(57)【要約】  本発明は、1つ以上の特定の融合遺伝子を有するがん患者を治療する方法に関する。本発明は、MAN2A1-FER融合遺伝子によりコードされるタンパク質がキナーゼ活性を示し、前立腺以外のがん、例えば肝細胞がんにおける、MAN2A1-FERを標的化するチロシンキナーゼ阻害剤の使用が、がんを異種移植された動物の生存の劇的な改善につながったという発見に少なくとも部分的に基づく。【選択図】図１−１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象を治療する方法であって、少なくとも1つの融合遺伝子が対象から得られた試料中に存在することを決定すること、並びに次いで、凍結療法、放射線療法、化学療法、ホルモン療法、高密度焦点式超音波及び頻繁なモニタリングの1つ以上を行って対象において抗新生物効果を達成することを含み、対象が前立腺がんを有しない、方法。
【請求項２】
融合遺伝子が、TRMT11-GRIK2、SLC45A2-AMACR、MTOR-TP53BP1、LRRC59-FLJ60017、TMEM135-CCDC67、KDM4B-AC011523.2、MAN2A1-FER、PTEN-NOLC1、CCNH-C5orf30、ZMPSTE24-ZMYM4、CLTC-ETV1、ACPP-SEC13、DOCK7-OLR1、PCMTD1-SNTG1及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
対象が前悪性又は新生物性状態を有する、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
対象ががんを有する、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
対象が、乳がん、肝臓がん、肺がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、膵臓がん、卵巣がん、胃がん、甲状腺がん、多形膠芽腫、結腸直腸がん、肉腫、びまん性大B細胞リンパ腫、又は食道腺癌であるがんを有する、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
がんが肺腺癌、多形膠芽腫及び肝細胞癌のいずれでもない、請求項4に記載の方法。
【請求項７】
1つ以上の融合遺伝子がFISH分析により検出される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８】
1つ以上の融合遺伝子が逆転写ポリメラーゼ連鎖反応により検出される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
融合遺伝子がMAN2A1-FER融合遺伝子である、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
対象を治療する方法であって、(i)対象から得られた1つ以上の細胞が1つ以上の融合遺伝子を含有するかどうかを決定すること、及び(ii)1つ以上の細胞が1つ以上の融合遺伝子を含有する場合、1つ以上の細胞内に含有される1つ以上の融合遺伝子に特異的な治療有効量の阻害剤を投与することを含み、対象が前立腺がんを有しない、方法。
【請求項１１】
対象を治療する方法であって、(i)対象から得られた1つ以上の細胞が1つ以上の融合遺伝子を含有するかどうかを決定すること、及び(ii)1つ以上の細胞が1つ以上の融合遺伝子を含有する場合、1つ以上の細胞内に含有される1つ以上の融合遺伝子の産物を阻害する治療有効量の作用剤を投与することを含み、対象が前立腺がんを有しない、方法。
【請求項１２】
対象を治療する方法であって、(i)対象から得られた1つ以上の細胞が1つ以上の融合遺伝子を含有するかどうかを決定すること、及び(ii)1つ以上の細胞が1つ以上の融合遺伝子を含有する場合、1つ以上の細胞内に含有される1つ以上の融合遺伝子を標的化する治療有効量のsiRNAを投与することを含み、対象が前立腺がんを有しない、方法。
【請求項１３】
がんを有する対象を治療する方法であって、(i)対象から得られた1つ以上の細胞が1つ以上の融合遺伝子を含有するかどうかを決定すること、及び(ii)1つ以上の細胞が1つ以上の融合遺伝子を含有する場合、治療有効量の抗がん剤を対象に投与することを含み、対象が前立腺がんを有しない、方法。
【請求項１４】
前悪性又は新生物性状態を有する対象を治療する方法であって、(i)対象から得られた1つ以上の細胞が1つ以上の融合遺伝子を含有するかどうかを決定すること、及び(ii)1つ以上の細胞が1つ以上の融合遺伝子を含有する場合、1つ以上の細胞内に含有される1つ以上の融合遺伝子の産物を阻害して抗新生物効果を生じさせる治療有効量の作用剤を対象に投与することを含み、対象が前立腺がんを有しない、方法。
【請求項１５】
1つ以上の融合遺伝子が、TRMT11-GRIK2、SLC45A2-AMACR、MTOR-TP53BP1、LRRC59-FLJ60017、TMEM135-CCDC67、KDM4B-AC011523.2、MAN2A1-FER、PTEN-NOLC1、CCNH-C5orf30、ZMPSTE24-ZMYM4、CLTC-ETV1、ACPP-SEC13、DOCK7-OLR1、PCMTD1-SNTG1及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項10〜14のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１６】
対象ががんを有する、請求項10〜12のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１７】
がんが、乳がん、肝臓がん、肺がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、膵臓がん、卵巣がん、胃がん、甲状腺がん、多形膠芽腫、結腸直腸がん、肉腫、びまん性大B細胞リンパ腫、又は食道腺癌である、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
がんが肺腺癌、多形膠芽腫及び肝細胞癌のいずれでもない、請求項16に記載の方法。
【請求項１９】
対象が前悪性又は新生物性状態を有する、請求項10〜12のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２０】
1つ以上の融合遺伝子がFISH分析により検出される、請求項10〜19のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２１】
1つ以上の融合遺伝子が逆転写ポリメラーゼ連鎖反応により検出される、請求項10〜19のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２２】
1つ以上の融合遺伝子がMAN2A1-FER融合遺伝子である、請求項10〜21のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２３】
対象を治療する方法であって、(i)対象の細胞中のMAN2A1-FER遺伝子の存在を決定すること、及び(ii)MAN2A1-FER融合遺伝子が細胞中に存在する場合、細胞内に含有されるMAN2A1-FER融合遺伝子に特異的な治療有効量の1つ以上の阻害剤を投与することを含み、対象が前立腺がんを有しない、方法。
【請求項２４】
対象が前悪性又は新生物性状態を有する、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
1つ以上の阻害剤がカネルチニブとクリゾチニブとの組合せを含む、請求項23に記載の方法。
【請求項２６】
がんを有する対象を治療する方法であって、(i)対象のがん細胞中のMAN2A1-FER融合遺伝子の存在を決定すること、及び(ii)MAN2A1-FER融合遺伝子ががん細胞中に存在する場合、治療有効量のFER阻害剤を投与することを含み、がんが前立腺がんではない、方法。
【請求項２７】
がんを有する対象を治療する方法であって、(i)対象のがん細胞中のMAN2A1-FER融合遺伝子の存在を決定すること、及び(ii)MAN2A1-FER融合遺伝子ががん細胞中に存在する場合、治療有効量のEGFR阻害剤を投与することを含み、がんが前立腺がんではない、方法。
【請求項２８】
がんを有する対象を治療する方法であって、(i)対象のがん細胞中のMAN2A1-FER融合遺伝子の存在を決定すること、並びに(ii)MAN2A1-FER融合遺伝子ががん細胞中に存在する場合、治療有効量のFER阻害剤及びEGFR阻害剤を投与することを含み、がんが前立腺がんではない、方法。
【請求項２９】
対象を治療する方法であって、(i)対象の細胞中のMAN2A1-FER融合遺伝子の存在を決定すること、並びに(ii)MAN2A1-FER融合遺伝子が細胞中に存在する場合、治療有効量のFER阻害剤及びEGFR阻害剤を投与することを含み、対象が前立腺がんを有しない、方法。
【請求項３０】
EGFR阻害剤がカネルチニブである、請求項27、28又は29に記載の方法。
【請求項３１】
FER阻害剤がクリゾチニブである、請求項26、28又は29に記載の方法。
【請求項３２】
がんが、乳がん、肝臓がん、肺がん、非小細胞肺がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、膵臓がん、卵巣がん、胃がん、甲状腺がん、多形膠芽腫、結腸直腸がん、肉腫、びまん性大B細胞リンパ腫、又は食道腺癌である、請求項26、27又は28に記載の方法。
【請求項３３】
がんが肺腺癌、多形膠芽腫及び肝細胞癌のいずれでもない、請求項26、27又は28に記載の方法。
【請求項３４】
融合遺伝子がFISH分析により検出される、請求項23〜33のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３５】
融合遺伝子が逆転写ポリメラーゼ連鎖反応により検出される、請求項23〜33のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３６】
FISH分析により1つ以上の融合遺伝子を検出するために好適な1つ以上のプローブを含む、請求項1〜35に記載の方法のいずれかを行うためのキット。
【請求項３７】
PCR分析により1つ以上の融合遺伝子を検出するために好適な1つ以上のプライマー対を含む、請求項1〜35に記載の方法のいずれかを行うためのキット。
【請求項３８】
TRMT11-GRIK2、SLC45A2-AMACR、MTOR-TP53BP1、LRRC59-FLJ60017、TMEM135-CCDC67、KDM4B-AC011523.2、MAN2A1-FER、PTEN-NOLC1、CCNH-C5orf30、ZMPSTE24-ZMYM4、CLTC-ETV1、ACPP-SEC13、DOCK7-OLR1、PCMTD1-SNTG1及びこれらの組合せからなる群から選択される1つ以上の融合遺伝子のPCR分析用の核酸プライマーを含む、1つ以上の融合遺伝子を含有する細胞を有する対象を治療するためのキットであって、対象が前立腺がんを有しない、キット。
【請求項３９】
TRMT11-GRIK2、SLC45A2-AMACR、MTOR-TP53BP1、LRRC59-FLJ60017、TMEM135-CCDC67、KDM4B-AC011523.2、MAN2A1-FER、PTEN-NOLC1、CCNH-C5orf30、ZMPSTE24-ZMYM4、CLTC-ETV1、ACPP-SEC13、DOCK7-OLR1、PCMTD1-SNTG1及びこれらの組合せからなる群から選択される1つ以上の融合遺伝子のPCR分析用の核酸プライマーを含む、1つ以上の融合遺伝子を含有するがんを有する対象を治療するためのキットであって、がんが前立腺がんではない、キット。
【請求項４０】
TRMT11-GRIK2、SLC45A2-AMACR、MTOR-TP53BP1、LRRC59-FLJ60017、TMEM135-CCDC67、KDM4B-AC011523.2、MAN2A1-FER、PTEN-NOLC1、CCNH-C5orf30、ZMPSTE24-ZMYM4、CLTC-ETV1、ACPP-SEC13、DOCK7-OLR1、PCMTD1-SNTG1及びこれらの組合せからなる群から選択される1つ以上の融合遺伝子のFISH分析用の核酸プローブを含む、1つ以上の融合遺伝子を含有するがんを有する対象を治療するためのキットであって、がんが前立腺がんではない、キット。
【請求項４１】
がんが、乳がん、肝臓がん、肺がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、膵臓がん、卵巣がん、胃がん、甲状腺がん、多形膠芽腫、結腸直腸がん、肉腫、びまん性大B細胞リンパ腫、又は食道腺癌である、請求項39又は40に記載のキット。
【請求項４２】
融合遺伝子がMAN2A1-FER融合遺伝子である、請求項39、40又は41に記載のキット。
【請求項４３】
1つ以上の融合遺伝子を含有する細胞を有する対象の治療において使用するための、FER阻害剤及びEGFR阻害剤並びに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物であって、対象が前立腺がんを有しない、医薬組成物。
【請求項４４】
FER阻害剤がクリゾチニブである、請求項43に記載の医薬組成物。
【請求項４５】
EGFR阻害剤がカネルチニブである、請求項43又は44に記載の医薬組成物。
【請求項４６】
1つ以上の融合遺伝子を含有する1つ以上の細胞を有する対象のための治療を決定する方法であって、
i)対象からの試料を用意すること、
ii)対象の1つ以上の細胞が、TMEM135-CCDC67、TRMT11-GRIK2、SLC45A2-AMACR、MTOR-TP53BP1、LRRC59-FLJ60017、KDM4B-AC011523.2、MAN2A1-FER、PTEN-NOLC1、CCNH-C5orf30、ZMPSTE24-ZMYM4、CLTC-ETV1、ACPP-SEC13、DOCK7-OLR1、PCMTD1-SNTG1及びこれらの組合せからなる群から選択される1つ以上の融合遺伝子を含有するかどうかを決定すること、並びに
iii)1つ以上の融合遺伝子が対象の1つ以上の細胞中に検出された場合、検出された1つ以上の融合遺伝子に特異的な治療有効量の1つ以上の阻害剤の投与を指示すること
を含み、対象が前立腺がんを有しない、方法。
【請求項４７】
融合遺伝子がMAN2A1-FER融合遺伝子である、請求項46に記載の方法。
【請求項４８】
TMEM135-CCDC67、TRMT11-GRIK2、SLC45A2-AMACR、MTOR-TP53BP1、LRRC59-FLJ60017、KDM4B-AC011523.2、MAN2A1-FER、PTEN-NOLC1、CCNH-C5orf30、ZMPSTE24-ZMYM4、CLTC-ETV1、ACPP-SEC13、DOCK7-OLR1、PCMTD1-SNTG1及びこれらの組合せからなる群から選択される1つ以上の融合遺伝子を含有する1つ以上の細胞を有する対象を治療するためのEGFR阻害剤であって、対象が前立腺がんを有しない、EGFR阻害剤。
【請求項４９】
TMEM135-CCDC67、TRMT11-GRIK2、SLC45A2-AMACR、MTOR-TP53BP1、LRRC59-FLJ60017、KDM4B-AC011523.2、MAN2A1-FER、PTEN-NOLC1、CCNH-C5orf30、ZMPSTE24-ZMYM4、CLTC-ETV1、ACPP-SEC13、DOCK7-OLR1、PCMTD1-SNTG1及びこれらの組合せからなる群から選択される1つ以上の融合遺伝子を含有する1つ以上の細胞を有する対象を治療するためのFER阻害剤であって、対象が前立腺がんを有しない、FER阻害剤。
【請求項５０】
MAN2A1-FER融合遺伝子を含有する1つ以上の細胞を有する対象を治療するための阻害剤であって、対象が前立腺がんを有しない、阻害剤。
【請求項５１】
がんを発症するリスクのある対象を同定する方法であって、対象から得られた1つ以上の細胞が1つ以上の融合遺伝子を含有するかどうかを決定することを含み、1つ以上の細胞が1つ以上の融合遺伝子を含有する場合、対象はがんを発症するリスクがあり、がんが前立腺がんではない、方法。
【請求項５２】
がんが、乳がん、肝臓がん、肺がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、膵臓がん、卵巣がん、胃がん、甲状腺がん、多形膠芽腫、結腸直腸がん、肉腫、びまん性大B細胞リンパ腫、又は食道腺癌である、請求項51に記載の方法。
【請求項５３】
がんが肺腺癌、多形膠芽腫及び肝細胞癌のいずれでもない、請求項51に記載の方法。
【請求項５４】
融合遺伝子がFISH分析により検出される、請求項51〜53のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５５】
融合遺伝子が逆転写ポリメラーゼ連鎖反応により検出される、請求項51〜53のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５６】
融合遺伝子がMAN2A1-FERである、請求項51〜55のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５７】
前悪性状態を有する対象を診断する方法であって、対象から得られた1つ以上の細胞が1つ以上の融合遺伝子を含有するかどうかを決定することを含み、1つ以上の細胞が1つ以上の融合遺伝子を含有する場合、対象は前悪性状態を有し、対象が前立腺がんを有しない、方法。
【請求項５８】
がんが、乳がん、肝臓がん、肺がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、膵臓がん、卵巣がん、胃がん、甲状腺がん、多形膠芽腫、結腸直腸がん、肉腫、びまん性大B細胞リンパ腫、又は食道腺癌である、請求項57に記載の方法。
【請求項５９】
がんが肺腺癌、多形膠芽腫及び肝細胞癌のいずれでもない、請求項57に記載の方法。
【請求項６０】
融合遺伝子がFISH分析により検出される、請求項57〜59のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６１】
融合遺伝子が逆転写ポリメラーゼ連鎖反応により検出される、請求項57〜59のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６２】
融合遺伝子がMAN2A1-FERである、請求項57〜61のいずれか1項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の情報
本出願は、2016年12月13日に出願された米国仮特許出願第62/433,600号に対する優先権を主張し、該仮出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
助成金の情報
本発明は、米国国立衛生研究所により授与された助成金第RO1 CA098249号及び米陸軍医学研究-資材コマンドにより授与されたW81XWH-16-1-0364の下で政府の支援により為された。政府は本発明において特定の権利を有する。
【０００３】
1.序論
本発明は、1つ以上の特定の融合遺伝子を有する患者を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
2.発明の背景
米国において、前立腺がんは男性において最も頻繁に観察される悪性腫瘍の1つである。前立腺がんでの死亡は2014年には27,540人に達し、男性にとって2番目に致死的ながんであった(Siegel et al., (2015) A Cancer Journal For Clinicians 65:5-29)。国際公開第2015/103057号及び国際公開第2016/011428号に開示されるように、染色体組換えにより生成される多数の融合遺伝子が、再発性且つ致死性であると示された前立腺がんにおいて同定された。これらの融合遺伝子の発現は侵攻性前立腺がんにおいて広く存在するが、正常組織においては存在しない。国際公開第2015/103057号には、in vitroにおいて前立腺がん細胞の細胞死を結果としてもたらす、チロシン阻害剤を用いるMAN2A1/FER融合遺伝子を発現する前立腺がん細胞の処置が開示されている。
【０００５】
一般に、がんは米国において主要な死の原因である。2015年にがんの死亡率は米国単独で595,690人に達し、心臓血管疾患に次いで死の2番目に多い致死的原因であった(Siegel et al., (2016) A Cancer Journal For Clinicians 66(1):7-30)。肝臓がんは世界中で男性及び女性の両方にとってがん関連死の主要な原因の1つである(Jemal et al., (2011) Global cancer statistics. CA Cancer J Clin 61:69-90)。過去数十年に大きな進歩が為されたが、がんの発生及び進行の機序に関して多くが理解されないままである。がん、特に転移性となるがんの治療は問題を抱えたままであり、がんの治癒法は理解されないままである。したがって、がんを治療する方法の必要性が当該技術分野において依然として存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
3.発明の概要
本発明は、1つ以上の特定の融合遺伝子を有するがん又は前悪性若しくは新生物性状態を患う患者を治療する方法に関する。それは、MAN2A1-FER融合遺伝子によりコードされるタンパク質がキナーゼ活性を示し、前立腺がん以外のがん、例えば肝細胞がんにおけるMAN2A1-FERを標的化するチロシンキナーゼ阻害剤の使用が、がん異種移植片を有する動物の生存の劇的な改善につながったという発見に少なくとも部分的に基づく。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
様々な非限定的な実施形態では、本発明は、対象、例えば、がん又は新生物性若しくは前悪性状態を有する、又は有することが疑われる対象において融合遺伝子を同定するための方法及び組成物を提供する。特定の実施形態では、がんは前立腺がんではない。特定の実施形態では、がんは肺腺癌、多形膠芽腫及び肝細胞癌のいずれでもない。そのような融合遺伝子としては、TRMT11-GRIK2、SLC45A2-AMACR、MTOR-TP53BP1、LRRC59-FLJ60017、TMEM135-CCDC67、KDM4B-AC011523.2、MAN2A1-FER、PTEN-NOLC1、CCNH-C5orf30、ZMPSTE24-ZMYM4、CLTC-ETV1、ACPP-SEC13、DOCK7-OLR1及びPCMTD1-SNTG1が挙げられる。さらに、特定の融合遺伝子の存在に基づいて、本発明は、例えば、1つ以上の特定の融合遺伝子に特異的な治療有効量の作用剤（薬剤）を投与することにより、該融合遺伝子を有する対象を治療する方法を提供する。特定の実施形態では、融合遺伝子はMAN2A1-FERである。
【０００８】
特定の非限定的な実施形態では、本発明はさらに、融合遺伝子を有する対象を治療する方法を行うためのキットを提供する。特定の実施形態では、対象は前立腺がんを有しない。特定の実施形態では、対象は肺腺癌、多形膠芽腫及び肝細胞癌のいずれも有しない。特定の実施形態では、本発明のキットは、対象からの試料中の1つ以上の融合遺伝子の存在を検出するためのPCR分析用の核酸プライマー又はRNA in situ分析用の核酸プローブを含むことができる。特定の非限定的な実施形態では、1つ以上の融合遺伝子は、TRMT11-GRIK2、SLC45A2-AMACR、MTOR-TP53BP1、LRRC59-FLJ60017、TMEM135-CCDC67、PTEN-NOLC1、CCNH-C5orf30、TRMT11-GRIK2、SLC45A2-AMACR、KDM4B-AC011523.2、MAN2A1-FER、MTOR-TP53BP、ZMPSTE24-ZMYM4、CLTC-ETV1、ACPP-SEC13、DOCK7-OLR1、PCMTD1-SNTG11及びこれらの組合せからなる群から選択することができる。特定の実施形態では、融合遺伝子はMAN2A1-FERである。限定ではなく、例えば、本発明のキットは、MAN2A1-FER融合遺伝子の存在を検出するためのPCR分析用の核酸プライマー又はRNA in situ分析用の核酸プローブを含むことができる。
【０００９】
特定の実施形態では、本発明のキットは、1つ以上の融合遺伝子に特異的な1つ以上の阻害剤を含む医薬組成物を含むことができる。限定ではなく、例えば、本発明のキットは、MAN2A1-FER融合遺伝子を有するがんを有する対象の治療において使用するための、FER阻害剤、例えばクリゾチニブ、及びEGFR阻害剤、例えばカネルチニブを含む医薬組成物を含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
4.図面の簡単な説明
【図１−１】独特の融合遺伝子事象。左パネル:融合遺伝子のゲノム、転写方向、連結する遺伝子間の距離及び融合の方向の小図解。中央パネル:融合遺伝子の代表的なシークエンシングクロモグラム。連結する遺伝子配列を指し示した(配列番号45〜52)。右パネル:融合遺伝子の翻訳産物の図解。青-ドライバー遺伝子翻訳産物;赤-パッセンジャー遺伝子翻訳産物;橙-フレームシフトによる新規の翻訳産物又は非遺伝子領域からの翻訳産物。
【図１−２】図１−１の続きである。
【図１−３】図１−１の続きである。
【図２】融合遺伝子のゲノム切断点分析。上パネル:融合遺伝子のゲノム、転写方向、連結する遺伝子間の距離及び染色体連結の方向の小図解。中央パネル:融合ゲノム及び転写方向の小図。下:染色体(配列番号53〜55)の連結切断点を包含する代表的なシークエンシングクロモグラム。
【図３Ａ】前立腺がんにおけるPTEN-NOLC1融合遺伝子。(A)PTEN-NOLC1融合転写物。上パネル:PTEN及びNOLC1遺伝子のゲノム、転写方向、連結する遺伝子間の距離及び融合の方向の小図解。中央パネル:PTEN-NOLC1転写物の代表的なシークエンシングクロモグラム。連結する遺伝子配列を指し示した(配列番号56)。下パネル:融合転写物の翻訳産物の図解。青-ヘッド遺伝子翻訳産物;赤-テイル遺伝子翻訳産物。(B)PTEN及びNOLC1ゲノム組換え並びにFISHプローブ位置の構成図。
【図３Ｂ】図３Ａの続きである。
【図４】MAN2A1-FERのモチーフ分析。MAN2A1、FER及びMAN2A1-FER融合タンパク質の機能ドメインの図解。融合遺伝子MAN2A1-FERにおいて、FERのN末端はSH2及びFHCドメインの喪失を被る。これらのドメインはMAN2A1からのグリコシドヒドロラーゼ及びα-マンノシダーゼミドルドメインで置き換えられた。
【図５】CCNH-C5orf30陽性の前立腺がん細胞中の融合遺伝子切断点におけるゲノム編集標的化の構成図。前立腺がん症例3Tにおけるゲノム組換えは、CCNHのイントロン6をC5orf30のイントロン1と接続する第5染色体中の切断点を生じさせた。切断点領域に特異的なプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)配列を含む23bpのガイドRNA(gRNA)を設計する。この標的配列に対応するDNA配列を、gRNAの残りの部分及びCas9を含有するベクター中に人工的にライゲートする。この配列を組み換え、組換えウイルス(アデノウイルス又はレンチウイルス)中にパッケージングする。CCNHエクソン7のイントロン/エクソン接合点からのスプライスタグ配列と共にアデノウイルス用のシャトルベクター中にプロモーターレス単純ヘルペスウイルス1型(HSV-1)チミジンキナーゼを構築する。効率的な相同組換えを生じさせてドナーDNAの構築を完了するために、各側からのCCNH-C5orf30切断点の周囲の500bpの配列もシャトルベクター中にライゲートする。ベクターを組み換え、AdEasy中にパッケージングして組換えウイルスを生成させる。これらのウイルスは、CCNH-C5orf30融合転写物陽性のがんを有する患者又は動物に投与することができる。これは、標的部位(融合切断点)中へのドナーDNAの挿入につながる。組換えウイルス中のHSV-1 TKはプロモーターレスであるので、HSV-1 TK cDNAが転写活性ゲノム中に組み込まれなければ転写は起こらない。しかしながら、HSV-1 TKが患者のCCNH-C5orf30の標的部位中に組み込まれればHSV-1 TKの転写は活性であり、ガンシクロビル又はその経口ホモログであるバルガンシクロビルを患者に投与した場合、ホモログはHSV-1 TKにより三リン酸グアニンアナログに容易に変換され、がん細胞のゲノム中に組み込まれる。これは、CCNH-C5orf30陽性の細胞におけるDNA伸長の停止につながる。
【図６−１】融合遺伝子の構成図。左パネル:融合パートナーのゲノムの構成図。遺伝子座、パートナー間の距離、転写方向及び融合方向を示す。中央パネル:各融合遺伝子の融合点の周囲(配列番号40〜44)のサンガーシークエンシングのヒストグラム。右パネル:融合遺伝子の予測されるタンパク質産物。青:ヘッド遺伝子のタンパク質;黄:フレームシフト翻訳;赤:テイル。
【図６−２】図６−１の続きである。
【図７】ZMPSTE24-ZMYM5融合物の形成の構成図。機能ドメインが示されている。ZMPSTE24とZMYM4との融合物の形成は、ZMPSTE24のC末端から159アミノ酸及びZMYM4のN末端から1315アミノ酸の切断を生じさせる。ZMPSTE24-ZMYM4融合物はZMPSTE24からペプチダーゼドメインの約50%を欠失させ、且つZMYM4から全てのジンクフィンガーを除去するが、ZUF3504(機能未知のドメイン)及びアポトーシス阻害ドメインをインタクト（完全）なまま残すことをモチーフ分析は示唆する。
【図８】CLTC-ETV1融合物の形成の構成図。機能ドメインが示されている。CLTC-ETV1融合物は、ETV1中の概ねインタクトな転写ドメインを保存し、且つCLTCからの3つのクラスリンドメインを欠失させる。ETV1のN末端における切断は、ETV1から全てのこれらの調節エレメントを取り除く。
【図９】ACPP-SEC13融合物の形成の構成図。機能ドメインが示されている。ACPP-SEC13融合物において、ACPPのN末端の72アミノ酸のみが保存され、ホスファターゼドメインの2/3より多くが切断される一方、SEC13はそのN末端から196アミノ酸を喪失し、3つのWDリピートドメインを欠失している。
【図１０】DOCK7-OLR1融合物の形成の構成図。機能ドメインが示されている。DOCK7-OLR1はキメラタンパク質を産生しない。DOCK7及びOLR1の別々の翻訳が融合転写物から起こる。融合遺伝子は、DOCKの細胞質分裂ドメインの大部分を欠失させ、融合転写物はインタクトなOLR1タンパク質を産生する。
【図１１】PCMTD1-SNTG1融合物の形成の構成図。機能ドメインが示されている。PCMTD1-SNTG1融合物はキメラタンパク質を産生しない。PCMTD1-SNTG1融合物は、PCMTD1のメチル-トランスフェラーゼドメインの半分を除去する切断されたPCMTD1を産生し、SNTG1はインタクトなままである。
【図１２】SLC45A2-AMACRキメラタンパク質の構成図。SLC45A2とAMACRとの融合物は、SLC45A2中の(MFS)ドメインの3分の2の切断を結果としてもたらすが、AMACRのCoA-トランスフェラーゼドメインを概ね保持する。SLC45A2-AMACRは、SLC45A2のN末端の187アミノ酸及びAMACRのC末端の311アミノ酸を有するキメラタンパク質を産生する。SLC45A2-AMACRは、SLC45A2の5つの膜貫通及びサイトゾルドメインをAMACRからのインタクトなラセマーゼドメインで置換するが、細胞外及びN末端膜貫通ドメインをインタクトなまま残す。
【図１３Ａ】ヒト悪性腫瘍中のMAN2A1-FER。(A)MAN2A1、FER及びMAN2A1-FERタンパク質の構成図。FCHはFER-CP4相同領域を表す。PKはプロテインキナーゼを表す。SH2はSrc相同領域2を表す。(B)MAN2A1-FERの染色体切断点はMAN2A1のイントロン13及びFERのイントロン14に位置する。全ゲノムシークエンシングを通じて前立腺がん試料PRCa159T中で1つの切断点を同定した。ネステッドPCRを通じて肝臓がん細胞株HUH7中で別の切断点を同定した。(C)多形膠芽腫(GBM)、肝細胞癌(HCC)、前立腺がん(PRCA)、非小細胞肺がん(NSCLC)、卵巣がん(OV)及び食道腺癌(ESCA)中でのMAN2A1-FER融合転写物の頻度。調べた試料の数を示す。(D)ヒトがんにおけるMAN2A1-FERタンパク質の発現。MAN2A1又はFERに特異的な抗体を使用して、肝臓がん細胞株HUH7及びHEP3B、MAN2A1-FER転写物陽性(PRCA159T及びPRCA23T)又は陰性(PRCA25T、PRCA20T及びPRCA119T)の前立腺がん試料からのタンパク質抽出物に対してイムノブロッティングを行った。MAN2A1、FER及びMAN2A1-FERを示す。GAPDHの抗体を使用するイムノブロッティングを対照として使用した。
【図１３Ｂ】図１３Ａの続きである。
【図１３Ｃ】図１３Ａの続きである。
【図１３Ｄ】図１３Ａの続きである。
【図１４−１】MAN2A1-FER融合タンパク質はゴルジ装置中に位置する。(A)pCDNA4-MA2A1-FER-FLAG/pCDNA6-TO中のMAN2A1-FER-FLAGの発現はNIH3T3(NMF)及びHEP3B(HEPMF)細胞を形質転換させた。FLAG又はGAPDHに特異的な抗体を使用してイムノブロッティングを行った。(B)MAN2A1-FER-FLAGはゴルジ内在性タンパク質N-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼと共局在する。FLAG及びN-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼの免疫蛍光染色。共焦点顕微鏡法により写真を撮影した。(C)HEPMF細胞のスクロース勾配超遠心分離はMAN2A1-FER-FLAGの発現を誘導した。画分番号を上に示す。細胞内の場所を下に示す。指し示した抗体(右)を使用してイムノブロッティングを行った。受容体結合がん関連表面抗原(receptor-binding cancer associated surface antigen;RCAS1)をゴルジ装置のマーカーとして使用する。(D)ゴルジ中のMAN2A1-FERはゴルジ単離方法により確認した。MAN2A1-FERを発現するHUH7(上)及びNMF(下)細胞のゴルジ画分を単離し、FER(HUH7)又はFLAG(NMF)に特異的な抗体を用いてイムノブロットした。RCAS1、GAPDH及びヒストン3に特異的な抗体を純度対照として使用した。G-ゴルジ;C-細胞質;N-核。
【図１４−２】図１４−１の続きである。
【図１５−１】MAN2A1-FERのチロシンキナーゼ活性。(A)基質としてpoly(EY 4:1)を使用するin vitroキナーゼアッセイ。GST-FER、GST-MAN2A1-FER及びGSTタンパク質を大腸菌(Escherichia coli)中で発現させた。BL21を抽出し、グルタチオンカラムを通して精製した。キナーゼ活性を定量化し、タンパク質1pmolに対して正規化した。(B)クリゾチニブはGST-MAN2A1-FERのキナーゼ活性を阻害する。(C)GST-MAN2A1-FERはEGFRのチロシン88をリン酸化した。上パネル:HisTAG-EGFRaa1-650(レーン1〜8)又はHisTAG-ΔEGFRのN末端Y88A(レーン9)のATP用量依存的リン酸化。過剰のペプチド3(FLKTIQEVAGYVLIALNTVER(配列番号144))又は変異体ペプチド3(FLKTIQEVAGAVLIALNTVER(配列番号145))(レーン7〜8)でGST-MAN2A1-FERによるHisTAG-ΔEGFRaa1-650のリン酸化を行った。下パネル:GST-MAN2A1-FERによる表4に列記される合成ペプチドに対するリン酸化アッセイ。(D)MAN2A1-FER-FLAGを有する又は有しないHEPMF細胞からの部分消化EGFR産物のイムノブロット分析。HEPMF細胞からのタンパク質抽出物をトロンビン又はヒドロキシルアミンに曝露した。これに続いて、EGFRのN末端に特異的な抗体による免疫沈降を行った。免疫沈降物を15%のSDS-PAGE中に溶解し、ホスホチロシン特異的抗体を用いてイムノブロットした。(E)MAN2A1-FER-FLAGはEGFRを活性化させる。MAN2A1-FER-FLAGを発現するように誘導性MAN2A21-FER-FLAG(PMF)を有するPC3又はHEPMF細胞を誘導した。pY1068、pY845又はpYに特異的な抗体を使用してイムノブロッティングを行った。EGFR及びGAPDHを対照として使用した。(F)EGFRのY88はEGFRのMAN2A1-FER-FLAG誘導性の活性化のために必要とされる。上パネル:HEPMF細胞にpCMV-ΔEGFRY88A-c-myc(レーン1〜2)又はpCMV-EGFR-c-myc(レーン3〜4)をトランスフェクトした。MAN2A1-FER-FLAGを発現するようにこれらの細胞を誘導し、抗c-myc抗体を用いて免疫沈降を行った。次に、免疫沈降物を抗ホスホチロシン抗体を用いてブロットした。下パネル:上パネルのMAN2A1-FER-FLAG発現の誘導。これに続いてEGFR-c-mycの架橋を行い、次に抗c-myc抗体を用いてブロットした。(G)MAN2A1-FER陽性(右)又は陰性(中)の前立腺がん試料中のEGFR pY1068の免疫染色。正常な前立腺(左)を陰性対照として使用した。
【図１５−２】図１５−１の続きである。
【図１５−３】図１５−１の続きである。
【図１６】MAN2A1-FERによるEGFRシグナル伝達経路の活性化。pCDNA4-MAN2A1-FERFLAG/pCDNA6-TOで形質転換させたPC3(PMF)、HEP3B(HEPMF)、NIH3T3(NMF)及びA-172(GMF)細胞をテトラサイクリンで処理してMAN2A1-FERFLAGの発現を誘導した(レーン1〜8)。EGFR pY1068、B-raf pS445、MEK1/2 pS221及びAkt pS473をイムノブロッティングによりリン酸化状態について調べた。GAPDH、EGFR、B-raf、MEK1/2及びAktも正規化対照としてイムノブロットした。(B)ドミナントネガティブ変異体ΔEGFRaa1-650を(A)の細胞にトランスフェクトした(レーン9〜16)。(A)と類似のイムノブロッティングを行った。(C)pCDNA4-ΔMAN2A1-FER-FLAGK723A/pCDNA6-TOで形質転換させたPC3(PMFΔK)、HEP3B(HEPMFΔK)、NIH3T3(NMFΔK)、A-172(GMFΔK)細胞をテトラサイクリンで処理してMAN2A1-FERK723A-FLAGの発現を誘導した(レーン17〜24)。(A)と類似のイムノブロッティングを行った。(D)HUH7細胞中でのMAN2A1-FERの妨害はEGFR、B-raf、MEK及びAktの過剰リン酸化を減少させた。
【図１７−１】MAN2A1-FERの増殖促進及び侵襲活性。(A)pCDNA4-ΔMAN2A1-FER-FLAGK723A/pCDNA6-TO又はその野生型対応物で形質転換させた細胞の細胞周期分析。ドミナントネガティブ変異体ΔEGFRaa1-650をHEPMF細胞中で使用して、MAN2A1-FERの増殖促進活性がEGFR活性化に依存するかどうかを調べた。HUH7及びそのMAN2A1-FERノックアウト対応物(KO)を使用して、細胞増殖がMAN2A1-FERに依存するかどうかを調べた。(B)(A)からの複製物のコロニー形成アッセイ。(C)MAN2A1-FER-FLAGを有する又は有しないPMF、DMF、HEPMF GMF及びHMF細胞のマトリゲル通過分析。(D)MAN2A1-FERは異種移植したヒトがんの腫瘍体積を増加させた。(E)MAN2A1-FERは異種移植したヒトがんの転移率を増加させた。(F)MAN2A1-FERはヒトがんを異種移植したマウスの死亡を増加させた。
【図１７−２】図１７−１の続きである。
【図１８】クリゾチニブ又はカネルチニブによるMAN2A1-FER陽性のがん細胞の殺滅。上パネル:HUH7又はそのMAN2A1-FERノックアウト対応物細胞を様々な濃度のクリゾチニブ又はカネルチニブで処理した。次に、細胞死の割合をアネキシンV及びヨウ化プロピジウム染色により定量化した。中央パネル:テトラサイクリンを用いて又は用いずに誘導したPMF細胞を様々な濃度のクリゾチニブ又はカネルチニブで処理した。次に、細胞死の割合をアネキシンV及びヨウ化プロピジウム染色により定量化した。下パネル:テトラサイクリンを用いて又は用いずに誘導したGMF細胞を様々な濃度のクリゾチニブ又はカネルチニブで処理した。次に、細胞死の割合をアネキシンV及びヨウ化プロピジウム染色により定量化した。
【図１９−１】MAN2A1-FERは、キナーゼ阻害剤クリゾチニブ及びカネルチニブへのがんの感受性を増加させた。(A)クリゾチニブ又はカネルチニブの処理は、MAN2A1-FER陽性の異種移植したがんの体積を減少させた。(B)クリゾチニブ又はカネルチニブの処理は、MAN2A1-FER陽性の異種移植したがんの転移の発生を減少させたが、MAN2A1-FER陰性の異種移植したがんの転移の発生は減少させなかった。(C)クリゾチニブ又はカネルチニブの処理は、MAN2A1-FER陽性のがんを異種移植したSCIDマウスの死亡を減少させたが、MAN2A1-FER陰性のがんを異種移植したSCIDマウスの死亡を減少させなかった。
【図１９−２】図１９−１の続きである。
【図２０−１】MAN2A1-FER-FLAGは、体細胞Pten欠失を有するマウスにおいて自発的な肝臓がんを誘導した。(A)手順の構成図。(B)目立つ肝臓がんを有するマウス(右)及び陰性対照(左)の代表的な写真。AAV-CREプラス対照ベクターpT3を対照として使用した。(C)pT3-MAN2A1-FER-FLAGの尾静脈ハイドロダイナミック注射は肝臓の大きさを増加させた。AAV-CREプラス対照ベクターpT3を対照として使用した。(D)pT3-MAN2A1-FER-FLAGの尾静脈ハイドロダイナミック注射はEGFR及びAktの活性化を誘導した。AAV-CREプラス対照ベクターpT3を対照として使用した。(E)pT3-MAN2A1-FER-FLAGの尾静脈ハイドロダイナミック注射により生じさせた肝臓がんの進行。AAV-CREプラス対照ベクターpT3を対照として使用した。
【図２０−２】図２０−１の続きである。
【図２１】AAV-cre及びpT3-MAN2A1-FER-FLAG処理Ptentm1Hwu/JマウスのKi-67、グルタミンシンターゼ及び油染色の代表的な画像。AAV-cre及びpT3処置マウスを対照として使用した。
【図２２−１】HCC及び正常肝臓臓器ドナー試料のTaqman定量的逆転写(RT)PCR。Taqman RT-PCRの元々の正規化したグラフを示した。*MAN2A1-FER融合物をサンガーシークエンシングにより検証した。
【図２２−２】図２２−１の続きである。
【図２２−３】図２２−１の続きである。
【図２２−４】図２２−１の続きである。
【図２２−５】図２２−１の続きである。
【図２２−６】図２２−１の続きである。
【図２２−７】図２２−１の続きである。
【図２３】MAN2A1-FERはin vitro及びin vivoでEGFRに結合する。(A)EGFRとのMAN2A1-FER-FLAGの共免疫沈降。(B)EGFRのN末端(HisTAG-DEGFRaa1-650)との精製組換えGST MAN2A1-FERのin vitro結合。IP、免疫沈降;WB、ウエスタンブロット。
【図２４】肝臓中の転移がん結節の代表的な画像。異種移植した腫瘍細胞及びテトラサイクリン(tet)処理を示す。緑色の矢印は肝臓中の転移がん結節を示す。
【図２５】MAN2A1及びFER遺伝子のトランスクリプトームシークエンシングリード分布。グラフは、MAN2A1(左上)又はFER(左下)の最初の3エクソンのリード数と全てのエクソンのリードとの比又はMAN2A1(右上)又はFER(右下)の最後の3エクソンのリード数と全てのエクソンのリードとの比に関する個々の試料の分布を表す。橙色の試料は、The Cancer Genome Atlas(TCGA)のデータセット(550試料);Luo et al.のデータセット(54試料)(Luo et al. Discovery and classification of fusion transcripts in prostate cancer and normal prostate tissue. Am J Pathol 185:1834-1845 (2015))から。P値を示す。
【図２６】形質膜へのEGFR-SNAPトラフィッキングのパルスチェイス分析。pEGFR-SNAPをHEPMF細胞にトランスフェクトした。次に、これらの細胞を5mg/mLのテトラサイクリンを用いて又は用いずに処理して、図14に示すようにMAN2A1-FER-FLAGの発現を誘導した。培地を10mMのSNAP-Cell Block(ブロモテニルプテリジン)ブロッキング培地で20分間置き換えることにより蛍光を遮断した。培養培地でこれらの細胞を2回洗浄することによりブロッキングから解放させた。次に、EGFR-SNAPタンパク質をSNAP-Cell 505-Star(5mM)で30分間パルスし、0、1、2、3、4、5、及び6時間にわたってチェイス（追跡）した。形質膜画分を精製した。形質膜中のEGFR-SNAPタンパク質の蛍光を蛍光マイクロプレートリーダーにより532nMで定量化した。RFU、相対蛍光単位。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
5.発明の詳細な説明
限定ではなく明確性のために、本発明の詳細な説明を以下のサブセクションに分ける:
(i)融合遺伝子、
(ii)融合遺伝子の検出、
(iii)がん標的、
(iv)治療方法、
(v)医薬組成物、及び
(vi)キット。
【００１２】
5.1融合遺伝子
本明細書で使用される場合、「融合遺伝子」という用語は、野生型/正常な核酸又はタンパク質配列においては見出されない様式で記載された遺伝子又はそれらのRNA転写物の要素を組み合わせた核酸又はタンパク質配列を指す。限定するものではなく、例えば、ゲノムDNAの形態の融合遺伝子において、記載された遺伝子のゲノム配列の部分の相対位置は、(例えば、本明細書に記載されるNCBI染色体位置又は配列に反映されるような)野生型/正常配列と比べて変化している。mRNAの形態の融合遺伝子において、両方の要素遺伝子から生じるRNA転写物の部分が存在する(野生型転写物におけるのと必ずしも同じレジスター（位置）になく、また正常な成熟転写物中に通常存在しない部分を含むことがある)。非限定的な実施形態では、ゲノムDNA又はmRNAのそのような部分は、少なくとも約10個の連続するヌクレオチド、又は少なくとも約20個の連続するヌクレオチド、又は少なくとも約30個の連続するヌクレオチド、又は少なくとも40個の連続するヌクレオチドを含んでよい。特定の実施形態では、ゲノムDNA又はmRNAのそのような部分は、融合遺伝子中に存在する遺伝子のヌクレオチド配列の最大約10個の連続するヌクレオチド、最大約50個の連続するヌクレオチド、最大約100個の連続するヌクレオチド、最大約200個の連続するヌクレオチド、最大約300個の連続するヌクレオチド、最大約400個の連続するヌクレオチド、最大約500個の連続するヌクレオチド、最大約600個の連続するヌクレオチド、最大約700個の連続するヌクレオチド、最大約800個の連続するヌクレオチド、最大約900個の連続するヌクレオチド、最大約1,000個の連続するヌクレオチド、最大約1,500個の連続するヌクレオチド又は最大約2,000個の連続するヌクレオチドを含んでよい。特定の実施形態では、ゲノムDNA又はmRNAのそのような部分は、融合遺伝子中に存在する遺伝子のヌクレオチド配列の約10個以下の連続するヌクレオチド、約50個以下の連続するヌクレオチド、約100個以下の連続するヌクレオチド、約200個以下の連続するヌクレオチド、約300個以下の連続するヌクレオチド、約400個以下の連続するヌクレオチド、約500個以下の連続するヌクレオチド、約600個以下の連続するヌクレオチド、約700個以下の連続するヌクレオチド、約800個以下の連続するヌクレオチド、約900個以下の連続するヌクレオチド、約1,000個以下の連続するヌクレオチド、約1,500個以下の連続するヌクレオチド又は約2,000個以下の連続するヌクレオチドを含んでよい。特定の実施形態では、ゲノムDNA又はmRNAのそのような部分は、融合遺伝子中に存在する遺伝子の全体的な（全長）野生型/正常ヌクレオチド配列を含まない。タンパク質の形態の融合遺伝子において、両方の要素遺伝子から生じるアミノ酸配列の部分が存在する(限定ではなく、少なくとも約5個の連続するアミノ酸又は少なくとも約10個のアミノ酸又は少なくとも約20個のアミノ酸又は少なくとも約30個のアミノ酸)。特定の実施形態では、融合遺伝子タンパク質のそのような部分は、融合遺伝子中に存在する遺伝子によりコードされるアミノ酸配列の最大約10個の連続するアミノ酸、最大約20個の連続するアミノ酸、最大約30個の連続するアミノ酸、最大約40個の連続するアミノ酸、最大約50個の連続するアミノ酸、最大約60個の連続するアミノ酸、最大約70個��連続するアミノ酸、最大約80個の連続するアミノ酸、最大約90個の連続するアミノ酸、最大約100個の連続するアミノ酸、最大約120個の連続するアミノ酸、最大約140個の連続するアミノ酸、最大約160個の連続するアミノ酸、最大約180個の連続するアミノ酸、最大約200個の連続するアミノ酸、最大約220個の連続するアミノ酸、最大約240個の連続するアミノ酸、最大約260個の連続するアミノ酸、最大約280個の連続するアミノ酸又は最大約300個の連続するアミノ酸を含んでよい。特定の実施形態では、融合遺伝子タンパク質のそのような部分は、融合遺伝子中に存在する遺伝子によりコードされるアミノ酸配列の約10個以下の連続するアミノ酸、約20個以下の連続するアミノ酸、約30個以下の連続するアミノ酸、約40個以下の連続するアミノ酸、約50個以下の連続するアミノ酸、約60個以下の連続するアミノ酸、約70個以下の連続するアミノ酸、約80個以下の連続するアミノ酸、約90個以下の連続するアミノ酸、約100個以下の連続するアミノ酸、約120個以下の連続するアミノ酸、約140個以下の連続するアミノ酸、約160個以下の連続するアミノ酸、約180個以下の連続するアミノ酸、約200個以下の連続するアミノ酸、約220個以下の連続するアミノ酸、約240個以下の連続するアミノ酸、約260個以下の連続するアミノ酸、約280個以下の連続するアミノ酸又は約300個以下の連続するアミノ酸を含んでよい。特定の実施形態では、融合遺伝子タンパク質のそのような部分は、融合遺伝子中に存在する遺伝子によりコードされる全体的な野生型/正常アミノ酸配列を含まない。この段落において、両方の遺伝子、転写物又はタンパク質から生じる部分は、両方の遺伝子の野生型形態において偶然に同一であり得る配列を指さない(すなわち、部分は「共有されない」)。そのため、融合遺伝子は、一般的に言えば、通常は連結して一緒になっていない遺伝子要素がスプライシングで一緒になること又は融合することを表す。開示される融合遺伝子に関する追加の情報については、国際公開第2015/103057号及び国際公開第2016/011428号を参照(これらの内容は参照により本明細書に組み込まれる)。
【００１３】
融合遺伝子TRMT11-GRIK2は、tRNAメチルトランスフェラーゼ11ホモログ(「TRMT11」)とイオンチャネル型グルタミン酸受容体カイニン酸型2(glutamate receptor, ionotropic, kainate 2;「GRIK2」)遺伝子との融合物である。ヒトTRMT11遺伝子は典型的に染色体6q11.1上に位置し、ヒトGRIK2遺伝子は典型的に染色体6q16.3上に位置する。特定の実施形態では、TRMT11遺伝子は、NCBI遺伝子ID番号:60487、配列  第6染色体;NC_000006.11(126307576..126360422)を有するヒト遺伝子であり、且つ/又は、GRIK2遺伝子は、NCBI遺伝子ID番号:2898、配列  第6染色体;NC_000006.11(101841584..102517958)を有するヒト遺伝子である。特定の実施形態では、TRMT11-GRIK2融合遺伝子の接合部(junction)(本明細書において染色体切断点(chromosomal breakpoint)及び/又は接合断片(junction fragment)と称されることもある)は、図1及び/又は表1に示されるような配列を含む。
【００１４】
融合遺伝子SLC45A2-AMACRは、溶質キャリアファミリー45メンバー2(solute carrier family 45, member 2;「SLC45A2」)とアルファ-メチルアシル-CoAラセマーゼ(「AMACR」)遺伝子との融合物である。ヒトSLC45A2遺伝子は典型的にヒト染色体5p13.2上に位置し、ヒトAMACR遺伝子は典型的に染色体5p13上に位置する。特定の実施形態では、SLC45A2遺伝子は、NCBI遺伝子ID番号:51151、配列  第5染色体;NC_000005.9(33944721..33984780、相補体)を有するヒト遺伝子であり、且つ/又は、AMACR遺伝子は、NCBI遺伝子ID番号:23600、配列  第5染色体;NC_000005.9(33987091..34008220、相補体)を有するヒト遺伝子である。特定の実施形態では、SLC45A2-AMACR融合遺伝子の接合部及び/又は接合断片は、図1及び/又は表1に示されるような配列を含む。
【００１５】
融合遺伝子MTOR-TP53BP1は、ラパマイシンの機構的標的(mechanistic target of rapamycin;「MTOR」)と腫瘍タンパク質p53結合タンパク質1(「TP53BP1」)遺伝子との融合物である。ヒトMTOR遺伝子は典型的に染色体1p36.2上に位置し、ヒトTP53BP1遺伝子は典型的に染色体15q15-q21上に位置する。特定の実施形態では、MTOR遺伝子は、NCBI遺伝子ID番号:2475、配列  第1染色体  NC_000001.10(11166588..11322614、相補体)を有するヒト遺伝子であり、且つ/又は、TP53BP1遺伝子は、NCBI遺伝子ID番号:7158、配列  第15染色体;NC_000015.9(43695262..43802707、相補体)を有するヒト遺伝子である。特定の実施形態では、MTOR-TP53BP1融合遺伝子の接合部及び/又は接合断片は、図1及び/又は表1に示されるような配列を含む。
【００１６】
融合遺伝子LRRC59-FLJ60017は、ロイシンリッチリピート含有59(leucine rich repeat containing 59;「LRRC59」)遺伝子と「FLJ60017」核酸との融合物である。ヒトLRRC59遺伝子は典型的に染色体17q21.33上に位置し、ヒトFLJ60017をコードする核酸は典型的に染色体11q12.3上に位置する。特定の実施形態では、LRRC59遺伝子は、NCBI遺伝子ID番号:55379、配列  第17染色体;NC_000017.10(48458594..48474914、相補体)を有するヒト遺伝子であり、且つ/又は、FLJ60017は、GeneBank AK_296299に記載される核酸配列を有する。特定の実施形態では、LRRC59-FLJ60017融合遺伝子の接合部及び/又は接合断片は、図1、図2及び/又は表1に示されるような配列を含む。
【００１７】
融合遺伝子TMEM135-CCDC67は、膜貫通タンパク質135(transmembrane protein 135;「TMEM135」)とコイルドコイルドメイン含有67(coiled-coil domain containing 67;「CCDC67」)遺伝子との融合物である。ヒトTMEM135遺伝子は典型的に染色体11q14.2上に位置し、ヒトCCDC67遺伝子は典型的に染色体11q21上に位置する。特定の実施形態では、TMEM135遺伝子はNCBI遺伝子ID番号:65084、配列  第11染色体;NC_000011.9(86748886..87039876)を有するヒト遺伝子であり、且つ/又は、CCDC67遺伝子はNCBI遺伝子ID番号:159989、配列  第11染色体;NC_000011.9(93063156..93171636)を有するヒト遺伝子である。特定の実施形態では、TMEM135-CCDC67融合遺伝子の接合部及び/又は接合断片は図1、図2及び/又は表1に示されるような配列を含む。
【００１８】
融合遺伝子CCNH-C5orf30は、サイクリンH(「CCNH」)と第5染色体オープンリーディングフレーム30(chromosome 5 open reading frame 30;「C5orf30」)遺伝子との融合物である。ヒトCCNH遺伝子は典型的に染色体5q13.3-q14上に位置し、ヒトC5orf30遺伝子は典型的に染色体5q21.1上に位置する。特定の実施形態では、CCNH遺伝子はNCBI遺伝子ID番号:902、配列  第5染色体;NC_000005.9(86687310..86708850、相補体)を有するヒト遺伝子であり、且つ/又は、C5orf30遺伝子はNCBI遺伝子ID番号:90355、配列  第5染色体;NC_000005.9(102594442..102614361)を有するヒト遺伝子である。特定の実施形態では、CCNH-C5orf30融合遺伝子の接合部及び/又は接合断片は、図1、図2、図5及び/又は表1に示されるような配列を含む。
【００１９】
融合遺伝子KDM4B-AC011523.2は、リシン(K)特異的デメチラーゼ4B(「KDM4B」)と染色体領域「AC011523.2」との融合物である。ヒトKDM4B遺伝子は典型的に染色体19p13.3上に位置し、ヒトAC011523.2領域は典型的に染色体19q13.4上に位置する。特定の実施形態では、KDM4B遺伝子はNCBI遺伝子ID番号:23030、配列  第19染色体;NC_000019.9(4969123..5153609)を有するヒト遺伝子であり、且つ/又は、AC011523.2領域は図1に示されるような配列を含む。特定の実施形態では、KDM4B-AC011523.2融合遺伝子の接合部及び/又は接合断片は、図1及び/又は表1に示されるような配列を含む。
【００２０】
融合遺伝子MAN2A1-FERは、マンノシダーゼ、アルファ、クラス2A、メンバー1(mannosidase, alpha, class 2A, member 1;「MAN2A1」)と(fps/fes関連)チロシンキナーゼ(「FER」)との融合物である。ヒトMAN2A1遺伝子は典型的に染色体5q21.3上に位置し、ヒトFER遺伝子は典型的に染色体5q21上に位置する。特定の実施形態では、MAN2A1遺伝子はNCBI遺伝子ID番号:4124、配列  第5染色体;NC_000005.9(109025156..109203429)又はNC_000005.9(109034137..109035578)を有するヒト遺伝子であり、且つ/又は、FER遺伝子はNCBI遺伝子ID番号:2241、配列  第5染色体:NC_000005.9(108083523..108523373)を有するヒト遺伝子である。特定の実施形態では、MAN2A1-FER融合遺伝子の接合部及び/又は接合断片は、図1、図13及び/又は表1に示されるような配列を含む。
【００２１】
融合遺伝子PTEN-NOLC1は、ホスファターゼ-テンシンホモログ(phosphatase and tensin homolog;「PTEN」)と核小体-コイル小体リン酸化タンパク質1(nucleolar and coiled-body phosphoprotein 1;「NOLC1」)との融合物である。ヒトPTEN遺伝子は典型的に染色体10q23.3上に位置し、ヒトNOLC1遺伝子は典型的に染色体10q24.32上に位置する。特定の実施形態では、PTEN遺伝子はNCBI遺伝子ID番号:5728、配列  第10染色体;NC_000010.11(87863438..87970345)を有するヒト遺伝子であり、且つ/又は、NOLC1遺伝子はNCBI遺伝子ID番号:9221、配列  第10染色体;NC_000010.11(102152176..102163871)を有するヒト遺伝子である。特定の実施形態では、PTEN-NOLC1融合遺伝子の接合部及び/又は接合断片は、図3及び/又は表1に示されるような配列を含む。
【００２２】
融合遺伝子ZMPSTE24-ZMYM4は、亜鉛メタロペプチダーゼSTE24(「ZMPSTE24」)とジンクフィンガー、MYM4型(zinc finger, MYM-type 4;「ZMYM4」)との融合物である。ヒトZMPSTE24は典型的に染色体1p34上に位置し、ヒトZMYM4遺伝子は典型的に染色体1p32-p34上に位置する。特定の実施形態では、ZMPSTE24遺伝子はNCBI遺伝子ID番号:10269、配列  第1染色体;NC_000001.11(40258050..40294184)を有するヒト遺伝子であり、且つ/又は、ZMYM4遺伝子はNCBI遺伝子ID番号:9202、配列  第1染色体;NC_000001.11(35268850..35421944)を有するヒト遺伝子である。特定の実施形態では、ZMPSTE24-ZMYM4融合遺伝子の接合部及び/又は接合断片は図6に示されるような配列を含む。
【００２３】
融合遺伝子CLTC-ETV1は、クラスリン、重鎖(Hc)(clathrin, heavy chain (Hc);「CLTC」)とetsバリアント1(「ETV1」)との融合物である。ヒトCLTCは典型的に染色体17q23.1上に位置し、ヒトETV1遺伝子は典型的に染色体7p21.3上に位置する。特定の実施形態では、CLTC遺伝子はNCBI遺伝子ID番号:1213、配列  第17染色体;NC_000017.11(59619689..59696956)を有するヒト遺伝子であり、且つ/又は、ETV1遺伝子はNCBI遺伝子ID番号:2115、配列  第7染色体;NC_000007.14(13891229..13991425、相補体)を有するヒト遺伝子である。特定の実施形態では、CLTC-ETV1融合遺伝子の接合部及び/又は接合断片は、図6に示されるような配列又はその断片を含む。
【００２４】
融合遺伝子ACPP-SEC13は、前立腺酸ホスファターゼ(acid phosphatase, prostate「ACPP」)とSEC13ホモログ(「SEC13」)との融合物である。ヒトACPPは典型的に染色体3q22.1上に位置し、ヒトSEC13遺伝子は典型的に染色体3p25-p24上に位置する。特定の実施形態では、ACPP遺伝子はNCBI遺伝子ID番号:55、配列  第3染色体;NC_000003.12(132317367..132368302)を有するヒト遺伝子であり、且つ/又は、SEC13遺伝子はNCBI遺伝子ID番号:6396、配列  第3染色体;NC_000003.12(10300929..10321188、相補体)を有するヒト遺伝子である。特定の実施形態では、ACPP-SEC13融合遺伝子の接合部及び/又は接合断片は図6に示されるような配列を含む。
【００２５】
融合遺伝子DOCK7-OLR1は、細胞質分裂デディケーター7(dedicator of cytokinesis 7;「DOCK7」)と酸化型低密度リポタンパク質(レクチン様)受容体1(oxidized low density lipoprotein (lectin-like) receptor 1;「OLR1」)との融合物である。ヒトDOCK7は典型的に染色体1p31.3上に位置し、ヒトOLR1遺伝子は典型的に染色体12p13.2-p12.3上に位置する。特定の実施形態では、DOCK7遺伝子はNCBI遺伝子ID番号:85440、配列  第1染色体;NC_000001.11(62454726..62688368、相補体)を有するヒト遺伝子であり、且つ/又は、OLR1遺伝子はNCBI遺伝子ID番号:4973、配列  第12染色体;NC_000012.12(10158300..10172191、相補体)を有するヒト遺伝子である。特定の実施形態では、DOCK7-OLR1融合遺伝子の接合部及び/又は接合断片は図6に示されるような配列を含む。
【００２６】
融合遺伝子PCMTD1-SNTG1は、タンパク質-L-イソアスパラギン酸(D-アスパラギン酸)O-メチルトランスフェラーゼドメイン含有1(protein-L-isoaspartate (D-aspartate) O-methyltransferase domain containing 1;「PCMTD1」)とシントロフィンガンマ1(syntrophin, gamma 1;「SNTG1」)との融合物である。ヒトPCMTD1は典型的に染色体8q11.23上に位置し、ヒトSNTG1遺伝子は典型的に染色体8q11.21上に位置する。特定の実施形態では、PCMTD1遺伝子はNCBI遺伝子ID番号:115294、配列  第8染色体;NC_000008.11(51817575..51899186、相補体)を有するヒト遺伝子であり、且つ/又は、SNTG1遺伝子はNCBI遺伝子ID番号:54212、配列  第8染色体;NC_000008.11(49909789..50794118)を有するヒト遺伝子である。特定の実施形態では、PCMTD1-SNTG1融合遺伝子の接合部及び/又は接合断片は図6に示されるような配列を含む。
【００２７】
5.2融合遺伝子の検出
セクション5.1に上記される以上の融合遺伝子の任意のものは、当該技術分野において公知の方法により同定することができる。融合遺伝子は、DNA、RNA又はタンパク質中に現れる融合遺伝子を検出することにより検出されてよい。特定の実施形態では、融合遺伝子は、DNA分子、RNA分子又は融合遺伝子によりコードされるタンパク質の存在を決定（判定）することにより検出することができる。限定ではなく、例えば、融合遺伝子の存在は、融合遺伝子によりコードされるタンパク質の存在を決定することにより検出されてよい。
【００２８】
融合遺伝子、例えばMAN2A1-FERは、対象の試料中で検出されてよい。本明細書において交換可能に使用される「患者」又は「対象」は、ヒト又は非ヒト対象を指す。非ヒト対象の非限定的な例としては、非ヒト霊長類動物、イヌ、ネコ、マウスなどが挙げられる。対象は、がんを有すると以前に診断されていてもよいし、診断されていなくてもよい。
【００２９】
特定の非限定的な実施形態では、試料としては、培養物中の細胞、細胞上清、細胞溶解物、血清、血漿、体液(例えば、血液、血漿、血清、糞便、尿、リンパ液、腹水、乳管洗浄液、唾液及び脳脊髄液)及び組織試料が挙げられるがこれらに限定されない。試料の供給源は、固体組織(例えば、新鮮な、冷凍された、且つ/又は保存された臓器、組織試料、生検、又は吸引液)、血液若しくは任意の血液構成成分、体液(例えば、尿、リンパ液、脳脊髄液、羊水、腹膜液又は間質液など)、又は個体からの細胞(循環がん細胞など)であってよい。特定の非限定的な実施形態では、試料はがんから得られる。特定の実施形態では、試料は、対象に由来する試料である「生検試料」又は「臨床試料」であってよい。特定の実施形態では、対象から得られた1つ以上の試料中に1つ以上の融合遺伝子を検出することができる。特定の実施形態では、対象から得られた試料の1つ以上の細胞中に1つ以上の融合遺伝子を検出することができる。特定の実施形態では、試料は、対象からの1つ以上の前立腺がん細胞を含む。特定の実施形態では、試料は前立腺がん試料ではない。特定の実施形態では、試料は肺腺癌、多形膠芽腫及び肝細胞癌試料のいずれでもない。
【００３０】
特定の非限定的な実施形態では、融合遺伝子は、核酸ハイブリダイゼーション分析、例えばin situハイブリダイゼーションにより検出される。in situハイブリダイゼーションは、細胞又は生体試料中のDNA又はRNAの特定の配列を直接的に同定でき、組織試料中の融合遺伝子の存在及び/又は発現の視覚的判定を可能とする技術である。特定の非限定的な実施形態では、融合遺伝子が同じ染色体上に典型的に存在しない遺伝子を組み合わせたものである場合、in situハイブリダイゼーション分析により、同じ染色体へのプローブ結合を実証することができる。限定ではなく、例えば、分析は、1つの遺伝子が通常存在する染色体に焦点を当てたものであってよく、そして他の遺伝子もその染色体上に存在するかどうかを決定するためにハイブリダイゼーション分析を行うことができる。
【００３１】
特定の非限定的な実施形態では、融合遺伝子は蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)分析により検出され、該分析では、細胞又は生体試料中のDNA又はRNAの特定の配列を検出するために蛍光プローブが使用される。
【００３２】
特定の非限定的な実施形態では、融合遺伝子は、DNAハイブリダイゼーション、例えば、これに限定されないがサザンブロット分析により検出される。
【００３３】
特定の非限定的な実施形態では、融合遺伝子は、RNAハイブリダイゼーション、例えば、これに限定されないがノーザンブロット分析により検出される。特定の実施形態では、融合遺伝子の検出のためにノーザンブロット分析を使用することができ、該分析では、単離されたRNA試料が変性性アガロースゲルに流され、好適な支持体、例えば、活性化セルロース、ニトロセルロース又はガラス又はナイロン膜に移される。次に、放射性標識されたcDNA又はRNAを調製物にハイブリダイズさせ、洗浄し、オートラジオグラフィーにより分析してRNA試料中の融合遺伝子の存在を検出する。
【００３４】
特定の非限定的な実施形態では、融合遺伝子は核酸シークエンシング分析により検出される。
【００３５】
特定の非限定的な実施形態では、融合遺伝子は、DNAアレイ、チップ又はマイクロアレイ上に存在するプローブにより検出される。限定ではなく、例えば、1つ以上の融合遺伝子に対応するオリゴヌクレオチドをチップ上に固定化し、次に該チップを対象から得られた試料の標識された核酸とハイブリダイズさせることができる。陽性のハイブリダイゼーションシグナルが融合遺伝子転写物を含有する試料を用いて得られる。
【００３６】
特定の非限定的な実施形態では、融合遺伝子は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(「RT-PCR」)を含む方法により検出される。特定の実施形態では、融合遺伝子は、本明細書に開示される1以上のプライマー対を使用するRT-PCRを含む方法により検出される(例えば、表2を参照)。
【００３７】
【表１】
2020512286.tif 000003
【００３８】
特定の非限定的な実施形態では、融合遺伝子は、抗体結合分析、例えば、これらに限定されないがウエスタンブロット分析及び免疫組織化学により検出される。
【００３９】
特定の非限定的な実施形態では、融合遺伝子が同じ染色体上に典型的に存在しない遺伝子を組み合わせたものである場合、FISH分析により同じ染色体へのプローブ結合を実証することができる。例えば、分析は、1つの遺伝子が通常存在する染色体に焦点を当てたものであってよく、そして他の遺伝子もその染色体上に存在するかどうかを決定するためにハイブリダイゼーション分析を行うことができる。
【００４０】
5.3がん標的
本開示の発明に供され得るがんの非限定的な例としては、前立腺がん、乳がん、肝臓がん、肝癌、ヘパトーマ、肺がん、非小細胞肺がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、膵臓がん、卵巣がん、胃がん、甲状腺がん、多形膠芽腫、結腸直腸がん、肉腫、びまん性大B細胞リンパ腫及び食道腺癌が挙げられる。特定の実施形態では、がんは前立腺がんではない。特定の実施形態では、がんは肺腺癌、多形膠芽腫及び肝細胞癌のいずれでもない。特定の実施形態では、治療の標的は、肺、子宮頸部、子宮内膜、膵臓、卵巣、胃、甲状腺、グリア、腸管、食道、筋肉又はB細胞を伴う前悪性又は新生物性状態（疾患）である。特定の実施形態では、治療の標的は、1つ以上の融合遺伝子、例えばMAN2A1-FERを有する細胞である。
【００４１】
5.4治療方法
本発明は、1つ以上の融合遺伝子を有する対象、例えば、1つ以上の融合遺伝子を有するがん又は新生物性若しくは前悪性状態を有する又は有することが疑われる対象を治療する方法を提供する(前悪性状態は、とりわけ、前悪性又は新生物性の細胞の存在により特徴付けられる)。特定の実施形態では、治療方法は、抗がん効果、抗新生物効果及び/又は抗細胞増殖効果を生じさせるように1つ以上の融合遺伝子を有する対象を治療することを含む。融合遺伝子の非限定的な例は、本明細書及びセクション5.1に開示されている。特定の実施形態では、融合遺伝子はMAN2A1-FERである。開示される方法を使用して治療できるがんの非限定的な例はセクション5.3に提供されている。特定の実施形態では、がんは前立腺がんではない。特定の実施形態では、がんは肺腺癌、多形膠芽腫及び肝細胞癌のいずれでもない。
【００４２】
特定の実施形態では、がんを有する対象を治療する方法は、対象から得られた試料、例えばがんからの試料中の1つ以上の融合遺伝子の存在を決定することを含む。融合遺伝子の非限定的な例としては、TRMT11-GRIK2、SLC45A2-AMACR、MTOR-TP53BP1、LRRC59-FLJ60017、TMEM135-CCDC67、KDM4B-AC011523.2、MAN2A1-FER、PTEN-NOLC1、CCNH-C5orf30、ZMPSTE24-ZMYM4、CLTC-ETV1、ACPP-SEC13、DOCK7-OLR1及びPCMTD1-SNTG1が挙げられる。1つ以上の融合遺伝子が試料中に存在する場合、抗がん効果及び/又は抗新生物効果を生じさせるように対象が治療される。特定の実施形態では、方法は、本明細書に開示される融合遺伝子の1以上、2以上、3以上、4以上、5以上、6以上、7以上、8以上、9以上、10以上、11以上、12以上、13以上又は14全ての存在又は非存在を決定することを含むことができる。限定ではなく、例えば、がんを有する対象を治療する方法は、対象から得られた試料中のMAN2A1-FER融合遺伝子の存在を決定することを含む。
【００４３】
特定の実施形態では、本開示は、前悪性又は新生物性状態を有する対象を治療する方法を提供する。特定の実施形態では、前悪性又は新生物性状態は、対象から得られた試料(又は1つ以上の細胞)内の1つ以上の融合遺伝子の存在により同定される。特定の実施形態では、方法は、対象から得られた試料(又は試料の1つ以上の細胞)中の1つ以上の融合遺伝子の存在を決定することを含み、1つ以上の融合遺伝子が試料中に検出された場合、例えば、融合遺伝子の産物に特異的な治療有効量の作用剤を対象に投与することにより、抗新生物効果を生じさせるように対象を治療することを含む。融合遺伝子の産物に特異的な作用剤の非限定的な例は、本明細書の全体を通じて開示されている。
【００４４】
「抗がん効果（抗がん作用）」は、凝集がん細胞量の低減、がん細胞増殖速度の低減、がん進行の低減、がん細胞増殖の低減、腫瘍量の低減、腫瘍体積の低減、腫瘍細胞増殖の低減、腫瘍成長速度の低減及び/又は腫瘍転移の低減の1つ以上を指す。特定の実施形態では、抗がん効果は、がんを有すると診断された患者における完全奏功、部分奏功、安定した疾患(進行又は再発なし)、後の再発を伴う応答又は無増悪生存を指すことができる。同様に、「抗新生物効果（抗新生物作用）」は、凝集新生物細胞量の低減、新生物細胞の増殖速度の低減、新生物進行の低減(例えば、進行性の脱分化又は上皮間葉転換)、新生物細胞の増殖の低減、新生物量の低減、新生物体積の低減、及び/又は新生物の増殖速度の低減の1つ以上を指す。
【００４５】
特定の実施形態では、対象、例えば、融合遺伝子を有するがんを有する対象又は融合遺伝子を含む1つ以上の細胞を有する対象を治療する方法は、対象から得られた試料中の1つ以上の融合遺伝子の存在を決定することを含み、1つ以上の融合遺伝子が試料中に検出された場合、治療有効量の阻害剤、例えば、融合遺伝子の産物に特異的な阻害剤を対象に投与することを含む。特定の実施形態では、阻害剤を投与して、対象において抗がん効果(作用）を生じさせることができる。限定ではなく、例えば、本発明は、対象から得られた試料中のMAN2A1-FER融合遺伝子の存在を決定すること、及び、MAN2A1-FER融合遺伝子が試料中に検出された場合、治療有効量の阻害剤、例えば、MAN2A1-FER融合遺伝子の産物に特異的な阻害剤を対象に投与することを含む、対象を治療する方法を提供する。
【００４６】
「治療有効量（治療的に有な効量）」は、以下の1つ以上を達成できる量を指す:抗がん効果(作用）、抗新生物効果(作用）、生存の延長及び/又は再発までの期間の延長。
【００４７】
特定の実施形態では、対象を治療する方法は、融合遺伝子を阻害すること及び/又は融合遺伝子産物、例えば、融合遺伝子によりコードされるタンパク質及び/又はRNAを阻害することを対象とする。限定ではなく、例えば、対象を治療する本発明の方法は、MAN2A1-FER融合遺伝子を阻害すること及び/又はMAN2A1-FER融合遺伝子産物、例えば、MAN2A1-FER融合遺伝子によりコードされるタンパク質及び/又はRNAを阻害することを対象とする。
【００４８】
本発明はさらに、腫瘍の成長を予防し、最小化させ且つ/又は低減させる方法であって、対象の試料中の1つ以上の融合遺伝子の存在を決定することを含み、1つ以上の融合遺伝子が試料中に存在する場合、融合遺伝子の産物に特異的な治療有効量の作用剤を対象に投与して、腫瘍の成長を予防し、最小化させ且つ/又は低減させることを含む、方法を提供する。
【００４９】
本発明は、がん細胞の成長及び/又は増殖を予防し、最小化させ且つ/又は低減させる方法であって、対象の試料中の1つ以上の融合遺伝子の存在を決定することを含み、1つ以上の融合遺伝子が試料中に存在する場合、融合遺伝子の産物に特異的な治療有効量の作用剤を対象に投与して、がん細胞の成長及び/又は増殖を予防し、最小化させ且つ/又は低減させることを含む、方法を提供する。
【００５０】
特定の非限定的な実施形態では、本発明は、対象においてがん及び/又は腫瘍及び/又は新生物成長を治療し且つ/又はその進行を阻害する方法であって、対象の試料中の1つ以上の融合遺伝子の存在を決定することを含み、1つ以上の融合遺伝子が試料中に存在する場合、融合遺伝子の産物に特異的な治療有効量の剤を対象に投与して、がん及び/又は腫瘍を治療し且つ/又はその進行を阻害することを含む、方法を提供する。
【００５１】
特定の実施形態では、本発明は、がんを有する対象の生存期間を長期化させる方法を提供する。特定の実施形態では、方法は、対象の試料中の1つ以上の融合遺伝子の存在を決定することを含み、1つ以上の融合遺伝子が試料中に検出された場合、治療有効量の阻害剤、例えば、融合遺伝子の産物に特異的な阻害剤を対象に投与することを含む。特定の実施形態では、がんを有する対象の生存期間は、開示される方法を使用して、約1カ月、約2カ月、約4カ月、約6カ月、約8カ月、約10カ月、約12カ月、約14カ月、約18カ月、約20カ月、約2年、約3年、約5年又はそれより長く長期化させることができる。
【００５２】
本発明はさらに、1つ以上の融合遺伝子を含有する1つ以上の細胞を有する対象のための治療を決定する方法を提供する。特定の実施形態では、方法は、i)対象からの試料を提供すること、ii)対象の1つ以上の細胞が、TMEM135-CCDC67、TRMT11-GRIK2、SLC45A2-AMACR、MTOR-TP53BP1、LRRC59-FLJ60017、KDM4B-AC011523.2、MAN2A1-FER、PTEN-NOLC1、CCNH-C5orf30、ZMPSTE24-ZMYM4、CLTC-ETV1、ACPP-SEC13、DOCK7-OLR1、PCMTD1-SNTG1及びこれらの組合せからなる群から選択される1つ以上の融合遺伝子を含有するかどうかを決定すること、及びiii)1つ以上の融合遺伝子が対象の1つ以上の細胞中に検出された場合、検出された1つ以上の融合遺伝子に特異的な治療有効量の1つ以上の阻害剤の投与を指示することを含み、対象は前立腺がんを有しない。
【００５３】
本発明はさらに、がんを発症するリスクのある対象を同定する方法を提供する。特定の実施形態では、方法は、対象から得られた1つ以上の細胞が1つ以上の融合遺伝子を含有するかどうかを決定することを含み、1つ以上の細胞が1つ以上の融合遺伝子を含有する場合、対象はがんを発症するリスクがあり、がんは前立腺がんではない。
【００５４】
本発明はさらに、前悪性状態を有する対象を診断する方法を提供する。特定の実施形態では、方法は、対象から得られた1つ以上の細胞が1つ以上の融合遺伝子を含有するかどうかを決定することを含み、1つ以上の細胞が1つ以上の融合遺伝子を含有する場合、対象は前悪性状態を有し、対象は前立腺がんを有しない。
【００５５】
特定の実施形態では、試料中の融合遺伝子はゲノムシークエンシングにより検出される。特定の実施形態では、試料中の融合遺伝子はRNAシークエンシングにより検出される。限定ではなく、例えば、RNAシークエンシングは、本明細書に開示されるプライマーを使用して行うことができる。特定の実施形態では、試料中の融合遺伝子はFISHにより検出される。
【００５６】
阻害剤の例としては、融合遺伝子によりコードされるタンパク質の発現及び/又は活性を阻害し且つ/又は低減させる化合物、分子、化学物質、ポリペプチド及びタンパク質が挙げられるがこれらに限定されない。代替的又は追加的に、阻害剤としては、融合遺伝子の1つ以上の下流の標的の発現、例えばRNA発現若しくはタンパク質発現、及び/又は活性を阻害し且つ/又は低減させる化合物、分子、化学物質、ポリペプチド及びタンパク質を挙げることができる。阻害剤の追加の非限定的な例としては、融合遺伝子の発現及び/若しくは活性を特異的に阻害し若しくは低減させ且つ/又は融合遺伝子の1つ以上の下流の標的の発現及び/若しくは活性を阻害し若しくは低減させるリボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、shRNA分子及びsiRNA分子が挙げられる。阻害剤の1つの非限定的な例は、融合遺伝子配列の少なくとも一部分に相同的なアンチセンス、shRNA又はsiRNA核酸配列を含み、融合遺伝子配列と比べた該部分の相同性は、少なくとも約75又は少なくとも約80又は少なくとも約85又は少なくとも約90又は少なくとも約95又は少なくとも約98パーセントであり、相同性パーセントは、例えばBLAST又はFASTAソフトウェアにより決定することができる。特定の実施形態では、アンチセンス、shRNA又はsiRNA核酸配列は、本明細書において染色体切断点と称されることもある、融合遺伝子のスプライシングされた遺伝子間の境界を含む「接合断片」における配列に相同的なものであり得る。開示される融合遺伝子の接合断片配列に相同的なsiRNAの非限定的な例は表1に示される。標的化できる染色体切断点の非限定的な例は、表1並びに図1〜3、6及び13に開示されている。特定の実施形態では、阻害剤は、MAN2A1-FERの接合断片配列に相同的なsiRNAである。特定の実施形態では、アンチセンス、shRNA又はsiRNA核酸配列は、接合断片の部分に相同的な配列を含むことができる。
【００５７】
特定の非限定的な実施形態では、アンチセンス核酸、shRNA又はsiRNA分子の相補的部分は、少なくとも10ヌクレオチド又は少なくとも15ヌクレオチド又は少なくとも20ヌクレオチド又は少なくとも25ヌクレオチド又は少なくとも30ヌクレオチドを構成してよく、且つ、アンチセンス核酸、shRNA又はsiRNA分子は、最大15又は最大20又は最大25又は最大30又は最大35又は最大40又は最大45又は最大50又は最大75又は最大100ヌクレオチドの長さであってよい。アンチセンス、shRNA又はsiRNA分子は、DNA又は非典型的な若しくは天然に存在しない残基、例えば、以下に限定されないが、ホスホロチオエート残基及びロックド核酸を含んでよい。
【００５８】
特定の実施形態では、阻害剤は、融合遺伝子によりコードされるタンパク質に特異的に結合し且つその発現及び/又は活性を阻害し且つ/又は低減させる抗体、又はその誘導体、例えばアンタゴニスト抗体を含むことができる。代替的又は追加的に、阻害剤は、融合遺伝子の1つ以上の下流の標的に特異的に結合し且つその発現及び/又は活性を阻害し且つ/又は低減させる抗体、又はその誘導体を含むことができる。「特異的に結合する」という語句は、同一又は類似のエピトープ、抗原又は抗原決定基の第2の調製物により結合を解離させ又は結合に競合することができる様式でのエピトープ又は抗原又は抗原決定基への例えば抗体の結合を指す。開示される方法において使用できる抗体、及びその誘導体の非限定的な例としては、ポリクローナル又はモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、霊長類化(CDRグラフト)抗体、ベニア抗体又は一本鎖抗体、ファージ産生抗体(例えば、ファージディスプレイライブラリーから)の他に、抗体の機能的結合断片が挙げられる。抗原結合断片、又はその部分としては、Fv、Fab、Fab'及びF(ab')2が挙げられるがこれらに限定されない。そのような断片は、酵素切断又は組換え技術により製造することができる。特定の実施形態では、阻害剤は、MAN2A1-FER融合遺伝子によりコードされるタンパク質に特異的に結合し且つその発現及び/若しくは活性を阻害し且つ/若しくは低減させ又はMAN2A1-FER融合遺伝子の1つ以上の下流の標的に結合し且つその発現及び/若しくは活性を阻害し且つ/若しくは低減させる抗体、又はその誘導体であってよい。限定ではなく、例えば、MAN2A1-FER融合遺伝子の阻害剤、例えば、抗体、又はその誘導体は、MAN2A1、FER及び/又はMAN2A1-FERの下流の標的を標的化することができる。限定ではなく、例えば、阻害剤は、EGFR、B-raf、MEK及び/又はAKTの発現及び/又は活性を阻害し且つ/又は低減させることができる。
【００５９】
特定の実施形態では、対象の試料中に検出される融合遺伝子によりコードされるタンパク質がキナーゼ活性を示す場合、対象、例えば、融合遺伝子を有するがんを有する対象を治療する方法は、融合遺伝子によりコードされるタンパク質、すなわちキナーゼ阻害剤のキナーゼ活性を阻害し且つ/又は低減させる治療有効量の阻害剤を対象に投与することを含むことができる。キナーゼ阻害剤の非限定的な例としては、アファチニブ、アレクチニブ、アキシチニブ、ベバシズマブ、ボスチニブ、セツキシマブ、クリゾチニブ、カネルチニブ、ダサチニブ、エルロチニブ、フォスタマチニブ、ゲフィチニブ、GSK1838705A、イブルチニブ、イマチニブ、ラパチニブ、レンバチニブ、ムブリチニブ、ニロチニブ、パニツムマブ、パゾパニブ、ペガプタニブ、ラニビズマブ、ルキソリチニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、su6656、トラスツズマブ、トファシチニブ、バンデタニブ及びベムラフェニブが挙げられる。限定ではなく、例えば、対象の試料中に検出される融合遺伝子によりコードされるタンパク質がチロシンキナーゼ活性を示す場合、治療有効量のチロシンキナーゼ阻害剤を対象に投与することができる。
【００６０】
特定の実施形態では、対象、例えば、がん(例えば、前立腺がんではない)を有する対象を治療する方法は、対象の試料中のMAN2A1-FERの存在を決定することを含むことができ、MAN2A1-FER融合遺伝子が試料中に存在する場合、治療有効量のFER阻害剤を用いて対象を治療することができる。FER阻害剤の非限定的な例としては、クリゾチニブ、TAE684、WZ-4-49-8、WZ-4-49-10及びWZ-4-24-7が挙げられる。特定の非限定的な実施形態では、FER阻害剤は、ジアミノピリミジン又はピラゾロピリジジン(pyrazologyrididine)化合物に由来するものであってよい。FER阻害剤のさらなる非限定的な例は、PCT出願第2009/019708号パンフレット(その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)に開示されている。特定の実施形態では、FER阻害剤としては、チロシンキナーゼ阻害剤及び、FERはALKと高い配列類似度を示すのでALK阻害剤を挙げることができる。特定の実施形態では、FER阻害剤は、MAN2A1-FERタンパク質の発現及び/又は活性を低減させ且つ/又は阻害する抗体である。特定の実施形態では、FER阻害剤は、MAN2A1-FER融合遺伝子又はMAN2A1-FER融合遺伝子の接合部配列を標的化するsiRNAを含む。MAN2A1-FER融合遺伝子を標的化するsiRNA配列の非限定的な例は表1に示される。特定の実施形態では、開示される方法を使用して標的化できるMAN2A1-FER融合遺伝子の染色体切断点は、表1並びに図1及び図13に示される。
【００６１】
代替的又は追加的に、MAN2A1-FER融合遺伝子を発現する対象、例えば、MAN2A1-FER融合遺伝子を有するがんを有する対象を治療する方法は、MAN2A1-FER融合遺伝子の1つ以上の下流の標的の活性及び/又は発現を低減させ且つ/又は阻害する化合物を対象に投与することを含むことができる。限定ではなく、例えば、方法は、EGFR-RAS-BRAF-MEKシグナル伝達経路の阻害を含むことができる。EGFR活性を阻害する化合物の非限定的な例としては、エルロチニブ、セツキシマブ、ゲフィチニブ、ベバシズマブ、カネルチニブ、パニツムマブ及びボルテゾミブが挙げられる。EGFR阻害剤の追加の非限定的な例は、Dziadziuszko及びJassem, Annals of Oncology 23(Suppl._10):193-196(2012)に開示されている。B-raf活性を阻害する化合物の非限定的な例はRAF265である。MEK活性を阻害する化合物の非限定的な例としては、ビニメチニブ、ベムラフェニブ、PD-325901、セルメチニブ及びトラメチニブが挙げられる。AKT阻害剤の非限定的な例は、Nitulescu et al., Int J Oncol. 48(3):869-885 (2016)に開示されている(Nitulescu et al. (2016)の表1を参照)。EGFR-RAS-BRAF-MEKシグナル伝達経路を阻害する化合物の追加の非限定的な例としては、TAK-733、ホノキオール、AZD8330、PD318088、BIX 02188、ピマセルチブ、SL-327、BIX 02189、PD98059、MEK162、PD184352及びU0126-EtOHが挙げられる。
【００６２】
特定の実施形態では、方法は、融合遺伝子の第1のタンパク質の活性及び/又は発現を低減させ且つ/又は阻害する化合物を、融合遺伝子の第2のタンパク質の活性及び/又は発現を低減させ且つ/又は阻害する化合物と組み合わせて対象に投与することを含むことができる。例えば、特定の実施形態では、MAN2A1-FER融合遺伝子を発現する対象、例えば、MAN2A1-FER融合遺伝子を有するがんを有する対象を治療する方法は、FERの活性及び/又は発現を低減させ且つ/又は阻害する化合物、例えばFER阻害剤を、MAN2A1-FER融合遺伝子の1つ以上の下流の標的の活性及び/又は発現を低減させ且つ/又は阻害する化合物と組み合わせて対象に投与することを含むことができる。特定の実施形態では、組み合わせて使用されることは、FER阻害剤とMAN2A1-FER融合遺伝子の1つ以上の下流の標的の活性及び/又は発現を低減させ且つ/又は阻害する化合物とが投与の前に物理的に合わせられること又はそれらが同じ時間枠にわたって投与されることを必要としない。したがって、MAN2A1-FER融合遺伝子の1つ以上の下流の標的の活性及び/又は発現を低減させ且つ/又は阻害する化合物は、FER阻害剤の1つ以上の用量の投与の前に、それと並行して、又はその後に投与されてよい。限定ではなく、例えば、MAN2A1-FER融合遺伝子を発現する対象を治療する方法は、治療有効量のクリゾチニブ及び治療有効量のカネルチニブを対象に投与することを含むことができる。
【００６３】
特定の実施形態では、対象、例えば、融合遺伝子を有するがんを有する又は前悪性若しくは新生物性状態を有する対象を治療する方法は、対象の試料中のSLC45A2-AMACRの存在を決定することを含むことができ、SLC45A2-AMACR融合遺伝子が試料中に存在する場合、治療有効量のラセマーゼ阻害剤及び/又はAMACR阻害剤を用いて対象を治療することを含むことができる。ラセマーゼ及び/又はAMACR阻害剤の非限定的な例としては、エブセレン、2-(2,5-ジヒドロキシ-4-メチルフェニル)-5-メチルベンゼン-1,4-ジオール(DMPMB)、2-メチルスルファニル-7,9-ジヒドロ-3H-プリン-6,8-ジチオン(MSDTP)、2,5-ジ(ピラゾル-1-イル)ベンゼン-1,4-ジオール(DPZBD)、Rose Bengal、Congo Red、3,5-ジ(ピリジン-4-イル)-1,2,4-チアジアゾール(DPTD)、エブセレンオキシド及び3,7,12-トリヒドロキシコレスタノイルコエンザイムA(THCA-CoA)が挙げられる。特定の非限定的な実施形態では、ラセマーゼ阻害剤はN-メチルチオカルバメートであってよい。AMACR阻害剤のさらなる非限定的な例は、Wilson et al., Mol. Cancer Ther. (2011), 10(5): 825-838(その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)に開示されている。
【００６４】
特定の実施形態では、対象、例えば、本明細書に開示される融合遺伝子、例えばMAN2A1-FER融合遺伝子を有するがんを有する対象を治療する方法は、治療有効量の抗がん剤又は抗新生物効果を結果としてもたらす作用剤（薬剤）を投与することをさらに含むことができる。「抗がん剤」は、抗がん効果を有する任意の分子、化学的化合物又は組成物であってよい。抗がん剤としては、化学療法剤、放射線療法剤、サイトカイン、抗血管新生剤、アポトーシス誘導剤又は抗がん性免疫毒素が挙げられるがこれらに限定されない。特定の非限定的な実施形態では、本明細書に開示される阻害剤は、1つ以上の抗がん剤と組み合わせて投与することができる。本明細書で使用される場合、「と組み合わせて」は、1つ以上の阻害剤化合物及び/又は対象に投与される作用剤と1つ以上の抗がん剤とが治療レジメン又は計画の部分として対象に投与されることを意味する。この用語は、阻害剤及び/又はキナーゼ阻害剤と1つ以上の抗がん剤とが投与の前に物理的に合わせられることも、それらが同じ時間枠にわたって投与されることも必要としない。抗がん剤の追加の非限定的な例としては、アビラテロン酢酸塩、ビカルタミド、カバジタキセル、カソデックス(ビカルタミド)、デガレリクス、ドセタキセル、エンザルタミド、ゴセレリン酢酸塩、ジェブタナ(カバジタキセル)、ロイプロリド酢酸塩、ルプロン(ロイプロリド酢酸塩)、ルプロンデポー(Lupron Depo;ロイプロリド酢酸塩)、ルプロンデポー3カ月(Lupron Depo-3 Month;ロイプロリド酢酸塩)、ルプロンデポー4カ月(Lupron Depo-4 Month;ロイプロリド酢酸塩)、ルプロンデポー-Ped(ロイプロリド酢酸塩)、ミトキサントロン塩酸塩、プレドニゾン、プロベンジ(シプリューセル-T)、ラジウム223二塩化物、シプリューセル-T、タキソテール(ドセタキセル)、ビアデュール(Viadur;ロイプロリド酢酸塩)、ゾーフィゴ(ラジウム223二塩化物)、イクスタンジ(エンザルタミド)、ゾラデックス(ゴセレリン酢酸塩)及びザイティガ(アビラテロン酢酸塩)が挙げられる。
【００６５】
特定の実施形態では、対象、例えば、1つ以上の融合遺伝子、例えばMAN2A1-FER融合遺伝子を有するがんを有する対象を治療する方法は、対象の試料中の1つ以上の融合遺伝子の存在を決定することを含み、1つ以上の融合遺伝子が試料中に検出された場合、凍結療法（寒冷療法）、放射線療法、化学療法、ホルモン療法、生物学的療法、ビスホスホネート療法、高密度焦点式超音波（高強度焦点式超音波）、頻繁なモニタリング、頻繁な前立腺特異的抗原(PSA)のチェック及び根治的前立腺摘除の1つ以上を行うことを含む。生物学的治療の非限定的な例はシプリューセル-Tである。ビスホスホネート療法としては、クロドロネート又はゾレドロネートが挙げられるがこれらに限定されない。特定の実施形態では、これらの方法を使用して、対象において抗がん効果を生じさせることができる。特定の実施形態では、試料は前立腺がん試料ではない。
【００６６】
ホルモン療法は、睾丸摘除術、黄体形成ホルモン放出ホルモン(LHRH)アナログ及び/又はアゴニスト、LHRHアンタゴニスト、抗アンドロゲン又はアンドロゲン抑制薬物、エストロゲン、抗エストロゲン、プロゲスチン、ゴナドトロピン放出ホルモン(GnRH)アナログ及びアロマターゼ阻害剤の投与の1つ以上を含むことができる。LHRHアナログ及び/又はアゴニストの非限定的な例としては、ロイプロリド、ゴセレリン及びブセレリンが挙げられる。LHRHアンタゴニストの非限定的な例としては、アバレリクス、セトロレリクス、ガニレリクス及びデガレリクスが挙げられる。抗アンドロゲン薬物としては、フルタミド、ビカルタミド、エンザルタミド及びニルタミドが挙げられるがこれらに限定されない。アンドロゲン抑制薬物の非限定的な例としては、エストロゲン、ケトコナゾール及びアミノグルテチミドが挙げられる。頻繁なモニタリングは、定期的な間隔、例えば、約3〜約6カ月間隔でのPSA血液試験、デジタル直腸検査、超音波及び/又は経直腸超音波ガイド前立腺生検により前立腺がんの状態をモニターすることを含むことができる。根治的前立腺摘除は、前立腺全体及び一部の周囲組織の除去を伴う外科的処置である。前立腺摘除は観血手術により行うことができ、又は腹腔鏡手術により行ってもよい。
【００６７】
【表２】
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2020512286.tif 000005
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【００６８】
5.6医薬配合物
特定の非限定的な実施形態では、本発明は、治療的な使用のための阻害剤及び/又は上記に開示される作用剤の医薬配合物を提供する。特定の実施形態では、医薬配合物は、融合遺伝子の産物に特異的な1つ以上の作用剤及び薬学的に許容される担体を含む。限定ではなく、例えば、医薬配合物は、例えば、MAN2A1-FER融合遺伝子を有するがんを有する対象の治療において使用するために、FER及び/又はEGFR阻害剤並びに薬学的に許容される担体を含む。特定の実施形態では、がんは前立腺がんではない。作用剤及び/又は阻害剤の非限定的な例は、上記のセクション5.5に開示されている。
【００６９】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、活性成分、例えば阻害剤の生物学的活性の有効性に干渉せず、且つそれが投与される患者にとって毒性でない任意の担体を含む。好適な薬学的担体の非限定的な例としては、リン酸緩衝食塩水溶液、水、エマルション、例えば油/水エマルション、様々な種類の湿潤剤及び滅菌溶液が挙げられる。薬学的に許容される担体の追加の非限定的な例としては、阻害剤を含有するゲル、生体吸着性マトリックス材料、インプラント挿入成分及び/又は任意の他の好適なビヒクル、送達若しくは分配手段又は材料を挙げることができる。そのような担体は従来法により配合することができ、対象に投与することができる。特定の実施形態では、薬学的に許容される担体は、緩衝剤、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸;アスコルビン酸及びメチオニンなどの酸化防止剤;防腐剤(以下に限定されないが、例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール、アルキルパラベン、例えばメチル又はプロピルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、3-ペンタノール及びm-クレゾール);低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン;アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリシン;単糖、二糖、及び他の炭水化物、例えば、グルコース、マンノース又はデキストリン;キレート剤、例えばEDTA;糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール;塩形成対イオン、例えばナトリウム;金属錯体(例えば、Zn-タンパク質複合体);及び/又は非イオン性界面活性剤、例えばポリエチレングリコール(PEG)を含むことができる。特定の実施形態では、好適な薬学的に許容される担体は、水、食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール又はこれらの組合せの1つ以上を含むことができる。
【００７０】
特定の実施形態では、本発明の方法及び配合物は、がん及び/又は腫瘍成長を低減させ、阻害し、予防し又は後退させるために使用することができる。細胞内送達のための標準的な方法を使用することができる(例えば、リポソームを介する送達)。そのような方法は当業者に周知である。細胞内への阻害剤の治療的投与はまた、例えばshRNAを使用することにより、遺伝子療法を使用して達成することができる。最終的に選択される投与経路は多数の要因に依存し、当業者により確認することができる。
【００７１】
特定の非限定的な実施形態では、本発明の医薬配合物は、経口投与のために好適な当該技術分野において周知の薬学的に許容される担体を使用して配合することができる。そのような担体は、治療される患者による経口又は経鼻摂取のための錠剤、丸剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁液剤などとして医薬組成物が配合されることを可能とする。特定の実施形態では、医薬配合物は固体投与剤形であってよい。特定の実施形態では、錠剤は即時放出錠剤であってよい。代替的又は追加的に、錠剤は持続又は制御放出錠剤であってよい。特定の実施形態では、固体投与量は、即時放出部分及び持続又は制御放出部分の両方を含むことができる。
【００７２】
特定の実施形態では、本発明の医薬配合物は、非経口投与のために好適な当該技術分野において周知の薬学的に許容される担体を使用して配合することができる。本明細書で使用される「非経口投与」及び「非経口的に投与される」という用語は、経腸及び外用投与以外の投与の様式(通常、注射による)を指し、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外及び胸骨内への注射及び注入が挙げられるがこれらに限定されない。限定ではなく、例えば、本発明の配合物は、生理食塩水などの薬学的に許容される担体中で患者に静脈内投与することができる。特定の実施形態では、本発明は、FER及び/又はEGFR阻害剤を含む非経口配合物を提供する。
【００７３】
特定の実施形態では、本発明において使用するために好適な医薬配合物は、活性成分、例えばFER及び/又はEGFR阻害剤が治療有効量で含有された配合物を含むことができる。活性成分の治療有効量は、活性成分、例えばFER及び/又はEGFR阻害剤、使用される配合物、がん及びその重篤度、並びに治療される対象の年齢、体重などに応じて変化し得る。特定の実施形態では、1つ以上の配合物の単回又は複数回投与(これは患者により必要とされる及び認容される投与量及び頻度に依存し得る)で治療有効量の本明細書に開示される阻害剤及び/又は作用剤を患者に与えることができる。
【００７４】
特定の非限定的な実施形態では、上記される阻害剤及び/又は作用剤は、単独で又は1つ以上の抗がん剤と組み合わせて使用することができる。上記の通り、「と組み合わせて」は、阻害剤及び1つ以上の抗がん剤が治療レジメン又は計画の部分として対象に投与されることを意味する。特定の実施形態では、組み合わせて使用されることは、阻害剤と1つ以上の抗がん剤とが投与の前に物理的に合わせられること又はそれらが同じ時間枠にわたって投与されることを必要としない。したがって、第2の抗がん剤は、阻害剤の1つ以上の用量の投与の前に、それと並行して、又はその後に投与されてよい。
【００７５】
特定の非限定的な実施形態では、FER阻害剤は、EGFR阻害剤と組み合わせて使用することができる。限定ではなく、例えば、本発明の医薬配合物は、1つ以上のFER及び/又は1つ以上のEGFR阻害剤を含むことができる。限定ではなく、例えば、本発明の医薬配合物は、治療有効量の1つ以上のFER阻害剤及び治療有効量の1つ以上のEGFR阻害剤を含むことができる。特定の実施形態では、FER阻害剤はクリゾチニブである。特定の実施形態では、EGFR阻害剤はカネルチニブである。特定の実施形態では、本発明の医薬配合物は、クリゾチニブ及びカネルチニブを含むことができる。
【００７６】
特定の実施形態では、阻害剤が抗がん剤と組み合わせて使用される場合、それぞれの量は、一部の例では、その作用剤が単独で摂取される場合の治療有効量未満であるが、両方が治療的に使用された時に有効性が達成される量であってよい。
【００７７】
5.7キット
本発明はさらに、本明細書に開示される1つ以上の融合遺伝子を検出するため並びに/又は上記に列記される検出及び治療方法のいずれか1つを実行するためのキットを提供する。
【００７８】
キットの種類としては、パッケージ化された融合遺伝子特異的プローブ及びプライマーセット(例えば、TaqManプローブ/プライマーセット)、アレイ/マイクロアレイ、抗体が挙げられるがこれらに限定されず、これらは例えば、対象の1つ以上の細胞、例えばがん細胞中の本発明の1つ以上の融合遺伝子を検出するための1つ以上のプローブ、プライマー、又は他の試薬をさらに含有する。特定の実施形態では、1つ以上のがん細胞は前立腺がん細胞ではない。特定の実施形態では、1つ以上のがん細胞は肺腺癌、多形膠芽腫及び肝細胞癌細胞のいずれでもない。
【００７９】
特定の非限定的な実施形態では、上記に列記される方法のいずれかの実行において使用するための1つ以上の核酸プライマー若しくはプローブ及び/又は抗体プローブを含むキットが提供される。前記プローブは、例えば、ビオチン、比色、蛍光又は放射性マーカーにより、検出可能に標識されていてよい。核酸プライマーは、例えばポリメラーゼ連鎖反応において使用するために、ペアの部分として提供されてよい。特定の非限定的な実施形態では、核酸プライマーは、少なくとも約10ヌクレオチド若しくは少なくとも約15ヌクレオチド若しくは少なくとも約20ヌクレオチドの長さ且つ/又は最長約200ヌクレオチド若しくは最長約150ヌクレオチド若しくは最長約100ヌクレオチド若しくは最長約75ヌクレオチド若しくは最長約50ヌクレオチドの長さであってよい。核酸プローブは、オリゴヌクレオチドプローブ及び/又はFISH分析のために好適なプローブであってよい。特定の非限定的な実施形態では、キットは、TRMT11-GRIK2、SLC45A2-AMACR、MTOR-TP53BP1、LRRC59-FLJ60017、TMEM135-CCDC67、KDM4B-AC011523.2、MAN2A1-FER、PTEN-NOLC1、CCNH-C5orf30、ZMPSTE24-ZMYM4、CLTC-ETV1、ACPP-SEC13、DOCK7-OLR1及びPCMTD1-SNTG1の少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14個の分析のためのプライマー及び/又はプローブを含む。特定の実施形態では、本発明のキットは、対象の試料中、例えば、対象からの1つ以上のがん細胞中のMAN2A1-FERの存在を決定するためのプライマー及び/又はプローブを含むことができる。特定の実施形態では、1つ以上のがん細胞は前立腺がん細胞ではない。特定の実施形態では、1つ以上のがん細胞は肺腺癌、多形膠芽腫及び肝細胞癌のいずれのがん細胞でもない。
【００８０】
特定の非限定的な実施形態では、核酸プライマー及び/又はプローブは、固体表面、基板又は支持体、例えば核酸マイクロアレイ上に固定化されていてよく、固体表面又は支持体に結合した各プライマー及び/又はプローブの位置は既知且つ同定可能である。核酸プライマー及び/又はプローブは、基板、例えば、ガラス、プラスチック、紙、ナイロン若しくは他の種類の膜、フィルター、チップ、ビーズ、又は任意の他の好適な固体支持体に取り付けることができる。核酸プライマー及び/又はプローブは、基板上で直接的に合成してもよく、又は基板から離れて合成した後に基板に取り付けてもよい。アレイは、公知の方法を使用して作製することができる。
【００８１】
非限定的な実施形態では、キットは、例えば、TRMT11-GRIK2、SLC45A2-AMACR、MTOR-TP53BP1、LRRC59-FLJ60017、TMEM135-CCDC67、KDM4B-AC011523.2、MAN2A1-FER、PTEN-NOLC1、CCNH-C5orf30、ZMPSTE24-ZMYM4、CLTC-ETV1、ACPP-SEC13、DOCK7-OLR1及びPCMTD1-SNTG1からなる群から選択される1つ以上の融合遺伝子のFISH分析のための核酸プローブを提供する。特定の実施形態では、本発明のキットは、MAN2A1-FER融合遺伝子のFISH分析のための核酸プローブを含む。特定の非限定的な実施形態では、融合遺伝子を検出するためのプローブは、別々のプローブが融合遺伝子の2つの成分にそれぞれ結合するように提供されてもよく、又はプローブがスプライシングされた遺伝子間の境界を含む「接合断片」に結合してもよい。特定の非限定的な実施形態では、キットは、TRMT11-GRIK2、SLC45A2-AMACR、MTOR-TP53BP1、LRRC59-FLJ60017、TMEM135-CCDC67、KDM4B-AC011523.2、MAN2A1-FER、PTEN-NOLC1、CCNH-C5orf30、ZMPSTE24-ZMYM4、CLTC-ETV1、ACPP-SEC13、DOCK7-OLR1及びPCMTD1-SNTG1の少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13又は14個全ての分析のための前記プローブを含む。特定の実施形態では、本発明のキットは、MAN2A1-FER融合遺伝子の「接合断片」に結合するMAN2A1-FER融合遺伝子のFISH分析のための核酸プローブを含み、又はMAN2A1遺伝子に結合する1つの核酸プローブ及びFER遺伝子に結合する第2の核酸プローブを含む。
【００８２】
非限定的な実施形態では、キットは、例えば、TRMT11-GRIK2、SLC45A2-AMACR、MTOR-TP53BP1、LRRC59-FLJ60017、TMEM135-CCDC67、KDM4B-AC011523.2、MAN2A1-FER、PTEN-NOLC1、CCNH-C5orf30、ZMPSTE24-ZMYM4、CLTC-ETV1、ACPP-SEC13、DOCK7-OLR1及びPCMTD1-SNTG1からなる群から選択される1つ以上の融合遺伝子のPCR分析用の核酸プライマーを提供する。特定の非限定的な実施形態では、キットは、TRMT11-GRIK2、SLC45A2-AMACR、MTOR-TP53BP1、LRRC59-FLJ60017、TMEM135-CCDC67、KDM4B-AC011523.2、MAN2A1-FER、PTEN-NOLC1、CCNH-C5orf30、ZMPSTE24-ZMYM4、CLTC-ETV1、ACPP-SEC13、DOCK7-OLR1及びPCMTD1-SNTG1の少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14個の分析のための前記プライマーを含む。特定の実施形態では、本発明のキットは、MAN2A1-FER融合遺伝子のPCR分析用の核酸プライマーを含む。
【００８３】
特定の実施形態では、キットは、本明細書に開示される、例えば、セクション5.6に開示される医薬組成物を提供する。限定ではなく、例えば、キットは、融合遺伝子の産物に特異的な作用剤及び/又は阻害剤を含む医薬組成物を含むことができる。特定の実施形態では、キットは、例えば、MAN2A1-FER融合遺伝子を有する1つ以上の細胞を有する対象の治療において使用するための、FER及び/又はEGFR阻害剤並びに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を含むことができる。特定の実施形態では、キットは、同じ又は異なる容器中にクリゾチニブ及びカネルチニブを含むことができる。特定の非限定的な実施形態では、キットは、上記に開示される1つ以上の融合遺伝子を検出するための1つ以上の核酸プライマー若しくはプローブ及び/又は抗体プローブをさらに含むことができる。
【００８４】
以下の実施例は本開示をより充分に説明するために与えるものであり、その範囲を限定するものと解してはならない。
【００８５】
（実施例）
[実施例1:ヒト悪性腫瘍におけるMAN2A1-FERの発がん活性]
6.1序論
発がん性融合遺伝子は、ヒトがんの進行を推進する根本的な機序の1つである。融合遺伝子の1つは、マンノシダーゼアルファクラス2Aメンバー1(MAN2A1)の5'末端のエクソン13とFERチロシンキナーゼ(FER)の3'末端の最後の6エクソンとの融合物である。MAN2A1は、膜タンパク質の成熟グリコシル化のためのN-グリカンの複合体型構造物への高マンノースの変換のために必要とされるゴルジ酵素である(Moremen及びRobbins (1991) J Cell Biol 115:1521-1534;Misago et al. (1995) Proc Natl Acad Sci USA 92:11766-11770)。ヒト悪性腫瘍との関係についてはほとんど分かっていない。他方、チロシンキナーゼFERは、多くの報告があるがん遺伝子である(Hao et al. (1989) Mol Cell Biol 9:1587-1593)。キメラMAN2A1-FERタンパク質は、MAN2A1のN末端からの703アミノ酸及びFERのC末端からの251アミノ酸を含有する。結果として生じるキメラタンパク質は、MAN2A1のC末端中のグリコシドヒドロラーゼドメイン及びFERのN末端のSH2ドメインを喪失しているが、FER中のチロシンキナーゼドメインを概ねインタクトなまま残している。先行する分析は、MAN2A1-FER陽性前立腺がんを有する患者の約80%が不良な臨床アウトカムを経験することを示した。しかしながら、本研究以前には、MAN2A1-FER融合物は他の種類のヒト悪性腫瘍においても起こるのかどうか明確でなかった。
【００８６】
本実施例では、MAN2A1-FER融合遺伝子が複数の種類のヒト悪性腫瘍において起こることを示す。特に、MAN2A1-FERは、前立腺がん、肝臓がん、非小細胞肺がん、多形膠芽腫、卵巣がん及び食道腺癌において見出された。MAN2A1-FERタンパク質の発現はin vitro及びin vivoで発癌につながり、チロシンキナーゼ阻害剤でのMAN2A1-FER陽性のがんの治療は融合遺伝子陽性のがんを異種移植した動物の生存の劇的な改善につながった。MAN2A1-FER融合物のFERドメインは細胞質からゴルジ装置へと移行し、EGFRのN末端のリン酸化及びEGFRシグナル伝達経路の活性化につながる。MAN2A1-FERの発現は、in vitro及びin vivoでがんの成長及び侵襲の劇的な増加を生成したが、ノックアウトを通じた融合物の除去は、成長及び転移の有意により低いレベルを生成した。MAN2A1-FERの存在は、in vitro及びin vivoの両方でFERキナーゼ阻害剤クリゾチニブ又はEGFRキナーゼ阻害剤カネルチニブへのヒトがんの感受性を増加させた。MAN2A1-FER遺伝子のハイドロダイナミック尾静脈注射は、体細胞Pten欠失を有するマウスにおいて肝臓がんを結果としてもたらした。以上を合わせると、MAN2A1-FER融合遺伝子はヒトがんの発生の鍵となる推進因子の1つであることをこれらの結果は示す。
【００８７】
6.2材料及び方法
細胞株。PC3(前立腺がん)、Du145(前立腺がん)、H23、HUH7及びHEP3Bを含む全ての細胞株はAmerican Type Cell Culture(Manassas、VA)から購入した。PC3細胞は、10%のウシ胎児血清を添加したF12K培地(InVitrogen、Carlsbad、CA)を用いて培養した。DU145及びHEP3B細胞は、10%のウシ胎児血清を添加した改変イーグル培地(InVitrogen)を用いて培養した。A-172、NIH3T3及びHUH7細胞は、10%のウシ胎児血清を添加したダルベッコ改変イーグル培地を用いて培養した。H23細胞は、10%のウシ胎児血清を添加したRPMI1640培地を用いて培養した。以下のセットのプライマーを使用するPCRによりゲノムの8つの異なる遺伝子座(CSF1PO、D13S317、D16S539、D5S818、D7S820、THO1、TPOX、及びvWA)に対して短鎖縦列反復配列(STR)DNAプロファイルについてこれらの細胞株のゲノムを試験した:
CSF1PO: AACCTGAGTCTGCCAAGGACTAGC (配列番号76)/TTCCACACACCACTGGC CATCTTC (配列番号77)、
D13S317: ACAGAAGTCTGGGATGTGGA (配列番号78)/GCCCAAAAAGACAGACAGAA (配列番号79)、
D16S539: GATCCCAAGCTCTTCCTCTT (配列番号80)/ACGTTTGTGTGTGCATCTGT (配列番号81)、
D5S818: GGGTGATTTTCCTCTTTGGT(配列番号82)/TGATTCCAATCATAGCCACA (配列番号83)、
D7S820: TGTCATAGTTTAGAACGAACTAACG(配列番号84)/CTGAGGTATCAAAAACTCAGAGG (配列番号85)、
TH01: GTGGGCTGAAAAGCTCCCGATTAT(配列番号86)/ATTCAAAGGGTATCTGGGCTCTGG (配列番号87)、
TPOX: ACTGGCACAGAACAGGCACTTAGG(配列番号88)/GGAGGAACTGGGAACCAC ACAGGT (配列番号89)、
vWA: CCCTAGTGGATGATAAGAATAATCAGTATG(配列番号90)/GGACAGATGATAAAT ACATAGGATGGATGG (配列番号91)
【００８８】
これらの細胞株の短鎖縦列反復配列(STR)プロファイルはATCCにより刊行されたものと完全にマッチしたので、細胞株は真正のものであった。ABCキットはVector Labs, Inc.、OHから購入した。ABCキットはVector Labs(Youngstown、OH)から購入した。別に指し示さない限り、MAN2A1-FER融合遺伝子で形質転換した細胞に対する全てのシグナル伝達分析は、テトラサイクリンによるMAN2A1-FER発現の誘導の24時間前に血清なしで枯渇させて行った。
【００８９】
組織試料。139個のPCaの検体、10個のマッチさせた血液試料及び20個の臓器ドナー前立腺(OD)、102個の非小細胞肺がん、61個の卵巣がん、70個の肝臓がん、156個の多形膠芽腫、27個の食道腺癌及び269個の前立腺がん試料は、施設の規制ガイドラインを順守してピッツバーグ大学のTissue Bankから得た(表5〜10)。PCa試料の顕微解剖及びDNA抽出の手順は以前に記載されている3。組織調達のプロトコール及び手順は、ピッツバーグ大学の治験審査委員会により承認された。
【００９０】
RNA抽出、cDNA合成及びTaqman RT-PCR。FFPE試料のスライド上で顕微解剖を行って少なくとも50%のがん細胞を得た。Trizol法(InVitrogen、CA)により上皮細胞からトータルRNAを抽出した。抽出手順は製造者の推奨にしたがって行った。ランダムな六量体を1ugのトータルRNA及びSuperscript II TM(InVitrogen, inc、CA)を用いる第1鎖のcDNA合成において使用した。これに続いて、プライマーTGGAAGTTCAAGTCAGCGCAG(配列番号92)/GAAGTTTTATCCTTTAATGTGCCC(配列番号93)及びTaqmanプローブ5'-/56-FAM/TCAGAA ACA(配列番号94)/ZEN/GCC TAT GAG GGA AAT T(配列番号95)/3IABkFQ/-3'を使用してEppendorf Realplex(商標)サイクラーにてTaqman PCR(94℃で2分の後、94℃で30秒、61℃で30秒、72℃で30秒を50サイクル)を行った。プライマーGCATGGGTCAGAAGGATTCCT(配列番号96)/GTGCTCGATGGGGTACTTCAG(配列番号97)及びTaqmanプローブ5'-/56-FAM/CGA CGA GGC(配列番号98)/ZEN/CCA GAG CAA GAG(配列番号99)/3IABkFQ/-3'を使用して量及び品質管理にβ-アクチンTaqman RT-PCRを使用した。36未満のCtを有する試料をMAN2A1-FER陽性と呼んだ。試料が35より高いβ-アクチンCtを示した場合、MAN2A1-FERのネステッドTaqman RT-PCRを、プライマーCTGCTTCAGGAAAACCTGTGG(配列番号100)/TACATGTTTTAACAGCAACAGAAG(配列番号101)を使用してこの条件:94℃で2分の後、94℃で30秒、61℃で30秒、72℃で30秒を25サイクルで行った。これに続いて、この条件:94℃で2分の後、94℃で30秒、61℃で30秒、72℃で30秒を40サイクルでプライマーTGGAAGTTCAAGTCAGCGCAG(配列番号102)/GAAGTTTTATCCTTTAATGTGCCC(配列番号103)及びTaqmanプローブ:5'-/56-FAM/TCA GAA ACA(配列番号104)/ZEN/GCC TAT GAG GGA AAT T(配列番号105)/3IABkFQ/-3'を使用してネステッドPCRを行った。MAN2A1-FER検出のCt閾値:ホルマリン固定パラフィン包埋組織について30サイクル、冷凍組織について25サイクル。鋳型なしの陰性対照及びMAN2A1-FER cDNA鋳型を各バッチ中でそれぞれ陰性及び陽性対照として使用した。
【００９１】
ベクターの構築。MAN2A1-FERの全長cDNAは、以下の条件:94℃で2分の後、94℃で1分、62℃で1分、72℃で5分の40サイクルでAccuPrime Taqポリメラーゼ(ThermoFisher Scientific、Waltham、MA)を使用し、プライマー
GACTCAGATGCTTAAGGAGACTAGGTGCGGAGCAAG (配列番号106)/GTACTCACGTTCTAGATGTGAGTTTTCTCTTGATGATAGTG (配列番号107)を使用して前立腺がん患者試料PRCA159TのcDNAライブラリーから得た。これに続いて、72℃で10分を行った。次に、PCR生成物をAflII及びXbaIで消化し、同様に制限処理したpCDNA4-FLAGベクターにライゲートしてpCDNA4-MAN2A1-FER-FLAGを作出した。pGST-MAN2A1-FERを構築するために、上記と同じ条件で全長MAN2A1-FER cDNA鋳型に対してプライマー
GACTCAGATGGGATCCATGAAGTTAAGCCGCCAGTTC (配列番号108)/GTACTCACGTGCGGCCGCTGTGAGTTTTCTCTTGATGATAGTG (配列番号109)を使用してPCRを行った。PCR生成物をBamHI及びNotIで制限処理し、同様に制限処理したpGEX-5x-3ベクターにライゲートしてpGST-MAN2A1-FERを作出した。pT3-MAN2A1-FER-FLAGを作出するために、以下の条件:94℃で2分の後、94℃で1分、62℃で1分、72℃で5分の40サイクルで全長MAN2A1-FER相補的DNA鋳型に対してプライマーGACTCAGATGGTCGACGAGACTAGG TGCGGAGCAAG (配列番号110)/GTACTCACGTGCGGCCGCTGTGAGTTTTCTCTTGATGATAGTG (配列番号111)を使用してpCDNA4-MAN2A1-FER-FLAGの鋳型に対してPCRを行った。PCR生成物をSalI及びNotIで制限処理し、同様に制限処理したpENTRベクターにライゲートした。その後、Gateway(登録商標) Vector Conversion Systemを使用する組換えによりベクターをpT3-eF1αベクターと組み換えてpT3-MAN2A1-FER-FLAGを作出した。ΔMAN2A1-FER-FLAGK722Aを構築するために、Stratagene, IncのQuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kitを使用した。変異生成プライマーは以下:pGCAACATGTAAAGAAGATCTTCCTCAGG (配列番号112)/pAACAGCAACAGAA GTTTTATCCTTTAATG (配列番号113)の通りである。pGST-ΔEGFRaa1-650を構築するために、以下の条件:94℃で2分の後、94℃で1分、62℃で1分、72℃で5分の40サイクルでプライマーGACTCAGATGGCTAGCATGCGAC CCTCCGGGACGGC (配列番号114)/GTACTCACGTAAGCTTTCATCCCAGTGGCGATGGACG (配列番号115)を使用してpCMV-EGFR DNA鋳型4に対してPCRを行った。これに続いて、72℃で10分を行った。PCR生成物をNheI及びHindIIIで制限処理し、同様に制限処理したpGEX-5x-3にライゲートしてpGST-ΔEGFRaa1-650を作出した。pCMV-EGFRaa1-650を構築するために、上記と同じ条件でプライマー
GACTCAGATGAAGCTTTGACTCCGTCCAGTATTGATC (配列番号116)/GTACTCACGTTTCTAGACATCCCAGTGGCGATGGACG (配列番号117)を使用してEGFR cDNA鋳型に対してPCRを行った。PCR生成物をHindIII及びXbaIで制限処理し、同様に制限処理したpCMVscriptベクターにライゲートしてpCMV-EGFRaa1-650を作出した。
【００９２】
pMAN2A1int13-EGFP-FERint14の構築のために、以下のプライマー:
GACTCAGATGGCGGCCGCGAACATCAGAACTGGGAGAGG (配列番号134)/GTACTCACGTAAGCTTCAGGAGAATCACTTGAACCCG (配列番号135)を使用してHUH7細胞からの1mgのゲノムDNAに対して広域ロングPCR(extended long PCR)を行った。次に、PCR生成物をHindIII及びNot1で消化し、同様に消化したpEGFPベクターにライゲートしてpMAN2A1int13-EGFPを作出した。MAN2A1イントロン13/エクソン14のスプライシングアクセプター部位に対応する合成配列
(TAATGTTGGTTTTACCAAAAATATAAATGGTTTGCCTCTCAGTAGATAACATTTATCTTTAATAAATTCCCTTCCCTATCTTTTAAAGATCTCTTTTCGAGCACATAT (配列番号136)/TAATATGTGCTCGAAAAGAGATCTTTAAAAGATAGGGAAGGGAATTTATTAAAGATAAATGTTATCTACTGAGAGGCAAACCATTTATATTTTTGGTAAAACCAACAT (配列番号137))をASE1制限pMAN2A1int13-EGFPにライゲートした。これとは別に、プライマー
GACTCAGATGGAATTCAAGGTGGAACACAGAAGGAGG (配列番号138) /GTACTCACGTGAATTCGATTACTTTAAATAACTCACTTGGCTTCTTGCAGAGGTAGAGCTGAGAGAAG (配列番号139)を使用してHUH7ゲノムDNAに対してPCRを行って、FERエクソン15/イントロン15に対応する31bpのスプライスドナー部位の配列を含むFERのイントロン14に対応する1984bpの配列を生成させた。次に、PCR産物をEcoR1で制限処理し、同様に制限処理したpMAN2A1int13-EGFPにライゲートしてpMAN2A1int13-EGFP-FERint14を作出した。ガイドRNA NickaseNingaベクターのために、以下のガイドRNAペアを使用した:ATAGCTAGAAGGTGGATCAC(配列番号140)/TAGCATTAAGGGCCCCCTAA(配列番号141)。構築手順は製造者(DNA 2.0、Menlo Park、CA)により提供されたマニュアルに従った。
【００９３】
コロニー形成及びマトリゲル通過アッセイ。コロニー形成アッセイは、以前に記載されたものと類似していた5。pCDNA4-MAN2A1-FER-FLAG/pCDNA6-TOをトランスフェクトしたPC-3、DU145、NIH3T3、Hep3B、A-172及びH23細胞を使用して、コロニー形成に対するMAN2A1-FERを追加することの影響力を評価した。MAN2A1-FERノックアウトを有するHUH7又はベクター対照を使用して、コロニー形成に対するMAN2A1-FERの除去の影響力を評価した。コロニー形成アッセイのために、5000個の細胞を60mmディッシュ中で培養し、又は1000個の細胞を35mmディッシュ中で培養した。各細胞クローンについて3連の実験を行った。pCDNA4-MAN2A1-FER-FLAG/pCDNA6-TOをトランスフェクトした細胞について、培地に5μg/mlのテトラサイクリンを添加してMAN2A1-FER-FLAGの発現を誘導する。培地を4日毎に交換した。10日目に1%のクリスタルバイオレットでプレートを染色し、2mmより大きい直径を有するコロニーを計数した。
【００９４】
マトリゲル通過アッセイ6のために、指し示した各クローンからの細胞を、1×105細胞/インサートで上チャンバーに加えた0.1%のウシ血清アルブミンを含有する培地中に懸濁させた。50μg/mlのアスコルビン酸の存在下で10%のウシ胎児血清を添加したDMEM中24時間のNIH 3T3細胞のインキュベーションにより得られた条件培地を、化学走性誘引物質としてインベーションチャンバーの下コンパートメントに入れた。24時間の培養後、インサートの上表面を綿スワブで拭き取り、インサートをヘマトキシリン及びエオシン(H&E)で染色した。各実験は、3連で各試料を用いて2回行った。インサート当たり5つのランダムな高倍率視野で光学顕微鏡下、マトリゲル及びフィルター孔を通って下表面に遊走する細胞を計数した。
【００９５】
in vitroキナーゼアッセイ:GST、GST-MAN2A1-FER及びGST-FERを宿す大腸菌(E. coli)を室温で終夜生育させた。1mMのIPTGを用いて4時間、組換えタンパク質を誘導した。GST、GST-MAN2A1-FER及びGST-FERをグルタチオンカラムにより精製し、製造者(Cell Signaling, Inc、Danvers、MA)により提供された1Xキナーゼアッセイ緩衝液を用いて1ng/μlに希釈した。これに続いて、25μlのGST又はGST-MAN2A1-FER又はGST-FER及び25μlの基質(3μMのポリEY[4:1])を合わせた。溶液を37℃で60分間インキュベートした。各反応ウェルに25μlの2N NaOH停止溶液を加えることにより反応を終了させた。Promega, Inc、Madison、WIのADP-Glo(商標) Kinase Assayのキット及びプロトコールを使用してキナーゼ活性を定量化した。
【００９６】
ゴルジ装置を単離するためのスクロース勾配遠心分離。MAN2A1-FER-FLAGを発現するように誘導したHEP3B細胞(2×108)を3mlのHM緩衝液(0.25Mのスクロース、10mMのトリスCl、pH7.4)に再懸濁させ、Dounceホモジナイザーでホモジナイズした。これに続いて、6mlの2.0Mのスクロース勾配溶液(0.8、12、1.6、2.0M)を加えた。次に、試料に6mlの1.2Mのスクロース勾配溶液及び3mlの0.8Mのスクロース溶液を重層した。その後、注射器及び金属カニューレにより、チューブの下に2mlの1.6Mのスクロース勾配溶液を置いた。次に、110,000×gで2時間、4℃で試料を遠心分離した。次に、試料溶液の画分をチューブの底から回収した。ゴルジ単離実験のために、ゴルジ単離キット(Sigma-Aldrich、St. Louise、MO)を使用した。手順は、製造者により提供されたマニュアルに従った。
【００９７】
細胞周期分析。PMF、DMF、NMF、HepMF、AMF、HMF、HEPΔK、NMFΔK、HUH7/KO及びHUH7/HC細胞を「細胞株」セクションに記載した培地を用いて40%〜50%コンフルエンスまで培養した。これらの細胞を血清を含有しない培地で24時間処理して、培養物をG0期に同期させた。次に、10%のウシ胎児血清を含むBrdU標識性培地(Sigma-Aldrich, Inc.、St. Louise、MO)に4時間、培養物を移した。その後、細胞を回収し、500×gで5分間遠心分離し、0.5mlのPBSに再懸濁させた。次に、細胞を抗BrdU抗体と12時間インキュベートした。これに続いて、Triton X-100透過緩衝液で洗浄し、FITCで標識された二次抗体と室温で1時間インキュベートした。細胞を別のチューブに移し、4.5mlの70%の冷エタノール中に2時間保持した。代替的に、次に細胞を固定し、BD cytofix/cytoperm緩衝液を用いて透過処理した。次に、フルオレセインイソチオシアネートを共役させた希釈した抗ブロモデオキシウリジン抗体を含有する50mLのBD cytofix/cytoperm緩衝液に細胞を再懸濁させ、室温で20分間インキュベートした。細胞ペレットを1mlの7-アミノアクチノマイシンD/triton X-100染色で30分間室温で染色した。FACSCalibur Automated Benchtop Flow Cytometer(Becton Dickinson、MA)を使用してフローサイトメトリーを通じてDNA含有量及び細胞数を定量化した。Cell Questプログラム又はWinMDIソフトウェアを通じてデータを定量化及び分析した。
【００９８】
MAN2A1、FER、MAN2A1-FER、及びβ-アクチンのイムノブロット分析。HUH7細胞中のMAN2A1-FER発現を調べた。最初に、細胞をPBSで洗浄し、RIPA緩衝液(50mMのトリス-HCl、pH7.4、1%のNonidet P-40、0.25%のデオキシコール酸ナトリウム、150mMのNaCl、1mMのEDTA、1mMのフッ化フェニルメチルスルホニル、1μg/mLのアプロチニン、1μg/mLのロイペプチン、1μg/mLのペプスタチン、及び1mMのNa3VO4)により溶解させた。溶解液を超音波処理し、12,000gで30分間4℃で遠心分離して不溶性材料を除去した。8.5%のポリアクリルアミドゲル中のドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)によりタンパク質を分離し、ポリビニリデンジフルオリド(PVDF)膜にバンドをブロットした。トリス-Tween 20緩衝液(0.1Mのトリス-HCl及び0.1%のTween-20、pH7.4)中の5%の粉末スキムミルクを用いて室温で1時間、膜を遮断した後、一次抗MAN2A1抗体(1:1000の希釈、Santa Cruz)、抗FER抗体(1:1000の希釈;Santa Cruz、CA)、又は抗GAPDH抗体(1:500の希釈;Santa Cruz)と2時間インキュベートした。次に、膜をトリス-Tween 20緩衝液で3回洗浄し、ウサギ(抗GAPDH、1:1000の希釈)、マウス(抗MAN2A1、1:1000の希釈)、又はヤギ(抗FER、1:1000の希釈)に特異的なホースラディッシュペルオキシダーゼ共役二次抗体と室温で1時間インキュベートした。製造者のプロトコールにしたがってECLシステム(Amersham Life Science)を用いてタンパク質発現を検出した。前立腺がん試料PRCa159T、PRCa23T、PRCa25T、PRCa20T、PRCa119T、及び肝臓がん細胞株HEP3Bからのタンパク質抽出物に対しても類似のイムノブロッティングを行った。
【００９９】
腫瘍成長及び自発転移。異種移植手順は以前に記載されている4-6,8。簡潔に述べれば、0.2mLのハンクス平衡塩溶液(Krackeler Scientific, Inc、Albany、NY)中に懸濁させた約5×106個の生存可能なPMF、DMF、HEPMF、GMF、HMF、及びHUH7及びHUH7/ko細胞を71匹の重症複合免疫不全(SCID)マウスの脇腹に皮下移植してマウス当たり1つの腫瘍を生成させた。処置群の内訳は以下の通りである:PMF細胞について12匹、DMF細胞について12匹、HEPMF細胞について11匹、GMF細胞について12匹、HMF細胞について12匹、HUH7細胞について6匹、及びHUH7/ko細胞について6匹。PMF、DMF、HEPMF、GMF、及びHMFの各群からの6匹のマウスに5mg/mlのテトラサイクリン水を連日与えた。マウスを連日観察し、体重及び腫瘍サイズを週毎に記録した。異種移植の6週後の終わりまで腫瘍サイズを週毎に測定した。死亡及び転移を記録した。
【０１００】
がん細胞を異種移植した重症複合免疫不全マウスの治療。キナーゼ阻害剤治療実験のために、PMF、GMF、HUH7、及びHUH7/ko細胞(2×107細胞)をSCIDマウスの皮下領域に異種移植した。異種移植の2週後、腹腔内適用を通じて、図19に示すとおり、週に3回、ジメチルスルホキシド、クリゾチニブ(12.5mg/kg)、カネルチニブ(10mg/kg)、又はこれらの2つの薬物の組合せでこれらのマウスを処置した。7週後、全ての生存したマウスを屠殺し、検死を行った。対照試薬で処置したマウスについて、マウスが異種移植したがんにより死亡した時に検死を行った。ホルマリン固定パラフィン包埋の肺、脳、肝臓、腎臓、椎骨、及びリンパ節検体の連続切片を回収し、H&Eで染色し、顕微鏡により調べた。
【０１０１】
マウス及びハイドロダイナミック尾静脈注射。ハイドロダイナミック尾静脈注射は、以前に記載された通りに行った8。簡潔に述べれば、Pten遺伝子のエクソン5がloxP部位に挟まれた第1のPtentm1Hwu/Jマウスを腹腔内注射を通じてアデノ随伴ウイルス-cre(1×1010pfu)で処置して、ほとんどの肝細胞においてPtenノックアウトを作出した。次に、25:1の比で20μgのpT3-MAN2A1-FER-FLAGと共にsleeping beautyトランスポザーゼを2mLの生理食塩水(0.9%のNaCl)中に希釈し、0.22μmのフィルター(Millipore)で濾過し、側尾静脈に5〜7秒注射した。ピッツバーグ大学医学部の施設内動物実験委員会により承認されたプロトコールにしたがってマウスを飼育し、給餌し、モニターした。
【０１０２】
6.3結果:
ヒト悪性腫瘍中のMAN2A1-FER融合物の発現。MAN2A1とFERとの融合物は、MAN2A1のC末端から441アミノ酸及びFERのN末端から571アミノ酸の喪失を結果としてもたらした。これは、タンパク質における大きな構造的変化を生じさせる(図13A)。どの種類のヒトがんがMAN2A1-FER融合物を宿すかを研究するために、Taqman定量的RT-PCRを使用して前立腺がん、多形膠芽腫、非小細胞肺がん、卵巣がん、食道腺癌及び肝臓がんを含む6つの異なる種類のヒトがんを調べた。これらのがんの6種類全てはMAN2A1-FER融合物陽性であることが見出され、それは2〜25.9%に及んだ(図13C及び表5〜10)。これは、16.8%(17/101)の非小細胞肺がん、15.7%(11/70)の肝臓がん(図22)、7.1%(11/156)のGBM、25.9%(7/27)の食道腺癌、5.2%(14/269)の前立腺がん、及び1.7%(1/60)の卵巣がんを含む(図13C)。前立腺がん患者からの20個の臓器ドナー前立腺試料、10個の肝臓ドナー試料及び10個の血液試料の全てはMAN2A1-FER融合物陰性であった。キメラMAN2A1-FERタンパク質は954アミノ酸を含有するが、MAN2A1は1144アミノ酸、FERは822アミノ酸をそれぞれ有する。したがって、MAN2A1-FERキメラタンパク質のタンパク質分子量は分子量114kdを有すると推定されるが、MAN2A1は137kd、FERは99kdの分子量を有する。
【０１０３】
MAN2A1-FER融合遺伝子が安定なキメラタンパク質を産生するかどうかを調べるために、いくつもの異なる種類のがんに由来する15のヒトがん細胞株をスクリーニングした。肝細胞癌細胞株HUH7は、高レベルのMAN2A1-FER転写物を発現することが見出された。MAN2A1-FER陽性の前立腺がん(PRCA159T)の全ゲノムシークエンシングを通じて、染色体切断点は、MAN2A1のイントロン13及びFERのイントロン14に位置することが見出された(図13B)。別々のMAN2A1-FER染色体切断点がHUH7細胞株中に見出された(図13B)。32bpのみがこの切断点を前立腺がん試料中に見出されたものから分離する。MAN2A1又はFERに特異的な抗体を使用するイムノブロットを行った場合、分子量114kdを有するタンパク質バンドがMAN2A1及びFERに特異的な抗体の両方により認識された。このタンパク質バンドは、MAN2A1-FER転写物陰性のHCC細胞株HEP3B中に存在しない(図13D)。MAN2A1-FER融合遺伝子は安定なキメラタンパク質を産生することをこれは示唆する。MAN2A1-FERタンパク質が原発がん試料中でも発現されるかどうかを試験するために、MAN2A1-FER融合物陽性の前立腺がんに対して類似のイムノブロッティングを行った。図13Dに示すように、MAN2A1-FER転写物陽性の試料(PCA159T、PRCA23T、HCC#1、HCC#2及びHCC#5)は、MAN2A1及びFERに特異的な抗体により認識される分子量114kdの余分なタンパク質バンドを含有したが、MAN2A1-FER陰性の試料(PRCA25T、PRCA20T、PRCA119T、HCC#10、HCC#37、Normalliver#71及びNormalliver#72)はそのようなタンパク質を含有しなかった。融合転写物が存在する場合、MAN2A1-FERタンパク質は安定に発現されることをこれらの実験は示す。
【０１０４】
MAN2A1-FERはゴルジ装置中に位置する。FERタンパク質は、FERタンパク質の微小管にとっての結合部位であるFCHドメインを含有する。MAN2A1-FER融合物中、このドメインは喪失している。代わりに、MAN2A1-FERはMAN2A1からのゴルジ局在のためのシグナルペプチドを保持する。結果として、FERのキナーゼドメインはゴルジ装置に移行すると思われる。この仮説を試験するために、NIH3T3及びHEP3B細胞にpCDNA4-MAN2A1-FER-FLAG/pCDNA6をトランスフェクトした。安定なテトラサイクリン誘導性MAN2A1-FER-FLAG発現クローンを選択した(NMF及びHEPMF、図14A)。FLAG及び内在性ゴルジタンパク質N-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼに特異的な抗体を使用する共免疫染色により、MAN2A1-FER-FLAG及びN-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼはゴルジ装置中に共局在することが示された(図14B)。MAN2A1-FER-FLAGで形質転換されたHEP3B細胞の画分のスクロース勾配遠心分離により、MAN2A1-FER-FLAGは、細胞質画分中に見出された野生型FERタンパク質とは明瞭に異なって、ゴルジ画分中に位置することが示された(図14C)。最後に、HUH7及びNMF細胞からのMAN2A1-FERのゴルジ局在性もゴルジ単離方法により確認された(図14D)。
【０１０５】
MAN2A1-FERキナーゼはEGFRを活性化する。FERは、シグナル伝達において重大な役割を果たすチロシンキナーゼである。MAN2A1-FERがそのチロシンキナーゼ活性を保持するかどうかを試験するために、MAN2A1-FERをpGEX-5x-3ベクターにライゲートしてpGST-MAN2A1-FERを作出し、それにより、融合タンパク質を大腸菌中でGST-MAN2A1-FERキメラタンパク質として発現させた。図15Aに示すように、基質としてポリ(EY 4:1)を使用した時に、GST-MAN2A1-FERは高レベルのチロシンキナーゼ活性を示した。加えて、GST-MAN2A1-FERはGST-FERより4倍高いキナーゼ活性を示し、FERからのSH2ドメインの阻害の除去は融合タンパク質のチロシンキナーゼ活性を増加させることを示唆した。興味深いことに、MAN2A1-FERのキナーゼ活性は、元々ALK及びFER/FEZについて開発されたチロシンキナーゼ阻害剤であるクリゾチニブに対して感受性であり、IC50は約29nMである(図15B;表3)。
【０１０６】
MAN2A1-FER融合物はゴルジ装置へのFERキナーゼの移行を結果としてもたらすので、FERキナーゼの標的が結果として変化する可能性がある。上皮成長因子受容体(EGFR)シグナル伝達の活性化はヒトがんの進行を推進する主な機序の1つであることが示されており7、EGFRのN末端のみがゴルジ装置の内腔に露出している。EGFRのN末端はMAN2A1-FERキナーゼの基質であるという仮説を我々は立てる。この仮説を試験するために、我々のキナーゼアッセイにおける基質としてEGFRのN末端(HisTAG-EGFRaa1-650)を使用した。図15Cに示すように、GST-MAN2A1-FERはATP用量依存的に組換えHisTAG-EGFRaa1-650をリン酸化した。いずれのチロシン残基がGST-MAN2A1-FERによりリン酸化されるかを研究するために、EGFRのN末端中の各チロシン残基に対応する合成ペプチドを化学合成し、GST-MAN2A1-FERによるリン酸化についてアッセイを行った。EGFR中のFLKTIQEVAGYVLIALNTVER(ペプチド3)に対応する配列のみがGST-MAN2A1-FERによりリン酸化されることを結果は示した。このペプチドはEGFRのaa88にチロシン残基を含有する。EGFR中のY88が実際にGST-MAN2A1-FERによりリン酸化されるかどうかを立証するために、このチロシンの変異(Y88A)を含有するペプチドをGST-MAN2A1-FERのプロテインキナーゼ活性についてアッセイした。変異体ペプチドは融合タンパク質によりリン酸化されないことを結果は指し示した。GST-MAN2A1-FER融合物によるHisTAG-EGFRaa1-650のリン酸化がY88のリン酸化の結果であるかどうかを検証するために、過剰量のペプチド3によりHisTAG-ΔEGFRaa1-650のリン酸化を行った。図15C(レーン7〜8)に示すように、ペプチド3はGST-MAN2A1-FERによるEGFRのN末端のリン酸化を部分的に遮断したが、変異体対応物は遮断しなかった。EGFRのN末端においてY88をアラニンに変異させた時にリン酸化は見出されなかった(図15C)。したがって、Y88はEGFRのN末端中の唯一のGST-MAN3A1-FERリン酸化部位である(図23)。
【０１０７】
MAN2A1-FERキナーゼによるEGFRのN末端のリン酸化がin vivoで起こるかどうかを研究するために、MAN2A1-FER-FLAGを発現するようにHEPMF細胞をテトラサイクリンで誘導した。EGFRをトロンビン又はヒドロキシルアミンを用いて部分的に断片化した。次に、消化されたペプチドをEGFRのN末端に特異的な抗体を用いて免疫沈降させた。MAN2A1-FERの発現はEGFRのN末端のリン酸化を結果としてもたらすが、非誘導の対照はN末端EGFRリン酸化について陰性であることを結果は示した(図15D)。MAN2A1-FERの発現は、キナーゼドメイン中のY1068及びY848の自己リン酸化の劇的な増加により立証されるように、EGFRのチロシンキナーゼ活性の活性化につながった(図15E)。EGFRのN末端リン酸化がMAN2A1-FER媒介性のEGFR活性化に必須であるかどうかを研究するために、EGFRのアミノ酸88に点変異(Y88A)を有する変異体を作出した。この変異体をHEPMF細胞にトランスフェクトし、MAN2A1-FER-FLAGを発現するように誘導した。図15Fに示すように、EGFRのチロシン88の変異は、MAN2A1-FERを発現するように誘導した時に自己リン酸化及び二量体化がないことにより立証される通り、EGFRのチロシンキナーゼ活性化を妨げた。EGFRの活性化は、MAN2A1-FER融合物陽性であることが見出された前立腺がん試料においても同定されたが(図15G)、陰性の試料においては同定されず、MAN2A1-FERにより誘導されるEGFRの活性化についての有意な臨床的関連性を示唆する。
【０１０８】
MAN2A1-FERによるEGFRのキナーゼ活性の活性化は、がん細胞中の増殖促進シグナル伝達のカスケードにつながる可能性がある。MAN2A1-FERの発現がEGFRシグナル伝達経路を活性化するかどうかを調べるために、EGFR-B-raf-MEK及びEGFR-Akt経路を調べた。図16に示すように、異なる起源の4つの細胞株(PC3-前立腺がん、HEP3B-肝臓がん、NIH3T3-マウス不死化線維芽細胞及びA-172多形膠芽腫)におけるMAN2A1の発現はB-raf、MEK及びAktキナーゼの活性化につながったが、MAN2A1-FERのキナーゼ陰性変異体はこれらのキナーゼのいずれも活性化しなかった。EGFRがこれらのキナーゼの主な活性化因子であるかどうかを調べるために、そのキナーゼドメインを欠失したEGFRのドミナントネガティブ変異体(ΔEGFRaa1-650)をこれらの細胞株にトランスフェクトした。ΔEGFRaa1-650の存在はこれらのキナーゼの活性化を概ね消去することを結果は指し示した。ΔEGFRaa1-650の存在はこれらのキナーゼの活性化を概ね消去することを結果は指し示した(図16B)。MAN2A1-FERのキナーゼ陰性変異体はこれらのキナーゼのいずれも活性化しなかった(図16C)。CRISPRシステムを使用して、MAN2A-FER発現が細胞株において存在しないようにHUH7細胞中のMAN2A1-FERのゲノムを妨害した(図16D、レーン25〜26)。MAN2A1-FERのノックアウトを有するHUH7細胞は、EGFR、B-raf、MEK、及びAktのリン酸化の有意な減少を示し、HUH7細胞中でのこれらのキナーゼの過剰活性化はMAN2A1-FER融合物に概ね依存することを示唆した。
【０１０９】
MAN2A1-FERは細胞増殖及び侵襲を加速させる。増殖促進シグナル伝達経路のMAN2A1-FER誘導性活性化の帰結を調べるために、MAN2A1-FER-FLAGで形質転換させた4つの異なる起源の細胞株(PC3及びDU145-前立腺がん、HEP3B-肝臓がん、A-172-多形膠芽腫、H23-肺がん)及びNIH3T3に対して細胞周期分析を行った。図17Aに示すように、テトラサイクリンによるMAN2A1-FERの発現の誘導は、これらの細胞株のS期を劇的に増加させ、PC3について2.1倍、DU145について52%、HEP3Bについて42倍、H23について40倍、A-172について3.9倍、NIH3T3細胞について2倍であった。しかしながら、これらの増殖促進の影響力は、MAN2A1-FER-FLAGのキナーゼ陰性変異体をこれらの細胞中に導入した時に完全に消失した(図17A)。ドミナントネガティブ変異体ΔEGFRaa1-650の発現もまた、HEP3B細胞中でMAN2A1-FER-FLAGにより誘導されるS期の増加を有意に減弱させた。HUH7細胞中でのMAN2A1-FERのゲノム妨害は、S期及びM期細胞の有意な低減を結果としてもたらした。
【０１１０】
これらの細胞周期分析と並行して、MAN2A1-FER-FLAGで形質転換させた細胞のコロニー形成分析は、MAN2A1-FER-FLAGを誘導した時にコロニーの90%から2.7倍の増加を示した(図17B)。コロニー形成に対するMAN2A1-FER-FLAGの影響力は、MAN2A1-FERキナーゼ変異体又はドミナントネガティブEGFR変異体を使用した時に消失した。HUH7細胞のゲノム中のMAN2A1-FERの妨害は、これらの細胞のコロニー形成の55%の減少を結果としてもたらした。MAN2A1-FERの発現はまた、より高レベルの侵襲性を結果としてもたらした(図17C)。in vivoでのMAN2A1-FER発現の影響力を調べるために、MAN2A1-FERで形質転換させたPC3、DU145、HEP3B、A-172、H23細胞を重症複合免疫不全症(SCID)マウスの皮下組織に異種移植した。テトラサイクリン水(5μg/ml)を通じてMAN2A1-FER-FLAGを誘導した。図17D-Fに示すように、MAN2A1-FER-FLAGの発現は、PC3及びDU145腫瘍について2.3倍、HEP3Bについて2.6倍、A-172腫瘍について2.4倍大きい体積の腫瘍を生じさせた。HUH7細胞中でMAN2A1-FERを妨害した時に腫瘍体積の55%の低下があった。MAN2A1-FERを発現する腫瘍中でより高レベルの転移も見られ、MAN2A1-FER陰性腫瘍について3/36であったのに対して、MAN2A1-FER陽性腫瘍については19/35であった(p<0.0001、表11及び図24)。MAN2A1-FERを有しないSCIDマウスの83パーセント(30/36)は6週を超えて生存したが、MAN2A1-FERを有するマウスでそうなったのは28.6%(10/35)のマウスのみであった(p=4.5×10-7)。
【０１１１】
MAN2A1-FER陽性がんはクリゾチニブ及びカネルチニブに感受性である。MAN2A1-FERのキナーゼ活性及びEGFR活性化はMAN2A1-FER発がん活性の推進因子であるので、MAN2A1-FERのキナーゼ活性又はEGFRの阻害がMAN2A1-FERの発がん活性、したがって腫瘍の成長を妨害するかを調べることは興味深い。この仮説を研究するために、MAN2A1-FERキナーゼ阻害剤クリゾチニブ及びEGFRキナーゼ阻害剤カネルチニブをMAN2A1-FERを有する又は有しないPC3、A-172又はHUH7を処理するために選択した。MAN2A1-FERの存在はクリゾチニブに対するがん細胞の感受性を増加させることを結果は指し示し、それは細胞株に応じて1.8〜2.1倍に及んだ(図18、表3)。興味深いことに、これらのがん細胞株はカネルチニブに対してより高い感受性のようであり、全てが15nM未満のIC50値(50%阻害濃度)を示した(表3)。MAN2A1-FERの存在は感受性を2.1〜2.5倍増加させた。
【０１１２】
MAN2A1-FERによる悪性細胞株のこれらのキナーゼ阻害剤への増加した感受性が、これらの薬物で治療されたがんについてのより良好なアウトカムにつながるかどうかを研究するために、MAN2A1-FERを有する又は有しないPC3、A-172及びHUH7細胞をSCIDマウスの皮下領域に異種移植した。183mm3の平均サイズまで2週にわたって腫瘍を成長させた。次に、腹膜注射を通じて週に3回、クリゾチニブ(12.5mg/kg)、カネルチニブ(10mg/kg)又はこれらの2つの薬物の組合せでこれらのマウスを処置した。MAN2A1-FERが存在する場合、クリゾチニブの処置は、PC3細胞についてDMSO対照との比較で平均78.6%(p<0.001)、A-172について67.6%(p<0.001)、HUH7細胞について80.7%(p<0.001)、最終の腫瘍サイズを低減させた。MAN2A1-FERが存在しない場合、クリゾチニブははるかに低効果であり、PC3について腫瘍サイズの平均27.1%の低減、A-172について4%の増加、HUH7細胞について27.6%の低減であった。SCIDマウスをカネルチニブで処置した時に類似の結果が得られ、MAN2A1-FERが存在する場合、PC3細胞について85.0%(p<0.001)、A-172について73.2%(p<0.001)、HUH7について81.7%(p<0.001)、腫瘍サイズが低減した(図19A)。MAN2A1-FERを有しない細胞でのPC3について32.0%、A-172について19.2%、HUH7細胞について40.2%の低減に対し、これは良好に比較されるものであった。最良の結果は、クリゾチニブとカネルチニブとの組合せで得られた。クリゾチニブとカネルチニブとの組合せは腫瘍サイズを有意に低減させ、MAN2A1-FERが存在する時にPC3について92.2%(p<0.001)、A-172について89.0%(p<0.001)、HUH7細胞について86.0%(p<0.001)の腫瘍サイズの低減であった。MAN2A1-FERなしでは、有効性はPC3について46.5%、HUH7細胞について43.2%に低減した。MAN2A1-FERが存在しない場合、クリゾチニブとカネルチニブとの組合せはA-172腫瘍に対して効果がなかった(腫瘍サイズの19.4%の増加)。クリゾチニブ若しくはカネルチニブのいずれか又はこれらの2つの薬物の組合せによる処置は、MAN2A1-FERが存在する時に、対照(61%、11/18)に対して全ての腫瘍(PC3、A-172及びHUH7、0%、0/18)の転移を完全に取り除いた(p<0.001)(図19B)。しかしながら、MAN2A1-FER陰性細胞に対するこれらの薬物の効果は概ね有意でなく、対照についての1/18に対してクリゾチニブ又はカネルチニブ処置について2/18であった。これらの結果は、MAN2A1-FERを除去した後のこれらの悪性細胞の全体を通じて低い転移率を反映する可能性がある。クリゾチニブ、カネルチニブ又はこれらの2つの薬物の組合せの処置は、MAN2A1-FER陽性の腫瘍を異種移植したマウスの死亡を完全に取り除いた(図19C)。しかしながら、これらの薬物による死亡改善効果は、それらをMAN2A1-FER陰性の腫瘍に適用した時に観察されなかった。MAN2A1-FERががん進行の推進因子であることをこれらの結果は明確に示す。MAN2A1-FERの存在はEGFRシグナル伝達を推進し、それがこの経路に特異的な薬物に対してがん細胞を増感させる。
【０１１３】
【表３】
2020512286.tif 000007
【０１１４】
MAN2A1-FERは自発的な肝臓がんを生じさせる。MAN2A1-FER陽性の10個のヒト肝臓がん試料のうち6個がPten欠失を示し、がんの発生についての2つの事象間の潜在的な関連を示唆した。Pten欠失及びMAN2A1-FER融合物はがんを生成するために充分であるかどうかを研究するために、ヒトがんにおける体細胞変異を模倣するためのマウス体細胞がんモデルを開発した。そのようなモデルにおいて、Pten遺伝子のエクソン5がloxP部位に挟まれたPtentm1Hwu/Jマウスを腹膜内注射を通じてアデノ随伴ウイルス-Cre(1×1010PFU)で処置して、ほとんどの肝細胞においてPtenノックアウトを作出した。これに続いて、1〜2%の肝細胞がベクターによりトランスフェクトされるようにpT3-MAN2A1-FER-FLAGの尾静脈ハイドロダイナミック注射8を行った(図20A)。これらのマウスは12/14週まで生存したか、又は肝臓がんにより自然死した。pT3-MAN2A1-FER-FLAGを注射した全てのマウスは肝細胞癌を発症した(図20B)。これらの全てのマウスは肝肥大を有し、対照の172%より高い肝臓対身体比を有した(図20C)。EGFR/Akt経路の過剰活性化がこれらのマウスにおいて見出された(図20D)。尾静脈を通じたpT3-MAN2A1-FER-FLAGの導入の4週後には明確な形態のがん細胞が観察された(図20E)。がんの島は8週のうちに迅速に拡大し、12週の終わりにはほとんどの肝臓実質ががん細胞で置き換えられた。これらのがん細胞は大きい核及び核小体を含有し、脂肪空胞に富み、有意に多い数のKi-67陽性細胞を有した(図21)。グルタミンシンセターゼ染色パターンはがんにおいて喪失した(図21)。これらの特徴は、高グレードの肝臓がんに特徴的である。実際、pT3-MAN2A1-FER-FLAGの導入後14週を超えて生存するマウスはいなかった。対照的に、AAV-cre/pT3処置マウスは、同じ期間中に検出可能な病理学的表現型を示さなかった。以上を合わせると、特定の理論により限定されるものではないが、MAN2A1-FERはヒトがん進行の鍵となる推進因子の1つであることをこれらの分析は示唆する。
【０１１５】
【表４】
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【０１１６】
6.4考察
融合遺伝子の存在は、ヒト悪性腫瘍における鍵となる特徴の1つである。MAN2A1-FER融合物は、第5染色体の長鎖アーム中の組換えの結果物である。6つの異なるヒト悪性腫瘍、例えば肝臓がん及び食道腺癌におけるMAN2A1-FERの有意な存在は、この融合物がヒトがんの発生において重大な役割を果たす可能性を示唆する。17種類のヒトがんのThe Cancer Genome Atlasトランスクリプトームシークエンシングデータの検索ではMAN2A1-FER融合物は検出されなかった。そのような不一致は、The Cancer Genome Atlasデータ中のMAN2A1及びFERの両遺伝子の50の末端に位置する有意により小さい割合のマッピングされたリードの結果もたらされた可能性があり(図25)、その理由は、MAN2A1及びFERのメッセンジャーRNAの50の末端中の大きい数のリードがMAN2A1-FERの検出のために必要とされるからである。我々の知る限り、MAN2A1-FERは、EGFRシグナル伝達経路の発がん活性化につながる様式での構成的活性化チロシンキナーゼのゴルジ装置への移行の最初の例である。特定の理論に限定されないが、この活性化プロセスにおける極めて重要なリンクはEGFRの細胞外ドメイン中のチロシン残基88のリン酸化であると思われる。特定の理論に限定されないが、チロシン88はMAN2A1-FERによりリン酸化されるEGFRの唯一のチロシン残基であり、この残基のリン酸化はEGFRのMAN2A1-FER媒介性の活性化及び二量体化に必須であると思われる。チロシン88はEGFRのドメインI/IIの境界に位置する。この領域はEGFR二量体化の開始に関与すると推定される。この領域中の変異が報告されており、恐らくは二量体化のためのドメインコンフォメーションの変化により10、発がん性であることが示されている9。チロシン88のリン酸化はEGFR二量体化ドメインのコンフォメーションを同様に変化させ、受容体の発がん活性化につながる可能性がある。EGFR活性化及び二量体化の明白な増進にもかかわらず、MAN2A1-FERはゴルジ装置から形質膜へのEGFR輸送の速度に影響しないようである(図26)。
【０１１７】
チロシンキナーゼであるFERは報告が多いがん遺伝子である11。FERはアンドロゲン受容体(AR)12中のTyr223をリン酸化することによりARを活性化することをいくつもの研究が示した。FERは幹細胞チロシンキナーゼ1(STK1)13、マスト細胞増殖因子受容体(kit)14シグナル伝達及びc-met19シグナル伝達の必須成分であることをいくつかの研究は指し示している。FERの過剰発現は、乳がん15、腎臓細胞癌16、非小細胞肺がん17及び肝細胞癌18の不良な臨床アウトカムに関連する。FERのキナーゼ活性は明確に維持され、恐らくは、FERタンパク質中のSH2ドメインの除去によりMAN2A1-FER融合物中で過剰活性化される。微小管結合のために必要とされるFCHドメインの喪失は、その生理学的基質のほとんどにとってMAN2A1-FERキナーゼを利用できないものとする可能性がある。したがって、基質パターンの完全な変化がin vivoで起こる可能性がある。実際、ヒトがん中に検出されるFERの過剰発現の一部はFERに関連する融合遺伝子である可能性がある。
【０１１８】
FERキナーゼの構成的活性化及びゴルジ装置への移行はEGFRシグナル伝達の過剰活性化につながることをこの分析は示唆する。そのような活性化の帰結は、がんの過剰成長につながるだけでなく、EGFRシグナル伝達経路のキナーゼ阻害剤に対してがん細胞を感受性にする。実際、FER及びEGFRのキナーゼを標的化することにより、このアプローチはin vitro及びin vivoの両方でMAN2A1-FER陽性の異なる種類のヒトがんに対して一貫して効果的であることを我々は示した。これらの阻害剤の有効性は、MAN2A1-FERタンパク質をがん細胞から除去した場合、天然のFERタンパク質がいまだ存在する場合であっても、概ね妨げられる。特定の理論に制限されないが、天然FERではなく、MAN2A1-FER融合物はヒトがんの推進因子であることをこれらの発見は明確に主張する。MAN2A1-FER陽性のヒト悪性腫瘍に対するクリゾチニブ及びカネルチニブの有効性は重大な臨床的意味を有し、MAN2A1-FER融合物の存在はこれらのヒトがんにおいてスクリーニングすることができる。MAN2A1-FER融合物陽性の患者をこれらの薬物を用いて治療してより良好な臨床アウトカムを達成することができ、これは特に、転移を有し、手術又は放射線が好適でない患者に当てはまる。本研究は唯一、MAN2A1-FER融合遺伝子陽性がんの薬物治療の例を提供する。同様に、MAN2A1-FER又はEGFRシグナル伝達経路を標的化する他のキナーゼ阻害剤はこの融合物陽性のヒトがんに対して効果的であり得る。したがって、MAN2A1-FER/EGFR標的化は、肝臓がん及び他の悪性腫瘍などのこの融合遺伝子陽性のヒトがんの効果的な治療として見込みを有する可能性がある。
【０１１９】
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【０１２０】
様々な参考文献及び受託番号を本文献中に引用したが、これらは参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【０１２１】
【表５】
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【０１２２】
【表６】
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【０１２３】
【表７】
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【０１２４】
【表８】
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【０１２５】
【表９】
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【０１２６】
【表１０】
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【０１２７】
【表１１】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２２−３】
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【図２２−４】
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【図２２−５】
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【図２２−６】
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【図２２−７】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2020512286.tif 000076
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