(57)【要約】  本発明は、マイクロＲＮＡ１９ａおよび１９ｂの阻害剤、ならびに骨量減少、特に骨粗鬆症および骨形成不全症（ＯＩ）に関連する状態または疾患を治療または予防するための阻害剤の使用に関する。阻害剤は、単独で、または副甲状腺ホルモンまたはその組換え断片と併用投与された場合に、骨同化作用を誘発するのにも有用である。本発明はさらに、マイクロＲＮＡ１９ａおよび１９ｂの阻害剤、ならびに筋機能低下、特に筋変性および筋萎縮に関連する状態または疾患を治療または予防するための阻害剤の使用に関する。阻害剤は、筋機能の安定化および／または強化にも有用である。さらに、マイクロＲＮＡ１９ａおよび１９ｂの阻害剤は、癌関連の骨破壊または骨転移の治療または予防に使用できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨量減少または筋機能低下に関連する疾患または病的状態を治療または予防、あるいは癌関連の骨破壊を治療または予防する方法に使用されるための、マイクロＲＮＡ１９ａおよび／またはマイクロＲＮＡ１９ｂの阻害剤。
【請求項２】
骨量減少に関連する該疾患が骨粗鬆症または骨形成不全症（ＯＩ）である、請求項１に記載の方法で使用するためのマイクロＲＮＡ１９ａおよび／またはマイクロＲＮＡ１９ｂの阻害剤。
【請求項３】
前記方法が副甲状腺ホルモンまたはその断片の投与も含む、請求項１または２に記載の方法で使用するためのマイクロＲＮＡ１９ａおよび／またはマイクロＲＮＡ１９ｂの阻害剤。
【請求項４】
筋機能低下に関連する前記疾患が、筋ジストロフィー、筋萎縮、サルコペニア、または癌誘発性悪液質等の悪液質である、請求項１に記載の方法で使用するためのマイクロＲＮＡ１９ａおよび／またはマイクロＲＮＡ１９ｂの阻害剤。
【請求項５】
前記癌関連の骨破壊が骨転移によって引き起こされる、請求項１に記載の方法で使用するためのマイクロＲＮＡ１９ａおよび／またはマイクロＲＮＡ１９ｂの阻害剤。
【請求項６】
前記阻害剤が、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸、あるいは核酸アナログである、請求項１〜５のいずれかに記載の方法で使用するためのマイクロＲＮＡ１９ａおよび／またはマイクロＲＮＡ１９ｂの阻害剤。
【請求項７】
前記阻害剤が静脈内、皮下、経皮、または経粘膜投与により投与される、請求項１〜６のいずれかに記載の方法で使用するためのマイクロＲＮＡ１９ａおよび／またはマイクロＲＮＡ１９ｂの阻害剤。
【請求項８】
前記阻害剤が、マイクロＲＮＡ１９ａおよび／またはマイクロＲＮＡ１９ｂに結合する、あるいはマイクロＲＮＡ１９ａおよび／またはマイクロＲＮＡ１９ｂの発現を低減するＤＮＡまたはＲＮＡ配列を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法で使用するためのマイクロＲＮＡ１９ａおよび／またはマイクロＲＮＡ１９ｂの阻害剤。
【請求項９】
前記阻害剤が、
（ａ）配列番号１または配列番号２の配列、または
（ｂ）配列番号１または配列番号２の配列の相補鎖、または
（ｃ）それらに対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、マイクロＲＮＡ１９ａおよび／またはマイクロＲＮＡ１９ｂにハイブリダイズすることができる、（ａ）または（ｂ）の配列のいずれかの変異体
を含むＤＮＡである、請求項８に記載の方法で使用するためのマイクロＲＮＡ１９ａおよび／またはマイクロＲＮＡ１９ｂの阻害剤。
【請求項１０】
（ａ）マイクロＲＮＡ１９ａおよび／またはマイクロＲＮＡ１９ｂの阻害剤、および（ｂ）の薬学的に許容される担体を含む、骨量減少に関連する疾患または病的状態、あるいは筋機能低下に関連する疾患または病的状態を治療する方法で使用するため医薬組成物。
【請求項１１】
前記阻害剤が核酸または核酸アナログである、請求項１０に記載の方法で使用するための医薬組成物。
【請求項１２】
前記阻害剤がＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１０〜１１のいずれかに記載の方法で使用するための医薬組成物。
【請求項１３】
前記阻害剤が注入または注射により投与される、請求項１０〜１２のいずれかに記載の方法で使用するための医薬組成物。
【請求項１４】
前記阻害剤が、マイクロＲＮＡ１９ａおよび／またはマイクロＲＮＡ１９ｂに結合する、あるいはマイクロＲＮＡ１９ａおよび／またはマイクロＲＮＡ１９ｂの発現を阻害または低減するＤＮＡまたはＲＮＡ配列を含む、請求項１０〜１３のいずれかに記載の方法で使用するための医薬組成物。
【請求項１５】
前記阻害剤が、
（ａ）配列番号１または配列番号２の配列、または
（ｂ）配列番号１または配列番号２の配列の相補鎖、または
（ｃ）それらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、マイクロＲＮＡ１９ａおよび／またはマイクロＲＮＡ１９ｂにハイブリダイズすることができる、（ａ）または（ｂ）の配列のいずれかの変異体
を含むＤＮＡである、請求項１０〜１４のいずれかに記載の方法で使用するための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロＲＮＡ１９ａおよび１９ｂの阻害剤、ならびに骨量減少、特に骨粗鬆症および骨形成不全症（ＯＩ）に関連する状態または疾患を治療または予防するための阻害剤の使用に関する。阻害剤は、単独で、または副甲状腺ホルモンまたはその組換え断片と併用投与された場合に、骨同化作用を誘発するのにも有用である。本発明はさらに、マイクロＲＮＡ１９ａおよび１９ｂの阻害剤、ならびに筋機能低下、特に筋変性および筋萎縮に関連する状態または疾患を治療または予防するための阻害剤の使用に関する。阻害剤は、筋機能の安定化および／または強化にも有用である。さらに、マイクロＲＮＡ１９ａおよび１９ｂの阻害剤は、癌関連の骨破壊または骨転移の治療または予防に使用できる。
【背景技術】
【０００２】
骨粗鬆症は、女性および男性の筋骨格系の最も一般的な疾患であり、頻繁に脆弱性骨折を引き起こす。これらの骨折は、多くの場合、特に高齢者の罹患率と死亡率を増加させるため、大きな医学的および社会経済的負担となる。骨は、骨吸収性破骨細胞と骨形成骨芽細胞によって生涯にわたって絶えず分解および再構築される非常に動的な組織であるが、これらの過程は、骨量を一定に保つために緊密に結合され、またバランスが取られている。加齢に伴い、骨吸収が増加しながらも骨形成が減少するため、骨量が減少し、最終的に骨粗鬆症になる。
【０００３】
ビスホスホネートやＲＡＮＫＬ中和抗体（Ｄｅｎｏｓｕｍａｂ（商標））などの確立された抗吸収薬は、破骨細胞の活性を阻害し、それにより骨量のさらなる損失を防ぐことにより、骨粗鬆症の治療アプローチを提供する。対照的に、副甲状腺ホルモンの組み換え断片（文献ではＰＴＨ  １−３４またはテリパラチド（Ｆｏｒｔｅｏ（商標）／Ｆｏｒｓｔｅｏ（商標））と称する）の投与は、現在利用可能な唯一の骨同化療法である。ただし、ＰＴＨ療法では、ＰＴＨ１−３４断片を毎日注射する必要があり、安全上の懸念から、療法は２４か月の全期間に制限されている。したがって、骨量減少を防止し、および／または骨量および骨密度の増加をもたらすさらなる治療法が必要である。
【０００４】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、タンパク質をコードする遺伝子の発現をブロックできる非コードＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、哺乳類および非哺乳類動物を含む多くの生物のゲノムにコードされていることがわかっている。ｍｉＲＮＡは、その塩基相補性により、標的遺伝子のｍＲＮＡの３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）に結合できる。結合する配列と関与するタンパク質の相補性に応じて、ｍｉＲＮＡはｍＲＮＡの翻訳を阻害するか、ｍＲＮＡの分解を誘導する。ｍｉＲＮＡと同族ｍＲＮＡとの間の部分的な塩基相補性は通常、ｍＲＮＡ翻訳の阻害をもたらすが、完全な塩基相補性はｍＲＮＡの分解を誘発する。
【０００５】
ｍｉＲＮＡは通常１８〜２４ヌクレオチド長で、前駆体分子の段階的な処理によって生成される。ｍｉＲＮＡは、エンコーディング遺伝子またはイントロンのいずれかからポリメラーゼＩＩまたはＩＩＩによって転写される。遺伝子の転写から生じる一次転写物は、一次マイクロＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）と呼ばれる。それは、５００〜３０００ヌクレオチド長を備え、５’末端に７−メチルグアノシンキャップを、３’末端にポリＡテー
ルを保持する。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは、細胞核内でＲＮＡｓｅ  ＩＩＩ酵素ＤｒｏｓｈａとｄｓＲＮＡ結合タンパク質ＤＧＣＲ８によって処理され、長さ７０〜８０ヌクレオチドの前駆体マイクロＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）に至る。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは特徴的なヘアピン構造を形成し、核の細孔を介して細胞質に輸送され、そこでＲＮＡｓｅ  ＩＩＩ酵素ダイサーによって１７〜２４ヌクレオチドの長さのｄｓ−ｍｉＲＮＡに処理される。ダイサーは、ｄｓ−ｍｉＲＮＡに特異的に結合するタンパク質と相互作用して、これらの二重鎖を巻き戻す。結果として生じるｓｓ−ｍｉＲＮＡは、それぞれの標的ｍＲＮＡの発現を妨げる可能性がある。
【０００６】
いくつかのｍｉＲＮＡは、多数の生理学的および発達過程の調節に関与していることが報告されている。最近、ｍｉＲＮＡは、Ｃ型肝炎［１］、慢性リンパ性白血病［２］、結腸直腸癌［３］、肥満［４］、または統合失調症［５］などの疾患を治療するための潜在的な治療標的として大きな注目を集めてきた。
【０００７】
本発明は、ｍｉＲＮＡ−１９ａおよびｍｉＲＮＡ−１９ｂが骨形成の調節に関与し、これらのｍｉＲＮＡの阻害が骨量減少を予防または低減する非常に効率的な方法であるという洞察に基づいている。したがって、これらのｍｉＲＮＡの阻害は、骨量の減少に関連する骨粗鬆症などの疾患の治療に有用である。ｍｉＲＮＡ−１９ａおよびｍｉＲＮＡ−１９ｂの阻害剤は同化作用を発揮し、単独で、または互いに組み合わせて使用できる。好ましい実施形態では、骨同化効果を高めるために、ｍｉＲＮＡ−１９ａおよび／またはｍｉＲＮＡ−１９ｂの１つまたは複数の阻害剤を、副甲状腺ホルモン、またはＰＴＨ１−３４などのその断片と併用する。本発明はさらに、ｍｉＲＮＡ−１９ａおよびｍｉＲＮＡ−１９ｂが筋肉再生の調節、特に筋肉量、筋力および／またはパフォーマンスの低下の防止に関与することを示す。以下の例に示すように、これらのｍｉＲＮＡの阻害は、様々な条件下での筋機能の損失を防ぐのに効果的である。したがって、これらのｍｉＲＮＡの阻害は、筋ジストロフィー、筋萎縮、サルコペニア、または癌誘発性悪液質などの悪液質のような疾患の治療にも有用である。本発明はさらに、ｍｉＲＮＡ−１９ａおよびｍｉＲＮＡ−１９ｂ阻害剤が、癌誘発骨破壊および骨転移、特に骨への乳癌転移の予防または治療に使用できることを示している。
【発明の概要】
【０００８】
一態様では、本発明は、骨量減少に関連する疾患を治療する方法で使用するためのマイクロＲＮＡ１９ａおよび／またはマイクロＲＮＡ１９ｂの阻害剤を提供する。病理学的な程度の骨量減少に関連する疾患は、例えば、骨代謝が高い状態での異常な骨吸収および／または骨形成を特徴とする疾患であり得る。本明細書において、マイクロＲＮＡ１９ａおよび／またはマイクロＲＮＡ１９ｂの阻害は、骨量減少の病的レベルが生じる疾患および状態を治療するためのマイクロＲＮＡ１９ａおよび／またはマイクロＲＮＡ１９ｂ阻害剤の有用性を実証する強力な骨同化作用をもたらすことを以下に示す。そのような疾患および状態には、特に骨粗鬆症および骨形成不全症（ＯＩ）が含まれる。したがって、好ましい態様において、マイクロＲＮＡ１９ａおよび／またはマイクロＲＮＡ１９ｂ阻害剤によって治療される疾患および状態は骨粗鬆症である。本明細書で使用される場合、「骨粗鬆症」という用語には、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、および閉経後骨粗鬆症などのあらゆる形態の骨粗鬆症が含まれる。性ステロイドの欠乏により誘発される骨粗鬆症、およびグルココルチコイドにより誘発される骨粗鬆症も含まれる。阻害剤は、骨同化作用を必要とする状態の治療にも有用である。例えば、骨折を患う患者に阻害剤を一時的に使用すると、骨量の誘導により自然な治癒の過程を促進することができる。好ましい態様において、マイクロＲＮＡ１９ａおよび／またはマイクロＲＮＡ１９ｂの阻害剤は、単独で、すなわち、他のいずれかの活性成分なしで使用される。別の好ましい態様において、マイクロＲＮＡ１９ａおよび／またはマイクロＲＮＡ１９ｂの阻害剤は、副甲状腺ホルモンまたはその断片、例えばＰＴＨ１−３４と組み合わせて使用される。マイクロＲＮＡ１９ａおよび／またはマイクロＲＮＡ１９ｂの阻害剤は、ＰＴＨ１−３４によって付与される骨同化作用を効果的に増強する。
【０００９】
別の態様では、本発明は、筋肉量または機能の損失に関連する疾患を治療する方法で使用するためのマイクロＲＮＡ１９ａおよび／またはマイクロＲＮＡ１９ｂの阻害剤を提供する。本発明者らは、マイクロＲＮＡ１９ａおよび／またはマイクロＲＮＡ１９ｂの発現を阻害すると、筋機能が著しく増加または回復することを見出した。したがって、マイクロＲＮＡ１９ａおよび／またはマイクロＲＮＡ１９ｂの阻害剤は、同様に、筋ジストロフィーまたは筋萎縮のような疾患の治療における治療的使用に適している。好ましい態様では、マイクロＲＮＡ１９ａおよび／またはマイクロＲＮＡ１９ｂ阻害剤は、筋ジストロフィー、サルコペニア、癌誘発性悪液質などの悪液質、または筋萎縮の治療に使用される。別の好ましい態様では、マイクロＲＮＡ１９ａおよび／またはマイクロＲＮＡ１９ｂ阻害剤は、性ステロイド欠乏誘発性または糖質コルチコイド誘発性骨粗鬆症などの骨粗鬆症に関連する筋機能の損失を治療するために使用される。別の好ましい態様において、マイクロＲＮＡ１９ａおよび／またはマイクロＲＮＡ１９ｂ阻害剤は、乳癌の骨転移に関連する筋機能の損失を治療するために使用される。さらに別の好ましい態様では、マイクロＲＮＡ１９ａおよび／またはマイクロＲＮＡ１９ｂ阻害剤は、骨形成不全症（ＯＩ）に関連する筋機能の損失を治療するために使用される。さらに別の好ましい態様において、マイクロＲＮＡ１９ａおよび／またはマイクロＲＮＡ１９ｂ阻害剤は、筋ジストロフィー、特にジストロフィン遺伝子の突然変異による遺伝性筋ジストロフィー、例えばデュシェンヌ型またはベッカー型に関連する筋機能の損失を治療するために使用される。
【００１０】
別の態様では、本発明は、癌関連の骨破壊を予防または治療する方法で使用するためのマイクロＲＮＡ１９ａおよび／またはマイクロＲＮＡ１９ｂの阻害剤を提供する。本明細書において、マイクロＲＮＡ１９ａおよび／またはマイクロＲＮＡ１９ｂの阻害剤は、骨破壊性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１転移性乳癌細胞の増殖を効果的に阻害することが見出された。したがって、マイクロＲＮＡ１９ａおよび／またはマイクロＲＮＡ１９ｂの阻害剤は、癌関連の骨破壊の治療的処置または予防、乳癌から生じる骨転移などの骨転移の治療または予防に、使用することができる。
【００１１】
特定の好ましい実施形態では、本発明は、骨形成不全症（ＯＩ）を治療する方法で使用するためのマイクロＲＮＡ１９ａおよび／またはマイクロＲＮＡ１９ｂの阻害剤を提供する。脆性骨疾患としても知られる骨形成不全症は、Ｉ型コラーゲンをコードする遺伝子の１つまたは複数の変異によって引き起こされる、骨に影響するまれな遺伝性疾患である。ＯＩを引き起こすいくつかの変異およびサブタイプが同定されている。ＯＩを患う者は、些細な外傷があると、または外傷がなくても骨折することがある。ＯＩは、非常に重度なものから軽度のものまである。最重度の型のＯＩを患う個人は、出生時に死亡することがある。生存している重度のＯＩの者たちは、腕や脚が曲がっていたり、身長が非常に低かったり、歩くことができなかったりする場合がある。最も軽度の形態のＯＩの者たちは、骨をたまにしか折らず、通常の身長で、通常の寿命であることがある。骨折はどの骨でも発生する可能性があるが、最も一般的なのは腕と脚である。重度の型のＯＩの現在の標準治療には、ビスホスホネートの使用と、骨を強化するために骨にロッドを挿入する手術が含まれる。ビスホスホネートによる吸収抑制治療は、破骨細胞依存性の骨吸収の減少を対象としている。吸収を減らすことにより、より多い骨量が得られる。骨の質は不良なままであるが、骨量が多いと骨折のリスクが大幅に減少する。さらに、骨形成剤は骨量をさらに増加させるのに効果的であることが示されており、現在臨床試験で検討されている。本明細書では、マイクロＲＮＡ１９ａおよび／またはマイクロＲＮＡ１９ｂの阻害剤が様々な条件下で骨形成および骨量を改善することが示されているため、それらはＯＩの治療に適している。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
マイクロＲＮＡ１９ａおよび／または１９ｂは、ｍｉＲＮＡ１７、１８、１９ａ、２０ａ、１９ｂ−１、および１９２を含むポリシストロン性クラスターｍｉＲ−１７〜９２から発現することが知られている。これらのマイクロＲＮＡのいくつかは、すでにヒトの癌に関連付けられている。
【００１３】
本発明では、骨量減少または筋機能低下に関連する疾患を治療するためにマイクロＲＮＡ１９ａおよび／または１９ｂの阻害剤を使用することを提案する。本発明はこれに関して限定されないが、疾患または状態に苦しむ対象はヒト対象であることが好ましい。好ましくは、対象は少なくとも３０歳、好ましくは少なくとも４０歳、少なくとも４５歳、少なくとも５０歳、少なくとも５５歳、少なくとも６０歳、または少なくとも６５歳である。
【００１４】
原則として、マイクロＲＮＡ１９ａおよび／またはマイクロＲＮＡ１９ｂまたはそれらのｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを妨害する任意の種類の分子を使用して、これらのマイクロＲＮＡまたはそれらの対応するｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの発現または機能を低減またはブロックできる。本明細書で使用される阻害剤は、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子などの核酸分子、または以下で説明するように修飾されたそれらの誘導体であることが好ましい。阻害剤は、同種のｍｉＲＮＡ、すなわちマイクロＲＮＡ１９ａおよび／またはマイクロＲＮＡ１９ｂとハイブリダイズして、マイクロＲＮＡが標的のｍＲＮＡへ結合するのを防ぐ二重鎖を形成できる配列を含む、または該配列からなるＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドであることが、特に好ましい。マイクロＲＮＡ１９ａおよび／またはマイクロＲＮＡ１９ｂまたはそれらのｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの阻害のための他の技術は当業者に知られており、マイクロＲＮＡスポンジ、レンチベクターベースの抗マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＺｉｐ）およびタフデコイ阻害剤が含まれる。
【００１５】
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドモノマーのオリゴマーまたはポリマーを指す。本発明によれば、オリゴヌクレオチドは任意の長さであり得るが、好ましくは８〜５０ヌクレオチド、より好ましくは１０〜４０ヌクレオチド、１２〜３０ヌクレオチド、１５〜２５ヌクレオチド、最も好ましくは１８〜２４ヌクレオチドの長さを有する。例えば、オリゴヌクレオチドは、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０ヌクレオチドの長さを有し得る。いくつかの適用では、オリゴヌクレオチドは、５０個を超えるヌクレオチド、例えば６０、７０、８０、９０または１００個のヌクレオチドを含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、一本鎖、二本鎖、または部分的に二本鎖の核酸分子であり得る。オリゴヌクレオチドを生成する方法は広く知られており、化学合成またはＰＣＲベースの方法を含む。
【００１６】
オリゴヌクレオチドは、好ましくは、ホスホジエステルブリッジにより結合されたヌクレオチドモノマーからなる。しかし、糖リン酸骨格が機能的に類似した構造、例えばペプチド骨格、またはホスホルアミド、チオリン酸、メチルホスホン酸またはジチオリン酸骨格で置換されたオリゴマーまたはポリマーを使用することもできる。場合によっては、これらの修飾により、治療対象への投与後のヌクレアーゼによる酵素分解に対するオリゴヌクレオチドの耐性が増加する。
【００１７】
さらに、１つ以上の修飾された糖残基を有するオリゴヌクレオチドも本発明に含まれる。例えば、１つまたは複数のヒドロキシル基をハロゲンまたは脂肪族基で置き換えるか、エーテル、アミンまたは類似の構造で官能化することができる。好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、メチル（ＯＭｅ）またはメトキシエチル（ＭＯＥ）基を付加することにより２’ヒドロキシルが修飾された１つ以上の糖を含む。これらの糖修飾は、酵素分解に対するより高い安定性と耐性をもたらす。
【００１８】
本発明のオリゴヌクレオチドはまた、天然に存在する塩基であるアデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシルとともに、またはそれらの代わりに、修飾された塩基を含んでもよい。前述の修飾された塩基は、例えば、５−メチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチルアデニン、６−メチルグアニン、２−チオウラシル、２−チオチミン、２−チオシトシン、５−ハロウラシル、５−ハロシトシン、５−プロピニル−ウラシル、５−プロピニルシトシン、６−アゾウラシル、６−アゾシトシン、６−アゾチミン、５−ウラシル、４−チオウラシル、８−チオアルキルアデニン、８−ヒドロキシルアデニン、８−チオールアデニン（８−ｔｈｉｏｌａｄｅｎｉｎｅ）、チオアルキルグアニン、８−ヒドロキシルグアニン、８−チオールグアニン（８−ｔｈｉｏｌｇｕａｎｉｎｅ）、７−メチルグアニン、７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、３−デアザグアニンおよび／または３−デアザアデニンを含む。
【００１９】
上記とは別に、本発明のオリゴヌクレオチドはまた、その３’および／または５’末端
に１つまたは複数の修飾を含んでもよい。例えば、末端の一方または両方を保護基に結合して、オリゴヌクレオチドがヌクレアーゼによる酵素分解を受けにくくなるようにすることができる。
【００２０】
好ましくは、マイクロＲＮＡ１９ａおよび／またはマイクロＲＮＡ１９ｂの阻害剤は、マイクロＲＮＡ１９ａおよび／またはマイクロＲＮＡ１９ｂに実質的に相補的である。阻害剤の抗マイクロＲＮＡ１９ａ（５’−ＴＧＣＡＴＡＧＡＴＴＴＧＣＡＣ−３’）および
抗マイクロＲＮＡ１９ｂ（５’−ＴＧＣＡＴＧＧＡＴＴＴＧＣＡＣ−３’）の配列は、そ
れぞれ配列番号１および配列番号２に記載されている。マイクロＲＮＡ１９ａおよびマイクロＲＮＡ１９ｂの配列は、それぞれ配列番号３および配列番号４に示されている。オリゴヌクレオチドは、少なくとも１０、１２、１４、１６、１８または２０ヌクレオチドの長さに対して少なくとも７０％の配列同一性を含む場合、これらの配列のいずれかに実質的に相補的である。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、２０ヌクレオチドの長さに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する。好ましくは、配列同一性は少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％である。オリゴヌクレオチドは、少なくとも１０、１２、１４、１６、１８または２０ヌクレオチドの長さに対して完全に相補的であることが特に好ましい。一実施形態では、相補性の領域は、５未満の不一致、例えば４、３、２、または１つの不一致を有する。
【００２１】
特に好ましい態様において、マイクロＲＮＡ１９ａおよび／またはマイクロＲＮＡの阻害剤は、
（ａ）配列番号１または配列番号２の配列、または
（ｂ）配列番号１または配列番号２の配列の相補鎖、または
（ｃ）それらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、マイクロＲＮＡ１９ａおよび／またはマイクロＲＮＡ１９ｂにハイブリダイズすることができる、（ａ）または（ｂ）の配列のいずれかの変異体
を含むＤＮＡである。
【００２２】
上に開示された阻害剤は、好ましくは医薬組成物として投与される。したがって、別の態様では、本発明は、（ａ）核酸または核酸アナログなどの、マイクロＲＮＡ１９ａおよび／またはマイクロＲＮＡ１９ｂの阻害剤、および（ｂ）薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。上述のように、阻害剤は好ましくはＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。一態様では、医薬組成物は、好ましくは、骨量減少に関連する疾患を治療する方法で使用するためのものである。別の態様では、医薬組成物は、好ましくは、筋機能の損失に関連する疾患を治療する方法で使用するためのものである。
【００２３】
核酸ベースの阻害剤を含む医薬組成物の調製は、薬剤学の分野に従事する者に周知である。典型的には、そのような組成物は、液状の溶液または懸濁液として注射用に調製される。薬学的に活性な阻害剤は、ヒトの患者で使用される場合、阻害剤と適合する賦形剤と混合することができる。本発明の医薬組成物は、通常、活性成分として溶解または分散されたマイクロＲＮＡ阻害剤分子とともに生理学的に許容される担体を含む。
【００２４】
薬学的に許容される担体は、例えば、水、生理食塩水、リンゲル液、またはデキストロース溶液を含む。マイクロＲＮＡ阻害剤を含む組成物にさらに適した担体は、標準的な教科書、例えば“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃ
ｅｓ”，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ（１９９１）に記載されてい
る。担体に加えて、本発明の医薬組成物は、本発明のマイクロＲＮＡ阻害剤の阻害活性を妨害しないという条件で、任意の濃度の湿潤剤、緩衝剤、安定剤、染料、防腐剤などを含み得る。
【００２５】
治療を必要とする部位にマイクロＲＮＡ阻害剤を提供するには、様々な投与経路が実行可能である。医薬組成物は、例えば非経口投与用に製剤化されてもよい。非経口投与には、静脈内、皮内、動脈内、皮下、局所、経粘膜、経皮または直腸投与が含まれる。特に好ましい実施形態によれば、医薬組成物は、注射または注入（infusion）用に製剤化される。
【００２６】
注射に適した医薬組成物には、通常、無菌の水溶液または分散液、および無菌の注射液または分散液の即時調製用の無菌の粉末が含まれる。さらに、組成物は、製造および保管の通常の条件下で安定しているべきである。無菌性を維持するために、医薬組成物は通常、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどの防腐剤を含み、製品の微生物の増殖を抑制する。静脈内または動脈内投与の場合、適切な担体には、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれ得る。また、担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液状ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒体であってもよい。注射可能な組成物の長期の吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンを組成物に含めることにより、達成することができる。無菌の注射液は、適切な溶媒に必要量のマイクロＲＮＡ阻害剤を上記の成分の１つ以上と混合し、その後無菌でろ過することで調製できる。同様に、分散物は、マイクロＲＮＡ阻害剤を、分散媒体および必要に応じてこれまでに概説した他の成分を含む無菌のビヒクルに組み込むことにより調製される。無菌の溶液はまた、真空乾燥または凍結乾燥などの当技術分野で知られている方法によって無菌の粉末の形態でマイクロＲＮＡ阻害剤を提供し、注射用の最終的な溶液を得るために無菌の液体で粉末を再構成することによって得ることもできる。あるいは、本発明による医薬組成物はまた、連続注入によって投与することもできる。
【００２７】
医薬組成物の投与は、経粘膜または経皮送達によって達成されてもよい。経粘膜または経皮投与の場合、本発明のマイクロＲＮＡ阻害剤を含む医薬組成物は、皮膚または粘膜関門を通過するのに適した浸透剤を含み得る。そのような浸透剤は当技術分野で知られており、例えば、経粘膜投与の場合、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与は、鼻スプレーまたは坐剤の使用により達成することができる。経皮投与の場合、活性化合物は、当技術分野で一般的に知られているように、軟膏、膏薬、ゲル、またはクリームに製剤化される。経皮組成物は、例えばパッチまたは極微針により投与することができる。好ましくは、化合物は、ココアバターおよび直腸送達用の他のグリセリドなどの従来の坐薬基剤を用いて、坐薬の形態で調製される。
【００２８】
一実施形態では、マイクロＲＮＡ阻害剤は、インプラントやマイクロカプセル化送達システムを含む放出制御製剤など、阻害剤を身体からの排出から保護する担体とともに調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生分解性の生体適合性ポリマーを使用できる。放出制御製剤を調製する方法は、当技術分野で周知である。さらに、徐放性組成物を調製してもよい。徐放性調製物の適切な例には、固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、このマトリックスは、造形品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド、Ｌ−グルタミン酸とエチル−Ｌ−グルタミン酸の共重合体、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸共重合体などが含まれる。
【００２９】
さらなる態様において、本発明は、治療有効量のマイクロＲＮＡ１９ａおよび／またはマイクロＲＮＡ１９ｂの阻害剤、またはそのような阻害剤を含む上で定義した医薬組成物を投与することを含む、骨粗鬆症やＯＩなどの骨量減少の病的レベルに関連する疾患または状態を治療する方法を提供する。さらに別の態様では、本発明は、治療有効量のマイクロＲＮＡ１９ａおよび／またはマイクロＲＮＡ１９ｂの阻害剤、またはそのような阻害剤を含む上記で定義した医薬組成物を投与することを含む、筋ジストロフィー、サルコペニア、癌誘発性悪液質などの悪液質、または筋萎縮などの筋機能の損失に関連する疾患または状態を治療する方法を提供する。
【００３０】
マイクロＲＮＡ阻害剤の治療有効量は、典型的には、投与時に、マイクロＲＮＡ１９ａおよび／またはマイクロＲＮＡ１９ｂ、またはそれらのそれぞれのｐｒｉ−もしくはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの発現を効果的にブロックまたは低減するのに十分な量である。原則として、マイクロＲＮＡ１９ａおよび／またはマイクロＲＮＡ１９ｂの発現を妨げる任意のタイプの分子を、本発明の目的に使用することができる。
【００３１】
患者に投与されるべき阻害剤の量は、患者の年齢および体重、ならびに治療すべき症状の性質および重症度などのいくつかの要因に依存するということは、当業者に理解される。所望の治療効果を発揮する阻害剤の量は、日常的な実験の使用により、各患者の症例で判定され得る。典型的には、体重あたりのマイクロＲＮＡ阻害剤の投与量は、患者の体重１ｋｇあたり約０．１ｍｇから患者の体重１ｋｇあたり約５０ｍｇ、より好ましくは患者の体重１ｋｇあたり約０．５ｍｇから患者の体重１ｋｇあたり約２０ｍｇ、さらにより好ましくは、患者の体重１ｋｇあたり１ｍｇから患者の体重１ｋｇあたり約１０ｍｇまで可変である。投与計画は、阻害剤の１日１回以上の投与を含み得る。
【００３２】
例えば、治療は、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、少なくとも８週間、少なくとも９週間、少なくとも１０週間、少なくとも１１週間、または少なくとも１２週間続いてよい。一部の適応症では、治療は少なくとも４ヶ月、少なくとも５ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも７ヶ月、少なくとも８ヶ月、少なくとも９ヶ月、少なくとも１０ヶ月、少なくとも１１ヶ月、少なくとも１２か月、または少なくとも１８か月続いてよい。治療期間は、治療される症状の性質および重症度、投与経路などのいくつかの要因を考慮して、医師が決定する。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、ｍｉＲ−１９ａ／ｂの阻害によるｉｎ  ｖｉｖｏの骨量の増加を示している。（ａ）：マウスをＰＴＨ、またはスクレロスチンに対する抗体各々で治療することにより減少したｍｉＲＮＡのベン図。（ｂ）：ＰＴＨまたはＳｃｌ−Ａｂで治療したマウスの骨におけるｍｉＲ−１９ａおよびｍｉＲ−１９ｂの発現量。（ｃ）：ＰＴＨまたはＷｎｔ３ａでｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激された頭蓋冠骨芽細胞におけるｍｉＲ−１９ａおよびｍｉＲ−１９ｂの発現量。（ｄ）：アルカリホスファターゼ活性の染色により評価した、スクランブルコントロールｍｉＲＮＡ阻害剤（ｓｃｒ）、ｍｉＲ−１９ａまたはｍｉＲ−１９ｂの阻害剤（抗ｍｉＲ）、または抗ｍｉＲ−１９ａと抗ｍｉＲ−１９ｂの併用（１９ａ／ｂ）をトランスフェクトした頭蓋冠骨芽細胞の分化。（ｅ）：脛骨近位部のフォンコッサ（Ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ）染色、および骨形成の蛍光二重標識（インセット）。（ｆ）：脛骨近位部の組織形態計測分析。（ｇ）：（ｅ）〜（ｆ）と同じ動物の第４腰椎のフォンコッサ染色。（ｈ）：（ｅ）〜（ｆ）と同じ動物の第４腰椎のＢＶ／ＴＶ。平均値±標準誤差。*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１、対ビヒクル、＃ｐ＜０．０５、＃＃＃ｐ＜０．００１、対スクランブル。（ｉ）〜（ｋ）：治療終了後の（ｅ）と同じ動物の大腿骨遠位部（ｉ、ｊ）および中軸大腿骨断面（ｋ）のマイクロコンピューター断層撮影（μＣＴ）スキャン。（ｌ）：（ｅ）と同じ動物の大腿骨遠位部のμＣＴ分析の定量化。平均値±標準誤差。*ｐ＜０．０５、対スクランブル。略語：ＢＶ／ＴＶ、骨体積／組織体積；ＭＳ／ＢＳ、骨石灰化面／骨面；ＢＦＲ／ＢＳ、骨形成速度／骨面；ＭＡＲ、骨石灰化速度；ＯＳ／ＢＳ、類骨面／骨面；Ｏｂ．Ｓ／ＢＳ、骨芽細胞面／骨面；Ｎ．Ｏｂ／ＢＳ、骨芽細胞数／骨面；ＥＳ／ＢＳ、侵食面／骨面；Ｏｃ．Ｓ／ＢＳ、破骨細胞面／骨面；Ｎ．Ｏｃ／ＢＳ、破骨細胞数／骨面；Ｔｂ．Ｔｈ、骨梁幅；Ｔｂ．Ｓｐ、骨梁間隔；Ｔｂ．Ｎ、骨梁数；ＳＭＩ、構造モデリングインデックス。
【図２】図２は、ｍｉＲ−１９ａおよびｍｉＲ−１９ｂの阻害により、ｉＰＴＨ治療の骨同化作用が強化され、骨粗鬆症のマウスモデルで骨量が回復することを示している。（ａ）：フォンコッサ染色、および（ｂ）：遺伝子型Ｄｍｐ１−Ｃｒｅ-の１２週齢の雄マウスの脛骨近位部の組織形態計測分析；４週間にわたる断続的なＰＴＨおよび／または抗ｍｉＲ−１９ａ／ｂの週１回の注射による治療後のＴｇｉｆ１fl/fl。略語については、図１の凡例を参照されたい。スケールバーは１ｍＭを示す。（ｃ）：抗ｍｉＲ−１９ａ／ｂによる毎週の治療開始の２１日前に、卵巣切除（ＯＶＸ）により骨粗鬆症が誘発された雌マウスの脛骨の相対的なＢＶ／ＴＶの時間経過。（ｄ）〜（ｆ）、治療終了後の、ｃと同じ動物の大腿骨遠位部（ｄ、ｅ）および中軸大腿骨断面（ｆ）のμＣＴスキャン。（ｇ）〜（ｉ）、卵巣切除７０日後の大腿骨（ｇ）、脛骨（ｈ）、および第４腰椎（ｉ）の骨梁のＢＶ／ＴＶのμＣＴ分析。（ｊ）ｍｉＲ−１９ａ／ｂ作用のモデル。平均値±ＳＥＭ。*ｐ＜０．０５、***ｐ＜０．００１、対ｓｃｒ、ビヒクル；＃＃ｐ＜０．０１、対抗ｍｉＲ−１９ａ／ｂ、ビヒクル；§§§ｐ＜０．００１対ｓｃｒ、ｉＰＴＨ。*ｐ＜０．０５、対偽；ｓｃｒ＃ｐ＜０．０５、＃＃ｐ＜０．０１対ＯＶＸ；ｓｃｒ。
【図３】図３は、マウスの卵巣切除誘発型の筋機能の損失に対する抗ｍｉＲ−１９ａ／ｂの効果を示している。（ａ）：ＦＡＭ標識スクランブルまたは抗ｍｉＲ−１９ａ／ｂオリゴヌクレオチドを注射したＣ５６Ｂｌ／６野生型雄マウスの前脛骨筋の組織学的分析。矢印は核中心を示す。（ｂ）：スクランブル（Ｓｃｒ）または抗ｍｉＲ−１９ａ／ｂオリゴヌクレオチドの投与後の卵巣切除または偽手術の雌Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスにおける長指伸筋のｅｘ  ｖｉｖｏの収縮性。（ｃ）：Ｓｃｒまたは抗ｍｉＲ−１９ａ／ｂオリゴヌクレオチドの投与後の卵巣切除または偽手術の雌Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスにおける長指伸筋のｅｘ  ｖｉｖｏの収縮性。（ｄ）：Ｓｃｒまたは抗ｍｉＲ−１９ａ／ｂオリゴヌクレオチドの投与後の卵巣切除または偽手術した雌Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスにおける長指伸筋のｅｘ  ｖｉｖｏの疲労。（ｅ）：Ｓｃｒまたは抗ｍｉＲ−１９ａ／ｂオリゴヌクレオチドの投与後の卵巣切除または偽手術の雌Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスにおけるヒラメ筋のｅｘ  ｖｉｖｏの疲労。*ｐ＜０．０５、対ＯＶＸ；ｓｃｒ。
【図４】図４は、骨転移性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖に対する抗ｍｉＲ−１９ａ／ｂの効果を示している。（ａ）：Ｓｃｒまたは抗ｍｉＲ−１９ａ／ｂオリゴヌクレオチドをトランスフェクトしたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の増殖。（ｂ）：ＳｃｒまたはｍｉＲ−１９ａ／ｂオリゴヌクレオチドをトランスフェクトしたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の増殖。**ｐ＜０．０１、対ｓｃｒ。
【図５】図５は、ｍｉＲ−１９ａとｍｉＲ−１９ｂの阻害により、乳癌の骨転移が減少し、乳癌誘発型の骨量と筋機能の損失が回復することを示している。（ａ）スクランブル（Ｓｃｒ、正方形）または抗ｍｉＲ−１９ａ／ｂオリゴヌクレオチド（三角形）で４週間治療した腫瘍保有マウスの生物発光シグナルの定量。（ｂ）非腫瘍保有マウス（コントロール）およびＳｃｒまたは抗ｍｉＲ−１９ａ／ｂオリゴヌクレオチドによる治療後に骨転移のあるマウスの脛骨近位部のμＣＴ分析。（ｃ）非腫瘍保有マウス（コントロール）およびＳｃｒまたは抗ｍｉＲ−１９ａ／ｂオリゴヌクレオチドの投与後の腫瘍保有マウスにおけるヒラメ筋のｅｘ  ｖｉｖｏ収縮性。（ｄ）非腫瘍保有マウス（コントロール）およびＳｃｒまたは抗ｍｉＲ−１９ａ／ｂオリゴヌクレオチドを投与した腫瘍保有マウスにおけるヒラメ筋のｅｘ  ｖｉｖｏの疲労。平均値±標準誤差。*ｐ＜０．０５、対非腫瘍保有マウス。
【図６】図６は、マウスのグルココルチコイド誘発型の骨量と筋機能の損失に対する抗ｍｉＲ−１９ａ／ｂの効果を示している。（ａ）プラセボまたはグルココルチコイド（プレドニゾロン）治療時のマウスの脂肪量、およびデュアルエネルギーＸ線吸収法（ＤＸＡ）で測定したスクランブル（Ｓｃｒ）または抗ｍｉＲ−１９ａ／ｂオリゴヌクレオチドの送達。（ｂ）ＤＸＡにより測定された体重。（ｃ）〜（ｅ）プラセボまたはプレドニゾロン治療時のマウスの骨密度のＤＸＡ分析、および全身（ｃ）、大腿骨（ｄ）および脊椎（ｅ）でのＳｃｒまたは抗ｍｉＲ−１９ａ／ｂオリゴヌクレオチドの送達。（ｆ）〜（ｈ）プラセボまたはプレドニゾロンおよびＳｃｒまたは抗ｍｉＲ−１９ａ／ｂオリゴヌクレオチドで治療したマウスの腓腹筋（ｆ）、大腿四頭筋（ｇ）および前脛骨筋（ｈ）の筋肉の湿重量。（ｉ）プラセボまたはプレドニゾロンおよびＳｃｒまたは抗ｍｉＲ−１９ａ／ｂオリゴヌクレオチドによる２週間の治療後に、垂直前肢握力検査（ｖｅｒｔｉｃａｌ  ｆｏｒｅｌｉｍｂ  ｇｒｉｐ  ｓｔｒｅｎｇｔｈ  ｔｅｓｔ）を使用して判定されたｉｎ  ｖｉｖｏの筋力。（ｊ）プラセボまたはプレドニゾロンおよびＳｃｒまたは抗ｍｉＲ−１９ａ／ｂオリゴヌクレオチドで治療したマウスでのｉｎ  ｖｉｖｏ筋機能検査（足底屈トルク（ｐｌａｎｔａｒｆｌｅｘｉｏｎ  ｔｏｒｑｕｅ））。平均値±標準誤差。*ｐ＜０．０５、対対応するプラセボ治療マウス、＃Ｐ＜０．０５、対プレドニゾロンおよびｓｃｒ治療マウス。
【実施例】
【００３４】
実施例１：ｍｉＲＮＡ発現のｉｎ  ｖｉｖｏ分析
骨同化刺激に応答して調節されるｍｉＲＮＡを特定するために、８週齢のマウスにヒト副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ１−３４）の組換え断片またはスクレロスチンに対する抗体（Ｓｃｌ−Ａｂ）を注射した。具体的には、野生型雄マウスにビヒクル、１００μｇ／ｋｇのＰＴＨ１−３４（Ｂａｃｈｅｍ）、または１００μｇ／ｋｇのＳｃｌ−Ａｂを注射した。４時間後、製造業者が提供した指示に従って、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してマウスの骨からスモールＲＮＡを含む全ＲＮＡを単離した。発現分析のために、ＰｒｏｔｏＳｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ合成キット（ＮＥＢｉｏＬａｂｓ）を使用して、１μｇの全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＢｉｏＲａｄ）を使用して、ＣＦＸ９６検出システム（ＢｉｏＲａｄ）で定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を実行した。ＴＡＴＡ結合タンパク質（Ｔｂｐ）ｍＲＮＡの正規化の後、比較ＣＴ（ΔΔＣＴ）法を使用して、各標的遺伝子の相対的発現レベルと誘導倍率を計算した。Ｔｒｉｚｏｌを用いて、様々なマウスの組織からスモールＲＮＡを分離した。ＱｕａｎｔｉｍｉＲ−ｋｉｔ（ＳＢＩ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、製造業者のガイドラインに従ってｃＤＮＡ合成のために、ｐｏｌｙＡテールをスモールＲＮＡに追加した。相対的なｍｉＲＮＡの発現は、ユニバーサルリバースプライマーと目的の各ｍｉＲＮＡ向けに設計された特定のフォワードプライマーを使用して、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ検出（ＢｉｏＲａｄ）により測定した。Ｕ６発現量を内部コントロールとして使用し、相対的なｍｉＲＮＡの発現量を、ΔΔＣＴ法を使用して計算した。
【００３５】
結果：ＰＴＨまたはＳｃｌ−Ａｂ治療によるマウスの試みで、それぞれ骨における３５または１２９のｍｉＲＮＡの発現量が減少した。２２のｍｉＲＮＡが両方の治療でダウンレギュレートされていることが見出された（図１ａ）。共通してダウンレギュレートされたｍｉＲＮＡの中で、ｍｉＲ−１９ａおよびｍｉＲ−１９ｂが同定された。骨におけるｍｉＲ−１９ａ／ｂの発現の直接的な定量化により、ＰＴＨおよびＳｃｌ−Ａｂによる負の調節が確認された（図１ｂ）。
【００３６】
実施例２：ｍｉＲＮＡ発現のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析
ＰＴＨ１−３４およびＷｎｔ３ａによる頭蓋冠骨芽細胞の刺激の効果を検証するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを実施した。頭蓋冠骨芽細胞を２〜３日齢のマウスから単離し、１０％ＦＢＳおよびＰ／Ｓを含むα−ＭＥＭで増殖させた。骨芽細胞をビヒクル、ＰＴＨ１−３４（１００μＭ）またはＷｎｔ３ａ（１００ｎｇ／ｍｌ）で４時間刺激し、ｍｉＲＮＥａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、細胞からスモールＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡ合成後、ｑＲＴ−ＰＣＲを使用して、ｍｉＲ−１９ａおよびｍｉＲ−１９ｂの発現量を分析した。Ｕ６発現を内部コントロールとして使用し、相対的なｍｉＲＮＡの発現量を、ΔΔＣＴ法を使用して計算した。
【００３７】
結果：ＰＴＨ１−３４とＷｎｔ３ａの両方の刺激により、頭蓋冠骨芽細胞におけるｍｉＲ−１９ａ／ｂの発現の減少が誘導された（図１ｃ）。
【００３８】
実施例３：骨芽細胞分化のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析
頭蓋冠骨芽細胞の分化がｍｉＲ−１９ａ／ｂの発現の干渉によって影響され得るかどうかを検証するために、細胞に内因性ｍｉＲ−１９ａ（抗ｍｉＲ−１９ａ：６−ＦＡＭ／ＴＧＣＡＴＡＧＡＴＴＴＧＣＡＣ）およびｍｉＲ−１９ｂ（抗ｍｉＲ−１９ｂ：６−ＦＡＭ／ＴＧＣＡＴＧＧＡＴＴＴＧＣＡＣ）に結合して阻害するように設計されたオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした。これらの合成オリゴヌクレオチドは、機能研究での最適な使用に加えて、最適化された薬物動態および薬力学的特性と最小限の毒性のために、ホスホロチオエート骨格結合を含んでいる。さらに、５’フルオレセインＦＡＭラベルによ
り、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのトランスフェクション効率とｉｎ  ｖｉｖｏでの組織送達のモニタリングが可能になっている。Ｎｅｏｎエレクトロポレーションシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、細胞に抗ｍｉＲ−１９ａ／ｂ（５０ｎＭ）をトランスフェクトした。骨芽細胞の分化は、α−ＭＥＭに０．２ｍＭのＬ−アスコルビン酸と１０ｍＭのβ−グリセロホスフェート（両方ともＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）を補充することによって誘導した。骨芽細胞の分化は、細胞を４％の中性の緩衝ホルムアルデヒド溶液で固定した後、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）染色によって判定した。ＡＬＰ染色では、細胞をＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液中のナフトールＡＳ−ＭＸ／Ｆａｓｔ  Ｂｌｕｅ（両方ともＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で、室温にて１５分間インキュベートした。
【００３９】
結果：頭蓋冠骨芽細胞の分化が、ｍｉＲ−１９ａおよびｍｉＲ−１９ｂに対する阻害剤をトランスフェクションすることにより相乗的に増大されることが分かった（図１ｄ）。
【００４０】
実施例４：抗ｍｉＲ−１９ａ／ｂで治療したマウスの骨分析
ｍｉＲ−１９ａおよびｍｉＲ−１９ｂに対する阻害剤の併用（抗ｍｉＲ−１９ａ／ｂ）による治療が、ｉｎ  ｖｉｖｏで骨同化作用を発揮し得るかどうかを検証するために、８週齢のマウスを２８日間、毎週抗ｍｉＲ−１９ａ／ｂの静脈内投与（ｉ．ｖ．）の注射およびそれに続く骨量の測定により治療した。屠殺の７日前と２日前に、カルセイン（４０ｍｇ／ｋｇ）とデモサイクリン（２０ｍｇ／ｋｇ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）をそれぞれマウスに注射した。脛骨および第４腰椎（Ｌ４）椎体を収集し、３．７％ＰＢＳ緩衝ホルムアルデヒドで固定した。組織形態計測分析のために、脛骨とＬ４をメタクリル酸メチルとトルイジンブルーに包埋した。フォンコッサ染色および酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）染色を、４μｍの矢状切片を使用して実施した。ＯｓｔｅｏＭｅａｓｕｒｅシステム（ＯｓｔｅｏＭｅｔｒｉｃｓ）を使用して、標準化されたプロトコル（ＡＳＢＭＲ標準）［６］に従って、骨組織形態計測の定量的測定を実施した。マイクロコンピューター断層撮影（μＣＴ）が、長骨および椎体の骨の特性の３次元分析に使用された。マウスの第４腰椎（Ｌ４）椎体を、１０μｍの固定等方性ボクセルサイズ（ＸμＡ４００ｍｓの統合時間で７０ピークｋＶ、Ｖｉｖａ８０  ｍｉｃｒｏ−ＣＴ、Ｓｃａｎｃｏ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＡＧ）の高解像度マイクロコンピューター断層撮影を使用して分析した。この閾値は、群ごとに４つのサンプルから得た１０個の単一断層スライスを手動で評価し、石灰化している組織を単離しその形態を維持する一方で非石灰化組織を除外することによって検証した。すべての分析は、３Ｄ距離技術（Ｓｃａｎｃｏ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＡＧ）を使用して、デジタルで抽出された骨組織で行った。
【００４１】
結果：抗ｍｉＲ−１９ａ／ｂによる治療により、脛骨近位部の骨梁骨量が増加した。組織形態計測分析により、抗ｍｉＲ−１９ａ／ｂの治療は骨芽細胞および破骨細胞のパラメーターを増強することにより骨リモデリングを活性化し、骨形成を促進し、骨量の正味の増加をもたらしたことが明らかになった（図１ｅおよび図１ｆ）。抗ｍｉＲ−１９ａ／ｂの治療の骨同化作用は、Ｌ４椎体（図１ｇおよび図１ｈ）、および大腿骨遠位部でマイクロコンピューター断層撮影（μＣＴ）分析を使用して確認された（図１ｉ〜図１ｌ）。
【００４２】
実施例５：ｍｉＲ−１９ａ／ｂ阻害剤と断続的ＰＴＨ（１−３４）による同時治療
ＰＴＨと抗ｍｉＲ−１９ａ／ｂの両方が骨量を増加させるため、同時治療が評価された。ヒト副甲状腺ホルモンの組換え断片（ＰＴＨ１−３４；体重の１００μｇ／ｋｇ、Ｂｉｏｃｈｅｍ）またはビヒクルを、８週齢のオスのマウスに３週間、週５回腹腔内投与した。抗ｍｉＲ−１９ａ／ｂまたはｓｃｒコントロールに、同時治療として週に１回投与した。
【００４３】
結果：抗ｍｉＲ−１９ａ／ｂは、雄のマウスの脛骨における、ＰＴＨを介した骨量の増加を増強した（図２ａおよび図２ｂ）。
【００４４】
実施例６：骨粗鬆症モデルにおけるｍｉＲ−１９ａ／ｂ阻害剤
骨量の減少は骨粗鬆症の特徴であるため、抗ｍｉＲ−１９ａ／ｂ投与による骨量の増加が雌の骨粗鬆症の治療にも有用であり得るかどうかを検証した。そのため、８週齢の雌マウスに卵巣切除をし、性ステロイドを奪い、脛骨における骨梁の骨量が著しく減少するに至った。臨床的な状況を模倣するために、卵巣切除の２１日後に骨粗鬆症が完全に確立された後に、抗ｍｉＲ−１９ａ／ｂまたはスクランブルコントロールの毎週の注射による抗ｍｉＲ−１９ａ／ｂの治療を開始した。
【００４５】
結果：この治療法は、最初の治療の１４日後にさらなる骨量減少を防いでおり、この骨粗鬆症モデルの骨量減少を緩和した。治療終了後の大腿骨遠位部、脛骨近位部、およびＬ４椎体の骨梁骨量の定量化により、抗ｍｉＲ−１９ａ／ｂの治療には骨粗鬆症の骨量減少に対する保護効果があることが確認された。
【００４６】
実施例７：筋肉の組織学的分析
卵巣切除誘発型の筋機能の損失に対する抗ｍｉＲ−１９ａ／ｂの効果を分析した。ＦＡＭ標識スクランブルまたは抗ｍｉＲ−１９ａ／ｂオリゴヌクレオチドを８週齢のＣ５６Ｂｌ／６野生型雄マウスに、１週に１回（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）、４週間注射して、組織学的分析を行った。最後の治療の１週間後、マウスを屠殺し、筋肉（前脛骨筋）を採取した。クライオスタットで凍結切片を作成する前に、筋肉を最適切断温度化合物（ＯＣＴ）に包埋した。組織切片を過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）およびヘマトキシリン溶液で染色した。
【００４７】
結果：定常状態では、核は筋線維の端に位置している。興味深いことに、抗ｍｉＲ−１９ａ／ｂで治療した筋線維では、末梢から中心位置への核のシフトが観察され（図３Ａ）、ｍｉＲ−１９ａ／ｂの阻害に応答して活発で自発的な筋肉組織のリモデリングが示唆された。
【００４８】
実施例８：筋肉の機能分析
実施例７で到達した発見の機能的意味を調査するために、採取したばかりの筋肉（長指伸筋およびヒラメ筋）を使用して、ｅｘ  ｖｉｖｏ機能試験を実施した。８週齢の雌Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスに卵巣切除または偽の手術をし、３週間後にスクランブル（Ｓｃｒ）または抗ｍｉＲ−１９ａ／ｂ（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）で週に１回、７週間治療した。最後の注射の１週間後、マウスを屠殺し、ｉｎ  ｓｉｔｕ、ｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでのマウスの筋肉の特性を測定するために設計された特別なデバイス（Ａｕｒｏｒａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、長指伸筋（ＥＤＬ）およびヒラメ筋のｅｘ  ｖｉｖｏでの収縮性を分析した。この目的のために、ＥＤＬおよびヒラメ筋を後肢から解剖し、鋼鉄のフックを筋肉の腱に結び付け、筋肉を力変換器の間に取り付けた。筋肉は、２つの電極間で最大を超えた刺激を使用して、収縮するように刺激した。疲労試験では、長指伸筋とヒラメ筋を７０Ｈｚで５０回繰り返し刺激し、最大の強縮力を検出した。Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ／Ｄａｔａ  ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  （ＤＭＣ）およびＤｙｎａｍｉｃ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＤＭＡ）プログラム（Ａｕｒｏｒａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、データを収集および分析した。
【００４９】
結果：機能検査で、卵巣摘出術により、長指伸筋およびヒラメ筋の強さ（図３ｂおよび図３ｃ）および弾力性（図３ｄおよび図３ｅ）が有意に低下することが明らかになった。抗ｍｉＲ−１９ａ／ｂ（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．、週１回、７週間）は、強さと弾力性の両方を、偽のコントロールのレベルまで回復させた（図３ｂ〜図３ｅ）。このことは、ｍｉＲ−１９ａ／ｂに拮抗することで、卵巣切除誘発型の筋機能の損失を防ぐことを強く示唆している。これらの知見は、ｍｉＲ−１９ａ／ｂが筋機能低下の治療に関する新規の標的であることを示している。
【００５０】
実施例９：骨転移性乳癌細胞の増殖
上記の知見は、ｍｉＲ−１９ａ／ｂに拮抗することは骨を保護するという概念を支持している。そのため、抗ｍｉＲ−１９ａ／ｂの治療が骨破壊性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞の活性を低下させ得るかどうかを検証した。この仮説を検証するために、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞に抗ｍｉＲ−１９ａ／ｂ、ｍｉＲ−１９ａ／ｂヌクレオチド、またはそれぞれのｓｃｒコントロールをトランスフェクトした。細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで４日間増殖させ、実験の終了まで、毎日ＭＴＳアッセイにより細胞増殖を測定した。
【００５１】
結果：抗ｍｉＲ−１９ａ／ｂヌクレオチドによる骨破壊性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞の処置は、３日目および４日目までに癌細胞の増殖を有意に低下させたが、ｍｉＲ−１９ａ／ｂヌクレオチドのデリバリーでは、同時点でコントロールと比較すると、癌細胞の増殖が増加した。これらのデータは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞において内因性ｍｉＲ−１９ａ／ｂを阻害することが、転移性乳癌疾患の状況で骨破壊の能力の発揮を妨げる可能性があることを強く示唆している。
【００５２】
実施例１０：転移性骨疾患の治療
抗ｍｉＲ−１９ａ／ｂの処置が骨破壊性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞の活性を減衰させ、ｉｎ  ｖｉｖｏで乳癌誘発型の骨溶解性疾患を防げるかどうかを検証した。ルシフェラーゼ遺伝子を安定して発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞を、８週齢の免疫不全ＳＣＩＤマウスの左心室に注射した。生物発光イメージング（ＢＬＩ）によって、乳癌細胞注入の２週間後に微小転移が検出され、マウスをランダムに２つの処置群に分けた。１週間に１回で４週間、１つの群にはスクランブルオリゴヌクレオチド（Ｓｃｒ；１０ｍｇ／ｋｇ）を、他方の群には抗ｍｉＲ−１９ａ／ｂ（１０ｍｇ／ｋｇ）を静脈内（ｉ．ｖ）投与した。腫瘍量はＢＬＩによって毎週測定された。最後の注射の１週間後、マウスを屠殺し、ｉｎ  ｓｉｔｕ、ｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでのマウスの筋肉の特性を測定するために設計された特別なデバイス（Ａｕｒｏｒａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ヒラメ筋のｅｘ  ｖｉｖｏ収縮性を分析した。この目的のために、ヒラメ筋を後肢から切り裂き、フックを筋肉の腱に結び付け、筋肉を力変換器の間に取り付けた。２つの電極間で最大上刺激を使用して、筋肉を収縮するように刺激した。疲労試験では、ヒラメ筋を７０Ｈｚで５０回繰り返し刺激し、最大の強縮力を検出した。Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ／Ｄａｔａ  ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  （ＤＭＣ）およびＤｙｎａｍｉｃ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＤＭＡ）プログラム（Ａｕｒｏｒａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、データを収集および分析した。マイクロコンピューター断層撮影（μＣＴ）を、長骨の３次元分析に使用した。マウスの長骨を、１０μｍの固定等方性ボクセルサイズの高解像度マイクロコンピューター断層撮影を使用して分析した（ＸμＡ４００ｍｓの統合時間で７０ピークｋＶ；Ｖｉｖａ８０  ｍｉｃｒｏ−ＣＴ；Ｓｃａｎｃｏ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＡＧ）。この閾値は、群ごとに４つのサンプルから得た１０個の単一断層スライスを手動で評価し、石灰化している組織を単離しその形態を維持する一方で非石灰化組織を除外することによって検証した。すべての分析は、３Ｄ距離技術（Ｓｃａｎｃｏ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＡＧ）を使用して、デジタルで抽出された骨組織で実行された。
【００５３】
結果：ＢＬＩイメージングにより、Ｓｃｒで治療したコントロールと比較して、抗ｍｉＲ−１９ａ／ｂで治療したマウスの骨の腫瘍の増殖が有意に減少したことが明らかになった（図５ａ）。乳癌は、Ｓｃｒで治療したマウスにおいて有意な骨量減少を誘発した。それは週１回の抗ｍｉＲ−１９ａ／ｂの治療で予防した（図５ｂ）。筋肉機能検査により、抗ｍｉＲ−１９ａ／ｂ（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．、週１回、４週間）により、ヒラメ筋の強さと持久力の両方の癌誘発性損失が回復したことが明らかになった（図５ｃおよび図５ｄ）。これは、ｍｉＲ−１９ａ／ｂに拮抗することで、骨転移負荷を軽減し、乳癌誘発型の骨量と筋機能の損失を防ぐことを強く示唆している。
【００５４】
実施例１１：グルココルチコイド誘発性骨粗鬆症の治療
抗ｍｉＲ−１９ａ／ｂがグルココルチコイド誘発性骨粗鬆症に関係しているかどうかを調べるために、プラセボまたはプレドニゾロン（２．１ｍｇ／ｋｇ／ｄ）ペレットを４か月齢の雌Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスに皮下移植した。ペレット移植の１日前に、続いて週に１回、マウスをスクランブル（Ｓｃｒ）または抗ｍｉＲ−１９ａ／ｂで処置した（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）。骨密度（ＢＭＤ）および体脂肪量を、デュアルエネルギーＸ線吸収法（ＤＥＸＡ、Ｐｉｘｉｍｕｓ）を使用して、４週間の治療の前後に測定した。ｉｎ  ｖｉｖｏの筋力を、垂直前肢握力検査を使用して、２週間の治療後に測定した。ｉｎ  ｖｉｖｏの筋肉機能検査（足底屈トルク）を、ｉｎ  ｖｉｖｏでマウスの筋肉の特性を測定するために設計された特別なデバイス（オーロラサイエンティフィック）を使用して行った。最大筋収縮力を、体重に対して正規化した。４週間の治療の後、マウスを屠殺し、腓腹筋、大腿四頭筋および前脛骨筋（ＴＡ）の湿重量を測定した。
【００５５】
結果：デュアルエネルギーＸ線吸収測定により、グルココルチコイド（プレドニゾロン）治療時の脂肪量の増加が明らかになった。これは、抗ｍｉＲ−１９ａ／ｂの週１回の送達によって防がれていた（図６ａ）。総体重の変化は観察されなかった（図６ｂ）。さらに、ＢＭＤは、プレドニゾロン投与マウスの大腿骨および脊椎で有意に減少した（図６ｃ〜図６ｅ）。抗ｍｉＲ−１９ａ／ｂで処置したマウスは、グルココルチコイド誘発型のＢＭＤの損失が防がれた（図６ｃ〜図６ｅ）。グルココルチコイドはＳｃｒおよび抗ｍｉＲ−１９ａ／ｂで処置したマウスの両方で筋肉量を減少させたが、腓腹筋、大腿四頭筋および前脛骨筋の量は、Ｓｃｒ処置コントロールと比較して、抗ｍｉＲ−１９ａ／ｂで処置したマウスで有意に高かった（図６ｆ〜図６ｈ）。重要なことに、抗ｍｉＲ−１９ａ／ｂの処置は、握力および足底屈トルク検査によって判定される筋機能のグルココルチコイド誘発性の損失を防いだ（図６ｉ、図６ｊ）。
【００５６】
文献
1.     Janssen, H. L. A. et al., Treatment of HCV Infection by Targeting MicroRN    A, N. Engl. J. Med. 368, 1685-1694 (2013).
2.     Musilova K. & Mraz M., MicroRNAs in B cell lymphomas: How a complex biolo    gy gets more complex", Leukemia, 2015 29 (5), 1004-17 (2015). 
3.     Nielsen B.S., et al., High levels of microRNA-21 in the stroma of colorec    tal cancers predict short disease-free survival in stage II colon cancer pat    ients, Clin Exp Metastasis 28 (1): 27-38 (2010).
4.     Romao J.M. et al., MicroRNA regulation in mammalian adipogenesis, Exp. Bi    ol. Med. 236 (9), 997-1004 (2011).
5.     Hommers L.G. et al., Heterogeneity and Individuality: microRNAs in Mental     Disorders, J Neural Transm. 122 (1): 79-97 (2015).
6.     Parfitt, A.M. et al., Bone histomorphometry: standardization of nomenclat    ure, symbols, and units. Report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature C    ommittee. J. Bone Miner. Res. 2, 595-610 (1987).
【００５７】
配列
配列番号:1 - 5'-TGCATAGATTTGCAC-3' (抗miR-19a)
配列番号:2 - 5'-TGCATGGATTTGCAC-3' (抗miR-19b)
配列番号:3 - 5'-UGUGCAAAUCUAUGCAAAACUGA-3'(miR-19a)
配列番号:4 - 5'-UGUGCAAAUCCAUGCAAAACUGA-3'(miR-19b)
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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