(57)【要約】  本発明は、  −中心波長λ１が１０１０ｎｍ〜１０５０ｎｍの範囲にある第１のビーム（１４）を発するレーザー源（１２）と、  −当該第１のビーム（１４）の一部（１６）から、中心波長λ２が１６７０ｎｍ〜１７３０ｎｍの範囲にある第２のビーム（３１）を生成する、当該レーザー源（１２）の下流に位置するスペクトル超連続体発生器（２２）と、  −当該第２のビーム（３１）の少なくとも一部及び当該第１のビーム（１４）の一部（２８）から、中心波長λ３が２５４０ｎｍ〜２６９０ｎｍの範囲にある第３のビーム（７２）を生成する、当該スペクトル超連続体発生器（２２）の下流に位置する光パラメトリック増幅システム（３７）と、  −当該光パラメトリック増幅システム（３７）の下流に位置する２次高調波発生器（７８）であって、当該第３のビーム（７２）の少なくとも一部から、中心波長λ４が１２７０ｎｍ〜１３４５ｎｍの範囲にある第４のビーム（８６）を生成する２次高調波発生器（７８）を含む装置（１０）に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
−中心波長λ１が１０１０ｎｍ〜１０５０ｎｍの範囲にある第１のビーム（１４）を発するレーザー源（１２）と、
−前記第１のビーム（１４）の一部（１６）から、中心波長λ２が１６７０ｎｍ〜１７３０ｎｍの範囲にある第２のビーム（３１）を生成する、前記レーザー源（１２）の下流に位置するスペクトル超連続体発生器（２２）と、
−前記第２のビーム（３１）の少なくとも一部及び前記第１のビーム（１４）の一部（２８）から、中心波長λ３が２５４５ｎｍ〜２６９０ｎｍの範囲にある第３のビーム（７２）を生成する、前記スペクトル超連続体発生器（２２）の下流に位置する光パラメトリック増幅システム（３７）と、
−前記光パラメトリック増幅システム（３７）の下流に位置する２次高調波発生器（７８）であって、前記第３のビーム（７２）の少なくとも一部から、中心波長λ４が１２７０ｎｍ〜１３４５ｎｍの範囲にある第４のビーム（８６）を生成する２次高調波発生器（７８）を含む装置（１０）。
【請求項２】
前記第１のビーム（１４）の中心波長λ１が１０２０ｎｍ〜１０４０ｎｍの範囲にあり、より好適には１０３０ｎｍにほぼ等しい、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記第２のビーム（３１）の中心波長λ２が１６９５ｎｍ〜１７１０ｎｍの範囲にあり、より好適には１７０３ｎｍにほぼ等しい、請求項１又は２に記載の装置。
【請求項４】
前記第３のビーム（７２）の中心波長λ３が２５９０ｎｍ〜２６２０ｎｍの範囲にあり、より好適には２６０６ｎｍにほぼ等しい、請求項１〜３のいずれか１項に記載の装置。
【請求項５】
前記第４のビーム（８６）の中心波長λ４が１２９５ｎｍ〜１３１０ｎｍの範囲にあり、より好適には１３０３ｎｍにほぼ等しい、請求項１〜４のいずれか１項に記載の装置。
【請求項６】
前記第１のビーム（１４）が、持続時間が５００ｆｓ以下のパルス列からなる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の装置。
【請求項７】
前記レーザー源（１２）がイッテルビウム添加ファイバレーザーであり、第１のビーム（１４）が、持続時間が４００ｆｓ以下のパルスを発し、４０μＪを超えるパルス毎エネルギーを発する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の装置。
【請求項８】
前記スペクトル超連続体発生器（２２）が非線形効果を有するファイバ、又はより好適にはＹＡＧ結晶である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の装置。
【請求項９】
前記光パラメトリック増幅システム（３７）が少なくとも１個の光パラメトリック増幅器（３８）を含んでいる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１０】
前記光パラメトリック増幅システム（３７）が、少なくとも２個の連結された光パラメトリック増幅器（３８、５４）を含み、前記第１の光パラメトリック増幅器（３８）が前記第２のビームの前記少なくとも一部を、前記スペクトル超連続体発生器（２２）により生成された前記第２のビーム（３１）から、及び前記第１のビーム（２８）の一部から増幅し、第２の光パラメトリック増幅器（５４）が、前記第１の光パラメトリック増幅器（３８）により増幅された前記第２のビーム（４９）の少なくとも一部及び前記第１のビーム（５２）の一部から前記第３のビーム（７２）を生成する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１１】
前記第２の光パラメトリック増幅器（５４）が前記第１の光パラメトリック増幅器（３８）よりも大きい軸寸法を有し、前記第２の光パラメトリック増幅器（５４）の入力端における前記第１のビーム（５２）の前記部分が前記第１の光パラメトリック増幅器（３８）の入力端よりも高い出力を有する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１２】
前記スペクトル超連続体発生器（２２）の下流及び前記光パラメトリック増幅システム（３７）の上流に少なくとも１個の拡張器（２６）と、前記光パラメトリック増幅システム（３７）の下流に少なくとも２個の圧縮器（７４、７６）、すなわち前記第２のビーム（７０）を圧縮する第１の圧縮器（７４）及び前記第３のビーム（７２）を圧縮する第２の圧縮器（７６）を含み、前記第２の圧縮器（７６）が好適には前記２次高調波発生器（７８）の上流のある、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１３】
前記スペクトル超連続体発生器（２２）の下流及び光パラメトリック増幅システム（３７）の上流に少なくとも１個の拡張器（２６）、前記２個の光パラメトリック増幅器（３８、５４）の間に１個の拡張器（４８）、及び光パラメトリック増幅システム（３７）の下流に少なくとも２個の圧縮器（７４、７６）、すなわち前記第２のビーム（７０）用に１個の圧縮器（７４）及び前記第３のビーム（７２）用に１個の圧縮器（７６）を、好適には前記２次高調波発生器（７８）の上流に含んでいる、請求項１０又は１１に記載の装置。
【請求項１４】
前記光パラメトリック増幅器又は増幅器群（３８、５４）が、２次非線形帯磁率を有し、前記第１と第２のビームの間のパラメトリック位相同調を可能にする非線形結晶、特にＰＰＬＮ（周期的分極反転ニオブ酸リチウム）、ＫＴＡ（ヒ酸化チタンカリウム）又はＢＢＯ（ベータホウ酸バリウム）結晶を含んでいる、請求項９〜１１及び１３のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１５】
前記２次高調波発生器（７８）が、２次非線形帯磁率を有していて且つ前記第３のビームの周波数倍増位相同調を可能にする非線形結晶、特にＡＧＳ（チオ没食子酸銀）又はＰＰＬＮ結晶である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１６】
少なくとも１個のビームから、より好適には請求項１〜１５のいずれか１項に記載の装置（１０）の出力端で得られた、中心波長が１０１０ｎｍ〜１０５０ｎｍ、１２８０ｎｍ〜１３４５及び／又は１６７０ｎｍ〜１７３０ｎｍの範囲にあるビームの結合から、組織内の１個以上の発色団を励起するステップを含む多光子顕微鏡測定撮像方法。
【請求項１７】
前記発色団又は発色団群の励起が、一方のビームが１２８０ｎｍ〜１３４５の範囲に、他方のビームが１６７０ｎｍ〜１７３０ｎｍの範囲に中心波長を有する２本のビームの結合から行われる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記発色団又は発色団群の励起が、第１のビームが１０１０ｎｍ〜１０５０ｎｍの範囲に、第２のビームが１２７０ｎｍ〜１３４５の範囲に、第３のビームが１６７０ｎｍ〜１７３０ｎｍの範囲に中心波長を有する２本のビームの結合から行われる、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は多光子顕微鏡測定に関する。
【背景技術】
【０００２】
多光子顕微鏡測定は、生物組織を測微三次元分解能で特定の深さまで非侵襲的に撮像可能にする。測定は、蛍光色素を所与の焦点でいくつかの光子と共に同時に励起し、表面を走査して組織からの応答の２Ｄ又は３Ｄ画像を構築するものである。多光子顕微鏡測定は神経科学分野で特に関心が持たれている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
多光子顕微鏡測定技術による生物組織の深さ方向の撮像は主として３個のパラメータ、すなわちａ）組織による、及び主として組織に含まれる水による光の吸収、ｂ）組織内での光子の散乱、及びｃ）入射ビームの強度により制約される。これら３個のパラメータは特に、実現可能な撮像深度を制約する。
【０００４】
第１の点に関して、吸収の制約の解決策の一つは、吸収係数を小さくする吸収スペクトルの範囲内で励起波長を選択するものである。水の吸収スペクトルを大域的に表す図３に見られるように、波長が長いほど水の吸収係数が大きい。特に、水は７００ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲ではほとんど何も吸収せず、吸収が減少する１３００ｎｍ〜１７００ｎｍ付近でウインドウが現れる。
【０００５】
第２の点に関して、波長が増大するに従い光の散乱が減少する。
【０００６】
最後の点に関して、高エネルギー超短波パルスを発するフェムト秒レーザーを用いる。
【０００７】
従って、波長が７００ｎｍ〜１１００ｎｍの範囲にある超短波パルスを発するフェムト秒レーザーを用いる多光子顕微鏡測定により生物組織を撮像することは公知の方式である。当該波長は、生物学的媒体の水及び成分の吸収が最も少ない波長に対応している。しかし、撮像深度は、組織内での光の散乱により依然として制約される。
【０００８】
波長が１３００ｎｍ又は１７００ｎｍに中心を有する超短波パルスを発するフェムト秒レーザーを用いて作業することで深度が増すことも公知の方式である。
【０００９】
上述の公知技術により得られる発色団は、２光子顕微鏡測定では入射ビームの波長の半波長、及び／又は３光子顕微鏡測定では入射ビームの波長の３分の１での励起に影響される発色団である。これにより撮像可能性が発色団の限られた選択肢に制約される。
【００１０】
従って、多光子顕微鏡測定方法及び装置を改良するニーズがある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、
−中心波長が１０１０ｎｍ〜１０５０ｎｍの範囲にある第１のビームを発するレーザー源と、
−第１のビームの一部から、中心波長が１６７０ｎｍ〜１７３０ｎｍの範囲にある第２のビームを生成する、レーザー源の下流に位置するスペクトル超連続体発生器と、
−第２のビームの少なくとも一部及び第１のビームの一部から、中心波長が２５４５ｎｍ〜２６９０ｎｍの範囲にある第３のビームを生成する、スペクトル超連続体発生器の下流に位置する光パラメトリック増幅システムと、
−光パラメトリック増幅システムの下流に位置する２次高調波発生器であって、第３のビームの少なくとも一部から、中心波長が１２７０ｎｍ〜１３４５ｎｍの範囲にある第４のビームを生成する２次高調波発生器を有する装置を用いて上述のニーズに応える。
【００１２】
上述のような装置は、中心波長が約１０３０ｎｍのビームを発する単一のレーザー源から、各々の中心波長が約１０３０ｎｍ、及び１３００ｎｍ〜１７００ｎｍの範囲である３本のビームが得られるようにする。３本のビームが単一ビームから得られるという事実により当該ビームが同期されていることが保証される。
【００１３】
波長λ１、λ２及びλ３は以下の関係により関連付けられる。
【数１】
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【００１４】
例えばλ１≒１０３０ｎｍ且つλ２≒１３０３ｎｍならばλ３≒１７０３ｎｍである。
【００１５】
得られた中心波長は、水の吸収がより少ないウインドウに位置し、特に中心波長が最も長い、すなわち約１３００ｎｍ〜１７００ｎｍの範囲にあるビームの場合は組織による散乱が殆どない。
【００１６】
パラメータ増幅システムにより、水の吸収がより少ないウインドウ内の中心波長が約１０３０ｎｍのポンプ及び中心波長が約１７００ｎｍの源から、同じく水の吸収がより少ないウインドウ内の１３００ｎｍの二倍に相当する約２６００ｎｍの追加的な波長を生成することが可能になる。従って、中心波長が約１０３０ｎｍである単一入射ビームにより、異なる中心波長が共に水の吸収がより少ないウインドウ内にある２本のビームを簡単に発生可能になることは極めて驚異且つ斬新である。
【００１７】
ビームは、個別に又は結合して用いられてよい。例えば、２本又は３本のビームが結合されて多光子顕微鏡測定により生物組織を深さ方向に撮像する。使用可能な波長及びビームを介して、多数の発色団励起可能性が生じる。
【００１８】
好適には、第１のビームは、中心波長が１０２０ｎｍ〜１０４０ｎｍの範囲にあり、より好適には１０３０ｎｍにほぼ等しい。
【００１９】
好適には、第２のビームは、中心波長が１６９５ｎｍ〜１７１０ｎｍの範囲にあり、より好適には１７０３ｎｍにほぼ等しい。
【００２０】
好適には、第３のビームは、中心波長が２５９０ｎｍ〜２６２０ｎｍの範囲にあり、より好適には２６０６ｎｍにほぼ等しい。
【００２１】
好適には、第４のビームは、中心波長が１２９５ｎｍ〜１３１０ｎｍの範囲にあり、より好適には１３０３ｎｍにほぼ等しい。
【００２２】
好適には、第１のビームは、持続時間が５００ｆｓ以下であるパルス列を含んでいる。パルスの持続時間が極めて短いことで、スペクトル超連続体発生器は第２のビームを容易に発生させることができる。実際に、第１のビームのパルスの持続時間が短いほど、スペクトル超連続体発生器により入射ビームのスペクトルが広がる。
【００２３】
好適には、レーザー源はイッテルビウム添加ファイバレーザーであり、第１のビームは持続時間が４００ｆｓ以下のパルス列を発し、４０μＪを超えるパルス毎エネルギーを発する。このようなレーザーにより、スペクトル超連続体発生器により第２のビームが容易に得られるようになり、レーザーの出力により光パラメトリック増幅システムにおける第２のビームの増幅の強い出力が可能になる。好適には、本装置は、第１のビームを２個の部分に分割するビームスプリッタをスペクトル超連続体発生器の上流に含んでいて、第１のビームの第１の部分により第２のビームが発生可能になる。
【００２４】
第２のビームの発生に用いる第１のビームの当該部分は、好適には２μＪ〜４μＪの範囲にあるパルス毎エネルギーを発し、及び／又は第１のビームの出力の５％〜１０％の範囲にある出力を発する。例えば、第１のビームの第１の部分は、初期ビームの８％を発する。
【００２５】
好適には、スペクトル超連続体発生器は、透明な固体材料、特にガラス、ファイバ又は結晶、或いはより好適にはＹＡＧ（イットリウム及びアルミニウムガーネット）結晶である。ＹＡＧ結晶により、特に１センチメートルのオーダーの短い光路を内部に設けることができるようになり、小型の装置の製造が簡単になる。更に、ＹＡＧ結晶は、ファイバよりも好適であって、高強度入力ビームを実現できることが本明細書の主旨である。
【００２６】
光パラメトリック増幅システムは、少なくとも１個の光パラメトリック増幅器を含んでいてよい。
【００２７】
好適には、光パラメトリック増幅システムは少なくとも２個の連結された光パラメトリック増幅器を含み、第１の光学パラメトリック増幅器が第２のビームの前記少なくとも一部を、スペクトル超連続体発生器により生成された第２のビームから、及び第１のビームの一部から増幅し、第２の光パラメトリック増幅器が、第１の光パラメトリック増幅器により増幅された第２のビームの少なくとも一部及び第１のビームの一部から第３のビームを生成する。第２の光パラメトリック増幅器は次いで、入力として、第１のビーム及び第２の高出力ビームの一部を有するため、第２のビーム及び第３の高出力ビームを生成することができる。２個の光パラメトリック増幅器を用いることで良好な増幅効率が得られるようになるため、各々が高出力の第１、第２及び第３のビームを出力として得られるようになる。
【００２８】
好適には、第２の光パラメトリック増幅器は、第１の光パラメトリック増幅器よりも軸寸法が大きく、第２の光パラメトリック増幅器の入力端における第１のビームの一部が第１の光パラメトリック増幅器の入力における出力よりも高い出力を有している。これにより、光パラメトリック増幅システムの効率を向上させることが可能になる。
【００２９】
好適には、本装置は、第１のビームの第２の部分を２個の部分に分割するビームスプリッタを光パラメトリック増幅システムの上流に含み、これらの部分の一方が第１の光パラメトリック増幅器のポンプを構成し、これらの部分の他方が第２の光パラメトリック増幅器のポンプを構成している。例えば、エネルギーは以下のよう分布している。第１のビームが４０μＪのパルス毎エネルギーを発し、第１の増幅器のポンプは第１のビームの約１０％を占める４μＪであり、第２の増幅器のポンプは第１のビームの約８２％を占める３３μＪである。
【００３０】
好適には、本装置は、スペクトル超連続体発生器の下流及び光パラメトリック増幅システムの上流に少なくとも１個の拡張器と、光パラメトリック増幅システムの下流に少なくとも２個の圧縮器とを含んでいる。好適には、圧縮器及び拡張器はガラス又は結晶を含んでいる。結晶又はガラスにより、特に１センチメートルのオーダーの短い光路を内部に設けることができるようになる。例えば、拡張器はシリコン製である。第１の圧縮器は、第２のビームを圧縮可能にし、好適には拡張器に対して逆符号の分散を有している。第１の圧縮器はシリカ製であってよい。第２の圧縮器は、第３のビームを圧縮可能にし、好適には拡張器と同符号の分散を有している。第２の圧縮器は好適には２次高調波発生器の上流にある。第２の圧縮器はシリコン製であってよい。拡張器、光パラメトリック増幅システム及び圧縮器の存在により、低周波ドリフトを伴う増幅を行い、ビームの損失及び経路を減らすことが可能になる。拡張器により、光パラメトリック増幅システムからの信号を構成する第２のビームのパルスの持続時間を、光パラメトリック増幅システムのポンプを構成する第１のビームの一部に同調させることができ、圧縮器により、光パラメトリック増幅システムの後で、第２のビーム及び第３のビームを、高エネルギーパルス列を発するビームに変換できるようになる。
【００３１】
好適には、拡張器により、持続時間が２００ｆｓ〜４００ｆｓの範囲にあるパルス列を発する第２のビームを第１のビームの持続時間に適合させることが可能になる。
【００３２】
好適には、本装置は、スペクトル超連続体発生器の下流及び光パラメトリック増幅システムの上流に少なくとも１個の拡張器、２個の光パラメトリック増幅器の間に１個の拡張器、及び光パラメトリック増幅システムの下流に少なくとも２個の圧縮器、すなわち第２のビーム用に１個の圧縮器及び第３のビーム用に１個の圧縮器を、好適には２次高調波発生器の上流に含んでいる。
【００３３】
好適には、圧縮器は、１つ又は複数の拡張器の１つ又は複数の拡張をほぼ相殺して、圧縮後の持続時間が５０ｆｓ〜１００ｆｓの範囲にある、好適には７０ｆｓにほぼ等しい第２及び第３のビームのパルスを得るべく構成されている。
【００３４】
１つ又は複数の光パラメトリック増幅器は、２次非線形帯磁率を有し、第１と第２のビームの間のパラメトリック位相同調を可能にする非線形結晶、好適にはＰＰＬＮ（周期的分極反転ニオブ酸リチウム）、ＫＴＡ（ヒ酸化チタンカリウム）又はＢＢＯ（ベータホウ酸バリウム）結晶を含んでいてよい。
【００３５】
２次高調波発生器は、２次非線形帯磁率を有していて且つ第３のビームの周波数倍増位相同調を可能にする非線形結晶、好適にはＡＧＳ（チオ没食子酸銀）又はＰＰＬＮ結晶であってよい。
【００３６】
本装置は、１本以上の遅延線を含んでいてよい。このような遅延線により、異なるビームの位相を調整して、光パラメトリック増幅システム内の事実上出力端で同期パルスが得られるようになる。第１の遅延線は、第１の光パラメトリック増幅器の下流の経路に配置されていてよく、前記増幅器で増幅された第２のビームの波長を調整可能にする。当該遅延線は、ポンプを構成する第１のビームの、又は信号を構成する第２のビームの経路に、好適にはポンプを構成する第１のビーム上に配置されていてよい。ポンプと信号の間の同調性は、第２のビームの波長を一時的に拡張する拡張器の使用により好転する。第２の遅延線が、第２の光パラメトリック増幅器の下流の経路に配置されていてよく、前記増幅器の効率を最適化できるようになる。
【００３７】
好適には、本装置からの出力として送られる第１のビームの一部が、０．５μＪよりも大きい、例えば１．５μＪにほぼ等しいパルス毎エネルギーを発する。
【００３８】
好適には、光パラメトリック増幅システムにより増幅された第２のビームが、持続時間が５０ｆｓ〜１００ｆｓの範囲にあるパルス列、及び１μＪよりも大きい、例えば２．５μＪにほぼ等しいパルス毎エネルギーを発する。
【００３９】
好適には、第４のビームが、持続時間が５０ｆｓ〜１００ｆｓの範囲にあるパルス列、及び０．２μＪよりも大きい、例えば０．４μＪにほぼ等しいパルス毎エネルギーを発する。
【００４０】
本装置は、本装置の特定の要素の入力端又は出力端で求められる波長から不要な波長を分離可能にする１個以上のフィルタを含んでいる。これらのフィルタは有利な特徴として、特定の波長で光を通過させ、他の波長で当該光を反射させることを可能にするダイクロイックミラーである。これらのダイクロイックミラーは、フィルタリングされた入射ビームに対して４５°に配置することができる。本装置は特に、このようなフィルタを第１及び第２のパラメトリック増幅器の出力端に含んでいてよい。
【００４１】
本発明の主題はまた、少なくとも１個のビームから、より好適には上で定義したような本発明の装置の出力端で得られた、中心波長が１０１０ｎｍ〜１０５０ｎｍ、１２７０ｎｍ〜１３４５及び／又は１６７０ｎｍ〜１７３０ｎｍの範囲にあるビームの結合から、組織内の１個以上の発色団を励起するステップを含む多光子顕微鏡測定撮像方法である。
【００４２】
異なるビームのパルス列は組織内で同期的に発せられる。
【００４３】
本装置の出力端で得られたビームを結合することが有利である。例えば、発色団は、１３００ｎｍで１個光子及び１７００ｎｍで１個の光子により同時に励起され、これは７３７ｎｍでの１個の光子、又は１３００ｎｍでの１個の光子及び１７００ｎｍでの２個の光子による同時励起に等価であり、５１４ｎｍでの１個の光子又は１７００ｎｍでの３個の光子による励起により等価であり、５６７ｎｍでの１個の光子による励起に等価である。これにより多光子顕微鏡測定が利用できる発色団の視野を広げることが可能になる。
【００４４】
好適には、１つ又は複数の発色団の励起は、一方のビームが１２８０ｎｍ〜１３２０の範囲に、他方のビームが１６５０ｎｍ〜１７５０ｎｍの範囲に中心波長を有する２本のビームの結合により行われる。
【００４５】
一変型例として、１つ又は複数の発色団の励起は、第１のビームが１０１０ｎｍ〜１０５０ｎｍの範囲に、第２のビームが１２８０ｎｍ〜１３２０の範囲に、第３のビームが１６５０ｎｍ〜１７５０ｎｍの範囲に中心波長を有する３本のビームの結合から行われる。
【００４６】
本発明は、添付の図面を検討しつつ以下の非限定的な例示的実装方式の詳細な記述を精査することにより理解が深まろう。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】本発明による装置を模式的に示す。
【図２】中心波長及びレーザービームの概念を示す。
【図３】水の吸収スペクトルを波長の関数として示す。
【図４Ａ】３次高調波発生により得られた組織の画像である。
【図４Ｂ】３光子顕微鏡測定により得られた図４Ａの組織の画像である。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
装置
本発明による装置１０の一例を図１に示す。
【００４９】
本装置１０は、約１．２５ＭＨｚの反復周波数を有する超短波パルス列を含むビーム１４を発するパルスレーザー源１２を含んでいる。これらのパルスは、約１０３０ｎｍの中心波長λ１及び、４００ｆｓ以下の、好適には２５０ｆｓ〜４００ｆｓの範囲にあって、例えば３５０ｆｓにほぼ等しい持続時間を有している。
【００５０】
図２に示すように、中心波長λｃは、パルスの最大スペクトル強度に達した波長として定義される。ビーム１４は、スプリッタ２０、例えば入射ビームに対して４５°に配置された半透明の鏡により、２本のビーム１６及び１８に分割される。
【００５１】
透過ビーム１６は、ＹＡＧ結晶等のスペクトル超連続体発生器２２内に送られる。スペクトル超連続体発生器２２は、持続時間が１００ｆｓ以下、例えば約７０ｆｓであって少なくとも１０３０ｎｍ〜１８００ｎｍまで延びる拡張された波長スペクトルを有するパルス列を発するビーム２４を出力として伝送する。
【００５２】
当該ビーム２４は拡張器２６を通過することにより、拡張ビーム２９のパルス列の持続時間が２００ｆｓ〜４００ｆｓの範囲にある、例えば２５０ｆｓにほぼ等しい持続時間になる。
【００５３】
スプリッタ２０により反射されたビーム１８は、例えば入射ビームに対して４５°傾いた半透明の鏡を含むスプリッタ３２により再度２本のビーム２８、３０に分割される。
【００５４】
遅延線３３が、スプリッタ３２の上流の反射ビーム１８の経路上に配置され、スプリッタ３２により反射されたビーム２８及び拡張ビーム２９がほぼ同期的であるように設定されている。
【００５５】
ビーム２８、２９は、入射ビーム２９に対して４５°に配置されたダイクロイックミラー３４に送られる。
【００５６】
ダイクロイックミラー３４により、透過時に約１７００ｎｍの中心波長λ２で拡張ビーム２９を透過ビーム３１にフィルタリングし、反射時にビーム２８を透過させて、これらの二つビーム２８、３１を光パラメトリック増幅器３８の入力端でビーム３６に結合することが可能になる。
【００５７】
従って、当該ビーム３６は、中心波長λ１のポンプ成分及び中心波長λ２の信号部分を有している。入力端でのビーム３６の２個の成分のパルス列は同期的であり、これらのパルスは同様の持続時間を有している。
【００５８】
光パラメトリック増幅器３８は出力端で３個の成分、すなわち
・中心波長λ１のポンプ成分、ビーム２８の残留成分、
・中心波長λ２の信号成分、及び
・中心波長λ３が、
【数２】
2020522757.tif 000004
すなわち２６００ｎｍ±１０ｎｍにほぼ等しい追加的成分を含むビーム４０を生成する。
【００５９】
ビーム４０は、連続的ダイクロイックミラー４２、４４により中心波長成分λ１、λ３が除去されて中心波長λ２が約１７００ｎｍの単一成分だけを有するビーム４６を形成する。
【００６０】
ミラー４２は４５°での反射により成分λ１を拒絶して成分λ２、λ３を透過させる。ミラー４４は成分λ２を反射して成分λ３を透過させる。
【００６１】
フィルタ４４により反射されたビーム４６は、出力端でのパルス列の持続時間が２００ｆｓ〜４００ｆｓの範囲にあるように選択された、例えば２５０ｆｓにほぼ等しい拡張器４８を通過する。
【００６２】
拡張器４８の出力端での拡張ビーム４９はダイクロイックミラー５８、次いで光パラメトリック増幅器５４に送られる。
【００６３】
ミラー５８は、入射ビーム４９に対して４５°に配置されていて入射ビーム４９を透過させる。
【００６４】
スプリッタ３２により透過されたビーム３０は、スプリッタ５０により再度２本のビーム５２、５３に分割される。反射ビーム５２だけが、ダイクロイックミラー５８次いで光パラメトリック増幅器５４に送られるべく保持される。スプリッタ５０によりビーム５２の出力を弱めることが可能になる。
【００６５】
図示するように、遅延線５６はスプリッタ５０へのビーム３０の経路上に配置され、ビーム５２とビーム４９が光パラメトリック増幅器５４の入力端でほぼ同期的であるように設定されている。
【００６６】
ダイクロイックミラー５８により、拡張ビーム４９とビーム５２を増幅器５４の入力端でビーム６０内に結合することが可能になる。当該ビーム６０は従って、中心波長λ１のポンプ及び中心波長λ３の信号成分を有している。ビーム６０内の波長λ１及びλ２の２個の成分のパルス列は同期的であて、これらのパルスは同様の持続時間を有している。
【００６７】
光パラメトリック増幅器５４は、出力端で３個の成分、すなわち
・中心波長λ１のポンプ、ビーム２８の残留成分、
・中心波長λ２の信号成分、及び
・中心波長λ３の追加的成分
を含むビーム６２を生成する。
【００６８】
光パラメトリック増幅器３８、５４及び拡張器４８、並びにダイクロイックミラー４２、４４、５０及び５８並びに遅延線５６は、一体化されたパラメータ増幅システム３７の一部を形成することができる。
【００６９】
光パラメトリック増幅器５４の出力端でのビーム６２の３個の成分は、ダイクロイックミラー６４、６６により、各々の中心波長λ１、λ２及びλ３を有する３本のビーム６８、７０及び７２に分割される。
【００７０】
ミラー６４は、入射ビーム６２に対して４５°に配置されていて、成分λ３を透過させ、成分λ１、λ２を反射する。ミラー６６は、ミラー６４により反射された入射ビームに対して４５°に配置されていて、成分λ１を透過させ、成分λ２を反射する。
【００７１】
中心波長λ２の反射ビーム７０は、拡張器２６、４８によりビーム７０に対して実行された拡張の効果を相殺すべく圧縮器７４により圧縮される。
【００７２】
中心波長λ３の透過ビーム７２は、拡張器２６、４８により実行された拡張のビーム７２に対する効果を相殺すべく圧縮器７６に、次いで２次高調波発生器７８に送られる。２次高調波発生器７８は、２個の成分、すなわち中心波長λ３、圧縮ビーム７２の残留成分を有する成分と、すなわちλ３の半分である約１３００ｎｍの中心波長λ４を有する成分とを有するビーム８０を生成する。
【００７３】
ビーム８０は、入射ビーム８０に対して４５°に配置されたダイクロイックミラー８２により、中心波長λ３の成分がフィルタリングされ、透過ビーム８６は中心波長λ４の成分だけを有している。
【００７４】
従って、装置１０により、中心波長λ１が約１０３０ｎｍの単一ビーム１４から、中心波長λ１、λ２及びλ４が各々約１０３０ｎｍ、１７００ｎｍ及び１３００ｎｍである３本のビーム６８、８４及び８６を得ることが可能になり、得られた３本のビームは１．２５ＭＨｚのオーダーの反復周波数の同期パルスを有している。
【００７５】
例示的な実装において、エネルギーが４０μＪ以上のパルス列を発するイッテルビウム添加ファイバレーザーをレーザー源１２として用いることによりＡｍｐｌｉｔｕｄｅｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）社のＳａｔｓｕｍａ（登録商標）型産業用レーザーを含むプロトタイプを作成する。
【００７６】
スペクトル超連続体発生器２２はＹＡＧ結晶である。
【００７７】
拡張器２６、３８は、各々厚さが約１ｍｍ及び２ｍｍ、又は２ｍｍ及び１ｍｍのシリコン結晶である。
【００７８】
光パラメトリック増幅器３８、５４は各々ＰＰＬＮ結晶を含んでいてよい。好適には、光パラメトリック増幅器５４の厚さは、より良好な効率が得られるよう光パラメトリック増幅器３８よりも厚い。例えば、光パラメトリック増幅器３８は厚さが１ｍｍにほぼ等しいＰＰＬＮ結晶であり、光パラメトリック増幅器５４は厚さが３ｍｍにほぼ等しいＰＰＬＮ結晶である。
【００７９】
圧縮器７４は厚さが約７５ｍｍのガラスシートである。圧縮器７８は厚さが約５ｍｍのシリコンの結晶である。２次高調波発生器７８はＡＧＳ又はＰＰＬＮ結晶である。
【００８０】
遅延線３３、５６、ビームスプリッタ２０、３２及び５０、並びにダイクロイックミラー３４、４２、４４、５８、６４、６６及び８２は従来型であって公知である。
【００８１】
このようなプロトタイプにおいて、ビーム１６の出力はビーム１４の出力の５％〜１０％に相当し、ビーム２８の出力はビーム１４の出力の５％〜３０％に相当し、ビーム５２の出力はビーム１４の出力の６０％〜９０％に相当する。
【００８２】
このような装置により、得られたビーム６８の出力はビーム１４の出力の２％〜２０％に相当し、ビーム８４は持続時間が約６５ｆｓであってエネルギーが１μＪを超えるパルス列を発し、ビーム８６は持続時間が約８５ｆｓであってエネルギーが約０．１μＪに等しいパルス列を発する。
【００８３】
多光子顕微鏡測定方法
図１に関して上で述べた装置により発生したビーム６８、８４及び／又は８６は結合されて中心波長λ１、λ２及びλ４の成分を有するビームを形成することができる。
【００８４】
形成されたビームは多光子顕微鏡で用いることができる。
【００８５】
異なるビーム６８、８４及び／又は８６を結合する前に、当該ビームは各々遅延線を通過するか又は通過しなくてもよいため、当該ビームがサンプルのレベルで完全には同期的でない可能性がある場合にビームの同期を微細に調整することを可能になる。これにより、源と顕微鏡の間で当該ビームの各々の異なる光路を補償することが可能になる。
【００８６】
図３に示すように、波長λ１、λ２及びλ４は、水の吸収がより少ないウインドウに位置し、組織内への浸透が良好であるため、深い箇所で蛍光色素を励起することが可能になる。
【００８７】
この励起は、同一波長の又は異なる波長の１個以上の同時光子によりに行うことができる。
【００８８】
例えば、波長がλｉ及びλｊである２個の同時光子により励起が実行された場合、励起は同一波長の２個の光子の励起と等価である。
【数３】
2020522757.tif 000005
【００８９】
例えば、波長がλｉ及びλｊである３個の同時光子、すなわち３個のうち少なくとも２個の光子が同一波長である光子により励起が実行された場合、励起は同一波長波長の３個の光子の励起と等価である。
【数４】
2020522757.tif 000006
【００９０】
一例として、波長がλ１、λ２又はλ４である２個の光子、或いは波長がλ１、λ４又はλ２である３個の光子による励起の異なる結合が以下の表１、２で実現されている。等価波長は都度示されている。
【００９１】
【表１】
2020522757.tif 000007
【００９２】
【表２】
2020522757.tif 000008
【００９３】
【表３】
2020522757.tif 000009
【００９４】
同様の表が、４個の光子による励起についても提示でき、以下同様である。
【００９５】
実現可能な等価波長の個数は、同一波長のいくつかの同時光子による励起の場合よりも本発明の場合の方がはるかに多い。
【００９６】
これらの等価波長は本発明において可視域から赤外域線にわたる。
【００９７】
上述の多光子顕微鏡測定は従って、可視域か赤外域にわたり発せられるより多様な発色団を励起可能にすると共に、組織の画像を励起した発色団の関数として複数のコントラストで取得可能にする。
【００９８】
多色顕微鏡測定を実行すべく得られたビームの一使用例を以下に述べる。
【実施例】
【００９９】
１７００ｎｍにほぼ等しい中心波長λ２、及び１３００ｎｍにほぼ等しいλ４のビームが、本装置を図１に関して述べたように用いて同時に得られる。
【０１００】
これらのビームは、蛍光マークを付した鶏胚脊髄のサンプルに同時に送られる。
【０１０１】
複数の画像が同時に得られる。
【０１０２】
波長λ４の光子により、蛍光無しで組織の形態の視覚化を可能にする３次高調波発生により得られる、図４Ａに示す第１の画像の生成が可能になる。
【０１０３】
波長λ４の光子により、励起した蛍光色素が緑色で再発光する３光子顕微鏡測定により得られる第２の画像の生成もまた可能になる。
【０１０４】
波長λ２の光子により、励起した蛍光色素が赤色で再発光する３光子顕微鏡測定により得られる第３の画像の生成が可能になる。
【０１０５】
第２及び第３の画像が図４Ｂに結合されて２色の単一画像を形成する。
【０１０６】
本発明による装置は従って、共に多光子撮像を行うべく使用可能な異なる波長のビームを発生可能にする。従って、重ね合わせ可能な異なる色の画像を同時に得ることが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【国際調査報告】
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