(57)【要約】  本発明は、Ｇｌｙ−Ｔβ４を有効成分とする眼球乾燥症の治療用薬学的組成物であって、損傷した角膜上皮細胞を回復させ、同時に杯細胞（Ｇｏｂｌｅｔ  ｃｅｌｌ）を増殖させる効果を示すので、眼球乾燥症の治療、予防、軽減に効果的である。
2020530435.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｇｌｙ−Ｔβ４（Ｇｌｙ−チモシンβ４）を有効成分として含む眼球乾燥症の治療、軽減または予防用薬学的組成物。
【請求項２】
前記Ｇｌｙ−Ｔβ４は、配列番号１のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１に記載の眼球乾燥症の治療、軽減または予防用薬学的組成物。
【請求項３】
前記Ｇｌｙ−Ｔβ４の含量は、組成物の全体体積を基準として０．００５〜５％（ｗ／ｖ）であることを特徴とする請求項１に記載の眼球乾燥症の治療、軽減または予防用薬学的組成物。
【請求項４】
前記薬学的組成物は、点眼剤の形態であることを特徴とする請求項１に記載の眼球乾燥症の治療、軽減または予防用薬学的組成物。
【請求項５】
前記眼球乾燥症は、水性涙液−欠乏性眼球乾燥症または蒸発性眼球乾燥症であることを特徴とする請求項１に記載の眼球乾燥症の治療、軽減または予防用薬学的組成物。
【請求項６】
前記眼球乾燥症は、無漏症、角膜乾燥症、シェーグレン症候群、乾燥角膜結膜炎、スティーブンス・ジョンソン症候群、眼類天疱瘡、眼科手術後の眼球乾燥症、アレルギー性結膜炎に伴われる眼球乾燥症、ＶＤＴ（ビジュアル・ディスプレイ・ターミナル（Ｖｉｓｕａｌ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｔｅｒｍｉｎａｌ））労働者の涙液の減少および空気調節装置による乾燥した部屋によって引き起こされる任意の全身症状がない涙液の減少を含む眼球乾燥症類似状態よりなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の眼球乾燥症の治療、軽減または予防用薬学的組成物。
【請求項７】
前記薬学的組成物は、損傷した角膜上皮細胞を回復させ、同時に杯細胞（Ｇｏｂｌｅｔ  ｃｅｌｌ）を増殖させることを特徴とする請求項１に記載の眼球乾燥症の治療、軽減または予防用薬学的組成物。
【請求項８】
Ｇｌｙ−Ｔβ４（Ｇｌｙ−チモシンβ４）を有効成分として含む眼球乾燥症の軽減または予防用人工涙液。
【請求項９】
Ｇｌｙ−Ｔβ４（Ｇｌｙ−チモシンβ４）を有効成分として含む薬学的組成物を個体に投与する段階を含む、眼球乾燥症の予防または治療方法。
【請求項１０】
Ｇｌｙ−Ｔβ４（Ｇｌｙ−チモシンβ４）を有効成分として含む薬学的組成物の、眼球乾燥症の予防または治療用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｇｌｙ−Ｔβ４（Ｇｌｙ−チモシンβ４）を有効成分として含む眼球乾燥症の予防または治療用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
眼球乾燥症は、眼をしっとりと濡らしてやわらかくて安らかな眼状態を維持する涙層の量と質が減少したり変動が生じて涙層に異常が発生することを意味し、涙が不足したり、涙が過度に蒸発したりまたは涙の構成成分の均衡が取れなくて、眼球の表面が損傷して感じる刺激感、異物感または乾燥感などの刺激症状はもちろん、このような症状から始まった角膜炎または膜上皮障害などを含む。代表的に、眼球乾燥症には、結膜乾燥症または乾性角結膜炎などがあるが、これに限定されるものではない。
【０００３】
このような眼球乾燥症は、ｉ）眼表面で涙が蒸発する場合、ｉｉ）涙腺の炎症によって涙が分泌されない場合、ｉｉｉ）粘液層（ｍｕｃｉｎ）の損傷によりその上側の水層が十分に眼表面を覆わないため、涙が不足した場合に発生すると知られているが、まだその明確な原因が明らかにされていないのが現状である。
【０００４】
眼球乾燥症を治療するための治療剤としては、ＲＥＳＴＡＳＩＳ（登録商標）（Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ  Ａ）  ｂｙ  Ａｌｌｅｒｇａｎ，ＤＩＱＵＡＳ（登録商標）（Ｄｉｑｕａｆｏｓｏｌ）ｂｙ  ＳａｎｔｅｎおよびＨｙａｌｅｉｎ（登録商標）（Ｓｏｄｉｕｍ  Ｈｙａｌｕｒｏｎａｔｅ）ｂｙ  Ｓａｎｔｅｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｒｉｃｓなどが市販されているが、このような治療剤は、眼灼熱感および点眼感が良くない短所があり、多因性疾患の眼球乾燥症に適合しない。また、このような治療剤は、抗炎症作用またはムチン（ｍｕｃｉｎ）の分泌促進を通じて眼球乾燥症の改善効果を発揮するが、根本的な治療が難しいのが現状である。
【０００５】
一方、Ｇｌｙ−Ｔβ４（Ｇｌｙ−Ｔｈｙｍｏｓｉｎβ４）は、４４個のアミノ酸配列からなるペプチドであって、既存のＴｈｙｍｏｓｉｎβ４（Ｔβ４）のＮ−末端にＧｌｙ（グリシン）を追加したものである。
【０００６】
Ｇｌｙ−Ｔβ４は、すでに公知となったＴβ−４の４次構造分析と前記タンパク質Ｎ−末端の遺伝工学的変形を通じて発見されたものであって、本来Ｔβ−４とは異なる活性を示す。
【０００７】
Ｔβ４は、構造と機能が相対的に定義され、公知となった主な胸腺因子の一つである。Ｔβ４は、牛の乳腺から抽出されたチモシン分画５（ＴＦ５）から初めて分離したポリペプチドであり、４３個のアミノ酸を有し、二硫化結合とグリコシル化なしに４．９６３ＫＤの分子量を有することが公知されている（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２５７，Ｎｏ．２，ｐｐ．１０００−１００６，１９８２，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈｙｍｏｓｉｎ  ｂｅｔａ）。Ｔβ４は、胚芽で心臓疾患が発病する間に発現するタンパク質であり、心臓細胞の移動を増進させ、このような細胞の生存に影響を及ぼすことができる（チモシンベータ４は、インテグリン−リンクされたキナーゼを活性化させ、心臓細胞の移動、生存および心臓修繕を増進させる、Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．４３２，Ｎｏｖ．２５，２００４）と知られている。
【０００８】
本発明者らは、Ｇｌｙ−Ｔβ４に関する研究のところ、眼球乾燥症の動物モデルおよび臨床研究を通じて眼球乾燥症患者の症状が改善されることを確認して、本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者は、Ｔβ４およびこれに対する誘導体に関する研究のところ、Ｇｌｙ−Ｔβ４（Ｇｌｙ−チモシンβ４）がＴβ４より眼球乾燥症の治療効果にさらに優れていることを確認し、Ｇｌｙ−Ｔβ４を有効成分とする組成物が眼球乾燥症の治療剤として活用され得ることを確認して、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、前記課題を解決するために、Ｇｌｙ−Ｔβ４（Ｇｌｙ−チモシンβ４）を有効成分として含む眼球乾燥症の治療、軽減または予防用薬学的組成物を提供する。
【００１１】
前記Ｇｌｙ−Ｔβ４は、配列番号１のアミノ酸配列からなるものであり得る。
【００１２】
前記Ｇｌｙ−Ｔβ４の含量は、組成物の全体重量を基準として０．００５〜５％（ｗ／ｖ）であり得る。
【００１３】
前記薬学的組成物は、点眼剤の形態であり得る。
【００１４】
前記眼球乾燥症は、水性涙液−欠乏性眼球乾燥症または蒸発性眼球乾燥症であり得る。
【００１５】
前記眼球乾燥症は、無漏症、角膜乾燥症、シェーグレン症候群、乾燥角膜結膜炎、スティーブンス・ジョンソン症候群、眼類天疱瘡、眼科手術後の眼球乾燥症、アレルギー性結膜炎に伴われる眼球乾燥症、ＶＤＴ（ビジュアル・ディスプレイ・ターミナル（Ｖｉｓｕａｌ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｔｅｒｍｉｎａｌ））労働者の涙の減少および空気調節装置による乾燥した部屋によって引き起こされる任意の全身症状がない涙の減少を含む眼球乾燥症類似状態よりなる群から選択されるものであり得る。前記薬学的組成物は、損傷した角膜上皮細胞を回復させ、同時に杯細胞（Ｇｏｂｌｅｔ  ｃｅｌｌ）を増殖させるものであり得る。
【００１６】
また、本発明は、Ｇｌｙ−Ｔβ４（Ｇｌｙ−チモシンβ４）を有効成分として含む眼球乾燥症の軽減または予防用人工涙液を提供する。
【００１７】
また、本発明は、Ｇｌｙ−Ｔβ４（Ｇｌｙ−チモシンβ４）を有効成分として含む薬学的組成物を個体に投与する段階を含む眼球乾燥症の予防または治療方法を提供する。
【００１８】
また、本発明は、Ｇｌｙ−Ｔβ４（Ｇｌｙ−チモシンβ４）を有効成分として含む薬学的組成物の眼球乾燥症の予防または治療用途を提供する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明は、Ｇｌｙ−Ｔβ４を有効成分とする眼球乾燥症の治療用薬学的組成物であって、損傷した角膜上皮細胞を回復させ、同時に杯細胞（Ｇｏｂｌｅｔ  ｃｅｌｌ）を増殖させる効果を示すので、眼球乾燥症の治療、予防、軽減に効果的である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、実験グループ（Ｇｒｏｕｐ  １：ＥＤＥ，Ｇｒｏｕｐ  ２：Ｖｅｈｉｃｌｅ，Ｇｒｏｕｐ  ３：Ｇｌｙ−Ｔβ４  １０ｕｇ／ｍＬ，Ｇｒｏｕｐ  ４：Ｇｌｙ−Ｔβ４  １００ｕｇ／ｍＬ，Ｇｒｏｕｐ  ５：Ｇｌｙ−Ｔβ４  １０００ｕｇ／ｍＬ）で測定した涙液の量（Ｔｅａｒ  Ｖｏｌｕｍｅ）を測定した結果である。
【図２】図２は、実験グループ（Ｇｒｏｕｐ  １：ＥＤＥ，Ｇｒｏｕｐ  ２：Ｖｅｈｉｃｌｅ，Ｇｒｏｕｐ  ３：Ｇｌｙ−Ｔβ４  １０ｕｇ／ｍＬ，Ｇｒｏｕｐ  ４：Ｇｌｙ−Ｔβ４  １００ｕｇ／ｍＬ，Ｇｒｏｕｐ  ５：Ｇｌｙ−Ｔβ４  １０００ｕｇ／ｍＬ）で涙膜破壊時間（Ｔｅａｒ  Ｆｉｌｍ  Ｂｒｅａｋ  Ｕｐ  Ｔｉｍｅ）を測定した結果である。
【図３】図３は、実験グループ（Ｇｒｏｕｐ  １：ＥＤＥ，Ｇｒｏｕｐ  ２：Ｖｅｈｉｃｌｅ，Ｇｒｏｕｐ  ３：Ｇｌｙ−Ｔβ４  １０ｕｇ／ｍＬ，Ｇｒｏｕｐ  ４：Ｇｌｙ−Ｔβ４  １００ｕｇ／ｍＬ，Ｇｒｏｕｐ  ５：Ｇｌｙ−Ｔβ４  １０００ｕｇ／ｍＬ）で蛍光染色を通じて角膜での傷を数値化した結果である。
【図４】図４は、結膜（Ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖａ）でのＴ細胞の分布を測定するためのフローサイトメーター（Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）結果である。
【図５】図５は、涙腺（Ｌａｃｒｉｍａｌ  Ｇｌａｎｄ）でのＴ細胞の分布を測定するためのフローサイトメーター（Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）結果である。
【図６】図６は、実験グループ（Ｇｒｏｕｐ  １：ＥＤＥ，Ｇｒｏｕｐ  ２：Ｖｅｈｉｃｌｅ，Ｇｒｏｕｐ  ３：Ｇｌｙ−Ｔβ４  １０ｕｇ／ｍＬ，Ｇｒｏｕｐ  ４：Ｇｌｙ−Ｔβ４  １００ｕｇ／ｍＬ，Ｇｒｏｕｐ  ５：Ｇｌｙ−Ｔβ４  １０００ｕｇ／ｍＬ）での杯細胞の密度(Ｇｏｂｌｅｔ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｎｓｉｔｙ)の測定結果である。
【図７】図７は、実験グループ（Ｇｒｏｕｐ  １：ＥＤＥ，Ｇｒｏｕｐ  ２：Ｖｅｈｉｃｌｅ，Ｇｒｏｕｐ  ３：Ｇｌｙ−Ｔβ４  １０ｕｇ／ｍＬ，Ｇｒｏｕｐ  ４：Ｇｌｙ−Ｔβ４  １００ｕｇ／ｍＬ，Ｇｒｏｕｐ  ５：Ｇｌｙ−Ｔβ４  １０００ｕｇ／ｍＬ）で損傷した角膜上皮細胞を確認するための蛍光染色結果である。
【図８】図８は、Ｇｌｙ−Ｔβ４，Ｔβ４の効能比較のために再生した杯細胞の濃度を比較した結果である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
Ｇｌｙ−Ｔβ４（Ｇｌｙ−Ｔｈｙｍｏｓｉｎβ４）は、４４個のアミノ酸配列からなるＴβ４誘導体（アミノ酸配列番号１）であって、既存のＴｈｙｍｏｓｉｎβ４（Ｔβ４）のＮ−末端にＧｌｙ（グリシン）を追加したものである。Ｇｌｙ−Ｔβ４は、遺伝的組換え方法を通じて発現したり、化学合成により製造され得、これに限定されず、公知の方法により製造され得る。より好ましくは、遺伝的組換えを通した組換えおよび発現方法を通じて得られ、より具体的には、Ｇｌｙ−Ｔβ４遺伝子が含まれたプラズミド（ｐｌａｓｍｉｄ）で形質転換された大腸菌を利用して培養を進めて組換えタンパク質（ＧＳＴ−Ｔβ４融合タンパク質）の形態で過発現させた後、これを精製した後、トロンビンで処理して、最終産物であるＧｌｙ−Ｔβ４を獲得することができる。
【００２２】
Ｇｌｙ−Ｔβ４は、角膜上皮細胞の移動を促進させることができ、これによって、コラーゲンおよびｌａｍｉｎｉｎ−５の形成が促進され得る。このようなコラーゲンおよびｌａｍｉｎｉｎ−５は、角膜の損傷を回復させ、最終的には、眼球乾燥を改善させることができる。また、これに限定されず、Ｇｌｙ−Ｔβ４は、ＭＵＣ５ＡＣ（眼球の表面に存在する杯細胞）および 杯細胞の成長を促進させてムチン（Ｍｕｃｉｎ）を増加させ、損傷した角膜上皮細胞の再生を助けて眼球乾燥を治癒する効力を有するものと知られている。
【００２３】
眼球乾燥症（Ｄｒｙ  ｅｙｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）は、涙液の欠乏または過多蒸発による涙膜の障害を含み、眼瞼間（ｉｎｔｅｒｐａｌｐｅｂｒａｌ）の眼表面のき損を引き起こす眼の不快感の症状も含むことができる。また、眼球乾燥症は、不快感、視力障害および涙膜の不安定性の症状と共に、眼表面に潜在的なき損を引き起こす涙液および眼表面の多因子性疾患を意味し、このような疾患は、涙膜の増加した浸透圧および眼表面の炎症を伴うことができる。
【００２４】
眼球乾燥症は、水性涙液−欠乏性眼球乾燥症および蒸発性眼球乾燥症を含み、水性涙液−欠乏性眼球乾燥症は、涙腺涙の分泌の不足により引き起こされた疾患を含むことができる。また、蒸発性眼球乾燥症は、正常的な涙腺の分泌機能の存在下での露出した眼表面からの過多な水分喪失によって引き起こされた疾患を含むことができる。
【００２５】
本発明は、Ｇｌｙ−Ｔβ４（Ｇｌｙ−チモシンβ４）を有効成分として含む眼球乾燥症の治療、軽減または予防用薬学的組成物に関するものである。
【００２６】
本薬学的組成物は、眼科用製剤であり得る。
【００２７】
前記製剤は、ゲル、ローション、噴霧剤、クリーム、懸濁液、溶液、分散液またはオイル形態であり得る。前記組成物は、薬学的に許容される、より好ましくは眼科用で許容され得る賦形剤または担体が含まれ得る。「薬学的に許容される」は、一般的に動物または具体的に哺乳類、特にヒトに対する用途を意味する。
【００２８】
また、前記組成物には、安定剤、溶解剤、緩衝剤、保存剤、増粘剤またはその他賦形剤が含まれ得る。
【００２９】
前記担体は、局所投与または汎用投与に適切なものであれば、本発明に使用され得る。より具体的に、前記担体は、水、水と水−混和性溶媒の混合物［前記水−混和性溶媒は、例えば、Ｃ１〜Ｃ７アルカノール類、植物性オイル類またはミネラルオイル類（例えば０．５〜５重量％のヒドロキシエチルセルロース、エチルオレエート、カルボキシメチルセルロース、ポリビニル−ピロリドンなど）、アクリレート類（例えばポリアクリル酸の塩類またはエチルアクリレート）、メタクリレート類、ポリアクリルアミド類、天然生成物類（例えばゼラチン、アルギネート類、ペクチン類、トラガカント、カラヤガム、キサンタンガム、カラギニン、寒天、アカシア、デンプン誘導体（例えばデンプンアセテートおよびヒドロキシプロピルデンプン））］、眼科用途のその他無毒性水−溶解性重合体（例えばセルロース誘導体（例えばメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースのアルカリ金属塩、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシプロピルセルロースおよびヒドロキシプロピルセルロース））、他の合成生成物（例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリエチレン酸化物、架橋されたポリアクリル酸（例えば中性カーボポール））、またはこれらの重合体の混合物であり得る。
【００３０】
前記緩衝剤は、ボレート系、炭酸水素／カルボネート系、グルコネート系、ホスフェート系、プロピオネート系およびトロメタミン（ＴＲＩＳ）系緩衝剤よりなる群から選択され得る。具体的に、前記緩衝剤は、トロメタミン系緩衝剤またはボレート系緩衝剤であり得る。前記緩衝剤基質の量は、例えば、生理学上許容されるｐＨの範囲を保障し維持するのに必要な量であり得る。前記生理学上許容されるｐＨの範囲は、ｐＨ５〜９、具体的に、６〜８．２、より具体的には、６．８〜８．１であり得る。
【００３１】
前記保存剤は、４次アンモニウム塩（例えばセトリミド、塩化ベンザルコニウムまたは塩化べンゾキソニウム）、チオサリチル酸のアルキル−水銀塩類（例えばチメロサール、フェニルマーキュリーナイトレート、フェニルマーキュリーアセテートまたはフェニルマーキュリーボレート）、パラベン類（例えばフェニルパラベンまたはプロピルパラベン）、アルコール類（例えばクロロブタノール、ベンジルアルコールまたはフェニルエタノール）、グアニジン誘導体（例えばクロロヘキシジンまたはポリヘキサメチレンビグアナイド）、またはソルビン酸であり得る。具体的に、前記保存剤は、４次アンモニウム塩またはパラベン類であり得る。前記保存剤の含量は、細菌および真菌により使用中に誘発される２次汚染を防止できる量であれば特に限定されない。
【００３２】
眼科用製剤内の適切な粘度を維持するために、次の剤形が使用され得るが、これに限定されるものではない：（ａ）単量体性ポリオール類（例えば、チロキサポール、グリセロール、プロピレングリコール、エチレングリコール）；（ｂ）重合体性ポリオール類、（例えば、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００））；（ｃ）セルロース誘導体（セルロース類の重合体）（例えば、ヒドロキシエチルセルロース、ヒプロメロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースソジウム、ヒドロキシルプロピルセルロース）；（ｄ）デクストラン類（例えば、デクストラン７０）；（ｅ）水溶性タンパク質（例えば、ゼラチン）；（ｆ）ビニル重合体類（例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン）；（ｇ）他のポリオール類（例えば、ポリソルベート８０，ポビドン）；（ｈ）カルボマー類（例えば、カルボマー９３４Ｐ、カルボマー９４１、カルボマー９４０、カルボマー９７４Ｐ）；および（ｉ）多糖類／グリコサミノグリカン類（例えば、ヒアルロナン（ヒアルロン酸／ヒアルロネート）、コンドロイチンサルフェート）。
【００３３】
本発明の上述した組成物を個体に投与する段階を含む眼球乾燥症を予防または治療する方法を提供する。
【００３４】
前記個体は、動物、より具体的には、哺乳類であり得、より好ましくはヒトを含むことができる。
【００３５】
前記投与は、経皮投与、非経口投与、鼻腔内（例えば、吸入）投与、粘液膜を通した投与を含むことができ、より具体的には、眼組織に直間接的に接触させる段階を含むことができる。
【００３６】
前記組成物は、Ｇｌｙ−Ｔβ４（Ｇｌｙ−チモシンβ４）を有効成分として含み、前記組成物は、単独投与またはその他他の薬物と併用投与も可能である。
【００３７】
前記組成物は、総組成物を基準として０．００５〜５％（ｗ／ｖ）のＧｌｙ−Ｔβ４を含むことができ、より好ましくは総組成物を基準として０．０１〜０．１％（ｗ／ｖ）のＧｌｙ−Ｔβ４を含むことができる。
【００３８】
本発明は、Ｇｌｙ−Ｔβ４（Ｇｌｙ−チモシンβ４）を有効成分として含む眼球乾燥症の軽減または予防用人工涙液を提供する。
【００３９】
本発明の理解を助けるために、実施例などにより詳細に説明することとする。しかしながら、本発明による実施例は、様々な他の形態に変形され得、本発明の範囲が下記実施例に限定されるものと解すべきものではない。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
実施例１．Ｇｌｙ−Ｔβ４の製造
ＨＵ０２４（Ｇｌｙ−Ｔβ４）は、ＷＣＢ  １  ｖｉａｌを解凍して２回のシード培養（ｓｅｅｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ）を進めて細胞数を増殖した後、培養器（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）で培養する。培養の終了後、スラリーを作った後、細胞破砕し、これをＤｅｐｔｈ／Ｍｉｃｒｏ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ（ＵＦ／ＤＦ）する。培養上澄み液は、イオン交換クロマトグラフィー（Ａｎｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を行った後、アフィニティークロマトグラフィー（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を進める。以後、酵素分解し、さらに陰イオン交換、陽イオン交換クロマトグラフィーを進め、ＵＦ／ＤＦを通じて最終原剤の剤形に作る。
【００４１】
下記表は、５００Ｌ基準培養および精製に対する構成図である。
【００４２】
【表１】
2020530435.tif 000003
【００４３】
実験例１．Ｇｌｙ−Ｔβ４の眼球乾燥症の治療効能実験
＊スコポラミン（Ｓｃｏｐｏｌａｍｉｎｅ）を投与（０．５ｍｇ／０．２ｍｌ、３ｔｉｍｅｓ  ａ  ｄａｙ）した後、ケージ内乾燥空気をファン（Ｆａｎ）を通じて注入（ａｉｒ  ｄｒａｆｔ）させて作った実験的乾性眼マウスモデル（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｄｒｙ  Ｅｙｅ（ＥＤＥ）Ｍｏｄｅｌ）を利用して本発明のＧｌｙ−Ｔβ４（以下、ＨＵ０２４という）の効能を次のように検証した。
【００４４】
１．実験群
【００４５】
【表２】
2020530435.tif 000004
【００４６】
２．投与方法Ｇｌｙ−Ｔβ４を一日３回、マウスの各眼当たり１滴ずつ投与した。
【００４７】
３．評価方法
１）臨床パラメーター（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）のために、ａ 涙液の量（Ｄａｙ  ７，Ｄａｙ  １４間隔で測定）、ｂ．涙膜破壊時間（Ｄａｙ  ７，Ｄａｙ  １４間隔で測定）、ｃ．蛍光染色（Ｄａｙ  ７，Ｄａｙ  １４間隔で測定）を実施した。
２）生物学的パラメーター（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）のために、ａ．炎症性サイトカインの分析（対象サイトカイン：ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α）を実施した。
３）細胞免疫学的パラメーター（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ／Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）のために、ａ．杯細胞の密度の確認（ＰＡＳ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ法を使用）、ｂ．炎症性Ｔ細胞分布の確認（Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ，ＣＤ４＋ＣＣＲ５＋）を実施した。
【００４８】
４．実験結果
１．１  涙液の量（Ｔｅａｒ  Ｖｏｌｕｍｅ）の測定
涙液の分泌量は、マウスの外眼角側結膜嚢にＰｈｅｎｏｌ−ｒｅｄ  ｉｍｐｒｅｇｎａｔｅｄ  ｃｏｔｔｏｎ  ｔｈｒｅａｄｓを２０秒間接触させてその長さをＳＭＺ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙを利用して測定した後、定められた公式に代入して体積に変換した。その結果は、次の通りである（図１参照）。
【００４９】
【表３】
2020530435.tif 000005
【００５０】
１．２  涙膜破壊時間（Ｔｅａｒ  Ｆｉｌｍ  ＢＵＴ）
乾性眼において最も重要な臨床因子である涙膜の安定性（ｔｅａｒ  ｆｉｌｍ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）を判断する涙膜破壊時間の検査のために、マウスの下側の結膜嚢に１％蛍光染色液（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）１ｕｌを点眼した後、眼を３回程度の眼瞬きをさせた後、滑らかに広げた後、コバルトブルーフィルターが装着された細隙灯顕微鏡を通じて染色された涙膜に最初の欠損が生じるまでの時間（秒）を測定した。これを３回繰り返して行って、平均値を求めた。その結果は、次の通りである（図２参照）。
【００５１】
【表４】
2020530435.tif 000006
【００５２】
１．３  蛍光染色（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ）
１％蛍光染色液１μＬの染色を点眼後に食塩水で洗浄した後、マウスの角膜を細隙灯顕微鏡で観察して、上皮の損傷程度（蛍光染色がにじみ出る程度）を点数化して評価した。このために角膜を４個の区域に分けた後、各等分を下記のように０〜４点まで評価した後、合算した（合計０〜１６点）。
１  Ａｂｓｅｎｔ
２  Ｓｌｉｇｈｔｌｙ  ｐｕｎｃｔｕａｔｅ  ｓｔａｉｎｉｎｇ＜３０  ｓｐｏｔｓ
３  Ｐｕｎｃｔａｔｅ  ｓｔａｉｎｉｎｇ＞３０  ｓｐｏｔｓ，ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｄｉｆｆｕｓｅ
４  Ｓｅｖｅｒｅ  ｄｉｆｆｕｓｅ  ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｐｌａｑｕｅ
【００５３】
その結果は、次の通りである（図 ３参照）。
【００５４】
【表５】
2020530435.tif 000007
【００５５】
２．１  生物学的パラメーター（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐａｒａｍｅｔｅｒ）
各群当たり３匹６眼で結膜組織を切除採取した後、これをプロテアーゼインヒビター を含むｌｙｓｉｓバッファに３０分間浸漬した後、遠心分離して−７０℃に保管した。その後、Ｌｕｍｉｎｅｘ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｉｍｍｕｎｏｂｅａｄ  ａｓｓａｙを利用して抗炎性サイトカイン（ＩＬ−１ｂ、ＴＮＦ−ａ）の濃度（ｐｇ／ｍｌ）を測定し、その結果は、次の通りである。
【００５６】
【表６】
2020530435.tif 000008
【００５７】
【表７】
2020530435.tif 000009
【００５８】
３．１   細胞免疫学的パラメーター（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ／Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）
結膜を切除してはさみで切った後、０．５ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼタイプＤで３７℃で６０分間混ぜた。組織を磨砕した後、セルストレーナーに通過させた後、遠心分離を行った。Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ＣＤ４  ａｎｔｉｂｏｄｙとｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ＩＦＮ−γ  ａｎｔｉｂｏｄｙを利用してフローサイトメトリーを行って、ＣＤ４＋ＣＣＲ５＋Ｔ細胞の数を計算した。Ｔ細胞の分布を測定した結果は、次の通りである（図４、図５参照）。
【００５９】
【表８】
2020530435.tif 000010
【００６０】
ＰＡＳ（Ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ａｃｉｄ−Ｓｃｈｉｆｆ）染色を実施して、杯細胞の密度を評価した。マウスの眼および付属器を切除して、４％パラホルムアルデヒドに固定し、パラフィンに包埋した後、組織断面に対するＰＡＳ染色を行った。各断面で顕微鏡とｉｍａｇｅ−ａｎａｌｙｓｉｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅを利用して結膜内杯細胞（ｇｏｂｌｅｔ  ｃｅｌｌ）の密度を計算した。その結果、杯細胞の密度は、下記の通りである（図６、図７参照）。
【００６１】
【表９】
2020530435.tif 000011
【００６２】
乾性眼でＨＵ０２４濃度依存的に 涙液の量（Ｔｅａｒ  Ｖｏｌｕｍｅ）の増加が確認され、また、涙膜破壊時間（Ｔｅａｒ  Ｆｉｌｍ  ＢＵＴ）の場合、濃度依存的に時間が増加した。
【００６３】
そして、蛍光染色（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ）の場合、眼球乾燥症がひどくなると、損傷した角膜上皮細胞の染色された点の数が増加することを確認して、眼球乾燥症を確認するが、この数値が減少したことが分かる。
【００６４】
このような三つの方法を通じて濃度依存的な涙液の量（Ｔｅａｒ  Ｖｏｌｕｍｅ）の増加、 涙膜破壊時間（Ｔｅａｒ  Ｆｉｌｍ  ＢＵＴ）の減少、蛍光染色（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ）の減少が確認されて、乾性眼モデルで眼球乾燥症上が緩和／治療されることを確認することができた。
【００６５】
また、炎症作用をするｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１  ｂｅｔａとＴＮＦ−ａｌｐｈａの量が濃度依存的に減少することが確認されて、ＨＵ０２４の抗炎症作用を確認することができ、また、フローサイトメーター（Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）の結果においても、ＣＤ４＋ＣＣＲ５＋  Ｔ細胞の分布が濃度依存的に減少したところ、炎症部位に特異的に存在するＴ細胞の量が減少することによって、炎症が緩和されたことを間接的に確認することができる。
【００６６】
そして、ＰＡＳ染色を通した杯細胞の密度(Ｇｏｂｌｅｔ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｎｓｉｔｙ)がＨＵ０２４濃度依存的に増加することが分かるが、既存の蛍光染色（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ）の結果から分かるように、損傷した角膜上皮細胞が減少すると同時に、杯細胞が増殖したことが分かる。
【００６７】
このような結果から分かるように、ＨＵ０２４は、抗炎症効果と細胞再生効果を有することを確認することができた。
【００６８】
比較例．効能比較実験（Ｇｌｙ−Ｔβ４、Ｔβ４の効能比較実験）
実験群は、次のように構成した。
Ｇｒｏｕｐ  １：ＥＤＥ，Ｇｒｏｕｐ  ２：Ｖｅｈｉｃｌｅ，Ｇｒｏｕｐ  ３：ＷＴ−Ｔβ４，Ｇｒｏｕｐ  ４：Ｇｌｙ−Ｔβ４
【００６９】
杯細胞の密度(Ｇｏｂｌｅｔ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｎｓｉｔｙ)値の増加を通じて実験的乾性眼の誘導によって減少した角膜内杯細胞が薬物により再生されて増加することを確認することができる。
【００７０】
【表１０】
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【００７１】
前記表から明らかなように、Ｇｒｏｕｐ  ３：ＷＴ−Ｔβ４に比べてＧｒｏｕｐ  ４：Ｇｌｙ−Ｔβ４で杯細胞がさらに多く再生されたことを確認することができる（図８参照）。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明は、Ｇｌｙ−Ｔβ４を有効成分とする眼球乾燥症の治療用薬学的組成物であって、損傷した角膜上皮細胞を回復させ、同時に杯細胞（Ｇｏｂｌｅｔ  ｃｅｌｌ）を増殖させる効果を示すので、眼球乾燥症の治療、予防、軽減に効果的であり、眼球乾燥症の治療剤の開発のための医療産業分野において有用に利用され得る。
【図１】
2020530435.tif 000013
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年1月16日(2020.1.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｇｌｙ−Ｔβ４（Ｇｌｙ−チモシンβ４）を有効成分として含む眼球乾燥症の治療、軽減または予防用薬学的組成物。
【請求項２】
前記Ｇｌｙ−Ｔβ４は、配列番号１のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１に記載の眼球乾燥症の治療、軽減または予防用薬学的組成物。
【請求項３】
前記Ｇｌｙ−Ｔβ４の含量は、組成物の全体体積を基準として０．００５〜５％（ｗ／ｖ）であることを特徴とする請求項１に記載の眼球乾燥症の治療、軽減または予防用薬学的組成物。
【請求項４】
前記薬学的組成物は、点眼剤の形態であることを特徴とする請求項１に記載の眼球乾燥症の治療、軽減または予防用薬学的組成物。
【請求項５】
前記眼球乾燥症は、水性涙液−欠乏性眼球乾燥症または蒸発性眼球乾燥症であることを特徴とする請求項１に記載の眼球乾燥症の治療、軽減または予防用薬学的組成物。
【請求項６】
前記眼球乾燥症は、無漏症、角膜乾燥症、シェーグレン症候群、乾燥角膜結膜炎、スティーブンス・ジョンソン症候群、眼類天疱瘡、眼科手術後の眼球乾燥症、アレルギー性結膜炎に伴われる眼球乾燥症、ＶＤＴ（ビジュアル・ディスプレイ・ターミナル（Ｖｉｓｕａｌ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｔｅｒｍｉｎａｌ））労働者の涙液の減少および空気調節装置による乾燥した部屋によって引き起こされる任意の全身症状がない涙液の減少を含む眼球乾燥症類似状態よりなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の眼球乾燥症の治療、軽減または予防用薬学的組成物。
【請求項７】
前記薬学的組成物は、損傷した角膜上皮細胞を回復させ、同時に杯細胞（Ｇｏｂｌｅｔ  ｃｅｌｌ）を増殖させることを特徴とする請求項１に記載の眼球乾燥症の治療、軽減または予防用薬学的組成物。
【請求項８】
前記薬学的組成物は、１日に３回投与される、請求項１に記載の眼球乾燥症の治療、軽減または予防用薬学的組成物。
【請求項９】
Ｇｌｙ−Ｔβ４（Ｇｌｙ−チモシンβ４）を有効成分として含む眼球乾燥症の軽減または予防用人工涙液。
【請求項１０】
眼球乾燥症の治療薬の製造のための、Ｇｌｙ−Ｔβ４（Ｇｌｙ−チモシンβ４）の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７２】
本発明は、Ｇｌｙ−Ｔβ４を有効成分とする眼球乾燥症の治療用薬学的組成物であって、損傷した角膜上皮細胞を回復させ、同時に杯細胞（Ｇｏｂｌｅｔ  ｃｅｌｌ）を増殖させる効果を示すので、眼球乾燥症の治療、予防、軽減に効果的であり、眼球乾燥症の治療剤の開発のための医療産業分野において有用に利用され得る。
以下、参考形態の例を付記する。
１．  Ｇｌｙ−Ｔβ４（Ｇｌｙ−チモシンβ４）を有効成分として含む眼球乾燥症の治療、軽減または予防用薬学的組成物。
２．  前記Ｇｌｙ−Ｔβ４は、配列番号１のアミノ酸配列からなることを特徴とする１．に記載の眼球乾燥症の治療、軽減または予防用薬学的組成物。
３．  前記Ｇｌｙ−Ｔβ４の含量は、組成物の全体体積を基準として０．００５〜５％（ｗ／ｖ）であることを特徴とする１．に記載の眼球乾燥症の治療、軽減または予防用薬学的組成物。
４．  前記薬学的組成物は、点眼剤の形態であることを特徴とする１．に記載の眼球乾燥症の治療、軽減または予防用薬学的組成物。
５．  前記眼球乾燥症は、水性涙液−欠乏性眼球乾燥症または蒸発性眼球乾燥症であることを特徴とす１．に記載の眼球乾燥症の治療、軽減または予防用薬学的組成物。
６．  前記眼球乾燥症は、無漏症、角膜乾燥症、シェーグレン症候群、乾燥角膜結膜炎、スティーブンス・ジョンソン症候群、眼類天疱瘡、眼科手術後の眼球乾燥症、アレルギー性結膜炎に伴われる眼球乾燥症、ＶＤＴ（ビジュアル・ディスプレイ・ターミナル（Ｖｉｓｕａｌ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｔｅｒｍｉｎａｌ））労働者の涙液の減少および空気調節装置による乾燥した部屋によって引き起こされる任意の全身症状がない涙液の減少を含む眼球乾燥症類似状態よりなる群から選択されることを特徴とする１．に記載の眼球乾燥症の治療、軽減または予防用薬学的組成物。
７．  前記薬学的組成物は、損傷した角膜上皮細胞を回復させ、同時に杯細胞（Ｇｏｂｌｅｔ  ｃｅｌｌ）を増殖させることを特徴とする１．に記載の眼球乾燥症の治療、軽減または予防用薬学的組成物。
８．  Ｇｌｙ−Ｔβ４（Ｇｌｙ−チモシンβ４）を有効成分として含む眼球乾燥症の軽減または予防用人工涙液。
９．  Ｇｌｙ−Ｔβ４（Ｇｌｙ−チモシンβ４）を有効成分として含む薬学的組成物を個体に投与する段階を含む、眼球乾燥症の予防または治療方法。
１０．  Ｇｌｙ−Ｔβ４（Ｇｌｙ−チモシンβ４）を有効成分として含む薬学的組成物の、眼球乾燥症の予防または治療用途。
【国際調査報告】
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