルにより合成した。原液は、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で作成し、濃度は、Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で２８０ｎＭでの吸光度により測定した。
【００７０】
フローサイトメトリー。ビオチン化ペプチドを、ＲＴで３０分間、ストレプトアビジン−Ｒ−フィコエリトリン（１：１）と複合体形成させた。ストレプトアビジンに残存する結合部位を、ＲＰＭＩ  １６４０でクエンチし、溶液を２５ｎＭに希釈した。腫瘍細胞を、１２ウェルプレート中、９０％集密度に成長させ、次いで、ペプチド色素複合体５００μｌとともに、３７℃で１時間インキュベートした。１時間後、ペプチドを除去し、細胞に、ＰＢＳで５分間の洗浄を３回、酸でのリンスを２回、ＰＢＳでのリンスを１回行った。細胞が浮き上がってくるまでトリプシン３００μｌを加え、次いで７００μｌのＲＰＭＩ＋５％のＦＢＳを加えてトリプシンを不活性化した。細胞をフローチューブに移し、暗中で氷上に置いた。ＢＤ  ＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａでフローサイトメトリーを行い、データは、Ｆｌｏｗｉｎｇソフトウェアで分析した。陰性対照中細胞の＜５％を含有する領域を確立し、陽性細胞の％に蛍光強度を乗算することにより、各試料のＭｃＧｕｉｒｅスコアを計算する。
【００７１】
フローサイトメトリー実験のため、細胞を、色素を有するペプチド（例えば、ＭＧＳペプチド）で１時間処理する。ペプチドが細胞（複数可）に進入すれば、色素も細胞（複数可）に進入することになる（図１１を参照）。次に、細胞を洗浄し、試験管に入れて、フローサイトメトリーを行う。フローサイトメーターは、１０，０００個以上の個別細胞の輝度を測定することができる。
【００７２】
共焦点顕微鏡観察。ＧＦＰで標識された細胞小器官特異的マーカーを有するプラスミドを、Ａｄｄｇｅｎｅから購入し、電気穿孔によりＨ１２９９細胞に入れた。Ｇ４１８選別後、ＧＦＰ標識化腫瘍細胞を、試験の前日に８ウェルチャンバースライドに播種した。ビオチン化ペプチドを、ＲＴで３０分間、ストレプトアビジン−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ５５５（１：１）と複合体形成させ、ＲＰＭＩでクエンチし、次いでウェルに５０ｎＭで加えた。１時間インキュベーション後、細胞に、ＰＢＳで５分間の洗浄を３回、酸でのリンスを２回、ＰＢＳでのリンスを１回行った。細胞を、１０分間２％ホルムアルデヒドに入れて固定し、ＰＢＳで洗浄し、マウントメディアに加えたＤＡＰＩで染色し、カバーガラスを乗せた。顕微鏡観察は、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ７００にＰｌｎ  Ａｐｏ  ６３×／１．４  ｏｉｌ  ＤＩＣ  ＩＩＩ対物レンズを装着して行った。ＩｍａｇｅＪソフトウェアの最大強度投影を使用して、圧縮画像を得た。
【００７３】
顕微鏡観察実験のため、細胞を、色素を有するペプチド（例えば、ＭＧＳペプチド）で１時間処理する。ペプチドが細胞（複数可）に進入すれば、色素も細胞（複数可）に進入することになる（図１を参照）。次に、細胞を洗浄し、スライドガラスに固定する。細胞の他の部分（例えば、細胞膜、細胞小器官、または核）を染色する。蛍光顕微鏡観察を行い、細胞中の色素を評価する。共焦点顕微鏡観察を用いて、３Ｄ画像を組み立てる（ＭＲＩのように）のに使用可能な一連の層別画像を撮影する。
【００７４】
実施例２：ＨＣＣ１５．２内部移行は、受容体が介在する
ＨＣＣ１５．２は、内部移行することができ、この内部移行は、受容体が介在することを示す実験が行われた（図３を参照）。より具体的には、ＨＣＣ１５．２は、ＮＳＣＬＣ及び他の腫瘍細胞の特定のサブセットに結合する（図１２を参照）。ファージブロッキング（Ｐｈａｇｅ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ）を対照として用いた。ＨＣＣ１５．２は、細胞株の特定パネルにより内部移行したが、他ではしなかった。結果は、受容体が介在する内部移行は配列特異的であったことも示す。ＨＣＣ１５．２を加える前に２分間トリプシンで処理すると、内部移行は起こらなかった。また、４℃でもＨＣＣ１５．２は内部移行しない。
【００７５】
図４は、ＨＣＣ１５．２の四量体化が、受容体介在型内部移行を顕著に改善することはないことを示す。この結果は、ＦＯＸ３分子誘導システムを通じて研究及び同定されたペプチドの大部分が結合／内部移行に非相加的上昇を示したことを考えると、驚くべきことである。
【００７６】
実施例３：ＨＣＣ１５．２の切断
図５及び図１５は、ＨＣＣ１５．２ペプチドのＮ末端及びＣ末端での切断により、最小結合配列が明らかになったことを示す。
【００７７】
図６は、アセチル化が、切断型ペプチドの結合を改善することを示す。
【００７８】
実施例４：ペプチドは、リソソームと共存する。
図７は、ＭＧＳペプチドがリソソームと共存し、時間とともにリソソーム中に蓄積することを示す（図８及び図１６を参照）。
【００７９】
実施例５：サポリンと複合体形成したＨＣＣ１５．２。
サポリンと複合体形成したＨＣＣ１５．２を細胞生存アッセイにおいて試験するため、さらなる実験を行った（図９及び表２を参照）。この目的で、腫瘍細胞株を、黒色壁透明平底９６ウェルプレートに播種した。翌日、濃度勾配をつけたＨｃｃ１５．２−サポリン、サポリン単独、または処理なしを用いて、培地を交換した。１時間インキュベーション後、処理を除去し、培養培地に交換した。７２時間後、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（登録商標）を使用して細胞生存度を測定し、ＬｊＬ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製のＡｎａｌｙｓｔ  ＨＴで蛍光を測定した。Ｇｒａｐｈｐａｄ  ＰｒｉｚｍでＩＣ５０を計算した。
【００８０】
がん細胞殺傷アッセイを行った（図２２を参照）。がん細胞を、皿にいれた。２４時間後、細胞に、異なる用量のペプチドサポリンを加えて１時間おいた。ペプチドサポリンを洗い落とし、細胞をさらに７２時間放置した。生細胞を測定するアッセイを行った。図２１は、ＨＣＣ１５．２が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、がん細胞を標的としてサポリンを向かわせることを示す。これらの結果は、サポリンが、それ自身では細胞に進入しなかったが、必要とされるＭＧＳペプチド（例えば、ＨＣＣ１５．２）と複合体形成している場合、サポリンが細胞に進入したことを実証する。これらの結果は、ＨＣＣ１５．２サポリンが、標的外効果を低下させ、細胞内小胞を回避することも示す。
表２．複数の細胞株における細胞生存度。
【表２】
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【００８１】
図１０は、サポリンと複合体形成したＨＣＣ１５．２が、ヒトＮＳＣＬＣ異種移植片モデルにおいて、遊離サポリンと比較して腫瘍成長を減少させることを示す。
【００８２】
実施例６：四量体化は、最大結合半量を顕著に改善することはない。
フローサイトメトリーを行い、ＫＤを測定する。細胞を、ペプチド−色素の濃度を上昇させながら、１時間処理する。細胞に進入するまたは入っていくＭＧＳペプチド（複数可）は、色素を共に連れて行く。細胞を洗浄し、試験管に入れて、フローサイトメトリーを行う。フローサイトメーターは、１０，０００個以上の個別細胞の輝度を測定することができる。各濃度を、定量し、プロットする（図１３及び図１４を参照）。曲線を数学的にデータにあてはめると、中間点がＫＤである（例えば、結合がどのくらい良好であるかの測定）。
【００８３】
実施例７：ＨＣＣ１５．２標的指向化ＮＩＲ色素は、ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍中に蓄積する。
Ｉｎ  ｖｉｖｏ画像化。Ｈ２００９腫瘍細胞を、１０６細胞／１００μｌで滅菌ＰＢＳに懸濁させ、メス胸腺欠損ヌードマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ．）の側腹部に皮下注射した。システイン標識化ペプチドを、滅菌ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で１時間、マレイミドＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ−７５０  Ｃ５（１：１．１）と複合体形成させた。ペプチド色素複合体を、滅菌ＰＢＳで１００μｌあたり色素１５μｇに希釈し、１００ｕｌを、４匹／群のマウスに外側尾静脈から静脈内注射した。１２、２４、４８、及び７２時間の時点で、マウスをＩｓｏｔｈｅｓｉａで麻酔し、ＩＶＩＳで動物の全体画像を撮影した。次いで、７２時間の時点で、Ｅｘ  ｖｉｖｏで腫瘍及び臓器を、重量測定し、撮影した。
【００８４】
Ｉｎ  ｖｉｖｏ動物撮影試験を行った。これらの実験のため、ヒトがん細胞を、マウスの皮下に接種し、腫瘍をある特定寸法まで成長させた。腫瘍が予め定めた寸法になった時点で、色素を持ったペプチドを、ＩＶ注射した。１２、２４、４８、及び７２時間の時点で、動物を麻酔し、撮影した。７２時間の時点で、臓器及び腫瘍を撮影した。黄色は、ペプチドが大半であり、海老茶／赤色は、ペプチドが少ないということであり、無色は、ペプチドが非常に少ない／ないということである。ＨＣＣ１５．２標的指向化ＮＩＲ色素は、腫瘍中に蓄積し（図１７を参照）、時間が経過しても腫瘍に保持されている（図１８を参照）。図１９及び図２０は、ｅｘ  ｖｉｖｏ画像化の結果を示す。
【００８５】
皮下腫瘍成長アッセイ。Ｈ２００９腫瘍を、胸腺欠損ヌードマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ）の側腹部の皮下で確立させた。ストレプトアビジン（ＳＡＺＡＰ）と複合体形成したサポリンを、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入し、最適化されたビオチン化Ｈｃｃ１５．２及び対照ペプチドと、１：１で複合体形成させた。腫瘍が寸法約１００３ｍＭに到達した時点で、マウスに、非標的指向化サポリン（ＭＧＳペプチドなし）または１５．２−サポリン複合体を外側尾静脈からＩＶで注射した、あるいは何も注射しなかった。標的指向化及び非標的指向化サポリン毒素は、２．５週間、約７ｕｇ／用量で、週に２回投与された。腫瘍は、盲検で、１日おきにノギスで測定し、腫瘍体積を、以下の式を用いて計算した
π／６*（長さ*幅）＾３／２。
【００８６】
次の実験セットのため、ヒトがん細胞を、マウスの皮下に接種し、腫瘍をある特定の予め定めた寸法まで成長させた。腫瘍が所定の寸法になった時点で、サポリンと複合体形成または連結したペプチドを、ＩＶ注射した。動物には、２．５週間にわたり、７または７．５μｇ／用量で５回の用量を投与した。腫瘍は、１日おきに測定した。図２３は、サポリンのＨＣＣ１５．２による標的指向化が、腫瘍成長を顕著に遅くしたことを示す。
【００８７】
実施例８：Ｈ１２９９．３ペプチドのさらなる特性評価。
元来のＭＧＳペプチドのアミノ酸１〜５番及び１１〜２０番を融合させた修飾ＭＧＳペプチド（配列番号３１）：ＬＱＷＲＲＮＦＧＶＷＡＲＹＲＬ（配列番号３１）を評価した。このＭＧＳペプチドは、そのがん特性を維持しており、オートファゴソームに送り込む能力を上昇させている。アセチル化は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの分解から保護し、溶解性を改善する。このＭＧＳペプチドは、動物において、ＮＳＣＬＣ腫瘍に対する能力に磨きがかかる（図２７を参照）。データは、非アセチル化型では腫瘍標的指向性は全く観察されなかったことを示す。このＭＧＳペプチド（例えば、修飾１５量体）は、心臓、肺、及び腎臓腫瘍で＞２倍の減少を有する（図２７を参照）。１２９９．３Ａｃ−１５量体と細胞の結合結果を、図２８に示す。
【００８８】
細胞培養。ヒトＮＳＣＬＣ細胞株が提供された。細胞は、Ｌ−グルタミン及び５％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ  １６４０中、３７℃及び５％ＣＯ2で培養された。
【００８９】
実施例９：他のペプチドと合わせたサポリンのＩｎ  ｖｉｔｒｏ送達。
図２９は、選択されたＭＧＳペプチドと複合体形成したまたは連結したサポリンを投与した様々な細胞株におけるＩＣ５０を示す。
【００９０】
当業者には明らかながら、本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく、本発明に様々な修飾及び改変を行うことができる。本発明の他の態様は、本明細書中開示される本発明の仕様及び実行を検討することで、当業者に明らかとなるだろう。明細書及び実施例は、例示としてのみ見なされ、本発明の真の範囲及び趣旨は以下の特許請求の範囲により示されることが意図される。
【００９１】
本明細書中記載される方法及び組成物の具体的な実施形態に対する多くの等価物が、当業者にはわかるだろう、または定法実験に過ぎないものを用いて確認することができるだろう。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲に含まれるものとする。
【図１】
2020527556.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2020527556.tif 000016
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０−１】
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【図３０−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2020527556.tif 000042
2020527556.tif 000043
2020527556.tif 000044