(57)【要約】  本発明はｃＧＡＳ−ＳＴＩＮＧシグナル伝達経路阻害剤としてのキク科環状ペプチド化合物又はその薬理学的に許容される塩の応用、及びｃＧＡＳ−ＳＴＩＮＧシグナル伝達経路の異常な活性化を伴う疾患の治療薬の調製におけるｃＧＡＳ−ＳＴＩＮＧシグナル伝達経路阻害剤としてのキク科環状ペプチド化合物又はその薬理学的に許容される塩の応用を開示する。本発明に記載のキク科環状ペプチド化合物は天然化合物であるため、その剤形と投与方式は多様化しており、幅広い臨床応用の見通しがある。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｃＧＡＳ−ＳＴＩＮＧシグナル伝達経路阻害剤としてのキク科環状ペプチド化合物又はその薬理学的に許容される塩の応用。
【請求項２】
ｃＧＡＳ−ＳＴＩＮＧシグナル伝達経路の異常な活性化を伴う疾患の治療薬の調製におけるｃＧＡＳ−ＳＴＩＮＧシグナル伝達経路阻害剤としてのキク科環状ペプチド化合物又はその薬理学的に許容される塩の応用。
【請求項３】
前記キク科環状ペプチド化合物は、骨格がβ−フェニルアラニンを含有し、通常のアミノ酸ペプチド結合によって直接接続されて形成された単環式ペンタペプチド化合物であり、１つのＬ−β−フェニルアラニン、１つのＬ−セリン誘導体、１つのＬ−プロリン誘導体及び２つのほかのアミノ酸誘導体を含有することを特徴とする請求項１又は２に記載の応用。
【請求項４】
前記キク科環状ペプチド化合物は下記の構造式で示されるキク科環状ペプチドＡｓｔｉｎｓ  Ａ−Ｈ（１−８）とＡｓｔｉｎｓ  Ｋ−Ｐ（９−１４）であることを特徴とする請求項３に記載の応用。
【化１】
2020531482.tif 000004
【請求項５】
前記キク科環状ペプチドはＡｓｔｉｎ  Ｃであることを特徴とする請求項４に記載の応用。
【請求項６】
前記キク科環状ペプチドはシオン属の植物シオンの根及び根茎から抽出されることを特徴とする請求項１又は２に記載の応用。
【請求項７】
前記キク科環状ペプチド化合物又はその薬理学的に許容される塩は、ＤＮＡ類似物ＩＳＤの刺激におけるｃＧＡＳ−ＳＴＩＮＧシグナル伝達経路の下流遺伝子ＩＦＮβ、ＩＦＮα４及びＣＸＣＬ１０の発現を抑制できることを特徴とする請求項１に記載の応用。
【請求項８】
前記薬理学的に許容される塩は無機酸、有機酸、アルカリ金属、アルカリ土類金属又は塩基性アミノ酸により形成された塩を備えることを特徴とする請求項１に記載の応用。
【請求項９】
前記ｃＧＡＳ−ＳＴＩＮＧシグナル伝達経路の異常な活性化を伴う疾患は自己免疫、炎症性疾患及びがんを備えることを特徴とする請求項２に記載の応用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は製薬技術に属し、具体的に、ｃＧＡＳ−ＳＴＩＮＧシグナル伝達経路阻害剤としてのキク科環状ペプチドの応用、及び関連疾患の治療薬の調製におけるその応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
自然免疫は、宿主の免疫系の防御の最前線である。長い生物学的進化過程において、宿主細胞中のパターン認識受容体は、核酸分子、ＬＰＳなどの侵襲性病原微生物の保存性成分病原体の関連分子パターンを認識し、病原微生物の侵入を感知すると、感染シグナルは、下流のリンカータンパク質、キナーゼ及び転写因子を介して伝達され、Ｉ型インターフェロンと炎症誘発性サイトカインの発現を誘導し、最終的に侵入した病原微生物を除去する。過去数十年にわたる研究により、宿主細胞が「非自己」ＲＮＡを認識及び除去するシグナル伝達メカニズムが詳しく分析されてきたが、近年、「非自己」ＤＮＡ、特にｃＧＡＳ−ＳＴＩＮＧシグナル伝達経路を認識するシグナル伝達メカニズムの研究が始まる。
【０００３】
ＳＴＩＮＧ（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｇｅｎｅｓ）は、別名としてＴＭＥＭ１７３、ＭＩＴＡ、ＥＲＩＳ又はＭＰＹＳであり、ＤＮＡ侵入に対する細胞内応答の重要なノード分子として、細胞質ＤＮＡ刺激により、細胞質ＤＮＡ受容体からのシグナルに反応し、インターフェロン産生を誘導する過程中に重要な役割を果たす。宿主細胞のＤＮＡ認識受容体は、外因性又は内因性の「非自己」ＤＮＡを認識した後、小胞体上のノード分子ＳＴＩＮＧにシグナルを送信し、次にＳＴＩＮＧは急速に二量体化し、且つ小胞体から核周囲体に移行する。この過程において、キナーゼＴＢＫ１もリクルートされ、活性化のために核周囲体に移行し、活性化されたＴＢＫ１は転写因子ＩＲＦ３をリン酸化し、その後、ＩＲＦ３は二量体化して核に入り、複数の標的遺伝子の転写発現を活性化し、抗ウイルス、炎症反応、免疫反応及び腫瘍形成と発達などの重要な生理学的及び病理学的過程が含まれる複数の生物学的効果に参加する。
【０００４】
正常に活性化されたｃＧＡＳ−ＳＴＩＮＧシグナル伝達経路は、侵入するＤＮＡ病原性微生物を認識して除去することに役立ち、ただし、異常に活性化されたｃＧＡＳ−ＳＴＩＮＧシグナル伝達経路は、体内でＡｉｃａｒｄｉ−Ｇｏｕｔｉｅｒｅｓ症候群、全身性エリテマトーデス又はループス様疾患などの炎症や自己免疫疾患を引き起こす可能性がある。したがって、ｃＧＡＳ−ＳＴＩＮＧシグナル伝達経路の制御を研究して、自然免疫を安定状態に維持することが重要である。現在の研究は主にｃＧＡＳ−ＳＴＩＮＧシグナル伝達経路における重要な分子の翻訳後修飾と新しい制御分子の探索に焦点を当て、ｃＧＡＳ−ＳＴＩＮＧシグナル伝達経路の制御に関与する低分子化合物の研究は少ないが、非常に重要な応用価値があり、これは、焦点を当てた研究方向の１つにもなる。
【０００５】
従来技術では、ｃＧＡＳ−ＳＴＩＮＧシグナル伝達経路阻害剤は報告されず、キク科の環状ペプチドが、この経路に作用し、また自己免疫疾患の治療薬の調製に応用されることも報告されない。キク科植物におけるキク科環状ペプチドの種類はあまり多くなく、現在では、キク科シオン属の植物シオン（Ａｓｔｅｒ  ｔａｔａｒｉｃｕｓ  Ｌ．ｆ．）のみから１５個を分離して取得する。キク科環状ペプチド化合物の抽出と分離には一定の特徴があり、該種類の化合物の極性が低く、溶解性が低く、且つ含有量が低いため、高純度の環状ペプチド成分を得ることは困難であることに原因がある。近年、シオン属植物から環状ペプチド成分を分離するためのいくつかの方法が公開され、例えば、徐会敏らの発表により、メタノール還流でキク科シオン属植物シオンの根茎から抽出した後、メタノール抽出物を取得し、水を加えて懸濁させた後、酢酸エチルとｎ−ブチルアルコールで繰り返して抽出し、酢酸エチル部分は、順相及び逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０を繰り返して利用して総環状ペプチド部位を濃縮し取得し、またＨＰＬＣを合わせてそれを分離且つ精製し、一連の環状ペプチドを得る。非特許文献１が参照になる。特許文献１も類似する調製方法を開示する。ただし、これらの方法には一般的に、抽出効率が低い、過程が複雑であり、サンプルの損失が大きく、再現性及び制御性が低いなどの欠点がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｘｕ，Ｈ．Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ａｓｔｉｎｓ  Ｋ−Ｐ，ｓｉｘ  ｎｅｗ  ｃｈｌｏｒｉｎａｔｅｄ  ｃｙｃｌｏｐｅｎｔａｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｒｏｍ  Ａｓｔｅｒ  ｔａｔａｒｉｃｕｓ，Ｔｅｒｅａｈｅｄｒｏｎ  ２０１３，６９，７９６４−７９６９
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】中国特許第１０２１７４０８３号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明はｃＧＡＳ−ＳＴＩＮＧシグナル伝達経路阻害剤としてのキク科環状ペプチド化合物の応用、及びｃＧＡＳ−ＳＴＩＮＧシグナル伝達経路の異常な活性化を伴う疾患の治療薬の調製におけるその応用を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の上記目的を実現するように、本発明は、
ｃＧＡＳ−ＳＴＩＮＧシグナル伝達経路阻害剤としてのキク科環状ペプチド化合物又はその薬理学的に許容される塩の応用と、
ｃＧＡＳ−ＳＴＩＮＧシグナル伝達経路の異常な活性化を伴う疾患の治療薬の調製におけるｃＧＡＳ−ＳＴＩＮＧシグナル伝達経路阻害剤としてのキク科環状ペプチド化合物又はその薬理学的に許容される塩の応用という技術的解決手段を提供する。
【００１０】
ここで、前記キク科環状ペプチド化合物は好ましくは下記の構造式で示されるキク科環状ペプチドＡｓｔｉｎｓ  Ａ−Ｈ（１−８）とＡｓｔｉｎｓ  Ｋ−Ｐ（９−１４）である。
【化１】
2020531482.tif 000002
【００１１】
さらに好ましくは、前記キク科環状ペプチドはＡｓｔｉｎ  Ｃである。
【００１２】
前記キク科環状ペプチド化合物又はその薬理学的に許容される塩は、ＩＳＤの刺激におけるｃＧＡＳ−ＳＴＩＮＧシグナル伝達経路の下流遺伝子ＩＦＮβ、ＩＦＮα４及びＣＸＣＬ１０の発現を抑制でき、したがってｃＧＡＳ−ＳＴＩＮＧシグナル伝達経路を抑制することを達成する。
【００１３】
前記薬理学的に許容される塩は無機酸、有機酸、アルカリ金属、アルカリ土類金属又は塩基性アミノ酸により形成された塩を備える。
【００１４】
さらに、本発明に記載のキク科環状ペプチド又はその薬理学的に許容される塩は、塩酸、硝酸、硫酸、リン酸、臭化水素酸などの無機酸、或いは、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、乳酸、クエン酸、酢酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、アジピン酸、パルミチン酸、タンニン酸などの有機酸、或いは、リチウム、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属、或いは、カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属、或いは、リジンなどの塩基性アミノ酸により形成された塩などが挙げられる。
【００１５】
本発明に記載のｃＧＡＳ−ＳＴＩＮＧシグナル伝達経路の異常な活性化を伴う疾患の治療薬は、キク科環状ペプチド化合物又はその薬理学的に許容される塩と、薬学的に許容された担体を組み合わせた後に調製される。調製される薬の剤形は錠剤、カプセル剤、経口液剤、注射剤、注射用凍結乾燥剤又は粉末注射剤などであってもよい。キク科環状ペプチドがシオンから抽出分離され、錠剤、カプセル剤、経口液剤、注射剤、注射用凍結乾燥剤又は粉末注射剤などの薬の剤形の調製は当該分野の通常知識である。そのため、キク科環状ペプチド化合物と対応する担体とで調製された様々な薬の剤形も当業者により実現される。
【００１６】
前文に記載した薬学上に許容される担体は、水などの希釈剤、賦形剤や、澱粉、ショ糖などの充填剤や、セルロース誘導体、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン及びポリビニルピロリドンなどの粘着剤や、グリセリンなどの湿潤剤や、寒天、炭酸カルシウム及び重炭酸ナトリウムなどの崩壊剤や、第四級アンモニウム化合物などの吸収促進剤や、ヘキサデカノールなどの界面活性剤や、カオリンと石鹸粘土などの吸着担体や、タルカムパウダー、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム及びポリエチレングリコールなどの潤滑剤が含まれる薬学分野の通常の担体である。そのほか、組成物の中に、香味料、甘味料などのほかの添加剤を加えることができる。
【００１７】
本発明の化合物は組成物の形式で、経口、経鼻、直腸または非経口投与の方式でこのような治療が必要な患者に投与することができる。経口投薬の場合、それを、錠剤、粉剤、顆粒剤、カプセル剤などの通常の固体製剤に、水や油の懸濁剤又はシロップ剤、エリキシル剤などのほかの液体製剤に調製し、非経口投薬の場合、それを、注射用の溶液、水又は油性懸濁剤などに調製することができる。本発明の薬物組成物の様々な剤形は薬学分野の通常の生産方法に基づいて調製できる。例えば活性成分を１種又は複数種の担体と混合し、その後に必要な剤形に調製する。
【００１８】
前記薬の中、好ましくは、重量比０．１％〜９９．５％の活性成分のキク科環状ペプチド又はその薬理学的に許容される塩を含有し、最も好ましくは重量比０．５％〜９５％の活性成分を含有する。
【００１９】
本発明に記載の薬の投与量は投与経路、患者の年齢、体重、治療中の疾患の種類と重症度などに応じて変化でき、その毎日の投薬量は０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重であってもよく、好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重であり、１回又は数回で投与することができる。
【００２０】
本発明はＭＥＦ細胞中にＡｓｔｉｎｓ  Ａ−Ｈ（１−８）とＡｓｔｉｎｓ  Ｋ−Ｐ（９−１４）がＤＮＡ類似物のＩＳＤの刺激により活性化したｃＧＡＳ−ＳＴＩＮＧシグナル伝達経路の下流遺伝子の発現に対する影響、及びＨＳＶ−１により誘導されたマウス血清におけるＩＦＮβタンパク質発現に対する影響を検出することにより、キク科環状ペプチドが体内外でｃＧＡＳ−ＳＴＩＮＧシグナル伝達経路を抑制でき、該経路の最初の阻害剤であり、関連疾患の治療薬の調製に適用されることがわかる。前記ｃＧＡＳ−ＳＴＩＮＧシグナル伝達経路の異常な活性化を伴う疾患は、Ａｉｃａｒｄｉ−Ｇｏｕｔｉｅｒｅｓ症候群、全身性エリテマトーデスなどの自己免疫、炎症性疾患及びがんなどを備える。
【００２１】
本発明に記載のＡｓｔｉｎｓ  Ａ−Ｈ（１−８）とＡｓｔｉｎｓ  Ｋ−Ｐ（９−１４）の調製方法は、非特許文献１、及び特許文献１により開示した類似する調製方法を参照することができる。しかし、上記方法には一般的に、抽出効率が低く、過程が複雑であり、サンプルの損失が大きく、再現性と制御性が低いなどの欠点があり、本出願において調製方法を改善したが、改善後の調製方法は概ねに言えば、メタノール抽出物は、抽出せずにシリカゲルカラムクロマトグラフィーに直接かけられ、分離過程を簡素化するとともに、サンプルの損失を減少し、順相及び逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけられることにより、一部の色素及びそのほかの低極性成分を簡単に除去でき、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０ゲルクロマトグラフィーを利用して、環状ペプチドの分子量とは非常に異なる低分子成分の一部を分離でき、同時に環状ペプチドを迅速に濃縮し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）精製及び再結晶技術を利用して、環状ペプチドを順調に分離して取得できる。そのほか、本方法は、順相及び逆相シリカゲル、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０などの実験室又は工業用の通常のクロマトグラフィー材料のみを利用する。まとめれば、本発明の抽出分離方法は、制御性と再現性が優れ、サンプルの損失が少なく、コストが低く、操作しやすく、微量の環状ペプチドを分離して取得でき、溶媒は回収して再利用でき、工業生産に適用される。具体的な調製は実施例の部分を参照することができる。
【発明の効果】
【００２２】
有益な効果
キク科環状ペプチド化合物はｃＧＡＳ−ＳＴＩＮＧシグナル伝達経路阻害剤であり、ＤＮＡ類似物ＩＳＤの刺激によるｃＧＡＳ−ＳＴＩＮＧシグナル伝達経路の下流遺伝子ＩＦＮβ、ＩＦＮα４及びＣＸＣＬ１０の発現を効果的に抑制でき、それにより、ｃＧＡＳ−ＳＴＩＮＧシグナル伝達経路の異常な活性化を伴う疾患の治療薬の調製に適用され、本発明に記載のキク科環状ペプチド化合物は天然化合物であるため、その剤形と投薬方式が多様化されており、幅広い臨床応用の見通しがあることは本発明が初めて開示する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明のキク科環状ペプチド化合物の調製方法のフローチャートである。
【図２】図２ａは、本発明のキク科環状ペプチド化合物Ａｓｔｉｎｓ  Ａ−Ｈ（１−８）とＡｓｔｉｎｓ  Ｋ−Ｐ（９−１４）がＭＥＦ細胞中にＤＮＡ類似物ＩＳＤの刺激により活性化したＩＦＮβ  ｍＲＮＡの発現を抑制する作用である。図２ｂは、Ａｓｔｉｎ  Ｃ（３）のＭＥＦ細胞中におけるＤＮＡ類似物ＩＳＤの刺激により活性化したｃＧＡＳ−ＳＴＩＮＧシグナル伝達経路の下流遺伝子ＩＦＮβ、ＩＦＮα４及びＣＸＣＬ１０の発現に対する影響である。
【図３】本発明のキク科環状ペプチド化合物Ａｓｔｉｎ  Ｃ（３）のＨＳＶ−１により誘導されたマウス血清におけるＩＦＮβタンパク質の発現に対する影響である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
次に具体的な実施例を合わせて本発明の実質的な内容をさらに説明する。
【００２５】
特に明記しない限り、本実施例に使用される機器、材料、試薬は、市場での購入を通じて入手することができる。
【００２６】
実施例１
キク科環状ペプチド化合物Ａｓｔｉｎｓ  Ａ−Ｈ（１−８）とＡｓｔｉｎｓ  Ｋ−Ｐ（９−１４）の調製（調製方法のフローは図１に示される）
【００２７】
シオン（Ａｓｔｅｒ  ｔａｔａｒｉｃｕｓ  Ｌ．）の乾燥根及び根茎１０Ｋｇを秤取し、乾燥、粉砕し、且つメタノールで一晩浸漬した後、メタノール熱還流で抽出し、合計で３回抽出し、１回目は４時間、２回目は４時間、３回目は３時間であり、抽出液を合併し、減圧濃縮後にメタノール抽出物４．６Ｋｇを取得する。該抽出物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけられ、クロロホルム／メタノール（１００：０、９：１、８：２、７：３、１：１、０：１００）でグラジエント溶出させ、環状ペプチドＴＬＣ検出方法を利用して環状ペプチド含有の各留分を合併し、総環状ペプチド部位（２１２．６ｇ）を取得し、以下の各過程はすべて環状ペプチドＴＬＣ検出方法を合わせて分離精製を指導する必要がある。総環状ペプチド部位をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけ、１００：１−８：２のクロロホルム／メタノールグラジエントで溶出し、環状ペプチドポイントの異なりによって５つの成分Ｆｒ．１〜Ｆｒ．５に合併する。Ｆｒ．１（６４ｇ）に対して、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけ、１２：１−１：１の石油エーテル／アセトンでグラジエント溶出させて分離して、３つの成分Ｆｒ．１−１〜Ｆｒ．１−３を取得し、Ｆｒ．１−２（１０ｇ）に対して、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０ゲルカラムクロマトグラフィーにかけ、１：１のクロロホルム／メタノールを溶出剤とし、濃縮された環状ペプチド含有分をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけ、１０：１−３：１のクロロホルム／酢酸エチルでグラジエント溶出させ、３つの成分Ｆｒ．１−２−１〜Ｆｒ．１−２−３を取得し、Ｆｒ．１−２−１（３４ｍｇ）成分はＯＤＳ  ＨＰＬＣセミ分取カラムで精製され、２０％のアセトニトリルと５‰のトリフルオロ酢酸を流動相とし、Ａｓｔｉｎ  Ｌ（１０）（５ｍｇ）を取得し、Ｆｒ．１−２−２（２３１ｍｇ）はシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけ、１：３のクロロホルム／酢酸エチルを溶出剤とし、Ａｓｔｉｎ  Ｋ（９）（２０ｍｇ）を取得する。Ｆｒ．２（１５ｇ）に対してシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけ、２：１−１：２の石油エーテル／アセトンでグラジエント溶出させ、５つの成分Ｆｒ．２−１〜Ｆｒ．２−５を取得し、ここで、Ｆｒ．２−２（２．８ｇ）は再びシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけ、７：１のクロロホルム／メタノールでアイソクラティック溶出させ、４つの成分Ｆｒ．２−２−１〜Ｆｒ．２−２−４を取得し、Ｆｒ．２−２−１（７８６ｍｇ）に対してＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０クロマトグラフィーにかけ、１：１のクロロホルム／メタノールを溶出剤とし、環状ペプチド成分を取得し、ＯＤＳ  ＨＰＬＣセミ分取カラムで精製し、３５％のアセトニトリルと５‰のトリフルオロ酢酸を流動相とし、Ａｓｔｉｎ  Ｆ（６）（１０ｍｇ）、Ａｓｔｉｎ  Ｈ（８）（１５ｍｇ）とＡｓｔｉｎ  Ｍ（１１）（７ｍｇ）を取得し、Ｆｒ．２−３（１．１ｇ）はＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０クロマトグラフィーにかけ、１：１のクロロホルム／メタノールを溶出剤とし、環状ペプチド成分を取得し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけ、２０：１−５：１のクロロホルム／メタノールでグラジエント溶出させ、４つの成分Ｆｒ．２−３−１〜Ｆｒ．２−３−４を取得し、ここでＦｒ．２−３−４（４１ｍｇ）はＯＤＳ  ＨＰＬＣセミ分取カラムで精製してＡｓｔｉｎ  Ｎ（１２）（５ｍｇ）を取得し、Ｆｒ．２−４（７８９ｍｇ）はシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけ、２０：１−５：１のクロロホルム／メタノールでグラジエント溶出させ、Ａｓｔｉｎ  Ｄ（４）（２００ｍｇ）を取得し、Ｆｒ．２−５（９７１ｍｇ）はＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０クロマトグラフィーにかけ、１：１のクロロホルム／メタノールを溶出剤とし、２つの成分Ｆｒ．２−５−１〜Ｆｒ．２−５−２を取得し、ここで、Ｆｒ．２−５−１（１２８ｍｇ）はシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけ、２５：１の酢酸エチル／メタノールでアイソクラティック溶出させ、Ａｓｔｉｎ  Ａ（１）（１２．７ｍｇ）を取得し、Ｆｒ．２−５−２（７８ｍｇ）は繰り返してシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけ、クロロホルム／アセトンで溶出分離して、Ａｓｔｉｎ  Ｏ（１３）（３ｍｇ）を取得する。Ｆｒ．３（３０ｇ）に対してシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけ、１：１−１：２の石油エーテル／アセトンでグラジエント溶出させ、３つの成分Ｆｒ．３−１〜Ｆｒ．３−３を取得し、ここで、Ｆｒ．３−１（８ｇ）はまたシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけ、３：１−５：１のクロロホルム／酢酸エチルを溶出剤として、グラジエント溶出させ、合併して５つの成分Ｆｒ．３−１−１〜Ｆｒ．３−１−５を取得する。ここで、Ｆｒ．３−１−２（３ｇ）はＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０クロマトグラフィーにかけ、１：１のクロロホルム／メタノールを溶出剤とし、環状ペプチド部分を合併し、該部分はメタノールの再結晶により化合物Ａｓｔｉｎ  Ｃ（３）（１．４ｇ）を取得し、Ｆｒ．３−２（１２ｇ）はＲＰ−１８カラムクロマトグラフィーにかけ、１０％−８０％のメタノール／水でグラジエント溶出させ、３つの成分Ｆｒ．３−２−１〜Ｆｒ．３−２−３を取得し、Ｆｒ．３−２−２（４．１ｇ）はＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０クロマトグラフィーにかけ、１：１のクロロホルム／メタノールを溶出剤とし、濃縮環状ペプチド部分を取得し、該部分はシリカゲルクロマトグラフィーにかけ、２０：１−５：１のクロロホルム／メタノールを溶出剤としてグラジエント溶出させ、４つの成分Ｆｒ．３−２−２−１〜Ｆｒ．３−２−２−４を取得し、Ｆｒ．３−２−２−２（８２１ｍｇ）はＯＤＳ  ＨＰＬＣセミ分取カラムで精製し、４５％のアセトニトリルと５‰のトリフルオロ酢酸を溶出剤とし、Ａｓｔｉｎ  Ｐ（１４）（１２ｍｇ）とＡｓｔｉｎ  Ｅ（５）（２００ｍｇ）を取得し、Ｆｒ．３−２−２−３（４４ｍｇ）はＯＤＳ  ＨＰＬＣセミ分取カラムで精製し、１５％のアセトニトリルと５‰のトリフルオロ酢酸を溶出剤とし、Ａｓｔｉｎ  Ｇ（７）（１２ｍｇ）を取得する。Ｆｒ．３−２−２−４（１．３ｇ）はシリカゲルクロマトグラフィーにかけ、１：３−１：９のクロロホルム／酢酸エチルでグラジエント溶出させ、環状ペプチド部分を濃縮し、該部分はＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０クロマトグラフィーにかけて精製した後、シリカゲルクロマトグラフィーにかけ、１５：１−５：１のクロロホルム／メタノールでグラジエント溶出させ、化合物Ａｓｔｉｎ  Ｂ（２）（７８６ｍｇ）を取得する。
【００２８】
実施例２
実施例１により調製して取得したキク科環状ペプチド化合物Ａｓｔｉｎｓ  Ａ−Ｈ（１−８）とＡｓｔｉｎｓ  Ｋ−Ｐ（９−１４）はＭＥＦ細胞中に、ＤＮＡ類似物ＩＳＤの刺激により活性化したｃＧＡＳ−ＳＴＩＮＧシグナル伝達経路の下流遺伝子の発現に対する影響を検出する。実験原理、方法と結果は下記のとおりである。
【００２９】
実験原理
自然免疫シグナル伝達経路において、ｃＧＡＳ−ＳＴＩＮＧシグナル伝達経路は体内に侵入する外因性のＤＮＡ病原性微生物を認識することができる。外因性のＤＮＡ刺激は、下流のＩ型インターフェロン遺伝子及びインターフェロン刺激遺伝子の発現を誘導できる。そのため、外因性のＤＮＡ（ＤＮＡ類似物ＩＳＤ）の刺激により、経路の下流遺伝子ＩＦＮβ、ＩＦＮα４とＣＸＣＬ１０の発現を検出することにより、ｃＧＡＳ−ＳＴＩＮＧシグナル伝達経路の活性化状況を反映し、したがって、化合物のｃＧＡＳ−ＳＴＩＮＧシグナル伝達経路の活性化に対する影響を評価できる。
【００３０】
実験方法
（１）細胞培養
ＭＥＦ細胞は１０％のウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）及び５０Ｕ／ｍＬのペニシリンと５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ（Ｉｎｖｏｔｒｏｇｅｎ）を用いて培養する。培養条件は３７℃、５％のＣＯ２、２日ごとに１回継代し、
（２）リポソーム型トランスフェクションと化合物処理
ＭＥＦ細胞を１２ウェル細胞培養プレートの中に敷き、１０μＭの対応する化合物と等量のＤＭＳＯで細胞を６時間前処理した後、Ｌｉｐｏ２０００（Ｉｎｖｏｔｒｏｇｅｎ）を用いて５μｇのＩＳＤ刺激細胞をトランスフェクトし、６時間後に培養液を捨て、ＰＢＳを用いて細胞をＥＰチューブの中に遠心収集し、
（３）ＲＮＡ抽出
５００μＬのＴＲＩｚｏｌを用いて（２）における細胞を分裂分解し、その後に１００μＬのＣＨＣｌ３を加えて、溶解液の中のＲＮＡを抽出し、４℃と１２０００ｇの条件で１５ｍｉｎ遠心させ、２００μＬの上澄み液を新しいＥＰチューブの中に移転し、等体積のイソプロパノールを加えて、ＲＮＡを沈殿させ、１０ｍｉｎ静置した後、４℃と１２０００ｇの条件で１０ｍｉｎ遠心させ、上澄み液を除去し、７５％のエタノール含有のＤＥＰＣ水１ｍＬを加えて洗浄して沈殿させ、４℃と７５００ｇの条件で５ｍｉｎ遠心させ、上澄み液を除去し、且つ室温下で５ｍｉｎ乾燥沈殿させ、その後、適量のＤＥＰＣ水でＲＮＡを溶解した後に後続の実験を行い、
（４）リアルタイム蛍光定量ＰＣＲによる下流遺伝子発現の検出
（２）における抽出により取得した細胞全ＲＮＡをテンプレートとし、ｏｌｉｇｏ  ｄＴをプライマーとし、逆転写によりｃＤＮＡを取得する。Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  ＧＲＥＥＮ  ＰＣＲ  ＭＡＳＴＥＲ  ＭＩＸ（ＡＢＩ）試薬を用いてリアルタイム蛍光定量ＰＣＲを行い、ＧＡＤＰＨをリファレンス遺伝子とする。
【００３１】
実験結果は図２に示す。ここで、図２ａは本発明のキク科環状ペプチド化合物Ａｓｔｉｎｓ  Ａ−Ｈ（１−８）とＡｓｔｉｎｓ  Ｋ−Ｐ（９−１４）がＭＥＦ細胞中にＤＮＡ類似物ＩＳＤの刺激により活性化したＩＦＮβ  ｍＲＮＡ発現を抑制する作用である。図２ｂはＡｓｔｉｎ  Ｃ（３）のＭＥＦ細胞中にＤＮＡ類似物ＩＳＤの刺激により活性化したｃＧＡＳ−ＳＴＩＮＧシグナル伝達経路の下流遺伝子ＩＦＮβ、ＩＦＮα４とＣＸＣＬ１０の発現に対する影響である。
【００３２】
実験結果により、キク科環状ペプチド化合物は、ＤＮＡ類似物ＩＳＤの刺激におけるｃＧＡＳ−ＳＴＩＮＧシグナル伝達経路の下流遺伝子ＩＦＮβ、ＩＦＮα４及びＣＸＣＬ１０の発現を抑制でき、ここで、Ａｓｔｉｎ  Ｃの活性が一番よく、キク科環状ペプチドがｃＧＡＳ−ＳＴＩＮＧシグナル伝達経路の活性を抑制でき、これまでに見つかったこの経路の最初の阻害剤である。
【００３３】
実施例３
実施例１により調製されたキク科環状ペプチド化合物Ａｓｔｉｎ  Ｃ（３）のＨＳＶ−１により誘導されたマウス血清におけるＩＦＮβタンパク質の発現に対する影響である。
【００３４】
実験原理
体内でのＩＦＮβタンパク質の発現は、自然免疫の抗感染反応の象徴的なイベントであり、ＩＦＮβの発現は、インターフェロン受容体（ＩＦＮＲ）シグナル伝達経路を活性化して、サイトカインやインターフェロン刺激遺伝子などの細胞因子と炎症性因子の発現を誘導し、その後、ＮＫ細胞のリクルート又は適応免疫応答などの分子メカニズムのさらなる活性化により、侵入した病原微生物を最終的に排除する。そのため、ＤＮＡウイルスＨＳＶ−１がマウスに感染した後、マウス血清におけるＩＦＮ−βの発現量を検出することにより、自然の抗感染症に対する身体の免疫反応の活性化を反映し、したがって体の自然の抗感染免疫応答活動に対する化合物の影響を評価できる。
【００３５】
実験方法
（１）ＨＳＶ−１感染マウスモデルの構築
６−８週齢の野生型マウスを取り、尾静脈注射の方式で１００μＬの力価１×１０７のＨＳＶ−１をマウスの体内に注射し、６ｈ後に血清を収集して後続実験を行う。
（２）マウスの化合物処理
尾静脈注射の方式で野生型マウスに一定濃度の化合物を注射し、１日おきに１回注射し、３回注射する。
（３）眼窩採血法でマウス血液を収集して血清を取得する
毛細管でマウスの眼窩毛細血管を貫通し、毛細管で末梢血２００μＬをＥＰチューブの中に収集し、室温で一晩静置し、その後、３０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心させ、上澄み液を取る。
（４）ＥＬＩＳＡによる血清におけるＩＦＮβタンパク質含量の検出
Ｖｅｒｉｋｉｎｅキット（ＰＢＬ  Ａｓｓａｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）の実験操作マニュアルに記載した方法ステップによってマウス血清におけるＩＦＮβタンパク質の含量を検出する。
【００３６】
実験結果は図３に示す。
【００３７】
実験結果により、キク科環状ペプチド化合物Ａｓｔｉｎ  Ｃ（３）はＨＳＶ−１により誘導されるマウス血清におけるＩＦＮβタンパク質の含量を著しく低めることができ、キク科環状ペプチドは体内でｃＧＡＳ−ＳＴＩＮＧシグナル伝達経路の活性を抑制できることがわかる。
【００３８】
実施例４
実施例１により取得された化合物Ａｓｔｉｎｓ  Ａ−Ｈ（１−８）とＡｓｔｉｎｓ  Ｋ−Ｐ（９−１４）は、４％の硫酸エタノール溶液を加え、ＰＨ＝４、濾過、乾燥させ、硫酸塩化合物１−１４を取得する。
【００３９】
実施例５
実施例１により取得された化合物Ａｓｔｉｎｓ  Ａ−Ｈ（１−８）とＡｓｔｉｎｓ  Ｋ−Ｐ（９−１４）は、４％の塩酸溶液を加え、ＰＨ＝４、濾過、乾燥させ、塩酸塩化合物１−１４を取得する。
【００４０】
実施例６
実施例１により取得された化合物Ａｓｔｉｎｓ  Ａ−Ｈ（１−８）とＡｓｔｉｎｓ  Ｋ−Ｐ（９−１４）は、４％の酒石酸溶液を加え、ＰＨ＝４、濾過、乾燥させ、酒石酸塩化合物１−１４を取得する。
【００４１】
実施例７
実施例１により取得された化合物Ａｓｔｉｎｓ  Ａ−Ｈ（１−８）とＡｓｔｉｎｓ  Ｋ−Ｐ（９−１４）は、４％のクエン酸溶液を加え、ＰＨ＝４、濾過、乾燥させ、クエン酸塩化合物１−１４を取得する。
【００４２】
実施例８
錠剤
実施例１により取得された化合物Ａｓｔｉｎｓ  Ａ−Ｈ（１−８）とＡｓｔｉｎｓ  Ｋ−Ｐ（９−１４）又は実施例４−７により取得された塩１０ｍｇ、乳糖１８０ｍｇ、澱粉５５ｍｇ、ステアリン酸マグネシウム５ｍｇ。
【００４３】
調製方法
化合物又はその塩、乳糖と澱粉を混合し、水で均一に湿潤にし、湿潤になった混合物をふるいにかけ、乾燥させ、再びふるいにかけ、ステアリン酸マグネシウムを加え、その後、混合物を打錠し、１錠ごとの重量は２５０ｍｇであり、化合物の含量は１０ｍｇである。
【００４４】
実施例９
アンプル剤
実施例１により取得された化合物Ａｓｔｉｎｓ  Ａ−Ｈ（１−８）とＡｓｔｉｎｓ  Ｋ−Ｐ（９−１４）又は実施例４−７により取得された塩２ｍｇ、塩化ナトリウム１０ｍｇ。
【００４５】
調製方法
化合物又はその塩と塩化ナトリウムを適量の注射用水の中に溶解させ、濾過して溶液を取得し、無菌条件下でアンプルに詰める。
【００４６】
実施例１０
注射用凍結乾燥剤
実施例１により取得された化合物Ａｓｔｉｎｓ  Ａ−Ｈ（１−８）とＡｓｔｉｎｓ  Ｋ−Ｐ（９−１４）又は実施例４−７により取得された塩１０ｍｇ、重炭酸ナトリウム２ｍｇ、マンニトール２５２ｍｇ。
【００４７】
調製方法
重炭酸ナトリウム、マンニトールに対して、注射用水を加えて溶解させ、活性炭を加えて３０分間吸着させて発熱物質を除去し、活性炭を濾過して除去し、濾液に化合物又はその塩を加え、超音波処理して溶解させ、１Ｎの塩酸でＰＨを５．０〜７．０に調整し、微多孔膜で濾過し、注射用水を加え、分包、凍結乾燥し、栓を詰め、キャップを付け、完成する。
【００４８】
実施例１１
カプセル剤
実施例１により取得された化合物Ａｓｔｉｎｓ  Ａ−Ｈ（１−８）とＡｓｔｉｎｓ  Ｋ−Ｐ（９−１４）又は実施例４−７により取得された塩１０ｍｇ、乳糖１８７ｍｇ、ステアリン酸マグネシウム３ｍｇ。
【００４９】
調製方法
化合物又はその塩と共溶媒を混合し、ふるいにかけ、均一に混合し、得られた混合物をハードゼラチンカプセルに詰め、１カプセルごとの重量は２００ｍｇであり、活性成分の含量は１０ｍｇである。
【００５０】
（付記）
（付記１）
ｃＧＡＳ−ＳＴＩＮＧシグナル伝達経路阻害剤としてのキク科環状ペプチド化合物又はその薬理学的に許容される塩の応用。
【００５１】
（付記２）
ｃＧＡＳ−ＳＴＩＮＧシグナル伝達経路の異常な活性化を伴う疾患の治療薬の調製におけるｃＧＡＳ−ＳＴＩＮＧシグナル伝達経路阻害剤としてのキク科環状ペプチド化合物又はその薬理学的に許容される塩の応用。
【００５２】
（付記３）
前記キク科環状ペプチド化合物は、骨格がβ−フェニルアラニンを含有し、通常のアミノ酸ペプチド結合によって直接接続されて形成された単環式ペンタペプチド化合物であり、１つのＬ−β−フェニルアラニン、１つのＬ−セリン誘導体、１つのＬ−プロリン誘導体及び２つのほかのアミノ酸誘導体を含有することを特徴とする付記１又は２に記載の応用。
【００５３】
（付記４）
前記キク科環状ペプチド化合物は下記の構造式で示されるキク科環状ペプチドＡｓｔｉｎｓ  Ａ−Ｈ（１−８）とＡｓｔｉｎｓ  Ｋ−Ｐ（９−１４）であることを特徴とする付記３に記載の応用。
【化２】
2020531482.tif 000003
【００５４】
（付記５）
前記キク科環状ペプチドはＡｓｔｉｎ  Ｃであることを特徴とする付記４に記載の応用。
【００５５】
（付記６）
前記キク科環状ペプチドはシオン属の植物シオンの根及び根茎から抽出されることを特徴とする付記１又は２に記載の応用。
【００５６】
（付記７）
前記キク科環状ペプチド化合物又はその薬理学的に許容される塩は、ＤＮＡ類似物ＩＳＤの刺激におけるｃＧＡＳ−ＳＴＩＮＧシグナル伝達経路の下流遺伝子ＩＦＮβ、ＩＦＮα４及びＣＸＣＬ１０の発現を抑制できることを特徴とする付記１に記載の応用。
【００５７】
（付記８）
前記薬理学的に許容される塩は無機酸、有機酸、アルカリ金属、アルカリ土類金属又は塩基性アミノ酸により形成された塩を備えることを特徴とする付記１に記載の応用。
【００５８】
（付記９）
前記ｃＧＡＳ−ＳＴＩＮＧシグナル伝達経路の異常な活性化を伴う疾患は自己免疫、炎症性疾患及びがんを備えることを特徴とする付記２に記載の応用。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【国際調査報告】
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