(57)【要約】  本開示は、ヒトＣＤ３８に結合する抗体に見られる抗体配列を提供する。具体的には、本開示は、抗ヒトＣＤ３８抗体の配列を提供する。かかる配列を含む抗体およびその抗原結合部分は、医薬品製造および開発に適合した特徴を提示し、医学的方法および組成物に、具体的には、がんの治療に有用であり得る完全ヒト抗体（例えば、完全ヒトモノクローナル抗体または抗原結合断片）として提供され得る。
2020522280.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
可変重鎖相補性決定領域３としてａＣＤ３８−ｂ−３４８−ＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
ａ）可変重鎖相補性決定領域１としてａＣＤ３８−ｂ−３４８−ＨＣＤＲ１アミノ酸配列、および
ｂ）可変重鎖相補性決定領域２としてａＣＤ３８−ｂ−３４８−ＨＣＤＲ２アミノ酸配列をさらに含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３】
ａ）可変軽鎖相補性決定領域１としてａＣＤ３８−ｂ−３４８−ＬＣＤＲ１アミノ酸配列、
ｂ）可変軽鎖相補性決定領域２としてａＣＤ３８−ｂ−３４８−ＬＣＤＲ２アミノ酸配列、および
ｃ）可変軽鎖相補性決定領域３としてａＣＤ３８−ｂ−３４８−ＬＣＤＲ３アミノ酸配列をさらに含む、請求項１または請求項２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４】
前記抗体またはその抗原結合断片が、ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ＨＣＤＲ１２３アミノ酸配列を含む可変重鎖を含む、請求項１、２、または３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５】
前記抗体またはその抗原結合断片が、ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ＬＣＤＲ１２３アミノ酸配列を含む可変軽鎖をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６】
前記抗体またはその抗原結合断片が、ＬＣＤＲ３領域内のＤＧモチーフを除去するように突然変異する、請求項３〜５のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項７】
前記抗体またはその抗原結合断片が、ＱＱＥＡＮＶＹＴ、ＱＱＤＳＮＶＹＴ、ＱＱＤＡＮＶＹＴ、およびＱＱＥＧＮＶＹＴからなる群から選択されるＬＣＤＲ３領域を含む、請求項６に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項８】
前記抗体またはその抗原結合断片が、
ａ）配列番号１の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号２の配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号３の配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号５の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号６の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号７の配列を含むＬＣＤＲ３を含む抗体またはその抗原結合断片、
ｂ）配列番号１の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号２の配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号３の配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号５の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号６の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号１０の配列を含むＬＣＤＲ３を含む抗体またはその抗原結合断片、
ｃ）配列番号１の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号２の配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号３の配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号５の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号６の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号１１の配列を含むＬＣＤＲ３を含む抗体またはその抗原結合断片、
ｄ）配列番号１の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号２の配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号３の配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号５の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号６の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号１２の配列を含むＬＣＤＲ３を含む抗体またはその抗原結合断片、
ｅ）配列番号１の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号２の配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号３の配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号５の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号６の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号１３の配列を含むＬＣＤＲ３を含む抗体またはその抗原結合断片、
ｆ）配列番号４の配列を含む重鎖可変領域および配列番号８の配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合断片、
ｇ）配列番号４の配列を含む重鎖可変領域および配列番号２０の配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合断片、
ｈ）配列番号４の配列を含む重鎖可変領域および配列番号２１の配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合断片、
ｉ）配列番号４の配列を含む重鎖可変領域および配列番号２２の配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合断片、
ｊ）配列番号４の配列を含む重鎖可変領域および配列番号２３の配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合断片、
ｋ）配列番号１４の配列を含む重鎖可変領域および配列番号１９の配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合断片、
ｌ）配列番号１４の配列を含む重鎖可変領域および配列番号１５の配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合断片、
ｍ）配列番号１４の配列を含む重鎖可変領域および配列番号１６の配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合断片、
ｎ）配列番号１４の配列を含む重鎖可変領域および配列番号１７の配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合断片、および
ｏ）配列番号１４の配列を含む重鎖可変領域および配列番号１８の配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合断片からなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項９】
前記抗体またはその抗原結合断片が脱フコシル化される、請求項１〜８のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１０】
ヒトＣＤ３８のエピトープに特異的に結合する抗体または抗原結合断片であって、前記エピトープが、配列番号９のアミノ酸６５〜７９に含まれる１個以上のアミノ酸残基を含む、抗体または抗原結合断片。
【請求項１１】
前記エピトープが、配列番号９のアミノ酸６５〜７９を含む、請求項１０に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片の親和性成熟バリアント。
【請求項１３】
前記抗体またはその抗原結合断片が、モノクローナル抗体、ドメイン抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖ−Ｆｃ断片、一本鎖抗体（ｓｃＡｂ）、アプタマー、またはナノボディである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１４】
前記抗体またはその抗原結合断片が、ウサギ、マウス、キメラ、ヒト化、または完全ヒト抗原結合抗体である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１５】
前記抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４アイソタイプ抗体からなる群から選択される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１６】
前記抗体またはその抗原結合断片が、二重特異性抗体、多重特異性抗体、または治療薬もしくは診断薬をさらに含むイムノコンジュゲートに含まれる、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１７】
前記抗体またはその抗原結合断片が、ヒトＣＤ３８の細胞外ドメインに結合する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１８】
前記抗体またはその抗原結合断片が、細胞表面にヒトＣＤ３８を発現する細胞に結合し、ＣＤ３８調節抗体薬剤である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸分子。
【請求項２０】
請求項１９に記載の核酸分子を含む核酸ベクター。
【請求項２１】
請求項２０に記載の核酸ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２２】
請求項２１に記載の宿主細胞を培養することによって請求項１〜１８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片を産生するための方法。
【請求項２３】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む組成物。
【請求項２４】
薬学的に許容される担体または賦形剤をさらに含む、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記組成物が、がんの治療に使用するためのものである、請求項２４に記載の薬学的組成物。
【請求項２６】
がんを治療するための薬剤の製造における、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片の使用、または請求項２３に記載の組成物の使用。
【請求項２７】
がんを治療するための薬剤の製造における、ＣＤ３８の結合において請求項１〜１８のいずれか一項に記載の抗体と競合する抗体またはその抗原結合断片の使用。
【請求項２８】
対象におけるがんを治療する方法であって、前記対象に、請求項１４に記載の組成物の有効量を投与することを含む、方法。
【請求項２９】
対象におけるがんを治療する方法であって、前記対象に、ＣＤ３８の結合において請求項１〜１８のいずれか一項に記載の抗体と競合する抗体またはその抗原結合断片の有効量を投与することを含む、方法。
【請求項３０】
前記対象に、第２の薬剤を同時にまたは任意の順序で順次に投与することをさらに含む、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記対象が固形腫瘍を有する、請求項２８、２９、または３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記対象が血液癌を有する、請求項２８、２９、または３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
抗ＣＤ３８抗体を調製する方法であって、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の抗体を提供することと、前記抗体を親和性成熟に供することと、を含み、産生された前記抗ＣＤ３８抗体が、親抗体よりも高いＣＤ３８に対する親和性を有する、方法。
【請求項３４】
薬学的組成物を調製する方法であって、請求項３３に記載の方法に従って調製された抗体を提供することと、前記抗体を少なくとも１つ以上の薬学的に許容される賦形剤と共製剤化することと、を含む、方法。
【請求項３５】
請求項２３に記載の組成物を容器内に含むキット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ＣＤ３８は、特にニコチンアミドアデニンジヌクレオチドから環状アデノシン二リン酸リボース（ｃＡＤＰＲ）を産生する重要なＡＤＰ−リボシルシクラーゼとして酵素活性を有するＩＩ型膜受容体糖タンパク質である。異なる細胞外刺激によりｃＡＤＰＲ産生が誘導され得る。ｃＡＤＰＲは、細胞増殖、分化、接着、およびシグナル伝達等の多くの細胞機能に関与する細胞内カルシウム貯蔵の動員に重要である。ＣＤ３８は、当初は白血球活性化マーカーと特定されていたが、細胞シグナル伝達および細胞恒常性活性が寄与された受容体および外酵素としての２つの役割を果たす。ＣＤ３８は、慢性リンパ球性白血病、骨髄腫、および卵巣癌等の悪性腫瘍を含む様々なヒト疾患に関連している（Ｑｕａｒｏｎａ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．，２０１３、Ｗｅｉ  Ｗ，ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。
【０００２】
ＣＤ３８は、Ｔリンパ球およびＢリンパ球ならびにＮＫ細胞等のエフェクター細胞を含むが、制御性ＴおよびＢ細胞、脊髄由来抑制性細胞（ＭＤＳＣ）、または腫瘍関連マクロファージ等の免疫抑制性細胞も含む、免疫応答に関与する多くの細胞型（手短に免疫細胞と称される）の表面に見られる（Ｃｈｅｖｒｉｅｒ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．２０１７）。例えば、肺癌患者において、抗ＰＤ−１治療により、高レベルのＣＤ３８を発現したＰＤ−１発現Ｔ細胞の増殖が誘導された（Ｋａｍｐｈｏｒｓｔ  ＡＯ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。免疫細胞の生物学的活性のための、具体的には、生理学的および病理学的条件下での免疫応答の調節のためのｃＡＤＰＲ−およびＣＤ３８媒介性Ｃａ２＋シグナル伝達の重要性が文献に記載されている（Ｍｏｒａｎｄｉ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５、Ｒａｈ  ＳＹ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。
【０００３】
ＣＤ３８は、全ての病期の多発性骨髄腫患者および予後不良のＣＬＬ患者におけるがん細胞によって高度に発現される。主にＣＤ３８アンタゴニストまたは阻害剤としての役割を果たす化合物を生成することによって様々なＣＤ３８標的療法が開発されている（ｄｅ  Ｗｅｅｒｓ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１、ｖａｎ  ｄｅ  Ｄｏｎｋ  ＮＷ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６、Ｈｏｒｅｎｓｔｅｉｎ  ＡＬ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。ＣＤ３８アゴニストとしての役割を果たす抗ＣＤ３８モノクローナル抗体（ＩＢ４という名前のもの等）は、いくつかの活性の中でもとりわけ、カルシウムイオンの動員、ＣＤ３８シェディング、ＮＫ細胞媒介性細胞傷害性、サイトカイン分泌（具体的にはインターロイキン６およびインターフェロンガンマ）、およびヒトＴリンパ球の増殖を誘導することも特徴とし、免疫毒素を生成するように修飾された（Ｍａｌａｖａｓｉ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．，２００８、Ｈａｒａ−Ｙｏｋｏｙａｍａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００８、Ｆｒａｓｃａ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ，２００６、Ｋａｒａｋａｓｈｅｖａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。免疫細胞へのかかるプラスの影響は、Ｃａ２＋動員、ＣＤ３８酵素活性の阻害、および／または細胞内シグナル伝達経路の活性化の誘導に関連し得る。
【０００４】
モノクローナル抗体は、ＣＤ３８発現腫瘍細胞の標的直接死滅のために開発され、臨床試験で有望な結果を示している。しかしながら、かかる抗ＣＤ３８抗体の活性は、ＣＤ３８ががん細胞の表面に高度に発現される腫瘍に制限され得る。固形腫瘍では、ＣＤ３８の発現は、一般に、腫瘍細胞上でより低いか、または不在であり、エフェクターおよび抑制性の両方で腫瘍浸潤免疫細胞に関連し得る。したがって、ＣＤ３８特異的アゴニストまたは調節特性と標的細胞死滅または活性化等の異なる成分の組み合わせに由来する活性および医薬品開発との適合性を提示し、がんの治療、具体的には固形癌の治療に利用され得る抗ＣＤ３８抗体が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
いくつかの実施形態では、本発明は、新規のＣＤ３８調節抗体薬剤を提供する。いくつかの実施形態では、提供されるＣＤ３８調節抗体薬剤は、ＣＤ３８に、具体的にはヒトＣＤ３８に特異的に、多くの実施形態ではヒトＣＤ３８細胞外ドメイン内の部位に結合する抗体または抗原結合断片である。
【０００６】
いくつかの実施形態では、提供される抗体または抗原結合断片は、ＣＤ３８の１つ以上の特徴を調節する。すなわち、いくつかの実施形態では、ＣＤ３８のレベルおよび／もしくは活性、ならびに／またはその１つ以上の下流効果は、提供される抗体が不在の場合と比較して提供される抗体が存在した場合に検出可能に改変される。あるいは、または加えて、いくつかの実施形態では、ＣＤ３８のレベルおよび／もしくは活性、ならびに／またはその１つ以上の下流効果は、提供される抗体が存在した場合、参照ＣＤ３８調節抗体薬剤（既知の望ましい特質、例えば、ＣＤ３８の１つ以上の特徴を刺激する既知の能力を有する、例えば、ＩＢ−４等の参照抗ＣＤ３８抗体）が存在した場合と同等の条件下で観察されたものと同等であるか、またはそれを超える。
【０００７】
多くの実施形態では、ＣＤ３８の１つ以上の特徴は、提供されるＣＤ３８調節抗体薬剤（例えば、抗ＣＤ３８抗体またはその抗原結合断片）が存在した場合、強化される。例えば、いくつかの実施形態では、提供されるＣＤ３８調節抗体薬剤（例えば、抗ＣＤ３８抗体またはその抗原結合断片）の存在は、増加した免疫細胞活性化および／または増殖と相関する。したがって、提供されるＣＤ３８調節抗体薬剤は、多くの場合、本明細書で「アゴニスト」と称される。しかしながら、当業者であれば、本開示の教示が提供される抗体またはその抗原結合断片の特定の作用機構に限定されないことを理解するであろう。提供される抗体の関連する構造的および／または機能的特徴は、本明細書に記載されており、自明である。
【０００８】
いくつかの実施形態では、提供されるＣＤ３８調節抗体薬剤（例えば、ＣＤ３８抗体または抗原結合断片）は、例えば、ある特定の免疫エフェクター細胞（例えば、ＮＫ細胞および／またはＴ細胞）に対する影響を特徴とし得る。あるいは、または加えて、いくつかの実施形態では、提供されるＣＤ３８調節抗体薬剤（例えば、ＣＤ３８抗体または抗原結合断片）は、例えば、免疫抑制性細胞に対する影響を特徴とし得る。例えば、いくつかの実施形態では、提供されるＣＤ３８調節抗体薬剤は、ＮＫ細胞およびＴ細胞等の免疫エフェクター細胞に対する活性化特性、および免疫抑制性細胞等のＣＤ３８高度発現細胞に対する細胞傷害性特性を呈する。あるいは、または加えて、いくつかの実施形態では、提供されるＣＤ３８調節抗体薬剤は、ヒトＣＤ３８細胞外ドメイン内の特定のエピトープへの結合に関連し、かつ／またはそれらを薬学的使用および／または製造に特に従順なものにする１つ以上の特徴を特徴とする。
【０００９】
提供されるＣＤ３８調節抗体薬剤（例えば、提供される抗体またはその抗原結合断片（またはそのバリアント））、それらを含む組成物、および／またはそれらの使用を含む提供される技術が、医学に有用である。いくつかの実施形態では、かかる提供される技術は、がん療法および／または予防に有用である。
【００１０】
いくつかの実施形態では、提供されるＣＤ３８調節抗体薬剤は、ａＣＤ３８−ｂ−３４８の配列を有する抗体、およびより一般に１つ以上のその抗原結合断片または部分であるか、またはそれを含む抗体または薬剤、例えば、可変重鎖相補性決定領域３としてａＣＤ３８−ｂ−３４８−ＨＣＤＲ３アミノ酸配列（配列番号３）を含み、かつ／またはいくつかの実施形態ではａＣＤ３８−ｂ−３４８  ＨＣＤＲ１（配列番号１）配列およびＨＣＤＲ２（配列番号２）配列の一方または両方を含み、かつ／またはヒトＣＤ３８細胞外ドメインの結合においてａＣＤ３８−ｂ−３４８と競合する抗体または薬剤によって例証される。いくつかの実施形態では、提供される抗体またはその抗原結合断片は、１０−８Ｍの範囲、またはそれ以下（１０−９Ｍの範囲）のＫｄでヒトＣＤ３８に結合し、好ましくは、提供される抗体またはその抗原結合断片は、１０−８Ｍ〜１０−１１Ｍの範囲のＫｄでヒトＣＤ３８に結合する。いくつかの実施形態では、Ｋｄは、１０−８〜１０−１１である。抗体またはその抗原結合断片の結合親和性を評価するためのＫｄは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ分析またはＦｏｒｔｅ  Ｂｉｏ  Ｏｃｔｅｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓを使用した分析を含む標準の方法論によって得られ得る。
【００１１】
いくつかの実施形態では、提供されるＣＤ３８調節抗体薬剤（例えば、提供される抗体またはその抗原結合断片）は、ａＣＤ３８−ｂ−３４８によって結合されるヒトＣＤ３８上のエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、かかる提供されるＣＤ３８調節抗体薬剤は、ヒトＣＤ３８細胞外ドメインに結合し得る。いくつかの実施形態では、提供されるＣＤ３８調節抗体薬剤は、ＣＤ３８のエピトープ（例えば、本明細書に記載のまたはさもなければ当該技術分野で既知の１つ以上のアッセイを使用して評価される場合）、具体的には、ａＣＤ３８−ｂ−ｅｐと特定されるものに結合し得る。いくつかの実施形態では、提供される抗体またはその抗原結合断片は、ヒトおよびカニクイザルＣＤ３８（例えば、ヒトおよびカニクイザルＣＤ３８上の細胞外エピトープ）に１０−８Ｍの範囲のＫｄ値で結合し得、その抗原結合断片は、ヒトＣＤ３８に１０−８〜１０−１１Ｍの範囲のＫｄで結合する。
【００１２】
いくつかの実施形態では、提供される抗体またはその抗原結合断片は、（非突然変異体ヒトＣＤ３８（配列番号９）と比較して）突然変異体ヒトＣＤ３８に結合し、突然変異体ヒトＣＤ３８において、２７４位のセリン残基がフェニルアラニンで置換されている。
【００１３】
いくつかの実施形態では、提供される抗体またはその抗原結合断片は、（非突然変異体ヒトＣＤ３８（配列番号９）と比較して）突然変異体ヒトＣＤ３８に結合し、突然変異体ヒトＣＤ３８において、２０２位のアスパラギン酸残基がグリシン残基で置換されている。
【００１４】
いくつかの実施形態では、提供される抗体またはその抗原結合断片は、（非突然変異体ヒトＣＤ３８（配列番号９）と比較して）突然変異体ヒトＣＤ３８に結合し、突然変異体ヒトＣＤ３８において、２７４位のセリン残基がフェニルアラニンで置換されており、２０２位のアスパラギン酸残基がグリシン残基で置換されている。
【００１５】
とりわけ、本開示は、本明細書に記載の特に有用なＣＤ３８調節抗体薬剤（例えば、抗ＣＤ３８抗体またはその抗原結合断片）（例えば、ヒトＣＤ３８（例えば、その細胞外エピトープ）への特異的結合、１つ以上の本明細書に記載のＣＤＲ配列要素の包含（任意選択的にＨＣＤＲ１因子および／またはＨＣＤＲ２因子と組み合わせた、特にＨＣＤＲ３配列要素の包含）、本明細書に記載の細胞活性化活性、本明細書に記載の細胞傷害性活性（例えば、それらの表面で比較的高いＣＤ３８レベルで免疫制御性細胞に対して）、およびそれらの組み合わせ等のある特定の構造的および／または機能的特徴を特徴とする抗ＣＤ３８抗体またはその抗原結合断片）を特定および／または特徴付けるために利用され得る手順（図１）を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の特に有用な抗ＣＤ３８抗体は、複数のかかる特徴を特徴とする。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の抗体は、ＣＤ３８調節抗体薬剤として特徴付けられ得る。
【００１６】
したがって、本明細書に例証されるように、ａＣＤ３８−ｂ−３４８配列（具体的には、ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ＨＣＤＲ３（配列番号３）および／またはａＣＤ３８−ｂ−３４８−ＬＣＤＲ３（配列番号７））を含むある特定の抗体および／または抗原結合断片は、かかる望ましい構造的および／または機能的特徴を特徴とし、かかる抗体および／またはその抗原結合断片は、本明細書でＣＤ３８調節抗体薬剤と称され得る。加えて、本開示によれば、ａＣＤ３８−ｂ−３４８と競合する抗体およびその抗原結合断片が特に有用な抗体であり得、かかる抗体および／またはその抗原結合断片は、本明細書でＣＤ３８調節抗体薬剤とも称され得る。
【００１７】
本明細書に記載の抗体（および／またはその抗原結合断片）は、医学（例えば、療法および／または予防、例えば、がんの治療）に特に有用であり得、かつ／またはヒトＣＤ３８細胞外ドメイン内のエピトープ、例えば、ａＣＤ３８−ｂ−ｅｐと特定されるものを標的とすることを必要とするか、またはそれを含む方法に関する使用のためのものであり得る。提供される抗体またはその抗原結合断片は、最も適切なアイソタイプ、具体的には、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４アイソタイプ抗体からなる群からのヒトアイソタイプ、より具体的には、ヒトＩｇＧ１を提示するように調製され得る。
【００１８】
一態様では、本発明は、ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ＨＣＤＲ３アミノ酸配列（配列番号３）およびそれを含むポリペプチド、例えば、可変重鎖相補性決定領域３としてａＣＤ３８−ｂ−３４８−ＨＣＤＲ３アミノ酸配列（配列番号３）を含む抗体または抗原結合断片等を提供する。いくつかの実施形態では、かかる抗体または抗原結合断片は、
ａ）可変重鎖相補性決定領域１としてａＣＤ３８−ｂ−３４８−ＨＣＤＲ１アミノ酸配列（配列番号１）、および／または
ｂ）可変重鎖相補性決定領域２としてａＣＤ３８−ｂ−３４８−ＨＣＤＲ２アミノ酸配列（配列番号２）等のさらなるａＣＤ３８−ｂ−３４８アミノ酸配列要素を含むことをさらに特徴とし得る。
【００１９】
いくつかの実施形態では、提供される抗体またはその抗原結合断片は、ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ＨＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号４）に含まれるもの等の抗体フレーム配列によって特異的に分離された上で定義された可変重鎖相補性決定領域（すなわち、ａＣＤ３８−ｂ−３４８アミノ酸配列要素）を、特にそれらの結合特性および機能的特性を正しく発揮するために、さらに正しい順序で含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、提供される抗体またはその抗原結合断片は、ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ＨＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号４、またはそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列）を含み得、任意選択的に、
ａ）可変軽鎖相補性決定領域１としてａＣＤ３８−ｂ−３４８−ＬＣＤＲ１アミノ酸配列（配列番号５）、
ｂ）可変軽鎖相補性決定領域２としてａＣＤ３８−ｂ−３４８−ＬＣＤＲ２アミノ酸配列（配列番号６）、および
ｃ）可変軽鎖相補性決定領域３としてａＣＤ３８−ｂ−３４８−ＬＣＤＲ３アミノ酸配列（配列番号７）を含み得る。
【００２０】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ＨＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号４）を含む可変重鎖を含む単離された抗体またはその抗原結合断片を提供する。好ましくは、かかる単離された抗体またはその抗原結合断片は、実施例に記載されるように、ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ＬＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号８）を含む可変軽鎖をさらに含む。
【００２１】
いくつかの実施形態では、ａＣＤ３８−ｂ−３４８の可変重鎖配列は、配列：
2020522280.tif 000003
を含み、ａＣＤ３８−ｂ−３４８の可変軽鎖配列は、配列：
2020522280.tif 000004
を含む。
【００２２】
本発明は、ＨＣＤＲ３としてａＣＤ３８−ｂ−３４８−ＨＣＤＲ３の配列を含み、かつａＣＤ３８−ｂ−３４８−ＬＣＤＲ３、ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ１−ＬＣＤＲ３、ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ２−ＬＣＤＲ３、ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ３−ＬＣＤＲ３、およびａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ４−ＬＣＤＲ３からなる群から選択される配列を有するＬＣＤＲ３を含む抗体またはその抗原結合断片も提供する。
【００２３】
本発明は、ＨＣＤＲ１としてａＣＤ３８−ｂ−３４８−ＨＣＤＲ１の配列、ＨＣＤＲ２としてａＣＤ３８−ｂ−３４８−ＨＣＤＲ２の配列、ＨＣＤＲ３としてａＣＤ３８−ｂ−３４８−ＨＣＤＲ３の配列、ＬＣＤＲ１としてａＣＤ３８−ｂ−３４８−ＬＣＤＲ１の配列、ＬＣＤＲ２としてａＣＤ３８−ｂ−３４８−ＬＣＤＲ２の配列を含み、かつａＣＤ３８−ｂ−３４８−ＬＣＤＲ３、ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ１−ＬＣＤＲ３、ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ２−ＬＣＤＲ３、ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ３−ＬＣＤＲ３、およびａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ４−ＬＣＤＲ３からなる群から選択される配列を有するＬＣＤＲ３を含む抗体またはその抗原結合断片も提供する。
【００２４】
本発明は、可変重鎖領域としてａＣＤ３８−ｂ−３４８−ＨＣＤＲ１２３の配列を含み、かつａＣＤ３８−ｂ−３４８−ＬＣＤＲ１２３、ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ１−ＬＣＤＲ１２３、ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ２−ＬＣＤＲ１２３、ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ３−ＬＣＤＲ１２３、およびａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ４−ＬＣＤＲ１２３からなる群から選択される配列を有する可変軽鎖領域を含む抗体またはその抗原結合断片も提供する。
【００２５】
本発明は、可変重鎖領域としてａＣＤ３８−ｂ−３４８−ＶＨの配列を含み、かつａＣＤ３８−ｂ−３４８−ＶＬ、ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ１−ＶＬ、ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ２−ＶＬ、ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ３−ＶＬ、およびａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ４−ＶＬからなる群から選択される配列を有する可変軽鎖領域を含む抗体またはその抗原結合断片も提供する。
【００２６】
本発明は、ａＣＤ３８−ｂ−３４８のＣＤＲ配列または重鎖もしくは軽鎖可変配列等の参照配列に対してある特定の同一性％を有するバリアント抗体およびその抗原結合断片も提供する。かかる抗体およびその抗原結合断片は、本明細書でＣＤ３８調節抗体薬剤とも称され得る。
【００２７】
例えば、いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１４と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１４と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１４と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１４のアミノ酸配列を含む可変重鎖配列を含む。
【００２８】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１９と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１９と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１９と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む可変軽鎖配列を含む。
【００２９】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１４と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖配列および配列番号１９と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１４と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖配列および配列番号１９と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１４と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖配列および配列番号１９と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１４のアミノ酸配列を含む可変重鎖配列および配列番号１９のアミノ酸配列を含む可変軽鎖配列を含む。
【００３０】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４のアミノ酸配列を含む可変重鎖配列を含む。
【００３１】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体またはその抗原結合断片は、配列番号８と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体またはその抗原結合断片は、配列番号８と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体またはその抗原結合断片は、配列番号８と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体またはその抗原結合断片は、配列番号８のアミノ酸配列を含む可変軽鎖配列を含む。
【００３２】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖配列および配列番号８と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖配列および配列番号８と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖配列および配列番号８と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４のアミノ酸配列を含む可変重鎖配列および配列番号８のアミノ酸配列を含む可変軽鎖配列を含む。
【００３３】
かかるバリアント抗体およびその抗原結合断片は、ａＣＤ３８−ｂ−３４８について本明細書に開示される重鎖および軽鎖可変配列を有する抗体およびその抗原結合断片について記載されるものと同じ（または実質的に同じ）機能的および薬理学的特性を保持し得るか、または呈し得る。
【００３４】
さらに、ａＣＤ３８−ｂ−３４８アミノ酸配列は、上で定義されたａＣＤ３８−ｂ−３４８アミノ酸配列要素に対する置換の数によって定義される抗体配列も指す。例えば、かかる配列は、可変重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）として、ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ＨＣＤＲ３（配列番号３）内に最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸置換を含む配列を含み得る。さらなる実施形態では、ａＣＤ３８−ｂ−３４８アミノ酸配列は、可変重鎖相補性決定領域１、２、および３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）として、ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ＨＣＤＲ１、ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ＨＣＤＲ２、およびａＣＤ３８−ｂ−３４８−ＨＣＤＲ３内に最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸置換を含む配列、より好ましくは、ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ＨＣＤＲ１２３（配列番号４）内または配列番号１４内に最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸置換を含む配列を含む抗体配列も指す。いくつかの実施形態では、ａＣＤ３８−ｂ−３４８アミノ酸配列は、可変重鎖配列として、可変重鎖配列のフレームワーク領域内に最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸置換を含む配列を含む抗体配列も指す。かかるａＣＤ３８−ｂ−３４８アミノ酸配列要素およびかかる置換を提示する抗体は、ａＣＤ３８−ｂ−３４８、一般にＣＤ３８調節抗体薬剤の結合および／または機能的特性を依然として提示し得る。
【００３５】
かかるａＣＤ３８−ｂ−３４８アミノ酸配列は、可変軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）として、ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ＬＣＤＲ３（配列番号７）内に最大１、２、３、または４個のアミノ酸置換を含む配列も含み得る。さらなる実施形態では、ａＣＤ３８−ｂ−３４８アミノ酸配列は、可変軽鎖相補性決定領域１、２、および３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）として、ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ＬＣＤＲ１、ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ＬＣＤＲ２、およびａＣＤ３８−ｂ−３４８−ＬＣＤＲ３内に最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸置換を含む配列、より好ましくは、ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ＬＣＤＲ１２３（配列番号８）内または配列番号１９内に最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸置換を含む配列を含む抗体配列も指す。いくつかの実施形態では、ａＣＤ３８−ｂ−３４８アミノ酸配列は、可変軽鎖配列として、可変軽鎖配列のフレームワーク領域内に最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸置換を含む配列を含む抗体配列も指す。かかるａＣＤ３８−ｂ−３４８アミノ酸配列要素およびかかる置換を提示する抗体は、ａＣＤ３８−ｂ−３４８、一般にＣＤ３８調節抗体薬剤の結合および／または機能的特性を依然として提示し得る。
【００３６】
したがって、一実施形態では、本発明は、以下を含む抗ＣＤ３８抗体薬剤（すなわち、抗体またはその抗原結合断片、および本明細書に記載のそのバリアント、例えば、ＤＧモチーフを除去するように突然変異させたバリアント）を提供する：
ａ．ａＣＤ３８−ｂ−３４８（またはそのバリアント、例えば、その親和性成熟バリアント）の可変重鎖領域配列、またはａＣＤ３８−ｂ−３４８（またはそのバリアント、例えば、その親和性成熟バリアント）の可変重鎖領域配列と比較して最大５個のアミノ酸置換を有する可変重鎖領域配列、および／または
ｂ．ａＣＤ３８−ｂ−３４８（またはそのバリアント、例えば、その親和性成熟バリアント）の可変軽鎖領域配列、またはａＣＤ３８−ｂ−３４８（またはそのバリアント、例えば、その親和性成熟バリアント）の可変軽鎖領域配列と比較して最大５個のアミノ酸置換を有する可変軽鎖領域配列。
アミノ酸置換を組み込み得るａＣＤ３８−ｂ−３４８重鎖は、配列番号４および１４を含む。アミノ酸置換を組み込み得るａＣＤ３８−ｂ−３４８軽鎖は、配列番号８、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、および２３を含む。
【００３７】
アミノ酸置換は、好ましくは、本抗体の機能的特性に悪影響を及ぼさないか、または実質的に悪影響を及ぼさない。したがって、これらの置換は、保存的アミノ酸置換とみなされ得る。好ましくは、アミノ酸置換が生じる場合、それらは、重鎖および／または軽鎖可変領域の全長が変化しないように、１：１の比率で生じる。
【００３８】
本発明は、抗体の軽鎖または重鎖内のいずれのＤＧモチーフも、例えば、アスパラギン酸異性化に対する感受性を低下させるように改変され得る抗体またはその抗原結合断片、および／または抗体の軽鎖または重鎖内のいずれのメチオニンも、例えば、メチオニン酸化を低減するように改変され得る抗体またはその抗原結合断片も提供する。例えば、ＤＧモチーフは、モチーフ内のアミノ酸の一方または両方を異なるアミノ酸で置換するように改変され得る。例えば、かかるモチーフは、ＥＧ、ＤＱ、またはＤＡに突然変異し得る。メチオニン残基は、それを異なるアミノ酸、例えば、ロイシンまたはフェニルアラニンで置換するように改変され得る。
【００３９】
したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に提供される抗体またはその断片は、当該技術分野で標準であるように、ＤＧモチーフ、具体的にはＣＤＲ領域内に現れるＤＧモチーフを除去または修飾するように突然変異して、アスパラギン酸異性化に対する感受性を低下させ得る。このように修飾されたかかる抗体は、最終配列に到達する前にさらなる修飾（例えば、親和性成熟）を経る必要があり得る。
【００４０】
本発明の一実施形態では、本明細書に開示される抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列（例えば、ａＣＤ３８−ｂ−３４８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列）、または本明細書に開示されるいずれかの抗体の可変重鎖および可変軽鎖（例えば、ａＣＤ３８−ｂ−３４８の可変重鎖および可変軽鎖）であるが、ＣＤＲ（存在する場合）内の少なくとも１つのＤＧモチーフが異なるモチーフに変化した特定の配列とは異なる配列を有するバリアント抗体が提供される。開示されるバリアントは、ａＣＤ３８−ｂ−３４８について記載されるように使用および製剤化され得る。
【００４１】
例えば、ａＣＤ３８−ｂ−３４８は、そのＬＣＤＲ３配列内にＤＧモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ＤＧモチーフのアスパラギン酸が異なるアミノ酸に変化し得、かつ／またはＤＧモチーフのグリシンが異なるアミノ酸に変化し得る。かかる実施形態では、抗ＣＤ３８抗体またはその抗原結合断片は、例えば、ａＣＤ３８−ｂ−３４８であり得るか、またはそれに由来し得る。これらの実施形態のうちのいくつかでは、バリアント抗体またはその抗原結合断片は、表５に提供されるＶＬ  ＣＤＲ３配列（ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ１、ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ２、ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ３、およびａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ４とラベル付けされたもの）を有する。例えば、バリアントＬＣＤＲ３配列（例えば、ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ１バリアントＬＣＤＲ３配列、ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ２バリアントＬＣＤＲ３配列、ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ３バリアントＬＣＤＲ３配列、またはａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ４バリアントＬＣＤＲ３配列）は、ａＣＤ３８−ｂ−３４８のＬＣＤＲ１配列および／またはＬＣＤＲ２配列を含む抗体に組み込まれ得る。一実施形態では、バリアントＬＣＤＲ３配列（例えば、ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ１バリアントＬＣＤＲ３配列、ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ２バリアントＬＣＤＲ３配列、ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ３バリアントＬＣＤＲ３配列、またはａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ４バリアントＬＣＤＲ３配列）は、ａＣＤ３８−ｂ−３４８のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列を含む抗体に組み込まれ得る。いくつかの実施形態では、バリアント抗体またはその抗体結合断片は、ａＣＤ３８−ｂ−３４８の可変重鎖および可変軽鎖配列であるが、ＬＣＤＲ３配列がＤＧモチーフを除去するように突然変異した配列を含み得る（例えば、ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ１−ＬＣＤＲ３、ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ２−ＬＣＤＲ３、ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ３−ＬＣＤＲ３、またはａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ４−ＬＣＤＲ３が代わりにＬＣＤＲ３として存在し得る）。バリアント抗ＣＤ３８抗体は、親ａＣＤ３８−ｂ−３４８のいずれかおよび恐らく全ての結合特性および機能的特性を有するさらなる抗体を提供する。開示されるバリアントは、ａＣＤ３８−ｂ−３４８について記載されるように使用および製剤化され得る。
【００４２】
したがって、バリアント抗体ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ１は、
2020522280.tif 000005
の配列を含む重鎖可変領域、および
2020522280.tif 000006
の配列を含むバリアント軽鎖を含むことを特徴とし得る。
【００４３】
バリアント抗体ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ２は、
2020522280.tif 000007
の配列を含む重鎖可変領域、および
2020522280.tif 000008
の配列を含むおよびバリアント軽鎖を含むことを特徴とし得る。
【００４４】
バリアント抗体ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ３は、
2020522280.tif 000009
の配列を含む重鎖可変領域、および
2020522280.tif 000010
の配列を含むバリアント軽鎖を含むことを特徴とし得る。
【００４５】
バリアント抗体ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ４は、
2020522280.tif 000011
の配列を含む重鎖可変領域、および
2020522280.tif 000012
の配列を含むバリアント軽鎖を含むことを特徴とし得る。
【００４６】
本発明は、親和性成熟抗体、例えば、本明細書に開示される抗体のうちのいずれかに由来する親和性成熟バリアントも提供する。一実施形態では、親和性成熟抗体は、改変されたＤＧモチーフおよび／またはＮＧモチーフを有し、かつ／またはいずれかのメチオニン残基を除去するか、またはそれを突然変異させるように改変された親和性成熟抗体である。開示される親和性成熟バリアントは、ａＣＤ３８−ｂ−３４８について記載されるように使用および製剤化され得る。
【００４７】
いくつかの実施形態では、本発明は、抗ＣＤ３８抗体を調製する方法を提供し、本方法は、本明細書に記載の抗体（例えば、ａＣＤ３８−ｂ−３４８、またはその抗原結合断片もしくはバリアント）を提供することと、その抗体を親和性成熟に供することと、を含み、産生された抗体は、親抗体よりも高い親和性でＣＤ３８に結合する。好ましくは、産生された抗体は、例えば、Ｋｄによって測定される、ＣＤ３８に結合する親抗体よりも少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％高い親和性でＣＤ３８に結合する。親和性を測定するための方法は、当該技術分野で既知であり、以下の実施例に記載される。かかる方法によって産生された親和性成熟抗体は、他の抗ＣＤ３８抗体薬剤について本明細書に記載されるように製剤化および使用され得る。
【００４８】
親和性成熟は、当業者に既知の任意の好適な方法に従って行われ得る。例えば、インビトロ抗体ディスプレイシステムが、高親和性を有する特定の抗体の生成に広く使用されている。これらのシステムでは、表現型（すなわち、抗体断片）が遺伝子型（すなわち、抗体遺伝子）に結合されて、抗体の配列の直接決定が可能になる。抗体レパートリーのディスプレイを達成して、その後の結合剤の選択が可能になるいくつかのシステムが開発されており、選択ストリンジェンシーを増加させることにより、徐々に高くなる親和性のバリアントの選択が可能になる。抗体断片は、酵母で、リボソームで、ファージディスプレイ粒子で、またはＤＮＡへの直接結合によって発現され得る。
【００４９】
現在の抗体親和性成熟法は、２つの突然変異誘発カテゴリー、確率的および非確率的に属する。エラープローンポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、突然変異誘発因子細菌株、および飽和突然変異誘発が、確率的突然変異誘発法の典型的な例である。非確率的技法は、多くの場合、アラニンスキャニングまたは部位特異的突然変異誘発を使用して、特定のバリアントの限定された収集物を生成する。加えて、親抗体のシャッフルされたバリアントを得るためのシャッフリングアプローチを使用して、抗体親和性をさらに改善することもできる。
【００５０】
したがって、本発明の一実施形態では、親和性成熟法は、確率的突然変異誘発（例えば、エラープローンポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、突然変異誘発因子細菌株、または飽和突然変異誘発）、非確率的突然変異誘発（例えば、アラニンスキャニングまたは部位特異的突然変異誘発）、シャッフリング（例えば、ＤＮＡシャッフリング、鎖シャッフリング、またはＣＤＲシャッフリング）、および修飾を導入するためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムの使用からなる群から選択される。
【００５１】
親和性成熟法は、例えば、Ｒａｊｐａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，２００５，１０２（２４）：８４６６−７１，Ｓｔｅｉｎｗａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＡｂｓ，２０１４，６（１）：２０４−１８、ならびにＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｗｉｌｅｙ，２０１４，Ｃｈａｐｔｅｒ  ６，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ（１１５〜１４０貢）に記載されている。
【００５２】
いくつかの実施形態では、薬学的組成物を調製する方法が提供され、本方法は、上記の方法（すなわち、親和性成熟によって抗体を産生するための方法）に従って調製された抗体を提供することと、本抗体を少なくとも１つ以上の薬学的に許容される賦形剤と共製剤化することと、を含む。薬学的組成物の調製に使用される抗体は、ａＣＤ３８−ｂ−３４８の親和性成熟バリアントであり得る。かかる方法によって産生された薬学的組成物は、他の抗ＣＤ３８抗体薬剤について本明細書に記載の本発明の治療法に使用され得る。
【００５３】
本明細書に記載の提供される抗体および／またはその抗原結合断片（例えば、１つ以上のａＣＤ３８−ｂ−３４８アミノ酸配列要素、例えば、ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ＨＣＤＲ３またはａＣＤ３８−ｂ−３４８−ＨＣＤＲ１２３を含み得、かつ／またはヒトＣＤ３８および非ヒト霊長類ＣＤ３８、例えば、カニクイザルＣＤ３８等への結合においてａＣＤ３８−ｂ−３４８と競合し得るＣＤ３８調節抗体薬剤）は、様々な型式のうちのいずれかで提供され得る。例えば、いくつかの実施形態では、適切な型式は、モノクローナル抗体、ドメイン抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖ−Ｆｃ断片、一本鎖抗体（ｓｃＡｂ）、アプタマー、またはナノボディであり得るか、またはそれらを含み得る。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片（および具体的にはモノクローナル抗体）は、ウサギ、マウス、キメラ、ヒト化、または完全ヒト抗体またはその抗原結合断片であり得る。いくつかの実施形態では、提供される抗体またはその抗原結合断片は、最も適切であり得るように、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、またはＩｇＭアイソタイプのもの（好ましくはヒトのもの）であり得る。いくつかの実施形態では、提供される抗体またはその抗原結合断片は、ＩｇＧアイソタイプ、より具体的には、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４アイソタイプ（好ましくはヒトＩｇＧ１）であり得る。いくつかの実施形態では、提供される抗体またはその抗原結合断片は、（例えば、さらなる結合部分および／または機能的部分を、ａＣＤ３８−ｂ−３４８アミノ酸配列等のＣＤ３８調節抗体薬剤に結合させることが望ましい場合、例えば、多重特異性結合剤の一部として提供され、単離された抗体または抗原結合は、二重特異性抗体、多重特異性抗体、または当該技術分野で利用可能であり得る他の多重特異性型式に含まれ得る。
【００５４】
いくつかの実施形態では、提供されるＣＤ３８調節抗体薬剤は、ＣＤ３８結合実体（例えば、抗ＣＤ３８抗体またはその抗原結合断片）およびコンジュゲートされたペイロード、例えば、治療薬または診断薬を含む。多くのかかる実施形態では、この薬剤は、「イムノコンジュゲート」と見なされ、かつ／または「イムノコンジュゲート」と称される。抗体−薬物等の特定のイムノコンジュゲートを生成するために使用され得る技術および化合物の例は、文献（Ｂｅｃｋ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）に記載されており、いくつかの既知の抗ＣＤ３８抗体に適用可能なものであると記載されている（ＷＯ２０１６／１６６３０４）。
【００５５】
いくつかの実施形態では、本発明は、本発明は、提供される抗体またはその抗原結合断片を特定するａＣＤ３８−ｂ−３４８アミノ酸配列を提供する。いくつかの実施形態では、かかる配列は、ヒトＣＤ３８の細胞外ドメイン内のエピトープ（ａＣＤ３８−ｂ−ｅｐ等）に結合し、かつ任意選択的に、単離されたタンパク質として、またはＣＤ３８を発現する細胞（免疫細胞または細胞株等、例えば、Ｒａｊｉ細胞）の表面のいずれかで、カニクイザルおよび／またはマウスＣＤ３８の対応するエピトープにも結合する提供される抗体またはその抗原結合断片を特定する。
【００５６】
本発明は、本発明のＣＤ３８調節抗体薬剤によって結合されるエピトープと同じ（または同様の）エピトープに結合するＣＤ３８調節抗体薬剤も提供する。例えば、一実施形態では、（ａＣＤ３８−ｂ−３４８（またはそのバリアント））と同じ（または同様の）エピトープに結合する抗体が提供される。
【００５７】
いくつかの実施形態では、本発明は、ヒトＣＤ３８のエピトープに特異的に結合する抗ＣＤ３８抗体または抗原結合断片を提供し、このエピトープは、配列番号９のアミノ酸６５〜７９に含まれる１個以上のアミノ酸残基（すなわち、ａＣＤ３８−ｂ−ｅｐ）を含む。好ましくは、このエピトープは、少なくとも４個のアミノ酸を含み、このエピトープは、配列番号９のアミノ酸６５〜７９に含まれる１個以上のアミノ酸を含む。好ましくは、このエピトープは、少なくとも５個のアミノ酸、少なくとも６個のアミノ酸、少なくとも７個のアミノ酸、少なくとも８個のアミノ酸、少なくとも９個のアミノ酸、少なくとも１０個のアミノ酸、少なくとも１１個のアミノ酸、少なくとも１２個のアミノ酸、少なくとも１３個のアミノ酸、または少なくとも１４個またはそれ以上のアミノ酸を含み、このエピトープは、配列番号９のアミノ酸６５〜７９に含まれる１個以上のアミノ酸を含む。このエピトープは、直鎖状または立体構造的、すなわち、不連続のいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体または抗原結合断片は、ヒトＣＤ３８のエピトープに特異的に結合し、このエピトープは、配列番号９のアミノ酸６５〜７９に含まれる少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、または少なくとも１４個またはそれ以上のアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体または抗原結合断片は、配列番号９のアミノ酸６５〜７９を含むエピトープに結合する。
【００５８】
いくつかの実施形態では、本発明は、同じエピトープにおいて、具体的には、実施例においてａＣＤ３８−ｂ−ｅｐ（タンパク質配列ＡＲＣＶＫＹＴＥＩＨＰＥＭＲＨ、Ｕｎｉｐｒｏｔ配列Ｐ２８９０７内のアミノ酸６５〜７９、配列番号９）と特定されたエピトープにおいて競合する、単離されたタンパク質として、かつヒトＣＤ３８を発現する細胞の表面でのヒトＣＤ３８細胞外ドメインへの結合を可能にする、ａＣＤ３８−ｂ−３４８アミノ酸配列を含み、かつ／または１つ以上のａＣＤ３８−ｂ−３４８アミノ酸配列要素を含む抗体またはその抗原結合断片と同等の結合特徴を提示する（例えば、ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ＨＣＤＲ３アミノ酸配列（配列番号３）を含み、かつ／またはａＣＤ３８−ｂ−３４８と競合する）抗体またはその抗原結合断片をスクリーニングおよび／または特徴付けるための手順を提供する。
【００５９】
さらに、本発明は、１つ以上のａＣＤ３８−ｂ−３４８アミノ酸配列要素を含む抗体またはその抗原結合断片と同等の機能的特徴を提示する抗体またはその抗原結合断片をスクリーニングするための手順も提供し、かかる特徴は、細胞活性化および細胞傷害性活性であり、ＣＤ３８調節抗体薬剤の役割を果たす。これらの範囲で、インビトロ／エクスビボアッセイ、細胞ベースのアッセイ、および／または動物モデルで評価される場合、かかる特徴のうちのいずれかであるが、これらの恐らく全ての存在を確立するために、候補抗体が、実施例に記載のアッセイ（図１を参照のこと）または当該技術分野で既知の他のアッセイで試験され得る。
【００６０】
いくつかの実施形態では、本発明は、ａＣＤ３８−ｂ−３４８アミノ酸配列等のＣＤ３８調節抗体薬剤を含む単離された抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸分子を提供する。いくつかの実施形態では、かかる提供される核酸分子は、コドン最適化核酸配列を含み得、かつ／または宿主細胞、例えば、最近、酵母、昆虫、魚、マウス、サル、またはヒト細胞等での発現に適切な核酸ベクター内の発現カセットに含まれ得る。
【００６１】
いくつかの実施形態では、本発明は、ＣＤ３８調節抗体薬剤（例えば、ａＣＤ３８−ｂ−３４８アミノ酸配列を含む）の１つ以上の特性、例えば、本明細書に記載の特性を有する提供されるＣＤ３８調節抗体薬剤（例えば、抗体またはその抗原結合断片）を発現する異種核酸分子（例えば、ＤＮＡベクター）を含む宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＣＤ３８調節抗体薬剤（例えば、ａＣＤ３８−ｂ−３４８アミノ酸配列を含む）の１つ以上の特性、例えば、本明細書に記載の特性を有するＣＤ３８調節抗体薬剤（例えば、抗体またはその抗原結合断片）を調製する方法を提供する。いくつかの実施形態では、かかる方法は、核酸（例えば、ベクターを含み得、かつ／またはベクターを介して宿主細胞に送達され得る異種核酸）を含む宿主細胞を培養することを含み得る。いくつかの実施形態では、かかる宿主細胞（および／または異種核酸配列）は、ＣＤ３８調節抗体薬剤（例えば、本抗体またはその抗原結合断片）が宿主細胞から分泌され（例えば、それが細胞培養上清から単離され得るように）、かつ／または細胞表面に曝露されるように配置および構築される（例えば、かかるａＣＤ３８−ｂ−３４８アミノ酸配列および配列要素が、モノクローナル抗体の特異性をＴ細胞にグラフトする人工Ｔ細胞受容体で見られるように、かかる細胞との関連で使用されるか、またはかかる細胞と一緒に使用されるよう意図されている場合）。
【００６２】
いくつかの実施形態では、本抗体またはその抗原結合断片（またはそのバリアント）は、脱フコシル化され得る。抗体グリコシル化が、抗体（例えば、モノクローナル抗体、組換え抗体、および／または別様に操作または単離された抗体）の活性、薬物動態、および薬力学に影響を及ぼし得、Ｆｃ融合タンパク質および特定の技術を利用して、所望のグリコシル化プロファイルを有する抗体を得ることができることが周知である（Ｌｉｕ  Ｌ，２０１５）。本発明に従う使用のための抗体（例えば、ＣＤ３８調節抗体薬剤であり得るか、またはＣＤ３８調節抗体薬剤とされ得る抗体を含む、例えば、本明細書に記載の抗ＣＤ３８抗体）の細胞傷害性を支持するエフェクター機能は、抗体のフコシル化レベルを低下させる方法を使用して強化され得る。かかる特性を提示する特定のａＣＤ３８−ｂ−３４８配列要素を含む抗体は、例えば、フコシル化能力を有しないか、またはフコシル化能力が低下した抗体（これらのうちのいくつかは市販されている（Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（Ｌｏｎｚａ）ＧｌｙＭＡＸＸ（ＰｒｏＢｉｏｇｅｎ）等））を産生し得る細胞株を遺伝子操作するための技術を使用して、ａＣＤ３８−ｂ−３４８配列を発現させることによって、または製造プロセスを操作することによって、例えば、オスモル濃度を制御することによって、かつ／または酵素阻害剤を使用することによって生成され得、例えば、ＥＰ２４８０６７１に記載の方法も参照されたい。
【００６３】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の（具体的には、例えば、ａＣＤ３８−ｂ−３４８抗体またはその抗原結合断片、およびそれらのバリアントを含む、例えば、本明細書でＣＤ３８調節抗体薬剤と称される抗体について記載の）望ましい特性を有する提供される抗体またはその抗原結合断片を含む組成物（例えば、薬学的組成物）を提供する。いくつかの実施形態では、かかる提供される組成物は、治療的使用、診断的使用、または予防的使用等の医学的使用を目的とし、かつ／またはそれらで使用される。いくつかの実施形態では、かかる提供される組成物は、薬学的に許容される担体または賦形剤をさらに含み得、かつ／またはがんの治療に使用するためのものであり得る。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、当該技術分野で既知のように、１つ以上の担体、賦形剤、塩、緩衝剤等と製剤化され得る。当業者であれば、所与の方法および／または投与部位、例えば、非経口投与（例えば、皮下、筋肉内、または静脈内注射）、粘膜、腫瘍内、腫瘍周辺、経口、または局所投与に特に望ましく、かつ／または有用であり得るものを含む、様々な製剤化技術を認識し、それらを容易に利用することができる。多くの実施形態では、本明細書に記載のＣＤ３８調節抗体薬剤（例えば、抗ＣＤ３８抗体またはその抗原結合部分）を含む提供される薬学的組成物は、非経口送達（例えば、注射および／または注入による）用に製剤化される。いくつかの実施形態では、かかる提供される薬学的組成物は、例えば、予充填シリンジまたはバイアル型式で提供され得る。いくつかの実施形態では、かかる提供される薬学的組成物は、例えば、乾燥（例えば、凍結乾燥）形態で提供および／または利用され得、あるいは、いくつかの実施形態では、かかる提供される薬学的組成物は、液体形態（例えば、溶液、懸濁液、分散液、乳濁液等）、ゲル形態等で提供および／または利用され得る。
【００６４】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の（例えば、ａＣＤ３８−ｂ−３４８アミノ酸配列要素を含む）ＣＤ３８調節抗体薬剤（例えば、抗ＣＤ３８抗体またはその抗原結合断片）の使用、および／またはそれらを含む組成物の使用、がん、例えば、Ｂ細胞悪性腫瘍、リンパ腫、（ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性白血病、急性リンパ性白血病、骨髄腫）、骨髄増殖性障害、固形腫瘍（例えば、乳癌（ｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、扁平上皮細胞癌、結腸癌、頭頸部癌、肺癌、泌尿生殖器癌、直腸癌、胃癌、肉腫、黒色腫、食道癌、肝臓癌、睾丸癌、子宮頸癌、肥満細胞腫、血管腫、眼癌、喉頭癌、口腔癌、中皮腫、皮膚癌、直腸癌、咽喉癌、膀胱癌、乳癌（ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ）、子宮癌、前立腺癌、肺癌、膵臓癌、腎臓癌、胃癌、非小細胞肺癌、および卵巣癌）の治療および／または治療のための薬剤の製造における使用を提供する。上記のがんは、特定の腫瘍関連マーカーおよび抗原、例えば、ＣＤ２０、ＨＥＲ２、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＳＬＡＭ７Ｆ、ＣＤ４７、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４、ＴＩＭ３、ＣＤ２５、ＣＤ３８、ＧＩＴＲ、ＥＧＦＲ等、または高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ−Ｈ）もしくはミスマッチ修復欠損（ｄＭＭＲ）と称されるバイオマーカーを有すると特定されたがんの存在に基づいて定義することもできる。さらに、かかる状態は、上記のがんの前癌性非侵襲性状態、例えば、上皮内癌、くすぶり型骨髄腫、意義不明の単クローン性高ガンマグロブリン血症モノクローナル、頸部上皮内癌、ＭＡＬＴｏｍａｓ／ＧＡＬＴｏｍｅｓ、および様々なリンパ増殖性障害を定義する際にも考慮され得る。好ましくはいくつかの実施形態では、治療される対象は、固形腫瘍を有する。一実施形態では、対象は、血液癌を有する。いくつかの実施形態では、対象は、ＣＤ３８陽性腫瘍を有する。
【００６５】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、対象におけるがんを治療する方法を提供し、本方法は、対象に、本明細書に記載の（例えば、ａＣＤ３８−ｂ−３４８アミノ酸配列を含む）提供されるＣＤ３８調節抗体薬剤（例えば、抗ＣＤ３８抗体またはその抗原結合断片）を含む組成物の有効量を投与することを含む。いくつかの実施形態では、提供される方法は、対象に、少なくとも１つの追加の薬剤または療法を同時にまたは任意の順序で順次に投与する（すなわち、対象が併用療法を受けるようになる）ことをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、かかる少なくとも１つの追加の薬剤または療法は、抗がん剤（例えば、化学療法剤）、放射線療法（Ｘ線照射を外部から身体に当てることによって、または放射線コンジュゲート化合物を投与することによって）、抗腫瘍抗原またはマーカー抗体（例えば、抗原またはマーカーが、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＡ１２５、ＰＳＭＡ、ｃ−ＭＥＴ、ＶＥＧＦ、ＣＤ１３７、ＶＥＧＦＲ２、ＣＤ２０、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３２６、ＣＡＩＸ、ＣＤ４０、ＣＤ４７、またはＥＧＦ受容体である）、チェックポイント阻害剤または免疫調節抗体（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＴＩＭ３、ＣＤ２５、ＧＩＴＲ、ＣＤ１３４、ＣＤ１３４Ｌ、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７ＲＰ１、ＬＡＧ３、ＩＣＯＳ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＣＤ２８、ＡＰ２Ｍ１、ＳＨＰ−２、ＯＸ−４０等を標的とする抗体）、ワクチン、アジュバント、使用基準プロトコル、がん細胞を標的とするか、またはがん細胞に対する免疫応答を刺激する１つ以上の他の化合物、またはそれらの任意の組み合わせであり得るか、またはそれらを含み得る。ある特定の具体的な実施形態では、かかる少なくとも１つの追加の薬剤または療法が抗体であるか、またはそれを含む場合、かかる抗体の型式および／またはかかる抗体によって標的とされる抗原は、文献で列記されるものから選択され、恐らく所与のがんに適合され得る（Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ  Ｍ＆Ｍｅｌｌｍａｎ  Ｉ，２０１３、Ｒｅｄｍａｎ  ＪＭ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５、Ｋｉｊａｎｋａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。
【００６６】
なおさらに、本発明は、本明細書に記載の（例えば、ａＣＤ３８−ｂ−３４８アミノ酸配列を含む）提供されるＣＤ３８調節抗体薬剤（例えば、抗ＣＤ３８抗体またはその抗原結合断片）、またはかかる単離された抗体または抗原結合断片の投与、保管、または他の使用を可能にする関連組成物を含む様々なキットまたは製品を提供する。いくつかの実施形態では、提供されるキットは、かかる組成物を、任意選択的に、１つ以上の製品、希釈剤、試薬、固相、および／またはキットの正しい使用に関する指示と一緒に含む容器（ｖｅｓｓｅｌ）、シリンジ、バイアル、または他の容器（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）を含む。
【００６７】
いくつかの実施形態では、医学的使用等の特定の使用のための、具体的には、がんを治療するための本明細書に記載の（例えば、ａＣＤ３８−ｂ−３４８アミノ酸配列を含む）特定のＣＤ３８調節抗体薬剤（例えば、抗ＣＤ３８抗体またはその抗原結合断片）の特定、特徴付け、および／または検証は、本明細書に記載の１つ以上のアッセイまたはシステムを使用することによって行われ得る。いくつかの実施形態では、かかる特定、特徴付け、および／または検証は、例えば、異なる実験設定および／または選択されたパネル（例えば、がん由来の細胞株）を使用して、１つ以上の細胞ベースのアッセイにおける活性の分析を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の提案された免疫学的機構に関連するある特定の望ましいＣＤ３８調節抗体薬剤の活性を特に考慮して、望ましい特定、特徴付け、および／または検証は、がんが誘導された動物モデルまたはがん細胞が異種移植片もしくは同系／同種がん由来の細胞として移植された動物モデルで生成された関連データの収集を含み得る。あるいは、または加えて、いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣ（すなわち、ヒト化ＰＢＭＣマウスモデル）またはＣＤ３４＋造血幹細胞（すなわち、ＣＤ３４＋ヒト化マウス）等のヒト細胞の移植を伴う動物モデルを利用して、モデル系におけるヒト免疫細胞でのＣＤ３８調節抗体薬剤の活性の評価を可能にすることができる。
【００６８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の（例えば、ａＣＤ３８−ｂ−３４８アミノ酸配列を含むか、またはさもなければＣＤ３８調節抗体薬剤として本明細書に記載の薬剤の構造的および／または機能的特性を含む）ＣＤ３８調節抗体薬剤（例えば、抗ＣＤ３８抗体またはその抗原結合断片）の関連配列は、薬学的および／または技術的理由のためより適切または望ましい抗体フレームとの関連でクローン化され得、かつ／またはそこで発現され得る。例えば、かかる配列（恐らくコドン最適化ＶＨおよびＶＬコード配列として）は、ヒトＩｇＧ１定常領域（ｈＩｇＧ１）と一緒にクローン化され得、および適切な抗体発現ベクターおよび細胞株（ＣＨＯ由来の細胞株、例えば、ＣＨＯ−Ｓ等）を使用して発現され得る。いくつかの具体的な実施形態では、ヒトＩｇＧ１型式の抗体における提供される抗体配列の発現および分泌は、（親和性クロマトグラフィー、ゲル濾過、および／または他の適切な技法によって）後に抗体を精製するために使用される細胞溶解物中の還元条件下でのトランスフェクションおよび上清中の非還元条件でのトランスフェクション後に分析され得る。ヒトＩｇＧ１型式（例えば、ＣＤ３８調節抗体薬剤−ｈＩｇＧ１）での提供される抗ＣＤ３８抗体配列の結合および／または他の機能的特性は、例えば、以下の実施例に記載の１つ以上のアッセイを使用することによって分析され得る。例えば、かかるｈＩｇＧ１−型式での提供される抗体は、例えば、フローサイトメトリーを使用して、ヒトおよびカニクイザルＰＢＭＣへの結合について評価され得る。あるいは、または加えて、特定の免疫細胞集団への結合は、例えば、特定の免疫細胞集団に対する１つ以上の特異的マーカー、例えば、ＣＤ３、ＣＤ４５、ＣＤ５６、およびＣＤ１５９（ＮＫＧ２Ａ）（ＮＫ細胞の場合）、ＣＤ１４（単球の場合）、ＣＤ１９（Ｂ細胞の場合）、および／またはＣＤ４／ＣＤ８（Ｔ細胞の場合）を用い得るフローサイトメトリーを使用して評価され得る。
【００６９】
さらに、本明細書に記載の（例えば、ａＣＤ３８−ｂ−３４８アミノ酸配列を含むか、またはさもなければＣＤ３８調節抗体薬剤−ｈＩｇＧ１等のＣＤ３８調節抗体薬剤として本明細書に記載の薬剤の構造的および／または機能的特性を含む）１つ以上のＣＤ３８調節抗体薬剤（例えば、抗ＣＤ３８抗体またはその抗原結合断片）の、ヒト健常ドナーおよび／または患者から単離されたヒト原発腫瘍細胞および／または免疫細胞に対する影響が評価され得る。個々の免疫細胞集団への潜在的影響をより詳細に調査するために、かかるＣＤ３８調節抗体薬剤を使用して、腫瘍（および／もしくはリンパ節等の臓器）から単離されたＰＢＭＣおよび／もしくは細胞、ならびに／または精製されたヒトＣＤ８およびＣＤ４Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、ＭＤＳＣ細胞、樹状細胞、マクロファージおよび単球、好中球、ＮＫ細胞、ならびに他の細胞型を処理することができる。潜在的読み出しは、サイトカイン放出、腫瘍細胞死滅、細胞増殖、および／または活性化、アポトーシス、抗原特異的および／もしくは同種応答、またはそれらの任意の組み合わせを含む。あるいは、または加えて、マウスまたは非ヒト霊長類が処理され得、細胞状態が、フローサイトメトリーを使用して、またはそれらの動物から様々な臓器および／または細胞を単離した後に追跡され得る。
【００７０】
あるいは、または加えて、本明細書に記載の（例えば、ａＣＤ３８−ｂ−３４８アミノ酸配列を含むか、またはさもなければＣＤ３８調節抗体薬剤−ｈＩｇＧ１等のＣＤ３８調節抗体薬剤として本明細書に記載の薬剤の構造的および／または機能的特性を含む）ＣＤ３８調節抗体薬剤（例えば、抗ＣＤ３８抗体またはその抗原結合断片）の１つ以上の特性は、かかるＣＤ３８調節抗体薬剤の、ＣＤ３８発現細胞（例えば、ＮＫ細胞またはＴ細胞）、ＣＤ３８酵素活性、ＣＤ３８誘導性Ｃａ２＋レベルおよびタンパク質リン酸化、ＣＤ３８シェディングおよび／もしくは内部移行、細胞内経路（例えば、ＮＦκＢ経路）のＣＤ３８誘導性活性化、ならびに／またはＣＤ３１および他の受容体タンパク質（例えば、ＣＤ１６、ＴＣＲ、ＢＣＲ等）との相互作用への影響を研究することによって、単独で、または組み合わせで評価され得る。ＣＤ３８下流活性における後者のプロセスの関与も、これらのプロセスの特異的阻害剤を使用して評価され得る。その後、ａＣＤ３８調節抗体薬剤−ｈＩｇＧ１抗体がカニクイザルに投与された場合、これらの細胞効果がインビボで追跡され得る。
【００７１】
本発明のいくつかの実施形態では、本抗体（および本明細書に記載のそのバリアント、例えば、ＤＧモチーフを除去するように突然変異させたバリアント）は、有利な活性プロファイルを有し得る。例えば、一実施形態では、本抗体またはその抗原結合断片（およびそのバリアント）は、
−ＣＤ３８＋標的細胞に対する抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）活性を呈し得、
−補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を呈し得、
−抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）を呈し得、かつ／または
−免疫エフェクター細胞活性化を誘導し得る。
【００７２】
好ましくは、ａＣＤ３８−ｂ−３４８またはその抗原結合断片（またはそのバリアント）は、同じまたは実質的に同じ条件下でのダラツムマブと比較して、ＣＤ３８＋標的細胞に対する低下したＣＤＣ活性を呈する。
【００７３】
抗ＣＤ３８抗体またはその抗原結合断片の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）活性は、実施例に記載のアッセイを使用して、例えば、標的細胞としてＣＤ３８＋Ｄａｕｄｉ細胞およびエフェクター細胞としてヒトＰＢＭＣ細胞を使用して、インビトロで決定され得、標的細胞のエフェクター細胞に対する比率は、約５０：１〜約２５：１である。
【００７４】
ＣＤ３８＋標的細胞に対する補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）活性は、実施例に記載のアッセイを使用して、例えば、１０％補体の存在下でＣＤ３８＋Ｄａｕｄｉ細胞および／またはＲａｊｉ細胞を使用して、インビトロで決定され得る。ＣＤＣ活性は、ヒト補体の存在下で抗体濃度を最大１０μｇ／ｍＬに増加させて標的細胞を処理することによって決定され得る。いくつかの実施形態では、ＣＤＣ活性は、１０％補体の存在下でＣＤ３８＋細胞、すなわち、ＣＤ３８＋Ｄａｕｄｉ細胞の最大細胞溶解パーセンテージを測定することによって決定され得る。所与の抗体の最大溶解は、実験間で異なり得る。したがって、例えば、ＥＣ５０値ならびに／または参照抗体（ダラツムマブ等）と比較した最大溶解％および／もしくはＥＣ５０の倍差を含む、ＣＤＣ活性を測定するための他の測定基準を考慮することが有益である。したがって、ダラツムマブと比較してより低いＣＤＣ活性の決定は、いずれかの値のダラツムマブと比較した最大溶解％、ＥＣ５０、および／または倍変化を参照し得る。
【００７５】
本発明の好ましい一実施形態では、ＣＤ３８調節抗体薬剤は、ＣＤＣを、
ａ）ダラツムマブよりも少なくとも０．５倍高い（またはより好ましくは少なくとも１倍高い）ＥＣ５０で、または
ｂ）ダラツムマブが呈する最大溶解％の半分以下である、１０％補体の存在下でのＲａｊｉ細胞および／またはＤａｕｄｉ細胞において測定される最大溶解％で呈し得る。
【００７６】
言うまでもなく、ダラツムマブのＣＤＣは、比較のために同じまたは実質的に同じ条件下で決定される。ＣＤＣ活性は、最大約１０μｇ／ｍＬの抗体濃度を使用して決定され得る。当業者であれば、最大細胞溶解を決定する際に、最大細胞溶解がより低い抗体濃度で生じ得るため、１０μｇ／ｍＬの濃度が必ずしも必要とされるわけではないが、１０μｇ／ｍＬが必要に応じて使用され得ることを理解するであろう。
【００７７】
いくつかの実施形態では、ダラツムマブと比較したＣＤＣ活性の低下は、抗体またはその抗体結合断片のＥＣ５０が、同じまたは実質的に同じ条件下でのダラツムマブのＥＣ５０よりも少なくとも約０．５倍高い（すなわち、少なくとも約１．５倍高い）、または好ましくは少なくとも約１倍高い（すなわち、少なくとも約２倍高い）ようなものである。例えば、抗体またはその抗体結合断片のＥＣ５０は、１０％補体の存在下でのＤａｕｄｉ細胞および／またはＲａｊｉに対するダラツムマブのＥＣ５０よりも少なくとも約０．５倍高い、または好ましくは約１倍高い。
【００７８】
いくつかの実施形態では、本抗体またはその抗原結合断片（またはそのバリアント）は、ＣＤ３８＋Ｄａｕｄｉ細胞および／またはＲａｊｉ細胞に対する少なくとも約０．０５μｇ／ｍＬのＥＣ５０でＣＤＣを誘導する（かつ任意選択的にＣＤＣによるかかるＣＤ３８＋発現細胞の６０％未満の溶解を引き起こす）。いくつかの実施形態では、本抗体またはその断片は、ＣＤ３８＋Ｄａｕｄｉ細胞および／またはＲａｊｉ細胞に対する少なくとも約０．０５μｇ／ｍＬ、少なくとも約０．１０μｇ／ｍＬ、または少なくとも約０．１５μｇ／ｍＬのＥＣ５０でＣＤＣを誘導する（かつ任意選択的に最大約１０μｇ／ｍＬの抗体濃度でＣＤＣによるかかるＣＤ３８＋発現細胞の６０％未満の溶解を引き起こす）。
【００７９】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体またはその抗原結合断片（またはそのバリアント）は、ＣＤ３８発現細胞に対する抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）を呈し得る。ＡＤＣＰ活性は、ＦｃｇＲＩＩａを発現するエフェクター細胞としてＪｕｒｋａｔ細胞におけるＦｃｇＲＩＩａ結合を測定するレポーター細胞アッセイによって決定され得る。エフェクター細胞は、ＮＦＡＴ誘導性ルシフェラーゼも発現する。このアッセイにおける標的細胞は、ＣＤ３８発現Ｒａｊｉ細胞であり得る。ＮＦＡＴシグナル伝達を測定して、活性を決定することができる。
【００８０】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体またはその抗原結合断片（またはそのバリアント）は、インビトロで生成された制御性Ｔ細胞に対するＡＤＣＰを誘導し得る。これは、実施例で論じられるように測定され得る。
【００８１】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体またはその抗原結合断片（またはそのバリアント）は、同じまたは実質的に同じ条件下でのダラツムマブと比較してより高い量でＴ細胞活性化を誘導し得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞活性化は、ルシフェラーゼレポーターＪｕｒｋａｔ細胞におけるＮＦＡＴシグナル伝達を測定することによって決定され得る。いくつかの実施形態では、ルシフェラーゼレポーターＪｕｒｋａｔ細胞において測定された抗ＣＤ３８抗体またはその抗原結合断片によって誘導されたＮＦＡＴシグナル伝達は、同じまたは実質的に同じ条件下で測定されたダラツムマブのＮＦＡＴシグナル伝達よりも少なくとも約１０％高い。いくつかの実施形態では、ＮＦＡＴシグナル伝達は、同じまたは実質的に同じ条件下で測定されたダラツムマブのＮＦＡＴシグナル伝達よりも少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％高い。
【００８２】
Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＮＦＡＴルシフェラーゼレポーターアッセイでは、ＮＦＡＴシグナル伝達は、可溶性ＣＤ３モノクローナル抗体の存在下で、相対発光単位（ＲＬＵ）で測定され得る。ＣＤ３モノクローナル抗体は、１μｇ／ｍＬの濃度であり得、Ｊｕｒｋａｔ細胞は、約５μｇ／ｍＬ〜約４０μｇ／ｍＬ（例えば、１０μｇ／ｍＬ）の濃度の抗ＣＤ３８抗体で刺激され得る。かかるアッセイを使用して、ＮＦＡＴシグナル伝達は、ＣＤ３のみでの刺激のＲＬＵがベースラインとして使用された場合、同じまたは実質的に同じ条件下で測定されたダラツムマブのＮＦＡＴシグナル伝達よりも少なくとも約３０％高い場合がある。
【００８３】
Ｔ細胞活性化は、Ｔ細胞増殖の増加および／またはサイトカイン分泌の増加をさらに特徴とし得、サイトカインは、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、およびＧＭ−ＣＳＦからなる群から選択され得る。
【００８４】
Ｔ細胞増殖は、実施例で見られるように、例えば、７２時間のインキュベーション後に１０μｇ／ｍＬの抗体濃度および０．１μｇ／ｍＬまたは０．５μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体の存在下で決定されるように測定され得る。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体またはその抗原結合断片は、未処理細胞と比較してＣＤ４＋細胞および／またはＣＤ８＋細胞のＴ細胞増殖を少なくとも約２０％増加させる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞増殖は、未処理細胞と比較して少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、または少なくとも約４０％増加する。
【００８５】
好ましくは、抗ＣＤ３８抗体またはその抗原結合断片（またはそのバリアント）は、ＣＤ４＋細胞および／またはＣＤ８＋細胞におけるＴ細胞増殖を、同じまたは実質的に同じ条件下（例えば、同じ抗体濃度で７２時間のインキュベーション）で、ヒトＩｇＧ１で処理された細胞と比較して少なくとも約０．５倍（すなわち、少なくとも１．５倍）または少なくとも１倍（すなわち、少なくとも２倍）または少なくとも２倍（すなわち、少なくとも３倍）または少なくとも３倍（すなわち、少なくとも４倍）増加させる。
【００８６】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体またはその抗原結合断片（またはそのバリアント）は、同じまたは実質的に同じ条件下でのダラツムマブによって誘導されるものよりも高い量で、ＣＤ４＋細胞および／またはＣＤ８＋細胞におけるＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、および／またはＧＭ−ＣＳＦからなる群から選択されるサイトカインの分泌を誘導する。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体またはその抗原結合断片は、ダラツムマブと比較してＧＭ−ＣＳＦの分泌を増加させる。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体またはその抗原結合断片は、ダラツムマブと比較してＩＬ−２の分泌を増加させる。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体またはその抗原結合断片は、ダラツムマブと比較してＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、およびＧＭ−ＣＳＦの分泌を増加させる。サイトカイン分泌は、実施例に提供されるように、例えば、７２時間のインキュベーション後に１０μｇ／ｍＬの抗体濃度で決定されるように測定され得る。
【００８７】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体またはその抗原結合断片（またはそのバリアント）は、ＮＫ細胞活性化を誘導し得る。ＮＫ細胞活性化は、ＮＫ細胞増殖の増加を特徴とし得る。あるいは、または加えて、ＮＫ細胞活性化は、細胞内ＩＦＮｇ産生を示す増加および／または脱顆粒マーカーＣＤ１０７ａの発現増加によって決定され得る。
【００８８】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体またはその抗原結合断片（またはそのバリアント）は、シクラーゼおよび／またはＮＡＤａｓｅ活性に影響を及ぼし得る。ＣＤ３８  ＮＡＤａｓｅ活性への影響は、実施例のアッセイで見られるように、例えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＥ−ＮＡＤ＋の５’−ｅＡＭＰへの変換を測定することによって測定され得る。ＣＤ３８シクラーゼ活性への影響は、実施例のアッセイで見られるように、例えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＮＧＤ＋のｃＧＤＰＲへの変換を測定することによって測定され得る。
【００８９】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体またはその抗原結合断片（またはそのバリアント）は、ＣＤ３８シクラーゼ活性に対する阻害作用を有する。ＣＤ３８シクラーゼ活性に対する阻害作用は、実施例のアッセイで見られるように、例えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＮＧＤ＋のｃＧＤＰＲへの変換を測定することによって測定され得る。ＣＤ３８シクラーゼ活性に対する阻害作用は、Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＮＧＤ＋のｃＧＤＰＲへの変換によって測定されるＩｇＧ非結合対照抗体の存在下でのＣＤ３８シクラーゼ活性と比較して少なくとも１０％低いＣＤ３８活性をもたらし得る。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体またはその抗原結合断片は、同じまたは実質的に同じ条件下でのＣＤ３８シクラーゼ活性に対するダラツムマブの阻害作用未満のＣＤ３８シクラーゼに対する阻害作用を有する。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体またはその抗原結合断片は、ＣＤ３８シクラーゼ活性を、Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＮＧＤ＋のｃＧＤＰＲへの変換によって測定されるＩｇＧ非結合対照抗体の存在下でのＣＤ３８シクラーゼ活性の約２５％以上に低下させる。好ましくは。本抗体は、ＣＤ３８シクラーゼ活性を、ＩｇＧ非結合対照抗体の存在下でのＣＤ３８シクラーゼ活性の約３０％以上、約４０％以上、または約５０％以上に低下させる。好ましくは、本抗体は、ＣＤ３８シクラーゼ活性を、ＩｇＧ非結合対照抗体の存在下でのＣＤ３８シクラーゼ活性の２５％〜９５％、約３０％〜９０％、または約５０％〜９０％に低下させる。これは、抗ＣＤ３８抗体またはその抗原結合断片の存在下で、ＣＤ３８シクラーゼ活性が依然としてＪｕｒｋａｔ細胞に存在するが、ＩｇＧ非結合対照抗体の存在下でのＣＤ３８シクラーゼ活性と比較して低下した量で存在することを意味する。
【００９０】
ダラツムマブがシクラーゼ活性を阻害し、ＮＡＤａｓｅ活性を刺激することが示されている。対照的に、本発明の抗体は、同じまたは実質的に同じ条件下でのＣＤ３８シクラーゼ活性に対するダラツムマブの阻害作用未満のＣＤ３８シクラーゼに対する阻害作用を有し得る。
【００９１】
したがって、抗ＣＤ３８抗体またはその抗原結合断片（またはそのバリアント）は、ＣＤ３８＋標的細胞に対する抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）活性を呈し、同じまたは実質的に同じ条件下でのダラツムマブと比較してＣＤ３８＋標的細胞に対する低下したＣＤＣ活性を呈し（例えば、本明細書に記載されるように測定されるＥＣ５０値は、ダラツムマブのＥＣ５０値の少なくとも２倍であり得る）、免疫エフェクター細胞活性化を誘導し、Ｔ細胞増殖を誘導し、ＩＬ−２、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＩＬ−１０を含むサイトカイン分泌の増加を誘導し、ＮＫ細胞活性化を誘導する。かかる抗体は、ＣＤ３８シクラーゼ活性に対するわずかな阻害作用も呈し得る。
【００９２】
本発明は、抗体ａＣＤ３８−ｂ−３４８のバリアントまたは誘導体も含む。抗体またはその抗原結合断片のバリアントまたは誘導体（例えば、ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ１、ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ２、ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ３、およびａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ４）は、それらが由来する抗体と同じ機能的プロファイル（すなわち、薬理学的特性）を共有し得る。同様に、本発明は、ＣＤ３８への結合においてａＣＤ３８−ｂ−３４８（またはそのバリアント）と競合する抗体または抗原結合断片を含む。かかる競合抗体は、ａＣＤ３８−ｂ−３４８と同じ機能的プロファイル（すなわち、薬理学的特性）を有し得る。
【００９３】
提供されるＣＤ３８調節抗体薬剤とヒトＣＤ３８との間の分子間相互作用についてのさらなる洞察を得るために、ＣＤ３８調節抗体薬剤（例えば、具体的な例を１つ挙げると、ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｈＩｇＧ１抗体）およびヒトＣＤ３８タンパク質の結晶構造が決定され得る。提供されるＣＤ３８調節抗体薬剤（具体的には、例えば、ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｈＩｇＧ１抗体を含む）の溶解性および／または安定性が、溶解性研究、加速ストレス研究、凍結融解研究、および公式安定性研究によって評価され得る。抗体の凝集は、目視検査、サイズ排除クロマトグラフィー、ならびに動的光散乱およびＯＤ２８０／３２０吸光度によって追跡され得る。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】ａＣＤ３８−ｂ−３４８を、本発明による１つ以上の特性を有するアゴニスト抗ＣＤ３８抗体、具体的には、特に目的とするＣＤ３８調節抗体薬剤の特徴：薬学的に関連した標的細胞死滅（例えば、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、およびＣＤＣアッセイで測定される）、免疫細胞（細胞生存および／もしくは増殖、サイトカイン分泌、ならびに／または活性化マーカー等の特性を測定するための、Ｔｒｅｇ、ＣＤ８およびＣＤ４  Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、ＭＤＳＣ、マクロファージ、ならびに／または単球等）への影響、ＣＤ３８酵素活性またはＣＤ３８媒介性シグナル伝達への影響、ＣＤ３８を発現する（または発現しない）がん細胞への影響、他の薬物（例えば、腫瘍抗原を標的とする抗体または他の抗がん剤）との組み合わせ、ならびに／または凝集する傾向のある配列に関連する安定性問題を特定するため抗体配列および型式、可変ドメイン内でのグリコシル化部位または遊離システインの存在、ならびに／または影響（例えば、Ｆａｂ、ナノボディ、二重／多重特異性抗体としてヒトＩｇＧ１フレーム内、または非抗体足場内）を示す本明細書に記載のものと特定するためのスクリーニング手順を要約する流れ図である。
【図２】関連タンパク質配列（Ａ）、ａＣＤ３８−ｂ−３４８タンパク質配列。スクリーニング手順によって最初に特定された重鎖および軽鎖抗体のフレーム配列（それぞれ、ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ＨＣＤＲ１２３（配列番号４）およびａＣＤ３８−ｂ−３４８−ＬＣＤＲ１２３（配列番号８））内の重鎖（ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ＨＣＤＲ１（配列番号１）、ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ＨＣＤＲ２（配列番号２）、およびａＣＤ３８−ｂ−３４８−ＨＣＤＲ３（配列番号３））、ならびに軽鎖（ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ＬＣＤＲ１（配列番号５）、ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ＬＣＤＲ２（配列番号６）、およびａＣＤ３８−ｂ−３４８−ＬＣＤＲ３（配列番号７））の各ＣＤＲを別個に示し、下線を引いてある。ＤＧモチーフ（二重下線を引いたもの）は、抗体の異性化および分解のホットスポットを示し（Ｓｙｄｏｗ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．２０１４）、ａＣＤ３８−ｂ−３４８のいずれかおよび恐らく全ての結合特性および機能的特性を有する代替の抗ＣＤ３８抗体を提供するために突然変異させられ得る。（Ｂ）ダラツムマブエピトープ（本明細書でＤＡＲＡｅｐ−ａおよびＤＡＲＡｅｐ−ｂとして示される２つのヒトＣＤ３８領域によって形成されたＷＯ２００６／０９９８７５に特定および開示されるＤＡＲＡ）の一方と比較した、ヒトＣＤ３８の配列（ＵｎｉｐｒｏｔコードＰ２８９０７）（配列番号９）であり、異なるボックスが、細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞外ドメイン内の予め特定されたａＣＤ３８−ｂ−３４８主要エピトープの位置（ａＣＤ３８−ｂ−ｅｐ）を特定する。
【図３】カニクイザル由来の細胞（Ａ）またはヒト由来の細胞を増加した抗体濃度で使用し、本分析をＣＤ８陽性細胞またはＣＤ４陽性細胞に限定し、かつヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照、ダラツムマブ（ＤＡＲＡ）、または一次抗体の存在下のいずれかと比較することによる、ＰＢＭＣで発現したＣＤ３８へのａＣＤ３８−ｂ−３４８結合の特徴付け。
【図４】いずれのさらなる腫瘍標的抗体の投与とも無関係の細胞ベースのモデルにおけるダラツムマブ（ＤＡＲＡ）または陰性対照抗体（抗ヒトＣＤ３またはヒトＩｇＧ１アイソタイプ）と比較したａＣＤ３８−ｂ−３４８の機能的特徴付け。（Ａ）ａＣＤ３８−ｂ−３４８は、各グラフに示されるように、ＴＣＲ媒介性ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞増殖のパーセンテージを増加させる。（ＩｇＧ１および抗ＣＤ３８抗体の各々を１０、５、２．５μｇ／ｍＬで試験し、抗ＣＤ３を０．１μｇ／ｍＬで試験する）。（Ｂ）ａＣＤ３８−ｂ−３４８は、ＰＢＭＣ−ＭＤＡ−ＭＢ−２３１共培養（比率１００：１）におけるＮＫ増殖および活性化を増加させる。増殖性ＣＤ５６陽性、ＣＤ５６陽性、およびＣＤ１３７陽性ＮＫ細胞のパーセンテージを各グラフに示す。（Ｃ）ａＣＤ３８−ｂ−３４８は、ＴＣＲ活性化ＣＤ４／ＣＤ８  Ｔ細胞による選択されたサイトカインの分泌を増加させる（試験した５体のドナーのうち５体で同様のパターン）。
【図５】細胞傷害性に関するＤＡＲＡと比較したａＣＤ３８−ｂ−３４８の機能的特徴付け。（Ａ）ａＣＤ３８−ｂ−３４８もＤＡＲＡもいずれも、ＣＤ３８陽性制御性Ｔ細胞の食作用を誘導することによって制御性Ｔ細胞の死滅を１μｇ／ｍＬおよび１０μｇ／ｍＬで誘導する。（Ｂ）この直接的抗体媒介性死滅効果は、ダラツムマブ（ＤＡＲＡ）と同様に抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を伴うが、ＤＡＲＡとは異なり、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ、文献に記載されるように、ＤＡＲＡのＣＤＣが特に有意である）は伴わない。（Ｃ）さらに、ａＣＤ３８−ｂ−３４８を、活性が抗体架橋によってあまり増加しないＤＡＲＡと比較した場合、Ｄａｕｄｉ細胞において決定された標的細胞死滅は、抗体架橋によって強く誘導される。
【図６】示される日数にわたるＤａｕｄｉ細胞（Ａ）およびＲａｍｏｓ細胞（Ｂ）の静脈内投与に基づく２体のがんモデルにおける動物生存率に関するａＣＤ３８−ｂ−３４８（１０ｍｇ／ｋｇで投与）の機能的特徴付け。ａＣＤ３８−ｂ−３４８での処理は、陰性対照と比較した場合のみならず、ダラツムマブ（ＤＡＲＡ）と比較した場合にも、動物生存率を増加させる。
【図７】Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄ  ９６機器でのバイオ層干渉分光法によって測定される、ダラツムマブと比較した、Ｈｉｓタグ付き組換えヒトＣＤ３８への抗ＣＤ３８抗体ａＣＤ３８−ｂ−３４８の結合を示す。４．２ｎＭのｒｈＣＤ３８−Ｈｉｓ、続いて、７ｎＭの抗体をＮｉ  ＮＴＡバイオセンサに充填し、その後、それらを動態緩衝液中で解離させた。
【図８】細胞傷害性に関するＤＡＲＡと比較したａＣＤ３８−ｂ−３４８の機能的特徴付け。ａＣＤ３８−ｂ−３４８は、ＮＦＡＴレポートアッセイを使用して測定されるＡＤＣＰ活性を示す。
【図９】酵素活性に関するダラツムマブおよびヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照と比較したａＣＤ３８−ｂ−３４８の機能的特徴付け。ａＣＤ３８−ｂ−３４８および対照抗体によるＪｕｒｋａｔ細胞におけるＣＤ３８シクラーゼまたはＮＡＤａｓｅ（ヒドロラーゼ）活性の阻害または活性化を試験する。（Ａ）ａＣＤ３８−ｂ−３４８（ｐ＝０．３４）およびＤＡＲＡは、シクラーゼ活性を低下させる。しかしながら、ａＣＤ３８−ｂ−３４８で観察されたわずかな阻害は統計的に有意ではなかった。（Ｂ）ａＣＤ３８−ｂ−３４８およびＤＡＲＡは、ＮＡＤａｓｅ活性を低下させない。
【図１０】示される日数にわたるインビボ固形腫瘍がんモデルにおける動物生存率に関するａＣＤ３８−ｂ−３４８（１０ｍｇ／ｋｇで投与）の特徴付け。ａＣＤ３８−ｂ−３４８での処理は、陰性対照と比較した場合のみならず、ダラツムマブ（ＤＡＲＡ）と比較した場合にも、動物生存率を増加させた。
【図１１】Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＮＦＡＴシグナル伝達ルシフェラーゼレポーターアッセイでのダラツムマブ（ＤＡＲＡ）または陰性対照抗体（ヒトＩｇＧ１アイソタイプ）と比較したａＣＤ３８−ｂ−３４８の機能的特徴付け。本抗体のＮＦＡＴシグナル伝達（相対発光単位（ＲＬＵ）として測定される）は、細胞を１０〜２０ｕｇ／ｍＬの抗体濃度で刺激した場合、かつＣＤ３のみ刺激のＲＬＵをアッセイのベースラインとして使用した（ＣＤ３のみ条件のＲＬＵが他の条件から差し引かれた）場合、ダラツムマブのＮＦＡＴシグナル伝達よりも少なくとも３０％高い。
【図１２】Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄ  ９６機器でのバイオ層干渉分光法によって測定される、ダラツムマブ（図１２Ｂ）と比較した、Ｈｉｓタグ付き組換えヒトＣＤ３８へのａＣＤ３８−ｂ−３４８（図１２Ａ）の結合を示す。４．２ｎＭのｒｈＣＤ３８−Ｈｉｓ、続いて、様々な濃度の抗体（図に示される）をＮｉ  ＮＴＡバイオセンサに充填し、その後、それらを動態緩衝液中で解離させた。
【図１３】１０％補体でのＲａｊｉ細胞におけるＤａｒａおよびヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体と比較したａＣＤ３８−ｂ−３４８のＣＤＣを示す。ａＣＤ３８−ｂ−３４８は、Ｄａｒａと比較して低下したＣＤＣを呈する。
【図１４】低用量抗ＣＤ３８抗体は、非ヒト霊長類におけるＴ細胞活性化を増加させる。ａＣＤ３８−ｂ−３４８を０．０３ｍｇ／ｋｇの用量でカニクイザルに投与し、Ｔ細胞活性化を評価した。
【図１５】バリアントａＣＤ３８−ｂ−３４８抗体、Ａ）ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ１、Ｂ）ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ２、Ｃ）ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ３、およびＤ）ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ４の関連重鎖および軽鎖タンパク質配列。ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ１の場合、それぞれ、ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ１−ＨＣＤＲ１２３（配列番号４）およびａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ１−ＬＣＤＲ１２３（配列番号２０）、ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ２の場合、それぞれ、ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ２−ＨＣＤＲ１２３（配列番号４）およびａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ２−ＬＣＤＲ１２３（配列番号２１）、ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ３の場合、それぞれ、ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ３−ＨＣＤＲ１２３（配列番号４）およびａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ３−ＬＣＤＲ１２３（配列番号２２）、ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ４の場合、それぞれ、ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ４−ＨＣＤＲ１２３（配列番号４）およびａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ４−ＬＣＤＲ１２３（配列番号２３）のフレーム配列内の重鎖および軽鎖の各ＣＤＲに下線を引いてある。
【図１６】ＤａｒａおよびＩｇＧ１対照と比較したＤａｕｄｉ細胞へのバリアント配列の結合。ＣＤ３８発現ヒト細胞株（Ｄａｕｄｉ）への結合を、抗ＣＤ３８一次抗体を２０μｇ／ｍＬで、続いて、半対数希釈系列（７点）で添加し、その後、二次抗体で染色することによって試験した。ａＣＤ３８−ｂ−３４８バリアントは、親ａＣＤ３８−ｂ−３４８およびＤＡＲＡと同様のＤａｕｄｉ細胞への結合を示す。
【図１７】細胞傷害性に関するＤＡＲＡと比較したａＣＤ３８−ｂ−３４８およびそのバリアント配列の機能的特徴付け。ａＣＤ３８−ｂ−３４８およびそのバリアント配列、ならびにＤＡＲＡは、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）によるＣＤ３８＋細胞株（Ｄａｕｄｉ）の死滅を誘導し、活性（ＥＣ５０または最大溶解）に検出可能な差はなかった。
【図１８】示される日数にわたるＲａｊｉ細胞（Ａ）およびＲａｍｏｓ細胞（Ｂ）の静脈内投与に基づく２体のがんモデルにおける動物生存率に関するａＣＤ３８−ｂ−３４８およびバリアントａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ２（全て１０ｍｇ／ｋｇで投与）の機能的特徴付け。両モデルにおいて、ａＣＤ３８−ｂ−３４８での処理は、陰性対照と比較して、かつＤＡＲＡと比較して、動物生存率を増加させる。両モデルにおいて、バリアントａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ２での処理は、陰性対照と比較して、動物生存率を増加させる。
【図１９】Ｂｉａｃｏｒｅ  ２０００でのＨｉｓタグ付きｒｈＣＤ３８に対する精製された抗体（ＩｇＧ１）のＳＰＲに基づく分析。Ａ）ａＣＤ３８−ｂ−３４８、Ｂ）ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ１、Ｃ）ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ２、Ｄ）ａＣＤ３８−ｂ−３４８ｍ３、およびＥ）ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ４。
【図２０】ｈＩｇＧ１アイソタイプ、ダラツムマブ、および対照と比較したａＣＤ３８−ｂ−３４８によって誘導された活性化されていないヒトＮＫ細胞またはＩＬ−２で予め活性化されたヒトＮＫ細胞の脱顆粒。
【図２１】ｈＩｇＧ１アイソタイプおよびダラツムマブと比較したａＣＤ３８−ｂ−３４８によって誘導された腫瘍標的（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞）の存在下または不在下でのＮＫ細胞のＩＦＮγ産生。
【図２２】ｈＩｇＧ１アイソタイプおよびダラツムマブと比較したａＣＤ３８−ｂ−３４８によって誘導されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍細胞の存在下でのヒトＮＫ細胞のＮＫ細胞増殖。Ａ）抗体を１０μｇ／ｍＬで試験した。Ｂ）０．４μｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬの用量滴定の抗体を試験した。
【図２３】Ｏｃｔｅｔにおける競合アッセイ。ａＣＤ３８−ｂ−３４８の固定化ｒｈＣＤ３８への結合を、再び第１の抗体（ダラツムマブ（対照として））または第２の抗体（ａＣＤ３８−ｂ−３４８）のいずれかによって追跡する。非競合抗体が他の抗体（示されず）の存在下でＣＤ３８に結合する（図示されず）一方で、同じエピトープに結合する抗体が競合し、さらなる結合が観察されないであろう。
【発明を実施するための形態】
【００９５】
本明細書で使用されるある特定の用語の定義、技術的な意味、および実施形態が以下に提供され、これらのうちの多くまたは大半は、当業者の共通の理解を確認する。
【００９６】
投与：本明細書で使用される場合、「投与」という用語は、対象への組成物の投与を指す。動物対象（例えば、ヒト）への投与は、任意の適切なルートにより得る。例えば、いくつかの実施形態では、投与は、気管支（気管支滴下を含む）、頬側、経腸、動脈内、皮内、胃内、髄内、筋肉内、鼻腔内、腹腔内、髄腔内、静脈内、心室内、特定の臓器または組織内（例えば、肝臓内、腫瘍内、腫瘍周辺等）、粘膜、経鼻、経口、直腸、皮下、舌下、局所、気管（気管内滴下を含む）、経皮、膣内、および硝子体であり得る。投与は、間欠投薬を含み得る。あるいは、投与は、少なくとも選択された時間にわたる連続投薬（例えば、灌流）を含み得る。当該技術分野で既知のように、抗体療法は、一般に、例えば、静脈内、皮下、または腫瘍内注射（例えば、特に腫瘍内の高用量が所望される場合）によって非経口投与される。
【００９７】
薬剤：本明細書で使用される場合「薬剤」という用語は、例えば、ポリペプチド、核酸、サッカリド、小分子、金属、またはそれらの組み合わせを含む、任意の化学的分類の化合物または実体を指し得る。本発明に従って利用され得る薬剤の特定の実施形態は、小分子、薬物、ホルモン、抗体、抗体断片、アプタマー、核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム）、ペプチド、ペプチド模倣薬等を含む。薬剤は、ポリマーであり得るか、またはそれを含み得る。
【００９８】
抗体：本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、ＣＤ３８、ヒトＣＤ３８、具体的には細胞外ヒトＣＤ３８等の特定の標的抗原への特異的結合を与えるのに十分な標準的な免疫グロブリン配列要素を含むポリペプチドを指す。当該技術分野で既知のように、天然に産生されるインタクトな抗体は、２つの同一の重鎖ポリペプチド（各々約５０ｋＤ）および２つの同一の軽鎖ポリペプチド（各々約２５ｋＤ）で構成され、それらが互いに結合して一般に「Ｙ字形」構造と称されるものになる、およそ１５０ｋＤの四量体作用物質である。各重鎖は、少なくとも４つのドメイン（各約１１０アミノ酸長）、アミノ末端可変（ＶＨ）ドメイン（Ｙ構造の端部に位置する）、続いて、３つの定常ドメイン：ＣＨ１、ＣＨ２、およびカルボキシ末端ＣＨ３（Ｙの幹の基部に位置する）で構成される。「スイッチ」として既知の短い領域は、重鎖可変領域と重鎖定常領域を連結する。「ヒンジ」は、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを抗体の残り部分に連結する。このヒンジ領域内の２つのジスルフィド結合は、インタクトな抗体における２つの重鎖ポリペプチドを互いに連結する。各軽鎖は、別の「スイッチ」によって互いに分離された２つのドメイン、アミノ末端可変（ＶＬ）ドメイン、続いて、カルボキシ末端定常（ＣＬ）ドメインで構成される。インタクトな抗体四量体は、重鎖と軽鎖が単一のジスルフィド結合によって互いに連結された２つの重鎖−軽鎖二量体で構成され、２つの他のジスルフィド結合が重鎖ヒンジ領域を互いに連結し、二量体が互いに連結されて四量体が形成されるようになる。天然に産生された抗体は、典型的にはＣＨ２ドメインがグリコシル化されており、各ドメインは、圧縮逆平行ベータバレル内に互いに密集した２つのベータシート（例えば、３本、４本、または５本鎖シート）から形成された「免疫グロブリンフォールド」を特徴とする構造を有する。各可変ドメインは、「相補性決定領域」として既知の３つの超可変ループ（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けスキームに従って決定される、当該技術分野で理解されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）ならびに４つのいくらか不変の「フレームワーク」領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４）を含む。天然抗体がフォールドすると、ドメインに構造的フレームワークを提供するベータシート由来のＦＲ領域ならびに重鎖および軽鎖の両方由来のＣＤＲループ領域が三次元空間内で一緒になり、それらがＹ構造の端部に位置する単一の超可変抗原結合部位を作製する。天然に存在する抗体のＦｃ領域は、補体系の要素に結合し、例えば、細胞傷害性を媒介するエフェクター細胞を含むエフェクター細胞上の受容体にも結合する。当該技術分野で既知のように、Ｆｃ受容体に対するＦｃ領域の親和性および／または他の結合特質は、抗体の開発可能性を改善することができるグリコシル化または他の修飾によって調節され得る（Ｊａｒａｓｃｈ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。
【００９９】
いくつかの実施形態では、本発明に従って産生および／または利用される抗体は、かかるグリコシル化が修飾または操作されたＦｃドメインを含むグリコシル化Ｆｃドメインを含む。本発明の目的のために、ある特定の実施形態では、天然抗体で見られる十分な免疫グロブリンドメイン配列を含む任意のポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、かかるポリペプチドが天然に産生される（例えば、抗原に反応する生物によって生成される）か、または組換え操作、化学合成、もしくは他の人工系もしくは方法論によって産生されるかにかかわらず、「抗体」と称され得、かつ／または「抗体」として使用され得る。いくつかの実施形態では、抗体は、抗体のパネルとして生成されるポリクローナルまたはオリゴクローナルであり、各々単一の抗体配列に結合し、抗原内のほぼ別個のエピトープ（異なる参照抗ＣＤ３８抗体に結合されるヒトＣＤ３８細胞外ドメイン内の異なるエピトープ等）に結合する。
【０１００】
ポリクローナル抗体またはオリゴクローナル抗体は、文献に記載されるように医学的使用のために単一調製物で提供され得る（Ｋｅａｒｎｓ  ＪＤ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナルである。いくつかの実施形態では、抗体は、マウス、ウサギ、霊長類、またはヒト抗体の特徴を示す定常領域配列を有する。いくつかの実施形態では、抗体配列要素は、当該技術分野で既知のように、ヒト化、霊長類化、キメラ等である。さらに、本明細書で使用される「抗体」という用語は、適切な実施形態では（別途明記されない限りまたは文脈から明らかでない限り）、代替の提示での抗体の構造的および機能的特徴を利用するための当該技術分野で既知であるか、または当該技術分野で開発された構築物または型式、例えば、以下で定義される抗原結合断片のうちのいずれかを指し得る。例えば、本発明に従って利用される抗体は、インタクトなＩｇＧ、ＩｇＥ、およびＩｇＭ、二重または多重特異性抗体（例えば、Ｚｙｂｏｄｉｅｓ（登録商標）等）、一本鎖可変ドメイン（ｓｃＦｖ）、ポリペプチド−Ｆｃ融合物、Ｆａｂ、ラクダ科抗体、重鎖サメ抗体（ＩｇＮＡＲ）、マスク抗体（例えば、Ｐｒｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標））、または細胞表面での発現および曝露を可能にするポリペプチドとの融合タンパク質（モノクローナル抗体の特異性をＴ細胞に移植するために使用される人工Ｔ細胞受容体を得るための構築物内のｓｃＦｖとして）から選択されるが、これらに限定されない型式である。いくつかの実施形態では、抗体は、天然に産生された場合に有するであろう共有結合的修飾（例えば、グリカンの結合）を欠き得る。あるいは、抗体は、共有結合的修飾（例えば、グリカン、ペイロード［例えば、検出可能な部分、治療的部分、触媒部分等］、または他のペンダント基［例えば、ポリエチレングリコール等］の結合）を含み得る。
【０１０１】
抗原：本明細書で使用される「抗原」という用語は、免疫応答を誘発し、かつ／またはＴ細胞受容体（例えば、ＭＨＣ分子によって提示された場合）および／またはＢ細胞受容体に結合する作用物質を指す。抗原特異的抗体の産生を伴うか、またはＣＤ３８細胞外ドメインについて実施例に示される、体液性応答を誘発する抗原は、抗体ライブラリをスクリーニングし、さらに特徴付けられる候補抗体配列を特定するために使用され得る。
【０１０２】
抗原結合断片：本明細書で使用される場合、「抗原結合断片」という用語は、抗体によって標的とされる抗原に特異的に結合する能力を抗原結合断片に与えるのに十分な本明細書に記載の抗体の１つ以上の部分を含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）または含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）作用物質を包含する。例えば、いくつかの実施形態では、この用語は、特異的結合を与えるのに十分な免疫グロブリン構造要素を含むいずれのポリペプチドまたはポリペプチド複合体も包含する。例示の抗原結合断片としては、小モジュラー免疫薬（「ＳＭＩＰ（商標）」）、一本鎖抗体、ラクダ科抗体、単一ドメイン抗体（例えば、サメ単一ドメイン抗体）、一本鎖またはタンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ（登録商標））、ＶＨＨ、Ａｎｔｉｃａｌｉｎ（登録商標）、ナノボディ（登録商標）、ミニボディ、ＢｉＴＥ（登録商標）、アンキリン反復タンパク質またはＤＡＲＰＩＮ（登録商標）、Ａｖｉｍｅｒ（登録商標）、ＤＡＲＴ、ＴＣＲ様抗体、Ａｄｎｅｃｔｉｎ（登録商標）、Ａｆｆｉｌｉｎ（登録商標）、Ｔｒａｎｓ−ｂｏｄｙ（登録商標）、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）、ＴｒｉｍｅｒＸ（登録商標）、ＭｉｃｒｏＰｒｏｔｅｉｎ、Ｃｅｎｔｙｒｉｎ（登録商標）、ＣｏＶＸボディ、二環式ペプチド、Ｋｕｎｉｔｚドメイン由来の抗体構築物、または任意の他の抗体断片（それらが所望の生物学的活性を呈する限り）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、この用語は、他のタンパク質構造、例えば、ステープルペプチド、抗体様結合ペプチド模倣薬、抗体様結合足場タンパク質、モノボディ、および／または他の非抗体タンパク質足場、例えば、文献で概説されるもの（Ｖａｚｑｕｅｚ−Ｌｏｍｂａｒｄｉ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）を包含する。いくつかの実施形態では、抗原結合断片は、アミノ酸配列が相補性決定領域（ＣＤＲ）として当業者によって認識される１つ以上の構造要素を含むポリペプチドであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合断片は、アミノ酸配列が、本明細書に記載の抗ＣＤ３８抗体（例えば、ａＣＤ３８−ａ−３４８アミノ酸配列要素）に見られるものと実質的に同一の少なくとも１つの参照ＣＤＲ（例えば、少なくとも１つの重鎖ＣＤＲおよび／または少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲ）、具体的には、少なくとも１つの重鎖ＣＤＲ、例えば、ＨＣＤＲ３（例えば、ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ＨＣＤＲ３配列）を含むポリペプチドであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合断片は、アミノ酸配列が、かかる参照ＣＤＲと比較して配列が同一であるか、または参照ＣＤＲが由来する抗体（例えば、ａＣＤ３８−ｂ−３４８）の標的への結合を維持しながら少数の（例えば、１、２、３、または４つの）アミノ酸改変（例えば、置換、付加、または欠失、多くの場合、置換）を含むかのいずれかである、少なくとも１つのＣＤＲ（例えば、少なくとも１つの重鎖ＣＤＲおよび／または少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲ）を含むポリペプチドであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合断片は、参照抗体の重鎖または軽鎖（例えば、ａＣＤ３８−ａ−３４８）由来の３つ全てのＣＤＲ（またはいくつかの実施形態では、それらと実質的に同一の配列）を含むポリペプチドまたはその複合体であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合断片は、参照抗体由来の（例えば、ａＣＤ３８−ｂ−３４８由来の）６つ全てのＣＤＲ（またはいくつかの実施形態では、それらと実質的に同一の配列）を含むポリペプチドまたはその複合体であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合断片は、参照抗体（例えば、ａＣＤ３８−ｂ−３４８）の重鎖および／または軽鎖可変ドメイン（またはいくつかの実施形態では、それらと実質的に同一の配列）を含むポリペプチドまたはその複合体であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、「抗原結合断片」という用語は、非ペプチド構造および非タンパク質構造、例えば、核酸アプタマー、例えば、ＲＮＡアプタマーおよびＤＮＡアプタマーを包含する。アプタマーは、ポリペプチド等の特定の標的に結合するオリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの類似体もしくは誘導体）である。アプタマーは、様々な分子標的、例えば、小分子、タンパク質、核酸、さらには細胞および組織に特異的に結合する短い合成一本鎖オリゴヌクレオチドである。これらの小核酸分子は、タンパク質または他の細胞標的に特異的に結合することができる二次構造および三次構造を形成することができ、本質的に抗体の化学的等価物である。アプタマーは、高度に特異的であり、比較的小さいサイズであり、非免疫原性である。アプタマーは、一般に、ＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）として既知のバイオパニング法から選択される（例えば、Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．１９９０；３４６（６２８７）：８１８−８２２、Ｔｕｅｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９０；２４９（４９６８）：５０５−５１０、Ｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅ  ２０１１；１８（２７）：４２０６−１４を参照のこと）。任意の所与の標的に対するアプタマーを生成する方法は、当該技術分野で周知である。アフィマーを含むペプチドアプタマーも包含される。アフィマーは、特定の標的タンパク質に対する高親和性結合表面を提供するペプチドループをディスプレイするように操作された小さく高度に安定したタンパク質である。これは、シスタチンのシステインプロテアーゼ阻害剤ファミリーに由来する低分子量（１２〜１４ｋＤａ）のタンパク質である。アフィマータンパク質は、シスタチンタンパク質の折り畳みに基づく安定したタンパク質である足場から成る。それらは、抗体と同様の高親和性および特異性で異なる標的タンパク質に結合するようにランダム化され得る２つのペプチドループおよびＮ末端配列をディスプレイする。タンパク質足場でのペプチドの安定化は、ペプチドがとり得る可能な立体構造を制約し、それ故に、遊離ペプチドのライブラリと比較して結合親和性および特異性を増加させる。
【０１０３】
配列同一性パーセント（％）：２つの配列間の「配列同一性」パーセント（％）は、当該技術分野で既知の方法を使用して決定され得る。ペプチド、ポリペプチド、または抗体配列に対する配列同一性は、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入して、最大配列同一性パーセントを達成した後の、いずれの保存的置換も配列同一性の一部とみなさない、特定のペプチドまたはポリペプチド配列内のアミノ酸残基と同一の候補配列内のアミノ酸残基のパーセンテージと定義され得る。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のための整列は、当該技術分野の技術の範囲内の様々な方法で、例えば、公的に入手可能なコンピュータソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２（ギャップ付きＢＬＡＳＴを含む）、およびＢＬＡＳＴｐ（タンパク質の場合）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦ  ｅｔ  ａｌ（１９９７））、またはデフォルトパラメータを使用するＦＡＳＴＡを使用して達成され得る。
【０１０４】
生体試料。本明細書で使用される場合、「生体試料」または「試料」という用語は、典型的には、本明細書に記載の目的とする生物学的源（例えば、組織または生物または細胞培養物）から得られるか、またはそれに由来する試料を指す。目的とする源は、動物またはヒト等の生物であり得る。生体試料は、生体組織または生体液を含み得る。
【０１０５】
がん：「がん」、「悪性腫瘍」、「新生物」、「腫瘍（ｔｕｍｏｒ）」、「腫瘍（ｔｕｍｏｕｒ）」、および「癌腫」は、それらが細胞増殖の著しい制御不能を特徴とする異常増殖表現型を呈するように、比較的異常な、制御不能の、かつ／または自律的な増殖を呈する細胞を指すために本明細書で同義に使用される。概して、本出願における検出または治療のための目的とする細胞には、前癌性（例えば、良性）、悪性、前転移性、転移性、および非転移性細胞が含まれる。本開示の教示は、ありとあらゆるがんに関し得る。非限定的な例をほんの数例挙げると、いくつかの実施形態では、本開示の教示は、１つ以上のがん、例えば、造血癌（白血病、リンパ腫（ホジキンおよび非ホジキン）、骨髄腫、および骨髄増殖性症候群を含む）、肉腫、黒色腫、腺腫、固形組織癌、口腔、咽喉、喉頭、および肺扁平上皮癌、肝臓癌、泌尿生殖器癌、例えば、前立腺癌、子宮頸癌、膀胱癌、子宮癌、および子宮内膜癌、ならびに腎細胞癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、皮膚または眼内黒色腫、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、頭頸部癌、乳癌、胃腸癌、および神経系癌、良性病変、例えば、乳頭腫等に適用される。本発明の抗体は、ＣＤ３８＋発現腫瘍の治療に使用され得る。
【０１０６】
ＣＤ３８調節抗体薬剤。「ＣＤ３８調節抗体薬剤」という用語は、本明細書に記載の特定の特性を示すＣＤ３８調節抗体薬剤（例えば、抗ＣＤ３８抗体）を指すために本明細書で使用される。多くの実施形態では、本明細書に記載の望ましいＣＤ３８調節抗体薬剤は、それらが免疫エフェクター細胞を刺激し、かつ／または免疫細胞機能を修飾し、免疫抑制性細胞または腫瘍細胞（例えば、いずれの場合も、それらの表面にＣＤ３８を発現する）等のＣＤ３８発現細胞に対して細胞傷害性であるか、またはＣＤ３８発現細胞の食作用を誘導する（例えば、高レベルのＣＤ３８を発現する）ことを特徴とする。いくつかの実施形態では、ＣＤ３８調節抗体薬剤は、免疫細胞（例えば、免疫細胞と、具体的には、ＣＤ３８を発現する免疫細胞と接触した場合）および腫瘍細胞に対するａＣＤ３８−ｂ−３４８の活性とかなり同等の活性（例えば、レベルおよび／またはタイプ）を特徴とする。いくつかの実施形態では、関連活性は、ＡＤＣＰ、ＣＤＣの不在下でのＡＤＣＣ、直接死滅、ある特定のＣＤ３８発現細胞（例えば、高発現細胞）の枯渇、エフェクター免疫細胞の活性化、Ｔ細胞、Ｂ細胞、またはＮＫ細胞増殖の促進、免疫細胞活性の調節（例えば、抑制性マクロファージの炎症性マクロファージへの再分極）、Ｔ細胞レパートリーの歪み等、およびそれらの組み合わせであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３８調節抗体薬剤は、存在またはレベルがＣＤ３８のレベルおよび／もしくは活性と相関し、かつ／またはＣＤ３８活性の特徴を示す１つ以上の特徴または結果と相関する実体または部分である。いくつかの実施形態では、レベルおよび／または活性の増加は、実体（複数可）または部分（複数可）の不在下でのさもなければ同等の条件下で観察されたものに対して評価または決定される。あるいは、または加えて、いくつかの実施形態では、レベルおよび／または活性の増加は、参照ＣＤ３８調節抗体薬剤（例えば、多くの実施形態ではＩＢ４等のＣＤ３８アゴニスト抗体である適切な参照抗ＣＤ３８抗体）が存在する場合の同等の条件下で観察されたものと同等であるか、またはそれを超える。多くの実施形態では、本開示による使用のためのＣＤ３８調節抗体薬剤は、ＣＤ３８に、典型的にはその細胞外ドメインに直接または間接的に結合する実体または部分であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３８調節抗体薬剤は、本明細書に例証される抗ＣＤ３８抗体、その抗原結合断片（例えば、１つ以上のＣＤＲ、全ての重鎖ＣＤＲ、全ての軽鎖ＣＤＲ、全てのＣＤＲ、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、または重鎖可変領域および軽鎖可変領域の両方を含む）、その親和性成熟バリアント（またはその抗原結合断片）、または前述のうちのいずれかの任意の代替の型式（例えば、キメラ、ヒト化、多重特異性、代替アイソタイプ等）であるか、それを含むか、またはＣＤ３８への結合においてそれと競合する。あるいは、または加えて、いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＤ３８調節抗体薬剤は、本明細書に開示されるように、ヒトＣＤ３８（ａＣＤ３８−ｂ−ｅｐと特定される配列等）内の関連エピトープのスクリーニング、製造、（前）臨床試験、および／もしくは特定に、かつ／または特定の文脈において製剤化、投与、および／もしくは有効性に（例えば、がん療法に）有利な特徴であり得る１つ以上の特徴を特徴とし得る。
【０１０７】
併用療法：本明細書で使用される場合、「併用療法」という用語は、対象が２つ以上の治療レジメン（例えば、２つ以上の治療薬）に同時に曝露される状況を指す。いくつかの実施形態では、２つ以上の薬剤が同時に投与され得る。あるいは、かかる薬剤は、順次に投与され得るか、さもなければ、かかる薬剤は、重複投薬レジメンで投与される。
【０１０８】
同等の：本明細書で使用される場合、「同等の」という用語は、互いに同一ではない場合があるが、観察された差または類似点に基づいて正当に結論を下すことができるように、それらの間の比較（例えば、レベルおよび／または活性により）を可能にするのに十分に同様の２つ以上の薬剤、実体、状況、効果、条件セットを指す。かかる同等の条件セット、効果、状況、個体、または集団は、複数の実質的に同一の特徴および１つまたは少数の多様な特徴を特徴とする。当業者であれば、同等とみなされる２つ以上のかかる薬剤、実体、状況、条件セット、効果、または集団等についてどの程度の同一性が任意の所与の状況で必要とされるかを文脈から理解するであろう。
【０１０９】
含む：１つ以上の指名された要素またはステップを「含む」と本明細書に記載される組成物または方法には制約がなく、要素またはステップが必須であるが、他の要素またはステップがその組成物または方法の範囲内で追加され得ることを意味する。１つ以上の指名された要素またはステップを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と記載される（またはそれらを「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」）いずれの組成物または方法も、同じ指名された要素またはステップ「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」（またはそれら「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」）対応するより限定された組成物または方法も説明し、この組成物または方法が指名された必須の要素またはステップを含み、その組成物または方法の基本的かつ新規の特性（複数可）に実質的に影響を及ぼさない追加の要素またはステップも含み得ることを意味することも理解される。
【０１１０】
ダラツムマブ：本明細書で使用される場合、「ダラツムマブ」という用語は、ＷＯ２００６／０９９８７５で公開されたＶＨ配列およびＶＬ配列を有し、かつヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体である抗体を含む。例えば、以下に提供される配列を含む可変重鎖および軽鎖配列を有する。
重鎖：
2020522280.tif 000013
軽鎖：
2020522280.tif 000014
【０１１１】
剤形：本明細書で使用される場合、「剤形」という用語は、対象に投与するための活性薬剤（例えば、治療薬または診断薬）の物理的に別個の単位を指す。各単位は、所定の量の活性薬剤を含む。いくつかの実施形態では、かかる量は、関連集団に投与されたときに所望のまたは有益な結果と相関させるように決定された投薬レジメン（すなわち、治療的投薬レジメン）に従う投与に適切な単位投薬量（またはその全部分）である。当業者であれば、特定の対象に投与され治療的組成物または治療薬の総量が１名以上の主治医によって決定され、かつ複数の剤形の投与を伴い得ることを理解する。
【０１１２】
投薬レジメン：本明細書で使用される場合、「投薬レジメン」という用語は、対象に個別に投与され、典型的には、時間で隔てられた一組の単位用量（典型的には２つ以上）を指す。いくつかの実施形態では、所与の治療薬は、１つ以上の用量を含み得る推奨される投薬レジメンを有する。いくつかの実施形態では、投薬レジメンは、各々が同じ長さの時間で互いに隔てられた複数の用量を含む。あるいは、投薬レジメンは、複数の用量および個々の用量を隔てる少なくとも２つの異なる時間を含む。いくつかの実施形態では、投薬レジメン内の全ての用量は、同じ単位用量の量のものである。あるいは、投薬レジメン内の異なる用量は、異なる量のものである。いくつかの実施形態では、投薬レジメンは、第１の用量を第１の用量の量で含み、続いて、１つ以上の追加の用量を第１の用量の量とは異なる第２の用量の量で含む。投薬レジメンは、第１の用量を第１の用量の量で含み得、続いて、１つ以上の追加の用量を第１の用量の量と同じ第２の用量の量で含み得る。いくつかの実施形態では、投薬レジメンは、関連集団にわたって投与されたときに所望のまたは有益な結果と相関する（すなわち、治療的投薬レジメンである）。
【０１１３】
エピトープ：本明細書で使用される場合、「エピトープ」という用語は、抗体または抗原結合断片によって結合される抗原の一部分を指す。いくつかの実施形態では、抗原がポリペプチドである場合、エピトープは、抗原において共有結合的に隣接していないが、抗原が関連立体構造である場合に三次元空間内で互いに近接している抗原の一部分で構成されるという点で、立体構造的である。例えば、ＣＤ３８の場合、立体構造的エピトープは、ＣＤ３８細胞外ドメイン内で隣接していないアミノ酸残基で構成されるものであり、直鎖状エピトープは、ＣＤ３８細胞外ドメイン内で隣接しているアミノ酸残基で構成されるものである。いくつかの実施形態では、本発明に従って利用されるエピトープは、本明細書に提供されるＣＤ３８調節抗体薬剤によって（例えば、ａＣＤ３８−ｂ−ｅｐと定義されるａＣＤ３８−ｂ−３４８によって）結合される参照を用いて提供される。抗原配列由来のペプチドとの競合、異なる種由来のＣＤ３８配列への結合、切断、および／または突然変異誘発（例えば、アラニンスキャニングまたは他の部位特異的突然変異誘発による）、ファージディスプレイに基づくスクリーニング、または（共）結晶学技法を含む、ａＣＤ３８−ｂ−３４８のエピトープの正確な配列および／または特にアミノ酸残基を決定するための手段は、文献および実施例で既知である。
【０１１４】
患者：本明細書で使用される場合、「患者」または「対象」という用語は、提供される組成物が、例えば、実験目的、診断目的、予防目的、美容目的、および／または治療目的で投与されるか、または投与され得る任意の生物を指す。典型的な患者には、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、および／またはヒト等の哺乳動物）が含まれる。いくつかの実施形態では、患者は、ヒトである。いくつかの実施形態では、患者は、１つ以上の障害または状態に罹患しているか、またはそれに罹り易い。患者は、障害または状態の１つ以上の症状を示し得るか、または１つ以上の障害または状態（がん等、または１つ以上の腫瘍の存在）と診断された場合がある。いくつかの実施形態では、患者は、かかる疾患、障害、または状態を診断および／または治療するためのある特定の療法を受けているか、またはそれを受けていた。
【０１１５】
薬学的に許容される：本明細書で使用される場合、本明細書に開示される組成物を製剤化するために使用される担体、希釈剤、または賦形剤に適用される「薬学的に許容される」という用語は、担体、希釈剤、または賦形剤が組成物の他の成分と適合しなければならず、かつそのレシピエントに有害ではないことを意味する。
【０１１６】
薬学的組成物：本明細書で使用される場合、「薬学的組成物」という用語は、活性薬剤が１つ以上の薬学的に許容される担体と一緒に製剤化される組成物を指す。いくつかの実施形態では、活性薬剤は、関連集団に投与されたときに所定の治療効果を達成する統計的に有意な可能性を示す治療レジメンにおける投与に適切な単位用量の量で存在する。薬学的組成物は、経口投与、例えば、水薬（水溶液もしくは非水溶液または懸濁液）、錠剤、例えば、口腔、舌下、および体内吸収を目標とするもの、ボーラス、粉末、顆粒、舌に塗布するためのペースト、非経口投与、例えば、皮下、筋肉内、静脈内、腫瘍内、または滅菌溶液もしくは懸濁液として硬膜外注射、または持続放出製剤、局所適用（例えば、皮膚、肺、もしくは口腔に適用されるクリーム、軟膏、または放出制御パッチもしくは噴霧剤として）、膣内、直腸内、舌下、眼内、経皮、経鼻、肺、および他の粘膜表面に適応したものを含む、投与のために固体または液体形態で製剤化され得る。
【０１１７】
固形腫瘍：本明細書で使用される場合、「固形腫瘍」という用語は、通常嚢胞も液体領域も含まない組織の異常な塊を指す。固形腫瘍は、良性または悪性であり得る。異なる型の固形腫瘍は、それらが由来する細胞の型にちなんで名付けられる。固形腫瘍の例は、肉腫（海綿骨、軟骨、脂肪、筋肉、血管、造血、または線維性結合組織等の組織における間葉由来の形質転換細胞由来のがんを含む）、癌腫（上皮細胞由来の腫瘍を含む）、黒色腫、リンパ腫、中皮腫、神経芽細胞腫、網膜芽腫等である。固形腫瘍を含むがんとしては、脳癌、肺癌、胃癌、十二指腸癌、食道癌、乳癌、結腸・直腸癌、腎臓癌、膀胱癌、腎臓癌、膵臓癌、前立腺癌、卵巣癌、黒色腫、口腔癌、肉腫、眼癌、甲状腺癌、尿道癌、膣癌、頸部癌、リンパ腫等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１８】
治療有効量：本明細書で使用される場合、「治療有効量」という用語は、治療的投薬レジメンに従って疾患および／または状態に罹患しているか、またはそれに罹り易い集団に投与されたときに、かかる疾患および／または状態を治療するのに十分な量（例えば、薬剤または薬学的組成物の量）を意味する。治療有効量は、疾患、障害、および／または状態の１つ以上の症状の発生率および／または重症度を低下させ、安定させ、かつ／またはその発症を遅延させるものである。当業者であれば、「治療有効量」が特定の対象において成功的治療が達成されることを実際に必要としないことを理解するであろう。
【０１１９】
治療：本明細書で使用される場合、「治療」（同様に「治療する」または「治療すること」）という用語は、１つ以上の症状を部分的または完全に緩和し、改善し、軽減し、抑制し、その発症を遅延させ、その重症度を低下させ、かつ／またはその発生率を低下させる物質（例えば、ａＣＤ３８−ｂ−３４８によって例証される、提供されるＣＤ３８調節抗体薬剤、または任意の他の薬剤）の任意の投与を指す。いくつかの実施形態では、治療は、ａＣＤ３８−ｂ−３４８等のＣＤ３８調節抗体薬剤の直接投与（例えば、静脈内、腫瘍内、または腫瘍周辺注射用の、任意選択的に薬学的に許容される担体、賦形剤、および／またはアジュバントを含む、注射可能な水性組成物として）、または対象から（例えば、マーカーの発現の存在または不在に基づく選択ありまたはなしで、血液、組織、または腫瘍から）細胞を得ることと、かかる細胞をａＣＤ３８−ｂ−３４８等のＣＤ３８調節抗体薬剤とエクスビボで接触させることと、かかる細胞を対象に投与する（マーカーの発現の存在または不在に基づく選択ありまたはなしで）こととを含むレジメンを使用した投与を含み得る。
【０１２０】
投薬および投与。本発明による使用のための本明細書に記載のＣＤ３８調節抗体薬剤（例えば、ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、例えば、抗ＣＤ３８またはその抗原結合断片）を含む薬学的組成物は、当業者に既知であり、かつ／または当業者が利用可能な様々な技法および／または技術のうちのいずれかを使用して、保管および／または送達のために調製され得る。いくつかの実施形態では、提供されるＣＤ３８調節抗体薬剤は、例えば、関連適応症のために、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）および／または欧州医薬品庁（ＥＭＥＡ）等の規制当局によって承認された投薬レジメンに従って投与される。いくつかの実施形態では、提供されるＣＤ３８調節抗体薬剤は、それら自体が、例えば、関連適応症のために、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）および／または欧州医薬品庁（ＥＭＥＡ）等の規制当局によって承認された投薬レジメンに従って投与され得る、１つ以上の他の薬剤または療法と組み合わせて投与される。しかしながら、いくつかの実施形態では、提供されるＣＤ３８調節抗体薬剤の使用により、ＣＤ３８調節抗体薬剤療法と組み合わせて使用される承認された薬剤または療法の投薬回数の低減（例えば、より少ない量の１回以上の用量、より少ない投薬回数、および／または投薬頻度の低減）が可能になり得る。いくつかの実施形態では、投薬および／または投与は、同様に投与される他の薬物、患者状況、および／またはＣＤ３８調節抗体薬剤（例えば、イムノコンジュゲート、ナノボディ、または二重特異性抗体として修飾されたもの）の型式に適合され得る。
【０１２１】
さらに、いくつかの実施形態では、特定の細胞型であるか、特定の腫瘍もしくはその型であるか、または特定の患者集団（例えば、遺伝子マーカーを持つ患者集団）であるかにかかわらず、タイミングおよび／またはＣＤ３８の閾値発現レベルに基づいて、投薬レジメンを調整すること、具体的には、順次投薬レジメンを設計することが望ましくあり得る。いくつかのかかる実施形態では、治療的投薬レジメンは、療法前および／または療法中に１つ以上の誘導性マーカーの発現または他の基準を評価する検出方法と組み合わせられ得るか、またはそれを考慮して調整され得る。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、本発明による投薬および投与は、任意のまたは様々な形態で１つ以上の生理学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤と組み合わせられた所望の純度を有する活性薬剤を利用する。これらには、例えば、液体、半固体および固体剤形、例えば、液体溶液（例えば、注射可能および注入可能な溶液）、分散液または懸濁液、錠剤、丸剤、粉末、リポソーム、および坐薬が含まれる。好ましい形態は、典型的には、注射可能および注入可能な溶液、例えば、抗体でヒト対象を治療するために使用されるものと同様の組成物の形態での、意図される投与方法および／または治療的適用に依存し得る。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、成分（複数可）は、移植片、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化送達系を含む、放出制御製剤等の薬剤（複数可）を急速な放出および／または分解から保護する担体とともに調製され得る。ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸等の生分解性生体適合性ポリマーが使用され得る。概して、各活性薬剤は、良好な医療行為と一致しており、かつ関連薬剤（複数可）（例えば、抗体等の作用物質）に適切な薬学的組成物および投薬レジメンを使用して、治療有効量で製剤化、投薬、および投与される。活性薬剤を含む薬学的組成物は、経口、粘膜、吸入、局所、口腔、経鼻、直腸、または非経口（例えば、対象の組織の物理的突破およびかかる突破口を通した薬学的組成物の投与を含む、静脈内、注入、腫瘍内、節内、皮下、腹腔内、筋肉内、皮内、経皮、または他の種類の投与）を含むが、これらに限定されない当該技術分野で既知の任意の適切な方法によって投与され得る。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、特定の活性薬剤のための投薬レジメンは、例えば、対象における目的とする１つ以上の組織または体液における特定の所望の薬物動態プロファイルまたは他の曝露パターンを達成するために、間欠または連続（例えば、灌流または持続放出系による）投与を含み得る。いくつかの実施形態では、組み合わせで投与される異なる薬剤は、異なる送達経路により、かつ／または異なるスケジュールに従って投与され得る。あるいは、または加えて、いくつかの実施形態では、第１の活性薬剤の１回以上の用量が、１つ以上の他の活性薬剤と実質的に同時に、いくつかの実施形態では、一般的な経路により、かつ／または単一の組成物の一部として投与される。
【０１２５】
所与の治療レジメンの経路および／または投薬スケジュールを最適化する際に考慮される要因としては、例えば、治療される特定のがん（例えば、型、病期、位置等）、対象の臨床状態（例えば、年齢、全般的な健康状態、体重等）、薬剤の送達部位、薬剤の本質（例えば、抗体または他のタンパク質ベースの化合物）、薬剤の投与方法および／または経路、併用療法の存在または不在、ならびに他の医師に既知の要因が挙げられ得る。
【０１２６】
当業者であれば、例えば、特定の送達経路が用量に影響を及ぼし得、かつ／または必要とされる用量が送達経路に影響を及ぼし得ることを理解するであろう。例えば、特定の部位または位置内（例えば、組織または臓器内）で特に高い濃度の薬剤を目的とする場合、集中的送達（例えば、腫瘍内送達）が所望され得、かつ／または有用であり得る。いくつかの実施形態では、特定の薬学的組成物および／または利用される投薬レジメンの１つ以上の特徴は、例えば、所望の治療効果または応答（例えば、本明細書に記載のＣＤ３８調節抗体薬剤の機能的特徴に関連する治療的または生物学的応答）を最適化するために、経時的に変更され得る（例えば、任意の個々の用量における活性量を増加または減少させる、用量間の時間間隔を増加または減少させる等）。概して、本発明による活性薬剤の投薬の種類、量、および頻度は、関連薬剤（複数可）が哺乳動物、好ましくは、ヒトに投与されるときに適用される安全性および有効性要件によって支配されている。概して、投薬のかかる特徴は、療法なしで観察されたものと比較して、特定の、典型的には、検出可能な治療的応答を提供するように選択される。本発明の文脈において、例示の望ましい治療的応答は、腫瘍成長の阻害および／または軽減、腫瘍サイズ、転移、腫瘍に関連する症状および副作用のうちの１つ以上、ならびにがん細胞のアポトーシスの増加、１つ以上の細胞マーカーまたは循環マーカーの治療的に関連した減少または増加等を含み得るが、これらに限定されない。かかる基準は、様々な免疫学的方法、細胞学的方法、および文献に開示される他の方法のうちのいずれかによって容易に評価され得る。例えば、ＣＤ３８調節抗体薬剤の治療有効量は、単独で、またはさらなる薬剤と組み合わせて、実施例に記載されるようにがん細胞の死滅を強化するのに十分であると決定され得る。
【０１２７】
活性薬剤またはかかる薬剤を含む組成物としてのＣＤ３８調節抗体薬剤の治療有効量は、１つ以上の要因、例えば、治療される疾患または状態、疾患の病期、治療される哺乳動物の年齢および健康および身体状態、疾患の重症度、投与される特定の化合物等を含む、例えば、それらを考慮する当該技術分野で利用可能な技法を使用して容易に決定され得る。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、治療有効量は、少なくとも約０．０１μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約０．０５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約０．１μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重、またはそれ以上（例えば、約１００μｇ／ｋｇ体重）であり得る活性薬剤の有効用量（および／または単位用量）である。当業者であれば、いくつかの実施形態では、かかるガイドラインが活性薬剤の分子量に対して調整され得ることを理解するであろう。投薬量は、投与経路、治療サイクル、またはその結果として増加用量でのａＣＤ３８−ｂ−３４８−ＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む単離された抗体またはその抗原結合断片の投与に関連して最大許容用量および用量制限毒性（存在する場合）を決定するために使用され得る用量増加プロトコルによっても異なり得る。
【０１２９】
治療的組成物は、典型的には、滅菌されており、製造および保管条件下で安定していなければならない。本組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、または高薬物濃度に好適な他の秩序構造として製剤化され得る。滅菌の注射可能な溶液は、上に列挙される成分のうちの１つまたはそれらの組み合わせとともに必要量の抗体を適切な溶媒に組み込み、その後、濾過滅菌することによって調製され得る。概して、分散液は、活性化合物を、塩基性分散媒体および上に列挙されるもの由来の他の必要な成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌の注射可能な溶液を調製するための粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分および先に滅菌濾過された溶液由来の任意の追加の所望の成分の粉末をもたらす真空乾燥および凍結乾燥である。溶液の適切な流動性が、例えば、コーティングを使用することによって、分散液の場合には必要な粒径の維持によって、かつ界面活性剤の使用によって維持され得る。注射可能な組成物の持続的吸収は、組成物中に吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを含むことによってもたらされ得る。
【０１３０】
各薬剤の製剤は、望ましくは、滅菌濾過膜を通した濾過によって達成され得るように滅菌であり、その後、ボーラス投与または連続投与に好適な形態でパッケージングまたは販売されるべきである。注射可能な製剤は、防腐剤を含むアンプルまたは多用量容器等の単位剤形で調製、パッケージング、または販売され得る。非経口投与用の製剤としては、本明細書で論じられる油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液、乳濁液、ペースト、および移植可能な持続放出または生分解性製剤が挙げられるが、これらに限定されない。滅菌の注射可能な製剤は、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒、例えば、水または１，３ブタンジオールを使用して調製され得る。有用な他の非経口的に投与可能な製剤としては、活性成分を微結晶形態で、リポソーム調製物で、または生分解性ポリマー系の成分として含むものが挙げられる。持続放出または移植のための組成物は、薬学的に許容されるポリマーまたは疎水性材料、例えば、乳濁液、イオン交換樹脂、難溶性ポリマー、または塩を含み得る。
【０１３１】
本発明による使用のための各薬学的組成物は、用いられる投薬量および濃度で対象に非毒性の薬学的に許容される分散剤、湿潤剤、懸濁剤、等張剤、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、担体、賦形剤、塩、または安定剤を含み得る。かかるさらなる薬学的に許容される化合物の非包括的なリストには、緩衝液、例えば、リン酸、クエン酸、および他の有機酸；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸およびメチオニン；薬理学的に許容されるアニオンを含む塩（例えば、酢酸塩、安息香酸塩、重炭酸塩、重硫酸塩、イソチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、ラウリン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクル酸塩、トシル酸塩、トリエチオダイド、および吉草酸塩）；防腐剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；塩化ナトリウム；フェノール、ブチル、もしくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルもしくはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジン；単糖、二糖、および他の炭水化物、例えば、グルコース、マンノース、もしくはデキストリン；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ならびに／または非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれる。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、２つ以上の活性薬剤が本発明に従って利用される場合、かかる薬剤は、同時にまたは順次に投与され得る。いくつかの実施形態では、１つの薬剤の投与は、別の薬剤の投与に対して特異的に時間調整される。いくつかの実施形態では、組み合わせで投与される薬剤に所望の相対投薬レジメンは、例えば、エクスビボ、インビボ、および／またはインビトロモデルを使用して、評価されるか、または実験的に決定され得、いくつかの実施形態では、かかる評価または経験的決定は、（例えば、相関させるように）特定の患者または患者集団においてインビボで行われる。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、本発明の実施において利用される１つ以上の活性薬剤は、少なくとも２つのサイクルを含む間欠投薬レジメンに従って投与される。２つ以上の薬剤が組み合わせで投与され、かつ各々がかかる間欠サイクルレジメンによって投与される場合、異なる薬剤の個々の用量は、互いに組み合わせられ得る。いくつかの実施形態では、第２の薬剤の１つ以上の用量は、本明細書に記載のＣＤ３８調節抗体薬剤の用量の後に投与される。いくつかの実施形態では、第２の薬剤の各用量は、本明細書に記載のＣＤ３８調節抗体薬剤の用量の後に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＤ３８調節抗体薬剤は、患者の応答に応じて、１、２、４週間、またはそれ以上の期間にわたる１回以上の治療サイクル内で、かかるサイクルを同じレジメンで繰り返す（または投与間の間隔を延長することによって）、同じ経路によるその後の投与のみならず、皮下（または筋肉内）投与および腫瘍内投与等の投与経路の交替も含むレジメンで投与され得る。また、いくつかの実施形態では、従う正確なレジメン（例えば、用量の数、用量の間隔（例えば、互いに対して、または別の療法の投与等の別の事象に対して）、用量の量等は、１回以上の他のサイクルと比較して１回以上のサイクルにおいて異なり得る。
【０１３４】
本明細書に記載の投与経路、投薬量、および／またはレジメンのうちのいずれかを使用して、本明細書に記載のＣＤ３８調節抗体薬剤が、例えば、生検、血液試料、および／または他の臨床基準を使用して患者において測定される１つ以上の基準を考慮して、特定され、特徴付けられ、かつ／または検証され得る。いくつかの実施形態では、腫瘍サイズおよび／または転移の直接評価の代替案として、またはそれに加えて、本明細書に記載のＣＤ３８調節抗体薬剤の治療的有効性は、１つ以上の異なる一般的基準：がん細胞に対する直接的細胞傷害性（がん細胞のアポトーシスおよび壊死）、腫瘍浸潤免疫細胞（ＣＤ４陽性および／もしくはＣＤ８陽性腫瘍浸潤Ｔ細胞等）の増加、血液中を循環する免疫細胞（リンパ球、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞等の全集団または特定の亜集団）の増加、ならびに／または応答患者または無応答患者のいずれかのみの治療前と治療後を比較したいくらかの差次的発現の提示（ＲＮＡシーケンシング、質量フローサイトメトリー、および／または他の質量シーケンシングアプローチによって決定されるもの）が評価される方法で決定され得る。あるいは、または加えて、いくつかの実施形態では、かかる特定、特徴付け、および／または検証は、１つ以上の特異的タンパク質または１組以上のタンパク質のｍＲＮＡおよび／またはタンパク質発現をスクリーニングすることによる分子レベルでのフォローアップを含み得る。いくつかの実施形態では、１つ以上のかかる技法は、例えば、組織分布ならびに／または腫瘍内の（もしくは腫瘍付近の）および／もしくは血液中を循環する特定の細胞集団のマーカーに関連し得る、本明細書に記載のＣＤ３８調節抗体薬剤に対する応答の特定またはそれを評価するための関連情報を可能にし得る。
【０１３５】
かかるアプローチおよび免疫生物学的データにより、１つ以上の有効性および／または安全性パラメータまたは特性の決定が可能になり得るのみならず、いくつかの実施形態では、例えば、所与の適応症についての１つ以上の臨床試験において単独で、かつ／またはさらなる治療的利点を提供し得る他の薬物、標準治療プロトコル、もしくは免疫療法と組み合わせて利用され得る、特定の用量、経路、または投薬レジメンの選択についての理論的根拠が提供され得る。したがって、本発明の一連のさらなる実施形態では、本明細書に記載のＣＤ３８調節抗体薬剤は、かかる製剤での治療後または治療前の患者の細胞または組織（腫瘍、血液試料、または血液画分等）における１つ以上の遺伝子のＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルでの発現の組み合わせ存在（および／または不在）を決定した後に、疾患（がん等）に罹患している患者を治療する方法または疾患（がん等）を予防する方法において使用される。したがって、かかる方法により、１つ以上のバイオマーカー、または望ましいＣＤ３８調節抗体薬剤の治療有効量に関連したより複雑な遺伝子発現シグネチャ（または細胞集団分布）、対象が本明細書に記載のＣＤ３８調節抗体薬剤での治療後に抗腫瘍または抗抗感染応答を有し得ると予測する治療関連バイオマーカー（複数可）、または対象がＣＤ３８調節抗体薬剤での治療後に化合物での治療に応答し得ると予測する治療関連バイオマーカー（複数可）の特定が可能になり得る。
【０１３６】
あるいは、または加えて、いくつかの実施形態では、本明細書に開示される特定のＣＤ３８調節抗体薬剤の投薬および投与は、予め確立され得、かつ／またはヒトがんおよび／もしくは他のヒト組織におけるＣＤ３８発現を考慮して（例えば、様々ながん、組織、および／または患者における間質および／または免疫サブセットにおけるＣＤ３８分布についてのデータを収集することによって）後に評価され得る。かかるデータは、様々な免疫亜集団と非免疫亜集団におけるＣＤ３８発現の関係ならびに／またはその細胞浸潤物尺度および／もしくはがん細胞もしくは免疫細胞のサブセット（Ｆｏｘｐ３およびＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１等）に関連したがん関連マーカーとの関係を特定するための一般的な技術（フローサイトメトリー、質量サイトメトリー、免疫組織化学、またはｍＲＮＡ発現ライブラリ等）を一般的ながん型および／または組織（中枢神経系、食道、胃、肝臓、結腸、直腸、肺、膀胱、心臓、腎臓、甲状腺、膵臓、子宮、皮膚、乳、卵巣、前立腺、および睾丸）にわたって使用することによって生成され得る。ＣＤ３８発現は、腫瘍組織（ＮＫ細胞および他のエフェクターまたは制御性免疫細胞等）における免疫サブセットに限定される場合があり（または限定されない場合があり）、陽性の場合、ＣＤ３８発現と免疫チェックポイント阻害剤との間の相関が決定され得、それ故に、かかる免疫チェックポイント阻害剤を標的とする化合物と組み合わせたＣＤ３８調節抗体薬剤の適切な使用を示唆する。
【０１３７】
製品およびキット。本発明のいくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＤ３８調節抗体薬剤は、別個の製品で提供される。本発明のいくつかの実施形態では、ＣＤ３８調節抗体薬剤を含む製品は、ラベルを有する容器内に提供されるか、またはそれとともに提供される。好適な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、および試験管が含まれ得る。いくつかの実施形態では、容器は、ガラスまたはプラスチック等の任意のまたは様々な材料から形成され得る。いくつかの実施形態では、容器は、特定の疾患、障害、もしくは状態、またはその病期もしくは型の治療に効果的な組成物を保持する。いくつかの実施形態では、容器は、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針によって穿孔可能な栓を有する静脈注射用溶液袋またはバイアルであり得る）。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＤ３８調節抗体薬剤を含む組成物は、ゴム栓およびアルミニウムシールを有する透明なガラスバイアル内にパッケージングされる。容器上のラベル、または容器に関連するラベルは、組成物が選択した状態の治療に使用されることを示す。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、製品は、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、およびデキストロース溶液等の薬学的に許容される緩衝液を含む別個の容器をさらに含み得、かつ／または商業的観点および利用者の観点から望ましい他の材料、例えば、他の緩衝液、希釈剤、充填剤、針、シリンジ、および使用に関する指示を記載した添付文書をさらに含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、製品は、０．１ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、またはより高い濃度の最終濃度で、適切な希釈剤および緩衝液とともに製剤化される、滅菌水溶液として、合計２ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ、５０ｍｇ、またはそれ以上を含む静脈注射用製剤中への薬剤の各々の提供を可能にし得る。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＤ３８調節抗体薬剤は、キットとともに提供されるか、またはキットとともに提供されない任意の適切な水溶液で再構成される凍結乾燥形態で部品キット内に、または任意の適合性薬学的担体を使用して他の種類の投薬装置内に提供され得る。ＣＤ３８調節抗体薬剤の１つ以上の単位剤形は、パックまたは分注ディスペンサデバイス内に提供され得る。かかるパックまたはデバイスは、例えば、金属またはプラスチックホイル、例えば、ブリスターパックを含み得る。かかる部品キットを正しく使用するために、これは、緩衝液、希釈剤、充填剤、針、シリンジ、およびがんの治療における使用に関する指示を記載した添付文書をさらに含み得る。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、製品または本明細書に記載のキットに関連する指示は、正しい使用法について知らせるために使用され得、かつ／または製品および／もしくはキット内の薬剤、製剤、および他の材料の可能な効果を監視するための、ラベル、小冊子、出版物、記録物、図表、または任意の他の手段の形態であり得る。指示は、製品と一緒に提供され得、かつ／またはキット内に提供され得る。
【実施例】
【０１４１】
実施例１：インビトロでのＣＤ３８に結合する抗体の生成
材料および方法
ＣＤ３８抗原の調製。ヒト、カニクイザル（Ｃｙｎｏ）、およびマウスＣＤ３８タンパク質の組換えヒスチジンタグ付き細胞外ドメインを、Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．から購入した。タンパク質試薬のビオチン化を、ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号２１４２５）を使用して行った。ＣＤ３８抗原を約１ｍｇ／ｍＬに濃縮し、緩衝液をＰＢＳに交換した後、１：７．５モル比でビオチン化試薬（ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号２１４２５）を添加した。混合物を４℃で一晩保持した後、別の緩衝液に交換して、溶液中の遊離ビオチンを除去した。ビオチン化を、標識タンパク質のストレプトアビジンセンサ結合により確認した。
【０１４２】
抗ＣＤ３８抗体のライブラリ照合および抗ＣＤ３８抗体を単離するための選択方法論。各々が約１０９の多様性の８つのナイーブヒト合成酵母ライブラリを、以前に説明されたように、モノクローナル抗体を発現する酵母細胞株のハイスループットスクリーニングおよび選択のために設計し、生成し、増殖させた（Ｘｕ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ，２０１３、ＷＯ２００９／０３６３７９、ＷＯ２０１０／１０５２５６、ＷＯ２０１２／００９５６８）。８つの並列選択を、単量体ヒトＣＤ３８ベースの選択のための８つのナイーブライブラリを使用して行った。
【０１４３】
第１の２回の選択ラウンドのために、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＭＡＣｓシステムを利用する電磁ビーズ選別技法を、本質的に記載されるように行った（Ｓｉｅｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。簡潔には、酵母細胞（約１０１０細胞／ライブラリ）を、０．１％ＢＳＡを含むＦＡＣＳ洗浄緩衝液ＰＢＳ中で、３ｍＬの１００ｎＭビオチン化単量体ヒトＣＤ３８抗原と室温で１５分間インキュベートした。５０ｍＬの氷冷洗浄緩衝液で１回洗浄した後、細胞ペレットを４０ｍＬの洗浄緩衝液中に再懸濁させ、５００μＬのＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ、カタログ番号１３０−０４８−１０１）を酵母細胞に添加し、４℃で１５分間インキュベートした。次に、酵母細胞をペレット化し、５ｍＬの洗浄緩衝液中に再懸濁させ、ＭＡＣＳ  ＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ、カタログ番号１３０−０４２−４０１）に装填した。５ｍＬを装填した後、カラムを３ｍＬのＦＡＣＳ洗浄緩衝液で３回洗浄した。カラムを磁場から除去し、酵母細胞を５ｍＬの成長培地で溶出し、その後、一晩成長させた。
【０１４４】
２回のＭＡＣＳラウンド後、５回の選別ラウンドを、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を使用して行った。第１のＦＡＣＳ選択ラウンドについて、およそ４×１０７の酵母細胞をペレット化し、洗浄緩衝液で３回洗浄し、各々１００ｎＭのビオチン化単量体ヒト、マウス、およびカニクイザルＣＤ３８抗原と室温で１０分間インキュベートした。その後、酵母細胞を２回洗浄し、ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）２カッパ−ＦＩＴＣ（１：１００で希釈）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＵＳＡ、カタログ番号２０６２−０２）で、かつ二次試薬としてストレプトアビジンＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡ、カタログ番号Ｓ２１３７５）（１：５００で希釈）またはエクストラアビジン（Ｅｘｔｒａｖｉｄｉｎ）−フィコエリトリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ、カタログ番号Ｅ４０１１）（１：５０で希釈）のいずれかで、４℃で１５分間染色した。氷冷洗浄緩衝液で２回洗浄した後、細胞ペレットを０．４ｍＬの洗浄緩衝液中に再懸濁させ、濾過器で蓋をした選別管に移した。選別を、ＦＡＣＳ  ＡＲＩＡ選別機（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して行い、選別ゲートを決定して、ＣＤ３８結合のみを選択した。第１のＦＡＣＳラウンド由来のマウス選択集団およびカニクイザル選択集団を合わせて２つのプールにした。その後、これらのプールをヒトＣＤ３８結合について選別して、試薬多重特異性結合剤を低減するための第２のＦＡＣＳラウンドにおける交差反応性結合剤を特定した（Ｘｕ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。第４のＦＡＣＳラウンドは、１００ｎＭのビオチン化単量体ＣＤ３８を抗原として使用した正の選択から主になった。選択されたクローンの試料をプレーティングし、配列決定した。
【０１４５】
ナイーブ選択において特定されたクローンの親和性成熟。第４のＦＡＣＳ選別選択ラウンド出力由来の重鎖を使用して、４つのさらなる選択ラウンドに使用した軽鎖多様化ライブラリを調製した。第１の選択ラウンドは、抗原として１００ｎＭのビオチン化単量体ヒトＣＤ３８または抗原として２００ｎＭのビオチン化単量体マウスＣＤ３８のいずれかとコンジュゲートしたＭｉｌｔｅｎｙｉ  ＭＡＣｓビーズを含んだ。ＭＡＣｓビーズ選択後、３回のＦＡＣＳ選別ラウンドを行った。第１のＦＡＣＳラウンドは、１００ｎＭもしくは１０ｎＭのヒトＣＤ３８または２００ｎＭのマウスＣＤ３８のいずれかを含んだ。上述の第２のＦＡＣＳラウンドと並行して、競合選択を、７５〜１００ｎＭの競合ＩｇＧを用いて行った。選択ラウンド後、１ｎＭまたは１０ｎＭのヒトＣＤ３８で第３の正の選別を行った後に、プレーティングした。各ＦＡＣＳ選択ラウンド由来の個々のコロニーをＩｇＧ配列決定のために選んだ。
【０１４６】
ＩｇＧおよびＦａｂの産生および精製。酵母クローンを飽和するまで成長させ、その後、振盪しながら３０℃で４８時間誘導した。誘導後、酵母細胞をペレット化し、上清を精製のために収集した。ＩｇＧを、タンパク質Ａカラムを使用して精製し、酢酸（ｐＨ２．０）で溶出した。Ｆａｂ断片をパパイン消化によって生成し、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  ＩｇＧ−ＣＨ１親和性マトリックス（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１９４３２００２５０）で精製した。
【０１４７】
抗ＣＤ３８抗体の親和性測定。ＣＤ３８抗体の親和性を、Ｆｏｒｔｅ  ＢｉｏによりそれらのＫＤを測定することによって決定した。Ｆｏｒｔｅ  Ｂｉｏ親和性測定を、記載されるようにＩｇＧをオンラインでＡＨＱセンサに装填することによって行った（Ｅｓｔｅｐ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。簡潔には、センサをアッセイ緩衝液中で３０分間、オフラインで平衡化し、その後、ベースライン確立のためにオンラインで６０秒間監視した。結合力測定のために、ＩｇＧを装填したセンサを、２００ｎＭのヒト、カニクイザル、またはマウスＣＤ３８に３分間曝露し、その後、それらをオフ速度測定のために３分間にわたってアッセイ緩衝液に移した。一価結合測定結果を、ビオチン化ＣＤ３８単量体をＳＡセンサに装填し、その後、２００ｎＭの抗体に曝露することによって得た。反応速度データを、Ｆｏｒｔｅ  Ｂｉｏから提供されたデータ分析ソフトウェアの１：１結合モデルを使用してフィッティングした。参照アゴニスト抗ＣＤ３８抗体についてこのアッセイで確立されたＫｄ値は、以下の通りである：ＩＢ４について、ヒトＣＤ３８の場合では０．９×１０−８Ｍ、ＩＢ４についてカニクイザルＣＤ３８には結合しない。
【０１４８】
抗ＣＤ３８抗体の結合力測定：Ｎｉ−ＮＴＡセンサをアッセイ緩衝液中で３０分間、オフラインで平衡化し、その後、ベースライン確立のためにオンラインで６０秒間監視した。それらに４．２ｎＭの抗原（ＨＩＳタグ付き組換えヒトＣＤ３８）を５０分間装填し、その後、それらを洗浄のために０．５分間にわたってアッセイ緩衝液に移し、ベースライン決定のために再びアッセイ緩衝液中に１分間置いた。その後、抗体を異なる濃度（図７および図１２に記載される）で５０分間結合させた。その後、それらをオフ速度測定のために３０分間にわたってアッセイ緩衝液に移した。反応速度データを、ＦｏｒｔｅＢｉｏから提供されたデータ  分析ソフトウェアにおける１：１結合モデルを使用してフィッティングした。
【０１４９】
あるいは、抗ヒトＣＤ３８抗体の親和性を、２５℃の周囲実験温度でＣＭ−５センサチップを使用したＢｉａｃｏｒｅ  ２０００におけるＳＰＲによってそれらのＫＤを測定することによって決定した。抗ヒト抗体を最初に分析緩衝液（ｐＨ７．４、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）中で全てのフローセルにわたって固定化して、１０分かけて１２，０００〜１４，０００のＲＵにした。その後、リガンド（抗体試験物質）を装填して、５４〜２０８ＲＵの捕捉レベルにした。その後、分析物（Ｈｉｓタグ付き組換えヒトＣＤ３８）を、３２００ｎＭから始まり最低濃度０．７８ｎＭの２倍希釈した分析緩衝液中で６分間結合させた。解離を分析緩衝液中で１０分間行った。試料濃度間の再生ステップを３Ｍ  ＭｇＣｌ２中で０．５分間にわたって３回行った。このプロセスを通して２５μＬ／分の流量を維持した。反応速度データを、基準を差し引いたＢｉａｃｏｒｅから提供された分析ソフトウェアにおけるグローバルフィッティングを使用してフィッティングした。
【０１５０】
エピトープビニング：抗体のエピトープビニングを、標準のサンドイッチビニングアッセイを使用してＦｏｒｔｅ  Ｂｉｏ  Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄ３８４システム（Ｐａｌｌ  Ｆｏｒｔｅ  Ｂｉｏ  Ｃｏｒｐ．，ＵＳＡ）で行った。抗ヒトＣＤ３８抗体をＡＨＱセンサに装填し、センサ上の非占有Ｆｃ結合部位を非関連ヒトＩｇＧ１抗体で遮断した。センサを１００ｎＭの標的抗原に、その後、第２の抗ＣＤ３８抗体、参照モノクローナルアゴニストマウス抗ヒトＣＤ３８抗体（ＩＢ４、Ｐｒｏｆ．Ｆ．Ｍａｌａｖａｓｉ  ａｔ  Ｕｎｉｖ．Ｔｏｒｉｎｏ，Ｉｔａｌｙから快く提供されたもの）に曝露した。データを、Ｆｏｒｔｅ  Ｂｉｏ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ７．０を使用して処理した。抗原会合後の第２の抗体によるさらなる結合が非占有エピトープを示す一方で、結合なしはエピトープ遮断を示す。
【０１５１】
抗ＣＤ３８抗体のＣＤ３８発現細胞への結合。候補ヒットを、精製されたカニクイザルＴ細胞への結合を分析することによって評価する。この目的のために、カニクイザル汎Ｔ細胞を、２０μｇ／ｍＬ、続いて、半対数連続希釈（７点）のａＣＤ３８−ｂ−３４８またはＤＡＲＡで、氷上で３０分間にわたって染色した。結合していない一次抗体を洗浄によって除去し、その後、氷上で３０分間にわたって二次抗体（５μｇ／ｍＬ）で染色した。全ての試料を適切なＣＤ３、ＣＤ４、およびＣＤ８交差反応性抗体で三連染色した。試料をフローサイトメトリーによって測定した。データ分析のために、生細胞を、試料取得中のＦＳＣ対ＳＳＣパラメータを使用してゲーティングした。染色した細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、濃度の対数に対するＭＦＩをグラフ化したＸＹチャート上にプロットし、データを、ＥＣ５０が算出される非線形回帰曲線に当てはめた。
【０１５２】
あるいは、結合をヒトＰＢＭＣで評価した。この目的のために、ＰＢＭＣを３名のヒトドナー由来の全血から調製し、１μＭ、２００ｎＭ、４０ｎＭ、８ｎＭ、１．６ｎＭ、３２０ｐＭ、６４ｐＭ、１３ｐＭ、および２．５ｐＭの最終濃度で、ａＣＤ３８−ｂ−３４８またはＤＡＲＡと３０分間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、ＡＦ４８８二次抗体で標識した。その後、細胞を、さらなる表面染色抗体：抗ＣＤ３  ＰＥ−Ｃｙ７、抗ＣＤ４  ＡＰＣ、および抗ＣＤ８  ＢＶ４５１とインキュベートした。試料取得を、ＢＤ  ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で起動する８色（３レーザー）ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩサイトメーターを使用して行った。分析後処理を、ＦＣＳ発現（ｖ３．０）ソフトウェア（ＤｅＮｏｖｏソフトウェア）を使用して行った。異なる細胞集団の相対的割合（％）および平均蛍光強度（ＭＦＩ）データを小数第２位まで報告した。
【０１５３】
哺乳類細胞で発現したヒトＩｇＧ１としてのａＣＤ３８−ｂ−３４８の再クローン化、産生、および特徴付け。抗体のコドン最適化ＶＨおよびＶＬコード配列の合成をＧｅｎｅｗｉｚによって行った。可変領域のｃＤＮＡを、ヒトＩｇＧ１重鎖およびカッパ軽鎖定常領域（それぞれ、Ｐ０１８５７およびＰ０１８３４）を含む抗体発現ベクター（Ｉｃｏｓａｇｅｎ，ＥＳＴ）にクローン化した。全長重鎖および軽鎖ｃＤＮＡを、最終ベクターにおける配列決定によって実証し、その後、ＣＨＯに基づく細胞（ＣＨＯＥＢＮＡＬＴ８５）を使用する安定したエピソーム発現系であるＱＭＣＦ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｉｃｏｓａｇｅｎ）を使用してそれらを発現させるために再クローン化し、組換えタンパク質、抗体、ＣＨＯＥＢＮＡＬＴ８５細胞の産生に適切なベクターを、抗体産生のために１μｇの発現プラスミドでトランスフェクトした。４８時間トランスフェクトした後、７００μｇ／ｍＬのＧ４１８を添加して、プラスミド含有細胞集団を選択した。産生のために、温度を３０℃に変化させ、培養物をさらに供給した。産生の終わりに、培養上清を遠心分離（１０００ｇ、３０分、および１５℃）によって精製し、ＰＭＳＦを添加し、上清を精製まで処理または凍結した。ｈＩｇＧ１抗体を、２５ｍＭ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ５，５）、５０ｍＭ  ＮａＣｌまたはＰＢＳのいずれかで、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ親和性クロマトグラフィー、続いて、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ゲル濾過によって精製した。ＣＨＯＥＢＮＡＬＴ８５細胞で産生されたヒトＩｇＧ１抗体を、組換えウサギＣＤ３８（６５００３−Ｔ０８Ｈ−２０、Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）および組換えラットＣＤ３８：（８０２２９−Ｒ０８Ｈ−２０、Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を使用して、組換えヒトＣＤ３８に対する親和性、マウス、ラット、ウサギ、およびカニクイザルＣＤ３８に対する交差反応、ならびにエピトープに結合する抗体対選択されたＣＤ３８に結合する抗体について特徴付けた。
【０１５４】
ａＣＤ３８−ｂ−３４８エピトープマッピング。ヒトＣＤ３８配列（Ｕｎｉｐｒｏｔ登録番号Ｐ２８９０７）を表す異なる組の直鎖状単ループ、β−ターン模倣物、ジスルフィド架橋模倣物、不連続ジスルフィド架橋、不連続エピトープ模倣物ペプチドを、固相Ｆｍｏｃ合成を使用して合成した（Ｐｅｐｓｃａｎ  ＢＶ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、Ｔｉｍｍｅｒｍａｎｎ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，２００７、Ｌａｎｇｅｄｉｊｋ  ＪＰ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。合成したペプチドの各々への抗体の結合を、ＰｅｐｓｃａｎベースのＥＬＩＳＡ（Ｐｅｐｓｃａｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で試験した。ペプチドアレイを一次抗体溶液とインキュベート（４℃で一晩）した。洗浄後、ペプチドアレイを、適切な抗体−ペルオキシダーゼコンジュゲートの１／１０００希釈物（２０１０−０５、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）と２５℃で１時間インキュベートした。洗浄後、ペルオキシダーゼ基質２，２’−アジノ−ジ−３−エチルベンズチアゾリンスルホネート（ＡＢＴＳ）および２０μＬ／ｍＬの３パーセントＨ２Ｏ２を添加した。１時間後、着色を測定した。着色を電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラおよび画像処理システムで定量化した。ＣＣＤカメラから得た値は、０〜３０００ｍＡＵの範囲であり、標準の９６ウェルプレートＥＬＩＳＡリーダーと同様である。合成したペプチドの品質を実証するために、別個の組の陽性および陰性対照ペプチドを並行して合成し、非関連対照抗体でスクリーニングした。
【０１５５】
アラニンスキャニングを行い、エピトープを確認した。ショットガン突然変異誘発に基づくＩｎｔｅｇｒａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒのエピトープマッピングプラットホームを使用してアラニンスキャニングを行い、ｍＡｂのエピトープをさらに特徴付けた。全長ＣＤ３８タンパク質のコード領域を成功裏にコドン最適化し、合成し、哺乳類高発現ベクターにサブクローン化した。その後、この親構築物の配列を実証し、免疫検出によって哺乳類細胞発現について検証した。ハイスループットフローサイトメトリーを使用したａＣＤ３８−ｂ−３４８（ｍＡｂおよびＦａｂ）の結合およびスクリーニング条件を、専売ベクターにクローン化し、かつＨＥＫ−２９３Ｔ細胞で発現させた野生型ＣＤ３８を使用して最適化した。
【０１５６】
抗体のエピトープをマッピングするために、ＣＤ３８のアラニンスキャニングライブラリを構築した。その後、抗体（ｍＡｂおよびＦａｂ）を各個々のＣＤ３８バリアントへの結合についてスクリーニングし、試験ｍＡｂ結合に重要なＣＤ３８接触残基の特定を可能にした。
【０１５７】
抗ヒトＣＤ３８抗体競合アッセイ：抗体競合を、標準の順次結合アッセイを使用してＦｏｒｔｅ  Ｂｉｏ  Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄ９６システム（Ｐａｌｌ  Ｆｏｒｔｅ  Ｂｉｏ  Ｃｏｒｐ．，ＵＳＡ）で行った。０．６２５ｕｇ／ｍＬのＨｉｓタグ付き組換えヒトＣＤ３８を３００秒間にわたってＮｉ−ＮＴＡバイオセンサに装填した。１５秒間洗浄し、ベースラインステップを動態緩衝液で６０秒間行った後、センサを６６．６ｎＭの第１の抗体（ダラツムマブ）に６００秒間、続いて、第２の抗ＣＤ３８抗体（ダラツムマブ（対照）またはａＣＤ３８−ｂ−３４８）に（同様に６６．６ｎＭで６００秒間）曝露した。データを、Ｆｏｒｔｅ  Ｂｉｏ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ９．０を使用して処理した。第２の抗体によるさらなる結合が非占有エピトープ（エピトープにおいて競合なし）を示す一方で、結合なしはエピトープ遮断（エピトープにおいて競合あり）を示す。
【０１５８】
結果
組換えヒトＣＤ３８細胞外タンパク質配列（ｒｈＣＤ３８）に結合するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を、材料および方法に記載の酵母に基づく抗体提示ライブラリを使用して単離した。これらの抗体を配列決定し、特有のクローンを酵母細胞で産生した（Ｂａｒｎａｒｄ  ＧＣ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。特有の抗体配列を発現する各酵母クローンの細胞培養上清をｒｈＣＤ３８結合についてスクリーニングした。
【０１５９】
選択した抗体のＫＤ値（親和性および結合力測定結果）および交差ビニング分析を表１Ａに提供する。
【表１Ａ】
2020522280.tif 000015
【０１６０】
ＯｃｔｅｔおよびＢｉａｃｏｒｅによって測定され、かつダラツムマブと比較した抗ＣＤ３８抗体の組換え一価ヒトＣＤ３８への結合を、図７、図１２、および図１９Ａに示す。
【０１６１】
エピトープマッピングおよびアラニンスキャニングによる確認の結果を表１Ｂに示す。
【表１Ｂ】
2020522280.tif 000016
【０１６２】
ｒｈＣＤ３８への結合、配列特有性、および発現レベルに基づいて、ｍＡｂのパネルを特定した。これらの抗体を組換えカニクイザルおよびマウスＣＤ３８細胞外ドメインタンパク質配列への結合についてさらに特徴付けた。加えて、エピトープビニングを行い、特定された抗体が参照アゴニスト抗ＣＤ３８抗体ＩＢ４のエピトープと重複するエピトープに結合するかを決定した（Ａｕｓｉｅｌｌｏ  ＣＭ  ｅｔ  ａｌ．，２０００、Ｆｅｒｒｅｒｏ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。クローンを、１０−８Ｍ〜１０−１０Ｍから成る一価ｒｈＣＤ３８および／または組換えカニクイザルＣＤ３８細胞外タンパク質配列に対するＩｇＧ結合値を提示するものとして特徴付けた。加えて、各抗体を、参照アゴニスト抗ＣＤ３８抗体ＩＢ４または市販のダラツムマブ、ＤＡＲＡ）と競合するものまたは競合しないものとして特徴付けた。選択した抗体は、表１に示されるように異なる交差ビニング群に属する。抗体クローンをカニクイザル汎Ｔ細胞（図３Ａ）およびヒトＰＢＭＣ（図３Ｂ）への結合レベルでも評価し、それを確認した。
【０１６３】
最後に、凝集および非特異的相互作用を起こす傾向がある抗体配列を排除するために、抗体を、多重特異性試薬（ＰＳＲ）アッセイおよび親和性捕捉自己相互作用ナノ粒子分光法（ＡＣ−ＳＩＮＳ）（初期段階の抗体開発のためのハイスループットスクリーニングを可能にするアプローチ）でスクリーニングした（Ｌｉｕ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。抗体のいずれも後者のアッセイで陽性とスコア化されず、したがって、パネルから排除しなかった。
【０１６４】
上述のように配列決定および特徴付けられた選択したヒットのうち、クローンａＣＤ３８−ｂ−３４８が、ヒトＣＤ３８結合においてＩＢ４ともダラツムマブとも競合しない新規の相補性決定領域（ＣＤＲ、図２Ａ）を提示する抗体である。実際には、Ｐｅｐｓｃａｎ技術を使用して行ったエピトープマッピング研究により、ａＣＤ３８−ｂ−３４８が、ダラツムマブについて公開されたもの（アミノ酸２３３〜２４６および２６７〜２８０を含む２つのベータ鎖、図２Ｂ）または他の抗ヒトＣＤ３８抗体について報告されたもの（ＷＯ２０１５／１２３６８７の表２を参照のこと）とははっきりと異なる領域内のヒトＣＤ３８に結合し、かつ１０−９Ｍの範囲のＫｄ値でヒトおよびカニクイザルＣＤ３８細胞外タンパク質配列に結合することが示されるであろう。アラニンスキャニングにより、ａＣＤ３８−ｂ−３４８のエピトープ領域、具体的には、ヒトＣＤ３８のそのアミノ酸残基７８が結合に関与することが確認される。抗体競合アッセイは、ダラツムマブが同じエピトープにおいてａＣＤ３８−ｂ−３４８と競合しない（図２３）ことを示した。
【０１６５】
したがって、ａＣＤ３８−ｂ−３４８配列（図２Ａ）は、ＣＤ３８に特異的に結合する抗体を特定し、その用語が本明細書で使用されるようにＣＤ３８調節抗体薬剤を定義する機能的特徴に関連したそれらのアゴニスト活性を、細胞ベースのアッセイまたは動物モデルによって機能的に評価することができる。ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ＬＣＤＲ３の分析は、抗体特性のうちのいくつかに影響を及ぼし得る製造中の修飾の潜在的標的を表すＤＧ（Ａｓｐ−Ｇｌｙ）モチーフの存在を示す。この範囲で、いずれか一方または両方の残基が置換され、全てのかかる突然変異体のうち、限られた数の突然変異体（例えば、Ｄａｕｄｉ細胞の表面に発現したもの）のみがヒトＣＤ３８への結合を維持したａＣＤ３８−ｂ−３４８ベースの抗体ライブラリ（実施例２を参照のこと）。このように、対応するａＣＤ３８−ｂ−３４８ベースの抗体バリアントを、ＣＤ３８調節抗体薬剤の全ての特性を維持するか、または単にＣＤ３８結合特性を有するものとして試験することができる。これらのバリアントのさらなる検証を、実施例に開示されるアッセイを使用して続行することができる。
【０１６６】
実施例２：ＣＤ３８調節抗体薬剤を検証するための細胞ベースのモデル
材料および方法
インビトロＴ細胞活性化アッセイ：予め凍結させた初代ヒト汎Ｔ細胞（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をｅＦｌｕｏｒ４５０蛍光色素（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で標識し、０．１５×１０６細胞／ウェルを、抗ＣＤ３抗体（０．１μｇ／ｍＬのコーティング濃度、クローンＯＫＴ３、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を事前にコーティングし、かつ抗ＣＤ３８調節抗体を、１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、および１０，０００Ｕ／ｍＬのＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ（Ｓｉｇｍａ）を含有するＲＰＭＩ１６４０（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中１０、５、および２．５μｇ／ｍＬの濃度でコーティングした９６ウェルプレート内で７２時間インキュベートした。Ｔ細胞増殖の読み出しをフローサイトメーターで取得し、生存率色素（Ｚｏｍｂｉｅ  ＮＩＲ，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で標識した死細胞を排除し、蛍光色素標識抗体（ＣＤ８−ＦＩＴＣクローンＨＩＴ８ａ  ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＤ２５−ＰＥクローンＭ−Ａ２５１  Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ＣＤ４−ＢＶ５１０クローンＲＰＡ−Ｔ４  ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、ＣＤ３８−ＰＥ−Ｃｙ７クローンＨＢ＿７、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＤ１３７−ＡＰＣクローン４Ｂ４−１  ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）での染色によって表面マーカーを区別した。上清におけるサイトカイン分析を、製造業者の指示に従ってＭｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＭＳＤプラットホームを使用して行い、ＩＦＮｇ、ＩＬ２、ＩＬ１０、ＴＮＦａ、およびＧＭ−ＣＳＦの発現を決定した（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘアッセイキット、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、図中のアスタリスクは適合曲線範囲を超える値を示す）。
【０１６７】
ＮＦＡＴシグナル伝達アッセイによるインビトロＴ細胞活性化：ルシフェラーゼレポーター系（ＢＰＳ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で安定してトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞を、ＣＤ３８（または対照ＩｇＧ）に対する異なる濃度のｍＡｂ（０．２、１、５、１０、２０、４０ｕｇ／ｍＬ）を有するＰＢＳ（ＧＩＢＣＯ）で、４℃で２０分間インキュベートし、その後、細胞をペレット化し、ＰＢＳ上清を除去し、細胞を、４０ｕｇ／ｍＬのＦ（Ａｂ’）２−断片架橋Ａｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を補充し、かつ１ｕｇ／ｍＬの可溶性ＣＤ３  ｍＡｂの存在下の冷成長培地（ＲＰＭＩ（ＡＴＣＣ）＋１０％ＦＢＳ（ＳＩＧＭＡ））中に再懸濁させた。架橋抗体を添加した１０分後、細胞を３７℃でのインキュベーションに移した。３７℃でのインキュベーションの開始から６〜２４時間後、細胞を溶解させ、ルシフェラーゼ活性を、製造業者の指示（ＢＰＳ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ一段階ルシフェラーゼアッセイキット）に従って、特定のルシフェラーゼ基質の加水分解からの平均発光放出によって測定した。ＮＦＡＴシグナル伝達を相対発光単位（ＲＬＵ）で測定する。
【０１６８】
インビトロＮＫ細胞活性化アッセイ。ヒトＰＢＭＣをＣｅｌｌ  Ｔｒａｃｅ  ｖｉｏｌｅｔ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｄｙｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で標識し、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の存在下で、１００：１の比率で（培養培地ＩＭＤＭ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１０％ヒト血清熱不活性化、Ｓｉｇｍａ、１０，０００Ｕ／ｍＬ  Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ、Ｓｉｇｍａ）５日間培養した。抗ＣＤ３８抗体を添加するか、または対照細胞を未処理のままにした。蛍光色素の希釈によって定量化した増殖の読み出しをＦＡＣＳ分析によって行った。細胞を蛍光色素コンジュゲート抗体で標識し、ＮＫ細胞を、死細胞（Ｚｏｍｂｉｅ  ＮＩＲ色素、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を除外し、ＣＤ４５＋造血細胞（ＣＤ４５−ＰＥ−Ｃｙ７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）上でゲーティングし、さらにＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞（ＣＤ５６−ＢＶ７１１クローンＨＩ３０  Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ＣＤ３−ＢＶ５１０クローンＯＫＴ３  Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）上でゲーティングすることによってゲーティングした。
【０１６９】
インビトロＡＤＣＰアッセイ。抗ヒトＣＤ３８抗体の特徴付けのために、インビトロ分化Ｔｒｅｇを標的細胞として使用し、かつ単球由来のマクロファージをエフェクター細胞として使用して、抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）を行った。異なるエフェクターと標的との比率を評価した。標的細胞を１×１０４細胞／ウェルで添加し、エフェクター細胞を（１×１０４、２．５×１０４、５×１０４、または１×１０５細胞／ウェル）で添加した。抗ヒトＣＤ３８抗体を３つの濃度（１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、および５０μｇ／ｍＬ）で評価した。以下のプロトコルを使用してアッセイを行った：ＰＢＭＣをＦｉｃｏｌｌ勾配遠心分離によって白血球錐体から単離した。ＣＤ１４＋細胞を、ＣＤ１４  Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ（ＣＤＫ００６、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して単離した。単球を、１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、および１０，０００Ｕ／ｍＬ  Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ（Ｓｉｇｍａ）を含有するＲＰＭＩ１６４０（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中５０ｎｇ／ｍＬのＭ−ＣＳＦの存在下で７日間培養し、４日後にＭ−ＣＳＦを含有する新鮮培地を添加した。制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を、ヒトＴｒｅｇ細胞分化キット（１３０−０５０−２０１、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して単離した。これらの細胞を３７℃および５％ＣＯ２の加湿インキュベータ内で５日間インキュベートした。７日目に、マクロファージおよびｅＦｌｕｏｒ４５０標識（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）Ｔｒｅｇを上述の比率で、ＣＤ３８または対照抗体の存在下で一晩共培養した。Ｔｒｅｇ食作用を、Ｔｒｅｇ標識（ｅＦｌｕｏｒ４５０色素）に対して陽性のＣＤ１４＋細胞（ＣＤ１４−ＰＥ−Ｃｙ７クローンＭｆＰ９で染色、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上でのフローサイトメトリーゲーティングによって決定した。
【０１７０】
インビトロＡＤＣＰレポーターアッセイ：ＰｒｏｍｅｇａバイオアッセイコアキットＧ９９０１を使用した。標的ウェルの５０００Ｒａｊｉ細胞／ウェルを、９６ウェル白色ポリスチレンプレート（Ｃｏｓｔａｒカタログ番号３９１７）を使用して２５ｕＬ／ウェルの培地中にプレーティングした。試験抗体を別個のプレート内で連続希釈（１：３）した。２５ｕＬの連続希釈した抗体を細胞に添加した。エフェクター細胞の５００００細胞／ウェルをプレートに添加した（２５ｕＬ／ウェル）。プレートを３７℃で一晩２０時間インキュベートした。翌日、プレートをインキュベータから取り出し、室温で２０分間保持した。６０ｕＬのＢｉｏ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ基質を各ウェルに添加し、３０分間インキュベートした。発光を、ＧｌｏＭａｘ  Ｍｕｌｔｉ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して読み取った。細胞培養培地：ＲＰＭＩ＋４％低ＩｇＧ血清。
【０１７１】
インビトロＡＤＣＣアッセイ：抗ヒトＣＤ３８抗体の特徴付けのために、Ｄａｕｄｉ（ＣＤ３８陽性）ヒト細胞株を標的細胞として使用し、かつヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞源として使用して、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性アッセイ（ＡＤＣＣアッセイ）を行った。エフェクターと標的との比率を、１０μｇ／ｍＬの最高濃度、続いて、三連での対数希釈系列（７点）で、３７℃および５％ＣＯ２で４時間評価した試験物質（対照として抗ＣＤ３８一次抗体またはリツキシマブ）を用いて５０：１または２５：１で評価した。ＰＢＭＣをＩＬ−２で刺激し、ＩＬ−２が共培養アッセイ中に存在した。インビトロ培養前に、標的細胞株を１μＭのカルセインＡＭで標識し、２．５ｍＭのプロベネシドとインキュベートした。溶解細胞が装填したカルセインを上清中に放出し、これにより蛍光測定が可能になる。カルセインＡＭ放出をＥｘｃｅｌおよびＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア分析によって分析して、１％サポニン処置値を使用して最大溶解を決定する正規化によって用量反応曲線を生成した。標的細胞溶解パーセンテージを、濃度の対数に対する正規化カルセインＡＭ放出パーセンテージをグラフ化したＸＹチャート上にプロットし、データを、ＥＣ５０が算出される非線形回帰曲線に当てはめた。
【０１７２】
インビトロＣＤＣアッセイ：ＣＤ３８発現ヒト細胞株（Ｄａｕｄｉ）に対するＣＤＣ活性を、細胞を、１０μｇ／ｍＬの最高濃度、続いて、三連での対数希釈系列（７点）（正常ヒト血清補体の最終濃度１０％）で、試験物質（対照として抗ＣＤ３８一次抗体またはリツキシマブ）で処理することによって試験した。試料を３７℃および５％ＣＯ２で３時間培養した。フローサイトメトリー分析前に、培養条件に従って、細胞を洗浄し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を含む１倍ＰＢＳ中に５μｇ／ｍＬの最終濃度で再懸濁させた。全ての細胞を試料取得中にフローサイトメトリーによって試験した。ＰＩ陽性細胞のパーセンテージを、濃度の対数に対するＰＩパーセンテージをグラフ化したＸＹチャート上にプロットし、データを、ＥＣ５０が算出される非線形回帰曲線に当てはめた。
【０１７３】
直接的細胞死アッセイ。ＣＤ３８発現ヒト細胞株（Ｄａｕｄｉ）に対する直接的プロアポトーシス活性を、細胞を、１０μｇ／ｍＬの最高濃度、続いて、三連での対数希釈系列（７点）で、対照として試験物質（抗ＣＤ３８一次抗体）またはリツキシマブで処理することによって試験した。Ｆｃγ受容体媒介性架橋活性による細胞死を、細胞を、１０μｇ／ｍＬの最高濃度、続いて、三連での対数連続希釈（７点）で、対照として試験物質（抗ＣＤ３８一次抗体またはリツキシマブ）で処理し、その後、５μｇ／ｍＬのウサギ抗ヒトＦｃγ  Ｆ（ａｂ’）２（二次抗体）で処理することによって試験した。試料を３７℃および５％ＣＯ２で２４時間培養した。培養条件に従って、細胞を洗浄し、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ結合緩衝液および７−ＡＡＤ中に再懸濁させて、細胞死をフローサイトメトリー分析によって試験した。全ての細胞を試料取得中にフローサイトメトリーによって試験した。後期アポトーシス細胞パーセンテージを、濃度の対数に対するＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ陽性細胞および７−ＡＡＤ陽性細胞パーセンテージをグラフ化したＸＹチャート上にプロットし、データを、ＥＣ５０が算出される非線形回帰曲線に当てはめた。
【０１７４】
細胞表面（シクラーゼ活性およびＮＡＤａｓｅ／ヒドロラーゼ活性）上でのＣＤ３８の酵素活性：Ｄａｕｄｉ細胞およびＪｕｒｋａｔ細胞の細胞表面上でのＣＤ３８のシクラーゼ活性およびＮＡＤａｓｅ活性の両方を、ＮＧＤ＋（Ｓｉｇｍａ）およびＥ−ＮＡＤ＋（Ｓｉｇｍａ）のそれらのそれぞれの蛍光生成物：ｃＧＤＰＲ（ＮＤＧ＋からの環状生成物）および５’−ｅＡＭＰ（Ｅ−ＮＡＤ＋の加水分解生成物）へのＣＤ３８依存性変換を監視することによって測定した。１５万個のＤａｕｄｉ細胞を７５μＬのＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）中１０μｇ／ｍＬの抗体と氷上で２０分間インキュベートし、２０分後、７５μＬの酵素反応緩衝液（または対照緩衝液）を添加し、Ｄａｕｄｉ細胞を３７℃で４５分間インキュベートし、Ｊｕｒｋａｔ細胞を３７℃で６０分間インキュベートした。酵素反応緩衝液は、２０ｍＭのＵｌｔｒａＰｕｒｅ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）（ｐＨ７．５）、ＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）、および２００μＭのＮＧＤ＋またはＥ−ＮＡＤ＋のいずれかを含んだ。３７℃でインキュベートした後、細胞を、５５０×ｇの遠心分離手段によってペレット化し、１００μＬの上清を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ＭｉｎｉＭａｘ  ３００プレートリーダー（励起波長３００および発光波長４１０）での蛍光測定のために利用した。
【０１７５】
統計。Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して曲線当てはめを行い、ＥＣ５０値および最大活性を決定した。
【０１７６】
結果
同じ実験におけるダラツムマブの結果と比較した、ＡＤＣＣおよびＣＤＣアッセイからのＥＣ５０値および溶解パーセンテージの結果を、表２、３、および４に示す。
【０１７７】
【表２】
2020522280.tif 000017
【表３】
2020522280.tif 000018
【表４】
2020522280.tif 000019
【０１７８】
実施例１で特徴付けられた他の抗体としてａＣＤ３８−ｂ−３４８候補抗体を免疫細胞に関してさらに評価した。第１の一連の実験では、ａＣＤ３８−ｂ−３４８は、ヒトＴ細胞およびカニクイザルＴ細胞への用量依存的結合を示す（図３Ａおよび図３Ｂ）。Ｔ細胞を使用して試験する場合、例えば、かかる細胞の培養のためのプレートをコーティングするためにａＣＤ３８−ｂ−３４８を使用する場合、ａＣＤ３８−ｂ−３４８がヒトＴ細胞活性化を増加させる一方で、参照抗ＣＤ３８抗体（ＤＡＲＡ）ははるかに弱いアゴニスト活性を提示する（図４Ａ）。ａＣＤ３８−ｂ−３４８を溶液中で試験する場合、この抗体は、乳癌細胞株と共培養したヒト初代ＮＫ細胞の増殖および活性化を誘導する（図４Ｂ）。ａＣＤ３８−ｂ−３４８のアゴニスト活性は、ＤＡＲＡと比較して、ａＣＤ３８−ｂ−３４８によって誘発されたヒトＴ細胞によるより強力な炎症性サイトカイン分泌によってさらに強まる（図４Ｃ）。ａＣＤ３８−ｂ−３４８のキラー活性は、ＣＤ３８発現標的細胞（図５Ａ）、例えば、制御性Ｔ細胞のマクロファージ媒介性食作用の誘導によりもたらされたように見える。この効果は、ＤＡＲＡと同等である。加えて、ａＣＤ３８−ｂ−３４８およびＤＡＲＡは、ＡＤＣＣアッセイにおいて同等の活性を示すが、後者のみがより高いＣＤＣ活性を提示する（図５Ｂ）。ａＣＤ３８−ｂ−３４８によって誘発される低下したＣＤＣ効果は、低下した注入部位反応のため、増加した安全性を有する抗ＣＤ３８抗体を提供するであろう。ＤＡＲＡおよびａＣＤ３８−ｂ−３４８は、ａＣＤ３８−ｂ−３４８の活性のみが抗体架橋によって強化されたように見えるが、ヒトＰＢＭＣによるＣＤ３８発現腫瘍細胞（Ｄａｕｄｉ）の死滅においても同等の活性を示す（図５Ｃ）。ａＣＤ３８−ｂ−３４８がレポーター細胞アッセイにおいてダラツムマブと比較して増加したＡＤＣＰを有することを示した（図８）。
【０１７９】
インビトロでの死滅活性に加えて、ａＣＤ３８−ｂ−３４８がＣＤ３８のシクラーゼ活性をわずかに低下させることを示した（図９Ａ）が、ＤＡＲＡは、Ｊｕｒｋａｔ細胞アッセイにおいてシクラーゼ活性をより強力に阻害した。ａＣＤ３８−ｂ−３４８がＣＤ３８のＮＡＤａｓｅ（ＮＡＤ＋ヒドロラーゼ）活性への効果を示さなかった一方で、ＤＡＲＡは、Ｊｕｒｋａｔ細胞アッセイにおいてその活性を増加させる（図９Ｂ）
【０１８０】
結論として、ａＣＤ３８−ｂ−３４８を、異なる実験設定において免疫細胞に対してＣＤ３８調節抗体薬剤の活性を提示する例示の抗ＣＤ３８抗体と特徴付けた。
【０１８１】
同じアッセイを、本明細書に提供されるバリアント抗体（すなわち、改変されたＤＧモチーフを有するａＣＤ３８−ａ−３４８のバリアント）に行うことができる。
【０１８２】
実施例３：動物モデルにおけるＣＤ３８調節抗体薬剤の検証
材料および方法
リンパ腫細胞ベースのモデル。Ｄａｕｄｉヒトバーキットリンパ腫細胞およびＲａｍｏｓヒトバーキットリンパ腫細胞を、１０％ウシ胎仔血清を補充した２ｍＭのＬ−グルタミン＋１ｍＭのピルビン酸ナトリウム＋４．５ｇ／Ｌのグルコース＋１０ｍＭのＨｅｐｅｓを含有するＲＰＭＩ１６４０中で培養した。健常雌ｃｂ１７  ＳＣＩＤマウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒから入手した。腫瘍を、２００μＬのＲＰＭＩ１６４０中５×１０５個のＤａｕｄｉ細胞または５×１０６個のＲａｍｏｓ細胞の動物の尾静脈への静脈内注射によって誘導した。細胞注射をγ線源（１．４４Ｇｙ／マウス、６０Ｃｏ、ＢｉｏＭｅｐ，Ｂｒｅｔｅｎｉｅｒｅｓ，Ｆｒａｎｃｅ）での全身照射の２４〜７２時間後に行った。マウスを体重によってランダムに処理群分けした（１群当たり８匹のマウス）。第１群の動物には、ビヒクルを５ｍＬ／ｋｇで週２回３週間連続して（ＴＷ×３）静脈内注射した。第２群の動物には、ＤＡＲＡを１０ｍｇ／ｋｇ／注射で週２回３週間連続して（ＴＷ×３）静脈内注射した。第３群の動物には、ａＣＤ３８−ｂ−３４８を１０ｍｇ／ｋｇ／注射で週２回３週間連続して（ＴＷ×３）静脈内注射した。マウスを最大８週間後に屠殺した。
【０１８３】
固形腫瘍モデル
雌ＣＢ．１７  ＳＣＩＤマウスの側腹部に、０％マトリゲル中１×１０７個のＲａｍｏｓ腫瘍細胞を皮下注射した（ｎ＝１０／群）。腫瘍が１００〜１３０ｍｍ３のサイズに達したときに処理を開始し、週２回３週間処理した。マウスを、１０ｍｇ／ｋｇで、ダラツムマブおよびビヒクル対照と比較して、抗体ａＣＤ３８−ｂ−３４８で静脈内処理した。腫瘍体積が２０００ｍｍ２に達したときまたは処理開始の４３日後のいずれかが先に起こったときに、マウスを屠殺した。
【０１８４】
結果
ａＣＤ３８−ｂ−３４８の治療的特性を、ヒトがんの動物モデルで、具体的には、ヒト腫瘍細胞の死滅に関するＣＤ３８調節抗体薬剤の特性をより適切に評価することができる免疫不全マウスを使用して試験することができる。ａＣＤ３８−ｂ−３４８は、ダラツムマブ（ＤＡＲＡ）よりも優れた効果である、２つの異なる型のヒトリンパ腫細胞を静脈内注射したマウスの生存率を高める顕著な効力を示す（図６）。
【０１８５】
ａＣＤ３８−ｂ−３４８は、ダラツムマブと比較して、皮下注射したＲａｍｏｓ細胞に対する強化された抗腫瘍活性を示した（図１０）。
【０１８６】
これらの特性を、動物生存率の観点のみならず、同時免疫学的効果とともに、文献に記載されるように、固形腫瘍が皮下で増殖するヒトがん株またはヒト初代がん細胞のいずれかの注射に基づくヒト腫瘍（具体的には、固体がん）の他のインビボモデルにおいて（Ｍｏｒｔｏｎ  ＪＪ  ｅｔ  ａｌ．２０１６、Ｈｏｌｚａｐｆｅｌ  ＢＭ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）、かつ腫瘍細胞および免疫細胞が単離された患者から直接単離され、かつ抗ＣＤ３８抗体に対するそれらの応答（細胞活性化、増殖、サイトカイン産生、および／または細胞死によって測定される）についてインビトロで試験された腫瘍試料の使用に基づいてエクスビボモデルにおいてさらに調査することができる。遠達効果または選択された組織もしくは生体物質における遺伝子発現の変化等のさらなる特徴を、恐らく、ａＣＤ３８−ｂ−３４８を、異なる用量で、かつ／または他の抗がん剤（キナーゼもしくは他の酵素阻害剤、抗体、放射線／化学療法、アジュバント、またはワクチン等）と組み合わせて投与することによって評価することができる。
【０１８７】
実施例４：低用量抗ＣＤ３８抗体は、非ヒト霊長類におけるＴ細胞活性化を増加させる
１日目および８日目に非ヒト霊長類（カニクイザル）を０．０３ｍｇ／ｋｇのａＣＤ３８−ｂ−３４８で静脈内処理した。末梢Ｔ細胞の頻度および活性化マーカー（ＣＤ６９、ＣＤ１３７、およびＨＬＡ−ＤＲ）を、第１の投薬前に分析し、第２の投薬の２４時間後および５日後にも分析した。Ｔ細胞は、投薬後に活性化の増加の兆候を示し、ＣＤ４  Ｔ細胞上でのＣＤ６９およびＣＤ１３７およびＣＤ８  Ｔ細胞上でのＨＬＡ−ＤＲの上方制御による増加が最も顕著であった。いずれの免疫活性化関連の有害反応は観察されなかった。結果を図１４Ａ〜図１４Ｆに示す。
【０１８８】
実施例５：ａＣＤ３８−ｂ−３４８のバリアントの生成
アスパラギン酸異性化を阻止するために、ＶＬ  ＣＤＲ３  ＤＧ配列についての潜在的な置換のライブラリを生成した。ＤＧモチーフを除去するために、２つの酵母ライブラリをａＣＤ３８−ｂ−３４８について生成した。第１のライブラリは、アスパラギン酸周辺およびグリシン周辺の両方の縮重プライマーＮＮＫＮＮＫに基づいた。このライブラリは、４００の多様性を有した。第２のライブラリは、グリシンを保存する一方でアスパラギン酸に焦点を合わせた縮重プライマーＮＮＫに基づき、２０の多様性を有した。これらのライブラリを１０ｎＭのヒトＣＤ３８単量体において単一ラウンドで選別し、ＰＳＲ陰性選別を行った。各系統から９６を配列決定し、産生し、上述のように特徴付けた。加えて、合計５つの９６ウェルプレートをＮＮＫＮＮＫライブラリから選択して、ＯｃｔｅｔでｒｈＣＤ３８への結合についてスクリーニングした。限られた数の置換が許容され、最良の親和性を示すバリアントを選択し、ＯｃｔｅｔでバリアントをｒｈＣＤ３への結合について試験した。最良の親和性を示すバリアントを、実施例２に記載のアッセイを使用して哺乳類産生およびさらなる特徴付けのために選択した。
【０１８９】
バリアントの機能的特徴付け：リンパ腫細胞ベースのモデル、Ｒａｊｉヒトバーキットリンパ腫細胞およびＲａｍｏｓヒトバーキットリンパ腫細胞を、１０％ウシ胎仔血清を補充した２ｍＭのＬ−グルタミン＋１ｍＭのピルビン酸ナトリウム＋４．５ｇ／Ｌのグルコース＋１０ｍＭのＨｅｐｅｓを含有するＲＰＭＩ１６４０中で培養した。健常雌ｃｂ１７  ＳＣＩＤマウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒから入手した。腫瘍を、２００μＬのＲＰＭＩ１６４０中５×１０５個のＲａｊｉ細胞または５×１０６個のＲａｍｏｓ細胞の動物の尾静脈への静脈内注射によって誘導した。細胞注射をγ線源（１．４４Ｇｙ／マウス、６０Ｃｏ、ＢｉｏＭｅｐ，Ｂｒｅｔｅｎｉｅｒｅｓ，Ｆｒａｎｃｅ）での全身照射の２４〜７２時間後に行った。マウスを体重によってランダムに処理群分けした（１群当たり１０匹のマウス）。第１群の動物には、ビヒクルを５ｍＬ／ｋｇで週２回３週間連続して（ＴＷ×３）静脈内注射した。第２群の動物には、ＤＡＲＡを１０ｍｇ／ｋｇ／注射で週２回３週間連続して（ＴＷ×３）静脈内注射した。第３群の動物には、ａＣＤ３８−ｂ−３４８を１０ｍｇ／ｋｇ／注射で週２回３週間連続して（ＴＷ×３）静脈内注射した。第４群の動物には、ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ２を１０ｍｇ／ｋｇ／注射で週２回３週間連続して（ＴＷ×３）静脈内注射した。マウスを図に示される時点で屠殺した。
【０１９０】
結果
バリアント抗体のＶＨ鎖およびＶＬ鎖のＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３配列を図１５に示す（ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ１の場合、配列番号４および配列番号２０、ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ２の場合、配列番号４および配列番号２１、ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ３の場合、配列番号４および配列番号２２、ａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ４の場合、配列番号４および配列番号２３）。Ｄａｕｄｉ細胞結合実験により、バリアント抗体のＣＤ３８への結合が親クローンおよびダラツムマブと同等であったことが確認された（表５ならびに図１６および図１９を参照のこと）。
【表５】
2020522280.tif 000020
【０１９１】
バリアントは、親クローンおよびダラツムマブと同等のＡＤＣＣ活性を示した（図１７）。バリアントは、ＡＤＣＣ活性について親系統よりも低いＥＣ５０（ｕｇ／ｍＬ）を有したが、最大溶解については同等であった（表６）。
【表６】
2020522280.tif 000021
【０１９２】
ペプチドマッピング試料をＤＴＴ還元およびヨードアセトアミドアルキル化によって調製し、トリプシンを使用して消化し、ＬＣ−ＵＶ−ＭＳシステムで分析した。異性化ペプチドおよび非異性化ペプチドのレベルを決定し、異性化ペプチドの％を表７に示す。
【表７】
2020522280.tif 000022
【０１９３】
ａＣＤ３８−ｂ−３４８およびそのバリアントａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ２の治療的特性を、ヒトがんの動物モデルで、具体的には、ヒト腫瘍細胞の死滅に関するＣＤ３８調節抗体薬剤の特性をより適切に評価することができる免疫不全マウスを使用して試験した。ａＣＤ３８−ｂ−３４８バリアントａＣＤ３８−ｂ−３４８−ｍ２は、両モデル（ＲａｊｉおよびＲａｍｏｓ）において２つの異なる型のヒトリンパ腫細胞を静脈内注射したマウスの生存率を高める顕著な効力を示す（図１８）。
【０１９４】
実施例６：ＮＫ細胞におけるａＣＤ３８−ｂ−３４８の分析
ＮＫ細胞の脱顆粒：
健常志願者のバフィーコートから単離したＮＫ細胞を、２×１０６細胞／ｍＬで、１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で２日間、５００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２で刺激するか、または新たに単離したものをＩＬ−２で事前に刺激することなく使用した。機能アッセイについて、１〜１．５×１０６個のＮＫ細胞をＤＭＥＭ完全培地中に再懸濁させ、１００ｕＬ／ウェルの細胞懸濁液を、９６ウェルプレートの２０ウェルに播種した。ＣＤ１０７ａ抗体を含有する２０ｕＬの培地（１４ｕＬの抗体を１４０ｕＬの培地中で予混合したもの）を、染色していない／刺激していない対照条件を除いて全てのウェルに添加した。試験抗体ａＣＤ３８−ｂ−３４８、ダラツムマブ、およびヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照を１０ｕｇ／ｍＬで添加した。陽性対照について、ＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍＬ）およびイオノマイシン（１ｍｇ／ｍＬ）を含有する５０ｕＬの培地を陽性対照ウェルに添加し、加えて、陰性対照条件の場合は培地のみを添加した。細胞を３７℃および５％ＣＯ２で４５分間インキュベートした。１０ｕＬのＧｏｌｇｉ  Ｓｔｏｐを各ウェルに添加し、細胞をさらに４時間インキュベートした。読み出しのために、細胞を収集し、ＦＡＣＳ管に移し、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、抗ＣＤ５６−ＢＶ−５７０および近赤外死細胞マーカーで標識した。２０分間インキュベートした後、細胞を洗浄し、新鮮な緩衝液中に再懸濁させ、フローサイトメーター上で実行した。
【０１９５】
ＮＫ細胞のＩＦＮγ産生：
健常志願者のバフィーコートから単離したＮＫ細胞を、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地中で４８時間、５００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２で刺激した。細胞を収集し、ＰＢＳで２回洗浄し、ＤＭＥＭ完全培地中に１×１０６細胞／ｍＬで再懸濁させた。１００ｕＬ／ウェルの細胞懸濁液を９６ウェルプレートに播種した。２０ｕＬの培地（培地のみ（陰性対照）を含有するか、またはａＣＤ３８−ｂ−３４８、ダラツムマブ、もしくはアイソタイプ対照を含有するかのいずれか）を全ての試料に添加して、各試験ウェル１０  ｍｇ／ｍＬの最終濃度にした。陽性対照は、ＰＭＡ／イオノマイシンを含有した。同じ条件をＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍細胞（１００，０００細胞／ウェル）とＮＫ細胞（上述のもの）との共培養物を含有するウェルに設定した。ＧｏｌｇｉＰｌｕｇおよびＧｏｌｇｉＳｔｏｐを全てのウェル（１０ｕＬ）に添加した。細胞を３７℃および５％ＣＯ２で６時間インキュベートした。読み出しのために、細胞を収集し、洗浄し、ＦＡＣＳ管に移し、抗ＣＤ５６−ＦＩＴＣおよびＡｑｕａ死細胞マーカーで２０分間染色した。ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した後、細胞を固定緩衝液で２０分間固定し、透過処理し、抗ＩＦＮγ−ＡＰＣで３０分間染色した。細胞を洗浄し、フローサイトメーターでの読み出しのために再懸濁させた。
【０１９６】
ＮＫ細胞の増殖：
健常志願者のバフィーコートから単離したＮＫ細胞を、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地中で４８時間、５００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２で刺激した。ＮＫ細胞を収集し、洗浄し、ＣＦＳＥ増殖色素で標識した。８×１０６個の細胞をＦａｌｃｏｎ管内の１ｍＬのＰＢＳ中に再懸濁させた。１１０ｕＬのＰＢＳを水平に保持した管の側面に１液滴として添加し、０．２ｕＬのＣＦＳＥをＰＢＳ液滴中に添加した。管をボルテックスして細胞懸濁液とＣＳＦＥ溶液を混合し、３７℃および５％ＣＯ２で２０分間インキュベートした。５ｍＬのＤＭＥＭ培地を添加し、細胞をさらに５分間インキュベートし、遠心沈殿させ、洗浄し、１×１０６細胞／ｍＬで完全培地中に再懸濁させた。１００ｕＬ／ウェルの細胞懸濁液を９６ウェルプレートに播種した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を８０ｕＬ／ウェルの培地中５０：１の比率で添加した。ａＣＤ３８−ｂ−３４８、ダラツムマブ、またはＩｇＧ１アイソタイプ対照を含有する２０ｕＬの培地を添加して、０．４、２、または１０ｕｇ／ｍＬの最終濃度にした。細胞を６日間インキュベートし、増殖を、ＮＫ細胞集団における増殖色素ＣＦＳＥの希釈を観察するフローサイトメトリーによって評価した。
【０１９７】
結果
可溶性ａＣＤ３８−ｂ−３４８またはダラツムマブ（１０ｕｇ／ｍＬ）は、活性化されていないまたはＩＬ２で予め活性化されたヒトＮＫ細胞の脱顆粒を増加させる（図２０）。可溶性ａＣＤ３８−ｂ−３４８またはダラツムマブ（１０ｕｇ／ｍＬ）は、腫瘍標的（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞）の存在下または不在下でＮＫ細胞のＩＦＮγ産生を増加させる（図２１）。可溶性ａＣＤ３８−ｂ−３４８は、対照と比較して、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍細胞の存在下でヒトＮＫ細胞の増殖を増加させるが、ダラツムマブは増加させない（図２２）。
【０１９８】
結果は、可溶性ａＣＤ３８−ｂ−３４８抗体が、脱顆粒、ＩＦＮγ産生、および増殖によって定義されるインビトロでの初代ヒトＮＫ細胞の強力な活性化を誘導することを示す。ＮＫ細胞のさらなる刺激はこれらの効果に必要とされない。ダラツムマブは、同様のＮＫ細胞の脱顆粒およびＩＦＮγ産生を誘導するが、ＮＫ細胞の増殖は誘導しない。
【０１９９】
実施例７：突然変異体ＣＤ３８への抗体結合
材料および方法：ヒトＣＤ３８の２つの突然変異体バージョンを構築した。第１のバージョンでは、２０２位でＤをＧに突然変異させ（Ｄ２０２Ｇ）、第２のバージョンでは、２７４位でＳをＦに突然変異させた（Ｓ２７４Ｆ）。
【０２００】
突然変異したＣＤ３８タンパク質の各々へのａＣＤ３８−ｂ３４８の結合を評価し、ダラツムマブと比較した。
【０２０１】
結果
【表８】
2020522280.tif 000023
【０２０２】
表８に提供される結果は、ａＣＤ３８−ｂ３４８の結合が、ヒトＣＤ３８への突然変異Ｄ２０２Ｇまたは突然変異Ｓ２７４Ｆの導入によって影響されなかったことを示した。これを、抗体結合がヒトＣＤ３８への突然変異Ｓ２７４Ｆの導入によって影響されたが、ヒトＣＤ３８への突然変異Ｄ２０２Ｇの導入によって影響されなかったダラツムマブと比較する。これらの結果は、ａＣＤ３８−ｂ−３４８がダラツムマブとは異なるエピトープに結合することを確認する。
【０２０３】
本出願に含まれる配列の要約を以下に提供する。
【表９】
2020522280.tif 000024
2020522280.tif 000025
【０２０４】
等価物および範囲
当業者であれば、本発明が、実施例または本明細書に含まれるある特定の実施形態の他の記述ではなく、添付の特許請求の範囲によって定義されることを理解するであろう。
【０２０５】
同様に、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という単数形は、文脈が別途明確に示さない限り、複数の指示対象を含む。
【０２０６】
別途上記で定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様または同等の任意の方法および材料も、本発明の実施または試験で使用され得る。一般に、本明細書に記載の細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、遺伝学、ならびにタンパク質および核酸化学に関連して使用される命名法、およびそれらの技法は、当技術分野で周知であり、一般に使用されているものであるか、製造業者の仕様書に従うものである。
【０２０７】
本明細書で言及される全ての刊行物は、それらの刊行物が引用されることに関連して方法および／または材料を開示および説明するために参照により本明細書に組み込まれる。
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図１９−３】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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