(57)【要約】本発明は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）亜種を、ＦＶＩＩＩを含む組成物から精製するための方法であって、アニオン交換クロマトグラフィーステップ、サイズ排除クロマトグラフィーステップ、および濃縮ステップを含む方法に関する。本発明は、精製されたＦＶＩＩＩ亜種を含む組成物にも関する。特に、第ＶＩＩＩ因子を含む組成物から第ＶＩＩＩ因子亜種を精製するための方法を開発するための取り組みにおいて、本発明者らは、２つのクロマトグラフィーステップ、すなわち、アニオン交換クロマトグラフィーステップおよびサイズ排除クロマトグラフィーステップ、その後、別のアニオン交換クロマトグラフィーステップであってよい濃縮ステップを使用することにより、前記第ＶＩＩＩ因子亜種を高い純度および高濃度で含む組成物がもたらされることを見出した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）亜種を、ＦＶＩＩＩを含む組成物から精製するための方法であって、前記ＦＶＩＩＩ亜種が、ＦＶＩＩＩ軽鎖と会合したＦＶＩＩＩ重鎖であり、前記方法が、
（１）前記ＦＶＩＩＩを含む組成物をアニオン交換クロマトグラフィーに供し、前記ＦＶＩＩＩ亜種を含む溶出液を収集するステップと、
（２）前記ＦＶＩＩＩ亜種を含むステップ（１）の溶出液をサイズ排除クロマトグラフィーに供し、前記ＦＶＩＩＩ亜種を含む溶出液を収集するステップと、
（３）前記ＦＶＩＩＩ亜種を含むステップ（２）の溶出液を濃縮するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
ステップ（１）の前に以下のステップ（０）
（０）前記組成物中に含まれるＦＶＩＩＩをフューリンプロテアーゼ処理に供するステップ
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＦＶＩＩＩ軽鎖が、ＦＶＩＩＩ  ８０ｋＤａ軽鎖である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記濃縮ステップ（３）が、前記ＦＶＩＩＩ亜種を含むステップ（２）の溶出液をアニオン交換クロマトグラフィーに供し、前記ＦＶＩＩＩ亜種を含む溶出液を収集するステップである、請求項１から３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（３）において、ＳｏｕｒｃｅＱ樹脂をアニオン交換クロマトグラフィーに使用する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＦＶＩＩＩが組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）であり、ＦＶＩＩＩ亜種が組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）亜種である、請求項１から５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＦＶＩＩＩ亜種が、ＦＶＩＩＩ軽鎖と会合したＦＶＩＩＩ  １８０ｋＤａ重鎖、またはＦＶＩＩＩ軽鎖と会合したＦＶＩＩＩ  １５０ｋＤａ重鎖、またはＦＶＩＩＩ軽鎖と会合したＦＶＩＩＩ  １１０ｋＤａ重鎖、またはＦＶＩＩＩ軽鎖と会合したＦＶＩＩＩ  ９０ｋＤａ重鎖である、請求項１から６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（１）において、ビーズサイズが２０μｍ未満の高分解能Ｑ−樹脂をアニオン交換クロマトグラフィーに使用する、請求項１から７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（２）において、分解能が１００００Ｄａ〜６００００Ｄａにわたるサイズ排除クロマトグラフィー樹脂をサイズ排除クロマトグラフィーに使用する、請求項１から８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（１）の溶出をリニアグラジエント溶出によって実施し、前記リニアグラジエント溶出のグラジエントの長さが、少なくとも約１６カラム体積、少なくとも約２４カラム体積、または少なくとも約３２カラム体積である、請求項１から９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
精製された第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）亜種を含む組成物であって、前記ＦＶＩＩＩ亜種が、ＦＶＩＩＩ軽鎖と会合したＦＶＩＩＩ重鎖である、組成物。
【請求項１２】
前記組成物中の前記精製されたＦＶＩＩＩ亜種の前記組成物中の他の全てのＦＶＩＩＩ亜種に対する重量比が、少なくとも９、または少なくとも８である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記精製されたＦＶＩＩＩ亜種の濃度が、少なくとも０．１ｍｇ／ｍＬ、または少なくとも０．３ｍｇ／ｍＬである、請求項１１または１２に記載の組成物。
【請求項１４】
出血性障害の処置に使用するための、請求項１１から１３までのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
血友病Ａの処置に使用するための、請求項１１から１４までのいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）亜種を、ＦＶＩＩＩを含む組成物から精製するための方法であって、アニオン交換クロマトグラフィーステップ、サイズ排除クロマトグラフィーステップ、および濃縮ステップを含む方法に関する。本発明は、精製されたＦＶＩＩＩ亜種を含む組成物にも関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
止血は、傷害または組織損傷が生じた後の失血を止めるための全ての反応を包含するプロセスである。止血は以下の３つの主要なステップを伴う：
１．血管収縮。これは、血流を減少させ、それにより、急性失血を減少させるための、周囲の筋線維の収縮による罹患血管の狭小化を意味する。
２．損傷を受けた血管壁を一時的に塞ぐための血小板血栓の形成。これは、傷害後の最初の１分以内に起こり、下にある結合組織のコラーゲンとのフォン・ヴィルブランド因子により媒介される接触に主に起因する（Clemetson,  2012）。
３．凝固。これは、血液凝固因子の活性化、および最終的に、トロンビンの活性化、フィブリンの形成、ならびにそれによる血栓安定化である。活性化は、カスケード様、増幅様式で起こり、それにより、下流に続く凝固因子のそれぞれの活性が増強される。
【０００３】
血液凝固因子は、わずかな例外を除いて、主にセリンプロテアーゼである。これらは、ＦＶＩＩＩおよびＦＶであり、補助因子として作用し、酵素的機能は示さない。血液凝固因子は、一般に、大文字のＦ、その後にローマ数字、例えば、ＦＶＩＩと名付けられている。血液凝固因子が活性化されると、多くの場合、不活性チモーゲンから活性セリンプロテアーゼへの変換を示すために、さらに小文字の「ａ」を用い、例えば、ＦＶＩＩａと示される。凝固カスケード自体は、トロンビン活性化の基本的なステップで交わる２つの異なる経路に分けることができる。
【０００４】
組織因子経路は、外因系経路としても公知であり、内皮下組織細胞の表面上に位置する４７ｋＤａの膜貫通タンパク質である組織因子への曝露で開始される。組織が傷害を受けると、因子ＦＶＩＩが組織因子と複合体を形成し、それにより活性化される。この複合体は、外因性テナーゼ複合体とも称され、これにより今度はそれぞれ因子ＦＩＸが活性化されてＦＩＸａになり、ＦＸが活性化されてＦＸａになる。第２の経路は接触活性化経路または内因系経路と称され、血栓形成においては軽微な役割しか果たさない。接触活性化経路は、最初に因子ＦＸＩＩ、ＦＸＩおよびＦＩＸを必要とする。活性な因子ＦＩＸａは、その活性な補助因子ＦＶＩＩＩａ、カルシウムイオンおよびリン脂質と、いわゆる内因性テナーゼ複合体を形成する。テナーゼ複合体は、因子ＦＸを活性化してＦＸａにすることができる（概要に関しては図１を参照されたい）。
【０００５】
組織因子経路または接触活性化経路のいずれかによって活性化される因子ＦＸａは、ＦＶを活性化してＦＶａにする。因子ＦＸａおよびＦＶａの両方がカルシウムイオンと共に補助因子としてプロトロンビンに作用してトロンビンを形成する。組織因子経路と接触活性化経路がこの時点で交わる。この最初の相ではほんの少量のトロンビンが形成され、十分なフィブリノーゲンをフィブリンに変換して安定なフィブリン塊を形成することができるわけではない。しかし、トロンビンはフィードフォワードループの一部であり、それにより、それ自体の形成を触媒する。トロンビンは、ＦＶ、ＦＸＩを活性化し、血流中を不活性複合体として循環しているｖＷＦからＦＶＩＩＩを遊離させる。それにより、ＦＶＩＩＩが活性化されてＦＶＩＩＩａになる。前述の通り、ＦＸＩａはＦＩＸを活性化し、それがＦＶＩＩＩａおよびカルシウムイオンと共に内因性テナーゼ複合体を形成する。テナーゼ複合体は大量のＦＸを活性化し、それにより、さらに多くのトロンビンの生成が導かれる。トロンビンは、凝固の重要な目的である、未熟な血餅においてそれを安定化し、強化するためのフィブリノーゲンのフィブリンへの変換のために必要である。さらに、トロンビンは、ＦＸＩＩＩを活性化して、血餅内のフィブリンの架橋結合に関与するＦＸＩＩＩａにする。
【０００６】
血液凝固第ＶＩＩＩ因子は、最も大きな血液凝固因子の１つである。ネイティブな単鎖ＦＶＩＩＩは、通常、２３３２アミノ酸を含有し、その分子量は、大まかに３００ｋＤａである（ExPASy,  2016）。図２Ａに示されている通り、ＦＶＩＩＩは６つのドメインで構成され、これらのドメインはＡ１−Ａ２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２と称される。
【０００７】
ネイティブな血液凝固ＦＶＩＩＩは、肝細胞、腎臓細胞、内皮細胞およびリンパ組織において１つの単一のポリペプチド鎖として合成される。細胞内フューリンプロテアーゼの影響下で、ＦＶＩＩＩは、２つの鎖、重鎖１つと軽鎖１つに切断される。単鎖ＦＶＩＩＩ全体を通して異なる位置が利用可能であり、そこにフューリンプロテアーゼが付着し、それを切断することができる。その結果、それぞれが重鎖１つと軽鎖１つを含む、ある特定の数の不均一な活性ＦＶＩＩＩ亜種がもたらされる。重鎖および軽鎖の長さは、Ｂドメイン短縮の程度に応じて変動する。Ｂドメインがない軽鎖は、ドメインＡ３−Ｃ１−Ｃ２からなり、一方、伸長型軽鎖はＢドメインの画分をなお含有する。軽鎖バリアントの分子量は、それぞれ、標準軽鎖については８０ｋＤａであり、伸長型軽鎖については１２０ｋＤａである。ＦＶＩＩＩ重鎖は、Ｂドメインの主要な画分がなお付着している全長バリアント（１８０ｋＤａ）、ならびに、Ｂドメインの量が減少している短縮型バリアント（１５０ｋＤａおよび１１０ｋＤａ）、およびＢドメインを全く含まないＢドメイン枯渇重鎖（９０ｋＤａ）として出現し得る。ドメインＡ１およびＡ２は、記載されている重鎖バリアントのそれぞれの一部である。
【０００８】
ＦＶＩＩＩは、分泌された後、大きな多量体糖タンパク質であるｖＷＦと非共有結合により結合した不活性型として血流中を循環する。ｖＷＦ結合性部位は、８０ｋＤａ軽鎖のＮ末端付近に位置する高度に酸性の領域である（図２Ａにおいてドメインの呼称の間の色付けされていない空間として示されている）（OBrien  and  Tuddenham,  1997）。トロンビンによってこの酸性領域が取り除かれた後、ＦＶＩＩＩがｖＷＦから遊離する。２つの追加的な酸性領域が、それぞれドメインＡ１とＡ２の間、およびＡ２とＢの間に位置する。トロンビンによりこれらの酸性領域の切断も引き起こされ、それにより、ドメインＡ１、Ａ２およびＢが分離される。次いで、ＦＶＩＩＩの活性型が、ドメインＡ１、Ａ２および軽鎖Ａ３−Ｃ１−Ｃ２を含むヘテロ三量体分子として形成される  −  Ｂドメインは活性ＦＶＩＩＩ分子の一部ではない。活性ＦＶＩＩＩ分子は、活性なプロテインＣによるＡ２ドメインの切断によって不活化される。不活化されたＦＶＩＩＩは血流から急速に一掃される。
【０００９】
各Ａドメインは、およそ３３０アミノ酸を含有し、２つの高度に保存されたβバレルを形成する。重鎖と軽鎖がドメインＡ１およびＡ３に結合した二価金属イオンを介して接続している。ドメインＡ２は、特異的なＦＩＸａ結合性部位を含有する。不活性ＦＸの結合性部位は、ドメインＡ１に位置する。したがって、活性ＦＶＩＩＩａは、ＦＩＸａとＦＸのメディエーターとして作用し得る。ＦＶＩＩＩａ自体は酵素活性を有さない。Ｂドメインは、全てのＦＶＩＩＩドメインの中で最も大きい。Ｂドメインは、高度にグリコシル化されており、細胞内プロセシングの間にフューリンプロテアーゼによって少なくとも部分的に取り除かれる。Ｂドメインは、ＦＶＩＩＩの細胞内輸送、標的化および分泌において役割を果たすと思われる。ＡドメインおよびＣドメインは球状構造を形成するが、Ｂドメインは直鎖構造として大部分がアンフォールディングされたままである。Ｂドメインはまた、その高度に極性のグリコシル化およびシャペロンとの相互作用に起因して、細胞内凝集体の形成の防止において主要な役割を果たすと思われる（Pipe  et  al.,  1998）。ＦＶＩＩＩにはＣドメインが２つ存在し、それぞれが、およそ１５０〜１６０アミノ酸を含有する。これらはどちらもＦＶＩＩＩ単鎖のＣ末端に存在する。Ｃ２ドメインの一部は疎水性領域を形成し、これは、リン脂質結合性部位として作用し、血液凝固の間のテナーゼ複合体の形成のために重要である（Mazurkiewicz-Pisarek  et  al.,  2016）。Ｃ１ドメインは、ｖＷＦとの結合強度に影響を及ぼすと思われる（Liu  et  al.,  2000）。
【００１０】
全体として、ヒト第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）は、第Ｘ因子の第Ｘａ因子への変換において第ＩＸａ因子の補助因子としての機能を果たすことによって血液凝固カスケードにおいて重要な役割を果たす血漿糖タンパク質である（Toole  et  al.,  1984、Vehar  et  al.,  1984）。ＦＶＩＩＩは、ドメイン構造ＮＨ２−Ａ１−ａ１−Ａ２−ａ２−Ｂ−ａ３−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２−ＣＯＯＨを含む大きな単鎖タンパク質（２３３２アミノ酸）として肝臓類洞細胞によって主に産生される（Do  et  al.,  1999）。Ｂドメインの変動する細胞内プロセシングおよび細胞外プロセシングの結果、血漿中を循環するヘテロ二量体の分子種の混合物が生じる。したがって、ＦＶＩＩＩは、一定のサイズの軽鎖（ＬＣ）（ａ３−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２）、および、Ａ１−ａ１−Ａ２−ａ２ドメインで最小に構成されるが、隣接するＢドメインの一部または全部の存在に起因してサイズが変動する重鎖（ＨＣ）を含有する（Jankowski  et  al,  2007）（図２Ｂ）。ＨＣとＬＣは、二価金属イオンを必要とする非共有結合性の連結によって会合している（Kaufman  et  al.,  1988、Fay  et  al.,  2006）。ＦＶＩＩＩは、フォン・ヴィルブランド因子（ｖＷＦ）と複合体を形成して循環している（Krishnaswamy  et  al.,  2015、Pipe  et  al.,  2016）。ＦＶＩＩＩは、トロンビンにより、ＨＣおよびＬＣの両方が特異的に切断されることによってその活性型（ＦＶＩＩＩａ）に変換される（Lenting  et  al.,  1998）。このタンパク質分解プロセスの間にＢドメインは完全に取り除かれる（Myles  et  al.,  2002）。
【００１１】
ＦＶＩＩＩ  Ｂドメインは、他の公知のタンパク質とアミノ酸相同性を有さず、重度にグリコシル化されており、また、凝血促進活性には必要ない（Fay  et  al.,  2006、Toole  et  al.,  1986）。しかし、ＦＶＩＩＩ  Ｂドメインは、S.W.  Pipe（Pipe  et  al.,  2009）によって詳細に検討されている通り、ＦＶＩＩＩの生活環全体を通して機能的影響を有することが示されている。Ｂドメインは、シャペロンと相互作用して正しいタンパク質フォールディングを補助すること（Pipe  et  al.,  1998）、および、カーゴ特異的選別受容体と主に炭水化物部分を介して相互作用して分泌効率を上昇させること（Pipe  et  al.,  2005、Zhang  et  al.,  2005）により、ＦＶＩＩＩの細胞内プロセシングおよび輸送において主要な役割を果たし得る。さらに、Ｂドメインはおそらく、早すぎるタンパク質分解を防止し（Khrenov  et  al.,  2006）、活性化された血小板に対する不活性ＦＶＩＩＩの親和性を低下させ（Li  et  al.,  1997）、したがって、循環ＦＶＩＩＩを保護する。Ｂドメインは、溶液中の全体的なＦＶＩＩＩ二次構造にはほとんど影響を及ぼさない（Grushin  et  al.,  2014）。ＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩの三次構造が唯一入手可能なことから（Shen  et  al.,  2008、Ngo  et  al.,  2008）、Ｂドメインの結晶化の難しさが示される。最近、Ｂドメインは低Ｃａ２＋濃度下でＦＶＩＩＩ分子のコアと密接に会合することが示されたので、非活性化条件下でのＢドメインの安定化機能が提唱された（Bonazza  et  al.,  2015）。
【００１２】
出血性障害は、傷害、外傷または外科手術後の血餅形成のプロセスにおけるあらゆる機能不良と定義される。血液凝固カスケードのあらゆる成分、すなわち、血液凝固因子、または一過性血小板血栓形成などの関連プロセスが影響を受ける可能性がある。全ての出血性障害で、共通して、血餅形成が実現されないかまたは部分的にのみ実現し、それにより、自然および／または拡張出血事象が導かれる。これらの疾患は、遺伝性の場合もあり、例えば薬の使用によるまたは他の疾患による後天性の場合もある。出血性障害の数例を以下に示す。
１．フォン・ヴィルブランド病は、フォン・ヴィルブランド因子の欠乏によって引き起こされる。結果として、ｖＷＦによって媒介される血小板接着が適正に働かない。
２．血友病Ａは、血液凝固第ＶＩＩＩ因子欠乏症に起因して生じる。一過性血小板接着および凝固の開始期は機能的であるが、凝固の伝播期における大規模トロンビン形成が進行できない。
３．血友病Ｂは、第ＩＸ因子欠乏症であり、血友病Ａと同様の症状が生じる。内因性テナーゼ複合体を形成することができず、それにより、因子ＦＸが大部分不活性のままになり、その結果、トロンビン活性化が非効率的になり、フィブリン生成が不十分になる。
【００１３】
血友病Ａは、凝固ＦＶＩＩＩ欠乏によって引き起こされる遺伝性出血性障害である。影響を受けるＦ８Ａ遺伝子はＸ染色体上に位置する。したがって、血友病Ａは、男性生殖細胞系列に主に影響を及ぼす伴性、劣性疾患である。最も一般的な原因は、相同組換えの結果としてのエクソン１〜２２の転座を伴う大きな逆位である（Mazurkiewicz-Pisarek  et  al.,  2016）。血友病Ａの突発の他の理由は、点突然変異、ならびに一般的ではないが観察される小さな欠失、挿入および逆位である。結果として、ＦＶＩＩＩタンパク質が全く発現されないか、またはタンパク質発現により、非機能的タンパク質が導かれる。傷害の場合、ｖＷＦによって媒介される、基礎をなす結合組織への血小板の接着を意味する一次止血が、適正に機能する。機能的ＦＶＩＩＩが存在しないことが、血液凝固カスケードの伝播期の間の問題を引き起こす最初の原因である。ＦＩＸａ、ＦＶＩＩＩａ、カルシウムイオンおよびリン脂質を含む内因性テナーゼ複合体を形成することができず、したがって、それが主に関与する因子ＦＸのＦＸａへの活性化を行うことができない。その結果、フィブリノーゲン切断に必要な活性なトロンビンが欠如する。血餅を強化する水不溶性フィブリン分子が形成されず、したがって、血餅が非常に不安定になり、破壊されやすくなる。全体として、ＦＶＩＩＩの欠損または欠乏の結果、最も一般的な重症出血性障害である血友病Ａが生じる（Mannucci  et  al.,  2004）。
【００１４】
血友病Ａは、血液中に存在する機能的な因子ＦＶＩＩＩの量によって分類される、３つの重症度の形態に分けられる。機能的ＦＶＩＩＩの量は、その活性によって定義され、これは、二段階凝固アッセイによって、またはより好ましくは発色アッセイによって決定することができる。発色アッセイの基本原理を以下に記載する。第ＶＩＩＩ因子活性が非血友病Ａ患者におけるＦＶＩＩＩ活性の５〜４０％に対応する５〜４０ＩＵ／ｄＬである患者は、一般に、軽症型血友病Ａ患者とみなされる。自然出血事象はほとんどないが、外科手術後の出血はごく一般的である。中等症型血友病Ａは、ＦＶＩＩＩ活性が１〜５ＩＵ／ｄＬ（正常の１〜５％）であることによって定義される。自然出血は低頻度で起こり、関節出血が時々生じるが、全ての中等症型患者が影響を受けるわけではない。重症型血友病Ａ患者は、１ＩＵ／ｄＬ未満の機能的ＦＶＩＩＩ（正常の＜１％）を示す。これらの患者では、身体活動中の自然筋肉内出血および関節内出血が生じる。再発する関節出血により、炎症が導かれる恐れがあり、さらにその結果として関節症および機能障害が導かれる恐れがある（Valentino,  2010）。
【００１５】
血友病Ａの患者の、健康を脅かし、生活の質を低下させる疾患の増悪および関連する結果を防止するために、有効な治療の利用をもたらすことが必要である。一般に使用される薬物、ならびに、新しく開発段階にある薬物のいくつかの例を以下に示す。
【００１６】
欠乏した血液凝固因子、例えばＦＶＩＩＩの投与は、補充療法（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｏｒ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ）と称される。補充療法は、予防のため、および急性出血の場合にオンデマンド治療として使用される。予防は、疾患に関連する関節破壊を防止するために、できるだけ早く開始すべきである。２つの異なる群の補充薬が存在する。血漿由来ＦＶＩＩＩを大きな血漿プールから分離し、その後、凍結乾燥させ、それにより、濃縮させる。しかし、少なくとも理論的には、これらの薬剤から生じるウイルスまたはプリオンなどの感染因子のリスクがある。組換えＦＶＩＩＩは、哺乳動物細胞株に由来し、哺乳動物細胞株において産生され、また、ヒト血漿と接触していないので、はるかに安全であると考えられている。抗血友病因子ＦＶＩＩＩの供給源にかかわらず、幾分短い半減期およびこれらの薬物に対する抗体の発生という主要な欠点が残っている。血液中のＦＶＩＩＩの典型的な半減期は、およそ８〜１２時間であり、これにより、１週間当たり２〜３回という極めて頻繁な投与が必要になる。別の不都合は、免疫応答を急速に開始する抗体が発生すること、およびそれによる補充の低下である。
【００１７】
新しい手法は、半減期の増大を目的とするものである。ＦＶＩＩＩにポリエチレングリコールポリマーを付加すること、またはＦＶＩＩＩをヒトアルブミンもしくはＩｇＧのＦｃ領域などの半減期がより長いタンパク質と融合することにより、半減期の増大が導かれたが、この改善は、ネイティブな因子ＦＶＩＩＩと比較して平均でたった１．５倍であった（Peyvandi  et  al.,  2016）。
【００１８】
上記の通り、組換えタンパク質技術により、タンパク質補充療法によって血友病Ａを処置するための組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）製品の開発および生産が導かれた。これらの製品は、主に、Ｂドメインが存在するかしないかによって互いと区別され、それぞれ全長（ＦＬ−）ｒＦＶＩＩＩおよびＢドメイン欠失（ＢＤＤ−）ｒＦＶＩＩＩと称される（Jankowski  et  al.,  2007、D'Amici  et  al.,  2010、Thim  et  al.,  2010、Peters  et  al.,  2013、Kannicht  et  al.,  2013）。
【００１９】
タンパク質治療薬であるＦＶＩＩＩは、他のタンパク質に基づく治療薬と同じリスク、特に、製造、貯蔵および診療所における取扱いの間に凝集する傾向にさらされる（Joubert  et  al.,  2011、Roberts  et  al.,  2014）。臨床の場におけるタンパク質治療薬に関して、凝集体が存在することにより、患者において、治療の有効性に影響を及ぼし得る望ましくない免疫応答が誘導される可能性があることが実証されている（Moussa  et  al.,  2016、Hermeling  et  al.,  2003、van  Beers  et  al.,  2010、Barnard  et  al.,  2013、Robbins  et  al.,  1987a、Robbins  et  al.,  1987b、Maislos  et  al.,  1986、Ahmadi  et  al.,  2015、Joubert  et  al.,  2012）。
【００２０】
非補充療法は、異なる戦略に従う。以下の２つの手法は、失われた凝固因子を補充するのではなく、止血を改善しようとするものである。組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）を標的とするモノクローナル抗体によりＴＦＰＩの阻害効果が低下し、それにより、組織因子経路が活性な状態に維持される。第２の戦略では、ＦＩＸａおよびＦＸの両方に結合し、それにより、ＦＶＩＩＩａの補助因子の役割を模倣することができる二重特異性抗体を適用することにより、ＦＶＩＩＩの非存在を回避する。ＦＩＸａ−二重特異性抗体−ＦＸで構成される人工テナーゼ複合体を形成し、因子ＦＸを活性化してＦＸａにすることができる。完全に異なる手法は遺伝子治療である。遺伝子治療は、重症度の持続的な低下を目的とするので、予防的というよりも治癒的である。非機能的Ｆ８遺伝子を置き換え、機能的な血液凝固ＦＶＩＩＩの発現を可能にするために、機能的なＦ８遺伝子を肝細胞−ＦＶＩＩＩ産生の部位に送達し、組み込むためにウイルスベクターが使用される。
【００２１】
組換えＦＶＩＩＩ製品であるＡＤＶＡＴＥは、血友病Ａ治療のために最も広範囲にわたって研究され、最も一般的に使用されており、副作用および有害事象の発生率が低い補充薬の１つである（ＦＤＡ  Ａｐｐｒｏｖａｌ  ２００３に従う）。したがって、ＡＤＶＡＴＥは、安全かつ効率的な薬剤であると考えられる。
【００２２】
哺乳動物細胞培養物において産生される組換え抗血友病ＦＶＩＩＩの、血漿由来ヒトＦＶＩＩＩに対する類似性を組成の観点でさらに調査するため、および主要な亜種全ての性質ならびに挙動を特徴付けるためには、適切な量の各ＦＶＩＩＩ亜種を十分な純度で生成することが必要である。これらの精製されたＦＶＩＩＩ亜種の１つもしくは複数、またはこれらの混合物を治療に使用することもできる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２３】
【非特許文献１】Clemetson,  K.  J.  (2012).  Platelets  and  primary  haemostasis.  Thrombosis  Research,  129(3):220-224.
【非特許文献２】ExPASy  (2016).  ProtParam  Entry  number  P00451.  http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam.  [Online;  accessed  12-September-2016]
【非特許文献３】OBrien,  D.  and  Tuddenham,  E.  (1997).  The  structure  and  function  of  factor  VIII.  Journal  of  Haemostasis  and  Thrombosis,  pages  333-348.
【非特許文献４】Pipe,  S.,  Morris,  J.,  Shah,  J.,  and  Kaufman,  R.  (1998).  Differential  interaction  of  coagulation  factor  VIII  and  factor  V  with  protein  chaperones  calnexin  and  calreticulin.  The  Journal  of  Biological  Chemistry,  273(14):8537-8544.
【非特許文献５】Mazurkiewicz-Pisarek,  A.,  Pucienniczak,  G.,  Ciach,  T.,  and  Pucienniczak,  A.  (2016).  The  factor  VIII  protein  and  its  function.  Acta  Biochimica  Polonica,  63(1):11-16.
【非特許文献６】Liu,  M.,  Shen,  B.,  Nakaya,  S.,  Pratt,  K.,  Fujikawa,  K.,  Davie,  E.,  Stoddard,  B.,  and  Thompson,  A.  (2000).  Hemophilic  factor  VIII  C1-  and  C2-domain  missense  mutations  and  their  modeling  to  the  1.5-angstrom  human  C2-domain  crystal  structure.  Blood  Journal,  96(3):979-987.
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【非特許文献４４】Joubert  MK,  Hokom  M,  Eakin  C,  Zhou  L,  Deshpande  M,  Baker  MP,  et  al.  Highly  aggregated  antibody  therapeutics  can  enhance  the  in  vitro  innate  and  late-stage  T-cell  immune  responses.  J  Biol  Chem.  2012;287(30):25266-79.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
したがって、本発明は、クロマトグラフィーステップに基づく精製戦略を提供する。精製戦略は、以下が可能なものであることが好ましい：
１．十分な量の各ＦＶＩＩＩ亜種をもたらすこと。
２．最終製剤中の十分なＦＶＩＩＩ亜種タンパク質濃度をもたらすこと。
３．例えば、その後の免疫学的研究において信頼できる結果をもたらすことができるように、不純物とみなされる他のＦＶＩＩＩ亜種の量が十分に低い最終製剤をもたらすこと。最終生成物は、無菌かつ生物学的夾雑物を含まないものであるべきである。
４．最終的なＦＶＩＩＩ亜種画分は、定義されたマトリックス、例えば、定義されたｐＨで塩ならびに界面活性物質を含めたバッファー成分を含有するマトリックス中に提供される。
５．さらに、本発明において有用であると評価されたプロセスのステップは、十分な量の生成物の生成を確実にするために分取スケールに容易にアップグレード可能である。
【００２５】
本発明は、スモールスケールクロマトグラフィーカラムに対する実現可能性実験の形態の初期開発期、ならびに分取スケールへのスケールアッププロセスおよび各ＦＶＩＩＩ亜種の最終生成スキームに関する。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
発明の説明
本発明は、上記の必要性を満たし、当技術分野における上記の問題を、下記の実施形態を提供することによって解決する。
【００２７】
特に、第ＶＩＩＩ因子を含む組成物から第ＶＩＩＩ因子亜種を精製するための方法を開発するための取り組みにおいて、本発明者らは、２つのクロマトグラフィーステップ、すなわち、アニオン交換クロマトグラフィーステップおよびサイズ排除クロマトグラフィーステップ、その後、別のアニオン交換クロマトグラフィーステップであってよい濃縮ステップを使用することにより、前記第ＶＩＩＩ因子亜種を高い純度および高濃度で含む組成物がもたらされることを見出した。驚いたことに、本発明者らは、さらに、第ＶＩＩＩ因子を含む組成物のフューリンプロテアーゼ処理ならびにグラジエントの長さを延長したリニアグラジエント溶出による第１のアニオン交換クロマトグラフィーステップの実施により、クロマトグラフィーの間の第ＶＩＩＩ因子亜種の分離がさらに改善され、したがって、前記第ＶＩＩＩ因子亜種をさらに高い純度および濃度で含む組成物がもたらされることを見出した。
【００２８】
さらなる実験において、本発明者らは、本発明に従って得られた精製された第ＶＩＩＩ因子亜種を特徴付けた。驚いたことに、本発明者らは、精製されたｒＦＶＩＩＩ種およびその混合物全てで、精製されていない出発材料と比較して活性の増大が示されることを見出した。さらに、本発明者らは、Ｂドメインの７０％を含有する第ＶＩＩＩ因子亜種は、Ｂドメイン全体を欠く第ＶＩＩＩ因子亜種よりも凝集する傾向が有意に低く、オリゴマーを形成する傾向が高いことを示したことを見出した。したがって、本発明の方法に従って得られる精製された第ＶＩＩＩ因子亜種は、潜在的に、改善された性質を有する薬学的に活性な組成物（すなわち、医薬）に製剤化することができる。薬学的に活性な組成物は、単一の精製されたＦＶＩＩＩ亜種を含有し得る。あるいは、精製されたＦＶＩＩＩ亜種の２つまたはそれよりも多くを、例えば、ｐｄＦＶＩＩＩにおいて、または患者を処置するために現在使用されているｒＦＶＩＩＩ製品において見出されるものと同じＦＶＩＩＩ亜種の比率で混合することができる。そのような薬学的に活性な組成物を、血友病Ａなどの出血性障害を有する患者を処置するために使用することができる。
【００２９】
追加的な実験において、本発明者らは、驚いたことに、組換えＦＶＩＩＩのフューリン処理により、亜種精製をしない場合であってもＦＶＩＩＩの活性が増大することを見出した。
【００３０】
全体として、本発明は、以下の項目１から８６までに列挙する好ましい実施形態を提供することにより、第ＶＩＩＩ因子を含む組成物から第ＶＩＩＩ因子亜種を精製するための改善された手段を提供する：
【００３１】
１．第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）亜種を、ＦＶＩＩＩを含む組成物から精製するための方法であって、
（１）ＦＶＩＩＩを含む組成物をアニオン交換クロマトグラフィーに供し、前記ＦＶＩＩＩ亜種を含む溶出液を収集するステップと、
（２）前記ＦＶＩＩＩ亜種を含むステップ（１）の溶出液をサイズ排除クロマトグラフィーに供し、前記ＦＶＩＩＩ亜種を含む溶出液を収集するステップと、
（３）前記ＦＶＩＩＩ亜種を含むステップ（２）の溶出液を濃縮するステップと
を含む方法。
【００３２】
２．濃縮ステップ（３）が、前記ＦＶＩＩＩ亜種を含むステップ（２）の溶出液をアニオン交換クロマトグラフィーに供し、前記ＦＶＩＩＩ亜種を含む溶出液を収集するステップである、項目１に記載の方法。
【００３３】
３．ＦＶＩＩＩが組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）であり、ＦＶＩＩＩ亜種が組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）亜種である、項目１または２に記載の方法。
【００３４】
４．ＦＶＩＩＩ亜種が、ＦＶＩＩＩ軽鎖と会合したＦＶＩＩＩ重鎖である、項目１から３までのいずれか１つに記載の方法。
【００３５】
５．ＦＶＩＩＩ亜種が、ＦＶＩＩＩ軽鎖と会合したＦＶＩＩＩ  １８０ｋＤａ重鎖である、項目１から４までのいずれか１つに記載の方法。
【００３６】
６．ＦＶＩＩＩ亜種が、ＦＶＩＩＩ軽鎖と会合したＦＶＩＩＩ  １５０ｋＤａ重鎖である、項目１から４までのいずれか１つに記載の方法。
【００３７】
７．ＦＶＩＩＩ亜種が、ＦＶＩＩＩ軽鎖と会合したＦＶＩＩＩ  １１０ｋＤａ重鎖である、項目１から４までのいずれか１つに記載の方法。
【００３８】
８．ＦＶＩＩＩ亜種が、ＦＶＩＩＩ軽鎖と会合したＦＶＩＩＩ  ９０ｋＤａ重鎖である、項目１から４までのいずれか１つに記載の方法。
【００３９】
９．ステップ（１）において、ビーズサイズが２０μｍ未満の高分解能Ｑ−樹脂をアニオン交換クロマトグラフィーに使用する、項目１から８までのいずれか１つに記載の方法。
【００４０】
１０．ビーズサイズが２０μｍ未満の高分解能Ｑ−樹脂が、ＭｏｎｏＱ樹脂である、項目９に記載の方法。
【００４１】
１１．ステップ（２）において、分解能が１００００Ｄａ〜６００００Ｄａにわたるサイズ排除クロマトグラフィー樹脂をサイズ排除クロマトグラフィーに使用する、項目１から１０までのいずれか１つに記載の方法。
【００４２】
１２．分解能が１００００Ｄａ〜６００００Ｄａにわたるサイズ排除クロマトグラフィー樹脂が、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｐｇ樹脂である、項目１１に記載の方法。
【００４３】
１３．ステップ（３）において、ＳｏｕｒｃｅＱ樹脂をアニオン交換クロマトグラフィーに使用する、項目２から１２までのいずれか１つに記載の方法。
【００４４】
１４．ステップ（１）の前に以下のステップ（０）：
（０）組成物中に含まれるＦＶＩＩＩをフューリンプロテアーゼ処理に供するステップ
をさらに含む、項目１から１３までのいずれか１つに記載の方法。
【００４５】
１５．フューリンプロテアーゼ処理を、フューリンを１００ＩＵ／ｍＬよりも高い最終濃度で使用して実施する、項目１４に記載の方法。
【００４６】
１６．ステップ（０）の後に以下のステップ（０’）：
（０’）ＦＶＩＩＩを含む組成物を、孔径が約０．２μｍのフィルターを通して濾過するステップ
をさらに含む、項目１４または１５に記載の方法。
【００４７】
１７．ＦＶＩＩＩ軽鎖が、ＦＶＩＩＩ  ８０ｋＤａ軽鎖である、項目１４から１６までのいずれか１つに記載の方法。
【００４８】
１８．ステップ（１）の溶出をリニアグラジエント溶出によって実施する、項目１から１７までのいずれか１つに記載の方法。
【００４９】
１９．ステップ（１）において、リニアグラジエント溶出のグラジエントの長さが少なくとも約１６カラム体積である、項目１８に記載の方法。
【００５０】
２０．ステップ（１）において、リニアグラジエント溶出のグラジエントの長さが少なくとも約２４カラム体積である、項目１８に記載の方法。
【００５１】
２１．ステップ（１）において、リニアグラジエント溶出のグラジエントの長さが少なくとも約３２カラム体積である、項目１８に記載の方法。
【００５２】
２２．ステップ（１）において、溶出を、エチレングリコールを含むバッファーを使用して実施する、項目１から２１までのいずれか１つに記載の方法。
【００５３】
２３．ステップ（１）において、溶出を、エチレングリコールを含むバッファーを約１０％（ｖ／ｖ）の濃度で使用して実施する、項目２２に記載の方法。
【００５４】
２４．ステップ（２）を、
（２）前記ＦＶＩＩＩ亜種を含むステップ（１）の溶出液を疎水性相互作用クロマトグラフィーに供するステップ
で置き換える、項目１から２３までのいずれか１つに記載の方法。
【００５５】
２５．ステップ（２）の前に以下のステップ（１’）：
（１’）ステップ（１）の溶出液に含まれるＦＶＩＩＩ亜種をフューリンプロテアーゼ処理に供するステップ
をさらに含む、項目２４に記載の方法。
【００５６】
２６．フューリンプロテアーゼ処理を、フューリンを１００ＩＵ／ｍＬよりも高い最終濃度で使用して実施する、項目２５に記載の方法。
【００５７】
２７．ステップ（１’）の後に、以下のステップ（１’’）：
（１’’）前記ＦＶＩＩＩ亜種を含む溶出液を、孔径が約０．２μｍのフィルターを通して濾過するステップ
をさらに含む、項目２５または２６に記載の方法。
【００５８】
２８．ＦＶＩＩＩ軽鎖が、ＦＶＩＩＩ  ８０ｋＤａ軽鎖である、項目２５から２７までのいずれか１つに記載の方法。
【００５９】
２９．疎水性相互作用クロマトグラフィーが、ネガティブモードクロマトグラフィーである、項目２４から２８までのいずれか１つに記載の方法。
【００６０】
３０．ＦＶＩＩＩ亜種が、ＦＶＩＩＩ軽鎖と会合したＦＶＩＩＩ  １５０ｋＤａ重鎖である、項目２４から２９までのいずれか１つに記載の方法。
【００６１】
３１．ＦＶＩＩＩ亜種が、ＦＶＩＩＩ軽鎖と会合したＦＶＩＩＩ  １８０ｋＤａ重鎖である、項目２４から２９までのいずれか１つに記載の方法。
【００６２】
３２．ステップ（３）の溶出をステップグラジエント溶出によって実施する、項目２から３１までのいずれか１つに記載の方法。
【００６３】
３３．ＦＶＩＩＩ亜種がＦＶＩＩＩ  ９０ｋＤａ重鎖であり、方法のステップ（２）を省略し、ステップ（３）において、前記ＦＶＩＩＩ亜種を含むステップ（１）の溶出液で前記ＦＶＩＩＩ亜種を含むステップ（２）の溶出液を置き換える、項目１から４まで、９、１０、１３から２３まで、または３２のいずれか１つに記載の方法。
【００６４】
３４．項目１から３３までのいずれか１つに従って入手可能な精製されたＦＶＩＩＩ亜種を含む組成物。
【００６５】
３５．組成物中の精製されたＦＶＩＩＩ亜種の組成物中の他の全てのＦＶＩＩＩ亜種に対する重量比が少なくとも９である、項目３４に記載の精製されたＦＶＩＩＩ亜種を含む組成物。
【００６６】
３６．組成物中の精製されたＦＶＩＩＩ亜種の組成物中の他の全てのＦＶＩＩＩ亜種に対する重量比が少なくとも８である、項目３４に記載の精製されたＦＶＩＩＩ亜種を含む組成物。
【００６７】
３７．精製されたＦＶＩＩＩ亜種の濃度が少なくとも０．１ｍｇ／ｍＬである、項目３４から３６までのいずれか１つに記載の精製されたＦＶＩＩＩ亜種を含む組成物。
【００６８】
３８．精製されたＦＶＩＩＩ亜種の濃度が少なくとも０．３ｍｇ／ｍＬである、項目３４から３６までのいずれか１つに記載の精製されたＦＶＩＩＩ亜種を含む組成物。
【００６９】
３９．精製された第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）亜種を含む組成物。
【００７０】
４０．ＦＶＩＩＩが組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）であり、ＦＶＩＩＩ亜種が組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）亜種である、項目３９に記載の組成物。
【００７１】
４１．ＦＶＩＩＩ亜種が、ＦＶＩＩＩ軽鎖と会合したＦＶＩＩＩ  １８０ｋＤａ重鎖、ＦＶＩＩＩ軽鎖と会合したＦＶＩＩＩ  １５０ｋＤａ重鎖、ＦＶＩＩＩ軽鎖と会合したＦＶＩＩＩ  １１０ｋＤａ重鎖、またはＦＶＩＩＩ軽鎖と会合したＦＶＩＩＩ  ９０ｋＤａ重鎖である、項目３９または４０に記載の組成物。
【００７２】
４２．組成物中の精製されたＦＶＩＩＩ亜種の組成物中の他の全てのＦＶＩＩＩ亜種に対する重量比が、少なくとも９、または少なくとも８である、項目３９から４１までのいずれか１つに記載の組成物。
【００７３】
４３．精製されたＦＶＩＩＩ亜種の濃度が、少なくとも０．１ｍｇ／ｍＬ、または少なくとも０．３ｍｇ／ｍＬである、項目３９から４２までのいずれか１つに記載の組成物。
【００７４】
４４．医薬として使用するための、項目３４から４３までのいずれか１つに記載の組成物。
【００７５】
４５．出血性障害の処置に使用するための、項目３４から４４までのいずれか１つに記載の組成物。
【００７６】
４６．血友病Ａの処置に使用するための、項目３４から４５までのいずれか１つに記載の組成物。
【００７７】
４７．いくつかのタンパク質またはタンパク質のいくつかのサブユニットを含む組成物からタンパク質またはタンパク質のサブユニットを精製するための方法であって、
（１）タンパク質またはタンパク質のサブユニットを含む組成物をアニオン交換クロマトグラフィーに供し、前記タンパク質またはタンパク質のサブユニットを含む溶出液を収集するステップと、
（２）前記タンパク質またはタンパク質のサブユニットを含むステップ（１）の溶出液をサイズ排除クロマトグラフィーに供し、前記タンパク質またはタンパク質のサブユニットを含む溶出液を収集するステップと、
（３）前記タンパク質またはタンパク質のサブユニットを含むステップ（２）の溶出液を濃縮するステップと
を含む方法。
【００７８】
４８．濃縮ステップ（３）が、前記タンパク質またはタンパク質のサブユニットを含むステップ（２）の溶出液をアニオン交換クロマトグラフィーに供し、前記タンパク質またはタンパク質のサブユニットを含む溶出液を収集するステップである、項目４７に記載の方法。
【００７９】
４９．タンパク質またはタンパク質のサブユニットが、組換えタンパク質またはタンパク質の組換えサブユニットである、項目４７または４８に記載の方法。
【００８０】
５０．ステップ（１）において、ビーズサイズが２０μｍ未満の高分解能Ｑ−樹脂をアニオン交換クロマトグラフィーに使用する、項目４７から４９までのいずれか１つに記載の方法。
【００８１】
５１．ビーズサイズが２０μｍ未満の高分解能Ｑ−樹脂が、ＭｏｎｏＱ樹脂である、項目５０に記載の方法。
【００８２】
５２．ステップ（２）において、分解能が１００００Ｄａ〜６００００Ｄａにわたるサイズ排除クロマトグラフィー樹脂をサイズ排除クロマトグラフィーに使用する、項目４７から５１までのいずれか１つに記載の方法。
【００８３】
５３．分解能が１００００Ｄａ〜６００００Ｄａにわたるサイズ排除クロマトグラフィー樹脂が、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｐｇ樹脂である、項目５２に記載の方法。
【００８４】
５４．ステップ（３）において、ＳｏｕｒｃｅＱ樹脂をアニオン交換クロマトグラフィーに使用する、項目４８から５３までのいずれか１つに記載の方法。
【００８５】
５５．ステップ（１）の前に以下のステップ（０）：
（０）組成物に含まれるタンパク質またはタンパク質のサブユニットをフューリンプロテアーゼ処理に供するステップ
をさらに含む、項目４７から５４までのいずれか１つに記載の方法。
【００８６】
５６．フューリンプロテアーゼ処理を、フューリンを１００ＩＵ／ｍＬよりも高い最終濃度で使用して実施する、項目５５に記載の方法。
【００８７】
５７．ステップ（０）の後に以下のステップ（０’）：
（０’）タンパク質またはタンパク質のサブユニットを含む組成物を、孔径が約０．２μｍのフィルターを通して濾過するステップ
をさらに含む、項目５５または５６に記載の方法。
【００８８】
５８．ステップ（１）の溶出をリニアグラジエント溶出によって実施する、項目４７から５７までのいずれか１つに記載の方法。
【００８９】
５９．ステップ（１）において、リニアグラジエント溶出のグラジエントの長さが少なくとも約１６カラム体積である、項目５８に記載の方法。
【００９０】
６０．ステップ（１）において、リニアグラジエント溶出のグラジエントの長さが少なくとも約２４カラム体積である、項目５８に記載の方法。
【００９１】
６１．ステップ（１）において、リニアグラジエント溶出のグラジエントの長さが少なくとも約３２カラム体積である、項目５８に記載の方法。
【００９２】
６２．ステップ（１）において、溶出を、エチレングリコールを含むバッファーを使用して実施する、項目４７から６１までのいずれか１つに記載の方法。
【００９３】
６３．ステップ（１）において、溶出を、エチレングリコールを含むバッファーを約１０％（ｖ／ｖ）の濃度で使用して実施する、項目６２に記載の方法。
【００９４】
６４．ステップ（２）を、
（２）前記タンパク質またはタンパク質のサブユニットを含むステップ（１）の溶出液を疎水性相互作用クロマトグラフィーに供するステップ
で置き換える、項目４７から６３までのいずれか１つに記載の方法。
【００９５】
６５．ステップ（２）の前に以下のステップ（１’）：
（１’）ステップ（１）の溶出液に含まれるタンパク質またはタンパク質のサブユニットをフューリンプロテアーゼ処理に供するステップ
をさらに含む、項目６４に記載の方法。
【００９６】
６６．フューリンプロテアーゼ処理を、フューリンを１００ＩＵ／ｍＬよりも高い最終濃度で使用して実施する、項目６５に記載の方法。
【００９７】
６７．ステップ（１’）の後に、以下のステップ（１’’）：
（１’’）前記タンパク質またはタンパク質のサブユニットを含む溶出液を、孔径が約０．２μｍのフィルターを通して濾過するステップ
をさらに含む、項目６５または６６に記載の方法。
【００９８】
６８．疎水性相互作用クロマトグラフィーがネガティブモードクロマトグラフィーである、項目６４から６７までのいずれか１つに記載の方法。
【００９９】
６９．ステップ（３）の溶出をステップグラジエント溶出によって実施する、項目４７から６８までのいずれか１つに記載の方法。
【０１００】
７０．方法のステップ（２）を省略し、ステップ（３）において、前記タンパク質またはタンパク質のサブユニットを含むステップ（１）の溶出液で前記タンパク質またはタンパク質のサブユニットを含むステップ（２）の溶出液を置き換える、項目４７から５１まで、５４から６３まで、または６９のいずれか１つに記載の方法。
【０１０１】
７１．項目４７から７１までのいずれか１つに従って入手可能な精製されたタンパク質またはタンパク質のサブユニットを含む組成物。
【０１０２】
７２．組成物中の精製されたタンパク質またはタンパク質のサブユニットの組成物中の他の全てのタンパク質またはタンパク質のサブユニットに対する重量比が少なくとも９である、項目７１に記載の精製されたタンパク質またはタンパク質のサブユニットを含む組成物。
【０１０３】
７３．組成物中の精製されたタンパク質またはタンパク質のサブユニットの組成物中の他の全てのタンパク質またはタンパク質のサブユニットに対する重量比が少なくとも８である、項目７１に記載の精製されたタンパク質またはタンパク質のサブユニットを含む組成物。
【０１０４】
７４．精製されたタンパク質またはタンパク質のサブユニットの濃度が、少なくとも０．１ｍｇ／ｍＬである、項目７１から７３までのいずれか１つに記載の精製されたタンパク質またはタンパク質のサブユニットを含む組成物。
【０１０５】
７５．精製されたタンパク質またはタンパク質のサブユニットの濃度が、少なくとも０．３ｍｇ／ｍＬである、項目７１から７３までのいずれか１つに記載の精製されたタンパク質またはタンパク質のサブユニットを含む組成物。
【０１０６】
７６．医薬として使用するための、項目７１から７５までのいずれか１つに記載の組成物。
【０１０７】
７７．第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）をフューリンプロテアーゼ処理に供する方法。
【０１０８】
７８．ＦＶＩＩＩが組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）である、項目７７に記載の方法。
【０１０９】
７９．ＦＶＩＩＩが単鎖ＦＶＩＩＩを含む、項目７７または７８に記載の方法。
【０１１０】
８０．フューリンプロテアーゼ処理を、フューリンを１００ＩＵ／ｍＬよりも高い最終濃度で使用して実施する、項目７７から７９までのいずれか１つに記載の方法。
【０１１１】
８１．ＦＶＩＩＩからフューリンプロテアーゼを分離するステップをさらに含む、項目７７から８０までのいずれか１つに記載の方法。
【０１１２】
８２．ＦＶＩＩＩの活性を増大させるためのものである、項目７７から８１までのいずれか１つに記載の方法。
【０１１３】
８３．ＦＶＩＩＩが、項目７７から８２までのいずれか１つに従って入手可能である、ＦＶＩＩＩを含む組成物。
【０１１４】
８４．医薬として使用するための、項目８３に記載のＦＶＩＩＩを含む組成物。
【０１１５】
８５．出血性障害の処置に使用するための、項目８３または８４に記載のＦＶＩＩＩを含む組成物。
【０１１６】
８６．血友病Ａの処置に使用するための、項目８３から８５までのいずれか１つに記載のＦＶＩＩＩを含む組成物。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】図１は、右側に組織因子依存性または外因系経路および左側に接触活性化または内因系経路を含み、黒色矢印がそれぞれの血液凝固因子の活性化を示し、「ｆｅｅｄ  ｆｒｏｗ．」および「ｉｎａｃｔ．」と記された断続線がそれぞれフィードフォワード不活化効果を示す、血液凝固カスケードを示す図である。図はSchaller  et  al.  (2008)に基づく。
【０１１８】
【図２】図２は、（Ａ）上部に第ＶＩＩＩ因子単鎖分子の、それに由来する重鎖断片を左側、および軽鎖断片を右側に示す概略図である。図は（Schaller  et  al.  ,2008）に基づく。特定のタンパク質ドメインＡ１、Ａ２、Ｂ、Ａ３およびＣ１プラスＣ２が異なる灰色の濃淡で示されている。Ｂドメインが重鎖断片および軽鎖断片に異なる程度に分布している。色付きのドメイン領域間の白色の空間は、異なる機能を有する高度に酸性の配列を表す。（Ｂ）ＦＶＩＩＩの不均一性および分子種。ＦＶＩＩＩのドメイン構造。角括弧は、ＦＬ−ＦＶＩＩＩに存在する末端アミノ酸を有する主要なＨＣ／Ｂドメイン種を示す。
【０１１９】
【図３】図３は、（１）一点鎖線で示されている定組成溶出、（２）断続線で示されているステップ溶出、および（３）実線で示されているグラジエント溶出である３つの最も一般的な型の溶出方式の概略図である。
【０１２０】
【図４】図４は、標準バッファーＱＡ１およびＱＢ１を用いてｐＨ６．７で分離した、ＡＩＥＸ  Ｍｏｎｏ  １０Ｑ樹脂でのＦＶＩＩＩ分子亜種の溶出相のクロマトグラムである。グラジエント：８カラム体積において１３５．０〜７５０．０ｍＭの塩化ナトリウム。カラム寸法：内径０．５ｃｍ×ベッド高５．０ｃｍ、カラム体積０．９８ｍＬ。
【０１２１】
【図５】図５は、標準バッファーＱＡ１およびＱＢ１を用いてｐＨ６．７で分離した、Ｍｏｎｏ  １０Ｑ樹脂でのＦＶＩＩＩ分子亜種の分離のＳＤＳ  ｐａｇｅゲル電気泳動を示す図である。グラジエント：８カラム体積において１３５．０〜７５０．０ｍＭの塩化ナトリウム。Ｍ）分子量マーカー、ＡＳ）全ての関連する重鎖種および軽鎖種を示す、市販のＦＶＩＩＩ原薬である標準物質、ＳＢ）サンプルバッファー、画分Ｂ７〜Ｃ８、ＮＥ）溶出後液（posteluate）。上から下まで：全長単鎖（３００ｋＤａ）、１８０ｋＤａ重鎖、１５０ｋＤａの短縮型重鎖、１２０ｋＤａの伸長型軽鎖、１１０ｋＤａの短縮型重鎖、Ｂドメインを有さない９０ｋＤａ重鎖、８０ｋＤａの軽鎖。
【０１２２】
【図６】図６は、標準バッファーＱＡ１およびＱＢ１を用いてｐＨ６．７で分離した、ＡＩＥＸ  Ｍｏｎｏ  １０Ｑ樹脂でのＦＶＩＩＩ分子亜種分離のオーバーレイである。（１）グラジエント：８カラム体積において１３５．０〜７５０．０ｍＭの塩化ナトリウム、破線：電気伝導率、実線：２８０ｎｍにおける吸光度。（２）グラジエント：１６カラム体積において１３５．０〜７５０．０ｍＭの塩化ナトリウム、断続線：電気伝導率、点線：２８０ｎｍにおける吸光度。カラム寸法：内径０．５ｃｍ×ベッド高５．０ｃｍ、カラム体積０．９８ｍＬ。
【０１２３】
【図７】図７は、ｐＨ６．７におけるＡＩＥＸ  Ｍｏｎｏ  １０Ｑ樹脂でのＦＶＩＩＩ分子亜種分離のオーバーレイである。実線）：標準バッファーＱＡ１およびＱＢ１を用いた１６カラム体積において１３５．０〜７５０．０ｍＭの塩化ナトリウム、破線）グラジエント：ＱＡ１およびＱＢ１バッファーを含有する１０％エチレングリコールを用いた３２カラム体積において１３５．０〜７５０．０ｍＭの塩化ナトリウム。カラム寸法：内径０．５ｃｍ×ベッド高５．０ｃｍ、カラム体積０．９８ｍＬ。
【０１２４】
【図８】図８は、フューリン処理したＦＶＩＩＩ分子亜種およびフューリン処理していないＦＶＩＩＩ分子亜種の、標準バッファーＱＡ１およびＱＢ１を用いてｐＨ６．７で分離した、ＡＩＥＸ  Ｍｏｎｏ  １０Ｑ樹脂での分離のオーバーレイである。グラジエント：１６カラム体積において１３５．０〜７５０．０ｍＭの塩化ナトリウム。（１）フューリン処理を伴わない試料：断続線）電気伝導率、破線）２８０ｎｍにおける吸光度、（２）フューリン処理した試料：点線）電気伝導率、実線）２８０ｎｍにおける吸光度。カラム寸法：内径０．５ｃｍ×ベッド高５．０ｃｍ、カラム体積０．９８ｍＬ。
【０１２５】
【図９】図９は、フューリン処理したＦＶＩＩＩ分子亜種の、標準バッファーＱＡ１およびＱＢ１を用いてｐＨ６．７で分離した、ＡＩＥＸ  Ｍｏｎｏ  １０Ｑ樹脂での溶出相のクロマトグラムである。グラジエント：１６カラム体積において１３５．０〜７５０．０ｍＭの塩化ナトリウム。カラム寸法：内径０．５ｃｍ×ベッド高５．０ｃｍ、カラム体積０．９８ｍＬ。
【０１２６】
【図１０】図１０は、フューリン処理したＦＶＩＩＩ分子亜種の、標準バッファーＱＡ１およびＱＢ１を用いてｐＨ６．７で分離した、ＡＩＥＸ  Ｍｏｎｏ  １０Ｑ樹脂での分離のＳＤＳ  ｐａｇｅゲル電気泳動を示す図である。グラジエント：１６カラム体積において１３５．０〜７５０．０ｍＭの塩化ナトリウム。Ｍ）分子量マーカー、ＡＳ）全ての関連する重鎖種および軽鎖種を示す、市販のＦＶＩＩＩ原薬である標準物質、Ｌ）ロード、ＦＴ）フロースルー、Ｗ１）洗浄相１、Ｗ２）洗浄相２、Ｗ３）洗浄相３、ＶＥ）溶出前液（pre-eluate）、画分Ｂ５〜Ｃ７。
【０１２７】
【図１１】図１１は、フューリン処理したＦＶＩＩＩ分子亜種の、標準バッファーＱＡ１およびＱＢ１を用いてｐＨ６．７で分離した、ＡＩＥＸ  Ｍｏｎｏ  １０Ｑ樹脂での分離のＳＤＳ  ｐａｇｅゲル電気泳動を示す図である。グラジエント：１６カラム体積において１３５．０〜７５０．０ｍＭの塩化ナトリウム。Ｍ）分子量マーカー、ＡＳ）全ての関連する重鎖種および軽鎖種を示す、市販のＦＶＩＩＩ原薬である標準物質、画分Ｃ８〜Ｄ１２、ＮＥ）溶出後液。
【０１２８】
【図１２】図１２は、１１０ｋＤａの短縮型重鎖断片の、およそ３００ｍＭの塩化ナトリウムバッファーを用いてｐＨ６．７で分離した、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  Ｉｎｃｒｅａｓｅでのサイズ排除クロマトグラフィー最終精製を示すグラフである。カラム寸法：内径１．０ｃｍ×ベッド高３０．０ｃｍ、カラム体積２３．５６ｍＬ。
【０１２９】
【図１３】図１３は、ＭｏｎｏＱアニオン交換クロマトグラフィーによって得られた１１０ｋＤａの短縮型重鎖断片およびそれぞれの出発材料（画分Ｇ４、Ｇ５およびＧ６）を精製するためのＳＥＣステップのＳＤＳ  ｐａｇｅゲル電気泳動を示す図である。Ｍ）分子量マーカー、ＡＳ）全ての関連する重鎖種および軽鎖種を示す、市販のＦＶＩＩＩ原薬である標準物質、画分Ｃ４〜Ｅ２。
【０１３０】
【図１４】図１４は、１８０ｋＤａの全長重鎖の、およそ３００ｍＭの塩化ナトリウムバッファーを用いてｐＨ６．７で分離した、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  Ｉｎｃｒｅａｓｅでのサイズ排除クロマトグラフィー最終精製を示すグラフである。カラム寸法：内径１．０ｃｍ×ベッド高３０．０ｃｍ、カラム体積２３．５６ｍＬ。
【０１３１】
【図１５】図１５は、ＭｏｎｏＱアニオン交換クロマトグラフィーによって得られた１８０ｋＤａの全長重鎖断片およびそれぞれの出発材料（画分Ｆ４、Ｆ５およびＦ６）を精製するためのＳＥＣステップのＳＤＳ  ｐａｇｅゲル電気泳動を示す図である。Ｍ）分子量マーカー、ＡＳ）全ての関連する重鎖種および軽鎖種を示す、市販のＦＶＩＩＩ原薬である標準物質、画分Ｃ４〜Ｄ９。
【０１３２】
【図１６】図１６は、高性能フェニルセファロースで分離したＦＶＩＩＩ分子亜種の２次元溶出相のクロマトグラムである。１．グラジエント：２０カラム体積において６８０．０〜０．０ｍＭの塩化ナトリウム、２．グラジエント：１６カラム体積において０〜５０％エチレングリコール。カラム寸法：内径０．５ｃｍ×ベッド高５．０ｃｍ、カラム体積０．９８ｍＬ。
【０１３３】
【図１７】図１７は、フューリン処理した出発材料Ｂ１４３９００００−３０からＦＶＩＩＩ分子亜種を精製するための２次元ＨＩＣステップのＳＤＳ  ｐａｇｅゲル電気泳動を示す図である。Ｍ）分子量マーカー、ＡＳ）全ての関連する重鎖種および軽鎖種を示す、市販のＦＶＩＩＩ原薬である標準物質、ＦＴ）フロースルー、画分Ａ５〜Ｂ１２。図は、図１８に続く。
【０１３４】
【図１８】図１８は、フューリン処理した出発材料Ｂ１４３９００００−１０からＦＶＩＩＩ分子亜種を精製するための２次元ＨＩＣステップのＳＤＳ  ｐａｇｅゲル電気泳動を示す図である。Ｍ）分子量マーカー、ＡＳ）全ての関連する重鎖種および軽鎖種を示す、市販のＦＶＩＩＩ原薬である標準物質、画分Ｃ２〜Ｇ６。
【０１３５】
【図１９】図１９は、高性能フェニルセファロースで分離したＦＶＩＩＩ分子亜種の１次元溶出相のクロマトグラムである。グラジエント：４０カラム体積において６８０．０〜０．０ｍＭの塩化ナトリウム。カラム寸法：内径０．５ｃｍ×ベッド高５．０ｃｍ、カラム体積０．９８ｍＬ。
【０１３６】
【図２０】図２０は、フューリン処理した出発材料Ｂ１４３９００００−１０から１５０ｋＤａの短縮型重鎖断片を精製するための１次元ＨＩＣステップのＳＤＳ  ｐａｇｅゲル電気泳動を示す図である。Ｍ）分子量マーカー、ＡＳ）全ての関連する重鎖種および軽鎖種を示す、市販のＦＶＩＩＩ原薬である標準物質、ＦＴ）フロースルー、画分Ｂ２〜Ｇ１１。
【０１３７】
【図２１】図２１は、高性能フェニルセファロースで分離したＦＶＩＩＩ分子亜種のネガティブモード洗浄相および溶出相のクロマトグラムである。洗浄相：３０カラム体積に対して８６０ｍＭの塩化ナトリウム、ステップ溶出：１０カラム体積に対して０ｍＭの塩化ナトリウム。カラム寸法：内径０．５ｃｍ×ベッド高５．０ｃｍ、カラム体積０．９８ｍＬ。
【０１３８】
【図２２】図２２は、１５０ｋＤａの短縮型重鎖断片を精製するためのネガティブモードＨＩＣステップのＳＤＳ  ｐａｇｅゲル電気泳動を示す図である。Ｍ）分子量マーカー、ＡＳ）全ての関連する重鎖種および軽鎖種を示す、市販のＦＶＩＩＩ原薬である標準物質、画分Ａ１０〜Ｃ１２。
【０１３９】
【図２３】図２３は、ＦＶＩＩＩ分子亜種の分取精製プロセスの流れ図である。１８０ｋＤａ、１５０ｋＤａおよび１１０ｋＤａの分子量を有する亜種についての精製戦略は、ＡＩＥＸ（ＭｏｎｏＱ）およびＳＥＣ（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００）による２つの精製ステップ、ならびに、最終的に、ＡＩＥＸ（ＳｏｕｒｃｅＱ）による濃縮ステップを含む。Ｂドメイン枯渇重鎖断片にはサイズ排除クロマトグラフィーによるさらなる精製は必要なく、したがって、ＭｏｎｏＱ  ＡＩＥＸに適用し、その後、ＳｏｕｒｃｅＱ  ＡＩＥＸで濃縮する。
【０１４０】
【図２４】図２４は、ＭｏｎｏＱ樹脂で分離したＦＶＩＩＩ分子亜種の分取スケールアニオン交換クロマトグラフィー溶出相のクロマトグラムである。グラジエント溶出：３２カラム体積において１３５〜７５０ｍＭの塩化ナトリウム。カラム寸法：内径１．６ｃｍ×ベッド高１０．０ｃｍ、カラム体積２０．１６０ｍＬ。画分サイズ：Ｅ１：２２．６ｍＬ、Ｅ２：３１．５ｍＬ、Ｅ３：３４．６ｍＬ、Ｅ４：４３．７ｍＬ、Ｅ５：２８．９ｍＬ、Ｅ６：２２．９ｍＬ、Ｅ７：２６．１ｍＬ、Ｅ８：５３．１ｍＬ。
【０１４１】
【図２５】図２５は、ＦＶＩＩＩ分子亜種を精製するための分取アニオン交換クロマトグラフィーステップのＳＤＳ  ｐａｇｅゲル電気泳動を示す図である。Ｍ）分子量マーカー、ＡＳ）全ての関連する重鎖種および軽鎖種を示す、市販のＦＶＩＩＩ原薬である標準物質、Ｌ１）濾過前のロード、Ｌ２）濾過後のロード、ＦＴ）フロースルー、Ｗ１）洗浄ステップ１、Ｗ２）洗浄ステップ２、Ｗ３）洗浄ステップ３、ＶＢ）溶出前液、Ｅ１〜Ｅ８）溶出液プール１〜８、ＮＥ）溶出後液１、ＰＥ）溶出後液２。
【０１４２】
【図２６】図２６は、ＭｏｎｏＱ樹脂で分離したＦＶＩＩＩ分子亜種の分取スケールアニオン交換クロマトグラフィー溶出相のクロマトグラム。グラジエント溶出：３２カラム体積において１３５〜７５０ｍＭの塩化ナトリウム。カラム寸法：内径１．６ｃｍ×ベッド高１０．０ｃｍ、カラム体積２０．１６０ｍＬ。画分サイズ：Ｅ１：１１４．９ｍＬ、Ｅ２：２４．０ｍＬ、Ｅ３：２２．８ｍＬ、Ｅ４：８３．６ｍＬ。
【０１４３】
【図２７】図２７は、ＦＶＩＩＩ分子亜種を精製するための分取スケールアニオン交換クロマトグラフィーステップのＳＤＳ  ｐａｇｅゲル電気泳動を示す図である。Ｍ）分子量マーカー、ＡＳ）全ての関連する重鎖種および軽鎖種を示す、市販のＦＶＩＩＩ原薬である標準物質、Ｌ１）濾過前のロード、Ｌ２）濾過後のロード、ＦＴ）フロースルー、Ｗ１）洗浄ステップ１、Ｗ２）洗浄ステップ２、画分１．Ｅ６〜３．Ｂ５、ＰＥ）溶出後液。
【０１４４】
【図２８】図２８は、１８０ｋＤａの全長重鎖を精製するための分取スケールサイズ排除クロマトグラフィーのクロマトグラムである。カラム寸法：内径５．０ｃｍ×ベッド高９４．４ｃｍ、カラム体積１８５３．５４ｍＬ。画分サイズＥ１：７０．０ｍＬ。
【０１４５】
【図２９】図２９は、分取ＭｏｎｏＱアニオン交換クロマトグラフィーによって得られた１８０ｋＤａの全長重鎖を精製するための分取スケールサイズ排除クロマトグラフィーステップのＳＤＳ  ｐａｇｅゲル電気泳動を示す図である。Ｍ）分子量マーカー、ＡＳ）全ての関連する重鎖種および軽鎖種を示す、市販のＦＶＩＩＩ原薬である標準物質、画分Ｂ５〜Ｄ１。
【０１４６】
【図３０】図３０は、ＳｏｕｒｃｅＱ樹脂で濃縮された１８０ｋＤａの全長重鎖の分取スケールアニオン交換クロマトグラフィー溶出相のクロマトグラムである。ステップ溶出：３００ｍＭの塩化ナトリウム。カラム寸法：内径１．０ｃｍ×ベッド高３．９ｃｍ、カラム体積３．０６ｍＬ。画分サイズＥ１：６．９８ｍＬ。
【０１４７】
【図３１】図３１は、分取スケールサイズ排除クロマトグラフィーによって得られた１８０ｋＤａの全長重鎖を濃縮するためのＳｏｕｒｃｅＱ  ＡＩＥＸステップのＳＤＳ  ｐａｇｅゲル電気泳動、銀染色（左）およびＦＶＩＩＩウエスタンブロット（右）を示す図である。Ｍ）分子量マーカー、ＡＳ）全ての関連する重鎖種および軽鎖種を示す、市販のＦＶＩＩＩ原薬である標準物質、Ｌ）ロード、ＳＢ）サンプルバッファー、ＦＴ）フロースルー、Ｗ）洗浄相、ＶＥ）溶出前液、Ｅ１）１：１９８希釈（銀染色）および１：２６４希釈（ＦＶＩＩＩウエスタンブロット）での溶出液プール、Ｅ２）１：６６希釈（銀染色）および１：８８希釈（ＦＶＩＩＩウエスタンブロット）での溶出液プール、ＮＥ）溶出後液。
【０１４８】
【図３２】図３２は、（１）スモールスケールＳＥＣカラムＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  Ｉｎｃｒｅａｓｅ（実線）と分取スケールＳＥＣカラムＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  Ｐｒｅｐ  Ｇｒａｄｅ（破線）の性能比較。両方の曲線は、それぞれの、分子量１８０ｋＤａの全長重鎖の溶出相を示す。カラム寸法：（１）内径１．０ｃｍ×ベッド高３０．０ｃｍ、カラム体積２３．５６ｍＬ、（２）内径５．０ｃｍ×ベッド高９４．４ｃｍ、カラム体積１８５３．５４ｍＬ。
【０１４９】
【図３３】図３３は、１５０ｋＤａの短縮型重鎖断片を精製するための分取スケールサイズ排除クロマトグラフィーのクロマトグラムである。カラム寸法：内径５．０ｃｍ×ベッド高９４．４ｃｍ、カラム体積１８５３．５４ｍＬ。画分サイズ：Ｃ１：１５．８０ｍＬ、Ｃ２：１５．７５ｍＬ、Ｃ３：１５．７４ｍＬ、Ｅ２：４５．６９ｍＬ。
【０１５０】
【図３４】図３４は、分取ＭｏｎｏＱアニオン交換クロマトグラフィーによって得られた１５０ｋＤａの短縮型重鎖断片を精製するための分取スケールサイズ排除クロマトグラフィーステップのＳＤＳ  ｐａｇｅゲル電気泳動を示す図である。Ｍ）分子量マーカー、ＡＳ）全ての関連する重鎖種および軽鎖種を示す、市販のＦＶＩＩＩ原薬である標準物質、ＳＢ）サンプルバッファー、画分Ｂ７〜Ｄ１。
【０１５１】
【図３５】図３５は、ＳｏｕｒｃｅＱ樹脂で濃縮された１５０ｋＤａの全長重鎖の分取スケールアニオン交換クロマトグラフィー溶出相のクロマトグラムである。ステップ溶出：３００ｍＭの塩化ナトリウム。カラム寸法：内径１．０ｃｍ×ベッド高３．９ｃｍ、カラム体積３．０６ｍＬ。画分サイズＥ１：約７．５ｍＬ。
【０１５２】
【図３６】図３６は、分取スケールサイズ排除クロマトグラフィーによって得られた１５０ｋＤａの短縮型重鎖断片を濃縮するためのＳｏｕｒｃｅＱ  ＡＩＥＸステップのＳＤＳ  ｐａｇｅゲル電気泳動、銀染色（左）およびＦＶＩＩＩウエスタンブロット（右）を示す図である。Ｍ）分子量マーカー、ＡＳ）全ての関連する重鎖種および軽鎖種を示す、市販のＦＶＩＩＩ原薬である標準物質、Ｌ）ロード、ＳＢ）サンプルバッファー、ＦＴ）フロースルー、Ｗ）洗浄相、ＶＥ）溶出前液、Ｅ１）１：１２０希釈（銀染色）および１：１６０希釈（ＦＶＩＩＩウエスタンブロット）での溶出液プール、Ｅ２）１：４０希釈（銀染色）および１：５３希釈（ＦＶＩＩＩウエスタンブロット）での溶出液プール、ＮＥ）溶出後液。
【０１５３】
【図３７】図３７は、１１０ｋＤａの短縮型重鎖断片を精製するための分取スケールサイズ排除クロマトグラフィーのクロマトグラムである。カラム寸法：内径５．０ｃｍ×ベッド高９４．４ｃｍ、カラム体積１８５３．５４ｍＬ。画分サイズ：Ｂ１０〜Ｃ１：１４０ｍＬ、Ｃ２〜Ｃ３：７０ｍＬ、Ｃ４：３５ｍＬ、Ｃ５：３５ｍＬ、Ｃ６：３５ｍＬ、Ｃ７〜Ｃ８：７０ｍＬ。
【０１５４】
【図３８】図３８は、分取ＭｏｎｏＱアニオン交換クロマトグラフィーによって得られた１１０ｋＤａの短縮型重鎖断片を精製するための分取スケールサイズ排除クロマトグラフィーステップのＳＤＳ  ｐａｇｅゲル電気泳動を示す図である。Ｍ）分子量マーカー、ＡＳ）全ての関連する重鎖種および軽鎖種を示す、市販のＦＶＩＩＩ原薬である標準物質、画分Ｂ９〜Ｃ１０。
【０１５５】
【図３９】図３９は、ＳｏｕｒｃｅＱ樹脂で濃縮された１１０ｋＤａの全長重鎖の分取スケールアニオン交換クロマトグラフィー溶出相のクロマトグラムである。ステップ溶出：３００ｍＭの塩化ナトリウム。カラム寸法：内径１．０ｃｍ×ベッド高３．９ｃｍ、カラム体積３．０６ｍＬ。画分サイズＥ１：７．２０ｍＬ。
【０１５６】
【図４０】図４０は、分取スケールサイズ排除クロマトグラフィーによって得られた１１０ｋＤａの短縮型重鎖断片を濃縮するためのＳｏｕｒｃｅＱ  ＡＩＥＸステップのＳＤＳ  ｐａｇｅゲル電気泳動、銀染色（左）およびＦＶＩＩＩウエスタンブロット（右）を示す図である。Ｍ）分子量マーカー、ＡＳ）全ての関連する重鎖種および軽鎖種を示す、市販のＦＶＩＩＩ原薬である標準物質、Ｌ）ロード、ＦＴ）フロースルー、Ｗ）洗浄相、ＶＥ）溶出前液、Ｅ１）１：１４７希釈（銀染色）および１：１９６希釈（ＦＶＩＩＩウエスタンブロット）での溶出液プール、Ｅ２）１：４９希釈（銀染色）および１：６５希釈（ＦＶＩＩＩウエスタンブロット）での溶出液プール、ＮＥ）溶出後液。
【０１５７】
【図４１】図４１は、ＳｏｕｒｃｅＱ樹脂で濃縮された９０ｋＤａの全長重鎖の分取スケールアニオン交換クロマトグラフィー溶出相のクロマトグラムである。ステップ溶出：３００ｍＭの塩化ナトリウム。カラム寸法：内径１．０ｃｍ×ベッド高８．９ｃｍ、カラム体積７．０ｍＬ。画分サイズＥ１：１８．３７ｍＬ。
【０１５８】
【図４２】図４２は、分取スケールサイズ排除クロマトグラフィーによって得られた９０ｋＤａのＢドメイン枯渇重鎖断片を濃縮するためのＳｏｕｒｃｅＱ  ＡＩＥＸステップのＳＤＳ  ｐａｇｅゲル電気泳動、銀染色（左）およびＦＶＩＩＩウエスタンブロット（右）を示す図である。Ｍ）分子量マーカー、ＡＳ）全ての関連する重鎖種および軽鎖種を示す、市販のＦＶＩＩＩ原薬である標準物質、ＳＢ）サンプルバッファー、Ｌ）ロード、ＦＴ）フロースルー、Ｗ）洗浄相、Ｅ１）１：９９希釈（銀染色）および１：１３２希釈（ＦＶＩＩＩウエスタンブロット）での溶出液プール、Ｅ２）１：３３希釈（銀染色）および１：４４希釈（ＦＶＩＩＩウエスタンブロット）での溶出液プール、ＮＥ）溶出後液。
【０１５９】
【図４３】図４３は、ＦＶＩＩＩ分子亜種の分取精製プロセスの要約を示す図である。左から右に：１８０ｋＤａの全長重鎖断片、１５０ｋＤａの短縮型重鎖断片、１１０ｋＤａの短縮型重鎖断片、９０ｋＤａのＢドメイン枯渇重鎖断片。
【０１６０】
【図４４】図４４は、ＦＶＩＩＩの不均一性および分子種を示す図である。（左）ＦＬ−ｒＦＶＩＩＩ（１）、ｐｄＦＶＩＩＩ（２）、精製されたｒＦＶＩＩＩ種Ｂ７０−ｒＦＶＩＩＩ（３）、Ｂ２０−ｒＦＶＩＩＩ（４）、ＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩ（５）の銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルならびに（右）２００５年（１）、２００７年（２）、２００８年（３）、２０１２年（４）、２０１３年（５）、２０１４年（６）および２０１５年（７）に生成されたＦＬ−ｒＦＶＩＩＩの歴史的ロット；ＨＣ、重鎖；ＬＣ、軽鎖；Ｍｍ、ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ｐｌｕｓ  ｕｎｓｔａｉｎｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。
【０１６１】
【図４５】図４５は、温度上昇時のｒＦＶＩＩＩの凝集を示すグラフである。ＦＬ−ｒＦＶＩＩＩ（点線）、Ｂ７０−ｒＦＶＩＩＩ（点鎖線）、Ｂ２０−ｒＦＶＩＩＩ（断続線）およびＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩ（実線）の熱により誘導された凝集体をＤＬＳによって分析した。挿入図は、ＨＰＬＣ−ＳＥＣによって分析された対応する試料を示す。
【０１６２】
【図４６】図４６は、ｒＦＶＩＩＩオリゴマーおよび凝集体の形成の経路を示すグラフである。ＦＬ−ｒＦＶＩＩＩ（点線、Ｃ）、Ｂ７０−ｒＦＶＩＩＩ（点鎖線）、Ｂ２０−ｒＦＶＩＩＩ（断続線）、ＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩ（実線、Ｄ）およびｐｄＦＶＩＩＩ（二点鎖線、Ｅ）を４５℃で２４時間インキュベートした。オリゴマーの量（Ａ）、凝集体の量（Ｂ）および単量体の量（Ｆ）をＨＰＬＣ−ＳＥＣによって継続的に分析し、インキュベート時間に対してプロットした。
【０１６３】
【図４７】図４７は、蛍光色素ＴｈＴのＦＶＩＩＩのオリゴマーおよび凝集体への結合を示すグラフである。ＴｈＴのタンパク質オリゴマーおよび凝集体への結合能が、４５℃で２４時間インキュベートした後の４４０および２８０ｎｍ励起における蛍光シグナルの比として表されている。ｎ＝２〜４、エラーバーはＳＤ値を示す。
【０１６４】
【図４８】図４８は、ｒＦＶＩＩＩ凝集の均一シーディングを示すグラフである。ＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩ、Ｂ７０−ｒＦＶＩＩＩおよびＦＬ−ｒＦＶＩＩＩを４５℃で２、５、８または１８時間のいずれかにわたってインキュベートすることによってシードを調製した。ＢＤＤ−ｒＦＶＩＩ（Ａ）、Ｂ７０−ｒＦＶＩＩＩ（Ｂ）およびＦＬ−ｒＦＶＩＩＩ（Ｃ）試料をそれぞれの予め形成されたシードと１：１混合し、４５℃で２４時間インキュベートした。オリゴマーの量（左側のパネル）および凝集体の量（右側のパネル）をＨＰＬＣ−ＳＥＣによって継続的に分析し、インキュベート時間に対してプロットした。
【０１６５】
【図４９】図４９は、タンパク質を含有する肉眼では見えない粒子の形成を示すグラフである。ＦＶＩＩＩ試料（０．２４４μＭ）を撹拌およびずり応力に曝露し、フローサイトメトリーに基づく粒子分析に供した。対応のないｔ検定を使用することによって統計学的差異が示された。タンパク質粒子濃度はＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩとＦＬ−ｒＦＶＩＩＩの間（Ｐ＝０．０００２）およびＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩとｐｄＦＶＩＩＩの間（Ｐ＝０．００１０）、ならびにＢ２０−ｒＦＶＩＩＩとＦＬ−ｒＦＶＩＩＩの間（Ｐ＜０．０００１）およびＢ２０−ｒＦＶＩＩＩとｐｄＦＶＩＩＩの間（Ｐ＜０．０００１）で有意に異なることが示された；ｎ＝４〜６、エラーバーはＳＤ値を示す。
【０１６６】
【図５０】図５０は、ｒＦＶＩＩＩを熱ストレスに曝露させた後のオリゴマーおよび凝集体の形成の図式モデルである。ＦＬ−ｒＦＶＩＩＩがｒＦＶＩＩＩ種の不均一混合物として示されているが、実際の種の比を反映するものではない。矢印の長さにより、ＦＬ−ｒＦＶＩＩＩおよびＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩのオリゴマー形成および凝集速度の差異が示される。
【０１６７】
【図５１】図５１は、高度に精製されたｐｄＦＶＩＩＩ、ＦＬ−ｒＦＶＩＩＩおよび精製されたｒＦＶＩＩＩ分子種の等モル濃度（０．１２２μＭ）でのサイズ排除クロマトグラフィープロファイルを示すグラフである。
【０１６８】
【図５２−１】図５２は、Ｂ７０−ｒＦＶＩＩＩのＨＤＸ−ＭＳヒートマップである。１２０ペプチドのＨＤＸ−ＭＳカイネティクスを３秒、１０秒、３０秒、２分、１０分、６０分および３時間のインキュベート時間後に測定した。灰色のレベルにより重水素組み入れの％が示される。
【図５２−２】図５２は、Ｂ７０−ｒＦＶＩＩＩのＨＤＸ−ＭＳヒートマップである。１２０ペプチドのＨＤＸ−ＭＳカイネティクスを３秒、１０秒、３０秒、２分、１０分、６０分および３時間のインキュベート時間後に測定した。灰色のレベルにより重水素組み入れの％が示される。
【図５２−３】図５２は、Ｂ７０−ｒＦＶＩＩＩのＨＤＸ−ＭＳヒートマップである。１２０ペプチドのＨＤＸ−ＭＳカイネティクスを３秒、１０秒、３０秒、２分、１０分、６０分および３時間のインキュベート時間後に測定した。灰色のレベルにより重水素組み入れの％が示される。
【図５２−４】図５２は、Ｂ７０−ｒＦＶＩＩＩのＨＤＸ−ＭＳヒートマップである。１２０ペプチドのＨＤＸ−ＭＳカイネティクスを３秒、１０秒、３０秒、２分、１０分、６０分および３時間のインキュベート時間後に測定した。灰色のレベルにより重水素組み入れの％が示される。
【図５２−５】図５２は、Ｂ７０−ｒＦＶＩＩＩのＨＤＸ−ＭＳヒートマップである。１２０ペプチドのＨＤＸ−ＭＳカイネティクスを３秒、１０秒、３０秒、２分、１０分、６０分および３時間のインキュベート時間後に測定した。灰色のレベルにより重水素組み入れの％が示される。
【図５２−６】図５２は、Ｂ７０−ｒＦＶＩＩＩのＨＤＸ−ＭＳヒートマップである。１２０ペプチドのＨＤＸ−ＭＳカイネティクスを３秒、１０秒、３０秒、２分、１０分、６０分および３時間のインキュベート時間後に測定した。灰色のレベルにより重水素組み入れの％が示される。
【図５２−７】図５２は、Ｂ７０−ｒＦＶＩＩＩのＨＤＸ−ＭＳヒートマップである。１２０ペプチドのＨＤＸ−ＭＳカイネティクスを３秒、１０秒、３０秒、２分、１０分、６０分および３時間のインキュベート時間後に測定した。灰色のレベルにより重水素組み入れの％が示される。
【図５２−８】図５２は、Ｂ７０−ｒＦＶＩＩＩのＨＤＸ−ＭＳヒートマップである。１２０ペプチドのＨＤＸ−ＭＳカイネティクスを３秒、１０秒、３０秒、２分、１０分、６０分および３時間のインキュベート時間後に測定した。灰色のレベルにより重水素組み入れの％が示される。
【図５２−９】図５２は、Ｂ７０−ｒＦＶＩＩＩのＨＤＸ−ＭＳヒートマップである。１２０ペプチドのＨＤＸ−ＭＳカイネティクスを３秒、１０秒、３０秒、２分、１０分、６０分および３時間のインキュベート時間後に測定した。灰色のレベルにより重水素組み入れの％が示される。
【図５２−１０】図５２は、Ｂ７０−ｒＦＶＩＩＩのＨＤＸ−ＭＳヒートマップである。１２０ペプチドのＨＤＸ−ＭＳカイネティクスを３秒、１０秒、３０秒、２分、１０分、６０分および３時間のインキュベート時間後に測定した。灰色のレベルにより重水素組み入れの％が示される。
【０１６９】
【図５３】図５３は、ＦＬ−ｒＦＶＩＩＩ凝集体の組成を示す図である。ネイティブなＦＬ−ｒＦＶＩＩＩ（１）および精製されたＦＬ−ｒＦＶＩＩＩの凝集体（２）の銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル；Ｍｍ、ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ｐｌｕｓ  ｕｎｓｔａｉｎｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）。
【０１７０】
【図５４】図５４は、（Ａ）ＦＶＩＩＩ一段凝固活性を示すグラフである。灰色の線は、ＦＶＩＩＩ種精製の出発材料であったＳＯＳ−Ｅ活性のレベルを示す。試料を２連で測定した。矢棒はＳＤ値を示す。（Ｂ）ＦＶＩＩＩ発色活性。灰色の線は、ＦＶＩＩＩ種精製の出発材料であったＳＯＳ−Ｅ活性のレベルを示す。試料を２連で測定した。矢棒はＳＤ値を示す。
【０１７１】
【図５５】図５５は、ＦＶＩＩＩ種のトロンビンピークおよび遅延時間を示すグラフである。灰色の線は、ＦＶＩＩＩ種精製の出発材料であったＳＯＳ−Ｅ活性のレベルを示す。
【０１７２】
【図５６】図５６は、ＦＶＩＩＩ生成物の銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
【０１７３】
【図５７】図５７は、フューリン処理後のＦＬ−ｒＦＶＩＩＩの銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。ＮｕＰＡＧＥ  ３〜８％ＴｒｉｓＡｃｅｔａｔｅ  Ｍｉｄｉ  Ｇｅｌ（１．０ｍｍ；２０ウェル、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｔ．Ｎｒ  ＷＧ１６０２ＢＯＸ）。試料を、還元性ＬＤＳ−ＳＢと１：２で、３７℃で１時間インキュベートした。７５０ｍＭのヨードアセトアミド溶液を２０μｌ／１００μｌで添加した。ゲルに１５０Ｖ（一定）で７０分にわたって流し、銀染色した。
【０１７４】
【図５８】図５８は、フューリン処理後のＦＬ−ｒＦＶＩＩＩのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗ＦＶＩＩＩ−ウエスタンブロットを示す図である。ＮｕＰＡＧＥ  ３〜８％ＴｒｉｓＡｃｅｔａｔｅ  Ｍｉｄｉ  Ｇｅｌ（１．０ｍｍ；２０ウェル、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｔ．Ｎｒ  ＷＧ１６０２ＢＯＸ）。試料を、還元性ＬＤＳ−ＳＢと１：２で、３７℃で１時間インキュベートした。７５０ｍＭのヨードアセトアミド溶液を２０μｌ／１００μｌで添加した。ゲルに１５０Ｖ（一定）で７０分にわたって流した。ウエスタンブロット：一次抗体：ヒツジ抗ＦＶＩＩＩ：Ｃ  二次抗体、ロバ抗ヒツジＩｇＧ  ＡＬＰ。
【発明を実施するための形態】
【０１７５】
発明の詳細な説明
以下で特に定義されていなければ、本発明において使用される用語は、当業者に公知のそれらの一般的な意味に従って理解されるものとする。
【０１７６】
本明細書において引用された全ての刊行物、特許および特許出願は、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７７】
本発明によると、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語の各出現は、必要に応じて「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という用語で置き換えることができる。
【０１７８】
本開示では以下の略語を使用する：
略語  完全な文脈／説明
ＡＩＥＸ  アニオン交換クロマトグラフィー
ＡＬＰ  アルカリホスファターゼ
ＡＳ  ＦＶＩＩＩ標準物質
Ｂ１４３９００００−３０  ＳｏｕｒｃｅＳ由来の出発材料
Ｂ２０／Ｂ７０／Ｂ１００−ｒＦＶＩＩＩ  Ｂドメインを２０％／７０％／１００％含有するヒト組換え第ＶＩＩＩ因子
ＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩ  ヒトＢドメイン欠失組換え第ＶＩＩＩ因子
ＢＤＳ  バルク原薬
Ｃ１８  炭素原子１８個を含有する直鎖アルカン（ｎ−オクタデカン）を用いた逆相ＨＰＬＣ固定相
Ｃ４  炭素原子４個を含有する直鎖アルカン（ｎ−ブタン）を用いた逆相ＨＰＬＣ固定相
ＣＨＯ  チャイニーズハムスター卵巣
ＣＩＥＸ  カチオン交換クロマトグラフィー
ＣＬ４Ｂ  架橋アガロースベースマトリックス
Ｃｒｉｌｌｅｔ４ＨＰ  ポリソルベート８０の商品名
ＣＶ  カラム体積
Ｃｙｓ２  シスチン
ＤＬＳ  動的光散乱
ＤＴＴ  ジチオスレイトール
Ｅ１  溶出液プール１
Ｅ２  溶出液プール２
ＥＧ  エチレングリコール
ＥＬＩＳＡ  酵素結合免疫吸着検定法
ＥｔＯＨ  エタノール
ＥｘＰＡＳｙ  Ｓｗｉｓｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｐｏｒｔａｌ
Ｆ８＿ＡＤ２＿９０ｋＤａ  ＳｏｕｒｃｅＱおよびＭｏｎｏＱの実行により得られた９０ｋＤａの亜種が濃縮された出発材料
Ｆ８Ａ  血液凝固第ＶＩＩＩ因子をコードする遺伝子座
Ｆｃ  結晶化可能断片
ＦＩＸ  血液凝固第ＩＸ因子
ＦＩＸａ  活性化された血液凝固第ＩＸ因子
ＦＬ−ｒＦＶＩＩＩ  （好ましくはヒト）全長組換え第ＶＩＩＩ因子
ＦＰＬＣ  高速タンパク質液体クロマトグラフィー
Ｆｒａｃ  画分収集器具
ＦＴ  フロースルー
ＦＶ  血液凝固第Ｖ因子
ＦＶａ  活性化された血液凝固第Ｖ因子
ＦＶＩＩ  血液凝固第ＶＩＩ因子
ＦＶＩＩａ  活性化された血液凝固第ＶＩＩ因子
ＦＶＩＩＩ  血液凝固第ＶＩＩＩ因子
ＦＶＩＩＩａ  活性化された血液凝固第ＶＩＩＩａ因子
ＦＸ  血液凝固第Ｘ因子
ＦＸａ  活性化された血液凝固第Ｘ因子
ＦＸＩ  血液凝固第ＸＩ因子
ＦＸＩａ  活性化された血液凝固第ＸＩ因子
ＦＸＩＩ  血液凝固第ＸＩＩ因子
ＦＸＩＩＩ  血液凝固第ＸＩＩＩ因子
ＦＸＩＩＩａ  活性化された血液凝固第ＸＩＩＩ因子
ＨＡｃ  酢酸
ＨＤＸ−ＭＳ  水素／重水素交換質量分析
ＨＥＰＥＳ  ４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸
ＨＩＣ  疎水性相互作用クロマトグラフィー
ＨＰＬＣ  高速液体クロマトグラフィー
ＨＰＬＣ−ＳＥＣ  高性能サイズ排除クロマトグラフィー
ＨＲＰ  西洋ワサビペルオキシダーゼ
ＩｇＧ  免疫グロブリンＧ
ＩＰＡ  イソプロピルアルコール
ＩＵ  国際単位
ｋＤａ  キロダルトン
Ｌ  ロード
ＬＤＳ  ドデシル硫酸リチウム
Ｍ  分子量マーカー
Ｍ  モル濃度
ｍＡＢ  モノクローナル抗体
ＭＥＳ  ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸
ＭｉｌｌｉＱ  超純水１型
ＮａＣｌ  塩化ナトリウム
ＮａＯＨ  水酸化ナトリウム
ＮＥ  溶出後液
ＯＣ１  アルカリ性平衡化バッファー
Ｏｕｔ１〜７  出口弁１〜７
Ｐ１  生成物プール１
Ｐ２  生成物プール２
ｐｄＦＶＩＩＩ（好ましくはヒト）血漿由来第ＶＩＩＩ因子
ＰＥ  溶出後液
ＰＥＴＧ  ポリエチレンテレフタレート
ポリソルベート８０  非イオン性界面活性物質
ＰｒｏｔＰａｒａｍ  タンパク質の種々の物理的および化学的パラメータを算出するためのツール
ＰＶＤＦ  ポリビニルジスルホン
ＱＡ１  ＡＩＥＸ平衡化バッファー
ＱＢ１  ＡＩＥＸ溶出バッファー１
ＱＢ２  ＡＩＥＸ溶出バッファー２
Ｒｅｌ．Ａｂｓ．  相対吸光度
ｒＦＶＩＩＩ  組換え血液凝固第ＶＩＩＩ因子
ＲＰ  逆相
Ｓ／Ｄ  溶媒／界面活性剤
ＳＡ３  ＣＩＥＸ平衡化バッファー
ＳＤＳ  ドデシル硫酸ナトリウム
ＳＤＳ−Ｐａｇｅ  ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＳＥＣ  サイズ排除クロマトグラフィー
ＳＯＰ  標準操作手順
ＳＯＳ−Ｅ  ＳｏｕｒｃｅＳ溶出液
ＴＦＡ  トリフルオロ酢酸
ＴＦＰＩ  組織因子経路インヒビター
ＴｈＴ  チオフラビンＴ
ＴＮＢＰ  リン酸トリブチル
Ｔｒｉｓ  トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン
Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００  ４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェニル−ポリエチレングリコール
Ｔｒｐ  トリプトファン
ＴＷＡ  １Ｍの塩化ナトリウム溶液
Ｔｗｅｅｎ  ８０  ポリソルベート８０の商品名
Ｔｙｒ  チロシン
ＵＶ  紫外線
ｖ／ｖ  体積／体積
ＶＥ  溶出前液
ｖＷＦ  フォン・ヴィルブランド因子
Ｗ１〜３  洗浄相１〜３
【０１７９】
図２Ａに示されている通り、全長単鎖第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）は、Ａ１、Ａ２、Ｂ、Ａ３、Ｃ１およびＣ２と称される６つの主要なドメインを含む。生合成の間に、単鎖ＦＶＩＩＩは２つの鎖、重鎖１つと軽鎖１つに切断される。単鎖ＦＶＩＩＩ全体を通して異なる切断位置が存在することにより、４つの重鎖バリアントおよび２つの軽鎖バリアント：全長重鎖バリアント（１８０ｋＤａ）、短縮型重鎖バリアント（１５０ｋＤａおよび１１０ｋＤａ）およびＢドメイン枯渇重鎖バリアント（９０ｋＤａ）、標準軽鎖（８０ｋＤａ）および伸長型軽鎖（１２０ｋＤａ）の生成が導かれる。本明細書では、重鎖バリアントは主にＦＶＩＩＩ  １８０ｋＤａ重鎖またはＢ１００−ＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩＩ  １５０ｋＤａ重鎖またはＢ７０−ＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩＩ  １１０ｋＤａ重鎖またはＢ２０−ＦＶＩＩＩ、およびＦＶＩＩＩ  ９０ｋＤａ重鎖またはＢＤＤ−ＦＶＩＩＩと称される。これらの重鎖バリアントの１つと軽鎖の１つの会合により、それぞれが重鎖１つと軽鎖１つを含むいくつかの不均一ＦＶＩＩＩ亜種がもたらされる。
【０１８０】
「ＦＶＩＩＩを含む組成物」という用語は、本明細書で使用される場合、全てのＦＶＩＩＩが以下の通り定義される組成物を指す。別段の指定のない限り、「第ＶＩＩＩ因子」または「ＦＶＩＩＩ」という用語は、本明細書で使用される場合、いくつかの不均一ＦＶＩＩＩ亜種を含む天然にプロセシングされたＦＶＩＩＩを指す。しかし、天然にプロセシングされた後であっても、ＦＶＩＩＩは、残留単鎖（すなわち、切断されていない）ＦＶＩＩＩを含み得る（以下を参照されたい）。天然のプロセシングが非効率的である場合、ＦＶＩＩＩは、主に単鎖ＦＶＩＩＩを含むこともあり得る。したがって、「第ＶＩＩＩ因子」または「ＦＶＩＩＩ」という用語は、本明細書で使用される場合、残留単鎖ＦＶＩＩＩまたはさらには主に単鎖ＦＶＩＩＩを含む天然にプロセシングされたＦＶＩＩＩも指す。
【０１８１】
当業者には分かる通り、「全長ｒＦＶＩＩＩ」という用語は、本明細書で使用される場合、全長ＦＶＩＩＩ  ｃＤＮＡから発現されるｒＦＶＩＩＩを指す。上記の通り、全長ｒＦＶＩＩＩは、ｒＦＶＩＩＩ亜種の不均一混合物で構成される。
【０１８２】
当業者には分かる通り、種々のＦＶＩＩＩ重鎖の分子量、すなわち、１８０ｋＤａ、１５０ｋＤａ、１１０ｋＤａおよび９０ｋＤａ、ならびにＦＶＩＩＩ軽鎖の分子量、すなわち、８０ｋＤａおよび１２０ｋＤａは、ＳＤＳ  ｐａｇｅで示される「見かけの分子量」である。必要であれば、個々のＦＶＩＩＩ重鎖および軽鎖の既知のアミノ酸配列に基づいて「真の分子量」をどのように算出することができるかが当業者には分かるであろう。
【０１８３】
当業者には理解される通り、「単鎖ＦＶＩＩＩ」は、本明細書で使用される場合、一般に、切断されていないＦＶＩＩＩを指す。図２Ａに示されている通り、単鎖は、第ＶＩＩＩ因子の全てのドメインを含み得る。しかし、全長ＦＶＩＩＩに存在するいくつかのドメイン、１つのドメイン、またはドメインの一部を欠くＦＶＩＩＩを生成することも可能である。そのような場合、「単鎖ＦＶＩＩＩ」はなお、それぞれいくつかのドメイン、１つのドメイン、またはドメインの一部を欠く切断されていないＦＶＩＩＩ生成物を指す。
【０１８４】
当業者には理解される通り、本発明に従ってＦＶＩＩＩ亜種を精製する方法では、ＦＶＩＩＩを含む組成物は、溶液であることが好ましいが、組成物は、本発明の方法を実施する前に溶解させる固体であってもよい。上記の通り、ＦＶＩＩＩの細胞内生成の結果、通常、いくつかの不均一活性ＦＶＩＩＩ亜種の生成がもたらされる。したがって、当業者には明らかになる通り、ＦＶＩＩＩを含む組成物は、１つよりも多くのＦＶＩＩＩ亜種を含有する。
【０１８５】
本明細書で使用される場合、「重量比」という用語は、重量の比を指す。例えば、組成物中の精製されたＦＶＩＩＩ亜種の組成物中の他の全てのＦＶＩＩＩ亜種に対する重量比は、組成物中の精製されたＦＶＩＩＩ亜種の重量を組成物中の他の全てのＦＶＩＩＩ亜種の重量で割ることによって算出される。
【０１８６】
当業者には理解される通り、本発明に従ってＦＶＩＩＩ亜種を精製する方法は、ＦＶＩＩＩ亜種の組成物に含まれる他の全てのＦＶＩＩＩ亜種に対する重量比を増大させることを指す。本発明の方法の出発材料として使用されるＦＶＩＩＩを含む組成物は、本発明の方法を実施した後の精製されたＦＶＩＩＩ亜種を含む組成物とは異なるバッファーを含有し得、また、異なる体積を有し得る。それでも、本発明の方法を実施することによって重量比の増大を評価するため（すなわち、精製を評価するため）に、ＦＶＩＩＩ亜種の重量を、本発明の方法の出発材料として使用されるＦＶＩＩＩを含む組成物において、および本発明の方法を実施した後の組成物において決定する。さらに、他の全ての亜種の重量を、本発明の方法の出発材料として使用されるＦＶＩＩＩを含む組成物において、および本発明の方法を実施した後の組成物において決定する。次いで、ＦＶＩＩＩ亜種の他の全てのＦＶＩＩＩ亜種に対する重量比を、本発明の方法の出発材料として使用されるＦＶＩＩＩを含む組成物において、および本発明の方法を実施した後の組成物において算出することができ、そして、重量比の増大を決定することができる。
【０１８７】
組成物中のＦＶＩＩＩ亜種の他の全てのＦＶＩＩＩ亜種に対する重量比を決定するために、ＦＶＩＩＩ亜種の重量を下記の通りＣ４逆相ＨＰＬＣによって決定する。当業者には明らかになる通り、Ｃ４逆相ＨＰＬＣを使用して、曲線下面積、したがって、組成物中のＦＶＩＩＩ亜種の濃度を決定する（以下を参照されたい）。所与の体積を有する溶液では、ＦＶＩＩＩ亜種の濃度の他の全てのＦＶＩＩＩ亜種の濃度に対する比は、ＦＶＩＩＩ亜種の他の全てのＦＶＩＩＩ亜種に対する重量比と等しい。したがって、本発明では、曲線下面積の比、したがって、濃度の比を、ＦＶＩＩＩ亜種の組成物に含まれる他の全てのＦＶＩＩＩ亜種に対する重量比の増大を評価するために使用する。
【０１８８】
上記の通り、ＦＶＩＩＩ亜種は、通常、重鎖１つと軽鎖１つを含み、これらは互いと会合している。したがって、本発明に従ってＦＶＩＩＩ亜種を精製するための方法では、出発材料として使用されるＦＶＩＩＩを含む組成物および本発明の方法を実施した後の精製されたＦＶＩＩＩ亜種を含む組成物は、重鎖１つと軽鎖１つで構成されるＦＶＩＩＩ亜種を含むことが好ましい。しかし、本発明の方法を実施する前または実施中のいずれかに、ＦＶＩＩＩ重鎖とＦＶＩＩＩ軽鎖を解離させることも可能である。したがって、本発明の方法の代替の実施形態では、本発明の方法の実施後、精製されたＦＶＩＩＩ亜種は、重鎖を１つ含むが、軽鎖は含まない。そのような実施形態では、本発明の方法の出発材料として使用されるＦＶＩＩＩを含む組成物は、重鎖１つで構成され、軽鎖がないか、または軽鎖１つと会合した重鎖１つで構成される１つまたは複数のＦＶＩＩＩ亜種を含み得る。当然、本発明の方法の出発材料として使用されるＦＶＩＩＩを含む組成物が、重鎖１つで構成され、軽鎖がないＦＶＩＩＩ亜種を含む場合、解離した軽鎖はなお組成物中に存在し得る。
【０１８９】
本明細書では、「ＦＶＩＩＩ種」という用語は、一般に、「ＦＶＩＩＩ亜種」と同等に使用される。しかし、時々、「ＦＶＩＩＩ種」という用語は、本明細書で使用される場合、単一のＦＶＩＩＩ重鎖または軽鎖も指し得ることが当業者には明らかになろう。
【０１９０】
当業者には明らかになる通り、本発明の方法の個々のステップを任意の次のステップに進む前に繰り返すことができる。そのような実施形態では、同じステップの各反復の結果得られた溶液（例えば、クロマトグラフィー溶出液）をプールし、次いで、次のステップの出発材料として使用することができる。
【０１９１】
本発明のＦＶＩＩＩはヒトＦＶＩＩＩであることが好ましく、精製されるＦＶＩＩＩ亜種はヒトＦＶＩＩＩ亜種であることが好ましい。
【０１９２】
本発明のＦＶＩＩＩは組換えＦＶＩＩＩであることが好ましく、精製されるＦＶＩＩＩ亜種は組換えＦＶＩＩＩ亜種であることが好ましい。しかし、本発明のＦＶＩＩＩが血漿由来（ｐｄ）ＦＶＩＩＩであり、精製されるＦＶＩＩＩ亜種が血漿由来（ｐｄ）ＦＶＩＩＩ亜種であることも可能である。
【０１９３】
原理上は、第ＶＩＩＩ因子を含む任意の組成物を、本発明に従って第ＶＩＩＩ因子亜種を精製するための方法を実施するための出発材料として使用することができる。
【０１９４】
例えば、組換えヒト抗血友病因子ＶＩＩＩ  ＡＤＶＡＴＥ（Ｂａｘａｌｔａの製品）またはＡＤＶＡＴＥバルク原薬（ＢＤＳ）を本発明の方法に使用することができる。ＡＤＶＡＴＥは、あるいはＯｃｔｏｃｏｇ  ａｌｆａと称され、ＡＤＶＡＴＥに関するさらなる情報は、例えば、Keating  et  al.（Keating  et  al.,  2012；その全体が本明細書に組み込まれる）において見出すことができる。ＡＤＶＡＴＥ生成の間、組換えＦＶＩＩＩが小胞輸送によって分泌され、したがって、発酵上清中に濃縮される。精製後、ｒＦＶＩＩＩ生成物プールを−８０℃で急速冷凍し、本明細書では、ＡＤＶＡＴＥバルク原薬（ＢＤＳ）と称される。特に、ＡＤＶＡＴＥ／ＡＤＶＡＴＥ  ＢＤＳは、いくつかの不均一ＦＶＩＩＩ亜種を含む。
【０１９５】
あるいは、ＳＯＳ−Ｅなどの溶出液を本発明の方法における出発材料として使用することができる。ＳＯＳ−Ｅは上記のＡＤＶＡＴＥ  ＢＤＳとして生成されるが、最終的な精製ステップを欠く。
【０１９６】
あるいは、ヒト全長ＦＶＩＩＩ（ＦＬ−ＦＶＩＩＩ）を含む他の組成物を本発明の方法における出発材料として使用することができる。特に、上記の通り、生合成の間、単鎖ＦＶＩＩＩがプロセシングされて異なる重鎖および軽鎖になる。したがって、本発明の方法の出発材料として使用することができるＦＬ−ＦＶＩＩＩは、一般に、いくつかの不均一ＦＶＩＩＩ亜種を含み、そのそれぞれが重鎖１つと軽鎖１つを含む。
【０１９７】
本発明の方法では、第ＶＩＩＩ因子を含む組成物をフューリンプロテアーゼ処理することにより、クロマトグラフィーの間の第ＶＩＩＩ因子亜種の分離が改善され、それにより、前記第ＶＩＩＩ因子亜種をさらに高い純度および濃度で含む組成物がもたらされる。フューリン処理は、当業者には分かる通り実施される。例えば、フューリン処理は、ＦＶＩＩＩを含む組成物をフューリンと混合することによって、または、ＦＶＩＩＩを含む組成物をフューリンを含むカラムに適用することによって実施することができる。例えば、フューリンをカラムに固定化することができ、次いで、ＦＶＩＩＩを含む組成物をカラムに適用することができる。あるいは、ＦＶＩＩＩをカラムに結合させ、次いで、フューリンをカラムに適用することができる。本発明では、組成物中に含まれるＦＶＩＩＩをフューリンプロテアーゼ処理に供する場合、フューリンの最終濃度は、１００ＩＵ／ｍＬよりも高いことが好ましい。最終濃度とは、本明細書で使用される場合、ＦＶＩＩＩを含む組成物をフューリンと共にインキュベートしている間、すなわち、ＦＶＩＩＩを含む組成物をフューリンと混合した後のフューリン濃度を指す。
【０１９８】
フューリンプロテアーゼ処理の間、ＦＶＩＩＩを含む組成物中に含まれ得る伸長型ＦＶＩＩＩ軽鎖（１２０ｋＤａ）の大部分が切断されて標準軽鎖（８０ｋＤａ）がもたらされる。したがって、本発明の方法がフューリンプロテアーゼ処理を伴う場合、精製されたＦＶＩＩＩ亜種は、ＦＶＩＩＩ  ８０ｋＤａ軽鎖を含有し、ＦＶＩＩＩ  １２０ｋＤａ軽鎖をほとんど含有しないことが好ましい。ＦＶＩＩＩ  １２０ｋＤａ軽鎖をほとんど含有しないとは、ＦＶＩＩＩ  １２０ｋＤａ軽鎖の重量が、精製されたＦＶＩＩＩ亜種の中の全てのＦＶＩＩＩ軽鎖の総重量の５％未満、好ましくは１％未満であることを指す。
【０１９９】
本発明の方法では、ＦＶＩＩＩ亜種を精製するために、いくつかのクロマトグラフィーステップを実施する。これらのクロマトグラフィーステップはそれぞれが「前記ＦＶＩＩＩ亜種を含む溶出液を収集すること」を含む。本明細書で使用される場合、「前記ＦＶＩＩＩ亜種を含む溶出液を収集すること」とは、通常、溶出液の画分、すなわち、精製されるＦＶＩＩＩ亜種を含む画分だけを収集することを意味する。精製されるＦＶＩＩＩＩ亜種を含む前記画分は、溶出液中に存在する、精製されるＦＶＩＩＩ亜種の全てを含む必要はない。そうではなく、精製されるＦＶＩＩＩ亜種を含む画分は、精製されるＦＶＩＩＩ亜種を最大量で含むと同時に他のＦＶＩＩＩ亜種を最小量で含むように選択する。精製されるＦＶＩＩＩ亜種を最大量で含むと同時に他のＦＶＩＩＩ亜種を最小量で含む画分を選択するための種々の方法が当業者には分かるであろう。例えば、溶出液をいくつかの等体積の別々のアリコートとして収集することができる。次いで、各アリコート中の精製されるＦＶＩＩＩ亜種の濃度および他の全てのＦＶＩＩＩ亜種の濃度を、タンパク質濃度の分光光度測定による決定、ポリアクリルアミドゲル電気泳動プラス銀染色および／またはウエスタンブロッティング、またはクロマトグラフィーなどの公知の方法によって決定することができる。最後に、精製されるＦＶＩＩＩ亜種を最高量で含有すると同時に他のＦＶＩＩＩ亜種を最低量で含むアリコートを、精製されるＦＶＩＩＩ亜種を含む画分として選択することができる。これらのアリコートをプールし、本発明によるＦＶＩＩＩ亜種を含む溶出液として使用することができる。
【０２００】
当業者には明らかになる通り、精製されるＦＶＩＩＩ亜種を最高量で含有すると同時に他のＦＶＩＩＩ亜種を最低量で含有するアリコートを選択するプロセスは、本発明の方法を実施することによって得られる精製されたＦＶＩＩＩ亜種の純度および濃度に影響を及ぼす。例えば、本発明によるＦＶＩＩＩ亜種を含む溶出液から精製されるＦＶＩＩＩ亜種を含有するアリコートがいくらかでも漏れると、本発明の方法を実施することによって得られる精製されたＦＶＩＩＩ亜種の濃度が低下する。また、他のＦＶＩＩＩ亜種を有意な量で含有するアリコートが含まれることによって、本発明の方法を実施することによって得られる精製されたＦＶＩＩＩ亜種の純度が低下する。したがって、本発明の方法を実施することによって得られる精製されたＦＶＩＩＩ亜種の所望の濃度および純度に応じて、当業者は、いずれのアリコートを、精製されるＦＶＩＩＩＩ亜種を含む画分として選択するかを決定する。
【０２０１】
当業者には明らかになる通り、本発明の方法において、精製されるＦＶＩＩＩ亜種を含む溶出液が１回または限られた回数決定されたら、方法を、精製されるＦＶＩＩＩ亜種を含む溶出液を決定せずに繰り返すことができる。そのような実施形態では、精製されるＦＶＩＩＩ亜種を含む溶出液を、精製されるＦＶＩＩＩ亜種を含む溶出液についての前の決定に基づいて選択し、同じ溶出液を収集する。当然、本発明の方法を精製されるＦＶＩＩＩ亜種を含む溶出液を決定せずに実施する場合であっても、精製されるＦＶＩＩＩ亜種を最大量で含むと同時に他のＦＶＩＩＩ亜種を最小量で含む画分の選択を、例えばクロマトグラムを使用してモニタリングすることができる。
【０２０２】
本発明のＦＶＩＩＩ亜種を精製するための方法は、いくつかのクロマトグラフィーステップを含む。当業者には分かる通り、本発明による方法におけるクロマトグラフィーを実施する異なる方式が存在する。例えば、わずかな不純物を伴い、対応する樹脂での挙動が全く異なるただ１つまたは２つの生成物を含有する試料の精製を、定組成溶出方式またはステップグラジエント溶出のいずれかを使用して実施することができ、結果は十分であると思われ得る。定組成溶出は溶出相全体を通して溶出液混合物を変化させずに実施するが、段階溶出では、１つの溶出液の分率を徐々に上昇させる。
【０２０３】
上記の通り、典型的な全長組換えＦＶＩＩＩの組成物は、全ての可能性のある重鎖断片および軽鎖断片を含むので、高度に不均一である。さらに、全ての亜種が同じ単鎖分子に由来するので、これらは大体同じ挙動を示す。したがって、一般に、定組成溶出では満足のいく結果が導かれない可能性がある。本発明の方法によるＦＶＩＩＩ亜種を精製するための方法は、リニアグラジエント溶出であることが好ましい。これらに限定されないが、リニアグラジエント溶出の一般的な原理ならびに他の型の溶出に対する利点および不都合を含めた簡単な説明を以下に提供する（図３も参照されたい）。
【０２０４】
定組成溶出方式とは対照的に、リニアグラジエント溶出における２つの溶出液の相対量は、時間の経過とともに変動する。リニアグラジエント溶出は、多くの場合、強力な溶出液を低パーセンテージで用いて開始される。次いで、その量を絶えず上昇させ、したがって、弱い溶出液の分率を低下させる。それにより、溶出液相の溶出を引き起こす性質、例えば、イオン交換クロマトグラフィーでは極性が、経時的に強化される。グラジエントの長さおよび傾きは、互いに反比例する。傾きが急であるほど、グラジエントの長さ、およびそれにより、溶出相が短くなる。グラジエントの長さは、ほとんどの場合、カラム体積の倍数として表される。グラジエントの傾きは、溶出挙動に大きな影響を及ぼす。親和性が弱い物質はグラジエントの最初に溶出し、強力な親和性を有する物質の固定相との連結を破壊するためには、強力な溶出液がより多量に必要になる。
【０２０５】
リニアグラジエント溶出は、同様の分子の混合物に適したものであることが好ましい。他の溶出型とは対照的に、条件の全範囲がリニア溶出方式に包含される。これにより、ある特定の分子を溶出するための適切な条件がある時点でもたらされることが確実になる。２つの分子が高い類似性を示す場合であっても、それらの差異により、少なくともわずかに異なる溶出挙動が引き起こされる。グラジエントの傾きを平坦化することは、これらの２つの物質を、より弱い結合性物質を溶出し、親和性が高い結合性物質を付着したままにすることによって少なくとも部分的に分解するために役立ち得る。一般に、これにより、リニアグラジエント溶出が、多くの適用分野を有する非常に頑強なプロセスになる。しかし、グラジエントの傾きを平坦化することには欠点がある。グラジエントが平らになるほど、より多くの移動相がカラムを通って運ばれ、それにより、総体積がより大きくなる。ある特定の物質を溶出するのにより長くかかり、より多くの溶出液が必要になり、したがって、最終的な溶出液画分においてより希釈されることになる。クロマトグラムにおいていわゆるピークブロードニングが観察される。逆に、リニアグラジエントでは、定組成溶出と比較してピークブロードニングが最小限になり得る。定組成溶出では、分子が広範なピークの形態の長い範囲で溶出され得る。溶出挙動が分かっている場合、より急なリニアグラジエントを適用して別個の物質の溶出を加速することができる。得られるピークはより鋭く、溶出液画分はより高度に濃縮される。
【０２０６】
本発明の方法の種々のクロマトグラフィーステップは、当業者には分かる通り実施される。以下に、本発明による方法において実施される異なるクロマトグラフィーステップの好ましい実施形態を記載する。しかし、本発明は、これらの実施形態に限定されない。
【０２０７】
当業者には明らかになる通り、本発明の方法は、スモールスケールでまたはラージ（すなわち、分取）スケールで実施することができる。スモールスケールでは、方法を種々の異なる条件下で実施して最適な条件を見出し、次いでそれをラージスケールで使用することができる。本発明者らが特に適切であることを見出した条件を以下に示す。しかし、本発明はこれに限定されない。
【０２０８】
本発明の全てのクロマトグラフィーの実行に先立って、クロマトグラフィーシステムを１Ｍの水酸化ナトリウム、１Ｍの酢酸および最終的に、衛生化のためにＭｉｌｌｉＱを用いて処理することができる。さらに、システムポンプおよび試料ポンプをパージして閉じ込められた空気をポンプ本体から取り除くことができる。最後に、全ての入口を対応するバッファーで流すことができる。
【０２０９】
本発明の方法の第１のクロマトグラフィーステップ：
本発明による第ＶＩＩＩ因子亜種を精製するための方法では、第１のクロマトグラフィーステップは、アニオン交換クロマトグラフィーステップである。本発明者らは、驚いたことに、その分解能が高いことにより、高い分離能がもたらされることを見出した。
【０２１０】
スモールスケールでは、ＭｏｎｏＱ樹脂を使用し、異なる条件下でいくつかの実行を実施して、最も適切なパラメータの組合せを評価することができる。そのような実行は、例えば、ＡＫＴＡ  Ａｖａｎｔ  ２５またはＡＫＴＡ  Ｐｕｒｅ  ２５システムで、４℃において、カラム体積が０．９８２ｍＬのＭｏｎｏＱスモールスケールカラムを使用して実施することができる。ＦＶＩＩＩ亜種の大まかな分離が実現される。
【０２１１】
当業者には明らかになる通り、標準のＭｏｎｏＱバッファー系および標準の条件を本発明の方法の（第１の）アニオン交換クロマトグラフィーステップに使用することができる。本発明の方法において使用することができる例示的なＭｏｎｏＱバッファーを表９に列挙する。出発材料は、ＦＬ−ｒＦＶＩＩＩを含む組成物、例えば、ＳｏｕｒｃｅＳ溶出液（ＳＯＳ−Ｅ）と称される組成物であり得る。ＳＯＳ−Ｅは、高イオン強度条件下で溶出され、−６０℃未満で保管されている。活性の喪失を回避するために、出発材料を室温でゆっくりと解凍することが好ましい。その後、ネイティブな試料を、低イオン強度バッファー、例えば、ＱＡ１バッファーを用いて希釈係数４で希釈することができる。これにより、電気伝導率が十分な程度まで低下し、したがって、生成物がＭｏｎｏＱ樹脂に結合することが可能になる。試料溶液を最終的に、０．２μｍのメンブランフィルターで滅菌濾過してカラムベッドの潜在的な混入または遮断を回避することができる。以下の表は、各クロマトグラフィーステップについてのバッファー、グラジエント、直線流速および滞留時間ならびにカラム体積および流れ方向に関する情報を含めた例示的な一般的なクロマトグラフィースキームを示す。
【０２１２】
【表１】
2020524688.tif 000002
【０２１３】
本発明による方法の第１のステップにおいてスモールスケールクロマトグラフィーをどのように実施するかに関する例示的な（「標準の」）実施形態を以下に記載する。当業者には明らかになる通り、条件は全て、ただ単に好ましいパラメータおよび条件を表し、本発明をそれらに限定するものではない。さらに、列挙されているパラメータおよび条件は全て、本発明の方法に従って第１のクロマトグラフィーステップを実施するために任意の他の列挙されているパラメータおよび条件と組み合わせることができる。最初に、カラムを４つの別個のステップで構成される集中的な平衡化相に供することが好ましい。カラムを、高イオン強度アルカリ性溶液であるＯＣ１バッファーを用いて６カラム体積にわたって洗浄し、その後、ＯＣ１バッファーをカラムから取り除くために、超純水を用いた洗浄ステップを行う。ＯＣ１バッファーを用いた処理により、ＭｏｎｏＱ樹脂の全ての第四級アンモニウム基がそれらの対応する対イオン、この場合には一価塩化物イオンにカップリングすることが確実になる。以前の保管または任意の他の残りの分子から生じる水酸化物イオンのようなイオンでの塩化物イオンの交換はアルカリ性条件下で優先的に起こる。最終的なバッファー組成に対するカラムを調製するために、樹脂を、６５％ＱＡ１と３５％ＱＢ１の混合物を用いて５カラム体積にわたって平衡化することができる。これらはどちらも５０ｍＭのＴｒｉｓバッファーであり、塩化ナトリウム濃度のみが異なる。さらに、どちらのバッファーも、それぞれタンパク質構造の安定化および負に荷電した表面への吸着の防止のために必要である５ｍＭの塩化カルシウムおよび０．１％ポリソルベート８０を含有する。すでに述べたＱＡ１バッファーとＱＢ１バッファーの比により、塩化ナトリウム容量モル濃度およそ２６０ｍＭがもたらされる。第４のおよび実際の平衡化ステップは、排他的にＱＡ１バッファーを用いて実施することが好ましい。これが試料適用前の最後のステップであるので、総体積１０カラム体積をカラムを通過させて、どちらもＦＶＩＩＩ分子の樹脂への結合のために必要である低電気伝導率およびほぼ中性のｐＨ条件を保証する。試料を上記の通り調製し、次いで、試料ポンプおよび空気センサーを使用してカラムに適用することができる。カラムロードは、およそ１８，５００ＩＵ／ｍＬのＭｏｎｏＱ樹脂である。得られたフロースルーを出口弁を介して収集し、残りの結合していない生成物をさらに分析するために使用することができる。結合していない試料溶液を４カラム体積のＱＡ１バッファーを使用した洗浄ステップによってカラムから取り出すことができる。軽微な不純物を低塩濃度によって取り除くことができる。したがって、どちらも１０カラム体積の、１３％および１８％ＱＢ１バッファーを用いた２つの洗浄ステップを実行することが好ましい。これまでに記載したこれらのステップは全て、滞留時間８．４０分に対応する直線流速３５．７１ｃｍ／ｈで実施することができる。リニアグラジエント溶出の間の流速は２０．０ｃｍ／ｈまで低下させることが好ましく、８カラム体積にわたってＱＢ１バッファーの濃度を１８％から１００％まで上昇させる。これにより、２０ｍＳ／ｃｍで始まり、最終的に、大まかに８０ｍＳ／ｃｍで終わる電気伝導率グラジエントがもたらされる。このレベルをさらなる５カラム体積にわたってほぼ同様の流速で維持して、最終的に、残りのＦＶＩＩＩ亜種を取り除くことができる。３つの洗浄ステップの全てならびにグラジエントおよび直線ステップ溶出をその後の試料採取のために画分収集器具に妥当な画分サイズで集めることができる。溶出が完了したら、カラムを再生して、あらゆる種類の残りの物質、主にタンパク質およびペプチドを樹脂から取り除かなければならない。各ステップが５カラム体積である一連のＭｉｌｌｉＱ、７５％酢酸、ＭｉｌｌｉＱおよび１Ｍの水酸化ナトリウムを２回繰り返し、最終的に、別のＭｉｌｌｉＱすすぎのステップで完了することが好ましい。ＭｏｎｏＱ樹脂の莫大な結合能に起因して結合はカラムの上部領域で起こることが想定されるので、流れは上方に方向付ける。能力の限界に達することはほとんどない。しかし、再生相におけるダウンフロー方式では、不純物が１つの結合性部位から次の結合性部位まで、最終的にカラム出口で取り除かれるまで単に輸送される。アップフロー方式では、対照的に、不純物がはるかに効率的に取り除かれる。さらに、カラム衛生化により、細菌または藻類による生物学的混入が防止される。再生サイクルの間の直線流速は、それぞれの溶液に依存する。ＭｉｌｌｉＱは粘度が低いので、最大直線流速６０．４８ｃｍ／ｈのみを使用する。７５％酢酸ははるかに粘性が高く、カラム内の圧力問題を引き起こす可能性がある。これを防止するために、その流れを１９．０５ｃｍ／ｈ、大まかに最大流速の３分の１まで遅くすることができる。１Ｍの水酸化ナトリウム溶液を使用するステップは、中間の流速で動作させることが好ましい。最終ステップはカラム保管であり得る。ＭｏｎｏＱ樹脂は、それらを無菌に保つため、または少なくとも微生物ファウリングを防止するために、１０ｍＭの水酸化ナトリウム溶液中で保管する。カラムを、１０ｍＭの水酸化ナトリウム溶液を５カラム体積で用い、ダウンフロー方式、中間の流速３８．１０ｃｍ／ｈで流すことができる。
【０２１４】
本発明の方法による第１のクロマトグラフィーステップでは、溶出相におけるグラジエントの長さを延長することが好ましい。本発明者らは、驚いたことに、これにより、ＦＶＩＩＩ亜種の分離が増強されることを見出した。標準のリニアグラジエントの長さは、上記の通り８カラム体積に設定する。得られるグラジエントは、電気伝導率がその標的値にちょうど８カラム体積で達するので、比較的急勾配であり、持続時間が短い。グラジエントの長さを１６カラム体積に倍加することにより、２倍平らな電気伝導率の上昇が導かれる。バッファー系自体および他の相をさらに改変する必要はない。
【０２１５】
好ましい実施形態では、本発明による方法における第１のクロマトグラフィーステップの前にフューリンプロテアーゼ成熟化を実施することができる。フューリンプロテアーゼは、通常、プロペプチドおよび未成熟タンパク質を切断してそれらのそれぞれの活性型にすることに関与する。本発明者らは、驚いたことに、試料をある特定の量の活性なフューリンと共にインキュベートすることにより、不均一性の低減、したがって溶出の間の異なる挙動が導かれることを見出した。したがって、成熟化手順を標準の試料調製に含めることが好ましい。そのような実施形態では、ネイティブな試料を、そのイオン強度を低下させるため、および溶液温度を上昇させるために、例えば室温にしたＱＡ１バッファーを用いて希釈係数２で希釈することができる。どちらも酵素が妥当な機能および活性を示すために必要である。次いで、ある特定の量の酵素溶液を添加し、その結果、この時点の濃度を、希釈された試料溶液１ｍＬ当たり少なくとも１００ＩＵすることができる。例えば最小の持続時間である４時間にわたって室温でインキュベートした後、酵素反応を停止させるため、および試料電気伝導率をさらに低下させるために、冷ＱＡ１バッファーを用いた別の希釈ステップ（１：２）を実施することができる。どちらの希釈ステップも、総希釈係数４に対応し得る。最終的に、試料溶液を０．２μｍの滅菌フィルターカプセルを通して濾過して、最終的に存在する固体粒子を取り除き、カラム損傷を防止することができる。フューリンプロテアーゼ処理に加えて、上記の通りグラジエントの長さを延長する手法を適用することが好ましい。溶出相に対して１６カラム体積のグラジエントの長さを保持することができる。
【０２１６】
本発明の方法による第１のクロマトグラフィーステップのさらなる実施形態では、さらに延長されたグラジエントの長さおよび溶出相への添加剤としてのエチレングリコールによりＦＶＩＩＩ亜種の分離が実現される。クロマトグラフィースキームは、表１に記載のものとグラジエントの長さおよびバッファー組成以外はほぼ同一であり得る。フューリンプロテアーゼで処理し、希釈した試料をカラムに適用し、その後、４カラム体積の元のＱＡ１バッファーで流すことができる。次の２つの洗浄ステップは、ＱＡ１およびＱＢ１バッファーを含有するエチレングリコールを用いて実施することができる。次いで、３２カラム体積の増大されたグラジエントの長さにわたってＱＢ１バッファーを含有するエチレングリコールのパーセンテージを１８％から１００％まで上昇させることにより、溶出を行うことができる。グラジエントの長さの延長により、ＦＶＩＩＩ亜種ピークの分布がさらに広がるはずである。エチレングリコールにより、溶出の間のバッファーの電気伝導率が低下する。エチレングリコールは、標的タンパク質の疎水性に対処することによって分解能を増大させるために添加することができる。
【０２１７】
本発明による方法の第１のステップにおいてラージスケール（分取）クロマトグラフィーをどのように実施することができるかに関する例示的な実施形態を以下に記載する。当業者には明らかになる通り、条件は全て、ただ単に好ましいパラメータおよび条件を表し、本発明をそれらに限定するものではない。さらに、列挙されているパラメータおよび条件は全て、本発明の方法に従って第１のクロマトグラフィーステップを実施するために任意の他の列挙されているパラメータおよび条件と組み合わせることができる。ＦＶＩＩＩ亜種のラージスケール精製の第１のステップとして、ＭｏｎｏＱ  Ｐｒｅｐ  Ｓｃａｌｅカラムをおよそ２０ｍＬのカラム体積で使用して分取アニオン交換クロマトグラフィーを実施することができる。ＭｏｎｏＱ樹脂および対応するカラムハードウェアに関するさらなる情報を以下に提示する。分取的実行を上記と同様の条件下で実施することができる。したがって、スモールスケールでの実行について記載されている好ましい実施形態は分取的実行の好ましい実施形態でもある。それでも、有用であると評価されたいくつかのパラメータを分取ＭｏｎｏＱ実行のための例示的なクロマトグラフィースキームに実装することが好ましく、それを以下の表に示す。
【表２】
2020524688.tif 000003
【０２１８】
スモールスケールでの実行と同様に、ＳＯＳ−Ｅを分取的実行のための出発材料として使用することができる。カラムローディングをＭｏｎｏＱ樹脂１ｍＬ当たり２０，０００ＩＵに設定することができる。カラムローディングに対応する必要量をゆっくりと解凍し、その後、例えば、室温にしたＱＡ１バッファーを用いて希釈係数２で希釈することが好ましい。フューリンプロテアーゼ成熟化を、希釈された試料溶液１ｍＬ当たり≧１００ＩＵの活性レベルで、例えば室温で少なくとも４時間にわたって実施することができる。次いで、フューリン成熟化された試料溶液を、再度ＱＡ１バッファーを用いて希釈係数２で希釈し、したがって、総希釈度を１：４と等しくすることができる。この時は、溶液温度を低下させることによってフューリン活性を低下させるために、使用するＱＡ１バッファーを４℃に冷却することが好ましい。最終的に、試料溶液を、蠕動ポンプおよび滅菌ケイ素チューブを使用して０．２μｍの滅菌フィルターモジュールを流速５０ｍＬ／分で通して濾過することができる。出発材料のバッファー組成には、例えば、それらが由来する異なるクロマトグラフィーステップに起因して差異があり得る。例えば、本発明では、Ｆ８＿ＡＤ２＿９０ｋＤａと称される９０ｋＤａの亜種のプールの精製により、改変された試料調製手順を開発することが必要になる。ＦＶＩＩＩ以外のタンパク質をそれほど伴わず出発材料に利用可能な発色値が存在しない場合、活性は、タンパク質濃度から、タンパク質１ｍｇ当たり５０００ＩＵである概算の比活性を使用して大まかに導き出すことができる。例を以下に示す：
【数１】
2020524688.tif 000004
【０２１９】
ここで、４０００ＩＵ／ｍＬは、カラムローディングの上限である２０，０００ＩＵ／ｍＬよりもかなり低く、したがって、試料プール全体を単一の実行でカラムに適用することができる。したがって、試料を解凍し、その後、例えば室温にしたＱＡ１バッファーおよびＳＡ３バッファーを用いて、電気伝導率１１ｍＳ／ｃｍおよびｐＨ値６．５に達するまで希釈することができる。ネイティブな試料体積とＱＡ１バッファーとＳＡ３バッファーの比は、およそ１：４：２．９である。この手順により、バッファー組成、電気伝導率およびｐＨ値に関して、ＳｏｕｒｃｅＳ溶出液から開始したものと同様の条件が保証される。材料がすでに精製サイクル全体を通っており、したがって、非常に純粋であるはずである場合には、フューリン成熟化および滅菌濾過を実施しないことが好ましい。一般的なクロマトグラフィーステップおよびバッファーを変化させずに保持することができる。カラム平衡化を、６カラム体積のアルカリ性ＯＣ１バッファーを直線流速７１．０ｃｍ／ｈで用いて開始することができる。直線流速は、グラジエント溶出相まで維持することができる。その後、アルカリ性ＯＣ１バッファーを取り除くために、２カラム体積の超純水をカラムに適用することができる。実際のカラム平衡化は、標準手順と同様に実施することができる。まず、５カラム体積の、６５％ＱＡ１バッファーおよび３５％ＱＢ１バッファーを含有する混合物をカラムに適用し、その後、試料ローディングのための妥当な条件を実現するために、１０カラム体積のＱＡ１バッファーを適用することができる。試料適用は、試料ポンプおよび空気センサーを使用してカラムに直接適用することによって行うことができる。通過する液体を、最終的に結合していない試料成分をさらに分析するために収集することができる。その後、結合していない試料を４カラム体積のＱＡ１バッファーによって洗い流すことができる。弱い結合の試料成分を、それぞれＱＡ１バッファー中１３％および１８％ＱＢ１のステップグラジエントを用いた２つの洗浄ステップによって溶出することができる。どちらも相の長さは１０カラム体積であり、直線流速７１．０ｃｍ／ｈで実施することができる。リニアグラジエント溶出自体により、３２カラム体積において１８％から１００％までのＱＢ１溶出バッファーの量が生じる。スモールスケールでの実行における評価から、延長されたグラジエントの長さを使用することが好ましい。溶出相の間の流速は、４０．０ｃｍ／ｈまで低下させることが好ましい。別の５カラム体積のＱＢ１バッファー、直線流速３９．０ｃｍ／ｈにより、カラムになお結合しているタンパク質が取り除かれると推測される。カラム再生は、上記の標準の再生相とほぼ同一であってよい。７５％酢酸などの高い粘度溶液に対して超純水のような粘度が低い溶液を使用する場合の高圧条件を防止するために、後の相を１カラム体積に対して前の相の低い直線流速で動作させた後に流れを増加させることができる。カラム再生はアップフロー方式で駆動することができる。カラムを最終的に、１０ｍＭの水酸化ナトリウム溶液中で保管することができる。分取ＭｏｎｏＱ実行は、ＡＫＴＡ  Ｐｕｒｅ  １５０システムで実施することができ��。試料適用から開始して直線溶出相で終了する全ての相を異なる出口および画分収集器具を通じて収集することができる。リニアグラジエント溶出相の最初の部分および最後は出口位置に収集することができるが、生成物が最終的に溶出する範囲は、その後のプールのために画分収集器具で小画分に収集されることが好ましい。
【０２２０】
本発明の方法の第２のクロマトグラフィーステップ：
本発明による方法の第２のステップにおいてスモールスケールクロマトグラフィーをどのように実施することができるかに関する例示的な実施形態を以下に記載する。当業者には明らかになる通り、条件は全て、ただ単に好ましいパラメータおよび条件を表し、本発明をそれらに限定するものではない。さらに、列挙されているパラメータおよび条件は全て、本発明の方法に従って第２のクロマトグラフィーステップを実施するために任意の他の列挙されているパラメータおよび条件と組み合わせることができる。本発明の方法の第２のクロマトグラフィーステップとしてのサイズ排除クロマトグラフィーは、ＭｏｎｏＱカラムでアニオン交換クロマトグラフィーによって生成した溶出液をさらに精製するためのプロセスのステップとしての機能を果たす。これは、軽微な不純物を取り除くための最終精製ステップとも称することができる。サイズ排除クロマトグラフィーの一般的な手順の展開は、ベッド高が３０ｃｍであり、おおよそのカラム体積が２３．５ｍＬの予め充填されたＳｕｐｅｒｄｅｘ  Ｉｎｃｒｅａｅｓｅ  ２００カラムで実現することができる。サイズ排除クロマトグラフィーは、分子が出入りできるゲル体積がその分子のサイズに応じて異なることに基づく。したがって、ＳＥＣ樹脂は標的タンパク質に結合するまたはそれを保持するいかなる官能基も有さない。したがって、特定の平衡化または溶出バッファーを有する必要はなく、そうではなく、平衡化、試料適用および溶出相の間にランニングバッファーとしての機能を果たすバッファーを有する。大まかに３００ｍＭの塩化ナトリウムを得るために、ＳＥＣランニングバッファーは２０％ＱＡ１バッファーおよび８０％ＱＢ２バッファーで構成されることが好ましい。これは、生成物をＭｏｎｏＱ樹脂から溶出することが好ましい塩濃度と同じ範囲内である。一般的なクロマトグラフィースキームは表３に見出すことができる。第１の平衡化相を使用して、カラムを通常保管する２０％エタノールを取り除く。したがって、１．５カラム体積のＭｉｌｌｉＱは、滞留時間９０分に対応する２０．０ｃｍ／ｈで流すことができる。次いで、カラムをＳＥＣランニングバッファー中、２カラム体積に対して直線流速４５．０ｃｍ／ｈで平衡化することができる。これがカラム保管以外の全てのステップについてのデフォルト流速であってもよい。より高い流速を試験したが、高圧条件が時に引き起こされるので不適切であることが分かった。満足のいく分離結果を得るためには、推奨される試料体積は２５μＬから５００μＬまでにわたる。そのような小さな試料体積は、キャピラリーループを使用して適用することができる。分離が実際に起こる溶出相の間に試料を１．５カラム体積のランニングバッファーで洗い流すことができる。この体積は、画分収集器具を使用して小画分中に収集する。その後、カラムを、２カラム体積の０．５Ｍの水酸化ナトリウム溶液および２カラム体積の超純水を含む短い再生相にデフォルト流速で供することができる。最終的に、保管のために、カラムに２カラム体積の２０％エタノールを低下させた直線流速２０．０ｃｍ／ｈで流すことができる。
【０２２１】
【表３】
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【０２２２】
本発明による方法の第２のステップにおいてラージスケール（分取）クロマトグラフィーをどのように実施するかに関する例示的な実施形態を以下に記載する。当業者には明らかになる通り、条件は全て、ただ単に好ましいパラメータおよび条件を表し、本発明をそれらに限定するものではない。さらに、列挙されているパラメータおよび条件は全て、本発明の方法に従って第２のクロマトグラフィーステップを実施するために任意の他の列挙されているパラメータおよび条件と組み合わせることができる。分取スケールサイズ排除クロマトグラフィーの手順は、上記のスモールスケール手順に基づき、したがって、大多数のパラメータを一定に保つ。分取スケールＳＥＣカラムベッド高はほぼ１００ｃｍであるので、ゲルベッド圧縮に対する感受性がはるかに高い。したがって、超過圧力条件および潜在的に生じるカラム損傷を回避するために、流速を劇的に低下させる必要がある。保管溶液を取り除くために第１の平衡化のステップを使用し、これは、通常は０．１Ｍの水酸化ナトリウムであるが、一部の場合では２０％エタノール溶液も使用される。その目的で、実際の平衡化相の前に１カラム体積の超純水をカラムに低下させた流速で流すことができる。この相は、２カラム体積のＳＥＣ平衡化／溶出バッファーを滞留時間５９６．２１分に対応する流速９．５ｃｍ／ｈで用いて行うことができる。以下のステップは全て、滞留時間５２９．３５分と等しいデフォルト流速１０．７ｃｍ／ｈで実施することが好ましい。所望のＦＶＩＩＩ亜種を含有するＭｏｎｏＱ溶出液試料およそ３０〜３５ｍＬを室温でゆっくりと解凍し、５０ｍＬのスーパーループによってカラムに直接適用することができる。スモールスケール実験において好ましく使用された元の溶出相は１．５カラム体積の長さであり、完全に分画されたものであった。分取スケールカラムサイズでは、適切な画分において目的の溶出の範囲を収集できるようにするために、元の溶出相を３つの別個の溶出相に分けることが必要になる。他の溶出相と同様に、第１の溶出相は、ＳＥＣ平衡化／溶出バッファーをデフォルト流速で用いて０．２４カラム体積に対して実施することが好ましく、出口弁を通じて収集する。生成物の実際の溶出は、第２の溶出相において起こるはずである。総体積０．４９カラム体積をそれぞれ約１６．５ｍＬである５５画分中に収集することができる。第３の溶出相は、０．７７カラム体積の長さであり、第１の溶出相と同様に、出口弁を通じて完全に収集することができる。３つの溶出相は全て合わせて、全部で１．５カラム体積であってよく、これは、元の好ましいスモールスケール実験の溶出手順と等しい。その後、０．５Ｍの水酸化ナトリウムおよび超純水を用いた処理を含有する短いカラム再生を行うことができる。両方の相のそれぞれは、２カラム体積の長さであってよく、デフォルト流速１０．７ｃｍ／ｈで行うことができる。最終的に、保管のためにカラムに１．５カラム体積の０．１Ｍの水酸化ナトリウム溶液を流すことができる。同じＦＶＩＩＩ亜種の２つまたはそれよりも多くのバッチが順次精製される場合には、カラム再生およびカラム保管を最終的にスキップすることができる。そのような場合では、ＳＥＣ平衡化／溶出バッファーを用いた再平衡化を第３の溶出相の直後に置くことができる。
【０２２３】
【表４】
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【０２２４】
本発明による方法における第２のクロマトグラフィーステップの別の実施形態では、１５０ｋＤａの亜種と１８０ｋＤａの亜種を互いに分離する代替法として疎水性相互作用クロマトグラフィーを実施する。室温、ＡＫＴＡ  Ａｖａｎｔ  ２５システムにおいて１．０ｍＬのフェニルセファロース高性能カラムでの実行を実施することができる。種々のパラメータおよび条件を変動させ、試験することができる。標準の条件下での実行のための例示的なクロマトグラフィースキームを表５に見ることができる。疎水性相互作用クロマトグラフィーの機構はイオン交換クロマトグラフィーとは反対であるので、試料の結合は高塩濃度条件下で起こり、一方、溶出は低電気伝導率で引き起こされる。標準のセットアップは、強度が異なる溶出バッファーを用いた２つの連続したリニアグラジエントを使用する２次元クロマトグラフィーである。本発明による方法の第２のステップにおいて疎水性相互作用クロマトグラフィーをどのように実施することができるかに関する例示的な実施形態を以下に記載する。当業者には明らかになる通り、条件は全て、ただ単に好ましいパラメータおよび条件を表し、本発明をそれらに限定するものではない。さらに、列挙されているパラメータおよび条件は全て、本発明の方法に従って第２のクロマトグラフィーステップを実施するために任意の他の列挙されているパラメータおよび条件と組み合わせることができる。カラムローディングの上限を樹脂１ｍＬ当たり１０，０００ｌＵと指定することができ、実際のカラムローディングはその限界をさらに下回るように選択することができる。ある特定の量の、例えばＳｏｕｒｃｅＳ溶出液を室温でゆっくりと解凍することが好ましい。その後、フューリンプロテアーゼを、フューリン活性が試料溶液１ｍＬ当たり１００ＩＵを上回る程度まで添加することができる。室温で４時間にわたってフューリン成熟化したら、試料をＨＩＣバッファーＡを用いて希釈係数２で希釈することができる。これは、塩濃度を上昇させるため、および試料の結合を可能にするために必要である。０．２μｍのフィルターディスクを通す濾過滅菌を試料調製の最終ステップとすることができる。カラム保管には２０％エタノール溶液が一般に使用される。カラムに、最初に２カラム体積のＨＩＣ平衡化バッファーＥ１を流して、エタノールをカラムから取り除くことができる。これは、直線流速１０ｃｍ／ｈで行うことができる。その後、カラムを、５カラム体積の、バッファーＤを含有するエチレングリコール、および５カラム体積の高塩濃度平衡化バッファーＥ１を用いて平衡化することができる。直線流速２０ｃｍ／ｈをこれらの２つのステップならびにその後のステップの全てのデフォルト流速として使用することができる。カラムを高塩濃度条件で平衡化した後、試料を適用することができる。タンパク質表面上の疎水性領域は、高度に極性の周囲の水相との接触を回避するために、樹脂上の疎水性フェニル基に結合する傾向がある。試料適用は、試料ポンプおよび空気センサーを用い、試料体積全体がカラムを通過するまで行うことができる。フロースルー画分を、出口位置を経て収集することができる。カラムを５カラム体積の平衡化バッファーＥ１で洗浄した後、溶出相を開始することができる。最初に、溶出バッファーＣのパーセンテージ画分を２０カラム体積において０から１００％まで上昇させることができる。このレベルを溶出の第２の部分を開始するまでさらに５カラム体積にわたって保つことが好ましい。バッファーＤを含有するエチレングリコールのレベルを１６カラム体積において１００％まで上昇させ、さらなる５カラム体積にわたって維持することができる。両方のグラジエントを含む溶出相全体を、画分収集器具を使用して小画分に収集することができる。カラムを、一連の超純水、イソプロピルアルコール、超純水、１Ｍの水酸化ナトリウム溶液および最終的に、再度超純水によって再生することができる。その後、保管のために、カラムに５カラム体積の２０％エタノール溶液を流すことができる。
【０２２５】
本発明による方法の疎水性相互作用クロマトグラフィーステップの別の実施形態では、バッファーを調整し、グラジエントの長さを延長する。全体的な手順は上記の実施形態と同様であるが、この実施形態ではいくつかのパラメータを変動させることが好ましい。塩化ナトリウム容量モル濃度が７５０ｍＭである新しい平衡化バッファーを実装することが好ましく、これは、ＨＩＣバッファーＥ２と称される−その電気伝導率はおよそ７１ｍＳ／ｃｍである。出発材料を１５０ｋＤａが富化されたＭｏｎｏＱ溶出液プールに置き換えることができる。そのような試料がＭｏｎｏＱカラムへのローディング前にすでにフューリンプロテアーゼで処理されている場合、第２のフューリン成熟化は必要ない。試料溶液の電気伝導率を、平衡化バッファーと同じレベルに調整するために、ＨＩＣバッファーＡおよび２Ｍの塩化ナトリウム溶液を用いておよそ７１ｍＳ／ｃｍまで上昇させることが好ましい。カラム平衡化、試料適用およびカラム再生は、標準手順と同じであってよい。試料適用後の洗浄相を、新しい平衡化バッファーＥ２を使用して１０カラム体積に倍加することが好ましい。溶出相自体は、塩化ナトリウムを全く含有しない溶出バッファーＣを使用し、ただ１つのグラジエントからなることが好ましい。バッファーＣの量を、延長されたグラジエントの長さ４０カラム体積において、１００％まではるかに平らに上昇させることが好ましい。１００％バッファーＣのレベルをさらに５カラム体積にわたって保つことができる。その直後に、カラムを通常の再生手順に供すことができる。バッファーＤを含有するエチレングリコールを使用した第２のグラジエントはもはや使用しないことが好ましい。
【０２２６】
本発明による方法における第２のクロマトグラフィーステップの好ましい実施形態では、疎水性相互作用クロマトグラフィーは、ネガティブモードクロマトグラフィーである。ネガティブモードクロマトグラフィーは、生成物ではなく不純物を結合させることを目的とする。本発明では、１５０ｋＤａの亜種以外の残りの亜種がカラムに結合すると予想され、一方、１５０ｋＤａの亜種は、程度の差はあるがカラムを通過し、フロースルー画分中に溶出すると考えられる。ネガティブモードクロマトグラフィーの手順は他のＨＩＣ手法とは全く異なり、例示的な手順を表５に示す。本発明による方法の第２のステップにおいてネガティブモードクロマトグラフィーをどのように実施することができるかに関する例示的な実施形態を以下に記載する。当業者には明らかになる通り、条件は全て、ただ単に好ましいパラメータおよび条件を表し、本発明をそれらに限定するものではない。さらに、列挙されているパラメータおよび条件は全て、本発明の方法に従って第２のクロマトグラフィーステップを実施するために任意の他の列挙されているパラメータおよび条件と組み合わせることができる。試料は、分取精製ステップから得られた、１５０ｋＤａの亜種が富化されたＭｏｎｏＱ溶出液プールであってよい。試料溶液を解凍し、同じ量の室温にしたバッファーＡで希釈する（１：２希釈）ことが好ましい。次いで、高塩濃度のバッファーＧを使用して電気伝導率を７０．０ｍＳ／ｃｍまでさらに上昇させることができる。平衡化バッファーＥ２を、バッファーＧを添加することにより、電気伝導率レベル７５．０ｍＳ／ｃｍまで同様に調整することができる。カラムを標準手順に従って平衡化することができる。希釈および調整したＭｏｎｏＱ溶出液を、試料ポンプを使用してカラムに直接適用することができる。最大のカラムローディングをはるかに超える可能性があり、その場合、ある時点で、ブレークスルーが観察される可能性がある。洗浄相は、生成物がカラムから洗い流されることが予想されるステップであるので、３０カラム体積に延長することが好ましい。単一画分の詳細な分析を可能にするために、洗浄相を小画分に収集することができる。カラム溶出のために、結合したタンパク質全てを取り除くためにカラムに１０カラム体積の溶出バッファーＣを流すことができる。カラム再生を標準手順に従って実施することができる。
【０２２７】
【表５】
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【０２２８】
本発明の方法の濃縮ステップ（例えば、第３のクロマトグラフィーステップ）
本発明の方法による濃縮ステップでは、濃縮のためにアニオン交換クロマトグラフィーを実施することができる。アニオン交換樹脂ＳｏｕｒｃｅＱは、ＭｏｎｏＱ樹脂と同様である。官能基は同一であるが、ＳｏｕｒｃｅＱ粒子はＭｏｎｏＱ粒子の３倍の大きさである−したがって、ＳｏｕｒｃｅＱ樹脂での分解能は低下する。ＳｏｕｒｃｅＱアニオン交換体は、本発明では、ＦＶＩＩＩ亜種の分取精製の最終ステップとして使用され得る。しかし、サイズ排除クロマトグラフィーから生じる溶出液をさらに精製する代わりに、このステップを濃縮のために使用することができる。ＭｏｎｏＱ溶出液は分取サイズ排除クロマトグラフィーの間に著しく希釈され、これにより、濃縮ステップが必要になる。一般的な手順は、カラム平衡化、試料適用、総タンパク質含量の小さな体積での迅速な溶出を目的とする急なステップ溶出相、ならびに最終的に、カラム再生および保管を含む。ＳＥＣ溶出液を濃縮するために利用可能なＳｏｕｒｃｅＱカラムが２つ存在する。ＳｏｕｒｃｅＱ樹脂の結合能は、非常に高い結合能を有するＭｏｎｏＱ樹脂と同等であるので、ほとんどの場合、カラム体積およそ３ｍＬの小さなＳｏｕｒｃｅＱカラムの使用で十分である。表６に示されている好ましいクロマトグラフィースキームは、小さなＳｏｕｒｃｅＱカラムを指す。しかし、いくつかの生成物プールはタンパク質濃度が高いので、それらにはカラム体積７ｍＬのより大きなＳｏｕｒｃｅＱカラムを使用することが必要になり得る。より大きなカラムのためのクロマトグラフィースキームは、原理上は表６に示されているものと同様である。それぞれのカラムの性質に応じて、滞留時間が一定に保たれるように直線流速をスケールアップする。
【０２２９】
【表６】
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【０２３０】
本発明による方法の第３のステップにおいてクロマトグラフィーをどのように実施することができるかに関する例示的な実施形態を以下に記載する。当業者には明らかになる通り、条件は全て、ただ単に好ましいパラメータおよび条件を表し、本発明をそれらに限定するものではない。さらに、列挙されているパラメータおよび条件は全て、本発明の方法による第３のクロマトグラフィーステップにおいてクロマトグラフィーを実施するために任意の他の列挙されているパラメータおよび条件と組み合わせることができる。官能基に塩化物イオンを対イオンとして会合させるために、平衡化を最初に６．８カラム体積のアルカリ性ＯＣ１バッファーを低下させた直線流速２９．８ｃｍ／ｈで用いて開始することができる。その後、２カラム体積のＭｉｌｌｉＱを滞留時間２．９７分に対応する流速７８．８ｃｍ／ｈで用いてカラムをすすぐことによってＯＣ１バッファーを取り除くことができる。その後、カラムを３０％ＱＡ１バッファーと７０％ＱＢ２バッファーの混合物を用いて５カラム体積にわたって処理することができる。この混合物は、およそ２６０ｍＭの塩化ナトリウムを含有し、バッファー系が変化した時に対イオンである塩化物イオンが官能基から洗い流されるのを防止する。第４の平衡化相を、ＱＡ１バッファーを用いて排他的に実施することができる。カラムを試料適用に適した条件にするために、カラムに１０カラム体積を流速２．９７ｃｍ／ｈで適用することができる。試料適用は低電気伝導率条件においてのみ行う。分取サイズ排除クロマトグラフィーは、ＳｏｕｒｃｅＱカラムへの試料の結合を防止すると思われるおよそ３０ｍＳ／ｃｍの電気伝導率レベルを引き起こす中間の塩化ナトリウム濃度で動作させることが好ましい。したがって、電気伝導率レベルを、ＱＡ１バッファーを添加することによって１１ｍＳ／ｃｍまたはそれ未満に達するまで低下させることが必要である。これにより、試料体積の大まかに５倍の増大が引き起こされ得る。試料を、試料ポンプおよび空気センサーを使用し、直線流速７８．８ｃｍ／ｈでカラムに適用することができる。その後、溶出相を開始する前にカラムを４カラム体積のＱＡ１バッファーで洗浄することができる。溶出は、８０％ＱＢ２バッファーおよび２０％ＱＡ１バッファーのステップグラジエントを用いて４カラム体積にわたって行うことが好ましい。これは、塩化ナトリウム濃度３００ｍＭまたは電気伝導率３０ｍＳ／ｃｍと相関する。それにより、標的タンパク質が小さな体積で急速に溶出する。画分を画分収集器具に収集することができる。それぞれの画分を、適切なタンパク質濃度が実現されるようにプールすることができる。第２のレベルの溶出は、３７５ｍＭの塩化ナトリウム濃度に対応する１００％ＱＢ２バッファーを用いて実施することが好ましい。次いで、一連の超純水、５０％酢酸、超純水、１Ｍの水酸化ナトリウムおよび最終的に再度の超純水により、それぞれ５．５カラム体積の長さ、それらの粘度に応じた種々の流速でカラムを再生することができる。カラムに５カラム体積の１０ｍＭの水酸化ナトリウムを流すことによって抗菌保管条件を得ることができる。
【０２３１】
当業者には明らかになる通り、任意の適切なクロマトグラフィーシステムを使用して本発明の方法を実施することができる。例えば、スモールスケールおよびラージスケール精製をＡＫＴＡ  ＦＰＬＣ（高速タンパク質液体クロマトグラフィー）システムで実施することができる。スモールスケールカラムおよび低流速にはＡＫＴＡ  Ｐｕｒｅ  ２５およびＡＫＴＡ  Ａｖａｎｔ  ２５システムが適しているが、より多量のタンパク質および付随するより大きなカラム直径ならびにより大きな流速の精製にはＡＫＴＡ  Ｐｕｒｅ  １５０システムが使用される。全てのＡＫＴＡクロマトグラフはＵＮＩＣＯＲＮソフトウェアパッケージによって動作させることができる。
【０２３２】
【表７】
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【０２３３】
【表８】
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【０２３４】
【表９−１】
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【表９−２】
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【表９−３】
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【０２３５】
当業者には明らかになる通り、本発明の方法の最終濃縮ステップは必ずしもクロマトグラフィーステップではない。本発明の前述の（第２の）クロマトグラフィーステップのＦＶＩＩＩ亜種を含む溶出液を濃縮するための多数の適切な代替が当業者には分かるであろう。例えば、限外濾過を濃縮に使用することができる。
【０２３６】
当業者には明らかになる通り、本発明に従ってＦＶＩＩＩ亜種を精製するための方法は、他のタンパク質またはタンパク質サブユニットをいくつかのタンパク質またはタンパク質サブユニットを含む組成物から高い純度で精製するために使用することもできる。当然、そのあと、精製されたタンパク質またはタンパク質サブユニットを含む組成物を例えば医薬として使用することができる。
【０２３７】
驚いたことに、本発明者らは、亜種精製をしない場合であっても、組換えＦＶＩＩＩのフューリン処理によりＦＶＩＩＩの活性が増大することも見出した。そのようなＦＶＩＩＩのフューリン処理は、フューリン処理に関して上記の通りＦＶＩＩＩ亜種を精製するための方法の一部として実施することができる。単鎖（すなわち、切断されていない）ＦＶＩＩＩを含む組換えＦＶＩＩＩを、本発明の亜種精製は伴わずにフューリン処理に供することが好ましい。そのようなフューリン処理は、フューリンを５０ＩＵ／ｍＬよりも高い、１００ＩＵ／ｍＬよりも高い、２００ＩＵ／ｍＬよりも高いまたは３００ＩＵ／ｍＬよりも高い最終濃度で使用して実施することができるが、フューリンを１００ＩＵ／ｍＬよりも高い最終濃度で使用して実施することが好ましい。フューリン処理は、室温で、すなわち、およそ２１℃で１時間にわたって実施することができる。フューリン処理後、フューリンをＦＶＩＩＩから分離することができる。フューリンで処理したＦＶＩＩＩを、例えば、血友病Ａなどの出血性障害を有する患者を処置するための医薬として使用することができる。
【０２３８】
当業者には分かる通り、水溶液中のタンパク質濃度を決定するために利用可能な種々の方法が存在する。高度に精製されたタンパク質溶液に対しては２８０ｎｍにおける紫外線領域での分光光度測定が適切であり、したがって、本発明において使用されることが好ましい。ランベルト・ベールの法則によると、
Ａ＝ε・ｌ・ｃ
は、タンパク質濃度ｃ（Ｍ）、セル行路の長さ１（ｃｍ）および吸光係数ε（Ｍ−１ｃｍ−１）の一次関数である、測定される吸光度Ａである。タンパク質溶液の２８０ｎｍにおける吸光度に関する根本原理は、芳香族アミノ酸であるトリプトファンおよびチロシン、ならびに、総吸光度により少ない程度に寄与するシスチン、すなわち、ジスルフィド結合の含有量である。フェニルアラニンは、低波長においてのみ吸光度に寄与し、したがって、２８０ｎｍにおけるＵＶ測定には関連しない。水溶液からタンパク質濃度を観察できるようにするために、アミノ酸組成ならびに芳香族アミノ酸およびシスチンの存在量に主に依存する特定のタンパク質についての吸光係数を決定する必要がある。組換えＦＶＩＩＩの組成は不均一であるので（上記を参照されたい）、精製された亜種画分についてタンパク質濃度を算出するために、各ＦＶＩＩＩ亜種に特異的な吸光係数が必要である。タンパク質濃度１ｍｇ／ｍＬにおけるこれらの亜種に特異的な吸光係数の算出を以下に見出すことができる。これらの亜種に特異的な吸光係数に基づく換算係数を算出して、タンパク質濃度の算出をさらに単純化した。測定自体を、試料と同一のバッファー組成を含有するブランク溶液に対して実施する。吸収の度合いを、上記の方程式を使用してそれぞれのタンパク質濃度に変換することができる。この方法の標的値としてのタンパク質濃度を、例えば、クロマトグラフィー濃縮ステップがどのくらい有効に働くかの尺度として使用する。
【０２３９】
当業者には分かる通り、ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、高分子生体分子、例えばタンパク質を、それらのサイズ、コンフォメーションおよび電荷に応じて分離するために使用される技法である。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）またはドデシル硫酸リチウム（ＬＤＳ）の使用により、複合体形成による二次および三次構造の破壊、ならびにそれにより、タンパク質の直鎖化が引き起こされる。ジスルフィド結合を分離するため、および再形成を防止するためにジチオスレイトール（ＤＴＴ）およびヨードアセトアミドなどの還元剤を使用する。さらに、ＳＤＳの結合により、ポリペプチド鎖の負の正味の電荷が生じ、これにより、分離がタンパク質分子量にのみ依存するものになる。ゲル自体は、アクリルアミド単量体および架橋結合するビス−アクリルアミドで構成され、それによってゲルの密度および孔径がビス−アクリルアミドの濃度によって定義される。ゲルに電場を印加すると、タンパク質は正極（すなわち、陽極）に向かってそれらの実際の重量に応じて異なる速度で移動する。その後の染色により、分離されたタンパク質画分が可視化され、さらなる処理または解釈に利用できるようになる。ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、適用される試料の純度および濃度の両方に関する定性的記載が作成される。ポリアクリルアミドゲル電気泳動を実施する種々のやり方ならびに対応する染色手順が当業者には分かるであろう。例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動ならびに対応する染色手順は、Ｔｒｉｓ−酢酸緩衝器具を還元条件下で用いて実施することができる。例示的な器具および一般条件を以下の表に要約する。
【０２４０】
【表１０】
2020524688.tif 000014
【０２４１】
当業者には分かる通り、ゲル電気泳動後の銀染色は、タンパク質バンドを検出するための迅速かつ非常に感度が高い方法である。その基本的な原理は、タンパク質表面への銀イオンの結合、およびその後の微細な金属銀への還元であり、これにより暗色のタンパク質バンドが生じる。非特異的シグナルの発生を回避するために、発色後に過剰な銀イオンを取り除かなければならない。基本的な染色プロトコールはまた、干渉するイオンの除去、感度およびコントラストの増大ならびにいくつかの洗浄ステップなどの追加的な調製ステップも含み得る。銀染色は、試料中に存在するあらゆるタンパク質を染色する非特異的な方法である。したがって、本発明において純度を評価するために使用することができる。
【０２４２】
当業者には分かる通り、ウエスタンブロッティングはタンパク質バンドを検出するためのはるかに感度が高い方法である。さらに、ウエスタンブロッティングはまた、特定の型のタンパク質に特異的であり、それにより、標的タンパク質と不純物の区別が可能になる。ゲル電気泳動でタンパク質を分離した後、タンパク質をメンブレンに転写する。これは、種々の機構によって実現することができる。電場を使用してタンパク質をメンブレンに移動させるエレクトロブロッティングが最も有名である。発色には２つの異なる抗体を必要とする。抗体のメンブレン表面への非特異的結合を防止するために、メンブレンをウシ血清アルブミンまたは脱脂粉乳でブロッキングすることが不可欠である。一次抗体は、標的タンパク質（例えば、血液凝固ＦＶＩＩＩ）に高度に特異的である。二次抗体はアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）とカップリングしており、一次抗体を対象とする。両方の抗体の結合後、ＡＬＰに特異的な基質を添加し、その後、それが不溶性の色の付いた形態に変換され、固定化されたＦＶＩＩＩの極めて近傍に沈殿する。
【０２４３】
当業者には分かる通り、ＦＶＩＩＩ発色アッセイは、その出現を４０５ｎｍにおける分光光度測定によって追跡することができる発色性生成物の生成に依拠する。そのようなアッセイでは、ＦＶＩＩＩ試料を、トロンビン、リン脂質、ＦＩＸａおよびＣａ２＋の溶液と混合する。トロンビンによって不活性ＦＶＩＩＩが活性化されてその活性型であるＦＶＩＩＩａになり、ＦＶＩＩＩａ、ＦＩＸａ、リン脂質およびカルシウムを含有する複合体が形成される。この複合体は、ＦＸを活性化して活性ＦＸａにし、今度はそれを発色基質に分解することができる。この反応によりパラ−ニトロアニリンが遊離し、その形成は４０５ｎｍにおける光度測定によって追跡することができる。消失の増加はＦＸａの量に正比例し、今度はこれが試料中のＦＶＩＩＩの量と正比例する。本発明では、発色活性アッセイを当技術分野で公知の通り実施することができる。例えば、ＦＶＩＩＩ活性アッセイを、自動凝固分析機器（ＢＣＳ  ＸＰ、Ｓｉｅｍｅｎｓ）で市販の試薬（Ｓｉｅｍｅｎｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて実施することができる。発色アッセイの第１のステップでは、未知量の機能的ＦＶＩＩＩを含有する試料を、トロンビン、活性化されたＦＩＸ（ＦＩＸａ）、リン脂質、ＦＸおよびカルシウムを含有するバッファーからなる反応混合物に添加することができる。ＦＶＩＩＩがトロンビンによって活性化される。活性化されたＦＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩａ）はリン脂質、ＦＩＸａおよびカルシウムと複合体を形成し、その結果、第Ｘ因子（ＦＸａ）が活性化される。発色アッセイの第２のステップでは、ＦＸａをＦＸａに特異的なペプチドニトロアニリド基質の切断を通じて測定することができる。Ｐ−ニトロアニリンが生成し、それにより、４０５ｎｍにおける吸光度によって光度測定で測定することができる色がもたらされる。生じる色は、試料中に存在する機能的ＦＶＩＩＩの量に正比例する。標準品は、ＷＨＯ国際標準に対して較正された全長ＦＶＩＩＩであってよい。
【０２４４】
一段凝固アッセイを当技術分野で公知の通り実施することができる。例えば、一段凝固アッセイによるＦＶＩＩＩ活性を、自動凝固分析機器（ＢＣＳ  ＸＰ、Ｓｉｅｍｅｎｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で市販のａＰＴＴ試薬、アクチンＦＳＬ（Ｓｉｅｍｅｎｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて実施することができる。未知量の機能的ＦＶＩＩＩを含有する試料をヒトＦＶＩＩＩ欠乏血漿および活性化因子と混合することができる。＋３７℃でインキュベートした後、塩化カルシウムを添加することによって凝固が開始され得、血餅形成までの時間を記録する。凝固時間は、試料中のＦＶＩＩＩ濃度に間接的に比例する。結果は、参照曲線からの読み取り、ＩＵ  ＦＶＩＩＩ／ｍＬで示すことができる。標準品は、ＷＨＯ国際標準に帰することができる全長ｒＦＶＩＩＩであってよい。
【０２４５】
組織因子誘発性トロンビン生成アッセイを当技術分野で公知の通り実施することができる。例えば、トロンビン生成アッセイ（ＴＧＡ）の一種である較正された自動トロンボグラフィー（ＣＡＴ）、は、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける有効性パラメータとして、および研究ツールとして臨床研究における使用が増加している包括的止血アッセイである。トロンボグラムは、凝固血漿中のトロンビンの濃度を記載するものであり、したがって、生理的条件に近いところでの止血系の機能試験である。当該アッセイは、組織因子による凝固の開始時から経時的な、トロンビンによる蛍光発生基質Ｚ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−ＡＭＣの切断によって生じる蛍光の測定に基づく。当該アッセイは、９６ウェルプレート蛍光光度計であるＴｈｒｏｍｂｏｇｒａｐｈ（商標）で実施され、また、内部フィルター効果、血漿の色のドナー間の変動性、基質枯渇および機器による差異を補正するために必要なトロンビン較正物質を使用する。
【０２４６】
以下のＣＡＴパラメータにより、血漿試料の止血の状態が特徴付けられる：
・遅延時間［分］：凝固時間、トロンビン生成の開始を表す
・ピークまでの時間［分］：最大量のトロンビンが生成するまでの時間
・トロンビンピーク［ｎＭ］：形成される最大トロンビン濃度
・内在性トロンビン潜在性（ＥＴＰ）［ｎＭ  分］：生成されるトロンビンの総量を表すトロンビン生成曲線下面積。
【０２４７】
当業者には分かる通り、酵素結合免疫吸着検定法は、抗原を検出し、数量化するための、抗体および通常は酵素によって媒介される呈色反応を使用する免疫学的手法である。抗原は、９６ディープウェルプレートの表面上に直接固定化され得る、または試料適用前に表面上に固定化された抗体と結合する。それぞれの場合において、抗原は、抗原特異的な二次抗体が抗原に付着し得るように固定化される。多くの場合、二次抗体は、無色の基質を光度測定によって検出することができる色の付いた物質に変換することができる酵素とコンジュゲートしている。したがって、酵素結合免疫吸着検定法は、それぞれの試料中のＦＶＩＩＩタンパク質の活性に関する情報をもたらす定量的方法である。結果を解釈するためには、同一の条件下で作成される標準曲線が必要である。
【０２４８】
ＣＨＯ細胞において産生された組換えタンパク質（例えば、ｒＦＶＩＩＩ）を本発明の方法において使用する場合、ＣＨＯ宿主細胞のタンパク質含有量の決定を使用して、出発材料の品質を解釈することができる。この目的のために、９６ディープウェルプレートをＣＨＯ特異的ポリクローナルヤギＩｇＧ抗体で覆うことができる。種々の希釈度の試料溶液を添加することにより、一次抗ＣＨＯ抗体と抗原とを含む免疫複合体の形成が導かれる。過度の試料タンパク質を洗浄によって取り除くことができる。ＨＲＰとコンジュゲートしたヤギ抗ＣＨＯポリクローナル二次抗体が免疫複合体を認識する。結合し、別の追加的な洗浄ステップを行ったら、基質溶液を添加することができる。この基質溶液は、西洋ワサビペルオキシダーゼの触媒作用下で黄色〜オレンジ色の２，３−ジアミノフェナジンに変換されるオルト−フェニレンジアミンを含有する。呈色の度合いは、試料中のＣＨＯ宿主細胞タンパク質の量に正比例し、光度測定により４９０ｎｍにおいて検出することができる。
【０２４９】
当業者には分かる通り、ｖＷＦ抗原ＥＬＩＳＡの基本原理は上記のものと同様である。ウサギ抗ヒトｖＷＦ抗体を使用して、試料中に存在するｖＷＦを固定化する。ＨＲＰとコンジュゲートしたウサギ抗ヒトｖＷＦ二次抗体が免疫複合体に結合する。洗浄ステップ後、オルト−フェニレンジアミン溶液を添加し、西洋ワサビペルオキシダーゼの触媒作用下で２，３−ジアミノフェナジンに変換する。検出は上記のＣＨＯ抗原ＥＬＩＳＡと同様である。
【０２５０】
当業者には分かる通り、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して、試料中の全成分を分析的に分離し、同定し、数量化することができる。従来の液体クロマトグラフィーは低圧で動作するが、ＨＰＬＣは高圧条件下で実施される。逆相という用語は、固定相の疎水性を指し、これは、シリカゲルなどの極固定樹脂を使用する、歴史的に称される順相とは反対である。逆相樹脂は、シリカゲルマトリックスを、通常炭素原子４個から１８個までにわたる（Ｃ４〜Ｃ１８）様々な長さの炭水化物鎖でアルキル化することによって生成される。典型的な溶出液は、一方では極性の塩または酸の水溶液であり、他方ではアセトニトリルまたはメタノールなどの非極性の有機溶媒である。血液凝固ＦＶＩＩＩ亜種の分離は、Ｃ４逆相カラム（Ｊｕｐｉｔｅｒ（登録商標）５ｍ  Ｃ４  ３００Å、ＬＣカラム１５０×２ｍｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）で、溶出液Ａとして水中０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、および溶出液Ｂとしてアセトニトリル中０．０８５％のＴＦＡを、以下の表に例示される通り、溶出の間溶出液Ｂのパーセンテージを漸増させて用いて行うことが好ましい。
【０２５１】
【表１１】
2020524688.tif 000015
【０２５２】
注入される試料の量は、それぞれタンパク質１５μｇまたは７５ＩＵに対応することが好ましい。疎水性相互作用は温度依存的であるので、分解能を増大させるためにカラムを６０℃まで加熱することが好ましい。溶出するタンパク質をフォトダイオードアレイ検出器でペプチド結合の励起波長に対応する２１４ｎｍにおいて検出することが好ましい。逆相ＨＰＬＣは、それらの異なる疎水性に起因して、それだけでタンパク質の分離の原因となる。検出の方式は、分光光度測定性のものである。分離および検出の両方を合わせて、違うように溶出するタンパク質の吸光度強度の測定、および曲線下面積の組込み時のそれぞれのタンパク質濃度の算出が可能になる。これは、本発明における分離成功の質の尺度として使用することができるので、非常に重要であり、上記の通りＦＶＩＩＩ亜種の重量比を決定するために使用される。
【０２５３】
当業者には分かる通り、各ＦＶＩＩＩ亜種、ならびに全長単鎖分子についてのモル吸光係数の算出は、それぞれの分子の実際の性質に基づいた概算である。表１２に示す一般的な情報は、ＥｘＰＡＳｙバイオインフォマティクスリソースポータルにより提供されるＰｒｏｔＰａｒａｍツール（インプット番号Ｐ００４５１）から得ることができる。これは、アミノ酸の数、理論的な等電点、アミノ酸骨格の分子量、およびＦＶＩＩＩ亜種の１ｇ／Ｌ溶液の波長２８０ｎｍにおける概算の吸光係数を含む。グリコシル化および他の翻訳後修飾はアミノ酸骨格分子量データには含まれない。分子の理論的なモル吸収係数は、以下の方程式から導き出すことができる。
ε＝Ｎ（Ｔｙｒ）・ε（Ｔｙｒ）＋Ｎ（Ｔｒｐ）・ε（Ｔｒｐ）＋Ｎ（Ｃｙｓ２）・ε（Ｃｙｓ２）
【０２５４】
２８０ｎｍにおける光吸収に寄与する３つのアミノ酸−チロシン、トリプトファンおよびシステイン−の数に、それらのそれぞれのモル吸光係数を掛ける。濃度１ｇ／Ｌについて、３つの積全ての合計は分子の総吸光係数と等しい。算出には、グリコシル化およびチロシン硫酸化などの翻訳後修飾を含めない。さらに、シスチンは光吸収に寄与するがシステインは光吸収に寄与しないので、全てのシステイン残基がシスチンを形成することが想定される。フォールディングされたタンパク質におけるチロシン、トリプトファンおよびシスチン残基の実際の場所、したがって、最終的に生じる周囲の環境による影響はこの推定では考慮しない。各ＦＶＩＩＩ重鎖は８０ｋＤａの軽鎖または１２０ｋＤａの伸長型軽鎖のいずれかと会合している。１つの重鎖種および１つの軽鎖種を含有する溶液は、それぞれ５０％で構成されることが想定される。重鎖種および軽鎖種のどちらも、溶液の総吸収に寄与するそれらの別個の光吸収係数を、それらの質量分率の関数として示す。質量分率は、一方の亜種のアミノ酸骨格のそれぞれの分子量および両方の亜種の総分子量の商として算出される。
【数２】
2020524688.tif 000016
【０２５５】
【表１２】
2020524688.tif 000017
【０２５６】
例えば、１８０ｋＤａ重鎖と８０ｋＤａの軽鎖の組合せでは、それぞれ０．６５および０．３５の質量分率がもたらされる。
【数３】
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【０２５７】
これは、特異的な吸光係数が１．０６６Ｍ−１ｃｍ−１である１８０ｋＤａ重鎖が溶液の総吸光度の６５％に寄与することを意味する。対照的に、８０ｋＤａの軽鎖は、たった３５％という低い程度に寄与し、吸光係数は１．６１７Ｍ−１ｃｍ−１である。重鎖および軽鎖の両方についての質量分率と亜種に特異的な吸光係数εの積を合計することにより、１ｇ／Ｌのタンパク質溶液についての総吸光係数ε総がもたらされる。
ε総＝ω重鎖・ε重鎖＋ω軽鎖・ε軽鎖
【０２５８】
したがって、８０ｋＤａの軽鎖と会合した１８０ｋＤａの重鎖を含有するタンパク質溶液は、以下の方程式によって示されるおよその吸光係数を有する。
ε総＝０．６５・１．０６６Ｍ−１ｃｍ−１＋０．３５・１．６１７Ｍ−１ｃｍ−１＝１．２６Ｍ−１ｃｍ−１
【０２５９】
４つの重鎖バリアント（１８０ｋＤａ、１５０ｋＤａ、１１０ｋＤａおよび９０ｋＤａ）のそれぞれと８０ｋＤａの軽鎖の組合せを含有する溶液の総吸光係数ε総を同様に算出することができる。結果を表１３に示す。
【表１３】
2020524688.tif 000019
【０２６０】
当業者には明らかになる通り、本発明の方法を実施するために、任意の適切な実験器具を使用することができる。しかし、以下の表に、本発明の方法に使用することができる例示的な小さな実験器具を示す。例示的な一覧は、バッファーの調製、試料調製、クロマトグラフィー実験自体、ならびに分析および保管のための器具を含む。製造者、製品コード、測定範囲などに関するいくつかの対応する情報が提示されている。
【０２６１】
【表１４−１】
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【表１４−２】
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【０２６２】
以下に、実施例によりそれらに限定することなく、本発明を例示する。
【実施例】
【０２６３】
別段の指定のない限り、以下の実施例１〜１６における方法のステップは全て、上の節「発明を実施するための形態」に詳しく記載されているそれぞれの（好ましい）実施形態に従って実施した。
【０２６４】
（実施例１）
ＦＶＩＩＩ亜種を精製するための出発材料
以下の精製実験はほとんど全て、Ｂ１４３９００００−３０と称されるＦＬ−ｒＦＶＩＩＩを含有するＳｏｕｒｃｅＳ溶出液（ＳＯＳ−Ｅ）を用いて実施する。ＳＯＳ−ＥはＡＤＶＡＴＥ  ＢＤＳとして生成されるが、最終的な精製ステップを欠く。
【０２６５】
１つのラージスケール精製においてのみ使用する第２の出発材料は、富化された９０ｋＤａのＦＶＩＩＩ亜種を低濃度で含有する、種々のＭｏｎｏＱおよびＳｏｕｒｃｅＱ溶出後液のプールである。単一の溶出後液をプールして、１つの大きな生成物プールを受け取った。このプールは、Ｆ８＿ＡＤ２＿９０ｋＤａと称される。
【０２６６】
（実施例２）
ＦＶＩＩＩ亜種のスモールスケール精製−第１のクロマトグラフィーステップ
クロマトグラフィーの一般的な型−ＭｏｎｏＱ樹脂を使用したアニオン交換クロマトグラフィーまたはＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００樹脂でのサイズ排除クロマトグラフィー−に関係なく、以下のスモールスケール実験の間にもたらされた結果を分取精製ステップのラージスケールプロセスに使用する。結果は、それぞれのクロマトグラフィー手順の構成に重要である。
【０２６７】
アニオン交換クロマトグラフィーはＦＶＩＩＩ亜種の第１の精製ステップであるので、動作条件の精密化のために非常に興味深い。ＭｏｎｏＱは、サイズが１０μｍであり、形状がほぼ一様の単分散粒子を有する分析用ＡＩＥＸ樹脂として、はるかに群を抜いて優れた分解能および最も有望な分離性を示す。したがって、このステップは、試料調製を含めた多数のパラメータ試験および変動を受けている。
【０２６８】
図４は、標準の条件下で分離した、フューリン処理していないＳｏｕｒｃｅＳ溶出液Ｂ１４３９００００−３０のクロマトグラムを示す。溶出相は８カラム体積の長さであり、標準バッファーＱＡ１およびＱＢ１で動作する。溶出は、電気伝導率の最初の増大と共に比較的初期に開始される。わずかな広がったピークならびにＵＶシグナルの強度が増大するとすぐに認識できる非常に突出したピークが存在する。これらは、Ｂドメイン領域の異なるグリコシル化ならびに伸長型軽鎖と他の重鎖亜種の組合せによって引き起こされる可能性が最も高い、全長重鎖（１８０ｋＤａ）の違うように荷電したバリアントであることが分かっている。基礎をなす機構はまだ完全には理解されていないが、疎水性相互作用もこの特異的な溶出挙動の理由であり得る。画分番号Ｂ８およびＢ９において溶出した最も突出したピークは、対応するＳＤＳ  ｐａｇｅの写真に見ることができる（図５）。これは１８０ｋＤａの全長重鎖断片で主に構成される。しかし、ある特定の量の全長単鎖も存在し、ゲルの上部の２５０ｋＤａマーカー位置の上に見ることができる。ゲルの下の部分には、１２０ｋＤａの伸長型軽鎖によって引き起こされる１００ｋＤａのわずかに上の強いシグナルがある。真下には１１０ｋＤａの短縮型重鎖亜種の痕跡がある。７５ｋＤａあたりに別の強力なバンドを見ることができる。これは、８０ｋＤａの軽鎖断片を表す。
【０２６９】
別の強いピークが画分Ｂ１０に収集されている。ＳＤＳ  ｐａｇｅゲルでのその組成は、上記のものと全く同様である。これは、主に１８０ｋＤａの全長重鎖、ならびに１２０ｋＤａの伸長型軽鎖および８０ｋＤａの軽鎖と、より少量の１１０ｋＤａ重鎖断片および全長単鎖の混合物から生じると思われる。しかし、さらに、画分Ｂ１１およびＢ１２も１５０ｋＤａの領域に弱いシグナルを含有する。これは、１５０ｋＤａの短縮型重鎖亜種であり、クロマトグラムのピークの下降側の小さな肩として同定可能である。
【０２７０】
クロマトグラムにおいて次に興味深い点は、ベースラインで左隣のピークと分離されない、およその強度１００ｍＡＵを有する小さなピークである。画分Ｃ１およびＣ２は、他の画分と比較して最大量の１１０ｋＤａ重鎖亜種が存在することを示す。これらの画分には、ある特定の量の１８０ｋＤａの亜種も存在し、これは、樹脂分解能が両方のピークを分離するのに十分でないからである。それでも、この小さなピークは１１０ｋＤａの短縮型重鎖断片の原因である。最後に、画分Ｃ４〜Ｃ６において、強度が大まかに４０ｍＡＵの小さな２重のピークが存在する。このピークは、ＳＤＳ  ｐａｇｅによって示されるＢドメイン枯渇９０ｋＤａ重鎖を表す。したがって、電気伝導率の上昇に伴う一般的な溶出の順序は以下の通りである：
１．違うように荷電した重鎖亜種のバリアント、主に１８０ｋＤａの全長断片、単鎖ＦＶＩＩＩおよび伸長型軽鎖と他の亜種の異なる組合せ
２．全長重鎖（１８０ｋＤａ）
３．部分的なＢドメイン短縮を伴う重鎖（１５０ｋＤａ）
４．部分的なＢドメイン短縮を伴う重鎖（１１０ｋＤａ）
５．Ｂドメイン枯渇重鎖（９０ｋＤａ）
【０２７１】
（実施例３）
ＦＶＩＩＩ亜種のスモールスケール精製−第１のクロマトグラフィーステップにおけるグラジエントの長さの最適化
強力な溶出液のパーセンテージ上昇はより遅いことに起因して、グラジエントがより平らであることは、分離がより良好であることと等しい。図６は、２つの異なる実現可能性実験のオーバーレイを示し、一方は、８カラム体積のグラジエントで動作し、ＵＶシグナルについては実線で示され、電気伝導率については破線で示されており、他方は、１６カラム体積のグラジエント溶出で実施され、ＵＶシグナルについては点線で示され、対応する電気伝導率シグナルについては断続線で示されている。８カラム体積での溶出と比較して１６カラム体積での溶出の間では電気伝導率の上昇がはるかに遅いことが明白に目に見える。それぞれのＵＶシグナルは、それらの全体的なパターンに関しては高い類似性を共有するが、溶出挙動は明らかに異なる。１６カラム体積での溶出のＵＶシグナルを表す点線の曲線は、８カラム体積でのＵＶ曲線と比較して広がっており、また、１５０ｋＤａの亜種を表す小さな肩がよりよく目に見える。溶出相が収集される体積は１６カラム体積での溶出については８カラム体積での溶出の２倍であるので、これらの構造の一部が別々の画分に収集され得る可能性もある。最も突出した差異は、通常、１５０ｋＤａのＢドメイン短縮型亜種がカラムから溶出する傾向がある領域において見ることができる。この領域は、８カラム体積の溶出相において幾分短い。これは、１８０ｋＤａの完全重鎖シグナルの強度が急速に低下し、次いで、１１０ｋＤａの亜種の溶出が起こったことに起因して再度上昇するかのように思われる。１６カラム体積の溶出相では、対照的に、１５０ｋＤａの亜種の溶出が分解される。分離の成功は全く満たされない可能性があるが、１８０ｋＤａの全長重鎖ピークの下降側において、小さな肩が認識できる。これは、着実に上昇する電気伝導率条件下では、１８０ｋＤａの完全重鎖が溶出するが１５０ｋＤａのＢドメイン短縮型鎖はなお結合しているある点がより長い期間にわたって保持されるからである。
【０２７２】
図７は、実線で示されている１６カラム体積の溶出相および破線で示されている１０％エチレングリコールを添加剤として伴う３２カラム体積の溶出相から得た２つのＵＶ曲線のオーバーレイを示す。どちらの試料も試料適用前にフューリンプロテアーゼで処理されている。溶出相のピークブロードニング効果は、元が明白に目に見える限りは２倍である。３２カラム体積の溶出相の間に１５０ｋＤａのＢドメイン短縮型重鎖の溶出から生じる肩は、１６カラム体積の溶出相におけるものよりも突出している。さらに、その体積は、１６カラム体積での溶出の２倍であり、したがって、適切な画分サイズで生じる分画を考慮すると、さらなる精製に適した富化された１５０ｋＤａの生成物プールを生成することが可能であるはずである。
【０２７３】
（実施例４）
ＦＶＩＩＩ亜種のスモールスケール精製−第１のクロマトグラフィーステップ前のフューリンプロテアーゼ処理
フューリンプロテアーゼは、ＦＶＩＩＩの細胞内プロセシングに関与するタンパク質分解酵素である。ＦＶＩＩＩ配列全体を通して、フューリンが付着し、その基質を切断することができる種々の位置が存在する。ＦＶＩＩＩは、組換え供給源に由来するものであっても、完全にはプロセシングされないので、高度の不均一性が存在する。不均一性に寄与するのはＢドメインだけではない。異なる型のグリコシル化も、溶出の間のある特定のＦＶＩＩＩ分子の挙動の仕方に影響を及ぼす可能性がある。これは、１８０ｋＤａの全長重鎖に関して特に妥当である。この亜種はＢドメイン全体をなお含有し、高度にグリコシル化されている（Pipe  et  al.  (1998)）。タンパク質表面の異なる種類のグリコシル化、したがって、違うように荷電した領域が、全長重鎖が単一のピークとして溶出しないだけでなく、２つの別個のピークとして溶出する理由であると思われる。
【０２７４】
図８は、フューリン処理した試料のＵＶ曲線（実線）と試料適用前にフューリンプロテアーゼで処理していない試料のＵＶ曲線（破線）のオーバーレイを示す。どちらの実行も、電気伝導率曲線の類似性が高いことによって示される通り、１６カラム体積の溶出相を用いて実施する。唯一の差異は、試料調製の型、フューリン成熟化を含めるか否かである。明白である最初のことは、溶出相の前半において、フューリン処理した試料のピーク強度が有意に低下することである。この領域は、違うように荷電した重鎖バリアントと伸長型軽鎖の組合せを主に表す。さらに、実線の曲線では、フューリン処理していない試料の最も突出したピークがほぼ完全に消失した。今度は、典型的な全長重鎖ピークが有意に強化される。フューリン成熟化により、他の亜種の強度も同様に増大すると思われる。さらにＢドメイン枯渇９０ｋＤａの亜種および１１０ｋＤａの亜種の強度はフューリン処理していない試料と比較して高い。
【０２７５】
フューリン処理した試料の溶出を図９に示す。ほぼ全ての画分のそれぞれの組成を解明するために、それらをＳＤＳ  ｐａｇｅ分析に適用する（図１０および１１）。画分番号Ｂ５〜Ｃ７は、それらの組成に関して事実上一様だと思われる。この領域はクロマトグラムにおける個々のピークを含有するが、これらは全て、明らかに、ＳＤＳ  ｐａｇｅでは差異が生じない異なるグリコシル化を有する全長重鎖バリアントからなる。以下の最も強いピークの上昇側について考察すると、全長重鎖断片（１８０ｋＤａ）のいくつかの画分（Ｃ８〜Ｃ１０）がすでに存在し、これらは、さらなる精製に関して十分に純粋であると思われる。ピークの下降部分は、通常、１５０ｋＤａの短縮型重鎖断片と混同されるが、どちらの種も、標準の、フューリン成熟化していない分離と比較して互いから離れて現れる。１１０ｋＤａの短縮型亜種に関しては、特に画分Ｄ４およびＤ５が良く分離され、他の亜種をほんの微量含有する。Ｂドメインを有さない９０ｋＤａ重鎖は、完全に分離され、さらには濃縮の準備が整っている可能性がある。最も注目すべき差異の１つは、軽鎖バリアントの分布に関する。これはゲル全体を通して見ることができるので、１２０ｋＤａの伸長型軽鎖の痕跡は残っていない。１２０ｋＤａの伸長型軽鎖は、明らかにフューリンプロテアーゼによって処理されており、その結果、ほぼ排他的に８０ｋＤａの軽鎖断片がもたらされ、これにより、出発材料の不均一性が著しく低下する。
【０２７６】
以下のラージスケール（分取）精製のためにいくつかの改変を実装する：
１．ＦＶＩＩＩ亜種の不均一性を低下させるため、および全体的な分離の成功を改善するために、試料適用前に試料を＞１００ＩＵ／ｍＬフューリンプロテアーゼで処理する。
２．リニアグラジエント溶出の長さを４倍に増大させて３２カラム体積にする。溶出の後半における亜種特異的ピークの広がりの増大により、画分希釈の影響が克服されると思われる。
【０２７７】
（実施例５）
ＦＶＩＩＩ亜種のスモールスケール精製−第２のクロマトグラフィーステップ
サイズ排除クロマトグラフィーを、すでに所望の生成物を高い純度で含有するプールから軽微な不純物を取り除くための最終精製ステップとして使用する。サイズ排除クロマトグラフィーは、ＦＶＩＩＩ分子亜種についての、ＭｏｎｏＱアニオン交換クロマトグラフィーステップの後の第２の精製ステップとしても適切である。したがって、サイズ排除によって精製される予定の各試料は、当初はアニオン交換クロマトグラフィーによって導き出され、その後、所望の亜種を含有する画分をプールすることによって得られる。１２０ｋＤａの伸長型軽鎖はフューリン成熟化の過程で完全に取り除かれていると仮定すると、それぞれの試料中に存在する各重鎖バリアントは、８０ｋＤａの軽鎖に排他的に結合するはずである。したがって、全ての亜種間の分子量の平均差異は、およそ５０ｋＤａであり、これは、満足のいく結果を得るために十分であるはずである。
【０２７８】
（実施例６）
ＦＶＩＩＩ亜種のスモールスケール精製−第２のクロマトグラフィーステップにおける短縮型重鎖断片の精製
図１３の右側は、前のＭｏｎｏＱアニオン交換クロマトグラフィー実行のＳＤＳ  ｐａｇｅゲル電気泳動の一部を示す。画分Ｇ４、Ｇ５およびＧ６は、十分な純度の１１０ｋＤａ重鎖を示し、これらをサイズ排除クロマトグラフィーによるさらなる精製のためにプールし、使用した。大多数の画分の対応するクロマトグラムならびに銀染色ゲル電気泳動をそれぞれ図１２および図１３の左側において見ることができる。４つの重鎖亜種全てが試料中に明らかに存在するが、これらは、分子量およびサイズが異なるので、別個の時点でカラムから溶出する。全長重鎖（１８０ｋＤａ）は、全ＦＶＩＩＩバリアントの中で最も大きい。したがって、全長重鎖（１８０ｋＤａ）は、全ての亜種のなかでアクセスできる体積が最も少なく、最初に溶出する。これは、ゲルの画分Ｃ４〜Ｃ７において見ることができる。第２のピークは、画分Ｃ９〜Ｃ１１において目に見え、これは、１５０ｋＤａの短縮型重鎖種によって引き起こされる。最も突出したピークは予測通り１１０ｋＤａの短縮型重鎖断片であり、これは、画分Ｄ１で溶出し始め画分Ｄ９まで進む。１５０ｋＤａの断片および１１０ｋＤａの断片は互いと明白に分離されるが、画分Ｄ５およびその後の画分ではＢドメイン枯渇９０ｋＤａ重鎖の痕跡が混入していることも目に見える。１１０ｋＤａの亜種と９０ｋＤａの亜種はどちらも同様の細孔体積に浸透することができると思われ、これは、それらの分子量の差異がたったの２０ｋＤａであることから、驚くことではない。しかし、Ｂドメイン枯渇９０ｋＤａの亜種の強度は１１０ｋＤａの標的タンパク質と比較して非常に低く、画分Ｄ２、Ｄ３およびＤ４は絶対的に純粋であると思われる。
【０２７９】
（実施例７）
ＦＶＩＩＩ亜種のスモールスケール精製−第２のクロマトグラフィーステップにおける全長重鎖の精製
アニオン交換クロマトグラフィー溶出液は、全長重鎖断片のさらなる精製および最終精製の出発材料としての機能を果たす。図１５に示されている画分Ｆ４、Ｆ５およびＦ６は、主に１８０ｋＤａの亜種で構成される。軽微な不純物は短縮型重鎖種（１１０ｋＤａ）およびＢドメイン枯渇重鎖断片（９０ｋＤａ）から生じるが、より低い程度で１５０ｋＤａの短縮型重鎖バリアントからも生じる。これらの画分をプールし、サイズ排除クロマトグラフィーに適用した。それぞれのクロマトグラムを図１４において見ることができ、対応するＳＤＳ  ｐａｇｅゲル電気泳動を図１５の左側において見ることができる。この実験におけるタンパク質濃度は、一般に、１１０ｋＤａの短縮型重鎖断片の精製結果と比較して高い。したがって、吸光度がより高く、ＳＤＳ  ｐａｇｅゲル電気泳動でのシグナルがより強い。すでに上記されている通り、１８０ｋＤａの全長断片が最初にカラムから溶出する亜種である。１８０ｋＤａの全長断片は、クロマトグラムで画分Ｃ４〜Ｄ１における吸光度がおよそ７０ｍＡＵの大きなピークとして現れる。適当な銀染色ＳＤＳ  ｐａｇｅにより、このピークが排他的に１８０ｋＤａの全長重鎖を起源とするものであることが明白に示されるが、画分Ｃ１０〜Ｄ１では１５０ｋＤａの短縮型重鎖の混入が存在する。それでも、ピークの前半（画分Ｃ４〜Ｃ９）は、明確に純粋であると思われる。１５０ｋＤａの短縮型重鎖は、電気泳動ゲルにおいてのみ目に見え、クロマトグラムでは目に見えず、これは、１８０ｋＤａの全長断片がなお溶出している時点で少量が溶出することが原因だと思われる。１１０ｋＤａの短縮型重鎖断片、ならびにＢドメイン枯渇重鎖断片は、強度が極めて低い特定のピークとして認められ得る。どちらもＳＤＳ  ｐａｇｅにおいてそれぞれ画分Ｄ３〜Ｄ８およびＤ６〜Ｄ９として明らかである。実施例６においてすでに見られたように、１５０ｋＤａ種と１１０ｋＤａ種は十分に分離されている。全長重鎖および１５０ｋＤａ重鎖は十分には分離されず、純粋な生成物プールを得るために必要な画分を慎重に考えた上でプールする。同じことが１１０ｋＤａ種と９０ｋＤａのＢドメインを有さない重鎖にも当てはまる。これらは、群を抜いて全く完全には分離されず、ここでも同様に慎重に考えてプールすることが必要になる。
【０２８０】
（実施例８）
ＦＶＩＩＩ亜種のスモールスケール精製−第２のクロマトグラフィーステップにおける疎水性相互作用クロマトグラフィー
疎水性相互作用クロマトグラフィー手法を、アニオン交換クロマトグラフィーでは挙動が同様であり、それにより分離が極めて難しい全長重鎖（１８０ｋＤａ）と短縮型重鎖断片（１５０ｋＤａ）を区分するための可能性のある代替法としてスモールスケール相で試験した。
【０２８１】
フューリン処理したＳｏｕｒｃｅＳ溶出液の２次元溶出相のクロマトグラムを図１６において見ることができる。２次元疎水性相互作用クロマトグラフィーの一般的な手順は、上記の節「発明を実施するための形態」に詳しく記載されているそれぞれの（好ましい）実施形態に従う。試料適用が完了したら、平衡化バッファーを用いた短い洗浄相を行う。電気伝導率の差異は、およそ２ｍＳ／ｃｍだけであるが、ＵＶシグナルの増大を引き起こすのにすでに十分であると思われる。およそ４ｍＡＵだけのＵＶ吸光度であるこの最初の肩は対応するＳＤＳ  ｐａｇｅにおいて画分番号Ａ５〜Ｂ４として見ることができる（図１７および１８）。これは主に１５０ｋＤａの短縮型重鎖亜種によって生じるものであり、これにより、１５０ｋＤａの短縮型重鎖亜種が最も弱く結合し、低い電気伝導率低下ですでに溶出することが示される。
【０２８２】
溶出相自体は、互いとすぐ隣の２つのリニアグラジエントを含有する。第１の溶出バッファーは塩化ナトリウムを含有せず、それにより、最初の迅速な電気伝導率の低下が導かれる。およそ３ｍＳ／ｃｍのある特定のレベルの電気伝導率に達した後、第２の溶出バッファーをカラムに適用する。第２の溶出バッファーはエチレングリコールを含有し、したがって、電気伝導率がはるかに大きく１ｍＳ／ｃｍ未満まで低下する。溶出ピークはＭｏｎｏＱ樹脂におけるものほど明確ではない。この溶出ピークはどちらかというと広範に溶出するタンパク質の移行であり、互いと急激には分離されない。溶出の経過にわたる画分の実際の組成は、ＳＤＳ  ｐａｇｅゲル電気泳動でのみ目に見える。ＵＶシグナルは第１のグラジエントの開始と共に急勾配で上昇し、その結果、下降側に第２のグラジエントを開始するまで続く肩がある非常に広がったピークがもたらされる。ＳＤＳ  ｐａｇｅにより、溶出のこの領域が、全てが大体同じ時点で結合解除し始める全長重鎖断片（１８０ｋＤａ）ならびに１１０ｋＤａの短縮型重鎖断片およびＢドメイン枯渇９０ｋＤａ断片によって主に引き起こされることが示される。画分Ｃ１２〜Ｄ６に収集される肩は、１１０ｋＤａの短縮型断片に起因する可能性があり、これは、この時点で２回目に溶出すると思われる。エチレングリコールを含有する溶出バッファーを用いた第２のグラジエントにより、ＵＶシグナルが減少する傾向の構造化されていないパターンが生じる。以前の実験から分かっている通り、この領域は、少量の１８０ｋＤａ、１１０ｋＤａおよび９０ｋＤａの亜種の溶出によって引き起こされる。対応する８０ｋＤａの軽鎖は溶出相全体にわたってくまなく分布する。その強度はＵＶシグナルの一般的な強度に対して変動する。最後に、１５０ｋＤａの短縮型重鎖断片は他の断片よりも前に−すでに洗浄相の間に溶出するので前方にシフトすることが顕著である。亜種はカラムに適用されたのと大体同じように溶出するので、溶出自体は他の亜種を実際に分離するものではない。
【０２８３】
２次元ＨＩＣ実験の結果に依拠すると、以下における主要な目的は、１５０ｋＤａの短縮型重鎖種を他のもの、特に全長断片から分離することである。したがって、以下の１次元溶出手順は、上記の２次元疎水性相互作用クロマトグラフィーから導き出される。エチレングリコールバッファーを使用する第２のリニアグラジエント相はＦＶＩＩＩ亜種の分離に実際には寄与しないので、これをスキップする。代わりに、試料適用後の洗浄相を倍加して１０カラム体積にし、分離を増強するために実際の溶出相を４０カラム体積まで延長する。さらに、カラムローディングを有意に減少させる。その結果として、ＵＶシグナルの一般的な強度を低下させる（図１９）。図２０において見ることができる通り、１５０ｋＤａの短縮型重鎖断片の隣接する１８０ｋＤａの完全重鎖断片からの分離は有意には改善されない。さらに、収集された画分は高度に希釈され、分取プロセスが非常に非効率的であると思われるほど収率が低いと思われる。
【０２８４】
（実施例９）
ＦＶＩＩＩ亜種のスモールスケール精製−第２のクロマトグラフィーステップにおけるネガティブモード疎水性相互作用クロマトグラフィー
ネガティブモードクロマトグラフィー手法は、ブレークスルーおよび洗浄相の間に１５０ｋＤａの短縮型重鎖断片を洗い出すことを目的とし、一方で他の亜種はカラムに結合したままであると考えられる。この亜種は、移動相を通過する移動だけで自然に結合解除することができるほど弱く結合することが想定される。１５０ｋＤａの亜種が富化されたＭｏｎｏＱ溶出液プールがロードとしての機能を果たし、カラムへの結合のためにその電気伝導率を上昇させる。この理由から元の洗浄相が著しく持続する。図２１は、画分Ａ９付近のどこかでカラムの能力を超えること示す。この時点でブレークスルーが起こり、ＵＶシグナルの増加が導かれる。
【０２８５】
ＳＤＳ  ｐａｇｅ電気泳動（図２２）により、ブレークスルー（画分Ａ１０〜Ａ１２）であっても、高度に精製された１５０ｋＤａの短縮型重鎖断片を含有することが示される。ＵＶシグナルは画分Ｂ１の洗浄相の開始と共に減少し、当該相の終わりまで進む。ＳＤＳ  ｐａｇｅの対応する画分（Ｂ１〜Ｃ２）では主に１５０ｋＤａの短縮型重鎖断片が示されるが、１１０ｋＤａおよび９０ｋＤａの亜種、さらにはＭｏｎｏＱ精製ステップの前のフューリン成熟化が未完了であることから生じ得る１２０ｋＤａの伸長型軽鎖の痕跡もある。溶出自体は１００％溶出バッファーの急なステップとして行う。これにより、残りの全てのＦＶＩＩＩタンパク質のカラムからの迅速な溶出が導かれる。この時点で１８０ｋＤａの全長重鎖断片のほぼ全量が溶出するが、この時点よりも前では溶出しないことは注目に値する。ブレークスルーおよび洗浄相の間には１８０ｋＤａの亜種は見出されないので他の亜種がはるかに強力に結合すると思われる。どちらの亜種もネガティブモードで容易に満足のいく程度まで分離され得る。
【０２８６】
（実施例１０）
ＦＶＩＩＩ亜種のラージスケール（分取）精製
ＦＶＩＩＩ亜種の分取スケール精製は、所望の重鎖断片を富化するための最初のＭｏｎｏＱアニオン交換クロマトグラフィーステップ、その後の、不純物とみなされる他の亜種を分離する分離能が十分であるラージスケールサイズ排除クロマトグラフィーカラムでの最終精製ステップを伴う。Ｂドメイン枯渇重鎖断片（９０ｋＤａ）についてはサイズ排除ステップがスキップされるので、この亜種は例外である。この亜種は、ＭｏｎｏＱ  ＡＩＥＸステップによってすでに満足のいく程度まで精製されており、さらなる最終精製が必要ない。４つの異なる亜種の全てについての最終ステップは、サイズ排除クロマトグラフィーの間に大きく希釈されることに起因する濃縮である。これは、ＳｏｕｒｃｅＱアニオン交換樹脂での別のＡＩＥＸステップによって実施する。
【０２８７】
図２３は、それぞれのＦＶＩＩＩ亜種についてのプロセス全体の概要を提示する。
【０２８８】
（実施例１１）
ＦＶＩＩＩ亜種のラージスケール（分取）精製−第１のクロマトグラフィーステップ
アニオン交換クロマトグラフィーはＦＶＩＩＩ分子亜種の精製の一次ステップであり、適切な画分をさらなる精製のためにプールすることができるように、４つの所望の重鎖断片の全ての大まかな分離を実現する。図２４は、ラージスケールＭｏｎｏＱカラムでのＡＩＥＸステップの溶出相の第１のクロマトグラムを示す。出発材料Ｂ１４３９００００−３０を上記の改変された標準手順に従って分離し、特有の溶出パターンを示し、これは、スモールスケール実験からすでに分かっている。溶出相を８つの生成物プールにプールし、そのそれぞれが、精製され、富化された形態のある特定の重鎖断片を含有する。溶出の前半は、大体分離されたピークで溶出する、違うようにグリコシル化された全長重鎖バリアントが優位を占めることが分かっている。隣のものと明白に区別することができるピークを個々の生成物プールのために使用するが、さらには評価しない。
【０２８９】
表１５は、どのように画分のプールを行うかの所見を示し、最初の４つの生成物プールＥ１〜Ｅ４が違うようにグリコシル化された全長重鎖バリアントに専有されることを示す。最も豊富な全長重鎖は、画分２．Ｃ２〜２．Ｄ３を含有する生成物プールＥ５に収集され、０．６８９ｍｇ／ｍＬという適当なタンパク質濃度がもたらされる。図２５に示されているＳＤＳ  ｐａｇｅゲル電気泳動でもＥ５生成物プールの純度が確認され、さらに、この全長重鎖バリアントはその濃度がもっと高いので最も突出したものであることが示される。それに加えて、他の全ての全長重鎖バリアント（Ｅ１〜Ｅ４）がＳＤＳ  ｐａｇｅでほぼ同じパターンを示す−それぞれのバンドの位置にほんのわずかな差があり、これにより、Ｂドメインのグリコシル化が異なるという仮定が裏付けられる。画分番号２．Ｄ７〜２．Ｅ６は、分子量１５０ｋＤａの短縮型重鎖断片を含有するが、以前の実験から、この画分には通常、全長重鎖が混入していることがよく分かっており、これは、ＳＤＳ  ｐａｇｅ画像でも認めることができる。生成物プールＥ６は、約１８０ｋＤａおよび約１５０ｋＤａにおける比較的同様の強度の２つのバンドを示し、これにより、これらがどちらも同等量であることが示される。画分２．Ｄ４、２．Ｄ５および２．Ｄ６は、それらの画分が１８０ｋＤａの亜種と１５０ｋＤａの亜種の混合物を含有し、それらのいずれにも混入することになるので、隣接する生成物プールの両方のいずれにも使用しない。生成物プールＥ７は画分２．Ｅ７〜３．Ａ７で構成され、１１０ｋＤａの短縮型重鎖断片を含有する。クロマトグラムにおけるそれぞれのピークは、以前のものよりもはるかに良好に分離され、同様にＳＤＳ  ｐａｇｅでもおよそ１１０ｋＤａの短縮型重鎖断片が主に示されるが、ここでは全長重鎖の痕跡もある。第８の生成物プールは、９０ｋＤａの分子量を有するＢドメイン枯渇重鎖断片を含有し、画分３．Ｂ８〜３．Ｅ１に収集される。
【０２９０】
クロマトグラムにおいて、９０ｋＤａの亜種ピークがどちらかというと低いことがすでに目に見えており、したがって、この生成物プールのタンパク質濃度が０．０２５ｍｇ／ｍＬであり、はるかに低いことは驚くことではない。他方では、それらのピークは、すでに溶出している他の全てからベースラインで分離され、したがって、この画分の純度は満足のいくものである。これにより、実際にサイズ排除クロマトグラフィーによる最終精製ステップをスキップし、直接濃縮に進行することが可能になる。同時に、これにより、４つの亜種が全く異なる量で出発材料中に存在し、それらを単純に分離することだけが問題なのではないことが明白になる。単に、出発材料中に多くの全長重鎖が含有されているので、存在量が少ない亜種を十分な量で収集することはどちらかというと困難であると思われる。この実行の生成物プールＥ６は、十分な量の１５０ｋＤａの短縮型重鎖断片を含有し、これを分取スケールサイズ排除クロマトグラフィーカラムでのその後の精製のために選択する。対照的に、９０ｋＤａのＢドメイン枯渇重鎖断片を含有する生成物プールＥ８はＳｏｕｒｃｅＱでのＡＩＥＸステップによって直接濃縮し、任意の他の種類の精製または最終精製はスキップする。適当な結果を以下で論じる。
【０２９１】
【表１５】
2020524688.tif 000022
【表１６】
2020524688.tif 000023
【０２９２】
分取スケールＡＩＥＸの溶出相の第２の例が図２６に示されており、対応するＳＤＳ  ｐａｇｅゲル画像が図２７に示されている。プールの一般的な手順は以前に論じられたものとあまり変わらない。プールした画分および関連するタンパク質濃度の要約を表１６に見出すことができる。
【０２９３】
Ｅ２およびＥ３と称される生成物プールは、全長重鎖および１１０ｋＤａの短縮型重鎖断片を含有し、分取スケールサイズ排除クロマトグラフィーステップでのさらなる精製および最終精製のために興味深い画分である。ＳＤＳ  ｐａｇｅ電気泳動での画分を全て見ることはできず、したがって、プールに使用する画分は光学的手段によって部分的に決定される。その代わりに、Ｃ４逆相ＨＰＬＣ分析から入手可能なデータ（表１７）が存在し、それにより、生成物プールＥ２およびＥ３がどのように構成されるかに関するエビデンスがもたらされる。このデータから、全長重鎖生成物プールＥ２がおよそ９１％の標的タンパク質をすでに含有し、その標的タンパク質が全ての１８０ｋＤａの全長重鎖バリアントならびに両方の軽鎖バリアントを含むことが明らかになる。生成物プールＥ３では第１のＡＩＥＸステップ後に同等の純度は示されないが、タンパク質濃度０．１１９ｍｇ／ｍＬで８２．５％の標的タンパク質は、さらなる処理のための良好な基礎であると思われる。
【０２９４】
【表１７】
2020524688.tif 000024
【０２９５】
（実施例１２）
ＦＶＩＩＩ亜種のラージスケール（分取）精製−第２および第３のクロマトグラフィーステップにおける全長重鎖（１８０ｋＤａ）の精製および濃縮
図２３のプロセスフロー図に示されている通り、全長重鎖の精製は真の精製ステップとしてＡＩＥＸおよびＳＥＣ、ならびに濃縮のための別のＡＩＥＸステップの３つのステップで構成される。第１のＡＩＥＸ精製のＳＤＳ  ｐａｇｅゲル電気泳動の評価に基づいて、高タンパク質含有量ならびに低分率の不純物の両方を示す最も有望な画分を選択し、プールし、分取ＳＥＣカラムに適用する。サイズ排除クロマトグラフィーから収集されたアウトプットをＳｏｕｒｃｅＱカラムにさらに適用し、ステップ溶出によって最終的に濃縮する。それに応じた結果を以下に論じる。
【０２９６】
図２８は、富化された１８０ｋＤａの全長重鎖を含有するＡＩＥＸ生成物プールＥ２の、ラージスケールサイズ排除クロマトグラフィーカラムでのその後の精製を示す。分取スケールＳＥＣの一般的な手順は、上の「発明を実施するための形態」の節のそれぞれの実施形態に見出すことができる。軽微な不純物はＡＩＥＸでは完全に分離することができない１５０ｋＤａの短縮型重鎖断片に由来すると考えられる。クロマトグラムの最も突出したピークは、およそ５０ｍＡＵの吸光度強度を示し、画分１．Ｂ５中に溶出し始める。銀染色ＳＤＳ  ｐａｇｅゲル電気泳動の画像（図２９）から、画分１．Ｂ５〜１．Ｂ１１が８０ｋＤａの軽鎖と会合した所望の全長重鎖（１８０ｋＤａ）で主に構成されることが示される。１５０ｋＤａの短縮型重鎖断片は画分１．Ｃ１〜１．Ｃ４中に溶出し、これはクロマトグラムでは検出することができない。これは１８０ｋＤａの亜種ピークのテーリングのように見えるが、実際には１５０ｋＤａの亜種である。これは、ＳＤＳ  ｐａｇｅ画像でも目に見え、標的ピークの後ろの画分で１８０ｋＤａの分子量を有する亜種と１５０ｋＤａの分子量を有する亜種が重複する傾向があり、それにより、これらはプールには不適当になる。どちらかというと低強度の２つのピークがそれぞれ画分１．Ｃ６〜１．Ｃ９および１．Ｃ１０〜１．Ｄ３に現れる。それらのピークは、１１０ｋＤａの短縮型重鎖断片およびＢドメイン枯渇重鎖断片から生じ、これらはどちらも所望の全長重鎖ピークから明白に分離される。
【０２９７】
サイズ排除クロマトグラフィーは最終的な真の精製ステップであるので、いずれの画分を最終生成物プールに進めるかを慎重に考えなければならない。一方では、標的ピークの最初と最後の画分をスキップすることにより、他の亜種が生成物プールに入る機会を減らすことができるが、他方では、プールに使用されない各画分が総タンパク質のうちおよそ１ｍｇまたはさらにはそれよりも多くのタンパク質減少と等しいので、当該スキップにより、収率が劇的に低下する。画分１．Ｂ７〜１．Ｂ１０を包含する生成物プールは、妥当な純度を生じさせることと、効率的なプロセスをなお維持することの間の最良の折衷である可能性が高い。この生成物ピークをＥ１と称し、その最も有意なパラメータを表１８および１９に列挙する。
【０２９８】
最終的な試料体積は、およそ７０ｍＬであり、タンパク質濃度は０．１３４ｍｇ／ｍＬであり、ほぼ１０ｍｇの全長重鎖ＦＶＩＩＩタンパク質がもたらされる。純度は９２％の標的タンパク質まで、ほんのわずかだけ上昇し、１５０ｋＤａの短縮型重鎖種がなお最も大きな混入源である（５．７１％）。
【０２９９】
【表１８】
2020524688.tif 000025
【０３００】
【表１９】
2020524688.tif 000026
【０３０１】
ＳＥＣカラムでの希釈に起因して、所望の最終濃度＞０．３ｍｇ／ｍＬを実現するために、それらの希釈された溶出液を濃縮するためのステップを実装することが必要である。希釈された画分を、Ｓｏｕｒｃｅ３０Ｑ樹脂で実施する別のアニオン交換クロマトグラフィーステップに適用する。所望の最終的なバッファー組成と同等の組成のステップグラジエントにより、カラムに結合した全ての生成物の即時溶出がもたらされる。ＳＥＣ画分１．Ｂ７〜１．Ｂ１０を含有する生成物プールＥ１を濃縮のために第２のＡＩＥＸステップに適用し、図３０に示されている通りステップグラジエントで溶出する。分離効果は全くないが、その代わりに、画分１．Ａ６から開始してタンパク質含有量全体が溶出し、画分１．Ｂ７にまで達するピークテーリングの出現が示される。したがって、１．Ａ６から１．Ｂ８の間の全ての画分を最終生成物プールにプールし、その結果、およそ７ｍＬの生成物体積がもたらされる。その後のタンパク質濃度を決定するためのＵＶ測定により、約０．９８２ｍｇ／ｍＬの値がもたらされ、これは、総タンパク質６．８５ｍｇに対応する。図３１は、左側に銀染色を伴うＳＤＳゲル電気泳動の２つの画像および右側にＦＶＩＩＩウエスタンブロットを示す。これらはどちらも、排他的に全長重鎖断片と８０ｋＤａの軽鎖バリアントの組合せを示し、間に他のシグナルを示さない。表２０に示されている通り、Ｃ４逆相ＨＰＬＣデータからも同様に満足のいく結果が示される。１８０ｋＤａの全長重鎖の最終生成物溶液は、全ての全長重鎖バリアントおよび両方の軽鎖バリアントを含む、９４．５２％の標的タンパク質を含有する。比較すると、全タンパク質量のたった６％未満が短縮型重鎖種から主に生じる不純物であり、１５０ｋＤａおよび１１０ｋＤａ種がそれぞれ３．２８％および１．７６％である。
【０３０２】
【表２０】
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【０３０３】
この全長重鎖の精製の手順を数回繰り返して、所望の量のタンパク質をもたらした。これに応じたデータはさらに示していない。
【０３０４】
スモールスケール実験の間に使用するクロマトグラフィー樹脂と分取精製プロセスの間に使用するクロマトグラフィー樹脂はわずかに異なるので、性能および分解能に関する差異を評価することが興味深い。図３２は、同等の条件下で行った１８０ｋＤａの全長重鎖の実現可能性実行と分取精製のオーバーレイを示す。ランニングバッファー、適用される試料、滞留時間および溶出相の長さは両方の実行で同様である。
【０３０５】
方法は、１．５カラム体積の溶出相を有し、これにより、比較が容易になる−ｘ軸がカラム体積に変換されると仮定する。曲線を、両方が同じ開始点、この場合には注入ステップの終了を有するようにシフトさせた。実線で示されている実現可能性実行の溶出はおよそ０．３６ＣＶで開始し、一方、断続線で示されている分取実行の溶出は、０．０２ＣＶまでわずかに遅延する。差異はわずかであり、カラムサイズおよび通過するバッファー体積が全く異なることを考慮すると、これは、値に基づいて申告する意味のあるものとは思えない。それでも、全体的な形状および第１の断片−１８０ｋＤａの全長重鎖の溶出に必要なカラム体積の数に関しては、どちらの曲線も同一であると思われる。この場合、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  Ｉｎｃｒｅａｓｅは、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  Ｐｒｅｐ  Ｇｒａｄｅカラムの大まかに３分の１だけの長さである、つまり、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  Ｉｎｃｒｅａｓｅの分離効率はＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  Ｐｒｅｐ  Ｇｒａｄｅと比較しておよそ３倍良好である。しかし、任意の一定数量に応じたスケールアップは実施せず、その代わりに、このサイズおよび寸法のカラムの利用可能性を条件とした。したがって、それらのそれぞれの幾何学的形状を有する樹脂の両方を大体同様に実施することがはるかに有益であり、これは、それによりＳＥＣ実現可能性実験と分取サイズ排除精製が同等になるからである。
【０３０６】
（実施例１３）
ＦＶＩＩＩ亜種のラージスケール（分取）精製−第２および第３のクロマトグラフィーステップにおける短縮型重鎖断片（１５０ｋＤａ）の精製および濃縮
１５０ｋＤａの短縮型重鎖断片を精製するための手順は、前の節に記載されている全長重鎖の精製に使用したものと原理上は同様である。１５０ｋＤａの亜種として通常現れる典型的な肩により十分な純度のはるかに少ない画分が示されるので、この型のＦＶＩＩＩ亜種の適切な総量を精製することはどちらかというと難しい。必要な実行の数および最後の各亜種の総量によって示される通り、図４３は、同じ数の実行により、短縮型重鎖断片（６．７４ｍｇ）が全長重鎖（６２．９７ｍｇ）と比較して約１０分の１しかもたらされないことを示す。
【０３０７】
分子量が１５０ｋＤａである短縮型重鎖亜種（ＭｏｎｏＱ  ＡＩＥＸ生成物プールＥ６）のサイズ排除クロマトグラフィーによる精製が図３３に示されている。溶出の一般的なパターンは全長重鎖断片の精製と異なる。その分子量が全長重鎖の分子量よりも３０ｋＤａ下回るので、それはより多くの細孔、したがって、より大きな体積の樹脂に出入りすることができる。その溶出は、１８０ｋＤａの亜種と１１０ｋＤａの短縮型重鎖断片の間のどこかであると考えられるが、この断片についてはいかなる実現可能性実験もないので、正確な溶出挙動は分からない。強度が変動する異なるピークが溶出相全体を通して現れる。ＵＶシグナルは画分１．Ｂ４で上昇し始め、２重ピーク様構造を示し、最大強度は画分１．Ｂ６および１．Ｂ９で観察される。ＳＤＳ  ｐａｇｅゲル電気泳動により明らかになる通り、どちらのピークも残存する全長重鎖（１８０ｋＤａ）に由来する（図３４を参照されたい）。Ｂドメインのグリコシル化の変動に起因して異なる種類の全長重鎖断片が存在するという事実があるにもかかわらず、何故それらがサイズ排除クロマトグラフィーにおいて程度の差はあるが特定のピークとして溶出するのかは分からない。さらに、富化された１８０ｋＤａの亜種の溶出では別個の全長重鎖ピークは示されない。画分１．Ｂ１０〜１．Ｃ５は、最も高い強度のピークを含有し、これは所望の１５０ｋＤａの短縮型重鎖断片によってもたらされることが明白である。しかし、所望の断片を排他的に含有し、同時に満足のいくタンパク質濃度を有する画分の数は大きく限定される。画分１．Ｂ１１にはなお１８０ｋＤａの全長重鎖が混入しているが、以下の画分は、画分１．Ｃ５はタンパク質濃度だけが低く、ある特定の量の１２０ｋＤａの伸長型軽鎖が検出可能であるが、ほぼ純粋であると思われる。１１０ｋＤａの短縮型重鎖断片の溶出は画分１．Ｃ６で始まり、次いで、分離されたピークとして現れないＢドメイン枯渇重鎖と混同される。画分１．Ｃ１、１．Ｃ２および１．Ｃ３はタンパク質濃度が高く、また同様に他の亜種の混入が低いので、これらをＥ２と称される生成物プールに使用するために選択する。単一画分についてのタンパク質濃度測定値に応じて、プール全体のどちらかというと低いタンパク質濃度における総タンパク質量が２．６７ｍｇであると算出される。
【０３０８】
【表２１】
2020524688.tif 000028
【０３０９】
前に最終精製された分取ＳＥＣ画分Ｅ２および別の同様の１５０ｋＤａの短縮型重鎖断片のＳＥＣ溶出液プールを濃縮するために、両方をプールし、ＳｏｕｒｃｅＱ  ＡＩＥＸステップに適用する。その他に、図３５のクロマトグラムに示されている通り、溶出が通常通り画分１．Ａ６で始まり、ピークテーリング様式で画分１．Ｂ７まで続くように、全てのパラメータを一定に保つ。ピークの高さは、およそ１２００ｍＡＵであり、これは、ただ１つの代わりに２つのＳＥＣ溶出液プールを１つのＡＩＥＸステップで濃縮した結果としてより多量のタンパク質がローディングされることによってもたらされる。主要な優先事項は、失われる生成物をできるだけ少なくすることであるので、ＵＶ吸光度を有する全ての画分（１．Ａ６〜１．Ｂ８）を生成物プールのために使用する。
【０３１０】
関連するＳＤＳゲル電気泳動が図３６に、左側に銀染色および右側にＦＶＩＩＩウエスタンブロットで示されており、Ｅ１およびＥ２という呼称は、最終生成物プールの２つの希釈度に対応する（銀染色について１：４０および１：１２０ならびにＦＶＩＩＩウエスタンブロットについて１：５３および１：１６０）。銀染色ではいかなる追加的なバンドも示されず、これにより、排他的に１５０ｋＤａの短縮型重鎖種と８０ｋＤａの軽鎖バリアントの組合せという組成が示される。ＦＶＩＩＩウエスタンブロットは、対照的に、はるかに感度が高く、１８０ｋＤａ領域の呈色が少なく、これにより、全長重鎖の少なくとも軽微な不純物がなお残っていることが示唆される。１５０ｋＤａの短縮型重鎖種のサイズ排除ステップの論述の間に既に述べた通り、この亜種についての１回の精製列の収率はどちらかというと低い。ＳＥＣステージでは１回の通過後に精製することができる量はたった２．５ｍｇである。したがって、必要量である純粋なＦＶＩＩＩ  １５０ｋＤａの短縮型重鎖１０ｍｇを精製するために、それぞれの精製列を数回繰り返すことが必要である。それらの実行は、同じ手順に従って実施し、結果は同等であるので、さらに論じない。４つのＳＥＣ溶出液プールの総数をその後の２つのＳｏｕｒｃｅ３０Ｑ  ＡＩＥＸステップで濃縮し、その後、１つの単一の最終生成物プールにプールし、それをＣ４逆相ＨＰＬＣによって分析する。
【０３１１】
伸長型軽鎖、軽鎖および１５０ｋＤａ重鎖が標的タンパク質種であるとみなされ、他の全ての亜種が不純物とみなされる適当なデータを表２２に示す。標的タンパク質のパーセンテージはほぼ９２％であり、これは、分子量が１５０ｋＤａである短縮型重鎖断片の最終生成物プールに関して他の亜種が１０％未満という目的を果たすことができたことを意味する。
【０３１２】
【表２２】
2020524688.tif 000029
【０３１３】
（実施例１４）
ＦＶＩＩＩ亜種のラージスケール（分取）精製−第２および第３のクロマトグラフィーステップにおける短縮型重鎖断片（１１０ｋＤａ）の精製および濃縮
分子量が１１０ｋＤａである短縮型重鎖亜種を、１８０ｋＤａおよび１５０ｋＤａのＦＶＩＩＩ亜種に対してすでに使用された標準手順に従って精製する。第１のＡＩＥＸステップおよびサイズ排除クロマトグラフィーのどちらにおいても所望の断片のピークが隣のピークからはるかに良好に分離されるので、都合のよい画分を選択し、プールすることがはるかに容易であると思われる。結果を以下の２つの節に示す。
【０３１４】
１１０ｋＤａの短縮型重鎖亜種を含有するＭｏｎｏＱ  ＡＩＥＸ生成物プールＥ３のさらなる最終精製は、問題がないものであると考えられる。Ｂドメイン枯渇９０ｋＤａ重鎖はＭｏｎｏＱ  ＡＩＥＸ精製ステップですでに十分に分離されており、ほんの少量だけがなお残っていることが予測される。図３７のクロマトグラムは、初めの強度が低い３つのピークを示す。ゲル電気泳動で示される通り、それらのうち画分１．Ｂ１０〜１．Ｃ１の２つは、どちらも全長重鎖バリアントから生じるものである（図３８）。画分１．Ｃ２および１．Ｃ３の以下のピークは、微量の１５０ｋＤａの短縮型重鎖断片によってもたらされる。吸光度値がおよそ１０〜１１ｍＡＵである最も強いピークは１１０ｋＤａの短縮型重鎖断片によって引き起こされる。ＳＤＳゲル電気泳動により、所望の亜種を含有する３つの画分、すなわち、１．Ｃ４、１．Ｃ５および１．Ｃ６が示される。画分１．Ｃ４はピークの上昇部分を表し、これは、すでに比較的純粋であると思われる。最大のピークは画分１．Ｃ５に入り、これは、高いタンパク質濃度および満足のいく純度を同時に示す。ピークの下降部分は画分１．Ｃ６に収集され、これは、微量のＢドメイン枯渇重鎖断片（９０ｋＤａ）をすでに含有する。
【０３１５】
クロマトグラムでは、この亜種が主要なピークの肩として現れ、したがって、生成物ピークの下降部分に混入すると思われることも見ることができる。表２３は、生成物ピークを包含する画分番号１．Ｃ４、１．Ｃ５および１．Ｃ６のタンパク質濃度および総タンパク質量を示す。画分１．Ｃ４および１．Ｃ６は無視できる量のタンパク質を含有するので、潜在的な混入リスクが理由でそれらの画分をプールに使用することに価値がないと思われる。結果として、画分１．Ｃ５のみをＳｏｕｒｃｅＱカラムでのＡＩＥＸ濃縮ステップに使用する。Ｃ４逆相ＨＰＬＣ分析からのデータを表２４に示し、これにより、すでに画分１．Ｃ５だけで８．８２％の不純物を含有しているので、画分１．Ｃ４および１．Ｃ６を廃棄するという決定が明白に確認される。
【０３１６】
【表２３】
2020524688.tif 000030
【０３１７】
【表２４】
2020524688.tif 000031
【０３１８】
１１０ｋＤａの短縮型重鎖断片についてのＡＩＥＸ濃縮ステップのクロマトグラムを図３９において見ることができる。３回の特定のサイズ排除クロマトグラフィーの実行の溶出液プールを同時にプールし、濃縮する。電気伝導率は、全ての結合した試料を迅速に溶出するために約３０ｍＳ／ｃｍまで急勾配で上昇させるまで、最初は約５ｍＳ／ｃｍの安定レベルとする。ＵＶ曲線によって示される通り、試料は画分１．Ａ７で溶出し始め、画分１．Ａ９でその最大吸光度およそ１１００ｍＡＵに達する。吸光度は、画分１．Ａ１０〜１．Ａ１２で急速に降下し、次いで、長いテーリング相に入り、最終的に、画分１．Ｂ６でベースラインレベルに達する。画分１．Ａ７〜１．Ｂ８を最終生成物プールに使用する。
【０３１９】
試料はすでに２つの異なる精製ステップを通過しているので、１１０ｋＤａの短縮型重鎖断片のみを含有するはずである。これは、左側にＳＤＳ  ｐａｇｅゲル電気泳動の銀染色画像が示され、右側にＦＶＩＩＩウエスタンブロット発色が示されている図４０によっても確認される。
【０３２０】
どちらも、カラムローディング前にプロービングされたロード中に排他的に１１０ｋＤａの短縮型重鎖断片と８０ｋＤａの軽鎖バリアントの組合せを示す。他の画分、すなわち、フロースルー、洗浄相および生成物プールには使用しない溶出相の第１の画分（ＶＥと称される）は関連性のある量の生成物を示さない。これは、カラムの容量が試料量全体を結合させるのに十分に高いことを意味する。第２の濃縮ステップを同様に実施し、両方の溶出液を排他的に１１０ｋＤａの短縮型重鎖断片で構成される１つの最終生成物プールにプールする。その生成物プールの２つの異なる希釈度−銀染色について１：１４７（Ｐ１）および１：４９（Ｐ２）ならびにＦＶＩＩＩウエスタンブロットについて１：１９６（Ｐ１）および１：６５（Ｐ２）−は、ほぼ純粋な１１０ｋＤａの短縮型重鎖断片と見ることができる。銀染色画像では他のいかなる亜種も示されないが、ＦＶＩＩＩウエスタンブロット画像では、Ｐ２希釈度に関して全長重鎖の低いシグナルが目に見える。表２５は、濃縮されたＳＥＣ溶出液プール全てを含む最終生成物プールの組成に関する対応する分析データを提示する。最終的なプール中の標的タンパク質の分率は９３．７％であり、１２０ｋＤａの伸長型軽鎖および８０ｋＤａの軽鎖バリアントの両方ならびに１１０ｋＤａの短縮型重鎖バリアントを含む。不純物の分率は６．３％であり、１０％未満である。
【０３２１】
【表２５】
2020524688.tif 000032
【０３２２】
（実施例１５）
ＦＶＩＩＩ亜種のラージスケール（分取）精製−第３のクロマトグラフィーステップにおけるＢドメイン枯渇重鎖（９０ｋＤａ）断片の濃度
Ｂドメイン枯渇重鎖断片は、出発材料Ｂ１４３９０００−３０中に最少に存在するＦＶＩＩＩ亜種である。満足のいく量のこの亜種を得るためには莫大な数のＡＩＥＸ精製を実行することが必要になり、これには、どちらかというと利用可能性が限られているこの出発材料の大きな体積が必要になる。その結果として、約３８％の９０ｋＤａの亜種という適当な含有量を有するＦ８＿ＡＤ２＿９０ｋＤａと称される第２の出発材料をこの目的のために使用する。その供給源とは無関係に、サイズ排除クロマトグラフィーによる最終精製ステップをスキップし、溶液をＳｏｕｒｃｅＱカラムに直接濃縮する。２つの異なるサイズの２つのカラムが利用可能である−どちらの出発材料の体積および総タンパク質含有量もスモールスケールＳｏｕｒｃｅＱカラムの容量を超えるので、カラム体積が７．０ｍＬであるより大きなカラムを代わりに使用する。以下は、Ｂ１４３９００００−３０由来Ｂドメイン枯渇重鎖種の精製の結果に限定される。
【０３２３】
すでに前述した通り、９０ｋＤａのＢドメイン枯渇重鎖断片は、ＭｏｎｏＱ  ＡＩＥＸステップで他の亜種からほぼ完全に分離され、したがって、サイズ排除クロマトグラフィーによるいかなるさらなる精製も最終精製も必要ない。９０ｋＤａのＢドメイン枯渇重鎖断片は、すでに高度に希釈されているので、これにより、サイズ排除クロマトグラフィーにおける不十分な結果が導かれる可能性もあり、さらに、この特定の断片の大きな喪失も引き起こされ得る。実施例１１に記載の生成物プールＥ８などの、９０ｋＤａのＢドメイン枯渇種の典型的なＭｏｎｏＱ  ＡＩＥＸ生成物プールは、タンパク質を０．０２５ｍｇ／ｍＬしか含有せず、したがって、標的タンパク質１０ｍｇの所望の量を実現するためには、より多数のそのような生成物プールを濃縮することが必要になる。図４１は、６つのＭｏｎｏＱ溶出液プールを同時に濃縮するためのＡＩＥＸ  ＳｏｕｒｃｅＱ実行の溶出相を示す。生成物体積の有意な増大により室温における長すぎる試料保留時間が引き起こされることになるので、カラム体積が約３ｍＬである小さなＳｏｕｒｃｅＱカラムはもはや適さない。したがって、保留時間を許容される範囲内で維持するためには、カラム体積を大まかに倍加して約７ｍＬにすることは避けられなかった。溶出自体は前に論じられているものと同様であるが、ピークが広がると思われる。ＭｏｎｏＱアニオン交換クロマトグラフィーの溶出相においてすでに見られた通り、Ｂドメイン枯渇重鎖断片は、結合解除のために全ての亜種の中で最も高い電気伝導率を必要とするので、最後に溶出する。ＳｏｕｒｃｅＱ  ＡＩＥＸステップのステップグラジエントでは、Ｂドメイン枯渇断片を高速かつ急に溶出するのに十分に高い電気伝導率がもたらされない可能性がある。その代わりに、全てのタンパク質を樹脂から取り除き、それにより、ピークブロードニングを引き起こすためにより大きな体積の溶出バッファーを要する。しかし、タンパク質濃度０．４９３ｍｇ／ｍＬおよび総タンパク質量９．０６ｍｇを示す最終生成物プールに画分１．Ａ１１〜１．Ｄ１２を使用する。それぞれのＳＤＳゲル電気泳動を図４２において見ることができ、例によって、左側に銀染色ゲル画像が提示され、右側にＦＶＩＩＩウエスタンブロット発色が提示されている。銀染色画像では極めて純度が高く見えるが、はるかに感度が高いＦＶＩＩＩウエスタンブロット画像では、ロードおよび溶出液プール希釈液中になお有意な量の全長重鎖が目に見えることを見ることができる。Ｃ４逆相ＨＰＬＣ分析により、最終生成物プール中に３．８４％の量の全長重鎖がなお存在することが確認されるが、９４．４９％の標的タンパク質を純度目標＜１０％の他の亜種とコンパイルする。この全長重鎖の精製の手順を数回繰り返して、所望の量のタンパク質をもたらした。
【０３２４】
【表２６】
2020524688.tif 000033
【０３２５】
（実施例１６）
ラージスケール（分取）精製の要約
ＦＶＩＩＩ亜種の分取精製プロセスは、最初の分離のためのＭｏｎｏＱでのＡＩＥＸステップ、最終精製のためのＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００樹脂でのＳＥＣステップ、および最終的に、アニオン交換樹脂Ｓｏｕｒｃｅ３０Ｑでの濃縮ステップを包含する。全長鎖ならびに２つの短縮型断片は、妥当な精製成功のためにはこれらの３つのステップを通過しなければならない。Ｂドメイン枯渇断片は精製が容易な例外であり、これは、最終精製ステップをスキップし、アニオン交換ステップに単に適用される。図４３は、本発明の間に駆動される完全な精製プログラムの概要を示す。違うようにグリコシル化されたバリアント全てを含めた、分子量１８０ｋＤａの全長重鎖には、総数で４回のＡＩＥＸ精製実行、３回のＳＥＣ実行および濃縮のために３回のＡＩＥＸ実行が必要であった。これにより、全ての全長重鎖バリアント、ならびに両方の軽鎖バリアントを含む標的タンパク質６２．９７ｍｇがもたらされた。不純物のパーセンテージは、６．８４％である、または言い換えれば、最終生成物プールは９３．１６％の純度を示し、タンパク質の量および純度に関する目標が実現される。不純物は主に２つの短縮型重鎖種から生じる。１５０ｋＤａの短縮型重鎖断片は、精製が最も困難なものの１つである。短縮型重鎖種（１５０ｋＤａ）および両方の軽鎖バリアントを含むどちらかというと少量の標的タンパク質６．７４ｍｇをもたらすために総数で４回のＭｏｎｏＱでのＡＩＥＸ実行、４回のＳＥＣ最終精製実行および濃縮のための２回のＡＩＥＸ実行が必要であった。ほぼ排他的に全長重鎖から生じる不純物のパーセンテージは１０％（８．０４％）よりも下に保つことができ、これは、目標に見合う。１１０ｋＤａの短縮型重鎖種を、５回のＡＩＥＸ精製実行、その後の５回のＳＥＣ最終精製実行、および最終的に、２回のＡＩＥＸ濃縮実行によって精製した。最終的な１１０ｋＤａの短縮型重鎖断片８．５７ｍｇは、６．３１％の不純物を示し、これは、他の亜種の全てによって引き起こされる。Ｂドメイン枯渇重鎖断片では、７回のＡＩＥＸ実行およびラージスケールＳｏｕｒｃｅ３０Ｑカラムでの２回のＡＩＥＸ濃縮実行が必要であった。この精製プロセスにより、９０ｋＤａの亜種バリアントの両方と２つの軽鎖バリアントの組合せを含むタンパク質総量１５．３１ｍｇがもたらされた。不純物のパーセンテージは正確に５．００％であり、これは、全ての亜種の中で最低の不純物のパーセンテージ数であるが、中間の最終精製ステップは実施されていない。したがって、Ｂドメイン枯渇重鎖断片に関しては両方の目標が実現される。結論として、不純物が＜１０％という限界に関する目標は全ての亜種について実現することができた。タンパク質の総量は、全長重鎖断片については、出発材料中の存在量が多いことに起因して非常に満足のいくものであるが、Ｂドメイン枯渇重鎖断片についての結果も適正な範囲内に入る。
【０３２６】
４つの最終生成物プール全てについてのタンパク質濃度は、全長重鎖については０．９７４ｍｇ／ｍＬ、１５０ｋＤａの短縮型重鎖断片については０．５６８ｍｇ／ｍＬ、１１０ｋＤａの短縮型重鎖断片については０．６４０ｍｇ／ｍＬ、およびＢドメイン枯渇重鎖断片については０．５３７ｍｇ／ｍＬである。したがって、０．３ｍｇ／ｍＬの限界を上回ることである全ての生成物プールの目標が明白に実現される。さらに、生成物種の全てが所望のバッファーマトリックス中にもたらされる。
【０３２７】
結論として、異なる条件およびパラメータを４つの異なる樹脂で試験したスモールスケール実験はスケールアップおよび最終的な精製プロセスのために非常に重要であった。この最終的な戦略により、満足のいく結果が導かれた。特に、分子量１５０ｋＤａの短縮型重鎖断片は精製が極めて困難である。さらに、当該断片はまた、含有量がどちらかというと低いので、多くの出発材料を消費する。それでも、ほぼ７．０ｍｇの当該断片をもたらすことができ、これは良好な結果である。最終的な精製戦略により、４つの亜種全てを精製するための簡単な手順がもたらされる。表２７は、本発明の転帰を要約し、必要条件に関する評価を示す。
【０３２８】
【表２７】
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【０３２９】
最初に、疎水性相互作用クロマトグラフィーは１５０ｋＤａの短縮型重鎖種を全長重鎖からより分離させて溶出することができるので、これをＭｏｎｏＱ  ＡＩＥＸステップの代替と考えた。第１の実験から、疎水性相互作用クロマトグラフィーにより実際にそのような溶出がなされることが示されたが、１５０ｋＤａの亜種の含有量が精製には比較的少ないと思われた。これに対する可能な解決法は、ネガティブモードＨＩＣをサイズ排除クロマトグラフィーの代替として組み入れることであった。１つの実験が実施され、それは上首尾であり、１５０ｋＤａの亜種が富化されたプールを満足のいく程度まで精製することができることを示した。さらなる実験により、結合挙動に対して最大の影響を及ぼすと仮定される電気伝導率レベルに関する妥当な条件を明らかにすることができる。
【０３３０】
最終的に、目標が達成され、ＦＶＩＩＩ亜種を精製するための新規かつ効率的に働く手順、ならびにサイズ排除クロマトグラフィーステップと置き換えるための新規の手法がもたらされた。さらに、４つの亜種全ての純粋なタンパク質溶液をもたらすことは、ＦＶＩＩＩ分子亜種の性質をさらに調査することを可能にする礎石になる。さらに、精製されたＦＶＩＩＩ亜種またはこれらの混合物は、出血性障害の処置に有用であり得る。
【０３３１】
（実施例１７）
精製されたＦＶＩＩＩ亜種の機能的特徴付け−材料および方法
以下に、「精製されたＦＶＩＩＩ亜種の機能的特徴付け」に関する全ての実施例について実験の詳細を示す。
【０３３２】
ＦＶＩＩＩ試料および化学物質
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）において産生されたＦＬ−ｒＦＶＩＩＩ（市販のＦＬ−ｒＦＶＩＩＩ製品のプロセス中間材料、０．２３ｍｇ／ｍｌ）、ＦＬ−ｒＦＶＩＩＩの歴史的ロット、および市販の凍結乾燥した血漿ＦＶＩＩＩ製品は、Ｓｈｉｒｅ、Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａによって提供された。化学物質は、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、ＭＯ、ＵＳＡから購入した。別段の指定のない限り、ＦＬ−ｒＦＶＩＩＩはヒトＦＬ−ｒＦＶＩＩＩを指し、ｐｄＦＶＩＩＩはヒトｐｄＦＶＩＩＩを指す。
【０３３３】
ｐｄＦＶＩＩＩおよびｒＦＶＩＩＩ分子種の精製
ｖＷＦを含まないｐｄＦＶＩＩＩを市販の凍結乾燥した血漿ＦＶＩＩＩ製品から精製した。多数のバイアルの再構成をバッファー溶液で実施し、その後、プールして均一な出発材料を実現した。ｖＷＦおよびＦＶＩＩＩの分離を化学的手段によって誘導した。ＦＶＩＩＩの捕捉を抗ＦＶＩＩＩアフィニティーカラムで実施した。ｖＷＦのさらなる枯渇を強力なカチオン交換クロマトグラフィーによって実現した。最終的に、バッファー交換および濃縮のために強力なアニオン交換樹脂での追加的な最終精製ステップを実施した。
【０３３４】
Ｂドメイン短縮の程度が異なるｒＦＶＩＩＩ分子種をＦＬ−ｒＦＶＩＩＩから単離した。平らなグラジエントを用いた高分解能アニオン交換クロマトグラフィーステップを使用して、実体を予備分離した。次いで、富化された亜種を用いたプールを生成し、分取サイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製し、その後、強力なアニオン交換樹脂で濃縮し、バッファー交換した。
【０３３５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、Ｎｏｖｅｘ  ＮｕＰＡＧＥ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して行った。試料（各５０μｌ）を０．５Ｍのヨードアセトアミド２０μｌと混合し、３７℃で３０分インキュベートした。その後、脱イオン水１５μｌ、ＮｕＰＡＧＥ  ＬＤＳ  サンプルバッファー２５μｌおよびＮｕＰＡＧＥ還元剤１０μｌを反応混合物に添加し、３７℃で３０分にわたってインキュベーションを継続した。各試料１０μｌ（３０ｎｇ）およびｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ｐｌｕｓ  ｕｎｓｔａｉｎｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）２μｌをＮｕＰＡＧＥ  ７％Ｔｒｉｓ−酢酸ミニゲルにローディングした。電気泳動を１５０Ｖで９０分にわたって実行した。タンパク質バンドをＳｉｌｖｅｒＱｕｅｓｔ銀染色キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて可視化した。
【０３３６】
ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏタンパク質分析
Ｂドメインの平均疎水性親水性指標を算出するために、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  Ａｄｖａｎｃｅ  １１からのＢｉｏＡｎｎｏｔａｔｏｒツールを使用した。
【０３３７】
水素／重水素交換質量分析
ｒＦＶＩＩＩの構造モチーフを特徴付けるために、水素／重水素交換質量分析（ＨＤＸ−ＭＳ）を実施した。タンパク質構築物の局所アミドＨＤＸカイネティクスを３秒、１０秒、３０秒、２分、１０分、６０分、３時間および３日間のインキュベート時間後に追跡した。ＨＤＸ反応は、３秒のインキュベーション反応を６℃で行った以外は全て、室温（２２℃）で実施した。ｒＦＶＩＩＩ分子種Ｂ７０−ｒＦＶＩＩを重水素化バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓバッファー、ｐＨ６．７、５ｍＭのＣａＣｌ２および２６０ｍＭのＮａＣｌを含有する）と混合することによってＨＤＸ標識付け反応を開始した。１００ｍＭのトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンおよび３．３Ｍの尿素を含有する氷冷１００ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ２．３を添加することによって反応を停止させ、その後、液体窒素で瞬間凍結した。重水素化された試料を、ブタ胃粘膜由来のペプシン−アガロース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を充填し、２×１０ｍｍのＣ１８プレカラム（ＡＣＥ）で脱塩したＨＰＬＣカラム（２．１×３０ｍｍ）（ＡＣＥ、Ａｂｅｒｄｅｅｎ、ＵＫ）を使用して消化した。消化ペプチドを、２×５０ｍｍのＨＡＬＯ  Ｃ１８／１．８μｍカラム（ＡＭＴ、ＤＥ、ＵＳＡ）を使用した、ＭＳ（ＬＣ−ＭＳ）とカップリングした液体クロマトグラフィーに供した。アセトニトリルグラジエントによってペプチドを溶出し、Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＸＬ質量分析計（ｍ／ｚ４００で６０，０００分解能）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で分析した。重水素化されていないタンパク質試料の、重水素化された試料と同じ手順を使用した３回の独立したＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析によって消化ペプチド同定を実施した。
【０３３８】
ＦＶＩＩＩ発色活性
ＦＶＩＩＩ活性測定を、市販のＦＶＩＩＩ発色活性アッセイキット（Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｅｒｌａｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に従い、自動凝固分析機器（ＢＣＳ  ＸＰ）（Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で実施した。簡単に述べると、未知量の機能的ＦＶＩＩＩを含有する試料を、トロンビン、活性化された凝固第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）、リン脂質、凝固第Ｘ因子（ＦＸ）およびカルシウムを含有するバッファーからなる反応混合物に添加した。トロンビンによる切断後、ＦＶＩＩＩａはリン脂質、ＦＩＸａおよびカルシウムと複合体と形成し、その結果、ＦＸが活性化される。活性化されたＦＸ（ＦＸａ）を、ＦＸａに特異的な発色性ｐ−ニトロアニリン基質の切断を通じて光度測定により測定し、これは試料中に存在する機能的ＦＶＩＩＩの量と正比例した。標準品はＷＨＯ国際標準に対して較正された市販のＦＬ−ｒＦＶＩＩＩ（Ｓｈｉｒｅ）であった。
【０３３９】
ＦＶＩＩＩ凝集体の調製
全てのＦＶＩＩＩ試料を、０．９ｍＭのＣａＣｌ２および０．５ｍＭのＭｇＣｌ２を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ＋＋）に対して透析し、タンパク質濃度が０．１２２μＭ、０．２４４μＭまたは０．６１μＭのいずれかになるまで希釈した。再現性を確実にするために、全ての実験を少なくとも２回実施した。
【０３４０】
温度依存性凝集
タンパク質濃度が高性能サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ−ＳＥＣ）分析のために０．１２２μＭであるか、または動的光散乱（ＤＬＳ）分析のために０．６１μＭであるＦＶＩＩＩ試料を全て、Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｈ４  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｒｅａｄｅｒ（ＢｉｏＴｅｋ、ＶＴ、ＵＳＡ）中プレートシーラーで覆ったポリスチレン９６ウェルマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、ＵＳＡ）中、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃または５０℃のいずれかで２０時間、１０分ごとに２０秒間培地を振とうしながらインキュベートした。その後、試料を−８０℃で凍結させ、ＤＬＳおよびＨＰＬＣ−ＳＥＣ分析時まで置いた。
【０３４１】
４５℃における時間依存性凝集
全てのＦＶＩＩＩ試料（０．１２２μＭ）を、ＰＳＴ−６０ＨＬ  ｐｌｕｓサーモシェーカー（Ｂｉｏｓａｎ、ＭＩ、ＵＳＡ）中、プレートシーラーで覆ったポリスチレン９６ウェルマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中、４５℃で２４時間インキュベートした。試料を種々の時間間隔後に抜き取り、−８０℃で直ちに凍結させ、ＨＰＬＣ−ＳＥＣによる試験まで置いた。
【０３４２】
ＦＶＩＩＩ凝集の均一シーディング
シードを調製するために、ＦＶＩＩＩ試料（０．１２２μＭ）をＰＳＴ−６０ＨＬ  ｐｌｕｓサーモシェーカー（Ｂｉｏｓａｎ）中、プレートシーラーで覆ったポリスチレン９６ウェルマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中、４５℃で２、５、８または１８時間インキュベートした。ネイティブなＦＶＩＩＩ試料（０．１２２μＭ）をそれらの対応するシードと１：１で混合し、４５℃における時間依存性凝集を実施した。試料をＨＰＬＣ−ＳＥＣ分析まで−８０℃で保管した。
【０３４３】
撹拌およびずり応力により誘導される凝集
タンパク質濃度０．２４４μＭのＦＶＩＩＩ溶液を使い捨てＯｍｎｉｆｉｘシリンジ（Ｂｒａｕｎ、Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中で、手動で１０分間撹拌した。溶液をＴｅｒｕｍｏ  Ｅｕｒｏｐｅ、Ｂｅｌｇｉｕｍからの「Ｗｉｎｇｅｄ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｓｅｔｓ  ｗｉｔｈ  ｎｅｅｄｌｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ」（２３Ｇ×３／４’’；Ｌ＝３５ｃｍ、Ｖ＝０．２５ｍＬ）によって注入することによってずり応力を誘導した。この十分に制御されたストレス条件は、再構成および適用の間のｒＦＶＩＩＩ製品の潜在的な取り扱いミスを表すことを意図している。ストレス条件への曝露後の全ての試料をフローサイトメトリーに基づく粒子分析まで−８０℃で保管した。
【０３４４】
動的光散乱
Ｍａｌｖｅｒｎ  ＮａｎｏＺｅｔａｓｉｚｅｒ  ＺＳＰ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｍａｌｖｅｒｎ、ＵＫ）を使用してＤＬＳを実施した。全ての試料（０．２４４μＭ）を１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し（Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ５４１５Ｃ）（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ）、試料６０μＬをＺＥＮ００４０使い捨てマイクロキュベットに充填した。操作温度を２５℃に設定し、平衡化時間を２分間とした。角度を１７３°後方散乱に設定して、タンパク質の流体力学的直径を決定した。このパラメータを、ＤＬＳによってタンパク質の有効なサイズを分析するために使用した。試料当たり最低３回の実行を測定して平均結果を得た。
【０３４５】
高性能サイズ排除クロマトグラフィー
ＨＰＬＣ−ＳＥＣを、室温で、ＨＰＬＣ  １２６０  ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）とカップリングしたＴＳＫｇｅｌ  Ｇ４０００ＳＷｘｌカラム（７．８×３００ｍｍ）（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｔｏｋｉｏ、Ｊａｐａｎ）およびＴＳＫガードカラム（６×４０ｍｍ）（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して実施した。ＳＥＣを、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、４００ｍＭのＮａＣｌおよび０．０５％ＮａＮ３、ｐＨ７．０からなる水性バッファーを使用し、定組成条件下、流速０．３ｍｌ／分で行った。試料体積１００μｌ（タンパク質濃度０．１２２μＭ）を１ｍＭのチオフラビンＴ（ＴｈＴ）３μｌと混合し、その後、カラムにローディングした。蛍光検出を用いてタンパク質の溶出をモニタリングするために、励起および放出波長をそれぞれ２８０ｎｍおよびゼロ次に設定した。ＴｈＴ蛍光を４４０ｎｍ励起およびゼロ次放出を用いてモニタリングした。空隙容量（保持時間１８．０〜２１．２分）、保持時間２１．２〜２７．０分および２７．０〜４３．０分を用いたピーク溶出を、それぞれ可溶性タンパク質凝集体、オリゴマーおよび単量体と名付けた。凝集体、オリゴマーおよび単量体の量をクロマトグラムにおける全てのピークの総面積に対するパーセンテージとして算出した。ＴｈＴ結合をＴｈＴ蛍光シグナルと内因性タンパク質蛍光シグナルの比として算出した。タンパク質に基づくゲル濾過標準物質（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を試料の間に分析して、最適なカラム性能をモニタリングした。全ての試料を順不同で分析した。
【０３４６】
曲線あてはめおよび統計解析
曲線あてはめをＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ６によってコンピュータ処理した。オリゴマー形成についてのカイネティクス速度定数（ｋｏｌｉｇｏ［ｈ−１］）を、方程式：ｙ＝ｙ０＋（プラトー−ｙ０）＊［１−ｅｘｐ（−ｋｏｌｉｇｏ＊ｘ）］；ｙ＝オリゴマー量［％］；ｘ＝時間［ｈ］；ｙ０＝ｘがゼロである場合のｙ値；プラトー＝無限時間でのｙ値である）に従ってデータを一相会合モデルにあてはめることによって導き出した。凝集体の形成速度（ｋａｇｇ［ｈ−１］）を、方程式：ｙ＝ｙｍｉｎ＋（ｙｍａｘ−ｙｍｉｎ）／（１＋ｅｘｐ［（ｘ１／２−ｘ）／（１／ｋａｇｇ）］；ｙ＝凝集体量［％］；ｙｍｉｎ＝停滞期のｙ；ｙｍａｘ＝凝集終了後のｙ；ｘ＝時間［ｈ］；ｘ１／２＝ｙが最大半量になる時間（Uversky  et  al.,  2001）に従ってデータをＢｏｌｔｚｍａｎｎ  Ｓ字モデルにあてはめることによって導き出した。
【０３４７】
統計学的差異を、対応のないｔ検定を使用し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６によってコンピュータ計算した。
【０３４８】
フローサイトメトリーに基づく粒子分析
肉眼では見えない粒子を検出し、特徴付けるためのフローサイトメトリーに基づく粒子分析方法を使用した。フローサイトメトリーに基づく方法では、肉眼では見えない粒子を特徴付けるために、サイズ較正用ビーズ（Ｆｌｕｏｒｅｓｂｒｉｔｅ（登録商標）ＹＧ  Ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ  Ｓｉｚｅ  Ｒａｎｇｅ  ｂｅａｄｓ）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．、ＰＡ、ＵＳＡ）、計数用ビーズ（ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ（商標）Ａｂｓｏｌｕｔｅ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｂｅａｄｓ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、ＣＡ、ＵＳＡ）および蛍光プローブの組合せを使用する。タンパク質およびタンパク質を含有する粒子を肉眼では見えない非タンパク質粒子と区別するために、試料を蛍光色素４，４’−ジアニリノ−１，１’−ビナフチル−５，５’−ジスルホン酸二カリウム塩（Ｂｉｓ−ＡＮＳ）で染色した。この方法は刊行物（Lubich  et  al.,  2015）に詳細に記載されている。
【０３４９】
（実施例１８）
精製されたＦＶＩＩＩ亜種の機能的特徴付け−ｐｄＦＶＩＩＩとＦＬ−ｒＦＶＩＩＩの類似した不均一性
以下の実験において、目的は、Ｂドメイン、ならびにＦＬ−ｒＦＶＩＩＩおよび血漿由来（ｐｄ）ＦＶＩＩＩにＢドメインが存在することに起因する天然の不均一性の、タンパク質安定性および凝集に対する影響を調査することであった。Ｂドメインの構造特性を試験し、可変Ｂドメイン含有量を有するＦＬ−ｒＦＶＩＩＩ、ｐｄＦＶＩＩＩおよび精製されたｒＦＶＩＩＩ分子種の物理的ストレスに抵抗する能力を比較し、それらの凝集挙動を探求した。観察に基づいて、ＦＬ−ｒＦＶＩＩＩおよびＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩ凝集の図式モデルを構築し、ＦＶＩＩＩ分子の安定性を確実にすることにおけるＢドメインおよび分子不均一性の新しい役割が示唆された。
【０３５０】
ＦＶＩＩＩの多ドメイン構造の概略図が図２Ｂに示されている。角括弧は、ＦＬ−ＦＶＩＩＩのＢドメイン内の複合体転写後プロセシングの結果生じる分子種を示す。１００％（Ｂ１００−）、７０％（Ｂ７０−）、２０％（Ｂ２０−）または０％（ＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩ）のＢドメインを含有するｒＦＶＩＩＩ分子種は、ＦＬ−ｒＦＶＩＩＩにおいて見出される主要なＦＶＩＩＩ種を示す（Jankowski  et  al.,  2007、内部の分析データは示していない）。Ｂドメイン含有量のパーセンテージを、それぞれのｒＦＶＩＩＩ  ＨＣの見かけの分子質量に基づいて算出した。アミノ酸Ａｒｇ１３１３からＡｒｇ１６４８までに達するＢドメイン部分は、分泌されたＦＶＩＩＩ  ＨＣ種のいずれにおいても見出されなかったので、切断プロセス後に完全に取り除かれる可能性が高い（Jankowski  et  al.,  2007）。
【０３５１】
ｐｄＦＶＩＩＩを、プールされたヒト血漿から、アフィニティークロマトグラフィーとイオン交換クロマトグラフィーの組合せによって最高純度まで単離した。ｖＷＦの量はＦＶＩＩＩ  １ｍｇ当たりｖＷＦ７．５μｇまで枯渇した。銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでｐｄＦＶＩＩＩおよびＣＨＯ由来ＦＬ−ｒＦＶＩＩＩについてほぼ同一の異成分からなるタンパク質プロファイルが同定された（図４４の左側の画像、レーン１〜２）。どちらでも、およそ２００ｋＤａにおいて最も強いバンドが示され、これにより、グリコシル化されたＢ１００−ＨＣ種、および分子量が低いいくつかの短縮型ＨＣ／Ｂドメイン種が、ゲルにおいてＦＬ−ｒＦＶＩＩＩとｐｄＦＶＩＩＩで同等のレベルで移動することが示される。主要な分子ＦＶＩＩＩ種がＦＬ−ｒＦＶＩＩＩおよびｐｄＦＶＩＩＩの両方に存在することは、ＳＥＣプロファイルでさらに観察された（図５１）。さらに、ＦＬ−ｒＦＶＩＩＩの不均一性は２００５年から２０１５年までに生成された歴史的ロットにわたって一貫性を示した（図４４の右側の画像）。
【０３５２】
（実施例１９）
精製されたＦＶＩＩＩ亜種の機能的特徴付け−ｒＦＶＩＩＩ分子種の精製および特徴付け
単一のＦＶＩＩＩ分子種をＣＨＯ由来ＦＬ−ｒＦＶＩＩＩから、サイズ排除クロマトグラフィー法およびイオン交換クロマトグラフィー法を適用することによって精製した。ＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩ、Ｂ２０−ｒＦＶＩＩＩおよびＢ７０−ｒＦＶＩＩＩを、それぞれＣ４  ＨＰＬＣ分析に基づいて９５％、９４％および９２％の純度まで単離した（データは示していない）。それぞれの種のＬＣについては７５ｋＤａの一定の見かけの分子量バンドが観察されたが、Ｂ７０−ｒＦＶＩＩＩ、Ｂ２０−ｒＦＶＩＩＩおよびＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩのＨＣでは、様々な量のＢドメインに起因して、それぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで１５０、１１０および９０ｋＤａの見かけの分子量が示された（図４４の左側の画像、レーン３〜５）。精製されたｒＦＶＩＩＩ種の完全性をＨＰＬＣ−ＳＥＣによってさらに実証した（図５１）。Ｂ１００−ＦＶＩＩＩは以下では使用しない。
【０３５３】
（実施例２０）
精製されたＦＶＩＩＩ亜種の機能的特徴付け−Ｂドメイン構造特性
Ｂドメインは、全体的な疎水性が低いアミノ酸配列を有する。KyteおよびDoolittle（Kyte  et  al.,  1982）による疎水性親水性指標の平均は総Ｂドメインアミノ酸配列について０．７５１と算出された。低疎水性のクラスターはＢドメイン配列の中で一様に分布する。Ｂ１００−ｒＦＶＩＩＩ、Ｂ７０−ｒＦＶＩＩＩおよびＢ２０−ｒＦＶＩＩＩのＢドメイン配列は、それぞれ−０．７７９、−０．７４１および−０．８９６の同様の平均疎水性親水性指標値を示す。低疎水性は、一般には、Uversky（Uversky  et  al.,  2002）によって詳細に検討されている通り、ネイティブにアンフォールディングされたタンパク質を特徴付ける。
【０３５４】
ＦＶＩＩＩ分子種Ｂ７０−ｒＦＶＩＩＩを水素／重水素交換質量分析（ＨＤＸ−ＭＳ）に供した。この手法では、タンパク質をＤ２Ｏに曝露することにより、不規則な領域では迅速なアミドＨＤＸが誘導され、一方、密接にフォールディングされたエレメントは重水素の組み入れからはるかに大きく保護され、その結果、同位元素交換が遅くなるという事実を活用する（Konermann  et  al.,  2011）。総タンパク質配列の６３％およびＢ７０−ｒＦＶＩＩＩ  Ｂドメイン配列の３７％を包含するＢ７０−ｒＦＶＩＩＩ由来の１２０ペプチドのＨＤＸ−ＭＳカイネティクスを測定した（図５２）。Ｂドメインに属する配列から得た全てのペプチドで、重水素組み入れに関して非常に高速なカイネティクスが実証された。３秒間の最も短いインキュベート時間であっても、３日間の標識付け後に全てのペプチドでそれらの対応する完全に重水素化された試料と同じ量の重水素が組み入れられた。
【０３５５】
ＨＤＸ−ＭＳデータから、アミノ酸配列特性と共に、Ｂ７０−ｒＦＶＩＩＩのＢドメインは二次構造を欠くが、どちらかというと内因性に不規則かつ柔軟であると思われることが示される。上記のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ分析に基づいて、同様の溶媒曝露および柔軟性をＦＶＩＩＩ分子種に存在する総ＢドメインおよびいくつかのＢドメイン短縮について予測することができる。
【０３５６】
いかなるＢドメインも欠失したＨＣ配列のＨＤＸカイネティクス結果（図５２）は、Ａ１ドメイン内の不規則な表面ループならびにＡ１ドメインとＡ２ドメインの間の柔軟なリンカー領域によって破壊される順序づけられた構造要素を示す公開されたＦＶＩＩＩ結晶構造と良好に一致する（Shen  et  al.,  2008）。
【０３５７】
（実施例２１）
精製されたＦＶＩＩＩ亜種の機能的特徴付け−温度の上昇におけるＦＬ−ｒＦＶＩＩＩおよびｒＦＶＩＩＩ分子種の凝集挙動
ＦＬ−ｒＦＶＩＩＩ、Ｂ７０−ｒＦＶＩＩＩ、Ｂ２０−ｒＦＶＩＩＩおよびＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩの温度依存性凝集挙動を調査した。試料を温度の上昇（２５〜５０℃）に曝露し、ＤＬＳおよびＨＰＬＣ−ＳＥＣによって分析した（図４５）。強度で重み付けられたタンパク質凝集体の流体力学的直径の平均を記載するＺ平均はＦＬ−ｒＦＶＩＩＩおよびｒＦＶＩＩＩ種について２５から３５℃では変化しなかった。試験品目全てについて４０℃から始まってＺ平均の増加が観察されたが、ｒＦＶＩＩＩ試料間で明白な差異があった。他方では、２５〜５０℃で観察された凝集体平均サイズの増大倍率は、ＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩについては９．２、およびＢ２０−ｒＦＶＩＩＩについては６．４であり、Ｂ７０−ｒＦＶＩＩＩについては３．４、およびＦＬ−ｒＦＶＩＩＩについては２．５にしか達しなかった。４５℃および５０℃で２０時間インキュベートした後に検出されたＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩ凝集体は、それぞれ、ＦＬ−ｒＦＶＩＩＩ凝集体と比較してサイズが２．５倍および３．１倍であった。
【０３５８】
ＤＬＳによって検出された凝集挙動と同じ傾向がＨＰＬＣ−ＳＥＣによるｒＦＶＩＩＩ凝集体分析後に示された（図４５挿入図）。
【０３５９】
ＨＰＬＣ−ＳＥＣによってＦＬ−ｒＦＶＩＩＩ単量体から分離されたＦＬ−ｒＦＶＩＩＩ凝集体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析して、各ｒＦＶＩＩＩ分子種をネイティブなＦＬ−ｒＦＶＩＩＩと同様の比で含有することが示された（図５３）。
【０３６０】
要約すると、温度の上昇に曝露すると、Ｂドメイン含有量が減少するにしたがって平均凝集体サイズが増大した（凝集傾向の順序ＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩ＞Ｂ２０−ｒＦＶＩＩＩ＞Ｂ７０−ｒＦＶＩＩＩ＞ＦＬ−ｒＦＶＩＩＩ）。ＦＬ−ｒＦＶＩＩＩはｒＦＶＩＩＩ分子種の異成分からなる混合物であり、試験した全てのｒＦＶＩＩＩ試料の中で凝集体の形成の最低の傾向を示した。
【０３６１】
（実施例２２）
精製されたＦＶＩＩＩ亜種の機能的特徴付け−ＦＶＩＩＩ凝集経路は分子不均一性およびＢドメイン含有量に依存する
詳細な時間依存性凝集分析を、ＦＶＩＩＩ分子におけるコンフォメーションの変化の開始が報告された温度である４５℃で実施した（Grillo  et  al.,  2001、Ramani  et  al.,  2005a）。４５℃における凝集カイネティクス、その後のＨＰＬＣ−ＳＥＣにより、ｒＦＶＩＩＩ分子種とＦＬ−ｒＦＶＩＩＩの間で凝集体の経路およびオリゴマー形成に明白な差異が明らかになった（図４６）。使用するカラムの排除限界に基づいて、凝集体を、空隙容量で溶出する５０〜１００ｎｍのサイズ範囲の可溶性タンパク質凝集体と定義した。オリゴマー（保持時間：２１．２〜２７．０分）を、サイズ排除カラムによって遅延するがタンパク質単量体よりも前に溶出する１０〜５０ｎｍのサイズ範囲のタンパク質構造と定義した（保持時間：２７．０〜４３．０）。全てのＦＶＩＩＩ試料のオリゴマー形成が一相会合曲線に従ったが、分析された分子が含有するＢドメインが少ないほど、より急速にオリゴマーが形成された（図４６Ａ）。ＦＬ−ｒＦＶＩＩＩ、Ｂ７０−ｒＦＶＩＩＩ、Ｂ２０−ｒＦＶＩＩＩおよびＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩのオリゴマー形成の速度定数（ｋｏｌｉｇｏ）は、それぞれ０．１３±０．０２、０．１２±０．０５、０．３５±０．２４および０．７０±０．２４ｈ−１と算出された。凝集曲線はＳ字形状を示し、凝集体の形成率（ｋａｇｇ）は、重ねて、明白にＢドメイン含有量応じて変動する（図４６Ｂ）。Ｂドメインの不在下では、凝集体はより急速かつ過剰に形成された；ｋａｇｇ（ＦＬ−ｒＦＶＩＩＩ）＝０．１１±０．００ｈ−１、ｋａｇｇ（Ｂ７０−ｒＦＶＩＩＩ）＝０．１８±０．０２ｈ−１、ｋａｇｇ（Ｂ２０−ｒＦＶＩＩＩ）＝０．２１±０．０７ｈ−１、ｋａｇｇ（ＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩ）＝０．２１±０．０８ｈ−１。ＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩのオリゴマーの量は８時間後に最大２２％まで増加し、その後連続的に減少したが、ＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩの凝集体の数量は、２４時間インキュベートした後、１ｈの停滞期で４８％まで過剰に増加した（図４６Ｄ）。Ｂ２０−ｒＦＶＩＩＩオリゴマー含有量の最高値（３１％）が１７時間後に観察され、Ｂ２０−ｒＦＶＩＩＩ凝集体濃度（３１％）は２４時間後に同じであった。２２〜２４時間後に３３％のＢ７０−ｒＦＶＩＩＩおよび４４％のＦＬ−ｒＦＶＩＩＩオリゴマーがプラトーレベルで形成されたが、インキュベート時間の最後に、Ｂ７０−ｒＦＶＩＩＩおよびＦＬ−ｒＦＶＩＩＩについてそれぞれ１７％および１１％というほんの少しの凝集体含有量が観察された。ＦＬ−ｒＦＶＩＩＩおよびＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩの凝集経路は、それぞれ図４６ＣおよびＤに示されている通り、非常に好ましくなかった。ｐｄＦＶＩＩＩの凝集（図４６Ｅ）は、ＦＬ−ｒＦＶＩＩＩと非常に類似した経路に従い、速度定数ｋｏｌｉｇｏ（ｐｄＦＶＩＩＩ）＝０．２４±０．０４およびｋａｇｇ（ｐｄＦＶＩＩＩ）＝０．１５±０．０３ｈ−１であった。オリゴマーおよび凝集体の形成速度と一致して、ＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩの単量体の消失はＦＬ−ｒＦＶＩＩＩおよびｐｄＦＶＩＩＩと比較してより速かった（図４６Ｆ）。試験した試料それぞれのＦＶＩＩＩ活性は、単量体濃度の低下に応じて低下した（データは示していない）。
【０３６２】
要約すると、Ｂドメイン含有量が増加するにしたがってオリゴマー形成の傾向が増加するが、凝集体形成の傾向は、逆であり、不均一ＦＬ−ｒＦＶＩＩＩおよびｐｄＦＶＩＩＩのどちらでも、ｒＦＶＩＩＩのいずれの精製された単一成分からなる分子種に対しても、非常に類似しているがはるかに低い凝集体形成の傾向が示された。
【０３６３】
（実施例２３）
精製されたＦＶＩＩＩ亜種の機能的特徴付け−凝集体の構造的差異によって誘発される凝集経路の分岐
検出された凝集挙動の差異の原因を調査するために、４５℃で２４時間インキュベートした後のｒＦＶＩＩＩ分子種、ＦＬ−ｒＦＶＩＩＩおよびｐｄＦＶＩＩＩのオリゴマーおよび凝集体に結合した際のＴｈＴ蛍光をＨＰＬＣ−ＳＥＣによって分析した。ＴｈＴは、一般に使用される蛍光色素であり、クロスβシートリッチ構造に結合すると、蛍光の増強を示す（Biancalana  et  al.,  2010）。ＴｈＴの凝集したＦＶＩＩＩタンパク質構造への結合能力を、ＴｈＴ蛍光と内因性タンパク質蛍光の比として表した（図４７）。ＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩのオリゴマーへのＴｈＴ結合の増加が、Ｂドメインを含有する種（Ｂ２０−ｒＦＶＩＩＩおよびＢ７０ｒＦＶＩＩＩ）のＢドメインのオリゴマーと、ならびにＦＬ−ｒＦＶＩＩＩおよびｐｄＦＶＩＩＩと比較して観察された。ＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩの凝集体では、ＦＬ−ｒＦＶＩＩＩおよびｐｄＦＶＩＩＩと比較してＴｈＴ結合能力の３倍を超える増強が示された。さらに、Ｂ２０−ｒＦＶＩＩＩ凝集体のＴｈＴ蛍光は、Ｂ７０−ｒＦＶＩＩＩ凝集体について観察されたものよりも大きかった。ＦＬ−ｒＦＶＩＩＩおよびｐｄＦＶＩＩＩのオリゴマーおよび凝集体へのＴｈＴ結合の際に測定された蛍光は非常に類似していた（図４７）。ＴｈＴ蛍光と２８０ｎｍにおけるタンパク質吸収シグナルの比により、試験したＦＶＩＩＩ試料間で、ＴｈＴ／内因性タンパク質蛍光比と比較して同じＴｈＴ結合の差異が示された。いずれの分析したＦＶＩＩＩ試料でも単量体へのＴｈＴ結合は検出されなかった。
【０３６４】
（実施例２４）
精製されたＦＶＩＩＩ亜種の機能的特徴付け−ＦＶＩＩＩ凝集の均一シーディング
凝集体を含有するクロスβシートは、ストレス条件に際してさらなるタンパク質凝集の核となるシードとして機能することが公知である（Gsponer  et  al.,  2006、Jarrett  et  al,  1993）。凝集したＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩ、Ｂ７０−ｒＦＶＩＩＩおよびＦＬ−ｒＦＶＩＩＩ（４５℃で２、５、８または１８時間）のそれぞれの試料の凝集プロセスにシーディングする能力を探求した。図４８は、５０％の予め形成されたシードを含有するＦＶＩＩＩ試料の、シーディングされていないＦＶＩＩＩ試料と比較した時間依存性オリゴマーおよび凝集体の形成を示す。Ｂ７０−ｒＦＶＩＩＩおよび不均一ＦＬ−ｒＦＶＩＩＩの均一シーディング（それぞれ図４８ＢおよびＣ）では、オリゴマー形成および凝集挙動は変更されなかった。Ｂドメインを欠くｒＦＶＩＩＩ分子種は異なる機構を示す。ＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩの最初の迅速なオリゴマー形成後、均一なシードの添加と共に曲線は平らになり、最終的に、１０％のオリゴマー飽和濃度に達した。ＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩ凝集体の形成の停滞期は添加されるシードの型に応じて短縮した。４５℃で８または１８時間にわたってインキュベートすることによって生成したシードの添加後、ＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩ凝集曲線の停滞期は完全に消失した（図４８Ａ）。停滞期の短縮は、生物学的治療薬（ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）であるインスリンを含めたいくつかのタンパク質に関して以前に記載されている核生成依存性重合の典型的な特性である（Arosio  et  al.,  2015、Surmacz-Chwedoruk  et  al.,  2014）。
【０３６５】
ＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩのクロスβシートリッチ凝集体は、さらなるタンパク質凝集の均一シーディングにおいて有効であった。現象は、どちらもクロスβシート陽性凝集体を形成しないＢ７０−ｒＦＶＩＩＩでもＦＬ−ｒＦＶＩＩＩでも観察されなかった。興味深いことに、ＦＬ−ｒＦＶＩＩＩは、ＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩのごく一部も含有するその天然の不均一性が原因になるにもかかわらず、単一成分ｒＦＶＩＩＩ分子種と比較した場合に凝集およびシーディングしやすさが最小である。
【０３６６】
（実施例２５）
精製されたＦＶＩＩＩ亜種の機能的特徴付け−撹拌およびずり応力下での肉眼では見えないＦＶＩＩＩ粒子の形成
臨床的に関連するストレス条件をＦＬ−ｒＦＶＩＩＩ、ｐｄＦＶＩＩＩおよびｒＦＶＩＩＩ分子種に対して撹拌およびずり応力を適用することによってシミュレートした。０．７５〜７０μｍのサイズの誘導された肉眼では見えないタンパク質含有粒子は、ＨＰＬＣ−ＳＥＣの分析範囲を超え、フローサイトメトリーに基づく方法によって検出された（Lubich  et  al.,  2015、Nishi  et  al.,  2014）。撹拌およびずり応力への曝露後の、肉眼では見えないタンパク質含有粒子の検出濃度はＦＬ−ｒＦＶＩＩＩおよびｐｄＦＶＩＩＩにおいて同様のレベルに達し、２．４〜４．２×１０６計数／ｍｌの範囲であった（それぞれ平均値３．１×１０６計数／ｍｌおよび３．２×１０６計数／ｍｌ）。ＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩにおいて有意に高い濃度が検出された（平均値６．０×１０６計数／ｍｌ；４．９〜６．９×１０６計数／ｍｌの範囲）。Ｂドメイン短縮型分子種の肉眼では見えないタンパク質含有粒子濃度は、それぞれの種のＢドメイン含有量に依存し、Ｂ２０−ｒＦＶＩＩＩ（平均値５．５×１０６計数／ｍｌ）ではＢ７０−ｒＦＶＩＩＩ（平均値３．９×１０６計数／ｍｌ）よりも高かった（図４９）。ストレスを与えていない試料は、０．４〜４．６×１０４計数／ｍｌの範囲の肉眼では見えないタンパク質粒子濃度を示した。
【０３６７】
（実施例２６）
精製されたＦＶＩＩＩ亜種の機能的特徴付け−結果の考察
前の実施例において、ＣＨＯ細胞において発現させたヒトＦＬ−ｒＦＶＩＩＩの不均一性、安定性および凝集挙動を調査し、高度に精製されたヒトｐｄＦＶＩＩＩ、可変量のＢドメインを含有する精製されたｒＦＶＩＩＩ分子種と比較した。Ｂドメインの構造特性を探究し、ＦＶＩＩＩ分子の安定化におけるそれらの潜在的な役割に取り組む。
【０３６８】
データから、ＣＨＯ細胞株において産生されたＦＬ−ｒＦＶＩＩＩがｐｄＦＶＩＩＩと同様の天然の不均一性を示し、同様にｐｄＦＶＩＩＩに存在する全ての分子Ｂドメイン種を有することが示される。完全には理解されていないが、ＦＬ−ｒＦＶＩＩＩ分泌の間のＢドメインのプロセシングは、これらの実験において示される歴史的にＣＨＯ細胞株により産生されたＦＬ−ｒＦＶＩＩＩのロットの同一の異成分からなるタンパク質プロファイルによって示される通り一貫しており、ｐｄＦＶＩＩＩと同一である。興味深いことに、ベビーハムスター腎臓細胞株において産生されたＦＬ−ｒＦＶＩＩＩは、ＣＨＯ細胞株由来ＦＬ−ｒＦＶＩＩＩおよびｐｄＦＶＩＩＩとはわずかに異なるタンパク質プロファイルを示す（Jankowski  et  al.,  2007）。一般に、ＦＶＩＩＩの不均一性は、ＨＣ／Ｂドメイン短縮の正確な長さに軽微な差異があるにしても、種に依存しない特性である。これは、これらの実験および以前の研究においてヒトｐｄＦＶＩＩＩおよびＦＬ−ｒＦＶＩＩＩについて観察され（Jankowski  et  al.,  2007）、ブタｐｄＦＶＩＩＩについても観察された（Lollar  et  al.,  1988）。対照的に、これらの実験において分析されたＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩならびに販売されているＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩ製品は、単一成分からなる、ほぼ人工的に出現するタンパク質パターンを示し、したがって、異成分からなるｐｄＦＶＩＩＩと比較した場合に高い差異を示す（D'Amici  et  al.,  2010；  Thim  et  al.,  2010；  Peters  et  al.,  2013）。
【０３６９】
不均一性の役割およびＦＶＩＩＩ凝集に対するＢドメインの影響を探求した。ＦＬ−ｒＦＶＩＩＩは、４５℃で開始される三次構造の軽微な構造的変更に起因して凝集しやすいこと（Grillo  et  al.,  2001）、およびＣ２ドメイン内の脂質結合性領域のコンフォメーションの変化の結果として凝集し始めること（Ramani  et  al.,  2005a）が以前示された。本発明では、温度上昇時に、不均一ＦＬ−ｒＦＶＩＩＩは最低の凝集傾向を示すが、単一成分からなるＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩは広範囲にわたって凝集し、また、はるかに大きな凝集体を形成することが示された。ｒＦＶＩＩＩ分子種のＢドメイン含有量が減少するにしたがって凝集が上昇する傾向が観察された。熱ストレス（４５℃）下でのオリゴマーおよび凝集体の形成の詳細な時間依存性分析により、異なるＦＶＩＩＩ試料の多岐にわたる経路が明らかになった。熱ストレスを受けたＦＬ−ｒＦＶＩＩＩおよびｐｄＦＶＩＩＩのオリゴマー形成が遅いことにより、凝集がほぼ阻害された。ＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩに関しては、はるかに速いオリゴマー形成および同じく速い凝集が観察された。ｒＦＶＩＩＩの分子種は、残っているＢドメインの量に依存してオリゴマー形成または凝集しやすかった。熱により誘導されたＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩオリゴマーおよび凝集体ではＴｈＴ陽性クロスβシートリッチ構造が検出されたが、Ｂドメインを含有するＦＶＩＩＩでは低い程度で存在したかまたはさらには存在しなかった。ＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩオリゴマーにおけるクロスβシートにより、迅速かつ広範囲にわたる凝集が誘発され、ＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩとＦＬ−ｒＦＶＩＩＩの間の多岐にわたる凝集挙動が説明される可能性が最も高い。さらに、他のいずれの分析されたＦＶＩＩＩ試料でも観察されなかったＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩ凝集の効率的な均一シーディングは、ほぼ確実に、この構造的差異に起因して生じた。
【０３７０】
本発明において熱により誘導される凝集から観察された結果に基づいて、ＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩおよびＦＬ−ｒＦＶＩＩＩオリゴマーおよび凝集体の形成の多岐にわたる経路を説明する図式モデルを構築した（図５０）。ＦＬ−ｒＦＶＩＩＩに関する最初の出発材料は全てのｒＦＶＩＩＩ種の異成分からなる混合物を表すが、ＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩは、１つの単一の種のみで存在する。モデルにおける矢印の長さは、オリゴマーおよび凝集体の形成の速度を示し、どちらも、ＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩではＦＬ−ｒＦＶＩＩＩと比較してはるかに速い。ＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩは、順序づけられた大きなクロスβシートリッチ凝集体を形成し、ＦＬ−ｒＦＶＩＩＩ凝集体は反復性を欠き、種々の種で構成され、また、サイズがより小さい。順序づけられたクロスβ含有構造への可溶性タンパク質のアセンブリは、アルツハイマー病、パーキンソン病または海綿状脳症などの多くのヒト神経変性疾患の必須事象である（Chiti  et  al.,  2006）。いったん臨床症状が検出されたそのような障害の迅速な発症は、それぞれの蓄積されたタンパク質凝集体のシーディング能力に関連付けられている（Jarrett  et  al.,  1993）。
【０３７１】
本発明では、Ｂドメインが溶媒曝露、不規則かつ柔軟であり、さらに、低疎水性を示すことが解明された。これらの知見から、ＦＶＩＩＩについて、α−シヌクレインなどの有意な不規則なセグメントを有する他のタンパク質において観察されたものと同様のＢドメインの凝集保護機能を提唱することができる。α−シヌクレインのネイティブにアンフォールディングされた高度に荷電したＣ末端領域がタンパク質の凝集の安定化および防止に必須であることが示された。α−シヌクレインのＣ末端短縮型断片は、全長タンパク質よりも速く凝集した。短縮型断片の凝集は、Ｃ末端領域の長さに明白に依存し、不規則な領域の含有量が多くなるほど少なくなった（Murray  et  al.,  2003；  Serpell  et  al.,  2000；  Hoyer  et  al.,  2004）。
【０３７２】
興味深いことに、本発明において試験したＦＶＩＩＩ試料全てのうち、Ｂドメイン含有ｒＦＶＩＩＩ種、短縮型ｒＦＶＩＩＩ種およびＢドメイン欠失ｒＦＶＩＩＩ種の混合物からなる異成分からなるＦＬ−ｒＦＶＩＩＩについて最低の凝集の傾向が観察された。不均一性により、個々のｒＦＶＩＩＩ種間の配列類似性の低下が引き起こされる。実際、以前の研究において、そのようなタンパク質の配列多様性が凝集しやすさおよびシーディングプロセスの低下に必須であることがすでに実証されている。多ドメインタンパク質タイチンの凝集挙動に関するWrightおよび共同研究者の発見により、異なるドメイン間の共凝集の効率は配列同一性が低下するにしたがって著しく低下することが示され、さらに、彼らは、タンパク質間の低い配列同一性を維持することが、生体系の込み入った環境において凝集を強力に阻害する重要な進化特性であると主張した（Wright  et  al.,  2005）。同様に、リゾチームのシーディング原線維形成の効率は、それらの配列の類似性に強力に依存し、配列同一性が低いほどシーディング効率が低いことが示された（Krebs  et  al.,  2004）。これらの知見は、異成分からなるＦＬ−ｒＦＶＩＩＩの単一成分からなるｒＦＶＩＩＩ種と比較して低い凝集傾向およびシーディング効率を明白に示す本発明の結果とよく相関する。
【０３７３】
ＦＶＩＩＩ凝集に対する撹拌およびずり応力の影響も本発明において探究した。これらの臨床的に関連するストレス条件は、患者によるＦＶＩＩＩ治療用製品の潜在的な取り扱いミスを模倣するものであり、タンパク質と、多くの場合にシリンジの内部表面に存在するケイ素油の相互作用を促進して、滑らかなプランジャーの動きを可能にし得る（Lubich  et  al.,  2015、Thirumangalathu  et  al.,  2009、Gerhardt  et  al.,  2014）。これにより、一般には０．１〜５０μｍのサイズ範囲である肉眼では見えないタンパク質含有粒子の形成が導かれる（den  Engelsman  et  al.,  2011）。本発明では、撹拌およびずり応力での肉眼では見えないタンパク質含有粒子の形成は、熱により誘導される凝集に関して観察されたものと同様であり、Ｂドメイン含有量に明白に依存した。ＦＬ−ｒＦＶＩＩＩおよびｐｄＦＶＩＩＩにおける粒子濃度は同様のレベルに達したが、ＢＤＤ−ｒＦＶＩＩＩでは有意に多い粒子が検出された。
【０３７４】
本発明は、ＦＶＩＩＩ凝集が、（ｉ）クロスβシートリッチかつシーディングしやすい凝集体の形成を防止することによるＦＶＩＩＩ分子に対する安定化効果を有するＢドメインの含有量、および（ｉｉ）新たな配列多様性に起因する凝集を抑制する不均一性などの２つの主要なパラメータに依存し、今度はそれらのパラメータが互いに影響を及ぼす可能性があることを実証する。脱グリコシル化ＦＬ−ｒＦＶＩＩＩの凝集抵抗性の低下によって示された通り、グリコシル化がＦＬ−ｒＦＶＩＩＩの安定性に有意に影響を及ぼすことが以前公開された（Kosloski  et  al.,  2009）。Ｎ−グリコシル化部位の約８０％がＢドメイン内に分布していることを考慮すると（Fay  et  al.,  2006）、このドメインの欠失により、タンパク質がより凝集しやすくなる可能性が高いと思われる。製造および製剤化が一般にＦＶＩＩＩおよびタンパク質治療薬の凝集に影響を及ぼす別の重大な因子である（Eon-Duval  et  al,  2012）。医療専門家は、これらの品質の差異および結果生じる患者に対する潜在的な安全性の懸念についてよく分かっているはずである。
【０３７５】
タンパク質凝集体は、タンパク質薬物の安定性および貯蔵寿命に影響を及ぼすだけでなく、それらの免疫原性の増強もなす（Eon-Duval  et  al,  2012）。タンパク質凝集体の反復性は、免疫細胞上のパターン認識受容体または架橋結合抗原受容体によって認識することができる。形成された抗薬物抗体は、タンパク質に対する中和効果を有し、それが今度はその効力または薬物動態学、および、特に内在性タンパク質に関連する治療薬の場合には、患者安全性のリスクに影響を及ぼす（Moussa  et  al.,  2016）。ＦＶＩＩＩで処置された血友病Ａ患者のおよそ５分の１で阻害性抗体が形成される（Gouw  et  al.,  2013；  Hay  et  al.,  1998）。血友病Ａマウスモデルにおける阻害性抗体の誘導におけるＦＶＩＩＩ凝集体の影響が以前調査された。タンパク質凝集体により、ｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおけるＦＶＩＩＩ免疫原性が凝集体の性質およびそれらがどのように形成されたかに応じて違うようにモジュレートされることが示された（Ramani  et  al.,  2005b；  Pisal  et  al.,  2012）。しかし、現在まで、ＦＶＩＩＩ製品におけるタンパク質凝集体によりヒトにおける生物学的治療薬の免疫原性がどのようにモジュレートされるか、ならびにこの研究において特徴付けられたＦＶＩＩＩのオリゴマーおよび凝集体がどのような免疫原性を有し得るかについてのデータは存在しない。
【０３７６】
要約すると、本発明は、ＦＬ−ｒＦＶＩＩＩおよびｐｄＦＶＩＩＩの同様のタンパク質不均一性を実証し、物理的ストレスに曝露した際のタンパク質凝集しやすさを低減することによる不均一性の有益な効果を示唆する。さらに、タンパク質凝集経路をモジュレートし、ＦＶＩＩＩを過剰な凝集から保護することによってＦＶＩＩＩ分子の安定性を確実にすることにおけるＢドメインの新しい役割を同定した。
【０３７７】
上記の発見を、今後の新規ＦＶＩＩＩ治療薬の設計に、それらの安定性、貯蔵寿命、および、最も重要な安全性を改善するために使用することができる。
【０３７８】
（実施例２７）
ＦＶＩＩＩ種のタンパク質濃度の決定
ＦＶＩＩＩ種のタンパク質濃度をどのように決定することができるかの例を以下に示す。
【０３７９】
２８０ｎｍにおけるＦＶＩＩＩ吸収係数の算出：
アミノ酸配列に基づき、全てのシステインがジスルフィド結合していると仮定して、２８０ｎｍにおける吸収係数を算出した。チロシン硫酸化は算出に含めなかった。
【０３８０】
吸収係数は、示されているタンパク質の１ｍｇ／ｍｌ溶液の理論的な吸収である。
【０３８１】
ＳＯＳ−Ｅの吸収係数を、Ｃ４クロマトグラフィー分析データから分かっているＡｄｖａｔｅに存在する種の比に基づいて算出した。ｐｄＦＶＩＩＩ、およびＦＶＩＩＩ亜種の混合物の吸収係数をＳＯＳ−Ｅに関しては同じであると仮定した。
【０３８２】
【表２８】
2020524688.tif 000035
【０３８３】
ＦＶＩＩＩタンパク質濃度の決定：
２８０ｎｍにおけるＦＶＩＩＩ試料の吸収を分光光度により決定した。濃度を
濃度（ｍｇ／ｍｌ）＝測定された吸収／２８０ｎｍにおける吸収係数
に従って算出した。
【０３８４】
（実施例２８）
精製された組換えＦＶＩＩＩ種およびそれらの混合物の活性
精製された組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）種およびそれらの混合物の活性を測定し、ＦＬ−ｒＦＶＩＩＩ（ＳＯＳ−Ｅ）および血漿由来（ｐｄ）ＦＶＩＩＩの活性と比較した。
【０３８５】
ＦＶＩＩＩ試料の活性を、
・発色活性アッセイ
・一段凝固アッセイ
・較正された自動トロンボグラフィーによる組織因子誘発性トロンビン生成アッセイ
によって測定した。
【０３８６】
ＦＶＩＩＩ試料：
・精製されたｒＦＶＩＩＩ種（９０ｋＤａ、１１０ｋＤａ、１５０ｋＤａ、１８０ｋＤａ）
・混合物：９０ｋＤａ種、１１０ｋＤａ種、１５０ｋＤａ種および１８０ｋＤａ種のＡｄｖａｔｅ（Ｃ４クロマトグラフィー分析データに基づく）に存在するモル比での混合物
・ＳＯＳ−Ｅ：ＦＬ−ｒＦＶＩＩＩ、種精製の出発材料
・ｐｄＦＶＩＩＩ
【０３８７】
全ての試料を、塩ならびに界面活性物質を含めたバッファー成分を含有する定義されたｐＨのバッファー中に０．２４４μＭまで希釈した。ＦＶＩＩＩ種のサイズおよび分子量の差異に起因して、容量モル濃度０．２４４μＭにおける種の濃度（μｇ／ｍｌ）は以下の通りであった：
ＦＶＩＩＩ試料  濃度（μｇ／ｍｌ）
９０ｋＤａ      ４０
１１０ｋＤａ    ４２
１５０ｋＤａ    ４６
１８０ｋＤａ    ５５
混合物          ５２
ＳＯＳ−Ｅ      ５２
ｐｄＦＶＩＩＩ  ５２
【０３８８】
方法の説明：
一段凝固アッセイ
一段凝固アッセイによるＦＶＩＩＩ活性を、市販のａＰＴＴ試薬、アクチンＦＳＬ（Ｓｉｅｍｅｎｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて自動凝固分析機器（ＢＣＳ  ＸＰ、Ｓｉｅｍｅｎｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で実施した。未知量の機能的ＦＶＩＩＩを含有する試料をヒトＦＶＩＩＩ欠乏血漿および活性化因子と混合する。＋３７℃でインキュベートした後、塩化カルシウムを添加することによって凝固を開始させ、血餅形成までの時間を記録する。凝固時間は、試料中のＦＶＩＩＩ濃度に間接的に比例する。結果をＩＵ  ＦＶＩＩＩ／ｍＬ、参照曲線からの読み取りで示す。標準品はＷＨＯ国際標準に帰することができる全長ｒＦＶＩＩＩであった。
【０３８９】
発色活性アッセイ
ＦＶＩＩＩ活性アッセイを、市販の試薬（Ｓｉｅｍｅｎｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用い、自動凝固分析機器（ＢＣＳ  ＸＰ、Ｓｉｅｍｅｎｓ）で実施した。発色アッセイの第１のステップでは、未知量の機能的ＦＶＩＩＩを含有する試料を、トロンビン、活性化されたＦＩＸ（ＦＩＸａ）、リン脂質、ＦＸおよびカルシウムを含有するバッファーからなる反応混合物に添加する。ＦＶＩＩＩがトロンビンによって活性化される。活性化されたＦＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩａ）はリン脂質、ＦＩＸａおよびカルシウムと複合体を形成し、その結果、第Ｘ因子（ＦＸａ）が活性化される。発色アッセイの第２のステップでは、ＦＸａをＦＸａに特異的なペプチドニトロアニリド基質の切断を通じて測定する。Ｐ−ニトロアニリンが生成し、それにより、４０５ｎｍにおける吸光度によって光度測定で測定することができる色がもたらされる。生じる色は、試料中に存在する機能的ＦＶＩＩＩの量に正比例する。標準品はＷＨＯ国際標準に対して較正された全長ＦＶＩＩＩであった。
【０３９０】
組織因子誘発性トロンビン生成アッセイ
トロンビン生成アッセイ（ＴＧＡ）の一種である較正された自動トロンボグラフィー（ＣＡＴ）は、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける有効性パラメータとして、および研究ツールとして臨床研究における使用が増加している包括的止血アッセイである。トロンボグラムは、凝固血漿中のトロンビンの濃度を記載するものであり、したがって、生理的条件に近いところでの止血系の機能試験である。当該アッセイは、組織因子による凝固の開始時から経時的な、トロンビンによる蛍光発生基質Ｚ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−ＡＭＣの切断によって生じる蛍光の測定に基づく。当該アッセイは、９６ウェルプレート蛍光光度計であるＴｈｒｏｍｂｏｇｒａｐｈ（商標）で実施され、また、内部フィルター効果、血漿の色のドナー間の変動性、基質枯渇および機器による差異を補正するために必要なトロンビン較正物質を使用する。
【０３９１】
以下のＣＡＴパラメータにより血漿試料の止血の状態を特徴付ける：
・遅延時間［分］：凝固時間、トロンビン生成の開始を表す
・ピークまでの時間［分］：最大量のトロンビンが生成するまでの時間
・トロンビンピーク［ｎＭ］：形成される最大トロンビン濃度
・内在性トロンビン潜在性（ＥＴＰ）［ｎＭ  分］：生成されるトロンビンの総量を表すトロンビン生成曲線下面積。
【０３９２】
血友病Ａ患者血漿中の異なるｒＦＶＩＩＩ種およびそれらの混合物のトロンビン生成を、較正された自動トロンボグラフィー（ＣＡＴ）によって測定した。ｒＦＶＩＩＩ種および混合物の試料希釈物をサンプルバッファー（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１７５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４、５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ）中に調製した。試料を希釈して、アッセイにおける血漿中濃度を０．０６２５〜１ｎＭのｒＦＶＩＩＩにした。９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ  ２ＨＢ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ  ＵＳＡ）中、以下の成分を組み合わせた：ｒＦＶＩＩＩ試料希釈物１０μＬ、組織因子（ＴＦ）とリン脂質（ＰＬ）の混合物、最終濃度１ｐＭのＴＦおよび４μＭのＰＬ（ＰＰＰ−Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｌｏｗ  Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ、Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）１０μＬ、ならびに血友病Ａ患者由来の乏血小板血漿（ＰＰＰ）プール８０μＬ（ＦＶＩＩＩ＜１％Ｇｅｏｒｇｅ  Ｋｉｎｇ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）。血漿の事前活性化を回避するために、ＰＰＰをトウモロコシトリプシン阻害物質（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ）を６２μｇ／ｍＬで用いて前処理した。蛍光発生基質Ｚ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−ＡＭＣおよび塩化カルシウム（ＦｌｕＣａ  Ｋｉｔ、Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ）２０μＬを添加することによって反応を開始した。Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して蛍光を検出した。トロンビン生成を、Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ）を使用して算出した。Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ  ｓｏｆｔｗａｒｅによる分析の結果、ｘ軸が時間（分）であり、ｙ軸がトロンビン（ｎＭ）であるトロンビン生成曲線がもたらされる。このソフトウェアにより、以下のパラメータを決定する：遅延時間（分；最初のトロンビン生成が起こるまでの時間）；内在性トロンビン潜在性（ＥＴＰ；ｎＭ；トロンビン生成曲線下面積−アッセイの経過にわたって生成したトロンビンの総量を反映する）；ピークトロンビン（ｎＭ；アッセイのいずれか１つの時点で生成される最高量のトロンビン）、ピークまでの時間（分；アッセイのいずれか１つの時点で最高量のトロンビンが生成されるまでの時間）。異なるｒＦＶＩＩＩ試料の異なる濃度でのトロンビン生成活性を比較するために、トロンビンピークを主要なパラメータとして選択した。
【０３９３】
結果：
濃度０．２４４ｍＭにおけるＦＶＩＩＩ試料の一段凝固活性を図５４Ａに示し、比較している。濃度０．２４４ｍＭにおけるＦＶＩＩＩ試料の発色活性を図５４Ｂに示し、比較している。ＦＶＩＩＩ試料の濃度０．２５ｍＭ、０．５ｍＭおよび１ｍＭでのトロンビンピークおよび遅延時間を図５５に示し、比較している。これらの結果から、精製されたｒＦＶＩＩＩ種およびそれらの混合物の全てで発色性および一段凝固ＦＶＩＩＩ活性アッセイにおいてＳＯＳ−Ｅと比較して活性の増大が示されたことが示される。ｐｄＦＶＩＩＩは発色活性アッセイではＳＯＳ−Ｅと同様の活性が示したが、一段凝固アッセイでは活性の増大を示した。精製されたｒＦＶＩＩＩ種、それらの混合物およびｐｄＦＶＩＩＩの全てで、ＴＦ誘発性トロンビン生成アッセイにおいてＳＯＳ−Ｅと比較してトロンビンピークの増大が示された。試験した試料の全てでＳＯＳ−Ｅと比較して遅延時間の短縮が示された。
【０３９４】
（実施例２９）
ＡＤＶＡＴＥ  ＢＤＳおよび中間体のフューリン成熟化
驚いたことに、図５６は、単鎖ＦＶＩＩＩが種々の市販のＦＶＩＩＩ製品中に存在することを示す。したがって、フューリン成熟化によりＦＬ−ｒＦＶＩＩＩの活性の増大が導かれるかどうかを試験した。試料およびそれらの調製を以下に記載する：
【０３９５】
試料：
ＳＯＳ−Ｅ：最終精製ステップを伴わないＡｄｖａｔｅプロセス中間体
ＡＤＶＡＴＥ  ＢＤＳ
バッファー：陰性対照
【０３９６】
試料調製：
Ａ：ネイティブな試料
Ｂ：ネイティブな試料＋フューリンストック１００μｌ＋Ｍｉｌｌｉ−Ｑ  ２２．４μｌ
Ｃ：ネイティブな試料＋フューリンバッファー１００μｌ＋Ｍｉｌｌｉ−Ｑ  ２２．４μｌ
Ｄ：ネイティブな試料＋フューリンストック１００μｌ＋阻害剤ストック２２．４μｌ
Ｅ：ネイティブな試料＋フューリンバッファー１００μｌ＋阻害剤ストック２２．４μｌ
【０３９７】
Ｂ〜Ｅの総体積は等しく、したがって、直接比較が可能である。ｒＦｕｒｉｎ  ＢＤＳを使用した。フューリンバッファーはフューリンを伴わないフューリンストックのみと等しいものであった。阻害剤ストック：１００ｍＭのベンズアミジン塩酸塩。
【０３９８】
以下の表は、上記の試料を使用して実施した発色活性アッセイの結果を示す。
【０３９９】
【表２９】
2020524688.tif 000036
【０４００】
図５７は、上記の通り調製した試料の銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。図５８は、上記の通り調製した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのウエスタンブロット分析を示す。
【０４０１】
上記の結果から、全長ＦＶＩＩＩならびに伸長型軽鎖を、フューリンを２００〜３００ＩＵ／ｍｌの活性で添加することによってさらに成熟させることができることが示される。それにより、発色活性が約１７〜１９％増大する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより全長ＦＶＩＩＩならびに伸長型軽鎖についての成熟化が明白に示される。
【産業上の利用可能性】
【０４０２】
本発明の方法は、例えば、工業製造プロセスに有用である。本発明の生成物は、例えば、医薬の製造に有用である。したがって、本発明は産業的に利用可能である。
【０４０３】
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（項目１）
第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）亜種を、ＦＶＩＩＩを含む組成物から精製するための方法であって、
（１）前記ＦＶＩＩＩを含む組成物をアニオン交換クロマトグラフィーに供し、前記ＦＶＩＩＩ亜種を含む溶出液を収集するステップと、
（２）前記ＦＶＩＩＩ亜種を含むステップ（１）の溶出液をサイズ排除クロマトグラフィーに供し、前記ＦＶＩＩＩ亜種を含む溶出液を収集するステップと、
（３）前記ＦＶＩＩＩ亜種を含むステップ（２）の溶出液を濃縮するステップと
を含む方法。
（項目２）
前記濃縮ステップ（３）が、前記ＦＶＩＩＩ亜種を含むステップ（２）の溶出液をアニオン交換クロマトグラフィーに供し、前記ＦＶＩＩＩ亜種を含む溶出液を収集するステップである、項目１に記載の方法。
（項目３）
ＦＶＩＩＩが組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）であり、ＦＶＩＩＩ亜種が組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）亜種である、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記ＦＶＩＩＩ亜種が、ＦＶＩＩＩ軽鎖と会合したＦＶＩＩＩ重鎖である、項目１から３までのいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
ステップ（１）において、ビーズサイズが２０μｍ未満の高分解能Ｑ−樹脂をアニオン交換クロマトグラフィーに使用する、項目１から４までのいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
ステップ（２）において、分解能が１００００Ｄａ〜６００００Ｄａにわたるサイズ排除クロマトグラフィー樹脂をサイズ排除クロマトグラフィーに使用する、項目１から５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
ステップ（１）の前に、以下のステップ（０）：
（０）前記組成物中に含まれるＦＶＩＩＩをフューリンプロテアーゼ処理に供するステップ
をさらに含む、項目１から６までのいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
ステップ（１）の溶出をリニアグラジエント溶出によって実施し、前記リニアグラジエント溶出のグラジエントの長さが、少なくとも約１６カラム体積、少なくとも約２４カラム体積、または少なくとも約３２カラム体積である、項目１から７までのいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
ステップ（２）を、
（２）前記ＦＶＩＩＩ亜種を含むステップ（１）の溶出液を疎水性相互作用クロマトグラフィーに供するステップであって、前記疎水性相互作用クロマトグラフィーがネガティブモードクロマトグラフィーである、ステップ
で置き換える、項目１から８までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記ＦＶＩＩＩ亜種が、ＦＶＩＩＩ軽鎖と会合したＦＶＩＩＩ  ９０ｋＤａ重鎖であり、方法のステップ（２）を省略し、ステップ（３）において、前記ＦＶＩＩＩ亜種を含むステップ（１）の溶出液で前記ＦＶＩＩＩ亜種を含むステップ（２）の溶出液を置き換える、項目１から９までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
項目１から１０までのいずれか一項に従って入手可能な精製されたＦＶＩＩＩ亜種を含む組成物。
（項目１２）
血友病Ａなどの出血性障害の処置に使用するための、項目１１に記載の組成物。
（項目１３）
組換え第ＶＩＩＩ因子（ｒＦＶＩＩＩ）をフューリンプロテアーゼ処理に供する方法。
（項目１４）
ｒＦＶＩＩＩの活性を増大させるためのものである、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
血友病Ａなどの出血性障害の処置に使用するための、ｒＦＶＩＩＩを含む組成物であって、前記ｒＦＶＩＩＩが、項目１３または１４に従って入手可能である、組成物。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４４】
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【図５１】
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【図５２−１】
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【図５２−３】
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【図５２−４】
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【図５２−７】
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【図５２−１０】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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