(57)【要約】  本開示は、５Ｔ４および／または４−１ＢＢに特異的に結合するタンパク質分子に関する。これらの分子は、ヒト型化された５Ｔ４結合ドメインまたは４−１ＢＢ結合ドメインを少なくとも１つ有し得る。このような分子はがん治療に有用である。５Ｔ４または４−１ＢＢに結合する前記タンパク質分子は、別の標的に結合する第二結合ドメインを有し得る。前記分子は、５Ｔ４発現細胞と、エフェクター細胞が発現する細胞表面分子と、の両方に結合することで、エフェクター細胞の活性化、増殖、生存、および／またはエフェクター細胞を介した細胞毒性を増強し得る。本開示はまた、前記５Ｔ４結合性または４−１ＢＢ結合性のポリペプチド分子またはタンパク質分子を含む医薬組成物、これらのポリペプチドをコードする核酸分子、並びにこれらの分子の作製法および使用法を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト５Ｔ４に特異的に結合する５Ｔ４結合ドメインと４−１ＢＢ結合ドメインとを含む多特異性ポリペプチドであって、
前記５Ｔ４結合ドメインは、（ｉ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域と、（ｉｉ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域と、を含み、
（ａ）前記ＨＣＤＲ１は配列番号３０のアミノ酸配列を含み；
（ｂ）前記ＨＣＤＲ２は配列番号３２のアミノ酸配列を含み；
（ｃ）前記ＨＣＤＲ３は配列番号３４のアミノ酸配列を含み；
（ｄ）前記ＬＣＤＲ１は配列番号４２のアミノ酸配列を含み；
（ｅ）前記ＬＣＤＲ２は配列番号１０のアミノ酸配列を含み；
（ｆ）前記ＬＣＤＲ３は配列番号３６のアミノ酸配列を含む、
前記多特異性ポリペプチド。
【請求項２】
前記５Ｔ４結合ドメインが配列番号３８および４６からなる群から選択される配列に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項１に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項３】
前記５Ｔ４結合ドメインが配列番号３８および４６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項１に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項４】
前記５Ｔ４結合ドメインが配列番号４４、４８、および５０からなる群から選択される配列に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項５】
前記５Ｔ４結合ドメインが配列番号４４、４８、および５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項６】
前記５Ｔ４結合ドメインが、
ｉ）配列番号３８に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４４に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含むか；
ｉｉ）配列番号４６に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４８に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含むか；
ｉｉｉ）配列番号４６に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５０に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む、
請求項１に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項７】
前記５Ｔ４結合ドメインが、
ｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含むか；
ｉｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含むか；
ｉｉｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む、
請求項１に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項８】
ヒト５Ｔ４に特異的に結合する５Ｔ４結合ドメインとヒト４−１ＢＢに特異的に結合する４−１ＢＢ結合ドメインとを含む多特異性ポリペプチドであって、
前記４−１ＢＢ結合ドメインおよび５Ｔ４結合ドメインのそれぞれが、（ｉ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）と；（ｉｉ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）と、を含み、
前記５Ｔ４結合ドメインの前記ＶＨ領域および／または前記ＶＬ領域がフレームワーク領域に１または複数の変異を含み；
前記５Ｔ４結合ドメインが、
（ａ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１と；
（ｂ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２と；
（ｃ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３と；
（ｄ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１と；
（ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２と；
（ｆ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３と、
を含む、前記多特異性ポリペプチド。
【請求項９】
前記５Ｔ４結合ドメインが配列番号３８に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項８に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１０】
前記５Ｔ４結合ドメインが配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項８に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１１】
前記５Ｔ４結合ドメインが配列番号４０に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項８に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１２】
前記５Ｔ４結合ドメインが配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項８に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１３】
前記５Ｔ４結合ドメインが、
配列番号３８に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４０に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、
を含む、請求項８に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１４】
前記５Ｔ４結合ドメインが、
配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、
を含む、請求項８に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１５】
ヒト５Ｔ４に特異的に結合する５Ｔ４結合ドメインとヒト４−１ＢＢに特異的に結合する４−１ＢＢ結合ドメインとを含む多特異性ポリペプチドであって、
前記４−１ＢＢ結合ドメインおよび５Ｔ４結合ドメインのそれぞれが、（ｉ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）と；（ｉｉ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）と、を含み、
前記４−１ＢＢ結合ドメインの前記ＶＨ領域および／または前記ＶＬ領域がフレームワーク領域に１または複数の変異を含み；
前記５Ｔ４結合ドメインが、
（ａ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１と；
（ｂ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２と；
（ｃ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３と；
（ｄ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１と；
（ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２と；
（ｆ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３と、
を含む、前記多特異性ポリペプチド。
【請求項１６】
前記５Ｔ４結合ドメインが配列番号３８および４６からなる群から選択される配列に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項１５に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１７】
前記５Ｔ４結合ドメインが配列番号３８および４６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項１５に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１８】
前記５Ｔ４結合ドメインが配列番号４４、４８、および５０からなる群から選択される配列に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１５に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１９】
前記５Ｔ４結合ドメインが配列番号４４、４８、および５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１５に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項２０】
前記５Ｔ４結合ドメインが、
ｉ）配列番号３８に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４４に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含むか；
ｉｉ）配列番号４６に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４８に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含むか；
ｉｉｉ）配列番号４６に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５０に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む、
を含む、請求項１５に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項２１】
前記５Ｔ４結合ドメインが、
ｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と；
ｉｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と；
ｉｉｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、
を含む、請求項１５に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項２２】
ヒト５Ｔ４に特異的に結合する５Ｔ４結合ドメインとヒト４−１ＢＢに特異的に結合する４−１ＢＢ結合ドメインとを含む多特異性ポリペプチドであって、
前記４−１ＢＢ結合ドメインおよび５Ｔ４結合ドメインのそれぞれが、（ｉ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）と；（ｉｉ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）と、を含み、
前記４−１ＢＢ結合ドメインの前記ＶＨ領域および／または前記ＶＬ領域がフレームワーク領域に１または複数の変異を含み；
前記５Ｔ４結合ドメインが、
（ａ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１と；
（ｂ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２と；
（ｃ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３と；
（ｄ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１と；
（ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２と；
（ｆ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３と、
を含む、前記多特異性ポリペプチド。
【請求項２３】
前記５Ｔ４結合ドメインが配列番号５６に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項２２に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項２４】
前記５Ｔ４結合ドメインが配列番号５６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項２２に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項２５】
前記５Ｔ４結合ドメインが配列番号５８に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項２２に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項２６】
前記５Ｔ４結合ドメインが配列番号５８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項２２に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項２７】
前記５Ｔ４結合ドメインが、配列番号５６に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５８に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む、請求項２２に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項２８】
前記５Ｔ４結合ドメインが、配列番号５６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む、請求項２２に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項２９】
ヒト５Ｔ４に特異的に結合する５Ｔ４結合ドメインとヒト４−１ＢＢに特異的に結合する４−１ＢＢ結合ドメインとを含む多特異性ポリペプチドであって、
前記４−１ＢＢ結合ドメインおよび５Ｔ４結合ドメインのそれぞれが、（ｉ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）と；（ｉｉ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）と、を含み、
前記４−１ＢＢ結合ドメインの前記ＶＨ領域および／または前記ＶＬ領域がフレームワーク領域に１または複数の変異を含み；
前記５Ｔ４結合ドメインが、
（ａ）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１と；
（ｂ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２と；
（ｃ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３と；
（ｄ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１と；
（ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２と；
（ｆ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３と；
を含む、前記多特異性ポリペプチド。
【請求項３０】
前記５Ｔ４結合ドメインが配列番号６４に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項２９に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項３１】
前記５Ｔ４結合ドメインが配列番号６４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項２９に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項３２】
前記５Ｔ４結合ドメインが配列番号５８に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項２９に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項３３】
前記５Ｔ４結合ドメインが配列番号５８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項２９に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項３４】
前記５Ｔ４結合ドメインが、  配列番号６４に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５８に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む、請求項２９に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項３５】
前記５Ｔ４結合ドメインが、配列番号６４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む、請求項２９に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項３６】
前記４−１ＢＢ結合ドメインがヒト４−１ＢＢに特異的に結合する、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項３７】
前記４−１ＢＢ結合ドメインが結合ドメインリンカーを介して前記５Ｔ４結合ドメインに連結されている、請求項３６に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項３８】
アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、（ｉ）前記５Ｔ４結合ドメインと、（ｉｉ）結合ドメインリンカーと、（ｉｉｉ）前記４−１ＢＢ結合ドメインと、を含む、請求項３６に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項３９】
前記５Ｔ４結合ドメインが単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）である、請求項３６のいずれか一項に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項４０】
前記ｓｃＦｖの軽鎖可変領域が前記ｓｃＦｖの重鎖可変領域のカルボキシ末端側である、請求項３９に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項４１】
前記ｓｃＦｖの軽鎖可変領域が前記ｓｃＦｖの重鎖可変領域のアミノ末端側である、請求項３９に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項４２】
前記ｓｃＦｖがリンカーポリペプチドを含む、請求項３９に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項４３】
前記リンカーポリペプチドが前記ｓｃＦｖの軽鎖可変領域と重鎖可変領域との間に存在する、請求項４２に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項４４】
前記リンカーポリペプチドがＧｌｙ４Ｓｅｒリンカーを含む、請求項４２に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項４５】
前記リンカーポリペプチドがｎ＝１〜５である式（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎを含む、請求項４３に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項４６】
前記リンカーポリペプチドが配列番号８５〜１０８から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４５に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項４７】
前記リンカーポリペプチドが配列番号９８に記載のアミノ酸配列（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）を含む、請求項４４に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項４８】
前記ｓｃＦｖが配列番号１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、および１７０からなる群から選択されるアミノ酸配列に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む、請求項３９に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項４９】
ｓｃＦｖが配列番号１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、および１７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４８に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項５０】
前記５Ｔ４結合ドメインがヒト５Ｔ４の細胞外ドメインに結合する、請求項１〜４９のいずれか一項に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項５１】
ヒト４−１ＢＢに特異的に結合する４−１ＢＢ結合ドメインと５Ｔ４結合ドメインとを含む多特異性ポリペプチドであって、
前記４−１ＢＢ結合ドメインは、（ｉ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）と、（ｉｉ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）と、を含み、
（ａ）前記ＨＣＤＲ１は配列番号２のアミノ酸配列を含み；
（ｂ）前記ＨＣＤＲ２は配列番号４のアミノ酸配列を含み；
（ｃ）前記ＨＣＤＲ３は配列番号６のアミノ酸配列を含み；
（ｄ）前記ＬＣＤＲ１は配列番号８のアミノ酸配列を含み；
（ｅ）前記ＬＣＤＲ２は配列番号１０のアミノ酸配列を含み；
（ｆ）前記ＬＣＤＲ３は配列番号１２のアミノ酸配列を含む、
前記多特異性ポリペプチド。
【請求項５２】
前記４−１ＢＢ結合ドメインが配列番号１４に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項５１に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項５３】
前記４−１ＢＢ結合ドメインが配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項５１に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項５４】
前記４−１ＢＢ結合ドメインが配列番号１６に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項５１に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項５５】
前記４−１ＢＢ結合ドメインが配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項５１に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項５６】
前記４−１ＢＢ結合ドメインが、配列番号１４に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１６に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む、請求項５１に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項５７】
前記４−１ＢＢ結合ドメインが、  配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む、請求項５１に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項５８】
ヒト５Ｔ４に特異的に結合する５Ｔ４結合ドメインと４−１ＢＢ結合ドメインとを含む多特異性ポリペプチドであって、
前記４−１ＢＢ結合ドメインは、（ｉ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）と、（ｉｉ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）と、を含み、
前記４−１ＢＢ結合ドメインの前記ＶＨ領域および／または前記ＶＬ領域がフレームワーク領域に１または複数の変異を含み；
前記４−１ＢＢ結合ドメインが、
（ａ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１と；
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２と；
（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３と；
（ｄ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１と；
（ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２と；
（ｆ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３と、
を含む、前記多特異性ポリペプチド。
【請求項５９】
前記４−１ＢＢ結合ドメインが配列番号２０に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項５８に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項６０】
前記４−１ＢＢ結合ドメインが配列番号２０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項５８に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項６１】
前記４−１ＢＢ結合ドメインが配列番号２２に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項５８に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項６２】
前記４−１ＢＢ結合ドメインが配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項５８に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項６３】
前記４−１ＢＢ結合ドメインが、配列番号２０に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２２に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む、請求項５８に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項６４】
前記４−１ＢＢ結合ドメインが、配列番号２０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む、請求項５８に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項６５】
ヒト５Ｔ４に特異的に結合する５Ｔ４結合ドメインと４−１ＢＢ結合ドメインとを含む多特異性ポリペプチドであって、
前記４−１ＢＢ結合ドメインは、（ｉ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）と、（ｉｉ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）と、を含み、
前記４−１ＢＢ結合ドメインの前記ＶＨ領域および／または前記ＶＬ領域がフレームワーク領域に１または複数の変異を含み、
前記４−１ＢＢ結合ドメインが、
（ａ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１と；
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２と；
（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３と；
（ｄ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１と；
（ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２と；
（ｆ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３と、
を含む、前記多特異性ポリペプチド。
【請求項６６】
前記４−１ＢＢ結合ドメインが配列番号２６に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項６５に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項６７】
前記４−１ＢＢ結合ドメインが配列番号２６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項６５に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項６８】
前記４−１ＢＢ結合ドメインが配列番号１６に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項６５に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項６９】
前記４−１ＢＢ結合ドメインが配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項６５に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項７０】
前記４−１ＢＢ結合ドメインが、配列番号２６に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１６に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む、請求項６５に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項７１】
前記４−１ＢＢ結合ドメインが、配列番号２６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む、請求項６５に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項７２】
前記４−１ＢＢ結合ドメインが単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）である、請求項５１〜７１のいずれか一項に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項７３】
前記４−１ＢＢ結合ドメインが配列番号１１０、１１２、１１４、および１１６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む、請求項７２に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項７４】
前記４−１ＢＢ結合ドメインが配列番号１１０、１１２、１１４、および１１６からなる群から選択される配列を含む、請求項７２に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項７５】
前記ｓｃＦｖの軽鎖可変領域が前記ｓｃＦｖの重鎖可変領域のカルボキシ末端側である、請求項７２に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項７６】
前記ｓｃＦｖの軽鎖可変領域が前記ｓｃＦｖの重鎖可変領域のアミノ末端側である、請求項７２に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項７７】
前記ｓｃＦｖがリンカーポリペプチドを含む、請求項７２に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項７８】
前記リンカーポリペプチドが前記ｓｃＦｖの軽鎖可変領域と重鎖可変領域との間に存在する、請求項７７に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項７９】
前記リンカーポリペプチドがＧｌｙ４Ｓｅｒリンカーを含む、請求項７７に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項８０】
前記リンカーポリペプチドがｎ＝１〜５である式（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎを含む、請求項７９に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項８１】
前記リンカーポリペプチドが配列番号８５〜１０８から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項７９に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項８２】
前記リンカーポリペプチドが配列番号９８に記載のアミノ酸配列（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）を含む、請求項７９に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項８３】
前記４−１ＢＢ結合ドメインがヒト４−１ＢＢの細胞外ドメインに結合する、請求項５１〜８２のいずれか一項に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項８４】
前記４−１ＢＢ結合ドメインが薬剤または毒素と複合化している、請求項５１〜８３のいずれか一項に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項８５】
前記４−１ＢＢ結合ドメインが結合ドメインリンカーを介して前記５Ｔ４結合ドメインに連結されている、請求項５１〜８４のいずれか一項に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項８６】
アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、（ｉ）前記５Ｔ４結合ドメインと、（ｉｉ）結合ドメインリンカーと、（ｉｉ）前記４−１ＢＢ結合ドメインと、を含む、請求項８５に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項８７】
アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、（ｉ）前記４−１ＢＢ結合ドメインと、（ｉｉ）結合ドメインリンカーと、（ｉｉｉ）前記５Ｔ４結合ドメインと、を含む、請求項８５に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項８８】
前記５Ｔ４結合ドメインが免疫グロブリン定常領域に融合または複合化している、請求項８７に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項８９】
前記免疫グロブリン定常領域がヒトＦｃドメインである、請求項８８に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項９０】
前記ヒトＦｃドメインが配列番号１５８または配列番号１６０に記載の配列を含む、請求項８９に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項９１】
アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、（ｉ）前記５Ｔ４結合ドメインと、（ｉｉ）ヒンジ領域と、（ｉｉｉ）免疫グロブリン定常領域と、（ｉｖ）結合ドメインリンカーと、（ｖ）前記４−１ＢＢ結合ドメインと、を含む、請求項８５に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項９２】
前記結合ドメインリンカーがＧｌｙ４Ｓｅｒ配列を含む、請求項８５〜９１のいずれか一項に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項９３】
前記結合ドメインリンカーがｎ＝１〜５である式（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎを含む、請求項９２に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項９４】
前記結合ドメインリンカーが配列番号８５〜１０８から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項９２に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項９５】
前記結合ドメインリンカーが配列番号１０７に記載のアミノ酸配列（ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＰＳ）を含む、請求項９４に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項９６】
第一ｓｃＦｖドメインと第二ｓｃＦｖドメインとを含む多特異性ポリペプチドであって、
前記第一ｓｃＦｖドメインおよび第二ｓｃＦｖドメインが結合ドメインリンカー、または結合ドメインリンカーおよび免疫グロブリンＦｃドメインによって連結されており、
前記免疫グロブリンＦｃドメインがヒンジ領域と免疫グロブリン定常領域とを含み；
前記第二ｓｃＦｖドメインが、ヒト４−１ＢＢに特異的に結合し、且つ、
（ｉ）配列番号２、１８、および２４からなる群から選択されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号４のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号６のＨＣＤＲ３アミノ酸配列、を含む免疫グロブリン重鎖可変領域と；
（ｉｉ）配列番号８のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１０のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号１２のＬＣＤＲ３アミノ酸配列、を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域と、
を含む、前記多特異性ポリペプチド。
【請求項９７】
第一ｓｃＦｖドメインと第二ｓｃＦｖドメインとを含む多特異性ポリペプチドであって、
前記第一ｓｃＦｖドメインおよび第二ｓｃＦｖドメインが結合ドメインリンカー、または結合ドメインリンカーおよび免疫グロブリンＦｃドメインによって連結されており、
前記免疫グロブリンＦｃドメインがヒンジ領域と免疫グロブリン定常領域とを含み；
前記第二ｓｃＦｖドメインが、ヒト４−１ＢＢに特異的に結合し、且つ、
（ｉ）配列番号２のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号４のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号６のＨＣＤＲ３アミノ酸配列、を含む免疫グロブリン重鎖可変領域と；
（ｉｉ）配列番号８のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１０のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号１２のＬＣＤＲ３アミノ酸配列、を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域と、
を含む、前記多特異性ポリペプチド。
【請求項９８】
第一ｓｃＦｖドメインと第二ｓｃＦｖドメインとを含む多特異性ポリペプチドであって、
前記第一ｓｃＦｖドメインおよび第二ｓｃＦｖドメインが結合ドメインリンカー、または結合ドメインリンカーおよび免疫グロブリンＦｃドメインによって連結されており、
前記免疫グロブリンＦｃドメインがヒンジ領域と免疫グロブリン定常領域とを含み；
前記第一ｓｃＦｖドメインが、ヒト５Ｔ４に特異的に結合し、且つ、
（ｉ）配列番号３０のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号３２のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号３４のＨＣＤＲ３アミノ酸配列、を含む免疫グロブリン重鎖可変領域と；
（ｉｉ）配列番号４２のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１０のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号３６のＬＣＤＲ３アミノ酸配列、を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域と、
を含む、前記多特異性ポリペプチド。
【請求項９９】
第一ｓｃＦｖドメインと第二ｓｃＦｖドメインとを含む多特異性ポリペプチドであって、
前記第一ｓｃＦｖドメインおよび第二ｓｃＦｖドメインが結合ドメインリンカー、または結合ドメインリンカーおよび免疫グロブリンＦｃドメインによって連結されており、
前記免疫グロブリンＦｃドメインがヒンジ領域と免疫グロブリン定常領域とを含み；
前記第一ｓｃＦｖドメインがヒト５Ｔ４に特異的に結合し、且つ
配列番号３０のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号３２のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号３４のＨＣＤＲ３アミノ酸配列、を含む免疫グロブリン重鎖可変領域と、配列番号４２のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１０のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号３６のＬＣＤＲ３アミノ酸配列、を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域と、を含み；
前記第二ｓｃＦｖドメインがヒト４−１ＢＢに特異的に結合し、且つ
配列番号２のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号４のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号６のＨＣＤＲ３アミノ酸配列、を含む免疫グロブリン重鎖可変領域と；配列番号８のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１０のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号１２のＬＣＤＲ３アミノ酸配列、を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域と、を含む、
前記多特異性ポリペプチド。
【請求項１００】
アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、（ｉ）前記第一ｓｃＦｖドメインと、（ｉｉ）結合ドメインリンカーと、（ｉｉｉ）前記第二ｓｃＦｖドメインと、を含む、請求項９６〜９９のいずれか一項に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１０１】
アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、（ｉ）前記第二ｓｃＦｖドメインと、（ｉｉ）結合ドメインリンカーと、（ｉｉｉ）前記第一ｓｃＦｖドメインと、を含む、請求項９６〜９９のいずれか一項に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１０２】
アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、（ｉ）前記第一ｓｃＦｖドメインと、（ｉｉ）ヒンジ領域と、（ｉｉｉ）免疫グロブリン定常領域と、（ｉｖ）結合ドメインリンカーと、（ｖ）前記第二ｓｃＦｖドメインと、を含む、請求項９６〜９９のいずれか一項に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１０３】
前記結合ドメインリンカーがＧｌｙ４Ｓｅｒ配列を含む、請求項９６〜９９のいずれか一項に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１０４】
前記結合ドメインリンカーがｎ＝１〜５である式（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎを含む、請求項９６〜９９のいずれか一項に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１０５】
前記結合ドメインリンカーが配列番号８５〜１０８から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項９６〜９９のいずれか一項に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１０６】
前記結合ドメインリンカーが配列番号１０７に記載のアミノ酸配列（ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＰＳ）を含む、請求項１０５に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１０７】
前記第二ｓｃＦｖドメインが、
（ａ）配列番号２に記載のＨＣＤＲ１アミノ酸配列と；
（ｂ）配列番号４に記載のＨＣＤＲ２アミノ酸配列と；
（ｃ）配列番号６に記載のＨＣＤＲ３アミノ酸配列と；
（ｄ）配列番号８に記載のＬＣＤＲ１アミノ酸配列と；
（ｅ）配列番号１０に記載のＬＣＤＲ２アミノ酸配列と；
（ｆ）配列番号１２に記載のＬＣＤＲ３アミノ酸配列と、
を含む、請求項９６または９７に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１０８】
前記第二ｓｃＦｖドメインが、
（ａ）配列番号１８に記載のＨＣＤＲ１アミノ酸配列と；
（ｂ）配列番号４に記載のＨＣＤＲ２アミノ酸配列と；
（ｃ）配列番号６に記載のＨＣＤＲ３アミノ酸配列と；
（ｄ）配列番号８に記載のＬＣＤＲ１アミノ酸配列と；
（ｅ）配列番号１０に記載のＬＣＤＲ２アミノ酸配列と；
（ｆ）配列番号１２に記載のＬＣＤＲ３アミノ酸配列と、
を含む、請求項９６または９７に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１０９】
前記第二ｓｃＦｖドメインが、
（ａ）配列番号２４に記載のＨＣＤＲ１アミノ酸配列と；
（ｂ）配列番号４に記載のＨＣＤＲ２アミノ酸配列と；
（ｃ）配列番号６に記載のＨＣＤＲ３アミノ酸配列と；
（ｄ）配列番号８に記載のＬＣＤＲ１アミノ酸配列と；
（ｅ）配列番号１０に記載のＬＣＤＲ２アミノ酸配列と；
（ｆ）配列番号１２に記載のＬＣＤＲ３アミノ酸配列と、
を含む、請求項９６または９７に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１１０】
前記第二ｓｃＦｖドメインが配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号１６の軽鎖可変領域とを含む、請求項９６または９７に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１１１】
前記第二ｓｃＦｖドメインが配列番号２０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号２２の軽鎖可変領域とを含む、請求項９６または９７に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１１２】
前記第二ｓｃＦｖドメインが配列番号２６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号１６の軽鎖可変領域とを含む、請求項９６または９７に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１１３】
前記第二ｓｃＦｖドメインが配列番号２８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号１６の軽鎖可変領域とを含む、請求項９６または９７に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１１４】
前記第一ｓｃＦｖドメインが、
（ｉ）配列番号３０、５２、および６０からなる群から選択されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号３２および６２からなる群から選択されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号３４のＨＣＤＲ３アミノ酸配列、を含む免疫グロブリン重鎖可変領域と；
（ｉｉ）配列番号８、４２、および５４からなる群から選択されるＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１０のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号３６のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域と；
を含み、
前記第二ｓｃＦｖドメインが、
（ｉ）配列番号２、１８、および２４からなる群から選択されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号４のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号６のＨＣＤＲ３アミノ酸配列、を含む免疫グロブリン重鎖可変領域と；
（ｉｉ）配列番号８のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１０のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号１２のＬＣＤＲ３アミノ酸配列、を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域と、
を含む、請求項９６に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１１５】
前記第二ｓｃＦｖドメインが、
（ａ）配列番号２に記載のＨＣＤＲ１アミノ酸配列と；
（ｂ）配列番号４に記載のＨＣＤＲ２アミノ酸配列と；
（ｃ）配列番号６に記載のＨＣＤＲ３アミノ酸配列と；
（ｄ）配列番号８に記載のＬＣＤＲ１アミノ酸配列と；
（ｅ）配列番号１０に記載のＬＣＤＲ２アミノ酸配列と；
（ｆ）配列番号１２に記載のＬＣＤＲ３アミノ酸配列と、
を含む、請求項１１４に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１１６】
前記第一ｓｃＦｖドメインが、
（ａ）配列番号３０に記載のＨＣＤＲ１アミノ酸配列と；
（ｂ）配列番号３２に記載のＨＣＤＲ２アミノ酸配列と；
（ｃ）配列番号３４に記載のＨＣＤＲ３アミノ酸配列と；
（ｄ）配列番号８に記載のＬＣＤＲ１アミノ酸配列と；
（ｅ）配列番号１０に記載のＬＣＤＲ２アミノ酸配列と；
（ｆ）配列番号３６に記載のＬＣＤＲ３アミノ酸配列と、
を含む、請求項１１５に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１１７】
前記第一ｓｃＦｖドメインが、
（ａ）配列番号３０に記載のＨＣＤＲ１アミノ酸配列と；
（ｂ）配列番号３２に記載のＨＣＤＲ２アミノ酸配列と；
（ｃ）配列番号３４に記載のＨＣＤＲ３アミノ酸配列と；
（ｄ）配列番号４２に記載のＬＣＤＲ１アミノ酸配列と；
（ｅ）配列番号１０に記載のＬＣＤＲ２アミノ酸配列と；
（ｆ）配列番号３６に記載のＬＣＤＲ３アミノ酸配列と、
を含む、請求項１１５に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１１８】
前記第一ｓｃＦｖドメインが、
（ａ）配列番号３０に記載のＨＣＤＲ１アミノ酸配列と；
（ｂ）配列番号３２に記載のＨＣＤＲ２アミノ酸配列と；
（ｃ）配列番号３４に記載のＨＣＤＲ３アミノ酸配列と；
（ｄ）配列番号４２に記載のＬＣＤＲ１アミノ酸配列と；
（ｅ）配列番号１０に記載のＬＣＤＲ２アミノ酸配列と；
（ｆ）配列番号３６に記載のＬＣＤＲ３アミノ酸配列と、
を含む、請求項１１５に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１１９】
前記第一ｓｃＦｖドメインが、
（ａ）配列番号５２に記載のＨＣＤＲ１アミノ酸配列と；
（ｂ）配列番号３２に記載のＨＣＤＲ２アミノ酸配列と；
（ｃ）配列番号３４に記載のＨＣＤＲ３アミノ酸配列と；
（ｄ）配列番号５４に記載のＬＣＤＲ１アミノ酸配列と；
（ｅ）配列番号１０に記載のＬＣＤＲ２アミノ酸配列と；
（ｆ）配列番号３６に記載のＬＣＤＲ３アミノ酸配列と、
を含む、請求項１１５に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１２０】
前記第一ｓｃＦｖドメインが、
（ａ）配列番号６０に記載のＨＣＤＲ１アミノ酸配列と；
（ｂ）配列番号６２に記載のＨＣＤＲ２アミノ酸配列と；
（ｃ）配列番号３４に記載のＨＣＤＲ３アミノ酸配列と；
（ｄ）配列番号５４に記載のＬＣＤＲ１アミノ酸配列と；
（ｅ）配列番号１０に記載のＬＣＤＲ２アミノ酸配列と；
（ｆ）配列番号３６に記載のＬＣＤＲ３アミノ酸配列と、
を含む、請求項１１５に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１２１】
前記第二ｓｃＦｖドメインが、
（ａ）配列番号１８に記載のＨＣＤＲ１アミノ酸配列と；
（ｂ）配列番号４に記載のＨＣＤＲ２アミノ酸配列と；
（ｃ）配列番号６に記載のＨＣＤＲ３アミノ酸配列と；
（ｄ）配列番号８に記載のＬＣＤＲ１アミノ酸配列と；
（ｅ）配列番号１０に記載のＬＣＤＲ２アミノ酸配列と；
（ｆ）配列番号１２に記載のＬＣＤＲ３アミノ酸配列と、
を含む、請求項１１４に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１２２】
前記第一ｓｃＦｖドメインが、
（ａ）配列番号３０に記載のＨＣＤＲ１アミノ酸配列と；
（ｂ）配列番号３２に記載のＨＣＤＲ２アミノ酸配列と；
（ｃ）配列番号３４に記載のＨＣＤＲ３アミノ酸配列と；
（ｄ）配列番号４２に記載のＬＣＤＲ１アミノ酸配列と；
（ｅ）配列番号１０に記載のＬＣＤＲ２アミノ酸配列と；
（ｆ）配列番号３６に記載のＬＣＤＲ３アミノ酸配列と、
を含む、請求項１２１に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１２３】
前記第二ｓｃＦｖドメインが、
（ａ）配列番号２４に記載のＨＣＤＲ１アミノ酸配列と；
（ｂ）配列番号４に記載のＨＣＤＲ２アミノ酸配列と；
（ｃ）配列番号６に記載のＨＣＤＲ３アミノ酸配列と；
（ｄ）配列番号８に記載のＬＣＤＲ１アミノ酸配列と；
（ｅ）配列番号１０に記載のＬＣＤＲ２アミノ酸配列と；
（ｆ）配列番号１２に記載のＬＣＤＲ３アミノ酸配列と、
を含む、請求項１１４に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１２４】
前記第一ｓｃＦｖドメインが、
（ａ）配列番号５２に記載のＨＣＤＲ１アミノ酸配列と；
（ｂ）配列番号３２に記載のＨＣＤＲ２アミノ酸配列と；
（ｃ）配列番号３４に記載のＨＣＤＲ３アミノ酸配列と；
（ｄ）配列番号５４に記載のＬＣＤＲ１アミノ酸配列と；
（ｅ）配列番号１０に記載のＬＣＤＲ２アミノ酸配列と；
（ｆ）配列番号３６に記載のＬＣＤＲ３アミノ酸配列と、
を含む、請求項１２３に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１２５】
前記第二ｓｃＦｖドメインが、
（ａ）配列番号２４に記載のＨＣＤＲ１アミノ酸配列と；
（ｂ）配列番号４に記載のＨＣＤＲ２アミノ酸配列と；
（ｃ）配列番号６に記載のＨＣＤＲ３アミノ酸配列と；
（ｄ）配列番号８に記載のＬＣＤＲ１アミノ酸配列と；
（ｅ）配列番号１０に記載のＬＣＤＲ２アミノ酸配列と；
（ｆ）配列番号１２に記載のＬＣＤＲ３アミノ酸配列と、
を含む、請求項１１４に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１２６】
前記第一ｓｃＦｖドメインが、
（ａ）配列番号３０に記載のＨＣＤＲ１アミノ酸配列と；
（ｂ）配列番号３２に記載のＨＣＤＲ２アミノ酸配列と；
（ｃ）配列番号３４に記載のＨＣＤＲ３アミノ酸配列と；
（ｄ）配列番号８に記載のＬＣＤＲ１アミノ酸配列と；
（ｅ）配列番号１０に記載のＬＣＤＲ２アミノ酸配列と；
（ｆ）配列番号３６に記載のＬＣＤＲ３アミノ酸配列と、
を含む、請求項１２５に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１２７】
前記第一ｓｃＦｖドメインが、
ｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号４０のアミノ酸を含む軽鎖可変領域と、を含み、
前記第二ｓｃＦｖドメインが、
ｉｉ）配列番号１４のアミノ酸を含む重鎖可変領域と配列番号１６の軽鎖可変領域と、を含む、
請求項９６または１０２に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１２８】
前記第一ｓｃＦｖドメインが、
ｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号４４のアミノ酸を含む軽鎖可変領域と、を含み、
前記第二ｓｃＦｖドメインが、
ｉｉ）配列番号１４のアミノ酸を含む重鎖可変領域と配列番号１６の軽鎖可変領域と、を含む、
請求項９６または１０２に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１２９】
前記第一ｓｃＦｖドメインが、
ｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号４８のアミノ酸を含む軽鎖可変領域と、を含み、
前記第二ｓｃＦｖドメインが、
ｉｉ）配列番号１４のアミノ酸を含む重鎖可変領域と配列番号１６の軽鎖可変領域と、を含む、
請求項９６または１０２に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１３０】
前記第一ｓｃＦｖドメインが、
ｉ）配列番号５６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号５８のアミノ酸を含む軽鎖可変領域と、を含み、
前記第二ｓｃＦｖドメインが、
ｉｉ）配列番号１４のアミノ酸を含む重鎖可変領域と配列番号１６の軽鎖可変領域と、を含む、
請求項９６または１０２に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１３１】
前記第一ｓｃＦｖドメインが、
ｉ）配列番号６４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号５８のアミノ酸を含む軽鎖可変領域と、を含み、
前記第二ｓｃＦｖドメインが、
ｉｉ）配列番号１４のアミノ酸を含む重鎖可変領域と配列番号１６の軽鎖可変領域と、を含む、
請求項９６または１０２に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１３２】
前記第一ｓｃＦｖドメインが、
ｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号５０のアミノ酸を含む軽鎖可変領域と、を含み、
前記第二ｓｃＦｖドメインが、
ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸を含む重鎖可変領域と配列番号２２の軽鎖可変領域と、を含む、
請求項９６または１０２に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１３３】
前記第一ｓｃＦｖドメインが、
ｉ）配列番号５６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号５８のアミノ酸を含む軽鎖可変領域と、を含み、
前記第二ｓｃＦｖドメインが、
ｉｉ）配列番号２６のアミノ酸を含む重鎖可変領域と配列番号１６の軽鎖可変領域と、を含む、
請求項９６または１０２に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１３４】
前記第一ｓｃＦｖドメインが、
ｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号６８のアミノ酸を含む軽鎖可変領域と、を含み、
前記第二ｓｃＦｖドメインが、
ｉｉ）配列番号２８のアミノ酸を含む重鎖可変領域と配列番号１６の軽鎖可変領域と、を含む、
請求項９６または１０２に記載の多特異性ポリペプチドにおいて。
【請求項１３５】
前記第一ｓｃＦｖドメインが、
ｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号７０のアミノ酸を含む軽鎖可変領域と、を含み、
前記第二ｓｃＦｖドメインが、
ｉｉ）配列番号２８のアミノ酸を含む重鎖可変領域と配列番号１６の軽鎖可変領域と、を含む、
請求項９６または１０２に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１３６】
前記第一ｓｃＦｖドメインが、ヒト５Ｔ４に特異的に結合し、且つ、配列番号１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、および１７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記第二ｓｃＦｖドメインが、ヒト４−１ＢＢに特異的に結合し、且つ配列番号１１０、１１２、１１４、および１１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項９６または１０２に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１３７】
前記第一ｓｃＦｖドメインが配列番号１１８に記載のアミノ酸配列を含み、前記第二ｓｃＦｖドメインが配列番号１１０に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１３６に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１３８】
前記第一ｓｃＦｖドメインが配列番号１２０に記載のアミノ酸配列を含み、前記第二ｓｃＦｖドメインが配列番号１１０に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１３６に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１３９】
前記第一ｓｃＦｖドメインが配列番号１２２に記載のアミノ酸配列を含み、前記第二ｓｃＦｖドメインが配列番号１１０に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１３６に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１４０】
前記第一ｓｃＦｖドメインが配列番号１２４に記載のアミノ酸配列を含み、前記第二ｓｃＦｖドメインが配列番号１１２に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１３６に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１４１】
前記第一ｓｃＦｖドメインが配列番号１２６に記載のアミノ酸配列を含み、前記第二ｓｃＦｖドメインが配列番号１１４に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１３６に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１４２】
前記第一ｓｃＦｖドメインが配列番号１２６に記載のアミノ酸配列を含み、前記第二ｓｃＦｖドメインが配列番号１１０に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１３６に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１４３】
前記第一ｓｃＦｖドメインが配列番号１２８に記載のアミノ酸配列を含み、前記第二ｓｃＦｖドメインが配列番号１１０に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１３６に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１４４】
前記第一ｓｃＦｖドメインが配列番号１３０に記載のアミノ酸配列を含み、前記第二ｓｃＦｖドメインが配列番号１１６に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１３６に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１４５】
前記第一ｓｃＦｖドメインが配列番号１７０に記載のアミノ酸配列を含み、前記第二ｓｃＦｖドメインが配列番号１１６に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１３６に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１４６】
前記第一ｓｃＦｖドメインが配列番号１３２に記載のアミノ酸配列を含み、前記第二ｓｃＦｖドメインが配列番号１１６に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１３６に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１４７】
前記第一ｓｃＦｖドメインが配列番号１３４に記載のアミノ酸配列を含み、前記第二ｓｃＦｖドメインが配列番号１１６に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１３６に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１４８】
配列番号１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１７２、および１７４からなる群から選択される配列に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項９６または１０２に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１４９】
配列番号１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１７２、および１７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項９６または１０２に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１５０】
配列番号１３６、１３８、および１４６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項９６または１０２に記載の多特異性ポリペプチド。 
【請求項１５１】
前記第一ｓｃＦｖドメインが５Ｔ４の細胞外ドメインに結合し、前記第二ｓｃＦｖドメインが４−１ＢＢの細胞外ドメインに結合する、請求項９６〜１４７のいずれか一項に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１５２】
第一ｓｃＦｖドメインと第二ｓｃＦｖドメインとを含む多特異性ポリペプチドであって、
前記第一ｓｃＦｖドメインおよび第二ｓｃＦｖドメインが結合ドメインリンカー、または結合ドメインリンカーおよび免疫グロブリンＦｃドメインによって連結されており、
前記免疫グロブリンＦｃドメインがヒンジ領域と免疫グロブリン定常領域とを含み；
前記多特異性ポリペプチドは第二の同一の多特異性ポリペプチドとの結合によるホモ二量体の形成が可能であり；
前記第一ｓｃＦｖドメインが、ヒト５Ｔ４に特異的に結合し、且つ、
（ｉ）配列番号３０のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号３２のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号３４のＨＣＤＲ３アミノ酸配列、を含む免疫グロブリン重鎖可変領域と；
（ｉｉ）配列番号４２のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１０のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号３６のＬＣＤＲ３アミノ酸配列、を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域と、を含む、
前記多特異性ポリペプチド。
【請求項１５３】
前記第一ｓｃＦｖドメインが、配列番号１３０または１７０のフレームワーク領域との比較で、フレームワーク領域に変異を含む、請求項１５２に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１５４】
前記変異によってジスルフィド結合の安定化がもたらされる、請求項１５３に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１５５】
前記第一ｓｃＦｖドメインが、
ｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含むか；
ｉｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む、
請求項１５２に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１５６】
前記第二ｓｃＦｖドメインが、ヒト４−１ＢＢに特異的に結合し、且つ、
（ｉ）配列番号２のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号４のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号６のＨＣＤＲ３アミノ酸配列、を含む免疫グロブリン重鎖可変領域と；
（ｉｉ）配列番号８のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１０のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号１２のＬＣＤＲ３アミノ酸配列、を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域と、
を含む、請求項１５２〜１５５のいずれか一項に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１５７】
前記第二ｓｃＦｖドメインが、
ｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、
を含む、請求項１５６に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１５８】
アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、（ｉ）前記第一ｓｃＦｖドメインと、（ｉｉ）結合ドメインリンカーと、（ｉｉｉ）前記第二ｓｃＦｖドメインと、を含む、請求項１５２〜１５７のいずれか一項に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１５９】
アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、（ｉ）前記第二ｓｃＦｖドメインと、（ｉｉ）結合ドメインリンカーと、（ｉｉｉ）前記第一ｓｃＦｖドメインと、を含む、請求項１５２〜１５７のいずれか一項に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１６０】
アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、（ｉ）前記第一ｓｃＦｖドメインと、（ｉｉ）ヒンジ領域と、（ｉｉｉ）免疫グロブリン定常領域と、（ｉｖ）結合ドメインリンカーと、（ｖ）前記第二ｓｃＦｖドメインと、を含む、請求項１５２〜１５７のいずれか一項に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１６１】
前記結合ドメインリンカーがＧｌｙ４Ｓｅｒ配列を含む、請求項１４９〜１５７のいずれか一項に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１６２】
前記結合ドメインリンカーがｎ＝１〜５である式（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎを含む、請求項１６１に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１６３】
前記結合ドメインリンカーが配列番号８５〜１０８から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１６１に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１６４】
前記結合ドメインリンカーが配列番号１０７に記載のアミノ酸配列（ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＰＳ）を含む、請求項１６１に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１６５】
第一ｓｃＦｖドメインと第二ｓｃＦｖドメインとを含む多特異性ポリペプチドであって、
前記第一ｓｃＦｖドメインおよび第二ｓｃＦｖドメインが結合ドメインリンカーおよび免疫グロブリンＦｃドメインによって連結されており、
前記免疫グロブリンＦｃドメインがヒンジ領域と免疫グロブリン定常領域とを含み；
前記第一ｓｃＦｖドメインがヒト５Ｔ４に特異的に結合し、且つ配列番号１２０と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含み；
前記第二ｓｃＦｖドメインがヒト４−１ＢＢに特異的に結合し、且つ配列番号１１０と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む、
前記多特異性ポリペプチド。
【請求項１６６】
第一ｓｃＦｖドメインと第二ｓｃＦｖドメインとを含む多特異性ポリペプチドであって、
前記第一ｓｃＦｖドメインおよび第二ｓｃＦｖドメインが結合ドメインリンカーおよび免疫グロブリンＦｃドメインによって連結されており、
前記免疫グロブリンＦｃドメインがヒンジ領域と免疫グロブリン定常領域とを含み；
前記第一ｓｃＦｖドメインがヒト５Ｔ４に特異的に結合し、且つ配列番号１２０を含むか、それからなり；
前記第二ｓｃＦｖドメインがヒト４−１ＢＢに特異的に結合し、且つ配列番号１１０を含むか、それからなり；
前記結合ドメインリンカーが配列番号１０７を含むか、それからなる、
前記多特異性ポリペプチド。
【請求項１６７】
アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、（ｉ）第二ｓｃＦｖドメインと、（ｉｉ）免疫グロブリンＦｃドメインと、（ｉｉｉ）結合ドメインリンカーと、（ｉｖ）第一ｓｃＦｖドメインと、を含む多特異性ポリペプチドであって；
前記第一ｓｃＦｖドメインがヒト５Ｔ４に特異的に結合し、且つ配列番号１２０を含むか、それからなり；
前記第二ｓｃＦｖドメインがヒト４−１ＢＢに特異的に結合し、且つ配列番号１１０を含むか、それからなり；
前記免疫グロブリンＦｃドメインが配列番号１６０を含むか、それからなり；
前記結合ドメインリンカーが配列番号１０７を含むか、それからなる、
前記多特異性ポリペプチド。
【請求項１６８】
配列番号１７２と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含み、ヒト５Ｔ４およびヒト４−１ＢＢに特異的に結合する、多特異性ポリペプチド。
【請求項１６９】
配列番号１７２を含むかそれからなり、ヒト５Ｔ４およびヒト４−１ＢＢに特異的に結合する、多特異性ポリペプチド。
【請求項１７０】
第一ｓｃＦｖドメインと第二ｓｃＦｖドメインとを含む多特異性ポリペプチドであって、
前記第一ｓｃＦｖドメインおよび第二ｓｃＦｖドメインが結合ドメインリンカーおよび免疫グロブリンＦｃドメインによって連結されており、
前記免疫グロブリンＦｃドメインがヒンジ領域と免疫グロブリン定常領域とを含み；
前記第一ｓｃＦｖドメインがヒト５Ｔ４に特異的に結合し、且つ配列番号１２２と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含み；
前記第二ｓｃＦｖドメインがヒト４−１ＢＢに特異的に結合し、且つ配列番号１１０と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む、
前記多特異性ポリペプチド。
【請求項１７１】
第一ｓｃＦｖドメインと第二ｓｃＦｖドメインとを含む多特異性ポリペプチドであって、
前記第一ｓｃＦｖドメインおよび第二ｓｃＦｖドメインが結合ドメインリンカーおよび免疫グロブリンＦｃドメインによって連結されており、
前記免疫グロブリンＦｃドメインがヒンジ領域と免疫グロブリン定常領域とを含み；
前記第一ｓｃＦｖドメインがヒト５Ｔ４に特異的に結合し、且つ配列番号１２２を含むか、それからなり；
前記第二ｓｃＦｖドメインがヒト４−１ＢＢに特異的に結合し、且つ配列番号１１０を含むか、それからなり；
前記結合ドメインリンカーが配列番号１０７を含むか、それからなる、
前記多特異性ポリペプチド。
【請求項１７２】
アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、（ｉ）第二ｓｃＦｖドメインと、（ｉｉ）免疫グロブリンＦｃドメインと、（ｉｉｉ）結合ドメインリンカーと、（ｉｖ）第一ｓｃＦｖドメインと、を含む多特異性ポリペプチドであって；
前記第一ｓｃＦｖドメインがヒト５Ｔ４に特異的に結合し、且つ配列番号１２２を含むか、それからなり；
前記第二ｓｃＦｖドメインがヒト４−１ＢＢに特異的に結合し、且つ配列番号１１０を含むか、それからなり；
前記免疫グロブリンＦｃドメインが配列番号１６０を含むか、それからなり；
前記結合ドメインリンカーが配列番号１０７を含むか、それからなる、
前記多特異性ポリペプチド。
【請求項１７３】
配列番号１７４と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含み、ヒト５Ｔ４およびヒト４−１ＢＢに特異的に結合する、多特異性ポリペプチド。
【請求項１７４】
配列番号１７４を含むかそれからなり、ヒト５Ｔ４およびヒト４−１ＢＢに特異的に結合する、多特異性ポリペプチド。
【請求項１７５】
多特異性ポリペプチドのエフェクター細胞への結合が、エフェクター細胞の活性化を増強する、請求項９６〜１７４のいずれか一項に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１７６】
多特異性ポリペプチドのエフェクター細胞への結合が、エフェクター細胞の活性化および／またはエフェクター細胞の増殖を増大させる、請求項９６〜１７４のいずれか一項に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１７７】
多特異性ポリペプチドのエフェクター細胞および５Ｔ４発現細胞への結合が、エフェクター細胞依存的な、５Ｔ４発現細胞の溶解を増強する、請求項９６〜１７４のいずれか一項に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１７８】
前記５Ｔ４結合ドメインが５０ｎＭ未満のｋＤ値で５Ｔ４に結合できる、請求項１〜１７７のいずれか一項に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１７９】
前記５Ｔ４結合ドメインの前記軽鎖可変領域および／または前記重鎖可変領域がヒト型化されている、請求項１〜１７８のいずれか一項に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１８０】
前記４−１ＢＢ結合ドメインの前記軽鎖可変領域および／または前記重鎖可変領域がヒト型化されている、請求項１〜１７９のいずれか一項に記載の多特異性ポリペプチド。
【請求項１８１】
２つの同一のポリペプチドを含み、前記２つのポリペプチドがそれぞれ請求項１〜１８０のいずれか一項に記載のポリペプチドである、二量体。
【請求項１８２】
請求項１〜１８０のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項１８１に記載のタンパク質と、薬剤的に許容できる担体、希釈剤、または賦形剤と、を含む医薬組成物。
【請求項１８３】
経口投与用単位剤形、静脈内投与用単位剤形、鼻腔内投与用単位剤形、坐剤用単位剤形、皮内投与用単位剤形、筋肉内投与用単位剤形、腹腔内投与用単位剤形、皮下投与用単位剤形、硬膜外投与用単位剤形、舌下投与用単位剤形、および脳内投与用単位剤形からなる群から選択される剤形に製剤化された、請求項１８２に記載の医薬組成物。
【請求項１８４】
錠剤、丸剤、ペレット剤、カプセル剤、散剤、菓子錠剤、粒剤、水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤、徐放性製剤、エアゾール剤、および噴霧剤からなる群から選択される経口投与用単位剤形として製剤化された、請求項１８２に記載の医薬組成物。
【請求項１８５】
５Ｔ４発現細胞に対するエフェクター細胞の活性化を増強するための方法であって、前記５Ｔ４発現細胞を請求項１〜１８０のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項１８１に記載のタンパク質と接触させることを含み、前記接触が前記５Ｔ４発現細胞に対するエフェクター細胞の活性化の増強が誘導される条件下で行われる、前記方法。
【請求項１８６】
対象における、５Ｔ４の発現を特徴とする障害を治療するための方法であって、
治療有効量の、請求項１〜１８０のいずれか一項に記載のポリペプチド、または請求項１８１に記載のタンパク質、または請求項１８２〜１８４のいずれか一項に記載の医薬組成物を前記対象に投与すること、
を含む前記方法。
【請求項１８７】
前記障害ががんである、請求項１８６に記載の方法。
【請求項１８８】
前記がんが、乳がん、膵がん、卵巣がん、非小細胞肺がん、中皮腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、マントル細胞白血病（ｍａｎｔｌｅ  ｃｅｌｌ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）（ＭＣＬ）、急性リンパ芽球白血病（ＡＬＬ）、扁平上皮癌、メラノーマ、副腎がん、膀胱がん、子宮頸がん、腎がん、胃がん、前立腺がん、甲状腺がん、肝臓がん、子宮がん、神経線維腫、肉腫、癌腫、または頭頚部がんである、請求項１８７に記載の方法。
【請求項１８９】
対象における、５Ｔ４の発現を特徴とする障害を治療するための医薬の製造における、請求項１〜１８０のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項１８１に記載のタンパク質の使用。
【請求項１９０】
前記障害ががんである、請求項１８９に記載の使用。
【請求項１９１】
前記がんが、乳がん、膵がん、卵巣がん、非小細胞肺がん、中皮腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、マントル細胞白血病（ｍａｎｔｌｅ  ｃｅｌｌ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）（ＭＣＬ）、急性リンパ芽球白血病（ＡＬＬ）、扁平上皮癌、メラノーマ、副腎がん、膀胱がん、子宮頸がん、腎がん、胃がん、前立腺がん、甲状腺がん、肝臓がん、子宮がん、神経線維腫、肉腫、癌腫、または頭頚部がんである、請求項１９０に記載の使用。
【請求項１９２】
対象における、５Ｔ４の発現を特徴とする障害の治療において使用される、請求項１〜１８０のいずれか一項に記載のポリペプチド、または請求項１８１に記載のタンパク質。
【請求項１９３】
前記障害ががんである、請求項１９２に記載のポリペプチドまたはタンパク質。
【請求項１９４】
前記がんが、乳がん、膵がん、卵巣がん、非小細胞肺がん、中皮腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、マントル細胞白血病（ｍａｎｔｌｅ  ｃｅｌｌ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）（ＭＣＬ）、急性リンパ芽球白血病（ＡＬＬ）、メラノーマ、扁平上皮癌、副腎がん、膀胱がん、子宮頸がん、腎がん、胃がん、前立腺がん、甲状腺がん、肝臓がん、子宮がん、神経線維腫、肉腫、癌腫、または頭頚部がんである、請求項１９３に記載のポリペプチドまたはタンパク質。
【請求項１９５】
請求項１〜１８０のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項１８１に記載のタンパク質をコードする、単離された核酸分子。
【請求項１９６】
配列番号１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１７１、および１７３からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１９５に記載の単離された核酸分子。
【請求項１９７】
請求項１９５または請求項１９６に記載の単離された核酸分子を含む、発現ベクター。
【請求項１９８】
前記核酸分子が、宿主細胞における前記核酸セグメントの発現に好適な制御配列に作動可能なように連結されている、請求項１９７に記載の発現ベクター。
【請求項１９９】
請求項１９７または請求項１９８に記載の発現ベクターを含む、組換え宿主細胞。
【請求項２００】
５Ｔ４結合ドメインを含むポリペプチドを製造するための方法であって、請求項１９７または請求項１９８に記載の発現ベクターを含む組換え宿主細胞を、前記核酸セグメントが発現される条件下で培養することで、前記５Ｔ４結合ドメインを含むポリペプチドを産生させることを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１７年７月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／５３５，１０７号；２０１７年１０月２３日に出願された同第６２／５７５，８２０号；および２０１８年３月２６日に出願された同第６２／６４８，０７２号に基づく優先権を主張し、各米国仮特許出願の全内容を参照により援用するものである。
【０００２】
電子ファイルで提出されたテキストファイルの説明
本願で電子ファイルで提出されたテキストファイルの全内容は参照によって本明細書に援用される。コンピューターで読み取り可能な書式の配列表コピー（ファイル名：ＡＰＶＯ＿０５７＿０３ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、保存日：２０１８年７月２０日、ファイルサイズ：２６０キロバイト）。
【０００３】
開示の分野
本開示は、トロホブラスト糖タンパク質（trophoblast glycoprotein）（５Ｔ４）に特異的に結合する分子に関する。これらの分子は、ヒト型化された５Ｔ４結合ドメインを少なくとも１つ有し得る。これらの分子は、５Ｔ４の発現を特徴とする障害（例えば、がん）の特性評価や治療に有用である。５Ｔ４に結合するタンパク質治療薬は、単一特異性のタンパク質治療薬である場合と、多特異性のタンパク質治療薬である場合がある。本開示はまた、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー９（tumor necrosis factor receptor superfamily member 9）（４−１ＢＢまたはＣＤ１３７）に特異的に結合するタンパク質治療薬に関する。多特異性のタンパク質治療薬が、５Ｔ４発現細胞と、エフェクター細胞上に発現された４−１ＢＢと、の両方に結合することで、エフェクター細胞の活性化、増殖、および／またはエフェクター細胞を介した細胞毒性が増強され得る。
【背景技術】
【０００４】
５Ｔ４（別名：トロホブラスト糖タンパク質、ＴＰＢＧ、Ｍ６Ｐ１、およびＷａｉｆ１）は、詳細な定義がなされている腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）であり、マンチェスター大学のＰｅｔｅｒ  Ｓｔｅｒｎ教授によって最初に同定された（Hole and Stern, 1988）。５Ｔ４は、非小細胞肺がん、腎がん、膵がん、前立腺がん、乳がん、結腸直腸がん、胃がん、卵巣がん、および子宮頚がんをはじめとする種々の悪性腫瘍、並びに急性リンパ性白血病の患者において高い割合で発現されている癌胎児性抗原であり、腫瘍始原細胞で発現されていることも示されている（Castro et al., 2012; Damelin et al., 2011; Elkord et al., 2009; Southall et al., 1990）。
【０００５】
胎盤や特殊な上皮など、いくつかの健常組織で低レベルの５Ｔ４発現が検出されているが、腫瘍における発現レベルはそれよりもかなり高い。
【０００６】
５Ｔ４がＣＸＣＲ４の機能活性を制御することを示唆するデータがある（Castro et al., 2012; Southgate et al., 2010）。５Ｔ４に結合する抗体または５Ｔ４のノックダウンは、腫瘍の成長および転移に関与する経路である、ＣＸＣＲ４を介した細胞遊走の阻害をもたらした。すなわち、５Ｔ４の標的化は、様々ながんの治療において、治療上の利点を与える可能性がある。現在、５Ｔ４を特異的に標的とする、またはそれと特異的に結合する、ＦＤＡに認可された治療薬は存在しない。５Ｔ４が発現される悪性腫瘍を治療するための新規治療薬が必要とされている。
【０００７】
４−１ＢＢ（別名：ＣＤ１３７またはＴＮＦＲＳＦ９）は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーのメンバーである。４−１ＢＢは、活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞、活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、樹状細胞（ＤＣ）、単球、マスト細胞、好酸球、および腫瘍血管内皮細胞をはじめとする様々な細胞集団上に発現されている。４−１ＢＢの活性化は受容体のオリゴマー化に依存しており（Rabu et al., 2005; Wyzgol et al., 2009）、このオリゴマー化は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）および他の細胞型の細胞表面上に三量体として発現される４−１ＢＢＬ（別名：ＣＤ１３７Ｌ）への結合により誘導される。ＣＤ８＋Ｔ細胞上の４−１ＢＢの活性化は、ＣＤ８＋Ｔ細胞のエフェクター機能を持続および増強し、Ｔｈ１型サイトカイン産生を選択的に補助する（Shuford et al., 1997; Lee et al., 2002; Pulle et al., 2006）。ＣＤ４＋Ｔ細胞上の４−１ＢＢの活性化では、４−１ＢＢ刺激がまず活性化を引き起こして、その後、この活性化により細胞死が誘導されるが、このことは、４−１ＢＢ作動薬抗体が自己免疫だけでなく腫瘍免疫においても治療効果を示した理由を説明していると考えられる（Zhang, JCI, 2007; Sun, Trends Mol Med, 2003）。４−１ＢＢの活性化は、Ｔｒｅｇの機能を抑制したり、あるいはＴｒｅｇを細胞傷害性ＣＤ４＋Ｔ細胞に変換することも報告されている（Akhmetzyanova et al., 2016; So et al., 2008）。
【０００８】
Ｔ細胞上に発現しＴ細胞のエフェクター機能を調節していることに加え、４−１ＢＢは、ＣＤ１６やサイトカインで活性化されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上でも発現上昇している。４−１ＢＢの活性化は、マウス細胞およびヒト細胞の両方で、ＮＫ細胞の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を増加させることが示されている（Kohrt 2012 and 2014 J Clin Invest、Hout 2012, Oncoimmによるレビュー）。さらに、ＤＣおよびマクロファージなどのＡＰＣ上に発現された４−１ＢＢの活性化は、免疫活性化の誘導および／または調節も引き起こし得る。
【０００９】
免疫細胞活性化の調節における４−１ＢＢの役割は、４−１ＢＢが、複数種のがんの治療において好ましい免疫治療標的になり得ることを示唆している。実際に、２種類の４−１ＢＢ抗体が臨床開発中である：ブリストル・マイヤーズスクイブ社によって開発されたウレルマブ（ＢＭＳ−６６５１３）、およびファイザー社によって開発されたＰＦ−０５０８２５６６。それぞれの抗体について、様々な適応症で第Ｉ相試験および第ＩＩ相試験が進行中である。しかし、４−１ＢＢの活性化後、患者およびマウスモデルにおいて、肝臓および皮膚における毒性が確認されている（Ascierto et al., 2010; Dubrot et al., 2010; Niu et al., 2007）。さらに、転移性黒色腫における第二選択療法としてウレルマブを用いる第ＩＩ相試験が、肝臓における毒性を原因に２００９年に中止された（Garber et al., 2011; Li and Liu, 2013）。
【００１０】
すなわち、当該技術分野では、適応となる腫瘍の治療で使用するための、安全且つ効果的に４−１ＢＢを活性化する治療薬が必要とされている。
【発明の概要】
【００１１】
いくつかの態様において、本開示は、５Ｔ４および／または４−１ＢＢに特異的に結合する多特異性ポリペプチドに関する。いくつかの実施形態では、本開示の５Ｔ４結合ドメインが、ヒト５Ｔ４の細胞外ドメインに結合する。特定の実施形態では、本開示の４−１ＢＢ結合ドメインが、ヒト４−１ＢＢの細胞外ドメインに結合する。いくつかの実施形態において、本開示は、ヒト５Ｔ４に特異的に結合する５Ｔ４結合ドメインと４−１ＢＢ結合ドメインとを含む多特異性ポリペプチドであって、前記５Ｔ４結合ドメインは、（ｉ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域と、（ｉｉ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域と、を含み、（ａ）前記ＨＣＤＲ１は配列番号３０のアミノ酸配列を含み；（ｂ）前記ＨＣＤＲ２は配列番号３２のアミノ酸配列を含み；（ｃ）前記ＨＣＤＲ３は配列番号３４のアミノ酸配列を含み；（ｄ）前記ＬＣＤＲ１は配列番号４２のアミノ酸配列を含み；（ｅ）前記ＬＣＤＲ２は配列番号１０のアミノ酸配列を含み；（ｆ）前記ＬＣＤＲ３は配列番号３６のアミノ酸配列を含む、前記多特異性ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、上記の各ＣＤＲ配列を含む前記５Ｔ４結合ドメインは、配列番号３８および４６からなる群から選択される配列に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、前記５Ｔ４結合ドメインは、配列番号３８および４６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。他の実施形態では、上記の各ＣＤＲ配列を含む前記５Ｔ４結合ドメインは、配列番号４４、４８、および５０からなる群から選択される配列に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、前記５Ｔ４結合ドメインは、配列番号４４、４８、および５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。他の実施形態では、上記の各ＣＤＲ配列を含む前記５Ｔ４結合ドメインは、ｉ）配列番号３８に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４４に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含むか；ｉｉ）配列番号４６に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４８に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含むか；ｉｉｉ）配列番号４６に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む。いくつかの実施形態では、前記５Ｔ４結合ドメインは、ｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含むか；または、ｉｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含むか；または、ｉｉｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む。
【００１２】
特定の態様では、本開示は、ヒト５Ｔ４に特異的に結合する５Ｔ４結合ドメインとヒト４−１ＢＢに特異的に結合する４−１ＢＢ結合ドメインとを含む多特異性ポリペプチドであって、前記４−１ＢＢ結合ドメインおよび前記５Ｔ４結合ドメインはそれぞれ、（ｉ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）と；（ｉｉ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）と、を含み、前記５Ｔ４結合ドメインの前記ＶＨ領域および／または前記ＶＬ領域は、フレームワーク領域に１または複数の変異を含んでおり；前記５Ｔ４結合ドメインは、（ａ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１と；（ｂ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２と；（ｃ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３と；（ｄ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１と；（ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２と；（ｆ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３と、を含む、前記多特異性ポリペプチドを包含する。いくつかの実施形態では、上記の各ＣＤＲ配列を含む前記５Ｔ４結合ドメインは、配列番号３８に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。１つの実施形態では、前記５Ｔ４結合ドメインは、配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、上記の各ＣＤＲ配列を含む前記５Ｔ４結合ドメインは、配列番号４０に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、前記５Ｔ４結合ドメインは、配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、上記の各ＣＤＲ配列を含む前記５Ｔ４結合ドメインは、配列番号３８に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４０に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む。いくつかの実施形態では、５Ｔ４結合ドメインは、配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む。
【００１３】
本開示はさらに、ヒト５Ｔ４に特異的に結合する５Ｔ４結合ドメインとヒト４−１ＢＢに特異的に結合する４−１ＢＢ結合ドメインとを含む多特異性ポリペプチドであって、前記４−１ＢＢ結合ドメインおよび前記５Ｔ４結合ドメインはそれぞれ、（ｉ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）と；（ｉｉ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）と、を含み、前記４−１ＢＢ結合ドメインの前記ＶＨ領域および／または前記ＶＬ領域は、フレームワーク領域に１または複数の変異を含んでおり；前記５Ｔ４結合ドメインは、（ａ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１と；（ｂ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２と；ｃ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３と；（ｄ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１と；（ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２と；（ｆ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３と、を含む、前記多特異性ポリペプチドを包含する。いくつかの実施形態では、上記の各ＣＤＲ配列を含む前記５Ｔ４結合ドメインは、配列番号３８および４６からなる群から選択される配列に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、前記５Ｔ４結合ドメインは、配列番号３８および４６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、上記の各ＣＤＲ配列を含む前記５Ｔ４結合ドメインは、配列番号４４、４８、および５０からなる群から選択される配列に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの態様において、前記５Ｔ４結合ドメインは、配列番号４４、４８、および５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、上記の各ＣＤＲ配列を含む前記５Ｔ４結合ドメインは、ｉ）配列番号３８に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４４に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含むか；ｉｉ）配列番号４６に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４８に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含むか；ｉｉｉ）配列番号４６に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５０に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む。いくつかの実施形態では、前記５Ｔ４結合ドメインは、ｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含むか；または、ｉｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含むか；または、ｉｉｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む。
【００１４】
いくつかの態様において、本開示は、ヒト５Ｔ４に特異的に結合する５Ｔ４結合ドメインとヒト４−１ＢＢに特異的に結合する４−１ＢＢ結合ドメインとを含む多特異性ポリペプチドであって、前記４−１ＢＢ結合ドメインおよび前記５Ｔ４結合ドメインはそれぞれ、（ｉ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）と；（ｉｉ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）と、を含み、前記４−１ＢＢ結合ドメインの前記ＶＨ領域および／または前記ＶＬ領域は、フレームワーク領域に１または複数の変異を含んでおり；前記５Ｔ４結合ドメインは、（ａ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１と；（ｂ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２と；ｃ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３と；（ｄ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１と；（ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２と；（ｆ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３と、を含む、前記多特異性ポリペプチドを包含する。特定の実施形態では、上記の各ＣＤＲ配列を含む前記５Ｔ４結合ドメインは、配列番号５６に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの態様において、前記５Ｔ４結合ドメインは、配列番号５６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、上記の各ＣＤＲ配列を含む前記５Ｔ４結合ドメインは、配列番号５８に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、前記５Ｔ４結合ドメインは、配列番号５８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、上記の各ＣＤＲ配列を含む前記５Ｔ４結合ドメインは、配列番号５６に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５８に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む。いくつかの実施形態では、５Ｔ４結合ドメインは、配列番号５６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む。
【００１５】
本開示はまた、ヒト５Ｔ４に特異的に結合する５Ｔ４結合ドメインとヒト４−１ＢＢに特異的に結合する４−１ＢＢ結合ドメインとを含む多特異性ポリペプチドであって、前記４−１ＢＢ結合ドメインおよび前記５Ｔ４結合ドメインはそれぞれ、（ｉ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）と；（ｉｉ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）と、を含み、前記４−１ＢＢ結合ドメインの前記ＶＨ領域および／または前記ＶＬ領域は、フレームワーク領域に１または複数の変異を含んでおり；前記５Ｔ４結合ドメインは、（ａ）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１と；（ｂ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２と；ｃ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３と；（ｄ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１と；（ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２と；（ｆ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３と、を含む、前記多特異性ポリペプチドを包含する。特定の実施形態では、上記の各ＣＤＲ配列を含む前記５Ｔ４結合ドメインは、配列番号６４に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、前記５Ｔ４結合ドメインは、配列番号６４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。特定の態様では、上記の各ＣＤＲ配列を含む前記５Ｔ４結合ドメインは、配列番号５８に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、前記５Ｔ４結合ドメインは、配列番号５８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、上記の各ＣＤＲ配列を含む前記５Ｔ４結合ドメインは、配列番号６４に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５８に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む。いくつかの実施形態では、５Ｔ４結合ドメインは、配列番号６４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む。
【００１６】
特定の態様では、本開示は、ヒト４−１ＢＢに特異的に結合する４−１ＢＢ結合ドメインを含む多特異性ポリペプチドを提供する。本開示はまた、４−１ＢＢ結合ドメインと５Ｔ４結合ドメインとを含み、前記４−１ＢＢ結合ドメインが結合ドメインリンカーを介して前記５Ｔ４結合ドメインに結合している、多特異性ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、多特異性ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、（ｉ）５Ｔ４結合ドメインと、（ｉｉ）結合ドメインリンカーと、（ｉｉｉ）４−１ＢＢ結合ドメインと、を含む。特定の態様では、前記５Ｔ４結合ドメインは、単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）である。いくつかの実施形態では、前記ｓｃＦｖの軽鎖可変領域は、前記ｓｃＦｖの重鎖可変領域のカルボキシ末端側である。他の実施形態では、前記ｓｃＦｖの軽鎖可変領域は、前記ｓｃＦｖの重鎖可変領域のアミノ末端側である。特定の態様では、前記ｓｃＦｖは、リンカーポリペプチドを含む。いくつかの例で、前記リンカーポリペプチドは、前記ｓｃＦｖの軽鎖可変領域と重鎖可変領域との間に存在する。特定の実施形態では、前記リンカーポリペプチドは、Ｇｌｙ４Ｓｅｒリンカーを含む。いくつかの実施形態では、前記リンカーポリペプチドは、ｎ＝１〜５である式（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎを含む。いくつかの態様において、前記リンカーポリペプチドは、配列番号８５〜１０８から選択されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、前記リンカーポリペプチドは、配列番号９８に記載のアミノ酸配列（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）を含む。
【００１７】
特定の実施形態では、上記の各ＣＤＲ配列を含むｓｃＦｖは、配列番号１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、および１７０からなる群から選択されるアミノ酸配列に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、および１７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１８】
いくつかの態様において、本開示は、ヒト４−１ＢＢに特異的に結合する４−１ＢＢ結合ドメインと５Ｔ４結合ドメインとを含む多特異性ポリペプチドであって、前記４−１ＢＢ結合ドメインは、（ｉ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）と、（ｉｉ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）と、を含み、（ａ）前記ＨＣＤＲ１は配列番号２のアミノ酸配列を含み；（ｂ）前記ＨＣＤＲ２は配列番号４のアミノ酸配列を含み；（ｃ）前記ＨＣＤＲ３は配列番号６のアミノ酸配列を含み；（ｄ）前記ＬＣＤＲ１は配列番号８のアミノ酸配列を含み；（ｅ）前記ＬＣＤＲ２は配列番号１０のアミノ酸配列を含み；（ｆ）前記ＬＣＤＲ３は配列番号１２のアミノ酸配列を含む、前記多特異性ポリペプチドを提供する。特定の実施形態では、上記の各ＣＤＲ配列を含む前記４−１ＢＢ結合ドメインは、配列番号１４に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、前記４−１ＢＢ結合ドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、上記の各ＣＤＲ配列を含む前記４−１ＢＢ結合ドメインは、配列番号１６に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、前記４−１ＢＢ結合ドメインは、配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、上記の各ＣＤＲ配列を含む前記４−１ＢＢ結合ドメインは、配列番号１４に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１６に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む。いくつかの態様において、４−１ＢＢ結合ドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む。
【００１９】
本開示はさらに、ヒト５Ｔ４に特異的に結合する５Ｔ４結合ドメインと４−１ＢＢ結合ドメインとを含む多特異性ポリペプチドであって、前記４−１ＢＢ結合ドメインは、（ｉ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）と；（ｉｉ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）と、を含み、前記４−１ＢＢ結合ドメインの前記ＶＨ領域および／または前記ＶＬ領域は、フレームワーク領域に１または複数の変異を含んでおり、前記４−１ＢＢ結合ドメインは、（ａ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１と；（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２と；（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３と；（ｄ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１と；（ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２と；（ｆ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３と、を含む、前記多特異性ポリペプチドを包含する。特定の実施形態では、上記の各ＣＤＲ配列を含む前記４−１ＢＢ結合ドメインは、配列番号２０に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、前記４−１ＢＢ結合ドメインは、配列番号２０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、上記の各ＣＤＲ配列を含む前記４−１ＢＢ結合ドメインは、配列番号２２に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、前記４−１ＢＢ結合ドメインは、配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、上記の各ＣＤＲ配列を含む前記４−１ＢＢ結合ドメインは、配列番号２０に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２２に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む。いくつかの実施形態では、４−１ＢＢ結合ドメインは、配列番号２０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む。
【００２０】
本開示はまた、ヒト５Ｔ４に特異的に結合する５Ｔ４結合ドメインと４−１ＢＢ結合ドメインとを含む多特異性ポリペプチドであって、前記４−１ＢＢ結合ドメインが、（ｉ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）と；（ｉｉ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）と、を含み、前記４−１ＢＢ結合ドメインの前記ＶＨ領域および／または前記ＶＬ領域は、フレームワーク領域に１または複数の変異を含んでおり、前記４−１ＢＢ結合ドメインは、（ａ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１と；（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２と；（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３と；（ｄ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１と；（ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２と；（ｆ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３と、を含む、前記多特異性ポリペプチドを包含する。特定の実施形態では、上記の各ＣＤＲ配列を含む前記４−１ＢＢ結合ドメインは、配列番号２６に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、前記４−１ＢＢ結合ドメインは、配列番号２６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、上記の各ＣＤＲ配列を含む前記４−１ＢＢ結合ドメインは、配列番号１６に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、前記４−１ＢＢ結合ドメインは、配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、上記の各ＣＤＲ配列を含む前記４−１ＢＢ結合ドメインは、配列番号２６に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１６に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む。いくつかの実施形態では、４−１ＢＢ結合ドメインは、配列番号２６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む。
【００２１】
特定の実施形態では、本開示は、４−１ＢＢ結合ドメインを含み、前記４−１ＢＢ結合ドメインが単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）である、多特異性ポリペプチドを提供する。いくつかの態様では、前記ｓｃＦｖの軽鎖可変領域は、前記ｓｃＦｖの重鎖可変領域のカルボキシ末端側である。他の態様では、前記ｓｃＦｖの軽鎖可変領域は、前記ｓｃＦｖの重鎖可変領域のアミノ末端側である。特定の態様では、前記ｓｃＦｖは、リンカーポリペプチドを含む。いくつかの例で、前記リンカーポリペプチドは、前記ｓｃＦｖの軽鎖可変領域と重鎖可変領域との間に存在する。特定の実施形態では、前記リンカーポリペプチドは、Ｇｌｙ４Ｓｅｒリンカーを含む。いくつかの実施形態では、前記リンカーポリペプチドは、ｎ＝１〜５である式（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎを含む。いくつかの態様において、前記リンカーポリペプチドは、配列番号８５〜１０８から選択されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、前記リンカーポリペプチドは、配列番号９８に記載のアミノ酸配列（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）を含む。特定の態様では、本開示の多特異性ポリペプチドは、結合ドメインリンカーを介して５Ｔ４結合ドメインに連結されている４−１ＢＢ結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、多特異性ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、（ｉ）前記５Ｔ４結合ドメインと、（ｉｉ）結合ドメインリンカーと、（ｉｉｉ）前記４−１ＢＢ結合ドメインと、を含む。
【００２２】
いくつかの実施形態では、上記の各ＣＤＲ配列を含む前記４−１ＢＢ結合ドメインは、配列番号１１０、１１２、１１４、および１１６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。特定の実施形態では、前記４−１ＢＢ結合ドメインは、配列番号１１０、１１２、１１４、および１１６からなる群から選択される配列を含む。
【００２３】
特定の態様では、本開示の多特異性ポリペプチドは、薬剤または毒素と複合化した４−１ＢＢ結合ドメインを含む。
【００２４】
本開示はさらに、免疫グロブリン定常領域に融合または複合化した５Ｔ４結合ドメインを含む多特異性ポリペプチドを提供する。免疫グロブリン定常領域はヒトＦｃドメインであってもよい。いくつかの実施形態では、前記ヒトＦｃドメインは、配列番号１５８または配列番号１６０に記載の配列を含む。特定の実施形態では、本開示は、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、（ｉ）５Ｔ４結合ドメインと、（ｉｉ）ヒンジ領域と、（ｉｉｉ）免疫グロブリン定常領域と、（ｉｖ）結合ドメインリンカーと、（ｖ）４−１ＢＢ結合ドメインと、を含む、多特異性ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、前記結合ドメインリンカーは、Ｇｌｙ４Ｓｅｒ配列を含む。いくつかの例で、前記結合ドメインリンカーは、ｎ＝１〜５である式（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎを含む。いくつかの態様において、前記結合ドメインリンカーは、配列番号８５〜１０８から選択されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、前記結合ドメインリンカーは、配列番号１０７に記載のアミノ酸配列（ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＰＳ）を含む。
【００２５】
いくつかの態様において、本開示はまた、第一ｓｃＦｖドメインと第二ｓｃＦｖドメインとを含む多特異性ポリペプチドであって、前記第一ｓｃＦｖドメインおよび第二ｓｃＦｖドメインは結合ドメインリンカー、または結合ドメインリンカーおよび免疫グロブリンＦｃドメインによって連結されており、前記免疫グロブリンＦｃドメインはヒンジ領域と免疫グロブリン定常領域とを含み；前記第二ｓｃＦｖドメインは、ヒト４−１ＢＢに特異的に結合し、（ｉ）配列番号２、１８、２４からなる群から選択されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号４のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号６のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域と；（ｉｉ）配列番号８のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１０のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号１２のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域と、を含み、前記第一ｓｃＦｖドメインおよび第二ｓｃＦｖドメインは結合ドメインリンカーによってまたは結合ドメインリンカーおよび免疫グロブリンＦｃドメインによって結合しており、前記免疫グロブリンＦｃドメインはヒンジ領域と免疫グロブリン定常領域とを含む、前記多特異性ポリペプチドを提供する。特定の実施形態では、このポリペプチドは、配列番号１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、および１５６からなる群から選択される配列に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、前記ポリペプチドは、配列番号１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、および１５６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ポリペプチドは、配列番号１３６、１３８、および１４６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２６】
いくつかの実施形態では、前記多特異性ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、（ｉ）前記第一ｓｃＦｖドメインと、（ｉｉ）結合ドメインリンカーと、（ｉｉｉ）前記第二結合ドメインと、を含む。他の実施形態では、前記多特異性ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、（ｉ）前記第二ｓｃＦｖドメインと、（ｉｉ）結合ドメインリンカーと、（ｉｉｉ）前記第一ｓｃＦｖドメインと、を含む。特定の態様では、前記多特異性ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、（ｉ）前記第一ｓｃＦｖドメインと、（ｉｉ）ヒンジ領域と、（ｉｉｉ）免疫グロブリン定常領域と、（ｉｖ）結合ドメインリンカーと、（ｖ）前記第二ｓｃＦｖドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、前記結合ドメインリンカーは、Ｇｌｙ４Ｓｅｒ配列を含む。いくつかの実施形態では、前記結合ドメインリンカーは、ｎ＝１〜５である式（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎを含む。特定の態様では、前記結合ドメインリンカーは、配列番号８５〜１０８から選択されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、前記結合ドメインリンカーは、配列番号１０７に記載のアミノ酸配列（ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＰＳ）を含む。いくつかの実施形態では、多特異性ポリペプチドの第二ｓｃＦｖドメインは、（ａ）配列番号２に記載のＨＣＤＲ１アミノ酸配列と；（ｂ）配列番号４に記載のＨＣＤＲ２アミノ酸配列と；（ｃ）配列番号６に記載のＨＣＤＲ３アミノ酸配列と；（ｄ）配列番号８に記載のＬＣＤＲ１アミノ酸配列と；（ｅ）配列番号１０に記載のＬＣＤＲ２アミノ酸配列と；（ｆ）配列番号１２に記載のＬＣＤＲ３アミノ酸配列と、を含む。他の実施形態では、多特異性ポリペプチドの第二ｓｃＦｖドメインは、（ａ）配列番号２４に記載のＨＣＤＲ１アミノ酸配列と；（ｂ）配列番号４に記載のＨＣＤＲ２アミノ酸配列と；（ｃ）配列番号６に記載のＨＣＤＲ３アミノ酸配列と；（ｄ）配列番号８に記載のＬＣＤＲ１アミノ酸配列と；（ｅ）配列番号１０に記載のＬＣＤＲ２アミノ酸配列と；（ｆ）配列番号１２に記載のＬＣＤＲ３アミノ酸配列と、を含む。いくつかの実施形態では、多特異性ポリペプチドの第二ｓｃＦｖドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１６の軽鎖可変領域と、を含む。他の実施形態では、多特異性ポリペプチドの第二ｓｃＦｖドメインは、配列番号２０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２２の軽鎖可変領域と、を含む。いくつかの実施形態では、多特異性ポリペプチドの第二ｓｃＦｖドメインは、配列番号２６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１６の軽鎖可変領域と、を含む。他の実施形態では、多特異性ポリペプチドの第二ｓｃＦｖドメインは、配列番号２８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１６の軽鎖可変領域と、を含む。
【００２７】
本開示はさらに、第一ｓｃＦｖドメインと第二ｓｃＦｖドメインとを含む多特異性ポリペプチドであって、前記第一ｓｃＦｖドメインおよび第二ｓｃＦｖドメインは結合ドメインリンカー、または結合ドメインリンカーおよび免疫グロブリンＦｃドメインによって連結されており、前記免疫グロブリンＦｃドメインはヒンジ領域と免疫グロブリン定常領域とを含み；前記第二ｓｃＦｖドメインはヒト４−１ＢＢに特異的に結合し；前記第一ｓｃＦｖドメインは、（ｉ）配列番号３０、５２、および６０からなる群から選択されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号３２および６２からなる群から選択されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号３４のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域と；（ｉｉ）配列番号８、４２、および５４からなる群から選択されるＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１０のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号３６のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域と、を含み；前記第二ｓｃＦｖドメインは、（ｉ）配列番号２、１８、２４からなる群から選択されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号４のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号６のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域と；（ｉｉ）配列番号８のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１０のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号１２のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域と、を含み、前記第一ｓｃＦｖドメインおよび第二ｓｃＦｖドメインは結合ドメインリンカーによってまたは結合ドメインリンカーおよび免疫グロブリンＦｃドメインによって結合しており、前記免疫グロブリンＦｃドメインはヒンジ領域と免疫グロブリン定常領域とを含む、前記多特異性ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、第二ｓｃＦｖドメインは、（ａ）配列番号２に記載のＨＣＤＲ１アミノ酸配列と；（ｂ）配列番号４に記載のＨＣＤＲ２アミノ酸配列と；（ｃ）配列番号６に記載のＨＣＤＲ３アミノ酸配列と；（ｄ）配列番号８に記載のＬＣＤＲ１アミノ酸配列と；（ｅ）配列番号１０に記載のＬＣＤＲ２アミノ酸配列と；（ｆ）配列番号１２に記載のＬＣＤＲ３アミノ酸配列と、を含む。特定の実施形態では、第一ｓｃＦｖドメインは、（ａ）配列番号３０に記載のＨＣＤＲ１アミノ酸配列と；（ｂ）配列番号３２に記載のＨＣＤＲ２アミノ酸配列と；（ｃ）配列番号３４に記載のＨＣＤＲ３アミノ酸配列と；（ｄ）配列番号８に記載のＬＣＤＲ１アミノ酸配列と；（ｅ）配列番号１０に記載のＬＣＤＲ２アミノ酸配列と；（ｆ）配列番号３６に記載のＬＣＤＲ３アミノ酸配列と、を含む。いくつかの実施形態では、第一ｓｃＦｖドメインは、（ａ）配列番号３０に記載のＨＣＤＲ１アミノ酸配列と；（ｂ）配列番号３２に記載のＨＣＤＲ２アミノ酸配列と；（ｃ）配列番号３４に記載のＨＣＤＲ３アミノ酸配列と；（ｄ）配列番号４２に記載のＬＣＤＲ１アミノ酸配列と；（ｅ）配列番号１０に記載のＬＣＤＲ２アミノ酸配列と；（ｆ）配列番号３６に記載のＬＣＤＲ３アミノ酸配列と、を含む。特定の態様では、第一ｓｃＦｖドメインは、（ａ）配列番号３０に記載のＨＣＤＲ１アミノ酸配列と；（ｂ）配列番号３２に記載のＨＣＤＲ２アミノ酸配列と；（ｃ）配列番号３４に記載のＨＣＤＲ３アミノ酸配列と；（ｄ）配列番号４２に記載のＬＣＤＲ１アミノ酸配列と；（ｅ）配列番号１０に記載のＬＣＤＲ２アミノ酸配列と；（ｆ）配列番号３６に記載のＬＣＤＲ３アミノ酸配列と、を含む。いくつかの実施形態では、第一ｓｃＦｖドメインは、（ａ）配列番号５２に記載のＨＣＤＲ１アミノ酸配列と；（ｂ）配列番号３２に記載のＨＣＤＲ２アミノ酸配列と；（ｃ）配列番号３４に記載のＨＣＤＲ３アミノ酸配列と；（ｄ）配列番号５４に記載のＬＣＤＲ１アミノ酸配列と；（ｅ）配列番号１０に記載のＬＣＤＲ２アミノ酸配列と；（ｆ）配列番号３６に記載のＬＣＤＲ３アミノ酸配列と、を含む。いくつかの実施形態では、第一ｓｃＦｖドメインは、（ａ）配列番号６０に記載のＨＣＤＲ１アミノ酸配列と；（ｂ）配列番号６２に記載のＨＣＤＲ２アミノ酸配列と；（ｃ）配列番号３４に記載のＨＣＤＲ３アミノ酸配列と；（ｄ）配列番号５４に記載のＬＣＤＲ１アミノ酸配列と；（ｅ）配列番号１０に記載のＬＣＤＲ２アミノ酸配列と；（ｆ）配列番号３６に記載のＬＣＤＲ３アミノ酸配列と、を含む。特定の実施形態では、いくつかの実施形態では、第二ｓｃＦｖドメインは、（ａ）配列番号１８に記載のＨＣＤＲ１アミノ酸配列と；（ｂ）配列番号４に記載のＨＣＤＲ２アミノ酸配列と；（ｃ）配列番号６に記載のＨＣＤＲ３アミノ酸配列と；（ｄ）配列番号８に記載のＬＣＤＲ１アミノ酸配列と；（ｅ）配列番号１０に記載のＬＣＤＲ２アミノ酸配列と；（ｆ）配列番号１２に記載のＬＣＤＲ３アミノ酸配列と、を含む。いくつかの実施形態では、第一ｓｃＦｖドメインは、（ａ）配列番号３０に記載のＨＣＤＲ１アミノ酸配列と；（ｂ）配列番号３２に記載のＨＣＤＲ２アミノ酸配列と；（ｃ）配列番号３４に記載のＨＣＤＲ３アミノ酸配列と；（ｄ）配列番号４２に記載のＬＣＤＲ１アミノ酸配列と；（ｅ）配列番号１０に記載のＬＣＤＲ２アミノ酸配列と；（ｆ）配列番号３６に記載のＬＣＤＲ３アミノ酸配列と、を含む。いくつかの実施形態では、第二ｓｃＦｖドメインは、（ａ）配列番号２４に記載のＨＣＤＲ１アミノ酸配列と；（ｂ）配列番号４に記載のＨＣＤＲ２アミノ酸配列と；（ｃ）配列番号６に記載のＨＣＤＲ３アミノ酸配列と；（ｄ）配列番号８に記載のＬＣＤＲ１アミノ酸配列と；（ｅ）配列番号１０に記載のＬＣＤＲ２アミノ酸配列と；（ｆ）配列番号１２に記載のＬＣＤＲ３アミノ酸配列と、を含む。いくつかの実施形態では、第一ｓｃＦｖドメインは、（ａ）配列番号５２に記載のＨＣＤＲ１アミノ酸配列と；（ｂ）配列番号３２に記載のＨＣＤＲ２アミノ酸配列と；（ｃ）配列番号３４に記載のＨＣＤＲ３アミノ酸配列と；（ｄ）配列番号５４に記載のＬＣＤＲ１アミノ酸配列と；（ｅ）配列番号１０に記載のＬＣＤＲ２アミノ酸配列と；（ｆ）配列番号３６に記載のＬＣＤＲ３アミノ酸配列と、を含む。いくつかの実施形態では、第二ｓｃＦｖドメインは、（ａ）配列番号２４に記載のＨＣＤＲ１アミノ酸配列と；（ｂ）配列番号４に記載のＨＣＤＲ２アミノ酸配列と；（ｃ）配列番号６に記載のＨＣＤＲ３アミノ酸配列と；（ｄ）配列番号８に記載のＬＣＤＲ１アミノ酸配列と；（ｅ）配列番号１０に記載のＬＣＤＲ２アミノ酸配列と；（ｆ）配列番号１２に記載のＬＣＤＲ３アミノ酸配列と、を含み、所望により、前記第一ｓｃＦｖドメインは、（ａ）配列番号３０に記載のＨＣＤＲ１アミノ酸配列と；（ｂ）配列番号３２に記載のＨＣＤＲ２アミノ酸配列と；（ｃ）配列番号３４に記載のＨＣＤＲ３アミノ酸配列と；（ｄ）配列番号８に記載のＬＣＤＲ１アミノ酸配列と；（ｅ）配列番号１０に記載のＬＣＤＲ２アミノ酸配列と；（ｆ）配列番号３６に記載のＬＣＤＲ３アミノ酸配列と、を含む。
【００２８】
本開示はまた、第一ｓｃＦｖドメインが、ｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４０のアミノ酸を含む軽鎖可変領域と、を含み、第二ｓｃＦｖドメインが、ｉｉ）配列番号１４のアミノ酸を含む重鎖可変領域と、配列番号１６の軽鎖可変領域と、を含む、多特異性ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、前記第一ｓｃＦｖドメインは、ｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４４のアミノ酸を含む軽鎖可変領域と、を含み、前記第二ｓｃＦｖドメインは、ｉｉ）配列番号１４のアミノ酸を含む重鎖可変領域と、配列番号１６の軽鎖可変領域と、を含む、多特異性ポリペプチドを提供する。特定の実施形態では、前記第一ｓｃＦｖドメインは、ｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４８のアミノ酸を含む軽鎖可変領域と、を含み、前記第二ｓｃＦｖドメインは、ｉｉ）配列番号１４のアミノ酸を含む重鎖可変領域と、配列番号１６の軽鎖可変領域と、を含む、多特異性ポリペプチドを提供する。他の実施形態では、前記第一ｓｃＦｖドメインは、ｉ）配列番号５６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５８のアミノ酸を含む軽鎖可変領域と、を含み、前記第二ｓｃＦｖドメインは、ｉｉ）配列番号１４のアミノ酸を含む重鎖可変領域と、配列番号１６の軽鎖可変領域と、を含む、多特異性ポリペプチドを提供する。特定の実施形態では、前記第一ｓｃＦｖドメインは、ｉ）配列番号６４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５８のアミノ酸を含む軽鎖可変領域と、を含み、前記第二ｓｃＦｖドメインは、ｉｉ）配列番号１４のアミノ酸を含む重鎖可変領域と、配列番号１６の軽鎖可変領域と、を含む、多特異性ポリペプチドを提供する。他の実施形態では、前記第一ｓｃＦｖドメインは、ｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５０のアミノ酸を含む軽鎖可変領域と、を含み、前記第二ｓｃＦｖドメインは、ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸を含む重鎖可変領域と、配列番号２２の軽鎖可変領域と、を含む、多特異性ポリペプチドを提供する。さらに他の実施形態では、前記第一ｓｃＦｖドメインは、ｉ）配列番号５６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５８のアミノ酸を含む軽鎖可変領域と、を含み、前記第二ｓｃＦｖドメインは、ｉｉ）配列番号２６のアミノ酸を含む重鎖可変領域と、配列番号１６の軽鎖可変領域と、を含む、多特異性ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、前記第一ｓｃＦｖドメインは、ｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号６８のアミノ酸を含む軽鎖可変領域と、を含み、前記第二ｓｃＦｖドメインは、ｉｉ）配列番号２８のアミノ酸を含む重鎖可変領域と、配列番号１６の軽鎖可変領域と、を含む、多特異性ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、前記第一ｓｃＦｖドメインは、ｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号７０のアミノ酸を含む軽鎖可変領域と、を含み、前記第二ｓｃＦｖドメインは、ｉｉ）配列番号２８のアミノ酸を含む重鎖可変領域と、配列番号１６の軽鎖可変領域と、を含む、多特異性ポリペプチドを提供する。
【００２９】
いくつかの実施形態において、本開示はまた、第一ｓｃＦｖドメインと第二ｓｃＦｖドメインとを含む多特異性ポリペプチドであって、前記第一ｓｃＦｖドメインおよび第二ｓｃＦｖドメインは結合ドメインリンカー、または結合ドメインリンカーおよび免疫グロブリンＦｃドメインによって連結されており、前記免疫グロブリンＦｃドメインはヒンジ領域と免疫グロブリン定常領域とを含み；前記第一ｓｃＦｖドメインは、ヒト５Ｔ４に特異的に結合し、（ｉ）配列番号３０のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号３２のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号３４のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域と；（ｉｉ）配列番号４２のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１０のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号３６のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域と、を含む、前記多特異性ポリペプチドを提供する。
【００３０】
いくつかの実施形態では、前記第一ｓｃＦｖドメインは、ｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含むか；または、ｉｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含むか；または、ｉｉｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む。
【００３１】
いくつかの実施形態では、本開示は、第一ｓｃＦｖドメインと第二ｓｃＦｖドメインとを含む多特異性ポリペプチドであって、前記第一ｓｃＦｖドメインおよび第二ｓｃＦｖドメインは結合ドメインリンカー、または結合ドメインリンカーおよび免疫グロブリンＦｃドメインによって連結されており、前記免疫グロブリンＦｃドメインはヒンジ領域と免疫グロブリン定常領域とを含み；前記第一ｓｃＦｖドメインはヒト５Ｔ４に特異的に結合し、前記第二ｓｃＦｖドメインの前記ＶＨ領域および／または前記ＶＬ領域は、フレームワーク領域に１または複数の変異を含んでおり；前記第一ｓｃＦｖドメインは、（ａ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１と；（ｂ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２と；（ｃ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３と；（ｄ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１と；（ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２と；（ｆ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３と、を含む、前記多特異性ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、前記第一ｓｃＦｖドメインは、ｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含むか；または、ｉｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含むか；または、ｉｉｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む。
【００３２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の前記多特異性ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、（ｉ）前記第一ｓｃＦｖドメインと、（ｉｉ）結合ドメインリンカーと、（ｉｉｉ）前記第二結合ドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、前記多特異性ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、（ｉ）前記第二ｓｃＦｖドメインと、（ｉｉ）結合ドメインリンカーと、（ｉｉｉ）前記第一ｓｃＦｖドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、前記多特異性ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、（ｉ）前記第一ｓｃＦｖドメインと、（ｉｉ）ヒンジ領域と、（ｉｉｉ）免疫グロブリン定常領域と、（ｉｖ）結合ドメインリンカーと、（ｖ）前記第二ｓｃＦｖドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、前記結合ドメインリンカーは、Ｇｌｙ４Ｓｅｒ配列を含む。いくつかの実施形態では、前記結合ドメインリンカーは、ｎ＝１〜５である式（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎを含む。いくつかの実施形態において、前記結合ドメインリンカーは、配列番号８５〜１０８から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記結合ドメインリンカーは、配列番号１０７に記載のアミノ酸配列（ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＰＳ）を含む。
【００３３】
特定の態様では、本開示の多特異性ポリペプチドの前記第一ｓｃＦｖドメインは、ヒト５Ｔ４に特異的に結合し、配列番号１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、および１７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；前記第二ｓｃＦｖドメインは、ヒト４−１ＢＢに特異的に結合し、配列番号１１０、１１２、１１４、および１１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記第一ｓｃＦｖドメインは配列番号１１８に記載のアミノ酸配列を含み、前記第二ｓｃＦｖドメインは配列番号１１０に記載のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、前記第一ｓｃＦｖドメインは配列番号１２０に記載のアミノ酸配列を含み、前記第二ｓｃＦｖドメインは配列番号１１０に記載のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、前記第一ｓｃＦｖドメインは配列番号１２２に記載のアミノ酸配列を含み、前記第二ｓｃＦｖドメインは配列番号１１０に記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記第一ｓｃＦｖドメインは配列番号１２４に記載のアミノ酸配列を含み、前記第二ｓｃＦｖドメインは配列番号１１２に記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記第一ｓｃＦｖドメインは配列番号１２６に記載のアミノ酸配列を含み、前記第二ｓｃＦｖドメインは配列番号１１４に記載のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、前記第一ｓｃＦｖドメインは配列番号１２６に記載のアミノ酸配列を含み、前記第二ｓｃＦｖドメインは配列番号１１０に記載のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、前記第一ｓｃＦｖドメインは配列番号１２８に記載のアミノ酸配列を含み、前記第二ｓｃＦｖドメインは配列番号１１０に記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記第一ｓｃＦｖドメインは配列番号１７０に記載のアミノ酸配列を含み、前記第二ｓｃＦｖドメインは配列番号１１６に記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記第一ｓｃＦｖドメインは配列番号１３０に記載のアミノ酸配列を含み、前記第二ｓｃＦｖドメインは配列番号１１６に記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記第一ｓｃＦｖドメインは配列番号１３２に記載のアミノ酸配列を含み、前記第二ｓｃＦｖドメインは配列番号１１６に記載のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、前記第一ｓｃＦｖドメインは配列番号１３４に記載のアミノ酸配列を含み、前記第二ｓｃＦｖドメインは配列番号１１６に記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１７２、１７４、および１７６からなる群から選択される配列に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、多特異性ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、前記ポリペプチドは、配列番号１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１７２、１７４、および１７６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００３４】
いくつかの実施形態では、本開示は、５Ｔ４および４−１ＢＢに特異的に結合し、配列番号１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１７２、１７４、および１７６からなる群から選択される配列に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、多特異性ポリペプチドを提供する。特定の実施形態では、５Ｔ４および４−１ＢＢに特異的に結合する前記ポリペプチドは、配列番号１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１７２、１７４、および１７６からなる群から選択される配列に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ポリペプチドは、上記のそれぞれの配列番号と同じＣＤＲアミノ酸配列を含むか、または、前記ポリペプチドは、上記のそれぞれの配列番号との比較でただ１つのアミノ酸だけ異なるＣＤＲアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ポリペプチドは、配列番号１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１７２、１７４、および１７６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００３５】
本開示はさらに、第一ｓｃＦｖドメインが５Ｔ４の細胞外ドメインに結合し、第二ｓｃＦｖドメインが４−１ＢＢの細胞外ドメインに結合する、多特異性ポリペプチドを提供する。いくつかの態様において、前記ポリペプチドは、エフェクター細胞の活性化をもたらす。いくつかの態様において、本開示の多特異性ポリペプチドは、エフェクター細胞の活性化および／またはエフェクター細胞の増殖を増大させる。他の態様において、多特異性ポリペプチドは、エフェクター細胞依存性の、５Ｔ４発現細胞の溶解を増強する。いくつかの実施形態において、本開示の５Ｔ４結合ドメインは、５０ｎＭ未満のｋＤ値で５Ｔ４と結合できる。いくつかの態様において、５Ｔ４結合ドメインおよび／または４−１ＢＢ結合ドメインの軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域はヒト型化されている。
【００３６】
いくつかの実施形態では、本開示は、結合ドメインリンカーおよび免疫グロブリンＦｃドメインによって連結された第一単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）ドメインと第二ｓｃＦｖドメインとを含む多特異性ポリペプチドであって、前記免疫グロブリンＦｃドメインはヒンジ領域と免疫グロブリン定常領域とを含み；前記多特異性ポリペプチドは第二の同一の多特異性ポリペプチドとの結合によるホモ二量体の形成が可能であり；前記第一ｓｃＦｖドメインは、ヒト５Ｔ４に特異的に結合し、（ｉ）配列番号３０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）−１アミノ酸配列、配列番号３２のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号３４のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域と；（ｉｉ）配列番号４２の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）−１アミノ酸配列、配列番号１０のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号３６のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域と、を含み；前記第二ｓｃＦｖドメインは、ヒト４−１ＢＢに特異的に結合し、（ｉ）配列番号２のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号４のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号６のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域と；（ｉｉ）配列番号８のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１０のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号１２．２のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域と、を含む、前記多特異性ポリペプチドを提供する。アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、（ｉ）前記第一ｓｃＦｖドメインと、（ｉｉ）前記ヒンジ領域と、（ｉｉｉ）前記免疫グロブリン定常領域と、（ｉｖ）前記結合ドメインリンカーと、（ｖ）前記第二ｓｃＦｖドメインと、を含む、請求項１に記載の多特異性ポリペプチド。いくつかの実施形態では、前記第一ｓｃＦｖドメインは、配列番号１３０または１７０のフレームワーク領域との比較で、フレームワーク領域に変異を含む。いくつかの実施形態では、前記変異はジスルフィド結合の安定化をもたらす。
【００３７】
いくつかの実施形態では、多特異性ポリペプチドの前記第一ｓｃＦｖドメインは、配列番号３８の前記免疫グロブリン重鎖可変領域と配列番号４４の前記免疫グロブリン軽鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、多特異性ポリペプチドの前記第一ｓｃＦｖドメインは、配列番号４６の前記免疫グロブリン重鎖可変領域と配列番号４８の前記免疫グロブリン軽鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、多特異性ポリペプチドの前記第二ｓｃＦｖドメインは、配列番号１４の免疫グロブリン重鎖可変領域と配列番号１６の前記免疫グロブリン軽鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、前記多特異性ポリペプチドの前記第一ｓｃＦｖドメインは、配列番号４６の前記免疫グロブリン重鎖可変領域と配列番号４８の前記免疫グロブリン軽鎖可変領域とを含み、前記第二ｓｃＦｖドメインは、配列番号１４の前記免疫グロブリン重鎖可変領域と配列番号１６の前記免疫グロブリン軽鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、前記第一ｓｃＦｖドメインのアミノ酸配列は、配列番号１２０と少なくとも９７％同一であり、前記第二ｓｃＦｖドメインのアミノ酸配列は配列番号１１０と少なくとも９７％同一である。いくつかの実施形態では、前記ポリペプチドは、配列番号１７２と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むか、または、配列番号１７２と同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記第一ｓｃＦｖドメインのアミノ酸配列は、配列番号１２２と少なくとも９７％同一であり、前記第二ｓｃＦｖドメインのアミノ酸配列は配列番号１１０と少なくとも９７％同一である。いくつかの実施形態では、前記ポリペプチドは、配列番号１７４と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むか、または、配列番号１７４のアミノ酸配列を含む。
【００３８】
いくつかの実施形態では、前記多特異性ポリペプチドがエフェクター細胞に結合することで、エフェクター細胞の活性化の増大、エフェクター細胞の増殖の増大、がもたらされ、または、前記多特異性ポリペプチドがエフェクター細胞、５Ｔ４発現細胞に結合することで、エフェクター細胞依存性の５Ｔ４発現細胞の溶解の増強がもたらされる。
【００３９】
本開示はまた、それぞれが本開示に記載の多特異性ポリペプチドである、２つの同一のポリペプチドを含む二量体を包含する。
【００４０】
特定の態様では、本開示は、本開示に記載のポリペプチドまたはタンパク質と、薬剤的に許容できる担体、希釈剤、または賦形剤と、を含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、経口投与用単位剤形、静脈内投与用単位剤形、鼻腔内投与用単位剤形、坐剤用単位剤形、皮内投与用単位剤形、筋肉内投与用単位剤形、腹腔内投与用単位剤形、皮下投与用単位剤形、硬膜外投与用単位剤形、舌下投与用単位剤形、および脳内投与用単位剤形からなる群から選択される剤形の医薬組成物が製剤化され得る。経口投与用単位剤形の例としては、錠剤、丸剤、ペレット剤、カプセル剤、散剤、菓子錠剤、粒剤、水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤、徐放性製剤、エアゾール剤、および噴霧剤が挙げられるが、これらに限定はされない。
【００４１】
本開示はさらに、５Ｔ４を発現する細胞に対するエフェクター細胞の活性化を増強するための方法であって、前記５Ｔ４発現細胞を本開示のポリペプチドまたはタンパク質と接触させることを含み、前記接触が前記５Ｔ４発現細胞に対するエフェクター細胞の活性化の増強が誘導される条件下で行われる、前記方法を包含する。いくつかの態様において、本開示は、対象の５Ｔ４の発現を特徴とする障害を治療するための方法であって、前記対象に治療有効量の本開示のポリペプチドまたはタンパク質または医薬組成物を投与することを含む、前記方法を提供する。本開示はまた、対象の５Ｔ４の発現を特徴とする障害を治療するための医薬の製造における本開示のポリペプチドまたはタンパク質の使用を包含する。いくつかの実施形態では、本開示は、対象の５Ｔ４の発現を特徴とする障害の治療に使用される、本開示のポリペプチドまたはタンパク質に関する。いくつかの実施形態では、前記障害はがんである。特定の態様では、前記がんは、乳がん、膵がん、卵巣がん、非小細胞肺がん、中皮腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、マントル細胞白血病（mantle cell leukemia）（ＭＣＬ）、急性リンパ芽球白血病（ＡＬＬ）、扁平上皮癌、メラノーマ、副腎がん、膀胱がん、子宮頸がん、腎がん、胃がん、前立腺がん、甲状腺がん、肝臓がん、子宮がん、神経線維腫、肉腫、または頭頚部がんである。
【００４２】
いくつかの実施形態では、上記の方法で使用される多特異性ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、（ｉ）第一ｓｃＦｖドメインと、（ｉｉ）ヒンジ領域と、（ｉｉｉ）免疫グロブリン定常領域と、（ｉｖ）結合ドメインリンカーと、（ｖ）第二ｓｃＦｖドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、上記の方法で使用される多特異性ポリペプチドは、配列番号１４の免疫グロブリン重鎖可変領域および配列番号１６の免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む第二ｓｃＦｖドメインと、（ｉ）配列番号３８の免疫グロブリン重鎖可変領域および配列番号４４の免疫グロブリン軽鎖可変領域；または（ｉｉ）配列番号４６の免疫グロブリン重鎖可変領域および配列番号４８の免疫グロブリン軽鎖可変領域、を含む第一ｓｃＦｖドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、前記多特異性ポリペプチドの前記第二ｓｃＦｖドメインのアミノ酸配列は、配列番号１１０と少なくとも９７％同一であり、前記多特異性ポリペプチドの前記第一ｓｃＦｖドメインのアミノ酸配列は、配列番号１２０（２０９の場合、抗５Ｔ４  ｓｃＦｖ）または配列番号１２２と少なくとも９７％同一である。いくつかの実施形態では、配列番号２８を含む重鎖可変領域（variable heavy chain）および配列番号１６を含む軽鎖可変領域（variable light chain）を含む抗４−１ＢＢ抗体と、配列番号４６を含む重鎖可変領域および配列番号６６を含む軽鎖可変領域を含む抗５Ｔ４  ｓｃＦｖと、を含むＩｇＧ−ｓｃＦｖ構造体である第二の多特異性ポリペプチドと比較した場合に、前記ポリペプチドは、エフェクター細胞の活性化の統計的に有意な増強を示す。いくつかの実施形態では、配列番号２８を含む重鎖可変領域および配列番号１６を含む軽鎖可変領域を含む抗４−１ＢＢ抗体と、配列番号４６を含む重鎖可変領域および配列番号６６を含む軽鎖可変領域を含む抗５Ｔ４  ｓｃＦｖと、を含むＩｇＧ−ｓｃＦｖ構造体である第二の多特異性ポリペプチドと比較した場合に、前記ポリペプチドは、エフェクター細胞増殖の統計的に有意な増加を誘導する。
【００４３】
本開示のいくつかの態様は、本開示のポリペプチドをコードする単離された核酸分子を包含する。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１７１、１７３、および１７５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。本開示は、本明細書に記載の単離された核酸分子を含む発現ベクターを包含する。いくつかの実施形態では、前記発現ベクター内核酸分子は、宿主細胞における前記核酸セグメントの発現に好適な制御配列に作動可能なように連結されている。本開示は、本明細書に記載の発現ベクターを含む組換え宿主細胞を提供する。いくつかの態様において、本開示は、５Ｔ４結合ドメインを含むポリペプチドを製造するための方法であって、本明細書に記載の発現ベクターを含む組換え宿主細胞を、核酸セグメントが発現される条件下で培養することで、前記５Ｔ４結合ドメインを含むポリペプチドを産生させることを含む、前記方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】５Ｔ４（＋）細胞の存在下における、７種類のコンストラクト（ＡＬＧ．ＡＰＶ−００４、ＡＬＧ．ＡＰＶ−００６、ＡＬＧ．ＡＰＶ−０９９、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１２７、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１４８、およびＡＬＧ．ＡＰＶ−１５０）の、作動薬としての機能を示している。
【００４５】
【図２】７種類のｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖ分子（ＡＬＧ．ＡＰＶ−００６、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１７８、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１７９、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１８７、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１９１、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１９６、およびＡＬＧ．ＡＰＶ−１９８）の、ヒト４−１ＢＢを発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞株に対する結合曲線を示している。
【００４６】
【図３】７種類のｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖ分子（ＡＬＧ．ＡＰＶ−００６、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１７８、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１７９、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１８７、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１９１、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１９６、およびＡＬＧ．ＡＰＶ−１９８）の、カニクイザル４−１ＢＢを発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞株に対する結合曲線を示している。
【００４７】
【図４】７種類のｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖ分子（ＡＬＧ．ＡＰＶ−００６、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１７８、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１７９、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１８７、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１９１、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１９６、およびＡＬＧ．ＡＰＶ−１９８）の、ヒト５Ｔ４を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞株に対する結合曲線を示している。
【００４８】
【図５】ＣＨＯ−Ｋ１細胞株およびＳＫＯＶ−３細胞株におけるヒト５Ｔ４の発現レベルを示している。
【００４９】
【図６】コンストラクトＡＬＧ．ＡＰＶ−００６、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１７８、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１７９、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１８７、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１９６、およびＡＬＧ．ＡＰＶ−１９８の、ＳＫＯＶ−３細胞に対する結合曲線を示している。
【００５０】
【図７】ＡＬＧ．ＡＰＶ−００６、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１７８、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１７９、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１８７、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１９１、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１９６、およびＡＬＧ．ＡＰＶ−１９８の、カニクイザル５Ｔ４を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞株に対する結合曲線を示している。
【００５１】
【図８】抗５Ｔ４×抗４−１ＢＢコンストラクトの、４−１ＢＢレポーターアッセイにおける活性を示している。
【００５２】
【図９】抗５Ｔ４×抗４−１ＢＢコンストラクトの、ＰＢＭＣおよびＣＨＯ−Ｋ１の共培養物からのＩＦＮγ放出に対する影響を示している。
【００５３】
【図１０】ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖフォーマット（ＡＤＡＰＴＩＲ（商標）フォーマット）のタンパク質の例示的な実施形態を図示している。
【００５４】
【図１１】図１１Ａ〜図１１Ｂは、二重特異性ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖコンストラクトと共に培養されたヒトＣＤ８＋Ｔ細胞における、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）応答を示している。図１１Ａは、５Ｔ４−Ｆｃ抗原で被覆されたプレート内で培養した場合のＴ細胞の応答を示している。図１１Ｂは、５Ｔ４−Ｆｃ抗原なしで培養された場合のＴ細胞応答を示している。図１１は２人のドナーからの平均値を示している。
【００５５】
【図１２】ＡＬＧ．ＡＰＶ−００４、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１７８、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１７９、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１８７、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２０８、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２０９、およびＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０の、ヒトＣＤ１３７発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞株に対する結合曲線を示している。
【００５６】
【図１３】ＡＬＧ．ＡＰＶ−００４、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１７８、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１７９、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１８７、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２０８、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２０９、およびＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０の、ヒト５Ｔ４発現マウスＣＴ２６細胞（ＡＴＣＣ）に対する結合曲線を示している。
【００５７】
【図１４】ＡＬＧ．ＡＰＶ−００４、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１７８、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１７９、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１８７、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２０８、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２０９、およびＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０の、カニクイザル５Ｔ４トランスフェクトＣＨＯ−Ｋ１に対する結合曲線を示している。
【００５８】
【図１５】ＡＬＧ．ＡＰＶ−００４、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１７８、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１７９、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１８７、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２０８、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２０９、およびＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０の、ＣＤ１３７も５Ｔ４もどちらも発現しないヒト細胞株（ＭＯＬＭ１３細胞、ＡＴＣＣ）に対する結合曲線を示している。
【００５９】
【図１６】５Ｔ４（＋）細胞（ＨＣＣ１１４３）または５Ｔ４（−）細胞（ＭＯＬＭ１３）の存在下で５時間インキュベートした後の、ＮＦ−κＢレポーター発現Ｊｕｒｋａｔ細胞における、二重特異性コンストラクトの活性を示している。曲線上の全ての点は２連ウェルの平均を表す。Ｙ軸は相対蛍光単位（ＲＬＵ）の値を示す。
【００６０】
【図１７】ＡＬＧ．ＡＰＶ−１７８、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１７９、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１８７、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２０８、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２０９、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０、およびＭｏｒｒｉｓｏｎ型対照コンストラクトのＡＬＧ．ＡＰＶ−００４により、７２の時点で初代ＰＢＭＣ培養物において誘導された、ＩＦＮ−γのレベルを示している。曲線上の全ての点は２連ウェルの平均を表す。
【００６１】
【図１８】図１８Ａ〜図１８Ｂは、二重特異性コンストラクトであるＡＬＧ．ＡＰＶ−２０９、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０、およびＡＬＧ．ＡＰＶ−００４の、抗原発現腫瘍への５Ｔ４依存的な局在の、ＦＡＣＳ解析を示している。局在は、抗ヒトＦｃ抗体（図１８Ａ）またはビオチン化４−１ＢＢ（図１８Ｂ）を用いた染色により検出した。
【００６２】
【図１９】図１９Ａ〜図１９Ｂは、二重特異性コンストラクトであるＡＬＧ．ＡＰＶ−２０９、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０、およびＡＬＧ．ＡＰＶ−００４の、５Ｔ４＋腫瘍（図１９Ａ）および５Ｔ４−腫瘍（図１９Ｂ）に対する５Ｔ４依存的な局在の、免疫組織学的解析を示している。
【００６３】
【図２０】異なるレベルの５Ｔ４を発現するＣＴ２６細胞の存在下で、二重特異性抗体ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０と共に培養されたヒトＣＤ８  Ｔ細胞の、ＩＦＮγ応答を示している。
【００６４】
【図２１】図２１Ａ〜図２１Ｂは、異なるレベルの５Ｔ４を発現するＣＴ２６細胞の存在下で、二重特異性抗体ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０と共に培養されたヒトＣＤ８  Ｔ細胞の、最大ＩＦＮγ放出を示している。
【００６５】
【図２２】図２２Ａ〜図２２Ｃは、ＣＤ３で刺激された、または未刺激の、ヒトＰＢＭＣおよびカニクイザルＰＢＭＣからゲーティングされた一次ＣＤ８  Ｔ細胞に対する、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０またはＡＮＣ１０７（アイソタイプ対照）の結合を示している。図２２Ａおよび図２２Ｂは、２つの独立した実験からの平均蛍光強度（ＭＦＩ）（および平均値の標準誤差（ＳＥＭ））を示している。図２２Ｃは、２つの独立した実験から得られた、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０についての、正規化されたプールデータを示している。ｎ＝３ドナー／群／実験。
【００６６】
【図２３】図２３Ａ〜図２３Ｃは、ＣＤ３で刺激された、または未刺激の、ヒトＰＢＭＣおよびカニクイザルＰＢＭＣからゲーティングされた初代ＣＤ８  Ｔ細胞に対する、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０またはＡＮＣ１０７（アイソタイプ対照）の結合を示している。図２３Ａおよび図２３Ｂは、２つの独立した実験から得られた、ＣＤ８  Ｔ細胞に結合しているＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０の割合およびＳＥＭを示している。図２３Ｃは、実験１および実験２から得られた正規化されたプールデータを示している。ｎ＝３ドナー／群／実験。
【００６７】
【図２４】ヒトＣＤ８  Ｔ細胞に対するＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０の作動薬的な働きを示している。
【００６８】
【図２５】図２５Ａ〜図２５Ｂは、個々の代表的なドナーから得られた、ヒトＣＤ８  Ｔ細胞に対するＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０の作動薬的な働きを示している。
【００６９】
【図２６】カニクイザルＣＤ８  Ｔ細胞に対するＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０の作動薬的な働きを示している。
【００７０】
【図２７】図２７Ａ〜図２７Ｃは、個々の代表的なドナーから得られた、カニクイザルＣＤ８  Ｔ細胞に対するＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０の作動薬的な働きを示している。これらの図は、５Ｔ４−Ｆｃの存在下でＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０で活性化されたカニクイザルＣＤ８  Ｔ細胞による、用量反応に基づくＩＦＮγ産生を示している。
【００７１】
【図２８】５Ｔ４陽性ヒト結腸癌であるＨＣＴ−１１６の異種移植片腫瘍のＳＣＩＤベージュマウスモデルにおける、二重特異性抗体ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０の抗腫瘍活性を示している。
【００７２】
【図２９】ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０またはＡＬＧ．ＡＰＶ−２０９のＰＫ解析を示している。
【００７３】
【図３０】図３０Ａ〜図３０Ｂは、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０のＦｃ部分の、ＦｃγＲへの結合性を示している。漸増量の（titrated）ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０をＦｃγＲ−発現細胞と共にインキュベートし、蛍光標識抗ヒトＩｇＧ二次抗体でプローブした（図３０Ａ）。ヒトＩｇＧ１分子を陽性対照として用いた（図３０Ｂ）。
【００７４】
【図３１】図３１Ａ〜図３１Ｂは、ヒト５Ｔ４を発現しているＣＨＯ−Ｋ１細胞および抗ＣＤ３  抗体の存在下、二重特異性分子のＡＬＧ．ＡＰＶ−２０９およびＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０によって誘導されたＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を示している。
【００７５】
【図３２】図３２Ａ〜図３２Ｂは、２人の異なるヒトＰＢＭＣドナー（ＡおよびＢ）由来のＰＢＭＣ全培養物における、二重特異性分子ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０によるＩＦＮ−γ分泌の誘導を示している。
【００７６】
【図３３】図３３Ａ〜図３３Ｂは、２人の異なるヒトＰＢＭＣドナー由来のＰＢＭＣ全培養物における、二重特異性分子ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０によって誘導されたＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を示している。
【００７７】
【図３４】ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０の５Ｔ４発現細胞株への結合性を示している。
【００７８】
【図３５】ある密度範囲で５Ｔ４表面タンパク質を発現している細胞の存在下でインキュベートした後の、ＮＦ−κＢレポーター発現Ｊｕｒｋａｔ細胞における二重特異性コンストラクトＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０の作動薬的な働きを示している。
【００７９】
【図３６】５Ｔ４発現ヒトＨＣＴ１１６細胞の存在下、二重特異性抗体ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０と共に培養されたヒトＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＦＮγ応答を示している。
【００８０】
【図３７】５Ｔ４発現ヒトＨＣＴ１１６細胞の存在下、二重特異性抗体ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０と共に培養されたヒトＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＦＮγ応答を示している。
【００８１】
【図３８】ヒト５Ｔ４発現ＨＣＴ１１６細胞の存在下、二重特異性抗体ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０と共に培養されたヒトＣＤ８  Ｔ細胞の最大ＩＦＮγ放出を示している。
【００８２】
【図３９】図３９Ａ〜図３９Ｄは、５Ｔ４を発現しているヒト腫瘍細胞またはトランスフェクト細胞株に対するＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０の結合を示している。
【００８３】
【図４０】図４０Ａ〜図４０Ｄは、５Ｔ４を発現しているヒト腫瘍細胞またはトランスフェクト細胞株に対するＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０の結合を示す実験の、正規化されたＭＦＩを示している。
【発明を実施するための形態】
【００８４】
本開示は、トロホブラスト糖タンパク質（trophoblast glycoprotein）（５Ｔ４）に特異的に結合する結合ドメインを含むポリペプチド、および５Ｔ４に特異的に結合するポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、前記ポリペプチドは、５Ｔ４および別の標的に特異的に結合し得る多特異性ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、５Ｔ４に特異的に結合し、エフェクター細胞上の標的にも特異的に結合する、多特異性ポリペプチドである。本開示はまた、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー９（tumor necrosis factor receptor superfamily member 9）（４１ＢＢまたはＣＤ１３７）に特異的に結合する結合ドメインを含むポリペプチド、および４−１ＢＢに特異的に結合するポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、前記ポリペプチドは、４−１ＢＢおよび別の標的（例えば、腫瘍関連抗原）に特異的に結合し得る多特異性ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、４−１ＢＢに特異的に結合し、標的細胞上の標的にも特異的に結合する、多特異性ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、前記多特異性ポリペプチドは、５Ｔ４に特異的に結合し、且つ４−１ＢＢに特異的に結合する、二重特異性ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、前記二重特異性ポリペプチドは、標的細胞上に発現された５Ｔ４とエフェクター細胞上に発現された４−１ＢＢとに結合することで、エフェクター細胞の活性化を増幅し、標的細胞のエフェクター細胞媒介性細胞毒性を増強する。
【００８５】
いくつかの実施形態では、本開示は、従来公知の５Ｔ４結合ドメインおよび／または４−１ＢＢ結合ドメインとの比較で、非特異的な結合がより少ない、５Ｔ４結合ドメインおよび／または４−１ＢＢ結合ドメイン（並びにこのような結合ドメインを含むポリペプチドまたはタンパク質）を提供する。特定の態様では、本明細書に記載の結合ドメインおよび／または前記結合ドメインを含むポリペプチドは、ある特定の構成および／またはある特定の配向において（例えば、ＶＬ−ＶＨと比較してＶＨ−ＶＬにおいて）、５Ｔ４および／または４−１ＢＢにより効率的に結合することで、５Ｔ４の発現と関連した障害の治療における効力の上昇および／または有用性の向上を示す。
【００８６】
いくつかの実施形態では、治療有効量の本明細書に記載のポリペプチドまたはタンパク質のそれを必要とする患者への投与は、特定のがんをはじめとする、５Ｔ４の発現と関連した特定の障害の治療に有用である。１つの実施形態では、前記ポリペプチドまたはタンパク質は、５Ｔ４を発現する標的細胞およびエフェクター細胞の両方と結合することにより、前記５Ｔ４を発現する標的細胞と前記エフェクター細胞とを「架橋結合」する。両方のドメインが各々の標的に結合することで、エフェクター細胞の活性化が増強されて、エフェクター細胞応答（例えば、エフェクター細胞媒介性細胞毒性）がより長期的且つ／またはよりロバストなものとなる。本開示のポリペプチドおよびタンパク質は患者の治療において様々な利点を提供し、例えば、５Ｔ４への効果的な結合、エフェクター細胞活性の効率的な増強、サイトカイン放出レベルの減少、および／または有害事象（例えば、毒性）のリスク低減といった利点がある。いくつかの実施形態では、標的細胞は、５Ｔ４を発現する非標的細胞（例えば、同じ対象、臓器、または組織の正常細胞または非がん性細胞）よりも高いレベルで５Ｔ４を発現する。他の実施形態では、標的細胞は５Ｔ４を発現するが、その一方、非標的細胞（例えば、同じ対象、臓器、または組織の正常細胞または非がん性細胞）は５Ｔ４を発現しない。
【００８７】
本明細書で使用される節の見出しは構成のみを目的としており、記載された主題を限定するものと解釈されるべきではない。特許、特許出願、記事、書物、および論文を含むがこれらに限定はされない、本願で引用された全ての文献または文献の一部は、あらゆる目的でその全体が参照によって明示的に援用される。援用された文献または文献の一部のうちの１または複数における用語の定義が本願における当該用語の定義と食い違う場合、本願に記載された定義が優先される。しかしながら、本明細書に引用されたいずれの参考文献、記事、刊行物、特許、特許公報、および特許出願の言及も、それらが有効な先行技術を構成すること、または、それらが世界中のあらゆる国の共通一般知識の一部を形成していること、の承認でもいかなる形の示唆でもなく、またそれと解釈されるべきでもない。
【００８８】
本明細書では、特に記載がない限り、あらゆる濃度範囲、パーセンテージ範囲、比の範囲、または整数範囲は、記載された範囲に含まれるあらゆる整数の値と、適切な場合には、その分数（整数の１０分の１および１００分の１など）と、を包含すると理解されたい。特に記載がない限り、本明細書で使用される用語「ａ」および「ａｎ」は、列挙された構成要素が「１または複数」であることを指すと理解されたい。択一（例えば、「または（or）」）の使用は、択一物の一方、両方、またはそのあらゆる組み合わせを意味すると理解されたい。本明細書で使用される場合、用語「包含する（include）」および「含む（comprise）」は同義的に使用される。加えて、本明細書に記載の成分（例えば、ドメインまたは領域）および代替成分の様々な組み合わせを含むポリペプチドが、それぞれのポリペプチドが個別に記載された場合と同程度に、本願により開示されることを理解されたい。すなわち、個々のポリペプチドの特定成分の選択も、本開示の範囲内である。
【００８９】
定義
本明細書で使用される場合、用語「結合ドメイン」または「結合領域」とは、抗原、リガンド、受容体、基質、または阻害物質（例えば、５Ｔ４または４−１ＢＢ）など、標的分子を特異的に認識しそれに結合することが可能な、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、抗体、または抗体由来の結合ドメインのドメイン、領域、部分、または部位を指す。結合ドメインの例としては、抗体、抗体様タンパク質、抗体様ドメイン、抗体重鎖可変領域、抗体軽鎖可変領域、および一本鎖抗体可変領域（例えば、ドメイン抗体、ｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ）が挙げられる。特定の実施形態では、前記結合ドメインは、抗原結合部位を含むか、それからなる（抗原結合部位は、例えば、重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列、すなわち、別のフレームワーク領域（ＦＲ）（例えば、所望により１または複数のアミノ酸置換を含むヒトＦＲ）内に配置された抗体由来の３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）および３つの重鎖ＣＤＲ、から構成される）。特定の標的に特異的に結合する本開示の結合ドメインを同定するための種々の試験法が知られており、例えば、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ファージディスプレイライブラリースクリーニング、およびＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）による相互作用分析が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、標的細胞によって発現される標的抗原（例えば、５Ｔ４などの腫瘍関連抗原）に特異的に結合する結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、エフェクター細胞によって発現される標的抗原（例えば、４−１ＢＢ）に特異的に結合する結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、多特異性ポリペプチドであり、結合ドメインを２つ以上含む。
【００９０】
結合ドメインまたは結合ドメインを含むタンパク質は、１０５Ｍ−１以上の親和性またはＫａ（すなわち、１／Ｍを単位とする特定の結合相互作用の平衡結合定数）で標的と結合する場合、標的と「特異的に結合」するが、試験試料中に存在する他の成分とは顕著な結合を生じない。結合ドメインは「高親和性」結合ドメインおよび「低親和性」結合ドメインに分類できる。「高親和性」結合ドメインとは、少なくとも１０７Ｍ−１、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも１０９Ｍ−１、少なくとも１０１０Ｍ−１、少なくとも１０１１Ｍ−１、少なくとも１０１２Ｍ−１、または少なくとも１０１３Ｍ−１のＫａを有する結合ドメインを指す。「低親和性」結合ドメインとは、１０７Ｍ−１以下、１０６Ｍ−１以下、１０５Ｍ−１以下のＫａを有する結合ドメインを指す。あるいは、親和性は、Ｍを単位とする特定の結合相互作用の平衡解離定数（Ｋｄ）と定義することもできる（例えば、１０−５Ｍ〜１０−１３、または約５００ｎＭ、約３００ｎＭ、約２５０ｎＭ、約２００ｎＭ、約１５０ｎＭ、約１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約２５ｎＭ、約１０ｎＭ、もしくは約５ｎＭ）。本開示に係る結合ドメインポリペプチドおよび一本鎖ポリペプチドの親和性は、従来技術を用いて容易に測定できる（例えば、Scatchard et al. (1949) Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660；および米国特許第５，２８３，１７３号、同第５，４６８，６１４号、または対応特許を参照）。
【００９１】
本明細書で使用される「保存的置換」とは、当該技術分野では、１つのアミノ酸を同様の特性を有する別のアミノ酸に置換することと認識されている。保存的置換の例としては当該技術分野において周知のものである（例えば、１９９７年３月１３日に公開されたＰＣＴ出願公報ＷＯ９７／０９４３３号の１０頁；Lehninger, Biochemistry, Second Edition; Worth Publishers, Inc. NY:NY (1975), pp.71-77; Lewin, Genes IV, Oxford University Press, NY and Cell Press, Cambridge, MA (1990), p. 8）。
【００９２】
本明細書で使用される場合、用語「誘導体」とは、化学的手段または生物学的手段によって、酵素を用いて、または酵素を用いずに、例えば、グリコシル化、アルキル化、アシル化、エステル形成、またはアミド形成によって、１または複数のアミノ酸残基が修飾されたペプチドを指す。
【００９３】
本明細書で使用される場合、指定のポリペプチドまたはタンパク質「に由来する」ポリペプチド配列またはアミノ酸配列とは、当該ポリペプチドの起源を言及している。特定の実施形態では、前記ポリペプチドまたはアミノ酸配列は、特定の配列（「親（parent）」配列または「親（parental）」配列と称される場合もある）に由来し、且つ、前記親配列と本質的に同一のアミノ酸配列を有するか、または少なくとも１０〜２０個のアミノ酸、少なくとも２０〜３０個のアミノ酸、少なくとも３０〜５０個のアミノ酸、もしくは少なくとも５０〜１５０個のアミノ酸からなるその一部を有し、あるいは、その起源が前記親配列にあると当業者が確認できる。例えば、抗体から結合ドメイン（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）など）を派生させることができる。いくつかの実施形態では、コンピューターアルゴリズムまたはコンピュータシミュレーションによって、抗体またはタンパク質から結合ドメイン配列（例えば、５Ｔ４結合ドメインまたは４−１ＢＢ結合ドメイン）が派生される。
【００９４】
別のポリペプチドから派生したポリペプチドは、その親ポリペプチドとの比較で、１または複数の変異または変化を有し、例えば、１または複数のアミノ酸残基が、別のアミノ酸残基で置換されていたり、あるいは、１または複数のアミノ酸の挿入または欠失を有し得る。そのような実施形態では、親ポリペプチドから派生した、１または複数の変異または変化を含むポリペプチドは、「バリアント」と称される。本明細書で使用される場合、用語「バリアント（variant）」または「バリアント（variants）」とは、参照ポリヌクレオチドまたは参照ポリペプチドの配列と異なる配列を有するが、その重要な特性は保持している、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。通常、バリアントポリヌクレオチド配列またはバリアントポリペプチド配列は、参照ポリヌクレオチドまたは参照ポリペプチドと、全体的に極めて類似しており、多くの領域で同一である。例えば、バリアントポリヌクレオチドまたはバリアントポリペプチドは、活性のある部分または完全長の参照ポリヌクレオチドまたは参照ポリペプチドと比較して、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を示し得る。前記ポリペプチドは自然発生的ではないアミノ酸配列を含むことができる。このような変形物は、親ポリペプチドとの配列同一性または配列類似性が必然的に１００％未満となる。１つの実施形態では、前記バリアントは、親ポリペプチドのアミノ酸配列と、約６０％から１００％未満のアミノ酸配列同一性またはアミノ酸配列類似性を有する、アミノ酸配列を有する。別の実施形態では、前記バリアントは、親ポリペプチドのアミノ酸配列と、約７５％から１００％未満、約８０％から１００％未満、約８５％から１００％未満、約９０％から１００％未満、約９５％から１００％未満のアミノ酸配列同一性またはアミノ酸配列類似性を有するアミノ酸配列を有する。
【００９５】
本明細書で使用される場合、用語「配列同一性」とは、２以上のポリヌクレオチド配列間または２以上のポリペプチド配列間の関係を指す。ある配列のある位置が比較配列の対応する位置における同じ核酸塩基またはアミノ酸残基によって占められている場合、その配列はその位置において「同一」であると言われる。配列同一性パーセントは、両方の配列で同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が出現している位置の数を求め、同一の位置の数を得ることによって、算出される。次に、前記同一の位置の数を比較枠（comparison window）内の位置の総数で割り、１００を掛けることで、配列同一性パーセントが得られる。配列同一性パーセントは、２本の最適にアラインメントされた配列を比較枠全体で比較することで求められる。ポリヌクレオチド配列の場合の比較枠は、例えば、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０、少なくとも１８０、少なくとも１９０、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、またはそれ以上の核酸長であり得る。ポリペプチド配列の場合の比較枠は、例えば、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０、少なくとも１８０、少なくとも１９０、少なくとも２００、少なくとも３００、またはそれ以上のアミノ酸長であり得る。比較用に配列を最適にアラインメントするために、参照配列を一定に保ちつつ、比較枠内のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の部分にギャップと呼ばれる付加または欠失が含ませることができる。最適なアラインメントとは、ギャップを用いたとしても、参照配列と比較配列との間で可能な最大数の「同一」位置を生じるアラインメントである。２本の配列間の「配列同一性」パーセントは、２００４年９月１日の時点で国立バイオテクノロジー情報センターから入手できた、「ＢＬＡＳＴ  ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」プログラムのバージョンを用いて求めることができる。このプログラムには、ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列比較用）およびＢＬＡＳＴＰプログラム（ポリペプチド配列比較用）が組み込まれており、これらのプログラムはKarlin and Altschul(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(12):5873-5877, 1993)のアルゴリズムに基づいている。「ＢＬＡＳＴ  ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」を利用する場合、２００４年９月１日の時点でデフォルトパラメータであった、以下のパラメータを用いることができる：ワードサイズ（word size）（３）、ギャップ開始ペナルティ（open gap penalty）（１１）、ギャップ伸長ペナルティ（extension gap penalty）（１）、ギャップドロップオフ値（gap dropoff）（５０）、期待値（１０）、およ���、マトリックスオプション（matrix option）を含むがこれに限定はされないあらゆる他の必要なパラメータ。２本のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列は、互いに少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する場合に、「実質的に類似した配列同一性」または「実質的な配列同一性」を有していると見なされる。
【００９６】
本明細書で使用される場合、特に断りがない限り、免疫グロブリン分子の可変領域内のアミノ酸残基の位置は、ＩＭＧＴ基準（Brochet et al, Nucl. Acids Res. (2008) 36, W503-508）またはＥＵ命名規約（Ward et al., 1995 Therap. Immunol. 2:77-94）に従って付番され、免疫グロブリン分子の定常領域内のアミノ酸残基の位置は、ＥＵ命名規約（Ward et al., 1995 Therap. Immunol. 2:77-94）に従って付番される。本明細書では、カバット付番規約（Kabat、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第５版、ベテスダ、メリーランド州：公衆衛生局、アメリカ国立衛生研究所（１９９１））を、もう１つのシステムとして、免疫グロブリン分子の可変領域内のアミノ酸残基の位置について言及する際に用い、さらに、免疫グロブリン分子の可変領域内のアミノ酸残基の位置について言及する際に用いる場合もある。
【００９７】
本明細書で使用される場合、用語「二量体」とは、共有結合（例えば、ジスルフィド結合）および他の相互作用（例えば、静電的相互作用、塩橋、水素結合、および疎水性相互作用）を含む１または複数の形態の分子内力を介して互いに結合した２つのサブユニットからなり、適切な条件下（例えば、生理条件下で、組換えタンパク質の発現、精製、および／もしくは保存に適した水溶液中で、または非変性的且つ／もしくは非還元的な電気泳動用の条件下）で安定である、生物学的実体を指す。用語「ヘテロ二量体」または「ヘテロ二量体タンパク質」とは、本明細書で使用される場合、２つの異なるポリペプチドから形成された二量体を指す。ヘテロ二量体には、本明細書に記載の抗５Ｔ４×抗４−１ＢＢ分子が含まれ得る。ヘテロ二量体に、４つのポリペプチド（すなわち、２つの軽鎖および２つの重鎖）から形成された抗体は含まれない。用語「ホモ二量体」または「ホモ二量体タンパク質」とは、本明細書で使用される場合、２つの同一のポリペプチドから形成された二量体を指す。
【００９８】
「Ｆｃ領域」または「Ｆｃドメイン」とは、細胞上のＦｃ受容体および／または補体のＣ１ｑ成分に結合することで、抗体のエフェクター機能を媒介できる、ソース抗体の一部に対応する、またはそれに由来する、ポリペプチド配列を指す。Ｆｃとは、「結晶性フラグメント（fragment crystalline）」（タンパク質結晶を容易に形成する抗体のフラグメント）を表す。元来タンパク質消化によって表されていた独特なタンパク質フラグメントによって、免疫グロブリンタンパク質の全体的な一般構造を明らかにすることができる。本文書で最初に定義した通り、Ｆｃ領域は、各々がヒンジ領域と、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む、ジスルフィド結合で結合した２つのポリペプチドを含むホモ二量体タンパク質である。しかし、より最近では、この用語は、ＣＨ３と、ＣＨ２と、第二の鎖とジスルフィド結合型の二量体を形成するのに十分なヒンジの少なくとも一部と、からなる一本鎖単量体成分にも適用されている。従って、文脈によって、用語「Ｆｃ領域」または「Ｆｃドメイン」の使用は、本明細書では、二量体形態、または結合して二量体タンパク質を形成する個々の単量体のいずれかを指す。免疫グロブリンの構造および機能の概説については、Putnam, The Plasma Proteins, Vol. V (Academic Press, Inc., 1987), pp. 49-140；およびPadlan, Mol. Immunol. 31:169-217, 1994を参照されたい。本明細書で使用される場合、Ｆｃという用語は、天然配列のバリアントを包含する。
【００９９】
「免疫グロブリン定常領域」または「定常領域」は、本明細書における定義では、免疫グロブリンの１または複数の定常ドメインの一部または全てに一致する、またはそれに由来する、ペプチドまたはポリペプチド配列を指す用語である。特定の実施形態では、前記定常領域は、ＩｇＧのＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン、例えばＩｇＧ１のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン、を含む。特定の実施形態では、前記定常領域はＣＨ１ドメインを含まない。特定の実施形態では、前記定常領域を構成する定常ドメインは、ヒト定常ドメインである。いくつかの実施形態では（例えば、４１ＢＢ結合ポリペプチド、５Ｔ４結合ポリペプチド、またはその多特異性ポリペプチドの特定の変形形態では）、本開示の融合タンパク質の定常領域は、胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）などのいくつかのＦｃ受容体との結合能を保持しながら、且つ、比較的長い生体内半減期を保持しながら、エフェクター機能を持たないか、最低限しか持たない。例えば、本開示の融合タンパク質の定常領域は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞媒介性ファゴサイトーシス（ＡＤＣＰ）、補体活性化、および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の誘導をもたらさないか、またはそれを実質的に低減する。他の変形形態では、本開示の融合タンパク質は、ＡＤＣＣおよびＣＤＣの片方または両方など、１または複数のエフェクター機能を保持する定常ドメインを含む。特定の実施形態では、本開示の結合ドメインはヒトＩｇＧ１定常領域に融合されており、前記ＩｇＧ１定常領域は以下のアミノ酸のうちの１または複数が変異している：２３４位のロイシン（Ｌ２３４）、２３５位のロイシン（Ｌ２３５）、２３７位のグリシン（Ｇ２３７）、３１８位のグルタミン酸（Ｅ３１８）、３２０位のリジン（Ｋ３２０）、３２２位のリジン（Ｋ３２２）、またはこれらのあらゆる組み合わせ（付番はＥＵ準拠）。例えば、これらのアミノ酸のうちのいずれか１つまたは複数が、アラニンに変化され得る。別の実施形態では、ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、およびＫ３２２（ＥＵ付番に準拠）のそれぞれが、アラニンに変異しており（すなわち、それぞれ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２０Ａ、およびＫ３２２Ａ）、所望により、Ｎ２９７Ａ変異も有する（すなわち、ＣＨ２ドメインのグリコシル化は基本的には除外）。
【０１００】
用語「軽鎖可変領域」（別名「軽鎖可変ドメイン」または「ＶＬ」）および「重鎖可変領域」（別名「重鎖可変ドメイン」または「ＶＨ」）とは、それぞれ、抗体の軽鎖および重鎖に由来する可変性の結合領域を指す。可変性の結合領域は、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）および「フレームワーク領域」（ＦＲ）として知られている、個別の明確に定義された小領域から構成される。１つの実施形態では、前記ＦＲはヒト型化されている。用語「ＣＬ」とは、「免疫グロブリン軽鎖定常領域」または「軽鎖定常領域」、すなわち、抗体軽鎖由来の定常領域を指す。用語「ＣＨ」とは、「免疫グロブリン重鎖定常領域」または「重鎖定常領域」を指す。ＣＨは、抗体のアイソタイプに基づいて、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ）、またはＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、およびＣＨ４ドメイン（ＩｇＥ、ＩｇＭ）にさらに分割できる。「Ｆａｂ」（Fragment antigen binding）は、抗体の一部であって、抗原に結合し、鎖間ジスルフィド結合を介して軽鎖に連結された重鎖の可変領域およびＣＨ１ドメインを含む部分である。
【０１０１】
本明細書で使用される場合、用語「リンカー」とは、通常、ポリペプチドの２つのサブドメインを連結する短いポリペプチド配列を指す。リンカーの非限定的な例としては、グリシン−セリンリピートを含む可動性リンカー、並びに（ａ）膜貫通型タンパク質（例えば、Ｉ型膜貫通型タンパク質）のドメイン間領域由来のリンカー；（ｂ）ＩＩ  Ｃ型レクチン（type II C-lectin）の柄領域由来のリンカー；および（ｃ）免疫グロブリンのヒンジ由来のリンカーが挙げられる。いくつかの実施形態では、２つのサブ結合ドメインの相互作用に適合するスペーサー機能をリンカーが発揮することで、得られたポリペプチドが、同じ軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む抗体と同じ標的分子に対し特異的結合親和性を保持する。特定の実施形態では、リンカーは５〜約３５個のアミノ酸から構成され、例えば、約１５〜約２５個のアミノ酸から構成される。本明細書で使用される場合、「ＣＨ３とＣＨ１またはＣＬとの間のリンカー」という句は、ＣＨ３ドメイン（例えば、野生型ＣＨ３または変異型ＣＨ３）のＣ末端と、ＣＨ１ドメインまたはＣＬドメイン（例えば、Ｃκ）のＮ末端との間の、１または複数のアミノ酸残基（例えば、約２〜１２、約２〜１０、約４〜１０、約５〜１０、約６〜１０、約７〜１０、約８〜１０、約９〜１０、約８〜１２、約９〜１２、または約１０〜１２）を指す。
【０１０２】
いくつかの実施形態で、リンカーは、文脈によって、（１）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）内のＶＨ領域とＶＬ領域との間のポリペプチド領域を指す場合もあれば、（２）２つの結合ドメインを含む多特異性ポリペプチド内の第一結合ドメインと第二結合ドメインとの間のポリペプチド領域を指す場合もある。リンカーが２つ以上の結合ドメインを連結している後者の例では、このようなリンカーは「結合ドメインリンカー」と称される。いくつかの実施形態では、結合ドメインリンカーで２つ以上の結合ドメインを直接的に連結または接続することにより、以下の構造（結合ドメイン−結合ドメインリンカー−結合ドメイン）を含むコンストラクトを得ることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の多特異性ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシル末端へ順に、（ｉ）第一結合ドメインと、（ｉｉ）結合ドメインリンカーと、（ｉｉｉ）第二結合ドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、多特異性ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシル末端へ順に、（ｉ）第二結合ドメインと、（ｉｉ）結合ドメインリンカーと、（ｉｉｉ）第一結合ドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、結合ドメインリンカーは、少なくとも１つの結合ドメインを、免疫グロブリンＦｃドメインなどの結合ドメイン以外のポリペプチド（すなわち、Ｉｇヒンジ−Ｉｇ定常領域という構造を含むポリペプチド）に連結することによって、２つ以上の結合ドメインを連結または接続し得る。そのような実施形態では、得られたコンストラクトは以下の構造（結合ドメイン−Ｆｃドメイン−結合ドメインリンカー−結合ドメイン）を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の多特異性ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシル末端へ順に、（ｉ）第一結合ドメインと、（ｉｉ）ヒンジ領域と、（ｉｉｉ）免疫グロブリン定常領域と、（ｉｖ）結合ドメインリンカーと、（ｖ）第二結合ドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、多特異性ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシル末端へ順に、（ｉ）第二結合ドメインと、（ｉｉ）結合ドメインリンカーと、（ｉｉｉ）免疫グロブリン定常領域と、（ｉｖ）ヒンジ領域と、（ｖ）第一結合ドメインと、を含む。２つの結合ドメインを含む多特異性ポリペプチド内の免疫グロブリン定常領域と第二結合ドメインとの間のポリペプチド領域（例えば、結合ドメインリンカー）は、多特異性ポリペプチド内でのドメインの配向に応じて、「カルボキシル末端側リンカー」または「アミノ末端側リンカー」とも称され得る。リンカーの非限定例を表１に記載する。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、「ヒンジ」または「ヒンジ領域」は、免疫グロブリンヒンジ領域に由来し、本明細書に記載のポリペプチドにおいて結合ドメイン（例えば、５Ｔ４結合ドメインまたは４−１ＢＢ結合ドメイン）と免疫グロブリン定常領域との間に位置する、ポリペプチドを指す。「野生型免疫グロブリンヒンジ領域」とは、抗体の重鎖に存在する、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間に挿入されそれらを接続している（ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＤの場合）、またはＣＨ１ドメインとＣＨ３ドメインとの間の挿入されそれらを接続している（ＩｇＥおよびＩｇＭの場合）、天然の上部および中間部のヒンジアミノ酸配列を指す。特定の実施形態では、野生型免疫グロブリンヒンジ領域配列は、ヒト由来であり、ヒトＩｇＧヒンジ領域（例えば、ＩｇＧ１ヒンジ領域、ＩｇＧ２ヒンジ領域、ＩｇＧ３ヒンジ領域、またはＩｇＧ４ヒンジ領域）を含み得る。
【０１０４】
「改変型免疫グロブリンヒンジ領域」または「バリアント免疫グロブリンヒンジ領域」とは、対応する親野生型免疫グロブリンヒンジ領域と比較した場合に１または複数の変異、置換、挿入、または欠失を有するヒンジ領域ポリペプチドを指す。特定の実施形態では、改変型免疫グロブリンヒンジ領域は、野生型免疫グロブリンヒンジ領域に対し少なくとも７０％の相同性（例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の相同性）を有する。特定の実施形態では、改変型免疫グロブリンヒンジ領域は、約５個のアミノ酸長（例えば、約５個、約６個、約７個、約８個、約９個、約１０個、約１１個、約１２個、約１３個、約１４個、約１５個、約１６個、約１７個、約１８個、約１９個、約２０個、またはそれ以上のアミノ酸長）から約１２０個までのアミノ酸長（例えば、約１０個〜約４０個のアミノ酸長、または約１５個〜約３０個のアミノ酸長、または約１５個〜約２０個のアミノ酸長、または約２０個〜約２５個のアミノ酸長）を有する、野生型免疫グロブリンヒンジ領域のフラグメントである。通常、野生型免疫グロブリンヒンジ領域のフラグメントとしての改変型免疫グロブリンヒンジ領域は、米国特許出願公開第２０１３／０１２９７２３号および同第２０１３／００９５０９７号で開示されたような、ＩｇＧコアヒンジ領域（例えば、Ｘが任意のアミノ酸であるＣ−Ｘ−Ｘ−Ｃ配列を含むポリペプチド）を含む。ヒンジの非限定例を表１に記載する。
【０１０５】
本明細書で使用される場合、用語「ヒト型化」とは、元の抗体の抗原結合特性を保持しながらも、ヒトに対する免疫原性が低い、ヒト以外の種（例えば、マウスまたはラット）に由来する、抗体、免疫グロブリン結合タンパク質、または免疫グロブリン結合ポリペプチドを、遺伝子工学技術を用いて作製する方法を指す。いくつかの実施形態では、抗体、免疫グロブリン結合タンパク質、または免疫グロブリン結合ポリペプチドの結合ドメイン（例えば、軽鎖可変領域、重鎖可変領域、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ）は、ヒト型化されたものである。非ヒト結合ドメインは、ＣＤＲグラフティング（Jones et al., Nature 321:522 (1986)）として知られている技術およびその変法、例えば、「リシェイピング（reshaping）」（Verhoeyen, et al., 1988 Science 239:1534-1536; Riechmann, et al., 1988 Nature 332:323-337; Tempest, et al., Bio/Technol 1991 9:266-271）、「超キメラ化（hyperchimerization）」（Queen, et al., 1989 Proc Natl Acad Sci USA 86:10029-10033; Co, et al., 1991 Proc Natl Acad Sci USA 88:2869-2873; Co, et al., 1992 J Immunol 148:1149-1154）、および「べニアリング（veneering）」（Mark, et al., “Derivation of therapeutically active humanized and veneered anti-CD18 antibodies.” In: Metcalf BW, Dalton BJ, eds. Cellular adhesion: molecular definition to therapeutic potential. New York: Plenum Press, 1994: 291-312）を用いてヒト型化できる。ヒト以外の供給源由来である場合、ヒンジ領域ドメインおよび定常領域ドメインなど、抗体、免疫グロブリン結合タンパク質、または免疫グロブリン結合ポリペプチドの他の領域もヒト型化できる。本開示に係るポリペプチドに対して、これらのポリペプチドが抗体でない場合であっても、当該技術分野におけるヒト型化抗体に関する知見を適用できる。
【０１０６】
本明細書で使用される場合、用語「必要としている患者」とは、本明細書で提供される５Ｔ４結合タンパク質または多特異性ポリペプチドまたはその組成物による治療または改善に適した疾患、障害、または異常のリスクを有する、またはそれに罹っている患者を指す。
【０１０７】
本明細書で使用される場合、用語「薬剤的に許容できる」とは、分子体および組成物が、当該技術分野において周知の経路で投与された場合に、アレルギー反応や他の重篤な有害反応を通常は発生させないことを指す。動物、特にヒト、での使用について、連邦政府もしくは州政府の規制当局によって承認された、または米国薬局方もしくは他の一般的に認知された薬局方に記載された、分子体および組成物が、「薬剤的に許容できる」と見なされる。
【０１０８】
本明細書で使用される場合、用語「プロモーター」とは、転写を開始するためのＲＮＡポリメラーゼとの結合に関与するＤＮＡの領域を指す。
【０１０９】
本明細書で使用される場合、用語「核酸」、「核酸分子」、または「ポリヌクレオチド」とは、一本鎖形態または二本鎖形態の、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはその重合体を指す。特に限定がない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有する天然ヌクレオチドの類似体を含有し、天然ヌクレオチドと同様の代謝を受ける核酸を包含する。特に記載がない限り、ある特定の核酸配列は、明示的に示された配列だけではなく、保存的に改変されたそのバリアント（例えば、縮重コドン置換）および相補的配列も暗に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１または複数の選択された（または全ての）コドンの第三位が混合塩基残基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作製することにより、達成できる（Batzer et al. (1991) Nucleic Acid Res. 19:5081; Ohtsuka et al. (1985) J. Biol. Chem. 260:2605-2608; Cassol et al. (1992); Rossolini et al. (1994) Mol. Cell. Probes 8:91-98）。核酸という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、および遺伝子にコードされるｍＲＮＡと同義的に使用される。本明細書で使用される場合、用語「核酸」、「核酸分子」、または「ポリヌクレオチド」は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、核酸アナログを用いて作製されたＤＮＡ類似体およびＲＮＡ類似体、並びにその誘導体、フラグメント、および相同体を包含することが意図される。
【０１１０】
用語「発現」とは、核酸にコードされている産物の生合成を指す。例えば、目的のポリペプチドをコードする核酸セグメントの場合、発現は、核酸セグメントのｍＲＮＡへの転写と、ｍＲＮＡの１または複数のポリペプチドへの翻訳と、を含む。
【０１１１】
用語「発現ユニット」および「発現カセット」は、本明細書では同義的に使用されており、目的のポリペプチドをコードしており、且つ、宿主細胞における当該核酸セグメントの発現を実現することが可能な、核酸セグメントを表す。発現ユニットは、全て操作可能な立体配置にある、転写プロモーターと、目的ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームと、転写ターミネーターと、を通常含む。転写プロモーターおよび転写ターミネーターの他に、発現ユニットは、例えばエンハンサーまたはポリアデニル化シグナルなどの他の核酸セグメントをさらに含み得る。
【０１１２】
用語「発現ベクター」とは、本明細書で使用される場合、１または複数の発現ユニットを含む、直鎖状または環状の、核酸分子を指す。１または複数の発現ユニットの他に、発現ベクターは、例えば１または複数の複製開始点または１または複数の選択マーカーなどの追加の核酸セグメントも含み得る。発現ベクターは、通常はプラスミドＤＮＡ由来またはウイルスＤＮＡ由来であるが、両方のエレメントを含有する場合もある。
【０１１３】
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」、「ポリペプチド鎖」、または「タンパク質」とは、一本鎖の、直鎖状の、且つ連続的な、共有結合的に連結したアミノ酸の並びを指す。ポリペプチドは１または複数の鎖内ジスルフィド結合を形成し得る。本明細書に記載のポリペプチドに関して、配列番号によって指定されたものに対応するアミノ酸残基の修飾または変化について言及がなされる場合、そのような残基の翻訳後修飾も包含される。ポリペプチドおよびタンパク質という用語は、２本のポリペプチド鎖が鎖間ジスルフィド結合などを介して非直鎖状に連結された実施形態も包含する。例えば、ネイティブな免疫グロブリン分子は２つの重鎖ポリペプチドと２つの軽鎖ポリペプチドとから構成される。重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドとの間の鎖間ジスルフィド結合によって各重鎖ポリペプチドが軽鎖ポリペプチドに結合して、２つのヘテロ二量体タンパク質またはヘテロ二量体ポリペプチド（すなわち、２つの非相同ポリペプチド鎖から構成されるタンパク質）を形成する。この２つのヘテロ二量体タンパク質が、重鎖ポリペプチド間のさらなる鎖間ジスルフィド結合によって結合して、免疫グロブリンタンパク質または免疫グロブリンポリペプチドを形成する。本明細書では、タンパク質またはポリペプチドは抗体または抗体の抗原結合性フラグメントであり得る。いくつかの実施形態では、タンパク質はｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖタンパク質、ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ二量体、またはダイアボディであり得る。
【０１１４】
当業者には理解されることであるが、本明細書では、タンパク質およびポリペプチドは、本開示の全体を通じた配列番号の参照によって示される、個々のポリペプチド鎖のアミノ酸配列によって定義される。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖタンパク質またはポリペプチドは、鎖間結合（例えば、鎖間ジスルフィド結合）によって結合して、二量体ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖタンパク質（例えば、ホモ二量体ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖタンパク質またはヘテロ二量体ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖタンパク質）を形成する、２本のｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖポリペプチド鎖から構成される（例えば、図１０を参照）。そのような実施形態では、ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖタンパク質は、個々のｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖポリペプチド鎖のアミノ酸配列によって定義される。ポリペプチドおよびタンパク質は炭水化物基などの非ペプチド性成分を含むこともできる。タンパク質またはポリペプチドに対して、当該タンパク質を産生する細胞により、炭水化物および他の非ペプチド性置換基を付加可能であるが、この置換基は細胞の種類によって異なる。本明細書では、タンパク質およびポリペプチドはそのアミノ酸骨格構造によって定義され；炭水化物基などの置換基は、通常特に指定はされないが、存在していてもよい。
【０１１５】
用語「アミノ末端側」および「カルボキシル末端側」とは、ポリペプチド内の位置を表すために本明細書では使用される。文脈によっては、これらの用語は、ポリペプチドの特定の配列または部分に関して、近接または相対位置を表すために用いられる。例えば、ポリペプチド内の参照配列のカルボキシル末端側に位置する特定の配列は、当該参照配列のカルボキシル末端の近位に位置してはいるが、当該完全ポリペプチドのカルボキシル末端に存在する必要はない。
【０１１６】
本明細書で使用される場合、用語「形質転換」、「トランスフェクション」、および「形質導入」とは、核酸（すなわち、ヌクレオチド重合体）の核内への導入を指す。本明細書で使用される場合、用語「遺伝子形質転換」とは、ＤＮＡ、特に組換えＤＮＡの、細胞内への導入および取り込みを指す。この導入核酸は発現ベクターを介して細胞内に導入することができる。
【０１１７】
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」および「ＡＤＣＣ」とは、本明細書で使用される場合、ＦｃγＲを発現する非特異的な細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびマクロファージなどの単球系細胞）が、標的細胞上に結合した抗体（またはＦｃγＲと結合することが可能な他のタンパク質）を認識して、標的細胞の溶解を引き起こす、細胞媒介性のプロセスを指す。原則的に、活性化ＦｃγＲを有するいかなるエフェクター細胞も、惹起してＡＤＣＣを媒介させることができる。ＡＤＣＣを媒介する主要な細胞はＮＫ細胞であり、これはＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球は、その活性化、局在、または分化の状態に依存して、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩを発現できる。造血細胞上のＦｃγＲ発現の概要に関しては、例えば、Ravetch et al., 1991, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92を参照されたい。
【０１１８】
ポリペプチドまたはタンパク質に関連して本明細書で使用される、用語「ＡＤＣＣ活性を有する」は、当該ポリペプチドまたはタンパク質、例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１）などに由来するＦｃドメイン（例えば、免疫グロブリンヒンジ領域、並びにＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを有する免疫グロブリン定常領域）を含むポリペプチドまたはタンパク質が、Ｆｃ受容体を発現する細胞溶解性免疫エフェクター細胞（例えば、ＮＫ細胞）上の細胞溶解性Ｆｃ受容体（例えば、ＦｃγＲＩＩＩ）の結合を通じて、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介することが可能であること、を意味する。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインを含む多特異性ポリペプチドまたは多特異性タンパク質（例えば、本明細書に記載の抗５Ｔ４×抗４−１ＢＢ分子）が、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインにおける変異の結果、エフェクター機能を持たない（例えば、ヌルＡＤＣＣ活性）場合がある。
【０１１９】
「補体依存性細胞傷害」および「ＣＤＣ」とは、本明細書で使用される場合、正常血清中の成分（「補体」）が、標的抗原に結合した抗体または他の補体Ｃ１ｑ結合タンパク質と共に、標的抗原を発現している標的細胞の溶解を示すプロセスを指す。補体は、共同して順序立てて働いて効果を発揮する、血清タンパク質の一群からなる。
【０１２０】
用語「古典的補体経路」および「古典的補体系」とは、本明細書で使用される場合、同義語であり、補体を活性化するための特定の経路を指す。古典経路は惹起に抗原抗体複合体を必要とし、Ｃ１〜Ｃ９と名付けられた９種類の主要なタンパク質成分の順序だった活性化を含む。活性化プロセスのいくつかの段階において、その産物は次の段階を触媒する酵素となる。このカスケードにより、比較的小さな開始シグナルによる、大量の補体の増幅および活性化が実現される。
【０１２１】
ポリペプチドまたはタンパク質に関連して本明細書で使用される、用語「ＣＤＣ活性を有する」は、当該ポリペプチドまたはタンパク質、例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１）などに由来するＦｃドメイン（例えば、免疫グロブリンヒンジ領域、並びにＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを有する免疫グロブリン定常領域）を含むポリペプチドまたはタンパク質が、補体Ｃ１ｑタンパク質の結合および古典的補体系の活性化を通じて、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を媒介することが可能であること、を意味する。いくつかの実施形態では、多特異性ポリペプチドまたは多特異性タンパク質（例えば、本明細書に記載の抗５Ｔ４×抗４−１ＢＢ分子）が、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインにおける１または複数の変異の結果、エフェクター機能を持たない（例えば、ヌルＣＤＣ活性）場合がある。
【０１２２】
「エフェクター細胞の活性化の増強」とは、本明細書で使用される場合、本明細書に記載のポリペプチドまたはタンパク質によるエフェクター細胞応答の増加、長期化、および／または相乗を指す。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞の活性化の増強は、エフェクター細胞の細胞障害活性の増大を指す。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞の活性化の増強は、サイトカイン産生、細胞増殖の増加、またはエフェクター細胞の標的細胞を溶解する能力が増強されるような細胞表面分子発現の変化を指す。特定の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドおよびタンパク質は、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の調節することよって、エフェクター細胞の活性化を増強する。
【０１２３】
本明細書で使用される場合、用語「エフェクター細胞」とは、腫瘍細胞などの標的細胞を溶解または殺滅することが可能な免疫系の細胞を指す。本明細書では、エフェクター細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、またはＮＫＴ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、または顆粒球などの、リンパ球を指し得る。特定の実施形態では、エフェクター細胞という用語は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはＮＫＴ細胞を指す。
【０１２４】
本明細書で使用される場合、用語「治療（treatment）」、「治療する（treating）」、または「改善する（ameliorating）」は、治療的処置または予防的（prophylactic/preventative）処置のいずれかを指す。治療は、治療を受けている個体における疾患の少なくとも１つの症状が改善する場合、または治療が個体における進行性疾患の悪化を遅延できる場合、または治療が追加の関連疾患の発症を予防できる場合、治療的処置である。
【０１２５】
本明細書で使用される場合、本明細書に記載のポリペプチドもしくはタンパク質またはその組成物の「治療有効量（または用量）」または「有効量（または用量）」という用語は、その量の当該化合物が、治療を受けている疾患の１もしくは複数の症状の統計的に有意な回復、または臓器機能の統計的に有意な改善、をもたらすのに十分であることを指す。単独で投与された個々の活性成分についていう場合、治療有効量はその成分単独を指す。組み合わせについていう場合、治療有効量は、（同一製剤中で、または別々の製剤中で同時に）逐次投与されたか同時投与されたかにかかわらず、治療効果をもたらす活性成分の総量を指す。
【０１２６】
本明細書において、用語「統計的有意性」とは、ある試験結果の入手が偶然に生じたものである確率を指す。例えば、所見または試験結果は、それが純粋に偶然に発生したものである確率（ｐ）が所定の統計的閾値（ａ）未満である、すなわちｐ＜ａである場合、統計的に有意であるとされる。ある特定の試験の統計的閾値は、データの特徴および当該技術分野において公知の慣習に基づいて設定できる。例えば、所与の結果について、当該結果が統計的に有意と見なされるためにｐ＜０．０５となるように、ａは従来的には５％（０．０５）に設定される。
【０１２７】
本明細書で使用される場合、「５Ｔ４結合ドメイン」とは、ＴＰＢＧおよびＷＡＩＦ１（Wnt-activated inhibitory factor 1）としても知られている、癌胎児性トロホブラスト糖タンパク質（５Ｔ４）（例えば、ヒト５Ｔ４）に特異的に結合する、本明細書に記載のポリペプチドのドメインを指す。５Ｔ４は、７２ｋＤの癌胎児性糖タンパク質であり、タンパク質間相互作用に関連するいくつかのロイシンリッチリピートを有する、重度のＮ−グリコシル化が生じたタンパク質である。用語「５Ｔ４」は、５Ｔ４の任意のアイソフォームを指す場合がある。例示的なヒト５Ｔ４のヌクレオチド配列を配列番号１６３および配列番号１６７として、さらに、例示的なヒト５Ｔ４のアミノ酸配列を配列番号１６４および配列番号１６８として、下記の表１に示す。
【０１２８】
本明細書で使用される場合、「４−１ＢＢ結合ドメイン」とは、ヒト４−１ＢＢ（別名ＣＤ１３７）に特異的に結合することが可能な、本明細書に記載のタンパク質またはポリペプチドの結合ドメインを指す。用語「４−１ＢＢ」は、４−１ＢＢの任意のアイソフォームを指す場合がある。例示的なヒト４−１ＢＢのヌクレオチド配列を配列番号１６１および配列番号１６５として、さらに、例示的なヒト４−１ＢＢのアミノ酸配列を配列番号１６２および配列番号１６６として、下記の表１に示す。
【表１−１】
2020530770.tif 000002
【表１−２】
2020530770.tif 000003
【０１２９】
本明細書で使用される場合、「多特異性ポリペプチド」とは、それぞれ標的抗原に特異的に結合することが可能な２つ以上の結合ドメインを含むポリペプチドを指す。例えば、本明細書に記載のポリペプチドは、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の結合ドメインを含み、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の標的抗原と結合することが可能であり得る。いくつかの実施形態では、多特異性ポリペプチドは二重特異性ポリペプチドである。ここで、「二重特異性ポリペプチド」とは、２つの結合ドメインを含み、２つの別個の標的抗原に結合することが可能なものである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の二重特異性ポリペプチドは、５Ｔ４などの、標的細胞上に発現した細胞表面抗原に特異的に結合する第一結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の二重特異性ポリペプチドは、４−１ＢＢなどの、エフェクター細胞上に発現した細胞表面抗原に特異的に結合する結合ドメインを含む。特定の実施形態では、前記多特異性ポリペプチドは、ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖのフォーマットをとるホモ二量体二重特異性ポリペプチドの、ＡＤＡＰＴＩＲ（商標）である。
【０１３０】
足場を用いた多特異性ポリペプチドとしては、例えば、ＰＣＴ国際公開第２００７／１４６９６８号；同第２０１０／０４０１０５号；同第２０１０／００３１０８号；同第２０１６／０９４８７３号；同第２０１７／０５３４６９号；米国特許出願公開第２００６／００５１８４４号；並びに米国特許第７，１６６，７０７号および同第８，４０９，５７７号（それぞれその全体が参照によって本明細書に援用される）で開示されたものがある。特定の実施形態では、本明細書に記載の多特異性ポリペプチドは、二重特異性ポリペプチドであり、ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖ構造、別称ＡＤＡＰＴＩＲ（商標）ポリペプチドまたはフォーマット１、を含み得る。その例示的な実施形態を図１０に示す。フォーマット１構造を含むポリペプチドの構造は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、第一ｓｃＦｖ結合ドメイン−免疫グロブリン（Ｉｇ）ヒンジ領域−Ｉｇ定常領域−第二ｓｃＦｖ結合ドメインを含む（図１０）。特定の実施形態では、本明細書に記載の多特異性ポリペプチドは、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ構造（別称Ｍｏｒｒｉｓｏｎフォーマット、またはフォーマット２）を含み得る。フォーマット２構造を含むポリペプチドの構造は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ｓｃＦｖ結合ドメイン−Ｉｇ定常領域−Ｉｇヒンジ領域−Ｉｇ可変領域を含む。フォーマット２は、本質としては、Ｃ末端にｓｃＦｖドメインを含むインタクトなＩｇ分子である。
【０１３１】
結合ポリペプチドおよび結合タンパク質
いくつかの実施形態において、本開示は、５Ｔ４に特異的に結合することが可能なポリペプチド（例えば、５Ｔ４結合ポリペプチド）、並びにこれらの結合ドメインを含む多特異性のポリペプチドおよびタンパク質を記載している。このような実施形態は５Ｔ４結合ポリペプチドと称される場合がある。特定の実施形態では、本発明は、５Ｔ４結合ドメインと、エフェクター細胞上の細胞表面分子に結合することが可能な第二結合ドメインと、を含む多特異的結合タンパク質を提供する。特定の実施形態では、本発明は、５Ｔ４結合ドメインと、４−１ＢＢに結合することが可能な第二結合ドメイン（例えば、４−１ＢＢ結合ドメイン）と、を含む二重特異性結合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、前記５Ｔ４結合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、５Ｔ４結合ドメイン−Ｆｃドメインの構造を含む。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、本開示は、４−１ＢＢに特異的に結合することが可能なポリペプチド、並びにこれらの結合ドメインを含む多特異性のポリペプチドおよびタンパク質を記載している。このような実施形態は４−１ＢＢ結合ポリペプチドと称される場合がある。特定の実施形態では、本発明は、４−１ＢＢ結合ドメインと、標的細胞上の細胞表面分子に結合することが可能な第二結合ドメインと、を含む多特異的ポリペプチドを提供する。特定の実施形態では、本発明は、４−１ＢＢ結合ドメインと、５Ｔ４に結合することが可能な第二結合ドメイン（例えば、５Ｔ４結合ドメイン）と、を含む二重特異性ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、前記４−１ＢＢ結合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、４−１ＢＢ結合ドメイン−Ｆｃドメインの構造を含む。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、免疫グロブリン定常領域、リンカーペプチド、ヒンジ領域、免疫グロブリン二量体形成／ヘテロ二量体形成ドメイン、接合部アミノ酸、タグなどをさらに含むことができる。以下、本開示のポリペプチドおよびタンパク質のこれらの成分についてさらに詳細に説明する。
【０１３４】
本明細書に記載のポリペプチドおよびタンパク質（例えば、５Ｔ４結合ポリペプチド、４−１ＢＢ結合ポリペプチド、および／またはその多特異的結合タンパク質）は、標的抗原と特異的に結合することが可能な１または複数の結合ドメインを含む。本明細書に記載の結合ドメインは、種々様々なフォーマットのうちのいずれかの抗体または融合タンパク質の形態をとることができる（例えば、前記融合タンパク質は二重特異性分子または多特異性分子の形態をとることができる）。二重特異性分子の非限定的な例として、ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖ分子（例えば、フォーマット１の構造を含む二重特異性タンパク質）、ｓｃＦｖ−Ｉｇ分子（例えば、フォーマット２の構造を含む二重特異性タンパク質）、およびｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ分子が挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の二重特異性分子は、第一結合ドメインｓｃＦｖとそれに連結された第二結合ドメインｓｃＦｖとを含むか、これらからなり、免疫グロブリン定常領域などの他の配列を含まない。他の実施形態では、本明細書に記載の二重特異性タンパク質はダイアボディである。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドおよびタンパク質は、薬剤または毒性部分に複合化されている。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドおよびタンパク質（例えば、５Ｔ４結合ポリペプチド、４−１ＢＢ結合ポリペプチド、および／またはその多特異的結合タンパク質）は、表２〜１０に示されるアミノ酸配列および／または核酸配列を含み得る。特定の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドの結合ドメインは、（ｉ）ＣＤＲとしてＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）と、（ｉｉ）ＣＤＲとしてＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）と、を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドコンストラクトの場合に提供されるアミノ酸配列は、ヒト免疫グロブリンリーダー配列を含まない。示されるＣＤＲ配列およびアミノ酸置換位置は、ＩＭＧＴ基準（Brochet et al, Nucl. Acids Res. (2008) 36, W503-508）を用いて規定したものである。場合によっては、表２〜１０の配列を含む、本開示に示される配列は、親配列に対してアミノ酸置換を含有する（例えば、ＰＣＴ国際公開第２０１６／１８５０１６号で開示された、クローン１６１８／１６１９などの抗４−１ＢＢ抗体もしくはその結合性フラグメント、またはＰＣＴ国際公開第２０１６／１８５０１６号で開示されたものなどの抗５Ｔ４抗体もしくはその結合性フラグメント）。いくつかの実施形態では、抗５Ｔ４結合ドメインの親配列は配列番号３８および配列番号６８に提供されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗４−１ＢＢ結合ドメインの親配列は配列番号２８および配列番号１６に提供されるアミノ酸配列を含む。本明細書に記載の抗４−１ＢＢ結合ドメインおよび抗５Ｔ４結合ドメインの例示的な親配列を下記の表２に示す。下線が引かれたテキストはＣＤＲ配列を表している。
【表２】
2020530770.tif 000004
【０１３７】
特定の実施形態では、本開示の結合ドメインとしてのＶＬ領域および／またはＶＨ領域は、親ＶＬ領域および／または親ＶＨ領域のＶＬおよび／またはＶＨに由来するものであり（例えば、ＰＣＴ国際公開第２０１６／１８５０１６号に記載された１６１８／１６１９）、所望により、既知のモノクローナル抗体のＶＬ配列および／またはＶＨ配列と比較して、１または複数個程度（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個程度）の挿入、１または複数個程度（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個程度）の欠失、１または複数個程度（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個程度）のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換）、または上記変化の組み合わせ、を含有する。上記の挿入、欠失、または置換は、アミノ末端またはカルボキシル末端または両端をはじめとして、ＶＬ領域および／またはＶＨ領域のどこに存在してもよいが、ただし、各ＣＤＲが含む変化はゼロであるか、多くても１個、２個、または３個である。いくつかの実施形態では、この改変されたＶＬ領域および／またはＶＨ領域を含有する結合ドメインは、尚も、親結合ドメインと同様またはそれを超える親和性でその標的と特異的に結合できる。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の結合ドメインは、抗体由来であり、重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。例として、ＶＨ鎖およびＶＬ鎖を含むｓｃＦｖが挙げられる。これらの結合ドメインおよび可変領域鎖の配置の順番は、標的への結合性がいくらかでも保持される限り、特に限定はされない。例えば、可変ドメインは以下の順番で配置され得る：ＶＨ５Ｔ４−ＶＬ５Ｔ４−ＶＨ４−１ＢＢ−ＶＬ４−１ＢＢ；ＶＬ５Ｔ４−ＶＨ５Ｔ４−ＶＨ４−１ＢＢ−ＶＬ４−１ＢＢ；ＶＨ５Ｔ４−ＶＬ５Ｔ４−ＶＬ４−１ＢＢ−ＶＨ４−１ＢＢ；ＶＬ５Ｔ４−ＶＨ５Ｔ４−ＶＬ４−１ＢＢ−ＶＨ４−１ＢＢ；ＶＨ４−１ＢＢ−ＶＬ４−１ＢＢ−ＶＨ５Ｔ４−ＶＬ５Ｔ４；ＶＬ４−１ＢＢ−ＶＨ４−１ＢＢ−ＶＬ５Ｔ４−ＶＨ５Ｔ４；ＶＨ４−１ＢＢ−ＶＬ４−１ＢＢ−ＶＬ５Ｔ４−ＶＨ５Ｔ４；またはＶＬ４−１ＢＢ−ＶＨ４−１ＢＢ−ＶＨ５Ｔ４−ＶＬ５Ｔ４。４−１ＢＢに結合する結合ドメインおよび／または５Ｔ４に結合する結合ドメインにおけるＶＨ領域およびＶＬ領域の対は、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）のフォーマットをとり得る。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドおよびタンパク質（例えば、５Ｔ４結合ポリペプチド、４−１ＢＢ結合ポリペプチド、および／またはその多特異的結合タンパク質）は、ｓｃＦｖｓである結合ドメインを含む。そのような実施形態では、前記結合ドメインはｓｃＦｖドメインと称される場合がある。いくつかの実施形態では、目的の標的に対し特異的なＶＨ領域およびＶＬ領域を含む一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）が結合ドメインとなる。特定の実施形態では、これらのＶＨ領域およびＶＬ領域は、ヒトの、またはヒト型化されたものである。いくつかの変形形態では、ペプチドリンカーで連結されたＶＬ領域およびＶＨ領域を含む一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）が結合ドメインとなる。
【０１４０】
ＶＬ領域およびＶＨ領域を連結するためのペプチドリンカーの使用は、当該技術分野において周知であり、この特定の分野の中に多数の刊行物が存在している。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒが３回反復したアミノ酸配列（（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３）（配列番号９６）からなる、１５ｍｅｒのものである。他のリンカーも用いられており、ファージディスプレイ技術が、選択的感染性ファージ（selective infective phage）技術と同様に用いられており、適切なリンカー配列が多様化および選択される（Tang et al., J. Biol. Chem. 271, 15682-15686, 1996; Hennecke et al., Protein Eng. 11, 405-410, 1998）。特定の実施形態では、前記ＶＬ領域およびＶＨ領域は、ｎ＝１〜５である式（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎを含むアミノ酸配列を有するペプチドリンカーによって連結されている。例えば、本発明の１つの実施形態では、前記リンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４を含む。単一のリンカー（例えば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ）をランダム変異誘発を介して最適化することで、他の好適なリンカーを得ることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｓｃＦｖのＶＨ領域は、リンカー配列のＮ末端側に位置し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｓｃＦｖのＶＬ領域は、リンカー配列のＣ末端側に位置し得る。いくつかの実施形態では、前記ｓｃＦｖは、同じＶＨ領域およびＶＬ領域の配列を同じ配向で含む抗体よりも効率的に５Ｔ４および／または４−１ＢＢに結合し得る。特定の実施形態において、前記ｓｃＦｖは、ＶＨ−ＶＬ配向でよりもＶＬ−ＶＨ配向で５Ｔ４および／または４−１ＢＢにより効率的に結合する場合もあれば、逆にＶＬ−ＶＨ配向でよりもＶＨ−ＶＬ配向でより効率的に結合する場合もある。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、前記ポリペプチドは、前記結合ドメインを連結している（例えば、前記ｓｃＦｖドメインを連結している）結合ドメインリンカーを含む。いくつかの実施形態では、前記結合ドメインリンカーはＧｌｙ４Ｓｅｒリンカーである。いくつかの実施形態では、前記結合ドメインリンカーは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒが４回反復したアミノ酸配列（（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３）（配列番号９８）からなる、２０ｍｅｒのものである。いくつかの実施形態において、前記結合ドメインリンカーは、配列番号８６〜１０８から選択されるアミノ酸配列を含む。他のリンカーも用いられており、ファージディスプレイ技術が、選択的感染性ファージ技術と同様に用いられており、適切なリンカー配列が多様化および選択される（Tang et al., J. Biol. Chem. 271, 15682-15686, 1996; Hennecke et al., Protein Eng. 11, 405-410, 1998）。特定の実施形態では、前記ＶＬ領域およびＶＨ領域は、ｎ＝１〜５である式（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎを含むアミノ酸配列を有するペプチドリンカーによって連結されている。単一のリンカー（例えば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ）をランダム変異誘発を介して最適化することで、他の好適なリンカーを得ることができる。いくつかの例では、二重特異性分子が、４−１ＢＢに結合するｓｃＦｖに連結された５Ｔ４に結合するｓｃＦｖを含み得る。いくつかの実施形態では、二重特異性分子が、ヒンジ領域も定常領域も含まない。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドおよびタンパク質（例えば、５Ｔ４結合ポリペプチド、４−１ＢＢ結合ポリペプチド、および／またはその多特異的結合タンパク質）は、ヒンジをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記ヒンジは、野生型免疫グロブリンヒンジ領域内の１または複数のシステイン残基が１または複数の他のアミノ酸残基（例えば、セリンまたはアラニン）で置換された、改変型の免疫グロブリンヒンジである。例示的な改変型免疫グロブリンヒンジ、カルボキシル末端側リンカー、およびアミノ末端側リンカーは、野生型ヒトＩｇＧ１ヒンジに存在する１、２、または３個のシステイン残基が、１、２、または３個の異なるアミノ酸残基（例えば、セリンまたはアラニン）で置換された、免疫グロブリンヒトＩｇＧ１ヒンジ領域を包含する。改変型免疫グロブリンヒンジは、さらにプロリンが、別のアミノ酸（例えば、セリンまたはアラニン）で置換されていてもよい。例えば、前述の改変型ヒトＩｇＧ１ヒンジは、さらに、野生型ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域の３個のシステインのカルボキシル末端側に位置するプロリンが、別のアミノ酸残基（例えば、セリン、アラニン）で置換されていてもよい。１つの実施形態では、コアヒンジ領域のプロリンは置換されない。特定の実施形態では、ヒンジポリペプチド、カルボキシル末端側リンカーポリペプチド、またはアミノ末端側リンカーポリペプチドは、野生型ヒトＩｇＧ１ヒンジ、野生型ヒトＩｇＧ２ヒンジ、または野生型ヒトＩｇＧ４ヒンジなどの、野生型免疫グロブリンヒンジ領域と、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一な配列を含むか、またはそのような配列である。
【０１４３】
特定の実施形態では、別のポリペプチド鎖とヘテロ二量体を形成しているポリペプチドに存在するヒンジは、野生型免疫グロブリンヒンジ領域またはその改変型免疫グロブリンヒンジ領域などの免疫グロブリンヒンジであり得る。特定の実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質の一方のポリペプチド鎖のヒンジが、当該ヘテロ二量体の他方のポリペプチド鎖の対応するヒンジと同一である。他の特定の実施形態では、一方の鎖のヒンジが他方の鎖のヒンジと（長さと配列において）異なっている。異なる鎖に異なるヒンジがあることで、これらのヒンジが接続されている各結合ドメインの結合親和性に対して、異なる処置を加えることが可能となり、その結果、ヘテロ二量体を、一方の結合ドメインの標的に対して、他方の結合ドメインの標的よりも優先的に結合させることができるようになる。例えば、特定の実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質が、一方の鎖に４−１ＢＢ結合ドメインを有し、別の鎖に５Ｔ４結合ドメインを有する。２つの異なる鎖に２つの異なるヒンジがあることで、ヘテロ二量体の、５Ｔ４への結合を第一とし、４−１ＢＢへの結合を第二とすることができる。すなわち、このヘテロ二量体は、４−１ＢＢ発現エフェクター細胞を５Ｔ４発現標的細胞（例えば、５Ｔ４を発現している腫瘍またはがん細胞）に動員することで、その５Ｔ４発現細胞の傷害または破壊をもたらすことができる。
【０１４４】
特定の実施形態では、カルボキシル末端側リンカーまたはアミノ末端側リンカーが、グリシン−セリン（例えば、Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）リピートを含む可動性リンカー配列である。特定の実施形態では、前記リンカーは、３つのＧｌｙ４Ｓｅｒリピート（配列番号９６）と、その後にプロリン残基を含む。特定の実施形態では、前記プロリン残基の後に、グリシン、アルギニン、およびセリンからなる群から選択されるアミノ酸が続く。いくつかの実施形態では、カルボキシル末端側リンカーまたはアミノ末端側リンカーが、配列番号８６〜１０８から選択される配列を含むか、それからなる。
【０１４５】
本開示で用いるのに適した、いくつかの例示的なヒンジ、カルボキシル末端側リンカー、およびアミノ末端側リンカーの配列を、下記の表３に示す。追加の例示的なヒンジ領域およびリンカー領域が、米国特許出願公開第２０１３／０１２９７２３号の配列番号２４１〜２４４、６０１、７８、７６３〜７９１、２２８、３７９〜４３４、６１８〜７４９に記載されている（これらの配列は参照によって本明細書に援用される）。
表３：ヒンジおよびリンカーの例
【表３】
2020530770.tif 000005
【０１４６】
他の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドおよびタンパク質は、第二の同一でないポリペプチド鎖内の異なるヘテロ二量体形成ドメインとヘテロ二量体化することが可能な、ヘテロ二量体形成ドメインを含む。特定の変形例では、ヘテロ二量体化のための前記第二のポリペプチド鎖は、第二の結合ドメインを含む。従って、本開示の特定の実施形態では、一方が第一結合ドメインを含むポリペプチドを含み、２本目が所望により第二結合ドメインを含む、２本の同一でないポリペプチド鎖が、二量体化して、ヘテロ二量体結合タンパク質を形成している。二量体形成／ヘテロ二量体形成ドメインは、２本の同一でないポリペプチド鎖からのヘテロ二量体形成が望まれ、片方または両方のポリペプチド鎖が結合ドメインを含む場合に、使用できる。特定の実施形態では、本明細書に記載の特定のヘテロ二量体の一方のポリペプチド鎖メンバーが、結合ドメインを含有しない。ヘテロ二量体の種類の例として、米国特許出願公開第２０１３／００９５０９７号および同第２０１３／０１２９７２３号、ＰＣＴ国際公開第２０１６／０９４８７３号に記載されるものが挙げられる。
【０１４７】
特定の実施形態では、前記第一ポリペプチド鎖および第二ポリペプチド鎖は、「免疫グロブリン二量体形成ドメイン」または「免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメイン」を含むことにより、二量体化する。「免疫グロブリン二量体形成ドメイン」または「免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメイン」とは、本明細書では、第二ポリペプチド鎖の異なる免疫グロブリン領域と優先的に相互作用または結合する、第一ポリペプチド鎖の免疫グロブリン領域を指し、この異なる免疫グロブリン領域同士の相互作用が、第一ポリペプチド鎖および第二ポリペプチド鎖のヘテロ二量体化（すなわち、２本の異なるポリペプチド鎖間の二量体、別名「ヘテロ二量体」、の形成）の実質的な一因となり、またはそれを効率的に促進する。ヘテロ二量体の各ポリペプチド鎖の免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメインは、互いに異なっていることで、両方の鎖によるヘテロ二量体化を促進し、どちらかの鎖によるホモ二量体化を最小限にするように、異なる改変を加えることができる。本明細書において提供される免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメインは、異なるポリペプチド間の効率的なヘテロ二量体化を可能にし、得られるヘテロ二量体タンパク質の精製を容易にする。
【０１４８】
本明細書で提供されるように、本開示に係る２本の異なるポリペプチド鎖のヘテロ二量体化の促進に有用な免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメインは、野生型および改変型の免疫グロブリンのＣＨ１ドメインおよびＣＬドメイン、例えばヒトのＣＨ１ドメインおよびＣＬドメイン、を含む。特定の実施形態では、免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメインが、例えば、米国特許出願公開第２０１３／０１２９７２３号の配列番号１１４、１８６〜１９２、および１９４にそれぞれ記載されるような、または米国特許出願公開第２０１３／０１２９７２３号の配列番号１１４に記載されるような、野生型のＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭのＣＨ１ドメインなどの、野生型ＣＨ１ドメインである（前記配列は参照によって本明細書に援用される）。別の実施形態では、改変型ＣＨ１ドメインと野生型ＣＬドメインとの間でジスルフィド結合が形成されないように、野生型免疫グロブリンＣＬドメイン（例えば、ヒトＣＬ）とのジスルフィド結合形成に関与する野生型ＣＨ１ドメイン（例えば、ヒトＣＨ１）のシステイン残基が、改変型免疫グロブリンＣＨ１ドメインで欠失または置換されている。
【０１４９】
特定の実施形態では、免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメインは、例えば、米国特許出願公開第２０１３／０１２９７２３号の配列番号１１２および配列番号１１３（前記配列は参照によって本明細書に援用される）にそれぞれ記載されるような、野生型Ｃκドメインまたは野生型Ｃλドメインなどの、野生型ＣＬドメインである。別の実施形態では、免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメインは、改変型Ｃκドメインまたは改変型Ｃλドメインなどの改変型免疫グロブリンＣＬドメインであり、例えば、改変型ヒトＣκドメインまたは改変型ヒトＣλドメインである。特定の実施形態では、前記改変型免疫グロブリンＣＬドメイン、例えば米国特許出願公開第２０１３／０１２９７２３号の配列番号１４１に記載のＣκドメインまたは米国特許出願公開第２０１３／０１２９７２３号の配列番号１４０に記載のＣλドメイン（前記配列は参照によって本明細書に援用される）において、野生型免疫グロブリンＣＨ１ドメインとのジスルフィド結合の形成に関与する野生型ＣＬドメインのシステイン残基が欠失または置換されている。特定の実施形態では、前記改変型Ｃκドメインにおいて、前記野生型ヒトＣκドメインの最後のシステインのみが欠失しているが、これは、カルボキシル末端にアルギニンを有し且つ改変型Ｃκドメインのアミノ末端を別のドメイン（例えば、免疫グロブリンＣＨ２ドメインおよび免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含む小領域などの、免疫グロブリン小領域）と連結させるリンカーによって、前記野生型ヒトＣκドメインから欠失した第１アルギニンが供給され得るためである。
【０１５０】
別の実施形態では、免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメインは、Ｃκ−Ｃκ境界における鎖間水素結合ネットワークの形成に関与し得る位置において、野生型Ｃκドメインと比較して１または複数のアミノ酸置換を含有する、改変型Ｃκドメインである。例えば、特定の実施形態では、免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメインは、Ｎ２９位、Ｎ３０位、Ｑ５２位、Ｖ５５位、Ｔ５６位、Ｓ６８位、またはＴ７０位の１または複数のアミノ酸が異なるアミノ酸で置換された改変型ヒトＣκドメインである。アミノ酸の付番は、米国特許出願公開第２０１３／０１２９７２３号の配列番号１４１（前記配列は参照によって本明細書に援用される）に記載の改変型ヒトＣκ配列における位置に基づいている。特定の実施形態では、免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメインは、Ｎ２９位、Ｎ３０位、Ｖ５５位、またはＴ７０位に１、２、３、または４つのアミノ酸置換を有する改変型ヒトＣκドメインである。上記位置の置換基として使用されるアミノ酸は、アラニンか、または、アルギニン、トリプトファン、チロシン、グルタミン酸、グルタミン、リジン  アスパラギン酸、メチオニン、セリンもしくはフェニルアラニンなどの側鎖部分に嵩があるアミノ酸残基であり得る。改変型ヒトＣκドメインは、ＣＨ１ドメインとのヘテロ二量体化を促進するが、別のＣκドメインとのホモ二量体化は最小限にするものである。改変型ヒトＣκドメインの代表的なものとして、米国特許出願公開第２０１３／０１２９７２３号の配列番号１４２〜１７８；米国特許出願公開第２０１３／０１２９７２３号の配列番号１６０（Ｎ２９Ｗ  Ｖ５５Ａ  Ｔ７０Ａ）、配列番号１６１（Ｎ２９Ｙ  Ｖ５５Ａ  Ｔ７０Ａ）、配列番号２０２（Ｔ７０Ｅ  Ｎ２９Ａ  Ｎ３０Ａ  Ｖ５５Ａ）、配列番号１６７（Ｎ３０Ｒ  Ｖ５５Ａ  Ｔ７０Ａ）、配列番号１６８（Ｎ３０Ｋ  Ｖ５５Ａ  Ｔ７０Ａ）、配列番号１７０（Ｎ３０Ｅ  Ｖ５５Ａ  Ｔ７０Ａ）、配列番号１７２（Ｖ５５Ｒ  Ｎ２９Ａ  Ｎ３０Ａ）、配列番号１７５（Ｎ２９Ｗ  Ｎ３０Ｙ  Ｖ５５Ａ  Ｔ７０Ｅ）、配列番号１７６（Ｎ２９Ｙ  Ｎ３０Ｙ  Ｖ５５Ａ  Ｔ７０Ｅ）、配列番号１７７（Ｎ３０Ｅ  Ｖ５５Ａ  Ｔ７０Ｅ）、配列番号１７８（Ｎ３０Ｙ  Ｖ５５Ａ  Ｔ７０Ｅ）、配列番号８３８（Ｎ３０Ｄ  Ｖ５５Ａ  Ｔ７０Ｅ）、配列番号８３９（Ｎ３０Ｍ  Ｖ５５Ａ  Ｔ７０Ｅ）、配列番号８４０（Ｎ３０Ｓ  Ｖ５５Ａ  Ｔ７０Ｅ）、および配列番号８４１（Ｎ３０Ｆ  Ｖ５５Ａ  Ｔ７０Ｅ）（前記配列は参照によって本明細書に援用される）に記載のものがある。
【０１５１】
特定の実施形態では、本明細書に記載のＣκドメインの変異に加えて、またはそれの代わりに、ポリペプチドヘテロ二量体の免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメインの両方（すなわち、免疫グロブリンＣＨ１ドメインおよび免疫グロブリンＣＬドメイン）が変異を有し、その結果、得られた免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメインが、変異部位のアミノ酸残基間で塩橋（すなわち、イオン性相互作用）を形成する。例えば、ポリペプチドヘテロ二量体の免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメインは、変異型ＣＨ１ドメインと変異型Ｃκドメインとの組み合わせであり得る。前記変異型ＣＨ１ドメインでは、野生型ヒトＣＨ１ドメインの６８位のバリン（Ｖ６８）が負電荷を有するアミノ酸残基（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）で置換されており、最初のアルギニンと最後のシステインが欠失している変異型ヒトＣκドメインの２９位のロイシン（Ｌ２９）が正電荷を有するアミノ酸残基（例えば、リジン、アルギニンまたはヒスチジン）で置換されている。得られた変異型ＣＨ１ドメインの負電荷を有するアミノ酸残基と、得られた変異型Ｃκドメインの正電荷を有するアミノ酸残基と、の間の電荷間の相互作用により、塩橋が形成され、この塩橋が変異型ＣＨ１ドメインと変異型Ｃκドメインとの間のヘテロ二量体の境界面を安定化させる。あるいは、野生型ＣＨ１のＶ６８が正電荷を有するアミノ酸残基で置換され、最初のアルギニンおよび最後のシステインが欠失している変異型ヒトＣκドメインのＬ２９が負電荷を有するアミノ酸残基で置換されていてもよい。Ｖ６８が負電荷または正電荷を有するアミノ酸で置換されている変異型ＣＨ１配列の例として、米国特許出願公開第２０１３／０１２９７２３号の配列番号８４４および配列番号８４５（前記配列は参照によって本明細書に援用される）に記載のものがある。Ｌ２９が負電荷または正電荷を有するアミノ酸で置換されている変異型Ｃκ配列の例として、米国特許出願公開第２０１３／０１２９７２３号の配列番号８４２および配列番号８４３（前記配列は参照によって本明細書に援用される）に記載のものがある。
【０１５２】
ＣＨ１ドメインのＶ６８およびＣκドメインのＬ２９の変異に加えて、またはそれの代わりに、ヒトＣＨ１ドメインのＶ６８およびヒトＣκドメインのＬ２９以外の位置で、相反する電荷を有するアミノ酸による置換を行って、それらのアミノ酸間にイオン性相互作用を生み出すことができる。そのような位置は、あらゆる好適な方法で特定することができ、そのような方法としては、ランダム変異誘発、ＣＨ１−Ｃκ対の結晶構造解析によるＣＨ１−Ｃκ境界面に位置するアミノ酸残基の特定、さらに、一連の判定基準（例えば、イオン性相互作用に対する関与傾向、パートナーになり得る残基との近接性など）を用いたＣＨ１−Ｃκ境界面に位置するアミノ酸残基間の適切な位置の特定、が挙げられる。
【０１５３】
特定の実施形態では、本開示のポリペプチドヘテロ二量体は、免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメインを一対だけ含有する。例えば、ポリペプチドヘテロ二量体の第一鎖が免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメインとしてＣＨ１ドメインを含み、第二鎖が免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメインとしてＣＬドメイン（例えば、ＣκまたはＣλ）を含み得る。あるいは、第一鎖が免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメインとしてＣＬドメイン（例えば、ＣκまたはＣλ）を含み、第二鎖が免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメインとしてＣＨ１ドメインを含み得る。本明細書に記載されるように、第一鎖および第二鎖の免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメインは、互いに結合することで、本開示のヘテロ二量体タンパク質を形成することが可能である。
【０１５４】
他の特定の実施形態では、本開示のヘテロ二量体タンパク質は２対の免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメインを有し得る。例えば、ヘテロ二量体の第一鎖が２つのＣＨ１ドメインを含み、第二鎖が前記第一鎖内の２つのＣＨ１ドメインと結合する２つのＣＬドメインを有し得る。あるいは、第一鎖が２つのＣＬドメインを含み、第二鎖が前記第一鎖内の２つのＣＬドメインと結合する２つのＣＨ１ドメインを有し得る。特定の実施形態では、第一ポリペプチド鎖がＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインを含み、第二ポリペプチド鎖が前記第一ポリペプチド鎖内のＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインとそれぞれ結合するＣＬドメインおよびＣＨ１ドメインを含む。
【０１５５】
ヘテロ二量体タンパク質が１つのみのヘテロ二量体化対（すなわち、各鎖に１つの免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメイン）を含む実施形態では、各鎖の免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメインは、その鎖の免疫グロブリン定常領域のアミノ末端側に位置し得る。あるいは、各鎖の免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメインは、その鎖の免疫グロブリン定常領域のカルボキシル末端側に位置し得る。
【０１５６】
ヘテロ二量体タンパク質が２つのヘテロ二量体化対（すなわち、各鎖に２つの免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメイン）を含む実施形態では、各鎖の両方の免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメインが、その鎖の免疫グロブリン定常領域のアミノ末端側に位置し得る。あるいは、各鎖の両方の免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメインが、その鎖の免疫グロブリン定常領域のカルボキシル末端側に位置し得る。別の実施形態では、各鎖の一方の免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメインがその鎖の免疫グロブリン定常領域のアミノ末端側に位置し、各鎖の他方の免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメインがその鎖の免疫グロブリン定常領域のカルボキシル末端側に位置し得る。言い換えれば、これらの実施形態では、免疫グロブリン定常領域は、各鎖の２つの免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメインの間に挿入されている。
【０１５７】
本明細書で示されるように、いくつかの実施形態では、本開示のポリペプチドおよびタンパク質（例えば、５Ｔ４結合ポリペプチド、４−１ＢＢ結合ポリペプチド、および／またはその多特異的結合タンパク質）は、ポリペプチド鎖に免疫グロブリン定常領域（別名、定常領域、Ｆｃドメイン、Ｆｃ領域など）をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記免疫グロブリン定常領域は、配列番号１５８のアミノ酸配列、配列番号１６０のアミノ酸配列、またはそのバリアントを含む。免疫グロブリン定常領域が含まれることで、本発明のポリペプチドおよびタンパク質の、対象への投与後の循環血液からのクリアランスが遅くなる。変異または他の変化により、免疫グロブリン定常領域は、ポリペプチドのエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、ＣＤＣ、補体結合、およびＦｃ受容体への結合）の比較的容易なさらなる調節を可能にし、エフェクター機能は、当該技術分野において公知であり且つ本明細書に記載の、治療対象の疾患に基づいて増加または減少され得る。特定の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドおよびタンパク質は、これらのエフェクター機能のうちの１または複数を調節することが可能な免疫グロブリン定常領域を含む。他の実施形態では、これらのエフェクター機能のうちの１または複数が、対応する野生型免疫グロブリン定常領域と比較して、本開示の、本明細書に記載のポリペプチドまたはタンパク質の免疫グロブリン定常領域では、低減しているか、または存在しない。例えば、例えば４−１ＢＢ結合ドメインを含むことなどにより、エフェクター細胞の活性化を増強するように設計された、二量体型の５Ｔ４結合ポリペプチドまたは４−１ＢＢ結合ポリペプチドの場合、免疫グロブリン定常領域は、対応する野生型免疫グロブリン定常領域と比較して、エフェクター機能が低減されているか、エフェクター機能がないことが好ましい。
【０１５８】
本開示のポリペプチドおよびタンパク質（例えば、５Ｔ４結合ポリペプチド、４−１ＢＢ結合ポリペプチド、および／またはその多特異的結合タンパク質）に存在する免疫グロブリン定常領域は、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、またはこれらのあらゆる組み合わせ、の一部または全てを含むか、またはそれに由来し得る。例えば、免疫グロブリン定常領域は、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインの両方、ＣＨ３ドメインおよびＣＨ４ドメインの両方、２つのＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、２つのＣＨ４ドメイン、並びにＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインの一部を含み得る。特定の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドまたはタンパク質は、ＣＨ１ドメインを含まない。
【０１５９】
本明細書に記載のポリペプチドまたはタンパク質は、免疫グロブリンの特定のクラスもしくはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、またはＩｇＤ）由来、または様々な種（ヒト、マウス、ラット、および他の哺乳類を含む）由来の、野生型免疫グロブリンＣＨ２ドメインまたは改変型免疫グロブリンＣＨ２ドメインを含み得る。特定の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドまたはタンパク質のＣＨ２ドメインは、米国特許出願公開第２０１３／０１２９７２３号の配列番号１１５、１９９〜２０１、および１９５〜１９７（前記配列は参照によって本明細書に援用される）にそれぞれ記載されるヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、またはＩｇＤの野生型ＣＨ２ドメインなどの、野生型ヒト免疫グロブリンＣＨ２ドメインである。特定の実施形態では、前記ＣＨ２ドメインは、米国特許出願公開第２０１３／０１２９７２３号（前記配列は参照によって本明細書に援用される）の配列番号１１５に記載の野生型ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインである。
【０１６０】
特定の実施形態では、本開示のポリペプチドまたはタンパク質の改変型ＣＨ２領域は、野生型のヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、もしくはＩｇＧ４、またはマウスＩｇＧ２ａ（例えば、ＩＧＨＧ２ｃ）のＣＨ２領域などの、野生型免疫グロブリンＣＨ２領域と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一の配列を含むか、そのような配列である。
【０１６１】
本開示のポリペプチドまたはタンパク質の改変型免疫グロブリンＣＨ２領域（例えば、５Ｔ４結合ポリペプチド、４−１ＢＢ結合ポリペプチド、および／またはその多特異的結合タンパク質）は、様々な種（ヒト、マウス、ラット、および他の哺乳類を含む）由来の、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、およびＩｇＤなどの、様々な免疫グロブリンアイソタイプの、ＣＨ２領域に由来し得る。特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質の改変型免疫グロブリンＣＨ２領域は、米国特許出願公開第２０１３／０１２９７２３号（前記配列は参照によって本明細書に援用される）の、配列番号１１５、１９９、２０１、および３２０にその配列が記載される、ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４、またはマウスＩｇＧ２ａ（例えば、ＩＧＨＧ２ｃ）の、ＣＨ２領域に由来し得る。特定の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドまたはタンパク質（例えば、５Ｔ４結合ポリペプチド、４−１ＢＢ結合ポリペプチド、および／またはその多特異的結合タンパク質）の改変型ＣＨ２ドメインは、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、ＣＤＣ、補体結合、Ｆｃ受容体結合、またはこれらのあらゆる組み合わせなどの、免疫学的活性（すなわち、エフェクター機能）を増強または低減する、当該技術分野において公知の変異を有する、改変型ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインである。
【０１６２】
特定の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドまたはタンパク質のＣＨ２ドメインは、１または複数のアミノ酸の欠失または置換を含む改変型免疫グロブリンＣＨ２領域（例えば、改変型ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメイン）である。いくつかの実施形態では、前記ＣＨ２ドメインは、２９７位のアスパラギンにおけるアミノ酸置換（例えば、アスパラギンのアラニンへのアミノ酸置換）を含む。このようなアミノ酸置換は、この部位でのグリコシル化を低減または排除し、ＦｃのＦｃγＲおよびＣ１ｑへの効率的な結合を抑止する。２９７位のＡｓｎがＡｌａに置換された改変型ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインの配列は、米国特許出願公開第２０１３／０１２９７２３号の配列番号３２４（前記配列は参照によって本明細書に援用される）に記載されたものである。いくつかの実施形態では、前記改変型ＣＨ２ドメインは、２３４〜２３８位において少なくとも１つの置換または欠失を含む。例えば、免疫グロブリンＣＨ２領域は、２３４位、２３５位、２３６位、２３７位、もしくは２３８位；２３４位および２３５位；２３４位および２３６位；２３４位および２３７位；２３４位および２３８位；２３４〜２３６位；２３４位、２３５位および２３７位；２３４位、２３６位および２３８位；２３４位、２３５位、２３７位、および２３８位；２３６〜２３８位；または２３４〜２３８位の２個、３個、４個、もしくは５個のアミノ酸のあらゆる他の組み合わせに、置換を含み得る。いくつかの実施形態では、改変型ＣＨ２領域は、２３４〜２３８位に１または複数（例えば、２個、３個、４個、または５個）のアミノ酸欠失を含み、例えば、２３６位または２３７位の一方にアミノ酸欠失を含み、他方は置換されている。特定の実施形態では、２３４〜２３８位の１または複数におけるアミノ酸残基は、１または複数のアラニン残基で置換されている。別の実施形態では、２３４〜２３８位のアミノ酸残基のうち１つのみが欠失しており、２３４〜２３８位の１または複数の残りのアミノ酸は別のアミノ酸（例えば、アラニンまたはセリン）で置換されている場合がある。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、上記の変異は、前記改変型ＣＨ２ドメインを含むポリペプチドのＡＤＣＣ活性またはＦｃ受容体結合能を低減または排除する。
【０１６４】
他の特定の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドまたはタンパク質のＣＨ２ドメインは、２５３位、３１０位、３１８位、３２０位、３２２位、および３３１位に１または複数のアミノ酸置換を含む改変型免疫グロブリンＣＨ２領域（例えば、改変型ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメイン）である。例えば、免疫グロブリンＣＨ２領域は、２５３位、３１０位、３１８位、３２０位、３２２位、または３３１位に、３１８位および３２０位、３１８位および３２２位に、３１８位、３２０位および３２２位に、または、２５３位、３１０位、３１８位、３２０位、３２２位、および３３１位における２個、３個、４個、５個もしくは６個のアミノ酸の他のあらゆる組み合わせに、置換を含み得る。そのような実施形態では、上記の変異は、前記改変型ＣＨ２ドメインを含むポリペプチドのＣＤＣ活性を低減または排除する。
【０１６５】
他の特定の実施形態では、２９７位のアミノ酸置換に加えて、本明細書に記載のポリペプチドまたはタンパク質の改変型ＣＨ２領域（例えば、改変型ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメイン）は、２３４〜２３８位に１または複数（例えば、２個、３個、４個、または５個）の追加の置換をさらに含み得る。例えば、免疫グロブリンＣＨ２領域は、２３４位および２９７位に、２３４位、２３５位、および２９７位に、２３４位、２３６位および２９７位に、２３４〜２３６位および２９７位に、２３４位、２３５位、２３７位および２９７位に、２３４位、２３６位、２３８位および２９７位に、２３４位、２３５位、２３７位、２３８位および２９７位に、２３６〜２３８位および２９７位に、または、２９７位に加えて２３４〜２３８位における２個、３個、４個、もしくは５個のアミノ酸の他のあらゆる組み合わせに、置換を含み得る。さらに、またはあるいは、改変型ＣＨ２領域は、２３６位または２３７位など、２３４〜２３８位に１または複数（例えば、２個、３個、４個、または５個）のアミノ酸欠失を含み得る。この追加の変異は、前記改変型ＣＨ２ドメインを含むポリペプチドのＡＤＣＣ活性またはＦｃ受容体結合能を低減または排除する。特定の実施形態では、２３４〜２３８位の１または複数におけるアミノ酸残基は、１または複数のアラニン残基で置換されている。別の実施形態では、２３４〜２３８位のアミノ酸残基のうち１つのみが欠失しており、２３４〜２３８位の１または複数の残りのアミノ酸は別のアミノ酸（例えば、アラニンまたはセリン）で置換されている場合がある。
【０１６６】
特定の実施形態では、２３４〜２３８位における１または複数（例えば、２個、３個、４個、または５個）のアミノ酸置換に加えて、本開示の融合タンパク質の、本明細書に記載のポリペプチドまたはタンパク質の変異型ＣＨ２領域（例えば、改変型ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメイン）は、補体結合に関与する１または複数の位置（例えば、Ｉ２５３位、Ｈ３１０位、Ｅ３１８位、Ｋ３２０位、Ｋ３２２位、またはＰ３３１位）において、１または複数（例えば、２個、３個、４個、５個、または６個）の追加のアミノ酸置換（例えば、アラニンによる置換）を含有し得る。変異型免疫グロブリンＣＨ２領域の例としては、２３４位、２３５位、２３７位（存在する場合）、３１８位、３２０位、および３２２位にアラニン置換を有する、ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４のＣＨ２領域、およびマウスＩｇＧ２ａのＣＨ２領域が挙げられる。例示的な変異型免疫グロブリンＣＨ２領域は、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、およびＫ３２２にアラニン置換を有するマウスＩＧＨＧ２ｃ  ＣＨ２領域である。
【０１６７】
さらに別の実施形態では、２９７位のアミノ酸置換および２３４〜２３８位の追加の欠失または置換に加えて、本明細書に記載のポリペプチドまたはタンパク質の改変型ＣＨ２領域（例えば、改変型ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメイン）は、２５３位、３１０位、３１８位、３２０位、３２２位、および３３１位に１または複数（例えば、２個、３個、４個、５個、または６個）の追加の置換をさらに含み得る。例えば、免疫グロブリンＣＨ２領域は、（１）２９７位の置換と、（２）２３４〜２３８位における１または複数の置換または欠失またはその組み合わせと、を含み、さらに、Ｉ２５３位、Ｈ３１０位、Ｅ３１８位、Ｋ３２０位、Ｋ３２２位、およびＰ３３１位に１または複数（例えば、２個、３個、４個、５個、または６個）のアミノ酸置換（例えば、Ｅ３１８位、Ｋ３２０位およびＫ３２２位における１個、２個、３個の置換など）を含み得る。上記位置におけるアミノ酸はアラニンまたはセリンで置換されていてもよい。
【０１６８】
特定の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドまたはタンパク質の免疫グロブリンＣＨ２領域は、（ｉ）２９７位のアスパラギンのアミノ酸置換、および２３４位、２３５位、２３６位もしくは２３７位の１個のアミノ酸置換；（ｉｉ）２９７位のアスパラギンのアミノ酸置換、および２３４〜２３７位のうち２つのアミノ酸置換；（ｉｉｉ）２９７位のアスパラギンのアミノ酸置換、および２３４〜２３７位のうち３つのアミノ酸置換；（ｉｖ）２９７位のアスパラギンのアミノ酸置換、２３４位、２３５位、および２３７位のアミノ酸置換、並びに２３６位のアミノ酸欠失；（ｖ）２３４〜２３７位のうち３つのアミノ酸置換、並びに３１８位、３２０位、および３２２位のアミノ酸置換；または、（ｖｉ）２３４〜２３７位のうち３つのアミノ酸置換、２３６位のアミノ酸欠失、並びに３１８位、３２０位、および３２２位のアミノ酸置換、を含む。
【０１６９】
２９７位のアスパラギンのアミノ酸置換を有する、例示的な改変型免疫グロブリンＣＨ２領域としては、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７、およびＮ２９７にアラニン置換、並びにＧ２３６に欠失を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ２領域（参照によって本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１３／０１２９７２３号の配列番号３２５）、Ｖ２３４、Ｇ２３６、およびＮ２９７にアラニン置換を有するヒトＩｇＧ２  ＣＨ２領域（参照によって本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１３／０１２９７２３号の配列番号３２６）、Ｆ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７、およびＮ２９７にアラニン置換、並びにＧ２３６に欠失を有するヒトＩｇＧ４  ＣＨ２領域（参照によって本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１３／０１２９７２３号の配列番号３２２）、Ｆ２３４およびＮ２９７にアラニン置換を有するヒトＩｇＧ４  ＣＨ２領域（参照によって本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１３／０１２９７２３号の配列番号３４３）、Ｌ２３５およびＮ２９７にアラニン置換を有するヒトＩｇＧ４  ＣＨ２領域（参照によって本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１３／０１２９７２３号の配列番号３４４）、Ｇ２３６およびＮ２９７にアラニン置換を有するヒトＩｇＧ４  ＣＨ２領域（参照によって本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１３／０１２９７２３号の配列番号３４５）、並びに、Ｇ２３７およびＮ２９７にアラニン置換を有するヒトＩｇＧ４  ＣＨ２領域（参照によって本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１３／０１２９７２３号の配列番号３４６）が挙げられる。これらのＣＨ２領域は本開示のポリペプチド（例えば、５Ｔ４結合ポリペプチドおよび／または二重特異性４−１ＢＢポリペプチド）に用いることができる。
【０１７０】
特定の実施形態では、上記のアミノ酸置換に加えて、本明細書に記載のポリペプチドまたはタンパク質の改変型ＣＨ２領域（例えば、改変型ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメイン）は、上記の位置以外の１または複数の位置に、１または複数の追加のアミノ酸置換を含有し得る。そのようなアミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換であっても非保存的アミノ酸置換であってもよい。例えば、特定の実施形態では、改変型ＩｇＧ２  ＣＨ２領域において、Ｐ２３３がＥ２３３に変化している場合がある（例えば、参照によって本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１３／０１２９７２３号の配列番号３２６を参照）。さらに、またはあるいは、特定の実施形態では、前記改変型ＣＨ２領域は、１または複数のアミノ酸の挿入、欠失、またはその両方、を含み得る。これらの挿入、欠失、または置換は、ヒンジを介してＣＨ２領域が別の領域（例えば、結合ドメインまたは免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメイン）と連結されることにより生じる、野生型免疫グロブリンＣＨ２領域のＮ末端またはＣ末端など、免疫グロブリンＣＨ２領域のどこにでも存在し得る。
【０１７１】
特定の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドまたはタンパク質の改変型ＣＨ２ドメインは、２３５位、３１８位、３２０位、および３２２位にアラニン置換を有し（すなわち、Ｌ２３５Ａ置換、Ｅ３１８Ａ置換、Ｋ３２０Ａ置換、およびＫ３２２Ａ置換を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメイン）（参照によって本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１３／０１２９７２３号の配列番号５９５）、所望により、Ｎ２９７変異（例えば、アラニンへの変異）を有する、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインである。他の特定の実施形態では、改変型ＣＨ２ドメインは、２３４位、２３５位、２３７位、３１８位、３２０位、および３２２位にアラニン置換を有し（すなわち、Ｌ２３４Ａ置換、Ｌ２３５Ａ置換、Ｇ２３７Ａ置換、Ｅ３１８Ａ置換、Ｋ３２０Ａ置換、およびＫ３２２Ａ置換を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメイン）（参照によって本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１３／０１２９７２３号の配列番号５９６）、所望によりＮ２９７変異（例えば、アラニンへの変異）を有する、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインである。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドまたはタンパク質（例えば、５Ｔ４結合ポリペプチド、４−１ＢＢ結合ポリペプチド、および／またはその多特異的結合タンパク質）の免疫グロブリン定常領域は、ＥＵ付番方式に従う、Ｌ２３４Ａ置換、Ｌ２３５Ａ置換、Ｇ２３７Ａ置換、およびＫ３２２Ａ置換を含むヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインを含む。
【０１７３】
本明細書に記載のポリペプチドまたはタンパク質（例えば、５Ｔ４結合ポリペプチド、４−１ＢＢ結合ポリペプチド、および／またはその多特異的結合タンパク質）の免疫グロブリン定常領域を形成し得るＣＨ３ドメインは、様々な種（ヒト、マウス、ラット、および他の哺乳類を含む）の、特定の免疫グロブリンクラスまたは免疫グロブリンサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ）由来の、野生型免疫グロブリンＣＨ３ドメインまたはその改変型免疫グロブリンＣＨ３ドメインであり得る。特定の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド（例えば、５Ｔ４結合ポリペプチド、４−１ＢＢ結合ポリペプチド、および／またはその多特異的結合タンパク質）のＣＨ３ドメインは、米国特許出願公開第２０１３／０１２９７２３号の配列番号１１６、２０８〜２１０、２０４〜２０７、および２１２（前記配列は参照によって本明細書に援用される）にそれぞれ記載されるヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭの野生型ＣＨ３ドメインなどの、野生型ヒト免疫グロブリンＣＨ３ドメインである。特定の実施形態では、前記ＣＨ３ドメインは、米国特許出願公開第２０１３／０１２９７２３号（前記配列は参照によって本明細書に援用される）の配列番号１１６に記載の野生型ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインである。
【０１７４】
特定の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド（例えば、５Ｔ４結合ポリペプチド、４−１ＢＢ結合ポリペプチド、および／またはその多特異的結合タンパク質）のＣＨ３ドメインは、改変型ヒト免疫グロブリンＣＨ３ドメインであって、例えば、ヒトＩｇＧ１抗体、ヒトＩｇＧ２抗体、ヒトＩｇＧ３抗体、ヒトＩｇＧ４抗体、ヒトＩｇＡ１抗体、ヒトＩｇＡ２抗体、ヒトＩｇＤ抗体、ヒトＩｇＥ抗体、またはヒトＩｇＭ抗体の野生型ＣＨ３ドメインに基づく、またはそれに由来する、改変型ＣＨ３ドメインなどである。例えば、改変型ＣＨ３ドメインは、Ｈ４３３位およびＮ４３４位（位置はＥＵ付番に従って付番）に１つまたは２つの変異を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインであり得る。このような位置における変異は補体結合に関与し得る。他の特定の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド（例えば、５Ｔ４結合ポリペプチド、４−１ＢＢ結合ポリペプチド、および／またはその多特異的結合タンパク質）の改変型ＣＨ３ドメインは、Ｆ４０５位またはＹ４０７位に１つまたは２つのアミノ酸置換を有する、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインであり得る。このような位置のアミノ酸は、別のＣＨ３ドメインとの相互作用に関与している。特定の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドの改変型ＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインの最後のリジンが欠失した、改変型ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインであり得る。この改変型ＣＨ３ドメインの配列は、米国特許出願公開第２０１３／０１２９７２３号の配列番号７６１（前記配列は参照によって本明細書に援用される）に記載されている。
【０１７５】
特定の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドまたはタンパク質（例えば、５Ｔ４結合ポリペプチド、４−１ＢＢ結合ポリペプチド、および／またはその多特異的結合タンパク質）は、いわゆる「ノブと穴（knobs-into-holes）」型の変異を含むＣＨ３ドメインを含む（Marvin and Zhu, Acta Pharmacologica Sinica 26:649-58, 2005; Ridgway et al., Protein Engineering 9:617-21, 1966を参照）。より具体的には、ＣＨ３／ＣＨ３結合に必要な立体的相補性がこれら２つのＣＨ３ドメインを互いに対合させるように、各ポリペプチド鎖の各ＣＨ３ドメインに変異が導入され得る。例えば、ポリペプチドヘテロ二量体の一方の一本鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインがＴ３６６Ｗ変異（小型アミノ酸を大型アミノ酸と置換する「ノブ」型変異）を含有し、当該ポリペプチドヘテロ二量体のもう一方の一本鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインがＹ４０７Ａ変異（大型アミノ酸を小型アミノ酸と置換する「穴」型変異）を含有し得る。他の例示的なノブと穴型変異としては、（１）一方のＣＨ３ドメインのＴ３６６Ｙ変異、および他方のＣＨ３ドメインのＹ４０７Ｔ変異、並びに、（２）一方のＣＨ３ドメインのＴ３６６Ｗ変異、並びに他方のＣＨ３ドメインのＴ３６６Ｓ変異、Ｌ３６８Ａ変異、およびＹ４０７Ｖ変異が挙げられる。
【０１７６】
本明細書に記載のポリペプチドまたはタンパク質（例えば、５Ｔ４結合ポリペプチド、４−１ＢＢ結合ポリペプチド、および／またはその多特異的結合タンパク質）の免疫グロブリン定常領域を形成し得るＣＨ４ドメインは、ＩｇＥ分子またはＩｇＭ分子由来の野生型免疫グロブリンＣＨ４ドメインまたはその改変型免疫グロブリンＣＨ４ドメインであり得る。特定の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドのＣＨ４ドメインは、野生型ヒト免疫グロブリンＣＨ４ドメインであって、例えば、米国特許出願公開第２０１３／０１２９７２３号の配列番号２１３および配列番号２１４（前記配列は参照によって本明細書に援用される）にそれぞれ記載されるヒトＩｇＥ分子およびヒトＩｇＭ分子の野生型ＣＨ４ドメインなどである。特定の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドのＣＨ４ドメインは、改変型ヒト免疫グロブリンＣＨ４ドメインであって、例えば、ＩｇＥまたはＩｇＭのＦｃ領域と関連していることが知られている免疫学的活性を増加または減少させる変異を有する、ヒトＩｇＥ分子またはヒトＩｇＭ分子のＣＨ４ドメインに基づく、またはそれに由来する改変型ＣＨ４ドメインなどである。
【０１７７】
特定の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドまたはタンパク質（例えば、５Ｔ４結合ポリペプチド、４−１ＢＢ結合ポリペプチド、および／またはその多特異的結合タンパク質）の免疫グロブリン定常領域は、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはＣＨ４ドメインの組み合わせ（すなわち、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４から選択される２つ以上の定常領域ドメイン）を含む。例えば、免疫グロブリン定常領域は、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを含むか、またはＣＨ３ドメインとＣＨ４ドメインとを含み得る。他の特定の実施形態では、前記免疫グロブリン定常領域は、２つのＣＨ３ドメインを含むが、ＣＨ２ドメインもＣＨ４ドメインも含まない（すなわち、２つ以上のＣＨ３のみを含む）、免疫グロブリン定常領域であり得る。本明細書に記載のポリペプチドの免疫グロブリン定常領域を形成する複数の定常領域ドメインは、同じ免疫グロブリン分子、または同じクラスの免疫グロブリン分子、または同じサブクラスの免疫グロブリン分子、に基づいているか、それに由来し得る。特定の実施形態では、前記免疫グロブリン定常領域は、ＩｇＧ  ＣＨ２−ＣＨ３（例えば、ＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３、ＩｇＧ２  ＣＨ２−ＣＨ３、およびＩｇＧ４  ＣＨ２−ＣＨ３）であり、ヒト（例えば、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、およびヒトＩｇＧ４）ＣＨ２ＣＨ３であり得る。例えば、特定の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドの免疫グロブリン定常領域は、（１）野生型ヒトＩｇＧ１のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン、（２）Ｎ２９７Ａ置換を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ２（すなわち、ＣＨ２（Ｎ２９７Ａ））および野生型ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３、または（３）ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２（Ｎ２９７Ａ）および最後のリジンが欠失している改変型ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３、を含む。あるいは、本明細書に記載のポリペプチドまたはタンパク質（例えば、５Ｔ４結合ポリペプチド、４−１ＢＢ結合ポリペプチド、および／またはその多特異的結合タンパク質）の複数の定常領域ドメインは、異なる免疫グロブリン分子、または異なるクラスの免疫グロブリン分子、または異なるサブクラスの免疫グロブリン分子、に基づいているか、それに由来し得る。例えば、特定の実施形態では、免疫グロブリン定常領域は、ヒトＩｇＭ  ＣＨ３ドメインおよびヒトＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインの両方を含む。本明細書に記載のポリペプチドの免疫グロブリン定常領域を形成する複数の定常領域ドメインは、直接的に連結している場合もあるし、１または複数（例えば、約２〜約１０個）のアミノ酸を介して互いに連結している場合もある。
【０１７８】
本明細書に記載のポリペプチドまたはタンパク質（例えば、５Ｔ４結合ポリペプチド、４−１ＢＢ結合ポリペプチド、および／またはその多特異的結合タンパク質）に使用できる例示的な免疫グロブリン定常領域は、米国特許出願公開第２０１３／０１２９７２３の配列番号３０５〜３０９、３２１、３２３、３４１、３４２、および７６２（前記配列は参照によって本明細書に援用される）に記載されたものである。本明細書に記載のポリペプチドまたはタンパク質に使用できる免疫グロブリン定常領域のさらなる例を下記の表４に記載する。
【表４】
2020530770.tif 000006
【０１７９】
特定の実施形態では、本明細書に記載のホモ二量体タンパク質またはヘテロ二量体タンパク質（例えば、５Ｔ４結合ポリペプチド、４−１ＢＢ結合ポリペプチド、および／またはその多特異的結合タンパク質）の各ポリペプチド鎖の免疫グロブリン定常領域は、互いに同一である。他の特定の実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質の一方のポリペプチド鎖の免疫グロブリン定常領域が、当該ヘテロ二量体の他方のポリペプチド鎖の免疫グロブリン定常領域と異なっている。例えば、ヘテロ二量体タンパク質の一方の免疫グロブリン定常領域が「ノブ」型変異を有するＣＨ３ドメインを含有し、当該ヘテロ二量体タンパク質の他方の免疫グロブリン定常領域が「穴」型変異を有するＣＨ３ドメインを含有し得る。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、本開示のポリペプチドは、上記の変異のいずれかを含む免疫グロブリン定常領域と、親結合ドメインのアミノ酸配列と比較して１または複数のアミノ酸変異を含む結合ドメインと、を含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、本開示のポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインにＬ２３４Ａ変異、Ｌ２３５Ａ変異、Ｇ２３７Ａ変異、およびＫ３２２Ａ変異のうちの１または複数を含む免疫グロブリン定常領域と、配列番号３８および配列番号４６からなる群から選択されるＶＨドメイン並びに配列番号４４、４８、および５０からなる群から選択されるＶＬドメインを含む５Ｔ４結合ドメインと、を含み得る。いくつかの実施形態では、本開示のポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインにＬ２３４Ａ変異、Ｌ２３５Ａ変異、Ｇ２３７Ａ変異、およびＫ３２２Ａ変異のうちの１または複数を含む免疫グロブリン定常領域と、配列番号１４のＶＨドメインアミノ酸配列および配列番号１６のＶＬドメインアミノ酸配列を含む４１ＢＢ結合ドメインと、を含み得る。いくつかの実施形態では、本開示のポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインにＬ２３４Ａ変異、Ｌ２３５Ａ変異、Ｇ２３７Ａ変異、およびＫ３２２Ａ変異のうちの１または複数を含む免疫グロブリン定常領域と、配列番号３８および配列番号４６からなる群から選択されるＶＨドメイン並びに配列番号４４、４８、および５０からなる群から選択されるＶＬドメインを含む５Ｔ４結合ドメインと、配列番号１４のＶＨドメインアミノ酸配列および配列番号１６のＶＬドメインアミノ酸配列を含む４１ＢＢ結合ドメインと、を含み得る。
【０１８１】
本明細書に記載のポリペプチドおよびタンパク質（例えば、５Ｔ４結合ポリペプチド、４−１ＢＢ結合ポリペプチド、および／またはその多特異的結合タンパク質）は、それぞれその全体が参照によって本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１３／０１２９７２３号および同第２０１３／００９５０９７号で一般に開示された足場を用いて作製されてもよい。本明細書に記載のポリペプチドは、各々が免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメインを含む、２つの同一でないポリペプチド鎖を含んでいてもよい。この接続用の免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメインが異なっている。１つの実施形態では、前記免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメインはＣＨ１ドメインまたはその誘導体を含む。別の実施形態では、前記免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメインはＣＬドメインまたはその誘導体を含む。１つの実施形態では、前記ＣＬドメインは、ＣκもしくはＣλアイソタイプ、またはその誘導体である。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドおよびタンパク質（例えば、５Ｔ４結合ポリペプチド、４−１ＢＢ結合ポリペプチド、および／またはその多特異的結合タンパク質）は、他の５Ｔ４結合ポリペプチドまたは４−１ＢＢ結合ポリペプチドと比較して、改善された特徴を有し得る。例えば、本発明の５Ｔ４結合ポリペプチド、４−１ＢＢ結合ポリペプチド、またはその多特異性タンパク質は、異なる５Ｔ４結合ポリペプチドおよび／または４−１ＢＢ結合ポリペプチドの等電点と比較して、等電点の低下を示し得る。「等電点」または「ｐＩ」とは、実効電荷がゼロになるｐＨである。タンパク質の等電点は、あらゆる好適な方法で、例えば分析用キャピラリー等電点電気泳動クロマトグラフィーで、測定することができる。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドおよびタンパク質（例えば、５Ｔ４結合ポリペプチド、４−１ＢＢ結合ポリペプチド、および／またはその多特異的結合タンパク質）は、従来公知の５Ｔ４結合性ドメインおよび／もしくは４−１ＢＢ結合性ドメイン、並びに／または、５Ｔ４結合性の親ドメインもしくは親タンパク質および／もしくは４−１ＢＢ結合性の親ドメインもしくは親タンパク質よりも高い親和性で、５Ｔ４（例えば、ヒト５Ｔ４）および／または４−１ＢＢに結合し得る。いくつかの実施形態では、５Ｔ４結合性のドメインもしくはポリペプチドおよび／または４−１ＢＢ結合性のドメインもしくはポリペプチドの解離定数は、約２〜５ｎＭであり得る。特定の実施形態では、５Ｔ４結合性のドメインもしくはポリペプチドおよび／または４−１ＢＢ結合性のドメインもしくはポリペプチドの解離速度（off rate）は、従来公知の抗体もしくはｓｃＦｖコンストラクト、または５Ｔ４結合性の親ドメインもしくは親タンパク質および／もしくは４−１ＢＢ結合性の親ドメインもしくは親タンパク質の解離速度と比較して、１／４〜１／１０倍に減少し得る。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドおよびタンパク質（例えば、５Ｔ４結合ポリペプチド、４−１ＢＢ結合ポリペプチド、および／またはその多特異的結合タンパク質）は、ポリペプチドまたはタンパク質の組み換え発現時に生成される、低レベルの高分子量集合体を有し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドおよびタンパク質（例えば、５Ｔ４結合ポリペプチド、４−１ＢＢ結合ポリペプチド、および／またはその多特異的結合タンパク質）は、ポリペプチドまたはタンパク質内に存在するドメインの組み合わせに依存して、ヒト血清中でより長期の安定性を示し得る。
【０１８５】
５Ｔ４結合ドメインおよびそれを含むタンパク質
いくつかの実施形態では、本発明は、５Ｔ４（例えばヒト５Ｔ４）に特異的に結合する５Ｔ４結合ドメインを提供する。いくつかの実施形態では、本発明はさらに、５Ｔ４結合ドメインを含むポリペプチド（例えば、５Ｔ４結合ポリペプチド）を提供する。特定の変更形態では、前記５Ｔ４結合ポリペプチドは、前記５Ｔ４結合ドメインのカルボキシル末端側にヒンジ領域を含み、さらに免疫グロブリン定常領域を含む。さらなる変更形態では、前記５Ｔ４結合ポリペプチドは、前記免疫グロブリン定常領域のカルボキシル末端側にカルボキシル末端結合ドメインリンカーを含み、さらに、前記カルボキシル末端側リンカーのカルボキシル末端側に第二結合ドメインを含む。さらに他の変更形態では、５Ｔ４結合ポリペプチドは、前記５Ｔ４結合ドメインを含むポリペプチドのアミノ末端側にヒンジ領域を含み、さらに、前記ヒンジ領域のアミノ末端側に免疫グロブリン定常（immunoglobulin constant）を含む。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の５Ｔ４結合ドメインは、５Ｔ４の細胞外ドメイン上に位置するエピトープ（例えば、配列番号１６８の中に含まれるエピトープ）と結合する。特定の態様では、このエピトープは非連続的且つ／または立体構造のエピトープである。
【０１８７】
５Ｔ４結合ドメインポリペプチドは、ヒト５Ｔ４に特異的に結合し、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＤＲ１は配列番号３０、５２、および６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；前記ＨＣＤＲ２は配列番号３２および６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；前記ＨＣＤＲ３は配列番号３４のアミノ酸配列を含み；前記ＬＣＤＲ１は配列番号８、４２、および５４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；前記ＬＣＤＲ２は配列番号１０のアミノ酸配列を含み；前記ＬＣＤＲ３は配列番号３６のアミノ酸配列を含み得る。
【０１８８】
特定の実施形態では、５Ｔ４結合ドメインポリペプチドは、ヒト５Ｔ４に特異的に結合し、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、（ａ）前記ＨＣＤＲ１は配列番号３０に記載のアミノ酸配列を含み；（ｂ）前記ＨＣＤＲ２は配列番号３２に記載のアミノ酸配列を含み；（ｃ）前記ＨＣＤＲ３は配列番号３４に記載のアミノ酸配列を含み；（ｄ）前記ＬＣＤＲ１は配列番号８に記載のアミノ酸配列を含み；前記ＬＣＤＲ２は配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含み；（ｆ）前記ＬＣＤＲ３は配列番号３６に記載のアミノ酸配列を含み得る。他の特定の実施形態では、５Ｔ４結合ドメインポリペプチドは、ヒト５Ｔ４に特異的に結合し、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、（ａ）前記ＨＣＤＲ１は配列番号３０に記載のアミノ酸配列を含み；（ｂ）前記ＨＣＤＲ２は配列番号３２に記載のアミノ酸配列を含み；（ｃ）前記ＨＣＤＲ３は配列番号３４に記載のアミノ酸配列を含み；（ｄ）前記ＬＣＤＲ１は配列番号４２に記載のアミノ酸配列を含み；（ｅ）前記ＬＣＤＲ２は配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含み；（ｆ）前記ＬＣＤＲ３は配列番号３６に記載のアミノ酸配列を含む。他の特定の実施形態では、５Ｔ４結合ドメインポリペプチドは、ヒト５Ｔ４に特異的に結合し、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、（ａ）前記ＨＣＤＲ１は配列番号５２に記載のアミノ酸配列を含み；（ｂ）前記ＨＣＤＲ２は配列番号３２に記載のアミノ酸配列を含み；（ｃ）前記ＨＣＤＲ３は配列番号３４に記載のアミノ酸配列を含み；（ｄ）前記ＬＣＤＲ１は配列番号５４に記載のアミノ酸配列を含み；（ｅ）前記ＬＣＤＲ２は配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含み；（ｆ）前記ＬＣＤＲ３は配列番号３６に記載のアミノ酸配列を含む。他の特定の実施形態では、５Ｔ４結合ドメインポリペプチドは、ヒト５Ｔ４に特異的に結合し、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、（ａ）前記ＨＣＤＲ１は配列番号６０に記載のアミノ酸配列を含み；（ｂ）前記ＨＣＤＲ２は配列番号６２に記載のアミノ酸配列を含み；（ｃ）前記ＨＣＤＲ３は配列番号３４に記載のアミノ酸配列を含み；（ｄ）前記ＬＣＤＲ１は配列番号５４に記載のアミノ酸配列を含み；（ｅ）前記ＬＣＤＲ２は配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含み；（ｆ）前記ＬＣＤＲ３は配列番号３６に記載のアミノ酸配列を含む。
【０１８９】
特定の実施形態では、５Ｔ４結合ドメインポリペプチドは、配列番号４０、４４、４８、５０、５８、６８、および７０からなる群から選択される軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、または１００％同一の配列を含むか、またはそのような配列であり、このポリペプチドは、ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖフォーマットの多特異性ポリペプチドであり、ＶＬの９９位のＬＣＤＲ１にＹからＦへの置換、および／またはＶＬの１４８位のＦＲ３にＦからＳへの置換を含む。特定の実施形態では、５Ｔ４結合ドメインを含むポリペプチドは、配列番号４０、４４、４８、５０、５８、６８、および７０からなる群から選択される軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、５Ｔ４結合ドメインポリペプチドは、配列番号３８、４６、５６、および６４からなる群から選択される重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列を含む。
【０１９０】
特定の実施形態では、５Ｔ４結合ドメインポリペプチドは、配列番号３８のアミノ酸配列を含むＶＨ領域と、配列番号４０のアミノ酸配列を含むＶＬ領域と、を含む。特定の実施形態では、５Ｔ４結合ドメインポリペプチドは、配列番号３８のアミノ酸配列を含むＶＨ領域と、配列番号４４のアミノ酸配列を含むＶＬ領域と、を含む。特定の実施形態では、５Ｔ４結合ドメインポリペプチドは、配列番号４６のアミノ酸配列を含むＶＨ領域と、配列番号４８のアミノ酸配列を含むＶＬ領域と、を含む。特定の実施形態では、５Ｔ４結合ドメインポリペプチドは、配列番号４６のアミノ酸配列を含むＶＨ領域と、配列番号５０のアミノ酸配列を含むＶＬ領域と、を含む。特定の実施形態では、５Ｔ４結合ドメインポリペプチドは、配列番号５６のアミノ酸配列を含むＶＨ領域と、配列番号５８のアミノ酸配列を含むＶＬ領域と、を含む。特定の実施形態では、５Ｔ４結合ドメインポリペプチドは、配列番号６４のアミノ酸配列を含むＶＨ領域と、配列番号５８のアミノ酸配列を含むＶＬ領域と、を含む。特定の実施形態では、５Ｔ４結合ドメインポリペプチドは、配列番号３８のアミノ酸配列を含むＶＨ領域と、配列番号６８のアミノ酸配列を含むＶＬ領域と、を含む。特定の実施形態では、５Ｔ４結合ドメインポリペプチドは、配列番号４６のアミノ酸配列を含むＶＨ領域と、配列番号７０のアミノ酸配列を含むＶＬ領域と、を含む。
【０１９１】
抗５Ｔ４結合ドメイン配列の例を表５に示す。
表５：５Ｔ４結合ドメインポリペプチドのＣＤＲおよび可変領域のアミノ酸配列およびＤＮＡ配列
Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ：コンストラクト  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ：成分  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：配列
【表５−１】
2020530770.tif 000007
【表５−２】
2020530770.tif 000008
【表５−３】
2020530770.tif 000009
【表５−４】
2020530770.tif 000010
【表５−５】
2020530770.tif 000011
【表５−６】
2020530770.tif 000012
【表５−７】
2020530770.tif 000013
【表５−８】
2020530770.tif 000014
【０１９２】
いくつかの実施形態では、本発明は、５Ｔ４結合ドメインを含む多特異性ポリペプチド（例えば、二重特異性ポリペプチド）を提供する。そのような実施形態では、５Ｔ４結合性のタンパク質またはポリペプチドが、５Ｔ４以外の標的と結合する１または複数の追加の結合ドメイン（例えば、第二結合ドメイン）を含み得る。これらの他の結合ドメインは、例えば、特定のサイトカイン、または前記結合ドメインポリペプチドを特定の細胞型、毒素、追加の細胞受容体、もしくは抗体などに標的化する分子を含み得る。多特異性５Ｔ４結合ポリペプチドまたは多特異性５Ｔ４結合タンパク質は、２つの結合ドメイン（これらのドメインは同一または異なる標的に特異的に結合するように設計され得る）、ヒンジ領域、リンカー（例えば、カルボキシル末端リンカーまたはアミノ末端側リンカー）、および免疫グロブリン定常領域を含み得る。多特異性５Ｔ４結合タンパク質は、２つの同一の、ジスルフィド架橋されたポリペプチドを含むホモ二量体タンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、前記５Ｔ４結合ドメインは、５Ｔ４に結合するモノクローナル抗体に由来し得る。
【０１９３】
本開示のいくつかの実施形態では、５Ｔ４結合ポリペプチドは、第二のポリペプチド鎖とヘテロ二量体を形成することが可能であり、（ａ）免疫グロブリン定常領域のアミノ末端側に接した（例えば、前記免疫グロブリン定常領域がＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む場合の、ＣＨ２ドメインのアミノ末端側の、または、前記免疫グロブリン小領域がＣＨ３ドメインおよびＣＨ４ドメインを含む場合の、ＣＨ３ドメインのアミノ末端側の）ヒンジ領域を含むか、（ｂ）結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）と免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメインとの間に挟まれた、それらを接続するヒンジ領域を含むか、（ｃ）免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメインと免疫グロブリン定常領域（例えば、前記免疫グロブリン定常領域はＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインまたはＣＨ３ドメインおよびＣＨ４ドメインを含む）との間に挟まれた、それらを接続するヒンジ領域を含むか、（ｄ）免疫グロブリン定常領域と結合ドメインとの間に挟まれた、それらを接続するヒンジ領域を含むか、（ｅ）ポリペプチド鎖のアミノ末端にヒンジ領域を含むか、（ｆ）ポリペプチド鎖のカルボキシル末端にヒンジ領域を含む。本明細書に記載のヒンジ領域を含むポリペプチド鎖は、異なるポリペプチド鎖と結合して、本明細書において提供されるヘテロ二量体タンパク質を形成することを可能とし、形成されたヘテロ二量体は標的特異性または特異的な標的結合親和性を保持する結合ドメインを含有することとなる。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される５Ｔ４結合ポリペプチドは、２つのｓｃＦｖを含むポリペプチドである。いくつかの実施形態では、前記２つのｓｃＦｖは５Ｔ４結合ドメインを含む。特定の実施形態では、前記２つのｓｃＦｖは同一の５Ｔ４結合ドメインを含む。他の実施形態では、前記２つのｓｃＦｖは異なる５Ｔ４結合ドメインを含む。他の実施形態では、前記ポリペプチドは、第一のｓｃＦｖとして５Ｔ４結合ドメインを含み、第二のｓｃＦｖとしてエフェクター細胞結合ドメインを含む。例えば、前記エフェクター細胞結合ドメインは４−１ＢＢに特異的なｓｃＦｖであり得る。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される５Ｔ４結合ポリペプチドは、配列番号１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、および１７０からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８２％、少なくとも約８５％、少なくとも約８７％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一の抗５Ｔ４  ｓｃＦｖを含み、当該ポリペプチドは、ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖフォーマットの多特異性ポリペプチドであり、抗５Ｔ４  ＶＬの９９位のＬＣＤＲ１にＹからＦへの置換、および／または抗５Ｔ４  ＶＬの１４８位のＦＲ３にＦからＳへの置換を含む。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される５Ｔ４結合ポリペプチドは、配列番号１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、および１７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む抗５Ｔ４  ｓｃＦｖを含む。例示的な抗５Ｔ４  ｓｃＦｖのアミノ酸配列および核酸配列を下記の表６に記載する。
表６：例示的な抗５Ｔ４  ｓｃＦｖのアミノ酸配列およびＤＮＡ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ：ＤＮＡ配列
Ｎａｍｅ：名称  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：配列
【表６−１】
2020530770.tif 000015
【表６−２】
2020530770.tif 000016
【表６−３】
2020530770.tif 000017
【表６−４】
2020530770.tif 000018
【表６−５】
2020530770.tif 000019
【０１９６】
いくつかの実施形態では、５Ｔ４結合ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシル末端へ順に（またはカルボキシル末端からアミノ末端へ順に）、（ｉ）５Ｔ４結合ドメインと、（ｉｉ）ヒンジ領域と、（ｉｉｉ）免疫グロブリン定常領域と、（ｉｖ）カルボキシル末端側リンカー（またはアミノ末端側リンカー）と、（ｖ）第二結合ドメインと、を含む。別の実施形態では、前記第二結合ドメインは４−１ＢＢに特異的なｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、５Ｔ４結合ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシル末端へ順に（またはカルボキシル末端からアミノ末端へ順に）、（ｉ）第二結合ドメインと、（ｉｉ）ヒンジ領域と、（ｉｉｉ）免疫グロブリン定常領域と、（ｉｖ）カルボキシル末端側リンカー（またはアミノ末端側リンカー）と、（ｖ）５Ｔ４結合ドメインと、を含む。別の実施形態では、前記第二結合ドメインは、４−１ＢＢ結合ドメインを含むか、４−１ＢＢ結合ドメインである。特定の実施形態では、５Ｔ４結合タンパク質は、５Ｔ４を発現する標的細胞にエフェクター細胞を動員するための、エフェクター細胞結合ドメインを含み得る。特定の実施形態では、前記エフェクター細胞結合ドメインは、４−１ＢＢに特異的に結合する。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の５Ｔ４結合ポリペプチドの第二結合ドメインは、４−１ＢＢ結合ドメインであり、ＰＣＴ国際公開第２０１６／１８５０１６号；ＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５９６５６号；Dubrot et al., 2010; Gauttier et al., 2014; Kim et al., 2001; McMillin et al., 2006; Melero et al., 1997; Miller et al., 2002; Sallin et al., 2014; Taraban et al., 2002; Uno et al., 2006; Vinay and Kwon, 2012; Wilcox et al., 2002（それぞれその全体が参照によって本明細書に援用される）で開示された１または複数の４−１ＢＢ結合配列（例えば、ＣＤＲまたは可変領域）を含む。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、前記第二結合ドメインは、４−１ＢＢに特異的に結合し、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）および免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含み；前記ＶＬは、配列番号１６および２２からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９３％同一の、少なくとも約９５％同一の、少なくとも約９７％同一の、少なくとも約９８％同一の、少なくとも約９９％同一の、または１００％同一のアミノ酸配列を含み；前記ＶＨは、配列番号１４、２０、２６、および２８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９３％同一の、少なくとも約９５％同一の、少なくとも約９７％同一の、少なくとも約９８％同一の、少なくとも約９９％同一の、または１００％同一のアミノ酸配列を含み、当該ポリペプチドは、ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖフォーマットの多特異性ポリペプチドであり、ＶＨの１５０位のＨＣＤＲ１にＹからＨへの置換、および／またはＶＨの１２７位のＦＲ３にＲからＨへの置換を含む。いくつかの実施形態では、前記第二結合ドメインは、４−１ＢＢと特異的に結合し、ＶＬおよびＶＨを含み；前記ＶＬは配列番号１６および２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；前記ＶＨは配列番号１４、２０、２６、および２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、前記第二結合ドメインは、４−１ＢＢ結合ドメインポリペプチドであり、このポリペプチドは配列番号１１０、１１２、１１４、および１１６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８２％、少なくとも約８５％、少なくとも約８７％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一の配列を含むｓｃＦｖである。抗４−１ＢＢ結合ドメイン配列の例を表６および表７に示し、以下でさらに詳細に論じる。
【０２００】
４−１ＢＢ結合ドメインおよび４−１ＢＢ結合ドメインを含むタンパク質
いくつかの実施形態では、本発明は、４−１ＢＢ（例えばヒト４−１ＢＢ）に特異的に結合する４−１ＢＢ結合ドメインを提供する。４−１ＢＢはＣＤ１３７またはＴＮＦＲＳＦ９としても知られており、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体ファミリーのメンバーである。４−１ＢＢは、活性化Ｔ細胞サブセット（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、および制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ））、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞、単球、マスト細胞、および好酸球をはじめとする、複数の細胞型で発現される。ＣＤ８＋Ｔ細胞上の４−１ＢＢの活性化は細胞の活性化を維持および／または増強し、一方、ＣＤ４＋Ｔ細胞上の４−１ＢＢの活性化は、細胞の活性化を惹起し、場合によっては、活性化誘導細胞死をもたらし得る。Ｔｒｅｇ上の４−１ＢＢの活性化は、通常、Ｔｒｅｇの機能を抑制する。いくつかの研究で、４−１ＢＢ抗体の拮抗薬としての使用により、腫瘍免疫が誘導されることが明らかとなっている。例示的なヒト４−１ＢＢのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１６３および１６７と、配列番号１６４および１６６とに記載されている。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、本発明はさらに、４−１ＢＢ結合ドメインを含むポリペプチド（例えば、４−１ＢＢ結合ポリペプチド）を提供する。特定の変更形態では、前記４−１ＢＢ結合ポリペプチドは、前記４−１ＢＢ結合ドメインのカルボキシル末端側にヒンジ領域を含み、さらに免疫グロブリン定常領域を含む。さらなる変更形態では、前記４−１ＢＢ結合ポリペプチドは、前記免疫グロブリン定常領域のカルボキシル末端側にカルボキシル末端結合ドメインリンカーを含み、さらに、前記カルボキシル末端側リンカーのカルボキシル末端側に第二結合ドメインを含む。
【０２０２】
さらに他の変更形態では、４−１ＢＢ結合ポリペプチドは、前記４−１ＢＢ結合ドメインを含むポリペプチドのアミノ末端側にヒンジ領域を含み、さらに、前記ヒンジ領域のアミノ末端側に免疫グロブリン定常（immunoglobulin constant）を含む。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の４−１ＢＢ結合ドメインは、４−１ＢＢの細胞外ドメイン上に位置するエピトープ（例えば、配列番号１６６の中に含まれるエピトープ）と結合する。特定の態様では、このエピトープは非連続的且つ／または立体構造のエピトープである。
【０２０４】
４−１ＢＢ結合ドメインポリペプチドは、ヒト４−１ＢＢに特異的に結合し、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＤＲ１は配列番号２、１８、２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；前記ＨＣＤＲ２は配列番号４のアミノ酸配列を含み；前記ＨＣＤＲ３は配列番号６のアミノ酸配列を含み；前記ＬＣＤＲ１は配列番号８のアミノ酸配列を含み；前記ＬＣＤＲ２は配列番号１０のアミノ酸配列を含み；前記ＬＣＤＲ３は配列番号１２のアミノ酸配列を含み、当該ポリペプチドは、ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖフォーマットの多特異性ポリペプチドであり、抗４−１ＢＢ  ＶＨの１５０位のＨＣＤＲ１にＹからＨへの置換、および／または抗４−１ＢＢ  ＶＨの１２７位のＦＲ３にＲからＨへの置換を含み得る。
【０２０５】
特定の実施形態では、４−１ＢＢ結合ドメインポリペプチドは、ヒト４−１ＢＢに特異的に結合し、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、（ａ）前記ＨＣＤＲ１は配列番号２に記載のアミノ酸配列を含み；（ｂ）前記ＨＣＤＲ２は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含み；（ｃ）前記ＨＣＤＲ３は配列番号６に記載のアミノ酸配列を含み；（ｄ）前記ＬＣＤＲ１は配列番号８に記載のアミノ酸配列を含み；前記ＬＣＤＲ２は配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含み；（ｆ）前記ＬＣＤＲ３は配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含み得る。他の特定の実施形態では、５Ｔ４結合ドメインポリペプチドは、ヒト５Ｔ４に特異的に結合し、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、（ａ）前記ＨＣＤＲ１は配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含み；（ｂ）前記ＨＣＤＲ２は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含み；（ｃ）前記ＨＣＤＲ３は配列番号６に記載のアミノ酸配列を含み；（ｄ）前記ＬＣＤＲ１は配列番号８に記載のアミノ酸配列を含み；（ｅ）前記ＬＣＤＲ２は配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含み；（ｆ）前記ＬＣＤＲ３は配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含む。他の特定の実施形態では、５Ｔ４結合ドメインポリペプチドは、ヒト５Ｔ４に特異的に結合し、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、（ａ）前記ＨＣＤＲ１は配列番号２４に記載のアミノ酸配列を含み；（ｂ）前記ＨＣＤＲ２は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含み；（ｃ）前記ＨＣＤＲ３は配列番号６に記載のアミノ酸配列を含み；（ｄ）前記ＬＣＤＲ１は配列番号８に記載のアミノ酸配列を含み；（ｅ）前記ＬＣＤＲ２は配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含み；（ｆ）前記ＬＣＤＲ３は配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含む。
【０２０６】
特定の実施形態では、４−１ＢＢ結合ドメインポリペプチドは、配列番号１６および２２からなる群から選択される軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、４−１ＢＢ結合ドメインポリペプチドは、配列番号１４、２０、２６、および２８からなる群から選択される重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むか、またはそのようなアミノ酸配列であり、このポリペプチドは、ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖフォーマットの多特異性ポリペプチドであり、抗４−１ＢＢ  ＶＨの１５０位のＨＣＤＲ１にＹからＨへの置換、および／または抗４−１ＢＢ  ＶHの１２７位のＦＲ３にＲからＨへの置換を含む。特定の実施形態では、４−１ＢＢ結合ドメインポリペプチドは、配列番号１４、２０、２６、および２８からなる群から選択される重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列を含む。
【０２０７】
特定の実施形態では、４−１ＢＢ結合ドメインポリペプチドは、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＶＨ領域と、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＬ領域と、を含む。特定の実施形態では、４−１ＢＢ結合ドメインポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＶＨ領域と、配列番号２２のアミノ酸配列を含むＶＬ領域と、を含む。特定の実施形態では、４−１ＢＢ結合ドメインポリペプチドは、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＨ領域と、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＬ領域と、を含む。特定の実施形態では、４−１ＢＢ結合ドメインポリペプチドは、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＶＨ領域と、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＬ領域と、を含む。
【０２０８】
抗４−１ＢＢ結合ドメイン配列の例を表７に示す。
表７：例示的な４−１ＢＢ結合ドメインのポリペプチド配列および核酸配列
Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ：コンストラクト  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ：成分  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：配列
【表７−１】
2020530770.tif 000020
【表７−２】
2020530770.tif 000021
【表７−３】
2020530770.tif 000022
【表７−４】
2020530770.tif 000023
【０２０９】
いくつかの実施形態では、本発明は、４−１ＢＢ結合ドメインを含む多特異性ポリペプチド（例えば、二重特異性ポリペプチド）を提供する。多特異性４−１ＢＢ結合ポリペプチドまたは多特異性４−１ＢＢ結合タンパク質は、２つの結合ドメイン（これらのドメインは同一または異なる標的に特異的に結合するように設計され得る）、ヒンジ領域、リンカー（例えば、カルボキシル末端リンカーまたはアミノ末端側リンカー）、および免疫グロブリン定常領域を含み得る。多特異性４−１ＢＢ結合タンパク質は、２つの同一の、ジスルフィド架橋されたポリペプチドを含むホモ二量体タンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、前記４−１ＢＢ結合ドメインは、４−１ＢＢに結合するモノクローナル抗体（例えば、ウレルマブ（ＢＭＳ−６６５１３）またはＰＦ−０５０８２５６６（ファイザー社））由来、ＰＣＴ国際公開第２０１６／１８５０１６号に記載の４−１ＢＢ結合ドメイン由来、または、ＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５９６５６に記載の４−１ＢＢ結合ドメイン由来であり得る。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、４−１ＢＢ結合ドメインを含む多特異性ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシル末端へ順に、（ｉ）第一結合ドメインと；（ｉｉ）ヒンジ領域と；（ｉｉｉ）免疫グロブリン定常領域と；（ｉｖ）結合ドメインリンカーと；（ｖ）４−１ＢＢ結合ドメインと、を含み得る。いくつかの実施形態では、４−１ＢＢ結合ドメインを含む多特異性ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシル末端へ順に、（ｉ）４−１ＢＢ結合ドメインと；（ｉｉ）結合ドメインリンカーと；（ｉｉｉ）免疫グロブリン定常領域と；（ｉｖ）ヒンジ領域と；（ｖ）第一結合ドメインと、を含み得る。例示的な抗４−１ＢＢ結合ドメイン配列のアミノ酸配列および核酸配列を表７に記載する。
【０２１１】
特定の実施形態では、４−１ＢＢ結合性のタンパク質またはポリペプチドが、４−１ＢＢ以外の標的と結合する１または複数の追加の結合ドメイン（例えば、第二結合ドメイン）を含み得る。これらの他の結合ドメインは、例えば、特定のサイトカイン、または前記結合ドメインポリペプチドを特定の細胞型、毒素、追加の細胞受容体、もしくは抗体などに標的化する分子を含み得る。
【０２１２】
本開示のいくつかの実施形態では、４−１ＢＢ結合ポリペプチドは、第二のポリペプチド鎖とヘテロ二量体を形成することが可能であり、（ａ）免疫グロブリン定常領域のアミノ末端側に接した（例えば、前記免疫グロブリン定常領域がＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む場合の、ＣＨ２ドメインのアミノ末端側の、または、前記免疫グロブリン小領域がＣＨ３ドメインおよびＣＨ４ドメインを含む場合の、ＣＨ３ドメインのアミノ末端側の）ヒンジ領域を含むか、（ｂ）結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）と免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメインとの間に挟まれた、それらを接続するヒンジ領域を含むか、（ｃ）免疫グロブリンヘテロ二量体形成ドメインと免疫グロブリン定常領域（例えば、前記免疫グロブリン定常領域はＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインまたはＣＨ３ドメインおよびＣＨ４ドメインを含む）との間に挟まれた、それらを接続するヒンジ領域を含むか、（ｄ）免疫グロブリン定常領域と結合ドメインとの間に挟まれた、それらを接続するヒンジ領域を含むか、（ｅ）ポリペプチド鎖のアミノ末端にヒンジ領域を含むか、（ｆ）ポリペプチド鎖のカルボキシル末端にヒンジ領域を含む。本明細書に記載のヒンジ領域を含むポリペプチド鎖は、異なるポリペプチド鎖と結合して、本明細書において提供されるヘテロ二量体タンパク質を形成することを可能とし、形成されたヘテロ二量体は標的特異性または特異的な標的結合親和性を保持する結合ドメインを含有することとなる。
【０２１３】
特定の実施形態では、４−１ＢＢ結合ポリペプチドは、４−１ＢＢを発現するエフェクター細胞に標的細胞を動員するための、標的細胞結合ドメインを含み得る。特定の実施形態では、前記標的細胞結合ドメインは、５Ｔ４に特異的に結合する。特定の実施形態では、本明細書に記載の４−１ＢＢ結合タンパク質は、（ｉ）４−１ＢＢと特異的に結合する結合ドメインと、（ｉｉ）５Ｔ４に特異的に結合する別の結合ドメインと、を含み得る。前記５Ｔ４結合ドメインに派生させることができる抗５Ｔ４抗体の非限定的な例として、ＰＣＴ国際公開第２０１６／１８５０１６号およびＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５９６５６に記載のものが挙げられる。
【０２１４】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される４−１ＢＢ結合ポリペプチドは、２つのｓｃＦｖを含むポリペプチドである。いくつかの実施形態では、前記２つのｓｃＦｖは４−１ＢＢ結合ドメインを含む。特定の実施形態では、前記２つのｓｃＦｖは同一の４−１ＢＢ結合ドメインを含む。他の実施形態では、前記２つのｓｃＦｖは異なる４−１ＢＢ結合ドメインを含む。他の実施形態では、前記ポリペプチドは、第一のｓｃＦｖとして４−１ＢＢ結合ドメインを含み、第二のｓｃＦｖとして標的細胞結合ドメインを含む。例えば、前記標的細胞結合ドメインは５Ｔ４に特異的なｓｃＦｖであり得る。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される二重特異性４−１ＢＢ結合ポリペプチドおよび二重特異性４−１ＢＢ結合タンパク質は、配列番号１１０、１１２、１１４、および１１６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８２％、少なくとも約８５％、少なくとも約８７％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一の抗４−１ＢＢ  ｓｃＦｖを含み、当該ポリペプチドは、ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖフォーマットの多特異性ポリペプチドであり、抗４−１ＢＢ  ＶＨの１５０位のＨＣＤＲ１にＹからＨへの置換、および／または抗４−１ＢＢ  ＶＨの１２７位のＦＲ３にＲからＨへの置換を含む。特定の実施形態では、本明細書において提供される前記二重特異性４−１ＢＢ結合ポリペプチドおよび二重特異性４−１ＢＢ結合タンパク質は、配列番号１１０、１１２、１１４、および１１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む抗４−１ＢＢ  ｓｃＦｖを含む。例示的な抗４−１ＢＢ  ｓｃＦｖのアミノ酸配列および核酸配列を下記の表８に記載する。
表８：例示的な抗４−１ＢＢ  ｓｃＦｖのＤＮＡ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ：ＤＮＡ配列およびアミノ酸配列
Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ：コンストラクト
【表８−１】
2020530770.tif 000024
【表８−２】
2020530770.tif 000025
【表８−３】
2020530770.tif 000026
【０２１６】
二重特異性分子
いくつかの実施形態では、本発明は、２つの結合ドメインを含み、一方の結合ドメインが５Ｔ４に対して特異的であり、第二の結合ドメインが異なる標的抗原に対し特異的である、多特異性５Ｔ４結合ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、２つの結合ドメインを含み、結合ドメインが４−１ＢＢに対して特異的であり、第二の結合ドメインが異なる標的抗原に対し特異的である、二重特異性４−１ＢＢ結合ポリペプチドを提供する。特定の実施形態では、本発明は、２つの結合ドメインを含み、一方の結合ドメインが４−１ＢＢに対して特異的であり、他方の結合ドメインが５Ｔ４に対して特異的である、二重特異性ポリペプチドを提供する。このような実施形態は、本明細書では、抗５Ｔ４×抗４−１ＢＢ分子または抗５Ｔ４×抗４−１ＢＢポリペプチドまたは抗５Ｔ４×抗４−１ＢＢタンパク質と称される。特定の実施形態では、前記抗５Ｔ４×抗４−１ＢＢ分子の５Ｔ４結合ドメインおよび４−１ＢＢ結合ドメインは、５Ｔ４および４−１ＢＢにそれぞれ特異的に結合するｓｃＦｖドメインである。
【０２１７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗５Ｔ４×抗４−１ＢＢ分子は、アミノ末端からカルボキシル末端へ順に、（ｉ）５Ｔ４結合ドメインと；（ｉｉ）結合ドメインリンカーと；（ｉｉｉ）４−１ＢＢ結合ドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗５Ｔ４×抗４−１ＢＢ分子は、アミノ末端からカルボキシル末端へ順に、（ｉ）４−１ＢＢ結合ドメインと；（ｉｉ）結合ドメインリンカーと；（ｉｉｉ）５Ｔ４結合ドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗５Ｔ４×抗４−１ＢＢ分子は、アミノ末端からカルボキシル末端へ順に（またはカルボキシル末端からアミノ末端へ順に）、（ｉ）５Ｔ４結合ドメインと、（ｉｉ）ヒンジ領域と、（ｉｉｉ）免疫グロブリン定常領域と、（ｉｖ）カルボキシル末端側リンカー（またはアミノ末端側リンカー）と、（ｖ）第二結合ドメインと、を含む。
【０２１８】
本明細書に記載の抗５Ｔ４×抗４−１ＢＢ分子は、表４〜７に示される抗５Ｔ４結合ドメイン配列および抗４−１ＢＢ結合ドメイン配列をあらゆる組み合わせで含み得る。特定の実施形態では、本発明の抗５Ｔ４×抗４−１ＢＢ分子は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３をそれぞれ含む、５Ｔ４結合ドメインおよび４−１ＢＢ結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、前記抗５Ｔ４×抗４−１ＢＢ分子は、（ａ）（ｉ）配列番号３０、５２、および６０からなる群から選択されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号３２および６２からなる群から選択されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列、並びに配列番号３４のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含むＶＨと；（ｉｉ）配列番号８、４２、および５４からなる群から選択されるＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１０のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、並びに配列番号３６のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含むＶＬと、を含む第一ｓｃＦｖドメイン；並びに、（ｂ）（ｉ）配列番号２、１８、および２４からなる群から選択されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号４のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、並びに配列番号６のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含むＶＨと；（ｉｉ）配列番号８のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１０のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号１２のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含むＶＬと、を含む第二ｓｃＦｖドメイン、を含む。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、本発明の抗５Ｔ４×抗４−１ＢＢ分子は、ＶＨドメインおよびＶＬドメインをそれぞれ含む、５Ｔ４結合ドメインおよび４−１ＢＢ結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、前記抗５Ｔ４×抗４−１ＢＢ分子は、ｉ）配列番号３８、４６、５６、および６４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号４０、４４、４８、５０、５８、６６、６８、および７０からなる群から選択されるアミノ酸を含むＶＬと、を含む第一ｓｃＦｖドメイン；並びに、ｉｉ）配列番号１４、２０、２６、および２８からなる群から選択されるアミノ酸を含むＶＨと、配列番号１６および２２からなる群から選択されるアミノ酸を含むＶＬと、を含む第二ｓｃＦｖドメイン、を含む。
【０２２０】
特定の実施形態では、抗５Ｔ４×抗４−１ＢＢ分子の５Ｔ４結合ドメインは、配列番号１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、および１７０からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、または１００％同一のｓｃＦｖを含むか、またはそのようなｓｃＦｖであり、当該分子は、ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖフォーマットの多特異性ポリペプチドであり、抗５Ｔ４  ＶＬの９９位のＬＣＤＲ１にＹからＦへの置換、および／または抗５Ｔ４  ＶＬの１４８位のＦＲ３にＦからＳへの置換を含む。特定の実施形態では、抗５Ｔ４×抗４−１ＢＢ分子の５Ｔ４結合ドメインは、配列番号１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、および１７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含む。
【０２２１】
特定の実施形態では、抗５Ｔ４×抗４−１ＢＢ分子の４−１ＢＢ結合ドメインは、配列番号１１０、１１２、１１４、および１１６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、または１００％同一のｓｃＦｖを含むか、またはそのようなｓｃＦｖであり、当該分子は、ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖフォーマットの多特異性ポリペプチドであり、抗４−１ＢＢ  ＶＨの１５０位のＨＣＤＲ１にＹからＨへの置換、および／または抗４−１ＢＢ  ＶＨの１２７位のＦＲ３にＲからＨへの置換を含む。特定の実施形態では、抗５Ｔ４×抗４−１ＢＢ分子の４−１ＢＢ結合ドメインは、配列番号１１０、１１２、１１４、および１１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含む。
【０２２２】
特定の実施形態では、前記抗５Ｔ４×抗４−１ＢＢ分子は、下記の表９に示されるＣＤＲ配列、ＶＨ／ＶＬ配列、および／またはｓｃＦｖ配列を組み合わせて含む。
【表９−１】
2020530770.tif 000027
【表９−２】
2020530770.tif 000028
【表９−３】
2020530770.tif 000029
【０２２３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗５Ｔ４×抗４−１ＢＢ分子は、配列番号１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１７２、１７４、および１７６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗５Ｔ４×抗４−１ＢＢ分子は、配列番号１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１７２、１７４、および１７６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み得る。本明細書に記載の抗５Ｔ４×抗４−１ＢＢ分子の例示的なアミノ酸および核酸配列を表１０および表１１に記載する。表１０および表１１のそれぞれにおいて、免疫グロブリンＦｃドメイン（ヒンジ−ＣＨ１−ＣＨ２）は下線部で示され、結合ドメインリンカー配列は太字で示される。
表１０：抗５Ｔ４×抗４−１ＢＢ分子のＤＮＡ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ：ＤＮＡ配列の例
Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ：コンストラクト  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：配列
【表１０−１】
2020530770.tif 000030
【表１０−２】
2020530770.tif 000031
【表１０−３】
2020530770.tif 000032
【表１０−４】
2020530770.tif 000033
【表１０−５】
2020530770.tif 000034
【表１０−６】
2020530770.tif 000035
【表１０−７】
2020530770.tif 000036
【表１０−８】
2020530770.tif 000037
【表１０−９】
2020530770.tif 000038
【表１０−１０】
2020530770.tif 000039
【表１０−１１】
2020530770.tif 000040
【表１０−１２】
2020530770.tif 000041
表１１：抗５Ｔ４×抗４−１ＢＢ分子のアミノ酸配列の例
Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ：コンストラクト  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：配列
【表１１−１】
2020530770.tif 000042
【表１１−２】
2020530770.tif 000043
【表１１−３】
2020530770.tif 000044
【表１１−４】
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【表１１−５】
2020530770.tif 000046
【０２２４】
ポリヌクレオチドおよびタンパク質発現法
本開示はまた、本開示のポリペプチド（例えば、５Ｔ４結合ポリペプチド、４−１ＢＢ結合ポリペプチド、および／またはその多特異的結合タンパク質）または本明細書に記載のポリペプチドの１もしくは複数のポリペプチド鎖をコードする核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を包含する。本開示の核酸は、下記の、表１〜１０に列挙されたポリヌクレオチドと実質的に同一な領域を有する核酸を包含する。特定の実施形態では、本開示に係る核酸は、表１〜１０に列挙されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも８０％、典型的には少なくとも約９０％、より典型的には少なくとも約９５％または少なくとも約９８％の同一性を有し、当該核酸はｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖフォーマットの多特異性ポリペプチドであるポリペプチドをコードし、このコードされたポリペプチドは、（１）抗５Ｔ４  ＶＬの９９位のＬＣＤＲ１におけるＹからＦへの置換；（２）抗５Ｔ４  ＶＬの１４８位のＦＲ３におけるＦからＳへの置換；（３）抗４−１ＢＢ  ＶＨの１５０位のＨＣＤＲ１におけるＹからＨへの置換；および（４）抗４−１ＢＢ  ＶＨの１２７位のＦＲ３におけるＲからＨへの置換、のうちの１または複数を含む。また、本開示の核酸は相補的核酸も包含する。ある場合では、これらの配列はアラインメント時に完全相補（ミスマッチなし）となる。他の場合で、配列に最大で２０％程度のミスマッチが含まれることがある。本開示のいくつかの実施形態では、本開示の二重特異性タンパク質の第一ポリペプチド鎖および第二ポリペプチド鎖の両方をコードする核酸が提供される。本明細書において提供される核酸配列は、コドン最適化、縮重配列、サイレント変異、および特定の宿主における発現を最適化する他のＤＮＡ技術を用いて探索することができ、本開示はそのような配列改変も包含する。
【０２２５】
本開示は、本開示のポリペプチド（例えば、５Ｔ４結合ポリペプチド、４−１ＢＢ結合ポリペプチド、および／またはその多特異的結合タンパク質）をコードする単離された核酸分子であって、配列番号１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１７１、１７３、および１７５から選択されるヌクレオチド配列を含む、前記核酸分子に関する。
【０２２６】
目的のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子は、当該分子をベクター内に配置することにより伝搬される。ウイルスベクターおよび非ウイルスベクターが使用され、例えばプラスミドが使用される。プラスミドの選択は、伝搬が望まれる細胞の種類、および伝搬の目的に依存する。目的ＤＮＡ配列を大量に増幅および作製するのには、特定のベクターが有用である。他のベクターで、培養下の細胞での発現に好適なものもある。さらに他のベクターで、動物またはヒトの全身の細胞における、導入および発現に好適なものもある。適切なベクターの選択は十分に当業者の技能の範囲内である。このようなベクターの多くは市販されている。部分長または完全長のポリヌクレオチドは、通常はベクター内の切断した制限酵素部位へのＤＮＡリガーゼの結合によって、ベクターに挿入される。あるいは、インビボにおける相同組換えによって、目的のヌクレオチド配列を挿入することもできる。これは通常、目的のヌクレオチド配列の両脇に、ベクターと相同な領域を結合することにより達成される。相同領域は、例えば、オリゴヌクレオチドのライゲーションによって、または、相同領域および目的ヌクレオチド配列の一部の両方を含むプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって、追加される。
【０２２７】
発現には、発現カセットまたは発現系が用いられ得る。本明細書で開示されるポリペプチドをコードする核酸を発現させるため、当該ポリペプチドをコードする核酸分子が、発現ベクターにおける転写発現を制御する制御配列に機能的に連結され、これが宿主細胞に導入される。プロモーターおよびエンハンサーなどの転写制御配列に加え、発現ベクターは、翻訳制御配列、および当該発現ベクターを保有する細胞のセレクションに好適なマーカー遺伝子を含み得る。本開示のポリヌクレオチドにコードされる遺伝子産物は、好都合なあらゆる発現系で発現され、例えば、細菌系、酵母系、昆虫系、両生類系、および哺乳類系が挙げられる。前記発現ベクターにおいて、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、目的の発現特性を得るために、必要に応じて制御配列に連結される。これらの制御配列には、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、オペレーター、リプレッサー、およびインデューサーが包含され得る。プロモーターは、制御型（例えば、ステロイド誘導性ｐＩＮＤベクター（インビトロジェン社）由来のプロモーター）、または常時発現型（例えば、ＣＭＶ、ＳＶ４０、伸長因子、またはＬＴＲ配列由来のプロモーター）であり得る。プロモーターは、ベクターへの連結のための上記の技術を用いて、目的ヌクレオチド配列に連結される。当該技術分野において公知のあらゆる技術を使用できる。従って、発現ベクターは、通常、誘導型または常時発現型であり得る転写／翻訳開始領域を提供し、ここに、前記転写開始領域の転写調節下でコード領域が機能的に連結され、さらに、当該発現ベクターは転写／翻訳終結領域を提供する。
【０２２８】
発現カセット（「発現ユニット」）は、種々のベクター、例えば、プラスミド、ＢＡＣ、ＹＡＣ、λ、Ｐ１、Ｍ１３などのバクテリオファージ、植物ウイルスベクターまたは動物ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスをベースとしたベクター、アデノウイルスベクター）など、に導入することができ、これらのベクターは通常、当該発現ベクターを含む細胞のセレクションを可能にする能力によって特徴付けられる。これらのベクターは、染色体外での特にプラスミドもしくはウイルスとしての保持、または宿主染色体への組み込み、を実現し得る。染色体外の保持が望まれる場合、複製起点がプラスミドの複製用に与えられ、この複製起点は低コピー数であっても高コピー数であってもよい。種々様々なマーカーがセレクションに利用でき、特に毒素から保護するマーカー、より詳細には抗生物質から保護するマーカーが利用できる。選択された特定のマーカーは、宿主の性質に基づいて選択されたものであり、栄養要求性の宿主には相補性を利用できる場合がある。ＤＮＡコンストラクトの導入には、好都合なあらゆる方法を用いることができ、例えば、複合体形成（conjugation）、細菌形質転換、ＤＮＡのカルシウム沈殿、エレクトロポレーション、融合、トランスフェクション、ウイルスベクター感染、微粒子銃などが挙げられる。本開示は、配列番号１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１７１、１７３、および１７５から選択されるヌクレオチド配列を含み得る核酸セグメントを含む発現ベクターに関する。
【０２２９】
従って、本開示において使用されるタンパク質は、従来技術による遺伝子改変宿主細胞で産生させることができる。好適な宿主細胞とは、外来性ＤＮＡによる形質転換またはトランスフェクションが可能であり培養液中で培養できる細胞型であり、例えば、細菌、真菌細胞、およびより高次の培養真核細胞（多細胞生物の培養細胞を含む）、特に培養哺乳類細胞が挙げられる。クローン化ＤＮＡ分子を操作する法および種々の宿主細胞に外来性ＤＮＡを導入する方法は、Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001)、およびAusubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (4th ed., John Wiley & Sons, 1999)が開示している。
【０２３０】
例えば、本明細書に記載の２つの同一の結合ポリペプチドを含むホモ二量体結合タンパク質の組み換え発現の場合、発現ベクターには通常、前記結合ポリペプチドをコードする核酸セグメントが、プロモーターに機能的に連結された状態で含まれることとなる。相異なる第一ポリペプチド鎖および第二ポリペプチド鎖を含むヘテロ二量体結合タンパク質の組み換え発現の場合、当該ヘテロ二量体タンパク質全体の発現のために、前記第一ポリペプチド鎖および第二ポリペプチド鎖が、宿主細胞において、別々のベクターから共発現され得る。あるいは、ヘテロ二量体結合タンパク質の発現の場合、当該ヘテロ二量体タンパク質全体の発現のために、第一ポリペプチド鎖および第二ポリペプチド鎖が、宿主細胞において、同一ベクター内の別々の発現ユニットから共発現される。発現ベクターは従来技術によって宿主細胞に導入され、次に、このトランスフェクト細胞が従来技術によって培養されることにより、コードされたポリペプチドが産生されて、対応する結合タンパク質（例えば、５Ｔ４結合ポリペプチド、４−１ＢＢ結合ポリペプチド、および／またはその多特異的結合タンパク質）が生成される。
【０２３１】
組換えタンパク質を宿主細胞の分泌経路に向かわせるために、分泌シグナル配列（別名、リーダー配列）が発現ベクター内に与えられる。この分泌シグナル配列は、組換えタンパク質の天然型の分泌シグナル配列であってもよいし、別の分泌型タンパク質由来であってもよいし、新規に合成されてもよい。この分泌シグナル配列は、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に機能的に連結され、すなわち、これらの２つの配列は、新規合成ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に向かわせるように、正しい読み取り枠で接続され、配置される。分泌シグナル配列は通常、目的ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の５’側に位置するが、ある特定のシグナル配列は目的ＤＮＡ配列内のどこか他の場所に位置し得る（例えば、米国特許第５，０３７，７４３号および同第５，１４３，８３０号）。
【０２３２】
培養哺乳類細胞は、本開示の中で使用される、本開示の組換えポリペプチドおよび組換えタンパク質（例えば、５Ｔ４結合ポリペプチド、４−１ＢＢ結合ポリペプチド、および／またはその多特異的結合タンパク質）を産生させるのに好適な宿主である。哺乳類宿主細胞に外来性ＤＮＡを導入する方法としては、リン酸カルシウムを介したトランスフェクション（Wigler et al., Cell 14:725, 1978; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603, 1981: Graham and Van der Eb, Virology 52:456, 1973）、エレクトロポレーション（Neumann et al., EMBO J. 1:841-845, 1982）、ＤＥＡＥ−デキストランを介したトランスフェクション（Ausubel et al.、上記）、およびリポソームを介したトランスフェクション（Hawley-Nelson et al., Focus 15:73, 1993; Ciccarone et al., Focus 15:80, 1993）が挙げられる。培養哺乳類細胞における組換えポリペプチドの生成は、例えば、米国特許第４，７１３，３３９号；同第４，７８４，９５０号；同第４，５７９，８２１号；および同第４，６５６，１３４号に開示されている。好適な哺乳類宿主細胞の例としては、アフリカミドリザル腎細胞（Ｖｅｒｏ；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５８７）、ヒト胎児由来腎臓細胞（２９３−ＨＥＫ；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５７３）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ−２１、ＢＨＫ−５７０；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  ８５４４、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １０３１４）、イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ；ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１；ＡＴＣＣ  ＣＣＬ６１；ＣＨＯ  ＤＧ４４；ＣＨＯ  ＤＸＢ１１（ハイクローン社（Hyclone）、ユタ州ローガン）；例えば、Chasin et al., Som. Cell. Molec. Genet. 12:555, 1986も参照）、ラット下垂体細胞（ＧＨ１；ＡＴＣＣ  ＣＣＬ８２）、ＨｅＬａ  Ｓ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２．２）、ラット肝癌細胞（Ｈ−４−ＩＩ−Ｅ；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５４８）、ＳＶ４０形質転換サル腎細胞（ＣＯＳ−１；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５０）、およびマウス胎児性細胞（ＮＩＨ−３Ｔ３；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５８）が挙げられる。さらなる好適な細胞株として、当該技術分野において公知であり、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（バージニア州マナッサス）などの公的寄託機関から入手できるものがある。ＳＶ−４０またはサイトメガロウイルス由来のプロモーターなどの、強力な転写プロモーターを使用できる。例えば、米国特許第４，９５６，２８８号を参照されたい。他の好適なプロモーターとして、メタロチオネイン遺伝子由来のプロモーター（米国特許第４，５７９，８２１号および同第４，６０１，９７８号）、およびアデノウイルス主要後期プロモーターが挙げられる。
【０２３３】
外来ＤＮＡがインサートされた培養哺乳類細胞をセレクションするために、薬剤によるセレクションが通常は利用される。そのような細胞は一般に「トランスフェクタント」と称される。セレクション用薬剤の存在下で培養され、目的遺伝子を子孫に遺伝することが可能な細胞は、「安定なトランスフェクタント」と称される。選択マーカーの例としては、Ｇ−４１８などのネオマイシン型薬剤の存在下でのセレクションの実行を可能にする、抗生物質のネオマイシンに対する耐性をコードする遺伝子；ミコフェノール酸／キサンチンの存在下での宿主細胞の増殖を可能にする、キサンチン・グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（xanthine-guanine phosphoribosyl transferase）のｇｐｔ遺伝子；並びに、ゼオシン、ブレオマイシン、ブラストサイジン（blastocidin）、およびハイグロマイシンに対する耐性を与えるマーカー（例えば、Gatignol et al., Mol. Gen. Genet. 207:342, 1987; Drocourt et al., Nucl. Acids Res. 18:4009, 1990を参照）が挙げられる。セレクション系は、「増幅」と呼ばれる、目的遺伝子の発現レベルを増加させる工程にも使用できる。増幅は、トランスフェクタントを低レベルのセレクション用薬剤の存在下での培養した後、セレクション用薬剤の量を増加させることで、導入遺伝子産物を高レベルに産生する細胞をセレクションすることにより、実行される。増幅用選択マーカーの例として、メトトレキサートに対する耐性を付与するジヒドロ葉酸還元酵素がある。他の薬剤耐性遺伝子（例えば、ハイグロマイシン耐性、多剤耐性、ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ）も使用できる。
【０２３４】
他のより高次の真核細胞も宿主として使用でき、例えば、昆虫細胞、植物細胞、および鳥類細胞が挙げられる。アグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）の植物細胞における遺伝子発現用のベクターとしての使用は、Sinkar et al., J. Biosci. (Bangalore) 11:47-58, 1987でレビューされている。昆虫細胞の形質転換および当該形質転換細胞における外来ポリペプチドの産生が、米国特許第５，１６２，２２２号およびＰＣＴ国際公開第９４／０６４６３号で開示されている。
【０２３５】
昆虫細胞は、一般的にはオートグラファ・カリフォルニカ核多核体病ウイルス（Autographa californica nuclear polyhedrosis virus）（ＡｃＮＰＶ）由来の、組換えバキュロウイルスに感染させることができる。King and Possee, The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide (Chapman & Hall, London); O’Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual (Oxford University Press., New York 1994);およびBaculovirus Expression Protocols. Methods in Molecular Biology (Richardson ed., Humana Press, Totowa, NJ, 1995）を参照されたい。組換えバキュロウイルスは、Luckow et al. (J. Virol. 67:4566-4579, 1993)により報告された、トランスポゾンベースの系を用いることでも、作製できる。この系は、導入ベクターを利用しており、キットの形態で市販されている（ＢＡＣ−ＴＯ−ＢＡＣキット；ライフテクノロジーズ社、メリーランド州ゲイサーズバーグ）。前記導入ベクター（例えば、ＰＦＡＳＴＢＡＣ１；ライフテクノロジーズ社）は、「バクミド」と呼ばれる大型プラスミドとして大腸菌（E. coli）内に維持されるバキュロウイルスゲノム内に、目的タンパク質をコードするＤＮＡを移動させるためのＴｎ７トランスポゾンを含有する。Hill-Perkins and Possee, J. Gen. Virol. 71:971-976, 1990; Bonning et al., J. Gen. Virol. 75:1551-1556, 1994;およびChazenbalk and Rapoport, J. Biol. Chem. 270:1543-1549, 1995を参照されたい。さらに、導入ベクターは、上記で開示されたポリペプチド伸長物またはアフィニティータグをコードするＤＮＡとのインフレーム融合物を含み得る。当該技術分野において公知の技術を用いて、タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含有する導入ベクターが大腸菌宿主細胞にトランスフォームされ、それらの細胞が、組換えバキュロウイルスを示唆する分断化されたｌａｃＺ遺伝子を含有するバクミドについてスクリーニングされる。組換えバキュロウイルスゲノムを含有するバクミドＤＮＡが一般的な技術を用いて単離され、Ｓｆ９細胞などのヨトウガ（Spodoptera frugiperda）細胞のトランスフェクションに使用される。目的タンパク質（protein or interest）を発現する組換えウイルスがその後に産生される。当該技術分野において一般的に使用される方法により、組換えウイルスのストックが作製される。
【０２３６】
タンパク質産生について、前記組換えウイルスを用いて、宿主細胞、通常はツマジロクサヨトウ由来細胞株、ヨトウガ（Spodoptera frugiperda）由来細胞株（例えば、Ｓｆ９細胞またはＳｆ２１細胞）またはイラクサギンウワバ（Trichoplusia ni）由来細胞株（例えば、ＨＩＧＨ  ＦＩＶＥ（商標）細胞；インビトロジェン社、カリフォルニア州カールズバッド）への感染が行われる。通例、Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles & Applications of Recombinant DNA (ASM Press, Washington, D.C., 1994)を参照されたい。また、米国特許第５，３００，４３５号も参照されたい。細胞の増殖および維持には無血清培地が使用される。好適な培地配合物は当該技術分野において公知であり、商業的供給業者から入手できる。細胞を、およそ２〜５×１０５細胞の播種密度から１〜２×１０６細胞の密度まで増殖させ、この時点で、組換えウイルスのストックが、０．１〜１０、通常は３に近い感染効率（ＭＯＩ）で加えられる。使用される手順は、入手可能な実験手順書に通例記載されているものである（例えば、上記King and Possee；上記O’Reilly et al.；上記Richardson参照）。
【０２３７】
酵母細胞をはじめとする真菌細胞も、本開示のポリペプチド（例えば、５Ｔ４結合ポリペプチド、４−１ＢＢ結合ポリペプチド、および／またはその多特異的結合タンパク質）を産生させるために、本開示の中で使用できる。これに関連した酵母種としては、例えば、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、およびピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）が挙げられる。出芽酵母（S. cerevisiae）細胞を外来性ＤＮＡで形質転換し、形質転換細胞から組換えポリペプチドを産生させる方法は、例えば、米国特許第４，５９９，３１１号；同第４，９３１，３７３号；同第４，８７０，００８号；同第５，０３７，７４３号；および同第４，８４５，０７５号で開示されている。形質転換細胞は、選択マーカーによって決定される表現型、一般的には薬剤耐性または特定の栄養分（例えば、ロイシン）の非存在下での増殖能、によるセレクションを受ける。出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）で使用されるベクター系の例としては、Kawasaki et al.（米国特許第４，９３１，３７３号）で開示されたＰＯＴ１ベクター系があり、形質転換細胞の、グルコース含有培地中の増殖によるセレクションが可能である。酵母で使用される好適なプロモーターおよびターミネーターとしては、解糖酵素遺伝子由来のもの（例えば、米国特許第４，５９９，３１１号；同第４，６１５，９７４号；および同第４，９７７，０９２号）およびアルコール脱水素酵素遺伝子由来のものが挙げられる。また、米国特許第４，９９０，４４６号；同第５，０６３，１５４号；同第５，１３９，９３６号；および同第４，６６１，４５４号も参照されたい。ハンセヌラ・ポリモルパ（Hansenula polymorpha）、分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）、クリベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、クリベロマイセス・フラギリス（Kluyveromyces fragilis）、トウモロコシ黒穂病菌（Ustilago maydis）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、ピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）、ピキア・グイリエルモンディ（Pichia guillermondii）、およびカンジダ・マルトーサ（Candida maltosa）を含む、他の酵母用の形質転換系も、当該技術分野において公知である。例えば、Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132:3459-3465, 1986；米国特許第４，８８２，２７９号；およびRaymond et al., Yeast 14:11-23, 1998を参照されたい。アスペルギルス属細胞を、McKnight et al.、米国特許第４，９３５，３４９号の方法に従って利用できる。アクレモニウム・クリソゲナム（Acremonium chrysogenum）を形質転換する方法が、Sumino et al.、米国特許第５，１６２，２２８号で開示されている。アカパンカビ属（Neurospora）を形質転換する方法が、Lambowitz、米国特許第４，４８６，５３３号で開示されている。ピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）における組換えタンパク質の産生が、米国特許第５，７１６，８０８号；同第５，７３６，３８３号；同第５，８５４，０３９号；および同第５，８８８，７６８号で開示されている。
【０２３８】
大腸菌（Escherichia coli）、バチルス属細菌、および他の属の細菌の菌株を含む、原核生物宿主細胞も、例えば、５Ｔ４結合ポリペプチド、４−１ＢＢ結合ポリペプチド、および／または抗５Ｔ４×抗４−１ＢＢ分子を含むその多特異的結合タンパク質を産生させるために、本開示の中で有用な宿主細胞である。これらの宿主を形質転換し、クローニングされた外来ＤＮＡ配列を発現させる技術は、当該技術分野において周知である（例えば、上記Sambrook and Russell参照）。大腸菌などの細菌において組換えタンパク質を発現させる場合、タンパク質は、通常は不溶性の顆粒として細胞質中に保持させるか、または、細菌性分泌配列により細胞膜周辺腔へと方向付けることができる。前者の場合、細胞は溶解されて、前記顆粒が回収され、例えば、グアニジンイソチオシアネートまたは尿素を用いて変性される。この変性されたタンパク質はその後、尿素、並びに還元型グルタチオンおよび酸化型グルタチオンの組み合わせの溶液に対しての透析の後、緩衝生理食塩水に対しての透析などにより、前記変性剤を希釈することによって、リフォールディングおよび二量体化できる。あるいは、前記タンパク質は、可溶型で細胞質から回収し、変性剤を用いずに単離することができる。前記タンパク質は、リン酸緩衝生理食塩水などに含まれた水性の抽出物として前記細胞から回収される。目的のタンパク質を捕捉するために、前記抽出物が抗体固定カラムまたはヘパリンセファロースカラムなどのクロマトグラフ媒体に直接アプライされる。分泌タンパク質は、細胞を破壊して（例えば、超音波処理または浸透圧ショックにより）、細胞膜周辺腔の内容物を放出させ、当該タンパク質を回収することで、可溶性且つ機能的な形態で細胞膜周辺腔から回収することができ、これにより、変性およびリフォールディングの必要性をなくすことができる。細菌宿主細胞における、一本鎖抗体をはじめとした抗体の産生は、公知の方法に従って行うことができる。例えば、Bird et al., Science 242:423-426, 1988; Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, 1988;およびPantoliano et al., Biochem. 30:10117-10125, 1991を参照されたい。
【０２３９】
本開示のポリペプチドおよびタンパク質（例えば、５Ｔ４結合ポリペプチド、４−１ＢＢ結合ポリペプチド、および／またはその多特異的結合タンパク質）を産生するように形質転換またはトランスフェクションされた宿主細胞は、栄養分および選択された宿主細胞の増殖に必要な他の成分を含有する培地中で、従来の手順に従って培養される。限定培地および複合培地を含む様々な好適な培地が、当該技術分野において公知であり、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン、およびミネラルを通常含む。必要に応じて、培地は増殖因子または血清のような成分も含有できる。増殖培地は、通常、発現ベクターに保有された、または宿主細胞に同時トランスフェクションされた選択マーカーによって補完される、例えば、薬剤セレクションまたは必須栄養素の欠乏によって、外来性ＤＮＡを含有する細胞のセレクションが行われる。
【０２４０】
本開示のタンパク質およびポリペプチド（例えば、５Ｔ４結合ポリペプチド、４−１ＢＢ結合ポリペプチド、および／またはその多特異的結合タンパク質）は、従来のタンパク質精製法により、通常はクロマトグラフ法の組み合わせにより、精製できる。通例、Affinity Chromatography: Principles & Methods（ファルマシア・ＬＫＢ・バイオテクノロジー社（Pharmacia LKB Biotechnology）、ウプサラ、スウェーデン、１９８８年）；Scopes, Protein Purification: Principles and Practice（シュプリンガー・フェアラーク社（Springer-Verlag）、ニューヨーク、１９９４年）を参照されたい。免疫グロブリンＦｃ領域を含むタンパク質は、固定されたプロテインＡまたはプロテインＧに対するアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。ゲル濾過など、追加の精製工程を用いて、目的の精製レベルを達成したり、あるいは脱塩、緩衝液交換などを実現することができる。
【０２４１】
組成物および使用法
本開示は、５Ｔ４の発現を特徴とする障害を有する対象を治療するための方法を提供する。概して、このような方法は、そのような治療を必要としている対象に、本開示タンパク質（例えば、５Ｔ４結合ポリペプチド、４−１ＢＢ結合ポリペプチド、および／またはその多特異的結合タンパク質）を投与することを含む。いくつかの実施形態では、５Ｔ４結合ポリペプチド、４−１ＢＢ結合ポリペプチド、および／またはその多特異的結合タンパク質（例えば、抗５Ｔ４×抗４−１ＢＢ分子）は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を誘導しないか、最小限にしか誘導しない。
【０２４２】
他の実施形態では、前記結合タンパク質（例えば、多特異的結合タンパク質）がエフェクター細胞と特異的に結合する（例えば、４−１ＢＢに特異的に結合する）第二の結合ドメインを含む場合、前記結合タンパク質および／または多特異的結合タンパク質は、対象における５Ｔ４発現細胞に対するエフェクター細胞の活性化の増強をもたらす。例えば、いくつかの実施形態では、前記結合タンパク質および／または多特異的結合タンパク質は、エフェクター細胞の増殖の増大、エフェクター細胞の１もしくは複数のサイトカイン（例えば、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１αなど）の産生の増加、または１もしくは複数の細胞表面活性化マーカー（例えば、ＣＤ１３７、ＭＨＣ−ＩＩ、またはＣＤ６９）の発現増加をもたらす。エフェクター細胞の活性化は、当該技術分野において公知の様々な手段により測定することができ、例えば、細胞表面マーカーの発現の変化を評価するためのフローサイトメトリー、免疫蛍光法、および免疫組織化学、サイトカインおよび他の因子の産生を評価するためのＥＬＩＳＡ、増殖を評価するための細胞数、遺伝子発現の変化を評価するためのｑＰＣＲなどが挙げられる。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の多特異性結合タンパク質は、異なる構造の第二の多特異性ポリペプチドと比較して、エフェクター細胞の活性化の増強を示す。例えば、いくつかの実施形態では、第一の多特異性ポリペプチドは、５Ｔ４に特異的に結合する第一ｓｃＦｖドメインおよび４−１ＢＢに特異的に結合する第二ｓｃＦｖを、結合ドメインリンカーおよび免疫グロブリンＦｃドメインと共に、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって以下の構成で含む：（ｉ）第一ｓｃＦｖドメイン、（ｉｉ）ヒンジ領域、（ｉｉｉ）免疫グロブリン定常領域、（ｉｖ）結合ドメインリンカー、および（ｖ）第二ｓｃＦｖドメイン。この例では、第二の多特異的結合タンパク質は、抗４−１ＢＢ抗体と抗５Ｔ４  ｓｃＦｖとを含むＩｇＧ−ｓｃＦｖ構造を含む。いくつかの実施形態では、第一の多特異的結合タンパク質は、第二の多特異性ポリペプチドと比較して、エフェクター細胞の活性化の統計的に有意な増強を示す。例えば、いくつかの実施形態では、第一の多特異的結合タンパク質は、ＮＦ−κＢレポーター発現Ｊｕｒｋａｔ細胞アッセイにおいて、第二の多特異的結合タンパク質において確認された値よりも低値のＥＣ５０を示す（例えば、実施例１０を参照）。いくつかの実施形態では、第一の多特異的結合タンパク質のＥＣ５０は、第二の多特異的結合タンパク質のＥＣ５０と比較して、約１／２倍、約１／３倍、約１／４倍、約１／５倍、約１／６倍、約１／７倍、約１／８倍、約１／９倍、約１／１０倍、またはそれ以下に減少する。ＥＣ５０値は、非線形回帰分析および当該技術分野において公知の他の統計手法で求めることができる。
【０２４４】
いくつかの実施形態では、第一の多特異的結合タンパク質は、第二の多特異性ポリペプチドと比較して、エフェクター細胞の増殖の統計的に有意な増加を誘導する。例えば、いくつかの実施形態では、第一の多特異的結合タンパク質は、第二の多特異的結合タンパク質によって誘導される増殖と比較して、プライミングされたヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖の統計的に有意な増加を誘導する（例えば、実施例２２を参照）。いくつかの実施形態では、第一の多特異的結合タンパク質は、第二の多特異的結合タンパク質によって誘導されるエフェクター細胞の増殖と比較して約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、またはそれ以上のエフェクター細胞の増殖の増大を示す。
【０２４５】
本開示のタンパク質（例えば、５Ｔ４結合ポリペプチド、４−１ＢＢ結合ポリペプチド、および／またはその多特異的結合タンパク質）により対象を治療する前記方法の特定の変更形態では、前記障害はがんである。本開示のタンパク質による治療に適しているがんの例としては、例えば、乳がん（例えば、トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ））、膵がん、卵巣がん、肺がん（例えば、非小細胞肺がん）、造血器腫瘍（例えば、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、マントル細胞白血病（mantle cell leukemia）（ＭＣＬ）または急性リンパ芽球白血病（ＡＬＬ））、皮膚がん（例えば、扁平上皮癌またはメラノーマ）、副腎がん、膀胱がん、子宮頸がん、腎がん、胃がん、前立腺がん、甲状腺がん、肝臓がん、子宮がん、神経細胞または神経細胞鞘に形成される腫瘍（例えば、神経線維腫）、肉腫、癌腫、または頭頚部がんが挙げられる。ＴＮＢＣは、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、およびＨＥＲ２／ｎｅｕの染色が生じない乳がんと定義される。いくつかの実施形態では、対象における中皮腫を治療するために、本開示のタンパク質が前記対象に投与され得る。１つの実施形態では、対象における明細胞癌を治療するために、本開示のタンパク質が前記対象に投与され得る。１つの実施形態では、対象における横紋筋腫瘍を治療するために、本開示のタンパク質が前記対象に投与され得る。
【０２４６】
別の実施形態では、本開示は、５Ｔ４発現細胞に対するエフェクター細胞の活性化を増強するための方法であって、前記５Ｔ４発現細胞を本開示のタンパク質（例えば、５Ｔ４結合ポリペプチド、４−１ＢＢ結合ポリペプチド、および／またはその多特異的結合タンパク質）と接触させることを含み、前記接触が前記５Ｔ４発現細胞に対するエフェクター細胞の活性化の増強が誘導される条件下で行われる、前記方法を包含する。いくつかの実施形態では、本開示は、５Ｔ４発現細胞に対するエフェクター細胞の活性化を増強するための方法であって、前記５Ｔ４発現細胞を、ヒト５Ｔ４のエピトープと特異的に結合する第一結合ドメインおよび４−１ＢＢと特異的に結合する第二結合ドメイン（例えば、抗５Ｔ４×抗４−１ＢＢ分子）を含む本開示のタンパク質（例えば、５Ｔ４結合ポリペプチド、４−１ＢＢ結合ポリペプチド、および／またはその多特異的結合タンパク質）と接触させることを含み、前記接触が前記５Ｔ４発現細胞に対するエフェクター細胞の活性化の増強が誘導される条件下で行われる、前記方法に関する。本開示は、５Ｔ４発現細胞のエフェクター細胞依存性溶解を誘導するための方法であって、前記５Ｔ４発現細胞を本開示のタンパク質（例えば、５Ｔ４結合ポリペプチド、４−１ＢＢ結合ポリペプチド、および／またはその多特異的結合タンパク質）と接触させることを含み、第二の結合ドメインが４−１ＢＢと特異的に結合し（例えば、抗５Ｔ４×抗４−１ＢＢ分子）；前記接触が、前記５Ｔ４発現細胞のエフェクター細胞の活性化の増強が誘導される条件下で行われ、その結果、前記５Ｔ４発現細胞の溶解がもたらされる、前記方法を包含する。いくつかの実施形態では、本開示は、５Ｔ４発現細胞のエフェクター細胞依存性溶解を誘導するための方法であって、前記５Ｔ４発現細胞を、ヒト５Ｔ４のエピトープと特異的に結合する第一結合ドメインおよび４−１ＢＢと特異的に結合する第二結合ドメインを含む本開示のタンパク質（例えば、抗５Ｔ４×抗４−１ＢＢ分子）と接触させることを含み；前記接触が、前記５Ｔ４発現細胞のエフェクター細胞の活性化の増強が誘導される条件下で行われ、その結果、前記５Ｔ４発現細胞の溶解がもたらされる、前記方法に関する。
【０２４７】
本開示はまた、５Ｔ４の発現を特徴とする障害（例えば、がん）を治療するための医薬の製造のための、タンパク質およびポリペプチド（例えば、５Ｔ４結合ポリペプチド、４−１ＢＢ結合ポリペプチド、および／またはその多特異的結合タンパク質）を包含する。１つの実施形態では、前記タンパク質またはポリペプチドは、抗５Ｔ４結合ドメインおよび抗４−１ＢＢ結合ドメインを含み（例えば、抗５Ｔ４×抗４−１ＢＢ分子）、エフェクター細胞の活性化を増強する活性を有する。１つの実施形態では、本開示は、５Ｔ４の発現を特徴とする障害（例えば、がん）の治療に使用される、タンパク質およびポリペプチド（例えば、抗５Ｔ４×抗４−１ＢＢ分子）を提供する。特定の実施形態では、本開示は、対象における５Ｔ４の発現を特徴とする障害を治療するための方法であって、前記対象に、治療有効量の、ヒト５Ｔ４のエピトープと特異的に結合する５Ｔ４結合ドメインを含む本開示のタンパク質またはポリペプチド（例えば、５Ｔ４結合ポリペプチド、４−１ＢＢ結合ポリペプチド、および／またはその多特異的結合タンパク質）を投与することを含む、前記方法に関する。
【０２４８】
いくつかの実施形態では、本開示は、がん患者を治療する方法であって、前記患者に、本明細書に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド（例えば、配列番号１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１７２、１７４、および１７６からなる群から選択されるアミノ酸配列）を投与することを含む、前記方法を提供する。別の実施形態では、前記ポリペプチドはＦｃを含む。例えば、いくつかの実施形態では、本開示は、がん患者を治療する方法であって、前記患者に５Ｔ４結合ドメインおよびＦｃを含むポリペプチドを投与することを含み、前記ポリペプチドは配列番号１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１７２、１７４、および１７６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、前記方法を提供する。またさらなる実施形態では、本開示は、がん患者を治療する方法であって、前記患者に５Ｔ４結合ドメインおよび４−１ＢＢ結合ドメインを含むポリペプチドを投与することを含み、前記ポリペプチドは配列番号１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１７２、１７４、および１７６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、前記方法を提供する。１つの実施形態では、本開示は、がん患者を治療する方法であって、前記患者に５Ｔ４結合ドメインおよび４−１ＢＢ結合ドメインを含むポリペプチドを投与することを含み、前記ポリペプチドは配列番号１７２を含む、前記方法を提供する。１つの実施形態では、本開示は、がん患者を治療する方法であって、前記患者に５Ｔ４結合ドメインおよび４−１ＢＢ結合ドメインを含むポリペプチドを投与することを含み、前記ポリペプチドは配列番号１７４を含む、前記方法を提供する。
【０２４９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の治療法および使用においては、本明細書に記載のタンパク質またはポリペプチド（例えば、５Ｔ４結合ポリペプチド、４−１ＢＢ結合ポリペプチド、および／またはその多特異的結合タンパク質）が、治療が求められる疾患または障害の管理に関連した従来法に合致する方法で送達される。本明細書の開示によれば、治療有効量の前記タンパク質またはポリペプチドが、そのような治療を必要としている対象に、疾患または障害の予防または治療に十分な時間、それに十分な条件下で、投与される。
【０２５０】
本開示のタンパク質（例えば、５Ｔ４結合ポリペプチド、４−１ＢＢ結合ポリペプチド、および／またはその多特異的結合タンパク質）の投与の対象には、５Ｔ４発現を特徴とするある特定の障害を既に発症している患者だけでなく、そのような障害を発症するリスクが高い患者も包含される。通常、前記対象は、治療が求められる障害を有していると診断された対象である。さらに、対象は、治療中に、前記障害におけるあらゆる変化について（例えば、前記障害の臨床症状の増大または低減について）、モニタリングされ得る。また、いくつかの変更形態では、前記対象は、５Ｔ４発現細胞の標的化を含む治療を要する別の障害に罹患していない。
【０２５１】
予防的な適用では、本開示のタンパク質（例えば、５Ｔ４結合ポリペプチド、４−１ＢＢ結合ポリペプチド、および／またはその多特異的結合タンパク質）を含む医薬組成物または薬剤が、特定の障害に罹患しやすい、または特定の障害のリスクがある患者に、前記障害の除去、またはそのリスク低減、またはその発症の遅延に十分な量で、投与される。治療的な適用では、本開示のタンパク質を含む組成物または薬剤が、そのような障害に罹患している疑いがある、または既に罹患している患者に、障害およびその合併症の症状の治癒、またはその少なくとも部分的な進行阻止に十分な量で、投与される。これの達成に適した量を治療有効用量または治療有効量と称する。予防的なレジーム（regime）および治療的なレジームの両方において、薬剤は通常、十分な応答（例えば、不適切な血管新生活性の阻害）が達成されるまで、数回の投薬において、投与される。通常、この応答はモニターされ、目的の応答が弱まり始めた場合、反復的な投薬が行われる。
【０２５２】
本開示の方法による治療の対象患者を特定するために（例えば、５Ｔ４結合ポリペプチド、４−１ＢＢ結合ポリペプチド、および／またはその多特異的結合タンパク質）、特定の障害に関連する危険因子を決定するための、または、対象において確認された既存の障害の状態を決定するための、承認されたスクリーニング法が用いられ得る。このような方法は、例えば、個人に、特定の障害を持つと診断された親類がいるかどうかを確認することを含み得る。スクリーニング法は、例えば、遺伝的要素があることが知られている特定の障害について、家族の状態を確認するための、従来の精密検査も含み得る。例えば、種々のがんにも、特定の遺伝的要素があることが知られている。がんの遺伝的要素としては、例えば、がん化を起こしている複数の遺伝子における変異（例えば、Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＥＧＦＲ、ｃＭｅｔなど）、特定のＨＬＡおよびキラー細胞抑制受容体（ＫＩＲ）分子の有無、またはがん細胞による、ＮＫ細胞およびＴ細胞のような細胞の免疫抑制の調節を可能にする、直接的または間接的な機構が挙げられる（例えば、Ljunggren and Malmberg, Nature Rev. Immunol. 7:329-339, 2007; Boyton and Altmann, Clin. Exp. Immunol. 149:1-8, 2007を参照されたい）。この目的に向けて、通例、ヌクレオチドプローブを用いて、目的の特定の障害に関連した遺伝子マーカーを保因する個人が特定され得る。さらに、特定の障害のマーカーを特定するのに有用な、種々様々な免疫学的方法が、当該技術分野において公知である。例えば、モノクローナル抗体プローブを用いて特定の腫瘍に関連した抗原を検出する、様々なＥＬＩＳＡ免疫測定法が、利用可能であり、当該技術分野において周知である。既知の患者の症候、年齢因子、関連危険因子などで示される、スクリーニングが実行され得る。これらの方法は、臨床医が、本明細書に記載の治療法を必要としている患者をルーチンに選定することを可能にする。これらの方法によれば、病的な５Ｔ４発現細胞の標的化が、独立した治療プログラムとして、または他の治療に対する追跡的、補助的、もしくは協調的な治療レジメンとして、実行され得る。
【０２５３】
投与のために、本開示のタンパク質（例えば、５Ｔ４結合ポリペプチド、４−１ＢＢ結合ポリペプチド、および／またはその多特異的結合タンパク質）は医薬組成物として製剤化され得る。医薬組成物は、（ｉ）５Ｔ４結合ポリペプチド、４−１ＢＢ結合ポリペプチド、および／またはその多特異的結合タンパク質（例えば、抗５Ｔ４×抗４−１ＢＢ分子）；並びに（ｉｉ）薬剤的に許容できる担体、希釈剤、または賦形剤、を含み得る。５Ｔ４結合ポリペプチド、４−１ＢＢ結合ポリペプチド、および／またはその多特異的結合タンパク質（例えば、抗５Ｔ４×抗４−１ＢＢ分子）を含む医薬組成物が、薬剤として有用な組成物を調製するための既知の方法に従って製剤化されることにより、当該治療用分子が、混合物中で、薬剤的に許容できる担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わされ得る。担体は、その投与が受容者である患者に忍容され得る場合に、「薬剤的に許容できる担体」とされる。無菌リン酸緩衝生理食塩水は薬剤的に許容できる担体の一例である。他の好適な担体、希釈剤、または賦形剤が当業者に周知である（例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ（編）、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ出版社、第１９版、１９９５年）を参照）。製剤化は、１または複数の賦形剤、保存剤、溶解補助剤、緩衝剤、バイアル表面上でのタンパク質の損失を防ぐためのアルブミンなどをさらに含み得る。特定の実施形態では、医薬組成物は、ホモ二量体またはヘテロ二量体である、５Ｔ４結合ポリペプチド、４−１ＢＢ結合ポリペプチド、および／またはその多特異的結合タンパク質（例えば、抗５Ｔ４×抗４−１ＢＢ分子）を含む。「ホモ二量体」は、２つの同一のポリペプチド（例えば、本明細書に記載の抗５Ｔ４×抗４−１ＢＢ分子）から形成される二量体であり得る。
【０２５４】
本明細書に記載のポリペプチドまたはタンパク質を含む医薬組成物は、経口投与用単位剤形、静脈内投与用単位剤形、鼻腔内投与用単位剤形、坐剤用単位剤形、皮内投与用単位剤形、筋肉内投与用単位剤形、腹腔内投与用単位剤形、皮下投与用単位剤形、硬膜外投与用単位剤形、舌下投与用単位剤形、および脳内投与用単位剤形からなる群から選択される剤形に製剤化され得る。前記経口投与用単位剤形は、錠剤、丸剤、ペレット剤、カプセル剤、散剤、菓子錠剤、粒剤、水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤、徐放性製剤、エアゾール剤、および噴霧剤からなる群から選択され得る。
【０２５５】
本明細書に記載のポリペプチドまたはタンパク質（例えば、５Ｔ４結合ポリペプチド、４−１ＢＢ結合ポリペプチド、および／またはその多特異的結合タンパク質）を含む医薬組成物は、治療有効量で対象に投与され得る。本開示の方法によれば、本明細書に記載のポリペプチドまたはタンパク質（例えば、５Ｔ４結合ポリペプチド、４−１ＢＢ結合ポリペプチド、および／またはその多特異的結合タンパク質）は、例えば、筋肉内投与経路、皮下投与経路、静脈内投与経路、心房内投与経路、関節内投与経路、非経口投与経路、鼻腔内投与経路、肺内投与経路、経皮投与経路、胸膜内投与経路、くも膜下腔内投与経路、および経口投与経路を含む、種々の投与方法で対象に投与され得る。予防目的および治療目的で、作動薬（例えば、５Ｔ４結合ポリペプチド、４−１ＢＢ結合ポリペプチド、および／またはその多特異的結合タンパク質）は、長期に亘っての持続的な送達（例えば、持続的な経皮送達）を介した単回ボーラス送達で、または、反復投与プロトコル（例えば、毎時間、毎日、毎週、または毎月）で、対象に投与され得る。
【０２５６】
これに関連して、有効量の決定は、通常、動物モデル試験と、追跡的なヒト臨床試験をベースとして、モデル対象における対象障害の発生率または重症度を有意に低減する有効薬量および投与プロトコルの決定に基づいて行われる。本開示の組成物の有効量は、組成物それ自体の固有の活性と、個体において目的の応答を引き出す組成物の能力のほか、投与手段、標的部位、患者の生理状態、患者がヒトであるか動物であるか、他の投与薬剤、予防的処置か治療的処置かをはじめとする、多くの様々な要素に依存して異なる。通常、患者はヒトであるが、いくつかの疾患では、患者はヒト以外の哺乳動物であり得る。通例、投与計画は、最適な治療反応をもたらすように、すなわち、安全性および有効性を最適化するように、調整される。従って、治療有効量は、本明細書に記載の５Ｔ４結合ポリペプチド、４−１ＢＢ結合ポリペプチド、および／またはその多特異的結合タンパク質（例えば、抗５Ｔ４×抗４−１ＢＢ分子）の投与の有益な効果が好ましくないあらゆる副次効果を上回る量ともされる。本明細書に記載のタンパク質またはポリペプチドの投与について、投与量は、対象の体重１ｋｇ当たり、約０．１μｇ〜１００ｍｇ／ｋｇまたは１μｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの範囲であり、通常は１０μｇ〜５ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。より具体的な実施形態では、有効量の前記薬剤は、約１μｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、または約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇである。この範囲内の投与量は、単回投与でも反復投与でも達成することができ、例えば、１日に複数回の投与、または１日１回の投与、週１回の投与、２週間に１回の投与、もしくは月１回の投与が挙げられる。例えば、特定の変更形態では、投与計画は、初回投与と、１週間間隔または２週間間隔の複数回のそれ以降の投与と、からなる。別の投与計画は、初回投与と、１か月間隔または２か月間隔の複数回のそれ以降の投与と、からなる。あるいは、障害の臨床症状のモニタリングによって必要が示された場合、投与は不定期であってもよい。
【０２５７】
本明細書に記載のポリペプチドまたはタンパク質（例えば、５Ｔ４結合ポリペプチド、４−１ＢＢ結合ポリペプチド、および／またはその多特異的結合タンパク質）を含む医薬組成物の投与量は、標的部位における目的濃度を維持するために、担当臨床医による変更が可能である。例えば、静脈内送達様式が選択された場合、前記薬剤の標的組織における局所血中濃度は、約０．０１〜５０ｎＭ／Ｌの前記組成物であり、場合により、対象の状態および予測される応答測定値に依存して、約１．０ｎＭ／Ｌから１０、１５、または２５ｎＭ／Ｌまでであり得る。送達様式によって、より高濃度またはより低い濃度が選択され得る（例えば、経皮送達と粘膜表面送達を比較）。投与製剤の放出速度によっても、投与量は調整されるべきである（例えば、鼻噴霧と、粉末、徐放性の経口用または注射用粒子、経皮製剤などを比較）。同じ血清中濃度レベルを達成するために、例えば、放出速度が５ｎＭ（標準条件下）の徐放性粒子は、放出速度が１０ｎＭの粒子の投与量の約２倍で投与される。
【０２５８】
また、本明細書に記載のタンパク質およびポリペプチド（例えば、５Ｔ４結合ポリペプチド、４−１ＢＢ結合ポリペプチド、および／またはその多特異的結合タンパク質）（例えば、抗５Ｔ４×抗４−１ＢＢ分子）は、約０．００１〜約１０ミリグラム（ｍｇ）／キログラム（ｍｐｋ）体重の１日投与量で投与され、好ましくは単回一日量として、または１日に２〜６回程度の分割量で与えられ得る。ヒト成人患者に対しての投与の場合、治療有効量が、１回０．２ｍｇ、１回０．５ｍｇ、１回１ｍｇ、１回５ｍｇ、１回１０ｍｇ、１回２５ｍｇ、１回１００ｍｇ、１回２００ｍｇ、および１回４００ｍｇを含むがこれらに限定はされない、１回０．２ｍｇ〜８００ｍｇの範囲内の用量で投与され、一連の治療において、複数回の、通常は連続的な一日量が投与され得る。本明細書に記載のタンパク質およびポリペプチド（例えば、５Ｔ４結合ポリペプチド、４−１ＢＢ結合ポリペプチド、および／または抗５Ｔ４×抗４−１ＢＢ分子などのその多特異的結合タンパク質）は、様々な時間に投与することができる。１つの実施形態では、最適治療量が夜に投与され得る。別の実施形態では、最適治療量が朝に投与され得る。本明細書に記載のタンパク質およびポリペプチドの総１日投与量は、従って、１つの実施形態では約１ｍｇ〜約２ｇの範囲をとり得るが、約１００ｍｇ〜約１．５ｇの範囲をとる場合が多く、約２００ｍｇ〜約１２００ｍｇの範囲をとる場合が最も多い。典型的な７０ｋｇの成人の場合、抗５Ｔ４治療薬の総一日量は、約２ｍｇ〜約１２００ｍｇの範囲をとり得るが、多くの場合、上記で言及したように、約０．２ｍｇ〜約８００ｍｇの範囲をとることとなる。
【０２５９】
特に固形腫瘍の治療に関して、エンドポイントおよび抗腫瘍活性を評価するためのプロトコルが当該技術分野において周知である。各プロトコルにより規定される腫瘍反応評価は異なり得るが、ＲＥＣＩＳＴ（Response evaluation Criteria in solid tumors）（固形がんの治療効果判定のためのガイドライン）評価基準が、現在、国立がん研究所により、腫瘍反応を評価するための推奨のガイドラインとみなされている（Therasse et al., J. Natl. Cancer Inst. 92:205-216, 2000参照）。ＲＥＣＩＳＴ評価基準によれば、腫瘍反応とは、全ての測定可能な病変または転移の低減または除去を意味する。疾患は一般に、医療用写真もしくはＸ線、コンピューター体軸断層撮影法（ＣＴ）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、または臨床検査（病変が表層にある場合）により、少なくとも１つの寸法において、従来技術を用いた場合で２０ｍｍ以上、または、周縁部が明確に規定される特殊なＣＴスキャンを用いた場合で１０ｍｍ以上と、正確な測定が可能である病変を含む場合に、測定可能とみなされる。測定不可の疾患とは、疾患が、従来技術を用いた場合で２０ｍｍ未満、または特殊なＣＴスキャンを用いた場合で１０ｍｍ未満の病変と、真に測定不可な病変（小さすぎて正確に測定できない）とから構成されることを意味する。測定不可の疾患としては、胸水、腹水、および間接的な証拠によって実証される疾患が挙げられる。
【０２６０】
客観的な状態の評価基準が固形腫瘍反応を評価するためのプロトコルに必要とされる。代表的な評価基準としては以下が挙げられる：（１）全ての測定可能な疾患の完全消失；新規病変なし；疾患に関連した症状なし；測定不可な疾患の証拠なしと定義される、完全奏功（ＣＲ）；（２）標的病変の最長直径の合計の３０％減少と定義される、部分奏功（ＰＲ）  （３）標的病変の最長直径の合計の２０％増加またはあらゆる新規病変の出現と定義される、進行性疾患（ＰＤ）；（４）ＣＲにも、ＰＲにも、進行性疾患にも資さないと定義される、安定または反応なし（上記Therasse et al.参照）。
【０２６１】
腫瘍学分野の中で認められている追加のエンドポイントとして、全生存（ＯＳ）、無病生存期間（ＤＦＳ）、奏効率（ＯＲＲ）、腫瘍増殖停止時間（ＴＴＰ）、および無増悪生存期間（ＰＦＳ）が挙げられる（以下を参照：Guidance for Industry: Clinical Trial Endpoints for the Approval of Cancer Drugs and Biologics, April 2005、ＦＤＡ医薬品評価研究センター、メリーランド州ロックヴィル）。
【０２６２】
本明細書に記載のタンパク質およびポリペプチド（例えば、５Ｔ４結合ポリペプチド、４−１ＢＢ結合ポリペプチド、および／または５Ｔ４×抗４−１ＢＢ分子などのその多特異的結合タンパク質）を含む医薬組成物は、本明細書に記載の医薬組成物を含む容器を含むキットとして供給され得る。医薬組成物は、例えば、単回投与用もしくは反復投与用の注射剤の形態で、または注射前に再構成されることとなる無菌の粉末として、提供され得る。あるいは、そのようなキットは、医薬組成物の投与のための、乾燥粉末用ディスペーサー、液体エアゾール発生器、または噴霧器を含み得る。そのようなキットは、医薬組成物の適応症および用法に関する書面情報をさらに含み得る。
【０２６３】
以下、実施例により本開示をさらに明らかにするが、これらの実施例は、本開示の単なる例示であり、限定する意図は全くない。
【実施例】
【０２６４】
実施例１：「１６１８」型抗ＣＤ１３７モノクローナル抗体のｓｃＦｖフォーマットへの変換、およびＡＤＡＰＴＩＲ（商標）フォーマット（ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖ）の二重特異性抗ＣＤ１３７×抗５Ｔ４分子の作製
１６１８型ｓｃＦｖをコードするヌクレオチド配列を作製するために、例えば、限定はされないが、ＰＣＴ国際公開第２００７／１４６９６８号、同第２０１０／０４０１０５号、および同第２０１０／００３１０８号；米国特許出願公開第２００６／００５１８４４号；並びに米国特許第７，１６６，７０７号に記載される、標準的な分子生物学的手法を用いて、１６１８型抗４−１ＢＢモノクローナル抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）（それぞれ、配列番号２８および配列番号１６）をコードするヌクレオチド配列を、既存のプラスミドＤＮＡから合成および／または増幅し、（Ｇｌｙ）４Ｓｅｒベースのリンカーで連結した。次に、この１６１８型ｓｃＦｖのヌクレオチド配列を、点変異を含ませてＦｃ領域のエフェクター機能活性を除去した改変型ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域配列に融合させた。同様に、１２１０型抗５Ｔ４モノクローナル抗体のＶＨドメインをコードするヌクレオチド配列およびＶＬドメインをコードするヌクレオチド配列（それぞれ、配列番号３８および６８）を、追加の（Ｇｌｙ）４Ｓｅｒベースのリンカーで連結した。得られた二重特異性分子を、ＨＥＫ−２９３細胞またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の一過性トランスフェクションにより発現させ、培養上清から、プロテインＡアフィニティー精製（ＰｒｏＡ）および分子ふるいクロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて精製した。プロテインＡ精製工程およびＳＥＣ精製工程がそれぞれ完了した後、分析用ＳＥＣによりタンパク質純度を求めた。製造業者の使用説明書（instruct）に従ってＥｎｄｏｓａｆｅ  ＰＴＳ装置を用いてエンドトキシンレベルを測定し、これらのインビトロ活性測定の結果が、エンドトキシンの存在と交絡しないことを確かめた。各タンパク質バッチを、ＳＥＣ精製法の一部としてＰＢＳに緩衝液交換し、１ｍｇ／ｍＬに濃縮し、滅菌濾過し、必要となるまで４℃で保存した。理論吸光係数を用いて、２８０ｎｍの吸光度からタンパク質濃度を求めた。
【０２６５】
場合により、前記二重特異性分子は、２個のｓｃＦｖと１個のＦｃドメインとから構成され（ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖ）、Ｎ末端からＣ末端に向かって１６１８型ｓｃＦｖ−Ｆｃ−１２１０型ｓｃＦｖの構造を有した。加えて、１６１８型ｓｃＦｖをコンストラクトのＣ末端に配置し、１２１０型ｓｃＦｖをＮ末端に配置した（すなわち、１２１０型ｓｃＦｖ−Ｆｃ−１６１８型ｓｃＦｖ）、二重特異性分子を作製した。しかしながら、この別配向を有する分子は、１６１８型ｓｃＦｖ−Ｆｃ−１２１０型のｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖ分子との比較で評価した場合に、目的の特性が小さかった。
【０２６６】
ＨＥＫ−２９３細胞に一過性トランスフェクションされた場合に、全てではないが大部分の１６１８−Ｆｃ−１２１０型ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖ  ＡＤＡＰＴＩＲ（商標）分子（例えば、ＡＬＧ．ＡＰＶ−００６、ＡＬＧ．ＡＰＶ−０１０、ＡＬＧ．ＡＰＶ−０１４、およびＡＬＧ．ＡＰＶ−０１８）が、Ｍｏｒｒｉｓｏｎフォーマット（すなわちＡＬＧ．ＡＰＶ−００４）との比較で、発現レベルの有意な向上を示した。表１２は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ型二重特異性コンストラクト（ＡＬＧ．ＡＰＶ−００４）と比較した場合の、ＡＤＡＰＴＩＲ（商標）型二重特異性分子（例えば、ＡＬＧ．ＡＰＶ−００６、ＡＬＧ．ＡＰＶ−０１０、ＡＬＧ．ＡＰＶ−０１４、およびＡＬＧ．ＡＰＶ−０１８）の発現レベルの向上を示す代表的なデータを含む。１６１８型可変ドメインおよび１２１０型可変ドメインのアミノ酸配列はこの向上を達成するための改変がなされていなかったため、これは予期しない結果であった。これらの結果は、ＡＤＡＰＴＩＲ（商標）型二重特異性分子が治療用タンパク質薬剤の製造に有益であり得ることを示しており、というのも、高い発現レベルは、商品原価を引き下げ、他にも、市場の要求を満たすのに必要なプロダクションランが少なくなるなどの製造プロセスにおける効率をもたらし得るため、治療用タンパク質薬剤の製造に一般に有益と見なされるためである。
【０２６７】
ＨＥＫ−２９３における明らかな発現向上の他に、表１２に示されるように、培養上清から得られた二重特異性分子のプロテインＡ精製後に定量された凝集体レベルが、Ｍｏｒｒｉｓｏｎフォーマット二重特異性分子（ＡＬＧ．ＡＰＶ−００４）と比較した場合に、ＡＤＡＰＴＩＲ（商標）型二重特異性分子（ＡＬＧ．ＡＰＶ−００６、ＡＬＧ．ＡＰＶ−０１０、ＡＬＧ．ＡＰＶ−０１４、およびＡＬＧ．ＡＰＶ−０１８）において有意に改善された。
【表１２】
2020530770.tif 000047
【０２６８】
また、ＶＨドメインおよびＶＬドメインの順番（ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨ）について、１２１０型ｓｃＦｖおよび１６１８型ｓｃＦｖの両方を用いて評価を行ったところ、ＶＬ−ＶＨ配向を用いた場合にｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖ分子の発現レベルが著しく低下したことから、１６１８型ｓｃＦｖの好ましい配向はＶＨ−ＶＬであることが確認された。表１３に示されるように、１２１０型ｓｃＦｖの好ましい配向はＶＨ−ＶＬであり、ＶＬ−ＶＨフォーマットの１２１０型ｓｃＦｖから構成される二重特異性分子と比較して、５Ｔ４発現細胞への結合性の向上と、ＣＤ１３７レポーターアッセイにおけるインビトロ活性の向上が示された。
【表１３】
2020530770.tif 000048
【０２６９】
１６１８型ｓｃＦｖおよび１２１０型ｓｃＦｖの、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のリンカーの長さについても、評価も行った。ＶＨとＶＬとを接続するリンカー長の変化は、Ｇｌｙ４Ｓｅｒリンカーを４回リピートさせた場合も３回リピートさせた場合も、活性や安定性に有意差を生じていないように思われたため（データ未記載）、特に記載がない限り、通常は４回リピートを採用した。
【０２７０】
実施例２：１６１８型の抗ＣＤ１３７  ｓｃＦｖおよび抗５Ｔ４  ｓｃＦｖの結合ドメインの最適化
初期特性評価を終えて、ＡＤＡＰＴＩＲ（商標）型二重特異性分子（ＡＬＧ．ＡＰＶ−００６）は、１）各ｓｃＦｖの結合ドメインのそれぞれの標的への結合親和性；２）生物物理学的な安定性；および３）インビトロ活性の増加を好ましくも示した。これらのパラメーターの向上は、商品原価の改善と、製造の容易さと、臨床における投薬量の減少に繋がると期待される。結合ドメインの最適化のために、誤りがちなＰＣＲ法を用いて、１６１８型ｓｃＦＶおよび１２１０型ｓｃＦＶの両方の、ランダム変異誘発ファージライブラリーを作製した。簡潔に説明すると、市販の変異誘発キット（ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ  ＩＩ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ、アジレント・テクノロジー社）を製造業者のプロトコルに従って用いて、各ｓｃＦｖを誤りがちなＰＣＲ反応における鋳型として用いた。そのｅｐＰＣＲ産物を消化し、ファージミド−ｓｃＦＶベクターにライゲーションし、大腸菌ＳＳ３２０／Ｍ１３Ｋ０７コンピテント細胞に形質転換して、ファージライブラリーを作製した。ビオチン化された、４−１ＢＢまたは５Ｔ４の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を抗原として用いて（それぞれ、１６１８型または１２１０型の結合ドメインの場合）、各ライブラリーに対し５回のパニングを行った。抗原濃度を減少させ、洗浄時間を延長することにより、１回毎に、パニングのストリンジェンシーを増加させていった。最終回のパニングの後、ファージアウトプットを播種し、作製されたＡＤＡＰＴＩＲ（商標）発現ベクターへのｓｃＦｖプールの大量クローニング用に準備した。およそ４００個のコロニーを個別にピックし、ファージミドを単離および配列決定し、精製したＤＮＡをハイスル―プット小規模２９３一過性トランスフェクション（約０．６ｍＬの培養液量）に用いた。５日目の清澄上清を、フローサイトメトリーおよびＳＰＲにより、結合性について測定した。その後、最も成績が良かったバリアントを、細胞結合性、インビトロ活性、および種々の安定性実験を含む一連の試験へと進めた。これらの二重特異性ＡＤＡＰＴＩＲ（商標）バリアントは、１２１０型ｓｃＦｖまたは１６１８型ｓｃＦｖのいずれかに変化を有し、他方のｓｃＦｖは未改変の親配列を維持するように、作製された。これにより、データの解釈が単純化され、これらの単一の変化の結合性、活性、および安定性に対する影響の評価が可能となった。安定性、親和性、または生理活性に対する改善に基づいて、有益な点変異を特定した。次に、これらを組み合わせて、追加の一連のＡＤＡＰＴＩＲ  ＤＮＡコンストラクトを作製した。これらのコンストラクトでは、１２１０型ｓｃＦｖおよび／または１６１８型ｓｃＦｖに複数の変化が組み入れられていた。各コンストラクトを、２５０ｍＬの培養液量の一過性トランスフェクションを介してＨＥＫ−２９３細胞に発現させ、ＰｒｏＡ工程およびＳＥＣ工程を用いて精製した。最終的なタンパク質純度を分析用SECで確認し、製造業者の使用説明書（instruct）に従ってＥｎｄｏｓａｆｅ  ＰＴＳ装置を用いてエンドトキシンレベルを測定し、これらのインビトロ活性測定の結果が、エンドトキシンの存在と交絡しないことを確かめた。得られたタンパク質を、ＳＥＣ精製法の一部とし���ＰＢＳに緩衝液交換し、１ｍｇ／ｍＬに濃縮し、滅菌濾過し、必要となるまで４℃で保存した。理論吸光係数を用いて、２８０ｎｍの吸光度からタンパク質濃度を求めた。
【０２７１】
実施例３：ファージ由来最適化バリアントの評価
ファージパニングの試みの一環として、親ＡＬＧ．ＡＰＶ−００６コンストラクトと比較した場合の、１２１０型ｓｃＦｖおよび１６１８型ｓｃＦｖに対する数種類の有益なアミノ酸変化が特定された。タンパク質コロイド安定性の１つの尺度として、硫酸アンモニウムを最終濃度約１Ｍまで添加した場合に溶液から沈殿するタンパク質量の検査がある。これらの条件下では、親コンストラクトＡＬＧ．ＡＰＶ−００６は、溶液中のタンパク質の８９％近くを失った（表１４）。比較すると、ＡＬＧ．ＡＰＶ−０９９、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１２７、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１４８、およびＡＬＧ．ＡＰＶ−１５０によって示された変化は全て、これらの条件下でタンパク質損失の減少を示しており、このことは、これらのコンストラクトでなされた個々のアミノ酸変化が、ＡＤＡＰＴＩＲ（商標）型二重特異性分子のコロイド安定性を向上させたことを示唆している。タンパク質安定性の別の尺度として、タンパク質試料に剪断力を加えることの影響を調べ、二重特異性分子の沈殿または可溶性凝集形態の形成による損失についてその試料を検査することが挙げられる。タンパク質溶液を９６ウェルプレートに添加し、２，０００ＲＰＭで２時間振盪する剪断アッセイで評価した場合、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１２７変異体はタンパク質損失量を顕著に減少させたが、一方、その他のバリアントは、最小限の影響しか示していないか、または損失がわずかに悪化している（表１４）。別の尺度である熱安定性は、示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）または示差走査型蛍光定量法法（ＤＳＦ）を用いて、融解曲線の中間点温度（別名Ｔｍ）を求めることにより、決定することができる。１６１８型バリアントおよび１２１０型バリアントのＴｍを求めたところ、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１２７バリアントおよびＡＬＧ．ＡＰＶ−１５０バリアントが、ＡＬＧ．ＡＰＶ−００６親配列と比較して、１６１８型ｓｃＦｖのＴｍを３〜４℃上昇させたことが分かった（表１４）。Ｔｍ値の上昇は、そのタンパク質が熱によるアンフォールディング／変性に対してより抵抗性となることを意味しているため、概して折り畳みタンパク質の安定性の向上と見なすことができる。ＡＬＧ．ＡＰＶ−１４８は、ＡＬＧ．ＡＰＶ−００６に用いられた親１２１０型配列と比較してＴｍが３℃近く上昇したことから、１２１０型ｓｃＦｖの熱安定性を増加させた。
【０２７２】
変異の組み合わせが、ＡＤＡＰＴＩＲ（商標）型二重特異性コンストラクトの生物物理学的安定性に相加的な利点をもたらすかどうかを確認するために、ＡＬＧ．ＡＰＶ−０９９、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１２７、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１４８、およびＡＬＧ．ＡＰＶ−１５０の変異の様々な組み合わせを評価した。これらは、個々の点変異と同じ方法を用いて発現および精製を行い、同じアッセイで評価を行った。表１４の結果は、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１７８およびＡＬＧ．ＡＰＶ−１７９に含まれる変異の組み合わせが、代表例として、個々の変化から得られるものにおよそ相当するかそれよりも良好な、安定性の増加をもたらしたことを示している。
【表１４】
2020530770.tif 000049
【０２７３】
安定性評価の実施に加えて、ＡＬＧ．ＡＰＶ−００６およびファージ由来バリアントの結合親和性を、ヒト５Ｔ４およびヒトＣＤ１３７の組換え細胞外ドメインを用いて、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ−２００を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、測定した。ＡＬＧ．ＡＰＶ−１２７およびＡＬＧ．ＡＰＶ−１５０の改変は、ＣＤ１３７に対する結合親和性を顕著により堅固なものにした（表１５）。同様に、ＡＬＧ．ＡＰＶ−０９９が、ＡＬＧ．ＡＰＶ−００６よりも顕著により堅固な結合を示すことが確認された（それぞれ、１３ｎＭと１４９ｎＭ）。
【表１５】
2020530770.tif 000050
【０２７４】
ＡＬＧ．ＡＰＶ−０９９、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１２７、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１４８、およびＡＬＧ．ＡＰＶ−１５０バリアントの、細胞表面上に発現されたＣＤ１３７および５Ｔ４に対する結合性を、ＡＬＧ．ＡＰＶ−００６の結合性と比較した。これらの変異のいくつかが可溶性のＣＤ１３７または５Ｔ４に対し親和性の向上を示したが、細胞表面上の結合性実験においては特記すべき差異は確認されなかった（データ未記載）。ＣＤ１３７の標的依存活性化の誘導における、ファージディスプレイ由来バリアントの有効性を比較するため、ＣＤ１３７レポーターアッセイでバリアントを比較した。
【０２７５】
ＣＤ１３７レポーターアッセイ：
ＮＦ−κＢプロモーターの制御下にあるルシフェラーゼレポーター遺伝子を保有するＪｕｒｋａｔ／ＣＤ１３７トランスフェクタント（プロメガ社）を、製造業者のプロトコルに従って培養した。ＮＦ−κＢレポーター発現Ｊｕｒｋａｔ細胞を、ヒト５Ｔ４をトランスフェクションされたＣＨＯ−Ｋ１細胞と共に、３０，０００個の標的細胞に対しておよそ１５，０００個のレポーター細胞で、９６ウェルプレート内で培養した。最終濃度が１０ｎＭ〜０．００２ｎＭの範囲をとる各濃度の二重特異性分子を加えた。細胞を、１％ウシ胎児血清、ピルビン酸ナトリウム、抗生物質、および可欠アミノ酸を添加した、総体積１００μＬのＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２の加湿恒温器内で５〜６時間インキュベートした。１００μＬのＢｉｏ−Ｇｌｏｗバッファー（プロメガ社）を各ウェルに添加し、５〜１０分間インキュベートした後、蛍光を測定した。ＭｉｃｒｏＢｅｔａ２  ２４５０  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（パーキンエルマー社）で発光を測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６（登録商標）グラフ描画および統計ソフトウェアにおいて、ＥＣ５０値を求めるための非線形回帰分析を実施した。
【０２７６】
図１は、全てのコンストラクトが５Ｔ４（＋）細胞の存在下で作動薬的な働きを示したことを示しているが；５Ｔ４（＋）細胞の非存在下ではレポーター活性は認められなかった（図示せず）。ＡＬＧ．ＡＰＶ−０９９コンストラクト、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１２７コンストラクト、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１４８コンストラクト、およびＡＬＧ．ＡＰＶ−１５０コンストラクトは、元のＡＬＧ．ＡＰＶ−００６コンストラクトよりも良好な作動薬的な働き（より低いＥＣ５０値）を示した。曲線上の全ての点は２連ウェルの平均を表す。Ｍｏｒｒｉｓｏｎフォーマット分子のＡＬＧ．ＡＰＶ−００４は比較用に含まれた。Ｙ軸は、最大蛍光のパーセントとして表される、相対蛍光単位（ＲＬＵ）の値を示す。
【０２７７】
単一点突然変異により向上が達成されることが、ＡＬＧ．ＡＰＶ−０９９、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１２７、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１４８、およびＡＬＧ．ＡＰＶ−１５０によって示されたため、個々の特性が同一タンパク質内に含まれた場合に相加的な利点を示すかどうかを確認するために、これらを様々に組み合わせた。これらのユニークな変異の評価を、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１７８、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１７９、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１８７、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１９１、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１９６、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１９８、およびＡＬＧ．ＡＰＶ−１９９などの、特性が顕著に改善された１６１８型ｓｃＦｖバリアントおよび１２１０型ｓｃＦｖバリアントを派生させる組み合わせにおいて、実施した。ＡＬＧ．ＡＰＶ−１９１コンストラクト、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１９６コンストラクト、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１９８コンストラクト、およびＡＬＧ．ＡＰＶ−１９９コンストラクトを作製するために、これらの単一点突然変異を、ＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５９６５６の実施例２２および実施例２３に記載されるＬＯ１変異、ＬＯ２変異、およびＬＯ１１変異とさらに組み合わせた。さらに、不安定性の要因になり得る領域を特定するため、１６１８型ｓｃＦｖおよび１２１０型ｓｃＦｖの各領域を解析後、標的化されたファージライブラリーを作製した。しかし、これらのライブラリーをパニングしても、特性が向上されたｓｃＦｖは得られなかった（データ未記載）。
【０２７８】
実施例４：ジスルフィド結合の安定化の評価
１６１８型ｓｃＦｖおよび１２１０型ｓｃＦｖの両方のＶＨドメインおよびＶＬドメインに、追加のシステイン残基を組み入れる点変異を行った。これらの二重特異性分子が発現されたとき、これらのシステインが反応してジスルフィド結合を形成し、ｓｃＦｖの安定性を増加させ、これらの製品の製造および貯蔵を改善する有益な特性を与える働きをする可能性がある。１２１０型ｓｃＦｖに安定化用のジスルフィドを有する最適化二重特異性分子を、４℃もしくは２５℃で１週間保存するか、または−８０℃〜室温の凍結融解サイクルを３回行った場合に、当該ジスルフィドを有さない二重特異性分子よりも良好な純度を維持するか、を示す実験を行った。代表的なデータを表１６に示す。安定化用ジスルフィド結合を１６１８型ｓｃＦｖに追加した場合の評価も行った。このジスルフィドは安定性の恩恵を与えるように思われたが、Ｂｉａｃｏｒｅによる結合性データからは、非定型的な結合速度論をもたらす不均一性が試料中に存在することが示された（データ未記載）。
【表１６】
2020530770.tif 000051
【０２７９】
その後４０℃で実施された評価においても、１２１０型ｓｃＦｖに安定化用ジスルフィド結合を含ませることによる二重特異性分子の安定性の改善は明らかであった。２種類のコンストラクト、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２０９およびＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０は、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０の１２１０型ｓｃＦｖに安定化用ジスルフィドが追加されていることだけ異なる。この高温で１週間経過後、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０が形成した凝集物は著しく少なかった（表１７）。
【表１７】
2020530770.tif 000052
【０２８０】
１２１０にジスルフィド結合を含ませることは保存安定性に大きな恩恵を与えたが、評価が行われたもう一方の安定性パラメーターについては、２つのコンストラクトの間に有意差が認められなかった（表１８）。親二重特異性分子ＡＬＧ−００６と比較した場合、両方のコンストラクトが、これらのアッセイで顕著により良好な成績を示した（表１４）。
【表１８】
2020530770.tif 000053
【０２８１】
実施例５：二重特異性ｓｃＦｖ２Ｆｃタンパク質のヒト５Ｔ４およびヒトＣＤ１３７に対する結合親和性の評価
方法
組換え型のヒト５Ｔ４およびヒトＣＤ１３７の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の発現および精製：
標準的な分子生物学手法を用い、５Ｔ４タンパク質およびＣＤ１３７タンパク質の完全長配列をコードするベクターから開始して、ヒト５Ｔ４およびヒトＣＤ１３７の細胞外領域を増幅するようにヌクレオチドプライマーを設計した。未変性タンパク質において膜に進入すると予測される位置の、ＥＣＤのＣ末端に、さらなるペプチド配列を付加した。このペプチドには、アフィニティ精製の目的に利用できる認識配列を含ませた。この発現ベクターの、ＨＥＫ−２９３細胞への一過性トランスフェクションを実施した。固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）および分子ふるいクロマトグラフィーを用いて、組換えＥＣＤを培養上清から精製した。分析用ＳＥＣでタンパク質純度を確認した。
【０２８２】
組換え型のＣＤ１３７および５Ｔ４の外部ドメインに対する二重特異性タンパク質の表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）親和性解析：
組換え型単量体５Ｔ４外部ドメイン（ＥＣＤ）および組換え型単量体ＣＤ１３７外部ドメインに対しての、二重特異性抗５Ｔ４×抗ＣＤ１３７タンパク質のＳＰＲ結合親和性試験を、２５℃、ＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液中、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００システム上で実施した。１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）中２０μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（ジャクソン・イムノリサーチ社（Jackson ImmunoResearch））を、２０００レスポンスユニット（response unit）（ＲＵ）の密度で、ＣＭ５研究グレードセンサーチップ（ＧＥ社）のフローセル上に、標準的なアミン結合化学作用により、固定化した。ＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液中２００ｎＭの各二重特異性バリアントの捕捉を、抗ヒトＩｇＧが固定化された前記フローセル内で、５０μＬ／分の流速で６０秒間行って、約５００ＲＵの反応を達成させ、１つのフローセル表面はリファレンスとして未処理のままとした。３０秒間の安定化期間の後、４つの異なる濃度の各ＥＣＤ（０、２０、６０、および１８０ｎＭ）を、５０μＬ／分で、１２０秒間注入した後に２４０秒間の解離期間を置くか（５Ｔ４の場合）、または、９０秒間注入した後に１８０秒間の解離期間を置いた（４−１ＢＢの場合）。再生は、１０ｍＭグリシン（ｐＨ１．５）を５０μＬ／分の流速で３０秒間二重注入した後、ＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液で１分間安定化させることにより、達成した。
【０２８３】
カイネティクスＳＰＲ測定から得られたセンサーグラムを、二重減算法（double subtraction method）により解析した。リファレンスフローセルから得られたシグナルを、リガンドが固定または捕捉されたフローセルから得られたアナライト結合反応から、減算した。次に、複数回の注入から緩衝液リファレンス反応の平均を取った。次に、この平均した緩衝液リファレンス反応を、アナライト結合反応から減算し、この二重リファレンスを行ったデータを、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（２．０、ＧＥ社）で解析し、データのグローバルフィッティングを行って、カイネティクスパラメーターを導いた。センサーグラムは全て、シンプルな１対１結合モデルを用いてフィッティングを行った。
【０２８４】
結果
表１９は、ＣＤ１３７および５Ｔ４に結合するＡＤＡＰＴＩＲ（商標）型二重特異性分子の、ＳＰＲによって測定された結合パラメーターを示している。なお、二重特異性分子をチップ上に捕捉させ、組換え型単量体のＣＤ１３７または５Ｔ４のＥＣＤを注入する、この方式での親和性測定の実施は、アビディティー作用と交絡しない真の親和性の値が得られるはずである。表１９が示す通り、ランダム化ファージライブラリーを慎重にスクリーニングすることによって、抗ＣＤ１３７  ｓｃＦｖおよび／または抗５Ｔ４  ｓｃＦｖの結合親和性の著しい向上をもたらした結合ドメインバリアントを単離することができた。非最適化親コンストラクトのＡＬＧ．ＡＰＶ−００６と比較して、最適化ＡＤＡＰＴＩＲ（商標）型二重特異性分子であるＡＬＧ．ＡＰＶ−１７８、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１７９、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１８７、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２０９、およびＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０を用いた場合に、ヒトＣＤ１３７  ＫＤ値における大幅な減少が達成された。同様に、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１７９、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１８７、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２０９、およびＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０が、非最適化ＡＬＧ．ＡＰＶ−００６と比較して、ヒト５Ｔ４に対する親和性値の向上を示した。
【表１９】
2020530770.tif 000054
【０２８５】
実施例６：ヒト５Ｔ４およびヒトＣＤ１３７に対する二重特異性ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖタンパク質の熱安定性の評価
示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）および示差走査型蛍光定量法（ＤＳＦ）は、組換えタンパク質の構造的安定性を測定、評価するために通例使用される手段である。タンパク質試料の温度を上昇させるために必要なエネルギーを測定することにより、個々のタンパク質ドメインの融解温度中心点（Ｔｍ）を求めることができる。一般的な理解では、Ｔｍ値が高いタンパク質ドメインほど、より安定と見なされる。一連の最適化二重特異性ＡＤＡＰＴＩＲ（商標）型二重特異性タンパク質（ＡＬＧ．ＡＰＶ−１７８、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１７９、およびＡＬＧ．ＡＰＶ−１８７）を用いてＤＳＦ解析を実施し、非最適化ＡＤＡＰＴＩＲ（商標）型二重特異性分子バージョン（ＡＬＧ．ＡＰＶ−００６）と比較した（表２０）。上述のランダム変異誘発ファージディスプレイ法により特定された有益な変異を組み込んだ後、１６１８型抗ＣＤ１３７および１２１０型抗５Ｔ４のＴｍに著しい上昇が認められた。
【表２０】
2020530770.tif 000055
【０２８６】
実施例７：二重特異性ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖタンパク質分子のヒトおよび非ヒト霊長類のＣＤ１３７（＋）細胞株に対する結合性
細胞表面上のＣＤ１３７に対する結合性が可変ドメインのｓｃＦｖ変換後にも変異導入後にも失われないことを確認するため、フローサイトメトリーを用いて、構築された二重特異性ＣＤ１３７×５Ｔ４結合ＡＤＡＰＴＩＲ（商標）型分子のヒトまたはカニクイザル（cynomolgus macaque）のＣＤ１３７を発現する細胞株に対する結合性を定量化した。
【０２８７】
ＣＤ１３７を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞株に対する結合性試験を、標準的なフローサイトメトリーベースの染色法により実施した。ＣＨＯ−Ｋ１細胞（アリゲーター社（Alligator）製）に、ヒトＣＤ１３７またはカニクイザル（cynomolgus macaque）ＣＤ１３７をトランスフェクションした。通例の実験では、９６ウェルプレート内で、１ウェル当たりおよそ１００，０００個の細胞を、２％ＢＳＡおよび２ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する５０μＬの生理食塩水緩衝液中、１００ｎＭ〜０．０５ｎＭの一連の結合性分子により、氷上で３０分間標識した後、洗浄し、ＰＥ標識二次抗体であるヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ（ジャクソン研究所）と共に氷上で２０分間インキュベートした。結合した分子からのシグナルをＬＳＲ−ＩＩ（商標）またはＳｙｍｐｈｏｎｙ  Ａ３フローサイトメーター（ＢＤバイオサイエンス社）を用いて検出し、ＦｌｏｗＪｏフローサイトメトリー解析ソフトウェアで解析した。ダブレット細胞の除去後、生細胞上に結合した分子の蛍光強度中央値（ＭＦＩ−ｍｅｄｉａｎ）を求めた。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６（登録商標）グラフ描画および統計ソフトウェアにおいて、ＥＣ５０値を求めるための非線形回帰分析を実施した。
【０２８８】
図２は、７種類のＡＤＡＰＴＩＲ（商標）型分子（ＡＬＧ．ＡＰＶ−００６、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１７８、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１７９、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１８７、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１９１、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１９６、およびＡＬＧ．ＡＰＶ−１９８）の、ヒトＣＤ１３７発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞株に対する結合曲線を示している。全ての分子が同様の結合レベル（ＥＣ５０値）および飽和レベルを示した。図３は、同じ７種類のコンストラクトのカニクイザルＣＤ１３７発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞株に対する結合曲線を示している。７種類のコンストラクト全てに、カニクイザル標的に対する同様の結合レベルおよび飽和レベルが確認された。図１２は、６種類のＡＤＡＰＴＩＲ（商標）型分子（ＡＬＧ．ＡＰＶ−１７８、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１７９、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１８７、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２０８、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２０９、およびＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０）およびＭｏｒｒｉｓｏｎ型対照ＡＬＧ．ＡＰＶ−００４の、ヒトＣＤ１３７発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞株に対する結合曲線を示している。全ての分子が、０．３〜０．６ｎＭの範囲の同様のＥＣ５０値、および同様の飽和レベルで結合した。
【０２８９】
実施例８：二重特異性ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖタンパク質のヒトおよび非ヒト霊長類の５Ｔ４（＋）細胞株に対する結合性
ｓｃＦｖドメインに変化を導入した後のがん細胞表面上の５Ｔ４の結合性を比較するため、フローサイトメトリーを用いて、構築された二重特異性ＣＤ１３７×５Ｔ４結合ＡＤＡＰＴＩＲ（商標）型分子の５Ｔ４を発現する細胞株に対する結合性を定量化した。
【０２９０】
二重特異性ＣＤ１３７×５Ｔ４分子の５Ｔ４（＋）細胞株に対する結合性：
二重特異性ＡＤＡＰＴＩＲ（商標）型分子（ＡＬＧ．ＡＰＶ−１７８、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１７９、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１８７、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１９６、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２０８、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２０９、およびＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０）の結合特性を比較した。標準的なフローサイトメトリーベースの染色法によって、５Ｔ４を発現する２種類の細胞株、すなわち、ヒト５Ｔ４またはカニクイザル（cynomolgus macaque）５Ｔ４を導入されたＣＨＯ−Ｋ１細胞（アリゲーター社から入手）、および（ヒト）５Ｔ４を発現するＳＫＯＶ−３ヒト卵巣腺癌細胞に対し、結合試験を実施した。標識および洗浄は全て、Ｕ字底９６ウェルプレート内の、０．１％ＢＳＡおよび２ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する生理食塩水緩衝液中で行った。細胞をおよそ１００，０００細胞／ウェルで播種し、５０μＬ体積／ウェルの１００ｎＭ〜０．０５ｎＭの濃度範囲の被験分子と共に、氷上で３０分間インキュベートした。細胞を３回洗浄した後、蛍光標識ポリクローナル二次抗体のＦ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリーズ社（Jackson ImmunoResearch Laboratories））と共にさらに３０分間氷上でインキュベートした。その後、細胞を２回洗浄し、ＢＤ  ＬＳＲＩＩまたはＳｙｍｐｈｏｎｙ  Ａ３フローサイトメーターで試料を取得した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて試料ファイルを解析した。すなわち、生細胞に対するゲーティング（前方散乱ゲーティング対側方散乱ゲーティング）の後、各ウェル内の生細胞集団の平均蛍光強度（ＭＦＩ−ｍｅａｎ）または蛍光強度中央値（ＭＦＩ−ｍｅｄｉａｎ）を算出した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６（登録商標）グラフ描画および統計ソフトウェアにおいて、ＥＣ５０値を求めるための非線形回帰分析を実施した。
【０２９１】
図４は、７種類のＡＤＡＰＴＩＲ（商標）型分子（ＡＬＧ．ＡＰＶ−００６、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１７８、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１７９、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１８７、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１９１、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１９６、およびＡＬＧ．ＡＰＶ−１９８）のヒト５Ｔ４発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞株に対する結合曲線を示している。コンストラクトＡＬＧ．ＡＰＶ−００６は１０ｎＭより大きいＥＣ５０値で結合したが、残りのＡＤＡＰＴＩＲ（商標）型コンストラクト（ＡＬＧ．ＡＰＶ−１７８、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１７９、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１８７、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１９１、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１９６、およびＡＬＧ．ＡＰＶ−１９８）は３〜１０ｎＭの範囲のＥＣ５０値で結合した。結合アッセイをＳＫＯＶ−３細胞に対し実施した場合、コンストラクト間のＥＣ５０値の差異はより明白となった。ＳＫＯＶ−３細胞は、ヒト５Ｔ４発現ＣＨＯ−Ｋ１トランスフェクタントのおよそ１／１０倍の低レベルのヒト５Ｔ４を発現する（図５）。図６は、ＡＬＧ．ＡＰＶ−００６コンストラクト、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１７８コンストラクト、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１７９コンストラクト、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１８７コンストラクト、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１９６コンストラクト、およびＡＬＧ．ＡＰＶ−１９８コンストラクトの、ＳＫＯＶ−３細胞に対する結合曲線を示している。ＡＬＧ．ＡＰＶ−００６コンストラクト、ＡＬＧ．ＡＰＶ−０７８コンストラクト、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１７９コンストラクト、およびＡＬＧ．ＡＰＶ−１８７コンストラクトは、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１９６コンストラクトおよびＡＬＧ．ＡＰＶ−１９８コンストラクトよりも、わずかに低い親和性（高いＥＣ５０値）および高い最大結合レベルで結合した。図７は、ＡＬＧ．ＡＰＶ−００６、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１７８、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１７９、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１８７、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１９１、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１９６、およびＡＬＧ．ＡＰＶ−１９８の、カニクイザル５Ｔ４トランスフェクトＣＨＯ−Ｋ１に対する結合曲線を示している。ヒト５Ｔ４（＋）細胞に対しての結合プロファイルと同様に、ＡＬＧ．ＡＰＶ−００６コンストラクト、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１７８コンストラクト、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１７９コンストラクト、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１８７コンストラクト、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１９１コンストラクト、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１９６コンストラクト、およびＡＬＧ．ＡＰＶ−１９８コンストラクトは、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１９６コンストラクトおよびＡＬＧ．ＡＰＶ−１９８コンストラクトよりも低い親和性および高い最大結合レベルを示した。
【０２９２】
図１３は、６種類のＡＤＡＰＴＩＲ（商標）型分子（ＡＬＧ．ＡＰＶ−１７８、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１７９、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１８７、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２０８、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２０９、およびＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０）およびＭｏｒｒｉｓｏｎ型対照ＡＬＧ．ＡＰＶ−００４の、ヒト５Ｔ４を発現するマウスＣＴ２６細胞（ＡＴＣＣ）に対する結合曲線を示している。これらの細胞は、ＳＫＯＶ−３細胞上で認められるレベルと同等のレベルのヒト５Ｔ４を発現する（図５）。全てのコンストラクトが１〜３ｎＭの範囲のＥＣ５０値で結合した。ＡＬＧ．ＡＰＶ−１７９コンストラクト、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１８７コンストラクト、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２０９コンストラクト、およびＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０コンストラクトは、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１７８およびＡＬＧ．ＡＰＶ−２０８よりも高い最大結合レベルを示した。Ｍｏｒｒｉｓｏｎ型対照分子であるＡＬＧ．ＡＰＶ−００４は、最も低い最大結合レベルを示した。図１４は、ＡＬＧ．ＡＰＶ−００４、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１７８、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１７９、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１８７、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２０８、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２０９、およびＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０の、カニクイザル５Ｔ４トランスフェクトＣＨＯ−Ｋ１に対する結合曲線を示している。全ての分子が、６〜１０ｎＭの範囲の同様のＥＣ５０値、および同様の飽和レベルで結合した。図１５は、ＡＬＧ．ＡＰＶ−００４、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１７８、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１７９、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１８７、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２０８、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２０９、およびＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０の、ＣＤ１３７も５Ｔ４もどちらも発現しないヒト細胞株（ＭＯＬＭ１３細胞、ＡＴＣＣ）に対する結合曲線を示している。いかなる濃度のいずれの分子も結合性を示さなかった。
【０２９３】
実施例９：５Ｔ４−ＣＤ１３７二重特異性抗体の５Ｔ４発現細胞株に対する結合性
様々な受容体密度で細胞上に発現されたヒト５Ｔ４に対するＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０の結合性を測定するための実験を行った。ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０の標的結合性について、内在性レベルの５Ｔ４を有するヒト癌化細胞株および５Ｔ４を産生するようトランスフェクションされた細胞の両方を評価した。
【０２９４】
材料および方法
ビオチン化：
５Ｔ４発現細胞株に結合しているＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０を検出するために、まず、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０をビオチン化した。このビオチン化タンパク質の品質およびその標的への結合性に対する影響を、ＥＬＩＳＡで評価した。
【０２９５】
５Ｔ４発現細胞株のＦＡＣＳ染色およびＦＡＣＳ解析：
ＦＡＣＳ染色に先立ち、受容体密度キット（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｓｉｍｐｌｙ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ、抗ヒトＩｇＧ、バングス・ラボラトリーズ社（Bangs Laboratories, Inc））を用いて、５Ｔ４発現レベルについて、全ての細胞株のキャラクタライゼーションを行った。使用した細胞株に関する情報およびそれら各々の５Ｔ４発現密度を表２１に示す。接着細胞株を供給業者の説明書に従って培養し、トリプシン／ＥＤＴＡを用いて細胞培養フラスコから回収し、ビルケル計算盤でＲ１０培地中で計数し、ＦＡＣＳ用緩衝液（ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ、０．０５％ＮａＮ３）で４×１０６細胞／ｍＬの濃度に希釈した。５０μＬ（０．２０×１０６）の細胞溶液を、９６ウェルＦＡＣＳ染色用プレート（ファルコン社、製品番号３５１１９０）に添加した。細胞を、５０μＬのビオチン化ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０（２×最終濃度）と共に４℃で２０分間インキュベートした。２０μｇ／ｍＬから開始して、１２段階の１／２希釈で０．０１０μｇ／ｍＬまで漸減させる連続希釈を行った抗体を添加した。ＦＡＣＳ用緩衝液で２回洗浄を行った後、細胞を、１００μＬの二次抗体（ストレプトアビジン−ＰＥ、ＢＤ社、製品番号５５４０６１、１／５００希釈）と共に４℃で３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ用緩衝液を用いた２回の洗浄工程の後、細胞を２００μＬの細胞固定（ＢＤ  ＣｅｌｌＦＩＸ  １０×、ＢＤ社、製品番号３４０１８１、ＭＱ  Ｈ２Ｏで希釈）に再懸濁させた。細胞のＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０結合性を、単一細胞に対するゲーティングにより、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ）を用いて解析した。２つの独立した実験のうち１つのＭＦＩ値（二次抗体のみを減算）、並びに２つの実験より得られたプールデータの正規化データおよびＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７の非線形回帰ｌｏｇ（アゴニスト）ｖｓ．正規化反応−可変傾斜を用いて求めて、プロットした。
【表２１】
2020530770.tif 000056
【０２９６】
結果および結論
ＥＬＩＳＡを用いて、ビオチン化ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０の５Ｔ４に対する結合性を測定したところ、非ビオチン化ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０のそれと同様であった（データ未記載）。
【０２９７】
ヒト腫瘍細胞上または５Ｔ４を発現するようにトランスフェクションされた細胞上の内在性レベルで細胞上に発現された５Ｔ４に対するビオチン化ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０の結合性（ＥＣ５０）を評価した。ＭＦＩを用いている図３９に示されるように、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０は、内在性レベルの５Ｔ４を発現しているヒト腫瘍細胞、およびトランスフェクト細胞株の両方に、用量依存的に結合する。
【０２９８】
上記の表２１は、図４０に示される用量反応曲線にプロットされた、２つのプールされた実験からの、正規化ＭＦＩ値（バックグラウンドを減算）から求めた、５Ｔ４陽性ヒト癌化細胞株および５Ｔ４トランスフェクト細胞に対するＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０の結合性（ＥＣ５０）を示している。平均ＥＣ５０値は各種５Ｔ４陽性細胞株で８〜２３ｎＭの範囲をとった。結論として、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０は８〜２３ｎＭの範囲のＥＣ５０で５Ｔ４発現細胞に結合する。
【０２９９】
実施例１０：レポーターアッセイにおける二重特異性ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖタンパク質の作動薬的な働き
ＣＤ１３７の標的依存活性化の誘導における、種々の二重特異性ＣＤ１３７結合性分子の有効性を比較するため、７種類の異なる二重特異性抗ＣＤ１３７×抗５Ｔ４分子を、実施例３に記載した通りのＣＤ１３７レポーターアッセイで比較した。
【０３００】
ＣＤ１３７レポーターアッセイ
ＮＦ−κＢプロモーターの制御下にあるルシフェラーゼレポーター遺伝子を保有するＪｕｒｋａｔ／ＣＤ１３７トランスフェクタント（プロメガ社）を、製造業者のプロトコルに従って培養した。ＮＦ−κＢレポーター発現Ｊｕｒｋａｔ細胞を、ヒト５Ｔ４を発現するヒト初代乳管癌細胞ＨＣＣ１１４３（ＡＴＣＣ）と共に、３０，０００個の標的細胞に対しておよそ１５，０００個のレポーター細胞で、９６ウェルプレート内で培養した。最終濃度が１０ｎＭ〜０．００２ｎＭの範囲をとる各濃度の二重特異性分子を加えた。細胞の培養は、１０％ウシ胎児血清、ピルビン酸ナトリウム、抗生物質、および可欠アミノ酸を添加した、総体積１００μＬのＲＰＭＩ１６４０培地中で行った。プレートを加湿恒温器内、３７℃、５％ＣＯ２で５〜６時間インキュベートした。１００μＬのＢｉｏ−Ｇｌｏｗバッファー（プロメガ社）を各ウェルに添加し、５〜１０分間インキュベートした後、蛍光を測定した。ＭｉｃｒｏＢｅｔａ２  ２４５０  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（パーキンエルマー社）で発光を測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６（登録商標）グラフ描画および統計ソフトウェアにおいて、ＥＣ５０値を求めるための非線形回帰分析を実施した。
【０３０１】
結果
図８では、全てのコンストラクトが５Ｔ４（＋）細胞の存在下で作動薬的な働きを示しているが；５Ｔ４（＋）細胞の非存在下ではレポーター活性は認められなかった（データ未記載）。ＡＬＧ．ＡＰＶ−１７８コンストラクト、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１７９コンストラクト、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１８７コンストラクト、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１９１コンストラクト、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１９６コンストラクト、およびＡＬＧ．ＡＰＶ−１９８コンストラクトは、最適化されていないＡＤＡＰＴＩＲ（商標）型コンストラクトのＡＬＧ．ＡＰＶ−００６、およびＭｏｒｒｉｓｏｎ型対照のＡＬＧ．ＡＰＶ−００４と比べて、より良好な作動薬的な働き（１／６倍以下のより低いＥＣ５０値）を示した。曲線上の全ての点は２連ウェルの平均を表す。Ｙ軸は相対蛍光単位（ＲＬＵ）の値を示す。図１６は、５Ｔ４（＋）細胞（ＨＣＣ１１４３）または５Ｔ４（−）細胞（ＭＯＬＭ１３）の存在下で５時間インキュベートした後の、ＮＦ−κＢレポーター発現Ｊｕｒｋａｔ細胞における、二重特異性コンストラクトの活性を示している。ＡＬＧ．ＡＰＶ−１７８コンストラクト、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１７９コンストラクト、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１８７コンストラクト、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２０８コンストラクト、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２０９コンストラクト、およびＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０コンストラクトは、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ型対照のＡＬＧ．ＡＰＶ−００４と比べて、より良好な作動薬的な働き（１／１０倍のより低いＥＣ５０値）を示した。５Ｔ４（−）細胞（ＭＯＬＭ１３）の存在下ではレポーター活性は確認されなかった。曲線上の全ての点は２連ウェルの平均を表す。Ｙ軸は相対蛍光単位（ＲＬＵ）の値を示す。
【０３０２】
実施例１１：初代Ｔ細胞アッセイにおける二重特異性ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖタンパク質の作動薬的な働き
ＣＤ１３７の標的依存活性化の誘導における、種々の抗ＣＤ１３７×抗５Ｔ４二重特異性分子の作動薬的な働きを、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の培養物において試験した。抗ＣＤ１３７二重特異性コンストラクトの機能を調べるため、初代ＰＭＢＣを抗ＣＤ３抗体で刺激することにより、休止Ｔ細胞上には発現されないＣＤ１３７の発現を増加させた。ＴＣＲおよびＣＤ１３７による初代Ｔ細胞の同時刺激は、Ｔ細胞のサイトカインインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）分泌を増強する。
【０３０３】
ＰＢＭＣのＣＤ１３７刺激：
標準的なフィコール勾配法を用いて、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をヒト血液から単離した。この単離細胞を生理食塩水緩衝液で洗浄した。ＰＢＭＣを、ヒト５Ｔ４発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞と共に、３０，０００個の５Ｔ４（＋）細胞に対しおよそ１２０，０００個のＰＢＭＣで、９６ウェルプレート内で培養した。抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３（イーバイオサイエンス社（eBioscience））を全てのウェルに０．１μｇ／ｍＬの濃度で添加した。細胞を、１％ウシ胎児血清、ピルビン酸ナトリウム、抗生物質、および可欠アミノ酸を添加した、総体積２００μＬのＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２の加湿恒温器内で７２時間インキュベートした。７２時間の時点で、１００μＬの培地を収集した。Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘ（登録商標）キット（ミリポア社）を製造業者の取扱説明書に従って用いて、上清中のＩＦＮ−γレベルを測定した。Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ  Ｒｅａｄｅｒ  ２００  Ｓｙｓｔｅｍ（バイオラド社）でデータ収集を行った。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６（登録商標）グラフ描画および統計ソフトウェアにおいて、ＥＣ５０値を求めるための非線形回帰分析を実施した。
【０３０４】
図９は、ＡＬＧ．ＡＰＶ−００６、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１７８、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１７９、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１８７、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１９６、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１９８、およびＭｏｒｒｉｓｏｎ型対照ＡＬＧ．ＡＰＶ−００４によって誘導されたＩＦＮ−γのレベルを示している。全てのコンストラクトが抗ＣＤ３単独よりも高いレベルのＩＦＮ−γを用量依存的に誘導した。曲線上の全ての点は２連ウェルの平均を表す。図１７は、ヒト５Ｔ４発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞の存在下、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１７８、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１７９、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１８７、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２０８、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２０９、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０、およびＭｏｒｒｉｓｏｎ型対照コンストラクトのＡＬＧ．ＡＰＶ−００４により、７２の時点で初代ＰＢＭＣ培養物において誘導された、ＩＦＮ−γのレベルを示している。全てのコンストラクトが抗ＣＤ３単独よりも高いレベルのＩＦＮ−γを用量依存的に誘導した。曲線上の全ての点は２連ウェルの平均を表す。
【０３０５】
また、５Ｔ４−Ｆｃコンストラクトおよび抗ＣＤ３抗体をコートしたマイクロタイタープレート内で細胞を培養するＣＤ８＋Ｔ細胞アッセイで、抗５Ｔ４×抗ＣＤ１３７二重特異性コンストラクトの機能活性を評価した。
【０３０６】
精製したＴ細胞の５Ｔ４刺激：
ＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ρ：１．０７７ｇ／ｍＬ）（ＧＥヘルスケア社、製品番号１７−１４４０−０２）を用いる密度勾配遠心により、健常ドナーから得られた白血球濃厚液（leukocyte concentrate）（臨床免疫学および輸血医学（Clinical Immunology and Transfusion Medicine）、ラボラトリメディシン・リージョンスコーネ（Labmedicin Region Skane）、ルンド、スウェーデン）から、単離した。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＣＤ８＋Ｔ細胞単離キット（ミルテニー社（Miltenyi）、１３０−０９６−４９５）を用いたネガティブセレクションにより、濃縮した。プレートを、３μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３  ＯＫＴ３クローン（アフィメトリクス・イーバイオサイエンス社（Affymetrix eBioscience）、製品番号１６−００３７−８５）で４℃で一晩コーティングし、洗浄し、５μｇ／ｍＬの５Ｔ４−Ｆｃで３７℃で２時間コーティングした。５Ｔ４−Ｆｃのコーティング後、プレートを洗浄し、１０％ＦＣＳ（熱不活化、ギブコ社、製品番号１０２７０−１０６、ロット番号４１Ｑ９２４８Ｋ）および１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ギブコ社、製品番号１５６３００５６）を含有するＲＰＭＩ（ギブコ社、製品番号６１８７００１０）で最低３０分間ブロッキングした。二重特異性コンストラクトを、１０％ＦＣＳおよび１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓを含有するＲＰＭＩで希釈して、プレートに添加し、３０分後、ＣＤ８＋Ｔ細胞（０．０７×１０６細胞／ウェル）を添加した。アッセイプレートを３７℃で７２時間インキュベートした後、培養上清を回収した。上清中のＩＦＮ−γレベルをＥＬＩＳＡ（ＢＤ  ＯｐｔｉＥＩＡ、製品番号５５５１４２）で測定した。この実験を、合計３人のドナー用いて２回繰り返した。最初の実験の結果を図１１Ａに示す。５Ｔ４−Ｆｃでコーティングされていないプレート内で細胞および二重特異性コンストラクトが培養された対照試料の結果を、図１１Ｂに示す。
【０３０７】
図１１Ａは、５Ｔ４存在下における培養上清中のＩＦＮ−γレベルの増加によって示される、Ｍｏｒｒｉｓｏｎフォーマット二重特異性コンストラクト（ＡＬＧ．ＡＰＶ−００４）と比較した場合の、ＡＤＡＰＴＩＲ（商標）フォーマット抗５Ｔ４×抗ＣＤ１３７二重特異性コンストラクト（ＡＬＧ．ＡＰＶ−１７８、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１７９、ＡＬＧ．ＡＰＶ−１９６、およびＡＬＧ．ＡＰＶ−１９８）の機能活性の増大を示している。実際には、ＡＤＡＰＴＩＲ（商標）フォーマットコンストラクトは、Ｍｏｒｒｉｓｏｎフォーマットコンストラクトによって誘導されたものよりも２〜４．５倍高いＩＦＮ−γレベルを誘導した（図１１Ａ）。
【０３０８】
実施例１２：インビボにおける５Ｔ４陽性腫瘍内の二重特異性抗体の抗原依存的局在
５Ｔ４および４−１ＢＢを標的とする二重特異性コンストラクトの５Ｔ４陽性Ｂ１６−５Ｔ４腫瘍への抗原依存的局在を、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて評価した。
【０３０９】
材料および方法
マウス：
実験には、フランスのジャンヴィエ社（Janvier）から入手した８週齢雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスを用いた。全ての実験は、マルメ／ルンド自治体の倫理委員会の承認の下で実施した。
【０３１０】
二重特異性コンストラクト：
２種類の最適化された、５Ｔ４およびＣＤ１３７を標的とするＡＤＡＰＴＩＲ（商標）フォーマット二重特異性コンストラクト、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２０９およびＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０を使用した。Ｍｏｒｒｉｓｏｎフォーマットの二重特異性コンストラクトであるＡＬＧ．ＡＰＶ−００４を、陽性対照として用いた。溶剤投与を陰性対照として用いた。
【０３１１】
細胞：
Ｂ１６．Ｆ１０  ＷＴ（Ｂ１６）細胞をＡＴＣＣから入手して、推奨に従って培養した。ヒト５Ｔ４を発現するＢ１６細胞（以下、Ｂ１６−５Ｔ４）をＰｅｔｅｒ  Ｓｔｅｒｎ教授から入手して、１．２ｍｇ／ｍＬのＧ４１８セレクション用培地下で増殖させた。
【０３１２】
方法：
二重特異性コンストラクトの抗原依存的局在においては、各マウスの後側腹部／背部の両脇に１種類の５Ｔ４陰性腫瘍および１種類の５Ｔ４陽性腫瘍がそれぞれ移植された、Ｂ１６メラノーマ双腫瘍モデルを用いた。０日目、対数増殖期にあるこの癌化細胞株を皮下注射した（１００μＬ中１×１０５個の細胞）。６日目および１３日目にコンストラクト（１００μｇ）を腹腔内処置し、１４日目（最後の処置の２４時間後）にマウスを屠殺した。
【０３１３】
ＦＡＣＳ解析：
フローサイトメトリー解析用の腫瘍を、機械的消化、並びにＬｉｂｅｒａｓｅ  ＴＬおよびデオキシリボヌクレアーゼＩ（ロシュ社）を用いる酵素的消化にかけ、７０μｍストレーナーに通した。得られた単細胞浮遊液をＦＡＣＳ解析用に染色した。簡潔に説明すると、マウスＩｇＧまたはＦｃのブロッキングにより、前記コンストラクトの非特異的結合をブロックした。Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｓｔａｉｎ  ４５０（モレキュラープローブス社）を製造業者の取扱説明書に従って用いて、死細胞を除去した。前記２種類のＡＤＡＰＴＩＲ（商標）型二重特異性コンストラクトまたは前記対照用コンストラクトの腫瘍細胞への結合を、ヤギ抗ヒトＦｃ−ＰＥ二次抗体（ジャクソン・イムノリサーチ社）を用いて分析した。あるいは、ビオチン化４−１ＢＢ抗原に続いてストレプトアビジン−ＰＥ／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５を用いることにより、二重特異性コンストラクトの検出を行った。試料の分析はＢＤ  ＦＡＣＳＶｅｒｓｅで行い、データ解析にはＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いた。統計解析はマンホイットニーのノンパラメトリック両側ｔ検定およびＧｒａｐｈＰａｄ  ｐｒｉｓｍプログラムを用いて行った。
【０３１４】
免疫組織化学：
免疫組織化学用の腫瘍を、ドライアイス上のイソプロパノール中で急速凍結した。凍結切片（８ｍｍ）を、ウサギ抗ヒト５Ｔ４（アブカム社）またはウサギ抗ヒトＦｃ（ジャクソン・イムノリサーチ社）に続いて抗ウサギＢｒｉｇｈｔｖｉｓｉｏｎ−ＨＲＰ（イムノロジック社（Immunologic））を用いて５Ｔ４発現について染色し、ＤＡＰＩ染色した。免疫組織化学染色の評価は以下の通りに行った；陰性（０）、弱い染色（１＋）、中程度の染色（２＋）、または強い染色（３＋）。
【０３１５】
結果
ＡＤＡＰＴＩＲ（商標）フォーマットの二重特異性コンストラクト、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２０９およびＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０の両方、並びに陽性対照のＡＬＧ．ＡＰＶ−００４が、５Ｔ４発現Ｂ１６腫瘍に局在化したが、５Ｔ４陰性腫瘍（Ｂ１６．Ｆ１０）には局在化しなかった。このことは、フローサイトメトリー（図１８Ａおよび図１８Ｂ）および免疫組織化学（図１９Ａおよび図１９Ｂ）の両方によって示された。
【０３１６】
フローサイトメトリーで測定したところ、二重特異性コンストラクト（ＡＬＧ．ＡＰＶ−２０９、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０）および陽性対照（ＡＬＧ．ＡＰＶ−００４）の両方が、溶剤陰性対照と比較して、統計的に有意な、抗原陽性腫瘍に対する５Ｔ４依存的局在を示した（図１８Ａ）。検出用のビオチン化４−１ＢＢを用いた場合にも、５Ｔ４発現腫瘍に対する結合を検出することができ（図１８Ｂ）、これにより、二重特異性分子がインンタクトであることが確認された。
【０３１７】
免疫組織化学により、局在のさらなる証明を行った（図１９Ａおよび図１９Ｂ、並びに表２２）。これらの二重特異性抗体は５Ｔ４陽性腫瘍に強く結合したが（Ｂ１６−５Ｔ４、図１９Ａ）、５Ｔ４陰性腫瘍には結合しなかった（Ｂ１６．Ｆ１０、図１９Ｂ）。
【表２２】
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【０３１８】
実施例１３：ヒトＣＤ８  Ｔ細胞および５Ｔ４−ＣＴ２６腫瘍細胞を用いたＩＦＮγ放出アッセイにおける５Ｔ４−ＣＤ１３７二重特異性抗体のインビトロ活性
ビーズ上にコーティングされたＣＤ３抗体で刺激したＣＤ８  Ｔ細胞を様々なレベルの５Ｔ４を発現するＣＴ２６腫瘍細胞とプレート内で共培養するＣＤ８  Ｔ細胞アッセイにおいて、５Ｔ４−ＣＤ１３７二重特異性抗体ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０の機能活性を評価した。
【０３１９】
マウス結腸癌細胞株のＣＴ２６腫瘍細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２６３８）を、ヒト５Ｔ４を発現するように予めトランスフェクトしておき、フローサイトメトリーを用いてシングルセルソーティングを行って、高レベルまたは低レベルのヒト５Ｔ４を発現する単一細胞クローンを作製した（受容体密度については、表２３を参照）。５Ｔ４−ＣＴ２６腫瘍細胞または未トランスフェクトの野生型細胞（野生型ＣＴ２６）に、ＵＶＢ  Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ（アナリティクイエナ社、ランプ：２５４ｎｍ）を用いてＵＶ照射した。プレートの照射後、細胞を培地で１回洗浄し、新しい増殖培地Ｒ１０（１０％熱不活化ＦＢＳ（ハイクローン社、製品番号ＳＶ３０１６０、ロット番号ＲＢ３５９４４）および１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ギブコ社、製品番号１５６３００５６）を含有するＲＰＭＩ（ギブコ社、製品番号６１８７００１０））に、４×１０６細胞／ｍｌの濃度に再懸濁した。５０μＬ（２×１０５細胞／ウェル）の、ＵＶ照射された、ヒト５Ｔ４高発現ＣＴ２６細胞（CT26-h5T4high cell）、ヒト５Ｔ４低発現ＣＴ２６細胞（CT26-h5T4low cell）、または野生型ＣＴ２６細胞(CT26 wt cell)を、ＴＣ処理アッセイプレート（エッペンドルフ社（Eppendorf）、製品番号００３０  ７３０．１１９）に播種し、３７℃で一晩インキュベートした。
【表２３】
2020530770.tif 000058
【０３２０】
ＣＴ２６細胞に紫外線照射した翌日、ヒトＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ＧＥヘルスケア社、製品番号１７−１４４０−０２）を用いる密度勾配遠心により、健常ドナーから得られた白血球濃厚液（臨床免疫学および輸血医学（Clinical Immunology and Transfusion Medicine）、ラボラトリメディシン・リージョンスコーネ（Labmedicin Region Skane）、ルンド、スウェーデン）から、単離した。ＣＤ８＋細胞を、ＣＤ８＋Ｔ細胞単離キット（ミルテニー社、１３０−０９６−４９５）を用いたネガティブセレクションにより、濃縮した。
【０３２１】
二重特異性抗体ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０をＲ１０培地で連続希釈し、５０μＬをアッセイプレートの各ウェルに添加し、３７℃で３０分間インキュベートした後、ＣＤ８＋Ｔ細胞とビーズの比が１：１となるように、５０μＬの抗ＣＤ３ビーズ（４×１０８／ｍＬの抗ＣＤ３抗体クローン：ＯＫＴ−３、アフィメトリクス・イーバイオサイエンス社、製品番号１６−００３７−８５、ビーズ上にコーティング、２×１０６／ｍＬに希釈）を添加し、その後、５０μＬのエフェクター細胞（濃縮ＣＤ８＋細胞、２×１０６／ｍＬまたは１×１０５／ウェル）を添加した。アッセイプレートを３７℃で７２時間インキュベートし、培養上清を回収した。上清中のＩＦＮγレベルをＥＬＩＳＡ（ＢＤ  ＯｐｔｉＥＩＡ、製品番号５５５１４２）で測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７を用いて、非線形回帰ｌｏｇ（アゴニスト）ｖｓ．正規化反応（可変傾斜）により、ＥＣ５０を求めた。培養上清中のＩＦＮγ産生の２つの最高値の平均を算出することにより、ＴＯＰ値（最大機能効果）を求めた。合計１２人のドナーを含んで、実験は５回行った。
【０３２２】
様々なレベルの５Ｔ４を発現するＣＴ２６細胞とプレート内で共培養されたヒトＣＤ８  Ｔ細胞（エフェクター細胞）を用いて、ＣＤ１３７−５Ｔ４二重特異性抗体ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０の機能効果（５Ｔ４への結合を介したＣＤ１３７の架橋について）を試験した。図２０に示されるように、二重特異性ＣＤ１３７−５Ｔ４抗体ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０は、高レベルの５Ｔ４を発現するＣＴ２６細胞（ＣＴ２６−ｈ５Ｔ４ｈｉｇｈ）または低レベルの５Ｔ４を発現するＣＴ２６細胞（ＣＴ２６−ｈ５Ｔ４ｌｏｗ）の存在下で、用量依存的に、強力なＴ細胞活性化を誘導することが、ＩＦＮγ放出により測定された。ＩＦＮγ放出はＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０の正規化データとして図２０に示されており；５つのプールされた実験からの１２人のドナーの平均値が示されている。
【０３２３】
表２４は、ヒト５Ｔ４発現ＣＴ２６細胞の存在下でのＣＤ８  Ｔ細胞アッセイにおける、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０のＥＣ５０を示している。５つのプールされた実験からの１２人のドナーの、Ｌｏｇ（アゴニスト）ｖｓ．正規化反応（可変傾斜）平均値および９５％信頼区間が、表２４に示されている。図２１Ａおよび図２１Ｂから分かるように、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０の最大機能効果がＣＴ２６細胞上の５Ｔ４の発現レベルに依存的であることが、ＣＴ２６−ｈ５Ｔ４ｈｉｇｈ細胞との共培養と比較して、ＣＴ２６−ｈ５Ｔ４ｌｏｗ細胞との共培養において、最大ＩＦＮγ放出がわずかにより少ない分泌となったこと（ＣＴ２６−ｈ５Ｔ４ｌｏｗの最大効果はＣＴ２６−ｈ５Ｔ４ｈｉｇｈの８２％であった）から示された。ＣＴ２６−ｗｔ細胞を用いた場合、５Ｔ４誘導性の架橋が起こらないため、Ｔ細胞の活性はゼロであるか非常に低い（ＣＴ２６−ｈ５Ｔ４ｈｉｇｈの最大効果の７％）。最大ＩＦＮγ放出を、図２１に、絶対値（ｎｇ／ｍＬ）として（図２１Ａ）、またはＣＴ２６−ｈ５Ｔ４ｈｉｇｈに対しての正規化値として（図２１Ｂ）、表す。５つのプール実験からの１２人のドナーの平均およびＳＥＭ値を示す。
【表２４】
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【０３２４】
実施例１４：ＣＤ３刺激したヒトおよびカニクイザルの初代ＣＤ８  Ｔ細胞上のＣＤ１３７に対する５Ｔ４−ＣＤ１３７二重特異性抗体の結合性
活性化初代ＣＤ８  Ｔ細胞（ＣＤ３刺激ＰＢＭＣからゲーティング）上に発現したヒトＣＤ１３７およびカニクイザルＣＤ１３７に対するＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０の相対的な結合性を比較するための試験を行った。
【０３２５】
材料および方法
初代ヒト細胞および初代カニクイザル細胞に結合しているＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０をＦＡＣＳで検出するために、まず、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０をビオチン化した。このビオチン化タンパク質の品質をＨＰＣＬで評価し、その標的への結合性に対する影響をＥＬＩＳＡで評価した。ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０と同じフレームワーク（生殖細胞系列のＣＤＲ）を有するＡＤＡＰＴＩＲフォーマットの抗体であるＡＮＣ０１７を、陰性対照として用い、またビオチン化も行った。
【０３２６】
ヒトＰＢＭＣの単離および刺激：
ヒトＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ＧＥヘルスケア社、製品番号１７−１４４０−０２）を用いる密度勾配遠心により、３人の健常ドナーから得られた白血球濃厚液（臨床免疫学および輸血医学（Clinical Immunology and Transfusion Medicine）、ラボラトリメディシン・リージョンスコーネ（Labmedicin Region Skane）、ルンド、スウェーデン）から、単離した。非組織処理（non-tissue treated）９６ウェルプレート（ヌンク社、製品番号２６８２００）を、１０μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３、ＯＫＴ３クローン（アフィメトリクス・イーバイオサイエンス社、製品番号１６−００３７−８５）で、４℃で一晩プレコーティングした。翌日、プレートをＰＢＳで洗浄し、Ｒ１０（１０％熱不活化ＦＢＳ（ハイクローン社、製品番号ＳＶ３０１６０、ロット番号ＲＢ３５９４４）および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ギブコ社、製品番号１５６３００５６）を含有するＲＰＭＩ（ギブコ社、製品番号６１８７００１０））で希釈したヒトＰＢＭＣを、０．２×１０６細胞／ウェルの濃度で加え、ＣＤ３刺激有りまたは無しのウェル内で３７℃で４８時間インキュベートした。
【０３２７】
カニクイザルＰＢＭＣの単離および刺激：
カニクイザルＰＢＭＣを、フランスのシラベ社（Silabe）から入手した３匹の異なるドナー由来の、２０ｍＬのカニクイザル血液から、Ｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅ−Ｍａｍｍａｌ（セダレーン・ラボラトリーズ社（Cedarlane labs））を製造業者の説明書に従って用いる密度勾配遠心によって、単離した。非組織処理（non-tissue treated）９６ウェルプレートを、３μｇ／ｍＬの抗サルＣＤ３、ＦＮ−１８クローン（インビトロジェン社、製品番号ＡＰＳ０３０１）で、４℃で一晩プレコーティングした。その後、カニクイザルＰＢＭＣを上述のヒトＰＢＭＣと同様に刺激した。
【０３２８】
ＣＤ８  Ｔ細胞のＦＡＣＳ染色およびＦＡＣＳ解析：
ＣＤ３有りまたは無しで４８時間インキュベートした後、ヒトＰＢＭＣおよびカニクイザルＰＢＭＣを回収し、プールし、再度計数し、ＦＡＣＳ用緩衝液（ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ、０．０５％ＮａＮ３）で５×１０６細胞／ｍＬの濃度に希釈した。５０μＬ（０．２５×１０６個の細胞）の細胞液を、９６ウェルＦＡＣＳ染色用プレート（ファルコン社、製品番号３５１１９０）に添加した。Ｂｅｒｉｇｌｏｂｉｎ（ヒトＩｇＧ、２００μｇ／ｍＬ）を用いたＦｃブロッキングを室温で１０分間行った後、細胞をＦＡＣＳ用緩衝液で洗浄し、１００μＬのビオチン化ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０または陰性対照と共に４℃で１時間インキュベートした。５μｇ／ｍＬから開始して１２段階の１／３希釈で０．０００３μｇ／ｍＬまで漸減させる希釈系列（実験１）、または１μｇ／ｍＬから開始して１２段階の１／２希釈で０．０００５μｇ／ｍＬまで漸減させる希釈系列（実験２）で、抗体を添加した。ＦＡＣＳ用緩衝液で２回洗浄した後、細胞を、５０μＬの二次抗体（ストレプトアビジン−ＡＰＣ、ＢＤ社、製品番号５５４０６７）、および５０μＬの、種々のＴ細胞表面マーカーに対する蛍光結合抗体（ＣＤ４−ＦＩＴＣ、製品番号５５０６２８、ＣＤ３−ＰＥＣｙ７、製品番号５５７７４９、およびＣＤ８−ＡＰＣ−Ｈ７、製品番号５６０１７９７、ＢＤ社）と一緒に、４℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄後、細胞を、５０μＬのＦｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｓｔａｉｎ  ＢＶ５１０（非生細胞をゲーティングにより除去するため）で４℃で１５分間染色し、再度洗浄した後、１３０μＬの細胞固定液（ＢＤ  ＣｅｌｌＦＩＸ  １０ｘ、ＢＤ社、製品番号３４０１８１、ＭＱ  Ｈ２Ｏで希釈）で再懸濁した。ＣＤ３およびＣＤ８を発現している単一生細胞に対するゲーティングによるフローサイトメトリーを用いて、細胞のＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０結合性を解析した。２つの独立した実験からのＭＦＩ値（ＦＭＯ減算）、並びに２つの実験からの正規化されたプールデータおよびＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７の、非線形回帰ｌｏｇ（アゴニスト）ｖｓ．正規化反応−可変傾斜（ｎ＝６ドナー／群）を用いて求めて、プロットした。
【０３２９】
結果
ＥＬＩＳＡ試験において、ビオチン化ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０のＣＤ１３７に対する結合性は、非ビオチン化ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０のそれと同様であった（０．６ｎＭと０．７ｎＭ）。ビオチン化ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０の、ＣＤ３刺激ＰＢＭＣ由来の活性化初代ヒトＣＤ８  Ｔ細胞および活性化初代カニクイザルＣＤ８  Ｔ細胞上に発現されたその免疫調節性標的ＣＤ１３７に対する結合性（ＥＣ５０）を評価し、非刺激細胞との比較に加え、２種間の比較も行った。図２２Ａ、図２２Ｂ、および図２２Ｃ、並びに表２５において全てのＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞のＭＦＩを用いて示されているように、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０は、ヒトＣＤ８  Ｔ細胞およびカニクイザルＣＤ８  Ｔ細胞の両方に用量依存的に結合するが、非刺激細胞には結合しない。ＣＤ３で刺激された、または未刺激のヒトＰＢＭＣ細胞またはカニクイザルＰＢＭＣ細胞において、陰性対照ＡＮＣ１０７に対する結合は、低／検出不可であった。ＣＤ３刺激カニクイザルＰＢＭＣに結合したＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０の最大量（ＭＦＩ）が、ヒトＰＢＭＣと比較して高かったが、これは、最も可能性が高いのは、ＣＤ１３７を発現するＣＤ３刺激カニクイザルＰＢＭＣの割合が高いためであり、あるいは、カニクイザルＣＤ８  Ｔ細胞上のＣＤ１３７発現が通常高いためである。カニクイザル細胞がヒト細胞と比較してＣＤ３刺激に対しより感受性であり、それ故にＣＤ１３７をより多く発現増加したのかどうかは、これらの細胞が抗ＣＤ３試薬の種間交差反応性の欠如により異なる抗ＣＤ３クローンで刺激されたため、不明である。
【表２５】
2020530770.tif 000060
【０３３０】
また、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０の結合性を、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０が結合しているＣＤ８  Ｔ細胞の割合を調べることで評価した。ヒトＣＤ８  Ｔ細胞と比較して、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０が結合しているカニクイザルＣＤ８  Ｔ細胞の割合はより大きかった（カニクイザル細胞の場合は７１〜９６％、ヒト細胞の場合は６５〜７６％、図２３Ａ、図２３Ｂ、および図２３Ｃを参照）。また、ＣＤ１３７陽性細胞のＭＦＩに基づいて結合性ＥＣ５０値を算出した結果、ヒトＣＤ１３７への結合の場合のＥＣ５０は０．１７ｎＭであり、カニクイザルＣＤ１３７への結合の場合のＥＣ５０は０．２０ｎＭであった。
【０３３１】
まとめると、本試験の結果から、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０が、ヒトおよびカニクイザルのＣＤ３刺激初代ＣＤ８  Ｔ細胞に同様のＥＣ５０（０．２ｎＭ）で結合するが、非刺激細胞には結合しないことが示された。
【０３３２】
実施例１５：５Ｔ４存在下でヒトＣＤ８  Ｔ細胞またはカニクイザルＣＤ８  Ｔ細胞を用いるＩＦＮγ放出アッセイにおける５Ｔ４−ＣＤ１３７二重特異性抗体のインビトロ活性
プレートに固定された５Ｔ４の存在下でヒトまたはカニクイザルのＣＤ８  Ｔ細胞を用いるアゴニストアッセイ（agonist assay）において、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０の機能活性を比較し、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０のＥＣ５０を求めるための試験を行った。
【０３３３】
材料および方法
ＣＤ８  Ｔ細胞に、プレート固定ＣＤ３抗体による準最適刺激を与え、プレート固定５Ｔ４−ＦｃへのＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０結合を介したＣＤ１３７の架橋により活性化させた。細胞培養上清中のＩＦＮγ放出を求めることにより、ＣＤ８  Ｔ細胞の活性化を測定した。
【０３３４】
ヒトＣＤ８  Ｔ細胞の単離およびアッセイ設定：
ヒトＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ＧＥヘルスケア社、製品番号１７−１４４０−０２）を用いる密度勾配遠心により、健常ドナーから得られた白血球濃厚液（臨床免疫学および輸血医学（Clinical Immunology and Transfusion Medicine）、ラボラトリメディシン・リージョンスコーネ（Labmedicin Region Skane）、ルンド、スウェーデン）から、単離した。ＣＤ８＋細胞を、ＣＤ８＋Ｔ細胞単離キット（ミルテニー社、製品番号１３０−０９６−４９５）を用いたネガティブセレクションにより、濃縮した。非組織処理（non-tissue treated）９６ウェルアッセイプレートを、３μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ−３クローン、アフィメトリクス・イーバイオサイエンス社、製品番号１６−００３７−８５）で、４℃で一晩コーティングした。翌日、プレートをＰＢＳで洗浄し、５μｇ／ｍＬの５Ｔ４−Ｆｃで３７℃で２時間コーティングした。５Ｔ４−Ｆｃの固定後、アッセイプレートをＰＢＳで洗浄し、Ｒ１０（１０％熱不活化ＦＢＳ（ハイクローン社、製品番号ＳＶ３０１６０、ロット番号ＲＢ３５９４４）および１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ギブコ社、製品番号１５６３００５６）を含有するＲＰＭＩ（ギブコ社、製品番号６１８７００１０））で最低３０分間ブロッキングした。ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０をＲ１０で連続希釈し、５０μＬをアッセイプレートに３連で添加して、３０分後、５０μＬのエフェクター細胞（濃縮ＣＤ８  Ｔ細胞、１．４×１０６細胞／ｍＬまたは０．０７×１０５細胞／ウェル）を添加した。アッセイプレートを３７℃で７２時間インキュベートし、培養上清を回収した。上清中のＩＦＮγレベルをＥＬＩＳＡ（ＢＤ  ＯｐｔｉＥＩＡ、製品番号５５５１４２）で測定した。合計８人のドナーを含んで、実験は４回行った。
【０３３５】
カニクイザルＣＤ８  Ｔ細胞の単離およびアッセイ設定：
フランスのシラベ社から入手したカニクイザル（カニクイザル（Macaca fascicularis）、成体雄、３〜１５歳齢）の全血を用いた。製造業者のプロトコルに従って赤血球溶解（ＢＤ  Ｐｈａｒｍａ  ｌｙｓｅ、ＢＤバイオサイエンス社、製品番号５５５８９９）させることにより、赤血球を除去した。ＣＤ８＋細胞を、ＣＤ８  ＭｉｃｒｏＢｅａｄキット（ミルテニーバイオテク社、製品番号１３０−０９１−１１２）を用いたポジティブセレクションにより、濃縮した。プレートを、１μｇ／ｍＬの抗サルＣＤ３  ＦＮ−１８クローン（インビトロジェン社、製品番号ＡＰＳ０３０１）で４℃で一晩コーティングし、洗浄し、５μｇ／ｍＬの５Ｔ４−Ｆｃで３７℃で２時間コーティングした。５Ｔ４−Ｆｃコーティングの後、プレートを洗浄し、Ｒ１０で最低３０分間ブロッキングした。ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０をＲ１０で希釈し、５０μＬをプレートに３連で添加して、３０分後、５０μＬのＣＤ８  Ｔ細胞（０．０７×１０６細胞／ウェル）を添加した。アッセイプレートを３７℃で７２時間インキュベートし、培養上清を回収した。上清中のＩＦＮγレベルを、ＥＬＩＳＡ（Ｍｏｎｋｅｙ  ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＡ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｋｉｔ、マブテック社（MABTECH）、製品番号３４２１Ｍ−１Ｈ−２０）によって測定した。合計８人のドナーを含んで、実験は３回行った。ヒトドナーおよびカニクイザルドナーのそれぞれから得られたＩＦＮγレベルを正規化し、平均値を算出した。８人（匹）全てのヒトドナーまたはカニクイザルドナーから得られた正規化されたＩＦＮγレベルの平均値をプールし、ＧｒａｐｈＰａｄ７を用いた非線形回帰（ｌｏｇアゴニストｖｓ正規化反応、可変傾斜）によりＥＣ５０を求めた。
【０３３６】
結果
図２４および表２６に示されるように、ヒトＣＤ８  Ｔ細胞アッセイにおいて、二重特異性ＣＤ１３７−５Ｔ４抗体ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０は、０．２ｎＭのＥＣ５０という高い機能活性を有した。４つの実験および合計８人のドナーから正規化されたＩＦＮγレベルをプールし、ＧｒａｐｈＰａｄ７を用いた非線形回帰によりＥＣ５０を求めた。平均値およびＳＥＭを図２４に示す。１つの代表的実験の２人のドナーから得られた絶対平均ＩＦＮγ値を図２５Ａおよび図２５Ｂに示す。抗ＣＤ３試薬の最高値は、バックグラウンドのＩＦＮγレベルと同様、１つの実験の中ではドナーによって異なる。ドナー間でばらつきが認められたため、データを正規化した後に、プールされたデータセットの解析を行った。ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０のＣＤ８  Ｔ細胞活性化を、５Ｔ４−Ｆｃの存在下および非存在下の両方で評価し、５Ｔ４架橋依存性を検証した。その結果、二重特異性ＣＤ１３７−５Ｔ４抗体ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０が、５Ｔ４による架橋結合が生じる場合に、ＩＦＮγ放出により測定される強力なＴ細胞活性化を誘導するが；５Ｔ４の非存在下ではＴ細胞活性は生じないことが示された（図２５Ａおよび図２５Ｂ）。
【０３３７】
カニクイザルＣＤ８  Ｔ細胞を用いた場合のＣＤ１３７−５Ｔ４二重特異性抗体ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０の機能効果の評価も行った。３つの実験および合計８匹のドナーからプールされたデータに基づいて、カニクイザルＣＤ８  Ｔ細胞アッセイにおけるＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０のＥＣ５０を求めたところ、０．４ｎＭであった（図２６および表２６）。また、１つの代表的実験の３人のドナーから得られた絶対平均値を図２７Ａ、図２７Ｂ、および図２７Ｃに示す。ヒトを背景とする場合と同様、絶対値（最高値およびバックグラウンドＩＦＮγレベルを含む）は１つの実験の中の個々のカニクイザルドナー間でも異なる。従って、データを正規化し、その後にプールされたデータセットのＥＣ５０解析を行った。ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０のＣＤ８  Ｔ細胞活性化を、５Ｔ４−Ｆｃの存在下および非存在下の両方で評価し、５Ｔ４誘導性ＣＤ１３７架橋の依存性を検証した。図２７Ａ〜図２７Ｃに示されるように、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０の作動薬的な作用は、ヒト背景における所見と同様、カニクイザルＣＤ８  Ｔ細胞アッセイにおいても５Ｔ４依存的である。図２７Ａ、図２７Ｂ、および図２７Ｃはそれぞれ、１つの代表的実験から得られた３匹の個々のドナーのＩＦＮγの絶対平均値およびＳＥＭ値を示している。陰性対照として、５Ｔ４無しのウェルを含ませた。
【表２６】
2020530770.tif 000061
【０３３８】
本試験から、機能的ＣＤ８  Ｔ細胞活性化アッセイにおけるＣＤ１３７−５Ｔ４二重特異性抗体ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０のＥＣ５０は、ヒト（０．２ｎＭ）およびカニクイザル（０．４ｎＭ）の間で同等であることが示された。ヒトＣＤ８  Ｔ細胞アッセイおよびカニクイザルＣＤ８  Ｔ細胞アッセイの両方で、Ｔ細胞活性化は、５Ｔ４に依存的なＣＤ１３７の架橋を介してもたらされた。
【０３３９】
実施例１６：Ｔ細胞ＩＦＮ−γ分泌アッセイおよびＴ細胞増殖アッセイにおける５Ｔ４−ＣＤ１３７二重特異性抗体ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０のインビトロ活性
ＣＤ１３７の標的依存活性化の誘導における５Ｔ４−ＣＤ１３７二重特異性分子ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０の作動薬的な働きを、未分離の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を用いたＴ細胞ＩＦＮ−γ分泌アッセイおよびＴ細胞増殖アッセイで評価した。抗ＣＤ１３７二重特異性コンストラクトの機能を調べるため、初代ＰＭＢＣを抗ＣＤ３抗体で刺激することにより、休止Ｔ細胞上には発現されないか低レベルにしか発現されないＣＤ１３７の発現を増加させた。ＴＣＲおよびＣＤ１３７による初代Ｔ細胞の同時刺激は、Ｔ細胞のサイトカインインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）分泌を増強する。
【０３４０】
方法
ＩＦＮ−γ分泌アッセイ：
標準的なフィコール勾配法を用いて、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を健常ヒト血液から単離した。この単離細胞を生理食塩水緩衝液で洗浄して血小板を除去した。ＰＢＭＣを、ヒト５Ｔ４または空ベクターをトランスフェクションされたＣＨＯ−Ｋ１細胞と共に、およそ１２０，０００個のＰＢＭＣ対３０，０００個のＣＨＯ−Ｋ１細胞の比で、９６ウェルプレート内で培養した。抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３（イーバイオサイエンス社）を全てのウェルに１μｇ／ｍＬの濃度で添加した。細胞を、１０％ウシ胎児血清、ピルビン酸ナトリウム、抗生物質、および可欠アミノ酸を添加した、総体積２００μＬのＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２の加湿恒温器内で７２時間インキュベートした。ＣＤ１３７の発現上昇を誘導するために準最適濃度の抗ＣＤ３抗体によるプライミングでＰＢＭＣ培養物を刺激した７２時間後に、１００μＬの培地を回収した。Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘ（登録商標）キット（ミリポア社）を製造業者の取扱説明書に従って用いて、上清中のＩＦＮ−γレベルを測定した。Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ  Ｒｅａｄｅｒ  ２００  Ｓｙｓｔｅｍ（バイオラド社）でデータ収集を行った。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６（登録商標）グラフ描画および統計ソフトウェアにおいて、ＥＣ５０値を求めるための非線形回帰分析を実施した。
【０３４１】
Ｔ細胞増殖アッセイ：
標準的なフィコール勾配法を用いて、ＰＢＭＣを健常ヒト血液から単離した。単離後、細胞を生理食塩水緩衝液で洗浄して血小板を除去した。ＰＢＭＣをＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）Ｖｉｏｌｅｔ（サーモフィッシャー社）で標識し、洗浄し、ヒト５Ｔ４をトランスフェクションされた被照射ＣＨＯ−Ｋ１細胞と共に、およそ１２０，０００個のＰＢＭＣ対３０，０００個のＣＨＯ−Ｋ１細胞の比で、９６ウェルプレート内で培養した。ＣＨＯ−Ｋ１細胞は、照射し（Ｘ線照射装置Ｃｅｌｌ  Ｒａｄ、ファキシトロン・バイオプティクス社（Faxitron Bioptics, LLC））、培地で洗浄した後に、ＰＢＭＣと播種した。抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３（イーバイオサイエンス社）を全てのウェルに５ｎｇ／ｍＬの濃度で添加した。細胞を、１０％ヒト血清（シグマ社）、ピルビン酸ナトリウム、抗生物質、および可欠アミノ酸を添加した、総体積２００μＬのＲＰＭＩ１６４０培地（ギブコ社）中で培養した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２の加湿恒温器内で９６時間インキュベートした。
【０３４２】
上清を除去し、細胞を、同一アッセイプレート内で、２％ＢＳＡおよび２ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ緩衝液中の抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体、および抗ＣＤ５抗体で、氷上で３０分間、標識した。７ＡＡＤ（シグマ社）の添加により、分析内での死細胞の除外を可能とした。洗浄後、細胞を１２０μＬ／ウェルに再懸濁し、７０μＬ／ウェル体積を各ウェルから回収し、フローサイトメーター（ＬＳＲ−ＩＩ（商標）、ＢＤバイオサイエンス社）で解析した。データ解析を、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアを用いて、少なくとも１回の細胞分裂を経たＣＤ８＋生Ｔ細胞イベント（ＣＤ４−ＣＤ８＋ＣＤ５＋、７ＡＡＤ−）の％算出、または、ＣＤ８＋生Ｔ細胞イベント（ＣＤ４−ＣＤ８＋ＣＤ５＋、７ＡＡＤ−）の計数による、２つの方法で実施した。両方の場合で、ＦＳＣパラメーターおよびＳＳＣパラメーターを用いたリンパ球に対するゲーティングの後に、解析を実施した。各条件をデュープリケートで試験し、それぞれのデュープリケートセットの平均を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６（登録商標）グラフ描画および統計用ソフトウェアを用いてグラフ化した。
【０３４３】
結果および結論
ＩＦＮ−γ分泌実験の結果を図３２に示す。グラフ上の全てのデータ点は２連ウェルの平均を表す。二重特異性抗体無しの、抗ＣＤ３単独の添加は、非常に低いレベルのＩＦＮ−γしか誘導しなかった。ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０二重特異性分子の添加は、ＩＦＮ−γの分泌を用量依存的に増加させた。抗ＣＤ３抗体により誘導されるＩＦＮ−γのベースラインレベルも、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０により誘導されるＩＦＮ−γ分泌の総量と同様、ＰＢＭＣドナーによってばらつきがあった（図３２Ａおよび図３２Ｂ）。ＩＦＮ−γの分泌増強は、５Ｔ４発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞の存在下では認められたが、空ベクター対照でトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１細胞の存在下では認められなかった。すなわち、二重特異性分子ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０は、ＩＦＮ−γ分泌で測定されるＣＤ１３７機能を刺激するために、５Ｔ４の結合を必要とする。
【０３４４】
Ｔ細胞増殖実験の結果を図３３に示す。グラフ上の全てのデータ点は２連ウェルの平均を表す。準最適濃度の抗ＣＤ３抗体によるプライミング刺激の９６時間後に、ＣＤ８＋Ｔ細胞の多クローン性増殖を評価した。二重特異性抗体無しの、抗ＣＤ３単独の添加は、低レベルのＣＤ８＋Ｔ細胞増殖しか誘導しなかった。ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０の添加は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を用量依存的に増加させた（図３３Ａおよび図３３Ｂ）。ウェル毎に収集された、細胞分裂を経た細胞の割合（上段パネル）および総細胞数（下段パネル）は共に、一貫して、ロバストな細胞分裂を起こし、分裂後のＣＤ８＋Ｔ細胞をウェル内に蓄積させた。結果は複数のドナーの間で一貫性があった。
【０３４５】
実施例１７：一連のタンパク質密度で５Ｔ４を発現する各種ヒト腫瘍株の存在下におけるＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０の機能的レポーター活性
細胞表面上に一連の密度で５Ｔ４を発現する複数のヒト癌化細胞株にわたって、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０コンストラクトが結合性および機能的レポーター活性を有するかどうかを確認するための実験を行った。ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０の最大結合能は、細胞の５Ｔ４腫瘍抗原の発現レベルによって変わる。従って、５Ｔ４（ＣＨＯ／５Ｔ４）で安定トランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１細胞のほか、一連の密度で５Ｔ４を天然に発現する３種類の腫瘍細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、Ｈ１９７５、およびＴＦ−１）に対して、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０の結合を試験した。
【０３４６】
材料および方法
５Ｔ４結合アッセイ：
３倍に漸増させるＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０コンストラクト（１００ｎＭ〜０．１４ｎＭの範囲）を、ヒト５Ｔ４発現細胞株と共に、４０分間、４℃のＦＡＣＳ用緩衝液中でインキュベートし、３回洗浄し、ＰＥ標識ヤギ抗ヒトＦｃ二次抗体（ジャクソン・イムノリサーチ社）で検出した。ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０の結合をフローサイトメトリーで検出した。全ての試料はデュープリケートで実行した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６（登録商標）グラフ描画および統計ソフトウェアにおいて、ＥＣ５０値を求めるための非線形回帰分析を実施した。
【０３４７】
５Ｔ４タンパク質密度：
各細胞株上に存在する５Ｔ４の表面タンパク質密度を、Ｑｕａｎｔｉｂｒｉｔｅ（商標）Ｂｅａｄｓ（ＢＤファーミンゲン社）を用いて調べた。ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０との結合曲線用の細胞を得るために使用された、全く同じ血球計算器設定を用いて、Ｑｕａｎｔｉｂｒｉｔｅ（商標）Ｂｅａｄｓを得た。各ピークにおいて、４つのビーズ集団をゲーティングし、幾何平均蛍光を求めた。式ｙ＝ｍｘ＋ｃ（式中、ｙ＝Ｌｏｇ１０（蛍光）、ｘ＝Ｌｏｇ１０（ビーズ当たりのＰＥ分子））を用いて、線形回帰Ｌｏｇ１０（ビーズ当たりのＰＥ分子）を、Ｌｏｇ１０（蛍光）に対してプロットした。それから、細胞当たりのＰＥ分子（５Ｔ４）の数を算出することができた。この特定のアッセイでは、前記式はｙ＝１．０３６ｘ−１．４７８となった。全ての蛍光平均値は、製造業者のプロトコルによって示される、試料の幾何平均を用いて算出した。
【０３４８】
ＣＤ１３７レポーターアッセイ：
ＮＦ−κＢプロモーターの制御下のルシフェラーゼレポーター遺伝子を保有するＪｕｒｋａｔ／ＣＤ１３７トランスフェクタント（プロメガ社）を、Ｈ１９７５腫瘍細胞、ＴＦ−１腫瘍細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍細胞、またはＣＨＯ／５Ｔ４腫瘍細胞と共に、３０，０００このレポーター細胞対６０，０００個の標的細胞の比で、９６ウェルプレート内で培養した。最終濃度が１０ｎＭ〜０．０００６ｎＭの範囲をとる、５倍ずつの濃度の、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０分子を、添加した。細胞を、１％ウシ胎児血清、ピルビン酸ナトリウム、抗生物質、および可欠アミノ酸を添加した、総体積１００μＬのＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２の加湿恒温器内で５時間インキュベートした。１００μＬのＢｉｏ−Ｇｌｏｗバッファー（プロメガ社）を各ウェルに添加し、混合し、１０分間インキュベートした後、発光を測定した。ＭｉｃｒｏＢｅｔａ２  ２４５０  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（パーキンエルマー社）で発光を測定した。全てのデータ点はデュープリケート試料を表す。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６（登録商標）グラフ描画および統計ソフトウェアにおいて、ＥＣ５０値を求めるための非線形回帰分析を実施した。曲線上の全ての点は２連ウェルの平均を表す。Ｙ軸は相対蛍光単位（ＲＬＵ）の値を示す。
【０３４９】
結果および結論
試験された癌化細胞株は、Ｑｕａｎｔｉｂｒｉｔｅ（商標）Ｂｅａｄｓを用いて測定される細胞表面上に発現されている５Ｔ４タンパク質の量が各々異なっていた。従って、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０が、一連の５Ｔ４発現と、結合し機能的に活性となる能力を調べることができた。
【０３５０】
ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０は、一連の５Ｔ４細胞表面発現癌化細胞株に結合した。図３４に示されるように、５Ｔ４発現ＣＨＯは、５Ｔ４内因性発現癌化細胞株よりも１０倍多い５Ｔ４発現を有する。３種類の未トランスフェクト癌化細胞株のうち、Ｈ１９７５は最も高い５Ｔ４発現を示し、ＴＦ−１細胞は最も低い５Ｔ４タンパク質密度を示した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は中間の５Ｔ４発現を示した。表面５Ｔ４タンパク質密度を結合曲線から算出したところ、１７，０００から２５０，０００超の範囲の分子／細胞を示している。表２７は、結合曲線から求められた、５Ｔ４細胞表面タンパク質密度および結合性ＥＣ５０値を示している。癌化細胞株上の５Ｔ４発現の密度は蛍光性標準を用いて算出した。
【表２７】
2020530770.tif 000062
【０３５１】
図３５は、機能的ＣＤ１３７レポーターアッセイの結果を示している。図から分かる通り、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０は、細胞表面５Ｔ４発現が１７，０００から２５０，０００超という範囲をとるのにもかかわらず、ＣＨＯ／ヒト５Ｔ４、Ｈ１９７５、ＭＤＡ．ＭＢ．２３１、またはＴＦ−１腫瘍株への結合を介してＣＤ１３７を架橋結合する場合に、ＮＦ−κＢシグナル伝達を十分に誘導することができた。表面５Ｔ４タンパク質密度は最大機能活性（最大ＲＬＵ）に影響を与え、ヒト５Ｔ４発現ＣＨＯ細胞は最も高いＲＬＵ値を示した。しかし、３種類の癌化細胞株はロバストなレポーター機能を誘導した。これらの結果は、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０が一連の密度の５Ｔ４を発現する５Ｔ４陽性細胞の存在下で作動薬として機能することを示している。表２８は、種々のヒト５Ｔ４発現腫瘍株の存在下でのＣＤ１３７レポーターアッセイにおいてＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０により誘導された、ＥＣ５０および最大ＲＬＵを示している。
【表２８】
2020530770.tif 000063
【０３５２】
実施例１８：ヒトＣＤ８  Ｔ細胞およびヒトＨＣＴ１１６腫瘍細胞を用いたＩＦＮγ放出アッセイにおける５Ｔ４−ＣＤ１３７二重特異性抗体のインビトロ活性
ビーズ上にコーティングされた抗ＣＤ３抗体で刺激したＣＤ８＋Ｔ細胞を内在性レベルの５Ｔ４を発現するヒトＨＣＴ１１６腫瘍細胞とプレート内で共培養するＣＤ８  Ｔ細胞アッセイにおいて、５Ｔ４−ＣＤ１３７二重特異性抗体ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０の機能活性を評価した。
【０３５３】
材料および方法
ＨＣＴ１１６細胞のマイトマイシンＣ処理：
内在性レベルのヒト５Ｔ４（受容体密度＝６．２×１０４／細胞、表２１）を発現するヒト結腸癌細胞株のＨＣＴ１１６腫瘍細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−２４７（商標））を、濃度５０μｇ／ｍＬのマイトマイシンＣ（０．５ｍｇ／ｍＬ、シグマ・アルドリッチ社）で前処理し、腫瘍細胞の過増殖を阻害した。３７℃で４５分間のマイトマイシンＣとのインキュベーションの後、細胞をＲ１０培地（１０％熱不活化ＦＢＳ（ハイクローン社、製品番号ＳＶ３０１６０、ロット番号ＲＢ３５９４４）および１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ギブコ社、製品番号１５６３００５６）を含有するＲＰＭＩ（ギブコ社、製品番号６１８７００１０））で３回洗浄し、その後、新しいＲ１０培地で１０×１０６細胞／ｍＬの濃度に再懸濁した。５０μＬ（５×１０５細胞／ウェル）の、マイトマイシンＣ処理された、ＨＣＴ１１６細胞を、ＴＣ処理アッセイプレート（エッペンドルフ社、製品番号００３０  ７３０．１１９）に播種し、３７℃で一晩インキュベートした。
【０３５４】
ＣＤ８  Ｔ細胞アッセイの設定：
翌日、ヒトＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ＧＥヘルスケア社、製品番号１７−１４４０−０２）を用いる密度勾配遠心により、健常ドナーから得られた白血球濃厚液（臨床免疫学および輸血医学（Clinical Immunology and Transfusion Medicine）、ラボラトリメディシン・リージョンスコーネ（Labmedicin Region Skane）、ルンド、スウェーデン）から、単離した。ＣＤ８＋細胞を、ＣＤ８＋Ｔ細胞単離キット（ミルテニー社、１３０−０９６−４９５）を用いたネガティブセレクションにより、濃縮した。二重特異性抗体ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０、またはＡｄａｐｔｉｒフォーマットのアイソタイプ対照ＡＮＣ０１７（ＡＮＣ０１７の重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列は下記の表２９Ａおよび表２９Ｂに示す）をＲ１０培地で連続希釈し、５０μＬをアッセイプレートの各ウェルに添加し、３７℃で３０分間インキュベートし、その後、５０μＬの抗ＣＤ３ビーズ（４×１０８／ｍＬの抗ＣＤ３抗体  ＯＫＴ−３クローン、アフィメトリクス・イーバイオサイエンス社、製品番号１６−００３７−８５、をビーズにコーティングし、２×１０６／ｍＬに希釈）を、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびビーズの比が１：１となるように添加し、その後、５０μＬのエフェクター細胞（濃縮されたＣＤ８＋細胞、２×１０６／ｍＬまたは１×１０５／ウェル）を添加した。アッセイプレートを３７℃で７２時間インキュベートし、培養上清を回収した。上清中のＩＦＮγレベルをＥＬＩＳＡ（ＢＤ  ＯｐｔｉＥＩＡ、製品番号５５５１４２）で測定し、正規化データ（平均値およびＳＤ値）として図３６に示す。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７を用いて、非線形回帰ｌｏｇ（アゴニスト）ｖｓ．正規化反応（可変傾斜）により、ＥＣ５０値を求めた。培養上清中のＩＦＮγ産生の２つの最高値の平均を算出することにより、ＴＯＰ値（最大機能効果）を求めた。合計１２人のドナーを含んで、実験は４回行った。
【表２９Ａ】
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【表２９Ｂ】
2020530770.tif 000065
【０３５５】
結果および結論
ＣＤ１３７−５Ｔ４二重特異性抗体ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０の機能効果を、プレート内でＨＣＴ１１６細胞と共培養したヒトＣＤ８＋Ｔ細胞（エフェクター細胞）を用いて決定した。図３６に示されるように、二重特異性ＣＤ１３７−５Ｔ４抗体ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０は、５Ｔ４の内在性レベルを発現するＨＣＴ１１６細胞の存在下で、用量依存的に、ＩＦＮγ放出で測定される強力なＴ細胞活性化を誘導した。ＥＣ５０の決定については、４つのプール実験からの１２人のドナーの平均値および９５％信頼区間を示している表３０を参照されたい。ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０処置後の６人の個々のドナーのＩＦＮγレベルをアイソタイプ対照（ＡＮＣ０１７）と比較している図３７に示されるように、ＨＣＴ１１６細胞によって発現される５Ｔ４の内在性レベルは、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０の高い作動薬的機能効果を誘導するのに十分である。また、有効性（最大ＩＦＮγ応答）も図３８に示されている（アイソタイプ対照と比較した変化倍率、１２人のドナーの平均値およびＳＤ）。
【表３０】
2020530770.tif 000066
【０３５６】
実施例１９：５Ｔ４陽性異種移植片腫瘍であるＨＣＴ−１１６のＳＣＩＤベージュマウスモデルにおける、二重特異性抗体のインビボ抗腫瘍活性
ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０のインビボにおける抗腫瘍活性を評価するための試験を実施した。
【０３５７】
材料および方法
デンマークのタコニック社（Taconic）から入手した雌ＳＣＩＤベージュマウス（６〜８週齢）を実験に用いた。全ての動物処置は、動物の権利および保護に関するスウェーデンの法律に従って実施され、ルンド自治体／マルメの動物実験倫理委員会による承認を受けた（倫理申請番号（ethical application number）：Ｍ１５１−１３）。ＰＢＭＣを、４人の健常ドナーから得られた白血球濃厚液（臨床免疫学および輸血医学（Clinical Immunology and Transfusion Medicine）、ラボラトリメディシン・リージョンスコーネ（Labmedicin Region Skane）、ルンド自治体、スウェーデン）から、製造業者の説明書に従ってＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ＧＥヘルスケア社、製品番号１７−１４４０−０２）を用いた密度勾配遠心によって単離した。腫瘍関連抗原５Ｔ４陽性である、ヒト結腸癌細胞株のＨＣＴ−１１６細胞株を、ＡＴＣＣから購入し（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−２４７（商標）、ロット番号６２７６５６６８）、推奨に従って培養した。
【０３５８】
０日目、対数期増殖中のＨＣＴ−１１６腫瘍細胞を、マウスの右後側腹部に皮下接種した（１１０μＬのＰＢＳ中３×１０６個）。翌日（１日目）、１００μＬのＰＢＳ中の、４人のドナーから得られた７×１０６個のヒトＰＢＭＣを腹腔内注射した。６日目から、溶剤（ＰＢＳ）、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０（１０μｇ／マウス）、またはＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０（１００μｇ／マウス）による腹腔内抗体処置（ＰＢＳ中１００μＬ）を、週２回、合計５回の注射となるように、行った（ｎ＝５匹のマウス／処置／ドナー）。腫瘍成長を観察し、週２回ノギスで幅、長さ、および高さを測定し、腫瘍体積を算出した（ｗ／２×ｌ／２×ｈ／２×ｐｉ×（４／３））。実験のエンドポイントは、２ｃｍ３以上の腫瘍体積、負傷、またはマウスの健康障害とした。腫瘍成長について、種々の時点（９日目、１３日目、１６日目、２０日目、および２３日目）で、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ７を用いて、マンホイットニーのノンパラメトリック両側ｔ検定を用いた統計解析を行った。
【０３５９】
結果
図２８に示されるように、１０μｇ／マウスまたは１００μｇ／マウスのいずれの用量のＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０も、１３日目から２３日目まで、溶剤群と比較して統計的に有意な抗腫瘍活性（例えば、腫瘍体積抑制）を示した（４人のドナーからのプールデータ、統計解析およびｐ値については表３１を参照）。
【表３１】
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【０３６０】
結論としては、本試験により、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０が５Ｔ４陽性ヒト結腸癌異種移植片腫瘍モデルにおいて抗腫瘍特性を有することが示された。
【０３６１】
実施例２０：ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＡＬＧ．ＡＰＶ−２０９の薬物動態特性
マウスにおけるＡＬＧ．ＡＰＶ−２０９およびＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０の薬物動態（ＰＫ）特性を評価するための試験を実施した。正常ＢＡＬＢ／ｃ雌マウスに、時点０に、単回投与として２００μｇのＡＬＧ．ＡＰＶ−２０９またはＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０を静脈内（ＩＶ）注射し、各時点に１〜３匹のマウスから採血した。ｔ＝注射の１５分後、並びに２、６、２４、４８、７２、９６、１６８、３３６、および５０４時間後に、麻酔下のマウスを心穿刺により瀉血させて血清を採取した。血清中のＡＬＧ．ＡＰＶ−２０９およびＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０の濃度を、インタクトタンパク質のみを検出するように開発されたＥＬＩＳＡ法で、抗ＣＤ１３７  ＢＤを捕捉するためにヒトＣＤ１３７  ＥＣＤ−ＡＦＨ（ＡＬＧ０２７）を用い、抗５Ｔ４  ＢＤを検出するためにビオチン化５Ｔ４  ＥＣＤ−ｍＦｃ（ＡＬＧ０２９）を用いて、測定した。Ｐｈｏｅｎｉｘ  ６４ソフトウェア（ｖ６．４  ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（商標）ライセンス）を用いたノンコンパートメント解析（ＮＣＡ）から推定された薬物動態パラメーターを表３２に列挙し、半減期の推定値をフィット統計量（fit statistics）と共に図２９に示す。スパースサンプリングおよび均一な重み付けによるコンパイル済みＩＶ投与モデルをＮＣＡの際に用いた。
【０３６２】
ボーラス用量２００μｇのＡＬＧ．ＡＰＶ−２０９またはＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０をＩＶ注射された正常雌ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、ＮＣＡを用いて求められた見かけの終末相消失半減期は、それぞれ１４２時間および２１５時間であった（ＡＤＡによる影響を受けた可能性がある試料は除外）。コンパートメント解析（ＩＶ投与で２−コンパートメント）を用いて求められた半減期のパラメーター推定値は、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２０９およびＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０においては同様であった。ＮＣＡにより推定された、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２０９およびＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０のクリアランスおよび体積は、それぞれ、０．２６３ｍＬ／時間／ｋｇおよび０．２０４ｍＬ／時間／ｋｇ、５４ｍＬ／ｋｇおよび６３ｍＬ／ｋｇであった。両方の解析法で、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０は最も長い終末相消失半減期およびわずかにより良好なクリアランス値を示した。マウスにＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０を投与した場合、後期の時点で、抗薬物抗体（ＡＤＡ）の示唆となる急激な血清中濃度減少が認められたが、薬剤が試料中に存在し続けていることから、ＥＬＩＳＡ法ではＡＤＡの存在を確認できず、これは、ＡＤＡの急速なクリアランスという結果を生じる可能性もある。
【表３２】
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【０３６３】
実施例２１：ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０のＦｃ部分はＦｃγ受容体と相互作用しない
ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０は、ＦｃγＲを介したＴ細胞の活性化またはＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、ＣＤＣなどに繋がる可能性がある、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）との相互作用を防ぐために導入された変異を含有する。そのため、以下のＦｃγＲを安定発現するＣＨＯ細胞トランスフェクタントに対するＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０の結合性を調べた：ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ  Ｈｉｓ１３１）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＣＤ３２ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ  Ｖａｌ１５８およびＣＤ１６ａ  Ｐｈｅ１５８）、およびＦｃγＲＩＩＩｂ（ＣＤ１６ｂ）。未トランスフェクトＣＨＯ細胞を陰性対照として用いた。対照ヒトＩｇＧ１分子を陽性対照として用いた。種々の濃度のＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０または対照ＩｇＧ１を、ＦｃγＲ発現細胞株と共にインキュベートし、洗浄し、二次抗ヒトＩｇＧ試薬で標識した。ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０および対照ＩｇＧ１の結合をフローサイトメトリーで検出した。
【０３６４】
結果を図３０Ａおよび図３０Ｂに示す。図３０Ｂは、対照ＩｇＧ１が、試験されたＦｃγＲ発現細胞株の全て（ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ  Ｈｉｓ１３１）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＣＤ３２ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ  Ｖａｌ１５８およびＣＤ１６ａ  Ｐｈｅ１５８）、およびＦｃγＲＩＩＩｂ（ＣＤ１６ｂ））に結合したが、未トランスフェクトＣＨＯ細胞（陰性対照）には結合しなかったことを示している。ＦｃγＲ発現細胞株のいくつかに対する対照ＩｇＧ１の顕著な結合が、４ｎＭもの低濃度においても確認された。図３０Ａは、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０コンストラクトでは、試験されたＦｃγＲ（ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ  Ｈｉｓ１３１）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＣＤ３２ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ  Ｖａｌ１５８およびＣＤ１６ａ  Ｐｈｅ１５８）、およびＦｃγＲＩＩＩｂ（ＣＤ１６ｂ）に対し、検出可能な結合が確認されなかったことを示している。
【０３６５】
実施例２２：ヒトＰＢＭＣおよびＣＨＯ−５Ｔ４細胞を用いたＴ細胞増殖アッセイにおける５Ｔ４−ＣＤ１３７二重特異性抗体のインビトロ活性
５Ｔ４−ＣＤ１３７二重特異性分子であるＡＬＧ．ＡＰＶ−２０９およびＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０の機能活性を、ＰＢＭＣを用いたＴ細胞増殖アッセイで評価した。標準的なフィコール勾配法を用いて、ＰＢＭＣを健常ヒト血液から単離した。単離後、細胞を生理食塩水緩衝液で洗浄して血小板を除去した。ＰＢＭＣを、照射されたヒト５Ｔ４発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞と共に、およそ１２０，０００個のＰＢＭＣ対３０，０００個の５Ｔ４（＋）細胞の比で、９６ウェルプレート内で培養した。５Ｔ４発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞は、照射し（Ｘ線照射装置Ｃｅｌｌ  Ｒａｄ、ファキシトロン・バイオプティクス社）、培地で洗浄した後に、ＰＢＭＣと播種した。抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３（イーバイオサイエンス社）を全てのウェルに１ｎｇ／ｍＬの濃度で添加した。細胞を、１０％ウシ胎児血清（シグマ社）、ピルビン酸ナトリウム、抗生物質、および可欠アミノ酸を添加した、総体積２００μＬのＲＰＭＩ１６４０培地（ギブコ社）中で培養した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２の加湿恒温器内で７２時間インキュベートした。上清を除去し、細胞を、同一アッセイプレート内で、２％ＢＳＡおよび２ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ緩衝液中の抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体、および抗ＣＤ５抗体で、氷上で３０分間標識し、死細胞を除去するために７ＡＡＤを添加した。洗浄後、細胞を１２０μＬ／ウェルに再懸濁し、フローサイトメーター（ＬＳＲ−ＩＩ（商標）、ＢＤバイオサイエンス社）において、７０μＬ／ウェル体積を各ウェルから回収した。細胞解析はＦｌｏｗｊｏソフトウェアを用いて実施し、ＦＳＣパラメーターおよびＳＳＣパラメーターを用いたリンパ球に対するゲーティング後に、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋生Ｔ細胞イベント（ＣＤ４＋ＣＤ８−ＣＤ５＋、７ＡＡＤ−またはＣＤ４−ＣＤ８＋ＣＤ５＋７ＡＡＤ−）の数をカウントすることにより解析した。各条件をデュープリケートで試験し、それぞれのデュープリケートセットの平均を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ６（登録商標）グラフ描画および統計用ソフトウェアを用いてグラフ化した。
【０３６６】
試験結果を図３１Ａおよび図３１Ｂに示す。Ｔ細胞を低濃度の抗ＣＤ３抗体でプライミング刺激した７２時間後に、ＣＤ８＋Ｔ細胞の抗原特異的増殖を評価した。抗ＣＤ３刺激はＣＤ１３７の発現上昇を誘導する。二重特異性抗体無しの、抗ＣＤ３単独の添加は、ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖およびＣＤ４＋Ｔ細胞増殖をある程度誘導した。ＡＬＧ．ＡＰＶ−２０９またはＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０の添加は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を増加させた（図３１Ａ）。対照的に、ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ１３７の優先的発現から予想されるように、二重特異性抗体は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の抗ＣＤ３誘導性増殖に対しては限定的な影響しか示さなかった（図３１Ｂ）。結果は複数の実験の間で一貫性があった。Ｍｏｒｒｉｓｏｎ型対照分子（ＡＬＧ．ＡＰＶ−００４）は比較用に含まれた。
【０３６７】
まとめると、これらの結果から、ＡＬＧ．ＡＰＶ−２０９およびＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０の両方が、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を増強することが示された。ＡＬＧ．ＡＰＶ−２０９およびＡＬＧ．ＡＰＶ−２１０は、ＭｏｒｒｉｓｏｎフォーマットコンストラクトＡＬＧ．ＡＰＶ−００４よりも多量の細胞増殖を誘導した。
【０３６８】
実施例２３：正常組織および腫瘍組織における５Ｔ４発現の免疫組織化学的評価
正常ヒト組織および一連の種々の腫瘍型における腫瘍抗原５Ｔ４の発現を免疫組織化学（ＩＨＣ）によって評価した。
【０３６９】
染色法の開発：
対照細胞および被験ヒト組織の凍結切片およびホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）切片において、５種類の市販の抗５Ｔ４抗体および２種類の自家製の抗５Ｔ４抗体の５Ｔ４結合性を評価した。アイソタイプ対照染色も含まれた。マウスモノクローナル抗体（ＭＡＢ４９７５クローン、Ｒ＆Ｄシステムズ社）を、凍結切片およびＦＦＰＥ切片の両方で特異性および機能性が高かったため、最もパフォーマンスの良い抗体として選択した。抗原回復法および抗体価をこの抗体用に最適化した。
【０３７０】
組織および組織マイクロアレイ：
ヒト胎盤組織、およびヒト５Ｔ４を発現するようにトランスフェクトされたマウス結腸癌細胞株ＣＴ２６（ＡＴＣＣ（登録商標）、ＣＲＬ−２６３８）を陽性対照として用いた。ヒト大脳細胞、ヒト肝臓細胞、および未トランスフェクトＣＴ２６細胞を陰性対照として用いた。陽性対照および陰性対照用に用いたヒト組織はチャールス・リバー・ラボラトリーズ社の保管所から入手した。ＦＦＰＥ組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）はＵＳバイオマックス社（US Biomax Inc.）から得られた。全ての染色物は、チャールス・リバー・ラボラトリーズ社のＰＡＩの病理責任者によって評価された。
【０３７１】
正常ヒト組織マイクロアレイのＩＨＣ染色：
３人のドナー由来の２４種類の組織を含む正常ヒト組織パネル（ＦＤＡ８０８ｊ−１）において、５Ｔ４発現はいずれの主要器官にも見られなかった。
【０３７２】
ヒト腫瘍組織種のＩＨＣ染色：
５Ｔ４発現を、腫瘍ごとに単一のコアで表される７２の腫瘍症例の多臓器がん組織アレイ（multiple organ cancer tissue array）（ＦＤＡ８０８ｊ−２）においてスクリーングした。５Ｔ４発現は、膵臓、甲状腺、乳房、肝臓、子宮、子宮頚部、横紋筋、皮膚（扁平上皮癌）、神経（神経線維腫）、および膀胱の腫瘍で検出された。
【０３７３】
５Ｔ４発現を、２連または３連のコアで表される、表３３に示される選択された適応症のそれぞれについて、１０〜５０の腫瘍症例を含むＴＭＡで評価した。膀胱がん、頭頸部がん（Ｈ＆Ｎ）、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、および中皮腫において、試験された腫瘍の５０〜５６％が５Ｔ４陽性であった。かなりの数の膵腫瘍も５Ｔ４陽性であった（３６％）。試験された明細胞癌腫瘍の５０％が５Ｔ４陽性であった。
【表３３】
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参照による援用
【０３７４】
本明細書で引用された全ての参考文献、記事、刊行物、特許、特許公報、および特許出願は、あらゆる目的でその全体が参照により本明細書に援用される。しかしながら、本明細書で引用されたいずれの参考文献、記事、刊行物、特許、特許公報、および特許出願の言及も、それらが有効な先行技術を構成すること、または、それらが世界中のあらゆる国の共通一般知識の一部を形成していること、の承認でもいかなる形の示唆でもなく、またそれと解釈されるべきでもない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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